(57)【要約】本発明はＣＤ３及びＣＤ３８を結合するヘテロ二量体抗体を指向する。一部の実施形態では、ヘテロ二量体抗体は配列番号９１を含む第１の単量体と、配列番号９２を含む第２の単量体と、配列番号９３を含む軽鎖とを含む。一部の実施形態では、ヘテロ二量体抗体は配列番号８８を含む第１の単量体と、配列番号８９を含む第２の単量体と、配列番号９０を含む軽鎖とを含む。本発明はさらに、上記の配列をコードする第１、第２及び第３の核酸を含む核酸組成物、と同様に核酸組成物を含む発現ベクター、核酸または発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞、及びヘテロ二量体抗体を作製し、使用する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘテロ二量体抗体であって、
（ａ）第１のＦｃドメインと、抗ＣＤ３のｓｃＦｖと、を含む第１の単量体であって、前記抗ＣＤ３のｓｃＦｖが、
（ｉ）配列番号１５で定められたｖｌＣＤＲ１と配列番号１６で定められたｖｌＣＤＲ２と配列番号１７で定められたｖｌＣＤＲ３とを含むｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインと
（ｉｉ）配列番号１１で定められたｖｈＣＤＲ１と配列番号１２で定められたｖｈＣＤＲ２と配列番号１３で定められたｖｈＣＤＲ３とを含むｓｃＦｖ可変重鎖ドメインとを含み、前記ｓｃＦｖがドメインのリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合する第１の単量体と、
（ｂ）第２の単量体であって、
（ｉ）配列番号６５で定められたｖｈＣＤＲ１と配列番号６６で定められたｖｈＣＤＲ２と配列番号６７で定められたｖｈＣＤＲ３とを含む抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインと
（ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメインとを含む第２の単量体と、
（ｃ）可変定常ドメインと、抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインと、を含む軽鎖であって、前記抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインが、配列番号６９で定められたｖｌＣＤＲ１と配列番号７０で定められたｖｌＣＤＲ２と配列番号７１で定められたｖｌＣＤＲ３とを含む軽鎖と
を含む、ヘテロ二量体抗体。
【請求項２】
前記抗ＣＤ３のｓｃＦｖが配列番号１８で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項３】
前記抗ＣＤ３のｓｃＦｖが配列番号１８で定められたアミノ酸配列を含む請求項１に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項４】
前記抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインが配列番号６８で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項５】
前記抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインが配列番号６８で定められたアミノ酸配列を含む請求項４に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項６】
前記抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインが配列番号６４で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項７】
前記抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインが配列番号６４で定められたアミノ酸配列を含む請求項６に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項８】
前記第１の単量体が、配列番号３３５で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項９】
前記第１の単量体が、配列番号３３５で定められたアミノ酸配列を含む請求項８に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項１０】
前記第２の単量体が、配列番号８２で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項１〜９のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項１１】
前記第２の単量体が、配列番号８２で定められたアミノ酸配列を含む請求項１０に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項１２】
前記軽鎖が配列番号８４で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項１３】
前記軽鎖が配列番号８４で定められたアミノ酸配列を含む請求項１２に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項１４】
ＸｍＡｂ１３５５１より小さく、且つＸｍＡｂ１４７０２より大きい、ＣＤ３εに対する結合親和性を示す請求項１〜１３のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項１５】
ヘテロ二量体抗体であって、
（ａ）第１のＦｃドメインと、抗ＣＤ３のｓｃＦｖと、を含む第１の単量体であって、前記抗ＣＤ３のｓｃＦｖが、
（ｉ）配列番号１５で定められたｖｌＣＤＲ１と配列番号１６で定められたｖｌＣＤＲ２と配列番号１７で定められたｖｌＣＤＲ３とを含むｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインと
（ｉｉ）配列番号１１で定められたｖｈＣＤＲ１と配列番号１２で定められたｖｈＣＤＲ２と配列番号１３で定められたｖｈＣＤＲ３とを含むＳｃＦｖ可変重鎖ドメインとを含み、前記ｓｃＦｖがドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合する第１の単量体と、
（ｂ）第２の単量体であって、
（ｉ）配列番号７３で定められたｖｈＣＤＲ１と配列番号７４で定められたｖｈＣＤＲ２と配列番号７５で定められたｖｈＣＤＲ３と含む抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインと、
（ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメインとを含む第２の単量体と、
（ｃ）可変定常ドメインと、抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインとを含む軽鎖であって、前記抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインが、配列番号７８で定められたｖｌＣＤＲ１と配列番号７９で定められたｖｌＣＤＲ２と配列番号８０で定められたｖｌＣＤＲ３とを含む軽鎖と
を含む、ヘテロ二量体抗体。
【請求項１６】
前記抗ＣＤ３のｓｃＦｖが配列番号１８で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項１５に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項１７】
前記抗ＣＤ３のｓｃＦｖが配列番号１８で定められたアミノ酸配列を含む請求項１５に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項１８】
前記抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインが配列番号３５５で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項１９】
前記抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインが配列番号３５５で定められたアミノ酸配列を含む請求項１８に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項２０】
前記抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインが配列番号７３で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項２１】
前記抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインが配列番号７３で定められたアミノ酸配列を含む請求項２０に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項２２】
前記第１の単量体が、配列番号１０７で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項１５〜２１のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項２３】
前記第１の単量体が、配列番号１０７で定められたアミノ酸配列を含む請求項２２に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項２４】
前記第２の単量体が、配列番号１０６で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項１５〜２３のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項２５】
前記第２の単量体が、配列番号１０６で定められたアミノ酸配列を含む請求項２４に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項２６】
前記軽鎖が配列番号１０８で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項１５〜２５のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項２７】
前記軽鎖が配列番号１０８で定められたアミノ酸配列を含む請求項２６に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項２８】
ヘテロ二量体抗体であって、
（ａ）第１のＦｃドメインと、抗ＣＤ３のｓｃＦｖと、を含む第１の単量体であって、前記抗ＣＤ３のｓｃＦｖが、
（ｉ）配列番号４２で定められたｖｌＣＤＲ１と配列番号４３で定められたｖｌＣＤＲ２と配列番号４４で定められたｖｌＣＤＲ３とを含むｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインと
（ｉｉ）配列番号３８で定められたｖｈＣＤＲ１と配列番号３９で定められたｖｈＣＤＲ２と配列番号４０で定められたｖｈＣＤＲ３とを含むｓｃＦｖ可変重鎖ドメインとを含み、前記ｓｃＦｖがドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合する第１の単量体と、
（ｂ）第２の単量体であって、
（ｉ）配列番号６５で定められたｖｈＣＤＲ１と配列番号６６で定められたｖｈＣＤＲ２と配列番号６７で定められたｖｈＣＤＲ３とを含む抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインと
（ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメインとを含む第２の単量体と、
（ｃ）可変定常ドメインと、抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインと、を含む軽鎖であって、前記抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインが、配列番号６９で定められたｖｌＣＤＲ１と配列番号７０で定められたｖｌＣＤＲ２と配列番号７１で定められたｖｌＣＤＲ３とを含む軽鎖と
を含む、ヘテロ二量体抗体。
【請求項２９】
前記抗ＣＤ３のｓｃＦｖが配列番号４５で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項２８に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項３０】
前記抗ＣＤ３ｓｃＦｖが配列番号４５で定められたアミノ酸配列を含む請求項２８に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項３１】
前記抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインが配列番号６８で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項３２】
前記抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインが配列番号６８で定められたアミノ酸配列を含む請求項３１に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項３３】
前記抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインが配列番号６４で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項２８〜３２のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項３４】
前記抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインが配列番号６４で定められたアミノ酸配列を含む請求項３３に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項３５】
前記第１の単量体が、配列番号１１０で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項２８〜３４のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項３６】
前記第１の単量体が、配列番号１１０で定められたアミノ酸配列を含む請求項３５に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項３７】
前記第２の単量体が、配列番号１０９で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項２８〜３６のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項３８】
前記第２の単量体が、配列番号１０９で定められたアミノ酸配列を含む請求項３７に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項３９】
前記軽鎖が配列番号１１１で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項２８〜３８のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項４０】
前記軽鎖が配列番号１１１で定められたアミノ酸配列を含む請求項３９に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項４１】
前記第１のＦｃドメイン及び前記第２のＦｃドメインがホモ二量体化を減らす１以上の突然変異を含む請求項１〜７、１５〜２１及び２８〜３４のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項４２】
前記第１のＦｃドメイン及び前記第２のＦｃドメインが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑから成る群から選択される変異体のセットを含む請求項１〜７、１５〜２１及び２８〜３４のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項４３】
前記ｓｃＦｖドメインリンカーが荷電リンカーである請求項１〜７、１５〜２１、２８〜３４及び４２のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項４４】
前記重鎖定常ドメインが、アミノ酸置換Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含む請求項１〜７、１５〜２１、２８〜３４、４２及び４３のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項４５】
前記第１及び第２のＦｃドメインが、アミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む請求項１〜７、１５〜２１、２８〜３４、及び４２〜４４のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項４６】
請求項１〜４５のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体をコードする核酸組成物であって、前記組成物が
（ａ）前記第１の単量体をコードする第１の核酸と、
（ｂ）前記第２の単量体をコードする第２の核酸と、
（ｃ）前記軽鎖をコードする第３の核酸とを含む、核酸組成物。
【請求項４７】
請求項１〜４５のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体をコードする発現ベクター組成物であって、
（ａ）前記第１の単量体をコードする核酸を含む第１の発現ベクターと、
（ｂ）前記第２の単量体をコードする核酸を含む第２の発現ベクターと、
（ｃ）前記軽鎖をコードする核酸を含む第３の発現ベクターとを含む、発現ベクター組成物。
【請求項４８】
請求項４８に記載の核酸組成物を含む宿主細胞。
【請求項４９】
請求項４７に記載の発現ベクター組成物を含む宿主細胞。
【請求項５０】
請求項１〜４５のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体を作製する方法であって、前記抗体が発現される条件下で請求項４８または４９に記載の宿主細胞を培養することと、前記抗体を回収することとを含む、方法。
【請求項５１】
医薬組成物であって、請求項１〜４５のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体と、薬学上許容できるキャリア、賦形剤または安定剤とを含む、医薬組成物。
【請求項５２】
造血系悪性腫瘍を治療する方法であって、それを必要とする対象に請求項１〜４５のいずれか１項に記載のヘテロ二量体抗体を投与することを含む、方法。
【請求項５３】
前記造血系悪性腫瘍が、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、Ｂ及びＴの急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ），急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）から成る群から選択される請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記方法がさらに１以上の追加の治療剤を投与することを含む請求項５２または５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照及び参照による組み入れ
本出願は、その中での図面、説明文、及びクレームに対する特定の参照とともにその全体が参照によって本明細書に明白に組み入れられる２０１５年１１月２５日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６２７８６及び２０１５年１１月２５日に出願された米国特許出願番号１４／９５２，７８６に対する優先権を主張する。
【０００２】
全体が参照によって組み入れられるのは、添えて同時に提出され、以下：２０１６年１１月２３日に作られた７０７，４９４バイトの「５０６３６＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿．ｔｘｔ」と名付けられたＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルとして特定されるコンピュータ可読のヌクレオチド／アミノ酸の配列表である。
【背景技術】
【０００３】
抗体に基づいた治療法は、癌及び自己免疫性／炎症性の疾患を含む種々の疾患を治療するのに成功裡に使用されている。それにもかかわらず、特にその臨床的有効性を高めることに関してこのクラスの薬剤に対する改善がさらに必要とされている。検討されている手段の１つは、単一の免疫グロブリン分子が２つの異なる抗原を同時に結合するように抗体をベースにした薬剤の中で追加の及び新規の抗原結合部位を操作することである。２つの異なる抗原を結合するそのようなネイティブではないまたは代替の抗体形式は二重特異性と呼ばれることが多い。抗体可変領域（Ｆｖ）の相当な多様性によって実際どんな分子でも認識するＦｖを生じるのが可能であるので、二重特異性の生成に対する典型的なアプローチは新しい可変領域の抗体への導入である。
【０００４】
多数の代替抗体形式が二重特異性のターゲティングについて検討されている（そのすべてが参照によって本明細書に明白に組み入れられるＣｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ，２００９，ｍＡｂｓ，１［６］：１−９；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ＆  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３［９］：１１２６−１１３６；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ｍＡｂｓ，４（２）：１８２，（２０１２））。当初、二重特異性抗体は、それぞれ単一のモノクローナル抗体を産生する２つの細胞株を融合することによって作られた（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５４０）。得られたハイブリッドのハイブリドーマまたはクアドローマは二重特異性抗体を産生したけれども、それらは微量の集団にすぎず、所望の抗体を単離するには多大な精製を必要とした。これに対する工学的な解決は二重特異性を作るための抗体断片の使用だった。そのような断片は完全長抗体の複雑な四次構造を欠いているので、単一の遺伝子構築物にて可変軽鎖と可変重鎖を連結することができる。二機能性抗体、単鎖二機能性抗体、直列ｓｃＦｖ及びＦａｂ２二重特異性を含む、多数の様々な形態の抗体断片が生成されている（参照によって本明細書に明白に組み入れられるＣｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ，２００９，ｍＡｂｓ，１［６］：１−９；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ＆  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３［９］：１１２６−１１３６）。これらの形式は細菌にて高レベルで発現させることができ、その小さなサイズのために好都合な浸透利益を有してもよい一方で、それらは生体内では迅速に消えてなくなり、その製造及び安定性に関する製造障害を提示し得る。これらの欠点の主原因は、抗体断片が通常、大きなサイズ、高い安定性、及び血清における長い半減期を維持し（すなわち、新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎ）または精製のための結合部位として役立つ（すなわち、プロテインＡ及びプロテインＧ）種々のＦｃ受容体及びリガンドへの結合を含む、関連する機能的特性を持つ抗体の定常領域を欠いていることである。
【０００５】
さらに最近の研究では、完全長の抗体様の形式にて二元的な結合を操作することによって断片をベースにした二重特異性の欠点に対処するように試みられている（参照によって明白に本明細書に組み入れられるＷｕ，ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５［１１］：１２９０−１２９７；ＵＳＳＮ１２／４７７，７１１；Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００９，ｍＡｂｓ，１［２］：１２８−１４１；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７４６９３；Ｚｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１３［５］：３６１−３６７；ＵＳＳＮ０９／８６５，１９８；Ｓｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１［１６］：１０７０６−１０７１４；Ｌｕ，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０［２０］：１９６６５−１９６７２；ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２５４７２）。これらの形式は、原則的にＦｃ領域を含有するので抗体断片二重特異性の障害の一部を克服する。これらの形式の重大な欠点の１つは、ホモ二量体の定常鎖の上に新しい抗原結合部位を作るので、新しい抗原への結合は常に二価であることである。
【０００６】
治療用の二重特異性形式における共標的として魅力的である多数の抗体については、所望の結合は二価ではなく一価である。多数の免疫受容体については、細胞性の活性化は一価の結合相互作用の架橋によって達成される。架橋のメカニズムには通常、抗体／抗原免疫複合体または標的細胞に対するエフェクター細胞の結合が介在する。たとえば、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａのような低親和性のＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）は抗体のＦｃ領域に一価で結合する。一価の結合はこれらのＦｃγＲを発現している細胞を活性化することはないが、免疫複合体形成または細胞と細胞の接触の際、受容体が架橋され、細胞表面上でクラスター形成し、活性化をもたらす。細胞の殺傷に介在することに関与する受容体については、たとえば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞におけるＦｃγＲＩＩＩａについては、エフェクター細胞が高度に渇望する形式で標的細胞を結合する場合、受容体の架橋及び細胞の活性化が発生する（参照によって明白に組み入れられるＢｏｗｌｅｓ  ＆  Ｗｅｉｎｅｒ，２００５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３０４：８８−９９）。同様に、Ｂ細胞上では、阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂは、それが細胞表面のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）との免疫複合体に関与する場合にのみＢ細胞の活性化を下方調節し、そのメカニズムには、ＢＣＲによって認識される同じ抗原との可溶性ＩｇＧの免疫複合体形成が介在する（参照によって明白に組み入れられるＨｅｙｍａｎ，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．８８［２］：１５７−１６１；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｃｌａｔｗｏｒｔｈｙ，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０：３２８−３４３）。別の例として、Ｔ細胞のＣＤ３の活性化は、その関連するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が高度に渇望した細胞間シナプスにて抗原提示細胞上の抗原負荷ＭＨＣを結合する場合にのみ発生する（Ｋｕｈｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２４：１３３−１３９）。実際、抗ＣＤ３抗体を用いたＣＤ３の非特異的な二価の架橋は高サイトカイン血症及び毒性を引き出す（参照によって明白に組み入れられるＰｅｒｒｕｃｈｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３［２］：９５３−６１；Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ  ＆  Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７：６２２-６３２）。従って、実践的な臨床での使用については、標的細胞の再指向殺傷のためのＣＤ３同時結合の好ましい方式は同時結合する標的との結合の際にのみ活性化を生じる一価の結合である。
【０００７】
環状ＡＤＰリボース加水分解酵素としても知られるＣＤ３８は長いＣ末端の細胞外ドメインと短いＮ末端の細胞質ドメインを持つＩＩ型膜貫通型糖タンパク質である。造血系細胞の中で、リンパ球の増殖、サイトカインの放出、Ｂ細胞及び骨髄系細胞の発生及び生存の調節、及び樹状細胞の成熟の誘導を含む各種の機能的効果がＣＤ３８が介在するシグナル伝達によるものとされている。ＣＤ３８は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、Ｂ及びＴの急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ），急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む多数の造血系悪性腫瘍、及び種々の造血系悪性腫瘍に由来する細胞株にて上方調節される。一方、造血系の最も原始的な多能性幹細胞はＣＤ３８−である。抗癌剤の発見及び開発の最近の進歩にもかかわらず、ＣＤ３８を発現する腫瘍を含む癌の多数の形態は依然として予後不良である。従って、癌のそのような形態を治療するための改善された方法に対するニーズがある。
従って、抗体断片から生成される二重特異性が生物物理学的な及び薬物動態のハードルに苦しむ一方で、完全長の抗体様形式で作られたものの欠点は、主要な標的抗原の非存在下でそれらが共標的の抗原を多価で結合し、非特異的な活性化をもたらし、且つ潜在的に毒性をもたらすことである。本発明は、ＣＤ３とＣＤ３８とに向けられた新規の二重特異性抗体を導入することによってこの課題を解決する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ＆  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３［９］：１１２６−１１３６
【非特許文献２】Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ｍＡｂｓ，４（２）：１８２，（２０１２）
【非特許文献３】Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５４０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明はＣＤ３とＣＤ３８とに対して向けられたヘテロ二量体抗体を提供する。一部の実施形態では、ヘテロ二量体抗体は配列番号９１を含む第１の単量体と、配列番号９２を含む第２の単量体と、配列番号９３を含む軽鎖とを含む。一部の実施形態では、ヘテロ二量体抗体は配列番号８８を含む第１の単量体と、配列番号８９を含む第２の単量体と、配列番号９０を含む軽鎖とを含む。本発明はさらに、上記の配列をコードする第１、第２及び第３の核酸を含む核酸組成物、と同様に核酸組成物を含む発現ベクター、核酸または発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞、及びヘテロ二量体抗体を作製し、使用する方法を提供する。
【００１０】
追加の態様では、本発明は、（ｉ）第１のＦｃドメインと、（ｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインとｓｃＦｖリンカーとｓｃＦｖ可変重鎖ドメインとを含む抗ＣＤ３ｓｃＦｖとを含み、前記ｓｃＦｖがドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合する第１の単量体と、（ｉ）重鎖可変ドメインと、（ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメインとを含む重鎖を含む第２の単量体と、可変軽鎖ドメインと可変軽鎖定常ドメインとを含む軽鎖とを含むヘテロ二量体抗体を提供する。一部の態様では、ｓｃＦｖの可変軽鎖ドメインは配列番号１５を有するｖｌＣＤＲ１と配列番号１６を有するｖｌＣＤＲ２と配列番号１７を有するｖｌＣＤＲ３とを含み、前記ＳｃＦｖの可変重鎖ドメインは配列番号１１を有するｖｈＣＤＲ１と配列番号１２を有するｖｈＣＤＲ２と配列番号１３を有するｖｈＣＤＲ３とを含み、前記重鎖可変ドメイン及び前記可変軽鎖ドメインはＣＤ３８を結合する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）第１のＦｃドメインと、（ｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインとｓｃＦｖリンカーとｓｃＦｖ可変重鎖ドメインとを含む抗ＣＤ３ｓｃＦｖとを含み、前記ｓｃＦｖがドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合する第１の単量体と、（ｂ）（ｉ）重鎖可変ドメインと、（ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメインとを含む重鎖を含む第２の単量体と、（ｃ）可変軽鎖ドメインと可変軽鎖定常ドメインとを含む軽鎖とを含むヘテロ二量体抗体を提供する。この態様では、ｓｃＦｖの可変軽鎖ドメインは、配列番号２４を有するｖｌＣＤＲ１と配列番号２５を有するｖｌＣＤＲ２と配列番号２６を有するｖｌＣＤＲ３とを含み、前記ＳｃＦｖの可変重鎖ドメインは、配列番号１１を有するｖｈＣＤＲ１と配列番号１２を有するｖｈＣＤＲ２と配列番号１３を有するｖｈＣＤＲ３とを含み、前記重鎖可変ドメイン及び前記可変軽鎖ドメインはＣＤ３８を結合する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）第１のＦｃドメインと、（ｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインとｓｃＦｖリンカーとｓｃＦｖ可変重鎖ドメインとを含む抗ＣＤ３ｓｃＦｖとを含み、前記ｓｃＦｖがドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合する第１の単量体と、（ｂ）（ｉ）重鎖可変ドメインと、（ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメインとを含む重鎖を含む第２の単量体と、（ｃ）可変軽鎖ドメインと可変軽鎖定常ドメインとを含む軽鎖とを含むヘテロ二量体抗体を提供する。この態様では、ｓｃＦｖの可変軽鎖ドメインは、配列番号３３を有するｖｌＣＤＲ１と配列番号３４を有するｖｌＣＤＲ２と配列番号３５を有するｖｌＣＤＲ３とを含み、前記ＳｃＦｖの可変重鎖ドメインは、配列番号２９を有するｖｈＣＤＲ１と配列番号３０を有するｖｈＣＤＲ２と配列番号３１を有するｖｈＣＤＲ３とを含み、前記重鎖可変ドメイン及び前記可変軽鎖ドメインはＣＤ３８を結合する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）第１のＦｃドメインと、（ｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインとｓｃＦｖリンカーとｓｃＦｖ可変重鎖ドメインとを含む抗ＣＤ３ｓｃＦｖとを含み、前記ｓｃＦｖがドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合する第１の単量体と、（ｂ）（ｉ）重鎖可変ドメインと、（ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメインとを含む重鎖を含む第２の単量体と、（ｃ）可変軽鎖ドメインと可変軽鎖定常ドメインとを含む軽鎖とを含むヘテロ二量体抗体を提供する。この態様では、ｓｃＦｖの可変軽鎖ドメインは、配列番号４２を有するｖｌＣＤＲ１と配列番号４３を有するｖｌＣＤＲ２と配列番号４４を有するｖｌＣＤＲ３とを含み、前記ＳｃＦｖの可変重鎖ドメインは、配列番号３８を有するｖｈＣＤＲ１と配列番号３９を有するｖｈＣＤＲ２と配列番号４０を有するｖｈＣＤＲ３とを含み、前記重鎖可変ドメイン及び前記可変軽鎖ドメインはＣＤ３８を結合する。
【００１４】
追加の態様では、本発明の「栓抜き型」ヘテロ二量体抗体は、ＣＤ３、ｖｈ及びｖｌのドメインを結合するｓｃＦｖを有し、その際、可変軽鎖ドメインは、配列ＲＡＳＱＮＶＤＴＷＶＡ（配列番号６９）を有するｖｌＣＤＲ１と配列ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号７０）を有するｖｌＣＤＲ２と配列ＱＱＹＤＳＹＰＬＴ（配列番号７１）を有するｖｌＣＤＲ３とを含み、前記可変重鎖ドメインは、配列ＲＳＷＭＮ（配列番号６５）を有するｖｈＣＤＲ１と配列ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＴＳＶＫＧ（配列番号６６）を有するｖｈＣＤＲ２と配列ＹＧＮＷＦＰＹ（配列番号６７）を有するｖｈＣＤＲ３とを含む。
【００１５】
追加の実施形態では、可変軽鎖ドメインは、配列ＲＡＳＱＮＶＤＴＮＶＡ（配列番号７８）を有するｖｌＣＤＲ１と配列ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号７９）を有するｖｌＣＤＲ２と配列ＱＱＹＤＳＹＰＬＴ（配列番号８０）を有するｖｌＣＤＲ３とを含み、前記可変重鎖ドメインは、配列ＲＳＷＭＮ（配列番号７４）を有するｖｈＣＤＲ１と配列ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＴＳＶＫＧ（配列番号７５）を有するｖｈＣＤＲ２と配列ＹＧＮＷＦＰＹ（配列番号７６）を有するｖｈＣＤＲ３とを含む。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）（１）第１の可変重鎖ドメインと（２）第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖ドメインと（３）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインとｓｃＦｖリンカーとｓｃＦｖ可変重鎖ドメインとを含むｓｃＦｖを含み、前記ｓｃＦｖがドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＣ末端に共有結合する第１の重鎖を含む第１の単量体と、（ｂ）第２の可変重鎖ドメインと、第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖とを含む第２の重鎖を含む第２の単量体と、（ｃ）可変軽鎖ドメインと定常軽鎖ドメインとを含む共通の軽鎖とを含むヘテロ二量体抗体を提供し、その際、前記第１及び前記第２のＦｃドメインは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑから成る群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記可変軽鎖ドメインはヒトＣＤ３８（配列番号１３１）を結合し、前記第２の可変重鎖ドメイン及び前記可変軽鎖ドメインはヒトＣＤ３８（配列番号１３１）を結合し、前記ｓｃＦｖはヒトＣＤ３（配列番号１２９）を結合する。
【００１７】
本発明はさらに、（ａ）第１のＦｃドメインと、（ｉ）配列番号１５で定められたｖｌＣＤＲ１と配列番号１６で定められたｖｌＣＤＲ２と配列番号１７で定められたｖｌＣＤＲ３とを含むｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインと、（ｉｉ）配列番号１１で定められたｖｈＣＤＲ１と配列番号１２で定められたｖｈＣＤＲ２と配列番号１３で定められたｖｈＣＤＲ３とを含むｓｃＦｖ可変重鎖ドメインとを含み、前記ｓｃＦｖがドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合する抗ＣＤ３のｓｃＦｖとを含む第１の単量体と、（ｂ）（ｉ）配列番号６５で定められたｖｈＣＤＲ１と配列番号６６で定められたｖｈＣＤＲ２と配列番号６７で定められたｖｈＣＤＲ３とを含む抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインと（ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメインとを含む第２の単量体と、（ｃ）配列番号６９で定められたｖｌＣＤＲ１と配列番号７０で定められたｖｌＣＤＲ２と配列番号７１で定められたｖｌＣＤＲ３とを含む抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインと可変定常ドメインとを含む軽鎖とを含むヘテロ二量体抗体を提供する。任意で、抗ＣＤ３のｓｃＦｖは、配列番号１８で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である（たとえば、１００％同一である）アミノ酸配列を含み；抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインは、配列番号６８で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である（たとえば、１００％同一である）アミノ酸配列を含み；抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインは、配列番号６４で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である（たとえば、１００％同一である）アミノ酸配列を含み；第１の単量体は、配列番号３３５で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である（たとえば、１００％同一である）アミノ酸配列を含み；第２の単量体は、配列番号８２で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である（たとえば、１００％同一である）アミノ酸配列を含み；及び／または軽鎖は配列番号８４で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である（たとえば、１００％同一である）アミノ酸配列を含む。
【００１８】
提供されるのはまた、（ａ）第１のＦｃドメインと、（ｉ）配列番号４２で定められたｖｌＣＤＲ１と配列番号４３で定められたｖｌＣＤＲ２と配列番号４４で定められたｖｌＣＤＲ３とを含むｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインと（ｉｉ）配列番号３８で定められたｖｈＣＤＲ１と配列番号３９で定められたｖｈＣＤＲ２と配列番号４０で定められたｖｈＣＤＲ３とを含むＳｃＦｖの可変重鎖ドメインとを含む抗ＣＤ３のｓｃＦｖとを含み、前記ｓｃＦｖがドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合する第１の単量体と、（ｂ）（ｉ）配列番号６５で定められたｖｈＣＤＲ１と配列番号６６で定められたｖｈＣＤＲ２と配列番号６７で定められたｖｈＣＤＲ３とを含む抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインと（ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメインとを含む第２の単量体と、（ｃ）配列番号６９で定められたｖｌＣＤＲ１と配列番号７０で定められたｖｌＣＤＲ２と配列番号７１で定められたｖｌＣＤＲ３とを含む抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインと可変定常ドメインとを含む軽鎖とを含むヘテロ二量体抗体である。任意で、抗ＣＤ３のｓｃＦｖは、配列番号１８で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である（たとえば、１００％同一である）アミノ酸配列を含み；抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインは、配列番号３５５で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である（たとえば、１００％同一である）アミノ酸配列を含み；抗ＣＤ３８重鎖定常ドメインは、配列番号７３で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である（たとえば、１００％同一である）アミノ酸配列を含み；第１の単量体は、配列番号１０７で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である（たとえば、１００％同一である）アミノ酸配列を含み；第２の単量体は、配列番号１０６で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である（たとえば、１００％同一である）アミノ酸配列を含み；及び／または軽鎖は、配列番号１０８で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である（たとえば、１００％同一である）アミノ酸配列を含む。
【００１９】
本発明はまた、（ａ）第１のＦｃドメインと、（ｉ）配列番号１５で定められたｖｌＣＤＲ１と配列番号１６で定められたｖｌＣＤＲ２と配列番号１７で定められたｖｌＣＤＲ３とを含むｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインと（ｉｉ）配列番号１１で定められたｖｈＣＤＲ１と配列番号１２で定められたｖｈＣＤＲ２と配列番号１３で定められたｖｈＣＤＲ３とを含むＳｃＦｖの可変重鎖ドメインとを含む抗ＣＤ３のｓｃＦｖとを含み、前記ｓｃＦｖがドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合する第１の単量体と、（ｂ）（ｉ）配列番号７３で定められたｖｈＣＤＲ１と配列番号７４で定められたｖｈＣＤＲ２と配列番号７５で定められたｖｈＣＤＲ３とを含む抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインと（ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメインとを含む第２の単量体と、（ｃ）配列番号７８で定められたｖｌＣＤＲ１と配列番号７９で定められたｖｌＣＤＲ２と配列番号８０で定められたｖｌＣＤＲ３とを含む抗ＣＤ３８可変軽鎖ドメインと可変定常ドメインとを含む軽鎖とを含むヘテロ二量体抗体も提供する。任意で、抗ＣＤ３のｓｃＦｖは、配列番号４５で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である（たとえば、１００％同一である）アミノ酸配列を含み；抗ＣＤ３８の可変軽鎖ドメインは、配列番号６８で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である（たとえば、１００％同一である）アミノ酸配列を含み；抗ＣＤ３８重鎖可変ドメインは、配列番号６４で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である（たとえば、１００％同一である）アミノ酸配列を含み；第１の単量体は、配列番号１１０で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である（たとえば、１００％同一である）アミノ酸配列を含み；第２の単量体は、配列番号１０９で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である（たとえば、１００％同一である）アミノ酸配列を含み；及び／または軽鎖は、配列番号１１１で定められたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である（たとえば、１００％同一である）アミノ酸配列を含む。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）（１）第１の可変重鎖ドメインと（２）第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖ドメインと（３）第１の可変軽鎖ドメインとを含む第１の重鎖を含み、前記第１の可変軽鎖ドメインがドメインリンカーを用いて前記第１のＦｃドメインのＣ末端に共有結合する第１の単量体と、（ｂ）（ｉ）第２の可変重鎖ドメインと（ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖ドメインと（ｉｉｉ）第３の可変重鎖ドメインとを含み、前記第２の可変重鎖ドメインがドメインリンカーを用いて前記第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合する第２の単量体と、（ｃ）可変軽鎖ドメインと定常軽鎖ドメインとを含む共通の軽鎖とを含むヘテロ二量体抗体を提供し、その際、前記第１及び前記第２のＦｃドメインは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑから成る群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記第１の可変軽鎖ドメインはヒトＣＤ３８（配列番号１３１）を結合し、前記第２の可変重鎖ドメイン及び前記可変軽鎖ドメインは前記ヒトＣＤ３８（配列番号１３１）を結合し、前記第２の可変軽鎖ドメイン及び前記第３の可変重鎖ドメインはヒトＣＤ３（配列番号１２９）を結合する。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）（１）第１の可変重鎖ドメインと（２）第１のＣＨ１ドメイン及び第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖と（３）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカー及びｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むｓｃＦｖとを含む第１の重鎖を含み、前記ｓｃＦｖがドメインリンカーを用いて前記ＣＨ１のＣ末端と前記第１のＦｃドメインのＮ末端との間で共有結合する第１の単量体と、（ｂ）第２の可変重鎖ドメインと第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖とを含む第２の重鎖を含む第２の単量体と、（ｃ）可変軽鎖ドメインと定常軽鎖ドメインとを含む共通の軽鎖とを含むヘテロ二量体抗体を提供し、その際、前記第１及び前記第２のＦｃドメインはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑから成る群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記可変軽鎖ドメインはヒトＣＤ３８（配列番号１３１）を結合し、前記第２の可変重鎖ドメイン及び前記可変軽鎖ドメインは前記ヒトＣＤ３８（配列番号１３１）を結合し、前記ｓｃＦｖはヒトＣＤ３（配列番号１２９）を結合する。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）（１）第１の可変重鎖ドメインと（２）第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖ドメインと（３）第１の可変軽鎖ドメインとを含む第１の重鎖を含み、前記第２の可変軽鎖ドメインがドメインリンカーを用いて前記第１の定常重鎖ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と前記第１のＦｃドメインのＮ末端との間で共有結合する第１の単量体と、（ｂ）（ｉ）第２の可変重鎖ドメインと（ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖ドメインと（ｉｉｉ）第３の可変重鎖ドメインとを含み、前記第２の可変重鎖ドメインがドメインリンカーを用いて前記第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合する第２の単量体と、（ｃ）可変軽鎖ドメインと定常軽鎖ドメインとを含む共通の軽鎖とを含むヘテロ二量体抗体を提供し、その際、前記第１及び前記第２のＦｃドメインはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑから成る群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記可変軽鎖ドメインはヒトＣＤ３８（配列番号１３１）を結合し、前記第２の可変重鎖ドメイン及び前記可変軽鎖ドメインは前記ヒトＣＤ３８（配列番号１３１）を結合し、前記第２の可変軽鎖ドメイン及び前記第３の可変重鎖ドメインはヒトＣＤ３（配列番号１２９）を結合する。
【００２３】
追加の態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）（１）第１の可変重鎖ドメインと（２）第１のＣＨ１ドメイン及び第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖と（３）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカー及びｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むｓｃＦｖとを含む第１の重鎖を含み、前記ｓｃＦｖがドメインリンカーを用いて前記ＣＨ１ドメインのＣ末端と前記第１のＦｃドメインのＮ末端との間で共有結合する第１の単量体と、（ｂ）第２のＦｃドメインを含む第２の単量体と、（ｃ）可変軽鎖ドメインと定常軽鎖ドメインとを含む軽鎖とを含むヘテロ二量体抗体を提供し、その際、前記第１及び前記第２のＦｃドメインはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑから成る群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、前記第１の可変重鎖ドメイン及び前記可変軽鎖ドメインはヒトＣＤ３８（配列番号１３１）を結合し、前記ｓｃＦｖはヒトＣＤ３（配列番号１２９）を結合する。
【００２４】
追加の態様では、一部の実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑから成る群から選択される変異体のセットを含む第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインを含む。
【００２５】
さらなる態様では、ｓｃＦｖは荷電リンカーであるｓｃＦｖリンカーを含む。
【００２６】
追加の態様では、本明細書で要点が述べられるヘテロ二量体抗体の重鎖定常ドメインはアミノ酸置換Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含む。
【００２７】
さらなる態様では、本発明のヘテロ二量体抗体は、アミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む第１及び第２のＦｃドメインを有する。
【００２８】
追加の態様では、本発明は、（ａ）前記第１の単量体をコードする第１の核酸と（ｂ）前記第２の単量体をコードする第２の核酸と（ｃ）前記軽鎖をコードする第３の核酸とを含む本発明のヘテロ二量体抗体をコードする核酸組成物を提供する。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）前記第１の単量体をコードする核酸を含む第１の発現ベクターと、（ｂ）前記第２の単量体をコードする核酸を含む第２の発現ベクターと、（ｃ）前記軽鎖をコードする核酸を含む第３の発現ベクターとを含む発現ベクター組成物を提供する。本発明はさらに、核酸組成物または発現ベクター組成物のいずれかを含む宿主細胞を提供する。
【００３０】
本発明はさらに、ヘテロ二量体抗体が発現される条件下で宿主細胞を培養することと、前記抗体を回収することとを含む、前記抗体を作製する方法を提供する。
【００３１】
本発明はさらに、それを必要とする患者に本発明のヘテロ二量体抗体を投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】図１Ａ及び図１Ｂは、本発明の幾つかの形式を示す図である。「栓抜き型」形式の２つの形態が示され、一方はｓｃＦｖを含む抗ＣＤ３抗原結合ドメインとＦａｂを含む抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを伴い、もう一方はこれらを逆向きにしている。ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央ｓｃＦｖ及び中央Ｆｖの形式をすべて示す。加えて、１つの単量体が単にＦｃを含む「１アーム」の形式、１アームの中央ｓｃＦｖ及び１アームの中央Ｆｖの双方を示す。二重ｓｃＦｖの形式も示す。
【図１Ｂ】同上。
【図２】可変重鎖及び軽鎖のドメイン（下線のＣＤＲ）を含む「高ＣＤ３」の抗ＣＤ３＿Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７構築物、と同様に個々のｖｌＣＤＲ及びｖｈＣＤＲ、と同様に荷電リンカー（二重下線）を伴ったｓｃＦｖ構築物の配列を示す。図面で示される配列すべてに当てはまることであるが、この荷電リンカーは、必要に応じて非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーに置き換えられてもよい。
【図３】可変重鎖及び軽鎖のドメイン（下線のＣＤＲ）を含む「高〜中間＃１」の抗ＣＤ３＿Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７構築物、と同様に個々のｖｌＣＤＲ及びｖｈＣＤＲ、と同様に荷電リンカー（二重下線）を伴ったｓｃＦｖ構築物の配列を示す。図面で示される配列すべてに当てはまることであるが、この荷電リンカーは、必要に応じて非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーに置き換えられてもよい。
【図４】可変重鎖及び軽鎖のドメイン（下線のＣＤＲ）を含む「高〜中間＃２」の抗ＣＤ３＿Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７構築物、と同様に個々のｖｌＣＤＲ及びｖｈＣＤＲ、と同様に荷電リンカー（二重下線）を伴ったｓｃＦｖ構築物の配列を示す。図面で示される配列すべてに当てはまることであるが、この荷電リンカーは、必要に応じて非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーに置き換えられてもよい。
【図５】可変重鎖及び軽鎖のドメイン（下線のＣＤＲ）を含む「高〜中間＃３」の抗ＣＤ３＿Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７構築物、と同様に個々のｖｌＣＤＲ及びｖｈＣＤＲ、と同様に荷電リンカー（二重下線）を伴ったｓｃＦｖ構築物の配列を示す。図面で示される配列すべてに当てはまることであるが、この荷電リンカーは、必要に応じて非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーに置き換えられてもよい。
【図６】可変重鎖及び軽鎖のドメイン（下線のＣＤＲ）を含む「中間」の抗ＣＤ３＿Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７構築物、と同様に個々のｖｌＣＤＲ及びｖｈＣＤＲ、と同様に荷電リンカー（二重下線）を伴ったｓｃＦｖ構築物の配列を示す。図面で示される配列すべてに当てはまることであるが、この荷電リンカーは、必要に応じて非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーに置き換えられてもよい。
【図７】可変重鎖及び軽鎖のドメイン（下線のＣＤＲ）を含む「低」抗ＣＤ３＿Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７構築物、と同様に個々のｖｌＣＤＲ及びｖｈＣＤＲ、と同様に荷電リンカー（二重下線）を伴ったｓｃＦｖ構築物の配列を示す。図面で示される配列すべてに当てはまることであるが、この荷電リンカーは、必要に応じて非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーに置き換えられてもよい。
【図８】可変重鎖及び軽鎖のドメイン（下線のＣＤＲ）を含む高ＣＤ３８：ＯＫＴ１０＿Ｈ１．７７＿Ｌ１．２４構築物、と同様に個々のｖｌＣＤＲ及びｖｈＣＤＲ、と同様に荷電リンカー（二重下線）を伴ったｓｃＦｖ構築物の配列を示す。
【図９】可変重鎖及び軽鎖のドメイン（下線のＣＤＲ）を含む中間ＣＤ３８：ＯＫＴ１０＿Ｈ１Ｌ１．２４構築物、と同様に個々のｖｌＣＤＲ及びｖｈＣＤＲ、と同様に荷電リンカー（二重下線）を伴ったｓｃＦｖ構築物の配列を示す。
【図１０】可変重鎖及び軽鎖のドメイン（下線のＣＤＲ）を含む低ＣＤ３８：ＯＫＴ１０＿Ｈ１Ｌ１構築物、と同様に個々のｖｌＣＤＲ及びｖｈＣＤＲ、と同様に荷電リンカー（二重下線）を伴ったｓｃＦｖ構築物の配列を示す。
【図１１】ＸＥＮＰ１５３３１の配列を示す。
【図１２】ＸＥＮＰ１３２４３の配列を示す。
【図１３】ＸＥＮＰ１４７０２の配列を示す。
【図１４】ＸＥＮＰ１５４２６の配列を示す。
【図１５】ＸＥＮＰ１４７０１の配列を示す。
【図１６】ＸＥＮＰ１４７０３の配列を示す。
【図１７】ＸＥＮＰ１３２４３の配列を示す。
【図１８】ＸＥＮＰ１８９６７の配列を示す。
【図１９】ＸＥＮＰ１８９７１の配列を示す。
【図２０】ＸＥＮＰ１８９６９の配列を示す。
【図２１】ＸＥＮＰ１８９７０の配列を示す。
【図２２】ＸＥＮＰ１８９７２の配列を示す。
【図２３】ＸＥＮＰ１８９７３の配列を示す。
【図２４】ＸＥＮＰ１５０５５の配列を示す。
【図２５】ＸＥＮＰ１３５４４の配列を示す。
【図２６】ＸＥＮＰ１３６９４の配列を示す。
【図２７】ヒトＣＤ３εの配列を示す。
【図２８】ヒトＣＤ３８タンパク質の完全長（配列番号１３０）及び細胞外ドメイン（ＥＣＤ；配列番号１３１）を示す。
【図２９Ａ】（Ａ〜Ｅ）ヘテロ二量体化変異体のセット（非対称変異体及びｐＩ変異体を含む）の有用なペアを示す。
【図２９Ｂ】同上。
【図２９Ｃ】同上。
【図２９Ｄ】同上。
【図２９Ｅ】同上。
【図３０】同配体の変異体抗体の定常領域及びそのそれぞれの置換のリストである。ｐＩ_（−）はｐＩの低い変異体を示し、ｐＩ_（＋）はｐＩが高い変異体を示す。これらは任意で且つ独立して本発明のヘテロ二量体化変異体（及び同様に本明細書で要点が述べられている他の変異体の型）と組み合わせることができる。
【図３１】ＦｃγＲ結合を消失させる有用な消失変異体（「ノックアウト」または「ＫＯ」変異体と呼ぶこともある）を示す。
【図３２】本発明の２つの特に有用な実施形態を示す。
【図３３Ａ】図３３Ａ及び図３３Ｂは、成分として１以上のｓｃＦｖを利用するヘテロ二量体抗体のｐＩを高くするまたは低くするのに使用される多数の荷電ｓｃＦｖリンカーを示す。単一の電荷を持つ単一の従来技術のｓｃＦｖリンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，６（８）：９８９−９９５（１９９３）からの「Ｗｈｉｔｌｏｗ」として参照される。このリンカーはｓｃＦｖにて凝集を減らし、タンパク分解安定性を高めるために使用されたことが言及されるべきである。
【図３３Ｂ】同上。
【図３４】ヘテロ二量体の収量（ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸによって測定される）及び熱安定性（ＤＳＣによって測定される）と共に操作されたヘテロ二量体−非対称Ｆｃ変異体を示すリストである。測定されなかった熱安定性は「ｎ.ｄ.」によって示す。
【図３５】プロテインＡ親和性精製ののちの二重特異性の発現収量を示す図である。
【図３６】カチオン交換精製のクロマト図である。
【図３７】２４時間のインキュベート、１０ｋのＲＰＭＩ８２２６細胞、４００ｋのＴ細胞での再指向Ｔ細胞の細胞傷害性を示す図である。被験物質は抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３の二重特異性である。検出はＬＤＨによった。
【図３８】２４時間のインキュベート、１０ｋのＲＰＭＩ８２２６細胞、５００ｋのヒトＰＢＭＣでの再指向Ｔ細胞の細胞傷害性を示す図である。被験物質は抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３の二重特異性である。検出はＬＤＨによった。
【図３９】ＸＥＮＰ１４４１９の配列を示す。
【図４０】ＸＥＮＰ１４４２０の配列を示す。
【図４１】ＸＥＮＰ１４４２１の配列を示す。
【図４２】ＸＥＮＰ１４４２２の配列を示す。
【図４３】ＸＥＮＰ１４４２３の配列を示す。
【図４４】９６時間のインキュベート、４０ｋのＲＰＭＩ８２２６細胞、４００ｋのヒトＰＢＭＣでの再指向Ｔ細胞の細胞傷害性を示す図である。被験物質は抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃである。検出、特にＣＤ３８＋細胞の消失はフローサイトメトリーによった。
【図４５】図１で記載された再指向Ｔ細胞の細胞傷害性アッセイのさらなる解析を示す図である。最初の列はフローサイトメトリーによって検出されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞における活性化マーカーＣＤ６９の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。２番目の列は、細胞増殖の測定であるＫｉ−６７＋であるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。３番目の列はフローサイトメトリーによって検出されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞におけるグランザイムＢ阻害剤ＰＩ−９の細胞内平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図４６】抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異性剤の抗腫瘍活性を調べるマウス試験の設計を示す図である。
【図４７】時間と処理の関数としてＩＶＩＳ（登録商標）によって測定された腫瘍サイズを示す図である。
【図４８】ＩＶＩＳ（登録商標）の生物発光画像（１０日目）を示す図である。
【図４９】示した被験物質の単回投与に続くカニクイザルにおけるＣＤ３８＋細胞の枯渇を示す図である。
【図５０】図４９にあるようなカニクイザル、色分けにおけるＣＤ６９の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定されたＴ細胞の活性化を示す図である。
【図５１】示した被験物質の単回投与に続くＩＬ−６の血清レベルを示す図である。
【図５２】ＸＥＮＰ１５４２７の配列を示す。
【図５３】ＸＥＮＰ１５４２８の配列を示す。
【図５４】ＸＥＮＰ１５４２９の配列を示す。
【図５５】ＸＥＮＰ１５４３０の配列を示す。
【図５６】ＸＥＮＰ１５４３１の配列を示す。
【図５７】ＸＥＮＰ１５４３２の配列を示す。
【図５８】ＸＥＮＰ１５４３３の配列を示す。
【図５９】ＸＥＮＰ１５４３４の配列を示す。
【図６０】ＸＥＮＰ１５４３５の配列を示す。
【図６１】ＸＥＮＰ１５４３６の配列を示す。
【図６２】ＸＥＮＰ１５４３７の配列を示す。
【図６３】ＸＥＮＰ１５４３８の配列を示す。
【図６４】Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにおける結合親和性を示す。
【図６５】多様な軽鎖、Ｆａｂ−Ｆｃ及びｓｃＦｖ−Ｆｃの比を用いた安定なプール生成の間でのヘテロ二量体の純度を示す。
【図６６】ｈｕＰＢＭＣのマウスモデルにおける抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性剤によるヒトＩｇＭ及びＩｇＧ２の枯渇を示す図である。
【図６７Ａ】図６７Ａ〜図６７Ｂは、安定性を最適化したヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖを示す。Ｈ１＿Ｌ１．４ｓｃＦｖの配列に対して置換が付与される。アミノ酸の番号付けはＫａｂａｔの番号付けである。
【図６７Ｂ】同上。
【図６８Ａ】図６８Ａ〜図６８Ｚは、安定性を最適化したヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す。ＣＤＲに下線を引く。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては４つの配列：（ｉ）Ｃ末端での６×Ｈｉｓタグを伴うｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖのみ、（ｉｉｉ）ＶＨのみ、（ｉｖ）ＶＬのみをリストにする。
【図６８Ｂ】同上。
【図６８Ｃ】同上。
【図６８Ｄ】同上。
【図６８Ｅ】同上。
【図６８Ｆ】同上。
【図６８Ｇ】同上。
【図６８Ｈ】同上。
【図６８Ｉ】同上。
【図６８Ｊ】同上。
【図６８Ｋ】同上。
【図６８Ｌ】同上。
【図６８Ｍ】同上。
【図６８Ｎ】同上。
【図６８Ｏ】同上。
【図６８Ｐ】同上。
【図６８Ｑ】同上。
【図６８Ｒ】同上。
【図６８Ｓ】同上。
【図６８Ｔ】同上。
【図６８Ｕ】同上。
【図６８Ｖ】同上。
【図６８Ｗ】同上。
【図６８Ｘ】同上。
【図６８Ｙ】同上。
【図６８Ｚ】同上。
【図６９】２４時間インキュベート、１０ｋのＲＰＭＩ８２２６細胞、５００ｋのＰＢＭＣでの再指向Ｔ細胞の細胞傷害性を示す図である。被験物質は抗ＣＤ３８（ＯＫＴ１０＿Ｈ１Ｌ１，ＯＫＴ１０＿Ｈ１．７７＿Ｌ１．２４）×抗ＣＤ３Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃｓである。検出はＬＤＨによった。
【図７０】ｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤのＩｇ枯渇試験を示す図である。被験物質は、０．０３、０．３または３ｍｇ／ｋｇでＰＭＢＣの生着８日後に投与した。投与の経路は腹腔内だった。ＰＢＭＣの生着１４日後に血液試料を採取し、血清に処理し、ヒトＩｇＭ及びＩｇＧ２についてアッセイした。
【図７１】ＸＥＮＰ１８９６７抗ＣＤ３８の配列を示す。
【図７２】ＸＥＮＰ１８９７１の配列を示す。
【図７３】ＸＥＮＰ１８９６９の配列を示す。
【図７４】ＸＥＮＰ１８９７０の配列を示す。
【図７５】ＸＥＮＰ１８９７２の配列を示す。
【図７６】ＸＥＮＰ１８９７３の配列を示す。
【図７７】本発明の実施形態について考えられる組み合わせのマトリクスを示す。「Ａ」は参照ＣＤ３配列のＣＤＲを左側のＣＤ３８構築物のＣＤＲと組み合わせることができることを意味する。すなわち、たとえば、左の一番上のセルについては、可変重鎖ＣＤ３Ｈ１．３０配列のｖｈＣＤＲ及びＣＤ３Ｌ１．４７配列の可変軽鎖のｖｌＣＤＲをＣＤ３８ＯＫＴ１０Ｈ１．７７配列のｖｈＣＤＲ及びＯＫＴ１０Ｌ１．２４配列のｖｌＣＤＲと組み合わせることができる。「Ｂ」はＣＤ３構築物に由来するＣＤＲをＣＤ３８構築物に由来する可変重鎖及び軽鎖のドメインと組み合わせることができることを意味する。すなわち、たとえば、左の一番上のセルについては、可変重鎖ＣＤ３Ｈ１．３０配列のｖｈＣＤＲ及びＣＤ３Ｌ１．４７配列の可変軽鎖のｖｌＣＤＲを可変重鎖ドメインＣＤ３８ＯＫＴ１０Ｈ１．７７配列及びＯＫＴ１０Ｌ１．２４配列と組み合わせることができる。「Ｃ」は反転されるので、ＣＤ３配列に由来する可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインがＣＤ３８配列のＣＤＲと共に使用される。「Ｄ」はそれぞれに由来する可変重鎖及び可変軽鎖が組み合わせられる場合である。「Ｅ」はＣＤ３のｓｃＦｖがＣＤ３８抗原結合ドメイン構築物のＣＤＲと共に使用される場合であり、「Ｆ」はＣＤ３のｓｃＦｖがＣＤ３８抗原結合ドメインの可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインと共に使用される場合である。
【図７８】ヒト細胞株ＭＯＬＭ１３に対するＴ細胞依存性細胞の細胞傷害性（ＴＤＣＣ）アッセイから作った細胞傷害性曲線を示す図である。各曲線に相当する抗体が括弧内に提供されている。
【図７９】カニクイザル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＴＤＣＣアッセイから作った細胞傷害性曲線を示す図である。各曲線に相当する抗体が括弧内に提供されている。
【図８０】ヒト細胞株（ＫＭＳ１２ＢＭ、ＭＯＬＭ１３、ＯＰＭ２、Ｕ９３７、ＳＫＭ１）におけるＣＤ３８の発現を示す図である。
【図８１】ＣＤ３−×ＣＤ３８−結合二重特異性抗体の投与前及び投与後でのカニクイザルにおけるＢ細胞の計数を示す図である。抗体及び投与量は、ＣＤ３及びＣＤ３８に対する各抗体の相対的親和性と共に各グラフの上に提供されている（実施例６を参照のこと）。矢印は投与日を示す。
【図８２】ＸｍＡｂ１８９６８（４１２２２０）の配列を示す図である。
【図８３】図８３Ａ〜図８３Ｄは、Ｆｖ配列（たとえば、ｓｃＦｖ及びＦａｂ側のｖｈやｖｌ）を伴わない幾つかの栓抜き型の主鎖の配列を示す。当業者によって十分に理解され、以下で要点が述べられるように、これらの配列は本明細書で要点が述べられているｖｈとｖｌのペアと共に使用することができ、一方の単量体はｓｃＦｖ（任意で荷電ｓｃＦｖリンカーを含む）を含み、他方の単量体はＦａｂ配列（たとえば、「Ｆａｂ側の重鎖」に連結されたｖｈ及び「定常軽鎖」に連結されたｖｌ）を含む。ｓｃＦＶは抗ＣＤ３または抗ＣＤ３８であることができ、Ｆａｂが他方である。すなわち、ＣＤ３及びＣＤ３８について本明細書で要点が述べられているどんなＦｖ配列も任意の組み合わせで図８３の主鎖に組み込むことができる。
【図８４Ａ】（記載なし）
【図８４Ｂ】（記載なし）
【図８４Ｃ】（記載なし）
【図８４Ｄ】（記載なし）
【発明を実施するための形態】
【００３３】
Ｉ．定義
本出願がさらに完全に理解され得るために、幾つかの定義を以下で定める。そのような定義は文法上の同等物を包含するものとする。
【００３４】
「消失」によって活性の低下または除去を意味する。従ってたとえば、「ＦｃγＲの結合を消失させること」は、Ｆｃ領域のアミノ酸変異体が特定の変異体を含有しないＦｃ領域に比べて５０％未満の出発結合を有することを意味し、活性の７０〜８０〜９０〜９５〜９８％未満の喪失が好ましく、一般に活性はＢｉａｃｏｒｅアッセイにおける検出可能な結合のレベルを下回る。ＦｃγＲ結合の消失にて特に使用されるのは図１６で示されるものである。
【００３５】
本明細書で使用されるような「ＡＤＣＣ」または抗体依存性細胞介在性の細胞傷害性によって、ＦｃγＲを発現している非特異的な細胞傷害性細胞が標的細胞上で結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす細胞が介在する反応を意味する。ＡＤＣＣはＦｃγＲＩＩＩａへの結合と相関し、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の上昇はＡＤＣＣ活性の上昇をもたらす。
【００３６】
本明細書で使用されるような「ＡＤＣＰ」または抗体依存性細胞介在性の貪食作用によって、ＦｃγＲを発現している非特異的な細胞傷害性細胞が標的細胞上で結合した抗体を認識し、その後標的細胞の貪食を引き起こす細胞が介在する反応を意味する。
【００３７】
本明細書での「修飾」によって、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／または欠失、またはタンパク質に化学的に連結される部分に対する変化を意味する。たとえば、修飾はタンパク質に連結された炭水化物またはＰＥＧ構造の変化であってもよい。本明細書での「アミノ酸の修飾」によってポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／または欠失を意味する。明瞭性のために、言及されない限り、アミノ酸の修飾は常に、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、たとえば、ＤＮＡ及びＲＮＡにてコドンを有する２０のアミノ酸に対するものである。
【００３８】
本明細書での「アミノ酸置換」または「置換」によって、親ポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えを意味する。特に一部の実施形態では、置換は、特定の位置で天然に存在しない、生物内にまたは任意の生物で天然に存在しないアミノ酸へのものである。たとえば、置換Ｅ２７２Ｙは、変異体ポリペプチドを指し、この場合、２７２位でグルタミン酸がチロシンで置き換えられるＦｃ変異体を指す。明瞭性のために、核酸がコードする配列を変えるが、出発アミノ酸を変えない（たとえば、ＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（依然としてアルギニンをコードする）に交換して宿主生物での発現レベルを高める）ように操作されているタンパク質は「アミノ酸置換」ではなく；すなわち、同じタンパク質をコードする新しい遺伝子を作り出したにもかかわらず、タンパク質がそれから出発した特定の位置での同じアミノ酸を有するのであれば、それはアミノ酸置換ではない。
【００３９】
本明細書で使用されるとき「アミノ酸の挿入」または「挿入」によって、親ポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸配列の付加を意味する。たとえば、−２３３Ｅまたは２３３Ｅは２３３位の後で且つ２３４位の前にてグルタミン酸の挿入を指定する。さらに、−２３３ＡＤＥまたはＡ２３３ＡＤＥは２３３位の後で且つ２３４位の前にてＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を指定する。
【００４０】
本明細書で使用されるとき「アミノ酸の欠失」または「欠失」によって、親ポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸配列の除去を意味する。たとえば、Ｅ２３３−またはＥ２３３＃またはＥ２３３（）は２３３位でのグルタミン酸の欠失を指定する。さらに。ＥＤＡ２３３−またはＥＤＡ２３３＃は２３３位で始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を指定する。
【００４１】
本明細書で使用されるとき「変異体タンパク質」または「タンパク質変異体」または「変異体」によって、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親タンパク質とは異なるタンパク質を意味する。タンパク質変異体は、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物、またはそれをコードするアミノ配列を指してもよい。好ましくは、タンパク質変異体は、親タンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸修飾を有し、たとえば、約１〜約７０のアミノ酸修飾を有し、好ましくは親に比べて約１〜約５のアミノ酸修飾を有する。以下に記載されているように、一部の実施形態では、親ポリペプチド、たとえば、Ｆｃ親ポリペプチドは、変異体を伴うヒト配列が「親ポリペプチド」、たとえば、図１９のＩｇＧ１／２ハイブリッドとしても役立つことができるが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来するＦｃ領域のようなヒト野生型配列である。本明細書でのタンパク質変異体の配列は好ましくは、親タンパク質の配列との少なくとも約８０％の同一性を持ち、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも約９５〜９８〜９９％の同一性を持つ。変異体タンパク質は、変異体タンパク質自体、タンパク質変異体を含む組成物、またはそれをコードするＤＮＡ配列を指すことができる。従って、本明細書で使用されるとき「抗体変異体」または「変異体抗体」によって、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親抗体とは異なる抗体を意味し、「ＩｇＧ変異体」または「変異体ＩｇＧ」は本明細書で使用されるとき、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親ＩｇＧ（再び、多くの場合、ヒトＩｇＧ配列に由来する）とは異なる抗体を意味し、「免疫グロブリン変異体」または「変異体免疫グロブリン」は本明細書で使用されるとき、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親免疫グロブリン配列とは異なる免疫グロブリン配列を意味する。「Ｆｃ変異体」または「変異体Ｆｃ」は本明細書で使用されるとき、Ｆｃドメインにてアミノ酸修飾を含むタンパク質を意味する。本発明のＦｃ変異体はそれらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。従って、たとえば、Ｎ４３４Ｓまたは４３４Ｓは親Ｆｃポリペプチドに対して４３４位で置換セリンを伴うＦｃ変異体であり、番号付けはＥＵ指標に従う。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは親Ｆｃポリペプチドに対して置換Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを伴うＦｃ変異体を定義する。ＷＴのアミノ酸の同一性は特定されなくてもよく、その場合、前述の変異体は４２８Ｌ／４３４Ｓと呼ばれる。置換が提供される順序は任意であり、すなわち、たとえば、４２８Ｌ／４３４ＳはＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓと同じＦｃ変異体であること等が言及される。抗体に関連する本発明で議論されるすべての位置について、言及されない限り、アミノ酸の位置の番号付けはＥＵ指標に従う。ＥＵ指標またはＫａｂａｔもしくはＥＵの番号付け方式としてのＥＵ指標はＥＵ抗体（参照によって全体的に本明細書に組み入れられるＥｄｅｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６３：７８−８５，）の番号付けを指す。修飾は付加、欠失または置換であることができる。置換は天然に存在するアミノ酸、及び場合によっ���は合成のアミノ酸を含むことができる。例には、すべて全体的に参照によって組み入れられる米国特許第６，５８６，２０７号；ＷＯ９８／４８０３２；ＷＯ０３／０７３２３８；ＵＳ２００４−０２１４９８８Ａ１；ＷＯ０５／３５７２７Ａ２；ＷＯ０５／７４５２４Ａ２；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１２４：９０２６−９０２７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，１１：１１３５−１１３７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２），ＰＩＣＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，９９：１１０２０−１１０２４；及び，Ｌ．Ｗａｎｇ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．１−１０が挙げられる。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「タンパク質」は、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味し、それはタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを含む。ペプチジル基は、天然に存在するアミノ酸と及びペプチド結合、または合成のペプチド模倣体構造、すなわち、ペプトイドのような類似体（参照によって全体的に組み入れられるＳｉｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８９（２０）：９３６７（１９９２））を含んでもよい。アミノ酸は、当業者によって十分に理解されるように、天然に存在してもよく、または合成（たとえば、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸ではない）であってもよい。たとえば、ホモ−フェニルアラニン、シトルリン、オルニチン及びノルロイシンは本発明の目的で合成アミノ酸と見なされ、Ｄ−及びＬ−（ＲまたはＳ）構成のアミノ酸双方が利用されてもよい。本発明の変異体は、たとえば、すべて参照によって全体的に組み入れられるＣｒｏｐｐ  ＆  Ｓｈｕｌｔｚ，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２０（１２）：６２５−３０，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，（２）：７５６６−７１，Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２００３，３０３（５６５６）：３７１−３，及びＣｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１（５６３５）：９６４−７によって記載された方法を含むが、これらに限定されないＳｃｈｕｌｔｚ及び共同研究者によって開発された技法を用いて組み込まれる合成アミノ酸の使用を含む修飾を含んでもよい。加えて、ポリペプチドは、１以上の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ペグ化、環状再配列、環化、他の分子に対するリンカー、タンパク質またはタンパク質ドメインに対する融合、及びペプチドタグまたは標識の付加を含んでもよい。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「残基」によって、タンパク質及びその関連するアミノ酸の固有性における位置を意味する。たとえば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７またはＮ２９７とも呼ばれる）はヒト抗体ＩｇＧ１における２９７位での残基である。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」によって、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬの免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは単離におけるこの領域、または完全長抗体の文脈でのこの領域、抗体断片またはＦａｂ融合タンパク質を指してもよい。本明細書で使用されるとき、「Ｆｖ」または「Ｆｖ断片」または「Ｆｖ領域」によって、単一抗体のＶＬ及びＶＨのドメインを含むポリペプチドを意味する。当業者によって十分に理解されるように、これらは一般に２つの鎖で構成される。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「ＩｇＧサブクラスの修飾」または「アイソタイプの修飾」によって、１つのＩｇＧアイソタイプのアミノ酸１つを異なる位置合わせしたＩｇＧアイソタイプにおける対応するアミノ酸に変換するアミノ酸修飾を意味する。たとえば、ＥＵの２９６位にてＩｇＧ１はチロシンを含み、ＩｇＧ２はフェニルアラニンを含むので、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙの置換はＩｇＧサブクラスの修飾と見なされる。
【００４６】
本明細書で使用されるとき「天然に存在しない修飾」によって、アイソタイプではないアミノ酸修飾を意味する。たとえば、ＩｇＧはどれも４３４位でセリンを含まないので、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４（またはそれらのハイブリッド）における置換４３４Ｓは天然に存在しない修飾と見なされる。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、「アミノ酸」または「アミノ酸の固有性」によってＤＮＡ及びＲＮＡによってコードされる２０の天然に存在するアミノ酸の１つを意味する。
【００４８】
本明細書で使用されるとき「エフェクター機能」によって、抗体のＦｃ領域のＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用の結果生じる生化学的な事象を意味する。エフェクター機能には、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
本明細書で使用されるとき「ＩｇＧＦｃリガンド」によって、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する生物に由来する分子、好ましくはポリペプチドを意味する。ＦＣリガンドには、ＦｃγＲＩｓ、ＦｃγＲＩＩｓ、ＦｃγＲＩＩＩｓ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、及びウイルスＦｃγＲが挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｃリガンドにはまた、ＦｃγＲに対して相同であるＦｃ受容体のファミリーであるＦｃ受容体ホモログ（ＦｃＲＨ）も挙げられる（参照によって全体的に組み入れられるＤａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．、２００２、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９０：１２３−１３６）．ＦｃリガンドにはＦｃを結合する未発見の分子が含まれてもよい。特定のＩｇＧのＦｃリガンドはＦｃＲｎ及びＦｃガンマ受容体である。「Ｆｃリガンド」によって本明細書で使用されるとき抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する任意の生物に由来する分子、好ましくはポリペプチドを意味する。
【００５０】
本明細書で使用されるとき「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」または「ＦｃガンマＲ」によってＩｇＧ抗体のＦｃ領域を結合し、ＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質のファミリーのメンバーを意味する。ヒトではこのファミリーには、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、及びＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１及びＲ１３１を含む）を含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１及びＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、及びＦｃγＲＩＩｃ；及びアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８及びＦ１５８を含む）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ１及びＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（参照によって全体的に組み入れられるＪｅｆｆｅｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．、２００２、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ８２：５７−６５）、と同様に未発見のヒトＦｃγＲｓまたはＦｃγＲのアイソフォームまたはアロタイプが挙げられるが、これらに限定されない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ及びサルを含むが、これらに限定されない任意の生物に由来してもよい。マウスのＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、及びＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、と同様に未発見のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲのアイソフォームまたはアロタイプが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
本明細書で使用されるとき「ＦｃＲｎ」または「新生児Ｆｃ受容体」によって、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を結合し、ＦｃＲｎ遺伝子によって少なくともある程度コードされているタンパク質を意味する。ＦｃＲｎはヒト、マウス、ラット、ウサギ及びサルを含むが、これらに限定されない任意の生物に由来してもよい。当該技術で知られるように、機能的なＦｃＲｎタンパク質は、重鎖及び軽鎖と呼ばれることが多い２つのポリペプチドを含む。軽鎖はベータ−２−ミクログロブリンであり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。本明細書で言及されない限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖のベータ−２−ミクログロブリンとの複合体を指す。ＦｃＲｎ受容体への結合を増やすのに、場合によっては血清での半減期を増やすのに使用される種々のＦｃＲｎ変異体は図８３の説明文に示されている。
【００５２】
本明細書で使用されるとき「親ポリペプチド」によってその後修飾されて変異体を生成する出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドの変異体もしくは操作された型であってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指してもよい。従って、本明細書で使用されるとき「親免疫グロブリン」によって、修飾されて変異体を生成する未修飾の免疫グロブリンポリペプチドを意味し、本明細書で使用されるとき「親抗体」によって、修飾されて変異体抗体を生成する未修飾の抗体を意味する。「親抗体」には、以下で要点が述べられているような既知の市販の抗体、組換えで製造された抗体が含まれることが言及されるべきである。
【００５３】
本明細書で使用されるとき「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」のよって、第１の定常領域免疫グロブリンと場合によってはヒンジの部分を除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。従って、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、及びこれらのドメインに対してＮ末端側の柔軟なヒンジを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭについては、ＦｃはＪ鎖を含んでもよい。ＩｇＧについては、Ｆｃドメインは免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３（Ｃγ２及びＣγ３）及びＣγ１（Ｃγ１）とＣγ２（Ｃγ２）の間での低部ヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は変化してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は普通、残基Ｃ２２６またはＰ２３０からそのカルボキシル末端までを含むように定義され、番号付けはＫａｂａｔにあるようにＥＵ指標に従う。一部の実施形態では、以下でさらに完全に記載されているように、Ｆｃ領域に対してアミノ酸修飾が行われ、１以上のＦｃγＲ受容体またはＦｃＲｎ受容体への結合を変化させる。
【００５４】
本明細書での「重鎖定常領域」によって抗体のＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分を意味する。
【００５５】
本明細書での「Ｆｃ融合タンパク質」または「免疫付着因子」によって、本明細書に記載されているような、標的タンパク質への結合部分のような異なるタンパク質に一般に連結されている（任意で本明細書に記載されているようなリンカー部分を介して）Ｆｃ領域を含むタンパク質を意味する。場合によっては、ヘテロ二量体抗体の一方の単量体は抗体重鎖（ｓｃＦｖを含む、またはさらに軽鎖を含む）を含み、他方の単量体は変異体Ｆｃドメインとリガンドとを含むＦｃ融合物である。一部の実施形態では、これらの「半分抗体−半分融合タンパク質」は「融合体」と呼ばれる。
【００５６】
本明細書で使用されるとき「位置」によってタンパク質の配列における場所を意味する。位置は順に、または確立された形式、たとえば、抗体の番号付けについてのＥＵ指標に従って番号付けされてもよい。
【００５７】
本明細書で使用されるとき「標的抗原」によって所与の抗体の可変領域によって特異的に結合される分子を意味する。標的抗原はタンパク質、炭水化物、脂質、または他の化合物であってもよい。多数の好適な標的抗原が以下に記載されている。
【００５８】
本明細書での本発明のヘテロ二量体抗体の単量体の文脈における「特定の種類の鎖」は、「マッチする」ＤＮＡの２つの鎖と同様に、ヘテロ二量体を形成するように「マッチする」能力を保つようにヘテロ二量体化変異体が各単量体に組み込まれることを意味する。たとえば、幾つかのｐＩ変異体を単量体Ａで操作し（たとえば、ｐＩを高くする）、そのとき、同様に利用できる「荷電ペア」である立体変異体がｐＩ変異体に干渉しないのであれば、たとえば、ｐＩを高くする荷電変異体を同じ「鎖」または「単量体」に置いて双方の官能性を保つ。同様に、以下でさらに完全に要点が述べられているようなセットのペアに加わる「非対称」変異体については、技量のある熟練者はペアの１セットを組み込む鎖または単量体が決定に関わることにおいてｐＩを考慮するので、同様に非対称のｐＩを用いてｐＩ分離が最大化される。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、「標的細胞」によって標的抗原を発現している細胞を意味する。
【００６０】
本明細書で使用されるとき「可変領域」によって、それぞれ、カッパ、ラムダ、及び重鎖の免疫グロブリン遺伝子座を作り出すＶ．カッパ、Ｖ．ラムダ及び／またはＶＨの遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。
【００６１】
本明細書での「野生型またはＷＴ」は対立遺伝子の変異を含む自然界で見いだされるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴのタンパク質は、意図的には修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【００６２】
本発明の抗体は一般に単離される、または組換えである。本明細書で開示されている種々のポリペプチドを記載するのに使用される場合の「単離される」は、それが発現された細胞または細胞培養物から特定され、分離され、回収されているポリペプチドを意味する。普通、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程によって調製されるであろう。「単離された抗体」は異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。組換え体は、外来の宿主細胞にて組換え核酸法を用いて抗体が生成されることを意味する。
【００６３】
特定の抗原またはエピトープに対する「特異的結合」または「特異的に結合する」またはそれに「対して特異的である」は、非特異的な相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的な結合は、たとえば、一般に結合活性を有さない類似の構造の分子である対照分子の結合に比べた分子の結合を測定することによって測定することができる。たとえば、特異的な結合は標的に類似する対照分子との競合によって決定することができる。
【００６４】
特定の抗原またはエピトープに対する特異的な結合は、たとえば、少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、代わりに少なくとも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ以上の抗原またはエピトープについてのＫＤを有する抗体によって示すことができ、その際、ＫＤは特定の抗体／抗原相互作用の解離速度を指す。通常、抗原を特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープに対する対照分子について２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５０００倍、１０，０００倍以上大きいＫＤを有するであろう。
【００６５】
また、特定の抗原またはエピトープに対する特異的な結合は、たとえば、対照に対するエピトープについて少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５０００倍、１０，０００倍以上大きい抗原またはエピトープについてのＫＡまたはＫａを有する抗体によって示すことができ、その際、ＫＡまたはＫａは特定の抗体／抗原相互作用の会合速度を指す。
【００６６】
ＩＩ．概説
ＣＤ３と腫瘍抗原標的とを同時結合する二重特異性抗体が設計され、Ｔ細胞を攻撃に向け直し、標的とされた腫瘍細胞を溶解するのに使用されている。例には、一価でＣＤ３と腫瘍抗原とを結合するＢｉＴＥ及びＤＡＲＴの形式が挙げられる。これらの形式はＦｃドメインを含有せず、患者にて非常に短い血清半減期を示す。
【００６７】
ＣＤ３を標的とするアプローチは相当な有望さを示している一方で、そのような治療法の共通する副作用はサイトカインの関連する産生であり、毒性サイトカイン放出症候群をもたらすことが多い。二重特異性抗体の抗ＣＤ３結合ドメインはすべてのＴ細胞を結合するので、サイトカイン高産生ＣＤ４Ｔ細胞サブセットが動員される。さらに、ＣＤ４Ｔ細胞サブセットは調節性Ｔ細胞を含み、その動員及び増殖は潜在的に免疫抑制をもたらす可能性があり、長期の腫瘍抑制に対する悪影響を有する。サイトカイン産生を減らし、ＣＤ４Ｔ細胞の活性化を多分減らす考えられる方法の１つは、ＣＤ３についての抗ＣＤ３ドメインの親和性を低下させることによる。しかしながら、親和性を下げ過ぎることは抗ＣＤ３ドメインを含む治療剤の有効性の低下をもたらし得る。
【００６８】
従って、一部の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に対する「強力な」または「高親和性」の結合剤であり（たとえば、一例はＨ１．３０＿Ｌ１．４７（任意で適宜荷電リンカーを含む）として示される重鎖及び軽鎖可の変ドメインである）、ＣＤ３８にも結合する抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含む抗体構築物を提供する。種々の実施形態では、抗体構築物は、実施例にて記載されているアッセイを用いて任意で測定される約３〜１５ｎＭ（たとえば、３〜１０ｎＭまたは４〜７ｎＭ）の親和性（ＫＤ）でＣＤ３εに結合する。他の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に対する「軽い」または「低い親和性」の結合剤である抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含む抗体構築物を提供する。この点で、抗体構築物は、実施例にて記載されているアッセイを用いて任意で測定される約５１ｎＭ以上（たとえば、５１〜１００ｎＭ）の親和性（ＫＤ）でＣＤ３εに任意で結合する。追加の実施形態は、ＣＤ３８にも結合するＣＤ３に対して中間のまたは「中位」の親和性を有する抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含む抗体構築物を提供する。種々の態様では、抗体構築物は、実施例にて記載されているアッセイを用いて任意で測定される約１５〜５０ｎＭ（たとえば、約１６〜５０ｎＭ、１５〜４５ｎＭ、約２０〜４０ｎＭ、約２５〜４０ｎＭ、または約３０〜４０ｎＭ）親和性（ＫＤ）でＣＤ３εに結合する。種々の実施形態では、抗体は、本明細書に記載されているＸｍＡｂ１３５５１より小さく且つＸｍＡｂ１４７０２より大きいＣＤ３εに対する結合親和性を実証する。実施例で示されているように、二重特異性抗体のＣＤ３８に対する親和性は、ＣＤ３８を発現している標的とする細胞における抗体の有効性にも影響を有する。ＣＤ３８に対して「中位」または「低い」親和性を有する二重特異性抗体は、低下した毒性プロファイルを伴って試験管内及び生体内にて標的細胞を効率的に殺傷することができる。種々の実施形態では、ＣＤ３８について「高い」親和性を示す二重特異性抗体は、たとえば、１ｎＭ未満の親和性（ＫＤ）でＣＤ３８に結合し；ＣＤ３８について「中位」まはた「中間」の親和性を示す二重特異性抗体は、たとえば、約１〜１０ｎＭ（たとえば、２〜８ｎＭまたは３〜７ｎＭ）の親和性（ＫＤ）でＣＤ３８に結合し；ＣＤ３８について「低い」または「軽い」親和性を示す二重特異性抗体は、たとえば、約１１ｎＭ以上（たとえば、１１〜１００ｎＭ）の親和性（ＫＤ）でＣＤ３８に結合し、すべて実施例で定められる方法を用いて任意で測定される。
【００６９】
本発明の「高い、中位の、低い」抗ＣＤ３配列は種々のヘテロ二量体化形式で使用することができることが十分に理解されるべきである。本明細書での開示の大半がヘテロ二量体の「栓抜き型」形式を使用する一方で、これらの可変重鎖及び軽鎖の配列はｓｃＦｖ配列（及びこれらの可変重鎖及び軽鎖の配列を含むＦａｂ配列）と同様に、他の形式、たとえば、その図面、形式及び説明文が参照によって全体的に本明細書に組み入れられるＷＯ公開番号２０１４／１４５８０６の図２にて示されたものにおいて使用することができる。
【００７０】
従って、本発明は２つの異なる抗原に結合するヘテロ二量体抗体を提供し、たとえば、抗体は本発明にてそれらが２つの異なる標的抗原、たとえば、ＣＤ３及びＣＤ３８を結合するという点で「二重特異性」である。これらのヘテロ二量体抗体は、一価で（たとえば、可変重鎖と可変軽鎖のドメインのペアのような単一の抗原結合ドメインがある）、または二価で（それぞれ独立して抗原を結合する２つの抗原結合ドメインがある）これらの標的抗原を結合することができる。本発明のヘテロ二量体抗体は、以下でさらに完全に要点が述べられているようなホモ二量体からのヘテロ二量体の単純な精製を可能にする「ｐＩ変異体」と対にした、以下で同様に要点が述べられているようなホモ二量体に比べてヘテロ二量体の形成を「非対称にする」アミノ酸置換を含有する異なる単量体の使用に基づく。本発明のヘテロ二量体二重特異性抗体について、本発明は一般に、産生細胞にて自己集合してヘテロ二量体タンパク質を生じることができる操作されたまたは変異体のＦｃドメイン、及びそのようなヘテロ二量体タンパク質を生成し、精製する方法を頼りにする。
【００７１】
ＩＩＩ．抗体
本発明は、一般に治療用抗体（たとえば、高い有効性と低い毒性を有する抗体）である、ＣＤ３とＣＤ３８とを結合する二重特異性抗体の生成に関する。以下で議論されるように、用語「抗体」が一般に使用される。本発明で使用される抗体は、従来の抗体と同様に、本明細書に記載されている抗体の誘導体、断片及び模倣体を含む、本明細書に記載されているような多数の形式を採用することができる。
【００７２】
従来の抗体の構造単位は通常、四量体を含む。各四量体は通常、ポリペプチド鎖の２つの同一のペアで構成され、各ペアは１つの「軽」鎖（通常、約２５ｋＤａの分子量を有する）と１つの「重」鎖（通常、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。ヒト軽鎖はカッパ軽鎖とラムダ軽鎖に分類される。本発明はＩｇＧクラスを指向し、それは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むが、これらに限定されない幾つかのサブクラスを有する。ＩｇＧ１は３５６（ＤまたはＥ）及び３５８（ＬまたはＭ）での多型性を持つ異なるアロタイプを有することが言及されるべきである。本明細書で示される配列は３５６Ｄ／３５８Ｍアロタイプを使用するが、他のアロタイプは本明細書に含まれる。すなわち、本明細書に含まれるＩｇＧ１のＦｃドメインを含むどんな配列も３５６Ｄ／３５８Ｍアロタイプを置き換える３５６Ｅ／３５８Ｌを有することができる。
【００７３】
加えて、本明細書での配列の多くはセリンによって置き換えられる２２０位にて少なくとも１つのシステインを有し；一般にこれはジスルフィドの形成を減らすために、本明細書で示される配列のほとんどで「ｓｃＦｖ単量体」側にあるが、「Ｆａｂ単量体」側、または双方の側にあってもよい。本明細書の配列の範囲内に具体的に含まれるのは、置き換えられたこれらシステインの一方または双方（Ｃ２２０Ｓ）である。
【００７４】
従って、本明細書で使用されるとき「アイソタイプ」は、その定常領域の化学的及び抗原性の特徴によって定義される免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。治療用抗体はアイソタイプ及び／またはサブクラスのハイブリッドも含むことができることが理解されるべきである。たとえば、参照によって組み入れられる米国公開２００９／０１６３６９９にて示されたように、本発明はＩｇＧ１／Ｇ２ハイブリッドのｐＩ操作を対象にする。
【００７５】
各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識に関与し、当該技術及び本明細書では一般に「Ｆｖドメイン」または「Ｆｖ領域」と呼ばれる約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。可変領域では、重鎖及び軽鎖のＶドメインのそれぞれについて３つのループが集まって抗原結合部位を形成する。ループのそれぞれは相補性決定領域（以後「ＣＤＲ」と呼ぶ）と呼ばれ、アミノ酸配列における変異が最も有意である。「可変」は、可変領域の特定のセグメントが抗体の間の配列で広範に異なるという事実を指す。可変領域における変動性は均一には分配されない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９〜１５アミノ酸以上の長さである「超可変領域」と呼ばれる極端に変動性の短い領域によって分離された１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる相対的に不変の鎖から成る。
【００７６】
各ＶＨ及びＶＬは、以下の順：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）と４つのＦＲで構成される。
【００７７】
超可変領域は一般に、軽鎖可変領域においてほぼアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１：「Ｌ」は軽鎖を意味する）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域においてほぼアミノ酸３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１；「Ｈ」は重鎖を意味する）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸残基を包含し；Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）及び／または軽鎖可変領域において超可変ループ（たとえば、残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）及び９１〜９６（ＬＣＤＲ３）を形成するそれらの残基及び重鎖可変領域において超可変ループ２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）及び９６〜１０１（ＨＣＤＲ３）を形成するそれらの残基を包含する；Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ，（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７。本発明の特定のＣＤＲは以下に記載されている。
【００７８】
当業者によって十分に理解されるように、ＣＤＲの正確な番号付け及び配置は異なる番号付け方式の間で異なり得る。しかしながら、可変重鎖及び／または可変軽鎖の配列の開示には関連するＣＤＲの開示が含まれることが理解されるべきである。従って、各可変重鎖領域の開示はｖｈＣＤＲ（たとえば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３）の開示であり、可変軽鎖領域の開示はｖｌＣＤＲｓ（たとえば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３）の開示である。
【００７９】
本明細書の全体を通して、可変ドメイン（近似的に、軽鎖可変領域の残基１〜１０７及び重鎖可変領域の残基１〜１１３）における残基を参照する場合、Ｋａｂａｔ番号付け方式が一般に使用され、Ｆｃ領域についてはＥＵ番号付け方式が使用される（たとえば、Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，上記（１９９１））。
【００８０】
本発明は多数の異なるＣＤＲのセットを提供する。この場合、「完全なＣＤＲのセット」は、３つの可変軽鎖のＣＤＲ及び３つの可変重鎖ＣＤＲ、たとえば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む。これらはそれぞれ、さらに大きな可変軽鎖または可変重鎖のドメインの一部であることができる。加えて、本明細書でさらに完全に要点が述べられているように、可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインは、重鎖及び軽鎖が使用される場合（たとえば、Ｆａｂが使用される場合）別々のポリペプチド鎖にあることができ、またはｓｃＦｖ配列の場合、単一のポリペプチド鎖にあることができる。
【００８１】
ＣＤＲは、抗原結合の形成、さらに具体的には抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域における特異的な抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖のような分子の群化であり、特定の構造的特徴と同様に特定の電荷の特徴を有する。単一の抗原が１を超えるエピトープを有してもよい。
【００８２】
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの主要抗原成分とも呼ばれる）と、特異的な抗原結合ペプチドによって効果的に阻止されるアミノ酸残基のような結合に直接関与しない他のアミノ酸残基とを含んでもよく；言い換えれば、アミノ酸残基は特異的な抗原結合ペプチドのフットプリントの範囲内にある。
【００８３】
エピトープは立体的であってもよいし、または線状であってもよい。立体的なエピトープは線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって生じる。線状エピトープはポリペプチド鎖における隣接するアミノ酸残基によって作られるものである。立体的なエピトープ及び非立体的なエピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下で失われるという点で区別されてもよい。
【００８４】
エピトープには通常、独特の空間立体構造にて少なくとも３つ、さらに普通、少なくとも５つ、または８〜１０のアミノ酸が含まれる。同一のエピトープを認識する抗体は、標的抗原への別の抗体の結合を阻止する一方の抗体の能力を示す単純な免疫アッセイ、たとえば、ビニングにて検証することができる。
【００８５】
各鎖のカルボキシ末端は主としてエフェクター機能に関与する定常領域を定義する。Ｋａｂａｔらは、重鎖及び軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存の程度に基づいて、彼らは、個々の一次配列をＣＤＲとフレームワークに分類し、そのリストを作製した（参照によって全体的に組み入れられるＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．を参照のこと）。
【００８６】
免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスでは、重鎖には幾つかの免疫グロブリンのドメインがある。本明細書での「免疫グロブリン（Ｉｇ）のドメイン」によって異なる三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。本発明で関心があるのは、定常重鎖（ＣＨ）ドメイン及びヒンジドメインを含む重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体の文脈では、ＩｇＧアイソタイプはそれぞれ３つのＣＨ領域を有する。従って、ＩｇＧの文脈における「ＣＨ」ドメインは以下のとおりである：「ＣＨ１」はＫａｂａｔにあるようなＥＵ指標に従って１１８〜２２０位を指す。「ＣＨ２」はＫａｂａｔにあるようなＥＵ指標に従って２３７〜３４０位を指し、「ＣＨ３」はＫａｂａｔにあるようなＥＵ指標に従って３４１〜４４７位を指す。本明細書で示され、以下に記載されているように、ｐＩ変異体は、以下で議論されているようにＣＨ領域の１以上と同様にヒンジ領域にあることができる。
【００８７】
本明細書で示される配列はＣＨ１領域の１１８位で出発し、言及される場合を除いて可変領域は含まれないことが言及されるべきである。たとえば、配列番号２の最初のアミノ酸は配列表では「１」位と指定されているが、ＥＵ番号付けに従えばＣＨ１領域の１１８位に相当する。
【００８８】
重鎖の別の型のＩｇドメインはヒンジ領域である。本明細書での「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「免疫グロブリンヒンジ領域」によって、抗体の第１と第２の定常ドメインの間のアミノ酸を含む柔軟性のポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧのＣＨ１ドメインはＥＵの２２０位で終了し、ＩｇＧのＣＨ２ドメインはＥＵの２３７位の残基で始まる。従って、ＩｇＧについては、抗体ヒンジは本明細書では、２２１位（ＩｇＧ１ではＤ２２１）から２３６位（ＩｇＧ１ではＧ２３６）を含むと定義され、番号付けはＫａｂａｔにあるようにＥＵ指標に従う。一部の実施形態では、たとえば、Ｆｃ領域の文脈では、低部ヒンジが含まれ、「低部ヒンジ」は一般に２２６位〜２３０位を指す。本明細書で言及されるように、ｐＩ変異体は同様にヒンジ領域で作ることができる。
【００８９】
軽鎖は一般に２つのドメイン、可変軽鎖ドメイン（軽鎖ＣＤＲを含有し、可変重鎖ドメインと一緒にＦｖ領域を形成する）と、定常軽鎖領域（ＣＬまたはＣκと呼ばれることが多い）を含む。
【００９０】
以下で要点が述べられている、追加の置換についての対象とする別の領域はＦｃ領域である。
【００９１】
従って、本発明は異なる抗体ドメインを提供する。本明細書に記載され、当該技術で知られるように、本発明のヘテロ二量体抗体は重鎖及び軽鎖の範囲内で異なるドメインを含み、それらは同様に重複することができる。これらのドメインには、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１−ヒンジ−ＦｃドメインまたはＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、ＦＡｂドメイン及びｓｃＦｖドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
従って、「Ｆｃドメイン」にはＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、及び任意でヒンジドメインが含まれる。本明細書の実施形態では、ｓｃＦｖがＦｃドメインに連結される場合、それは、Ｆｃドメインのヒンジに連結されるｓｃＦｖ構築物のＣ末端であり；たとえば、それは一般にヒンジの開始である配列ＥＰＫＳに連結される。重鎖は、可変重鎖ドメイン及び定常ドメインを含み、それはＣＨ１−任意のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含むＦｃドメインを含む。軽鎖は、可変軽鎖と軽鎖定常ドメインとを含む。ｓｃＦｖは可変重鎖とｓｃＦｖリンカーと可変軽鎖ドメインとを含む。本明細書で要点が述べられている構築物及び配列のほとんどでは、可変軽鎖のＣ末端はｓｃＦｖリンカーのＮ末端に連結され、そのＣ末端は、交換する（Ｎ−ｖｌ−リンカー−ｖｈ−Ｃ）ことができるが、可変重鎖（Ｎ−ｖｈ−リンカー−ｖｌ−Ｃ）のＮ末端に連結される。従って、ｓｃＦｖの描写及び記載に具体的に含まれるのは、いずれかの方向性でのｓｃＦｖである。
【００９３】
本発明の一部の実施形態は、少なくとも１つのｓｃＦｖドメインを含み、それは天然に存在しない一方で、ｓｃＦｖリンカーによって一緒に連結される可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインとを一般に含む。本明細書で示されているように、組換え技法によって生成される従来のペプチド結合を含む、使用することができる多数の好適なｓｃＦｖリンカーがある。
【００９４】
リンカーペプチドは以下のアミノ酸残基；Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＴｈｒを優勢に含んでもよい。リンカーペプチドはそれらが所望の活性を保持するように互いに対して正しい立体構造を想定するような方法で２つの分子を連結するのに適正である長さを有するべきである。一実施形態では、リンカーは約１〜５０アミノ酸の長さ、好ましくは約１〜３０アミノ酸の長さである。一実施形態では、長さ１〜２０アミノ酸のリンカーが使用されてもよく、約５〜約１０アミノ酸が一部の実施形態で使用される。有用なリンカーには、たとえば、ｎが少なくとも１（及び一般に３〜４）の整数である（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号：３３３）、及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号：３３４）を含むグリシン−セリンポリマー、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、及び他の柔軟なリンカーが挙げられる。或いは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマー、を含むが、これらに限定されない種々の非タンパク質様のポリマーが、リンカーとして使用されてもよい。
【００９５】
他のリンカー配列には、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの残基すべてではないが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の長さの配列が挙げられ、たとえば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５〜１２アミノ酸残基が挙げられる。リンカーは免疫グロブリン軽鎖、たとえば、ＣκまたはＣλに由来することができる。リンカーは、たとえば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、及びＣμを含む、任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来することができる。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（たとえば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）のような他のタンパク質、ヒンジ領域に由来する配列、及び他のタンパク質に由来する天然の配列に由来してもよい。
【００９６】
一部の実施形態では、リンカーは、本明細書で一緒に要点が述べられているような２つのドメインを連結するのに使用される「ドメインリンカー」である。好適なリンカーのいずれをも使用することができる一方で、多数の実施形態は、たとえば、ｎが少なくとも１（及び一般に３〜４〜５）の整数である（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３３２）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号：３３３）、及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号：３３４）を含むグリシン−セリンポリマー、と同様に十分な長さと柔軟性を持つ２つのドメインの組換え連結を可能にして各ドメインにその生物学的機能を保持させる任意のタンパク質配列を利用する。場合によっては、及び以下で要点が述べられているような「特定の種類の鎖」に対して注意を払って、ｓｃＦｖリンカーの一部の実施形態にて使用されるような荷電ドメインリンカーを使用することができる。
【００９７】
一部の実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは荷電ｓｃＦｖリンカーであり、その多くは図３３で示されている。従って、本発明はさらに、荷電ｓｃＦｖリンカーを提供して第１と第２の単量体の間でのｐＩでの分離を促す。すなわち、正または負（または異なる単量体でｓｃＦｖを使用する足場の場合、双方）の荷電ｓｃＦｖリンカーを組み込むことによって、これは、Ｆｃドメインにてさらなる変化を起こすことなく、荷電リンカーを含む単量体がｐＩを変えるのを可能にする。これらの荷電リンカーはｓｃＦｖが含有する標準のリンカーに置換することができる。再び、当業者によって十分に理解されるように、ｐＩにおける所望の変化に従って、荷電ｓｃＦｖリンカーは正しい「鎖」または単量体で使用される。たとえば、本明細書で議論されているように、トリプルＦ形式のヘテロ二量体抗体を作るには、所望の抗原結合ドメインのそれぞれについてＦｖ領域の元々のｐＩを算出し、１つを選択してｓｃＦｖを作り、ｐＩに応じて正または負のリンカーを選択する。
【００９８】
荷電ドメインリンカーを使用しても同様に本発明の単量体のｐＩ分離を高めることができるので、図３３で挙げられたものを、リンカーが利用される本明細書の任意の実施形態にて使用することができる。
【００９９】
一部の実施形態では、抗体は完全長である。本明細書での「完全長の抗体」によって、可変領域及び定常領域を含み、特にヘテロ二量体化形成またはホモ二量体から離れてのヘテロ二量体の精製を可能にするＦｃドメインにおける本明細書で要点が述べられているような１以上の修飾を含む抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。完全長の抗体は一般にＦａｂ及びＦｃのドメインを含み、さらに、図にて一般に描写されているようなｓｃＦｖのような余分な抗原結合ドメインを含有することができる。
【０１００】
一実施形態では、抗体は、それがｐＩ操作のようなヘテロ二量体を生じるように操作することができる少なくとも１つの定常ドメインを含有する限り、抗体断片である。使用することができる他の抗体断片には、ｐＩ操作されている本発明のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジ及びＣＬのドメインの１以上を含有する断片が挙げられる。たとえば、Ｆｃ融合物は、別のタンパク質に融合したＦｃ領域（ＣＨ２及びＣＨ３、任意でヒンジ領域を伴う）の融合物である。多数のＦｃ融合物が当該技術で既知であり、本発明のヘテロ二量体化変異体の付加によって改善することができる。この場合、ＣＨ１；ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３；ＣＨ２；及びＣＨ３；ＣＨ１及びＣＨ３を含む抗体融合物を作製することができ、そのいずれかまたはすべては本明細書に記載されているヘテロ二量体化変異体の組み合わせを利用して任意でヒンジ領域と共に作製することができる。
【０１０１】
特に、図１に描かれた形式は普通、「ヘテロ二量体抗体」と呼ばれ、タンパク質がヘテロ二量体Ｆｃドメインに自己集合した少なくとも２つの関連するＦｃ配列を有することを意味する抗体である。
【０１０２】
キメラ抗体及びヒト化抗体
一部の実施形態では、抗体は異なる種に由来する混合物であることができ、たとえば、キメラ抗体及び／またはヒト化抗体であることができる。一般に、「キメラ抗体」及び「ヒト化抗体」は双方とも１を超える種に由来する領域を組み合わせる抗体を指す。たとえば、「キメラ抗体」は従来、マウス（場合によっては、ラット）に由来する可変領域（複数可）とヒトに由来する定常領域（複数可）とを含む。「ヒト化抗体」は一般に、ヒト抗体で見いだされる配列について交換された可変ドメインのフレームワーク領域を有している非ヒト抗体を指す。一般に、ヒト化抗体では、ＣＤＲを除く抗体全体がヒト起源のポリヌクレオチドによってコードされ、またはＣＤＲ内を除いてそのような抗体と同一である。ＣＤＲは、その一部またはすべてが非ヒト生物を起源とする核酸によってコードされ、ヒト抗体可変領域のベータシートフレームワークに移植されて抗体を作り出し、その特異性は生着したＣＤＲによって決定される。そのような抗体の作出は、たとえば、すべて参照によって全体的に組み入れられるＷＯ９２／１１０１８，Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６に記載されている。選択されたアクセプターフレームワーク残基の相当するドナー残基への「復帰突然変異」は最初の移植された構築物で失われる親和性を取り戻すのに必要とされることが多い（すべて参照によって全体的に組み入れられるＵＳ５５３０１０１；ＵＳ５５８５０８９；ＵＳ５６９３７６１；ＵＳ５６９３７６２；ＵＳ６１８０３７０；ＵＳ５８５９２０５；ＵＳ５８２１３３７；ＵＳ６０５４２９７；ＵＳ６４０７２１３）。ヒト化抗体は最適には免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部も、通常、ヒト免疫グロブリンのそれを含むので、通常ヒトＦｃ領域を含むであろう。ヒト化抗体は遺伝子操作された免疫系を持つマウスを用いても生成することができる。参照によって全体的に組み入れられるＲｏｑｕｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４。ヒト化する及び非ヒト抗体を作り直す種々の技法及び方法は当該技術で周知である（すべて参照によって全体的に組み入れられるＴｓｕｒｕｓｈｉｔａ  ＆  Ｖａｓｑｕｅｚ，２００４，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ，５３３−５４５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ），及びその中で引用された参考文献を参照のこと）。ヒト化の方法には、すべて参照によって全体的に組み入れられるＪｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６；Ｑｕｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８６：１００２９−３３；Ｈｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９−１０３５；Ｃａｒｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５−９，Ｐｒｅｓｔａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７（２０）：４５９３−９；Ｇｏｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：４１８１−４１８５；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１１：３２１−８に記載されている方法が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト化の方法及び非ヒト抗体可変領域の免疫原性を減らす他の方法には、たとえば、参照によって全体的に組み入れられるＲｏｇｕｓｋａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：９６９−９７３に記載されているような表面再構成法が挙げられてもよい。
【０１０３】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、特定の生殖系列の重鎖免疫グロブリン遺伝子に由来する重鎖可変領域及び／または特定の生殖系列の軽鎖免疫グロブリン遺伝子に由来する軽鎖可変領域とを含む。たとえば、そのような抗体は、特定の生殖系列の配列「の産物」であるまたは「それに由来する」重鎖または軽鎖の可変領域を含むヒト抗体を含んでもよく、またはそれから成ってもよい。ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるまたは「それに由来する」ヒト抗体は、ヒト生殖系列の免疫グロブリンのアミノ酸配列とヒト抗体のアミノ酸配列を比較し、ヒト抗体の配列に配列で最も近い（すなわち、最大の％同一性）ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列を選択することによってそのようなものとして特定することができる。特定のヒト生殖系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるまたは「それに由来する」ヒト抗体は、たとえば、天然に存在する体細胞突然変異または部位特異的突然変異の故意の導入によって、生殖系列の配列に比べてアミノ酸の差異を含有してもよい。しかしながら、ヒト化抗体は通常、ヒト生殖系列の免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列で少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖系列の免疫グロブリンアミノ酸配列（たとえば、マウスの生殖系列の配列）と比べた場合、ヒト配列に由来すると抗体を特定するアミノ酸残基を含有する。一部の例では、ヒト化抗体は、生殖系列の免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列で少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であってもよい。通常、特定のヒト生殖系列の配列に由来するヒト化抗体は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列からのわずか１０〜２０アミノ酸の差異を示すにすぎない（非対称、ｐＩ及び消失の本明細書の変異体の導入に先立って；すなわち、変異体の数が一般に少ない、本発明の変異体の導入に先立って）。一部の例では、ヒト化抗体は、生殖系列の免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列からのわずか５、またはさらにわずか４、３、２もしくは１のアミノ酸差異を示してもよい（再び、非対称、ｐＩ及び消失の本明細書の変異の導入に先立って；すなわち、変異体の数が一般に少ない、本発明の変異体の導入に先立って）。
【０１０４】
一実施形態では、親抗体は当該技術で知られるように、親和性成熟している。ヒト化及び親和性成熟について、たとえば、ＵＳＳＮ，１１／００４，５９０に記載されているような構造に基づく方法が採用されてもよい。抗体の可変領域をヒト化し、及び／または親和性成熟させるのに、すべて参照によって全体的に組み入れられるＷｕ  ｅｔ，ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２；Ｂａｃａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８−１０６８４；Ｒｏｓｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３７）：２２６１１−２２６１８；Ｒａｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：８９１０−８９１５；Ｋｒａｕｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１６（１０）：７５３−７５９に記載されている方法を含むが、これらに限定されない選択に基づく方法が採用されてもよい。他のヒト化法には、すべて参照によって全体的に組み入れられるＵＳＳＮ，０９／８１０，５１０；Ｔａｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−１１２５；Ｄｅ  Ｐａｓｃａｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６−３０８４に記載されている方法を含むが、これらに限定されないＣＤＲの一部だけを移植することが関与してもよい。
【０１０５】
ＩＶ．ヘテロ二量体抗体
従って、一部の実施形態では、本発明は、自己集合してヘテロ二量体抗体を形成する２つの異なる重鎖可変Ｆｃドメインの使用に頼るヘテロ二量体抗体を提供する。
【０１０６】
本発明は、１を超える抗原またはリガンドへの結合を可能にする、たとえば、二重特異性結合を可能にするヘテロ二量体抗体を提供する新規の構築物を指向する。ヘテロ二量体抗体の構築物は、抗体の重鎖の２つのＦｃドメイン、たとえば、「二量体」に集合する２つの「単量体」の自己集合する性質に基づく。ヘテロ二量体抗体は、以下でさらに完全に議論されているように、各単量体のアミノ酸配列を変えることによって作製される。従って、本発明は一般に、各鎖で異なってヘテロ二量体の形成を促進する及び／またはホモ二量体に比べたヘテロ二量体の精製の容易さを可能にする定常領域におけるアミノ酸変異体を頼って、幾つかの方法で抗原を同時結合することができるヘテロ二量体抗体を作り出すことを指向する。
【０１０７】
従って、本発明は二重特異性抗体を提供する。抗体技法における進行中の課題は、２つの異なる抗原に同時に結合するので、一般に異なる抗原が近傍にもたらされるのを可能にし、且つ新しい機能性及び新しい治療法を生じる「二重特異性」抗体に対する切望である。一般に、これらの抗体は各重鎖及び軽鎖についての遺伝子を宿主細胞に含めることによって作製される。これは一般に、所望のヘテロ二量体（Ａ−Ｂ）と同様に２つのホモ二量体（Ａ−Ａ及びＢ−Ｂ（軽鎖ヘテロ二量体の課題を含まない））の形成を生じる。しかしながら、二重特異性抗体の形成における主要な障害は、ホモ二量体から離れてヘテロ二量体抗体を精製すること及び／またはホモ二量体の形成に対してヘテロ二量体の形成にバイアスをかけることにおける困難さである。
【０１０８】
本発明のヘテロ二量体を生成するのに使用することができる多数のメカニズムがある。加えて、当業者によって十分に理解されるように、これらのメカニズムを組み合わせて高いヘテロ二量体化を確保することができる。従って、ヘテロ二量体の生産をもたらすアミノ酸変異体は「ヘテロ二量体化変異体」と呼ばれる。以下で議論されるように、ヘテロ二量体化変異体には、立体変異体（たとえば、以下に記載されているような「ノブアンドホール（ｋｎｏｂｓ  ａｎｄ  ｈｏｌｅｓ）」または「非対称」変異体、及び以下に記載されているような「電荷ペア」変異体）と同様にヘテロ二量体から離れてホモ二量体の精製を可能にする「ｐＩ変異体」を挙げることができる。その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２０１４／１４５８０６にて一般的に記載され、「ヘテロ二量体化変異体」の議論について以下のように具体的に記載されているように、ヘテロ二量体化の有用なメカニズムには、「ノブアンドホール」（「ＫＩＨ」；本明細書では時に「非対称」変異体（ＷＯ２０１４／１４５８０６における議論を参照）、ＷＯ２０１４／１４５８０６に記載されているような「静電的ステアリング」または「電荷ペア」、ＷＯ２０１４／１４５８０６に記載されているようなｐＩ変異体、及びＷＯ２０１４／１４５８０６及び以下で要点が述べられているような一般的な追加のＦｃ変異体が挙げられる。
【０１０９】
本発明では、ヘテロ二量体抗体を精製する容易さをもたらすことができる幾つかの基本的なメカニズムがあり；１つは、各単量体が異なるｐＩを有するようにｐＩ変異体の使用に頼るので、従ってＡ−Ａ、Ａ−Ｂ及びＢ−Ｂ二量体タンパク質の等電点精製を可能にする。或いは、「トリプルＦ」形式のような一部の足場形式もサイズを基にした分離を可能にする。以下でさらに要点が述べられているように、ホモ二量体に比べてヘテロ二量体の形成を非対称にすることも可能である。従って、立体ヘテロ二量体化変異体及びｐＩ変異体または電荷ペア変異体の組み合わせは本発明で特に使用される。
【０１１０】
一般に、本発明の特定の使用の実施形態は、非対称変異体を含む、ホモ二量体化形成に比べてヘテロ二量体化形成を促す、２つの単量体間でｐＩの差異を高めるｐＩ変異体と対にする変異体のセットを頼りにする。
【０１１１】
さらに、以下でさらに完全に要点が述べられているように、ヘテロ二量体抗体の形式に応じて、ｐＩ変異体を単量体の定常ドメイン及び／またはＦｃドメインの範囲内に含有することができ、または荷電リンカーであるドメインリンカーもしくはｓｃＦｖリンカーを使用することができる。すなわち、トリプルＦ形式のようなｓｃＦｖ（複数可）を利用する足場は、精製目的のためにさらなるｐＩの上昇を付与する荷電ｓｃＦｖリンカー（正または負のいずれか）を含むことができる。当業者によって十分に理解されるように、本発明は単量体の一方または双方にあるｐＩ変異体、及び／または同様に荷電ドメインリンカーを提供するが、一部のトリプルＦ形式は単に荷電したｓｃＦｖリンカーと共に有用であり、追加のｐＩ調整はいらない。加えて、たとえば、Ｆｃ、ＦｃＲｎ及びＫＯの変異体のような、代替の機能性のための追加のアミノ酸操作もｐＩの変化を付与する。
【０１１２】
ｐＩを分離メカニズムとして利用してヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にする本発明では、単量体ポリペプチドの一方または双方にアミノ酸変異体を導入することができ；すなわち、単量体の一方（単純化のために本明細書では「単量体Ａ」と呼ぶ）を単量体Ｂとは離れて操作することができ、または双方の単量体Ａ及びＢを変えることができ、単量体ＡのｐＩが上昇し、単量体ＢのｐＩが低下する。以下でさらに完全に要点が述べられているように、一方または双方の単量体のｐＩの変化は、荷電残基を取り除く、または付加すること（たとえば、中性アミノ酸を正または負に荷電したアミノ酸残基によって置き換える、たとえば、グリシンをグルタミン酸に置き換える）、荷電した残基を正または負の荷電から反対の荷電に変える（アスパラギン酸からリジンに）こと、または荷電した残基を中性残基に変える（たとえば、荷電の喪失；リジンからセリンに）ことによって実施することができる。多数のこれらの変異体が図面に示されている。
【０１１３】
従って、本発明のこの実施形態は、ヘテロ二量体をホモ二量体から分離することができるように単量体の少なくとも一方でｐＩに十分な変化を作り出すことを提供する。当業者によって十分に理解されるように、且つ以下でさらに議論されるように、これは、「野生型」重鎖定常領域と、そのｐＩを上げるまたは下げるように（ｗｔＡ−＋ＢまたはＡ−−Ｂ）操作されている可変領域とを用いること、または一方の領域を上げ、他方の領域を下げる（Ａ＋−Ｂ−またはＡ−Ｂ＋）ことによって実施することができる。
【０１１４】
従って、一般に、本発明の一部の実施形態の成分は、二量体タンパク質の双方でなければ少なくとも一方の単量体の等電点（ｐＩ）を変えて、アミノ酸置換（「ｐＩ変異体」または「ｐＩ置換」）を一方または双方の単量体に組み込むことによって「ｐＩ抗体」を形成することを指向する抗体の定常領域におけるアミノ酸変異体である。本明細書で示されるように、２つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、２つの単量体のｐＩがわずか０．１ｐＨ単位、０．２、０．３、０．４及び０．５以上異なれば、これらはすべて本発明にて使用可能である。
【０１１５】
当業者によって十分に理解されるように、良好な分離を得るために各々のまたは双方の単量体（複数可）に含められるｐＩ変異体の数は、たとえば、トリプルＦ形式における成分の出発ｐＩ、対象とするｓｃＦｖ及びＦａｂの出発ｐＩに一部左右されるであろう。すなわち、どの単量体を操作するかまたはどの「方向」（たとえば、さらに正またはさらに負）で操作するかを決定するために、２つの標的抗原のＦｖ配列を計算し、それから決定が為される。当該技術で知られるように、異なるＦｖが本発明で検討される異なる出発ｐＩを有するであろう。一般に、本明細書で要点が述べられているように、ｐＩを操作して少なくとも約０．１ｌｏｇの各単量体の合計のｐＩの差異を生じ、本明細書で要点が述べられているように０．２〜０．５が好ましい。
【０１１６】
さらに、当業者によって十分に理解されるように、且つ本明細書で要点が述べられているように、一部の実施形態では、ヘテロ二量体はサイズに基づいてホモ二量体から分離することができる。たとえば、図１に示すように、幾つかの形式がサイズに基づくヘテロ二量体とホモ二量体からの分離を可能にする。
【０１１７】
重鎖（複数可）の定常領域（複数可）を用いてヘテロ二量体化を達成するのにｐＩ変異体を使用する場合、抗体を含む二重特異性タンパク質を設計し、精製するさらなるモジュール的なアプローチが提供される。従って、一部の実施形態では、ヘテロ二量体化変異体（非対称及び精製のヘテロ二量体化変異体を含む）は可変領域には含まれないので、各個々の抗体が操作されなければならない。加えて、一部の実施形態では、ｐＩ変異体から生じる免疫原性の可能性は、有意な免疫原性を導入しないでｐＩを変化させるように異なるＩｇＧアイソタイプからのｐＩを移入することによって有意に低減される。従って、解決される追加の課題は、ヒト配列の含量が高い、低いｐＩの定常ドメインの解明、たとえば、任意の特定の位置での非ヒト残基の最少化または回避である。
【０１１８】
このｐＩ操作と共に生じ得る副効用は血清半減期の延長及びＦｃＲｎ結合の上昇でもある。すなわち、ＵＳＳＮ１３／１９４，９０４（その全体が参照によって組み入れられる）にて記載されているように、抗体定常ドメイン（抗体及びＦｃ融合物で見いだされるものを含む）のｐＩを下げることは生体内でさらに長い血清保持をもたらすことができる。血清半減期の増加ためのこれらのｐＩ変異体は精製のためのｐＩ変化も促す。
【０１１９】
加えて、ホモ二量体が存在する場合、排除または最少化し、区別する能力が重要なので、ヘテロ二量体化変異体のｐＩ変異体は二重特異性抗体の分析性及び品質管理工程について追加の利益を付与することが言及されるべきである。同様に、ヘテロ二量体抗体の産生の再現性を確実に調べる能力が重要である。
【０１２０】
ヘテロ二量体化変異体
本発明は、ヘテロ二量体変異体を利用してヘテロ二量体の形成及び／またはホモ二量体から離れての精製を可能にする、種々の形式でのヘテロ二量体抗体を含むヘテロ二量体タンパク質を提供する。
【０１２１】
ヘテロ二量体化非対称変異体のセットの多数の好適なペアがある。これらの変異体は、「セット」の「ペア」で供給される。すなわち、ペアの一方のセットが第１の単量体に組み込まれ、ペアの他方のセットが第２の単量体に組み込まれる。これらのセットは「ノブインホール（ｋｎｏｂｓ  ｉｎ  ｈｏｌｅｓ）」変異体として必ずしも挙動せず、一方の単量体における残基と他方の単量体における残基との間で一対一の対応があり、すなわち、セットのこれらのペアは、ヘテロ二量体の形成を促し、ホモ二量体の形成を妨害する２つの単量体間での界面を形成し、予想される５０％（２５％ホモ二量体Ａ／Ａ：５０％ヘテロ二量体Ａ／Ｂ：２５％ホモ二量体Ｂ／Ｂ）ではなく９０％を超える生物学的条件下で自然に形成するヘテロ二量体の比率を可能にすることが言及されるべきである。
【０１２２】
立体変異体
一部の実施形態では、ヘテロ二量体の形成は立体変異体の付加によって促進され得る。すなわち、各重鎖におけるアミノ酸を変化させることによって、異なる重鎖が、同じＦｃアミノ酸配列とのホモ二量体を形成するよりも高い可能性でヘテロ二量体構造を形成するように会合する。好適な立体変異体は図２９に挙げられている。
【０１２３】
メカニズムの１つは一般に、当該技術では「ノブアンドホール」と呼ばれ、ヘテロ二量体の形成の方を好み、ホモ二量体の形成を嫌う立体的影響を作り出すアミノ酸操作を参照することも任意で使用することができ；これが時には、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＵＳＳＮ６１／５９６，８４６，Ｒｉｄｇｗａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９（７）：６１７（１９９６）；Ａｔｗｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７，２７０：２６；米国特許第８，２１６，８０５号に記載されているような「ノブアンドホール」と呼ばれる。図は、「ノブアンドホール」を頼る多数の「単量体Ａ−単量体Ｂ」のペアを特定している。加えて、Ｍｅｒｃｈａｎｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）に記載されているように、これらの「ノブアンドホール」突然変異はジスルフィド結合と組み合わせてヘテロ二量体化への形成を非対称にすることができる。
【０１２４】
ヘテロ二量体の生成で使用される追加のメカニズムは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）に記載されているような「静電的ステアリング」と呼ばれることがある。これは本明細書では「電荷ペア」と呼ばれることがある。この実施形態では、静電気を用いてヘテロ二量体化に向けた形成を非対称にする。当業者が十分に理解するように、これらもｐＩに対して影響を有してもよいので、精製に対して影響を有し、従って場合によっては、ｐＩ変異体であるとも見なされ得る。しかしながら、これらはヘテロ二量体化を強要するために生成され、精製ツールとしては使用されないので、それらは「立体変異体」として分類される。これらには、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒ（たとえば、これらは単量体対応セットである）と対合するＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ及びＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対合するＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
たとえば、本明細書で要点が述べられているｐＩ変異体またはその図面、説明文及び配列番号が参照によって明白に本明細書に組み入れられるＵＳ２０１２／０１４９８７６の図３７で示されている他の立体変異体のような他の変異体と任意で且つ独立して任意の量で組み合わせることができる追加の単量体Ａ及び単量体Ｂの変異体。
【０１２６】
一部の実施形態では、本明細書で要点が述べられている立体変異体は、任意のｐＩ変異体（またはたとえば、Ｆｃ変異体、ＦｃＲｎ変異体等のような他の変異体）と共に任意で且つ独立して一方または双方の単量体に組み込むことができ、独立して且つ任意で本発明のタンパク質に含めることができ、またはそれから排除することができる。
【０１２７】
好適な非対称の変異体のリストは図２９に見いだされ、図３４は多数の実施形態における特定の有用性の幾つかのペアを示す。多数の実施形態における特定の使用は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含むが、これらに限定されないセットのペアである。命名法という点で、ペア「Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ」は、単量体の一方が二重変異体セットＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを有し、他方が二重変異体セットＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを有することを意味する。
【０１２８】
ヘテロ二量体のためのｐＩ（等電点）変異体
一般に、当業者によって十分に理解されるように、ｐＩ変異体の２つの一般的なカテゴリー：タンパク質のｐＩを上げるもの（塩基性の変化）及びタンパク質のｐＩを下げるもの（酸性の変化）がある。本明細書に記載されているように、これらの変異体の組み合わせすべてを実施することができ：一方の単量体は野生型または野生型と有意に異なるｐＩを示さない変異体であってもよく、他方はさらに塩基性またはさらに酸性であることができる。或いは、各単量体は、１つがさらに塩基性に且つ１つがさらに酸性に変えられる。
【０１２９】
ｐＩ変異体の好ましい組み合わせを図３０にて示す。本明細書で要点が述べられているように、且つ図面で示されているように、これらの変化はＩｇＧ１に対して示されるが、すべてのアイソタイプはアイソタイプハイブリッドと同様にこのように変化させることができる。重鎖定常ドメインがＩｇＧ２〜４に由来する場合、Ｒ１３３Ｅ及びＲ１３３Ｑも使用することができる。
【０１３０】
一実施形態では、たとえば、栓抜き型形式では、ｐＩ変異体の好ましい組み合わせは、２０８Ｄ／２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄ変異体（ヒトＩｇＧ１に対する場合Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む一方の単量体（負のＦａｂ側）と、（ＧＫＰＧＳ）４を含む正に荷電したｓｃＦｖリンカーを含む第２の単量体（正のｓｃＦｖ側）を有する。しかしながら、当業者によって十分に理解されるように、第１の単量体は２０８位を含むＣＨ１ドメインを含む。従って、ＣＨ１ドメインを含まない構築物（たとえば、二重ｓｃＦｖ形式におけるドメインの１つでＣＨ１ドメインを利用しないヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質について）では、好ましい負のｐＩ変異体Ｆｃセットには２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄ変異体（ヒトＩｇＧ１に対する場合Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）が挙げられる。
【０１３１】
抗体ヘテロ二量体の軽鎖変異体
抗体に基づくヘテロ二量体の場合、たとえば、単量体の少なくとも一方が重鎖ドメインに加えて軽鎖を含む場合、ｐＩ変異体は軽鎖にても作ることができる。軽鎖のｐＩを下げるためのアミノ酸置換には、Ｋ１２６Ｅ、Ｋ１２６Ｑ、Ｋ１４５Ｅ、Ｋ１４５Ｑ、Ｎ１５２Ｄ、Ｓ１５６Ｅ、Ｋ１６９Ｅ、Ｓ２０２Ｅ、Ｋ２０７Ｅ及び軽鎖のｃ末端でのペプチドＤＥＤＥの付加が挙げられるが、これらに限定されない。定常ラムダ軽鎖に基づくこのカテゴリーにおける変化にはＲ１０８Ｑ、Ｑ１２４Ｅ、Ｋ１２６Ｑ、Ｎ１３８Ｄ、Ｋ１４５Ｔ及びＱ１９９Ｅでの１以上の置換が挙げられる。加えて、軽鎖のｐＩを上げることも行うことができる。
【０１３２】
アイソタイプ変異体
加えて、本発明の多数の実施形態は、特定の位置でのｐＩアミノ酸の１つのＩｇＧアイソタイプから別のアイソタイプへの移入に頼るので、変異体に導入される望ましくない免疫原性の可能性を減らすまたは排除する。これらの多数は、参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ公開２０１４／０３７００１３の図２１にて示されている。すなわち、ＩｇＧ１は高いエフェクター機能を含む種々の理由で治療用抗体のための共通するアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重鎖定常領域はＩｇＧ２のそれよりも高いｐＩを有する（８．１０対７．３１）。ＩｇＧ１主鎖に特定の位置でのＩｇＧ２の残基を導入することによって、得られる単量体のｐＩが低下し（または上昇し）、さらに長い血清半減期を示す。たとえば、ＩｇＧ１は１３７位でグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２はグルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有し；グルタミン酸を移入することは得られるタンパク質のｐＩに影響を与えるであろう。以下で議論されているように、変異体抗体のｐＩに有意に影響を及ぼすには多数のアミノ酸置換が一般に必要とされる。しかしながら、以下で議論されているように、ＩｇＧ２におけるさらなる変化が長い血清半減期を可能にすることが言及されるべきである。
【０１３３】
他の実施形態では、得られるタンパク質の全体的な荷電状態を軽減するために（たとえば、高いｐＩのアミノ酸を低いｐＩのアミノ酸に変化させることによって）、または以下でさらに記載されているように安定性等のための構造における適応を可能にするために、非アイソタイプアミノ酸の変化が行われる。
【０１３４】
加えて、重鎖及び軽鎖の定常ドメイン双方をｐＩ操作することによってヘテロ二量体の各単量体にて有意な変化を見ることができる。本明細書で議論されているように、少なくとも０．５異なる２つの単量体のｐＩを有することはイオン交換クロマトグラフィまたは等電点電気泳動、または等電点に感受性の他の方法による分離を可能にすることができる。
【０１３５】
ｐＩを算出すること
各単量体のｐＩは、変異体の重鎖定常ドメインのｐＩ及び変異体重鎖定常ドメインと融合相手を含む単量体全体のｐＩに依存することができる。従って、一部の実施形態では、ｐＩにおける変化は、ＵＳ公開２０１４／０３７００１３の図１９におけるチャートを用いて変異体の重鎖定常ドメインに基づいて算出される。本明細書で議論されているように、どの単量体を操作するかは、Ｆｖ及び足場領域の固有のｐＩによって一般に決定される。或いは、各単量体のｐＩを比較することができる。
【０１３６】
生体内の結合でさらに良好なＦｃＲｎも付与するｐＩ変異体
ｐＩ変異体が単量体のｐＩを低下させる場合、それらは生体内での血清保持を改善する追加の利益を有することができる。
【０１３７】
未だに検討中ではあるが、エンドソームにおけるｐＨ６でのＦｃＲｎへの結合がＦｃを隔離する（参照によって全体的に組み入れられるＧｈｅｔｉｅ及びＷａｒｄ，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ．１８（１２）：５９２−５９８）ので、Ｆｃ領域は生体内で長い半減期を有すると考えられている。次いでエンドソーム区画は細胞表面までＦｃを再利用する。区画が細胞外空間に向かっていったん開くと、さらに高い約７．４のｐＨがＦｃの血中へ戻る放出を誘導する。マウスでは、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａらは、ｐＨ６及びｐＨ７．４での高いＦｃＲｎ結合を伴うＦｃ突然変異は実際、低い血清濃度及び野生型Ｆｃと同じ半減期を有することを示した（参照によって全体的に組み入れられるＤａｌｌ’  Ａｃｑｕａ，ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５１７１−５１８０）。ｐＨ７．４でのＦｃＲｎへのＦｃの高い親和性は、血中に戻るＦｃの放出を禁じると考えられる。従って、生体内でのＦｃの半減期を増やすＦｃ突然変異は、低いｐＨでのＦｃＲｎ結合を理想的に高める一方で、高いｐＨでのＦｃの放出を可能にする。アミノ酸ヒスチジンは６．０〜７．４のｐＨ範囲でその荷電状態を変化させる。従って、Ｆｃ／ＦｃＲｎ複合体における重要な位置でＨｉｓ残基が見いだされるのは驚くべきではない。
【０１３８】
最近、低い等電点を有する可変領域を持つ抗体もさらに長い血清半減期を有してもよいことが示唆されている（参照によって全体的に組み入れられるＩｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＰＥＤＳ．２３（５）：３８５−３９２）。しかしながら、このメカニズムは未だに不十分にしか理解されていない。さらに、可変領域は抗体ごとに異なる。低いｐＩ及び長い半減期を持つ定常領域の変異体は、本明細書に記載されているように、抗体の薬物動態特性を改善するさらにモジュール的なアプローチを提供する。
【０１３９】
追加の機能性のための追加のＦｃ変異体
ｐＩアミノ酸変異体に加えて、１以上のＦｃγＲ受容体への結合を変えること、ＦｃＲｎ受容体への変化した結合、等を含むが、これらに限定されない種々の理由で、行うことができる多数の有用なＦｃアミノ酸の修飾がある。
【０１４０】
従って、本発明のタンパク質は、ｐＩ変異体及び立体変異体を含む本明細書で要点が述べられているヘテロ二量体化変異体を含むアミノ酸修飾を含むことができる。変異体の各セットは独立して且つ任意で特定のヘテロ二量体タンパク質に含めることができ、またはそれから排除することができる。
【０１４１】
ＦｃγＲ変異体
従って、ＦｃγＲ受容体の１以上への結合を変化させるために行うことができる多数の有用なＦｃ置換がある。増加した結合と同様に低下した結合を生じる置換は有用であることができる。たとえば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加は一般に高いＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性の細胞傷害性；ＦｃγＲを発現している非特異的な細胞傷害性細胞が標的細胞上で結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす細胞が介在する反応）を生じることが知られている。同様に、ＦｃγＲＩＩｂ（阻害性受容体）への結合の低下は一部の状況では同様に有益であり得る。本発明で使用されるアミノ酸置換には、そのすべてが全体として参照によって明白に、及びその中で開示された変異体について具体的に本明細書に組み入れられるＵＳＳＮｓ１１／１２４，６２０（特に図４１）、１１／１７４，２８７、１１／３９６，４９５、１１／５３８，４０６にてリストにしたものが挙げられる。使用される特定の変異体には、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖ及び２９９Ｔが挙げられる。
【０１４２】
加えて、４３４Ｓ、４３４Ａ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６ＩまたはＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ及び２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌを含むが、これらに限定されない、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＵＳＳＮ１２／３４１，７６９にて具体的に開示されたような、ＦｃＲｎ受容体への結合の増加及び血清半減期の増加で使用される追加のＦｃ置換がある。
【０１４３】
消失変異体
同様に、機能的変異体の別のカテゴリーは、「ＦｃγＲ消失変異体」または「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯまたはＫＯ）」変異体である。これらの実施形態では、一部の治療応用について、Ｆｃγ受容体（たとえば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、等）の１以上またはすべてへのＦｃドメインの正常な結合を減らしてまたは除去して作用の追加のメカニズムを回避することが望ましい。すなわち、たとえば、多数の実施形態では、特にＣＤ３を一価で結合する二重特異性抗体の使用では、ＦｃγＲＩＩＩａの結合を消失させてＡＤＣＣ活性を排除するまたは有意に低下させることが一般に望ましく、その際、Ｆｃドメインの１つが１以上のＦｃγ受容体消失変異体を含む。これらの消失変異体は図３１で描かれ、それぞれを独立して且つ任意で含めることができ、または排除することができ、好ましい態様は、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌから成る群から選択される消失変異体を利用する。本明細書で参照される消失変異体はＦｃγＲの結合を消失させるが、ＦｃＲｎの結合は一般に消失させないことが言及されるべきである。
【０１４４】
ヘテロ二量体変異体とＦｃ変異体の組み合わせ
当業者によって十分に理解されるように、引用されるヘテロ二量体化変異体（非対称変異体及び／またはｐＩ変異体を含む）のすべては、それらが「特定の種類の鎖」または「単量体の区分」を保持する限り、任意で且つ独立してどんな方法でも組み合わせることができる。加えて、これら変異体のすべてはヘテロ二量体化形式のいずれかと組み合わせることができる。
【０１４５】
ｐＩ変異体の場合、特定の使用を見いだす実施形態は図面に示されている一方で、他の組み合わせは、２つの単量体間のｐＩの差異を変えて精製を促す基本的な規則に従って生成することができる。
【０１４６】
加えて、本明細書で一般的に要点が述べられているように、ヘテロ二量体化変異体、非対称変異体及びｐＩ変異体のいずれかも独立して且つ任意でＦｃ消失変異体、Ｆｃ変異体、ＦｃＲｎ変異体と組み合わせられる。
【０１４７】
本発明の有用な形式
当業者によって十分に理解されるように、且つ以下でさらに完全に議論されているように、本発明のヘテロ二量体融合タンパク質は図１で一般に描かれるように様々な立体配置を採用することができる。一部の図は、分子の一方のアームに１つの種類の特異性があり、他方のアームに異なる特異性がある「シングルエンド型」の立体配置を描いている。他の図は、分子の「最上部」に１つの種類の特異性があり、分子の「最下部」に１以上の異なる特異性がある「デュアルエンド型」の立体配置を描いている。従って、本発明は異なる第１と第２の抗原を同時結合する新規の免疫グロブリン組成物を指向する。
【０１４８】
当業者によって十分に理解されるように、本発明のヘテロ二量体形式は二重特異性であると同様に異なる価数を有することができる。すなわち、本発明のヘテロ二量体抗体は二価であり且つ二重特異性であることができ、その際、ＣＤ３は一方の結合ドメインによって結合され、ＣＤ３８は第２の結合ドメインによって結合される。ヘテロ二量体抗体は三価であり且つ二重特異性であることができ、その際、ＣＤ３８は２つの結合ドメインによって結合され、ＣＤ３は第２の結合ドメインによって結合される。本明細書で要点が述べられているように、ＣＤ３は一価のみで結合されて潜在的な副作用を減らすことが好ましい。
【０１４９】
本発明は、抗ＣＤ３抗原結合ドメインと抗ＣＤ３８抗原結合ドメインとを利用する。当業者によって十分に理解されるように、図（特に図２〜図７及び図６８）のいずれかで描かれているような抗ＣＤ３ＣＤＲ、抗ＣＤ３可変軽鎖及び可変重鎖のドメイン、Ｆａｂ及びｓｃＦｖのいずれかのグループをも使用することができる。同様に、図（図８、９及び１０を参照）のいずれかで描かれているような抗ＣＤ３８ＣＤＲ、抗ＣＤ３８可変軽鎖及び可変重鎖のドメイン、Ｆａｂ及びｓｃＦｖであろうとなかろうと抗ＣＤ３８抗原結合ドメインのいずれかを使用し、任意で且つ独立して任意の組み合わせで組み合わせることができる。
【０１５０】
栓抜き型形式
本発明で特に使用されるヘテロ二量体足場の１つは、図１Ａ、Ａ及びＢで示されているような「トリプルＦ」または「栓抜き」型の足場形式である。この実施形態では、抗体の一方の重鎖は単鎖Ｆｖ（以下で定義されるような「ｓｃＦｖ」）を含有し、他方の重鎖は可変の重鎖及び軽鎖を含む「定番の」ＦＡｂ形式である。この構造は本明細書では、「トリプルＦ」形式（ｓｃＦｖ−Ｆａｂ−Ｆｃ）または視覚的に大まかに栓抜きに似ているので「栓抜き型」形式と呼ばれることがある（図１を参照のこと）。２つの鎖は、以下でさらに完全に記載されているように、ヘテロ二量体抗体の形成を促進する定常領域（たとえば、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン及び／またはヒンジ領域）におけるアミノ酸変異体の使用によって接合される。
【０１５１】
この「トリプルＦ」形式に対して幾つかの異なる利点がある。当該技術で知られるように、２つのｓｃＦｖ構築物を頼りにする抗体類似体は安定性及び凝集の課題を有することが多く、「定番の」重鎖及び軽鎖の対合を加えることによって本発明にてそれを軽減することができる。加えて、２つの重鎖及び２つの軽鎖を頼りにする形式とは対照的に、重鎖と軽鎖の不正確な対合（たとえば、軽鎖２と対合する重鎖１、等）による課題はない。
【０１５２】
本明細書で要点が述べられている実施形態の多くは一般に、ｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖリンカー（多くの場合、荷電した）を用いて共有結合した可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインとを含む第１の単量体を含む栓抜き型形式を頼り、その際、ｓｃＦｖは普通ドメインリンカー（本明細書で要点が述べられているように、非荷電または荷電であることができる）を介して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合する。栓抜き型形式の第２の単量体は重鎖であり、組成物はさらに軽鎖を含む。
【０１５３】
一般に、多数の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖはＣＤ３に結合するドメインであり、重鎖及び軽鎖のＦａｂがＣＤ３８に結合する。加えて、本発明のＦｃドメインは一般に、非対称変異体（たとえば、図２９及び図３４で示されるようなアミノ酸置換のセット；特に有用な非対称変異体はＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ及びＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑから成る群から選択される）、任意で消失変異体を含み、重鎖はｐＩ変異体を含む。
【０１５４】
本発明は、抗ＣＤ３のｓｃＦｖ配列が図２〜７及び図６８にて示される栓抜き型形式を提供する。
【０１５５】
本発明は抗ＣＤ３８の配列が図８〜１０にて示される栓抜き型形式を提供する。
【０１５６】
ｍＡｂ−Ｆｖ形式
本発明で特に使用されるヘテロ二量体の足場の１つは図１で示されるｍＡｂ−Ｆｖ形式である。この実施形態では、形式は、一方の単量体への「余分な」可変重鎖ドメインのＣ末端連結及び他方の単量体への「余分な」可変軽鎖ドメインのＣ末端連結の使用を頼り、従って第３の抗原結合ドメインを形成し、その際、２つの単量体のＦａｂ部分はＣＤ３８を結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインはＣＤ３を結合する。
【０１５７】
この実施形態では、第１の単量体は、第１の可変重鎖ドメインと第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖ドメインとを含む第１の重鎖を含み、第１の可変軽鎖ドメインはドメインリンカーを介して第１のＦｃドメインのＣ末端に共有結合する（ｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意のリンカー］−ｖｌ２）。第２の単量体は、第２の可変重鎖ドメインと、第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖ドメインと、ドメインリンカーを用いて第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合する第３の可変重鎖ドメインとを含む（ｖｊ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意のリンカー］−ｖｈ２）。２つのＣ末端で連結した可変ドメインがＣＤ３を結合するｓｃＦｖを作り出す。この実施形態はさらに、重鎖と会合してＣＤ３８を結合する２つの同一のＦａｂを形成する、可変軽鎖ドメインと定常軽鎖ドメインとを含む共通の軽鎖を利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、所望どおりに且つ本明細書に記載されているように、これらの構築物は、非対称変異体、ｐＩ変異体、消失変異体、追加のＦｃ変異体等を含む。
【０１５８】
本発明は、抗ＣＤ３のｓｃＦｖ配列が図２〜７にて示されるｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。
【０１５９】
本発明は、抗ＣＤ３８の配列が図８〜１０にて示されるｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。
【０１６０】
本発明は、図３１にて示されるような消失変異体を含むｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。
【０１６１】
本発明は、図２９及び３４にて示されるような非対称変異体を含むｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。
【０１６２】
ｍＡｂ−ｓｃＦｖ
本発明で特に使用されるヘテロ二量体の足場の１つは図１で示されるｍＡｂ−Ｆｖ形式である。この実施形態では、形式は、単量体の一方へのｓｃＦｖのＣ末端連結の使用に頼り、従って第３の抗原結合ドメインを形成し、その際、２つの単量体のＦａｂ部分がＣＤ３８を結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインがＣＤ３を結合する。従って、第１の単量体は第１の重鎖（可変重鎖ドメイン及び定常ドメインを含む）を含み、Ｃ末端で共有結合したｓｃＦｖはいずれかの方向性でｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインとｓｃＦｖリンカーとｓｃＦｖ可変重鎖ドメインとを含む（ｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意のリンカー］−ｖｈ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ２またはｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意のリンカー］−ｖｌ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ２）。この実施形態はさらに、重鎖と会合してＣＤ３８を結合する２つの同一のＦａｂを形成する、可変軽鎖ドメインと定常軽鎖ドメインとを含む共通の軽鎖を利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、所望どおりに且つ本明細書に記載されているように、これらの構築物は、非対称変異体、ｐＩ変異体、消失変異体、追加のＦｃ変異体等を含む。
【０１６３】
本発明は、抗ＣＤ３のｓｃＦｖ配列が図２〜７にて示されるｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式を提供する。
【０１６４】
本発明は、抗ＣＤ３８の配列が図８〜１０にて示されるｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式を提供する。
【０１６５】
本発明は、図３１にて示されるような消失変異体を含むｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式を提供する。
【０１６６】
本発明は、図２９及び３４にて示されるような非対称変異体を含むｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式を提供する。
【０１６７】
中央ｓｃＦｖ
本発明で特に使用されるヘテロ二量体の足場の１つは図１で示される中央ｓｃＦｖ形式である。この実施形態では、形式は、挿入されたｓｃＦｖドメインの使用を頼るので第３の抗原結合ドメインを形成し、その際、２つの単量体のＦａｂ部分がＣＤ３８を結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインがＣＤ３を結合する。ｓｃＦｖドメインは、一方の単量体のＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域の間に挿入されるので、第３の抗原結合ドメインを提供する。
【０１６８】
この実施形態では、一方の単量体は、第１の可変重鎖ドメインとＣＨ１ドメイン（及び任意でヒンジ）とＦｃドメインとを含む第１の重鎖を含み、ｓｃＦｖはｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインとｓｃＦｖリンカーとｓｃＦｖ可変重鎖ドメインとを含む。ｓｃＦｖは重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間で任意のドメインリンカーを用いて共有結合される（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意のリンカー］−ｖｈ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ２−［ヒンジを含む任意のリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３、またはｓｃＦｖについて反対の方向性、ｖｈ１−ＣＨ１−［任意のリンカー］−ｖｌ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ２−［ヒンジを含む任意のリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）。他方の単量体は標準のＦａｂ側である。この実施形態さらに、重鎖と会合してＣＤ３８を結合する２つの同一のＦａｂを形成する、可変軽鎖ドメインと定常軽鎖ドメインとを含む共通の軽鎖を利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、所望どおりに且つ本明細書に記載されているように、これらの構築物は、非対称変異体、ｐＩ変異体、消失変異体、追加のＦｃ変異体等を含む。
【０１６９】
本発明は、抗ＣＤ３のｓｃＦｖ配列が図２〜７にて示される中央−ｓｃＦｖ形式を提供する。
【０１７０】
本発明は、抗ＣＤ３８の配列が図８〜１０にて示される中央−ｓｃＦｖ形式を提供する。
【０１７１】
本発明は、図３１にて示されるような消失変異体を含む中央−ｓｃＦｖ形式を提供する。
【０１７２】
本発明は、図２９及び３４にて示されるような非対称変異体を含む中央−ｓｃＦｖ形式を提供する。
【０１７３】
中央−Ｆｖ形式
本発明で特に使用されるヘテロ二量体の足場の１つは図１で示される中央−Ｆｖ形式である。この実施形態では、形式は、挿入されたｓｃＦｖドメインの使用を頼るので第３の抗原結合ドメインを形成し、その際、２つの単量体のＦａｂ部分がＣＤ３８を結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインがＣＤ３を結合する。ｓｃＦｖドメインは、単量体のＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域の間に挿入されるので、第３の抗原結合ドメインを提供し、その際、各単量体はｓｃＦｖの成分を含有する（たとえば、一方の単量体が可変重鎖ドメインを含み、他方が可変軽鎖ドメインを含む）。
【０１７４】
この実施形態では、一方の単量体は、第１の可変重鎖ドメインとＣＨ１ドメインとＦｃドメインとを含む第１の重鎖と、追加の可変軽鎖ドメインとを含む。軽鎖ドメインは、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間でドメインリンカーを用いて共有結合される（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意のリンカー］−ｖｌ２−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）。他方の単量体は、第１の可変重鎖ドメインとＣＨ１ドメインとＦｃドメインと追加の可変重鎖ドメインを含む第１の重鎖を含む（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意のリンカー］−ｖｈ２−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）。軽鎖ドメインは、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間でドメインリンカーを用いて共有結合される。
【０１７５】
この実施形態はさらに、重鎖と会合してＣＤ３８を結合する２つの同一のＦａｂを形成する、可変軽鎖ドメインと定常軽鎖ドメインとを含む共通の軽鎖を利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、所望どおりに且つ本明細書に記載されているように、これらの構築物は、非対称変異体、ｐＩ変異体、消失変異体、追加のＦｃ変異体等を含む。
【０１７６】
本発明は、抗ＣＤ３のｓｃＦｖ配列が図２〜７にて示される中央−ｓｃＦｖ形式を提供する。
【０１７７】
本発明は、抗ＣＤ３８の配列が図８〜１０にて示される中央−ｓｃＦｖ形式を提供する。
【０１７８】
本発明は、図３１にて示されるような消失変異体を含む中央−ｓｃＦｖ形式を提供する。
【０１７９】
本発明は、図２９及び３４にて示されるような非対称変異体を含む中央−ｓｃＦｖ形式を提供する。
【０１８０】
１アームの中央−ｓｃＦｖ
本発明で特に使用されるヘテロ二量体の足場の１つは図１で示される１アームの中央−ｓｃＦｖ形式である。この実施形態では、一方の単量体は、単にＦｃドメインを含むが、他方の単量体は挿入されたｓｃＦｖドメインを使用するので第２の抗原結合ドメインを形成する。この形式では、Ｆａｂ部分がＣＤ３８を結合し、ｓｃＦｖがＣＤ３を結合し、または逆もまた同様である。ｓｃＦｖドメインは一方の単量体のＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入される。
【０１８１】
この実施形態では、一方の単量体は、第１の可変重鎖ドメインとＣＨ１ドメインとＦｃドメインとを含む第１の重鎖を含み、ｓｃＦｖはｓｃＦｖ可変軽鎖ドメインとｓｃＦｖリンカーとｓｃＦｖ可変重鎖ドメインとを含む。ｓｃＦｖは重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間でドメインリンカーを用いて共有結合される。第２の単量体はＦｃドメインを含む。この実施形態はさらに、重鎖と会合してＦａｂを形成する、可変軽鎖ドメインと定常軽鎖ドメインとを含む軽鎖を利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、所望どおりに且つ本明細書に記載されているように、これらの構築物は、非対称変異体、ｐＩ変異体、消失変異体、追加のＦｃ変異体等を含む。
【０１８２】
本発明は、抗ＣＤ３のｓｃＦｖ配列が図２〜７にて示される１アームの中央−ｓｃＦｖ形式を提供する。
【０１８３】
本発明は、抗ＣＤ３８の配列が図８〜１０にて示される１アームの中央−ｓｃＦｖ形式を提供する。
【０１８４】
本発明は、図３１にて示されるような消失変異体を含む１アームの中央−ｓｃＦｖ形式を提供する。
【０１８５】
本発明は、図２９及び３４にて示されるような非対称変異体を含む１アームの中央−ｓｃＦｖ形式を提供する。
【０１８６】
二重ｓｃＦｖ
本発明はまた、当該技術で知られ、図１で示されるような二重ｓｃＦｖ形式も提供する。特に、本発明は、抗ＣＤ３のｓｃＦｖ配列が図２〜７にて示される二重ｓｃＦｖ形式を提供する。
【０１８７】
本発明は、抗ＣＤ３８の配列が図８〜１０にて示される二重ｓｃＦｖ形式を提供する。
【０１８８】
本発明は、ｐＩ変異体及び／または荷電ｓｃＦｖリンカーを含む二重ｓｃＦｖ形式を提供する（一般にいずれか一方の単量体がＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４８１Ｄを含み、他方が正に荷電したｓｃＦｖリンカーを含む、またはそれらは双方とも反対に荷電したｓｃＦｖリンカーを含む）。
【０１８９】
本発明の核酸
本発明はさらに本発明の二重特異性抗体をコードする核酸組成物を提供する。当業者によって十分に理解されるように、核酸組成物はヘテロ二量体タンパク質の形式及び足場に依存するであろう。従って、たとえば、トリプルＦ形式（たとえば、ＦｃドメインとｓｃＦｖとを含む第１のアミノ酸単量体、重鎖及び軽鎖を含む第２のアミノ酸単量体）のために形式が３つのアミノ酸配列を必要とする場合、３つの核酸配列を発現用の１以上の発現ベクターに組み込むことができる。同様に、たった２つの核酸を必要とする一部の形式（たとえば、図１で開示されているような二重ｓｃＦｖ形式）；この場合も、それらを１または２の発現ベクターに入れることができる。
【０１９０】
当該技術で知られるように、本発明の成分をコードする核酸を、当該技術で知られるように、且つ使用される宿主細胞に応じて、発現ベクターに組み込んで本発明のヘテロ二量体抗体を産生させることができる。一般に、核酸は任意の数の調節性要素（プロモータ、複製開始点、選択可能なマーカー、リボソーム結合部位、誘導因子等）に操作可能に連結される。発現ベクターは染色体外ベクターまたは組込み型ベクターであることができる。
【０１９１】
本発明の核酸及び／または発現ベクターは次いで、哺乳類、細菌、酵母、昆虫及び／または真菌の細胞を含む、当該技術で周知のような任意の数の様々な種類の宿主細胞で形質転換され、哺乳類細胞（たとえば、ＣＨＯ細胞）が多数の実施形態で使用される。
【０１９２】
一部の実施形態では、各単量体をコードする核酸及び軽鎖をコードする任意の核酸は、該当する場合、形式に応じて、一般に異なるまたは同一のプロモータ制御下にてそれぞれ単一の発現ベクター内に含有される。本発明の特定の使用の実施形態では、これら２つまたは３つの核酸のそれぞれが異なる発現ベクターに含有される。本明細書及び参照によって本明細書に組み入れられる６２／０２５，９３１にて示されるように、異なるベクターの比を用いてヘテロ二量体の形成を推進することができる。すなわち、驚くべきことに、タンパク質が第１の単量体：第２の単量体：軽鎖（ヘテロ二量体抗体を含む３つのポリペプチドを有する本明細書の実施形態の多くの場合）を１：１：２の比で含む一方で、これらは最良の結果を生じる比ではない。図６５を参照のこと。
【０１９３】
本発明のヘテロ二量体抗体は、当該技術で周知のように発現ベクター（複数可）を含む宿主細胞を培養することによって作製される。いったん産生されると、イオン交換クロマトグラフィ工程を含む従来の抗体精製工程を行う。本明細書で議論されているように、少なくとも０．５異なる２つの単量体のｐＩを有することは、イオン交換クロマトグラフィ、または等電点電気泳動法または他の等電点に感受性の方法による分離を可能にすることができる。すなわち、各単量体が異なるｐＩを有し、ヘテロ二量体も異なるｐＩを有するように等電点を変えるｐＩ置換の包含は、「トリプルＦ」ヘテロ二量体の等電精製（たとえば、アニオン交換カラム、カチオン交換カラム）を促す。これらの置換はまた、精製後混入している二重ｓｃＦｖ−Ｆｃ及びｍＡｂのホモ二量体の判定及びモニタリングにも役立つ（たとえば、ＩＥＦゲル、ｃＩＥＦ及び分析用ＩＥＸカラム）。
【０１９４】
治療
いったん作製されると、本発明の組成物は多数の応用で使用される。ＣＤ３８は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、Ｂ及びＴの急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ），急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む多数の造血系悪性腫瘍、及び種々の造血系悪性腫瘍に由来する細胞株にて上方調節される。
【０１９５】
従って、本発明のヘテロ二量体組成物はこれらの癌の治療で使用される。
【０１９６】
生体内投与のための抗体組成物
本発明に従って使用される抗体の製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の程度の純度を有する抗体を任意の薬学上許容できるキャリア、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］）と混合することによって保存のために調製される。許容できるキャリア、賦形剤または安定剤は採用される投与量及び濃度でレシピエントにとって非毒性であり、それらには、たとえば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（たとえば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；たとえば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質；たとえば、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；たとえば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；たとえば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールのような糖類；ナトリウムのような塩形成性対イオン；金属錯体（たとえば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／またはたとえば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１９７】
本明細書の製剤は、治療される特定の適応のために必要に応じて１を超える活性化合物、好ましくは互いに有害に影響を及ぼさない補完活性を持つものも含有してもよい。たとえば、他の特異性を持つ抗体を提供することが望ましくてもよい。代わりにまたは加えて、組成物は、細胞傷害剤、サイトカイン、増殖阻害剤及び／または小分子アンタゴニストを含んでもよい。そのような分子は意図する目的に有効である量にて併用で好適に存在する。
【０１９８】
有効成分はまた、たとえば、液滴形成法によってまたは界面重合によって、たとえば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルによって調製されるマイクロカプセルにて、コロイド状薬剤送達系（たとえば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）にて、またはマクロエマルションにて捕捉されてもよい。そのような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）にて開示されている。
【０１９９】
生体内投与に使用される製剤は無菌であるべきであり、またはほぼそうあるべきである。これは無菌の濾過膜を介した濾過によって容易に達成される。
【０２００】
持続性放出製剤が調製されてもよい。持続性放出製剤の好適な例には、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられ、そのマトリクスは成形された物品の形態、たとえば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続性放出マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（たとえば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性酢酸エチレン−ビニル、分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー、たとえば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドで構成された注射用ミクロスフェア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸のようなポリマーが１００日を超える分子の放出を可能にする一方で、特定のヒドロゲルは短い時間でタンパク質を放出する。
【０２０１】
被包された抗体が長期間体内に残る場合、それらは３７℃の水分への曝露の結果、変性または凝集する可能性があり、生物活性の喪失及び免疫原性における見込まれる変化を生じる。関与するメカニズムに応じて安定化のために合理的な戦略を考案することができる。たとえば、凝集のメカニズムがチオジスルフィドの交換を介した分子間のＳ−Ｓ結合の形成であることが発見されれば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を制御し、適当な添加剤を使用し、特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されてもよい。
【０２０２】
投与様式
本発明の抗体及び化学療法剤は、ボーラスとしての静脈内投与のような既知の方法に従って、またはある期間にわたる連続点滴によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、クモ膜下、経口、局所、または吸入の経路によって対象に投与される。抗体の静脈内または皮下の投与が好ましい。
【０２０３】
治療様式
本発明の方法では、治療法を用いて疾患または状態に関して積極的な治療応答を提供する。「積極的な治療応答」によって、疾患または状態における改善及び／または疾患または状態に関連する症状における改善が意図される。たとえば、積極的な治療応答は、疾患における以下の改善：（１）腫瘍細胞の数の低下、（２）腫瘍細胞死の上昇、（３）腫瘍細胞の生存の抑制、（５）腫瘍増殖の阻害（すなわち、ある程度の遅延、好ましくは停止）、（６）患者の生存率の上昇、及び（７）疾患または状態に関連する１以上の症状からの若干の緩和の１以上を指す。
【０２０４】
所与の疾患または状態における積極的な治療応答は、その疾患または状態に専用の標準化された応答基準によって判定することができる。腫瘍の応答は、たとえば、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）走査、Ｘ線画像診断、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）走査、骨走査画像診断、内視鏡、及び骨髄吸引（ＢＭＡ）や循環における腫瘍細胞の計数を含む腫瘍生検試料採取のようなスクリーニング法を用いて腫瘍の形態（すなわち、腫瘍全体の負荷、腫瘍のサイズ等）における変化について評価することができる。
【０２０５】
これらの積極的な治療応答に加えて、治療を受けている対象は疾患に関連する症状での改善の有益な効果を経験してもよい。
【０２０６】
疾患における改善は完全奏効として特徴付けられてもよい。「完全奏効」によって、以前の異常なＸ線試験、骨髄、及び脳脊髄液（ＣＳＦ）、または骨髄腫の場合の異常なモノクローナルタンパク質の正常化による臨床的に検出可能な疾患の非存在が意図される。
【０２０７】
そのような応答は、本発明の方法に従った治療の後、少なくとも４〜８週間、または時には６〜８週間持続してもよい。或いは、疾患における改善は部分奏効であるとして分類されてもよい。「部分奏効」によって、新しい病変の非存在下で測定できる全身腫瘍組織量（すなわち、対象に存在する悪性細胞の数、または腫瘍質量の測定された嵩または異常なモノクローナルタンパク質の量）すべてにおける少なくとも約５０％の低下が意図され、それは４〜８週間、または６〜８週間持続してもよい。
【０２０８】
本発明に従った治療には使用される薬物の「治療上有効な量」が含まれる。「治療上有効な量」は、所望の治療成績を達成するのに必要な投与量及び時間での有効な量を指す。
【０２０９】
治療上有効な量は、たとえば、個体の疾患の状態、年齢、性別及び体重、及び個体にて所望の応答を引き出す薬物の能力のような因子に従って変化してもよい。治療上有効な量は、抗体または抗体の一部の毒性効果または有害効果を治療上有益な効果が上回るものでもある。
【０２１０】
腫瘍の治療についての「治療上有効な量」は疾患の進行を安定化させる能力によって測定されてもよい。癌を抑制する化合物の能力はヒト腫瘍での有効性を予測する動物モデル系で評価されてもよい。
【０２１１】
或いは、組成物のこの特性は、技量のある実行者に既知の試験管内アッセイによって細胞増殖を阻害するまたはアポトーシスを誘導する化合物の能力を調べることにより評価されてもよい。治療上有効な量の治療用化合物は腫瘍の大きさを減らしてもよく、またはさもなければ対象における症状を改善してもよい。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重症度、及び選択される特定の化合物または投与の経路のような因子に基づいてそのような量を決定することができる。
【０２１２】
投与計画を調整して最適な所望の応答（たとえば、治療応答）を提供する。たとえば、単一ボーラスを投与してもよいし、幾つかに分割した用量を時間をかけて投与してもよいし、または治療状況の要求によって示されるように用量を比例して減らしてもよく、もしくは増やしてもよい。投与の容易さ及び投与量の均一さのために非経口組成物が単位剤形で製剤化されてもよい。単位剤形は本明細書で使用されるとき、単位の投与量として対象に適した物理的に個別の単位を指し、各単位は必要とされる医薬キャリアと関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含有する。
【０２１３】
本発明の単位剤形の明細は、（ａ）活性化合物の独特の特徴及び達成される特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の治療についてそのような活性化合物を配合する当該技術で固有の限界によって指示され、且つそれらに直接依存する。
【０２１４】
本発明で使用される二重特異性抗体のための効率的な投与量及び投与計画は治療される疾患または状態に左右されるが、当業者によって決定されてもよい。
【０２１５】
本発明で使用される二重特異性抗体の治療上有効な量の例となる非限定の範囲は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約０．５、約たとえば、０．３、約１、または約３ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態では、抗体は、１ｍｇ／ｋｇ以上の用量、たとえば、１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量、たとえば、５〜２０ｍｇ／ｋｇの用量、たとえば、８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０２１６】
当該技術で普通の技量を有する医療専門家は必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方してもよい。たとえば、内科医または獣医は、所望の治療効果を達成するために必要とされるものより低いレベルで医薬組成物にて採用される薬物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増やせばよい。
【０２１７】
一実施形態では、二重特異性抗体は１０〜５００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、２００〜４００ｍｇ／ｋｇの毎週の投与量で点滴によって投与される。そのような投与は、たとえば、１〜８回、たとえば、３〜５回繰り返されてもよい。投与は、２〜２４時間、たとえば、２〜１２時間の時間をかけて連続点滴によって実施されてもよい。
【０２１８】
一実施形態では、二重特異性抗体は、毒性を含む副作用を軽減する必要があれば、たとえば、２４時間を超える長期間にわたる緩慢な連続点滴によって投与される。
【０２１９】
一実施形態では、二重特異性抗体は、２５０ｍｇ〜２０００ｍｇ、たとえば、３００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇまたは２０００ｍｇの週１回の投与量で８回まで、たとえば、４〜６回投与される。投与は、２〜２４時間、たとえば、２〜１２時間の時間にわたる連続点滴によって実施されてもよい。そのような投薬計画は、必要に応じて１回以上、たとえば、６ヵ月または１２ヵ月後に繰り返されてもよい。投与量は、たとえば、生体試料を取り出し、二重特異性抗体の抗原結合領域を標的とする抗イディオタイプ抗体を使用することによって投与の際、血中における本発明の化合物の量を測定することにより決定されてもよいし、または調整されてもよい。
【０２２０】
さらなる実施形態では、二重特異性抗体は、週に１回、２〜１２週間、たとえば、３〜１０週間、たとえば、４〜８週間投与される。
【０２２１】
一実施形態では、二重特異性抗体は、維持治療によって、たとえば、週１回、６ヵ月以上の期間にわたって投与される。
【０２２２】
一実施形態では、二重特異性抗体は、二重特異性抗体の１回の点滴に続いて放射性同位元素に結合された二重特異性抗体の点滴を含む投薬計画によって投与される。投薬計画は、たとえば、７〜９日後に繰り返されてもよい。
【０２２３】
非限定例として、本発明に係る治療は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、１日当たり０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｋｇの量で治療の開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０日目の少なくとも１つ、または代わりに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０週目の少なくとも１つで、またはその組み合わせで、単回用量または２４、１２、８、６、４もしくは２時間ごとの、もしくはその組み合わせの分割用量を用いて、抗体の１日１回投与量として提供されてもよい。
【０２２４】
一部の実施形態では、その二重特異性抗体分子は、１以上の追加の治療剤、たとえば、化学療法剤との併用で使用される。ＤＮＡを損傷する化学療法剤の非限定例には、トポイソメラーゼＩ阻害剤（たとえば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン及びそれらの類似体または代謝体、及びドキソルビシン）；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（たとえば、エトポシド、テニポシド、及びダウノルビシン）；アルキル化剤（たとえば、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イフォスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、デカルバジン、メソトレキセート、マイトマイシンＣ、及びサイクロホスファミド）；ＤＮＡ挿入剤（たとえば、シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン）；ＤＮＡ挿入剤及びフリーラジカル生成剤、たとえば、ブレオマイシン；及びヌクレオシド模倣体（たとえば、５−フルオロウラシル、カペシタビン、ゲムシタビン、フルダラビン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、及びヒドロキシ尿素）が挙げられる。
【０２２５】
細胞複製を破壊する化学療法剤には、パクリタキセル、ドセタキセル、及び関連する類似体；ビンクリスチン、ビンブラスチン、及び関連する類似体；サリドマイド、レナリドミド、及び関連する類似体（たとえば、ＣＣ−５０１３及びＣＣ−４０４７）；タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（たとえば、イマチニブメシル酸塩及びゲフィチニブ）；プロテアソーム阻害剤（たとえば、ボルテゾミブ）；ＩκＢキナーゼの阻害剤を含むＮＦ−κＢ阻害剤；癌で過剰発現されたタンパク質に結合する及びそれによって細胞複製を下方調節する抗体（たとえば、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、及びベバシズマブ）；癌で上方調節される、過剰発現されるまたは活性化される、その阻害が細胞複製を下方調節することが知られるタンパク質または酵素の他の阻害剤が挙げられる。
【０２２６】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）（ボルテゾミブ）による治療に先立って、それと同時にまたはその後に使用することができる。
【０２２７】
引用されている参考文献はすべてその全体が参照によって本明細書に明白に組み入れられる。
【０２２８】
本発明の特定の実施形態が説明の目的で上述されているのに対して、添付のクレームで記載されているような本発明から逸脱することなく詳細の多数の変化が作り出されてもよいことが当業者によって十分に理解されるであろう。
【実施例】
【０２２９】
本発明を説明するために実施例が以下で提供される。これらの実施例は、本発明を特定の応用または操作の理論に限定するものではない。本発明で議論されている定常領域の位置すべてについて、番号付けはＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指標（参照によって全体的に組み入れられるＫａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）に従う。抗体の当業者は、この慣例が免疫グロブリン配列の特定の領域の不連続な番号付けから成り、免疫グロブリンファミリーにおける保存された位置に対する基準化された参照を可能にすることを十分に理解するであろう。従って、ＥＵ指標によって定義されるような所与の免疫グロブリンの位置は必ずしもその連続した配列に対応しないであろう。
【０２３０】
一般的な及び特定の科学的技法は、すべて、その全体が、且つ特にその中で要点が述べられている技法について参照によって明白に組み入れられるＵＳ公開２０１５／０３０７６２９、２０１４／０２８８２７５及びＷＯ２０１４／１４５８０６にて要点が述べられている。
【０２３１】
実施例１：代替形式
Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃの作出
Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃの発現に必要とされる３つの鎖：Ｆａｂ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ及びＬＣをコードするＤＮＡを遺伝子合成（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）によって生成し、標準の分子生物学的技法を用いて発現ベクターｐＴＴ５にサブクローニングした。部位特異的変異誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃｅｄａｒ  Ｃｒｅｅｋ，Ｔｅｘ．）または追加の遺伝子合成及びサブクローニングを用いて置換を導入した。発現のためにＨＥＫ２９３Ｅ細胞にてＤＮＡを形質移入し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びカチオン交換（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィを用いて、得られたタンパク質を上清から精製した。Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異性剤についてのアミノ酸配列を表３でリストにしている。
【０２３２】
表面プラスモン共鳴親和性測定
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器を用いて表面プラスモン共鳴結合実験を行った（データは示さず）。親和性を調節するためのアミノ酸置換（複数可）の後でさえ、抗ＣＤ３の可変領域はカニクイザルＣＤ３について交差反応性のままである。
【０２３３】
細胞表面結合
Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−ＦｃのＣＤ３への結合を二次抗体の検出を介してＴ細胞上で測定した。
【０２３４】
再指向Ｔ細胞の細胞傷害性
抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異性剤を、ＣＤ２０＋Ｒａｍｏｓバーキットリンパ腫（ＢＬ）細胞株、ＣＤ２０＋Ｊｅｋｏ−１マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞株、及びＣＤ３８＋ＲＰＭＩ８２６６黒色腫細胞株の再指向Ｔ細胞の細胞傷害性（ＲＴＣＣ）について試験管内で特徴付けた。ＲＴＣＣを測定し、ＲＴＣＣの間のＩＬ−６の産生も特徴付けた（データは示さず）。
【０２３５】
ｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤ免疫グロブリン枯渇マウスの試験
ヒトＢ細胞または形質細胞の枯渇を介してヒト免疫グロブリンを枯渇させる抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異性剤の能力を、ヒトＰＢＭＣを生着させたＳＣＩＤマウスを用いて評価した。結果を図に示す。
【０２３６】
実施例２：代替形式
二重特異性の作出
抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性剤の模式図を図１で示す。代替形式の抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性剤のアミノ酸配列を図３９〜図４３でリストにしている。二重特異性の発現に必要とされる３つの鎖をコードするＤＮＡを遺伝子合成（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）によって生成し、標準の分子生物学的技法を用いて発現ベクターｐＴＴ５にサブクローニングした。部位特異的変異誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃｅｄａｒ  Ｃｒｅｅｋ，Ｔｅｘ．）または追加の遺伝子合成及びサブクローニングを用いて置換を導入した。発現のためにＨＥＫ２９３Ｅ細胞にてＤＮＡを形質移入し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びカチオン交換クロマトグラフィを用いて、得られたタンパク質を上清から精製した。プロテインＡアフィニティ精製の後の収量を図３５で示す。５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０の洗浄／平衡緩衝液及び５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０＋１ＭのＮａＣｌの線形勾配の溶出緩衝液と共にＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてカチオン交換クロマトグラフィ精製を行った（クロマト図については図３６を参照のこと）。
【０２３７】
再指向Ｔ細胞の細胞傷害性
抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性剤を、ＣＤ３８＋ＲＰＭＩ８２６６黒色腫細胞株の再指向Ｔ細胞の細胞傷害性（ＲＴＣＣ）について試験管内で特徴付けた。１０ｋのＲＰＭＩ８２６６細胞を５００ｋのヒトＰＢＭＣと共に２４時間インキュベートした。ＲＴＣＣは示したようにＬＤＨの蛍光によって測定した（図３７を参照のこと）。
【０２３８】
実施例３
再指向Ｔ細胞の細胞傷害性
抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異性剤を、ＣＤ３８＋ＲＰＭＩ８２６６黒色腫細胞株の再指向Ｔ細胞の細胞傷害性（ＲＴＣＣ）について試験管内で特徴付けた。４０ｋのＲＰＭＩ８２６６細胞を４００ｋのヒトＰＢＭＣと共に９６時間インキュベートした。ＲＴＣＣは示したようにフローサイトメトリーによって測定した（図４４を参照のこと）。ＣＤ６９、Ｋｉ−６７及びＰＩ-９のＣＤ４＋及びＣＤ８+Ｔ細胞の発現をフローサイトメトリーによって特徴付けたが、それを図４５で示す。
【０２３９】
抗腫瘍活性のマウスモデル
−２３日目での尾静脈内注射によって５匹のＮＯＤｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスの４群にそれぞれ５×１０６個のＲＰＭＩ８２２６ＴｒＳ腫瘍細胞（多発性骨髄腫、ルシフェラーゼ発現）を生着させた。０日目に１０×１０６個のヒトＰＢＭＣを腹腔内でマウスに生着させた。０日目でのＰＢＭＣの生着後、図４で示した投与レベルでの腹腔内注射によって被験物質を毎週投与した（０、７日目）。試験の設計は図４６でさらに要約する。生体内画像化システム（ＩＶＩＳ（登録商標））を用いてマウス当たりの総変動を測定することによって腫瘍増殖をモニターした。ＸｍＡｂ１３５５１及びＸｍＡｂ１５４２６は双方とも実質的な抗腫瘍効果を示した（図４７及び図４８を参照のこと）。
【０２４０】
カニクイザルにおける試験
カニクイザルに単回用量の抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性剤を与えた。抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性剤対照も含めた。用量レベルは、２０μｇ／ｋｇのＸｍＡｂ１３５５１（ｎ＝２）、０．５ｍｇ／ｋｇのＸｍＡｂ１５４２６（ｎ＝３）、３ｍｇ／ｋｇのＸｍＡｂ１４７０２（ｎ＝３）、または３ｍｇ／ｋｇのＸｍＡｂ１３２４５（抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３対照、ｎ＝３）（３回の独立した試験）であった。抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性剤は末梢血にて迅速にＣＤ３８＋細胞を枯渇させた（図４９を参照のこと）。抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性剤はＣＤ６９の発現によって測定されるとＴ細胞の活性化を生じた（図５０を参照のこと）。ＩＬ−６の血清レベルも測定した（図５１を参照のこと）。ＸｍＡｂ１３５５１に比べて、ＸｍＡｂ１５４２６はＣＤ３８＋細胞の枯渇の時間が長く、低レベルのＴ細胞の活性化及びＩＬ−６の産生を有したことに留意のこと。
【０２４１】
ＸｍＡｂ１５４２６及びＸｍＡｂ１４７０２をそれぞれ０．５ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの単回用量で調べた。双方の抗体はこれらの高い用量で上手く忍容され、調べたサルの血清で観察された適度なレベルのＩＬ６と矛盾はしなかった。さらに、２、５、または２０μｇ／ｋｇで投与された元々の高親和性のＸｍＡｂ１３５５１と比べて、中間のＣＤ３親和性を持つＸｍＡｂ１５４２６は０．５ｍｇ／ｋｇでさらに効果的にＣＤ３８＋細胞を枯渇させた。以前の試験にてＸｍＡｂ１５４２６による枯渇は最高用量のＸｍＡｂ１３５５１に比べてさらに持続した（それぞれ７日対２日）。特に、標的細胞の枯渇はＸｍＡｂ１５４２６についてさらに大きかったが、Ｔ細胞に活性化（ＣＤ６９、ＣＤ２５及びＰＤ１の誘導）は２０μｇ／ｋｇのＸｍＡｂ１３５５１群よりも２５倍高い用量でのＸｍＡｂ１５４２６で処理したサルではるかに低かった。非常に低いＣＤ３親和性を持つＸｍＡｂ１４７０２はＣＤ３８＋細胞及びＴ細胞活性化にほとんど効果を有さなかった。
【０２４２】
これらの結果は、ＣＤ３の親和性を減衰させることによってＴ細胞の活性化を調節することが、Ｔ細胞に結合する二重特異性抗体の治療ウインドウを改善する有望な方法であることを実証している。この戦略は、忍容性を改善し、高投薬がＣＤ３８のような標的で抗原シンクのクリアランスを克服することを可能にすることによって標的とされるＴ細胞免疫療法に適する抗原のセットを拡大する可能性を有する。ＣＤ３に対する親和性を低下させることによって、ＸｍＡｂ１５４２６はＣＤ３８＋細胞を効果的に枯渇させる一方で、その高親和性の対応物であるＸｍＡｂ１３５５１の匹敵する用量で見られるＣＲＳ効果を最小化する。
【０２４３】
実施例４：ヒト及びカニクイザルのＣＤ３８及びＣＤ３εに対する抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性抗体の親和性
いわゆる「栓抜き型」形式で多数の抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性抗体を作り出した。抗体は、ＣＤ３を結合するｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体と共にＣＤ３８を結合する軽鎖及び重鎖を含有する。
【０２４４】
ＯｃｔｅｔＨＴＸバイオセンサーを用いてＣＤ３８の親和性を測定した。組換えで最少限にビオチン化した（＜３ビオチン／タンパク質のモル）ヒトＣＤ３８−Ｈｉｓ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはカニクイザルＣＤ３８−Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ.）を２ｎｍの負荷レベルでストレプトアビジンの先端部に負荷した。連続希釈した可溶性被験物質を含有するウェルにて負荷した先端部をインキュベートし、結合を３００〜１２００秒間測定した。次いで緩衝液を含有するウェルに先端部を移し、解離を５００〜５，４００秒間測定した。１：１の結合モデルをすべての会合及び解離の曲線に適用し、単一の会合速度定数（ｋａ）及び単一の解離速度定数（ｋｄ）を生成した。平衡解離定数（ＫＤ）の親和性を解離速度定数と会合速度定数の比（ｋｄ／ｋａ）として導き出した。結果を表１にて提供する。
【０２４５】
ＳｅｎｓｉＱ  ＰｉｏｎｅｅｒＦＥを用いた表面プラスモン共鳴によってＣＤ３εの親和性を測定した。アミンカップリングを介して５０〜６５ＲＵの最終レベルで組換えヒトＣＤ３ε−ＦｃまたはカニクイザルＣＤ３ε−ＦｃをＣＭ５チップに不動化した。試料の会合を６０秒間行い、解離を３００秒間行い、グラフを１：１の結合モデルに適合させた。高親和性抗体（ＸｍＡｂ１３５５１、ＸｍＡｂ１３５４５、及びＸｍＡｂ１３２４３）についてのＫＤ値は測定された解離と会合の速度定数の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として導き出した。低親和性及び中親和性の抗体（ＸｍＡｂ１５４２６、ＸｍＡｂ１８９６７、ＸｍＡｂ１８９６８、ＸｍＡｂ１８９６９、ＸｍＡｂ１８９７１、及びＸｍＡｂ１８９７２）についてのＫＤ値は３点適合曲線を用いた平衡解析によって決定した。結果は表１に提供されている。
【表１】
2019503661.tif 000002
【０２４６】
抗体ＸｍＡｂ１８９６７、ＸｍＡｂ１８９６８、及びＸｍＡｂ１８９７１のＣＤ３εへの結合親和性はヒト及びカニクイザル双方のＣＤ３εについて中間であり、抗体ＸｍＡｂ１３５５１、ＸｍＡｂ１３５４５、及びＸｍａｂ１３２４３より低いが、ＸｍＡｂ１５４２６より高い。
【０２４７】
追加の親和性試験を行って「絶対ＫＤ」を決定した。絶対ＫＤは所与の標的に対する抗体の固有の結合特性を反映する定数である。絶対ＫＤは標的の濃度に応じて変化することができる複数の測定されたＫＤの積分から生じる。絶対的なＣＤ３８の親和性はＯｃｔｅｔＨＴＸバイオセンサーを用いて測定した。０．３〜２ｎｍの範囲で５つの上昇する負荷レベルにて、組換えで最少限にビオチン化した（＜３ビオチン／タンパク質のモル）ヒトＣＤ３８−Ｈｉｓ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはカニクイザルＣＤ３８−Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ.）をストレプトアビジンの先端部に負荷した。連続希釈した可溶性被験物質を含有するウェルにて負荷した先端部をインキュベートし、結合を３００〜１２００秒間測定した。次いで緩衝液を含有するウェルに先端部を移し、解離を５００〜５，４００秒間測定した。１：１の結合モデルをすべての会合及び解離の曲線に適用し、単一の会合速度定数（ｋａ）及び単一の解離速度定数（ｋｄ）を生成した。平衡解離定数（ＫＤ）の親和性を解離速度定数と会合速度定数の比（ｋｄ／ｋａ）として導き出した。測定したＫＤ親和性をＣＤ３８負荷レベルの関数としてグラフにし、絶対的ＫＤ親和性を特定した。絶対的ＫＤ親和性はＣＤ３８の濃度の関数として各負荷レベルでの測定されたＫＤをグラフにすることから導き出された。絶対ＫＤはＣＤ３８濃度が低下するにつれて測定されたＫＤのプラトー値として決定された。結果を表２にて提供する。
【０２４８】
ＢｉａｃｏｒｅＴ２００機器（ＧＥ）を用いた表面プラスモン共鳴によって絶対的ＣＤ３ε親和性を測定した。標準のアミンカップリング（ＥＤＣ／ＮＨＳ）化学を用いてＣＭ５チップ表面に不動化するリガンドとして組換えのヒトＣＤ３ε−ＦｃまたはカニクイザルＣＤ３ε−Ｆｃを使用した。ＣＤ３ε−Ｆｃの不動化密度の範囲を調べて１：１の結合モデルに対する非線形回帰を介して測定された得られた結合及び解離の動態に対するリガンド密度の効果を規定した。試料の会合は６０秒間行い、解離は３００秒間行った。報告されたデータは、１：１の結合モデルからの大きな体系的な逸脱がなくノイズに対する十分なシグナルが得られる低密度のＣＭ５チップの表面から取得した。ＫＤ値は、報告されたＫＤを上回る及び下回る少なくとも５点の連続希釈にわたる濃度を用いて全体的に適合する解離速度定数と会合速度定数の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として導き出された。結果を表２にて提供する。ＮＤは値が決定されなかったことを示し、親和性の欠如を示すのではない。
【表２】
2019503661.tif 000003
【０２４９】
実施例５：Ｔ細胞依存性細胞の細胞傷害性（ＴＤＣＣ）アッセイにおける抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異性抗体の活性
ルシフェラーゼを発現しているヒト細胞株ＭＯＬＭ１３に対するＴ細胞依存性細胞の細胞傷害性（ＴＤＣＣ）アッセイは以下のように行った：２，５００個の標的細胞を２５，０００個の休止ヒトＴ細胞と混合し、６ｎＭ〜５．７×１０−７ｐＭの範囲での濃度の抗ＣＤ３８−抗ＣＤ３ＸｍＡｂの存在下で４８時間インキュベートし；Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼのシグナルを測定した。ＥＣ５０値は特異的な細胞傷害性曲線から導き出した（図７８、表３）。
【表３】
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【０２５０】
カニクイザルの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＴ細胞依存性細胞の細胞傷害性（ＴＤＣＣ）アッセイを行った：６ｎＭ〜５．７×１０−７ｐＭの範囲での濃度の抗ＣＤ３８−抗ＣＤ３ＸｍＡｂの存在下で１０，０００個の休止カニクイザルＰＢＭＣを７２時間インキュベートし、抗ＣＤ４０抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によるフローサイトメトリーによって各ウェルに残っているＣＤ４０陽性Ｂ細胞の総数を測定した。ＥＣ５０値は特異的な細胞傷害性曲線から導き出した（図７９、表４）。
【表４】
2019503661.tif 000005
【０２５１】
ＣＤ３８の発現レベルの範囲でルシフェラーゼを発現しているヒト細胞株（ＫＭＳ１２ＢＭ、ＭＯＬＭ１３、ＯＰＭ２、Ｕ９３７、ＳＫＭ１）に対するＴ細胞依存性細胞の細胞傷害性（ＴＤＣＣ）アッセイを行った：２，５００個の標的細胞を２５，０００個の休止ヒトＴ細胞と混合し、６ｎＭ〜５．７×１０−７ｐＭの範囲での濃度のＣＤ３８ＸｍＡｂの存在下で４８時間インキュベートし；Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼのシグナルを測定した。ＥＣ５０は特異的な細胞傷害性曲線から導き出した。３〜６名の間のＴ細胞ドナーを使用し、ドナーすべてからの平均ＥＣ５０を表５に記録する。
【０２５２】
Ｑｉｆｉｋｉｔアッセイ（Ｄａｋｏ）及び抗ヒトＣＤ３８マウスモノクローナル抗体）クローンＨ１Ｔ２）を用いてＣＤ３８受容体の密度（細胞当たりの抗体結合部位の数）を評価した（図８０）。
【表５】
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【０２５３】
表５で示すように、ＸｍＡｂ１８９６８（４１２２２０）は、２，０００個未満のＣＤ３８分子を有するものを含むその表面に広い範囲のＣＤ３８を有する細胞におけるＴＤＣＣを引き起こすのに有効である。ＸｍＡｂ１８９７１（４１９５７８）も、低いＣＤ３８発現ＳＫｍ１細胞株を標的とすることでＸｍＡｂ１８９６８（４１２２２０）よりも有効ではなかったが、調べた細胞株でＴＤＣＣを引き起こすのに有効である。
【０２５４】
実施例６：非ヒト霊長類における薬物動態／薬物力学（ＰＫ／ＰＤ）試験
最初の試験では、調べた各抗体について３匹のカニクイザルの群が０日目に予備投薬を受け（１５または１００ｍｇ／ｋｇ）その後１日目と４日目に治療投薬を受けた（４５、７５または５００ｍｇ／ｋｇ）。最初の治療投薬の４時間後に血清ＩＬ−６のレベルを測定し、４日目、７日目及び１０日目の血液試料のフローサイトメトリーによって循環Ｂ細胞の数を解析した。７日目及び１０日目での予備投薬の数に比べた平均の最大Ｂ細胞枯渇を提示する。結果を表６にて提供する。
【表６】
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【０２５５】
その後のＰＫ／ＰＤ試験では、調べた各抗体について３匹のカニクイザルの群が０日目に予備投薬を受け、その後１、４、７及び１０日目に治療投薬を受けた。最初の治療投薬の４時間後にＭＣＰ−１のレベルを測定した。４、７、１０、１１及び１３日目の血液試料のフローサイトメトリーによって循環Ｂ細胞の数を解析した（図８１）。結果を表６で要約する。１１日目での予備投薬に比べた平均の最大Ｂ細胞枯渇を提示する
【表７】
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【０２５６】
ＭＣＰ−１はＴ細胞活性化の際に放出されるサイトカインである。この実施例は、双方の標的に対して「中間の」または「中位の」親和性レベルを有する抗ＣＤ３×抗ＣＤ３８抗体、たとえば、ＸｍＡｂ１８９６８（４１２２２０）が依然としてＣＤ３８＋Ｂ細胞を枯渇させる一方で低レベルのサイトカインの放出に介在することを実証している。実施例は、本開示の抗体が安全に且つ効率的に免疫系を活性化し、標的細胞の枯渇を引き起こす追加の証拠を提供している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2019503661.tif 000014
【図６】
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【図７】
2019503661.tif 000016
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2019503661.tif 000020
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2019503661.tif 000023
【図１５】
2019503661.tif 000024
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図２９Ｅ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７Ａ】
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【図６７Ｂ】
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【図６８Ａ】
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【図６８Ｂ】
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【図６８Ｃ】
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【図６８Ｄ】
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【図６８Ｅ】
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【図６８Ｆ】
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【図６８Ｇ】
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【図６８Ｈ】
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【図６８Ｉ】
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【図６８Ｊ】
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【図６８Ｋ】
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【図６８Ｌ】
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【図６８Ｍ】
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【図６８Ｎ】
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【図６８Ｏ】
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【図６８Ｐ】
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【図６８Ｑ】
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【図６８Ｒ】
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【図６８Ｓ】
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【図６８Ｔ】
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【図６８Ｕ】
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【図６８Ｖ】
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【図６８Ｗ】
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【図６８Ｘ】
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【図６８Ｙ】
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【図６８Ｚ】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４Ａ】
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【図８４Ｂ】
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【図８４Ｃ】
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【図８４Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2019503661.tif 000128
2019503661.tif 000129
2019503661.tif 000130
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