(57)【要約】ヒトＳｙｔＩＩ受容体へのボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）の結合を改変するアミノ酸変異を有する改変ＢｏＮＴ／Ｂ４受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）を有するボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドが、本明細書に開示される。特定の変異及び変異の組み合わせが開示される。単離された改変ＨＣ、そのような改変ＨＣを含むポリペプチド、キメラ分子、薬学的組成物、ならびにその製造方法及び使用方法もまた開示される。追加のそのような改変受容体結合ドメインを同定する方法もさらに開示される。2019533430.tif 000016
2019533430.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）プロテアーゼドメインと；
ｂ）プロテアーゼ切断部位と；
ｃ）移行ドメインと；
ｄ）ヒトＳｙｔＩＩに結合するボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）と
を含む、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチド。
【請求項２】
前記改変受容体結合ドメインが、置換変異Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ及びＩ１１９７Ｐを含む、請求項１に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項３】
Ｑ１１９１Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ、Ｑ１１９１Ｌ、Ｑ１１９１Ｙ、Ｑ１１９１Ｍ、Ｙ１１９９Ｗ、Ｙ１１９９Ｅ、Ｙ１１９９Ｈ、Ｗ１１７８Ｙ、Ｗ１１７８Ｑ、Ｗ１１７８Ａ、Ｗ１１７８Ｓ、Ｙ１１８３Ｃ、Ｙ１１８３Ｐ及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、血清型Ｂ株４における置換変異に対応する１つ以上の置換変異をさらに含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記改変（Ｂ４−ＨＣ）が、Ｑ１１９１Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ、Ｑ１１９１Ｌ、Ｑ１１９１Ｙ、Ｑ１１９１Ｍ、Ｙ１１９９Ｗ、Ｙ１１９９Ｅ、Ｙ１１９９Ｈ、Ｗ１１７８Ｙ、Ｗ１１７８Ｑ、Ｗ１１７８Ａ、Ｗ１１７８Ｓ、Ｙ１１８３Ｃ及びＹ１１８３Ｐからなる群より選択される、血清型Ｂ株４における置換変異に対応する２つの置換変異を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
血清型Ｂ株４における置換変異に対応する２つ以上の置換変異をさらに含み、前記置換変異の１つが、Ｑ１１９１Ｍ、Ｑ１１９１Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ、Ｑ１１９１Ｌ及びＱ１１９１Ｙからなる群より選択される、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
血清型Ｂ株４における置換変異に対応する２つ以上の置換変異をさらに含み、前記置換変異の１つが、血清型Ｂ株４におけるＹ１１９９Ｗ、Ｙ１１９９Ｅ、Ｙ１１９９Ｈ、Ｗ１１７８Ｙ、Ｗ１１７８Ｑ、Ｗ１１７８Ａ、Ｗ１１７８Ｓ、Ｙ１１８３Ｃ、Ｙ１１８３Ｐ、Ｙ１１９９ＦまたはＹ１１９９Ｌに対応する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
血清型Ｂ株４における、Ｑ１１９１Ｍ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｃ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｖ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｌ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｙ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｍ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｍ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｃ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｃ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｖ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｌ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｌ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｙ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｙ及びＹ１１８３Ｃ、Ｗ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｐ、ならびにＷ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｃに対応する置換変異から選択される２つの置換変異をさらに含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記２つの置換変異が、血清型Ｂ株４におけるＱ１１９１Ｍ及びＷ１１７８Ｑに対応する、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記２つの置換変異が、血清型Ｂ株４におけるＱ１１９１Ｍ及びＷ１１８３Ｐに対応する、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記２つの置換変異が、血清型Ｂ株４におけるＱ１１９１Ｍ及びＷ１１８３Ｃに対応する、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記改変（Ｂ４−ＨＣ）が、３つの置換変異をさらに含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記３つのさらなる置換変異が、血清型Ｂ株４のＱ１１９１、Ｗ１１７８及びＹ１１８３に対応する位置にある、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記３つのさらなる置換変異が、血清型Ｂ株４のＱ１１９１Ｍ、Ｗ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｐに対応する、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＢｏＮＴポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含む、核酸ベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載の核酸を含む、細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＢｏＮＴポリペプチドを発現する、細胞。
【請求項１８】
ａ）プロテアーゼドメインと；
ｂ）プロテアーゼ切断部位と；
ｃ）移行ドメインと；
ｄ）置換変異Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ及びＩ１１９７Ｐを含み、かつ、血清型Ｂ株４のＳ１２０１に対応する位置に置換変異をさらに含む、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）と
を含む、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチド。
【請求項１９】
前記プロテアーゼドメイン、移行ドメイン及びプロテアーゼ切断部位が、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びそれらの組み合わせからなる群より選択される血清型に由来する、請求項１〜１３及び１８のいずれか一項に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項２０】
前記プロテアーゼドメイン、移行ドメイン及びプロテアーゼ切断部位が、血清型Ｂ株１に由来する、請求項１９に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項２１】
前記プロテアーゼドメイン及び移行ドメインが、血清型Ａ株１に由来する、請求項１９に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項２２】
前記プロテアーゼ切断部位が、血清型Ａ、血清型Ｂに由来する、または血清型Ａ及びＢのキメラ切断部位である、請求項１９に記載のＢｏＮＴポリペプチド。
【請求項２３】
ヒトＳｙｔＩＩに結合するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４重鎖の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）を含む、ポリペプチド。
【請求項２４】
前記改変受容体結合ドメインが、置換変異Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ及びＩ１１９７Ｐを含む、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
Ｑ１１９１Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ、Ｑ１１９１Ｌ、Ｑ１１９１Ｙ、Ｑ１１９１Ｍ、Ｙ１１９９Ｗ、Ｙ１１９９Ｅ、Ｙ１１９９Ｈ、Ｗ１１７８Ｙ、Ｗ１１７８Ｑ、Ｗ１１７８Ａ、Ｗ１１７８Ｓ、Ｙ１１８３Ｃ、Ｙ１１８３Ｐ及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、血清型Ｂ株４における置換変異に対応する１つ以上の置換変異をさらに含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記改変（Ｂ４−ＨＣ）が、Ｑ１１９１Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ、Ｑ１１９１Ｌ、Ｑ１１９１Ｙ、Ｑ１１９１Ｍ、Ｙ１１９９Ｗ、Ｙ１１９９Ｅ、Ｙ１１９９Ｈ、Ｗ１１７８Ｙ、Ｗ１１７８Ｑ、Ｗ１１７８Ａ、Ｗ１１７８Ｓ、Ｙ１１８３Ｃ及びＹ１１８３Ｐからなる群より選択される、血清型Ｂ株４における置換変異に対応する２つの置換変異を含む、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
血清型Ｂ株４における置換変異に対応する２つ以上の置換変異をさらに含み、前記置換変異の１つが、Ｑ１１９１Ｍ、Ｑ１１９１Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ、Ｑ１１９１Ｌ及びＱ１１９１Ｙからなる群より選択される、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）を含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
血清型Ｂ株４における置換変異に対応する２つ以上の置換変異をさらに含み、前記置換変異の１つが、血清型Ｂ株４におけるＹ１１９９Ｗ、Ｙ１１９９Ｅ、Ｙ１１９９Ｈ、Ｗ１１７８Ｙ、Ｗ１１７８Ｑ、Ｗ１１７８Ａ、Ｗ１１７８Ｓ、Ｙ１１８３Ｃ、Ｙ１１８３Ｐ、Ｙ１１９９ＦまたはＹ１１９９Ｌに対応する、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
血清型Ｂ株４における、Ｑ１１９１Ｍ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｃ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｖ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｌ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｙ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｍ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｍ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｃ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｃ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｖ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｌ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｌ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｙ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｙ及びＹ１１８３Ｃ、Ｗ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｐ、ならびにＷ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｃに対応する置換変異から選択される２つの置換変異をさらに含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記２つの置換変異が、血清型Ｂ株４におけるＱ１１９１Ｍ及びＷ１１７８Ｑに対応する、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記２つの置換変異が、血清型Ｂ株４におけるＱ１１９１Ｍ及びＷ１１８３Ｐに対応する、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記２つの置換変異が、血清型Ｂ株４におけるＱ１１９１Ｍ及びＷ１１８３Ｃに対応する、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記改変（Ｂ４−ＨＣ）が、３つの置換変異をさらに含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記３つのさらなる置換変異が、血清型Ｂ株４のＱ１１９１、Ｗ１１７８及びＹ１１８３に対応する位置にある、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記３つのさらなる置換変異が、血清型Ｂ株４のＱ１１９１Ｍ、Ｗ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｐに対応する、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
請求項２２〜３５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項３７】
請求項３６に記載の核酸を含む、核酸ベクター。
【請求項３８】
請求項３６に記載の核酸を含む、細胞。
【請求項３９】
請求項２２〜３５のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはキメラ分子を発現する、細胞。
【請求項４０】
第２部分に連結された、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）である第１部分を含む、キメラ分子であって、前記改変Ｂ４−ＨＣがヒトＳｙｔＩＩに結合する、前記キメラ分子。
【請求項４１】
前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）が、置換変異Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ及びＩ１１９７Ｐを含む、請求項４０に記載のキメラ分子。
【請求項４２】
前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）が、Ｑ１１９１Ｍ；Ｑ１１９１Ｃ；Ｑ１１９１Ｖ；Ｑ１１９１Ｌ；Ｑ１１９１Ｙ；Ｗ１１７８Ｙ；Ｗ１１７８Ｑ；Ｗ１１７８Ａ；Ｗ１１７８Ｓ；Ｙ１１８３Ｃ；Ｙ１１８３Ｐ及びこれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の置換変異をさらに含む、請求項４１に記載のキメラ分子。
【請求項４３】
前記改変Ｂ４−ＨＣが、Ｑ１１９１Ｍ、Ｑ１１９１Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ、Ｑ１１９１Ｌ、Ｑ１１９１Ｙ、Ｗ１１７８Ｙ、Ｗ１１７８Ｑ、Ｗ１１７８Ａ、Ｗ１１７８Ｓ、Ｙ１１８３Ｃ及びＹ１１８３Ｐからなる群より選択される２つの置換変異を含む、請求項４１に記載のキメラ分子。
【請求項４４】
第２部分に連結された、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）である第１部分を含む、キメラ分子であって、前記改変Ｂ４−ＨＣが、血清型Ｂ株４における置換変異に対応する２つ以上の置換変異を含み、かつ、ヒトＳｙｔＩＩに結合し、前記置換変異の１つが、Ｑ１１９１Ｍ；Ｑ１１９１Ｃ；Ｑ１１９１Ｖ；Ｑ１１９１Ｌ及びＱ１１９１Ｙからなる群より選択される、前記キメラ分子。
【請求項４５】
前記置換変異の１つが、血清型Ｂ株４におけるＷ１１７８Ｙ、Ｗ１１７８Ｑ、Ｗ１１７８Ａ、Ｗ１１７８Ｓ、Ｙ１１８３ＣまたはＹ１１８３Ｐに対応する、請求項４４に記載のキメラ分子。
【請求項４６】
２つの置換変異が、血清型Ｂ株４における、Ｑ１１９１Ｍ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｃ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｖ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｌ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｙ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｍ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｍ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｃ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｃ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｖ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｌ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｌ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｙ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｙ及びＹ１１８３Ｃ、Ｗ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｐ、またはＷ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｃに対応する、請求項４４に記載のキメラ分子。
【請求項４７】
前記改変（Ｂ−ＨＣ）が、３つの置換変異を含む、請求項４４に記載のキメラ分子。
【請求項４８】
前記３つの置換変異が、血清型Ｂ株４のＱ１１９１、Ｗ１１７８及びＹ１１８３に対応する位置にある、請求項４７に記載のキメラ分子。
【請求項４９】
前記３つの置換変異が、血清型Ｂ株４のＱ１１９１Ｍ、Ｗ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｐに対応する、請求項４７に記載のキメラ分子。
【請求項５０】
前記第１部分と前記第２部分が共有結合的に連結される、請求項４０〜４９のいずれか一項に記載のキメラ分子。
【請求項５１】
前記第１部分と前記第２部分が非共有結合的に連結される、請求項４０〜４９のいずれか一項に記載のキメラ分子。
【請求項５２】
前記第２部分が、低分子、核酸、短いポリペプチド、及びタンパク質からなる群より選択される、請求項４０〜４９のいずれか一項に記載のキメラ分子。
【請求項５３】
前記第２部分が生物活性分子である、請求項４０〜４９のいずれか一項に記載のキメラ分子。
【請求項５４】
前記第２部分が治療用のポリペプチドまたは非ポリペプチド薬物である、請求項５３に記載のキメラ分子。
【請求項５５】
請求項４０〜４９のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項５６】
請求項５５に記載の核酸を含む、核酸ベクター。
【請求項５７】
請求項５５に記載の核酸を含む、細胞。
【請求項５８】
請求項４０〜４９のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはキメラ分子を発現する、細胞。
【請求項５９】
請求項１〜１３、１８〜３５のいずれか一項に記載のボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドもしくはポリペプチド、または請求項４０〜５４のいずれか一項に記載のキメラ分子、または請求項１５、３７もしくは５６に記載の核酸ベクターを含む、薬学的組成物。
【請求項６０】
薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む、請求項５９に記載の薬学的組成物。
【請求項６１】
請求項５９に記載の薬学的組成物、及び前記薬学的組成物の治療的投与のための説明書を含む、キット。
【請求項６２】
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドを産生するための方法であって、前記ＢｏＮＴポリペプチドが産生される条件下で請求項１７、３９または５８に記載の細胞を培養するステップを含む、前記方法。
【請求項６３】
以下のステップ：
培養物から前記ＢｏＮＴポリペプチドを回収すること、
前記ＢｏＮＴポリペプチドを精製すること、
前記ＢｏＮＴポリペプチドを活性化すること、及び／または
前記ＢｏＮＴポリペプチドを製剤化すること
の１つ以上をさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
望ましくないニューロン活動と関連した病態を治療するための方法であって、治療上有効量の請求項１〜１３、１８〜３５のいずれか一項に記載のＢｏＮＴポリペプチド、または請求項４０〜４９のいずれか一項に記載のキメラ分子を対象に投与し、それにより、望ましくないニューロン活動を示す１つ以上のニューロンと接触させ、それにより、前記病態を治療することを含む、前記方法。
【請求項６５】
前記病態が、痙攣性発声障害、痙性斜頸、喉頭ジストニア、口下顎発声障害、舌ジストニア、頸部ジストニア、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼疾患、脳性麻痺、局所性痙縮及び他の発声障害、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、肢痙縮、チック、振戦、歯ぎしり、裂肛、アカラシア、嚥下障害及び他の筋緊張障害及び筋肉群の不随意運動を特徴とする他の障害、流涙、多汗症、唾液分泌過多、消化管分泌過多、分泌障害、筋痙攣による疼痛、頭痛、片頭痛、ならびに皮膚科学的または審美的／美容的な病態からなる群より選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
医薬における使用のための、請求項１〜１３、１８〜３５のいずれか一項に記載のボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチド、請求項５９もしくは６０のうち一項に記載の薬学的組成物、または請求項４０〜４９のいずれか一項に記載のキメラ分子。
【請求項６７】
望ましくないニューロン活動と関連した病態の治療における使用のための、請求項１〜１３、１８〜３５のいずれか一項に記載のボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチド、請求項５９もしくは６０のうち一項に記載の薬学的組成物、または請求項４０〜４９のいずれか一項に記載のキメラ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年８月２４日に出願された米国仮出願第６２／３７８，９６７号の利益を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所によって付与されたＮＩＨ  １Ｒ２１ＮＳ０８２８３０の下で政府の支援を受けてなされたものである。当該政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本明細書は、２０１７年８月２４日に「０３４２９４１＿０６０２＿ＳＬ．ＴＸＴ」という名前の．ｔｘｔファイルとして電子的に提出された配列表を参照する。．ｔｘｔファイルは、２０１７年８月２２日に作成され、サイズは１０６，９０５バイトである。配列表の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
発明の分野
本発明は、改変神経毒素の分野、ならびに医学的及び／または審美的障害を治療するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
ボツリヌス神経毒素は細菌毒素のファミリーであり、このファミリーは７つの主要な血清型（ＢｏＮＴ／Ａ〜Ｇ）を含む（１）。これらの毒素は、ニューロンからの神経伝達物質の放出を遮断することによって作用し、これにより動物及びヒトを麻痺させる。近年、ＢｏＮＴは、増加する医学的病態のリストを治療するために広く用いられている：微量の毒素を局所注射することで、標的指向された領域においてニューロン活動を弱めることができ、これは多くの医学的病態及び美容上の目的に有益であり得る（７−９）。
【０００６】
ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂは、ヒトでの使用において現在ＦＤＡ認可を受けた唯一の２つのＢｏＮＴである（７−９）。これらは、いかなる配列改変ももたない細菌から精製された毒素である（野生型、ＷＴと定義される）。ＢｏＮＴの用途が拡大するにつれて、限界及び有害作用が報告されてきた。主な限界は、患者における中和抗体の産生であり、これによりその後の治療が無効となる（１１）。ＢｏＮＴの使用を終えると、患者には、障害を治療／緩和するための有効な方法が他にない場合が多い。抗体応答の可能性は、毒素の用量及び注射の頻度の両方と直接関連がある（１１）。したがって、この限界は、主に、比較的高用量の毒素を伴う筋痙攣の治療で起こる。
【０００７】
主な有害作用は、多くの場合、筋痙攣の治療に関連し、美容的用途には関連していない。これは、有害作用が身体の他の領域への毒素の拡散によるところが大きく、毒素拡散の可能性が注射用量と直接関連しているためである。有害作用は、眼瞼下垂及び複視のような一過性の重篤ではない事象から、生命にかかわる事象、さらには死亡まで様々である。２００８年にＤｒ．  Ｓｉｄｎｅｙ  ＷｏｌｆｅによりＦＤＡに対して提出された嘆願書には、１６件の死亡を含む合計１８０件の重篤な有害事象が記述されていた。結果として、ＦＤＡは現在、欧州連合によって発令された同様の警告を受けて、全てのＢｏＮＴ製品に対して、毒素の拡散のリスクを強調する「黒枠警告」を要求している。
【０００８】
中和抗体の生成及び毒素の拡散はいずれも注射用量と直接関連しているため、（同レベルの毒素活性を維持しつつ）毒素用量を下げることが大いに望まれており、このことは個々の毒素分子の有効性を増強させる必要があることを意味している。ニューロンに対する特異性が改善されたこのような改変ＢｏＮＴはまた、他の細胞型への非特異的侵入によるあらゆる潜在的オフターゲット効果も減少させる。
【０００９】
ＢｏＮＴは、文献において明確に定義されているそれらの受容体結合ドメイン（ＢｏＮＴ−ＨＣ、図１Ａ、Ｂ）を介して、それらの特異的受容体に結合することによって、ニューロンを標的指向し、これに侵入する１。受容体結合は、ニューロンを認識するためのＢｏＮＴの有効性及び特異性を左右する。ＢｏＮＴの受容体結合能を改善することで、ニューロンを標的指向するためのＢｏＮＴの有効性及び特異性が高まる。大部分のＢｏＮＴに対する受容体は同定されている（図１Ｃ）。ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ−Ｃ及びＧは、それらの受容体として２つの相同なシナプス小胞タンパク質、シナプトタグミンＩ及びＩＩ（Ｓｙｔ  Ｉ／ＩＩ）を共有するのに対して１３−１８、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｅ、Ｄ及びＦは、別のシナプス小胞タンパク質、ＳＶ２を使用する。タンパク質受容体に加えて、ＢｏＮＴは全て、ニューロン表面上に豊富な脂質共受容体ガングリオシド（図１Ｄ）を必要とする２７。２つのＳｙｔアイソフォームのうち、Ｓｙｔ  ＩＩは、ＢｏＮＴ／Ｂに対する結合親和性がＳｙｔ  Ｉよりも約１０倍高く、さらにＢｏＮＴの標的指向されたニューロンである運動神経終末において発現される主要なアイソフォームである（図２Ａ）。したがって、Ｓｙｔ  ＩＩは、ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ−Ｃ及びＧに対する主要な毒素受容体と見なされている一方、Ｓｙｔ  Ｉは運動神経終末においてマイナーな毒素受容体である。これは、齧歯類、及びおそらくは大部分の哺乳動物における場合である。
【００１０】
ＢｏＮＴはニューロンに対して既に高い特異性を有するとも言えるため、ニューロンに対するそれらの結合をさらに改善することも可能かと問う者もいる。その答えは、ヒトＳｙｔ  ＩＩが、毒素結合部位内の齧歯類（ラット／マウス）Ｓｙｔ  ＩＩからの特有のアミノ酸変化のために、ＢｏＮＴ／Ｂに対する結合及び受容体としての機能を大幅に低下させていることが最近発見されたことを考慮すると、ヒトに関しては、少なくとも部分的に「可能（Ｙｅｓ）」である。これは、５４位（マウスＳｙｔ  ＩＩ配列）におけるフェニルアラニン（Ｆ）からロイシン（Ｌ）への変化である（ＵＳ９，５９８，６８５、図２Ｂに示される）。配列アラインメントにより、この位置のフェニルアラニンが、カモノハシ、魚類、齧歯類、及びサルを含む脊椎動物にわたって、Ｓｙｔ  Ｉ及びＳｙｔ  ＩＩの両方で高度に保存されていることが明らかになった４８。ヒト及びチンパンジーのＳｙｔ  ＩＩのみが、この位置にロイシンを含む。この残基置換の結果として、ヒト及びチンパンジーのＳｙｔ  ＩＩは、マウスＳｙｔ  ＩＩと比較して、ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ−Ｃ、及びＧに対する結合が大幅に低下しており（ＵＳ９，５９８，６８５、図２Ｃに示される）、ＢｏＮＴ／Ｂの侵入を媒介する上で著しく効率が低い（ＵＳ９，５９８，６８５、図２Ｄに示される）。ヒト及びチンパンジーのＳｙｔ  Ｉは、この同じ位置に依然としてフェニルアラニンを含み、ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ−Ｃ、及びＧと結合することができるため（ＵＳ９，５９８，６８５、図２Ｅに示される）、ヒトにおけるＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ−Ｃ、及びＧに対する高親和性受容体は、マイナーな受容体Ｓｙｔ  Ｉに限定される。これらの知見は、（異なる受容体と結合する）ＢｏＮＴ／Ａよりもはるかに高用量のＢｏＮＴ／Ｂが、患者において同レベルの治療効果を達成するために必要であるという臨床的観察について説明する。従来は、これらの観察は、用いられる調製物中の活性神経毒素の割合といった他の理由によるものとされた。ＢｏＮＴ／ＢからヒトＳｙｔ  ＩＩと、ＢｏＮＴ／Ｂから他の種のＳｙｔ  ＩＩとのこのような結合の違いの最近の観察により、ＢｏＮＴ／Ｂの異なる残基がヒトＳｙｔ  ＩＩへの結合に関与している可能性が示唆される。したがって、齧歯類ＳｙｔＩＩへの結合に影響すると予測されるＢｏＮＴ／Ｂへの配列改変は、ヒトＳｙｔ  ＩＩへのＢｏＮＴ／Ｂの結合に予測不可能な影響を及ぼす可能性がある。
【００１１】
したがって、ヒトニューロンを標的指向するためのその有効性及び特異性を増大させ、治療的用途で必要とされる毒素用量を減らすための方法として、ヒト受容体Ｓｙｔ  ＩＩへのＢｏＮＴ／Ｂの結合を改善する必要がある。
【発明の概要】
【００１２】
前述のように、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素は、病的状態の治療及び美容目的の両方のための医薬において使用されている。野生型のボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ株４のポリペプチドは、ヒトＳｙｔＩＩ受容体に高親和性で結合しないか、または望ましくないニューロン活動の有効な阻害をもたらさない。改変受容体結合ドメイン（ＢｏＮＴ／Ｂ４  ＨＣ）のヒトＳｙｔＩＩ受容体への結合能力を劇的に高める血清型Ｂ株４（ＢｏＮＴ／Ｂ４）受容体結合ドメインへの部位特異的変異が、本明細書に記載される。ｈＳｙｔＩＩ受容体への改変ＢｏＮＴ／Ｂ４  ＨＣドメインの向上した結合により、ニューロン活動を阻害するドメインを含むＢｏＮＴポリペプチドの能力を向上させ、そのようなドメインを含むＢｏＮＴポリペプチドを大幅により効果的にし、治療及び美容目的にとって望ましくない免疫応答を引き起こす可能性を低減する。
【００１３】
次いで、一態様では、ａ）プロテアーゼドメイン、ｂ）プロテアーゼ切断部位、ｃ）移行ドメイン、及びｄ）ヒトＳｙｔＩＩに結合するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）を含む、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドが本明細書に記載される。
【００１４】
一実施形態では、ＢｏＮＴポリペプチドの改変受容体結合ドメインは、置換変異Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ及びＩ１１９７Ｐを含む。
【００１５】
別の実施形態では、ＢｏＮＴポリペプチドの改変受容体結合ドメインは、Ｑ１１９１Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ、Ｑ１１９１Ｌ、Ｑ１１９１Ｙ、Ｑ１１９１Ｍ、Ｙ１１９９Ｗ、Ｙ１１９９Ｅ、Ｙ１１９９Ｈ、Ｗ１１７８Ｙ、Ｗ１１７８Ｑ、Ｗ１１７８Ａ、Ｗ１１７８Ｓ、Ｙ１１８３Ｃ、Ｙ１１８３Ｐ及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、血清型Ｂ株４における置換変異に対応する１つ以上の置換変異をさらに含む。別の実施形態では、改変（Ｂ４−ＨＣ）は、Ｑ１１９１Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ、Ｑ１１９１Ｌ、Ｑ１１９１Ｙ、Ｑ１１９１Ｍ、Ｙ１１９９Ｗ、Ｙ１１９９Ｅ、Ｙ１１９９Ｈ、Ｗ１１７８Ｙ、Ｗ１１７８Ｑ、Ｗ１１７８Ａ、Ｗ１１７８Ｓ、Ｙ１１８３Ｃ及びＹ１１８３Ｐからなる群より選択される、血清型Ｂ株４における置換変異に対応する２つの置換変異を含む。
【００１６】
別の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）ポリペプチドは、血清型Ｂ株４における置換変異に対応する２つ以上の置換変異をさらに含み、前記置換変異の１つは、Ｑ１１９１Ｍ、Ｑ１１９１Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ、Ｑ１１９１Ｌ及びＱ１１９１Ｙからなる群より選択される。
【００１７】
別の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）ポリペプチドは、血清型Ｂ株４における置換変異に対応する２つ以上の置換変異をさらに含み、前記置換変異の１つは、血清型Ｂ株４における、Ｙ１１９９Ｗ、Ｙ１１９９Ｅ、Ｙ１１９９Ｈ、Ｗ１１７８Ｙ、Ｗ１１７８Ｑ、Ｗ１１７８Ａ、Ｗ１１７８Ｓ、Ｙ１１８３Ｃ、Ｙ１１８３Ｐ、Ｙ１１９９ＦまたはＹ１１９９Ｌに対応する。
【００１８】
別の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）ポリペプチドは、血清型Ｂ株４における、Ｑ１１９１Ｍ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｃ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｖ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｌ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｙ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｍ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｍ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｃ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｃ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｖ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｌ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｌ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｙ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｙ及びＹ１１８３Ｃ、Ｗ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｐ、ならびにＷ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｃに対応する置換変異から選択される２つの置換変異をさらに含む。別の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）ポリペプチドは、血清型Ｂ株４におけるＱ１１９１Ｍ及びＷ１１７８Ｑに対応する２つの置換変異をさらに含む。別の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）ポリペプチドは、血清型Ｂ株４におけるＱ１１９１Ｍ及びＷ１１８３Ｐに対応する２つの置換変異をさらに含む。別の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）ポリペプチドは、血清型Ｂ株４におけるＱ１１９１Ｍ及びＷ１１８３Ｃに対応する２つの置換変異をさらに含む。
【００１９】
別の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）ポリペプチドは、３つの置換変異をさらに含む。別の実施形態では、前記３つのさらなる置換変異は、血清型Ｂ株４のＱ１１９１、Ｗ１１７８及びＹ１１８３に対応する位置にある。別の実施形態では、前記３つのさらなる置換変異は、血清型Ｂ株４のＱ１１９１Ｍ、Ｗ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｐに対応する。
【００２０】
別の実施形態では、改変受容体結合ドメインは、Ｑ１１９１Ｃ；Ｑ１１９１Ｖ；Ｑ１１９１Ｌ；Ｑ１１９１Ｙ；Ｑ１１９１Ｍ；Ｙ１１９９Ｗ；Ｙ１１９９Ｅ及びＹ１１９９Ｈからなる群より選択される、血清型Ｂ株４における置換変異に対応する置換変異をさらに含む。
【００２１】
別の実施形態では、改変受容体結合ドメインは、血清型Ｂ株４における置換変異Ｑ１１９１Ｍに対応する置換変異をさらに含む。
【００２２】
別の実施形態では、改変受容体結合ドメインは、Ｑ１１９１Ｃ；Ｑ１１９１；Ｑ１１９１Ｌ；Ｑ１１９１Ｙ及びＱ１１９１Ｍから選択される第１の変異、ならびにＹ１１９９Ｗ；Ｙ１１９９Ｅ及びＹ１１９９Ｈから選択される第２の変異からなる群より選択される、血清型Ｂ株４における置換変異に対応する２つの置換変異をさらに含む。
【００２３】
別の実施形態では、改変受容体結合ドメインは、Ｗ１１７８Ｙ；Ｗ１１７８Ｑ；Ｗ１１７８Ａ；Ｗ１１７８Ｓ；Ｙ１１８３Ｃ；Ｙ１１８３Ｐ及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、血清型Ｂ株４における置換変異に対応する１つ以上の置換変異をさらに含む。
【００２４】
別の実施形態では、改変受容体結合ドメインは、血清型Ｂ株４における、Ｑ１１９１Ｍ及びＹ１１９９Ｗ、Ｑ１１９１Ｍ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｃ及びＹ１１９９Ｗ、Ｑ１１９１Ｃ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｖ及びＹ１１９９ＷまたはＱ１１９１Ｖ及びＷ１１７８Ｑに対応する２つの置換変異を含む。
【００２５】
別の実施形態では、改変（Ｂ−ＨＣ）は、血清型Ｂ株４のＱ１１９１、Ｗ１１７８及びＹ１１８３に対応する位置にある３つの置換変異を含む。別の実施形態では、前記３つの置換変異は、血清型Ｂ株４のＱ１１９１Ｍ、Ｗ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｃに対応する。
【００２６】
本明細書中の任意の態様または実施形態に記載のＢｏＮＴポリペプチドをコードする核酸、または該ＢｏＮＴポリペプチドの発現を可能にする配列に作動可能に連結されたそのような核酸を含む核酸ベクターもまた本明細書において提供される。そのような核酸または核酸ベクターを含む細胞、及び／またはそのようなＢｏＮＴポリペプチドを発現する細胞もまた本明細書において提供される。
【００２７】
別の態様では、ａ）プロテアーゼドメイン、ｂ）プロテアーゼ切断部位、ｃ）移行ドメイン、ならびにｄ）置換変異Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ及びＩ１１９７Ｐを含む、かつ血清型Ｂ株４のＳ１２０１に対応する位置に置換変異をさらに含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）とを含む、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドが本明細書に記載される。
【００２８】
前述の態様のいずれかの一実施形態では、前記ＢｏＮＴポリペプチドのプロテアーゼドメイン、移行ドメイン及びプロテアーゼ切断部位は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びそれらの組み合わせからなる群より選択される血清型に由来する。
【００２９】
前述の態様のいずれかの別の実施形態では、前記プロテアーゼドメイン、移行ドメイン及びプロテアーゼ切断部位は、血清型Ｂ株１に由来する。
【００３０】
前述の態様のいずれかの別の実施形態では、前記プロテアーゼドメイン、移行ドメイン及びプロテアーゼ切断部位は、血清型Ａ、株１に由来する。
【００３１】
別の実施形態では、前記プロテアーゼ切断部位は、血清型Ａ、血清型Ｂに由来する、または血清型Ａ及びＢのキメラ切断部位である。
【００３２】
別の態様では、ヒトＳｙｔＩＩに結合するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４重鎖の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）を含むポリペプチドが本明細書に記載される。
【００３３】
一実施形態では、改変受容体結合ドメインは、置換変異Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ及びＩ１１９７Ｐを含む。
【００３４】
別の実施形態では、改変受容体結合ドメインは、Ｑ１１９１Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ、Ｑ１１９１Ｌ、Ｑ１１９１Ｙ、Ｑ１１９１Ｍ、Ｙ１１９９Ｗ、Ｙ１１９９Ｅ、Ｙ１１９９Ｈ、Ｗ１１７８Ｙ、Ｗ１１７８Ｑ、Ｗ１１７８Ａ、Ｗ１１７８Ｓ、Ｙ１１８３Ｃ、Ｙ１１８３Ｐ及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、血清型Ｂ株４における置換変異に対応する１つ以上の置換変異をさらに含む。
【００３５】
別の実施形態では、改変（Ｂ４−ＨＣ）は、Ｑ１１９１Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ、Ｑ１１９１Ｌ、Ｑ１１９１Ｙ、Ｑ１１９１Ｍ、Ｙ１１９９Ｗ、Ｙ１１９９Ｅ、Ｙ１１９９Ｈ、Ｗ１１７８Ｙ、Ｗ１１７８Ｑ、Ｗ１１７８Ａ、Ｗ１１７８Ｓ、Ｙ１１８３Ｃ及びＹ１１８３Ｐからなる群より選択される、血清型Ｂ株４における置換変異に対応する２つの置換変異を含む。
【００３６】
別の実施形態では、改変Ｂ４−ＨＣは、血清型Ｂ株４における置換変異に対応する２つ以上の置換変異をさらに含み、前記置換変異の１つは、Ｑ１１９１Ｍ、Ｑ１１９１Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ、Ｑ１１９１Ｌ及びＱ１１９１Ｙからなる群より選択される。
【００３７】
別の実施形態では、改変Ｂ４−ＨＣは、血清型Ｂ株４における置換変異に対応する２つ以上の置換変異をさらに含み、前記置換変異の１つは、血清型Ｂ株４における、Ｙ１１９９Ｗ、Ｙ１１９９Ｅ、Ｙ１１９９Ｈ、Ｗ１１７８Ｙ、Ｗ１１７８Ｑ、Ｗ１１７８Ａ、Ｗ１１７８Ｓ、Ｙ１１８３Ｃ、Ｙ１１８３Ｐ、Ｙ１１９９ＦまたはＹ１１９９Ｌに対応する。
【００３８】
別の実施形態では、改変Ｂ４−ＨＣは、血清型Ｂ株４における、Ｑ１１９１Ｍ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｃ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｖ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｌ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｙ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｍ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｍ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｃ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｃ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｖ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｌ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｌ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｙ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｙ及びＹ１１８３Ｃ、Ｗ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｐ、ならびにＷ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｃに対応する置換変異から選択される２つの置換変異をさらに含む。
【００３９】
別の実施形態では、前記２つの置換変異は、血清型Ｂ株４におけるＱ１１９１Ｍ及びＷ１１７８Ｑに対応する。
【００４０】
別の実施形態では、前記２つの置換変異は、血清型Ｂ株４におけるＱ１１９１Ｍ及びＷ１１８３Ｐに対応する。
【００４１】
別の実施形態では、前記２つの置換変異は、血清型Ｂ株４におけるＱ１１９１Ｍ及びＷ１１８３Ｃに対応する。
【００４２】
別の実施形態では、改変（Ｂ４−ＨＣ）は、３つの置換変異をさらに含む。別の実施形態では、前記３つのさらなる置換変異は、血清型Ｂ株４のＱ１１９１、Ｗ１１７８及びＹ１１８３に対応する位置にある。別の実施形態では、前記３つのさらなる置換変異は、血清型Ｂ株４のＱ１１９１Ｍ、Ｗ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｐに対応する。
【００４３】
別の態様では、第２部分に連結された、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）である第１部分を含む、キメラ分子であって、前記改変Ｂ４−ＨＣがヒトＳｙｔＩＩに結合する、キメラ分子が、本明細書に記載される。
【００４４】
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）は、置換変異Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ及びＩ１１９７Ｐを含む。
【００４５】
別の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）は、Ｑ１１９１Ｍ、Ｑ１１９１Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ、Ｑ１１９１Ｌ、Ｑ１１９１Ｙ、Ｗ１１７８Ｙ、Ｗ１１７８Ｑ、Ｗ１１７８Ａ、Ｗ１１７８Ｓ、Ｙ１１８３Ｃ、Ｙ１１８３Ｐ及びこれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の置換変異をさらに含む。
【００４６】
別の実施形態では、改変Ｂ４−ＨＣは、Ｑ１１９１Ｍ、Ｑ１１９１Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ、Ｑ１１９１Ｌ、Ｑ１１９１Ｙ、Ｗ１１７８Ｙ、Ｗ１１７８Ｑ、Ｗ１１７８Ａ、Ｗ１１７８Ｓ、Ｙ１１８３Ｃ及びＹ１１８３Ｐからなる群より選択される２つの置換変異をさらに含む。
【００４７】
別の態様では、第２部分に連結された、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ株４の改変受容体結合ドメイン（Ｂ４−ＨＣ）である第１部分を含む、キメラ分子であって、前記改変Ｂ４−ＨＣが、血清型Ｂ株４における置換変異に対応する２つ以上の置換変異を含み、かつ、ヒトＳｙｔＩＩに結合し、前記置換変異の１つが、Ｑ１１９１Ｍ、Ｑ１１９１Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ、Ｑ１１９１Ｌ及びＱ１１９１Ｙからなる群より選択されるキメラ分子が本明細書に記載される。
【００４８】
一実施形態では、置換変異の１つは、血清型Ｂ株４におけるＷ１１７８Ｙ、Ｗ１１７８Ｑ、Ｗ１１７８Ａ、Ｗ１１７８Ｓ、Ｙ１１８３ＣまたはＹ１１８３Ｐに対応する。
【００４９】
別の実施形態では、２つの置換変異は、血清型Ｂ株４における、Ｑ１１９１Ｍ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｃ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｖ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｌ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｙ及びＷ１１７８Ｑ、Ｑ１１９１Ｍ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｍ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｃ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｃ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｖ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｌ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｌ及びＹ１１８３Ｃ、Ｑ１１９１Ｙ及びＹ１１８３Ｐ、Ｑ１１９１Ｙ及びＹ１１８３Ｃ、Ｗ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｐ、ならびにＷ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｃに対応する。
【００５０】
別の実施形態では、改変（Ｂ−ＨＣ）は、３つの置換変異を含む。別の実施形態では、前記３つの置換変異は、血清型Ｂ株４のＱ１１９１、Ｗ１１７８及びＹ１１８３に対応する位置にある。別の実施形態では、前記３つの置換変異は、血清型Ｂ株４のＱ１１９１Ｍ、Ｗ１１７８Ｑ及びＹ１１８３Ｐに対応する。
【００５１】
別の実施形態では、第１部分と第２部分は、共有結合的に連結される。
【００５２】
別の実施形態では、第１部分と第２部分は、非共有結合的に連結される。
【００５３】
別の実施形態では、第２部分は、低分子、核酸、短いポリペプチド、及びタンパク質からなる群より選択される。
【００５４】
別の実施形態では、第２部分は、生物活性分子である。
【００５５】
別の実施形態では、第２部分は、治療用のポリペプチドまたは非ポリペプチド薬物である。
【００５６】
別の態様では、本明細書に記載されるボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドもしくはキメラ分子を含む、または本明細書に記載されるＢｏＮＴポリペプチドをコードする核酸もしくは核酸ベクターを含む、薬学的組成物が本明細書に記載される。
【００５７】
一実施形態では、前記薬学的組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む。
【００５８】
別の態様では、本明細書に記載される薬学的組成物を含むキットが、本明細書に記載される。前記キットは、前記薬学的組成物の治療的投与のための説明書を含むことができる。
【００５９】
別の態様では、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドを産生するための方法であって、ＢｏＮＴポリペプチドまたはキメラＢｏＮＴポリペプチドが産生される条件下で、本明細書に記載されるＢｏＮＴポリペプチドまたはキメラＢｏＮＴポリペプチドをコードする核酸または核酸ベクターを含む本明細書に記載される細胞を培養するステップを含む方法が、本明細書に記載される。
【００６０】
一実施形態では、前記方法は、以下のステップ：培養物からＢｏＮＴポリペプチドを回収すること、ＢｏＮＴポリペプチドを精製すること、ＢｏＮＴポリペプチドを活性化すること、またはＢｏＮＴポリペプチドを製剤化すること、の１つ以上をさらに含む。
【００６１】
別の態様では、望ましくないニューロン活動と関連した病態を治療するための方法であって、治療上有効量の本明細書に記載されるＢｏＮＴポリペプチドもしくはキメラＢｏＮＴポリペプチド、またはそのようなポリペプチドを含む薬学的組成物を対象に投与し、それにより、望ましくないニューロン活動を示す１つ以上のニューロンと接触させ、それにより、前記病態を治療することを含む方法が、本明細書に記載される。
【００６２】
一実施形態では、前記病態は、痙攣性発声障害、痙性斜頸、喉頭ジストニア、口下顎発声障害、舌ジストニア、頸部ジストニア、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼疾患、脳性麻痺、局所性痙縮及び他の発声障害、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱、アニスムス、肢痙縮、チック、振戦、歯ぎしり、裂肛、アカラシア、嚥下障害及び他の筋緊張障害及び筋肉群の不随意運動を特徴とする他の障害、流涙、多汗症、唾液分泌過多、消化管分泌過多、分泌障害、筋痙攣による疼痛、頭痛、片頭痛、ならびに皮膚科学的または審美的／美容的な病態からなる群より選択される。
【００６３】
別の態様では、医薬における使用のための、本明細書に記載されるボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチド、本明細書に記載されるキメラＢｏＮＴポリペプチド、またはそのようなＢｏＮＴポリペプチドもしくはキメラポリペプチドを含む薬学的組成物が、本明細書に記載される。
【００６４】
別の態様では、望ましくないニューロン活動と関連した病態の治療における使用のための、本明細書に記載されるボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチド、本明細書に記載されるキメラＢｏＮＴポリペプチド、またはそのようなＢｏＮＴポリペプチドもしくはキメラポリペプチドを含む薬学的組成物が、本明細書に記載される。
【００６５】
定義
本明細書で用いられる場合、「結合親和性」という用語は、特定の受容体系に対するある分子の結合活性の強さを意味する。一般に、高い結合親和性は、結合ドメインとその受容体系との間のより大きな分子間力によって生じるのに対して、低い結合親和性は、リガンドとその受容体との間のより小さな分子間力を伴う。高い結合親和性は、結合ドメインのその受容体結合部位での滞留時間が、低い結合親和性の場合よりも長い。したがって、高い結合親和性を有する分子は、受容体系の結合部位を最大限に占有し、生理反応を引き起こすために、より低濃度の該分子が必要であることを意味する。逆に、低い結合親和性は、受容体系の受容体結合部位が最大限に占有され、最大の生理反応を得るには、比較的高濃度の分子が必要であることを意味する。よって、結合親和性が高いために結合活性が増大した本明細書に記載されるボツリヌス神経毒素は、より低用量の毒素の投与を可能とし、それにより標的指向されていない領域への毒素の拡散に伴う望ましくない副作用を軽減または予防する。
【００６６】
結合親和性の測定のためによく使用される１つのパラメーターは、結合ＫＤと定義される。ＫＤは、解離定数（Ｋｏｆｆ）と会合定数（Ｋｏｎ）との比として定義されるため、ＫＤ値が低いほど、結合親和性は高い。
【００６７】
本用語が本明細書で用いられる場合、特異的受容体（例えば、ヒトＳｙｔ  ＩＩまたはヒトＳｙｔ  Ｉ）への本明細書に記載されるＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素分子またはＢｏＮＴ／Ｂ−ＨＣドメインまたはその受容体結合断片の結合親和性を説明するために用いられる場合の「著しく増強した結合」という用語は、該分子の非置換型と比較して、実質的に増加している（例えば、野生型分子の結合親和性の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）特異的受容体に対する結合親和性の増加を意味する。一実施形態では、置換分子の増強した結合は、非置換分子（例えば、天然のＢｏＮＴ  ＨＣ分子を有する神経毒素）の結合親和性よりも一桁以上高い結合親和性によって証明される。言い換えれば、置換分子のＫＤは、非置換分子のＫＤよりも一桁以上低い。一実施形態では、増強した結合は、非置換分子の結合親和性よりも著しく高い（例えば、１．５×、２．０×、２．５×、３．０×など）結合親和性によって証明される。言い換えれば、置換分子のＫＤは、非置換分子のＫＤよりも著しく低い（例えば、１．５×、２．０×、２．５×、３．０×など）。一実施形態では、証明された増強した結合は、約０．５９μＭ〜５．８２μＭ  ＫＤの範囲である。一実施形態では、証明された増強した結合は、約０．５９μＭ〜４．３μＭ  ＫＤの範囲である。一実施形態では、増強した結合は、ＫＤ≦５．８２μＭによって証明された。一実施形態では、増強した結合は、ＫＤ≦４．３０μＭによって証明された。一実施形態では、増強した結合は、ＫＤ≦２．９μＭによって証明された。一実施形態では、増強した結合は、約０．５９μＭのＫＤによって証明された。
【００６８】
一実施形態では、ヒトＳｙｔ  ＩＩに対する置換分子のＫＤは、≦１０μＭであり、好ましくは、≦９、８、７、６、５、４、３または２μＭ、より好ましくは、≦１または０．６μＭである。一実施形態では、ヒトＳｙｔ  Ｉに対する置換分子のＫＤは、≦１０μＭであり、好ましくは、≦９、８、７、６、５、４μＭ、より好ましくは、≦３μＭである。一実施形態では、ヒトＳｙｔ  ＩＩに対する置換分子のＫＤは、≦７μＭであり、ヒトＳｙｔ  Ｉに対する置換分子のＫＤは、≦６μＭである。好ましい実施形態では、ヒトＳｙｔ  ＩＩに対する置換分子のＫＤは、≦１μＭであり、ヒトＳｙｔ  Ｉに対する置換分子のＫＤは、≦３μＭである。
【００６９】
一実施形態では、増強した結合により、本明細書に記載される実験により例示されるように、共受容体ガングリオシドの非存在下で、ヒトＳｙｔ  Ｉへの検出可能な結合がもたらされる。
【００７０】
本明細書に記載される点変異によって産生されたＢｏＮＴ／Ｂ−ＨＣ結合断片の結合親和性を説明するために用いられる場合の「著しく増強した結合」または「著しく低下した結合」という用語は、すぐ上で説明した、特異的受容体（例えば、ヒトＳｙｔ  ＩＩまたはヒトＳｙｔ  Ｉ）への改変結合ドメイン（例えば、単離された断片として、またはより大きな神経毒素ポリペプチド構築物において発現する）の結合親和性の増加または低下のそれぞれを意味する。
【００７１】
本用語が本明細書で用いられる場合、特異的受容体（例えば、ヒトＳｙｔ  ＩまたはヒトＳｙｔ  ＩＩ）への本明細書に記載されるボツリヌス神経毒素分子またはその結合断片（例えば、ＢｏＮＴ／Ｂ−ＨＣ）の結合親和性を説明するために用いられる場合の「著しく低下した結合」という用語は、該分子の非置換型と比較して、実質的に低下している（例えば、野生型分子の結合親和性の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）特異的受容体に対する結合親和性の低下を意味する。一実施形態では、置換分子の低下した結合により、非置換神経毒素（例えば、天然のＢｏＮＴ  ＨＣ分子を有する神経毒素）の結合親和性よりも一桁以上低い結合親和性がもたらされる。言い換えれば、置換分子のＫＤは、非置換神経毒素のＫＤよりも一桁以上高い。一実施形態では、置換分子の低下した結合により、非置換分子の結合親和性よりも著しく低い（例えば、１．５×、２．０×、２．５×、３．０×など）結合親和性がもたらされる。言い換えれば、置換分子のＫＤは、非置換分子のＫＤよりも著しく高い（例えば、１．５×、２．０×、２．５×、３．０×など）。一実施形態では、著しく低下した結合により、共受容体ガングリオシドの非存在下で、ヒトＳｙｔ  Ｉへの検出可能な結合が喪失する。
【００７２】
本明細書で用いられる場合、「ボツリヌス神経毒素」という用語は、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素がニューロンに侵入し、神経伝達物質の放出を阻害する全体的な細胞機序を実行することができる任意のポリペプチドを意味する。この機序は、低親和性または高親和性受容体複合体へのＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素の結合、毒素の内部移行、細胞質への毒素軽鎖の移行、及びＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素基質の酵素的改変を包含する。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素分子及びその断片に関して、本明細書では互換的に使用される。
【００７３】
「改変受容体結合ドメイン」または「改変ＨＣ」は、本用語が本明細書で用いられる場合、それが含まれるＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素分子の、標的細胞の表面上に位置するＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素に対する受容体への結合を促進する。このような分子は典型的には、遺伝子組換え技術によって生成される。改変ＨＣは、標的細胞の表面上に位置するＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素に対する受容体への結合活性を有する。本明細書で用いられる場合、「結合活性」と言う用語は、１つの分子が、非限定的に、共有結合、イオン結合、金属結合、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用など、またはそれらの任意の組み合わせを含む、少なくとも１つの分子間力または分子内力を介して、別の分子と直接的または間接的に接触することを意味する。「結合した」及び「結合する」は、結合に関する用語と見なされる。
【００７４】
本明細書で用いられる場合、「Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素プロテアーゼドメイン」という用語は、中毒過程の酵素的標的改変ステップを実行することができるＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメインを意味する。したがって、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素プロテアーゼドメインは、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素基質を特異的に標的指向し、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素基質（例えば、ＳＮＡＰ−２５基質、ＶＡＭＰ基質、及びシンタキシン基質のようなＳＮＡＲＥタンパク質）のタンパク質分解的切断をもたらす。
Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素プロテアーゼドメインの非限定的な例を、表１に提供する。
【００７５】
本明細書で用いられる場合、「Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素移行ドメイン」または「ＨＮ」という用語は、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素軽鎖の移行を媒介する中毒過程の移行ステップを実行することができるＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメインを意味する。したがって、ＨＮは、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素軽鎖の、膜を越える移動を促進し、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素軽鎖の、細胞の細胞内小胞の膜を細胞質へと通過する移動をもたらす。ＨＮの非限定的な例には、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＮ、ＢｏＮＴ／Ｂ  ＨＮ、ＢｏＮＴ／Ｃ１  ＨＮ、ＢｏＮＴ／Ｄ  ＨＮ、ＢｏＮＴ／Ｅ  ＨＮ、ＢｏＮＴ／Ｆ  ＨＮ、及びＢｏＮＴ／Ｇ  ＨＮが含まれ、これらのアミノ酸配列を表１及び図８及び図１０〜図１６に提供する。
【００７６】
本明細書で用いられる場合、「Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ受容体結合ドメイン」という用語は、「ＨＣドメイン」と同義であり、例えば、標的細胞の形質膜表面上に位置するＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素特異的受容体系へのＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素の結合を含む中毒過程の細胞結合ステップを実行することができる、任意の天然Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ受容体結合ドメインを意味する。結合活性の置き換えは、例えば、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍＨＣドメイン全体を、改変（例えば、増強した）ＨＣドメインと置き換えることによって達成することができると想定される。
【００７７】
本明細書で用いられる場合、「Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素標的細胞」という用語は、天然Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素が中毒を起こすことができる天然細胞である細胞を意味し、これには、非限定的に、運動ニューロン；感覚ニューロン；自律神経ニューロン；例えば、交感神経ニューロン及び副交感神経ニューロンなど；非ペプチド作動性ニューロン、例えば、コリン作動性ニューロン、アドレナリン作動性ニューロン、ノルアドレナリン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロンなど；ならびにペプチド作動性ニューロン、例えば、サブスタンスＰニューロン、カルシトニン遺伝子関連ペプチドニューロン、血管作用性小腸ペプチドニューロン、ニューロペプチドＹニューロン、コレシストキニンニューロンなどが含まれる。
【００７８】
「単離された」とは、その天然状態において見出される場合に通常それに伴う成分を様々な程度で含まない材料を意味する。「単離する」とは、元の供給源または環境、例えば隣接するアミノ酸（例えば、単離されたポリペプチド断片において）から、または細胞もしくは生物学的試料からのある程度の分離を意味する。
【００７９】
「精製された」という用語は、調製物の他の成分（例えば、他のポリペプチド）に関して、「実質的に純粋」であるポリペプチドなどの物質を指すために用いられる。これは、他の成分に関して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、または７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、及び最も好ましくは少なくとも約９５％の純度であるポリペプチドを指し得る。言い換えると、ポリペプチドに関して、「実質的に純粋」または「本質的に精製された」という用語は、１つ以上の他の成分（例えば、他のポリペプチドまたは細胞成分）を約２０％よりも少なく、より好ましくは約１５％、１０％、８％、７％よりも少なく、最も好ましくは約５％、４％、３％、２％、１％よりも少なく（ｆｅｗｅｒ  ｔｈａｎ）、または１％未満（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ）含む調製物を指す。
【００８０】
本明細書で用いられる「保存的」または「保存的置換変異」という用語は、あるアミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸と取って代わり、その結果、ペプチド化学の当業者により、そのポリペプチドの二次構造、化学的性質、及び／またはヒドロパシー性質が実質的に変化しないと予測される変異を指す。以下のアミノ酸群が、保存的変化として歴史的に互いに取って代わられている：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｒｙ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；及び（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。一般に許容されている他の保存的置換を、以下のリストに記載する：
2019533430.tif 000003
【００８１】
特定のアミノ酸に言及しない「置換変異」という用語は、その位置に通常見出される野生型残基以外の任意のアミノ酸を含み得る。このような置換は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びプロリンなどの非極性（疎水性）アミノ酸との置き換えであってよい。置換は、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンなどの極性（親水性）アミノ酸との置き換えであってよい。置換は、荷電アミノ酸、例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸などの負荷電アミノ酸、ならびにリジン、アルギニン、及びヒスチジンなどの正荷電アミノ酸との置き換えであってよい。
【００８２】
本明細書に記載される置換変異は、典型的には異なる天然アミノ酸残基との置き換えであるが、場合によっては非天然アミノ酸残基が置換されてもよい。非天然アミノ酸とは、本用語が本明細書で用いられる場合、天然に存在するかまたは化学合成された非タンパク質構成（すなわち、非タンパク質コード）アミノ酸である。この例には、β−アミノ酸（β３及びβ２）、ホモアミノ酸、プロリン及びピルビン酸誘導体、３−置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環−置換フェニルアラニン及びチロシン誘導体、直鎖コアアミノ酸、ジアミノ酸、Ｄ−アミノ酸、ならびにＮ−メチルアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アミノ酸は置換または非置換であってよい。置換アミノ酸または置換基は、ハロゲン化芳香族アミノ酸もしくは脂肪族アミノ酸、疎水性側鎖上のハロゲン化脂肪族修飾もしくは芳香族修飾、または脂肪族修飾もしくは芳香族修飾であってよい。
【００８３】
「治療的有効量」という用語は、ある病態を有する典型的な対象に投与した場合に、その病態の１つ以上の症状に治療的に有意な軽減をもたらすのに十分である量を指す。症状の治療的に有意な軽減とは、対照または未治療対象と比較して、例えば約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、またはそれ以上である。
【００８４】
「治療する」または「治療」という用語は、その目的が症状の解消または和らげることである治療的処置を指す。有益な、または望ましい臨床結果としては、症状の解消、症状の緩和、病態の程度の軽減、病態の安定した（すなわち、悪化しない）状態、病態の進行の遅延または緩徐化が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
本明細書で用いられる場合、「対象」とは、ヒトまたは動物を指す。通常、動物とは、霊長類、齧歯類、家畜、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク、例えばアカゲザルが含まれる。齧歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、及びハムスターが含まれる。家畜及び狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、水牛、ネコ科種、例えば家猫、イヌ科種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥類種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚類、例えば、マス、ナマズ、及びサケが含まれる。患者または対象には、前述の任意のサブセット、例えば、ヒト、霊長類、または齧歯類などの１つ以上の群または種を除く上記の全てが含まれる。本明細書に記載される態様のある種の実施形態では、対象は哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。「患者」及び「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。対象は、雄であっても、または雌であってもよい。対象は、十分に発達した対象（例えば、成体）であっても、または発達過程にある対象（例えば、子供、乳児、または胎児）であってもよい。
【００８６】
好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであってよいが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、望ましくないニューロン活動と関連した障害の動物モデルを表す対象として有利に使用することができる。加えて、本明細書に記載される方法及び組成物は、家畜及び／またはペットを治療するために用いることもできる。
【００８７】
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含む本特許または特許出願公開のコピーは、請求及び必要な料金の支払いに基づいて、特許庁により提供されることとなる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｄ。（背景に関して公開されているデータ）は、どのようにＢｏＮＴがニューロンを標的指向するかについての概略モデル（図１Ａ）、それらの全体的なタンパク質構造（図１Ｂ）、同定された受容体のリスト（図１Ｃ）、ならびにＢｏＮＴ／Ｂのその受容体Ｓｙｔ及びガングリオシドへの結合に関する構造モデル（図１Ｄ）を示す。（図１Ａ）ＢｏＮＴ作用の概略図：ＢｏＮＴは、それらの特異的受容体に結合することによりニューロンを認識し（ステップ１）、受容体介在性エンドサイトーシスを介してニューロンに侵入し（ステップ２）、次いで、ＢｏＮＴの軽鎖がエンドソーム膜を越えてサイトゾルへと移行し（ステップ３）、そこでこれらの軽鎖がプロテアーゼとして作用し、標的宿主タンパク質を切断する（ステップ４）。図１Ａは、Ａｒｎｏｎ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ，  ＪＡＭＡ，  ２８５：１０５９，  ２００１２４からの出典である。（図１Ｂ）ＢｏＮＴは、ジスルフィド結合を介して結合している軽鎖及び重鎖からなる。重鎖は２つのドメイン：移行ドメイン（ＨＮ）及び受容体結合ドメイン（ＨＣ）にさらに分類することができる。これらの機能的ドメインは、異なるＢｏＮＴ間でスイッチング可能である。例えば、ＢｏＮＴ／Ｂ−ＨＣを用いてＢｏＮＴ／Ａ−ＨＣを置換して、キメラ毒素を生成することができる。（図１Ｃ）同定された毒素受容体のリスト。（図１Ｄ）細胞表面上で、ＢｏＮＴ／Ｂから、そのタンパク質受容体Ｓｙｔ（Ｉ／ＩＩ）、及びその脂質共受容体ガングリオシドへの結合を示す構造モデル。図１Ｄは、Ｃｈａｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４４４：１０９６，  ２００６３１からの出典である。
【図１Ｂ】図１Ａの説明を参照のこと。
【図１Ｃ】図１Ａの説明を参照のこと。
【図１Ｄ】図１Ａの説明を参照のこと。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｅ。細菌性ツーハイブリッド（ＢＡＣＴＨ）スクリーニングは、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへのＢｏＮＴ／Ｂの結合を増強する点変異を同定した。（図２Ａ）上のパネル：ヒトＳｙｔ  ＩＩ（ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩ、配列番号６）とマウスＳｙｔ  ＩＩ（ｍ−Ｓｙｔ  ＩＩ、配列番号５）のＢｏＮＴ／Ｂ結合部位の配列アラインメント。下のパネル：ＨＣＢとＳｙｔ  ＩＩとの間の界面のクローズアップ図：突然変異誘発研究のためのＢｏＮＴ／Ｂの標的指向された残基は、緑色（薄灰色）で標識されている。Ｓｙｔ  ＩＩ残基は、紫色（濃い灰色）でマークされ、Ｆ５４、Ｆ５５、及びＩ５８が強調表示されている（ボックス内）。（図２Ｂ）ＨＣＢ変異体ライブラリーの構築及びＢＡＴＣＨアッセイの模式図。（図２Ｃ）ＢＡＴＣＨアッセイにおいて同定された陽性変異（青いコロニーをもたらす）のリスト。（図２Ｄ）パネルＣに列挙されたＨＣＢ変異体を、再構成されたアデニル酸シクラーゼのレベルを反映するβ−ガラクトシダーゼ活性アッセイによってさらに分析した。（ｎ＝６、＊ｐ＜０．０５）。（図２Ｅ）Ｅ１１９１部位でのＨＣＢ変異を、固定化ｍ−Ｓｙｔ  ＩＩ（残基１−８７）またはｈ−Ｓｙｔ  ＩＩ配列（ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩと呼ぶ）を模倣するＦ５４Ｌ変異を含むマウスＳｙｔ  ＩＩ（１−８７）を用いて、プルダウンアッセイで調べた。結合したＨＣＢ変種は、ＨＣＢに融合したＨＡタグを検出するイムノブロット分析によって検出された。追加のＨＣＢ変異は図１８及び図２１に示されている。
【図２Ｂ】図２Ａの説明を参照のこと。
【図２Ｃ】図２Ａの説明を参照のこと。
【図２Ｄ】図２Ａの説明を参照のこと。
【図２Ｅ】図２Ａの説明を参照のこと。
【図３】図３Ａ〜図３Ｃ。ＨＣＢにおける組み合わせ変異は、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩ及びＳｙｔ  Ｉへのその結合を増強した。（図３Ａ）ＨＣＢ二重変異を、プルダウンアッセイにて、ｍ−Ｓｙｔ  ＩＩに結合する能力とｈ−Ｓｙｔ  ＩＩに結合する能力について調べた。ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへの強固な結合を示した３つの二重変異を、赤（太字）で記した。（図３Ｂ）ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへのＨＣＢの結合をＢＬＩアッセイにより定量した。代表的な会合及び解離曲線をＷＴ  ＨＣＢ及び３つのＨＣＢ変異体：Ｅ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｙ、Ｅ１１９１Ｖ／Ｓ１１９９Ｗ、及びＥ１１９１Ｃ／Ｓ１１９９Ｗについて示した。１２個全ての二重変異についての結合パラメーターを表４に列挙し、それらの代表的結合トレースを図１９に示す。（図３Ｃ）固定化ＧＳＴタグ付きｈ−Ｓｙｔ  Ｉ（残基１−８０）へのＷＴ  ＨＣＢ、ＨＣＢ（Ｅ１１９１Ｍ）、及びＨＣＢ（Ｅ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｙ）の結合を、ガングリオシド（Ｇａｎｇｌ）と共に（＋）及びそれなし（−）でプルダウンアッセイで調べた。ｈ−Ｓｙｔ  ＩへのＷＴ  ＨＣＢの結合は、共受容体ガングリオシドの存在を必要とするが、ＨＣＢ（Ｅ１１９１Ｍ）及びＨＣＢ（Ｅ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｙ）は、ガングリオシドの非存在下でｈ−Ｓｙｔ  Ｉに結合する。
【図４】図４Ａ〜図４Ｂ。ＨＣＢＭＹは、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩを発現するヒト化ニューロンへの強固な結合を示した。（図４Ａ）内在性Ｓｙｔ  ＩのＫＤによりヒト化ニューロンを作製し、培養ラット皮質ニューロンにおいて完全長ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩを発現する。完全長ｍ−Ｓｙｔ  ＩＩまたはｍ−Ｓｙｔ  ＩＩ（Ｆ５４Ｌ）を発現するニューロンは、さらなる対照として機能した。これらのニューロンを、ＷＴ  ＨＣＢに暴露し、続いて免疫染色分析した。ＨＣＢに融合したＨＡタグを介して結合ＨＣＢを検出した。シナプシンは、シナプス前終末のマーカーとして標識された。ＷＴ  ＨＣＢは、ＷＴニューロンのシナプスに結合したが、Ｓｙｔ  Ｉ  ＫＤニューロンには結合しなかった。レンチウイルス形質導入による完全長ｍ−Ｓｙｔ  ＩＩの発現は、ＨＣＢの結合を回復させたが、完全長ｍ−Ｓｙｔ  ＩＩ（Ｆ５４Ｌ）または完全長ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩの発現は、結合を救済することができなかった。（図４Ｂ）Ｓｙｔ  Ｉ  ＫＤは、ニューロンへのＨＣＢＭＹの結合を消失した。結合は、完全長ｍ−Ｓｙｔ  ＩＩ、ｍ−Ｓｙｔ  ＩＩ（Ｆ５４Ｌ）、またはｈ−Ｓｙｔ  ＩＩの発現により救済された。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃ。ＢｏＮＴ／ＢＭＹは、ヒト化ニューロンにおける神経伝達の遮断に対して増強した有効性を示した。（図５Ａ）ヒト化ニューロンを、図４Ａに記載のよう作製した。これらのニューロンを、完全長ＷＴ  ＢｏＮＴ／ＢまたはＢｏＮＴ／ＢＭＹの濃度勾配に２４時間暴露した。細胞溶解物を回収し、イムノブロット分析に供した。β−チューブリンは、インターナルローディング対照として機能した。ＢｏＮＴ／ＢＭＹは、同じ濃度でＷＴ  ＢｏＮＴ／Ｂよりも多くのＶＡＭＰ２を切断した。このことは、ＢｏＮＴ／ＢＭＹが、ＷＴ  ＢｏＮＴ／Ｂよりも効率的にニューロンに侵入したことを示している。（図５Ｂ〜図５Ｃ）ヒト化ニューロンを、ＷＴ  ＢｏＮＴ／ＢまたはＢｏＮＴ／ＢＭＹの濃度勾配に２４時間暴露し、次いで、ｍＩＰＳＣ活性を全細胞パッチクランプ法によって記録した。パネルＢ（図５Ｂ）は、３０ｐＭ毒素での代表的なｍＩＰＳＣ記録を示す。パネルＣ（図５Ｃ）は、ｍＩＰＳＣ活性対毒素濃度を図示し、いかなる毒素にも暴露されなかったニューロンに標準化した。各データポイントの記録されたニューロンの数を（括弧内）に示した。同じ数のニューロンが、ＷＴ  ＢｏＮＴ／Ｂ及びＢｏＮＴ／ＢＭＹについて記録された。半数阻害濃度（ＩＣ５０）は、ＷＴ  ＢｏＮＴ／Ｂでは８９ｐＭ、ＢｏＮＴ／ＢＭＹでは７．８ｐＭであると測定された。このことは、ヒト受容体への結合の増強が、ニューロンの機能レベルで毒素の有効性を高めたことを示す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｄ。ＢｏＮＴ／Ｂサブタイプでの配列変化は、それらのｈ−Ｓｙｔ  ＩＩに結合する能力に影響を与える。（図６Ａ）以下を含む、ＢｏＮＴ／Ｂの残基Ｅ１１９１／Ｓ１１９９の周囲領域におけるＢｏＮＴ／Ｂサブタイプの配列アラインメント：ＢｏＮＴ／Ｂ１（配列番号９）；ＢｏＮＴ／Ｂ２（配列番号１０）；ＢｏＮＴ／Ｂ３（配列番号１１）；ＢｏＮＴ／Ｂ４（配列番号１２）；ＢｏＮＴ／Ｂ５（配列番号１３）；ＢｏＮＴ／Ｂ６（配列番号１４）；ＢｏＮＴ／Ｂ７（配列番号１５）；ＢｏＮＴ／Ｂ８（配列番号１６）。（図６Ｂ）Ｑ１１９１及びＹ１１９９を含むＨＣＢ４は、プルダウンアッセイにおいてｈ−Ｓｙｔ  ＩＩに結合しなかった。（図６Ｃ）Ｓｙｔ  Ｉ／ＩＩに対する結合ポケットを形成する１９個の重要な残基の内、ＨＣＢ４とＨＣＢの間で異なる６個の残基がある。ＨＣＢ４内の６個の残基全てをＨＣＢ内の対応する残基と置き換えることにより、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩに結合することができる変異ＨＣＢ４（「６つの変異」：Ｖ１１１３Ｋ／Ｓ１１１７Ｐ／Ｓ１１９６Ａ／Ｉ１１９７Ｐ／Ａ１１８２Ｔ／Ｎ１１８５Ｙと呼ばれる）を作製した。ＨＣＢ１とＨＣＢ４との配列アラインメントを図７に示す。（図６Ｄ）固定化ＧＳＴタグ付きｈ−Ｓｙｔ  ＩへのＨＣＢ及びＨＣＢ４の結合をプルダウンアッセイで調べた。ｈ−Ｓｙｔ  ＩへのＨＣＢの結合は、ガングリオシドの存在を必要とするが、ＨＣＢ４は、プルダウンアッセイにおいてガングリオシドなしでｈ−Ｓｙｔ  Ｉに結合することができる。
【図７】ＢｏＮＴ／Ｂ１（配列番号１７）及びＢｏＮＴ／Ｂ４（配列番号１８）のＨＣドメインのアミノ酸配列のアラインメントである。ＢｏＮＴ／Ｂ１及びＢ４のＨＣドメインポリペプチド配列のアラインメントは、Ｂ血清型のこれらの２つの株間で異なるそれらのアミノ酸を強調する。Ｂ４アミノ酸Ｖ１１１３、Ｓ１１１７、Ｓ１１９６及びＩ１１９７は、本明細書において、Ｂ４  ＨＣドメインがヒトＳｙｔＩＩ分子に結合する能力を調節する残基として同定される。図７はまた、Ｓｙｔ  ＩＩ結合ポケットを形成する１９個の重要な残基をアスタリスクで示すことによって、表５に既に示されているものを確認する。
【図８】ＢｏＮＴ／Ｂ−ＨＣ（株１；ＢｏＮＴ／Ｂ１  Ｏｋｒａ株）のアミノ酸配列である。ＢｏＮＴ／Ｂ株１、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２３２９２７．１の残基８５７−１２９１（配列番号１９）。
【図９】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現に最適化されたＢｏＮＴ／Ｂ−ＨＣ（株Ｂ１、Ｏｋｒａ株）ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２３２９２７．１に基づくＢｏＮＴ／Ｂ株１の残基８５７−１２９１）（配列番号２０）をコードする核酸配列である。
【図１０−１】Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ａ（１２９６アミノ酸）（配列番号２１）のアミノ酸配列を示す。
【図１０−２】図１０−１の続きを示す図である。
【図１１−１】Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ（１２９１アミノ酸）（配列番号２２）のアミノ酸配列を示す。
【図１１−２】図１１−１の続きを示す図である。
【図１２−１】Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｃ１（１２９１アミノ酸）（配列番号２３）のアミノ酸配列を示す。
【図１２−２】図１２−１の続きを示す図である。
【図１３−１】Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｄ（１２７６アミノ酸）（配列番号２４）のアミノ酸配列を示す。
【図１３−２】図１３−１の続きを示す図である。
【図１４−１】Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｅ（１２５２アミノ酸）（配列番号２５）のアミノ酸配列を示す。
【図１４−２】図１４−１の続きを示す図である。
【図１５−１】Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｆ（１２７４アミノ酸）（配列番号２６）のアミノ酸配列を示す。
【図１５−２】図１５−１の続きを示す図である。
【図１６−１】Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｇ（１２９７アミノ酸）（配列番号２７）のアミノ酸配列を示す。
【図１６−２】図１６−１の続きを示す図である。
【図１７】Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ、Ｅｋｌｕｎｄ  １７Ｂ株（ＢｏＮＴ／Ｂ４）Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｒｅｆ：ＥＦ０５１５７０．１（配列番号２８）のアミノ酸配列を示す。
【図１８】マウス及びヒトＳｙｔＩＩへの変異ＢｏＮＴ／Ｂ１  ＨＣドメインの結合に対する１３の異なる単一置換変異の効果を示す。
【図１９】一次変異Ｅ１１９１Ｍ／Ｃ／Ｖ／Ｑ、適合する二次変異Ｓ１１９９Ｗ／Ｙ及びＷ１１７８Ｑ、ならびに三重変異Ｅ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｗ／Ｗ１１７８Ｑの１２個全ての組み合わせについて、ヒトＳｙｔＩＩへの結合に関するバイオレイヤー干渉トレースを示す。ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩに対する１２個全ての変異体の結合親和性（ＫＤ）を、表４に列挙したパラメーターを用いて、バイオレイヤー干渉アッセイ（ＢＬＩ）を使用して測定した。
【図２０】ｈ−Ｓｙｔ  Ｉに対する上位２つのＢｏＮＴ／Ｂ１  ＨＣドメイン変異体（Ｅ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｙ及びＥ１１９１Ｖ／Ｓ１１９９Ｙ）の結合親和性のＢＬＩアッセイ測定値を示す。Ｅ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｙ（ＨＣＢＭＹ）またはＥ１１９１Ｖ／Ｓ１１９９Ｙ（ＨＣＢＶＹ）を含有するＨＣＢは、それぞれ２．９μＭ及び５．８２μＭのＫＤを示した。
【図２１】図２Ｅに記載のように、プルダウンアッセイで調べたｍ−Ｓｙｔ  ＩＩ及びｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへのＨＣＢ変異体の結合を示す。
【図２２】ｍ−Ｓｙｔ  ＩＩ及びｈ−Ｓｙｔ  ＩＩに結合する変異体ＨＣＢ４を示す。
【図２３】図２３Ａ〜図２３Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉで産生されたＢｏＮＴ／ＢＭＹが活性であり、ＢｏＮＴ／Ｂ抗体によって中和され得ることを示す。（図２３Ａ）完全長ＢｏＮＴ／Ｂ及びＢｏＮＴ／ＢＭＹをＥ．ｃｏｌｉから精製した。これらの毒素は、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃによって活性化された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＷＴ  ＢｏＮＴ／Ｂ毒素が、純度約９３％、その二本鎖形態では純度約８０％であり、そしてＢｏＮＴ／ＢＭＹ毒素が、純度約８６％、その二本鎖形態では純度約９９％であることを明らかにした。（図２３Ｂ）培養ラット皮質ニューロンを、ウサギポリクローナル抗ＢｏＮＴ／Ｂ抗体（培地中１：２００希釈）またはＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、及びＥに対する三価のウマ抗血清（培地中１：４０希釈）のいずれかと共にプレインキュベートしたＢｏＮＴ／ＢＭＹ（培地中１ｎＭ、１６時間）に暴露した。ニューロン溶解物を１６時間後に回収した。ＶＡＭＰ２の切断を、イムノブロットアッセイによって分析した。ＢｏＮＴ／ＢＭＹは、ニューロンのＶＡＭＰ２を切断したため活性である。ウサギポリクローナル抗ＢｏＮＴ／Ｂ抗体及び３価のウマ抗血清はどちらもＢｏＮＴ／ＢＭＹを容易に中和した。アクチンは、インターナルローディング対照として機能した。これらの結果により、Ｅ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｙ変異が、ＢｏＮＴ／Ｂの免疫原性を変化させないことが確認された。
【図２４】図２４Ａ〜図２４Ｂは、ＢｏＮＴ／Ｂ結合界面におけるＳｙｔ  ＩとＳｙｔ  ＩＩ間、及びヒトＳｙｔ  ＩとマウスＳｙｔ  Ｉ間の比較を示す。（図２４Ａ）マウスＳｙｔ  Ｉ（配列番号７）とＳｙｔ  ＩＩ（配列番号８）間の配列アラインメント及び構造の比較。アスタリスクは、ＢｏＮＴ／Ｂと相互作用する保存された残基を強調しており、これはＳｙｔ  Ｉ（下、薄い灰色）及びＳｙｔ  ＩＩ（下、暗い灰色）に結合したＢｏＮＴ／Ｂ（上）のモデル化構造に見ることができる。ＢｏＮＴ／ＢへのＳｙｔ  Ｉの結合は、入手可能なＢｏＮＴ／Ｂ−Ｓｙｔ  ＩＩ結晶構造（ＰＤＢ：４ＫＢＢ）に基づいてモデル化された。（図２４Ｂ）ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン内のヒトＳｙｔ  Ｉ（配列番号４）とマウス／ラットＳｙｔ  Ｉ（配列番号２９）との配列アラインメント。唯一の違いであるヒトＳｙｔ  ＩでのＥ４５、マウス／ラット−Ｓｙｔ  ＩでのＱが、太字で表示されている。このモデルは、残基４５の側鎖（矢印で示す）が、結合部位から外側を向いており、ＢｏＮＴ／Ｂと相互作用しないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
発明の詳細な説明
本発明の態様は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍの改変受容体結合ドメイン（例えば、血清型Ｂ（Ｂ−ＨＣ））を含むポリペプチド、及びそのようなポリペプチドをコードする核酸の生成に関し、より具体的には、改変受容体結合ドメインの組み込みによりそれらのヒト受容体への結合を改善したＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチド、及びそのようなポリペプチドをコードする核酸に関する。これらの知見から、現在利用されているＷＴ  ＢｏＮＴと比較して、ヒトニューロンを標的指向するための有効性及び特異性が改善された本明細書で同定された改変受容体結合ドメインを含む新世代の治療用ＢｏＮＴを作製することができる。
【００９０】
ヒトＳｙｔＩＩ受容体分子へのＢｏＮＴ／Ｂ  ＨＣポリペプチドの結合は、ＢｏＮＴ／Ｂ１  ＨＣ残基Ｅ１１９１及びＳ１１９９に対応する残基における変異によって著しく増強され得ることが既に判明されていた。その全体が参照により本明細書に組み入れられるＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２４２１１を参照されたい。特に、残基Ｅ１１９１でのＢｏＮＴ／Ｂ１  ＨＣドメインの、Ｑ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、ＬまたはＹへの変異は、ＷＴと比較して、ｈＳｙｔＩＩ結合を増強した。変異Ｅ１１９１Ｍは、最も劇的な結合の向上をもたらしたが、Ｅ１１９１Ｑもまた結合を有意に促進した。例えば、図２Ｄ及びＥを参照されたい。ＢｏＮＴ／Ｂ１  ＨＣＥ１１９１Ｍ変異、及び残基Ｓ１１９９のＹへの変異との組み合わせは、ｈＳｙｔＩＩ受容体へのＢｏＮＴ／Ｂ１分子の結合をさらに向上した。二重変異体は、ｈＳｙｔＩＩ受容体分子を発現するヒトニューロンへの強い結合を示し、そして神経伝達の遮断において増強した有効性を示した。図４及び５を参照されたい。
【００９１】
ＢｏＮＴ血清型Ｂ４（ＢｏＮＴ／Ｂ４）ＷＴ  ＨＣドメインは、血清型Ｂ１分子のＥ１１９１及びＳ１１９９に対応する位置にグルタミン及びチロシンを含み、その結果、強い結合を促進することが予測される血清型Ｂ１分子のＥ１１９１Ｑ、Ｓ１１９９Ｙ二重変異体に対応することが確認された。興味深いことに、血清型Ｂ１神経毒素の結合及び活性を促進する血清型Ｂ１タンパク質の位置にグルタミン及びチロシンを有するにもかかわらず、野生型Ｂ４分子は、ｈＳｙｔＩＩ受容体分子に効果的に結合しない。したがって、Ｂ４分子のＱ１１９１及びＹ１１９９以外のアミノ酸は、ｈＳｙｔＩＩ分子への結合にとって重要であるに違いない。
【００９２】
本明細書の実施例に記載されるように、血清型Ｂ１とＢ４との間で異なるＢ４分子のＨＣドメインの１９個のアミノ酸のうち４個を変異させると、血清型Ｂ４分子に強いｈＳｙｔＩＩ結合がもたらされることが見出された。具体的には、Ｂ４アミノ酸Ｖ１１１３、Ｓ１１１７、Ｓ１１９６及びＩ１１９７が、Ｂ４がｈＳｙｔＩＩに結合するのに重要であることが見出された。血清型Ｂ１分子の対応する残基へのこれらの残基の変異は、血清型Ｂ４分子に強い結合をもたらした。すなわち、Ｂ４変異Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ、及びＩ１１９７Ｐは、強いｈＳｙｔＩＩ結合をもたらした。したがって、これらの変異を含むＢ４  ＨＣドメイン変異体は、天然に存在するＱ１１９１及びＹ１１９９に加えて、治療的または美容的用途のための改変Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素調製物に使用することができる。Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ、及びＩ１１９７Ｐ変異を含むＢ４  ＨＣ変異体のさらなる改変（例えば、単独でまたは組み合わせて、ｈＳｙｔＩＩへの血清型Ｂ１分子の結合を促進することが見出された変異を含む）が、改変血清型Ｂ４  ＨＣドメインの結合を促進することが予測されることもまた理解されるべきである。したがって、Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ、及びＩ１１９７Ｐ変異を含むＢ４変異体において、例えばＱ１１９１から、例えばＣ、Ｖ、Ｌ、Ｙ、Ｍ、及び／またはＹ１１９９から、例えばＷ、Ｅ、またはＨへのさらなる変異もまた、結合によい影響を及ぼすことが予測され得る。ほんの一例として、Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ、及びＩ１１９７Ｐ変異に加えて変異Ｑ１１９１Ｍを含むＢ４  ＨＣドメイン変異体を含むＢｏＮＴ神経毒素もまた強く結合し、神経伝達活性に影響を及ぼす可能性がある。
【００９３】
以下に、本明細書に記載される発見、ならびに本明細書に開示される方法及び組成物にそれらを適用するための当業者の考察につながった研究のさらなる説明を含む。
【００９４】
実施形態
ＢｏＮＴ／Ｂが、ヒトＳｙｔ  ＩＩに結合できないために、ヒトにおいて特異性が低く、かつより強力ではないという観察結果により、ＢｏＮＴ／Ａよりも比較的高用量が必要とされる理由が説明され得る。より高いＢｏＮＴ／Ｂ用量は、抗体応答を誘発する可能性、及び重篤な副作用が起こる可能性の増加に対応する。したがって、ヒト受容体Ｓｙｔ  ＩＩへのＢｏＮＴ／Ｂの結合を改善して、ヒトニューロンを標的指向するためのその有効性及び特異性を増大させることにより、治療的用途で用いられる毒素用量の減量が可能になるはずである。
【００９５】
本発明の態様は、ＢｏＮＴ血清型Ｂ４−ＨＣのタンパク質配列の改変が、受容体結合ドメインを含む断片の、ヒトＳｙｔ  ＩＩ受容体への結合を改変するという知見から生じている。結合を増強し、それにより高親和性でヒトＳｙｔ  ＩＩに結合するドメインを生成する特定の改変が同定された。改変ＢｏＮＴ／Ｂ４−ＨＣは、完全長ＢｏＮＴタンパク質においては、これらの結合特性を保持する。結合が増強された改変受容体結合ドメインを、他のＢｏＮＴドメインを含む分子に組み込み、それにより受容体結合が同様に増強された完全長ＢｏＮＴが生成される。したがって、ヒトＳｙｔ  ＩＩへの親和性結合が高い新型のＢｏＮＴが生成される。結合が著しく増強されたＢｏＮＴは、現在利用可能なＢｏＮＴ分子よりも低用量であるにもかかわらず、同様の治療において使用することができ、したがってより安全な治療方法を提供する。
【００９６】
本明細書に記載される完全長ＢｏＮＴポリペプチド及びＢｏＮＴポリペプチド断片またはドメイン（例えば、改変ＢｏＮＴ／ＨＣ）を含むＢｏＮＴポリペプチド、ならびにそれらをコードする核酸分子は、本発明に明確に包含される。これらのポリペプチド及び核酸分子は、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ手順によって生成することができる。このようなポリペプチドは典型的に、「組換えポリペプチド」または「組換え核酸」と称される。
【００９７】
ボツリヌス神経毒素タンパク質
本発明の一態様は、本明細書に記載される改変受容体結合ドメイン（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ４の）を含むボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）タンパク質に関する。ＢｏＮＴタンパク質は、プロテアーゼドメイン、移行ドメイン、及びプロテアーゼ切断部位をさらに含む。典型的には、これらは、プロテアーゼドメイン、プロテアーゼ切断部位、移行ドメイン、及び改変受容体結合ドメインの直鎖状のアミノからカルボキシルへの単一ポリペプチド順序で配置される。しかしながら、様々なドメインの異なる配置も適切に機能すると予測される。一実施形態では、改変受容体結合ドメインは、ヒトＳｙｔ  Ｉ受容体及び／またはヒトＳｙｔ  ＩＩ受容体への著しく増強した結合をもたらす１つ以上の置換変異を含む。
【００９８】
ＢｏＮＴタンパク質は、ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６）（配列番号１）などの分子、またはヘマグルチニン（ＨＡ）タグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号２）などのエピトープタグの精製に有用なドメインをさらに含んでもよい。そのような目的のために様々なそのようなドメインが当技術分野において公知であり、使用されている。
【００９９】
ＢｏＮＴは、図１Ｂに示される全体構造を有する。ＢｏＮＴは、それぞれが特異的かつ独立した機能を有する３つのドメイン：プロテアーゼドメイン（軽鎖とも称される）、移行ドメイン（ＨＮ）、及び受容体結合ドメイン（ＨＣ）で構成される。様々な株のＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素のドメインが、ほぼ互換的であることが示されている（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，０５２，９７９号において、ＢｏＮＴ／Ｃの軽鎖及びＨＮと、ＢｏＮＴ／ＤのＨＣから構成されるＢｏＮＴ／ＣＤなどの天然キメラ毒素によって証明される（５２））。このタンパク質は、一本鎖型または二本鎖型であってよい。二本鎖型は、プロテアーゼドメインと移行ドメインの間に位置するプロテアーゼ切断部位の天然のプロテアーゼプロセシングによって生じる。このタンパク質は、ジスルフィド結合の存在によって、プロテアーゼプロセシング後に二本鎖型で維持される。
【０１００】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍの株は、抗原性の異なる７つの型のボツリヌス毒素を産生し、それらはヒト（ＢｏＮＴ／Ａ、／Ｂ、／Ｅ、及び／Ｆ）、動物（ＢｏＮＴ／Ｃ１及び／Ｄ）におけるボツリヌス中毒の大発生を調査することによって同定されてきたか、または土壌から単離された（ＢｏＮＴ／Ｇ）。７個全てのＢｏＮＴ血清型が類似の構造及び薬理学的特性を有するが、それぞれはまた多様な細菌学的特徴を示す。Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ株の遺伝的多様性は、Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １８９，  Ｎｏ．  ３，  ｐ．  ８１８−８３２  （２００７））（５３）に詳細に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。一実施形態では、本発明のＢｏＮＴは、全て同一の血清型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、またはＧ）であるドメインを有する。一実施形態では、同一の血清型の１つ以上のそれらのドメインは、株及び／またはサブタイプに関して異なる。
【０１０１】
様々なＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型／株由来の毒素は、同一の機能的ドメイン構成及び全体構造アーキテクチャを共有する。Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素はそれぞれ、およそ１５０ｋＤａの一本鎖ポリペプチドとして翻訳され、これは次いで、天然プロテアーゼ、例えば内在性Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素プロテアーゼ、またはその環境において産生された天然プロテアーゼなどによるジスルフィドループ内でのタンパク質分解的切断によって切断される。この翻訳後プロセシングにより、単一のジスルフィド結合及び非共有結合的相互作用によって結合する、およそ５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）及びおよそ１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）を含む二本鎖分子が生じる。各成熟二本鎖分子は、３つの機能的に異なるドメイン：１）神経伝達物質放出装置のコア成分を特異的に標的指向する亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性を含むメタロプロテアーゼ領域を含む、ＬＣ内に位置するタンパク質分解ドメイン；２）標的細胞の細胞内小胞から細胞質中へのＬＣの放出を促進する、ＨＣのアミノ末端側半分内に含まれる移行ドメイン（ＨＮ）；及び３）標的細胞の表面に位置する受容体複合体への毒素の結合活性及び結合特異性を決定する、ＨＣのカルボキシル末端側半分内に見出される結合ドメイン、を含む。様々な血清型／株の毒素内の特異的ドメインの位置を表１に提供する。
【０１０２】
（表１）様々な血清型／株由来のＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメイン
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【０１０３】
毒素の完全なアミノ酸配列を図１０〜１６に提供する。ＢｏＮＴ／Ｂ４神経毒素ポリペプチド（Ｅｋｌｕｎｄ株とも称される）の完全なアミノ酸配列を図１７に提供する。
【０１０４】
毒性には、これらの３つの機能的ドメインの結合活性、移行活性、及びプロテアーゼ活性が全て必要である。Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素がニューロンに侵入し、神経伝達物質放出を阻害する全体的な細胞中毒機序は、血清型またはサブタイプにかかわらず類似している。理論に束縛されるものではないが、中毒機序は、少なくとも４つのステップ：１）受容体結合、２）複合体の内部移行、３）軽鎖の移行、及び４）プロテアーゼ標的改変を伴う。この過程は、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素のＨＣドメインが、標的細胞の形質膜表面上に位置する毒素特異的受容体に結合した時に始まる。受容体複合体の結合特異性は、一部には、ガングリオシドとタンパク質受容体の特定の組み合わせによって達成されると考えられている。ひとたび結合すると、毒素／受容体複合体は、エンドサイトーシスによって内部移行し、内部移行した小胞は特定の細胞内経路へと選別される。移行ステップは、小胞区画の酸性化によって誘発される。ひとたび移行すると、毒素の軽鎖エンドペプチダーゼが、細胞内小胞からサイトゾル中に放出され、そこで、神経伝達物質放出装置のコア成分として知られる３つのタンパク質（小胞結合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）／シナプトブレビン、２５ｋＤａのシナプトソーム結合タンパク質（ＳＮＡＰ−２５）、及びシンタキシン）のうちの１つを特異的に標的指向する。これらのコア成分は、神経終末におけるシナプス小胞のドッキング及び融合に必要であり、可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（ＳＮＡＲＥ）ファミリーのメンバーを構成する。ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｅは、ＳＮＡＰ−２５をカルボキシル末端領域で切断し、それぞれ９または２６アミノ酸セグメントを放出し、ＢｏＮＴ／Ｃ１もまたＳＮＡＰ−２５をカルボキシル末端の近傍で切断する。ボツリヌス血清型ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ、及びＢｏＮＴ／Ｇ、ならびに破傷風毒素は、ＶＡＭＰの保存された中心部分に作用し、ＶＡＭＰのアミノ末端部分をサイトゾル中に放出する。ＢｏＮＴ／Ｃ１は、シンタキシンをサイトゾル側（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）形質膜表面の近傍の単一部位で切断する。シナプスＳＮＡＲＥの選択的タンパク質分解は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素によって引き起こされる神経伝達物質放出の遮断の原因である。Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素のＳＮＡＲＥタンパク質標的は、種々の非ニューロン型のエキソサイトーシスに共通している；これらの細胞では、ニューロンの場合と同様に、軽鎖ペプチダーゼ活性がエキソサイトーシスを阻害する。例えば、Ｙａｎｎ  Ｈｕｍｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｏｗ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  Ｂｌｏｃｋ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ８２（５）  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．  ４２７−４４６  （２０００）；Ｋａｔｈｒｙｎ  Ｔｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｔｉｌｉｔｙ，  ２７（１１）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ５５２−５５８．  （２００２）；Ｇｉｏｖａｎｎａ  Ｌａ��ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎｅｙ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｎｓ，  １１（９）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４３１−４３７，  （２００３）を参照されたい。
【０１０５】
ドメイン及びキメラ神経毒素
本明細書に記載されるボツリヌス神経毒素は、改変受容体結合ドメイン（ＨＣ）を含む。改変受容体結合ドメインは、１つ以上のＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素株によって典型的に結合され、使用される１つ以上のヒト受容体（例えば、ＳｙｔＩＩ、ＳｙｔＩ）への著しく増強した結合を示す。その改変受容体結合ドメインは、改変血清型Ｂ４受容体結合ドメイン（本明細書に記載される）となる。これは、ＢｏＮＴ内の１つ以上の他のドメインと同一または異なる血清型、株／サブタイプであってよい。特定の改変受容体結合ドメインの例を本明細書において提供する。本明細書に記載される単離された改変受容体結合ドメインポリペプチドもまた、本発明によって包含され、それがコードされる単離された核酸分子も同様に本発明によって包含される。
【０１０６】
本発明のボツリヌス神経毒素はまた、当技術分野で軽鎖変種とも称されるプロテアーゼドメインを含む。軽鎖変種は、天然軽鎖変種、例えばＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素軽鎖アイソフォーム及びＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素軽鎖サブタイプなど；または、非天然Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素軽鎖変種、例えば保存的置換Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素軽鎖変種などであってよい。プロテアーゼドメインは、任意の血清型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、またはＧ）、株、またはサブタイプ（本明細書に記載の）であることができる。これは、ＢｏＮＴ内の１つ以上の他のドメインと同一または異なる血清型、株／サブタイプであってよい。一実施形態では、プロテアーゼドメインは、血清型Ｂである。一実施形態では、プロテアーゼドメインは、血清型Ａである。
【０１０７】
本発明のボツリヌス神経毒素はまた毒素移行ドメイン（ＨＮ）を含む。毒素移行ドメインは、任意の血清型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、またはＧ）、株、またはサブタイプ（本明細書に記載の）であることができる。これは、ＢｏＮＴ内の１つ以上の他のドメインと同一または異なる血清型、株／サブタイプであってよい。一実施形態では、ＨＮは、血清型Ｂである。一実施形態では、ＨＮは、血清型Ａである。
【０１０８】
本明細書に記載される様々なドメイン（例えば、ＨＮ、ＨＣ、またはプロテアーゼドメイン）には、非限定的に、天然変種、例えば、アイソフォーム及びサブタイプなど；非天然変種、例えば、保存的置換変異などが含まれる。非天然変種とは、参照配列（例えば、表１または図８または１０〜１７の）の対応する領域からの少なくとも１つのアミノ酸変化を有するドメインを指し、その参照配列の対応する領域に対するパーセント同一性で記載され得る。
【０１０９】
本明細書に記載されるボツリヌス神経毒素変種は、改変血清型Ｂ４  ＨＣドメインを包含することが理解されるが、各血清型のＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素には、それらのアミノ酸配列、及びそれらのタンパク質をコードする核酸においてもまたいくらか異なる天然Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍドメイン変種が存在し得ることが、当業者によって認識されている。本発明のＢｏＮＴの生成での使用が想定される天然Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメイン（例えば、軽鎖、ＨＮ、またはＨＣ）変種は、その天然Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍドメイン変種の基礎となる参照Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメインと実質的に同じ様式で機能することができ、参照Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメインに取って代わることができる。
【０１１０】
天然Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメイン変種の非限定的な例は、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメインアイソフォーム、例えば、ＢｏＮＴ／Ａドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｂドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｃ１ドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｄドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｅドメインアイソフォーム、ＢｏＮＴ／Ｆドメインアイソフォーム、及びＢｏＮＴ／Ｇドメインアイソフォームなどである。Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメインアイソフォームは、そのＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメインアイソフォームの基礎となる参照Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメインと実質的に同じ様式で機能することができ、参照Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメインに取って代わることができる。
【０１１１】
天然Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメイン変種の別の非限定的な例は、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメインサブタイプ、例えば、サブタイプＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３、ＢｏＮＴ／Ａ４、ＢｏＮＴ／Ａ５に由来するドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｂ１、ＢｏＮＴ／Ｂ２、ＢｏＮＴ／Ｂ３、ＢｏＮＴ／Ｂ４、ＢｏＮＴ／Ｂ５、ＢｏＮＴ／Ｂ６、ＢｏＮＴ／Ｂ７に由来するドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｃ１−１、ＢｏＮＴ／Ｃ１−２、ＢｏＮＴ／Ｄ−Ｃに由来するドメイン；サブタイプＢｏＮＴ／Ｅ１、ＢｏＮＴ／Ｅ２、ＢｏＮＴ／Ｅ３、ＢｏＮＴ／Ｅ４、ＢｏＮＴ／Ｅ５、ＢｏＮＴ／Ｅ６、ＢｏＮＴ／Ｅ７、ＢｏＮＴ／Ｅ８に由来するドメイン；及びサブタイプＢｏＮＴ／Ｆ１、ＢｏＮＴ／Ｆ２、ＢｏＮＴ／Ｆ３、ＢｏＮＴ／Ｆ４、ＢｏＮＴ／Ｆ５、ＢｏＮＴ／Ｆ６、ＢｏＮＴ／Ｆ７に由来するドメインなどである。Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメインサブタイプは、そのＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメインサブタイプの基礎となる参照Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメインと実質的に同じ様式で機能することができ、参照Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメインに取って代わることができる。
【０１１２】
本明細書で用いられる場合、「非天然変種」（例えば、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素軽鎖変種、ＨＣ及びＨＮ）という用語は、人為的操作の助けを借りて産生されたＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍドメインを意味し、これには非限定的に、ランダム突然変異誘発または合理的設計を用いた遺伝子操作により産生されたドメイン、及び化学合成によって産生されたＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍドメインが含まれる。非天然Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍドメイン変種の非限定的な例には、例えば保存的Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍドメイン変種が含まれる。本明細書で用いられる場合、「保存的Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍドメイン変種」という用語は、参照Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍドメイン配列（例えば、表１及び図８及び１０〜１７）由来の元のアミノ酸の性質と類似した少なくとも１つの性質を有する別のアミノ酸またはアミノ酸類似体によって置換された少なくとも１つのアミノ酸を有するＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍドメインを意味する。変種は、参照ドメイン配列と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換を有し得る。性質の例には、非限定的に、類似のサイズ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能、水素結合能、物理化学的性質など、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。保存的Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍドメイン変種は、その保存的Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメイン変種の基礎となる参照Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメインと実質的に同じ様式で機能することができ、本発明の任意の態様において参照Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍドメインに取って代わることができる。
【０１１３】
非天然Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメイン変種では、その天然Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメインの基礎となる参照Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメインから１つ以上のアミノ酸（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、またはそれ以上）を置換することができる。非天然Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメイン変種はまた、その天然Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍドメイン変種の基礎となる参照Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素ドメインに対して９５％以上（例えば、９６％、９７％、９８％、または９９％）のアミノ酸同一性を有することができる。
【０１１４】
様々な非天然Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素またはその特異的ドメインが、国際特許出願公開ＷＯ９５／３２７３８、ＷＯ９６／３３２７３、ＷＯ９８／０７８６４、及びＷＯ９９／１７８０６に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に記載されるＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素またはその特異的ドメインは、典型的には天然アミノ酸残基を含むが、場合によっては非天然アミノ酸残基が存在してもよい。したがって、特定のアミノ酸またはペプチドの構造を模倣する非アミノ酸化学構造を含み得る、いわゆる「ペプチド模倣体」及び「ペプチド類似体」を、本発明において用いることもできる。このような模倣体または類似体は、一般的に、類似のサイズ、電荷、または疎水性などの物理的特性、及びそれらの天然ペプチド対応物中に見出される適切な空間的方向性を示すと特徴づけられる。ペプチド模倣体化合物の具体例は、当技術分野で周知であるように、１つ以上のアミノ酸間のアミド結合が、例えば炭素−炭素結合またはその他の非アミド結合によって置き換えられた化合物である（例えば、Ｓａｗｙｅｒ，  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，  ｐｐ．  ３７８−４２２，  ＡＣＳ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．  １９９５を参照されたい）。
【０１１５】
本明細書に記載される改変ボツリヌス神経毒素は、野生型またはＥｋｌｕｎｄ、株のＨＣドメインと比較して、４つの置換変異：Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ及びＩ１１９７Ｐを含むＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ血清型Ｂ４の改変受容体結合ドメイン（ＢｏＮＴ／Ｂ−ＨＣ）を含む。これらの置換変種は、ヒトＳｙｔ  ＩＩ受容体への著しく増強した結合をもたらす。本発明において参照テンプレートとして使用されるＢｏＮＴ／Ｂ４−ＨＣ  Ｅｋｌｕｎｄ株のアミノ酸配列を図１７に示す（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００１８９３６６１．１、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｒｅｆ：ＥＦ０５１５７０．１もまた参照されたい）。改変Ｂ−ＨＣを含む完全ＢｏＮＴまたはポリペプチドなどの改変Ｂ４−ＨＣを組み込んだより長い分子の生成は、本明細書において特に企図される。
【０１１６】
毒素の拡散及び中和抗体の生成は、ＢｏＮＴ／Ａにも見られるように、ＢｏＮＴ／Ｂに関連するがこれに限定されない問題である。ＢｏＮＴ／Ａのその受容体ＳＶ２への結合親和性の改善は、これらの問題を軽減するであろう。Ｓｙｔ  Ｉ／ＩＩへのＢｏＮＴ／Ｂの結合は、ＳＶ２へのＢｏＮＴ／Ａの結合よりもはるかに高親和性を有するため、ヒトＳｙｔ  ＩＩを結合する能力を有する改変ＢｏＮＴ／Ｂ受容体結合ドメイン（ＢｏＮＴ／Ｂ−ＨＣ）を用いて、ＢｏＮＴ／Ａ−ＨＣを置き換え、ヒトニューロンに対してＷＴ  ＢｏＮＴ／Ａよりもより高い有効性及び特異性を有し得る改変キメラＢｏＮＴ／Ａを生成することもできる。（４９−５１）。
【０１１７】
上記の改変Ｂ４  ＨＣを使用して、他の全てのＢｏＮＴ血清型／株のＨＣを置き換えることができることもさらに想定される。したがって、本発明の別の態様は、異なる血清型（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、またはＧ）、株またはサブタイプの１つ以上のドメインと結合し、これによりキメラ神経毒素を産生する、改変血清型Ｂ４受容体結合ドメイン（ＨＣ）を含むＢｏＮＴポリペプチドである。各ＢｏＮＴのＨＣ領域は明確に定義されており、各ＨＣ領域は、ＢｏＮＴ分子中で交換することができる（例えば、遺伝子操作を介して）。そのような操作は、当技術分野において確立されている、ＢｏＮＴ／Ｂ−ＨＣと、他のＢｏＮＴの軽鎖（ＬＣ）及び移行ドメイン（ＨＮ）またはＨＮ−ＬＣとをコードするＤＮＡの標準的なＰＣＲ融合を介して当業者によって日常的に行われる。加えて、置き換えはまた、各ＢｏＮＴにおいてタンパク質受容体及びガングリオシドに対する結合部位を含む領域である、ＢｏＮＴ／Ｂ−ＨＣのＣ末端部分（ＨＣＣと呼ばれる）を用いて行ってもよい。結果として生じるキメラ毒素は、ヒトＳｙｔ  Ｉ／ＩＩへの結合を介してヒトニューロンを標的指向する能力を有し得る。非限定的な例として、改変ＢｏＮＴ／Ｂ４−ＨＣ（またはＢｏＮＴ／Ｂ４−ＨＣＣ）を用いて、ＢｏＮＴ／ＡのＨＣ（またはＨＣＣ）を置き換えることができる。結果として生じるポリペプチドは、本発明によって包含される。これらのキメラ毒素は、ＷＴ  ＢｏＮＴ／Ａよりも、ヒトニューロンを標的指向する高い有効性及び特異性を有し得る。このようなキメラＢｏＮＴ／Ａ毒素は、ヒトにおける治療的用途のために用いることができ、ＷＴ  ＢｏＮＴ／Ａを超える著しい改善をもたらす。
【０１１８】
一態様は、本明細書に記載される単離、精製された改変受容体結合ドメインポリペプチドに関する。一実施形態では、改変受容体結合ドメインは、改変ＢｏＮＴ／Ｂ４−ＨＣである。一実施形態では、Ｂ４−ＨＣは、本明細書に記載されるＢ４中の特定の位置（複数可）に対応するアミノ酸の置換により、異なる株及び／またはサブタイプのＢｏＮＴから生成される。一実施形態では、ＨＣは、サブタイプＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、またはＢ７である。一実施形態では、改変Ｂ−ＨＣは、株３、７、または８のものではない。
【０１１９】
本発明は、ヒトにおける治療的用途のための、本明細書に記載されるアミノ酸置換を有する改変ＨＣ（例えばＢ４−ＨＣ）を含む変異株完全長ＢｏＮＴを包含する。一実施形態では、完全長ＢｏＮＴは、アミノ酸置換Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ、及びＩ１１９７Ｐを有する改変ＨＣ（例えばＢ４−ＨＣ）を含み、さらに、Ｂ４のＱ１１９１、Ｙ１１９９、Ｙ１１８３、及びＷ１１７８位（例えば、表２に列挙されたものから選択される）に対応する１つ以上の組み合わせのアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＢｏＮＴは、アミノ酸置換Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ、及びＩ１１９７Ｐ、ならびに本明細書に記載される１つの追加アミノ酸置換を有する改変Ｂ４  ＨＣを含む。一実施形態では、ＢｏＮＴは、アミノ酸置換Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ、及びＩ１１９７Ｐ、ならびに本明細書に記載される２つの追加アミノ酸置換を有する改変Ｂ４  ＨＣを含む。一実施形態では、ＢｏＮＴは、アミノ酸置換Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ、及びＩ１１９７Ｐ、ならびに本明細書に記載される３つの追加アミノ酸置換を有する改変Ｂ４  ＨＣを含む。一実施形態では、改変Ｂ−ＨＣは、株３、７、または８のものではない。
【０１２０】
結果として生じるＢｏＮＴ毒素は、ヒトＳｙｔ  ＩＩへの著しく増強した結合を有することができ、これにより、ＷＴ  ＢｏＮＴよりもヒトニューロンを標的指向するより高い有効性及び特異性を達成することとなる。結果として生じる変異体は、さらに、ヒトＳｙｔＩへの類似の結合を維持し得るか、ヒトＳｙｔＩへの著しく増強した結合を有し得るか、またはヒトＳｙｔＩへの著しく低下した結合を有し得る。
【０１２１】
ポリペプチド及びキメラポリペプチド
本発明の別の態様は、改変ＢｏＮＴ／Ｂ４受容体結合ドメインを含むポリペプチドに関する。一実施形態では、改変ＨＣは、ポリペプチドにおいては、ＨＣ中の改変された特定の位置にＷＴアミノ酸を有する類似のポリペプチド（血清型Ｂ４野生型対応物）と比較して、ヒトＳｙｔ  ＩＩ及び／またはＳｙｔ  Ｉへの著しく増強した結合を有する。一実施形態では、改変血清型Ｂ４  ＨＣは、本明細書に記載されるＢ４中の特定の位置（複数可）に対応するアミノ酸の置換により、異なる血清型、株及び／またはサブタイプのＢｏＮＴから生成される。一実施形態では、改変Ｂ−ＨＣは、株３、７、または８のものではない。一実施形態では、結果として生じるポリペプチドは、ヒトＳｙｔＩ／ＩＩへの結合を介してヒトニューロンを標的指向する能力を有する。
【０１２２】
改変受容体結合ドメインを含むポリペプチドは、受容体結合ドメイン及び別の機能性ポリペプチド（例えば、ツーハイブリッドシステムに使用される機能性ポリペプチド（Ｔ１８もしくはＴ２５などの釣り餌もしくは餌食、またはグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ））との融合タンパク質であり得る。これは、キメラポリペプチド分子と呼ばれることもある。あるいは、改変受容体結合ドメイン、ならびに、同定目的及び／または精製目的のポリペプチドタグ（例えば、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）（配列番号１）、またはヘマグルチニン（ＨＡ）タグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号２）などのエピトープタグ、またはＧＳＴ）との融合であってもよく、これらの多くは当該技術分野において公知であり、一般的に使用される。融合は、連結を容易にするか、切断部位として機能するか、または独立した高次構造及び／または機能を保存する各機能的ドメイン間に、一連のアミノ酸を有し得る。一実施形態では、連結は、改変受容体結合ドメインの機能を保存する。一実施形態では、連結は、改変受容体結合ドメインの機能をマスクする。本発明の別の態様は、このようなポリペプチドの任意の１つをコードする核酸分子に関する。
【０１２３】
改変ＢｏＮＴ／Ｂ４  ＨＣは、他の物質（例えば、タンパク質、小分子、短いポリペプチド、核酸）に、共有結合的に（例えば、融合タンパク質として）または非共有結合的に連結することができる。したがって、本発明の別の態様は、第２部分に連結された、本明細書に記載のＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（例えば、血清型Ｂ４）の改変受容体結合ドメインである第１部分を含む、キメラ分子に関する。前記分子の第２部分は、治療薬（例えば、ポリペプチド薬物、または小分子もしくは核酸などの非ポリペプチド薬物）などの生物活性（または「生物学的に活性な」）分子であり得る。前記分子の第１及び第２部分の連結は、共有結合的（例えば、融合タンパク質の形態）または非共有結合的であり得る。そのような連結の方法は、当技術分野で公知であり、熟練した実務者により容易に適用することができる。本発明のキメラ分子のそのような用途の１つは、ヒトにおいてニューロンを標的指向するための送達手段としてである。例えば、改変ＢｏＮＴ／ＨＣを他の治療薬に連結させ、ヒトＳｙｔ  Ｉ及び／またはＳｙｔ  ＩＩに結合することによってヒトのニューロンに治療薬を送達するためのターゲティング媒体として機能させることができる。
【０１２４】
受容体結合ドメイン（ＨＣ）の改変
本明細書に述べられるように、本発明は、改変ＨＣ、及び改変ＨＣを含むポリペプチド（例えば、ＢｏＮＴまたは融合またはキメラポリペプチド）に関する。これらの様々な本発明のポリペプチドを生成するために使用されるＨＣアミノ酸配列の改変は、熟練した実務者により公知の様々な方法によって実施することができる。例としては、非限定的に、Ｓｙｔ  Ｉ／ＩＩに結合することが公知の領域内の各アミノ酸残基の標的指向された突然変異誘発（部位特異的突然変異誘発）またはランダム突然変異誘発が挙げられる。これらのＳｙｔ結合領域は、マウスまたはラットＳｙｔ受容体に関する先行研究により明確に定義されているが、ＢｏＮＴ／Ｂ−ＨＣ及びヒトＳｙｔ受容体間の相互作用については明確に解明されていない。ＢｏＮＴ／Ｂの異なるサブタイプ、またはＳｙｔ  Ｉ／ＩＩ（Ｄ−ＣまたはＧ）に結合する他の血清型をテンプレートとして用いて、Ｂ４−ＨＣについて本明細書に記載の対応する変異を起こすことによって、同一または類似の変異を引き起こすことができる。変異させるために選択された残基の対応する位置は、Ｂ４サブタイプとの配列アラインメントによって容易に同定することができる。結果として生じるポリペプチド産物は、前記産物を含むポリペプチドならびに前記ポリペプチド及び産物をコードする核酸分子と同様に、本発明によって包含される。
【０１２５】
改変受容体結合ドメインを生成するためのＨＣのアミノ酸配列の改変は、単一の残基の異なるアミノ酸への変異（単一部位置換）、同時に複数の残基の変異（複数部位置換）、１つ以上の残基の欠失（欠失）、及び１つ以上の残基の挿入（挿入）、ならびにそれらの組み合わせであり得る。タンパク質を変異させる方法は、当技術分野において周知である（例えば、ＢｏＮＴ／ＨＣ配列をコードするＤＮＡ上の標的指向された単一部位及び複数部位の置換）。
【０１２６】
一実施形態では、ＢｏＮＴ／Ｂ受容体結合ドメインに関する従来の文献（２９）＿ＥＮＲＥＦ＿２９及び報告されたＢｏＮＴ／Ｂ−Ｓｙｔ  ＩＩ構造（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＮＭ１）に基づいて、齧歯類のＳｙｔ  ＩＩまたは周辺領域のいずれかに接触するＨＣの１つ以上の残基が改変される。これらには、非限定的に、ＢｏＮＴ／Ｂ４のＹ１１８１、Ｉ１１９７、Ｓ１１９６、Ｆ１２０４、Ｆ１１９４、Ｓ１１１７、Ｗ１１７８、Ｙ１１８３、Ｖ１１１８、Ｓ１１１６、Ｖ１１１３、Ｋ１１９２、Ｙ１１９９、Ｓ１２０１、Ｑ１１９１、Ｅ１２４５、Ｙ１２５６、Ｄ１１１５、及びＥ１２０３位に対応する位置が含まれる。一実施形態では、Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ及びＩ１１９７Ｐ置換に加えて、これらの残基のうちの１つまたは複数を、他のアミノ酸によってシステミックに（ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ）置き換える。様々な改変の組み合わせもまた想定され、これには非限定的に、列挙された２つ以上の位置の、本明細書に列挙されたものなど任意の種々の様々なアミノ酸への変異が含まれる。
【０１２７】
これらの同定された重要な残基における変異を組み合わせることによって、複数部位置換（例えば、２または３）を生成することができる。そのような複数部位置換変異体は、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへのさらに増強した結合を有し得、さらに、ヒトＳｙｔ  Ｉへの増強した結合を維持または有し得る。一実施形態では、改変Ｂ４  ＨＣは、Ｂ４野生型配列に対して４つのアミノ酸置換（Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ及びＩ１１９７Ｐ）を有し、さらに、Ｑ１１９１Ｃ、Ｑ１１９１Ｖ、Ｑ１１９１Ｌ、Ｑ１１９１Ｙ、Ｑ１１９１Ｍ、Ｙ１１９９Ｗ、Ｙ１１９９Ｅ、Ｙ１１９９Ｈ、Ｗ１１７８Ｙ、Ｗ１１７８Ｑ、Ｗ１１７８Ａ、Ｗ１１７８Ｓ、Ｙ１１８３Ｃ、Ｙ１１８３Ｐ及びこれらの組み合わせから選択される血清型Ｂ株４における置換変異に対応する１つ以上の置換変異を含む。
【０１２８】
以下表２に示す、置換変異Ｖ１１１３Ｋ、Ｓ１１１７Ｐ、Ｓ１１９６Ａ及びＩ１１９７Ｐ、ならびに単一アミノ酸置換変異を有する改変Ｂ４  ＨＣもまた想定され、本明細書に記載の様々なポリペプチドにおけるその組み込みと同様である。
【０１２９】
（表２）
2019533430.tif 000005
【０１３０】
一実施形態では、改変Ｂ４  ＨＣは、特定の位置にＷＴアミノ酸を有する類似のポリペプチド（野生型対応物とも称される）と比較して、ｈＳｙｔ  ＩＩへの増強した結合を有する。一実施形態では、生成された変異体は、野生型対応物と比較して、ヒトＳｙｔ  Ｉへの著しく増強した結合を維持、または有する。
【０１３１】
一実施形態では、ＨＣは、表３の血清型Ｂ株４について示されるものに対応する２つの置換変異を有する。
【０１３２】
（表３）
2019533430.tif 000006
【０１３３】
核酸分子
本発明の別の態様は、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、本明細書に記載される、改変受容体結合ドメイン、または該改変受容体結合ドメインを含むポリペプチド、または該改変受容体結合ドメインを含むボツリヌス神経毒素）をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。一実施形態では、核酸分子は、図９に示される核酸配列を含む。このような核酸分子は、例えば、組換えＤＮＡ技術によって、熟練した実務者により生成することができる。所望のアミノ酸置換変異は、例えば、コーディングＤＮＡの改変によってなされる。例えば、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸配列は、以下に示す遺伝暗号を用いて、特定のアミノ酸をコードする核酸コドンを所望のアミノ酸に変異させることによって生成される：
2019533430.tif 000007
【０１３４】
一実施形態では、核酸配列は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現するのに最適化される（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ２３２９２７．１に基づく核酸配列、その関連部分は図９に示される）。
【０１３５】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される核酸分子を含む核酸ベクターに関する。一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。そのような発現ベクターは、本明細書において発現構築物と称され、細胞または無細胞抽出物中で核酸分子を発現するのに有用な発現ベクターに作動可能に連結された、本明細書に開示される核酸分子を含む。本発明のＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素をコードする核酸分子を発現させるには、多種多様なベクターを用いることができ、これには非限定的に、ウイルス発現ベクター；原核生物発現ベクター；真核生物発現ベクター、例えば、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクター、及び哺乳動物発現ベクターなど；ならびに無細胞抽出物発現ベクターが含まれる。これらの方法の態様を実施するのに有用な発現ベクターには、構成的、組織特異的、細胞特異的、または誘導性のプロモーターエレメント、エンハンサーエレメント、またはその両方の制御下でＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素を発現するものが含まれ得ることがさらに理解される。発現ベクターの非限定的な例は、そのような発現ベクターから発現構築物を作製し使用するための確立された試薬及び条件と共に、非限定的に、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  Ｃａｌｉｆ．；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  Ｃａｌｉｆ．；ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．；ＱＩＡＧＥＮ，  Ｉｎｃ．，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  Ｃａｌｉｆ．；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａｌｉｆを含む商業的販売業者から容易に入手可能である。適切な発現ベクターの選択、作製、及び使用は、十分に当業者の技術の範囲内であり、本明細書における教示からの日常的手順である。
【０１３６】
細胞
本発明の別の態様は、本明細書に記載される核酸分子または発現構築物を含む細胞に関する。細胞は、核酸の増殖もしくは核酸の発現またはその両方のためのものであってよい。このような細胞には、好気性、微好気性、好二酸化炭素性、通性、嫌気性、グラム陰性、及びグラム陽性菌細胞の株、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ナイセリア・メニンギルルス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｒｕｌｌｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、及びネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）に由来するものなどを非限定的に含む原核細胞；ならびに酵母株、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・アウグスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及びヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に由来するものなどを非限定的に含む真核細胞；昆虫細胞及び昆虫に由来する細胞株、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、及びタバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）に由来するものなど；ならびに哺乳動物細胞及び哺乳動物細胞に由来する細胞株、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類、及びヒトなどに由来するものなどが非限定的に含まれる。細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ及びｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓから入手することができる。適切な細胞株を選択、作製、及び使用するための具体的なプロトコールの非限定的な例は、例えば、ＩＮＳＥＣＴ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  （Ｍａｔｔｈｅｕｓ  Ｆ．  Ａ．  Ｇｏｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  １９９３）；ＩＮＳＥＣＴ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲ���Ｓ：  ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＡＳＰＥＣＴＳ  （Ｊ．  Ｍ．  Ｖｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  １９９６）；Ｍａｕｒｅｅｎ  Ａ．  Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＆  Ｉａｎ  Ｆ．  Ｒａｅ，  ＧＥＮＥＲＡＬ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  ＯＦ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９７）；ＣＥＬＬ  ＡＮＤ  ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ：  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ  （Ａｌａｎ  Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ  ｅｄｓ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  １９９８）；Ｒ．  Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＦ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬＳ：  Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥ  （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  ４．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄ．  ２０００）；ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  （Ｊｏｈｎ  Ｒ．  Ｗ．  Ｍａｓｔｅｒｓ  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ３．ｓｕｐ．ｒｄ  ｅｄ．  ２０００）；ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  ｓｕｐｒａ，  （２００１）；ＢＡＳＩＣ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  （Ｊｏｈｎ  Ｍ．  Ｄａｖｉｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ，  ２．ｓｕｐ．ｎｄ  ｅｄ．  ２００２）；及びＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  ｓｕｐｒａ，  （２００４）に記載されている。これらのプロトコールは、当業者の技術の範囲内であり、本明細書における教示からの日常的手順である。
【０１３７】
細胞は、核酸を発現し、これによりコードされたポリペプチドを生成するためのものであり得る。したがって、本発明の別の態様は、本明細書に記載されるボツリヌス神経毒素タンパク質、単離ＨＣ、または改変ＨＣを含むポリペプチドを生成するための方法である。そのようなポリペプチドは、発現構築物において、該ポリペプチドをコードする核酸をその中に有する宿主細胞を培養することによって生成される。培養は、ＢｏＮＴポリペプチドの生成に適した条件下で実施される。発現ポリペプチドは、当業者に公知の方法によって、培養物から回収でき、精製でき、そして製剤化できる。発現ポリペプチドは、当業者に公知の方法によって、必要に応じて活性化することもできる。発現ポリペプチドを活性化する１つの方法は、プロテアーゼにより切断して（またはニックを入れて）活性二本鎖形態にすることである。このような方法は、例えば、Ｐｅｔｅｒ  Ｆ．  Ｂｏｎｖｅｎｔｒｅ  ａｎｄ  Ｌｌｏｙｄ  Ｌ．  Ｋｌｅｍｐｅ  （  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９６０，  ７９（１）：  ２３及びＭｉｃｈａｅａｌ  Ｌ．  Ｄｅｋｌｅｖａ  ａｎｄ  Ｂｉｂｈｕｔｉ  Ｒ．  ＤａｓＧｕｐｔａ  （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｉｔｏｎｓ  １９８９，  １６２：  ７６７−７７２）によって開示されているような、当技術分野において公知のものから適応することができる。
【０１３８】
薬学的組成物
本発明の別の態様は、本明細書に記載されるＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒素またはキメラ分子を含む薬学的組成物に関する。一実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、薬学的に許容し得る担体を含む組成物（本明細書において薬学的組成物と称される）中の活性成分である。「薬学的に許容し得る担体」とは、標的指向された送達組成物を混合する、及び／または対象に送達するための薬学的に許容し得る任意の手段を意味する。本明細書で用いられる「薬学的に許容し得る担体」という用語は、対象に送達するための形態でＢｏＮＴポリペプチドを維持または樹立するのを助ける、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料などの、薬学的に許容し得る材料、組成物、または媒体を意味する。各担体は、組成物の他の成分と適合性があるという意味において「許容可能」でなければならず、対象、例えばヒトへの投与に適合性がある。このような組成物は、本明細書に記載される投与経路などのいくつかの経路のうちの１つまたは複数による投与のために特別に製剤化することができる。補助活性成分もまた、組成物中に組み込むことができる。本明細書に記載される薬剤、製剤、または薬学的組成物を対象に投与する場合、好ましくは治療的有効量が投与される。本明細書で用いられる場合、「治療的有効量」という用語は、病態の改善または好転をもたらす量を指す。一実施形態では、薬学的組成物は、注射による投与のために製剤化される。一実施形態では、薬学的組成物は、マイクロスフェア中に封入されたボツリヌス神経毒素を含む。一実施形態では、薬学的組成物は、経上皮送達のために製剤化されたボツリヌス神経毒素を含む。一実施形態では、薬学的組成物は、徐放のために製剤化されたボツリヌス神経毒素を含む。
【０１３９】
一実施形態では、本発明のボツリヌス神経毒素、ポリペプチド、またはキメラ分子は、徐放性製剤の形態である。このような組成物及び投与方法は、米国特許出願第２００７／００２０２９５号に提供されており、この内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４０】
ボツリヌス神経毒素は、公知の手順に従って、樹立し、発酵槽においてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍの培養物を増殖させ、次いで回収し、その発酵混合物を精製することによって得ることができる。全てのボツリヌス毒素血清型は、初めに不活性な一本鎖タンパク質として合成され、これが神経活性となるためには、プロテアーゼによって切断されるかまたはニックが入らなければならない。ボツリヌス毒素血清型Ａ及びＧを産生する細菌株は内在性プロテアーゼを有し、したがって血清型Ａ及びＧは細菌培養物から主にその活性形態で回収することができる。これに対して、ボツリヌス毒素血清型Ｃ１、Ｄ、及びＥは、非タンパク質分解株によって合成され、したがって培養物から回収される際は典型的には活性化されていない。血清型Ｂ及びＦは、タンパク質分解株及び非タンパク質分解株の両方によって産生され、したがって活性形態または不活性形態のいずれでも回収することができる。例えば、ボツリヌス毒素血清型Ｂを産生するタンパク質分解株は、産生された毒素の一部のみを切断し得る。ニックの入った分子対ニックの入っていない分子の正確な比率は、インキュベーションの長さ及び培養の温度に依存する。したがって、例えばボツリヌス毒素Ｂ型毒素の調製物の一定の割合は不活性となる可能性がある。一実施形態では、本発明の神経毒素は活性状態にある。一実施形態では、神経毒素は不活性状態にある。一実施形態では、活性神経毒素と不活性神経毒素の組み合わせが想定される。
【０１４１】
キット
本発明には、本明細書に記載されるＢｏＮＴまたはポリペプチドを含むキットもまた包含される（例えば、薬学的組成物の形態で）。キットは、バイアルに包装された本明細書に記載される１つ以上の組成物を含み得る。キットは、組成物の治療的投与のための送達ツールもしくは装置、及び／または治療的投与のための説明書をさらに含み得る。キットは、成形容器に包装されたその中の全ての構成要素を有し得る。
【０１４２】
本発明の別の態様は、薬学的組成物が予め充填された、本明細書に記載される薬学的組成物の投与のための送達ツールまたは装置（例えば、単回使用用）に関する。このような装置は、組成物を送達するためのシリンジまたはマイクロニードル装置であってよい。シリンジは、有効量の組成物が予め充填された単回使用シリンジであってよい。マイクロニードル装置は、その内容が全体として本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１０／０１９６４４５号に記載されているような、本明細書に記載される組成物でコーティングされた１つ以上のマイクロニードルを含み得る。
【０１４３】
治療方法
本発明はまた、典型的に神経毒素で治療が行われる病態（例えば、骨格筋病態、平滑筋病態、腺病態、神経筋障害、自律神経障害、疼痛、または審美的／美容的病態）を治療するための方法を含む。このような病態は、熟練した実務者によって判断される望ましくないニューロン活動と関連している。本方法は、望ましくないニューロン活動を軽減するために、哺乳動物の適切な位置に、治療的有効量の本明細書に記載されるＢｏＮＴまたはポリペプチド／キメラ分子（例えば、薬学的組成物として）を投与し、それにより病態を治療するステップを含む。投与は、有効量の組成物を、望ましくない活動を示すニューロンに接触させる経路によるものである。
【０１４４】
本明細書で述べられる方法による治療に関して想定される特定の病態には、非限定的に、痙攣性発声障害、痙性斜頸、喉頭ジストニア、口下顎発声障害、舌ジストニア、頸部ジストニア、上肢局所性ジストニア、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、眼瞼疾患、脳性麻痺、局所性痙縮及び他の発声障害、痙攣性大腸炎、神経因性膀胱（すなわち、神経性排尿筋過活動または特発性過活動膀胱などの尿失禁を伴う全ての疾患）、前立腺癌及び他のがん形態、アニスムス、肢痙縮、チック、振戦、歯ぎしり、裂肛、アカラシア、嚥下障害及び他の筋緊張障害及び筋肉群の不随意運動を特徴とする他の障害、流涙、多汗症、唾液分泌過多、消化管分泌過多、ならびに他の分泌障害、筋痙攣による疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、頭痛、例えば片頭痛など、かゆみ（そう痒）、ざ瘡が含まれる。加えて、本発明は、皮膚科学的または審美的／美容的な病態の治療、例えば、額のしわの軽減、肌のしわの軽減に用いることもできる。本発明はまた、スポーツ傷害の治療に用いることもできる。他の用途としては、流涎症及び多汗症などの障害の治療が挙げられる。加えて、ＢｏＮＴ／Ａに対する中和抗体を発現した患者の治療のための代替毒素として、ＢｏＮＴ／Ｂが必要とされる。
【０１４５】
加えて、ボツリヌスＡ型によって一般的に実施される周知の技術を使用して、改変神経毒素を投与して、他の神経筋障害を治療することができる。例えば、本発明を使用して、疼痛、例えば、頭痛、筋痙攣による疼痛、及び様々な形態の炎症性疼痛を治療することができる。例えば、Ａｏｋｉ米国特許第５，７２１，２１５号及びＡｏｋｉ米国特許第６，１１３，９１５号は、疼痛を治療するためにボツリヌス毒素Ａ型を使用する方法を開示している。これらの２つの特許の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１４６】
自律神経系障害もまた、改変神経毒素によって治療することができる。例えば、腺機能不全は自律神経系障害である。腺機能不全には、多汗及び唾液分泌過多が含まれる。呼吸器機能不全は、自律神経系障害の別の例である。呼吸器機能不全には、慢性閉塞性肺疾患及び喘息が含まれる。Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．は、自律神経系を治療するための方法；例えば、天然ボツリヌス毒素を用いた、多汗、唾液分泌過多、喘息などの自律神経系障害の治療を米国特許第５，７６６，６０５に開示している。Ｓａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。一実施形態では、改変神経毒素を用いるが、Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．の方法と実質的に同様の方法を使用して、上記のものなどの自律神経系障害を治療することができる。例えば、鼻腔における粘液分泌を制御する自律神経系のコリン作動性ニューロンを退化させるのに十分な量で、改変神経毒素を哺乳動物の鼻腔に局所適用することができる。
【０１４７】
改変神経毒素によって治療され得る疼痛には、筋緊張もしくは痙攣による疼痛、または筋痙攣を伴わない疼痛が含まれる。例えば、Ｂｉｎｄｅｒは米国特許第５，７１４，４６８号において、血管障害、筋緊張、神経痛、及び神経障害による頭痛を、天然ボツリヌス毒素、例えばボツリヌスＡ型で治療することができることを開示する。Ｂｉｎｄｅｒの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。一実施形態では、改変神経毒素を用いるが、Ｂｉｎｄｅｒの方法と実質的に同様の方法を使用して、頭痛、特に、血管障害、筋緊張、神経痛、及び神経障害による頭痛を治療することができる。筋痙攣による疼痛もまた、改変神経毒素の投与によって治療することができる。例えば、ＷＯ２００６００１６７６（Ｋａｎｇ  Ａｈｎ）は、伏在神経絞扼によって引き起こされる膝関節痛を治療するためのボツリヌス神経毒素を使用する方法を開示しており、ＷＯ２００８０５９１２６（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｆａｖｒｅ  ｅｔ  ａｌ．）は、化学療法によって誘発される疼痛を治療するためのボツリヌス神経毒を使用する方法を開示し、ＷＯ２００８０９０２８７（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｆａｖｒｅ  ｅｔ  ａｌ．）は、抗ＨＩＶ治療によって誘発される疼痛を治療するためのボツリヌス神経毒素を使用する方法を開示し、ＷＯ２００９１３０６００（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｆａｖｒｅ  ｅｔ  ａｌ．）は、糖尿病性神経障害に関連する疼痛を治療するためのボツリヌス神経毒素を使用する方法を開示し、そしてＷＯ２００７１４４４９３（Ｍｉｃｈｅｌ  Ａｕｇｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）は、疼痛を治療するために、オピエート誘導体と組み合わせてボツリヌス神経毒素を使用する方法を開示している。ＷＯ２００６００１６７６、ＷＯ２００８０５９１２６、ＷＯ２００８０９０２８７、ＷＯ２００９１３０６００、ＷＯ２００７１４４４９３の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。さらに、改変神経毒素を哺乳動物に投与して、痙攣などの筋障害に関連しない疼痛を治療することができる。一幅広い実施形態では、痙攣に関連しない疼痛を治療する本発明の方法は、改変神経毒素の中枢投与または末梢投与を含む。
【０１４８】
筋痙攣を伴わない急性または慢性疼痛はまた、哺乳動物の実際のまたは知覚される疼痛部位への改変神経毒素の局所、末梢投与によって緩和することができる。一実施形態では、改変神経毒素が、疼痛部位またはその近傍、例えば傷口またはその近傍に皮下投与される。いくつかの実施形態では、改変神経毒素が、疼痛部位またはその近傍、例えば哺乳動物の挫傷部位またはその近傍に筋肉内投与される。いくつかの実施形態では、関節炎病態による疼痛を治療または緩和するために、改変神経毒素が哺乳動物の関節に直接注射される。また、末梢疼痛部位への改変神経毒素の頻回反復注射または注入も本発明の範囲内である。
【０１４９】
このような方法のための投与経路は、当技術分野で公知であり、熟練した実務者によって、本明細書に記載される方法に容易に適合化される（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （１９９８），Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｆａｕｃｉ  ｅｔ  ａｌ．編，  １４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ出版を参照されたい）。非限定的な例として、神経筋障害の治療は、筋肉または筋肉群に有効量の分子を局所投与するステップを含み得、自律神経障害の治療は、腺（複数可）に有効量の分子を局所投与するステップを含み得、そして疼痛の治療は、疼痛部位に有効量の分子を投与するステップを含み得る。加えて、疼痛の治療は、脊髄に有効量の改変神経毒素を投与するステップを含み得る。
【０１５０】
本明細書に記載の改変Ｂ４  ＨＣは、ヒトにおいてヒトシナプトタグミンＩＩを発現するニューロン及び他の細胞型を標的とするための送達ツールとして利用され得ることもまた想定される。例えば、別の生物活性分子（例えば、治療薬）に共有結合的または非共有結合的に連結し、これにより本明細書に記載されるキメラ分子を形成する改変ＨＣは、その生物活性分子を、ヒトＳｙｔ  Ｉ及び／またはＳｙｔ  ＩＩへの結合によって、ヒトにおいてヒトシナプトタグミンＩＩを発現するニューロン及び他の細胞型に送達する標的指向媒体として機能することができる。したがって、本発明の別の態様は、ヒト対象において、生物活性分子をニューロンに送達するための本明細書に記載されるキメラポリペプチド分子の使用に関する。前記分子の第２部分は、治療薬（例えば、ポリペプチドまたは薬物）などの生物活性分子であり得る。前記分子の第１及び第２部分の連結は、共有結合的（例えば、融合タンパク質の形態）または非共有結合的であり得る。そのような連結の方法は、当技術分野で公知であり、熟練した実務者により容易に適用することができる。本明細書に記載されるように、キメラポリペプチド分子は、改変Ｂ−ＨＣが特異的に結合する受容体を発現するニューロン（標的ニューロン）にポリペプチドを接触させる経路によって投与され得る。
【０１５１】
受容体結合活性の同定
本発明の別の態様は、改変ＢｏＮＴ受容体結合ドメインの、受容体（例えば、ヒトＳｙｔ  ＩまたはヒトＳｙｔ  ＩＩまたはヒトＳＶ２）へのその結合能を同定する方法に関する。該方法は、ツーハイブリッドシステムを使用し、ツーハイブリッドアッセイ（例えば、活性化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを利用するＧａｌ  ４転写活性化システム）に使用される各「釣り餌」及び「餌食」サブユニットにそれぞれ融合された受容体及び改変ＨＣから作製された融合タンパク質（融合タンパク質として表される）を使用する。このツーハイブリッドアッセイは、典型的に酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で実施されるが、類似のアッセイシステムが、他の単細胞生物、例えばＥ．Ｃｏｌｉにおいても使用されるために開発されている。これらのシステムは、同等である。一実施形態では、細菌性アデニル酸シクラーゼのツーハイブリッドアッセイが使用される（Ｋａｒｉｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  Ｍａｙ  １２，  １９９８；９５（１０）：  ５７５２−５７５６、この内容は参照により本明細書に組み入れられる）。このシステムは、釣り餌及び餌食としてＴ１８及びＴ２５を使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＴＨ１０１細胞を利用することができる。
【０１５２】
改変ＨＣは、ツーハイブリッドアッセイのＥ．ＣｏｌｉでのＴ１８との融合タンパク質（第１融合タンパク質と称される）として発現する。この方法では、受容体（またはｈ−Ｓｙｔ  ＩＩアミノ酸１〜８７などのその結合断片）は、ツーハイブリッドアッセイのＥ．ＣｏｌｉでのＴ２５との融合タンパク質（第２融合タンパク質と称される）として共発現する。このアッセイは、それらの各融合体を介した各分子間の相互作用の陽性インジケーターを利用する。１つの可能性ある陽性インジケーターは発色である。第１及び第２の融合タンパク質の両方を発現するクローンＥ．Ｃｏｌｉコロニーを、適切な選択培地及び報告培地（例えば、アンピシリン、カナマイシン、Ｘ−ｇａｌ、及びＩＰＴＧ）を含有する固体培地上で、陽性コロニーから陽性インジケーションの発生（例えば、色の発生）を可能にする任意の時間、成長させた。受容体断片への改変結合ドメインの結合は、陽性インジケーションをもたらし得る（例えば、ＬａｃＺ遺伝子の発現により、Ｘ−ｇａｌプレート上で成長したコロニーにおいて青色が発生する）。
【０１５３】
コロニーは、適切な対照（陽性及び陰性）と比較して、そのような陽性インジケーション（例えば発色）について分析される。分析は、目視、またはノンヒューマン（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ）の機械によるものであり得る。検知できるほどの陽性インジケーション（例えば、ＬａｃＺ発現）を生じさせることができない適切な陰性対照（例えば、融合なしで発現される釣り餌及び餌食を有するなどのアッセイシステムの重要な構成要素を欠くクローンコロニー）が使用される。適切で強力な陽性対照もまた使用することができる。アッセイにおけるヒトＳｙｔ  ＩＩ受容体に対する強力な陽性対照の一例は、Ｅ１１９１（Ｍ／Ｃ／ＶまたはＱ）での置換変異を有するＢ１−ＨＣである。弱い陽性対照もまた、結合の強度を同定するために使用され得る。アッセイにおけるヒトＳｙｔ  ＩＩ受容体に対する弱い陽性対照の一例は、Ｗ１１７８（Ｑ／Ｙ／ＡまたはＳ）での置換変異を有するＢ１−ＨＣである。陽性インジケーション（例えば、発色）の同定により、改変ＨＣが受容体に結合することが示される。強力な発色（例えば、弱い陽性対照を超える）などの強力な陽性インジケーションの同定により、ＨＣが受容体に高親和性で結合することが示される。
【０１５４】
アッセイに使用される改変ＨＣは、本明細書に開示されるいずれかの改変ＨＣであり得る。非限定的な例として、改変ＨＣは、本明細書中に開示されるものなどの１、２または３つの置換変異を含み得る。改変ＨＣは、本明細書中に開示される任意の血清型／株またはサブタイプのものであり得る。
【０１５５】
本明細書及び以下の実施例に記載される実施形態は、例示目的のためだけであり、当業者に明らかな様々な改変または変更が本発明の範囲内に含まれる。
【０１５６】
本明細書で特に定義されない限り、本出願に関連して使用される科学用語及び専門用語は、当業者によって一般に理解される意味をもたなければならない。さらに、文脈により特に要求されない限り、単数の用語は、複数を含み、複数の用語は、単数を含むものとする。
【０１５７】
本発明は、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコール、及び試薬などに限定されず、したがって変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、これは特許請求の範囲によってのみ定義される。
【０１５８】
操作例以外において、または別段の指示のない場合、本明細書において用いられる成分の量または反応条件を表す数字は全て、あらゆる場合において「約」という用語で修飾されると理解されるべきである。本発明を説明するために、パーセント値と共に用いられる場合の「約」という用語は、±１％を意味する。
【０１５９】
一態様では、本発明は、本発明にとって必須である本明細書中に記載される組成物、方法、及びそのそれぞれの構成要素（複数可）に関するが、必須であるか否かにかかわらず、指定されていない要素の包含も受け入れる（「含む」）。いくつかの実施形態では、組成物、方法、またはそのそれぞれの構成要素の説明に含まれる他の要素は、本発明の基本的かつ新規の特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさないものに限定される（「本質的に〜からなる」）。このことは、記載される方法内のステップならびに組成物及びその中の構成要素にも同様にあてはまる。他の実施形態では、本明細書に記載される発明、組成物、方法、及びそのそれぞれの構成要素は、その構成要素、組成物、または方法にとって必須の要素であると見なされない任意の要素を排除することが意図される（「からなる」）。
【０１６０】
関連付けられた特許、特許出願、及び出版物は全て、例えば、本発明に関連して使用され得るそのような出版物中に記載された方法論を説明及び開示する目的で、参照により本明細書に明確に組み入れられる。これらの出版物は、単に本出願の出願日よりも前に開示されたものが提供されているに過ぎない。この点に関するいかなるものも、先行発明または任意の他の理由によって、かかる開示に先行する権利が本発明者らに与えられないことを承認するものとして解釈されるべきではない。日付に関する全ての記載またはこれらの文書の内容に関する表現は、本出願に利用可能な情報に基づいており、日付またはこれらの文書の内容の正確性に関して認めるものではない。
【０１６１】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらはさらなる限定として解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１６２】
実施例１  ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへのＢｏＮＴ／Ｂの結合を増強する単一変異の同定
ラットＳｙｔ  ＩＩに結合したＢｏＮＴ／Ｂの共結晶構造が解明されている（１９，２０）。これにより、突然変異誘発の研究のための、ＢｏＮＴ／Ｂ−Ｓｙｔ  ＩＩ界面における合計１９種類の残基に関する安定した基礎が提供された（図２Ａ、表５）。本発明者らの戦略は、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへの結合を向上させる全ての単一残基の変異を同定することを目的として、これら１９の位置のそれぞれを２０個全ての可能性のあるアミノ酸で飽和させることであった。そのために、本発明者らは、細菌性アデニル酸シクラーゼツーハイブリッドアプローチ（ＢＡＣＴＨ）を利用した（＊＊３３）。要約すると、ＢｏＮＴ／ＢのＨＣ（ＨＣＢ）を、細菌性アデニル酸シクラーゼの分割断片（Ｔ１８と呼ぶ）を有するベクターへとサブクローニングした。Ｔ１８−ＨＣＢ融合構築物を、選択した位置にランダムトリヌクレオチド（ＮＮＮ）を含むプライマーを用いてＰＣＲによって増幅し、選択した部位に２０個全ての可能性のあるアミノ酸をコードする構築物のプールを作製した（図２Ｂ）。次いで、この構築物のプールを、分割された細菌性アデニル酸シクラーゼの残り半分（Ｔ２５と呼ぶ）と融合した毒素結合部位を含むｈ−Ｓｙｔ  ＩＩの断片（残基１−８７）を構成的に発現する構築物と共に、細菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ株ＢＴＨ１０１）に同時形質転換した。ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへのＨＣＢの結合により、Ｔ１８及びＴ２５が一緒になり、アデニル酸シクラーゼの活性が回復し、これによりｌａｃＺ遺伝子の発現につながり、Ｘ−Ｇａｌプレート上に青いコロニーがもたらされる（図２Ｂ）。
【０１６３】
４箇所で青いコロニーＥ１１９１が確認された（総コロニー数の２２．７％）、Ｗ１１１７８（７．８％）、Ｙ１１８３（４．０％）、及びＳ１１９９（５．１％）（表６）。これらの青いコロニーからプラスミドを抽出し配列決定し、これにより、各部位での変異Ｅ１１９１Ｍ／Ｃ／Ｖ／Ｑ／Ｌ／Ｙ、Ｙ１１８３／Ｃ／Ｐ、Ｓ１１９９Ｗ／Ｅ／Ｙ／Ｈ、Ｗ１１７８Ｙ／Ｑ／Ａ／Ｓを明らかにした（図２Ｃ）。これらの変異は、再構成されたアデニル酸シクラーゼ活性を反映する細菌中のβ−ガラクトシダーゼのレベルを測定することによってさらに確認された。Ｅ１１９１部位での４つの変異、Ｅ１１９１Ｍ／Ｃ／Ｖ／Ｑが、全変異の中で最も強いβ−ガラクトシダーゼ活性を示した（図２Ｄ）。本発明者らは、さらにプルダウンアッセイを用いてＥ１１９１での変異を調べた。ＧＳＴタグ付き野生型（ＷＴ）マウスＳｙｔ  ＩＩ断片（ｍ−Ｓｙｔ  ＩＩ、残基１−８７）を陽性対照として使用した。ヒトＳｙｔ  ＩＩ断片は、マウスＳｙｔ  ＩＩ（１−８７）中のＦ５４をＬに変異させることにより作製され、それによりヒト配列（ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩと呼ぶ）を模倣する。ＧＳＴタグ付きＳｙｔ  ＩＩ断片をビーズ上に固定化し、そしてＨＣＢをプルダウンするために使用した。イムノブロット分析により、融合ＨＡタグを介して、結合ＨＣＢを検出した。Ｅ１１９１Ｍ／Ｃ／Ｖ／Ｑは、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへの有意なレベルの結合をもたらした（図２Ｅ）。Ｅ１１９１における他の変異は、他の部位と同様に、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへの有意な結合をもたらさなかった（図１８）。図１８にて既に示されたものが確認されるが、図２１はまた、他の変異がｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへの有意な結合をもたらさなかったことを示す。まとめると、これらのデータは、Ｅ１１９１Ｍ／Ｃ／Ｖ／Ｑ変異を含むＨＣＢが、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩに結合する改善した能力を獲得したことを証明する。
【０１６４】
実施例２  ＨＣＢにおける組み合わせ変異は、そのｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへの結合をさらに増強した
次に、本発明者らは、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへのＨＣＢ（Ｅ１１９１Ｍ／Ｃ／Ｖ／Ｑ）の結合が、異なる位置に二次変異を含むことによってさらに増強され得るかどうかを調べた。Ｅ１１９１Ｍを、１１８３、１１９９、及び１１７８部位でのＢＡＣＴＨスクリーニングにおいて同定された残基の変化と組み合わせることによって、二重変異を発生させた（図２Ｃ）。これらの１０個の二重変異体を、プルダウンアッセイにおいて、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩに結合するそれらの能力について分析した（図３Ａ）。それらのうちの３つ、Ｅ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｗ、Ｅ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｙ、及びＥ１１９１Ｍ／Ｗ１１７８Ｑは、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへの強固な結合を示したが、Ｅ１１９１ＭをＹ１１８３Ｃ／Ｐと組み合わせると、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへの結合が減少した（図３Ａ）。Ｅ１１９１が空間的にＹ１１８３に近いことを考慮すると（図２Ａ）、このことからＥ１１９１及びＹ１１８３の両方を変異させる際の潜在的な構造的対立が示唆される。
【０１６５】
次に、一次変異Ｅ１１９１Ｍ／Ｃ／Ｖ／Ｑと適合する二次変異Ｓ１１９９Ｗ／Ｙ及びＷ１１７８Ｑ、ならびに三重変異Ｅ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｗ／Ｗ１１７８Ｑの１２個全ての組み合わせを本発明者らは発生させた。ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩに対する１２個全ての変異体の結合親和性（ＫＤ）を、表４に列挙されたパラメーター、及び図１９に示された代表的なトレースを用いて、バイオレイヤー干渉アッセイ（ＢＬＩ）を使用して測定した。要約すると、ＧＳＴタグ付きＳｙｔフラグメントをプローブ上に固定化し、次いでこれを異なる濃度の精製ＨＣＢに暴露し（会合段階、図３Ｂ）、続いて洗浄ステップ（解離段階、図３Ｂ）を行った。ｍ−Ｓｙｔ  ＩＩへのＷＴ  ＨＣＢの結合は、陽性対照として機能し、０．１３μＭのＫＤを示した（表４）。ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへのＷＴ  ＨＣＢの結合は、検出限界を超えて確実に測定されることができないほど弱く、推定ＫＤ＞２０μＭであった（図３Ｂ、表４）。Ｅ１１９１Ｍ変異体は、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩに対して６．７μＭの結合ＫＤをもたらした。大部分の二重変異体は、結合親和性をさらに改善し、ＫＤ値は０．５９μＭから４．３μＭの間であった（図１９、表４）。上位２つの二重変異体Ｅ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｙ（ＫＤ＝０．７２μＭ）及びＥ１１９１Ｖ／Ｓ１１９９Ｙ（ＫＤ＝０．５９μＭ）は、Ｅ１１９１Ｍ変異体よりも桁違いの親和性をもたらした（図３Ｂ、表４）。Ｅ１１９１Ｑ／Ｗ１１７８Ｑ二重変異体は、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩに唯一結合しなかった。三重変異Ｅ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｗ／Ｗ１１７８Ｑは、二重変異体Ｅ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｗと同様の結合親和性を示し、第３の変異部位を追加してもさらなる改善がもたらされなかったことを示している（表４）。
【０１６６】
実施例３  ＨＣＢ変異体は、ｈ−Ｓｙｔ  Ｉへの増強された結合を示した
次に、ＨＣＢ変異体が依然としてｈ−Ｓｙｔ  Ｉに結合するかどうかを調べた。図２４は、本明細書に記載のＢｏＮＴ／Ｂ結合界面におけるＳｙｔ  ＩとＳｙｔ  ＩＩ間、及びヒトＳｙｔ  ＩとマウスＳｙｔ  Ｉ間の比較を示す。Ｓｙｔ  ＩへのＷＴ  ＨＣＢの結合は、プルダウンアッセイにおいて共受容体ガングリオシドの存在下でのみ検出することができる。これは、Ｓｙｔ  Ｉが、Ｓｙｔ  ＩＩと比較して、ＢｏＮＴ／Ｂに対して低い結合親和性を示すためである（１５，２８）。本発明者らは、プルダウンアッセイにおいて、ガングリオシドの非存在下で、Ｅ１１９１Ｍ及びＥ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｙ変異体の両方がｈ−Ｓｙｔ  Ｉに結合することを見出し（図３Ｃ）、このことから、これらの変異体がｈ−Ｓｙｔ  Ｉへの増強した結合を有し得ることが示唆される。本発明者らは、ＢＬＩアッセイを用いて、本発明者らの上位２つの変異体（Ｅ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｙ及びＥ１１９１Ｖ／Ｓ１１９９Ｙ）のｈ−Ｓｙｔ  Ｉへの結合親和性を測定した。Ｅ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｙ（ＨＣＢＭＹ）またはＥ１１９１Ｖ／Ｓ１１９９Ｙ（ＨＣＢＶＹ）を含有するＨＣＢは、それぞれ２．９μＭ及び５．８２μＭのＫＤを示した。ｈ−Ｓｙｔ  ＩへのＷＴ  ＨＣＢの結合が確実に測定することができないほど弱いことが確認されるが（表４、図２０）、ＨＣＢ変異体は、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへの結合を増強するだけでなく、ｈ−Ｓｙｔ  Ｉへの結合も増強した。ＨＣＢＭＹは、ＨＣＢＶＹと比較して、ｈ−Ｓｙｔ  Ｉに対してより高い結合親和性を示し、かつＳｙｔ  Ｉ及びＳｙｔ  ＩＩの両方に対しては、より低い解離定数を示したため、本発明者らは、さらに特性解析するために、この変異体を選択した。
【０１６７】
実施例４  ＨＣＢＭＹは、ニューロン表面のｈ−Ｓｙｔ  ＩＩに結合する
次に、ＨＣＢＭＹ変異体が生理学的に関連のあるニューロン表面上のｈ−Ｓｙｔ  ＩＩに結合し得るかどうかを調べた。この目的のために、Ｓｙｔ  Ｉを発現するがＳｙｔ  ＩＩを発現しない培養ラット皮質ニューロンを使用した（１３）。これにより、Ｓｙｔ  Ｉのノックダウン（ＫＤ）により、内在性受容体のないニューロンを生成した。これらのＳｙｔ  Ｉ  ＫＤニューロンにおける完全長ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩの発現により、毒素受容体としてｈ−Ｓｙｔ  ＩＩのみを有する「ヒト化」ニューロンが作製された（１８）。予想通り、ＷＴ  ＨＣＢはラットニューロンに強く結合し、その結合は内在性Ｓｙｔ  Ｉをノックダウンした後に消失した。ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩでもＦ５４Ｌ変異を含むｍ−Ｓｙｔ  ＩＩでもなく、完全長ｍ−Ｓｙｔ  ＩＩの発現は、ＷＴ  ＨＣＢの結合を回復させた（図４Ａ）。対照的に、ＨＣＢＭＹは、ｍ−Ｓｙｔ  ＩＩ、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩ、またはｍ−Ｓｙｔ  ＩＩ（Ｆ５４Ｌ）を発現するニューロンへの強固な結合を示し、ＨＣＢＭＹがニューロン表面上のｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへの増強した結合能を有することを示した（図４Ｂ）。
【０１６８】
実施例５  ＢｏＮＴ／Ｂ変異体は、ヒト化ニューロンにおける神経伝達を遮断するための増強した有効性を示した
ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへの増強した結合が、ニューロンの機能レベルにおいて有効性につながるかどうかという重要な問題に取り組むために、完全長ＷＴ  ＢｏＮＴ／Ｂ及びＥ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｙ二重変異毒素（ＢｏＮＴ／ＢＭＹ）を、Ｅ．Ｃｏｌｉで組換え産生した（図２３）。ヒト化ニューロンを、ＷＴまたはＢｏＮＴ／ＢＭＹ毒素の勾配に暴露した。ＶＡＭＰ２の切断をイムノブロット分析によって調べた。図５Ａに示すように、試験した各毒素濃度において、ＷＴ  ＢｏＮＴ／Ｂに暴露したニューロンと比較して、ＢｏＮＴ／ＢＭＹに暴露したニューロンにおいて、より多くのＶＡＭＰ２が切断された。このことは、ＢｏＮＴ／ＢＭＹが、ＷＴ毒素よりも効率的にニューロンを標的指向し、侵入したことを示す。
【０１６９】
次に、全細胞パッチクランプ記録法を用いて、微小抑制性シナプス後電流（ｍＩＰＳＣ）を記録することによって、神経伝達物質放出をモニターした。ｍＩＰＳＣの周波数は、ニューロン集団における神経伝達物質放出の活性を反映する。シナプス前終末へのＢｏＮＴ／Ｂの侵入は、神経伝達物質の放出を遮断し、これによりｍＩＰＳＣの周波数を減少させる（図５Ｂ）。ヒト化ニューロンを、ＷＴ  ＢｏＮＴ／ＢまたはＢｏＮＴ／ＢＭＹの勾配に暴露した。図５Ｃに示すように、ＢｏＮＴ／ＢＭＹは、ＷＴ毒素よりも約１１倍低い半数阻害濃度（ＩＣ５０）で、非常に増強された効力を示した。これらのデータは、ヒト受容体への増強した結合が、ニューロンの機能レベルにおいて毒素の有効性を増大させることを証明した。
【０１７０】
実施例６  ＢｏＮＴ／Ｂ４サブタイプはＱ１１９１／Ｙ１１９９を含むが、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩには結合しない
最後に、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへの結合に影響を与え得るＢｏＮＴ／Ｂサブタイプに天然に存在する配列変化が存在するかどうかを調べた。ＢｏＮＴ／Ｂは、今日までに知られている８つのサブタイプ（ＢｏＮＴ／Ｂ１〜Ｂ８、ＢｏＮＴ／Ｂ１はＢｏＮＴ／Ｂプロトタイプとして知られる）を有し、７％までの配列変化を有する（３４）。配列アラインメントにより、Ｅ１１９１及びＳ１１９９の両方における変化が明らかとなった（図６Ａ）。興味深いことに、Ｅ１１９１Ｑ（ＢｏＮＴ／Ｂ４、／Ｂ８）及びＳ１１９９Ｙ（ＢｏＮＴ／Ｂ２、／Ｂ３、／Ｂ４、／Ｂ７）のケースがあった。Ｂ４においてはＥ１１９１Ｑ及びＳ１１９９Ｙの組み合わせ（ＢｏＮＴ／Ｂ１におけるその二重変異体は、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへの強固な結合をもたらした（表４））もある。しかしながら、ＨＣＢ４は、プルダウンアッセイにおいてｈ−Ｓｙｔ  ＩＩに結合しなかった（図６Ｂ）。これは、ＢｏＮＴ／Ｂ１からＨＣＢ４の他の残基が変化していることに起因すると考えられる。ＢｏＮＴ／Ｂ−Ｓｙｔ界面における１９個の重要な残基の中には、ＢｏＮＴ／Ｂ１とＢ４との間で異なる４つの他の残基がある（図７）。実際、ＨＣＢ４中の４つの残基全てをＢｏＮＴ／Ｂ１中の対応する残基に置換すると、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへのその結合が向上した（図６Ｃ）。図６Ｃにて既に示されたものが確認されるが、図２２はまた、ＨＣＢ４の４つの残基全てをＢｏＮＴ／Ｂ１中の対応する残基と置換することにより、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへと結合できる変異体ＨＣＢ４が作製されたことを示す。興味深いことに、ガングリオシドの非存在下で、ＨＣＢ４はｈ−Ｓｙｔ  Ｉに対して強固な結合を示し、このことは、このサブタイプがＢｏＮＴ／Ｂ１よりもＳｙｔ  Ｉに対して優れた結合親和性を有することを示唆している（図６Ｄ）。
【０１７１】
検討
ＢｏＮＴ／Ｂ−Ｓｙｔ  ＩＩ複合体の利用可能な共結晶構造に基づく合理的設計を、選択された各標的残基において起こり得る全ての単一点変異を飽和させるＢＡＣＴＨ法と組み合わせることによって、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへの結合を改善するＢｏＮＴ／Ｂ１における一連の点変異が同定された。これらの点変異は、異なる組み合わせでさらに調べられ、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩに対して高親和性を示した二重変異体を明らかにした。さらに、これらの変異のうちの２つを含む完全長ＢｏＮＴ／Ｂ１は、ヒト化ニューロンに対してＷＴ  ＢｏＮＴ／Ｂ１よりも約１１倍高い効力を示し、毒素受容体への増強された結合が、ニューロンの機能レベルにおいてより高い効力につながることを示した。
【０１７２】
ＢｏＮＴ／Ｂ１の残基Ｅ１１９１は、ｈ−Ｓｙｔ  Ｉ及びｈ−Ｓｙｔ  ＩＩの両方に結合するための重要な位置であることがわかった。この残基は、ＢｏＮＴ／Ｂ・Ｓｙｔ  ＩＩ界面の周辺部に位置し、そこでは、Ｍ／Ｃ／Ｖ／Ｑを配置することによって、これらの残基がＳｙｔ  ＩＩと新たな／追加の結合を形成し得、加えて潜在的に好ましくない負電荷を除去し、これにより全体的な結合親和性を高め得る。ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩに加えて、Ｅ１１９１Ｍ変異はまた、Ｓｙｔ  Ｉへの結合親和性を増加させた。Ｅ１１９１ＬがＳｙｔ  ＩへのＢｏＮＴ／Ｂの結合を向上させることは、既に示されている（３５）。さらに、Ｅ１１９１をＬまたはＹで置換すると、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへの結合が向上するが、Ｍ／Ｃ／Ｖ／Ｑよりははるかに少ない程度であることも見出された。したがって、これらの結果は、１１９１が、全体的な結合界面を乱すことなく、ＢｏＮＴ／ＢとＳｙｔ  Ｉ／ＩＩとの間の結合親和性を調節するための重要な位置にあることを示唆している。
【０１７３】
ＢＡＣＴＨスクリーニングは、Ｗ１１７８Ｙ／Ｑ／Ａ／Ｓ、Ｙ１１８３Ｃ／Ｐ、及びＳ１１９９Ｗ／Ｅ／Ｙ／Ｈを含む、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへの結合においてほんのわずかな向上をもたらすＢｏＮＴ／Ｂにおける他の変異を同定した。Ｓ１１９９Ｙが、おそらくＳ１１９９ＹとＳｙｔ  ＩＩのＦ４７との間のπスタッキング相互作用の結果として、Ｓｙｔ  ＩＩへのＢｏＮＴ／Ｂの結合を向上させることは既に報告されている（１９）。興味深いことに、ＢｏＮＴ／Ｂサブタイプの配列分析は、いくつかのこれらの部位における残基の変化を明らかにした。例えば、１１９９部位は、Ｓ、Ｙ、またはＨであり得、１１９１部位はＥ、Ｋ、またはＱであり得る。そのような残基の変化は、Ｓｙｔ  ＩまたはＳｙｔ  ＩＩに対する結合親和性を変化させると予想される。例えば、ＢｏＮＴ／Ｂ４は、ＢｏＮＴ／Ｂ１よりもｈ−Ｓｙｔ  Ｉにより強く結合する。これはおそらく、ＢｏＮＴ／Ｂ４が１１９１部位にＱを含み、１１９９部位にＹを含むからである。本発明者らのＢＡＣＴＨスクリーニングで同定されたこれら２つの重要な位置で毒素−受容体相互作用を変化させるそれらの能力について、自然界は残基のレパートリーを既にサンプリングしているように思われる。ますます多くのサブタイプ毒素が明らかになることによって、毒素のＨＣドメインにおいて天然に存在する配列変化によって、毒素−受容体相互作用を調節することができる残基を調査するための豊富な情報源がもたらされる。
【０１７４】
ＢｏＮＴ／ＤＣ及びＢｏＮＴ／Ｇは、ＢｏＮＴ／Ｂと同じＳｙｔ  Ｉ／ＩＩ上の表面残基を認識し、両方ともｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへの結合の低下を示した（１８）。Ｓｙｔ  Ｉ／ＩＩと複合したＢｏＮＴ／ＤＣの共結晶構造は解明されているため（３６）、結合界面で重要な残基を標的指向する類似のアプローチにより、ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへのその親和性を増加させるＢｏＮＴ／ＤＣにおける特定の変異が同定され得る。
【０１７５】
興味深いことに、ヒトのヒトＶＡＭＰ１基質における単一残基の変化（マウスのＭ４８（マウスＶＡＭＰ１配列番号）からヒトのＩ４８へ）のために、ヒトはＢｏＮＴ／Ｄに対して感受性が低いことが知られている。この位置に残基Ｉがあると、ＢｏＮＴ／Ｄは著しく低い切断効率を示した（３７−３９）。ＢｏＮＴ／ＤＣが、ＢｏＮＴ／Ｄと同じプロテアーゼドメインを共有することを考慮すると、ヒトは、その受容体における単一残基の変化、及びその基質における単一残基の変化の両方のために、ＢｏＮＴ／ＤＣに対する感受性が低い。これら２つの変化がランダムな事象であるという可能性を排除することはできないが、ＢｏＮＴが、ヒトの進化における選択圧であった可能性がある（３７）。
【０１７６】
ＢｏＮＴの医学的使用は、猛毒の毒素を有効な治療薬に変換することの注目すべき例である。その医学的用途の急速な拡大に伴い、ＢｏＮＴを操作し、その治療効果を改善し、その有害作用を軽減することへの関心が高まっている（４０−４４）。先行研究では、ＢｏＮＴ／ＡのＨＣをＢｏＮＴ／ＢのＨＣで置換すると、マウス組織において効力を増大したキメラＢｏＮＴ／ＡＢをもたらすことが示されている（４５，４６）。これらの知見は、ＨＣＢを利用して、ヒトにおけるＢｏＮＴ／Ａの効力を潜在的にさらに改善するキメラＢｏＮＴ／ＡＢを作製することができる可能性を示唆している。したがって、本明細書で同定されたＢｏＮＴ／Ｂ変異体は、ヒトにおいて改善された有効性を有する新世代の治療用毒素の開発を可能にする。加えて、そのような改変ＢｏＮＴ／Ｂ及びそのＨＣもまた、ヒトニューロンを標的指向するための貴重な科学的ツール及び送達媒体であり得る。
【０１７７】
材料及び方法
材料及び構築物
以下の抗体は、明記した業者から購入した：Ｓｙｎａｐｓｉｎ  Ｉ（Ｃｌｏｎｅ  ４６．１，Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＶＡＭＰ２（Ｃｌｏｎｅ  ６９．１，Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＨＡ  （１６Ｂ１２，Ｃｏｖａｎｃｅ）、及びβ−ｔｕｂｕｌｉｎ  ＩＩＩ（ａｂ１８２０７，Ａｂｃａｍ）。既に説明されているように、ウシ混合脳ガングリオシドをＭａｔｒｅｙａ  ＬＬＣ（Ｐｌｅａｓａｎｔ  Ｇａｐ，ＰＡ）から購入し、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中に再構成した（１４）。ＨＣＢ（残基８５７−１２９１、Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＣＡ４６９９０．１）及びＨＣＢ４（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＦ０５１５７０）をコードするｃＤＮＡを、Ｅ．Ｃｏｌｉ発現のためにコドン最適化し、そしてＧｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）によって合成した。以下のｃＤＮＡは、明記したグループにより供与された：ラットＳｙｔ  Ｉ（Ｔ．Ｃ．  Ｓｕｄｈｏｆ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）、マウスＳｙｔ  ＩＩ（Ｍ．  Ｆｕｋｕｄａ，  Ｉｂａｒａｋｉ，  Ｊａｐａｎ）、ヒトＳｙｔ  Ｉ（Ｒ．Ｂ．  Ｓｕｔｔｏｎ，  Ｌｕｂｂｏｃｋ，  ＴＸ）。ＨＣＢをコードするＤＮＡを、そのＮ末端にＨｉｓ６タグ（配列番号１）及びＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号２）の両方を融合して、ｐＥＴ２８ａベクターにサブクローニングした。ＨＣＢにおける変異は、部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＣＡ）を用いて、ＰＣＲにより生成した。ＧＳＴタグ付きＳｙｔ  Ｉ／ＩＩ断片及びＳｙｔ  ＩＩ  Ｆ５４Ｌ変異体については、既に説明されている（１５，１８，２３）。
【０１７８】
完全長ＢｏＮＴ／Ｂ及びＢｏＮＴ／ＢＭＹの産生及び活性化
完全長の不活性ＢｏＮＴ／ＢＲ３７０Ａ，Ｙ３７３Ｆ（受託Ｂ１ＩＮＰ５）をコードするｃＤＮＡを、Ｅ．Ｃｏｌｉでの発現のためにコドン最適化した。それをＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩを介してｐＥＴ３２ａへとクローニングし、Ｃ末端にヘキサヒスチジン親和性タグ（配列番号１）を付加した。その構築物を、標準的な部位特異的突然変異誘発（Ａｇｉｌｅｎｔ）により、その活性ＷＴ型に回復させた。Ｅ１１９１Ｍ／Ｓ１１９９Ｙ変異を導入し、ＢｏＮＴ／ＢＭＹ二重変異体を作製した。構築物をＥ．Ｃｏｌｉ（ＢＬ２１  ＤＥ３株）へ形質転換し、ｍＴＢ＋１００μｇ／ｍＬアンピシリン中で増殖させ、そして１ｍＭのＩＰＴＧを用いて１６℃で２０時間誘導した。細菌を回収し、ペレット１グラム当たり、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８中０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ５ｍＬ、及びベンゾナーゼ０．５μＬ中での超音波処理によって溶解した。粗溶解物を４０００×ｇで１時間、遠心分離により清澄化し、ＢｏＮＴ／ＢをＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ）で捕捉し、ＦＰＬＣ（ＧＥ）により５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８中０．５Ｍ  ＮａＣｌ中０．１Ｍイミダゾールで溶出した。溶出液を、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ）を用いて、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８中１２５ｍＭ  ＮａＣｌに脱塩し、次いで１０  ｋＤａ  ＭＷＣＯスピンフィルターを用いて、０．６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。濃縮物を０．１μｇ／ｍＬのエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃにより２時間３７℃で処理し、次いで１Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４に調整した後、ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥ）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーにより最終精製を行った。タンパク質を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８中１Ｍから０Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４のリニアグラジエントにより溶出した。二本鎖ＢｏＮＴ／Ｂを含有する画分をプールし、脱塩し、濃縮し、そして−８０℃で保存した。
【０１７９】
ＢＡＣＴＨ（細菌性アデニル酸シクラーゼツーハイブリッドアッセイ）。
ＢＡＣＴＨアッセイを製造元の指示（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）に従って実施した。２つの適合性のあるプラスミドｐＵＴ１８Ｃ及びｐＫＴ２５をスクリーニングのために選択した。Ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩ内腔ドメイン（残基１−８０）をｐＫＴ２５にクローニングし、ｐＫＴ２５−ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩを作製した。Ｔ１８−ＨＣＢを産生するために、ＨＣＢをｐＵＴ１８Ｃにクローニングした。指定された位置にランダムヌクレオチドトリプレット（ＮＮＮ）を含むプライマーを用いてＨＣＢ変異体ライブラリーを作製した。各ライブラリーをエレクトロポレーションにより、ｐＫＴ２５−ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩプラスミドと共に、Ｅ．Ｃｏｌｉ指示株ＢＴＨ１０１に同時形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ及び４０μｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌを含有するＬＢ寒天プレート上でスクリーニングした。このプレートを３０℃で６４時間インキュベートした。プラスミドを青いコロニーから抽出し、配列決定した。総コロニー数は、選択した変異部位で２０個全てのアミノ酸を網羅する可能性を明らかにした。これは、クラーク−カーボンの式：Ｐ＝１−（１−ｆ）Ｎによって計算され、式中、ｆは、可能性のある残基の数（２０個の異なるアミノ酸があるので、本明細書ではｆ＝１／２０）、Ｎは、コロニーの総数を表す。本発明者らのアッセイにおけるコロニーの最小数３８０個では、各位置における２０個全てのアミノ酸をカバーする確率は＞９９．８％である。
【０１８０】
β−ガラクトシダーゼ活性アッセイ。
このアッセイは、既に説明されているように実施される（４７）。要約すると、目的のプラスミドを有するＥ．Ｃｏｌｉ  ＢＴＨ１０１細胞を、抗生物質及びＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）を含有するＬＢ培地に播種した。この培養物を３７℃で一晩増殖させ、定常期に到達させた。この培養物のＯＤ６００を回収前に記録した。培養物を遠心分離し、細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄し、Ｚ緩衝液（６０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、４０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及び２０ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁した。その後、１：１０（ｖ／ｖ）のクロロホルム及び１：２０（ｖ／ｖ）の０．１％ＳＤＳを添加してよく混合し、細胞を透過処理した。次に、５：１の比で混合物をｏ−ニトロフェニル−ｐ−ガラクトシド（Ｚ緩衝液中４ｍｇ／ｍｌ）と混合し、２８℃で１０分間インキュベートした。１ＭのＮａ２ＣＯ３  ８０μｌを添加することによって反応を停止させた。β−ガラクトシダーゼ活性は、Ａ４２０／ＯＤ６００として産出された。
【０１８１】
ＧＳＴプルダウンアッセイ。
２種類のプルダウンアッセイを実施した。最初のシリーズは、ＧＳＴタグ付きｍ−Ｓｙｔ  ＩＩ（残基１−８７）、及びヒトＳｙｔ  ＩＩ（ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩと呼ばれる）を模倣する変異体ｍ−Ｓｙｔ  ＩＩ（Ｆ５４Ｌ）への変異体ＨＣＢの結合を迅速にスクリーニングするために使用された。要約すると、ＨＣＢを発現する６ｍｌのＥ．Ｃｏｌｉをスピンダウンし、８００μｌのＴＢＳに再懸濁し、超音波処理した後、２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と共に４℃で１時間インキュベートした。次いで、サンプルをマイクロ遠心機中で４℃で１５分間スピンダウンした。上清を回収し、グルタチオン−セファロースビーズ（ＧＥ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）に固定化した１０μｇのＧＳＴ−Ｓｙｔタンパク質と共に４℃で１時間インキュベートすることによってプルダウンアッセイに使用した。サンプルを洗浄緩衝液（０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＴＢＳ）中で３回洗浄し、抗ＨＡ抗体を使用する免疫ブロット分析によって分析した。ｈ−Ｓｙｔ  ＩＩへの増強された結合を示した変異体について、Ｈｉｓ６タグ化タンパク質（配列番号１として開示された「Ｈｉｓ６」）として、これらのＨＣＢ変異体を精製することによって、さらなる特性解析を実施した。次いで、１００μｌのＴＢＳ緩衝液及び０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中の精製ＨＣＢ（１００ｎＭ）及び固定化ＧＳＴ−Ｓｙｔ  ＩＩを用いて、ガングリオシド（６０μｇ／ｍｌ）と共にまたはそれなしで、プルダウンアッセイを４℃で１時間行った。ビーズを、ＴＢＳ緩衝液及び０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて３回洗浄した。結合した材料の１０％をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてイムノブロット分析に供した。
【０１８２】
バイオレイヤー干渉アッセイ
ＨＣＢ変種とＳｙｔ  Ｉ／Ｓｙｔ  ＩＩとの間の結合親和性を、Ｂｌｉｔｚシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いたＢＬＩアッセイにより測定した。要約すると、ＧＳＴタグ付きＳｙｔ  ＩまたはＳｙｔ  ＩＩ（２０μｇ／ｍｌ）を、Ｄｉｐ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ（商標）Ａｎｔｉ−ＧＳＴ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に固定し、ＰＢＳ緩衝液で平衡化した。次いで、該バイオセンサーを一連の濃度のＨＣＢに暴露し、続いてＰＢＳで洗浄した。製造業者の指示（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に従って、Ｂｌｉｔｚシステムソフトウェアを使用して、結合親和性（ＫＤ）を算出した。
【０１８３】
ニューロン培養物、レンチウイルス、及び毒素結合／侵入アッセイ。
ラット皮質ニューロンを、既に説明されているようにＥ１８−１９胚から調製した（１４）。ニューロンにおけるＳｙｔ  Ｉ  ＫＤ、ｍ−Ｓｙｔ  ＩＩ、及びｈ−Ｓｙｔ  ＩＩ発現のための構築物は、既に説明されている（１８）。レンチウイルスをＤＩＶ５（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの日数）のニューロン培養物に添加し、毒素結合／侵入実験をＤＩＶ１２−１４で実施した。毒素を高Ｋ＋緩衝液（８７ｍＭ  ＮａＣｌ、５６ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び１ｍＭ  ＣａＣｌ）で希釈し、３７℃に予熱した。ニューロンを上記の毒素含有緩衝液に３７℃で５分間暴露した後、ＰＢＳで洗浄した。これらのニューロンを、免疫染色分析に供するか、または毒素不含培地中でさらに２４時間インキュベートした後にイムノブロット分析を行った。
【０１８４】
ｍＩＰＳＣ記録
全細胞パッチクランプ記録を、ＤＩＶ  １４−１８培養皮質ニューロン（ＤＩＶ  １４−１８）から作成した。ピペット溶液は以下のものを含んだ（ｍＭ）：１３５  ＣｓＣｌ、１０  ＨＥＰＥＳ、１  ＥＧＴＡ、１  Ｎａ−ＧＴＰ、４  Ｍｇ−ＡＴＰ、及び１０  ＱＸ−３１４（ＣｓＯＨでｐＨ  ７．４に調整）。細胞内液が充填されたピペットの抵抗は、４〜５ＭΩの間で変動した。全細胞構成の形成及びピペットの細胞内液の平衡化後、直列抵抗を１０ＭΩに調整した。シナプス電流を、−７０ｍＶの保持電位でＥＰＣ−１０／２増幅器（ＨＥＫＡ）を用いてモニターした。バスの溶液は以下のものを含んだ（ｍＭ）：１４０  ＮａＣｌ、５  ＫＣｌ、２  ＣａＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、１０  ＨＥＰＥＳ、１０  グルコース（ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）。自発性抑制性シナプス後電流（ｓＩＰＳＣ）及び誘発性抑制性シナプス後電流（ｅＩＰＳＣ）は、ＡＭＰＡ及びＮＭＤＡ受容体遮断薬ＣＮＱＸ及びＡＰＶをバスの細胞外液に添加することによって、薬理学的に抑制された。活動電位を遮断するために、テトロドトキシン（ＴＴＸ）の存在下で自発的な微小抑制性シナプス後電流（ｍＩＰＳＣ）をモニターした。Ｃｌａｍｐｆｉｔ  １０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、Ｏｒｉｇｉｎ８ソフトウェア（Ｍｏｃｒｏｃａｌ  Ｉｎｃ．）、ＭｉｎｉＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ）、及びＩｇｏｒ（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ）を使用してデータを分析した。統計分析は、スチューデントのｔ検定で行った（＊Ｐ＜０．０１）。示されているデータは全て、平均値±標準誤差である。
【０１８５】
参考文献
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【０１８６】
（表４）ＢＬＩによって測定されたＧＳＴ−Ｓｙｔ  ＩＩ／Ｓｙｔ  ＩとＨＣＢ変種の間の相互作用。
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【０１８７】
（表５）Ｓｙｔ  ＩＩと複合したＢｏＮＴ／Ｂの利用可能な共結晶構造に基づいて選択された、Ｓｙｔ  Ｉ／ＩＩに対する結合ポケットを形成するＢｏＮＴ／Ｂ中の１９個の重要な残基のリスト（１９，２０）。
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【０１８８】
（表６）ＢＡＣＴＨスクリーニング後の各突然変異誘発部位におけるコロニー数の要約。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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