(57)【要約】本発明は、細胞外小胞またはオルガネラから膜小胞を作製するための方法、およびそのような方法によって作製される治療用膜小胞に関する。本発明はさらに、治療用膜小胞、そのような小胞を用いることにより代謝障害を処置する方法、および代謝障害の処置などの治療で使用するためのそのような小胞に関する。本発明はさらに、オルガネラから膜小胞を作製する方法に関する。加えて、本発明は、細胞外小胞バルクから細胞外小胞の亜集団を分離する方法に関する。2019513019.tif 000003
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
a. 細胞外小胞またはオルガネラを提供する工程；
b. 9から14の範囲のpHを有する水溶液での処理によって該細胞外小胞または該オルガネラを開口させ、膜を得る工程；
c. 小胞内内容物またはオルガネラ内容物を取り除く工程；および
d. 該膜を再構成し、膜小胞を形成する工程
を含む、膜小胞を作製するための方法。
【請求項２】
工程dが、超音波処理、機械的振動、多孔質膜を通しての押し出し、電流、およびそれらの組み合わせの1つまたは複数によって行われる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
e.前記膜小胞内にカーゴを搭載する工程
をさらに含み、
工程eを工程dと同時にまたはその後に実施することができる、
請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
工程eが工程dの後に物理的操作によって行われ、該物理的操作が、エレクトロポレーション、超音波処理、機械的振動、多孔質膜を通しての押し出し、電流の印加、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記カーゴが、合成生理活性化合物、天然生理活性化合物、抗菌化合物、抗ウイルス化合物、タンパク質、ヌクレオチド、ゲノム編集システム、マイクロRNA、siRNA、長鎖非コードRNA、アンタゴ-miR、モルホリノ、mRNA、t-RNA、y-RNA、RNA模倣体、DNA、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項3または4記載の方法。
【請求項６】
前記カーゴがTGFβである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記ゲノム編集システムがCRISPRシステムである、請求項5記載の方法。
【請求項８】
前記CRISPRシステムがCRISPR-Cas9システムである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記マイクロRNAまたは前記siRNAが、変異したがん遺伝子または未変異のがん遺伝子をコードする転写物に特異的に結合する、請求項5記載の方法。
【請求項１０】
前記がん遺伝子が、KRAS G12D、KRAS G12C、KRASG12V、N-Myc、c-Myc、またはL-Mycである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
前記膜小胞が、該膜小胞が由来する細胞外小胞またはオルガネラの集団と異なる少なくとも1つの生理学的特性を有し、該生理学的特性が、生体内分布、細胞取り込み、半減期、薬物力学、効力、用量、免疫反応、搭載効率、安定性、または他の化合物との反応性の1つまたは複数に関連する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記異なる生理学的特性が、改善された標的指向性効率、改善された送達、またはレシピエント細胞、器官、もしくは対象への治療用カーゴの増大である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記カーゴが、前記膜小胞が由来する細胞外小胞またはオルガネラ内へ該カーゴが搭載される場合より効率的に該膜小胞内に搭載される、請求項3〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞外小胞が、細胞外小胞バルクに由来する細胞外小胞の亜集団であるか、または前記オルガネラが、複数のオルガネラに由来するオルガネラの1つのサブタイプである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
エピトープ特異的結合体を前記細胞外小胞バルクまたは前記オルガネラと接触させる工程；および
該細胞外小胞バルクまたは複数のオルガネラから、前記細胞外小胞の亜集団またはオルガネラのサブタイプを分離する工程
を、工程aの前にさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
前記エピトープ特異的結合体が、抗体、ファージ、またはアプタマーである、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記エピトープ特異的結合体が、少なくとも1つのミトコンドリア膜タンパク質、好ましくはMTCO2タンパク質に対する抗体である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記エピトープ特異的結合体が表面マーカーCD63に対する抗体である、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
細胞外小胞またはオルガネラに由来する膜から形成された小胞
を含む、治療用膜小胞。
【請求項２０】
治療用カーゴを搭載する、請求項19記載の治療用膜小胞。
【請求項２１】
前記治療用カーゴが、合成生理活性化合物、天然生理活性化合物、抗菌化合物、抗ウイルス化合物、タンパク質、ヌクレオチド、ゲノム編集システム、マイクロRNA、siRNA、長鎖非コードRNA、アンタゴ-miR、モルホリノ、mRNA、t-RNA、y-RNA、RNA模倣体、DNA、およびそれらの組み合わせから選択される1つまたは複数の治療用化合物を含む、請求項20記載の治療用膜小胞。
【請求項２２】
前記治療用カーゴが、ATPの産生を触媒する酵素を含む、請求項20または21記載の治療用膜小胞。
【請求項２３】
前記酵素がATP合成酵素である、請求項22記載の治療用膜小胞。
【請求項２４】
前記治療用カーゴが、間葉系幹細胞の遊走または抗炎症性機能を増大させるなど、間葉系幹細胞の表現型および/または機能に影響を与える能力を伴う化合物を含む、請求項20または21記載の治療用膜小胞。
【請求項２５】
前記治療用カーゴが、抗炎症性機能に関連する化合物または炎症促進性機能に関連する化合物を含む、請求項20または21記載の治療用膜小胞。
【請求項２６】
前記治療用カーゴがTGFβである、請求項24または25記載の治療用膜小胞。
【請求項２７】
前記治療用カーゴがゲノム編集システムを含む、請求項20または21記載の治療用膜小胞。
【請求項２８】
ゲノム編集システムがCRISPRシステムである、請求項27記載の治療用膜小胞。
【請求項２９】
CRISPRシステムがCRISPR-Cas9システムである、請求項28記載の治療用膜小胞。
【請求項３０】
前記カーゴが、前記膜小胞が由来する細胞外小胞またはオルガネラ内へ該カーゴが搭載される場合より効率的に該膜小胞内に搭載される、請求項20〜29のいずれか一項記載の治療用膜小胞。
【請求項３１】
前記細胞外小胞が、細胞外小胞バルクとは異なる膜および表面分子のサブセットを有する細胞外小胞バルクの亜集団であるか、または前記オルガネラが、オルガネラバルクとは異なる膜および表面分子のサブセットを有するオルガネラバルクの1つのサブタイプである、請求項19〜30のいずれか一項記載の治療用膜小胞。
【請求項３２】
前記膜小胞が、以下の少なくとも1つによって特徴付けられる、請求項31記載の治療用膜小胞：
i. 表面膜分子が反転している；
ii. 間葉系幹細胞の抗炎症性機能が増大するように間葉系幹細胞の表現型および機能に影響を与える能力を伴う、少なくとも1種類の表面分子；
iii. 細胞外小胞に共通する少なくとも1種類の表面マーカーが存在するかまたは存在しないかのいずれか；
iv. 少なくとも1種類のミトコンドリア膜表面分子が存在する；
v. 少なくとも1種類の核膜表面分子が存在する；ならびに
vi.ゴルジおよび/または小胞体由来の少なくとも1種類の膜分子が存在する。
【請求項３３】
組織を通って遊走する能力を有する、請求項19〜32のいずれか一項記載の治療用膜小胞。
【請求項３４】
前記膜小胞が由来する細胞外小胞またはオルガネラと比較して、増大した運動性を有する、請求項19〜33のいずれか一項記載の治療用膜小胞。
【請求項３５】
前記細胞外小胞またはオルガネラが、がん細胞、がん細胞株、炎症細胞、構造細胞、神経/グリア細胞/オリゴデンドロサイト、または間葉系/胚性幹細胞に起源をもつ、請求項19〜34のいずれか一項記載の治療用膜小胞。
【請求項３６】
前記細胞外小胞またはオルガネラが、腫瘍；骨髄；または血液、リンパ節、もしくは脾臓から単離された免疫細胞を含む、正常組織または病変組織から単離されている、請求項19〜35のいずれか一項記載の治療用膜小胞。
【請求項３７】
請求項1〜18のいずれか一項に定義された方法によって得ることができる、請求項19〜36のいずれか一項記載の治療用膜小胞。
【請求項３８】
治療で使用するための、請求項19〜37のいずれか一項記載の治療用膜小胞。
【請求項３９】
代謝障害の処置で使用するための、請求項19〜38のいずれか一項記載の治療用膜小胞。
【請求項４０】
請求項19〜39のいずれか一項記載の治療用膜小胞をその必要がある患者に投与する工程を含む、代謝障害を処置する方法。
【請求項４１】
前記治療用カーゴを標的に向けて送達するための、請求項20〜40のいずれか一項記載の治療用膜小胞の使用。
【請求項４２】
エピトープ特異的結合体を細胞外小胞バルクと接触させる工程；および
該細胞外小胞バルクから細胞外小胞の亜集団を分離する工程
を含む、細胞外小胞バルクから細胞外小胞の亜集団を分離する方法。
【請求項４３】
前記エピトープ特異的結合体が、抗体、ファージ、またはアプタマーである、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
前記エピトープ特異的結合体が、少なくとも1つのミトコンドリア膜タンパク質、好ましくはMTCO2タンパク質に対する抗体である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
前記エピトープ特異的結合体がCD63に対する抗体である、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞外小胞の亜集団が、前記細胞外小胞バルクと比較して減少したRNA量を有する、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
治療で使用するための、請求項42〜46のいずれか一項によって作製された細胞外小胞の亜集団。
【請求項４８】
代謝障害の処置で使用するための、請求項42〜46のいずれか一項によって作製された細胞外小胞の亜集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜小胞の作製、特に、治療用膜小胞の作製の分野に関する。さらに、本発明は、治療用化合物を標的に向けて送達するためのそのような膜小胞の治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
エクソソーム、エクトソーム、微小胞、およびアポトーシス小体などの細胞外小胞は、人体内で多数の細胞によって放出されることが公知であり、機能的RNA分子およびタンパク質を他の細胞に往復輸送できる。これらの細胞外小胞のカーゴは、脂質膜二重層によって細胞外酵素および免疫系から保護される。エクソソームなどの細胞外小胞が、治療用ヌクレオチドを含む機能分子を所望の細胞、例えばがん細胞、がん性組織、および炎症細胞などへ送達するのに利用できることが以前に示唆されている。
【０００３】
レシピエント細胞の内側への送達のために、例えば治療用RNAカーゴなどをエクソソームまたは微小胞に搭載するための、複数の技術が提案されている（Alvarez-Erviti L. et al.,Nat Biotechnol. 2011 Apr;29(4):341-5（非特許文献1）; Ohno S. et al., Mol Ther. 2013 Jan;21(1):185-91; EP2010663（非特許文献2））。全てのこれらの技術に共通していることは、それらが比較的「インタクトな」小胞を利用することである。小胞は、それらに搭載されているいずれかの特定のカーゴとは別に、それらが通常保有する分子、例えば、siRNAまたはマイクロRNAを保有するという点でインタクトとみなされうる。
【０００４】
多くの作業がこれまでに行われているが、細胞外小胞の分野はいまだ十分に調査されていない。そのような小胞の最大の治療上の可能性はいまだ認識されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Alvarez-Erviti L. et al.,Nat Biotechnol. 2011 Apr;29(4):341-5
【非特許文献２】Ohno S. et al., Mol Ther. 2013 Jan;21(1):185-91; EP2010663
【発明の概要】
【０００６】
本開示の課題は、治療用化合物を標的に向けて送達するために用いることができる新たな治療用膜小胞を提供することである。さらなる課題は、その結果提供される小胞の治療における使用である。
【０００７】
本開示の課題は、治療用途のための膜小胞を含む、膜小胞を作製するための新たな方法を提供することである。そのような方法には、特に、特定の膜小胞を単離するための方法、および予め決定された分子内容物を有する膜小胞を提供する方法が含まれる。
【０００８】
これらおよび他の課題は、本開示から当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲に記載しかつ本明細書において概して開示するようなさまざまな局面によって対処される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書で使用するとき用語「細胞外小胞」は、内部空間を囲む膜を含む細胞由来の小胞を指す。細胞外小胞は、それらが由来する細胞より小さな直径を有する全ての膜に包まれた小胞を含む。一般に、細胞外小胞の直径は20 nmから1000 nmにわたり、細胞外小胞は内部空間内にある、細胞外小胞の外表面上に呈示される、および/または膜に貫通するさまざまな高分子カーゴを含むことができる。該カーゴは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、低分子、および/またはそれらの組み合わせを含むことができる。例としておよびこれらに限定されないが、細胞外小胞には、アポトーシス小体、細胞の断片、直接的または間接的な操作による（例えば、連続的な押し出しまたはアルカリ溶液による処理による）細胞に由来する小胞、小胞化したオルガネラ、および生細胞から産生される小胞（例えば、直接的な形質膜の発芽または形質膜による後期エンドソームの融合による）が含まれる。細胞外小胞は、生きているもしくは死んだ生物、外植した組織もしくは器官、および/または培養した細胞に由来しうる。
【００１０】
本明細書で使用するとき用語「ナノ小胞」は、内部空間を囲む膜を含む細胞由来の小さな（20〜250 nmの間の直径、より好ましくは30〜150 nmの直径）小胞を指し、直接的または間接的な操作によって該細胞から生じ、該ナノ小胞は前記操作なしには前記プロデューサー細胞から作製されない。前記プロデューサー細胞の適切な操作には、これらに限定されないが、連続的な押し出し、アルカリ溶液による処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせが含まれる。ナノ小胞の作製は、いくつかの例では、前記プロデューサー細胞の破壊をもたらす可能性がある。好ましくは、ナノ小胞の集団は、形質膜からの直接的出芽または後期エンドソームの形質膜との融合の手段によるプロデューサー細胞に由来する小胞を実質的に含まない。ナノ小胞は、脂質または脂肪酸およびポリペプチドを含み、任意でペイロード（payload）（例えば、治療剤）、レシーバ（例えば、標的指向性成分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、RNA、またはDNA）、糖（例えば、単糖、多糖、またはグリカン）、または他の分子を含む。ナノ小胞は、ひとたび前記操作によってプロデューサー細胞から生じると、その大きさ、密度、生化学的パラメーター、またはそれらの組み合わせに基づき、プロデューサー細胞から単離することができる。別段の指定がない限り、用語「膜小胞」または「治療用膜小胞」はナノ小胞の一種を指す。
【００１１】
本明細書で使用するとき用語「エクソソーム」は、内部空間を囲む膜を含む細胞由来の小さな（20〜300 nmの間の直径、より好ましくは40〜200 nmの直径）小胞を指し、直接的な形質膜出芽または後期エンドソームの形質膜との融合によって前記細胞から生じる。概して、エクソソームの作製はプロデューサー細胞の破壊をもたらさない。エクソソームは、脂質または脂肪酸およびポリペプチドを含み、任意でペイロード（例えば、治療剤）、レシーバ（例えば、標的指向性成分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、RNA、またはDNA）、糖（例えば、単糖、多糖、またはグリカン）または他の分子を含む。エクソソームはプロデューサー細胞に由来し、その大きさ、密度、生化学的パラメーター、またはそれらの組み合わせに基づき、プロデューサー細胞から単離されうる。
【００１２】
本明細書で使用するとき用語「オルガネラ」は、特定の機能を有する細胞内の特殊化したサブユニットを意味する。個々のオルガネラは通常、それ自体の脂質二重層、すなわち膜内に別個に囲まれる。オルガネラの非限定的な例には、葉緑体、小胞体、鞭毛、ゴルジ装置、ミトコンドリア、エンドソーム、リソソーム、液胞、および核が挙げられる。
【００１３】
本明細書で使用するとき用語「エピトープ特異的結合体」は、特定のエピトープに結合する分子を意味する。エピトープは、免疫系、特に抗体、B細胞、もしくはT細胞、ファージ、またはアプタマーによって認識される抗原の一部である。「エピトープ特異的結合体」は、例えば、ビーズの表面などにさらに結合できるあるいはできない。エピトープ特異的結合体の例には、抗体、B細胞、もしくはT細胞、またはアプタマーが挙げられる。
【００１４】
本明細書で使用するとき用語「膜」は、生体膜、すなわち、ある特定の化合物の通過を可能にする細胞およびオルガネラの外側被覆を意味する。いくつかの文脈において、用語「膜」は、一度に細胞外小胞またはオルガネラを包みかつ小胞内またはオルガネラの内容物を封入し、続いて開口して細胞外小胞またはオルガネラの内部内容物を露出するかまたは開口した膜からそのような内容物を解離する、脂質二重層を指すことができる。
【００１５】
1つの局面によれば、以下を含む、膜小胞を作製するための方法が提供される：
a. 細胞外小胞またはオルガネラを提供する工程；
b. 9から14のpHを有する水溶液による処理によって前記細胞外小胞または前記オルガネラを開口させ、膜を得る工程；
c. 小胞内またはオルガネラの内容物を取り除く工程；および
d. 前記膜を再構成し、膜小胞を形成する工程。
【００１６】
上記で定義した方法は、開口され、その小胞内またはオルガネラの内容物から切り離され、次いで再構成されている、細胞外小胞またはオルガネラから作製された膜小胞を提供する。このように作製された膜小胞は、DNAまたは核膜構成成分などの有害な内在性分子、または任意の望ましくないRNA種、酵素もしくは他のタンパク質、ならびにウイルス、ウイルスゲノム物質を含むウイルス構成成分およびまたはプリオンなどの感染性成分または同様の感染性成分を含む、それらが天然に含有しうる有害なカーゴを欠いている。任意の天然の小胞内内容物の細胞外小胞からの除去は、そのような小胞内内容物によって引き起こされる副作用の可能性を低下させ、それによって、望ましくない作用の危険性を低下させる。同様に、任意の天然のオルガネラ内容物のオルガネラからの除去は、そのようなオルガネラ内容物によって引き起こされる副作用の可能性を低下させ、それによって、望ましくない作用の危険性を低下させる。
【００１７】
任意の天然の内容物の除去によって、膜小胞は治療用化合物を搭載でき、それによって、純粋な治療効果を誘導するために用いることができる。小胞内またはオルガネラの内容物がもたらしうるネガティブな副作用のいかなる可能性も避けながら、表面分子の作用は維持される。このような任意の内部内容物の除去は好ましくは、膜結合/表面結合分子の機能に影響を与えない。これらは好ましくは維持され、そのために、それらの機能は好ましくは維持される。そのような膜/表面分子の機能は、標的指向機能または治療的機能でありうる。
【００１８】
本明細書に開示されるような治療用膜小胞は、例えば、（細胞外小胞と比較して）膜小胞の収量を最適化することによって、現在の細胞外小胞治療による複数の課題を潜在的に解決する。
【００１９】
この局面の1つの態様によれば、方法は細胞外小胞に限定される
【００２０】
この局面の1つの態様によれば、方法はオルガネラに限定される。
【００２１】
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法の工程dは、超音波処理、機械的振動、多孔質膜を通しての押し出し、電流、およびそれらの組み合わせの1つまたは複数によって行うことができる。開口した細胞外小胞またはオルガネラの膜の再構成はそれに応じて、超音波処理、機械的振動、多孔質膜を通しての押し出し、電流、またはそれらの組み合わせによって達成することができる。これらの技術の1つまたは複数を利用することができる。
【００２２】
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法の工程dは超音波処理によって行うことができる。典型的には、開口した細胞外小胞またはオルガネラの膜の再構成は超音波処理によって行われる。
【００２３】
本明細書に記載される方法の工程cの小胞内またはオルガネラのカーゴ分子を取り除く工程は、超遠心分離または密度勾配超遠心分離によって行うことができる。
【００２４】
いくつかの局面では、方法は、
e.  前記膜小胞内にカーゴを搭載する工程
をさらに含み、工程eは、工程dと同時にまたはその後に実施することができる。
【００２５】
空の小胞またはオルガネラを再構成する工程と同時にまたはその後に、新たに形成された膜小胞は、細胞内もしくは細胞外標的を有するさまざまな種類の合成分子および/またはタンパク質もしくはポリペプチド；または細胞の機能、表現型、増殖、もしくは生存能に影響を与えることのできるヌクレオチド；または類似の機能を有するタンパク質、ペプチド、もしくはホルモンを含む、非常に特異的なカーゴを搭載することができる。細胞内または細胞外標的を有するタンパク質またはポリペプチドには、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、受容体、および酵素などの、生理活性ペプチドまたは阻害ポリペプチドが含まれる。さらなるカーゴの例を以下に定義する。
【００２６】
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法の工程eは、工程dの後に、物理的操作によって行うことができ、ここで、該物理的操作は、エレクトロポレーション、超音波処理、機械的振動、多孔質膜を通しての押し出し、電流、およびこれらの組み合わせから選択される。開口した細胞外小胞またはオルガネラからの膜によって形成された小胞へのカーゴの搭載は、そのような膜の形成後に、混合、コインキュベーション、エレクトロポレーション、超音波処理、機械的振動、多孔質膜を通しての押し出し、電流、およびそれらの組み合わせによって行うことができる。
【００２７】
いくつかの態様では、工程eの搭載は工程dと同時に行うことができる。特定の分子のカーゴは、例えば、細胞外小胞またはオルガネラの開口した（膜）形態と混合され、続いて、例えば、上記で定義した方法のいずれか1つを用いて膜小胞を形成するように再構成される。
【００２８】
前記カーゴは、合成生理活性化合物、天然生理活性化合物、抗菌化合物、抗ウイルス化合物、タンパク質またはポリペプチド、ヌクレオチド、ゲノム編集システム、マイクロRNA、siRNA、長鎖非コードRNA、アンタゴ-miR（antago-miR）、モルホリノ、mRNA、t-RNA、y-RNA、RNA模倣体、DNA、およびそれらの組み合わせから選択することができる。膜の再構成と同時にまたはその後に膜小胞内に搭載されるカーゴは、多くの特定のタイプ、例えば、RNA干渉分子（RNAi:マイクロRNAもしくはsiRNAもしくは長鎖非コードRNA、アンタゴ-miR、モルホリノ、またはRNA干渉機能を有しうるもしくは転写因子を含む細胞中のRNAまたはタンパク質の機能を遮断しうる任意の他の分子）、mRNA（レシピエント細胞中の機能タンパク質を生成する全長または縮小した長さのメッセンジャーRNA）、t-RNA、y-RNA、RNA模倣体、DNA分子（機能的低分子DNAプローブまたは全DNA遺伝子配列のいずれかを送達して、レシピエント細胞における機能障害に取って代わるかまたはそれを抑制する）、酵素阻害剤、または他の低分子薬剤などのカーゴでありうる。それはまた、例えば、細胞内送達を最適化するための天然または合成ホルモン、ならびに細胞の細胞質または細胞オルガネラまたは細胞の核内で薬理学的機能を有する合成低分子でありうる。これらの特定の分子のタイプの1つまたは複数が、それらの形成中またはそれらの形成後のいずれかに、膜小胞内に搭載できることが企図される。
【００２９】
前記カーゴは、抗炎症性機能、炎症促進性機能、または細胞遊走に関連する化合物でありうる。1つの態様では、前記カーゴはTGFβである。
【００３０】
前記カーゴはゲノム編集システムでありうる。ゲノム編集システムには、これらに限定されないが、メガヌクレアーゼシステム、Znフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）システム、およびCRISPR（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）システムが含まれる。CRISPRシステムはCRISPR-Cas9システムでありうる。CRISPR-Cas9システムは、Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列、標的配列にハイブリダイズするCRISPR RNAをコードするヌクレオチド配列（crRNA）、およびトランス活性化CRISPR RNAをコードするヌクレオチド配列（tracrRNA）を含む。crRNAおよびtracrRNAは、1つのガイドRNAに融合されうる。CRISPR-Casシステムの構成成分は、同じベクター中または異なるベクター中に位置づけられうる。CRISPR-Cas9システムは、核移行シグナル（NLS）をさらに含みうる。
【００３１】
前記カーゴは、変異したまたは未変異のがん遺伝子をコードする転写物に特異的に結合するマイクロRNAまたはsiRNAでありうる。マイクロRNAまたはsiRNAの結合は、がん遺伝子のmRNA転写およびタンパク質合成を阻害しうる。そのようながん遺伝子には、これらに限定されないが、ABLI、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3、およびYESが挙げられる。1つの態様では、がん遺伝子は、変異したKRAS、例えば、KRAS G12D、KRAS G12C、またはKRAS G12Vである。別の態様では、がん遺伝子は、N-Myc、c-Myc、またはL-MycなどのMycである。
【００３２】
治療用膜小胞は、前記膜小胞が由来する細胞外小胞またはオルガネラの集団とは異なる、少なくとも1つの生理学的特性を有することができ、該生理学的特性は、生体内分布、細胞取り込み、半減期、薬物力学、効力、用量、免疫反応、搭載効率、安定性、または他の化合物との反応性の1つまたは複数に関連する。さまざまな生理学的特性が、当技術分野おいて公知の種々の方法によって測定されうる。さまざまな生理学的特性は、改善された標的指向性効率、改善された送達、またはレシピエント細胞、器官、もしくは対象への治療用カーゴの増大でありうる。カーゴは、膜小胞が由来する細胞外小胞またはオルガネラ内にカーゴが搭載される場合よりも効率よく膜小胞内に搭載されうる。
【００３３】
前記細胞外小胞は、細胞外小胞バルクに由来する細胞外小胞の亜集団でありうる、または前記オルガネラは複数のオルガネラに由来するオルガネラの1つのサブタイプである。
【００３４】
任意の細胞または任意の組織由来の遊離した小胞には、異なる内容物、異なる表面分子、およびいくつかの場合では異なる起源を有する小胞の群が含まれる。細胞外小胞の亜集団は、例えば、表面分子、機能、および標的に関して非常に特異的な特徴を有しうる。そのような細胞外小胞は、細胞膜、ゴルジ装置、小胞体、核、またはミトコンドリアに起源をもちうる。
【００３５】
同様に、オルガネラの特定のサブタイプは、細胞中に存在する複数のオルガネラのタイプに由来しうる。例えば、複数のオルガネラは、密度勾配アプローチなどの通常の技術によって細胞可溶化物から取り出されうる。続いて、オルガネラの1種または複数種の特定のサブタイプが、例えば、本明細書に開示されるような技術の利用によって単離されうる。本方法での使用のために企図される特定のサブタイプのオルガネラには、ゴルジ装置、小胞体、リソソーム、エンドソーム、核、またはミトコンドリアが含まれる。
【００３６】
いくつかの局面では、発明は工程aの前に、
前記細胞外小胞バルクまたは前記オルガネラとエピトープ特異的結合体を接触させる工程；および
前記細胞外小胞バルクまたは複数のオルガネラから細胞外小胞の亜集団またはオルガネラのサブタイプを分離する工程
を含む。
【００３７】
小胞の各サブグループは、その表面上および小胞内カーゴの両方に非常に異なる分子を保有できることから、エピトープ特異的結合技術によって他の小胞からポジティブ単離および/またはネガティブ単離によって分離することができる。典型的には、単離用のエピトープ特異的結合体は、1種または複数種の特異的抗体、ファージ、またはアプタマーでありうる。互いに異なる細胞内起源のオルガネラまたは小胞の分離は、特定の特徴を有する精製された細胞外小胞またはオルガネラを提供しうる。そのような特定の特徴には、上述のような望ましい分子カーゴ、ならびに/または例えば表面分子および/もしくはカーゴ分子などを標的とする細胞へ送達するために標的とする細胞によって取り込まれる能力が含まれうる。エピトープ特異的結合体はまた、望ましくない亜集団が結合し、よって、この亜集団がいわゆるネガティブ単離によって細胞外バルクから取り除かれるように選択することもできる。
【００３８】
前記エピトープ特異的結合体は、少なくとも1つのミトコンドリア膜タンパク質、好ましくはMTCO2タンパク質に対する抗体でありうる。ミトコンドリア膜タンパク質、好ましくはMTCO2に対する抗体をエピトープ特異的結合体として用いることによって、単離された細胞外小胞の亜集団は、増大されたATP合成酵素活性を有する。
【００３９】
前記エピトープ特異的結合体は、表面マーカーCD63に対する抗体でありうる。CD63に対する抗体をエピトープ特異的結合体として用いることによって、単離された細胞外小胞の亜集団は、細胞外小胞バルクと比較して減少したRNA量を有しうる。
【００４０】
本開示の範囲内には、
細胞外小胞またはオルガネラに由来する膜から形成された小胞
を含む、治療用膜小胞が含まれる。
【００４１】
本明細書に開示されるような治療用膜小胞は、例えば、レシピエント細胞、器官、または対象への標的指向性効率を改善することによって、現在の細胞外小胞治療による複数の課題を解決する。治療用膜小胞は、それらの表面分子を介してレシピエント細胞と相互作用するその能力によってエクソソームなどの細胞外小胞を模倣する。治療用膜小胞は細胞外小胞またはオルガネラに由来する膜から形成されることが理解されるべきである。例えば、前記膜は、細胞外小胞またはオルガネラの開口によってそのような細胞外小胞またはオルガネラから生じうる。したがって、結果として生じる空の治療用膜小胞は、DNAまたは核膜構成成分などの有害な内在性分子、または任意の望ましくないRNA種、酵素もしくは他のタンパク質、ならびにウイルス、ウイルスゲノム物質を含むウイルス構成成分、およびまたはプリオンなどの感染性構成成分または同様の感染性成分を含む、天然の細胞外小胞またはオルガネラが含有する有害な内容物を欠くことができる。
【００４２】
治療用膜小胞は、治療用カーゴを搭載することができる。搭載されたカーゴを含む治療用膜小胞は、それらの表面分子を介してレシピエント細胞と相互作用する能力および該レシピエント細胞にそれらのカーゴを送達する能力を有する、天然の細胞外小胞を模倣する。この局面による治療用膜小胞内に含まれうる治療用カーゴの例は、本明細書の他の部分に開示されるが、典型的には、合成生理活性化合物、抗菌化合物、抗ウイルス化合物、天然生理活性化合物、タンパク質、ヌクレオチド、ゲノム編集システム、マイクロRNA、siRNA、長鎖非コードRNA、アンタゴmiR、モルホリノ、mRNA、t-RNA、y-RNA、RNA模倣体、DNA、およびそれらの組み合わせの1つまたは複数が含まれうる。
【００４３】
前記治療用カーゴは、ATPの産生を触媒する酵素を含むことができる。ATP合成酵素などのATPの産生を触媒する酵素を含む治療用膜小胞は、代謝条件に有益な作用を有しうる。
【００４４】
前記治療用カーゴは、間葉系幹細胞の抗炎症性機能を増大させるなど、間葉系幹細胞の表現型および/または機能に影響を与える能力を伴う化合物を含みうる。TGFβを含む治療用膜小胞を間葉系幹細胞に接触させることによって、そのような幹細胞の遊走性活性、創傷治癒活性、および治療効率を増大させることができる。間葉系幹細胞の表現型および/または機能に影響を与える能力を伴う化合物を含む治療用膜小胞に間葉系幹細胞を曝すことによって、それに応じて、そのような幹細胞の抗炎症性機能を増大させることができる。例えば、そのような治療用膜小胞は、喘息のマウスモデルにおいて炎症を低減させることができる。
【００４５】
前記治療用カーゴは、抗炎症性機能に関連する化合物、または炎症促進性機能に関連する化合物を含むことができる。抗炎症性機能に関連する化合物の例には、IL-10、インターフェロンα、インターフェロンγおよび抗炎症性マイクロRNAが挙げられる。前記抗炎症性マイクロRNAは例えばmiR-146である。炎症促進性機能に関連する化合物の例には、TGFβ、TNFα、IL-4、IL-6、toll様受容体リガンドおよび炎症促進性マイクロRNAが挙げられる。前記炎症促進性マイクロRNAは例えばmiR-10、miR-29、またはmiR-155である。
【００４６】
カーゴは、CRISPR-Cas9システムなどのゲノム編集システムを含むことができる。CRISPR-Cas9システムを搭載した治療用膜小胞を用いて、疾患の処置、再生医学、および組織工学のために遺伝子の発現および機能を変更させることができる。
【００４７】
カーゴは、膜小胞が由来する細胞外小胞またはオルガネラ内にカーゴが搭載される場合よりも効率的に膜小胞内に搭載されうる。膜小胞の任意の天然の内容物、例えば、望ましくないRNA種、酵素または他のタンパク質、ならびにウイルス、ウイルスゲノム物質を含むウイルス構成成分および/またはプリオンなどの感染性構成成分または同様の感染性成分などの除去は、治療用カーゴへの混入または害を回避することができる。
【００４８】
前記細胞外小胞は、細胞外小胞バルクと異なる膜および表面分子のサブセットを有する細胞外小胞バルクの亜集団を意味しうる。細胞外小胞バルクと異なる膜および表面分子のサブセットを有する細胞外小胞バルクの亜集団は、より特異的な作用を有する可能性があり、よってより少ない副作用を有しうる。細胞外小胞バルクの亜集団の例は、本明細書の他の部分に開示される。細胞外小胞の特定の亜集団に由来する膜小胞は、例えば、特定の膜および/または表面分子の存在によって、または特定の治療用カーゴを標的に向けて送達するために、特に有用でありうることが企図される。
【００４９】
いくつかの局面では、本明細書に記載されるオルガネラは、複数のオルガネラに由来するオルガネラのサブタイプを意味する。複数のオルガネラに由来するオルガネラのサブタイプの例は、本明細書の他の部分に開示される。オルガネラの特定のサブタイプに由来する膜小胞は、特定の膜および/または表面分子の存在によって、特定の治療用カーゴを標的に向けて送達するのに特に有用でありうることが企図される。
【００５０】
膜小胞は以下の少なくとも1つによって特徴付けられうる：
i. 表面膜分子が反転している；
ii. 間葉系幹細胞の抗炎症性機能が増大するように間葉系幹細胞の表現型および機能に影響を与える能力を伴う、少なくとも1種類の表面分子；
iii. 細胞外小胞に共通する少なくとも1種類の表面マーカーが存在するかまたは存在しないのいずれか；
iv. 少なくとも1種類のミトコンドリア膜表面分子が存在する；
v. 少なくとも1種類の核膜表面分子が存在する；および
vi. 少なくとも1種類のゴルジおよび/または小胞体由来の膜分子が存在する。
【００５１】
その表面膜分子が反転している治療用膜小胞は、細胞内シグナル伝達などの第2のメッセージを有する表面分子をそれらが直接送達するのを可能にする。さらに、間葉系幹細胞の表現型および/または機能に影響を与える能力を伴う表面分子を有する治療用膜小胞は、間葉系幹細胞の抗炎症性機能を増大させうる。
【００５２】
実施例4および共通表面マーカーCD63を参照すると、CD63陰性細胞外小胞は多くのRNAを包含するのに対して、CD63陽性細胞外小胞はRNAを欠いており、これは、細胞外小胞の各亜集団が異なるカーゴを有し、そのため特定の作用を潜在的に誘導する能力を有することを示唆する。
【００５３】
実施例3を参照すると、膜小胞上の1種類のミトコンドリア膜表面分子、MTCO2の存在は、より高いATP合成酵素活性をもたらす。よって、核、ゴルジまたは小胞体起源など他のオルガネラ起源の膜小胞は同じように、それらの異なる膜表面分子に応じて他の特性または機能を呈する。上述のような特定の特徴のいずれか1つを有する治療用膜小胞はさらに、細胞外小胞の特定の亜集団またはオルガネラの特定のサブタイプから生じうる。
【００５４】
本明細書に開示されるようないくつかの局面において、前記治療用膜小胞は組織を通って遊走する能力を有する。ある特定の例では、治療用膜小胞はまだ固定されていないときにその形状を変化させることができることから、治療用膜小胞が改善された運動性を有することが示されている。これは、インビトロでセルフリー小胞の目に見える形状変化をもたらす。これは、小胞のある特定の亜集団/サブタイプにおける運動性タンパク質、アクチン、および関連タンパク質の存在に関連し、その存在は小胞プロテオミクスアプローチを用いて決定できる。
【００５５】
治療用膜小胞は、該膜小胞が由来する細胞外小胞またはオルガネラと比較して、増大した運動性を有しうる。
【００５６】
細胞外小胞またはオルガネラは、がん細胞、がん細胞株、炎症細胞、構造細胞、神経/グリア細胞/オリゴデンドロサイト、または間葉系/胚性幹細胞に起源をもつ可能性がある。
【００５７】
細胞外小胞またはオルガネラは、腫瘍；骨髄；または血液、リンパ節、もしくは脾臓から単離された免疫細胞を含む、正常組織または病変組織から単離されうる。
【００５８】
膜小胞は、本明細書に開示されるような局面のいずれか1つに定義されるような方法によって得られうる。
【００５９】
本明細書に開示されるような局面による治療用膜小胞は、治療において用いられうる。本発明による治療用膜小胞は、例えば、標的指向性効率、送達を改善し、レシピエント細胞/器官/対象への治療用カーゴを増大させることによって、現在の細胞外小胞治療による複数の課題を解決することができる。治療用膜小胞は、それらの表面分子を介してレシピエント細胞と相互作用する、および/またはレシピエント細胞に治療用カーゴを送達するその能力において細胞外小胞を模倣することによって、エクソソームまたは任意の他の細胞外小胞を模倣すると言える。同時に、治療用膜小胞はネガティブな副作用の可能性を伴う望ましくない細胞外小胞ならびにこれらが天然に含有しうる任意の有害な内容物による混入の可能性を軽減できるという点で、治療用膜小胞は、エクソソームおよび他の天然の細胞外小胞と異なる。さらに、治療用膜小胞はまた、抗生物質または抗ウイルス分子を搭載し、エプスタイン・バーウイルス（Epstein-Barr virus）、HIV、または任意の他の感染性種を含む、細胞内の細菌、ウイルス、またはプリオンなどの細胞内感染を処置することもできる。
【００６０】
治療用膜小胞は、代謝障害の処置で用いることができる。治療用膜小胞は、酵素ATP合成酵素などATPの産生にとって重要な酵素を送達する能力を有しうる。
【００６１】
治療用膜小胞は、本発明による治療用膜小胞をその必要がある患者に投与することを含む障害を処置する方法において用いることができる。
【００６２】
治療用膜小胞は、本発明による治療用膜小胞をその必要がある患者に投与することを含む代謝障害を処置する方法において用いることができる。
【００６３】
治療用膜小胞は、前記治療用カーゴを標的に向けて送達するために用いることができる。細胞外小胞またはオルガネラの亜集団から作製された治療用膜小胞は、それらが特定の標的に到達し、その治療用カーゴを送達し、より特異的な処置ならびに特定の治療用カーゴの送達をもたらすことを可能にする、特定の表面分子を有しうる。治療用カーゴは、例えば、悪性疾患における変異したまたは未変異のがん遺伝子などの細胞内機能、または転写因子、タンパク質産生、ホルモン受容体、サイトカイン、膜フォールディング、エネルギー産生、増殖、DNA複製、もしくは任意の他の細胞内機能を含む任意の他の細胞内プロセスまたは機能を標的としうる。治療用膜小胞はまた、抗生物質または抗ウイルス分子を搭載し、エプスタイン・バーウイルス、HIV、または任意の他の感染性種を含む、細胞内の細菌、ウイルス、またはプリオンなどの細胞内感染を処置することもできる。
【００６４】
本開示の範囲には、以下を含む、オルガネラから膜小胞を作製する方法が含まれる：
a. 細胞を溶解し、細胞内容物を放出させる工程；
b. 前記オルガネラを前記細胞内容物から分離する工程；および
c. pH 9〜14を有する水溶液で前記オルガネラを処理することによって該オルガネラを開口させ、膜を得る工程；および
d. 前記膜を再構成し、膜小胞を形成する工程。
【００６５】
その内容物が空になっているオルガネラは、DNAまたは核膜構成成分などの有害な内在性分子、または任意の望ましくないRNA種、酵素もしくは他のタンパク質、ならびにウイルス、ウイルスゲノム物質を含むウイルス構成成分およびまたはプリオンなどの感染性構成成分または同様の感染性成分を含む、それらが天然に含有しうる有害なカーゴを欠いている。オルガネラからの内容物の除去は、そのような内容物によって引き起こされる副作用の可能性を低下させ、それによって、望ましくない作用の可能性を減少させる。
【００６６】
前記オルガネラはミトコンドリアでありうる。
【００６７】
本方法は、
e.  カーゴを前記膜小胞に搭載する工程
をさらに含むことができ、工程eは、工程dと同時にまたはその後に実施することができる。
【００６８】
空のオルガネラを再構成する工程と同時にまたはその後に、細胞内もしくは細胞外標的を有するさまざまな種類の合成分子/化学物質およびもしくはタンパク質（ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、受容体、または酵素などの生理活性分子または阻害性分子を含む）、または細胞の機能、表現型、増殖もしくは生存能に影響を与えることのできるヌクレオチド、または類似の機能を有するタンパク質、ペプチドもしくはホルモンを含む、特定のカーゴを、新たに形成された小胞に搭載することができる。膜小胞内に組み入れることができるカーゴの他の例は、他の局面に関連して開示される。この局面により作製された膜小胞は、例えば、特定の治療用カーゴを標的に向けて送達するための治療において有用でありうる。
【００６９】
本開示の範囲には、以下を含む、オルガネラから膜小胞を作製する方法が含まれる：
a. pH 9〜14を有する水溶液で前記細胞を処理することによって細胞を開口させ、膜の混合物を得る工程；
b. 前記膜の混合物からオルガネラの膜を分離する工程；および
c. 前記オルガネラの膜を再構成し、膜小胞を形成する工程。
【００７０】
本方法は、
d. 前記膜小胞にカーゴを搭載する工程
をさらに含むことができ、工程dは、工程cと同時にまたはその後に実施できる。
【００７１】
膜小胞内に搭載できるカーゴの例は、本明細書の他の部分に開示される。この方法によって得られた膜小胞は好ましくは、治療において用いることができる。同様に、例えば、エピトープ特異的結合体の使用による、混合物からオルガネラの膜を分離するための例示的方法が、本明細書において開示される。1つの態様では、前記分離は、前記混合物からのオルガネラの1つまたは複数のサブタイプの分離をさらに含む。
【００７２】
本開示の範囲には、以下を含む、細胞外小胞バルクから細胞外小胞の亜集団を分離する方法が含まれる：
エピトープ特異的結合体を前記細胞外小胞バルクと接触させる工程；および
前記細胞外小胞の亜集団を前記細胞外小胞バルクから分離する工程。
【００７３】
任意の細胞または任意の組織から遊離した小胞には、異なる内容物、表面分子、および細胞起源を有する小胞の群が含まれる。細胞外小胞の亜集団は、例えば、表面分子、機能、および標的に関して非常に特異的な特徴およびより低い多様性を有しうる。細胞外小胞の亜集団は、エピトープ特異的結合体によるポジティブおよび/またはネガティブ分離によって分離されうる。典型的には、エピトープ特異的結合体は、抗体、ファージ、またはアプタマーでありうる。
【００７４】
エピトープ特異的結合体は、少なくとも1つのミトコンドリア膜タンパク質、好ましくはMTCO2タンパク質に対する抗体でありうる。エピトープ特異的結合体としてミトコンドリア膜タンパク質に対する抗体、好ましくはMTCO2に対する抗体を用いることによって、細胞外小胞の単離された亜集団は、増大されたATP合成酵素活性を有しうる。増大されたATP合成酵素活性を有する単離された亜集団は、代謝障害を処置するために用いることができる。
【００７５】
エピトープ特異的結合体は、表面マーカーCD63に対する抗体でありうる。CD63陽性細胞外小胞の単離された亜集団は、細胞外小胞バルクと比較して、減少したRNA量を有しうる。減少したRNA量を有する単離された亜集団は、最小のRNA混入でカーゴを送達するために用いることができる。
【００７６】
細胞外小胞の亜集団は、治療での使用のために分離されうる。具体的には、細胞外小胞の亜集団は、上記に開示されるような方法によって分離されうる。
【００７７】
細胞外小胞の亜集団は、代謝障害の治療で使用するために作製されうる。具体的には、細胞外小胞の亜集団は、上記に開示されるような方法によって分離されうる。
【００７８】
略語のリスト
略語              意味
PBS               リン酸緩衝生理食塩水
Tris              トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
EDTA              エチレンジアミン四酢酸
EV                細胞外小胞
BSA               ウシ血清アルブミン
CD9               CD9抗原、細胞表面糖タンパク質
CD63              CD63分子、CD63抗原
CD81              分化抗原群81
FACL4             脂肪酸-CoAリガーゼ4
MTCO2             ミトコンドリアがコードするシトクロムcオキシダーゼII
HRP               ホースラディッシュペルオキシダーゼ
HEPES             4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸
MES               2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸
M                 モル濃度、モル/リットル
mM                ミリモル濃度、ミリモル/リットル
SDS               ドデシル硫酸ナトリウム
RNA               リボ核酸
DNA               デオキシリボ核酸
TSG101            腫瘍感受性遺伝子101
TGFβ             トランスフォーミング増殖因子β
SDS-PAGE          ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
TBS               トリス緩衝生理食塩水
Tween-20          ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
AF647             Alexa fluor(登録商標) 647色素
PE                フィコエリトリン
HMC-1             ヒトマスト細胞株-1
Triton X-100      ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル
SMAD2             デカペンタプレジックホモログ2に対する母体
（mothers against decapentaplegic homolog 2）
DAPI              4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール
qPCR              定量的ポリメラーゼ連鎖反応
cDNA              相補DNA
EF1               伸長因子1
LY2157299         ガルニセルチブ（Gulunisertib）
MEM               最小必須培地
ECM               細胞外マトリクス
OVA               卵白アルブミン
NP40              ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール
16s rRNA          16SリボソームRNA
18s rRNA          18SリボソームRNA
【図面の簡単な説明】
【００７９】
例示のみを目的として与えられ、よって本発明を限定するものではない、本明細書の下記の実施例および添付の図面から、本発明はさらに十分に理解される。
【図１】特異的結合技術による細胞外小胞（EV）の亜集団の単離の概略図。
【図２】ELISAで検出されたEV単離物におけるミトコンドリア膜タンパク質および標準的なEVマーカータンパク質であり、これはEVの亜集団を含有するミトコンドリアタンパク質の存在を示す。
【図３Ａ】図3は、EVの亜集団のプロテオミクスの結果を示す。MTCO2を含有するEVの亜集団は、異なるタンパク質プロファイルおよび生物学的プロセスを示す。図3Aは、それぞれのEV亜集団における特定されたタンパク質の数、および各亜集団に特有なまたは2つ以上の亜集団に存在する特定されたタンパク質の数を示す。FACL4-EVおよびMTCO2-EVはそれぞれ、FACL4抗体およびMTCO2抗体によって単離されたEVの亜集団を表す。
【図３Ｂ】図3Bは、EVの亜集団における特定されたタンパク質のヒートマップ分析を示す。
【図３Ｃ】図3Cは、タンパク質の相対的定量に基づく、さまざまな群における遺伝子オントロジー（GO）分析を示す。
【図４】EVのMTCO2含有亜集団において濃縮されたミトコンドリアタンパク質および該タンパク質の相互作用。図4Aは、EVの異なる亜集団におけるミトコンドリアタンパク質の相対的存在量を示す。図4Bは、強調表示されているATP合成酵素のサブユニットを含む、エネルギー産生マシナリータンパク質（energy production machinery protein）との、ミトコンドリアタンパク質の相互作用を示す。
【図５】EVの亜集団のATP合成酵素活性測定。EVのMTCO2含有亜集団は、未単離のEVより高いATP合成酵素活性を有する。
【図６】CD63陽性EVの単離およびCD63陽性EVのRNAプロファイル。図6Aは、CD63陽性EVおよびCD63陰性EVの単離の概略図を示す。図6Bは、CD63陽性EVおよびCD63陰性EVのRNAプロファイルを示す。CD63陰性EVはRNAを含有するのに対して、CD63陽性EVはそうではない。図6Cは、第1回および第4回のCD63およびRNAシグナルの間の相対的変化倍率を表す。
【図７】EVの亜集団は表面に活性型TGFβを含有する。TGFβはEVマーカーと共局在し、間葉系幹細胞に対して細胞内シグナル伝達を誘導することができた。図7Aは、ウエスタンブロットによって測定された小胞マーカーTSG101およびCD81、ならびに対応する画分においてELISAによって測定されたTGFβレベルを示す。図7Bは、画分2におけるTGFβの合計および活性型の量を表す。図7Cは、TGFβおよびCD63からの2種の蛍光シグナルの検出を示す。図7Dは、TGFβ含有EVによる処理後の間葉系幹細胞におけるSMAD2リン酸化の検出を表す。
【図８】TGFβ含有EVはインビトロで間葉系幹細胞（MSC）の遊走を誘導する。図8Aは、TGFβ含有EVの処理の有りまたは無しのMSC形態変化の顕微鏡画像を示す。図8Bは、TGFβ含有EVの処理の有りまたは無しのMSC遊走の顕微鏡画像を示す。図8Cは、48ウェルボイデンチャンバー（Boyden chamber）を用いるMSC遊走の結果を示す。図8Dは、48ウェルボイデンチャンバーを用いるMSC浸潤の結果を示す。
【図９】EV上のTGFβは、間葉系幹細胞の遊走およびシグナル伝達について、遊離TGFβより強力である。図9Aは、同量の遊離TGFβと比較した、TGFβ含有EVにより処理した遊走MSCの数を示す。図9Bは、同量の遊離TGFβと比較した、TGFβ含有EVにより処理したMSCにおけるSMAD2のリン酸化を示す。
【図１０】TGFβ含有EVはインビボで間葉系幹細胞の遊走および治療可能性を増大する。図10Aは、EV処理したMSCまたは未処理のMSCを受けた後の、OVA曝露マウスモデルまたは対照マウスの生物発光画像を示す。図10Bは、EV処理したMSCまたは未処理のMSCを受けた後の、OVA曝露マウスモデルまたは対照マウスの好酸球数を表す。
【図１１】蛍光顕微鏡によって明らかにされるEVの運動性。
【図１２】小胞内カーゴを除去することによる空のEVの作製の概略図。
【図１３】細胞外小胞の小胞内カーゴを取り除くことによって作製した空のEVの特徴。図13Aは、ZetaView(登録商標)PMX110によって測定されたEVおよび空のEVの大きさを示す。図13Bは、EVおよび空のEVにおける選択したタンパク質のウエスタンブロットの結果を示す。図13Cは、Agilent Bioanalyzerによって測定されたEV中のRNA量を示す。図13Dは、Agilent Bioanalyzerによって測定された空のEV中のRNA量を示す。
【図１４】高pHで処理したEV調製物（図14A）または超音波処理後に再小胞化したEV調製物（図14B）の電子顕微鏡像。
【図１５】膜小胞は、活性エンドサイトーシスプロセスにより培養細胞によって取り込まれる。図15Aは、DiO標識化EVと共にインキュベートした後のHEK293細胞のFACS分析結果を示す。図15Bは、DiO標識化膜小胞と共にインキュベートした後のHEK293細胞のFACS分析結果を示す。図15Cは、37℃でDiO標識化膜小胞と共にインキュベートした後のHEK293細胞のFACS分析結果を示す。図15Dは、4℃でDiO標識化膜小胞と共にインキュベートした後のHEK293細胞のFACS分析結果を示す。
【図１６】蛍光標識したEVまたは蛍光標識した膜小胞と共にインキュベートした後の培養細胞の共焦点顕微鏡画像。矢印は緑色蛍光を示す。
【図１７】PBS処理と比較した、高pH処理によるsiRNA分子の搭載。siRNAは、EV内より効率的に膜小胞内に搭載される。
【図１８】膜小胞は、内腔空間中にsiRNAカーゴを包含する。図18Aは、インキュベーション媒体中のsiRNAの濃度の増加に伴う膜小胞中に搭載されるsiRNAの数を示す。図18Bは、EVおよび膜小胞中に搭載されたsiRNAの数を示す。図18Cは、RNase A処理の有りまたは無しのEVおよび膜小胞中のsiRNAの数を示す。
【図１９】蛍光標識したコレステロールsiRNAと共にインキュベートした後の培養細胞の共焦点顕微鏡画像。蛍光siRNAカーゴを搭載した膜小胞は培養細胞によって取り込まれる。矢印は赤色蛍光を示す。
【図２０】単離された細胞オルガネラからのRNAプロファイルは、RNA量はEVのものと類似していることを示す。
【実施例】
【００８０】
実施例1. ミトコンドリア膜タンパク質を用いる特異的結合技術による細胞外小胞の亜集団の単離
材料および方法：
分画超遠心分離によって、細胞外小胞（EV）をヒトマスト細胞株（HMC-1）から単離した。簡単に説明すると、10％エクソソーム除去ウシ胎仔血清を含有する培地中で3日間、細胞を成長させた。細胞培養上清を300×gで10分間および16,500×gで20分間遠心し、細胞およびより大きな小胞をそれぞれ除去した。上清を118,000×gで3.5時間さらに超遠心し、エクソソーム濃縮EVを得た。より高純度のEVを得るために、OptiPrep(商標)（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）による浮遊密度勾配を実施した。PBS（1 ml）中のEVを60％のイオジキサノール（3 ml）と混合し、超遠心管の底に置いた。0.25 Mショ糖、10 mM Tris、および1 mM EDTAでの不連続イオジキサノール勾配（35、30、28、26、24、22、20％；各1 mlだが、22％は2 ml）を重ね、最終的に、管をおよそ400 μlのPBSで完全に満たした。試料を178,000×gで16時間超遠心した。画分2および3（上から）の混合物をPBS（最大で94 ml）で希釈し、118,000×gで3.5時間超遠心した。ペレット化EVをPBSで再懸濁した。
【００８１】
最初に、EV単離物中のミトコンドリア膜タンパク質の存在をELISAによって確認した。EVを96ウェルプレート上に一晩4℃でコーティングした。次いで、プレートをPBS中の1％BSAで室温にて1時間ブロッキングし、CD9、CD81、FACL4、またはMTCO2に対する抗体と共に室温にて2時間さらにインキュベートした。PBSでの洗浄後、HRPコンジュゲート二次抗体を室温にて1時間インキュベートした。プレートをPBSで洗浄し、次いで、HRPの比色反応によって発色させた。
【００８２】
EVのミトコンドリアタンパク質含有亜集団を単離するために、ミトコンドリア膜タンパク質に対する特異的抗体を図1に示すように用いた。FACL4およびMTCO2の抗体を、製造者の説明書（Thermo Fischer)にしたがってDynabeadsに結合させた。抗体結合ビーズをEVと共に室温にて2時間インキュベートした。未結合EVを除去し、PBSで2回洗浄した。ビーズに結合したEVを酸性洗浄緩衝液（10 mM HEPES、10 mM MES、120 mM NaCl、0.5 mM MgCl2、0.9 mM CaCl2、pH5)で溶出した。
【００８３】
結果：
EVのマーカー、CD9およびCD81をELISAで検出した、これは光学密度（O.D.）によって示される。加えて、ミトコンドリア膜タンパク質、FACL4およびMTCO2を検出した（図2）。この結果は、ミトコンドリア膜タンパク質がEV単離物中に存在し、それらの抗体によって検出および単離できることを示す。
【００８４】
実施例2. 細胞外小胞の亜集団のプロテオミクス分析
材料および方法：
EVの単離されたミトコンドリアタンパク質含有亜集団のプロテオームをLC-MS/MSによって特定した。簡単に説明すると、単離していないEV（EV）、FACL4単離したEV（FACL4-EV)、およびMTCO2単離したEV（MTCO2-EV）の10 μgの小胞を、2％SDSで溶解し、超音波処理した。タンパク質のトリプシン消化をFilter Aided Sample Preparationによって実施した。消化したペプチドをOrbiTrap質量分析計で分析した。MSデータのピークリストを作成し、Andromeda検索エンジン（version 1.5.2.8）によるMaxQuant定量化ツールを用いて、ペプチド/タンパク質を同定および定量化した。使用した検索パラメーターは以下の通りであった；酵素特異性、トリプシン；可変修飾（variable modification）、メチオニンの酸化（15.995 Da）およびシステインのカルバミドメチル化（57.021 Da）；切り残し（missed cleavage）の値2；プレカーサ-イオン許容誤差20 ppmおよびフラグメントイオン許容誤差4.5 ppm。Swiss-Protデータベース（20196エントリー)から設定したホモサピエンス参照プロテオーム、混入物、および逆配列を検索のために用いた。ペプチドおよびタンパク質同定のために、1％の逆データベース（reverse database）ヒットを蓄積することによって、1％偽陽性率（false discovery rate）が決定された。定量的データを得るために、最小2の比率数（ratio count）による無標識定量化（LFQ）を適用した。正規化したLFQ強度を得た。遺伝子オントロジー（GO）分析の生物学的プロセスの用語をdavid.ncifcrf.govウェブサイト（https://david.ncifcrf.gov/）で入手可能なDAVIDを用いて得た。
【００８５】
結果：
合計で、EV、FACL4-EV、およびMTCO2-EVからそれぞれ449種、646種、839種のタンパク質が特定された。サンプル間で重複するタンパク質を図3Aに提示する。加えて、小胞のヒートマップ分析を図3Bに示す。タンパク質の相対的定量に基づき、タンパク質を5つの異なる群に分類した。それらのうち「共通」、「FACL4-EV濃縮」、「MTCO2-EV濃縮」、および「FACL4/MTCO2-EV濃縮」を遺伝子オントロジーによりさらに分析した（図3C）。タンパク質の大部分は、3種全ての小胞で共通であり、EVおよびFACL4-EVは非常に類似していた。しかしながら、MTCO2-EVは、他の2種類の小胞とは異なっていた。重要なことには、ミトコンドリアタンパク質含有EVは、単離していないEVと比較して、代謝プロセス関連タンパク質を濃縮した。これらの結果は、EVの亜集団は異なるタンパク質カーゴを有し、よって、異なる生物学的機能を媒介できることを示す。
【００８６】
ミトコンドリアタンパク質はMTCO2-EVにおいて、他の2種類の小胞と比較してより高い存在量で同定され（図4A）、相互に物理的に結合した（図4B）。重要なことには、ATP合成酵素のサブユニットを含むエネルギー産生マシナリータンパク質がMTCO2-EVにおいて認められた（図4B）。
【００８７】
実施例3. 細胞外小胞の亜集団のATP合成酵素活性
材料および方法：
LC-MS/MSにより見いだされたMTCO2-EV濃縮ミトコンドリアタンパク質の1つはATP合成酵素であった。ATP合成酵素の活性を、製造者の説明書にしたがってATP合成酵素の酵素活性マイクロプレートアッセイキット（Abcam）により試験した。単離していないEV、MTCO2-EV、およびMTCO2未結合EVを試験に供し、相対活性を測定した。
【００８８】
結果：
単離していないEVと比較して、MTCO2-EVはおよそ2倍高いATP合成酵素活性を有する（図5）。加えて、MTCO2未結合EVはわずかに減少したATP合成酵素活性を有するが、これは統計的に有意なものではない。この結果は、EVのミトコンドリアタンパク質含有亜集団が活性ATP合成酵素で濃縮されることを示唆する。
【００８９】
実施例4. CD63陽性細胞外小胞の単離およびRNAプロファイリング
材料および方法：
CD63は、EVの古典的なマーカーである。発明者らは、抗CD63被覆磁性ビーズを用いて、CD63陽性EVサブセットを捕捉した。100 μgのEVを107の磁性ビーズ（Life-technology, 10606D）と共に4℃にて一晩、緩やかに回転させながらインキュベートした（図6A）。ビーズを取り除き、新しいビーズを加えた。これらの工程をさらに3回繰り返した。その後、ビーズ上のCD63陽性EVおよびCD63陰性上清を、製造者の推奨のとおりにExiqonトータル植物および動物細胞キットを用いるRNA単離に供した。RNAサイズのプロファイルをナノチップによりバイオアナライザーを用いて比較した。CD63ビーズ上に結合したEV関連タンパク質またはEV関連RNAシグナルの増加を、第1回および第4回の捕捉からの、ビーズに結合したEVにおけるCD63蛍光シグナルおよびRNA測定値の増加を測定することによって評価した。
【００９０】
結果：
発明者らの知見により、バイオアナライザーRNAプロファイルはCD63陽性EVではRNAの痕跡が全くない/RNAの痕跡が検出できないことを示すことが示唆された（図6B）。これは、任意の検出可能なRNAを含有しないCD63陽性EVサブセットの存在を示唆する。これに対して、CD63陰性EVはビーズに未結合の形態に存在するRNAヌクレオチドの大部分を有した。
【００９１】
ビーズ上のCD63陽性EVの捕捉をさらに確認するために、発明者らは、第1回の捕捉および第4回の捕捉からの、フローサイトメトリーを用いるCD63 の平均蛍光シグナルおよびRNAを測定した。第1回および第4回のCD63およびRNAシグナル間の比率はそれぞれ、〜50％および〜0.3％の増加を示した（図6C）。まとめると、このデータは、CD63陽性EVは通常EVの一部であると見なされるRNAを欠くことを示す。
【００９２】
実施例5. 細胞外小胞の亜集団はTGFβを含有する
材料、方法、および結果： 
実施例1に記載したように分画超遠心分離によってHMC-1からEVを単離した。OptiPrep(商標)勾配後に、各画分を得た。小胞マーカー（TSG101およびCD81）およびTGFβレベルをそれぞれ、ウエスタンブロットおよびELISAによって測定した。ウエスタンブロットのために、OptiPrep(商標)勾配の各画分をSDS-PAGEに供し、ニトロセルロース膜上に転写した。0.05％をTween-20含有するTBS中の5％BSAで膜をブロッキングし、一次抗体と共に4℃にて一晩インキュベートした。0.05％Tween-20を含有するTBSで洗浄した後、HRPコンジュゲート二次抗体を室温にて1時間。免疫反応性ビーズを視覚化した。小胞中のTGFβ1（合計および活性型）のレベルを、TGFβ1 ELISA Ready-SET-Goキット（eBioscience, Affymetrix, Inc）を用いて製造者の説明書にしたがって実施した。
【００９３】
TSG101およびCD81はどちらも画分2において大部分が認められたが、他の画分でも認められた（図7A)。加えて、TGFβの大部分は、TGFβの活性型で画分2において認められた（図7Aおよび7B）。これらの結果は、EVが活性型TGFβを収容していることを示す。
【００９４】
EVおよびTGFβの共局在、蛍光相関分光測定を実施した。新たに単離したEVをTGFβ-AF647およびCD63-PEで標識した。標識化EVをOptiPrep(商標)クッション（0、20、30、50％）上に底からロードし、40,000 rpmで4時間遠心し（SW40-Ti Rotor）、それらを遊離の未結合色素から分離した。脂質標識した小胞を20〜30％から収集し、PBSで120,000×gで3.5時間洗浄した。洗浄したペレットを、立体配置顕微鏡システムによる特注設計した2色蛍光相関分光測定システムに供した。図7Cに示すように、TGFβおよびCD63からの2種の蛍光シグナルが同時点で検出され、EVがその表面上にTGFβを収容することが暗示された。
【００９５】
次に、小胞上のTGFβの活性を、間葉系幹細胞（MSC）にそれらを処理することによって調べた。MSCを70〜80％のコンフルエンスに成長させた。PBSで洗浄した後、HMC-1細胞（100 μg/ml）由来のEVを処理した。処理後0、5、15、および30分に、TGFβの下流シグナルをウエスタンブロットによって分析した。重要なTGFβ下流シグナル分子の1つ、SMAD2は、時間依存的にリン酸化された（図7D）。
【００９６】
要約すると、EVはその表面に活性型TGFβを持つ。TGFβは、1型TGFβ受容体およびSMAD2を介して細胞内シグナル伝達を誘導できる。
【００９７】
実施例6. 細胞外小胞のTGFβ含有亜集団は、遊離TGFβよりも高い活性でインビトロでのMSCの遊走を誘導する
材料、方法、および結果：
MSCをEVで処理し、それらの形態変化を顕微鏡で観察した（図8A）。細胞は処理後、より伸長した。MSCを6ウェルプレート中で70〜80％コンフルエンスに成長させ、単層細胞をウェルの中心を越えて1 mlピペットチップで引っ掻いた。PBSで洗浄した後、HMC-1細胞由来のEVを有するまたは有さない（100 μg/ml）MEM平板培地をプレートに添加した。引っ掻いた境界域からの遊走性細胞を24および48時間後に画像化した。EV処理したMSCは、未処理のMSCと比較して増大した創傷治癒活性を示した（図8B）。
【００９８】
MSCの遊走および浸潤を、48ウェルボイデンチャンバー（Neuroprobe Inc）を用いて評価した。細胞（5000細胞/ウェル）を底面区画に播種し、8 μm孔のポリカーボネート膜によって上側部分から分離した。膜を0.1％ゼラチンまたは200 μg/mlのEngelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫由来のECMゲル（Sigma-Aldrich）で予めコーティングした。播種後、チャンバー集合体を3.5時間上下逆にすることによって、細胞を膜の上に付着させた。その後、チャンバーを正しい方向で配置し、EVを上側区画に加えた。37℃にて12時間のインキュベーションの後、膜を取り除き、遊走した側の細胞をメタノール中に固定し（10分）、ギムザ（Histolab）で1時間染色した。非遊走側からの細胞を画像化の前に拭き取った。40×拡大率で3つの視野を画像化した。MSCの遊走および浸潤はEV処理によって用量依存的に有意に増加した（図8Cおよび8D）。この遊走性活性は、同量の遊離TGFβと比較して、MSCをEVで処理した場合に高かった（図9A）。さらに、SMAD2のリン酸化はEB処理したMSCで持続した（図9B）。
【００９９】
まとめると、EVのTGFβ含有亜集団は、インビトロでMSC遊走性活性を誘導し、この活性は、TGFβがEV内に局在する場合よりも強力である。
【０１００】
実施例7. 細胞外小胞のTGFβ含有亜集団はインビボでMSCの遊走および治療効果を増大させる
材料および方法：
肺の炎症のOVA曝露マウスモデルを用いて、EV処理MSCの遊走および治療可能性を評価した。1日目に腹腔内（i.p）注入OVA（8 μg/匹）を実施し、マウスを感作した。連続3日間（14、15および16日目）、マウスを100 μg/匹 OVA（OVA/OVA群）またはPBS（OVA/PBS）に鼻腔内（i.n）で曝した。感作後17日目に、各群のマウスは、EVと共に48時間インキュベートしたかまたはインキュベートしていないかのいずれかの50万のMSC（構成的にルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質を発現する）を受けた。10分、30分、および60分後に、マウスの全身からの生物発光（光子/秒/cm2）をIVISスペクトル（Caliper Life Sciences）によって取得した。3日後、マウスを屠殺し、気管支肺胞（BAL）洗浄液中の好酸球を数えた。
【０１０１】
結果：
炎症性肺組織へのMSCの遊走は、10分、30分、および60分でOVA/OVA群では未処理MSCと比較してEV処理MSCにおいてより高かった（図10A）。しかしながら、OVA/PBS群ではEV処理MSCと未処理MSCの間には差はなかった。注入の3日後、MSCの治療活性をBAL洗浄液における好酸球の計数によって評価した。未処理MSCを注入したマウスと比較して、EV処理MSCを注入したマウスは、OVA/OVA群で好酸球数の低下を示した（図10B）。これらの結果は、TGFβ含有EVは炎症性組織へのMSCの遊走性活性を増大させ、それによって、MSCの治療効果を増強させることを示唆する。
【０１０２】
実施例8. 細胞外小胞の亜集団の運動性
材料および方法：
EVを16,500×gでペレット状に沈降させ、PBSで再懸濁しさらに希釈した。次いで、100 μlの量をガラスボトム培養ディッシュ（35 mmペトリ皿、14 mmマイクロウェル、no. 1.0カバーガラス（1.13〜1.16 mm）、MatTek Corporation）の中心に置き、室温にて15分間沈降させた。次いで、ガラスボトムディッシュをPBSで3回緩やかに洗浄した。Diluent C（Sigma-Aldrich）で1:1000に希釈したPKH67色素を500 μlの量でガラスボトムディッシュの中心に加え、室温にて5分間インキュベートした。次いで、ディッシュを再びPBSで3回緩やかに洗浄し、その後、試料を直ちに顕微鏡（Axio Observer.Z1, Zeiss）下で評価した。微速度撮影の写真を8分間にわたって30秒の間隔で取得し、サンプル中の小胞の運動性を監視した。
【０１０３】
結果：
PKH67色素で標識されたEVは、緑色蛍光シグナルで視覚化され、一定期間にわたりその形態を変化させた（図11）。この結果は、EVの亜集団は運動性活性を有することを示す。
【０１０４】
実施例9. 細胞外小胞の小胞内カーゴの除去による空のEVの作製
材料および方法：
治療用膜小胞の作製の概略図を図12に示す。HMC-1細胞からのEVを高pH溶液（200 mM炭酸ナトリウム、pH 11）で室温にて2時間インキュベートした。膜だけを収集するために、OptiPrep(商標)密度勾配を行った。試料を60％OptiPrep(商標)と混合し、45％OptiPrep(商標)を作製した。混合した45％OptiPrep(商標)を底に置き、10％および30％OptiPrep(商標)で重層した。試料を100,000×gで2時間超遠心した。膜を10％および 30％ OptiPrepの境界面から入手した。単離された膜を超音波処理によって再小胞化した。
【０１０５】
結果：
ZetaView(登録商標) PMX110（Particle Matrix）を用いて測定したEVおよび空のEVのサイズは類似していて、それぞれ124および122 nmのメジアン径を示した（図13A）。小胞内カーゴ、タンパク質、およびRNAをウエスタンブロットおよびバイオアナライザーによってそれぞれ分析した。空のEVは、小胞内タンパク質、βアクチン、およびTSG101が低減していたが、膜タンパク質CD81を依然として含有していた（図13B）。さらに、EVは豊富なRNAを含有した（図13C）が、空のEVはAgilent Bioanalyzerによって測定されるRNAをほとんど含有しなかった（図13D）。加えて、電子顕微鏡によって、高pH処理後に収集したEV膜は小胞を形成しなかった（図14A）が、超音波処理により処理し再小胞化したEVは、典型的なエクソソームの特徴を有する小胞を容易に形成した（図14B）ことを確認した。これらの結果から、発明者らは、小胞内カーゴを有さないEVの膜を高pH処理によって得ることができ、再構成できると結論づけることができた。
【０１０６】
実施例10. 再小胞化した膜小胞の細胞取り込み
材料および方法：
HEK293T細胞からのEVを高pH溶液（200 mM炭酸ナトリウム（aq.)、pH 11）で室温にて2時間インキュベートした。膜を標識するために、親油性色素、DiO（5 μM)を添加し、室温にて1時間インキュベートした。続いて、試料を60％（w/V）イオジキサノールと混合し、45％（w/V）イオジキサノールを含有する試料溶液を得た。試料溶液を遠心管の底に置き、10％（w/V）イオジキサノール溶液、続いて30％（w/V）イオジキサノール溶液を試料溶液の上に加え、密度勾配を形成した。続いて、その内容物を伴う該管を100,000×gにて2時間超遠心し、10％（w/V）イオジキサノール層と30％（w/V）イオジキサノール層との間の境界面から膜を得た。単離された膜を超音波処理に供し、膜小胞を再構成した。同時に、HEK293T細胞からのEVをDiO（5 μM）と共にインキュベートし、上記の通りであるが高pH処理なしのイオジキサノール密度勾配によって精製した。膜小胞およびEVの数をZetaView(登録商標)機器によって測定した。
【０１０７】
FACS分析のために、HEK293T細胞（1×105細胞）を24ウェルプレート上に播種し、一晩インキュベートした。さまざまな数のDiO標識した膜小胞またはEVを細胞と共に37℃または4℃にて1時間インキュベートした。細胞をPBSで1回洗浄し、トリプシン処理し、次いで、4％パラホルムアルデヒドによって室温にて10分間固定した。細胞におけるDiOシグナルをFACSによって分析した。
【０１０８】
共焦点顕微鏡観察のために、HEK293T細胞（1×105細胞）を24ウェルプレート上のガラスのカバースリップ上に播種し、一晩インキュベートした。DiO標識した膜小胞（1×108/ml）またはEV（1×108/ml）を37℃にて異なる時点（3、6、12、24時間）でインキュベートした。細胞をCellMask Deep Red Plasma膜染色色素によって37℃にて10分間染色した。細胞をPBSで1回洗浄し、4％パラホルムアルデヒドによって室温にて10分間固定した。ガラスのカバースリップをDAPIを含むProLong(登録商標) Diamond退色防止用封入剤を用いてスライド上にマウントした。共焦点顕微鏡によって蛍光を観察した。
【０１０９】
結果：
FACSデータは、EVおよび膜小胞のどちらとも、1時間のインキュベーション後にレシピエントHEK293T細胞によって効率的に取り込まれたことを示した。膜小胞はEVと比較して高い蛍光シグナルを示した（図15A〜B）。この取り込みは4℃のインキュベーションによって完全に消失し、取り込みは活性エンドサイトーシス機構と関連することが示唆される（図15C〜D）。
【０１１０】
共焦点データは、膜小胞およびEVのどちらもHEK293T細胞によって取り込まれるが、膜小胞の取り込みはEVより早いことを示した（図16）。
【０１１１】
実施例11. コレステロール-siRNAの膜小胞内への搭載
材料および方法：
HEK293細胞からのEVを1×1012/mlに希釈し、PBSまたは0.1 M炭酸ナトリウムpH 11中で室温にて2時間インキュベートした。調製物を100,000×gで4℃にて15分間ペレット化し、結果として生じたペレットをPSBで1回洗浄して再懸濁した。0.5 μMから5 μMまでの範囲で量を増加させた、ルシフェラーゼを標的とするAlexa 647標識化siRNAと、2種類の調製物をインキュベートした。PBSで懸濁したEVについて、調製物を450 RPMで37℃にて1時間混合した。次いで、各試料を100,000×gで15分間回転してEVをペレット化し、上清を取り除き、ペレットをPBSで再懸濁した。pH 11で処理したEVについて、調製物を30分間超音波処理し、上記の実施例10に記載したようにイオジキサノール勾配で精製した。全ての試料をPBSで再懸濁し、96ウェルプレートに分割し、総蛍光シグナル（647 nmで励起、675 nmで発光）について分析し、Alexa 647標準曲線に対してプロットした。
【０１１２】
結果：
図17に示すように、PBSで再懸濁したEVおよびpH 11で処理したEVどちらも、用量依存的に蛍光siRNAに結合した。測定した全濃度で、pH 11で処理したEVはPBS中のEVより高い蛍光シグナルを有した。使用した最も高いsiRNA濃度（5 μM）で、pH 11小胞は、PBS小胞の約800のsiRNA分子/小胞と比較して、約1,100のsiRNA分子/小胞を含有した。これらの結果は、高pHでEVを処理することによって、未改変EVよりも高い搭載効率を可能にすることを示す。
【０１１３】
実施例12. 高pH処理膜小胞中のsiRNAの内腔保護
材料および方法：
HEK293T細胞からのEVを高pH溶液（200 mM炭酸ナトリウム（aq.)、pH 11）で室温にて2時間インキュベートした。cMycに対するCy3標識化コレステロール-siRNAをさまざまな濃度（0、0.6、2、6、20、60 μM）で添加し、37℃にて1時間インキュベートした。膜を上記のようなイオジキサノール密度勾配によって単離した。単離した膜を超音波処理に供し、膜小胞を再構成した。膜小胞の数をZetaView(登録商標)機器によって測定した。膜小胞上のsiRNAの数を、650 nm/670 nmの励起/発光でVarioscan機器によって測定した、蛍光強度標準曲線に当てはめることによって計算した。
【０１１４】
HEK293T細胞からのEVをCy3標識化コレステロール-siRNA（60 μM）と共に37℃にて1時間インキュベートし、上記のようなイオジキサノール勾配によって精製した。siRNAの数を上述の方法と同じ方法によって計算した。
【０１１５】
Cy3標識化コレステロール-siRNA（60 μM）を搭載した膜小胞およびEVをRNase A（10 μg/ml）と共に37℃にて20分間インキュベートし、次いで、イオジキサノール密度勾配によってさらに単離した。残った蛍光強度を測定し、siRNAの数を計算した。
【０１１６】
結果：
膜小胞の搭載はsiRNA濃度に大きく依存した。図18Aに示すように、膜小胞あたりのsiRNA分子の平均数は、膜小胞が60 μMの最高濃度で使用される場合に、〜10,000に達した。この濃度では、膜小胞はEVより効率的にsiRNAを搭載した（図18B）。重要なことには、EVに付随するsiRNAシグナルの著しい量がRNase A処理後に除去されるのに対して、膜小胞からのsiRNAシグナルはRNase A処理後、より緩やかに低下した（図18C）。これらの結果は、膜小胞は小胞表面上と小胞の内腔内の両方にsiRNAを取り込んだが、EVはその外面上のみにsiRNAを取り込んだことを示唆する。この方法は、膜小胞がEVより効率的に高分子カーゴを搭載できることを実証する。
【０１１７】
実施例13. コレステロール-siRNAを搭載した膜小胞の取り込み
材料および方法：
上述の実施例12に記載したように、Cy3標識化コレステロール-siRNA（60 μM）を膜小胞に搭載した。HEK293T細胞（1×105細胞）を24ウェルプレート上のガラスのカバースリップ上に播種し、一晩インキュベートした。siRNAを搭載した膜小胞（5×108/ml）を37℃にて異なる期間（3、6、12、24時間）インキュベートした。細胞をPBSで1回洗浄し、4％パラホルムアルデヒドによって室温にて10分間固定した。ガラスのカバースリップをDAPIを含むProLong(登録商標) Diamond退色防止用封入剤を用いてスライド上にマウントした。共焦点顕微鏡によって蛍光を観察した。
【０１１８】
結果：
レシピエント細胞の細胞質中の蛍光シグナルは、処理後3時間および6時間で最も強く観察されたが、12時間および24時間で低減した（図19）。蛍光siRNA取り込みシグナルのキネティクスは、上記実施例10で記載されたような膜小胞の取り込みと類似していた。この結果は、siRNAを搭載した膜小胞がレシピエント細胞の細胞質に効率的に送達されたことを示す。
【０１１９】
実施例14. 細胞からのオルガネラの単離
材料および方法：
粗オルガネラ調製物をHMC-1細胞から作製した。簡単に説明すると、細胞をPBSで洗浄し、氷中で氷冷した緩衝液I（150 mM NaCl、50 mM HEPES pH 7.4および25 μg/mlジギトニン）で20分間懸濁し、次いで2,000×gで遠心分離し、細胞をペレット化した。このペレットを氷中で緩衝液II（150 mM NaCl、50 mM HEPES pH 7.4および1％ NP40）で40分間インキュベートし、7,000×gで遠心分離し、核および細胞デブリをペレット化した。膜に包まれた粗オルガネラを含有する上清を、小胞体（ER）、ゴルジ、ミトコンドリア、および一部の核内腔タンパク質において濃縮した。この画分を60％イオジキサノールと混合し、以下のさまざまなパーセンテージのOptiPrep(商標)をロードして密度勾配を形成し（0、20、22、24、26、28、30、35および50％）、178,000×gで16時間超遠心した。10の画分（上から下）を収集し、Exiqonトータル植物および動物細胞キット（Exiqon）を用いるRNA単離に供した。さまざまな浮遊密度中のRNA痕跡の分布をBioanalyzerプロファイルによって決定した。
【０１２０】
結果：
図20に示すように、勾配中のRNAの分布は非常に広範であり、RNA痕跡は勾配全体にわたって認められた。興味深いことに、長いRNA（16sおよび18s rRNA）配列は低密度画分において濃縮されたが、短いRNA伸長は高密度画分で高度に濃縮された。粗オルガネラの全体的な分布は、EV調製物から見られるRNAプロファイルに類似していた。このRNAベースの分布データは、細胞オルガネラが混合EV集団におけるEVのサブセットに寄与することを示す。
【図１】
2019513019.tif 000004
【図２】
2019513019.tif 000005
【図３Ａ】
2019513019.tif 000006
【図３Ｂ】
2019513019.tif 000007
【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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