(57)【要約】  本発明は、新規のクロマトグラフィー媒体、さらに詳細には新規のＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）媒体に関する。新規のクロマトグラフィー媒体は、五座配位子を含み、本発明の媒体上で精製された試料タンパク質の高い動的結合容量ならびに高い純度を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
直径５〜６０μｍのクロマトグラフィービーズＱに結合した五座配位子を含むＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）媒体。
【請求項２】
請求項１に記載のＩＭＡＣ媒体であって、前記配位子が五座であり、前記媒体が下記式を有し、
【化１】
2019533571.tif 000009
（式中、
Ｑはクロマトグラフィービーズであり、
Ｓはスペーサーであり、
Ｌはアミド結合であり、
ＸはＣＯＯＨであり、
ｎ＝２〜３である。）
ＱＢ１０％での動的結合容量（ＤＢＣ）が、６０μｍよりも大きいビーズサイズを有するＩＭＡＣ媒体と比較して２倍超であるＩＭＡＣ媒体。
【請求項３】
前記ＱＢ１０％が少なくとも３倍以上である、請求項２に記載の媒体。
【請求項４】
Ｑが多孔質の天然または合成ポリマー、好ましくはアガロースである、請求項１または２に記載の媒体。
【請求項５】
Ｑがアガロースから製造され、Ｑの直径が３０〜４０μｍである、請求項１乃至４のいずれか１項または複数の項に記載の媒体。
【請求項６】
Ｑがデキストランコーティングされている、請求項１乃至５のいずれか１項または複数の項に記載の媒体。
【請求項７】
ｎが２、すなわちエチレンであり、Ｓが好ましくは、少なくとも３個の原子を含むＣおよびＯの親水性鎖でなければならない、請求項２乃至６のいずれか１項または複数の項に記載の媒体。
【請求項８】
前記Ｑ吸着剤に、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ３＋およびＧａ３＋からなる群から選択される金属イオンを充填する、請求項１乃至７のいずれか１項または複数の項に記載の媒体。
【請求項９】
Ｑが磁性粒子を含む、請求項１乃至８のいずれか１項または複数の項に記載の媒体。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか１項または複数の項に記載の媒体上に試料を充填することを含む、ＩＭＡＣ媒体上の生体分子の精製方法であって、前記試料が、ＥＤＴＡなどのキレート剤を含み、ＱＢ１０％での動的結合容量が、従来のＩＭＡＣ媒体と比較して２倍超である精製方法。
【請求項１１】
前記ＩＭＡＣ媒体が請求項２乃至８のいずれか１項または複数の項に記載の五座媒体であり、ＱＢ１０％が３〜６倍である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体分子が、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも６つのＨｉｓ残基で標識されている、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
アガロースから製造され、デキストランの外層を含むクロマトグラフィービーズに結合した四座または五座配位子を含むＩＭＡＣ媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のクロマトグラフィー媒体、さらに詳細には新規のＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）媒体に関する。新規のクロマトグラフィー媒体は、本発明の媒体上で精製された試料タンパク質の高い動的結合容量ならびに高い純度を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
固定化金属キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）は、ここ数年にわたりタンパク質精製のための技術として使用されてきた。ＩＭＡＣの背後にある原理は、多くの遷移金属イオンが、一般にアミノ酸側鎖の、特にヒスチジン、システインおよびトリプトファンの酸素原子と窒素原子との間に配位結合を形成することができるという事実にある。クロマトグラフィー目的でこの相互作用を利用するためには、不溶性担体上に金属イオンを固定化しなければならない。これは、担体にキレート配位子を結合させることによって行うことができる。最も重要なことに、有用であるためには、選択される金属イオンは、精製される化合物よりもキレート配位子に対して顕著に高い親和性を有しなければならない。好適な配位金属イオンの例は、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ａｌ（ＩＩＩ）、Ｇａ（ＩＩＩ）、Ｓｃ（ＩＩＩ）などである。三座キレート剤であるイミノ二酢酸（ＩＤＡ）（Ｐｏｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２５８，５９８−５９９，１９７５）および四座キレート剤であるニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）（Ｈｏｃｈｕｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１，１７７−１８４，１９８７）など、ＩＭＡＣに使用するための様々なキレート基が知られている。
【０００３】
ＩＭＡＣの分野では、組換え標的タンパク質、例えば、余分なヒスチジン残基を含むタンパク質、いわゆるヒスチジンタグ付きタンパク質に対して高い吸着容量を有する吸着剤を提供することに多くの努力が払われてきた。しかし、組換え標的タンパク質が産生される細胞および発酵ブロスは、一般に宿主細胞タンパク質と呼ばれる、宿主細胞によって産生される他のタンパク質も含み、それらの一部も吸着剤に結合する。したがって、この分野では、宿主細胞タンパク質の吸着が少なく、および／または標的タンパク質の選択的結合および／または溶出を可能にする改善された選択性を示すＩＭＡＣ吸着剤が必要とされている。
【０００４】
理論的には五座キレート配位子に起因し得るいくつかの潜在的な利点が存在する。ほとんどの非タグ付きタンパク質が結合し得ないほど、タンパク質分子に利用可能な配位部位の数が少ないため、金属イオンに対するあらゆるタンパク質結合が三座および四座配位子よりも弱くなり、ヒスチジンタグ付きタンパク質に対する選択性がさらに高くなるはずである。これは、最強の結合剤、すなわちヒスチジンタグ付きタンパク質による弱く望ましくない結合剤の競合的置換を精製時に有利に使用することが困難である低レベルの標的タンパク質発現にとって特に重要であり得る。さらに、金属イオンの結合が強くなるほど、クロマトグラフィー中のイオンの損失が減少し、微量の金属イオンによる精製タンパク質の汚染の危険性が低下し、次の使用の前に金属イオンを再充填する必要なくクロマトグラフィー樹脂を再使用することが可能になる。そのような態様は、「攻撃的」である、すなわち固定化された金属イオンを除去する傾向がある動物細胞培地および緩衝液などの供給物（クロマトグラフィーカラムに適用される試料）にとって特に重要である。また、一部のジスルフィド還元剤など、金属イオンと相互作用することによって精製を妨げる物質が供給物および／または緩衝液中に存在する場合、五座キレート剤を有するＩＭＡＣ樹脂を使用するのが有利であるはずである。
【０００５】
米国特許第６，４４１，１４６号明細書（Ｍｉｎｈ）は、キレート剤によって占められた五座配位部位を有する多価金属イオンと八面体錯体を形成することができ、１つの配位部位を標的タンパク質との相互作用のために遊離のままにする金属キレート樹脂である五座キレート剤樹脂に関する。可溶性カルボジイミドを使用してあらゆるタンパク質を共有結合的に固定化するための汎用支持体として、開示されたキレート剤樹脂を使用することが示唆されている。さらに具体的には、開示された五座キレート剤樹脂は、最初にリジンと活性化セファロースなどの担体とを反応させることによって調製される。得られた固定化リジンは、次いでブロモ酢酸との反応により五座配位子にカルボキシル化される。
【０００６】
ＭｃＣｕｒｌｅｙ＆Ｓｅｉｔｚ（Ｔａｌａｎｔａ［１９８９］３６，３４１−３４６：“Ｏｎ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｔｒｉｓ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ”）は、タンパク質分画のためのＩＭＡＣ固定相として使用される固定化五座キレート剤、すなわちＴＥＤとしても知られるトリス（カルボキシメチル）エチレンジアミンに関する。炭水化物支持体にエチレンジアミンを固定化し、続いてカルボキシル化してキレート化カルボキシル基を得ることによって、ＴＥＤ樹脂が得られた。この論文の実験的証拠は、それに従って調製されたＴＥＤ樹脂では、ＴＥＤではなく、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＥＤＤＡ）との配位子の混合物が優勢であるように見えることを示す。この論文はまた、窒素含有量から決定される理論的金属イオン結合容量と実験容量との間の大きな相違を報告しており、これは配位子の大部分が金属イオンに結合しない形態であることを示している。
【０００７】
欧州特許第２１６４５９１Ｂ１号明細書は、アルキレンジアミン四酢酸二無水物を提供する工程と、これを担体に結合して、アミド結合およびスペーサーを介して上記担体に結合したアルキレンジアミン三酢酸から構成される五座配位子を形成する工程と、そのようにして得られた吸着剤に金属イオンを充填する追加工程とを含む生体分子吸着剤の製造を記載する。五座配位子は、非常に安定な金属キレートを形成し、これにより、同時に、精製および／または検出プロセスにおいて特定のポリペプチドまたはタンパク質に対して高度に選択的な結合特性がもたらされる。
【０００８】
ＩＭＡＣ媒体は既に存在するが、容量および純度について依然として改善が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１３／０７２６３８号明細書
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、試料の純度を犠牲にすることなく、高い動的結合容量を有する普遍的な有用性の新規なＩＭＡＣ媒体を提供する。
【００１１】
第１の態様では、本発明は、直径５〜６０μｍのクロマトグラフィービーズＱに結合した五座配位子を含むＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）媒体に関する。
【００１２】
好ましくは、配位子は五座であり、媒体は下記式を有し、
【００１３】
【化１】
2019533571.tif 000002
（式中、
Ｑは直径３０〜４０μｍのクロマトグラフィービーズであり、
Ｓはスペーサーであり、
Ｌはアミド結合であり、
ＸはＣＯＯＨであり、ｎ＝２〜３である。）
ＱＢ１０％での動的結合容量（ＤＢＣ）は、６０μｍよりも大きいビーズサイズを有するＩＭＡＣ媒体と比較して２倍超であり、好ましくはＱＢ１０％は３倍超以上、例えば６倍以上である。
【００１４】
クロマトグラフィー媒体は、多孔質の天然または合成ポリマー、好ましくはアガロースであり得る。一実施形態では、Ｑはアガロースから製造され、Ｑの直径は３０〜４０μｍである。
【００１５】
クロマトグラフィービーズＱ吸着剤には、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ３＋およびＧａ３＋からなる群から選択される金属イオン、好ましくはＮｉ２＋を充填する。
【００１６】
一実施形態では、クロマトグラフィービーズＱはデキストランコーティングされてもよく、これにより、実施例に記載されるように媒体によって得られる精製を増大させる。
【００１７】
別の実施形態では、Ｑは磁性粒子を含んでもよい。
【００１８】
一実施形態では、ｎは２、すなわち上記式中のエチレンであり、Ｓは好ましくは少なくとも３個の原子を含むＣおよびＯの親水性鎖でなければならない。
【００１９】
第２の態様では、本発明は、ＩＭＡＣ媒体上の生体分子の精製方法であって、上記のような媒体上に試料を充填することを含む精製方法に関し、ここで、試料は、ＥＤＴＡなどのキレート剤を含み、ＱＢ１０％での動的結合容量は、従来のＩＭＡＣ媒体と比較して２倍超である。好ましくは、ＩＭＡＣ媒体は上記のような五座媒体であり、ＱＢ１０％は３〜６倍である。
【００２０】
好ましくは、生体分子は、２つ以上のヒスチジン、トリプトファンおよび／またはシステイン残基を含む。最も好ましくは、生体分子は、少なくとも２つのＨｉｓ残基、例えば少なくとも６つのＨｉｓ残基で標識されている。生体分子が組換えタンパク質である場合、標識は遺伝的レベルで行われる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】市販のＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌ（太線）対Ｅｘｃｅｌ  ＨＰプロトタイプＬＳ０１８８１９（点線）のＭＢＰ−Ｈｉｓに対する動的結合容量（ＱＢ１０％）の試験を示すクロマトグラム。矢印は、試料適用中の１０％ブレークスルーを示す。２８０ｎｍでの吸光度曲線は、プロトタイプの遅いブレークスルーを示す。
【図２】市販のＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌおよびＥｘｃｅｌ  ＨＰプロトタイプＬＳ０１８８１９のＱＢ１０％結果の図。試料：ＭＢＰ−Ｈｉｓ
【図３】市販のＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌ（太線）およびＥｘｃｅｌ  ＨＰプロトタイプＬＳ０１９３８２（点線）のＧＦＰ−Ｈｉｓに対する（ＱＢ１０％）での動的結合容量の試験を示すクロマトグラム。矢印は、試料適用中の１０％ブレークスルーを示す。２８０ｎｍでの吸光度曲線は、標的タンパク質の損失が少ない、プロトタイプの遅いブレークスルーを示す。
【図４】市販のＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌおよびＥｘｃｅｌ  ＨＰプロトタイプＬＳ０１９３８２のＱＢ１０％結果の図。試料：ＧＦＰ−Ｈｉｓ
【図５】大腸菌溶解物中のＧＦＰ−Ｈｉｓの精製。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＷＢシステム）による分析。レーン１：開始試料、レーン２：ＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌの溶出ピーク、レーン３：Ｅｘｃｅｌ  ＨＰプロトタイプＬＳ０１９３８２の溶出ピーク。
【図６】大腸菌溶解物中のＧＦＰ−Ｈｉｓの精製（溶出画分）。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１：参照（ＩＭＡＣ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）、レーン２：エポキシ活性化樹脂プロトタイプＬＳ０１８８３５Ｂ、レーン３：デキストランコーティング樹脂プロトタイプＬＳ０１８８３５Ａ。別個のレーン４は、参照により得られたプレピークの分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ＩＭＡＣ精製時の主な困難の１つは、高純度および高容量の両方を得るという課題である。高純度は、高容量を犠牲にして犠牲にされることが多く、その逆もある。
【００２３】
様々な試料および様々な目的のために、数多くの入手可能なＩＭＡＣ樹脂が存在している。例えば、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）は高容量を有するのに対して、ＴＡＬＯＮ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は容量は低いが、比較的高い純度をもたらす。Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｅｘｃｅｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）は、あらゆる種類の試料に（金属ストリッピング試料にも）使用することができる五座樹脂であり、高純度をもたらすが、容量が低く、試料適用中の標的タンパク質の損失を伴う。
【００２４】
あらゆる利点を兼ね備え、高い最終純度、高容量、およびあらゆる種類の試料を精製する可能性を提供する汎用ＩＭＡＣ樹脂が非常に望ましいであろう。
【００２５】
本発明は、ここで、いくつかの非限定的な実施例および添付の図面に関連して、さらに詳細に記載される。
【００２６】
実施例
材料および方法
ＩＭＡＣプロトタイプ
１．Ｅｘｃｅｌ  ＨＰプロトタイプ
・Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅに結合したＬＳ０１８８１９  Ｅｘｃｅｌ配位子、アリル含有量１７０μｍｏｌｅ／ｍｌ
・Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅに結合したＬＳ０１９３８２  Ｅｘｃｅｌ配位子、アリル含有量１８９μｍｏｌｅ／ｍｌ
・参照カラム：ＨｉＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌ、１ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ
２．デキストランコーティングプロトタイプ
・ＬＳ０１８８３５ＡデキストランコーティングＩＭＡＣ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ
・参照カラム：ＬＳ０１８８３５Ｂ  ＮａＯＨ処理エポキシ活性化ＩＭＡＣ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ
ＨｉＴｒａｐパッキング方法（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）に従って、１ｍｌのＨｉＴｒａｐカラムにプロトタイプ樹脂をパッキングした。ＨｉＴｒａｐカラムのパッキングには５０〜６０％のスラリー濃度を使用した。
【００２７】
ブレークスルー、純度および分離能の試験
精製ヒスチジンタグ付きマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ−Ｈｉｓ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ−Ｈｉｓ）をカラムに充填することによって、動的結合容量（ＤＢＣ）を試験した。吸光度を記録し、試料吸光度の１０％ブレークスルー（ＱＢ１０％）での容量を計算した。
【００２８】
大腸菌溶解物中のＧＦＰ−Ｈｉｓの勾配精製によって、純度および分離能を試験した。イミダゾール緩衝液によってヒスチジンタグ付きタンパク質を溶出し、画分を回収した。純度分析には還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した。
【００２９】
動的結合容量試験のための試料
１７％グリセロール、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中のヒスチジン（６）タグ付き緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ−Ｈｉｓ）、濃度２．５ｍｇ／ｍｌ。
【００３０】
２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中のヒスチジン（６）タグ付きマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ−Ｈｉｓ）、濃度１．４ｍｇ／ｍｌ。
【００３１】
最終純度および分離能試験のための試料
大腸菌、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中のヒスチジン（６）タグ付き緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ−Ｈｉｓ）、濃度約３ｍｇ／ｍｌ。
【００３２】
試料を遠心分離し（１０分間２００００ｇ）、カラムに注入した際に上清を濾過した（０．４５μｍ）。
【００３３】
緩衝液
結合緩衝液、Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４
溶出緩衝液、Ｂ：結合緩衝液中の５００ｍＭイミダゾール
クロマトグラフィー法
【００３４】
【表１】
2019533571.tif 000003
【００３５】
【表２】
2019533571.tif 000004
【００３６】
【表３】
2019533571.tif 000005
Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＷＢシステムを用いて、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＷＢ  Ｍｉｎｉｔｒａｐキットを用いて、最初に試料を緩衝液交換した。
【００３７】
実験１：Ｅｘｃｅｌ  ＨＰプロトタイプの合成
この実験では、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）（ビーズサイズ直径３４μｍ）に、欧州特許第２１６４５９１Ｂ１号明細書に記載されている五座配位子（ｐｅｎｔａｌｉｇａｎｄ）を結合させた。このビーズは、大きいビーズサイズを有する樹脂と比較して、結合のための表面積を増加させる小さいビーズサイズを有する。ビーズサイズを小さくすると、カラム内の繰り返し結合（オフ−オン事象）の数も増えるはずである。これは、試料適用中の標的タンパク質の漏出を減らすのに有益であり得る。従来のＩＭＡＣ媒体と比較してわずかに大きい孔径のＨｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ樹脂もまた、標的タンパク質への接近可能性を高め得る。
【００３８】
工程１：アリル化
ガラスフィルター（ｐ３、６ＧＶ）上で、１２０ｍｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ樹脂を水で洗浄し、水に吸引させた。次いで、７．５ｍｌの蒸留水とともに、１２０ｇの吸引された樹脂をジャケット付き反応器に移した。撹拌を開始し、１２ｍｌの５０％ＮａＯＨをスラリーに加えた。スラリーを３０分間撹拌し、次いで４７℃に加熱し、６０ｍｌのＡＧＥを加えた。約１８時間後、撹拌を止め、スラリーをガラスフィルターに移した。その後、スラリーを水（１ＧＶ×３）、ＥｔＯＨ（１ＧＶ×３）、次いで水（１ＧＶ×６）で洗浄した。
【００３９】
アリル滴定（Ａｌｌｙｌｔｉｔｒａｔｉｏｎ）（滴定を使用）アリル含有量：ＬＳ０１８８１９では約１７０μｍｏｌ／ｍｌ。
【００４０】
アリル滴定（滴定を使用）：アリル含有量：ＬＳ０１９３８２では約１８９μｍｏｌ／ｍｌ。
【００４１】
工程２：臭素化
１００ｇ／ｍｌの吸引された乾燥アリル化ゲルを反応反応器に移し、続いて５分間撹拌しながら３００ｍｌの水および４．６ｇの酢酸ナトリウム三水和物を加えた。ゲルの色が濃い暗黄色になるまで、反応混合物に約５ｍｌの臭素を加え、室温で５分間撹拌しながら反応を放置した。反応混合物に約７．８ｇのギ酸ナトリウムを加え、黄色が消えるまで１５分間撹拌しながら反応を放置した。ガラスフィルター（Ｐ３）上でゲルを水（１０×１ＧＶ）で洗浄した。
【００４２】
工程３：アミノ化工程
工程２から得られた１００ｇの臭素化ゲルを反応反応器に移し、１５０ｍｌのアンモニア溶液を加え、反応混合物を一晩４５℃で放置した。ガラスフィルター（Ｐ３）上でゲルを１０×１ＧＶで洗浄した。
【００４３】
工程４：ＥＤＴＡ配位子結合工程
工程３から得られた１００ｇのアミノ化ゲルをアセトン（６×１ＧＶ）で洗浄し、反応反応器に移し、１００ｍｌのアセトンを加えた。反応混合物に２．９ｇのＤＩＰＥＡを加え、５分間撹拌しながら反応を放置した。反応混合物に５．３ｇのＥＤＴＡを加え、混合物を一晩２４〜２８℃で放置した。ゲルをアセトン（３×１ＧＶ）、続いて水（３×１ＧＶ）で洗浄した。吸引されたゲルを反応器に移し、２Ｍ  ＮａＯＨ（１ＧＶ）を加えて未反応のＥＤＴＡのアクセス（ａｃｃｅｓｓ）を加水分解した。ガラスフィルター（Ｐ３）上でゲルを６×１ＧＶで洗浄した。
【００４４】
最後に、０．１Ｍ硫酸ニッケルによってゲルにニッケルを充填した。
【００４５】
スキーム１：アリル活性化、アミノ化およびＥＤＴＡ配位子結合の一般反応スキーム。
【００４６】
【化２】
2019533571.tif 000006
動的結合容量
２つの異なる精製ヒスチジンタグ付きタンパク質（ＭＢＰ−ＨｉｓおよびＧＦＰ−Ｈｉｓ）を用いて動的結合容量、ＤＢＣを試験し、１０％ブレークスルー、ＱＢ１０％で計算した。弱結合ＭＢＰ−Ｈｉｓの損失は、市販のＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌからは、ほぼ即座に始まったのに対して、Ｅｘｃｅｌ  ＨＰプロトタイプＬＳ０１８８１９では遅延が検出された（図１）。計算されたＱＢ１０％は、ＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌについてはＬＳ０１８８１９  ＭＢＰ−Ｈｉｓ（約５ｍｇ）／樹脂（ｍｌ）であり、プロトタイプについてはＭＢＰ−Ｈｉｓ（約３０ｍｇ）／樹脂（ｍｌ）であった（図２）。したがって、プロトタイプのＱＢ１０％は約６倍優れていた。
【００４７】
弱結合ＭＢＰ−Ｈｉｓと比較して、強結合ＧＦＰ−Ｈｉｓについては遅いブレークスルーを予測することができる。ＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌについて得られたＱＢ１０％は、ＧＦＰ−Ｈｉｓ（約３０ｍｇ）／樹脂（ｍｌ）であった。Ｅｘｃｅｌ  ＨＰプロトタイプＬＳ０１９３８２は、性能がさらに向上したことを示した。試料適用が終了するまで、吸光度は非常に低く（０ｍＡＵ）、標的タンパク質の損失はなかった（図３）。計算されたＱＢ１０％は、ＧＦＰ−Ｈｉｓ（約９０ｍｇ）／樹脂（ｍｌ）であった（図４）。
【００４８】
純度
ヒスチジンタグ付きタンパク質に対する高容量はまた、１つまたは複数のヒスチジンを含む不純物に対する高容量をもたらし得る。大腸菌溶解物中のＧＦＰ−Ｈｉｓの試料をカラムに加えることによって、最終純度を検討した。不純物が結合するための遊離配位部位を残すために低充填を使用した。イミダゾールを加えずに試料を適用し、イミダゾール勾配により溶出した。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって溶出ピークを分析した（図５）。図５のレーン１〜３の２つの主要なバンドの理由は、ＧＦＰ−Ｈｉｓの既知の切断（まだヒスチジンタグが残っている）によって説明することができると考えられる。２つの樹脂の最終純度は同等であった。
【００４９】
したがって、結果は、Ｅｘｃｅｌ  ＨＰプロトタイプの方が容量が高いにもかかわらず、等しい純度が得られたことを示している。これは、ｅｘｃｅｌ配位子がタンパク質への結合のために残されたただ一つの配位部位を有する五座であるという事実によって説明され得る。６つのヒスチジンタグは、不純物タンパク質に沿って分布している単一のヒスチジンと比較して、ただ一つの配位部位に結合する可能性が向上し、有益であり得る。結果は、Ｅｘｃｅｌ  ＨＰプロトタイプを用いて高容量および高純度の両方が得られたことを示している。
【００５０】
現行のＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｅｘｃｅｌ製品と比較して、プロトタイプは、試料適用中の標的タンパク質の損失が顕著に低く、３〜６倍の動的容量をもたらした。容量が増加した理由は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ビーズサイズ９０μｍ）と比較してＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ビーズサイズ３４μｍ）の表面積が増加したこと、ならびに比較的大きい孔径およびカラム内の繰り返し結合の数の増加による接近可能性などの他の効果によるものである可能性がある。
【００５１】
実験２：デキストランコーティングプロトタイプの合成
デキストランコーティングの目的は、ヒスチジンタグ付きタンパク質の結合を維持しながら、１つまたは複数のヒスチジンを含む不純物の多点結合を防ぐことであった。（Ｎｅｗ  ｄｅｘｔｒａｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｄｅｓｉｒｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，９１５（２００１）９７−１０６．）この場合、四座のＩＭＡＣ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）を使用したが、結果は五座樹脂にも当てはまるはずである。
【００５２】
デキストラン効果を評価するために、２つのプロトタイプを作製した。デキストランをＬＳ０１８８３５Ａそれに結合させたものと、エポキシ基を加水分解するためにＮａＯＨのみによって処理された対照プロトタイプＬＳ０１８８３５Ｂ。
【００５３】
工程１：エポキシ活性化
ガラスフィルター上で、ゲル（ＩＭＡＣ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）のスラリー約１００ｍｌを水（５×１ＧＶ）で洗浄した。次いでゲルを吸引乾燥し、エポキシ活性化のために５０ｇを２５０ｍｌの三口フラスコに量り入れた。次いでフラスコに１２ｍｌの水を加え、撹拌しながら２８℃に加熱し始めた。撹拌中に８ｍｌの５０％ＮａＯＨを加え、次いでスラリーを２８℃で約１０分間撹拌し、その後エピクロロヒドリン（１２．５ｍｌ）を加え、次いで３．５時間撹拌した。次いで、ガラスフィルター上でゲルを水（６×１ＧＶ）で洗浄した。
【００５４】
エポキシ滴定（６０分滴定、方法０１８ＢＬ５−３）により、結合に使用されたエポキシド活性化ゲルに対して約１６μｍｏｌ／ｍｌのエポキシド含有量をもたらした。
【００５５】
工程２：デキストラン結合工程（プロトタイプＬＳ０１８８３５Ａ）
約３時間回転撹拌しながら、３５．２ｍｌの水を入れたＤｕｒａｎフラスコ内で、８ｇのデキストランＴＦ（１０％Ｄｘ  ＴＦ）を溶解した。次いで、上記から得られた４０ｇの排出されたエポキシ活性化ゲルをフラスコに加え、その後スラリーを４０℃に加熱し、６０分間回転撹拌した。次いで、フラスコに４．８ｍｌの５０％ＮａＯＨおよび０．１ｇのＮａＢＨ４を加え、その後４０℃で一晩回転撹拌した。ゲルを水（１０×１ＧＶ）で洗浄した。
【００５６】
工程３：エポキシ活性化ゲルプロトタイプＬＳ０１８８３５ＢのＮａＯＨ処理
５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに、８．８ｍｌの蒸留水とともに、上記から得られた１０ｇの排出されたエポキシ活性化ゲルを加え、均一なスラリーになるまで振盪した。次いで、チューブに１．２ｍｌの５０％ＮａＯＨおよび０．０５ｇのＮａＢＨ４を加えた。その後チューブを振盪台の上に置き、４０℃に加熱し、一晩振盪した。
【００５７】
約１８．５時間後に反応を停止させ、ガラスフィルター（ｐ３）上でスラリーを水（約１０×２ＧＶ）で洗浄した。最後に、０．１Ｍ硫酸ニッケルによって樹脂にニッケルを充填した。
【００５８】
スキーム２：ＩＭＡＣ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅのエピクロロヒドリン活性化とそれに続くデキストラン結合の一般反応スキーム。
【００５９】
【化３】
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乾燥重量分析
標準的な方法（１２０℃の乾燥温度）を用いて、プロトタイプの乾燥重量を測定した。
【００６０】
【表４】
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表に見られるように、約５ｍｇ／ｍｌのデキストランが媒体に結合している。ＮａＯＨ処理Ｂプロトタイプについても乾燥重量のわずかな増加を見ることができる。
【００６１】
純度および動的結合容量
上記のように、エポキシ活性化ＩＭＡＣ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅに約１０％のデキストラン層を加えた。試料は大腸菌溶解物中のＧＦＰ−Ｈｉｓであり、イミダゾール勾配を用いて溶出を行った。クロマトグラムによると、参照では、２８０ｎｍでの吸光度を有するプレピークが検出されたが、デキストランコーティングプロトタイプＬＳ０１８８３５Ａ（図示せず）では検出されなかった。プレピークは４９０ｎｍでの吸光度（ＧＦＰ−Ｈｉｓに特異的）を欠き、これは混入物の含有を示すものであった。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって溶出試料を分析した（図６）。結果は、デキストランコーティング樹脂の方が純度が高いことを示しているが、エポキシ活性化樹脂ＬＳ０１８８３５Ｂも参照よりも高い純度を有した。したがって、両プロトタイプは、参照よりも明らかに優れた純度特性を有した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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