(57)【要約】  本発明は、フルクトースからアロースを生産する組換え菌株、前記菌株を含むフルクトース−含有原料からアロースを生産するアロース生産用組成物、およびこれを用いたアロースの製造方法に関するものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プシコースエピマー化酵素（ｐｓｉｃｏｓｅ  ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）をコードするヌクレオチド配列およびアロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクター。
【請求項２】
前記プシコースエピマー化酵素は、配列番号１〜３からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項３】
前記アロース異性化酵素は、配列番号４のアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項４】
前記プシコースエピマー化酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５〜９からなる群より選択された塩基配列を含むものである、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項５】
前記アロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０の塩基配列を含むものである、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項６】
前記プシコースエピマー化酵素およびアロース異性化酵素は、リンカーペプチドで連結された一つの融合蛋白質である、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項７】
前記プシコースエピマー化酵素は配列番号１〜３からなる群より選択されたアミノ酸配列を含み、前記アロース異性化酵素は配列番号４のアミノ酸配列を含むものである、請求項６に記載の組換えベクター。
【請求項８】
前記リンカーペプチドは、１〜６個のアミノ酸からなるものである、請求項６に記載の組換えベクター。
【請求項９】
前記融合蛋白質は、配列番号２３または２５のアミノ酸配列を含むものである、請求項６に記載の組換えベクター。
【請求項１０】
前記融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２２または２４の塩基配列を含むものである、請求項６に記載の組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１〜１０のうちのいずれか一項の組換えベクターで形質転換された組換え菌株、前記組換え菌株の培養物またはこれらの混合物を含む、フルクトース−含有原料からのアロース生産用組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、１２〜１５％の転換率でフルクトースからアロースを生産することを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記アロースは、フルクトース、プシコースおよびアロースから構成された糖類組成物１００重量％基準に、フルクトース６０〜６３重量％、プシコース２４〜２６重量％、およびアロース１２〜１５重量％を含む混合糖組成物の形態である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、銅イオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン、アルミニウムイオン、およびカルシウムイオンからなる群より選択された１種以上の金属イオンを含まないものである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１０のうちのいずれか一項の組換えベクターで形質転換された組換え菌株、前記組換え菌株の培養物、またはこれらの混合物をフルクトース−含有原料と反応させる段階を含むフルクトース−含有原料からアロース（ａｌｌｏｓｅ）を生産する方法。
【請求項１６】
前記方法は、フルクトースから１２〜１５％の転換率でアロースを生産することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アロースは、フルクトース、プシコースおよびアロースから構成された糖類組成物１００重量％基準に、フルクトース６０〜６３重量％、プシコース２４〜２６重量％、およびアロース１２〜１５重量％を含む混合糖組成物の形態である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記反応に使用されるフルクトースの濃度は１０〜８０％（ｗ／ｖ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記反応は、ｐＨ６〜９の条件下で行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記反応は３０℃〜８０℃の温度条件下で行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は、銅イオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン、アルミニウムイオン、およびカルシウムイオンからなる群より選択された１種以上の金属イオンを添加する段階を含まない、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
プシコースエピマー化酵素（ｐｓｉｃｏｓｅ  ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）およびアロース異性化酵素がリンカーペプチドで連結された融合蛋白質を含むフルクトースからのアロース生産用酵素。
【請求項２３】
前記プシコースエピマー化酵素は配列番号１〜３からなる群より選択された１種のアミノ酸配列を含むものであり、前記アロース異性化酵素は配列番号４のアミノ酸配列を含むものである、請求項２２に記載の酵素。
【請求項２４】
前記リンカーペプチドは、１〜６個のアミノ酸配列からなるものである、請求項２２に記載のフルクトースからのアロース生産用酵素。
【請求項２５】
前記融合蛋白質は、配列番号２３または２５のアミノ酸配列を含むものである、請求項２２に記載のフルクトースからのアロース生産用酵素。
【請求項２６】
前記酵素は、フルクトースから１２〜１５％の転換率でアロースを生産することを特徴とする、請求項２２に記載の酵素。
【請求項２７】
生物学的方法で生産され、フルクトース、プシコースおよびアロースから構成された糖類組成物１００重量％基準に、フルクトース６０〜６３重量％、プシコース２４〜２６重量％、およびアロース１２〜１５重量％を含む混合糖組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フルクトースからアロースを生産する組換え菌株、前記菌株を含むフルクトース−含有原料からアロースを生産するアロース生産用組成物、およびこれを用いたアロースの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アロース（Ｄ−ａｌｌｏｓｅ）はグルコース（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）と３番炭素の−ＯＨ基方向のみ異なるエピマー（ｅｐｉｍｅｒ）であって、プシコース（ｐｓｉｃｏｓｅ）の異性体と知られた希少糖単糖類である。アロースは血栓形成、臓器移植手術患者の自己免疫反応および癌細胞の増殖を抑制する機能を有している。また、肝と脳の虚血後神経細胞の死滅を延長させる効果もあり、白血病患者の治療薬としても研究が行われている。
【０００３】
前記のような特徴により、アロースは医薬分野で次世代核心素材として高い利用価値があるが、自然系に極めて珍しく存在するため、産業的に適用するためには効率的な生産工程を開発することが必要である。従来にアロースは主に化学的合成方法によってのみ生産されたが、付加的な糖類の生成およびこれによる複雑な精製過程と工程上で化学的廃棄物が発生するという問題がある。
【０００４】
よって、最近は微生物が生産する酵素を用いてアロースを大量生産する方法が提案された。日本香川大学のイズモリグループで始めてシュードモナススタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来のラムノース異性化酵素（Ｌ−ｒｈａｍｎｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）を用いてプシコースからアロースを生産して報告したが（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５（５）；５３９−５４１、１９９８）、前記酵素はアロース生成時に副産物として多量のアルトロース（Ｄ−ａｌｔｒｏｓｅ）も共に生成させる短所があった。
【０００５】
したがって、アルトロースのような副産物を生成せず、産業化に適した温度およびｐＨ条件を示し、高い熱安定性を示し、高い収率でアロースを生産することができる酵素の開発が要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、プシコースエピマー化酵素（ｐｓｉｃｏｓｅ  ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）をコードするヌクレオチド配列およびアロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、前記組換えベクターを含む組換え菌株を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記組換え菌株、前記組換え菌株の培養物、および前記組換え菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上を含むアロース生産用組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、組換え菌株、前記組換え菌株の培養物、およびこれらの混合物をフルクトース−含有原料と反応させる段階を含むフルクトース−含有原料からアロースを生産する方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、配列番号２３または２５のアミノ酸配列を含むフルクトースからアロース生産用融合蛋白質を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記フルクトース、プシコースおよびアロースを含む混合糖組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、フルクトースからアロースを生産する組換え菌株、前記菌株を含むフルクトース−含有原料からアロースを生産するアロース生産用組成物、およびこれを用いたアロースの製造方法に関するものである。
【００１３】
既存のアロースを化学的合成方法によって生産する場合、付加的な糖類の生成およびこれによる複雑な精製過程と工程上で化学的廃棄物が発生し、微生物を用いた方法はアロース生成時に副産物として多量のアルトロース（Ｄ−ａｌｔｒｏｓｅ）も共に生成させる短所があるので、アルトロースのような副産物を生成せず、産業化に適した温度およびｐＨ条件を示し高い熱安定性を示し、高い収率でフルクトースからアロースを生産することができるアロースの製造方法を提供しようとする。
【００１４】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
【００１５】
ここに本発明の一つの様態は、プシコースエピマー化酵素（ｐｓｉｃｏｓｅ  ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）をコードするヌクレオチド配列およびアロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供する。
【００１６】
前記プシコースエピマー化酵素は、クロストリジウムシンデンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃｉｎｄｅｎｓ）、エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）またはトレポネーマプリミティア（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｒｉｍｉｔｉａ）に由来したものであってもよい。
【００１７】
前記クロストリジウムシンデンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃｉｎｄｅｎｓ）に由来したプシコースエピマー化酵素（以下、ＣＤＰＥ）は、フルクトースからプシコースを生産する活性を有する蛋白質である。例えば、前記ＣＤＰＥは、配列番号１のアミノ酸配列を有しフルクトースからプシコースを生産する活性を有するものであってもよい。前記ＣＤＰＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドをコードするヌクレオチド配列、例えば、配列番号５の塩基配列および／または配列番号６の塩基配列を含んでもよい。
【００１８】
前記ＣＤＰＥは、ソジウムドデシルスルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定された単量体の分子量が３０〜３７ｋＤａ、例えば３０〜３５ｋＤａであるものであってもよい。前記ＣＤＰＥの最適温度は４０〜６５、具体的に５０〜６５であってもよい。前記最適温度は、例えば、ｐＨ７．０、１ｍＭ  Ｃｏ２＋存在下で５分間反応進行時の結果であり得るが、これに制限されない。また、前記蛋白質の最適ｐＨは、ｐＨ６〜９、ｐＨ７〜９、ｐＨ７〜８．５、またはｐＨ７〜８であってもよい。前記最適ｐＨは例えば、６０、１ｍＭ  Ｃｏ２＋存在下で５分間反応進行の結果であり得るが、これに制限されるものではない。
【００１９】
前記エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）に由来したプシコースエピマー化酵素（以下、ＥＤＰＥ）は、フルクトースからプシコースを生産する活性を有する蛋白質である。例えば、前記ＥＤＰＥは、配列番号２のアミノ酸配列を有しフルクトースからプシコースを生産する活性を有するものであってもよい。
【００２０】
前記ＥＤＰＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号７の塩基配列を含んでもよい。
【００２１】
前記トレポネーマプリミティア（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｒｉｍｉｔｉａ）に由来したプシコースエピマー化酵素（以下、ＴＤＰＥ）は、フルクトースからプシコースを生産する活性を有する蛋白質である。例えば、前記ＴＤＰＥは、配列番号３のアミノ酸配列を有しフルクトースからプシコースを生産する活性を有するものであってもよい。
【００２２】
前記ＴＤＰＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドをコードするヌクレオチド配列、例えば、配列番号８の塩基配列および／または配列番号９の塩基配列を含んでもよい。
【００２３】
前記プシコースエピマー化酵素は、フルクトースをプシコースに転換する活性が維持される限り、配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸のうちの一部が置換、挿入および／または欠失されたものであってもよい。例えば、前記プシコースエピマー化酵素は、配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００２４】
前記プシコースエピマー化酵素をコードするヌクレオチド配列は、クロストリジウムシンデンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃｉｎｄｅｎｓ）、エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）またはトレポネーマプリミティア（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｒｉｍｉｔｉａ）から得られたプシコースエピマー化酵素のコーディングヌクレオチド配列であるか、大腸菌またはコリネバクテリウム属菌株で発現に最適化することができるように変形されたヌクレオチド配列であってもよい。
【００２５】
例えば、前記プシコースエピマー化酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドをコーディングするヌクレオチド配列、配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドをコーディングするヌクレオチド配列または配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドをコーディングするヌクレオチド配列であってもよい。
【００２６】
具体的に、前記プシコースエピマー化酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５〜配列番号９からなる群より選択されたヌクレオチド配列を含むものであってもよい。または、前記配列番号５〜配列番号９からなる群より選択されたヌクレオチド配列に対して実質的同一性を有するヌクレオチド配列を含むものであってもよい。
【００２７】
前記アロース異性化酵素は、パーセフォネラマリナ（Ｐｅｒｓｅｐｈｏｎｅｌｌａ  ｍａｒｉｎａ）ＥＸ−Ｈ１に由来したものであってもよく、好ましくは配列番号４のアミノ酸配列を含むペプチドを含むアロース異性化酵素であってもよい。
【００２８】
前記アロース異性化酵素は、プシコースをアロースに異性化する酵素活性が維持される限り、配列番号４のアミノ酸のうちの一部が置換、挿入および／または欠失されたものであってもよい。例えば、前記アロース異性化酵素は、配列番号４のアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００２９】
前記アロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列は、パーセフォネラマリナ（Ｐｅｒｓｅｐｈｏｎｅｌｌａ  ｍａｒｉｎａ）ＥＸ−Ｈ１から得られたアロース異性化酵素のコーディングヌクレオチド配列であるか、大腸菌またはコリネバクテリウム属菌株で発現に最適化することができるように変形されたヌクレオチド配列であってもよい。
【００３０】
例えば、前記アロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４のアミノ酸配列を含むペプチドをコーディングするヌクレオチド配列であってもよい。例えば、配列番号１０の塩基配列を含むヌクレオチドであってもよい。または前記配列番号１０のヌクレオチド配列に対して実質的同一性を有するヌクレオチド配列を含むものであってもよい。
【００３１】
前記の実質的な同一性は、それぞれのヌクレオチド配列と任意の他のヌクレオチド配列をできる限り対応するように整列し、その配列を分析して、前記任意の他のヌクレオチド配列がそれぞれのヌクレオチド配列と７０％以上、９０％以上、または９８％以上の配列相同性を有することを意味する。
【００３２】
当該分野の通常の知識を有する技術者は、当該分野に公知された遺伝子組換え技術などを用いて前記ヌクレオチド配列中の一つまたはそれ以上の塩基を置換、付加または欠失させることによって前記実質的相同性を有する範囲で同一な活性を有する酵素蛋白質をコードするヌクレオチド配列を製造することができるのを容易に理解できるはずである。このような相同性の比較は、市販されるコンピュータプログラムを用いて２つ以上の配列間の相同性を百分率（％）で計算して行うことができる。
【００３３】
本発明による具体的な酵素のアミノ酸配列を表１に、これをコードするヌクレオチド配列を下記表２〜３に例として記載する。
【表１】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【００３４】
前記プシコースエピマー化酵素およびアロース異性化酵素は、リンカーペプチドで連結された一つの融合蛋白質であってもよい。
【００３５】
前記プシコースエピマー化酵素は、配列番号１〜３からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むものであってもよい。また、前記アロース異性化酵素は、配列番号４のアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００３６】
前記リンカーペプチドは、１〜６個のアミノ酸配列からなるものであってもよい。前記リンカーペプチドが前記アミノ酸個数未満または超過であれば、二つの蛋白質を連結する時、互いの蛋白質の構造に否定的な影響を与えることがあるため、前記個数が適当である。
【００３７】
前記一つの融合された蛋白質は、配列番号２３または２５のアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００３８】
また、前記融合された蛋白質は、プシコースエピマー化酵素をコードするヌクレオチド配列およびアロース異性化酵素をコードするヌクレオチド配列が一つの融合されたヌクレオチド配列によってコードするものであってもよく、前記一つの融合されたヌクレオチド配列は配列番号２２または配列番号２４の塩基配列を含む配列であってもよい。
【表４】
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【表５】
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【００３９】
前記組換えベクターは、当業界に広く知られた方法によってクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築され得る（Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ｂａｎｅｙｘ、ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９９、１０：４１１−４２１）。前記組換えベクターは遺伝子組換えに用いられてきたベクターであれば全て使用可能であり、例えば、プラスミド発現ベクター、ウイルス発現ベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）およびこれらと同等な機能を果たすことができるウイルスベクターなどからなる群より選択されたものであってもよいが、これらに限定されるのではない。
【００４０】
例えば、前記組換えベクターは、ｐＡＣＹＣ、ＲＳＦ、ｐＥＴ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＴｒｃ９９ａ、ｐＫＤ、ｐＸＭＪ１９、ｐＣＥＳ２０８ベクターなどからなる群より選択されたものから製作されたものであってもよく、好ましくはｐＡＣＹＣまたはＲＳＦであってもよい。
【００４１】
前記組換えベクターとは作動可能なように連結された目的ポリヌクレオチドを伝達することができる組換え核酸分子を意味し、前記目的ポリヌクレオチドはプロモーターおよび転写終結因子などからなる一つ以上の転写調節要素と作動可能に連結されているものであってもよい。
【００４２】
前記転写終結因子は、ｒｒｎＢ、ｒｒｎＢ＿Ｔ１、ｒｒｎＢ＿Ｔ２、Ｔ７ターミネーターなどであってもよく、好ましくはｐＥＴ２１ａベクターからＰＣＲされたＴ７転写終結因子であってもよい。
【００４３】
本発明のまた他の様態は、前記組換えベクターで形質転換された組換え菌株に関するものである。
【００４４】
本発明による具体的な組換えベクターの開裂地図を図１〜図４に例示的に記載した。
【００４５】
前記組換えベクターで宿主細胞を形質転換させる方法は、当業界に公知された全ての形質転換方法を特別な制限なく選択して用いることができ、例えば、細菌原形質体の融合、電気穿孔法、推進体砲撃（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、およびウイルスベクターを用いた感染などから選択されたものであってもよい。
【００４６】
本発明による形質転換された組換え菌株は高い安定性を有し、導入されたプシコースエピマー化酵素およびアロース異性化酵素を過発現することができ、したがって長期間安定的に高いアロース転換能を提供することができる。したがって、前記形質転換された組換え菌株はアロース製造に有用に適用され、アロース生産収率をより増進させることができる。
【００４７】
前記組換え菌株の培養は、適当な培地で当業界で知られている多様な培養方法によって行うことができる。前記培養方法の例には、回分式、連続式および流加式培養が含まれる。前記流加式培養には注入配置および反復注入配置培養が含まれるが、これに限定されるのではない。
【００４８】
本発明によって用いることができる培地は、一般に一つ以上の炭素供給源、窒素供給源、無機塩、ビタミンおよび（または）微量元素を含む。好ましい炭素供給源は、単糖類、二糖類または多糖類のような糖類である。窒素供給源は、一般に有機または無機窒素化合物、またはこれら化合物を含む物質である。窒素供給源の例としてはアンモニア気体またはアンモニウム塩、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウム、ニトラート、ウレア、アミノ酸、または複合窒素供給源、例えばとうもろこし浸漬液、大豆粉末、大豆蛋白質、酵母抽出物、肉類抽出物などがある。窒素供給源は単独で、または混合物として使用することができる。
【００４９】
培地に存在し得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リン酸塩または硫酸塩を含む。リン供給源として、リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム−含有塩を使用することができる。溶液中の金属イオンを維持させるために、培地にキレート剤を添加することができる。培地の全ての成分は加熱（１．５ｂａｒおよび１２１℃で２０分）または滅菌ろ過によって滅菌させる。これら成分は共に、または必要によって個別的に滅菌させることができる。培地の全ての成分は培養開始時に存在してもよく、または任意には連続または回分式に添加されてもよい。
【００５０】
本発明のまた他の様態は、前記組換え菌株の菌体および／または組換え菌株の培養物を含むアロース生産用組成物を提供する。
【００５１】
前記組成物は、フルクトース−含有原料からアロースを製造するものであってもよい。また、前記培養物は前記組換え菌株から生産された酵素を含むものであって、前記菌株を含むか、菌株を含まない無細胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）形態であってもよい。
【００５２】
本明細書において、別途の言及がない限り、アロースの製造に使用される組換え菌株は前記菌株の菌体および／または前記菌株の培養物を意味するものとして使用される。
【００５３】
前記アロース生産用組成物において、前記アロースは、フルクトース、プシコースおよびアロースから構成された糖類組成物の形態のものであってもよく、例えば、フルクトース、プシコースおよびアロースから構成された糖類組成物１００重量％基準に、フルクトース６０〜６３重量％、プシコース２４〜２６重量％およびアロース１２〜１５重量％を含む混合糖組成物の形態のものであってもよい。
【００５４】
前記組成物は、フルクトースから１２％以上、例えば、１２〜１５％、１２〜１４％または１２〜１３％の転換率でアロースを生産するものであってもよい。フルクトースからプシコースを生産した後、プシコースからアロースを生産する２段階の工程による場合には約９％程度の転換率でアロースが生産され、一つの工程によって生産することができないため時間が長くかかり、生産費用が増加する問題点が生ずる。しかし、前記組成物を用いてアロースを生産する場合には、１段階の工程によってアロースを生産することができるので時間が短縮され生産費用を節減することができ、特に２段階の工程によって生産する場合より３０％以上向上した収率でアロースを生産することができる。
【００５５】
前記組成物は、銅イオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン、アルミニウムイオン、およびカルシウムイオンからなる群より選択された１種以上の金属イオンを含まないものであってもよい。
【００５６】
本発明のまた他の様態は、前記組換え菌株の菌体および／または前記組換え菌株の培養物を含むアロース生産用組成物をフルクトース−含有原料と接触してアロースを生産する方法を提供する。
【００５７】
前記アロース生産方法は、前記組換え菌株をフルクトース−含有原料と反応させる段階を含む。一実施形態で、前記組換え菌株をフルクトースと反応させる段階は、前記組換え菌株の菌体をフルクトースが含まれている培養培地で培養する段階によって行うことができる。他の実施形態で、前記組換え菌株をフルクトースと反応させる段階は、前記組換え菌株（菌体および／または菌株の培養物）をフルクトースと接触させる段階、例えば、前記組換え菌株をフルクトースと混合する段階または前記組換え菌株が固定化された担体にフルクトースを接触させる段階によって行うことができる。このように組換え菌株をフルクトースと反応させることによってフルクトースをプシコースに転換し、プシコースをアロースに転換してフルクトースからアロースを生産することができる。
【００５８】
前記アロース生産方法において、前記アロースはフルクトース、プシコースおよびアロースから構成された糖類組成物の形態のものであってもよく、例えば、フルクトース、プシコースおよびアロースから構成された糖類組成物１００重量％基準に、フルクトース６０〜６３重量％、プシコース２４〜２６重量％およびアロース１２〜１５重量％を含む混合糖組成物の形態のものであってもよい。
【００５９】
また、前記方法は、フルクトースから１２％以上、例えば、１２〜１５％、１２〜１４％または１２〜１３％の転換率でアロースを生産するものであってもよい。
【００６０】
また、前記アロース生産方法において、効率的なプシコース生産のために、基質として使用されるフルクトースの濃度は、全体反応物基準に１０〜８０％（ｗ／ｖ）、２０〜３０％（ｗ／ｖ）、４０〜８０％（ｗ／ｖ）、１０〜７５％（ｗ／ｖ）、２０〜７５％（ｗ／ｖ）、３０〜７５％（ｗ／ｖ）、例えば、４０〜７５％（ｗ／ｖ）であってもよい。フルクトースの濃度が前記範囲より低ければ経済性が低くなり、前記範囲より高ければフルクトースがよく溶解されないので、フルクトースの濃度は前記範囲とすることがよい。前記フルクトースは、緩衝溶液または水（例えば、蒸留水）に溶解された溶液状態で使用することができる。
【００６１】
前記アロース生産方法において、前記反応は、ｐＨ６〜９、例えば、ｐＨ７〜９、ｐＨ７〜８またはｐＨ８〜９の条件下で行うことができる。また、前記反応は、３０以上、例えば４０以上の温度条件下で行うことができる。温度が８０以上になれば基質のフルクトースの褐変現象が起こることがあるので、前記反応は３０〜８０、例えば、３５〜８０、４０〜８０、３５〜７５、４０〜７５、３５〜７０または４０〜７０の条件下で行うことができる。
【００６２】
また、前記生産方法において、前記反応時間が長いほど、アロース転換率が高くなる。例えば、前記反応時間は１時間以上、例えば２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上または６時間以上とすることがよい。反応時間が４８時間を超過すればアロース転換率の増加率が微少であるか、むしろ減少するので、反応時間は４８時間を超過しないことがよい。したがって、前記反応時間は１〜４８時間、２〜４８時間、３〜４８時間、４〜４８時間、５〜４８時間、または６〜４８時間にしてもよく、産業的および経済的側面を考慮して、１〜４８時間、２〜３６時間、３〜２４時間、３〜１２時間、または３〜６時間程度にしてもよいが、これに制限されるものではない。前記条件は、フルクトースからアロースロへの転換効率が最大化される条件として選定されたものである。
【００６３】
また、前記アロース生産方法において、使用される組換え菌株の菌体濃度は、全体反応物基準に５ｍｇ（ｄｃｗ：乾燥細胞重量）／ｍｌ以上、例えば、５〜１００ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、１０〜９０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、２０〜８０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、３０〜７０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、４０〜６０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、または４５〜５５ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌであってもよい。菌体濃度が前記範囲未満である場合にはアロース転換活性が低いか殆どなく、前記範囲を超過すれば菌体が過度に多くなりアロース転換反応の全体的な効率が低くなるので、菌体濃度は前記範囲とすることがよい。
【００６４】
また、前記アロース生産方法において、前記方法は、銅イオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン、アルミニウムイオン、およびカルシウムイオンからなる群より選択された１種以上の金属イオンを添加しないものであってもよい。
【００６５】
本発明のまた他の様態は、プシコースエピマー化酵素（ｐｓｉｃｏｓｅ  ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）およびアロース異性化酵素がリンカーペプチドで連結された融合蛋白質を含むフルクトースからアロース生産用酵素を提供する。
【００６６】
前記酵素は、フルクトースから１２％以上、例えば、１２〜１５％、１２〜１４％または１２〜１３％の転換率でアロースを生産することを特徴とするものである。
【００６７】
また、前記プシコースエピマー化酵素は、配列番号１〜３からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むものであってもよい。また、前記アロース異性化酵素は、配列番号４のアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００６８】
前記リンカーペプチドは、１〜６個のアミノ酸からなるものであってもよい。前記リンカーペプチドが前記アミノ酸個数未満であるか超過であれば、二つの蛋白質を連結する時、互いの蛋白質の構造に否定的な影響を与えることがあるため、前記個数が適当である。
【００６９】
前記一つの融合された蛋白質は、配列番号２３または２５のアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００７０】
本発明のまた他の様態は、生物学的方法で生産され、フルクトース、プシコースおよびアロースから構成された糖類組成物１００重量％基準に、フルクトース６０〜６３重量％、プシコース２４〜２６重量％およびアロース１２〜１５重量％を含む混合糖組成物を提供する。
【発明の効果】
【００７１】
本発明は、フルクトースからアロースを生産する組換え菌株、前記組換え菌株を含むフルクトース−含有原料からアロースを生産するアロース生産用組成物、およびこれを用いたアロースの製造方法に関するものであって、本発明による組換え菌株および／またはこれを用いたアロースの製造方法を用いて、副産物を生成せず、産業化に適した温度およびｐＨ条件を示し高い熱安定性を示し、高い収率でアロースを生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の一実施形態によってｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクターにＣＤＰＥまたはＴＤＰＥとＲＰＩ遺伝子を導入した組換えベクターの開裂地図を示したものである。
【図２】本発明の一実施形態によってｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクターにＥＤＰＥとＲＰＩ遺伝子を導入した組換えベクターの開裂地図を示したものである。
【図３】本発明の一実施形態によってＲＳＦＤｕｅｔ−１ベクターにＣＤＰＥまたはＴＤＰＥとＲＰＩ遺伝子を導入した組換えベクターの開裂地図を示したものである。
【図４】本発明の一実施形態によってＲＳＦＤｕｅｔ−１ベクターにＥＤＰＥとＲＰＩ遺伝子を導入した組換えベクターの開裂地図を示したものである。
【図５】本発明の一実施形態によるＲＳＦ＿ＣＤＰＥ＿ＲＰＩ菌株の温度による細胞反応活性分析結果を示すグラフである。
【図６】本発明の一実施形態によるＲＳＦ＿ＴＤＰＥ＿ＲＰＩ菌株の温度による細胞反応活性分析結果を示すグラフである。
【図７】本発明の一実施形態によるＲＳＦ＿ＥＤＰＥ＿ＲＰＩ菌株の温度による細胞反応活性分析結果を示すグラフである。
【図８】本発明の一実施形態によるＲＳＦ＿ＣＤＰＥ＿ＲＰＩ菌株のｐＨによる細胞反応活性分析結果を示すグラフである。
【図９】本発明の一実施形態によるＲＳＦ＿ＴＤＰＥ＿ＲＰＩ菌株のｐＨによる細胞反応活性分析結果を示すグラフである。
【図１０】本発明の一実施形態によるＲＳＦ＿ＥＤＰＥ＿ＲＰＩ菌株のｐＨによる細胞反応活性分析結果を示すグラフである。
【図１１】本発明の一実施形態によるＲＳＦ＿ＣＤＰＥ＿ＲＰＩ菌株での酵素の金属イオン要求性分析結果を示すグラフである。
【図１２】本発明の一実施形態によるＲＳＦ＿ＴＤＰＥ＿ＲＰＩ菌株での酵素の金属イオン要求性分析結果を示すグラフである。
【図１３】本発明の一実施形態によるＲＳＦ＿ＥＤＰＥ＿ＲＰＩ菌株での酵素の金属イオン要求性分析結果を示すグラフである。
【図１４】本発明の一実施形態によるＲＳＦ＿ＣＤＰＥ＿ＲＰＩ菌株の細胞反応熱安定性分析結果を示すグラフである。
【図１５】本発明の一実施形態によるＲＳＦ＿ＴＤＰＥ＿ＲＰＩ菌株の細胞反応熱安定性分析結果を示すグラフである。
【図１６】本発明の一実施形態によるＲＳＦ＿ＥＤＰＥ＿ＲＰＩ菌株の細胞反応熱安定性分析結果を示すグラフである。
【図１７】本発明の一実施形態による１５％フルクトースからアロース生産結果を示すグラフである。
【図１８】本発明の一実施形態による５０％フルクトースからアロース生産結果を示すグラフである。
【図１９】本発明の一実施形態によってｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクターにＣＤＰＥまたはＴＤＰＥとＲＰＩ遺伝子が融合された遺伝子を導入した組換えベクターの開裂地図を示したものである。
【図２０】本発明の一実施形態による融合酵素の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて確認した写真である。
【図２１】本発明の一実施形態による融合酵素のアロース転換率を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
以下、本発明を下記の実施例によってさらに詳しく説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例によって限定されるのではない。
【実施例】
【００７４】
実施例１．デュエットプラスミドの製造および形質転換
遺伝子組換えによって、プシコースからアロースを生産するＲＰＩ酵素と共に一つの菌株で、フルクトースからプシコースを生産する酵素ＣＤＰＥ、ＥＤＰＥ、またはＴＤＰＥそれぞれを発現させるためのプラスミドを製作した。
【００７５】
具体的に、ＲＰＩコーディング配列を導入したベクターを製造するために、ＲＰＩ蛋白質の配列番号４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１）をＮｄｅＩとＸｈｏＩ（ＮＥＢ）を用いて発現ベクターのｐＡＣＹＣ（ＮＯＶＡＧＥＮ）またはＲＳＦ（ＮＯＶＡＧＥＮ）の同一な制限酵素部位に挿入して組換えベクターを製造した。
【００７６】
その次に、プシコースエピメラーゼコーディング配列を導入したベクターを製造するために、先ずプシコースエピメラーゼコーディング配列を製造した。
【００７７】
具体的に、クロストリジウムシンデンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃｉｎｄｅｎｓ）に由来した配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（Ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ：ＥＤＳ０６４１１．１）、エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）に由来した配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、トレポネーマプリミティア（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｒｉｍｉｔｉａ）に由来した配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとして（Ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ：ＷＰ＿０１０２５６４４７）、発現菌株として使用される大腸菌に最適化されるように元のコーディングポリヌクレオチドの塩基配列（それぞれ配列番号５、７および８）およびこれに変形が加わったポリヌクレオチド（それぞれ配列番号６および９）をバイオニア（Ｂｉｏｎｅｅｒ．Ｃｏ、Ｋｏｒｅａ）に依頼して合成した。
【００７８】
その次に、制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩ（ＮＥＢ）を用いて、前記合成されたそれぞれのプシコースエピメラーゼコーディングポリヌクレオチドをＲＰＩ遺伝子が挿入された発現ベクターのｐＡＣＹＣ（ＮＯＶＡＧＥＮ）またはＲＳＦ（ＮＯＶＡＧＥＮ）の同一な制限酵素部位に挿入し、ＲＰＩが含まれている組換えベクターにＴＤＰＥ、ＣＤＰＥ、ＥＤＰＥをそれぞれ挿入して一つのベクターに二つの遺伝子（ＲＰＩ酵素遺伝子およびプシコースエピメラーゼ酵素遺伝子）が挿入されるようにした。前記制限酵素は下記表６に示した。
【表６】
2019503711.tif 000012
【００７９】
その次に、ヒートショック（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を前記製作したそれぞれの組換えベクターで形質転換して組換え大腸菌菌株を製造した。
【００８０】
前記製造された組換え大腸菌菌株を５ｍｌ  ＬＢ−アンピシリン（ＬＢ−ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ）培地（Ｄｉｆｃｏ）に接種した後、６００ｎｍでの吸光度（ＯＤ）が１．５に到達するまで３７℃、２００ｒｐｍで振とう培養し、これを再び５００ｍｌ  ＬＢ−アンピシリン培地に接種した後、３７℃の振とう培養機で種培養した。その次に、培養液の６００ｎｍで吸光度が０．５である時、１ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加して目的酵素の過発現を誘導した。前記過発現誘導時点から培養条件を１６℃および１５０ｒｐｍに転換して１６時間維持した。
【００８１】
実施例２．アロース生産菌株の反応条件確立
２−１．温度による細胞反応活性分析
アロース生産最適温度を確認するために、１０％（ｖ／ｖ）フルクトース１ｍｌ、５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０）溶液に、実施例２で分離された菌株の菌体濃度を５ｍｇ／ｍｌ＿ＤＣＷ範囲で、６０℃下で２時間反応させ、基質反応停止のために５分間加熱して反応を終了（停止）させた後に、最大活性を示す温度を測定した。その次に、二時間のフルクトースからのアロース転換率を測定して、最適温度でのアロース転換率を１００％にした時のそれぞれの温度でのアロース転換率の相対的な値で示した（図面のＹ軸値のＲＡ（％））。その結果を下記表７および図５〜７に示した。
【００８２】
［計算式］
転換率（％）＝（生産量／いれた基質量）＊１００
いれた基質量＝残余フルクトース＋プシコース残余量＋アロース生産量
【表７】
2019503711.tif 000013
【００８３】
上記表７および図５〜７に示されているように、ＲＳＦ＿ＴＤＰＥ＿ＲＰＩは５５℃で（図５）最適の活性を示すのを、ＲＳＦ＿ＣＤＰＥ＿ＲＰＩ（図６）とＲＳＦ＿ＥＤＰＥ＿ＲＰＩ（図７）は５０℃で最適の活性を示すのを確認することができた。
【００８４】
２−２．ｐＨによる細胞反応活性分析
ｐＨによる細胞反応活性を分析するために、実施例１で分離された菌株の菌体濃度５ｍｇ／ｍｌ＿ＤＣＷおよびフルクトース濃度１０％（ｖ／ｖ）の緩衝溶液５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ、ｐＨ４〜５）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ６〜８）、５０ｍＭグリシン水酸化ナトリウム（ｇｌｙｃｉｎｅ  ＮａＯＨ、ｐＨ９〜１０）をそれぞれ使用して各ｐＨ条件で５０℃で２時間反応させ、基質反応停止のために５分間加熱して反応を終了（停止）させ、最大活性を示すｐＨを測定した。その次に、二時間のフルクトースからのアロース転換率を測定して、最適ｐＨでのアロース転換率を１００％にした時のそれぞれのｐＨでのアロース転換率の相対的な値で示した（図面のＹ軸値のＲＡ（％））。その結果を下記表８および図８〜１０に示した。
【００８５】
［計算式］
転換率（％）＝（生産量／いれた基質量）＊１００
いれた基質量＝残余フルクトース＋プシコース残余量＋アロース生産量
【表８】
2019503711.tif 000014
【００８６】
上記表８および図８〜１０に示されているように、ＲＳＦ＿ＴＤＰＥ＿ＲＰＩはｐＨ７．０で最適の活性を示し（図８）、ＲＳＦ＿ＣＤＰＥ＿ＲＰＩ（図９）とＲＳＦ＿ＥＤＰＥ＿ＲＰＩ（図１０）はｐＨ８．０で最適の活性を示した。
【００８７】
２−３．酵素の金属イオン要求性分析
金属イオン要求性を確認するために、１０％（ｖ／ｖ）フルクトースを基質として使用し、前記実施例２で分離された菌株の菌体濃度５ｍｇ／ｍｌ＿ＤＣＷ、および５０℃で、５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．０または８．０、各酵素の最適ｐＨで遂行）に溶かした１ｍＭ金属イオン（ＣｕＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＦｅＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＮｉＳＯ４、またはＣｏＣｌ２）溶液をそれぞれ使用して２時間反応させ、基質反応停止のために５分間加熱して反応を終了（停止）させた後に、前記実施例３−１と同様な方法でＨＰＬＣ分析を通じてアロース生産量を測定した。対照群（Ｎｏｎ）としては金属イオンを処理していないものを使用した。
【００８８】
その結果を下記表９および図１１〜１３に示した。
【表９】
2019503711.tif 000015
【００８９】
上記表９および図１１〜１３に示されているように、ＣＤＰＥ＿ＲＰＩの場合、Ｆｅイオンによって若干活性が増加したが（図１１）、三つの酵素は全て大きく金属イオンに依存する結果を示しないのを確認した（図１１〜１３）。
【００９０】
即ち、既存のＣＤＰＥ、ＴＤＰＥ、ＥＤＰＥを単独で発現した場合には金属がなければ活性、転換率、熱安定性などが顕著に低下するが、二つの酵素を同時に一つのベクターで発現した時は、既存のそれぞれの酵素とは異なり金属イオンがなくても転換反応が起こるのを確認した。
【００９１】
２−４．細胞反応の熱安定性分析
細胞反応の熱安定性を確認するために、４０〜５０℃で２４時間酵素に熱を加えた後、熱衝撃が加えられた菌株を反応に使用した。
【００９２】
具体的に、１０％（ｖ／ｖ）フルクトースを基質として使用し、前記熱衝撃が加えられた菌株の菌体濃度５ｍｇ／ｍｌ＿ＤＣＷ、および５０で、５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．０または８．０、各酵素の最適ｐＨで遂行）をそれぞれ使用して２時間反応させ、基質反応停止のために５分間加熱して反応を終了（停止）させた。下記の計算式を通じてアロース転換率を測定した。その結果を下記表１０（４０℃）および表１１（５０℃）に示し、図１４〜１６に転換率をログ値に変換させて示した。
【００９３】
［計算式］
転換率（％）＝（生産量／いれた基質量）＊１００
いれた基質量＝残余フルクトース＋プシコース残余量＋アロース生産量
【表１０】
2019503711.tif 000016
【表１１】
2019503711.tif 000017
【００９４】
上記表１０〜１１および図１４〜１６に示されているように、４０℃では２０時間以上ある程度熱に酵素が耐える様相を示したが、各温度での半減期（Ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を比較してみる時、５０℃では３時間程度熱衝撃が加えられた時に活性が半分に減ったのを確認した。
【００９５】
実施例３．アロース生産
３−１．１５％（ｖ／ｖ）フルクトースからアロース生産反応
フルクトースからアロース生産を確認するために、基質として１５％（ｖ／ｖ）フルクトース１ｍｌと５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０または８．０、各酵素の最適ｐＨで遂行）溶液に、実施例２で分離された菌株の菌体濃度を５ｍｇ／ｍｌ＿ＤＣＷ範囲で、５０℃温度で０〜２０時間反応させながら、時間別サンプリングをして下記の計算式を通じてアロース転換率を測定した。その結果を表１２および図１７に示した。
【００９６】
［計算式］
転換率（％）＝（生産量／いれた基質量）＊１００
いれた基質量＝残余フルクトース＋プシコース残余量＋アロース生産量
【表１２】
2019503711.tif 000018
【００９７】
上記表１２で確認できるように、１２個の酵素反応転換分析結果、酵素ごとに若干の差はあるが、平均的にフルクトースから約１３％程度の転換率でアロースを生産するのを確認することができた。
【００９８】
３−２．５０％（ｖ／ｖ）フルクトースからアロース生産反応
フルクトースからアロース生産を確認するために、基質として５０％（ｖ／ｖ）フルクトース１ｍｌと５０ｍＭ  ＰＩＰＥバッファー（ｐＨ７．０または８．０、各酵素の最適ｐＨで遂行）溶液に、実施例２で分離された菌株の菌体濃度を５ｍｇ／ｍｌ＿ＤＣＷ範囲で、５０下で０〜２０時間反応させながら、時間別サンプリングをしてアロース転換率を測定した。その結果を表１３および図１８に示した。
【表１３】
2019503711.tif 000019
【００９９】
上記表１３で確認できるように、１２個の酵素反応転換分析結果、酵素ごとに若干の差はあるが、平均的にフルクトースから約１３％程度の転換率でアロースを生産するのを確認することができた。
【０１００】
実施例４．融合酵素プラスミドの製造および形質転換
エンシファーアドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）に由来したプシコースエピマー化酵素のコーディング遺伝子を、大腸菌に最適化して変形した形態のポリヌクレオチド（配列番号６）で合成してＥＤＰＥと命名した。大腸菌に最適化したポリヌクレオチド、パーセフォネラマリナ（Ｐｅｒｓｅｐｈｏｎｅｌｌａ  ｍａｒｉｎａ）ＥＸ−Ｈ１のｇＤＮＡから確保したＰＲＩのコーディング遺伝子（配列番号１０）をＰＣＲを通じてそれぞれの鋳型として確保し、これをオーバーラップＰＣＲ法で一つの鋳型に連結した（配列番号２２）。
【０１０１】
前記一つの鋳型に連結されたポリヌクレオチドを制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩを用いて発現ベクターのｐＥＴ２１ａの同一な制限酵素部位に挿入して組換えベクターを製造した。前記製造された組換えベクターの開裂地図を図１９に開示した。
【０１０２】
その次に、ヒートショック（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を前記製作した組換えベクターで形質転換して組換え菌株を製造した。
【０１０３】
前記製造された組換え菌株を５ｍｌ  ＬＢ−アンピシリン（ＬＢ−ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ）培地（Ｄｉｆｃｏ）に接種した後、６００ｎｍでの吸光度（ＯＤ）が１．５に到達するまで３７℃、２００ｒｐｍで振とう培養し、これを再び５００ｍｌ  ＬＢ−アンピシリン（ＬＢ−ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ）培地に接種した後、３７℃の振とう培養機で種培養した。この培養液の６００ｎｍで吸光度が０．５である時、１ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加して目的酵素の過発現を誘導した。前記過発現誘導時点から培養条件を１６℃および１５０ｒｐｍに転換して１６時間維持した。その後、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して菌体のみを回収し、０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで２回洗浄した後、アロース生産および酵素精製に使用した。
【０１０４】
実施例５．融合酵素を用いたアロース生産反応（酵素反応）
５−１：融合酵素の精製
前記実施例４で回収された菌体をｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０  ３００ｍＭ  ＮａＣｌ）に混濁させた後、音波振動機（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ．ＣｏｌｅｐＰａｒｍｅｒ）を用いて４℃で２０分間破砕した。前記破砕液を１３，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離して上澄み液を回収し、予めｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで平衡させたＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、Ｑｉａｇｅｎ）に適用させた後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に２０ｍＭイミダゾールと２５０ｍＭイミダゾールが含まれている緩衝溶液を順次に流した。溶出された目的蛋白質は酵素活性測定用緩衝溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で転換してその次の実験に使用した。前記方法で部分精製された酵素が得られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて単量体の大きさが約４７ｋＤａであることを確認した（図２０）。
【０１０５】
５−２：フルクトースからアロース生産
フルクトースからアロース生産を確認するために、基質として５０％（ｖ／ｖ）フルクトース１ｍｌと５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０または８．０、各酵素の最適ｐＨで遂行）溶液に、実施例６で精製された酵素の濃度を１．０ｍｇ／ｍｌ範囲で、５０℃で２４時間反応させながら、時間別サンプリングをしてアロース転換率を測定した。その結果を表１４および図２１に示した。
【表１４】
2019503711.tif 000020
【０１０６】
上記表１４および図２０で確認できるように、二つの酵素反応分析結果、２４時間ＥＤＰＥ＿ＲＰＩ＿ＦＵＳＩＯＮは約１３．４％、ＣＤＰＥ＿ＲＰＩ＿ＦＵＳＩＯＮは約１３．１％の転換率でアロースを生産することを確認した。即ち、融合酵素の場合、発現率は減少したが、二つの酵素をそれぞれ発現させて反応する時と転換率においては類似した平衡値の１３％に到達することを確認した。
【図１】
2019503711.tif 000021
【図２】
2019503711.tif 000022
【図３】
2019503711.tif 000023
【図４】
2019503711.tif 000024
【図５】
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【図６】
2019503711.tif 000026
【図７】
2019503711.tif 000027
【図８】
2019503711.tif 000028
【図９】
2019503711.tif 000029
【図１０】
2019503711.tif 000030
【図１１】
2019503711.tif 000031
【図１２】
2019503711.tif 000032
【図１３】
2019503711.tif 000033
【図１４】
2019503711.tif 000034
【図１５】
2019503711.tif 000035
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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