(57)【要約】  本発明は、レット症候群に罹患している対象を治療するための方法であって、対象を治療するために有効量のプリドピジンを対象に投与することを含む、方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レット症候群（ＲＴＴ）に罹患している対象を治療するための方法であって、
前記対象を治療するために有効量のプリドピジンを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記プリドピジンが塩酸プリドピジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プリドピジンが、経口、経鼻、吸入、皮下注射、または静脈内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、口腔内、膣内、直腸内、眼内、鞘内、局所もしくは皮内経路によって投与される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記プリドピジンが経口投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記プリドピジンが、エアロゾル、吸入粉末、注射剤、液体、ゲル、固体、カプセルまたは錠剤の形態で投与される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記プリドピジンが定期的に投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記プリドピジンが１日１回より少ない頻度で投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記プリドピジンが、１日１回または１日２回投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
投与されるプリドピジンの量が、１０ｍｇ／日〜３１５ｍｇ／日である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
投与されるプリドピジンの前記量が、４５ｍｇ／日〜９０ｍｇ／日である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
投与されるプリドピジンの前記量が、４５ｍｇ／日〜１８０ｍｇ／日である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
投与されるプリドピジンの前記量が、２０ｍｇ／日、２２．５ｍｇ／日、４５ｍｇ／日、６７．５ｍｇ／日、９０ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、１１２．５ｍｇ／日、１２５ｍｇ／日、１３５ｍｇ／日、１５０ｍｇ／日、１８０ｍｇ／日、２００ｍｇ／日、２２５ｍｇ／日、２５０ｍｇ／日、または３１５ｍｇ／日である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
投与されるプリドピジンの前記量が、４５ｍｇ／日、または９０ｍｇ／日、または１８０ｍｇ／日である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
プリドピジンの前記量が、１日１回または２回の投与量で投与される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ある投与量で投与されるプリドピジンの前記量が、１０ｍｇ、２２．５ｍｇ、４５ｍｇ、６７．５ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１１２．５ｍｇ、１２５ｍｇ、１３５ｍｇ、１５０ｍｇ、１８０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、または３１５ｍｇである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ある投与量で投与されるプリドピジンの前記量が、１０ｍｇ〜４５ｍｇである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
プリドピジンの前記量が、１回の投与量あたり１０ｍｇ〜４５ｍｇの量で、１日あたり２回の投与量で投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記プリドピジンが最初に、前記対象の生後１日、１週間、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、３年、５年、１０年、１５年、２０年、２５年、または３０年以内に投与される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記プリドピジンが最初に、前記対象の生後３０年以上後に投与される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
プリドピジンの定期的な投与が、少なくとも３日間、少なくとも３０日間、少なくとも４２日間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、少なくとも２４週間、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも１５年、少なくとも２０年、少なくとも２５年、または３０年以上継続する、請求項６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記プリドピジンが、前記対象における少なくとも１つの症状の発症を遅らせることによって前記対象を治療する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記プリドピジンが、前記対象における少なくとも１つの症状の悪化を防止することによって前記対象を治療する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記プリドピジンが、前記対象における少なくとも１つの症状の悪化を遅らせることによって前記対象を治療する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記プリドピジンが、前記対象における少なくとも１つの症状を改善することによって前記対象を治療する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記症状が、運動スキルの習得における遅延である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記症状が、座ること、這うこと、および／または歩くことの遅延である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記症状が、習得した運動スキルの部分的または完全な喪失である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記症状が、座る、這う、および／または歩く能力の低下である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記運動スキルが運動協調スキルである、請求項２５または２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記症状が、異常歩行、運動失調、失行、筋力低下、痙縮、硬直性、異常筋緊張、末梢血管運動障害、脊柱側弯症、または歩行障害の始まりである、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記症状が、意図的な手の技能の習得の遅延であるか、または習得した意図的な手の技能の部分的もしくは完全な喪失である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記症状が、異常な手の動きである、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記異常な手の動きが、手を捻ること、絞ること、拍手すること、洗うこと、叩くこと、擦ること、および／または繰り返し口に手を持っていくことである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記症状が、コミュニケーションスキルの習得における遅延であるか、または習得したコミュニケーションスキルの部分的もしくは完全な喪失である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記コミュニケーションスキルは、言語スキルまたはアイコンタクトである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記言語スキルが、音声言語スキルである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記症状が、眼球運動異常である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記眼球運動異常が、長期にわたる凝視、過度の瞬き、斜視、および／または一度に片眼を閉じることである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記症状が、呼吸の不規則性である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記呼吸の不規則性が、前記対象が起きているときに生じる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記呼吸の不規則性が、無呼吸または過換気である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記症状が、前記対象が起きているときの歯ぎしりである、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記症状が、過敏性の増大、警戒心の低下、注意期間の短縮、不適切な笑い声、および／または叫び声、発作、心臓の異常、疼痛に対する反応の低下、発育遅延、睡眠パターンの障害、および／または低栄養性の冷たい青い足である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記心臓の異常が、徐脈または頻脈である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記発育遅延が、小頭症である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記プリドピジンが、前記症状を少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、または１００％改善する、請求項２４〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記プリドピジンが、日常生活の活動を行う、家事を行う、財政を管理する、および／または作業を行う前記対象の能力を改善または維持することによって前記対象を治療する、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記プリドピジンが、前記対象が必要とする看護ケアのレベルを低下させることによって前記対象を治療する、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記プリドピジンが、前記対象におけるＢＤＮＦ血清レベルを上昇させるかもしくは維持するために、および／または前記対象においてＢＤＮＦ脳レベルを上昇させるために有効である、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記対象がヒト患者である、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ヒト患者が女性である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象が、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）遺伝子、サイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）遺伝子またはフォークヘッドボックスタンパク質Ｇ１（ＦＯＸＧ１）遺伝子のうちの少なくとも１つにおいて突然変異を有する、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
ＲＴＴに罹患している対象を治療するのに使用するためのある量のプリドピジンを含む、医薬組成物。
【請求項５４】
ＲＴＴに罹患している対象を治療するのに有用である、単位剤形の医薬組成物。
【請求項５５】
プリドピジンの前記量が、１０ｍｇ／日〜３１５ｍｇ／日である、請求項５３または５４に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
プリドピジンの前記量が、２０ｍｇ／日、２２．５ｍｇ／日、４５ｍｇ／日、６７．５ｍｇ／日、９０ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、１１２．５ｍｇ／日、１２５ｍｇ／日、１３５ｍｇ／日、１５０ｍｇ／日、１８０ｍｇ／日、２００ｍｇ／日、２２５ｍｇ／日、２５０ｍｇ／日、または３１５ｍｇ／日である、請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
プリドピジンの前記量が、４５ｍｇ／日〜９０ｍｇ／日、もしくは４５ｍｇ／日〜１８０ｍｇ／日、または９０ｍｇ、もしくは１８０ｍｇである、請求項５６に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
ＲＴＴに罹患している対象を治療するための医薬品の製造におけるある量のプリドピジンの使用。
【請求項５９】
ＲＴＴに罹患している対象を治療するためのある量のプリドピジンの使用。
【請求項６０】
（ａ）ある量のプリドピジンおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物と、
（ｂ）ＲＴＴに罹患している対象を治療するための前記医薬組成物の使用説明書と、を含む、パッケージ。
【請求項６１】
ＲＴＴに罹患している対象に投薬するための、またはＲＴＴに罹患している対象への投薬に使用するための治療用パッケージであって、
（ａ）各単位投与量がＲＴＴに罹患している前記対象を治療するのに有効な量のプリドピジンを含む、１つ以上の単位投与量と、
（ｂ）そのための完成した医薬容器であって、前記単位投与量（複数可）を収容し、前記対象を治療する際の前記パッケージの前記使用を指示するラベルをさらに収容するかまたは含む医薬容器と、を含む、パッケージ。
【請求項６２】
ＲＴＴに罹患している対象においてＢＤＮＦ血清レベルまたはＢＤＮＦ脳レベルを上昇させる方法であって、
有効量のプリドピジンを前記対象に投与することを含み、
それによって、前記対象においてＢＤＮＦ血清レベルＢＤＮＦ脳レベルを上昇させる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／３９５，８５４号の利益を主張する。
【０００２】
本出願は、「１７０９１５＿８８９７３−Ａ−ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＪＴＣ．ｔｘｔ」（サイズ３キロバイト）という名前のファイルに存在するヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を参照により組み込んでおり、これは、２０１７年９月１５日に、ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓとの互換性のあるオペレーティングシステムを有するＩＢＭ−ＰＣマシンフォーマットで作成されており、本出願の一部として、２０１７年９月１５日に出願されたテキストファイルに含まれている。
【０００３】
本出願全体に、様々な刊行物が、最初の著者および刊行年によって参照される。これらの刊行物の完全な引用は、請求項の直前にある「参考文献」の項に記載されている。本明細書に記載の発明の日付時点での最新技術をより完全に記載するために、参考文献の項に引用した刊行物の開示内容は、その全体が参照により本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
レット症候群
【０００５】
レット症候群（ＲＴＴ）は、全ての人種および民族の集団において、１０，０００人から１５，０００人の出生女児中１人が罹患すると推定されている神経障害である（Ａｍａｒａｌ  ２００７）。
【０００６】
９５〜９７％の症例では、ＲＴＴは、Ｘ染色体上にあるメチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）遺伝子内での突然変異によって引き起こされる（Ｉｓａｉａｓ  ２０１４）。突然変異は、通常、ランダムであり、かつ自然発生的である。記録された症例の１％未満では、この突然変異は遺伝するか、またはある世代から次の世代に継承される。ＭｅＣＰ２遺伝子は、メチルシスチン結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）タンパク質の産生に関与している。ＭｅＣＰ２タンパク質は、標的遺伝子のプロモーター領域内のＣｐＧ部位でメチルシトシンおよび５−ヒドロキシメチルシトシンに結合し、コリプレッサーおよびコアクチベータを動員することによってそれらの転写を制御する（Ｐｏｚｚｏ−Ｍｉｌｌｅｒ  ２０１５）。
【０００７】
珍しい症例では、ＲＴＴは、サイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）、フォークヘッドボックスタンパク質Ｇ１（ＦＯＸＧ１）、およびまだ同定されていないと考えられる他の遺伝子など、他の遺伝子において部分的な遺伝子の欠失または突然変異によっても引き起こされ得る。
【０００８】
ＲＴＴは、調整不良、知的低下（ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  ｄｅｃｌｉｎｅ）、歩行異常、および発作を伴って現れる（Ｗｅｎｇ  ２０１１）。現在、ＲＴＴの治療法は存在していない。
【０００９】
プリドピジン
【００１０】
プリドピジン（４−［３−（メチルスルホニル）フェニル］−１−プロピル−ピペリジン）（以前はＡＣＲ１６として公知であった）は、ハンチントン病の治療のために開発中の薬物である。プリドピジンの化学名は、４−（３−（メチルスルホニル）フェニル）−１−プロピルピペリジンであり、その化学登録番号はＣＡＳ  ３４６６８８−３８−８（ＣＳＩＤ：７９７１５０５  ２０１６）である。塩酸プリドピジンの化学物質登録番号は、８８２７３７−４２−０（ＣＳＩＤ：２５９４８７９０  ２０１６）である。
【００１１】
プリドピジンは、活動亢進を抑制するかまたは活動低下を増強することのいずれかによって運動活動を調節することが示されている。プリドピジンの神経保護特性は、シグマ−１受容体（Ｓ１Ｒ、結合ＩＣ５０〜１００ｎＭ）に対するその高い親和性に起因することが示唆されているが、その一方で、プリドピジンの運動活性は、主にドーパミンＤ２受容体（Ｄ２Ｒ）（結合ＩＣ５０〜１０μＭ）におけるその低親和性の拮抗活性によって媒介され得る（Ｐｏｎｔｅｎ  ２０１０）。プリドピジンは、マイクロモル範囲内の追加の受容体に対して低親和性の結合を示す。
【００１２】
Ｓ１Ｒは、細胞の分化、神経可塑性、神経保護および脳内の認知機能に関与している小胞体（ＥＲ）シャペロンタンパク質である。近年では、ラット線条体のトランスクリプトーム分析では、プリドピジン処理が、神経可塑性および生存を促進し、ＨＤでは損なわれていることが公知であるＢＤＮＦ、ドーパミン受容体１（Ｄ１Ｒ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、およびセリン−トレオニンキナーゼプロテインキナーゼＢ（Ａｋｔ）／ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路の発現を活性化することを示した。さらに、プリドピジン遺伝子発現プロファイルは、Ｑ１７５ノックイン（Ｑ１７５  ＫＩ）ＨＤマウスモデルにおいてＨＤ疾患遺伝子発現プロファイルの逆パターンを示した（Ｇｅｖａ  ２０１６）。プリドピジンはまた、神経芽細胞腫細胞株における神経保護性脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の分泌をＳ１Ｒ依存的様式で増大させる（Ｇｅｖａ  ２０１６）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、対象を治療するために有効量のプリドピジンを対象に投与することを含む、レット症候群（ＲＴＴ）に罹患している対象を治療するための方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、ＲＴＴに罹患している対象を治療するのに使用するための、ある量のプリドピジンを含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
本発明はまた、ＲＴＴに罹患している対象を治療するのに有用な単位剤形の医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明はまた、ＲＴＴに罹患している対象を治療するための医薬品の製造におけるある量のプリドピジンの使用を提供する。
【００１７】
本発明はまた、ＲＴＴに罹患している対象を治療するためのある量のプリドピジンの使用を提供する。
【００１８】
また、本発明は、
（ａ）ある量のプリドピジンおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物と、
（ｂ）ＲＴＴに罹患している対象を治療するための医薬組成物の使用説明書と、を含む、パッケージを提供する。
【００１９】
本発明はまた、ＲＴＴに罹患している対象に投薬するための、またはＲＴＴに罹患している対象への投薬に使用するための治療用パッケージであって、
（ａ）各単位投与量がＲＴＴに罹患している対象を治療するのに有効な量のプリドピジンを含む、１つ以上の単位投与量と、
（ｂ）そのための完成した医薬容器であって、単位投与量（複数可）を収容し、対象を治療する際のパッケージの使用を指示するラベルをさらに収容するかまたは含む医薬容器と、を含む、パッケージを提供する。
【００２０】
本発明はまた、ＲＴＴに罹患している対象における脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）血清レベルを上昇させるための方法であって、対象に有効量のプリドピジンを投与し、それによって対象におけるＢＤＮＦ血清レベルを上昇させる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】特徴値と特徴ランクの差を示す図である（四角で囲まれている曲線）。２つの異なるセットにおける特徴値間の相対差（％）を計算し、特徴ランクに対応する順序でそれらのランクを０から１００％まで変化させてプロットする。
【図２】ランク付けされた無相関特徴空間において、２値を識別する可視化を示す図である。２つの最上位ランクの無相関特徴は、可視化を目的とした２Ｄ座標平面を形成するために選択される。それぞれの円または四角はマウスを表す。対照群のマウスは円として示され、疾患群のマウスは四角として示される。他の（規模の観点から）簡便ではあるが、クラウドの重なりから得られる同等の尺度は、識別確率＝１−重なりである。これは、分類者がＡ群とＢ群との間でチャンスレベルを超えて識別するためにどれだけ確実に訓練され得るかを測定するものであり、ゼロは、１００％の重なりに対応し、チャンスレベルを超える２つの群を識別することができず、１００％はエラーのない識別を意味する。
【図３】８週目の後肢握りを示したマウスの割合を示す図である（ＷＴおよびプリドピジン３０ｍｇ／ｋｇでは、握りが見られなかった）。ＷＴと比較して＃ｐ＜０．０５、ＨＥＴ−ビヒクル群と比較して＾ｐ＜０．０６。
【図４】ロータロッドから落下するまでの時間を示す図である。データは平均±ＳＥＭとして表す。ＷＴ−ビヒクル群と比較して＃ｐ＜０．０５。
【図５】落下時のロータロッドの速度を示す図である。データは平均±ＳＥＭとして表す。ＷＴ−ビヒクル群と比較して＃ｐ＜０．０５。
【図６】平均驚愕反応を示す図である。データは平均±ＳＥＭとして表す。ＷＴ−ビヒクル群と比較して＃ｐ＜０．０５。ＨＥＴ−ビヒクル群と比較して＃ｐ＜０．０５。
【図７】処理中の全マウスの体重を示す図である。データは平均値±ＳＥＭとして表す。ＨＥＴ−ビヒクル群とＷＴ−ビヒクル群とを比較して、＃＃＃ｐ＜０．００１、＃＃ｐ＜０．０１、＃ｐ＜０．０５。ＨＥＴ−ビヒクル群とＨＥＴ−プリドピジン群とを比較して、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図８Ａ】８週齢のプリドピジン（３ｍｇ／ｋｇ）によるＭｅＣＰ２（ＢＩＲＤ）マウスの歩行特徴の回復分析のまとめを示す図である。クラウドグラフは、最適識別特徴空間におけるＷＴ（上のクラウド）、ＨＥＴマウス（右下のクラウド）、およびＨＥＴ＋処理（左下のクラウド）の関係を可視化するために使用される。棒グラフは、さまざまな処理の回復率を示すが、図８Ａでは回復がない。
【図８Ｂ】８週齢のプリドピジン（３０ｍｇ／ｋｇ）によるＢＩＲＤマウスの歩行特徴の回復分析のまとめを示す図である。クラウドグラフは、最適識別特徴空間におけるＷＴ（上のクラウド）、ＨＥＴマウス（右下のクラウド）、およびＨＥＴ＋処理（左下のクラウド）の関係を可視化するために使用される。棒グラフは、さまざまな処理の回復率（最も濃い色）を示し、５５％が回復している。
【図９Ａ】１２週齢のプリドピジン（３ｍｇ／ｋｇ）によるＢＩＲＤマウスの歩行特徴の回復分析のまとめを示す図である。クラウドグラフは、最適識別特徴空間におけるＷＴ（上のクラウド）、ＨＥＴマウス（左下のクラウド）、およびＨＥＴ＋処理（右下のクラウド）の関係を可視化するために使用される。棒グラフは、さまざまな処理の回復率を示すが、図９Ａでは回復がない。
【図９Ｂ】１２週齢のプリドピジン（３０ｍｇ／ｋｇ）によるＢＩＲＤマウスの歩行特徴の回復分析のまとめを示す図である。クラウドグラフは、最適識別特徴空間におけるＷＴ（上のクラウド）、ＨＥＴマウス（左下のクラウド）、およびＨＥＴ＋処理（右下のクラウド）の関係を可視化するために使用される。棒グラフは、さまざまな処理の回復率（最も濃い色）を示し、５５％が回復している。
【図１０】（Ａ）〜（Ｃ）よりなり、全脳ハウスキーピング遺伝子の相対的ｍＲＮＡの発現を示す。ＡＴＰ５Ｂ（Ａ）、ＧＡＰＤＨ（Ｂ）、およびＲＰＬ１３Ａ（Ｃ）；それぞれ、他の２つの遺伝子の幾何平均に正規化されている。カラムＡはビヒクル処理ＭｅＣＰ２ｗｔマウスを表し、カラムＢはビヒクル処理ＭｅＣＰ２  ＨＥＴマウスを表し、カラムＣはプリドピジン処理ＭｅＣＰ２マウス（３ｍｇ／ｋｇ）を表し、カラムＤはプリドピジン処理ＭｅＣＰ２マウス（３０ｍｇ／ｋｇ）を表す。
【図１１】（Ａ）及び（Ｂ）よりなり、全脳におけるＢＤＮＦ  Ｉの相対的ｍＲＮＡの発現を示す。ＭｅＣＰ２（Ｒｅｔｔ）マウスモデルにおける薬物有効性（Ａ）、ＭｅＣＰ２＿ＷＴと比較したＢＤＮＦ  Ｉ転写物レスキューの程度、ビヒクル処理群（Ｂ）。カラムＡはビヒクル処理ＭｅＣＰ２ｗｔマウスを表し、カラムＢはビヒクル処理ＭｅＣＰ２  ＨＥＴマウスを表し、カラムＣはプリドピジン処理ＭｅＣＰ２マウス（３ｍｇ／ｋｇ）を表し、カラムＤはプリドピジン処理ＭｅＣＰ２マウス（３０ｍｇ／ｋｇ）を表す。
【図１２】（Ａ）及び（Ｂ）よりなり、全脳におけるＢＤＮＦ  ＩＶの相対的ｍＲＮＡの発現を示す。ＭｅＣＰ２（Ｒｅｔｔ）マウスモデルにおける薬物有効性（Ａ）、ＭｅＣＰ２＿ＷＴと比較したＢＤＮＦ  ＩＶ転写物レスキューの程度、ビヒクル処理群（Ｂ）。カラムＡはビヒクル処理ＭｅＣＰ２ｗｔマウスを表し、カラムＢはビヒクル処理ＭｅＣＰ２  ＨＥＴマウスを表し、カラムＣはプリドピジン処理ＭｅＣＰ２マウス（３ｍｇ／ｋｇ）を表し、カラムＤはプリドピジン処理ＭｅＣＰ２マウス（３０ｍｇ／ｋｇ）を表す。
【図１３】（Ａ）及び（Ｂ）よりなり、全脳におけるＢＤＮＦ  ＶＩの相対的ｍＲＮＡの発現を示す。ＭｅＣＰ２マウスモデルにおける薬物有効性（Ａ）、ＭｅＣＰ２＿ＷＴと比較したＢＤＮＦ  ＶＩ転写物レスキューの程度、ビヒクル処理群（Ｂ）。カラムＡはビヒクル処理ＭｅＣＰ２ｗｔマウスを表し、カラムＢはビヒクル処理ＭｅＣＰ２  ＨＥＴマウスを表し、カラムＣはプリドピジン処理ＭｅＣＰ２マウス（３ｍｇ／ｋｇ）を表し、カラムＤはプリドピジン処理ＭｅＣＰ２マウス（３０ｍｇ／ｋｇ）を表す。
【図１４】（Ａ）及び（Ｂ）よりなり、全脳におけるＢＤＮＦ  ＩＸ（全長）の相対的ｍＲＮＡ発現を示す。ＭｅＣＰ２マウスモデルにおける薬物有効性（１４Ａ）、ＭｅＣＰ２＿ＷＴと比較したＢＤＮＦ  ＩＸ転写物レスキューの程度、ビヒクル処理群（１４Ｂ）。カラムＡはビヒクル処理ＭｅＣＰ２ｗｔマウスを表し、カラムＢはビヒクル処理ＭｅＣＰ２  ＨＥＴマウスを表し、カラムＣはプリドピジン処理ＭｅＣＰ２マウス（３ｍｇ／ｋｇ）を表し、カラムＤはプリドピジン処理ＭｅＣＰ２マウス（３０ｍｇ／ｋｇ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、レット症候群（ＲＴＴ）に罹患している対象を治療するための方法であって、対象を治療するために有効量のプリドピジンを対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００２３】
一実施形態では、対象はヒト患者である。一実施形態では、ヒト患者は女性である。
【００２４】
一実施形態では、対象は、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）遺伝子に突然変異を有する。一実施形態では、対象は、サイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）遺伝子に突然変異を有する。一実施形態では、対象は、フォークヘッドボックスタンパク質Ｇ１（ＦＯＸＧ１）遺伝子に突然変異を有する。
【００２５】
一実施形態では、プリドピジンは、塩酸プリドピジンである。
【００２６】
一実施形態では、プリドピジンは、経口、経鼻、吸入、皮下注射、または静脈内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、口腔内、膣内、直腸内、眼内、髄腔内、局所もしくは皮内経路で投与される。一実施形態では、プリドピジンは経口投与される。
【００２７】
一実施形態では、プリドピジンは、エアロゾル、吸入用粉末、注射用、液体、ゲル、固体、カプセル、または錠剤の形態で投与される。
【００２８】
一実施形態では、プリドピジンは、定期的に投与される。
【００２９】
一実施形態では、プリドピジンは、１日１回未満の頻度で投与される。一実施形態では、プリドピジンは、毎日投与される。一実施形態では、プリドピジンは、１日１回投与される。別の実施形態では、プリドピジンは、１日１回以上の頻度で投与される。一実施形態では、プリドピジンは、１日２回投与される。
【００３０】
一実施形態では、投与されるプリドピジンの量は、１０ｍｇ／日〜３１５ｍｇ／日である。一実施形態では、投与されるプリドピジンの量は、９０ｍｇ／日〜３１５ｍｇ／日である。一実施形態では、投与されるプリドピジンの量は、９０ｍｇ／日〜２２５ｍｇ／日である。一実施形態では、投与されるプリドピジンの量は、１８０ｍｇ／日〜２２５ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与されるプリドピジンの量は、約２０ｍｇ／日、２２．５ｍｇ／日、約４５ｍｇ／日、約６７．５ｍｇ／日、約９０ｍｇ／日、約１００ｍｇ／日、約１１２．５ｍｇ／日、約１２５ｍｇ／日、約１３５ｍｇ／日、約１５０ｍｇ／日、約１８０ｍｇ／日、約２００ｍｇ／日、約２２５ｍｇ／日、約２５０ｍｇ／日、または約３１５ｍｇ／日である。一実施形態では、投与されるプリドピジンの量は、４５ｍｇ／日である。一実施形態では、投与されるプリドピジンの量は、９０ｍｇ／日である。一実施形態では、投与されるプリドピジンの量は、１８０ｍｇ／日である。一実施形態では、投与されるプリドピジンの量は、２２５ｍｇ／日である。
【００３１】
一実施形態では、プリドピジンの量は、１日１回の投与量で投与される。一実施形態では、プリドピジンの量は、１日２回の投与量で投与される。
【００３２】
一実施形態では、ある投与量で投与されるプリドピジンの量は、約１０ｍｇ、約２２．５ｍｇ、約４５ｍｇ、約６７．５ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１２．５ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１３５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、または約３１５ｍｇである。一実施形態では、ある投与量で投与されるプリドピジンの量は、４５ｍｇである。一実施形態では、ある投与量で投与されるプリドピジンの量は、１０〜４５ｍｇである。
【００３３】
一実施形態では、プリドピジンの量は、１回の投与量あたり４５ｍｇの量で１日２回の投与量で投与される。
【００３４】
一実施形態では、プリドピジンは、対象の生後１日以内に最初に投与される。一実施形態では、プリドピジンは、対象の生後１週間以内に最初に投与される。一実施形態では、プリドピジンは、対象の生後１ヶ月以内に最初に投与される。一実施形態では、プリドピジンは、対象の生後３ヶ月以内に最初に投与される。一実施形態では、プリドピジンは、対象の生後６ヶ月以内に最初に投与される。一実施形態では、プリドピジンは、対象の生後９ヶ月以内に最初に投与される。一実施形態では、プリドピジンは、対象の生後１２ヶ月以内に最初に投与される。一実施形態では、プリドピジンは、対象の生後１８ヶ月以内に最初に投与される。一実施形態では、プリドピジンは、対象の生後３年以内に最初に投与される。一実施形態では、プリドピジンは、対象の生後５年以内に最初に投与される。一実施形態では、プリドピジンは、対象の生後１０年以内に最初に投与される。一実施形態では、プリドピジンは、対象の生後１５年以内に最初に投与される。一実施形態では、プリドピジンは、対象の生後２０年以内に最初に投与される。一実施形態では、プリドピジンは、対象の生後２５年以内に最初に投与される。一実施形態では、プリドピジンは、対象の生後３０年以内に最初に投与される。一実施形態では、プリドピジンは、対象の生後３０年以上後に最初に投与される。
【００３５】
一実施形態では、プリドピジンの定期的な投与が、少なくとも３日間、少なくとも３０日間、少なくとも４２日間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、少なくとも２４週間、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも１５年、少なくとも２０年、少なくとも２５年、または３０年以上継続する。
【００３６】
一実施形態では、プリドピジンは、対象における症状の発症を遅らせることによって対象を治療する。
【００３７】
一実施形態では、プリドピジンは、対象における少なくとも１つの症状の悪化を防止することによって対象を治療する。一実施形態では、プリドピジンは、対象における少なくとも１つの症状の悪化を遅らせることによって対象を治療する。一実施形態では、プリドピジンは、対象における少なくとも１つの症状を改善することによって対象を治療する。
【００３８】
一実施形態では、症状は、運動スキルの習得の遅延である。一実施形態では、症状は、座ること、這うこと、および／または歩くことの遅延である。一実施形態では、症状は、習得した運動スキルの部分的または完全な喪失である。一実施形態では、症状は、座る、這う、および／または歩く能力の低下である。一実施形態では、運動スキルは運動協調スキルである。
【００３９】
一実施形態では、症状は歩行異常である。一実施形態では、症状は運動失調症である。一実施形態では、症状は失行症である。一実施形態では、症状は筋力低下である。一実施形態では、症状は痙縮である。一実施形態では、症状は硬直性である。一実施形態では、症状は歩行障害の始まりである。
【００４０】
一実施形態では、症状は異常な筋緊張である。一実施形態では、症状は低緊張症である。一実施形態では、症状は末梢血管運動障害である。一実施形態では、症状は脊柱側弯症である。一実施形態では、症状は歩行障害の始まりである。
【００４１】
一実施形態では、症状は、意図的な手の技能の習得の遅延である。一実施形態では、症状は、習得した意図的な手の技能の部分的または完全な喪失である。一実施形態では、症状は異常な手の動きである。一実施形態では、異常な手の動きは、手を捻ること、絞ること、拍手すること、洗うこと、叩くこと、擦ること、および／または繰り返し口に手を持っていくことである。
【００４２】
一実施形態では、症状は、コミュニケーションスキルの習得の遅延である。一実施形態では、症状は、習得したコミュニケーションスキルの部分的または完全な喪失である。一実施形態では、コミュニケーションスキルは、言語スキルである。一実施形態では、言語スキルは、音声言語スキルである。一実施形態では、コミュニケーションスキルは、アイコンタクトである。
【００４３】
一実施形態では、症状は眼球運動異常である。一実施形態では、眼球運動異常は、長期にわたる凝視、過度の瞬き、斜視、および／または一度に片眼を閉じることである。
【００４４】
一実施形態では、症状は、呼吸の不規則性である。一実施形態では、呼吸の不規則性は、対象が起きているときに生じる。一実施形態では、呼吸の不規則性は、無呼吸である。一実施形態では、呼吸の不規則性は、過換気である。
【００４５】
一実施形態では、症状は、対象が起きているときの歯ぎしりである。
【００４６】
一実施形態では、症状は、過敏性の増大、警戒心の低下、および／または注意期間の短縮である。一実施形態では、症状は不適切な笑い声および／または叫び声である。
【００４７】
一実施形態では、症状は発作である。
【００４８】
一実施形態では、症状は心臓の異常である。一実施形態では、心臓の異常は徐脈である。一実施形態では、心臓の異常は頻脈である。
【００４９】
一実施形態では、症状は、疼痛に対する反応の低下である。一実施形態では、症状は、発育遅延である。一実施形態では、症状は、小頭症である。一実施形態では、症状は、睡眠パターンの障害である。一実施形態では、症状は、低栄養性の冷たい青い足である。
【００５０】
一実施形態では、プリドピジンが、症状を少なくとも２０％改善する。一実施形態では、プリドピジンが、症状を少なくとも３０％改善する。一実施形態では、プリドピジンが、症状を少なくとも５０％改善する。一実施形態では、プリドピジンが、症状を少なくとも８０％改善する。一実施形態では、プリドピジンが、症状を１００％改善する。
【００５１】
一実施形態では、プリドピジンは、日常生活の活動を行う、家事を行う、財政を管理する、および／または作業を行う対象の能力を改善することによって対象を治療する。一実施形態では、プリドピジンは、対象が必要とする看護ケアのレベルを低下させることによって対象を治療する。
【００５２】
一実施形態では、プリドピジンは、日常生活の活動を行う、家事を行う、財政を管理する、および／または作業を行う対象の能力を維持することによって対象を治療する。
【００５３】
一実施形態では、プリドピジンは、対象のＢＤＮＦ血清レベルを上昇させるのに有効である。一実施形態では、プリドピジンは、対象の脳内のＢＤＮＦレベルを上昇させるのに有効である。一実施形態では、プリドピジンは、対象のＢＤＮＦ血清レベルを維持するのに有効である。
【００５４】
本発明はまた、ＲＴＴに罹患している対象を治療するのに使用するための、ある量のプリドピジンを含む医薬組成物を提供する。
【００５５】
本発明はまた、ＲＴＴに罹患している対象を治療するのに有用な単位剤形の医薬組成物を提供する。
【００５６】
一実施形態では、プリドピジンの量は、１０ｍｇ〜３１５ｍｇである。一実施形態では、プリドピジンの量は、９０ｍｇ〜３１５ｍｇである。一実施形態では、プリドピジンの量は、９０ｍｇ〜２２５ｍｇである。別の実施形態では、プリドピジンの量は、約２２．５ｍｇ、約４５ｍｇ、約６７．５ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１２．５ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１３５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２５０ｍｇ、または約３１５ｍｇである。一実施形態では、プリドピジンの量は、４５ｍｇである。一実施形態では、プリドピジンの量は、９０ｍｇである。一実施形態では、プリドピジンの量は、１８０ｍｇである。一実施形態では、プリドピジンの量は、２２５ｍｇである。
【００５７】
本発明はまた、ＲＴＴに罹患している対象を治療するための医薬品の製造におけるある量のプリドピジンの使用を提供する。
【００５８】
本発明はまた、ＲＴＴに罹患している対象を治療するためのある量のプリドピジンの使用を提供する。
【００５９】
また、本発明は、
（ａ）ある量のプリドピジンおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物と、
（ｂ）ＲＴＴに罹患している対象を治療するための医薬組成物の使用説明書と、を含む、パッケージを提供する。
【００６０】
ＲＴＴに罹患している対象に投薬するための、またはＲＴＴに罹患している対象への投薬に使用するための治療用パッケージであって、
（ａ）各単位投与量がＲＴＴに罹患している対象を治療するのに有効な量のプリドピジンを含む、１つ以上の単位投与量と、
（ｂ）そのための完成した医薬容器であって、単位投与量（複数可）を収容し、対象を治療する際のパッケージの使用を指示するラベルをさらに収容するかまたは含む、医薬容器と、を含む。
【００６１】
本発明はまた、ＲＴＴに罹患している対象におけるＢＤＮＦ血清レベルを上昇させる方法であって、対象に有効量のプリドピジンを投与することを含み、それによって対象におけるＢＤＮＦ血清レベルを上昇させる方法を提供する。本発明はまた、ＲＴＴに罹患している対象におけるＢＤＮＦ脳レベルを上昇させる方法であって、対象に有効量のプリドピジンを投与することを含み、それにより対象にＢＤＮＦ脳レベルを上昇させる方法を提供する。
【００６２】
前述の実施形態について、本明細書に開示されている各実施形態は、他の開示されている実施形態のそれぞれに適用可能であることが企図される。さらに、方法の実施形態に記載の要素は、本明細書に記載の医薬組成物、使用、およびパッケージの実施形態に使用することができ、その逆もまた同様である。
【００６３】
用語
【００６４】
本明細書で使用されるとき、また他に述べられない限り、以下の用語の各々は、以下に記載される定義を有するものとする。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、「プリドピジン」は、プリドピジン塩基またはその薬学的に許容される塩、ならびに誘導体、例えば重水素富化プリドピジンおよび塩を意味する。重水素富化プリドピジンおよびその塩の例ならびにそれらの調製方法は、米国特許出願公開第２０１３／０１９７０３１号、同第２０１６／０１６６５５９号および同２０１６／００９５８４７号に見いだすことができ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
「重水素富化」とは、化合物の任意の関連部位における重水素の存在量が、その化合物のある量においてその部位に天然に存在する重水素の存在量より多いことを意味する。天然に存在する重水素の分布は、約０．０１５６％である。したがって、「重水素富化」化合物では、その関連部位のいずれかにおける重水素の存在量が、０．０１５６％超であり、また０．０１５６％超〜１００％の範囲であってもよい。重水素富化化合物は、水素を重水素と交換するか、または化合物を重水素富化出発物質と合成することによって得てもよい。
【００６７】
本発明に従って使用するための活性化合物は、意図された投与に好適である任意の形態で提供することができる。好適な形態としては、本発明の化合物の薬学的に許容される塩、およびプレドラッグまたはプロドラッグの形態が挙げられる。
【００６８】
「これらの塩」は、化合物の酸性塩または塩基性塩を作ることによって修飾されている即時化合物（ｉｎｓｔａｎｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の塩である。これに関して「薬学的に許容される塩」という用語は、薬学的使用に好適である本発明の化合物の比較的非毒性である無機のおよび有機の酸または塩基付加塩を指す。薬学的に許容される塩は、当技術分野において周知であり、記載されている手順によって形成することができる。このような塩を調製する１つの手段は、本発明の化合物を無機塩基で処理することによる。
【００６９】
本発明の化合物の酸付加塩の例としては、これらに限定されないが、塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、アコネート、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、桂皮酸、クエン酸塩、エンボン酸塩（ｅｍｂｏｎａｔｅ）、エナンタート（ｅｎａｎｔａｔｅ）、フマル酸塩、グルタミン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホネート、フタル酸塩、サリチル酸塩、ソルビン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トルエン−ｐ−スルホネートなど、が挙げられる。特定の実施形態では、プリドピジンは、ＨＣｌ塩または酒石酸塩の塩などの薬学的に許容される塩である。好ましくは、本明細書に記載の本発明の任意の実施形態では、プリドピジンはその塩酸塩の塩の形態である。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、ミリグラム単位で測定される場合のプリドピジンの「量」または「投与量」とは、調製物の形態に関係なく、調製物中に存在するプリドピジン（４−［３−（メチルスルホニル）フェニル］−１−プロピル−ピペリジン）のミリグラムを指す。例えば、「９０ｍｇプリドピジン」を含む単位投与量は、調製物の形態にかかわらず、調製物中のプリドピジンの量が９０ｍｇであることを意味する。したがって、塩、例えば塩酸プリドピジンの形態である場合、９０ｍｇの投与量のプリドピジンを提供するのに必要な塩形態の重量は、塩が存在するために９０ｍｇよりも多くなる。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、「単位投与量（複数可）」および「単位剤形（複数可）」は、単一の薬物の投与実体（複数可）を意味する。「単位投与量（複数可）」および「単位剤形（複数可）」は、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉剤および顆粒剤などの経口剤形用に調製することができる。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、数値または数値範囲の文脈における「約」は、列挙または特許請求されている数値または数値範囲の９０〜１１０％を意味する。
【００７３】
「対象へ投与すること」または「（ヒト）患者へ投与すること」とは、病的状態などの状態に関連する症状を遅延、軽減、治癒、または軽減するための対象／患者への医薬品、薬物または治療薬の付与、投薬または適用を意味する。経口投与は、即時化合物を対象に投与する１つの方法である。
【００７４】
本発明による化合物は、塩基形態または薬学的に許容される塩の形態で、好ましくは１つ以上のアジュバント、賦形剤、担体、緩衝剤、希釈剤、および／または他の慣用の医薬助剤と一緒に医薬組成物中で投与することができる。
【００７５】
「薬学的に許容される担体」とは、高くない利益／危険率に相当する過度の有害な副作用（毒性、刺激、およびアレルギー反応など）なく、ヒトおよび／または動物と共に使用するのに好適である担体または賦形剤を指す。これは、即時化合物を対象に送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁剤またはビヒクルであってもよい。
【００７６】
投与は、定期的投与であってもよい。本明細書で使用されるとき、「定期的投与」は、期間によって分けられる繰り返し／反復投与を意味する。投与間の期間は、随時一定であることが好ましい。定期的投与は、例えば、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、毎週、週２回、週３回、週４回などの投与を含み得る。
【００７７】
本明細書で使用される「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、ＲＴＴに罹患している対象における身体的、精神的または感情的な限界を軽減すること、低減させること、これらの重症度を低下させること、これらを消失させるか、もしくは実質的に消失させること、または改善することを含む。治療することはまた、症状を遅らせることもしくは防止すること、または疾患に関連する欠陥を減少させることを指す。
【００７８】
本明細書で使用されるとき、目標を達成するのに有効な量にあるような「有効な」とは、本開示の様式で使用された場合の高くない利益／危険比に相当する過度の有害な副作用（毒性、刺激、またはアレルギー反応など）なく、指示された治療応答を生じるのに十分な成分の量を意味する。例えば、ＲＴＴの症状を治療するのに有効である量。具体的な有効量は、治療されている特定の状態、患者の身体状態、治療されている哺乳動物の種類、治療期間、併用療法の性質（ある場合）、および採用された特定の製剤、および化合物またはその誘導体の構造などの要因によって変動する。
【００７９】
パラメータ範囲が提供される場合、その範囲内の全ての整数、およびそれらの整数の１０分の１もまた本発明によって提供されることが理解される。例えば、「２２ｍｇ〜３００．０ｍｇ」は、２２．０ｍｇ、２２．１ｍｇ、２２．２ｍｇ、２２．３ｍｇ、２２．４ｍｇなど、最大３００．０ｍｇまでを含む。
【００８０】
本発明は、以下の実験の詳細を参照することによってよりよく理解されるであろうが、詳述された特定の実験は、その後に続く特許請求の範囲においてより十分に記載されている発明の単なる例示であることを当業者は容易に認識する。
【００８１】
実験の詳細
【００８２】
実施例１：レット症候群のＭｅＣＰ２マウスモデルにおけるプリドピジンの有効性の評価
【００８３】
この調査の目標は、ＲＴＴの雌ＭｅＣＰ２（ＢＩＲＤ）マウスモデルにおけるプリドピジンの効果を査定することであった（Ｇｕｙ  ２００１）。
【００８４】
材料：
【００８５】
プリドピジン（３および３０ｍｇ／ｋｇ）を１０ｍｌ／ｋｇの投与量で１日２回（投与間６時間）経口投与した。試験の日には、試験の３０分前にプリドピジンを投与した。
【００８６】
マウスが約５．５週齢のときに投薬を開始し、行動試験終了まで継続した。行動試験は、８週齢および１２週齢に行った。
【００８７】
雌ＭｅＣＰ２（ＭｅＣＰ１＿ＨＥＴ、ＨＥＴ）マウスおよび野生型（ＭｅＣＰ２＿ＷＴ、ＷＴ）同腹仔を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから約４．５週齢の２つのコホートで受け取った。それらは固有の識別番号を割り当てられ、ｏｐｔｉ−ＭＩＣＥ  ｃａｇｅ（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＯ）にグループ収容された。十分な健康状態および適合性を保証し、かつ操作に関連する非特異的ストレスを最小限に抑えるために、開始前および全調査中の全動物を調べて体重を測定した。調査期間中、１２／１２の明／暗サイクルを維持した。相対湿度を約５０％に維持しながら、室温を２０〜２３℃に維持した。調査期間中、固形飼料および水を自由に摂取させた。試験は、動物の明サイクル中に行った。
【００８８】
方法：
【００８９】
治療群：
【００９０】
・ＷＴマウス−ビヒクル（週１回皮下、食塩水）、ｎ＝２４（ｎ＝２０コホート１；ｎ＝４コホート２）
・ＨＥＴ  ＭｅＣＰ２マウス−ビヒクル（週１回皮下、食塩水）、ｎ＝２４（ｎ＝２０コホート１；ｎ＝４コホート２）
・ＨＥＴ  ＭｅＣＰ２マウス−プリドピジン（３ｍｇ／ｋｇ；１日２回経口投与）、ｎ＝２０（コホート２）
・ＨＥＴ  ＭｅＣＰ２マウス−プリドピジン（３０ｍｇ／ｋｇ；１日２回経口投与）、ｎ＝２０（コホート１）
【００９１】
体重：
【００９２】
・体重は、週２回評価した。
【００９３】
行動試験：
【００９４】
（１）ＮｅｕｒｏＣｕｂｅ（登録商標）システムを用いた歩行分析
【００９５】
ＮｅｕｒｏＣｕｂｅ（登録商標）システムは、コンピュータビジョンを使用して、神経疾患、疼痛および神経障害のげっ歯類モデルにおける歩行形態および歩行動態の変化を検出するプラットフォームである。このプラットフォームは、以下の理由から歩行試験に独自のものである。
・完全に自動化されているために、バイアスまたは主観性が除去される。
・このシステムでは、歩行形態および歩行動態（立脚、スイング、推進力など）の両方を取得する。
【００９６】
マウスを５分間試験するためにＮｅｕｒｏＣｕｂｅに入れた。疾患表現型（症状記述子）を定義する、集められた特徴のうち最も優勢なものが同定され、かつランク付けされた。複雑なバイオインフォマティックアルゴリズムを使用して、ＷＴマウスとＢＩＲＤマウスとの間の識別確率を計算し、疾患表現型を逆転させる試験化合物の能力を検出した。試験化合物で治療したＨＥＴマウスにおける突然変異体と野生型との識別、ならびに疾患の特徴の回復を計算した。
【００９７】
（２）握り
【００９８】
握りは、四肢の筋肉の筋力を査定するために使用する。マウスを尾で保持し、前脚が反対面からちょうど持ち上がるまで穏やかに持ち上げた。実験者は脚を観察し、四肢の握りまたは広がりを判定した。試験後、動物を試験またはホームケージに戻した。後肢の握り率を決定し、報告した。
【００９９】
（３）ロータロッド
【０１００】
マウスを実験室に連れて行き、ロータロッド装置に置いた。ロッドは、４ｒｐｍの一定または可変の加速速度で回転する。マウスがバランスを失い、下にあるプラットフォームに落ちると、タイマーは自動的に停止した。ペーパータオルまたはおむつパッドを使用して落下を和らげた。動物が落下するのに要した時間（秒）または各マウスの持久時間は、装置が自動的に記録した。マウスを毎回定速で試験しながら装置に曝して、５分間トレーニングし、各落下後にロッドに戻した。少なくとも１時間の休止期間の後、動物を試験のためにロータロッド装置に戻した。試験セッション中の全ての動物をロッドに載せて、ロータロッド装置を５分間かけて加速速度（０〜４０ｒｐｍ）に置き、最初に落下するまでの時間を記録した。落下速度および落下までの時間を記録した。
【０１０１】
（４）驚愕反応／プレパルス抑制（ＰＰＩ）
【０１０２】
音響驚愕では、外部の聴覚刺激に対する無条件反射反応を測定する。弱い聴覚刺激またはプレパルス提示後の聴覚刺激に対する抑制された驚愕反応（振幅の減少）からなるプレパルス抑制（ＰＰＩ）は、統合失調症に見られるものなどの感覚運動ゲーティングにおける欠陥を査定するためのツールとして使用されてきた。これは聴覚発作を呈さない動物にのみ実施される任意の試験である。
【０１０３】
マウスは、５分間のホワイトノイズ（７０ｄＢ）に順化するために、ＰＰＩチャンバ（Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）に入れた。順応期間の後、試験セッションは自動的に開始した。セッションは、驚愕刺激のみ６回提示される順化ブロック、続いて６つの異なる種類の治験の１０のＰＰＩブロックにより開始した。
【０１０４】
治験の種類は、ヌル（刺激なし）、驚愕（１２０ｄＢ）、驚愕＋プレパルス（暗雑音に対して４、８および１２ｄＢ、すなわち７４、７８または８２ｄＢ）およびプレパルス単独（８２ｄＢ）であった。治験の種類は、各ブロック内でランダムに提示された。各治験は、ベースラインの動きが記録されている５０ミリ秒のゼロ期間から開始した。その後の２０ミリ秒の間にプレパルス刺激が提示され、プレパルスに対する応答が測定された。さらに１００ミリ秒後、驚愕刺激を４０ミリ秒間提示し、驚愕発生から１００ミリ秒間、反応を記録した。応答は、１ミリ秒ごとにサンプリングした。治験間の間隔は、平均１５秒（１０から２０秒の範囲）で変動した。
【０１０５】
驚愕単独治験では、基本聴覚驚愕を測定し、プレパルス＋驚愕治験では、正常驚愕の阻害量を決定し、最初の順化ブロックの驚愕反応を除いて、（驚愕単独治験からの）基本驚愕反応の割合（百分率）として表した。
【０１０６】
脳の採取：
【０１０７】
全ての行動試験が完了した後、脳試料をプリドピジン投薬の６０分後に採取した。マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、断頭した。１０匹のマウス／治療群から、全脳を採取し、秤量し、次にドライアイス上で凍結した。試料は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の分析まで、−８０℃で保存した。
【０１０８】
残りの１０個の脳から、全脳を採取し、次に矢状に切断した。左半球から、線条体、ＰＦＣ、および海馬を解剖し、ＲＮＡｌａｔｅｒに入れた。右半球から、線条体、ＰＦＣ、および海馬を採取し、ドライアイス上で瞬間凍結し、タンパク質分析のために後援の指定試験所に出荷するまで−８０℃で貯蔵した。
【０１０９】
ＢＤＮＦ分析：
【０１１０】
トータルＲＮＡ抽出：
【０１１１】
組織（全脳）を、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）および５ｍｍステンレススチールビーズ（カタログ番号６９９８９、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）とともに、７５０μＬのＱＩＡｚｏｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号７９３０６、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）中、２５Ｈｚで２ｘ１分間均質化した。組織が破壊されたら、試料を室温で５分間インキュベートした。
【０１１２】
ＲＮＡの抽出には、ＲＮＡ単離用のＲＮｅａｓｙ  ９６  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（カタログ番号７４８８１、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）の製造業者のプロトコルに従った。簡単に説明すると、１５０μＬのクロロホルム（カタログ番号Ｃ２４３２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加し、試料を１５秒間激しく振盪した後、室温で３分間インキュベートした。水相は、６，０００ｘｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｖａｎｔｉ  Ｊ−３０Ｉ）、４℃で１５分間遠心分離することにより、有機相から分離した。次に水相を新しい９６ウェルブロックに移し、トータルＲＮＡを等容量の７０％エタノールで沈殿させた。内容物をＲＮｅａｓｙ  ９６ウェルプレートに移し、続いて６，０００ｘｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｖａｎｔｉ  Ｊ−３０Ｉ）で４分間室温で遠心分離した。カラム膜に結合したトータルＲＮＡをＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅセット（カタログ番号７９２５４、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で３０分間処理し、続いてＲＷ１緩衝液およびＲＰＥ緩衝液（ＲＮｅａｓｙ  ９６  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔで提供される）で３回洗浄ステップを行った。ＲＮＡをＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒで溶出した。
【０１１３】
トータルＲＮＡの定量と逆転写：
【０１１４】
試料は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ８０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。１μｇのトータルＲＮＡを、総容量２０μＬで、３．２μｇのランダムヘキサマー（カタログ番号１１０３４７３１００１，Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、各ｄＮＴＰ  １ｍＭ（カタログ番号１１８１４３６２００１），Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、２０Ｕ  Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（カタログ番号０３３３５４０２００１，Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、１Ｘ転写産物逆転写反応緩衝液および１０Ｕ転写体逆転写酵素（カタログ番号０３５３１２８７００１，Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。
【０１１５】
各ＲＮＡ試料について、最大３つの独立したＲＴ反応を実施した。反応を室温で１０分間、５５℃で３０分間進行させ、次いでＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９７００ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）において８５℃で５分間不活性化した。ｑＰＣＲ分析のために、ｃＤＮＡ試料をＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒで１０倍希釈した。
【０１１６】
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）：
【０１１７】
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｏｂｅｓを利用する全ての反応について、２５μＬの反応容量中、５μｌの希釈ｃＤＮＡを１２．５μＬの２ｘＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｒｏｘ（カタログ番号０４９１４０５８００１、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、０．５μＬのＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｏｂｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、２００ｎＭの遺伝子特異的プライマー−ＨＰＬＣ精製（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で増幅した。反応は、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で行った。ｑＣＰＲ条件は、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの活性化のために９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクル行った。ｑＰＣＲに使用されるプライマーおよびＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｌｉｂｒａｒｙについては、以下の表１を参照されたい。
【０１１８】
【表１】
2019532926.tif 000003
【０１１９】
ｑＰＣＲデータ解析
【０１２０】
ＷＴビヒクル処理動物のプール試料から調製した全脳ｃＤＮＡを、標準化したプレートごとの変動に対するキャリブレータ（キャリブレータは試料ｃＤＮＡと同じように希釈する）として使用した。この調査で使用されたｑＰＣＲアッセイのＰＣＲ効率については、上記の表１を参照のこと。
【０１２１】
各ｃＤＮＡ試料（１：１０希釈）を３回アッセイし、Ｃｔ値を平均化した。平均の０．５標準偏差よりも大きい値は捨てた。
【０１２２】
ＰＣＲ産物の相対量（キャリブレーターに対する）は、以下の数１の式のように計算した。
【０１２３】
【数１】
2019532926.tif 000004
【０１２４】
３つのハウスキーピング遺伝子の幾何平均は次の数２の式のように算出した。
【０１２５】
【数２】
2019532926.tif 000005
【０１２６】
標的遺伝子の相対レベルは以下の数３の式のように計算した。
【０１２７】
【数３】
2019532926.tif 000006
【０１２８】
次いで、標的遺伝子の相対レベルをＷＴビヒクル群に対して正規化した。
【０１２９】
統計分析：
【０１３０】
標準試験のデータを、遺伝子型（ｔ検定）ごと、および治療（ＡＮＯＶＡ）ごと、続いて必要に応じて事後比較により分析した。いくつかの尺度（すなわち体重およびＰＰＩ）については、繰り返し尺度ＡＮＯＶＡを実施した。握りデータについては、Ｎ−１  ２比例検定を実施した。ｐ＜０．０５の場合、効果は有意であると見なした。全てのデータを、平均値と平均値に対する標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）として表す。平均から±２の標準偏差値は、異常値と見なした。
【０１３１】
ＮｅｕｒｏＣｕｂｅからのデータ解析：
【０１３２】
ＮｅｕｒｏＣｕｂｅの出力結果は、バイオインフォマティクスで使用される機械学習技術を用いる解析のために提出された一連の数十の行動的特徴である。これらの特徴の多くは相関している（例：飼育数およびサポートされている飼育数）。したがって、ＰＧＩは、２つの群をより効果的に識別する元の特徴の統計的に独立した組み合わせを形成する（非相関特徴とも呼ばれる）。
【０１３３】
無相関である各特徴が、元の特徴のクラスタ全体から情報を抽出するために、新しい特徴空間はより低い次元を有する。次に、ＰＧＩは独自の特徴ランク付けアルゴリズムを適用して、各特徴の識別力（２つの群、例えば、対照と疾患とを分ける能力）のスコア付けを行う。
【０１３４】
ランク付けは、それぞれの特徴の変化をその関連性によって重み付けするため、解析の重要な部分である。特定の表現型について測定された、いくつかの無関係な特徴に大きな変化がある場合、低いランクのこうした特徴は、分析内におけるこうした変化の影響を自動的に減少させるため、従来の「特徴選択」アプローチに頼って、情報量の少ない特徴に埋め込まれている情報を破棄する必要はない。ランク付けアルゴリズムは、主要な対照と疾患との差に関する洞察を得るために、元の特徴または新しい特徴のいずれかに適用できる（図１を参照）。
【０１３５】
特徴の分析：疾患表現型の定量的評価
【０１３６】
新しい特徴空間では、「クラウド」（ランク付けされた無相関特徴空間内のマウスの群を近似させるガウス分布）間の重なりが、二群間の分離可能性（「識別可能性」）の定量的尺度として機能する（図２参照）。可視化を目的として、各クラウドは、対応する寸法に沿った１つの標準偏差に等しいその半軸でプロットした。
【０１３７】
結果：
【０１３８】
図３〜図６において、左側の黒いカラムはビヒクル処理野生型動物を表し、薄灰色のカラムはビヒクル処理ＨＥＴ動物を表し、より暗灰色のカラムは、プリドピジン処理ＨＥＴ動物（３ｍｇ／ｋｇ）を表し、右側の最も暗い灰色のカラムは、プリドピジン処理ＨＥＴ動物（３０ｍｇ／ｋｇ）を表す。
【０１３９】
行動試験：
【０１４０】
（１）握り
【０１４１】
８週目および１２週目の握りに対するプリドピジンの効果を図３に示す。ビヒクル処理ＨＥＴマウスは、ＷＴマウスと比較して有意により強い握りを示した。プリドピジン（３ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）は、この測定値に有意な効果を及ぼすことはなかった。しかしながら、プリドピジン（３０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）は、８週目でこの挙動を正常化する傾向があった（ｐ＜０．０６）が、この効果は１２週目では見られなかった（８週目では、野生ビヒクル処理動物およびプリドピジン処理（３０ｍｇ、ｋｇ）動物を表すカラムはなく、１２週目では、野生ビヒクル処理動物を表すカラムはない）。
【０１４２】
（２）ロータロッド
【０１４３】
回転しているロッドから落下するまでの時間および落下速度に対する試験化合物の効果を、それぞれ図４および図５に示す。ＭｅＣＰ２＿ＨＥＴマウスは、ＷＴマウスと比較してより急速に、かつより遅い回転速度で落下した。これらの処理のいずれにも治療の効果はなかった。
【０１４４】
（３）驚愕反応／ＰＰＩ
【０１４５】
驚愕反応に対するプリドピジンの効果を図６に示す。ビヒクル処理ＨＥＴマウスは、ビヒクル処理ＷＴマウスと比較して驚愕が少なかった。プリドピジン（３０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）は、この測定値に有意な効果を及ぼすことはなかった。しかしながら、プリドピジン（３ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）で処理したＨＥＴマウスは、いずれの週齢においてもビヒクル処理したＨＥＴマウスと比較して高い驚愕反応を示した。プレパルス抑制反応では遺伝子型または治療効果はいずれも観察されなかったが、この反応は歴史的に可変のものであり、この試験の主要な尺度としては使用されていないが、試験の過程で集められている。
【０１４６】
（４）体重
【０１４７】
処理期間中の全マウスの体重の変化率を図７に示す。繰り返し測定ＡＮＯＶＡでは、有意な遺伝子型効果および遺伝子型ｘ時間相互作用を発見した。調査の第２週から調査完了までの間、ＢＷの増加率は、ＷＴマウスと比較してＨＥＴマウスにおいて高かった。
【０１４８】
ＨＥＴマウスでは、繰り返し測定ＡＮＯＶＡにより有意な治療効果が見られた。プリドピジン（３ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）で処理した群は両方とも、ビヒクルと比較して処理後１．５週間以降、ほとんど体重増加を示さなかった。図中、薄灰色の丸はビヒクル処理野生型マウスを表す。薄灰色の四角はビヒクル処理ＭｅＣＰ２  ＨＥＴマウスを表し、濃灰色の菱形はプリドピジン処理ＭｅＣＰ２  ＨＥＴマウス（３ｍｇ／ｋｇ）を表し、濃灰色の丸はプリドピジン処理ＭｅＣＰ２  ＨＥＴマウス（３０ｍｇ／ｋｇ）を表す。
【０１４９】
（５）ＮｅｕｒｏＣｕｂｅ（登録商標）
【０１５０】
８週齢および１２週齢のＷＴマウスとＨＥＴマウスとの間の識別確率は、それぞれ９０％および９４％であった。ＷＴとＨＥＴとを識別した上位の歩行特徴のいくつかは、８週齢のＨＥＴマウスと比較して、より長いストライドおよび歩幅、より狭い基底幅、およびより少ない足強度のＷＴマウスが含まれる。１２週齢では、ＷＴマウスはまた、ＨＥＴマウスと比較して、長いストライド長、ストライド時間、およびスイング時間、大きい足面積、および低い足強度を示した。８週目での歩行能力に対するプリドピジンの効果を図８に示す。１２週目での歩行能力に対するプリドピジンの効果を図９に示す。プリドピジン（３０ｍｇ／ｋｇ）は、８週目および１２週目で全体的な歩行特徴の有意な回復を示した（それぞれ４５％および５５％）。
【０１５１】
さらなる分析では、以下の表２に示すように、いくつかの歩行領域において有意差が示された。ＭｅＣＰ２＿ＨＥＴマウスは、全ての歩行特徴において、全体としてＷＴ対照マウスと有意に異なっていた（８週目での律動性を除く）。８週目のデータは、プリドピジン（３および３０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）で処理したＭｅＣＰ２＿ＨＥＴマウスが両方の週齢で身体動作に対して有効性を示したことを示唆している。プリドピジン（３０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）では、１２週間の時点で、歩行単独に対する有意な効果も見られた。
【０１５２】
【表２】
2019532926.tif 000007
【０１５３】
ＢＤＮＦ分析
【０１５４】
ＷＴマウスおよびＨＥＴマウスの脳試料における相対的ＢＤＮＦ発現に対するプリドピジンの効果を図１０〜１４に示す。
【０１５５】
全脳ハウスキーピング遺伝子ｍＲＮＡ発現レベルは、調査した異なる動物群処理間で変化はなかった（図１０参照）。
【０１５６】
ＢＤＮＦ  Ｉ  ｍＲＮＡ発現は、ＭｅＣＰ２＿ＷＴ（ビヒクル）と比較して、ＭｅＣＰ２＿ＨＥＴ（ビヒクル）処理群において有意に減少した。ＭｅＣＰ２＿ＨＥＴビヒクル処理群と比較して、ＭｅＣＰ２＿ＨＥＴ処理群において有意な変化は観察されなかった（図１１参照）。
【０１５７】
ＭｅＣＰ２＿ＷＴ（ビヒクル）と比較して、ＢＤＮＦ  ＩＶ  ｍＲＮＡ発現は、ＭｅＣＰ２＿ＨＥＴ（ビヒクル）処理群において有意に減少した。プリドピジン処理（３または３０ｍｇ／ｋｇ）は、ＭｅＣＰ２＿ＨＥＴマウスにおいて、ＭｅＣＰ２＿ＷＴレベルに近い下方制御されたＢＤＮＦ  ＩＶ  ｍＲＮＡをレスキューした（図１２参照）。
【０１５８】
ＭｅＣＰ２＿ＷＴ（ビヒクル）と比較して、ＢＤＮＦ  ＶＩ  ｍＲＮＡ発現は、ＭｅＣＰ２＿ＨＥＴ（ビヒクル）処理群において有意に減少した。ＭｅＣＰ２＿ＨＥＴビヒクル処理群と比較して、ＭｅＣＰ２＿ＨＥＴ処理群において有意な変化は観察されなかった（図１３参照）。
【０１５９】
ＭｅＣＰ２＿ＷＴ（ビヒクル）と比較して、ＢＤＮＦ  ＩＸ  ｍＲＮＡ発現は、ＭｅＣＰ２＿ＨＥＴ（ビヒクル）処理群において有意に減少した。プリドピジン処理（３または３０ｍｇ／ｋｇ）は、ＭｅＣＰ２＿ＨＥＴマウスにおいて、ＭｅＣＰ２＿ＷＴレベルに近い下方制御されたＢＤＮＦ  ＩＸ  ｍＲＮＡをレスキューした（図１４参照）。
【０１６０】
結論
【０１６１】
本調査では、ＭｅＣＰ２＿ＨＥＴマウスにおける歩行、握り、ロータロッド、および驚愕／ＰＰＩに対するプリドピジンの慢性皮下投与の効果を評価した。
【０１６２】
プリドピジン（３ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）は、歩行測定においてビヒクル処理突然変異体と有意に異なっていた。さらに、プリドピジン（３ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）で処理したＨＥＴマウスは、両方の試験時点でビヒクル処理ＨＥＴマウスと比較して驚愕反応が増大したことを示した。プリドピジン（３０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）で処理したＭｅＣＰ２＿ＨＥＴマウスは、歩行特徴の有意な回復を示し、８週齢で握りを正常化する傾向があった。
【０１６３】
発明者らの以前のデータは、選択的スプライシングから生成されたが同じタンパク質を産生する、ＢＤＮＦ  Ｉ、ＩＶ、ＶＩ、ＩＸアイソフォームをコードする転写物が、４ヶ月齢のヘテロ接合ＭｅＣＰ２ノックアウトマウスの脳において下方制御されることを示した。
【０１６４】
ビヒクル処理ＭｅＣＰ２＿ＨＥＴマウスおよびＷＴマウスの脳におけるこれらの転写物の相対的ｍＲＮＡ発現レベルを比較することによって、以前の観察結果が再現された。
【０１６５】
ＭｅＣＰ２マウスでは、いずれの処理も、ＢＤＮＦ  ＩおよびＢＤＮＦ  ＶＩ  ｍＲＮＡ発現レベルに対する有意な効果を有することはなかった。両方の投与量のプリドピジン（３および３０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）による処理は、ＢＤＮＦ  ＩＶおよびＢＤＮＦ  ＩＸの下方制御されたｍＲＮＡレベルを完全にレスキューした。ＢＤＮＦ  ｍＲＮＡの発現に対するプリドピジンの好ましい効果は、行動パラダイムにおいて観察された改善と一致する。
【０１６６】
実施例２：プリドピジン処理ＭｅＣＰ２マウスのＲＮＡ分析
【０１６７】
約４．５週齢の雌ＭｅＣＰ２（ＨＥＴ、ヘテロ接合）マウスおよび野生型同腹仔を、プリドピジンまたはビヒクルのいずれかで処理した。プリドピジン（３および３０ｍｇ／ｋｇ）を１０ｍｌ／ｋｇの投与量で１日２回（投与間６時間）経口投与した。４つの治療群が存在した：１．ＷＴマウス−ビヒクル、２．ＨＥＴ  ＭｅＣＰ２マウス−ビヒクル、３．ＨＥＴ  ＭｅＣＰ２マウス−プリドピジン（３ｍｇ／ｋｇ；１日２回ＰＯ）、４．ＨＥＴ  ＭｅＣＰ２マウス−プリドピジン（３０ｍｇ／ｋｇ；１日２回ＰＯ）。
【０１６８】
ＲＮＡは、プリドピジン処理マウスおよびビヒクル処理マウスの線条体、海馬、および皮質組織から単離した。次に、ＨｉＳｅｑ  ２ｘ５０ｎｔペアエンドシークエンシングを備えたＩｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡ  Ｋｉｔを用いてＲＮＡａｓｅｑを実施した。ｆａｓｔｑファイルをダウンロードし、ＧＲＣｍ３８プライマリアセンブリアノテーションおよび標準オプションを有するＳｔａｒ  ａｌｉｇｎｅｒを使用して、ｆａｓｔｑファイルを整列させた。遺伝子は、ＧｅｎｅＣｏｄｅ  ｖＭ７のＦｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓでカウントした。ｆｅａｔｕｒｅ＿ｔｙｐｅおよびｇｒｏｕｐ＿ｂｙについては、「ｇｅｎｅ」を使用し、「ｒｅｖｅｒｓｅ」を撚り合わせに使用した。読み取り数を単一の行列および他の全ての下流の計算処理にマージされており、これは、Ｒ統計プログラミング言語で行われる。試料の１番目および２番目の主成分を示すプロットを使用して、外れ値を選択した。平均して１遺伝子あたり１０リード未満の転写物は、除外した。ｅｄｇｅＲ  ＲパッケージのＣａｌｃＮｏｒｍＦａｃｔｏｒｓを使用して、ＴＭＭ法で数を正規化した。ｌｉｍｍａ  Ｒパッケージを使用して、遺伝子レベルの定量化データを変換し、モデル化した。ｌｉｍｍａ：：ｖｏｏｍを使用して、カウントデータを１００万あたりのｌｏｇ  ２カウントに変換し、平均分散関係を計算した。
【０１６９】
未だ完了していない示差的発現分析では、ｌｉｍｍａ：：ｌｍＦｉｔを用いて、各遺伝子について、実験計画マトリックスに基づいて線形モデルをフィッティングし、バッチ情報を補正するための追加用語を用いる。ｌｉｍｍａ：：ｅＢａｙｅｓを使用して、コントラストの有意性について経験的ベイズ緩和ｔ統計量を計算する。多重仮説により調整されたｐ値はｌｉｍｍａ：：ｔｏｐｔａｂｌｅを使用して計算され、ＦＤＲを制御するためにＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順を実行した。未処理のＭｅＣＰ２  ＨＥＴ試料と未処理のＷＴ試料、処理済みＭｅＣＰ２  ＨＥＴ試料と未処理のＭｅＣＰ２  ＨＥＴ試料との間の差次的発現コントラストは、３つの組織全てについて独立して計算する。関連する生物学的サインについて、治療遺伝子発現サインが富化されているかどうかを試験するために、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）を使用する。遺伝子は、与えられたコントラストに対して、ｌｉｍｍａ生成ｔ統計量によってランク付けされる。Ｅｎｒｉｃｈｒは、経路解析に使用する。
【０１７０】
期待される結果および潜在的な用途
【０１７１】
この実験は、プリドピジンがＭｅＣＰ２  ＨＥＴマウスで観察された異常な転写を逆転させるかどうかを査定するために設計した。これは、疾患の文脈において、混乱している遺伝子のリストを取り、プリドピジンがこれらの遺伝子の発現をそれらの野生型レベルまで回復させるかどうかを試験することによって行われる。さらに、レット病マウスモデルの文脈においてプリドピジンが遺伝子発現にどのような影響を与えるかという問題に対する答えが求められている。経路分析は、関連経路、転写因子、またはＲＴＴにおけるプリドピジンの潜在的な作用機序を示すキナーゼの富化をもたらし得る。ＢＤＮＦ経路、および他の関連経路が具体的に照会される。レット症候群の文脈におけるプリドピジン遺伝子発現のサインは、薬力学的バイオマーカー（ＰＤバイオマーカー）の開発を助けるために使用される。線条体、海馬、または皮質で観察される治療的に関連のあるプリドピジン誘導遺伝子発現の変化は、臨床試験中により接近しやすい組織において観察可能であり得る。
【０１７２】
これらの実験は、ＲＴＴに罹患している対象の治療におけるプリドピジンの使用を裏付けるために行う。
【０１７３】
実施例３：ＲＴＴに罹患している患者の治療におけるプリドピジンの有効性の評価
【０１７４】
ＲＴＴに罹患している患者にプリドピジンを定期的に（例えば、毎日または毎日２回）静脈内または経口投与することは、患者を治療するのに有効である。
【０１７５】
プリドピジンを投与することは、ＲＴＴ患者における症状の発症を効果的に遅らせる。
【０１７６】
プリドピジンを投与することは、ＲＴＴ患者における少なくとも１つの症状の悪化を効果的に防止するか、もしくは遅延させるか、または改善する。
【０１７７】
プリドピジンを投与することは、ＲＴＴ患者の運動スキルの悪化を効果的に防止するか、もしくは遅延させるか、または改善する。プリドピジンを投与することは、ＲＴＴ患者の習得した運動スキルの部分的または完全な喪失を効果的に防止する。
【０１７８】
プリドピジンを投与することは、ＲＴＴ患者の悪化を効果的に防止するか、もしくは遅延させるか、または歩行を改善する。
【０１７９】
プリドピジンを投与することは、ＲＴＴ患者における運動失調、失行、筋力低下、痙縮、および／または硬直性を効果的に防止するか、遅延させるか、または改善する。プリドピジンを投与することは、ＲＴＴ患者における歩行障害の始まりを効果的に防止するか、遅延させるか、または改善する。
【０１８０】
プリドピジンを投与することは、ＲＴＴ患者における異常な筋緊張、末梢血管運動障害、および／または脊柱側弯症を効果的に防止するか、遅延させるか、または改善する。
【０１８１】
プリドピジンを投与することは、ＲＴＴ患者における意図的な手の技能の悪化を効果的に防止するか、もしくは遅延させるか、または改善する。プリドピジンを投与することは、これらに限定されないが、手を捻ること、絞ること、拍手すること、洗うこと、叩くこと、擦ること、および繰り返し口に手を持っていくことを含む、異常な手の動きを効果的に防止するか、遅延させるかまたは改善する。プリドピジンを投与することは、ＲＴＴ患者の習得した意図的な手の技能の部分的または完全な喪失を効果的に防止する。
【０１８２】
プリドピジンを投与することは、発話および通常のアイコンタクトを含むがこれらに限定されない、ＲＴＴ患者のコミュニケーションスキルの悪化を効果的に防止するか、もしくは遅延させるか、または改善する。プリドピジンを投与することは、ＲＴＴ患者の習得したコミュニケーションスキルの部分的または完全な喪失を効果的に防止する。
【０１８３】
プリドピジンを投与することは、発育遅延、発作、心臓の異常、呼吸の不規則性、睡眠パターンの障害、起きている間の歯ぎしり、疼痛に対する反応の低下、低栄養性の冷たい青い足、過敏性の増大、警戒心の低下、注意力の低下、不適切な笑い、および／または不適切な叫び声を効果的に防止するか、遅延させるか、または改善する。
【０１８４】
参考文献
【０１８５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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