(57)【要約】  トランスポゾン系を用いて外来ＤＮＡ配列を細胞のゲノムに組み込むｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。トランスポゾン系は逆方向反復配列及び外来ＤＮＡを保有する第１のベクターと、トランスポザーゼを発現する第２のベクターとを含む。外来ＤＮＡを細胞のゲノムに組み込むためのトランスポゾン系を含むキットも提供する。上記の方法及び／又はキットを用いて外来ＤＮＡ配列を保有するように免疫細胞を改変することと、有効量の改変免疫細胞を被験体に投与することとを含む、被験体を治療する方法を記載する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来ＤＮＡ配列を細胞のゲノムに組み込むｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｉ）トランスポゾン系であって、
配列番号１からなる核酸配列を有する第１の逆方向反復、
前記第１の逆方向反復の下流の外来ＤＮＡ配列、及び、
前記外来ＤＮＡ配列の下流の第２の逆方向反復、ここで当該第２の逆方向反復は配列番号２からなる核酸配列を有する、を含有する第１のベクターと、
配列番号４のアミノ酸配列を有するトランスポザーゼをコードする核酸に操作可能に連結したプロモーターを含有する第２のベクターと、
を含むトランスポゾン系を得ることと、
（ｉｉ）前記外来ＤＮＡ配列が前記細胞のゲノムに組み込まれるように、前記第１のベクター及び前記第２のベクターを前記細胞に導入することと、
を含み、
前記トランスポザーゼが前記細胞中で発現され、前記第１のベクターからの前記外来ＤＮＡ配列の切出し及び切り出された外来核酸の前記細胞のゲノムへの組込みを触媒する、方法。
【請求項２】
前記外来ＤＮＡ配列が抗生物質耐性タンパク質、ｓｉＲＮＡ、レポータータンパク質、サイトカイン、キナーゼ、抗原、抗原特異的受容体、サイトカイン受容体又は自殺ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のベクターが、前記外来ＤＮＡ配列に操作可能に連結した非原核生物プロモーターを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記非原核生物プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子１−αプロモーター、ヒトＨ１プロモーター及びＵ６プロモーターからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のベクターがエンハンサー、サイレンサー又はインシュレーターを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記第２のベクター中の前記プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子１−αプロモーター、ヒトＨ１プロモーター及びＵ６プロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のベクターが、細菌複製に必要とされる原核生物配列を欠き、前記外来ＤＮＡ配列を除いて５００ｂｐ〜１５００ｂｐの長さを有するミニサークルＤＮＡである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ミニサークルＤＮＡが前記外来ＤＮＡ配列を除いて７００ｂｐ〜１２００ｂｐの長さを有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ミニサークルＤＮＡが前記外来ＤＮＡ配列を除いて８００ｂｐ〜１０００ｂｐの長さを有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ又はマスト細胞からなる群から選択される免疫細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が骨髄、脂肪組織、末梢血、臍帯血又は歯髄に由来する幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
導入工程の前に前記第１のベクターを線状化することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のベクター及び前記第２のベクターをリン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、細胞スクイージング、ソノポレーション、光学トランスフェクション、インペールフェクション、遺伝子銃、マグネトフェクション、ウイルス形質導入、又はデンドリマー、リポソーム若しくはカチオン性ポリマーによるトランスフェクションによって前記細胞に導入する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のベクターが、細菌複製に必要とされる原核生物配列を欠き、前記外来ＤＮＡ配列を除いて５００ｂｐ〜１５００ｂｐの長さを有するミニサークルＤＮＡである、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ミニサークルＤＮＡが前記外来ＤＮＡ配列を除いて７００ｂｐ〜１２００ｂｐの長さを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ミニサークルＤＮＡが前記外来ＤＮＡ配列を除いて８００ｂｐ〜１０００ｂｐの長さを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１８】
外来ＤＮＡ配列を細胞のゲノムに組み込むためのキットであって、
容器と、
トランスポゾン系であって、
配列番号１からなる核酸配列を有する第１の逆方向反復、
前記第１の逆方向反復の下流の配列番号２からなる核酸配列を有する第２の逆方向反復、及び、
前記外来ＤＮＡ配列を導入するための前記第１の逆方向反復と前記第２の逆方向反復との間のクローニング部位を含有する第１のベクターと、
配列番号４のアミノ酸配列を有するトランスポザーゼをコードする核酸に操作可能に連結したプロモーターを含有する第２のベクターと、
を含むトランスポゾン系と、
前記容器に付随し、前記トランスポゾン系の使用方法を示す取扱説明書と、
を含み、前記トランスポザーゼが、前記第１のベクターからの前記外来ＤＮＡ配列の切出し及び切り出された外来ＤＮＡ配列の前記細胞のゲノムへの組込みを触媒する、キット。
【請求項１９】
前記第２のベクター中の前記プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子１−αプロモーター、ヒトＨ１プロモーター及びＵ６プロモーターからなる群から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記第１のベクターが、前記第１の逆方向反復の下流かつ前記クローニング部位の上流に非原核生物プロモーターを更に含み、該非原核生物プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子１−αプロモーター、ヒトＨ１プロモーター及びＵ６プロモーターからなる群から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
前記第１のベクターが細菌複製に必要とされる原核生物配列を欠くミニサークルＤＮＡである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２２】
免疫関連疾患を有する又は有する疑いがある被験体を治療する方法であって、
（１）免疫細胞を、請求項１８に記載のキットを使用して外来遺伝子を保有するように改変することと、
（２）有効量の工程（１）の改変免疫細胞を前記被験体に投与して、前記免疫関連疾患の症状を改善又は緩和することと、
を含む、方法。
【請求項２３】
前記被験体がヒトである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫細胞が前記被験体又はドナーに由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記外来遺伝子が前記被験体における免疫応答を増強し、前記免疫関連疾患が腫瘍又は感染性疾患である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記外来遺伝子が前記被験体における免疫応答を阻害し、前記免疫関連疾患がアレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病又は炎症性疾患である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ又はマスト細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記外来遺伝子が抗生物質耐性タンパク質、レポータータンパク質、サイトカイン、キナーゼ、抗原、抗原特異的受容体、サイトカイン受容体、自殺ポリペプチド又は調節要素をコードする、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は概して、対象の遺伝子を保有するように細胞を改変する系、キット及び方法、並びに治療を必要とする被験体を治療するための治療剤としての改変細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンは、「カットアンドペースト」機構によりベクターと染色体との間で効率的に転移する可動遺伝因子である。ＰＢトランスポザーゼは転移の際に、トランスポゾンベクターの両端に位置するトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を認識し、その内容を元の部位から移動させ、それらをＴＴＡＡ染色体部位に効率的に組み込む。ＰＢトランスポゾン系の強力な活性により、ＰＢベクター中の２つのＩＴＲ間の対象の遺伝子を容易に標的ゲノム内に動員することが可能となる。
【０００３】
ＰＢトランスポゾンの独自の特徴としては、（１）カーゴ（cargo）の制限がないこと（ＰＢトランスポゾンが最大１００キロベースのＤＮＡフラグメントを標的細胞内に動員することができると報告されている）、（２）転移プロセスが可逆的であること（挿入ＰＢベクターを含有するゲノムを、ＰＢトランスポザーゼのみを発現するベクターにより一時的にトランスフェクトし、トランスポゾンをゲノムから除去することができる）、及び（３）ＰＢトランスポゾンの使用が特定の種に限定されないこと（ＴＴＡＡ特異的ＰＢトランスポゾンは広範な種、例えば昆虫細胞及び哺乳動物細胞の遺伝子改変に極めて有用なトランスポゾンである）が挙げられる。さらに、ＰＢトランスポゾンはウイルスベクターに比べて低い免疫原性を有する。
【０００４】
免疫系はヒトの健康において重要な役割を果たす。免疫系の不全又は機能障害は、異常体細胞及び侵入病原体を排除する身体の能力を低下させ、腫瘍及び感染に対する脆弱性を引き起こす。一方で、免疫系が過剰に活性であると、身体は自己組織を攻撃及び損傷し、結果として自己免疫疾患及び炎症が発症する。このため、免疫細胞の発現、機能又は相互作用を調節すること、例えば（ｉ）免疫細胞の遺伝子発現を上方調節若しくは下方調節するため、又は（ｉｉ）免疫細胞の機能を強化若しくは抑制するために外来遺伝子を導入することで、免疫関連疾患を予防及び／又は治療する潜在的手段がもたらされ得る。しかしながら、免疫細胞に外来遺伝子を恒常的に発現させることは困難であるため、細胞療法におけるそれらの使用は制限される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、関連技術分野では、外来ＤＮＡ配列、例えば遺伝子を免疫細胞中で効率的かつ恒常的に発現させることを可能にし、続いて免疫関連疾患及び／又は障害を予防又は治療するための細胞療法に使用することができる、改善された発現系及び方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
読者に基礎知識を与えるために本開示の簡単な概要を以下に提示する。この概要は本開示の広範な概説ではなく、本発明の重要／決定的な要素を特定する又は本発明の範囲を定めるものではない。その唯一の目的は、この後に提示するより詳細な説明の序章として本明細書で開示される幾つかの概念を簡単に提示することである。
【０００７】
外来ＤＮＡ配列を細胞のゲノムに組み込むｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を開示する。該方法は、（ｉ）トランスポゾン系であって、（ａ）配列番号１からなる核酸配列を有する第１の逆方向反復、第１の逆方向反復の下流の外来ＤＮＡ配列、及び配列番号２からなる核酸配列を有する、外来ＤＮＡ配列の下流の第２の逆方向反復を含有する第１のベクター、並びに（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有するトランスポザーゼをコードする核酸に操作可能に連結したプロモーターを含有する第２のベクターを含むトランスポゾン系を得ることと、（ｉｉ）第１のベクター及び第２のベクターを細胞内に導入することとによって行われる。外来ＤＮＡ配列は、細胞内で発現され、第１のベクターからの外来ＤＮＡ配列の切出し及び切り出された外来核酸の細胞のゲノムへの組込みを触媒するトランスポザーゼによって細胞のゲノムに組み込まれる。
【０００８】
外来ＤＮＡ配列を細胞のゲノムに組み込むためのキットも開示する。該キットは、（ｉ）容器と、（ｉｉ）トランスポゾン系であって、（ａ）配列番号１からなる核酸配列を有する第１の逆方向反復、第１の逆方向反復の下流の配列番号２からなる核酸配列を有する第２の逆方向反復、及び外来ＤＮＡ配列を導入するための第１の逆方向反復と第２の逆方向反復との間のクローニング部位を含有する第１のベクター、並びに（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有するトランスポザーゼをコードする核酸に操作可能に連結したプロモーターを含有する第２のベクターを含む、トランスポゾン系と、（ｉｉｉ）容器に付随し、トランスポゾン系の使用方法を示す取扱説明書とを含む。トランスポザーゼは、第１のベクターからの外来ＤＮＡ配列の切出し及び切り出された外来ＤＮＡ配列の細胞のゲノムへの組込みを触媒する。
【０００９】
さらに、免疫関連疾患を有する又は有する疑いがある被験体を治療する方法が本発明の範囲内である。該方法は、上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を好ましくは同様に上記のキットと共に用いて外来ＤＮＡ配列を免疫細胞のゲノムに組み込み、改変免疫細胞を得ることと、有効量の改変免疫細胞を被験体に投与して、免疫関連疾患の症状を改善又は緩和することとを含む。
【００１０】
本開示の付随特徴及び利点の多くが、添付の図面に関連して検討される以下の詳細な説明を参照してより良好に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】酵素消化／ライゲーション法によって作製される指定のヘルパープラスミド及びＤＮＡドナー（環状型）を同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のハイグロマイシン耐性コロニーの数を示すヒストグラムである。
【図１Ｂ】酵素消化／ライゲーション法によって作製される指定のヘルパープラスミド及びＤＮＡドナー（線状型）を同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のハイグロマイシン耐性コロニーの数を示すヒストグラムである。
【図１Ｃ】下記実施例１に従い市販のキットによって作製される指定のヘルパープラスミド及びＤＮＡドナーを同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のハイグロマイシン耐性コロニーの数を示すヒストグラムである。
【図２Ａ】酵素消化／ライゲーション法によって作製される指定のヘルパープラスミド及びＤＮＡドナーを同時トランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞のハイグロマイシン耐性コロニーの数を示すヒストグラムである。
【図２Ｂ】下記実施例２に従い市販のキットによって作製される指定のヘルパープラスミド及びＤＮＡドナーを同時トランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞のハイグロマイシン耐性コロニーの数を示すヒストグラムである。
【図３】下記実施例３に従い初代ヒトＴ細胞に同時トランスフェクトした指定のＤＮＡドナー及びヘルパープラスミドの転移有効性を示すヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
添付の図面に関連して下記に提示する詳細な説明は本実施例の説明を意図し、本実施例を構成又は利用し得る唯一の形態を表すことを意図するものではない。該説明は、実施例の機能及び実施例を構成し、実施する工程の順序を記載するものである。しかしながら、同じ又は同等の機能及び順序を異なる実施例によって達成することができる。
【００１３】
１．  定義
便宜上、本明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲に用いられる或る特定の用語をここにまとめる。本明細書において他に規定のない限り、本開示に用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解され、使用されるものと同じ意味を有するものとする。また、文脈上必要とされない限り、単数形の用語がその複数形を含み、複数形の用語がその単数形を含むことを理解されたい。特に、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、数量を特定していない単数形（the singular forms "a" and "an"）は文脈上そうでないことが明らかに示されない限り、複数の指示対象を含む。また、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「少なくとも１つの」及び「１つ以上の」という用語は同じ意味を有し、１つ、２つ、３つ又はそれ以上を含む。
【００１４】
本発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメーターは近似値であるが、特定の実施例に記載される数値は可能な限り正確に報告される。しかしながら、いずれの数値もそれぞれの試験測定値に見られる標準偏差に必然的に起因する或る特定の誤差を本質的に有する。また、本明細書で使用される場合、「約」という用語は概して、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％内であることを意味する。代替的には、「約」という用語は、当業者が検討した場合に許容可能な平均値の標準誤差の範囲内であることを意味する。実施例（operating/working examples）以外において又は他に明白な指定のない限り、本明細書で開示される材料の量、時間、温度、操作条件、量の比率等のようなその数値範囲、量、値及びパーセンテージの全てが、いずれの場合にも「約」という用語によって修飾されると理解されるものとする。したがって、そうでないことが示されない限り、本開示及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメーターは、必要に応じて変更され得る近似値である。少なくとも、各々の数値パラメーターは、少なくとも報告される有効数字を考慮して、通常の丸めの手法により解釈されるものとする。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「トランスポゾン」又は「転移因子」という用語は、ドナーポリヌクレオチド（例えば、ベクター）からの切出しによりゲノム内のその位置を変え、標的部位（例えば、細胞のゲノムＤＮＡ又は染色体外ＤＮＡ）に組み込むことが可能なポリヌクレオチドを指す。トランスポゾンは、シス作用ヌクレオチド配列が隣接した核酸配列を含むポリヌクレオチドであり、少なくとも１つのシス作用ヌクレオチド配列が核酸配列の５’に位置し、少なくとも１つのシス作用ヌクレオチド配列が核酸配列の３’に位置する。シス作用ヌクレオチド配列は、トランスポゾンの両端に少なくとも１つの逆方向反復（ＩＲ）を含み、これにトランスポザーゼ、好ましくは哺乳動物ｐｉｇｇｙＢａｃファミリーのトランスポザーゼの成員が結合する。或る特定の好ましい実施形態では、トランスポゾンはガのｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「トランスポザーゼ」という用語は、ドナーポリヌクレオチド、例えばミニサークル構築物からのトランスポゾンの切出し、及びその後の標的細胞のゲノムＤＮＡ又は染色体外ＤＮＡへのトランスポゾンの組込みを触媒するポリペプチドを指す。トランスポザーゼは逆方向反復配列に結合するのが好ましい。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。このため、例えばペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、抗体及び酵素という用語がポリペプチドの定義内に含まれる。「ポリペプチド」という用語はポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化（例えば、糖類の付加）、アセチル化、リン酸化等も含む。
【００１８】
「ベクター」という用語は本明細書で使用される場合、それが連結した別の核酸分子を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターの例としては、細菌、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス及び挿入可能なＤＮＡフラグメント、すなわち相同組換えにより宿主細胞ゲノムに挿入されることが可能なフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「プラスミド」という用語は、外来ＤＮＡフラグメントを受け入れることが可能であり、原核細胞又は真核細胞内で複製することが可能な環状二本鎖ＤＮＡを指す。
【００２０】
「ミニサークル」、「ミニサークルＤＮＡ」及び「ミニサークル核酸配列」という用語は同義であり、通例原核生物抗生物質耐性遺伝子及び原核生物複製起点等の複製に必要とされるプラスミド／ベクター骨格配列のいずれかを欠いている核酸配列を指すために用いられる。ミニサークルは、プラスミド中のリコンビナーゼ認識部位間の部位特異的分子内組換えによってｉｎ  ｖｉｖｏで細菌プラスミドから生成することができ、細菌プラスミド骨格ＤＮＡを欠いているミニサークルＤＮＡベクターが得られる。本開示の一実施形態によると、本ミニサークルは酵素消化／ライゲーション法によって作製される。本開示の別の実施形態によると、本ミニサークルは市販のキット、すなわちＭｉｎｉｃｉｒｃｌｅ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎキット（System Biosciences，CA，USA）によって作製される。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「導入する」という用語は、細胞又は生物へのポリヌクレオチド（例えば、ミニサークル核酸配列又は本トランスポゾン系のヘルパーベクター）の導入を指す。ポリヌクレオチドの核酸は、様々なタンパク質と会合しているか又はベクターに組み込まれた裸のＤＮＡ又はＲＮＡの形態であり得る。「導入する」という用語は本明細書で使用される場合、可能な限り最も広い意味を伝え、例えばトランスフェクション法（物理的及び／又は化学的処理による真核細胞へのポリヌクレオチドの導入）、形質転換法（物理的及び／又は化学的処理による原核細胞へのポリヌクレオチドの導入）、ウイルス法／ウイルス形質導入法（ウイルス又はウイルスベクターによる真核細胞及び／又は原核細胞へのポリヌクレオチドの導入）、コンジュゲーション法（或る細胞から別の細胞への直接細胞間接触又は細胞間の細胞質間橋によるポリヌクレオチドの導入）及び融合法（同型細胞融合及び異型細胞融合を含む２つの細胞の融合）による導入を包含することを意図するものである。
【００２２】
「改変する」という用語は本明細書で使用される場合、細胞における検出可能な変化を生じる細胞の任意の操作を指し、該操作としては、細胞と異種／同種のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの挿入、並びに細胞に固有のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの突然変異が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
「転移」という用語は本明細書で使用される場合、多くの場合ゲノム内、又はゲノム間、ＤＮＡ構築物（プラスミド、バクミド及びコスミド等）間若しくはゲノムとＤＮＡ構築物との間に生じる、ポリヌクレオチド（トランスポゾン）の或る位置からの移動又はコピー及び別の位置への挿入を伴う複雑な遺伝子再配列プロセスを指す。本開示の実施形態によると、転移はゲノムとＤＮＡ構築物との間に生じ、ポリヌクレオチド（例えば、本トランスポゾン系の発現カセット）が本トランスポゾン系のミニサークル核酸配列から宿主細胞（例えば、免疫細胞）のゲノムへと移入される。
【００２４】
「転移有効性」という用語は本明細書で使用される場合、宿主細胞の集団における導入ポリヌクレオチドを含有する宿主細胞の数を指す。概して、転移有効性はレポーター遺伝子、例えばβ−ｇａｌをコードするポリヌクレオチドを標的細胞の集団にトランスフェクトすることによって決定することができる。このため、トランスフェクション効率は、導入ポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物をアッセイすること、例えばβ−ｇａｌ活性を有する細胞の数を測定することによって決定することができる。本開示の一実施形態によると、導入ポリペプチドはハイグロマイシン耐性遺伝子であり、したがって転移有効性はハイグロマイシンに耐性を示す細胞の数を測定することによって決定することができる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、免疫応答において役割を果たす細胞を指す。免疫細胞は造血系起源であり、Ｂ細胞及びＴ細胞等のリンパ球；ナチュラルキラー細胞；単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球及び顆粒球等の骨髄細胞を含む。
【００２６】
「免疫関連疾患」という用語は本明細書で使用される場合、免疫系が疾患の原因に関与するか、又は免疫系の適切な刺激若しくは阻害が疾患の治療及び／又は疾患からの保護をもたらし得る疾患及び／又は病態を指す。本発明によって治療可能な例示的な免疫関連疾患としては、腫瘍、感染性疾患、アレルギー、自己免疫疾患、移植片対宿主病又は炎症性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
「被験体」という用語は、本発明の方法を用いて治療可能なヒト種を含む哺乳動物を指す。「被験体」という用語は一方の性が特に指定されない限り、雄性及び雌性の両方を指すことを意図するものである。
【００２８】
２．  本発明の説明
概して、本開示は、対象の遺伝子（例えば、治療用タンパク質の遺伝子）を保有するように細胞を改変するための系、方法及び／又はキットに関する。改変細胞はこの場合、対象の遺伝子の産物によって治療可能な疾患及び／又は障害を患う患者を治療する治療剤として使用される。
【００２９】
上述のように、外来ＤＮＡ配列を細胞のゲノムに組み込むｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法が提供される。外来ＤＮＡ配列は、抗生物質耐性タンパク質、ｓｉＲＮＡ、レポータータンパク質、サイトカイン、キナーゼ、抗原、抗原特異的受容体、サイトカイン受容体又は自殺ポリペプチドをコードすることができる。例えば、外来ＤＮＡ配列は、腫瘍関連抗原に特異的な受容体をコードすることができる。該方法によって改変されたＴ細胞は、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞を認識し、特異的に殺すことが可能である。別の例では、外来ＤＮＡ配列はハイグロマイシン耐性タンパク質をコードするため、ハイグロマイシン耐性細胞株を樹立することができる。代替的には、外来ＤＮＡ配列は任意の生物学的機能を有しなくてもよく、それ自体を必須遺伝子に挿入し、それによりその機能を妨げることによって別の遺伝子の機能を妨げるために使用することができる。例えば、外来ＤＮＡ配列はＰＤ−１又はＴ細胞特異的受容体（ＴＣＲ）遺伝子サイレンシングのためのアンチセンスＲＮＡをコードし得る。
【００３０】
上記の方法は、初めにトランスポゾン系を得ることによって行う。
【００３１】
トランスポゾン系は、配列番号１からなる核酸配列を有する第１の逆方向反復、第１の逆方向反復の下流の外来ＤＮＡ配列、及び、配列番号２からなる核酸配列を有する、外来ＤＮＡ配列の下流の第２の逆方向反復を含有する第１のベクターを含む。第１のベクターは、外来ＤＮＡ配列に操作可能に連結した非原核生物プロモーターを更に含み得る。非原核生物プロモーターは、例えばサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子１−αプロモーター、ヒトＨ１プロモーター及びＵ６プロモーターであり得る。例としては、第１のベクターはエンハンサー、サイレンサー又はインシュレーターを更に含む。
【００３２】
特定の実施形態では、第１のベクターは、細菌複製に必要とされる原核生物配列を欠くミニサークルＤＮＡである。ミニサークルＤＮＡは、外来ＤＮＡ配列を除いて５００ｂｐ〜１５００ｂｐの長さを有することができる。例えば、ミニサークルＤＮＡは、外来ＤＮＡ配列を除いて７００ｂｐ〜１２００ｂｐ又は８００ｂｐ〜１０００ｂｐの長さを有することができる。
【００３３】
概して、原核生物ＤＮＡは、宿主において免疫応答を引き出し、第１のベクターが保有する外来ＤＮＡの発現効果を減少させ得る免疫刺激抗原とみなされる。したがって、ミニサークルＤＮＡ中に原核生物配列を欠くことから、本トランスポゾン系は宿主細胞、例えば真核細胞における外来ＤＮＡの導入及び発現の点で、原核生物ＤＮＡ配列を含む他のトランスポゾン／発現系と比較してより効率的である。さらに、上記のトランスポゾン系は、ミニサークルＤＮＡ中に原核生物ＤＮＡ配列が存在しないために、典型的なトランスポゾン／発現系と比較してサイズがより小さい。
【００３４】
トランスポゾン系はまた、第２のベクター、すなわちトランスポザーゼをコードする核酸に操作可能に連結したプロモーターを含有するヘルパープラスミドを含む。トランスポザーゼは、第１のベクター中の第１の逆方向反復及び第２の逆方向反復を認識し、それらに結合する。トランスポザーゼは、例えばＴｈｙＰＬＧＭＨ、ｍｙｃＰＢａｓｅ、ＴＰＬＧＭＨ又はＨＡｈｙＰＢａｓｅであり得る。特定の実施形態では、トランスポザーゼは配列番号３によってコードされる配列番号４のアミノ酸配列を有する。ヘルパーベクターは、Yaa-Jyuhn James Meir et. al.（A versatile, highly efficient, and potentially safer piggyBac transposon system for mammalian genome manipulations, FASEB, 2013: 27, 4429-4443）によって記載されるような当該技術分野で既知の方法に従って作製することができる。
【００３５】
第２のベクター中のプロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子１−αプロモーター、ヒトＨ１プロモーター及びＵ６プロモーターから選択される。特定の実施形態では、プロモーターはサイトメガロウイルスプロモーターである。
【００３６】
上記方法を行うために、第１のベクター及び第２のベクターを細胞に導入する。これはリン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、細胞スクイージング（cell squeezing）（細胞膜の軽い圧迫）、ソノポレーション（高強度超音波による細胞膜における細孔形成の誘導）、光学トランスフェクション（optical transfection）（高集束レーザーによる細胞膜における小さな穴の生成）、インペールフェクション（impalefection）（ナノファイバーの表面に結合したＤＮＡの細胞への挿入）、遺伝子銃（不活性固体のナノ粒子に接続したＤＮＡの細胞核への「打込み」）、マグネトフェクション（磁力を用いた標的細胞へのＤＮＡの送達）、ウイルス形質導入（ウイルスを担体として使用した標的細胞へのＤＮＡの送達）、又はデンドリマー、リポソーム若しくはカチオン性ポリマーによるトランスフェクションを含むが、これらに限定されない技法を用いて達成することができる。一例では、トランスポゾン系を非リポソーム化学的方法、すなわちＦｕＧＥＮＥ（商標）  ＨＤトランスフェクションにより細胞に導入する。別の例では、トランスポゾン系をヌクレオフェクションにより細胞に導入する。上記方法の特定の実施形態では、トランスポゾン系の第１のベクターを、例えば制限酵素を使用して線状化した後、細胞に導入する。
【００３７】
第１のベクター及び第２のベクターを、２：１〜１：１の範囲の重量比で細胞に導入する。一実施形態によると、外来ＤＮＡを上皮細胞に導入し、第１のベクター、例えばミニサークルＤＮＡと第２のベクターとの重量比は２：１〜１：１である。別の実施形態によると、外来ＤＮＡを不死化Ｔ細胞に導入し、ミニサークル核酸配列とヘルパーベクターとの重量比は約２：１〜１：１である。更に別の実施形態では、外来ＤＮＡを初代Ｔ細胞に導入し、ミニサークル核酸配列とヘルパーベクターとの重量比は約２：１〜１：１である。
【００３８】
外来ＤＮＡ配列を、第２のベクターによって細胞内で発現され、第１のベクターからの外来ＤＮＡ配列の切出し及び切り出された外来ＤＮＡの細胞のゲノムへの組込みを触媒するトランスポザーゼにより細胞のゲノムに組み込む。
【００３９】
上記の方法に使用される細胞は、免疫細胞であり得る。より具体的には、免疫細胞はＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ又はマスト細胞であり得る。
【００４０】
別の態様では、細胞は幹細胞である。幹細胞は、例えば骨髄、脂肪組織、末梢血、臍帯血又は歯髄に由来し得る。特定の方法では、細胞はヒト細胞である。
【００４１】
上記の方法を実現するためには、外来ＤＮＡ配列を細胞のゲノムに組み込むためのキットが提供される。キットは上記の本トランスポゾン系を含む容器と、容器に付随し、本トランスポゾン系の使用方法を示す取扱説明書とを含む。上述のように、本トランスポゾン系は第１のベクター及び第２のベクターを含む。
【００４２】
第１のベクターは、配列番号１からなる核酸配列を有する第１の逆方向反復、第１の逆方向反復の下流の配列番号２からなる核酸配列を有する第２の逆方向反復、及び、外来ＤＮＡ配列を導入するための第１の逆方向反復と第２の逆方向反復との間のクローニング部位を含有する。
【００４３】
キット内の第１のベクターは、第１の逆方向反復の下流かつクローニング部位の上流の非原核生物プロモーターを更に含み得る。外来ＤＮＡは、非原核生物プロモーターが外来ＤＮＡ配列に操作可能に連結するようにクローニング部位に挿入することができる。非原核生物プロモーターは、例えばサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子１−αプロモーター、ヒトＨ１プロモーター及びＵ６プロモーターであり得る。一例では、第１のベクターはエンハンサー、サイレンサー又はインシュレーターを更に含む。
【００４４】
キットは第２のベクター、すなわちトランスポザーゼをコードする核酸に操作可能に連結したプロモーターを含有するヘルパープラスミドも含む。トランスポザーゼは、例えばＴｈｙＰＬＧＭＨ、ｍｙｃＰＢａｓｅ、ＴＰＬＧＭＨ又はＨＡｈｙＰＢａｓｅであり得る。特定の実施形態では、トランスポザーゼは配列番号４のアミノ酸配列を有する。
【００４５】
上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に使用される第２のベクターのようなキット内の第２のベクターはサイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、伸長因子１−αプロモーター、ヒトＨ１プロモーター及びＵ６プロモーターから選択されるプロモーターを含有する。特定の実施形態では、プロモーターはサイトメガロウイルスプロモーターである。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「取扱説明書」は、使用者に本トランスポゾン系の使用方法を伝える又は教示するために使用することができるパンフレット、記録、図表又は任意の他の表現手段（例えばテープ、ＣＤ、ＶＣＤ又はＤＶＤ）を含む。取扱説明書は容器に貼り付けることができるか、又は本トランスポゾン系を含む容器とは独立して包装される。
【００４７】
本明細書に記載のキットは、トランスポゾン系を安定化する及び／又は細胞トランスフェクションを行うための緩衝溶液を更に含み得る。緩衝溶液は、例えばリン酸緩衝生理食塩水、トリス系生理食塩水、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液又は（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝液であり得る。
【００４８】
上述のように、免疫関連疾患を有する又は有する疑いがある被験体を治療する方法が提供される。該方法は、上記のキットを用いて免疫関連疾患の治療に好適な遺伝子を保有するように細胞を改変することと、免疫関連疾患の治療にとって有効量の改変細胞を投与することとを含む。一例では、遺伝子は、急性リンパ芽球性白血病の治療のためのＣＡＲ  Ｔ細胞を改変するＣＤ１９に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
【００４９】
免疫関連疾患を有する又は有する疑いがある被験体はヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル及びブタを含む哺乳動物である。特定の実施形態では、被験体はヒトである。治療される被験体がヒトである場合、本方法の導入／移入免疫細胞は、被験体自身に由来するのが好ましい。代替的には、本方法の導入／移入免疫細胞はドナーに由来する。
【００５０】
本開示の幾つかの実施形態によると、本方法は腫瘍又は感染性疾患等の免疫抑制疾患の治療に有用である。これらの実施形態では、本トランスポゾン系は、被験体における免疫応答が増強されるように免疫増強遺伝子を含み得る。
【００５１】
本開示の他の実施形態によると、本方法は、過剰な（hyperactive）免疫応答に起因する疾患（例えば、自己免疫疾患）又は不適切な免疫応答に起因する疾患（例えばアレルギー、移植片対宿主病又は炎症性疾患）の治療に有用である。実施形態では、免疫抑制遺伝子を含む本トランスポゾン系は、被験体において免疫応答を阻害することが可能である。
【００５２】
以下の実施例は、本発明の或る特定の態様を明瞭にし、当業者が本発明を実施するのを助けるために提示される。これらの実施例は、本発明の範囲をいかなる形にも限定するとみなされるものではない。更なる詳述がなくとも、当業者は本明細書の記載に基づいて本発明を最大限に利用することができると考えられる。本明細書に引用される全ての刊行物は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【実施例】
【００５３】
材料及び方法
細胞培養
ヒト胎児腎臓細胞株２９３（ＨＥＫ２９３）、ヒトＪＫ不死化Ｔリンパ球（Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ）及び初代ヒトＴ細胞を本研究に使用した。ＨＥＫ２９３細胞は１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１倍非必須アミノ酸、１倍ペニシリン／ストレプトマイシン及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有するＭＥＭ培地中で培養した。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞及び初代ヒトＴ細胞は２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。全ての細胞を３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
【００５４】
馴化培地の作製
Ｊｕｒｋａｔ細胞を新鮮培地中、２×１０６／ｍＬの密度で２４時間培養した後、培養培地を回収し、濾過し、馴化培地として使用した。
【００５５】
プラスミド及び／又は発現構築物の生成
ｐＢＳ−カセット
ＳＶ４０プロモーターによって駆動されるハイグロマイシン耐性遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１＿ｈｙｇｒｏ＿ＬａｃＺベクター（Invitrogen）から切り出した。ＸｍｎＩ及びＳａｐＩ消化後に、ＤＮＡフラグメントをｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＳＫＩＩのＳｍａＩ部位にクローニングし、ｐＢＳ−ｈｙｇｒｏの構築を完了した。カナマイシン耐性遺伝子及びＣｏｌＥ１複製起点を更に挿入するために、ｐＺＥｒＯ−２．１（Invitrogen）のＡｐｏＩ＿ＡｆｌＩＩＩフラグメントをｐＢＳ−ｈｙｇｒｏのＥｃｏＲＶ部位にクローニングし、ｐＢＳ−カセットの構築を完了した。
【００５６】
ｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇ
ｐＢＳ−カセットを制限酵素ＳｍａＩ及びＥｃｏＲＶで消化し、続いてｐＢＳＩＩ−ＩＴＲ１に由来するｐＸＬＢａｃＩＩＰＵｂｎｌｓＥＧＦＰに消化フラグメントを挿入した。このようにして作製した構築物ｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇは、その５’末端及び３’末端にそれぞれ３０８ｂｐ及び２３８ｂｐの末端反復（ＴＲ）を有するものであった。
【００５７】
線状型のｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇは、ｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇをＸｍｎＩで消化することによって作製する。
【００５８】
ｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔ
ｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇ構築物をＰｃｉＩ及びＡｃｌＩで消化し、クレノウ（NE Biolabs）によってフィルインし（filled-in）、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（NE Biolabs）によって自己ライゲートさせ、アンピシリン耐性遺伝子及びｆ１複製起点を含有しないｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔを作製した。
【００５９】
線状型のｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔは、ｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔをＢｇｌＩで消化することによって作製する。
【００６０】
ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇ
短いｐｉｇｇｙＢａｃ末端反復ドメイン（ＴＲＤ）（すなわち、ｐＸＬ−ＢａｃＩＩの７４６〜８０８の３’ＬＴＲ及び１４２６〜１４６０の５’ＬＴＲ）を以下の４対のプライマー；ｐＢ−１１−ＫｐｎＩ（配列番号５）、ｐＢ−５−フォワード（配列番号６）、ｐＢ−６−リバース（配列番号７）及びｐＢ−１２−ＳａｃＩ（配列番号８）からなるＰＣＲ混合物から得た。間にＳｗａＩ及びＸｈｏ  Ｉ制限部位を有する６７ｂｐの５’ＴＲＤ及び４０ｂｐの３’ＴＲＤの両方を含有する得られるアンプリコンを、Ｋｐｎ  Ｉ及びＳａｃ  Ｉ制限部位を介してｐＢＳ−ＳＫＩＩにクローニングし、ｐＰＢｅｎｄＡＡＴＴを得た。上記のｐＢＳ−カセットから得られる発現カセットを、平滑末端Ｘｈｏ  Ｉ部位を介してｐＰＢｅｎｄＡＡＴＴ中の短いｐｉｇｇｙｂａｃｋ  ＴＲＤの間に挿入し、ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇを作製した。
【００６１】
線状型のｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇは、ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇをＸｍｎＩで消化することによって作製する。
【００６２】
ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔ
ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇをＡｃｃ６５Ｉ及びＡｆｌＩＩＩで消化し、アンピシリン耐性遺伝子及びｆ１複製起点を除去した。残りのＤＮＡフラグメントを平滑末端化し、続いて自己ライゲーションを行い、アンピシリン耐性遺伝子及びｆ１複製起点を含有しないｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔの構築物を生成した。この構築物もミニサークルカセットと指定される。
【００６３】
線状型のｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔは、ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔをＸｍｎＩで消化することによって作製する。
【００６４】
ミニサークル−ｍｉｃｒｏＰＢ−カセット
代替的には、ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔ、すなわちミニサークルカセットは、ＭＣ−Ｅａｓｙ  ｃｉｒｃｌｅ  Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎキットを用いて作製することができる。この方法では、ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇをＫｐｎＩ、ＳａｃＩ及びＸｍｎＩで消化し、ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃの左（ｍｉｃｒｏＬ）及び右（ｍｉｃｒｏＲ）逆方向反復を含有するＫｐｎＩ−ＳａｃＩフラグメント（３９９３ｂｐ）を平滑末端化し、ｐＭＣ．ＢＥＳＰＸ−ＭＣＳ１のＥｃｏＲＶ部位に挿入して、ｐＭＣ−ｍｉｃｒｏＰＢ−カセットを作製した。ミニサークル−ｍｉｃｒｏＰＢ−カセットは、ｐＭＣ−ｍｉｃｒｏＰＢ−カセットからＭＣ−Ｅａｓｙ  ｃｉｒｃｌｅ  Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎキットを用い、製造業者のプロトコルに従って作製した。このようにして作製したミニサークル−ｍｉｃｒｏＰＢ−カセットは、アンピシリン耐性遺伝子及びｆ１複製起点を含有しないものであった。
【００６５】
ヘルパープラスミド
ヘルパープラスミドｐＣＭＶ−ＴｈｙＰＬＧＭＨ、ｐＣＭＶ−ｍｙｃＰＢａｓｅ、ｐＣＭＶ−ＴＰＬＧＭＨ及びｐＣＭＶ−ＨＡｈｙＰＢａｓｅを、Yaa-Jyuhn James Meir et. al.（A versatile, highly efficient, and potentially safer piggyBac transposon system for mammalian genome manipulations, FASEB, 2013: 27, 4429-4443）によって記載されるプロトコルに従って構成した。この刊行物の内容全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【００６６】
転移アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞
トランスフェクションの１８時間前に８０％コンフルエンスの細胞を採取し、２４ウェルプレートの個々のウェルに１×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。各トランスフェクションについては、Ｆｕｇｅｎｅ  ６（Roche，Florence，SC）を用いて合計３００ｎｇのＤＮＡ混合物をトランスフェクトした。各ＤＮＡ混合物は、合計３００ｎｇのＤＮＡに対して１００ｎｇのヘルパープラスミド（すなわち、ｐＣＭＶ−ＴｈｙＰＬＧＭＨ、ｐＣＭＶ−ｍｙｃＰＢａｓｅ、ｐＣＭＶ−ＴＰＬＧＭＨ又はｐＣＭＶ−ＨＡｈｙＰＢａｓｅ）、様々な量のＤＮＡドナー（すなわち、ｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇ、ｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔ、ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇ、ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔ、ｐＭＣ−ｍｉｃｒｏＰＢ−カセット又はミニサークル−ｍｉｃｒｏＰＢ−カセット；最小のドナーの量を１００ｎｇと設定した）及びｐｃＤＮＡ３．１を含有するものであった。各トランスフェクション反応については、トランスフェクト細胞の５分の１を１００ｍｍプレートに移し、続いて１４日間のハイグロマイシン選択を行った。クローンを計数するために、４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳで細胞を１０分間固定した後、０．２％メチレンブルーで１時間染色した。１４日間のハイグロマイシン選択の後、直径０．５ｍｍのコロニーのみを計数した。
【００６７】
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞
細胞をヌクレオフェクションの２４時間前に１×１０６／ｍＬで播種した。各ヌクレオフェクション反応については、合計６μｇのＤＮＡを用いて１×１０６個の細胞にトランスフェクトした。各ＤＮＡ混合物は、合計６μｇのＤＮＡに対して２．５μｇのヘルパープラスミド（すなわち、ｐＣＭＶ−ＴｈｙＰＬＧＭＨ、ｐＣＭＶ−ｍｙｃＰＢａｓｅ、ｐＣＭＶ−ＴＰＬＧＭＨ又はｐＣＭＶ−ＨＡｈｙＰＢａｓｅ）、様々な量のＤＮＡドナー（すなわち、ｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇ、ｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔ、ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇ、ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔ、ｐＭＣ−ｍｉｃｒｏＰＢ−カセット又はミニサークル−ｍｉｃｒｏＰＢ−カセット；最小のドナーの量を２．０μｇと設定した）及びｐｃＤＮＡ３．１を含有するものであった。ヌクレオフェクションの２４時間後に、１．２ｍｇのハイグロマイシンを含む上記の馴化培地５０μＬ中３０個の生細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。２、３日おきに、細胞クラスターを乱すことなく同量の馴化培地を各ウェルに静かに添加した。各反応について、合計１０２００個の生細胞をハイグロマイシン選択に供した。転移活性を、各反応についての細胞クラスターの総数をハイグロマイシン選択の６日後又は７日後に光学顕微鏡下で計数することによって決定した。
【００６８】
初代Ｔ細胞
ヌクレオフェクションの１日前に、ヒト初代細胞（ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋）をＲＰＭＩ完全培地中で融解した。一晩の培養後に細胞を採取し、ヌクレオフェクションに供した。各ヌクレオフェクション反応については、合計２．２μｇのＤＮＡを用いて、２０μｌのオールインワンヌクレオフェクション緩衝液（ＧＦ１００１、GenomeFrontier, Biosciences）中１×１０５個の細胞にトランスフェクトした。各ＤＮＡ混合物は、合計２．２μｇの量のＤＮＡに対して０．８μｇのヘルパープラスミド（すなわち、ｐＣＭＶ−ＨＡｈｙＰＢａｓｅ又はｐＣＭＶ−ＴｈｙＰＬＧＭＨ）、様々な量のドナープラスミド（すなわち、ｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇ、ｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔ、ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇ又はｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔ；最大のドナーの量を１．４μｇと設定した）及びｐｃＤＮＡ３．１を含有するものであった。ヌクレオフェクションの２４時間後に、各反応においてトランスフェクトした全細胞を、刺激物質（stimuli）（ＩＬ−２（５０ｕｇ／ｍｌ）及びＰＨＡ）及びハイグロマイシン（１．０ｍｇ／ｍｌ）を添加した５００ｕｌのＲＰＭＩ  １６４０完全培地中で培養した。転移活性を、ハイグロマイシン選択の２２日後の生存細胞の総数を計数することによって決定した。
【００６９】
実施例１：ＨＥＫ２９３細胞における転移活性
本実施例ではＤＮＡドナー及びヘルパープラスミドの転移活性を分析した。結果を図１Ａ〜図１Ｃに示す。
【００７０】
図１Ａに示されるように、どのＤＮＡドナーを同時トランスフェクトするかに関わらず、ｐＣＭＶ−ＴｈｙＰＬＧＭＨをトランスフェクトした細胞はｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＭＶ−ＴＰＬＧＭＨ又はｐＣＭＶ−ｍｙｃＰＢａｓｅをトランスフェクトしたものと比較してより多くのハイグロマイシン耐性細胞を生じた。データから、ＴｈｙＰＬＧＭＨが試験したトランスポザーゼの中で最も強い転移活性を示すことが示された。ＤＮＡドナーに関しては、試験した４つ全てのＤＮＡドナー（すなわち、ｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇ、ｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔ、ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇ及びｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔ）がＨＥＫ２９３細胞において同様の転移活性を示した（図１Ａ）。驚くべきことに、ＤＮＡドナーを線状化形態でＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした場合、ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ（すなわち、ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔ又はｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇ）の転移活性は、ｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ（すなわち、ｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔ又はｍｉｎｉ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇ）よりも明らかに高く（図１Ｂ）、ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔが最も強い転移活性を示した。
【００７１】
転移活性を、ＭＣ−Ｅａｓｙ  ｃｉｒｃｌｅ  Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎキットにより作製したミニサークルを用いて更に検査した。図１Ｃに示すデータから、ｐＣＭＶ−ＴｈｙＰＬＧＭＨを同時トランスフェクトした場合に、ミニサークル−ｍｉｃｒｏＰＢ−カセットの活性がｐＭＣ−ｍｉｃｒｏＰＢ−カセットよりも約２．７倍高いことが示された。
【００７２】
まとめると、これらのデータから、転移活性が全長又はＤＮＡドナーのＴＲＤの増大と共に減少し、ＴｈｙＰＬＧＭＨが試験した他のトランスポザーゼよりも高い転移活性を有することが示された。したがって、他のＤＮＡドナー及びヘルパープラスミドと比較して、ｐＣＭＶ−ＴｈｙＰＬＧＭＨとｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃミニサークル（すなわち、ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔ又はミニサークル−ｍｉｃｒｏＰＢ−カセットのいずれか）との組合せは、ＨＥＫ２９３細胞において最も高い転移有効性をもたらした。
【００７３】
実施例２：Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞における転移活性
ｐＣＭＶ−ＴｈｙＰＬＧＭＨ及びｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃミニサークルの転移活性をＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞において更に検査した。結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。
【００７４】
図２Ａに示されるように、ｐＣＭＶ−ＴｈｙＰＬＧＭＨ及びｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔを同時トランスフェクトした細胞から得られるハイグロマイシン耐性コロニーの数は、他のＤＮＡドナー及びヘルパープラスミドを同時トランスフェクトした細胞よりも顕著に高かった。
【００７５】
図１Ｃに示す研究結果と同様に、ｐＣＭＶ−ＴｈｙＰＬＧＭＨとミニサークル−ｍｉｃｒｏＰＢ−カセットとの組合せは、他のＤＮＡドナー／ヘルパープラスミドの組合せと比較して最も高い転移有効性をもたらした（図２Ｂ）。
【００７６】
実施例３：初代ヒトＴ細胞における転移活性
上記の細胞株、すなわちＨＥＫ２９３細胞及びＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に加えて、特定のＤＮＡドナー及びヘルパープラスミドの転移活性を初代ヒトＴ細胞において更に分析した。
【００７７】
図３に示されるように、ヒト初代Ｔ細胞における最良の転移活性が、単鎖型又は長鎖型のｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ、すなわちｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔ又はｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇのいずれかと共にｐＣＭＶ−ＴｈｙＰＬＧＭＨをトランスフェクトした細胞において観察された。
【００７８】
結論として、本開示は外来遺伝子を細胞のゲノム、特に免疫細胞中に組み込むためのトランスポゾン系及び方法を提供する。他のＤＮＡドナー及びヘルパープラスミドの組合せと比較して、ｐＣＭＶ−ＴｈｙＰＬＧＭＨ及びｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃミニサークル（酵素消化／ライゲーション法によって作製される（すなわち、ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｓｈｏｒｔ）又はＭＣ−Ｅａｓｙ  ｃｉｒｃｌｅ  Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎキットによって作製される（すなわち、ミニサークル−ｍｉｃｒｏＰＢ−カセット））又はｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｇｙＢａｃ＿ｌｏｎｇの組合せは最も高い転移有効性をもたらし得る。したがって、本開示は、治療を必要とする被験体に治療用遺伝子を効率的に輸送することにより種々の疾患（例えば、免疫関連疾患）を治療する潜在的手段を提供する。
【００７９】
上記の実施形態の説明はほんの一例として与えられ、様々な修正を当業者が加え得ることを理解されたい。上記の明細書、例及びデータは、本発明の例示的な実施形態の構造及び使用に関する完全な説明を提供する。本発明の種々の実施形態が、或る程度まで詳細に、又は１つ以上の個別の実施形態を参照しながら、これまで説明されてきたが、当業者は、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、開示された実施形態に数多くの変更を加えることができる。
【図１Ａ】
2019503653.tif 000003
【図１Ｂ】
2019503653.tif 000004
【図１Ｃ】
2019503653.tif 000005
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2019503653.tif 000007
【図３】
2019503653.tif 000008
【配列表】
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【国際調査報告】
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