(57)【要約】伝染性気管支炎及びシチメンチョウ鼻気管炎に対する家禽ワクチンが提供されている。本ワクチンは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含有する油エマルジョンでアジュバント化されている。ワクチンの使用方法も提供されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原成分とアジュバント成分とを含む免疫原性組成物であって、
ａ）  前記抗原成分が少なくとも１つのＴＲＴ抗原と少なくとも１つのＩＢ抗原とを含み、前記少なくとも１つのＩＢ抗原がＩＢ  ＱＸ抗原を含み；
ｂ）  前記アジュバント成分が、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと油エマルジョンとを含む、前記免疫原性組成物。
【請求項２】
前記油エマルジョンがＷ／Ｏエマルジョンである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
ステロールをさらに含む、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記ステロールがコレステロールである、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
本質的にサポニンを含まない、請求項３または４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記ステロールが前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドと混合される、請求項３〜５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
リポソームを含まない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つのＩＢ抗原がＩＢ  Ｄ１４６６抗原をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記抗原成分が、ＩＢ  Ｄ１４６６抗原、ＴＲＴ抗原、ニューカッスル病抗原、ＥＤＳ抗原及びＩＢ  Ｍ４１抗原のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記抗原成分が、ＩＢ  Ｍ４１抗原、ＩＢ  Ｄ２７４抗原、ニューカッスル病ＬａＳｏｔａ株抗原、ＥＤＳ抗原、及びＴＲＴ抗原のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
家禽動物におけるＴＲＴを予防する方法であって、請求項１〜１０に記載の免疫原性組成物を前記家禽動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項１２】
家禽動物におけるＩＢを予防する方法であって、請求項１〜１０に記載の免疫原性組成物を前記家禽動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項１３】
前記家禽動物がニワトリである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１０に記載の免疫原性組成物を投与前に、プライマーワクチンを投与することを含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記プライマーワクチンが、生菌の伝染性気管支炎ウイルス株Ｈ１２０型Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
家禽動物におけるＩＢを予防する方法であって、単回用量の請求項１〜１０に記載の免疫原性組成物を前記家禽動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項１７】
抗原成分とアジュバント成分とを含むワクチンであって、前記アジュバント成分が免疫刺激性オリゴヌクレオチドと油エマルジョンとを含み、且つ前記抗原成分がＩＢＤ抗原を含む、前記ワクチン。
【請求項１８】
前記ＩＢＤ抗原が不活性化Ｌｕｋｅｒｔ株抗原である、請求項１７に記載のワクチン。
【請求項１９】
前記ＩＢＤ抗原が１０７．５〜１０８ＴＣＩＤ５０の量で存在する、請求項１７または１８に記載のワクチン。
【請求項２０】
前記抗原成分が、
ａ）  ＩＢＤの非Ｌｕｋｅｒｔ株に由来する抗原；
ｂ）  伝染性気管支炎抗原；
ｃ）  レオウイルス抗原；
ｄ）  ニューカッスル病抗原；
ｅ）  シチメンチョウ鼻気管炎抗原
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１８〜１９のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２１】
前記伝染性気管支炎抗原が不活性化伝染性気管支炎ウイルスを含み、前記レオウイルス抗原が不活性化レオウイルスを含み、前記ＩＢＤの非Ｌｕｋｅｒｔ株に由来する抗原が非Ｌｕｋｅｒｔ株の不活性化ＩＢＤウイルスを含み、前記ニューカッスル病抗原が不活性化ニューカッスルウイルスを含み、前記シチメンチョウ鼻気管炎抗原が不活性化シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスを含む、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
抗原成分とアジュバント成分とを含むワクチンであって、前記アジュバント成分が免疫刺激性オリゴヌクレオチドと油エマルジョンを含み、前記抗原成分が
ａ）  ＴＲＴ抗原と；
ｂ）  ニューカッスル抗原と；
ｃ）  産卵低下症候群（ＥＤＳ）抗原と；
ｄ）  ＩＢＫ抗原と；
ｅ）  コリーザ抗原と
を含む、前記ワクチン。
【請求項２３】
ａ）  前記ＴＲＴ抗原が不活性化シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスを含み；
ｂ）  前記ニューカッスル抗原が不活性化ニューカッスルウイルスを含み；
ｃ）  前記ＥＤＳ抗原が不活性化ＥＤＳウイルスを含み；
ｄ）  前記ＩＢＫ抗原が不活性化ＥＤＳウイルスを含み；
ｅ）  前記コリーザ抗原が、コリーザＭ抗原とコリーザ２２１抗原とコリーザＳ抗原との混合物を含む、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２４】
前記ＴＲＴが、１用量当たり１０６．００ＴＣＩＤ５０〜１０６．５０ＴＣＩＤ５０の量で存在する、請求項２２または２３に記載のワクチン。
【請求項２５】
前記油エマルジョンがＷ／Ｏエマルジョンである、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２６】
前記油エマルジョンが鉱油を含む、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２７】
前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが配列番号８を含む、請求項１７〜２６のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２８】
前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが１用量当たり２．５〜２０μｇの量で存在する、請求項１７〜２７のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２９】
前記アジュバントが、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドと、前記油と、１種以上の乳化剤とから本質的になる、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
［０００１］
シチメンチョウ鼻気管炎（ＴＲＴ）は、ニューモウイルスによって引き起こされるシチメンチョウ及びニワトリの上気道感染症であり、あらゆる年齢のシチメンチョウが罹患する高度に接触感染性の急性疾患である。ＴＲＴ感染の臨床症状には、顕著なしばしば泡沫状鼻汁、水泡音、クリック音（ｓｎｉｃｋｉｎｇ）、くしゃみ、頭振れが挙げられる。また、感染したシチメンチョウにおいて、眼漏または腫脹性眼窩下洞が観察される場合もある。ＴＲＴウイルス（ＴＲＴＶ）に対する抗体は、膨潤頭症候群（ＳＨＳ）に罹患しているいくつかの鶏群（若鶏、及び若鶏／繁殖鶏の両方）において検出されている。ＴＲＴＶは、ＳＨＳの病因及び関連する呼吸窮迫において役割を果たすと仮定されている。
【０００２】
［０００２］
伝染性気管支炎（ＩＢ）は、ニワトリにおいてのみ疾患を引き起こすコロナウイルスであるが、他の一部の鳥類において亜臨床的に感染する可能性もある。一部の血清型は地理的に制限されているのに対して、多数の血清型は１つの地理的領域内で共循環するのが一般的である。近年になってから、新規なＩＢＶ遺伝子型であるＱＸ株は、アジア及びヨーロッパにおいて徐々に普及しつつある。罹患率は一般的に１００％に近い。ヒナ鶏の咳、くしゃみ、及び気管支収縮は、１０〜１４日間にわたって持続する場合がある。結膜炎及び呼吸困難が見られる場合があり、時には顔面腫脹、特に副鼻腔の同時の細菌感染を伴うこともある。ランプヒーターの下でヒナ鶏が元気消失し、うずくまって見える場合もある。飼料消費及び体重増加が減る。腎病原性株による感染は、初期呼吸性徴候を発呈させ、引き続いて後に、元気消失、羽毛逆立、湿潤糞、水分摂取量の増加、及び死亡につながる。産卵鶏の場合、鶏卵の生産量が７０％も低下することがあり、鶏卵の奇形で、卵殻が薄く、軟質で、粗く及び／または淡色になることもしばしばであり、小さめで、卵白が水っぽくなる。たいていの場合、鶏卵の生産と鶏卵の品質は通常どおりに戻るが、戻るまでの所要期間は最大８週間と見られている。ほとんどの集団感染では、死亡率は５％であるが、細菌感染を併発して疾患が悪化すれば死亡率が高まる。幼鶏において、腎病原性株は、間質性腎炎を高い死亡率（最大６０％）にて誘発する恐れがある。幼鶏の感染は、卵管に永久的な損傷を与え、産卵鶏または繁殖鶏が標準の生産レベルに達しない結果となりうる。
【０００３】
［０００３］
ＩＢウイルスの公知のワクチン株は、ＩＢ−ＱＸウイルス及びＩＢ−ＱＸ様ウイルスによって引き起こされる伝染性気管支炎に対して保護するには不十分であることが立証されてきた。国際公開第２０１００１７４４０号を参照のこと。
【０００４】
［０００４］
伝染性ファブリキウス嚢病（ＩＢＤ、別称：ガンボロ病）は、全世界においてニワトリに見られる高度に接触感染性の免疫抑制性疾患であり、鶏卵及び肉の生産に対し経済的に深刻な影響を及ぼす。ＩＢＤワクチンは、ガンボロ制御戦略の重要な部分を成す。投与対象となるワクチンの選択は、ワクチン接種を受けるニワトリの種類、及び優勢な挑戦的状況に依存する。
【０００５】
［０００５］
概して、不活化抗原は家禽ワクチンにおいて使用されてきた。しかし、不活性化ウイルスの製造は比較的高コストであるので、抗原含有レベルの低い有効ワクチンが所望されている。
【０００６】
［０００６］
家禽ワクチン接種におけるもう１つのニーズは、ワクチン接種自体のコストに密接に関連している。複数の疾患を予防するように設計された多価ワクチンを作製することは、経済的に有利である。そのような多価ワクチンは、ワクチン投与のコストを削減するが、周知の抗原干渉という現象が起こるせいで、単に同じ剤形中に抗原を混合するだけでは、多価ワクチンの作製に対するアプローチとして効を奏さないこともしばしばである。
【０００７】
［０００７］
したがって、抗原及び／または多価ワクチンの含有量を低減させた家禽ワクチンに対するニーズが存在している。
【発明の概要】
【０００８】
［０００８］
一態様において、本発明は、抗原成分と、免疫学的に有効量のアジュバント成分と、を含む免疫原性組成物を提供する。本抗原成分は、少なくとも１つのＴＲＴ抗原と少なくとも１つのＩＢ抗原とを含み、本アジュバント成分は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと、油エマルジョンと、任意で、ステロールとを含む。
【０００９】
［０００９］
或る実施形態において、少なくとも１つのＴＲＴ抗原はＴＲＴ株Ｋである。
［００１０］
或る実施形態において、少なくとも１つのＩＢ抗原は、ＩＢ  Ｄ１４６６抗原及びＩＢ  ＱＸ抗原のうちの少なくとも１つである。
【００１０】
［００１１］
或る実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、非リポソーム及び／または本質的にサポニンを含まない。
【００１１】
［００１２］
或る実施形態では、任意で、本ステロールを免疫刺激性オリゴヌクレオチドと混合する。
【００１２】
［００１３］
本発明はまた、抗原成分と有効量のアジュバント成分とを含むワクチンであって、アジュバント成分が免疫刺激性オリゴヌクレオチドと油エマルジョンとを含み、且つ抗原成分がＩＢＤ抗原を含むワクチンを提供する。
【００１３】
［００１４］
或る実施形態において、前記ＩＢＤ抗原は、１０７．５〜１０８ＴＣＩＤ５０の量で存在しうる、不活性化Ｌｕｋｅｒｔ株抗原である。
【００１４】
［００１５］
或る実施形態において、本ワクチンは、ＩＢＤの非Ｌｕｋｅｒｔ株に由来する抗原；伝染性気管支炎抗原；レオウイルス抗原；ニューカッスル病抗原；シチメンチョウ鼻気管炎抗原のうちの少なくとも１つを含む、多価ワクチンである。
【００１５】
［００１６］
別の態様において、本発明は、抗原成分と有効量のアジュバント成分とを含むワクチンを提供するものである。本アジュバント成分は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと油エマルジョンとを含み、本抗原成分は、ＴＲＴ抗原と；ニューカッスル抗原と；産卵低下症候群（ＥＤＳ）抗原と；ＩＢＫ抗原と；コリーザ抗原とを含む。
【００１６】
［００１７］
或る実施形態において、ＴＲＴ抗原は不活性化シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスを含み、ニューカッスル抗原は不活性化ニューカッスルウイルスを含み、ＥＤＳ抗原は不活性化ＥＤＳウイルスを含み、ＩＢＫ抗原は不活性化ＩＢＫウイルスを含み、コリーザ抗原はコリーザＭバクテリンとコリーザ２２１バクテリンとコリーザＳバクテリンとの混合物を含む。
【００１７】
［００１８］
或る実施形態において、ＴＲＴ抗原は、１用量当たり１０６．００ＴＣＩＤ５０〜１０６．５０ＴＣＩＤ５０の量で存在する。
【００１８】
［００１９］
或る実施形態において、前記油エマルジョンはＷ／Ｏエマルジョンである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［００２０］
定義：
［００２１］
「約」または「およそ」という用語は、測定可能な数値変数と関連して用いられている場合に、指示された値の実験誤差内（例えば、平均の９５％信頼区間内）の変数もしくは指示値の１０％以内にある変数のうちのいずれか大きい方の、指示された変数値及び全ての変数値を指す。但し、「約３週間」を１７〜２５日間とし且つ約２〜約４週間を１０〜４０日間とした数週間の時間間隔に関して「約」が用いられている場合はこの限りではない。
【００２０】
［００２２］
本発明のアジュバント製剤に適用される「〜から本質的になる」という用語及びこれに類するものは、前記薬剤が測定可能なアジュバント化作用または免疫調節作用を発揮する量の追加的なアジュバント化剤または免疫調節剤を含有しない組成物を指す。
【００２１】
［００２３］
「本質的にサポニンを含まない」、「実質的にサポニンを含まない」という用語及びこれに類するものは、サポニンが測定可能なアジュバント化作用または免疫調節作用を発揮する量のサポニンを含有しない組成物を指す。或る実施形態において、本質的にサポニンを含まない組成物の場合、サポニン含有量が、発熱などの全身性免疫応答を引き起こすうえで十分でない量である。或る実施形態において、本質的にサポニンを含まない組成物の場合、サポニン含有量がゼロであるか、または検出限界以下である。
【００２２】
［００２４］
「免疫刺激性分子」という用語は、免疫応答を生成する分子を指す。
［００２５］
「非経口投与」という用語は、消化管を含まない経路を介して、または経由して、ワクチンのような物質を被験者の体内に導入することを指す。非経口投与には、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、皮内投与、腹腔内投与、眼内投与、及び静脈内投与が含まれる。
【００２３】
［００２６］
免疫刺激性オリゴヌクレオチド製剤に適用される純度百分率または「純度Ｘパーセント」は、Ｘ％の指定されたオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド分子の集団を指す（例えば、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ：番号：５、配列ＩＤ番号：８等）、及び残部（すなわち、１００％からＸ％を減算した値）は、指定された配列の製造中に不純物として存在する、指定されたオリゴヌクレオチドの短断片を含む。ゆえに、３’〜５’配列決定によって本配列を製造する場合、５’短縮型には残部が含まれることになる。非限定例として、８０％純度の配列番号８の調製物のうち１００μｇは、配列番号８（８０μｇ）を含み、残部２０μｇは配列番号８の短断片であって製剤中に存在する。
【００２４】
［００２７］
「治療的に有効な量」、「免疫学的に有効な量」及び「有効量」という用語は、ウイルスもしくは細菌のような病原体による感染によって引き起こされる有害な健康上の影響もしくはその合併症を含む、疾患の徴候もしくは症状を予防または軽減するのに十分な抗原、アジュバントもしくはワクチンを投与される被験者において免疫応答を誘発する程度の抗原、アジュバントもしくはワクチンの量を指す。体液性免疫または細胞性免疫、あるいは体液性免疫及び細胞性免疫の両方が誘発される可能性がある。動物におけるワクチンの免疫原性及び有効性は、例えば、抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイを介して間接的に、または野生型株による抗原投与後の徴候及び症状のモニタリングを通じて直接的に評価できる。ワクチンを介して付与される保護免疫は、例えば、死亡率、罹患率、体温の数値、全般的な身体状態、ならびに被験者の全般的な健康状態及びパフォーマンスなどの臨床徴候の低下を測定することによって評価できる。治療的に有効なワクチン量は、使用される特定のアジュバント、使用される特定の抗原、または被験者の病態に応じて異なる場合もあれば、当業者によって決定される場合もある。
【００２５】
［００２８］
商業用の産卵鶏及び繁殖鶏は、生存中に、多種多様なワクチンを用いてワクチン接種される。これらのワクチンは、主として、弱毒化された生菌ワクチンである。ニワトリに対し、産卵の開始準備が整うまでに、不活化混合ワクチンで予防接種して、既にワクチン接種を受けたことのある伝染性病原体に対する免疫力を補強し、飼育期間中に鶏卵の産生またはその他の損傷を引き起こす恐れのある他の病原体に対する免疫を誘発する。これらのワクチンが高い抗体力価を誘発しうること、及びワクチンがおよそ２０週から７０週までの全飼育期間中に保護する必要のあることから、免疫の持続時間が長いことが重要とされる。長期間の免疫を達成するためには、抗原をアジュバント、例えば油中水（Ｗ／Ｏ）型エマルジョン中に処方することが必要である。
【００２６】
［００２９］
したがって、概して、本発明は、抗原成分とアジュバント成分とを含む免疫原性組成物を提供し、ここで抗原成分は、少なくとも１つのＴＲＴ抗原及び少なくとも１つのＩＢ抗原を含み、アジュバント成分は、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、油エマルジョン、及び任意で、ステロールを含み（または、いくつかの実施形態ではこれらから本質的になり、あるいは他の実施形態ではこれらからなる）。
【００２７】
抗原成分
［００３０］
異なるＩＢ  ＱＸ抗原が、本発明に好適である。或る実施形態において、ＩＢ  ＱＸ抗原は完全に不活性化されたウイルスである。他の実施形態において、ウイルスは、改変された生菌ウイルスである。さらに他の実施形態では、サブユニットワクチンが使用される場合がある。例えば、ウイルスの表面に存在するタンパク質で好適と考えられるものとしては、これらに限定されるものではないが、Ｓタンパク質、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを挙げることができる。不活性化全ウイルスの使用を伴う実施形態では、抗原を１用量当たり１０３〜１０１０感染単位、例えば１０４、１０５、１０６、１０７感染単位の量で用いる場合がある。或る実施形態において、ＩＢ  ＱＸ不活性化ウイルスの量は、１用量当たり約１０５〜約１０８感染単位である。
【００２８】
［００３１］
抗原成分は、さらなる実施形態ではＩＢＤ抗原を含み、或る実施形態では不活性化Ｌｕｋｅｒｔ  ＩＢＤウイルスである。
【００２９】
［００３２］
或る実施形態において、不活性化されたＬｕｋｅｒｔ  ＩＢＤウイルスの量は、１用量当たり１０７〜１０８ＴＣＩＤ５０（例えば、１用量当たり１０７．１、１０７．２、１０７．３、１０７．４、１０７．５、１０７．６、１０７．７、１０７．８、１０７．９ＴＣＩＤ５０）である。
【００３０】
［００３３］
或る実施形態において、ワクチンの抗原成分は、不活性化されたＬｕｋｅｒｔ  ＩＢＤウイルスだけでなく、他の抗原を含む。例えば、ＩＢ  Ｍ４１及び／またはＩＢ  Ｄ１４６６及び／またはＩＢ  Ｄ２７４などのそれぞれ異なる伝染性気管支炎ウイルス株を使用できる。代替的または追加的に、本発明のワクチンはまた、ＴＲＴ、ニューカッスル病（例えば、ＬａＳｏｔａ株）、ＥＤＳ（産卵低下症候群）、レオウイルス、及び伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの抗原、鳥インフルエンザを含みうる。
【００３１】
［００３４］
他の態様において、本発明は、ＴＲＴ抗原；ニューカッスル抗原；産卵低下症候群（ＥＤＳ）抗原；ＩＢＫ抗原（伝染性気管支炎ウイルス）；及びコリーザ抗原を含む多価ワクチンを提供する。
【００３２】
［００３５］
本発明の或る実施形態において、ＴＲＴ抗原は、１用量当たり１０６．００ＴＣＩＤ５０〜１０６．５０ＴＣＩＤ５０（例えば、１０６．００ＴＣＩＤ５０、１０６．１０ＴＣＩＤ５０、１０６．２０ＴＣＩＤ５０、１０６．３０ＴＣＩＤ５０、１０６．４０ＴＣＩＤ５０または１０６．５０ＴＣＩＤ５０）の量で存在する。
【００３３】
［００３６］
本発明のワクチンに使用されるウイルスを、弱毒化または不活性化することが可能である。ウイルスを不活性化し減弱させる方法は、当該技術分野において周知である。例えば、ウイルスを培養継代によって不活性化させる場合もある。不活性化の方法としては、限定されるものではないが、ホルマリン、βプロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリエチレンイミン（ＢＥＩ）またはフェノールから選択される有効量の不活性化化学物質に対しウイルスを曝露させることが挙げられる。
【００３４】
［００３７］
コリーザはそれぞれ異なるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株によって引き起こされる。ゆえに、或る実施形態において、コリーザ抗原は、１種以上のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株（例えば、株Ｍ、株Ｚ、株２２１及びこれらに類するもの）を含む。他の実施形態では、血清型Ａ、Ｂ及びＣを表す株の混合物が使用される。ゆえに、株２２１（コリーザ２２１）はＳｅｒｏｖａｒ  Ａ株として使用され、Ｓｐｒｏｓｓ（コリーザＳ）株はＳｅｒｏｖａｒ  Ｂ染色剤として使用され、Ｓｔｏｒｄ  Ｍｏｄｅｓｔｏ（コリーザＭ）はＳｅｒｏｖａｒ  Ｃ株として使用される場合がある。
【００３５】
［００３８］
当業者であれば、ウイルス滴定の方法論に応じて、時には約３０％程度まで、ウイルスの力価が変動する可能性のあることを実感する場合がある。本開示において、用量が１０の指数として測定されている場合、指数が０．２ずつ変動する可能性がある。ゆえに、例えば、力価１０６．４０ＴＣＩＤ５０には、１０６．２０ＴＣＩＤ５０〜１０６．６０ＴＣＩＤ５０間の値が包含される場合がある。同じ考え方は力価の範囲に当てはまる。例えば、力価１０６．００ＴＣＩＤ５０〜１０６．５０ＴＣＩＤ５０には、１０５．８０ＴＣＩＤ５０〜１０６．７０ＴＣＩＤ５０の範囲が包含される。
【００３６】
［００３９］
他の実施形態では、上記の抗原に加えて他の抗原、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａが用いられる場合がある。ウイルスを不活性化する場合と同様、例えば、ホルマリン、βプロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリエチレンイミン（ＢＥＩ）またはフェノールから選択される有効量の不活性化化学物質への曝露によって、細菌を不活性化できる。
【００３７】
アジュバント成分
［００４０］
概して、本発明の免疫原性組成物中に使用されるアジュバント成分は、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、油、及び、任意で、界面活性剤（類）を含む。或る実施形態において、本アジュバント成分は、サポニン及び／またはＩＳＣＯＭを含まないか、または本質的に含まない。
【００３８】
［００４１］
或る実施形態において、本アジュバント成分は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと、油と、任意で、界面活性剤（類）と、から本質的になる。或る実施形態において、本アジュバント成分は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと、油と、任意で、界面活性剤（類）と、からなる。
【００３９】
［００４２］
好適な免疫刺激性オリゴヌクレオチドとしては、ＯＤＮ（ＤＮＡベース）、ＯＲＮ（ＲＮＡベース）オリゴヌクレオチド、またはキメラＯＤＮ−ＯＲＮ構造が挙げられる。これらの構造は、ホスホロチオエート修飾、ハロゲン化、アルキル化（例えば、エチル修飾またはメチル修飾）及びホスホジエステル修飾を含むがこれらに限定されない、修飾骨格を有しうる。いくつかの実施形態では、ポリイノシン−シチジル酸またはその誘導体（ポリＩ：Ｃ）が使用される場合がある。
【００４０】
［００４３］
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、特定の塩基配列のコンテキスト（ＣｐＧモチーフ）において非メチル化ＣＧジヌクレオチドが存在することを特徴とする。（本文献は、本明細書において参照により援用されているＨａｎｓｅｌ  ＴＴ，Ｂａｒｎｅｓ  ＰＪ（編著）：Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  Ａｓｔｈｍａ，Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ＣＯＰＤ．Ｐｒｏｇ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｓ．Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ，２００１，ｖｏｌ  ３１，ｐｐ  ２２９−２３２）。これらのＣｐＧモチーフは、真核生物のＤＮＡ内には見られない。これら真核生物ＤＮＡにおいて、ＣＧジヌクレオチドは抑制されており、存在する場合には通常はメチル化されるが、ＣＧジヌクレオチドは免疫刺激特性を付与される細菌ＤＮＡ中に存在する。
【００４１】
［００４４］
選択された実施形態において、本発明のアジュバントは、いわゆるＰクラスの免疫刺激性オリゴヌクレオチドを利用し、より好ましくは修飾Ｐクラスの免疫刺激性オリゴヌクレオチドを利用し、さらにより好ましくはＥ修飾Ｐクラスのオリゴヌクレオチドを利用する。Ｐクラスの免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、概ね６〜２０ヌクレオチド長のパリンドロームの存在を特徴とする、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである。Ｐクラスのオリゴヌクレオチドは、インビトロ及び／またはインビボのいずれかにて、自発的にコンカテマーに自己組織化する能力を有する。これらのオリゴヌクレオチドは、厳密な意味では一本鎖であるが、パリンドロームの存在により、コンカテマー（または場合によってはステム‐アンド‐ループ構造）の形成を可能にしている。Ｐクラスの免疫刺激性オリゴヌクレオチドの全長は、１９〜１００ヌクレオチド、例えば１９〜３０ヌクレオチド、３０〜４０ヌクレオチド、４０〜５０ヌクレオチド、５０〜６０ヌクレオチド、６０〜７０ヌクレオチド、７０〜８０ヌクレオチド、８０〜９０ヌクレオチド、９０〜１００ヌクレオチドである。
【００４２】
［００４５］
本発明の一態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、５’ＴＬＲ活性化ドメインと、少なくとも２つのパリンドローム領域と、を含む。一方のパリンドローム領域は、少なくとも６ヌクレオチド長の５’パリンドローム領域であって、直接的にまたはスペーサーを介して少なくとも８ヌクレオチド長の３’パリンドローム領域に対し連結されている。
【００４３】
［００４６］
Ｐクラスの免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、当該技術分野において公知の技術に従って修飾することが可能である。例えば、Ｊ修飾とは、ヨード修飾ヌクレオチドを指す。Ｅ修飾とは、エチル修飾ヌクレオチド（類）を指す。ゆえに、Ｅ修飾Ｐクラスの免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチド（好ましくは５’ヌクレオチド）がエチル化されている、Ｐクラスの免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。さらなる修飾には、６−ニトロ−ベンズイミダゾールの付着、Ｏ−メチル化、プロビニル−ｄＵによる修飾、イノシン修飾、（好ましくはウリジンに対する）２−ブロモビニルの付着が含まれる。
【００４４】
［００４７］
Ｐクラスの免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、ホスホジエステル結合及びホスホロチオエート結合を含むがこれらに限定されない、修飾ヌクレオチド間結合を含む場合がある。本発明のオリゴヌクレオチドは、商業的供給源から合成される場合もあれば、または入手される場合もある。
【００４５】
［００４８］
Ｐクラスのオリゴヌクレオチド及び修飾Ｐクラスのオリゴヌクレオチドは、公開ＰＣＴ出願国際公開第２００８／０６８６３８号（２００８年６月１２日発行）においてさらに開示されている。修飾Ｐクラスの免疫刺激性オリゴヌクレオチドの適切な非限定例は、下掲のとおりである（配列ＩＤ番号１〜１０において、「＊」はホスホロチオエート結合を指し、「−」はホスホジエステル結合を指す）。配列ＩＤ番号１１〜１４において、全ての結合はホスホジエステル結合である。
【００４６】
配列番号１                    ５’Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ａ＊Ｃ−Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ−Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’
配列番号２                    ５’Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’
配列番号３                    ５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ  ３’
配列番号４                    ５’ＪＵ＊Ｃ−Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’
配列番号５                    ５’ＪＵ＊Ｃ−Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ  ３’
配列番号６                    ５’ＪＵ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ  ３’
配列番号７                    ５’ＥＵ＊Ｃ−Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’
配列番号８                    ５’ＪＵ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ  ３’
配列番号９                    ５’ＪＵ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ  ３’
配列番号１０                    ５’Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ａ＊Ｃ−Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ−Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’
配列番号１１                    ５’−ＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵ−３’
配列番号１２                    ５’−ＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵＡＵＵ−３’
配列番号１３                    ５’−ＡＡＡＣＧＣＵＣＡＧＣＣＡＡＡＧＣＡＧ−３’
配列番号１４                    ５’−ｄＴｄＣｄＧｄＴｄＣｄＧｄＴｄＴｄＴｄＴｒＧｒＵｒＵｒＧｒＵｒＧｒＵｄＴｄＴｄＴｄＴ−３’
［００４９］
本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、化学的に合成できる。さらに、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、約６０％純度（均質性）またはそれを上回る（例えば、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％もしくは１００％純度）で使用できる。
【００４７】
［００５０］
アジュバント組成物中に用いられるＰクラスの免疫刺激性オリゴヌクレオチドの量は、使用されるＰクラスの免疫刺激性オリゴヌクレオチドの性質、及び意図された種に依存する。
【００４８】
［００５１］
ステロール同士はる共通の化学コアを共有する。この化学コアは、ヒドロキシル（ＯＨ）基が通常炭素−３に付着した、ステロイド環構造［複数可］である。脂肪酸置換基の炭化水素鎖の長さは可変（通常、１６〜２０個の炭素原子）であり、飽和または不飽和でありうる。ステロールは通例、環構造内に１つ以上の二重結合を含み、環に付着した多様な置換基もまた含有する。ステロール及びこれらの脂肪酸エステルは、本質的に水不溶性である。ゆえに、これらの化学的類似性を考慮すると、この化学コアを共有するステロールが、本発明のワクチン組成物中に使用される場合に同様の特性を有する可能性は高い。ステロールは当該技術分野において周知であり、ステロールの市販品を購入することが可能である。例えば、コレステロールはＭｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，１２ｔｈ  Ｅｄ．，ｐ．３６９に開示されている。好適なステロールとしては、限定されないが、β−シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール、コレステロール及びこれらの誘導体、例えば、ＤＣ−コレステロール（３β−［Ｎ−（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール）が挙げられる。
【００４９】
［００５２］
複数の油及びこれらの組み合わせは、本発明の使用に適している。これらの油としては、限定されないが、動物油、植物油、及び非代謝性油が挙げられる。本発明において好適な植物油の非限定例は、コーン油、ピーナッツ油、ダイズ油、ヤシ油、オリーブ油、及びフィトスクワランである。動物油の非限定例は、スクワランである。非代謝性油の好適な非限定例としては、軽質鉱油、直鎖状または分岐鎖状飽和油、分岐状油、及びこれらに類するものが挙げられる。
【００５０】
［００５３］
一連の態様において、本発明のアジュバント製剤中に使用される油は軽質鉱物油である。本明細書において、「鉱油」という用語は、ペトロラタムから蒸留技術によって得られる液体炭化水素の混合物を指す。この用語は、「液化パラフィン」、「液体ペトロラタム」及び「白色鉱油」と同義語である。この用語はまた、「軽質鉱油」（すなわち、ワセリンの蒸留によって同様に得られるが、白色鉱油よりもわずかに比重が低い油）を含むことを意図している。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ａｔ  ｐａｇｅｓ  ７８８及び１３２３）を参照のこと。鉱油は、様々な商業的供給源、例えばＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（ペンシルバニア州フィリップスバーグ）、ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（オハイオ州クリーブランド）から入手可能である。好ましい鉱油は、ＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）という名称で市販されている軽鉱油である。別の実施形態において、好適な油は、鉱油ＭＡＲＣＯＬ（商標）５２を含む。ＭＡＲＣＯ（商標）５２は、液体飽和炭化水素の精製混合物であって、毒性不純物を含有せず透明で澄みきった水白色の生成物であり、後続の精製段階（接触水素化による最終的な精製を含む）を伴う真空蒸留を介して石油から採取される。
【００５１】
［００５４］
本乳剤中に使用するのに適した乳化剤としては、生物学的に適合した天然乳化剤、及び非天然合成界面活性剤が挙げられる。生物学的に適合した乳化剤としては、リン脂質化合物またはリン脂質の混合物が挙げられる。リン脂質として好ましいのは、ホスファチジルコリン（レシチン）、例えば、ダイズレシチンまたは卵レシチンである。粗植物油を水洗し、結果として得られた水和ガムを分離して乾燥させることにより、ホスファチドとトリグリセリドとの混合物としてのレシチンを得ることができる。トリグリセリド及び植物油をアセトン洗浄により除去した後に残存したアセトン不溶性リン脂質及び糖脂質の混合物を分画することにより、精製された生成物を得ることができる。あるいは、レシチンを様々な商業的供給源から入手することも可能である。他の好適なリン脂質としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトール、及びリゾホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。リン脂質は天然源から単離される場合もあれば、慣例的に合成される場合もある。
【００５２】
［００５５］
さらなる実施形態では、本明細書中に使用されている乳化剤には、レシチンが含まれないか、または免疫学的に有効でない量のレシチンが使用される。
【００５３】
［００５６］
本発明のアジュバント製剤中に使用するのに適した非天然合成乳化剤としては、ソルビタン系非イオン性界面活性剤、例えば、脂肪酸置換ソルビタン界面活性剤（ＳＰＡＮ（登録商標）またはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）という名称で市販されている）、ポリエトキシル化ソルビトールの脂肪酸エステル（ＴＷＥＥＮ（登録商標））、ヒマシ油のような供給源由来の脂肪酸のポリエチレングリコールエステル（ＥＭＵＬＦＯＲ（登録商標））；ポリエトキシル化脂肪酸（例えば、ＳＩＭＵＬＳＯＬ（登録商標）Ｍ−５３という名称で入手可能なステアリン酸）、ポリエトキシル化イソオクチルフェノール／ホルムアルデヒドポリマー（ＴＹＬＯＸＡＰＯＬ（登録商標））、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標））；ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｎ）、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ）が挙げられる。合成界面活性剤として好ましいのは、ＳＰＡＮ（登録商標）ならびにＴＷＥＥＮ（登録商標）という名前で入手可能な界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレアート）及びＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）８３Ｖ（ソルビタンセスキオレエート））である。
【００５４】
［００５７］
乳化剤（類）は、一般に、ワクチン組成物中に０．０１％〜４０％（体積基準）、好ましくは０．１％〜１５％、より好ましくは２％〜１０％の量で存在しうる。
【００５５】
［００５８］
実施形態のサブセットにおいて、油及び油溶性乳化剤の体積百分率は合算で、少なくともワクチン組成物の５０％  ｖ／ｖ、例えば、５０〜９５％  ｖ／ｖ（体積基準）であり；好ましくは５０％  ｖ／ｖ以上８５％  ｖ／ｖ以下の量で、より好ましくは５０〜６０  ｖ／ｖ％、より好ましくは５５〜６５％  ｖ／ｖの量である。ゆえに、例えば、限定されるものではないが、油は４５％  ｖ／ｖの量で存在し、脂溶性乳化剤は５％  ｖ／ｖより多い量で存在しうる。したがって、油及び油溶性乳化剤の体積百分率は共に少なくとも５０％であろう。
【００５６】
［００５９］
本発明の全てのワクチンに適用可能なさらに別のサブセットにおいて、油の体積百分率は、ワクチン組成物の４０％  ｖ／ｖ超、例えば、４０〜９０体積％  ｖ／ｖ（体積基準）であり；４０％  ｖ／ｖ〜８５％  ｖ／ｖ；４３％〜６０％  ｖ／ｖ、４４〜５０％  ｖ／ｖである。或る実施形態において、エマルジョンは、少なくとも６０％  ｖ／ｖの油相と４０％  ｖ／ｖの水相とを含有する。
【００５７】
［００６０］
時には、特にスケールアップされた商業的適用において、抗原を濃縮することは不可能または非実用的であるため、低濃度の抗原溶液を使用せざるをえないこともある。ゆえに、いくつかの実施形態において、本発明のワクチン組成物は、上記のようなアジュバント製剤を含み、これらのアジュバント製剤中の油相の含量は希釈され、ワクチン組成物は油中水型エマルジョンである。
【００５８】
［００６１］
実際には、油相が５０％  ｖ／ｖ未満である油中水型エマルジョンを作製することは可能である。
【００５９】
［００６２］
概略説明すると、最初に、本発明のアジュバント製剤を上記のように調製する。前記アジュバント製剤において、油相はアジュバント製剤の５０％  ｖ／ｖ超を占める。油及び乳化剤（類）以外の成分の量はそれぞれ、最終目標濃度及び所望の希釈率に基づいてスケールアップされる。例えば、アジュバント製剤が８０％  ｖ／ｖを含むワクチン組成物を調製しようと企図する場合、油以外の成分の量を１．２５（１／０．８）倍にスケールアップする。乳化剤（存在する場合にはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０及び／またはＳＰＡＮ（登録商標）８０）の量を、必ずしもスケールアップする必要はないが、アジュバント製剤及び最終ワクチン組成物中の油と乳化剤（類）との容量比を、同じに維持することが好ましい。
【００６０】
［００６３］
次いで、抗原溶液をアジュバント製剤に添加する。
［００６４］
分散された球状の水滴が、単分散液滴のランダム充填の最大充填率、すなわち０．６４よりも濃縮された形態で存在しない限り、油中水型エマルジョンの完全性を維持することが可能である。Ｔａｄｒｏｓ，Ｅｍｕｌｓｉｏｎ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｈｅｏｌｏｇｙ，１ｓｔ  ｅｄ．２０１３，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ  ＫＧａＡを参照のこと。水性液滴が占める総体積分率が０．６４（すなわち：６４％  ｖ／ｖ）を超えない限りと言った場合、これは、逆に、油性相が３６％  ｖ／ｖ未満に降下してはならないことを暗に示す。
【００６１】
［００６５］
いくつかの実施形態において、好適な１用量のアジュバントは、約０．１μｇ〜約２０μｇ（例えば、１〜２０μｇ、５〜１５μｇ、８〜１２μｇまたは１０μｇ）の免疫刺激性オリゴヌクレオチド、最高約５０μｇ（例えば、０．５〜２０μｇ、または１〜１０μｇ）のステロール（コレステロールなど）を含む。
【００６２】
［００６６］
或る実施形態において、本アジュバント成分の調製方法は以下のとおり。
ａ）  セスキオレイン酸ソルビタン及びコレステロール（ある場合）を軽質鉱油中に溶解する。結果として得られた油状溶液を滅菌濾過する。
【００６３】
ｂ）  免疫刺激性オリゴヌクレオチド及びポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレアートを水相中に溶解し、これにより、水溶液を形成する。
ｃ）  この水溶液を、連続的に均質化しながら油溶液に加える。
【００６４】
［００６７］
本発明の免疫原性組成物は、抗原成分を水性相に添加し、続いて水相を油相と結合することによって調製できる。他の実施形態では、アジュバント成分の調製後に、このアジュバント成分に抗原成分を添加する場合がある。
【００６５】
［００６８］
本免疫原性組成物に、医薬的に許容される担体をさらに含めてもよい。本明細書において、「医薬的に許容される担体」には、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、防腐剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤、及びこれらに類するものが含まれる。担体（類）は、本組成物の他の成分と適合性があり、被験者に有害ではないという意味で、「許容される」ものでなければならない。担体は典型的に、無菌であり、且つパイロジェンを含まず、使用される投与様式に基づいて選択される。当業者に周知のように、本組成物を含む医薬的に許容される担体の好ましい製剤は、米国（米国）農業局、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）または米国以外の国の同等の政府機関によって公布された適用法規により承認された医薬担体を含む。したがって、本組成物の商業生産用の医薬的に許容される担体は、米国もしくは外国における適切な政府機関により既に承認済みであるかまたは承認される予定の担体である。
【００６６】
［００６９］
組成物の他の成分としては、医薬的に許容される賦形剤、例えば、担体、溶媒及び希釈剤、等張剤、緩衝剤、安定剤、防腐剤、血管収縮剤、抗菌剤、抗真菌剤、及びこれらに類するものを挙げることができる。典型的な担体、溶媒及び希釈剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール、油、及びこれらに類するものが挙げられる。代表的な等張剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、及びこれらに類するものが挙げられる。有用な安定剤としては、ゼラチン、アルブミン、及びこれらに類するものが挙げられる。
【００６７】
ワクチンの投与
［００７０］
本発明のワクチンは概して、複数の経路を介して投与することが可能である。そのような経路は、当業者に公知であり、筋肉内注射及び皮下注射を含むが、これらに限定されない。
【００６８】
［００７１］
或る実施形態では、産卵予定日の約３〜７週間（例えば、約４〜６週間）前に、ワクチンが投与される。このレジメンは、ＩＢ  ＱＸに対する免疫が、ワクチン接種された雌鶏の産卵期までに発呈され、その産卵期全体にわたって持続することを保証するものである。
【００６９】
［００７２］
さらなる実施形態において、本発明のワクチンは、初回抗原刺激された雌鶏に対するブースターワクチンとして投与される。当該技術分野では複数のＩＢプライマーが公知である。例えば、ＰＯＵＬＶＡＣ（登録商標）ＩＢプライマーは、凍結乾燥の生菌、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ型伝染性気管支炎ウイルスを含む。Ｎｏｂｉｌｉｓ（登録商標）ＩＢ  Ｈ１２０は、伝染性気管支炎に対する一次ワクチン接種として使用される凍結乾燥の生菌ワクチンである。このワクチンにはＨ１２０型Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓが含有されている。他のＩＢプライマーも、本発明のワクチンと併用可能である。
【００７０】
［００７３］
以下の非限定例では、本発明についてさらに説明する。
【実施例】
【００７１】
実施例１．ワクチンの調製
［００７４］
表１に、例示的な油中水型エマルジョンを示す。ＣｐＧもまた添加された水相中で、抗原が希釈されている。水相は、抗原とＣｐＧとチメロサールとを含み、油相と混合される。完全に混合した後、安定したＷ／Ｏエマルジョンが形成される。
【００７２】
【表１】
2019517526.tif 000002
【００７３】
実施例２．ＩＢまたはＴＲＴの効力アッセイ
［００７５］
本発明者らは、不活性化ＩＢ  Ｍ４１抗原（１用量当たり不活性化前に１０７．２ＥＩＤ５０）または不活性化ＴＲＴ抗原（１用量当たり不活性化前に１０５．３ＴＣＩＤ５０）が含有されているＷ／Ｏエマルジョンを製造した。これらのエマルジョン中のＣｐＧ含有量は、それぞれ異なるかまたはゼロ（配列ＩＤ番号：８、６５％純度）であった。これらのエマルジョンはニワトリにおける効力試験で試験された。ニワトリは４週齢にてワクチン接種を受けた。ワクチン接種後５週間目に血液試料を採取して、ＥＬＩＳＡにより抗原に対する抗体力価を試験した。
【００７４】
［００７６］
９６ウェルマイクロＥＬＩＳＡプレートのウェルに抗原をコーティングした酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、シチメンチョウ鼻気管炎（ＴＲＴ）ウイルスに対する抗体力価を測定した。コーティング後に、標準陰性血清及び標準陽性血清を、ウェル及び試験対象の血清に添加した。全ての血清を二重に試験した。対照として、抗原を含まないウェルにおいても同様に、全ての血清を二重に試験した。非結合抗体を除去し、ペルオキシダーゼが抱合された血清抗体に対する抗体を添加することにより、抗原に対する抗体の反応性を明視化した。非結合抱合抗体を除去した後、ペルオキシダーゼ基質オルトフェニレンジアミノ＋Ｈ２Ｏ２を添加した。発色反応が呈されたことにより、ペルオキシダーゼの存在が実証された。
【００７５】
［００７７］
表２は、ＴＲＴ抗原の効力試験結果の要約である。一般に、抗体力価は十分な値であり、奏効しない例はいずれの群にも存在しなかった。抗体力価に対してはＣｐＧの正の効果があった。１用量当たりＣｐＧ  １０μｇで最良の結果が得られたが、１用量当たりＣｐＧ  １μｇの場合も同様にプラス効果が得られた。
【００７６】
【表２】
2019517526.tif 000003
【００７７】
［００７８］
また、ＩＢ  Ｍ４１に対する抗体応答に関しても、ＣｐＧのプラス効果を特定した（表３参照）。１用量当たりＣｐＧ  １μｇの用量は、抗体応答を実質的に刺激するうえで既に十分であった。ＣｐＧなしではニワトリ１５羽中７羽の抗体応答が閾値２．６０未満であったのに対し、１用量当たりＣｐＧ  １μｇの試験では全てのニワトリが応答した。１用量当たりＣｐＧ  １０μｇでさらなる増加が得られた。
【００７８】
【表３】
2019517526.tif 000004
【００７９】
実施例３．ＩＢ、ＮＤ、ＥＤＳの効力アッセイ
［００７９］
４週齢の特定病原不在（ＳＰＦ）ニワトリ１０羽の群に対し、１用量当たり０．５ｍｌの用量を筋肉注射でワクチン接種した。ワクチン接種後５週間目に、血清学的検査用に血液試料を採取した。ＩＢ、ＮＤ及びＥＤＳに対する抗体力価を測定するために、ＥＬＩＳＡ（Ｉｄｅｘｘ  ＦｌｏｃｋＣｈｅｃｋ  ＩＢＶ抗体キット；Ｉｄｅｘｘ、米国メイン州）、赤血球凝集阻害試験、及びＥＬＩＳＡ（Ｉｄｅｘｘ  ＦｌｏｃｋＣｈｅｃｋ  ＮＣＤ抗体キット；Ｉｄｅｘｘ、米国メイン州）をそれぞれ使用した。
【００８０】
［００８０］
ワクチンは、
ＩＢ  Ｍ４１            ：        １０６．９ＥＩＤ５０／用量、
ニューカッスル病（ＮＤ）：    １０８，１ＥＩＤ５０／用量、
産卵低下症候群（ＥＤＳ）：    ２５６  ＨＡｕ／用量をそれぞれ異なる分量のＣｐＧ含有の油中水型エマルジョン中に含有する。
【００８１】
［００８１］
４週齢の特定病原不在（ＳＰＦ）ニワトリ１０羽の群に対し、１用量当たり０．５ｍｌの用量を筋肉注射でワクチン接種した。ワクチン接種後５週間目に、血清学的検査用に血液試料を採取した。ＩＢ、ＮＤ及びＥＤＳに対する抗体力価を測定するために、ＥＬＩＳＡ（Ｉｄｅｘｘ  ＦｌｏｃｋＣｈｅｃｋ  ＩＢＶ抗体キット；Ｉｄｅｘｘ、米国メイン州）、赤血球凝集阻害試験、及びＥＬＩＳＡ（Ｉｄｅｘｘ  ＦｌｏｃｋＣｈｅｃｋ  ＮＣＤ抗体キット；Ｉｄｅｘｘ、米国メイン州）をそれぞれ使用した。
【００８２】
［００８２］
表４〜表６にＩＢ、ＮＤ及びＥＤＳの結果をそれぞれ示す。
【００８３】
【表４】
2019517526.tif 000005
【００８４】
【表５】
2019517526.tif 000006
【００８５】
【表６】
2019517526.tif 000007
【００８６】
［００８３］
結果と結論
［００８４］
ＩＢ  Ｍ４１及びＮＤについては、ＣｐＧ不含の製剤と１用量当たりＣｐＧ  ５μｇ含有の製剤との間には有意差がある。１用量当たりＣｐＧ  ２．５μｇ含有のＮＤについても、抗体力価が有意に改善された。ＥＤＳについては、ＣｐＧ不含の製剤とＣｐＧ含有の製剤との間に有意差はなかったが、１用量当たりＣｐＧ  ５μｇ含有の場合の方がＣｐＧ不含の場合よりも数値的に良好であった。
【００８７】
［００８５］
１用量当たり５μｇの量で添加すると、ＣｐＧはＩＢ  Ｍ４１、ＮＤ及びＥＤＳの抗体応答に対して刺激効果が得られる。１用量当たりＣｐＧ  ２．５μｇの効果には限界がある。
【００８８】
実施例４．有効性試験
［００８６］
１用量当たりＣｐＧ  １０μｇ含有Ｗ／Ｏエマルジョン中に、不活性化ＩＢ  ＱＸと、不活性化ＩＢ  Ｄ１４６６と、不活性化ＴＲＴ抗原とを、それぞれ異なる分量にて含有している混合ワクチンを作製した。これらのエマルジョンは、１４週齢の特定病原不在（ＳＰＦ）産卵鶏にワクチン接種するために使用された。それぞれ異なるワクチン群の半数は、１０週齢にて生菌ＩＢワクチンをワクチン接種されていた。２６週齢のニワトリに毒性ＱＸ様ＩＢウイルスまたは毒性ＩＢ  Ｄ１４６６ウイルスを抗原投与した。抗原投与２週間前から抗原投与４週間後までの間に、鶏卵の生産力を測定した。そのうえ、ワクチン接種後７週目に、血清中和試験で抗体力価を測定した。
【００８９】
［００８７］
表４に示すデータに見られるように、生菌の初回抗原刺激後に、ＥＬＩＳＡで明確な抗体応答を検出できた。不活化ワクチンによるワクチン接種後に、ＳＮ試験でＩＢに対する抗体力価もまた算定した。ＳＮ試験では、ＩＢ  ＱＸ及びＩＢ  Ｄ１４６６に対する抗体が特異的に検出される。交差反応は全く観察されなかったが、ＥＬＩＳＡを用いてＩＢ  ＱＸ及びＩＢ  Ｄ１４６６に対する抗体を区別できなかった。
【００９０】
［００８８］
また、表７のデータが示すように、抗原投与後に、ワクチン接種されていないニワトリにおいて有害なＩＢ  ＱＸ抗原投与ウイルスによる鶏卵の産生低下はきわめて明白となる。生菌ワクチンのみ、ワクチン不活性化ワクチンのみ、またはその両方をワクチン接種した場合、ＩＢ  ＱＸ抗原投与ウイルスによって引き起こされる産卵低下に対して保護免疫が生ずる結果となる。
【００９１】
【表７】
2019517526.tif 000008
【００９２】
［００８９］
さらに、不活性化されたＩＢ  ＱＸ抗原は、ＩＢの非ＱＸ株とは異なり、ワクチン接種後のニワトリにおいて抗体力価を誘発することはほとんど不可能であると以前は考えられていた。例えば、伝染性気管支炎の他の非ＱＸ株（例えば、ＩＢ  Ｍ４１、ＩＢ  Ｄ２７４、またはＩＢ  Ｄ１４６６）由来の抗原を含有する現在市場投入されている製品は、ＣｐＧを含まない油エマルジョンでアジュバント化され、さらに十分な保護を誘発する。それとは対照的に、表８に示すように、ＣｐＧ不含の油乳剤は中和抗体を誘発するには不十分であるが、ＣｐＧを添加することによって抗体応答が堅牢化される。
【００９３】
【表８】
2019517526.tif 000009
【００９４】
［００９０］
同時に、上述したように、ＩＢウイルスの公知のワクチン株は、ＩＢ−ＱＸウイルス及びＩＢ−ＱＸ様ウイルスによって引き起こされる伝染性気管支炎に対して保護するには不十分であることが立証されてきた。ＷＯ２０１００１７４４０号を参照のこと。驚くべきことに、本発明のワクチンは、不活性化ＩＢ  ＱＸ抗原に対して明らかな抗体応答を誘発した。
【００９５】
実施例５．伝染性気管支炎、ニューカッスル病、ＴＲＴ、伝染性ファブリキウス嚢病、及び
レオウイルスに対するワクチン
［００９１］
この実験では、生まれたての特定病原不在（ＳＰＦ）Ｌｅｇｈｏｒｎ種鶏を雌雄混合にて使用した。ニワトリに標準食餌及び水を自由に与えた。
【００９６】
［００９２］
０日目に、これらの鳥にＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ１株含有のワクチンを点眼にて接種して、伝染性気管支炎に対するワクチンを接種させた。実験後２８日目に、これらの鳥の羽翼及び眼に対しＰＯＵＬＶＡＣ（登録商標）ＲＥＯ及びＰＯＵＬＶＡＣ（登録商標）ＴＲＴワクチンをそれぞれ推奨用量で投与した。実験後４９日目に、これらの鳥に実験用ワクチンを投与した。Ｔ０１群、Ｔ０２群、Ｔ０４群、及びＴ０５群は１群当たり３２羽の鳥を有し、Ｔ０３群、Ｔ０６群、及びＴ０７群は１群当たり１３羽の鳥を有した。
【００９７】
【表９】
2019517526.tif 000010
【００９８】
［００９３］
Ｔ０１、Ｔ０２、Ｔ０４、及びＴ０５中に使用された抗原はいずれも、ホルムアルデヒド中で不活性化されたものであった。
【００９９】
［００９４］
Ｔ０１群〜Ｔ０５群は、乳房領域に０．５ｍｌの筋肉内注射を受けた。製造元のプロトコールに準じて、Ｔ０６群及びＴ０７群に治療を施した。
【０１００】
［００９５］
７０日目及び７７日目に、これらの鳥から血液を血清学分析用に採取した。血清中和試験（ＩＢ、ＩＢＤ、レオ）、ＨＡＩ試験（ニューカッスル）及びＥＬＩＳＡ（ＴＲＴ）によって分析を実施した。反復測定を伴う一般線形混合（ｇｅｎｅｒａｌ  ｌｉｎｅａｒ  ｍｉｘｅｄ）モデルを用い、Ｔ０１、Ｔ０２、Ｔ０４及びＴ０５に関する血清学データを分析した。適切な対数変換を適用した。治療（時間点、及び時間点相互作用毎の治療）がもたらす固定的効果；ならびにブロック、ブロック内部の動物、及び治療がもたらすランダム効果（動物用語）が、モデルに含まれていた。
【０１０１】
［００９６］
（逆変換された）最小自乗平均及び９０％信頼区間が、未加工データの範囲と共に報告された。治療（すなわち、時間相互作用毎の治療）の主効果が有意（Ｐ≦０．１０）であった場合、各時点における全ての治療群間の比較を実施して報告した。治療群Ｔ０３、Ｔ０６及びＴ０７を、幾何平均、標準誤差ならびに範囲に関して要約した。
【０１０２】
［００９７］
結果を表１０に示す。
【０１０３】
【表１０】
2019517526.tif 000011
【０１０４】
［００９８］
これらの結果は、Ｗ／ＯエマルジョンにＣｐＧを添加したことによって、ＩＢＤＶに対する免疫応答がほぼ３倍に増大したことを実証するものである。異なる視点からの結果を見ると、これらの結果は、ＩＢＤ  Ｌｕｋｅｒｔ用量の減少を示す。１０８ＴＣＩＤ５０〜１０７．５ＴＣＩＤ５０（約１／３の減少）、及び製剤にＣｐＧを添加した結果、ＩＢＤに対する応答が（Ｔ０１及びＴ０５を比べて）増強した。同様に、ニューカッスル、レオウイルス、及びＴＲＴに対する応答も増強し、ＩＢに対する反応は統計的に低減しなかった。
【０１０５】
［００９９］
さらに、全てのウイルスに対する応答によって保護力価が生じた（ＩＢの保護力価は２０、ニューカッスルに対する保護力価は１６、ＩＢＤに対する保護力価は３２、レオウイルスに対する保護力価は１６である）。ＴＲＴワクチンの効率は、血清転換率を基準に測定される。血清転換率が７０％を超える場合、ワクチンが有効であることを示した。
【０１０６】
［００１００］
上記実験では、ＣｐＧ含有の製剤（Ｔ０１群及びＴ０２群）が両方とも、ＴＲＴに対して有効であった（血清転換率が９０％を上回った）。対照的に、ＣｐＧが欠けた製剤（Ｔ０４群及びＴ０５群）は、ＴＲＴに対して有効でなかった（血清転換率は６２．５％以下であった）。
【０１０７】
［００１０１］
Ｔ０６群をＩＢＤＶの陽性対照として用いた。表１０に示すように、ワクチンＴ０２によって誘発された力価は、陽性対照によって誘発された力価と同等であった。Ｔ０７群をＴＲＴの陽性対照として用いた。表１０に示すように、実験用ワクチンＴ０１及びＴ０２は、Ｔ０７よりも高いＴＲＴ力価を誘発した。
【０１０８】
［００１０２］
つまり、Ｗ／ＯエマルジョンにＣｐＧを添加することによって、気管支炎、ニューカッスル病、ＴＲＴ、伝染性嚢病（ＩＢＤまたはガンボロ）及びレオウイルスに対して効能を発揮する５価ワクチンの生成が可能となった。ＣｐＧを含まない製剤はＴＲＴに対しては効能を発揮しなかった。加えて、ニューカッスル、レオウイルス、及びＩＢＤに対する力価は、ＣｐＧ不含の製剤の方がＣｐＧ含有の製剤よりも低かった。
【０１０９】
実施例６．伝染性気管支炎、コリーザ、産卵低下症候群、ニューカッスル病、及びＴＲＴに対するワクチン
［００１０３］
この実験では、生まれたての特定病原不在（ＳＰＦ）Ｌｅｇｈｏｒｎ種鶏を雌雄混合にて使用した。ニワトリに標準食餌及び水を自由に与えた。
【０１１０】
［００１０４］
０日目に、これらの鳥にＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ１株含有のワクチンを点眼にて接種して、伝染性気管支炎に対するワクチンを接種させた。実験後１４日目に、ＰＯＵＬＶＡＣ（登録商標）ＴＲＴワクチンをそれぞれ推奨用量で眼内投与した。実験後３５日目に、実験用ワクチンを筋肉内注射によって投与した。
【０１１１】
［００１０５］
表１１に、これらの実験に使用された実験用ワクチン組成物及び対照用ワクチン組成物を示す。各群には５６羽の鳥が含まれていた。
【０１１２】
【表１１】
2019517526.tif 000012
【０１１３】
［００１０６］
Ｔ０１、Ｔ０２、Ｔ０４、及びＴ０５中に使用された抗原はいずれも、ホルムアルデヒド中で不活性化されたものであった。
【０１１４】
［００１０７］
血清学分析用に、５６日目及び７０日目に、これらの鳥から血液を採取した。分析には、１０％両側有意水準を用いた。
【０１１５】
［００１０８］
反復測定を伴う一般線形混合（ｇｅｎｅｒａｌ  ｌｉｎｅａｒ  ｍｉｘｅｄ）モデルを用い、Ｔ０１、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５及びＴ０６に関する血清学データを分析した。適切な対数変換を適用した。治療（時間点、及び時間点相互作用毎の治療）がもたらす固定的効果；ならびにブロック、ブロック内部の動物、及び治療がもたらすランダム効果（動物用語）が、モデルに含まれていた。
【０１１６】
［００１０９］
（逆変換された）最小自乗平均及び９０％信頼区間が、未加工データの範囲と共に報告された。治療（すなわち、時間相互作用毎の治療）の主効果が有意（Ｐ≦０．１０）であった場合、各時点における全ての治療群間の比較を実施して報告した。Ｔ０２を血清学的に、幾何平均、標準誤差及び範囲に関して要約した。
【０１１７】
［００１１０］
表１２に、実験群（Ｔ０３〜Ｔ０６）の結果を要約する。
【０１１８】
【表１２】
2019517526.tif 000013
【０１１９】
［００１１１］
これらの結果は、Ｗ／ＯエマルジョンにＣｐＧを添加したことによって、ＥＬＩＳＡで測定されたＴＲＴに対する免疫応答が２〜３倍に増大したことを実証するものである。血清転換率の観点から結果を見ると、ＣｐＧなしの製剤（治療薬Ｔ０３及びＴ０５）で治療した群では、効率的なＴＲＴ血清転換応答率が実証されなかった（５７％以下）。対照的に、製剤Ｔ０４及びＴ０６（両方ともＣｐＧ含有）で治療した群では、効率的な血清転換率（７５％以上）は実証されなかった。ＴＲＴ抗原の投与量を約１／３倍に減少させたとしても、（Ｔ０４及びＴ０５を１比較して）抗原投与量減少に対してＣｐＧを添加することで補える。
【０１２０】
［００１１２］
さらに、全てのウイルスに対する応答によって保護力価が生じた（ＩＢの保護力価は２０、ニューカッスルに対する保護力価は１６、コリーザに対する保護力価は５、ＥＤＳに対する保護力価は１８である）。製剤Ｔ０４及びＴ０６（ＣｐＧ含有）によって誘発されたＳＮ力価またはＨＡＩ力価は通常、製剤Ｔ０３及びＴ０５（ＣｐＧなし）によって誘発された力価の約２倍であった。
【０１２１】
［００１１３］
本明細書中に引用されている全ての刊行物（特許刊行物及び非特許刊行物の両方）は、あたかも個々の刊行物が具体的且つ個別に参照により援用されているかのように示されるのと同じ程度まで完全に本明細書において参照により援用されている。
【０１２２】
［００１１４］
特定の実施形態を参照しながら本発明について説明してきたが、これらの実施形態は、本発明の原理及び用途の単なる例証であることを理解すべきである。したがって、例示的な実施形態に対して多くの修正を加えることが可能であり、下記の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなしに他のアレンジを考案できることを理解すべきである。
【配列表】
2019517526000001.app
【国際調査報告】
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2019517526.tif 000015
2019517526.tif 000016
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