(57)【要約】  組成物、例えば、細胞治療薬及び／又はタンパク質治療薬を含む組成物、並びに癌を治療するためのそうした組成物の使用方法が記載される。
2019503200.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）腫瘍抗原に結合する抗原結合タンパク質又は断片；及び（ｂ）細胞治療薬、抗体、又は抗体薬物複合体のポリペプチド標的を含む融合タンパク質をコードする構成性発現構築物を含む細胞。
【請求項２】
前記腫瘍抗原が腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記腫瘍抗原がＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５、ＣＥＡ、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バール・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）抗原ＥＢＶＡ、ヒトパピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）抗原Ｅ６若しくはＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｅｒｂＢ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、βカテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、αフェトプロテイン、βＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、ＦＲα、ＶＥＧＦＲ２、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ｙ、ＦＡＰ、ＥｐｈＡ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＥＧＦＲ、ＣＡ６、ＣＡ９、ＧＰＮＭＢ、ＥＧＰ１、ＦＯＬＲ１、内皮受容体、ＳＴＥＡＰ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ネクチン−４、ＡＧＳ−１６、グアナリルシクラーゼＣ、ＭＵＣ−１、ＣＦＣ１Ｂ、インテグリンα３鎖（ａ３ｂ１、ラミニン受容体鎖）、ＴＰＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７２、ＣＤ１８０、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３７、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１６６、ＣＤ７１、ＣＬＬ−１／ＣＬＥＣ１２Ａ、ＲＯＲ１、グリピカン（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）３（ＧＰＣ３）、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、グリコリピドＦ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＧＤ−２、ＭＹ−ＥＳＯ−１、又はＭＡＧＥ  Ａ３である、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
前記抗原結合タンパク質がＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン、ＣＤ１９変異体、Ｂ細胞特異的マーカ変異体、又は抗体若しくは断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、又はＶＨＨ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
前記細胞治療薬がＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫ細胞、ＴＣＲ−Ｔ細胞、ＴＩＬ細胞、同種異系ＮＫ細胞、又はオートロガスＮＫ細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
前記ポリペプチド標的がＢ細胞特異的マーカ又は断片である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
前記Ｂ細胞特異的マーカがＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、又はＣＤ１８０である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記融合タンパク質がＮ末端に前記抗原結合タンパク質又は断片を、且つＣ末端に前記ポリペプチド標的を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
前記融合タンパク質がＣ末端に前記抗原結合タンパク質又は断片を、且つＮ末端に前記ポリペプチド標的を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞が免疫細胞又は腫瘍細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
（ａ）腫瘍抗原に結合する、マスクされた抗原結合タンパク質又は断片；及び（ｂ）細胞治療薬、抗体、又は抗体薬物複合体のポリペプチド標的を含む融合タンパク質をコードする構成性発現構築物を含む細胞。
【請求項１２】
前記マスクされた抗原結合タンパク質又は断片がマスキング部分及び開裂可能部分を含む、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記開裂可能部分が腫瘍関連プロテアーゼの基質である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記開裂可能部分がレグマイン、プラスミン、ＴＭＰＲＳＳ−３／４、ＭＭＰ−９、ＭＴ１−ＭＭＰ、カテプシン、カスパーゼ、ヒト好中球エラスターゼ、βセクレターゼ、マトリプターゼ、ｕＰＡ、又はＰＳＡの基質である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１５】
前記開裂可能部分が開裂すると、前記抗原結合タンパク質又は断片が前記腫瘍抗原に結合する、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６】
前記腫瘍抗原が腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＡＡ）である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１７】
前記腫瘍抗原がＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５、ＣＥＡ、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バール・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）抗原ＥＢＶＡ、ヒトパピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）抗原Ｅ６若しくはＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｅｒｂＢ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、βカテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、αフェトプロテイン、βＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、ＦＲα、ＶＥＧＦＲ２、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ｙ、ＦＡＰ、ＥｐｈＡ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＥＧＦＲ、ＣＡ６、ＣＡ９、ＧＰＮＭＢ、ＥＧＰ１、ＦＯＬＲ１、内皮受容体、ＳＴＥＡＰ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ネクチン−４、ＡＧＳ−１６、グアナリルシクラーゼＣ、ＭＵＣ−１、ＣＦＣ１Ｂ、インテグリンα３鎖（ａ３ｂ１、ラミニン受容体鎖）、ＴＰＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７２、ＣＤ１８０、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３７、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１６６、ＣＤ７１、ＣＬＬ−１／ＣＬＥＣ１２Ａ、ＲＯＲ１、グリピカン（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）３（ＧＰＣ３）、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、グリコリピドＦ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＧＤ−２、ＭＹ−ＥＳＯ−１、又はＭＡＧＥ  Ａ３である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
前記抗原結合タンパク質がＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン、ＣＤ１９変異体、Ｂ細胞特異的マーカ変異体、又は抗体若しくは断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、又はＶＨＨ）である、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１９】
前記細胞治療薬がＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫ細胞、ＴＣＲ−Ｔ細胞、ＴＩＬ細胞、同種異系ＮＫ細胞、又はオートロガスＮＫ細胞である、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
前記ポリペプチド標的がＢ細胞特異的マーカ又は断片である、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２１】
前記Ｂ細胞特異的マーカがＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、又はＣＤ１８０である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
前記融合タンパク質がＮ末端に前記抗原結合タンパク質又は断片を、且つＣ末端に前記ポリペプチド標的を含む、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３】
前記融合タンパク質がＣ末端に前記抗原結合タンパク質又は断片を、且つＮ末端に前記ポリペプチド標的を含む、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４】
前記細胞が免疫細胞又は腫瘍細胞である、請求項１１〜２３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５】
（ｉ）第１腫瘍抗原、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインに結合する抗原結合ドメインを含む抗原結合受容体と、（ｉｉ）（ａ）第２腫瘍抗原に結合する抗原結合タンパク質又は断片；及び（ｂ）細胞治療薬、抗体、又は抗体薬物複合体のポリペプチド標的を含む融合タンパク質をコードする誘導性発現構築物とを含む細胞。
【請求項２６】
前記第１腫瘍抗原が神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン−反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１α、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＣＬＬ−１／ＣＬＥＣ１２Ａ、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、又はメソテリンである、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
前記第２腫瘍抗原が腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＡＡ）である、請求項２５又は２６に記載の細胞。
【請求項２８】
前記第２腫瘍抗原がＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５、ＣＥＡ、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バール・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）抗原ＥＢＶＡ、ヒトパピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）抗原Ｅ６若しくはＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｅｒｂＢ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、βカテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、αフェトプロテイン、βＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、ＦＲα、ＶＥＧＦＲ２、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ｙ、ＦＡＰ、ＥｐｈＡ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＥＧＦＲ、ＣＡ６、ＣＡ９、ＧＰＮＭＢ、ＥＧＰ１、ＦＯＬＲ１、内皮受容体、ＳＴＥＡＰ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ネクチン−４、ＡＧＳ−１６、グアナリルシクラーゼＣ、ＭＵＣ−１、ＣＦＣ１Ｂ、インテグリンα３鎖（ａ３ｂ１、ラミニン受容体鎖）、ＴＰＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７２、ＣＤ１８０、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３７、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１６６、ＣＤ７１、ＣＬＬ−１／ＣＬＥＣ１２Ａ、ＲＯＲ１、グリピカン（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）３（ＧＰＣ３）、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、グリコリピドＦ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＧＤ−２、ＭＹ−ＥＳＯ−１、又はＭＡＧＥ  Ａ３である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２９】
前記抗原結合タンパク質がＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン、ＣＤ１９変異体、Ｂ細胞特異的マーカ変異体、又は抗体若しくは断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、又はＶＨＨ）である、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３０】
前記細胞治療薬がＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫ細胞、ＴＣＲ−Ｔ細胞、ＴＩＬ細胞、同種異系ＮＫ細胞、又はオートロガスＮＫ細胞である、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１】
前記ポリペプチド標的がＢ細胞特異的マーカ又は断片である、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３２】
前記Ｂ細胞特異的マーカがＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、又はＣＤ１８０である、請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
前記融合タンパク質がＮ末端に前記抗原結合タンパク質又は断片を、且つＣ末端に前記ポリペプチド標的を含む、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３４】
前記融合タンパク質がＣ末端に前記抗原結合タンパク質又は断片を、且つＮ末端に前記ポリペプチド標的を含む、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３５】
前記細胞が免疫細胞又は腫瘍細胞である、請求項２５〜３４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３６】
（ｉ）第１腫瘍抗原、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインに結合する抗原結合ドメインを含む抗原結合受容体と、（ｉｉ）（ａ）第２腫瘍抗原に結合するマスクされた抗原結合タンパク質又は断片；及び（ｂ）細胞治療薬、抗体、又は抗体薬物複合体のポリペプチド標的を含む融合タンパク質をコードする誘導性発現構築物とを含む細胞。
【請求項３７】
前記マスクされた抗原結合タンパク質又は断片がマスキング部分及び開裂可能部分を含む、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
前記開裂可能部分が腫瘍関連プロテアーゼの基質である、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
前記開裂可能部分がレグマイン、プラスミン、ＴＭＰＲＳＳ−３／４、ＭＭＰ−９、ＭＴ１−ＭＭＰ、カテプシン、カスパーゼ、ヒト好中球エラスターゼ、βセクレターゼ、マトリプターゼ、ｕＰＡ、又はＰＳＡの基質である、請求項３７に記載の細胞。
【請求項４０】
前記開裂可能部分が開裂すると、前記抗原結合タンパク質又は断片が前記第２腫瘍抗原に結合する、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４１】
前記第１腫瘍抗原が神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン−反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１α、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＣＬＬ−１／ＣＬＥＣ１２Ａ、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、又はメソテリンである、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４２】
前記第２腫瘍抗原が腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＡＡ）である、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４３】
前記第２腫瘍抗原がＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５、ＣＥＡ、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バール・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）抗原ＥＢＶＡ、ヒトパピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）抗原Ｅ６若しくはＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｅｒｂＢ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、βカテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、αフェトプロテイン、βＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、ＦＲα、ＶＥＧＦＲ２、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ｙ、ＦＡＰ、ＥｐｈＡ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＥＧＦＲ、ＣＡ６、ＣＡ９、ＧＰＮＭＢ、ＥＧＰ１、ＦＯＬＲ１、内皮受容体、ＳＴＥＡＰ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ネクチン−４、ＡＧＳ−１６、グアナリルシクラーゼＣ、ＭＵＣ−１、ＣＦＣ１Ｂ、インテグリンα３鎖（ａ３ｂ１、ラミニン受容体鎖）、ＴＰＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７２、ＣＤ１８０、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３７、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１６６、ＣＤ７１、ＣＬＬ−１／ＣＬＥＣ１２Ａ、ＲＯＲ１、グリピカン（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）３（ＧＰＣ３）、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、グリコリピドＦ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＧＤ−２、ＭＹ−ＥＳＯ−１、又はＭＡＧＥ  Ａ３である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４４】
前記抗原結合タンパク質がＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン、ＣＤ１９変異体、Ｂ細胞特異的マーカ変異体、又は抗体若しくは断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、又はＶＨＨ）である、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４５】
前記細胞治療薬がＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫ細胞、ＴＣＲ−Ｔ細胞、ＴＩＬ細胞、同種異系ＮＫ細胞、又はオートロガスＮＫ細胞である、請求項３６〜４４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４６】
前記ポリペプチド標的がＢ細胞特異的マーカ又は断片である、請求項３６〜４５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４７】
前記Ｂ細胞特異的マーカがＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、又はＣＤ１８０である、請求項４６に記載の細胞。
【請求項４８】
前記融合タンパク質がＮ末端に前記抗原結合タンパク質又は断片を、且つＣ末端に前記ポリペプチド標的を含む、請求項３６〜４７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４９】
前記融合タンパク質がＣ末端に前記抗原結合タンパク質又は断片を、且つＮ末端に前記ポリペプチド標的を含む、請求項３６〜４７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５０】
前記細胞が免疫細胞又は腫瘍細胞である、請求項３６〜４９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５１】
（ａ）腫瘍抗原に結合する抗原結合タンパク質又は断片；及び（ｂ）細胞治療薬、抗体、又は抗体薬物複合体のポリペプチド標的を含む融合タンパク質。
【請求項５２】
前記腫瘍抗原が腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、請求項５１に記載の融合タンパク質。
【請求項５３】
前記腫瘍抗原がＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−１）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５、ＣＥＡ、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バール・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）抗原ＥＢＶＡ、ヒトパピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）抗原Ｅ６若しくはＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｅｒｂＢ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、βカテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、αフェトプロテイン、βＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、ＦＲα、ＶＥＧＦＲ２、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ｙ、ＦＡＰ、ＥｐｈＡ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＥＧＦＲ、ＣＡ６、ＣＡ９、ＧＰＮＭＢ、ＥＧＰ１、ＦＯＬＲ１、内皮受容体、ＳＴＥＡＰ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ネクチン−４、ＡＧＳ−１６、グアナリルシクラーゼＣ、ＭＵＣ−１、ＣＦＣ１Ｂ、インテグリンα３鎖（ａ３ｂ１、ラミニン受容体鎖）、ＴＰＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７２、ＣＤ１８０、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３７、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１６６、ＣＤ７１、ＣＬＬ−１／ＣＬＥＣ１２Ａ、ＲＯＲ１、グリピカン（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）３（ＧＰＣ３）、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、グリコリピドＦ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＧＤ−２、ＭＹ−ＥＳＯ−１、又はＭＡＧＥ  Ａ３である、請求項５１に記載の融合タンパク質。
【請求項５４】
前記抗原結合タンパク質がＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン、ＣＤ１９変異体、Ｂ細胞特異的マーカ変異体、又は抗体若しくは断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、又はＶＨＨ）である、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５５】
前記細胞治療薬がＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫ細胞、ＴＣＲ−Ｔ細胞、ＴＩＬ細胞、同種異系ＮＫ細胞、又はオートロガスＮＫ細胞である、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５６】
前記ポリペプチド標的がＢ細胞特異的マーカ又は断片である、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５７】
前記Ｂ細胞特異的マーカがＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、又はＣＤ１８０である、請求項５６に記載の融合タンパク質。
【請求項５８】
前記融合タンパク質がＮ末端に前記抗原結合タンパク質又は断片を、且つＣ末端に前記ポリペプチド標的を含む、請求項５１〜５７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５９】
前記融合タンパク質がＣ末端に前記抗原結合タンパク質又は断片を、且つＮ末端に前記ポリペプチド標的を含む、請求項５１〜５７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６０】
（ａ）腫瘍抗原に結合する、マスクされた抗原結合タンパク質又は断片；及び（ｂ）細胞治療薬、抗体、又は抗体薬物複合体のポリペプチド標的を含む融合タンパク質。
【請求項６１】
前記マスクされた抗原結合タンパク質又は断片がマスキング部分及び開裂可能部分を含む、請求項６０に記載の融合タンパク質。
【請求項６２】
前記開裂可能部分が腫瘍関連プロテアーゼの基質である、請求項６１に記載の融合タンパク質。
【請求項６３】
前記開裂可能部分がレグマイン、プラスミン、ＴＭＰＲＳＳ−３／４、ＭＭＰ−９、ＭＴ１−ＭＭＰ、カテプシン、カスパーゼ、ヒト好中球エラスターゼ、βセクレターゼ、マトリプターゼ、ｕＰＡ、又はＰＳＡの基質である、請求項６１に記載の融合タンパク質。
【請求項６４】
前記開裂可能部分が開裂すると、前記抗原結合タンパク質又は断片が前記腫瘍抗原に結合する、請求項６１〜６３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６５】
前記腫瘍抗原が腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＡＡ）である、請求項６０〜６４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６６】
前記腫瘍抗原がＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５、ＣＥＡ、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バール・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）抗原ＥＢＶＡ、ヒトパピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）抗原Ｅ６若しくはＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｅｒｂＢ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、βカテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、αフェトプロテイン、βＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、ＦＲα、ＶＥＧＦＲ２、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ｙ、ＦＡＰ、ＥｐｈＡ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＥＧＦＲ、ＣＡ６、ＣＡ９、ＧＰＮＭＢ、ＥＧＰ１、ＦＯＬＲ１、内皮受容体、ＳＴＥＡＰ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ネクチン−４、ＡＧＳ−１６、グアナリルシクラーゼＣ、ＭＵＣ−１、ＣＦＣ１Ｂ、インテグリンα３鎖（ａ３ｂ１、ラミニン受容体鎖）、ＴＰＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７２、ＣＤ１８０、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３７、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１６６、ＣＤ７１、ＣＬＬ−１／ＣＬＥＣ１２Ａ、ＲＯＲ１、グリピカン（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）３（ＧＰＣ３）、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、グリコリピドＦ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＧＤ−２、ＭＹ−ＥＳＯ−１、又はＭＡＧＥ  Ａ３である、請求項６０〜６４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６７】
前記抗原結合タンパク質がＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン、ＣＤ１９変異体、Ｂ細胞特異的マーカ変異体、又は抗体若しくは断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、又はＶＨＨ）である、請求項６０〜６６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６８】
前記細胞治療薬がＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫ細胞、ＴＣＲ−Ｔ細胞、ＴＩＬ細胞、同種異系ＮＫ細胞、又はオートロガスＮＫ細胞である、請求項６０〜６７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６９】
前記ポリペプチド標的がＢ細胞特異的マーカ又は断片である、請求項６０〜６８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７０】
前記Ｂ細胞特異的マーカがＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、又はＣＤ１８０である、請求項６９に記載の融合タンパク質。
【請求項７１】
前記融合タンパク質がＮ末端に前記抗原結合タンパク質又は断片を、且つＣ末端に前記ポリペプチド標的を含む、請求項６０〜７０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７２】
前記融合タンパク質がＣ末端に前記抗原結合タンパク質又は断片を、且つＮ末端に前記ポリペプチド標的を含む、請求項６０〜７０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７３】
（ｉ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインを含む抗原結合受容体と、（ｉｉ）誘導性発現構築物とを含む免疫細胞。
【請求項７４】
前記誘導性発現構築物が目的の遺伝子を含む、請求項７３に記載の免疫細胞。
【請求項７５】
前記誘導性発現構築物が、目的の前記遺伝子に作動可能に連結したプロモータをさらに含む、請求項７４に記載の免疫細胞。
【請求項７６】
抗原と前記抗原結合領域との結合が前記シグナル伝達ドメインを活性化する、請求項７５に記載の免疫細胞。
【請求項７７】
前記活性化シグナル伝達ドメインが目的の前記遺伝子の発現を誘導する、請求項７５に記載の免疫細胞。
【請求項７８】
前記免疫細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞、又はＴＩＬである、請求項７３〜７７のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項７９】
前記抗原結合領域が第１腫瘍抗原に結合する、請求項７３〜７８のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項８０】
目的の前記遺伝子が、抗体、又は抗原結合断片、及び異種ポリペプチドを含む融合タンパク質である、請求項７９に記載の免疫細胞。
【請求項８１】
前記抗体又は抗原結合断片が第２腫瘍抗原に結合する、請求項８０に記載の免疫細胞。
【請求項８２】
前記異種ポリペプチドがＣＡＲ−Ｔ細胞の抗原である、請求項８１に記載の免疫細胞。
【請求項８３】
前記異種ポリペプチドがＣＤ１９又はその断片である、請求項８２に記載の免疫細胞。
【請求項８４】
（ｉ）第１腫瘍抗原、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインに結合する抗原結合ドメインを含む抗原結合受容体と、（ｉｉ）（ａ）第２腫瘍抗原に結合する抗体又はその抗原結合断片；及び（ｂ）ＣＤ１９又はその断片を含む融合タンパク質をコードする誘導性発現構築物とを含む免疫細胞。
【請求項８５】
前記抗原結合ドメインが、前記第１腫瘍抗原に結合するｓｃＦｖ、ＶＨＨ、又はＴ細胞受容体を含む、請求項８４に記載の免疫細胞。
【請求項８６】
前記第１腫瘍抗原が神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン−反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１α、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、又はメソテリンである、請求項８４又は８５に記載の免疫細胞。
【請求項８７】
前記融合タンパク質が前記第２腫瘍抗原、及びＣＤ１９若しくはその断片に結合するｓｃＦｖ、又はＶＨＨを含む、請求項８４〜８６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項８８】
前記第２腫瘍抗原が神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン−反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１α、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、又はメソテリンである、請求項８４〜８７のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項８９】
前記誘導性発現構築物が、前記融合タンパク質をコードするヌクレオチドに作動可能に連結したプロモータを含む、請求項８４〜８８のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項９０】
前記プロモータがＩＬ−２プロモータ、細胞表面タンパク質プロモータ（例えば、ＣＤ６９プロモータ）、サイトカインプロモータ（例えば、ＴＮＦプロモータ）、細胞活性化プロモータ（例えば、ＣＴＬＡ４、ＯＸ４０、ＣＤ４０Ｌ）、又は細胞表面接着タンパク質プロモータ（例えば、ＶＬＡ−１プロモータ）である、請求項８９に記載の免疫細胞。
【請求項９１】
前記免疫細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞、又はＴＩＬである、請求項８４〜９０のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項９２】
前記細胞が、前記抗原結合受容体及び前記誘導性発現構築物をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む、請求項８４〜９１のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項９３】
前記細胞が、前記抗原結合受容体をコードするヌクレオチド配列を含む第１発現ベクターを含み、且つ前記誘導性発現構築物を含む第２発現ベクターを含む、請求項８４〜９１のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項９４】
前記抗原結合領域が前記第１腫瘍抗原に結合すると、前記シグナル伝達ドメインが前記融合タンパク質の発現を誘導する、請求項８４〜９３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項９５】
（ｉ）第１腫瘍抗原、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインに結合する抗原結合ドメインを含む抗原結合受容体と、（ｉｉ）（ａ）第２腫瘍抗原に結合する抗体、及び（ｂ）Ｂ細胞特異的マーカ又はその断片を含む融合タンパク質をコードする誘導性発現構築物とを含む免疫細胞。
【請求項９６】
前記Ｂ細胞特異的マーカがＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２４、又はＢＣＭＡである、請求項９５に記載の免疫細胞。
【請求項９７】
前記抗原結合ドメインが、前記第１腫瘍抗原に結合するｓｃＦｖ、ＶＨＨ、又はＴ細胞受容体を含む、請求項９５又は９６に記載の免疫細胞。
【請求項９８】
前記第１腫瘍抗原が神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン−反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１α、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＢＣＭＡ、又はメソテリンである、請求項９５〜９７のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項９９】
前記融合タンパク質が、前記第２腫瘍抗原に結合するｓｃＦｖ又はＶＨＨ、及びＢ細胞特異的マーカを含む、請求項９５〜９８のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１００】
前記第２腫瘍抗原が神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン−反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１α、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＢＣＭＡ、又はメソテリンである、請求項９５〜９９のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１０１】
前記誘導性発現構築物が、前記融合タンパク質をコードするヌクレオチドに作動可能に連結したプロモータを含む、請求項９５〜１００のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１０２】
前記プロモータがＩＬ−２プロモータ、細胞表面タンパク質プロモータ（例えば、ＣＤ６９プロモータ）、サイトカインプロモータ（例えば、ＴＮＦプロモータ）、細胞活性化プロモータ（例えば、ＣＴＬＡ４、ＯＸ４０、ＣＤ４０Ｌ）、又は細胞表面接着タンパク質プロモータ（例えば、ＶＬＡ−１プロモータ）である、請求項１０１に記載の免疫細胞。
【請求項１０３】
前記免疫細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞、又はＴＩＬである、請求項９５〜１０２のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１０４】
前記細胞が、前記抗原結合受容体及び前記誘導性発現構築物をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む、請求項９５〜１０３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１０５】
前記細胞が、前記抗原結合受容体をコードするヌクレオチド配列を含む第１発現ベクターを含み、且つ前記誘導性発現構築物を含む第２発現ベクターを含む、請求項９５〜１０３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１０６】
前記抗原結合領域が前記第１腫瘍抗原に結合すると、前記シグナル伝達ドメインが前記融合タンパク質の発現を誘導する、請求項９５〜１０５のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１０７】
（ｉ）腫瘍抗原、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインに結合する抗原結合ドメインを含む抗原結合受容体と、（ｉｉ）サイトカイン及びＣＤ１９又はその断片を含む融合タンパク質をコードする誘導性発現構築物とを含む免疫細胞。
【請求項１０８】
前記サイトカインがＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−３６、ＴＮＦ、ＬＴα、ＧＭ−ＣＳＦ、又はＧ−ＣＳＦである、請求項１０７に記載の免疫細胞。
【請求項１０９】
前記抗原結合ドメインが、前記腫瘍抗原に結合するｓｃＦｖ、ＶＨＨ、又はＴ細胞受容体を含む、請求項１０７又は１０８に記載の免疫細胞。
【請求項１１０】
前記腫瘍抗原が神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン−反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１α、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＢＣＭＡ、又はメソテリンである、請求項１０７〜１０９のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１１１】
前記誘導性発現構築物が、前記融合タンパク質をコードするヌクレオチドに作動可能に連結したプロモータを含む、請求項１０７〜１１０のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１１２】
前記プロモータがＩＬ−２プロモータ、細胞表面タンパク質プロモータ（例えば、ＣＤ６９プロモータ）、サイトカインプロモータ（例えば、ＴＮＦプロモータ）、細胞活性化プロモータ（例えば、ＣＴＬＡ４、ＯＸ４０、ＣＤ４０Ｌ）、又は細胞表面接着タンパク質プロモータ（例えば、ＶＬＡ−１プロモータ）である、請求項１１１に記載の免疫細胞。
【請求項１１３】
前記免疫細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞、又はＴＩＬである、請求項１０７〜１１２のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１１４】
前記細胞が、前記抗原結合受容体及び前記誘導性発現構築物をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む、請求項１０７〜１１３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１１５】
前記細胞が、前記抗原結合受容体をコードするヌクレオチド配列を含む第１発現ベクターを含み、且つ前記誘導性発現構築物を含む第２発現ベクターを含む、請求項１０７〜１１３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１１６】
前記抗原結合領域が前記腫瘍抗原に結合すると、前記シグナル伝達ドメインが前記融合タンパク質の発現を誘導する、請求項１０７〜１１５のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１１７】
（ｉ）腫瘍抗原、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインに結合する抗原結合ドメインを含む抗原結合受容体と、（ｉｉ）サイトカインをコードする誘導性発現構築物とを含む免疫細胞。
【請求項１１８】
前記サイトカインがジフテリア毒素又はリシンである、請求項１１７に記載の免疫細胞。
【請求項１１９】
前記抗原結合ドメインが、前記腫瘍抗原に結合するｓｃＦｖ、ＶＨＨ、又はＴ細胞受容体を含む、請求項１１７又は１１８に記載の免疫細胞。
【請求項１２０】
前記腫瘍抗原が神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン−反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１α、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＢＣＭＡ、又はメソテリンである、請求項１１７〜１１９のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１２１】
前記誘導性発現構築物が、前記サイトカインをコードするヌクレオチドに作動可能に連結したプロモータを含む、請求項１１７〜１２０のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１２２】
前記プロモータがＩＬ−２プロモータ、細胞表面タンパク質プロモータ（例えば、ＣＤ６９プロモータ）、サイトカインプロモータ（例えば、ＴＮＦプロモータ）、細胞活性化プロモータ（例えば、ＣＴＬＡ４、ＯＸ４０、ＣＤ４０Ｌ）、又は細胞表面接着タンパク質プロモータ（例えば、ＶＬＡ−１プロモータ）である、請求項１２１に記載の免疫細胞。
【請求項１２３】
前記免疫細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞、又はＴＩＬである、請求項１１７〜１２２のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１２４】
前記細胞が、前記抗原結合受容体及び前記誘導性発現構築物をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む、請求項１１７〜１２３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１２５】
前記細胞が、前記抗原結合受容体をコードするヌクレオチド配列を含む第１発現ベクターを含み、且つ前記誘導性発現構築物を含む第２発現ベクターを含む、請求項１１７〜１２３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１２６】
前記抗原結合領域が前記腫瘍抗原に結合すると、前記シグナル伝達ドメインが前記サイトカインの発現を誘導する、請求項１１７〜１２５のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１２７】
（ｉ）第１腫瘍抗原、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインに結合する抗原結合ドメインを含む抗原結合受容体と、（ｉｉ）第２腫瘍抗原に結合する、ＣＤ１９変異体又はその抗原結合断片をコードする誘導性発現構築物とを含む免疫細胞。
【請求項１２８】
前記抗原結合ドメインが、前記第１腫瘍抗原に結合するｓｃＦｖ、ＶＨＨ、又はＴ細胞受容体を含む、請求項１２７に記載の免疫細胞。
【請求項１２９】
前記第１腫瘍抗原が神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン−反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１α、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＢＣＭＡ、又はメソテリンである、請求項１２７又は１２８に記載の免疫細胞。
【請求項１３０】
前記ＣＤ１９変異体が、野生型ＣＤ１９と比較して、ＣＤ１９のＥＣＤ、又はＣ２型Ｉｇドメインの一方又は両方にアミノ酸残基のアミノ酸置換を含む、請求項１２７〜１２９のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１３１】
前記第２腫瘍抗原が神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン−反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１α、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＢＣＭＡ、又はメソテリンである、請求項１２７〜１３０のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１３２】
前記誘導性発現構築物が、前記ＣＤ１９変異体をコードするヌクレオチドに作動可能に連結したプロモータを含む、請求項１２７〜１３１のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１３３】
前記プロモータがＩＬ−２プロモータ、細胞表面タンパク質プロモータ（例えば、ＣＤ６９プロモータ）、サイトカインプロモータ（例えば、ＴＮＦプロモータ）、細胞活性化プロモータ（例えば、ＣＴＬＡ４、ＯＸ４０、ＣＤ４０Ｌ）、又は細胞表面接着タンパク質プロモータ（例えば、ＶＬＡ−１プロモータ）である、請求項１３２に記載の免疫細胞。
【請求項１３４】
前記免疫細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞、又はＴＩＬである、請求項１２７〜１３３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１３５】
前記細胞が、前記抗原結合受容体及び前記誘導性発現構築物をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む、請求項１２７〜１３４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１３６】
前記細胞が、前記抗原結合受容体をコードするヌクレオチド配列を含む第１発現ベクターを含み、且つ前記誘導性発現構築物を含む第２発現ベクターを含む、請求項１２７〜１３４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１３７】
前記抗原結合領域が前記第１腫瘍抗原に結合すると、前記シグナル伝達ドメインが前記ＣＤ１９変異体の発現を誘導する、請求項１２７〜１３６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１３８】
（ａ）腫瘍抗原に結合する抗体又はその抗原結合断片、及び（ｂ）ＣＤ１９又はその断片を含む融合タンパク質。
【請求項１３９】
前記腫瘍抗原が神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン−反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１α、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＢＣＭＡ、又はメソテリンである、請求項１３８に記載の融合タンパク質。
【請求項１４０】
前記融合タンパク質が前記腫瘍抗原、及びＣＤ１９若しくはその断片に結合するｓｃＦｖ、又はＶＨＨを含む、請求項１３８又は１３９に記載の融合タンパク質。
【請求項１４１】
（ａ）腫瘍抗原に結合する抗体又は断片及び（ｂ）Ｂ細胞特異的マーカ又はその断片を含む融合タンパク質。
【請求項１４２】
前記Ｂ細胞特異的マーカがＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２４、又はＢＣＭＡである、請求項１４１に記載の融合タンパク質。
【請求項１４３】
前記腫瘍抗原が神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン−反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１α、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＢＣＭＡ、又はメソテリンである、請求項１４１又は１４２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４４】
前記融合タンパク質が、前記腫瘍抗原、及びＢ細胞特異的マーカ又はその断片に結合するｓｃＦｖ又はＶＨＨを含む、請求項１４１〜１４３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４５】
サイトカイン及びＣＤ１９又はその断片を含む融合タンパク質。
【請求項１４６】
前記サイトカインがＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−３６、ＴＮＦ、ＬＴα、ＧＭ−ＣＳＦ、又はＧ−ＣＳＦである、請求項１４５に記載の融合タンパク質。
【請求項１４７】
腫瘍を有する対象を治療する方法であって、請求項１〜５０又は８４〜９４のいずれか一項に記載の細胞を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１４８】
前記腫瘍が前記第１腫瘍抗原及び前記第２腫瘍抗原を発現する、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記腫瘍がＣＤ１９を発現しない、請求項１４７又は１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記細胞が前記第１腫瘍抗原に結合する、請求項１４７〜１４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５１】
前記細胞と前記第１腫瘍抗原との結合が前記融合タンパク質の発現を誘導する、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記融合タンパク質が前記細胞から分泌される、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記融合タンパク質が前記第２腫瘍抗原に結合する、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
抗体、抗体薬物複合体、又はＣＡＲ−Ｔ細胞を前記対象に投与するステップをさらに含み、前記抗体、前記抗体薬物複合体、又は前記ＣＡＲ−Ｔ細胞がＣＤ１９をターゲティングする、請求項１４７〜１５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５５】
投与後、前記抗体、抗体薬物複合体、又はＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＣＤ１９を含む前記融合タンパク質に結合する、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞と、ＣＤ１９を含む前記融合タンパク質との結合が前記腫瘍の殺傷を誘導する、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
腫瘍を有する対象を治療する方法であって、請求項１〜５０又は９５〜１０６のいずれか一項に記載の細胞を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１５８】
前記腫瘍が前記第１腫瘍抗原及び前記第２腫瘍抗原を発現する、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記腫瘍が前記Ｂ細胞特異的マーカを発現しない、請求項１５７又は１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
前記細胞が前記第１腫瘍抗原に結合する、請求項１５７〜１５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記細胞と前記第１腫瘍抗原との結合が前記融合タンパク質の発現を誘導する、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記融合タンパク質が前記細胞から分泌される、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記融合タンパク質が前記第２腫瘍抗原に結合する、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
抗体、抗体薬物複合体、又はＣＡＲ−Ｔ細胞を前記対象に投与するステップをさらに含み、前記抗体、前記抗体薬物複合体、又は前記ＣＡＲ−Ｔ細胞が前記Ｂ細胞特異的マーカをターゲティングする、請求項１５７〜１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
投与後、前記抗体、抗体薬物複合体、又はＣＡＲ−Ｔ細胞が、前記Ｂ細胞特異的マーカを含む前記融合タンパク質に結合する、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞と、前記Ｂ細胞特異的マーカを含む前記融合タンパク質との結合が前記腫瘍の殺傷を誘導する、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
腫瘍を有する対象を治療する方法であって、請求項１〜５０又は１２７〜１３７のいずれか一項に記載の細胞を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１６８】
前記腫瘍が前記第１腫瘍抗原及び前記第２腫瘍抗原を発現する、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
前記細胞が前記第１腫瘍抗原に結合する、請求項１６７又は１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
前記細胞と前記第１腫瘍抗原との結合が前記ＣＤ１９変異体の発現を誘導する、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
前記ＣＤ１９変異体が前記細胞から分泌される、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記ＣＤ１９変異体が前記第２腫瘍抗原に結合する、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
抗体、抗体薬物複合体、又はＣＡＲ−Ｔ細胞を前記対象に投与するステップをさらに含み、前記抗体、前記抗体薬物複合体、又は前記ＣＡＲ−Ｔ細胞がＣＤ１９をターゲティングする、請求項１６７〜１７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７４】
投与後、前記抗体、抗体薬物複合体、又はＣＡＲ−Ｔ細胞が前記ＣＤ１９変異体に結合する、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞と、前記ＣＤ１９変異体との結合が前記腫瘍の殺傷を誘導する、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
腫瘍を有する対象を治療する方法であって、請求項５１〜７２又は１３８〜１４０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１７７】
前記腫瘍が前記腫瘍抗原を発現する、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
前記腫瘍がＣＤ１９を発現しない、請求項１７６又は１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
投与後、前記融合タンパク質が前記腫瘍抗原に結合する、請求項１７６〜１７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８０】
抗体、抗体薬物複合体、又はＣＡＲ−Ｔ細胞を前記対象に投与するステップをさらに含み、前記抗体、前記抗体薬物複合体、又は前記ＣＡＲ−Ｔ細胞がＣＤ１９をターゲティングする、請求項１７６〜１７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８１】
投与後、前記抗体、抗体薬物複合体、又はＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＣＤ１９を含む前記融合タンパク質に結合する、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞と、ＣＤ１９を含む前記融合タンパク質との結合が前記腫瘍の殺傷を誘導する、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
腫瘍を有する対象を治療する方法であって、請求項５１〜７２又は１４１〜１４４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１８４】
前記腫瘍が前記腫瘍抗原を発現する、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記腫瘍が前記Ｂ細胞特異的マーカを発現しない、請求項１８３又は１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
投与後、前記融合タンパク質が前記腫瘍抗原に結合する、請求項１８３〜１８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８７】
抗体、抗体薬物複合体、又はＣＡＲ−Ｔ細胞を前記対象に投与するステップをさらに含み、前記抗体、前記抗体薬物複合体、又は前記ＣＡＲ−Ｔ細胞が前記Ｂ細胞特異的マーカをターゲティングする、請求項１８３〜１８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８８】
投与後、前記抗体、抗体薬物複合体、又はＣＡＲ−Ｔ細胞が、前記Ｂ細胞特異的マーカを含む前記融合タンパク質に結合する、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞と、前記Ｂ細胞特異的マーカを含む前記融合タンパク質との結合が前記腫瘍の殺傷を誘導する、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
（ｉ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインを含む第１抗原結合受容体と、（ｉｉ）誘導性発現構築物とを含む免疫細胞であって、前記膜貫通ドメイン及び／又は前記細胞質ドメインが、ＰＤＧＦ受容体（例えば、ＰＤＧＦＲα又はＰＤＧＦＲβ）、ＩＬ−１２受容体鎖（例えば、ＩＬ−１２Ｒβ１／ＩＬ−１２β２）、ＩＬ−６受容体α鎖、レプチン受容体、プロラクチン受容体、前記ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路をエンゲージするＧ−タンパク質結合受容体（例えば、ＡＧＴＲ−１．５−ＨＴ２Ａ、ＰＡＲ、ＰＡＲ３、ＰＡＲ４、ブラジキニン（Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）−ＲＢ２、ＰＡＦＲ、αアドレナリン性受容体、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ１）、ＩＬ−１２受容体（例えば、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−２７Ｒ）、ＩＬ−１０受容体、ＩＬ−６受容体（例えば、ＩＬ−１１Ｒ、ＣＮＴＦＲ、ＬＩＦＲ、ＯＳＭＲ、ＧＣＳＦＲ、ＩＬ−３１Ｒ、ＣＴＮＦＲ）、γ鎖受容体ファミリー（例えば、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−２１Ｒ及び前記関連受容体ＴＳＬＰＲ）、β鎖受容体（例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−５Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲ）、ホモ二量体ホルモン受容体（例えば、ＧＨＲ、ＴｐｏＲ、ＥｐｏＲ）、インスリン−Ｒ、ＥＧＦＲ／ＥＲｂＢ受容体、ＳＣＦ−Ｒ／ｃ−Ｋｉｔ、Ｍ−ＣＳＦＲ、ＦＧＦ受容体（例えば、ＦＧＦ受容体１〜４）、ＥｐｈＡ４、ＴｒｋＢ、Ｔｉｅ２、ＶＥＧＦ受容体、Ｍｅｒ、ＨＧＦＲ／ｃ−ＭＥＴ、又はＩ／ＩＩ型インターフェロン受容体からの膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインを含む、免疫細胞。
【請求項１９１】
前記誘導性発現構築物が第２抗原結合受容体をコードする、請求項１９０に記載の免疫細胞。
【請求項１９２】
第１抗原と前記第１抗原結合領域との結合が前記シグナル伝達ドメインを活性化する、請求項１９０又は１９１に記載の免疫細胞。
【請求項１９３】
前記シグナル伝達ドメインの活性化が標的細胞の細胞傷害性を誘導しない、請求項１９０〜１９２のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１９４】
前記シグナル伝達ドメインの活性化が前記第２抗原結合受容体の発現を誘導する、請求項１９３に記載の免疫細胞。
【請求項１９５】
第２抗原と前記第２抗原結合領域との結合が標的細胞の細胞傷害性を誘導する、請求項１９４に記載の免疫細胞。
【請求項１９６】
前記第１抗原が第１腫瘍抗原であり、及び前記第２抗原が第２腫瘍抗原である、請求項１９５に記載の免疫細胞。
【請求項１９７】
前記第１腫瘍抗原及び前記第２腫瘍抗原が同じ腫瘍抗原である、請求項１９６に記載の免疫細胞。
【請求項１９８】
前記第１腫瘍抗原及び前記第２腫瘍抗原が異なる腫瘍抗原である、請求項１９６に記載の免疫細胞。
【請求項１９９】
前記第１腫瘍抗原及び／又は前記第２腫瘍抗原がＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−１）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５、ＣＥＡ、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バール・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）抗原ＥＢＶＡ、ヒトパピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）抗原Ｅ６若しくはＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｅｒｂＢ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、βカテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、αフェトプロテイン、βＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、ＦＲα、ＶＥＧＦＲ２、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ｙ、ＦＡＰ、ＥｐｈＡ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＥＧＦＲ、ＣＡ６、ＣＡ９、ＧＰＮＭＢ、ＥＧＰ１、ＦＯＬＲ１、内皮受容体、ＳＴＥＡＰ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ネクチン−４、ＡＧＳ−１６、グアナリルシクラーゼＣ、ＭＵＣ−１、ＣＦＣ１Ｂ、インテグリンα３鎖（ａ３ｂ１、ラミニン受容体鎖）、ＴＰＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７２、ＣＤ１８０、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３７、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１６６、ＣＤ７１、ＣＬＬ−１／ＣＬＥＣ１２Ａ、ＲＯＲ１、グリピカン（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）３（ＧＰＣ３）、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、グリコリピド（Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ）Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＧＤ−２、ＭＹ−ＥＳＯ−１、又はＭＡＧＥ  Ａ３である、請求項１９５〜１９８のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項２００】
第１腫瘍抗原と前記第２腫瘍抗原がＣＤ５６及びＣＤ１３８；ＣＤ５６及びＢＣＭＡ；ＣＤ１３８及びＢＣＭＡ；ＩＬ−３Ｒ（ＣＤ１２３）及びＣＤ３３；ＣＤ１２３及びＣＬＥＣ１２Ａ；ＣＤ３３及びＣＬＥＣ１２Ａ；ＣＤ５６及びｃ−ＫＩＴ；ＣＥＡ及びＰＳＭＡ；ＰＳＣＡ及びＰＳＭＡ；ＣＥＡ及びＰＳＣＡ；ＣＡ−ＩＸ及びＣＤ７０；ＨＥＲ２及びＥＧＦＲ；ＥＧＦＲ及びＩＧＦＲ；ＭＵＣ１６及び葉酸受容体α；並びにメソテリン及び葉酸受容体αからなる群から選択されるペアのメンバーである、請求項１９８に記載の免疫細胞。
【請求項２０１】
腫瘍を有する対象を治療する方法であって、請求項１９０〜２００のいずれか一項に記載の免疫細胞を前記対象に投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月３０日に提出された米国仮特許出願第６２／２４９，１４４号明細書；２０１６年５月３日に提出された同第６２／３３１，０１０号明細書；及び２０１６年９月１９日に提出された同第６２／３９６，７８３号明細書（これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）の各々に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
養子細胞療法（ＡＣＴ）は、ドナーから細胞を採取し、培養及び／又はインビトロで操作した後、疾患の治療のために患者に投与する治療方法である。いくつかのクラスの障害を治療する試みで、ＡＣＴには多様な細胞型が使用されてきた。癌の治療の場合、ＡＣＴは、一般に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞などのリンパ球の移入を含む。そうしたＣＡＲ  Ｔ細胞の使用は、ＣＡＲ  Ｔ細胞が結合することができる腫瘍細胞上の抗原を同定するステップを含むが、腫瘍の不均一性のために、抗原の同定が困難となり得る。従って、養子細胞療法を用いて癌を治療する方法の向上が依然として求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
概要
本発明は、癌の治療のために及び／又は免疫応答を開始若しくは調節する上で有用な方法及び組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、目的の遺伝子に作動可能に連結したプロモータを含む構成性発現構築物を含む細胞治療薬（例えば、免疫細胞）を提供する。一部の実施形態では、本発明は、（ｉ）抗原結合受容体（ここで、抗原結合受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインを含む）と、（ｉｉ）目的の遺伝子に作動可能に連結したプロモータを含む誘導性発現構築物を含む細胞治療薬（例えば、免疫細胞）を提供する。中でも、本発明は、本明細書に記載の細胞治療薬と、１つ又は複数の別の治療薬（例えば、本明細書に記載される１つ又は複数の別の細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫ細胞、ＴＣＲ−Ｔ細胞、ＴＩＬ細胞、同種異系ＮＫ細胞、及びオートロガスＮＫ細胞）、抗体−薬物複合体、抗体、及び／又はポリペプチド）との組合せが有益な免疫応答、例えば、細胞応答（例えば、Ｔ細胞活性化）の誘導を向上させることができるという認識を包含する。
【０００４】
一部の実施形態では、本開示は、腫瘍を有する対象を治療する方法であって、本明細書に記載の細胞治療薬及び／又は本明細書に記載のタンパク質治療薬を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、１つ又は複数の別の治療薬（例えば、本明細書に記載される第２細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫ細胞、ＴＣＲ−Ｔ細胞、ＴＩＬ細胞、同種異系ＮＫ細胞、及びオートロガスＮＫ細胞）、抗体−薬物複合体、抗体、及び／又はポリペプチド）の投与をさらに含む。
【０００５】
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態を示すものであるが、限定のためではなく、あくまで例示として提供されることを理解すべきである。本発明の範囲に含まれる様々な変更形態及び改変形態が詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。
【０００６】
図面は、限定のためではなく、あくまで例示を目的とするものである。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、例示的な細胞治療薬を示す概略図である。
【０００８】
【図２−１】図２は、誘導性ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質をコードする、例示的な細胞治療薬を示す概略図である。
【図２−２】同上。
【０００９】
【図３】図３は、誘導性ｓｃＦｖ−ＥＧＦＲ融合タンパク質をコードする、例示的な細胞治療薬を示す概略図である。
【００１０】
【図４−１】図４は、誘導性ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質及びＣＤ１９をターゲティングする誘導性ＣＡＲをコードする、例示的な「自己増幅」細胞治療薬を示す概略図である。
【図４−２】同上。
【００１１】
【図５−１】図５は、誘導性ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質及びＣＤ１９をターゲティングする構成性発現ＣＡＲをコードする、例示的な「自己増幅」細胞治療薬を示す概略図である。
【図５−２】同上。
【００１２】
【図６】図６は、殺傷の誘導を招くシグナル伝達ドメインを含まないが、遺伝子転写を誘導するのに十分なシグナル伝達ドメインを含む抗原結合受容体を発現すると共に、誘導性ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質及びＣＤ１９をターゲティングする誘導性ＣＡＲ（左）又は構成性発現ＣＡＲ（右）もコードする、例示的な「自己増幅」細胞治療薬を示す概略図である。
【００１３】
【図７】図７は、様々な誘導性遺伝子をコードする、例示的な細胞治療薬を示す概略図である。
【００１４】
【図８】図８は、誘導性サイトカインをコードする、例示的な細胞治療薬を示す概略図である。
【００１５】
【図９】図９は、誘導性ｓｃＦｖ−ＣＤ３０融合タンパク質をコードする、例示的な細胞治療薬を示す概略図である。
【００１６】
【図１０】図１０は、誘導性毒素をコードする、例示的な細胞治療薬を示す概略図である。
【００１７】
【図１１】図１１は、様々な誘導性遺伝子をコードする、例示的な細胞治療薬を示す概略図である。
【００１８】
【図１２−１】図１２Ａ、Ｂ、Ｃは、例示的なＣＤ１９変異体を示す概略図である。
【図１２−２】同上。
【図１２−３】同上。
【００１９】
【図１３】図１３は、１つのポリペプチド抗原が抗体の軽鎖（ＬＣ）のＣ末端に融合され、１つのポリペプチド抗原が抗体のＬＣのＮ末端に融合され、１つのポリペプチド抗原が抗体の重鎖（ＨＣ）のＣ末端に融合され、又は１つのポリペプチド抗原が抗体のＨＣのＮ末端に融合されている、例示的な抗体融合タンパク質を示す概略図である。
【００２０】
【図１４−１】図１４Ａ及びＢは、様々なポリペプチド抗原−抗体融合構築物の発現レベルを示す。
【図１４−２】同上。
【００２１】
【図１５】図１５は、ポリペプチド抗原が様々な配向でｓｃＦｖに融合した例示的な抗体融合タンパク質を示す概略図である。
【００２２】
【図１６】図１６は、様々なポリペプチド抗原−ｓｃＦｖ融合構築物の発現レベルを示す概略図である。
【００２３】
【図１７−１】図１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ及び１７Ｄは、パニツムマブ−ＣＤ１９融合タンパク質と抗ＣＤ１９抗体（ＦＭＣ６３）との結合を示す。
【図１７−２】同上。
【図１７−３】同上。
【００２４】
【図１８】図１８は、陰性対照と比較したパニツムマブ−ＣＤ１９融合タンパク質と抗ＣＤ１９抗体（ＦＭＣ６３）との結合を示す。
【００２５】
【図１９−１】図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ及び１９Ｄは、ＬＹ２８７５３５８−ＣＤ１９融合タンパク質と抗ＣＤ１９抗体（ＦＭＣ６３）との結合を示す。
【図１９−２】同上。
【００２６】
【図２０】図２０は、陰性対照と比較したＬＹ２８７５３５８−ＣＤ１９融合タンパク質と抗ＣＤ１９抗体（ＦＭＣ６３）との結合を示す。
【００２７】
【図２１】図２１は、様々な抗体−ＣＤ１９融合タンパク質の発現及びそのＦＭＣ６３結合の概要を示す。
【００２８】
【図２２】図２２は、トラスツズマブｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質と抗ＣＤ１９抗体（ＦＭＣ６３）との結合を示す。
【００２９】
【図２３−１】図２３Ａ、２３Ｂ及び２３Ｃは、ＬＹ２８７５３５８−ＣＤ１９融合タンパク質と、ｃ−Ｍｅｔ発現細胞及び抗ＣＤ１９抗体（ＦＭＣ６３）との結合を示す。
【図２３−２】同上。
【図２３−３】同上。
【００３０】
【図２４−１】図２４Ａ及び２４Ｂは、トラスツズマブｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質と、抗ＣＤ１９抗体（ＦＭＣ６３）及びＨｅｒ２タンパク質との結合を示す。
【図２４−２】同上。
【００３１】
【図２５】図２５Ａ及び２５Ｂは、陰性対照と比較したトラスツズマブｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質と抗ＣＤ１９抗体（ＦＭＣ６３）との結合を示す。
【００３２】
【図２６】図２６は、抗Ｈｉｓ抗体被覆ＥＬＩＳＡプレート上に捕捉されたＣＤ１９−ｓｃＦｖ融合タンパク質の結合を示す。
【００３３】
【図２７】図２７は、抗Ｈｉｓ抗体被覆ＥＬＩＳＡプレート上に捕捉されたＣＤ１９−ｓｃＦｖ融合タンパク質の結合を示す。
【００３４】
【図２８】図２８は、抗ＦＭＣ６３（抗ＣＤ１９）被覆プレート上に捕捉された後、抗Ｈｉｓ−ＨＲＰで検出されたＣＤ１９−ｓｃＦｖ融合タンパク質の結合を示す。
【００３５】
【図２９】図２９は、「サンドイッチＥＬＩＳＡ」フォーマットでのＣＤ１９−抗Ｈｅｒ２トラスツズマブｓｃＦｖ−ヒトＦｃ融合タンパク質の検出を示す。
【００３６】
【図３０】図３０は、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＦＭＣ６３による複数の融合タンパク質の捕捉及びＨＲＰに結合した抗Ｈｉｓ抗体によるそれらの検出を示す。
【００３７】
【図３１】図３１は、Ｃ末端ＨｉｓタグによるＣＤ１９完全長細胞外ドメイン−抗ＣＤ２０Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖＶｈ−Ｖｌ−Ｈｉｓ融合タンパク質の捕捉、次にマウスモノクローナル抗体ＦＭＣ６３抗ＣＤ１９、続いて抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰによる検出を示す。
【００３８】
【図３２】図３２は、ＣＤ２２タンパク質ドメイン、又は抗ＥＧＦＲｖＩＩＩｓｃＦｖ（♯６４：ＣＤ２２−ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ−Ｈｉｓ；♯６５：ＣＤ２２−抗ＣＤ２０ｓｃＦｖ−Ｈｉｓ；♯６７：ＣＤ１９全ＥＣＤ−抗ＥＧＦＲｖＩＩＩｓｃＦｖ−ｈｉｓ；♯６８：ＣＤ２２−抗ＥＧＦＲｖＩＩＩｓｃＦｖ−Ｈｉｓ）を組み込む融合タンパク質の結果を示す。
【００３９】
【図３３】図３３は、同じ抗体であるパニツムマブに由来するタンパク質−抗体融合タンパク質及びタンパク質−ｓｃＦｖ融合タンパク質（＃５７：Ｈｅｒ２細胞外ドメイン−パニツムマブｓｃＦｖ  Ｖｈ−Ｖｌ−Ｈｉｓ；＃５８  Ｈｅｒ２細胞外Ｄ４−パニツムマブｓｃＦｖ  Ｖｈ−Ｖｌ−Ｈｉｓ；＃３３＋４（重鎖及び軽鎖の同時トランスフェクション；一方の鎖はＣＤ１９融合物を保有する）：ＣＤ１９細胞外Ｄ１＋２パニツムマブ抗体−Ｈｉｓ）についての結果を示す。
【００４０】
【図３４】図３４は、ＦＭＣ６３抗体に対する精製済ＣＤ１９−抗Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ−Ｈｉｓ融合タンパク質の結合親和性を示す。
【００４１】
【図３５】図３５は、Ｈｅｒ２に対するＦＭＣ６３結合ＣＤ１９−抗Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ−Ｈｉｓ融合タンパク質の結合親和性を示す。
【００４２】
【図３６】図３６は、抗Ｈｅｒ２ｓｃＦｖに対するＦＭＣ６３結合ＣＤ１９−抗Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ−Ｈｉｓ融合タンパク質の結合親和性を示す。
【００４３】
【図３７】図３７は、ＣＤ２０発現２９３細胞に結合され、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＦＭＣ６３−ＰＥコンジュゲートで標識された融合タンパク質ＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）（＃６３）のフローサイトメトリープロフィールを示す。
【００４４】
【図３８】図３８は、ＣＤ２０発現２９３細胞に結合され、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＦＭＣ６３−ＰＥコンジュゲートで標識された融合タンパク質ＣＤ１９−Ｄ１＋２−Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）（＃８３）のフローサイトメトリープロフィールを示す。
【００４５】
【図３９】図３９は、ＣＤ２０発現２９３細胞に結合され、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＦＭＣ６３−ＰＥコンジュゲートで標識された融合タンパク質ＣＤ１９−Ｄ１＋２−Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ（ＶＬ／ＶＨ）（＃８５）のフローサイトメトリープロフィールを示す。
【００４６】
【図４０】図４０は、ＣＤ２０発現２９３細胞＋α−ｈｕＩｇＧ−ＦＩＴＣに結合された融合タンパク質ＣＤ１９−Ｄ１＋２−Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）−ｈｕＩｇＧＦｃ（＃８２）のフローサイトメトリープロフィールを示す。
【００４７】
【図４１】図４１は、抗ｈｕＩｇＧ−ＦＩＴＣ陰性対照：２９３−ＣＤ２０＋α−ｈｕＩｇＧ−ＦＩＴＣの分析を示す。
【００４８】
【図４２】図４２は、ＣＤ２０発現２９３細胞＋α−ｈｕＩｇＧ−ＦＩＴＣに結合された融合タンパク質ＣＤ１９−Ｄ１＋２−Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ（ＶＬ／ＶＨ）−ｈｕＩｇＧＦｃ（＃８４）のフローサイトメトリープロフィールを示す。
【００４９】
【図４３】図４３は、ＣＤ２０発現２９３細胞＋α−Ｈｉｓ−ＰＥに結合された融合タンパク質ＣＤ２２−Ｄ１２３−Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）（＃６５）のフローサイトメトリープロフィールを示す。
【００５０】
【図４４】図４４は、バックグラウンドレベルの結合を呈示するＨｅｒ２−Ａ４３１細胞＋トラスツズマブ−ＰＥの対照の検出を示す（Ａ４３１細胞は、Ｈｅｒ２陰性である）。
【００５１】
【図４５】図４５は、Ａ４３１＋融合タンパク質Ｈｅｒ２−ＥＣＤ−パニツムマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）（＃５７）＋トラスツズマブ−ＰＥコンジュゲートの分析を示す。
【００５２】
【図４６】図４６は、Ａ４３１＋融合タンパク質Ｈｅｒ２−Ｄ４−パニツムマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）（＃５８）＋トラスツズマブ−ＰＥコンジュゲートの分析を示す。
【００５３】
【図４７】図４７は、表示のペプチドで被覆し、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔと１０：１のエフェクター標的比でインキュベートしたＢＴ４７４細胞のＩＦＮγＥＬＩＳＡ結果を示す。
【００５４】
【図４８】図４８は、表示のペプチドで被覆し、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔと１：１のエフェクター標的比でインキュベートしたＢＴ４７４細胞のＩＦＮγＥＬＩＳＡ結果を示す。
【００５５】
【図４９】図４９は、表示のペプチドで被覆し、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔと１０：１のエフェクター標的比でインキュベートしたＢＴ４７４細胞のＸＴＴ細胞傷害性結果の概要を示す。
【００５６】
【図５０】図５０は、表示のペプチドで被覆し、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔと１０：１のエフェクター標的比でインキュベートしたＢＴ４７４細胞のＩＦＮγＥＬＩＳＡ結果を示す。
【００５７】
【図５１】図５１は、表示のペプチドで被覆し、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔと１：１のエフェクター標的比でインキュベートしたＢＴ４７４細胞のＩＦＮγＥＬＩＳＡ結果を示す。
【００５８】
【図５２】図５２Ａ−５２Ｃは、例示的なＦｃベース構築物を示す。
【００５９】
【図５３】図５３Ａ−５３Ｃは、例示的なＦｃベース二重特異性構築物を示す。
【００６０】
【図５４】図５４Ａ及び５４Ｂは、ＦｃＩｇ「スワップ」を含む例示的なＦｃベースの構築物を示す。
【００６１】
【図５５】図５５Ａ及び５５Ｂは、一方又は両方のＦｃＣＨ３ドメインが置換された例示的な構築物を示す。
【００６２】
【図５６】図５６は、マスキング部分がｓｃＦｖのＮ末端に融合した、図５２Ｂ及び５２Ｃに記載の構築物及びマスキング部分の融合を有する例示的な構築物を示す。
【００６３】
【図５７】図５７は、マスキング部分がＶＨ／ＶＬアーム上のＶＨ及び／又はＶＬのＮ末端に融合した、図５３Ｂ及び５３Ｃに記載の構築物及びマスキング部分の融合を有する例示的な構築物を示す。
【００６４】
【図５８】図５８は、マスキング部分が各重鎖のＮ末端に融合した、図５４Ｂに記載の構築物及びマスキング部分の融合を有する例示的な構築物を示す。
【００６５】
【図５９】図５９は、マスキング部分が重鎖及び／又はｓｃＦｖ  ＶＨのＮ末端に融合した、図５５Ａ及び５５Ｂに記載の構築物及びマスキング部分の融合を有する例示的な構築物を示す。
【００６６】
【図６０−１】図６０Ａ−６０Ｄは、休止又は活性化条件下でのＣＭＶプロモータ−ｔＧＦＰ構築物（＃６６）からのＧＦＰ発現の分析を示す。
【図６０−２】同上。
【００６７】
【図６１−１】図６１Ａ−６１Ｄは、休止又は活性化条件下でのヒトＣＤ６９プロモータ−ｔＧＦＰ（＃４６）からのＧＦＰ発現の分析を示す。
【図６１−２】同上。
【００６８】
【図６２−１】図６２Ａ−６２Ｄは、休止又は活性化条件下でのヒトＴＮＦαプロモータ−ｔＧＦＰ（＃４７）からのＧＦＰ発現の分析を示す。
【図６２−２】同上。
【００６９】
【図６３−１】図６３Ａ−６３Ｄは、休止又は活性化条件下でのヒトＮＦＡＴエレメント×６プロモータ−ｔＧＦＰ（＃４９）からのＧＦＰ発現の分析を示す。
【図６３−２】同上。
【００７０】
【図６４】図６４Ａ−６４Ｄは、休止又は活性化条件下での細胞表面上でのＣＤ６９の発現の分析を示す。
【００７１】
【図６５−１】図６５Ａ−６５Ｃは、ＣＤ１９含有融合タンパク質（＃４２、＃４３、＃５６、＃８２、＃８３、＃９１、＃９２、＃９３、＃９４）とＦＭＣ６３被覆プレートとの結合を示す。図６５Ｄは、融合タンパク質＃８２、＃８３、＃９１、及び＃９２の力価決定を示す。
【図６５−２】同上。
【００７２】
【図６６−１】図６６Ａ−６６Ｄは、プレート結合抗原による複数の融合タンパク質の捕捉、並びにＨＲＰに結合した抗Ｈｉｓ抗体によるそれらの検出を示す。
【図６６−２】同上。
【図６６−３】同上。
【００７３】
【図６７】図６７Ａ及び６７Ｂは、ＣＤ２０発現２９３細胞に結合し、抗Ｈｉｓ−ＰＥ（６７Ａ）又は抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＦＭＣ６３−ＰＥ（６７Ｂ）で標識された融合タンパク質ＣＤ１９−Ｄ１＋２−Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）（＃８３）のフローサイトメトリー結果を示す。
【００７４】
【図６８】図６８Ａ及び６８Ｂは、ＣＤ２０発現２９３細胞に結合し、α−ｈｕＩｇＧ−ＦＩＴＣ（６８Ａ）又はＦＭＣ６３−ＰＥ又は抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＦＭＣ６３−ＰＥ（６８Ｂ）で標識された融合タンパク質ＣＤ１９−Ｄ１＋２−Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）−ｈｕＩｇＧＦｃ（＃８２）のフローサイトメトリー結果を示す。
【００７５】
【図６９】図６９Ａ−６９Ｄは、構築物＃８３融合タンパク質についてのＩＦＮγＥＬＩＳＡの結果を示す。図６９Ａ：２４時間、１０：１エフェクター：標的比；図６９Ｂ：２４時間、２：１エフェクター：標的比；図６９Ｃ：４８時間、１０：１エフェクター：標的比；図６９Ｄ：４８時間、２：１エフェクター：標的比。
【００７６】
【図７０】図７０は、２：１エフェクター：標的比で、２４時間後の構築物＃３３＋構築物＃４の同時トランスフェクションから得られた融合タンパク質についてのＩＦＮγＥＬＩＳＡの結果を示す。
【００７７】
【図７１】図７１Ａ及び７１Ｂは、融合タンパク質＃８３及び２９３−ＣＤ２０細胞についてのＸＴＴ細胞傷害性結果の概要を示す。図７１Ａ：４８時間、１０：１エフェクター：標的比；図７１Ｂ：４８時間、２：１エフェクター：標的比。
【００７８】
【図７２】図７２Ａ及び７２Ｂは、構築物＃３３＋構築物＃４及びＡ４３２１細胞の同時トランスフェクションから得られた融合タンパク質についてのＸＴＴ細胞傷害性結果の概要を示す。図７２Ａ：２４時間、１０：１エフェクター：標的比。図７２Ｂ：２４時間、２：１エフェクター：標的比。
【００７９】
【図７３】図７３Ａ及び７３Ｂは、一過的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞におけるＨＥＲ２及びＥＧＦＲの発現を示す。
【００８０】
【図７４】図７４Ａ−７４Ｄは、２９３Ｔ−Ｈｅｒ２発現細胞に対する融合タンパク質＃４３の結合を示す。
【００８１】
【図７５】図７５Ａ−７５Ｄは、２９３Ｔ−Ｈｅｒ２発現細胞に対する融合タンパク質＃９４、及び＃９５の結合を示す。
【００８２】
【図７６】図７６Ａ及び７６Ｂは、２９３Ｔ−ＥＧＦＲ発現細胞に対する融合タンパク質＃９４の結合を示す。
【００８３】
【図７７】図７７Ａ及び７７Ｂは、構築物＃４２によりコードされた融合タンパク質のＣＡＲ１９Ｔ細胞分泌によりＨＥＲ２＋細胞に再指向されたＣＡＲ１９媒介性細胞傷害性を示す。
【００８４】
【図７８】図７８は、ＨＲＰ共役マウスＩｇＧ抗体により検出される、融合タンパク質＃２９及び＃１０３からなるヘテロマー融合タンパク質と抗ＣＤ１９抗体ＦＭＣ６３の結合を示す。
【００８５】
【図７９】図７９Ａ及び７９Ｂは、野生型ＣＤ１９細胞外ドメインの酵母表面ディスプレイを示す。
【００８６】
【図８０】図８０は、酵母にディスプレイされたＣＤ１９細胞外ドメインに結合する抗体を示す。
【００８７】
【図８１】図８１は、細胞外ドメインの多様化領域を示す。
【００８８】
【図８２】図８２は、コンビナトリアルＣＤ１９ライブラリが酵母表面上に有効にディスプレイされ、抗体結合を維持することを示す。
【００８９】
【図８３】図８３Ａ及び８３Ｂは、リガンドをＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に結合させるために、コンビナトリアルＣＤ１９ライブラリを富化し得ること示す。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
定義
本発明を理解しやすくする目的で、初めにいくつかの用語を以下に定義する。下記の用語及び他の用語についてのさらに別の定義は、本明細書全体を通して記載する。
【００９１】
投与：本明細書で使用されるとき、用語「投与」は、対象又は体系に対する組成物の投与を指す。動物対象（例えば、ヒト）への投与は、任意の適切な経路によって行ってよい。例えば、一部の実施形態では、投与は、気管支（気管支内注入など）、口腔、腸内、皮下、動脈内、皮内、胃内、脊髄内、筋肉内、鼻内、腹腔内、髄腔内、静脈内、心室内、特定の器官内（例えば、肝臓内）、粘膜、鼻、経口、直腸、皮下、舌下、局所、気管（気管内注入によってなど）、経皮、膣内及び硝子体であってよい。一部の実施形態では、投与は、腫瘍内又は腫瘍周辺であってもよい。一部の実施形態では、投与は、間欠投与を含んでもよい。一部の実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間にわたる持続投与（例えば、灌流）を含んでもよい。
【００９２】
養子細胞療法：本明細書で使用されるとき、「養子細胞療法」又は「ＡＣＴ」は、抗腫瘍活性を有する免疫細胞の癌患者への移入を含む。一部の実施形態では、ＡＣＴは、抗腫瘍活性を有するリンパ球の使用、これらの細胞数のインビトロでの拡大及び担癌宿主へのその注入を含む治療法である。
【００９３】
薬剤：本明細書で使用される用語「薬剤」は、例えば、ポリペプチド、核酸、多糖類、脂質、小分子、金属、又はそれらの組合せをはじめとする、任意の化学クラスの化合物又は実体を指し得る。文脈から明らかになるように、一部の実施形態では、薬剤は、細胞若しくは生物、又は画分、抽出物、又はそれらの組合せであるか、或いはそれらを含み得る。一部の実施形態では、薬剤は、天然に見出される、及び／若しくは天然から得られる天然産物であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、薬剤は、人の手によって設計、操作、及び／若しくは製造される、並びに／又は天然に見出されないという点で人工である１つ又は複数の実体であるか、或いはそれを含む。一部の実施形態では、薬剤は、単離形態又は純粋な形態で使用してもよく；一部の実施形態では、薬剤は、粗形態で使用してもよい。一部の実施形態では、薬剤候補は、集団又はライブラリとして提供され、例えば、それらをスクリーニングして、それらの中で活性薬剤を同定又は特性決定することができる。本発明に従って使用することができる薬剤のいくつかの具体的な実施形態は、小分子、抗体、抗体断片、アプタマー、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム）、ペプチド、ペプチド模倣物などを含む。一部の実施形態では、薬剤は、ポリマーであるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、薬剤は、ポリマーではなく、且つ／又はいずれのポリマーも実質的に含まない。一部の実施形態では、薬剤は、少なくとも１つのポリマー部分を含む。一部の実施形態では、薬剤は、ポリマーポリマー部分が欠如しているか、又はいずれのポリマー部分も実質的に含まない。
【００９４】
改善：本明細書で使用されるとき、「改善」は、状態の予防、軽減及び／若しくは好転、又は対象の状態の改善を指す。改善は、疾患、障害若しくは病状の完全な回復又は完全な予防を含むが、それを要求するわけではない。
【００９５】
アミノ酸：本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸」は、その広い意味において、ポリペプチド鎖に組み込むことができる任意の化合物及び／又は物質を指す。一部の実施形態では、アミノ酸は、一般的構造：Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。一部の実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。一部の実施形態では、アミノ酸は、合成アミノ酸であり；一部の実施形態では、アミノ酸は、ｄ−アミノ酸であり；一部の実施形態では、アミノ酸は、ｌ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然に存在するペプチドに一般的に見出される２０の標準ｌ−アミノ酸のいずれかを指す。「非標準アミノ酸」は、それが合成により作製されるか、又は天然の供給源から得られるかにかかわらず、標準アミノ酸以外のあらゆるアミノ酸を指す。本明細書で使用されるとき、「合成アミノ酸」は、化学的に修飾されたアミノ酸を包含し、そうしたものとして、限定されないが、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、及び／又は置換物が挙げられる。ペプチド中のカルボキシ−及び／又はアミノ−末端アミノ酸をはじめとするアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基、及び／又はその活性に有害に作用することなく、ペプチドの循環半減期を変えることができる他の化学基での置換によって修飾することができる。アミノ酸は、ジスルフィド結合に参加し得る。アミノ酸は、１つ又は複数の翻訳後修飾、例えば、１つ又は複数の化学的実体（例えば、メチル基、酢酸基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分など）との結合を含んでもよい。用語「アミノ酸」は、「アミノ酸残基」と置き換え可能に使用され、遊離アミノ酸及び／又はペプチドのアミノ酸残基を指す場合もある。この用語が遊離アミノ酸又はペプチドの残基のいずれを指すにかかわらず、使用されることは文脈から明らかであろう。
【００９６】
抗体：本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、特定の標的抗原に対する特異的な結合を付与する上で十分な規定免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドを指す。当技術分野で公知のように、天然に産生されるインタクトな抗体は、互いに結合して、一般に「Ｙ字型」構造と呼ばれるものを形成する、２つの同じ重鎖ポリペプチド（各々約５０ｋＤ）と２つの同じ軽鎖ポリペプチド（各々約２５ｋＤ）からなるおよそ１５０ｋＤの四量体物質である。各重鎖は、少なくとも４つのドメイン（各々約１１０アミノ酸長）−アミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の先端に位置する）、続いて３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、及びカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙ字の幹の下端に位置する）からなる。「スイッチ」として知られる短い領域は、重鎖可変及び定常領域をつなげる。「ヒンジ」は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを抗体の残り部分とつなげる。このヒンジ領域中の２つのジスルフィド結合は、２つの重鎖ポリペプチドをインタクトな抗体中のもう１つのポリペプチドとつなげる。各軽鎖は、互いに他の「スイッチ」により隔てられた２つのドメイン、すなわち、アミノ末端可変（ＶＬ）ドメインと、それに続くカルボキシ末端定常（ＣＬ）ドメインからなる。インタクトな抗体四量体は、２つの重鎖−軽鎖二量体から構成され、重鎖及び軽鎖は、単一のジスルフィド結合によって互いに結合され；他の２つのジスルフィド結合が重鎖ヒンジ領域を互いに結合することにより、二量体が互いに結合して四量体が形成される。天然に産生される抗体も典型的にはＣＨ２ドメインでグリコシル化される。天然抗体中の各ドメインは、圧縮された逆平行βバレル中に互いに接触して充填される２つのβシート（例えば、３、４、若しくは５本鎖シート）から形成される「免疫グロブリンフォールド」を特徴とする構造を有する。各可変ドメインは、「補体決定領域」（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）として知られる３つの超可変ループと、４つの幾分不変の「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）とを含む。天然抗体が折り畳まれると、ＦＲ領域は、ドメインの構造フレームワークを付与するβシートを形成すると共に、重鎖及び軽鎖の両方からのＣＤＲループ領域が３次元空間内で一緒になって、Ｙ字構造の先端に位置する単一の超可変抗原結合部位を形成する。天然に存在する抗体のＦｃ領域は、補体系の要素に、さらには例えば細胞傷害性を媒介するエフェクター細胞をはじめとするエフェクター細胞上の受容体にも結合する。当技術分野で公知のように、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性及び／又は他の結合属性は、グリコシル化又は他の修飾を介して調節することができる。一部の実施形態では、本開示に従って生成及び／又は使用される抗体は、修飾又は操作されたそのようなグリコシル化を有するＦｃドメインなどのグリコシル化Ｆｃドメインを含む。本開示の目的のために、いくつかの実施形態では、天然抗体に見出されるように十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む任意のポリペプチド又はポリペプチドの複合体は、そのようなポリペプチドが天然に生成される（例えば、抗原に反応する生物によって産生される）か、又は組換え操作、化学的合成、又は他の人工系若しくは方法によって生成されるかにかかわらず、「抗体」と呼ぶことができ、且つ／又は「抗体」として使用することができる。一部の実施形態では、抗体は、ポリクローナルであり；一部の実施形態では、抗体は、モノクローナルである。一部の実施形態では、抗体は、マウス、ウサギ、霊長類、又はヒト抗体に特有の定常領域配列を有する。一部の実施形態では、抗体配列要素は、当技術分野で公知のように、完全にヒト由来であるか、又はヒト化、霊長類化、キメラなどである。さらに、本明細書で使用される用語「抗体」は、適切な実施形態（別の解釈が記載されているか、又は文脈から明らかでない限り）では、別の形態で抗体構造及び機能的特徴を使用することを目的とする、当技術分野で公知の又は開発された構築物若しくはフォーマットのいずれも指し得る。例えば、一部の実施形態では、本開示に従って使用される抗体は、限定されないが、以下：インタクトなＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭ、二重若しくは多重特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）、単鎖Ｆｖ、ポリペプチド−Ｆｃ融合物、Ｆａｂ、カメロイド（ｃａｍｅｌｏｉｄ）抗体、マスクされた抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、小モジュラー免疫薬（Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（「ＳＭＩＰｓＴＭ」）、単鎖若しくはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ミニボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、アンキリン反復タンパク質若しくはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）、Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）、及びＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択されるフォーマットである。一部の実施形態では、抗体は、天然に生成されていれば有する共有結合修飾（例えば、グリカンの結合）が欠如していてもよい。一部の実施形態では、抗体は、共有結合修飾（例えば、グリカン、ペイロード（例えば、検出可能な部分、治療薬部分、触媒部分など）、又は別のペンダント基（例えば、ポリエチレングリコールなど））の結合）を含んでもよい。
【００９７】
抗体依存性細胞傷害性：本明細書で使用されるとき、用語「抗体依存性細胞傷害性」又は「ＡＤＣＣ」は、抗体が結合する標的細胞が免疫エフェクター細胞によって殺傷される現象を指す。いずれの特定の理論にも拘束されることは意図しないが、ＡＤＣＣは、典型的に、抗体被覆標的細胞（例えば、その表面に、抗体によって結合される特定の抗原を発現する細胞）を認識した後、それらを殺傷することができるＦｃ受容体（ＦｃＲ）担持エフェクター細胞を含むと理解されている。ＡＤＣＣを媒介するエフェクター細胞は、限定されないが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、好酸球の１つ又は複数をはじめとする、免疫細胞を含み得る。
【００９８】
抗体フラグメント：本明細書で使用されるとき、「抗体フラグメント」は、例えば、抗体の抗原結合領域又は可変領域など、インタクトな抗体の一部分を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；トリアボディ；テトラボディ；直鎖抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）；単鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。例えば、抗体フラグメントは、単離されたフラグメント、「Ｆｖ」フラグメント（重鎖及び軽鎖の可変領域からなる）、軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによって結合された組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、抗体重鎖の可変領域（例えば、ＶＨＨ）からなる組換え単一ドメイン抗体、並びに超可変領域（例えば、重鎖可変領域（ＶＨ）の超可変領域、軽鎖可変領域（ＶＬ）の超可変領域、ＶＨ内の１つ又は複数のＣＤＲドメイン、及び／又はＶＬ内の１つ又は複数のＣＤＲドメイン）を模倣するアミノ酸残基から構成される最小認識単位が挙げられる。多くの実施形態では、抗体フラグメントは、親抗体の十分な配列を含有し、その場合、これは、親抗体が結合するのと同じ抗原に結合するフラグメントであり；一部の実施形態では、フラグメントは、親抗体と同等の親和性で抗原に結合し、及び／又は抗原に対する結合について親抗体と競合する。抗体の抗原結合断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、重鎖可変領域、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域が挙げられる。抗体の抗原結合断片は、任意の手段で生成してよい。例えば、抗体の抗原結合断片は、インタクトな抗体の断片化によって酵素的若しくは化学的に生成してもよく、及び／又は部分的抗体配列をコードする遺伝子から組換えにより生成してもよい。代わりに又は加えて、抗体の抗原結合断片は、完全又は部分的に合成により生成してもよい。抗体の抗原結合断片は、任意選択で単鎖抗体フラグメントを含んでもよい。代わりに又は加えて、抗体の抗原結合断片は、例えば、ジスルフィド結合により互いに結合された複数の鎖を含んでもよい。抗体の抗原結合断片は、任意選択で多分子複合体を含んでもよい。機能的抗体フラグメントは、一般的には、少なくとも約５０アミノ酸を含み、より一般的には、少なくとも約２００アミノ酸を含む。
【００９９】
抗原：用語「抗原」は、本明細書で使用されるとき、免疫応答を誘発する物質；及び／又はＴ細胞受容体（例えば、ＭＨＣ分子により提示される場合）又は抗体若しくは抗体フラグメントに結合する物質を指す。一部の実施形態では、抗原は、体液性応答（例えば、抗原特異的抗体の産生を含む）を誘発し；一部の実施形態では、抗原は、細胞性応答（例えば、受容体が抗原と特異的に相互作用するＴ細胞を含む）を誘導する。一部の実施形態では、抗原は、抗体に結合して、生物内で特定の生理的応答を誘導し得るか、又は誘導しない場合もある。一般に、抗原は、例えば、小分子、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂質、ポリマー（一部の実施形態では、生体ポリマー以外（例えば、核酸若しくはアミノ酸ポリマー以外））などの任意の化学的実体であってもよく、又はそれを含んでもよい。一部の実施形態では、抗原は、ポリペプチドであるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、抗原は、グリカンであるか、又はそれを含む。当業者であれば、一般に、抗原が、単離された形態若しくは純粋な形態で提供されてもよく、或いは粗形態（例えば、細胞抽出物などの抽出物、又は抗原含有供給源の他の比較的天然のままの調製物中に、例えば、他の材料を一緒に含む）で提供されてもよく、或いは細胞上若しくは細胞中に存在してもよいことが理解されるであろう。一部の実施形態では、抗原は、組換え抗原である。
【０１００】
抗原提示細胞：フレーズ「抗原提示細胞」又は「ＡＰＣ」は、当技術分野で理解されている意味を有し、本明細書で使用されるとき、抗原をプロセシングし、Ｔ細胞に抗原を提示する細胞を指す。例示的なＡＰＣとしては、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、いくつかの活性化上皮細胞、並びにＴＣＲ刺激及び適切なＴ細胞共刺激が可能な他の細胞型が挙げられる。
【０１０１】
およそ又は約：本明細書で使用されるとき、用語「およそ」又は「約」は、対象の１つ又は複数の値に適用される場合、記載の参照値と類似する値を指す。いくつかの実施形態では、用語「およそ」又は「約」は、別の記載があるか、又は文脈から別の解釈が明らかでない限り（そうした数値が、考えられる値の１００％を超える場合を除いて）、記載される参照値のいずれか（プラス又はマイナス）の方向に２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内に入るか又はそれを下回る値の範囲を指す。
【０１０２】
結合：用語「結合」は、本明細書で使用されるとき、典型的に、２つ以上の実体同士又はそれらの間の非共有結合を指すことが理解されるであろう。「直接」結合は、実体又は部分間の物理的接触を含み；間接結合は、１つ又は複数の中間実体との物理的接触による物理的相互作用を含む。２つ以上の実体間の結合は、典型的に、様々な状況（相互作用する実体若しくは部分が独立に研究される場合又はより複雑な系である場合（例えば、担体実体と共有若しくはそれ以外で結合する場合、及び／又は生物系若しくは細胞中））のいずれでも評価することができる。
【０１０３】
癌：用語「癌」、「悪性」、「新生物」、「腫瘍」、及び「癌腫」は、本明細書において置き換え可能に使用され、相対的に異常な非制御的及び／又は自律的増殖を示し、それにより細胞増殖の制御の有意な喪失を特徴とする異常増殖表現型を呈示する細胞を指す。一般に、本出願において検出又は治療の対象となる細胞としては、前癌（例えば、良性）、悪性、前転移、転移、及び非転移性細胞が挙げられる。本開示の教示は、あらゆる癌に関連し得る。ほんの少数の非限定的な例を挙げると、一部の実施形態では、本開示の教示は、例えば、白血病、リンパ腫（ホジキン及び非ホジキンリンパ腫）、骨髄種及び骨髄増殖性疾患をはじめとする血液癌；肉腫、黒色腫、腺癌、固形組織の癌腫、口、咽喉、喉頭、及び肺の扁平上皮癌、肝臓癌、前立腺、子宮頸部、膀胱、子宮、及び子宮内膜癌などの泌尿生殖器の癌、並びに網膜細胞癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、皮膚若しくは眼内黒色腫、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、頭部及び頚部癌、乳癌、胃腸の癌及び神経系の癌、パピローマなどの良性病変などの１つ若しくは複数１つ若しくは複数の癌に適用される。
【０１０４】
キメラ抗原受容体：「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」又は「複数のＣＡＲ」は、本明細書で使用されるとき、細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞若しくはそれらの組合せなどのＴ細胞）に抗原特異性を移植する、操作された受容体を指す。ＣＡＲはまた、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体又はキメラ免疫受容体としても知られる。一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗原特異的標的領域、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、１つ又は複数の共刺激ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０１０５】
併用療法：本明細書で使用されるとき、用語「併用療法」は、対象が２つ以上の治療レジメン（例えば、２種以上の治療薬）に同時に曝露される状況を指す。一部の実施形態では、２種以上の薬剤を同時に投与してもよく；一部の実施形態では、そうした薬剤を順次投与してもよく；一部の実施形態では、そうした薬剤を重複投薬レジメンで投与する。
【０１０６】
ドメイン：用語「ドメイン」は、実体の１区分又は一部分を指すよう本明細書で使用される。一部の実施形態では、「ドメイン」は、その実体の特定の構造的及び／又は機能的特徴に関連し、そのため、ドメインがその親実体の他の部分から物理的に分離されたとき、その特定の構造的及び／又は機能的特徴を実質的に若しくは完全に保持する。上記に代わり又は加えて、ドメインは、（親）実体から分離されて、異なる（レシピエント）実体と結合されたとき、親実体においてそれを特徴付ける１つ若しくは複数の構造的及び／若しくは機能的特徴をレシピエント実体において実質的に保持する、並びに／又はレシピエント実体に付与する実体の一部分であるか、又はそれを含んでもよい。一部の実施形態では、ドメインは、分子（例えば、小分子、炭水化物、脂質、核酸、若しくはポリペプチド）の１区分又は一部分である。一部の実施形態では、ドメインは、ポリペプチドの１区分であり；一部のそうした実施形態では、ドメインは、特定の構造的要素（例えば、特定のアミノ酸配列若しくは配列モチーフ、αヘリックス特徴、βシート特徴、コイルドコイル特徴、ランダムコイル特徴など）、及び／又は特定の機能的特徴（例えば、結合活性、酵素活性、折り畳み活性、シグナル伝達活性など）を特徴とする。
【０１０７】
剤形：本明細書で使用されるとき、用語「剤形」及び「単位剤形」は、治療しようとする患者の治療薬の物理的に個別の単位を指す。各単位は、所望の治療効果を生み出すように計算された予定量の活性物質を含有する。しかしながら、組成物の総投与量は、健全な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されることが理解されるであろう。
【０１０８】
投与レジメン：本明細書で使用されるとき、用語「投与レジメン」は、典型的には時間的間隔をあけて、対象に個別に投与される単位用量（典型的には２つ以上）のセットを指す。一部の実施形態では、所与の治療薬は、１つ又は複数の用量を含み得る、推奨される投与レジメンを有する。一部の実施形態では、投与レジメンは、各々が互いに同じ長さの時間的間隔をあけた複数の用量を含み；一部の実施形態では、投与レジメンは、複数の用量と、個々の用量間の少なくとも２つの異なる時間的間隔とを含む。一部の実施形態では、投与レジメン内の用量は全て同じ単位用量である。一部の実施形態では、投与レジメン内の様々な用量は異なる量である。一部の実施形態では、投与レジメンは、第１投与量の第１用量と、それに続いて第１投与量と異なる第２投与量の１つ又は複数回の追加用量を含む。一部の実施形態では、投与レジメンは、第１投与量の第１用量と、それに続いて第１投与量と同じ第２投与量の１つ又は複数回の追加用量を含む。一部の実施形態では、投与レジメンは、関連集団全体に投与される（すなわち、治療投与レジメンである）とき、所望又は有益な転帰と相関する。
【０１０９】
エフェクター機能：本明細書で使用されるとき、「エフェクター機能」は、Ｆｃ受容体又はリガンドと抗体Ｆｃ領域の相互作用によって生じる生化学的事象を指す。エフェクター機能は、限定されないが、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、及び補体媒介性細胞傷害性（ＣＭＣ）が挙げられる。一部の実施形態では、エフェクター機能は、抗原の結合後に作動するもの、抗原結合とは独立に作動するもの、又はその両方である。
【０１１０】
エフェクター細胞：本明細書で使用されるとき、「エフェクター細胞」は、１つ又は複数のＦｃ受容体を発現して、１つ又は複数のエフェクター機能を媒介する免疫系の細胞を指す。一部の実施形態では、エフェクター機能は、限定されないが、以下：単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球の１つ又は複数であってもよく、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルなどの任意の生物由来のものであってよい。
【０１１１】
発現：本明細書で使用されるとき、核酸配列の「発現」は、以下の事象：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの生成（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／又は３’末端形成による）；（３）ポリペプチド若しくはタンパク質へのＲＮＡの翻訳；及び／又は（４）ポリペプチド若しくはタンパク質の翻訳後修飾の１つ又は複数を指す。
【０１１２】
細胞外ドメイン：本明細書で使用されるとき、「細胞外ドメイン」（又は「ＥＣＤ」）は、膜貫通ドメインを超えて細胞外空間へと延伸するポリペプチドの部分を指す。
【０１１３】
融合タンパク質：本明細書で使用されるとき、用語「融合タンパク質」は一般に、各々が（１）天然に存在する、及び／又は（２）ポリペプチドの機能性ドメインを表すペプチド部分に対して高度のアミノ酸同一性を示す少なくとも２つのセグメントを含むポリペプチドを指す。典型的には、少なくとも２つのこうしたセグメントを含むポリペプチドは、２つのセグメントが（１）同じペプチド中に天然に含まれず、且つ／又は（２）事前に単一ポリペプチド中で互いに連結されておらず、且つ／又は（３）人の手によって互いに連結されていない部分である場合に融合タンパク質であると考えられる。
【０１１４】
遺伝子：本明細書で使用されるとき、用語「遺伝子」は、当技術分野で理解されている意味を有する。当業者であれば、用語「遺伝子」が遺伝子調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサーなど）及び／又はイントロン配列を含み得ることを理解するであろう。さらに、遺伝子の定義には、タンパク質をコードしないが、代わりにｔＲＮＡ、ＲＮＡｉ誘導物質などの機能性ＲＮＡ分子などをコードする核酸を示す場合も含まれることが理解されるであろう。明瞭化のために、本発明者らは、本出願で使用されるとき、用語「遺伝子」が、一般に、タンパク質をコードする核酸の一部分を指し；当業者に文脈から明らかとなるように、この用語は、任意選択で、調節配列を含む場合もあることを明記する。この定義が用語「遺伝子」の非タンパク質コード発現単位への適用を排除することは意図されず、むしろ、ほとんどの場合、本明細書で使用されるこの用語がタンパク質コード核酸を指すことを明らかにすることが意図される。
【０１１５】
遺伝子産物又は発現産物：本明細書で使用されるとき、用語「遺伝子産物」又は「発現産物」は、一般に、遺伝子から転写されるＲＮＡ（プロセシング前及び／又は後）又は遺伝子から転写されるＲＮＡによってコードされるポリペプチド（修飾前及び／又は後）を指す。
【０１１６】
免疫応答：本明細書で使用されるとき、用語「免疫応答」は、動物において誘発された応答を指す。免疫応答は、細胞性免疫、液性免疫を指すか、又はその両方を含み得る。免疫応答は、免疫系の一部に限定される場合もある。例えば、いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、増大したＩＦＮγ応答を誘導し得る。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、粘膜性ＩｇＡ応答を誘導し得る（例えば、鼻及び／又は直腸洗浄液中で測定される）。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、全身性ＩｇＧ応答を誘導し得る（例えば、血清中で測定される）。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、ウイルス中和抗体又は中和抗体応答を誘導し得る。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、Ｔ細胞による細胞溶解（ＣＴＬ）応答を誘導し得る。
【０１１７】
改善する、増加する、又は低減する：本明細書で使用されるとき、用語「改善する」、「増加する」、又は「低減する」、或いは文法上の均等物は、本明細書に記載される治療の開始前の同じ個体の測定値、又は本明細書に記載される治療の非存在下の対照個体（若しくは複数の対照個体）の測定値などのベースライン測定値と比した値を示す。
【０１１８】
個体、対象、患者：本明細書で使用されるとき、用語「対象」、「個体」又は「患者」は、ヒト又は非ヒト哺乳動物対象を指す。治療対象である個体（「患者」又は「対象」とも呼ばれる）は、疾患、例えば、癌に罹患している個体（胎児、乳児、小児、青年、若しくは成人）である。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
【０１１９】
リンカー：本明細書で使用されるとき、用語「リンカー」は、例えば、融合タンパク質において、天然のタンパク質中の特定の位置に出現するものと異なる適切な長さのアミノ酸配列を指し、これは、一般に、柔軟であり、且つ／又は２つのタンパク質部分間にヘリックスなどの構造を挿入するように設計される。一般に、リンカーは、融合タンパク質の２つ以上のドメインがドメイン各々の生物活性の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上を保持することを可能にする。リンカーは、スペーサとも呼ばれ得る。
【０１２０】
マスキング部分：本明細書で使用されるとき、「マスキング部分」は、本明細書に記載の抗原結合タンパク質に連結されると、その標的抗原に対するそうした抗原結合部分の結合をマスクすることができる分子部分を指す。こうしたマスキング部分を含む抗原結合タンパク質は、本明細書において「マスクされた」抗原結合タンパク質と呼ばれる。
【０１２１】
核酸：本明細書で使用されるとき、「核酸」は、その広い意味で、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるか又は組み込むことができる任意の化合物及び／又は物質を指す。一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるか又は組み込むことができる任意の化合物及び／又は物質である。文脈から明らかになるように、一部の実施形態では、「核酸」は、個別の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／又はヌクレオシド）を指し；一部の実施形態では、「核酸」は、個別の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡであるか、又はＲＮＡを含み；一部の実施形態では、「核酸」は、ＤＮＡであるか、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、１つ又は複数の天然の核酸残基であるか、それを含むか、又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸は、１つ又は複数の核酸類似体であるか、それを含むか、又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸類似体は、ホスホジエステル骨格を使用しない点で核酸と異なる。例えば、一部の実施形態では、核酸は、１つ又は複数の「ペプチド核酸」であるか、それを含むか、又はそれから構成され、ペプチド核酸は、当技術分野において公知であり、骨格中にホスホジエステル結合ではなく、ペプチド結合を有し、本発明の範囲内にあるとみなされる。上記に代わり又は加えて、一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合ではなく、１つ又は複数のホスホロチオエート及び／又は５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合を有する。一部の実施形態では、核酸は、１つ又は複数の天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）であるか、それを含むか、又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸は、１つ又は複数の核酸類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５ピロピニル−シチジン、Ｃ−５ピロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、０（６）−メチルグアニン、２−チオシチジン、メチル化塩基、挿入された塩基、並びにこれらの組合せ）であるか、それを含むか、又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸は、天然の核酸中のものと比較して、１つ又は複数の修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラリボース、及びヘキソース）を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡ又はタンパク質などの機能性遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸は、１つ又は複数のイントロンを含む。一部の実施形態では、核酸は、天然供給源からの単離、相補的テンプレートに基づく重合による酵素的合成（インビボ若しくはインビトロ）、組換え細胞若しくは系における再生、並びに化学的合成の１つ又は複数によって製造される。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００残基長又はそれを上回る。一部の実施形態では、核酸は、一本鎖であり；一部の実施形態では、核酸は、二本鎖である。一部の実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードする少なくとも１つの要素を含むヌクレオチド配列を有するか、又はポリペプチドをコードする配列の補体である。一部の実施形態では、核酸は、酵素活性を有する。
【０１２２】
作動可能に連結された：本明細書で使用されるとき、「作動可能に連結された」は、記載の成分がその意図される様式で機能することを可能にする関係にある、並置を指す。１つ又は複数のコード配列と「作動可能に連結された」制御配列とは、１つ又は複数のコード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるように連結される。「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子と連続する発現制御配列、並びに目的の遺伝子を制御するためにトランスで又は間隔を置いて作用する発現制御配列の両方を含む。本明細書で使用される用語「発現制御配列」は、それらが連結されるコード配列の発現及びプロセシングを達成するのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモータ及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザック（Ｋｏｚａｋ）共通配列）；タンパク質安定性を高める配列；並びに必要に応じてタンパク質分泌を増大する配列を含む。こうした制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。例えば、原核生物の場合、そうした制御配列は、一般に、プロモータ、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含むが、真核生物の場合、典型的に、そうした制御配列は、プロモータと転写終結配列とを含む。用語「制御配列」は、存在が発現及びプロセシングに不可欠な成分を含むことが意図され、存在が有利な別の成分、例えばリーダ配列及び融合パートナー配列を含んでもよい。
【０１２３】
患者：本明細書で使用されるとき、用語「患者」は、提供される組成物が例えば実験、診断、予防、美容、及び／又は治療目的のために投与されるか、又は投与され得る任意の生物を指す。典型的な患者としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及び／又はヒトなどの哺乳動物）が挙げられる。一部の実施形態では、患者はヒトである。一部の実施形態では、患者は、１つ若しくは複数の疾患又は病状に罹患しているか、又は罹患しやすい。一部の実施形態では、患者は、疾患又は病状の１つ若しくは複数の症状を呈示する。一部の実施形態では、患者は、１つ若しくは複数の疾患又は病状を有すると診断されている。一部の実施形態では、疾患又は病状は、癌、又は１つ若しくは複数の腫瘍の存在であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、患者は、疾患、障害若しくは病状を診断及び／又は治療するために特定の療法を受けているか又は受けたことがある。
【０１２４】
ペプチド：本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド」は、典型的には、相対的に短い、例えば、約１００アミノ酸未満、約５０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満、又は１０アミノ酸未満の長さを有するペプチドを指す。
【０１２５】
薬学的に許容される：本明細書で使用される用語「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を起こすことなく、ヒト及び動物の組織と接触させる使用に好適であり、妥当な受益度／危険度比に相応する物質を指す。
【０１２６】
ポリペプチド：本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」は、一般的に、ペプチド結合によって互いに結合された少なくとも２つのアミノ酸の鎖である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、各々が少なくとも１つのペプチド結合によって互いに結合された少なくとも３〜５のアミノ酸を含んでもよい。当業者であれば、ポリペプチドが、ときとして、それでもなお任意選択で、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る「非天然」アミノ酸又は他の実体を含むことが理解されるであろう。
【０１２７】
プロモータ：本明細書で使用されるとき、「プロモータ」は、ポリヌクレオチド配列の特定の転写を開始する上で必要である、細胞の合成装置又は導入された合成装置によって認識されるＤＮＡ配列である。「構成性」プロモータは、遺伝子産物をコードするか、又はそれを規定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されると、細胞のほとんど若しくは全ての生理的条件下で、細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。「誘導性」プロモータは、遺伝子産物をコードするか、又はそれを規定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されると、実質的に、細胞中にプロモータ特異的誘導物質が存在するときに限って、細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【０１２８】
タンパク質：本明細書で使用されるとき、用語「タンパク質」は、ポリペプチド（すなわち、ペプチド結合によって互いに結合された少なくとも２つのアミノ酸の鎖）を指す。タンパク質は、アミノ酸以外の部分を含んでもよく（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカンなどであってもよく）、及び／又は別の方法でプロセシング若しくは修飾されていてもよい。当業者であれば、「タンパク質」が、細胞によって産生される通りの完全なポリペプチド鎖（シグナル配列を含む若しくは含まない）であっても、又はその一部分であってもよいことを理解するであろう。当業者であれば、タンパク質が、ときとして、例えば１つ若しくは複数のジスルフィド結合により連結されているか、又は他の手段で結合された２つ以上のポリペプチド鎖を含み得ることを理解するであろう。ポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又はその両方を含んでもよく、当技術分野で公知の多様なアミノ酸修飾又は類似体のいずれを含んでもよい。有用な修飾として、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化などが挙げられる。一部の実施形態では、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、及びそれらの組合せを含んでもよい。
【０１２９】
参照：本明細書で使用されるとき、「参照」は、比較が行われる標準又は対照を表す。例えば、一部の実施形態では、対象の薬剤、動物、個体、集団、サンプル、配列若しくは値を参照又は対照薬剤、動物、個体、集団、サンプル、配列若しくは値と比較する。一部の実施形態では、参照又は対照は、対象の試験若しくは決定と実質的に同時に、試験及び／若しくは決定される。一部の実施形態では、参照又は対照は、任意選択で有形的表現媒体に組み入れられた履歴的参照又は対照である。典型的に、当業者は、参照又は対照が評価対象のものと同等の条件若しくは状況下で決定又は特性決定されることを理解するであろう。当業者であれば、考えられる特定の参照又は対照への信頼性、及び／若しくはそれとの比較を正当化する上で十分な類似性がいつ存在するかを認識するであろう。
【０１３０】
固形腫瘍：本明細書で使用されるとき、用語「固形腫瘍」は、通常、嚢胞又は液体領域を含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は、良性又は悪性のいずれであってもよい。様々なタイプの固形腫瘍がそれらを形成する細胞型の名を取って命名されている。固形腫瘍の例としては、肉腫、癌腫、リンパ腫、中皮腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫などがある。
【０１３１】
癌の病期：本明細書で使用されるとき、用語「癌の病期」は、癌の進行レベルの定性的又は定量的評価を指す。癌の病期を決定するために用いられる基準としては、限定されないが、腫瘍のサイズ及び転移の範囲（例えば、局在化若しくは遠位）が挙げられる。
【０１３２】
対象：「対象」とは、哺乳動物（例えば、ヒト、一部の実施形態では、出生前のヒト形態を含む）を意味する。一部の実施形態では、対象は、関連疾患、障害又は病状に罹患している。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害又は病状に罹患しやすい。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害又は病状の１つ又は複数の症状若しくは特徴を呈示する。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害又は病状のいずれの症状若しくは特徴も呈示しない。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害又は病状の危険性に対する感受性に特有の１つ又は複数の特徴を有する者である。一部の実施形態では、対象は、患者である。一部の実施形態では、対象は、診断及び／又は療法が投与される、及び／又は投与された個体である。
【０１３３】
に罹患している：疾患、障害又は病状（例えば、癌）に「罹患している」個体は、疾患、障害又は病状を有すると診断されているか、及び／又はその１つ若しくは複数の症状を呈示する。
【０１３４】
症状が軽減される：本発明によれば、特定の疾患、障害又は病状の１つ若しくは複数の症状が程度（例えば、強度、重症度など）又は頻度において低減したとき、「症状が軽減される」。明瞭化のために、特定の症状の発症が遅れることも、その症状の頻度の軽減の一形態とみなされる。本発明を、症状が排除される場合のみに限定することは意図されない。本発明は、特に、１つ若しくは複数の症状が、完全に排除されていなくても、軽減される（並びにそれによって対象の病状が「改善される」）治療を考慮する。
【０１３５】
Ｔ細胞受容体：本明細書で使用されるとき、「Ｔ細胞受容体」又は「ＴＣＲ」は、Ｔ細胞の表面に存在する抗原認識分子を指す。正常Ｔ細胞の発生中に、４つのＴＣＲ遺伝子、α、β、γ、及びδの各々は再編成して、極めて多様なＴＣＲタンパク質をもたらすことができる。
【０１３６】
治療薬：本明細書で使用されるとき、フレーズ「治療薬」は、概して、生物に投与されると、所望の薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。一部の実施形態では、薬剤は、適切な集団全体に統計的に有意な効果を示す場合、治療薬であるとみなされる。一部の実施形態では、適切な集団は、モデル生物の集団であってよい。一部の実施形態では、適切な集団は、特定の年齢群、性別、遺伝的背景、既往歴などの様々な基準によって定義してもよい。一部の実施形態では、治療薬は、疾患、障害及び／又は病状の１つ若しくは複数の症状又は特徴の発症の緩和、改善、軽減、阻害、予防、遅延、その重症度の軽減、及び／又はその発生率の低減のために使用することができる物質である。一部の実施形態では、「治療薬」は、ヒトへの投与のために市販が可能になる前に、政府機関によって承認されているか、又は承認を必要とする薬剤である。一部の実施形態では、「治療薬」は、ヒトへの投与のために処方箋を必要とする薬剤である。
【０１３７】
治療有効量：本明細書で使用されるとき、用語「治療有効量」は、治療薬投与レジメンに従って、疾患、障害及び／又は病状に罹患している、又は罹患しやすい集団に投与されるとき、その疾患、障害及び／又は病状を治療する上で十分な量を意味する。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患、障害及び／又は病状の１つ若しくは複数の症状の発生率及び／又は重症度を軽減し、その１つ若しくは複数の特徴を安定化させ、並びに／或いはその発症を遅延させる量である。当業者であれば、用語「治療有効量」が、実際には、特定の個体において治療の成功の達成を要求しないことを認識するであろう。そうではなく、治療有効量は、そうした治療を必要とする患者に投与されるとき、有意な数の対象において特定の所望の薬理学的応答をもたらす量であってよい。例えば、一部の実施形態では、「治療有効量」は、集中療法に関連して、それを必要とする個体に投与されると、前記個体に起こる癌の支持プロセスを遮断、安定化、減衰、又は逆転するか、或いは前記個体における癌の支持プロセスを増強又は増加する量を指す。癌治療に関連して、「治療有効量」は、癌と診断された個体に投与されると、個体における癌のさらなる発生を予防、安定化、阻害、又は軽減する量である。本明細書に記載される組成物の特に好ましい「治療有効量」は、膵臓癌などの悪性腫瘍の発生を逆転させる（治療的療法の場合）か、又は悪性腫瘍の寛解を達成若しくは持続させるのを助ける。個体における癌を治療するために個体に投与される治療有効量は、寛解を促進する、又は転移を阻害するために投与される治療有効量と同じでも異なってもよい。ほとんどの癌治療と同様に、本明細書に記載される治療方法は、癌の「治癒」として解釈される、それに制限される、或いは限定されるべきではなく；むしろ、これらの治療方法は、癌を「治療する」、すなわち癌を有する個体の健康に望ましい若しくは有益な変化をもたらすことを目的とする記載の組成物の使用に関する。こうした利益は、腫瘍学の分野の熟練した医療供給者によって認識されており、そのようなものとして、限定されないが、患者の病状の安定化、腫瘍サイズの減少（腫瘍退縮）、生活機能の改善（例えば、癌組織若しくは器官の機能改善）、それ以上の転移の減少若しくは阻害、日和見感染の減少、生存率の増加、痛みの軽減、運動機能の改善、認知機能の改善、エネルギーの感覚改善（活力、不快感の軽減）、良好な状態の感覚改善、正常な食欲の回復、健全な体重増加の回復、並びにこれらの組合せが挙げられる。さらに、個体の特定の腫瘍の退縮（例えば、本明細書に記載の治療の結果として）は、膵臓腺癌などの腫瘍の部位から癌細胞のサンプルを採取し（例えば、治療過程を通して）、代謝及びシグナル伝達マーカのレベルについて癌細胞をテストして、分子レベルで、より低悪性の表現型への癌細胞の退縮を確認するために癌細胞の状態をモニターすることによって評価してもよい。例えば、本発明の方法を使用することにより誘導される腫瘍退縮は、１つ又は複数の血管新生促進マーカの減少、抗血管新生マーカの増加、癌と診断された個体において異常活性を呈示する代謝経路、細胞間シグナル伝達経路、又は細胞内シグナル伝達経路の正常化（すなわち、癌に罹患していない正常な個体に見出される状態に向かう改変）を見出すことによって示される。当業者であれば、実施形態によっては、治療有効量を単回用量に製剤化、及び／又は投与してもよいことを認識するであろう。一部の実施形態では、例えば、投与レジメンの一環として、治療有効量を複数回の用量に製剤化、及び／又は投与してもよい。
【０１３８】
形質転換：本明細書で使用されるとき、「形質転換」は、外性ＤＮＡ配列を宿主細胞に導入するあらゆる工程を指す。形質転換は、当技術分野で公知の様々な方法を用いて天然又は人工的条件下で行ってよい。形質転換に、外来核酸配列を原核又は真核宿主細胞に挿入する任意の公知の方法を利用してもよい。一部の実施形態では特定の形質転換法は、形質転換しようとする宿主細胞に基づいて選択され、限定されないが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、交配、リポフェクションを挙げることができる。一部の実施形態では「形質転換」細胞は、挿入されたＤＮＡが、自律的複製プラスミドとして又は宿主染色体の一部としてのいずれかで複製可能であるという点で安定して形質転換されている。一部の実施形態では、形質転換細胞は、限定的な期間にわたって、導入された核酸を一過性発現する。
【０１３９】
治療：本明細書で使用されるとき、用語「治療」（さらに「治療する」又は「治療すること」）は、特定の疾患、障害及び／又は病状（例えば、癌）の１つ若しくは複数の症状、特徴、及び／又は原因を部分的若しくは完全に緩和、改善、軽減、阻害する、その発症を遅延させる、その重症度を軽減する、及び／又はその発生率を低減する物質のあらゆる投与を指す。こうした治療は、関連疾患、障害及び／若しくは病状の徴候を示していない対象、並びに／又は疾患、障害及び／若しくは病状の早期徴候のみを呈示している対象に対するものであり得る。代わりに又は加えて、こうした治療は、関連疾患、障害及び／若しくは病状の１つ又は複数の確定された徴候を示す患者に対するものでもあり得る。一部の実施形態では、治療は、関連疾患、障害及び／若しくは病状に罹患していると診断された対象に対するものであり得る。一部の実施形態では、治療は、関連疾患、障害及び／若しくは病状の発生の危険性増加と統計的に相関する１つ又は複数の感受性因子を有することがわかっている対象に対するものであり得る。
【０１４０】
腫瘍浸潤リンパ球：本明細書で使用されるとき、用語「腫瘍浸潤リンパ球」は、癌（黒色腫など）に罹患した対象の白血球で、血流を出て、腫瘍に移動したものを指す。一部の実施形態では、腫瘍浸潤リンパ球は、腫瘍特異性を有する。
【０１４１】
ベクター：本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、それが結合する別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。一部の実施形態では、ベクターは、それらが、真核及び／又は原核細胞などの宿主細胞中で、連結される核酸の染色体外複製及び／又は発現が可能である。作動可能に連結された遺伝子の発現を指令することができるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
【０１４２】
詳細な説明
中でも、本発明は、癌の治療のために有用な方法及び組成物を提供する。特に、本開示は、細胞治療薬、例えば、組み込まれた遺伝子、例えば、目的のヌクレオチド配列（例えば、そうしたヌクレオチド配列を含む構成性発現構築物及び／又は誘導性発現構築物）で遺伝子改変された免疫細胞を提供する。一部の実施形態では、目的のヌクレオチド配列の発現は、本明細書に記載される通り、そうした目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現プロモータ配列の適切な選択、構築及び／又は設計によって構成性若しくは誘導性となるように設計することができる。構成性発現構築物の場合、構築物中の遺伝子は、構成的に発現される。誘導性発現構築物の場合、抗原結合受容体をコードする核酸及び誘導性発現構築物で、細胞治療薬を遺伝子改変することができる。標的抗原と結合すると、細胞治療薬の抗原結合受容体は、例えば、図１に示されるように、誘導性発現構築物に含まれる遺伝子の発現を誘導する。いくつかの実施形態では、こうした遺伝子の発現は、例えば、１つ又は複数の細胞治療薬による癌の治療を促進及び／又は改善する。本発明はまた、特に、例えば、遺伝子療法のための、このような遺伝子によりコードされるタンパク質（例えば、そうした遺伝子産物の可溶性形態、例えば、そうしたタンパク質を含む、投与のための医薬組成物）、並びにそのようなタンパク質をコードする核酸を含むタンパク質治療薬を開示する。
【０１４３】
構成性発現構築物
いくつかの実施形態では、本開示は、構成性発現構築物を含む。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、目的のヌクレオチド配列、例えば、本明細書に記載の遺伝子に作動可能に連結した少なくとも１つのプロモータを含む核酸配列を含む。構成性発現構築物は、転写開始及び翻訳開始及び終結コドンなどの調節配列を含み得る。一部の実施形態では、こうした調節配列は、必要に応じて、非誘導性発現構築物を導入しようとする細胞型に特異的である。構成性発現構築物は、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結したネイティブ若しくは非ネイティブプロモータを含み得る。好ましくは、プロモータは、免疫細胞において機能性である。例示的プロモータとして、例えば、ＣＭＶ、Ｅ１Ｆ、ＶＡＶ、ＴＣＲｖｂｅｔａ、ＭＳＣＶ、及びＰＧＫプロモータが挙げられる。ヌクレオチド配列とプロモータとの作動可能な連結は、当業者の技術の範囲内である。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、本明細書に記載の組換え発現ベクターであるか、又はそれを含む。
【０１４４】
誘導性発現構築物及び誘導性発現
誘導性発現の場合、本開示の細胞治療薬は、（ｉ）細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内（又は細胞質）ドメインを含む、１つ若しくは複数１つ若しくは複数の抗原結合受容体、並びに（ｉｉ）誘導性発現構築物を含み得る。
【０１４５】
抗原結合受容体
抗原結合受容体の細胞外ドメインは、標的特異的抗原結合ドメインを含む。抗原結合受容体の細胞内ドメイン（又は細胞質ドメイン）は、シグナル伝達ドメインを含む。シグナル伝達ドメインは、アミノ酸配列を含み、これは、抗原結合ドメインと標的抗原とが結合すると、細胞内シグナル伝達経路を開始、及び／又は媒介し、この経路は、中でも、誘導性遺伝子が発現されるように、本明細書に記載の誘導性発現構築物を活性化することができる。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、１つ若しくは複数の免疫細胞エフェクター機能（例えば、ネイティブ免疫細胞エフェクター機能）を活性化する１つ又は複数のシグナル伝達領域（例えば、共刺激シグナル伝達領域）をさらに含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化、増殖、生存、又は他のＴ細胞機能を活性化するが、細胞傷害活性は誘導しない。一部の実施形態では、抗原結合受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の全部又は一部を含む。こうしたＣＡＲは、当技術分野で公知である（例えば、Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２６３：６８−８９（２０１５）；Ｓｔａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４：１１３−１１８  （２０１５）を参照）。
【０１４６】
抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、標的抗原、例えば、本明細書に記載の腫瘍抗原に特異的に結合する任意のポリペプチドであるか、又はそれを含み得る。例えば、一部の実施形態では、抗原結合ドメインとして、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、カメロイド（ｃａｍｅｌｏｉｄ）抗体、マスクされた抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｙ（登録商標））、単鎖若しくはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）、単一ドメイン抗体（例えば、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標））、アンキリン反復タンパク質若しくはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒ（登録商標）、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）、又はＣｅｎｔｙｒｉｎ（登録商標））が挙げられる。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）若しくはその抗原結合部分であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ｐＨ感受性ドメインである（例えば、Ｓｃｈｒｏｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ  ７：１３８−５１（２０１５）参照）。
【０１４７】
抗原結合ドメインは、例えば、標的細胞の表面上又はその近傍に存在する標的抗原のタイプ及び数に基づいて選択することができる。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカとして作用する抗原を認識するように、選択することができる。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合するように選択される。腫瘍抗原は、腫瘍細胞によって産生されるタンパク質であり、一部の実施形態では、免疫応答、特にＴ細胞媒介性免疫応答を誘発するタンパク質である。抗原結合ドメインの選択は、例えば、治療しようとする癌の具体的なタイプに左右され得る。
【０１４８】
膜貫通ドメイン
概して、「膜貫通ドメイン」は、本明細書で使用されるとき、膜中に存在する属性を有する（例えば、細胞膜の一部分又は全部にわたる）ドメインを指す。認識されるように、膜貫通ドメイン中の全てのアミノ酸が膜中に存在する必要はない。例えば、一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、タンパク質の指定区間又は部分が実質的に膜中に位置することを特徴とする。当技術分野で公知のように、タンパク質細胞下局在化（例えば、膜貫通局在化）を予測するための様々なアルゴリズムを用いてアミノ酸又は核酸配列を分析することができる。こうしたプログラムとして、中でも、ｐｓｏｒｔ（ＰＳＯＲＴ．ｏｒｇ）、Ｐｒｏｓｉｔｅ（ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）がある。
【０１４９】
本明細書に記載の抗原結合受容体中に含まれる膜貫通ドメインのタイプは、特定のタイプに限定されない。一部の実施形態では、天然状態で抗原結合ドメイン及び／又は細胞内ドメインと結合している膜貫通ドメインが選択される。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、例えば、こうしたドメインが同じ若しくは異なる表面の膜タンパク質の膜貫通ドメインと結合するのを回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、１つ又は複数のアミノ酸の修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）を含む。
【０１５０】
膜貫通ドメインは、天然又は合成供給源のいずれから得ることもできる。供給源が天然の場合、ドメインは、任意の膜結合又は膜貫通タンパク質から得ることができる。例示的な膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα、β若しくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＴＮＦＳＦＲ２５、又はＣＤ１５４から得ることができる（例えば、その少なくとも１つの膜貫通領域を含み得る）。或いは、膜貫通ドメインは、合成であってよい（例えば、主として疎水性残基、例えば、ロイシン及びバリンなどを含み得る）。一部の実施形態では、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの各末端に含まれる。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞質ドメインに直接連結される。一部の実施形態では、短いオリゴ−又はポリペプチドリンカー（例えば、２〜１０アミノ酸長）が膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間に結合を形成し得る。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン−セリンダブレットである。
【０１５１】
細胞質ドメイン
細胞内ドメイン（又は細胞質ドメイン）は、シグナル伝達ドメインを含み、これは、標的抗原が抗原結合ドメインと結合すると、細胞内シグナル伝達経路を開始及び／又は媒介し、この経路が本明細書に記載の誘導性発現構築物の発現を誘導する。
【０１５２】
免疫細胞と抗原が結合すると、シグナルを伝達することができる細胞内シグナル伝達ドメインは、公知であり、そのいずれも本発明で使用することができる。例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列は、ＴＣＲが抗原と結合した後に、シグナル伝達を開始することがわかっている（例えば、Ｂｒｏｗｎｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：２５７−２６９（２０１３））。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンによる活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。ＩＴＡＭを含む細胞質シグナル伝達配列の例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄ由来のものが挙げられる（例えば、Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：ａ００２４８５（２０１０）；Ｓｍｉｔｈ−Ｇａｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５９１−６１９（２００９）を参照）。
【０１５３】
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）による殺傷を引き起こすシグナルを伝達する配列を含まない。例えば、ＴＣＲ細胞質配列は、いくつかのシグナル伝達経路を活性化し、そのいくつかが殺傷を引き起こすことがわかっている（例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｇａｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５９１−６１９（２００９）を参照）。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、誘導性発現構築物の発現を媒介するが、殺傷の誘導は媒介しないシグナル伝達をもたらすシグナル伝達ドメインを含む（例えば、図６に例示する通り）。例えば、細胞質ドメインは、ＰＤＧＦ受容体の細胞質部分を含むことができ、抗原結合ドメインが抗原と結合すると、誘導性発現構築物のプロモータを誘発する細胞内シグナルをもたらすことができる。当業者は、当技術分野の知識に基づいて、誘導性発現構築物内に含有させる細胞内ドメイン及びコグネイトプロモータを選択することができる。
【０１５４】
ＴＣＲのみを介して生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化のためには不十分であり、二次又は共刺激シグナルも必要であることがわかっている。従って、一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、１つ又は複数の免疫細胞エフェクター機能（例えば、本明細書に記載のネイティブ免疫細胞エフェクター機能）を活性化する１つ又は複数の別のシグナル伝達領域（例えば、共刺激シグナル伝達領域）をさらに含む。一部の実施形態では、こうした共刺激シグナル伝達領域の一部分は、その部分がエフェクター機能シグナルを伝達する限り、使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞質ドメインは、Ｔ細胞補助受容体の１つ又は複数の細胞質配列（又はその断片）を含む。こうしたＴ細胞補助受容体の非限定的な例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球結合抗原１（ＬＦＡ−１）、ＭＹＤ８８、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが挙げられる。
【０１５５】
一部の実施形態では、２つ以上のシグナル伝達ドメインは、ランダム若しくは指定の順序で互いに連結される。任意選択で、短いオリゴ−又はポリペプチドリンカー（例えば、２〜１０アミノ酸長）は連結を形成し得る。一部の実施形態では、こうしたリンカーは、グリシン−セリンダブレットである。
【０１５６】
例示的な抗原結合受容体
一部の実施形態では、膜貫通及び／又は細胞質ドメインは、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）から得られる。ＲＴＫは、細胞型及び細胞表面からのシグナル統合に応じて、様々な生理的応答をトリガーするシグナルを伝達する細胞表面受容体の大型且つ多様なファミリーである。シグナル伝達のための下流成分は、種々の細胞型間で共有されているため、多くのＲＴＫがＴ細胞中にシグナルを伝達するのに好適である（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．２０００．Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅｓ  Ｃｅｌｌ  １０３，２１１−２２５）。以下に挙げる例は、ＰＤＧＦ受容体に関する。これらの受容体は、例示的であり、他の受容体ペア、例えば、ＳＣＦ−Ｒとｃ−ｋｉｔ、並びに他のヘテロ二量体及びホモ二量体受容体を使用することもできる。
【０１５７】
ＲＴＫは、受容体がリガンドの結合に応答してシグナル伝達する様式に基づいてサブファミリーに分けられる。一例は、２つのＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ−アルファ（α）及びＰＤＧＦＲ−ベータ（β））、ＣＳＦ１Ｒ、ＫＩＴ、ＲＫ２及びＦＬＴ３を含むＰＤＧＦＲファミリーである（ＩＩＩ型ＲＴＫ）。これらの受容体は、リガンド（ＰＤＧＦファミリーのメンバーであるリガンド）の結合によって誘導される二量体化の際に、シグナルを伝達する。これらの受容体は、ホモ二量体（αα及びββ）として、及びヘテロ二量体（αβ）としてシグナルを伝達することができる（Ｗｕ  Ｅ，Ｐａｌｍｅｒ  Ｎ，Ｔｉａｎ  Ｚ，Ｍｏｓｅｍａｎ  ＡＰ，Ｇａｌｄｚｉｃｋｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＤＧＦ−ＰＤＧＦＲ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ＰＤＧＦＲ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３：ｅ３７９４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００３７９４）。ＰＤＧＦＲ及びいくつかの他のＴＹＰＥ  ＩＩＩ  ＲＴＫは、一部のＴ細胞腫瘍及び他の血液系腫瘍において調節異常を起こすが、これは、細胞傷害活性をトリガーすることなく、これらが増殖及び生存のシグナルを伝達する可能性を示す（Ｗａｄｌｅｉｇｈ  Ｍ，ＤｅＡｎｇｅｌｏ  ＤＪ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＪＤ，Ｓｔｏｎｅ  ＲＭ．２００５．Ａｆｔｅｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｏｔｈｅｒ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｂｌｏｏｄ．１０５，２２−３０；Ｂｌｏｏｄ．２０１０  Ｊａｎ  ７；１１５（１）：５１−６０；Ｙａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｌａｒｇｅ  ｇｒａｎｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｖｉａ  ａｎ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００９−０６−２２３７１９）。重要なことに、ＰＤＧＦＲの突然変異により、受容体を自律的様式で、すなわちリガンドの結合により誘導される二量体化とは独立にシグナル伝達させることができる。この自律的シグナル伝達は、タンパク質配列の突然変異によって引き起こされ、これは、ＰＤＧＦＲの膜貫通（ＴＭ）及び細胞質ドメインのみを必要とすることが明らかにされている。このように、ＰＤＧＦＲ受容体は、ＣＡＲ−Ｔシグナル伝達ドメインを設計する上で有用なＲＴＫの一例である。
【０１５８】
一部の実施形態では、ＰＤＧＦＲα並びに／又はＰＤＧＦＲβ受容体のＴＭ及び／若しくは細胞質ドメインは、シグナル伝達ドメインとして使用することができる。一実施形態では、ＰＤＧＦＲ、例えば、ＰＤＧＦＲβのＴＭ及び細胞質ドメインをコードするヌクレオチド配列とフレーム内でクローン化されたＣＤ１９（例えば、抗体ＦＭＣ６３から得られ得るものなど）に対するｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列で、Ｔ細胞をトランスフェクトするが、その際、成分間に好適なリンカー配列が挿入される。得られたＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗原結合ドメインとして抗ＣＤ１９ｓｃＦｖを発現し、細胞（例えば、正常Ｂ細胞又は悪性Ｂ細胞）上のＣＤ１９の認識は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化及び増殖を誘導して、細胞生存を支持するが、細胞傷害性は誘導しない。ＰＤＧＦＲβシグナル伝達のこれらの性質は、ＰＤＧＦＲβが調節異常となるＴ細胞腫瘍及び他の血液系腫瘍、例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及びＴ細胞白血病においてわかっている。抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）への抗原の結合は、ＰＤＧＦＲ二量体化を誘発する。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＰＤＧＦＲ二量体化を特異的に誘導する能力について評価され、且つ既知のシグナル伝達アッセイ及び機能性アッセイにより決定することができる。
【０１５９】
一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞活性化及び増殖の結果は、特定のプロモータ、例えば、本明細書に記載のプロモータ、例えば、ＣＤ６９プロモータ、ＣＤ２５プロモータ、ＴＮＦプロモータ、ＶＬＡ１プロモータ、ＬＦＡ１プロモータ、及び本明細書に記載されるその他多数（例えば、実施例９を参照）の刺激であり、これにより、本明細書に記載の誘導性発現構築物の発現が起こり得る。一部の実施形態では、抗原（例えば、ＣＤ１９）が第１抗原結合受容体（例えば、抗原結合ドメインとしての抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、並びにＰＤＧＦＲの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを含む）と結合すると、第２抗原結合受容体をコードする誘導性発現構築物が発現するように誘導される。この第２の誘導された抗原結合受容体は、目的の腫瘍抗原に結合することができ、本明細書に記載の標準ＣＡＲ−Ｔシグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８若しくはＣＤ３／４−１ＢＢ又はＣＤ３／ＣＤ２８／４−１ＢＢを含み得る。従って、こうした例示的なＣＡＲ−Ｔ細胞は、次の２つの活性を有する：まず、第１結合受容体（抗原結合ドメインとしての抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、並びにＰＤＧＦＲの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを含む）を介したシグナル伝達により誘導されるようなＴ細胞活性化、増殖及び生存であり；もう１つは、標準Ｔ細胞活性化、増殖、生存及び抗腫瘍細胞傷害活性であり、この場合、腫瘍細胞は、誘導された抗原結合受容体の標的によって同定される。
【０１６０】
別の実施形態では、ＰＤＧＦＲβＴＭ及び細胞質ドメインの代わりにＰＤＧＦＲαＴＭ及び細胞質ドメインが使用される。また別の実施形態では、ＰＤＧＦＲαＴＭ及び／又は細胞質ドメインと連結した抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、並びにＰＤＧＦＲβＴＭ及び／又は細胞質ドメインと連結した抗ＣＤ１９ｓｃＦｖをコードする核酸配列がＴ細胞に発現され、これにより、Ｔ細胞は、ＰＤＧＦＲα及びＰＤＧＦＲβＴＭ及び細胞質ドメインの両方から構成されるヘテロ二量体ＣＡＲ構築物を発現する。抗原（例えば、ＣＤ１９）に応答するＣＡＲ媒介性シグナル伝達及びＴ細胞機能の実証分析を用いて、ＰＤＧＦＲα及びＰＤＧＦＲβを代表する適切なＰＤＧＦＲ  ＴＭ及び細胞質ドメイン（例えば、抗原陽性細胞上にディスプレイされるような、抗原に応答してＴ細胞増殖及び生存を誘導するが、細胞傷害活性を誘導しないドメイン）を同定することができる。
【０１６１】
別の実施形態では、例えば、抗原陽性細胞上にディスプレイされるような、抗原に応答して細胞傷害活性を誘導せず、Ｔ細胞活性化、増殖及び生存を誘導するために、ＰＤＧＦＲα及び／又はＰＤＧＦＲβの細胞質ドメインを突然変異誘発させて、下流シグナル伝達の１つ若しくは複数の成分を増強又は低減する。突然変異誘発及び後の分析のための技術は、当業者に周知であり、容易に認識されるであろう。別の実施形態では、特定のプロモータ、例えば、本明細書に記載のプロモータ、例えば、ＣＤ６９プロモータ、ＣＤ２５プロモータ、及び／又は実施例９に記載されるプロモータの誘導を最適化するために、ＰＤＧＦＲα及び／又はＰＤＧＦＲβの細胞質ドメインを突然変異誘発して、下流シグナル伝達の１つ若しくは複数の成分を増強又は低減する。
【０１６２】
別の実施形態では、Ｔ細胞は、（ｉ）第１抗原結合受容体（例えば、抗原結合ドメインとしてのｓｃＦｖ、並びにＰＤＧＦＲの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを含む）を発現し、ここで、ｓｃＦｖは、腫瘍型上に発現された第１腫瘍抗原に向けられ、（ｉｉ）第１抗原結合受容体が第１腫瘍抗原と結合すると、Ｔ細胞は誘導されて、同じ腫瘍型に発現される第２腫瘍抗原に対するｓｃＦｖを含む第２抗原結合受容体を発現する。一部の実施形態では、第１抗原結合受容体は、Ｔ細胞活性化、増殖及び生存のシグナルを伝達するが、細胞傷害活性はシグナル伝達せず、誘導された抗原結合受容体（すなわち、第２抗原結合受容体）が細胞傷害性をトリガーする。いくつかのこうした実施形態では、Ｔ細胞は、「抗原ゲーティング（ａｎｔｉｇｅｎ−ｇａｔｉｎｇ）」を可能にし、これにより、ＣＡＲ  Ｔ細胞の拡大及び持続性を依然として促進しながら、両方の抗原が良好に遭遇したときにのみ細胞傷害性が誘導される。このような実施形態は、例えば、単一抗原のエンゲージメント（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）が正常細胞（すなわち、非悪性細胞）破壊及びオンターゲット毒性に対して不十分な治療濃度域をもたらす場合に有用となり得る。第１及び第２抗原結合受容体を向かわせることができるこのような「抗原ペア」の例として、限定されないが、ＣＤ５６及びＣＤ１３８、ＣＤ５６及びＢＣＭＡ、ＣＤ１３８及びＢＣＭＡ（多発性骨髄腫）、ＩＬ−３Ｒ（ＣＤ１２３）及びＣＤ３３、ＣＤ１２３及びＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ３３及びＣＬＥＣ１２Ａ（急性骨髄性白血病）、ＣＤ５６及びｃ−ＫＩＴ（例えば、小細胞肺癌）、ＣＥＡ及びＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ及びＰＳＭＡ、ＣＥＡ及びＰＳＣＡ（膵臓癌）、ＣＡ−ＩＸ及びＣＤ７０（腎細胞癌）、ＨＥＲ２及びＥＧＦＲ、Ｅｐｃａｍ及びｃ−ＭＥＴ、ＥＧＦＲ及びＩＧＦＲ（例えば、乳癌の場合）、ＭＵＣ１６及び葉酸受容体α、メソテリン及び葉酸受容体α（例えば、卵巣癌、中皮腫）、並びにその他多数がある。一部の実施形態では、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）、例えば、腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）又は骨髄系由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）又は腫瘍随伴線維芽細胞をターゲッティングすることを選択してもよい。関連ターゲッティング抗原ペアの例として、限定されないが、ＦＡＰ及びＣＤ４５、ＦＡＰ及びＣＳＦＲ１、並びにＣＤ４５及びＣＳＦＲ１が挙げられる。
【０１６３】
別の実施形態では、Ｔ細胞は、（ｉ）第１抗原結合受容体（例えば、抗原結合ドメインとしての二重特異性抗体（若しくは部分）、並びにＰＤＧＦＲの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを含む）を発現し、ここで、二重特異性抗体（若しくは部分）は、Ｂ細胞抗原（例えば、ＣＤ１９）及び目的の腫瘍に発現された腫瘍抗原に結合し、（ｉｉ）第１抗原結合受容体が第１腫瘍抗原と結合すると、Ｔ細胞は誘導されて、同じ腫瘍型に発現される第２腫瘍抗原に対するｓｃＦｖを含む第２抗原結合受容体を発現する。一部の実施形態では、第１抗原結合受容体は、拡大、持続性及び／又は細胞傷害性を促進するために、ＣＤ１９認識（拡大及び／又は持続性を促進するため）と「抗原ペア」認識との両方を使用する。「抗原ペア」の例として、限定されないが、ＣＤ５６及びＣＤ１３８、ＣＤ５６及びＢＣＭＡ、ＣＤ１３８及びＢＣＭＡ（多発性骨髄腫）、ＩＬ−３Ｒ（ＣＤ１２３）及びＣＤ３３（急性骨髄性白血病）、ＣＤ５６及びｃ−ＫＩＴ（例えば、小細胞肺癌）、ＣＥＡ及びＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ及びＰＳＭＡ、ＣＥＡ及びＰＳＣＡ（膵臓癌）、ＣＡ−ＩＸ及びＣＤ７０（腎細胞癌）、ＨＥＲ２及びＥＧＦＲ、Ｅｐｃａｍ及びｃ−ＭＥＴ、ＥＧＦＲ及びＩＧＦＲ（例えば、乳癌の場合）、ＭＵＣ１６及び葉酸受容体α、メソテリン及び葉酸受容体α（例えば、卵巣癌、中皮腫）、並びにその他多数がある。一部の実施形態では、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）、例えば、腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）又は骨髄系由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）又は腫瘍随伴線維芽細胞をターゲッティングすることを選択してもよい。関連ターゲッティング抗原ペアの例として、限定されないが、ＦＡＰ及びＣＤ４５、ＦＡＰ及びＣＳＦＲ１、並びにＣＤ４５及びＣＳＦＲ１が挙げられる。
【０１６４】
ＩＩＩ型ＲＴＫファミリーの他の受容体のドメイン、例えば、ＣＳＦ１Ｒ、ＫＩＴ、ＲＫ２及びＦＬＴ３を本明細書に記載の抗原結合受容体に含有させることができる。本開示は、ＩＩＩ型ＲＴＫファミリーに限定されず、他のＲＴＫファミリーのＴＭ及び細胞質ドメイン、並びに受容体、例えば、表皮増殖因子受容体ファミリー、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）ファミリー、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）ファミリー、ＲＥＴ受容体ファミリー、Ｅｐｈ受容体ファミリー、又はジスコイジン（Ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ）ドメイン受容体（ＤＤＲ）ファミリー、並びにＲＴＫファミリーＩ〜ＸＶＩＩ内の受容体及びファミリーを含むその他多数に容易に適用される。受容体シグナル伝達をトリガーするために異なるＲＴＫファミリー内で使用される異なる生理的手段を構成するように、本明細書に記載される構築物を修飾することができる。
【０１６５】
一部の実施形態では、膜貫通及び／又は細胞質ドメインは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の１つ又は複数の成分から得られる。シグナル伝達タンパク質のＪＡＫファミリーは、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＡＫ３及びＴＹＫ２から構成される。ＪＡＫタンパク質は、ＳＴＡＴタンパク質をリン酸化するために、ホモ二量体化及びヘテロ二量体化する。ＳＴＡＴタンパク質は、このようにシグナル伝達を拡大する。ＳＴＡＴファミリーは、ＳＴＡＴ１〜６からなる。ＳＴＡＴ５ｂと呼ばれるＳＴＡＴ５の調節形態も同定されている。特定の細胞表面受容体は、シグナル伝達の際に、ＪＡＫ及びＳＴＡＴのサブセットを使用することがわかっているが、ほぼ全てのＪＡＫ／ＳＴＡＴ組合せが可能であると考えられる。
【０１６６】
血液系腫瘍は、細胞増殖及び生存を支持することができる調節異常ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達カスケードのいくつかの例を提供する。骨髄細胞障害、真性多血症（ＰＶ）、本態性血小板血症（ＥＴ）及び原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）は、ＪＡＫ２シグナル伝達に突然変異を示し、これは、構成性ＳＴＡＴ３及び／又はＳＴＡＴ５活性化を引き起こし得る。突然変異は、偽キナーゼドメインに最も頻繁に出現し、ＪＡＫシグナル伝達及びその調節に影響を及ぼす。遺伝子型／表現型の関係は、複雑であり、単一の対立遺伝子型が、一般に、二重対立遺伝子型と異なる転帰を有するような遺伝子量効果を示す（例えば、ＰＶに対するＥＴの発生）。ＪＡＫ２とＪＡＫ１のいずれも、Ｔ細胞白血病におけるドライバー遺伝子突然変異として同定されており、多様なＴ細胞白血病及びリンパ腫にＳＴＡＴタンパク質の活性化が関与していた。ＪＡＫ３遺伝子の体細胞突然変異が急性リンパ芽球性及び急性骨髄性白血病、並びに多発性骨髄腫及び非ホジキンリンパ腫に認められる。ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を制御する多様な調節及び負のフィードバック経路における発癌性突然変異も記載されている。これらの事例は、悪性突然変異を受けた際の病原体活性化にもかかわらず、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路により駆動される増殖性Ｔ細胞活性化のエビデンスを提供する。
【０１６７】
多くの受容体がＪＡＫ／ＳＴＡＴ複合体を介してシグナル伝達することがわかっている。ＲＴＫの中でも、ＩＧＦ−Ｒ、ＦＧＦＲ／ＥｒｂＢ受容体、ＳＣＦＲ／ｃＫｉｔ、ＢＤＮＦ、ＥｐｈＡ４、ＶＥＧＦＲ／Ｆｌｔ−１及びＨＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔは、ＪＡＫ１及び／又は２並びにＳＴＡＴ１、３及び５の様々な組合せを優先的に使用する。ＲＴＫはまた、多くの他のシグナル伝達カスケードも誘導する。ホルモン受容体（ＧＨＲ、ＴｐｏＲ、ＥｐｏＲ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）−Ｒ）も、ＪＡＫ１及び／又は２（ホモ二量体及びヘテロ二量体）並びにＳＴＡＴ１、３及び５の様々な組合せを優先的に使用する。ＴｒｏＲはまた、ＪＡＫ２／ＴＹＫ２複合体を介してＴＹＫ２でもシグナル伝達することができる）。プロラクチン−受容体（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）経路により活性化される主要なシグナル伝達経路は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路である。リガンド（プロラクチン）は、結合して、受容体二量体化及びＪＡＫ２活性化を誘導する。ＪＡＫ２は、プロラクチン受容体と構成的に結合する。ＪＡＫ２は、受容体細胞質ドメインチロシン残基をリン酸化し、ＳＴＡＴタンパク質結合及びリン酸化を可能にする。リン酸化ＳＴＡＴ５は、受容体から解離し、二量体化し、核酸転位を経て、遺伝子プロモータ活性化をターゲティングする。プロラクチン受容体はまた、ＺＡＰ７０、Ｔｅｃ、ＰＴＫ２、Ｆｙｎ、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰＫを介してもシグナル伝達する。プロラクチン受容体は、リンパ球中で活性であり、この活性は、活性化中のリンパ球生存に関連している。
【０１６８】
共通β鎖及び共通γ鎖受容体ファミリーのサイトカイン受容体は、リガンド（すなわち、サイトカイン）の結合時にシグナルを伝達するために、特にＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を使用する。あらゆる場合において、リガンド結合及び受容体シグナル伝達は、特定のα鎖と共通（β又はγ）鎖との間にヘテロマー複合体の形成を必要とする。共通β鎖ファミリー（ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦ）内で、ＩＬ−５Ｒα／共通β鎖複合体は、ＪＡＫ１及び２並びにＳＴＡＴ３及び５を介してシグナル伝達するのに対し、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒα／共通β鎖複合体は、ＪＡＫ１及び２を利用して、ＳＴＡＴ１、３、５及び６を介してシグナル伝達する。共通γ鎖ファミリー（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１）内で、ＪＡＫ３は、典型的に、ＪＡＫ１及び／若しくは２並びに／又はＴＹＫ２と一緒にエンゲージされている。その結果、ＳＴＡＴシグナル伝達は変動する。関連サイトカインＴＳＬＰは、ＩＬ−７Ｒα／ＴＳＬＰ−Ｒ複合体を介してＪＡＫ１及び２、並びにＳＴＡＴ１、３及び５にシグナル伝達するため、限定的なＪＡＫ利用を示す。
【０１６９】
ＩＬ−６受容体ファミリー、ＩＬ−１０受容体ファミリー及びＩＬ−１２受容体ファミリーは全て、類似する特徴を有する。受容体は、多様に共有されるα鎖（例えば、ＩＬ−２０Ｒα）、β鎖（例えば、ＩＬ−１０Ｒβ）、λ鎖（例えば、ＩＦＮ−λ−Ｒ１）、又は受容体特異的鎖及びｇｐ１３０補助受容体から構成されるヘテロマー複合体を形成する。このモジュール性により、リガンド／受容体相互作用及びＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達にかなりの差異が生じる。これら３つのサイトカイン受容体ファミリー内の受容体複合体の全てがＪＡＫ１及びＪＡＫ２並びにＴＹＫ２、又はそれらのサブセットを利用し、ほとんどの場合、ＳＴＡＴ１、３及び５は、わずかに例外はあるが、ＪＡＫ活性のリン酸化標的である。ＴＹＫ２の利用は、往々にしてＳＴＡＴ４及び６などの別のＳＴＡＴタンパク質をエンゲージする。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介してシグナル伝達するＧタンパク質結合受容体（例えば、５−ＨＴ２Ａ、ＡＧＴＲ−１、様々なケモカイン受容体）内に非常に類似するパターンが認められる。
【０１７０】
ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒα／ｇｐ１３０）は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、及びＴＹＫ２を含むＪＡＫ複合体をエンゲージする。次に、これらがＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ５を介してシグナル伝達する。Ｔ細胞では、ＩＬ−６受容体シグナル伝達は、細胞増殖、生存、分化及びＴ調節細胞媒介性抑制からの保護を助ける。レプチン受容体は、主にＪＡＫ２並びにＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５を介してシグナル伝達して、増殖及び抗アポトーシスシグナル伝達の両方を誘導する。レプチン受容体は、Ｔ細胞に発現され、その細胞型において、これは、Ｔ調節活性の低下にも関連する。ＩＬ−１２受容体（ＩＬ−１２Ｒβ１／ＩＬ−１２β２）は、Ｔ細胞に発現され、これは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のＴｈ１表現型の確立に重要である。ＩＬ−１２受容体は、ＪＡＫ２及びＴＹＫ２を活性化する。具体的には、ＩＬ−１２ＲＢ１がＴＹＫ２と結合し、ＩＬ−１２ＲＢ２がＪＡＫ３と結合する。活性化すると、ＪＡＫ２は、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ４のチロシン残基をリン酸化し、これが次に核に転位して、ＩＦＮ−γプロモータに結合することによってＴｈ１活性及び分化を駆動する。
【０１７１】
一部の実施形態では、受容体と結合するＪＡＫ／ＳＴＡＴのＴＭ及び／又は細胞質ドメインは、本明細書に記載の抗原結合受容体に含まれる。一実施形態では、ＣＤ１９（例えば、抗体ＦＭＣ６３から得られ得るものなど）に対するｓｃＦｖは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ結合活性を有するホモ二量体化若しくはヘテロ二量体化受容体のＴＭ及び細胞質ドメインとフレーム内でクローン化され、その際、これらの成分間に好適なリンカー配列が挿入される。得られたＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖを発現し、細胞（例えば、正常Ｂ細胞又は悪性Ｂ細胞）上のＣＤ１９の認識は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化及び増殖を誘導して、細胞生存を支持するが、細胞傷害性は誘導しない。ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達のこれらの特性は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達が調節異常となったＴ細胞腫瘍をはじめとする血液系腫瘍に認められる。ｓｃＦｖへの抗原の結合は、受容体二量体化を誘導するのに十分なものとなる。関連する実施形態では、ｓｃＦｖは、シグナル伝達アッセイ及び機能性アッセイによりモニターされる通り、受容体二量体化を特異的に誘導するその能力について評価される。
【０１７２】
一実施形態では、ＴＭ及び／又は細胞質ドメインは、ＩＬ−１２受容体鎖（ＩＬ−１２Ｒ−β１／ＩＬ−１２β２）から得られる。別の実施形態では、ＴＭ及び／又は細胞質ドメインは、ＩＬ−６受容体α鎖から得られる。別の実施形態では、ＴＭ及び／又は細胞質ドメインは、レプチン受容体から得られる。別の実施形態では、ＴＭ及び／又は細胞質ドメインは、プロラクチン受容体から得られる。別の実施形態では、ＴＭ及び／又は細胞質ドメインは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路をエンゲージするＧタンパク質結合受容体（例えば、ＡＧＴＲ−１．５−ＨＴ２Ａ、ＰＡＲ、ＰＡＲ３、ＰＡＲ４、ブラジキニン（Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）−ＲＢ２、ＰＡＦＲ、αアドレナリン性受容体、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ１）から得られる。別の実施形態では、ＴＭ及び／又は細胞質ドメインは、ＩＬ−１２受容体ファミリー（例えば、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−２７Ｒ、しかし、ＩＬ−３５Ｒではない）から得られる。別の実施形態では、ＴＭ及び／又は細胞質ドメインは、ＩＬ−１０受容体ファミリーから得られる。別の実施形態では、ＴＭ及び／又は細胞質ドメインは、ＩＬ−６受容体ファミリー（ＩＬ−１１Ｒ、ＣＮＴＦＲ、ＬＩＦＲ、ＯＳＭＲ、ＧＣＳＦＲ、ＩＬ−３１Ｒ、ＣＴＮＦＲ）から得られる。別の実施形態では、ＴＭ及び／又は細胞質ドメインは、γ鎖受容体ファミリー（例えば、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−２１Ｒ及び関連受容体ＴＳＬＰＲ）から得られる。別の実施形態では、ＴＭ及び／又は細胞質ドメインは、β鎖受容体ファミリー、例えば（ＩＬ−３、ＩＬ−５Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲ）から得られる。別の実施形態では、ＴＭ及び／又は細胞質ドメインは、ホモ二量体受容体ファミリー（例えば、ＧＨＲ、ＴｐｏＲ、ＥｐｏＲ）から得られる。別の実施形態では、ＴＭ及び／又は細胞質ドメインは、ＲＴＫファミリー（例えば、インスリン−Ｒ、ＥＧＦＲ／ＥＲｂＢ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＳＣＦ−Ｒ／ｃ−Ｋｉｔ、Ｍ−ＣＳＦＲ、ＦＧＦ受容体１〜４、ＥｐｈＡ４、ＴｒｋＢ、Ｔｉｅ２、ＶＥＧＦ受容体、Ｍｅｒ、ＨＧＦＲ／ｃ−ＭＥＴ）から得られる。別の実施形態では、ＴＭ及び／又は細胞質ドメインは、Ｉ／ＩＩ型インターフェロン受容体から得られる。
【０１７３】
一部の受容体について、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路との相互作用をインタクトにしたまま、受容体複合体シグナル伝達の１つ又は複数のシグナル伝達成分を除去するのが望ましい場合もあることが理解される。こうした改変又は突然変異受容体鎖を作製する方法は、十分に理解されており、当業者は容易に入手し得ることが理解される。
【０１７４】
一部の実施形態では、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路をエンゲージする受容体のＴＭ及び／又は細胞質ドメインをシグナル伝達ドメインとして使用することができる。一実施形態では、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路をエンゲージする受容体のＴＭ及び細胞質ドメインをコードするヌクレオチド配列と一緒にフレーム内でクローン化されたＣＤ１９（例えば、抗体ＦＭＣ６３から得られ得るものなど）に対するｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列で、Ｔ細胞をトランスフェクトし、任意選択で、好適なリンカー配列が成分間に挿入される。得られたＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗原結合ドメインとして抗ＣＤ１９ｓｃＦｖを発現し、細胞（例えば、正常Ｂ細胞又は悪性Ｂ細胞）上でのＣＤ１９の認識は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化及び増殖を誘導して、細胞生存を支持するが、細胞傷害性は誘導しない。一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化及び増殖は、特定のプロモータ、例えば、ＣＤ６９プロモータ、ＣＤ２５プロモータ、ＴＮＦプロモータ、ＶＬＡ１プロモータ、ＬＦＡ１プロモータ、及び本明細書に記載のその他多数（例えば、実施例９を参照）の刺激であり、本明細書に記載の誘導性発現構築物の発現をもたらすことができる。一部の実施形態では、抗原（例えば、ＣＤ１９）が第１抗原結合受容体（例えば、抗原結合ドメインとしての抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、並びにＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路をエンゲージする受容体の膜貫通及び／又は細胞質ドメインを含む）と結合すると、第２腫瘍抗原をコードする誘導性発現構築物が誘導されて、発現する。この第２の誘導された抗原結合受容体は、目的の腫瘍抗原に結合することができ、本明細書に記載の標準ＣＡＲ−Ｔシグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８又はＣＤ３／４−１ＢＢ又はＣＤ３／ＣＤ２８／４−１ＢＢを含み得る。従って、こうした例示的なＣＡＲ−Ｔ細胞は、次の２つの活性を有する：まず、第１抗原結合受容体（抗原結合ドメインとしての抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、並びにＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路をエンゲージする受容体の膜貫通及び／又は細胞質ドメインを含む）を介したシグナル伝達により誘導されるようなＴ細胞活性化、増殖及び生存であり；もう１つは、標準Ｔ細胞活性化、増殖、生存及び抗腫瘍細胞傷害活性であり、この場合、腫瘍細胞は、誘導された抗原結合受容体の標的によって同定される。
【０１７５】
別の実施形態では、両方の受容体鎖（例えば、α／β、γ／γ、α／α、α／λ、共通β、共通γ、ｇｐ１３０、並びに列記したファミリー内の特定の受容体のクラス）のＴＭ及び／又は細胞質ドメインが使用される。例えば、異なる受容体鎖のこうしたＴＭ及び／又は細胞質ドメインに連結した抗ＣＤ１９ｓｃＦｖをコードする核酸配列がＴ細胞に発現され、これにより、Ｔ細胞は、両受容体鎖のＴＭ及び細胞質ドメインからなるヘテロ二量体ＣＡＲ構築物を発現する。抗原（例えば、ＣＤ１９）に応答するＣＡＲ媒介性シグナル伝達及びＴ細胞機能の実証分析を用いて、様々な受容体鎖（例えば、異なる共有βパートナー、又は異なるｇｐ１３０パートナーの）を代表する適切な受容体ＴＭ及び細胞質ドメイン（例えば、抗原陽性細胞上にディスプレイされるような、抗原に応答してＴ細胞増殖及び／若しくは生存を誘導するが、細胞傷害活性を誘導しないドメイン）を同定することができる。
【０１７６】
別の実施形態では、例えば、抗原陽性細胞上にディスプレイされるような、抗原に応答して細胞傷害活性を誘導せず、Ｔ細胞活性化、増殖及び／若しくは生存を誘導するために、特定の受容体又は特定クラスの受容体鎖の細胞質ドメインを突然変異誘発させて、下流シグナル伝達の１つ若しくは複数の成分を増強又は低減する。突然変異誘発及びその後の分析のための技術は、当業者に周知であり、容易に明らかである。別の実施形態では、特定のプロモータ、例えば、ＣＤ６９プロモータ、ＣＤ２５プロモータなど、並びに／又は実施例９に記載されるプロモータの誘導をさらに最適化するために、特定の受容体又は特定クラスの受容体鎖の細胞質ドメインを突然変異誘発させて、下流シグナル伝達の１つ若しくは複数の成分を増強又は低減する。
【０１７７】
別の実施形態では、Ｔ細胞は、（ｉ）第１抗原結合受容体（例えば、抗原結合ドメインとしてのｓｃＦｖ、並びにＪＡＫ／ＳＴＡＴをエンゲージする受容体の膜貫通及び／又は細胞質ドメインを含む）を発現し、ここで、ｓｃＦｖは、腫瘍型に発現された第１腫瘍抗原に向けられ、（ｉｉ）第１抗原結合受容体が第１腫瘍抗原と結合すると、Ｔ細胞は誘導されて、同じ腫瘍型に発現される第２腫瘍抗原に対するｓｃＦｖを含む第２抗原結合受容体を発現する。一部の実施形態では、第１抗原結合受容体は、Ｔ細胞活性化、増殖及び／又は生存のシグナルを伝達するが、細胞傷害活性はシグナル伝達せず、誘導された抗原結合受容体（すなわち、第２抗原結合受容体）が細胞傷害性をトリガーする。いくつかのこのような実施形態では、本明細書に記載されるように、Ｔ細胞は、「抗原ゲーティング」を可能にする。これは、単一抗原のエンゲージメントが正常細胞（すなわち、非悪性細胞）破壊及びオンターゲット毒性に対して不十分な治療濃度域をもたらす場合に有用となる。このような「抗原ペア」の例として、限定されないが、ＣＤ５６及びＣＤ１３８、ＣＤ５６及びＢＣＭＡ、ＣＤ１３８及びＢＣＭＡ（多発性骨髄腫）、ＩＬ−３Ｒ（ＣＤ１２３）及びＣＤ３３、ＣＤ１２３及びＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ３３及びＣＬＥＣ１２Ａ（急性骨髄性白血病）、ＣＤ５６及びｃ−ＫＩＴ（例えば、小細胞肺癌）、ＣＥＡ及びＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ及びＰＳＭＡ、ＣＥＡ及びＰＳＣＡ（膵臓癌）、ＣＡ−ＩＸ及びＣＤ７０（腎細胞癌）、ＨＥＲ２及びＥＧＦＲ、Ｅｐｃａｍ及びｃ−ＭＥＴ、ＥＧＦＲ及びＩＧＦＲ（例えば、乳癌の場合）、ＭＵＣ１６及び葉酸受容体α、メソテリン及び葉酸受容体α（例えば、卵巣癌、中皮腫）、並びにその他多数がある。一部の実施形態では、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）、例えば、腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）又は骨髄系由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）又は腫瘍随伴線維芽細胞をターゲッティングすることを選択してもよい。関連ターゲッティング抗原ペアの例として、限定されないが、ＦＡＰとＣＤ４５、ＦＡＰとＣＳＦＲ１、及びＣＤ４５とＣＳＦＲ１が挙げられる。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ構築物のＣＡＲ−ｓｃＦｖ−受容体と抗原標的が重複する場合（例えば、ＥＲｂＢ／ＥＧＦＲ受容体）に、ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖのエピトープの選択が、ＣＡＲ−Ｔ細胞の認識と異なるいくつかの標的抗原の認識の達成のために重要となり得ることは理解されたい。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ構築物のＣＡＲ−ｓｃＦｖ−受容体中の細胞外残基の使用は、設計によって制限し得ることから、これは容易に達成される。
【０１７８】
別の実施形態では、Ｔ細胞は、（ｉ）第１抗原結合受容体（例えば、抗原結合ドメインとしての二重特異性抗体（若しくは部分）、並びにＪＡＫ／ＳＴＡＴをエンゲージする受容体の膜貫通及び／又は細胞質ドメインを含む）を発現し、ここで、二重特異性抗体（若しくは部分）は、Ｂ細胞抗原（例えば、ＣＤ１９）及び目的の腫瘍に発現された腫瘍抗原に結合し、（ｉｉ）第１抗原結合受容体が第１腫瘍抗原と結合すると、Ｔ細胞は誘導されて、同じ腫瘍型に発現される第２腫瘍抗原に対するｓｃＦｖを含む第２抗原結合受容体を発現する。一部の実施形態では、第１抗原結合受容体は、拡大及び／又は持続性並びに細胞傷害性を促進するために、ＣＤ１９認識（拡大及び／又は持続性を促進するため）と「抗原ペア」認識との両方を利用する。「抗原ペア」の例として、限定されないが、ＣＤ５６及びＣＤ１３８、ＣＤ５６及びＢＣＭＡ、ＣＤ１３８及びＢＣＭＡ（多発性骨髄腫）、ＩＬ−３Ｒ（ＣＤ１２３）及びＣＤ３３、ＣＤ１２３及びＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ３３及びＣＬＥＣ１２Ａ（急性骨髄性白血病）、ＣＤ５６及びｃ−ＫＩＴ（例えば、小細胞肺癌）、ＣＥＡ及びＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ及びＰＳＭＡ、ＣＥＡ及びＰＳＣＡ（膵臓癌）、ＣＡ−ＩＸ及びＣＤ７０（腎細胞癌）、ＨＥＲ２及びＥＧＦＲ、Ｅｐｃａｍ及びｃ−ＭＥＴ、ＥＧＦＲ及びＩＧＦＲ（例えば、乳癌の場合）、ＭＵＣ１６及び葉酸受容体α、メソテリン及び葉酸受容体α（例えば、卵巣癌、中皮腫）、並びにその他多数がある。一部の実施形態では、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）、例えば、腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）又は骨髄系由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）又は腫瘍随伴線維芽細胞をターゲッティングすることを選択してもよい。関連ターゲッティング抗原ペアの例として、限定されないが、ＦＡＰ及びＣＤ４５、ＦＡＰ及びＣＳＦＲ１、並びにＣＤ４５及びＣＳＦＲ１が挙げられる。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ構築物のＣＡＲ−ｓｃＦｖ−受容体と抗原標的とが重複する場合（例えば、ＥＲｂＢ／ＥＧＦＲ受容体）に、ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖのエピトープの選択が、ＣＡＲ−Ｔ細胞の認識と異なるいくつかの標的抗原の認識の達成のために重要となり得ることは理解されたい。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ構築物のＣＡＲ−ｓｃＦｖ−受容体中の細胞外残基の使用は、設計によって制限し得ることから、これは容易に達成される。
【０１７９】
誘導性発現構築物
一部の実施形態では、本明細書で使用される「誘導性発現構築物」は、目的のヌクレオチド配列、例えば、本明細書に記載の遺伝子に作動可能に連結した少なくとも１つのプロモータを含む核酸配列であるか、それを含み得る。誘導性発現構築物は、転写開始及び翻訳開始並びに終結コドンなどの調節配列を含み得る。一部の実施形態では、こうした調節配列は、必要に応じて、誘導性発現構築物を導入しようとする細胞型に特異的である。一部の実施形態では、こうした調節配列は、本明細書に記載のシグナル伝達ドメインによって誘導されるシグナル伝達経路に特異的である。
【０１８０】
誘導性発現構築物は、目的の遺伝子をコードする核酸に作動可能に連結したネイティブ若しくは非ネイティブプロモータを含み得る。好ましくは、プロモータは、免疫細胞において機能性である。ヌクレオチド配列とプロモータの作動可能な連結は、当業者の技術の範囲内である。プロモータは、非ウイルスプロモータ又はウイルスプロモータ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＲＳＶプロモータ、又はマウス幹細胞ウイルスの長い末端反復に見出されるプロモータであってよい。一部の実施形態では、プロモータは、例として、ＮＦＡＴ、ＮＦκＢ、ＡＰ−１又は他の認識配列を含む。
【０１８１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の誘導性発現構築物に含まれるプロモータは、ＩＬ−２プロモータ、細胞表面タンパク質プロモータ（例えば、ＣＤ６９プロモータ）、サイトカインプロモータ（例えば、ＴＮＦプロモータ）、細胞活性化プロモータ（例えば、ＣＴＬＡ４、ＯＸ４０、ＣＤ４０Ｌ）、又は細胞表面接着タンパク質プロモータ（例えば、ＶＬＡ−１プロモータ）である。例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的、発生特異的、特定の活性化動態（例えば、早期及び／若しくは後期活性化）を有する、並びに／又は誘導された遺伝子の特定の発現動態（例えば、短い、若しくは長い発現）有するプロモータの選択は、当業者の技術の範囲内である。一部の実施形態では、プロモータは、数日で測定される高速で、持続的な発現を媒介する（例えば、ＣＤ６９）。一部の実施形態では、プロモータは、遅延された発現、後期誘導性発現（例えば、ＶＬＡ１）を媒介する。一部の実施形態では、プロモータは、高速で、一過性の発現を媒介する（例えば、ＴＮＦ、即初期応答遺伝子及びその他多数）。
【０１８２】
抗原結合受容体が抗原に結合すると、例えば、既知の経路を用いて、本明細書に記載される抗原結合受容体のシグナル伝達ドメインから誘導性発現構築物へとシグナルが伝達され得る（例えば、Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：２３００−２３０７（１９９９）；Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５４６３−７３（１９９７）；Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ  ２７０：６５７７−６５８３（１９９５）；Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：３８３１−４０（２００７））；Ｔｓｙｔｓｙｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３７６３−７０（１９９６）；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８：２０１−１０  （２００７）を参照）。従って、抗原と結合すると、抗原結合受容体は、シグナル伝達経路を活性化し、これが発現の誘導をもたらす（例えば、転写因子と本明細書に記載のプロモータとの結合によって）。
【０１８３】
発現構築物のための遺伝子
あらゆる遺伝子を本明細書に記載の発現構築物（例えば、構成性発現構築物又は誘導性発現構築物）に含有させることができ、本開示は、特定の遺伝子に限定されない。発現構築物に含有させることができる例示的な非限定的遺伝子のタイプとして、例えば、以下：ポリペプチド（例えば、ポリペプチド抗原及び／又は治療用ペプチド）、抗体（例えば、抗体の抗原結合断片及び／又は抗体若しくは抗原結合断片を含む融合タンパク質）、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、毒素、腫瘍微小環境をターゲティングする物質、並びに免疫細胞成長／増殖を支持する物質をコードする遺伝子が挙げられる。一部の実施形態では、発現構築物に含まれる遺伝子配列は、転写され、次いで翻訳される。他の事例では、転写された治療薬は、限定しないが、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は調節ＲＮＡの他のクラスについてわかっているように、遺伝子としての有用性を有する。
【０１８４】
１．発現されたポリペプチド
一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞治療薬は、ポリペプチド抗原（又はその断片、例えば、エピトープを含む断片）をコードする発現構築物（例えば、構成性発現構築物又は誘導性発現構築物）を含むことができる。一部の実施形態では、発現構築物は、腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を含む。腫瘍抗原は、当技術分野で公知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン−反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１α、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、及びメソテリンが挙げられる。
【０１８５】
一部の実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つ若しくは複数の癌エピトープであるか、又はそれを含む。そうしたエピトープを含む悪性腫瘍抗原として、例えば、黒色腫のＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ及びＧＰ１００などの組織特異的抗原、並びに前立腺癌の前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺癌抗原（ＰＳＡ）などがある。他の腫瘍抗原は、癌遺伝子ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２などの形質転換関連分子の群に属する。また別の腫瘍抗原群は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの癌胎児抗原である。Ｂ細胞リンパ腫の場合、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に固有の腫瘍特異的免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫の他の腫瘍抗原である。これらの抗原のいくつか（例えば、ＣＥＡ、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイプ）は、モノクローナル抗体を用いた受動的免疫療法の標的として使用されているが、成果は限定的である。
【０１８６】
本明細書に記載される腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗体（ＴＳＡ）又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であってよい。ＴＳＡは、腫瘍細胞に固有であり（又は固有であると考えられ）、身体の他の細胞には存在しない（例えば、他の細胞に有意な程度まで存在しない）。ＴＡＡは、腫瘍に固有ではなく、正常細胞にも発現される（例えば、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導できない条件下で発現される）。例えば、ＴＡＡは、免疫系が未成熟で、応答することができない胎児発生中に、正常細胞に発現される抗原であるか、又は通常は、正常細胞には極めて低いレベルで存在するが、腫瘍細胞にはより高いレベルで発現される抗原であり得る。
【０１８７】
ＴＳＡ又はＴＡＡ抗原の非限定的な例としては、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−１）などの分化抗原、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２並びにＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５などの腫瘍特異的多系統抗原；ＣＥＡなどの過剰発現胎児抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕなどの過剰発現癌遺伝子及び突然変異腫瘍抑制遺伝子；ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲなどの染色体転座により生じたユニークな腫瘍抗原；並びにエプスタイン・バール・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）抗原ＥＢＶＡ及びヒトパピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７などのウイルス抗原が挙げられる。他の抗原としては、以下のものが挙げられる：ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｅｒｂＢ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、βカテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、αフェトプロテイン、βＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、ＦＲα、ＶＥＧＦＲ２、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ｙ、ＦＡＰ、ＥｐｈＡ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＥＧＦＲ、ＣＡ６、ＣＡ９、ＧＰＮＭＢ、ＥＧＰ１、ＦＯＬＲ１、内皮受容体、ＳＴＥＡＰ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ネクチン−４、ＡＧＳ−１６、グアナリルシクラーゼＣ、ＭＵＣ−１、ＣＦＣ１Ｂ、インテグリンα３鎖（ａ３ｂ１、ラミニン受容体鎖）、及びＴＰＳ。
【０１８８】
一部の実施形態では、腫瘍抗原は、以下：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７２、ＣＤ１８０、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３７、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１６６、ＣＤ７１、ＣＬＬ−１／ＣＬＥＣＫ１２Ａ、ＲＯＲ１、グリピカン（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）３（ＧＰＣ３）、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、グリコリピド（Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ）Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＭＹ−ＥＳＯ−１、又はＭＡＧＥ  Ａ３である。別の腫瘍抗原は、例えば、腫瘍ゲノム及びエキソームの配列決定、及び／又は腫瘍プロテオームの高感度質量分析によって同定することができ、そのいずれも本明細書に記載の方法で使用することができる。
【０１８９】
一部の実施形態では、腫瘍抗原は、例えば、全ての細胞に存在する、一般的な又は「ハウスキーピング」膜タンパク質である。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍幹細胞マーカである。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、ネオアンチゲン（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）（すなわち、例えば、異常増殖のために、腫瘍自体の中に発生する抗原）である。
【０１９０】
一部の実施形態では、発現ポリペプチドは、融合タンパク質、例えば、ポリペプチド抗原と、本明細書に記載の抗体又は抗体断片を含む融合タンパク質の一部として含有させる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、別のタンパク質のアミノ（Ｎ）末端に融合したポリペプチド抗原、例えば、抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に記載の抗体若しくは抗体断片、又は本明細書に記載のスカフォールドタンパク質（例えば、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）様ドメイン、アンキリン反復ドメイン、リポクライン、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン、ＣＤ１９変異体タンパク質、又は本明細書に記載のＢ細胞特異的マーカ変異体））のアミノ（Ｎ）末端に融合したポリペプチド抗原であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、抗体、又はその断片の軽鎖のアミノ末端に融合したポリペプチド抗原であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、抗体、又はその部分の重鎖のアミノ末端に融合したポリペプチド抗原であるか、又はそれを含む。
【０１９１】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、別のタンパク質のカルボキシル（Ｃ）末端に融合したポリペプチド抗原、例えば、抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に記載の抗体若しくは抗体断片、又は本明細書に記載のスカフォールドタンパク質（例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン、ＣＤ１９変異体タンパク質、又は本明細書に記載のＢ細胞特異的マーカ変異体））のカルボキシル（Ｃ）末端に融合したポリペプチド抗原であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、抗体、又はその断片の軽鎖のカルボキシル末端に融合したポリペプチド抗原であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質は、抗体、又はその部分の重鎖のカルボキシル末端に融合したポリペプチド抗原であるか、又はそれを含む。
【０１９２】
一部の実施形態では、発現ポリペプチド抗原（若しくはその断片）は、細胞治療薬の表面に発現される、及び／又は細胞治療薬によって分泌される、及び／又は腫瘍細胞の表面に結合する。任意のポリペプチドを本明細書に記載の発現構築物から発現させることができるが、特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質（例えば、抗体（例えば、二重特異性抗体若しくは多重特異性抗体若しくはその断片）、抗体融合タンパク質又は抗体−薬物複合体）の標的である（例えば、それと結合する）ポリペプチドが選択される。一部の実施形態では、抗体又は抗体融合タンパク質は、例えば、公知の治療用抗体（例えば、ＡＤＣＣ若しくはＣＤＣを呈示する）、治療用融合タンパク質、又は治療用抗体−薬物複合体であってよい。
【０１９３】
一部の実施形態では、１つ若しくは複数の抗体又は抗体−薬物複合体に結合するポリペプチド抗原をコードする核酸を本明細書に記載の発現構築物に含有させることができる。有用な抗腫瘍抗体を記載する様々な論評記事が公開されている（例えば、Ａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．２６：４４７−８１（２０１２）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｈｅｒ．７：１７８−８４（２０１３）；Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ．１２：１４（２０１２）；及びＳｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１：１１９２−１１９８（２０１３）を参照）。表１は、既知の入手可能な抗体剤によってターゲティングされるいくつかのヒトポリペプチド抗原の非包括的なリストを示し、抗体剤が有用であると提唱されているいくつかの癌適用を記載する。
【表１−１】
2019503200.tif 000003
【表１−２】
2019503200.tif 000004
【表１−３】
2019503200.tif 000005
【０１９４】
一部の実施形態では、１つ又は複数のこうしたポリペプチド抗原をコードする発現構築物（例えば、構成性発現構築物又は誘導性発現構築物）を含む細胞治療薬が１つ又は複数のこれらの（若しくは他の）公知の抗体と組み合わせて対象に投与される。
【０１９５】
抗体−薬物複合体は公知であり、例えば、ブレンツキシバブベドチン（ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）；アド−トラスツズマブエムタンシン（ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）；ゲムツズマブオゾガミシン（Ｗｙｅｔｈ）；ＣＭＣ−５４４；ＳＡＲ３４１９；ＣＤＸ−０１１；ＰＳＭＡ−ＡＤＣ；ＢＴ−０６２；及びＩＭＧＮ９０１が挙げられる（例えば、Ｓａｓｓｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０４５：１−２７（２０１３）；Ｂｏｕｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２４：５３５７−５３６３（２０１４）を参照）。一部の実施形態では、１つ又は複数のこうした公知の抗体−薬物複合体に結合するポリペプチド抗原をコードする核酸を本明細書に記載の発現構築物に含有させることができる。一部のこうした実施形態では、１つ又は複数のこうしたポリペプチド抗原をコードする発現構築物を含む細胞治療薬が１つ又は複数のこれらの（若しくは他の）公知の抗体−薬物複合体と組み合わせて対象に投与される。
【０１９６】
一部の実施形態では、発現ポリペプチドは、融合タンパク質の一部として含有される。例えば、発現構築物は、本明細書に記載の腫瘍抗原などの腫瘍抗原をターゲティングする（例えば、それに結合する）本明細書に記載の発現ポリペプチド（例えば、抗体のポリペプチド標的、抗体融合タンパク質、及び／若しくは抗体薬物複合体）並びに第２ポリペプチド（例えば、本明細書に記載のスカフォールドタンパク質（例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン、ＣＤ１９変異体タンパク質、若しくは本明細書に記載のＢ細胞特異的マーカ変異体）、抗体又はその断片、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、ＣＤＲ領域、カメロイド（ｃａｍｅｌｏｉｄ）抗体、マスクされた抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｙ（登録商標））、単鎖若しくはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）、単一ドメイン抗体（例えば、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標））、アンキリン反復タンパク質若しくはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒ（登録商標）、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）、又はＣｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標））を含む融合タンパク質をコードすることができる。
【０１９７】
１つの例示的な細胞治療薬を図９に示す。図９に示すように、例示的な細胞治療薬は、抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン）とシグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のシグナル伝達ドメイン）とを含む、抗原結合受容体を含有する。細胞治療薬は、ｓｃＦｖ−ＣＤ３０融合タンパク質をコードする誘導性発現構築物（例えば、本明細書に記載の誘導性発現構築物）も含有する。抗原結合ドメインが腫瘍細胞上の抗原に結合する（例えば、対象への投与後）と、シグナル伝達ドメインは、ｓｃＦｖ−ＣＤ３０融合タンパク質の発現を誘導する。融合タンパク質のｓｃＦｖ部分は、腫瘍細胞上の第２抗原に結合して、ＣＤ３０（すなわち、ｓｃＦｖ融合パートナー）を腫瘍細胞に局在化させる。この例示的な実施形態では、続いて、ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシバブベドチン；Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を投与して、ＣＤ３０をターゲティングする。ｓｃＦｖ−ＣＤ３０融合タンパク質（腫瘍細胞に結合している）のＣＤ３０に結合すると、ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）は、増殖腫瘍細胞の殺傷を引き起こす。
【０１９８】
別の実施形態では、細胞治療薬は、その表面にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、これは、抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン）とシグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のシグナル伝達ドメイン）とを含む。細胞治療薬は、ＣＤ３０をコードする誘導性発現構築物（例えば、本明細書に記載の誘導性発現構築物）も含む。抗原結合ドメインが腫瘍細胞上の抗原に結合する（例えば、対象への投与後）と、シグナル伝達ドメインは、その表面上にＣＤ３０の発現を誘導する。この例示的な実施形態では、細胞治療薬上のＣＤ３０をターゲティングするためにＡＤＣＥＴＲＩＳが使用され（例えば、対象への投与後）、これは、細胞治療薬の表面上のＣＤ３０に結合すると、増殖腫瘍細胞の局所的殺傷を引き起こす。
【０１９９】
これらは、少数の例示的な細胞治療薬であり、本開示を限定するものではない。例えば、表１に列記した抗原のいずれも、単独で、又は融合タンパク質（例えば、腫瘍抗原をターゲティングするポリペプチドを含む融合タンパク質）の一部として、発現構築物によってコードされ得る。こうした細胞治療薬のいずれも単独で、又は表１に列記した対応する抗体若しくは抗体薬物複合体と組み合わせて使用することができる。
【０２００】
一部の実施形態では、発現構築物（例えば、構成性発現構築物又は誘導性発現構築物）は、１つ若しくは複数の放射性抗体（例えば、放射線療法（ＲＩＴ）で使用される放射性抗体）の標的である（例えば、それと結合する）ポリペプチドと、本明細書に記載の腫瘍抗原などの腫瘍抗原をターゲティングする（例えば、それに結合する）第２ポリペプチド（例えば、本明細書に記載のスカフォールドタンパク質（例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン、ＣＤ１９変異体タンパク質、若しくは本明細書に記載のＢ細胞特異的マーカ変異体）、抗体又はその断片、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、若しくはＣＤＲ領域）とを含む融合タンパク質をコードすることができる。放射性抗体は、公知である（例えば、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ）、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ａｃｔｉｍａｂ−Ａ（アクチニウム−２２５に結合した抗−ＣＤ３３抗体リンツズマブ；Ａｃｔｉｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、及びβ放射体を含むモノクローナル抗体、例えば、Ｌｕ１７７（例えば、Ｎｏｒｄｉｃ  Ｎａｎｏ）。さらに、本明細書に記載される任意の抗体を、例えば、β放射体、オージェ（Ａｕｇｅｒ）放射体、転換電子放射体、α放射体、及び低光子エネルギー放射体をはじめとする放射性同位体に直接又は間接的に連結することができる。例示的な放射性同位体として、９０Ｙ、３２Ｐ、１８６Ｒｅ／１８８Ｒｅ；１６６Ｈｏ、７６Ａｓ／７７Ａｓ、８９Ｓｒ、１５３Ｓｍなどの長飛程β放射体；１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、１６１Ｔｂ、１０５Ｒｈなどの中飛程β放射体；４５Ｃａ又は３５Ｓなどの低飛程β放射体；５１Ｃｒ、６７Ｇａ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１１４ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、２０１Ｔｌなどの転換若しくはオージェ（Ａｕｇｅｒ）放射体；並びに２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ａｃ、２２５Ａｃ、２１２Ｐｂ、２５５Ｆｍ、２２３Ｒａ、１４９Ｔｂ及び２２１Ａｔなどのα放射体を挙げることができる。好適なリンカーは、当技術分野で公知であり、例えば、補欠分子族、非フェノールリンカー（Ｎ−スクシミジル−ベンゾエートの誘導体；ドデカボラート）、大環状及び非環状キレート剤両方のキレート部分、例えば、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−トリ酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体及び１，４，８，１１−テトラアザシクロドデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体並びに他のキレート部分が挙げられる。こうした抗体の放射性標識は、当技術分野において公知である（例えば、Ｂａｒｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９０７：６８１−９７（２０１４）；Ｓｔｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７：６４０６（２０１１）；Ｇｏ���ｄｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４３：６９３−７１３（２００２）を参照）。
【０２０１】
一部の実施形態では、発現構築物（例えば、構成性発現構築物又は誘導性発現構築物）は、１つ若しくは複数の別の細胞治療薬、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞の標的であるポリペプチド抗原をコードする遺伝子を含む。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、当技術分野では公知であり、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１７１、ＣＤ１３３、ＥｐｈＡ２、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲ突然変異体（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＥＡ、ＧＰＣ３、ＨＥＲ２、ＧＤ２、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＡ１９−９、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、及びＢＣＭＡなどをターゲティングするＣＡＲ−Ｔ細胞が挙げられる（例えば、Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；Ｂｅｌｌｉｃｕｍ；Ｋｉｔｅ  Ｐｈａｒｍａ；Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ；Ｈｉｌｌｅｒｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２９：７５−８９（２０１５）；Ｍａｇｅｅ  ｅ  ｔａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．１８：２６５−７１（２０１４）；Ｋａｋａｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．２０：１５１−１５５（２０１４）を参照）。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、一般に、特定タイプのＣＡＲ−Ｔ細胞により認識される特定の抗原を発現する細胞のみを殺傷する。ＣＡＲ−Ｔ細胞の使用について知られる１つの問題は、腫瘍不均一性に関するものである。例えば、固形腫瘍は、不均一な抗原分布を特徴とする。一部の実施形態では、本開示の方法及び組成物は、特定のＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識することができる腫瘍の数及び／又はタイプを増加する。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載される発現構築物は、１つ又は複数の既知ＣＡＲ−Ｔ細胞の標的抗原を発現する。いくつかのこうした実施形態では、標的抗原の発現後、こうした標的抗原は、細胞治療薬から分泌され、腫瘍細胞上又はその近傍に結合することができる。続いて、標的抗原をターゲティングするＣＡＲ−Ｔ細胞で処理すると、こうしたＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍細胞上又はその近傍で発現された標的抗原に結合する。このように、いくつかのこうした方法により、特定のＣＡＲ−Ｔ細胞を使用して、これが、そうでなければターゲティングしない腫瘍細胞（すなわち、関連標的抗原を発現しない腫瘍細胞）をターゲティングさせることができる。
【０２０２】
一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞治療薬は、１つ若しくは複数１つ若しくは複数の別の細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ−Ｔ）のポリペプチド標的（例えば、ＣＡＲ標的）をコードする発現構築物（例えば、構成性発現構築物又は誘導性発現構築物）を含むことができる。特定の理論に拘束されることは望まないが、このような発現されたポリペプチド標的（例えば、ＣＡＲ標的）がターゲティング及び／若しくは殺傷の上での利点を提供し、且つ／又はＴＩＬ及び／若しくはＴＣＲ  Ｔ細胞に対して増殖及び／又は生存の上で利点を提供し得る（例えば、メモリーＴ細胞サブセット及び／若しくは長寿命ＮＫ細胞サブセットの分化をもたらす）。別の細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）が入手可能で、且つ／又はこうしたポリペプチド標的を認識してそれに結合するように操作することができれば、本明細書に記載される発現構築物によって発現させようとするポリペプチド抗原は、いずれか特定のポリペプチド又はその部分に限定されない。一部の実施形態では、ポリペプチド標的は、腫瘍関連抗原ではないポリペプチドである。一部の実施形態では、標的は、本明細書に記載の腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、グリピカン（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）３（ＧＰＣ３）、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、グリコリピド（Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ）Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、又はＭＡＧＥ  Ａ３である。一部の実施形態では、こうしたポリペプチド標的は、単独で、又は融合タンパク質（例えば、本明細書に記載の腫瘍抗原をターゲティングするポリペプチドを含む融合タンパク質）の一部としてのいずれかで、発現構築物によりコードされ得る。任意のこうした細胞治療薬を単独で、又は対応する別の細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）と組み合わせて使用することができる。
【０２０３】
一部の実施形態では、発現構築物は、治療用ペプチドをコードする。例えば、治療用ペプチドは、ＴＧＦβとＴＧＦβ受容体との相互作用を遮断することができ、且つ／又はＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断することができる。別の治療用ペプチドは当技術分野で公知である。
【０２０４】
一部の実施形態では、発現構築物は、ＴＬＲアゴニスト、ＮＫリガンド、及び／又はＮＫＴリガンドをコードする。
【０２０５】
一部の実施形態では、発現されたポリペプチドは、例えば、細胞治療薬からのポリペプチドの分泌をもたらすために、シグナル配列を含む。シグナル配列及びその使用は、当技術分野で公知である。
【０２０６】
一部の実施形態では、構成性発現構築物は、本明細書に記載の１つ又は複数のポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、含有される発現構築物は、本明細書に記載の１つ又は複数のポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、加えて又は代わりに、本明細書に記載のポリペプチドは、公知の方法を用いて生成及び／又は精製することができる。一部の実施形態では、このような生成及び／又は精製されたポリペプチドを、本明細書に記載のように、タンパク質治療薬として使用することができる。
【０２０７】
２．発現された抗体
一部の実施形態では、細胞治療薬は、抗体（若しくはその断片）、及び／又は抗体若しくはその断片を含む融合タンパク質をコードする発現構築物（例えば、構成性発現構築物又は誘導性発現構築物）を含む。抗体としては、例えば、インタクトなＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭ、二重及び多重特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）、単鎖Ｆｖ、ポリペプチド−Ｆｃ融合物、Ｆａｂ、カメロイド（ｃａｍｅｌｏｉｄ）抗体、マスクされた抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、小モジュラー免疫薬（Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（「ＳＭＩＰｓＴＭ」）、一本鎖若しくはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ミニボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、アンキリン反復タンパク質若しくはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）、Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）、及びＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）が挙げられる。例示的な抗体を表１に列記する。一部の実施形態では、抗体は、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＩＤＯ、Ａ２ＡＲ、ＴＧＦβ、ＣＤ４７、又は免疫抑制剤経路に関与する別のタンパク質をターゲティングする。例えば、誘導性発現構築物は、抗体フラグメント（例えば、抗ＰＤ１ｓｃＦｖ；抗ＰＤ−Ｌ１ｓｃＦｖ；抗ＣＤ３９ｓｃＦｖ；又は抗ＣＤ７３ｓｃＦｖ）をコードすることができる。
【０２０８】
一部の実施形態では、細胞治療薬は、抗体（又はその断片）と本明細書に記載の別のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする発現構築物を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される発現構築物は、抗体（又はその抗原結合断片）と、１つ若しくは複数１つ若しくは複数の別の細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）の標的を含む融合タンパク質をコードする。抗体（又は断片）は、例えば、腫瘍抗原（例えば、本明細書に記載のＴＡＡ若しくはＴＳＡ）に結合するように選択することができ、その融合パートナーは、１つ若しくは複数１つ若しくは複数の別の細胞治療薬の標的を含むことができる。こうした抗体（又は抗原結合断片）として、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨドメイン、ダイアボディ、ナノボディなどを含む。一実施形態では、発現構築物は、ｍＡｂの融合タンパク質（例えば、抗腫瘍関連抗原ｍＡｂ又は抗原結合断片）及びＣＤ１９又はその断片（例えば、ＣＤ１９Ｉｇドメイン）をコードする。
【０２０９】
一部の実施形態では、抗体（又は断片）は、いくつかの細胞型に発現される抗原に結合する。一部の実施形態では、抗体（又は断片）は、腫瘍選択的抗原に結合する。一部の実施形態では、抗体（又は断片）は、腫瘍選択的ではあるが、特異的ではない抗原に結合する。一部の実施形態では、抗体（又は断片）は、血液系腫瘍に関連する腫瘍抗原に結合する。一部の実施形態では、抗体（又は断片）は、固形腫瘍に関連する腫瘍抗原に結合する。一部の実施形態では、抗体（又は断片）は、以下：ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＣＤ１８０、ＲＯＲ１、ＣＣＬ−１、グリピカン（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）３（ＧＰＣ３）、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、グリコリピド（Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ）Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、及びＭＡＧＥ  Ａ３の１つ又は複数に結合する。
【０２１０】
一部の実施形態では、抗体（又は断片）は、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＲＯＲ１、又はＢＣＭＡをはじめとする、本明細書に記載のＢ細胞特異的マーカに結合する。一部の実施形態では、抗体（又は断片）は、Ｂ細胞特異的マーカの断片又は部分に結合する。例えば、一部の実施形態では、抗体（又はその断片）は、ＣＤ２０の大きい細胞外ループ（例えば、アミノ酸１６３〜１８７の少なくとも一部分）に結合する（Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．ＪＢＣ  Ｖｏｌ．２８２，ＮＯ．２０，２００７，ｐｐ．１５０７３−１５０８０を参照）。
【０２１１】
いくつかのこうした実施形態は、細胞治療薬、例えば、Ｂ細胞特異的マーカをターゲティングするＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、Ｂ細胞腫瘍を治療するための）と組み合わせて使用することができる。細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）を対象に治療すると、ＣＡＲ−Ｔ細胞の拡大が効果を媒介することができ、これは、特定の事例では、連続的な抗原刺激を必要とする場合がある。Ｂ細胞特異的マーカをターゲティングするＣＡＲ−Ｔ細胞の場合、対象の正常Ｂ細胞がＣＡＲ−Ｔ細胞の抗原標的を提供することができ、これによってＣＡＲ−Ｔ細胞刺激及び拡大をもたらす。しかし、Ｂ細胞（Ｂ細胞特異的マーカを発現する）は、同じＢ細胞特異的マーカを発現するＢ細胞腫瘍と一緒に、ＣＡＲ−Ｔ細胞によって破壊される。従って、一部の実施形態では、発現構築物は、抗体（又はその抗原結合断片）とＢ細胞特異的マーカを含む融合タンパク質をコードする。抗体（又は断片）は、腫瘍抗原（例えば、本明細書に記載のＴＡＡ若しくはＴＳＡ）に結合するように選択することができ、またＢ細胞特異的マーカは、別の細胞治療薬、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞の標的となり得る。一部のこうした実施形態では、融合タンパク質は、腫瘍抗原に結合し、Ｂ細胞特異的マーカ（腫瘍抗原に結合した）は、対象に投与された別の細胞治療薬、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞刺激及び拡大をもたらす。
【０２１２】
細胞治療薬の１つの例示的な実施形態を図２に示す。図２に示すように、細胞治療薬は、その表面上に抗原結合受容体を含み、これは、抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン）とシグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のシグナル伝達ドメイン）を含む。細胞治療薬はまた、誘導性発現構築物（例えば、本明細書に記載の誘導性発現構築物）も含み、これは、ｓｃＦｖ−ＣＤ１９ＩｇＣドメイン融合タンパク質をコードする。抗原結合ドメインが腫瘍細胞上の第１抗原と結合すると、シグナル伝達ドメインがｓｃＦｖ−ＣＤ１９ＩｇＣドメイン融合タンパク質の発現を誘導する。融合タンパク質のｓｃＦｖ部分は、腫瘍細胞上の第２抗原（例えば、腫瘍関連抗原、ＴＡＡ）に結合し、ＣＤ１９（すなわち、ｓｃＦｖ融合パートナー）を腫瘍細胞に局在化させる。このように、腫瘍細胞はＣＤ１９で「修飾（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）」される。別の細胞治療薬（例えば、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ）は、ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質のＣＤ１９（腫瘍細胞に結合している）に結合した後、ＣＤ１９で「修飾」された腫瘍細胞を殺傷する。図２に示すように、誘導されたｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質は、第１抗原を発現しない第２腫瘍細胞もターゲティングすることができ、ＣＡＲ−Ｔ細胞を第２腫瘍細胞に結合させて、これを殺傷させる。図２は、発現された抗原に関して腫瘍不均一性を克服するための例示的な方法を示す。
【０２１３】
細胞治療薬の別の例示的な実施形態を図３に示す。図３に示すように、細胞治療薬は、その表面上に抗原結合受容体を含み、これは、抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン）とシグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のシグナル伝達ドメイン）を含む。さらに、細胞治療薬は、誘導性発現構築物（例えば、本明細書に記載の誘導性発現構築物）も含み、これは、ｓｃＦｖ−ＥＧＦＲ融合タンパク質をコードする。抗原結合ドメインが腫瘍細胞上の第１抗原と結合すると、シグナル伝達ドメインがｓｃＦｖ−ＥＧＦＲ融合タンパク質の発現を誘導する。融合タンパク質のｓｃＦｖ部分は、腫瘍細胞上の第２抗原に結合し、ＥＧＦＲ（すなわち、ｓｃＦｖ融合パートナー）を腫瘍細胞に局在化させる。このように、腫瘍細胞はＥＧＦＲで「修飾（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）」される。別の細胞治療薬（例えば、ＥＧＦＲに結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ）を使用して、ｓｃＦｖ−ＥＧＦＲ融合タンパク質のＥＧＦＲ（腫瘍細胞に結合している）に結合させた後、ＥＧＦＲで「修飾」された腫瘍細胞を殺傷させることができる。
【０２１４】
別の例示的な細胞治療薬を図４に示す。図４に示すように、細胞治療薬は、その表面上に第１抗原結合受容体を含み、これは、第１抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン）とシグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のシグナル伝達ドメイン）を含む。さらに、細胞治療薬は、誘導性発現構築物（例えば、本明細書に記載の誘導性発現構築物）も含み、これは、２つのタンパク質：（ｉ）ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質；及び（ｉｉ）第２抗原結合ドメイン（ＣＤ１９に結合する）を含むＣＡＲをコードする。第１抗原結合ドメインが腫瘍細胞上の第１抗原と結合すると、シグナル伝達ドメインがｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質及びＣＡＲの発現を誘導する。ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質のｓｃＦｖ部分は、腫瘍細胞上の第２抗原に結合し、ＣＤ１９（すなわち、ｓｃＦｖ融合パートナー）を腫瘍細胞に局在化させる。このように、腫瘍細胞はＣＤ１９で「修飾（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）」される。続いて、細胞治療薬は、ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質のＣＤ１９（腫瘍細胞に結合している）に結合し、これはＣＡＲの発現によって媒介される。代わりに又は加えて、別の細胞治療薬（すなわち、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ）を用いて、ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質のＣＤ１９（腫瘍細胞に結合している）に結合させた後、ＣＤ１９で「修飾された」腫瘍細胞を殺傷させることができる。
【０２１５】
一部の実施形態では、ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質とＣＡＲを同時に発現させることもできるし（例えば、同じ若しくは別のプロモータを用いて）、又は異なる時点で発現させることもできる。一部の実施形態では、誘導性発現構築物は、ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質を発現させるための第１プロモータを含み、第２ＣＡＲを発現させるための第２プロモータを含む。例えば、第１プロモータは、ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質の高速発現を媒介することができ、第２プロモータは、第２ＣＡＲの遅延させた発現を媒介することができる。
【０２１６】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質及び／又はＣＡＲの構成性若しくは誘導性発現をもたらすことができる（例えば、細胞治療薬を「自己増幅」するために）第２シグナル伝達ドメインを含む。図５は、構成的に発現されたＣＡＲをコードする例示的な細胞治療薬を示す。図５に示すように、細胞治療薬は、その表面上に第１抗原結合受容体を含み、これは、第１抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン）とシグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のシグナル伝達ドメイン）を含む。さらに、細胞治療薬は、第２抗原結合ドメイン（ＣＤ１９に結合する）を含むＣＡＲも発現する。細胞治療薬はまた、誘導性発現構築物（例えば、本明細書に記載の誘導性発現構築物）も含み、これは、ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質をコードする。第１抗原結合ドメインが腫瘍細胞上の第１抗原と結合すると、シグナル伝達ドメインがｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質の発現を誘導する。ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質のｓｃＦｖ部分は、腫瘍細胞上の第２抗原に結合し、ＣＤ１９（すなわち、ｓｃＦｖ融合パートナー）を腫瘍細胞に局在化させる。このように、腫瘍細胞はＣＤ１９で「修飾（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）」される。続いて、細胞治療薬は、ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質のＣＤ１９（腫瘍細胞に結合している）に結合し、これは構成的に発現されたＣＡＲによって媒介される。この実施形態では、ＣＤ１９をターゲティングするＣＡＲがより多くのｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質の放出をトリガーするため、細胞治療薬は、自己増幅している。代わりに又は加えて、別の細胞治療薬（すなわち、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ）を用いて、ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質のＣＤ１９（腫瘍細胞に結合している）に結合させた後、ＣＤ１９で「修飾（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）」された腫瘍細胞を殺傷させることができる。
【０２１７】
別の例示的な細胞治療薬を図６に示す。図６に示すように、細胞治療薬は、その表面上に第１抗原結合受容体を含み、これは、第１抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン）と、殺傷を誘導しないシグナル伝達ドメイン（例えば、抗原結合受容体はＣＡＲではない）を含む。図６（左）に示す細胞治療薬は、さらに、誘導性発現構築物（例えば、本明細書に記載の誘導性発現構築物）を含み、これは、２つのタンパク質：（ｉ）ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質；及び（ｉｉ）第２抗原結合ドメイン（ＣＤ１９に結合する）を含むＣＡＲをコードする。第１抗原結合ドメインが腫瘍細胞上の第１抗原と結合すると、シグナル伝達ドメインがｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質及びＣＡＲの発現を誘導する。ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質のｓｃＦｖ部分は、腫瘍細胞上の第２抗原に結合し、ＣＤ１９（すなわち、ｓｃＦｖ融合パートナー）を腫瘍細胞に局在化させる。このように、腫瘍細胞はＣＤ１９で「修飾（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）」される。続いて、細胞治療薬は、ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質のＣＤ１９（腫瘍細胞に結合している）に結合し、これはＣＡＲの発現によって媒介される。
【０２１８】
図６（右）に示す細胞治療薬は、さらに、第２抗原結合ドメイン（ＣＤ１９に結合する）を含むＣＡＲを構成的に発現し、また、誘導性発現構築物（例えば、本明細書に記載の誘導性発現構築物）も含み、これは、ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質をコードする。第１抗原結合ドメインが腫瘍細胞上の第１抗原と結合すると、シグナル伝達ドメインがｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質の発現を誘導する。ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質のｓｃＦｖ部分は、腫瘍細胞上の第２抗原に結合し、ＣＤ１９（すなわち、ｓｃＦｖ融合パートナー）を腫瘍細胞に局在化させる。このように、腫瘍細胞はＣＤ１９で「修飾（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）」される。続いて、細胞治療薬は、ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質のＣＤ１９（腫瘍細胞に結合している）に結合し、これは構成的に発現したＣＡＲによって媒介される。
【０２１９】
図７は、様々な遺伝子を含む誘導性発現構築物を含む別の例示的な細胞治療薬を示す。
【０２２０】
別の例示的な細胞治療薬は、本明細書に記載の抗原結合受容体を含み、また、ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質をコードする誘導性発現構築物（例えば、本明細書に記載の誘導性発現構築物）も含む。融合タンパク質のｓｃＦｖ部分は、腫瘍抗原に結合する。抗原結合ドメインが腫瘍細胞上の抗原に結合すると（例えば、対象への投与後）、シグナル伝達ドメインがｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質の発現を誘導する。融合タンパク質のｓｃＦｖ部分は、腫瘍細胞上の第２抗原に結合し、ＣＤ１９（すなわち、ｓｃＦｖ融合パートナー）を腫瘍細胞に局在化させる。この例示的実施形態では、次に、ＢＬＩＮＣＹＴＯ（登録商標）（ブリナツモマブ；Ａｍｇｅｎ）を投与して、Ｔ細胞をＣＤ１９（腫瘍細胞に結合している）にターゲティングさせる。
【０２２１】
一部の実施形態では、構成性発現構築物は、ＣＤ１９、又は部分に融合した抗原結合タンパク質（Ｂ細胞抗原をターゲティングする）を含む、本明細書に記載の融合タンパク質又はＦｃベースの構築物をコードする。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、Ｂ細胞特異的抗体（若しくはその部分）／ＣＤ１９融合タンパク質、又はＣＤ１９／Ｂ細胞特異的抗体（若しくは部分）融合タンパク質をコードする。抗原結合タンパク質（例えば、Ｂ細胞特異的抗体）は、あらゆる既知のＢ細胞抗原、例えば、本明細書に記載のＢ細胞抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＢＣＭＡ、又はＣＤ１８０）に結合することができる。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、ｓｃＦｖ／ＣＤ１９融合タンパク質、例えば、抗ＣＤ２０ｓｃＦｖ／ＣＤ１９融合タンパク質又は抗ＣＤ２０ｓｃＦｖ／ＣＤ１９断片融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、ＣＤ１９／ｓｃＦｖ融合タンパク質、例えば、ＣＤ１９／抗ＣＤ２０ｓｃＦｖ融合タンパク質、又はＣＤ１９断片／抗ＣＤ２０ｓｃＦｖ融合タンパク質をコードする。
【０２２２】
一部の実施形態では、構成性発現構築物は、Ｂ細胞抗原又は部分に融合した抗原結合タンパク質（Ｂ細胞抗原をターゲティングする）を含む、本明細書に記載の融合タンパク質又はＦｃベースの構築物をコードする。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、Ｂ細胞特異的抗体（若しくはその部分）／Ｂ細胞抗原（若しくは部分）融合タンパク質、又はＢ細胞抗原（若しくは部分）／Ｂ細胞特異的抗体（若しくは部分）融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、以下：（ｉ）ＣＤ２２若しくは部分（例えば、ドメイン１〜３の１つ又は複数）、ＣＤ７９若しくは部分（例えば、ＣＤ７９ａ若しくはＣＤ７９ｂ）、及び（ｉｉ）Ｂ細胞特異的抗体又は部分（例えば、抗ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＢＣＭＡ、又はＣＤ１８０ｓｃＦｖ）を含む融合タンパク質をコードする。
【０２２３】
一部の実施形態では、構成性発現構築物は、ＣＤ２０（若しくは部分）に融合した抗原結合タンパク質（Ｂ細胞抗原をターゲティングする）を含む、本明細書に記載の融合タンパク質又はＦｃベースの構築物をコードする。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、Ｂ細胞特異的抗体（又はその部分）及びＣＤ２０（又は部分）を含む融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、Ｂ細胞特異的抗体（又はその部分）と、ＣＤ２０のエピトープであるか、又はそれを含むＣＤ２０の一部分を含む融合タンパク質をコードする（Ｎａｔａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９：６８２０−９（２０１３）に記載されている通り）。
【０２２４】
一部の実施形態では、構成性発現構築物は、抗原結合タンパク質（ＴＳＡ若しくはＴＡＡをターゲティングする）及びＣＤ１９、又は部分を含む、本明細書に記載の融合タンパク質又はＦｃベースの構築物をコードする。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、抗ＴＳＡ抗体（若しくはその部分）／ＣＤ１９融合タンパク質、又はＣＤ１９／抗ＴＳＡ抗体（若しくは部分）融合タンパク質をコードする。抗ＴＳＡ抗体は、任意の既知ＴＳＡ、例えば、本明細書に記載の任意のＴＳＡに結合することができる。一部の実施形態では、ＴＳＡは、ＥＧＦＲｖＩＩＩスプライス変異体である。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、ｓｃＦｖ／ＣＤ１９融合タンパク質、例えば、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩｓｃＦｖ／ＣＤ１９融合タンパク質又は抗ＥＧＦＲｖＩＩＩｓｃＦｖ／ＣＤ１９断片融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、ＣＤ１９／ｓｃＦｖ融合タンパク質、例えば、ＣＤ１９／抗ＥＧＦＲｖＩＩＩｓｃＦｖ融合タンパク質、又はＣＤ１９断片／抗ＥＧＦＲｖＩＩＩｓｃＦｖ融合タンパク質をコードする。
【０２２５】
一部の実施形態では、構成性発現構築物は、抗原結合タンパク質（ＴＳＡ若しくはＴＡＡをターゲティングする）及びＢ細胞抗原又は部分を含む、本明細書に記載の融合タンパク質又はＦｃベースの構築物をコードする。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、抗ＴＳＡ抗体（若しくはその部分）／Ｂ細胞抗原融合タンパク質、又はＢ細胞抗原／抗ＴＳＡ抗体をコードする。抗原結合タンパク質（例えば、抗ＴＳＡ抗体）は、任意の既知ＴＳＡ、例えば、本明細書に記載の任意のＴＳＡに結合することができる。一部の実施形態では、ＴＳＡは、ＥＧＦＲｖＩＩＩスプライス変異体である。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、以下：（ｉ）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩｓｃＦｖと（ｉｉ）Ｂ細胞抗原又は部分（例えば、ＣＤ２０若しくは部分（例えば、Ｎａｔａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９：６８２０−９（２０１３）に記載されているようなエピトープ）、ＣＤ２２若しくは部分（例えば、ドメイン１〜３の１つ又は複数）、ＣＤ７９若しくは部分（例えば、ＣＤ７９ａ若しくはＣＤ７９ｂ））を含む融合タンパク質をコードする。
【０２２６】
一部の実施形態では、構成性発現構築物は、本明細書に記載される１つ又は複数の抗体（若しくは断片）をコードする。一部の実施形態では、誘導性発現構築物は、本明細書に記載される１つ又は複数の抗体（若しくは断片）をコードする。加えて又は代わりに、一部の実施形態では、発現構築物によりコードされる本明細書に記載の抗体は、公知の方法を用いて生成し、且つ／又は精製することができる。一部の実施形態では、このような生成及び／又は精製された抗体を本明細書に記載のように、タンパク質治療薬として使用することができる。
【０２２７】
３．発現されたサイトカイン
一部の実施形態では、本明細書に記載される発現構築物（例えば、構成性発現構築物又は誘導性発現構築物）は、１つ又は複数のサイトカイン、例えば、癌療法に使用される、当技術分野で公知の１つ若しくは複数１つ若しくは複数のサイトカインをコードする。一部の実施形態では、１つ又は複数のサイトカインをコードする発現構築物は、誘導性発現構築物である。一部の実施形態では、１つ又は複数のサイトカインをコードする発現構築物は、構成性発現構築物である。発現構築物に含有させることができる非限定的で、例示的なサイトカインとして、例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−３６、ＴＮＦ、ＬＴα、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦが挙げられる。サイトカインは、腫瘍に対するＴ細胞の動員をはじめとする、様々な機構によって作動することによって免疫応答に参加する。サイトカインをコードするヌクレオチド配列は、公知であり、そのようなヌクレオチド配列は、ヒト、サル、ラット、マウス、ハムスター、イヌ、又はネコなどの任意の動物に由来するものでよい。
【０２２８】
サイトカイン療法に関連する周知の問題として、例えば、高用量要件、毒性、及び限定的な有効性が挙げられる。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現構築物を用いて、（例えば、サイトカイン療法に関連する１つ若しくは複数の危険性を低減若しくは排除するために）特定の部位に及び／又は特定の用量で、１つ若しくは複数１つ若しくは複数のサイトカインを送達する。一部の実施形態では、発現構築物は、サイトカインをコードする遺伝子に作動可能に連結されたプロモータを含み、このプロモータは、高速で、持続的な発現を媒介する。一部の実施形態では、発現構築物は、サイトカインをコードする遺伝子に作動可能に連結されたプロモータを含み、このプロモータは、遅延した、後期誘導性発現を媒介する。一部の実施形態では、発現構築物は、サイトカインをコードする遺伝子に作動可能に連結されたプロモータを含み、このプロモータは、高速で、一過性の発現を媒介する。
【０２２９】
一部の実施形態では、腫瘍表面又はその近傍でのサイトカイン（例えば、免疫刺激性サイトカイン）の発現は、腫瘍に対する免疫応答を誘導する。一部の実施形態では、発現されたサイトカインは、１つ又は複数の別の細胞治療薬（例えば、１つ又は複数の別のＣＡＲ−Ｔ細胞）の標的となり得る。一部の実施形態では、腫瘍表面近傍でのサイトカインの発現は、腫瘍に対する免疫応答を誘導し、また、１つ又は複数の別の細胞治療薬（例えば、１つ又は複数の別のＣＡＲ−Ｔ細胞）の標的としても使用される。
【０２３０】
例えば、ＩＬ−２１の放出を用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大及び／若しくはエフェクター分化を誘導する、且つ／又はＮＫ細胞活性化及び細胞傷害活性を支持することができる。１つの例示的な実施形態では、細胞治療薬は、ＣＤ６９プロモータと、ＩＬ−２１をコードする核酸を含む発現構築物を含む。一部の実施形態では、腫瘍細胞上の抗原と結合すると、本明細書に記載の細胞治療薬は、ＩＬ−２１の持続的な放出を呈示する。一部の実施形態では、ＩＬ−２１は、細胞治療薬の対象への投与後、細胞治療薬によって構成的に発現される。例示的な細胞治療薬として、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫ細胞、ＴＣＲ−Ｔ細胞、ＴＩＬ細胞、同種異系ＮＫ細胞、及びオートロガスＮＫ細胞が挙げられる。
【０２３１】
別の例示的な方法では、ＩＬ−１５の放出を用いて、ＮＫ細胞拡大を支持し、及び／又はＮＫ細胞を動員して、抗腫瘍応答を広めることができる。図８は、ＴＮＦプロモータと、ＩＬ−１５をコードする核酸を含む誘導性発現構築物を含む、例示的な細胞治療薬を示す。腫瘍細胞上の抗原と結合すると、細胞治療薬は、ＩＬ−１５の分泌（例えば、高速分泌）を示す。例示的な細胞治療薬として、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫ細胞、ＴＣＲ−Ｔ細胞、ＴＩＬ細胞、同種異系ＮＫ細胞、及びオートロガスＮＫ細胞が挙げられる。
【０２３２】
一部の実施形態では、発現構築物によってコードされる１つ若しくは複数１つ若しくは複数のサイトカインは、高い親和性（例えば、約１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、若しくはそれを下回るＫＤ）で細胞に結合し、且つ／又は低い内在化率（例えば、１日につき１細胞当たり約１０、１０２、１０３、１０４、若しくは１０５個のサイトカイン分子）を有する。様々なサイトカインの結合親和性及び内在化率は、当技術分野で公知であり、及び／又は公知の方法を用いて測定することができる。
【０２３３】
一部の実施形態では、本明細書に記載される発現構築物（構成性発現構築物又は誘導性発現構築物）は、サイトカイン融合タンパク質、例えば、サイトカインの融合タンパク質（例えば、抗腫瘍サイトカイン）及び本明細書に記載の１つ若しくは複数１つ若しくは複数の別の細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ−Ｔ標的）の標的をコードする。こうした発現構築物は、腫瘍表面に１つ又は複数の別の細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ−Ｔ標的）の標的と刺激性サイトカインとの両方を提供することができる。例えば、発現構築物は、サイトカイン−ＣＤ１９融合タンパク質、又はサイトカインとＣＤ１９断片（例えば、ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞が結合するＣＤ１９断片）の融合物をコードすることができる。一部の実施形態では、ＣＤ１９断片は、ＣＤ１９ＩｇＣドメインである。特定の理論に拘束されることは望まないが、こうした融合タンパク質をコードする単一発現構築物は、有利にも、最小（例えば、単一）トランスジーンを用いて、細胞治療薬を遺伝子改変することができる。
【０２３４】
一部の実施形態では、非誘導性発現構築物は、本明細書に記載される１つ又は複数のサイトカイン若しくはサイトカイン融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、誘導性発現構築物は、本明細書に記載される１つ又は複数のサイトカイン若しくはサイトカイン融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、加えて又は代わりに、発現構築物によりコードされる本明細書に記載のサイトカイン融合タンパク質は、公知の方法を用いて生成及び／又は精製することができる。一部の実施形態では、このように生成及び／又は精製された融合タンパク質は、本明細書に記載される通り、タンパク質治療薬として使用することができる。
【０２３５】
４．発現されたスカフォールド融合タンパク質
一部の実施形態では、本明細書に記載される発現構築物（構成性発現構築物又は誘導性発現構築物）は、スカフォールドポリペプチド（又はその断片）と本明細書に記載される１つ若しくは複数１つ若しくは複数の別の細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ−Ｔ標的）の標的を含む融合タンパク質をコードする。スカフォールドポリペプチド（又は断片）は、例えば、腫瘍抗原（例えば、本明細書に記載の腫瘍抗原）に結合するように選択することができる。こうしたスカフォールドポリペプチド（又は断片）として、例えば、フィブロネクチンドメイン（例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン）、ＤＡＲＰｉｎ、アドヒロン、リポカリン／アンチカリン、プロテインＡ、アフィボディ、チオレドキシンなどが挙げられる。例えば、発現構築物は、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン−ＣＤ１９融合タンパク質、又はＩＩＩ型フィブロネクチンドメインとＣＤ１９断片、例えば、ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞が結合するＣＤ１９断片の融合物をコードすることができる。一部の実施形態では、ＣＤ１９断片は、ＣＤ１９  ＩｇＣドメインである。
【０２３６】
一部の実施形態では、構成性発現構築物は、本明細書に記載される１つ又は複数のスカフォールド融合タンパク質タンパク質をコードする。一部の実施形態では、誘導性発現構築物は、本明細書に記載される１つ又は複数のスカフォールド融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、加えて又は代わりに、本明細書に記載のスカフォールド融合タンパク質は、公知の方法を用いて生成及び／又は精製することができる。一部の実施形態では、このような生成及び／又は精製されたスカフォールド融合タンパク質は、本明細書に記載される通り、タンパク質治療薬として使用することができる。
【０２３７】
５．発現されたＣＤ１９変異体タンパク質及びＣＤ１９変異体融合タンパク質のスカフォールドとしてのＣＤ１９
ＣＤ１９は、Ｉｇスーパーファミリーに属する９５ｋｄ膜貫通タンパク質であり、２つの細胞外Ｃ２型Ｉｇドメインを含む（例えば、Ｔｅｄｄｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍ．５：５７２−５７７（２００９）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．２０１２  Ｎｏｖ  ２９；１（１）：３６．ｄｏｉ：１０．１１８６／２１６２−３６１９−１−３６．）を参照）。一部の実施形態では、ＣＤ１９の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、及び／又はＣ２型Ｉｇドメインの一方若しくは両方を突然変異誘発のスカフォールドとして使用し、ＣＤ１９変異体（例えば、ＥＣＤ及び／又は一方若しくは両方のＣ２型Ｉｇドメイン内に１つ若しくは複数の突然変異を含むＣＤ１９若しくはその一部分）を、本明細書に記載の標的抗原への結合についてスクリーニング及び選択することができる。
【０２３８】
ヒトＣＤ１９のヌクレオチド配列は公知である（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｍ８４３７１．１を参照）。特定の抗原に結合するＣＤ１９変異体をコードする変異体核酸配列を取得するために、当技術分野で公知のいくつかの方法を使用することができる。一部の実施形態では、特定の抗原に結合するＣＤ１９変異体をコードする核酸の同定及び／又は単離を可能にするスクリーニング法を使用する。例示的な方法としては、いわゆるバイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）ステップがあり、これは、ファージディスプレイ（Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８，４３６３−４３６６）、リボソームディスプレイ（Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１，１１９−１３５）、ＤＮＡディスプレイ（Ｃｕｌｌ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９，１８６５−１８６９）、ＲＮＡペプチドディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，１９９７．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４，１２２９７−１２３０２）、共有結合ディスプレイ（国際公開第９８／３７１８６号パンフレット）、細菌表面ディスプレイ（Ｆｕｃｈｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，１３６９−１３７２）、酵母表面ディスプレイ（Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．，１９９７．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５，５５３−５５７）及び真核ウイルスディスプレイ（Ｇｒａｂｈｅｒｒ，Ｒ．，Ｅｒｎｓｔ，Ｗ．，２００１．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ．Ｓｃｒｅｅｎ．４，１８５−１９２）などの技術から知られている。ＦＡＣＳ及び磁気ビーズ選別も、標識抗原を用いた富化（パニング）用途に適用可能である。また、バイオパニングステップの後に又は単独で、ＥＬＩＳＡ（Ｄｒｅｈｅｒ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３９，１９７−２０５）及びＥＬＩＳＰＯＴ（Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ．ａｌ．１９８３．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．６５，１０９−２１）などの免疫検出アッセイを用いることもできる。
【０２３９】
従って、一部の実施形態では、本明細書に記載される発現構築物（構成性発現構築物又は誘導性発現構築物）は、単独で、又は本明細書に記載の融合タンパク質の一部としてＣＤ１９変異体（若しくは断片）をコードする。例えば、本明細書に記載される発現構築物は、腫瘍因子に結合するように選択され、発現すると、腫瘍抗原に結合することができ、しかも、それ自体が別の細胞治療薬（例えば、ＣＤ１９に結合するＣＡＲ−Ｔ細胞）の標的となり得るＣＤ１９変異体（又は断片）をコードすることができる。一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体（又は断片）は、ＥＣＤ及び／又は一方若しくは両方のＩｇドメイン内に、野生型ＣＤ１９に対して、１つ又は複数の突然変異を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される発現構築物は、主要抗原に結合するように選択されたＥＣＤ変異体又はＣ２型Ｉｇドメイン変異体を含むＣＤ１９変異体をコードする。ＣＤ１９変異体が発現すると、ＥＣＤ又はＣ２型Ｉｇドメインは、腫瘍細胞上の腫瘍抗原に結合する。続いて、ＣＤ１９を認識するＣＡＲ−Ｔ細胞による治療（例えば、対象への投与）により、ＣＤ１９変異体が結合した腫瘍細胞を殺傷する。このようなＣＤ１９変異体の一例を図１２Ａに示す。
【０２４０】
一部の実施形態では、本明細書に記載される発現構築物は、各々が腫瘍抗原（例えば、腫瘍抗原の異なるエピトープ）に結合するように選択された両方のＣ２型Ｉｇドメインの変異体を含むＣＤ１９変異体をコードする。ＣＤ１９変異体が発現すると、Ｃ２型Ｉｇドメインは、腫瘍細胞上の腫瘍抗原に結合する。これに続いて、ＣＤ１９を認識するＣＡＲ−Ｔ細胞による治療（例えば、対象への投与）により、ＣＤ１９変異体が結合した腫瘍細胞を殺傷する。このようなＣＤ１９変異体の一例を図１２Ｂに示す。
【０２４１】
一部の実施形態では、標的抗原に結合させるために選択されたＣＤ１９変異体を融合タンパク質に含有させる。例えば、標的抗原に結合するように選択されたＥＣＤ変異体又はＣ２型Ｉｇドメイン変異体を含むＣＤ１９変異体を、やはり腫瘍抗原（例えば、腫瘍抗原上の異なるエピトープ）に結合する抗体若しくはその断片と融合することができる。例示的な融合タンパク質として、例えば、ＣＤ１９変異体／ｓｃＦｖ融合タンパク質及びＣＤ１９変異体／ＶＨＨ融合タンパク質が挙げられる。本明細書に記載される発現構築物は、こうしたＣＤ１９変異体／抗体融合タンパク質をコードすることができ、発現すると、融合タンパク質のＣＤ１９変異体及び抗体は、腫瘍細胞上の腫瘍抗原に結合する。これに続いて、ＣＤ１９を認識するＣＡＲ−Ｔ細胞による治療（例えば、対象への投与）により、ＣＤ１９変異体／抗体融合タンパク質が結合した腫瘍細胞を殺傷する。このようなＣＤ１９変異体の一例を図１２Ｃに示す。
【０２４２】
一部の実施形態では、構成性発現構築物は、本明細書に記載される１つ若しくは複数のＣＤ１９変異体タンパク質又はＣＤ１９変異体融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、誘導性発現構築物は、本明細書に記載される１つ若しくは複数のＣＤ１９変異体タンパク質又はＣＤ１９変異体融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、加えて又は代わりに、本明細書に記載されるＣＤ１９変異体タンパク質又はＣＤ１９変異体融合タンパク質は、公知の方法を用いて生成及び／又は精製することができる。一部の実施形態では、こうした生成及び／又は精製ＣＤ１９変異体タンパク質又はＣＤ１９変異体融合タンパク質は、本明細書に記載される通り、タンパク質治療薬として使用することができる。
【０２４３】
ＣＤ１９変異体（又は断片）をスカフォールドとして含む融合タンパク質の非限定的な例として、例えば、ＣＤ１９変異体／サイトカイン融合タンパク質及びＣＤ１９変異体／ＴＬＲアゴニスト融合タンパク質が挙げられる。
【０２４４】
６．スカフォールドとしてのＢ細胞特異的マーカ及び別のタンパク質
ＣＤ１９以外に、Ｉｇスーパーファミリーに属する他のＢ細胞特異的マーカも突然変異誘発のスカフォールドとして使用することができ、Ｂ細胞特異的マーカ変異体を本明細書に記載の標的抗原に対する結合についてスクリーニング及び選択することができる。一部の実施形態では、Ｂ細胞特異的マーカは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ７２、ＣＤ１８０、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ７９ａ、又はＣＤ７９ｂである（例えば、ＬｅＢｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１２：１５７０−１５８０（２００８）を参照）。
【０２４５】
例えば、ＣＤ２２は、７つのＩｇドメインを含み、その各々を個別に、又は１つ若しくは複数の他のＣＤ２２Ｉｇドメインと組み合わせて突然変異させてから、本明細書に記載の方法を用いてスクリーニングして、腫瘍抗原に結合させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ２２変異体又は断片は、最初の１、２、３、４、５、６、若しくは全７つのＩｇドメイン（例えば、ドメイン１〜３）を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２２変異体（又は断片）は、１つ若しくは複数のＣＤ２２Ｉｇドメイン（例えば、ＣＤ２２ドメイン１及び２、又はＣＤ２２ドメイン１〜３など）の各々に、野生型ＣＤ２２に対して、１つ若しくは複数の突然変異を含み得る。従って、一部の実施形態では、本明細書に記載される発現構築物は、単独で、又は本明細書に記載の融合タンパク質の一部としてのいずれかで、ＣＤ２２変異体（又は断片）をコードする。例えば、本明細書に記載される発現構築物は、腫瘍因子に結合するように選択され、発現すると、腫瘍抗原に結合することができ、しかも、それ自体が別の細胞治療薬（例えば、ＣＤ２２に結合するＣＡＲ−Ｔ細胞）の標的となり得るＣＤ２２変異体（又は断片）をコードすることができる。同様に、ＣＤ７９ａ及びＣＤ７９ｂは、各々単一のＩｇドメインから構成され、それぞれを突然変異させてから、本明細書に記載の方法を用いてスクリーニングして、腫瘍抗原に結合させることができる。このように、一部の実施形態では、本明細書に記載される誘導性発現構築物は、単独で、又は本明細書に記載の融合タンパク質の一部としてのいずれかで、ＣＤ７９ａ又はＣＤ７９ｂ変異体をコードする。例えば、本明細書に記載される発現構築物は、腫瘍因子に結合するように選択され、発現すると、腫瘍抗原に結合することができ、しかも、それ自体が別の細胞治療薬（例えば、ＣＤ７９ａ又はＣＤ７９ｂに結合するＣＡＲ−Ｔ細胞）の標的となり得るＣＤ７９変異体をコードすることができる。
【０２４６】
本明細書に記載されるスカフォールドとして使用することができる別のＢ細胞特異的タンパク質には、Ｃ型レクチンＣＤ２３及びＣＤ７２がある（例えば、ＬｅＢｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１２：１５７０−１５８０（２００８）を参照）。先例として、別のＣ型レクチンであるテトラネクチン（例えば、Ｂｙｌａ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ  ２８５：１２０９６−１２１００（２０１０）を参照）がスカフォールドタンパク質として好適に使用されている。従って、一部の実施形態では、本明細書に記載される発現構築物は、単独で、又は本明細書に記載の融合タンパク質の一部としてのいずれかで、ＣＤ２３又はＣＤ７２変異体（若しくは断片）をコードする。例えば、本明細書に記載される発現構築物は、腫瘍抗原に結合するように選択され、発現すると、腫瘍抗原に結合することができる、ＣＤ２３又はＣＤ７２変異体（若しくは断片）を含む融合タンパク質をコードすることができる。この融合タンパク質は、別の細胞治療薬（例えば、ポリペプチド標的に結合するＣＡＲ−Ｔ細胞）のポリペプチド標的をさらに含み得る。
【０２４７】
７．発現毒素
一部の実施形態では、本明細書に記載される発現構築物（例えば、構成性発現構築物又は誘導性発現構築物）は、１つ又は複数の毒素をコードする。一部のそうした実施形態では、発現構築物は、コードされた毒素の発現のタイミングが制御される（例えば、「スマート爆弾（ｓｍａｒｔ  ｂｏｍｂ）」細胞治療薬を生成する）ように設計される。例えば、発現構築物は、コードされた毒素の遅延した発現を媒介するための適切なプロモータ（例えば、ＶＬＡ１プロモータ）を含むか、又は発現構築物は、高速及び／若しくは一過性発現を媒介する適切なプロモータ（例えば、ＴＮＦプロモータ）を含むことができる。
【０２４８】
任意の既知タンパク質毒素をコードするヌクレオチド配列を誘導性発現構築物に含有させることができ、こうした毒素として、例えば、ジフテリア毒素などの細菌毒素及びリシンなどの植物毒素がある。使用することができる別の酵素活性型毒素及び断片として、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、炭疽毒素、志賀毒素、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンが挙げられる。例えば、国際公開第９３／２１２３２号パンフレットを参照されたい。
【０２４９】
一部の実施形態では、標的細胞での毒素の発現及び／又は標的細胞へのその送達は、毒素をコードする発現構築物を含む規定数の細胞治療用細胞を投与するか、又はそれを標的細胞と接触させることによって制御する。例えば、細胞治療用細胞の集団を対象に投与する、及び／又は標的細胞と接触させることができる。一部の実施形態では、こうした集団は、発現構築物を含む細胞治療用細胞と、発現構築物を含まない細胞治療用細胞を特定の比で含む。例えば、約１：１０、１：１００、１：１０００、１：１００００、１：１０００００、又はそれを上回る比の発現構築物を含有する細胞治療用細胞と発現構築物を含有する細胞治療用細胞を有する集団を投与することができる。
【０２５０】
一部の実施形態では、毒素を発現するように誘導された細胞治療薬による毒素の送達により、標的細胞近傍で例えば約１０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、又はそれを上回る細胞を殺傷することができる。
【０２５１】
一部の実施形態では、毒素をコードする核酸とタンデムで「キルスイッチ（ｋｉｌｌ  ｓｗｉｔｃｈ）」を含み、これにより、規定時間（例えば、１、２、４、８、１２時間、又はそれを上回る時間）後に細胞治療薬による毒素の発現を停止することができる。例えば、細胞治療薬が生命を脅かす炎症を引き起こすか、又は健全な正常組織を攻撃する場合、安全「スイッチ」を用いて、細胞治療薬をオフにすることができる。例えば、こうした「スイッチ」は、リミズシド（ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ）（生命を脅かす副作用を患者が発生した場合、患者に投与することができる丸薬；Ｂｅｌｌｉｃｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）にＣＡＲ  Ｔ細胞が曝露されると、カスパーゼ９−依存性アポトーシスを誘導することができる。前臨床及び臨床試験では多くのこうしたスイッチが知られており、本開示に関して使用することができる（例えば、Ｔｅｙ，２０１４．Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ：ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ＆Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３，  ｅ１７；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｔｉ．２０１４．１１を参照）。
【０２５２】
図１０は、誘導によって発現された毒素（例えば、ジフテリア毒素、炭疽毒素、志賀毒素）をコードする例示的な細胞治療薬を示す。図１０に示すように、細胞治療薬は、その表面上に抗原結合受容体を含み、この受容体は、抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン）とシグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のシグナル伝達ドメイン）を含む。細胞治療薬はまた、ジフテリア毒素をコードする誘導性発現構築物（例えば、本明細書に記載の誘導性発現構築物）も含む。抗原結合ドメインが腫瘍細胞上の抗原に結合すると、シグナル伝達ドメインは、ジフテリア毒素の発現を誘導し、これによって細胞死を引き起こす。
【０２５３】
８．他の発現遺伝子
一部の実施形態では、発現構築物（例えば、構成性発現構築物又は誘導性発現構築物）は、腫瘍微小環境をターゲティングする物質をコードする。特定の癌及び／又は腫瘍の微小環境は、細胞治療薬の攻撃からの腫瘍の防御を賦与することがわかっている。例えば、こうした防御微小環境は、細胞攻撃の有効性を妨害又は低減する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含み、低酸素及び／若しくは酸性ｐＨ条件を含み、且つ／又は免疫抑制シグナルを含み得る。一部の実施形態では、発現構築物は、腫瘍微小環境をターゲティングする、及び／又はその分解を媒介するタンパク質をコードする。こうしたタンパク質は、当技術分野で公知である。例えば、発現構築物は、ヒアルロニダーゼ、ヘパリナーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、及び／又はＡＤＡＭ（ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ、例えば、ＡＤＡＭ１〜２０、例えば、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７）をコードすることができる（例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ａｓｐｅｃｔｓ  Ｍｅｄ．２９：２５８−８９（２００８）；Ｄｅｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１５：１２５４−６５（２０１１）；ＭｃＡｔｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２３：１−３４（２０１４）；Ｓｔａｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １８１２：１６１６−１６２９（２０１１）を参照）。
【０２５４】
図１１は、誘導的に発現された遺伝子をコードする例示的な細胞治療薬を示す。図１１に示すように、細胞治療薬は、その表面上に抗原結合受容体を含み、この受容体は、抗原結合ドメイン（例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン）とシグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のシグナル伝達ドメイン）を含む。細胞治療薬はまた、遺伝子（例えば、図１１に示す遺伝子）をコードする誘導性発現構築物（例えば、本明細書に記載の誘導性発現構築物）も含む。抗原結合ドメインが腫瘍細胞上の抗原に結合すると、シグナル伝達ドメインは、遺伝子の発現を誘導する。
【０２５５】
一部の実施形態では、誘導性発現構築物は、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞機能及び／又は生存のための因子（例えば、リンパ球拡大分子（ＬＥＭ）；Ｌｅａｖｙ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：３３４  （２０１５）を参照）をコードする。
【０２５６】
９．開裂可能な（Ｃｌｅａｖａｂｌｅ）リンカーを含む発現融合タンパク質
一部の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれも（例えば、ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質）、融合パートナー間にリンカーを含んでよい。多種の好適なリンカー及びリンカーを含む融合タンパク質の調製方法が当技術分野で知られている。リンカーは、リンカーが開裂すると融合パートナーが放出されるように、例えば、生理的条件下、例えば、細胞内条件下で、開裂可能となるものでよい。リンカーは、例えば、限定されないが、アミノペプチダーゼ、プラスミン、及びキニン−カリクレインをはじめとする、血漿ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素によって開裂されるペプチジルリンカーであってよい。一部の実施形態では、リンカーは、腫瘍関連プロテアーゼ、例えば、マトリプターゼ、カテプシンＢによって開裂され得る。一部の実施形態では、腫瘍関連プロテアーゼによる開裂は、ＣＤ１９の配座変化を誘導し、これにより、殺傷を達成するためのＣＡＲエピトープの結合及び／又は発現が可能になる。一部の実施形態では、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長又は少なくとも３アミノ酸長である。
【０２５７】
１０．発現Ｆｃベース構築物
一部の実施形態では、本明細書に記載される発現構築物（例えば、構成性発現構築物又は誘導性発現構築物）は、Ｆｃベース構築物をコードする。一部の実施形態では、Ｆｃベース構築物は、ＣＤ１９−Ｆｃ融合タンパク質、例えば、図５２Ａに示す構築物である。図５２Ａに示すように、ＣＤ１９−Ｆｃ融合タンパク質は、２つの単量体からなる二量体であってよく、単量体の各々が、ＣＤ１９の細胞外Ｃ２型Ｉｇドメイン含有形態に融合した抗体の重鎖Ｆｃ領域の全部又は一部を含む。一部の実施形態では、ＣＤ１９−Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に記載されるＥＣＤ変異体又は１つ若しくは２つのＣ２型Ｉｇドメイン変異体を含む。一部の実施形態では、ＣＤ１９の細胞外Ｃ２型Ｉｇドメインの一方又は両方が、本明細書に記載されるＣ２型Ｉｇドメイン変異体である。図５２Ａに示される例示的な実施形態では、両方のＣ２型ＩｇドメインがＣ２型Ｉｇドメイン変異体（「＊＊」で示す）である。一部の実施形態では、こうした構築物は、一方又は両方のＣ２型Ｉｇドメイン変異体（若しくはＥＣＤ変異体）を介して腫瘍抗原（例えば、本明細書に記載のＴＳＡ若しくはＴＡＡ）に結合すると共に、本明細書に記載の１つ若しくは複数１つ若しくは複数の別の細胞治療薬（例えば、ＣＡＲＴ、ＡＤＣなど）の標的としてＣＤ１９を提示する。
【０２５８】
一部の実施形態では、Ｆｃベース構築物は、図５２Ｂに概略的に示されるものであり、この場合、構築物は、ＣＤ１９−ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質である。図５２Ｂに示すように、例示的な構築物は、ヘテロ二量体であり、この場合、１つの単量体が、ｓｃＦｖ（例えば、本明細書に記載のｓｃＦｖ）に融合した抗体の重鎖Ｆｃ領域の全部若しくは一部を含み、もう１つは、ＣＤ１９の全部若しくは一部に融合した抗体の重鎖Ｆｃ領域の全部若しくは一部を含む。一部の実施形態では、こうした構築物は、ｓｃＦｖを介して腫瘍抗原（例えば、本明細書に記載のＴＳＡ若しくはＴＡＡ）に結合すると共に、本明細書に記載の１つ若しくは複数１つ若しくは複数の別の細胞治療薬（例えば、ＣＡＲＴ、ＡＤＣなど）の標的としてＣＤ１９を提示する。
【０２５９】
一部の実施形態では、Ｆｃベース構築物は、図５２Ｃに概略的に示されるものであり、この場合、構築物は、ＣＤ１９−ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質である。図５２Ｃに示すように、例示的な構築物は、ヘテロ二量体であり、この場合、１つの単量体が、ｓｃＦｖ（例えば、本明細書に記載のｓｃＦｖ）に融合した抗体の重鎖Ｆｃ領域の全部若しくは一部を含み、もう１つの単量体は、本明細書に記載される細胞外Ｃ２型Ｉｇドメイン変異体（「＊＊」で示す）に融合した抗体の重鎖Ｆｃ領域の全部若しくは一部を含む。一部の実施形態では、こうした構築物は、二価であってよく、この場合、ｓｃＦｖ及びＣ２型Ｉｇドメイン変異体（若しくはＥＣＤ変異体）は、同じ標的（例えば、本明細書に記載のＴＳＡ若しくはＴＡＡ）に結合し、或いは構築物は二重特異性であってもよく、その場合、ｓｃＦｖ及びＣ２型Ｉｇドメイン変異体は、異なる標的（例えば、本明細書に記載のＴＳＡ若しくはＴＡＡ）に結合する。さらに、こうした構築物は、本明細書に記載の１つ又は複数の別の細胞治療薬（例えば、ＣＡＲＴ、ＡＤＣなど）の標的としてＣＤ１９を提示する。
【０２６０】
一部の実施形態では、Ｆｃベース構築物は、異なる標的（例えば、本明細書に記載のＴＳＡ若しくはＴＡＡ）に結合する、二重特異性抗体又はその部分であるか、それを含む。様々な二重特異性抗体が当技術分野において知られており（例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ  ２０：８３８−８４７（２０１５）；Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７：９５−１０６（２０１５））、本明細書に記載される構築物で使用することができる。例示的な二重特異性抗体として、例えば、トリオマブ、ノブイントゥホール（ｋｎｏｂ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅ）ＩｇＧ、ｃｒｏｓｓＭａｂ、オルト−Ｆａｂ  ＩｇＧ、デュアル可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）、２ｉｎ  １−ＩｇＧ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ２−Ｆｃ、ビ−ナノボディ、ＢｉＴＥ、ｔａｎｄＡｂ、ＤＡＲＴ、ＤＡＲＴ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−ＨＡＳ−ｓｃＦｖ、ドックアンドロック（ＤＮＬ）−Ｆａｂ３、ＩｍｍＴＡＣ、ＤＡＦ、ＨＡＳボディ、ＩｇＧ−フィノマー、及びＡＲＴ−Ｉｇが挙げられる。別の例として、ＸｍＡｂ５５７４、ＸｍＡｂ５８７１、ＸｍＡｂ７１９５、Ｘｔｅｎｄ−ＴＮＦ、ＸｍＡｂ１４０４５、ＸｍＡｂ１３６７６、ＸｍＡｂ１３５５１（Ｘｅｎｃｏｒ）が挙げられる。１つの例示的な構築物を図５３Ａに示すが、これは、ヘテロ二量体重鎖を含み、構築物の一方のアームは、ＶＨ／ＶＬを含み、他方のアームは、Ｆｃ領域に融合したｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、図５３Ａに示される構築物は、一価であり、この場合、ＶＨ／ＶＬアームは、腫瘍抗原（例えば、本明細書に記載のＴＳＡ若しくはＴＡＡ）に結合し、ｓｃＦｖは、本明細書に記載のＴ細胞抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する。別の例示的な構築物を図５３Ｂに示すが、この場合、図５３Ａに示す構築物のｓｃＦｖがＣＤ１９の１つ又は２つの細胞外Ｃ２型Ｉｇドメインで置換されている。さらに、図５３Ｂに示される構築物は、本明細書に記載の１つ又は複数の別の細胞治療薬（例えば、ＣＡＲＴ、ＡＤＣなど）の標的としてＣＤ１９を提示する。別の例示的な構築物を図５３Ｃに示すが、ここでは、ＣＤ１９の細胞外Ｃ２型Ｉｇドメインの一方又は両方が、本明細書に記載されるＣ２型Ｉｇドメイン変異体（「＊＊」で示す）である。一部の実施形態では、こうした構築物は、二価であってよく、この場合、ＶＨ／ＶＬとＣ２型Ｉｇドメイン変異体（若しくはＥＣＤ変異体）は、同じ標的（例えば、本明細書に記載のＴＳＡ若しくはＴＡＡ）に結合し、又は構築物は、二重特異性であってもよく、その場合、ＶＨ／ＶＬとＣ２型Ｉｇドメイン変異体（若しくはＥＣＤ変異体）は、異なる標的（例えば、本明細書に記載のＴＳＡ若しくはＴＡＡ）に結合する。さらに、図５３Ｃに示されるこうした構築物は、本明細書に記載の１つ又は複数の別の細胞治療薬（例えば、ＣＡＲＴ、ＡＤＣなど）の標的としてＣＤ１９を提示する。
【０２６１】
一部の実施形態では、Ｆｃベース構築物は、Ｆｃ  Ｉｇ「スワップ」を含む。図５４Ａは、各Ｆｃ重鎖が２つのＩｇ定常ドメイン（１つはＣＨ２（青色）、他方はＣＨ３（赤色）と称する）を含む抗体を概略的に示す。一部の実施形態では、Ｆｃベース構築物は、図５４Ｂに示すような抗体を含み、これは、本明細書に記載のＣＤ１９の１つ若しくは複数の細胞外Ｃ２型Ｉｇドメインに融合したＣＨ２（青色）、本明細書に記載のＣＤ２２の１つ若しくは複数のＩｇドメイン、及び／又は本明細書に記載のＣＤ７９ａ又はＣＤ７９ｂの１つ若しくは複数のＩｇドメイン（図５４Ｂに緑色で示す）を含む１つ又は２つの重鎖を含む。
【０２６２】
一部の実施形態では、Ｆｃベース構築物は、融合タンパク質（本明細書に記載される通り）を含み、これは、Ｉｇ定常ドメイン、又はＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン、並びに本明細書に記載のＣＤ１９の細胞外Ｃ２型Ｉｇドメインの１つ若しくは複数の「ループ」を含む。ＣＤ１９の細胞外Ｃ２型Ｉｇドメインの構造は、３つの「ループ」を含むことがわかっている。１つの例示的な構築物を図５５Ａに示すが、この場合、一方又は両方のＦｃ  ＣＨ３ドメインのループがＣＤ１９の細胞外Ｃ２型Ｉｇドメインのループで置換されている。別の例示的な構築物を図５５Ｂに示すが、この場合、ＣＤ１９の細胞外Ｃ２型Ｉｇドメインの１、２、若しくは３つのループがＶＨ、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン、又はｓｃＦｖに移植されている。
【０２６３】
一部の実施形態では、構成性発現構築物は、本明細書に記載される１つ又は複数のＦｃベース構築物をコードする。一部の実施形態では、誘導性発現構築物は、本明細書に記載される１つ又は複数のＦｃベース構築物をコードする。一部の実施形態では、加えて又は代わりに、本明細書に記載のＦｃベース構築物は、公知の方法を用いて生成及び／又は精製することができる。一部の実施形態では、このように生成及び／又は精製されたＦｃベース構築物は、本明細書に記載されるように、タンパク質治療薬として使用することができる。
【０２６４】
１１．誘導性機能を有する発現ポリペプチド
一部の実施形態では、本明細書に記載される発現構築物（例えば、構成性発現構築物又は誘導性発現構築物）は、１つ若しくは複数の誘導性機能を呈示する１つ又は複数のポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、抗体若しくは酵素であるか、又はそれを含み、その１つ若しくは複数の機能は、可逆的に低減、遮断又は阻害され、その機能は、例えば、脱遮断又は脱阻害によって誘導することができる。誘導性機能を有する様々なポリペプチドが当技術分野で知られており、例えば、リガンド結合部位（例えば、ホルモン結合ドメイン誘導性機能（例えば、Ｅｉｌｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４０，６６−６８  １９８９を参照）を含むポリペプチド又はマスクされたポリペプチド（例えば、抗体、酵素）がある。一部の実施形態では、誘導性機能は、標的抗原（例えば、本明細書に記載のＴＡＡ若しくはＴＳＡ）の誘導性結合である。
【０２６５】
マスクされた構築物
一部の実施形態では、発現ポリペプチドは、本明細書に記載される抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に記載の抗体若しくは抗体断片、又は本明細書に記載のスカフォールドタンパク質（例えば、本明細書に記載されるＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン、ＣＤ１９変異体タンパク質、又はＢ細胞特異的マーカ変異体））のマスクされたバージョンであるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、発現ポリペプチドは、本明細書に記載される抗体若しくは抗体断片のマスクされたバージョン（例えば、Ｓａｎｄｅｒｓｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．（２０１５）７２：１４０５−１４１５；米国特許出願公開第２０１５／０１８３８７５号明細書；米国特許第８，５１３，３９０号明細書；及び同第９，１２０，８５３号明細書に記載されている、Ｐｒｏｂｏｄｙ（登録商標））を含む。一部の実施形態では、マスクされた構築物は、抗体若しくはその断片、又は本明細書に記載のスカフォールドタンパク質（例えば、本明細書に記載されるＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン、ＣＤ１９変異体タンパク質、又はＢ細胞特異的マーカ変異体）、マスキング部分、開裂可能な部分、及び／又はリンカーを含む。一部の実施形態では、マスクされた構築物は、本明細書に記載される１つ又は複数のＴＳＡをターゲティングする抗原結合タンパク質を含む。一部の実施形態では、マスクされた構築物は、本明細書に記載される１つ又は複数のＴＡＡをターゲティングする抗原結合タンパク質を含む。一部の実施形態では、マスクされた構築物は、本明細書に記載される１つ又は複数のＴＳＡ及び１つ又は複数のＴＡＡをターゲティングする抗原結合タンパク質を含む。一部の実施形態では、誘導された発現構築物は、１つ又は複数のマスクされた構築物をコードする。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、１つ又は複数のマスクされた構築物をコードする。
【０２６６】
一部の実施形態では、マスクされた抗体は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体若しくはその断片、又は本明細書に記載のスカフォールドタンパク質（例えば、本明細書に記載されるＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン、ＣＤ１９変異体タンパク質、又はＢ細胞特異的マーカ変異体））、及びマスキング部分を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、抗原結合タンパク質に連結されて、タンパク質が特異的にその標的に結合する能力を低減する（抗原結合タンパク質を「マスクする」）ように配置されたアミノ酸配列である。一部の実施形態では、マスキング部分は、リンカーによって抗原結合タンパク質に連結される。一部の実施形態では、マスクされた抗原結合タンパク質のその標的に対する特異的結合は、標的に対する、「マスクされていない」抗原結合タンパク質の特異的結合と比較して、又は親抗原結合タンパク質の特異的結合と比較して、低減若しくは阻害される。一部の実施形態では、マスクされた抗原結合タンパク質は、標的に対して、測定可能な結合がないか、又は測定可能な結合を実質的に示さない、並びに／或いは標的に対する、マスクされていない抗原結合タンパク質の結合と比較して、又は親抗原結合タンパク質の結合と比較して、例えば、インビボで、若しくは標的置換（Ｔａｒｇｅｔ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）インビトロイムノソルベントアッセイ（米国特許第８，５１３，３９０号明細書に記載）で測定したとき、例えば、少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間、若しくは５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、１８０日、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月若しくはそれを上回って０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、若しくは５０％以下を示す。
【０２６７】
一部の実施形態では、マスクされた抗原結合タンパク質のその標的に対する特異的結合は、標的に対する、マスクされていない抗原結合タンパク質の特異的結合と比較して、又は親抗原結合タンパク質の特異的結合と比較して、低減若しくは阻害される。標的に対するマスクされた抗原結合タンパク質のＫｄは、マスクされていない抗原結合タンパク質の特異的結合のもの又は親抗原結合タンパク質のものと比べて、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００，５００，０００，１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００倍以上、又は５〜１０、１０〜１００、１０〜１，０００、１０〜１０，０００、１０〜１００，０００、１０〜１，０００，０００、１０〜１０，０００，０００、１００〜１，０００、１００〜１０，０００、１００〜１００，０００、１００〜１，０００，０００、１００〜１０，０００，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜１００，０００、１，０００〜１，０００，０００、１０００〜１０，０００，０００、１０，０００〜１００，０００、１０，０００〜１，０００，０００、１０，０００〜１０，０００，０００、１００，０００〜１，０００，０００、若しくは１００，０００〜１０，０００，０００倍高くなり得る。逆に、標的に対するマスクされた抗原結合タンパク質の結合親和性は、マスクされていない抗原結合タンパク質の特異的結合のもの又は親抗原結合タンパク質のものと比べて、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００，５００，０００，１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００倍以上、又は５〜１０、１０〜１００、１０〜１，０００、１０〜１０，０００、１０〜１００，０００、１０〜１，０００，０００、１０〜１０，０００，０００、１００〜１，０００、１００〜１０，０００、１００〜１００，０００、１００〜１，０００，０００、１００〜１０，０００，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜１００，０００、１，０００〜１，０００，０００、１０００〜１０，０００，０００、１０，０００〜１００，０００、１０，０００〜１，０００，０００、１０，０００〜１０，０００，０００、１００，０００〜１，０００，０００、若しくは１００，０００〜１０，０００，０００倍低くなり得る。
【０２６８】
マスキング部分は、当技術分野において知られており、例えば、抗体、若しくはその断片の既知結合パートナーを含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、抗原結合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端の、及び／又は内部部位（例えば、抗原結合ループ）内のアミノ酸配列である。一部の実施形態では、マスキング部分は、１つ又は複数のシステイン残基ペアであるか、又はそれを含み、例えば、それにより、システインペア間にジスルフィド結合が形成される。一部のそうした実施形態では、ジスルフィド結合によって配座固定された構造が得られ、これは、例えば、還元剤によるジスルフィド結合の開裂によって「マスク解除」することができる。例示的なマスキング部分は、例えば、Ｓａｎｄｅｒｓｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．（２０１５）７２：１４０５−１４１５；米国特許出願公開第２０１５／０１８３８７５号明細書；米国特許第８，５１３，３９０号明細書及び同第９，１２０，８５３号明細書に記載されている。
【０２６９】
一部の実施形態では、発現ポリペプチドは、マスキング部分を含む本明細書に記載の抗体融合タンパク質、例えば、本明細書に記載のマスクされたｓｃＦｖ−ＣＤ１９又はマスクされたＣＤ１９−ｓｃＦｖ融合タンパク質である。一部の実施形態では、マスクされたｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端にマスキング部分を含む。一部の実施形態では、マスクされたｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質は、融合タンパク質のＣ末端にマスキング部分を含む。一部の実施形態では、マスクされたＣＤ１９−ｓｃＦｖ融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端にマスキング部分を含む。一部の実施形態では、マスクされたＣＤ１９−ｓｃＦｖ融合タンパク質は、融合タンパク質のＣ末端にマスキング部分を含む。
【０２７０】
一部の実施形態では、発現ポリペプチドは、Ｎ末端に本明細書に記載のｓｃＦｖを、Ｃ末端にＣＤ１９の断片を含むマスクされた融合タンパク質（ｓｃＦｖ−ＣＤ１９断片融合タンパク質）、又はＮ末端にＣＤ１９の断片を、Ｃ末端に本明細書に記載のｓｃＦｖを含むマスクされた融合タンパク質（ＣＤ１９断片−ｓｃＦｖ融合タンパク質）である。一部の実施形態では、マスクされたｓｃＦｖ−ＣＤ１９断片融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端にマスキング部分を含む。一部の実施形態では、マスクされたｓｃＦｖ−ＣＤ１９断片融合タンパク質は、融合タンパク質のＣ末端にマスキング部分を含む。一部の実施形態では、マスクされたＣＤ１９断片−ｓｃＦｖ融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端にマスキング部分を含む。一部の実施形態では、マスクされたＣＤ１９断片−ｓｃＦｖ融合タンパク質は、融合タンパク質のＣ末端にマスキング部分を含む。
【０２７１】
一部の実施形態では、発現ポリペプチドは、当技術分野で公知のマスクされた抗体（若しくはその断片）であるか、又はそれを含み、そうしたものとして、限定されないが、セツキシマブ、パニツムマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、エファリズマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、アデカツムマブ、Ｈｕ５ｃ８、アレムツズマブ、ラニビズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、リツキシマブ、インフリキシマブ、ベバシズマブ、若しくはフィギツムマブ、又はそれらの断片（例えば、マスクされたｓｃＦｖ断片）のマスクされたバージョンが挙げられる。マスクすることができる別の抗体は、例えば、米国特許第８，５１３，３９０号明細書、同第９，１２０，８５３号明細書、同第９，１２７，０５３号明細書、米国特許出願公開第２０１５０１８３８７５号明細書、同第２０１４０３６３４３０号明細書、同第２０１４００４５１９５号明細書、同第２０１３０１０１５５５号明細書、及び同第２０１００１８９６５１号明細書に記載されている。
【０２７２】
一部の実施形態では、マスクされた抗体又は融合タンパク質は、さらに、１つ又は複数の開裂可能部分を含む。一部の実施形態では、開裂可能部分は、例えば、１つ又は複数の細胞外プロテアーゼなどの１つ又は複数のプロテアーゼのための基質として役立つことができる１つ又は複数のアミノ酸配列であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、開裂可能部分は、還元剤の作用により開裂することができるジスルフィド結合を形成することができるシステイン−システインペアであるか、又はそれを含む。他の実施形態では、開裂可能部分は、光分解時に切断することができる基質であるか、又はそれを含む。
【０２７３】
一部の実施形態では、開裂可能部分は、抗体若しくはその断片の所望の標的を有する組織中又はその近傍でのプロテアーゼの存在に基づいて選択される。一部の実施形態では、標的組織は癌組織である。いくつかの癌、例えば、固形腫瘍中に基質を有するプロテアーゼが当技術分野において知られている（例えば、Ｌａ  Ｒｏｃｃａ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ９０（７）：１４１４−１４２１を参照）。一部の実施形態では、開裂可能部分は、例えば、レグマイン、プラスミン、ＴＭＰＲＳＳ−３／４、ＭＭＰ−９、ＭＴ１−ＭＭＰ、ＡＤＡＭ（ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ、例えば、ＡＤＡＭ１〜２０、例えば、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７）、カテプシン（例えば、カテプシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｏ、Ｓ、Ｖ、若しくはＷ（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４：９１−１０１（２０１３））、カスパーゼ、ヒト好中球エラスターゼ、βセクレターゼ、マトリプターゼ、ｕＰＡ、又はＰＳＡの標的であるか、或いはそれを含む。
【０２７４】
一部の実施形態では、本明細書に記載のマスクされた構築物は、リンカー、例えば、マスキング部分及び／若しくは開裂部分に対するＣ末端並びに／又はＮ末端を含む。一部の実施形態では、リンカーは、抗原結合タンパク質のその標的に対する結合を可逆的に阻害するために、マスキング部分に柔軟性を賦与することができる。好適なリンカーを容易に選択することができ、それは、４アミノ酸〜１０アミノ酸、５アミノ酸〜９アミノ酸、６アミノ酸〜８アミノ酸、又は７アミノ酸〜８アミノ酸をはじめとする、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）〜２０アミノ酸、２アミノ酸〜１５アミノ酸、３アミノ酸〜１２アミノ酸などの様々な長さのうちの好適ないずれであってもよく、１、２、３、４、５、６、若しくは７アミノ酸であってもよい。一部の実施形態では、マスキング部分は、ポリペプチドリンカーを介して抗原結合タンパク質に融合される。一部の実施形態では、マスキング部分を抗原結合タンパク質に融合させるために用いられるリンカーは、本明細書に記載の開裂可能な部分である。一部の実施形態では、マスキング部分は、抗原結合タンパク質のＮ末端に、直接又はリンカーにより融合される。一部の実施形態では、マスキング部分は、抗原結合タンパク質のＣ末端に、直接又はリンカーにより融合される。
【０２７５】
マスクされた構築物は、本明細書に記載される任意の発現ポリペプチドを含んでよい。例示的な１組のマスクされた構築物を図５６に示すが、これは、図５２Ｂ及び５２Ｃに記載される構築物とマスキング部分の融合物を示す。一部の実施形態では、図５６に示すように、マスキング部分をｓｃＦｖのＮ末端に融合させることができる。別の例示的な１組のマスクされた構築物を図５７に示すが、これは、図５３Ｂ及び５３Ｃに記載される構築物とマスキング部分の融合物を示す。一部の実施形態では、図５７に示すように、マスキング部分をＶＨ／ＶＬアーム上のＶＨ及び／又はＶＬのＮ末端に融合させることができる。別の例示的な１組のマスクされた構築物を図５８に示すが、これは、図５４Ｂに記載される構築物とマスキング部分の融合物を示す。一部の実施形態では、図５８に示すように、マスキング部分は、各重鎖のＮ末端に融合させることができ、これらは各々、本明細書に記載のＣＤ１９の１つ若しくは複数の細胞外Ｃ２型Ｉｇドメインに融合したＣＨ２（青色）、本明細書に記載のＣＤ２２の１つ若しくは複数のＩｇドメイン、及び／又は本明細書に記載のＣＤ７９ａ若しくはＣＤ７９ｂのＩｇドメイン（緑色で示す）を含む。一部の実施形態では、マスキング部分を一方又は両方の重鎖のＮ末端に融合させることができる。上記に加えて又はその代わりに、一部の実施形態では、マスキング部分は、一方又は両方の軽鎖のＮ末端に融合させることができる。さらに別の例示的なマスクされた構築物を図５９に示すが、これは、図５５Ａ及び５５Ｂに記載される構築物とマスキング部分の融合物を示す。一部の実施形態では、図５９に示すように、マスキング部分を重鎖及び／又はｓｃＦｖ  ＶＨのＮ末端に融合させることができる。
【０２７６】
一部の実施形態では、構成性発現構築物は、本明細書に記載される１つ又は複数のマスクされた構築物をコードする。一部の実施形態では、誘導性発現構築物は、本明細書に記載される１つ又は複数のマスクされた構築物をコードする。
【０２７７】
一部の実施形態では、構成性発現構築物は、本明細書に記載のマスクされた構築物（例えば、図５６、５７、５８、又は５９に示されるマスクされた構築物）をコードする。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、本明細書に記載されるＣＡＲＴ細胞、ＡＤＣなどの標的に融合した抗原結合タンパク質（ＴＳＡ若しくはＴＡＡをターゲッティングする）を含む、本明細書に記載のマスクされた融合タンパク質又はマスクされたＦｃベース構築物をコードする。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、本明細書に記載されるＢ細胞抗原若しくは部分に融合した抗原結合タンパク質（ＴＳＡ若しくはＴＡＡをターゲッティングする）を含む、本明細書に記載のマスクされた融合タンパク質又はマスクされたＦｃベース構築物をコードする。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、マスクされた抗ＴＡＡ及び／又は抗ＴＳＡ抗体（若しくはその部分）及びＣＤ１９若しくは断片を含む融合タンパク質をコードする。マスクされた抗原結合タンパク質は（アンマスキングされると）、任意の既知ＴＡＡ及び／又はＴＳＡ、例えば、本明細書に記載のＴＡＡ及び／又はＴＳＡに結合することができる。
【０２７８】
上記に加えて又はその代わりに、一部の実施形態では、本明細書に記載のマスクされた構築物は、公知の方法を用いて生成及び／又は精製することができる。一部の実施形態では、このような生成及び／又は精製済のマスクされた構築物を、本明細書に記載されるように、タンパク質治療薬として使用することができる。
【０２７９】
細胞治療薬を生成する方法
一般に、本明細書に記載される細胞治療薬は、免疫細胞、例えば、養子細胞療法において有用な細胞又は養子細胞療法に使用することができる細胞から生成することができる。一部の実施形態では、細胞治療薬は、ＴＩＬ、Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＮＫ細胞、δ−γＴ細胞、調節Ｔ細胞又は末梢血単核細胞からなる群から選択される細胞型から生成される。本明細書で使用されるとき、「腫瘍浸潤リンパ球」又はＴＩＬは、血流から出て、腫瘍中に移動した白血球を指す。リンパ球は、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞を含む３つの群に区分することができる。本明細書で使用されるとき、「Ｔ細胞」は、ＣＤ３＋細胞を指し、ＣＤ４＋ヘルパー細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞及びδ−γＴ細胞などを含む。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、細胞治療薬は、細胞、例えば、免疫細胞を、抗原結合受容体及び／又は本明細書に記載の発現構築物をコードする核酸（例えば、（ｉ）抗原結合受容体をコードする核酸を含む第１組換え発現ベクターと誘導性発現構築物を含む第２組換え発現ベクター、（ｉｉ）抗原結合受容体をコードする核酸と誘導性発現構築物との両方を含む単一組換え発現ベクター；又は（ｉｉｉ）構成性発現構築物を含む組換え発現ベクター）で遺伝子改変（例えば、形質転換）することによって生成される。組換え発現ベクターは、限定されないが、ＤＮＡ及びＲＮＡをはじめとする、あらゆるタイプのヌクレオチドを含むことができ、これらは、一本鎖若しくは二本鎖でも、合成又は一部が天然供給源から得られるものでもよく、天然、非天然若しくは改変ヌクレオチドを含有してもよい。組換え発現ベクターは、天然若しくは非天然のヌクレオチド間結合、又は両タイプの結合を含むことができる。
【０２８１】
組換え発現ベクターは、任意の好適な組換え発現ベクターであってよい。好適なベクターとしては、増殖及び拡大、若しくは発現、又はその両方のために設計されたもの、例えば、プラスミド及びウイルスが挙げられる。例えば、ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ，Ｍｄ．）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から選択することができる。また、λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９などのバクテリオファージベクターも使用することができる。本開示に関して有用な植物発現ベクターの例として、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。本開示に関して有用な動物発現ベクターの例として、ｐｃＤＮＡ、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。一部の実施形態では、バイシストロン性ＩＲＥＳベクター（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を使用して、抗原結合受容体をコードする核酸と本明細書に記載の誘導性発現構築物との両方を含有させる。
【０２８２】
一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、ウイルスベクターである。好適なウイルスベクターとして、限定されないが、レトロウイルスベクター、アルファウイルス、ワクシニア、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、及び鶏痘ウイルスが挙げられ、これらは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を形質転換するネイティブ若しくは操作された能力を有するのが好ましい。
【０２８３】
組換え発現ベクターは、例えば、以下の文献に記載される標準的組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２００１；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４。環状又は線状の発現ベクターの構築物を調製して、原核若しくは真核宿主細胞中で機能性の複製系を含有させることができる。複製系は、例えば、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどから得ることができる。
【０２８４】
組換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクトされた宿主の選択を可能にする、１つ又は複数のマーカ遺伝子を含んでもよい。マーカ遺伝子は、バイオサイド耐性、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主における相補性などを含む。組換え発現ベクターに好適なマーカ遺伝子として、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、プロマイシン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【０２８５】
本開示に関して有用なベクターは、「ネイキッド」核酸ベクター（すなわち、それらを包膜するタンパク質、糖、及び／若しくは脂質がほとんど若しくは全くないベクター）、又は他の分子と複合体化したベクターであってよい。ベクターと好適に組み合わせることができる他の分子として、限定されないが、ウイルスコート、カチオン性脂質、リポソーム、ポリアミン、金粒子、並びに細胞分子をターゲッティングするリガンド、受容体、又は抗体などのターゲティング部分が挙げられる。
従来の形質転換又はトランスフェクション技術を用いて、ベクターＤＮＡを細胞、例えば、免疫細胞に導入することができる。本明細書で使用されるとき、用語「形質転換」及び「トランスフェクション」は、外来の核酸（例えば、ＤＮＡ）を細胞に導入するための多様な当技術分野で承認されている技術を指すことが意図され、そうした技術として、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム同時沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介トランスフェクション、リポフェクション、遺伝子ガン、又はエレクトロポレーションが挙げられる。
【０２８６】
タンパク質治療薬
一部の態様では、本明細書に記載の発現構築物に含有させることができる遺伝子によってコードされるポリペプチドを生成し、本明細書に記載の細胞治療薬によって生成されるものの代わりに又はそれに加えて、治療薬として使用することができる。こうしたポリペプチドは、例えば、医薬組成物などの組成物に含有させて、タンパク質治療薬として使用することができる。例えば、細胞治療薬、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞若しくはＡＤＣの標的であるか、またそれを含むポリペプチドを含むタンパク質治療薬は、こうした細胞治療薬、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞若しくはＡＤＣと組み合わせて投与することができる。
【０２８７】
一例では、タンパク質治療薬は、抗原（例えば、本明細書に記載される１つ又は複数のタイプ）に結合する抗体（例えば、本明細書に記載される１つ又は複数のタイプ）の抗原結合断片を含有する抗体融合タンパク質を含む。別の例では、抗体融合タンパク質は、２つの抗原に結合する二重特異性抗体（又は断片）を含む。一部の実施形態では、そうした二重特異性抗体は、例えば、一緒に特定の腫瘍型を規定する、１つ若しくは複数のＴＡＡ及び／又はＴＳＡ標的に結合する。腫瘍型の特異的な認識を可能にするＴＡＡ及び／又はＴＳＡ標的のそうした組合せの例として、例えば、ＣＤ７０及び炭酸脱水酵素ＩＸ（腎細胞癌）、ＭＵＣ１６及びメソテリン（卵巣癌）、並びにその他多数がある。こうした抗原結合断片（例えば、二重特異性）は、次に、細胞治療薬、例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞によって認識されるポリペプチド抗原に融合する。１つの例示的なポリペプチド抗原は、ＣＡＲ−ＣＤ１９Ｔ細胞によって認識されるＣＤ１９のＩｇドメインである。抗体抗原認識ドメインのモジュール特性により、細胞治療薬の標的ポリペプチドに融合させる抗原認識ドメインの多数の組合せの検討が可能になる。
【０２８８】
一部の実施形態では、ポリペプチド抗原、例えば、細胞治療薬によって認識されるものを、抗原結合断片のアミノ（Ｎ）末端に融合させる。一部の実施形態では、ポリペプチド抗原を抗原結合断片のカルボキシ（Ｃ）末端に融合させる。特定の実施形態では、タンパク質治療薬は、本明細書に記載されるＦｃベース構築物であるか、又はそれを含む。
【０２８９】
ポリペプチドを作製する様々な方法が当技術分野で公知であり、これらを用いて、タンパク質治療薬に含有させるポリペプチドを作製することができる。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸を発現させるように操作された宿主細胞系を使用して、組換えにより生成することができる。遺伝子の組換え発現は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を含んでもよい。ポリヌクレオチドが得られたら、当技術分野で公知の技術を用いて、組換えＤＮＡ技術により、ポリペプチド生成のためのベクターを生成することができる。公知の方法を用いて、ポリペプチドコード配列と適切な転写及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えを含む。
【０２９０】
発現ベクターを従来の技術によって宿主細胞に移入した後、トランスフェクトした細胞を従来の技術により培養して、ポリペプチドを生成することができる。
【０２９１】
様々な宿主発現ベクター系を使用することができる（例えば、米国特許第５，８０７，７１５号明細書を参照）。こうした宿主発現系を用いて、ポリペプチドを生成することができ、必要に応じて後に精製することができる。こうした宿主発現系としては、ポリペプチドコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ若しくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物；ポリペプチドコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換させた酵母（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））；ポリペプチドコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ））に感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）ＴＭＶ）に感染させた、又はポリペプチドコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換させた植物細胞系；或いは哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモータ（例えば、メタロチオネインプロモータ）又は哺乳動物ウイルス由来のプロモータ（例えば、アデノウイルス後期プロモータ；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）を含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０、及び３Ｔ３細胞）が挙げられる。
【０２９２】
細菌系の場合、いくつかの発現ベクターを使用することができ、こうしたものとして、限定されないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，ＥＭＢＯ  １２：１７９１）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９）などが挙げられる。グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために、ｐＧＥＸベクターも使用することができる。
【０２９３】
哺乳動物宿主細胞での発現の場合、ウイルスベースの発現系を使用することができる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８  １：３５５−３５９を参照）。適切な転写エンハンサーエレメント、転写終結因子などの含有によって発現の効率を高めることができる（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照）。
【０２９４】
加えて、挿入された配列の発現を調節する、又は所望する特定の様式で遺伝子産物を修飾及びプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。様々な宿主細胞がタンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的且つ特異的機構を有する。発現されるポリペプチドの正しい修飾及びプロセシングを確実にするために、適切な細胞株又は宿主系を選択することができる。こうした細胞として、例えば、樹立された哺乳動物細胞株及び昆虫細胞株、動物細胞、真菌細胞、及び酵母細胞が挙げられる。哺乳動物細胞としては、例えば、以下のものが挙げられる：ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄種細胞株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６，ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；Ｓ４０により形質転換させたサル腎臓ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児腎臓細胞株（懸濁培養のためにサブクローン化した２９３若しくは２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９，１９７７）；ヒト線維肉腫細胞株（例えば、ＨＴ１０８０）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６，１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１，１９８０）；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファロー（ｂｕｆｆａｌｏ）ラット腎細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト腎細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８，１９８２）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；並びにヒト肝細胞株（Ｈｅｐ  Ｇ２）。
【０２９５】
組換えタンパク質の長期高収率生産のために、ポリペプチドを安定的に発現するように宿主細胞を操作する。プロモータ、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位、及び選択マーカをはじめとする、当技術分野で公知の適切な発現制御要素によって制御されるＤＮＡで宿主細胞を形質転換することができる。組換えＤＮＡ技術の当技術分野で周知の方法を用いて、所望の組換えクローンを選択することができる。
【０２９６】
本明細書に記載のタンパク質が組換え発現によって生成されたら、当技術分野で公知の任意の精製方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、較差溶解度により、又は任意の他の標準的なタンパク質精製方法によりそれを精製することができる。例えば、プロテインＡカラムなどのアフィニティカラムを適切に選択し、クロマトグラフィーカラム、濾過、限外濾過、塩析及び透析法と組み合わせることにより、抗体を分離及び精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照）。さらに、本明細書に記載されるように、精製を促進するために、ポリペプチドを異種ポリペプチド配列に融合させることができる。上記に代わり又は加えて、化学的合成により、ポリペプチドの一部又は全部を調製することもできる。上記に代わり又は加えて、天然供給源からポリペプチドを精製することもできる。
【０２９７】
投与
本開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の細胞治療薬（若しくはその集団）、本明細書に記載のタンパク質治療薬、細胞治療薬を含む組成物、及び／又はタンパク質治療薬を含む組成物を、例えば対象を治療するのに有効な量で、対象に投与する方法を含む。一部の実施形態では、本方法は対象の癌を有効に治療する。
【０２９８】
一部の実施形態では、免疫細胞を対象から採取し、これを、本明細書に記載の誘導性発現構築物又は構成性発現構築物、例えば、本明細書に記載の誘導性発現構築物又は構成性発現構築物を含む発現ベクターで形質転換、例えば、形質導入することによって細胞治療薬を取得する。従って、一部の実施形態では、細胞治療薬は、オートロガス細胞を含み、これを、免疫細胞を採取した同じ対象に投与する。或いは、免疫細胞を対象から採取し、これを、本明細書に記載の誘導性発現構築物又は構成性発現構築物、例えば、本明細書に記載の誘導性発現構築物又は構成性発現構築物を含む発現ベクターで形質転換、例えば、形質導入することによって細胞治療薬を取得し、これを別の対象に同種移入する。
【０２９９】
一部の実施形態では、細胞治療薬は、対象にオートロガスであり、対象は、対象から免疫細胞を単離する前に、免疫学的にナイーブ、免疫されている、疾患状態、又は別の状態であってよい。
【０３００】
一部の実施形態では、対象への投与前に別のステップを実施することができる。例えば、本明細書に記載の誘導性発現構築物又は構成性発現構築物（例えば、誘導性発現構築物又は構成性発現構築物を含む発現ベクター）と免疫細胞を接触（例えば、形質導入若しくはトランスフェクト）させた後で、しかも、対象への投与の前に、細胞治療薬をインビトロで拡大することができる。インビトロ拡大は、対象への投与の前に、１日以上、例えば、２日以上、３日以上、４日以上、６日以上、又は８日以上にわたって実施することができる。代わりにまた加えて、インビトロ拡大は、対象への投与の前に、２１日以下、例えば、１８日以下、１６日以下、１４日以下、１０日以下、７日以下、又は５日以下にわたって実施することができる。例えば、インビトロ拡大は、対象への投与の前に、１〜７日、２〜１０日、３〜５日、又は８〜１４日にわたって実施することができる。
【０３０１】
一部の実施形態では、インビトロ拡大中、細胞治療薬を抗原（例えば、ＴＣＲ抗原）で刺激することができる。抗原特異的拡大は、任意選択で、例えば、抗ＣＤ３抗体、抗Ｔａｃ抗体、抗ＣＤ２８抗体、又はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）など、リンパ球増殖を非特異的に刺激する条件下の拡大によって補うことができる。拡大された細胞治療薬を対象に直接投与してもよく、又は将来の使用、すなわち対象への後の投与のために凍結してもよい。
【０３０２】
一部の実施形態では、細胞治療薬をインターロイキン−２（ＩＬ−２）でエクスビボ処置した後、癌患者に注入し、注入後に癌患者をＩＬ−２で治療する。さらに、一部の実施形態では、癌患者は、細胞治療薬の投与の前に、前処置的リンパ枯渇（免疫系の一時的アブレーション）を受けることができる。ＩＬ−２処置及び前処置的リンパ枯渇の組合せは、細胞治療薬の持続性を増大することができる。
【０３０３】
一部の実施形態では、サイトカインをコードする核酸で細胞治療薬を形質導入又はトランスフェクトし、この核酸は、サイトカインの構成性、調節可能、又は一過性制御発現を提供するように操作することができる。好適なサイトカインとしては、例えば、収縮期中のＴリンパ球の生存を増大するために作用するサイトカインがあり、これは、メモリーＴリンパ球の形成及び生存を促進することができる。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、細胞治療薬は、癌治療薬などの別の治療薬の投与前、ほぼ同時、又は投与後に投与する。癌治療薬は、例えば、化学療法薬、生物剤、又は放射線治療であってよい。一部の実施形態では、細胞治療薬を受ける対象に、リンパ枯渇化学療法又は放射線療法などの免疫細胞の枯渇を引き起こすのに十分な治療を投与しない。
【０３０５】
本明細書に記載される細胞治療薬は、組成物、例えば、細胞治療薬及び薬学的に許容される担体として、形成することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の少なくとも１種の細胞治療薬と、薬学的に許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を含む医薬組成物である。本明細書に記載の薬学的に許容される担体、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、及び希釈剤は、公知であり、当業者には容易に入手可能である。好ましくは、薬学的に許容される担体は、活性薬剤、例えば、細胞治療薬に対して化学的に不活性であり、使用条件下で有害な副作用又は毒性を誘発しない。
【０３０６】
組成物は、例えば、静脈内、腫瘍内、動脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、及び／又は皮下投与経路などのいずれかの好適な経路による投与のために製剤化することができる。好ましくは、組成物は、非経口投与経路のために製剤化される。
【０３０７】
非経口に好適な組成物は、水性又は非水性、等張滅菌注射液であってよく、これは、酸化防止剤、バッファー、静菌薬、並びに例えば、組成物を対象レシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる。水性若しくは非水性滅菌懸濁液は、１つ又は複数の懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含有してよい。
【０３０８】
対象、特にヒトに投与される用量は、具体的な実施形態、使用される組成物、投与方法、並びに治療しようとする具体的な部位及び対象によって変動し得る。しかし、用量は、治療応答をもたらす上で十分でなければならない。当技術分野で熟練した臨床医は、特定の医学的状態を治療する、又は予防するために、ヒト又は他の対象に投与すべき組成物の治療有効量を決定することができる。治療有効的であるのに必要な組成物の正確な量は、対象に特有の多くの考慮事項に加えて、例えば、細胞治療薬の具体的な活性、及び投与経路などの様々な要因に応じて変動するが、これは当業者の技術の範囲内である。
【０３０９】
任意の好適な数の細胞治療用細胞を対象に投与することができる。本明細書に記載される単一の細胞治療用細胞で、治療利益を拡大及び提供することができるが、一部の実施形態では、１０２以上、例えば、１０３以上、１０４以上、１０５以上、又は１０８以上の細胞治療用細胞を投与する。代わりに又は加えて、１０１２以下、例えば、１０１１以下、１０９以下、１０７以下、又は１０５以下の本明細書に記載される細胞治療用細胞を対象に投与する。一部の実施形態では、１０２〜１０５、１０４〜１０７、１０３〜１０９、又は１０５〜１０１０の本明細書に記載される細胞治療用細胞を投与する。
【０３１０】
本明細書に記載される細胞治療薬の用量は、哺乳類に一度に投与することもできるし、又は好適な期間にわたって、必要に応じて、例えば、毎日、週２回、毎週、隔週、月２回、隔月、年２回、若しくは年毎に、一連のサブ用量で投与することもできる。必要に応じて、有効量の細胞治療薬を含む１用量単位を単回１日用量として投与してもよく、又は１日の総用量を２、３、４回、若しくはそれを上回って分割して毎日投与してもよい。
【０３１１】
本明細書に記載されるポリペプチドは、医薬組成物中に組み込むことができる（例えば、タンパク質治療薬としての使用のために）。ポリペプチドを含む医薬組成物は、当業者に周知の方法によって製剤化することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｐｐ．１４４７−１６７６（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，１９ｔｈ  ｅｄ．１９９５）を参照）。医薬組成物は、滅菌溶液若しくは水中懸濁液、又は別の薬学的に許容される液体を含む注射液の形態で非経口投与することができる。例えば、医薬組成物は、滅菌水及び生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、矯味賦形剤、希釈剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤などの薬学的に許容されるビヒクル若しくは媒体とポリペプチドを好適に組み合わせた後、一般に認められている製薬基準に必要な単位剤形中で混合することにより製剤化することができる。医薬製剤中に含有させる活性成分の量は、指定範囲内の好適な用量が供給されるような量である。
【０３１２】
注射用の滅菌組成物は、ビヒクルとして注射用蒸留水を用いて、一般的製薬基準に従って製剤化することができる。例えば、グルコース、並びにＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、及び塩化ナトリウムなどの他の添加剤を含有する生理食塩水又は等張液を注射用水溶液として、任意選択で、好適な可溶化剤、例えば、エタノールなどのアルコール及びプロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどのポリアルコール、並びにポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ−５０などのノニオン性界面活性剤などと組み合わせて使用してもよい。
【０３１３】
油性液体の非限定的例として、ゴマ油及びダイズ油が挙げられ、これは、可溶化剤としての安息香酸ベンジル又はベンジルアルコールと組み合わせてもよい。含有させることができる他の品目は、リン酸バッファー、又は酢酸ナトリウムバッファーなどのバッファー、水酸化プロカインなどの無痛化薬、ベンジルアルコール若しくはフェノールなどの安定剤、並びに酸化防止剤である。製剤化した注射液は好適なアンプルにパッケージングすることができる。
【０３１４】
投与経路は、非経口、例えば、注射、経鼻投与、経肺投与、又は経皮投与による投与であってよい。投与は、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射による全身又は局所のいずれであってもよい。
【０３１５】
好適な投与手段は、対象の年齢及び状態に基づいて選択することができる。ポリペプチドを含有する医薬組成物の単回用量は、０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から選択することができる。他方で、用量は、０．００１〜１０００００ｍｇ／体重の範囲内で選択することができるが、本開示は、このような範囲に限定されない。用量及び投与方法は、対象の体重、年齢、状態などに応じて変動し得るものであり、必要に応じて当業者により好適に選択することができる。
【０３１６】
腫瘍
本開示は、あらゆる腫瘍の治療において有用な技術を提供する。一部の実施形態では、腫瘍は、限定されないが、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ランゲルハンス細胞組織球症、多発性骨髄腫、若しくは骨髄増殖性腫瘍などの血液系腫瘍であるか、又はそれを含む。
【０３１７】
一部の特定の実施形態では、腫瘍は、限定されないが、乳癌、扁平上皮細胞癌、結腸癌、頭部及び頚部癌、卵巣癌、肺癌、中皮腫、生殖泌尿器癌、直腸癌、胃癌、若しくは食道癌などの固形腫瘍であるか、又はそれを含む。
【０３１８】
一部の実施形態では、腫瘍は、進行性腫瘍、及び／若しくは不応性腫瘍であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、腫瘍は、腫瘍（例えば、腫瘍から採取した生検試料などの組織サンプル）中に特定の病理が観察される場合、及び／又はそうした腫瘍を有する癌患者が典型的に従来の化学療法の候補ではないとみなされる場合、進行していると特徴付けられる。一部の実施形態では、進行性として腫瘍を特徴付ける病理としては、腫瘍サイズ、遺伝子マーカの発現改変、腫瘍細胞による隣接器官及び／又はリンパ節の浸潤を挙げることができる。一部の実施形態では、腫瘍は、そうした腫瘍を有する患者が１つ若しくは複数１つ若しくは複数の既知の治療法（例えば、１つ若しくは複数１つ若しくは複数の従来の化学療法レジメン）に対して耐性である場合、及び／又は特定の患者が１つ若しくは複数１つ若しくは複数のそうした既知の治療法に対して耐性（例えば、応答性の欠如）を示した場合、不応性と特徴付けられる。
【０３１９】
黒色腫
黒色腫は、アメリカ人男性において新たに診断される第５番目に頻度の高い癌の種類であり、アメリカ人女性では７番目に頻度が高い。浸潤性黒色腫の発生率及び死亡率は、黒色腫発生の危険性がアフリカ系アメリカ人よりはるかに高い白人において、最も高い。４５歳未満の人では、発生率は男性より女性の方が高い。６０歳まででは、男性の黒色腫発生率は、女性の２倍を超え；８０歳まででは、男性が黒色腫を発症する傾向は、女性のほぼ３倍高い。白人における黒色腫の年間発生率は、１９９１年から２０１１年までに６０％超増加した。黒色腫の発生率は、６５歳以上の白人において他の群より急速に増加している。
【０３２０】
黒色腫の危険因子は、日焼けしやすい色白の皮膚、天然若しくは人工日光への高い生涯曝露、日焼けによる水膨れ歴（特に若年時の）、多数の一般的母斑、異型母斑若しくは黒色腫の個人又は家族の病歴、並びに白人であることが挙げられる。黒色腫の標準的治療としては、手術、化学療法、放射線療法、標的療法、及び生物学的療法が挙げられる。
【０３２１】
肺癌
肺癌は、２番目に頻度の高い癌であり、米国において男性及び女性の両方で癌に関連する死亡の主要原因である。肺及び気管支癌の総死亡率は、１９８０年代までに段々上昇し、１９９０年代初めにピークに達し、２００１年以降ゆっくりと下降している。肺癌発生率及び死亡率の傾向は、一定のタイムラグを置いて、喫煙普及の歴史パターンと酷似している。喫煙の普及は、男性より女性の方が遅くピークに達したため、肺癌発生率及び死亡率も男性より女性の方が遅く下降し始めた。発生率は、男性では１９８０年代半ば以降下降しているが、女性では２０００年代半ばからようやく下降しており；死亡率は、男性では１９９１年に下降し始め、女性では２００３年まで下降しなかった。発生率及び死亡率は、アフリカ系アメリカ人男性が最も高く、次に白人男性が続く。
【０３２２】
喫煙は、肺癌の主要原因であるが、肺癌の危険性は、間接喫煙への曝露；例えば、ラドン、作業場の毒素（例えば、アスベスト、ヒ素）、及び大気汚染などの環境への曝露によっても増加する。肺癌の標準的治療としては、手術、放射線療法、化学療法、標的療法、レーザ療法、光線力学療法、凍結手術、内視鏡ステント留置術、及び電気焼灼術が挙げられる。
【０３２３】
頭部及び頚部癌
口腔、喉頭、咽頭、唾液腺、及び鼻／鼻腔の癌をはじめとする、頭部及び頚部癌は、米国における全悪性腫瘍の約３％を占める。アルコール及びタバコが頭部及び頚部癌の２つの突出した危険因子であり、頭部及び頚部癌の少なくとも７５％がアルコール及びタバコの使用に起因する。他の危険因子としては、ヒトパピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）、特にＨＰＶ−１６への感染；Ｐａｎｎ（ビンロウジュ（ｂｅｔｅｌ  ｑｕｉｄ））、Ｍａｔｅ及び特定の保存又は塩蔵食品の消費；口腔の健康状態不良、職業上の曝露又は放射線曝露；エプスタイン・バール・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）感染；並びに家系を挙げることができる。
【０３２４】
大腸癌
大腸癌は、男性及び女性の両方で３番目に頻度の高い非皮膚癌である。これは、米国での癌に関連する主な死亡原因の第２位を占める。過去１０年にわたって、大腸癌の発生率及び死亡率は、アメリカンインディアン／アラスカ先住民を除く全ての人種／民族集団で減少している。３９歳まで男性及び女性は同様の発生率を有し；４０歳を超えると、男性の方が高くなる。
【０３２５】
発生率及び死亡率の両方で人種／民族群間に差が存在する。アフリカ系アメリカ人は、他の全ての人種／民族群より死亡率が高く、アメリカンインディアン／アラスカ先住民を除く全ての群より発生率が高い。発生率及び死亡率は、ヒスパニック系及びアジア系／パシフィックアイランダー間で最も低い。大腸癌の発生率及び死亡率全体が過去２０年にわたって下降しており；このような減少は、主にスクリーニングテストの使用増加によるものである。
【０３２６】
大腸癌の危険因子としては、高齢、大腸ポリープ、大腸癌の家族歴、特定の遺伝子突然変異、過剰なアルコール摂取、肥満、身体不活動、喫煙、及び炎症性腸疾患の病歴などが挙げられる。大腸癌の標準的治療には、手術、化学療法、放射線療法、凍結手術、高周波アブレーション、及び標的療法などがある。
【０３２７】
リンパ腫
ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）をはじめとするリンパ腫は、米国で最も一般的な血液癌であり、２０１４年に米国で診断される新たな癌全体の約５％を占めることが推定される。約７１，０００人の新たなＮＨＬ患者及び約９，２００人の新たなホジキンリンパ腫患者が２０１４年に推定されている。ホジキンリンパ腫の発生率は、白人及びアフリカ系アメリカ人が最も高く、死亡率は、白人、ヒスパニック系、及びアフリカ系アメリカ人が最も高い。
【０３２８】
ホジキンリンパ腫及びＮＨＬ両方の危険因子としては、男性であること、免疫系の低下、又はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）若しくはエプスタイン・バール・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）への感染などが挙げられる。ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）若しくはヒトＴ細胞白血病／リンパ腫ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）への感染は、特定のタイプのＮＨＬに対する危険性を高める。ＮＨＬの危険性は年齢と共に増加し、ホジキンリンパ腫の危険性は、成人早期及びそれ以降の両方で高くなる。両タイプのリンパ腫の標準的治療は、化学療法、放射線療法、及び幹細胞移植である。別の標準的療法として、ホジキンリンパ腫の場合には手術、並びにＮＨＬの場合には標的療法、血漿交換療法、経過観察及び生物学的療法がある。
【０３２９】
Ｂ細胞腫瘍
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＢ細胞特異的抗体（若しくはその部分）／ＣＤ１９融合タンパク質、又はＣＤ１９／Ｂ細胞特異的抗体（若しくはその部分）融合タンパク質を用いて、Ｂ細胞腫瘍を有する対象を治療する。一部の実施形態では、ｓｃＦｖ／ＣＤ１９融合タンパク質、例えば、抗ＣＤ２０ｓｃＦｖ／ＣＤ１９融合タンパク質又は抗ＣＤ２０ｓｃＦｖ／ＣＤ１９断片融合タンパク質を用いて、Ｂ細胞腫瘍を有する対象を治療する。一部の実施形態では、ＣＤ１９／ｓｃＦｖ融合タンパク質、例えば、ＣＤ１９／抗ＣＤ２０ｓｃＦｖ融合タンパク質、又はＣＤ１９断片／抗ＣＤ２０ｓｃＦｖ融合タンパク質を用いて、Ｂ細胞腫瘍を有する対象を治療する。
【０３３０】
一部の実施形態では、Ｂ細胞特異的抗体（若しくはその部分）／Ｂ細胞抗原（若しくはその部分）融合タンパク質、又はＢ細胞抗原（若しくはその部分）／Ｂ細胞特異的抗体（若しくはその部分）融合タンパク質を用いて、Ｂ細胞腫瘍を有する対象を治療する。一部の実施形態では、（ｉ）ＣＤ２２若しくは部分（例えば、ドメイン１〜３の１つ又は複数）、ＣＤ７９若しくは部分（例えば、ＣＤ７９ａ又はＣＤ７９ｂ）、並びに（ｉｉ）Ｂ細胞特異的抗体若しくは部分（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ７２、又はＣＤ１８０ｓｃＦｖ）を含む融合タンパク質を用いて、Ｂ細胞腫瘍を有する対象を治療する。
【０３３１】
一部の実施形態では、Ｂ細胞特異的抗体（若しくはその部分）とＣＤ２０（若しくは部分）を含む融合タンパク質を用いて、Ｂ細胞腫瘍を有する対象を治療する。一部の実施形態では、Ｂ細胞特異的抗体（若しくはその部分）と、ＣＤ２０のエピトープであるか、又はそれを含むＣＤ２０の部分（例えば、Ｎａｔａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９：６８２０−９（２０１３）に記載の通り）を含む融合タンパク質を用いて、Ｂ細胞腫瘍を有する対象を治療する。
【０３３２】
一部の実施形態では、タンパク質治療薬としての上記の融合タンパク質の１つ又は複数でＢ細胞腫瘍を有する対象を治療する。一部の実施形態では、上記の融合タンパク質の１つ又は複数をコードする本明細書に記載の構成性発現構築物を含む細胞治療薬で、Ｂ細胞腫瘍を有する対象を治療する。一部の実施形態では、Ｂ細胞腫瘍を有する対象を、上記の融合タンパク質の１つ若しくは複数をコードするネイキッド核酸で治療するか、又はそうした融合タンパク質をコードする核酸を含む本明細書に記載のウイルスベクターで治療する。
【０３３３】
血液系腫瘍
一部の実施形態では、（ｉ）ＴＳＡに結合する抗原結合タンパク質及び（ｉｉ）ＣＤ１９若しくはその断片を含む本明細書に記載の融合タンパク質を用いて、血液系腫瘍を有する対象を治療する。一部の実施形態では、ＴＳＡ結合タンパク質（例えば、抗ＴＳＡ抗体（若しくはその部分）／ＣＤ１９融合タンパク質、又はＣＤ１９／ＴＳＡ結合タンパク質（例えば、抗ＴＳＡ抗体）融合タンパク質を用いて、血液系腫瘍を有する対象を治療する。一部の実施形態では、血液系腫瘍は、ＣＤ１９発現によって確定されない血液細胞の悪性腫瘍である。一部の実施形態では、血液系腫瘍は、非Ｂ細胞系統悪性腫瘍であってもよい。一部の実施形態では、血液系腫瘍は、例えば、骨髄悪性腫瘍（例えば、急性骨髄悪性腫瘍）、血漿細胞悪性腫瘍、及び骨髄異形成悪性腫瘍を含み得る。一部の実施形態では、ＴＳＡ結合タンパク質（例えば、抗ＴＳＡ抗体）は、いずれか既知のＴＳＡ、例えば、本明細書に記載されるいずれかのＴＳＡに結合し得る。一部の実施形態では、ＴＳＡは、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、又はＣＬＬ−１／ＣＬＥＣＫ１２Ａである。
【０３３４】
一部の実施形態では、（ｉ）ＴＳＡに結合する抗原結合タンパク質及び（ｉｉ）Ｂ細胞抗原又はその部分を含む本明細書に記載の融合タンパク質を用いて、血液系腫瘍を有する対象を治療する。一部の実施形態では、ＴＳＡ結合タンパク質（例えば、抗ＴＳＡ抗体（若しくはその部分）／Ｂ細胞抗原融合タンパク質、又はＢ細胞抗原／ＴＳＡ結合タンパク質（例えば、抗ＴＳＡ抗体）融合タンパク質を用いて、血液系腫瘍を有する対象を治療する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｂ細胞抗原若しくは部分（例えば、ＣＤ２０若しくは部分（例えば、Ｎａｔａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９：６８２０−９（２０１３）に記載される通り）、ＣＤ２２若しくは部分（例えば、ドメイン１〜３の１つ又は複数）、又はＣＤ７９若しくは部分（例えば、ＣＤ７９ａ又はＣＤ７９ｂ））を含む。
【０３３５】
一部の実施形態では、タンパク質治療薬としての上記の融合タンパク質の１つ又は複数を用いて、血液系腫瘍を有する対象を治療する。一部の実施形態では、上記の融合タンパク質の１つ又は複数をコードする本明細書に記載の構成性発現構築物を含む細胞治療薬を用いて、血液系腫瘍を有する対象を治療する。一部の実施形態では、血液系腫瘍を有する対象は、上記の融合タンパク質の１つ若しくは複数をコードするネイキッド核酸で治療するか、又はそうした融合タンパク質をコードする核酸を含む本明細書に記載のウイルスベクターで治療する。
【０３３６】
固形腫瘍
一部の実施形態では、構成性発現構築物を含む本明細書に記載の細胞治療薬を用いて、固形腫瘍を有する対象を治療することができる。一部の実施形態では、構成性発現構築物は、（ｉ）ＴＳＡをターゲッティングする抗原結合タンパク質、及び（ｉｉ）第２細胞治療薬、抗体、又は抗体−薬物複合体の標的を含む本明細書に記載の融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、誘導性発現構築物を含む本明細書に記載の細胞治療薬を用いて、固形腫瘍を有する対象を治療することができる。一部の実施形態では、誘導性発現構築物は、（ｉ）ＴＳＡ又はＴＡＡをターゲッティングする抗原結合タンパク質、及び（ｉｉ）第２細胞治療薬、抗体、又は抗体−薬物複合体の標的を含む本明細書に記載の融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、マスクされた構築物若しくはその部分（本明細書に記載される）であるか、又はそれを含む融合タンパク質を用いて、固形腫瘍を有する対象を治療する。一部の実施形態では、マスクされた抗原結合タンパク質（アンマスキングされると、本明細書に記載のＴＡＡに結合する）及びＣＤ１９若しくは断片を含む融合タンパク質を用いて、固形腫瘍を有する対象を治療する。
【０３３７】
一部の実施形態では、タンパク質治療薬としての上記の融合タンパク質の１つ又は複数を用いて、固形腫瘍を有する対象を治療する。一部の実施形態では、上記の融合タンパク質の１つ又は複数をコードする本明細書に記載の構成性発現構築物を含む細胞治療薬を用いて、固形腫瘍を有する対象を治療する。一部の実施形態では、固形腫瘍を有する対象は、上記の融合タンパク質の１つ若しくは複数をコードするネイキッド核酸で治療するか、又はそうした融合タンパク質をコードする核酸を含む本明細書に記載のウイルスベクターで治療する。
【０３３８】
併用療法
本明細書に記載されるように、一部の実施形態では、細胞治療薬及び／又はタンパク質治療薬は、第２細胞治療薬、抗体−薬物複合体、抗体、及び／又はポリペプチドと組み合わせて投与する。一部の実施形態では、第２細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）による腫瘍のターゲッティング及び／又は殺傷の程度は、本明細書に記載の細胞治療薬又はタンパク質治療薬との併用療法の非存在下で観察若しくは測定されるレベルよりも高い。
【０３３９】
本明細書に記載される細胞治療薬及び／又はタンパク質治療薬を含む医薬組成物は、任意選択で、例えば、化学療法薬若しくは生物剤といった癌治療薬などの１つ若しくは複数の別の治療薬を含有してもよく、及び／又はそれと組み合わせて投与してもよい。本明細書に記載の細胞治療薬と組み合わせて使用することができる化学療法薬の例として、以下のものが挙げられる：白金化合物（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチン）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ナイトロジェンマスタード、チオテパ、メルファラン、ブスルファン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、テモゾロミド、ダカルバジン、及びベンダムスチン）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、プリカマイシン、及びダクチノマイシン）、タキサン（例えば、パクリタキセル及びドセタキセル）、代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシル、シタラビン、プレメトレキセド、チオグアニン、フロクスウリジン、カペシタビン、及びメトトレキサート）、ヌクレオシド類似体（例えば、フルダラビン、クロファラビン、クラドリビン、ペントスタチン、及びネララビン）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、トポテカン及びイリノテカン）、ヒポメチル化剤（例えば、アダシチジン及びデシタビン）、プロテオソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、エピドフィロトキシン（例えば、エトポシド及びテニポシド）、ＤＮＡ合成阻害剤（例えば、ヒドロキシウレア）、ビンカアルカロイド（例えば、ビクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、及びビンブラスチン）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、及びスニチニブ）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、フォテムスチン、及びロムスチン）、ヘキサメチルメラミン、ミトタン、血管新生阻害剤（例えば、タリドミド及びレナリドミド）、ステロイド（例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン、及びプレドニゾロン）、ホルモン剤（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、ロイプロリド、ビカルアトミド、グラニセトロン、及びフルタミド）、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール及びアナストロゾール）、三酸化ヒ素、トレチノイン、非選択性シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えば、非ステロイド性抗炎症剤、サリチル酸塩、アスピリン、ピロキシカム、イブプロフェン、インドメタシン、ナプロシン、ジクロフェナク、トルメチン、ケトプロフェン、ナブメトン、及びオキサプロジン）、選択性シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤、又はこれらの任意の組合せ。
【０３４０】
本明細書に記載される組成物及び方法で使用することができる生物剤の例としては、以下のものが挙げられる：モノクローナル抗体（例えば、リツキシマブ、セツキシマブ、パネツムマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、ベバシズマブ、カツマキソマブ、デノスマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、ラムシルマブ、ペルツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、ニモツズマブ、ラムブロリズマブ、ピジリズマブ、シルツキシマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＲＧ７４４６／ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、トレメリムマブ、若しくは本明細書の表１に列記するその他）、酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）、サイトカイン（例えば、インターフェロン及びインターロイキン）、増殖因子（例えば、コロニー刺激因子及びエリスロポエチン）、癌ワクチン、遺伝子療法ベクター、又はこれらの任意の組合せ）。
【０３４１】
一部の実施形態では、本明細書に記載される治療方法は、医学的状態の他の治療が失敗したか、又は他の手段による治療であまり成果がなかった対象に対して実施される。さらに、本明細書に記載される治療方法は、医学的状態の１つ又は複数の別の治療と一緒に実施することができる。例えば、本方法は、本明細書に記載の細胞治療薬及び／若しくはタンパク質治療薬、又はそれらの組合せの投与前、ほぼ同時、又は投与後に、癌レジメン、例えば、骨髄非破壊的化学療法、手術、ホルモン療法、及び／若しくは放射線を投与するステップを含んでよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞治療薬及び／若しくはタンパク質治療薬が投与される対象は、抗生物質及び／又は１つ若しくは複数の別の薬剤で治療することもできる。
【０３４２】
本開示の例示的なアミノ酸及びヌクレオチド配列を以下の表に列記する。
【表２−１】
2019503200.tif 000006
【表２−２】
2019503200.tif 000007
【表２−３】
2019503200.tif 000008
【表２−４】
2019503200.tif 000009
【０３４３】
本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、本明細書に記載のタンパク質及び／又は構築物は、開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ／又は本明細書に開示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【０３４４】
本明細書で引用される、ＧｅｎＢａｎｋ配列をはじめとする全ての刊行物は、参照により本明細書に明示的に組み込むものとする。
【実施例】
【０３４５】
実施例１．抗体−ＣＤ１９融合タンパク質の構築
抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体パニツムマブ、ヒト化抗ｃ−ＭＥＴモノクローナル抗体ＬＹ２８７５３５８（エミベツズマブ）、又は抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体トラスツズマブを用いて、ＣＤ１９といずれかの完全長抗体若しくはｓｃＦｖを含有する融合タンパク質を生成した。Ｃ末端に１３アミノ酸が欠失し、且つＣＤ１９の２つのＣ２型Ｉｇドメイン（「ＣＤ１９−Ｄ１＋Ｄ２」、ＣＤ１９遺伝子のエキソン１〜４の非コード及びコード配列を含む）を含むＣＤ１９の細胞外ドメインを、図１３に概略的に示すように、様々な配向で完全長抗体に融合した。いくつかの構築物では、融合タンパク質にＣＤ１９ドメイン１（「ＣＤ１９−Ｄ１」）又はドメイン２（「ＣＤ１９−Ｄ２」）を単独で使用した。いくつかの構築物では、ＣＤ１９の完全長細胞外ドメイン（「ＣＤ１９−ＥＣＤ」；配列番号１１２）を使用した。
【０３４６】
パニツムマブ−ＣＤ１９融合タンパク質は、パニツムマブ−ＣＤ１９融合タンパク質をコードする核酸を含有するベクターを発現することによって２９３Ｔ細胞中に生成した。本明細書に記載のパニツムマブの重鎖及び軽鎖のコード配列を用いて、ｐｃＤＮＡ由来のベクター中で合成遺伝子配列を設計した。合成遺伝子配列は、ＣＤ１９−Ｄ１＋Ｄ２ドメインがフレーム内で重鎖のＮ末端、若しくは重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＮ末端、若しくは軽鎖のＣ末端のいずれかで融合された、パニツムマブ抗体配列をコードした。
【０３４７】
２９３Ｔ細胞において、ＬＹ２８７５３５８−ＣＤ１９融合タンパク質をコードする核酸を含有するベクターを発現することによってＬＹ２８７５３５８−ＣＤ１９融合タンパク質を生成した。ＬＹ２８７５３５８の重鎖及び軽鎖のコード配列（本明細書に記載される）を用いて、ｐｃＤＮＡ由来のベクター中で合成遺伝子配列を設計した。合成遺伝子配列は、ＣＤ１９−Ｄ１＋Ｄ２ドメインがフレーム内で重鎖のＮ末端、若しくは重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＮ末端、若しくは軽鎖のＣ末端のいずれかで融合された、ＬＹ２８７５３５８抗体配列をコードした。いくつかの構築物では、ＣＤ１９−Ｄ１又はＣＤ１９−Ｄ２のみを融合タンパク質に使用した。いくつかの構築物では、ＣＤ１９−ＥＣＤを使用した。
【０３４８】
トランスフェクションの際に、２９３Ｔ細胞を９０〜９５％密集となるように培養した。第０日に２ｍｌ／ウェル（１プレート当たり６ウェル）中に細胞を１×１０ｅ６で接種し、一晩培養した。細胞は、第１日に約９０％密集に達した。重鎖及び軽鎖をコードするベクターＤＮＡをトランスフェクション試薬と混合した。第１日に１５０μｌの無血清ＯｐｔｉＭＥＭ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）を１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合してから、室温で５分間インキュベートした（Ａ部）。別のチューブ内で２．５μｇの各ベクターＤＮＡ（重鎖及び軽鎖）を混合した（Ｂ部）後、１５０μｌの無血清ＯｐｔｉＭＥＭ（商標）を添加した。次に、Ａ部とＢ部を穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートした。続いて、２ｍｌ細胞培地中の細胞を含むウェルにトランスフェクション試薬を直接添加した。４８時間後、細胞培養物の上清を採取した。
【０３４９】
パニツムマブ−ＣＤ１９及びＬＹ２８７５３５８−ＣＤ１９融合タンパク質の発現レベルを、融合タンパク質を発現する細胞の培養物からのウエスタンブロット分析によって決定した。トランスフェクションから４８時間後に細胞培養物から１ｍｌの上清を取得した。細胞培地をＰＢＳ中２０μｌの５０％ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗスラッシュ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と室温で３時間穏やかに揺らしながら混合した。捕捉された抗体が結合したプロテインＡビーズを遠心分離により旋回させ、ＰＢＳで洗浄した。洗浄ステップを繰り返した。次に、還元剤としてＤＴＴを含む２０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加して、ビーズによって捕捉された抗体を全て除去した。還元条件下でタンパク質を分離するために、溶解物（１０μｌ）をＢｉｏ−Ｒａｄ製の４〜２０％ポリアクリルアミドゲルにロードした。ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体を用いて重鎖及び軽鎖を同定した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、酵素によりペルオキシダーゼシグナルを検出し、Ｃｈｅｍｉ  Ｄｏｃ  ＭＰ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）及びＩｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェアを用いて、得られたバンドをイメージングした。発現レベルを図１４Ａ及び１４Ｂに示す。図１４Ａ及び１４Ｂには、以下の構築物の発現を示す：パニツムマブ重鎖（配列番号１）及びパニツムマブ軽鎖（配列番号４）（構築物「１＋４」）；ＣＤ１９−Ｄ１＋２−パニツムマブＬＣ（配列番号３２）及びパニツムマブＨＣ（配列番号１）（構築物「３２＋１」）；ＣＤ１９−Ｄ１＋２−パニツムマブＨＣ（配列番号３３）及びパニツムマブＬＣ（配列番号４）（構築物「３３＋４」）；パニツムマブＬＣ−ＣＤ１９−Ｄ１＋２（配列番号３４）及びパニツムマブＨＣ（配列番号１）（構築物「３４＋１」）；パニツムマブＨＣ−ＣＤ１９−Ｄ１＋２（配列番号３５）及びパニツムマブＬＣ（配列番号４）（構築物「３５＋４」）；ＣＤ１９−Ｄ１＋２−ＬＹ２８７５３５８ＬＣ（配列番号３６）及びＬＹ２８７５３５８ＨＣ（配列番号７）（構築物「３６＋７」）；ＣＤ１９−Ｄ１＋２−ＬＹ２８７５３５８ＨＣ（配列番号３７）及びＬＹ２８７５３５８ＬＣ（配列番号１０）（構築物「３７＋１０」）；ＬＹ２８７５３５８ＬＣ−ＣＤ１９−Ｄ１＋２（配列番号３８）及びＬＹ２８７５３５８ＨＣ（配列番号７）（構築物「３８＋７」）；ＬＹ２８７５３５８ＨＣ−ＣＤ１９−Ｄ１＋２（配列番号３９）及びＬＹ２８７５３５８ＬＣ（配列番号１０）（構築物「３９＋１０」）；ＬＹ２８７５３５８ＨＣ（配列番号７）及びＬＹ２８７５３５８ＬＣ（配列番号１０）（構築物「７＋１０」）。
【０３５０】
図１４に示すように、ＣＤ１９含有重鎖及び軽鎖は検出可能であり、非修飾重鎖及び軽鎖よりも高分子量で泳動した（例えば、図１４Ａ（パニツムズマブ）でのレーン１と３、並びに図１４Ｂ（ＬＹ２８７５３５８）のレーン７と１０を比較）。
【０３５１】
ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質は、図１５に概略的に示すように、抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ由来のｓｃＦｖと、ｓｃＦｖのＮ末端若しくはＣ末端に融合したＣＤ１９（すなわち、親抗体の連結したＶＨ及びＶＬ配列）を用いて生成した。ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質は、Ｃ末端ＨＩＳタグ（例えば、構築物＃４０及び４２）又はヒトＩｇＧ（「ｈｕＩｇＧＦｃ」）由来のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（例えば、構築物＃４１及び４３）を含有するように設計した。いくつかの構築物には、融合タンパク質のためにＣＤ１９−Ｄ１又はＣＤ１９−Ｄ２のみを使用した。いくつかの構築物には、ＣＤ１９−ＥＣＤを使用した。
【０３５２】
構築物が直鎖状であるため、発現させる配列をコードするただ１つのベクターを使用した以外は、前述したのと同じ方法を用いて、ｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質を２９３Ｔ細胞に発現させた。ｓｃＦｖ−融合タンパク質の発現レベルは、ウエスタンブロット分析によって決定した。プロテインＡを被覆したビーズを用いて、Ｆｃタグ付けｓｃＦｖ融合タンパク質を免疫沈降させ、還元ゲル上で泳動させて、抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ染色及び酵素検出によって検出した。抗ＨＩＳ樹脂（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＨＩＳタグ付けｓｃＦｖ融合タンパク質を免疫沈降させ、抗ＨＩＳポリクローナル抗体−ペルオキシダーゼコンジュゲート及び酵素的検出によって検出した。トラスツズマブｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質の発現を図１６に示す。
【０３５３】
実施例２．抗体−ＣＤ１９融合タンパク質は抗ＣＤ１９抗体により認識される
特異的結合を示す様々な方法を用いて、抗ＣＤ１９抗体（ＦＭＣ６３）が実施例１に記載した様々な抗体−ＣＤ１９融合タンパク質に結合する能力を決定した。
【０３５４】
図１７Ａ〜１７Ｄは、実施例１に記載したパニツムマブ−ＣＤ１９融合タンパク質とＦＭＣ６３との結合を示す。ＥＬＩＳＡプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を１μｇ／ｍｌのＦＭＣ６３抗ヒトＣＤ１９抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で、４℃において一晩被覆した。プレートをＴＢＳ中の０．３％ＮＦ粉乳で室温において１時間遮断した。細胞培養上清をＥＬＩＳＡバッファー中のウェルに直接添加した後、１：３から１：２１８７への希釈を順次行った。ＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳＴ（５０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）ＥＬＩＳＡバッファーで穏やかに３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ共役ポリクローナル抗ヒトＩｇＧを添加して、結合したヒト抗体を検出した。このアッセイフォーマットにおいて、プレート表面に被覆されたＦＭＣ６３へのＣＤ１９の結合を介してヒト抗体を保持する。特異性を立証するために、別の対照も使用した（図１８に示す）。「ｍＡｂのみ」は、ＣＤ１９融合物を保有しない親抗体の添加を示し、「擬似Ｔｆｘ」は、トランスフェクションプロトコルで処理したが、ベクターは一切添加していないウェルからの培地の添加を示す。結合は、試験した４つの融合タンパク質全て（ＣＤ１９と重鎖及び軽鎖とのＮ及びＣ末端融合物に対応する；図１８）についてバックグラウンドを超えることが立証された。結合の強度は、ウエスタンブロットに示されるように、タンパク質発現の量を表すことが判明した（図１４Ａ）。
【０３５５】
図１９Ａ〜１９Ｄは、パニツムマブ−ＣＤ１９融合タンパク質について記載したのと同じ方法を用いて、実施例１に記載したＬＹ２８７５３５８−ＣＤ１９融合タンパク質とＦＭＣ６３との結合を示す。図２０に示すように、ＬＹ２８７５３５８−ＣＤ１９融合タンパク質とＦＭＣ６３との結合は、パニツムマブ−ＣＤ１９融合タンパク質の実施例について記載したように、「ｍＡｂのみ」及び「擬似Ｔｆｘ」対照と比較して特異的であった。
【０３５６】
この実施例は、抗ＣＤ１９抗体が抗ＣＤ１９融合タンパク質を認識し得ることを立証している。図２１に、実施例１に記載した抗体−ＣＤ１９融合タンパク質の発現、及びＦＭＣ６３との結合をまとめる。
【０３５７】
図２２は、ＦＭＣ６３被覆ＥＬＩＳＡプレートに対するＣＤ１９−Ｄ１＋２−トラスツズマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）融合タンパク質（実施例１に記載の構築物＃４２）の結合を示す。結合したｓｃＦｖ−融合タンパク質をペルオキシダーゼ結合抗ＨＩＳ抗体で検出した。ＣＤ１９のＣ末端（構築物＃４２にはない）に結合する抗ＣＤ１９ｍＡｂである３Ｂ１０は、結合しなかったことに留意されたい。
【０３５８】
実施例３．ＬＹ２８７５３５８−ＣＤ１９融合タンパク質は、Ａ５４９癌細胞に結合し、抗ＣＤ１９抗体に結合する
ＬＹ２８７５３５８−ＣＤ１９融合タンパク質（実施例１に記載の構築物「３７＋１０」）がＡ５４９癌細胞及びＦＭＣ６３（抗ＣＤ１９抗体）に結合する能力を蛍光活性化細胞選別（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）（別名「ＦＡＣＳ」又は「フローサイトメトリー」）によってテストした。Ａ５４９細胞は、ＬＹ２８７５３５８によって特異的に認識される癌細胞関連タンパク質ｃ−ＭＥＴを発現する。ＬＹ２８７５３５８ＨＣ（配列番号７）及びＬＹ２８７５３５８ＬＣ（配列番号１０）を２９３Ｔ細胞で発現させ、細胞培養物上清をＡ５４９細胞と一緒にインキュベートした。氷上で３０分間のインキュベーション後、細胞をＦＡＣＳバッファー（１％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で洗浄した。次に、フローサイトメータ内で特殊なレーザにより活性化されると蛍光シグナルを発する抗ヒトＩｇＧフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートと一緒に細胞をインキュベートすることにより、結合した抗体を検出した。得られたＦＡＣＳシグナルは、計器により検出された平均蛍光強度（ＭＦＩ）の増加として見ることができ、これによってシグナルがより高くシフトされる（図２３Ａに示す右側のシフト）。構築物「３７＋１０」融合タンパク質を含有する上清をＡ５４９細胞と一緒にインキュベートしたとき、類似のシフトが検出された。重要なことに、Ａ５４９細胞と結合した構築物「３７＋１０」融合タンパク質は、抗ＣＤ１９抗体ＦＭＣ６３を用いて、フィコエリスリン（ＰＥ）がフローサイトメータにより活性化されたＰＥ−コンジュゲート、又は抗ヒトＩｇＧＦＩＴＣが後に結合する精製済抗体のいずれかとして検出することができた（図２３Ｂ〜Ｃ）。これらの結果は、ＬＹ２８７５３５８−ＣＤ１９融合タンパク質が抗体結合ドメインによるｃ−ＭＥＴの認識によってＡ５４９細胞と結合し、次に、この融合タンパク質がＦＭＣ６３抗ＣＤ１９抗体によって認識されたことを示す。従って、抗体結合ドメインとＣＤ１９との両方はインタクトであった。この実施例は、ＬＹ２８７５３５８−ＣＤ１９融合タンパク質がｃ−ＭＥＴを発現する細胞及び抗ＣＤ１９抗体に結合することができたことを立証するものである。
【０３５９】
実施例４．トラスツズマブｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質は、Ｈｅｒ２及び抗ＣＤ１９抗体に結合する
２つのトラスツズマブｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質（ＣＤ１９−Ｄ１＋２−トラスツズマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）；実施例１に記載の構築物＃４２；及びＣＤ１９−Ｄ１＋２−トラスツズマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）−ｈｕＩｇＧＦｃ；実施例１に記載の構築物＃４３）がＨｅｒ２及び抗ＣＤ１９抗体（ＦＭＣ６３）に結合する能力を決定した。ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌのＦＭＣ６３抗ＣＤ１９抗体で被覆してから、ＨＩＳタグ付け構築物＃４２又はＦｃ−融合構築物＃４３を含有する細胞培養物上清を様々な希釈物に添加した。室温で１時間のインキュベーション及び洗浄後、精製済ビオチン化ＨＥＲ２タンパク質（ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を１μｇ／ｍｌの濃度でさらに１時間室温において添加し、プレートを再度洗浄し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを添加して、ＨＥＲ２と共役した結合ビオチンを検出した（図２４Ａ、Ｂ）。特異性を立証するためのさらなる一連の実験において、ビオチン化ＨＥＲ２タンパク質に代わって無関係のビオチン化タンパク質を使用する（「ビオ−ＥｐＣＡＭ」、「ビオ−ＥＧＦＲ」）か、又はトラスツズマブｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質の代わりにトラスツズマブｓｃＦｖの非共役形態を使用する（「＃１７−ビオ−ＨＥＲ２」）か、又はトラスツズマブｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質の代わりに培地のみを添加した（「培地−ビオ−ＨＥＲ２」）。これらの結果から、抗ＣＤ１９抗体によってＥＬＩＳＡプレート上に捕捉されたトラスツズマブｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質に対するビオチン化ＨＥＲ２の結合の特異性が立証された（図２５Ａ、Ｂ）。図２４Ａに示すように、構築物＃４２は、ＦＭＣ６３とＨｅｒ２抗原との両方に結合した。図２４Ｂは、構築物＃４３融合タンパク質もＦＭＣ６３とＨｅｒ２抗原との両方に結合したことを示す。この実施例は、トラスツズマブｓｃＦｖ−ＣＤ１９融合タンパク質がＨｅｒ２及び抗ＣＤ１９抗体に結合することができたことを立証するものである。
【０３６０】
実施例５．様々な融合タンパク質のＥＬＩＳＡ分析
方法
以下に記載する様々な融合タンパク質についてＥＬＩＳＡを実施した。手短には、９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ＃１５０４１）を０．１Ｍ炭酸塩、ｐＨ９．５中の１．０μｇ／ｍｌの試薬で、一晩４℃で被覆した。次に、プレートをＴＢＳ（２００μｌ／ウェル）中の０．３％脱脂粉乳（ＮＦＤ）で、１時間ＲＴで遮断した。続いて、プレートを洗浄バッファー（１×ＴＢＳＴ：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。１つの非希釈細胞培養物上清又はウェル当たり１００μｌ、段階的３×希釈物を含む１．０μｇ／ｍｌの精製済タンパク質から滴定を実施し、ＲＴで１時間インキュベートした。希釈バッファーは、１×ＴＢＳ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）中の１％ＢＳＡであり、続いて、洗浄バッファーで３回洗浄する。１μｇ／ｍｌ濃度のビオチン化試薬などの二次試薬をＲＴで１時間（必要に応じて）添加した。ＨＲＰ共役試薬を１：２０００で添加し、１ウェル当たり１００μｌ塗布して、ＲＴの暗所において１時間インキュベートした。１ウェル当たり１００μｌの１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｒｏｄ♯３４０２８）を添加した。発色が起こったとき、プレートを４０５ｎｍで読み取った。
【０３６１】
以下の試薬を使用した。
・ヒトＣＤ１９（２０−２７８）タンパク質、Ｆｃタグ：ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃ＣＤ９−Ｈ５２５５
・ヒトＣＤ１９（２０−２９１）タンパク質、Ｈｉｓタグ：ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃ＣＤ９−Ｈ５２２６
・抗ＣＤ１９（３Ｂ１０）：ＮＯＶＵＳ，Ｃａｔ♯ＮＢＰ２−４６１１６
・抗ＣＤ１９（ＭＦＣ６３）：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ♯ＭＡＢ１７９４
・ヒトＨｅｒ２／ＥｒｂＢ２タンパク質、Ｆｃタグ：ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃ＨＥ２−Ｈ５２５３
・ヒトＥＧＦ  Ｒタンパク質、Ｆｃタグ：ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃ＥＧＲ−Ｈ５２５２
・ヒトＢＣＭＡタンパク質、Ｆｃタグ：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃１９３−ＢＣ−０５０
・ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ＃３１１３０
・６×−Ｈｉｓエピトープタグ抗体：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ＃ＰＡ１−９８３Ｂ
・６×−Ｈｉｓエピトープタグ抗体、ＨＲＰコンジュゲート：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ＃ＭＡ１−２１３１５−ＨＲＰ
・Ｐｉｅｒｃｅ高感受性ストレプトアビジン−ＨＲＰ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ＃２１１３０
・ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＨＲＰコンジュゲート：Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ♯１１５−０３５−０６２
・ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＨＲＰコンジュゲート：Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ♯１０９−０３５−０８８
以下の表に、この実施例で検定した様々な融合タンパク質を列記する。
【表３−１】
2019503200.tif 000010
【表３−２】
2019503200.tif 000011
【表３−３】
2019503200.tif 000012
【０３６２】
結果
図２６は、抗Ｈｉｓ抗体被覆ＥＬＩＳＡプレート上に捕捉された融合タンパク質を示す。図２６に示すように、Ｃ末端−Ｈｉｓタグ付けＣＤ１９−ｓｃＦｖ融合タンパク質の結合能力が立証された（図２６、矢印）。ＣＤ１９−ＥＣＤ−ＭＯＣ３１ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）（構築物＃５２）及びＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）（構築物＃６３）がＣ末端Ｈｉｓタグに対する抗体を介してＥＬＩＳＡプレート上に捕捉された。一旦結合したら、ＣＤ１９タンパク質を認識するＨＲＰ結合抗ＣＤ１９モノクローナル抗体３Ｂ１０を用いて、融合タンパク質を検出した。このように、陽性シグナルにより、融合タンパク質のＣ末端及びＮ末端の両方がインタクトであり、結合し得ることが立証された。
【０３６３】
図２７は、抗Ｈｉｓ抗体被覆ＥＬＩＳＡプレート上に捕捉された融合タンパク質を示す。図２７に示すように、Ｃ末端−Ｈｉｓタグ付けＣＤ１９−ｓｃＦｖ融合タンパク質の結合能力が立証された。Ｈｉｓタグ付けＣＤ１９タンパク質（Ｄ１＋Ｄ２；構築物＃２８）をＣＤ１９認識のための陽性対照として作製した。融合タンパク質は、Ｃ末端Ｈｉｓタグに対する抗体を介してＥＬＩＳＡプレート上に捕捉された。一旦結合したら、抗ＣＤ１９マウスモノクローナル抗体ＦＭＣ６３を用いて、融合タンパク質を検出した。マウスＩｇＧＦｃドメインに対するＨＲＰ結合ポリクローナル抗体を用いて、結合したＦＭＣ６３を検出した。このように、陽性シグナルにより、融合タンパク質のＣ末端及びＮ末端の両方がインタクトであり、結合し得ることが立証された。
【０３６４】
図２８は、抗ＦＭＣ６３（抗ＣＤ１９）被覆プレート上に捕捉され、次に抗Ｈｉｓ−ＨＲＰで検出された融合タンパク質を示す。図２８に示すように、Ｃ末端−Ｈｉｓタグ付けＣＤ１９−ｓｃＦｖ融合タンパク質の結合能力が立証された。融合タンパク質は、抗ＣＤ１９マウスモノクローナル抗体ＦＭＣ６３で被覆したＥＬＩＳＡプレート上に捕捉された。ＦＭＣ６３は、Ｎ末端ＣＤ１９タンパク質と結合することによって融合タンパク質を捕捉する。一旦結合したら、融合タンパク質上のｃ末端Ｈｉｓタグを認識するＨＲＰ結合抗Ｈｉｓ抗体を用いて、融合タンパク質を検出した。このように、陽性シグナルにより、融合タンパク質のＣ末端及びＮ末端の両方がインタクトであり、結合し得ることが立証された。
【０３６５】
図６５Ａ、６５Ｂ、及び６５Ｃは、別のＣＤ１９含有融合タンパク質（構築物＃４２、＃４３、＃５６、＃８２、＃８３、＃９１、＃９２、＃９３、＃９４）と図２８に記載するＦＭＣ６３被覆ＥＬＩＳＡプレートの結合を示す。結合した融合タンパク質を、ペルオキシダーゼ結合抗ＨＩＳ抗体又はペルオキシダーゼ結合抗ｈＩｇＧ抗体を用いて検出した。図６５Ｄは、精製済構築物＃４２に対する滴定による融合タンパク質構築物力価の推定値を示す。
【０３６６】
図６５Ｃは、ＣＤ１９二重特異性融合タンパク質（構築物＃９４）が発現され、抗ＣＤ１９抗体ＦＭＣ６３に結合し、これが、Ｃ末端Ｈｉｓタグに結合した抗Ｈｉｓ抗体によって検出されたことを明らかにする。これは、このタンパク質がインタクトであること、並びにＮ及びＣ末端が存在したことを示す。対照は、トラスツズマブｓｃＦｖのみを含む融合タンパク質（構築物＃４２）による、及びトラスツズマブｓｃＦｖ−ｈｕＩｇＧＦｃ融合タンパク質（構築物＃４３）による強力な結合を示す。ｈｕＩｇＧＦｃをＣＤ１９タンパク質の正確にＣ末端の位置に移すと、ＦＭＣ６３ｍＡｂとの結合が低下した融合タンパク質（構築物＃５６及び＃９３）が得られた。
【０３６７】
図２９は、「サンドイッチＥＬＩＳＡ」フォーマットのＣＤ１９−抗Ｈｅｒ２トラスツズマブｓｃＦｖ−ヒトＦｃ融合タンパク質（構築物＃２９、４３、５６）の検出を示す。ポリクローナル抗ヒトＩｇＧＦｃポリクローナル抗体を用いて、ヒトＦｃドメインをプレートに結合させた。一旦結合したら、ＨＲＰに結合した異なる抗ヒトＩｇＧＦｃポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質を検出した。結果から、これらの融合タンパク質が発現されること、並びにヒトＦｃドメインが存在することが立証された。
【０３６８】
図３０及び３１は、様々なＥＬＩＳＡフォーマットによって検出された融合タンパク質を示す。図３０は、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＦＭＣ６３による複数の融合タンパク質（構築物＃５２、５３、５４、６３）の捕捉及びＨＲＰに結合した抗Ｈｉｓ抗体によるそれらの検出を示す。さらに、図３１は、逆のフォーマットを用いて、ＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）融合タンパク質（構築物＃６３）が検出されたことを示し、ここで、タンパク質は、Ｃ末端Ｈｉｓタグを介して捕捉され、次にマウスモノクローナル抗体ＦＭＣ６３抗ＣＤ１９、続いて抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰによって検出された。これらの結果は、これらの融合タンパク質の所望の結合特性が維持されたことを立証するものである。
【０３６９】
図３２は、ＣＤ２２タンパク質ドメイン、又は抗ＥＧＦＲｖＩＩＩｓｃＦｖを組み込む融合タンパク質の結果を示す。図３２は、短縮且つ最適化された形態である、ＣＤ２２タンパク質が、タンパク質の細胞外部分の最初の３つのＮ末端ドメイン及び特定の突然変異をコードする２つのフォーマットをｓｃＦｖに良好に融合し得ることを明らかにする。構築物＃６４及び＃６５は、Ｃ末端Ｈｉｓタグを介して捕捉され、Ｎ末端のＣＤ２２を検出した。対照的に、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質に融合した同じＣＤ２２タンパク質は十分に検出されず（＃６８）、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩｓｃＦｖに融合したＣＤ１９タンパク質（＃６７）も同様であった。
【０３７０】
図３３は、同じ抗体、パニツムマブから得られたタンパク質−抗体融合タンパク質（構築物「３３＋４」）及びタンパク質−ｓｃＦｖ融合タンパク質（構築物＃５７及び５８）についての結果を示す。プレートを抗Ｈｉｓ抗体で被覆し、結合したタンパク質をビオチン化ＥＧＦＲタンパク質及びストレプトアビジン−ＨＲＰで検出した。図３３は、パニツムマブ及びパニツムマブ由来のｓｃＦｖ融合タンパク質がＣ末端Ｈｉｓタグによってプレートに結合すると、それらの抗原リガンド、ＥＧＦＲと結合する能力があったことを明らかにする。図３３はまた、Ｈｅｒ２細胞外ドメイン（完全長又はドメイン４（Ｄ４）のみ）がパニツムマブ及びパニツムマブ由来のｓｃＦｖ結合機能を破壊しないことも示す。Ｈｅｒ２融合タンパク質は、これに関してＣＤ１９融合タンパク質と同様であった。
【０３７１】
図６６Ａ〜６６Ｄは、プレート結合抗原による様々な融合タンパク質（構築物＃４２、＃５２、＃８９、＃９０、＃９１、＃９２、＃９４、＃９５、＃９６、＃９７）の捕捉、並びにＨＲＰに結合した抗Ｈｉｓ抗体によるそれらの検出を示す。表示されるように、ヒトＢＣＭＡ−Ｆｃ（図６６Ａ）、Ｈｅｒ２−Ｆｃ（＃４２、＃９４）又はＥＧＦＲ−Ｆｃ（＃９４、＃５７）（図６６Ｂ）、及びＨｅｒ２−Ｆｃ又はＥＧＦＲ−Ｆｃ（図６６Ｄ）は、ポリクローナル抗ヒトＩｇＧＦｃポリクローナル抗体を用いてプレートに結合させた。表示の融合タンパク質（精製済若しくは発現）によるトランスフェクションから得られた上清を被覆プレートに添加して、インキュベートさせた。洗浄後、ＨＲＰ共役抗ＨＩＳ抗体を用いて結合タンパク質を検出した。これは、融合タンパク質がそれぞれの抗原に結合する能力を維持することを立証するものである。さらに、融合タンパク質＃９４（図６６Ｂ、６６Ｃ）及び融合タンパク質＃９５、＃９６、及び＃９７（図６６Ｃ〜６６Ｄ）は、Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲに対してコードされたｓｃＦｖを介して捕捉されたが、これは、両方のｓｃＦｖが、生成された融合タンパク質において機能性であったことを示す。
【０３７２】
実施例６．様々な融合タンパク質の標的親和性の分析
ＣＤ１９タンパク質と抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の結合及びトラスツズマブｓｃＦｖと精製済Ｈｅｒ２タンパク質の結合についてのＣＤ１９−Ｄ１＋２−トラスツズマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）融合タンパク質（構築物＃４２）の結合親和性を評価した。
【０３７３】
方法
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＦＭＣ６３で被覆した。プレートを４℃で一晩インキュベートさせた。被覆プレートをＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ／０．３％脱脂粉乳（ＮＦＤ）で３０分間３７℃において遮断した。精製済ＣＤ１９−Ｄ１＋２−トラスツズマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）融合タンパク質をＰＢＳ／ＮＦＤで希釈し、最終濃度の３ｌｏｇ超にわたる０．００５μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの様々な量で添加した。融合タンパク質を３７℃で１時間インキュベートさせた後、プレートを洗浄し、ＨＲＰ結合抗Ｈｉｓ抗体を３７℃で３０分間かけて添加してから、製造者の指示に従い、酵素的検出のために使用した。Ｓｏｆｔｍａｘソフトウェアの４パラメータ曲線あてはめ関数を用いて、見掛けＥＣ５０を計算した。
【０３７４】
次に、Ｈｅｒ２に対するＦＭＣ６３結合ＣＤ１９−Ｄ１＋２−トラスツズマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）融合タンパク質の結合親和性を評価した。前述と同様に、ＥＬＩＳＡプレートを被覆し、洗浄した後、融合タンパク質と一緒にインキュベートした。続いて、精製済Ｈｅｒ２−Ｆｃの滴定物をウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートさせた。ＰＢＳでの洗浄後、ＨＲＰ結合抗ｈＩｇＧＦｃ抗体を添加してから、３７℃で３０分間インキュベートした。製造者の指示に従い、酵素的検出によりＨＲＰを検出した。
【０３７５】
ＣＤ１９−Ｄ１＋２−トラスツズマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）融合タンパク質のＨｅｒ２に対する結合親和性は、親（トラスツズマブ）ｓｃＦｖ（構築物＃１６）のＨｅｒ２に対する結合親和性とも比較した。ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌのＨＥＲ２−ｈＦｃで一晩４℃において被覆した。プレートをＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ／ＮＦＤで、１時間３７℃で遮断した。ＰＢＳでもう１回洗浄した後、タンパク質又は上清をプレートに滴定しながら添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳでプレートを再度洗浄し、ＨＲＰ結合抗Ｈｉｓ抗体を３７℃で３０分間かけて添加して、製造者の指示に従って展開させた。前述した通りに見掛けＥＣ５０を計算した。
【０３７６】
結果
精製済ＣＤ１９−Ｄ１＋２−トラスツズマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）融合タンパク質は、０．１４ｎＭの見掛けＥＣ５０でＦＭＣ６３抗体に結合した（図３４）が、これは、ＦＭＣ６３由来のＣＡＲ構築物ｓｃＦｖに結合する精製済ＣＤ１９について記載されている０．４ｎＭのＥＣ５０と非常に類似していた（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｉ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３４：１１５７−１１６５）。ＦＭＣ６３結合ＣＤ１９−Ｄ１＋２−トラスツズマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）融合タンパク質のＨｅｒ２に対する結合親和性をＥＬＩＳＡフォーマットで評価した。図３５に示すように、このフォーマットでの見掛け親和性は、０．１８ｎＭであった（丸は、精製済ＣＤ１９タンパク質対照を示すが、Ｈｅｒ２に結合しなかったため、検出されなかった）。発現された抗Ｈｅｒ２ｓｃＦｖに対する融合タンパク質中のｓｃＦｖの親和性を比較した。タンパク質上清の見掛け親和性は、Ｈｅｒ２について非常に似通っており、発現された融合タンパク質が０．３３ｎＭの見掛け親和性で結合するのに対し、発現されたｓｃＦｖの見掛け親和性は、０．７７ｎＭであった（図３６）。精製済融合タンパク質の親和性は、０．４ｎＭであり、精製がＨｅｒ２に対する融合タンパク質の結合能力に影響を与えなかったことを示す（図３６）。これらの親和性は、トラスツズマブｓｃＦｖについて公開されたものと非常に類似している（０．３ｎＭ、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３：５５６３−５５７４）。
【０３７７】
実施例７．フローサイトメトリーによる様々な融合タンパク質の分析
方法
必要に応じて、分析しようとする細胞をＰＢＳ中の０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて脱離させ、氷冷ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ＋０．１％アジ化ナトリウム）で２回洗浄した。細胞をＦＡＣＳバッファー（５×１０５／μｌ／テスト）中に再懸濁させた。精製済タンパク質（最終濃度が最大１０μｇ／ｍｌ）、又は２００μｌの上清を、１００μｌのＦＡＣＳバッファー中に懸濁させた細胞に添加した後、４℃で３０分間インキュベートした。氷冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳバッファー（５×１０５／１００μｌ／テスト）中に再懸濁させ、ＦＡＣＳバッファー中の検出抗体と一緒に４℃で３０分間インキュベートした。二次抗体が必要な場合、細胞を洗浄した後、検出ステップのために所望の濃度の二次抗体を４℃で３０分かけて添加した。次に、サンプルを氷冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、細胞をＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒドで固定してから、Ａｃｃｕｒｉ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
【０３７８】
実施例５に記載のいくつかの構築物を検定した。追加構築物を以下の表に列記する。
【表４】
2019503200.tif 000013
【０３７９】
結果
安定な形質転換体株２９３−ＣＤ２０を２００μｌの融合タンパク質ＣＤ１９−ＥＣＤ−Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）（構築物＃６３）、次に、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体ＦＭＣ６３−ＰＥコンジュゲート（別名「２９３−ＣＤ２０＋＃６３＋ＦＭＣ６３−ＰＥ」）と一緒にインキュベートした。図３７に示すように、小さい正シフトが対照に対してフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）プロフィールに観察された。
【０３８０】
図３８は、２９３−ＣＤ２０＋２００μｌの融合タンパク質ＣＤ１９−Ｄ１＋２−Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）（構築物＃８３）の分析を示す。ＦＭＣ６３−ＰＥを用いて、２９３−ＣＤ２０細胞に結合した融合タンパク質を検出した。結果は、＃６３に比べ、ＦＡＣＳプロフィールにおいて良好なシフトを示した。これは、短縮型ＣＤ１９タンパク質（Ｄ１＋Ｄ２、すなわちエキソン１〜４がコードされ、細胞外ドメインの最後の１３アミノ酸が欠失している）が、完全長細胞外ドメインよりも、この融合タンパク質フォーマットにおいて（＃６３と＃８３を比較）ＦＭＣ６３と有効に結合するためである。さらに、図６７Ａは、αＨＩＳ−ＰＥによって検出された、２９３−ＣＤ２０細胞に結合した構築物＃８３の様々な濃度の分析を示す。図６７Ｂは、ＦＭＣ６３−ＰＥによって検出された、２９３−ＣＤ２０細胞に結合した構築物＃８３の様々な濃度の分析を示す。これらの結果は、融合タンパク質が細胞表面上のＣＤ２０に良好に結合し、検出抗体により認識されるべきＣＤ１９ドメインを提示するという結論をさらに支持するものである。
【０３８１】
図３９は、２９３−ＣＤ２０＋２００μｌの融合タンパク質ＣＤ１９−Ｄ１＋２−Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ（ＶＬ／ＶＨ）（構築物＃８５）の分析を示す。ＦＭＣ６３−ＰＥを用いて、２９３−ＣＤ２０細胞に結合した融合タンパク質を検出した。この結果から、ｌｅｕ１６ｓｃＦｖは、＃８３の逆にコードされた融合タンパク質を示すこと：従って、＃８３がＶＨ、続いてＶＬをコードするのに対し、＃８５は、ＶＬ、続いてＶＨをコードすることが判明した。ＶＬ−ＶＨｌｅｕ１６ｓｃＦｖは、細胞に結合しなかったため、ＣＤ１９（融合タンパク質のＮ末端成分）は検出されなかった。
【０３８２】
図４０は、２９３−ＣＤ２０＋２００μｌの融合タンパク質ＣＤ１９−Ｄ１＋２−Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）−ｈｕＩｇＧＦｃ（構築物＃８２）の分析を示す。抗ｈｕＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体を用いて、２９３−ＣＤ２０細胞に結合した融合タンパク質を検出した。図４１は、抗ｈｕＩｇＧ−ＦＩＴＣ陰性対照：２９３−ＣＤ２０細胞＋抗ｈｕＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体（２μｌ）の分析を示す。この実験は、ＣＤ１９−Ｄ１＋２−Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）−ｈｕＩｇＧＦｃ（図４０）が、平均蛍光強度（ＭＦＩ）により、陰性対照（図４１）に対して少なくとも１−ｌｏｇで結合したこと、並びに９１．７％の２９３−ＣＤ２０細胞がＦＡＣＳプロフィールにおいて陽性染色されたことを明らかにした。これは、ヒトＩｇＧＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）に結合した融合タンパク質が細胞表面上のＣＤ２０に良好に結合して、検出抗体（抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ共役）によって認識されるべきＣ末端ヒトＩｇＧＦｃドメインを提示したことを立証するものである。さらに、図６８Ａは、α−ｈＩｇＧ−ＦＩＴＣによって検出された、２９３−ＣＤ２０細胞に結合した構築物＃８２の様々な濃度の分析を示す。図６８Ｂは、ＦＭＣ６３−ＰＥによって検出された、２９３−ＣＤ２０細胞に結合した構築物＃８２の様々な濃度の分析を示す。これらの結果は、ヒトＩｇＧＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）に結合した融合タンパク質が細胞表面上のＣＤ２０に良好に結合し、検出抗体により認識されるべきＣ末端ＩｇＧＦｃドメインを提示したという結論をさらに支持するものである。
【０３８３】
図４２は、２９３−ＣＤ２０＋２００μｌの融合タンパク質ＣＤ１９−Ｄ１＋２−Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ（ＶＬ／ＶＨ）−ｈｕＩｇＧＦｃ（構築物＃８４）の分析を示す。抗ｈｕＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体を用いて、２９３−ＣＤ２０細胞に結合した融合タンパク質を検出した。この実験から、構築物＃８５の融合タンパク質と同様に、この融合タンパク質フォーマットで、ｓｃＦｖをＶＬ−ＶＨとして良好にコードすることができなかったことが判明した。
【０３８４】
図４３は、２９３−ＣＤ２０＋２００μｌの融合タンパク質ＣＤ２２−Ｄ１２３−Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）（構築物＃６５）＋抗Ｈｉｓ−ＰＥ抗体の分析を示す。図４３は、ＣＤ２２の最初の３つのドメイン（さらに突然変異していた）をＬｅｕ１６ｓｃＦｖに融合させた融合タンパク質ＣＤ２２−Ｄ１２３−Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）がＣ末端Ｈｉｓタグに対する抗体によって２９３−ＣＤ２０細胞の表面上で検出されたことを明らかにする。
【０３８５】
図４４〜４６は、融合タンパク質がパニツムマブｓｃＦｖによるＥＧＦＲ結合を介してトラスツズマブをＨｅｒ２−陰性／ＥＧＦＲ−陽性細胞に架橋することを明らかにする。図４４は、Ｈｅｒ２−Ａ４３１細胞＋トラスツズマブ−ＰＥの検出対照を示し、これは、バックグラウンドレベルの結合を示す（Ａ４３１細胞は、Ｈｅｒ２−低／陰性である）。図４５は、Ａ４３１＋融合タンパク質Ｈｅｒ２−ＥＣＤ−パニツムマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）（構築物＃５７）＋ＰＥ−共役トラスツズマブの分析を示す。図４６は、Ａ４３１＋融合タンパク質Ｈｅｒ２−Ｄ４−パニツムマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）（構築物＃５８）＋ＰＥ−共役トラスツズマブの分析を示す。これらの結果は、Ｈｅｒ２−抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖ融合タンパク質がＥＧＦＲ−陽性細胞に結合してＨｅｒ２を提示し、これにより、次にこれが抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体トラスツズマブに結合されたことを立証するものである。
【０３８６】
図７３〜７６は、さらに、融合タンパク質が抗原結合ドメインを他の抗原結合ドメインと架橋し得ることを明らかにする。２９３Ｔ細胞を、リポフェクタミン２０００試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、製造者の指示に従い、ＨＥＲ２又はＥＧＦＲｃＤＮＡ発現構築物（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）で一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、ＥＤＴＡ溶液を用いて、組織培養プレートから細胞を穏やかに取り出した。ＦＡＣバッファーで洗浄した後、トランスフェクト細胞を、表示の発現融合タンパク質を含有する上清と一緒にインキュベートした。インキュベーションは全て、４℃で実施した。低温ＦＡＣバッファーで細胞を洗浄した後、２μｇ／ｍｌのＨＥＲ２−ｈｕＩｇＧＦｃ又はＥＧＦＲ−ｈｕＩｇＧＦｃのいずれかを添加し、細胞と一緒にインキュベートした。結合融合タンパク質をフローサイトメータ（Ａｃｃｕｒｉ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上の抗ｈｕＩｇＧＦｃ−ＦＩＴＣ共役抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｃａｔ  ♯：１００−０９６−０９８）で検出した。
【０３８７】
図７３Ａ及び７３Ｂは、発現を確認するために、抗ＥＧＦＲ又は抗ＨＥＲ２抗体で染色した対照サンプルを示す。図７４Ａ〜７４Ｄは、２９３Ｔ−Ｈｅｒ２発現細胞に結合する構築物＃４３により発現される融合タンパク質を示す。蛍光標識抗ＣＤ１９抗体（ＦＭＣ６３−ＰＥ）が存在する（図７４Ａ対７４Ｃ）か、又は蛍光標識抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（抗ｈｕＩｇＧ−Ｆｃ−ＦＩＴＣ）が存在する（図７４Ｂ対７４Ｄ）いずれかの場合、シグナルの増加が認められた。図７５Ａ〜７５Ｄは、構築物＃９４、及び＃９５と２９３Ｔ−Ｈｅｒ２発現細胞の結合を示す。組換えＦｃタグ付けＥＧＦＲ（ＥＧＦＲ−Ｆｃ）を、融合タンパク質＃９４に結合した細胞と一緒にインキュベートしたとき、融合タンパク質＃９４について蛍光シグナルの増加が認められたが、これは、抗ＨＥＲ２及び抗ＥＧＦＲｓｃＦｖの両方が、発現された融合タンパク質中で機能性であることを示す。対照的に、抗ＥＧＦＲｓｃＦｖがＶＨ／ＶＬではなくＶＬ／ＶＨとして含まれる構築物＃９５は、ＨＥＲ２陽性細胞との結合が乏しく、あったとしてもごくわずかであることが判明した。図７６Ａ及び７６Ｂは、精製済可溶性ＨＥＲ２−Ｆｃ及びｈｕＩｇＧ−Ｆｃの検出によって検出される融合タンパク質＃９４と２９３Ｔ−ＥＧＦＲ発現細胞の結合を示す。
【０３８８】
実施例８．融合タンパク質によるＣＡＲ１９Ｔ細胞ターゲッティング及び活性化
特定の構築物（実施例５に記載）の発現から得られた様々な融合タンパク質及び下記の標的細胞株の存在下で、ＣＡＲ１９Ｔ細胞の活性化及び細胞傷害性を評価した。
【０３８９】
方法
１．Ｈｅｒ２に結合する融合タンパク質によりＢＴ４７４細胞をターゲティングするＣＡＲ１９Ｔ細胞
Ｈｅｒ２発現標的細胞としてＢＴ４７４細胞を使用した。表示の構築物により発現された、以下のサンプルを重複して使用した。
・ＢＴ４７４＋構築物＃４２融合タンパク質＋ＣＡＲ−Ｔ
・ＢＴ４７４＋構築物＃２８タンパク質＋ＣＡＲ−Ｔ
・ＢＴ４７４＋ＣＡＲ−Ｔ
・ＢＴ４７４＋構築物＃４２融合タンパク質又は構築物＃２８タンパク質
・ＢＴ４７４のみ
・ＣＡＲ−Ｔ＋構築物＃４２融合タンパク質又は構築物＃２８タンパク質
・ＣＡＲ−Ｔのみ
【０３９０】
第１日において、腫瘍細胞株ＢＴ４７４を細胞培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ）中に平底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ♯１３０１８８）の１ウェル当たり１×１０４で接種した。１つのプレートを２４時間の培養及び分析のために接種し、第２のプレートは、４８時間の培養及び分析のために接種した。第２日において、構築物＃４２の融合タンパク質（実施例５に記載）又は対照タンパク質（実施例５に記載の構築物＃２８）を０．５μｇ／ウェルで表示の通り添加した後、細胞培養インキュベータを用いて、３７℃で１時間インキュベートした。
【０３９１】
ＣＡＲ−ＣＤ１９指向性Ｔ細胞（Ｐｒｏｍａｂからの）を、液体窒素中に維持された一定分量バイアルから新しく解凍し、培地で１回洗浄して、ＤＭＳＯを除去した。次に、ＣＡＲ１９Ｔ細胞を９６ウェルプレートに、表示の通り、標的がＢＴ４７４細胞の場合、１０：１又は１：１のＴ細胞：標的細胞（別名エフェクター：標的）細胞比を用いて添加した。
【０３９２】
第３日において、２４時間の培養プレートを分析のために回収した。細胞培養物上清を取り出し、後のインターフェロンγ測定のために−２０℃で凍結した。プレートをＲＰＭＩ１６４０で２回穏やかに洗浄し、続いて１００μｌの培地を各ウェルに添加した後、ＸＴＴ細胞傷害性アッセイを実施した。第４日において、２４時間プレートについて用いたのと全く同じ手順で４８時間培養プレートを分析のために回収した。
【０３９３】
ＸＴＴ細胞増殖アッセイ（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃３０−１０１１Ｋ）
ＸＴＴ試薬のアリコート及び活性化試薬を使用前に３７℃で急速解凍した。次に、０．１ｍｌの活性化試薬を５．０ｍｌのＸＴＴ試薬に添加した。続いて、５０μｌの活性化−ＸＴＴ溶液を各ウェルに添加した。プレートを細胞培養インキュベータ内に２〜４時間配置し、発色についてモニターした。プレートの吸光度を波長４５０ｎｍで読み取った。細胞死％（別名：細胞傷害性）を以下のように計算した。
殺傷％＝［１−ＯＤ（実験ウェル−対応するＴ細胞数）／ＯＤ（Ｔ細胞−培地を含まない腫瘍細胞）］×１００
【０３９４】
ＥＬＩＳＡによるインターフェロンγ濃度アッセイ
９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、製品＃１５０４１）を０．１Ｍ炭酸塩バッファー、ｐＨ９．５中の１．０μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＩＦＮγ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｃａｔ♯５５１２２１）で一晩４℃において被覆した。次に、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）中の０．３％脱脂粉乳溶液２００μｌ／ウェルを用いて、プレートを１時間室温で遮断した。プレートを洗浄バッファー（１×ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。２４時間又は４８時間培養プレート（前述参照）からの１００μｌの培養物上清をＥＬＩＳＡプレートに添加した。組換えヒトＩＦＮγ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ♯ＲＩＦＮＧ１００）の滴定も、３００ｎｇ／ｍｌから段階的３×希釈により２ｐｇ／ｍｌまで同じプレート中で実施して標準曲線を作成した。次に、プレートを室温で１時間インキュベートした。希釈バッファーは、１％ＢＳＡを含む１×ＴＢＳ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）であった。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。ビオチン化マウス抗ヒトＩＦＮγ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｃａｔ♯５５４５５０）を１μｇ／ｍｌ濃度で添加してから、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートをさらに洗浄バッファーで３回洗浄した。ＨＲＰ共役ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ♯２１１３０）を原液から１：２０００希釈で、１ウェル当たり１００μｌ添加した。次に、プレートを室温の暗所において１時間インキュベートした。プレートをさらに洗浄バッファーで３回洗浄した。１ウェル当たり１００μｌの１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ発色溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ♯３４０２８）を各ウェルに添加した。発色が十分に起こったとき、プレートを波長４０５ｎｍで読み取った。
【０３９５】
２．ＣＤ２０結合融合タンパク質による、２９３−ＣＤ２０細胞をターゲッティングするＣＡＲ１９Ｔ細胞の分析
ＣＤ２０を発現する２９３細胞を標的細胞として用いて、前述と同じＸＴＴアッセイにより検定した。
【０３９６】
３．ＥＧＦＲ結合融合タンパク質による、Ａ４３１細胞をターゲッティングするＣＡＲ１９Ｔ細胞の分析
ＥＧＦＲを発現する標的細胞として、Ａ４３１細胞を用いて、前述と同じＸＴＴアッセイにより検定した。
【０３９７】
結果
構築物＃４２融合タンパク質について２４時間後のＩＦＮγＥＬＩＳＡの概略的結果を図４７（１０：１エフェクター：標的比）及び図４８（１：１エフェクター：標的比）に示す。いずれの場合もＩＦＮγ濃度の増加は、バックグラウンドに対して＞２倍であった。構築物＃８３融合タンパク質について２４時間後のＩＦＮγＥＬＩＳＡの概略的結果を図６９Ａ（１０：１エフェクター：標的比）及び図６９Ｂ（２：１エフェクター：標的比）に示す。構築物＃８３融合タンパク質について４８時間後のＩＦＮγＥＬＩＳＡの概略的結果を図６９Ｃ（１０：１エフェクター：標的比）及び図６９Ｄ（２：１エフェクター：標的比）に示す。構築物＃３３−４について２４時間後のＩＦＮγＥＬＩＳＡの概略的結果を図７０（２：１エフェクター：標的比）に示す。
【０３９８】
図４９は、構築物＃４２融合タンパク質及びＢＴ４７４細胞を用いた４８時間後の１０：１エフェクター：標的比のＸＴＴ−細胞傷害性結果の概要を示し、バックグラウンドに対して＞３倍の細胞傷害性増加を呈示する。これらの結果は、構築物＃４２の融合タンパク質の添加により、Ｈｅｒ２−陽性（及びＣＤ１９−陰性）細胞を殺傷するように、ＣＡＲ１９Ｔ細胞のターゲッティング活性が良好に再指向されたことを立証するものである。追加的ＩＦＮγ濃度対照を図５０及び５１に示す。
【０３９９】
図７１Ａは、構築物＃８３融合タンパク質及び２９３−ＣＤ２０細胞を用いた４８時間後の１０：１エフェクター：標的比のＸＴＴ−細胞傷害性結果の概要を示す。図７１Ｂは、構築物＃８３融合タンパク質及び２９３−ＣＤ２０細胞を用いた４８時間後の２：１エフェクター：標的比のＸＴＴ−細胞傷害性結果の概要を示す。負の値は、アッセイ過程での活発な細胞増殖を示す。これらの結果は、融合タンパク質（＃８３）の添加により、抗ＣＤ２０ｓｃＦｖ−ＣＤ１９タンパク質融合物を介してＣＤ２０−陽性（及びＣＤ１９−陰性）細胞を殺傷するように、ＣＡＲ１９Ｔ細胞のターゲッティング活性が良好に再指向されたことを立証するものである。
【０４００】
図７２Ａは、構築物＃３３＋＃４及びＡ４３２１細胞を用いた２４時間後の１０：１エフェクター：標的比のＸＴＴ−細胞傷害性結果の概要を示す。図７２Ｂは、構築物＃３３＋＃４及びＡ４３２１細胞を用いた２４時間後の２：１エフェクター：標的比のＸＴＴ−細胞傷害性結果の概要を示す。これらの結果は、融合タンパク質（構築物＃３３＋＃４、同時発現）の添加により、抗ＥＧＦＲ−ＣＤ１９タンパク質融合物を介してＥＧＦＲ−陽性（及びＣＤ１９−陰性）細胞を殺傷するように、ＣＡＲ１９Ｔ細胞のターゲッティング活性が良好に再指向されたことを立証するものである。図７７Ａは、ＣＤ１９ＣＡＲ構築物（配列番号７１：ＦＭＣ６３ＣＡＲ−１９構築物Ｆｌａｇタグ付け−１）を安定して発現するトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞から分泌される構築物＃４２融合タンパク質の発現及び分泌を示す。捕捉のための抗体ＦＭＣ６３と、検出のためのＨＲＰ共役抗ＨＩＳ抗体を用いて、本明細書に記載されるＥＬＩＳＡ手順により、融合タンパク質の分泌の検出を実施した。図７７Ｂは、構築物＃４２によりコードされる融合タンパク質のＣＡＲ１９Ｔ細胞分泌によってＨＥＲ２＋細胞に再指向されたＣＡＲ１９媒介の細胞傷害性を示す。１×１０４ＨＥＲ２＋ＢＴ４７４細胞を１２ウェル細胞培養プレートの各ウェル中に平板培養した。＃４２が挿入された、又は挿入されていないＪｕｒｋａｔ−＃７１安定株を、ＸＴＴアッセイを用いた細胞傷害性分析のために、ＢＴ４７４細胞を含むウェルに２：１の比で添加した。Ｔ細胞とＢＴ４７４細胞の２４時間の同時培養後にアッセイを実施した。アッセイの陽性対照は、Ｊｕｒｋａｔ−７１と架橋する構築物＃４２融合タンパク質からの精製済融合タンパク質の使用及びＣＡＲ１９Ｔ細胞（Ｐｒｏｍａｂ）と架橋する構築物＃４２融合タンパク質からの精製済融合タンパク質の使用であった。ＣＡＲ１９構築物＃７１で安定にトランスフェクトした後、構築物＃４２で一過的にトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞は、コードされた＃４２融合タンパク質を分泌し、ＨＥＲ２＋ＢＴ４７４細胞の殺傷の再指向を媒介することができた。
【０４０１】
実施例９．Ｊｕｒｋａｔ細胞中の構成性及び誘導性プロモータの分析
方法
１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ培地中でＪｕｒｋａｔ細胞を増殖させて、以下のようにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｎｅｏｎエレクトロポレーションシステムを用いてトランスフェクトした。全てのステップは室温で実施した。約１．４×１０７個の細胞を１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を取り出し、カルシウム又はマグネシウムなしのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で細胞を２回洗浄した後、前述のように遠心分離した。Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム１００μｌキット（ｃａｔ．＃ＭＰＫ１００９６）に供給された１．３ｍｌのＲ再懸濁バッファー中に細胞を再懸濁させた。約１０６のＪｕｒｋａｔ細胞を含有する１００μｌの細胞懸濁液を各エレクトロポレーションのために使用した。ＤＮＡ構築物（最小ＤＮＡ濃度０．７３μｇ／μｌ；最大ＤＮＡ濃度１．４８μｇ／μｌ）を各々１０μｌの最大量で１．５ｍｌチューブに添加した後、細胞を配分した。混合物を穏やかに混合し、Ｎｅｏｎチップに導入した。Ｎｅｏｎトランスフェクションシステムキットに供給される、３ｍｌの電解バッファーＥ２が充填されたＮｅｏｎエレクトロポレーションチューブにおいて、１６００ボルト、１０ｍｓ及び３パルスの設定で細胞及びＤＮＡ混合物をエレクトロポレーションした。次に、細胞を６ウェルディッシュ内の２ｍｌのＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ中に導入し、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。第２日に各ウェルからの細胞をピペッティングし、１２ウェルディッシュ（各１ｍｌ）の２ウェルに移した。一方のウェルは、刺激しないまま維持し、他方のウェルは、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）で様々な時間にわたって刺激した。６時間、１８時間又は４８時間後、フローサイトメータ（Ａｃｃｕｒｉ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりＦＬ１チャンネルでＧＦＰリポータの発現を読み取った。抗ヒトＣＤ６９染色（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３２８８−３２９８）を用いて、細胞の活性化状態を決定した。
【０４０２】
次の構築物を評価した：ＣＭＶプロモータ−ｔＧＦＰ（配列番号２６６）；ヒトＣＤ６９プロモータ−ｔＧＦＰ（配列番号２４６）；ヒトＴＮＦαプロモータ−ｔＧＦＰ（配列番号２４７）；及びＮＦＡＴ要素×６プロモータ−ｔＧＦＰ（配列番号２４９）。対照としてＤＮＡなしのエレクトロポレーションを使用した。
【０４０３】
５×１０５細胞／テストを用いてフローサイトメトリーを実施し、ＦＬ１にゲーティングして、ｔＧＦＰを検出した。抗ＣＤ６９−ＰＥ共役抗体を１００μｌ中１０μｌ／テストで使用した（ＢＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＣＤ６９に対するＰＥ（フィコエリスリン）蛍光染料−共役抗体をＦＬ２チャンネルで読み取った。ＦＡＣＳバッファーは、１％ＢＳＡと０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳであった。最終洗浄後、細胞を２％パラホルムアルデヒド中に固定した。
【０４０４】
結果
図６１Ｂ及び６１Ｄに示すように、構成性ＣＭＶプロモータはＪｕｒｋａｔ細胞活性化によりわずかに影響を受け、増加したＭＦＩのｔＧＦＰゲートに約４％多く細胞が存在した。しかし、陽性ゲートに１４．７〜１７．９％細胞を有する非活性化サンプルに示されるように（図６０Ａ及び６０Ｃを参照）、構成性活性化は十分であった。
【０４０５】
誘導性プロモータの場合、ＰＭＡ及びイオノマイシンを用いて細胞を活性化させて、標準Ｔ細胞活性化を模倣した。これらの活性化条件（「Ｐ＋Ｉ」）下で、ＴＮＦプロモータは、６時間後にＭＦＩに顕著な影響をもたらし（図６２Ａ〜Ｄを参照）、ＣＤ６９プロモータは、４８時間後の陽性細胞％及びＭＦＩの両方に劇的な影響をもたらす（図６１Ａ〜６１Ｄを参照）。これらの知見は、Ｔ細胞活性化後のＴＮＦ及びＣＤ６９上方制御の既知動態と一致し、ここで、ＴＮＦは、急速且つ一時的な活性化を有するが、ＣＤ６９は、徐々に上昇した後、高レベルを維持する（Ｓａｒｅｎｅｖａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９３：３５０−３５７；Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３２８８−３２９８）。細胞表面上のＣＤ６９の発現は、１８時間後に上昇制御を示し、これは４８時間まで持続し（図６４Ａ〜６４Ｄを参照）、ＣＤ６９−ｔＧＦＰプロモータデータを支持する。ＮＦＡＴ×６は、６時間後にわずかな影響をもたらしたに過ぎず、ここに示した中で最も弱いことが明らかになった（図６３Ａ〜Ｄを参照）。結果を以下の表にまとめる。
【表５】
2019503200.tif 000014
【０４０６】
実施例１０．ヘテロマー融合タンパク質の分析
方法
ＣＤ１９−Ｄ１＋Ｄ２−ｈｕＩｇＧＦｃ（実施例５に記載の構築物＃２９）とトラスツズマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）−ｈｕＩｇＧＦｃ（アミノ酸配列番号１０３：ヌクレオチド配列番号３０３；構築物＃１０３）の同時発現を２９３Ｔ細胞において分析した。構築物＃２９のみ、又は＃２９と＃１０３をコードするヌクレオチド配列でリポフェクタミン２０００を用いて２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし；３日後上清を採取した。構築物＃２９ホモ二量体の検出のためにｍＡｂ  ＦＭＣ６３で、また、構築物＃２９＋＃１０３ヘテロ二量体の検出のためにはＨＥＲ２＋ｈｕＩｇＧＦｃでＥＬＩＳＡプレートを被覆した。上清を被覆プレートに添加して、１時間インキュベートさせた。洗浄後、結合したタンパク質を、＃２９のホモ二量体についてＨＲＰ共役抗ｈｕＩｇＧ抗体を用いて検出した。＃２９＋＃１０３のヘテロ二量体は、ｍＡｂ  ＦＭＣ６３、続いてＨＲＰ共役マウスＩｇＧ抗体の結合によって検出した。
【０４０７】
図７８は、構築物＃１０３（トラスツズマブｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）−ｈｕＩｇＧＦｃを発現する）と一緒に構築物＃２９（ＣＤ１９−Ｄ１＋Ｄ２−ｈｕＩｇＧＦｃを発現する）を同時トランスフェクトすると、ホモ二量体とヘテロ二量体が形成されることを示し、ここで、一方のアームは、ＣＤ１９−Ｄ１＋Ｄ２−ｈｕＩｇＧＦｃで、他方のアームは、ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）−ｈｕＩｇＧＦｃである。ヘテロ二量体の形成は、トラスツズマブ（Ｈｅｒ２−Ｆｃ）のリガンドを用いて複合体を捕捉し、抗ＣＤ１９ｍＡｂ、ＦＭＣ６３を用いて検出することにより、検出された。
【０４０８】
実施例１１  −  ＣＤ１９及び変異体の酵母ディスプレイ
本開示に論じるように、一部の実施形態では、ＣＤ１９をスカフォールドとして用いて、目的の標的に結合することができるＣＤ１９変異体を生成することができる。この実施例では、こうしたＣＤ１９変異体をスクリーニングするための酵母ディスプレイライブラリの生成を示す。
【０４０９】
野生型ＣＤ１９細胞外ドメインの酵母ディスプレイ
ヒト野生型ＣＤ１９の細胞外ドメイン（アミノ酸１〜２７２）を、ポリペプチドリンカーを介して、Ａｇａ２ｐのＣ末端又はＮ末端のいずれかに遺伝子的に融合させた。Ｃ末端ｃ−ｍｙｃエピトープタグを有する融合構築物をＥＢＹ１００サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母内に発現させた。フルオレセイン共役マウス抗ｃ−ｍｙｃエピトープ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）で標識した後、酵母毎にＣＤ１９発現をフローサイトメトリーにより評価した。実験は、以下：Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１，７５５−７６８（２００６）に記載されている通りに実施した。図７９に示すように、野生型ＣＤ１９細胞外ドメインは、Ａｇａ２ｐ−リンカー−ＣＤ１９（図７９Ａ）又はＣＤ１９−リンカー−Ａｇａ２ｐ（図７９Ｂ）いずれかのフォーマットにおいて、Ａｇａ２ｐとの融合物として酵母表面上に有効にディスプレイされた。
【０４１０】
酵母にディスプレイされたＣＤ１９ＥＣＤは、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に有効に結合する
Ｃ末端ｃ−ｍｙｃエピトープタグを有する融合構築物をＥＢＹ１００サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母内に発現させた。フルオレセイン共役ヤギ抗ｃ−ｍｙｃエピトープ抗体並びに表示のマウスモノクローナル抗体、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７−共役抗マウス抗体で標識した後、酵母毎のＣＤ１９発現及び抗体結合をフローサイトメトリーにより評価した。実験は、以下の文献に記載の通りに実施した：Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１，７５５−７６８（２００６）。図８０に示すように、酵母にディスプレイされたＣＤ１９細胞外ドメインは、市販の抗ＣＤ１９ｍＡｂ  ＵｌｔｒａｍＡｂ１０３（Ｏｒｉｇｅｎｅ）及び３Ｂ１０（Ｎｏｖｕｓ）に有効に結合した。
【０４１１】
コンビナトリアルリガンドライブラリの作製及び初期分析
ＣＤ１９ＥＣＤを多様化して、様々な分子標的に対する新しい結合機能性を生み出すことができる（Ｗｏｌｄｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｓｉｔｅｗｉｓｅ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｅｖｏｌｖｅｄ  Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０，ｅ０１３８９５６（２０１５）を参照）。これを例示するために、Ｉｇドメイン１、若しくはＩｇドメイン２の溶媒曝露ループ、又はＩｇドメイン２のβシート表面を変更した。多様性設計の例を図８１に示す。相同性モデルを以下のように決定した。Ｎ末端ドメイン、ドメインリンカー、及びＣ末端ドメインからなるＣＤ１９の２５８残基アミノ酸配列を、デフォルトパラメータを用いてＨＨＰｒｅｄ３に付した。次に、ＨＨＰｒｅｄメイクモデルを使用して、最良テンプレートオプションの自動選択を用い、ＭＯＤＥＬＬＥＲ４のモデルを作製した。最適な単一テンプレート（１ｑｚ１）をＭＯＤＥＬＬＥＲのために選択した（注：複数の最適テンプレートを選択するオプションでも、１ｑｚ１と類似の構造を出力する）。次に、出力された構造を、側鎖再充填、及び全構造最小化により、Ｆｏｌｄｉｔ５中で単独に改良した。
【０４１２】
これらのライブラリ例は、Ｗｏｌｄｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｓｉｔｅｗｉｓｅ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｅｖｏｌｖｅｄ  Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０，ｅ０１３８９５６（２０１５）に記載されているように、遺伝子レベル（＞１×１０８酵母形質転換体）で構築した。以下：Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１，７５５−７６８（２００６）に記載されている通りに、フルオレセイン共役ヤギ抗ｃ−ｍｙｃエピトープ抗体並びに表示のマウスモノクローナル抗体、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７−共役抗マウス抗体で標識した後、酵母毎のＣＤ１９発現及び抗体結合をフローサイトメトリーにより評価した。変異体は、酵母細胞表面上に有効にディスプレイされ、ｍＡｂ  ＵｌｔｒａｍＡｂ１０３及び３Ｂ１０に対する結合を維持した（図８２）が、これは、突然変異ＣＤ１９ＥＣＤがその構造全体を保持することを示唆している。
【０４１３】
コンビナトリアルライブラリからのリガンド発見により新規の結合分子を有効に取得することができる
ビオチン化表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）及びビオチン化ヒト表皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）に対する結合剤について、磁気ビーズ選択を用いて、例示的ライブラリを選別した（Ｗｏｌｄｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｓｉｔｅｗｉｓｅ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｅｖｏｌｖｅｄ  Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０，ｅ０１３８９５６（２０１５）；Ａｃｋｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈｌｙ  ａｖｉｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ  ｃａｐｔｕｒｅ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２５，７７４−７８３（２００９）；Ｈａｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ＣＤＲ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｂｉａｓｅｓ  Ｅｎｒｉｃｈ  Ｂｉｎｄｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０１，８４−９６（２０１０）に記載されている通り）。ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に対する結合剤の選択性富化は、３つ全てのライブラリから明らかにされた（図８３）。図８３Ａは、アビジン（ＣｔｌＡ及びＣｔｌＢ）又は所望の標的（ＥＧＦＲ又はＨＥＲ２）に対する結合について評価された、得られたリガンド集団の結果を示す。所望の標的についての実質的な選択性が観察された。図８３Ｂは、ドメイン２シートライブラリ分析からの結果を示し、このライブラリは、ＨＥＲ２に対する結合について２回選別され、５０ｎＭビオチン化ＩｇＧ（左パネル）又はビオチン化ＨＥＲ２（右パネル）、続いてストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で標識した。酵母は、マウス抗−ｃ−ｍｙｃ抗体、続いて抗−マウス−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８でも標識した。選択変異体は、強力なＨＥＲ２特異的結合を示す（右パネル、右上象限）。
【０４１４】
均等物
当業者であれば、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を認識するか、又はルーティンに過ぎない実験を使用して確認することができよう。本発明の範囲は、以上の説明に限定することが意図されるのではなく、以下の特許請求の範囲に記載される。
【０４１５】
アミノ酸配列表
【化１】
2019503200.tif 000015
【化２】
2019503200.tif 000016
【化３】
2019503200.tif 000017
【化４】
2019503200.tif 000018
【化５】
2019503200.tif 000019
【化６】
2019503200.tif 000020
【化７】
2019503200.tif 000021
【化８】
2019503200.tif 000022
【化９】
2019503200.tif 000023
【化１０】
2019503200.tif 000024
【化１１】
2019503200.tif 000025
【化１２】
2019503200.tif 000026
【化１３】
2019503200.tif 000027
【化１４】
2019503200.tif 000028
【化１５】
2019503200.tif 000029
【化１６】
2019503200.tif 000030
【化１７】
2019503200.tif 000031
【化１８】
2019503200.tif 000032
【化１９】
2019503200.tif 000033
【化２０】
2019503200.tif 000034
【化２１】
2019503200.tif 000035
【化２２】
2019503200.tif 000036
【０４１６】
ヌクレオチド配列表
【化２３】
2019503200.tif 000037
【化２４】
2019503200.tif 000038
【化２５】
2019503200.tif 000039
【化２６】
2019503200.tif 000040
【化２７】
2019503200.tif 000041
【化２８】
2019503200.tif 000042
【化２９】
2019503200.tif 000043
【化３０】
2019503200.tif 000044
【化３１】
2019503200.tif 000045
【化３２】
2019503200.tif 000046
【化３３】
2019503200.tif 000047
【化３４】
2019503200.tif 000048
【化３５】
2019503200.tif 000049
【化３６】
2019503200.tif 000050
【化３７】
2019503200.tif 000051
【化３８】
2019503200.tif 000052
【化３９】
2019503200.tif 000053
【化４０】
2019503200.tif 000054
【化４１】
2019503200.tif 000055
【化４２】
2019503200.tif 000056
【化４３】
2019503200.tif 000057
【化４４】
2019503200.tif 000058
【化４５】
2019503200.tif 000059
【化４６】
2019503200.tif 000060
【化４７】
2019503200.tif 000061
【化４８】
2019503200.tif 000062
【化４９】
2019503200.tif 000063
【化５０】
2019503200.tif 000064
【化５１】
2019503200.tif 000065
【化５２】
2019503200.tif 000066
【化５３】
2019503200.tif 000067
【化５４】
2019503200.tif 000068
【化５５】
2019503200.tif 000069
【化５６】
2019503200.tif 000070
【化５７】
2019503200.tif 000071
【化５８】
2019503200.tif 000072
【化５９】
2019503200.tif 000073
【化６０】
2019503200.tif 000074
【図１】
2019503200.tif 000075
【図２−１】
2019503200.tif 000076
【図２−２】
2019503200.tif 000077
【図３】
2019503200.tif 000078
【図４−１】
2019503200.tif 000079
【図４−２】
2019503200.tif 000080
【図５−１】
2019503200.tif 000081
【図５−２】
2019503200.tif 000082
【図６】
2019503200.tif 000083
【図７】
2019503200.tif 000084
【図８】
2019503200.tif 000085
【図９】
2019503200.tif 000086
【図１０】
2019503200.tif 000087
【図１１】
2019503200.tif 000088
【図１２−１】
2019503200.tif 000089
【図１２−２】
2019503200.tif 000090
【図１２−３】
2019503200.tif 000091
【図１３】
2019503200.tif 000092
【図１４−１】
2019503200.tif 000093
【図１４−２】
2019503200.tif 000094
【図１５】
2019503200.tif 000095
【図１６】
2019503200.tif 000096
【図１７−１】
2019503200.tif 000097
【図１７−２】
2019503200.tif 000098
【図１７−３】
2019503200.tif 000099
【図１８】
2019503200.tif 000100
【図１９−１】
2019503200.tif 000101
【図１９−２】
2019503200.tif 000102
【図２０】
2019503200.tif 000103
【図２１】
2019503200.tif 000104
【図２２】
2019503200.tif 000105
【図２３−１】
2019503200.tif 000106
【図２３−２】
2019503200.tif 000107
【図２３−３】
2019503200.tif 000108
【図２４−１】
2019503200.tif 000109
【図２４−２】
2019503200.tif 000110
【図２５】
2019503200.tif 000111
【図２６】
2019503200.tif 000112
【図２７】
2019503200.tif 000113
【図２８】
2019503200.tif 000114
【図２９】
2019503200.tif 000115
【図３０】
2019503200.tif 000116
【図３１】
2019503200.tif 000117
【図３２】
2019503200.tif 000118
【図３３】
2019503200.tif 000119
【図３４】
2019503200.tif 000120
【図３５】
2019503200.tif 000121
【図３６】
2019503200.tif 000122
【図３７】
2019503200.tif 000123
【図３８】
2019503200.tif 000124
【図３９】
2019503200.tif 000125
【図４０】
2019503200.tif 000126
【図４１】
2019503200.tif 000127
【図４２】
2019503200.tif 000128
【図４３】
2019503200.tif 000129
【図４４】
2019503200.tif 000130
【図４５】
2019503200.tif 000131
【図４６】
2019503200.tif 000132
【図４７】
2019503200.tif 000133
【図４８】
2019503200.tif 000134
【図４９】
2019503200.tif 000135
【図５０】
2019503200.tif 000136
【図５１】
2019503200.tif 000137
【図５２】
2019503200.tif 000138
【図５３】
2019503200.tif 000139
【図５４】
2019503200.tif 000140
【図５５】
2019503200.tif 000141
【図５６】
2019503200.tif 000142
【図５７】
2019503200.tif 000143
【図５８】
2019503200.tif 000144
【図５９】
2019503200.tif 000145
【図６０−１】
2019503200.tif 000146
【図６０−２】
2019503200.tif 000147
【図６１−１】
2019503200.tif 000148
【図６１−２】
2019503200.tif 000149
【図６２−１】
2019503200.tif 000150
【図６２−２】
2019503200.tif 000151
【図６３−１】
2019503200.tif 000152
【図６３−２】
2019503200.tif 000153
【図６４】
2019503200.tif 000154
【図６５−１】
2019503200.tif 000155
【図６５−２】
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【図６６−１】
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【図６６−２】
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【図６６−３】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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