(57)【要約】  本発明は、組換えアデノウイルスベクターに基づいた、マラリア感染症に対する新規なワクチンに関する。マラリアの原因となる寄生虫、好ましくは熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に由来するスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質ＮＡＮＰ反復（ＣＳショート）を、少数のカプシドタンパク質ＩＸを介してコード化及び表示し、導入遺伝子として異種タンパク質をコード化するカプシド改変複製欠損アデノウイルス粒子が記載されている。特定の実施形態では、ヒトアデノウイルス３５（ＨＡｄＶ３５）及びヒトアデノウイルス２６（ＨＡｄＶ２６）等の稀な血清型の前記複製不全ベクターは、（１）タンパク質ＩＸに直接融合された、（２）フレキシブルなリンカーを介してタンパク質ＩＸに融合された、又は（３）α−ヘリックスウイルス起源スペーサーＳＰ１を介してタンパク質ＩＸに融合された、マラリアの原因となる寄生虫に由来するＣＳタンパク質を導入遺伝子としてコード化し、マラリアの原因となる寄生虫に由来するＮＡＮＰ反復をコード化及び表示する核酸を含んで、選択された抗原に対する体液及び細胞応答の両方を確実にする。
2019508031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質ＩＸと、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の断片とからなる融合タンパク質を含むカプシドを含み、前記断片が配列番号１のアミノ酸配列を含む、組換えアデノウイルスベクター。
【請求項２】
前記融合タンパク質が、前記ｐＩＸタンパク質と前記ＣＳタンパク質断片との間に位置するリンカーを含む、請求項１に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項３】
前記リンカーが、グリシン及び／又はセリンの２〜１５の連続したフレキシブルな残基を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項４】
前記融合タンパク質が、前記ｐＩＸタンパク質と前記ＣＳタンパク質断片との間に位置するスペーサーを含む、請求項１に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項５】
前記スペーサーが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項６】
前記スペーサーが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項７】
前記ベクターが、導入遺伝子として１つ以上の異種タンパク質をコード化する核酸を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項８】
前記アデノウイルスが：ＨＡｄＶ４、ＨＡｄＶ５、ＨＡｄＶ１１、ＨＡｄＶ２６、ＨＡｄＶ３５、ＨＡｄＶ４８、ＨＡｄＶ４９、ＨＡｄＶ５０非ヒト霊長類ベクター及びキメラベクターからなる群から選択される血清型に由来する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学の分野に関する。より詳細には、本発明は、マラリア感染症に対するワクチンの開発のための、組換えにより作製された、抗原決定基のキャリアとしてのウイルスベクターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアの原因となる病原体である熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に対する有効なワクチンの必要性は、毎年８０万人の死亡及び２億５千万人超の臨床例の記録から明らかである（ＷＨＯ  ２００９）。流行国における疾病負荷を低減し、完全なマラリア根絶を達成するために、有効なワクチンが必要である。現在、最も有望なワクチン候補である、ＲＴＳ、Ｓ／ＡＳ０１Ｂ／ＡＳ０２Ａと称される熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）ベースのマラリアワクチンは、臨床及び野外試験において、有望ではあるが様々な結果を示した（１−５、７−９）。ＲＴＳ、Ｓにより誘導される保護に関連した免疫相関は、ワクチンの有効性と、体液及び細胞応答の大きさとの間に強い関連性を示した（１４）。
【０００３】
代替的に、マラリアワクチンの開発において、スポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質を発現するヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ）ベクターは、高い細胞応答を誘導したが、ＣＳタンパク質に対して比較的低い抗体応答を誘導した（１０、１１、１３）。ＨＡｄＶ３５．ＣＳによるプライミングと、ＲＴＳ、Ｓ／ＡＳ０１Ｂによる追加免疫との組み合わせは、いずれかのワクチン単独と比較して、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳ対する免疫原性を有意に改善した（１５）。この免疫原性の有意な改善は、ＨＡｄＶベクターを強いＢ細胞誘導因子成分と組み合わせることの利益を示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、強い細胞応答と強い体液応答の両方を誘導する組換えアデノウイルスベクターが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、タンパク質ＩＸ及び熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の断片からなる融合タンパク質を含むカプシドを含み、前記断片が配列番号１のアミノ酸配列を含む、組換えアデノウイルスベクターに関する。好ましくは、前記融合タンパク質は、ｐＩＸタンパク質とＣＳタンパク質断片との間に位置するリンカーを含む。好ましくは、前記リンカーは、例えば２〜１５の連続したグリシン及び／又はセリン残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０００６】
本発明による別の実施形態では、前記融合タンパク質は、ｐＩＸタンパク質とＣＳタンパク質断片との間に位置するスペーサーを含む。好ましくは、前記スペーサーは、配列番号２．（ＳＰ１）のアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、前記スペーサーは、配列番号３．（ＳＰ２）のアミノ酸配列を含む。
【０００７】
好ましい実施形態において、本発明による組換えアデノウイルスベクターは、異種タンパク質をコード化する核酸を更に含む。好ましくは、前記異種タンパク質は、マラリア熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）スポロゾイト周囲タンパク質である。更により好ましくは、前記マラリア熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）スポロゾイト周囲タンパク質は、配列配列番号８を含む。
【０００８】
好ましい実施形態において、本発明による組換えアデノウイルスベクターは：ＨＡｄＶ４、ＨＡｄＶ５、ＨＡｄＶ１１、ＨＡｄＶ２６、ＨＡｄＶ３５、ＨＡｄＶ４８、ＨＡｄＶ４９及びＨＡｄＶ５０からなる群から選択される血清型から誘導される。本発明に適した他の可能なタイプの組換えアデノウイルスベクターには、非限定的に：イヌアデノウイルス、チンパンジーアデノウイルス、ゴリラアデノウイルス及びキメラアデノウイルスが含まれる。
【０００９】
好ましくは、前記血清型は、ＨＡｄＶ２６、ＨＡｄＶ３５、ＨＡｄＶ４、ＨＡｄＶ１１、ＨＡｄＶ４８及びＨＡｄＶ４９の群から選択される。
【００１０】
好ましい実施形態において、本発明による組換えアデノウイルスベクターは、複製欠損である。
【００１１】
本発明はまた、本発明による組換えアデノウイルスベクター、及び薬学的に許容され得る担体を含み、好ましくはアジュバントを更に含むワクチン組成物に関する。更に、本発明は、マラリアの治療的、予防的又は診断的処置における本発明によるワクチン組成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１：ＨＡｄＶタンパク質ＩＸ（ｐＩＸ）に対するＣＳショート抗原の直接融合。（Ａ）Ｅ１領域内にコード化されたＣＳ導入遺伝子（ＴＧ）（１２）と直接比較した、タンパク質ＩＸ（ｐＩＸ）を介してＨＡｄＶベクター上にコード化及び表示されたＣＳショート抗原におけるＢ細胞エピトープ（２７）ＮＡＮＰ反復を有する熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）スポロゾイト周囲（ＣＳ）中央領域の配列アラインメント。（Ｂ）Ｅ１単独内の発現カセットを有し、コード化ｐＩＸ−ＣＳショート及びｐＩＸ−ＣＳ改変を有する又は有さない、ＨＡｄＶベクターの遺伝的設計の概略図。導入遺伝子のみのベクターは、ＣＳ、ＣＳショートをコードし又は導入遺伝子をコード化せず、天然ｐＩＸ（「空」）を含む。ｐＩＸ−ＣＳショート及びｐＩＸ−ＣＳ改変ベクターは、空であるか、又はＥ１内にＣＳ導入遺伝子を含む。（Ｃ）ローディングコントロールとしての抗−ＣＳ特異的（２Ａ１０）抗体及び抗−繊維（４Ｄ２）で染色した、ＣＳ導入遺伝子を有する又は有さないｐＩＸ−ＣＳショート改変ベクターと非改変ｐＩＸ対照とのカプシド組み込みを比較するウイルス粒子のウェスタンブロット。１．５、０．５及び０．１７×１０１０ウイルス粒子（ＶＰ）／ウェルの段階希釈を負荷し、ｐＩＸ−ＣＳショート含有量に関して比較する。ＣＳ導入遺伝子の予想サイズは約４２ｋＤａであり、ｐＩＸ−ＣＳショートタンパク質は約３２ｋＤａであるが、両方のタンパク質は、ＮＡＮＰ反復に起因してゲル内で更に移動する。（Ｄ）左グラフにおいて、示したＥＬＩＳＡ（ＥＵ／ｍｌ対数）力価は、５μｇのＣＳタンパク質及びＨＡｄＶ３５．空と直接比較した、１×１０１０  ＶＰ／動物のＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．ＣＳ．ｐＩＸ−ＣＳショートを用いた免疫化後４週目の、マウスにおける総ＣＳ特異的（ＩｇＧ）抗体応答（体液応答、Ｂ細胞応答）を示す。右グラフにおいて、ＩＳＣＯＭ−ベースのアジュバントと混合した、又は１×１０１０  ＶＰ／動物の空Ａｄ−ベクターＨＡｄＶ３５、ＨＡｄＶ２６、又はＨＡｄＶ５と混合した、ＰＢＳ中の５μｇ  ＣＳタンパク質で免疫化した後の４週目のＢ細胞応答。対照としての役割を果たしたアジュバントのみを注射されたマウス。アッセイの検出下限（ＬＬｏＣ）を破線で描いた。対数変換データに関する多重比較のためのＤｕｎｎｅｔｔ補正を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用して、統計的有意性を決定した。黒色水平バーｐ≦０．０５。
【図１Ｂ】（上記の通り。）
【図１Ｃ】（上記の通り。）
【図１Ｄ】（上記の通り。）
【図２Ａ】図２：ｐＩＸに対するインフルエンザＡ赤血球凝集素（ＨＡ）抗原の直接融合。（Ａ）対応するＮ−＆Ｃ−末端、シグナルペプチド、膜ドメイン及びｅｃｔｏドメイン（灰色）を有するＨＡ（５１２アミノ酸（ａ．ａ．））分子を示す、異なるインフルエンザＡ  ＨＡ抗原設計の概略図。中間のバーは、ＨＡタンパク質のＮ−＆Ｃ−末端部分及びｅｃｔｏドメインからなるｍＨＡ（３０３ａ．ａ．）タンパク質を示す。ｍＨＡ−ＧＣＮ（ｅｃｔｏ）分子（２４８ａ．ａ．）は、Ｎ−末端シグナルペプチドを欠き、天然ＨＡのｅｃｔｏドメインは、ＧＣＮ三量体形成ドメインで置換されている。（Ｂ）Ｅ１領域内の異なるＨＡ設計をコード化し、及び／又はｐＩＸカプシドタンパク質に融合され、及びそれらの全ての組み合わせのＨＡｄＶベクターの図。
【図２Ｂ】（上記の通り。）
【図３Ａ】図３：α−ヘリックススペーサーを介したＨＡｄＶ  ｐＩＸに対するＣＳショート抗原融合物。（Ａ）４５Åα−ヘリックススペーサー（１６）、Ｇｌｙ−リンカー及びＧｌｙ−４５Åを介してｐＩＸに融合したＣＳショートを用いて設計された、概略的に示すＨＡｄＶベクター。ｐＩＸ改変ベクターは、Ｅ１−カセット内のＣＳ導入遺伝子を有し及び有さずに作製される。（Ｂ）ＣＳ導入遺伝子を有し及び有さず、カプシドにおける異なるｐＩＸ−ＣＳショート改変を有するベクターの組み込み効率を比較するために、ローディングコントロールとしての抗−ＣＳ特異的（２Ａ１０）抗体及び抗−繊維（４Ｄ２）で染色した、１．５、０．５及び０．１７×１０１０  ＶＰ／ウェル当たりの段階希釈のＨＡｄＶ３５．空／ＣＳ．ｐＩＸ−４５Å−ｐＩＸ−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．空／ＣＳ．ｐＩＸ−Ｇｌｙ４５Å−ｐＩＸ−ＣＳショート及びＨＡｄＶ３５．空／ＣＳ．ｐＩＸ−ＧｌｙｐＩＸ−ＣＳショートを用いたウェスタンブロットを示す。非改変ｐＩＸ対照として、ＨＡｄＶ３５．空ベクターを持ってくる。ＣＳ導入遺伝子の予想サイズは約４２ｋＤａであり、ｐＩＸ−ＣＳショートタンパク質変異体は約３５ｋＤａであるが、両方のタンパク質は、ＮＡＮＰ反復に起因してゲル内で更に移動する。（Ｃ）マウスにおける１×１０８、１×１０９、又は１×１０１０  ＶＰ／動物のＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−４５−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．ＣＳ．ｐＩＸ−４５−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−４５−ＣＳショート及びＨＡｄＶ３５．ＣＳの混合物、ＨＡｄＶ３５．ＣＳ単独、又はＨＡｄＶ３５．空（１０９ＶＰ／動物のみ）を用いた免疫化後８週目のＣＳ特異的抗体（ＥＵ／ｍｌ対数）応答をグラフに示す。（Ｄ）２つのグラフは、全熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳタンパク質配列又はＨ−２Ｋｄ制限免疫優性ＨＡｄＶ３５ヘキソンエピトープＫＹＴＰＳＮＶＴＬに対する免疫化後のＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す。時点及び用量による対数変換データに関する多重比較のためのＤｕｎｎｅｔｔ補正を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用して、統計的有意性を決定した。黒色水平バーｐ≦０．０５。
【図３Ｂ】（上記の通り。）
【図３Ｃ】（上記の通り。）
【図３Ｄ】（上記の通り。）
【図４Ａ】図４：ヒトＡｐｏＥ４ベースのα−ヘリックススペーサー置換。（Ａ）以前記載されたヒトＡｐｏＥ４ベースのα−ヘリックス４５Åスペーサー（１６）と比較した、４つの異なるウイルス起源スペーサー（ＳＰ１〜４）、即ち呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）融合タンパク質（Ｆ−タンパク質）、インフルエンザＡ  ＨＡ、流行性耳下腺炎Ｆ−タンパク質及びＨＡｄＶ３５  ｐＩＸｍｏｄに由来するαヘリックスを介してｐＩＸに融合されたＣＳショートのみをコード化する空ベクターの概略図。（Ｂ及びＣ）異なるスペーサー（ＳＰ１〜４）を介して結合したＣＳショートのカプシド組み込み効率を示すウェスタンブロット。１．５、０．７５及び０．３７×１０１０  ＶＰ／ウェルの各スペーサーベクターＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＳＰ１−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＳＰ２−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＳＰ３−ＣＳショート及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＳＰ４−ＣＳショートを、等量の天然−ｐＩＸ  ＨＡｄＶ３５．空ベクター及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−４５Å−ＣＳショートベクターと直接比較した。ブロットはローディングコントロールとしての抗−ｐＩＸ（６７４０）モノクローナル抗体及び抗−繊維（４Ｄ２）で染色した。（Ｄ）抗−ＣＳ（２Ａ１０）で染色して、ｐＩＸ−４５Å−ＣＳショートと比較したｐＩＸ−ＳＰ１−ＣＳショートのカプシド組み込みを示す、１．５、０．５及び０．１６×１０１０  ＶＰ／ウェルのＨＡｄＶ２６．空．ｐＩＸ−ＳＰ１−ＣＳショート、ＨＡｄＶ２６．空．ｐＩＸ−４５Å−ＣＳショート及びＨＡｄＶ２６．空を用いたウェスタンブロットを示す。
【図４Ｂ】（上記の通り。）
【図４Ｃ】（上記の通り。）
【図４Ｄ】（上記の通り。）
【図５Ａ】図５：ｐＩＸ−ＣＳショート改変ベクターの製造可能性。（Ａ）時間内での複製動態及び相対的なＶＰ／ｍｌ増大（即ち、「生産性」）。１０ｍｌの懸濁液ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（ｓＰＥＲ．Ｃ６（登録商標））細胞培養物を７０及び９００ＶＰ／細胞にてＨＡｄＶ２６ベクターで感染させ、その後、培養物を時間内に採取し（感染後ｔ＝０、１、２、３及び４日目（ＤＰＩ））（ｎ＝３）、ウイルス粒子ＱＰＣＲ（ＶＰ−ＱＰＣＲ）により分析する。グラフは、ｓＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）内での高（ＨＡｄＶ２６．ＴＧ１）及び低（ＨＡｄＶ２６．ＴＧ２）産生量を有する対照ベクターと比較した、ｐＩＸ−改変ベクター（ＨＡｄＶ２６．ＣＳ．ｐＩＸ−ＣＳショート＆ＨＡｄＶ２６．空．ｐＩＸ−ＣＳショート）の動態及びＶＰ／ｍｌ増大を示す。（Ｂ）ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内でのｐＩＸ−改変バッチの延長された継代後の遺伝的安定性の評価。バッチの生成は、６〜７のウイルス継代（ＶＰＮ７）をもたらすＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）内でのアップルケーリングを含む。遺伝的に安定なベクターを確実にするために、精製バッチを１０ｍｌ  ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）内で７０又は９００ＶＰ／細胞で、想定される商業規模を３〜４継代超えて（ＶＰＮ  １３−１４）（プロセスの詳細に応じて）、制御条件下で更に継代する。続いてウイルスＤＮＡを単離し、ｐＩＸ−ＰＣＲで分析して遺伝的安定性を決定する。（Ｃ）ＶＰＮ７及びＶＰＮ１４（継代済ｎ＝２）におけるＨＡｄＶ２６．ＣＳ／空．ｐＩＸ−ＣＳショート及びＨＡｄＶ３５．ＣＳ／空．ｐＩＸ−ＣＳショートｐＩＸ−ＰＣＲの代表的なアガロースゲル写真を示す。正（＋）の対照は、それぞれのプラスミドＤＮＡ構築物及び非改変（−）ｐＩＸ−天然プラスミドＤＮＡであり、ＰＣＲ水（Ｈ２０）対照及びＤＮＡマーカー（Ｍ）を伴う。
【図５Ｂ】（上記の通り。）
【図５Ｃ】（上記の通り。）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、タンパク質ＩＸと、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の断片とからなる融合タンパク質を含むカプシドを含む複製欠損組換えアデノウイルスベクターに関する。前記断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
マラリア熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）スポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質は、Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．２０１１及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２００９（１２、１３）により以前に記載されている哺乳動物−コドンＣＳタンパク質最適化タンパク質（ＥＭＢＬ  ＣＡＨ０４００７配列に基づく）である。
【００１５】
本明細書では、ＣＳタンパク質の２つの形態が使用される。いわゆる「導入遺伝子」形態と、いわゆる「ＣＳショート」形態（又は断片）であり、「ＣＳショート」形態は、ＣＳタンパク質の切断型である（図１Ａ）。ＣＳショートは、アミノ酸配列配列番号１を含む。
【００１６】
導入遺伝子ＣＳは、切断されているＣ−末端の最終１４アミノ酸を除いて、天然ＣＳタンパク質（３Ｄ７クローン）と類似している。導入遺伝子（ＴＧ）は、アデノウイルスベクターのＥ１領域内に挿入及びコード化されている。ＣＳタンパク質の反復領域は、２７の連続したＮＡＮＰ反復からなり、これは導入遺伝子（ＴＧ）と、タンパク質ＩＸに融合された切断型（ＣＳショート）との両方に存在する。ＣＳタンパク質の導入遺伝子形態は、アミノ酸配列配列番号８を含む。
【００１７】
タンパク質ＩＸ（ｐＩＸ）という用語は、正二十面体アデノウイルスカプシドを安定化する主な機能を有するタンパク質を指す（Ｒｏｓｅ−Ｃａｌａｔｒａｖａ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。
【００１８】
ｐＩＸは、アデノウイルス血清型特異的であり、即ち、血清型３５アデノウイルス（ＨＡｄＶ３５）のｐＩＸは、アミノ酸配列配列番号６を含み；血清型２６アデノウイルス（ＨＡｄＶ２６）のｐＩＸは、アミノ酸配列配列番号７を含む。
【００１９】
リンカーという用語は、タンパク質ドメインの間に配置され得る短いペプチド配列を指す。リンカーは、異なるサイズ範囲のグリシン（ｇｌｙ）及び／又はセリン等のフレキシブルな残基から構成され、異なるドメインの互いに対する自由な動きを確実にする。リンカーの例には、非限定的に３−Ｇｌｙ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）及び中間リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）ｘ２が挙げられる。本発明による好ましい一実施形態では、グリシンリンカーは２〜１５の連続したグリシン及び／又はセリン残基を有するアミノ酸配列を含む。
【００２０】
スペーサーという用語は、タンパク質ドメインの間に配置され得る短いペプチド配列を指す。数個のスペーサーが本明細書に開示され、本発明に使用され、即ち、ヒトＡｐｏＥ４タンパク質起源のＡｐｏＥ４タンパク質α−ヘリックス４５Åスペーサー（１６）；スペーサー１（ＳＰ１）、ＲＳＶ融合タンパク質；スペーサー２（ＳＰ２）、インフルエンザＡ  ＨＡ；スペーサー３（ＳＰ３）、流行性耳下腺炎融合タンパク質及び最終的にスペーサー４（ＳＰ４）、点変異を有するＨＡｄＶ３５．ｐＩＸ断片が使用され得る。ＳＰ１〜ＳＰ４スペーサーはウイルス起源であり、それぞれアミノ配列配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５を含む。
【００２１】
本明細書で使用される、アデノウイルスに関する用語「組換え」は、人為的に改変されていることを含意し、例えば、その中に能動的にクローン化された改変末端を有し、及び／又は、異種遺伝子を含み、即ち、天然に存在する野生型アデノウイルスではない。
【００２２】
本明細書の配列は、当技術分野で慣習的なように、５’から３’の方向に提供されている。
【００２３】
「アデノウイルスカプシドタンパク質」は、特定のアデノウイルスの血清型及び／又は指向性の決定に関与する、アデノウイルスのカプシド上のタンパク質を指す。アデノウイルスカプシドタンパク質は、典型的には、繊維、ペントン及び／又はヘキソンタンパク質を含む。本発明による所定の血清型の（又は該血清型「に基づいた」）アデノウイルスは、典型的には、所定の血清型の繊維、ペントン及び／又はヘキソンタンパク質を含み、好ましくは所定の血清型の繊維、ペントン及び／又はヘキソンタンパク質を含む。これらのタンパク質は、典型的には、組換えアデノウイルスのゲノムによりコード化されている。所定の血清型の組換えアデノウイルスは、場合により、他のアデノウイルス血清型由来の他のタンパク質を含み及び／又はコード化し得る。従って、非限定的な例として、ＨＡｄＶ３５のヘキソン、ペントン及び繊維を含む組換えアデノウイルスは、ＨＡｄＶ３５に基づいた組換えアデノウイルスと見なされる。
【００２４】
本明細書で使用される場合、組換えアデノウイルスは、少なくとも配列において野生型から誘導することにより、アデノウイルスに「基づいている」。該誘導は、出発物質として野生型ゲノム又はその一部を使用した分子クローニングにより達成することができる。野生型アデノウイルスゲノムの既知の配列を使用して、デノボＤＮＡ合成によりゲノム（その一部）を生成することも可能であり、該合成は、ＤＮＡ合成及び／又は分子クローニングの分野を手掛けているサービス会社（例えばＧｅｎｅＡｒｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）により、日常的な手順を用いて行うことができる。
【００２５】
本発明の組換えアデノウイルスは、好ましくは：ＨＡｄＶ４、ＨＡｄＶ５、ＨＡｄＶ１１、ＨＡｄＶ２６、ＨＡｄＶ３５、ＨＡｄＶ４８、ＨＡｄＶ４９及びＡｄ５０からなる群から選択される血清型由来のアデノウイルスに基づく。本発明に適した他の可能なタイプのアデノウイルスには、非限定的に：イヌアデノウイルス、チンパンジーアデノウイルス、ゴリラアデノウイルス及びキメラアデノウイルスが含まれる。好ましくは、前記血清型は、ＨＡｄＶ４、ＨＡｄＶ２６、ＨＡｄＶ３５、ＨＡｄＶ４８、ＨＡｄＶ４９及びＨＡｄＶ５０の群から選択される。
【００２６】
複製欠損組換えアデノウイルスベクターは、異種抗原（又はポリペプチド）をコード化する異種核酸を更に含む。
【００２７】
遺伝暗号の縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチド及び核酸が同じポリペプチドをコード化し得ることが当業者により理解される。当業者は日常的な技術を用いて、記述されるポリヌクレオチドによりコード化されたポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行って、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映し得ることも理解される。従って、特に特定しない限り、「アミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列」は、互いの縮重版であり、同じアミノ酸配列をコード化する全ヌクレオチド配列を含む。タンパク質をコード化するヌクレオチド配列及びＲＮＡは、イントロンを含み得る。
【００２８】
本発明の特定の一態様では、本発明による組換えウイルスベクターは、スポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質又はその免疫原性部分である抗原決定基をコード化する核酸を含む。好ましくは、前記異種核酸は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける発現の向上のためにコドン最適化されている。コドン最適化は、必要なアミノ酸含有量、関心対象の哺乳動物における一般的かつ最適なコドン使用、及び適切な発現を確実にするために避けるべき多数の局面の提供に基づくものである。そのような局面は、スプライス供与部位又はスプライス受容部位、終止コドン、Ｃｈｉ部位、ポリ（Ａ）ストレッチ、ＧＣ−及びＡＴ−リッチ配列、内部ＴＡＴＡボックス等であり得る。
【００２９】
好ましい実施形態において、本発明は、前記異種核酸中のアデニン＋チミン含有量が、シトシン＋グアニン含有量と比較して８７％未満であり、好ましくは８０％未満であり、より好ましくは５９％未満であり、最も好ましくはおよそ４５％に等しい、本発明による複製欠損組換えウイルスベクターに関する。
【００３０】
当業者は、例えば日常的な分子生物学的手順を用いて、例えばアミノ酸置換、欠失、付加等によりタンパク質を変化させることができることも認識するであろう。一般に、ポリペプチドの機能又は免疫原性を喪失させることなく、保存的アミノ酸置換を適用することができる。これは当業者に周知の日常的な手順に従って調べることができる。
【００３１】
「ワクチン」という用語は、所定の病原体又は疾病に対する対象の治療的な免疫程度の誘導に有効な活性成分を含む薬剤又は組成物を指す。本発明では、ワクチンは、異種タンパク質に対する免疫応答をもたらす、異種タンパク質又はその抗原断片をコード化する有効量の組換えアデノウイルスを含む。本発明による用語「ワクチン」は、これが医薬組成物であり、従って典型的には薬学的に許容され得る希釈剤、担体又は賦形剤を含むことを示唆する。これは、更なる活性成分を含んでも又は含まなくてもよい。所定の実施形態では、これは、例えば他のタンパク質に対する及び／又は他の感染性因子に対する免疫応答を誘導する他の成分を更に含む組み合わせワクチンであってもよい。
【００３２】
本発明のベクターは、組換えアデノウイルスであり、組換えアデノウイルスベクターとも称される。組換えアデノウイルスベクターの調製は、当技術分野で周知である。
【００３３】
所定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要なアデノウイルスゲノムのＥ１領域、例えばＥ１ａ領域及び／又はＥ１ｂ領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能が欠損している。所定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部において欠損している。所定の実施形態では、ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能と、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部とにおいて欠損している。アデノウイルスベクターは、「乗算欠損」であり得、これはアデノウイルスベクターがアデノウイルスゲノムの２つ以上の領域のそれぞれにおいて、１つ以上の必須遺伝子機能が欠損していることを意味する。例えば、前述のＥ１−欠損又はＥ１−、Ｅ３−欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の少なくとも１つの必須遺伝子、及び／又はＥ２領域の少なくとも１つの必須遺伝子（例えば、Ｅ２Ａ領域及び／又はＥ２Ｂ領域）において更に欠損し得る。
【００３４】
アデノウイルスベクター、その構築方法、及びその増殖方法は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，５５９，０９９号、同第５，８３７，５１１号、同第５，８４６，７８２号、同第５，８５１，８０６号、同第５，９９４，１０６号、同第５，９９４，１２８号、同第５，９６５，５４１号、同第５，９８１，２２５号、同第６，０４０，１７４号、同第６，０２０，１９１号、同第６，１１３，９１３号、及び同第８，９３２，６０７号、並びにＴｈｏｍａｓ  Ｓｈｅｎｋ，「Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」，Ｍ．Ｓ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ」，それぞれＣｈａｐｔｅｒｓ  ６７及び６８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｄ  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）に、並びに本明細書に言及した他の参考文献に記載されている。典型的には、アデノウイルスベクターの構築は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，２ｄ  ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ（１９９２），及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９５）、及び本明細書に言及した他の参考文献に記載されているもの等の標準的な分子生物学技術の使用を含む。
【００３５】
本発明によれば、アデノウイルスは、血清型３５のヒトアデノウイルスである。この血清型に基づいた本発明によるワクチン、及びＨＡｄＶ２６に基づいたものは、驚くべきことに、ＨＡｄＶ５に基づいた先行技術に記載されたものよりも強力であるように思われる。本発明の血清型は更に、一般に、ヒト集団において低い血清有病率、及び／又は低い既存の中和抗体力価を有する。異なる導入遺伝子を有する、この血清型及びＨＡｄＶ２６の組換えアデノウイルスベクターは、臨床試験において評価されており、これまでの所、卓越した安全性プロファイルを有することが示されている。ＨＡｄＶ２６ベクターの調製は、例えば国際公開第２００７／１０４７９２号及びＡｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｖｉｒｏｌ  ８１（９）：４６５４−６３に記載されている。ＨＡｄＶ２６の例示的なゲノム配列は、ジェンバンク受入ＥＦ  １５３４７４及び国際公開第２００７／１０４７９２号の配列番号１に見出される。ＨＡｄＶ３５ベクターの調製は、例えば米国特許第７，２７０，８１１号、国際公開第００／７００７１号、及びＶｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７（１５）：８２６３−７１に記載されている。ＨＡｄＶ３５の例示的なゲノム配列は、ジェンバンク受入ＡＣ＿００００１９及び国際公開第００／７００７１号の図６に見出される。本発明による組換えアデノウイルスは、複製コンピテント又は複製欠損であり得る。
【００３６】
所定の実施形態では、アデノウイルスは複製欠損であり、例えばこれは該アデノウイルスがゲノムのＥ１領域に欠失を含むためである。当業者に既知であるように、アデノウイルスゲノムからの必須領域の欠失の場合、これらの領域でコード化された機能は、好ましくはプロデューサー細胞によってトランスに提供される必要があり、即ちＥ１、Ｅ２及び／又はＥ４領域の一部又は全部がアデノウイルスから欠失した場合、これらはプロデューサー細胞内に存在する必要があり、例えばそのゲノムに統合され、又はいわゆるヘルパーアデノウイルス若しくはヘルパープラスミドの形態で、統合される必要がある。アデノウイルスは、Ｅ３領域内に欠失も有し、これは複製に不要であるため、そのような欠失は補完される必要はない。
【００３７】
使用し得るプロデューサー細胞（時々、当技術分野及び本明細書で「パッケージング細胞」又は「補完細胞」又は「宿主細胞」とも称される）は、所望のアデノウイルスが増殖できる任意のプロデューサー細胞であってよい。例えば、組換えアデノウイルスベクターの増殖は、アデノウイルス内の欠損を補完するプロデューサー細胞内で行われる。そのようなプロデューサー細胞は、好ましくはそれらのゲノム内に少なくとも１つのアデノウイルスＥ１配列を有し、それによりＥ１領域内の欠失を有する組換えアデノウイルスを補完することができる。Ｅ１により不死化されたヒト網膜細胞、例えば９１１又はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（米国特許第５，９９４，１２８号参照）、Ｅ１−形質転換羊膜細胞（欧州特許第１２３０３５４参照）、Ｅ１−形質転換Ａ５４９細胞（例えば国際公開第９８／３９４１１号、米国特許第５，８９１，６９０号参照）、ＧＨ３２９：ＨｅＬａ（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，２０００、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：２１３−２１９）、２９３等の任意のＥ１−補完プロデューサー細胞を使用することができる。所定の実施形態では、プロデューサー細胞は、例えばＨＥＫ２９３細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、又は９１１細胞、又はＩＴ２９３ＳＦ細胞等である。
【００３８】
ＨＡｄＶ３５（サブグループＢ）又はＨＡｄＶ２６（サブグループＤ）等の非サブグループＣ  Ｅ１−欠損アデノウイルスの場合、これらの非サブグループＣアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６コード化配列を、ＨＡｄＶ５等のサブグループＣのアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６と交換することが好ましい。これにより、例えば２９３細胞又はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞等の、Ａｄ５のＥ１遺伝子を発現する周知の補完細胞株におけるそのようなアデノウイルスの増殖が可能となる（例えばＨａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２１３５−２１４３；その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０３／１０４４６７号参照）。所定の実施形態では、ワクチン組成物中のアデノウイルスは、Ｅ１領域内に欠失を有し、該欠失内にＣＳタンパク質抗原をコード化する核酸がクローン化されており、ＨＡｄＶ５のＥ４  ｏｒｆ６領域を有する、血清型３５のヒトアデノウイルスである。所定の実施形態では、使用し得るアデノウイルスは、Ｅ１領域内に欠失を有し、該欠失内にＣＳタンパク質抗原をコード化する核酸がクローン化されており、ＨＡｄＶ５のＥ４  ｏｒｆ６領域を有する、血清型２６のヒトアデノウイルスである。
【００３９】
代替的な実施形態では、異種Ｅ４ｏｒｆ６領域（例えばＨＡｄＶ５の）をアデノウイルスベクター内に配置する必要はなく、代わりにＥ１欠失非サブグループＣベクターを、Ｅ１及び適合性のＥ４ｏｒｆ６の両方を発現する細胞株、例えばＥ１及びＡｄ５からのＥ４ｏｒｆ６の両方を発現する２９３−ＯＲＦ６細胞株内で増殖させる（例えば、２９３−ＯＲＦ６細胞の生成を記載するＢｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０：６４９７−５０１；Ａｂｒａｈａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７１：８９４６−５１及びＮａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：３２６−３６参照。これらはそれぞれ、そのような細胞株を使用したＥ１欠失非サブグループＣアデノウイルスベクターの生成を記載する）。
【００４０】
代替的に、増殖させるべき血清型由来のＥ１を発現する補完細胞を使用することができる（例えば国際公開第００／７００７１号、国際公開第０２／４０６６５号参照）。
【００４１】
Ｅ１領域内に欠失を有するＨＡｄＶ３５等のサブグループＢアデノウイルスの場合、アデノウイルス内のＥ１Ｂ  ５５Ｋオープンリーディングフレームの３’末端、例えばｐＩＸオープンリーディングフレームの１６６ｂｐ直接上流、又はこれを含む断片、例えばｐＩＸ開始コドンの直接上流の２４３ｂｐ断片等（ＨＡｄＶ３５ゲノム内のＢｓｕ３６Ｉ制限部位により５’末端に標識（ｍａｒｋ）される）を保持することが好ましく、これは、この領域内にｐＩＸ遺伝子のプロモーターが部分的に存在するため、このことがアデノウイルスの安定性を増大させるためである（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２１３５−２１４３；国際公開第２００４／００１０３２号参照）。
【００４２】
所定の実施形態では、本発明の組換えＨＡｄＶ２６又はＨＡｄＶ３５ベクターは、５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列：ＣＴＡＴＣＴＡＴを含む。これらの実施形態は、そのようなベクターが、元の５’末端配列（一般にＣＡＴＣＡＴＣＡ）を有するベクターと比較して、生成プロセスにおける複製の改善を示し、均質性が改善されたアデノウイルスのバッチをもたらすため有利である（Ｃｒｕｃｅｌｌ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂ．Ｖ．の名義で２０１２年３月１２日に出願された「Ｂａｔｃｈｅｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄｓ」と題された特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０５４８４６号及び米国特許第１３／７９４，３１８号も参照されたい）、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。従って、本発明は、ＣＳタンパク質又はその一部をコード化する組換えアデノウイルスのバッチも提供し、ここでアデノウイルスはヒトアデノウイルス血清型３５であり、本質的にバッチ中の全て（例えば少なくとも９０％）のアデノウイルスは、末端ヌクレオチド配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを有するゲノムを含む。
【００４３】
本開示に使用される数値に関する用語「約」は、値±１０％を意味する。
【００４４】
所定の実施形態では、本発明は、マラリア又は他の感染症抗原、即ち、結核に対するワクチンの作製方法に関し、該方法は、タンパク質ＩＸ及び熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の断片からなる融合タンパク質を含むカプシドを含み、前記断片が配列番号１のアミノ酸配列を含む、組換えアデノウイルスベクターを提供することと、前記組換えアデノウイルスを宿主細胞の培養液中で増殖させることと、組換えアデノウイルスを単離及び精製することと、組換えアデノウイルスを薬学的に許容され得る組成物とすることとを含む。
【００４５】
組換えアデノウイルスは、アデノウイルスで感染させた宿主細胞の細胞培養を含む、周知の方法に従って宿主細胞内で調製及び増殖され得る。細胞培養は、接着細胞培養、例えば培養器の表面又はマイクロキャリアに付着した細胞、及び懸濁培養を含む任意のタイプの細胞培養であってよい。
【００４６】
殆どの大規模懸濁培養は、バッチ又は供給バッチプロセスとして操作され、これは、それらの操作及び規模拡大が最も容易であるためである。最近、灌流原理に基づいた連続プロセスがより一般的となり始め、好適でもある（例えば、大量の組換えアデノウイルスの獲得及び精製に好適な方法を記載する、両方とも参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／０６０７１９号及び国際公開第２０１１／０９８５９２号参照）。
【００４７】
プロデューサー細胞は培養されて、細胞及びウイルスの数、並びに／又はウイルス力価を増大させる。細胞の培養は、本発明による関心対象のウイルスの代謝、及び／又は成長、及び／又は分裂、及び／又は生成を可能にするように行われる。このことは、当業者に周知の方法等により達成することができ、非限定的に、例えば適切な培地中に細胞用の栄養素を提供することを含む。好適な培地は当業者に周知であり、一般に、商業的供給源から大量に得られ、又は標準的なプロトコルに従って誂えることができる。培養は、例えば、バッチ、供給バッチ、連続システム等を用いて、シャーレ、ローラーボトル又はバイオリアクター内で行うことができる。細胞の培養に好適な条件は、既知である（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）、及びＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ  ０−４７１−３４８８９−９参照）。
【００４８】
典型的には、アデノウイルスは、培養液中の適切なプロデューサー細胞に暴露され、ウイルスが組み込まれる。通常、最適な撹拌は約５０〜３００ｒｐｍ、典型的には約１００〜２００、例えば約１５０であり、典型的なＤＯは２０〜６０％、例えば４０％であり、最適ｐＨは６．７〜７．７であり、最適温度は３０〜３９℃、例えば３４〜−３７℃であり、最適ＭＯＩは５〜１０００、例えば約５０〜３００である。典型的には、アデノウイルスはプロデューサー細胞に自発的に感染し、プロデューサー細胞を組換えアデウイルス（ａｄｅｖｉｒｕｓ）粒子に接触させることは、細胞を感染させるのに十分である。一般に、アデノウイルスのシードストック（ｓｅｅｄ  ｓｔｏｃｋ）が培養液に添加されて感染を開始させ、続いてアデノウイルスはプロデューサー細胞内で増殖する。これらは全て当業者には日常的である。
【００４９】
アデノウイルスの感染後、ウイルスは細胞内で複製することより増幅され、このプロセスは、本明細書ではアデノウイルスの増殖と称される。アデノウイルス感染は最終的には、細胞の溶解をもたらす。従ってアデノウイルスの溶解特性はウイルス産生の２つの異なるモードを可能にする。第１のモードは、細胞を溶解するのに外部因子を使用する細胞溶解に先立ってウイルスを回収することである。第２のモードは、生成されたウイルスによる（殆ど）完全な細胞溶解後にウイルス上清を回収することである（例えば、外部因子による、宿主細胞を溶解しないアデノウイルスの回収を記載している米国特許第６，４８５，９５８号参照）。外部因子を使用して、細胞を能動的に溶解してアデノウイルスを回収することが好ましい。
【００５０】
能動的な細胞溶解に使用し得る方法は、当業者に既知であり、例えば国際公開第９８／２２５８８号、ｐ．２８〜３５に論じられている。これに関して有用な方法は、例えば、凍結融解、固体せん断、高張及び／又は低張溶解、液体せん断、超音波処理、高圧押出、洗浄剤溶解、上記の組み合わせ等である。本発明の一実施形態では、細胞は、少なくとも１種の洗浄剤を使用して溶解される。溶解のための洗浄剤の使用は、方法が容易であること、及び容易に拡大可能であることの利点を有する。
【００５１】
使用できる洗浄剤、及びその使用方法は、一般に当業者に既知である。数個の例が、例えば国際公開第９８／２２５８８号、ｐ．２９〜３３に論じられている。洗浄剤は、陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性及び非イオン性洗浄剤を含むことができる。洗浄剤の濃度は、例えば約０．１％〜５％（ｗ／ｗ）の範囲内で変動してもよい。一実施形態において、使用される洗浄剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【００５２】
ヌクレアーゼを使用して、混入、即ち、殆どプロデューサー細胞由来の、核酸を除去することができる。本発明での使用に好適な例示的なヌクレアーゼには、ベンゾナーゼ（登録商標）、プルモザイム（登録商標）、又は当技術分野において通常使用される任意の他のデオキシリボヌクレアーゼ及び／又はリボヌクレアーゼが挙げられる。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼはベンゾナーゼ（登録商標）であり、これは特定のヌクレオチド間の内部リン酸ジエステル結合を加水分解することにより核酸を急速に加水分解して、細胞溶解物の粘度を低下させる。ベンゾナーゼ（登録商標）は、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ（コードＷ２１４９５０）から商業的に得ることができる。ヌクレアーゼが使用される濃度は、好ましくは１〜１００単位／ｍｌの範囲内である。ヌクレアーゼ処理の代わりに又はこれに加えて、アデノウイルス精製中に、ドミフェン臭化物等の選択的沈殿剤を使用して、アデノウイルス製剤から宿主細胞ＤＮＡを選択的に沈殿させることも可能である（例えば、米国特許第７，３２６，５５５号；Ｇｏｅｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．９１：１２−２１；国際公開第２０１１／０４５３７８号；国際公開第２０１１／０４５３８１号参照）。
【００５３】
プロデューサー細胞の培養液からのアデノウイルスの回収方法は、国際公開第２００５／０８０５５６号に広範に記載されている。
【００５４】
所定の実施形態では、回収されたアデノウイルスは、更に精製される。アデノウイルスの精製は、数個の工程で行うことができ、該工程は、例えば参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０５／０８０５５６号に記載されている清澄化、限外ろ過、ダイアフィルトレーション又はクロマトグラフィーを用いた分離を含む。清澄化は、ろ過工程により行われ、細胞溶解物から細胞デブリ及び他の不純物を除去することができる。限外ろ過は、ウイルス溶液の濃縮に使用される。限外ろ過装置を使用したダイアフィルトレーション、又は緩衝液交換は、塩、糖等の除去及び交換のための一方法である。当業者は、各精製工程の最適な条件を見出す方法を知っている。その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９８／２２５８８号も、アデノウイルスベクターの生成及び精製方法を記載している。該方法は、宿主細胞を成長させ、該宿主細胞をアデノウイルスで感染させ、該宿主細胞を回収及び溶解し、粗溶解物を濃縮し、粗溶解物の緩衝液を交換し、該溶解物をヌクレアーゼで処理し、クロマトグラフィーを用いてウイルスを更に精製することを含む。
【００５５】
精製は、例えば国際公開第９８／２２５８８号、ｐ．６１〜７０に論じられているように、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を用いることが好ましい。アデノウイルスの更なる精製に関して多数のプロセスが記載されており、該プロセスにはクロマトグラフィー工程が含まれている。当業者は、これらのプロセスに気づき、正しいクロマトグラフ工程に使用方法を変更して、プロセスを最適化することができる。例えば陰イオン交換クロマトグラフィー工程によりアデノウイルスを精製することが可能であり、例えば国際公開第２００５／０８０５５６号及びＫｏｎｚ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １６：１３４６−１３５３を参照されたい。多数の他のアデノウイルス精製方法が記載されており、これらは当業者の手の届く範囲にある。アデノウイルスの更なる生成及び精製方法は、例えば（国際公開第００／３２７５４号；国際公開第０４／０２０９７１号；米国特許第５，８３７，５２０号；同第６，２６１，８２３号；国際公開第２００６／１０８７０７号；Ｋｏｎｚ  ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４３４：１３−２３；Ａｌｔａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９９：１９３−２６０）に開示されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００５６】
ヒトへの投与のために、本発明は、アデノウイルス及び薬学的に許容され得る担体又は賦形剤を含む医薬組成物を使用することができる。本明細書の文脈において、用語「薬学的に許容され得る」は、担体又は賦形剤が、使用される投与量及び濃度において、それらが投与される対象に任意の望ましくない又は有害な効果を生じないことを意味する。それらの薬学的に許容され得る担体及び賦形剤は、当技術分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；及びＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］参照）。精製Ａｄは、好ましくは滅菌溶液として調製及び投与されるが、凍結乾燥製剤を使用することも可能である。滅菌溶液は、滅菌ろ過、又はそれ自体が当技術分野で既知の他の方法により調製される。次いで、溶液は凍結乾燥され又は医薬品投与容器（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）内に満たされる。溶液のｐＨは、一般にｐＨ  ３．０〜９．５、例えばｐＨ  ５．０〜７．５の範囲内である。Ａｄは、典型的には、薬学的に許容され得る好適な緩衝液を有する溶液中にあり、Ａｄの溶液は、塩も含み得る。場合によりアルブミン等の安定化剤が存在してもよい。所定の実施形態では、洗浄剤が添加される。所定の実施形態では、Ａｄは注射用製剤に調製され得る。これらの製剤は、有効な量のＡｄを含み、滅菌液体溶液、液体懸濁液又は凍結乾燥型のいずれかであり、場合により安定剤又は賦形剤を含む。アデノウイルスワクチンはまた、鼻腔内投与用にエアロゾル化されてもよい（例えば、国際公開第２００９／１１７１３４号参照）。
【００５７】
例えば、アデノウイルスは、Ａｄｎｏｖｉｒｕｓ  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ用にも使用される緩衝液中で保存されてもよい（Ｈｏｇａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｍａｒｃｈ  ２００２，ｐ．４３−４８）：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％グリセロール。ヒトへの投与に好適な、有用な別の製剤緩衝液は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ショ糖１０％  ｗ／ｖ、ポリソルベート−８０  ０．０２％  ｗ／ｖである。多数の他の緩衝液を使用できることは明らかであり、精製（アデノ）ウイルス製剤の保存及び医薬品投与に好適な製剤の数個の例は、例えば欧州特許第０８５３６６０号、米国特許第６，２２５，２８９号及び国際特許出願である国際公開第９９／４１４１６号、国際公開第９９／１２５６８号、国際公開第００／２９０２４号、国際公開第０１／６６１３７号、国際公開第０３／０４９７６３号、国際公開第０３／０７８５９２号、国際公開第０３／０６１７０８号に見出すことができる。
【００５８】
所定の実施形態では、アデノウイルスを含む組成物は、更に１つ以上のアジュバントを含む。アジュバントは、適用される抗原決定基に対する免疫応答を更に増大することで当技術分野で既知であり、アデノウイルス及び好適なアジュバントを含む医薬組成物は、例えば参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／１１０４０９号に開示されている。用語「アジュバント」及び「免疫刺激剤」は、本明細書で交換可能に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１つ以上の物質として定義される。この状況において、アジュバントは、本発明のアデノウイルスベクターの免疫応答を向上させるために使用される。好適なアジュバントの例には、水酸化アルミニウム及び／又はリン酸アルミニウム等のアルミニウム塩；ＭＦ５９（例えば国際公開第９０／１４８３７号参照）等のスクアレン−水エマルションを含む油エマルション組成物（又は水中油組成物）；例えばＱＳ２１等のサポニン製剤及び免疫賦活性複合体（ＩＳＣＯＭＳ）（例えば米国特許第Ｓ５，０５７，５４０号；国際公開第９０／０３１８４号、国際公開第９６／１１７１１号、国際公開第２００４／００４７６２号、国際公開第２００５／００２６２０号参照）；細菌又は微生物誘導体、その例は、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ−リボシル化細菌毒素又はその変異体（ｍｕｔａｎｔ）、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴ等が挙げられる。例えば、関心対象の抗原に対するＣ４−結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）のオリゴマー化ドメインの融合物をコード化する異種核酸を使用することによって、ベクター−コード化アジュバントを使用することも可能である（例えば、Ｓｏｌａｂｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７６：３８１７−２３）。所定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸アルミニウムカリウム、又はそれらの組み合わせの形態のアルミニウムをアジュバントとして、用量当たりのアルミニウム含有量が０．０５〜５ｍｇ、例えば０．０７５〜１．０ｍｇの濃度で含む。
【００５９】
別の実施形態では、組成物はアジュバントを含まない。
【００６０】
本発明によれば、更なる活性成分を、本発明によるワクチンと組み合わせて投与することも可能である。そのような更なる活性成分は、例えば他のマラリア抗原又はこれらをコード化する核酸を含むベクターを含むことができる。そのようなベクターは、非アデノウイルス性又はアデノウイルス性であってもよく、この後者は任意の血清型であってもよい。他のマラリア抗原の例には、マラリアタンパク質又はその免疫学的に活性な部分が挙げられる。更なる活性成分は、例えばウイルス、細菌、寄生虫等の他の病原体に由来する非マラリア抗原も含み得る。更なる活性成分の投与は、例えば、別々の投与により又は本発明のワクチンの製品と更なる活性成分との組み合わせの投与により行うことができる。所定の実施形態では、更なる非アデノウイルス抗原が、本発明のベクター内にコード化され得る。従って、所定の実施形態では、単一のアデノウイルスから１種を超えるタンパク質の発現が望ましい可能性があり、そのような場合、例えばより多くのコード化配列が結合されて、単一の発現カセットから単一の転写産物が形成され得るか、又は、アデノウイルスゲノムの異なる部分内にクローン化された２つの別個の発現カセット内に存在し得る。
【００６１】
アデノウイルス組成物は、対象、例えばヒト対象に投与され得る。１回の投与で対象に提供されるアデノウイルスの総用量は、熟練者に既知のように様々であり得、一般に１×１０７ウイルス粒子（ＶＰ）〜１×１０１２  ＶＰ、好ましくは１×１０８  ＶＰ〜１×１０１１  ＶＰ、例えば３×１０８〜５×１０１０  ＶＰ、例えば１０９〜３×１０１０  ＶＰである。
【００６２】
アデノウイルス組成物の投与は、標準的な投与経路を用いて行うことができる。非限定的な実施形態は、例えば注射による非経口投与、例えば皮内、筋内等、又は皮下、経皮、又は粘膜投与、例えば鼻腔内、経口等を含む。本発明によれば、ワクチンを筋内投与することが好ましい。筋内投与の利点は、単純かつ安定しており、６カ月未満の乳児における鼻腔内適用に安全性の懸念を有さないことである。一実施形態において、組成物は、筋内注射により、例えば腕の三角筋、又は大腿の外側広筋内に投与される。当業者は、ワクチン中の抗原（複数可）に対する免疫応答を誘導するための組成物、例えばワクチンの投与の様々な可能性を知っている。
【００６３】
本明細書で用いられる対象は、好ましくは哺乳動物、例えば齧歯類、例えばマウス、コットンラット、又は非ヒト−霊長類、又はヒトである。好ましくは、対象はヒト対象である。対象は、任意の年齢、例えば約１カ月〜１００歳、例えば約２カ月〜約８０歳、例えば約１カ月〜約３歳、約３歳〜約５０歳、約５０歳〜約７５歳等であり得る。
【００６４】
本発明の１つ以上のアデノウイルスワクチンの１つ以上の追加免疫投与を提供することも可能である。追加免疫ワクチン接種を行う場合、典型的には、そのような追加免疫ワクチン接種は、組成物を対象に最初に投与した後（これは、この場合、「プライミングワクチン接種」と称される）、１週間〜１年、好ましくは２週間〜４カ月の時点で、同じ対象に投与されるであろう。代替的な追加免疫レジメンでは、異なるベクター、例えば異なる血清型の１つ以上のアデノウイルス、又はＭＶＡ等の他のベクター、又はＤＮＡ、又はタンパク質を、プライミングワクチン接種の後に、対象に投与することも可能である。例えば本発明による組換えアデノウイルスベクターを予備刺激として対象に投与し、マラリアタンパク質を含む組成物で追加免疫することが可能である。
【００６５】
所定の実施形態では、投与は、プライミング及び少なくとも１つの追加免疫投与を含む。その所定の実施形態では、プライミング投与は、本発明によるマラリアタンパク質をコード化する核酸を含むＨＡｄＶ３５を用い、追加免疫投与は、前記マラリアタンパク質をコード化する核酸を含むＨＡｄＶ２６を用いる。その別の実施形態では、プライミング投与はＨＡｄＶ２６を用い、追加免疫投与はＨＡｄＶ３５を用いる。別の実施形態では、プライミング及び追加免疫投与の両方がＨＡｄＶ３５を用いる。所定の実施形態では、プライミング投与はＨＡｄＶ３５を用い、追加免疫投与はマラリアタンパク質を用いる。これらの全実施形態において、同じ又は他のベクター又はタンパク質を用いて更なる追加免疫投与を提供することが可能である。
【００６６】
所定の実施形態では、投与は、更なる（追加免疫）投与なしでの、本発明による組換えアデノウイルスの単独投与を含む。そのような実施形態は、予備刺激−追加免疫レジメンと比較して、単独投与レジメンで複雑性及び費用が低減されている点で有利である。本明細書の実施例のコットンラットモデルでは、追加免疫投与なしでの本発明の組換えアデノウイルスベクターの単独投与後の完全な保護が既に観察されている。
【００６７】
本発明を以下の実施例で更に説明する。実施例は本発明を如何様にも限定するものではない。これらは本発明を明確にする役割を果たす。
【実施例】
【００６８】
実施例１：ｐＩＸ−ＣＳショート改変ＨＡｄＶ３５ベクター及びＨＡｄＶ２６ベクターの生成及び特徴付け。
マラリア熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳタンパク質導入遺伝子（ＴＧ）を有する又は有さないＥ１  ｐＩＸ−ＣＳショート改変ベクターの生成
複製欠損ヒトアデノウイルスベクター（ＨＡｄＶｖ）の生成
ＣＳ若しくはＣＳショート導入遺伝子及び／又はｐＩＸ−ＣＳ若しくはＣＳショートをコード化する複製欠損ヒトアデノウイルス３５（ＨＡｄＶ３５）及びヒトアデノウイルス２６（ＨＡｄＶ２６）ベクターの生成のために、改変を主にＨＡｄＶゲノムの左部分、即ちｐＡｄａｐｔ３５．Ｂｓｕ／ｐＳｈｕｔｔｌｅ２６プラスミドに挿入する。続いて３つのプラスミド系によりＨＡｄＶ３５ベクターの救助を行い、ゲノムｐＢｒ．ＨＡｄＶ３５  ＰＲｄＥ３  ５Ｅ４  ｏｒｆ６／７（ＰａｃＩ及びＮｏｔＩで消化）の右末端、及びｐＷＥ．ＨＡｄＶ３５．ｄｐＩＸ．ＥｃｏＲＶ、（ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＶで消化）及びゲノムｐＡｄａｐｔ３５．Ｂｓｕ．ｐＩＸ−ｍｏｄの左末端、（ＰａｃＩで消化）がリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造業者の推奨に従ってＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内にトランスフェクトされた。Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．２００６により以前に記載されているように、ウイルスをプラーク精製し、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２で補充したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞上で更に増殖させた（６）。
【００６９】
ＨＡｄＶ２６ベクターは、以前記載されたように（Ｃｈａｒｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）、ＢＪ５１８３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内での左（ｐＳｈｕｔｔｌｅ２６．ｐＩＸ−ｍｏｄ、ＰｍｅＩ及びＳｂｆＩで消化）及び右末端コスミド（ｐＷＥ．ＨＡｄＶ２６．ｄＥ３．５ｏｒｆ６、ＰａｃＩで消化）間の相同組換え（ＨＲ）を可能にすることにより生成された。ＰａｃＩ直線化ＨＡｄＶ２６ゲノムを、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造業者の推奨に従ってＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内にトランスフェクトし、１０％のウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）及び１０ｍＭＭｇＣｌ２を補充したダルベッコの修正イーグル培地中で、接着ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内で３７℃／１０％  ＣＯ２で更に増幅させた。
【００７０】
複製欠損ウイルスを標準的な２工程ＣｓＣｌ−ｇＡｄｉｅｎｔにより精製し、製剤緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％ショ糖、０．０２％  ＰＳ−８０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭヒスチジン、及び０．５％  ＥＴＯＨ）中で透析した。ＳＤＳの存在下、光学濃度によりウイルス濃度ウイルス粒子／ｍｌ（ＶＰ／ｍｌ）及び感染性単位／ｍｌ（ＩＵ／ｍｌ）力価を決定し（Ｍａｉｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９６８）、感染性はＴＣＩＤ５０アッセイにより滴定した。表１で認められ得るように、ｐＩＸ−改変ベクターはＶＰ／ｍｌ力価（範囲１×１０１１〜５×１０１２）及び／又はＩＵ／ｍｌ力価（範囲１×１０１０〜５×１０１１）の点で、ｐＩＸ−天然対照ベクター（Ａｄ．空）と相違しなかった。加えて、ＶＰ／ＩＵ（３つを除いて０〜３０の範囲）比及びＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内での生産性（ＶＰ／ｃｍ２、範囲５×１０７〜５×１０９）を決定した（表１）。ｐＩＸ−改変ベクターのＶＰ／ｍｌ、ＩＵ／ｍｌ、ＶＰ／ＩＵ比及びＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内での生産性は、対照（天然ｐＩＸ）ベクターと同等であった。従って、このことはｐＩＸ−改変が力価及びＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内での生産性に有害効果を有さないことを暗示している（表１）。
【００７１】
「導入遺伝子のみ」ベクター：ＨＡｄＶ３５．空（導入遺伝子なし）、ＨＡｄＶ３５．ＣＳショート及びＨＡｄＶ３５．ＣＳを、導入遺伝子を有する又は有さない「ｐＩＸ改変」ベクター、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．ＣＳ．ｐＩＸ−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＣＳ及びＨＡｄＶ３５．ＣＳ．ｐＩＸ−ＣＳの対照として使用した（図１Ｂ）。
【００７２】
【表１】
2019508031.tif 000003
【００７３】
ウェスタンブロットによるｐＩＸ−ＣＳ及びｐＩＸ−ＣＳショートのカプシド組み込み及び導入遺伝子発現の評価
ｐＩＸ−ＣＳ及び／又はｐＩＸ−ＣＳショート変異体のカプシド組み込みを、精製ウイルス粒子のウェスタンブロット（ＷＢ）により、１．５、０．５及び０．１７×１０１０ウイルス粒子／ウェル（ＶＰ／ウェル）濃度で行った。還元及び変性させた精製ウイルス粒子を、ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のプレキャスト１２％  Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ  Ｎｕ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で１７５Ｖ、５００ｍＡで分離した。続いて、ｉＢｌｏｔ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｔａｃｋｓ（ｉＢｌｏｔ  ｓｙｓｔｅｍ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造業者の推奨に従ってタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。ローディングコントロールとしての抗−ＣＳ特異的抗体（２Ａ１０）（又は抗−ＨＡｄＶ３５．ｐＩＸモノクローナル）及び抗−繊維（ＨＡｄＶ５  ４Ｄ２、Ａｂｃａｍ）を５％脱脂粉乳（ＢｉｏＡｄ）／トリス緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で用いて染色を１時間行った。蛍光標識されたＩＲＤｙｅ８００ＣＷ  １：１００００ヤギ抗−マウスを用いて染色することにより関心対象のタンパク質を可視化し、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）（Ｌｉ−Ｃｏｒ）上に記録した。
【００７４】
抗−ＣＳ抗体（２Ａ１０）及び抗−繊維抗体（４Ｄ２）で染色した、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．ＣＳ．ｐＩＸ−ＣＳショート及び負の対照ベクターＨＡｄＶ３５．空のカプシド中のｐＩＸ−ＣＳショート（約３２ｋＤａ）の直接比較により、ウェル当たり等しい負荷における（繊維タンパク質約３５ｋＤａ）、ＣＳ導入遺伝子コード化ベクター及び空ベクターの間の同等のｐＩＸ−ＣＳショート含有量が示される（図１Ｃ、左  ＷＢ及び表２）。同じことが、ＨＡｄＶ２６．空ベクター又はＣＳ導入遺伝子ｐＩＸ−ＣＳショートベクターに関して観察することができる。等しい負荷において、（空）コード化ＣＳ導入遺伝子を有する又は有さない、いずれかのＨＡｄＶ２６におけるカプシド組み込みｐＩＸ−ＣＳショート間で明らかな相違は存在しない（繊維タンパク質約４０ｋＤａ、最高濃度ＶＰ／ウェルで可視）（図１Ｃ、右ＷＢ及び表３）。
【００７５】
【表２】
2019508031.tif 000004
【００７６】
【表３】
2019508031.tif 000005
【００７７】
ＣＳ導入遺伝子コード化ベクターにおけるカプシドｐＩＸ−ＣＳショート（約３２ｋＤａ）に加えて、ＣＳタンパク質（約４２ｋＤａ）自体も精製ＨＡｄＶ２６及びＨＡｄＶ３５バッチ中に検出され、このことは、カプシドへの非特異的結合又は少なくとも共精製を暗示する（図１Ｃ）。抗−ＣＳ（２Ａ１０）による精製ベクターの染色による、導入遺伝子としてのＣＳを有する又は有さないＨＡｄＶ３５  ｐＩＸ−ＣＳ改変ベクターにおけるｐＩＸ−ＣＳのカプシド組み込みの評価は、ｐＩＸ−ＣＳのカプシド組み込みを示さなかった（表２）。ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＣＳ及びＨＡｄＶ３５．ＣＳ．ｐＩＸ−ＣＳにおけるｐＩＸ−ＣＳのカプシド組み込みの欠如は、ベクターの生成中のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内でのｐＩＸ−ＣＳ改変の発現の低下又は不存在に起因するものではないことを確実にするために、５０００ＶＰ／細胞で感染させたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞溶解物をＷＢで試験し、抗−ＨＡｄＶ３５．ｐＩＸモノクローナル抗体で染色した。ＷＢ分析は、ＨＡｄＶ３５．ＣＳ及び空ｐＩＸ−ＣＳ改変ベクターのいずれかで感染させたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）内でのｐＩＸ−ＣＳ（約５５ｋＤａ）の発現を示す（データは示さず）。後者は、カプシド中のｐＩＸ−ＣＳの欠如が、ｐＩＸに融合したＣＳタンパク質のウイルスカプシド中の不十分な組み込みに起因するものであり、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）内でのベクターの生成中のｐＩＸ−ＣＳタンパク質発現の欠如ではないことを暗示する。ｐＩＸ−ＣＳショートはＨＡｄＶ２６及びＨＡｄＶ３５ウイルスカプシドの両方に効率的に組み込まれ、ＨＡｄＶ２６及びＨＡｄＶ３５ベクター中のコード化ＣＳ導入遺伝子は、ｐＩＸ−ＣＳショートの組み込み効率に影響を及ぼさないことが結論付けられ得る。対照的に、ｐＩＸ−ＣＳはウイルスカプシドに組み込まれず、このことは、抗原のサイズ（ＣＳショート１５１ａ．ａ．対ＣＳ  ３７６ａ．ａ．）又はおそらく３次構造がカプシド組み込みに影響を及ぼし得ることを示している。
【００７８】
導入遺伝子発現
ｐＩＸ−改変ベクターが尚、導入遺伝子を発現し得ることを確実にするために、本発明者らは、ｐＩＸ−カプシド改変が導入遺伝子発現に影響する可能性があり得るか否かを評価した。ｐＩＸ−改変及びＥ１導入遺伝子コード化ベクターを、Ａ５４９細胞内で導入遺伝子の発現に関して非複製条件下で試験した。ＨＡｄＶ２６．ＣＳ．ｐＩＸ−ＣＳショート及びＨＡｄＶ２６．空．ｐＩＸ−ＣＳショートを１００００、２５０００及び５００００ＶＰ／細胞で、又はＨＡｄＶ３５．ＣＳ．ｐＩＸ−ＣＳショート／ｐＩＸ−ＣＳ及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＣＳショート／ｐＩＸ−ＣＳを１０００、２５００及び５０００ＶＰ／細胞でＡ５４９細胞に形質導入し、３７℃で４８時間インキュベートし、回収し、溶解し、ＷＢで抗−ＣＳ（２Ａ１０）抗体を用いて分析した。ＣＳ導入遺伝子をコード化する全ｐＩＸ−ＣＳショートベクターのＣＳ導入遺伝子（約４２ｋＤａ）の発現は、導入遺伝子のみの対照（即ち、ＨＡｄＶ２６．ＣＳ及びＨＡｄＶ３５．ＣＳ）と同等であった。ホタルルシフェラーゼ（ｌｕｃ）コード化ベクターにおいて、ルシフェラーゼの発現も決定した（データは示さず）。Ｅ１−カセットにおける内因性ｐＩＸプロモーター及び可能な上流ＣＭＶプロモーターの増強効果（Ｎａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００７）に起因して、ｐＩＸ−改変の発現が予想され、非複製条件下で確認された。しかしながら、驚くべきことに、導入遺伝子としてのＣＳショートタンパク質（ＨＡｄＶ３５．ＣＳショート）はＡ５４９細胞内で検出されず、タンパク質代謝回転における幾分かの調節不全が示された。累積的に、これらの観察事項により、（１）ｐＩＸに対するＣＳショートの融合は、それ自体の存続タンパク質が検出されないため、ほぼ確実にＣＳショートタンパク質を安定化させること、（２）ｐＩＸ−ＣＳショート改変は、Ａ５４９細胞内でＣＳ導入遺伝子発現に対する効果を有さないこと、が示唆される。まとめると、ｐＩＸに融合されたＣＳショートはウイルスカプシドに組み込まれ、このことは導入遺伝子発現を損なわなかった。
【００７９】
ｐＩＸ−ＨＡ改変ベクター：ウェスタンブロットによるカプシド組み込み及び導入遺伝子発現の評価
インフルエンザＡｄＶａｃ（登録商標）ベースのワクチンの開発の一部として、インフルエンザＡタンパク質の異なる変異体を、Ｅ１内のこれらの変異体の相同導入遺伝子と組み合わせて表示するｐＩＸ改変ベクターを設計した。インフルエンザＡ赤血球凝集素（ＨＡ）の３つの異なる変異体、即ち５１２アミノ酸ＨＡ、３０３アミノ酸ｍＨＡ、及び２４８アミノ酸ｍＨＡ．ＧＣＮ（ｅｃｔｏ）（ｅｃｔ−ドメインをＧＣＮドメインと交換した）を、対応するタンパク質を導入遺伝子として同じベクターのＥ１領域内に有し又は有さずに設計し、ｐＩＸに融合した（図２）。ウェスタンブロットにおけるポリクローナル抗−ＨＡ及びモノクローナル抗−ｐＩＸ抗体の両方を用いたＨＡｄｖ３５．ＨＡ．ｐＩＸ−ＨＡ、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＨＡ、ＨＡｄＶ３５．ｍＨＡ．ｐＩＸ−ｍＨＡ、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ｍＨＡ、ＨＡｄＶ３５．ｍＨＡ．ＧＣＮ．ｐＩＸ−ｍＨＡ．ＧＣＮ（ｅｃｔｏ）及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ｍＨＡ．ＧＣＮ（ｅｃｔｏ）ウイルス粒子（ＶＰ）の直接染色によるｐＩＸ−ＨＡ−変異体のカプシド組み込みの分析は、カプシド中のｐＩＸ改変タンパク質を示さなかった（表２）。しかしながら、示したベクターにより１０００、２５００及び５０００ＶＰ／細胞で形質導入されたＡ５４９細胞溶解物の染色によって、Ａ５４９細胞内での導入遺伝子発現が確認された（データは示さず）。この観察結果は、ｐＩＸに融合されたＣＳ（３７６アミノ酸）と同一であり、これは、論じたように、カプシドに組み込まれなかったが、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内での複製及びベクター生成中に生成された（データは示さず）。総じて、ＣＳショート（１５１ａ．ａ．）の効率的なカプシド組み込みが観察されたが、ｐＩＸに直接融合されたＣＳ（３７６ａ．ａ．）及びＨＡ変異体（２４８、３０３及び５１２ａ．ａ．）にはカプシド組み込みが観察されなかった。このことは、どの抗原がカプシドに効率的に組み込まれ、どの抗原が組み込まれないかを予測することが困難なことを示している。ＷＢ分析で行われた（バンド強度の）定性的観察のみに基づいた、対照ベクターとの直接比較による、全ｐＩＸ−改変ベクターのカプシド組み込み効率の概要を表２及び３に提供する。
【００８０】
ＣＳタンパク質の免疫原性と直接比較した、ｐＩＸ−ＣＳショートカプシド改変ベクターの免疫原性
抗体−ＥＬＩＳＡによるＣＳ特異的体液免疫応答の決定
血清中の熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳ−タンパク質特異的な総ＩｇＧ、又はサブクラス特異的なＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ応答を、以前（１０）に記載されたように、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）平底９６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ、ｌｏｃａｔｉｏｎ）を、４℃で０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ  ９．６）中の２μｇ／ｍｌのＣＳ特異的（ＮＡＮＰ）６Ｃペプチド（Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｐｒｅｓｔｏ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で一晩被覆した。プレートをＰＢＳ／０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄し、ＰＢＳ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０中の１％  ＢＳＡにより室温で１時間ブロックした後、再び洗浄した。マウス血清サンプルをサンプル緩衝液（ＰＢＳ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ／０．２％  ＦＢＳ）中で開始濃度１：１００で希釈し、２倍希釈シリーズにて蒔き、室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。全結合ＩｇＧをビオチン化ヤギ−抗−マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ、ｌｏｃａｔｉｏｎ）及びストレプトアビジン結合西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で検出した。ＩｇＧサブクラスの検出のために、二重プレートを並行してインキュベートし、結合ＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａをＨＲＰに直接結合したヤギ−抗−マウスＩｇＧ１又は抗ＩｇＧ２ａ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）で検出した。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ；Ｐｉｅｒｃｅ）を加え、プレートを１０分間展開し、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止した後、光学濃度を４９２ｎｍで決定した。全ＩｇＧの相対血清力価（ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌ）を、４−パラメーター曲線適合モデルを使用して、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳ特異的参照血清と比較して計算した。ＩｇＧ１−及びＩｇＧ２ａ特異的な測定値を、ＯＤ４９２が未処理対照サンプルの背景測定の３倍に達した反復希釈（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を割ることにより、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１の比の計算に直接使用した。
【００８１】
統計的分析
応答変数、即ち、ＥＵ（ＥＬＩＳＡ単位）及びＳＦＵ（スポット形成単位（Ｓｐｏｔ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ））を対数変換し、ＡＮＯＶＡモデルを用いてグループ比較を行った。経時的な反復測定の場合、ランダム切片をＡＮＯＶＡモデルに加えて、相関する観察結果を適切に計上した。定量化の下限を下回る値を含むグループ間の比較は、打ち切り回帰モデルを使用して分析した。各分析において固定基準グループが存在したため、Ｄｕｎｎｅｔｔ方法を用いて多数試験に関する補正を適用した。ｐ≦０．０５を有する差は、有意であると見なされた。全ての統計的分析は、ＳＡＳ（登録商標）ソフトウエア、バージョン９．２（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、２０１１）を使用して行った。
【００８２】
ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＣＳショート及びＨＡｄＶ３５．ＣＳ．ｐＩＸ−ＣＳショートにより誘導されたＣＳ特異的体液応答（Ｂ細胞応答）をマウスで試験し、ＣＳタンパク質（ＣＳＰ）と比較した。Ｂａｌｂ／Ｃマウス（グループ当たりｎ＝７）を１×１０１０  ＶＰ  ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．ＣＳ．ｐＩＸ−ＣＳショート又は５μｇ（アジュバント不使用）酵母−生成ＣＳＰにより筋肉内に免疫化した。１×１０１０  ＶＰ  ＨＡｄＶ３５．空ベクターで免疫化したマウスは、負の対照の役割を果たした。免疫化後の４週目にＣＳ特異的Ｂ細胞応答を決定した。両方のｐＩＸ−ＣＳショートベクターは、ＣＳＰにより誘導されたものを遥かに超える高いＣＳ特異的総ＩｇＧ力価を誘導し（ｐ≦０．０００１、多重比較のためのＤｕｎｎｅｔｔ補正を用いたＡＮＯＶＡ）、ウイルス粒子のカプシド上のＣＳ抗原の表示は、高い免疫原性を有するＣＳタンパク質と比較しても非常に強力なプラットフォームであることを示している（図１Ｄ  左パネル）。ｐＩＸ−ＣＳショートベクターの比較的高い免疫原性が、該ベクター自体の潜在的な免疫賦活効果により仲介されるか否かを決定するために、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを５μｇ  ＣＳＰ単独で又は１×１０１０  ＶＰ  ＨＡｄＶ３５．空、ＨＡｄＶ２６．空又はＨＡｄＶ５．空（グループ当たりｎ＝６マウス）と混合して筋肉内に免疫化した。５μｇのアジュバント化ＣＳＰを基準点とし、アジュバントのみは負の対照としての役割を果たした。
【００８３】
アジュバント化ＣＳＰで免疫化したマウスの、免疫化から４週後のＣＳ特異的ＩｇＧ力価は、ＣＳＰタンパク質単独で誘導したものを超え（ｐ＝０．０００６、多重比較のためのＤｕｎｎｅｔｔ補正を用いたＡＮＯＶＡ）、１×１０１０  ＶＰのｐＩＸ−ＣＳショート改変ＨＡｄＶ３５ベクターで免疫化した動物において、免疫化後の同時点で観察されたものと同様のレベルに達した。ＣＳ特異的ＩｇＧ力価の統計的に有意な（ｐ＝０．８）増大は、ＣＳＰタンパク質単独と比較した場合、ＣＳＰと混合したＨＡｄＶ．空ベクターで免疫化したマウスで観察されなかった（図１Ｄ）。１×１０７、１×１０８、１×１０９、又は１×１０１０  ＶＰの用量範囲のＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＣＳショートで免疫化したＢａｌｂ／Ｃマウスは、ＨＡｄＶ３５．ＣＳ導入遺伝子のみのベクターと比較して、ＣＳ特異的ＩｇＧ力価の誘導において、免疫化後の８週間に亘ってより強力であった（データは示さず）。ＨＡｄＶ２６．ＣＳ導入遺伝子のみのベクターと比較した、ＨＡｄＶ２６．空．ｐＩＸ−ＣＳショート及びＨＡｄＶ２６．ＣＳ．ｐＩＸ−ＣＳショートの免疫原性もマウスにて決定した。Ｂａｌｂ／Ｃマウスを１×１０７、１×１０８、１×１０９、又は１×１０１０  ＶＰの用量範囲のＨＡｄＶ２６．空．ｐＩＸ−ＣＳショート、ＨＡｄＶ２６．ＣＳ．ｐＩＸ−ＣＳショート及びＨＡｄＶ２６．ＣＳで免疫化した。負の対照として、ＨＡｄＶ２６．空を動物（ｎ＝５）当たり最も高い用量１×１０１０  ＶＰで使用した。観察された結果は、ＨＡｄＶ３５  ｐＩＸ−ＣＳショートを用いたものと同様であった；全体的に、免疫化後の４週目にｐＩＸ−改変ベクターは、全用量において、ＣＳ導入遺伝子のみのベクターよりも、ＣＳ特異的ＩｇＧ力価の誘導において強力であった（データは示さず）。
【００８４】
まとめると、ｐＩＸ−ＣＳショート改変ベクターは、ＣＳタンパク質単独又はＨＡｄＶ３５．ＣＳ導入遺伝子ベクター（ｐＩＸ−ＣＳショート融合タンパク質なし）よりも、ＣＳ特異的抗体応答の誘導において強力である。この効果は、タンパク質をＨＡｄＶ．空ベクターと混合することによっては達成することができず、カプシドへのＣＳショートタンパク質の融合が、優れた抗原特異的抗体応答の誘導に必要であることが暗示される。
【００８５】
実施例２：ｐＩＸとＣＳショートとの間にスペーサーを含むｐＩＸ−ＣＳショート改変ＨＡｄＶ３５及びＨＡｄＶ２６ベクターの生成及び特徴付け
４５Åスペーサー（１６、Ｖｅｌｌｉｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．２００４）のみ、フレキシビリティの付加のためにＧｌｙ−リンカーと組み合わせた４５Åスペーサー、又はＧｌｙ−リンカーのみを介してＣＳショートタンパク質をｐＩＸに融合することによってＨＡｄＶ３５及びＨＡｄＶ２６ベクターを改変した。４５Åスペーサーの配列は、表４に見出すことができる。Ｅ１内のＣＳ導入遺伝子を有する又は有さないＨＡｄＶ３５．ｐＩＸ−４５−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．ｐＩＸ−Ｇｌｙ４５−ＣＳショート及びＨＡｄＶ３５．ｐＩＸ−Ｇｌｙ−ＣＳショートベクターを、ＨＡｄＶ３５直接融合（ｐＩＸ−ＣＳショート）ベクターに関して上記に示したように、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）内で生成した（図３Ａ及び表１）。
【００８６】
ウェスタンブロットによるｐＩＸ−ＣＳショートスペーサー変異体カプシド組み込み及び導入遺伝子発現の評価
ｐＩＸ−ＣＳショートスペーサー変異体のカプシド組み込みを、上述したようにＷＢにより評価した。精製したウイルス粒子１．５、０．５及び０．１７×１０１０  ＶＰ／ウェルを還元し、変性し、ゲル上で分離させ、ニトロセルロース膜に転写した。ｐＩＸ−ＣＳショートスペーサー変異体の染色は、ローディングコントロールとしてのＣＳ特異的抗体（２Ａ１０）及び抗−繊維抗体（４Ｄ２）を用いて行い、ＨＡｄＶ３５．空ベクターは負の対照としての役割を果たした。ＣＳ導入遺伝子が、異なるスペーサー変異体ｐＩＸ−ＣＳショート改変のカプシド組み込みに効果を有さないことを確実にするために、導入遺伝子を有する又は有さない全ベクターを並べて比較した。同等の負荷（繊維バンド約３５ｋＤａ）において、ＷＢ結果は、Ｅ１内にＣＳ導入遺伝子をコード化するベクターと空ベクターとの間で、ｐＩＸ−ＣＳショートスペーサー変異体のカプシド組み込みにおける相違を示さなかった。ＣＳ導入遺伝子をコード化する精製ベクター内のｐＩＸ−ＣＳショート直接融合改変と同様、ＣＳ導入遺伝子は、ｐＩＸスペーサーベクターと共精製されたように思われる。４５−スペーサー含有ベクターとＧｌｙ−のみ又は直接融合ＣＳショートのいずれかとの間の明らかな相違は、ｐＩＸ−融合タンパク質に加えた、およそ１００ｋＤａにおけるバンド移動である（図３Ｂ）。これはアッセイアーチファクト又はｐＩＸ及びＣＳショート改変に対する４５−スペーサーの未知の効果であり得る。抗−ＣＳ抗体（２Ａ１０）で染色された直接融合を含む異なるｐＩＸ−ＣＳショート変異体の直接比較は、全ベクター間の、カプシドに組み込まれた同等のレベルのｐＩＸを示す。スペーサー又はＧｌｙ−リンカーの付加は、カプシド組み込み効率に有害な効果を有さないと思われる。ｐＩＸ−４５−ＣＳショート、ｐＩＸ−Ｇｌｙ４５−ＣＳショート及びｐＩＸ−Ｇｌｙ−ＣＳショートは、ＣＳ導入遺伝子を有し又は有さずに、ベクターにおけるウイルスカプシドに効率的に組み込まれる。
【００８７】
ＣＳ導入遺伝子ベクターと直接比較したスペーサーｐＩＸ−ＣＳショートカプシド改変ベクターの免疫原性
ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｇｌｙ４５−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．ＣＳ．ｐＩＸ−Ｇｌｙ４５−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｇｌｙ−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．ＣＳ．ｐＩＸ−Ｇｌｙ−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．ＣＳ．ｐＩＸ−４５−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−４５−ＣＳショートベクターに対するＣＳ特異的Ｂ細胞応答をマウスにて決定し、ＨＡｄＶ３５．ＣＳ対照ベクターと直接比較した。Ｂａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝５）を用量範囲１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０  ＶＰで筋肉内に免疫化した。１×１０１０  ＶＰのＨＡｄＶ３５．空で免疫化した動物は、負の対照としての役割を果たした。血清中の総ＣＳ特異的ＩｇＧ応答を免疫化後の８週間に亘って２週間間隔で測定した。１×１０７  ＶＰ／マウスでは、試験したベクターのいずれも、アッセイの定量化の下限を超えて高まらなかった。１×１０８では、ＣＳショートを表示する全構築物が、免疫化後の４週目までにＣＳ特異的ＩｇＧ応答を誘導し、これらの応答は８週目の実験の終了時まで維持された。ＨＡｄＶ３５．ＣＳは、比較的低い効力を示し、ＣＳ特異的ＩｇＧ応答を誘導する最小用量は１×１０９  ＶＰであった。検出可能なＣＳ特異的応答を誘導する全用量において、ｐＩＸを介して４つのベクターｐＩＸ−ＣＳショートにより引き出された全力価は、ＨＡｄＶ３５．ＣＳにより誘導されたものよりも高かった。３つの任意のスペーサー構築物のＣＳショート表示は、免疫原性を更に増大させることが証明され、ｐＩＸ−ＣＳショート改変ベクターと比較して早いＣＳ特異的ＩｇＧ応答の誘導と、ＨＡｄＶ３５．ＣＳにより誘導されたものよりも有意に高い力価との両方をもたらす（１×１０８  １×１０１０  ＶＰ；混合モデル分析）。３つの異なるスペーサー構築物は、同等の大きさのＣＳ特異的ＩｇＧ力価を誘導したが、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−４５−ＣＳショートは、３つの免疫原性用量（１×１０８〜１×１０１０  ＶＰ）の全てで、ＨＡｄＶ３５．ＣＳを有意に超える応答に一貫して到達する唯一のベクターであることが証明された（データは示さず）。
【００８８】
ｐＩＸ−４５−ＣＳショートカプシド改変ベクターにおけるＣＳ導入遺伝子に対する免疫応答
マラリアの原因となる病原体、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に対する体液応答に加えた細胞免疫応答の誘導は、前赤血球段階における感染に対する保護ワクチンの所望の特徴であると考えられる。アデノウイルスベクターは、ＨＡｄＶ３５．ＣＳで免疫化したマウス及び非ヒト霊長類で検出された高いＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答により明らかなように、コード化導入遺伝子に対するＴ細胞応答の強い誘導により特徴付けられる（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。従って、本発明者らは、ＣＳ導入遺伝子をコード化するＨＡｄＶ３５上にＣＳショート抗原を保有するＢ細胞エピトープ（免疫優性Ｈ−２ＫＤ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープＮＹＤＮＡＧＴＮＬを含む）のｐＩＸ−表示の実施が、以前見られた強い体液免疫応答の誘導を維持するか否か、またこの組み合わせが、コード化導入遺伝子に対するＴ細胞応答に影響するか否かを評価した。
【００８９】
これを目的として、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−４５−ＣＳショート及びＨＡｄＶ３５．ＣＳ．ｐＩＸ−４５−ＣＳショートにより誘導されたＣＳ特異的体液応答を、用量設定１×１０８、１×１０９及び１×１０１０  ＶＰ／動物で筋肉内に免疫化したＢａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝５）で試験した。ベクターをＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−４５−ＣＳショート＋ＨＡｄＶ３５．ＣＳ導入遺伝子ベクター混合物、ＨＡｄＶ３５．ＣＳ単独と直接比較し、ＨＡｄＶ３５を負の対照として使用した。混合物（ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−４５−ＣＳショート＋ＨＡｄＶ３５．ＣＳ）を受容するグループに付与されたＶＰ数を調整するために、残りのグループの総ＶＰ数を、ＨＡｄＶ３５．空を使用して補足し、これは正式な総ベクター用量２×１０８〜２×１０１０  ＶＰ／マウスをもたらした。
【００９０】
免疫化後の８週目に血清中のＣＳ特異的総ＩｇＧ応答を測定した（図３Ｃ）。ＨＡｄＶ３５．ＣＳとは対照的に、またＨＡｄＶ３５．空ｐＩＸ−４５−ＣＳショートと同様に、ＨＡｄＶ３５．ＣＳ．ｐＩＸ−４５−ＣＳショートは最小用量（１×１０８）にて測定可能なＣＳ特異的抗体応答を誘導し、ｐＩＸ非改変ＨＡｄＶ３５．ＣＳと比較して高いベクターの効力を示した。加えて、１×１０１０  ＶＰにおいて２週目にＨＡｄＶ３５．ＣＳ．ｐＩＸ−４５−ＣＳショート及びＨＡｄＶ３５．空ｐＩＸ−４５−ＣＳショートの両方により高まった力価は、１×１０１０  ＶＰの同じ用量でＨＡｄＶ３５．ＣＳにより誘導されたものを大きく超えた（全比較に関してｐ≦０．００５、図３Ｃ）。全グループにおける総力価の大きさは経時的に増大したが、ＨＡｄＶ３５．ＣＳにより誘導されたものは、免疫化後の８週目に、２つのｐＩＸ−４５−ＣＳショート融合構築物により誘導されたものよりも有意に低いままであった（１×１０８及び１×１０９  ＶＰを受容したグループにおける全比較に関してｐ≦０．００５、図３Ｃ）。ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−４５−ＣＳショート融合構築物及びＨＡｄＶ３５．ＣＳの等しい混合物への適用により、最小用量１×１０８を除いて、全用量及び時点において有意に増大したＣＳ特異的力価ももたらされ、該最小用量では、力価の相違が、免疫化後の８週目に有意性に到達しなかった。このことは、導入遺伝子に対する免疫応答が、ｐＩＸ−ＣＳショート融合構築物に対する体液応答の誘導を妨げないことを示している。
【００９１】
ＥＬＩＳＰＯＴによるＣＳ−及びＨＡｄＶ３５ヘキソン特異的細胞免疫応答の決定
（１０）にて以前記載されている方法に基づいたＩＦＮγ酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）を用いて、ワクチン接種マウスにおける抗原特異的細胞免疫応答を評価した。新たに単離した脾細胞を、記載されたＨ−２Ｋｄ−ＭＨＣクラスＩ−制限、免疫優性ＮＹＤＮＡＧＴＮＬ  ＣＳエピトープ、又は同じＭＨＣクラスＩエピトープにより制限された免疫優性ＨＡｄＶ３５ヘキソンエピトープＫＹＴＰＳＮＶＴＬを有する、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳタンパク質の全配列に及ぶ１１アミノ酸により重複している１５−ｍｅｒペプチドのプールと共にインキュベートした。ペプチドプール及び単一のペプチドを、個々の各ペプチドに関して最終濃度１ｕｇ／ｍｌで使用した。９６−ウェルマルチスクリーンプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を、内毒素フリーのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）中の１００μｌ／ウェルの１０μｇ／ｍｌ抗−マウスＩＦＮ−γ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で一晩被覆した。次いで、プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｄ−ＰＢＳＴｗｅｅｎ）を含むＤ−ＰＢＳで３回洗浄し、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤ−ＰＢＳで３７℃で２時間ブロックし、１０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０で濯いだ。個々のマウスからの脾細胞をＣＳペプチドプール、ＣＳ  ９−ｍｅｒ又はＨＡｄＶ３５ヘキソン９−ｍｅｒで３７℃で１８時間刺激した。インキュベーション後、プレートをＤ−ＰＢＳＴｗｅｅｎで６回し、蒸留水で１回洗浄した。次いで、プレートを２μｇ／ｍｌビオチン化抗−マウスＩＦＮ−γ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と共に室温で２時間インキュベートし、Ｄ−ＰＢＳＴｗｅｅｎで６回洗浄し、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）の１：５００希釈物と共に２時間インキュベートした。Ｄ−ＰＢＳＴｗｅｅｎで６回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄した後、プレートをニトロブルーテトラゾリウム５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸塩色素原（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で展開し、反応を水道水で停止し、プレートを風乾し、ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ａｅｌｖｉｓ  ＧｍｂＨ）を使用して読み取った。１０６細胞当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）の数を計算した。
【００９２】
予備刺激から８週間後に、ＥＬＩＳＰＯＴ（全ＣＳタンパク質配列に及ぶペプチド）により、４つの全構築物に対するＣＳ特異的細胞免疫応答を評価した（図３Ｄ）。ＣＳショート配列に免疫−優性Ｔ細胞エピトープＮＹＤＮＡＧＴＮＬが存在しないため、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−４５−ＣＳショートは、予想通り、いずれの細胞免疫応答も誘導しなかった。応答を誘導した他の全免疫化レジメンは、用量−用量設定の関係に従い、増大する応答は増大する用量に対応した。ＨＡｄＶ３５．ＣＳ．ｐＩＸ−４５−ＣＳショートにより誘導されたＩＦＮ応答は、１×１０８及び１×１０１０  ＶＰ用量でＨＡｄＶ３５．ＣＳにより誘導されたものと有意に相違しなかったが、１×１０９  ＶＰの中間用量で僅かに低下した（ｐ＝０．０４）。ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−４５−ＣＳショート及びＨＡｄＶ３５．ＣＳの等しい混合物により誘導された応答は、任意の所定の用量で、ＨＡｄＶ３５．ＣＳにより誘導されたものと相違しなかった。ワクチン接種対照として、ＨＡｄＶ３５ヘキソンの免疫−優性Ｈ−２Ｋｄ制限エピトープＫＹＴＰＳＮＶＴＬを標的とするＩＦＮ応答を測定し、これは予想通り、同じ用量で免疫化したグループ間で相違はなかった（図３Ｄ）。これらの結果は、ｐＩＸ−ＣＳショート−改変ベクターがベクター効力の僅かな低下をもたらすが、より高い用量のベクターで到達し得る絶対的な大きさの細胞応答をもたらさない可能性があることを示す。まとめると、これらの結果は、ｐＩＸ上のＣＳショート表示が、ＣＳ導入遺伝子−発現ＨＡｄＶ３５ベクター上で実行することができ、体液免疫応答を有意に増大させると共に、強い細胞免疫応答を維持することを示す。
【００９３】
４５ÅスペーサーＳＰ１（ウイルス起源）によるα−ヘリックス４５Å−スペーサー（ヒト起源）の置換
ヒト起源４５−スペーサーを含むベクターを用いたワクチン接種後の自己免疫疾病に関する潜在的な好ましくない効果を回避するために、ウイルス起源の４種の生化学的に類似したスペーサー（ＳＰ１〜ＳＰ４）を設計した（表４）。
【００９４】
【表４】
2019508031.tif 000006
【００９５】
ウイルス起源の以下の４種のスペーサータンパク質を、インビトロで試験した：スペーサー１（ＳＰ１）、配列番号２のアミノ酸配列を含むＲＳＶ融合タンパク質；スペーサー２（ＳＰ２）、配列番号３のアミノ酸配列を含むインフルエンザＡ  ＨＡ；スペーサー３（ＳＰ３）、配列番号４のアミノ酸配列を含む流行性耳下腺炎融合タンパク質；及び最終的にスペーサー４（ＳＰ４）、点変異を有するＨＡｄＶ３５．ｐＩＸ断片は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【００９６】
４種の異なるスペーサー、ＳＰ１〜４を有するｐＩＸ−ＣＳショートをコード化するＨＡｄＶ３５．空ベクター、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＳＰ１−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＳＰ２−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＳＰ３−ＣＳショート及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＳＰ４−ＣＳショートを、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内で３つのプラスミド系を使用して上述したように生成した（図４Ａ及び表１）。ＣｓＣｌ−精製ベクターをＷＢで試験して、４種の異なるスペーサーを有する４種のｐＩＸタンパク質のカプシド組み込み効率を決定した。３つの異なる濃度のＳＰ１〜４ベクター（１．５、０．７５及び０．３７×１０１０  ＶＰ／ウェル）を、４５−スペーサー対照ベクター及びＨＡｄＶ３５．空内の天然ｐＩＸと直接比較した（図４Ｂ）。タンパク質の染色は、抗−ｐＩＸモノクローナル及び抗−ＣＳ（２Ａ１０）抗体の両方を用いて行った。抗−ＣＳ抗体（２Ａ１０）に対する２７−ＮＡＮＰ反復配列とは対照的に、抗−ｐＩＸ抗体はｐＩＸ  ＨＡｄＶ３５内の１つの特異的エピトープを認識するため、抗−ｐＩＸ抗体は抗−ＣＳ  ＮＡＮＰ反復特異的抗体よりもカプシド組み込みの相違に感受性であると見なされた。等しいベクター負荷において（繊維バンド約３５ｋＤａ）、ｐＩＸ−ＳＰ１−ＣＳショート（約３２ｋＤａ）はｐＩＸ−４５−ＣＳショート（約３２ｋＤａ）及びｐＩＸ（約１４ｋＤａ）と比較して、カプシド中で最も豊富であることが示された。カプシド組み込みの観点から、ｐＩＸ−ＳＰ２−ＣＳショートは２番目、続いてｐＩＸ−ＳＰ３−ＣＳショート、最後にｐＩＸ−ＳＰ４−ＣＳショートは最も低いカプシド組み込み改変ｐＩＸであった。ｐＩＸ融合物に対する機能的スペーサーとしてのＳＰ１の適用を確認するために、ＳＰ２を除いた同じカプシド改変をＨＡｄＶ２６内で生成した。ＨＡｄＶ２６．空．ｐＩＸ−ＳＰ１−ＣＳショート、ＨＡｄＶ２６．空．ｐＩＸ−ＳＰ３−ＣＳショート及びＨＡｄＶ２６．空．ｐＩＸ−ＳＰ４−ＣＳショートを、前述したように、全ゲノムプラスミドを用いてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内で生成し、特徴付けた（表１）。示したベクターをＷＢで、３つの異なる濃度（１．５、０．５及び０．１６×１０１０  ＶＰ／ウェル）のＳＰ１、ＳＰ３及びＳＰ４を対照ベクター４５スペーサーと比較することにより分析した（図４Ｄ）。ＨＡｄＶ３５  ＳＰ１〜ＳＰ４スペーサーベクターで観察された結果と一致して、抗−ＣＳ  ＮＡＮＰ反復抗体２Ａ１０を用いて行った染色は、カプシド組み込み効率において相違を示さなかった（抗−ｐＩＸ抗体を用いた染色とは異なり）（表３）。カプシド組み込み効率の観点から、ＳＰ１スペーサーは、ＨＡｄＶ３５及びＨＡｄＶ２６ベクター内の４５−スペーサーと同等である。カプシド組み込みの観点から、ＳＰ２スペーサーで僅かな相違が観察され、ＳＰ３及びＳＰ４で大きな相違が観察された。観察されたカプシド組み込み効率に対するこのスペーサーの効果は、スペーサーの選択が重要であることを示す。ＨＡｄＶ３５内のＳＰ２、ＳＰ３及びＳＰ４スペーサーを用いてカプシド組み込み効率において観察された相違は、α−ヘリックススペーサーの選択が効率的なカプシド組み込みに重要であることを暗示する。
【００９７】
実施例３：ｐＩＸ−ＣＳショート改変ＨＡｄＶ３５及びＨＡｄＶ２６ベクターの製造可能性
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内におけるＨＡｄＶ２６  ｐＩＸ改変ベクターの動態及び増殖
マラリアを引き起こす寄生虫等の多数の病原体は、多くの場合、資源の乏しい領域に流行性であるため、高い生産性を有する製造プロセスは、適切なワクチン接種率を確実にするために必要である。いくつかのＨＡｄＶベクターは、挿入された導入遺伝子等の所定の遺伝子改変に感受性であり得るとの観察事項に基づいて、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の懸濁培養液中で、それらの高い及び低い生産可能性（即ち、「良プロデューサー」及び「低プロデューサー」）で知られる対照ベクターと並行して、相対的なウイルス粒子増大（ＶＰ／ｍｌ）及びｐＩＸ改変ベクターの動態を評価した。バイオリアクター内でのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（懸濁液中）上のアデノウイルスベクターの成長（データは示さず）を行って、これらのベクターの相対的なＶＰ／ｍｌ増大及び動態を評価した。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞上でのアデノウイルスベクター増殖の評価は、以下を含む：７０又は９００のいずれかの所定のＶＰ／細胞比におけるＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（１０〜１５ｍｌ  １×１０６生細胞（ｖｃ／ｍｌ））の感染（ｎ＝３）、感染後の０、１、２、３及び４日目（ＤＰＩ）の回収（１００μｌ  ｎ＝３）、並びにＣＭＶプロモーターベースのＶＰ−ＱＰＣＲによる力価（ＶＰ／ｍｌ）決定。
【００９８】
ＣＭＶ  ＶＰ−ＱＰＣＲによる力価（ＶＰ／ｍｌ）決定
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内のｐＩＸ改変ベクターのＶＰ／ｍｌ力価及び動態を決定するために、１％  Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えることにより細胞溶解を行った後、デオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ）で処理して、溶媒中の非カプシド化ウイルスＤＮＡを除去した。溶解後、サンプルをＨ２０（Ｇｉｂｃｏ）中で希釈（１０００×）し、ＣＭＶベースのＱＰＣＲを行った。ＱＰＣＲのために、フォワードプライマー（５’−ＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡ−３’）及びリバースプライマー（５’−ＣＧＡＴＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＡＣＴＡＡＡＣＧ−３’）を使用した。反応は最終容積１５μｌで３回行い、そのうち５μｌの希釈サンプルを１０μｌ反応混合物と混合した。この反応混合物は、１０ｐｍｏｌプライマー及び２．５ｐｍｏｌプローブに加えて、２ｘ  ＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスター混合物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含んでいた。最終反応は、ＱＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｉｉａ７）内でサンプルを９５℃で８分間、続いて９５℃で１０秒間及び６０℃で３０秒間、３５サイクルで変性することにより行った。
【００９９】
結果は、細胞が７０ＶＰ／細胞で感染した際、「良」プロデューサーコントロールに関しておよそ２Ｌｏｇ、「低」プロデューサーコントロールに関して１ＬｏｇのＶＰ増大を３日目に示す。ＶＰ／ｍｌ力価の更なる増大が、両方に関して４日目に観察される（約１Ｌｏｇ）（図５Ａ、上部グラフ）。７０ＶＰ／細胞感染により観察されたものと同じ相対的な増大が、細胞が９００ＶＰ／細胞で感染した際にも「良」プロデューサーコントロール（約２Ｌｏｇ）及び「低」プロデューサーコントロール（約１Ｌｏｇ）に関して３日目に観察される（図５Ａ、下部グラフ）。試験したＨＡｄＶ２６．ＣＳ．ｐＩＸ−ＣＳショート及びｒＨＨＡｄＶ２６．空．ｐＩＸ−ＣＳショートベクターは、０〜４日目の時点で「良」プロデューサーコントロールと同じ相対的ＶＰ／ｍｌ増大に従う。この観察結果により、Ｅ１内のＣＳ導入遺伝子を有する又は有さないＨＡｄＶ２６ベクターのｐＩＸ−ＣＳショート改変は、懸濁液ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内で相対的な力価（ＶＰ／ｍｌ）増大に影響を与えないという結論が導かれる。
【０１００】
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内における延長された継代後のｐＩＸ改変ベクターの遺伝的安定性
以前記したように、導入遺伝子産物は、非常に強力なＣＭＶプロモーターにより、Ｅ１−補完ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株内でのウイルス増幅中に産生される。導入遺伝子及びおそらく発現タンパク質の量に応じて、これはウイルス形成に有害であり得る。ｐＩＸ−ＣＳショート及びＣＳ導入遺伝子の両方は、ウイルス増殖及びアップスケーリング中にＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内で発現されるため、本発明者らは、これらのベクターがＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内での延長された継代後に遺伝的に安定なままであるか否かを試験することを欲した。プロデューサーＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内での産生後、Ｅ１内のＣＳ導入遺伝子を有する又は有さないｐＩＸ−ＣＳショート改変ベクターの遺伝的安定性を決定するために、予測される商業的プロセスを超える４回までのウイルス継代（ＶＰＮ）まで、精製ベクターをＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）内で更に増殖させた（図５Ｂは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内でのアデノウイルスベクターの継代の概略図を与える）。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内での救助及びアップスケーリング後、ベクターは、ＣｓＣｌによるそれらの精製に先立って、平均７回継代されている。救助中、ＨＡｄＶウイルスＤＮＡが単離されて、ＰＣＲ及び配列決定（Ｓａｎｇｅｒ）によりｐＩＸ−ＣＳショート改変及びＥ１  ＣＳ導入遺伝子（該当する場合）の配列が確認される。正確なｐＩＸ−ＣＳショート及びＥ１  ＣＳ配列を含むベクターにより更なるアップスケーリングが行われる。精製された際、ウイルスＤＮＡはさらにもう１度単離され、ＰＣＲにより分析され、配列決定（Ｓａｎｇｅｒ）により確認される。続くＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（１０ｍｌ  １×１０６  ＶＣ／ｍｌ）内での継代が、細胞を７０又は９００ＶＰ／細胞のいずれかで感染させ、３  ＤＰＩ（ｎ＝２）で回収することにより制御条件下で行われる。最終的に、ＶＰＮ１４において、ウイルスＤＮＡが単離され、ＰＣＲにより分析される。
【０１０１】
ｐＩＸ及びＥ１  ＰＣＲアッセイ及びウイルスＤＮＡ単離
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内での延長された継代後、ゲノム内の改変領域（即ち、ｐＩＸ−ＣＳショート及びＣＳ導入遺伝子）が尚ベクター内に遺伝的にコード化されているか否かを評価するために、ｐＩＸ及びＥ１特異的ＰＣＲをウイルスＤＮＡ上で行った。粗溶解物又は精製ベクターバッチのいずれかに由来するウイルスＤＮＡを、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ  Ｓｐｉｎキット（Ｂｉｏ１０１  Ｉｎｃ．）を製造業者の推奨に従って使用することにより行った。続いて、ＤＮＡをテンプレートとして使用してｐＩＸ領域及び／又はＥ１領域を分析した。ＨＡｄＶ２６  ｐＩＸ−ＰＣＲにはプライマー（５’−ＧＡＣＡＴＣＡＴＧＡＡＣＧＧＧＡＣＴＧ−３’及び５’−ＧＡＴＣＧＡＧＡＴＧＣＣＧＴＡＧＡＧ−３’）及びＨＡｄＶ３５  ｐＩＸ−ＰＣＲにはプライマー（５’−ＧＧＴＧＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧ−３’及び５’−ＣＡＧＧＧＣＡＴＡＣＣＧＴＧＣＧ−３’）を使用した。プライマー（５’−ＧＧＡＧＧＴＴＴＣＧＡＴＴＡＣＣＧＴ−３’及び５’−ＣＣＣＴＣＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＣＡＴＣＡ−３’）を用いてＨＡｄＶ３５  Ｅ１−ＰＣＲを行い、プライマー（５’−ＴＧＧＣＧＣＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴＧＡＧ−３’及び５’−ＧＣＡＧＧＣＧＧＧＴＴＧＴＣＡＡＡＴＡＡＧ−３’）を用いてＨＡｄＶ２６  Ｅ１−ＰＣＲを行った。ＨＡｄＶ３５及びＨＡｄＶ２６  ｐＩＸ−ＰＣＲ条件は、以下の通りであった：９４℃で１分間、９４℃の３０サイクルを３０秒間、６５℃で３０秒間及び７２℃で２分間の伸長。ＨＡｄＶ３５及びＨＡｄＶ２６  Ｅ１−ＰＣＲ条件は：９４℃で１分間、９４℃の１０サイクルを３０秒間、６２℃  ３０秒間（−０．５Ｃ／サイクル）及び７２℃で２分間の伸長、続いて９４℃の２０サイクルを３０秒間、５７℃で３０秒間及び７２℃で２分間の伸長であった。全反応はＴａＫａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて製造業者の推奨に従って行った。ＰＩＸ−ＰＣＲアガロースゲル分析は、ＶＰＮ  ７（プレＭＶＳ）及びＶＰＮ１４におけるＨＡｄＶ２６．ＣＳ．ｐＩＸ−ＣＳショート、ＨＡｄＶ２６．空．ｐＩＸ−ＣＳショート、ＨＡｄＶ３５．ＣＳ．ｐＩＸ−ＣＳショート及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−ＣＳショートを示す（図５Ｃ）。Ｅ１内のＣＳ導入遺伝子を有する又は有さない、ＨＡｄＶ３５及びＨＡｄＶ２６  ｐＩＸ−ＣＳショート改変ベクターの両方は、ｓＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）内での延長された継代後に遺伝的に安定であり、これは、正のプラスミド対照と同等な唯一のバンドがＶＰＮ  ７及びＶＰＮ１４で検出されたためである。同じ分析をＥ１−カセットに関してＥ１−ＰＣＲによりこれらのベクター上で行った；ｐＩＸ−ＰＣＲを用いたものと同じ観察結果が得られ、予想されたバンド以外の更なるバンドは観察されなかった（データは示さず）。まとめると、このデータは、懸濁液ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内での産生後、ＨＡｄＶ２６及びＨＡｄＶ３５ベクターの両方におけるｐＩＸ−ＣＳショート及びＥ１  ＣＳ導入遺伝子は、遺伝的に安定なままであることを暗示する。優れたＣＳ特異的体液応答の誘導に加えて、Ｅ１内のＣＳ−導入遺伝子を有する又は有さないｐＩＸ−ＣＳショート改変ベクターは、遺伝的に安定なままであり、Ｅ１−補完ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞プラットフォーム内で高いＶＰ／ｍｌ力価で産生され得る。複雑な免疫応答を必要とする病原体の多くが資源の乏しい領域に流行性であることを考慮すると、ワクチンレジメンの単純化及び高い生産性は、ワクチン接種率に最も依存する十分なサービスを受けていないコミュニティーに到達するように、ｐＩＸ−表示技術を特に価値あるものとする。
【０１０２】
ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ
１．Ａｉｄｅ，  Ｐ．，  Ｃ．  Ｄｏｂａｎｏ，  Ｊ．  Ｓａｃａｒｌａｌ，  Ｊ．  Ｊ．  Ａｐｏｎｔｅ，  Ｉ．  Ｍａｎｄｏｍａｎｄｏ，  Ｃ．  Ｇｕｉｎｏｖａｒｔ，  Ｑ．  Ｂａｓｓａｔ，  Ｍ．  Ｒｅｎｏｍ，  Ｌ．  Ｐｕｙｏｌ，  Ｅ．  Ｍａｃｅｔｅ，  Ｅ．  Ｈｅｒｒｅｒｏｓ，  Ａ．  Ｌｅａｃｈ，  Ｍ．  Ｃ．  Ｄｕｂｏｉｓ，  Ｍ．  Ａ．  Ｄｅｍｏｉｔｉｅ，  Ｍ．  Ｌｉｅｖｅｎｓ，  Ｊ．  Ｖｅｋｅｍａｎｓ，  Ｃ．  Ｌｏｕｃｑ，  Ｗ．  Ｒ．  Ｂａｌｌｏｕ，  Ｊ．  Ｃｏｈｅｎ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｌ．  Ａｌｏｎｓｏ．  Ｆｏｕｒ  ｙｅａｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＴＳ，Ｓ／ＡＳ０２（Ａ）  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  Ｍｏｚａｍｂｉｃａｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩｂ  ｔｒｉａｌ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９：６０５９−６０６７．
２．Ａｌｏｎｓｏ，  Ｐ．  Ｌ．，  Ｊ．  Ｓａｃａｒｌａｌ，  Ｊ．  Ｊ．  Ａｐｏｎｔｅ，  Ａ．  Ｌｅａｃｈ，  Ｅ．  Ｍａｃｅｔｅ，  Ｐ．  Ａｉｄｅ，  Ｂ．  Ｓｉｇａｕｑｕｅ，  Ｊ．  Ｍｉｌｍａｎ，  Ｉ．  Ｍａｎｄｏｍａｎｄｏ，  Ｑ．  Ｂａｓｓａｔ，  Ｃ．  Ｇｕｉｎｏｖａｒｔ，  Ｍ．  Ｅｓｐａｓａ，  Ｓ．  Ｃｏｒａｃｈａｎ，  Ｍ．  Ｌｉｅｖｅｎｓ，  Ｍ．  Ｍ．  Ｎａｖｉａ，  Ｍ．  Ｃ．  Ｄｕｂｏｉｓ，  Ｃ．  Ｍｅｎｅｎｄｅｚ，  Ｆ．  Ｄｕｂｏｖｓｋｙ，  Ｊ．  Ｃｏｈｅｎ，  Ｒ．  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｒ．  Ｂａｌｌｏｕ．  ２００５．  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＲＴＳ，Ｓ／ＡＳ０２Ａ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｍｏｚａｍｂｉｃａｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ：  ｓｉｎｇｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｏｆ  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３６６：２０１２−２０１８．
３．Ａｌｏｎｓｏ，  Ｐ．  Ｌ．，  Ｊ．  Ｓａｃａｒｌａｌ，  Ｊ．  Ｊ．  Ａｐｏｎｔｅ，  Ａ．  Ｌｅａｃｈ，  Ｅ．  Ｍａｃｅｔｅ，  Ｊ．  Ｍｉｌｍａｎ，  Ｉ．  Ｍａｎｄｏｍａｎｄｏ，  Ｂ．  Ｓｐｉｅｓｓｅｎｓ，  Ｃ．  Ｇｕｉｎｏｖａｒｔ，  Ｍ．  Ｅｓｐａｓａ，  Ｑ．  Ｂａｓｓａｔ，  Ｐ．  Ａｉｄｅ，  Ｏ．  Ｏｆｏｒｉ−Ａｎｙｉｎａｍ，  Ｍ．  Ｍ．  Ｎａｖｉａ，  Ｓ．  Ｃｏｒａｃｈａｎ，  Ｍ．  Ｃｅｕｐｐｅｎｓ，  Ｍ．  Ｃ．  Ｄｕｂｏｉｓ，  Ｍ．  Ａ．  Ｄｅｍｏｉｔｉｅ，  Ｆ．  Ｄｕｂｏｖｓｋｙ，  Ｃ．  Ｍｅｎｅｎｄｅｚ，  Ｎ．  Ｔｏｒｎｉｅｐｏｒｔｈ，  Ｗ．  Ｒ．  Ｂａｌｌｏｕ，  Ｒ．  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｃｏｈｅｎ．  ２００４．  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＴＳ，Ｓ／ＡＳ０２Ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ：  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３６４：１４１１−１４２０．
４．Ａｐｏｎｔｅ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ｃ．  Ｍｅｎｅｎｄｅｚ，  Ｄ．  Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇ，  Ｅ．  Ｋａｈｉｇｗａ，  Ｈ．  Ｍｓｈｉｎｄａ，  Ｐ．  Ｖｏｕｎｔａｓｏｕ，  Ｍ．  Ｔａｎｎｅｒ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｌ．  Ａｌｏｎｓｏ．  ２００７．  Ａｇｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．  ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ４：ｅ２４２．
５．Ｂｏｊａｎｇ，  Ｋ．  Ａ．，  Ｐ．  Ｊ．  Ｍｉｌｌｉｇａｎ，  Ｍ．  Ｐｉｎｄｅｒ，  Ｌ．  Ｖｉｇｎｅｒｏｎ，  Ａ．  Ａｌｌｏｕｅｃｈｅ，  Ｋ．  Ｅ．  Ｋｅｓｔｅｒ，  Ｗ．  Ｒ．  Ｂａｌｌｏｕ，  Ｄ．  Ｊ．  Ｃｏｎｗａｙ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｒｅｅｃｅ，  Ｐ．  Ｇｏｔｈａｒｄ，  Ｌ．  Ｙａｍｕａｈ，  Ｍ．  Ｄｅｌｃｈａｍｂｒｅ，  Ｇ．  Ｖｏｓｓ，  Ｂ．  Ｍ．  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，  Ａ．  Ｈｉｌｌ，  Ｋ．  Ｐ．  ＭｃＡｄａｍ，  Ｎ．  Ｔｏｒｎｉｅｐｏｒｔｈ，  Ｊ．  Ｄ．  Ｃｏｈｅｎ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｄｏｈｅｒｔｙ．  ２００１．  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ＲＴＳ，Ｓ／ＡＳ０２  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｅｍｉ−ｉｍｍｕｎｅ  ａｄｕｌｔ  ｍｅｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｇａｍｂｉａ：  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｔｒｉａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３５８：１９２７−１９３４．
６．Ｈａｖｅｎｇａ，  Ｍ．，  Ｒ．  Ｖｏｇｅｌｓ，  Ｄ．  Ｚｕｉｊｄｇｅｅｓｔ，  Ｋ．  Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ，  Ｓ．  Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｍ．  Ｓｉｅｕｗｅｒｔｓ，  Ｆ．  Ｗｅｉｃｈｏｌｄ，  Ｉ．  Ｄａｍｅｎ，  Ｊ．  Ｋａｓｐｅｒｓ，  Ａ．  Ｌｅｍｃｋｅｒｔ，  Ｍ．  ｖａｎ  Ｍｅｅｒｅｎｄｏｎｋ，  Ｒ．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｕｇｔ，  Ｌ．  Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ，  Ｄ．  Ｈｏｎｅ，  Ｙ．  Ｓｋｅｉｋｙ，  Ｒ．  Ｍｉｎｔａｒｄｊｏ，  Ｇ．  Ｇｉｌｌｉｓｓｅｎ，  Ｄ．  Ｂａｒｏｕｃｈ，  Ｊ．  Ｓａｄｏｆｆ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｇｏｕｄｓｍｉｔ．  ２００６．  Ｎｏｖｅｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｂ−ｇｒｏｕｐ  ｖｅｃｔｏｒｓ：  ｈｉｇｈ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｙｉｅｌｄ  ｉｎ  ＰＥＲ．Ｃ６  ｃｅｌｌｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８７：２１３５−２１４３．
７．Ｋｅｓｔｅｒ，  Ｋ．  Ｅ．，  Ｊ．  Ｆ．  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，  Ｃ．  Ｆ．  Ｏｃｋｅｎｈｏｕｓｅ，  Ｒ．  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｂ．  Ｔ．  Ｈａｌｌ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｇｏｒｄｏｎ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｓｃｈｗｅｎｋ，  Ｕ．  Ｋｒｚｙｃｈ，  Ｃ．  Ａ．  Ｈｏｌｌａｎｄ，  Ｇ．  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  Ｍ．  Ｇ．  Ｄｏｗｌｅｒ，  Ｊ．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｒ．  Ａ．  Ｗｉｒｔｚ，  Ｎ．  Ｔｏｒｎｉｅｐｏｒｔｈ，  Ｌ．  Ｖｉｇｎｅｒｏｎ，  Ｍ．  Ｄｅｌｃｈａｍｂｒｅ，  Ｍ．  Ａ．  Ｄｅｍｏｉｔｉｅ，  Ｗ．  Ｒ．  Ｂａｌｌｏｕ，  Ｊ．  Ｃｏｈｅｎ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｇ．  Ｈｅｐｐｎｅｒ，  Ｊｒ．  ２００８．  Ｐｈａｓｅ  ２ａ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ０，  １，  ａｎｄ  ３  ｍｏｎｔｈ  ａｎｄ  ０，  ７，  ａｎｄ  ２８  ｄａｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｃｈｅｄｕｌｅｓ  ｏｆ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ＲＴＳ，Ｓ／ＡＳ０２  ｉｎ  ｍａｌａｒｉａ−ｎａｉｖｅ  ａｄｕｌｔｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｗａｌｔｅｒ  Ｒｅｅｄ  Ａｒｍｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６：２１９１−２２０２．
８．Ｋｅｓｔｅｒ，  Ｋ．  Ｅ．，  Ｄ．  Ａ．  ＭｃＫｉｎｎｅｙ，  Ｎ．  Ｔｏｒｎｉｅｐｏｒｔｈ，  Ｃ．  Ｆ．  Ｏｃｋｅｎｈｏｕｓｅ，  Ｄ．  Ｇ．  Ｈｅｐｐｎｅｒ，  Ｔ．  Ｈａｌｌ，  Ｕ．  Ｋｒｚｙｃｈ，  Ｍ．  Ｄｅｌｃｈａｍｂｒｅ，  Ｇ．  Ｖｏｓｓ，  Ｍ．  Ｇ．  Ｄｏｗｌｅｒ，  Ｊ．  Ｐａｌｅｎｓｋｙ，  Ｊ．  Ｗｉｔｔｅｓ，  Ｊ．  Ｃｏｈｅｎ，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｒ．  Ｂａｌｌｏｕ．  ２００１．  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｒｅｇｉｍｅｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍａｌａｒｉａ．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８３：６４０−６４７．
９．Ｋｅｓｔｅｒ，  Ｋ．  Ｅ．，  Ｄ．  Ａ．  ＭｃＫｉｎｎｅｙ，  Ｎ．  Ｔｏｒｎｉｅｐｏｒｔｈ，  Ｃ．  Ｆ．  Ｏｃｋｅｎｈｏｕｓｅ，  Ｄ．  Ｇ．  Ｈｅｐｐｎｅｒ，  Ｊｒ．，  Ｔ．  Ｈａｌｌ，  Ｂ．  Ｔ．  Ｗｅｌｌｄｅ，  Ｋ．  Ｗｈｉｔｅ，  Ｐ．  Ｓｕｎ，  Ｒ．  Ｓｃｈｗｅｎｋ，  Ｕ．  Ｋｒｚｙｃｈ，  Ｍ．  Ｄｅｌｃｈａｍｂｒｅ，  Ｇ．  Ｖｏｓｓ，  Ｍ．  Ｃ．  Ｄｕｂｏｉｓ，  Ｒ．  Ａ．  Ｇａｓｓｅｒ，  Ｊｒ．，  Ｍ．  Ｇ．  Ｄｏｗｌｅｒ，  Ｍ．  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，  Ｊ．  Ｗｉｔｔｅｓ，  Ｒ．  Ｗｉｒｔｚ，  Ｊ．  Ｃｏｈｅｎ，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｒ．  Ｂａｌｌｏｕ．  ２００７．  Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩａ  ｓａｆｅｔｙ，  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａ  ｔｗｏ−ｄｏｓｅ  ｒｅｇｉｍｅｎ  ｏｆ  ｌｉｑｕｉｄ  ａｎｄ  ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ＲＴＳ，Ｓ／ＡＳ０２Ａ  ｉｎ  ｍａｌａｒｉａ−ｎａｉｖｅ  ａｄｕｌｔｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５：５３５９−５３６６．
１０．Ｏｐｈｏｒｓｔ，  Ｏ．  Ｊ．，  Ｋ．  Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｋｌａｐ，  Ｊ．  Ｓｉｊｔｓｍａ，  Ｇ．  Ｇｉｌｌｉｓｓｅｎ，  Ｒ．  Ｍｉｎｔａｒｄｊｏ，  Ｍ．  Ｊ．  ｖａｎ  Ｏｏｉｊ，  Ｌ．  Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ，  Ａ．  Ｃｏｍｐａｎｊｅｎ，  Ｊ．  Ｇｏｕｄｓｍｉｔ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｊ．  Ｈａｖｅｎｇａ．  ２００７．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＨＡｄＶ３５−ｂａｓｅｄ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５：６５０１−６５１０．
１１．Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ，  Ｋ．，  Ａ．  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，  Ａ．  Ａ．  Ｌｅｍｃｋｅｒｔ，  Ｍ．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ，  Ｇ．  Ｇｉｌｌｉｓｓｅｎ，  Ｃ．  Ｗａｒｎａｒ，  Ｒ．  ｖｏｎ  Ｅｙｂｅｎ，  Ｍ．  Ｇ．  Ｐａｕ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｇｏｕｄｓｍｉｔ．  ２０１１．  Ｔｈｅ  Ｔｈ１  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｂｏｏｓｔｅｄ  ｂｙ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ３５  ａｎｄ  ２６  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｉｎｓｅｒｔ．  Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：１６８７−１６９４．
１２．Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ，  Ｋ．，  Ｃ．  Ｗ．  Ｗｉｅｌａｎｄ，  Ａ．  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，  Ｇ．  Ｊ．  Ｗｅｖｅｒｌｉｎｇ，  Ｒ．  Ｍｉｎｔａｒｄｊｏ，  Ｇ．  Ｇｉｌｌｉｓｓｅｎ，  Ｒ．  Ｖｏｇｅｌｓ，  Ｙ．  Ａ．  Ｓｋｅｉｋｙ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｈｏｎｅ，  Ｊ．  Ｃ．  Ｓａｄｏｆｆ，  Ｔ．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌｌ，  Ｍ．  Ｈａｖｅｎｇａ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｇｏｕｄｓｍｉｔ．  ２００７．  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３５  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｍｏｕｓｅ  ｓｔｒａｉｎｓ：  ＣＤ４  ａｎｄ  ＣＤ８  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇａｍｍａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７５：４１０５−４１１５．
１３．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，  Ａ．，  Ｒ．  Ｍｉｎｔａｒｄｊｏ，  Ｄ．  Ｔａｘ，  Ｇ．  Ｇｉｌｌｉｓｓｅｎ，  Ｊ．  Ｃｕｓｔｅｒｓ，  Ｍ．  Ｇ．  Ｐａｕ，  Ｊ．  Ｋｌａｐ，  Ｓ．  Ｓａｎｔｒａ，  Ｈ．  Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ，  Ｎ．  Ｌ．  Ｌｅｔｖｉｎ，  Ｊ．  Ｇｏｕｄｓｍｉｔ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ．  ２００９．  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｃｈｅｄｕｌｅ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７：６２２６−６２３３．
１４．Ｓｈｏｔｔ，  Ｊ．  Ｐ．，  Ｓ．  Ｍ．  ＭｃＧｒａｔｈ，  Ｍ．  Ｇ．  Ｐａｕ，  Ｊ．  Ｈ．  Ｃｕｓｔｅｒｓ，  Ｏ．  Ｏｐｈｏｒｓｔ，  Ｍ．  Ａ．  Ｄｅｍｏｉｔｉｅ，  Ｍ．  Ｃ．  Ｄｕｂｏｉｓ，  Ｊ．  Ｋｏｍｉｓａｒ，  Ｍ．  Ｃｏｂｂ，  Ｋ．  Ｅ．  Ｋｅｓｔｅｒ，  Ｐ．  Ｄｕｂｏｉｓ，  Ｊ．  Ｃｏｈｅｎ，  Ｊ．  Ｇｏｕｄｓｍｉｔ，  Ｄ．  Ｇ．  Ｈｅｐｐｎｅｒ，  ａｎｄ  Ｖ．  Ａ．  Ｓｔｅｗａｒｔ．  ２００８．  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ５  ａｎｄ  ３５  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｌｉｃｉｔ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６：２８１８−２８２３．
１５．Ｓｔｅｗａｒｔ，  Ｖ．  Ａ．，  Ｓ．  Ｍ．  ＭｃＧｒａｔｈ，  Ｐ．  Ｍ．  Ｄｕｂｏｉｓ，  Ｍ．  Ｇ．  Ｐａｕ，  Ｐ．  Ｍｅｔｔｅｎｓ，  Ｊ．  Ｓｈｏｔｔ，  Ｍ．  Ｃｏｂｂ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｂｕｒｇｅ，  Ｄ．  Ｌａｒｓｏｎ，  Ｌ．  Ａ．  Ｗａｒｅ，  Ｍ．  Ａ．  Ｄｅｍｏｉｔｉｅ，  Ｇ．  Ｊ．  Ｗｅｖｅｒｌｉｎｇ，  Ｂ．  Ｂａｙａｔ，  Ｊ．  Ｈ．  Ｃｕｓｔｅｒｓ，  Ｍ．  Ｃ．  Ｄｕｂｏｉｓ，  Ｊ．  Ｃｏｈｅｎ，  Ｊ．  Ｇｏｕｄｓｍｉｔ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｇ．  Ｈｅｐｐｎｅｒ，  Ｊｒ．  ２００７．  Ｐｒｉｍｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ３５−ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＣＳ）  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  ＲＴＳ，Ｓ／ＡＳ０１Ｂ  ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｔｏ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ＣＳ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ｔｈａｔ  ｗｉｔｈ  ｅｉｔｈｅｒ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｌｏｎｅ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７５：２２８３−２２９０．
１６．Ｖｅｌｌｉｎｇａ，  Ｊ．，  Ｍ．Ｊ．Ｗ．Ｅ．  Ｒａｂｅｌｉｎｋ，  Ｓ．  Ｊ．  Ｃｒａｍｅｒ，  Ｄ．  Ｊ．  Ｍ．  Ｖａｎ    ｄｅｒ  Ｗｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，  Ｈ．  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｕｌｅｎ，  Ｋ．  Ｎ．  Ｌｅｐｐａｒｄ，  Ｆ．  Ｊ．  Ｆａｌｌａｕｘ，  Ｒ．  Ｃ．  Ｈｏｅｂｅｎ．  ２００４．  Ｓｐａｃｅｒｓ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃａｒｂｏｘｙｌ  Ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｍｉｎｏｒ  Ｃａｐｓｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＸ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ａｐｒ．  ２００４，  ｐ．  ３４７０−３４７９，  Ｖｏｌ．  ７８，  Ｎｏ．７．
【０１０３】
配列表
配列番号１（ＣＳショート）：
【化１】
2019508031.tif 000007
配列番号２（ＳＰ１スペーサー）：
ＣＮＧＴＤＡＫＩＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＳＴ
配列番号３（ＳＰ２スペーサー）：
ＴＮＥＫＦＨＱＩＥＫＥＦＳＥＶＥＧＲＩＱＤＬＥＫＹＶＥＤＴＫＩＤＬ
配列番号４（ＳＰ３スペーサー）：
ＱＴＮＡＲＡＩＡＡＭＫＮＳＩＱＡＴＮＲＡＩＦＥＶＫＥＧＴＱＱ
配列番号５（ＳＰ４スペーサー）：
ＳＳＡＲＤＤＫＡＴＡＡＬＡＱＡＤＳＡＴＲＥＡＮＶＶＳＱＱＡＬＤＡ
配列番号６（ＨＡｄＶ−３５  ｐＩＸ）：
【化２】
2019508031.tif 000008
配列番号７（ＨＡｄＶ−２６  ｐＩＸ）：
【化３】
2019508031.tif 000009
配列番号８（熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質）：
【化４】
2019508031.tif 000010
【図１Ａ】
2019508031.tif 000011
【図１Ｂ】
2019508031.tif 000012
【図１Ｃ】
2019508031.tif 000013
【図１Ｄ】
2019508031.tif 000014
【図２Ａ】
2019508031.tif 000015
【図２Ｂ】
2019508031.tif 000016
【図３Ａ】
2019508031.tif 000017
【図３Ｂ】
2019508031.tif 000018
【図３Ｃ】
2019508031.tif 000019
【図３Ｄ】
2019508031.tif 000020
【図４Ａ】
2019508031.tif 000021
【図４Ｂ】
2019508031.tif 000022
【図４Ｃ】
2019508031.tif 000023
【図４Ｄ】
2019508031.tif 000024
【図５Ａ】
2019508031.tif 000025
【図５Ｂ】
2019508031.tif 000026
【図５Ｃ】
2019508031.tif 000027
【配列表】
2019508031000001.app
【国際調査報告】
2019508031.tif 000028
2019508031.tif 000029
2019508031.tif 000030