(57)【要約】本発明は特に、核酸含有ナノ粒子を酵素と共に製剤化する方法を提供し、対象となる細胞または組織に皮下投与を介してペイロードを効率よく送達できるようにするものである。一部の実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子が様々な量のヒアルロニダーゼと共混合され、皮下投与を介して投与されるプロセスを提供する。得られたペイロードは、治療された対象の肝臓および他の器官または組織に効率よく送達され得る。【選択図】図１
2019533708.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を治療する方法であって、
治療を必要とする対象に、皮下注射を介して、
ａ）オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするｍＲＮＡと、
ｂ）ヒアルロニダーゼ酵素と、を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記皮下注射が、肝臓にｍＲＮＡの送達をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記皮下注射が、前記対象の肝臓において前記ＯＴＣタンパク質の発現をもたらす、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記皮下注射が、前記対象の血清中において前記ＯＴＣタンパク質の発現をもたらす、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＯＴＣタンパク質が、注射の少なくとも２４時間後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、または１カ月後に検出可能である、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＯＴＣタンパク質が機能的アッセイによって検出される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒアルロニダーゼ酵素が５０，０００Ｕ未満の用量で投与される、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒアルロニダーゼ酵素が、４０，０００Ｕ未満、３０，０００Ｕ未満、２０，０００Ｕ未満、１０，０００Ｕ未満、９０００Ｕ未満、８０００Ｕ未満、７０００Ｕ未満、６０００Ｕ未満、５０００Ｕ未満、４０００Ｕ未満、３０００Ｕ未満、２０００Ｕ未満、１０００Ｕ未満、９００Ｕ未満、８００Ｕ未満、７００Ｕ未満、６００Ｕ未満、または５００Ｕ未満の用量で投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒアルロニダーゼ酵素が、少なくとも１６０Ｕ、少なくとも１８０Ｕ、少なくとも２００Ｕ、少なくとも２２０Ｕ、少なくとも２４０Ｕ、少なくとも２６０Ｕ、少なくとも２８０Ｕ、少なくとも３００Ｕ、少なくとも３２０Ｕ、少なくとも３４０Ｕ、少なくとも３６０Ｕ、少なくとも３８０Ｕ、または少なくとも４００Ｕの用量で投与される、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒアルロニダーゼ酵素が、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも１０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも２０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも３０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも４０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも５０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも１００Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも２００Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも３００Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも４００Ｕ、またはｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも５００Ｕの用量で投与される、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｍＲＮＡがナノ粒子内に封入されている、請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ナノ粒子が脂質ベースまたはポリマーベースのナノ粒子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記脂質ベースのナノ粒子がリポソームである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記リポソームがＰＥＧ化脂質を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＥＧ化脂質が、前記リポソーム内の総脂質の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％を構成する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＥＧ化脂質が、前記リポソーム内の総脂質の少なくとも５％を構成する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＥＧ化脂質が、前記リポソーム内の総脂質の５％を構成する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記皮下注射が、対照のオロチン酸値と比較して、前記対象における尿オロチン酸値の低下を生じさせる、請求項１から請求項１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記対照のオロチン酸値が、前記治療前の前記対象におけるベースラインの尿オロチン酸値である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記対照のオロチン酸値が、治療を行っていないＯＴＣ患者における平均尿オロチン酸値を示す参照値である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記皮下注射が、対照のシトルリン値と比較して、前記対象の血清中においてシトルリン値の増加を生じさせる、請求項１から請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記対照のシトルリン値が、前記治療前の前記対象におけるベースラインの血清シトルリン値である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２２】
前記対照シトルリン値が、治療を行っていないＯＴＣ患者における平均の血清シトルリン値を示す参照値である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記ＯＴＣタンパク質をコードする前記ｍＲＮＡと前記ヒアルロニダーゼ酵素とが同時に注射される、請求項１から請求項２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＯＴＣタンパク質をコードする前記ｍＲＮＡと前記ヒアルロニダーゼ酵素とが一つの組成物として注射される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＯＴＣタンパク質をコードする前記ｍＲＮＡと前記ヒアルロニダーゼ酵素とが別個の組成物として注射される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＯＴＣタンパク質をコードする前記ｍＲＮＡと前記ヒアルロニダーゼ酵素とが逐次的に注射される、請求項１から請求項２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＯＴＣタンパク質をコードする前記ｍＲＮＡと前記ヒアルロニダーゼ酵素とが、２０ｍｌ未満、１５ｍｌ未満、１０ｍｌ未満、５ｍｌ未満、４ｍｌ未満、３ｍｌ未満、２ｍｌ未満、または１ｍｌ未満で注射される、請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を治療するための組成物であって、
ａ）オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするｍＲＮＡと、
ｂ）ヒアルロニダーゼ酵素と、を含む、組成物。
【請求項２９】
前記ｍＲＮＡおよび／または前記ヒアルロニダーゼ酵素がナノ粒子内に封入されている、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ｍＲＮＡと前記ヒアルロニダーゼ酵素とが同一のナノ粒子内に封入されている、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ｍＲＮＡと前記ヒアルロニダーゼ酵素とが別個のナノ粒子内に封入されている、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ｍＲＮＡと前記ヒアルロニダーゼ酵素とを封入している前記別個のナノ粒子が同一の製剤を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ｍＲＮＡと前記ヒアルロニダーゼ酵素とを封入している前記別個のナノ粒子が異なる製剤を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ｍＲＮＡがナノ粒子内に封入されており、前記ヒアルロニダーゼ酵素が封入されていない、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ナノ粒子が脂質ベースまたはポリマーベースのナノ粒子である、請求項２８から請求項３４のいずれかに記載の組成物。
【請求項３６】
前記脂質ベースのナノ粒子がリポソームである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記リポソームがＰＥＧ化脂質を含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ＰＥＧ化脂質が、前記リポソーム内の総脂質の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％を構成する、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ｍＲＮＡが、一個以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項２８から請求項３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ｍＲＮＡが修飾されていない、請求項２８から請求項３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記組成物が液体形態である、請求項２８から請求項４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記組成物が凍結乾燥粉末である、請求項２８から請求項４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
ｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質発現のためのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）送達方法であって、
対象に皮下注射を介して、
ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡと、
ｂ）ヒアルロニダーゼ酵素と、を投与することを含む、方法。
【請求項４４】
前記皮下注射が、肝臓においてｍＲＮＡの送達をもたらす、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記皮下注射が、前記対象の肝臓におけるＯＴＣタンパク質の発現をもたらす、請求項４３または請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記皮下注射が、前記対象の血清中において前記ＯＴＣタンパク質の発現をもたらす、請求項４３から請求項４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記タンパク質が、注射の少なくとも２４時間後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、または１カ月後に検出可能である、請求項４３から請求項４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記タンパク質が機能的アッセイによって検出される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ヒアルロニダーゼ酵素が５０，０００Ｕ未満の用量で投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記ヒアルロニダーゼ酵素が、４０，０００Ｕ未満、３０，０００Ｕ未満、２０，０００Ｕ未満、１０，０００Ｕ未満、９０００Ｕ未満、８０００Ｕ未満、７０００Ｕ未満、６０００Ｕ未満、５０００Ｕ未満、４０００Ｕ未満、３０００Ｕ未満、２０００Ｕ未満、１０００Ｕ未満、９００Ｕ未満、８００Ｕ未満、７００Ｕ未満、６００Ｕ未満、または５００Ｕ未満の用量で投与される、請求項４９に記載の方法
【請求項５１】
前記ヒアルロニダーゼ酵素が、少なくとも１６０Ｕ、少なくとも１８０Ｕ、少なくとも２００Ｕ、少なくとも２２０Ｕ、少なくとも２４０Ｕ、少なくとも２６０Ｕ、少なくとも２８０Ｕ、少なくとも３００Ｕ、少なくとも３２０Ｕ、少なくとも３４０Ｕ、少なくとも３６０Ｕ、少なくとも３８０Ｕ、または少なくとも４００Ｕの用量で投与される、請求項４３から請求項５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ヒアルロニダーゼ酵素が、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも１０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも２０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも３０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも４０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも５０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも１００Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも２００Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも３００Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも４００Ｕ、またはｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも５００Ｕの用量で投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｍＲＮＡがナノ粒子内に封入されている、請求項４３から請求項５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ナノ粒子が脂質ベースまたはポリマーベースのナノ粒子である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記脂質ベースのナノ粒子がリポソームである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記リポソームがＰＥＧ化脂質を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＰＥＧ化脂質が、前記リポソーム内の総脂質の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％を構成する、請求項５６に記載の方法
【請求項５８】
前記ＰＥＧ化脂質が、前記リポソーム内の総脂質の５％以下を構成する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ｍＲＮＡと前記ヒアルロニダーゼ酵素とが同時に注射される、請求項４３から請求項５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ｍＲＮＡと前記ヒアルロニダーゼ酵素とが一つの製剤で注射される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ｍＲＮＡと前記ヒアルロニダーゼ酵素とが別個の製剤で注射される、請求項４３に記載の方法。
【請求項６２】
前記ｍＲＮＡと前記ヒアルロニダーゼ酵素とが逐次的に注射される、請求項４３に記載の方法。
【請求項６３】
前記ｍＲＮＡと前記ヒアルロニダーゼ酵素とが、２０ｍｌ未満、１５ｍｌ未満、１０ｍｌ未満、５ｍｌ未満、４ｍｌ未満、３ｍｌ未満、２ｍｌ未満、または１ｍｌ未満で注射される、請求項４３に記載の方法。
【請求項６４】
ｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質発現のためのｍＲＮＡ送達用の組成物であって、
ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡと、
ｂ）ヒアルロニダーゼ酵素と、を含む、組成物。
【請求項６５】
前記ｍＲＮＡおよび／または前記ヒアルロニダーゼ酵素がナノ粒子内に封入されている、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記ｍＲＮＡと前記ヒアルロニダーゼ酵素とが前記同一のナノ粒子内に封入されている、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６７】
前記ｍＲＮＡと前記ヒアルロニダーゼ酵素とが別個のナノ粒子内に封入されている、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６８】
前記ｍＲＮＡがナノ粒子内に封入されており、前記ヒアルロニダーゼ酵素が封入されていない、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
前記ナノ粒子が脂質ベースまたはポリマーベースのナノ粒子である、請求項６４から請求項６８のいずれかに記載の組成物。
【請求項７０】
前記脂質ベースのナノ粒子がリポソームである、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
前記リポソームがＰＥＧ化脂質を含む、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記ＰＥＧ化脂質が、前記リポソーム内の総脂質の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％を構成する、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７３】
前記ｍＲＮＡが、一個以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項６４から請求項７２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７４】
前記ｍＲＮＡが修飾されていない、請求項６４から請求項７２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７５】
前記組成物が液体形態である、請求項６４から請求項７４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７６】
前記組成物が凍結乾燥粉末である、請求項６４から請求項７４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７７】
請求項２８から請求項４２および請求項６４から請求項７６のいずれか一項に記載の組成物を含む容器。
【請求項７８】
前記容器がシリンジまたはバイアルである、請求項７７に記載の容器。
【請求項７９】
請求項４３から請求項６３のいずれか一項に記載の方法に従って、治療を必要とする対象にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達することを含む、疾患、障害または症状を治療する方法であって、前記ｍＲＮＡが前記対象におけるタンパク質欠損部をコードする、方法。
【請求項８０】
請求項６４から請求項７６のいずれか一項に記載の組成物を、治療を必要とする対象に送達することを含む、疾患、障害または症状を治療する方法であって、前記ｍＲＮＡが前記対象におけるタンパク質欠損部をコードする、方法。
【請求項８１】
前記疾患、障害、または症状が代謝障害である、請求項７９または８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記疾患、障害、または症状が、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）欠損症（フェニルケトン尿症、ＰＫＵ）、アルギニノコハク酸シンターゼ１（ＡＳＳ１）欠損症、エリスロポエチン（ＥＰＯ）欠損症、ファブリー病；血友病性疾患（例えば、血友病Ｂ（ＦＩＸ）、血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ））；ＳＭＮ１関連脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）；筋萎縮性側方硬化症（ＡＬＳ）；ＧＡＬＴ関連ガラクトース血症；アルポート症候群を含むＣＯＬ４Ａ５関連障害；ガラクトセレブロシダーゼ欠損症；Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー；フリートライヒ運動失調症；ペリツェウス・メルツバッハ病；ＴＳＣ１およびＴＳＣ２関連結節性（脳）硬化症；サンフィリポＢ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＢ）；脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ関連振戦／失調症候群、および脆弱Ｘ早期卵巣不全症候群を含むＦＭＲ１関連障害；プラダー・ウィリー症候群；遺伝性出血性毛細管拡張症（ＡＴ）；ニーマン・ピック病タイプＣ１；  若年型神経セロイドリポフスチノーシス（ＪＮＣＬ）、若年バッテン病、サンタヴォリ・ハルティア病、ヤンスキー・ビールショースキー病、ならびにＰＴＴ−１およびＴＰＰ１欠損症を含む、神経セロイドリポフスチン症関連疾患；中枢神経系ミエリン形成不全／白質消失病を伴うＥＩＦ２Ｂ１、ＥＩＦ２Ｂ２、ＥＩＦ２Ｂ３、ＥＩＦ２Ｂ４、およびＥＩＦ２Ｂ５関連小児期運動失調；ＣＡＣＮＡ１ＡおよびＣＡＣＮＢ４関連一過性運動失調症２型；古典的レット症候群、ＭＥＣＰ２関連重度新生児脳症、およびＰＰＭ−Ｘ症候群を含むＭＥＣＰ２関連障害；ＣＤＫＬ５関連非定型レット症候群；ケネディ病（ＳＢＭＡ）；皮質下梗塞および白質脳症（ＣＡＤＡＳＩＬ）を伴うノッチ−３関連常染色体優性脳動脈症；ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ１Ｂ関連の発作障害；アルパーズ・フッテンロッハー症候群、ＰＯＬＧ関連感覚性運動失調型ニューロパチー、構音障害、および眼麻痺、ならびにミトコンドリアＤＮＡ欠失を伴う常染色体優性および劣性の進行性外眼筋麻痺を含む、ポリメラーゼＧ関連障害；Ｘ連鎖副腎低形成；Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症；ウィルソン病から選択される、請求項７９から請求項８１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年１１月１０日に出願された米国仮出願第６２／４２０，４３５号に対する優先権を主張するものであり、その仮出願の開示は参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本明細書は、配列表（「ＭＲＴ−１２５１ＷＯ＿ＳＬ」という名称のテキスト（．ｔｘｔ）ファイルとして２０１７年１１月１０日に電子的に提出されたもの）を参照する。該テキストファイルは、２０１７年１１月１０日に作成されたものであり、サイズは１０，４２１バイトである。配列表の全内容が、参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
メッセンジャーＲＮＡ療法（ＭＲＴ）は、様々な疾患の治療にますます重要なアプローチとなっている。ＭＲＴは、治療を必要とする患者にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与し、患者体内でｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を産生するものである。一般的には、効率よくｍＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏで送達するために、脂質ナノ粒子を使用してｍＲＮＡを送達する。
【０００４】
通例、静脈点滴法または注入法を用いて、治療を必要とする患者に脂質ナノ粒子に封入されたｍＲＮＡを送達するが、このような方法は長時間になり、かつ投与に追加的な医学的注意を要するために患者に好まれない場合がある。患者に対してより配慮ある送達方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、とりわけ、皮下投与を介してｍＲＮＡを効果的にｉｎ  ｖｉｖｏで送達するための改善された方法および組成物を提供する。詳細には、ｍＲＮＡを、ヒアルロニダーゼなどの細胞外基質を分解できる酵素と共に皮下注射して、効率的に循環させる。本明細書に記載されるように、ｍＲＮＡは、ヒアルロニダーゼと合わせて皮下注射されたとき、ｉｎ  ｖｉｖｏで、特に肝臓に、予想外に効率的なｍＲＮＡの送達とタンパク質発現とをもたらした。ヒアルロニダーゼは小分子およびタンパク質薬剤の皮下送達を増強するために使用されているが、ヒアルロニダーゼが、ｍＲＮＡ、特に脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入されたｍＲＮＡの皮下送達を促進させるのに効果的であるかどうかは、ＬＮＰ−ｍＲＮＡ調製物のサイズがかなり異なることやその複雑性の観点から、本発明の前にはわからなかった。抗体を含む典型的なタンパク質は、２０ｎｍ未満の平均サイズを持つ。多くのｍＲＮＡ担持ＬＮＰは、約１００ｎｍに近いか、または約１００ｎｍのサイズを持ち、これは典型的なタンパク質の少なくとも五倍大きいサイズである。したがって、本発明者らが観察した複数の疾患モデルにおいて、高効率のｍＲＮＡの送達、タンパク質産生、タンパク質活性、および治療効果が実証されたことは、実に驚くべきことであり、ｍＲＮＡ送達分野の著しい進歩を表している。肝臓における効率的なｍＲＮＡ送達および高タンパク質発現の点から、本発明は、中でもオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症などの代謝疾患の治療において特に有用である。加えて、本出願におけるヒアルロニダーゼを用いたｍＲＮＡの皮下送達は、患者に対してより配慮があるものであり、医療コストを削減し、また病院での患者のスループットを高めることができる。
【０００６】
一態様では、本開示は、ｍＲＮＡ療法によるオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症の治療方法を提供する。本方法は、ＯＴＣタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とを含む皮下送達用の組成物を、皮下経路を介して治療を必要とする対象に投与することを含む。
【０００７】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素は、５０，０００単位（Ｕ）以下の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素は、４０，０００Ｕ未満、３０，０００Ｕ未満、２０，０００Ｕ未満、１０，０００Ｕ未満、９０００Ｕ未満、８０００Ｕ未満、７０００Ｕ未満、６０００Ｕ未満、５０００Ｕ未満、４０００Ｕ未満、３０００Ｕ未満、２０００Ｕ未満、１０００Ｕ未満、９００Ｕ未満、８００Ｕ未満、７００Ｕ未満、６００Ｕ未満、または５００Ｕ未満の用量で投与される。
【０００８】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素は１Ｕ以上の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素は、少なくとも５Ｕ、少なくとも１０Ｕ、少なくとも２０Ｕ、少なくとも３０Ｕ、少なくとも４０Ｕ、少なくとも５０Ｕ、少なくとも６０Ｕ、少なくとも７０Ｕ、少なくとも８０Ｕ、少なくとも１００Ｕ、または少なくとも１５０Ｕの用量で投与される。
【０００９】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素は、少なくとも１６０Ｕ、少なくとも１８０Ｕ、少なくとも２００Ｕ、少なくとも２２０Ｕ、少なくとも２４０Ｕ、少なくとも２６０Ｕ、少なくとも２８０Ｕ、少なくとも３００Ｕ、少なくとも３２０Ｕ、少なくとも３４０Ｕ、少なくとも３６０Ｕ、少なくとも３８０Ｕ、または少なくとも４００Ｕの用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素は、１〜５０，０００Ｕ（例えば、５０〜５０，０００Ｕ、５０〜４５，０００Ｕ、１００〜４０，０００Ｕ、１００〜３５，０００Ｕ、１００〜３０，０００Ｕ、１５０〜３０，０００Ｕ、１６０〜３０，０００Ｕ、１６０〜２５，０００Ｕ、２００〜５０，０００Ｕ、２００〜４０，０００Ｕ、２００〜３０，０００Ｕ、２５０〜３０，０００Ｕ、２５０〜２５，０００Ｕ、または２５０〜２０，０００Ｕ）の用量範囲で投与される。
【００１０】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素は、送達されたＲＮＡの１ｍｇ当たり少なくとも１Ｕの用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼは、ＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも２Ｕ、ＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも５Ｕ、ＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも１０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも２０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも３０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも４０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも５０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも１００Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも２００Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも３００Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも４００Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも５００Ｕ、ＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも１０００Ｕ、ＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも２０００Ｕ、ＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも３０００Ｕ、ＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも４０００Ｕ、またはＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも５０００Ｕの用量で投与される。
【００１１】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、または１５ｋｂ以上の長さを有する。
【００１２】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡはナノ粒子内に封入されている。一部の実施形態では、ナノ粒子は脂質ベースまたはポリマーベースのナノ粒子である。一部の実施形態では、脂質ベースのナノ粒子はリポソームである。一部の実施形態では、リポソームはＰＥＧ化脂質を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、リポソーム内の総脂質の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、リポソーム内の総脂質の少なくとも５％を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、リポソーム内の総脂質の約５％を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、リポソーム内の総脂質の１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、または３％以下を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、リポソーム内の総脂質の５％以下を構成する。
【００１３】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、一つ以上のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、該一つ以上のカチオン性脂質は、Ｃ１２−２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＯＦ−０２、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡおよびＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１４】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、一つ以上の非カチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、該一つ以上の非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１５】
一部の実施形態では、皮下注射は、対象の肝臓においてＯＴＣタンパク質の発現をもたらす。
【００１６】
一部の実施形態では、皮下注射はｍＲＮＡを肝細胞に送達する。一部の実施形態では、皮下注射は、肝細胞におけるＯＴＣ発現をもたらす。
【００１７】
一部の実施形態では、皮下注射は、対象の血清中においてＯＴＣタンパク質の発現をもたらす。
【００１８】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、投与の少なくとも２４時間後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、または１カ月後に検出可能である。
【００１９】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ投与後のＯＴＣ発現は、機能的アッセイにより検出され得る。
【００２０】
一部の実施形態では、当該組成物の投与は、対照レベルと比較して、対象血清中のＯＴＣタンパク質の発現レベルまたは活性レベルの増加を生じさせる。一部の実施形態では、対照レベルは、治療前の対象におけるベースライン血清ＯＴＣタンパク質の発現レベルまたは活性レベルである。一部の実施形態では、対照レベルは、治療を行わないＯＴＣ患者における血清ＯＴＣタンパク質の平均の発現レベルまたは活性レベルを示す参照値である。
【００２１】
一部の実施形態では、当該組成物の投与は、対照のオロチン酸値と比較して、対象における尿オロチン酸値の低下を生じさせる。一部の実施形態では、対照オロチン酸値は、治療前の対象におけるベースライン尿オロチン酸値である。一部の実施形態では、対照オロチン酸値は、治療を行わないＯＴＣ患者における平均尿オロチン酸値を示す参照値である。
【００２２】
一部の実施形態では、当該組成物の投与は、対照シトルリン値と比較して、対象血清中のシトルリン値の増加を生じさせる。一部の実施形態では、対照シトルリン値は、治療前の対象におけるベースライン血清シトルリン値である。一部の実施形態では、対照シトルリン値は、治療を行わないＯＴＣ患者における平均血清シトルリン値を示す参照値である。
【００２３】
一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とが、同時に注射される。
【００２４】
一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とが、一つの組成物で注射される。
【００２５】
一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とが、別個の組成物で注射される。
【００２６】
一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とが、逐次的に注射される。
【００２７】
一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とが、２０ｍｌ未満、１５ｍｌ未満、１０ｍｌ未満、５ｍｌ未満、４ｍｌ未満、３ｍｌ未満、２ｍｌ未満、または１ｍｌ未満の体積で注射される。
【００２８】
一部の実施形態では、皮下注射は、週に一回以下の頻度で実施される。一部の実施形態では、皮下注射は、月に二回以下の頻度で実施される。一部の実施形態では、皮下注射は月に一回以下の頻度で実施される。
【００２９】
別の態様では、本発明は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするｍＲＮＡと、ヒアルロニダーゼ酵素とを含む、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を治療するための組成物を提供する。
【００３０】
一部の実施形態では、ＯＴＣ欠損症を治療するための組成物は、ｍＲＮＡおよび／またはヒアルロニダーゼ酵素を含み、ここでｍＲＮＡおよび／またはヒアルロニダーゼ酵素はナノ粒子内に封入されている。
【００３１】
特定の実施形態では、ｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とは同一のナノ粒子内に封入されている。
【００３２】
特定の実施形態では、ｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とは別個のナノ粒子に封入されている。
【００３３】
特定の実施形態では、ｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とを封入している別個のナノ粒子は同一の製剤を含む。
【００３４】
特定の実施形態では、ｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とを封入している別個のナノ粒子は同一の製剤を含む。
【００３５】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡはナノ粒子内に封入されており、ヒアルロニダーゼ酵素は封入されていない。
【００３６】
一部の実施形態では、ナノ粒子は脂質ベースまたはポリマーベースのナノ粒子である。
【００３７】
一部の実施形態では、脂質ベースのナノ粒子はリポソームである。
【００３８】
一部の実施形態では、リポソームはＰＥＧ化脂質を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、リポソーム内の総脂質の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、リポソーム内の総脂質の少なくとも５％を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、リポソーム内の総脂質の約５％を構成する。
【００３９】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、非修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、一個以上の修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、該一個以上の修飾ヌクレオチドは、シュードウリジン、Ｎ−１−メチル−シュードウリジン、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、４’チオウリジン、４’−チオシチジン、および／または２−チオシチジンを含む。
【００４０】
一部の実施形態では、組成物は液体形態である。
【００４１】
一部の実施形態では、組成物は凍結乾燥粉末である。
【００４２】
一態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質発現のためのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）送達方法であって、タンパク質をコードするｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とを皮下注射を介して対象に投与することを含み、前記皮下注射が、対象において該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ発現をもたらす、方法を提供する。
【００４３】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素は、５０，０００Ｕ未満、４０，０００Ｕ未満、３０，０００Ｕ未満、２０，０００Ｕ未満、１０，０００Ｕ未満、９０００Ｕ未満、８０００Ｕ未満、７０００Ｕ未満、６０００Ｕ未満、５０００Ｕ未満、４０００Ｕ未満、３０００Ｕ未満、２０００Ｕ未満、１０００Ｕ未満、９００Ｕ未満、８００Ｕ未満、７００Ｕ未満、６００Ｕ未満、または５００Ｕ未満の用量で投与される。
【００４４】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素は、少なくとも１Ｕ、少なくとも５Ｕ、少なくとも１０Ｕ、少なくとも２０Ｕ、少なくとも３０Ｕ、少なくとも４０Ｕ、少なくとも５０Ｕ、少なくとも６０Ｕ、少なくとも７０Ｕ、少なくとも８０Ｕ、少なくとも１００Ｕ、または少なくとも１５０Ｕの用量で投与される。
【００４５】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素は、少なくとも１６０Ｕ、少なくとも１８０Ｕ、少なくとも２００Ｕ、少なくとも２２０Ｕ、少なくとも２４０Ｕ、少なくとも２６０Ｕ、少なくとも２８０Ｕ、少なくとも３００Ｕ、少なくとも３２０Ｕ、少なくとも３４０Ｕ、少なくとも３６０Ｕ、少なくとも３８０Ｕ、または少なくとも４００Ｕの用量で投与される。別の言い方をすると、ヒアルロニダーゼ酵素は１Ｕ〜５０，０００Ｕの用量範囲で投与される。
【００４６】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素は、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも１０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも２０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも３０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも４０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも５０Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも１００Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも２００Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも３００Ｕ、ｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも４００Ｕ、またはｍＲＮＡ１ｍｇ当たり少なくとも５００Ｕの用量で投与される。
【００４７】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡはナノ粒子内に封入されている。
【００４８】
一部の実施形態では、ナノ粒子は脂質ベースまたはポリマーベースのナノ粒子である。
【００４９】
一部の実施形態では、脂質ベースのナノ粒子はリポソームである。
【００５０】
特定の実施形態では、リポソームはＰＥＧ化脂質を含む。
【００５１】
一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、リポソーム内の総脂質の１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、または３％以下を構成する。特定の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、リポソーム内の総脂質の５％以下を構成する。
【００５２】
特定の実施形態では、皮下注射方法は、対象の肝臓においてタンパク質の発現をもたらす。
【００５３】
特定の実施形態では、皮下注射方法は、対象の血清中においてタンパク質の発現をもたらす。
【００５４】
一部の実施形態では、タンパク質は、注射の少なくとも２４時間後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、または１カ月後に検出可能である。一部の実施形態では、タンパク質は機能的アッセイによって検出される。
【００５５】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とは同時に注射される。
【００５６】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とは一つの製剤で注射される。
【００５７】
一つ以上の実施形態では、ｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とは別個の製剤で注射される。
【００５８】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とは逐次的に注射される。
【００５９】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とは、２０ｍｌ未満、１５ｍｌ未満、１０ｍｌ未満、５ｍｌ未満、４ｍｌ未満、３ｍｌ未満、２ｍｌ未満、または１ｍｌ未満で注射される。
【００６０】
一態様では、本発明は、ａ）タンパク質をコードするｍＲＮＡと、ｂ）ヒアルロニダーゼ酵素とを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質発現のためのｍＲＮＡ送達用の組成物を提供する。
【００６１】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とはナノ粒子内に封入されている。
【００６２】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは第一のナノ粒子内に封入されており、ヒアルロニダーゼ酵素は第二のナノ粒子内に封入されている。
【００６３】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とは、同一のナノ粒子内に封入されている。
【００６４】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とは、別個のナノ粒子に封入されている。
【００６５】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡはナノ粒子内に封入されており、ヒアルロニダーゼ酵素は封入されていない。
【００６６】
一部の実施形態では、ナノ粒子は脂質ベースまたはポリマーベースのナノ粒子である。
【００６７】
一部の実施形態では、脂質ベースのナノ粒子はリポソームである。
【００６８】
一部の実施形態では、リポソームはＰＥＧ化脂質を含む。
【００６９】
一部の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、リポソーム内の総脂質の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％を構成する。
【００７０】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、一個以上の修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、当該一個以上の修飾ヌクレオチドは、シュードウリジン、Ｎ−１−メチル−シュードウリジン、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および／または２−チオシチジンを含む。
【００７１】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、修飾されない。
【００７２】
一部の実施形態では、組成物は液体形態である。
【００７３】
別の実施形態では、組成物は凍結乾燥粉末である。
【００７４】
一態様では、本発明は上述の組成物を含む容器を提供する。容器はバイアルまたはシリンジである。シリンジは、単一皮下投与のために予め充填されていてもよい。バイアルは、組成物の凍結乾燥粉末または液体形態を含んでもよい。
【００７５】
本発明の態様は、上述の方法に従って、治療を必要とする対象にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達することを含む、疾患、障害、または症状を治療する方法であって、該ｍＲＮＡが対象におけるタンパク質欠損部をコードする、方法を提供する。
【００７６】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、代謝障害の治療に有用である。一部の実施形態では、疾患、障害、または症状は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）欠損症（フェニルケトン尿症、ＰＫＵ）、アルギニノコハク酸シンターゼ１（ＡＳＳ１）欠損症、エリスロポエチン（ＥＰＯ）欠損症、ファブリー病；血友病性疾患（例えば、血友病Ｂ（ＦＩＸ）、血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ））；ＳＭＮ１関連脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）；筋萎縮性側方硬化症（ＡＬＳ）；ＧＡＬＴ関連ガラクトース血症；アルポート症候群を含むＣＯＬ４Ａ５関連障害；ガラクトセレブロシダーゼ欠損症；Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー；フリートライヒ運動失調症；ペリツェウス・メルツバッハ病；ＴＳＣ１およびＴＳＣ２関連結節性（脳）硬化症；サンフィリポＢ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＢ）；脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ関連振戦／失調症候群、および脆弱Ｘ早期卵巣不全症候群を含むＦＭＲ１関連障害；プラダー・ウィリー症候群；遺伝性出血性毛細管拡張症（ＡＴ）；ニーマン・ピック病タイプＣ１；若年型神経セロイドリポフスチノーシス（ＪＮＣＬ）、若年バッテン病、サンタヴォリ・ハルティア病、ヤンスキー・ビールショースキー病、ならびにＰＴＴ−１およびＴＰＰ１欠損症を含む、神経セロイドリポフスチン症関連疾患；中枢神経系ミエリン形成不全／白質消失病を伴うＥＩＦ２Ｂ１、ＥＩＦ２Ｂ２、ＥＩＦ２Ｂ３、ＥＩＦ２Ｂ４、およびＥＩＦ２Ｂ５関連小児期運動失調；ＣＡＣＮＡ１ＡおよびＣＡＣＮＢ４関連一過性運動失調症２型；古典的レット症候群、ＭＥＣＰ２関連重度新生児脳症、およびＰＰＭ−Ｘ症候群を含むＭＥＣＰ２関連障害；ＣＤＫＬ５関連非定型レット症候群；ケネディ病（ＳＢＭＡ）；皮質下梗塞および白質脳症（ＣＡＤＡＳＩＬ）を伴うノッチ−３関連常染色体優性脳動脈症；ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ１Ｂ関連の発作障害；アルパーズ・フッテンロッハー症候群、ＰＯＬＧ関連感覚性運動失調型ニューロパチー、構音障害、および眼麻痺、ならびにミトコンドリアＤＮＡ欠失を伴う常染色体優性および劣性の進行性外眼筋麻痺を含む、ポリメラーゼＧ関連障害；Ｘ連鎖副腎低形成；Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症；ウィルソン病から選択される
【００７７】
本出願において、「または」の使用は、別段の記載がない限り、「および／または」を意味する。本開示において使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの該用語の変化形は、他の付加物、成分、整数、または工程を除外することを意図するものではない。本出願において使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は同意語として用いられている。両方の用語は、当業者によって理解される任意の通常の変動を網羅することを意味する。
【００７８】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲において明らかになる。しかしながら、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示すが、単に例示のために与えられるものであり、制限するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
図面は単に例示を目的とするものであり、限定するためのものではない。
【００８０】
【図１】図１は、ヒアルロニダーゼを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ｍＲＮＡ製剤および  ヒアルロニダーゼを含まない脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ｍＲＮＡ製剤の静脈内投与または皮下投与の２４時間後の、ＯＴＣノックアウト（ＫＯ）ｓｐｆａｓｈマウス肝臓におけるヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ｈＯＴＣ）タンパク質のシトルリン活性を比較した例を示す。
【００８１】
【図２】図２は、ヒアルロニダーゼを含むＬＮＰ  ｍＲＮＡ製剤およびヒアルロニダーゼを含まないＬＮＰ  ｍＲＮＡ製剤の静脈内投与または単回皮下投与の２４時間後の、ＯＴＣ  ＫＯｓｐｆａｓｈマウス肝臓におけるコドン最適化ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ＣＯ−ｈＯＴＣ）ｍＲＮＡのコピー数を比較した例を示す。
【００８２】
【図３】図３は、ヒアルロニダーゼを含むＬＮＰ  ｍＲＮＡ製剤の静脈内投与またはヒアルロニダーゼを含むＬＮＰ  ｍＲＮＡ製剤の皮下投与の２４時間後の、ＯＴＣ  ＫＯｓｐｆａｓｈマウス肝臓におけるシトルリン産生の例を示す。
【００８３】
【図４】図４は、生理食塩水で静脈内処置した野生型マウス、生理食塩水で静脈内処置したＯＴＣ  ＫＯｓｐｆａｓｈマウス、およびヒアルロニダーゼを含むＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤で皮下処置したＫＯｓｐｆａｓｈマウス肝臓におけるシトルリン産生の例を示す。投与の２４時間後にシトルリン値を測定した。
【００８４】
【図５】図５は、ＯＴＣ活性と該組成物に含まれる種々のヒアルロニダーゼ用量との関係の例を示す。図に示すように、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇのＯＴＣ  ｍＲＮＡと、０、５６０Ｕ、２８００Ｕ、または５６００Ｕのヒアルロニダーゼとを用いてＯＴＣ−ＫＯマウスを処置し、シトルリン値を測定した。
【００８５】
【図６】図６は、ヒアルロニダーゼを含むコドン最適化ｈＰＡＨ（ＣＯ−ｈＰＡＨ）ＬＮＰ  ｍＲＮＡ製剤の皮下投与、またはＣＯ−ｈＰＡＨ  ＬＮＰ  ｍＲＮＡ製剤の静脈内投与の２４時間後の、ＰＡＨ  ＫＯマウスにおける血清フェニルアラニンレベル（投与前および投与後）の例を示す。
【００８６】
【図７】図７は、ヒアルロニダーゼを含むコドン最適化ｈＡＳＳ１（ＣＯ−ｈＡＳＳ１）ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤の皮下投与、またはＣＯ−ｈＡＳＳ１  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤の静脈内投与の２４時間後の、ＡＳＳ１  ＫＯマウス肝臓におけるヒトアルギニノコハク酸シンテターゼ（ｈＡＳＳ１）タンパク質レベルの例を示す。
【００８７】
【図８】図８は、全身ｉｎ  ｖｉｖｏルミノメーター  を用いて発光出力によって評価したＦｉｒｅｆｌｙ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ＦＦＬ）タンパク質活性の測定例を示す。ＦＦＬタンパク質発光を、ヒアルロニダーゼを含むＦＦＬ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤の皮下投与３時間後および２４時間後の野生型マウス肝臓で観察した。測定期間中、発光強度は維持されていた。
【００８８】
【図９】図９は、ヒアルロニダーゼを含むｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤の皮下投与、またはｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤の静脈内投与の１〜４日後の、マウス血清中におけるヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質レベルの例を示す。
【００８９】
【図１０】図１０は、ヒアルロニダーゼを含むかまたは含まないｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ  の皮下投与後の、マウス血清中におけるヒトＥＰＯタンパク質発現の例を示す。静脈内投与の場合のｈＥＰＯ発現を比較のために示す。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
定義
本発明をより容易に理解するために、いくつかの用語を最初に以下に定義する。以下の用語および他の用語の追加の定義は、明細書全体を通して述べられている。
【００９１】
動物：本明細書で使用される場合、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階でのヒトを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階での非ヒト動物を意味する。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、ゲッ齒類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。一部の実施形態では、動物には、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、及び／または蠕虫類が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子組換え動物、及び／またはクローンであり得る。
【００９２】
略または約：本明細書で使用する場合、関心のある一つ以上の値に適用される「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、記載された基準値に類似する値を指す。特定の実施形態では、「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、特段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）、いずれかの方向（より大きいまたは小さい）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満の値の範囲を指す。
【００９３】
送達：本明細書で使用される場合、用語「送達」は局所送達及び全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、そのコードされたタンパク質が発現され、そしてその標的組織内で保持される状況（「局所分布」または「局所送達」とも称される）、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、そのコードされたタンパク質が発現され、そして患者の循環系（例えば、血清）内に分泌され、そして全身に分布され、他の組織によって取り込まれる状況（「全身分布」または「全身送達」とも称される）を包含する。
【００９４】
封入：本明細書で使用される場合、用語「封入」または文法的等価物は、ナノ粒子内に個々のｍＲＮＡ分子を閉じ込めるプロセスを指す。
【００９５】
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、ｍＲＮＡをポリペプチドへと翻訳すること、複数のポリペプチドをインタクトなタンパク質（例えば、酵素）へと構築すること、及び／またはポリペプチドもしくは完全に構築されたタンパク質（例えば、酵素）の翻訳後修飾をすることを指す。この用途において、用語「発現」及び「産生」ならびに文法的等価物は互換的に使用される。
【００９６】
半減期：本明細書で使用される場合、用語「半減期」は、核酸またはタンパク質の濃度または活性などの量が、ある期間の開始時に測定された値の半分まで下がるのに要する時間である。
【００９７】
ヒアルロニダーゼ：本明細書で使用される場合、用語「ヒアルロニダーゼ」は、ヒアルロン酸（ヒアルロナン）を分解することができる酵素のファミリーを指す。
【００９８】
改善、増加または低減：本明細書で使用される場合、「改善」、「増加」、もしくは「低減」という用語、または文法的等価物は、本明細書に記載される治療の開始前の同一個体での測定値、または本明細書に記載される治療を受けていない対照被験体（または複数の対照被験体）での測定値などのベースライン測定値に対する相対的な値を示唆するものである。「対照被験体」とは、治療を受けている対象と同じ疾患形態を患っており、治療を受けている対象とほぼ同じ年齢の対象のことである。
【００９９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、多細胞生物体内ではなく、例えば、試験管または反応容器中、細胞培養液中などの人工的な環境で生じる事象を意味する。
【０１００】
ｉｎ  ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、ヒトおよび非ヒト動物などの多細胞生物体内で生じる事象を意味する。細胞型系の文脈において、該用語は、生細胞内で生じる事象を意味するのに（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ系の対語として）使用され得る。
【０１０１】
局所分布または局所送達：本明細書において使用される場合、「局所分布」、「局所送達」またはその文法的に均等な用語は、組織特異的な送達または分布を指す。典型的には、局所分布または局所送達は、細胞内で翻訳および発現される、または分泌が限定的で、患者の循環系へ入ることを回避する、ｍＲＮＡにコードされるタンパク質（たとえば酵素）を必要とする。
【０１０２】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも一つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。本明細書で使用されるｍＲＮＡは、修飾および未修飾の両方のＲＮＡを包含する。ｍＲＮＡは一つ以上のコード領域および非コード領域を含み得る。ｍＲＮＡは、自然源から精製されてもよく、組換え発現系を用いて産生されてもよく、また任意選択的に精製、化学合成などをされてもよい。必要に応じて、例えば、化学的に合成された分子の場合、ｍＲＮＡは、化学修飾された塩基または糖類、骨格修飾などを有する類似体といった、ヌクレオシド類似体を含み得る。ｍＲＮＡ配列は、別段に示されない限り、５’から３’の方向に提示される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び２−チオシチジン）；化学修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）；介在塩基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ  ｂａｓｅ）；修飾された糖類（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）；及び／もしくは修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエート及び５’−Ｎ−ホスホルアミダイト結合）であるか、またはそれらを含む。
【０１０３】
患者：本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、提供される組成物が、例えば、実験、診断、予防、美容、及び／または治療目的のために投与され得る任意の生物体を意味する。典型的な患者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及び／またはヒトなどの哺乳類）が含まれる。一部の実施形態では、患者はヒトである。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。
【０１０４】
医薬的に許容される：本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、合理的な利益／リスクの比率に相応で、ヒト及び動物の組織に接触させて使用することに適した物質を指す。
【０１０５】
皮下投与：本明細書で使用される場合、「皮下投与」または「皮下注射」という用語は、皮膚と筋肉の間の組織層である皮下組織へのボーラス注射を意味する。
【０１０６】
対象：本明細書で使用する「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を意味する。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。多くの実施形態では、対象はヒトである。対象は患者である場合があり、これは、疾患の診断または治療のために医療機関に来院するヒトを意味する。用語「対象」は、本明細書において「個体」または「患者」と交換可能に使用される。対象は、疾患または障害に罹患している可能性があるか、またはそれに感受性を有するが、疾患または障害の症状を表していてもいなくてもよい。
【０１０７】
実質的：本明細書で使用される場合、用語「実質的」は、関心対象の特徴または特性の全てもしくはほぼ全ての範囲または程度を示す、定性的な状態を意味する。生物学分野の当業者であれば、生物学的及び化学的な現象が、完了すること及び／もしくは完了の域に到達すること、または絶対的な結果を達成もしくは回避することが、仮にあったとしても稀であることを理解するであろう。したがって、用語「実質的」は、本明細書において、多くの生物学的及び化学的現象に固有の潜在的な完全性の欠如を捉えるのに用いられる。
【０１０８】
全身分布または全身送達：本明細書で使用される場合、用語「全身分布」、「全身送達」、または文法的等価物は、全身もしくは生物体全体に影響を及ぼす送達または分布のメカニズムまたはアプローチを意味する。典型的には、全身分布または全身送達は、身体の循環系、例えば、血流を介して成し遂げられる。「局所分布または局所送達」の定義と比較される。
【０１０９】
標的組織：本明細書で使用される場合、用語「標的組織」は、治療される疾患の影響を受ける任意の組織を意味する。一部の実施形態では、標的組織には、疾患関連病態、症状、または特徴を現す組織が含まれる。
【０１１０】
治療有効量：本明細書で使用される場合、治療剤の「治療有効量」という用語は、疾患、障害、及び／もしくは症状に罹患しているか、または感受性を有する対象に投与される場合、その疾患、障害、及び／または症状の徴候を治療する、診断する、予防する、及び／またはその開始を遅延するのに十分な量を意味する。当業者は、治療有効量が少なくとも一つの単位用量を含む投与レジメンによって投与されるのが典型的であることを理解するであろう。
【０１１１】
治療：本明細書で使用される場合、用語「治療する」、「治療」または「治療している」は、ある特定の疾患、障害、及び／または症状の一つ以上の徴候または特徴を、部分的にまたは完全に軽減する、寛解させる、緩和する、抑制する、予防する、その開始を遅延する、その重篤度を低減する、及び／またはその発症率を低減するために使用する任意の方法を意味する。疾患の症状を提示していない対象、及び／または疾患の初期の症状のみを提示している対象に対して、該疾患に関連する病態を発症させる危険性を減らすために、治療が行われる場合もある。
［発明を実施するための形態］
【０１１２】
本発明は、特に、ヒアルロニダーゼ酵素と共に皮下注射することによって改善されたｍＲＮＡ送達の方法および組成物を提供する。予想外に、ヒアルロニダーゼ酵素との同時注射により、ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子が驚くほど効率的に全身曝露され、かつ分散された。得られたペイロードは、処置した動物の肝臓（および他の器官または組織）に効率的に送達された。こうしたヒアルロニダーゼを用いる方法は、それを用いなければ不耐性となる薬剤の新規な送達プロファイルを作成するのに大きな利点を持つ。複数の疾患モデルにおいて、効率的なｍＲＮＡの定着、タンパク質産生、タンパク質活性および有効性を示すいくつかの例が本明細書に提示されている。
【０１１３】
本発明は特に、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とを、治療を必要とする対象に皮下注射を介して投与することによって、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を治療するための方法および組成物を提供する。また、本発明を使用して、様々な他の疾患、障害、および症状、特に代謝の疾患、障害、および症状を治療することができる。
【０１１４】
本発明の様々な態様は、以下のセクションで詳細に説明される。セクションの使用は、本発明を限定することを意味しない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願において、「または」の使用は、他に記載がない限り、「および／または」を意味する。
ヒアルロニダーゼ酵素
【０１１５】
様々なヒアルロニダーゼ酵素を使用して、本発明を実施してもよい。例えば、ヒアルロニダーゼには作用機序に基づく三つの群がある。それらの群のうちの二つはエンド−β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ類である。一つの群には、基質の加水分解を利用する脊椎動物酵素類が含まれる。脊椎動物のヒアルロニダーゼ類（ＥＣ  ３．２．１．３５）は、触媒として基質の加水分解を利用するエンド−β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ類である。脊椎動物のヒアルロナン類はまた、トランスグリコシダーゼ活性を有し、ＨＡ鎖を架橋する能力と、ＨＡ鎖とＣｈＳまたはＣｈとを架橋し得る能力を持つ。脊椎動物のヒアルロニダーゼ類は、非進行性のエンド分解（ｅｎｄｏｌｙｔｉｃ）プロセスを通してＨＡを分解し、多くの場合、四糖類を生成する。哺乳類のヒアルロニダーゼ類は、グリコシダーゼファミリー５６と呼ばれる炭水化物活性酵素（ＣＡＺｙ）群のメンバーであり、β１，４グリコシド結合においてＨＡの触媒作用で加水分解を利用するエンド−β−アセチル−ヘキソサミニダーゼ類として定義される。
【０１１６】
第二の群は、主に細菌性であり、グリコシド結合をβ脱離して不飽和結合を導入する機能を有するエリミナーゼ類を含む。また、細菌性ヒアルロニダーゼ類は、エンド−β−アセチル−ヘキソサミニダーゼ類であるが、リアーゼ機構を利用する。これらは異なるＣＡＺｙファミリーに属し、多糖類リアーゼファミリー８に属する。一般的に、これらの多糖類リアーゼ類（ＥＣ  ４．２．２．＊）はβ脱離によって切断し、新しい非還元末端に二重結合をもたらす。ヒアルロン酸リアーゼ類（ＥＣ  ４．２．２．１；細菌性Ｈｙａｌ）は、ファミリー８内の一つのサブグループのみからなり、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ類（ＥＣ  ４．２．２．４）、コンドロイチンＡＣリアーゼ類（ＥＣ  ４．２．２．５）、およびキサンタンリアーゼ類（ＥＣ  ４．２．２．１２）も含む。これらの細菌性酵素類、ヒアルロニダーゼ類、コンドロイチナーゼ類、およびキサンタナーゼ類は全て、有意な配列的、構造的および機械的な相同性を共有している。
【０１１７】
第三の群はエンドβ−グルクロニダーゼ類である。これらは、環形動物のヒルや特定の甲殻類で見られる。
【０１１８】
また、ヒトゲノムのヒアルロニダーゼ様配列であるＨｙａｌ−１、Ｈｙａｌ−２、Ｈｙａｌ−３、Ｈｙａｌ−４、およびＰＨ−２０／Ｓｐａｍ１、ならびに偽遺伝子Ｐｈｙａｌ１（翻訳されず）をコードする六つの既知の遺伝子があり、その全ての相同性の程度が高い。マウスは同様に、ヒト遺伝子と高い相同性の程度を有するヒアルロニダーゼ類をコードする六つの遺伝子を持つ（Ｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００６，１０６（３）：８１８−８３９）。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼはまた、他の任意の動物性物質を含まない滅菌調製物としてウシまたはブタから得ることができる。
【０１１９】
ウシＰＨ−２０は一般的に使用されるヒアルロニダーゼであり、適度に純粋な形態で市販されている（シグマカタログ番号Ｈ３６３１、タイプＶＩ−Ｓ、ウシ精巣由来、３，０００〜１５，０００ＮＦＵ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  Ｕｎｉｔ）単位／ｍｇの活性有）。
【０１２０】
注射用ヒアルロニダーゼは、粉末形態または溶液で市販されている。例えば、ＦＤＡ承認されたウシ精巣ヒアルロニダーゼ酵素は、無色の無秩序な溶液として入手可能である。
【０１２１】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼの国際単位は、０．１ｍｇの国際標準調製物の活性として定義されてもよく、以下の反応に基づく１混濁度軽減単位（ＴＲＵ）（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｆｏｒ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ，”Ｂｕｌｌ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ．１９５７；１６（２）：２９１−２９４）に等しい：
ヒアルロニダーゼ
ヒアルロン酸−−−−−−−−−−−−＞二糖類と単糖類＋小ヒアルロン酸断片
したがって、ヒアルロニダーゼ活性の一単位は、２．０ｍｌの反応混合物において、ｐＨ５．３にて３７℃で毎分０．３３０のＡ６００の変化を引き起こす（４５分アッセイ）。％透過率は６００ｎｍで算出され、光経路は１ｃｍである。
【０１２２】
一部の実施形態では、組換え酵素、または任意の既知の方法もしくは利用可能な標準方法によって人工的に産生された酵素が、本目的のために使用され得る。
【０１２３】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼは、皮下注射について１単位〜５０，０００単位の範囲の用量で使用される。このタイプの例示的な組換えヒアルロニダーゼは、エンドグリコシダーゼＨｙｌｅｎｅｘである。ヒアルロニダーゼの皮下投与量は、約１単位〜５０，０００単位である。ヒアルロニダーゼは、４０，０００Ｕ未満、３０，０００Ｕ未満、２０，０００Ｕ未満、１０，０００Ｕ未満、９０００Ｕ未満、８０００Ｕ未満、７０００Ｕ未満、６０００Ｕ未満、５０００Ｕ未満、４０００Ｕ未満、３０００Ｕ未満、２０００Ｕ未満、１０００Ｕ未満、９００Ｕ未満、８００Ｕ未満、７００Ｕ未満、６００Ｕ未満、または５００Ｕ未満の用量で投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素は、少なくとも１Ｕ、少なくとも５Ｕ、少なくとも１０Ｕ、少なくとも２０Ｕ、少なくとも３０Ｕ、少なくとも４０Ｕ、少なくとも５０Ｕ、少なくとも６０Ｕ、少なくとも７０Ｕ、少なくとも８０Ｕ、少なくとも１００Ｕ、または少なくとも１５０Ｕの用量で投与される。一部の他の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素は、少なくとも１６０Ｕ、少なくとも１８０Ｕ、少なくとも２００Ｕ、少なくとも２２０Ｕ、少なくとも２４０Ｕ、少なくとも２６０Ｕ、少なくとも２８０Ｕ、少なくとも３００Ｕ、少なくとも３２０Ｕ、少なくとも３４０Ｕ、少なくとも３６０Ｕ、少なくとも３８０Ｕ、または少なくとも４００Ｕの用量で投与される。一つ以上の実施形態では、ブタ（豚）ヒアルロニダーゼを１単位〜５０，０００単位の範囲の用量で使用する。ヒアルロニダーゼ酵素は、４０，０００Ｕ未満、３０，０００Ｕ未満、２０，０００Ｕ未満、１０，０００Ｕ未満、９０００Ｕ未満、８０００Ｕ未満、７０００Ｕ未満、６０００Ｕ未満、５０００Ｕ未満、４０００Ｕ未満、３０００Ｕ未満、２０００Ｕ未満、１０００Ｕ未満、９００Ｕ未満、８００Ｕ未満、７００Ｕ未満、６００Ｕ未満、または５００Ｕ未満の用量で投与される。前記ヒアルロニダーゼ酵素が、少なくとも１Ｕ、少なくとも５Ｕ、少なくとも１０Ｕ、少なくとも２０Ｕ、少なくとも３０Ｕ、少なくとも４０Ｕ、少なくとも５０Ｕ、少なくとも６０Ｕ、少なくとも７０Ｕ、少なくとも８０Ｕ、少なくとも１００Ｕ、または少なくとも１５０Ｕの用量で投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。一部の他の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素は、少なくとも１６０Ｕ、少なくとも１８０Ｕ、少なくとも２００Ｕ、少なくとも２２０Ｕ、少なくとも２４０Ｕ、少なくとも２６０Ｕ、少なくとも２８０Ｕ、少なくとも３００Ｕ、少なくとも３２０Ｕ、少なくとも３４０Ｕ、少なくとも３６０Ｕ、少なくとも３８０Ｕ、または少なくとも４００Ｕの用量で投与される。
【０１２４】
一つ以上の実施形態では、ヒアルロニダーゼはｍＲＮＡと同時に投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼは、ｍＲＮＡの投与の前に投与され得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とは同一製剤の一部である。一部の実施形態では、ＲＮＡとヒアルロニダーゼ酵素とは、別個の製剤として注射される。
【０１２５】
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素は、水溶液で投与され得る。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素は生理食塩水溶液で投与される。いくつかの実施形態では、ヒアルロニダーゼ酵素はｍＲＮＡ製剤の一部であり、同じ溶液中に含まれ、この溶液はｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ封入脂質とヒアルロニダーゼ酵素とを含む凍結乾燥調製物が治療用途のために製剤化される。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：
【０１２６】
本発明を使用して、任意のｍＲＮＡを送達することができる。本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡは、コードされるタンパク質を翻訳するためにＤＮＡからリボソームに情報を伝えるタイプのＲＮＡである。ｍＲＮＡは様々な公知の方法のいずれかにより合成され得る。たとえば本発明に従うｍＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を介して合成することができる。簡潔に述べると、ＩＶＴは多くの場合、プロモーターを含む直線状または環状のＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含み得る緩衝系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅＩ、ピロホスファターゼ、ならびに／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を用いて行われる。厳密な条件は具体的なアプリケーションに従い変化するであろう。
【０１２７】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡを製剤化および封入前に精製して、ｍＲＮＡ合成中に使用する様々な酵素および他の試薬を含む望ましくない不純物を除去してもよい。
【０１２８】
本発明を使用して、様々な長さのｍＲＮＡを送達することができる。一部の実施形態では、本発明を使用して、長さ約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、または２０ｋｂ以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡを送達することができる。一部の実施形態では、本発明を使用して、長さ約１〜２０ｋｂ、約１〜１５ｋｂ、約１〜１０ｋｂ、約５〜２０ｋｂ、約５〜１５ｋｂ、約５〜１２ｋｂ、約５〜１０ｋｂ、約８〜２０ｋｂ、または約８〜１５ｋｂの範囲のｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡを送達することができる。
【０１２９】
本発明を使用して、未修飾のｍＲＮＡ、または安定性を一般的に強化する一つ以上の修飾を含むｍＲＮＡを送達することができる。一部の実施形態では、修飾は、修飾ヌクレオチド、修飾糖リン酸骨格、ならびに５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）から選択される。
【０１３０】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡの修飾は、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含み得る。本発明の修飾ｍＲＮＡは、例えば骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾を含み得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、以下に限定されないが、プリン類（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））またはピリミジン類（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））をはじめとする天然ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体（修飾ヌクレオチド）から合成されてもよく、ならびに例えば１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニル−アデニン、Ｎ６−メチル−アデニン、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン、２−チオ−シトシン、３−メチル−シトシン、４−アセチル−シトシン、５−メチル−シトシン、２，６−ジアミノプリン、１−メチル−グアニン、２−メチル−グアニン、２，２−ジメチル−グアニン、７−メチル−グアニン、イノシン、１−メチル−イノシン、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）（５−ウラシル）、ジヒドロウラシル、２−チオ−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウラシル、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、５−メチル−２−チオ−ウラシル、５−メチル−ウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、５−メチルアミノメチル−ウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５’−メトキシカルボニルメチル−ウラシル、５−メトキシ−ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、１−メチルシュードウラシル、キューオシン、ベータ−Ｄ−マンノシル−キューオシン、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、ならびにホスホロアミデート類、ホスホロチオエート類、ペプチドヌクレオチド類、メチルホスホネート類、７−デアザグアノシン、５−メチルシトシンおよびイノシンなどのプリン類ならびにピリミジン類の修飾ヌクレオチド類似体または誘導体として合成されてもよい。こうした類似体の調製は、米国特許第４，３７３，０７１号、同第４，４０１，７９６号、同第４，４１５，７３２号、同第４，４５８，０６６号、同第４，５００，７０７号、同第４，６６８，７７７号、同第４，９７３，６７９号、同第５，０４７，５２４号、同第５，１３２，４１８号、同第５，１５３，３１９号、第５，２６２，５３０号および第５，７００，６４２号から当業者に公知であり、これらの開示は参照によりその全範囲が本明細書に含まれる。
【０１３１】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡはＲＮＡ骨格修飾を含んでもよい。典型的には、骨格修飾は、ＲＮＡに含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸塩が化学的に修飾される修飾である。例示的な骨格修飾として、典型的には、以下に限定されないが、メチルホスホネート、メチルホスホルアミデート、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート（例えば、シチジン５’−Ｏ−（１−チオフォスフェート））、ボラノリン酸塩、正荷電グアニジウム基などからなる群由来の修飾が挙げられ、これは、ホスホジエステル結合を他のアニオン基、カチオン基、または中性基で置き換えることに基づくことを意味する。
【０１３２】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは糖修飾を含み得る。典型的な糖修飾は、ｍＲＮＡが有するヌクレオチドの糖の化学修飾であり、糖修飾として、以下に限定されないが、２’−デオキシ−２’−フルオロ−オリゴリボヌクレオチド（２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）、２’−デオキシ−２’−デアミン−オリゴリボヌクレオチド（２’−アミノ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）、２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルシチジン５’−三リン酸、２’−メチルウリジン５’−三リン酸）、２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、及びこれらの異性体（２’−アラシチジン５’−三リン酸、２’−アラウリジン５’−三リン酸）、またはアジド三リン酸（２’−アジド−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）からなる群から選択される糖修飾が挙げられる。
【０１３３】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡはヌクレオチドの塩基の修飾（塩基修飾）を含み得る。塩基修飾を含む修飾されたヌクレオチドは、塩基修飾ヌクレオチドとも称される。こうした塩基修飾ヌクレオチドの例として、以下に限定されないが、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド５’−三リン酸、２−アミノアデノシン５’−三リン酸、２−チオシチジン５’−三リン酸、２−チオウリジン５’−三リン酸、４−チオウリジン５’−三リン酸、５−アミノアリルシチジン５’−三リン酸、５−アミノアリルウリジン５’−三リン酸、５−ブロモシチジン５’−三リン酸、５−ブロモウリジン５’−三リン酸、５−ヨードシチジン５’−三リン酸、５−ヨードウリジン５’−三リン酸、５−メチルシチジン５’−三リン酸、５−メチルウリジン５’−三リン酸、６−アザシチジン５’−三リン酸、６−アザウリジン５’−三リン酸、６−クロロプリンリボシド５’−三リン酸、７−デアザアデノシン５’−三リン酸、７−デアザグアノシン５’−三リン酸、８−アザアデノシン５’−三リン酸、８−アジドアデノシン５’−三リン酸、ベンゾイミダゾールリボシド５’−三リン酸、Ｎ１−メチルアデノシン５’−三リン酸、Ｎ１−メチルグアノシン５’−三リン酸、Ｎ６−メチルアデノシン５’−三リン酸、Ｏ６−メチルグアノシン５’−三リン酸、プソイドウリジン５’−三リン酸、ピューロマイシン５’−三リン酸、またはキサントシン５’−三リン酸が挙げられる。
【０１３４】
ｍＲＮＡ合成には、５’末端への「キャップ」及び３’末端への「テール」の付加が含まれるのが典型的である。キャップの存在は、大半の真核生物細胞に見られるヌクレアーゼへの耐性を付与するのに重要である。「テール」の存在は、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護するのに役立つものである。
【０１３５】
したがって、一部の実施形態では、ｍＲＮＡは５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には次のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの一つを除去して二つの末端リン酸を残し、次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加されて５−’５’逆三リン酸結合を生成し、次いで、グアニンの７−窒素がメチルトランスフェラーゼによりメチル化される。２’−Ｏ−メチル化は、７−メチルグアノシン三リン酸残基に続く第一の塩基および／または第二の塩基でも生じ得る。キャップ構造の例には、以下に限定されないが、ｍ７ＧｐｐｐＮｐ−ＲＮＡ、ｍ７ＧｐｐｐＮｍｐ−ＲＮＡ、およびｍ７ＧｐｐｐＮｍｐＮｍｐ−ＲＮＡが含まれる（ｍは２’−Ｏメチル残基を示す）。
【０１３６】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端のポリＡテールは多くの場合、約１０〜３００個のアデノシンヌクレオチド（例えば、約１０〜２００個のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１５０個のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１００個のアデノシンヌクレオチド、約２０〜７０個のアデノシンヌクレオチド、または約２０〜６０個のアデノシンヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは３’ポリ（Ｃ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端の好適なポリＣテールは多くの場合、約１０〜２００個のシトシンヌクレオチド（例えば、約１０〜１５０個のシトシンヌクレオチド、約１０〜１００個のシトシンヌクレオチド、約２０〜７０個のシトシンヌクレオチド、約２０〜６０個のシトシンヌクレオチド、または約１０〜４０個のシトシンヌクレオチド）を含む。ポリＣテールは、ポリＡテールに付加され得るか、またはポリＡテールを置換し得る。
【０１３７】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’および／または３’の非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域には、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす一つ以上の要素、例えば、鉄応答要素が含まれる。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、長さ約５０〜５００のヌクレオチドであり得る。
【０１３８】
一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞中のｍＲＮＡの位置の安定性に影響を及ぼすタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの一つ以上の結合部位のうちの一つ以上を含む。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、長さ約５０〜５００ヌクレオチドであるか、またはそれ以上の長さであり得る。
キャップ構造
【０１３９】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には次のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの一つを除去して二つの末端リン酸を残し、次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加されて５’−５’逆三リン酸結合を生成し、次いで、グアニンの７−窒素がメチルトランスフェラーゼによりメチル化される。キャップ構造の例としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
天然に存在するキャップ構造は７−メチルグアノシンを含み、これは、三リン酸架橋を介して第一の転写ヌクレオチドの５’末端に連結され、その結果、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（Ｎは任意のヌクレオシドである）のジヌクレオチドキャップをもたらす。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、キャップは酵素を用いて付加される。キャップは、核に付加され、酵素グアニリルトランスフェラーゼによる触媒作用を受ける。ＲＮＡの５’末端へのキャップの付加は、転写の開始直後に生じる。末端ヌクレオシドは、グアノシンであるのが典型的であり、全ての他のヌクレオチドとは逆の方向になっており、すなわち、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧｐＮｐＮｐである。
【０１４１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により生成されたｍＲＮＡに対する普遍的なキャップは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇであり、これをｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写においてジヌクレオチドキャップとして使用し、その５’末端にキャップ構造を有するＲＮＡが取得される。キャップ化されたｍＲＮＡの一般的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成方法では、転写の開始因子として、形態がｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（「ｍ７ＧｐｐｐＧ」）である予め形成されたジヌクレオチドが用いられている。
【０１４２】
従来より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳実験に使用される合成ジヌクレオチドキャップの通常の形態は、アンチリバースキャップ類似体（「ＡＲＣＡ」）または修飾されたＡＲＣＡであり、これは、２’ＯＨ基または３’ＯＨ基が−ＯＣＨ３で置換される、修飾されたキャップ類似体であるのが一般的である。
【０１４３】
さらなるキャップ類似体として、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ；非メチル化キャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＧ）；ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、またはアンチリバースキャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ；ｍ７、２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧ、及びそれらの四リン酸誘導体）からなる群から選択される化学構造が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ‘ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ’ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３）を参照のこと）。
【０１４４】
一部の実施形態では、好適なキャップは７−メチルグアニル酸（「ｍ７Ｇ」）であり、これは、三リン酸架橋を介して第一の転写ヌクレオチドの５’末端に連結され、その結果、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（Ｎは任意のヌクレオシドである）をもたらすものである。本発明の実施形態に利用されるｍ７Ｇキャップの好適な実施形態は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである。
【０１４５】
一部の実施形態では、キャップはキャップ０構造である。キャップ０構造は、塩基１及び塩基２に結合したリボースの２’−Ｏ−メチル残基を欠く。一部の実施形態では、キャップはキャップ１構造である。キャップ１構造は、塩基２に２’−Ｏ−メチル残基を有する。一部の実施形態では、キャップはキャップ２構造である。キャップ２構造は、塩基２及び塩基３の両方に結合した２’−Ｏ−メチル残基を有する。
【０１４６】
様々なｍ７Ｇキャップ類似体が当該技術分野において既知であり、その多くは市販されている。これらには、上述のｍ７ＧｐｐｐＧ、ならびにＡＲＣＡ  ３’−ＯＣＨ３及び２’−ＯＣＨ３キャップ類似体が含まれる（Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３））。本発明の実施形態において使用するためのさらなるキャップ類似体として、Ｎ７−ベンジル化ジヌクレオシド四リン酸類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１０：１４７９−１４８７（２００４）に記載）、ホスホロチオエートキャップ類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１３：１７４５−１７５５（２００７）に記載）、ならびに米国特許第８，０９３，３６７号及び同第８，３０４，５２９号（参照により本明細書に援用される）に記載されるキャップ類似体（ビオチン化キャップ類似体を含む）が挙げられる。
テール構造
【０１４７】
多くの場合、「テール」の存在はエキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護するという役割を果たす。ポリＡテールは、天然のメッセンジャーセンスＲＮＡおよび合成センスＲＮＡを安定させると考えられている。したがって、ある実施形態では、長いポリＡテールをｍＲＮＡ分子に付加することにより、そのＲＮＡをさらに安定化することができる。ポリＡテールは、当該技術分野において認識されている様々な技術を使用して付加することができる。例えば、長いポリＡテールは、ポリＡポリメラーゼを使用して合成ＲＮＡまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡに付加することができる（Ｙｏｋｏｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９６；１４：１２５２−１２５６）。転写ベクターが、長いポリＡテールをコードすることもできる。加えて、ポリＡテールは、ＰＣＲ産物から直接転写することによって付加することができる。ポリＡは、ＲＮＡリガーゼを用いてセンスＲＮＡの３’末端にライゲーションすることもできる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９９１  ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照のこと）。
【０１４８】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは３’テール構造を含む。テール構造は典型的に、ポリ（Ａ）テールおよび／またはポリ（Ｃ）テールを含む。ｍＲＮＡの３’末端上のポリＡテールまたはポリＣテールは、典型的には、少なくとも５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも１５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、または少なくとも１ｋｂのアデノシヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチドをそれぞれ含む。一部の実施形態では、ポリＡテールまたはポリＣテールはそれぞれ、約１０〜８００個のアデノシンヌクレオチドまたはシトシンヌクレオチド（例えば、約１０〜２００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜３００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜４００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜５００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜５５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約５０〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１００〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１５０〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約２００〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約２５０〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約３００〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約３５０〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約４００〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約４５０〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約５００〜６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜１５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０〜１００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約２０〜７０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、または約２０〜６０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド）であり得る。一部の実施形態では、テール構造は、本明細書に記載の様々な長さを有するポリ（Ａ）テールおよびポリ（Ｃ）テールの組み合わせを含む。一部の実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアデノシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のシトシンヌクレオチドを含む。
【０１４９】
一部の実施形態では、ポリＡテールまたはポリＣテールの長さを調節して、本発明の修飾センスｍＲＮＡ分子の安定性を制御し、それにともなってタンパク質の転写を制御する。例えば、ポリＡテールの長さはセンスｍＲＮＡ分子の半減期に影響を及ぼし得るため、ポリＡテールの長さを調節して、ヌクレアーゼに対するｍＲＮＡの耐性のレベルを改変し、それによって、標的細胞におけるポリヌクレオチドの発現及び／またはポリペプチドの産生の時間経過を制御してもよい。
５’および３’の非翻訳領域
【０１５０】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’および／または３’の非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域には、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす一つ以上の要素、例えば、鉄応答要素が含まれる。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、長さ約５０〜５００のヌクレオチドであり得る。
【０１５１】
一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞中のｍＲＮＡの位置の安定性に影響を及ぼすタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの一つ以上の結合部位のうちの一つ以上を含む。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、長さ約５０〜５００ヌクレオチドであるか、またはそれ以上の長さであり得る。
【０１５２】
例示的な３’および／または５’のＵＴＲ配列は、センスｍＲＮＡ分子の安定性を強化するために、安定なｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸回路酵素）から誘導されてもよい。例えば、５’ＵＴＲ配列は、ヌクレアーゼ耐性を改善するため、及び／またはポリヌクレオチドの半減期を改善するために、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子またはその断片の部分配列を含み得る。ポリヌクレオチドをさらに安定化させるために、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’末端または非翻訳領域にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）またはその断片をコードする配列を含めることも想定される。一般に、これらの修飾は、ポリヌクレオチドの安定性及び／または薬物動態特性（例えば、半減期）を、それらの未修飾の対応物に比べて改善するものであり、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏヌクレアーゼ消化に対するポリヌクレオチド耐性を改善するように行われる修飾を含む。
【０１５３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応から得られたｍＲＮＡが一部の実施形態では望ましいことがあるが、細菌、真菌、植物、および／または動物から産生されたｍＲＮＡを含めたｍＲＮＡの他の供給源も、本発明の範囲内であると意図される。
【０１５４】
本発明を使用して、様々なタンパク質をコードするｍＲＮＡを送達することができる。本発明に適したｍＲＮＡの非限定的な例には、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）、ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、およびオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）などの標的タンパク質をコードするｍＲＮＡが含まれる。
ｍＲＮＡ配列の例
【０１５５】
一部の実施形態では、本発明は、標的タンパク質欠損の治療を目的に、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡを対象に送達するための方法および組成物を提供する。例示的なｍＲＮＡ配列を以下に示す。
【化１】
2019533708.tif 000003
【化２】
2019533708.tif 000004
【化３】
2019533708.tif 000005
【化４】
2019533708.tif 000006
【０１５６】
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ配列は、標的タンパク質の相同体または類似体をコードし得る。例えば、標的タンパク質の相同体または類似体は、実質的な標的タンパク質の活性を保持しながら、野生型または天然型の標的タンパク質と比較した場合に一つ以上のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含む修飾標的タンパク質であってもよい。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、上記の例示的な配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、標的タンパク質と実質的に同一であるタンパク質をコードする。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、上記の例示的な配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、標的タンパク質の断片または一部をコードする。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは標的タンパク質の断片または一部をコードし、該タンパク質の断片または一部は、野生型タンパク質と類似した標的活性を依然として維持している。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、上記の例示的な配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を有する。
【０１５７】
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、別のタンパク質に融合した標的タンパク質（例えばＮ末端またはＣ末端融合物）の全長、断片、または一部を含む融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、標的タンパク質の全長、断片、または一部をコードするｍＲＮＡに融合したタンパク質は、シグナル配列または細胞標的化配列をコードする。
脂質ナノ粒子
【０１５８】
本発明によると、ｍＲＮＡはナノ粒子に封入されるかまたは複合体化され得る。一部の実施形態では、ナノ粒子は、「送達ビヒクル」、「移送ビヒクル」、またはそれらの文法的等価物とも称される。
【０１５９】
様々な実施形態によると、好適なナノ粒子として、以下に限定されないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリマー系担体、脂質ナノ粒子およびリポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、天然および合成由来のエキソソーム、天然層状体、合成層状体および半合成層状体、ナノ粒子、カルシウムリン−ケイ酸塩ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、微結晶微粒子、半導体ナノ粒子、ポリ（Ｄ−アルギニン）、ゾルゲル、ナノデンドリマー、デンプンベース送達系、ミセル、エマルジョン、ニオソーム、多ドメインブロックポリマー（ビニルポリマー、ポリプロピルアクリル酸ポリマー、動的多抱合体）、乾燥粉末製剤、プラスミド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、ならびに他の指向性タグが挙げられる。
【０１６０】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは一個以上のリポソーム内に封入される。本明細書において使用される場合、「リポソーム」という用語は、任意の層状、多重層状、または固形のナノ粒子小胞を指す。典型的には、本明細書において使用されるリポソームは、１種以上の脂質を混合することにより、または１種以上の脂質とポリマーを混合することにより形成され得る。ゆえに本明細書において使用される「リポソーム」という用語は、脂質系ナノ粒子およびポリマー系ナノ粒子の両方を包含する。一部の実施形態では、本発明に適したリポソームは、カチオン性または非カチオン性の脂質、コレステロール系脂質、および／またはＰＥＧ修飾脂質を含む。
ＰＥＧ化脂質
【０１６１】
一部の実施形態では、適切な脂質溶液は、一つ以上のＰＥＧ化脂質を含む。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質と、Ｎ−オクタノイル−スフィンゴシン−ｌ−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８  ＰＥＧ−２０００セラミド）を含めた誘導体化されたセラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）などの誘導体化脂質との使用も、本発明により企図される。企図されるＰＥＧ修飾脂質は、長さがＣ６−Ｃ２０のアルキル鎖を有する脂質に共有結合された長さ最大５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖を含むが、これに限定されない。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ−２Ｋである。一部の実施形態では、特定の有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧセラミドである。
【０１６２】
ＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化脂質は、リポソーム内の総脂質の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％を構成し得る。
カチオン性脂質  
【０１６３】
本明細書で使用される場合、語句「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を有する多数の脂質種のいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂質は文献に記載されており、その多くは市販されている。本発明の組成物および方法に使用するのに特に好適なカチオン性脂質は、国際特許公開第２０１０／０５３５７２号（具体的には、段落［００２２５］に記載されているＣ１２−２００）および同第２０１２／１７０９３０号に記載されている脂質を含み、その両方の文献は参照により本明細書に援用される。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法に適したカチオン性脂質として、例えば、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−ｌ−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−ｌ−アミン（ＨＧＴ５００１）、および（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−５，１５，１８−トリエン−１−アミン（ＨＧＴ５００２）などの、２０１２年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたイオン化可能なカチオン性脂質が挙げられる。
【０１６４】
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に適したカチオン性脂質は、３，６−ビス（４−（ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）−２−ヒドロキシオクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン（ＯＦ−０２）などのカチオン性脂質を含む。
【０１６５】
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に適したカチオン性脂質は、３−（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）−６−（４−（（２−ヒドロキシドデシル）（２−ヒドロキシウンデシル）アミノ）ブチル）−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン（Ｔａｒｇｅｔ２３）、３−（５−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ペンタン−２−イル）−６−（５−（（２−ヒドロキシドデシル）（２−ヒドロキシウンデシル）アミノ）ペンタン−２−イル）−１，４−ジオキサン−２，５−ジオン（Ｔａｒｇｅｔ２４）などの、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」と題する国際公開第２０１５／１８４２５６  Ａ２号（参照により本明細書に援用される）に記載のカチオン性脂質を含む。
【０１６６】
一部の実施形態では、発明の組成物および方法に適したカチオン性脂質は、国際公開第２０１３／０６３４６８号と、「Ｌｉｐｉｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ」と題する米国仮出願（これらの両方の文献は、参照により本明細書に援用される）とに記載されるカチオン性脂質を含む。
【０１６７】
一部の実施形態では、本発明に適した一つ以上のカチオン性脂質はＮ−［ｌ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、すなわち「ＤＯＴＭＡ」であってもよい。（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号）。他の好適なカチオン性脂質として、例えば、５−カルボキシスペルミルグリジンジオクタデシルアミド（ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎｅｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ）すなわち「ＤＯＧＳ」、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｌ−プロパンアミニウムすなわち「ＤＯＳＰＡ」（Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２  （１９８９）；米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、ｌ，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパンすなわち「ＤＯＤＡＰ」、ｌ，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンすなわち「ＤＯＴＡＰ」が挙げられる。
【０１６８】
さらなる例示的なカチオン性脂質として、ｌ，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンすなわち「ＤＳＤＭＡ」、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンすなわち「ＤＯＤＭＡ」、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンすなわち「ＤＬｉｎＤＭＡ」、ｌ，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンすなわち「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドすなわち「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミドすなわち「ＤＤＡＢ」、Ｎ−（ｌ，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミドすなわち「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−ｌ−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパンすなわち「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−（５’−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−ｌ−（シス，シス−９’，ｌ−２’−オクタデカジエノキシ）プロパンすなわち「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンすなわち「ＤＭＯＢＡ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルミバル−３−ジメチルアミノプロパンすなわち「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノレオイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミンすなわち「ＤＬｉｎＤＡＰ」、ｌ，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルミバル−３−ジメチルアミノプロパンすなわち「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、ｌ，２−ジリノレオイルカルミバル−３−ジメチルアミノプロパンすなわち「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［ｌ，３］−ジオキソランすなわち「ＤＬｉｎ−  −ＤＭＡ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［ｌ，３］−ジオキソランすなわち「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」、および２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，ｌ  ２−ジエン−１−イル）−ｌ，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ））（国際公開第２０１０／０４２８７７号；Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２８：１７２−１７６（２０１０）を参照のこと）、またはこれらの混合物が挙げられる。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７：２７６−２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３−１００７（２００５）；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１号）。一部の実施形態では、カチオン性脂質のうちの一つ以上は、イミダゾール部分、ジアルキルアミノ部分、またはグアニジウム部分のうちの少なくとも一つを含む。
【０１６９】
一部の実施形態では、一つ以上のカチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル  ４−（ジメチルアミノ）ブタノアート）、ＡＬＮＹ−１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン））、ＮＣ９８−５  （４，７，１３−トリス（３−オキソ−３−（ウンデシルアミノ）プロピル）−Ｎ１，Ｎ１６−ジウンデシル−４，７，１０，１３−テトラアザヘキサデカン−１，１６−ジアミド）から選択されてもよい。
【０１７０】
一部の実施形態では、カチオン性脂質は、適切な脂質溶液において、重量％またはモル％で総脂質の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、重量％またはモル％で、総脂質混合物の約３０〜７０％（例えば、約３０〜６５％、約３０〜６０％、約３０〜５５％、約３０〜５０％、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。
非カチオン性／ヘルパー脂質
【０１７１】
本明細書で使用される場合、語句「非カチオン性脂質」は、任意の中性脂質、双性イオン脂質、またはアニオン性脂質を意味する。本明細書で使用される場合、語句「アニオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の負電荷を保有する多数の脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質として、以下に限定されないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、ｌ−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物が挙げられる。
【０１７２】
一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、適切な脂質溶液において、重量％またはモル％で総脂質の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％を構成し得る。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、適切な脂質溶液において、重量％またはモル％で総脂質の約３０〜５０％（例えば、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。
コレステロール系脂質
【０１７３】
一部の実施形態では、適切な脂質溶液は、一つ以上のコレステロール系脂質を含む。好適なコレステロール系カチオン性脂質として、例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３，１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥが挙げられる。一部の実施形態では、コレステロール系脂質は、適切な脂質溶液において、重量％またはモル％で総脂質の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％を構成する。一部の実施形態では、コレステロール系脂質は、適切な脂質溶液において、重量％またはモル％で総脂質の約３０〜５０％（例えば、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。
【０１７４】
カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール系脂質、およびＰＥＧ修飾脂質の例示的組み合わせが実施例のセクションに記載されている。例えば、適切な脂質溶液は、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２−２００、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５０００、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；またはＨＧＴ５００１、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含み得る。脂質混合物を含む、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および／またはＰＥＧ修飾脂質の選択、ならびにこれらの脂質の相互の相対モル割合の選択は、選択される脂質の特徴、性質、封入されるｍＲＮＡの特徴に基づいて行われる。さらなる考慮すべき事項には、例えば、選択される脂質のアルキル鎖の飽和度、ならびに大きさ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、融合性、及び毒性が含まれる。したがって、モル割合はそれらに応じて調節され得る。
ｍＲＮＡ担持ナノ粒子
【０１７５】
望ましい任意の脂質は、ｍＲＮＡの封入に適した任意の比で混合され得る。一部の実施形態では、適切な脂質溶液は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール、および／またはＰＥＧ化脂質を含む所望の脂質の混合物を含有する。
【０１７６】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子にｍＲＮＡを封入するプロセスは、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合することを含み、該ｍＲＮＡ溶液および／または脂質溶液は、混合前に周囲温度よりも高い所定温度に加熱されて、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子を形成する（２０１５年７月２日に出願された「Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ」と題する米国特許出願公開第１４／７９０，５６２号、および２０１４年７月２日に出願された米国仮特許出願第６２／０２０，１６３号を参照されたく、これらの開示はその全体が本明細書に援用される）。
【０１７７】
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子にｍＲＮＡを封入するプロセスは、予め形成した脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと混合することを含む（２０１６年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／４２０，４１３号、および２０１７年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６２／５８０，１５５号を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に援用される）。一部の実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと混合することで、ｍＲＮＡを細胞内に送達する効率を改善する脂質ナノ粒子が生じる。一部の実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと混合することで、極めて高い封入効率（すなわち、９０〜９５％の範囲）でｍＲＮＡを脂質ナノ粒子に封入することになる。一部の実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子とｍＲＮＡとを、プロセス全体にわたって脂質／ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を一定に維持し、かつ量産化を容易にするポンプシステムを用いて混合している。
【０１７８】
本発明による好適なリポソームは、様々な大きさに作製することができる。一部の実施形態では、提供されるリポソームは、従来から知られているｍＲＮＡ封入リポソームよりも小さく作製され得る。一部の実施形態では、リポソームの大きさが減少すると、ｍＲＮＡの送達効率が高くなる。適切なリポソームの大きさは、標的細胞または標的組織の部位を考慮し、また作製されるリポソームの用途をある程度考慮して選択することができる。
【０１７９】
一部の実施形態では、適切な大きさのリポソームを選択して、ｍＲＮＡによりコードされる抗体の全身分布を促進する。一部の実施形態では、特定の細胞または組織へのｍＲＮＡのトランスフェクションを限定することが望ましい場合がある。例えば、肝細胞を標的とするには、リポソームは、その寸法が肝臓の肝類洞を覆う内皮層の開窓よりも小さくなるように寸法決定されてもよく、こうした場合、リポソームは、その内皮開窓を容易に貫通して、標的肝細胞に達することができようになる。
【０１８０】
あるいはまたは加えて、リポソームは、リポソームの寸法が特定の細胞もしくは組織内への分布を制限するか、または意図的に分布しないようにするのに十分な直径であるように寸法決定されてもよい。例えば、リポソームは、その寸法が肝類洞を覆う内皮層の開窓より大きくなるように寸法決定されてもよく、それによって、リポソームの肝細胞への分布を制限する。
【０１８１】
一部の実施形態では、リポソームの大きさは、リポソーム粒子の最大直径の長さによって決定される。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約２５０ｎｍ以下（例えば、約２２５ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、または５０ｎｍ以下）の大きさを有する。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約１０〜２５０ｎｍの範囲（例えば、約１０〜２２５ｎｍ、１０〜２００ｎｍ、１０〜１７５ｎｍ、１０〜１５０ｎｍ、１０〜１２５ｎｍ、１０〜１００ｎｍ、１０〜７５ｎｍ、または１０〜５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約１００〜２５０ｎｍの範囲（例えば、約１００〜２２５ｎｍ、１００〜２００ｎｍ、１００〜１７５ｎｍ、１００〜１５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約１０〜１００ｎｍの範囲（例えば、約１０〜９０ｎｍ、１０〜８０ｎｍ、１０〜７０ｎｍ、１０〜６０ｎｍ、または１０〜５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。ある特定の実施形態では、好適なリポソームは、約１００ｎｍ未満の大きさを有する。
【０１８２】
リポソーム集団の寸法決定に対して、当該技術分野において既知の様々な別の方法を利用することができる。こうした寸法決定方法の一つは、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、この文献は参照によって本明細書に援用される。バス超音波処理またはプローブ超音波処理のいずれかによるリポソーム懸濁液の超音波処理によって、直径が約０．０５マイクロメートル未満の小さいＵＬＶまでサイズ漸減する。ホモジナイゼーションは別の方法であり、大きいリポソームをより小さいものに断片化するのに剪断エネルギーを利用する。典型的なホモジナイゼーション手順において、ＭＬＶは、選択されたリポソームの大きさ、典型的には約０．１〜０．５マイクロメートルの大きさが観察されるまで、標準的なエマルジョンホモジナイザーを用いて再循環される。リポソームの大きさは、Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１−１５０（１９８１）（参照によって本明細書に援用される）に記載された準電気光散乱（ＱＥＬＳ）によって算出され得る。平均リポソーム直径を、形成されたリポソームを超音波処理することによって減少させることができる。断続的な超音波処理サイクルをＱＥＬＳ評価と交互に行って、効率的なリポソーム合成を導くことができる。
医薬組成物
【０１８３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍＲＮＡの発現を促進するために、リポソームを含めた脂質ナノ粒子などの送達ビヒクルは、一つ以上の追加の核酸、担体、標的化リガンドまたは安定化試薬と組み合わせて製剤化されても、好適な賦形剤と混合されている薬理学的組成物に製剤化されてもよい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを封入している脂質ナノ粒子は、ヒアルロニダーゼと同時に投与される。薬物の製剤化及び投与の技術は、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎで知ることができる。
【０１８４】
提供されるリポソーム封入ｍＲＮＡ、またはリポソーム結合ｍＲＮＡ、及びそれを含む組成物は、対象の臨床状態、投与の部位及び投与方法、投与スケジュール、対象の年齢、性別、体重、ならびに当該技術分野の臨床医に関連する他の要因を考慮して、現在の医療行為に従い投与及び投薬され得る。本明細書における目的に適う「有効量」は、実験臨床研究、薬理学、臨床、及び医療分野の当業者に既知のこうした適切な考慮すべき事項により決定され得る。一部の実施形態では、投与される量は、症状や、当業者によって疾患の進行、退行、または改善の適切な基準として選択される他の指標を、少なくともいくらか安定化、改善、または排除するのに有効である。例えば、好適な量及び投薬レジメンは、少なくとも一過性タンパク質（例えば、酵素）の産生をもたらすものである。
【０１８５】
本発明は、皮下組織（皮膚と筋肉の間の組織層）へのボーラス注射といった皮下送達に焦点を当てているが、その他の適切な投与経路として、例えば、経口投与、直腸投与、膣投与、経粘膜投与、気管内もしくは吸入を含む肺投与、または腸投与；皮内注射、経皮（局所）注射、筋肉内注射、髄内注射、ならびにくも膜下腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、もしくは鼻腔内を含めた非経口送達が挙げられる。特定の実施形態では、筋肉内投与は、骨格筋、平滑筋、及び心筋からなる群から選択される筋肉に行う。一部の実施形態では、投与の結果、ｍＲＮＡが筋細胞に送達される。一部の実施形態では、投与の結果、ｍＲＮＡが肝細胞（すなわち肝臓細胞）に送達される。特定の実施形態では、筋肉内投与の結果、ｍＲＮＡが筋細胞に送達される。
【０１８６】
代替的または追加的に、本発明のリポソームに封入されたｍＲＮＡおよび組成物は、全身的な方法ではなく局所的な方法で投与され得る。
【０１８７】
本発明の提供される方法は、本明細書に記載される治療剤（例えば、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡ）の治療有効量の単回投与ならびに複数回投与を企図する。治療剤は、対象の状態（たとえばＯＴＣ欠損症）の性質、重篤度、及び程度によって規則的な間隔で投与されてもよい。一部の実施形態では、本発明の治療剤（例えば、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡ）の治療有効量を、規則的な間隔で（例えば、年に一回、六カ月に一回、五カ月に一回、三カ月に一回、隔月（二カ月に一回）、毎月（毎月一回）、隔週（二週間に一回）、月二回、３０日に一回、２８日に一回、１４日に一回、１０日に一回、７日に一回、毎週、週二回、毎日、または連続して）、周期的に皮下投与してもよい。
【０１８８】
一部の実施形態では、提供されるリポソーム及び／または組成物は、その中に含まれるｍＲＮＡの徐放に適するように製剤化される。こうした徐放性組成物は、投薬間隔を延長させて対象に適宜投与することができる。例えば、一部の実施形態では、本発明の組成物は、一日二回、毎日、または一日おきに対象に投与される。好適な実施形態では、本発明の組成物は、週二回、週一回、７日に一回、１０日に一回、１４日に一回、２８日に一回、３０日に一回、二週間に一回、三週間に一回もしくはより好ましくは四週間に一回、一か月に一回、一か月に二回、六週間に一回、八週間に一回、隔月に一回、三か月に一回、四か月に一回、六か月に一回、八か月に一回、九か月に一回、または毎年対象に投与される。長期間にわたるｍＲＮＡの送達または放出のいずれかを行うために、デポ投与（例えば、筋肉内、皮下、硝子体内）用に製剤化される組成物およびリポソームも企図される。好ましくは、採用される徐放手段は、安定性を強化するためにｍＲＮＡに施される修飾と組み合わされる。
【０１８９】
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、主として、本発明の医薬組成物に含まれる治療剤の総量に基づいている。一般に、治療有効量は、対象に対して意義のある利益を得る（例えば、ＯＴＣ欠損症を治療、調節、治癒、防止、及び／または改善する）のに十分な量である。例えば、治療有効量は、所望の治療作用及び／または予防作用を得るのに十分な量であり得る。通常、必要とする対象に投与される治療剤（例えば、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡ）の量は、該対象の特徴によって異なる。このような特徴には、対象の状態、疾患重篤度、全般的健康、年齢、性別および体重が含まれる。当業者は、これらおよび他の関連因子に応じて適切な用量を容易に決定することができるであろう。さらに、最適な投薬量範囲を同定するために、客観的および主観的アッセイの両方を任意に用いることができる。
【０１９０】
治療上有効な量は、複数の単位用量を含み得る投薬レジメンで一般的に投与される。任意の特定の治療用タンパク質について、治療上有効な量（および／または有効な投与レジメン内の適切な単位投与量）は、例えば、投与経路に応じて、他の医薬品と組み合わせて変化し得る。また、任意の特定の患者に固有の治療有効量（及び／または単位用量）は、治療される障害及び障害の重篤度；採用される特定の医薬作用剤の活性；採用される特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事；投与時間、投与経路、及び／または採用される特定のタンパク質の排出または代謝速度；治療期間；ならびに医療分野において周知の類似要因を含む様々な要因に依存し得る。
【０１９１】
一部の実施形態では、治療有効投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）、例えば、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜４００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜３００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜９０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜８０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜７０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜６０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜４０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜３０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２５ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１５ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲である。
【０１９２】
一部の実施形態では、治療有効投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１．０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約５ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１５ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約４０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約６０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約７０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約８０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約９０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約２００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約２５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約４００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約４５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約５００ｍｇ／ｋｇ（体重）超である。特定の実施形態では、治療有効投与量は１．０ｍｇ／ｋｇ（体重）である。一部の実施形態では、１．０ｍｇ／ｋｇ（体重）の治療有効投与量が筋肉内または静脈内に投与される。
【０１９３】
また、本明細書に開示されるリポソームのうちの一つ以上を含む凍結乾燥された医薬組成物と、例えば、２０１２年６月８日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／４１６６３に開示されるような、かかる組成物を使用するための関連方法も、本明細書において企図される。当該出願の教示内容はその全体で参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本発明による凍結乾燥された医薬組成物は、投与前に戻されるか、またはｉｎ  ｖｉｖｏで戻され得る。例えば、凍結乾燥された医薬組成物は、適切な剤形（例えば、ディスク、ロッド、または膜などの皮内剤形）に製剤化され、剤形が個体の体液によってｉｎ  ｖｉｖｏで経時的に再水和されるように投与され得る。
【０１９４】
提供されるリポソーム及び組成物は、任意の所望の組織に投与され得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを含む提供されるリポソームおよび組成物は皮下に送達され、ｍＲＮＡは皮下組織以外の細胞または組織型で発現する。一部の実施形態では、提供されるリポソームまたは組成物によって送達される標的タンパク質をコードするｍＲＮＡは、リポソームおよび／または組成物が投与された組織で発現する。一部の実施形態では、送達されるｍＲＮＡは、リポソーム及び／または組成物が投与された組織とは異なる組織で発現される。送達されるｍＲＮＡが送達および／または発現され得る場所となる組織の例としては、限定されないが、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、血清、脳、骨格筋、リンパ節、皮膚、および／または脳脊髄液が挙げられる。
【０１９５】
一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、投与されるｍＲＮＡの発現が増加するか、または対象由来の生体試料におけるｍＲＮＡコードタンパク質の活性レベルが、治療もしくは投与前のベースライン発現レベルもしくは活性レベルと比較して増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、対象由来の生体試料において、提供される組成物のｍＲＮＡによりコードされる治療用タンパク質の発現レベルまたは活性レベルが、治療前のベースライン発現レベルまたは活性レベルと比較して増加する。通例、ベースラインレベルは、治療直前に測定される。生体試料としては、例えば、全血、血清、血漿、尿、及び組織試料（例えば、筋肉、肝臓、皮膚線維芽細胞）が含まれる。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、治療用タンパク質（投与されたｍＲＮＡによってコードされるタンパク質）の発現レベルまたは活性レベルが、治療直前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、対象由来の生体試料におけるｍＲＮＡ発現レベルまたは活性レベルが、治療されていない対象と比較して増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、対象由来の生体試料において、提供される組成物のｍＲＮＡによってコードされる治療用タンパク質の発現レベルまたは活性レベルが、治療されていない対象と比較して増加する。
【０１９６】
様々な実施形態によると、送達されるｍＲＮＡの発現の時期を、特定の医学的要求に合うように調整することができる。一部の実施形態では、送達されるｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、提供されるリポソーム及び／または組成物の投与の１時間、２時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週、２週、または１カ月後に検出可能である。
【０１９７】
一部の実施形態では、提供される組成物の治療有効投与量は、定期的に投与された場合、対象において、治療前のベースラインのシトルリン産生と比較してシトルリン産生の増加をもたらす。典型的には、治療前または治療後のシトルリン値は、例えば血液、血漿もしくは血清、尿、または固形組織抽出物などの対象から取得された生体試料において測定され得る。一部の実施形態では、本発明に従う治療により、生体試料（例えば血漿、血清または尿）中のシトルリン値が、ベースラインのシトルリン値と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、または３倍増加する。
【０１９８】
本発明によると、提供される組成物の治療有効投与量は、定期的に投与された場合、タンパク質欠損症の少なくとも一つの症状または特徴の強度、重篤度、もしくは頻度の低下をもたらすか、または発症の遅延をもたらす。
治療用途
【０１９９】
本発明を使用して、様々な疾患、障害、および症状を治療することができる。一部の実施形態では、本発明は、肝疾患、例えばＯＴＣ欠損症の治療に有用である。ヒアルロニダーゼ酵素と、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡとの同時注射により、対象の肝臓細胞（例えば、肝細胞）におけるＯＴＣ酵素（タンパク質）のレベルが、治療前のベースラインレベルと比較して増加する。典型的には、ベースラインレベルは、治療前に（例えば、治療の１２カ月前まで、一部の場合においては治療の直前に）測定される。一部の実施形態では、本発明の皮下注射により、肝臓細胞におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％増加する。一部の実施形態では、本発明の皮下注射により、肝臓細胞におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療をしていない対象の肝臓細胞におけるＯＴＣタンパク質のレベルと比較して増加する。
【０２００】
一部の実施形態では、本発明の皮下注射により、対象の血漿または血清におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療前のベースラインのレベルと比較して増加する。典型的には、ベースラインレベルは、治療前に（例えば、治療の１２カ月前まで、一部の場合においては治療の直前に）測定される。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、血漿または血清におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療直前のベースラインのレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％まで増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、血漿または血清におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療をしていない対象の血漿または血清におけるＯＴＣタンパク質のレベルと比較して増加する。
【０２０１】
本発明の組成物および方法は、多数の障害を治療するためのｍＲＮＡの送達を提供する。特に、本発明の組成物および方法は、肝臓に排出または分泌されるタンパク質および／または酵素の欠損に関する疾患または障害の治療に適している。これらの疾患または障害には、以下に限定されないが、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）欠損症（フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）として従来より知られている）、肝臓の尿素サイクル異常シトルリン血症を引き起こすアルギニノコハク酸シンテターゼ１（ＡＳＳ１）欠損症、貧血を引き起こすエリスロポエチン（ＥＰＯ）欠損症（エリスロポエチンは腎臓内および肝臓内の両方で産生されるタンパク質）が含まれる。
【０２０２】
本発明が有用となる障害には、以下に限定されないが、ファブリー病などの障害；血友病性疾患（例えば、血友病Ｂ（ＦＩＸ）、血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ））；ＳＭＮ１関連脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）；筋萎縮性側方硬化症（ＡＬＳ）；ＧＡＬＴ関連ガラクトース血症；アルポート症候群を含むＣＯＬ４Ａ５関連障害；ガラクトセレブロシダーゼ欠損症；Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー；フリートライヒ運動失調症；ペリツェウス・メルツバッハ病；ＴＳＣ１およびＴＳＣ２関連結節性（脳）硬化症；サンフィリポＢ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＢ）；脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ関連振戦／失調症候群、および脆弱Ｘ早期卵巣不全症候群を含むＦＭＲ１関連障害；プラダー・ウィリー症候群；遺伝性出血性毛細管拡張症（ＡＴ）；ニーマン・ピック病タイプＣ１；若年型神経セロイドリポフスチノーシス（ＪＮＣＬ）、若年バッテン病、サンタヴォリ・ハルティア病、ヤンスキー・ビールショースキー病、ならびにＰＴＴ−１およびＴＰＰ１欠損症を含む、神経セロイドリポフスチン症関連疾患；中枢神経系ミエリン形成不全／白質消失病を伴うＥＩＦ２Ｂ１、ＥＩＦ２Ｂ２、ＥＩＦ２Ｂ３、ＥＩＦ２Ｂ４、およびＥＩＦ２Ｂ５関連小児期運動失調；ＣＡＣＮＡ１ＡおよびＣＡＣＮＢ４関連一過性運動失調症２型；古典的レット症候群、ＭＥＣＰ２関連重度新生児脳症、およびＰＰＭ−Ｘ症候群を含むＭＥＣＰ２関連障害；ＣＤＫＬ５関連非定型レット症候群；ケネディ病（ＳＢＭＡ）；皮質下梗塞および白質脳症（ＣＡＤＡＳＩＬ）を伴うノッチ−３関連常染色体優性脳動脈症；ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ１Ｂ関連の発作障害；アルパーズ・フッテンロッハー症候群、ＰＯＬＧ関連感覚性運動失調型ニューロパチー、構音障害、および眼麻痺、ならびにミトコンドリアＤＮＡ欠失を伴う常染色体優性および劣性の進行性外眼筋麻痺を含む、ポリメラーゼＧ関連障害；Ｘ連鎖副腎低形成；Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症；ウィルソン病が含まれる。
【０２０３】
一部の実施形態では、本発明の核酸、特にｍＲＮＡは、細胞外空間に分泌される機能的タンパク質または酵素をコードしてもよい。例えば、分泌されたタンパク質には、クロッティング因子、補体経路成分、サイトカイン、ケモカイン、ケモアトラクタント、タンパク質ホルモン（例えば、ＥＧＦ、ＰＤＦ）、血清のタンパク質成分、抗体、分泌トール様受容体などが含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物は、エリスロポエチン、α１−アンチトリプシン、カルボキシペプチダーゼＮ、またはヒト成長ホルモンをコードするｍＲＮＡを含み得る。
【実施例】
【０２０４】
本発明の特定の化合物、組成物、及び方法について、特定の実施形態に従って具体的に説明してきたが、以下の実施例は、本発明の化合物を単に説明するという役割を果たすものであり、それを制限することを意図するものではない。
脂質材料
【０２０５】
以下の実施例に記載される製剤は、特に記載しない限り、種々の核酸材料を封入するように設計された、一種以上のカチオン性脂質、ヘルパー脂質（例えば非カチオン性脂質および／またはコレステロール系脂質）、およびＰＥＧ化脂質を用いた様々な比率の多成分脂質混合物を含む。プロセス用のカチオン性脂質としては、以下に限定されないが、ｃＫＫ−Ｅ１２（３，６−ビス（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）、ＯＦ−０２、Ｔａｒｇｅｔ２３、Ｔａｒｇｅｔ２４、ＩＣＥ、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．”Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ”Ｊ．  Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，  １０７，２７６−２８７）、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．”Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２０１０，  ２８，１７２−１７６）、Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．”Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”ＰＮＡＳ  ２０１０，１０７，１８６４−１８６９）、ジアルキルアミノ系、イミダゾール系、グアニジニウム系などが挙げられ得る。ヘルパー脂質としては、以下に限定されないが、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン）、コレステロールなどが挙げられ得る。ＰＥＧ化脂質としては、以下に限定されないが、Ｃ６−Ｃ２０の長さのアルキル鎖を有する脂質に共有結合された、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖が挙げられ得る。
ｍＲＮＡ材料
【０２０６】
一部の実施形態では、標的タンパク質をコードするコドン最適化されたメッセンジャーＲＮＡを、該遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ鋳型からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により合成した。その後、５’キャップ構造（Ｃａｐ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．”Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｃａｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００５，８６，１２３９−１２４９）と３’ポリ（Ａ）を付加した。各ｍＲＮＡ産物中に存在する５’および３’の非翻訳領域はそれぞれＸおよびＹと表されており、前述したとおりに定義される。
実施例１．マウスにおける発現ｈＯＴＣのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
【０２０７】
本実施例は、ＯＴＣ  ＫＯ  ｓｐｆａｓｈマウスで、ヒトＯＴＣ（ｈＯＴＣ）ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を用いて、それぞれ所定の投与レベルで、ヒアルロニダーゼを伴わない静脈内投与と、ヒアルロニダーゼを伴う皮下投与およびヒアルロニダーゼを伴わない皮下投与とを比較した結果を示す。図１は、異なる条件下でのｈＯＴＣ  ｍＲＮＡの単回投与２４時間後のＯＴＣ  ＫＯ  ｓｐｆａｓｈマウス肝臓における発現ｈＯＴＣタンパク質の活性（シトルリン産生に換算）の例を示す。
【０２０８】
カスタムｅｘ  ｖｉｖｏ活性アッセイによるシトルリン産生レベルの測定から明らかになるように、ｈＯＴＣタンパク質は酵素的にも活性であることがわかっていた。一般的に、シトルリンの産生を用いて、発現したｈＯＴＣタンパク質の活性を評価できる。図１に示すように、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子の２０ｍｇ／ｋｇでの単回用量を、それぞれヒアルロニダーゼを伴って皮下送達した２４時間後およびヒアルロニダーゼを伴わないで皮下送達した２４時間後に、マウスの肝臓におけるｈＯＴＣタンパク質の例示的なシトルリン活性を測定した。さらに、比較として、マウスの肝臓のシトルリン活性を、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子溶液を０．５０ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した２４時間後に測定した。生理食塩水で処理したＯＴＣ  ＫＯマウスの肝臓におけるシトルリン活性も測定した。
【０２０９】
図１に示すようにヒアルロニダーゼと共に製剤化していないｈＯＴＣ  ｍＲＮＡの皮下投与後には、有意なｈＯＴＣタンパク質活性が観察されなかった。これらの動物におけるｈＯＴＣタンパク質活性は、生理食塩水で処置した動物に見られる活性と同様であった。対照的に、ｈＯＴＣタンパク質活性（シトルリンタンパク質レベルによって証明される）は、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ組成物を静脈内投与したマウスの肝臓と、ヒアルロニダーゼと共に製剤化されたｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ組成物を皮下投与したマウスの肝臓で同様であった。
実施例２．マウスにおけるＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ送達のｉｎ  ｖｉｖｏでの効率
【０２１０】
この例は、ＯＴＣ  ＫＯ  ｓｐｆａｓｈマウスにおいて、ＣＯ−ｈＯＴＣ（コドン最適化されたヒトＯＴＣ）ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を用いて、それぞれ所定の用量レベルで、ヒアルロニダーゼを伴わない静脈内投与と、ヒアルロニダーゼを伴う皮下投与およびヒアルロニダーゼを伴わない皮下投与とを比較した結果を示す。本実施例は、皮下送達された、ヒアルロニダーゼと共に製剤化されたＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子が、皮下送達されたヒアルロニダーゼを含まないｍＲＮＡ脂質ナノ粒子よりも効果的であったことを示している。
【０２１１】
図２は、異なる条件下でのＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡの単回投与２４時間後のＯＴＣ  ＫＯ  ｓｐｆａｓｈマウス肝臓における、ＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ封入ナノ粒子の送達効率（ＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡコピー数に換算）の例を示す。
【０２１２】
様々な治療群の肝臓におけるＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡコピー数を比較することによって、投与の効率を算出した。図２に示すように、マウスの肝臓におけるＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡコピー数を、ヒアルロニダーゼを含むＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤、およびヒアルロニダーゼを含まないＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤の２０ｍｇ／ｋｇでの皮下単回投与２４時間後に測定した。また比較として、ＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ溶液を０．５０ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した２４時間後のマウスの肝臓において、ＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡコピー数を測定した。同様に対照として、生理食塩水で処理した野生型（ＷＴ）マウス、生理食塩水で処理したＯＴＣ  ＫＯマウス、およびｈＯＴＣ  ＬＮＰ溶液を用いて静脈内処置されたか、ヒアルロニダーゼを含まないｈＯＴＣ  ＬＮＰ製剤で皮下処置されたか、またはヒアルロニダーゼと共に製剤化されたｈＯＴＣ  ＬＮＰを用いて皮下処置されたＯＴＣ  ＫＯマウスの肝臓で、ｍＯＴＣ  ｍＲＮＡコピー数を測定した。
【０２１３】
図２には、ヒアルロニダーゼ共製剤を用いずに皮下投与した後、生理食塩水で処理された肝臓と比べて、肝臓におけるＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡコピー数がわずかに増加した結果を示す。対照的に、ヒアルロニダーゼと共に製剤化されたＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰで処置したマウスの肝臓において、静脈内投与と比較して同等レベルのＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡコピーを検出した。具体的には、ヒアルロニダーゼと共に製剤化されたＣＯ−ｈＯＴＣ  ＬＮＰの皮下投与２４時間後に、少なくとも１２倍の内因性レベルとなった。
実施例３．ヒアルロニダーゼと共にｍＲＮＡ  ＬＮＰ投与した後のマウスにおける発現ｈＯＴＣのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
【０２１４】
この実施例は、ＯＴＣ  ＫＯ  ｓｐｆａｓｈマウスにおいて、ヒトＯＴＣ（ｈＯＴＣ）ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を用いて、それぞれ所定の用量レベルで、ヒアルロニダーゼを伴う静脈内投与と、ヒアルロニダーゼを伴う皮下投与とを比較した結果を示す。
【０２１５】
図３は、異なる条件下でのｈＯＴＣ  ｍＲＮＡの単回投与２４時間後のＯＴＣ  ＫＯ  ｓｐｆａｓｈマウス肝臓における発現ｈＯＴＣタンパク質の活性（シトルリン産生に換算）の例を示す。ヒアルロニダーゼと共にｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ２０ｍｇ／ｋｇの単回用量が皮下送達された２４時間後に、マウスの肝臓におけるｈＯＴＣタンパク質の例示的なシトルリン活性を測定した。比較として、ヒアルロニダーゼと共に製剤化したｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子溶液の０．５０ｍｇ／ｋｇ静脈内注射の２４時間後に、マウスの肝臓におけるシトルリン活性を測定した。生理食塩水で処理されたＯＴＣ  ＫＯ  ｓｐｆａｓｈマウスの肝臓におけるシトルリン活性も測定した。
【０２１６】
図３に示した結果は、ヒアルロニダーゼを含むｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤の静脈内投与および皮下投与の両方の単回投与により、生理食塩水で処理した対照と比較して、ｈＯＴＣタンパク質活性（シトルリン産生によって測定される）が増加したことを示す。
実施例４．野生型マウスと比較した場合のマウスにおける発現ＯＴＣのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
【０２１７】
この実施例は、未処置の野生型マウス、およびヒアルロニダーゼ共製剤を含むｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子の皮下投与で処置したＯＴＣ  ＫＯ  ｓｐｆａｓｈマウスの肝臓における、ＯＴＣタンパク質活性のレベルの比較を示す。
【０２１８】
図４に示すように、５６０Ｕのヒアルロニダーゼと共に製剤化したＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰの単回用量１０ｍｇ／ｋｇを皮下送達した２４時間後に、マウスの肝臓におけるｈＯＴＣタンパク質発現の結果としての例示的なシトルリン産生量を測定した。比較として、野生型マウスとＯＴＣ  ＫＯ  ｓｐｆａｓｈマウスの肝臓におけるシトルリン産生量を、生理食塩水を静脈内注射した後に測定した。
図４に示す結果は、ヒアルロニダーゼと共に製剤化したＣＯ−ｈＯＴＣで皮下処置したＯＴＣ  ＫＯマウスの肝臓において測定されたシトルリンタンパク質のレベルが、生理食塩水で処置した野生型マウスの肝臓で測定されたシトルリンタンパク質のレベルと同様であることを示す。
実施例５．マウスにおけるＯＴＣ発現に対する酵素とｍＲＮＡの種々比率の作用
【０２１９】
表１に示す結果は、皮下送達によって組成物中のヒアルロニダーゼとｍＲＮＡの種々比率を投与したマウスにおけるＯＴＣ発現レベルの変化を示す。表１Ａは、マウスの１１グループに投与されたｍＲＮＡとヒアルロニダーゼの用量を示す。組成物の単回投与後２日目および８日目の各グループのＯＴＣ発現量を表１Ｂに示す。表１Ｂに示すように、ＯＴＣ発現レベルは、調査された範囲内のヒアルロニダーゼの用量増加に伴い著しく変化することはなかった。しかしながら、０．３ｍｌ溶液で送達された５６０単位のヒアルロニダーゼと混合した５ｍｇ／ＫｇのｍＲＮＡで、ベースラインを超える良好なＯＴＣ発現レベルを観察した。データはまた、組成物の単回投与が、少なくとも８日間、持続的なタンパク質発現を効果的にもたらすことを示す。
表１Ａ
【表１】
2019533708.tif 000007
表１Ｂ
【表２】
2019533708.tif 000008
対照的に、図５に示すように、シトルリンアッセイで測定した場合、ＯＴＣノックアウトマウスで得られるＯＴＣ活性において、より高い用量のｍＲＮＡ（２０ｍｇ／Ｋｇ）でヒアルロニダーゼ投与の明確な効果を観察した。投与２４時間後、５６００Ｕのヒアルロニダーゼは、５６０Ｕのヒアルロニダーゼと比べて、シトルリンにより測定されるＯＴＣ活性を二倍誘発した（図５）。また、以前から示されていたように、ヒアルロニダーゼが組成物で投与されなかった場合、シトルリンはほぼ検出不能であることが明らかであった。
実施例６．マウスにおける発現ＰＡＨのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
【０２２０】
この例は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ＫＯマウス（フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）のマウスモデル）において、ＣＯ−ｈＰＡＨ（コドン最適化ヒトＰＡＨ）ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を用いた、ヒアルロニダーゼを伴わない静脈内投与とヒアルロニダーゼを伴う皮下投与の比較を示す。
【０２２１】
図６は、異なる条件下でのｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の単回投与２４時間後のＰＡＨ  ＫＯマウスにおける血清フェニルアラニンレベルの例を示す。
【０２２２】
図６に示すように、ＰＡＨ  ＫＯマウスにおける例示的な血清フェニルアラニンレベルを、５６００Ｕのヒアルロニダーゼと共に製剤化されたＣＯ−ｈＰＡＨｍＲＮＡ  ＬＮＰ２０ｍｇ／ｋｇの皮下単回投与の前に、かつ該単回投与２４時間後に測定した。また、ＰＡＨ  ＫＯマウスにおける血清フェニルアラニンレベルを、１．０ｍｇ／ｋｇのＣＯ−ｈＰＡＨｍＲＮＡ  ＬＮＰ溶液の静脈内注射前、かつ該静脈注射２４時間後に測定した。未処置のＰＡＨ  ＫＯマウスにおける血清フェニルアラニンレベルも測定した。図６に示す結果によると、臨床的に関連性のあるフェニルアラニンバイオマーカーが、両方の投与経路を介して同等に正常化された。
実施例７．マウスにおけるＡＳＳ１のｉｎ  ｖｉｖｏ発現
【０２２３】
この実施例は、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）ＫＯマウス（マウスモデルシトルリン血症）において、ＣＯ−ｈＡＳＳ１（コドン最適化ヒトＡＳＳ１）ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を用いた、ヒアルロニダーゼを伴わない静脈内投与と、ヒアルロニダーゼを伴う皮下投与との比較を示す。
【０２２４】
図７は、異なる条件下でのｈＡＳＳ１  ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の単回投与２４時間後のＡＳＳ１  ＫＯマウス肝臓におけるｈＡＳＳ１タンパク質レベルの例を示す。
【０２２５】
図７に示すように、ＡＳＳ１  ＫＯマウスの肝臓における例示的なｈＡＳＳ１タンパク質レベルを、５６００Ｕのヒアルロニダーゼと共に製剤化されたＣＯ−ｈＡＳＳ１  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ２０ｍｇ／ｋｇの皮下単回投与２４時間後に測定した。また、ＡＳＳ１  ＫＯマウスにおける肝臓のＡＳＳ１タンパク質レベルを、１．０ｍｇ／ｋｇのＣＯ−ｈＡＳＳ１ｍＲＮＡ  ＬＮＰ溶液の静脈内注射２４時間後に測定した。同様に、生理食塩水で処置したＡＳＳ１  ＫＯマウスにおける肝臓のＡＳＳ１タンパク質レベルも測定した。図７に示す結果によると、投与の両経路で処置したマウスの肝臓において有意なｈＡＳＳ１タンパク質レベルを観察した。
実施例８．マウスにおけるホタルルシフェラーゼタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ発現
【０２２６】
本実施例は、ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ担持ＬＮＰを投与する例示的な方法、および標的組織におけるホタルルシフェラーゼをｉｎ  ｖｉｖｏで分析するための例示的な方法を示す。
【０２２７】
ヒアルロニダーゼ（５６００Ｕ）と共に製剤化された、ＦＦＬをコードするｍＲＮＡ封入ＬＮＰ２０ｍｇ／ｋｇで、野生型マウスを皮下送達により処置した。図８左側のグラフは、皮下投与３時間後に観察された、ＦＦＬタンパク質によって産生された発光を示す。右側のグラフは、皮下投与２４時間後に観察された、ＦＦＬタンパク質によって産生された発光を示す。
【０２２８】
図８に示した結果は、皮下経路を介してヒアルロニダーゼと共に注射された脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ製剤により、広範囲の標的タンパク質活性が生じたことを示す。これらのマウスの肝臓における活性ＦＦＬタンパク質が成功裏に産生したことを表す顕著な発光が観察された。さらに、持続的ＦＦＬ活性が少なくとも２４時間維持され、強度の減少はほとんどないか全くなかった。
実施例９．マウスにおけるヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）のｉｎ  ｖｉｖｏ発現
【０２２９】
本実施例は、開示された方法を用いて、ｍＲＮＡをコードするｈＥＰＯの皮下投与後のヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質発現の例示的な時間経過を、同一のものを静脈内投与した場合と比較して示す。
【０２３０】
雄のＣＤ１マウスに、１日目に一回、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を投与量１ｍｇ／ｋｇで静脈内投与するか、または５６００Ｕのヒアルロニダーゼと共に製剤化したｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を投与量５ｍｇ／ｋｇで皮下投与した。ヒトＥＰＯタンパク質発現を、ｈＥＰＯ特異的ＥＬＩＳＡにより血清試料で４日間調べた。
【０２３１】
図９に示すように、ｍＲＮＡ投与（１日目）６時間後および２日目でのマウスの静脈内投与群と皮下投与群の両方で、高レベルのＥＰＯタンパク質発現が観察された。驚くべきことに、３日目および４日目に、血清ｈＥＰＯ発現レベルは、静脈内注射を受けたマウスと比較して皮下注射を受けたマウスで高かった。
【０２３２】
図１０は、ヒアルロニダーゼを伴ってまたは伴わずにヒトＥＰＯコードｍＲＮＡを皮下投与（ＳｕｂＱ）した後のマウスにおけるヒトＥＰＯの発現を示す。他のｍＲＮＡに対して示されるように、ヒアルロニダーゼを伴わない場合、ｍＲＮＡ  ＬＮＰの皮下投与は発現不良をもたらす一方、ヒアルロニダーゼを伴う場合には血清中のタンパク質が有意に増加する。その発現レベルは、同じｍＲＮＡ  ＬＮＰの静脈内投与に匹敵している。
実施例１０．  ＬＮＰにおけるＰＥＧ化脂質のタンパク質発現への作用
【０２３３】
表２に示すように、ｍＲＮＡが皮下送達を介して送達された場合（２０ｍｇ／Ｋｇ  ｍＲＮＡ）、ＰＥＧ化脂質−ＬＮＰの割合が高いと、より高いタンパク質の発現が誘発されることが示された。マウスの四つのグループに、静脈内送達経路または皮下送達経路を介して生理食塩水またはＬＮＰを投与した。皮下投与組成物が５％のＰＥＧ−ＬＮＰを含む場合、３％のＰＥＧ−ＬＮＰと比較して、ＡＳＳ１発現が劇的に増加した。静脈内投与組成物は反対の作用を示した。ＰＥＧ化脂質の濃度が低いと、高レベルのＡＳＳ１発現が誘発された。
表２．
【表３】
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均等
【０２３４】
当業者は、日常的な実験手法を越えない手法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の記載に限定されることは意図されず、むしろ以下の特許請求の範囲に記述されるとおりである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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