(57)【要約】  本発明は、幹細胞を凍結保存培地と組み合わせて、混合物を生成するステップと、混合物を凍結して、凍結幹細胞生成物を生成するステップと、を含む方法によって、幹細胞の保存のための方法および使用に関し、任意に、該方法は、凍結幹細胞生成物を解凍するステップと、解凍された細胞を保存培地に移すステップと、保存培地中で幹細胞を保存するステップと、をさらに含み、凍結保存培地および／または保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミンを含み、より好ましくは、組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、凍結保存培地中に存在し、保存培地中にも存在する。本発明はまた、幹細胞を保存培地に保存することを含む方法による幹細胞の保存のための方法および使用にも関し、幹細胞は、凍結保存培地中で凍結され、解凍され、次いで保存前に保存培地に移されており、凍結保存培地および／または保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含み、より好ましくは、組換え酵母由来血清アルブミン調製物は凍結保存培地中に存在し、保存培地中にも存在する。【選択図】図８
2019533442.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞の保存方法であって、前記幹細胞を凍結保存培地と組み合わせて、混合物を生成するステップと、前記混合物を凍結して、凍結幹細胞生成物を生成するステップと、を含み、
任意に、前記方法は、前記凍結幹細胞生成物を解凍するステップと、前記解凍された細胞を保存培地に移すステップと、幹細胞を前記保存培地中に保存するステップと、をさらに含み、
前記凍結保存培地および／または前記保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含み、より好ましくは前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、前記凍結保存培地中に存在し、前記保存培地中にも存在する、方法。
【請求項２】
幹細胞の保存方法であって、幹細胞を保存培地中に保存することを含み、
前記幹細胞は、凍結保存培地中で凍結され、解凍され、次いで保存前に保存培地に移されており、
前記凍結保存培地および／または前記保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含み、より好ましくは前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、前記凍結保存培地中に存在し、前記保存培地中にも存在する、方法。
【請求項３】
前記方法は、幹細胞を前記凍結乾燥培地中で凍結して、凍結幹細胞生成物を生成するステップと、前記凍結幹細胞生成物を解凍するステップと、前記解凍された細胞を前記保存培地に移すステップと、幹細胞を前記保存培地中に保存するステップと、を含み、
前記凍結保存培地および／または前記保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、前記幹細胞と混合したときに、前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に、約０．０１％（ｗ／ｖ）超および１０％（ｗ／ｖ）未満、例えば、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）、好ましくは約２％（ｗ／ｖ）である濃度の前記組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質を提供するのに好適な量で存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）前記幹細胞は、２〜８℃の温度で前記保存培地中に保存される、および／または
（ｂ）前記幹細胞は、２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば最大約７２時間、もしくはそれ以上、前記保存培地中に保存され、
任意に、前記幹細胞は、２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、２〜８℃の温度で保存され、前記保存期間の終了時の前記幹細胞の生存率は、５％超、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、以下の特性：
（ｅ）０．５％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは０．４％、０．３％、０．２％、もしくは０．１５％未満が、コンカナバリンＡへ結合すること、および／または
（ｆ）０．６モルのヘキソース／タンパク質１モル未満、好ましくは０．１０、０．０７５、もしくは０．０５モルのヘキソース／タンパク質１モル未満の糖化レベル、のうちの１つ以上を示す、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、
（ｇ）少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、より好ましくは少なくとも約９９．５％の単量体および二量体、好ましくは本質的に１００％の単量体および二量体であり、
（ｈ）少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、もしくは９７％の単量体であり、ならびに／または
（ｉ）約１．０％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）、もしくは０．０１％（ｗ／ｗ）以下、好ましくはそれ未満のアルブミンポリマー含有量を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。この文脈に使用されるように、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質に適用される「ポリマー」という用語は、単量体および二量体形態とは異なる。
【請求項８】
（ａ）前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、酵母由来血清アルブミンタンパク質、カチオン（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、好ましくはナトリウムなど）、および平衡アニオン（塩化物、リン酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、または酢酸塩、好ましくは塩化物またはリン酸塩）、水、ならびに任意にオクタノエートおよびポリソルベート８０を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、
（ｂ）前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地自体は、３５ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、１ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００１ｍＭ未満のオクタノエートを含むか、オクタノエートを実質的に含まないか、またはオクタノエートを含まず、
（ｃ）前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地自体は、３５ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、１ｍＭ以下の全脂肪酸含量を有するか、実質的に脂肪酸を含まないか、または脂肪酸を含まず、
（ｊ）前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または前記凍結保存培地および／または前記保存培地自体は、洗浄剤、例えばポリソルベート（好ましくはポリソルベート８０）を、２００ｍｇ．Ｌ−１、１００ｍｇ．Ｌ−１、５０ｍｇ．Ｌ−１、１０ｍｇ．Ｌ−１、１ｍｇ．Ｌ−１、０．１ｍｇ．Ｌ−１、０．０１ｍｇ．Ｌ−１、０．００１ｍｇ．Ｌ−１未満の濃度で含むか、前記洗浄剤を実質的に含まないか、または前記洗浄剤を含まず、
（ｋ）前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地自体は、３５ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、１ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．００１ｍＭ未満の全遊離アミノ酸レベルおよび／またはＮ−アセチルトリプトファンレベルを含むか、具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを実質的に含まないか、または具体的には、遊離アミノ酸および／またはＮ−アセチルトリプトファンを含まず、
（ｌ）前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または前記凍結保存培地および／または前記保存培地自体は、オクタノエート、具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファン、ならびに洗浄剤（ポリソルベート８０など）のすべてを実質的に含まないか、または全く含まず、
（ｍ）前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム、もしくはそれに類似の調製物、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ、もしくはそれに類似の調製物、またはＡｌｂＩＸ（登録商標）、もしくはそれに類似の調製物、から選択される調製物であり、
（ｎ）前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、ならびに／または凍結保存培地および／または保存培地自体は、ヘム、プレカリクレイン活性化因子、発熱物質、Ｃ型肝炎、および／もしくはヒトウイルスから選択される１つ以上、例えばすべての成分を含まず、ならびに／または２００μｇ．Ｌ−１、１００μｇ．Ｌ−１、５０μｇ．Ｌ−１未満、もしくは約１０μｇ．Ｌ−１〜約３０μｇ．Ｌ−１の範囲内のアルミニウム濃度を有し、
（ｏ）前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、無傷または実質的に無傷のＮ末端配列を有し、
（ｐ）前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、質量分析法によって試験したとき、組換え植物由来血清アルブミンタンパク質（図１に示される試料など）と比較して、天然の無傷のヒト血清アルブミン分子を表す約６６．４ｋＤａの主要ピークとは異なる、実質的により少ないピークを示し、
（ｑ）前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、６２％超、例えば、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、約９６％、約９７％である遊離チオール基含有量を有するアルブミンタンパク質を含み、
（ｒ）前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって試験したとき、１４分未満および１９分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外し、より好ましくは、１４分または１５分未満および１８分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外する、ＳＥＣプロファイルを示すアルブミンタンパク質を含み、
（ｓ）前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって試験したとき、天然単量体形態のアルブミンに対応する単一の主要ピークを示すアルブミンタンパク質を含み、
（ｔ）前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、質量分析法によって試験したとき、１タンパク質当たり１３、１２、１１、１０、９、８、７、６未満、例えば、約１〜１１、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、１、または１未満のヘキソース修飾リジンおよび／またはアルギニン残基を示す生成物であるアルブミンタンパク質を含み、かつ／あるいは
（ｕ）前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、植物特異的糖で糖化されていないアルブミンタンパク質を含み、例えば、植物特異的糖は、α−１，３−フコースおよび／またはβ−１，２−キシロースから選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記凍結保存培地は、前記組換え血清アルブミン調製物および凍結保存剤を含み、
任意に、前記凍結保存培地は、前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物の水溶液、凍結保存剤、およびイオン緩衝液を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、
前記凍結保存培地は、幹細胞培養増殖培地ではなく、好ましくは、幹細胞の増殖を支持せず、より好ましくは、ビタミン、ホルモン、成長因子、鉄源、遊離アミノ酸、および／またはグルコースなどの典型的な幹細胞培養培地の成分のうちのいかなる１つ以上（例えばすべて）のレベルも実質的に含まないか、または含まない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記保存培地は、前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含み、
任意に、前記保存培地は、前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物の水溶液およびイオン性緩衝液を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、
前記保存培地は、幹細胞培養増殖培地ではなく、好ましくは幹細胞の増殖を支持せず、より好ましくは、ビタミン、ホルモン、成長因子、鉄源、遊離アミノ酸、および／またはグルコースなどの典型的な幹細胞培養培地の成分のうちのいかなる１つ以上（例えばすべて）のレベルも実質的に含まないか、または含まない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
方法は、幹細胞を任意に２〜８℃の温度で、さらに任意に２４時間を超える時間の期間、例えば最大４８時間、例えば、最大約７２時間、またはそれ以上、前記保存培地中に保存することを含み、
幹細胞を前記保存培地中に保存するステップ後に直接的または間接的に、前記方法は、前記幹細胞を培養するステップと、前記幹細胞の培養を拡大するステップと、前記幹細胞を分化させるステップと、前記幹細胞、またはそれに由来する培養および／もしくは分化された細胞を、例えば組織もしくは医療用インプラントに固定化するステップと、幹細胞、またはそれに由来する培養および／もしくは分化された細胞もしくは他の生成物を、薬学的に許容可能な組成物または獣医学的に許容可能な組成物中に製剤化するステップと、幹細胞、またはそれらに由来する培養および／もしくは分化された細胞もしくは他の生成物を患者に投与するステップと、から選択される１つ以上のステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
幹細胞の前記凍結保存のための凍結保存培地であって、前記凍結保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物および凍結保存剤を含み、好ましくは前記凍結保存培地は、請求項１〜１１のいずれかに定義される凍結保存培地であり、
任意に、前記凍結保存培地は、幹細胞をさらに含み、
さらに任意に、凍結保存培地は、凍結されているか、または凍結され、次いで解凍されている幹細胞を含む凍結保存培地である、凍結保存培地。
【請求項１３】
凍結保存培地中で凍結され、解凍され、次いで前記保存培地に移されている幹細胞を保存するための保存培地であって、前記保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含み、好ましくは前記保存培地は、請求項１〜１１のいずれかに定義される保存培地であり、
任意に、前記保存培地は、幹細胞をさらに含み、
さらに任意に、前記幹細胞は、凍結保存培地（請求項１２に記載の凍結保存培地など）中で凍結され、解凍され、次いで前記保存培地に移されている、保存培地。
【請求項１４】
凍結保存培地中で凍結され、解凍され、次いで前記保存培地に移されており（または前記保存培地に移される前に別の生理学的ショックを受けた）、２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、２〜８℃の温度で保存されている、幹細胞をさらに含み、前記保存期間の終了時の前記幹細胞の生存率は、５％超、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上である、請求項１３に記載の保存培地。
【請求項１５】
幹細胞を保存するための、好ましくは前記幹細胞を２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存した後の生存状態での幹細胞の保存のための、任意に、
前記保存期間の終了時の前記幹細胞の生存率は、５％超、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上である、請求項１２に記載の凍結保存培地の使用。
【請求項１６】
（ａ）２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存する前に、前記幹細胞を前記凍結保存培地と組み合わせて、混合物を生成することと、前記混合物を凍結して、凍結幹細胞生成物を生成する（または前記幹細胞を別の生理学的ショックを受ける）ことと、によって、幹細胞を保存するための、
（ｂ）前記凍結幹細胞生成物を解凍するステップと、前記解凍された細胞を保存培地に移すステップと、幹細胞を２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、前記保存培地中に保存するステップと、をさらに含む方法によって、幹細胞を保存するための、または
（ｇ）前記幹細胞を前記凍結保存培地と組み合わせて、混合物を生成することと、前記幹細胞が生理学的ショックを受けることと、前記細胞を保存培地に移すことと、幹細胞を２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、前記保存培地中に保存することと、によって、幹細胞を保存するための、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
幹細胞を前記保存培中に保存することによって、任意に、
（ａ）前記幹細胞が凍結保存培地中で凍結され、解凍され、保存前に前記保存培地に移されており、好ましくは前記凍結保存培地は、請求項１２に記載の凍結保存培地であり、および／または
（ｂ）前記幹細胞が凍結保存培地と混合され、生理学的ショックにさらし、保存前に前記保存培地に移されており、好ましくは前記凍結保存培地が、請求項１２に記載の凍結保存培地である、幹細胞の保存のための、請求項１３または１４に記載の保存培地の使用。
【請求項１８】
凍結保存された幹細胞の解凍後の生存率を改善するための、組換え酵母由来血清アルブミンの使用であって、
前記改善は、同じ濃度で使用される血漿由来血清アルブミンと比較され、
前記改善は、２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存培地中に保存されたとき、前記解凍後の幹細胞において観察でき、
前記組換え酵母由来血清アルブミンは、それを凍結保存用培地に製剤化することと、凍結前に、幹細胞と前記凍結保存用培地、および請求項１２によって定義される前記凍結保存培地などを混合することと、によって使用される、ならびに／または
前記組換え酵母由来血清アルブミンは、それを保存培地に製剤化することと、解凍後に、幹細胞と前記保存培地を混合することと、によって使用され、任意に、前記保存培地は、請求項１３または１４によって定義される培地である、使用。
【請求項１９】
生理学的ショックを受ける幹細胞の生存率を改善するための組換え酵母由来血清アルブミンの使用であって、任意に、
前記改善は、同じ濃度で使用される血漿由来血清アルブミンの使用と比較され、
前記改善は、２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存培地中に保存されたとき、前記ショック後の幹細胞において観察でき、
前記組換え酵母由来血清アルブミンは、それを凍結保存培地に製剤化することと、前記生理学的ショック前に、幹細胞と前記凍結保存培地、例えば、請求項１２によって定義される凍結保存培地を混合することと、によって使用され、ならびに／または
前記組換え酵母由来血清アルブミンは、それを保存培地に製剤化することと、前記生物学的ショックを受けた後に、幹細胞と前記保存培地、例えば、請求項１３または１４によって定義される保存培地を混合することと、によって使用される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表への参照
本出願は、コンピュータ可読形式の配列表を含み、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、生理学的ショックの下流の効果から細胞を保護するための方法および使用、ならびにそれに有用な組換え酵母由来血清アルブミンを含む組成物に関する。具体的には、本発明は、具体的には、凍結および解凍後、ならびに解凍後の保存中の凍結保存幹細胞の生存率を延長するための、生存可能な形態の幹細胞の保存に関する。
【背景技術】
【０００３】
幹細胞は、長年にわたり臨床背景で使用されてきた。造血幹細胞は、血液疾患と非血液疾患の両方の治療に使用されているが、より最近では骨髄由来の間葉系幹細胞が実験室および初期の臨床試験の両方の対象となっている。これらの細胞は、多能性と拡大の可能性の両方を示す。ヒト胚性幹細胞は、多能性細胞であり、３つすべての胚葉から細胞に分化する能力を保持する安定な細胞株を形成することができる。これは、それらを再生医療と毒物学の両方において特別な意味を持たせる。誘発多能性幹（ｉＰＳ）細胞もまた、胚性幹細胞を取り巻くいくつかの交絡する倫理的問題なしに、同様の有用性の広さを提供し得る。
【０００４】
幹細胞の商業的および臨床的応用に必須の前提条件は、長期保存のための適切な凍結保存プロトコルである。
【０００５】
この日常的な手順は、一般に、細胞内氷形成の有害な影響を回避するために、抗凍結剤の存在下での徐冷を含む。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、一般的な抗凍結剤である。
【０００６】
現在の凍結保存プロトコルは臨床的に有効であるが、それらが最適であるかどうかに関しては依然として疑問が残る。ＤＭＳＯは組織および細胞に対して毒性があることが知られており、毒性は、時間、温度、および濃度に依存する。毒性は細胞の種類によって異なり、認められている方法は、実用的であると考えられるのと同じくらい短い期間、低温保護（＋４℃）で抗凍結剤を導入している。
【０００７】
細胞の解凍後、ＤＭＳＯを含まない培地に解凍された細胞を移すために、例えば、Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９２：１０１１９−１０１２２によって最初に開発されたものに基づいて、洗浄手順が一般に使用される。
【０００８】
しかしながら、凍結保存された幹細胞を解凍し、新鮮な（理想的にはＤＭＳＯを含まない）培地に移した後、幹細胞が生存し、その後の使用に適した非常に限られた期間（典型的には２４時間以下）がある。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、凍結後の幹細胞の長期保存能力を向上させ、生存性、同一性、および多能性を損なうことなく凍結中および凍結後の臨床グレードの幹細胞の安定性を向上させることである。
【発明の概要】
【００１０】
本出願者は、驚くべきことに、組換え酵母由来血清アルブミン調製物が、生理学的ショックの下流の影響から細胞を保護するのに（例えば、血漿由来血清アルブミンと比較して）特に有効であることを見出した。すなわち、Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄ．から入手可能なＡｌｂＩＸ（登録商標）、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ、およびＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム生成物などの組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、例えば、凍結保存で使用される凍結／解凍ステップのような生理学的ショック後に細胞（幹細胞など）が初期から後期アポトーシス状態へ移行するのを防ぐための血漿由来血清アルブミン調製物などの他の形態のアルブミン調製物と比較して特に有効である。
【００１１】
その結果、Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄ．から入手可能なＡｌｂＩＸ（登録商標）、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ、およびＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム生成物などの組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、凍結保存に使用され、使用前に保存される凍結／解凍ステップを受けた幹細胞の生存期間を実質的に延長するために、凍結保存培地および／または保存培地に特に有効であることが本出願者により実証されている。以前に凍結保存された幹細胞を解凍後に保存中に維持し、生存可能な状態に維持することができる期間の延長は、重要な改善およびさらなる柔軟性を提供する。
【００１２】
具体的には、凍結後の安定性を高めることによって、組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、保存および輸送の課題を解決し、幹細胞療法の使用における臨床医および患者に柔軟性を付加することができる。
【００１３】
したがって、本発明の第１の態様は、幹細胞の保存方法を提供し、本方法は、幹細胞を凍結保存培地と組み合わせて、混合物を生成するステップと、混合物を凍結して、凍結幹細胞生成物を生成するステップと、を含み、
任意に、本方法は、凍結幹細胞生成物を解凍するステップと、解凍された細胞を保存培地に移すステップと、幹細胞を保存培地中に保存するステップと、をさらに含み、
凍結保存培地および／または保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む。
【００１４】
本発明の第１の態様はまた、幹細胞の保存方法も提供し、本方法は、幹細胞を保存培地中に保存することを含み、
幹細胞は、凍結保存培地中で凍結され、解凍され、次いで保存前に保存培地に移されており、
凍結保存培地および／または保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む。
【００１５】
好ましくは、本発明の第１の態様の方法は、幹細胞を凍結保存培地中で凍結して、凍結幹細胞生成物を生成するステップと、凍結幹細胞生成物を解凍するステップと、解凍された細胞を保存培地に移すステップと、幹細胞を保存培地中に保存するステップと、を含み、凍結保存培地および／または保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む。
【００１６】
組換え酵母由来血清アルブミン調製物が、幹細胞と混合したときに、本発明の第１の態様によれば、凍結保存培地および／または保存培地中に、約０．０１％（ｗ／ｖ）超および１０％（ｗ／ｖ）未満、約９％（ｗ／ｖ）未満、約８％（ｗ／ｖ）未満、約７％（ｗ／ｖ）未満、または約６％（ｗ／ｖ）未満、例えば約０．１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）、好ましくは約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３（ｗ／ｖ）、または約４％（ｗ／ｖ）の濃度である組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質を提供するのに好適な量で存在することが好ましくあり得る。この文脈における「約」という用語は、記述された値の±５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％の意味を含むことができ、例えば、記述された値の１０％（ｗ／ｖ）±１０％は、９〜１１％（ｗ／ｖ）である。
【００１７】
組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、好ましくは凍結保存培地中に存在し得、保存培地中にも存在する。
【００１８】
任意に、本発明の第１の態様の好ましい実施形態において、幹細胞は、約２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃などの２〜８℃の温度で保存培地中に保存される。この文脈で使用される「約」という用語は、±０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１℃の意味を含むことができる。
【００１９】
例えば、幹細胞は、２４時間を超える期間（例えば、少なくとも、または約、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７）、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間（例えば、少なくとも、または、約４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、もしくは７２時間）、もしくはそれ以上（例えば、最大３、４、５、６、もしくは７日）保存培地中に保存され得、任意に、幹細胞は、２４時間を超える期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、２〜８℃の温度で保存され、保存期間の終了時の幹細胞の生存率は、５％超、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上、例えば、約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上である。期間の文脈で使用される「約」という用語は、記述した値の±５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％の意味を含むことができる。任意に、保存温度は、約２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃である。この文脈で使用される「約」という用語は、±０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１℃の意味を含むことができる。
【００２０】
好ましくは、本発明の第１の態様によれば、凍結保存培地および／または保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、以下の特性：
（ａ）０．５％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは０．４％、０．３％、０．２％、もしくは０．１５％未満が、コンカナバリンＡへ結合すること、および／または
（ｂ）０．６モルのヘキソース／タンパク質１モル未満、好ましくは０．１０、０．０７５、もしくは０．０５モルのヘキソース／タンパク質１モル未満の糖化レベル、のうちの１つ以上を示す。
【００２１】
本発明の第１の態様に従って使用される凍結保存培地および／または保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、
（ａ）少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、より好ましくは少なくとも約９９．５％の単量体および二量体、好ましくは本質的に１００％の単量体および二量体であり得（この文脈において使用される場合、「約」という用語は、±１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．３％、０．１％、またはそれ以下の意味を含むことができ）、
（ｂ）少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、もしくは９７％の単量体であり得（この文脈で使用される場合、「約」という用語は、±１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．３％、０．１％、またはそれ以下の意味を含むことができ）、および／または
（ｃ）約１．０％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）、もしくは０．０１％（ｗ／ｗ）以下、好ましくはそれ未満のアルブミンポリマー含有量を有し得る。この文脈に使用される場合、「約」という用語は、記述した値の±５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．３％、０．１％、またはそれ以下の意味を含むことができ、例えば、１．０％（ｗ／ｖ）±５０％は、０．５〜１．５％（ｗ／ｖ）の範囲である。この文脈に使用されるように、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質に適用される「ポリマー」という用語は、単量体および二量体形態とは異なる。
【００２２】
任意に、本発明の第１の態様による凍結保存培地および／または保存培地の形成に使用される組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、酵母由来血清アルブミンタンパク質、カチオン（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、好ましくはナトリウムなど）、および平衡アニオン（塩化物、リン酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、または酢酸塩、好ましくは塩化物またはリン酸塩など）、水、ならびに任意にオクタン酸塩およびポリソルベート８０を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【００２３】
任意に、本発明の第１の態様に従って凍結保存培地および／または保存培地の形成に使用される組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１８ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１２ｍＭ、１０ｍＭ、８ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．３ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００１ｍＭ未満のオクタノエートを含むか、オクタノエートを実質的に含まないか、またはオクタノエートを含まない。
【００２４】
さらに任意に、本発明の第１の態様に従って使用され、組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地および／または保存培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１８ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１２ｍＭ、１０ｍＭ、８ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．３ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００１ｍＭ未満のオクタノエートを含むか、オクタノエートを実質的に含まないか、またはオクタノエートを含まない。
【００２５】
任意に、本発明の第１の態様に従って凍結保存培地および／または保存培地の形成に使用される組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下の全脂肪酸含有量を有し得るか、実質的に脂肪酸を含まないか、または脂肪酸を含まない。
【００２６】
さらに任意に、本発明の第１の態様に従って使用され、組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地および／または保存培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下の全脂肪酸含有量を有するか、実質的に脂肪酸を含まないか、または脂肪酸を含まない。
【００２７】
任意に、本発明の第１の態様に従って凍結保存培地および／または保存培地の形成に使用される組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、２００ｍｇ．Ｌ−１、１５０ｍｇ．Ｌ−１、１００ｍｇ．Ｌ−１、９０ｍｇ．Ｌ−１、８０ｍｇ．Ｌ−１、７０ｍｇ．Ｌ−１、６０ｍｇ．Ｌ−１、５０ｍｇ．Ｌ−１、４０ｍｇ．Ｌ−１、３０ｍｇ．Ｌ−１、２０ｍｇ．Ｌ−１、１５ｍｇ．Ｌ−１、１０ｍｇ．Ｌ−１、５ｍｇ．Ｌ−１、４ｍｇ．Ｌ−１、３ｍｇ．Ｌ−１、２ｍｇ．Ｌ−１、１ｍｇ．Ｌ−１、０．５ｍｇ．Ｌ−１、０．１ｍｇ．Ｌ−１、０．０１ｍｇ．Ｌ−１、０．００１ｍｇ．Ｌ−１未満の濃度で、ポリソルベート（好ましくはポリソルベート８０）などの洗剤を含んでもよいか、洗剤を実質的に含まないか、または洗剤を含まない。
【００２８】
さらに任意に、本発明の第１の態様に従って使用され、組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地および／または保存培地は、２００ｍｇ．Ｌ−１、１５０ｍｇ．Ｌ−１、１００ｍｇ．Ｌ−１、９０ｍｇ．Ｌ−１、８０ｍｇ．Ｌ−１、７０ｍｇ．Ｌ−１、６０ｍｇ．Ｌ−１、５０ｍｇ．Ｌ−１、４０ｍｇ．Ｌ−１、３０ｍｇ．Ｌ−１、２０ｍｇ．Ｌ−１、１５ｍｇ．Ｌ−１、１０ｍｇ．Ｌ−１、５ｍｇ．Ｌ−１、４ｍｇ．Ｌ−１、３ｍｇ．Ｌ−１、２ｍｇ．Ｌ−１、１ｍｇ．Ｌ−１、０．５ｍｇ．Ｌ−１、０．１ｍｇ．Ｌ−１、０．０１ｍｇ．Ｌ−１、０．００１ｍｇ．Ｌ−１未満の濃度で、ポリソルベート（好ましくはポリソルベート８０）などの洗剤を含むか、ポリソルベート（好ましくはポリソルベート８０）などの洗剤を実質的に含まないか、または洗剤を含まない（好ましくはポリソルベート８０を含まない）。
【００２９】
任意に、本発明の第１の態様に従って凍結保存培地および／または保存培地の形成に使用される組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．００１ｍＭ未満の全遊離アミノ酸レベルおよび／もしくはＮ−アセチルトリプトファンレベルを含み得るか、具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを実質的に含まないか、または具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを含まない。
【００３０】
さらに任意に、本発明の第１の態様に従って使用され、組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地および／または保存培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．００１ｍＭ未満の全遊離アミノ酸レベルおよび／もしくはＮ−アセチルトリプトファンレベルを含むか、具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを実質的に含まないか、または具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを含まない。
【００３１】
１つの好ましい実施形態において、本発明の第１の態様に従って凍結保存培地および／または保存培地の形成に使用される組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、オクタノエート、具体的には、遊離アミノ酸および／またはＮ−アセチルトリプトファン、ならびに洗剤（ポリソルベート８０など）のすべてを実質的に含まなくても、完全に含まなくてもよい。
【００３２】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の第１の態様に従って使用され、組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地および／または保存培地は、オクタノエート、具体的には、遊離アミノ酸および／またはＮ−アセチルトリプトファン、ならびに洗剤（ポリソルベート８０など）のすべてを実質的に含まないか、または完全に含まない。
【００３３】
さらに好ましい実施形態において、本発明の第１の態様に従って凍結保存培地および／または保存培地の形成に使用される組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム、もしくはそれに類似の調製物、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ、もしくはそれに類似の調製物、またはＡｌｂＩＸ（登録商標）、もしくはそれに類似の調製物、から選択され得る。
【００３４】
典型的には、本発明の第１の態様に従って凍結保存培地および／または保存培地の形成に使用される組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、ヘム、プレカリクレイン活性化因子、発熱物質、Ｃ型肝炎、および／またはヒトウイルスから選択される１つ以上の、そのようなすべての成分を含まない。さらに、典型的には、本発明の第１の態様に従って凍結保存培地および／または保存培地の形成に使用される組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、２００μｇ．Ｌ−１未満、例えば、１８０μｇ．Ｌ−１、１６０μｇ．Ｌ−１、１４０μｇ．Ｌ−１、１２０μｇ．Ｌ−１、１００μｇ．Ｌ−１、９０μｇ．Ｌ−１，８０μｇ．Ｌ−１、７０μｇ．Ｌ−１、６０μｇ．Ｌ−１、５０μｇ．Ｌ−１、または４０μｇ．Ｌ−１未満、より典型的には、約１０μｇ．Ｌ−１〜約３０μｇ．Ｌ−１の範囲内のアルミニウム濃度を有する。この文脈で使用されるように、「約」という用語は、記述された値の±１０μｇ．Ｌ−１、５μｇ．Ｌ−１、４μｇ．Ｌ−１、３μｇ．Ｌ−１、２μｇ．Ｌ−１、１μｇ．Ｌ−１、０．５μｇ．Ｌ−１、０．１μｇ．Ｌ−１、またはそれ以下の意味を含み得る。
【００３５】
さらに典型的には、本発明の第１の態様に従って使用され、組換え酵母由来の血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地および／または保存培地は、ヘム、プレカリクレイン活性化因子、発熱物質、Ｃ型肝炎、および／またはヒトウイルスから選択される１つ以上の、そのようなすべての成分を含まない。凍結保存培地および／または保存培地は、さらにまたは代替的に、２００μｇ．Ｌ−１未満、例えば、１８０μｇ．Ｌ−１、１６０μｇ．Ｌ−１、１４０μｇ．Ｌ−１、１２０μｇ．Ｌ−１、１００μｇ．Ｌ−１、９０μｇ．Ｌ−１，８０μｇ．Ｌ−１、７０μｇ．Ｌ−１、６０μｇ．Ｌ−１、５０μｇ．Ｌ−１、または４０μｇ．Ｌ−１未満、より典型的には、約１０μｇ．Ｌ−１〜約３０μｇ．Ｌ−１の範囲内のアルミニウム濃度を有し得る。この文脈で使用されるように、「約」という用語は、記述された値の±１０μｇ．Ｌ−１、５μｇ．Ｌ−１、４μｇ．Ｌ−１、３μｇ．Ｌ−１、２μｇ．Ｌ−１、１μｇ．Ｌ−１、０．５μｇ．Ｌ−１、０．１μｇ．Ｌ−１、またはそれ以下の意味を含み得る。
【００３６】
さらに典型的には、本発明の第１の態様（または本発明の任意の他の態様）に従って使用され、組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地および／または保存培地は、トレハロース、ヒドロキシエチルデンプン、もしくはそれらの組み合わせを含む群から選択されるエネルギー基質を含まないか、または本質的に含まず、ならびに／またはＬ−グルタミン、ポリ−Ｌ−リジン、およびエクトインの組み合わせであり得る老化防止剤を含まないか、または実質的に含まない。これに関連して、エネルギー基質を「本質的に含まない」とは、約０．２５％ｖ／ｖ未満、例えば、０．１％ｖ／ｖ未満、０．０１％ｖ／ｖ未満、０．００１％ｖ／ｖ未満、または０％ｖ／ｖの意味を含む。老化防止剤を「本質的に含まない」とは、約０．０００５％ｖ／ｖ未満、例えば、５×１０−５％ｖ／ｖ未満、５×１０−６％ｖ／ｖ未満、５×１０−７％ｖ／ｖ未満、または０％ｖ／ｖの意味を含む。
【００３７】
典型的には、本発明の第１の態様に従って凍結保存培地および／または保存培地の形成に使用される組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、無傷または実質的に無傷のＮ末端配列を有する。
【００３８】
典型的には、本発明の第１の態様に従って凍結保存培地および／または保存培地の形成に使用される組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、約６２％超、例えば、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％である遊離チオール基含有量を有するアルブミンタンパク質を含む。この文脈で使用されるように、「約」という用語は、記述した値の±５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の意味を含み得、例えば、８０％±１０％は、７２〜８８％の範囲を指す。
【００３９】
典型的には、本発明の第１の態様に従って凍結保存培地および／または保存培地の形成に使用される組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって試験したとき、１４分未満および１９分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外し、より好ましくは、１４分または１５分未満および１８分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外する、ＳＥＣプロファイルを示すアルブミンタンパク質を含む。
【００４０】
典型的には、本発明の第１の態様に従って凍結保存培地および／または保存培地の形成に使用される組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により試験したとき、天然単量体形態のアルブミンに対応する単一の主要ピークを示すアルブミンタンパク質を含む。
【００４１】
典型的には、本発明の第１の態様に従って凍結保存培地および／または保存培地の形成に使用される組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、質量分析法によって試験したとき、１タンパク質当たり約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６未満、例えば、約１〜約１１、１〜約８、または１〜約５、１〜約４、１〜約３、１〜約２、約１、または１未満のヘキソース修飾リジンおよび／またはアルギニン残基を示す生成物であるアルブミンタンパク質を含む。この文脈で使用されるように、「約」という用語は、１タンパク質当たり±５、４、３、２、または１のヘキソース修飾リジンおよび／またはアルギニン残基の意味を含み得る。
【００４２】
典型的には、本発明の第１の態様に従って凍結保存培地および／または保存培地の形成に使用される組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、植物特異的糖で糖化されないアルブミンタンパク質、例えば、α−１，３−フコースおよび／またはβ−１，２−キシロースを含む。
【００４３】
誤解を避けるために、本発明の第１の態様（および他のすべての態様）に従って凍結保存培地および／または保存培地の形成に使用される組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびにそれによって生成される、凍結保存培地および／または保存培地などの培地は、植物性タンパク質加水分解物を本質的に含まないか、または含まないであろう。
【００４４】
「植物タンパク質加水分解物」という用語は、アミノ酸または／およびペプチドを含有する物質が植物タンパク質の加水分解によって調製される、アミノ酸または／およびペプチドを含有する物質を指す。植物タンパク質加水分解物は、特定の酵素を用いた植物タンパク質の加水分解などによって調製され得るが、これらに限定されない。その例は、タバコ、米、または豆タンパク質加水分解物であり得る。植物タンパク質加水分解物は、酵素などを用いた植物タンパク質の直接加水分解の生成物、または市販の植物タンパク質加水分解物であり得る。さらなる例は、加水分解豆タンパク質、およびＳｈｅｆｆｉｅｌｄによって製造されるＵＬＴＲＡＰＥＰ  ＳＯＹまたはＵＬＴＲＡＰＥＰ  ＹＥである。
【００４５】
この文脈における「本質的に含まない」という用語は、本発明の第１の態様（およびすべての他の態様）に従って凍結保存培地および／または保存培地の形成に使用される組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに培地、例えば、それによって製造された凍結保存培地および／または保存培地は、全組成物の１００重量部に基づいて、１重量部未満〜５０重量部、好ましくは１重量部未満〜１００重量部、より好ましくは１重量部未満〜１０００重量部、および最も典型的には、ゼロ植物性タンパク質加水分解物のレベルで植物性タンパク質加水分解物またはその成分を含有することを意味する。
【００４６】
植物性タンパク質加水分解物は、細胞の基本的なエネルギー源として使用することができる必須アミノ酸または／および非必須アミノ酸を含み、したがって細胞に栄養素を提供し、凍結および解凍時にそれらの活性を増加させる。理論に拘束されることなく、本出願者は、本発明に使用するための凍結保存培地および保存培地中にそのような成分の不在が、保存中に静止状態の形態で細胞を保持し、後期アポトーシスに進行する細胞の能力を低下させるので、解凍後に幹細胞の生存率を維持する本発明の能力に寄与すると考える。さらに、本発明で使用される組換え酵母由来血清アルブミン生成物中の高純度のアルブミンタンパク質（他の供給源からのアルブミン調製物中に使用されるより低い純度と比較して）が、より純粋でない調製物中に存在し、これが保存中の細胞における変化を最小限に抑えることにさらに寄与し得る要因によって生じる「ノイズ」をシグナリングすることから幹細胞を遮蔽するための寄与因子であると考えられる。
【００４７】
任意に、本発明の第１の態様に従って使用するための凍結保存培地は、組換え血清アルブミン調製物および別個の凍結保存剤を含む。さらに任意に、凍結保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物の水溶液、凍結保存剤、およびイオン性緩衝液を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。好ましくは、イオン性緩衝液は、電解質の水溶液を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、例えば、電解質は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、塩化物イオン、酢酸イオン、リン酸イオン、および／またはグルコン酸イオンからなる群から選択され、より好ましくは、イオン性緩衝液は、ヒトの生理学的血漿の電解質濃度、浸透圧、および／またはｐＨを模倣する電解質濃度、浸透圧、および／またはｐＨを有する。例えば、イオン性緩衝液は、１００ｍＬ当たり約５２６ｍｇの塩化ナトリウム、ＵＳＰ（ＮａＣｌ）、約５０２ｍｇのグルコン酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ１１ＮａＯ７）、約３６８ｍｇの酢酸ナトリウム三水和物、ＵＳＰ（Ｃ２Ｈ３ＮａＯ２・３Ｈ２Ｏ）、約３７ｍｇの塩化カリウム、ＵＳＰ（ＫＣｌ）、および約３０ｍｇの塩化マグネシウム、ＵＳＰ（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、例えばＰｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）と実質的に同等である等張緩衝剤を含有する、無菌の非発熱性等張溶液であり得る。最も好ましくは、イオン性緩衝液は、幹細胞に対して実質的に等張性であり、および／またはイオン性緩衝液は、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）である。
【００４８】
誤解を避けるために、本発明の第１の態様に従って使用するための凍結保存培地が幹細胞培養増殖培地ではないことに留意すべきである。幹細胞の増殖を支持しないことが好ましい。例えば、標準的な増殖条件下で観察された細胞増殖は、典型的には、ＤＭＥＭなどの標準的な幹細胞培養増殖培地中で増殖させたとき、同じ条件下で同じ細胞に対して観察されたものの５０％未満、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、または０％であり得る。
【００４９】
より好ましくは、本発明の第１の態様に従って使用するための凍結保存培地は、ビタミン、ホルモン成長因子、鉄源、遊離アミノ酸、および／またはグルコースなどの典型的な幹細胞培養培地の成分のいずれか１つ以上（例えばすべて）のレベルを実質的に全く含まないか、または全く含まない。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、「ビタミン」は、塩化コリン、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、ｄ−パントテン酸（ヘミカルシウム）、ピリドキサール、ピリドキシン、リボフラビン、および／またはチアミンのうちの１つ以上を含み得る。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、「ホルモン」は、トリヨードチロニン、パラホルモン、チロトロフィン放出ホルモン、ソマトメジン、エストロゲン、プロラクチン、成長ホルモン、テストステロン、および／またはヒドロコルチゾンのうちの１つ以上を含み得る。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、「鉄源」は、トランスフェリンを含み得る。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、「成長因子」は、アドレノメジュリン（ＡＭ）；アンジオポエチン（Ａｎｇ）；オートクリン運動性因子；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；毛様体神経栄養因子ファミリーの１つ以上のメンバー（毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、および／もしくはインターロイキン−６（ＩＬ−６）を含むが、これらに限定されない）；１つ以上のコロニー刺激因子（マクロファージコロニー刺激因子（ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、および／もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むが、これらに限定されない）；上皮成長因子（ＥＧＦ）；１つ以上のエフリン（エフリンＡ１、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エフリンＡ４、エフリンＡ５、エフリンＢ１、エフリンＢ２、エフリンＢ３を含むが、これらに限定されない）；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）；ウシ胎児ソマトトロピン（ＦＢＳ）；リガンドの１つ以上のＧＤＮＦファミリー（グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、ペルセフィン、および／もしくはアルテミンを含むが、これらに限定されない）；成長分化因子−９（ＧＤＦ９）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）；肝細胞癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）；インスリン；１つ以上のインスリン様増殖因子（インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）および／もしくはインスリン様増殖因子−２（ＩＧＦ−２）を含むが、これらに限定されない）；１つ以上のインターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、および／もしくはＩＬ−７を含むが、これらに限定されない）；ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）；移動刺激因子（ＭＳＦ）；マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）；ミオスタチン（ＧＤＦ−８）；１つ以上のニューレギュリン（ニューレギュリン１（ＮＲＧ１）、ニューレギュリン２（ＮＲＧ２）、ニューレギュリン３（ＮＲＧ３）、および／もしくはニューレギュリン４（ＮＲＧ４）を含むが、これらに限定されない）；１つ以上のニューロトロフィン（脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）；ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、および／もしくはニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）を含むが、これらに限定されない）；胎盤成長因子（ＰＧＦ）；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；レナラーゼ（ＲＮＬＳ）；Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；１つ以上のトランスフォーミング成長因子（トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）および／もしくはトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）を含むが、これらに限定されない）；腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）；血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）；ならびに／またはＷｎｔシグナル伝達経路、のうちの１以上を含み得る。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、「遊離アミノ酸」は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、グリシンＬ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、および／またはＬ−バリンのうちの１つ以上を含み得る。
【００５５】
凍結保存培地に使用される凍結保存剤は、組換え酵母由来血清アルブミンとは異なり、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール（ＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、およびトレハロースからなる群から選択され得る。ＤＭＳＯが特に好ましくあり得る。凍結防止剤は、幹細胞と混合したときに、凍結保存培地中に凍結保存効果をもたらすのに好適な濃度で存在し得る。ＤＭＳＯの場合、これは、約１０％（ｗ／ｖ）±５％、４％、３％、２％、または１％であり得る。当業者は、日常的な試験を用いて適切な量の凍結保存剤を容易に決定することができる。
【００５６】
本発明の第１の態様による方法に従って、保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含み得、任意に、保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物の水性溶液およびイオン性緩衝液を含むか、本質的にそれからなり得るか、またはそれからなり得、好ましくはイオン性緩衝液は、電解質の水溶液を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、例えば、電解質は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、塩化物イオン、酢酸イオン、リン酸イオン、および／またはグルコン酸イオンからなる群から選択されるからなる群から選択され、より好ましくは、イオン性緩衝液は、ヒトの生理学的血漿の電解質濃度、浸透圧、および／またはｐＨを模倣する電解質濃度、浸透圧、および／またはｐＨを有する。例えば、イオン性緩衝液は、１００ｍＬ当たり約５２６ｍｇの塩化ナトリウム、ＵＳＰ（ＮａＣｌ）、約５０２ｍｇのグルコン酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ１１ＮａＯ７）、約３６８ｍｇの酢酸ナトリウム三水和物、ＵＳＰ（Ｃ２Ｈ３ＮａＯ２・３Ｈ２Ｏ）、約３７ｍｇの塩化カリウム、ＵＳＰ（ＫＣｌ）、および約３０ｍｇの塩化マグネシウム、ＵＳＰ（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、例えばＰｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）と実質的に同等である等張緩衝剤を含有する、無菌の非発熱性等張溶液であり得る。最も好ましくは、イオン性緩衝液は、幹細胞に対して実質的に等張性であり、および／またはイオン性緩衝液は、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）である。
【００５７】
誤解を避けるために、本発明の第１の態様に従って使用するための保存培地は幹細胞培養増殖培地ではないことに留意されたい。幹細胞の増殖を支持しないことが好ましい。例えば、標準的な増殖条件下で観察された細胞増殖は、典型的には、ＤＭＥＭなどの標準的な幹細胞培養増殖培地中で増殖させたとき、同じ条件下で同じ細胞に対して観察されたものの５０％未満、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、または０％であり得る。
【００５８】
より好ましくは、本発明の第１の態様に従って使用するための保存培地は、ビタミン、ホルモン、成長因子、鉄源、遊離アミノ酸、および／またはグルコースなどの典型的な幹細胞培養培地の成分の任意の１つ以上（例えばすべて）のレベルを実質的に全く、または全く含まない。本明細書で使用されるとき、「ビタミン」、「ホルモン」、「鉄源」、「成長因子」、「遊離アミノ酸」という用語は、上記でさらに定義されたとおりであり得る。
【００５９】
本発明の第１の態様に従って使用される凍結保存培地および／または保存培地は、個々にまたは両方とも、血清由来アルブミン調製物のうちの１つ以上の成分、例えば、ヘム、プレカリクレイン活性化因子、発熱物質、Ｃ型肝炎ヒトウイルス、および／またはＮ−アセチルトリプトファンからなる一覧から選択される、１つ以上の成分（例えばすべて）を含まず、好ましくは、オクタノエートおよび／または洗剤（ポリソルベート８０など）を実質的に含まないか、または完全に含まないことが特に好ましい。
【００６０】
本発明の第１の態様の方法は、任意に２〜８℃の温度で（例えば、約２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃で、「約」という用語は、±０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１℃の意味を含み得る）、保存することを含み得る。ここで、用語「約」は、ことができ、およびさらに任意に、２４時間を超える期間（例えば、少なくとも、または約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７）、最大約４８時間など、例えば最大約７２時間（例えば、少なくとも、または約４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、もしくは７２時間）もしくはそれ以上（例えば、最大３、４、５、６、もしくは７日）、および任意に、幹細胞を保存培地中に保存するステップ後に直接的または間接的に、幹細胞を、保存培地中に保存することを含み得、本方法は、
−幹細胞を培養するステップと、
−幹細胞の培養を拡大するステップと、
−幹細胞を分化させるステップと、
−幹細胞、またはそれに由来する培養および／もしくは分化された細胞を、例えば組織または医療用インプラントに固定化するステップと、
−幹細胞、またはそれらに由来する培養および／もしくは分化された細胞もしくは他の生成物を、薬学的に許容可能な組成物または獣医学的に許容可能な組成物中に製剤化するステップと、ならびに／あるいは
−幹細胞、またはそれらに由来する培養および／もしくは分化された細胞もしくは他の生成物を患者に投与するステップと、から選択される１つ以上のステップをさらに含む。
【００６１】
任意に、本発明の第１の態様に従う方法は、幹細胞を保存培地中に保存することを含み、保存後、幹細胞は、例えば、骨細胞、心筋細胞、膵臓ベータ細胞、ニューロン、線維芽細胞、心筋細胞、骨芽細胞、および／または軟骨細胞から選択される細胞型に分化する。
【００６２】
本発明の第２の態様は、幹細胞の凍結保存のための凍結保存培地を提供し、凍結保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物および凍結保存剤を含む。凍結保存剤は、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール（ＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、およびトレハロースからなる群から選択され得る。好ましくは、組換え血清アルブミン調製物の水溶液、凍結保存剤、およびイオン性緩衝液を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる凍結保存培地。好ましくは、イオン性緩衝液は、電解質の水溶液を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、例えば、電解質は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、塩化物イオン、酢酸イオン、リン酸イオン、および／またはグルコン酸イオンからなる群から選択され、より好ましくは、イオン性緩衝液は、ヒトの生理学的血漿の電解質濃度、浸透圧、および／またはｐＨを模倣する電解質濃度、浸透圧、および／またはｐＨを有する。例えば、イオン性緩衝液は、１００ｍＬ当たり約５２６ｍｇの塩化ナトリウム、ＵＳＰ（ＮａＣｌ）、約５０２ｍｇのグルコン酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ１１ＮａＯ７）、約３６８ｍｇの酢酸ナトリウム三水和物、ＵＳＰ（Ｃ２Ｈ３ＮａＯ２・３Ｈ２Ｏ）、約３７ｍｇの塩化カリウム、ＵＳＰ（ＫＣｌ）、および約３０ｍｇの塩化マグネシウム、ＵＳＰ（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、例えばＰｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）と実質的に同等である等張緩衝剤を含有する、無菌の非発熱性等張溶液であり得る。最も好ましくは、イオン性緩衝液は、幹細胞に対して実質的に等張性であり、および／またはイオン性緩衝液は、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）である。
【００６３】
誤解を避けるために、本発明の第２の態様の凍結保存培地は、幹細胞培養増殖培地ではないことに留意すべきである。幹細胞の増殖を支持しないことが好ましい。例えば、標準的な増殖条件下で凍結保存培地中で観察された細胞増殖は、典型的には、ＤＭＥＭなどの標準的な幹細胞培養増殖培地中で増殖させたとき、同じ条件下で同じ細胞に対して観察されたものの５０％未満、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、または０％であり得る。
【００６４】
より好ましくは、本発明の第２の態様の凍結保存培地は、ビタミン、ホルモン、増殖因子、鉄源、遊離アミノ酸、および／またはグルコースなどの典型的な幹細胞培養培地の成分のいずれか１つ以上（例えばすべて）のレベルを実質的に含まないか、または全く含まない。本明細書で使用されるとき、「ビタミン」、「ホルモン」、「鉄源」、「成長因子」、「遊離アミノ酸」という用語は、上記でさらに定義されたとおりであり得る。
【００６５】
本発明の第２の態様の凍結保存培地は、幹細胞をさらに含んでもよく、任意に、幹細胞は、多能性幹細胞（胚性幹細胞、胚性生殖細胞、誘発多能性幹細胞など）、多能性幹細胞（例えば、任意に、脂肪、骨髄、臍帯血、もしくは臍帯に由来し得る間葉系幹細胞のような成体幹細胞；任意に、骨髄または末梢血に由来し得る造血幹細胞；神経幹細胞；または生殖幹細胞）、または単能性幹細胞（肝細胞のための単分化能幹細胞など）、からなる群から選択されてもよい。
【００６６】
任意に、幹細胞を含み得る本発明の第２の態様の凍結保存培地は、凍結形態、例えば、０℃未満の形態、より好ましくは約−８０℃〜約１９６℃の間の形態である。この文脈で使用されるように、「約」という用語は、±２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１℃を含み得る。この実施形態に従って、凍結組成物中に存在する任意の幹細胞は、好ましくは凍結睡眠の状態にある。凍結形態の幹細胞を含む凍結保存培地は、凍結形態で、１、２、３、４、５、５、６、または７日間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２カ月、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年、またはそれ以上維持し得る。
【００６７】
あるいは、本発明の第２の態様の凍結保存培地は、凍結形態ではないが、凍結され、その後解凍されている幹細胞の集団を含み得る。凍結され、解凍されている幹細胞集団は、凍結／解凍プロセスを経ていない幹細胞集団と区別され得る。凍結は、細胞にストレスを引き起こし、典型的にはプログラム細胞死（アポトーシス）を開始させるであろう。本実施例のデータは、アポトーシスの段階が、本明細書で論じられるように、アネキシンＶ結合、ならびにＰＩおよび／または７ＡＡＤの包含などの特定のマーカーによってどのように追跡され得るかを示す。凍結され、解凍されている幹細胞集団は、例えば、細胞集団内の初期および後期アポトーシスのレベルを測定することによって、凍結／解凍プロセスを経ていない幹細胞集団と区別され得る。すべての細胞集団は、アポトーシス段階で細胞の割合を有するであろうが、凍結および解凍後、特に本明細書に記載の保存溶液中に２〜８℃で２４時間を超える期間保存したとき、そのレベルは上昇する。任意に、保存温度は、約２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃である。この文脈で使用される「約」という用語は、±０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１℃の意味を含むことができる。
【００６８】
本発明の第２の態様の凍結保存培地は、好ましくは、本発明の第１の態様に関して使用される凍結保存培地について上述した特徴のうちの１つ以上（例えばすべて）を有するであろう。
【００６９】
好ましくは、組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、幹細胞と混合したときに、本発明の第２の態様の凍結保存培地中に、約０．０１％（ｗ／ｖ）超および１０％（ｗ／ｖ）未満、約９％（ｗ／ｖ）未満、約８％（ｗ／ｖ）未満、約７％（ｗ／ｖ）未満、または約６％（ｗ／ｖ）未満、例えば、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）の濃度で、好ましくは約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３（ｗ／ｖ）、または約４％（ｗ／ｖ）である組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質の濃度を提供するのに好適な量で存在する。この文脈における「約」という用語は、記述された値の±５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％の意味を含むことができ、例えば、記述された値の０．１％（ｗ／ｖ）±１０％は、０．９〜０．１１％（ｗ／ｖ）である。
【００７０】
好ましくは、本発明の第２の態様の凍結保存培地は、以下の特性：
（ａ）０．５％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは０．４％、０．３％、０．２％、もしくは０．１５％未満が、コンカナバリンＡへ結合すること、および／または
（ｂ）０．６モルのヘキソース／タンパク質１モル未満、好ましくは０．１０、０．０７５、もしくは０．０５モルのヘキソース／タンパク質１モル未満の糖化レベル、のうちの１つ以上を示す組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質を含む。
【００７１】
好ましくは、本発明の第２の態様の凍結保存培地は、
（ａ）少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、より好ましくは少なくとも約９９．５％の単量体および二量体、好ましくは本質的に１００％の単量体および二量体であり、
（ｂ）少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、または９７％の単量体であり、および／または
（ｃ）約１．０％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）、または０．０１％（ｗ／ｗ）以下、好ましくはそれ未満のアルブミンポリマー含有量を有する、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質を含む。この文脈に使用されるように、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質に適用される「ポリマー」という用語は、単量体および二量体形態とは異なる。
【００７２】
好ましくは、本発明の第２の態様によれば、
（ａ）凍結保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、酵母由来血清アルブミンタンパク質、カチオン（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、好ましくはナトリウムなど）、および平衡アニオン（塩化物、リン酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、または酢酸塩、好ましくは塩化物またはリン酸塩）、水、ならびに任意にオクタノエートおよびポリソルベート８０を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、
（ｂ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１８ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１２ｍＭ、１０ｍＭ、８ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．３ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００１ｍＭ未満のオクタノエートを含むか、オクタノエートを実質的に含まないか、またはオクタノエートを含まず、
（ｃ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下の全脂肪酸含有量を有するか、実質的に脂肪酸を含まないか、または脂肪酸を含まず、
（ｄ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地は、２００ｍｇ．Ｌ−１、１５０ｍｇ．Ｌ−１、１００ｍｇ．Ｌ−１、９０ｍｇ．Ｌ−１、８０ｍｇ．Ｌ−１、７０ｍｇ．Ｌ−１、６０ｍｇ．Ｌ−１、５０ｍｇ．Ｌ−１、４０ｍｇ．Ｌ−１、３０ｍｇ．Ｌ−１、２０ｍｇ．Ｌ−１、１５ｍｇ．Ｌ−１、１０ｍｇ．Ｌ−１、５ｍｇ．Ｌ−１、４ｍｇ．Ｌ−１、３ｍｇ．Ｌ−１、２ｍｇ．Ｌ−１、１ｍｇ．Ｌ−１、０．５ｍｇ．Ｌ−１、０．１ｍｇ．Ｌ−１、０．０１ｍｇ．Ｌ−１、０．００１ｍｇ．Ｌ−１未満の濃度で、ポリソルベート（好ましくはポリソルベート８０）などの洗剤を含むか、ポリソルベート（好ましくはポリソルベート８０）などの洗剤を実質的に含まないか、または洗剤を含まず（好ましくはポリソルベート８０を含まず）、
（ｅ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．００１ｍＭ未満の全遊離アミノ酸レベルおよび／もしくはＮ−アセチルトリプトファンレベルを含み、具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを実質的に含まないか、または具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを含まず、
（ｆ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地は、オクタノエート、具体的には、遊離アミノ酸、および／またはＮ−アセチルトリプトファン、ならびに洗剤（ポリソルベート８０など）のすべてを実質的に含まないか、または全く含まず、
（ｇ）凍結保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム、もしくはそれに類似の調製物、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ、もしくはそれに類似の調製物、またはＡｌｂＩＸ（登録商標）、もしくはそれに類似の調製物、から選択される調製物であり、
（ｈ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地は、ヘム、プレカリクレイン活性化因子、発熱物質、Ｃ型肝炎、および／またはヒトウイルス）から選択される１つ以上、例えばすべての成分を含まず、ならびに／または、２００μｇ．Ｌ−１未満、例えば、１８０μｇ．Ｌ−１、１６０μｇ．Ｌ−１、１４０μｇ．Ｌ−１、１２０μｇ．Ｌ−１、１００μｇ．Ｌ−１、９０μｇ．Ｌ−１、８０μｇ．Ｌ−１、７０μｇ．Ｌ−１、６０μｇ．Ｌ−１、５０μｇ．Ｌ−１、または４０μｇ．Ｌ−１未満、より典型的には、約１０μｇ．Ｌ−１〜約３０μｇ．Ｌ−１の範囲内のアルミニウム濃度を有し、
（ｉ）凍結保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、無傷または実質的に無傷のＮ末端配列を有し、
（ｊ）凍結保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、６２％超、例えば、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、約９６％、約９７％である遊離チオール基含有量を有するアルブミンタンパク質を含み、
（ｋ）凍結保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって試験したとき、１４分未満および１９分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外し、より好ましくは、１４分または１５分未満および１８分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外する、ＳＥＣプロファイルを示すアルブミンタンパク質を含み、
（ｌ）凍結保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって試験したとき、天然単量体形態のアルブミンに対応する単一の主要ピークを示すアルブミンタンパク質を含み、
（ｍ）凍結保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、質量分析法によって試験したとき、１タンパク質当たり１３、１２、１１、１０、９、８、７、６未満、例えば、約１〜１１、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、１、または１未満のヘキソース修飾リジンおよび／もしくはアルギニン残基を示す生成物であるアルブミンタンパク質を含み、かつ／あるいは
（ｎ）凍結保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、α−１，３−フコースおよび／またはβ−１，２−キシロースなどの植物特異的糖で糖化されていないアルブミンタンパク質を含む。
【００７３】
本発明の第３の態様は、凍結保存培地中で凍結され、解凍され、その後保存培地に移された幹細胞を保存するための保存培地を提供し、保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む。好ましくは、保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物の水溶液およびイオン性緩衝液を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。イオン性緩衝液は、電解質の水溶液を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、例えば、電解質は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、塩化物イオン、酢酸イオン、リン酸イオン、および／またはグルコン酸イオンからなる群から選択され、好ましくは、イオン性緩衝液は、ヒトの生理学的血漿の電解質濃度、浸透圧、および／またはｐＨを模倣する電解質濃度、浸透圧、および／またはｐＨを有する。例えば、イオン性緩衝液は、１００ｍＬ当たり約５２６ｍｇの塩化ナトリウム、ＵＳＰ（ＮａＣｌ）、約５０２ｍｇのグルコン酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ１１ＮａＯ７）、約３６８ｍｇの酢酸ナトリウム三水和物、ＵＳＰ（Ｃ２Ｈ３ＮａＯ２・３Ｈ２Ｏ）、約３７ｍｇの塩化カリウム、ＵＳＰ（ＫＣｌ）、および約３０ｍｇの塩化マグネシウム、ＵＳＰ（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、例えばＰｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）と実質的に同等である等張緩衝剤を含有する、無菌の非発熱性等張溶液であり得る。最も好ましくは、イオン性緩衝液は、幹細胞に対して実質的に等張性であり、および／またはイオン性緩衝液は、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）である。
【００７４】
誤解を避けるために、本発明の第３の態様の保存培地は、幹細胞培養増殖培地ではないことに留意されたい。幹細胞の増殖を支持しないことが好ましい。例えば、標準的な増殖条件下で凍結保存培地中で観察された細胞増殖は、典型的には、ＤＭＥＭなどの標準的な幹細胞培養増殖培地中で増殖させたとき、同じ条件下で同じ細胞に対して観察されたものの５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、または０％未満であり得る。
【００７５】
より好ましくは、本発明の第３の態様の保存培地は、ビタミン、ホルモン、増殖因子、鉄源、遊離アミノ酸、および／またはグルコースなどの典型的な幹細胞培養培地の成分のいずれか１つ以上（例えばすべて）のレベルを実質的に含まないか、または全く含まない。本明細書で使用されるとき、「ビタミン」、「ホルモン」、「鉄源」、「成長因子」、「遊離アミノ酸」という用語は、上記でさらに定義されたとおりであり得る。
【００７６】
本発明の第３の態様の保存培地は、好ましくは、本発明の第１の態様に関して使用される保存培地について上述した特徴のうちの１つ以上（例えば、すべて）を有するであろう。
【００７７】
好ましくは、組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、幹細胞と混合したときに、本発明の第３の態様の保存培地中に、約０．０１％（ｗ／ｖ）超および１０％（ｗ／ｖ）未満、約９％（ｗ／ｖ）未満、約８％（ｗ／ｖ）未満、約７％（ｗ／ｖ）未満、または約６％（ｗ／ｖ）未満、例えば、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）の濃度で、好ましくは約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３（ｗ／ｖ）、または約４％（ｗ／ｖ）である組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質を提供するのに好適な量で存在する。
【００７８】
典型的には、本発明の第３の態様の保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、以下の特性：
（ａ）０．５％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは０．４％、０．３％、０．２％、もしくは０．１５％未満が、コンカナバリンＡへ結合すること、および／または
（ｂ）０．６モルのヘキソース／タンパク質１モル未満、好ましくは０．１０、０．０７５、もしくは０．０５モルのヘキソース／タンパク質１モル未満の糖化レベル、のうちの１つ以上を示す。
【００７９】
典型的には、本発明の第３の態様の保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、
（ａ）少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、より好ましくは少なくとも約９９．５％の単量体および二量体、好ましくは本質的に１００％の単量体および二量体であり、
（ｂ）少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、または９７％の単量体であり、ならびに／または
（ｃ）は、約１．０％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）または０．０１％（ｗ／ｗ）以下、好ましくはそれ未満のアルブミンポリマー含有量を有する。この文脈に使用されるように、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質に適用される「ポリマー」という用語は、単量体および二量体形態とは異なる。
【００８０】
好ましくは、本発明の第３の態様の保存培地において、
（ａ）保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、酵母由来血清アルブミンタンパク質、カチオン（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、好ましくはナトリウムなど）、および平衡アニオン（塩化物、リン酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、または酢酸塩、好ましくは塩化物またはリン酸塩）、水、ならびに任意にオクタノエートおよびポリソルベート８０を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、
（ｂ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む保存培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１８ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１２ｍＭ、１０ｍＭ、８ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．３ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００１ｍＭ未満のオクタノエートを含むか、オクタノエートを実質的に含まないか、またはオクタノエートを含まず、
（ｃ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む保存培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下の全脂肪酸含有量を有するか、脂肪酸を実質的に含まないか、または脂肪酸を含まず、
（ｄ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む保存培地は、２００ｍｇ．Ｌ−１、１５０ｍｇ．Ｌ−１、１００ｍｇ．Ｌ−１、９０ｍｇ．Ｌ−１、８０ｍｇ．Ｌ−１、７０ｍｇ．Ｌ−１、６０ｍｇ．Ｌ−１、５０ｍｇ．Ｌ−１、４０ｍｇ．Ｌ−１、３０ｍｇ．Ｌ−１、２０ｍｇ．Ｌ−１、１５ｍｇ．Ｌ−１、１０ｍｇ．Ｌ−１、５ｍｇ．Ｌ−１、４ｍｇ．Ｌ−１、３ｍｇ．Ｌ−１、２ｍｇ．Ｌ−１、１ｍｇ．Ｌ−１、０．５ｍｇ．Ｌ−１、０．１ｍｇ．Ｌ−１、０．０１ｍｇ．Ｌ−１、０．００１ｍｇ．Ｌ−１未満の濃度で、ポリソルベート（好ましくはポリソルベート８０）などの洗剤を含むか、ポリソルベート（好ましくはポリソルベート８０）などの洗剤を実質的に含まないか、または洗剤を含まず（好ましくはポリソルベート８０を含まず）、
（ｅ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む保存培地は、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．００１ｍＭ未満の全遊離アミノ酸レベルおよび／もしくはＮ−アセチルトリプトファンレベルを含むか、具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを実質的に含まないか、または具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを含まず、
（ｆ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む保存培地は、オクタノエート、具体的には、遊離アミノ酸、および／またはＮ−アセチルトリプトファン、ならびに洗剤（ポリソルベート８０など）のすべてを実質的に含まないか、または全く含まず、
（ｇ）保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム、もしくはそれに類似の調製物、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ、もしくはそれに類似の調製物、またはＡｌｂＩＸ（登録商標）、もしくはそれに類似の調製物、から選択される調製物であり、
（ｈ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む保存培地は、ヘム、プレカリクレイン活性化因子、発熱物質、Ｃ型肝炎、および／またはヒトウイルス）から選択される１つ以上、例えばすべての成分を含まないか、および／または、２００μｇ．Ｌ−１未満、例えば、１８０μｇ．Ｌ−１、１６０μｇ．Ｌ−１、１４０μｇ．Ｌ−１、１２０μｇ．Ｌ−１、１００μｇ．Ｌ−１、９０μｇ．Ｌ−１、８０μｇ．Ｌ−１、７０μｇ．Ｌ−１、６０μｇ．Ｌ−１、５０μｇ．Ｌ−１、または４０μｇ．Ｌ−１未満、より典型的には、約１０μｇ．Ｌ−１〜約３０μｇ．Ｌ−１の範囲内のアルミニウム濃度を有し、
（ｉ）保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、無傷または実質的に無傷のＮ末端配列を有し、
（ｊ）保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、６２％超、例えば、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、約９６％、約９７％である遊離チオール基含有量を有するアルブミンタンパク質を含み、
（ｋ）保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって試験したとき、１４分未満および１９分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外し、より好ましくは、１４分または１５分未満および１８分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外する、ＳＥＣプロファイルを示すアルブミンタンパク質を含み、
（ｌ）保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって試験したとき、天然単量体形態のアルブミンに対応する単一の主要ピークを示すアルブミンタンパク質を含み、
（ｍ）保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、質量分析法によって試験したとき、１タンパク質当たり１３、１２、１１、１０、９、８、７、６未満、例えば、約１〜１１、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、１、または１未満のヘキソース修飾リジンおよび／もしくはアルギニン残基を示す生成物であるアルブミンタンパク質を含み、かつ／あるいは
（ｎ）保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、α−１，３−フコースおよび／もしくはβ−１，２−キシロースなどの植物特異的糖で糖化されていないアルブミンタンパク質を含む。
【００８１】
好ましい実施形態において、本発明の第３の態様の保存培地は、幹細胞をさらに含む。任意に、幹細胞は、多能性幹細胞（胚性幹細胞、胚性生殖細胞、誘発多能性幹細胞など）、多能性幹細胞（例えば、任意に、脂肪、骨髄、臍帯血、もしくは臍帯に由来し得る間葉系幹細胞のような成体幹細胞；任意に、骨髄もしくは末梢血に由来し得る造血幹細胞；神経幹細胞；または生殖幹細胞）、または単能性幹細胞（肝細胞のための単分化能幹細胞など）、からなる群から選択されてもよい。
【００８２】
任意に、本発明の第３の態様の保存培地は、凍結保存培地（好ましくは、本発明の第１および／または第２の態様によって定義される凍結保存培地）中で凍結され、解凍され、次いで保存培地に移された幹細胞をさらに含む。上述のように、凍結され、解凍されている幹細胞集団は、凍結／解凍プロセスを経ていない幹細胞集団と区別され得る。凍結は、細胞にストレスを引き起こし、典型的にはプログラム細胞死（アポトーシス）を開始させるであろう。本実施例のデータは、アポトーシスの段階が、本明細書で論じられるように、アネキシンＶ結合、ならびにＰＩおよび／または７ＡＡＤの包含などの特定のマーカーによってどのように追跡され得るかを示す。凍結され、解凍されている幹細胞集団は、例えば、細胞集団内の初期および後期アポトーシスのレベルを測定することによって、凍結／解凍プロセスを経ていない幹細胞集団と区別され得る。すべての細胞集団は、アポトーシス段階で細胞の割合を有するであろうが、凍結および解凍後、特に本明細書に記載の保存溶液中に２〜８℃で２４時間を超える期間保存したとき、そのレベルは上昇する。任意に、保存温度は、約２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃である。この文脈で使用される「約」という用語は、±０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１℃の意味を含むことができる。
【００８３】
任意に、本発明の第３の態様の保存培地は、本発明の第１および／または第２の態様の凍結保存培地中で凍結され、解凍され、次いで保存培地に移された幹細胞を含む。
【００８４】
典型的には、保存培地中に保存された幹細胞をさらに含む、本発明の第３の態様の保存培地は、冷蔵庫中におよび／または２〜８℃の温度で保存される。任意に、保存温度は、約２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃である。この文脈で使用される「約」という用語は、±０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１℃の意味を含むことができる。
【００８５】
幹細胞をさらに含む、本発明の第３の態様の保存培地は、幹細胞が凍結保存培地中で凍結され、解凍され、その後保存培地に移され、幹細胞は、２４時間を超える時間の期間（例えば、少なくとも、または約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７）、最大約４８時間など、例えば最大約７２時間（例えば、少なくとも、または約４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、もしくは７２時間）、またはそれ以上（例えば、最大３、４、５、６、もしくは７日間）、保存培地中に（典型的には、冷蔵庫中におよび／または２〜８℃の温度で）保存されるという点において任意に特徴付けられ得る。任意に、保存温度は、約２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃である。この文脈で使用される「約」という用語は、±０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１℃の意味を含むことができる。
【００８６】
本発明の第３の態様の実施形態に従って、保存培地は、２４時間を超える期間（例えば、少なくとも、または約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７）、最大約４８時間など、例えば最大約７２時間（例えば、少なくとも、または、約４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、または７２時間）、またはそれ以上（例えば、最大３、４、５、６、または７日間）保存培地中に２−８℃の温度で保存している、幹細胞（任意に、凍結保存培地中に凍結され、解凍され、その後保存培地に移されるか、または保存培地に移される前に別の生理学的ショックに供されている幹細胞）をさらに含み、保存期間の終了時の幹細胞の生存率は、５％超、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上、例えば、約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上である。任意に、保存温度は、約２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃である。この文脈で使用される「約」という用語は、±０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１℃の意味を含むことができる。
【００８７】
例えば、約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、またはそれ以上の生存率は、保存中の約４８時間後に好ましい。
【００８８】
約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、またはそれ以上の生存率は、保存中の約７２時間後に好ましい。
【００８９】
生存率は、例えば、図６および実施例１に関して以下に論じられるように、アネキシンＶ結合およびＰＩ包含などのマーカーを用いて決定され得る。
【００９０】
本実施例において驚くべきことに実証されるように、解凍後の生存率は、試験において５％（ｗ／ｖ）ではなく約２％（ｗ／ｖ）のアルブミン濃度を使用したときにさらに拡大した。それでも、血漿由来血清アルブミンよりもむしろ組換え酵母由来血清アルブミンを使用することの利点は、５％（ｗ／ｖ）アルブミンを使用するときにさらにより顕著であった。
【００９１】
したがって、本発明の第３の態様の一実施形態において、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、約２％（ｗ／ｖ）±１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１％（ｗ／ｖ）で、幹細胞と混合するとき、凍結保存および／または保存培地中に存在し、保存培地は、２４時間を超える期間（例えば、少なくとも、または約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７）、最大約４８時間など、例えば最大約７２時間（例えば、少なくとも、または、約４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、もしくは７２時間）、もしくはそれ以上（例えば、最大３、４、５、６、もしくは７日間）保存培地中に保存している、幹細胞（任意に、凍結保存培地中に凍結され、解凍され、その後保存培地に移されるか、または保存培地に移される前に別の生理学的ショックに供されている幹細胞）をさらに含み、保存期間の終了時の幹細胞の生存率は、５％超、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上、例えば、約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上である。
【００９２】
本発明の第３の態様の別の実施形態において、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、５％（ｗ／ｖ）±１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１％（ｗ／ｖ）で、幹細胞と混合するとき、凍結保存および／または保存培地中に存在し、保存培地は、２４時間を超える期間、最大約４８時間など、例えば最大約７２時間、もしくはそれ以上保存培地中に保存している、幹細胞（任意に、凍結保存培地中に凍結され、解凍され、その後保存培地に移されるか、または保存培地に移される前に別の生理学的ショックに供されている幹細胞）をさらに含み、保存期間の終了時の幹細胞の生存率は、５％超、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、もしくはそれ以上、例えば、約５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、もしくはそれ以上である。
【００９３】
凍結保存培地および保存培地の使用もまた、本発明によって提供される。
【００９４】
したがって、第４の態様において、本発明は、幹細胞の保存のための本発明の第２の態様による凍結保存培地の使用を提供する。
【００９５】
本発明の第４の態様の使用は、幹細胞を２〜８℃で２４時間を超える時間の期間（例えば、少なくとも、または約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７）、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間（例えば、少なくとも、または約４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、もしくは７２時間）、もしくはそれ以上（例えば、最大３、４、５、６、もしくは７日間）、保存した後、生存状態で幹細胞の保存のものであり得る。任意に、保存期間の終了時に幹細胞の生存率は、５％超、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上、例えば、約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上である。任意に、保存温度は、約２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃である。この文脈で使用される「約」という用語は、±０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１℃の意味を含むことができる。
【００９６】
任意に、本発明の第４の態様の使用に従って、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、凍結保存培地中に約２％（ｗ／ｖ）±１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１％（ｗ／ｖ）で、幹細胞と混合したとき、存在する。代替の選択肢では、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、凍結保存培地中に５％（ｗ／ｖ）±１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１％（ｗ／ｖ）で、幹細胞と混合したとき、存在し得る。
【００９７】
一実施形態において、本発明の第４の態様の使用は、２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、例えば、最大約４８時間、例えば最大約７２時間、もしくはそれ以上保存する前に、幹細胞を凍結保存培地と組み合わせて、混合物を生成することと、混合物を凍結して、凍結幹細胞生成物を生成する（または幹細胞が別の生理学的ショックを受ける）ことと、によって、幹細胞の保存のためのものである。任意に、保存温度は、約２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃である。この文脈で使用される「約」という用語は、±０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１℃の意味を含むことができる。
−これは、任意に、凍結幹細胞生成物を解凍するステップと、解凍された細胞を保存培地に移すステップと、幹細胞を２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、例えば、最大約４８時間、例えば最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存培地中に保存するステップと、を含み得る。
−さらなる代替において、これは、任意に、幹細胞を凍結保存培地と組み合わせて、混合物を生成することと、幹細胞を生理学的ショックを受けることと、細胞を保存培地に移すことと、幹細胞を２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、例えば、最大約４８時間、例えば最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存培地中に保存することによって、幹細胞の保存のためのものであり得る。
【００９８】
好ましくは、いずれかの代替では、保存培地は、本発明の第３の態様による保存培地である。
【００９９】
本発明の第５の態様は、幹細胞を保存培地中に保存することによって、幹細胞の保存のための本発明の第３の態様による保存培地の使用を提供する。任意に、幹細胞は、凍結保存培地中で凍結され、解凍され、その後保存前に保存培地に移されている。あるいは、幹細胞は、凍結保存培地と混合され、生理学的ショックにさらし、保存前に保存培地に移し得る。いずれかの代替では、凍結保存培地は、本発明の第２の態様による凍結保存培地であることが好ましくあり得る。
【０１００】
本発明の第６の態様は、凍結保存幹細胞の解凍後の生存率を改善するための組換え酵母由来血清アルブミンの使用を提供する。この改善は、典型的には、同じ濃度で、組換え酵母由来血清アルブミンの代わりに血漿由来血清アルブミンを使用したときに観察される凍結保存幹細胞の解凍後の生存率のレベルと比較される。この改善は、保存培地中に２〜８℃で２４時間を超える時間の期間（例えば、少なくとも、または約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７）、最大約４８時間など、例えば最大約７２時間（例えば、少なくとも、または約４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、もしくは７２時間）、またはそれ以上（例えば、最大３、４、５、６、もしくは７日間）、保存したとき、解凍後の幹細胞に観察可能であり得る。任意に、保存温度は、約２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃である。この文脈で使用される「約」という用語は、±０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１℃の意味を含むことができる。
【０１０１】
本発明の第６の態様によれば、組換え酵母由来血清アルブミンは、それを凍結保存培地に製剤化し、凍結前に、凍結保存培地を幹細胞と混合することによって使用することができ、凍結保存培地は、本発明の第２の態様によって定義される培地である。
【０１０２】
本発明の第６の態様によれば、組換え酵母由来血清アルブミンは、加えてまたは代替に、それを保存培地に製剤化することと、解凍後に、幹細胞と保存培地を混合することと、によって使用することができ、任意に、保存培地は、本発明の第３の態様によって定義される培地である。
【０１０３】
本発明の第７の態様は、生理学的ショックに供される細胞の生存率を改善させるために組換え酵母由来血清アルブミンの使用を提供する。細胞は、例えば、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、および／または好ましくは幹細胞もしくはリンパ球であり得る。この改善は、典型的には、同じ濃度で、組換え酵母由来血清アルブミンの代わりに血漿由来血清アルブミンを使用したときに観察される細胞（例えば幹細胞）のショック後の生存率のレベルと比較される。この改善は、保存培地中に２〜８℃で２４時間を超える時間の期間（例えば、少なくとも、または約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７）、最大約４８時間など、例えば最大約７２時間（例えば、少なくとも、または約４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、もしくは７２時間）、またはそれ以上（例えば、最大３、４、５、６、もしくは７日間）、保存したとき、ショック後の細胞（例えば幹細胞）に観察可能であり得る。任意に、保存温度は、約２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃である。この文脈で使用される「約」という用語は、±０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１℃の意味を含むことができる。
【０１０４】
本発明の第７の態様によれば、組換え酵母由来血清アルブミンは、それを凍結保存用培地に製剤化し、生理学的ショックの前に、凍結保存用培地を細胞（例えば幹細胞）と混合することによって使用することができ、凍結保存培地は、本発明の第２の態様によって定義される培地であり得る。
【０１０５】
本発明の第７の態様によると、組換え酵母由来血清アルブミンは、それに加えて、またはそれに代えて、それを保存培地に製剤化し、生理学的ショックを受けた後に、保存培地を細胞（例えば幹細胞）と混合することによって使用することができ、任意に、保存培地は、本発明の第３の態様によって定義される培地である。
【０１０６】
本実施例はまた、驚くべきことに、後期アポトーシス期ではなく初期アポトーシス期にストレスを受けた細胞を維持することにおける組換え酵母由来血清アルブミンの利点を示す。初期のアポトーシス段階にある細胞は、アポトーシスに関与しておらず、好ましい条件下で、生存細胞として使用することができる救助形態に戻ることができる。例えば、Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｍｅｔ．Ｅｎｇ．，５：１２４−１３２に論じられるように、細胞がアポトーシスプログラムを活性化することによっていくつかの傷害に応答することができるが、保護された細胞の生存率および増殖は、非誘導アポトーシス条件に再曝露されるとき、回復し得る一方で、後期アポトーシスに入ることから保護されない細胞は、回復できずに死滅するであろう。Ｔｉｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９５：２０５−２１４は、アポトーシス誘導培養条件に対して保護するためにカスパーゼ阻害剤を使用する、ハイブリドーマ細胞増殖の回復を示し、好ましい培養条件への逆戻り後に正常増殖への回帰を示す。
【０１０７】
したがって、本発明の第８の態様は、初期アポトーシスから後期アポトーシスへの細胞の転換を防止、遅延、または減少させるための方法を提供し、本方法は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地と細胞を混合することを含む。
【０１０８】
本発明の第８の態様はまた、例えば、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地の形態で、初期アポトーシスから後期アポトーシスまでの細胞の転換を防止、遅延、または減少させるための組換え酵母由来血清アルブミン調製物の使用も提供する。
【０１０９】
本発明の第８の態様に従って処理される細胞は、アポトーシスを受け得る任意の適切な細胞型であり得、例えば、動物細胞またはヒト細胞から選択され得る。好ましくは、細胞は、幹細胞である。このような幹細胞の例には、多能性幹細胞（胚性幹細胞、胚性生殖細胞、誘発多能性幹細胞など）、多能性幹細胞（例えば、任意に、脂肪、骨髄、臍帯血、もしくは臍帯に由来し得る間葉系幹細胞のような成体幹細胞；任意に、骨髄もしくは末梢血に由来し得る造血幹細胞；神経幹細胞；または生殖幹細胞）、または単能性幹細胞（肝細胞のための単分化能幹細胞など）、が含まれる。任意に、本発明の第８の態様に従って処理される細胞は、エクスビボ細胞であり得る。
【０１１０】
本発明の第８の態様によれば、細胞は、生理学的ショックを受ける前および／または受けた後に、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地と混合されてもよい。組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、生理学的ショックの前後の両方で細胞に提示されることが好ましくあり得る。「生理学的ショック」とは、処理される細胞の集団においてアポトーシスを誘発し得る細胞の環境における物理的および化学的変化を含む。好ましくは、本発明のこの態様の意味の範囲内で、生理学的ショックは、保存培地中に２〜８℃で２４時間を超える時間の期間（例えば、少なくとも、または約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７）、最大約４８時間など、例えば最大約７２時間（例えば、少なくとも、または約４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、もしくは７２時間）、またはそれ以上（例えば、最大３、４、５、６、もしくは７日間）、保存したとき、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質の不在下で、血漿由来血清アルブミンの存在下であっても、集団中の細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくはそれ以上のアポトーシスを誘発するであろう。任意に、保存温度は、約２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃である。この文脈で使用される「約」という用語は、±０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１℃の意味を含むことができる。
【０１１１】
生理学的ショックの例としては、熱ショック（例えば、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５６、４７、４８、４９、または５０℃超）、低温ショック（例えば、２、１、０、−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−２０、−８０、−１００℃、またはそれ以下）、浸透圧ショック（例えば、細胞と実質的に等張ではない条件への曝露）、栄養枯渇、毒性化合物への曝露、代謝物への曝露および／または喪失、酵素への曝露および／または喪失、化学ショック、ｐＨショック、有機溶液への曝露、ならびに他のショック、例えば、せん断力への曝露、表面曝露、および／または表面暴露の喪失が挙げられるが、これらに限定されない。任意に、生理学的ショックは、凍結保存中の凍結および／または解凍のステップのうちの１つ以上から生じるショックであり得る。
【０１１２】
本発明の第８の態様によれば、限定されないが、初期アポトーシスは、例えば、フローサイトメトリーを用いて決定されるように、アネキシン（アネキシンＶなど）結合を示すが、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）および／または７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）の包接を示さない細胞によって特徴付けられ得る。初期アポトーシスは、アネキシン結合を伴うが、ＰＩおよび／または７ＡＡＤの包接を伴わない、生理学的ショックを受けていない同じ細胞群において観察されるレベルより高いミトコンドリア透過性によってさらに特徴付けられ得る。初期アポトーシスの他の特徴的な特徴は、当技術分野において周知であり（その例は本出願内の他の箇所で論じられている）、さらなるまたは代替のマーカーとしても使用され得る。
【０１１３】
本発明の第８の態様によれば、限定されないが、後期アポトーシスは、例えばフローサイトメトリーを使用して決定されるように、アネキシン（アネキシンＶなど）結合を示し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の包接および／または７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）の包接も示す細胞によって特徴付けられ得る。後期アポトーシスの他の特徴的な特徴は、当技術分野において周知であり（その例は本出願内の他の場所で論じられている）、さらなるまたは代替のマーカーとしても使用され得る。
【０１１４】
本発明の第８の態様によれば、組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、約０．０１％（ｗ／ｖ）超および１０％（ｗ／ｖ）未満、約９％（ｗ／ｖ）未満、約８％（ｗ／ｖ）未満、約７％（ｗ／ｖ）未満、または約６％（ｗ／ｖ）未満、例えば、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）、好ましくは約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３（ｗ／ｖ）、または約４％（ｗ／ｖ）の濃度である組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質を提供するのに好適な量で、細胞と混合され得る。幹細胞と混合するとき、約２％（ｗ／ｖ）±１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１％（ｗ／ｖ）、またはこの細胞と混合するとき、５％（ｗ／ｖ）±１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１％（ｗ／ｖ）の濃度は、好ましくあり得る。
【０１１５】
任意に、本発明の第８の態様によれば、細胞は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地中に２〜８℃の温度で保存され得る。任意に、保存温度は、約２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃である。この文脈で使用される「約」という用語は、±０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１℃の意味を含むことができる。保存は、２４時間を超える時間の期間（例えば、少なくとも、または約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７）、最大約４８時間など、例えば最大約７２時間（例えば、少なくとも、または約４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、もしくは７２時間）、またはそれ以上（例えば、最大３、４、５、６、もしくは７日間）であり得る。初期アポトーシスから後期アポトーシスへの細胞の交換における防止、遅延、または減少は、保存期間中に観察可能であり得る。
【０１１６】
したがって、細胞は、２４時間を超える時間の期間（例えば、少なくとも、または約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７）、最大約４８時間など、例えば最大約７２時間（例えば、少なくとも、または約４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、もしくは７２時間）、またはそれ以上（例えば、最大３、４、５、６、もしくは７日間）、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地中に保存されることが好ましくあり得る。任意に、細胞は、２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば最大約７２時間、もしくはそれ以上２〜８℃の温度で保存され、保存期間の終了時に初期アポトーシスである細胞の割合は、５％超、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上、例えば、約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上である。任意に、保存温度は、約２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃である。この文脈で使用される「約」という用語は、±０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１℃の意味を含むことができる。
【０１１７】
典型的には、本発明の第８の態様による培地中で使用される組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、以下の特性：
（ａ）０．５％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは０．４％、０．３％、０．２％、もしくは０．１５％未満が、コンカナバリンＡへ結合すること、および／または
（ｂ）０．６モルのヘキソース／タンパク質１モル未満、好ましくは０．１０、０．０７５、もしくは０．０５モルのヘキソース／タンパク質１モル未満の糖化レベル、のうちの１つ以上を示す。
【０１１８】
典型的には、本発明の第８の態様による培地中で使用される組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、
（ａ）少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、より好ましくは少なくとも約９９．５％の単量体および二量体、好ましくは本質的に１００％の単量体および二量体であり、
（ｂ）少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、または９７％の単量体であり、および／または
（ｃ）は、約１．０％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）または０．０１％（ｗ／ｗ）以下、好ましくはそれ未満のアルブミンポリマー含有量を有する。この文脈に使用されるように、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質に適用される「ポリマー」という用語は、単量体および二量体形態とは異なる。
【０１１９】
典型的には、本発明の第８の態様によれば、
（ａ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、酵母由来血清アルブミンタンパク質、カチオン（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、好ましくはナトリウムなど）、および平衡アニオン（塩化物、リン酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、または酢酸塩、好ましくは塩化物またはリン酸塩）、水、ならびに任意にオクタノエートおよびポリソルベート８０を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、
（ｂ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に細胞を含む１つ以上の他の成分を含む培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１８ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１２ｍＭ、１０ｍＭ、８ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．３ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００１ｍＭ未満のオクタノエートを含むか、オクタノエートを実質的に含まないか、またはオクタノエートを含まず、
（ｃ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に細胞を含む１つ以上の他の成分を含む培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下の全脂肪酸含有量を有するか、脂肪酸を実質的に含まないか、または脂肪酸を含まず、
（ｄ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に細胞を含む１つ以上の他の成分を含む培地は、２００ｍｇ．Ｌ−１、１５０ｍｇ．Ｌ−１、１００ｍｇ．Ｌ−１、９０ｍｇ．Ｌ−１、８０ｍｇ．Ｌ−１、７０ｍｇ．Ｌ−１、６０ｍｇ．Ｌ−１、５０ｍｇ．Ｌ−１、４０ｍｇ．Ｌ−１、３０ｍｇ．Ｌ−１、２０ｍｇ．Ｌ−１、１５ｍｇ．Ｌ−１、１０ｍｇ．Ｌ−１、５ｍｇ．Ｌ−１、４ｍｇ．Ｌ−１、３ｍｇ．Ｌ−１、２ｍｇ．Ｌ−１、１ｍｇ．Ｌ−１、０．５ｍｇ．Ｌ−１、０．１ｍｇ．Ｌ−１、０．０１ｍｇ．Ｌ−１、０．００１ｍｇ．Ｌ−１未満の濃度で、ポリソルベート（好ましくはポリソルベート８０）などの洗剤を含むか、洗剤を実質的に含まないか、または洗剤を含まず、
（ｅ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に細胞を含む１つ以上の他の成分を含む培地は、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．００１ｍＭ未満の全遊離アミノ酸レベルおよび／もしくはＮ−アセチルトリプトファンレベルを含むか、具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを実質的に含まないか、または具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを含まず、
（ｆ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に細胞を含む１つ以上の他の成分を含む培地は、オクタノエート、具体的には、遊離アミノ酸、および／またはＮ−アセチルトリプトファン、ならびに洗剤（ポリソルベート８０など）のすべてを実質的に含まないか、または全く含まず、
（ｇ）組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム、もしくはそれに類似の調製物、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ、もしくはそれに類似の調製物、またはＡｌｂＩＸ（登録商標）、もしくはそれに類似の調製物、から選択される調製物であり、
（ｈ）組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質調製物、ならびに／または組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に細胞を含む１つ以上の他の成分を含む培地は、ヘム、プレカリクレイン活性化因子、発熱物質、Ｃ型肝炎、および／またはヒトウイルスから選択される１つ以上、例えばすべての成分を含まず、ならびに／または、２００μｇ．Ｌ−１未満、例えば、１８０μｇ．Ｌ−１、１６０μｇ．Ｌ−１、１４０μｇ．Ｌ−１、１２０μｇ．Ｌ−１、１００μｇ．Ｌ−１、９０μｇ．Ｌ−１、８０μｇ．Ｌ−１、７０μｇ．Ｌ−１、６０μｇ．Ｌ−１、５０μｇ．Ｌ−１、または４０μｇ．Ｌ−１未満、より典型的には、約１０μｇ．Ｌ−１〜約３０μｇ．Ｌ−１の範囲内のアルミニウム濃度を有し、
（ｉ）培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、無傷または実質的に無傷のＮ末端配列を有し、
（ｊ）培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、６２％超、例えば、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、約９６％、約９７％である遊離チオール基含有量を有するアルブミンタンパク質を含み、
（ｋ）培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって試験したとき、１４分未満および１９分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外し、より好ましくは、１４分または１５分未満および１８分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外する、ＳＥＣプロファイルを示すアルブミンタンパク質を含み、
（ｌ）培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって試験したとき、天然単量体形態のアルブミンに対応する単一の主要ピークを示すアルブミンタンパク質を含み、
（ｍ）培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、質量分析法によって試験したとき、１タンパク質当たり１３、１２、１１、１０、９、８、７、６未満、例えば、約１〜１１、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、１、または１未満のヘキソース修飾リジンおよび／もしくはアルギニン残基を示す生成物であるアルブミンタンパク質を含み、かつ／あるいは
（ｎ）培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、α−１，３−フコースおよび／またはβ−１，２−キシロースなどの植物特異的糖で糖化されていないアルブミンタンパク質を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】実施例５で報告されている市販のアルブミン生成物：（ａ）Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライムおよびＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ、（ｂ）市販のアルブミン１（植物由来）、（ｃ）市販のアルブミン２（植物由来）、（ｄ）市販のアルブミン３（酵母由来、Ｐｉｃｈｉａ）の質量分析を示す。
【図２】実施例５に記載される、市販のアルブミン生成物：（ａ）Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム、（ｂ）Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ、（ｃ）市販のアルブミン１、（ｄ）市販のアルブミン３、（ｅ）市販のアルブミン２、から記録された比較ゲル電気泳動データを示す。
【図３】実施例５に記載される組換えアルブミンの色素沈着の比較を示す。
【図４】実施例１に記載される研究において行われた実験段階のスキームを示す。
【図５】実施例１に記載される研究において、２〜８℃で安定性試験で使用された構成を示す。
【図６】アネキシンＶ結合（横軸）およびＰＩの包接（縦軸）に基づいて、２〜８℃での解凍後の安定性におけるアポトーシスアッセイの結果を示す。
【図７】実施例２で論じたように、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）（ＲＩ）またはＡｌｂＩＸ（登録商標）（ＴＩ）凍結保存溶液を比較した、凍結前および解凍後の時間におけるｈＭＳＣの同一性について％表面マーカーの割合（％）を示す。
【図８】（Ａ）フローサイトメトリー分析を示す。ｈＳＥＲＢで延長された細胞培養中のＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）（ＲＩ）またはＡｌｂＩＸ（登録商標）（ＴＩ）添加剤の安定性時点での生存率の割合（％）（点線は、７０％の生存率の規格限界を示す）。７２時間における、参照として時間０を考慮した減少の割合（％）が示されている。ＡＮＯＶＡ  Ｔｕｋｅｙ多重比較試験の結果が示されている。（Ｂ）フローサイトメトリー分析。ＰＬで延長された細胞培養中のＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）（ＲＩ）またはＡｌｂＩＸ（登録商標）（ＴＩ）添加剤の安定性時点での生存率の割合（％）（点線は、７０％の生存率の規格限界を示す）。７２時間における、参照として時間０を考慮した減少の割合（％）が示されている。ＡＮＯＶＡ  Ｔｕｋｅｙ多重比較試験の結果が示されている。（Ｃ）および（Ｄ）フローサイトメトリー分析。Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）（ＲＩ）およびＡｌｂＩＸ（登録商標）（ＴＩ）の凍結保存条件、ならびにｈＳＥＲＢ（Ｃ）およびＰＬ（Ｄ）における拡大戦略についての、時間０に対する生存率の減少の割合（％）。統計分析には、ＡＮＯＶＡノンパラメトリックＳｉｄａｋの多重比較試験を使用した。
【図９】本発明の第３の実施形態による組換え酵母由来アルブミン調製物のアルブミン製剤の脂肪酸プロファイルを示す。
【図１０】本発明の第３の実施形態による組換え酵母由来アルブミン調製物のアルブミン製剤の、ＩＣＰ−ＯＥＳによる金属イオンプロファイルを示す。
【図１１】ｈＳＥＲＢ培地で拡大した細胞培養物についてのＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）（Ｒｌ）またはＡｌｂＩＸ（登録商標）（ＴＩ）凍結保存溶液を比較した、安定性評価の異なる時点におけるｈＭＳＣの同一性についての表面マーカーの割合（％）を示す。
【図１２】Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）（対照）またはＡｌｂＩＸ（登録商標）凍結保存溶液を比較した、安定性評価の異なる時点におけるｈＭＳＣ細胞の初期および後期アポトーシス状態を示す。
【図１３】凍結保存培地、保存培地のいずれか、またはその両方で使用したときに、解凍直後の酵母由来組換えヒト血清アルブミンの保護効果を示す。（Ａ）フローサイトメトリーで得られた全項目（ＲＩ、ＴＩ１、ＴＩ２、ＴＩ３；１項目当たりｎ＝３）についての生存率の割合を示す。破線は、解凍後の生存率についての日常的な許容基準に対応する。一元配置分散分析、ダネット多重検定で比較を行った。（Ｂ）ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒで得られた全項目（ＲＩ、ＴＩ１、ＴＩ２、ＴＩ３；１項目当たりｎ＝３）についての生存率の割合を示す。破線は、解凍後の生存率についての日常的な許容基準に対応する。一元配置分散分析、ダネット多重検定で比較を行った。
【図１４】凍結保存培地、保存培地のいずれか、またはその両方で使用したときに、解凍直後から７２時間までの酵母由来組換えヒト血清アルブミンの保護効果を示す。（Ａ）フローサイトメトリーによって得られた生存率の割合を示す。（Ｂ）ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒによって得られた生存率の割合を示す。両方の表現は、全項目（１項目当たりｎ＝３）の標準偏差と関連した安定性研究に沿った生存率を示す。図１４Ａおよび図１４Ｂの両方において、●は参照項目、■は試験項目１、▲は試験項目１、および▼は試験項目３である。
【図１５】２〜８℃で保存したとき、解凍後の生存率（％）を評価したＲＩ試料とＴＩ２試料の比較を示す。（Ａ）フローサイトメトリーによって決定された結果を示し、（Ｂ）ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒによって決定された結果を示す。
【図１６】２〜８℃で保存したとき、解凍後の生存率（％）の経時的な低下を評価し、正規化されたデータを使用した、ＲＩ試料とＴＩ２試料の比較を示し、各試料の０時間の生存時間試料を生存率１００％の時点と見なし、この時点からの生存率の低下をこの値に対して評価した。（Ａ）フローサイトメトリーによって決定された結果を示し、（Ｂ）ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒによって決定された結果を示す。
【図１７】２〜８℃で保存したとき、解凍後の生存率（％）を評価したＴＩ１試料とＴＩ３試料の比較を示す。（Ａ）フローサイトメトリーによって決定された結果を示し、（Ｂ）ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒによって決定された結果を示す。
【図１８】２〜８℃で保存したとき、解凍後の生存率（％）を評価したＲＩ試料とＴＩ３試料の比較を示す。（Ａ）フローサイトメトリーによって決定された結果を示し、（Ｂ）ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒによって決定された結果を示す。
【図１９】初期アポトーシス細胞および後期アポトーシス細胞の割合の表示を示す。（Ａ）参照項目（ＲＩ）と試験項目２（ＴＩ２）との比較を示し、（Ｂ）試験項目１（ＴＩ１）と試験項目３（ＴＩ３）との比較を示し、（Ｃ）安定性研究の各時点における参照項目（ＲＩ）と試験項目３（ＴＩ３）の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２１】
定義
凍結：細胞調製物を凍結するという文脈において本出願で使用される「凍結」という用語は、氷晶を生成するか、または完全に凍結させた固体形態として、例えば、０℃以下である形態で細胞調製物を示すのに十分低い温度に細胞を曝すことを含む。「凍結」という用語は、好ましくは、凍結保存を指す。
【０１２２】
凍結保存：凍結保存は、非常に低い温度、一般的には−８０℃から−１９６℃の間で凍結することにより、生物学的物質（細胞、組織、および生物）を良好な状態に保つ方法である。このようにして、重要な機能が減少し、それらを長期間冬眠状態の状態で維持することができる。
【０１２３】
本明細書で使用されるとき、「凍結保存」という用語は、凍結によって長期間にわたって細胞を安定に維持することを指す。一般に、細胞が培養されると、突然変異は１対１万の割合で起こり、細胞が長期継代培養を経ると、細胞集団は変化し、元の集団と異なってくる。重症例では、細胞は、継代培養によってそれら自身の特定の機能を失し得る。さらに、細胞は、継代培養中にマイコプラズマなどに感染し得る。そのような問題のために、細胞凍結保存は、それらの固有の特徴を失う前に細胞を凍結し、保存し、必要に応じて、それらを再び使用するために行われる。特に、幹細胞を治療に使用する場合、必要に応じて、健康な幹細胞を直ちに使用できることが必要である。したがって、効果的な凍結保存は、幹細胞にとって特に重要であると考えられている。
【０１２４】
本発明の凍結保存用培地で処理された幹細胞の凍結は、当該技術分野で公知の任意の従来の幹細胞を凍結させる方法によって行うことができ、その例としては、ガラス化方法および緩慢凍結方法が挙げられるが、これらに限定されない。ガラス化方法は、例えば、制御速度冷凍庫（ＣＲＦ）などの装置を用いて一定の速度（例えば１分当たり１℃）で温度を絶えず下げることにより行われる。好ましくは、温度が−８０℃に達すると、細胞は、窒素タンクに直ちに保存される。緩慢凍結法は、細胞を含む凍結保存用培地を含むバイアルをイソプロピルアルコールを含む冷凍庫の箱に入れ、−７０℃以下の超低温冷凍庫中で特定の一定時間（例えば１２時間〜２４時間）にわたって温度を一定に下げることによって行うことができるが、これに限定されない。さらに、凍結細胞は、液体窒素タンクに保存し、必要に応じて、再利用することができる。
【０１２５】
好適な例示的な方法も実施例に記載されている。
【０１２６】
凍結保存溶液：細胞生成物の凍結は、凍結保存溶液中の１つ以上の凍結保護剤を用いて行われる。該溶液の使用は、一般に、細胞の細胞内区画における凍結水の結晶の形成を防ぐために、細胞内脱水による凍結プロセス中の細胞生存率の保存に基づいている。
【０１２７】
凍結保存剤：本明細書で使用されるとき、「凍結保存剤」という用語は、細胞、組織、または器官が−８０℃から−２００℃の超低温で保存されるときに、結晶形成ならびにイオン性および浸透性の不均衡を必然的に伴う凍結および解凍プロセスによって引き起こされる細胞損傷を最小限に抑えるために使用される物質を指す。
【０１２８】
本発明の目的のために、「凍結保存剤」は、組換え酵母由来血清アルブミンでも、他のいかなる形態のアルブミンタンパク質でもない。そうでなければ、凍結防止剤は、凍結保存中の細胞損傷を軽減することができる限り、特定の物質に限定されない。
【０１２９】
限定ではないが、凍結保存溶液中に存在する凍結保存剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール（ＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、およびトレハロースを含み得る。ＤＭＳＯが特に好ましくあり得る。凍結防止剤は、幹細胞と混合したときに、凍結保存培地中に凍結保存効果をもたらすのに好適な濃度で存在し得る。ＤＭＳＯの場合、これは、約１０％（ｗ／ｖ）±５％、４％、３％、２％、または１％であり得る。当業者は、日常的な試験を用いて適切な量の凍結保存剤を容易に決定することができる。
【０１３０】
幹細胞：本明細書で使用されるとき、「幹細胞」という用語は、自己複製能および分化能を有する未分化細胞を指す。幹細胞は、それらの分化能力に従って全能性幹細胞、多能性幹細胞、複能性幹細胞、および単能性幹細胞の亜集団を含む。全能性幹細胞とは、胚組織および胎盤細胞を含む生物内の任意の細胞に分化することができる細胞を指す。多能性幹細胞とは、生物を構成するすべての組織または細胞に分化する能力を有する細胞を指す。複能性幹細胞とは、あらゆる種類の組織または細胞であるが、複数の種類の組織または細胞に分化する能力を有さない細胞を指す。単能性幹細胞とは、特定の組織または細胞に分化する能力を有する細胞を指す。
【０１３１】
多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などを含み得る。
【０１３２】
多能性幹細胞は、間葉系幹細胞（脂肪、骨髄、臍帯血、もしくは臍帯などに由来する）、造血幹細胞（骨髄または末梢血に由来する）、神経幹細胞、生殖幹細胞などの成体幹細胞を含み得る。
【０１３３】
単能性幹細胞は、通常は自己複製能が低く静止しているが、特定の条件下では活発に肝細胞に分化する、肝細胞における単分化能幹細胞を含み得る。本発明の一実施形態において、骨髄間葉系幹細胞および臍帯幹細胞を使用して、本発明の組成物が安全性および安定性を有する幹細胞の凍結保存に使用され得ることを調べた。
【０１３４】
本発明によれば、「幹細胞」という用語は、典型的には、初代細胞を含まない。本明細書で使用されるとき、「初代細胞」という用語は、生物の器官／組織の機能を表す、いかなる遺伝子操作などもせずに、個体の組織から単離される細胞を指す。初代細胞は、皮膚または血管内皮、骨髄、脂肪、軟骨などから単離され、対応する組織および細胞の機能を研究するために、あるいは失われた組織を修復するための治療剤として用いられる。
【０１３５】
幹細胞および初代細胞の起源は、細胞が本発明の組成物によって安定に凍結保存され得る限り、特に限定されない。その例としては、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、またはウサギ由来の細胞を含み得る。幹細胞または初代細胞は、好ましくはヒト幹細胞または初代細胞であるが、これらに限定されない。
【０１３６】
任意に、本発明の方法および使用（具体的には、使用される幹細胞がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である方法および使用）は、工業目的または商業目的を含むあらゆる目的のためのヒト胚の使用を除外する。したがって、本発明に従って使用されるいかなるｈＥＳＣも、ヒト胚の破壊を通して直接的または間接的に得られないことが好ましくあり得る。言い換えれば、本発明に従って使用される任意のｈＥＳＣは、それが行われる段階がどうであれ、ヒト胚の事前の破壊または基材としてのそれらの使用を必要としない手段によって得られることが好ましくあり得る。例えば、本発明における使用のための任意のｈＥＳＣが、ヒトに発達する固有の能力を有さない単為生殖細胞および／もしくは他の細胞または細胞の集団に由来することが好ましくあり得る。
【０１３７】
アポトーシス：アポトーシスは、多細胞生物で起こるプログラム細胞死のプロセスである。生化学的事象は、特徴的な細胞の変化（形態）および死をもたらす。これらの変化は、ブレブ形成、細胞収縮、核断片化、クロマチン凝縮、染色体ＤＮＡ断片化、および包括的なｍＲＮＡ分解から選択される１つ以上の特徴を含み得る。アポトーシスは、壊死とは異なり、後者は急性細胞傷害から生じる外傷性細胞死の一形態である。対照的に、アポトーシスは、高度に調節され、制御されたプロセスである。壊死とは異なり、アポトーシスは、細胞の内容物が周囲の細胞にこぼれて損傷を引き起こすことができる前に、食細胞が飲み込み、迅速に除去することができるアポトーシス小体と呼ばれる細胞断片を生成する。
【０１３８】
アポトーシス細胞と壊死細胞を区別するための方法は、当技術分野でよく知られている。これには、例えば、タイムラプス顕微鏡、フローフルオロサイトメトリー、および透過型電子顕微鏡による形態の分析が含まれ得る。細胞表面マーカー（ホスファチジルセリン曝露対フローフルオロサイトメトリーによる細胞透過性）、ＤＮＡ断片化（フローフルオロサイトメトリー）、カスパーゼ活性化、Ｂｉｄ切断、およびシトクロムｃ放出（ウェスタンブロッティング）などの細胞マーカーの分析のための様々な生化学的技術もある。一次および二次壊死細胞は、カスパーゼの上清、ＨＭＧＢ１、およびサイトケラチン１８の放出の分析によって区別され得る。しかしながら、壊死性細胞死の明確な表面または生化学的マーカーはまだ同定されておらず、負のマーカーのみが利用可能である。これらには、アポトーシスマーカー（カスパーゼ活性化、シトクロムｃ放出、およびオリゴヌクレオソームＤＮＡ断片化）の非存在ならびに細胞死マーカーの異なる動態（ホスファチジルセリン曝露および細胞膜透過性化）が含まれる。壊死性細胞からアポトーシスを区別するために使用することができる技術の選択は、よく知られている。
【０１３９】
アネキシンは、アポトーシス細胞を同定するためにホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合するカルシウム依存性リン脂質結合タンパク質のファミリーである。健康な細胞では、ＰＳは、主に原形質膜の細胞質側に沿って位置している。アポトーシスが始まると、ＰＳは、リン脂質二重層内の非対称分布を失い、蛍光標識されたアネキシンＶで検出可能である細胞外膜に移動する。
−アポトーシスの初期段階では、細胞膜は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）および７ＡＡＤなどの生存色素を除外しているため、アネキシンＶ染色のみを示す細胞（ＰＩおよび／または７ＡＡＤ陰性）はアポトーシスの初期段階にある。アポトーシスの初期段階にある細胞は、アポトーシスに関与しておらず、好ましい条件下で、生存細胞として使用することができる救助形態に戻ることができる。したがって、アポトーシスの初期段階にある細胞は、本出願の目的のために、「生存可能」であると見なされる。
−後期アポトーシスの間、細胞膜の完全性が失われると、アネキシンＶが細胞質ＰＳへ結合すること、ならびにＰＩおよび／または７ＡＡＤが細胞に取り込まれることが可能になる。アポトーシスの後期段階にある細胞は、本出願の目的のために、「生存可能」であるとは見なされない。
【０１４０】
７ＡＡＤまたはＰＩと対をなすアネキシンＶ染色は、例えばフローサイトメトリーによってアポトーシス段階を同定するために広く使用されている。
【０１４１】
アポトーシスの初期段階のさらなる尺度には、例えば、Ｍｉｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１５，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０９：５８−６７（この内容は、参照により本明細書に組み込まれる）（具体的には、Ｍｉｌｉａｎらのセクション２．２および図５Ａを参照のこと）に記載されているようなＭｉｔｏｓｃｒｅｅｎキットを使用するなどのミトコンドリア透過性の決定が含まれ得る。さらに、カスパーゼ３活性アッセイは、例えば、Ｔｉｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９５：２０５−２１４（この内容は、参照により本明細書に組み込まれる）の方法を用いてアッセイされ得る。
【０１４２】
上記のＴｉｎｔｏらはまた、ＤＮＡラダー分析（Ｔｉｎｔｏらの図３Ｂ、Ｅ、Ｈを参照のこと）、および例えばＴｉｎｔｏらの図１Ｃに記載されるような共焦点イメージングを含む後期アポトーシスを特徴付けるために適用され得るさらなる有用なアッセイも記載している。
【０１４３】
組換え酵母由来血清アルブミン：本発明は、「組換え酵母由来血清アルブミン」タンパク質およびその調製物に関する。
【０１４４】
すなわち、血清アルブミンタンパク質は、アルブミンをコードするヌクレオチド配列で形質転換された酵母を発酵培地中で培養することによって得られる酵母培養培地に由来し、それによって当該酵母はアルブミンタンパク質を発現し、それを培地に分泌する。それは、好ましくは動物またはヒト由来の材料を使用せずに製造される。次いで、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を生成するために、実質的に精製された形態でそれから回収される。
【０１４５】
酵母は、好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属（例えばＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、またはＰｉｃｈｉａ属（例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のものである。組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質の製造方法は、例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ（Ｆｌｅｅｒ  １９９１、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９、９６８−９７５）、Ｐｉｃｈｉａ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  １９９８  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  ２、２５７−２６２）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｓｌｅｅｐ  １９９０、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８、４２−４６））に当該技術分野で公知である。すべての引用は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。最も好ましくは、属は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓであり、最も好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【０１４６】
例示的な組換え酵母由来血清アルブミン調製物、およびそのような調製物自体の生成のための好適な方法は、ＷＯ２０００／０４４７７２および／またはＷＯ２０１３／００６６７５に記載されており、それらの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４７】
ＥＰ１３２９４６０（Ａ１）、ＥＰ１３２９４６１（Ａ１）、ＥＰ１３２９４６２（Ａ１）、およびＥＰ１７１０２５０（Ａ１）（それぞれの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）はまた、組換え酵母由来血清アルブミン調製物の製造のために好適な方法、およびそのような調製物自体は、本発明における使用に潜在的に好適であり得ることも記載している。
【０１４８】
以下で論じられるように、酵母中での組換え血清アルブミンの製造、およびそれからの回収は、他の供給源（例えば、血漿から、または植物などの他の組換え供給源）から得られる血清アルブミン組成物と物理的に異なる組換え酵母由来血清アルブミン調製物を提供する。それらの区別は多数あり、血清アルブミンタンパク質自体の構造、ならびにアルブミンタンパク質が調製物中で共精製される付随成分の同一性および／またはレベルにおける物理的差異を含む。少なくとも部分的には、他の供給源から得られた血清アルブミンと比較して、元のアルブミン分子である組換え酵母由来血清アルブミン中のアルブミンタンパク質は、供給源によってタンパク質に課された変化および変更が比較的ないからである。
【０１４９】
アルブミンは、多数の哺乳動物および鳥類（例えば、ＷＯ２０１０／０９２１３５（特に表１）およびＷＯ２０１１／１２４７１８（特に９頁、ならびに配列番号２、４〜１９、および３１）として公開されたＰＣＴ／ＥＰ１１／０５５５７７（これらの両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に列挙されるアルブミン）に記載されており、特徴付けられている。
【０１５０】
本発明で使用するための組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、１つ以上の（いくつかの）アルブミンを含み得る。好ましくは、組成物は、ヒトアルブミン（例えば、ＡＡＡ９８７９７もしくはＰ０２７６８−１、配列番号２（成熟）、配列番号３（未成熟））、非ヒト霊長類アルブミン（例えば、チンパンジーアルブミン（例えば、予測された配列ＸＰ＿５１７２３３．２、配列番号４）、ゴリラアルブミンもしくはマカクアルブミン（例えば、ＮＰ＿００１１８２５７８、配列番号５）、齧歯類アルブミン（例えばハムスターアルブミン（例えばＡ６ＹＦ５６、配列番号６）、モルモットアルブミン（例えばＱ６ＷＤＮ９−１、配列番号７）、マウスアルブミン（例えば、ＡＡＨ４９９７１もしくはＰ０７７２４−１、バージョン３、配列番号８、もしくは成熟配列、配列番号１９）、およびラットアルブミン（例えば、ＡＡＨ８５３５９もしくはＰ０２７７０−１、バージョン２、配列番号  ９）））、ウシ科アルブミン（例えば、ウシアルブミンＰ０２７６９−１、配列番号１０）、ウマ科アルブミン、例えば、ウマアルブミン（例えば、Ｐ３５７４７−１、配列番号１１）もしくはロバアルブミン（例えば、Ｑ５ＸＬＥ４−１、配列番号１２）、ウサギアルブミン（例えばＰ４９０６５−１バージョン２、配列番号１３）、ヤギアルブミン（例えばＡＣＦ１０３９１、配列番号１４）、ヒツジアルブミン（例えばＰ１４６３９−１、配列番号１５）、イヌアルブミン（例えばＰ４９８２２−１、配列番号１６）、ニワトリアルブミン（例えば、Ｐ１９１２１−１バージョン２、配列番号１７）およびブタアルブミン（例えばＰ０８８３５−１バージョン２、配列番号１８）、から選択されるアルブミンを含む。成熟型アルブミンが、特に好ましく、当業者は、タンパク質データバンクなどの公的に入手可能な情報を使用して、および／またはＳｉｇｎａｌＰ（例えば、ＳｉｇｎａｌＰ（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：１−６））などのシグナルペプチド認識ソフトウェアを使用することによって成熟型を同定することができる。ＳｉｇｎａｌＰバージョン４．０が好ましい（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ（８）：７８５−７８６）。
【０１５１】
組換え酵母由来血清アルブミンは、好ましくは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＨＳＡドメインと同じおよび／または非常に類似した三次構造を有するタンパク質であり、ＨＳＡまたは関連ドメインと類似の特性を有する。
【０１５２】
配列番号２に開示されるようなヒトアルブミンまたはその任意の天然に存在する対立遺伝子は、本発明に従って使用するための好ましい組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質である。配列番号２は、配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされていてもよい。
【０１５３】
本発明に従って使用するための組換え酵母由来のヒト血清アルブミン調製物の特に好ましい形態は、組換え酵母由来Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ（旧Ａｌｂｕｃｕｌｔ（登録商標））、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム（旧Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標））および／またはＡｌｂＩＸ（登録商標）（すべてＡｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄ．から）の既知の商業的な提示物を含む。
【０１５４】
あるいは、組換え酵母由来血清アルブミンは、ＨＳＡまたはＨＳＡドメインと非常に類似した三次構造を有し、ＨＳＡまたは関連ドメインと類似の特性を有する配列を有するタンパク質であり得る。
【０１５５】
類似の三次構造は、例えば、親アルブミンの下で言及された種からのアルブミンの構造である。アルブミンの主な特性のいくつかは、ｉ）血漿体積を調節するその能力、ｉｉ）約１９日±５日の長い血漿中半減期、ｉｉｉ）リガンドへの結合、例えば、内因性分子、例えば、ビリルビン脂肪酸、ヘミン、およびチロキシンを含む、酸性、親油性化合物に対する結合性（Ｋｒａｇｈ−Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２５，６９５の表１も参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる）、ｉｖ）酸性または電気陰性特性を有する小型有機化合物に対する結合性、例えば、ワルファリン、ジアゼパム、イブプロフェン、およびパクリタキセルなどの薬物との結合性（Ｋｒａｇｈ−Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２５，６９５の表１も参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる）である。あるタンパク質または断片をアルブミンとして特徴付けるために、これらの特性のすべてが満たされる必要はない。例えば、ある断片がある特定のリガンドまたは有機化合物への結合に関与するドメインを含まない場合、そのような断片のバリアントにも、これらの特性を有することは期待できないであろう。アルブミンという用語は、バリアント、ならびに／またはアルブミンもしくはアルブミンバリアントの融合体および／もしくは接合体などの誘導体を含む。
【０１５６】
「親」または「親アルブミン」という用語は、本発明において使用され得るアルブミンバリアントを生成するために改変がなされるアルブミンを意味する。親は、天然に存在する（野生型）ポリペプチドもしくはその対立遺伝子またはそのバリアント、例えばＷＯ２０１１／０５１４８９として公開されたＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６６５７２に記載のバリアント、またはＷＯ２０１１／１２４７１８として公開されたＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５５５７７に記載のバリアントもしくは誘導体であり得る。
【０１５７】
「バリアント」という用語は、１つ以上の（いくつかの）位置に改変、すなわち、置換、挿入、および／または欠失を含む、親アルブミンに由来するポリペプチドを意味する。置換とは、ある位置を占めるアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味し、欠失は、ある位置を占めるアミノ酸の除去を意味し、挿入とは、ある位置を占めるアミノ酸に隣接して１〜３個のアミノ酸を付加することを意味する。改変ポリペプチド（バリアント）は、親アルブミンをコードするポリヌクレオチド配列の修飾によるヒトの介入により得ることができる。
【０１５８】
組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質、特に、ヒトアルブミンは、バリアント、またはアルブミンもしくはアルブミンバリアントの接合の融合などの誘導体であり得る。アルブミンは、ＨＳＡ（配列番号２）に対して少なくとも７０％の同一性、より好ましくは、ＨＳＡに対して少なくとも７２、７３、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％の同一性を有することが好ましい。アルブミンバリアントは、配列表に提供されるものなどの親アルブミン、特に配列番号２と比較して、１つ以上の点（いくつか）の突然変異体、例えば、Ｋ５７３Ｐ、Ｋ５７３Ｙ、Ｋ５７３Ｗ、Ｋ５００Ａを有し得る（突然変異体は、配列番号２に関して記載されており、当業者は、本明細書に記載のＥＭＢＯＳＳソフトウェアを使用して、配列番号２に対してアルブミン配列を整列させることにより、他のアルブミンにおける同等の突然変異体を同定することができる）。配列番号２と約７０〜８０％の同一性を有するアルブミン（例えばマウスアルブミン、例えば配列番号１９）については、カチオンが少なくとも２５０ｍＭから存在することがより好ましい。
【０１５９】
バリアントアルブミンは、配列番号２に対して、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性であり、親アルブミンまたはＨＳＡと類似の三次構造の主な特性のうちの少なくとも１つを維持する。
【０１６０】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）、好ましくはバージョン５．０．０もしくはそれ以降のＮｅｅｄｌｅプログラムに実施されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を使用して決定される。使用されるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）「最長同一性」というラベルが付けられたＮｅｅｄｌｅの出力を、パーセント同一性パーセントとして用い、以下のとおりに計算する：（同一残基数×１００）／（アラインメント長−アラインメント内のギャップの総数）。
【０１６１】
バリアントは、親アルブミンと比較して、内皮、上皮、および／または中皮単細胞層を横切って、ＦｃＲｎに対する変化した結合親和性および／またはトランスサイトーシスの変化した速度を有し得る。バリアントポリペプチド配列は、好ましくは天然には見出されないものである。バリアントは、例えば、アルブミンの少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４５０、５００、５５０の隣接アミノ酸を含むか、またはそれらからなる断片を含む。
【０１６２】
「野生型」（ＷＴ）アルブミンという用語は、動物または人間に天然に見出されるアルブミンと同じアミノ酸配列を有するアルブミンを意味する。配列番号２は、ホモサピエンス由来の野生型アルブミンの一例である。
【０１６３】
一実施形態によれば、組換え酵母由来血清アルブミン調製物（最も好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける組換えＤＮＡ発現に由来する）は、以下の特性：
（１）０．５％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは０．４％、０．３％、０．２％、もしくは０．１５％未満が、コンカナバリンＡへ結合すること、および／または
（２）０．６モルのヘキソース／タンパク質１モル未満、好ましくは０．１０、０．０７５、もしくは０．０５モルのヘキソース／タンパク質１モル未満の糖化レベル、のうちの１つ以上を示す組換え酵母由来血清アルブミンを含む。
【０１６４】
適切なコンカナバリンＡアッセイは、例えば、ＷＯ２０００／０４４７７２に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
組換え酵母由来血清アルブミン調製物（最も好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける組換えＤＮＡ発現に由来する）は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、より好ましくは少なくとも９９．５％の単量体および二量体、好ましくは本質的に１００％の単量体および二量体であり得る。最大０．５％、好ましくは０．２％の三量体が許容されるが、より大きな形態のアルブミンは、一般に存在しない。
【０１６６】
ある特定の好ましい実施形態において、組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、
ｉ．Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄ．から市販のＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム（旧Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標））生成物、または第１の特に好ましい実施形態において以下に記載されるような、それに類似である調製物。
ｉｉ．Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄ．から市販のＲｅｃｏｍｂｕｍｉｍ（登録商標）アルファ（旧Ａｌｂｕｃｕｌｔ（登録商標））生成物、または第２の特に好ましい実施形態において以下に記載されるような、それに類似の調製物、または
ｉｉｉ．最も好ましくは、Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄ．から市販のＡｌｂＩＸ（登録商標）生成物、または第２の特に好ましい実施形態において以下に記載されるような、それに類似の調製物であり得る。
【０１６７】
したがって、第１の特に好ましい実施形態において、組換え酵母由来血清アルブミン調製物（最も好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの組換えＤＮＡ発現に由来する）は、Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄ．から市販のＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム（旧Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標））生成物、またはそれと同様の調製物であり、以下の特徴のうちの１つ以上により特徴付けられ得る。
ｉ．それは、１グラムのアルブミンを基準として、１００ｎｇ未満のニッケルイオンレベルを有し得る。
ｉｉ．それは、Ａｍａｄｏｒｉ生成物アッセイで測定されるように、０．６モル未満、好ましくは０．１０モル未満、０．０７５モル、もしくは０．０５モルのヘキソース／タンパク質１モル未満の糖化レベルを有し得る。
ｉｉｉ．それは、無傷の、すなわち同種の、Ｃ末端を有し得る。
ｉｖ．それは、０．５％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは０．４％、０．３％、０．２％、または０．１５％未満のｃｏｎＡ結合アルブミン含有量を有し得、
ｖ．それは、少なくとも０．８５モルのＳＨ／タンパク質１モルの遊離チオール含有量を有し得る。
ｖｉ．それは、実質的にＣ１８またはＣ２０脂肪酸を含まなくてもよく、かつ／あるいは
ｖｉｉ．組換え酵母由来血清アルブミン調製物中のタンパク質の少なくとも９９重量％、好ましくは少なくとも９９．９重量％は、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質であり得る。
【０１６８】
加えてまたはその代わりに、第１の特に好ましい実施形態によれば、組換え酵母由来血清アルブミン調製物（最も好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける組換えＤＮＡ発現に由来する）は、Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄ．から市販のＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム（旧Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標））生成物、またはこれに類似の調製物であり、以下の成分を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。
ｉ．「活性」成分としての酵母由来組換えヒトアルブミン。例えば、酵母由来酵母由来組換えヒトアルブミンは、約１０〜４００ｇ／Ｌ、例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｇ／Ｌの濃度で調製物中に存在し得る。
ｉｉ．等張性を調整するためのナトリウム（例えば、ＮａＣｌの形態で添加）。ナトリウムは、例えば、約１４５ｍＭ、±１００ｍＭ、８０ｍＭ、６０ｍＭ、４０ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ、または５ｍＭの濃度で存在し得る。
ｉｉｉ．安定剤としてのオクタノエートオクタノエートは、例えば、酵母由来組換えヒトアルブミンの１０ｇ／Ｌ濃度当たり約１．６ｍＭの濃度、例えば２００ｇ／Ｌの調製物については約３２ｍＭで存在し得る。この文脈において、「約」という用語は、記述された値の±１．０、０．８、０．６、０．４、または０．２ｍＭを意味することを意図している。
ｉｖ．例えば２００ｇ／Ｌの組換えヒトアルブミン濃度については約１５ｍｇ／Ｌの濃度で、または他の濃度の組換えヒトアルブミンについては比例的に調整される、安定化剤としてのポリソルベート８０。この文脈において、「約」という用語は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｇ／Ｌのポリソルベート８０が、組換えヒトアルブミンの１０ｇ／Ｌの濃度当たり添加されることを意味することを意図している。
ｖ．希釈剤／ビヒクルとしての水
【０１６９】
加えてまたは代替的に、第１の好ましい実施形態によれば、組換え酵母由来血清アルブミン調製物（最も好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける組換えＤＮＡ発現に由来する）は、Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄから市販のＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム（旧Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標））生成物、またはそれに類似の調製物であり、以下の特徴のうちの１つ以上（例えば、すべて）により特徴付けられ得る。
（ｉ）理論的質量±２０Ｄａ（６６４１８〜６６４５８）を示す組換えヒトアルブミンの質量分析、
（ｉｉ）例えばＬＡＬアッセイによって決定されるように、０．５０ＥＵ／ｍｌ以下（好ましくはそれ未満）のエンドトキシン含有量、
（ｉｉｉ）ＵＳＰ＜７１＞試験の要件を満たす無菌性、
（ｉｖ）例えば標準的な品質管理方法により決定されるように、６．７〜７．３のｐＨ、
（ｖ）例えばネイティブＰＡＧＥによって決定されるように、少なくとも９９．０％（ｗ／ｗ）（好ましくはそれを超える）のタンパク質純度、
（ｖｉ）例えばＧＰ  ＨＰＬＣによって決定されるように、１．０％（ｗ／ｗ）以下（好ましくはそれ未満）のアルブミンポリマー含有量、
（ｖｉｉ）タンパク質１９．０〜２１．０％のケルダール、
（ｖｉｉｉ）例えば原子吸光分析によって決定されるように、１３０〜１６０ｍＭのナトリウム含有量。
（ｉｘ）例えば可視汚染物質によって決定されるように、目に見える汚染が実質的にない、わずかに粘性のある透明なストローからアンバー色の溶液を含有する、欠陥を含まない、凍結保存および／または保存培地に添加する前のガラスバイアル中の外観、
（ｘ）例えばＥＬＩＳＡによって決定されるように、０．１５μｇ／アルブミンタンパク質１ｇ以下（好ましくはそれ未満）の宿主細胞タンパク質含有量、
（ｘｉ）例えばＣｏｎ  Ａクロマトグラフィーによって測定されるように、０．３０％（ｗ／ｗ）以下（好ましくはそれ未満）のタンパク質の組換え酵母由来血清アルブミンのＣｏｎ  Ａ結合種、
（ｘｉｉ）例えば原子吸光分光法によって測定されるように、０．５μｇ／タンパク質１ｇ以下（好ましくはそれ未満）のニッケル含有量、
（ｘｉｉｉ）例えばフレーム原子吸光分析によって測定されるように、０．０１ｍｍｏｌ／タンパク質１ｇ以下（好ましくはそれ未満）のカリウム含有量、
（ｘｉｖ）例えば、それぞれ、ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定されるように、デルタブルーマトリックス（ＤＢＡ；ＷＯ９６／３７５１５に記載されているように）浸出液：０．１μｇ／タンパク質１ｇ以下（好ましくはそれ未満）の染料フラグメント（ＤＡＡＳ）、０．１μｇ／タンパク質１ｇ以下（好ましくはそれ未満）の染料ベース、および０．４μｇ／タンパク質１ｇ以下（好ましくはそれ未満）のＤｙｅ＋スペーサ、
（ｘｖ）ＲＰ−ＨＰＬＣの０．１８μｇ／タンパク質１ｇ以下（好ましくはそれ未満）のアミノフェニルボロネート（ＰＢＡ）浸出液、（ｘｖｉ）例えばガスクロマトグラフィーによって測定されるように、約２８．８ｍＭ〜約３５．２ｍＭの範囲内のオクタノエート含有量、ならびに／または
（ｘｖｉ）例えばＳＥＣ−ＨＰＬＣによって決定されるように、約１０ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌの範囲内のポリソルベート８０の含有量。
【０１７０】
第２の特に好ましい実施形態によれば、組換え酵母由来血清アルブミン調製物（最も好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける組換えＤＮＡの発現に由来する）は、Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄ．から市販のＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ（旧Ａｌｂｕｃｕｌｔ（登録商標））生成物、またはそれに類似する調製物であり、以下の成分を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
ｉ．「活性」成分としての酵母由来組換えヒトアルブミン。例えば、酵母由来酵母由来組換えヒトアルブミンは、約１０〜４００ｇ／Ｌ、例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｇ／Ｌの濃度で調製物中に存在し得る。
ｉｉ．等張性を調整するためのナトリウム（例えば、ＮａＣｌの形態で添加）。ナトリウムは、例えば、約１４５ｍＭ、±１００ｍＭ、８０ｍＭ、６０ｍＭ、４０ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ、または５ｍＭの濃度で存在し得る。
ｉｉｉ．安定剤としてのオクタノエートオクタノエートは、例えば、酵母由来組換えヒトアルブミンの１０ｇ／Ｌ濃度当たり約０．８ｍＭの濃度、例えば１００ｇ／Ｌの調製物については約８ｍＭ、および２００ｇ／Ｌの調製物については約１６ｍＭで存在し得る。この文脈において、「約」という用語は、記述された値の±０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１ｍＭを意味することを意図している。
ｉｖ．例えば１００ｇ／Ｌの組換えヒトアルブミン濃度については約５０ｍｇ／Ｌの濃度で、または他の濃度の組換えヒトアルブミンについては比例的に調整される、安定化剤としてのポリソルベート８０。この文脈において、「約」という用語は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｇ／Ｌのポリソルベート８０が、組換えヒトアルブミンの１０ｇ／Ｌの濃度当たり添加されることを意味することを意図している。
ｖ．希釈剤／ビヒクルとしての水
【０１７１】
加えてまたは代替的に、第２の好ましい実施形態によれば、組換え酵母由来血清アルブミン調製物（最も好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける組換えＤＮＡ発現に由来する）は、Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄから市販のＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ（旧Ａｌｂｕｃｕｌｔ（登録商標））生成物、またはそれに類似の調製物であり、以下の特徴のうちの１つ以上（例えば、すべて）により特徴付けられ得る。
（ｉ）理論的質量±２０Ｄａ（６６４１８〜６６４５８）を示す組換えヒトアルブミンの質量分析、
（ｉｉ）例えばＬＡＬアッセイによって決定されるように、０．５０ＥＵ／ｍｌ以下（好ましくはそれ未満）のエンドトキシン含有量、
（ｉｉｉ）ＵＳＰ＜７１＞試験の要件を満たす無菌性、
（ｉｖ）例えば標準的な品質管理方法により決定されるように、６．４〜７．４のｐＨ、
（ｖ）例えばネイティブＰＡＧＥによって決定されるように、少なくとも９９．０％（ｗ／ｗ）（好ましくはそれを超える）のタンパク質純度、
（ｖｉ）例えばＧＰ  ＨＰＬＣによって決定されるように、１．０％（ｗ／ｗ）以下（好ましくはそれ未満）のアルブミンポリマー含有量、
（ｖｉｉ）例えば原子吸光分析によって決定されるように、１２０〜１６０ｍＭのナトリウム含有量、
（ｖｉｉｉ）例えば可視汚染物質によって決定されるように、目に見える汚染が実質的にない、わずかに粘性のある透明なストローからアンバー色の溶液を含有する、欠陥を含まない、凍結保存および／または保存培地に添加する前のガラスバイアル中の外観、
（ｉｘ）ＥＬＩＳＡにより測定して、アルブミン１グラム当たり約２００ｎｇもしくは１５０ｎｇ未満以下（好ましくはそれ未満）の宿主細胞タンパク質含有量、例えば約１５ｎｇ／アルブミン１ｇ以下のＹＡ５３Ｍ、および／もしくは約１５０ｎｇ／アルブミン１ｇ以下のＹＡ５３Ｈ、ならびに／または
（ｘ）例えばＣｏｎ  Ａクロマトグラフィーによって測定されるように、０．３０％（ｗ／ｗ）以下（好ましくはそれ未満）のタンパク質の組換え酵母由来血清アルブミンのＣｏｎ  Ａ結合種。
【０１７２】
第３の実施形態によれば、組換え酵母由来血清アルブミン調製物（最も好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける組換えＤＮＡの発現に由来する）は、Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄ．から市販のＡｌｂＩＸ（登録商標）生成物、またはそれに類似する調製物であり、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質、溶媒、少なくとも１７５ｍＭのカチオンを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得、約５．０〜約９．０のｐＨを有し、調製物は、３０ｍＭ以下のオクタノエートを含む。
【０１７３】
第３の実施形態の調製物は、カチオンを平衡させるためにアニオンを含有することが好ましい。
【０１７４】
第３の実施形態の調製物中の溶媒は、水などの無機溶媒、またはリン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどのリン酸緩衝液のような無機緩衝液、または酢酸ナトリウムもしくはクエン酸ナトリウムなどの有機緩衝液であり得る。緩衝液は、ｐＨを安定化し得る。リン酸ナトリウム（例えばＮａＨ２ＰＯ４）は、ｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０などの好ましいｐＨ緩衝液である。
【０１７５】
第３の実施形態の調製物は、低レベルのオクタノエートを含む。例えば、調製物が、３０ｍＭ未満のオクタノエート、より好ましくは約２８、２６、２４、２２、２０、１８、１６、１５、１４、１２、１０、８ｍＭ未満のオクタノエート、さらにより好ましくは約６、５、４、３ｍＭ未満のオクタノエート、最も好ましくは約２未満、１、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０１、または０．００１ｍＭのオクタノエートを含むことが好ましい。調製物が、オクタノエートを実質的に含まないことが好ましい。最も好ましくは、調製物は、オクタノエートを含まない（０ｍＭのオクタノエート）。
【０１７６】
第３の実施形態の調製物における脂肪酸の好ましいパラメータを、以下に提供する。脂肪酸含有量は、好ましくは複数の試料、例えば２、３、４、または５つの試料の平均である。
【表１】
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【０１７７】
第３の実施形態の調製物の全脂肪酸含有量は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ以下、より好ましくは１５、１０、５、４、３、２、または１ｍＭ以下であることも好ましい。組成物が、脂肪酸を実質的に含まない、より好ましくは脂肪酸を含まないことがより好ましい。
【０１７８】
１００ｇ．Ｌ−１のアルブミン、１ｍＭ以下のオクタノエート、２５０ｍＭのＮａ＋を含み、約６．５のｐＨを有する、第３の実施形態の酵母由来組換えアルブミン調製物の脂肪酸プロファイルおよび金属イオンプロファイルを、それぞれ、図９および図１０に提供する。これらは、第３の実施形態の酵母由来組換えアルブミン調製物の特に好ましいプロファイルである。アルブミン調製物は、図９および図１０のプロファイルのいずれかまたは両方に適合し得る。
【０１７９】
カチオンは、少なくとも約１７５ｍＭ、例えば少なくとも約２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００ｍＭの第３の実施形態の酵母由来組換えアルブミン調製物中に存在することが好ましい。好ましい最大カチオン濃度は、１０００、９５０、９００、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５７５、５５０、５２５、５００、４７５、４５０、４２５、４００、３７５、３５０、３２５、３００、２７５、および２５０ｍＭを含む。好ましいカチオン濃度は、２００〜５００ｍＭを含む。より好ましいのは、約２００〜３５０ｍＭのカチオン濃度である。最も好ましいのは、約２５０ｍＭのカチオン濃度である。
【０１８０】
第３の実施形態の酵母由来組換えアルブミン調製物のｐＨは、約５．０〜約９．０、例えば、約５．０、５．２５、５．５、５．７５、６．０、６．２５、６．５、６．７５、７．０、７．２５、７．５、７．７５、８．０、８．２５、または８．５〜約５．５、５．７５、６．０、６．２５、６．５、６．７５、７．０、７．２５、７．５、７．７５、８．０、８．２５、８．５、８．７５、または９．０であり得る。ｐＨは、約５．０〜８．０、例えば約６．０〜約８．０、より好ましくは約６．０〜約７．０、または６．０〜６．５であることが好ましい。最も好ましいｐＨは、約６．５である。
【０１８１】
第３の実施形態の酵母由来組換えアルブミン調製物のカチオンは、任意のカチオンによって提供され得、以下に記載されるような１つ以上（いくつか）のクラスまたは種によって提供され得る。例えば、カチオンは、一価または二価、単原子または多原子であり得、１つ以上（いくつか）のアルカリ金属（ナトリウム、カリウムなど）、アルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウムなど）、またはアンモニウムによって提供され得る。カチオンは、ナトリウムおよび／またはカリウムおよび／またはマグネシウム、最も好ましくはナトリウムまたはマグネシウムによって提供されることが好ましい。
【０１８２】
カチオンは、無機酸の塩（例えば、塩化ナトリウムなどの第１族または２族の金属またはアンモニウム塩）、２価の酸の塩（例えば、硫酸ナトリウムなどの、第１族または２族の金属またはアンモニウムスルファートまたはホスフェート）、または有機酸の塩（例えば、酢酸ナトリウムなどの酢酸塩またはクエン酸塩の第１族または２族の金属またはアンモニウム塩）によって第３の実施形態の酵母由来組換えアルブミン調製物に提供され得る。
【０１８３】
第３の実施形態の酵母由来組換えアルブミン調製物中のアルブミンを安定化するために使用されるカチオンおよびアニオンは、（ｉ）塩および／または（ｉｉ）本明細書に記載される、ｐＨ緩衝液によって提供され得る。したがって、２種または３種など、１種を超える（いくつかの）種のカチオンまたはアニオンが存在し得る。単一のカチオンの１種を超える（いくつか）の供給源、例えば、ｐＨ緩衝液（例えばリン酸ナトリウム）および塩（例えばＮａＣｌ）の両方によって提供され得るＮａが存在し得る。
【０１８４】
第３の実施形態の酵母由来組換えアルブミン調製物に有用なアニオンとしては、ホスフェートなどの無機アニオン、および塩化物などのハロゲン化物、ならびに酢酸塩およびクエン酸塩などの有機アニオンが挙げられる。アニオンは、一価または二価、単原子または多原子のいずれかであり得る。好ましいアニオンとしては、硫酸塩、酢酸リン酸塩、および塩化物、特に塩化物、硫酸塩、および酢酸塩が挙げられる。
【０１８５】
したがって、第３の実施形態の酵母由来組換えアルブミン調製物は、アルカリ金属リン酸塩または塩化物（例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、または塩化カリウム）、アルカリ土類金属リン酸塩（リン酸カルシウム、リン酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなど）またはリン酸アンモニウムもしくは塩化アンモニウムを１つ以上（いくつか）含み得る。
【０１８６】
第３の実施形態の酵母由来組換えアルブミン調製物は、少なくとも１７５ｍｍｏｌ．Ｌ−１の全体的なイオン強度を有し得る。例えば、約１７５ｍｍｏｌ．Ｌ−１〜１０００ｍｍｏｌ．Ｌ−１、例えば、約１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００ｍｍｏｌ．Ｌ−１〜約１０００、９５０、９００、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５７５、５５０、５２５、５００、４７５、４５０、４２５、４００、３７５、３５０、３２５、３００、２７５、２５０ｍｍｏｌ．Ｌ−１。より好ましいのは、約２００〜３５０ｍｍｏｌ．Ｌ−１の全イオン強度である。最も好ましいのは、約２５０ｍｍｏｌ．Ｌ−１のイオン強度である。
【０１８７】
第３の実施形態の酵母由来組換えアルブミン調製物が、２０ｍｇ．Ｌ−１未満の洗剤（例えば、ポリソルベート８０）、好ましくは１５ｍｇ．Ｌ−１未満、１０、５、４、３、２、１、０．５、０．１、０．０１、０．００１ｍｇ．Ｌ−１の洗剤（例えば、ポリソルベート８０）であることが好ましい。さらにより好ましくは、調製物は、洗剤（例えば、ポリソルベート８０）を実質的に含まない。最も好ましくは、調製物は、洗剤（例えば、ポリソルベート８０）を含まない。洗剤（例えば、ポリソルベート８０）のレベルは、当業者に公知の技術、例えば、限定されないが、ＷＯ２００４／０９９２３４（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるアッセイによってアッセイされ得る。
【０１８８】
第３の実施形態の酵母由来組換えアルブミン調製物は、低レベルのアミノ酸（例えばＮ−アセチルトリプトファン）を有するか、アミノ酸（例えばＮ−アセチルトリプトファン）を実質的に含まないか、またはアミノ酸（例えばＮ−アセチルトリプトファン）を含まない、アルブミン組成物であり得る。第３の実施形態の酵母由来組換えアルブミン調製物は、５ｍＭ未満のアミノ酸（例えばＮ−アセチルトリプトファン）、好ましくは４ｍＭ未満、３、２、１、０．５、０．１、０．０１、０．０１、０．００５、０．００１ｍＭのアミノ酸（例えば、Ｎ−アセチルトリプトファン）を含むことが好ましくあり得る。さらにより好ましくは、第３の実施形態の酵母由来組換えアルブミン調製物は、アミノ酸（例えば、Ｎ−アセチルトリプトファン）を実質的に含まない。最も好ましくは、調製物は、アミノ酸（例えば、Ｎ−アセチルトリプトファン）を含まない。
【０１８９】
第３の実施形態の酵母由来組換えアルブミン調製物は、オクタノエート、アミノ酸（例えばＮ−アセチルトリプトファン）、および洗剤（例えば、ポリソルベート８０）を実質的に含まないか、または完全に含まないことがさらにより好ましい。
【０１９０】
第３の実施形態の酵母由来組換えアルブミン調製物の安定性は、水中または１５０ｍＭのＮａ中で同等のアルブミンの安定性よりも高いことが好ましい。特にアルブミンの不溶性凝集体の形成に関する安定性を比較するための１つの方法は、
ｉ）アルブミン調製物のアリコート（例えば１ｍＬ）をキュベット（例えば、Ｓａｒｓｔｅｄｔ  １０×４×４５ｍｍなどのポリスチレンキュベット）に入れる、
ｉｉ）予め平衡化され、所望の温度、例えば６５℃に制御されている温度制御分光光度計にキュベットを入れる、
ｉｉｉ）所定の間隔（例えば１８秒）で読みを取ることによって、所望の期間（例えば２時間）にわたって空のキュベットに対して参照される３５０ｎｍでの組成物の吸光度をモニター／測定する、
ｉｖ）最初のいくつかの（例えば７つの）データポイントを取ってデータを処理し、データポイントの読みを平均し、すべてのデータポイントからこのデータポイントを差し引いて約０の基本吸光度値を得る、
ｖ）処理された吸光度値がこのベースラインより０．１ＡＵ（吸光度単位）増加するのにかかる時間を決定および／または記録する。
安定性分析は二重に行われることが好ましい。
第３の実施形態の酵母由来組換えアルブミン調製物の安定性は、１５０ｍＭのＮａまたは水などの溶媒中の同じ濃度のアルブミンの対照溶液と比較し、同じ条件下で測定された、測定された吸光度がベースラインを超えて０．１ＡＵ増加するのにかかる時間（６５℃で行われる上記の試験に従って）が、少なくとも１０％良好であるのに十分に高いことが好ましい。安定性は、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％良好であることがより好ましい。
【０１９１】
特にアルブミンの可溶性凝集体の形成に関する代替的または追加的な安定性試験は、設定温度で経時的にＧＰ−ＨＰＬＣによって可溶性アルブミンポリマーの形成をモニターすることである。ＧＰ  ＨＰＬＣによる測定による１つの適切な安定性試験は、以下を含む。
ｉ）調査する各試料の１０ｍＬを滅菌する（例えば、滅菌０．２２μｍフィルタを通して濾過する）滅菌バイアル（例えば、焼成１０ｍＬガラスバイアル）に入れ、次いでこれに栓をする（例えば、滅菌ブチルゴムシールを用いて、任意に、過密封）。
ｉｉ）次いで、約２００μＬのＴ０試料を採取し、バイアルを特定の温度（例えば、特定の温度（例えば、約４０℃）に設定される水浴中に入れた）でインキュベートする。
ｉｉｉ）次いで、ある特定の時点（例えば１４日）後に各バイアルから試料（約２００μＬ）を採取する。
ｉｖ）バイアルから取り出したアルブミン試料のアリコート（例えば２５μＬ）をＧＰ−ＨＰＬＣカラム（例えば内径７．８ｍｍ×長さ３００ｍｍのＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム、（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に内径６．０ｍｍ、長さ４０ｍｍのＴＳＫ  ＳＷガードカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を用いて注入する、
ｖ）アリコートを、適切な緩衝液（例えば、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの硫酸ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、ｐＨ７．０）中で適切な速度（例えば１ｍＬ／分）でクロマトグラフする
ｖｉ）例えば２８０ｎｍでのＵＶ検出によってクロマトグラフ手順を監視する、
ｖｉｉ）アリコートの単量体、二量体、三量体、およびポリマー含有量のうちの１つ以上（いくつか）、またすべてを％（ｗ／ｗ）として、総ピーク面積に対するそれらのそれぞれのピーク面積を特定することによって定量化する。
【０１９２】
試験は３回実施することが好ましい。
【０１９３】
したがって、第３の実施形態の酵母由来組換えアルブミン調製物は、上記の試験の一方または両方において定義される、安定性を有することが好ましい。
【０１９４】
第３の実施形態の好ましい酵母由来組換えアルブミン調製物は、５０〜２５０ｇ．Ｌ−１の酵母由来組換えアルブミンタンパク質、２００〜３００ｍＭのＮａ＋（例えば、２２５〜２７５ｍＭのＮａ＋）、２０〜３０ｍＭのリン酸塩を含み、２ｍＭ未満のオクタノエートを含み、約６．０〜７．０のｐＨ（例えば、約ｐＨ６．５）を有する。特に好ましい調製物は、５０〜１５０ｇ．Ｌ−１の酵母由来組換えアルブミンタンパク質、２２５〜２７５ｍＭのＮａ＋、２０〜３０ｍＭのリン酸塩を含み、１ｍＭ未満のオクタノエートを含み、約６．５のｐＨを有する。
【０１９５】
第３の特に好ましい実施形態によれば、組換え酵母由来血清アルブミン調製物（最も好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける組換えＤＮＡ発現に由来する）は、Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄ．から市販のＡｌｂＩＸ（登録商標）生成物、またはそれに類似の調製物であり、以下の成分を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなり得る。
ｉ．「活性」成分としての酵母由来組換えヒトアルブミン。例えば、酵母由来酵母由来組換えヒトアルブミンは、約１０〜４００ｇ／Ｌ、例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｇ／Ｌの濃度で調製物中に存在し得る。
ｉｉ．等張性を調整するためのナトリウム（例えば、ＮａＣｌの形態で添加）。ナトリウムは、例えば、少なくとも約１５０ｍＭ、より典型的には約２００〜約３００ｍＭの濃度で存在し得る。
ｉｉｉ．希釈剤／ビヒクルとしての水または緩衝液。
ｉｖ．オクタノエート、アミノ酸（例えば、Ｎ−アセチルトリプトファン）および洗剤（例えば、ポリソルベート８０）を実質的に含まないか、または完全に含まない。
【０１９６】
加えてまたは代替的に、第３の好ましい実施形態によれば、組換え酵母由来血清アルブミン調製物（最も好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける組換えＤＮＡ発現に由来する）は、Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄから市販のＡｌｂＩＸ（登録商標）生成物、またはそれに類似の調製物であり、以下の特徴のうちの１つ以上（例えば、すべて）により特徴付けられ得る。
（ｉ）例えばネイティブＰＡＧＥによって決定されるように、少なくとも９９．０％（ｗ／ｗ）（好ましくはそれを超える）の組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質の純度、
（ｉｉ）例えばＵＳＰ＜８５＞試験によって決定されるように、０．５０ＥＵ／ｍｌ以下（好ましくはそれ未満）、より好ましくは０．０１ＥＵ／ｍｇ以下（好ましくはそれ未満）のエンドトキシン含有量の組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質、
（ｉｉｉ）例えばＵＳＰ＜７９１＞試験によって決定されるように、６．０〜７．０のｐＨ、
（ｉｖ）例えば原子吸光分光法によって決定されるように、２００〜３００ｍＭのナトリウム含有量、
（ｖ）例えば目視検査によって決定されるように、透明で淡いストローから琥珀色の溶液である外観、
（ｖｉ）例えばＣｏｎ  Ａクロマトグラフィーによって決定されるように、０．３０％（ｗ／ｗ）以下（好ましくはそれ未満）のタンパク質の、組換え酵母由来血清アルブミンのＣｏｎ  Ａ結合種。
【０１９７】
誤解を避けるために、本明細書で使用される「組換え酵母由来血清アルブミン調製物」という用語は、具体的には、血漿由来アルブミン生成物を除外する。それはまた、植物における組換え発現などによって、非酵母源に由来する組換えアルブミン生成物を特に除外する。
【０１９８】
歴史的に、血清アルブミン調製物の製造のためのヒトアルブミンを調達する古典的な方法は、それをヒト血液から精製し、それによって血漿由来血清アルブミン調製物を作り出すことであった。血漿から得られたヒトアルブミンは、米国では連邦規制基準（ＣＦＲ）タイトル２１、食品医薬品局、第１章−Ｆｏｏｄ  Ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｓｕｂｃｈａｐｔｅｒ  Ｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｐａｒｔ  ６４０  Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｕｂｐａｒｔ  Ｈ  Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｈｕｍａｎ）、セクション６４０．８０〜８６によって解釈されている。この標準は、ほとんど要件を有していないが、例えば、（ｉ）製剤は、安定剤（複数可）として存在する、タンパク質１グラム当たり０．０８±０．０１６ミリモルのカプリル酸ナトリウム（すなわちオクタン酸ナトリウム）または０．０８±０．０１６ミリモルのアセチルトリプタン酸ナトリウムおよび０．０８±０．０１６ミリモルのカプリル酸ナトリウムを含有しなければならない、（ｉｉ）製剤は、６０±０．５℃の到達温度で少なくとも１０、または１１時間を超えて連続的に加熱することによって熱処理されなければならない、（ｉｉｉ）タンパク質組成は、最終生成物中の全タンパク質の少なくとも９６％アルブミンでなければならない、（ｉｖ）ｐＨは、０．１５モルの塩化ナトリウムでタンパク質１パーセントの濃度に希釈した最終生成物の溶液中で測定したとき、６．９±０．５でなければならない、（ｖ）最終生成物のナトリウム濃度は、１リットル当たり１３０〜１６０ミリグラム当量でなければならない、（ｖｉ）最終生成物のカリウム濃度は、１リットル当たり２ミリグラム当量を超えてはならない、（ｖｉｉ）この加熱を受けていない同じロットからの、試料からなるその対照と比較したとき、５７℃で５０時間加熱した後に、目視検査によって判定されるように、最終容器試料が変化しないときに示されるように、熱安定性を実証しなければならないことを特定する。
【０１９９】
米国薬局方（ＵＳＰ）とは、その要件の基礎として上記のＣＦＲ登録を指し、健常なヒトドナーから材料（供給源の血液、血漿、血清または胎盤）、Ｂ型肝炎表面抗原の不在について試験されている供給源の材料を分画することによって得られた血清アルブミンの無菌非発熱性調製物としての生成物を指す。安定剤としてカプリル酸ナトリウムを含むか、または含まないアセチルトリプトファン酸ナトリウム、および１Ｌ当たり少なくとも１３０ｍＥｑおよび１Ｌ当たり１６０ｍＥｑ以下のナトリウム含有量を含むことが述べられている。４０３ｎｍの波長で測定された、１ｃｍの保持細胞中で１パーセントのタンパク質を含有するように希釈された溶液の吸光度が０．２５以下であるようなヘム含有量を有すると述べられている。
【０２００】
欧州薬局方（ＥＰ）のモノグラフ０２５５は、血漿から得られたタンパク質の水溶液としてヒトアルブミン溶液を記載しており、これは分画のための血漿に関するモノグラフの要件、ヒト（０８５３）に準拠している。カプリル酸ナトリウム（オクタン酸ナトリウム）またはＮ−アセチルトリプトファンまたはこれら２つの組み合わせのような熱の影響に対する好適な安定剤を含むことが特定されている。調製物がバクテリア保持フィルタを通過し、無菌容器に無菌的に分配されることを含む方法によって調製物が生成されることを特定し、その後、その最終容器中の溶液を、６０±１．０℃に加熱し、この温度に１０時間以上維持する。次いで、容器を３０〜３２℃で１４日以上または２０〜２５℃で４週間以上インキュベートし、微生物汚染の証拠について視覚的に検査する。
【０２０１】
すべての場合において、血漿由来血清アルブミン調製物についてのＣＦＲ、ＵＳＰ、およびＥＰは、少量の他の血漿タンパク質および他の混入物の存在を示すことを許可されている。例えば、血漿由来血清アルブミン調製物は、典型的には、以下を含む。
・単量体ヒトアルブミンとは異なる、最大４％、または５％の供給源由来タンパク質。
・（下記の方法により決定される）０．１５以下であるヘム含有量、
・最大３５ＩＵ／ｍｌのプレカリクレイン活性化因子の含有量、
・１リットル当たり最大２００μｇのアルミニウム、
・タンパク質１グラム当たり最大０．０５ｍｍｏｌのカリウム、および
・ナトリウム：１リットル当たり最大１６０ｍｍｏｌのＮａ。
【０２０２】
アルブミン調製剤中のヘム含有量は、以下の方法を用いて試験することができる。１０ｇ／ｌのタンパク質を含む溶液を得るために、９ｇ／ｌの塩化ナトリウムＲの溶液を用いて試験する調製物を希釈する。溶液の吸光度は、補償液として水Ｒを用いて４０３ｎｍで測定した。
【０２０３】
アルブミン調製剤中のアルミニウム含有量は、以下の方法を用いて試験することができる。原子吸光分析：原子発生器として炉を使用する。溶液を調製するためにプラスチック容器を使用する。使用前に装置を硝酸（２００ｇ／ｌのＨＮＯ３）で洗浄する。試験液：試験する調製剤を使用する。検証溶液：アルミニウム検証ＢＲＰについてはヒトアルブミンを使用する。参照溶液：既知体積の水Ｒに好適な体積のアルミニウム標準溶液（１０ｐｐｍ  Ａｌ）Ｒを加えることによって好適な範囲の参照溶液を調製する。１．７ｇ／ｌの硝酸マグネシウムＲおよび０．０５パーセントＶ／Ｖのオクトキシノール１０Ｒを含有する硝酸（１０ｇ／ｌのＨＮＯ３）を用いて必要に応じて溶液を希釈する。３０９．３ｎｍで吸光度を測定する。アルミニウム検証ＢＲＰについては、ヒトアルブミンについて決定されたアルミニウム含有量が、参照調製物に添付のリーフレットに記述された値の２０％以内である場合、試験は有効である。
【０２０４】
アルブミン調製物中のカリウム含有量は、原子発光分析法、波長：７６６．５ｎｍを用いて試験することができる。
【０２０５】
アルブミン調製物中のナトリウム含有量は、原子発光分析法、波長５８９ｎｍを用いて試験することができる。
【０２０６】
組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質およびその調製物は、「無血清」である。すなわち、組換え酵母由来血清アルブミンは、血清（例えば、ヒト血清、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウマ血清、ヤギ血清、または当業者に知られている任意の他の動物由来血清）を含まない。したがって、組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、出発物質中に存在しないので、一般に、血清由来汚染物質を全く含まないであろう。
【０２０７】
組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質およびその調製物は、血液、血漿、血清、または胎盤などの血清アルブミンの天然に存在する生物学的供給源からの血清アルブミンの調製に使用される供給源材料から特に由来する成分を含まない。供給源材料に特に由来する成分には、ヘム、プレカリクレイン活性化因子、ならびに／または血液、血漿、血清、もしくは胎盤などの血清アルブミンの天然に存在する生物学的供給源から由来する、他の非アルブミンタンパク質、ペプチド、もしくはアミノ酸が含まれる。血液、血漿、血清、または胎盤などの血清アルブミンの天然に存在する生物学的供給源からの血清アルブミンの調製物はまた、発熱物質および／または内毒素も含み得る。それらはまた、病気を引き起こし得るウイルス（Ｃ型肝炎を含む）のような感染性物質も含み得る。典型的には、そのような生成物が感染性病原体を伝播する危険性は、ある特定のウイルスへの以前の曝露について血漿ドナーをスクリーニングすることによって、ある特定の現在のウイルス感染の存在について試験することによって、ならびにある特定のウイルスを不活化および／または除去することによって低減されているが、これらの手段に関わらず、そのような生成物は、依然として潜在的に病気を伝播し得る。未知の感染因子がそのような生成物中に存在し得るという可能性もある。
【０２０８】
対照的に、例えば、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質およびその調製物は、ヘムがなくてもよく、一方、ヘムは、例えば溶液の吸光度によって試験され、１ｃｍの保持細胞中に１パーセントのタンパク質を含有するように希釈され、４０３ｎｍの波長で測定されるとき、血漿由来血清アルブミン調製物中で検出されるであろう。
【０２０９】
組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質およびその調製物は、プレカリクレイン活性化因子を含まなくてもよいが、プレカリクレイン活性化因子は、血漿由来血清アルブミン調製物中で検出されるであろう。
【０２１０】
発熱物質は、血漿由来血清アルブミン調製物中で検出され得るが、発熱物質は、典型的には、本発明における使用のために、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質およびその調製物中ではるかに低いレベルである。
【０２１１】
組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質およびそれらの調製物、ならびにそれらから調製され、本発明に従って使用される培地（例えば、凍結保存培地および／または保存培地）は、ヒトウイルス（Ｃ型肝炎を含む）を含まなくてよいが、一方、ヒトウイルス（Ｃ型肝炎を含む）は、血漿由来血清アルブミン調製剤中で検出され得る。
【０２１２】
組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質およびそれらの調製物、ならびにそれらから調製され、本発明に従って使用される培地（例えば、凍結保存培地および／または保存培地）は、低レベルのオクタノエートを含み得る。例えば、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、３．０、２．５、２．０、１．５、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０２、０．０１、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．０４、０．００３、０．００２、または０．００１ｍＭ未満のオクタノエートを含むか、オクタノエートを実質的に含まないか、またはオクタノエートを含まない（０ｍＭのオクタナート）ことが好ましくあり得る。対照的に、血漿由来血清アルブミン調製物は、典型的には、タンパク質１グラム当たり０．０８±０．０１６ミリモルのカプリル酸ナトリウムを含有する（２０％ｗ／ｖの血漿由来血清アルブミン調製物については、これは１６ｍＭ±３．２ｍＭのカプリル酸ナトリウム濃度に対応し、４％ｗ／ｖの血漿由来血清アルブミン調製物については、これは３．２ｍＭ±０．６４ｍＭのカプリル酸ナトリウム濃度に対応する）。
【０２１３】
組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質およびそれらの調製物、ならびにそれらから調製され、本発明に従って使用される培地（例えば、凍結保存培地および／または保存培地）は、低レベルのＮ−アセチルトリプトファンを含み得る。例えば、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、３．０、２．５、２．０、１．５、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．０４、０．００３、０．００２、または０．００１ｍＭ未満のＮ−アセチルトリプトファンを含むか、Ｎ−アセチルトリプトファンを実質的に含まないか、またはＮ−アセチルトリプトファンを含まない（０ｍＭのＮ−アセチルトリプトファン）ことが好ましくあり得る。対照的に、血漿由来血清アルブミン調製物は、典型的には、タンパク質１グラム当たり０．０８±０．０１６ミリモルのＮ−アセチルトリプトファンを含有する（２０％ｗ／ｖの血漿由来血清アルブミン調製物については、これは１６ｍＭ±３．２ｍＭのＮ−アセチルトリプトファン濃度に対応し、４％ｗ／ｖの血漿由来血清アルブミン調製物については、これは３．２ｍＭ±０．６４ｍＭのＮ−アセチルトリプトファン濃度に対応する）。
【０２１４】
本発明に従って使用するための酵母由来組換えアルブミン調製物、ならびにそれから調製され、本発明に従って使用される培地（例えば、凍結保存培地および／または保存培地）は、Ｎ−アセチルトリプトファンを実質的に含まないか、またはオクタノエートおよびＮ−アセチルトリプトファンを完全に含まないことがさらにより好ましくあり得る。
【０２１５】
さらに、典型的には、本発明に従って凍結保存培地および／または保存培地の形成に使用される組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびにそれから調製され、本発明に従って使用される培地（例えば、凍結保存培地および／または保存培地）は、２００μｇ．Ｌ−１未満、例えば、１８０μｇ．Ｌ−１、１６０μｇ．Ｌ−１、１４０μｇ．Ｌ−１、１２０μｇ．Ｌ−１、１００μｇ．Ｌ−１、９０μｇ．Ｌ−１、８０μｇ．Ｌ−１、７０μｇ．Ｌ−１、６０μｇ．Ｌ−１、５０μｇ．Ｌ−１、または４０μｇ．Ｌ−１未満、より典型的には、約１０μｇ．Ｌ−１〜約３０μｇ．Ｌ−１の範囲内のアルミニウム濃度を有する。
【０２１６】
したがって、本発明で使用するための組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、血液、血漿、血清、または胎盤などの血清アルブミンの天然に存在する生物学的供給源から得られた血清アルブミン組成物と物理的に異なる。
【０２１７】
本発明で使用するための組換え酵母由来血清アルブミン調製物はまた、（例えば、植物における組換え発現によって）他の供給源から得られた血清アルブミン組成物とは物理的に異なる。少なくとも部分的には、他の供給源から得られた血清アルブミンと比較して、組換え酵母由来血清アルブミン中のアルブミンタンパク質は、供給源によってタンパク質に課された変化および変更が比較的ないからである。
【０２１８】
例えば、血漿由来血清アルブミン調製物および組換え植物由来血清アルブミン調製物は、典型的には、アルブミンタンパク質から１つ、またはより一般的には２つのＮ末端アミノ酸を失うことが知られている。理論によって拘束されるものではないが、これは血漿由来血清アルブミン調製物および組換え植物由来血清アルブミン調製物の製造に使用される製造プロセスにおける加熱の使用によるものですると考えられる。対照的に、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、典型的には、無傷のＮ末端アミノ酸配列を有する。したがって、本発明で使用するための組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質およびその調製物は、無傷または実質的に無傷のＮ末端配列を有することが好ましくあり得る。その点に関して、タンパク質は、１．５％の定量レベルで無傷な質量分析を用いて試験したとき、Ｎ末端の喪失が観察されない場合、無傷なＮ末端配列を有すると定義され得る。
【０２１９】
さらに、実施例５のデータは、組換え酵母由来血清アルブミン調製物および組換え植物由来血清アルブミン調製物における明らかな物理的差異を実証する。
【０２２０】
より具体的には、実施例５に示されるように、酵母由来血清アルブミン調製物の質量分析プロファイリングは、還元Ｃｙｓ３４残基と共に、主に天然の無傷なヒト血清アルブミン分子を含む組換え酵母由来血清アルブミン調製物を表す約６６．４ｋＤａの単一種を示す。本出願の図１に示されるように、無傷な質量分析によって試験されたすべての組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、天然の無傷なヒト血清アルブミン分子を表す約６６．４ｋＤａの単一の主要ピーク、および非常に低レベルの他のピークを示した。対照的に、試験した２つの組換え植物由来血清アルブミン調製物は、天然の無傷なヒト血清アルブミン分子を表す約６６．４ｋＤａの主要ピークとは異なる多数のピークを示した。
【０２２１】
したがって、本発明に従って使用される酵母由来組換え血清アルブミン調製物は、質量分析法によって試験したとき、（例えば図１に示される試料などの組換え植物由来血清アルブミンタンパク質と比較して）天然の無傷なヒト血清アルブミン分子を表す約６６．４ｋＤａの主要ピークとは異なる、実質的に少ないピーク（例えば、５０％よりも低い、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、またはそれ以下など）を示す生成物である調製物であることが好ましくあり得る。
【０２２２】
さらに、実施例５に示されるように、異なる組換え血清アルブミン生成物は、異なるレベルの色素沈着を示す。図３に示される画像は、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライムおよびＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファが評価された生成物の中で最も着色が少ないことを示しており、どちらの生成物も透明／麦わら色をしている。代替生成物は、米由来生成物である供給者１からのアルブミンによる色素沈着のレベルの増加を示し、最大の色素沈着を示し、最終生成物は橙色／琥珀色を有する。
【０２２３】
したがって、本発明に従って使用される酵母由来組換え血清アルブミン調製物は、橙色／琥珀色として存在するには色素沈着が少なすぎる調製物であることが好ましくあり得、最も好ましくは、透明、麦わら色、または麦わら色から琥珀色である。
【０２２４】
さらに、実施例５に示されるように、酵母由来の組換えアルブミン調製物は、植物由来組換えアルブミン調製物よりも著しく高い遊離チオール基含有量を有するアルブミンタンパク質を含んでいた。したがって、酵母由来組換え血清アルブミン調製物は、（具体的にはＣｙｓ３４で）６２％超、例えば、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、約９６％、約９７％である遊離チオール基含有量を有するアルブミンタンパク質を含むことが好ましくあり得る。実際には、遊離チオール基含有量は、約８５％または約９７％であり得る。この文脈における「約」という用語は、任意に、±３、２、または１％を含むことを意図している。
【０２２５】
さらに、Ｆｒａｈｍ  ｅｔ  ａｌ，２０１４，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ，９（１）：ｅ１０９８９３（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）は、酵母由来組換え血清アルブミンの特性が血漿由来血清アルブミンおよび組換え植物由来血清アルブミン生成物と比較された研究を報告した。具体的には：
・試験された酵母由来組換え血清アルブミン生成物は、Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄ．から市販されている、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ（旧Ａｌｂｕｃｕｌｔ（登録商標））およびＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム（旧Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標））であり、両方とも、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅにおいて発現され、ＡｌｂａｇｅｎはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現され、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから供給され、これらはそれぞれ、Ｆｒａｈｍらにより「ＳｃｒＨＳＡ」、「Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）」、および「ＰｒＰＨＳＡ」と称された。
・試験された植物由来組換え血清アルブミン生成物は、ＣｅｌｌａｓｔｉｍからのＯｒｚｙａ  ｓａｔｉｖａ（米）で発現された４つの異なるロットの血清アルブミン（Ｆｒａｈｍらによって「ＯｓｒＨＳＡ−ｓｉｇ−Ｃ」、「ＯｓｒＨＳＡ−ｓｉｇ−Ｇ」、「Ｏｓｒ−ｓｉｇ−Ｈ」、および「ＯｓｒＨＳＡ−ｓｉｇ−Ｊ」と称される）であり、ｅＥｎｚｙｍｅ  ＬＬＣ（「ＯｒｓＨＳＡ−ｐｈｙ」）、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（「ＯｓｒＨＳＡ−ｓｃｉ」）、およびａｍｓｂｉｏ  ＬＬＣ（ＯｓｒＨＳＡ−ａｍｓ）からの３つのさらなる異なる米由来組換え血清アルブミン生成物、および
・血漿由来血清アルブミン生成物は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの本質的にＦＡを含まないアルブミン（「ｐＨＳＡ」）であった。
【０２２６】
Ｆｒａｈｍらは、一方では、酵母由来組換え血清アルブミン生成物と、他方では、血漿由来血清アルブミンおよび組換え植物由来血清アルブミン生成物との間に多数の相違点を見出した。
【０２２７】
例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価するとき、Ｆｒａｈｍらは、酵母由来組換え血清アルブミン生成物が特徴的な単一の集束ピークを生成することを示した。結果は以下のとおりである。
【表２】
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【０２２８】
したがって、すべての試料が約１７．３〜１７．４分に溶出する主要ピークを示したのに対して、酵母由来組換え血清アルブミン生成物のみが、１４分未満のピーク保持時間を有する高分子量混入物質に対応するピーク、および１９分を超えるピーク保持時間を有する低分子量の混入物質に対応するピークを除外するＳＥＣプロファイルを示した。
【０２２９】
さらに、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅに由来し、Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄ．から市販されている酵母由来組換え血清アルブミン生成物（すなわち、それぞれ、Ｆｒａｈｍらによって「ＳｃｒＨＳＡ」および「Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）」と呼ばれるＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファおよびＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム）は、１４分未満および１８分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外する、ＳＥＣプロファイルを示す唯一の試験生成物である（実際、ＳｃｒＨＳＡ生成物は、ピーク保持時間が１５分以内および１８分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外するＳＥＣプロファイルを示した）。それらはまた、９０％を超える相対量を表す主要ピークを示す、試験された唯一の生成物でもある。
【０２３０】
したがって、本発明に従って使用される酵母由来組換え血清アルブミン調製物は、ＳＥＣによって試験したとき、１４分未満および１９分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外し、より好ましくは、１４分または１５分未満および１８分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外する、ＳＥＣプロファイルを示す生成物であることが好ましくあり得る。本発明に従って使用される酵母由来組換え血清アルブミン調製物は、ＳＥＣによって試験したとき、９０％超、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、または少なくとも約９９．４％超である相対量を表す主要ピークを示す生成物である調製物であることも好ましくあり得る。
【０２３１】
前述の定義において、そのような測定に使用されるＳＥＣ技術は、Ｆｒａｈｍ  ｅｔ  ａｌ，２０１４，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ，９（１）：ｅ１０９８９３（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の方法であることが好ましくあり得る。具体的には、サイズ排除クロマトグラフィーシステムは、Ｗａｔｅｒｓ  ２９９６フォトダイオードアレイ検出器（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を取り付けたＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｍｏｄｕｌｅであり得る。機器操作およびデータ取得および操作は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｅｍｐｏｗｅｒ  ２クロマトグラフィーマネージャー（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて実施してもよい。５００×８．０ｍｍの内部寸法を有するＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｄｉｏｌ−２００カラム（製品番号ＤＬ２０Ｓ０５−５００８ＷＴ、ＹＭＣ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を０．８ｍｌ／分の流速で使用してもよい。移動相は、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）を含むことができ、ピークは、２１４ｎｍの波長で検出してもよい。
【０２３２】
Ｆｒａｈｍらは、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、血漿由来ＨＳＡ（すなわち、「ｐＨＳＡ」）が、不均一であり、２つの主要なピーク、１および２を示し、これらのそれぞれが、より疎水性のピーク２の一部として溶出する天然ＨＳＡを有するいくつかの成分からなることをこれまでに示していることをさらに報告した。酵母由来調製物であるＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファおよびＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム（それぞれ、Ｆｒａｈｍらにより「ＳｃｒＨＳＡ」および「Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）」と称される）ならびにＰｐｒＨＳＡのＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、主要ピークがピーク２であることを示し、これは、酵母由来調製物中のＨＳＡの大部分が天然型で存在することを示唆した。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから供給されたＯｓｒＨＳＡのＲＰ−ＨＰＬＣは、すべてのロットの主要ピークがピーク１であることを示し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから供給された植物由来のＯｓｒＨＳＡの大部分が修飾型として存在することを示唆した。すべての他の形態のＯｓｒＨＳＡ（ＯｓｒＨＳＡ−ｓｃｉ、−ｐｈｙ、および−ａｍｓ）もまた、ピーク１に対応するピークを示した。
【０２３３】
したがって、本発明に従って使用される酵母由来組換え血清アルブミン調製物は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって試験したとき、ｐＨＳＡのピーク２に対応する単一の主要ピークを示す生成物であり、酵母由来組換え血清アルブミン調製物中の血清アルブミンの大部分が天然型で存在することを示す、調製物であることが好ましくあり得る。
【０２３４】
前述の定義において、そのような測定に使用されるＲＰ−ＨＰＬＣ技術は、Ｆｒａｈｍ  ｅｔ  ａｌ，２０１４，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ，９（１）：ｅ１０９８９３（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の方法であることが好ましくあり得る。具体的には、ＨＰＬＣシステムは、Ｗａｔｅｒｓ  ２９９６  Ｕ／Ｖ−Ｖｉｓフォトダイオードアレイ検出器に連結された、カラムヒーターおよび試料冷却装置を有するオートサンプラーを備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５クロマトグラフを使用してもよい。データの取得および統合は、例えば、ＷａｔｅｒｓからのＥｍｐｏｗｅｒ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して実施され得る。分離条件は、Ｇｉｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１２：１８３−１８４（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるとおりであり得る。簡言すれば、カラムは、Ａｑｕａｐｏｒｅ  ＲＰ−３００，Ｃ８，７μｍ、内径２２０×２．１ｍｍ（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ）であり得、５０℃に維持され得る。移動相Ａ（ＭＰ  Ａ）は、１０％のアセトニトリル／９０％の水中の０．０５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）からなり得、移動相Ｂ（ＭＰ  Ｂ）は、９０％のアセトニトリル／１０％の水中の０．０５％のＴＦＡであり得、移動相Ｃ（ＭＰ  Ｃ）は、アセトニトリル中の０．０５％のＴＦＡであり得る。安定したベースラインが得られるまで、カラムは、ＭＰ  ＡとＭＰ  Ｂの混合物（７０：３０）で平衡化することができる。溶出は、ＭＰ  Ａ／ＭＰ  Ｂ（７０：３０）からなる多段階勾配（０．７ｍｌ／分）を１分間用いて、５分間にわたってＭＰ  Ａ／ＭＰ  Ｂ（６５：３５）に対して線形勾配（０．７ｍｌ／分）、１９分間にわたってＭＰ  Ａ／ＭＰ  Ｂ（６１：３９）に対して線形勾配（０．７ｍＬ／分）、１０分間にわたってＭＰ  Ａ／ＭＰ  Ｂ（５０：５０）に対して線形勾配（０．７ｍｌ／分）、５分間にわたってＭＰＣに対して線形勾配（１．０ｍＬ／分）、ＭＰＣで１２分間、３分間にわたってＭＰ  Ａ／ＭＰ  Ｂ（７０：３０）に対して線形勾配を用いて実施され得る。流出液は、２２０ｎｍでモニターされ得る。
【０２３５】
Ｆｒａｈｍらはまた、質量分析を使用して、リジン／アルギニン残基の示差的糖化も評価した。結果は、血漿試料（ｐＨＳＡ）およびすべての植物由来（ＯｓｒＨＳＡ）組換え血清アルブミン調製物と比較して、すべての酵母由来組換え血清アルブミン調製物においてより少ない数のヘキソース修飾リジンまたはアルギニン残基を示した。結果は以下のとおりである。
【表３】
2019533442.tif 000005
【０２３６】
Ｆｒａｈｍらは、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライムでは修飾された８個のヘキソース、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファでは修飾された５個のヘキソースを見出したが、これらは調製剤中の分子の完全集団にわたって定義されており、すべて、１つのアルブミンタンパク質分子で修飾されるわけではないことを、本出願者はさらに留意する。個々のＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライムアルブミン分子は、１または２個のみ、おそらく３個でさえ有する可能性があるが、すべて、８個のヘキソース修飾ＫおよびＲ残基を持つわけではないであろう。
【０２３７】
したがって、本発明に従って使用される酵母由来組換え血清アルブミン調製物は、質量分析法によって試験したとき、１タンパク質当たり１３未満、より好ましくは１２、１１、１０、９、８、７、６未満、例えば、約１〜１１、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、１、または１未満のヘキソース修飾リジンもしくはアルギニン残基を示す生成物である調製物であることが好ましくあり得る。前述の定義において、そのような測定に使用される質量分析技術は、Ｆｒａｈｍ  ｅｔ  ａｌ，２０１４，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ，９（１）：ｅ１０９８９３（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の方法であることが好ましくあり得る。
【０２３８】
特に、Ｆｒａｈｍらは、以下の残基が血漿由来血清アルブミンおよび植物由来組換え血清アルブミン：Ｋ５１、Ｋ６４、Ｋ７３、Ｋ１３７、Ｋ１５９、Ｋ１７４、Ｋ１８１、Ｋ２２５、Ｋ２３３、Ｋ２４０、Ｋ２６２、Ｋ４６６、Ｋ５２５、Ｋ５４５、およびＫ５７４と比較して、酵母由来組換え血清アルブミンにおいてほとんど糖化されていないことを見出した（以下の表Ｓ２）。
【０２３９】
反対に、Ｆｒａｈｍらは、血漿由来血清アルブミンおよび植物由来組換え血清アルブミン：Ｒ４８５、Ｋ５００と比較して、酵母由来組換え血清アルブミンにおいて一般的にさらに糖化されていることを見出した（以下の表Ｓ２）。
【０２４０】
したがって、本発明に従って使用される酵母由来組換え血清アルブミン調製物は、Ｆｒａｈｍらに報告されているように、Ｒｅｃｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファまたはＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム（それぞれ、Ｆｒａｈｍらにより「ＳｃｒＨＳＡ」および「Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）」と称される）またはＰｐｒＨＳＡに対して観察されるレベルと実質的に同一である、Ｋ５１、Ｋ６４、Ｋ７３、Ｋ１３７、Ｋ１５９、Ｋ１７４、Ｋ１８１、Ｋ２２５、Ｋ２３３、Ｋ２４０、Ｋ２６２、Ｋ４６６、Ｋ５２５、Ｋ５４５、Ｋ５７４、Ｒ４８５、および／またはＫ５００のうちの任意の１つ以上（例えばすべて）で糖化レベルを示す調製物であることを好ましくあり得る。糖化の測定されたレベルは、複数の、例えば、２、３、４、５、１０、またはそれ以上の試料の平均に基づき得る。
【０２４１】
Ｆｒａｈｍらは、血漿由来血清アルブミンおよび植物由来組換え血清アルブミンと比較して、酵母発現系において発現される組換え血清アルブミンの間に糖化に明らかな違いがあると結論付けた。糖化は、遊離アミン基を有する残基が糖で修飾される緩慢な非酵素的メイラード反応を介して生じると考えられている。血漿由来ＨＳＡの最大１０％が、健常な個体において糖化され、高血糖症を有する個体において最大３０％が糖化されると考えられている。血漿由来アルブミン中のリジンおよびアルギニン残基のヘキソース修飾は、タンパク質の長い（２６〜３１日）循環寿命にわたって生じると考えられているのに対して、リシンおよびアルギニンのインビトロ糖化は、温度および糖濃度の増加、ならびに約数日または数週間の時間スケールを必要とすると考えられている。対照的に、酵母発現組換え血清アルブミンは、典型的には、発現中に分泌され、その後、増殖培地中の糖（約２％のグルコースであり得る）は、分泌タンパク質の糖化に好適な環境を提供し得る。しかしながら、植物における糖化機構は、明／暗サイクルまたは植物に対する光ストレスを含み得、高次植物が初期の糖化付加物を修復する動物酵素の同族体を有するので、植物タンパク質の糖化が予想外ではないことが示唆されている。Ｆｒａｈｍらは、彼らの実験で使用されたＯｓｒＨＳＡは総重量１ｇ当たり最大１９ｍｇのグルコースを含有するＯ．ｓａｔｉｖａの内胚乳で発現されることを記載し、この単糖の存在が植物の生育期間（穀物熟成のために約３０日）にわたってタンパク質の糖化を可能にし得、植物の生育条件の変動は観察されたロット間の変動を説明し得ることを示唆した。さらに、植物由来組換え血清アルブミンタンパク質は、α−１，３−フコースおよび／またはβ−１，２−キシロースなどの植物特異的糖で糖化され得ることを示した。これは、植物由来組換え血清アルブミンタンパク質と、血漿などの他の供給源に由来するまたは酵母における組換え発現による血清アルブミンタンパク質との間のさらなる物理的区別であり得る。
【０２４２】
洗剤：洗剤は、電荷に応じて、陰イオン性洗剤、陽イオン性洗剤、非イオン性洗剤、両性イオン性洗剤である４つのグループに分類され得る。
【０２４３】
典型的な陰イオン性洗剤は、アルキルベンゼンスルホネートを含む。これらの陰イオンのアルキルベンゼン部分は、親油性であり、スルホネートは、親水性である。陰イオン性洗剤の種類の例には、分岐ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、および石鹸が含まれる。
【０２４４】
本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、０．０１未満、好ましくは０．００１未満、より好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）未満の陰イオン性洗剤を含んでもよい。
【０２４５】
陽イオン性洗剤は、疎水性成分を有する陰イオン性洗剤と同様であるが、陰イオン性スルホネート基の代わりに、陽イオン性洗剤は、極性部分として第４級アンモニウム（すなわち、正電荷を持つ基）を有する。
【０２４６】
本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、０．０１未満、好ましくは０．００１％未満、より好ましくは０．０００１（ｗ／ｖ）未満の陽イオン性洗剤を含んでもよい。
【０２４７】
両性イオン性洗剤は、同数の＋１および−１の電荷化学基の存在から生じる正味ゼロ電荷を有する。両性イオン性洗剤の一例は、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）である。一実施形態において、本発明の任意の態様に従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、０．００１％（ｗ／ｖ）未満の両性イオン洗剤を含み得、両性イオン洗剤を本質的に含まなくてもよい。
【０２４８】
非イオン性洗剤は、それらの電荷していない親水性の頭部基によって特徴付けられる。典型的な非イオン性洗剤は、ポリオキシエチレンまたは配糖体に基づいている。前者の一般的な例には、ポリソルベート８０（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標））、４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（例えばＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）、およびＢｒｉｊ（登録商標）シリーズが含まれる。これらの材料はまた、エトキシレートまたはペグレートとしても知られている。グリコシドは、それらの非電荷親水性頭部基として糖を有する。例には、オクチル−チオグルコシドおよびマルトシドが含まれる。ヒドロキシエチルグルカミド（ＨＥＧＡ）およびメチルグルカミド（ＭＥＧＡ）系洗剤は類似しており、頭部基として糖アルコールを有する。
【０２４９】
１つの好ましい実施形態において、本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、０．０１未満、好ましくは０．００１未満、より好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）未満の非イオン性洗剤を含んでもよい。
【０２５０】
さらなる実施形態において、本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、０．０１未満、好ましくは０．００１％未満、より好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）未満のポリソルベート８０を含んでもよく、ポリソルベート８０を本質的に含まなくてもよい。例えば、組成物は、３．３２５＊１０−４％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０、例えば２．８５＊１０−４％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０、例えば２．３７５＊１０−４％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０、例えば１．４２５＊１０−４％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０、例えば９＊１０−５％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０、例えば６．６２５＊１０−５％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０、例えば以下５．７＊１０−５％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０、例えば５＊１０−５％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０、例えば４．７５＊１０−５％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０、例えば４．５＊１０−５％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０、例えば４．７５＊１０−５％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０、例えば２．８５＊１０−５％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０、例えば２．５＊１０−５％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０、例えば１．９＊１０−５％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０、１．８＊１０−５％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０、例えば１＊１０−５％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０、例えば９．５＊１０−６％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０、例えば９＊１０−６％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０、例えば５＊１０−６％（ｗ／ｖ）以下のポリソルベート８０もしくは２０を含んでもよく、最も好ましくはポリソルベート８０もしくは２０を実質的に含まなくてもよい。
別の実施形態において、本発明の組成物は、０．０１未満、好ましくは０．００１未満、より好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）未満のポリソルベート２０を含み、ポリソルベート２０を含まなくてもよい。別の実施形態において、組成物は、０．０１未満、好ましくは０．００１未満、より好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）未満のポロキサマーを含んでもよく、ポロキサマーを含まなくてもよい。
【０２５１】
一実施形態において、本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、０．００１から、例えば０．００２から、例えば０．００３から、例えば０．００４から、例えば０．００５から、例えば０．００６から、例えば０．００７から、例えば０．００８から、例えば０．００９から、例えば０．０１から、例えば０．０２から、例えば０．０３から、例えば０．０４から、例えば０．０５、例えば０．０６から、例えば０．０７から、例えば０．０８から、例えば０．０９から、例えば０．１から、例えば０．２から、例えば０．３から、例えば０．４から、例えば０．５から、例えば０．６から、例えば０．７から、例えば０．８から、例えば０．９％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤から０．００２、例えば０．００３、例えば０．００４、例えば０．００５、例えば０．００６、例えば０．００７、例えば０．００８、例えば０．００９、例えば０．０１、例えば０．０２、例えば０．０３、例えば０．０４、例えば０．０５、例えば０．０６、例えば０．０７、例えば０．０８、例えば０．０９、例えば０．１、例えば０．２、例えば０．３、例えば０．４、例えば０．５、例えば０．６、例えば０．７、例えば０．８、例えば０．９、例えば１％（ｗ／ｖ）の非イオン性洗剤を含んでもよい。
【０２５２】
一実施形態において、非イオン性洗剤は、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、およびポロキサマーから選択される。
【０２５３】
一実施形態において、本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、最大０．０１、好ましくは最大０．００１、より好ましくは最大０．０００１％（ｗ／ｖ）の、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、およびポロキサマーなどであるが、これらに限定されない、非イオン性洗剤を含んでもよい。
【０２５４】
一実施形態において、本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、洗剤を本質的に含まなくてもよい。
【０２５５】
脂肪酸：典型的には、本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、２５ｍＭ以下の脂肪酸を含んでもよい。脂肪酸は、飽和または不飽和脂肪酸などの任意の脂肪酸、ならびにそれらの塩であり得る。好ましくは、脂肪酸は、プロパン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸、ノナデカン酸、エイコサン酸、ヘネイコサン酸、ドコサン酸、トリコサン酸、テトラコサン酸、ペンタコサン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸、ノナデカン酸、エイコサン酸、ヘンエイコサン酸、ドコサン酸、トリコサン酸、テトラコサン酸、ペンタコサン酸、ヘキサコサン酸、ヘプタコサン酸、オクタコサン酸、ノナコサン酸、トリアコンタン酸、ヘナトリアコンタン酸、ドトリアコンタン酸、トリトリアコンタン酸、テトラトリアコンタン酸、ペンタトリアコンタン酸、およびヘキサトリアコンタン酸からなる群から選択される脂肪酸などの１つ以上の飽和脂肪酸である。
【０２５６】
一実施形態において、本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、２５ｍＭ以下の脂肪酸、例えば２０ｍＭ以下の脂肪酸、例えば１５ｍＭ以下の脂肪酸、例えば１０ｍＭ以下の脂肪酸、例えば５ｍＭ以下の脂肪酸、例えば２ｍＭ以下の脂肪酸、例えば１ｍＭ以下の脂肪酸を含んでもよい。
【０２５７】
一実施形態において、本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、２５ｍＭ未満の脂肪酸、例えば２０ｍＭ未満の脂肪酸、例えば１５ｍＭ未満の脂肪酸、例えば１５ｍＭ未満の脂肪酸、例えば１４ｍＭ未満の脂肪酸、例えば１３ｍＭ未満の脂肪酸、例えば１２ｍＭ未満の脂肪酸、例えば１１ｍＭ未満の脂肪酸、例えば１０ｍＭ未満の脂肪酸、例えば９ｍＭ未満の脂肪酸、例えば８ｍＭ未満の脂肪酸、例えば７ｍＭ未満の脂肪酸、例えば６ｍＭ未満の脂肪酸、例えば５ｍＭ未満の脂肪酸、例えば４ｍＭ未満の脂肪酸、例えば、３ｍＭ未満の脂肪酸、例えば２ｍＭ未満の脂肪酸、例えば１ｍＭ未満の脂肪酸、例えば０．５ｍＭ未満の脂肪酸、例えば０．１ｍＭ未満の脂肪酸、例えば０．０５ｍＭ未満の脂肪酸、例えば０．０１ｍＭ未満の脂肪酸を含んでもよく、例えば、組成物は、脂肪酸を本質的に含まない。
【０２５８】
好ましい実施形態において、脂肪酸は、オクタノエート（オクタン酸）である。一実施形態において、本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、２５ｍＭ以下のオクタノエート、例えば２０ｍＭ以下のオクタノエート、例えば１５ｍＭ以下のオクタノエート、例えば１０ｍＭ以下のオクタノエート、例えば５ｍＭ以下のオクタノエート、例えば２ｍＭ以下のオクタノエート、例えば１ｍＭ以下のオクタノエートを含んでもよい。
【０２５９】
一実施形態において、本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、２５ｍＭ未満のオクタノエート、例えば２０ｍＭ未満のオクタノエート、例えば１５ｍＭ未満のオクタノエート、例えば１５ｍＭ未満のオクタノエート、例えば１４ｍＭ未満のオクタノエート、例えば１３ｍＭ未満のオクタノエート、例えば１２ｍＭ未満のオクタノエート、例えば１１ｍＭ未満のオクタノエート、例えば１０ｍＭ未満のオクタノエート、例えば９ｍＭ未満のオクタノエート、例えば８ｍＭ未満のオクタノエート、例えば７ｍＭ未満のオクタノエート、例えば６ｍＭ未満のオクタノエート、例えば５ｍＭ未満のオクタノエート、例えば４ｍＭ未満のオクタノエート、例えば３ｍＭ未満のオクタノエート、例えば２ｍＭ未満のオクタノエート、例えば１ｍＭ未満のオクタノエート、例えば０．５ｍＭ未満のオクタノエート、例えば０．１ｍＭ未満のオクタノエート、例えば０．０５ｍＭ未満のオクタノエート、例えば０．０１ｍＭ未満のオクタノエートを含んでもよく、例えば、組成物は、オクタノエートを本質的に含まない。
【０２６０】
例えば、本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、２５ｍＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸を含んでもよいか、２０ｍＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、１５ｍＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、１０ｍＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、５ｍＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、２．２８ｍＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、２．１６ｍＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、２ｍＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、１．５２ｍＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、１．４４ｍＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、１．２ｍＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、１ｍＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、８００ｕＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、７２０ｕＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、４５６ｕＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、４００ｕＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、３０４ｍＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、２８８ｍＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、２４０ｕＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、１６０ｕＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、１５２ｕＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、１４４ｕＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸、例えば、８０ｕＭ以下のオクタノエートもしくは全脂肪酸である。
【０２６１】
本発明の任意の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１以下である、オクタノエート対アルブミンのモル比を含んでもよい。１６：１、１１：１、または５：１以下のモル比が、好ましい。
【０２６２】
一実施形態において、本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、２５ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば２０ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば１５ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば１４ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば１３ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば１２ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば１１ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば１０ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば９ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば８ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば７ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば６ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば５ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば４ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば３ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば２ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば１ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば０．５ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば０．１ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば０．０５ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子、例えば０．０１ｍＭ未満のリン脂質などの疎水性分子を含んでもよく、例えば、組成物は、リン脂質などの疎水性分子を本質的に含まない。
【０２６３】
一実施形態において、疎水性分子という用語は、オクタノエートなどの脂肪酸を含むが、ポリソルベート８０などの非イオン性洗剤などの洗剤を含まない。
【０２６４】
本発明の任意の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、さまざまな両親媒性化合物を含んでも、含まなくてもよい。例えば、１つの種類の両親媒性化合物が含まれてもよいが、他のものは含まなくてもよい。
【０２６５】
あるいは、本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、洗剤、脂肪酸、および／またはリン脂質などの本質的にすべての両親媒性化合物を含まなくてもよい。
【０２６６】
一実施形態において、本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、２５ｍＭ以下の両親媒性化合物を含んでもよい。
【０２６７】
別の実施形態において、本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、両親媒性化合物を本質的に含まなくてもよい。
【０２６８】
遊離アミノ酸：本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、典型的には、５ｍＭ未満の遊離アミノ酸、例えば４ｍＭ未満の遊離アミノ酸、例えば３ｍＭ未満の遊離アミノ酸、例えば２ｍＭ未満の遊離アミノ酸、例えば１ｍＭ未満の遊離アミノ酸、例えば０．５未満、例えば０．１、例えば０．０１、例えば０．００５、例えば０．００１ｍＭの遊離アミノ酸を含むか、または遊離アミノ酸を本質的に含まない。
【０２６９】
遊離アミノ酸は、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、リジン、アルギニン、およびヒスチジン、または修飾および非天然アミノ酸からなる群から選択される天然アミノ酸を含む、１つ以上の遊離アミノ酸を含んでもよい。本発明の組成物のアミノ酸のうちのいずれか１つは、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸のいずれかであってもよい。
【０２７０】
一実施形態において、本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、遊離アミノ酸を本質的に含まない。
【０２７１】
本発明の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、典型的には、５未満、例えば４未満、例えば３未満、例えば２未満、例えば１未満、例えば０．５未満、例えば０．１未満、例えば０．０１未満、例えば０．００５未満、例えばなどのような複数のアミノ酸を含む。０．００５ｍＭ未満、例えば０．００１ｍＭ未満のトリプトファンもしくはＮ−アセチルトリプトファンを含むか、またはトリプトファンもしくはＮ−アセチルトリプトファンを本質的に含まない。好ましくは、それは、遊離トリプトファンまたはＮ−アセチル−トリプトファンを含まない。
【０２７２】
塩：本発明のいずれかの態様に従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、臭化物、塩化物、フッ化物、水素化物、ヨウ化物、窒化物、酸化物、リン化物、硫化物、過酸化物、ホウ酸塩、臭素酸塩、次亜臭素酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、重炭酸塩、塩素酸塩、過塩素酸塩、亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩、クロム酸塩、ヨウ素酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、リン酸塩、リン酸水素、リン酸二水素塩、亜リン酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫酸水素塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、亜硫酸水素塩、酢酸塩、ギ酸塩、シュウ酸塩、シュウ酸水素塩、重シュウ酸塩、硫化水素、ビスルフィド、テルル化物、アミド、チオシアネート、ムリン酸塩（ＨＣｌ）、コハク酸塩、およびマレイン酸塩、またはそれらの任意の組み合わせなどであるが、これらに限定されない、任意の好適な塩を含んでもよい。あるいは、本発明の組成物の塩はまた、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、フッ化水素酸、リンなどの無毒性無機酸からの誘導体、ならびに無毒性有機酸に由来する塩、例えば、脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、アルカンジオン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸なども含んでもよい。したがって、そのような塩は、硫酸塩、ピロ硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、硝酸塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、カプリル酸塩、イソ酪酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、フタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩なども含む。
【０２７３】
本発明の塩は、一価（例えば第１族）金属および二価（例えば第２族および遷移元素）金属などの金属の塩、ならびにアンモニウムの塩を含んでもよい。塩には、ＮａＣｌおよびＫＣｌが含まれる。
【０２７４】
金属イオン：組換え酵母由来の血清アルブミン製剤を含むさらなる実施形態において、組換え酵母由来の血清アルブミン製剤、ならびに（例えば、凍結保存培地、保存培地、および他のメディアなどの）メディア、のいずれかに従って使用するための本発明の態様は、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、および／またはＮｉ２＋イオンを本質的に含まないなど、本質的に金属イオンを含まないものであり得る。
【０２７５】
酸／塩基の検討：本発明の任意の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、４〜９、例えば４〜８、例えば４〜７、例えば５〜８、例えば６〜８のｐＨ、好ましくは６．４〜７．４、６．０〜７．０、６．７〜７．３、または６．５〜７．５のｐＨを有し得、例えば該組成物は約７のｐＨを有する。
【０２７６】
緩衝液：本発明の任意の態様のいずれかに従って使用するための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地（凍結保存培地、保存培地、および他の培地など）は、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはヒスチジン緩衝液などの緩衝液を含んでもよい。リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液が好ましい。緩衝液濃度は、約１０〜約１５０ｍＭ、例えば約３０〜約１５０ｍＭ、例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、または１４０から約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または約１５０ｍＭまでであり得る。
【０２７７】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明され、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２７８】
実施例１
幹細胞は、それらの最終製剤を調整する前に凍結保存される。現在、使用されている標準的な凍結保存溶液は、１０％のＤＭＳＯと、２％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ｇｒｉｆｏｌｓ、ＳＡからのＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標））の溶液との組み合わせからなる。細胞療法分野、特に同種異系の文脈における対象となる主題は、凍結−解凍サイクル後の細胞の回収を改善し、細胞懸濁液の安定性を拡大する新しい抗凍結剤の探索である。
【０２７９】
この研究の目的は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓによって開発され、現在、Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄ．からの市販品として入手可能な、２つの異なる組換えアルブミン（ＡｌｂＩＸ（登録商標）およびＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ）のヒト間葉系間質細胞（ｈＭＳＣ）と組み合わせた潜在的使用を評価することであった。
【０２８０】
Ｇｒｉｆｏｌｓ，Ｓ．Ａ．によって商品化されたヒト血液に由来するアルブミン溶液であるＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）を、参照項目として用いた。
【０２８１】
試験項目：
名称              試験１：ＡｌｂＩＸ（登録商標）
組成物            Ａ）安定性評価用：細胞を、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）
＋２％（ｗ／ｖ）および５％（ｗ／ｖ）のＡｌｂＩＸ（登録商標
）で調整した。
Ｂ）解凍後の安定性評価用：細胞を、２％（ｗ／ｖ）および５％
（ｗ／ｖ）のＡｌｂＩＸ（登録商標）濃度を有する２つの凍結保
存溶液を用いて２１日間凍結保存した。
名称              試験２：Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ
組成物            Ａ）安定性評価用：細胞を、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）
＋２％（ｗ／ｖ）および５％（ｗ／ｖ）のＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ
（登録商標）アルファで調整した。
Ｂ）解凍後の安定性評価用：細胞を、２％（ｗ／ｖ）および５％
（ｗ／ｖ）のＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ濃度を
有する２つの凍結保存溶液を用いて２１日間凍結保存した。
参照項目
名称              参照文献：Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）
組成物            Ａ）安定性評価用：細胞を、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）
＋２％（ｗ／ｖ）および５％（ｗ／ｖ）のＡｌｂｕｔｅｉｎ（登
録商標）で調整した。
Ｂ）解凍後の安定性評価用：細胞を、２％（ｗ／ｖ）および５％
（ｗ／ｖ）のＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）濃度を有する２つの
凍結保存溶液を用いて２１日間凍結保存した。
【０２８２】
実験計画：
研究の実験段階を、図４に示されるように実施した。
【０２８３】
細胞増殖および調整のために、ｈＭＳＣを解凍し、播種し、最初に１層ＣｅｌｌＳｔａｃｋに、その後５層ＣｅｌｌＳｔａｃｋに２７日間増殖させた。細胞を採取し、３つの５０ｍＬのファルコンチューブ（５２ｍＬの細胞懸濁液で充填された）および３つの１５ｍＬのファルコンチューブ（１３ｍＬの細胞懸濁液で充填された）に分配した。チューブを遠心分離した後、上清をデカンテーションにより除去し、細胞をＰｌａｓｍａｌｙｔｅおよび各研究アルブミンに再懸濁して、１５Ｍ／ｍＬの細胞濃度を達成した（図４に示すとおり）。
【０２８４】
凍結プロトコル：
装置
−クラスＩＩＡの層流ブース
−非プログラム凍結用チューブシステム
−生物学的超低温冷凍庫−８０℃
−液体窒素のシリンダ（該当する場合）
−自動ピペッター
−遠心分離機
−１、２、５、１０、２５、および５０ｍＬのピペット
−１５および５０ｍＬのチューブ
−１、１．５、または２ｍＬの凍結保存チューブ
−クロノメーター
−アイスパック（氷と交換可能）
【０２８５】
試薬
−Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）
−Ｇｒｉｆｏｌｓ．，Ｓ．Ａからの２０％のＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）ヒト血漿アルブミン
−Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  ＤＫ  Ａ／Ｓおよび／またはＤｅｌｔａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．によって開発され、現在、Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄ．からの市販品として入手可能な１０％のＡｌｂＩＸ（登録商標）および２０％のＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ
−ＤＭＳＯ
−イソプロパノール
【０２８６】
手順
１．凍結保存溶液の調製：
Ａ．図４に示されるように、必要とされる体積の凍結保存液を調製する。必要とされる体積が正確に分からない場合、必要と見なされる以上の過剰量を調製する（通常５または１０ｍＬ）。以下は、１０ｍＬの凍結保存溶液を調製するための体積、ならびに使用される試薬の最終濃度を示す。
【０２８７】
【表４】
2019533442.tif 000006
Ｂ．各試薬に必要とされる初期体積を求めるために、次の式（Ｅｑ）１を使用してこれらの計算を実施することが推奨される。
Ｃｉ×Ｖｉ＝Ｃｆ×Ｖｆ→式１
Ｃ．凍結保存溶液は、使用時まで２〜８℃の範囲で保存し、最大で２〜８℃の範囲で１日保存され得る。
【０２８８】
２．細胞懸濁液の入手および調製：
Ｄ．凍結する間葉系細胞は、既知の体積および濃度の細胞懸濁液から得られ、培養細胞の遠心分離、上清の除去、細胞をＰｌａｓｍａｌｙｔｅおよび各研究アルブミンに再懸濁することによって、正しく標識された無菌チューブ中に回収されて、１５Ｍ／ｍＬの細胞濃度を達成した（図４に示すとおり）。
Ｅ．１クライオチューブ当たりの凍結する細胞の数、クライオチューブの数、凍結のための細胞濃度（Ｃｃ）、および１クライオチューブ当たりの体積は、利用可能な細胞の量の関数、またはそれらが意図される使用として決定される。
Ｆ．式２から、凍結の最終体積（Ｖｃ）を計算する。
【数１】
2019533442.tif 000007
Ｇ．凍結プロセスは、細胞懸濁液（すなわち、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ＋各試験アルブミンに再懸濁された細胞）を凍結保存溶液（すなわちＰｌａｓｍａｌｙｔｅ＋各試験アルブミン＋２０％ｗ／ｖ  ＤＭＳＯ）と１：１で希釈することを含む。このため、凍結用に調製される細胞懸濁液の体積および添加される凍結保存溶液の体積は共に、式２で計算された体積の１／２になるであろう。
【０２８９】
３．凍結保存溶液の添加：
Ｈ．添加される凍結保存液の総体積（Ｖｃａ）が式２で計算された体積の１／２であり、該体積が、凍結保存する細胞懸濁液の体積に正確に対応し、以下の表に示される凍結ランプを生成するために、各ステップにおいて添加する凍結保存液の割合を計算することを考慮する。
【０２９０】
【表５】
2019533442.tif 000008
Ｉ．上記の表に示す「ランプ」スキームで指定された添加ランプ後に、細胞懸濁液に凍結保存溶液（予め冷却したもの）をゆっくり添加する。凍結保存溶液を徐々に添加することにより、起こり得る細胞浸透ショックを回避する。
【０２９１】
４．細胞懸濁液の分注：
Ｊ．細胞懸濁液の分注は、ＤＭＳＯが細胞にとって有毒な成分であるため、できるだけ迅速に行わなければならない手順である。分注プロセスは、（上述の表に示される）「ランプ」スキームのステップ６に示された凍結保存溶液の体積が追加されるとすぐに開始する。
Ｋ．あらかじめ標識された凍結保存チューブ（セクションＥに規定された１クライオチューブ当たり体積に従って）中に細胞試料の最終体積を分配する。
【０２９２】
５．凍結
Ｌ．正しいレベルのイソプロパノールを含有する、凍結保存チューブを、プログラムされていない凍結用チューブシステム（「システム」）に細胞懸濁液と共に入れる。理想的には、システム容器が各使用前に２〜８℃の範囲内の温度で平衡化することがより好ましいが、室温で平衡化されている場合には使用することもできる。
Ｍ．システム容器を、−８０℃の冷凍庫中に入れて、凍結して少なくとも一晩、最大１カ月間そこに保つ。
Ｎ．チューブをシステム容器から取り出したら、−８０℃の冷凍庫または液体窒素ボンベの対応する箱に入れる。
【０２９３】
解凍プロトコル：
装置
−クラスＩＩＡの層流ブース
−蒸留水または代替熱源付き恒温槽
−自動ピペッター
−インキュベーター
−遠心分離機
−クロノメーター
【０２９４】
腐りやすい材料および試薬
−１、２、５、１０、２５、および５０ｍＬのピペット
−１５および５０ｍＬのファルコンチューブ
−Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ＋各研究アルブミン
−該当する場合、アイスパック（入手できない場合、氷を使用してもよい）
【０２９５】
手順
ｉ．解凍溶液の調製
Ａ．Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ＋各研究アルブミンからなる解凍溶液の必要な体積を調製する。
Ｂ．解凍溶液は、使用時まで２〜８℃の範囲で保存しなければならない。
【０２９６】
ｅ．ｉｉ．解凍
Ｃ．解凍するクライオチューブ（複数可）を選択し、−８０℃の冷凍庫または液体窒素ボンベから取り出す。
Ｄ．凍結したクリオチューブを恒温槽（または同等の熱源）に移し、３７℃に予熱する。解凍が迅速に達成されることが重要である。クライオチューブは、液体状態に変換される正確な瞬間に熱源から取り出されなければならない（しかしながら、ごくわずかな割合が固体の粒状状態にある間に取り出され得る）。
Ｅ．細胞懸濁液が解凍したら、必要に応じてクライオチューブの内容物を１５ｍＬまたは５０ｍＬチューブに移す。同じ親細胞懸濁液について得られた１つを超えるクライオチューブを解凍する場合、各クライオチューブについて解凍プロセスを実行する代わりに、解凍した画分をすべて組み合わせることが推奨される。
Ｆ．細胞懸濁液を解凍溶液で１：１で希釈し、回収した細胞懸濁液の体積と同じ体積の解凍溶液を添加する。以下の表に示される戦略に従って、解凍溶液をゆっくり添加する。
【０２９７】
【表６】
2019533442.tif 000009
Ｇ．希釈液が、解凍された懸濁液の初期体積が１：１０になるまで細胞懸濁液を解凍溶液で希釈する。計算の一例を以下に示す。
解凍された細胞懸濁液の初期体積が、１ｍＬである場合、
１ｍＬ×１０＝１０ｍＬ（１：１０の希釈における最終体積）
これまでに１ｍＬの解凍溶液で希釈されていたので（セクションＦの指示に従って）、このステップで添加される体積は、
１０ｍＬ−１ｍＬ（懸濁液の初期体積）−１ｍＬ（１：１の希釈において添加された溶液の体積）＝８ｍＬ、になるであろう。
このステップでは、初期体積の１ｍＬの場合、８ｍＬの解凍溶液を添加する必要があるであろう。
Ｈ．ピペッティングにより、解凍溶液の総体積を測定し、懸濁液を完全に均質する（体積を測定するのが困難になる場合がある、泡の出現を防ぐために）。
【０２９８】
安定性試験：
図４に示されるように、合計６個のクリオバイアルを上に論じられる凍結プロトコルに従って凍結し、液体窒素タンクに−１９６℃で２１日間保存した。次いで、いずれの場合にも対応するアルブミン溶液を使用して、それらを上に論じられる解凍プロトコルに従って解凍した。
【０２９９】
２〜８℃での解凍後の細胞安定性の間に、各アルブミンを２つの濃度、２％（ｗ／ｖ）および５％（ｗ／ｖ）で試験した。
【０３００】
２〜８℃で細胞の安定性を評価するために、各アルブミン（ＡｌｂＩＸ（登録商標）、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ、またはＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標））の２％（ｗ／ｖ）で調整した細胞懸濁液を評価した。いずれの場合にも、図４に示されるように証明された細胞懸濁液のうちの１つを用いて、３つの注射器を、設定した。６．５Ｍ／ｍＬの所望の細胞濃度を達成するために、キャップした注射器に、０．８７ｍＬの対応するストック細胞溶液（１５Ｍ／ｍＬ）および１．１３ｍＬの類似のコンディショニング溶液（Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ＋２％の対応するアルブミン）を上部から充填した。次いで、プランジを組み立て、注射器の体積を、図５に示すように、２．８ｍＬ（２ｍＬの液体および０．８ｍＬの空気）で設定した。最後に、注射器を、冷蔵庫中に試験期間中保存して、標的温度を維持した。
【０３０１】
結果の分析：
ＮｕｃｌｅｏＶｉｅｗ  ＮＣ−３０００（商標）ソフトウェア（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を用いて、細胞計数、細胞生存率、および細胞凝集のＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）の結果の解釈および分析、ならびに細胞集団におけるアポトーシスを決定した。
【０３０２】
結果の分析およびプロット生成のために、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｅｘｃｅｌ  ２００７（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＷｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用した。
【０３０３】
結果および考察：
ヒトアルブミンタンパク質は、最新治療分野で広く使用されている。凍結解凍サイクルに伴う損傷から細胞を保護することにより、細胞ベースの生成物の安定性を保証する。したがって、細胞安定性は、異なる形態のアルブミンの有用性およびそれらの最適作業濃度を確認するために証明されなければならない。この場合、細胞安定性は、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ−３０００（商標）およびその製造業者のプロトコルおよび取扱説明書を用いて、細胞計数、細胞生存率、細胞凝集、ならびに細胞非アポトーシス、アポトーシス、および死滅集団によって評価した。
【０３０４】
２〜８℃での安定性の結果：
（ａ）凍結解凍による前処理なしの安定性
拡大し、遠心分離し、上清を除去しているｈＭＳＣ細胞、および１５Ｍ／ｍＬの細胞濃度を達成するために、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ＋各研究アルブミンに再懸濁した細胞を、凍結解凍することなく、２〜８℃で安定性について試験した。０時間、２３．７時間、４４時間、５１．５時間、および９３．５時間の保存後に試験したとき、試験した異なるアルブミン溶液の間で細胞濃度および細胞生存率に関して有意差は観察されなかった（データ示さず）。細胞濃度は、一定のままであり、細胞生存率は、５２時間まで９７％超であった。
【０３０５】
４４時間にわたるアポトーシスアッセイによって得られた結果（データは示さず）は、すべての場合において２つの異なる細胞集団：生存細胞および死滅細胞を同定した。アポトーシス集団は観察されず、したがって、細胞は以前にアポトーシスを被ることなく壊死したと考えられる。試験したアルブミン間に有意差はなく、細胞濃度および細胞生存率について得られた結果によると、３つのすべての場合において同じパターンが観察された。
（ｂ）凍結解凍による前処理後の安定性
拡大し、遠心分離し、上清を除去しているｈＭＳＣ細胞、および１５Ｍ／ｍＬの細胞濃度を達成するために、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ＋各研究アルブミンに再懸濁した細胞を、凍結解凍後に、２〜８℃で安定性について試験した。
【０３０６】
０時間、２３．５時間、４５．５時間、および７２時間の時点で反転による２０サイクルの均質化の後、試料を取り出した。
【０３０７】
図６に示されるように、３つのアルブミンにおいて試験された細胞は、経時的にそれらの生存率の漸進的な減少を示し、組換え酵母由来アルブミン調製物は、細胞に対して最大の保護を提供した。
【０３０８】
図６のデータは以下のように要約することができる。
【表７】
2019533442.tif 000010
【０３０９】
データは、以下のことを示す。
−２％のアルブミンで、２〜８℃で４５．５時間保存した後、生存細胞のレベルは、ＡｌｂＩＸ（登録商標）（９２．９％）、次いでＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ（５９．１％）が最も良く、血漿由来Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）（４０．７％）が最も悪かった。
−５％のアルブミンを使用したときに、生存率は全体的に低くかったが、２〜８℃で４５．５時間保存した後の生存細胞レベルの差はさらに顕著であり、ＡｌｂＩＸ（登録商標）（６３．２％）が最良の結果であり、次いでＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ（３４．５％）であり、血漿由来のＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）がまた最悪であった（４．５％のみ）。
【０３１０】
したがって、凍結および解凍などの生理学的ショック中および／またはその後に細胞を保護するために使用されるときに、組換え酵母由来アルブミン調製物は、血漿由来アルブミン生成物と比較して、保存中の細胞に対して最大の保護を提供することが結論付けられる。２〜８℃で２３．５時間保存した後に必ずしも差が明らかではないことに留意する。これは、その短期間の後に細胞が凍結解凍の生理学的ショックに十分に反応するのに不十分な時間を有していたという事実によると考えられる。
【０３１１】
凍結および解凍などの生理学的ショック後の保存中の細胞生存率を最大にするためには、２％のアルブミン濃度が５％のアルブミン濃度より好ましいことも結論付けられる。
【０３１２】
実施例２
ｈＭＳＣの凍結保存用添加剤としてのＡｌｂＩＸ（登録商標）の有益な効果、およびＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）（Ｇｒｉｆｏｌｓ  Ｓ．Ａ．によって製造された市販の血漿由来アルブミン溶液）との比較を確認するために、さらなる試験を行った。
【０３１３】
総合的分析は、標準的な１０％のｈＳＥＲＢ（ヒト血清Ｂ）、および探索的な５％のＰＬ（血小板溶解物）の２つの戦略を用いて拡大された異なるドナーからの異なる細胞培養において行われ、生存率、同一性、および多分化能に関して、解凍−凍結プロセスの効率および細胞懸濁液の安定性を評価した。
【０３１４】
幹細胞を、それらの最終製剤に調整する前に凍結保存した。使用されている標準的な凍結保存溶液は、１０％のＤＭＳＯと、２％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ｇｒｉｆｏｌｓ．，Ｓ．ＡからのＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標））の溶液との組み合わせからなった。
【０３１５】
試薬および溶液：
研究の実験段階で使用される重要な試薬および溶液は以下のとおりである。
−ＡｌｂＩＸ（登録商標）（Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ  Ｌｔｄ、バッチ：ＡＫ１９０２０１）
−Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）（Ｇｒｉｆｏｌｓ  Ｓ．Ａ．、バッチ：ＭＰＡＢ５ＨＡ００１）
−Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）＋２％ｗ／ｖのＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）
−Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）＋２％ｗ／ｖのＡｌｂＩＸ（登録商標）
【０３１６】
参照項目（ＲＩ）：
名称                 ＨＳＡ−ＭＳＣ（Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標））
組成物               ２％ｗ／ｖのＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）および１０％ｖ／ｖ
のＤＭＳＯ溶液でＰｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）中で凍結保
存したエクスビボ拡大したＢＭ−ｈＭＳＣ。
提示                 １０％のｈＳＥＲＢ拡大で各細胞バッチにおける２つのクライオ
バイアル、５％のＰＬ拡大で各細胞バッチにおける１つのクライ
オバイアル。
合格基準             クライオバイアルの細胞濃度：７．５×１０６の生存ｈＭＳＣ／
ｍＬ±２０％（６．０×１０６〜９．０×１０６の生存ｈＭＳＣ
／ｍＬ）。
１０％のｈＳＥＲＢ（ヒト血清Ｂ）：
ＸＣＣ１４０４０：７．５０×１０６の生存ｈＭＳＣ／ｍＬ
ＸＣＯ１５０４８：７．１０×１０６の生存ｈＭＳＣ／ｍＬ
ＸＣＯ１３００８：７．５０×１０６の生存ｈＭＳＣ／ｍＬ
５％のＰＬ（血小板溶解物）：
ＸＣＣ１４０４０：８．０１×１０６の生存ｈＭＳＣ／ｍＬ
ＸＣＯ１５０４８：７．５０×１０６の生存ｈＭＳＣ／ｍＬ
ＸＣＯ１５０５４：８．６５×１０６の生存ｈＭＳＣ／ｍＬ
【０３１７】
試験項目（ＴＩ）
名称                 ＡｌｂＩＸ（登録商標）−ＭＳＣ
組成物               ２％ｗ／ｖのＡｌｂＩＸおよび１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯ溶液でＰ
ｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）中で凍結保存したエクスビボ拡
大したＢＭ−ｈＭＳＣ。
提示                 １０％のｈＳＥＲＢ拡大で各細胞バッチにおける２つのクライオ
バイアル、５％のＰＬ拡大で各細胞バッチにおける１つのクライ
オバイアル。
合格基準             クライオバイアルの細胞濃度：７．５×１０６の生存ｈＭＳＣ／
ｍＬ±２０％（６．０×１０６〜９．０×１０６の生存ｈＭＳＣ
／ｍＬ）。
１０％のｈＳＥＲＢ（ヒト血清Ｂ）：
ＸＣＣ１４０４０：７．５０×１０６の生存ｈＭＳＣ／ｍＬ
ＸＣＯ１５０４８：７．１０×１０６の生存ｈＭＳＣ／ｍＬ
ＸＣＯ１３００８：７．５０×１０６の生存ｈＭＳＣ／ｍＬ
５％のＰＬ（血小板溶解物）：
ＸＣＣ１４０４０：８．３０×１０６の生存ｈＭＳＣ／ｍＬ
ＸＣＯ１５０４８：７．５０×１０６の生存ｈＭＳＣ／ｍＬ
ＸＣＯ１５０５４：７．７６×１０６の生存ｈＭＳＣ／ｍＬ
【０３１８】
実験計画：
細胞拡大
ＡｌｂＩＸ（登録商標）の評価およびＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）との比較のための実験を行うのに十分な数の細胞を生成するために、４つの異なる一次ｈＭＳＣ細胞培養試験系を解凍し、播種し、拡大した。
【０３１９】
異なる戦略に従って、６つの異なる拡大を実施した。第１のものについては、ＸＣＣ１４０４０、ＸＣＯ１５０４８、およびＸＣＯ１３００８と命名された初代細胞培養物を、標準培地製剤：ＤＭＥＭ＋１０％ヒト血清Ｂ（ｈＳＥＲＢ）を使用して培養し、一方、第２のものについては、ＸＣＣ１４０４０、ＸＣＯ１５０４８、ＸＣＯ１５０５４と命名された初代細胞培養物を、ＤＭＥＭ＋５％の血小板溶解物（ＰＬ）と共に培養した。
【０３２０】
異なる条件で、異なる初代細胞培養物の拡大中に得られた動態パラメータ：１０％のｈＳＥＲＢおよび５％のＰＬを、評価し、以下の表に示す。
【表８】
2019533442.tif 000011
【０３２１】
上記の表は、研究中に使用された細胞株の動態的特性を示す（ＣＰＤ：累積集団倍増）。細胞が現在の研究の前に既に拡大されていることを考慮してＣＰＤを計算した。したがって、各前継代培養ステップまたは継代について標準因子３を、計算したＣＰＤに加えた。
【０３２２】
これらのｈＭＳＣについて考慮された最初の継代は−０２であり、これは骨髄（ＢＭ）試料からのｈＭＳＣの単離における出発点である。すべての拡張で、ＣＰＤは、ヘイフリック限界の５０ＣＰＤよりも低くかった。
【０３２３】
両方の培養戦略、ＸＣＣ１４０４０およびＸＣＯ１５０４８に共通する初代細胞培養物の比較において、違いは、倍増時間において検出され、増殖速度は５％のＰＬに対してさらに遅いことを示し、次いで細胞のための準最適な培養条件としてこれを考慮した。このあまり好ましくない培養条件で得られた情報は、抗凍結剤間のより良好な比較の一因となった。
【０３２４】
細菌汚染物質の存在または細胞形態の変化を除外するために、倒立顕微鏡による定期的な目視検査を細胞拡大中に行った。ＰＬの拡大条件の場合、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ検出の相補的分析を行い、否定的な結果を示し、より遅い増殖の原因としてこれを破棄した（データは示さず）。
【０３２５】
細胞の凍結および解凍
コンフルエントに達したら（約７０％）、細胞をトリプシン処理し、細胞計数、生存率、および表現型を凍結前にフローサイトメトリー技術により決定した。サイトメトリー分析で決定された生存細胞の数を考慮して、異なる拡大からの細胞を、２つの異なる部分に分け、遠心分離し、培地上清を破棄し、各部分の細胞ペレットを、１５×１０６の生存ｈＭＳＣ／ｍＬ±２０％の濃度で再構成した。ペレット再構成のための溶液は、ＲＩ条件については、２％ｗ／ｖのＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）でＰｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）、ＴＩ条件については、２％ｗ／ｖのＡｌｂＩＸ（登録商標）でＰｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）であった。
【０３２６】
これらの細胞懸濁液を、実施例１に記載の凍結プロトコルに詳述された手順および工程に従って凍結し、冷却速度中に特定の凍結保存溶液を添加した。各クライオバイアルで達成された最終濃度は、７．５×１０６の生存ｈＭＳＣ／ｍＬ±２０％であり、最終凍結保存細胞懸濁液の組成は、ＲＩについては、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ中の１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯおよび２％ｗ／ｖのＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）であり、ＴＩについては、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ中の１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯおよび２％ｗ／ｖのＡｌｂＩＸ（登録商標）であった。
【０３２７】
最低７日後、細胞を、実施例１に記載の解凍プロトコルに従うが、異なる特定の解凍溶液：ＲＩについては、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）中の２％ｗ／ｖのＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）、およびＴＩについては、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ中の２％ｗ／ｖのＡｌｂＩＸ（登録商標）を使用して解凍した。
【０３２８】
アルブミン溶液の研究は、２つの部分：凍結保存プロセスおよび安定性に分けられた。
【０３２９】
凍結保存保護
アルブミン溶液がｈＭＳＣに提供し得る凍結保護効果を評価するために、サイトメトリー分析を、解凍後に繰り返し、凍結前の結果と比較した。補完的評価である、ＰＬで培養した細胞の場合、細胞計数および生存率のみを実施した。
【０３３０】
実施した凍結保存後のフローサイトメトリー分析は、安定性評価の時間０を構成した。
【０３３１】
安定性評価：細胞生存率および細胞同一性
ｈＭＳＣ懸濁液を、それぞれ、ＰＬまたはｈＳＥＲＢで拡大させた細胞のために、１０または２０ｍＬの注射器中にパッケージし、液体に対する空気体積の比率を０．４に維持した。試料を、２〜８℃で保存し、使用された培養戦略に応じて０時間、２４時間、４８時間、および７２時間の異なる時点で、さまざまな評価を行った。
【０３３２】
ＰＬは、培養を拡大した。
ＰＬで拡大された細胞の安定性評価は、２つの異なる方法を使用して、言及された時点に沿った生存率の決定からなった。
−フローサイトメトリー：７ＡＡＤおよびアネキシンＶマーカーを、それぞれ使用して、壊死細胞およびアポトーシス細胞の両方を考慮して、生存率の決定を行った。
−多重画像取得による蛍光細胞分析に基づくＮＣ３０００（商標）ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）技術：２つの異なるプロトコルに従い、第１のものまたは標準物は、細胞濃度、凝集、および生存率の決定を可能にし、第２のプロトコルは、初期および後期アポトーシス細胞をアネキシンＶ結合およびＰＩ包含を使用して測定することを考えると、アポトーシスプロセスのより完全な研究のために使用された。
【０３３３】
ｈＳＥＲＢは、培養を拡大した：
ｈＳＥＲＢを用いて拡大させた細胞の安定性評価は、生存率だけでなく同一性の評価からもなった。生存率の決定のために、ＰＬで拡大された培養物と同じ方法で、２つの異なる方法を実施した。
−０時間、２４時間、４８時間、および７２時間のフローサイトメトリー。
−０時間、２４時間、および７２時間での細胞計数、凝集、および生存率のみを含む標準的な手順によるＮｕｃｅｌｏＣｏｕｎｔｅｒの決定。
【０３３４】
同一性の決定はまた、０時間、２４時間、および７２時間の時点でフローサイトメトリーによっても評価した。考慮された表面マーカー発現は、ＩＳＣＴ（国際細胞療法学会）から適合され、合格基準も、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、およびＣＤ９０抗原については、少なくとも９５．０、ＣＤ４５およびＣＤ３１については、５％以下、およびＨＬＡ−ＤＲについては、２０％以下であった、経験に従って設定された。
【０３３５】
安定性評価：多能性
細胞効力は、１０％のｈＳｅｒＢ添加培地を用いて、拡大させた細胞培養物から得られた試料に対してのみ、０時間、２４時間、および７２時間の時点で評価した。３つの異なる系統（脂肪生成性、骨形成性、および軟骨形成性）に分化する細胞の能力を評価した。
【０３３６】
２つの４８ウェルフォーマットプレート（１つは基底状態用、もう１つは分化用）を、実施された各染色プロトコルのために播種した。基底状態は、播種後０〜２日で染色されたが、分化したものは標準的な培養条件下（３７℃、５％ＣＯ２、および９５％相対湿度（ＲＨ））で、特定の分化培地で細胞を培養した後に染色され、培地は、３〜４日毎に交換した。
【０３３７】
骨形成および脂肪生成分化アッセイの両方については、細胞が使用された分化の刺激および細胞密度にさらされた時間は、１〜４週間であり、３×１０３〜１×１０５細胞／ｃｍ２であった。
【０３３８】
軟骨細胞分化の場合、用いられた播種密度は、７２時間で８．０×１０４±１２．５％細胞／マイクロマスであり、生存細胞の数が少ないために、いくつかの細胞培養では不可能であった。
【０３３９】
結果の分析：
結果の分析およびプロット生成には、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＷｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ６．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を用いた。
【０３４０】
細胞計数、細胞生存率、および細胞凝集のＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）の結果の解釈および分析には、ＮｕｃｌｅｏＶｉｅｗ  ＮＣ−３０００（商標）ソフトウェア（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を用い、細胞集団におけるアポトーシスを決定した。
【０３４１】
細胞計数および細胞同一性評価のサイトメトリー分析には、ＢＤ  Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  ｖ５．２．１を用いた。
【０３４２】
結果および考察：
ＡｌｂＩＸ（登録商標）対Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）の凍結保存保護
研究されたアルブミン溶液である、ＡｌｂＩＸ（登録商標）（ＴＩ）およびＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）（ＲＩ）のｈＭＳＣにおける凍結保護効果を、フローサイトメトリーによって生存率および同一性に関して評価した。生存率の評価は、培養拡大戦略、ｈＳＥＲＢおよびＰＬの両方で実施したが、同一性は、ｈＳＥＲＢの拡大についてのみ評価した。
【０３４３】
使用した各初代細胞培養および拡大戦略については、各条件、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）またはＡｌｂＩＸ（登録商標）における凍結前および解凍直後の生存率の割合を評価した。
【０３４４】
研究された初代培養細胞、および使用された増殖戦略によって提供された生存率は、生存率の減少のみが考慮されたことを考慮すると、データ正規化後に減少した。この正規化後の結果（データは示さず）は、両方の凍結保存溶液間に有意な統計的差異がないことを示した（使用された対応のないｔ検定統計分析）。まとめると、解凍直後に、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）およびＡｌｂＩＸ（登録商標）を評価した両方の添加剤の凍結保護効果が同等であることが確認された。
【０３４５】
凍結前対凍結後の表現型
凍結前および解凍後にｈＭＳＣの同一性を比較し、考慮された異なる表面マーカーの発現の割合（％）を確認した（図７を参照のこと）。
【０３４６】
Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）またはＡｌｂＩＸ（登録商標）の凍結保存プロトコルを用いて検討されたすべての条件、凍結前、および解凍後について、ｈＭＳＣの同一性について現在認められている基準を、以下を満たした：ＣＤ１０５、ＣＤ７３、およびＣＤ９０抗原については、少なくとも９５．０、ＣＤ４５およびＣＤ３１については、５％以下、ならびにＨＬＡ−ＤＲについては、２０％以下であった。さらに、実施された統計分析（使用されたＡＮＯＶＡ  Ｔｕｋｅｙの多重比較検定）は、評価された凍結保護剤間にいかなる統計的有意差も見出さなかった。
【０３４７】
したがって、凍結保存プロセスは、表面マーカーの同一性を変えず、ＡｌｂＩＸ（登録商標）またはＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）溶液のいずれもｈＭＳＣの元の表現型を維持した。
【０３４８】
Ａｌｂｉｘ対Ａｌｂｕｔｅｉｎの安定性効果
凍結保存後のｈＭＳＣにおける、研究されたアルブミン溶液である、ＡｌｂＩＸ（登録商標）（ＴＩ）およびＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）（ＲＩ）の安定化効果を、生存率、同一性、および多能性に関して評価した。
（ａ）生存率：
生存率は、フローサイトメトリーによって評価した。ｈＳＥＲＢおよびＰＬ培養拡大戦略の両方について、壊死細胞（７ＡＡＤ）およびアポトーシス細胞（アネキシンＶ）の両方を考慮した二重染色プロトコルを用いて、生存率を、０、２４、４８、および７２時間の異なる時点で評価した。
【０３４９】
図８Ａ（ｈＳＥＲＢ拡大細胞）および図８Ｂ（ＰＬ拡大細胞）では、ＡｌｂＩＸ（登録商標）およびＡｌｂｕｔｉｅｎ（登録商標）の異なる時点および凍結保存条件に沿った生存率の割合（％）を示す。
【０３５０】
解凍直後の時間ｔ＝０時間では、細胞はすべて、細胞培養戦略（ｈＳＥＲＢまたはＰＬ）および凍結保存条件（ＡｌｂＩＸ（登録商標）またはＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標））と関係なく放出基準（生存率＝７０％）に適合した。
【０３５１】
ｈＳｅｒＢの細胞培養戦略およびＡｌｂＩＸ条件（図８Ａ）では、ｔ＝２４時間から規格外（ＯＯＳ）になったＸＣＯ１３００８を除いて、細胞はすべて、異なる時点で７０％よりも高い生存率を示した。この事実は、細胞がより長くＤＭＳＯに曝露された解凍中に起こるという事件の結果であり得、これは、ｔ＝０時間で既により低い生存率をもたらし得る。Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）条件では、ｔ＝２４時間から安定性評価の終了までの３回のうち２回の初代細胞培養は、ＯＯＳであり、７２時間では初代細胞培養はすべて、不適合であった。統計学的分析（ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）は、生存率の低下が、０時間〜７２時間の間の時点でＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）について有意であることを示した（ｐ＜０．０５）が、ＡｌｂＩＸ（登録商標）条件では、生存率の低下は、統計的に有意ではなかった。生存率の低下の値および統計学的分析の結果は、ｈＳＥＲＢで拡大された細胞におけるＡｌｂＩＸ（登録商標）条件に対する安定性の拡大を実証している。
【０３５２】
ＰＬを用いた準最適な細胞培養戦略（図８Ｂ）については、ＡｌｂＩＸ（登録商標）条件も、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）よりも良好な結果を示したが、この場合は、結果はより明白であった。２４時間から７２時間の間、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）で凍結保存した細胞はすべて、ＯＯＳであったが、ＡｌｂＩＸ（登録商標）での処置では、１回の初代培養細胞でのみ生存率が７０％を下回り、最後の時点までは生存しなかった。統計学的分析（ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）は、ｈＳＥＲＢで拡大した細胞について得られたものと同様の結果を示した：安定性時点に沿ったＡｌｂＩＸ（登録商標）条件に対する有意差はないが、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）は、２４、４８、および７２時間で差を示した（ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ｈＳＥＲＢで拡大した細胞と一致しており、ＡｌｂＩＸ（登録商標）での処置がＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）での処置よりも良好な性能を提供するという結論を強化した。
【０３５３】
凍結保存研究の比較のために両方の細胞培養戦略を組み合わせたデータ（図示せず）は、２４〜７２時間の平均生存率値がＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）溶液についてＯＯＳであったが、これらの結果は、ＡｌｂＩＸ（登録商標）溶液に対する安定性の時点研究のすべてに沿って本明細書に準拠した。
【０３５４】
ＡｌｂＩＸ（登録商標）およびＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）での処置条件についての生存率（％）をより良好に比較するために、異なる初代細胞株および拡大戦略において観察された生存率を正規化した。正規化は、安定性のＴ＝０を生存率を１００％と見なし、この値に関して経時的に減少率を計算することからなる。生存率の低下のこれらの割合のグラフ表示を、図８Ｃおよび８Ｄに示す。
【０３５５】
試験したすべての細胞株および培養戦略において、データ正規化後の生存率の低下は、ＡｌｂＩＸ（商標）条件よりもＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）の方が常に高かった。生存率の低下は、経時的に漸増し、ＰＬ細胞については７２時間で６０〜８０％、またはｈＳＥＲＢ細胞については４５〜８５％の値を達成した。統計学的分析（ＡＮＯＶＡノンパラメトリックＳｉｄａｋの多重比較検定を使用）を、凍結保存条件間の比較において実施し、ｈＳＥＲＢ培養戦略については、７２時間（ｐ＜０．０５）で、ならびにＰＬ培養拡大戦略については、ｔ＝２４（ｐ＜０．０５）、４８および７２時間（ｐ＜０．００１）で有意差の検出をもたらした。
【０３５６】
全体として、これらの結果は、以前の結論を確証し、ＡｌｂＩＸ（商標）がＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）と比較して生存率に関して解凍後の生成物の安定性を改善することを確認した。
【０３５７】
表現型
ｈＭＳＣの同一性を、ｈＳＥＲＢで拡大した細胞株についての異なる安定性時点（０、２４、および７２時間）に沿って比較し、考慮された異なる表面マーカーの発現の割合（％）を確認した（図１１を参照のこと）。
【０３５８】
０および２４時間の時点、およびＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）またはＡｌｂＩＸ（登録商標）の凍結保存プロトコルについては、現在認められている基準を、以下を満たした：ＣＤ１０５、ＣＤ７３、およびＣＤ９０抗原については、少なくとも９５．０、ＣＤ４５およびＣＤ３１については、５％以下、ならびにＨＬＡ−ＤＲについては、２０％以下であった。７２時間の時点の場合、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）およびＡｌｂＩＸ（登録商標）を研究した両方の凍結保存条件について、初代細胞培養物ＸＣＯ１３００８は、陽性表面マーカー（ＣＤ１０５、ＣＤ７３、およびＣＤ９０）についてＯＯＳであった。言及した抗原の発現は、許容限界の少なくとも９５．０未満であった。この結果は、この初代細胞培養物の低い生存率：１０％の結果であった。実際、細胞が死滅するとき、それらは、モノクローナル抗体コンジュゲートによって結合され得る環境におけるいくつかの細胞内タンパク質または成分を放出し、特に、この場合のように、細胞頻度が低いときに、誤った結論につながる可能性がある。
【０３５９】
実施された統計学的分析（ＡＮＯＶＡ  Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を使用した）は、安定性評価のために評価された凍結保護剤間にいかなる統計的有意差も示さなかった。凍結保存後の細胞懸濁液の安定性は、同一性に関してＡｌｂＩＸ（登録商標）およびＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）溶液と同等であった。
【０３６０】
ＡｌｂＩＸ（登録商標）対Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）の多能性保護
ｈＭＳＣの多能性、言い換えれば、ｈＳＥＲＢで拡大させ、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）またはＡｌｂＩＸ（登録商標）の条件で凍結保存した初代細胞培養について、解凍後ならびに異なる安定性時点（０、２４、および７２時間）に沿って、異なる中胚葉系統（脂肪生成、骨形成、および軟骨形成）に分化する能力を調べた。
【０３６１】
得られたデータ（図示せず）は、ｈＭＳＣの多能性が凍結保存後および７２時間の解凍後の間、ＡｌｂＩＸ（登録商標）およびＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）条件の両方について安定であることを示した。分化能の欠如がいくつかの条件で検出され、これは少数の生存細胞または細胞培養依存性に関連したが、使用された凍結保存溶液には関連しなかった。
【０３６２】
結論：
凍結防止効果
凍結前および凍結直後の細胞懸濁液を比較したときに、凍結保存溶液ＡｌｂＩＸ（登録商標）（Ｔｌ）とＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）（ＲＩ）との間に生存率および同一性に関して有意差は検出されなかった。
【０３６３】
凍結保存後の安定性の効果
解凍後、評価された安定性の時点に沿って、ＡｌｂＩＸ（登録商標）は、最高の細胞生存率の結果を保証した。
−ｈＳＥＲＢで拡大させた細胞培養物は、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）について４８時間でＯＯＳ（生存率＝７０％）を示したが、ＡｌｂＩＸ（登録商標）について７２時間で第１のＯＯＳが検出された。有意な統計的差異は、ｔ＝７２時間に対するｔ＝０の比較において、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）についてのみ検出された。
−準最適条件で拡大させた初代細胞培養ＰＬは、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）に関してＡｌｂＩＸ（登録商標）のより良好な性能を強化した。生存率のＯＯＳは、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）について２４時間で既に検出されたが、ＡｌｂＩＸ（登録商標）について７２時間で第１のＯＯＳが検出された。有意な統計学的差異が、０時間と比較して、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）について２４時間で検出され、ＡｌｂＩＸ（登録商標）については検出されなかった。
−データ正規化後、生存率の低下の割合は、これまでのデータを確認した：ｈＳＥＲＢで拡大した細胞について、７２時間で、ＰＬで拡大した細胞について、２４、４８、および７２時間の試験したすべての時点でＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）と比較したときに、より低い低下がＡｌｂＩＸ（登録商標）条件で検出され、特経学的に有意な差が観察された。
【０３６４】
ｈＭＳＣの同一性および多能性に関しては、溶液ＡｌｂＩＸ（登録商標）およびＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）は、時間０で得られた結果を維持しながら、研究の異なる時点で同等の結果を示した。
【０３６５】
実施例３
実施例２のＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）で処理した細胞（対照）およびＡｌｂＩＸ（登録商標）で処理した細胞を、２〜８℃で関連した保存培地中で保存したとき、解凍後の時点Ｔ＝０、２４、４８、および７２時間、解凍後の保存後の初期および後期アポトーシスについて評価した。初期および後期アポトーシスは、ＮＣ３０００（商標）ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒを用いて評価した。結果を図１２に示す。
【０３６６】
図１２Ａは、ＡｌｂＩＸ（登録商標）が２４時間より長い保存期間後に、後期アポトーシスに入る細胞数を減少させるのに有効であることを示し、４８および７２時間で明らかな違いを示す。
【０３６７】
図１２Ｂは、ＡｌｂＩＸ（登録商標）が評価されたすべての時点で初期アポトーシスに保持される細胞数を増加させるのに有効であることを示す。
【０３６８】
アポトーシス研究は、対照と比較して細胞が後期アポトーシスに進行するのを妨げることにより、ＡｌｂＩＸ（登録商標）の作用機序を説明し得る。
【０３６９】
実施例４
上述の実施例は、凍結保存の凍結／解凍サイクルの間の幹細胞に対する、凍結保存培地および保存培地の両方に存在するときに、試験酵母由来組換え血清アルブミン、ＡｌｂＩＸ（登録商標）の有益な効果を実証した。
【０３７０】
この実施例では、酵母由来組換え血清アルブミンの役割をさらに研究して、解凍後の安定剤として、または凍結中の凍結防止剤として、あるいはその両方としてその有益な効果を発揮するかどうかを決定した。
【０３７１】
そうするために、４つの異なる条件が設定された。３つの試験項目は、代表的な酵母由来組換え血清アルブミン（ＡｌｂＩＸ（登録商標））を使用し、それは凍結防止剤としてのみ、安定剤としてのみ、または凍結防止剤および安定剤の両方として使用された。参照項目（ＲＩ）として提供されている第４の条件は、ヒト血液由来し、Ｇｒｉｆｏｌｓによって商品化されているアルブミン溶液である、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）の使用であり、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）は、抗凍結剤および安定剤の両方として含まれた。
【０３７２】
これは、以下のとおりにさらに要約され得る。
【表９】
2019533442.tif 000012
【０３７３】
製造変更を実施するときに、ＧＭＰ規制により推奨されているように、凍結前、解凍直後、および安定性試験中に、生存率を評価した。酵母由来組換え血清アルブミンの潜在的な作用機序をさらに調査するためにアポトーシス研究も行った。
【０３７４】
ＭＳＣ培養：
骨髄（ＢＭ）由来の臨床グレードのＭＳＣは、他の箇所（Ｃｏｄｉｎａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，１８（９）：１１９７−１２０８）に記載されているように、適切なドナーインフォームドコンセントを伴う、適正製造基準（ＧＭＰ）準拠バイオプロセスに従って製造した。ＭＳＣは、２ｍＭのグルタミンを含み、１０％（ｖ／ｖ）のヒト血清Ｂ（ｈＳｅｒＢ；Ｂａｎｃ  ｄｅ  Ｓａｎｇ  ｉ  Ｔｅｉｘｉｔｓ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＵＳＡ）からなる「拡大培地」を用いてインビトロでさらに拡大した。すべての培養物を、加湿インキュベーター内で３７℃および５％ＣＯ２に維持し、全培地交換を３〜４日ごとに行った。
【０３７５】
凍結／解凍後の製剤：
大規模な拡大した後、細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；ＯｒｉＧｅｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）および２％（ｗ／ｖ）のＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）またはＡｌｂＩＸ（登録商標）を補充したダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＵＳＡ）からなる溶液中で凍結保存した。条件に応じて、細胞を、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ）中の２％（ｗ／ｖ）のＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）またはＡｌｂＩＸ（登録商標）の溶液で解凍した。次いで、細胞を、１０ｍＬの注射器で調整して、臨床用量を再生成し、安定性研究のために２〜８℃で保存した。
【０３７６】
安定性評価：
細胞濃度および生存率を、２つの技術：フローサイトメトリーおよび自動細胞計数器ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（商標）３０００（商標）（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ，Ａｌｌｅｒｏｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて評価した。細胞濃度は、Ｐｅｒｆｅｃｔ−Ｃｏｕｎｔｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（商標）（Ｃｙｔｏｇｎｏｓ）を用いてフローサイトメトリーによって評価した。Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ生存率アッセイおよび細胞計数を、製造業者の取扱説明書に従って行った。細胞生存率の割合は、７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）およびアネキシン−Ｖを用いた二重染色によるフローサイトメトリーで決定した。細胞膜が壊死プロセスによって損傷を受けるときに、７ＡＡＤはＤＮＡに特異的に結合するが、アネキシン−Ｖは、通常、原形質膜のリーフレット内で発現され、初期アポトーシスの間に外部に移行するホスファチジルセリンに結合する。
【０３７７】
アポトーシスアッセイ：
初期および後期アポトーシス細胞の割合は、製造業者の取扱説明書に記載されているように、自動細胞計数器ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ−３０００ＴＭ（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ，Ａｌｌｅｒｏｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて評価した。簡言すれば、細胞を、Ｈｏｅｓｃｈｔ  ３３３４２で染色して、全細胞集団を選択し、アネキシン−Ｖ結合を初期アポトーシス細胞の特異的染色に使用し、最終的に、細胞をＰＩでインキュベートして、壊死細胞を定量化した。ＮｕｃｌｅｏＶｉｅｗ  ＮＣ３０００ソフトウェア（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ  Ａ／Ｓ、Ａｌｌｅｒｏｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（商標）からの結果を分析し、解釈した。
【０３７８】
参考文献
Ｇｙｄｅｖａｎｇ  ４３，ＤＫ−３４５０  Ａｌｌｅｒｏｄ，ＤｅｎｍａｒｋのＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ  Ａ／Ｓによって公開された、「Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  Ａｓｓａｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ−３０００（商標）Ｓｙｓｔｅｍ」と題する出願記録番号３０１７  Ｒｅｖ．１．４、および例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ．ｃｏｍ／ｗｐ−ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１５／０４／９９４−３０１７−Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−Ａｓｓａｙ．ｐｄｆで、オンラインで利用可能である。
【０３７９】
結果：
生存率分析：
凍結前および凍結後の生存率を、フローサイトメーターおよびＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒの２つのデバイスを用いて項目すべてについて比較した。
【０３８０】
両方の技術からの結果を図１３に示す。両方のデバイスで同様の傾向が観察された。解凍直後、試験項目（ＴＩ１、ＴＩ２およびＴＩ３）がすべて、合格基準を満たした（生存率＞７０％）が、３つの参照項目のうち２つ（ＲＩ）は既に規格外であった。これは、ＡｌｂＩＸ（登録商標）を含む試験項目がすべて、凍結保存培地および保存培地の両方にＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）を用いた参照項目（ＲＩ）と比較して、解凍直後により良好な生存率を示したことを実証する。
【０３８１】
ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ技術によって決定されたＴＩ３の生存率の割合が、凍結前の試料中の生存率のレベルと有意に異ならないことは注目に値し、これは、ＡｌｂＩＸ（登録商標）などの酵母由来組換え血清アルブミンが、凍結保存培地および保存培地の両方に使用されているときに、特に高度の細胞保護を示す。
【０３８２】
これらのデータは、ＡｌｂＩＸ（登録商標）などの酵母由来組換え血清アルブミンが解凍後の生存率を改善することを示す。最大の効果のために、酵母由来組換え血清アルブミンが凍結保存培地のみ、保存培地のみ、または最大効果に対してその両方に含まれるときに、有益な効果が観察された。
【０３８３】
解凍直後（ｔ＝０時間）の生存率の測定可能な差が図１３のデータで観察されたことに注目することは興味深い。相対的に、実施例２では、解凍直後の生存率は、凍結保存および保存培地中のＡｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）およびＡｌｂＩＸ（登録商標）の使用の間で同等であることを報告した。理論によって拘束されることなく、この差は、実施例２および４において試験するための細胞を提供するために使用される拡大戦略の差に起因し得ると考えられる。実施例２などの場合、細胞拡大のための最適培地および条件の使用は、解凍直後に検出された生存率の等価性をもたらすようである（２４時間以上のようなより長い保存期間後に差異が明らかになった）が、凍結保存前の準最適および／または応力条件において拡大された細胞は、ＡｌｂＩＸ（登録商標）またはＡｌｂｕｅｔｉｎ（登録商標）の使用に応じて、解凍直後の生存率により顕著な差があるように見える。
【０３８４】
生存率はまた、解凍直後から７２時間までの２〜８℃での解凍後の長期保存期間にわたって評価した。結果を図１４に提供する。
【０３８５】
図１３および１４の結果は、酵母由来組換え血清アルブミンが、凍結保存培地および保存培地の両方に含まれたときに、最大の有益な保護効果を提供したことを示すが、有益な保護効果はまた、参照項目と比較して、凍結保存培地のみ、または保存培地のみのいずれかに含まれたときにも観察された。
【０３８６】
ＲＩとＴＩ２の直接比較は、保存培地中の酵母由来組換え血清アルブミンを単独で提供する利点を示す。フローサイトメトリーのために壊死細胞（７ＡＡＤ）およびアポトーシス細胞（アネキシンＶ）の両方を考慮した二重染色プロトコルを用いて、生存率を、０、２４、４８、および７２時間の解凍後の時点で評価した。壊死細胞（ＰＩ）およびアポトーシス細胞（アネキシンＶ）も考慮したｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒについて三重染色を使用した。フローサイトメトリーはそれらのサイズおよび形態に従って細胞をゲートしたが、ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒは、第３の染色Ｈｏｅｃｈｓｔで細胞を選択した。結果を図１５に示す。
【０３８７】
結果は、解凍後、ＲＩ試料からの３つのうち１つの細胞株のみが日常的な合格基準を満たした（生存率＞７０％）ことを示す。対照的に、ＴＩ２からの細胞株はすべて、７０％超の生存率を示した。ＡｌｂＩＸ（登録商標）で解凍および調整したＴＩ２は、試験したすべての時点でより高い割合の生存率を示した。
【０３８８】
ＲＩおよびＴＩ２のデータを正規化して、ｔ＝０時間で解凍直後に観察された生存率の初期の割合（％）に影響されずに経時的に生存率の変動を評価した。この試験の目的のために、時点０時間を、各試料について１００％の生存率を有する時点と見なし、この時点からの生存率の低下をこの値に関して評価した。図１６に示すように、各細胞株についてデータをプロットした。
【０３８９】
生存率の低下における同様の傾向が、フローサイトメトリーおよびｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒの両方で観察された。両方のデバイスについて、正規化された生存率の低下の有意差が、ｔ＝４８時間から観察され、その場合、生存率の低下は、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（商標）で解凍されたＲＩよりもＡｌｂＩＸ（登録商標）で解凍されたＴＩ２の方が低かった。参照項目の生存率の低下は、ｔ＝２４時間ですでに有意になったが、生存率の低下は、ｔ＝４８時間から有意になった（データは示さず）。
【０３９０】
データは、ＡｌｂＩＸなどの酵母由来組換え血清アルブミンが、２〜８℃で起こる生存率の低下を減少させることによって、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）などの血漿由来アルブミンと比較して、生成物の安定性を有意に増加させたことを示す。
【０３９１】
保存培地中のＡｌｂＩＸ（登録商標）などの酵母由来組換え血清アルブミンの有益な効果が、凍結保存培地中に酵母由来組換え血清アルブミンをさらに含むことによって改変されるかどうかを決定するために追加の試験を行った。ＴＩ１とＴＩ３とを比較するアポトーシスアッセイの結果を図１７に提供する。
【０３９２】
上述のように、ＴＩ１は、凍結保存培地にはＡｌｂＩＸ（登録商標）を使用するが、保存培地にはＡｌｂｕｔｅｉｎ（商標）を使用することを特徴とし、一方、ＴＩ３は、凍結保存培地および保存培地の両方にＡｌｂＩＸ（登録商標）を使用することを特徴とする。
【０３９３】
結果は、ＴＩ３がすべての時点でより高い生存率を有することを示す。データ正規化（図示せず）後、データは、各時点でＴＩ１に対してよりもＴＩ３に対しての方が生存率の低下が少ないことを示した。これらの結果は、保存培地中のＡｌｂＩＸ（登録商標）などの酵母由来組換え血清アルブミンの有益な効果を実証している。有益な効果は、凍結保存培地中に含まれることだけに限定されず、凍結保存培地の特定の同一性にも依存しない（最良の結果は、凍結保存培地および保存培地の両方においてＡｌｂＩＸ（登録商標）を用いて得られた）。
【０３９４】
ＲＩとＴＩ３との比較は、両方の培地（ＲＩ）中のＡｌｂｕｔｅｉｎ（商標）の使用と比較して、凍結保存培地および保存培地（ＴＩ３）の両方において、ＡｌｂＩＸ（登録商標）などの組換え血清アルブミンを含むことの利点を直接示す。結果を図１８に示し、生存率があらゆる時点でＴＩ３についての安定性研究において有意に高いことを示している。これらの差は、解凍後のより長い保存期間にわたって増加する傾向があった。
【０３９５】
ＲＩとＴＩ３とを比較するデータの正規化後（データは示さず）、ＲＩだけでなく評価された他の試験項目と比較して、各時点での生存率の低下は、ＴＩ３よりもＲＩの方が大きく、後者が、経時的に最も低い生存率の低下を伴う最良の条件であると思われる。
【０３９６】
ＡｌｂＩＸ（登録商標）などの酵母由来組換え血清アルブミンは生成物の安定性を改善すると結論付けられる。酵母由来組換え血清アルブミンが凍結保存培地のみ、保存培地のみ、またはその両方に含まれるときに、有益な効果が得られ得る。
【０３９７】
アポトーシス分析：
アポトーシスアッセイによるＲＩ試料とＴＩ２試料との比較の結果を図１９Ａに提供する。ｔ＝２４時間から、２つの項目間に明らかな有意差が観察された（ＡＮＯＶＡ  Ｓｉｄａｋの多重比較検定）。データ正規化後、ｔ＝０時間から７２時間までで、両方の項目について初期アポトーシス細胞の有意な減少が観察され、これは保存期間中に初期アポトーシスから後期アポトーシスへの切り替えの一般的過程を示す。しかしながら、ｔ＝２４およびｔ＝４８時間では、Ｒ  １とＴ  １２との間に明らかな差があった。データは、ＲＩ試料と比較して、ＴＩ２の後期アポトーシスへの転換の減少を示し、ＡｌｂＩＸ（登録商標）などの酵母由来組換え血清アルブミンが後期アポトーシスに入る細胞のプロセスを遅くし得るという結論を支持する。
【０３９８】
これらの結果から、ＡｌｂＩＸ（登録商標）などの酵母由来組換え血清アルブミンは、初期アポトーシス状態での解凍後の保存における凍結保存幹細胞の維持を支持し、後期アポトーシスへの転換を減少させ、保存培地の安定剤として使用されるときに、細胞生成物の安定性を増加させると結論付ける。
【０３９９】
アポトーシスアッセイによるＴＩ１試料とＴＩ３試料との比較の結果を図１９Ｂに提供する。データはさらに、保存培地中の安定化剤としてのＡｌｂＩＸ（登録商標）などの酵母由来組換え血清アルブミンが、凍結保存培地中のアルブミンの同一性にかかわらず、後期アポトーシス状態への細胞の転換を遅くし得るという結論を支持する。
【０４００】
アポトーシスアッセイによるＲＩ試料とＴＩ３試料との比較の結果を図１９Ｃに提供する。結果は、初期アポトーシス細胞の割合が安定性試験中の各時点でＲＩとＴＩ３の間で有意に異なっていたことを示す。同様に、これら２つの項目間の後期アポトーシス細胞の割合の差もまた有意であった。これらのデータはさらに、ＡｌｂＩＸ（登録商標）などの酵母由来組換え血清アルブミンが、解凍後の保存中に細胞の進入を後期アポトーシスに遅らせる能力を有することを確認する。
【０４０１】
実施例５
植物由来組換えアルブミン生成物に対するＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライムとＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファとの比較
上記のように、Ｆｒａｈｍ  ｅｔ  ａｌ，２０１４，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ，９（１）：ｅ１０９８９３（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）は、酵母由来組換え血清アルブミン（具体的には、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライムおよびＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ）の特性が、別の組換え植物由来血清アルブミン生成物、血漿由来血清アルブミンおよび組換え植物由来血清アルブミン生成物と比較された研究を報告した。
【０４０２】
組換え酵母由来血清アルブミン生成物は、他の供給源から（例えば、血漿から、または植物などの他の組換え供給源から）得られた血清アルブミン組成物からの多数の物理的差異を示した。さらに、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライムおよびＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ生成物は、Ｐｉｃｈｉａから入手した他の組換え酵母由来血清アルブミンとはいくつかの明らかな差を示した。
【０４０３】
本発明の実施例は、さらなる違いを実証する。
【０４０４】
生成物の要約を、以下の表に示す。記載されている組換えアルブミンはすべて、生物薬剤の用途を意図している。
【表１０】
2019533442.tif 000013
【０４０５】
「標識純度」という見出しの列は、生成物シートに製造業者によって示されている純度のレベルを指す。
【０４０６】
純度および均質性：
組換えアルブミンなどのタンパク質賦形剤の純度を理解することは複雑である。宿主細胞タンパク質レベルおよび賦形剤などの最終製剤中の他の成分の存在を理解することに加えて、タンパク質自体の均質性にも注意を払わなければならない。グリコシル化または部分的に分解されたタンパク質のような、修飾型のタンパク質が大量に存在すると、タンパク質の機能性に大きな影響を与え、さらに規制当局へのその物質の許容性を低下させる可能性がある。
【０４０７】
この実施例で試験された市販の組換えアルブミンはすべて、電気泳動に基づいて９５〜９９％の製造業者指定のタンパク質純度仕様書を有する。これはこのパラメータを決定するための標準的な技術であるが、タンパク質の不均質を完全には解決しないであろう。質量分析による市販の組換えアルブミンの詳細な分析を行い、データを図１に示す。これらのデータは、図２に比較ゲル電気泳動データと共に示されている。
【０４０８】
ゲル電気泳動による比較的同様の標識純度の主張にもかかわらず、質量分析はより興味深い写真を示す。Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライムおよびＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ（図１（ａ））は共に、天然のヒト血清アルブミン分子を表す６６．４ｋＤａの主に単一の種を示した。相対的に、評価された他の市販の組換えアルブミン試料はすべて、最終製剤中のタンパク質の部分的に分解またはグリコシル化された形態を示す複数のピークを含んでいた。恐らく、最も顕著な質量スペクトルは、供給源１からの米由来生成物で記録された（図１（ｂ））。この生成物は、評価された質量範囲において約４０のピークを示した。この分析に基づいて、存在するタンパク質のごく一部が天然のヒト血清アルブミンであることは明らかである。これは、９６％（ｗ／ｗ）超の標識純度の主張にもかかわらない。
【０４０９】
外観：
外観は、しばしば、生成物の色および透明度を調べるために行われる最初の分析試験のうちの１つである。このパラメータは、しばしば、生成物の品質および純度の直接的な指標と見なされるいため、重要である。材料が比較的大量に存在する可能性がある場合、賦形剤による生成物の色素沈着の有意な増加は望ましくない場合がある。
【０４１０】
図３に示される画像は、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライムおよびＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファが評価された製品の中で最も着色が少ないことを示しており、どちらの製品も透明／麦わら色をしている。代替生成物は、米由来生成物である供給者１からのアルブミンによる色素沈着のレベルの増加を示し、最大の色素沈着を示し、最終生成物は橙色／琥珀色を有する。
【０４１１】
機能の特徴付け：
アルブミン分子は、製剤安定化のための天然の抗酸化剤である天然の遊離チオール基を含む。この基は天然アルブミン分子に固有のものであるが、それは不十分な保存または処理のために酸化および不活性化され得る。
【０４１２】
この実施例に記載されている市販の組換えアルブミンの遊離チオール含有量を以下の表に示す。
【表１１】
2019533442.tif 000014
【０４１３】
遊離チオールレベルが生成物間で異なり、酵母由来組換えアルブミン生成物が最高レベルの遊離チオール含有量を示すことは明らかである。Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライムおよびＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファは、試験したアルブミンのすべての最高レベルを示した。米に由来する市販のアルブミン１は、ほぼ完全にブロックした。
【０４１４】
実施例６
酵母由来組換えアルブミン、植物由来組換えアルブミン生成物、または血漿由来アルブミンの存在下での幹細胞培養の比較
この研究の目的は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）培養用途における細胞培養サプリメントとしての使用のための６つの異なるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）試料の適合性を評価することであった。
【０４１５】
試験した試料は、以下のとおりであった：
・試料１、３、４、および５：異なる多くの酵母由来組換えＨＳＡ（ＡｌｂＩＸ（登録商標））。
・試料２：Ｓｉｇｍａから入手の血漿由来ＨＳＡ（Ａ  ９０８０）。
・試料６：Ｓｉｇｍａから入手の植物由来組換えＨＳＡ、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ（商標）（Ａ９７３１）。
【０４１６】
次いで、８継代の異種由来成分不含細胞培養系で予め培養した２つの異なるｈＥＳＣ株（ＳＡ１２１およびＳＡ１８１）を、異なる試験試料のそれぞれを含む異種由来成分不含培地に移し、免疫細胞化学およびＱＰＣＲによる多能性マーカーの発現について分析する前に、さらなる７継代のために対して成長させた。ＤＥＦ−ＣＳ（商標）（市販の化学的に定義されたヒトｉＰＳ細胞培養培地）およびＡｌｂＩＸ（登録商標）を含有する異種由来成分不含細胞培地を、研究における対照として使用した。
【０４１７】
細胞を各継代で計数し、倍増時間を式Ｔｄ＝ｔｘ［ｌｏｇ２／ｌｏｇ（収穫時の細胞密度／播種時の密度）］（式中、ｔ＝継代間の時間（時間））を用いて計算した。次いで、平均倍増時間を各試験培地について計算し、データを、Ｔｕｋｅｙの一対比較を用いて一元配置ＡＮＯＶＡによって分析した。
【０４１８】
結果
酵母由来組換えＨＳＡ（試料１、３、４、および５）は、それらが７継代の間ＳＡ１２１およびＳＡ１８１細胞株の両方の未分化増殖を支持するので、ｈＥＳＣのための培地サプリメントとしての使用に好適であることが見出された。ＱＰＣＲおよび免疫細胞化学的分析は、これらの培養物中で多能性マーカーが均一に発現されることを実証し、分化マーカーの低レベルの発現が調べられた。試料１、３、４、および５を用いて得られた結果は、両方の対照と比較して好都合である。
【０４１９】
血漿由来ＨＳＡ（試料２）は、ＳＡ１８１細胞系の未分化増殖を支持することができなかったので不適切であることが見出されたが、ＳＡ１２１細胞は、このＨＳＡを含有する培地中ではよく増殖した。
【０４２０】
植物由来組換えＨＳＡ、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ（商標）（試料６）もまた、ＳＡ１２１またはＳＡ１８１細胞系のいずれの成長も支持することができず、いずれの場合も初代継代前に培養が失敗したため、ｈＥＳＣ培養用途には不適当であることもわかった。
＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊  ＊
【０４２１】
したがって、本発明は、以下の番号付けされた段落によって定義される主題を提供する。
１．幹細胞の保存方法であって、幹細胞を凍結保存培地と組み合わせて、混合物を生成するステップと、混合物を凍結して、凍結幹細胞生成物を生成するステップと、を含み、
任意に、本方法は、凍結幹細胞生成物を解凍するステップと、解凍された細胞を保存培地に移すステップと、幹細胞を保存培地中に保存するステップと、をさらに含み、
凍結保存培地および／または保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む、方法。
２．幹細胞の保存方法であって、幹細胞を保存培地中に保存することを含み、
幹細胞は、凍結保存培地中で凍結され、解凍され、次いで保存前に保存培地に移されており、
凍結保存培地および／または保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む、方法。
３．該方法は、幹細胞を前記凍結乾燥培地中で凍結して、凍結幹細胞生成物を生成するステップと、凍結幹細胞生成物を解凍するステップと、解凍された細胞を保存培地に移すステップと、幹細胞を保存培地中に保存するステップと、を含み、
凍結保存培地および／または保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む、段落１または２に記載の方法。
４．組換え酵母由来血清アルブミン調製物が、幹細胞と混合したときに、凍結保存培地および／または保存培地中に、約０．０１％（ｗ／ｖ）超および１０％（ｗ／ｖ）未満、約９％（ｗ／ｖ）未満、約８％（ｗ／ｖ）未満、約７％（ｗ／ｖ）未満、または約６％（ｗ／ｖ）未満、例えば約０．１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）、好ましくは約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３（ｗ／ｖ）、または約４％（ｗ／ｖ）の濃度である組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質を提供するのに好適な量で存在する、段落１〜３のいずれかに記載の方法。
５．組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、凍結保存培地中に存在し、保存培地中にも存在する、段落１〜４のいずれかに記載の方法。
６．幹細胞は、２〜８℃の温度で保存培地中に保存される、段落１〜５のいずれかに記載の方法。
７．幹細胞は、２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存培地中に保存され、
幹細胞は、２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、２〜８℃の温度で保存され、保存期間の終了時の幹細胞の生存率は、５％超、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上、
例えば、約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上である、段落１〜６のいずれかに記載の方法。
８．凍結保存培地および／または保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、以下の特性：
（ｃ）０．５％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは０．４％、０．３％、０．２％、もしくは０．１５％未満が、コンカナバリンＡへ結合すること、および／または
（ｄ）０．６モルのヘキソース／タンパク質１モル未満、好ましくは０．１０、０．０７５、もしくは０．０５モルのヘキソース／タンパク質１モル未満の糖化レベル、のうちの１つ以上を示す、段落１〜７のいずれかに記載の方法。
９．凍結保存培地および／または保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、
（ｄ）少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、より好ましくは少なくとも約９９．５％の単量体および二量体、好ましくは本質的に１００％の単量体および二量体であり、
（ｅ）少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、もしくは９７％の単量体であり、ならびに／または
（ｆ）約１．０％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）、もしくは０．０１％（ｗ／ｗ）以下、好ましくはそれ未満のアルブミンポリマー含有量を有する、段落１〜８のいずれかに記載の方法。この文脈に使用されるように、組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質に適用される「ポリマー」という用語は、単量体および二量体形態とは異なる。
１０．凍結保存培地および／または保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、酵母由来血清アルブミンタンパク質、カチオン（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、好ましくはナトリウムなど）、および平衡アニオン（塩化物、リン酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、または酢酸塩、好ましくは塩化物またはリン酸塩）、水、ならびに任意にオクタノエートおよびポリソルベート８０を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、段落１〜９のいずれかに記載の方法。
１１．凍結保存培地および／または保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１８ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１２ｍＭ、１０ｍＭ、８ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．３ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００１ｍＭ未満のオクタノエートを含むか、オクタノエートを実質的に含まないか、またはオクタノエートを含まない、段落１〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．凍結保存培地ならびに／または組換え酵母由来血清アルブミン調製物および幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む保存培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１８ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１２ｍＭ、１０ｍＭ、８ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．３ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００１ｍＭ未満のオクタノエートを含むか、オクタノエートを実質的に含まないか、またはオクタノエートを含まない、段落１１に記載の方法。
１３．凍結保存培地および／または保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下の全脂肪酸含有量を有するか、実質的に脂肪酸を含まないか、または脂肪酸を含まない、段落１〜１２のいずれかに記載の方法。
１４．凍結保存培地ならびに／または組換え酵母由来血清アルブミン調製物および幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む保存培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下の全脂肪酸含有量を有するか、実質的に脂肪酸を含まないか、または脂肪酸を含まない、段落１３に記載の方法。
１５．凍結保存培地および／または保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製剤は、２００ｍｇ．Ｌ−１、１５０ｍｇ．Ｌ−１、１００ｍｇ．Ｌ−１、９０ｍｇ．Ｌ−１、８０ｍｇ．Ｌ−１、７０ｍｇ．Ｌ−１、６０ｍｇ．Ｌ−１、５０ｍｇ．Ｌ−１、４０ｍｇ．Ｌ−１、３０ｍｇ．Ｌ−１、２０ｍｇ．Ｌ−１、１５ｍｇ．Ｌ−１、１０ｍｇ．Ｌ−１、５ｍｇ．Ｌ−１、４ｍｇ．Ｌ−１、３ｍｇ．Ｌ−１、２ｍｇ．Ｌ−１、１ｍｇ．Ｌ−１、０．５ｍｇ．Ｌ−１、０．１ｍｇ．Ｌ−１、０．０１ｍｇ．Ｌ−１、０．００１ｍｇ．Ｌ−１未満の濃度で、ポリソルベート（好ましくはポリソルベート８０）などの洗剤を含むか、洗剤を実質的に含まないか、または洗剤を含まない、段落１〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．凍結保存培地、ならびに／または組換え酵母由来血清アルブミン調製物および幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む保存培地は、２００ｍｇ．Ｌ−１、１５０ｍｇ．Ｌ−１、１００ｍｇ．Ｌ−１、９０ｍｇ．Ｌ−１、８０ｍｇ．Ｌ−１、７０ｍｇ．Ｌ−１、６０ｍｇ．Ｌ−１、５０ｍｇ．Ｌ−１、４０ｍｇ．Ｌ−１、３０ｍｇ．Ｌ−１、２０ｍｇ．Ｌ−１、１５ｍｇ．Ｌ−１、１０ｍｇ．Ｌ−１、５ｍｇ．Ｌ−１、４ｍｇ．Ｌ−１、３ｍｇ．Ｌ−１、２ｍｇ．Ｌ−１、１ｍｇ．Ｌ−１、０．５ｍｇ．Ｌ−１、０．１ｍｇ．Ｌ−１、０．０１ｍｇ．Ｌ−１、０．００１ｍｇ．Ｌ−１未満の濃度で、ポリソルベート（好ましくはポリソルベート８０）などの洗剤を含むか、または洗剤を含まない（好ましくはポリソルベート８０を含まない）、段落１５に記載の方法。
１７．凍結保存培地および／または保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．００１ｍＭ未満の全遊離アミノ酸レベルおよび／もしくはＮ−アセチルトリプトファンレベルを含むか、具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを実質的に含まないか、または具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを含まない、段落１〜１６のいずれかに記載の方法。
１８．凍結保存培地ならびに／または組換え酵母由来血清アルブミン調製物および幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む保存培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．００１ｍＭ未満の全遊離アミノ酸レベルおよび／もしくはＮ−アセチルトリプトファンレベルを含み、具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを実質的に含まないか、または具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを含まない、段落１７に記載の方法。
１９．凍結保存培地および／または保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、オクタノエート、具体的には、遊離アミノ酸、および／もしくはＮ−アセチルトリプトファン、ならびに洗浄剤（ポリソルベート８０など）のすべてを実質的に含まないか、または完全に含まない、段落１〜１８のいずれかに記載の方法。
２０．凍結保存培地ならびに／または組換え酵母由来血清アルブミン調製物および幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む保存培地は、オクタノエート、具体的には、遊離アミノ酸、および／またはＮ−アセチルトリプトファン、ならびに洗剤（ポリソルベート８０など）のすべてを実質的に含まないか、または完全に含まない、段落１９に記載の方法。
２１．凍結保存培地および／もしくは前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム、もしくはそれに類似の調製物、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ、もしくはそれに類似の調製物、またはＡｌｂＩＸ（登録商標）、もしくはそれに類似の調製物、から選択される調製物である、段落１〜２０のいずれかに記載の方法。
２２．凍結保存培地および／または保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、ヘム、プレカリクレイン活性化因子、発熱物質、Ｃ型肝炎、および／またはヒトウイルスから選択される１つ以上、例えばすべての成分を含まず、ならびに／または２００μｇ．Ｌ−１未満、例えば、１８０μｇ．Ｌ−１、１６０μｇ．Ｌ−１、１４０μｇ．Ｌ−１、１２０μｇ．Ｌ−１、１００μｇ．Ｌ−１、９０μｇ．Ｌ−１、８０μｇ．Ｌ−１、７０μｇ．Ｌ−１、６０μｇ．Ｌ−１、５０μｇ．Ｌ−１、もしくは４０μｇ．Ｌ−１未満、より典型的には、約１０μｇ．Ｌ−１〜約３０μｇ．Ｌ−１の範囲内のアルミニウム濃度を有する、段落１〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．凍結保存培地、ならびに／または組換え酵母由来血清アルブミン調製物および幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む保存培地は、ヘム、プレカリクレイン活性化因子、発熱物質、Ｃ型肝炎、および／またはヒトウイルス）から選択される１つ以上、例えばすべての成分を含まず、ならびに／または２００μｇ．Ｌ−１未満、例えば、１８０μｇ．Ｌ−１、１６０μｇ．Ｌ−１、１４０μｇ．Ｌ−１、１２０μｇ．Ｌ−１、１００μｇ．Ｌ−１、９０μｇ．Ｌ−１、８０μｇ．Ｌ−１、７０μｇ．Ｌ−１、６０μｇ．Ｌ−１、５０μｇ．Ｌ−１、もしくは４０μｇ．Ｌ−１未満、より典型的には、約１０μｇ．Ｌ−１〜約３０μｇ．Ｌ−１の範囲内のアルミニウム濃度を有する、段落２０に記載の方法。
２４．凍結保存培地および／または保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、無傷または実質的に無傷のＮ末端配列を有する、段落１〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．凍結保存培地および／または保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、質量分析法によって試験したとき、組換え植物由来血清アルブミンタンパク質（図１に示される試料など）と比較して、天然の無傷のヒト血清アルブミン分子を表す約６６．４ｋＤａの主要ピークとは異なる、実質的により少ないピーク（例えば、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、もしくはそれ以下よりも少ない）を示す、段落１〜２４のいずれかに記載の方法。
２６．凍結保存培地および／または保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、６２％超、例えば、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、約９６％、約９７％である遊離チオール基含有量を有するアルブミンタンパク質を含む、段落１〜２５のいずれかに記載の方法。
２７．凍結保存培地および／または保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって試験したとき、１４分未満および１９分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外し、より好ましくは、１４分または１５分未満および１８分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外する、ＳＥＣプロファイルを示すアルブミンタンパク質を含む、段落１〜２６のいずれかに記載の方法。
２８．凍結保存培地および／または保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって試験したとき、天然単量体形態のアルブミンに対応する単一の主要ピークを示すアルブミンタンパク質を含む、段落１〜２７のいずれかに記載の方法。
２９．凍結保存培地および／または保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、質量分析法によって試験したとき、１タンパク質当たり１３、１２、１１、１０、９、８、７、６未満、例えば、約１〜１１、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、１、または１未満のヘキソース修飾リジンおよび／またはアルギニン残基を示す生成物であるアルブミンタンパク質を含む、段落１〜２８のいずれかに記載の方法。
３０．凍結保存培地および／または保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、植物特異的糖で糖化されていないアルブミンタンパク質を含む、段落１〜２９のいずれかに記載の方法。
３１．植物特異的糖は、α−１，３−フコースおよび／またはβ−１，２−キシロースから選択される、段落３０に記載の方法。
３２．凍結保存培地は、組換え血清アルブミン調製物および凍結保存剤を含み、
任意に、凍結保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物の水溶液、凍結保存剤、およびイオン性緩衝液を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、
好ましくは、イオン性緩衝液は、電解質の水溶液を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、例えば、電解質は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、塩化物イオン、酢酸イオン、リン酸イオン、および／またはグルコン酸イオンからなる群から選択され、
より好ましくは、イオン性緩衝液は、ヒトの生理学的血漿の電解質濃度、浸透圧、および／またはｐＨを模倣する電解質濃度、浸透圧、および／またはｐＨを有し、
最も好ましくは、イオン性緩衝液は、幹細胞に対して実質的に等張性であり、および／またはイオン性緩衝液は、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）である、段落１〜３１のいずれかに記載の方法。
３３．凍結保存培地は、幹細胞培養増殖培地ではなく、好ましくは、幹細胞の増殖を支持せず、より好ましくは、ビタミン、ホルモン、成長因子、鉄源、遊離アミノ酸、および／またはグルコースなどの典型的な幹細胞培養培地の成分のうちのいかなる１つ以上（例えばすべて）のレベルも実質的に含まないか、または含まない、段落３２に記載の方法。
３４．凍結保存剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール（ＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、およびトレハロースからなる群から選択される、段落３２または３３に記載の方法。
３５．保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含み、
任意に、保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物の水溶液およびイオン性緩衝液を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、
好ましくは、イオン性緩衝液は、電解質の水溶液を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、例えば、電解質は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、塩化物イオン、酢酸イオン、リン酸イオン、および／またはグルコン酸イオンからなる群から選択され、
より好ましくは、イオン性緩衝液は、ヒトの生理学的血漿の電解質濃度、浸透圧、および／またはｐＨを模倣する電解質濃度、浸透圧、および／またはｐＨを有し、
最も好ましくは、イオン性緩衝液は、幹細胞に対して実質的に等張性であり、および／またはイオン性緩衝液は、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）である、段落１〜３４のいずれかに記載の方法。
３６．保存培地は、幹細胞培養増殖培地ではなく、好ましくは、幹細胞の増殖を支持せず、より好ましくは、ビタミン、ホルモン、成長因子、鉄源、遊離アミノ酸、および／またはグルコースなどの典型的な幹細胞培養培地の成分のうちのいかなる１つ以上（例えばすべて）のレベルも実質的に含まないか、または含まない、段落３５に記載の方法。
３７．凍結保存培地および／または保存培地は、血清由来アルブミン調製物のうちの１つ以上の成分、例えば、ヘム、プレカリクレイン活性化因子、発熱物質、Ｃ型肝炎ヒトウイルス、および／または他のヒトウイルス、および／またはＮ−アセチルトリプトファンからなる一覧から選択される、１つ以上の成分（例えばすべて）を含まず、好ましくは、オクタノエートおよび／または洗剤（ポリソルベート８０など）を実質的に含まないか、または完全に含まない、段落１〜３６のいずれかに記載の方法。
３８．幹細胞は、ヒト幹細胞である、段落１〜３７のいずれかに記載の方法。
３９．幹細胞は、多能性幹細胞（胚性幹細胞、胚性生殖細胞、誘発多能性幹細胞など）、多能性幹細胞（例えば、任意に、脂肪、骨髄、臍帯血、もしくは臍帯に由来し得る間葉系幹細胞のような成体幹細胞；任意に、骨髄もしくは末梢血に由来し得る造血幹細胞；神経幹細胞；または生殖幹細胞）、または単能性幹細胞（肝細胞のための単分化能幹細胞など）、からなる群から選択される、段落１〜３８のいずれかに記載の方法。
４０．幹細胞は、非ヒト幹細胞である、段落１〜３９のいずれかに記載の方法。
４１．方法は、幹細胞を任意に２〜８℃の温度で、さらに任意に２４時間を超える時間の期間、例えば最大４８時間、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存培地中に保存することを含み、
幹細胞を保存培地中に保存するステップ後に直接的または間接的に、該方法は、幹細胞を培養するステップと、幹細胞の培養を拡大するステップと、幹細胞を分化させるステップと、幹細胞、またはそれに由来する培養および／もしくは分化された細胞を、例えば組織もしくは医療用インプラントに固定化するステップと、幹細胞、またはそれに由来する培養および／もしくは分化された細胞もしくは他の生成物を、薬学的に許容可能な組成物または獣医学的に許容可能な組成物中に製剤化するステップと、幹細胞、またはそれらに由来する培養および／もしくは分化された細胞もしくは他の生成物を患者に投与するステップと、から選択される１つ以上のステップをさらに含む、段落１〜４０のいずれかに記載の方法。
４２．方法は、幹細胞を保存培地中に保存することを含み、保存後、幹細胞は、例えば、骨細胞、心筋細胞、膵臓ベータ細胞、ニューロン、線維芽細胞、心筋細胞、骨芽細胞、および／または軟骨細胞から選択される細胞型に分化する、段落１〜４１のいずれかに記載の方法。
４３．幹細胞の凍結保存のための凍結保存培地であって、組換え酵母由来血清アルブミン調製物および凍結保存剤を含む、凍結保存培地。
４４．凍結保存剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール（ＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、およびトレハロースからなる群から選択される、段落４３に記載の凍結保存培地。
４５．組換え血清アルブミン調製物の水溶液、凍結保存剤、およびイオン緩衝液を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり、
好ましくは、イオン性緩衝液は、電解質の水溶液を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、例えば、電解質は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、塩化物イオン、酢酸イオン、リン酸イオン、および／またはグルコン酸イオンからなる群から選択され、
より好ましくは、イオン性緩衝液は、ヒトの生理学的血漿の電解質濃度、浸透圧、および／またはｐＨを模倣する電解質濃度、浸透圧、および／またはｐＨを有し、
最も好ましくは、イオン性緩衝液は、幹細胞に対して実質的に等張性であり、および／またはイオン性緩衝液は、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）である、段落４３または４４に記載の凍結保存培地。
４６．幹細胞をさらに含み、
任意に、幹細胞は、多能性幹細胞（胚性幹細胞、胚性生殖細胞、誘発多能性幹細胞など）、多能性幹細胞（例えば、任意に、脂肪、骨髄、臍帯血、もしくは臍帯に由来し得る間葉系幹細胞のような成体幹細胞；任意に、骨髄もしくは末梢血に由来し得る造血幹細胞；神経幹細胞；または生殖幹細胞）、または単能性幹細胞（肝細胞のための単分化能幹細胞など）、からなる群から選択される、段落４３から４５のいずれかに記載の凍結保存培地。
４７．凍結されている、段落４６に記載の凍結保存培地。
４８．凍結され、次いで解凍されている幹細胞を含む、段落４７に記載の凍結保存培地。
４９．組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、幹細胞と混合したときに、凍結保存培地中に、約０．０１％（ｗ／ｖ）超および１０％（ｗ／ｖ）未満、約９％（ｗ／ｖ）未満、約８％（ｗ／ｖ）未満、約７％（ｗ／ｖ）未満、または約６％（ｗ／ｖ）未満、例えば約０．１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）、好ましくは約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３（ｗ／ｖ）、または約４％（ｗ／ｖ）の濃度である組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質を提供するのに好適な量で存在する、段落４３〜４８のいずれかに記載の凍結保存培地。
５０．凍結保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、以下の特性：
（ａ）０．５％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは０．４％、０．３％、０．２％、もしくは０．１５％未満が、コンカナバリンＡへ結合すること、および／または
（ｂ）０．６モルのヘキソース／タンパク質１モル未満、好ましくは０．１０、０．０７５、もしくは０．０５モルのヘキソース／タンパク質１モル未満の糖化レベル、のうちの１つ以上を示す、段落４３〜４９のいずれかに記載の凍結保存培地。
５１．凍結保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、
（ａ）少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、より好ましくは少なくとも約９９．５％の単量体および二量体、好ましくは本質的に１００％の単量体および二量体であり、
（ｂ）少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、もしくは９７％の単量体であり、ならびに／または
（ｃ）は、約１．０％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）、もしくは０．０１％（ｗ／ｗ）以下、好ましくはそれ未満のアルブミンポリマー含有量を有する、段落４３〜４９のいずれかに記載の凍結保存培地。
５２．
（ａ）凍結保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、酵母由来血清アルブミンタンパク質、カチオン（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、好ましくはナトリウムなど）、および平衡アニオン（塩化物、リン酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、または酢酸塩、好ましくは塩化物またはリン酸塩）、水、ならびに任意にオクタノエートおよびポリソルベート８０を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、
（ｂ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１８ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１２ｍＭ、１０ｍＭ、８ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．３ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００１ｍＭ未満のオクタノエートを含むか、オクタノエートを実質的に含まないか、またはオクタノエートを含まず、
（ｃ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下の全脂肪酸含有量を有するか、実質的に脂肪酸を含まないか、または脂肪酸を含まず、
（ｄ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地は、２００ｍｇ．Ｌ−１、１５０ｍｇ．Ｌ−１、１００ｍｇ．Ｌ−１、９０ｍｇ．Ｌ−１、８０ｍｇ．Ｌ−１、７０ｍｇ．Ｌ−１、６０ｍｇ．Ｌ−１、５０ｍｇ．Ｌ−１、４０ｍｇ．Ｌ−１、３０ｍｇ．Ｌ−１、２０ｍｇ．Ｌ−１、１５ｍｇ．Ｌ−１、１０ｍｇ．Ｌ−１、５ｍｇ．Ｌ−１、４ｍｇ．Ｌ−１、３ｍｇ．Ｌ−１、２ｍｇ．Ｌ−１、１ｍｇ．Ｌ−１、０．５ｍｇ．Ｌ−１、０．１ｍｇ．Ｌ−１、０．０１ｍｇ．Ｌ−１、０．００１ｍｇ．Ｌ−１未満の濃度で、実質的にポリソルベート（好ましくはポリソルベート８０）などの洗剤を含まないか、または洗剤を含まず（好ましくはポリソルベート８０を含まず）、
（ｅ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．００１ｍＭ未満の全遊離アミノ酸レベルおよび／もしくはＮ−アセチルトリプトファンレベルを含むか、具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを実質的に含まないか、または具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを含まず、
（ｆ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地は、オクタノエート、具体的には、遊離アミノ酸、および／またはＮ−アセチルトリプトファン、ならびに洗剤（ポリソルベート８０など）のすべてを実質的に含まないか、または全く含まず、
（ｇ）凍結保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム、もしくはそれに類似の調製物、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ、もしくはそれに類似の調製物、またはＡｌｂＩＸ（登録商標）、もしくはそれに類似の調製物、から選択される調製物であり、
（ｈ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む凍結保存培地は、ヘム、プレカリクレイン活性化因子、発熱物質、Ｃ型肝炎、および／もしくはヒトウイルス）から選択される１つ以上、例えばすべての成分を含まず、ならびに／または２００μｇ．Ｌ−１未満、例えば、１８０μｇ．Ｌ−１、１６０μｇ．Ｌ−１、１４０μｇ．Ｌ−１、１２０μｇ．Ｌ−１、１００μｇ．Ｌ−１、９０μｇ．Ｌ−１、８０μｇ．Ｌ−１、７０μｇ．Ｌ−１、６０μｇ．Ｌ−１、５０μｇ．Ｌ−１、もしくは４０μｇ．Ｌ−１未満、より典型的には、約１０μｇ．Ｌ−１〜約３０μｇ．Ｌ−１の範囲内のアルミニウム濃度を有し、
（ｉ）凍結保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、無傷または実質的に無傷のＮ末端配列を有し、
（ｊ）凍結保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、６２％超、例えば、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、約９６％、約９７％である遊離チオール基含有量を有するアルブミンタンパク質を含み、
（ｋ）凍結保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって試験したとき、１４分未満および１９分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外し、より好ましくは、１４分または１５分未満および１８分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外する、ＳＥＣプロファイルを示すアルブミンタンパク質を含み、
（ｌ）凍結保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって試験したとき、天然単量体形態のアルブミンに対応する単一の主要ピークを示すアルブミンタンパク質を含み、
（ｍ）凍結保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、質量分析法によって試験したとき、１タンパク質当たり１３、１２、１１、１０、９、８、７、６未満、例えば、約１〜１１、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、１、または１未満のヘキソース修飾リジンおよび／もしくはアルギニン残基を示す生成物であるアルブミンタンパク質を含み、かつ／あるいは
（ｎ）凍結保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、α−１，３−フコースおよび／またはβ−１，２−キシロースなどの植物特異的糖で糖化されていないアルブミンタンパク質を含む、段落４３〜５１のいずれかに記載の凍結保存培地。
５３．凍結保存培地中で凍結され、解凍され、次いで保存培地に移された幹細胞を保存するための保存培地であって、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む、保存培地。
５４．組換え酵母由来血清アルブミン調製物の水溶液およびイオン性緩衝液を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、
イオン性緩衝液は、電解質の水溶液を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、例えば、電解質は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、塩化物イオン、酢酸イオン、リン酸イオン、および／またはグルコン酸イオンからなる群から選択され、
好ましくは、イオン性緩衝液は、ヒトの生理学的血漿の電解質濃度、浸透圧、および／またはｐＨを模倣する電解質濃度、浸透圧、および／またはｐＨを有し、
より好ましくは、イオン性緩衝液は、幹細胞に対して実質的に等張性であり、および／またはイオン性緩衝液は、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）である、段落５３に記載の保存培地。
５５．組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、幹細胞と混合したときに、保存培地中に、約０．０１％（ｗ／ｖ）超および１０％（ｗ／ｖ）未満、約９％（ｗ／ｖ）未満、約８％（ｗ／ｖ）未満、約７％（ｗ／ｖ）未満、または約６％（ｗ／ｖ）未満、例えば約０．１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）、好ましくは約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３（ｗ／ｖ）、または約４％（ｗ／ｖ）の濃度である組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質を提供するのに好適な量で存在する、段落５３または５４に記載の凍結保存培地。
５６．保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質が、以下の特性：
（ａ）０．５％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは０．４％、０．３％、０．２％、もしくは０．１５％未満が、コンカナバリンＡへ結合すること、および／または
（ｂ）０．６モルのヘキソース／タンパク質１モル未満、好ましくは０．１０、０．０７５、もしくは０．０５モルのヘキソース／タンパク質１モル未満の糖化レベル、のうちの１つ以上を示す、段落５３〜５５のいずれかに記載の保存培地。
５７．保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、
（ａ）少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、より好ましくは少なくとも約９９．５％の単量体および二量体、好ましくは本質的に１００％の単量体および二量体であり、
（ｂ）少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、または９７％の単量体であり、および／または
（ｃ）は、約１．０％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）または０．０１％（ｗ／ｗ）以下、好ましくはそれ未満のアルブミンポリマー含有量を有する、段落５３〜５６のいずれかに記載の保存培地。
５８．
（ａ）保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、酵母由来血清アルブミンタンパク質、カチオン（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、好ましくはナトリウムなど）、および平衡アニオン（塩化物、リン酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、または酢酸塩、好ましくは塩化物またはリン酸塩）、水、ならびに任意にオクタノエートおよびポリソルベート８０を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、
（ｂ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む保存培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１８ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１２ｍＭ、１０ｍＭ、８ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．３ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００１ｍＭ未満のオクタノエートを含むか、オクタノエートを実質的に含まないか、またはオクタノエートを含まず、
（ｃ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む保存培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下の全脂肪酸含有量を有するか、脂肪酸を実質的に含まないか、または脂肪酸を含まず、
（ｄ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む保存培地は、２００ｍｇ．Ｌ−１、１５０ｍｇ．Ｌ−１、１００ｍｇ．Ｌ−１、９０ｍｇ．Ｌ−１、８０ｍｇ．Ｌ−１、７０ｍｇ．Ｌ−１、６０ｍｇ．Ｌ−１、５０ｍｇ．Ｌ−１、４０ｍｇ．Ｌ−１、３０ｍｇ．Ｌ−１、２０ｍｇ．Ｌ−１、１５ｍｇ．Ｌ−１、１０ｍｇ．Ｌ−１、５ｍｇ．Ｌ−１、４ｍｇ．Ｌ−１、３ｍｇ．Ｌ−１、２ｍｇ．Ｌ−１、１ｍｇ．Ｌ−１、０．５ｍｇ．Ｌ−１、０．１ｍｇ．Ｌ−１、０．０１ｍｇ．Ｌ−１、０．００１ｍｇ．Ｌ−１未満の濃度で、ポリソルベート（好ましくはポリソルベート８０）などの洗剤を含むか、または洗剤を含まず（好ましくはポリソルベート８０を含まず）、
（ｅ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む保存培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．００１ｍＭ未満の全遊離アミノ酸レベルおよび／もしくはＮ−アセチルトリプトファンレベルを含むか、具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを実質的に含まないか、または具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを含まず、
（ｆ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む保存培地は、オクタノエート、具体的には、遊離アミノ酸、および／またはＮ−アセチルトリプトファン、ならびに洗剤（ポリソルベート８０など）のすべてを実質的に含まないか、または全く含まず、
（ｇ）保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム、もしくはそれに類似の調製物、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ、もしくはそれに類似の調製物、またはＡｌｂＩＸ（登録商標）、もしくはそれに類似の調製物、から選択される調製物であり、
（ｈ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に幹細胞を含む１つ以上の他の成分を含む保存培地は、ヘム、プレカリクレイン活性化因子、発熱物質、Ｃ型肝炎、および／もしくはヒトウイルス）から選択される１つ以上、例えばすべての成分を含まず、ならびに／または、２００μｇ．Ｌ−１未満、例えば、１８０μｇ．Ｌ−１、１６０μｇ．Ｌ−１、１４０μｇ．Ｌ−１、１２０μｇ．Ｌ−１、１００μｇ．Ｌ−１、９０μｇ．Ｌ−１、８０μｇ．Ｌ−１、７０μｇ．Ｌ−１、６０μｇ．Ｌ−１、５０μｇ．Ｌ−１、または４０μｇ．Ｌ−１未満、より典型的には、約１０μｇ．Ｌ−１〜約３０μｇ．Ｌ−１の範囲内のアルミニウム濃度を有し、
（ｉ）保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、無傷または実質的に無傷のＮ末端配列を有し、
（ｊ）保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、６２％超、例えば、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、約９６％、約９７％である遊離チオール基含有量を有するアルブミンタンパク質を含み、
（ｋ）保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって試験したとき、１４分未満および１９分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外し、より好ましくは、１４分または１５分未満および１８分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外する、ＳＥＣプロファイルを示すアルブミンタンパク質を含み、
（ｌ）保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって試験したとき、天然単量体形態のアルブミンに対応する単一の主要ピークを示すアルブミンタンパク質を含み、
（ｍ）保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、質量分析法によって試験したとき、１タンパク質当たり１３、１２、１１、１０、９、８、７、６未満、例えば、約１〜１１、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、１、または１未満のヘキソース修飾リジンおよび／もしくはアルギニン残基を示す生成物であるアルブミンタンパク質を含み、かつ／あるいは
（ｎ）保存培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、α−１，３−フコースおよび／もしくはβ−１，２−キシロースなどの植物特異的糖で糖化されていないアルブミンタンパク質を含む、段落５３〜５７のいずれかに記載の保存培地。
５９．幹細胞をさらに含み、
任意に、幹細胞は、多能性幹細胞（胚性幹細胞、胚性生殖細胞、誘発多能性幹細胞など）、多能性幹細胞（例えば、任意に、脂肪、骨髄、臍帯血、もしくは臍帯に由来し得る間葉系幹細胞のような成体幹細胞；任意に、骨髄もしくは末梢血に由来し得る造血幹細胞；神経幹細胞；または生殖幹細胞）、または単能性幹細胞（肝細胞のための単分化能幹細胞など）、からなる群から選択される、段落５３〜５８のいずれかに記載の保存培地。
６０．凍結保存培地中で凍結され、解凍され、次いで保存培地に移された幹細胞をさらに含む、段落５９に記載の保存培地。
６１．段落４３〜５２のいずれかに定義される、凍結保存培地中で凍結され、解凍され、次いで保存培地に移された幹細胞をさらに含む、段落６０に記載の保存培地。
６２．幹細胞をさらに含み、２〜８℃の温度で保存培地に保存されている、段落５３〜６１のいずれかに記載の保存培地。
６３．幹細胞、任意に凍結保存培地中で凍結され、解凍され、次いで保存培地に移された幹細胞をさらに含み、幹細胞が２４時間を超える時間の期間、例えば最大４８時間、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存することを含む、段落５３〜６２のいずれかに記載の保存培地。
６４．凍結保存培地中で凍結され、解凍され、次いで保存培地に移されており（または保存培地に移される前に別の生理学的ショックを受けた）、２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、２〜８℃の温度で保存されている、幹細胞をさらに含み、保存期間の終了時の幹細胞の生存率は、５％超、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上、
例えば、約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上である、段落６３に記載の保存培地。
６５．組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、幹細胞と混合したときに、保存培地中に約２％（ｗ／ｖ）±１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１％（ｗ／ｖ）で存在し、
保存培地は、幹細胞、任意に凍結保存培地中で凍結され、解凍され、次いで保存培地に移されており（または保存培地に移される前に別の生理学的ショックを受けた）、２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存培地中で保存されている、幹細胞をさらに含み、
保存期間の終了時の幹細胞の生存率は、５％超、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上、
例えば、約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上である、段落６３に記載の保存培地。
６６．組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、幹細胞と混合したときに、保存培地中に５％（ｗ／ｖ）±１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１％（ｗ／ｖ）で存在し、
保存培地は、幹細胞、任意に凍結保存培地中で凍結され、解凍され、次いで保存培地に移されており（または保存培地に移される前に別の生理学的ショックを受けた）、２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存培地中で保存されている、幹細胞を含みさらに含み、
保存期間の終了時の幹細胞の生存率は、５％超、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、もしくはそれ以上、
例えば、約５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、もしくはそれ以上である、段落６３に記載の保存培地。
６７．幹細胞の保存のための、段落４３〜５２のいずれかに記載の凍結保存培地の使用。
６８．２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、幹細胞の保存後に、生存状態での幹細胞の保存のための、任意に、
保存期間の終了時の幹細胞の生存率は、５％超、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上、
例えば、約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上である、段落６７に記載の使用。
６９．２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存する前に、幹細胞を凍結保存培地と組み合わせて、混合物を生成することと、混合物を凍結して、凍結幹細胞生成物を生成する（または幹細胞を別の生理学的ショックを受ける）ことによって、幹細胞を保存するための、段落６７または６８に記載の使用。
７０．凍結幹細胞生成物を解凍するステップと、解凍された細胞を保存培地に移すステップと、幹細胞を２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存培地中に保存するステップと、をさらに含む方法によって、幹細胞を保存するための、段落６９に記載の使用。
７１．幹細胞を凍結保存培地と組み合わせて、混合物を生成することと、幹細胞が生理学的ショックを受けることと、細胞を保存培地に移すことと、幹細胞を２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存培地中に保存することと、によって、幹細胞を保存するための、段落６９に記載の使用。
７２．保存培地は、段落５３〜６６のいずれかに記載の保存培地である、段落７０または７１に記載の使用。
７３．幹細胞を保存培地に保存することによって、幹細胞を保存するための、段落５３〜６６のいずれかに記載の保存培地の使用。
７４．幹細胞は、凍結保存培地中で凍結され、解凍され、次いで保存前に保存培地に移されている、段落７３に記載の使用。
７５．幹細胞は、凍結保存培地と混合され、生理学的ショックを受け、保存前に保存培地に移されている、段落７３に記載の使用。
７６．凍結保存培地は、段落４３〜５２のいずれかに記載の凍結保存培地である、段落７４または７５に記載の使用。
７７．凍結保存幹細胞の解凍後の生存率を改善するための、組換え酵母由来血清アルブミンの使用。
７８．改善は、同じ濃度で使用される血漿由来血清アルブミンと比較される、段落７７に記載の使用。
７９．改善は、２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存培地中に保存されたとき、解凍後の幹細胞において観察できる、段落７７または７８に記載の使用。
８０．組換え酵母由来血清アルブミンは、それを凍結保存培地に製剤化することと、凍結前に、幹細胞と凍結保存培地を混合することと、によって使用され、任意に、凍結保存培地は、段落４３〜５２のいずれかに定義される培地である、段落７７〜７９のいずれかに記載の使用。
８１．組換え酵母由来血清アルブミンは、それを凍結保存培地に製剤化することと、解凍後に、幹細胞と凍結保存培地を混合することと、によって使用され、任意に、保存培地は、段落５３〜６６のいずれかに定義される培地である、段落７７〜８０のいずれかに記載の使用。
８２．生理的衝撃を受ける、幹細胞の生存率を改善するための、組換え酵母由来血清アルブミンの使用。
８３．改善は、同じ濃度で使用される血漿由来血清アルブミンの使用と比較される、段落８２に記載の使用。
８４．改善は、２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存培地中に保存されたとき、解凍後の幹細胞において観察できる、段落８２または８３に記載の使用。
８５．組換え酵母由来血清アルブミンは、それを凍結保存培地に製剤化することと、生理学的ショック前に、幹細胞と凍結保存培地を混合することと、によって使用され、任意に、凍結保存培地は、段落４３〜５２のいずれかに定義される培地である、段落８２〜８４のいずれかに記載の使用。
８６．組換え酵母由来血清アルブミンは、それを保存培地に製剤化することと、生理学的ショックを受けた後に、幹細胞と保存培地を混合することと、によって使用され、任意に、保存培地は、段落５３〜６６のいずれかに定義される培地である、段落８２〜８６のいずれかに記載の使用。
８７．初期アポトーシスから後期アポトーシスへの細胞（例えば、動物細胞、ヒト細胞、および好ましくは幹細胞）の転換を防止、遅延、または減少させるための方法であって、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地と細胞を混合することを含む、方法。
８８．例えば、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地の形態で、初期アポトーシスから後期アポトーシスへの細胞（例えば、動物細胞、ヒト細胞、および好ましくは幹細胞）の転換を防止、遅延、または減少させるための、組換え酵母由来血清アルブミン調製物の使用。
８９．細胞は、エクスビボ細胞である、段落８７に記載の方法または段落８８に記載の使用。
９０．細胞は、生理学的ショックを受ける前および／または受けた後に組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地と混合される、段落８７もしくは８９に記載の方法、または段落８８もしくは８９に記載の使用。
９１．生理学的ショックは、熱ショック、低温ショック、浸透圧ショック、表面相互作用、せん断応力、栄養欠乏、毒性化合物への曝露、代謝産物への曝露および／またはその喪失、酵素への曝露および／またはその喪失、化学的ショック、ｐＨショック、有機溶液への曝露、せん断力への曝露、表面曝露および／または表面暴露の損失から選択され、任意に、凍結保存中、凍結および／または凍結のステップのうちの１つ以上に起因するショックであり得る、段落９０に記載の方法または使用。
９２．初期アポトーシスは、例えば、フローサイトメトリーを用いて決定されるように、アネキシン（アネキシンＶなど）結合を示すが、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）および／または７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）の包含を示さない細胞によって特徴付けられる、段落８７または８９〜９１のいずれかに記載の方法または段落８８〜９１のいずれかに記載の使用。
９３．初期アポトーシスは、アネキシン結合を伴うが、ＰＩおよび／または７ＡＡＤの包含を伴わない、生理学的ショックを受けていない同じバッチの細胞において観察されるレベルより高いミトコンドリア透過性によってさらに特徴付けられる、段落９２に記載の方法または使用。
９４．後期アポトーシスは、例えば、フローサイトメトリーを用いて決定されるように、アネキシン（アネキシンＶなど）結合を示し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）および／または７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）の包含も示す細胞によって特徴付けられる、段落８７もしくは８８〜９３のいずれかに記載の方法または段落８８〜９３のいずれかに記載の使用。
９５．組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、約０．０１％（ｗ／ｖ）超および１０％（ｗ／ｖ）未満、約９％（ｗ／ｖ）未満、約８％（ｗ／ｖ）未満、約７％（ｗ／ｖ）未満、または約６％（ｗ／ｖ）未満、例えば約０．１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）、好ましくは約１％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約３（ｗ／ｖ）、または約４％（ｗ／ｖ）の濃度である組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質を提供するのに好適な量で、細胞と混合する、段落８７もしくは８８〜９４のいずれかに記載の方法または段落８８〜９４のいずれかに記載の使用。
９６．細胞は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地中に２〜８℃の温度で保存される、段落８７もしくは８８〜９５のいずれかに記載の方法または段落８８〜９５のいずれかに記載の使用。
９７．細胞は、２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む培地中に保存され、
任意に、細胞は、２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、２〜８℃の温度で保存され、保存期間の終了時の初期アポトーシスである細胞の割合は、５％超、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上、
例えば、約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％以上である、段落８７もしくは８８〜９６のいずれかに記載の方法または段落８８〜９６のいずれかに記載の使用。
９８．組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質が、以下の特性：
（ａ）０．５％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは０．４％、０．３％、０．２％、もしくは０．１５％未満が、コンカナバリンＡへ結合すること、および／または
（ｂ）０．６モルのヘキソース／タンパク質１モル未満、好ましくは０．１０、０．０７５、もしくは０．０５モルのヘキソース／タンパク質１モル未満の糖化レベル、のうちの１つ以上を示す、段落８７もしくは８８〜９７のいずれかに記載の方法、または段落８８〜９７のいずれかに記載の使用。
９９．組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、
（ａ）少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、より好ましくは少なくとも約９９．５％の単量体および二量体、好ましくは本質的に１００％の単量体および二量体であり、
（ｂ）少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、もしくは９７％の単量体であり、および／または
（ｃ）は、約１．０％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）または０．０１％（ｗ／ｗ）以下、好ましくはそれ未満のアルブミンポリマー含有量を有する、段落８７もしくは８８〜９８のいずれかに記載の方法、または段落８８〜９８のいずれかに記載の使用。
１００．
（ａ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、酵母由来血清アルブミンタンパク質、カチオン（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、好ましくはナトリウムなど）、および平衡アニオン（塩化物、リン酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、または酢酸塩、好ましくは塩化物またはリン酸塩）、水、ならびに任意にオクタノエートおよびポリソルベート８０を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、
（ｂ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に細胞を含む１つ以上の他の成分を含む培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１８ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１２ｍＭ、１０ｍＭ、８ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．３ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００１ｍＭ未満のオクタノエートを含むか、オクタノエートを実質的に含まないか、またはオクタノエートを含まず、
（ｃ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に細胞を含む１つ以上の他の成分を含む培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ以下の総脂肪酸含量を有するか、実質的に脂肪酸を含まないか、または脂肪酸を含まず、
（ｄ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に細胞を含む１つ以上の他の成分を含む培地は、２００ｍｇ．Ｌ−１、１５０ｍｇ．Ｌ−１、１００ｍｇ．Ｌ−１、９０ｍｇ．Ｌ−１、８０ｍｇ．Ｌ−１、７０ｍｇ．Ｌ−１、６０ｍｇ．Ｌ−１、５０ｍｇ．Ｌ−１、４０ｍｇ．Ｌ−１、３０ｍｇ．Ｌ−１、２０ｍｇ．Ｌ−１、１５ｍｇ．Ｌ−１、１０ｍｇ．Ｌ−１、５ｍｇ．Ｌ−１、４ｍｇ．Ｌ−１、３ｍｇ．Ｌ−１、２ｍｇ．Ｌ−１、１ｍｇ．Ｌ−１、０．５ｍｇ．Ｌ−１、０．１ｍｇ．Ｌ−１、０．０１ｍｇ．Ｌ−１、０．００１ｍｇ．Ｌ−１未満の濃度で、ポリソルベート（好ましくはポリソルベート８０）などの洗剤を含むか、洗剤を実質的に含まないか、または洗剤を含まず、
（ｅ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に細胞を含む１つ以上の他の成分を含む培地は、３５ｍＭ、３２．５ｍＭ、３０ｍＭ、２８ｍＭ、２６ｍＭ、２４ｍＭ、２２ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．００１ｍＭ未満の全遊離アミノ酸レベルおよび／もしくはＮ−アセチルトリプトファンレベルを含むか、具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを実質的に含まないか、または具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを含まず、
（ｆ）組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に細胞を含む１つ以上の他の成分を含む培地は、オクタノエート、具体的には、遊離アミノ酸、および／またはＮ−アセチルトリプトファン、ならびに洗剤（ポリソルベート８０など）のすべてを実質的に含まないか、または全く含まず、
（ｇ）組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）プライム、もしくはそれに類似の調製物、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ、もしくはそれに類似の調製物、またはＡｌｂＩＸ（登録商標）、もしくはそれに類似の調製物、から選択される調製物であり、
（ｈ）組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質調製物、ならびに／または組換え酵母由来血清アルブミン調製物および任意に細胞を含む１つ以上の他の成分を含む培地は、ヘム、プレカリクレイン活性化因子、発熱物質、Ｃ型肝炎、および／またはヒトウイルスから選択される１つ以上、例えばすべての成分を含まず、ならびに／または、２００μｇ．Ｌ−１未満、例えば、１８０μｇ．Ｌ−１、１６０μｇ．Ｌ−１、１４０μｇ．Ｌ−１、１２０μｇ．Ｌ−１、１００μｇ．Ｌ−１、９０μｇ．Ｌ−１、８０μｇ．Ｌ−１、７０μｇ．Ｌ−１、６０μｇ．Ｌ−１、５０μｇ．Ｌ−１、または４０μｇ．Ｌ−１未満、より典型的には、約１０μｇ．Ｌ−１〜約３０μｇ．Ｌ−１の範囲内のアルミニウム濃度を有し、
（ｉ）培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、無傷または実質的に無傷のＮ末端配列を有し、
（ｊ）培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、６２％超、例えば、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、約９６％、約９７％である遊離チオール基含有量を有するアルブミンタンパク質を含み、
（ｋ）培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって試験したとき、１４分未満および１９分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外し、より好ましくは、１４分または１５分未満および１８分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外する、ＳＥＣプロファイルを示すアルブミンタンパク質を含み、
（ｌ）培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって試験したとき、天然単量体形態のアルブミンに対応する単一の主要ピークを示すアルブミンタンパク質を含み、
（ｍ）培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、質量分析法によって試験したとき、１タンパク質当たり１３、１２、１１、１０、９、８、７、６未満、例えば、約１〜１１、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、１、または１未満のヘキソース修飾リジンおよび／もしくはアルギニン残基を示す生成物であるアルブミンタンパク質を含み、かつ／あるいは
（ｎ）培地中に存在する組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、α−１，３−フコースおよび／またはβ−１，２−キシロースなどの植物特異的糖で糖化されていないアルブミンタンパク質を含む、段落８７もしくは８８〜９９のいずれかに記載の方法、または段落８８〜９９のいずれかに記載の使用。
【０４２２】
本明細書に記載され、特許請求される本発明は、本明細書に開示される特定の態様によって範囲が限定されるべきではなく、そのため、これらの態様は本発明のいくつかの態様の例示として意図されている。あらゆる同等の態様も、本発明の範囲内にあることが意図されている。実際、本明細書に示され、記載されているものに加えて、本発明の様々な改変は、前述の記載から当業者に明らかとなるであろう。そのような改変はまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図されている。矛盾が生じた場合には、定義を含む本開示は、制御するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年6月11日(2018.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞の保存方法であって、前記幹細胞を凍結保存培地と組み合わせて、混合物を生成するステップと、前記混合物を凍結して、凍結幹細胞生成物を生成するステップと、を含み、
任意に、前記方法は、前記凍結幹細胞生成物を解凍するステップと、前記解凍された細胞を保存培地に移すステップと、幹細胞を前記保存培地中に保存するステップと、をさらに含み、
前記凍結保存培地および／または前記保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含み、より好ましくは前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、前記凍結保存培地中に存在し、前記保存培地中にも存在する、方法。
【請求項２】
幹細胞の保存方法であって、幹細胞を保存培地中に保存することを含み、
前記幹細胞は、凍結保存培地中で凍結され、解凍され、次いで保存前に保存培地に移されており、
前記凍結保存培地および／または前記保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含み、より好ましくは前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、前記凍結保存培地中に存在し、前記保存培地中にも存在する、方法。
【請求項３】
前記方法は、幹細胞を前記凍結乾燥培地中で凍結して、凍結幹細胞生成物を生成するステップと、前記凍結幹細胞生成物を解凍するステップと、前記解凍された細胞を前記保存培地に移すステップと、幹細胞を前記保存培地中に保存するステップと、を含み、
前記凍結保存培地および／または前記保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、前記幹細胞と混合したときに、前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に、約０．０１％（ｗ／ｖ）超および１０％（ｗ／ｖ）未満、例えば、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）、好ましくは約２％（ｗ／ｖ）である濃度の前記組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質を提供するのに好適な量で存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）前記幹細胞は、２〜８℃の温度で前記保存培地中に保存される、および／または
（ｂ）前記幹細胞は、２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば最大約７２時間、もしくはそれ以上、前記保存培地中に保存され、
任意に、前記幹細胞は、２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、２〜８℃の温度で保存され、前記保存期間の終了時の前記幹細胞の生存率は、５％超、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、以下の特性：
（ａ）０．５％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは０．４％、０．３％、０．２％、もしくは０．１５％未満が、コンカナバリンＡへ結合すること、および／または
（ｂ）０．６モルのヘキソース／タンパク質１モル未満、好ましくは０．１０、０．０７５、もしくは０．０５モルのヘキソース／タンパク質１モル未満の糖化レベル、のうちの１つ以上を示す、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、
（ａ）少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、より好ましくは少なくとも約９９．５％の単量体および二量体、好ましくは本質的に１００％の単量体および二量体であり、
（ｂ）少なくとも約９３％、９４％、９５％、９６％、もしくは９７％の単量体であり、ならびに／または
（ｃ）約１．０％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）、もしくは０．０１％（ｗ／ｗ）以下、好ましくはそれ未満のアルブミンポリマー含有量を有し、前記アルブミンポリマーがアルブミンの単量体および二量体形態とは異なる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、酵母由来血清アルブミンタンパク質、カチオン（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、好ましくはナトリウムなど）、および平衡アニオン（塩化物、リン酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、または酢酸塩、好ましくは塩化物またはリン酸塩）、水、ならびに任意にオクタノエートおよびポリソルベート８０を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、
（ｂ）前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地自体は、３５ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、１ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００１ｍＭ未満のオクタノエートを含むか、オクタノエートを実質的に含まないか、またはオクタノエートを含まず、
（ｃ）前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地自体は、３５ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、１ｍＭ以下の全脂肪酸含量を有するか、実質的に脂肪酸を含まないか、または脂肪酸を含まず、
（ｄ）前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または前記凍結保存培地および／または前記保存培地自体は、洗浄剤、例えばポリソルベート（好ましくはポリソルベート８０）を、２００ｍｇ．Ｌ−１、１００ｍｇ．Ｌ−１、５０ｍｇ．Ｌ−１、１０ｍｇ．Ｌ−１、１ｍｇ．Ｌ−１、０．１ｍｇ．Ｌ−１、０．０１ｍｇ．Ｌ−１、０．００１ｍｇ．Ｌ−１未満の濃度で含むか、前記洗浄剤を実質的に含まないか、または前記洗浄剤を含まず、
（ｅ）前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地自体は、３５ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、１ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．００１ｍＭ未満の全遊離アミノ酸レベルおよび／またはＮ−アセチルトリプトファンレベルを含むか、具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファンを実質的に含まないか、または具体的には、遊離アミノ酸および／またはＮ−アセチルトリプトファンを含まず、
（ｆ）前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物、ならびに／または前記凍結保存培地および／または前記保存培地自体は、オクタノエート、具体的には、遊離アミノ酸および／もしくはＮ−アセチルトリプトファン、ならびに洗浄剤（ポリソルベート８０など）のすべてを実質的に含まないか、または全く含まず、
（ｇ）前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）Ｐｒｉｍｅ、もしくはそれに類似の調製物、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）アルファ、もしくはそれに類似の調製物、またはＡｌｂＩＸ（登録商標）、もしくはそれに類似の調製物、から選択される調製物であり、
（ｈ）前記凍結保存培地および／もしくは前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、ならびに／または凍結保存培地および／または保存培地自体は、ヘム、プレカリクレイン活性化因子、発熱物質、Ｃ型肝炎、および／もしくはヒトウイルスから選択される１つ以上、例えばすべての成分を含まず、ならびに／または２００μｇ．Ｌ−１、１００μｇ．Ｌ−１、５０μｇ．Ｌ−１未満、もしくは約１０μｇ．Ｌ−１〜約３０μｇ．Ｌ−１の範囲内のアルミニウム濃度を有し、
（ｉ）前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、無傷または実質的に無傷のＮ末端配列を有し、
（ｊ）前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミンタンパク質は、質量分析法によって試験したとき、組換え植物由来血清アルブミンタンパク質（図１に示される試料など）と比較して、天然の無傷のヒト血清アルブミン分子を表す約６６．４ｋＤａの主要ピークとは異なる、実質的により少ないピークを示し、
（ｋ）前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、６２％超、例えば、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、約９６％、約９７％である遊離チオール基含有量を有するアルブミンタンパク質を含み、
（ｌ）前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって試験したとき、１４分未満および１９分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外し、より好ましくは、１４分または１５分未満および１８分を超えるピーク保持時間を有するピークを除外する、ＳＥＣプロファイルを示すアルブミンタンパク質を含み、
（ｍ）前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって試験したとき、天然単量体形態のアルブミンに対応する単一の主要ピークを示すアルブミンタンパク質を含み、
（ｎ）前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、質量分析法によって試験したとき、１タンパク質当たり１３、１２、１１、１０、９、８、７、６未満、例えば、約１〜１１、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、１、または１未満のヘキソース修飾リジンおよび／またはアルギニン残基を示す生成物であるアルブミンタンパク質を含み、かつ／あるいは
（ｏ）前記凍結保存培地および／または前記保存培地中に存在する前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物は、植物特異的糖で糖化されていないアルブミンタンパク質を含み、例えば、植物特異的糖は、α−１，３−フコースおよび／またはβ−１，２−キシロースから選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記凍結保存培地は、前記組換え血清アルブミン調製物および凍結保存剤を含み、
任意に、前記凍結保存培地は、前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物の水溶液、凍結保存剤、およびイオン緩衝液を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、
前記凍結保存培地は、幹細胞培養増殖培地ではなく、好ましくは、幹細胞の増殖を支持せず、より好ましくは、ビタミン、ホルモン、成長因子、鉄源、遊離アミノ酸、および／またはグルコースなどの典型的な幹細胞培養培地の成分のうちのいずれか１つ以上（例えばすべて）のレベルも実質的に含まないか、または含まない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記保存培地は、前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含み、
任意に、前記保存培地は、前記組換え酵母由来血清アルブミン調製物の水溶液およびイオン性緩衝液を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、
前記保存培地は、幹細胞培養増殖培地ではなく、好ましくは幹細胞の増殖を支持せず、より好ましくは、ビタミン、ホルモン、成長因子、鉄源、遊離アミノ酸、および／またはグルコースなどの典型的な幹細胞培養培地の成分のうちのいずれか１つ以上（例えばすべて）のレベルも実質的に含まないか、または含まない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
方法は、幹細胞を任意に２〜８℃の温度で、さらに任意に２４時間を超える時間の期間、例えば最大４８時間、例えば、最大約７２時間、またはそれ以上、前記保存培地中に保存することを含み、
幹細胞を前記保存培地中に保存するステップ後に直接的または間接的に、前記方法は、前記幹細胞を培養するステップと、前記幹細胞の培養を拡大するステップと、前記幹細胞を分化させるステップと、前記幹細胞、またはそれに由来する培養および／もしくは分化された細胞を、例えば組織もしくは医療用インプラントに固定化するステップと、幹細胞、またはそれに由来する培養および／もしくは分化された細胞もしくは他の生成物を、薬学的に許容可能な組成物または獣医学的に許容可能な組成物中に製剤化するステップと、幹細胞、またはそれらに由来する培養および／もしくは分化された細胞もしくは他の生成物を患者に投与するステップと、から選択される１つ以上のステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
幹細胞の前記凍結保存のための凍結保存培地であって、前記凍結保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物および凍結保存剤を含み、好ましくは前記凍結保存培地は、請求項１〜１１のいずれかに定義される凍結保存培地であり、
任意に、前記凍結保存培地は、幹細胞をさらに含み、
さらに任意に、凍結保存培地は、凍結されているか、または凍結され、次いで解凍されている幹細胞を含む凍結保存培地である、凍結保存培地。
【請求項１３】
凍結保存培地中で凍結され、解凍され、次いで前記保存培地に移されている幹細胞を保存するための保存培地であって、前記保存培地は、組換え酵母由来血清アルブミン調製物を含み、かつ前記保存培地は、幹細胞培養増殖培地ではなく、好ましくは前記保存培地は、請求項１〜１１のいずれかに定義される保存培地であり、
任意に、前記保存培地は、幹細胞をさらに含み、
さらに任意に、前記幹細胞は、凍結保存培地（請求項１２に記載の凍結保存培地など）中で凍結され、解凍され、次いで前記保存培地に移されている、保存培地。
【請求項１４】
前記保存培地は、
（ａ）幹細胞の増殖を支持しない、ならびに／または
（ｂ）ビタミン、ホルモン、成長因子、鉄源、遊離アミノ酸、および／もしくはグルコースのうちのいかなる１つ以上のレベルも実質的に含まないか、または含まない、請求項１３に記載の保存培地。
【請求項１５】
凍結保存培地中で凍結され、解凍され、次いで前記保存培地に移されており（または前記保存培地に移される前に別の生理学的ショックを受けた）、２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、２〜８℃の温度で保存されている、幹細胞をさらに含み、前記保存期間の終了時の前記幹細胞の生存率は、５％超、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上である、請求項１３または１４に記載の保存培地。
【請求項１６】
幹細胞を保存するための、好ましくは前記幹細胞を２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存した後の生存状態での幹細胞の保存のための、任意に、
前記保存期間の終了時の前記幹細胞の生存率は、５％超、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、もしくはそれ以上である、請求項１２に記載の凍結保存培地の使用。
【請求項１７】
（ａ）２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存する前に、前記幹細胞を前記凍結保存培地と組み合わせて、混合物を生成することと、前記混合物を凍結して、凍結幹細胞生成物を生成する（または前記幹細胞を別の生理学的ショックを受ける）ことと、によって、幹細胞を保存するための、
（ｂ）前記凍結幹細胞生成物を解凍するステップと、前記解凍された細胞を保存培地に移すステップと、幹細胞を２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、前記保存培地中に保存するステップと、をさらに含む方法によって、幹細胞を保存するための、または
（ｃ）前記幹細胞を前記凍結保存培地と組み合わせて、混合物を生成することと、前記幹細胞を生理学的ショックを受けることと、前記細胞を保存培地に移すことと、幹細胞を２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、前記保存培地中に保存することと、によって、幹細胞を保存するための、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
幹細胞を前記保存培中に保存することによって、任意に、
（ａ）前記幹細胞が凍結保存培地中で凍結され、解凍され、保存前に前記保存培地に移されており、好ましくは前記凍結保存培地は、請求項１２に記載の凍結保存培地であり、および／または
（ｂ）前記幹細胞が凍結保存培地と混合され、生理学的ショックにさらし、保存前に前記保存培地に移されており、好ましくは前記凍結保存培地が、請求項１２に記載の凍結保存培地である、幹細胞の保存のための、請求項１３、１４、または１５に記載の保存培地の使用。
【請求項１９】
凍結保存された幹細胞の解凍後の生存率を改善するための、組換え酵母由来血清アルブミンの使用であって、
前記改善は、同じ濃度で使用される血漿由来血清アルブミンと比較され、
前記改善は、２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存培地中に保存されたとき、前記解凍後の幹細胞において観察でき、
前記組換え酵母由来血清アルブミンは、それを凍結保存用培地に製剤化することと、凍結前に、幹細胞と前記凍結保存用培地、および請求項１２によって定義される前記凍結保存培地などを混合することと、によって使用される、ならびに／または
前記組換え酵母由来血清アルブミンは、それを保存培地に製剤化することと、解凍後に、幹細胞と前記保存培地を混合することと、によって使用され、任意に、前記保存培地は、請求項１３、１４、または１５によって定義される培地である、使用。
【請求項２０】
生理学的ショックを受ける幹細胞の生存率を改善するための組換え酵母由来血清アルブミンの使用であって、任意に、
前記改善は、同じ濃度で使用される血漿由来血清アルブミンの使用と比較され、
前記改善は、２〜８℃で２４時間を超える時間の期間、最大約４８時間など、例えば、最大約７２時間、もしくはそれ以上、保存培地中に保存されたとき、前記ショック後の幹細胞において観察でき、
前記組換え酵母由来血清アルブミンは、それを凍結保存培地に製剤化することと、前記生理学的ショック前に、幹細胞と前記凍結保存培地、例えば、請求項１２によって定義される凍結保存培地を混合することと、によって使用され、ならびに／または
前記組換え酵母由来血清アルブミンは、それを保存培地に製剤化することと、前記生物学的ショックを受けた後に、幹細胞と前記保存培地、例えば、請求項１３、１４、または１５によって定義される保存培地を混合することと、によって使用される、使用。
【国際調査報告】
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