(57)【要約】  本発明は、インフルエンザウイルスリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体に含まれるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）の少なくとも１つの活性を阻害することができる物質を同定する方法であって、（ａ）上記ＲＮＰ複合体を含む、精製されたインフルエンザウイルスの水性懸濁物を準備することと、（ｂ）工程（ａ）の上記懸濁物に、（ｉ）非イオン性又は双性イオン性の界面活性剤、及び（ｉｉ）還元剤を添加することと、（ｃ）インフルエンザウイルス溶解物を得るため、工程（ｂ）で得られた混合物をインキュベートすることと、（ｄ）被験物質を、上記インフルエンザウイルス溶解物中に存在する上記ＲＮＰ複合体に含まれる上記ＲｄＲｐと相互作用させる条件下で、工程（ｃ）で得られたインフルエンザウイルス溶解物を被験物質と接触させることと、（ｅ）上記被験物質が、上記ＲｄＲｐの少なくとも１つの活性を阻害するかどうかを判定することとを含む、又はそれらのみからなる、方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルスリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体に含まれるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）の少なくとも１つの活性を阻害することができる物質を同定する方法であって、
（ａ）前記ＲＮＰ複合体を含む、精製されたインフルエンザウイルスの水性懸濁物を準備することと、
（ｂ）工程（ａ）の前記懸濁物に、
（ｉ）非イオン性又は双性イオン性の界面活性剤、及び、
（ｉｉ）還元剤、
を添加することと、
（ｃ）インフルエンザウイルス溶解物を得るため、工程（ｂ）で得られた混合物をインキュベートすることと、
（ｄ）被験物質を、前記インフルエンザウイルス溶解物中に存在する前記ＲＮＰ複合体に含まれる前記ＲｄＲｐと相互作用させる条件下で、工程（ｃ）で得られた前記インフルエンザウイルス溶解物を前記被験物質と接触させることと、
（ｅ）前記被験物質が、前記ＲｄＲｐの少なくとも１つの活性を阻害するかどうかを判定することと、
を含む、又はそれらのみからなる、方法。
【請求項２】
前記活性が、転写、キャップ結合、エンドヌクレアーゼ活性、複製及びポリメラーゼ活性から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｅ）における前記判定が、転写及び／又は複製を定量することを含む、又はそれらのみからなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｅ）が、
（ｅ１）少なくとも１つの放射能標識化ヌクレオチドを添加することと、
（ｅ２）前記放射能標識化ヌクレオチドが転写又は複製の生成物に組み込まれるように、転写及び／又は複製を起こさせることと、
（ｅ３）フィルター上に工程（ｅ２）の前記生成物を沈降させることと、
（ｅ４）前記フィルター上に保持された生成物の放射能を、好ましくはシンチレーション計数によって定量することと、
を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、前記ウイルス溶解物中に存在する他のウイルス成分からのＲＮＰ複合体の分離を含まない、及び／又は前記方法が、工程（ｄ）の前に工程（ｃ）の前記インフルエンザウイルス溶解物の精製を含まない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル、ポリオキシプロピレングリコールアルキルエーテル、グルコシドアルキルエーテル、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル、グリセロールアルキルエステル、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、及びソルビタンアルキルエステル、又はこれらの化合物の少なくとも２つの混合物から選択され、好ましくは前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテルから選択され、及び／又は、
前記双性イオン性界面活性剤がスルタイン、ベタイン、及びスルホベタイン、又はこれらの化合物の少なくとも２つの混合物、好ましくはスルホベタインから選択され、及び／又は、
（ｉｉ）前記還元剤がジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）、システイン、及び２−メルカプトエチルアミン、又はこれらの化合物の少なくとも２つの混合物から選択され、好ましくは前記還元剤が、ジチオスレイトールと２−メルカプトエタノールとの混合物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）において、更に（ｉｉｉ）安定剤、好ましくは凍結防止剤を添加し、該凍結防止剤が好ましくはグリセロール、エチレングリコール、又はそれらの混合物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）で得られる濃度について、
（ｉ）前記界面活性剤が約０．０５％〜約５％（重量／体積）、好ましくは約０．１％〜約２％（重量／体積）であり、
（ｉｉ）前記還元剤が約０．５ｍＭ〜約１００ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ〜約２５ｍＭであり、及び／又は、
（ｉｉｉ）前記安定剤が、存在する場合は、約０．５％〜約６０％（重量／体積）、好ましくは約１％〜約５０％（重量／体積）、より好ましくは約２％〜約２５％（重量／体積）である、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
（ｉ）、（ｉｉ）、及び存在する場合は（ｉｉｉ）が、１以上の溶液、好ましくは１以上の水溶液に含まれ、該溶液が工程（ｂ）において前記懸濁物に添加される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｃ）における前記インキュベートが約５分間〜約１８０分間、好ましくは約１５分間〜約６０分間、より好ましくは約３０分間である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｃ）における前記インキュベートが、約５℃〜約３５℃、好ましくは約１５℃〜約３０℃、より好ましくは約２５℃の温度である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記インフルエンザウイルスが、インフルエンザＡ型ウイルス、又はインフルエンザＢ型ウイルスである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法がハイスループット法である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
（ｆ）前記活性の５０％を阻害する前記被験物質の濃度を決定することを更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体に含まれるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）の少なくとも１つの活性を阻害することができる物質を同定する方法であって、（ａ）上記ＲＮＰ複合体を含む、精製されたインフルエンザウイルスの水性懸濁物を準備することと、（ｂ）工程（ａ）の上記懸濁物に、（ｉ）非イオン性又は双性イオン性の界面活性剤、及び、（ｉｉ）還元剤を添加することと、（ｃ）インフルエンザウイルス溶解物を得るため、工程（ｂ）で得られた混合物をインキュベートすることと、（ｄ）被験物質を、上記インフルエンザウイルス溶解物中に存在する上記ＲＮＰ複合体に含まれる上記ＲｄＲｐと相互作用させる条件下で、工程（ｃ）で得られた上記インフルエンザウイルス溶解物を上記被験物質と接触させることと、（ｅ）上記被験物質が、上記ＲｄＲｐの少なくとも１つの活性を阻害するかどうかを判定することとを含む、又はそれらのみからなる、方法を提供する。
【０００２】
本明細書において、特許出願及び製造者のマニュアルを含む多数の文書が引用される。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関連するとは見なされないものの、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。より詳細には、参照される全ての文書は、各個々の文書が引用することにより本明細書の一部をなすと具体的に個々に指示された場合と同程度、引用することにより本明細書の一部をなす。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザウイルスは、ＲＮＡウイルスのオルトミクソウイルス科に属する。インフルエンザウイルスは、ウイルスヌクレオカプシド及びマトリクスタンパク質の抗原性の違いに基づいて、インフルエンザＡ型ウイルス、Ｂ型ウイルス、及びＣ型ウイルスという名の３つの種類に更に分類される。全てのインフルエンザウイルスはエンベロープを有し、それらのゲノムは８個又は７個の一本鎖のネガティブ鎖（negative-sensed：マイナス鎖）ＲＮＡセグメントで構成される。これらのウイルスは、著しい罹患率及び死亡率を伴ってヒト及び動物において呼吸器疾患を引き起こす。１９１８年のインフルエンザ大流行、すなわちスペイン風邪で最大１億人が死亡したと考えられる。鳥インフルエンザＲＮＡフラグメントとの循環ヒトウイルスとの遺伝子再集合は、１９５７年のＨ２Ｎ２「アジア型インフルエンザ」及び１９６８年のＨ３Ｎ２「香港型インフルエンザ」の他の２つの大流行を引き起こした。現在、世界中の人々は、様々な角度からインフルエンザの課題に直面し、季節性インフルエンザの流行は、年間２５００００人〜５０００００人に及ぶ死亡率を伴って、世界人口の約５％〜１５％に影響を与えている。鳥インフルエンザ株、大半がＨ５Ｎ１の感染がアジア諸国で報告された。頻繁なヒトからヒトへの伝播は観察されていないが、鳥インフルエンザ感染は重篤であり、感染した人の最大６０％の高い死亡率を伴う。２００９年には、Ｈ１Ｎ１豚インフルエンザ感染が北アメリカで最初に出現し、新たな大流行へと発展した。現在、季節性三価インフルエンザワクチン、及びＨ５Ｎ１又は豚インフルエンザに特異的なワクチンが入手可能であるか、又は臨床試験中のいずれかである。予防処置は、インフルエンザウイルス感染及びその潜在的に重篤な合併症を予防するため、少なくとも一部の集団には有効な方法である。しかしながら、連続的なウイルスの抗原不連続変異及び抗原連続変異は、今後の循環インフルエンザ株を予測不能なものとする。さらに、大流行の間の比較的短期間のうちにワクチンを大量生産するには限度があるため、抗インフルエンザ薬等の他の抗インフルエンザアプローチが非常に望ましい。市場には、リン酸オセルタミビル（タミフル）及びザナミビル（リレンザ）等のノイラミニダーゼ阻害剤と、アマンタジン及びリマンタジン等のＭ２イオンチャネル遮断薬の入手可能な２種類の抗インフルエンザ薬が存在する。現在の抗インフルエンザ薬の有効性を増し、薬剤耐性ウイルスの出現を予防する又は減じるため、治療剤若しくは予防剤として単独で又は現在の抗インフルエンザ薬と組み合わせて使用され得る新たな抗インフルエンザ作用機構を有する化合物を発見することは非常に貴重である。
【０００４】
Ｈ５Ｎ１及び関連する高病原性鳥インフルエンザウイルスが突然変異を得ることで、より容易にヒト間で伝染可能になることは現実のようである。さらに、新たなＡ／Ｈ１Ｎ１はより有毒となるおそれがあり、単一の点突然変異だけでもオセルタミビルに対する耐性を与えるのに十分であると考えられる（非特許文献１）。これは、最近同定された幾つかの季節性Ｈ１Ｎ１株の場合に既に起こっている（非特許文献２、非特許文献３）。そのような場合、ワクチンの生成及び開発における避けられない遅れによって、人命及び社会的混乱において壊滅的に犠牲が大きくなり得る。
【０００５】
現在のパンデミック（pandemic）Ｈ１Ｎ１豚インフルエンザ、高病原性Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザ、及び薬剤耐性季節性インフルエンザの高い感染リスクの点からも、新たな抗インフルエンザ薬の開発の優先順位が高くなっている。
【０００６】
多くの場合、抗ウイルス医薬の開発は、ウイルスタンパク質の構造データの有効性によって促進され得る。インフルエンザウイルス表面抗原ノイラミニダーゼの構造データの有効性は、例えば、改善されたノイラミニダーゼ阻害剤の設計に結びついた（非特許文献４）。かかる構造データに基づいて開発された活性化合物の例として、ザナミビル（Glaxo）、及びオセルタミビル（Roche）が挙げられる。しかしながら、これらの医薬は疾患の持続期間の減少に結びつく場合があるものの、これらの疾患の治癒にも使用され得る改善された医薬が今なお緊急に必要とされている。
【０００７】
アマンタジン及びリマンタジン等のアダマンタン含有化合物は、インフルエンザを治療するために使用されてきた活性化合物の別の例である。しかしながら、アダマンタン含有化合物はしばしば副作用をもたらし、効果がないことがわかった症例の数も増えてきている（非特許文献５）。
【０００８】
より非特異的なウイルス薬がインフルエンザ及び他のウイルス感染の治療に使用されてきたが（非特許文献６）、それらの使用は副作用により制限されている（非特許文献７）。
【０００９】
上に記載されるようなオルトミクソウイルス科であるインフルエンザウイルスは、上に記載されるように、ネガティブ鎖ｓｓＲＮＡウイルスである。このグループのウイルスの他の例として、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、オフィオウイルス科、デルタウイルス、ボルナウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、及びニヤミウイルス科（Nyamiviridae）が挙げられる。これらのウイルスは、それらの遺伝物質としてネガティブ鎖ＲＮＡを使用する。一本鎖ＲＮＡウイルスは、ＲＮＡのセンス又は極性に応じてポジティブ（positive：プラス）又はネガティブに分類される。転写の前に、ＲＮＡポリメラーゼの作用は、ネガティブウイルスＲＮＡからポジティブＲＮＡを産生するのに必要である。したがって、ネガティブ鎖ウイルスのＲＮＡ（ｖＲＮＡ）は、単独で非感染性とされる。
【００１０】
ポリメラーゼ塩基性タンパク質１（ＰＢ１）サブユニット、ポリメラーゼ塩基性タンパク質２（ＰＢ２）サブユニット、及びポリメラーゼ酸性タンパク質（ＰＡ）サブユニットからなる三量体ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、ウイルスＲＮＡゲノムセグメントの転写及び複製を担う。ＰＢ２サブユニット中のｍＲＮＡキャップ結合ドメイン（非特許文献８）と、ＰＡサブユニット中のエンドヌクレアーゼ活性部位（非特許文献９）のポリメラーゼの２つの重要なドメインの構造データが利用可能となった。
【００１１】
リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、インフルエンザウイルスの最小の転写及び複製の機構を表す。また、ポリメラーゼは、ＲＮＰ複合体に含まれる場合、ｖＲＮＰ酵素と称される。複製の間、ウイルスＲＮＡポリメラーゼは相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）複製中間体、すなわちｖＲＮＡの新たなコピーの合成用テンプレートとしてはたらくｖＲＮＡの全長相補体を生成する。
【００１２】
転写の間、ＲＮＰ複合体に含まれるウイルスＲＮＡポリメラーゼは、５’キャップ化ＲＮＡプライマーを使用してキャップ化され、ポリアデニル化されたｍＲＮＡを合成する。このプロセスは、キャップ転用（cap snatching）と呼ばれる機構を含む。インフルエンザポリメラーゼは、ウイルス転写産物の合成用プライマーとして宿主細胞転写産物（キャップ化ｍＲＮＡ前駆体）を使用する。核タンパク質は、ウイルス転写機構の必須の構成要素である。したがって、ウイルスｍＲＮＡへの一本鎖のネガティブ鎖ウイルスＲＮＡの転写、及びウイルスｍＲＮＡの複製を担うポリメラーゼ複合体は、インフルエンザを治療するために使用され得る、新たなクラスの化合物の開発の有望な出発点である（非特許文献１０）。この知見は、ポリメラーゼ複合体が、ウイルスに対する宿主として機能する細胞のタンパク質中に存在する、機能性部位と相当程度異なると予想される多くの機能的な活性部位を含むという事実によって補強される（非特許文献５）。一例として、他のポリメラーゼの活性に影響を及ぼさないインフルエンザＡ型及びＢ型のウイルスのキャップ依存性転写酵素を選択的に阻害する、置換２，６−ジケトピペラジンが同定された（非特許文献１１）。さらに、リン酸化２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンがニワトリ胚細胞においてインフルエンザウイルス複製を可逆的に阻害することが報告されている。インフルエンザウイルスＲＮＡの一次及び二次転写が、低濃度の化合物であってもブロックされたのに対し、細胞タンパク質合成の阻害は高濃度の化合物であっても観察されなかった（非特許文献１２）。
【００１３】
所与の標的分子の活性を変えること、多くの場合、阻害することのできる化合物を同定する目的で様々なアッセイの設計を利用することができる。細胞アッセイと生化学アッセイとの間には、確立された１つの相違が存在する。細胞アッセイはｉｎ  ｖｉｖｏにより近い状況を模倣すると説明されるが、任意の候補化合物が、通常、第一段階で細胞膜を通過しなければならないという不利点に悩まされる。生化学アッセイは、その点ではより単純である。標的、典型的にはタンパク質は、水溶液中の濃縮形態又は精製された形態で提示され得る。かかるアッセイシナリオでは、メンブレンバリアは存在しないが、その条件は治療に供される生体内の環境とは更にかけ離れている可能性がある。
【００１４】
非特許文献１３は、インフルエンザＡ型ウイルスポリメラーゼ阻害剤の同定のためのアッセイを記載している。そのアッセイは、リボ核タンパク質複合体の全体を使用する。無細胞アッセイであるが、純粋なポリメラーゼと比較して、標的はより複雑な環境にある。このアッセイは転写アッセイである。検出スキームはハイブリダイゼーションに基づく。放射能（Radioactivity：放射活性）は使用されない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Neumann et al., Nature 2009, 18, 459(7249), 931-939
【非特許文献２】Dharan et al., The Journal of the American Medical Association, 2009, 301(10), 1034-1041
【非特許文献３】Moscona et al., The New England Journal of Medicine 2009, 360(10), 953-956
【非特許文献４】Von Itzstein et al., Nature 1993, 363, 418-423
【非特許文献５】Magden et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 66, 612-621
【非特許文献６】Eriksson et al., Antimicrob. Agents Chemother. 1977, 11, 946-951
【非特許文献７】Furuta et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2005, 981-986
【非特許文献８】Guilligay et al., Nature Structural & Molecular Biology 2008, 15(5), 500-506
【非特許文献９】Dias et al., Nature 2009, 458, 914-918
【非特許文献１０】Fodor, Acta virologica 2013, 57, 113-122
【非特許文献１１】Tomassini et al., Antimicrob. Agents Chemother. 1996, 40, 1189-1193
【非特許文献１２】Tisdale et al., Antimicrob. Agents Chemother. 1995, 39, 2454-2458
【非特許文献１３】Roch et al.（Assay and drug development technologies, 13, 388-506 (2015)）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の基礎となる技術的課題は、インフルエンザウイルスのウイルスポリメラーゼの活性を妨げることができる化合物を同定する改善された方法の提供に見ることができる。この技術的課題は、各請求項に記載の発明の要旨によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、インフルエンザウイルスリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体に含まれるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）の少なくとも１つの活性を阻害することができる物質を同定する方法であって、（ａ）上記ＲＮＰ複合体を含む、精製されたインフルエンザウイルスの水性懸濁物を準備することと、（ｂ）工程（ａ）の上記懸濁物に、（ｉ）非イオン性又は双性イオン性の界面活性剤、及び、（ｉｉ）還元剤を添加することと、（ｃ）インフルエンザウイルス溶解物を得るため、工程（ｂ）で得られた混合物をインキュベートすることと、（ｄ）被験物質を、上記インフルエンザウイルス溶解物中に存在する上記ＲＮＰ複合体に含まれる上記ＲｄＲｐと相互作用させる条件下で、工程（ｃ）で得られたインフルエンザウイルス溶解物を被験物質と接触させることと、（ｅ）上記被験物質が、上記ＲｄＲｐの少なくとも１つの活性を阻害するかどうかを判定することとを含む、又はそれらのみからなる、方法に関する。
【００１８】
したがって、スクリーニング方法が提供される。より詳細に以下に検討されるように、上記方法は、ハイスループットなフォーマットでの実施に適している。また、その方法は、活性物質のＩＣ５０値の決定を可能とする。
【００１９】
「阻害する」の用語は、酵素又は結合する分子の活性を減少させるというその技術上確立された意味を有する。「活性」の用語は、酵素活性を含み、（好ましくは同族の）リガンドを結合する能力まで拡大する。「阻害する」は、少なくとも１０−１倍、少なくとも１０−２倍、少なくとも１０−３倍、少なくとも１０−４倍、少なくとも１０−５倍、少なくとも１０−６倍、少なくとも１０−７倍、少なくとも１０−８倍、少なくとも１０−９倍の、及び／又は検出限界を下回る活性の減少を指す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
インフルエンザウイルスは、分節ネガティブ鎖ｓｓＲＮＡゲノムを有する。ウイルスのライフサイクルの間、複製及び転写の活性を与えるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが必要とされる。そのポリメラーゼはウイルスにコードされる。ポリメラーゼ分子は各リボ核タンパク質複合体に含まれ、複数のリボ核タンパク質複合体がウイルスエンベロープによって包まれる。インフルエンザウイルス、リボ核タンパク質複合体、及びウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、本明細書において上で検討され、適切な参照が引用される。本明細書において上に示されるこれらの用語の定義は、本発明に従う定義である。本発明による方法は、リボ核タンパク質複合体内に結合されるその形態でＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用する。ウイルスエンベロープは存在しない。
【００２１】
工程（ａ）により、ＲＮＰの水性懸濁物を準備する。懸濁物は、ＨＥＰＥＳバッファー中にあることが好ましい。インフルエンザウイルスと併せて使用される「精製された」の用語は、ウイルスＲｄＲｐ以外のポリメラーゼが存在しないことを意味する。特に、インフルエンザウイルスの作製に使用される宿主系のポリメラーゼが存在しない。好ましい宿主系は鶏卵である。したがって、上記宿主系を使用する場合、ニワトリポリメラーゼは上記精製されたインフルエンザウイルスには不在である。
【００２２】
好ましいウイルス精製手順は、ショ糖勾配精製であり、感染性尿膜腔液（ＡＦ）を各卵から採取する。その後、ＡＦを接線流濾過（ＴＦＦ：tangential flow filtration）によって濃縮し、ウイルスを遠心分離によってペレット化する。ペレットをＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水に再懸濁し、ショ糖段階勾配に入れ、遠心分離する。界面バンドを除去し、バッファー中で洗浄してショ糖を除去する。その後、ペレットをＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水に再懸濁し、比色タンパク質アッセイをバルク原料に対して行う。原料を、好ましくはバッファー中２ｍｇ／ｍｌまで希釈し、標準インベントリー抗原（inventoried antigen）用に等分する。インベントリー生成物を、好ましくは赤血球凝集、ＥＩＤ５０力価（ニワトリ胚５０％感染価）、及びタンパク質濃度について試験する。赤血球凝集試験は、ウイルス粒子の濃度を示す。好ましいインフルエンザウイルスを以下に更に開示する。
【００２３】
工程（ｂ）は、工程（ａ）の懸濁物に対する少なくとも２種類の薬剤の添加をもたらし、それら２種類の薬剤は各々単一の化合物であってもよく、２以上の化合物の混合物であってもよい。
【００２４】
薬剤（ｉ）は非イオン性又は双性イオン性の界面活性剤である。本発明による好ましい界面活性剤は非変性である。
【００２５】
「非変性」の用語は、その技術上確立された意味を有し、タンパク質のアンフォールディング（unfolding）、凝集、及び／又は機能喪失を引き起こさない界面活性剤を指す。所与の界面活性剤が非変性であるかどうかは、特に、本発明の教示が与えられる場合、更に面倒な作業を伴うことなく（without further ado）当業者によって判定され得る。更に説明するため、本発明による方法は、任意の被験物質がない状態で行なわれた場合には、ポリメラーゼ活性に対するアッセイである。変性界面活性剤を使用する場合、ポリメラーゼ活性は減少される、又は消失される。非変性界面活性剤は、本明細書に含まれる実施例において与えられる条件下で化学分析され、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００の使用と比較された場合、ＲｄＲｐの転写活性の５０％未満の喪失を引き起こすものである。
【００２６】
下記表１及び表２に示される好ましい非イオン性界面活性剤及び双性イオン性界面活性剤は、それぞれ非変性要件を満たす。
【００２７】
薬剤（ｉｉ）は還元剤である。したがって、電子供与性官能基を有する化合物を薬剤（ｉｉ）として利用してもよい。還元剤は、レドックス反応において別の化学種に電子を供与することができる。上記化学種には、例えばタンパク質中に生じるジスルフィド結合が含まれる。言いかえれば、本発明による還元剤は、タンパク質のシステイン残基間の分子内及び分子間のジスルフィド結合の形成を妨げる。
【００２８】
更なる薬剤を工程（ｂ）で添加してもよいが、必ずしも添加しなくてもよい。工程（ｂ）で添加される好ましい薬剤は安定剤であり、更に以下を参照されたい。添加される更なる好ましい薬剤は、ＲＮアーゼ阻害剤である。添加される更なる好ましい薬剤は、実施例１に記載されるものである。
【００２９】
その後、工程（ｂ）で得られた混合物をインキュベートして、インフルエンザウイルス溶解物を得る。特に時間及び温度の点で好適な条件は、当該技術分野において知られているか、又は更に面倒な作業を伴うことなく当業者によって決定され得る。好ましい条件を以下に更に示す。
【００３０】
本発明によれば、工程（ｃ）で得られるインフルエンザウイルス溶解物は、精製に供されない。スクリーニングの標的としてＲＮＰ複合体を使用するものを含む従来技術のプロトコルは、一般的にはインフルエンザウイルス溶解物からＲＮＰ複合体を精製する。当該技術分野では、かかる精製は不可欠であろう、及び／又はかかる精製を為すことで、スクリーニングでより良好な結果が得られるであろうと考えられる。本発明者らは、驚いたことに、真実はその逆であることを見出した。インフルエンザウイルス溶解物からＲＮＰ複合体を精製することを省くことは、より良好な結果をもたらし、バイアスの導入がより少なく、材料の喪失を回避する。より具体的には、技術上確立されているプロトコル（例えば、Klumpp et al., Meth. Enzymol. 342, 451 (2001)を参照されたい）と比較して、本発明の方法は、かなり速く、より多くの酵素をもたらし、重要なことには、得られた材料が、特に化合物のスクリーニングに関して同じ質を示す。
【００３１】
工程（ｄ）では、工程（ｃ）で得られたインフルエンザウイルス溶解物を被験物質と接触させる。この接触は、その被験物質をＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと相互作用させる条件下で為される。好適な条件は、更に面倒な作業を伴うことなく当業者によって決定され得る。好ましい条件は緩衝液を含む。好ましいバッファーは、好ましくはｐＨ＝７．５のＨＥＰＥＳである。ＲＮアーゼ阻害剤が存在することが好ましい。さらに条件は、好ましくはマグネシウム塩及び／又はマンガン塩、例えば、Ｍｇ（ＯＡｃ）２及び／又はＭｎ（ＯＡｃ）２を含む。被験物質は、有機溶媒中の溶液又は水溶液として添加され得る。好適な有機溶媒は、化合物ライブラリに対して一般的に使用されるもの、例えばＤＭＳＯが挙げられる。実施例２及び実施例３に、特に好ましい条件を記載する。
【００３２】
工程（ｅ）は、所与の被験物質がスクリーンで「ヒット」するかどうか、すなわちＲｄＲｐの少なくとも１つの活性を阻害することができる物質であるどうかの判定をもたらす。上記判定の好ましい実施は、評価されるＲｄＲｐの特定の活性に依存する。工程（ｅ）の好ましい実施を以下に更に詳述する。
【００３３】
「被験物質」の用語は特に限定されない。被験物質は、本発明の方法の工程（ｄ）の条件下で可溶性であることが理解される。被験物質又は被験物質のライブラリは、１つのＲｄＲｐ活性を阻害する能力が予想され得るように、又は上記ライブラリの１以上のメンバーがかかる能力を示すと予想され得るように選択される。したがって、「被験物質」と「ＲｄＲｐの少なくとも１つの活性を阻害することができる物質」との間には形式上の区別が存在し、被験物質は、かかる能力を有し得るが、必ずしもそうでなくてもよい。本発明の方法は、被験物質のうちでＲｄＲｐの少なくとも１つの活性を実際に阻害することができるそれらの物質の同定をもたらす。
【００３４】
好ましい被験物質は、好ましくは１０００Ｄａ未満、９００Ｄａ未満、７００Ｄａ未満、６００Ｄａ未満、又は５００Ｄａ未満の分子量を有する小さな有機分子である。
【００３５】
本発明の方法の好ましい実施形態では、上記活性は、転写、キャップ結合、エンドヌクレアーゼ活性、複製及びポリメラーゼ活性から選択される。
【００３６】
ウイルスのライフサイクルにおけるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの重要な活性は複製、すなわちウイルスゲノムコピーの合成、及び転写、すなわちウイルスｍＲＮＡ転写産物の合成である。いずれの場合も、生成物はポリヌクレオチドである。したがって、標識化ヌクレオチド、好ましくは放射能標識化（radioactively labeled：放射性物質で標識した）ヌクレオチドの使用は、上記ヌクレオチド中への放射能標識（radioactive label：放射性標識）の組み込みを可能とする。
【００３７】
複製の間、ＲｄＲｐに含まれるポリメラーゼ活性が関与する。転写の間、キャップ結合活性、エンドヌクレアーゼ活性、及びポリメラーゼ活性が関与する。
【００３８】
したがって、更に好ましい実施形態では、工程（ｅ）における上記判定は、転写及び／又は複製を定量することを含む、又はそれらのみからなる。代替的には、転写のみ又は複製のみをそれぞれ判定又は定量する。
【００３９】
好ましい実施形態では、工程（ｅ）は、（ｅ１）少なくとも１つの放射能標識化ヌクレオチドを添加することと、（ｅ２）放射能標識化ヌクレオチドが転写又は複製の生成物に組み込まれるように、転写及び／又は複製を起こさせることと、（ｅ３）フィルター上に工程（ｅ２）の生成物を沈降させることと、（ｅ４）フィルター上に保持された生成物の放射能を、好ましくはシンチレーション計数によって定量することとを含む。
【００４０】
ＲｄＲｐによって合成されるポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、上記放射能標識化ヌクレオチドはリボヌクレオチドである。放射能標識化ヌクレオチドは、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ及びＧＴＰのいずれか１つであってもよい。それほど好ましくはないものの、２種以上の放射能標識化ヌクレオチドを使用してもよい。典型的には１つの放射能標識化ヌクレオチドを使用する。同じ種類、例えばＧＴＰの放射能標識化ヌクレオチドと非標識化ヌクレオチドとの混合物を使用してもよく、実施例２及び実施例３を参照されたい。
【００４１】
工程（ｅ２）により転写及び／又は複製を起こさせることは、これらのプロセスが起こり得る条件の提供を含む。これらの条件は、当該技術分野において知られており、更に面倒な作業を伴うことなく当業者によって確立され得る。更なる指針を以下に示す。
【００４２】
また、「転写及び／又は複製を起こさせること」は、工程（ｅ１）において、４種類全てのリボヌクレオチド、すなわちＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ及びＧＴＰの提供を含み、ここで、４種類のリボヌクレオチドの１以上を上に記載されるように放射能標識化してもよいと理解される。工程（ｅ）が転写を定量することを含む場合、キャップ化ｍＲＮＡを工程（ｅ１）にて添加する。工程（ｅ）が複製を定量することを含む場合、ｐｐｐＡｐＧ等のプライマーを工程（ｅ１）にて添加する。
【００４３】
本発明による転写アッセイの好ましい実施を下記に示す。このｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、インフルエンザＡ型又はＢ型のウイルスのキャップ結合、エンドヌクレアーゼ活性及びポリメラーゼ活性の阻害剤を同定することを可能とする。インフルエンザリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）は、ウイルスゲノムネガティブ株ＲＮＡのポジティブ株ｍＲＮＡ、及びポジティブ株ｃＲＮＡへのそれぞれの転写及び複製を担う。転写は、ＰＢ２サブユニットによる細胞ｍＲＮＡのキャップ結合、及びＰＡサブユニットによるキャップ化ＲＮＡの切断の２工程からなる「キャップ転用」機構によって開始される。典型的には、得られた９個〜１３個のヌクレオチド長のキャップ化ＲＮＡオリゴは、ポリメラーゼサブユニットＰＢ１によるウイルスｍＲＮＡの後の合成のプライマーとしてはたらく。ｍＲＮＡ合成の間、放射能標識化されたヌクレオチドは、ｍＲＮＡ生成物に組み込まれ、例えばトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）による沈降によって、特異的フィルタープレート上に捕捉される。その後、ヌクレオチド組み込みの効率は、好ましくはシンチレーション計数によってフィルタープレート上に捕捉されたｍＲＮＡを定量することにより特定される。より高速のｍＲＮＡ合成は、より高いシグナルをもたらす。ｍＲＮＡの重合に先立つキャップ結合及び切断反応の本質的な関与により、ＰＡのエンドヌクレアーゼ活性部位又はＰＢ２のキャップ結合部位のいずれかをブロックすることにより、転写を阻害することができる。エンドヌクレアーゼ及びキャップ結合の阻害剤の両方のＩＣ５０値も決定され得る。
【００４４】
本発明の好ましい複製アッセイの説明を下記に示す。このｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、インフルエンザＡ型ウイルス、好ましくはインフルエンザＡ型のポリメラーゼ活性を標的とする阻害剤を同定することを可能とする。インフルエンザリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）は、ネガティブ鎖ウイルスゲノムＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のポジティブ鎖ｍＲＮＡへの転写のみならず、全長相補ゲノムＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の複製も担う。ｐｐｐＡｐＧジヌクレオチドは、ｃＲＮＡ合成を開始するため、ＲＮＰに与えられ、伸長プロセスの間、放射能標識化ヌクレオチドは、ｃＲＮＡ生成物に組み込まれ、ＴＣＡ沈降によって特異的フィルタープレート上に捕捉される。その後、ヌクレオチド組み込みの効率は、好ましくはフィルタープレート上で、好ましくは補足されたｃＲＮＡのシンチレーション計数によって特定される。より高速のｃＲＮＡ合成は、より高いシグナルをもたらす。ｃＲＮＡの重合に対するポリメラーゼサブユニットの本質的な関与により、ＰＢ１のポリメラーゼ活性部位を直接ブロックするか、又はｖＲＮＡテンプレート上のポリメラーゼ複合体の再アラインメントに必要なＲＮＰの構造変化を妨げるかのいずれかによって複製を阻害することができる。このアッセイは、複製阻害剤のＩＣ５０値を決定するために使用することができる。
【００４５】
工程（ｅ３）により、工程（ｅ２）の生成物がフィルター上に沈降する。
【００４６】
上記フィルターはミリポアフィルターであることが好ましい。好ましい孔径は、１０μｍ未満、５μｍ未満、又は２μｍ未満である。１．２μｍ及び０．６５μｍの孔径が特に好ましい。フィルターメンブレンはガラスフィルターであってもよい。真空マニホールドを使用することが好ましい。ＴＣＡ沈降に適合する９６ウェル又は３８４ウェルのプレート等のマルチウェルプレートが好ましい。
【００４７】
工程（ｅ４）は、フィルター上に保持される放射能の定量をもたらすことにより、次にＲｄＲｐの生成物となる放射能標識化ポリヌクレオチドを定量する。放射能を定量する好ましい方法は、シンチレーション計数である。
【００４８】
濾過プロセス（工程（ｅ３）及び工程（ｅ４））の特に好ましい実施を下記に示す。
【００４９】
ポリヌクレオチド、特に、転写反応に由来する合成ｍＲＮＡ生成物、又は複製反応に由来するｃＲＮＡ生成物を、５分間〜１時間、好ましくは３５分間、２５℃未満、好ましくは４℃にて、５％〜３０％ＴＣＡ）、好ましくは１０％ＴＣＡを使用してフィルタープレート上に沈降させた後、５％超のＴＣＡ及び５０％超のエタノールで複数回、好ましくは真空マニホールドにおいて、１０％ＴＣＡで３回、７０％エタノールで１回洗浄する。フィルタープレートを十分風乾した後、シンチレーションカクテル、好ましくはＭｉｃｒｏｓｉｎｔ  ２０溶液をウェルに添加し、シンチレーションカウンター、好ましくはＴｏｐＣｏｕｎｔ装置でシンチレーション計数を行う。用量反応曲線を、４−パラメーターカーブフィッティング法を使用して分析する。対照ウェルの阻害の５０％阻害をもたらす試験化合物の濃度をＩＣ５０として報告する。
【００５０】
概して言えば、工程（ｅ３）及び工程（ｅ４）の濾過プロセスは、有利にはクロマトグラフィー又は電気泳動によるいずれの分離も含まず、ハイブリダイゼーションにも基づかない。したがって、濾過プロセスによって、本発明の方法が特にハイスループットに適用可能となる。技術上確立された方法として、電気泳動の分離の後のオートラジオグラフィー及びその関連する定量と比較して、ここで濾過工程及びその後のシンチレーション計数を使用する本発明は、試料分離、シグナルの可視化及び定量に対して、はるかに速く、労力がより少ないプロセスである。
【００５１】
主な実施形態によれば、工程（ｃ）で得られたインフルエンザウイルス溶解物を被験物質と接触させる。したがって、工程（ｃ）と工程（ｄ）との間に介在する工程は存在せず、特に精製又は分離が介在しないことが理解される。上に示されるように、本発明者らは驚いたことに、ＲＮＰ複合体の精製が必ずしも必要でないことを見出した。言いかえれば、上記方法は、ウイルス溶解物中に存在する他のウイルス成分からのＲＮＰ複合体の分離を含まない、及び／又は上記方法は、工程（ｄ）の前に工程（ｃ）の上記インフルエンザウイルス溶解物の精製を含まない。
【００５２】
本発明の方法の更に好ましい実施形態では、上記非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル、ポリオキシプロピレングリコールアルキルエーテル、グルコシドアルキルエーテル、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル、グリセロールアルキルエステル、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、及びソルビタンアルキルエステル、又はこれらの化合物の少なくとも２つの混合物、好ましくはポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテルから選択され、及び／又は上記双性イオン性界面活性剤は、スルタイン（sultaines）、ベタイン、及びスルホベタイン、又はこれらの化合物の少なくとも２つの混合物から選択される。上記非イオン性界面活性剤はスルホベタインから選択されることが好ましい。
【００５３】
好ましい実施形態では、上記還元剤は、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）、システイン、及びび２−メルカプトエチルアミン、又はこれらの化合物の少なくとも２つの混合物から選択される。上記還元剤は、ジチオスレイトールと２−メルカプトエタノールとの混合物であることが好ましい。
【００５４】
混合物を使用する場合、これらは、例えば１つはポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、及び１つはポリオキシエチレングリコールアルキルエーテルといった、異なるクラスの化合物の混合物であってもよく、又は例えば２以上のポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテルといった、同じ化合物のクラスに由来する２以上の化合物の混合物であってもよい。また、１以上の双性イオン性界面活性剤との混合物では、１以上の非イオン性界面活性剤を使用することができる。
【００５５】
上に示されるように、本発明では、典型的には、非変性界面活性剤を使用する。好ましい非イオン性界面活性剤及び双性イオン性界面活性剤を下記表１及び表２にそれぞれ示す。
【００５６】
【表１】
2019503699.tif 000002
【００５７】
【表２】
2019503699.tif 000003
【００５８】
好ましい還元剤を表３に提示する。
【００５９】
【表３】
2019503699.tif 000004
【００６０】
更に好ましい実施形態では、工程（ｂ）において、更に（ｉｉｉ）安定剤、好ましくは凍結防止剤を添加し、該凍結防止剤が好ましくはグリセロール、エチレングリコール、又はそれらの混合物である。
【００６１】
保存用にインフルエンザウイルス溶解物を凍結させることが意図される場合、凍結防止剤が有用である。
【００６２】
更に好ましい実施形態では、工程（ｂ）で得られる界面活性剤の濃度は、約０．０５％〜約５％（重量／体積）、好ましくは約０．１％〜約２％（重量／体積）である。約１％（重量／体積）の界面活性剤の濃度が特に好ましい。更に予想される濃度は、約３％及び約４％（重量／体積）である。
【００６３】
更に好ましい実施形態では、工程（ｂ）で得られる還元剤の濃度は、約０．５ｍＭ〜約１００ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ〜約２５ｍＭである。約２０ｍＭの還元剤の濃度が特に好ましい。
【００６４】
更に好ましい実施形態では、工程（ｂ）で得られる安定剤の濃度は、存在する場合、約０．５％〜約６０％（重量／体積）、好ましくは約１％〜約５０％（重量／体積）、より好ましくは約２％〜約２５％（重量／体積）である。約５％（重量／体積）の安定剤の濃度が特に好ましい。更に予想される濃度は、約１０％、約１５％及び約２０％（重量／体積）である。
【００６５】
更に好ましい実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、及び存在する場合には（ｉｉｉ）は、溶液、好ましくは水溶液に含まれ、その溶液を工程（ｂ）において上記懸濁物に添加する。緩衝水溶液が好ましい。好ましいバッファーはＴｒｉｓである。
【００６６】
代替的には、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の２つのみを単一の溶液に含み、存在する場合、第３の成分が別の溶液に存在していてもよい。さらに、各々（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）をそれぞれ含む３つの別々の溶液を使用することも意図される。
【００６７】
更に好ましい実施形態では、工程（ｃ）における上記インキュベートが約５分間〜約１８０分間、好ましくは約１５分間〜約６０分間、より好ましくは約３０分間である。
【００６８】
更に好ましい実施形態では、工程（ｃ）における上記インキュベートが、約５℃〜約３５℃、好ましくは約１５℃〜約３０℃、より好ましくは約２５℃の温度である。
【００６９】
したがって、約２５℃で約３０分間、インキュベートを行うことが特に好ましい。
【００７０】
上記ＲＮＰ複合体は、ウイルスから得られた天然のＲＮＰ複合体であることが好ましい。また代替的には、ＲＮＰ複合体は、突然変異体又はそのホモログであってもよい。また、かかる突然変異体又はホモログはウイルスから得られてもよく、又は例えば遺伝子操作法によって人工的に作製されてもよい。突然変異体又はホモログが本発明の方法に対して使用される場合、突然変異体又はホモログのＲＮＰ複合体に含まれるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも１つ、好ましくは全てのキャップ結合、エンドヌクレアーゼ及びポリメラーゼの活性を示すと理解される。
【００７１】
更に好ましい実施形態では、インフルエンザウイルスは、インフルエンザＡ型ウイルス、又はインフルエンザＢ型ウイルスである。
【００７２】
インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４であるインフルエンザＡ型ウイルスが特に好ましい。インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４は、Charles River Vaccine Services（米国マサチューセッツ州ウィルミントン）カタログ番号１０１００３７４より入手可能である。インフルエンザＢ＼Ｌｅｅ＼４０）であるインフルエンザＢ型ウイルスが特に好ましい。インフルエンザＢ＼Ｌｅｅ＼４０は、Charles River Vaccine Services（米国マサチューセッツ州ウィルミントン）カタログ番号１０１００３７９より入手可能である。
【００７３】
更に好ましい実施形態では、上記方法はハイスループット法である。
【００７４】
「ハイスループット」の用語は、当該技術分野においてよく知られている。一連のハイスループット法では、少なくとも１００個の試験化合物、好ましくは少なくとも１０００個の試験化合物、及びより好ましくは少なくとも１００００個の被験物質を試験する。１日当たり少なくとも１００００個の被験物質を試験することが好ましい。
【００７５】
ハイスループットアッセイは、一般的には、マイクロタイタープレートのウェルにおいて行われ、各プレートは９６ウェル、３８４ウェル、又は１５３６ウェルを備え得る。周囲温度以外の温度でのインキュベーション、及び試験化合物をアッセイ混合物と接触させることを含むプレートの取扱いは、ピペッティング装置を備える１以上のコンピュータ制御ロボットシステムによって為されることが好ましい。試験化合物の大きなライブラリがスクリーニングされる場合、及び／又はスクリーニングが短時間で為される場合、例えば１０個、２０個、３０個、４０個、５０個又は１００個の試験化合物の混合物を各ウェルに添加してもよい。ウェルが生物活性を示す場合、その活性を生じさせる上記混合物中の１以上の試験化合物を同定するため、試験化合物の上記混合物をデコンヴォルーション（de-convoluted）してもよい。
【００７６】
更に好ましい実施形態では、本発明の方法は、（ｆ）上記活性の５０％を阻害する上記被験物質の濃度（ＩＣ５０）を決定することを更に含む。
【００７７】
有利には、本発明の方法は、上記ＲｄＲｐの少なくとも１つの活性を阻害する試験化合物のＩＣ５０値の決定を可能とする。
【００７８】
本明細書、特に特許請求の範囲において特徴づけられる実施形態について、従属項で言及される各実施形態は、その従属項が従属する各請求項（独立又は従属）の各実施形態と組み合わせられる。例えば、３つの選択肢Ａ、Ｂ及びＣを列挙する独立項１、３つの選択肢Ｄ、Ｅ及びＦを列挙する従属項２、並びに請求項１及び請求項２に従属し、３つの選択肢Ｇ、Ｈ及びＩを列挙する請求項３の場合、明細書は、別段の具体的な言及がない限り、Ａ、Ｄ、Ｇ；Ａ、Ｄ、Ｈ；Ａ、Ｄ、Ｉ；Ａ、Ｅ、Ｇ；Ａ、Ｅ、Ｈ；Ａ、Ｅ、Ｉ；Ａ、Ｆ、Ｇ；Ａ、Ｆ、Ｈ；Ａ、Ｆ、Ｉ；Ｂ、Ｄ、Ｇ；Ｂ、Ｄ、Ｈ；Ｂ、Ｄ、Ｉ；Ｂ、Ｅ、Ｇ；Ｂ、Ｅ、Ｈ；Ｂ、Ｅ、Ｉ；Ｂ、Ｆ、Ｇ；Ｂ、Ｆ、Ｈ；Ｂ、Ｆ、I；Ｃ、Ｄ、Ｇ；Ｃ、Ｄ、Ｈ；Ｃ、Ｄ、Ｉ；Ｃ、Ｅ、Ｇ；Ｃ、Ｅ、Ｈ；Ｃ、Ｅ、Ｉ；Ｃ、Ｆ、Ｇ；Ｃ、Ｆ、Ｈ；Ｃ、Ｆ、Ｉの組み合わせに対応する実施形態を明白に開示することが理解される。
【００７９】
また同様に、独立項及び／又は従属項が選択肢を列挙しない場合には、従属項が複数の先行する請求項を参照する場合、先行する請求項によって包含される発明の要旨の任意の組み合わせが明示的に開示されると考えられると理解される。例えば独立項１、請求項１を参照する従属項２、及び請求項２と請求項１の両方を参照する従属項３の場合、請求項３と請求項２と請求項１との発明の要旨の組み合わせと同様に、請求項３と請求項１との発明の要旨の組み合わせが、明らかに明白に開示されることとなる。さらに、請求項１〜請求項３のいずれか一項を参照する従属項４が存在する場合、請求項４と請求項３と請求項２と請求項１との発明の要旨の組み合わせと同様に、請求項４と請求項１、請求項４と請求項２と請求項１、請求項４と請求項３と請求項１との発明の要旨の組み合わせが、明確かつ一義的に開示されることとなる。
【実施例】
【００８０】
実施例は、本発明を説明するものである。しかしながら、本出願の範囲がそれらに限定されることを意図するものではない。
【００８１】
実施例１
天然インフルエンザｖＲＮＰ複合体を含むウイルス溶解物の作製
インフルエンザ精製ウイルス（インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４、インフルエンザＢ＼Ｌｅｅ＼４０）をＨＥＰＥＳバッファー中の懸濁物としてCharles River Laboratories International Inc.から得た。ウイルス粒子を、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭジチオスレイトール［ＤＴＴ］、５％グリセロール、４０Ｕ／ｍｌ  ＲＮアーゼ阻害剤、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、及び２ｍｇ／ｍｌリゾレシチンを含むバッファー中、室温にて３０分間、等量の２％Ｔｒｉｔｉｏｎ  Ｘ−１００とのインキュベーションによって破壊した。ウイルスの溶解物を等分し、アリコートで−８０℃にて保存した。
【００８２】
実施例２
インフルエンザＡ型又はＢ型のフィルターＲＮＰ転写アッセイ
ウイルス溶解物（Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株Ａ／ＰＲ／８／３４、Charles River、カタログ番号１０１００３７４、インフルエンザＢ＼Ｌｅｅ＼４０、Charles River、カタログ番号１０１００３７９）を、２４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１１８ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．１ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）２、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．３Ｕ  ＲＮアーゼ阻害剤（Riboguard）、７０ｍＭ  ＡＴＰ／ＣＴＰ／ＵＴＰ、１４ｍＭ  ＧＴＰ、及び０．１７５μＣｉ  ３３Ｐ−ＧＴＰを含む反応バッファー中、３０℃で３０分間、被験物質と共に予備インキュベートした。その後、キャップ化ＲＮＡ基質を０．０７μＭで反応混合物に添加した（５’ｍ７Ｇ−ｐｐｐ−ＧＡＡ  ＵＡＣ  ＵＣＡ  ＡＧＣ  ＵＡＵ  ＧＣＡ  ＵＣ−３’、５’−三リン酸化ＲＮＡをFidelity Systemsから購入し、CellScript製のＳｃｒｉｐｔＣａｐ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、キャップ化反応を行った）。キャップ転用及び後のｍＲＮＡ合成反応を、３０℃で９０分間行ってから、ＥＤＴＡの添加によって反応を終了させた。実施例４に記載されるように、合成されたｍＲＮＡ生成物をフィルタープレート（Millipore）上に沈降させ、処理した。
【００８３】
実施例３
インフルエンザＲＮＰベースの複製アッセイ
別段の言及がなければ、濃度は最終濃度を指す。被験物質を、４０％ＤＭＳＯ中に４倍に段階希釈し、２μｌの希釈した被験物質を、０．３５ｎＭ  ｖＲＮＰ酵素、好ましくはインフルエンザＡ型ｖＲＮＰ酵素、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．１ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）２、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５Ｕ  ＲＮアーゼ阻害剤（Epicentre）、７０μＭ  ＡＴＰ／ＣＴＰ／ＵＴＰ、１．４μＭ  ＧＴＰ、及び０．１７５μＣｉ  ３３Ｐ−ＧＴＰを含む反応混合物１７μｌに３０℃で３０分間、添加した。ｐｐｐＡｐＧジヌクレオチドを、最終濃度７５μＭで反応混合物に添加した。反応を３０℃で３時間行った後、最終濃度５６ｍＭまでＥＤＴＡを添加することによって停止した。複製反応に由来する合成されたｃＲＮＡ生成物を、実施例４に記載されるようにフィルタープレート（Millipore）上に沈降させ、処理した。
【００８４】
実施例４
フィルターＲＮＰ転写アッセイと複製アッセイの両方に対する濾過工程
転写反応に由来する合成されたｍＲＮＡ生成物、又は複製反応に由来するｃＲＮＡ生成物を、１０％ＴＣＡを使用して４℃で３５分間、フィルタープレート上に沈降させた後、真空マニホールドにおいて、１０％ＴＣＡで３回、７０％エタノールで１回洗浄した。フィルタープレートを十分に風乾した後、Ｍｉｃｒｏｓｉｎｔ  ２０溶液をウェルに添加し、シンチレーション計数をＴｏｐＣｏｕｎｔ装置で行った。用量反応曲線を、４−パラメーターカーブフィッティング法を使用して分析した。対照ウェルの阻害の５０％阻害をもたらす試験化合物の濃度をＩＣ５０として報告した。
【００８５】
実施例５
ＨＴＳスクリーン及び結果
本発明の、特に先の実施例に開示される方法を使用して、ハイスループットスクリーニング作戦を行った。多数のヒットが見出された。例えば、「ピリミジン及びピリジン誘導体、並びにウイルス性疾患の治療、寛解又は予防におけるそれらの使用（Pyrimidine and pyridine derivatives and their use in the treatment, amelioration or prevention of a viral disease）」と題され、本出願と同日にＳＩＰＯにおいて同じ譲受人によって出願されたＰＣＴ出願を参照されたい。
【００８６】
ヒット例として以下が挙げられる。
（−）−（１Ｒ，２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ，７Ｓ）−７−（（５−フルオロ−２−（５−フルオロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）ピリミジン−４−イル）アミノ）トリシクロ［３．２．２．０２，４］ノナン−６−カルボン酸
【化１】
2019503699.tif 000005
（−）−Ｎ−［（１Ｒ，２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−４−［［５−フルオロ−２−（５−フルオロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）ピリミジン−４−イル］アミノ］−２−ビシクロ［３．１．０］ヘキサニル］ベンズアミド
【化２】
2019503699.tif 000006
【００８７】
これらの化合物は、０．２ｎＭ及び０．１１２μＭのＩＣ５０値をそれぞれ有すると特定された。
【配列表】
2019503699000001.app
【国際調査報告】
2019503699.tif 000007
2019503699.tif 000008
2019503699.tif 000009