(57)【要約】  本発明は、核酸を単離する改善された方法に関する。特に、本方法は、核酸の溶出前に二価カチオンを含む洗浄緩衝液の使用を含む。
2019524084.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を単離する方法であって、
（ａ）核酸を含む結合混合物を提供するステップと、
（ｂ）核酸が極性固体支持体の表面に吸着するように、前記結合混合物を前記固体支持体と接触させるステップと、
（ｃ）結合していない結合混合物を除去するステップと、
（ｄ）前記固体支持体を洗浄緩衝液で洗浄するステップと、
（ｅ）溶出緩衝液を加え、前記固体支持体から核酸を除去するステップと、を含む方法。
【請求項２】
前記洗浄緩衝液は、水溶液中の二価カチオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記二価カチオンは、周期表の第ＩＩ族のアルカリ土類金属に由来する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記二価カチオンは、それらの塩化物の形態である、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記二価カチオンは、カルシウムイオンまたはバリウムイオンである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記二価カチオンは、カルシウムイオンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記二価カチオンは、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜５ｍＭの濃度である、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸は、二価カチオンを錯化することによって前記固体支持体の前記表面から除去される、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記溶出緩衝液は、キレート化剤を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記キレート剤は、前記洗浄緩衝液中に提供される前記二価カチオンを錯化し、前記固体支持体の前記表面からの前記核酸の除去を促進する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記キレート剤は、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、ＥＤＤＳ、ＭＧＤＡ、ＩＤＳ、ポリアスパラギン酸、またはＧＬＤＡであり、好ましくはＥＧＴＡである、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記キレート剤は、０．１ｍＭ〜５ｍＭの濃度、好ましくは０．１ｍＭ〜１ｍＭの濃度である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記溶出緩衝液は、ｐＨ７．０〜ｐＨ１０．０のｐＨ値、好ましくはｐＨ７．０〜ｐＨ９．０のｐＨ値を有する、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記固体支持体のｐＨをアルカリ性条件まで上昇させることによって、前記核酸が前記固体支持体の前記表面から除去される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶出緩衝液は、ｐＨ７．１〜ｐＨ１０．０、好ましくはｐＨ８．０〜ｐＨ１０．０、より好ましくはｐＨ９．０〜ｐＨ１０．０のｐＨ値を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記固体支持体の温度を上昇させること、および請求項８〜１３のいずれか一項に記載のように二価カチオンを錯化すること、ならびに／または前記固体支持体の前記ｐＨを請求項１４または請求項１５に記載のアルカリ性条件まで上昇させることによって、核前記酸が前記固体支持体の前記表面から除去される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記温度は、少なくとも３０℃まで上昇し、好ましくは、前記温度は３０℃〜７５℃まで上昇する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記固体支持体の前記表面は、二価カチオンに結合する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記固体支持体の前記表面への二価カチオンの結合は、前記固体支持体の前記表面への核酸の吸着をもたらす、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記固体支持体の前記表面は弱有機酸を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記弱有機酸は、ホモポリマーまたはヘテロポリマーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記弱有機酸ポリマーは、ポリアクリル酸、ポリホスホン酸、ポリメタクリル酸、メタクリル酸とマレイン酸とのヘテロポリマー、ならびにアクリル酸、メタクリル酸、およびマレイン酸のヘテロポリマーからなるリストから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記弱有機酸は、ホスホン酸、脂肪族カルボン酸、および芳香族カルボン酸からなるリストから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記結合混合物は、結合緩衝液を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記結合緩衝液は、水と混和性の有機溶媒、および／またはカオトロピック剤、および／または界面活性剤を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記結合緩衝液は、水と混和性の有機溶媒、カオトロピック剤、および界面活性剤のうちの少なくとも２つを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記結合緩衝液中の有機溶媒の体積／体積百分率は、少なくとも５％、好ましくは５％〜５０％、より好ましくは２０％〜５０％、さらにより好ましくは３０％〜５０％、最も好ましくは４０％〜５０％である、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記結合緩衝液中のカオトロピック剤の濃度は、少なくとも０．５Ｍ、好ましくは０．５Ｍ〜３Ｍ、より好ましくは０．５Ｍ〜１．５Ｍである、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記結合緩衝液中の界面活性剤の体積／体積百分率は、少なくとも０．５％、好ましくは５％〜２０％、より好ましくは７％〜１５％、最も好ましくは８％〜１２％である、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記有機溶媒は、アルコール、好ましくは低分子量アルコール、より好ましくはエタノール、１−プロパノール、またはプロパン−２−オールである、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記カオトロピック剤は、グアニジン塩、好ましくはチオシアン酸グアニジンまたは塩酸グアニジンであり、より好ましくは塩酸グアニジンである、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記界面活性剤は、イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤である、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記イオン性界面活性剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系界面活性剤である、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記非イオン性界面活性剤は、弱有機酸基を含む、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記固体支持体は微粒子を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記微粒子は超常磁性特性を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記微粒子は、少なくとも１μｍ、好ましくは１μｍ〜５０μｍ、より好ましくは１μｍ〜２０μｍの直径を有する、請求項３５または請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記単離される核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、またはＬＮＡであり、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記単離される核酸は、少なくとも２０ヌクレオチド長である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記核酸は、出発試料から単離される、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸の単離前に、前記出発試料は、化学的処理、酵素的処理、および／または機械的処理のうちの１つ以上を用いて処理される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記出発試料は、実験汚染物質を含む、請求項４０または請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記実験汚染物質は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬、制限酵素消化試薬、核酸を修飾および／もしくは処理するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試薬システム、アクリルアミドゲル、またはアガロースゲルを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記出発試料は、生物材料を含む、請求項４０または請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記生物材料は、真核細胞または原核細胞を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞は、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、古細菌細胞、または原生動物細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記生物材料は、動物由来の体液または固体生物材料である、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記体液または固形生物材料は、血液、血漿、血清、尿、糞便、唾液、精液、爪、毛髪、または組織から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記出発試料は、法医学的分析のために得られる材料である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記材料は、唾液、血液、尿、糞便、精液、汗、涙、毛髪、爪、または任意の組織を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
除去の前に、たとえ前記固体支持体の前記表面への吸着を促進する化学的条件がもはや存在しない場合であっても、前記核酸は前記固体支持体の前記表面に吸着したままである、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記溶出緩衝液は、水性溶出緩衝液である、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５４】
前記トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンは、１ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜２０ｍＭ、最も好ましくは５ｍＭ〜１５ｍＭの濃度である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
キットであって、
（ａ）請求項１および請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の極性固体支持体と、
（ｂ）請求項１および２４〜３４のいずれか一項に記載の結合緩衝液と、
（ｃ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の洗浄緩衝液と、
（ｄ）使用説明書と、を含む、キット。
【請求項５６】
前記キットが、
（ｆ）請求項１、８〜１６、および５２〜５４のいずれか一項に記載の溶出緩衝液をさらに含む、請求項５５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を単離する改善された方法に関する。特に、本方法は、核酸の溶出前に二価カチオンを含む洗浄緩衝液の使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
臨床および分子生物学の実験業務において核酸分析技術が確立されて以来、核酸精製に関連する方法は急速な技術発展を遂げてきた。特に、核酸収量および純度を改善する一方で、プロセスを合理化することおよび／または自動化（例えば、液体ハンドリングシステムを使用する）に適用することにも多くの焦点が当てられてきた。
【０００３】
核酸単離の固相抽出法は、一般に用いられている。そのような方法では、試料中の核酸が固体表面に吸着され、不純物を除去するために洗浄され、次いで、固相から溶液中に溶出される。この原理を利用した方法の初期の例の１つは、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，１９７９（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：６１５−６１９）に記載されており、核酸を吸着させるための微粉化したガラス等のシリカ質材料、および主としてカオトロピック塩を含有する緩衝液を含む。同様に、Ｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ，１９９９（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７：６１５−６１９）も、脳脊髄液および尿等の複雑な生体試料からＤＮＡを吸着させるおよび単離するためにシリカマトリックスおよびカオトロピック緩衝系を用いる方法を記載している。このような核酸単離の方法の１つの欠点は、結合緩衝液によって提供されるカオトロピック条件下で、核酸が固体表面に吸着したままになることである。さらに、単離された核酸と結合したままのカオトロピック剤は、高感度な下流用途（例えば、酵素反応、核酸分析等）を妨げる可能性がある。
核酸および固体表面からのカオトロピック塩の除去は、一般に、かなりの割合の水混和性有機溶媒（通常、＞５０体積％）を含有する洗浄液を用いて行われる。しかしながら、これらの有機溶媒は、それらが除去しようとするカオトロピック剤と同様に、高感度な下流プロセスを阻害する可能性もある。したがって、吸着した核酸の溶出前に、下流プロセスの阻害の可能性を最小限に抑えるために有機溶媒を除去しなければならないが、そうすることによってプロセスが大幅に遅くなり、かつ複雑になる。
【０００４】
非カオトロピック塩の使用に基づく方法は、ＤＥ１９８５／６０６４およびＵＳ２００１／０４１３３２に記載されている。これらの方法では、ケイ酸塩表面への核酸の結合を促進するためにいわゆるコスモトロピック塩が使用されるが、系から有機溶媒を除去することに伴う不都合が依然として存在する。
【０００５】
対照的に、ＷＯ９６０９３７９は、ＤＮＡの単離のための、負に帯電したカルボキシル基を有する磁性微粒子、およびポリエチレングリコールの割合が高い（即ち、カオトロピック塩ではない）緩衝系の使用を記載している。カオトロピック剤およびコスモトロピック剤に基づく方法と同様に、洗浄緩衝液中の有機溶媒の使用は、結合緩衝液の望ましくない成分を除去するために必要とされる。同様の手法がＷＯ０２０６６９９３に記載されており、核酸を固体表面に吸着させるために、磁気特性を有するセルロース誘導体がポリエチレングリコール含有緩衝液とともに使用される。
【０００６】
有機溶媒を含有する緩衝系と組み合わせたシリカ質材料の使用がＥＰ０５１２７６７に記載されており、それらの系では、成分の極性比が方法において重要な役割を果たす。この場合も同様に、有機溶媒が洗浄緩衝液中に存在し、吸着された核酸の溶出前に蒸発によって除去されなければならず、さもなければその後の精製された核酸の分析／使用が損なわれる可能性がある。
【０００７】
いわゆる電荷スイッチ機構（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＣＳＴ（登録商標））を使用した、根本的に異なる種類の方法がＷＯ０２４８１６４に記載されている。その方法では、弱酸性のｐＨを有する水性緩衝系において正に帯電した表面に核酸を結合させるためにイオン交換システムが使用される。弱酸性のｐＨが維持され、次いで、弱アルカリ性条件を用いて結合した核酸を溶出させる前に、汚染物質が系から洗浄される。そのような方法は、媒体のｐＨに依存して、正味電荷が正または中性であるイオン交換活性基（例えば、脂肪族または複素環式アミノ基）を系に導入することにより可能となる。固体表面への核酸の結合は、負に帯電した核酸と粒子の正に帯電した表面との相互作用のために生じる。
イオン交換に基づくシステムの１つの問題は、核酸の単離が電荷のみに基づいているため、（この方法で使用される条件下では）正味の負電荷を有する任意の他の巨大分子も、核酸とともに精製される可能性があるということである。潜在的な汚染物質は、タンパク質および多糖類を含む。さらに、イオン交換相互作用は、高いイオン強度および結合緩衝液中の界面活性剤の存在に非常に敏感であり、したがって、結合条件の非常に正確な設定を必要とする。ｐＨに加えて、塩濃度、および特にカチオン性界面活性剤の量等の因子を慎重に検討する必要がある。これらの検討事項は、最初の試料材料の消化に関する溶解条件の設計に問題となる妥協をもたらし得る。
【０００８】
ＷＯ２０１０／０１８２００Ａ１およびＤＥ１０２００７／００９３４７Ｂ４は、弱有機酸基を有する表面に吸着した核酸を維持するために、オリゴマーアミンの使用を記載している。それらのオリゴマーアミンは比較的高価であり、たとえ非常に低い濃度で使用した場合でも毒性を有する。驚くべきことに、オリゴマーアミンの代わりに二価カチオン、特にアルカリ土類金属の二価カチオンを使用することにより、弱有機酸を有する結合面に吸着した核酸を同じ効率で維持できることが見出された。当該技術分野では、マグネシウムイオンが核酸と相互作用し、それらの分子の安定化を促進することが知られている。実際、マグネシウムイオンは、多くの核酸ベースの用途（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））における重要な補因子である。対照的に、カルシウムイオンは、マグネシウムと同じグループの二価カチオンであるにもかかわらず、核酸との相互作用において異なる挙動を示す。事実、カルシウムイオンは、ＰＣＲ等の核酸関連プロセスの阻害剤であることが示されている（Ｓｃｈｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１３：１０１４−１０２６）。したがって、弱有機酸基を有する表面への核酸の結合を駆動するカルシウムイオンの能力は予期しないものであった。さらに、キレート剤を使用して二価カチオン（カルシウムイオン等）を錯化することおよび／または結合面のｐＨをアルカリ性条件まで増加させることにより、核酸と結合面との間の相互作用を破壊することができ、溶出のための液相中に核酸を再び放出させることも分かった。当該技術分野で既知の方法では、核酸の溶出は、一般に、水または非常に弱いアルカリ性溶液の添加によって媒介される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＤＥ１９８５／６０６４
【特許文献２】ＵＳ２００１／０４１３３２
【特許文献３】ＷＯ９６０９３７９
【特許文献４】ＷＯ０２０６６９９３
【特許文献５】ＥＰ０５１２７６７
【特許文献６】ＷＯ０２４８１６４
【特許文献７】ＷＯ２０１０／０１８２００Ａ１
【特許文献８】ＤＥ１０２００７／００９３４７Ｂ４
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，１９７９（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：６１５−６１９）
【非特許文献２】Ｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ，１９９９（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７：６１５−６１９）
【非特許文献３】Ｓｃｈｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１３：１０１４−１０２６
【発明の概要】
【００１１】
第１の態様において、本発明は、核酸を単離する方法であって、
（ａ）核酸を含む結合混合物を提供するステップと、
（ｂ）核酸が固体支持体の表面に吸着するように、結合混合物を極性固体支持体と接触させるステップと、
（ｃ）結合していない結合混合物を除去するステップと、
（ｄ）固体支持体を洗浄緩衝液で洗浄するステップと、
（ｅ）溶出緩衝液を加え、固体支持体から核酸を除去するステップと、を含む方法を提供する。
【００１２】
「核酸を単離する」は、所与の試料から核酸を実質的に精製する意味を含む。核酸が精製され得る試料は、限定されないが、真核細胞および原核細胞、組織試料または血液試料等の臨床試料、ＰＣＲまたは制限消化反応等の実験反応混合物、犯罪現場から得られるものを含む法医学的試料（例えば、物理的証拠、血液、唾液等）、土壌サンプル、および葉、種子、または根等の植物材料を含む。
【００１３】
「結合混合物」は、核酸および結合緩衝液を含む試料を含む溶液の意味を含む。
【００１４】
「結合緩衝液」は、固体支持体への核酸の吸着を促進する条件をもたらす組成を有する緩衝液の意味を含む。
【００１５】
「溶出緩衝液」は、吸着した核酸を固体支持体から放出させるように作用する緩衝液の意味を含む。
【００１６】
好ましい実施形態において、洗浄緩衝液は、水溶液中の二価カチオンを含む。他の実施形態において、二価カチオンは、周期表の第ＩＩ族のアルカリ土類金属に由来する。さらなる実施形態において、二価カチオンは、それらの塩化物の形態である。好ましい実施形態において、二価カチオンは、カルシウムイオンまたはバリウムイオンである。より好ましい態様において、二価カチオンは、カルシウムイオンである。
【００１７】
他の実施形態において、洗浄緩衝液は、純水または水性緩衝液中の水溶液である。さらなる実施形態において、水性緩衝溶液は、ｐＨ４．０〜ｐＨ７．０のｐＨ値を有する。好ましい実施形態において、水性緩衝液は、ｐＨ６．０〜ｐＨ６．５のｐＨ値を有する。
【００１８】
本発明の方法における使用に適した水性緩衝溶液は、当業者に周知であり、例えば、トリス（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−プロパン−１，３−ジオール）およびビス−トリス（ビス（２−ヒドロキシメチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン）の溶液を含む。
【００１９】
好ましい実施形態において、洗浄緩衝液は、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、０．１ｍＭ〜９ｍＭ、０．１ｍＭ〜８ｍＭ、０．１ｍＭ〜７ｍＭ、０．１ｍＭ〜６ｍＭ、０．１ｍＭ〜５ｍＭ、０．２ｍＭ〜４．５ｍＭ、０．３ｍＭ〜４ｍＭ、０．４ｍＭ〜３．５ｍＭ、０．５ｍＭ〜３ｍＭ、０．６ｍＭ〜２．５ｍＭ、０．７ｍＭ〜２ｍＭ、０．８ｍＭ〜１．５ｍＭ、または０．９ｍＭ〜１ｍＭの濃度で二価カチオンを含む。より好ましい実施形態において、洗浄緩衝液は、１ｍＭ〜５ｍＭの濃度で二価カチオンを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、核酸は、二価カチオンを錯化することによって固体支持体の表面から除去される。
【００２１】
「錯化する」は、原子または分子に別の原子または分子との会合を形成させること、すなわち錯体を形成することの意味を含む。
【００２２】
さらなる実施形態において、溶出緩衝液はキレート剤を含む。
【００２３】
「キレート剤」は、分子が単一の金属イオンに対していくつかの結合を形成し得る物質の意味を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、キレート剤は、洗浄緩衝液中に提供される二価カチオンを錯化し、固体支持体の表面からの核酸の放出を促進する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、キレート剤は、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、ＥＤＤＳ、ＭＧＤＡ、ＩＤＳ、ポリアスパラギン酸、ＧＬＤＡ、ＢＡＰＴＡ、およびクエン酸から選択される。好ましい実施形態において、キレート剤はＥＧＴＡである。
【００２６】
好ましい実施形態において、溶出緩衝液は、０．１ｍＭ〜５ｍＭ、０．１ｍＭ〜４．５ｍＭ、０．１ｍＭ〜４ｍＭ、０．１ｍＭ〜３．５ｍＭ、０．１ｍＭ〜３ｍＭ、０．１ｍＭ〜２．５ｍＭ、０．１ｍＭ〜２ｍＭ、０．１ｍＭ〜１．５ｍＭ、０．１ｍＭ〜１ｍＭ、０．２ｍＭ〜０．９ｍＭ、０．３ｍＭ〜０．８ｍＭ、０．４ｍＭ〜０．７ｍＭ、０．５ｍＭ〜０．６ｍＭの濃度で、好ましくは０．１ｍＭ〜１ｍＭの濃度でキレート剤を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、キレート剤を含む溶出緩衝液は、ｐＨ７．０〜ｐＨ１０．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．５、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．５、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０、ｐＨ７．０〜ｐＨ７．５のｐＨ値を有する。好ましい実施形態において、キレート剤を含む溶出緩衝液は、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０のｐＨ値を有する。
【００２８】
他の実施形態において、固体支持体のｐＨをアルカリ性条件まで上昇させることによって、核酸が固体支持体の表面から除去される。
【００２９】
「アルカリ性条件」は、ｐＨ７．０より高いｐＨ値の任意の条件の意味を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、ｐＨ７．１〜ｐＨ１０．０のｐＨ値を有する。好ましい実施形態において、溶出緩衝液は、ｐＨ８．０〜ｐＨ１０．０のｐＨ値を有する。最も好ましい実施形態において、溶出緩衝液は、ｐＨ９．０〜ｐＨ１０．０のｐＨ値を有する。
【００３１】
本明細書に開示される溶出緩衝液のｐＨは、さらなる緩衝物質によって支持され得る。本発明の方法における使用に適したさらなる緩衝物質は、当業者に周知であり、例えば、トリス、アミノメチルプロパノール（ＡＭＰ）、およびクエン酸塩を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、前述のように二価カチオンを錯化することによって、および／または前述のように固体支持体のｐＨをアルカリ性条件まで上昇させることによって、ならびに固体支持体の温度を上昇させることによって、核酸が固体支持体の表面から除去される。いくつかの実施形態において、固体支持体の温度は、少なくとも３０℃まで上昇する。いくつかの実施形態において、固体支持体の温度は、３０℃〜７５℃、３５℃〜７０℃、４０℃〜６５℃、４５℃〜６０℃、４０℃〜５０℃、または４５°Ｃ〜５５℃まで上昇する。好ましい実施形態において、固体支持体の温度は、３０℃〜７５℃まで上昇する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、固体支持体の表面は、二価カチオンに結合する。好ましい実施形態において、固体支持体の表面への二価カチオンの結合は、固体支持体の表面への核酸の吸着をもたらす。
【００３４】
いくつかの実施形態において、固体支持体の表面は弱有機酸を含む。
【００３５】
「弱有機酸」は、酸性を有する有機化合物の意味を含む。弱有機酸の非限定的な例として、ギ酸、リンゴ酸、マレイン酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸、および安息香酸が挙げられる。
【００３６】
さらなる実施形態において、弱有機酸は、ホスホン酸、脂肪族カルボン酸、および芳香族カルボン酸からなるリストから選択される。
【００３７】
好ましい実施形態において、弱有機酸は、ホモポリマーまたはヘテロポリマーである。
【００３８】
「ホモポリマー」は、単一種のモノマーを含むポリマーを意味する。
【００３９】
「ヘテロポリマー」は、２つ以上の異なる種のモノマーを含むポリマーを意味する。
【００４０】
さらなる実施形態において、弱有機酸ポリマーは、ポリアクリル酸、ポリホスホン酸、ポリメタクリル酸、ポリマレイン酸、アクリル酸とメタクリル酸とのヘテロポリマー、メタクリル酸とマレイン酸とのヘテロポリマー、ならびにアクリル酸、メタクリル酸、およびマレイン酸のヘテロポリマーからなるリストから選択される。
【００４１】
他の実施形態において、結合混合物は結合緩衝液を含む。さらなる実施形態において、結合緩衝液は、水と混和性の有機溶媒、および／またはカオトロピック剤、および／または界面活性剤を含む。
【００４２】
「水と混和性の有機溶媒」は、溶質を溶解させることができ、かつ水との均一な混合物を形成することができる有機物質の意味を含む。水混和性有機溶媒の非限定的な例として、エタノール、メタノール、１−プロパノール、プロパン−２−オール、アセトン、アセトニトリル、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２−ブトキシエタノール、ジメチルホルムアミド、ジメトキシエタン、ジメチルスルホキシド、１，４−ジオキサン、エチレングリコール、フルフリルアルコール、グリセロール、１，３−プロパンジオール、１，５−ペンタンジオール、プロパン酸、プロピレングリコール、ピリジン、テトラヒドロフラン、およびトリエチレングリコールが挙げられる。
【００４３】
「カオトロピック剤」は、水分子間の水素結合ネットワークを乱す可能性のある水溶液中の物質を意味する。カオトロピック剤の非限定的な例として、塩酸グアニジン、尿素、チオ尿素、過塩素酸リチウム、および酢酸リチウムが挙げられる。
【００４４】
「界面活性剤」は、硬水によって不活性化されず、湿潤剤および／または乳化剤の特性を有するイオン性または非イオン性の界面活性剤または界面活性剤の混合物の意味を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、結合緩衝液中の有機溶媒の体積／体積百分率は少なくとも５％である。好ましい実施形態において、結合緩衝液中の有機溶媒の体積／体積百分率は５％〜５０％である。好ましい実施形態において、結合緩衝液中の有機溶媒の体積／体積百分率は１０％〜５０％である。より好ましい実施形態において、結合緩衝液中の有機溶媒の体積／体積百分率は２０％〜５０％である。さらに好ましい実施形態において、結合緩衝液中の有機溶媒の体積／体積百分率は３０％〜５０％である。最も好ましい実施形態において、結合緩衝液中の有機溶媒の体積／体積百分率は４０％〜５０％である。
【００４６】
他の実施形態において、結合緩衝液中のカオトロピック剤の濃度は少なくとも０．５Ｍである。好ましい実施形態において、結合緩衝液中のカオトロピック剤の濃度は、０．５Ｍ〜３Ｍ、０．５Ｍ〜２．７５Ｍ、０．５Ｍ〜２．５Ｍ、０．５Ｍ〜２．２５Ｍ、０．５Ｍ〜２Ｍ、０．５Ｍ〜１．７５Ｍ、０．５Ｍ〜１．５Ｍ、０．５Ｍ〜１．２５Ｍ、０．５Ｍ〜１Ｍ、０．６Ｍ〜１．４Ｍ、０．７Ｍ〜１．３Ｍ、０．８Ｍ〜１．２Ｍ、または０．９Ｍ〜１．１Ｍである。最も好ましい実施形態において、結合緩衝液中のカオトロピック剤の濃度は０．５Ｍ〜１．５Ｍである。
【００４７】
いくつかの実施形態において、結合緩衝液中の界面活性剤の体積／体積百分率は少なくとも０．５％である。好ましい実施形態において、結合緩衝液中の界面活性剤の体積／体積百分率は５％〜２０％である。別の好ましい実施形態において、結合緩衝液中の界面活性剤の体積／体積百分率は７％〜１５％である。最も好ましい実施形態において、結合緩衝液中の界面活性剤の体積／体積百分率は８％〜１２％である。
【００４８】
特定の実施形態において、結合緩衝液中の有機溶媒はアルコールである。好ましい実施形態において、アルコールは低分子量アルコールである。本発明の方法における使用に適した低分子量アルコールは、当業者に周知であり、例えば、エタノール、１−プロパノール、またはプロパン−２−オールを含む。
【００４９】
特定の実施形態において、結合緩衝液中のカオトロピック剤はグアニジン塩である。好ましいグアニジン塩は、チオシアン酸グアニジンおよび塩酸グアニジンである。好ましい実施形態において、グアニジン塩は塩酸グアニジンである。
【００５０】
特定の実施形態において、結合緩衝液中の界面活性剤は、イオン性または非イオン性の界面活性剤である。好ましい非イオン性界面活性剤は、例えばＴｗｅｅｎ−２０またはＴｗｅｅｎ−８０等のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系界面活性剤である。好ましいイオン性界面活性剤は、弱有機酸基を含む界面活性剤、例えばナトリウムラウロイルサルコシネートである。
【００５１】
いくつかの実施形態において、固体支持体は微粒子を含む。特定の実施形態において、微粒子は超常磁性特性を有する。
【００５２】
他の実施形態において、微粒子は少なくとも１μｍの直径を有する。好ましい実施形態において、微粒子は１μｍ〜５０μｍの直径を有する。最も好ましい実施形態において、微粒子は１μｍ〜２０μｍの直径を有する。
【００５３】
さらなる実施形態において、単離される核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、またはＬＮＡである。好ましい実施形態において、単離される核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００５４】
他の実施形態において、単離される核酸は、少なくとも２０ヌクレオチド長である。
【００５５】
特定の実施形態において、核酸は、出発試料から単離される。
【００５６】
「出発試料」は、核酸を得ることができる任意の試料の意味を含む。
【００５７】
他の実施形態において、核酸の単離前に、出発試料は、化学的処理、酵素的処理、および／または機械的処理のうちの１つ以上に供される。
【００５８】
化学的処理の例として、限定されないが、界面活性剤による処理、または細胞壁分解剤による処理が挙げられる。
【００５９】
酵素的処理の例として、限定されないが、プロテアーゼによる処理、セルラーゼによる処理、またはアミラーゼによる処理が挙げられる。
【００６０】
機械的処理の例として、限定されないが、粉砕、破砕、圧砕、超音波による処理、または試料に機械的応力を全体的に加えることが挙げられる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、出発試料は、実験汚染物質を含む。特定の実施形態において、実験汚染物質は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬、制限酵素消化試薬、核酸を修飾および／もしくは処理するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試薬システム、アクリルアミドゲル、またはアガロースゲルを含む。
【００６２】
他の実施形態において、出発試料は、生物材料を含む。特定の実施形態において、生物材料は、真核細胞または原核細胞を含む。さらなる実施形態において、細胞は、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、古細菌細胞、または原生動物細胞である。
【００６３】
いくつかの実施形態において、生物材料は、動物由来の体液または固体生物材料である。特定の実施形態において、動物由来の体液または固体生物材料は、血液、血漿、血清、尿、糞便、唾液、精液、爪、毛髪、または組織である。
【００６４】
特定の実施形態において、出発試料は、法医学的分析のために得られる材料である。さらなる実施形態において、法医学的分析のために得られる材料は、唾液、血液、尿、糞便、精液、汗、涙、毛髪、爪、または任意の組織を含む。
【００６５】
他の実施形態において、たとえ固体支持体の表面への吸着を促進する化学的条件がもはや存在しない場合であっても、核酸は固体支持体の表面に吸着したままである。
【００６６】
いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、水性溶出緩衝液である。好ましい水性溶出緩衝液は、１ｍＭ〜５０ｍＭの濃度でトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む。好ましい実施形態において、水性溶出緩衝液は、１ｍＭ〜２０ｍＭの濃度でトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む。より好ましい実施形態において、水性溶出緩衝液は、５ｍＭ〜１５ｍＭの濃度でトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む。最も好ましい実施形態において、水性溶出緩衝液は、１０ｍＭの濃度でトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む。
【００６７】
本発明の方法における使用に適した他の緩衝物質は、ｐＨ７．０〜ｐＨ１０．０の緩衝能を有するものである。そのような緩衝物質は、当業者に周知であり、例えば、アミノメチルプロパノール（ＡＭＰ）を含む。
【００６８】
本発明の任意の溶出緩衝液はまた、防腐剤またはキレート剤を含んでもよい。
【００６９】
本発明の方法における使用に適した防腐剤は、当業者に周知であり、例えば、アジ化ナトリウムを含む。特定の実施形態において、溶出緩衝液は、１％以下の体積／体積濃度でアジ化ナトリウムを含む。
【００７０】
本発明の方法における使用に適したキレート剤は、当業者に周知であり、例えば、ＥＤＴＡを含む。特定の実施形態において、溶出緩衝液は、１ｍＭ以下の濃度でＥＤＴＡを含む。
【００７１】
第２の態様において、本発明は、核酸を単離するためのキットであって、
（ａ）本発明の第１の態様の実施形態のいずれかに定義される極性固体支持体と、
（ｂ）本発明の第１の態様の実施形態のいずれかに定義される結合緩衝液と、
（ｃ）本発明の第１の態様の実施形態のいずれかに定義される洗浄緩衝液と、
（ｄ）使用説明書と、を含むキットを提供する。
【００７２】
いくつかの実施形態において、キットは、
（ｅ）本発明の第１の態様の実施形態のいずれかに定義される溶出緩衝液をさらに含む。
【００７３】
本明細書における明らかに以前に公表された文書の列挙または考察は、必ずしもその文書が最新技術の一部である、または共通の一般知識であることを認めるものとして解釈されるべきではない。
【００７４】
本発明は、以下の非限定的な図および実施例を参照して、より詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】サケ精子ＤＮＡ溶液からの核酸の単離を示す図である。実施例１に記載の方法を用いてサケ精子ＤＮＡ溶液からＤＮＡを単離し、０．８％アガロースゲル電気泳動により分離した。（Ａ）λＤＮＡ（８μＬ中２００ｎｇ）。（Ｂ）サケ精子ＤＮＡから単離したＤＮＡ（実施例１：５ｍＭ  ＣａＣｌ２洗浄液）（８μＬ溶出液）。
【図２】パセリ由来の植物葉材料からのＤＮＡの単離を示す図である。Ｓｂｅａｄｅｘ  Ｍａｘｉ  Ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ抽出キット（ＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ、カタログ番号４１６０２／４１６２０）または実施例２〜４に記載の方法を用いて、パセリ由来の植物材料からＤＮＡを単離した。（Ａ）λＤＮＡ（８μＬ中２００ｎｇ）。（Ｂ）パセリの葉から単離したＤＮＡ（Ｓｂｅａｄｅｘ  Ｍａｘｉ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔ）（８μＬの溶出液）。（Ｃ）パセリの葉から単離したＤＮＡ（実施例２：５ｍＭ  ＣａＣｌ２洗浄液）（８μＬ溶出液）。（Ｄ）パセリの葉から単離したＤＮＡ（実施例３：１ｍＭ  ＣａＣｌ２洗浄液）（溶出液８μＬ）。（Ｅ）パセリの葉から単離したＤＮＡ（実施例４：０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２洗浄液）（溶出液８μＬ）。
【図３】ダイズ由来の植物葉材料からのＤＮＡの単離を示す図である。実施例５に記載の方法を用いて、ダイズ由来の植物材料からＤＮＡを単離した。レーンＲ１〜Ｒ８の各々は、複製ＤＮＡ単離実験を表す（ウェル当たり８μＬの溶出液）。
【図４】ヒマワリ由来の植物葉材料からのＤＮＡの単離を示す図である。実施例６に記載の方法を用いて、ヒマワリ由来の植物材料からＤＮＡを単離した。レーンＲ１〜Ｒ８の各々は、複製ＤＮＡ単離実験（ウェル当たり８μＬの溶出液）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
実施例１
この実施例は、サケ精子ＤＮＡの溶液からの核酸の単離に関する。
【００７７】
サケ精子由来の市販のＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号３１１４９）を、１％臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８）、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドンを含有する緩衝液中に最終濃度５００ｎｇ／μＬで溶解した。そのＤＮＡ溶液の２００μＬアリコートを、４００μＬの結合緩衝液ＰＮ（２．２５Ｍ塩酸グアニジン、１５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０％１−プロパノール）と、例えば、Ｓｂｅａｄｅｘ  Ｍａｘｉ  Ｐｌａｎｔ抽出キット（ＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ、カタログ番号４１６０２／４１６２０）において入手可能な１０μＬの標準Ｓｂｅａｄｅｘビーズ溶液と混合した。  得られた混合物を室温で５分間、１００ｒｐｍで振盪し、Ｓｂｅａｄｅｘビーズが溶液全体に均一に懸濁するよう維持した。振盪後、永久磁石の適用によりＳｂｅａｄｅｘビーズを除去し、上清を除去した。
【００７８】
Ｓｂｅａｄｅｘビーズを、４００μＬの洗浄緩衝液ＰＮ１（１．５Ｍ塩酸グアニジン、１０％Ｔｗｅｅｎ−２０、２０％１−プロパノール）に再懸濁し、５分間振盪した。永久磁石の適用によりＳｂｅａｄｅｘビーズを回収し、上清を除去した。次いで、Ｓｂｅａｄｅｘビーズを、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に５ｍＭ塩化カルシウムを含有する４００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁し、室温で５分間、１００ｒｐｍで振盪し、Ｓｂｅａｄｅｘビーズが溶液全体に均一に懸濁するよう維持した。前回のように、永久磁石の適用によりＳｂｅａｄｅｘビーズを回収した。
【００７９】
Ｓｂｅａｄｅｘビーズに結合したＤＮＡを、４０ｍＭの２−アミノメチルプロパノール−２（ｐＨ１０．０）および０．１ｍＭのエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）を含有する１００μＬの溶出緩衝液の添加により溶出した。Ｓｂｅａｄｅｘビーズを懸濁状態に保つために、時々試験管を振盪しながら５０℃で溶出を行った。
【００８０】
次いで、溶出したＤＮＡをＵＶ分光光度法により測定し、以下の読み取り値を記録した：
【００８１】
【表１】
2019524084.tif 000003
【００８２】
精製したＤＮＡの８μＬ試料を、既知の量のλＤＮＡとともに０．８％アガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウムで染色した（図１）。
【００８３】
実施例２
この実施例は、パセリ由来の植物葉材料からのＤＮＡの単離に関する。
８ｇの新鮮なパセリの葉の試料を、例えば、Ｓｂｅａｄｅｘ  Ｍａｘｉ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔ（ＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ、カタログ番号４１６０２／４１６２０）において入手可能な４０ｍＬの溶解緩衝液ＰＮ（２．２５Ｍ塩酸グアニジン、１５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０％１−プロパノール）中で粉砕し、そのキットのプロトコルに従って、６０℃で３０分間インキュベートした。
【００８４】
そのインキュベーション後、２００μＬの溶解物を４００μＬの結合緩衝液ＰＮ（２．２５Ｍ塩酸グアニジン、１５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０％１−プロパノール）および１０μＬの標準Ｓｂｅａｄｅｘビーズ溶液と混合し、室温で５分間、１００ｒｐｍで振盪し、Ｓｂｅａｄｅｘビーズが溶液全体に均一に懸濁するよう維持した。振盪後、永久磁石の適用によりＳｂｅａｄｅｘビーズを除去し、上清を除去した。
【００８５】
Ｓｂｅａｄｅｘビーズを、４００μＬの洗浄緩衝液ＰＮ１（１．５Ｍ塩酸グアニジン、１０％Ｔｗｅｅｎ−２０、２０％１−プロパノール）に再懸濁し、５分間振盪した。永久磁石の適用によりＳｂｅａｄｅｘビーズを回収し、上清を除去した。次いで、Ｓｂｅａｄｅｘビーズを、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に５ｍＭ塩化カルシウムを含有する４００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁し、室温で５分間、１００ｒｐｍで振盪し、Ｓｂｅａｄｅｘビーズが溶液全体に均一に懸濁するよう維持した。前回のように、永久磁石の適用によりＳｂｅａｄｅｘビーズを回収した。
【００８６】
Ｓｂｅａｄｅｘビーズに結合したＤＮＡを、４０ｍＭの２−アミノメチルプロパノール−２（ｐＨ１０．０）および０．１ｍＭのエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）を含有する１００μＬの溶出緩衝液の添加により溶出した。Ｓｂｅａｄｅｘビーズを懸濁状態に保つために、時々試験管を振盪しながら５０℃で溶出を行った。
【００８７】
ＤＮＡ単離実験を二重に行い、溶出したＤＮＡをＵＶ分光光度法により測定した（下の表１を参照）。単離したＤＮＡの各溶出液の８μＬ試料を０．８％アガロースゲル電気泳動より分離した（図２、レーンＢ）。比較として、Ｓｂｅａｄｅｘ  Ｍａｘｉ  Ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ抽出キット（ＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ、カタログ番号４１６０２／４１６２０）を使用して、同じ出発試料からＤＮＡを単離した（図２、レーンＡ）。
【００８８】
実施例３
この実施例は、パセリ由来の植物葉材料からのＤＮＡの単離に関する。
【００８９】
８ｇの新鮮なパセリの葉の試料を、例えば、Ｓｂｅａｄｅｘ  Ｍａｘｉ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔ（ＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ、カタログ番号４１６０２／４１６２０）において入手可能な４０ｍＬの溶解緩衝液ＰＮ（２．２５Ｍ塩酸グアニジン、１５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０％１−プロパノール）中で粉砕し、そのキットのプロトコルに従って、６０℃で３０分間インキュベートした。
【００９０】
そのインキュベーション後、２００μＬの溶解物を４００μＬの結合緩衝液ＰＮ（２．２５Ｍ塩酸グアニジン、１５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０％１−プロパノール）および１０μＬの標準Ｓｂｅａｄｅｘビーズ溶液と混合し、室温で５分間、１００ｒｐｍで振盪し、Ｓｂｅａｄｅｘビーズが溶液全体に均一に懸濁するよう維持した。振盪後、永久磁石の適用によりＳｂｅａｄｅｘビーズを除去し、上清を除去した。
【００９１】
Ｓｂｅａｄｅｘビーズを、４００μＬの洗浄緩衝液ＰＮ１（１．５Ｍ塩酸グアニジン、１０％Ｔｗｅｅｎ−２０、２０％１−プロパノール）に再懸濁し、５分間振盪した。永久磁石の適用によりＳｂｅａｄｅｘビーズを回収し、上清を除去した。次いで、Ｓｂｅａｄｅｘビーズを、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に１ｍＭ塩化カルシウムを含有する４００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁し、室温で５分間、１００ｒｐｍで振盪し、Ｓｂｅａｄｅｘビーズが溶液全体に均一に懸濁するよう維持した。前回のように、永久磁石の適用によりＳｂｅａｄｅｘビーズを回収した。
【００９２】
Ｓｂｅａｄｅｘビーズに結合したＤＮＡを、４０ｍＭの２−アミノメチルプロパノール−２（ｐＨ１０．０）および０．１ｍＭのエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）を含有する１００μＬの溶出緩衝液の添加により溶出した。Ｓｂｅａｄｅｘビーズを懸濁状態に保つために、時々試験管を振盪しながら５０℃で溶出を行った。
【００９３】
ＤＮＡ単離実験を二重に行い、溶出したＤＮＡをＵＶ分光光度法により測定した（下の表１を参照）。単離したＤＮＡの各溶出液の８μＬ試料を０．８％アガロースゲル電気泳動より分離した（図２、レーンＣ）。比較として、Ｓｂｅａｄｅｘ  Ｍａｘｉ  Ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ抽出キット（ＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ、カタログ番号４１６０２／４１６２０）を使用して、同じ出発試料からＤＮＡを単離した（図２、レーンＡ）。
【００９４】
実施例４
この実施例は、パセリ由来の植物葉材料からのＤＮＡの単離に関する。
【００９５】
８ｇの新鮮なパセリの葉の試料を、例えば、Ｓｂｅａｄｅｘ  Ｍａｘｉ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔ（ＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ、カタログ番号４１６０２／４１６２０）において入手可能な４０ｍＬの溶解緩衝液ＰＮ（２．２５Ｍ塩酸グアニジン、１５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０％１−プロパノール）中で粉砕し、そのキットのプロトコルに従って、６０℃で３０分間インキュベートした。
【００９６】
そのインキュベーション後、２００μＬの溶解物を４００μＬの結合緩衝液ＰＮ（２．２５Ｍ塩酸グアニジン、１５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０％１−プロパノール）および１０μＬの標準Ｓｂｅａｄｅｘビーズ溶液と混合し、室温で５分間、１００ｒｐｍで振盪し、Ｓｂｅａｄｅｘビーズが溶液全体に均一に懸濁するよう維持した。振盪後、永久磁石の適用によりＳｂｅａｄｅｘビーズを除去し、上清を除去した。
【００９７】
Ｓｂｅａｄｅｘビーズを、４００μＬの洗浄緩衝液ＰＮ１（１．５Ｍ塩酸グアニジン、１０％Ｔｗｅｅｎ−２０、２０％１−プロパノール）に再懸濁し、５分間振盪した。永久磁石の適用によりＳｂｅａｄｅｘビーズを回収し、上清を除去した。次いで、Ｓｂｅａｄｅｘビーズを、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に０．１ｍＭ塩化カルシウムを含有する４００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁し、室温で５分間、１００ｒｐｍで振盪し、Ｓｂｅａｄｅｘビーズが溶液全体に均一に懸濁するよう維持した。前回のように、永久磁石の適用によりＳｂｅａｄｅｘビーズを回収した。
【００９８】
Ｓｂｅａｄｅｘビーズに結合したＤＮＡを、４０ｍＭの２−アミノメチルプロパノール−２（ｐＨ１０．０）および０．１ｍＭのエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）を含有する１００μＬの溶出緩衝液の添加により溶出した。Ｓｂｅａｄｅｘビーズを懸濁状態に保つために、時々試験管を振盪しながら５０℃で溶出を行った。
【００９９】
ＤＮＡ単離実験を二重に行い、溶出したＤＮＡをＵＶ分光光度法により測定した（表１）。
【０１００】
【表２】
2019524084.tif 000004
【０１０１】
単離したＤＮＡの各溶出液の８μＬ試料を０．８％アガロースゲル電気泳動より分離した（図２、レーンＤ）。比較として、Ｓｂｅａｄｅｘ  Ｍａｘｉ  Ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ抽出キット（ＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ、カタログ番号４１６０２／４１６２０）を使用して、同じ出発試料からＤＮＡを単離した（図２、レーンＡ）。
【０１０２】
実施例５
この実施例は、ダイズ由来の植物葉材料からのＤＮＡの単離に関する。
乾燥したダイズ葉材料から４つのパンチ片（直径６ｍｍ）を採取し、ボールミル機器（Ｇｅｎｏｇｒｉｎｄｅｒ）を１秒当たり１，７５０ストロークで１分間使用して、４００μＬの溶解緩衝液ＰＮ（２．２５Ｍ塩酸グアニジン、１５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０％１−プロパノール）中で粉砕した。得られた試料を、Ｓｂｅａｄｅｘ  Ｍａｘｉ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔ（ＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ、カタログ番号４１６０２／４１６２０）のプロトコルに従って、６０℃で３０分間インキュベートした。  
【０１０３】
そのインキュベーション後、２００μＬの溶解物を４００μＬの結合緩衝液ＰＮ（２．２５Ｍ塩酸グアニジン、１５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０％１−プロパノール）および１０μＬの標準Ｓｂｅａｄｅｘビーズ溶液と混合し、室温で５分間、１００ｒｐｍで振盪し、Ｓｂｅａｄｅｘビーズが溶液全体に均一に懸濁するよう維持した。振盪後、永久磁石の適用によりＳｂｅａｄｅｘビーズを除去し、上清を除去した。
【０１０４】
Ｓｂｅａｄｅｘビーズを、４００μＬの洗浄緩衝液ＰＮ１（１．５Ｍ塩酸グアニジン、１０％Ｔｗｅｅｎ−２０、２０％１−プロパノール）に再懸濁し、５分間振盪した。永久磁石の適用によりＳｂｅａｄｅｘビーズを回収し、上清を除去した。次いで、Ｓｂｅａｄｅｘビーズを、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に０．１ｍＭ塩化カルシウムを含有する４００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁し、室温で５分間、１００ｒｐｍで振盪し、Ｓｂｅａｄｅｘビーズが溶液全体に均一に懸濁するよう維持した。前回のように、永久磁石の適用によりＳｂｅａｄｅｘビーズを回収した。
【０１０５】
Ｓｂｅａｄｅｘビーズに結合したＤＮＡを、４０ｍＭの２−アミノメチルプロパノール−２（ｐＨ１０．０）および０．１ｍＭのエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）を含有する１００μＬの溶出緩衝液の添加により溶出した。Ｓｂｅａｄｅｘビーズを懸濁状態に保つために、時々試験管を振盪しながら５０℃で溶出を行った。
【０１０６】
ＤＮＡ単離実験を合計８回繰り返し、溶出したＤＮＡをＵＶ分光光度法により測定した（表２）。
【０１０７】
【表３】
2019524084.tif 000005
【０１０８】
単離したＤＮＡの各溶出液の８μＬ試料を０．８％アガロースゲル電気泳動より分離した（図３）。
【０１０９】
実施例６
この実施例は、ヒマワリ由来の植物葉材料からのＤＮＡの単離に関する。
乾燥したヒマワリ葉材料から４つのパンチ片（直径６ｍｍ）を採取し、ボールミル機器（Ｇｅｎｏｇｒｉｎｄｅｒ）を１秒当たり１，７５０ストロークで１分間使用して、４００μＬの溶解緩衝液ＰＮ（２．２５Ｍ塩酸グアニジン、１５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０％１−プロパノール）中で粉砕した。得られた試料を、Ｓｂｅａｄｅｘ  Ｍａｘｉ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔ（ＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ、カタログ番号４１６０２／４１６２０）のプロトコルに従って、６０℃で３０分間インキュベートした。  
【０１１０】
そのインキュベーション後、２００μＬの溶解物を４００μＬの結合緩衝液ＰＮ（２．２５Ｍ塩酸グアニジン、１５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０％１−プロパノール）および１０μＬの標準Ｓｂｅａｄｅｘビーズ溶液と混合し、室温で５分間振盪した。振盪後、永久磁石の適用によりＳｂｅａｄｅｘビーズを除去し、上清を除去した。
【０１１１】
Ｓｂｅａｄｅｘビーズを、４００μＬの洗浄緩衝液ＰＮ１（１．５Ｍ塩酸グアニジン、１０％Ｔｗｅｅｎ−２０、２０％１−プロパノール）に再懸濁し、５分間振盪した。永久磁石の適用によりＳｂｅａｄｅｘビーズを回収し、上清を除去した。次いで、Ｓｂｅａｄｅｘビーズを、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に０．１ｍＭ塩化カルシウムを含有する４００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁し、室温で５分間振盪した。前回のように、永久磁石の適用によりＳｂｅａｄｅｘビーズを回収した。
【０１１２】
Ｓｂｅａｄｅｘビーズに結合したＤＮＡを、４０ｍＭの２−アミノメチルプロパノール−２（ｐＨ１０．０）および０．１ｍＭのエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）を含有する１００μＬの溶出緩衝液の添加により溶出した。Ｓｂｅａｄｅｘビーズを懸濁状態に保つために、時々試験管を振盪しながら５０℃で溶出を行った。
【０１１３】
ＤＮＡ単離実験を合計８回繰り返し、溶出したＤＮＡをＵＶ分光光度法により測定した（表３）。
【０１１４】
【表４】
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【０１１５】
単離したＤＮＡの各溶出液の８μＬ試料を０．８％アガロースゲル電気泳動より分離した（図４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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