(57)【要約】ヒト化またはキメラ抗ＣＤ８１（分化のクラスター８１）モノクローナル抗体が提供される。本抗体は、ヒトＣＤ８１に結合し、腫瘍転移の低下または防止を含むが限定されることなく、様々な療法的方法において用途を見い出す。重鎖及び軽鎖可変領域配列、ならびに関連した相補性決定領域（ＣＤＲ）配列がさらに提供される。本発明の実施形態は、単離された抗体ならびにその誘導体及びフラグメント、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ８１モノクローナル抗体のうちの１種または複数種を含む薬学的製剤；ならびにこれらのモノクローナル抗体を産生する細胞株を含む。本抗体のアミノ酸配列も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ８１に特異的に結合し、配列番号１または配列番号４の少なくとも１種のＣＤＲ配列を含む、単離されたキメラまたはヒト化抗体。
【請求項２】
前記抗体の軽鎖は配列番号４のＣＤＲ配列のそれぞれを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
重鎖は配列番号１のＣＤＲ配列のそれぞれを含む、請求項１または請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記重鎖は、配列番号１、２、または３に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
前記重鎖はヒトＦｃポリペプチドを含む、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記ヒトＦｃポリペプチドはＩｇＧである、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記ＩｇＧポリペプチドは高いＡＤＣＣ活性を提供する、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
前記軽鎖は、配列番号４、５、または６に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
前記軽鎖はヒトＦｃポリペプチドを含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
増強したＡＤＣＣ活性のために操作されたＦｃ領域を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記Ｆｃ領域は、糖操作された炭水化物側鎖を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
前記Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を増強するアミノ酸置換を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１３】
切断可能なリンカーによって連結されたアミノ末端アミノ酸残基を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載される抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載される抗体を産生する細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載される抗体を含む薬学的組成物。
【請求項１７】
腫瘍成長または転移を低下させる方法であって、前記方法は、請求項１〜１３のいずれか１項に記載される抗体の治療上有効量を対象に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項１８】
前記対象はヒトである、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１６年６月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／３５１，０５４号の利益を主張するものであり、その出願は参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＣＤ８１は、タンパク質の進化的に保存されたファミリーに属するテトラスパニン分子である。すべての多細胞生物は、このファミリーのメンバーを発現する。テトラスパニンは、短いアミノ及びカルボキシル細胞質末端、ならびに小さい及び大きい細胞外ループ（それぞれＳＥＬ及びＬＥＬ）に隣接する４つの膜貫通ドメインによって、原形質膜に埋め込まれている。ＬＥＬの三次元構造は、２つのより長いａヘリックスの柄、及び２つのジスルフィド架橋の助けにより折り畳まれた新規なキノコ様頭部構造から構成される（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ  １６７（４）：１０４１−１０５１．ｅ１１を参照のこと）。組換えＬＥＬタンパク質との反応性によって明白なように、ほとんどの抗ＣＤ８１  ｍＡｂはＬＥＬと反応する。
【０００３】
テトラスパニンは、シグナル伝達プラットフォームとしての役割を果たす動的な膜実体である細胞内の膜マイクロドメインにおいて互いと結び付く。これらのテトラスパニンに富んだマイクロドメイン（ＴＥＭ）は、関連タンパク質（パートナータンパク質）を含む。これらの協調関係は、様々な細胞タイプにおいて及びそれらの結び付きの強度の点で異なる。一般的に、テトラスパニンは、細胞タイプ特異的である協調関係においてインテグリンと結び付く傾向がある。ゆえに、いくつかの種のインテグリンを発現する細胞において、これらのインテグリンのうちの１種のみが、特異的なテトラスパニン分子と結び付いて見い出され得る。他のパートナーには、テトラスパニン分子と頻繁に結び付く、ＣＤ１９及びＥＷＩ−２など、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーが含まれる。
【０００４】
ＴＥＭは、細胞内シグナル伝達経路への細胞外刺激の伝達を促す。例えば、それらは、ＥＲＭファミリータンパク質のエズリン、ラディキシン、及びモエシンを活性化することによって、細胞骨格アクチンの導きを可能にする。加えて、ＣＤ８１とＥＷＩ−２との結び付きは、Ｔ細胞免疫シナプスにａ−アクチンを導くことが示された。ゆえに、ＴＥＭに埋め込まれたＣＤ８１は、細胞膜で受け取られたシグナルを、下流シグナル伝達分子に及びアダプタータンパク質に伝達し、それによって特異的免疫機能に寄与する。例えば、抗原がそれらの同族ＢＣＲに関わりかつ同時にＣＤ１９／ＣＤ８１／ＣＤ２１複合体に結合する場合、Ｂ細胞活性化の閾値は下がり、下流シグナル伝達事象を増強する。
【０００５】
近年、ヒト黒色腫細胞株において外因性ＣＤ８１を発現させることが、異種移植モデルにおいてその移動、浸潤、及び転移能を増強することが示された。この及び他の証拠は、ＣＤ８１が腫瘍細胞運動に寄与し得ることを示唆する。
【０００６】
腫瘍細胞上でのＣＤ８１の発現に加えて、証拠は、ＣＤ８１が、宿主の適応性及び先天性免疫応答を変調することを示唆する。腫瘍細胞は、免疫回避及び転移性伝播を促す調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び先天性骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を導くことによって、先天性及び適応性の抗腫瘍免疫応答に対抗する。ＣＤ８１は、これらの細胞の通常の発生には要されないものの、それらの免疫抑制機能に必須であることが示されている。Ｔｒｅｇ−Ｔ細胞相互作用を遮断することを目的とした療法は、腫瘍誘導性免疫抑制を逆転させることが示されているため、Ｔｒｅｇ及びＭＤＳＣに対するＣＤ８１の機能を変調することは、重要な臨床適用を提供し得る。
本発明は、臨床上有用な抗ＣＤ８１抗体を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ  １６７（４）：１０４１−１０５１．ｅ１１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
ヒト化またはキメラ抗ＣＤ８１モノクローナル抗体に関する組成物及び方法が提供される。本発明の抗体は、５Ａ６モノクローナル抗体に由来する配列を含み、ヒトＣＤ８１に結合し、腫瘍細胞の浸潤を阻害し、ならびに体内での腫瘍成長及び転移を低下させる。それゆえ、これらの抗体は、がんの治療における様々な療法的方法において用途を見い出す。本発明の実施形態は、単離された抗体ならびにその誘導体及びフラグメント、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ８１モノクローナル抗体のうちの１種または複数種を含む薬学的製剤；ならびにこれらのモノクローナル抗体を産生する細胞株を含む。本抗体のアミノ酸配列も提供される。
【０００９】
関心対象の抗体には、提供されるヒト化またはキメラ抗体、及びその変種が含まれる。本発明のモノクローナル抗体は、特にがん療法において、ヒトにおけるＣＤ８１と関連した疾患の診断及び免疫療法のための試薬としての特定の実用性を見い出す。本発明のモノクローナル抗体の利点は、ヒト化工程及びヒトＦｃ領域の使用に由来する。ゆえに、免疫療法のための本発明のモノクローナル抗体のインビボ使用は、当該抗体に対する重大な宿主免疫応答の問題を大幅に低下させる。
【００１０】
当該抗体の様々な形態が、本明細書において企図される。例えば、抗ＣＤ８１抗体は、例えば任意のアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ等のヒト免疫グロブリン定常領域を有する、全長のキメラもしくはヒト化抗体、または抗体フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）２フラグメント及びＦ（ａｂ）フラグメント等であり得る。例えばイメージング目的のための、ＣＤＲ領域を含むフラグメントも関心対象である。さらには、抗体は、検出可能な標識で標識され得る。本発明の抗体は、切断可能なリンカーによって連結されたＮ末領域に付加された付加的なアミノ酸配列を含み得、それは、体内において無作為な部位への結合を低下させ、リンカーを切断しかつ当該抗体を放出する組織酵素を有する部位（すなわち、腫瘍細胞）でのみの結合を可能にし、それは次いでその標的抗原に自由に結合する。抗体は、固相に固定化され得る、及び／または異種化合物と抱合され得る。抗体は、免疫療法抗原に対するがん抗原を特に含めた、第二の抗原と反応性の二重特異性または多特異性抗体としても提供され得る。
【００１１】
本発明の実施形態は、通常ではヒト可変領域由来のフレームワーク配列と組み合わせた、または単離されたＣＤＲペプチドとして、本明細書において提供される少なくとも１種、通常では少なくとも３種のＣＤＲ配列を含む、単離された抗体ならびにその誘導体及びフラグメントを含む。一部の実施形態において、抗体は、限定されることなくヒトまたはマウス可変領域フレームワークであり得る可変領域フレームワークに位置する本明細書において提供される３種の軽鎖ＣＤＲ配列を含む少なくとも１本の軽鎖、及び限定されることなくヒトまたはマウス可変領域フレームワークであり得る可変領域フレームワークに位置する本明細書において提供される３種の重鎖ＣＤＲ配列を含む少なくとも１本の重鎖を含む。
【００１２】
ヒト化抗体は、可変領域として、配列番号２及び配列番号５、配列番号３及び配列番号５、配列番号２及び配列番号６、または配列番号３及び配列番号６を含み得る。配列番号１、２、または３のいずれかとペアにされ得る重鎖定常領域は、所望の機能における効力に対して選定され得る。例えば、ヒトＩｇＧ１は、ヒトエフェクター細胞背景においてＡＤＣＣを向上させること；及びＣＤＣを向上させることが示されている。マウスＩｇＧ２Ａは、マウスエフェクター細胞の背景において効力を向上させることが示されている。
【００１３】
本発明は、当該抗体及びその変種をコードする単離された核酸；ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される制御配列に任意で作動的に連結された、その核酸を含むベクター；そのベクターを含む宿主細胞；当該核酸が発現されるように当該宿主細胞を培養すること、及び任意で、宿主細胞培養物から（例えば、宿主細胞培養培地から）当該抗体を回収することを含む、当該抗体を産生するための工程をさらに提供する。本発明は、ヒト抗ＣＤ８１抗体のうちの１種または複数種、及び薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤を含む組成物も提供する。療法的用途のための本組成物は、無菌であり、凍結乾燥され得、例えば希釈剤及び送達デバイス、例えば吸入器、シリンジ等とともに、単位用量でプレパックとして提供される。
【００１４】
がんの治療のための方法も提供され、当該方法は、腫瘍成長及び／または転移を低下させるのに充分な期間、本発明の抗ＣＤ８１抗体の有効な１回または複数回の用量を投与することを含む。一部の実施形態において、腫瘍はＣＤ８１発現腫瘍である。他の実施形態において、例えば抗体が患者のＴｒｅｇ及び／またはＭＤＳＣ細胞を標的にして免疫抑制を低下させる場合、腫瘍はＣＤ８１を発現しない。一部のそのような実施形態において、本発明の療法は、１つまたは複数の付加的な抗腫瘍治療、例えば化学療法、放射線療法、手術、抗腫瘍抗体、免疫調節抗体等と組み合わされる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の抗体に対する配列のアライメント。
【図２】図２Ａ．マウス抗ヒトＣＤ８１モノクローナル抗体５Ａ６は、ヒト乳癌細胞の浸潤を阻害する。抗ヒトＣＤ８１（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）へのヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の浸潤を阻害することを実証している、３Ｄ浸潤アッセイ。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１スフェロイドの浸潤アッセイ画像は、表示される時間に撮られた。上のパネル：マウスＩｇＧ１対照抗体を含有するＥＣＭ；下のパネル：抗ヒトＣＤ８１（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）を含有するＥＣＭ。図２Ｂ．浸潤の阻害は５Ａ６の特性であり、他の抗ＣＤ８１抗体は、ヒト乳癌細胞の浸潤を阻害しない。３Ｄ浸潤アッセイにおいて、抗ヒトＣＤ８１（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）は、ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の浸潤を阻害し得るその能力において、抗ＣＤ８１  Ａｂの間で固有であることを実証している、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞の３Ｄ浸潤アッセイ。パネル：ＥＣＭなし＝細胞外マトリックスの非存在下における乳癌細胞スフェロイド、ＩＣ＝対照マウスＩｇＧ１抗体（アイソタイプ対照）を埋め込まれたＥＣＭ、５Ａ６＝抗ヒトＣＤ８１（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）、１Ｄ６、ＪＳ８１を埋め込まれたＥＣＭ、及び１．３．３．２２＝マウス定常領域ＩｇＧ１とともに、表示される抗ヒトＣＤ８１抗体を埋め込まれたＥＣＭ。棒グラフは、表示される抗ヒトＣＤ８１抗体及び対照の浸潤面積を描写している。ｔ検定、＊＊＊ｐ値＝０．０００１。
【図３Ａ】マウス抗ヒトＣＤ８１モノクローナル抗体５Ａ６は、ヒトＢ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）を抗原投与されたＳＣＩＤマウスの生存を延長させる。ルシフェラーゼを発現するヒトＢ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ−Ｌｕｃ）をＳＣＩＤマウスに注射し（１．５×１０６個／マウス）、腫瘍を１００μｇのマウス抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂ（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）、１００μｇの対照マウスＩｇＧ１、及び１００μｇのリツキシマブで週１回×４処理した。腫瘍を生物発光によって可視化し、２３日目のイメージングが示されている（抗体の２回の投薬を受けた後）。マウスの生存は、マウス抗ヒトＣＤ８１（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）による及びリツキシマブ（ヒト定常領域ＩｇＧ１）による処理の同程度の効力を示している。ログ−ラング検定、５Ａ６対対照マウスＩｇＧ１＊＊＊ｐ値＝０．０００１；リツキシマブ対対照マウスＩｇＧ１＊＊＊ｐ値＝０．０００２。
【図３Ｂ】定常領域を切り替えることは、５Ａ６及びキメラ抗ヒトＣＤ８１抗体の治療効力を増強し、リツキシマブよりも、ヒトＢ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）による抗原投与からＳＣＩＤマウスをより良好に保護する。ルシフェラーゼを発現するヒトＢ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ−Ｌｕｃ）をＳＣＩＤマウスに注射した（１．５×１０６個／マウス）。腫瘍を、１００μｇの抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂ（マウス定常領域ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ａを有する、またはヒト軽鎖定常領域カッパ及びヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４を有する配列番号１／配列番号４）で週１回×４処理した。対照群は、１００μｇ週１回×３のマウスＩｇＧ１（ＭｓＩｇＧ１）またはリツキシマブ（ヒト定常領域ＩｇＧ１）を受けた。２２日目に生物発光によって可視化された腫瘍は、マウス抗ヒトＣＤ８１（マウス定常領域ＩｇＧ２ａを有する配列番号１／配列番号４）による処理の優位性、それに続くキメラ５Ａ６抗体（ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖領域カッパを有する配列番号１／配列番号４）のそれを示している。ｔ検定、＊ｐ値＝０．１４９。
【図４】図４Ａ．マウス抗ヒトＣＤ８１モノクローナル抗体５Ａ６は、異種移植モデルにおけるヒト乳癌転移を低下させる。ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を、ＳＣＩＤマウスの乳房パッド（ｍａｍｍａｒｙ  ｐａｄ）へマトリゲル中に注射した（２．５×１０６個／マウス）。マウスを、腫瘍接種後７日目に開始する、１００μｇの抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂ（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）、または対照マウスＩｇＧ１  ｍＡｂで週１回４週間処理した。マウスを７５日目に屠殺し、肺を膨らませ、インディアインクを注射して腫瘍転移を可視化した（白点として見える）。左：対照ｍＡｂで処理されたマウスから獲得された肺、右：抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂ（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）で処理されたマウスから獲得された肺。図４Ｂ．５Ａ６の定常領域を切り替えることは、ヒト乳癌細胞を抗原投与されたＳＣＩＤマウスにおける腫瘍成長及び転移を低下させる。ルシフェラーゼを発現する、ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のより侵攻性のクローンの細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｌｕｃ）を、ＳＣＩＤマウスの乳房パッドへマトリゲル中に注射した（１．５×１０６個／マウス）。マウスを、腫瘍接種後７日目に開始する、１００μｇの抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂ（マウス定常領域ＩｇＧを有する配列番号１／配列番号４、マウス定常領域ＩｇＧ２ａを有する配列番号１／配列番号４）、または対照マウスＩｇＧ１  ｍＡｂで週１回３週間処理した（上のパネルに図解される）。腫瘍容積を１日おきに測定した（２３日目が示される、下段左のパネル）。マウスを２６日目に屠殺し、肺、肝臓、及び脾臓における転移を、生物発光イメージングを用いて測定した。５Ａ６マウス抗ヒトＣＤ８１のＩｇＧ２ａアイソタイプ（マウス定常領域ＩｇＧ２ａを有する配列番号１／配列番号４）は、腫瘍成長（左下のパネル）、ならびに肺、肝臓、及び脾臓への転移を低下させることにおいて最も有効であった。ｔ検定、＊ｐ値＝０．０１、＊＊ｐ値＝０．００２３。
【図５−１】図５Ａ．マウス抗ヒトＣＤ８１抗体５Ａ６は、他の抗ヒトＣＤ８１抗体よりも抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をより良好に媒介し、５Ａ６は、Ｒａｊｉ細胞の直接殺傷においても、他の抗ヒトＣＤ８１抗体及びリツキシマブよりも良好である。抗ヒトＣＤ８１（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）は、ヒトＢ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）のＡＤＣＣを媒介し得るその能力において、抗ＣＤ８１抗体の間で固有である。抗ヒトＣＤ８１（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）による直接殺傷は、リツキシマブ及び他の抗ヒトＣＤ８１抗体の両方のそれよりも優れている。Ｒａｊｉ細胞を、１μｇ／ｍｌの表示されるｍＡｂのみと、または精製されたヒトＮＫ細胞の存在下で（ＮＫ：Ｒａｊｉ  ５：１）一晩インキュベートし、細胞死をアネキシンＶ／７ＡＡＤ陽性によって定量化した。ｔ検定、＊ｐ値＝０．０３４、＊＊＊ｐ値＝０．０００。図５Ｂ．５Ａ６の定常領域をヒトＩｇＧ１のそれに切り替えることは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増加させる。キメラ抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂ（ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖領域カッパを有する配列番号１／配列番号４）は、マウス抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂ（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）よりも有効であり、それはまた、ＮＫ細胞媒介性抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）においてリツキシマブよりも有効である。Ｒａｊｉ細胞を、０．５μｇ／ｍｌの表示されるｍＡｂのみと、または精製されたヒトＮＫ細胞の存在下で（ＮＫ：Ｒａｊｉ  ２：１）一晩インキュベートし、細胞死をアネキシンＶ／７ＡＡＤ陽性によって定量化した。図５Ｃ．ヒト化抗ヒトＣＤ８１抗体は、ＡＤＣＣ及びＲａｊｉ細胞の直接殺傷をリツキシマブよりも良好に媒介する。ヒト化抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂ（Ｈ１Ｌ１、ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖領域カッパを有する配列番号２／配列番号５）及びＨ２Ｌ１（ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖領域カッパを有する配列番号３／配列番号５）は、キメラ抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂ（ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖領域カッパを有する配列番号１／配列番号４）と同じぐらい有効である。キメラ抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂは、バッチ産物に関係なくＡＤＣＣを媒介する。ヒト化及びキメラ化抗ヒトＣＤ８１は、ＡＤＣＣを媒介することにおいて及びＲａｊｉ細胞の直接殺傷において、リツキシマブよりも有効である。Ｒａｊｉ細胞を、１μｇ／ｍｌの表示されるｍＡｂのみと、または精製されたヒトＮＫ細胞の存在下で（ＮＫ：Ｒａｊｉ  １０：１）一晩インキュベートし、細胞死をアネキシンＶ／７ＡＡＤ陽性によって定量化した。
【図５−２】図５Ａ．マウス抗ヒトＣＤ８１抗体５Ａ６は、他の抗ヒトＣＤ８１抗体よりも抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をより良好に媒介し、５Ａ６は、Ｒａｊｉ細胞の直接殺傷においても、他の抗ヒトＣＤ８１抗体及びリツキシマブよりも良好である。抗ヒトＣＤ８１（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）は、ヒトＢ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）のＡＤＣＣを媒介し得るその能力において、抗ＣＤ８１抗体の間で固有である。抗ヒトＣＤ８１（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）による直接殺傷は、リツキシマブ及び他の抗ヒトＣＤ８１抗体の両方のそれよりも優れている。Ｒａｊｉ細胞を、１μｇ／ｍｌの表示されるｍＡｂのみと、または精製されたヒトＮＫ細胞の存在下で（ＮＫ：Ｒａｊｉ  ５：１）一晩インキュベートし、細胞死をアネキシンＶ／７ＡＡＤ陽性によって定量化した。ｔ検定、＊ｐ値＝０．０３４、＊＊＊ｐ値＝０．０００。図５Ｂ．５Ａ６の定常領域をヒトＩｇＧ１のそれに切り替えることは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増加させる。キメラ抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂ（ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖領域カッパを有する配列番号１／配列番号４）は、マウス抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂ（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）よりも有効であり、それはまた、ＮＫ細胞媒介性抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）においてリツキシマブよりも有効である。Ｒａｊｉ細胞を、０．５μｇ／ｍｌの表示されるｍＡｂのみと、または精製されたヒトＮＫ細胞の存在下で（ＮＫ：Ｒａｊｉ  ２：１）一晩インキュベートし、細胞死をアネキシンＶ／７ＡＡＤ陽性によって定量化した。図５Ｃ．ヒト化抗ヒトＣＤ８１抗体は、ＡＤＣＣ及びＲａｊｉ細胞の直接殺傷をリツキシマブよりも良好に媒介する。ヒト化抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂ（Ｈ１Ｌ１、ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖領域カッパを有する配列番号２／配列番号５）及びＨ２Ｌ１（ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖領域カッパを有する配列番号３／配列番号５）は、キメラ抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂ（ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖領域カッパを有する配列番号１／配列番号４）と同じぐらい有効である。キメラ抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂは、バッチ産物に関係なくＡＤＣＣを媒介する。ヒト化及びキメラ化抗ヒトＣＤ８１は、ＡＤＣＣを媒介することにおいて及びＲａｊｉ細胞の直接殺傷において、リツキシマブよりも有効である。Ｒａｊｉ細胞を、１μｇ／ｍｌの表示されるｍＡｂのみと、または精製されたヒトＮＫ細胞の存在下で（ＮＫ：Ｒａｊｉ  １０：１）一晩インキュベートし、細胞死をアネキシンＶ／７ＡＡＤ陽性によって定量化した。
【図６】図６Ａ．マウス抗ヒトＣＤ８１  ＩｇＧ１抗体によって媒介される補体依存性細胞傷害は、定常領域をマウスＩｇＧ２ａのそれに切り替えることによって、及びヒトＩｇＧ１定常領域を用いて抗体をキメラ化することによって非常に増大される。マウス抗ヒトＣＤ８１抗体ＭＳＩｇＧ２ａ（マウス定常領域ＩｇＧ２ａを有する配列番号１／配列番号４）及びキメラＨｕＩｇＧ１（ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖定常領域カッパを有する配列番号１／配列番号４）は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を非常に増大する。対照的に、抗ヒトＣＤ８１  ＭｓＩＧ１（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）及びキメラＨｕＩｇＧ４（ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ４及びヒト軽鎖定常領域カッパを有する配列番号１／配列番号４）、ならびにリツキシマブは、ＣＤＣをあまり媒介しない。ｔ検定、＊＊ｐ値＝０．００５１  ＭｓＩｇＧ１対５Ａ６  ＭｓＩｇＧ２ａ、＊＊ｐ値＝０．００１５  ＭｓＩｇＧ１対５Ａ６  ＨｕＩｇＧ１。図６Ｂ．キメラ化抗ヒトＣＤ８１  ＩｇＧ１によって、及びヒト化抗ヒトＣＤ８１  ＩｇＧ１抗体によって媒介される補体依存性細胞傷害は、マウス抗ヒトＣＤ８１  ＩｇＧ１のそれよりも非常に優れている。キメラＨｕＩｇＧ１（ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖定常領域カッパを有する配列番号１／配列番号４）及びヒト化抗ＣＤ８１抗体（ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖定常領域カッパを有する配列番号３／配列番号５）は、マウス抗ヒトＣＤ８１抗体ＭＳＩｇＧ１（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）及びリツキシマブと比較して、ＣＤＣの優れた媒介因子である。ｔ検定、ｐ＊＊＊値＝０．０００１。
【図７Ａ】Ｒａｊｉ細胞は、とりわけより低い抗体濃度において、マウス抗ヒトＣＤ８１抗体５Ａ６に結合するのにＰＢＭＣ（健常ドナーに由来する）よりも有効であり、１：１０００の比率で存在する場合でさえ、抗ＣＤ８１媒介性ＣＤＣに対してより感受性が高い。ＰＢＭＣ対Ｒａｊｉ細胞への、マウス抗ヒトＣＤ８１（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）の相対的結合を判定するために、ＰＢＭＣをバイオレット追跡色素（ＶＴＤ）で、Ｒａｊｉ細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、１：１の比率で混合した。次いで、抗体の連続希釈物を、混合した細胞に添加した。細胞結合アッセイにおいて見られるように（左のパネル）、抗体は低濃度でＲａｊｉ細胞に結合し、一方でＰＢＭＣはより高い抗体濃度でのみ結合する。マウス抗ヒトＣＤ８１（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）によるＣＤＣ媒介性殺傷に対するＰＢＭＣ対Ｒａｊｉ細胞の感受性を判定するために、ＰＢＭＣをＶＴＤで、Ｒａｊｉ細胞をＣＦＳＥで標識し、ＰＢＭＣ対Ｒａｊｉ細胞の漸増する比率で混合した。１：１の混合物において、抗体はＲａｊｉ細胞の９０％を殺傷したが、ＰＢＭＣのほんの６％のみを殺傷した（中央のパネル）。著しく、Ｒａｊｉ細胞は、ＰＢＭＣに対して１：１０００の比率で存在する場合でさえ、抗ＣＤ８１媒介性ＣＤＣに対してより感受性が高かった（右のパネル）。
【図７Ｂ】患者由来リンパ腫Ｂ細胞は、同じ生検標本に存在する正常Ｔ細胞よりも、ＣＤ８１媒介性ＣＤＣに対して感受性が高い。ＣＤ８１は、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）腫瘍Ｂ細胞上、ならびにＦＬサンプルの生検内の正常Ｔ細胞上で発現される。３つのＦＬ生検標本のＢ及びＴ細胞上での、ならびに健常ドナー（ＨＤ）ＰＢＭＣ上でのＣＤ８１発現のヒストグラムが示されている。同じＦＬ患者の腫瘍Ｂ及び正常Ｔ細胞に対する、マウス抗ヒトＣＤ８１抗体（マウス定常領域ＩｇＧ２ａを有する配列番号１／配列番号４）によるＣＤＣ媒介性殺傷は、腫瘍Ｂ細胞が、５Ａ６媒介性殺傷に対して正常Ｔ細胞よりも感受性が高いことを明らかにしている。同じ結果が、キメラ抗ヒトＣＤ８１抗体（ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖定常領域カッパを有する配列番号１／配列番号４）を用いて獲得された。Ｂ細胞（正方形）、Ｔ細胞（三角形）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、ＣＤ８１に特異的であるヒト化モノクローナル抗体に関する。そのような抗体の核酸及びアミノ酸配列も開示される。本抗体は、ＣＤ８１と関連した療法的及び診断的方法において用途を見い出す。
【００１７】
「治療」とは、療法的治療及び予防的または防止的手段の両方を指す。治療を必要としているものには、すでに障害を有するものならびに障害が防止されるべきものが含まれる。
【００１８】
治療の目的のための「哺乳類」とは、ヒト、家畜及び農業用動物、ならびに動物園用、運動用、またはペット用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含めた、哺乳類として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００１９】
「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及びそれらが所望の生物学的活性を呈する限りは抗体フラグメントを具体的に網羅する。「抗体」（Ａｂ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造特徴を有する糖タンパク質である。抗体は、特異的抗原に対する結合特異性を呈する一方で、免疫グロブリンには、抗体、及び抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方が含まれる。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで及び骨髄腫によって増加したレベルで産生される。
【００２０】
本発明において使用するとき、「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する、抗原上の任意の抗原決定基を意味する。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖など、分子の化学的に活性な表面団（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）からなり、通常、特異的な三次元構造特徴ならびに特異的電荷特徴を有する。
【００２１】
「天然抗体及び免疫グロブリン」とは、通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、とはいえジスルフィド連結の数は、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変動する。各重鎖及び軽鎖は、規則的に間隔を置かれた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）、それに続くいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）及びその他方の末端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインと並び、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖及び重鎖可変ドメインの間に界面を形成すると考えられる（Ｃｌｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１（１９８５）；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４５９２（１９８５））。
【００２２】
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分が、抗体間で配列が幅広く異なり、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性において用いられるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインを通して均一に分布しているわけではない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方における相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、４つのＦＲ領域を含み、β−シート構造を接続する、ある場合にはその一部を形成するループを形成する３つのＣＤＲによって接続された、β−シート立体配置を大きく採用する。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域によって及び他方の鎖由来のＣＤＲとともに、ごく接近して一つにまとめられ、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体を抗原に結合させることに直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性への抗体の参加など、様々なエフェクター機能を呈する。
【００２３】
本発明の抗体は、例えばＦｃγＲＩＩＩＡへのそれらの結合能を増加させる及びＡＤＣＣ活性を増加させることによって、増強したエフェクター機能を有するＦｃ配列を有し得る。例えば、ＦｃのＡｓｎ−２９７におけるＮ−連結型グリカンに付着したフコースは、ＦｃとＦｃγＲＩＩＩＡとの相互作用を立体的に妨害し、糖操作によるフコースの除去は、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を増加させ得、それは、野生型ＩｇＧ１対照と比較して＞５０倍高いＡＤＣＣ活性に翻訳される。ＩｇＧ１のＦｃ部分におけるアミノ酸変異によるタンパク質操作により、ＦｃγＲＩＩＩＡへのＦｃ結合のアフィニティーを増加させる複数の変種が作出されている。顕著には、三重アラニン変異体Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａは、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合及びＡＤＣＣ機能の２倍の増加を呈示する。Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（２×）及びＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ（３×）変種は、インビトロ及びインビボで、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合アフィニティーの有意な増加、及びＡＤＣＣ能の増大を有する。酵母ディスプレイによって同定された他のＦｃ変種も、マウス異種移植モデルにおいて、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の向上、及び腫瘍細胞殺傷の増強を示した。例えば、参照により本明細書に具体的に組み入れられる、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＪＢＣ  ２８９（６）：３５７１−９０を参照のこと。
【００２４】
例示的な抗ＣＤ８１重鎖及び軽鎖組み合わせのＣＤＲ配列は、配列表に明記され及び図１に示されており、例示的なＣＤＲに下線が引かれている。一部の実施形態において、重鎖に対する配列番号１、２、または３；及び軽鎖に対する配列番号４、５、または６の、可変領域におけるＣＤＲ配列のセットが提供される。一部の実施形態において、ＣＤＲ配列は組み合わせで維持される、すなわちヒト化抗体は、重鎖ＣＤＲ配列及び軽鎖ＣＤＲ配列の両方を含むであろう。
【００２５】
抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を有する、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、及びその名前は容易に結晶化し得るその能力を反映する、残部の「Ｆｃ」フラグメントを産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有しかつ依然として抗原を架橋する能力がある、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産出する。
【００２６】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含有する最小抗体フラグメントである。二本鎖Ｆｖ種において、この領域は、緊密な非共有結合性の結び付きにある１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ種（ｓｃＦｖ）において、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が、二本鎖Ｆｖ種におけるそれと類似した「二量体」構造の状態で結び付き得るように、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合で連結され得る。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面の抗原結合部位を規定するのは、この立体配置においてである。集合的に、６つのＣＤＲが、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含む、Ｆｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも低いアフィニティーではあるものの、抗原を認識しかつ結合し得る能力を有する。ｓｃＦｖの概説に関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
【００２７】
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含めた、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端におけるいくつかの残基の付加によってＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つ、Ｆａｂ’に対する本明細書における指定である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、もともと、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントのペアとして産生された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも公知である。
【００２８】
免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２にさらに細分され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知である。本発明の一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ１を含むが限定されることなく、重鎖定常領域は、高いＡＤＣＣ活性を提供するように選択される。他の実施形態において、例えばヒトＩｇＧ４を用いて、またはエフェクター機能がないもしくは低下した「死んだ」Ｆｃを用いて、低いＡＤＣＣ活性が選択され得る。
【００２９】
ジスルフィド結合を形成し得る領域が欠失されているもの、または天然Ｆｃ形態のＮ末端においてある特定のアミノ酸残基が取り除かれている、もしくはメチオニン残基がそこに付加されているものを含むが限定されることなく、他のＦｃ変種が考え得る。ゆえに、本発明の１つの実施形態において、ｓｃＦｃ分子の１つまたは複数のＦｃ部分は、ジスルフィド結合を取り除くための、ヒンジ領域における１つまたは複数の変異を含み得る。さらに別の実施形態において、Ｆｃのヒンジ領域は全面的に除去され得る。なお別の実施形態において、ｓｃＦｃ分子はＦｃ変種を含み得る。
【００３０】
さらに、Ｆｃ変種は、補体結合またはＦｃ受容体結合をもたらすアミノ酸残基を置換する、欠失させる、または付加することによって、エフェクター機能を除去するまたは実質的に低下させるように構築され得る。例えば、かつ限定されることなく、Ｃ１ｑ結合部位などの補体結合部位において欠失が起こり得る。免疫グロブリンＦｃフラグメントのそのような配列誘導体を調製する技法は、国際特許公報第ＷＯ９７／３４６３１号及び第ＷＯ９６／３２４７８号に開示されている。加えて、Ｆｃドメインは、リン酸化、硫酸化、アクリレート化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、アミド化等によって修飾され得る。
【００３１】
本明細書において用いられる「抗体フラグメント」及びそのすべての文法的変形は、無傷抗体の抗原結合部位または可変領域を含む、無傷抗体の一部分として定義され、該一部分は、無傷抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体アイソタイプに応じて、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）を含んでいない。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；（１）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（２）結び付いた重鎖部分なしの、１つの軽鎖可変ドメインのみを含有する一本鎖ポリペプチド、または軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するそのフラグメント、及び（３）結び付いた軽鎖部分なしの、１つの重鎖可変領域のみを含有する一本鎖ポリペプチド、または重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するそのフラグメント、を含むが限定されることなく、連続アミノ酸残基の途切れることのない配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体フラグメント（本明細書において、「一本鎖抗体フラグメント」または「一本鎖ポリペプチド」と称される）；ならびに抗体フラグメントから形成される多特異性または多価の構造が含まれる。１本または複数本の重鎖を含む抗体フラグメントにおいて、重鎖（複数可）は、無傷抗体の非Ｆｃ領域に見い出される任意の定常ドメイン配列（例えば、ＩｇＧアイソタイプにおけるＣＨ１）を含有し得、及び／または無傷抗体に見い出される任意のヒンジ領域配列を含有し得、及び／または重鎖（複数可）のヒンジ領域配列もしくは定常ドメイン配列に融合されたもしくはそこに位置するロイシンジッパー配列を含有し得る。
【００３２】
それとは反対であることが具体的に示されていない限り、本明細書において記載される及び主張される「抱合体」という用語は、１つまたは複数のポリマー分子（複数可）への１つまたは複数の抗体フラグメント（複数可）の共有結合性付着によって形成される異種分子として定義され、該異種分子は水溶性、すなわち血液などの生理学的流体中に可溶性であり、及び該異種分子はいかなる構造化された凝集体をも含んでいない。関心対象の抱合体はＰＥＧである。前述の定義の文脈において、「構造化された凝集体」という用語は、（１）異種分子がミセルまたは他のエマルション構造になく及び脂質二重層、小胞、またはリポソームに固定されていないような、スフェロイドまたはスフェロイド状の殻構造を有する、水溶液中の分子の任意の凝集体；ならびに（２）水相と接触しても溶液中に異種分子を放出しない、クロマトグラフィービーズマトリックスなど、固体または不溶化形態の分子の任意の凝集体、を指す。したがって、本明細書において定義される「抱合体」という用語は、固体の水和があると水溶液中に異種分子を放出し得る、沈殿物、堆積物、生体分解性マトリックス、または他の固体中にある上述の異種分子を包含する。
【００３３】
本明細書において用いられる「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、実質的に均質な抗体の集団から獲得される抗体を指し、すなわち該集団を含む個々の抗体は、少量存在し得る考え得る天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられている。各ｍＡｂは、抗原上の単一の決定基に対して向けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが、他の免疫グロブリンが混入していないハイブリドーマ培養によって合成され得るという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語句は、抗体の実質的に均質な集団から獲得されるものとしての抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を要すると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いられる対象となるモノクローナル抗体は、不死化Ｂ細胞もしくはそのハイブリドーマにおいて作製され得る、または組換えＤＮＡ法によって作製され得る。
【００３４】
本明細書におけるモノクローナル抗体には、起源の種または免疫グロブリンのクラスもしくはサブクラス指定にかかわらず、抗ＣＤ８１抗体の可変（超可変を含む）ドメインを定常ドメインで（例えば、「ヒト化」抗体）、もしくは軽鎖を重鎖で、もしくは一方の種由来の鎖を別の種由来の鎖でつなぎ合わせることによって、または異種タンパク質との融合によって産生されるハイブリッド及び組換え抗体、ならびにそれらが所望の生物学的活性を呈する限りは抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ）が含まれる。
【００３５】
本明細書におけるモノクローナル抗体には、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一でありまたは相同であり、一方で鎖（複数可）の残部が、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一であるまたは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそれらが所望の生物学的活性を呈する限りはそのような抗体のフラグメントが具体的に含まれる。一部の実施形態において、キメラ抗体は、ヒト定常領域配列に融合した、例えば配列番号１及び配列番号４に記載されるマウス可変領域を含む。
【００３６】
「単離された」抗体とは、同定されており、その天然環境の構成要素から分離され及び／または回収されているものである。その天然環境の混入構成要素は、抗体に対する診断的または療法的使用を妨害するであろう材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含み得る。一部の実施形態において、抗体は、（１）ローリー法によって判定される、抗体の７５重量％よりも大きい、最も好ましくは８０重量％、９０重量％、もしくは９９重量％を上回る割合まで、または（２）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いた、還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで、精製される。単離された抗体には、抗体の天然環境の少なくとも１種の構成要素も存在しないであろうため、組換え細胞内のインサイチューでの抗体が含まれる。しかしながら、普通、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００３７】
「エピトープタグ付けされた」という用語は、本明細書において用いられる場合、「エピトープタグ」に融合された抗ＣＤ８１抗体を指す。エピトープタグポリペプチドは、それに対して抗体が作製され得るが、それがＣＤ８１抗体の活性を妨害しないように十分短いエピトープを提供するのに十分な残基を有する。エピトープタグは、好ましくは、エピトープに特異的な抗体が、他のエピトープと実質的に交差反応しないように充分に固有である。適切なタグポリペプチドは、一般的には少なくとも６アミノ酸残基、通常では約８〜５０アミノ酸残基（好ましくは、約９〜３０残基）を有する。例には、ｃ−ｍｙｃタグ、ならびにそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、及び９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（１２）：３６１０−３６１６（１９８５））；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３（６）：５４７−５５３（１９９０））が含まれる。
【００３８】
「標識」という単語は、本明細書において用いられる場合、抗体に直接的または間接的に抱合される、検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体がそれ自体によって検出可能であり得る（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合には、検出可能である、基質化合物もしくは組成物の化学的変化を触媒し得る。
【００３９】
「固相」によって、本発明の抗体が接着し得る非水性マトリックスが意味される。本明細書において包含される固相の例には、ガラス（例えば、制御性細孔ガラス）、多糖（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、及びシリコーンから部分的または全面的に形成されるものが含まれる。ある特定の実施形態において、背景に応じて、固相にはアッセイプレートのウェルが含まれ得；他において、それは精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語には、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されるものなど、個別の粒子の非連続的固相も含まれる。
【００４０】
ポリペプチド
１つの態様において、本発明は、ＣＤ８１と特異的に反応性であるヒト化またはキメラモノクローナル抗体、及びそのような抗体を産生する細胞株に向けられている。例示的な抗体の可変領域が提供される。関心対象の抗体は、これらの提供される組み合わせ、ならびに、例えばＦ（ａｂ）’抗体を作出するための、適当な定常領域または定常領域のフラグメントへの可変領域の融合を含む。関心対象の可変領域は、提供される抗ＣＤ８１抗体の少なくとも１種のＣＤＲ配列を含み、ＣＤＲは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれを上回る数のアミノ酸であり得る。あるいは、関心対象の抗体は、提供される抗体に記載される可変領域、または本明細書において記載される可変領域配列のペアを含む。
【００４１】
関心対象の可変領域は、本明細書において提供される可変領域由来の少なくとも１種のＣＤＲ配列、通常では少なくとも２種のＣＤＲ配列、より通常では３種のＣＤＲ配列を含む。例示的なＣＤＲ指定は図１に示されており、上記の下線が引かれた残基に相当するが、しかしながら当業者であれば、配列可変性に基づいており、最もよく用いられるＫａｂａｔ定義（「Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ」Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；４７：６９４−７００を参照のこと）を含めた、ＣＤＲのいくつかの定義がよく用いられることを理解するであろう。Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造ループ領域の位置に基づく（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ」Ｎａｔｕｒｅ．１９８９；３４２：８７７−８８３）。関心対象の代替的なＣＤＲ定義には、限定されることなく、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，「Ｙｅｔ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌ」Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００１；３０９：６５７−６７０；Ｏｆｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ（ＣＤＲｓ）  ｒｅｖｅａｌｓ  ｐｅｃｕｌｉａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ＣＤＲｓ  ａｎｄ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８１：６２３０−６２３５；Ａｌｍａｇｒｏ「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｉｚｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ」Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００４；１７：１３２−１４３；及びＰａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｆａｓｅｂ  Ｊ．１９９５；９：１３３−１３９によって開示されるものが含まれ、そのそれぞれは参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
【００４２】
一部の実施形態において、関心対象のポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、及び６のいずれかにおいて記載される、少なくとも約１０アミノ酸、少なくとも約１５アミノ酸、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約２５アミノ酸、少なくとも約３０アミノ酸、最高で完全な提供される可変領域、の連続配列を有する。関心対象のポリペプチドには、本明細書において記載されるアミノ酸配列と比較して、最高で１個、最高で２個、最高で３個、最高で４個、最高で５個、最高で６個、またはそれを上回る数のアミノ酸が異なる可変領域配列も含まれる。他の実施形態において、関心対象のポリペプチドは、本明細書において記載されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％同一である。
【００４３】
Ｆａｂに加えて、ＣＤ８１の少なくとも１つのエピトープに対する結合特異性を有する、より小さな抗体フラグメント及びエピトープ結合ペプチドも本発明によって企図され、本発明の方法においても用いられ得る。例えば、一本鎖抗体は、参照によりその全体として本明細書に組み入れられる、Ｌａｄｎｅｒらへの米国特許第４，９４６，７７８号の方法に従って構築され得る。一本鎖抗体は、柔軟なリンカー部分によって接合された軽鎖及び重鎖の可変領域を含む。さらにより小さなものは、単離ＶＨ単一ドメインを含む、単一ドメイン抗体として知られる抗体フラグメントである。それらが由来する無傷抗体の結合特異性の少なくとも一部を有する単一ドメイン抗体を獲得するための技法は、当技術分野において公知である。例えば、Ｗａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．「Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：６４４−６４６は、それに結合するその標的エピトープに対する充分なアフィニティーを有する抗体重鎖可変領域（Ｈ単一ドメイン抗体）を単離形態で獲得するためのスクリーニングのための方法を開示している。
【００４４】
本発明は、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ８１抗体をコードする単離された核酸、当該核酸を含むベクター及び宿主細胞、ならびに当該抗体の産生のための組換え技法も提供する。関心対象の核酸は、提供される核酸配列と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または同一であり得る。一部の実施形態において、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約７５ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔの、及び最高で完全な提供される配列の、配列番号１〜６のいずれか１つのポリペプチドをコードする連続ヌクレオチド配列が用いられ得る。そのような連続配列は、ＣＤＲ配列をコードし得る、または完全な可変領域をコードし得る。当技術分野において公知であるように、可変領域配列は、任意の適当な定常領域配列に融合され得る。
【００４５】
抗体の組換え産生に関して、それをコードする核酸は、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のためにまたは発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離され及びシーケンシングされる。多くのベクターが利用可能である。ベクター構成要素には、一般的に、以下の：シグナル配列、複製の起点、１種または複数種のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列、のうちの１つまたは複数が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４６】
本発明の抗ＣＤ８１抗体は、直接的にだけでなく、異種または相同ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換えにより産生され得、それには、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチド、免疫グロブリン定常領域配列等が含まれる。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識されかつプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであり得る。天然の抗体シグナル配列を認識せずかつプロセシングしない原核生物宿主細胞に関しては、シグナル配列は、選択される原核生物シグナル配列によって置換される。
【００４７】
「単離された」核酸分子とは、同定されており、抗体核酸の天然供給源においてそれが普通では結び付いている少なくとも１種の混入核酸分子から分離されている核酸分子である。単離された核酸分子とは、それが天然において見い出される形態または状況以外にあるものである。それゆえ、単離された核酸分子は、それが天然細胞に存在するような核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子には、例えば核酸分子が天然細胞のそれとは異なる染色体位置にある場合、抗体を普通に発現する細胞に含有される核酸分子が含まれる。
【００４８】
ＤＮＡをクローニングするまたは発現させるための適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、またはより高等な真核生物細胞である。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児腎臓株（２９３、または浮遊培養での成長のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１．９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。宿主細胞は、抗ＣＤ８１抗体産生のために上で記載される発現またはクローニングベクターで形質転換され、及びプロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、必要に応じて改変された従来の栄養培地中で培養される。
【００４９】
細胞から調製された抗体組成物は、例えばハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製され得、アフィニティークロマトグラフィーは好ましい精製技法である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適切性は、種、及び抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインのアイソタイプに依存する。プロテインＡを用いて、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製し得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、ヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドが付着されるマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスが利用可能である。制御性細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成され得るよりもより速い流速及びより短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が、精製に有用である。回収される対象となる抗体に応じて、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿など、タンパク質精製のための他の技法も利用可能である。
【００５０】
任意の予備精製ステップ（複数可）の後、関心対象の抗体及び混入物質を含む混合物は、好ましくは低い塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で実施される、約２．５〜４．５のｐＨにおける溶出バッファーを用いた低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供され得る。
【００５１】
使用の方法
本発明のヒト化またはキメラモノクローナル抗体は、付加的な免疫療法剤との併用療法において、例えば２種もしくはそれを上回る種類の抗体の組み合わせとして；または二重特異性もしくは他の多特異性様式として含めた、がんの治療において用いられ得る。本発明は、本発明のＣＤ８１結合抗体を含む、二重特異的を含むが限定されることなく、多種多様の単一特異的及び多特異的な抗体立体配置を提供する。一部のそのような実施形態において、第二の抗原結合領域が含まれる。一部の実施形態において、第二の抗原結合領域は、腫瘍抗原に特異的に結合する。一部の実施形態において、第二の抗原結合領域は、免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する。
【００５２】
一部の実施形態において、がんの治療のために方法が提供され、当該方法は、それを必要としている個体に、本発明の単一特異的、二重特異的等の抗体の有効用量を投与することを含む。抗体が二重特異的である場合、第二の抗原結合部位は、腫瘍抗原、チェックポイントタンパク質等に特異的に結合し得る。様々な実施形態において、がんは、卵巣癌、乳癌、消化管癌、脳腫瘍、頭頸部癌、前立腺癌、結腸癌、肺癌、白血病、リンパ腫、肉腫、癌腫、神経細胞腫瘍、扁平上皮細胞癌腫、胚細胞腫瘍、転移、未分化腫瘍、精上皮腫、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、混合細胞腫瘍、及び感染性因子によって引き起こされる新生物からなる群より選択される。
【００５３】
多くの腫瘍細胞は、血流中に放出され得るまたは細胞表面にとどまり得る抗原を産生する。バーキットリンパ腫、神経芽細胞腫、悪性黒色腫、骨肉腫、腎細胞癌腫、乳癌腫、前立腺癌、肺癌腫、及び結腸癌を含めた、ヒトがんのほとんどにおいて抗原が同定されている。免疫系の主な役割は、根絶のための後続の標的化を可能にする、これらの抗原の検出である。しかしながら、それらの異物構造にもかかわらず、腫瘍抗原に対する免疫応答は変動し、腫瘍成長を防止するには不充分であることが多い。
【００５４】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は腫瘍細胞に比較的制限され、一方で腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）は腫瘍細胞に固有である。ＴＳＡ及びＴＡＡは、主要組織適合性複合体の一部として細胞表面に発現される細胞内分子の部分である。
【００５５】
組織特異的分化抗原とは、腫瘍細胞及びそれらの正常細胞対応物に存在する分子である。治療用ｍＡｂによって認識されることが公知の腫瘍関連抗原は、いくつかの異なるカテゴリーに入る。造血分化抗原は、分化のクラスター（ＣＤ）グループ化と通常関連付けされている糖タンパク質であり、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、及びＣＤ５２を含む。細胞表面分化抗原は、正常細胞及び腫瘍細胞の両方の表面に見い出される糖タンパク質及び炭水化物の多様な群である。成長及び分化シグナル伝達に関与している抗原は、成長因子及び成長因子受容体であることが多い。がん患者において抗体の標的である成長因子には、ＣＥＡ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ＥＲＢＢ１としても知られる）、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２としても知られる）、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ（ＨＧＦＲとしても知られる）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、エフリン受容体Ａ３（ＥＰＨＡ３）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬＲ１；ＴＮＦＲＳＦ１０Ａとしても知られる）、ＴＲＡＩＬＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂとしても知られる）、及び核因子−κＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ；ＴＮＦＳＦ１１としても知られる）が含まれる。血管新生に関与する抗原は、通常、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）、インテグリンαＶβ３、及びインテグリンα５β１を含めた、新たな微小血管系の形成を支持するタンパク質または成長因子である。腫瘍間質及び細胞外マトリックスは、腫瘍に対する不可欠な支持構造である。治療標的である間質及び細胞外マトリックス抗原には、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びテネイシンが含まれる。
【００５６】
臨床的がん免疫療法の背景において最も活発に研究されている免疫チェックポイント受容体である細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４；ＣＤ１５２としても知られる）及びプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１；ＣＤ２７９としても知られる）は、両方とも阻害性受容体である。これらの受容体のいずれかを遮断する抗体の臨床的活性は、抗腫瘍免疫が多重レベルで増強され得ること、及び組み合わせストラテジーが理性的に設計され得、メカニズム的考察及び前臨床モデルによってガイドされることを暗示する。
【００５７】
ＰＤ１に対する２つのリガンドは、ＰＤ１リガンド１（ＰＤＬ１；Ｂ７−Ｈ１及びＣＤ２７４としても知られる）及びＰＤＬ２（Ｂ７−ＤＣ及びＣＤ２７３としても知られる）である。ＰＤＬ１はがん細胞上に発現され、Ｔ細胞上のその受容体ＰＤ１への結合を通じて、それはＴ細胞活性化／機能を阻害する。
【００５８】
リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３；ＣＤ２２３としても知られる）、２Ｂ４（ＣＤ２４４としても知られる）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ；ＣＤ２７２としても知られる）、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３；ＨＡＶｃｒ２としても知られる）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、ならびにキラー細胞阻害受容体のファミリーはそれぞれ、リンパ球活性の阻害、及びある場合にはリンパ球アネルギーの誘導と関連付けされている。これらの受容体の抗体標的化は、本発明の方法において用いられ得る。
【００５９】
免疫共刺激分子をアゴナイズする（ａｇｏｎｉｚｅ）作用物質も、本発明の方法において有用である。そのような作用物質には、ＣＤ４０及びＯＸ４０のアゴニストが含まれる。ＣＤ４０は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に見い出される共刺激性タンパク質であり、それらの活性化に要される。これらのＡＰＣには、食細胞（マクロファージ及び樹状細胞）及びＢ細胞が含まれる。ＣＤ４０は、ＴＮＦ受容体ファミリーの一部である。ＣＤ４０に対する一次活性化シグナル伝達分子は、ＩＦＮγ及びＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）である。ＣＤ４０を通じた刺激は、マクロファージを活性化する。
【００６０】
関心対象の抗ＣＣＲ４（ＣＤ１９４）抗体には、潜在的な抗炎症及び抗新生物活性を有する、Ｃ−Ｃケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）に対して向けられたヒト化モノクローナル抗体が含まれる。ＣＣＲ２は、様々な炎症性病状、例えば関節リウマチにおいて見い出され得る炎症性マクロファージ上に発現され；腫瘍促進性マクロファージ上に発現されるものとしても同定されている。ＣＣＲ２は調節性Ｔ細胞上にも発現され、ＣＣＲ２リガンドのＣＣＬ２は、腫瘍への調節性Ｔ細胞の導きを媒介する。調節性Ｔ細胞は、抗腫瘍Ｔ細胞に対する応答を抑制し、ゆえにそれらの阻害または枯渇が望まれる。
【００６１】
好都合なこととして、本発明の抗体または抗体の組み合わせは、キット、すなわち療法的使用のための取扱説明書とともに、所定の量の試薬のパッケージされた組み合わせで提供され得る。加えて、安定剤、バッファーなど、他の添加物が含まれ得る。特に、抗体は、通常では凍結乾燥された乾燥粉末として提供され得、溶解で、適当な濃度を有する試薬溶液を提供するであろう賦形剤を含む。
【００６２】
本発明の１種または複数種の抗体を含む治療用製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の程度の純度を有する抗体と任意の生理学的に許容されるキャリア、賦形剤、または安定剤とを混合することによって、保管のために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。抗体組成物は、適正診療規範（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）と合致した形式で製剤化され、投薬され、及び投与される。この背景における考察のための因子には、治療されている特定の障害、治療されている特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、作用物質の送達の部位、投与の方法、投与のスケジュール、及び医師に公知の他の因子が含まれる。投与される対象となる抗体の「治療上有効量」は、そのような考察によって管理され、ＣＤ８１関連疾患を防止するのに必要な最少量である。
【００６３】
治療用量は、少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２．５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５μｇ／ｋｇ体重、かつ多くて約１００μｇ／ｋｇ体重であり得る。そのような指針が、例えば抗体フラグメントの使用において、または抗体抱合体の使用において、活性剤の分子量に対して調整され得ることは、当業者によって理解されるであろう。投薬量は、局所投与、例えば鼻腔内、吸入等に対して、または全身投与、例えばｉ．ｍ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｖ．等に対しても変動され得る。
【００６４】
抗体は、活性を高める、または治療効果を別様に増加させる１種または複数種の作用物質とともに製剤化される必要はないが、任意でそれとともに製剤化される。これらは、一般的に、上記で用いられるのと同じ投薬量で及び投与経路で、またはこれまで採用された投薬量の約１〜９９％で用いられる。
【００６５】
許容されるキャリア、賦形剤、または安定剤は、採用される投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含めた抗酸化物質；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた、単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。インビボ投与に用いられる対象となる製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過を通した濾過によって容易に達成される。
【００６６】
活性成分は、例えばコアセルベーション技法によってもしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）内に、またはマクロエマルション内に封入もされ得る。そのような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【００６７】
抗ＣＤ８１抗体は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内を含めた、任意の適切な手段によって投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。加えて、抗ＣＤ８１抗体は、特に漸減用量の抗体を用いた、パルス注入によって適切に投与される。
【００６８】
疾患の防止または治療のために、抗体の適当な投薬量は、上記で規定される治療される対象となる疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体が防止目的のために投与されるのかどうか、以前の療法、患者の病歴及び抗体への応答、ならびに主治医の裁量に依存する。抗体は、一度でまたは一連の治療にわたって、患者に適切に投与される。
【００６９】
本発明の別の実施形態において、上で記載される障害の治療に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器及びラベルを含む。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成され得る。容器は、病状を治療するのに有効である組成物を保持し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静注液用バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の活性剤は、抗ＣＤ８１抗体である。容器上のまたはそれと結び付いたラベルは、組成物が、選定される病状を治療するために用いられることを表示する。製造品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液など、薬学的に許容されるバッファーを含む第二の容器をさらに含み得る。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用のための取扱説明書を有する添付文書を含めた、商業的な及びユーザーの立場から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【００７０】
本発明はここで十分に記載されているが、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、様々な変更及び改変がなされ得ることは、当業者に明らかであろう。
【００７１】
実験
以下の実施例は、本発明をどのように行い及び用いるかについての完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されるものであり、本発明者らが彼らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図されず、またはそれらは、下記の実験が、実施されたすべてのもしくは唯一の実験であることを表すことも意図されない。用いられる数（例えば、量、温度等）に関する正確性を保証するために努力がなされたが、いくらかの実験上の誤差及びズレは考慮されるべきである。別様に示されていない限り、部分は重量による部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度におけるものであり、及び圧力は大気におけるまたは大気付近のものである。
【００７２】
本明細書において引用されるすべての刊行物及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物または特許出願が、参照により組み入れられることを具体的かつ個々に示されているかのように、参照により本明細書に組み入れられる。
【００７３】
本発明は、本発明の実践のための好ましい様態を含むように、本発明者によって見い出されたまたは提案された特定の実施形態の観点から記載されている。本開示に照らして、本発明の意図される範囲から逸脱することなく、例示される特定の実施形態において多数の改変及び変更がなされ得ることは、当業者によって解されるであろう。例えば、コドン冗長性により、タンパク質配列に影響を及ぼすことなく、根本的なＤＮＡ配列において変更がなされ得る。さらに、生物学的な機能等価性の考察により、種類または量における生物学的作用に影響を及ぼすことなく、タンパク質構造において変更がなされ得る。すべてのそのような改変は、添付の特許請求の範囲の内に含まれることが意図される。
【実施例】
【００７４】
実施例１
ヒトＣＤ８１に対して向けられたモノクローナル抗体のクローニング及び作出
本発明の抗体は、ヒト定常領域とのキメラとして産生され得る；例えば互いとペアにされる、または本発明のヒト化可変領域とペアにされる、マウス可変領域、例えば重鎖配列番号１及び軽鎖配列番号４を含む。ヒト化重鎖可変領域には、配列番号２及び配列番号３に記載されるものが含まれ、それは、本明細書において提供される軽鎖可変領域のいずれかとペアにされ得る。ヒト化軽鎖可変領域には、配列番号５及び配列番号６に記載されるものが含まれ、それは、本明細書において提供される重鎖可変領域のいずれかとペアにされ得る。（例示的なＣＤＲ配列に下線が引かれている。）
【化１】
2019517813.tif 000002
【化２】
2019517813.tif 000003
【００７５】
機能解析      
３Ｄ浸潤アッセイを用いて、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）へのヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の浸潤性の阻害における抗ＣＤ８１抗体の有効性を判定した。図２Ａ及び図２Ｂに示されるデータ。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１スフェロイドの浸潤アッセイ画像は、表示される時間に撮られた。マウス抗ヒト抗体（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）は、ヒト乳癌細胞の浸潤を阻害する。図２Ｂに示されるように、効果は５Ａ６抗体に特異的であり、他の抗ＣＤ８１抗体はヒト乳癌細胞の浸潤を阻害しない。
【００７６】
インビボ異種移植モデルを用いて、マウスエフェクター細胞の背景における抗体有効性を査定した。図３Ａに示されるように、マウス抗ヒトＣＤ８１モノクローナル抗体は、ヒトＢ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）を抗原投与されたＳＣＩＤマウスの生存を延長させた。腫瘍を、１００μｇのマウス抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂ（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）、１００μｇの対照マウスＩｇＧ１、及び１００μｇのリツキシマブで週１回×４処理した。生存は、抗ＣＤ８１抗体による及びリツキシマブによる処理に対して同程度であった。マウスエフェクター細胞のこの背景において、定常領域をマウスＩｇＧ１からマウスＩｇＧ２ａに切り替えることは、５Ａ６及びキメラ抗ヒトＣＤ８１抗体の治療効力を増強することがさらに示された（図３Ｂを参照のこと）。
【００７７】
転移に関する異種移植モデルにおいて、マウス抗ヒトＣＤ８１モノクローナル抗体５Ａ６は、異種移植モデルにおけるヒト乳癌転移を低下させた（図４Ａに示される）。ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を、ＳＣＩＤマウスの乳房パッドへマトリゲル中に注射した（２．５×１０６個／マウス）。マウスを、腫瘍接種後７日目に開始する、１００μｇの抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂ（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）、または対照マウスＩｇＧ１  ｍＡｂで週１回４週間処理した。マウスエフェクター細胞のこの背景において、定常領域をマウスＩｇＧ１からマウスＩｇＧ２ａに切り替えることは、５Ａ６及びキメラ抗ヒトＣＤ８１抗体の腫瘍成長及び転移を低下させることにおける治療効力を増強することがさらに示された（図４Ｂを参照のこと）。
【００７８】
図５Ａに示されるように、マウス抗ヒトＣＤ８１抗体５Ａ６は、他の抗ヒトＣＤ８１抗体よりも抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をより良好に媒介し、５Ａ６は、Ｒａｊｉ細胞の直接殺傷においても、他の抗ヒトＣＤ８１抗体及びリツキシマブよりも良好である。抗ヒトＣＤ８１（配列番号１／配列番号４）は、ヒトＢ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）のＡＤＣＣを媒介し得るその能力において、抗ＣＤ８１抗体の間で固有であった。
【００７９】
図５Ｂに示されるように、ヒトエフェクター細胞（精製されたヒトＮＫ細胞）の背景において、定常領域をヒトＦｃ配列に切り替えることはＡＤＣＣを向上させる。キメラ抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂ（ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖領域カッパを有する配列番号１／配列番号４）は、マウス抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂ（マウス定常領域ＩｇＧ１を有する配列番号１／配列番号４）よりも有効であり、それはまた、ＮＫ細胞媒介性抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）においてリツキシマブよりも有効である。
【００８０】
図５Ｃに示されるように、ヒトエフェクター細胞（精製されたヒトＮＫ細胞）の背景において、ヒト化抗ヒトＣＤ８１抗体は、ＡＤＣＣ及びＲａｊｉ細胞の直接殺傷をリツキシマブよりも良好に媒介した。ヒト化抗ヒトＣＤ８１  ｍＡｂ（Ｈ１Ｌ１、ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖領域カッパを有する配列番号２／配列番号５）及びＨ２Ｌ１（ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖領域カッパを有する配列番号３／配列番号５）は、キメラ抗ＣＤ８１抗体と同じぐらい有効であり、リツキシマブよりも有効であった。
【００８１】
図６Ａに示されるように、補体依存性細胞傷害を媒介することにおける抗体の活性は、マウスＩｇＧ２ａ定常領域またはヒトＩｇＧ１定常領域の使用によって非常に増大された。対照的に、マウスＩｇＧ１及びヒトＩｇＧ４は、ＣＤＣをあまり媒介しなかった。
【００８２】
図６Ｂに示されるように、キメラ化抗ヒトＣＤ８１  ＩｇＧ１（ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖領域カッパを有する配列番号１／配列番号４）によって、及びヒト化抗ヒトＣＤ８１  ＩｇＧ１（ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖領域カッパを有する配列番号３／配列番号５）抗体によって媒介される補体依存性細胞傷害は、マウス抗ヒトＣＤ８１  ＩｇＧ１のそれよりも非常に優れていた。
【００８３】
図７Ａに示されるように、腫瘍細胞（Ｒａｊｉ）細胞は、とりわけより低い抗体濃度において、マウス抗ヒトＣＤ８１抗体５Ａ６に結合するのにＰＢＭＣ（健常ドナーに由来する）よりも有効であり、１：１０００の比率で存在する場合でさえ、抗ＣＤ８１媒介性ＣＤＣに対してより感受性が高い。図７Ｂに示されるように、患者由来リンパ腫Ｂ細胞も、同じ生検標本に存在する正常Ｔ細胞よりも、ＣＤ８１媒介性ＣＤＣに対して感受性が高かった。ＣＤ８１は、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）腫瘍Ｂ細胞上、ならびにＦＬサンプルの生検内の正常Ｔ細胞上で発現される。同じＦＬ患者の腫瘍Ｂ及び正常Ｔ細胞に対する、マウス抗ヒトＣＤ８１抗体（マウス定常領域ＩｇＧ２ａを有する配列番号１／配列番号４）によるＣＤＣ媒介性殺傷は、腫瘍Ｂ細胞が、５Ａ６媒介性殺傷に対して正常Ｔ細胞よりも感受性が高いことを明らかにしている。同じ結果が、キメラ抗ヒトＣＤ８１抗体（ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１及びヒト軽鎖定常領域カッパを有する配列番号１／配列番号４）を用いて獲得された。
【図１】
2019517813.tif 000004
【図２】
2019517813.tif 000005
【図３Ａ】
2019517813.tif 000006
【図３Ｂ】
2019517813.tif 000007
【図４】
2019517813.tif 000008
【図５−１】
2019517813.tif 000009
【図５−２】
2019517813.tif 000010
【図６】
2019517813.tif 000011
【図７Ａ】
2019517813.tif 000012
【図７Ｂ】
2019517813.tif 000013
【配列表】
2019517813000001.app
【国際調査報告】
2019517813.tif 000014
2019517813.tif 000015
2019517813.tif 000016