(57)【要約】  本発明は、顕微鏡、特に共焦点走査顕微鏡の検出光のための光学グループに関し、光学グループは、測定されるべき検出光の通過のための入力平面（１０）を有し、入力平面の下流に配列されて、検出光（１１）を検出平面（６７）中に誘導するための検出ビーム路を有し、検出ビーム路は、検出光を検出平面中に誘導するための、第１光学ビーム誘導手段、特に第１レンズ及び／又はミラー（２０、３０、３４、３６、５８、６０、６６）を有する少なくとも１つの第１ビーム路（１）を有する。第１ビーム路内に、光学グループは、測定されるべき検出光の空間スペクトル分割のための少なくとも１つの分散デバイス（２６）と、空間スペクトル分割された検出光を操作するための操作デバイス（４９）と、を有する。分散デバイス及び操作デバイスと共に第１光学ビーム誘導手段は、検出平面中への入力平面のスペクトル分離され回折制限された画像を生成するように配列され設計されている。光学グループは、好ましくは、光学ビーム誘導手段を有する第２ビーム路（２）を有し、第１ビーム路（１）又は第２ビーム路（２）を選択するための選択デバイス（２２）を有する。更なる側面において、本発明は、顕微鏡法のための方法及び顕微鏡に関する。
2019532360.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡の、特に共焦点走査顕微鏡の検出光のための光学グループであって、前記光学グループは、
測定されるべき検出光（１１）の通過のための入力平面（１０）を有し、
前記入力平面の下流に配列されて、前記検出光（１１）を検出平面（６７）中に誘導するように機能する検出ビーム路を有しており、
前記検出ビーム路は、前記検出光（１１）を前記検出平面（６７）中に誘導するための第１光学ビーム誘導手段、特に第１レンズ及び／又はミラー（２０、３０、３４、３６、５８、６０、６６）を有する少なくとも１つの第１ビーム路（１）を備える、光学グループにおいて、
測定されるべき検出光（２４）を空間スペクトル分割するための少なくとも１つの分散デバイス（２６）が、前記第１ビーム路（１）内に存在することと、
スペクトル空間分割された検出光（４２、４４、４６）を操作するための操作デバイス（４９）が、前記第１ビーム路（１）内に存在することと、
前記分散デバイス（２６）及び前記操作デバイス（４９）と共に前記第１光学ビーム誘導手段（２０、３０、３４、３６、５８、６０、６６）は、前記入力平面（１０）のスペクトル分離され回折制限された撮像を前記検出平面（６７）中に生成するように配列され構成されていることと、を特徴とする、光学グループ。
【請求項２】
前記検出ビーム路は、前記検出光（１１）を前記検出平面（６７）中に誘導するための第２光学ビーム誘導手段、特にレンズ及び／又はミラー（５６、６６）を有する第２ビーム路（２）を備えることと、
前記第２光学ビーム誘導手段（２０、２２、５８、６０、６６）は、前記入力平面（１０）の回折制限された撮像を前記検出平面（６７）中に生成するように配列され構成されていることと、
選択デバイス（２２）が、前記測定されるべき検出光のための前記第１ビーム路（１）又は前記第２ビーム路（２）を選択するために存在していることと、を特徴とする、請求項１に記載の光学グループ。
【請求項３】
前記検出光（１１）を測定するための少なくとも１つの空間分解、特に区画化、検出器（６８）が、前記検出平面（６７）内に存在することを特徴とする、請求項１又は２に記載の光学グループ。
【請求項４】
測定されるべき検出光（１１）を受け入れるための入力ピンホールストップ、特に共焦点ピンホールが、前記入力平面（１０）内に配列されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の光学グループ。
【請求項５】
前記選択デバイス（２２）は、調節可能ミラーであり、前記調節可能ミラーは、特に前記検出ビーム路中に移動可能である及びそれから外に移動可能である（２３）ことを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載の光学グループ。
【請求項６】
前記調節可能ミラー（２２）は、前記検出ビーム路の視準を合される部分中に移動可能であることを特徴とする、請求項５に記載の光学グループ。
【請求項７】
前記操作デバイス（４９）は、スペクトル選択平面（４８）を備え、前記スペクトル選択平面内に特に調節可能ビーム偏向手段（５０、５１、５２）が配列されていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の光学グループ。
【請求項８】
前記スペクトル選択平面（４８）は、前記検出平面とは異なるが、前記検出平面（６７）に関して光学的に共役である平面内にあることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の光学グループ。
【請求項９】
前記スペクトル選択平面（４８）内の前記操作デバイス（４９）、特に前記ビーム偏向手段（５０、５１、５２）は、マイクロミラーアレイ、ＳＬＭ（光空間変調器）、ＤＭＤ（ＤＭＤ＝デジタルミラーデバイス）及び／又はＭＥＭＳ（ＭＥＭＳ＝微小電気機械システム）によって形成されていることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の光学グループ。
【請求項１０】
少なくとも１つの第２検出器が、前記スペクトル選択平面（４８）を通って進む検出光を検出するために、前記スペクトル選択平面（４８）の下流に配列されていることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の光学グループ。
【請求項１１】
前記分散デバイス（２６）は、プリズムであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の光学グループ。
【請求項１２】
前記第１ビーム路（１）内で、前記操作デバイス（４９）から後方に反射された検出光（４３、４５、４７）が、反対方向に再び前記分散デバイス（２６）を通って進むことにより、特に、前記後方に反射された検出光は、反対順序で前記分散デバイスを通って進んだ後に有意な色収差を有さず、ピンホールの又は試料内のポイントエミッタの回折制限された撮像が可能であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の光学グループ。
【請求項１３】
前記空間分解検出器（６８）及び／又は第２空間分解検出器が、１つの、特に冷却可能、ＳＰＡＤ検出器（ＳＰＡＤ＝単一光子アバランシェフォトダイオードアレイ）であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の光学グループ。
【請求項１４】
前記空間分解検出器（６８）及び／又は第２空間分解検出器が、複数の光電子増倍管によって形成され、前記複数の光電子増倍管まで、前記検出光が、特に光ファイバの束を経由して送られることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の光学グループ。
【請求項１５】
前記空間分解検出器（６８）及び／又は第２空間分解検出器が、半導体検出器、特にＣＣＤ又はＣＭＯＳ検出器であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の光学グループ。
【請求項１６】
前記空間分解検出器（６８）及び／又は第２空間分解検出器は、上流の画像増幅器、特に上流のマルチチャネルプレートを有するカメラであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の光学グループ。
【請求項１７】
少なくとも１つの、特に２次元の、マルチレンズアレイ（１６）が存在することと、
調節デバイス（１７）が、前記マルチレンズアレイ（１６）を前記検出ビーム路中に及びそれから外に動かすために存在することと、を特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載の光学グループ。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の光学グループを用いる顕微鏡法のための方法であって、
顕微鏡、特に共焦点レーザ走査顕微鏡内の試料を照明ビーム路内の照明光によって照射するステップと、
測定されるべき検出光（１１）、特に蛍光を収集するステップであって、前記測定されるべき検出光を、前記試料が前記照明光によって照射されるために放出する、ステップと、
前記測定されるべき検出光（１１）を、前記光学グループ（１００）の前記入力平面（１０）、特に前記入力ピンホールストップを通して誘導するステップと、
前記検出光（１１）を、前記光学グループ（１００）の前記検出平面（６７）内に配列された少なくとも１つの検出器（６８）によって測定するステップと、が実行される方法。
【請求項１９】
スペクトル分解多点走査顕微鏡法のために、前記試料は、前記照明光の複数のスポットによって、特に１つの直線内にあるスポットによって同時に走査されることであって、マルチレンズアレイ（１６）が、前記入力平面（１０）の下流の前記検出ビーム路内に設置され、前記マルチレンズアレイ（１６）のレンズの数が、前記試料がそれによって走査される前記照明光のスポットの数に少なくとも等しい、ことと、
前記選択デバイス（２２）が、前記測定されるべき検出光（１１）のための前記第１ビーム路（１）を選択することと、
前記照明光の個々のスポットに帰属させられる前記検出光のビームが、スペクトル空間分割され、このように取得されたビーム（４２、４４、４６）が、前記操作デバイス（４９）によって、特に前記スペクトル選択平面内で操作されることと、
前記操作されたビームが、検出されることと、を特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記照明光の個々のスポットに帰属させられるビームを前記スポットのうちの少なくとも１つについて、特に全てについて操作することが、少なくとも１つの、特に単一のスペクトル成分を選択することであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記操作ビーム（４３、４５、４７）が、反対方向に再び前記第１ビーム路（１）内の前記分散デバイス（２６）を通って進むことを特徴とする、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
直接撮像（広視野顕微鏡法）のために、前記試料が、少なくとも視野領域内で照明光によって同時に照射されることと、
前記選択デバイス（２２）が、前記測定されるべき検出光（１１）のための前記第２ビーム路（２）を選択することであって、前記視野領域は、前記空間分解検出器（６８）上に撮像され、前記検出ビーム路は、マルチレンズアレイ（１６）を欠いている、ことと、を特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記視野領域は、前記試料にわたって走査されることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
高並列多点走査顕微鏡法のために、前記試料は、前記照明光の多くのスポットによって同時に走査され、前記照明光の多くのスポットは、特に２次元パターンに配列されていることであって、１つの、特に２次元、マルチレンズアレイ（１６）が、前記入力平面（１０）の下流の前記検出ビーム路内に設置され、前記マルチレンズアレイ（１６）のレンズの数が、前記試料がそれによって走査される前記照明光のスポットの数に少なくとも等しい、ことと、
前記選択デバイス（２２）が、前記測定されるべき検出光（１１）のための前記第２ビーム路（２）を選択することと、
前記照明光の個々のスポットに帰属させられる前記検出光（７９）のビームが、検出されることと、を特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
回析要素、特にＳＬＭ（光空間変調器）又はダンマン格子が、前記照明ビーム路の瞳平面内の照明のために設置されていることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
１つの、特に冷却される、ＳＰＡＤ検出器（ＳＰＡＤ＝単一光子アバランシェフォトダイオードアレイ）が、空間分解検出器（６８）として用いられることを特徴とする、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＳＰＡＤアレイ（６８）（ＳＰＡＤ＝単一光子アバランシェフォトダイオードアレイ）の場合、それぞれ必要とされる信号生成のために用いられるそれらの画素だけが作動させられることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つのマイクロ対物レンズを有する照明ビーム路と、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の光学グループと、前記光学グループ（１００）の前記検出平面（６７）内に配列された少なくとも１つの検出器（６８）と、を有する顕微鏡、特に共焦点走査顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第１側面において、請求項１の前文に従う顕微鏡、特に共焦点走査顕微鏡の検出光のための光学グループに関する。
【０００２】
更なる側面において、本発明は、顕微鏡法の方法、特に本発明に従う光学グループを用いる方法、及び顕微鏡、特に共焦点走査顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００３】
レーザ走査顕微鏡法は、生物医学研究に不可欠のツールとして確立されてきた。しかし、顕微鏡技術の最近の展開は、試料に対してますますより敏感でより注意深い方法を要求する。ここで、収束された単一レーザビームを用いる共焦点顕微鏡法は、別の方法と比較して有意な欠点を有する。このため、画像記録の特定の並列化をもたらすいわゆる多点方法が、ますます重要になっている。しかし、並列化の他に、異なるカラー励起が試料の異なる領域内に存在するような空間励起パターンも、また、用いられてもよい。有利には、個々のレーザビームによって試料内で励起された信号が、空間オーバーサンプリングによって検出されてもよい。
【０００４】
有感点走査法の他に、高分解能撮像顕微鏡法（広視野顕微鏡法）について最近開発された更なる方法がある。これに関連して、例えば、ＳＯＦＩ（超分解能光学変動撮像）方法が公知になっている。既存の色素においてこの方法を広く使用できるようにするためには、ＭＨｚ範囲内の画像レートによってデータを記録することができる非常に高速のセンサが必要とされる。そのようなセンサが既に存在するけれども、それらは、比較的制限された数の画素だけを有するという欠点がある。有利には、これらのセンサは、共焦点顕微鏡と組合せて用いられてもよい。共焦点撮像から生じるデータは、したがってＳＯＦＩ撮像のデータと組み合わされてもよい。
【０００５】
公知の共焦点システムは、比較的適応性が乏しい。一般に、単一共焦点体積だけが測定され得る。しかし、多点と直線パターンとが切替え可能な方式で測定され得るシステムが、また存在する。このために、様々なマスクが、照明ビーム路の中に、及びピンホール平面の中に導入される。
【０００６】
公知の回転ディスクシステムは、実際、多くの共焦点体積についての信号を測定するための撮像センサ（通常、ＥＭＣＣＤ）を用いる。しかし、これらのシステムは、非常に限られた適応性しか有しない。これに関しては、スポット同士間の距離を変更できない。更に、そのようなシステムでは、ズーミングが、実用的な態様で実行され得ず、使用可能な対物レンズについての制限が大きい。更に、３を超えるスペクトルチャネルを有するスペクトルモードに切り換えることが、実質的に不可能であり、その理由は、これらのシステムが通常のカメラに基づいており、スポットパターンが最終的にそれにわたって走査されるからである。
【０００７】
最後に、「アレイ走査」システムも公知であり、当該システムでは、点パターンが試料にわたって走査される。この場合、信号放射の結果として生じたパターンが、再び「デスキャン」される。光学操作が、次いで静止ビームによって実行されて、いわゆる「再割当」が分解能等に対して所望の影響を呈する。最終的に、このように生成された光学視野が、再びセンサにわたって走査される。原理的には、これは、また、レーザ走査顕微鏡の分解能限界で作動する、ピンホールサイズに対する独立性等の光子再割当の長所との組合せで、高並列化、例えば高画像速度及び低光損傷という長所を生じさせる。しかし、これらの長所は、コスト、伝送ロス、装置での実装問題に関する通例の短所を有する非常に複雑な光学システムの代償としてもたらされる。最後に、繰返しになるが、スペクトル適応性に関する厳しい制限が存在する。
【０００８】
更に、レーザ走査顕微鏡（ＬＳＭ）のメカニカルスキャナが用いられることにより、上述したセンサの画素数限界を補償し、この撮像に対してモザイクタイプ方式で対象物を同様に走査してもよい。そのことが特に重要であり、その理由は、今まで利用可能なセンサ、例えば、いわゆる単一光子アバランシェフォトダイオードアレイ（ＳＰＡＤアレイ）は、現在、まだ比較的少ない画素しか有しないからである。共焦点顕微鏡の光学システムは、この目的のために、特定の画像視野が試料からセンサまで伝送されてもよいように設計されなければならない。
【０００９】
検出光のための一般的光学グループが、特許文献１に記載されており、これは、測定されるべき検出光の通過のための入力平面と、入力平面の下流に配列されて、検出光を検出平面中に誘導するように機能する検出ビーム路と、を構成要素として備える。この場合、検出ビーム路は、第１光学ビーム誘導手段、特に第１レンズ及び／又はミラーを有する少なくとも１つの第１ビーム路を備えることにより、検出光を検出平面中に誘導する。
【００１０】
特許文献１においては、ビーム路を切り換えることによって、１つのセンサだけを用いて様々な励起及び検出モードを実現することが可能である。この場合、機能的に一体化されたレーザ走査顕微鏡が、点状の、多点状の、線状の、及び広視野状の照明の間で切り換えられてもよい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】独国特許出願公開第１０２０１４１０７６０６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、それによって多点顕微鏡法方法についての機能が増大されてもよい光学グループ、顕微鏡法のための方法及び顕微鏡を明示することであると考えられてもよい。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この目的は、請求項１の特徴を有する光学グループによって、請求項１８の特徴を有する方法によって、及び請求項２８の特徴を有する顕微鏡によって達成される。
【００１４】
上記で指定されたタイプの光学グループは、測定されるべき検出光を空間スペクトル分割するための少なくとも１つの分散デバイスが第１ビーム路内に存在するという事実によって、本発明に従って更に開発され、そこでは、スペクトル空間分割される検出光を操作するための操作デバイスが第１ビーム路内に存在し、分散デバイス及び操作デバイスと共に第１光学ビーム誘導手段が、入力平面のスペクトル分離され回折制限された撮像を検出平面中に生成するように配列され構成されている。
【００１５】
本発明に従う顕微鏡法のための方法において、本発明に従う光学グループが用いられ、そして、顕微鏡、特に共焦点レーザ走査顕微鏡内の試料を照明ビーム路内の照明光によって照射するステップと、試料が、照明光によって照射されるために放出する測定されるべき検出光、特に蛍光を収集するステップと、測定されるべき検出光を光学グループの入力平面、特に入力ピンホールストップを通して誘導するステップと、光学グループの検出平面内に配列された少なくとも１つの検出器によって検出光を測定するステップと、が実行される。好ましくは、この場合、入力平面は、試料がその内に配列されている平面に関して光学的に共役である平面内にある。
【００１６】
本発明に従う顕微鏡は、特に、共焦点走査顕微鏡であり、そして、構成要素として、本発明に従う少なくとも１つのマイクロ対物レンズ及び光学グループを有する照明ビーム路と、光学グループの検出平面内に配列された少なくとも１つの検出器と、を備える。本発明に従う顕微鏡は、特に、本発明に従う方法を実行することに対して好適である。好ましくは、この場合、入力平面は、試料がその内に配列されている平面に関して光学的に共役である平面内にある。
【００１７】
本発明に従う光学グループの好ましい構成、本発明に従う方法の及び本発明に従う顕微鏡の有利な変形が、特に従属請求項及び図面に関して以下に説明される。
【００１８】
本発明についての中心概念は、検出ビーム路が、測定されるべき検出光のための第１ビーム路を具備し、その路内で複数の照明スポットの検出光が、同時にスペクトル分割され操作されると考えられてもよい。スペクトル分解走査顕微鏡法の顕微鏡法方法が、その結果、可能にされる。
【００１９】
本発明の変形について、測定されるべき検出光のための第２ビーム路が、検出ビーム路内で追加的に選択されてもよいことが重要である。そのため、第２ビーム路を用いることによって、以下で詳細に追加的に説明される走査広視野顕微鏡法、及び高並列化マルチスポット共焦点顕微鏡法の両方が、全く同一の検出装置を用いて可能である。
【００２０】
本発明は、したがって、複数の顕微鏡法方法のために用いられてもよい高度に機能的な検出装置を提供する。
【００２１】
入力平面は、好ましくは、試料平面に関して光学的に共役である平面内にあるように設置される。入力ピンホールストップが、好ましくは、入力平面内に設置されるけれども、入力ピンホールストップは必須ではない。入力ピンホールストップは、また、ピンホール、又は特に共焦点ピンホールと称されてもよい。用語の検出ビーム路は、全ての光学構成要素を示し、当該光学構成要素は、それの入口から入力ピンホールストップを通って第１、第２又は更なる検出器内での検出まで、測定されるべき検出光に影響を及ぼす。用語の第１ビーム路及び第２ビーム路は、２つの異なる光学路を示し、当該光学路は、測定されるべき検出光によって、それの入口から入力ピンホールストップを通して検出平面内の検出器内での検出まで通されてもよい。この場合、第１ビーム路、及び第２又は更なるビーム路が、局所区間で、特に入力ピンホールストップの下流及び／又は検出器の上流において同一、すなわち一致してもよい。試料又は検出器上の照明スポットは、また、本説明の文脈においてスポット又は点と称される。特に、これらのスポット又は点は、回折制限されてもよい。
【００２２】
用語の光、特に照明光又は検出光は、顕微鏡法において典型的に用いられるか又は見られる電磁放射線を意味すると理解される。照明光は、特に赤外線、可視光又は紫外線スペクトル範囲内にあり、レーザによって典型的に提供される。好ましくは、本発明に従う顕微鏡は、レーザ走査顕微鏡である。ドイツ語文での用語「Ｓｃａｎｎｅｎ」（「走査」）及び「Ｒａｓｔｅｒｎ」（「走査」）は、本説明についてのドイツ語文において同義的に用いられる。
【００２３】
スペクトル空間分割、又は同義的に分散分割は、本説明の文脈において、具体的には、ビームの異なるスペクトル成分が、異なる空間方向に誘導されて、この意味で分割される状態を意味すると理解される。特定のゼロになることがない波長間隔及び空間方向間隔内で、空間方向への波長の連続写像が、この場合、達成される。つまり、互いに近接している波長は、また、互いに近接している空間方向に誘導される。互いに更に離れている波長は、したがって、互いに更に離れている空間方向に誘導される。したがって、この意味での分散分割は、複数の誘電体ビームスプリッタの配列によって達成されてもよいものとは異なる分割である。
【００２４】
特に好ましくは、本発明の文脈では、回析又は屈折要素、典型的には、プリズム又は回折格子が、分散分割のために用いられる。原理的には、光学フィルタは、本発明に従う配列には必要とされない。しかし、任意選択により、いわゆる吸収フィルタが、センサの上流に又は光学デバイスの上流に用いられてもよい。例として、励起光の部分又は個々の検出チャネルのクロストークが、その結果、更に低減されてもよい。実際の分割が、フィルタによらずに、言い換えると、フィルタの無い方式で達成されることは、本発明にとって重要である。このことは、第１に、具体的なビーム誘導に関して、離散ダイクロイックビームスプリッタ又は別のフィルタを有する配列と比較して、より大きい適合性が詳細に達成されるという長所を有する。それに加えて、いわゆるスペクトル段階型フィルタと比較して、より良好なスペクトル縁峻度及びより安定した実装が達成される可能性がある。
【００２５】
独国特許出願公開第１０２０１４１０７６０６号とは対照的に、本発明の場合、瞳及び画像平面は、照明モードが変化する場合にも交換されない。本発明に従う光学グループの１つの特に好ましい変形において、検出ビーム路は、第２光学ビーム誘導手段、特にレンズ及び／又はミラーを有する第２ビーム路を備えることにより、検出光を検出平面中に誘導する。この場合、それで、第２光学ビーム誘導手段が、入力平面の回折制限された撮像を検出平面中に生成するように配列され構成され、選択デバイスが、測定されるべき検出光に対して第１ビーム路又は第２ビーム路を選択するために存在する。
【００２６】
この構成によって、本発明は、このように、測定タスク及び対応する照明に基づいて異なる検出モードで操作されてもよい検出装置を提供する。特に、共焦点多点顕微鏡法の、及び可能なら走査広視野測定の測定タスクが、互いに組み合わされてもよい。
【００２７】
本発明は、したがって、特に、ピンホールの上流に切り換えられる必要がない検出ビーム路を伴わずに、単一システムにおいて異なる撮像方法をアクセス可能にする検出装置を明示するという目的を達成する。先行技術からの共焦点システムと比較して、より高い適応性が、検出に関してこのように達成される。独国特許出願公開第１０２０１４１０７６０６号が、異なる操作モードがレーザ走査システムにおいてたった１つのセンサを用いて実現され得る態様を示していることは真実である。その場合の１つの欠点は、瞳及び画像面が交換されなければならないことである。
【００２８】
好ましくは、検出光を測定するための、少なくとも１つの空間分解、特に区画化検出器が、検出平面内に存在する。検出平面内に設置された少なくとも１つの検出器を有する本発明に従う光学グループは、また、検出装置と称されてもよい。原理的には、本発明に従う光学グループは、入力平面内に入力ストップを伴わずに用いられてもよい。光学グループが共焦点顕微鏡法のために用いられる場合に対して、測定されるべき検出光を受け入れるための入力ピンホールストップ、特に共焦点ピンホールが、入力平面内に配列されてもよい。
【００２９】
本発明の１つの主な長所は、更に、比較的高い並列化度を可能にするモードがまた可能であることである。約１００層並列化の領域の値が、ここでは考えられる。そのような方法によって、生細胞さえ、より長い時間の間、穏やかに検査されてもよく、その理由は、所与の画像記録レートに対する画質を低下させることなく、最大光パワーがかなり低減されてもよいからである。しかし、大部分の光損傷効果に対して決定的であるのはまさに最大パワーである。全体量は、明らかに、より小さい影響しか及ぼさない。
【００３０】
選択デバイスは、また、原理的には、第１ビーム路と、第２ビーム路と、追加的に少なくとも１つの更なるビーム路との間で選択することができるように構成されてもよい。
【００３１】
選択デバイスは、原理的には、ビーム路を切り換えるのに適している任意のタイプのビーム偏向デバイスであってもよい。原理的には、電気光学構成要素も、ここで用いられてもよい。特に有利には、選択デバイスは、調節可能ミラーであり、当該調節可能ミラーは、特に検出ビーム路中に移動可能であり、及びそれから外に移動可能である。この変形は、構造的に単純で確実に作動する。例として、ミラーが、枢動可能及び／又は置換可能であってもよい。更なる有利な変形では、光の偏波が、また、選択デバイスの場合に利用されてもよい。例として、ダイクロイックミラーを用いることが可能であり、当該ダイクロイックミラーの反射及び伝送特性は、光の波長及び偏波に敏感に依存している。
【００３２】
好ましくは、調節可能ミラーが、検出ビーム路の視準が合される部分の中に動かされてもよい。その結果として達成されることは、そのように決定的ではないミラーの位置決めである。
【００３３】
原理的には、区画化又は画素化検出器が、空間分解検出器として用いられてもよい。
【００３４】
１つの特に好ましい例示的実施形態では、空間分解検出器及び／又は第２空間分解検出器が、１つの、特に冷却される、ＳＰＡＤ検出器（ＳＰＡＤ＝単一光子アバランシェフォトダイオードアレイ）、又は好適な構成の複数のこれらの検出器の配列である。
【００３５】
これらのセンサは、現在、共焦点システムにおいて商用ユーザビリティについての閾値付近にある。ＳＰＡＤ検出器は、またＳＰＡＤセンサとも称されるが、一連の長所を有する。この点に関して、８０％を超える量子効率が、特定の波長において達成される。個々の画素の高い利得は、これらのセンサが単一光子計数モードで作動させられることを可能にする。更に、これらのセンサは、走査顕微鏡法での１ＭＨｚの領域において必要な読出し速度をこのように達成するために必要な読出しレートを有する。この場合、読出し時間は、約１０００μｓから１０ｎｓまで変化してもよい。必要な動特性が、点像分布関数（ＰＳＦ）の部分が対応する数の画素の中に分布している場合に付与される。５０ｎｓの不感時間が付与されると、例えば、個々の要素毎に１〜５ＭＨｚの間の計数率を達成することが可能である。点像分布関数の光が複数、例えば２５の画素の間に分布している場合、ほぼ１００ＭＨｚの計数率が可能であり、当該係数率は、レーザ走査顕微鏡での現実応用にまったく十分なものである。電子工学の更なる発展は、今後、有意に短縮された不感時間によってセンサの電子雪崩の能動「消火」を可能にし、また最大計数率を増加させるであろう。更に、これらのセンサは、上記モードを実現することができるのに必要な数の画素を有する。この点に関して、およそ１００ｘ１００画素、また有意により多い画素を有するセンサが、既に公知である。ここで取り扱われる測定タスクに対して最も好適なセンサは、したがって、実際には、いわゆるＳＰＡＤアレイ（ＳＰＡＤ＝単一光子アバランシェフォトダイオードアレイ）である。このタイプのセンサは、全ての必要な特性、特に、光分布の空間分解測定のための画素構造、高い感度（高量子効率又は光子検出効率）、及び最後に、十分に高い利得の結果として、個々の光子をカウント（光子計数）する可能性を一体化させる。
【００３６】
しかし、更なる計量器具が、本発明に従うシステムにおいて、このセンサを使用することができるように実装されなければならない。例として、そのようなセンサは、光電子増倍管（ＰＭＴ）と比較して、かなりより高い暗騒音を有する。この影響を打ち消すために、２つの計量器具が、実装されなければならない。第１は、冷却が、暗騒音を有意に低減する（温度を８Ｋだけ低下させることによって、暗騒音はおよそ半分にされる場合がある）ことが知られている。それに加えて、センサは、それぞれの信号生成に実際に用いられる画素だけが実際に作動させられるように適応して切替え可能でなければならない。このことは、個々の画素に対するいわゆるランダムアクセス（個々にアクセス可能なこと）を必要とする。照明の光分布及び選択されたセンサモードに基づいて、センサの特定の検出パターンが、したがって選択される。
【００３７】
しかし、ＳＰＡＤアレイセンサ（ＳＰＡＤ＝単一光子アバランシェフォトダイオードアレイ）の他に、別のセンサがまた使用されてもよい。例として、空間分解検出器及び／又は第２空間分解検出器が、半導体検出器、特に、ＣＣＤ又はＣＭＯＳ検出器であってもよい。特に、高速度カメラが使用されてもよい。
【００３８】
特に好ましくは、空間分解検出器及び／又は第２空間分解検出器は、上流の画像増倍管、特に上流のマルチチャネルプレートを有するカメラであってもよい。
【００３９】
特に良好な感度が、例えば、非常に低い発光性対象物の検査に要求される場合、空間分解検出器及び／又は第２空間分解検出器は、複数の光電子増倍管によって形成されてもよい。この場合、検出光は、非撮像手段を用いて再分配されてもよい。個々の光子さえもがそれによって計数されてもよい空間分解検出器のような、マイクロチャネルプレートが、また用いられてもよい。
【００４０】
更に、光電子増倍管の上流にある非撮像光学要素を用いることによって、従来の光電子増倍管技術を伴う光学配列を用いることが可能である。これは、例えば、光ファイバ束（独国特許出願公開第１０２０１３０１５９３１号）であってもよい。結局、フォトダイオード、特にＰＩＮダイオード、又はいわゆるＳｉＰＭ、ＳｉＰＭＴ、ＭＰＰＣその他等の更なる固体センサが、また検出器として使用可能である。
【００４１】
どのような検出器が用いられるかによって、更なる方法さえもが、純粋の撮像に加えて用いられてもよい。この点に関して、ＳＰＡＤアレイ（ＳＰＡＤ＝単一光子アバランシェフォトダイオードアレイ）を用いて、色素の寿命が、また、測定及び表示されてもよい（蛍光寿命撮像）。同様に、信号同士の間の相関関係が、蛍光相関分光法のために測定及び評価されてもよい。対応する励起パターンによって、多点ＦＣＳ又は多点ＦＬＩＭ測定が、それによって実現されてもよい。
【００４２】
カメラのようなセンサ、例えば、ＥＭＣＣＤ、ＣＭＯＳ、ｓＣＭＯＳ又はＣＣＤタイプのカメラが用いられる場合、それらは、高速画像増幅器、例えばいわゆるマイクロチャネルプレートを備えていてもよい。更に、空間分解検出は、同様に、いわゆるハイブリッド検出器を用いて達成されてもよい。これらのセンサは、光電陰極及びＡＰＤ構造から構成される。この場合、光電効果によって光電陰極から排出された電子は、高電圧（約８ｋＶ）によって高速化され、次いで、ＡＰＤのように機能する感知表面に衝突する。単一光子測定が可能であるそのような高い利得を有する破壊及び雪崩効果が、生じる。ハイブリッド検出器が、また、空間分解方式で用いられてもよい。
【００４３】
更に、光は、光ファイバ又はファイバ束等の非撮像要素を用いることによって、別の検出器に再分配されてもよい。これは、例えば、光電子増倍管であってもよい。有利には、後者は、ＧａＡｓＰを含む光電陰極を備えていてもよい。
【００４４】
光学配列において、全てのスペクトル成分が撮像センサによって検出されるという効果への変形が許容される。
【００４５】
本発明に従う検出装置の更なる好ましい構成において、少なくとも１つの、特に２次元のマルチレンズアレイが存在し、そして、調節デバイスが、マルチレンズアレイを検出ビーム路中に及びそれから外に動かすために存在する。ビーム路中に導入されたマルチレンズアレイによって、この変形は、複数のビームによって入力ピンホールストップの、したがってマルチスポット共焦点顕微鏡法の利用を可能にする。マルチレンズアレイの場合、必ずしもレンズの全てが、この場合に利用される必要があるわけではない。例として、２次元マルチレンズアレイの場合、ちょうど１列のレンズが、用いられてもよい。
【００４６】
少なくとも１つのマルチレンズアレイを備える装置構成は、スペクトル分解多点走査顕微鏡法と称される、本発明に従う方法の開発を有利に可能にする。この場合、試料は、照明光の複数のスポットによって、特に１つの直線内にあるスポットによって同時に走査され、マルチレンズアレイは、入力ピンホールストップの下流の検出ビーム路内に設置され、このマルチレンズアレイのレンズの数は、試料が走査される照明光のスポットの数に少なくとも等しい。更に、選択デバイスは、測定されるべき検出光に対して第１ビーム路を選択し、照明光の個々のスポットに帰属させられる検出光のビームが、スペクトル空間分割され、このように取得されたビームが、操作デバイスによって、特にスペクトル選択平面内で操作され、そして、操作されたビームが検出される。
【００４７】
この方法変形において、照明光の個々のスポットに帰属させられる検出光の個々のビームのスペクトル分布が、標的化方式で操作されてもよい。
【００４８】
原理的には、このスペクトル分解多点走査顕微鏡法は、選択デバイスを形成する調節可能ミラーが、ビーム路中に導入された場合に作動させられてもよい。すなわち、そのとき、第１ビーム路内で、検出光が、ミラーにおいて少なくとも一度だけ反射される。しかし、特に好ましくは、ミラーは、第１ビーム路の選択のために、ビーム路から外に動かされるか又はそれから取り外される。すなわち、この変形では、第１ビーム路を経由して検出平面中に進む光が、ミラーにおいて反射されない。
【００４９】
スペクトル成分の操作は、原理的には、任意の所望の変更を含んでもよい。特に好ましくは、スポットのうちの少なくとも１つ、特にそれらの全てについて、照明光の個々のスポットに帰属させられるビームを操作することは、少なくとも１つの、特に単一のスペクトル成分を選択することである。照明光の対応するスポットのスペクトル励起と協調して、次いで、標的化方式で、例えば、特定の色素の放出波長若しくはスペクトル放出波長帯域を選択することが可能であり、又は標的化方式で、２つ以上の放出波長又はスペクトル放出波長帯域を選択することが可能である。
【００５０】
分散デバイスは、所望のスペクトル空間分割がそれによって実現されてもよい任意のデバイスであると考えられる。例として、回折格子等の回析構成要素が、用いられてもよい。その内部で分散デバイスがプリズムである検出装置が、特に好ましい。その結果、コンパクトで光効率がよい構成が可能であり、当該構成内で、第１ビーム路内で操作デバイスから後方に反射された検出光が、反対方向に再び分散デバイスを通って進むことにより、特に後方に反射された検出光が、反対の順序で分散デバイスを通って進んだ後には有意な色収差を有さないようにし、それにより、ピンホールの又は試料内のポイントエミッタの回折制限された撮像が可能である。
【００５１】
対応する方法において、操作されたビームは、反対方向に再び第１ビーム路内の分散デバイスを通って進む。本発明に従う検出装置の更なる好ましい実施形態変形において、操作デバイスは、スペクトル選択平面を備え、その中に、特に調節可能ビーム偏向手段が配列されてもよい。個々のスペクトル成分を偏向させることによって、これらの成分は、標的化方式で、検出器の方向に転送されても、又は検出されるべき光から除去されてもよい。
【００５２】
特に好ましくは、スペクトル選択平面は、検出平面ではなく、検出平面に関して光学的に共役である平面内にある。
【００５３】
少なくとも１つの第２検出器がスペクトル選択平面の下流に配列されることにより、スペクトル選択平面を通って進む、すなわちそれを通して伝送される検出光を検出する場合に、更なる評価可能性が生じる。原理的には、検出光は、次いで、特に個々の照明スポットについてスペクトル分解方式で評価されてもよい。
【００５４】
操作デバイスを用いたスペクトル選択は、原理的には、様々な方法で実行されてもよい。所望のスペクトル成分が、検出器まで誘導されることが重要である。スペクトル選択平面内の操作デバイス、特にビーム偏向手段が、ミラー、特に移動可能ミラー、又は別の光方向付け要素を有する光学機械式配列によって形成されてもよい。例として、マイクロミラーアレイが用いられてもよい。また、いわゆるＳＬＭ（ＳＬＭ＝光空間変調器）を用いることが有利な場合がある。後者が、所望のスペクトル成分に影響を及ぼして、それらを撮像センサに方向付けるように用いられてもよい。それに加えて、ここで、いわゆるＤＭＤ（デジタルミラーデバイス）又は光誘導機能を有する他のＭＥＭＳ（ＭＥＭＳ＝微小電気機械システム）を用いることが可能である。
【００５５】
本発明の１つの重要な側面は、更に、操作デバイスと検出平面とが、ビーム路内で互いに分離されていることである。操作デバイスと検出平面とは、したがって、互いに空間的に及び光学的に分離されている。しかし、それらは、好ましくは、互いに光学的に共役である平面内にあってもよい。
【００５６】
検出ビーム路内に、１つのマルチレンズアレイ、特に２次元のマルチレンズアレイを設置することは、高並列多点走査顕微鏡法と称される、特に好ましい方法変形を付加的に可能にする。この場合、試料は、特に２次元パターンに配列されている照明光の多くのスポットによって同時に走査され、１つのマルチレンズアレイ、特に２次元マルチレンズアレイが入力ピンホールストップの下流の検出ビーム路内に設置され、マルチレンズアレイのレンズの数が、試料がそれによって走査される照明光のスポットの数に少なくとも等しい。更に、選択デバイスが、測定されるべき検出光についての第２ビーム路を選択し、照明光の個々のスポットに帰属させられる検出光のビームが、検出される。この方法は、急速に褪色を受ける敏感な試料に特に適している。
【００５７】
先行技術の独国特許出願公開第１０２０１４１０７６０６号において、ビーム路を切り換えることによって、異なる励起及び検出モードが、ちょうど１つのセンサを用いて実現され得ることは真実である。しかし、本発明とは対照的に、多点照明／異なる程度の並列化による検出が、その場合には可能ではない。原理的には、本発明に従う検出装置に接続された顕微鏡内の照明は、それぞれ用いられる方法に適合させられなければならない。本発明に従う方法の好ましい変形において、回析要素、特にＳＬＭ（光空間変調器）又はダンマン格子が照明ビーム路の瞳平面内の照明のために設置される。望ましい照明パターン、例えば、１次元若しくは２次元多点パターン、又は他の照明ラインが、したがって、高度に画定された方式で生成されてもよい。
【００５８】
特にスペクトル分解マルチスポット共焦点顕微鏡法の場合、特に好ましくは、１つのＳＰＡＤ検出器（ＳＰＡＤ＝単一光子アバランシェフォトダイオードアレイ）、特に冷却型ＳＰＡＤ検出器が、空間分解検出器として用いられる。測定データのＳＮ比が、この場合、ＳＰＡＤアレイ（ＳＰＡＤ＝単一光子アバランシェフォトダイオードアレイ）の場合に、それぞれ必要とされる信号生成に用いられるそれらの画素だけが作動させられるならば、増加させられることがある。
【００５９】
結局、本発明に従う光学グループは、直接撮像について更なる有利な方法変形を可能にし、当該方法変形は、広視野顕微鏡法又は走査広視野顕微鏡法と称されることがある。この場合、試料は、少なくとも視野領域内で照明光によって同時に照射され、選択デバイスは、測定されるべき検出光についての第２ビーム路を選択し、視野領域は、空間分解検出器上に撮像され、検出ビーム路は、マルチレンズアレイ及び検出ピンホールストップを欠いている。
【００６０】
この方法に対する必要条件は、更に、光学システムが視野のための光を伝送してもよいということである。この伝送可能な視野が、通常、関連する共焦点顕微鏡の光学システムに対して特に大きいわけではないので、視野領域が試料にわたって走査されるこの方法の開発が好ましい。この文脈において、基準がまた、検出装置への適応のために、共焦点顕微鏡のエタンデュを増加させることにされてもよい。大きい試料領域の全体画像が、次いで、原理的には、それぞれのスキャナ位置についてそれぞれ取得された個々の画像を組み合わせることによって取得されてもよい。
【００６１】
本発明に従う顕微鏡は、好ましくは共焦点レーザ走査顕微鏡である。この場合、走査システムは、先行技術に従う共焦点システムであってもよい。原理的には、例えば、その中で試料自体が動かされるシステムが、また使用可能である。
【００６２】
本発明の更なる長所及び特徴が、図を参照して以下で説明される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明に従う検出装置についての斜視略図である。
【図２】図１の検出装置についての平面図である。
【図３】図１及び２の検出装置についての詳細を示す。
【図４】スペクトル分解マルチスポット共焦点顕微鏡法の方法変形についての、本発明に従う検出装置内の空間分解検出器の略図である。
【図５】高並列マルチスポット共焦点顕微鏡法の方法変形についての、本発明に従う検出装置内の空間分解検出器についての略図である。
【図６】走査広視野顕微鏡法の方法変形のための、本発明に従う検出装置内の空間分解検出器についての略図である。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
レーザ走査顕微鏡のための、本発明に従う検出装置１００についての１つの例示実施形態が、図１〜３に関して詳細に説明される。同一の及び同一作用の構成要素が、図中の同じ参照符号によって概して識別される。
【００６５】
図面１及び２に概略的に示されている検出装置１００は、本質的な構成要素として、入力平面１０と、空間分解区画化検出器６８と、第１ビーム路１及び第２ビーム路２を備える検出ビーム路と、を備える。第１ビーム路１内に、分散デバイス２６が存在し、調節可能ミラー２２が、第１ビーム路１と第２ビーム路２との間で切り替えるための選択デバイスとして機能する。特定の用途に対して、入力ピンホールと称されてもよい入力ピンホールストップ１０が、入力平面１０内に存在してもよい。
【００６６】
図１及び２内等には示されていない入力ピンホールストップは、参照符号１０によって識別される位置にあってもよい。ここには、対物レンズの焦点面に対して共役である平面と称されてもよい入力平面１０が存在する。測定されるべき検出光１１のビームが、上記入力平面１０から放射し、第１収束レンズ１２によって視準を合され、調節可能マルチレンズアレイ１６上に誘導され、当該調節可能マルチレンズアレイは、機構（図示せず）を用いて、特定の用途に対してビーム路から取り外されてもよい（両矢印１７）。マルチレンズアレイ１６から放射する放射１８は、第２収束レンズ２０まで進み、第２収束レンズ２０によって視準を合され、そこから調節可能ミラー２２まで進み、当該調節可能ミラーは、例えば、機構（図示せず）を用いてビーム路から引き外されるか又は枢動させて外されるか等、動かして外されてもよい（両矢印２３）。調節可能ミラー２２は、明確にするために図１には示されていない。
【００６７】
測定されるべき検出光１１に対して第１ビーム路１又は第２ビーム路２を選択するための選択デバイスを実現するミラー２２が、図２に示すように、ビーム路内にある場合、ミラー２２で反射された検出光５９、６２、６４は、レンズ５８、６０、６６を経由して検出平面６７中に及び空間分解検出器６８上に進む。それは、第２ビーム路２に一致する。入力平面１０に入る測定されるべき検出光１１は、空間分解検出器６８を用いて検出され、当該空間分解検出器は、顕微鏡に関して、マイクロ対物レンズの中間画像面内にある。
【００６８】
調節可能ミラー２２が、機構（図示せず）を用いてビーム路から、例えば引いて外されるか又は枢動させて外される（両矢印２３）場合、測定されるべき検出光２４は、レンズ２０からプリズム２６上まで進み、当該プリズムは、分散デバイスを実現して、測定されるべき検出光２４を空間スペクトル分割するように機能する。可変ミラー２２がビーム路から引き外される方法変形は、特に、スペクトル分解共焦点マルチスポット走査顕微鏡法のための方法に関連する。この場合、試料は、複数の光点によって同時に照明され、これらの照明された試料位置から放射する放射が同時に検出される。検出光は、この場合、第１ビーム路をとる。
【００６９】
例として、図２に示す状況の場合、測定されるべき検出光１４、１８、２４は、図面の平面に垂直に、すなわちｙ方向（図１の座標系５を参照）に、それぞれが異なる照明された試料位置と関連付けられた複数のビームに分割されてもよい。図面の平面に垂直な方向に分割されたこの検出光２４は、プリズム２６に入り、ｘ方向（図１の座標系５を参照）に後者によって分割される。レンズ３０、３４及び３６を経由して、空間スペクトル分割された検出光２８、３２は、スペクトル選択平面４８中に撮像される。
【００７０】
スペクトル空間分割された検出光を操作するための操作デバイス４９が、スペクトル選択平面４８内にある。そのような操作デバイス４９の一例が、図３に関連して以下で更に説明される。例として、操作デバイス４９を用いて、スペクトル分割された部分ビームから、個々のスペクトル成分４２、４４、４６が、後方に誘導されるか及び／又は阻止される。したがって、個々の選択されたスペクトル成分は、操作デバイス４９によって後方に反射され、次いで、同じ光学路上を後方に、すなわちレンズ３６、３４、３０を経由してプリズム２６上まで進む。プリズム２６を経由して、第１ビーム路は、次いで固定ミラー５７を経由し、そこからレンズ５８、６０、６６を経由して検出平面６７中に、及び空間分解検出器６８上まで続く。
【００７１】
そのため、図１及び２に表す光学機構の場合、ピンホール平面１０から来る測定されるべき検出光１１は、スペクトル成分を選択するための光学装置（操作デバイス４９）を経由して検出平面６７中に誘導されるか、又は検出平面６７中に、及び空間分解検出器６８上に直接撮像されるかのいずれかである。この場合、スペクトル成分は、スペクトル選択平面４８内の、スペクトル選択ユニットと称されてもよい操作デバイス４９によって選択されてもよく、そして、空間分解検出器６８上まで誘導されてもよい。
【００７２】
両方の変形において、すなわち、検出光が第１ビーム路又は第２ビーム路を経由して誘導されるか否かに無関係に、入力平面が、回折制限方式で検出平面中に撮像されることが、本発明にとって特に重要である。
【００７３】
検出光が、第１ビーム路を経由して検出平面６７中に誘導される場合、回折制限された撮像が、スペクトル分解方式で追加的に実行され、スペクトル分解及びスペクトル選択が、スペクトル操作モジュールのそれぞれの設定によって提供される。
【００７４】
本発明に従って、このように、分散デバイス２６及び操作デバイス４９と一緒に第１光学ビーム誘導手段３０、３４、３６、５７は、入力平面１０のスペクトル分離され回折制限された撮像を検出平面６７中に生成するように配列され構成されている。
【００７５】
検出光が、第２ビーム路を経由して検出器平面中に誘導される場合、第２光学ビーム誘導手段２０、２２、５８、６０、６６が、入力平面１０の回折制限された撮像を検出平面６７中に生成するように同様に配列され構成されている。
【００７６】
操作デバイス４９の詳細が、図３に関して説明される。図３は、操作デバイス４９を概略的に示し、当該操作デバイスは、示された例においてマイクロミラーアレイ４９であるように意図されている。上記マイクロミラーアレイ４９は、複数のそれぞれの個別調節可能ミラーを備え、そのうちの３つのミラー５０、５１、５２が、例として示されている。上記ミラー５０、５１、５２は、スペクトル選択平面４８内にあり、当該スペクトル選択平面は、次に、顕微鏡対物レンズの物体平面に関して共役である平面内、すなわち言い換えると中間画像平面内にある。実際には、マイクロミラーアレイ４９は、より多い数のマイクロミラー５０、５１、５２を備える。また、しかし、これらのミラーはまた、肉眼で見る様式で具現化されてもよく、そして好適な方式でスペクトル選択平面内のビーム路中に導入されてもよい。
【００７７】
図３に示す例示的実施形態では、プリズム２６によってスペクトル空間分離されたが、全く同一の照明された試料位置から元々放射された３つのビーム４２、４４、４６は、それぞれ、マイクロミラー５０、５１及び５２に衝突する。ビーム４２、４４、４６は、それぞれ、ビーム４３、４５及び４７へと反射される。標的化方式で選択されたミラー５０、５１、５２の設定は、例えば、特定の所望のスペクトル成分（例えば、示しているビーム４３、４５、４７）だけが、第２ビーム路上に後方に反射されて、検出平面６７中に及び空間分解検出器６８上に進み、そしてそこで検出されるという効果を有してもよい。原理的には、マイクロミラーアレイ４９のマイクロミラー５０、５１、５２は、また、入射光がマイクロミラーアレイ４９を通して伝送されるように設定されてもよい。上記光は、マイクロミラーアレイ４９の下流で既に空間スペクトル分解されているので、次いで、スペクトル分解方式で検出されるか、又は更なる検出器（図に示さず）によってそれのスペクトル全体で検出されてもよい。マイクロミラーアレイ４９を通して伝送されたこの光は、図３において矢印５３によって概略的に表示されている。
【００７８】
図４は、空間選択共焦点検出の顕微鏡法方法の場合についての、空間分解検出器６８上の例示的な光分布を示す。スペクトル励起が、試料内の４つの異なる位置において、それぞれの場合に達成されることが、ここで仮定された。その後に、これらの励起された位置から放射する全ての放出ビームが、顕微鏡配列を通して、そしてピンホール平面１０を通して、スペクトル選択ユニットすなわち操作デバイス４９まで伝播された。そこで、対象のスペクトル成分は、説明したように（図３）空間分解検出器６８の平面中へと後方に導かれ、そこで空間分解方式で検出される。
【００７９】
この場合、配列全体の光学品質が非常に良いので、物体平面内の光点は、画素型センサ上に点像分布関数、すなわち、回折制限特質を有する空間分解検出器６８を生成することにより、「光子再割当」の方法が利用されてもよい。特に、色彩補正が、このために好適な方式で実装されなければならない。プリズム２６における検出光のスペクトル分割のために、個々の波長が、プリズム２６から光学システムを通る異なる経路上のスペクトル選択平面４８まで進む。スペクトル選択平面４８内で、更に、特定のスペクトル成分が、標的化方式で設定された異なる角度で反射されることにより、それらは、次いで光学システムを通って異なる経路上に再度戻って、次いで、プリズム２６内でそれぞれの場合にスペクトル結合される。光学システムを通る異なる経路は、上述の光学システムの標的化色彩補正を必要とする。この点に関して、光学システムの純粋の軸外色収差は、重要でないが、色彩に依存した開口収差は、非常に重大な意味を持つ。通常、構成は、焦点、開口収差及び非点収差等の全ての偶数収差の良好な色彩の補正を必要とする一方、歪み及びコマ収差等の奇数収差は、二次的に重要であり、光学システムを通る二カ所で相互に補償する。
【００８０】
更に、信号は、したがってまたデコンボリューションされてもよい。スペクトル分解は、示された例示的実施形態での分散要素すなわちプリズム２６の分散率に関して、スペクトル選択デバイスすなわち操作デバイス４９の構成要素の調整正確度だけによって制限される。
【００８１】
図４に表す例の場合、空間分解検出器６８は、複数の画素６９によって概略的に図示されている。例として、冷却されるＳＰＡＤアレイ（ＳＰＡＤ＝単一光子アバランシェフォトダイオードアレイ）が含まれている。ノイズを最小化するために、有利には、表示された光分布７１〜７８の周りの領域の画素だけが、ここでは使用される。検出光が無いことが期待される中央領域７０内では、バイアス電圧が印加されていないか、又は、いずれかの割合で電圧が損傷閾値以下であり、そのため、全領域７０は、信号にも、ノイズにも寄与しない。ＳＮ比が、このように改善されてもよい。具体的には、点７１及び７５が、第１試料点の様々なスペクトル成分と関連している。それに対応して、点７２及び７６が、第２の照明された試料点と関連し、点７３及び７７が、第３の照明された試料点と関連し、最後に、点７４及び７８が、第４の照明された試料点と関連している。画素６９が、概略的に図示されている。実際には、画素は、光点７１〜７８がより多い数の画素、例えば９個の画素に重なるように、より小さくてもよい。スペクトル選択平面４８内で操作デバイス４９すなわち特にマイクロミラーアレイを用いて、個々のスペクトル成分の後方反射が、それぞれの個々の照明された試料点について個々に設定されてもよいので、点７１〜７８のそれぞれにおける光は、異なる波長又は異なるスペクトル範囲を有してもよく、スペクトル範囲は、それのスペクトル境界、したがってスペクトル内でのそれの位置及びそれのスペクトル幅によって画定される。この状況は、点７１〜７８のそれぞれ異なるハッチングによって、図４に概略的に図示されている。
【００８２】
実際、単一点励起によって、本発明に従う検出装置を用いて、最大３つのほとんど任意に選択可能なスペクトルチャネルを検出することが可能であり、上記チャネルのうちの２つは、空間分解方式で検出可能（いわゆる光子再割当の可能性）である。
【００８３】
空間分解は、ここでは、試料についての空間分解ではないと理解される。むしろ、常に同じ位置にあるＰＳＦすなわち点像分布関数が、空間的にオーバーサンプリングされるように意図されている。この意味でのＰＳＦは、したがって検出器空間内において空間分解方式で測定される。
【００８４】
Ｎ個のスペクトルレーザ点による試料の励起時に、３ｘＮ個の調節可能スペクトルチャネルが検出されてもよく、２ｘＮ個のチャネルが、空間分解方式で検出されてもよい。更に、ラインセンサを用いてＮ個のスペクトルを直接記録することが可能である。
【００８５】
生細胞は、極端に激しい光照射に対して特に高い感度を有する。第１に、蛍光色素がプロセス中に破壊される。このことは、光退色と称される。第２に、細胞への直接の損傷が、例えば、多光子プロセスの結果としてのＤＮＡへの損傷の結果として生じてもよい。これらのプロセスは、概して、より小さい程度で光線量に、むしろ光学ピークパワーに又は等しく強度に依存する。言い換えると、光子束又は光子密度が、これらのプロセスに対して重要である。好都合なＳＮ比（ＳＮＲ）は、生物学的撮像における下限を有する。一方、概して、画像記録レートは、特定の値を達成するように意図される。所与の試料及び所与の画像記録レートに対して特定のＳＮ比を達成するために、励起放射のレーザパワーが、そのため概して増加させられる。しかし、このことは、試料損傷の上述の理由のために、生細胞の場合に問題を含むことがある。これらの場合に、試料に対して特に注意深くあるモードに顕微鏡を切り換えることが可能であるべきである。光学切片（光学「セクショニング」）の可能性を有する高解像度撮像に存在するレーザ走査顕微鏡法の長所を放棄することを望まない場合、唯一の残りの可能性は、最大の可能な程度まで記録を並列化することである。本発明は、これを達成する。
【００８６】
この場合、検出装置内の切換え要素、すなわち調節可能ミラー２２が、第２ビーム路２に再度設定される。すなわちビーム路（両矢印２３）中に動かされる。更に、マイクロレンズアレイ１６が、ビーム路中に導入される（両矢印１７）。この場合、スペクトル選択平面４８を経由する第１ビーム路１が用いられるスペクトル分解共焦点マルチポイント顕微鏡法に対して、同じマルチレンズアレイ１６を高並列走査顕微鏡法のために用いることが可能であり、これがここで説明されることになる。最も重要なことは、マルチレンズアレイ１６のマイクロレンズの数が、測定されるべき焦点（測定スポット）の最大数に一致することである。更に、マルチレンズアレイ１６は、「ピッチ」とも称される、焦点同士の間の距離を画定する。これは、マルチビーム照明によって調整される方式で行なわれる。
【００８７】
図５は、高並列マルチポイント走査顕微鏡法についての検出状況を概略的に示す。この場合、多数の光点７９は、空間分解検出器６８に入射し、当該光点は、それぞれ試料内の異なる照明される位置と関連している。スペクトル選択平面４８を経由する第２ビーム路が用いられたスペクトル分解マルチポイント走査顕微鏡法とは対照的に、光点５９は、概して、標的化方式で設定されたスペクトルプロファイルを有しない。むしろ、光点４９のスペクトル成分は、それぞれ照明された試料スポットのそれぞれのスペクトル応答から入射光にもたらされる。ここでも、画素６９が概略的に示されており、実際は、画素は、光点７９がより多い数の画素、例えば９個の画素に重なるようにより小さくてもよい。
【００８８】
勿論、全ての用途に対して、対応する幾何形状を有する励起場を試料中に放射することが必要である。例として、高並列マルチスポット走査顕微鏡法の場合、個々の焦点同士の間に正しい距離を有する好適な照明パターンが、試料上に放射されなければならない。このことは、原理的には様々な方法で実行されてもよい。第１に、マルチポイントパターンを有する顕微鏡の直接照明が実行されてもよい。更に、例えば主要なカラースプリッタと走査対物レンズとの間のレーザ走査顕微鏡にあってもよい静止瞳内で、光空間変調器（ＳＬＭ）によって対応するパターンを切り換えることが可能である。例として、いわゆるダンマン格子が、また用いられてもよい。
【００８９】
それに加えて、高並列多共焦点レーザ走査顕微鏡のそれぞれ異なる領域内で異なる波長を励起すること、及びこれらの領域内でそれぞれ励起された放射を検出することがまた可能である。線形蛍光励起に加えて、蛍光の多光子励起が、また、上記で説明した方法変形の場合に可能である。
【００９０】
最後に、本発明に従う装置１００が、また、直接撮像のために用いられてもよい。このことは、図６に関連して説明される。図６は、空間分解検出器６８の画素６９上への細胞形成８０の撮像を概略的に示す。この場合、センサ画素６９の全てが活性である。視野を拡大するために、試料の異なる領域が、顕微鏡のメカニカルスキャナによって表されてもよい。直接撮像のためには、入力平面１０内のピンホールの上流及び下流にあるマイクロレンズアレイ１６が、ビーム路から外に動かされなければならず（両矢印１７）、そしてピンホール自体が、直接撮像される視野のサイズまで大きくされなければならない。この場合、可変ミラー２２は、光がスペクトル選択平面４８を経由するのではなく、第２ビーム路２を経由して空間分解検出器６８上まで誘導されるように設定される（両矢印２３）。この場合、一方でスペクトル選択平面４８内の操作デバイス４９から戻る光に対する、及び他方でピンホール平面１０から来る光に対する可動ミラー２２の位置が同等であるという事実にある配列の固有の対称性が利用される。光が、スペクトル選択平面４８を経由して誘導されるのではなく、むしろピンホール平面１０から来る光が、空間分解検出器６８上まで直接導かれるように、可変ミラー２２をビーム路中に導入することは、ピンホール平面１０が空間分解検出器６８上に撮像されるという効果を有する。しかし、ピンホール１０は、それ自体が試料に関して共役な平面内にあるので、試料の直接撮像がこのように提供される。それにより、そのことが、本発明に従う検出装置を用いて、全ての可能な広視野の検出方法をうまく実現することを可能にする。この場合、図６は、強度分布の簡易撮像を表す。この場合、試料は、勿論、対応するより大きい視野が照明されなければならず、それは、従来の広視野照明によって実現されてもよい。しかし、より良いものは、可能な限り正確に撮像視野に一致し、試料にわたって対応して走査される照度分布である。このため、原理的には、対応する明視野が主要カラースプリッタ及びスキャナを経由して試料上に放射される、及び上記試料にわたって走査されることが単に必要である。
【００９１】
試料の照明は、したがって、それぞれ用いられる顕微鏡法方法に適合されなければならない。この点に関して、共焦点操作モード対して、レーザビームは、試料に収束させられ、そして、この焦点は、試料にわたって走査される。広視野状検出に対して、試料内の小さい視野において対応する励起を実行することが必要である。この場合、照明された視野は、センサ上に撮像された領域のサイズに対応しなければならない。より大きい画像を走査するために、小さい画像視野が、メカニカルスキャナによって試料にわたって動かされなければならない。このために、レーザ走査システムの光学システムは、それが特定の画像視野を転送／伝播してもよいように設計されなければならない。そのことは、システムが特定のエタンデュを有しなければならないことを光学的に意味する。
【００９２】
強度についての簡易撮像に加えて、また、例えば、構造化照明（ＳＩＭ、構造化照明顕微鏡法）に基づく更なる方法を実現することが可能である。検出側において、それは、ちょうど図６に関して説明したのと同じ態様で機能する。違いは、単に照明が異なるだけである。直接撮像の場合、空間分解強度の表現に加えて、更なるパラメータもまた測定されてもよい。例として、ＳＰＡＤアレイセンサ（ＳＰＡＤ＝単一光子アバランシェフォトダイオードアレイ）によって、非常に速い読出し速度により、蛍光寿命がまた測定されてもよい。ＦＬＩＭ（蛍光寿命イメージング顕微法）として公知の顕微鏡法の速度の有意な増加が、したがって達成される。更に、例として、分子放出の相関関係が、光学分解を増加させるように用いられてもよい。このことは、例えば、いわゆるＳＯＦＩ方法によって達成される。
【００９３】
本発明は、したがって、多数の顕微鏡法方法において使用されてもよい新規な光学グループを提供する。先行技術に従う共焦点顕微鏡とは対照的に、特定の画像視野が、これで同様に記録されてもよい。この場合、検出装置は、有利な空間オーバーサンプリングを用いて共焦点顕微鏡法の標準的方法に従う検出に対して、及び、他方で広視野状検出に対しての両方に使用されてもよい。その結果、複数のスペクトルチャネルによって共焦点画像を記録することが可能である。更なる用途において、生きている試料の特に注意を要する顕微鏡法のための多点視野についての高並列記録が、追加的に可能である。最後に、センサの２次元特性が、試料にわたって走査される小さい広視野画像を記録することによって十分に利用されてもよい。この場合、照明との相互作用で、様々な広視野状方法が実装可能である。
【００９４】
本発明は、したがって、ビーム路の容易な切替えを可能にする光学配列を提案し、それにより、調節可能スペクトル符号を有する中間並列化による多共焦点作動モードと、比較的高度な並列化及びちょうど１つのセンサによる多共焦点作動モードとの間で切り換えることが可能である。更に、検出ビーム路から区画化光学システム（マルチ又はマイクロレンズアレイ）を引き外すすなわち取り外すことによって、広視野検出がまた可能である。検出ビーム路において、これらの２つのモードの間で切り替えるために、最大で２つの選択要素だけ、好ましくは、検出ユニット内の１つのミラー、そして、可能なら、ピンホール平面の下流の１つのマルチ又はマイクロレンズアレイが切り替えられる。
【００９５】
単純な場合に、中間並列を有するスペクトル分解多共焦点顕微鏡法を高並列顕微鏡法に切り替えるために、１つのミラーだけが、切り換えられなければならない。
【００９６】
本発明に従う検出装置は、したがって、光子再割当の有無にかかわらず、高並列多点走査及び直接撮像によって、共焦点多点走査を可能にする。
【符号の説明】
【００９７】
１  第１ビーム路
２  第２ビーム路
５  座標系
１０  ピンホールストップの平面（ピンホール平面）、入力ピンホールストップ
１２  第１収束レンズ
１４  第１収束レンズの下流の検出ビーム
１６  調節可能マルチレンズアレイ
１７  両矢印：調節可能マルチレンズアレイの運動
１８  マルチレンズアレイの下流の検出ビーム
２０  第２収束レンズ
２２  調節可能ミラー
２３  両矢印：調節可能ミラーの運動
２４  第２収束レンズの下流の検出ビーム
２６  プリズム
２８  プリズムの下流の検出ビーム
３０  第３収束レンズ
３２  第３収束レンズの下流の検出ビーム
３４  第１発散レンズ
３６  第４収束レンズ
４２、４４、４６  第４収束レンズの下流のスペクトル分割部分ビーム
４３、４５、４７  マイクロミラーアレイ４９から反射された部分ビーム４２、４４、４６
４８  スペクトル選択平面
４９  スペクトル選択平面内のマイクロミラーアレイ
５０、５１、５２  マイクロミラーアレイ４９のマイクロミラー
５３  矢印：スペクトル選択平面を通って進む検出光
５４  スペクトル選択平面からの後方に反射された検出光
５６  プリズムを通る更新通過後の検出光
５７  ミラー（固定して設定されるべき）
５８  第５収束レンズ
５９  第５収束レンズの下流の検出光
６０  第２発散レンズ
６２、６４  第２発散レンズの下流の検出光
６６  第６収束レンズ
６７  検出平面
６８  空間分解検出器
６９  空間分解検出器の画素
７０  空間分解検出器の受動的に設定された領域
７１〜７８  検出部分ビームのスペクトル分割光点
７９  高並列共焦点作動における光点
８０  広視野画像
１００  本発明に従う検出装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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