(57)【要約】  本発明は、主成分としてアンドログラホリド、ネオアンドログラホリド、および１４−デオキシ−１１，１２−ジデヒドロアンドログラホリドを含有しているセンシンレン葉からの、水性抽出物を提供する。本発明はまた、センシンレンの葉を乾燥させ、少なくとも５０℃の温度で、水でそれらを抽出する工程を含む、前記抽出物の生産方法も提供する。センシンレン葉の水性抽出物は、抗神経炎症および抗酸化効果を有する認知増強剤としての使用のために適切である。
2019517472.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１〜４重量％の量のアンドログラホリド、１〜３重量％の量のネオアンドログラホリド、および０．０５〜０．２重量％の量の１４−デオキシ−１１，１２−５ジデヒドロアンドログラホリドを含有しているセンシンレン葉の水性抽出物であって、０．２〜０．７重量％のタンパク質、０．０１〜０．０５重量％の多糖類、および１５〜２５重量％のグリコサポニンを含有する、前記抽出物。
【請求項２】
以下の工程：
−センシンレンの葉を乾燥させること、および
−少なくとも５０℃の、好ましくは５５〜７０℃の温度で、水でそれらを抽出すること
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抽出物の生産方法。
【請求項３】
抽出が、いかなる有機溶媒の添加もしないでなされる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
葉を乾燥させる工程が、少なくとも３０℃、好ましくは４０〜７０℃の温度で、オーブン乾燥器中で遂行され、その後に粉砕することを伴う、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
液体の水性抽出物が、固体の形の抽出物を得るために凍結乾燥に付される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
抗神経炎症および抗酸化効果を有する認知増強剤としての使用のための、請求項１に記載のセンシンレン葉の水性抽出物。
【請求項７】
使用が、記憶喪失、ストレス、痴呆またはアルツハイマー疾患などの認知障害の処置、改善、または予防のためである、請求項６に記載の使用のためのセンシンレン葉の水性抽出物。
【請求項８】
請求項１に記載の抽出物、および、充填剤、結合剤または溶媒などの担体として作用する少なくとも１つの補助物質を含有することを特徴とする、認知障害の処置、改善または予防のための組成物、特に食品補助剤。
【請求項９】
経口製剤、好ましくはタブレットまたはカプセルの形である、請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、センシンレンの抽出物、それらの調製方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マレーシアを含む先進諸国の老年人口の急増は、拡大している。高齢は、記憶喪失、痴呆、アルツハイマー疾患などの認知障害と関係することが多い。今日まで、認知障害を処置するかまたは予防するための治療法はない。ハーブのサプリメントは、あらゆる記憶改善の唯一の源である。長年にわたる調査によって、医科学者は、慢性神経炎症、酸化損傷、および変化した神経伝達物質作用が、神経可塑性を破壊するための主原因となる因子であるという結論に達した。現時点では、最も有効で商業的に入手可能なハーブに基づく認知増強薬は、イチョウ葉抽出物である。
【０００３】
このように、より有効であり、そして既存の処置に対して効果的な代替手段となるであろう新規な認知増強剤を捜す差し迫った必要がある。新規な剤が、既存の処置より低価格である場合、それも好ましい。
【０００４】
センシンレン（hempedu bumi）は、アジア中で見出されるハーブである。それは、多くの薬効成分を有することが報告され、上気道障害、いくつかの感染症、糖尿病、および高血圧を処置するために用いられてきた。最近の報告は、ビタミンＥとの組み合わせでニコチンによって誘発される毒性によって引き起こされる脳における酸化ストレス（Das et al., Appl Phy Nut Met 2009,34: 124-135）、ラットにおける脳虚血（Chan et al., Br J 30 Pharmacol 2010, 161(3): 668-679）、およびマウスにおける脳虚血／再灌流障害によって起こされる、低酸素によって誘発される酸化性／窒素性脳障害（Chang et al., Toxicol App Pharmacol 2011, 257(1): 137-147）における、アンドログラホリド（センシンレンの主生理活性成分）の保護の役割を、強調している。
【０００５】
植物抽出物は、これまで、大部分はアルコール、エーテル、アルカン、塩素化された溶媒などの有機溶媒を使用して調製されてきた。しかしながら、有機溶媒のあらゆる使用は、製品中の微量の溶媒をもたらし、この微量の溶媒は、患者にとって潜在的に有害である。
【発明の概要】
【０００６】
発明の開示
本発明は、主成分として１〜４重量％の量のアンドログラホリド（ＡＧＰ）、１〜３重量％の量のネオアンドログラホリド（ＮＡＧ）、および０．０５〜０．２重量％の量の１４−デオキシ−１１，１２−１０ジデヒドロアンドログラホリド（ＤＤＡＧ）を含有しているセンシンレン葉の水性抽出物を提供する。該抽出物は、０．２〜０．７重量％のタンパク質、０．０１〜０．０５重量％の多糖類、および１５〜２５重量％のグリコサポニンを含有する。
【０００７】
抽出物は、センシンレンの葉を乾燥し、そして、少なくとも５０℃、好ましくは５５〜７０℃の温度で、水でそれらを抽出することによって生産されることができる。好ましくは、抽出は、他のいかなる溶媒の添加もなしに行われる。これは、該抽出物によって処置される生物のために潜在的に有害であり得る、残存する非水溶媒を取り除くことの必要性を、回避する。好ましくは、葉を乾燥させることは、少なくとも３０℃、好ましくは４０〜７０℃の温度で、その後の粉末化を伴って、オーブン乾燥器中で遂行される。抽出物は、好ましくは、凍結乾燥によって液体抽出物から得られた固体の形で使用される。
【０００８】
センシンレン葉からの水性抽出物は、抗神経炎症および抗酸化効果を有する認知増強剤として適切である。それは、記憶喪失、ストレス、痴呆またはアルツハイマー疾患などの、認知障害の処置、改善、または予防のために使用されてもよい 。
【０００９】
本発明の発明者らは、センシンレン葉の抽出物が、ＬＰＳによって誘発された神経炎症の動物モデルにおいて治療的な効果を有し、および、神経保護を促進する抗神経炎症、抗酸化、および抗コリン作用を有し、そして、神経炎症を誘導された動物の記憶を増強することを見出した。さらにその上、モリス水迷路試験は、抽出物が、認知機能を増強することを示す。これらの種々の試験のすべての結果は、本発明の抽出物が、かかる処置を必要とする対象において、認知増強薬として有用であることを示す。
【００１０】
また、本発明は、抽出物、および、充填剤、結合剤または溶媒などの担体として作用する少なくとも１つの補助物質を含有する、認知障害の処置、改善、または予防のための組成物、特に食品サプリメントも提供する。薬学的に許容される充填剤、結合剤、および溶媒は、当業者にとって周知である。該組成物は、好ましくは経口製剤、好ましくはタブレットまたはカプセルの形である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１および２は、モリス水迷路タスクを使用した、ラットの認知障害の予防へのＡＰ抽出物の効果の評価の結果を示す。
【図２】図１および２は、モリス水迷路タスクを使用した、ラットの認知障害の予防へのＡＰ抽出物の効果の評価の結果を示す。
【図３】図３は、ＬＰＳによって誘発された炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１β）の生産への、ＡＰまたはイチョウの標準化水性抽出物の効果を示す。値は、平均±ＳＤで表される（ｎ＝１０）。ＬＰＳ群と比較して＊Ｐ≦０．０５、＊＊＊Ｐ≦０．００１。
【００１２】
【図４】図４は、ＬＰＳによって誘発された（Ａ）ＲＯＳおよび（Ｂ）ＴＢＡＲＳの生産レベルへの、ＡＰまたはイチョウ（ＧＢ）の標準化水性抽出物の効果を示す。
【図５】図５は、のＬＰＳで誘発された酸化ストレスマーカー（ＲＯＳおよびＴＢＡＲＳ）のアップレギュレーションに対する、ＡＰまたはイチョウ（ＧＢ）の標準化水性抽出物の前処置の効果を示す
【図６】図６は、ＬＰＳで誘発された、減少した（Ａ）ＳＯＤ、（Ｂ）ＣＡＴ活性、および（Ｃ）ＧＳＨレベルへの、ＡＰまたはイチョウ（ＧＢ）の標準化水性抽出物の前処置の効果を示す。
【００１３】
発明を実施する例
例１：抽出物の調製
センシンレンの葉を収穫し、流れる水道水で完全に洗浄し、そして、その後、３回連続して超高純度の蒸留水との交換に付し、配合機ＭＸ−８００Ｓ（パナソニック）を使用して粉末にする前に、オーブン乾燥器中で、４０℃で３日間にわたって乾燥した。粉末にした葉の試料の抽出は、水で１：２０（ｗ／ｖ）の比率で行った。
【００１４】
混合物を完全に混合し、頻繁に撹拌しながら６０℃で５時間加熱し、続いてワットマンＮｏ．１フィルター紙を通してろ過した。その後、濾過物（抽出物）を、−８０℃へと終夜凍結し、凍結乾燥機中で粉末形態へと乾燥した。収率は、乾燥葉のおおよそ１２．３％（ｗ／ｗ）であった。標準化されたセンシンレン抽出物は、認知アッセイのためのin vivo試験において使用する。
【００１５】
この抽出物中のセンシンレンの一次および二次代謝産物の量を、表１および２において示す。一次代謝産物の量は、マレーシア規格（2013）に従って決定し、二次代謝産物の量は、ＨＰＬＣを使用して決定した。
【００１６】
【表１】
2019517472.tif 000003
【００１７】
【表２】
2019517472.tif 000004
【００１８】
例２：ＬＰＳによって誘発された認知障害へのＡＰの標準化水性抽出物の効果
モリス水迷路（ＭＷＭ）試験は、動物モデルの空間学習および記憶を研究するための、十分に確立された行動タスクである（Morris 1984）。わずかな改変を加えた、Gulinelloら（2009）によって記載された２日間プロトコルを使用して、ラットの認知機能を試験した。簡潔には、ＡＰ、ＥＧｂ、またはビヒクルによる７日間の前処置に続いて、動物を、暗い背景を有する水槽であって、水面より約２ｃｍ上の槽の内側の黒い表面とは異なるコントラストを有する見えるプラットホームを含む水槽のプールにおいて、訓練した。訓練は、最初の日の４件の試行から成り、そして、Ｖ１〜Ｖ４（見えるプラットホームの試行１〜４）またはＤ１Ｖ１〜４（１日目、見えるプラットホームの試行１〜４）に指定される。
【００１９】
訓練試行の間に、動物は、１２０秒以内にプラットホームを見出して、逃避することを学習することが期待される。１２０秒以内に逃避することに失敗した動物は、手でプラットホームへ導かれた。すべての動物は、取り出される前に１５秒間プラットホーム上にとどまり、乾燥させられ、続いて別個のの乾いたケージ内に置かれた。その後に、ＬＰＳを実験動物に注入した。２４時間後、動物を３回連続の隠れたプラットホームの試行（Ｔ１〜Ｔ３）で試験し、続いて、プラットホームのないプール中で、２４時間後に遂行する一回の３０秒の試行からなるプローブ試行を行った。すべての試行の間、水泳潜時、経路の長さ、水泳速度を含むデータを、ウェブカメラに接続されたANY-maze Video Tracking System (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)を使用して、記録した。すべてのデータは、その後に、水迷路タスクの成績ならびに運動活性を評価するために用いた。同様に、プローブ実験の間の、新たな四分円に入るまでの潜時およびその中で消費した時間も捉えて分析した。
【００２０】
例３：炎症誘発性サイトカインのレベルの決定
製造業者（Cusabio Biotech Co. Ltd, Wuhan, China）によって提供されるプロトコルに従って、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、免疫反応性ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−６レベルの存在について、脳サイトゾル上清を分析し、結果をｐｇ／ｍＬで表した。
【００２１】
例４：酸化ストレスマーカーの測定
脳切片溶解物中の細胞内ＲＯＳの生成を、それ以前にShinomol & Muralidhara (2011)によって記載されたとおりに２，７−ジクロロフルオレシンジアセタート（ＤＣＦ−ＤＡ）を使用して測定した。簡潔には、反応混合物（１ｍｌのLockes緩衝液ｐＨ７．４、０．２ｍｌのサイトゾル分画、および１０μｌの５Ｍ  ＤＣＦＨ−ＤＡ）を、室温で１５分間インキュベートした。３０分の更なるインキュベーションの後、分光蛍光光度計（４８４ｎｍ励起および５３０ｎｍ発光）を使用して、蛍光生成物ＤＣＦの形成を測定した。ＲＯＳの生成は、コントロールに対する倍率変化として報告した。
【００２２】
脂質の過酸化レベルは、わずかな改変を加えた、Draper & Hadley (1990)によって記載されたチオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）アッセイを用いたＭＤＡインデックスに基づいて算定し、コントロールに対する倍率変化として表した。ＴＢＡＲＳ試験は、通常、高温（９０〜１００℃）かつ酸性条件反応の下で形成したピンクのＭＤＡ−ＴＢＡ生成物を測定するために使用される(Gupta et al. 2003)。簡潔には、２００μｌの２０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を、５０μｌの脳切片ホモジェネートに加え、混合し、続いて、４，０００rpmで２０分遠心分離した。続いて、等量の上清を、チオバルビツール酸（ＴＢＡ）試薬と混合した。同様の処置を、試薬ブランクに実施した。続いて、各試料の内容物を、９５℃で１０分間、水浴上で加熱し、冷却し、吸光度をＵＶ・可視ダブルビーム分光光度計（VersaMax microplate reader, Molecular devices, US）で、５３２ｎｍで測定した。
【００２３】
例５：コリンエステラーゼ酵素活性のレベルの測定
アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）阻害活性を、Ellmanら（１９６１）によって開発された原法を改変することによって決定した。９６ウェルプレートを使用して、反応混合物（２８５μｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ  ８．０）および５μｌ（１０ｍＭ）のＤＴＮＢ）を含有している各実験用ウェルに、５μｌの試料（脳切片ホモジェネート）のまたはブランク（コントロール）を加えた。続いて、２μｌのアセチルチオコリンヨーダイド（基質として使用される）（１５０ｍＭ）を加え、分光光度計を使用して、吸光度の変化を４１２ｎｍで５分間モニターした。
【００２４】
原理：アセチルチオコリンの加水分解を、アセチルチオコリンの酵素加水分解によって放出されたチオコリンとのＤＴＮＢの反応の結果としての、黄色の２−ニトロ−５−スルフィドベンゼン−カルボン酸エステルアニオンの形成によって示した。
ブチルコリンエステラーゼ酵素をアッセイするためにブチリルチオコリンヨーダイドを基質として使用した一方で、すべての他の試薬および条件が、上記のアセチルコリンエステラーゼ酵素アッセイについてのものと同じであった。
【００２５】
例６：酸化防止活性およびグルタチオンのレベルの測定
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびカタラーゼ（ＣＡＴ）アッセイを、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡキット（Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA）を使用して遂行した。VersaMaxマイクロプレートリーダー（Molecular devices, US）を使用して、ＳＯＤおよびＣＡＴについてそれぞれ４４０および５４０ｎｍで、光学濃度を読み取った。
【００２６】
Rajasekaranら（2004）によって以前に採用された方法にわずかな改変を加えたものによって、総還元グルタチオン（ＧＳＨ）を算定した。簡潔には、コントロールまたは実験動物からの脳切片ホモジェネートのアリコートを、１：１の比率で５％のＴＣＡを加えることによって沈殿させ、続いて遠心分離した。続いて、等体積の上清（１０μｌ）および０．２Ｍリン酸緩衝液（２５０μｌ）を混合し、その後４０μｌのＤＮＴＢ試薬（０．６ｍＭ）を添加し、コントロールに対して、発生した色を、４１２ｎｍで読み取った。結果を、脳切片のｕｎｉｔ／ｍｇとして表した（Mori et al. 2004）。
【００２７】
試験の結果を、添付の図に示す。
水迷路試験は、プラットホームの位置を学習し、続いて記憶する、動物の認知能力の相対的な基準である（Gulinello et al. 2009）。すべての試験されたラットは、一般的に減少した、見えるプラットホームの試行（１日目）においてプラットホームを見つけるまでの潜時を示した。初期の見えるプラットホームの試験は、長期空間記憶を評価するための隠れたプラットホームの試験（２４時間遅らせた後）の前に、逃避潜時に関する多数の利点の一部としての泳ぐ速度における、ベースラインの運動機能、馴化速度、ならびに個々のおよび処置群の差の評価を報告した、以前の研究に従う（chulz et al. 2007; Clinton et al. 2007; Galea et al. 2002）。ＬＰＳに対するラットの曝露は、ＭＷＭ試験によって評価されたように空間学習および記憶における変性を誘導する（図１）。
【００２８】
標的の四分円を見つけるラットの能力ならびに標的の四分円中で消費された総時間は、プローブ試験の間に、ＬＰＳによって誘発された神経炎症とともに有意に減少する。しかしながら、ＡＰの段階的な濃度によって前処置されたラットは、ＬＰＳコントロールラットと比較して有意に減少した逃避までの潜時を示した（Ｐ≦０．００１）。結果は、処置された群と比較して、ＬＰＳコントロール群のより大きな潜時の違いを伴う学習のはっきりした証拠を、有意に（Ｐ≦０．００１）現した。大きい数は、より劣った成績を表し、一方でより小さい数は、それらが、（見えるプラットホーム（１日目）において）学習し、そして、２日目に、隠れたプラットホームの位置を記憶できることを指す（Gulinello et al. 2009）（図２）。全体として、ＡＰは、該動物の記憶の改善において、特に低用量（５０および１００ｍｇ／ｋｇ）で、イチョウ葉エキス（ＥＧｂ  ７６１）より優れていた（図１）。同様に、短期記憶の評価（同日の実験中の潜時の違い（Ｄ２Ｈ２〜Ｄ２Ｈ１））も評価した。
【００２９】
海馬機能に影響を及ぼす神経炎症の結果として、多くの研究が、学習および記憶の欠乏も報告した（Gong et al. 2010; Lee et al. 2008; Tanaka et al. 2006）。我々は、脳障害および炎症に応答して神経炎症が主に生じる脳領域である海馬における、種々の炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）のレベルを決定した（McGeer & McGeer 2004; Ren et al. 1999）。ＬＰＳコントロールと比較して、段階的な用量のＡＰによる前処置は、用量依存的に、すべての測定されたサイトカインの生産を、有意に抑制した（図３）。
【００３０】
増加したＭＤＡのレベルは、増加したフリーラジカルの濃度を示すために報告されている（Suginoら、1987）。この検討において、イムノアッセイ分析は、ＬＰＳで処置された動物中の増加したサイトカインおよび酸化マーカー（ＲＯＳおよびＴＢＡＲＳ）の濃度を示し（図４）、そして、それは障害された海馬の機能に起因する学習および記憶の悪化した状態を説明することができる。
【００３１】
またさらに、我々は、コリン作用のマーカーとして、脳の海馬領域のＡＣｈＥ活性のレベルを測定した。ＬＰＳの投与は、コリン作用の減少を示すことができるＬＰＳコントロール群のラットの脳中のＡＣｈＥの活性を有意に増加させた（図５）。これは、ＡＰ抽出物の投与の後で、認知のための重要な神経伝達物質である脳中のアセチルコリンレベルの増加があるであろうことを意味する。
【００３２】
さらにその上、ＬＰＳ注入は、スーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼなどの酸化防止酵素の著しい減少を生み出す。しかしながら、標準化水性ＡＰ抽出物の異なる用量でのラットの処置は、ＬＰＳによって誘発される変性を、用量依存的に、有意に（Ｐ＜０．０５）改善した（図６）。
すべての上記の知見より、標準化水性ＡＰ抽出物が、ＬＰＳによって誘発された神経炎症から脳を保護し、記憶を増強すると推論される。
【００３３】
【表３−１】
2019517472.tif 000005
【００３４】
【表３−２】
2019517472.tif 000006
【図１】
2019517472.tif 000007
【図２】
2019517472.tif 000008
【図３】
2019517472.tif 000009
【図４】
2019517472.tif 000010
【図５】
2019517472.tif 000011
【図６】
2019517472.tif 000012
【国際調査報告】
2019517472.tif 000013
2019517472.tif 000014
2019517472.tif 000015