(57)【要約】  ＴＡＧ同族列を含む新規な保持指数システムに基づく未知化合物の同定方法であって、そのような同定は液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、又は質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ）によって行われる。
2019536063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィーに使用するための同族列のトリアシルグリセロール。
【請求項２】
奇数鎖脂肪酸で構成された単純なトリアシルグリセロールを含む、請求項１に記載の同族列。
【請求項３】
トリヘプタノインからトリヘネイコサノインまでの範囲のトリアシルグリセロール、又はそれらのいずれかの部分を含む、請求項１又は２に記載の同族列。
【請求項４】
トリヘプタノイン（Ｃ７Ｃ７Ｃ７）からトリノナデカノイン（Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９）まで、又は
トリノナノイン（Ｃ９Ｃ９Ｃ９）からトリノナデカノイン（Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９）まで、又は
トリノナノイン（Ｃ９Ｃ９Ｃ９）からトリヘネイコサノイン（Ｃ２１Ｃ２１Ｃ２１）まで、又は
それらのいずれかの部分
の範囲のトリアシルグリセロールを含む、請求項３に記載の同族列。
【請求項５】
前記系列が、液体クロマトグラフィーにおいて未知化合物を同定するための新規な保持指数システムの参照混合物を表す、請求項１〜４に記載の同族列。
【請求項６】
新規なＴＡＧ保持指数システムに基づく液体クロマトグラフィーにおける未知化合物の同定方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、請求項６に記載の方法：
ａ．各参照ＴＡＧに対して保持指数値を帰属させる工程；
ｂ．ＴＡＧ参照混合物をクロマトグラフィー分離する工程；
ｃ．試料中の未知化合物をクロマトグラフィー分離する工程；
ｄ．分離された各未知化合物の前記保持指数値を決定する工程；
ｅ．前記未知化合物を同定する工程。
【請求項８】
前記クロマトグラフィー分離（工程ｂ及び工程ｃ）が、好ましくはアセトニトリル／２−プロパノール移動相中で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記クロマトグラフィー分離が、グラジエント溶出で、好ましくは直線グラジエント溶出で行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記保持指数値の決定（工程ｄ）が、以下の式を適用することによって実施される、請求項７に記載の方法：
【数１】
2019536063.tif 000023
ここで、
ｔＲｉは未知化合物ｉの保持時間であり、ｔＲｚ及びｔＲ（ｚ＋１）はそれぞれ前記未知化合物ｉの直前及び直後に溶出したＴＡＧの保持時間であり、ｚは前記未知化合物ｉの直前に溶出した化合物に関連する分配数（ＰＮ）であり、ｎは前記未知化合物ｉの直前及び直後に溶出した参照ＴＡＧ間のｚ単位の差を表す。
【請求項１１】
前記同定工程ｅが、前記未知化合物について計算したＬＲＩ値を、列挙した化合物について以前に得られたＬＲＩ値と比較することによって行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記同定工程ｅはソフトウェアによって自動的に行われ、前記ソフトウェアは前記未知化合物のＬＲＩ値をＬＲＩライブラリのＬＲＩ値と自動的にマッチさせる、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記得られた保持指数が、同じ質量断片化を有する分析物間の識別に使用される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記得られた保持指数が、前記未知化合物のベースでのピーク幅よりも小さい決定再現性を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
同族列のトリアシルグリセロールを含む、液体クロマトグラフィーに使用するためのキット。
【請求項１６】
前記同族列が、奇数鎖脂肪酸で構成された単純トリアシルグリセロールを含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記同族列が、トリヘプタノインからトリヘネイコサノインまでの範囲のトリアシルグリセロール、又はそれらのいずれかの部分を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記キットが、トリヘプタノイン（Ｃ７Ｃ７Ｃ７）、トリノナノイン（Ｃ９Ｃ９Ｃ９）、トリウンデカノイン（Ｃ１１Ｃ１１Ｃ１１）、トリトリデカノイン（Ｃ１３Ｃ１３Ｃ１３）、トリペンタデカノイン（Ｃ１５Ｃ１５Ｃ１５）、トリヘプタデカノイン（Ｃ１７Ｃ１７Ｃ１７）、トリノナデカノイン（Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９）及びトリヘネイコサノイン（Ｃ２１Ｃ２１Ｃ２１）からなる群より選択される少なくとも２つの隣接ＴＡＧを含むという条件で、前記同族列のいずれかの部分を含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記同族列が、
トリヘプタノイン（Ｃ７Ｃ７Ｃ７）からトリノナデカノイン（Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９）まで、又は
トリノナノイン（Ｃ９Ｃ９Ｃ９）からトリノナデカノイン（Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９）まで、又は
トリノナノイン（Ｃ９Ｃ９Ｃ９）からトリヘネイコサノイン（Ｃ２１Ｃ２１Ｃ２１）まで、又は
それらのいずれか一部
の範囲のトリアシルグリセロールを含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
前記キットが、各々が参照ＴＡＧを含む個々のバイアルの形態で、又はＴＡＧ参照混合物を含む独自のバイアルとしてのいずれかで、ＴＡＧ同族列を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項２１】
前記キットが、各参照ＴＡＧ及び／又は前記ＴＡＧ参照混合物を固体乾燥形態で、又は前記ＬＣシステムに導入するためのすぐに使用可能な溶液として提供する、請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な保持指数システムに基づく未知化合物の同定方法に関し、そのような同定は液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、又は質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ）によって行われる。
【背景技術】
【０００２】
保持指数システムの導入前は、定性クロマトグラフィー分析は同定パラメータとして絶対保持時間（ｔＲ）及び／又は相対保持時間（ｔＲ（Ｒｅｌ））に頼っていた。
【０００３】
絶対保持時間の手法は、分析物の保持時間を既知の化合物の保持時間（例えば、列挙された参照化合物のｔＲ）と比較することにあり、ピークのｔＲが参照と同じである場合、ポジティブ同定を行うことができる。
【０００４】
しかしながら、そのような手法は一定のクロマトグラフィー条件下でのみ信頼性があり、わずかな違いでさえも保持時間のずれを引き起こし、目的の分析物を同定することは不可能ではないにしても非常に困難になる。したがって、絶対保持時間の高い変動性のために、そのような手法は再現性の問題を提起する。
【０００５】
この問題を克服するために、相対保持時間の手法（すなわち、分析物ｔＲと内部標準ｔＲとの間の比）を使用することができる。この方法では、両方の化合物に対する影響が等しいため、分析条件におけるわずかな変動を補償することができる。しかしながら、相対保持時間の手法は、１つの適切な標準の難しい選択を意味する。したがって、特に複雑なマトリックスにおいて、単一の標準を全ての分析対象物に十分に近いところに固定することは不可能であるため、そのような手法は精度の問題を提起する。
【０００６】
これらの制限は、保持指数システムを使用することでほとんど克服できる。
【０００７】
保持指数システムはＫｏｖａｔｓによって最初に提案され、クロマトグラムの同じ領域で溶出する分析物のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）保持挙動を固定するために同族列の標準化合物（すなわちｎ−アルカン）の使用が示唆された。この保持指数システムにおいて、保持指数値は、そのアルキル鎖中の炭素原子の数に従って、各標準ｎ−アルカンに任意に起因する。従来、小数の使用を避けるために、炭素原子の数は１００倍される。所与の化合物の保持指数は、その所与の化合物の同じ調整された保持時間を有する仮想のｎ−アルカンの炭素原子数（×１００）に等しい。したがって、例として、１０９０に等しい保持指数を有する化合物は、アルカンＣ１０（Ｉ＝１０００）とＣ１１（Ｉ＝１１００）との間で溶出する。
【０００８】
Ｋｏｖａｔｓの定義によると、特定の化学物質の保持指数（Ｉ）は、隣接して溶出するｎ−アルカンの保持時間に対して正規化されたその保持時間である。したがって、保持指数（Ｉ）の計算は、以下の式に従って行われ、
【数１】
2019536063.tif 000003
ここで、
ｔ’Ｒｉは未知化合物の調整された保持時間であり、ｔ’Ｒｚ  ｅ  ｔ’Ｒ（ｚ＋１）は未知化合物ｉの直前及び直後にそれぞれ溶出するアルカンの調整された保持時間であり、ｚはアルカン鎖中の炭素原子数（すなわち鎖長）を表す。
【０００９】
「調整された保持時間」（ｔ’Ｒ）という用語は、分析物が固定相に分配されるのに費やす時間を意味し、分析物保持時間（ｔＲ）マイナス未保持ピークの溶出時間（ｔＭ）に相当する（すなわち、ホールドアップ時間としても知られる）：
ｔ’Ｒ＝ｔＲ−ｔＭ
【００１０】
等温ＧＣ条件が適用されると、この同族列はアルカン鎖長と共に指数関数的に増加する保持時間で溶出する。したがって、調整された保持時間と参照アルカンの保持指数との間に半対数の関係が存在する。
【００１１】
温度プログラム化ＧＣでは、その代わりに、ｎ−アルカン系列が線形モードで溶出するという事実のために、保持時間と保持指数との間に線形関係が存在することを意味し、保持指数は線形保持指数（以下、ＬＲＩともいう）として定義され、以下の式によって計算される。
【数２】
2019536063.tif 000004
ここで、
ｔＲｉは未知化合物の保持時間であり、ｔＲｚ及びｔＲ（ｚ＋１）は未知化合物ｉの直前及び直後にそれぞれ溶出するアルカンの保持時間であり、ｚはアルカン鎖中の炭素原子数を表す。
【００１２】
そのような手法は、同族列として多環式芳香族炭化水素を使用することによっても提案された［Ｍ．Ｌ．Ｌｅｅ、Ｄ．Ｌ．Ｖａｓｓｉｌａｒｏｓ、Ｃ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅ、Ｍ．Ｎｏｖｏｔｎｙ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ、ｖ．５１、ｐ．７６８（１９７９）］。この論文においてＬｅｅらは、内部標準として密接に関連した化合物に基づく保持指数システムは多環式芳香族炭化水素分析のためにより信頼性が高いと報告した。言い換えれば、参照化合物が、測定されるべき分析物の化学的物理的特性と同様の化学的物理的性質を有する場合、保持指数の再現性は向上する。
【００１３】
他の保持指数システムが文献に記載されている。それらの中で、同族列として偶数の炭素鎖数を有する脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を使用するものが、脂肪酸試料の特徴付けのために一般的に使用された［Ｆ．Ｐ．Ｗｏｏｄｆｏｒｄ、Ｃ．Ｍ．Ｖａｎ  Ｇｅｎｔ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ、ｖ．１、ｐ．１８８（１９６０）；Ｔ．Ｋ．Ｍｉｗａ、Ｋ．Ｌ．Ｍｉｋｏｌａｊｃａｚａｋ、Ｆ．Ｒ．Ｅａｒｌｅ、Ｉ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ、ｖ．３２、ｐ．１７３９（１９６０）］。この場合、同族列の連続する２つの化合物間の炭素原子の差は２に等しいため、式２は以下のように修正される。
【数３】
2019536063.tif 000005
【００１４】
したがって、ＬＲＩ計算の一般化は式４に従って行うことができ、
【数４】
2019536063.tif 000006
ここで、
ｚは分析物の直前に溶出された化合物に関連する任意の数であり、ｎは未知分析物の直前及び直後に溶出された参照化合物間のｚ単位の差を表す。
【００１５】
ＧＣでは、ＬＲＩと質量分析（ＭＳ）の両方のデータの高い再現性を考慮すると、これらのパラメータの組み合わせと相補性により、明確な同定につながる。さらに、何千ものＭＳスペクトルを含む市販のデータベースの利用可能性は、非常に迅速かつ自動の同定プロセスを可能にし、ＬＲＩはしばしば二次的フィルタとして使用される（例えば、スペクトルマッチングは高いがＬＲＩ値は選択範囲から外れる化合物は、候補リストから自動的に除外される）。
【００１６】
しかしながら、今日まで、効果的で信頼性があり再現性が高い保持指数システムは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）においてまだ確立されていない。
【００１７】
液体クロマトグラフィーにおける保持指数の使用に関して、主に毒性学研究における薬物の同定のために、過去数年にわたっていくつかの手法が時にはＵＶスペクトル情報と組み合わせて提案されてきた。最初の試みはＢａｋｅｒ及びＭａ  ［Ｊ．Ｋ．Ｂａｋｅｒ、Ｃ−Ｙ．Ｍａ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ、ｖ．１６９、ｐ．１０７（１９７９）］によるもので、アイソクラティック条件における同族列参照混合物としてアルカン−２−オン系列（すなわちアセトンから２‐トリコサノン）の使用が示唆された。３年後、Ｓｍｉｔｈら［Ｓｍｉｔｈ、Ｒ．Ｍ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ、ｖ．２１６、ｐ．３１３（１９８２）］は、そのより高いＵＶ吸収のために、アルキルアリールケトン同族列の使用を示唆した。
【００１８】
次に、固定相の化学的性質及びパッケージング、並びに移動相組成の影響を評価し、わずかに異なる分析条件下であっても有意なｔＲ偏差が発生したため、液体クロマトグラフィーにおける信頼できる同定法と有用なデータベースを作成するためにはＬＣ条件の標準化が必要であるという結論に達した。
【００１９】
これに関して、Ｂｏｇｕｓｚらは、保持指数計算のための１−ニトロアルカン類（すなわち、ニトロメタンから１−ニトロオクタン）の使用を記載し、なぜならアルキルアリールケトン系列に関してそれらは一般的な逆相（ＲＰ）条件下でクロマトグラフィー空間をよりよくカバーすることを示すためである。さらに、ＧＣにおける温度プログラムに匹敵するグラジエント溶出モードが使用されたという事実により、式２が保持指数の計算に使用された［Ｍ．Ｂｏｇｕｓｚ、Ｒ．Ａｄｅｒｊａｎ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ、ｖ．４３５、ｐ．４３（１９８８）］。
【００２０】
それにもかかわらず、ニトロアルカンは容易に入手できる価格ではなく、また高ｐＨで非常に安定でもない。
【００２１】
さらに、国際公開第２０１３／１３４８６２号パンフレットに報告されているように、例えばアルキルフェノンなどの当技術分野で知られている保持指数標準は、主にＵＶ吸光度検出を用いるＬＣ用に設計された。
【００２２】
国際公開第２０１３／１３４８６２号パンフレットは、液体クロマトグラフィー、特に特にエレクトロスプレー（ＥＳＩ）又は大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）イオン化システムを用いるＬＣ−ＭＳ法のための保持指数標準としての同族列の１−アルキルピリジンスルホン酸の使用を記載している。
【００２３】
しかしながら、国際公開第２０１３／１３４８６２号パンフレットでは、他の検出器、特に例えばＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器）など、化合物の構造に関する情報を与えない検出器による未知化合物の同定についてのヒントはない。国際公開第２０１３／１３４８６２号パンフレットに記載されている方法は、質量分析と組み合わせた場合にのみ有効であるため、それ自体は液体クロマトグラフィーにおける同定手段として信頼性がない。さらに、同族列に含まれる化合物は、毒性学的観点からまだ研究されておらず、ピリジン環の存在により非常に高い毒性を示す可能性がある。これらの化合物のさらなる制限は、それらの市場における入手可能性が比較的限られていることに関連している。
【００２４】
上記の各同族列の使用によって遭遇する制限（例えば、低いＵＶ吸収、クロマトグラフィー空間の限られた適用範囲、高い毒性、低い入手可能性及び化学的安定性）、及び分析パラメータ、機器又はカラムパッケージングまでもの任意の変更によって実験された低い保持時間再現性が、液体クロマトグラフィーにおける保持指標データベースの実験室内及び実験室間レベルでの広範な使用を妨げていた。
【００２５】
したがって、液体クロマトグラフィーにおける未知化合物の同定のための新規な保持指数システムに基づく信頼性があり再現性が高い方法を確立することを可能にする参照混合物として有効な同族列が依然として必要である。
【発明の概要】
【００２６】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、同族列のトリアシルグリセロールを保持指数参照混合物として使用すると、新規の保持指数システムに基づく有利なＬＣ法が確立され、当技術分野で知られた制限を克服することができることを見出した。
【００２７】
したがって、本発明の目的は、液体クロマトグラフィーに使用するための同族列のトリアシルグリセロール（以下、ＴＡＧともいう）であり、この系列は、奇数鎖脂肪酸で構成される単純なトリアシルグリセロールを含むことが好ましい。
【００２８】
本明細書ではまた、液体クロマトグラフィーにおいて未知化合物を同定する方法が提供され、この方法は、最終的に質量分析（ＭＳ）と組み合わされるＨＰＬＣ又はＵＨＰＬＣ法であることが好ましい。この方法は、保持指数値を各参照ＴＡＧに帰属させる工程；ＴＡＧ参照混合物をクロマトグラフィーで分離する（及び最終的には、選択された参照混合物に含まれていない参照ＴＡＧの保持時間を外挿するために検量線を作成する）工程；試料中の未知化合物をクロマトグラフィーで分離する工程；分離された各未知化合物の保持指数値を決定する（最終的には、選択された同族列でカバーされるクロマトグラフィー空間の外側に溶出した参照ＴＡＧについても外挿ｔＲ値を使用することによる）工程；及び、得られたＬＲＩ値と列挙された化合物のＬＲＩ値との比較によって未知化合物を同定する工程を含む。
【００２９】
本明細書ではさらに、液体クロマトグラフィーにおける未知化合物の同定に有用な保持指数のライブラリ（すなわちデータベース）が提供される。
【００３０】
本明細書ではさらに、未知化合物のＬＲＩ値と以前に確立されたＬＲＩライブラリ（又はデータベース）のＬＲＩ値とのマッチのみに基づいて自動化及び高速同定プロセスを行うために適切に開発された、ＣｒｏｍａｔｏｐｌｕｓＳｐｅｃｔｒａと呼ばれるソフトウェアが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＵＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ法開発段階のＡ）アイソクラティック条件下でのタラ肝油のクロマトグラム（４０％溶媒Ｂ）、Ｂ）５分間のアイソクラティック工程（２０％溶媒Ｂ）を用いた７０分直線グラジエント（２０〜５０％Ｂ）下のタラ肝油のクロマトグラム、Ｃ）多段階グラジエント溶出下のタラ肝油のクロマトグラム（３０分で０〜２５％Ｂ及び７５分で２５〜５０％Ｂ）、Ｄ）多段階グラジエント溶出下のバター試料のクロマトグラム（３０分で０〜２５％Ｂ及び７５分で２５〜５０％Ｂ）、Ｅ）１０５分の直線グラジエント下のバター試料のクロマトグラム（０〜５０％Ｂ）を示す図である。
【図２】同族列の１つに含まれる参照ＴＡＧについての検量線ｔＲ対ＰＮ（Ｃ９Ｃ９Ｃ９からＣ１９Ｃ１９Ｃ１９まで）を示す図である。
【図３】最後に開発された方法を使用して取得された、ＵＨＰＬＣ−ＥＬＳＤで選択されたクロマトグラムで、Ａ）ルリヂサ油、Ｂ）山羊乳、Ｃ）メンヘーデン油、Ｄ）参照同族列を示す図である。
【図４】同定されたＡ）亜麻仁油及びＢ）メンヘーデン油のクロマトグラムを示す図である。
【図５】フラグメントの説明を伴う、Ａ）ＬＬＰ及びＢ）ＯＯＬｎのＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す図である。ＭＡＧはモノアシルグリセロール、ＤＡＧはジアシルグリセロール、ＴＡＧ＋Ｎａ＋はトリアシルグリセロールのナトリウム付加物を示す。
【図６】選択された同族列のクロマトグラムと、隣接ホモログの各対についてのＳＮ及びΔＬＲＩ値（Δ）の両方を示す図である。
【図７】ＵＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析とＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析の平均ＬＲＩ値を報告するヒストグラムを示す図であり（値は表８で報告する）、エラーバーはΔＬＲＩ値に対応する。
【図８】ＬＲＩデータベースのみを使用して同定された試料クロマトグラムの例として提供されているスズキクロマトグラムを示す図である。
【００３２】
定義
「同族列」という用語は、アルキル鎖中のメチレン基の数のみが異なる同じ一般式を有する一連の化合物を指す。言い換えれば、連続したメンバーは、鎖中に挿入された追加のメチレン架橋（すなわち、−ＣＨ２−）によって質量が異なる。この系列の隣接するメンバーは「隣接ホモログ」として知られている。
【００３３】
本発明の目的のために、奇数鎖脂肪酸によって構成されるトリアシルグリセロールが好ましい場合、例えばトリノナノイン（Ｃ９Ｃ９Ｃ９）及びトリウンデカノイン（Ｃ１１Ｃ１１Ｃ１１）などの隣接メンバー（又は隣接ＴＡＧ）は６つの余分なメチレン架橋によって質量が異なる。
【００３４】
「参照混合物」という用語は、本発明の目的のための標準として選択された同族列の一部である化合物の群を指す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の第一の目的は、液体クロマトグラフィーに使用するための同族列のトリアシルグリセロールであり、ここでこの系列は、奇数鎖脂肪酸で構成される単純なトリアシルグリセロールを含むことが好ましい。
【００３６】
トリアシルグリセロールを主な標的分析物として選択した理由は、特に逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＬＣ）における生物学的重要性及び非常に規則的な液体クロマトグラフィープロファイルのため、また同様の研究においてこれまで考慮されたことがなかったためである。
【００３７】
ここで以下にトリアシルグリセロールの一般構造を報告し、
【化１】
2019536063.tif 000007
式中、
Ｒ’、Ｒ’及びＲ’’は、一緒に又は単独で、同じ又は異なる直鎖アルキル鎖であり得る。
【００３８】
本発明のトリアシルグリセロールは、単純又は混合ＴＡＧであり得る。単純ＴＡＧは１種類の脂肪酸のみを含み（すなわち、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’は同じである）、混合ＴＡＧは２又は３つの異なる脂肪酸を含む（すなわち、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’のうち２又は３つは異なる）。好ましくは、同族列の参照トリアシルグリセロールは単純ＴＡＧである。各脂肪酸は飽和又は不飽和であり得、１、２又は３つの不飽和を含み得る。好ましくは、同族列の参照トリアシルグリセロールは飽和ＴＡＧである。本発明のトリアシルグリセロールは、偶数鎖脂肪酸と奇数鎖脂肪酸の両方を含み得る。好ましくは、同族列の参照トリアシルグリセロールは、奇数鎖脂肪酸を含む。
【００３９】
本発明の参照トリアシルグリセロールは市販されている。あるいは、それらはグリセロールと３つの適切な脂肪酸とのエステル化反応又はグリセロールと３つの適切なエステルとのエステル交換反応のいずれかによって容易に合成することができる。
【００４０】
使用される同族列は全ての可能な分析物の予想される保持時間をカバーしなければならないため、本発明の参照トリアシルグリセロールは広範囲の保持時間をカバーするように選択された。
【００４１】
本発明の一実施形態では、参照同族列は、トリヘプタノイン（Ｃ７Ｃ７Ｃ７）からトリヘネイコサノイン（Ｃ２１Ｃ２１Ｃ２１）までの範囲のトリアシルグリセロール又はそれらのいずれかの部分を含むが、これらに限定されない。
【００４２】
実際に本発明の目的のためには、限定ではないがトリヘプタノイン（Ｃ７Ｃ７Ｃ７）、トリノナノイン（Ｃ９Ｃ９Ｃ９）、トリウンデカノイン（Ｃ１１Ｃ１１Ｃ１１）、トリトリデカノイン（Ｃ１３Ｃ１３Ｃ１３）、トリペンタデカノイン（Ｃ１５Ｃ１５Ｃ１５）、トリヘプタデカノイン（Ｃ１７Ｃ１７Ｃ１７）、トリノナデカノイン（Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９）及びトリヘネイコサノイン（Ｃ２１Ｃ２１Ｃ２１）からなる群より選択される少なくとも２つの隣接ＴＡＧを含むという条件で、隣接ＴＡＧの同族列のいずれかの部分が参照混合物として適している。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、参照同族列は、
−トリヘプタノイン（Ｃ７Ｃ７Ｃ７）からトリノナデカノイン（Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９）まで、又は
−トリノナノイン（Ｃ９Ｃ９Ｃ９）からトリノナデカノイン（Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９）まで、又は
−トリノナノイン（Ｃ９Ｃ９Ｃ９）からトリヘネイコサノイン（Ｃ２１Ｃ２１Ｃ２１）まで、又は
それらのいずれかの部分
の範囲のトリアシルグリセロールを含む。
【００４４】
特に、Ｃ９Ｃ９Ｃ９からＣ１９Ｃ１９Ｃ１９までの範囲の参照混合物は、概して、消化の観点から関連する脂質試料が含まれるクロマトグラフィー空間をカバーする。より詳細には、図３Ｄに示すように、それらは均一な分布で約９分から約１２０分までのほぼ全てのクロマトグラムをカバーする。
【００４５】
さらに、上記に開示した参照混合物は、使用されるクロマトグラフィー法及び／又は試料組成に従って、短鎖トリアシルグリセロール（例えば、トリホルミン、Ｃ１Ｃ１Ｃ１）又は長鎖トリアシルグリセロールに拡張することができる。
【００４６】
クロマトグラフィー空間のその最適な適用範囲及びクロマトグラフィー分析条件によって影響されないという事実に主に起因して、参照ＴＡＧ同族列は、本発明の保持指数システムを実験室内及び実験室間レベルの両方で再現可能にする。
【００４７】
本明細書ではさらに、同族列のトリアシルグリセロールを含む液体クロマトグラフィーで使用するためのキットが提供される。
【００４８】
好ましくは、キットは、奇数鎖脂肪酸で構成された単純なトリアシルグリセロールを含む参照同族列を含む。
【００４９】
一実施形態では、キットは、トリヘプタノイン（Ｃ７Ｃ７Ｃ７）からトリヘネイコサノイン（Ｃ２１Ｃ２１Ｃ２１）までの範囲のトリアシルグリセロール、又はそれらのいずれかの部分を含むがこれらに限定されない参照同族列を含む。
【００５０】
本発明の目的のために、キットは、限定ではないがトリヘプタノイン（Ｃ７Ｃ７Ｃ７）、トリノナノイン（Ｃ９Ｃ９Ｃ９）、トリウンデカノイン（Ｃ１１Ｃ１１Ｃ１１）、トリトリデカノイン（Ｃ１３Ｃ１３Ｃ１３）、トリペンタデカノイン（Ｃ１５Ｃ１５Ｃ１５）、トリヘプタデカノイン（Ｃ１７Ｃ１７Ｃ１７）、トリノナデカノイン（Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９）及びトリヘネイコサノイン（Ｃ２１Ｃ２１Ｃ２１）からなる群より選択される少なくとも２つの隣接ＴＡＧを含むという条件で、同族列のいずれかの部分を含むことができる。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態では、キットは、
−トリヘプタノイン（Ｃ７Ｃ７Ｃ７）からトリノナデカノイン（Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９）まで、又は
−トリノナノイン（Ｃ９Ｃ９Ｃ９）からトリノナデカノイン（Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９）まで、又は
−トリノナノイン（Ｃ９Ｃ９Ｃ９）からトリヘネイコサノイン（Ｃ２１Ｃ２１Ｃ２１）まで、又は
それらのいずれかの部分
の範囲のトリアシルグリセロールを含むがこれらに限定されない参照同族列を含む。
【００５２】
さらに、本発明のキットは、使用するクロマトグラフィー法及び／又は試料組成に従って、上記に開示した参照同族列の各々又はその一部がより短い鎖のトリアシルグリセロール（例えば、トリホルミン、Ｃ１Ｃ１Ｃ１）又はより長い鎖のトリアシルグリセロールのいずれかに拡張することができるように、同族列を含むことができる。
【００５３】
キットは、各々が参照ＴＡＧを含む個々のバイアルの形態で、又は本発明によるＴＡＧ参照混合物を含む独自のバイアルとしてのいずれかで、ＴＡＧ同族列を含むことができる。各参照ＴＡＧ及び／又はＴＡＧ参照混合物は、固体の乾燥形態であっても、事前に又は未知化合物（すなわち、分析物）と一緒にＬＣシステムに導入されるすぐに使える溶液としてであってもよい。
【００５４】
好ましくは、キットは、適切な溶媒での単純な希釈の後に、事前に又は未知化合物と一緒にＬＣシステムに導入される、適切な溶媒中のすぐに使える溶液としてのＴＡＧ参照混合物を提供する。
【００５５】
実際には、キットは、２−プロパノールでの単純な希釈の後に、事前に又は未知化合物（すなわち分析物）と一緒にＬＣシステムに導入される、各ＴＡＧに対して１０００ｍｇ／Ｌの濃度であるが限定されない、２−プロパノール中のすぐに使える溶液としてのＴＡＧ参照混合物を提供する。
【００５６】
選択されたトリアシルグリセロールの標準的な混合物（すなわち、同族列）は、使用する検出器すなわちその感度に応じて好ましくは５０〜１０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲で調製され、ＭＳ検出器を用いる場合には５０〜１００ｍｇ／Ｌの濃度が使用され、一方、より感度の低いＥＬＳＤ又はＵＶ検出器にはより高い濃度が使用される。そして、同族列は、外部標準としても内部標準としても使用することができる。
【００５７】
第１の場合には、各参照トリアシルグリセロールを分離するために、そのようなＴＡＧ標準混合物を液体クロマトグラフィーシステムに注入する。得られたクロマトグラムは、その後の定性分析のための外部標準として有用なトリアシルグリセロールの参照パターンを形成する。
【００５８】
本発明の参照トリアシルグリセロールはまた、分析物が同定されるべき試料との同時注入によって内部標準として使用することができる。しかしながら、非常に複雑なマトリックスの場合には、クロマトグラムが参照ピークでも過剰に取り込まれるのを避けるために、外部標準手法が好ましいはずである。これは実際には分解能の問題を提起する可能性がある。
【００５９】
本発明のさらなる目的は、ＴＡＧ保持指数システムに基づく液体クロマトグラフィーにおいて未知化合物を同定する方法の開発であり、この方法は特に、現実世界の試料中の脂質化合物のベースライン分離を最大化することができる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は超高速液体クロマトグラフィーＵＨＰＬＣ）法における方法である。
【００６０】
より具体的には、本発明の好ましい目的は、質量分析の相補性を伴う、又は伴わなくても未知化合物の一義的同定に有効であり、かつ信頼できる現実世界の脂質試料中の脂質化合物のベースライン分離を最大化できるＵＨＰＬＣ法の開発である。
【００６１】
したがって、液体クロマトグラフィーにおいて未知化合物を同定する方法が本明細書に記載されており、この方法は、以下の工程を含む：
ａ．各参照ＴＡＧに対して保持指数値を帰属させる工程；
ｂ．ＴＡＧ参照混合物をクロマトグラフ分離する工程；
ｃ．試料中の未知化合物をクロマトグラフ分離する工程；
ｄ．分離された各未知化合物の保持指数値を決定する工程；
ｅ．未知化合物を同定する工程。
【００６２】
ここに開示された新規な保持指数システムは、保持時間をシステムに依存しない定数に変換することを可能にするため、選択される機器及び分析条件から独立して使用することができる。
【００６３】
工程ａに関して、上記に開示したように、保持指数値は、そのアルキル鎖中の炭素原子の数に従って有機化合物に任意に起因し得ることが文献から知られている。
【００６４】
したがって、本発明の目的のために、特許請求された同族列の各参照ＴＡＧに対して、保持指数値を以下に従って任意に帰属させた。
ＬＲＩｓｔｄ＝１００ｘＰＮ
ここで、
ＰＮ（分配数）は、以下の式に従って、グリセロール主鎖に結合した脂肪酸の炭素鎖長（ＣＮ）及び二重結合数（ＤＢ）に関連する。
ＰＮ＝ＣＮ−２ＤＢ
【００６５】
例として、ＬＲＩｓｔｄは、トリヘプタノイン（Ｃ７Ｃ７Ｃ７）については２１００、トリノナノイン（Ｃ９Ｃ９Ｃ９）については２７００、トリトリデカノイン（Ｃ１３Ｃ１３Ｃ１３）については３９００、トリノナデカノイン（Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９）については５７００に等しい。
【００６６】
詳細には、ｂ及びｃの両工程のクロマトグラフィー分離は、ＨＰＬＣ又はＵＨＰＬＣシステムのいずれかを用いて実施することができる。第１の場合、ＨＰＬＣシステム、例えばエレクトロスプレーイオン化質量分析計（すなわちＥＳＩ−ＭＳ）などの質量分析計に任意選択的に連結されたＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ）を用いて分析を実施した。第二の場合では、ＵＨＰＬＣシステム、例えば適切な検出器に連結されたＮｅｘｅｒａ  Ｘ２システム（島津製作所）を用いて分析を実施した。本発明の目的のために、適切な検出器は、蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）、紫外線検出器、ＵＶ及びフォトダイオードアレイ検出器の両方、大気圧インターフェース（ＡＰＩ）又は電子イオン化（ＥＩ）ソースによる質量分析計から選択されるがこれらに限定されない破壊的又は非破壊的検出器であり得る。ＥＬＳＤが好ましい。さらに、クロマトグラフが質量分析計と結合されている場合、適切なＡＰＩインターフェースは、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）又は大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）であり得、全てＴＡＧ分析に適している。
【００６７】
分析条件に関して、本発明の発明者らは、クロマトグラフ機器及び使用される条件の両方からほとんど独立した方法を確立することに成功した。
【００６８】
方法、特に方法の再現性に影響を与える唯一の特徴は、移動相である。事実、ｂ及びｃの両工程のクロマトグラフィー分離について、選択された移動相はアセトニトリル（以下、溶媒Ａともいう）及び２−プロパノール（以下、溶媒Ｂともいう）を含む。しかしながら、本発明者らは、驚くべきことに、グラジエント溶出、好ましくは直線グラジエント溶出（ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｅｌｕｔｉｏｎ）で操作されるこの移動相（すなわち、アセトニトリル／２−プロパノール移動相）が、クロマトグラフィー分解能（すなわち約１６２分のピーク分解能）と分析時間（すなわち約１２５分）との間で、本発明者らが知る限り、魚油や乳製品などの非常に複雑な試料についてこれまでのところ到達した最良の最適妥協点を得ることを可能にすることを見出した。
【００６９】
さらに、アセトニトリルと２−プロパノールの両方の毒性は、ジクロロメタン又はアセトンなど、とりわけ非常に高い揮発性から特徴付けられる以前の方法で使用される他の溶媒よりもはるかに低い。
【００７０】
別の問題は、最強の溶媒（すなわち２−プロパノール）の最大百分率の選択であった。徹底的な実験の後、本発明者らは、アイソクラティック条件下で、４０％〜６０％、好ましくは４５％〜５５％、より好ましくは５０％に等しい２−プロパノールの割合が、最も複雑な現実世界の試料の１つ、すなわちタラ肝油において全ての化合物を完全に溶出するのに十分であることを見出した（図１Ａ）。次に、クロマトグラフィー法を改善するために、複雑な実試料のベースライン分離を最大にすることを目的としてグラジエント溶出プログラムを慎重に評価した。
【００７１】
適切なグラジエントプログラムは、特に以下が設定されている。
ｉ．０〜５分、２０％Ｂ、７５分〜５０％Ｂ（図１Ｂ）であるが、これは低分配数（ＰＮ）領域（すなわち、約３０〜約３６）での貧弱な分解能及び最も豊富なＰＮ領域（すなわち、ＰＮ４２）におけるいくつかの共溶出の存在を示す。
ｉｉ．０〜３０分、０〜２５％Ｂ、３０〜１０５分〜５０％Ｂ（図１Ｃ）により、各ＰＮ領域における主要な分解能に加えて、３０、３２、及び３４ＰＮ領域間の明確な分解能が達成された。
ｉｉｉ．１０５分で０〜５０％Ｂの直線グラジエント（図１Ｅ）。
【００７２】
後者、すなわちｉｉｉは、本クロマトグラフィー法の大きな改善をもたらし、より良い分解能、より改善されたピーク形状、より均一でより狭いピーク幅（図１Ｄに関して図１Ｅを参照）、及び最適な分析時間を示す。
【００７３】
これらの理由から、そのような直線グラジエントアセトニトリル／２−プロパノールは、特にｂ及びｃの両工程のクロマトグラフィー分離に関して、本発明の方法に最も適している。
【００７４】
分離を最大にする目的で、本発明者らは温度も慎重に考慮した。３０〜４０℃の範囲で３つの温度を評価したところ（すなわち３０℃、３５℃、及び４０℃）、この範囲では本方法は容易に再現可能であるという結論が導かれた。しかしながら、３５℃の温度が好ましい。本明細書中に提供される実験はまた、本発明の方法が、分析条件及びクロマトグラフィー機器、例えばカラム寸法、固定相充填、流速及び移動相のグラジエント勾配から独立していることを示す（方法の独立性の証拠：再現性試験を参照）。
【００７５】
特許請求の範囲に記載された方法は、分析条件から可能な限り独立しており、本発明の保持指数システム、及びそれに基づくデータベースは、研究室内レベル及び研究室間レベルの両方で試料同定に使用可能であると結論付けることができる。
【００７６】
工程ｂの参照混合物は、好ましくは、本発明による新規な保持指数システムの参照同族列を表す奇数鎖脂肪酸で構成される単純なトリアシルグリセロールを含む。
【００７７】
工程ｂはさらに、最終的な検量線ｔＲ対ＰＮの最終的な設定を含むことができる。詳細には、ｔＲとＰＮとの間の線形関係を考慮すると、工程ａにおける参照ＴＡＧのＰＮ値及び工程ｂで得られた保持時間を使用してプロットを構築することが可能である（図２）。
【００７８】
工程ｃに関して、「クロマトグラフィー分離」は工程ｂに開示されるように理解されるべきであるが、「試料」という用語は現実世界の試料、より具体的には例えば非常に単純な植物油からより複雑な魚油、乳及び乳由来脂質試料までに及ぶ現実世界の脂質試料を意味し、限定されるものではないが、植物油、水生生物（例えば魚類及び藻類）及びそれらの派生物（例えば魚粉及び魚油）、全血、血漿及び細胞膜としての乳製品及び生物学的試料などが挙げられる。
【００７９】
工程ｄの保持指数値の決定に関しては、本発明による参照同族列として奇数鎖ＴＡＧを使用することにより（例えば、Ｃ９Ｃ９Ｃ９〜Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９）、式４（下記に報告）によって行うことができる。
【数５】
2019536063.tif 000008
ここで、
ｔＲｉは未知化合物ｉの保持時間であり、ｔＲｚ及びｔＲ（ｚ＋１）はそれぞれ未知化合物ｉの直前及び直後に溶出するＴＡＧの保持時間であり、ｚは未知化合物ｉの直前に溶出した化合物に関連するＰＮであり、ｎは未知化合物ｉの直前及び直後に溶出した参照ＴＡＧ間のｚ単位の差を表す。
【００８０】
上記のように、本発明の目的のために、ｚは各参照ＴＡＧのＰＮに等しい。したがって、例として、ｚはＣ９Ｃ９Ｃ９の場合２７、Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９の場合５７までである。
【００８１】
さらに、２つの隣接ホモログ間のｚ単位の差は６に等しいため、ＬＲＩの計算に式４を使用する場合、ｎは６とみなされるべきである。
【００８２】
工程ｄはさらに、工程ｂ（図２）で確立された検量線ｔＲ対ＰＮによる保持時間の外挿を含むことができる。詳細には、ｔＲとＰＮとの間の直線関係を考慮すると、使用される同族列（例えば、２７よりも小さい、又は５７よりも大きいＰＮ）に含まれない参照化合物の保持時間を外挿することが可能である。より詳細には、未知化合物の保持時間（工程ｃ）を考えると、未知化合物の直前及び直後に溶出する両方の参照ＴＡＧの保持時間及びＰＮを外挿することが可能である。したがって、同族列によってカバーされるクロマトグラフィー空間の外側に溶出する化合物のＬＲＩ値を計算するために、式４にそのような保持時間及び／又はＰＮを使用することが可能であろう。
【００８３】
本発明の別の実施形態では、工程ｄはＣｒｏｍａｔｏｐｌｕｓＳｐｅｃｔｒａソフトウェアを使用して行うこともでき、このソフトウェアは、同族列でカバーされるクロマトグラフィー空間の外側に溶出したピークの保持指標を自動的に外挿する。このような外挿もまた、ｔＲとＰＮとの間の直接的な比例性／線形性に基づいており、Ｅｘｃｅｌファイルで各オペレータが容易に行うこともできる。
【００８４】
同定工程ｅは、未知化合物について計算されたＬＲＩ値を、列挙された化合物について以前に得られた値と比較することによって行われる。未知のピークの計算されたＬＲＩが参照のＬＲＩと同じである場合、ポジティブ同定がなされ得る。
【００８５】
「列挙された化合物」という用語は、限定されるものではないが、工程ａで確立されたものを含む（すなわち、参照ＴＡＧのＬＲＩ値）。この用語は実際には、本発明の保持指数ライブラリの一部となった本クロマトグラフィー法によって分析された全ての化合物の保持指数値も含む（すなわち、２０９を超えるＴＡＧ及び他の単純及び複雑な脂質、例えば、遊離脂肪酸、モノ−及びジアシルグリセロール（それぞれＭＡＧ及びＤＡＧ）、並びにステロール、カロテノイド及びワックスなどを含むＬＲＩデータベース）。
【００８６】
本発明の別の実施形態では、同定工程ｅは、ＣｒｏｍａｔｏｐｌｕｓＳｐｅｃｔｒａソフトウェアによって行うことができ、このソフトウェアは、未知化合物のＬＲＩ値と以前に確立されたＬＲＩライブラリの値とのマッチのみに基づいて自動的かつ迅速に同定プロセスを行うように適切に開発された。この新しいソフトウェアによる同定プロセスは、保持時間を定義するために同族列ピークのクロマトグラムにおいてピーク積分を行う工程と、実試料のクロマトグラムにおけるピーク積分を行う工程と、以前に積分された同族列クロマトグラムのＬＲＩデータ処理ウィンドウにロードする工程と、ＬＲＩライブラリ（通常は化合物名とＬＲＩ値のみを含むＥｘｃｅｌファイル）をロードする工程と、各々の未知化合物についてＬＲＩ計算を行う工程と、単純なワンクリックでＬＲＩライブラリとマッチさせる工程と、そして、ソフトウェアに設定されたＬＲＩ許容範囲ウィンドウに応じて候補のリストを得る工程とからなる。
【００８７】
クロマトグラフ分離に関して、好ましい実施形態では、本方法は、２つの直列結合された狭口径カラム（１００×２．１ｍｍ（Ｌ×ＩＤ））を備えたＵＨＰＬＣシステムを含み、固定相充填物はサブ２μｍｄｐ単分散粒子からなり、移動相は１０５分で０〜５０％Ｂ（２０分間保持）のグラジエント条件下でアセトニトリル（Ａ）／２−プロパノール（Ｂ）である。３５℃のオーブン温度で流速を４００μＬ／分に維持する。検出条件に関して、好ましい実施形態では、ＥＬＳＤ検出器を使用し、蒸発温度６０℃、噴霧ガス（Ｎ２）圧力２７０ｋＰａ、検出器ゲイン１６６＜１ｍＶ、サンプリング周波数：１０ＨｚのＥＬＳＤパラメータを適用した。
【００８８】
ルリヂサ油、メンヘーデン油及び山羊乳のクロマトグラムは、参照同族列のクロマトグラム（図３Ｄ）と直接比較して、それぞれ図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃに報告されている。完全に異なる溶出プロファイルにもかかわらず、各ＰＮ領域の保持時間に関して試料間の再現性を強調するために、分配数に従った即時の同定（目視検査でさえも）が示されている。さらに、本方法の高いクロマトグラフィー有効性を指摘するために、注入された最も複雑な植物油の１つである亜麻仁油、及び同定されたＴＡＧの数が最も多い試料であるメンヘーデン油のクロマトグラムを図４に示す。
【００８９】
以下の表１は、分析した化合物中の複数の脂肪酸を指すのに使用した略語のリストを提供する。
【表１】
2019536063.tif 000009
【００９０】
本発明の保持指数システムのみに基づく同定はそれ自体信頼性があり、明確な同定をもたらす（すなわち保持指数の重ね合わせは生じない）。しかしながら、時には、得られたＬＲＩ値は、２つ以上の参照化合物と確実にマッチし得る。これは、４３６０±６のＬＲＩを有するジリノレイル−パルミトイル−グリセロール（ＬＬＰ）、及び４３５８±２のＬＲＩを有するジオレイル−リノレニル−グリセロール（ＯＯＬｎ）の場合である。したがって、あいまいな同定を避けるために、工程ｅはさらに、各種のＭＳ断片化パターンの検査を含むことができ、正しい候補の選択につながる。図５は、ＬＬＰ（図５Ａ）及びＯＯＬｎ（図５Ｂ）種のＥＳＩ−ＭＳスペクトルをそれらのフラグメントの説明と共に示す。詳細には、各ＴＡＧは、分子種、ジアシルグリセロール及びモノアシルグリセロールフラグメントのナトリウム付加物によって特徴付けられる断片化プロファイルを示し、明確な同定につながる。本発明のこの態様の詳細を説明すると、ＬＣ−ＭＳシステムを採用する場合、同定プロセスのために同じソフトウェアを使用し、ＭＳスペクトルを解釈するさらなる１工程を加え、この解釈はピーク上を単純に１クリックすると視覚化することができる。近い将来には、スペクトルライブラリも作成され、ＬＲＩデータベースと組み合わせて自動同定ツールとして使用される可能性がある。この場合、ソフトウェアは両方の同定フィルタを同時に適用して正しい候補のみを提供できなければならない。
【００９１】
逆に、本発明の方法はまた、非常に類似した又は同一の質量スペクトルを有する化合物を識別するために使用することもできる。まとめると、ＭＳ、特にＥＩ−ＭＳ又はＡＰＩ−ＭＳと組み合わせた液体クロマトグラフィーで保持指数を使用すると、第２の独立した実験値が得られるため、ピーク同定の信頼性が大幅に向上する。したがって、本発明によれば、保持指数は、ＬＲＩデータベースにおいて自動高速検索を行うために不可欠なパラメータであるだけでなく、ＭＳと相補的になり、同じ質量断片化を有する分析物を識別することを可能にし得ると結論付けることができ、これにより、信頼性の高い同定が実現される。
【００９２】
今日まで、脂質プロファイリングは、通常、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）のＧＣプロファイルと無傷の脂質のＬＣプロファイルとを補完的な方法で考慮することによって調査されていることも注目に値する。このようにして、無傷の脂質の同定はＦＡ組成物によって推進され得る。換言すれば、同重体（同一のＭＳスペクトル）は、ＦＡの相対存在量を考慮することにより区別することができ、ＦＡは、アシルグリセロール（ＭＡＧ、ＤＡＧ及びＴＡＧ）及びリン脂質中に組み合わされ、ステロールエステル、カロテノイドエステル、ワックス中に存在する。さらに、非常に単純な試料では、ＭＳ情報は必須ではなく、既知のＦＡ組成であり、ＲＰ−ＬＣ下での脂質の典型的な溶出プロファイルが考慮される可能性がある。実際、ＲＰ−ＬＣでは、増加するＰＮに従って脂質が溶出され、その後、保持挙動に基づいて予備的同定を行うことができる。それにもかかわらず、魚油又は乳及び乳由来の試料などの複雑な試料を検討する場合には、多くの例外が見られ、それは、より弱く保持されクロマトグラムの低ＰＮ領域で溶出する可能性のある高度不飽和及び短鎖飽和脂肪酸の予測不可能な保持挙動に起因する。
【００９３】
これに関して、各脂質に関連付けられた保持指数値を提供することで、本発明の方法はより信頼性の高い同定ツールを表す。
【００９４】
上記のように、本発明によれば、液体クロマトグラフィーにおいて有効な同定ツールとして使用可能な列挙された化合物についての保持指数のライブラリ（すなわちデータベース）がさらに提供される。
【００９５】
保持指数データベースは、ＣｒｏｍａｔｏｐｌｕｓＳｐｅｃｔｒａソフトウェア（Ｃｈｒｏｍａｌｅｏｎｔ、メッシーナ、イタリア）を用いて構築し、これは、保持指数と鎖長の間に線形関係が存在するために、Ｃ９Ｃ９Ｃ９よりも早く（トリホルミン、Ｃ１Ｃ１Ｃ１まで）及びＣ１９Ｃ１９Ｃ１９に続いて溶出されたＴＡＧのＬＲＩ値を外挿することができる。次に、分析はＣｒｏｍａｔｏｐｌｕｓＳｐｅｃｔｒａソフトウェアを使用して処理され、これにより、各ピークについて自動計算されたＬＲＩを以前に作成されたＬＲＩデータベースのＬＲＩと直接マッチさせることを可能にした。可能な限り狭い候補のリストを返すため、ＬＲＩデータベースにのみ基づいて、及び／又はスペクトルデータを考慮せずに、検索を行うことが可能である。さらに、ソフトウェアを、異なる種類の検出器（例えば、ＥＬＳＤ、ＡＰＩ−ＭＳ、ＥＩ−ＭＳなど）と組み合わせた異なる種類の機器（例えば、ＨＰＬＣ、ＵＨＰＬＣ、ナノＬＣ）を用いて実施したＬＣ分析で首尾よく試験した。
【００９６】
以前に開示したように、本発明者らは、全ての分析時間をカバーし、異なる実験条件下で規則的な溶出プロファイルを示す適切な参照混合物を見出すことに成功した。
【００９７】
したがって、ＴＡＧ同族列の規則的な保持挙動及び本明細書に開示されている本発明の方法の頑健性の両方により、表２を構築することが可能であった。
【００９８】
表２には、同定された全ての化合物のリストが溶出時間順に並べられ、試料間の平均の信頼区間として報告されたＰＮ及び計算されたＬＲＩと共に含まれている。平均からの絶対実験最大差（ΔＬＲＩ）も報告され、データベース検索のために考慮され得る。方法の不確実性は各ＬＲＩ値について得られた全ての標準偏差の平均に等しいと仮定して、信頼区間は正規確率分布を用いて９５％信頼水準で推定した。そのような仮定は、標準偏差分布がピアソンカイ二乗（χ２）関数に近似し得るという事実に由来する。したがって、それは測定された変数と関係があるのではなく、同じ変数の次元又は母集団に対応するその自由度だけに関係している。この特定の状況では、下記の表２の括弧内に示されるＬＲＩ値の母集団（ｐ）は、特定の化合物を含む試料の数（各試料について２つの分析が行われたためそれぞれ二重）に対応する。
【表２−１】
2019536063.tif 000010
【表２−２】
2019536063.tif 000011
【００９９】
表２はまた、液体クロマトグラフィーにおいて有効な同定ツールとして使用可能な参照保持指数の保持指数ライブラリ（すなわちデータベース）を表す。保持指数ライブラリには、限定ではないが、開示された保持指数システムに基づく本発明の方法によって得られた、保持挙動に従って同定された合計２２４の化合物が列挙されている。特に、データベースは、例えば遊離脂肪酸、モノ−、ジ−及びトリアシルグリセロール、並びにステロール、カロテノイド及びワックスなどの全ての単純及び複合脂質を含み得る。
【０１００】
信頼区間の長さは、全ての化合物で１２単位以下であった。結果として、１２ＬＲＩ単位を超える後続のＴＡＧ間の差（すなわち、ΔＬＲＩ）は、いかなるピークのミスマッチも回避する。上記に開示したように、実際、本発明の保持指数システムのみに基づく識別はそれ自体信頼性があり、明確な識別をもたらすことができる（すなわち保持指数の重ね合わせが生じない）。
【０１０１】
これに関連して、クロマトグラフ分解能は特に重要になり、これはいわゆる分離数（ＳＮ）と強く関連する。ＳＮは、同族列の２つの連続したＴＡＧ間で分解され得るピークの数（それぞれｚとｚ＋６）を表す。
【数６】
2019536063.tif 000012
ここで、
ｔＲ（ｚ＋６）及びｔＲｚは同族列の２つの連続したＴＡＧの保持時間であり、ｗｈ（ｚ＋６）及びｗｈｚは半値幅における対応するピーク幅である。
【０１０２】
式５を領域ｚ＝３９及びｚ＝４５（この領域には多数のＴＡＧが含まれるため任意に選択された）に適用することによって、ＳＮは２５に等しく、これは２５のピークが標準化合物Ｃ１３Ｃ１３Ｃ１３とＣ１５Ｃ１５Ｃ１５との間で十分に分解できることを意味する。結果として、２つの隣接するピーク間の最小保持指数の差（すなわちδ）は、
δ＝６００／（ＳＮ＋１）
でなければならない。これは、現在の状況では２３に等しく、上述の得られたΔＬＲＩを大部分克服する。正確なライブラリ検索結果を達成するために、実験的ＬＲＩ間隔長（すなわちΔＬＲＩ＊２）もまたδ値よりも小さくなければならない（ΔＬＲＩ＊２＜δ）。例えば、δが２３に等しい３９００〜４５００ＬＲＩ領域内では、ΔＬＲＩは１１．５（δ／２、以後最大許容変動とも呼ばれる）の値を超えるべきではなく、それはより大きい変動が隣接するピーク間に重なりを引き起こすことを意味する。したがって、隣接する２つのピークのＬＲＩ差が２３以上で、指数の変動が±１１．５未満であれば、ミスマッチや誤認は発生しない。したがって、その後の全ての参照化合物ピークに対してＳＮ及びδの計算が実施され、各領域についてδは実験的ＬＲＩ間隔長と等しいかそれをさらに超えることがわかった（δ≧ΔＬＲＩ＊２）。特に、１２２単位の総ＳＮ及び３０単位の平均δが得られ、これは１５未満のΔＬＲＩ値が通常信頼できる同定（δ／２≧ΔＬＲＩ）を確実にすることを意味し、したがって本発明の方法の高い精度を実証する。証拠として、表３を以下に提供する。
【表３−１】
2019536063.tif 000013
【表３−２】
2019536063.tif 000014
【表３−３】
2019536063.tif 000015
【０１０３】
表は、最も一般的に同定された化合物を、平均値±実験的変動として表したそのＬＲＩ値、及び隣接ホモログの各対についてのＳＮ値と共に示し、そこから最大許容変動を推定することができる。実験的変動は、クロマトグラムの全ての領域について最大許容変動よりも低く、本方法の有効性を実証している。
【０１０４】
同族列クロマトグラムを、隣接ホモログの各対についてのＳＮ及びΔＬＲＩ値と共に図６に示す。
【０１０５】
分析物の平均ピーク幅（ｗｂ）を考慮して、同様の考察が起こり得る。実際、ｗｂ＝０．８分（４８秒）及び１ＬＲＩ＝２５分／６００＝０．０４２分（２．５２秒）であり、２５分はＣ１３Ｃ１３Ｃ１３とＣ１５Ｃ１５Ｃ１５の保持時間の差の時間であり、ＬＲＩ変動（ΔＬＲＩ）は±１５単位であり、これは０．６３分（３７．８秒）に対応し、ｗｂよりも小さい結果となる（すなわち、ΔＬＲＩ＜ｗｂ）。言い換えれば、得られた保持指数は、未知化合物のベースピーク幅よりも小さい決定再現性を有する。
【０１０６】
このような結果もまた、各ＬＲＩが、保持時間に関してクロマトグラム中の特定の位置を占める化合物のみに対応し、本発明の保持指数システムのみに基づく潜在的同定の信頼性を正確に示すことを証明している。
【０１０７】
本発明の新規な保持指数システム及びそれに基づくＬＲＩデータベースは、限定されるものではないが、植物油、水生生物（例えば魚及び藻類）及びその派生物（例えば、魚粉及び魚油）、全血、血漿及び細胞膜としての乳製品並びに生物学的試料など、多数の異なる現実世界の脂質試料の同定に成功した。
【０１０８】
好ましい実施形態の説明
本明細書に記載の実施形態は例示目的のみを有し、特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定することを意味しない。さらに、当業者に明らかな以下の実施形態の修正及び変更は、添付の特許請求の範囲に包含されることを意図している。
【０１０９】
試料調製
本発明の目的のためには、いかなる脂質試料も適切な試料である。特に、植物油、魚油、乳脂肪、乳由来脂肪、それらの派生物及び組み合わせは全て適切な試料である。いくつかの実施形態では、植物油（例えば、ピーナッツ油、コーン油、ダイズ油、菜種油、グレープシード油、アーモンド油、ヘーゼルナッツ油、ヒマワリ油、亜麻仁油、チア油、サシャインチ油、ルリヂサ油、ヒマシ油、オリーブ油）、魚油（例えばメンヘーデン、タラ肝臓、鯛、マグロ、魚類、エビ）及び乳及び乳由来脂肪（例えば、ヤギ、ウシ、全乳、バッファローモッツァレラチーズ、バター）を選択した。
【０１１０】
脂質試料の調製は、脂質相を抽出するための当該分野で公知の任意の適切な方法（例えば、乳試料については有機溶媒、魚試料についてはＦｏｌｃｈ法及びＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法を用いる脂質抽出）に従って行った。通常、注入は１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で行われる。
【０１１１】
ＬＲＩ計算とデータ解析
ＬＲＩは、式４に従い、本発明による参照同族列として奇数鎖ＴＡＧを使用し（例えばＣ９Ｃ９Ｃ９からＣ１９Ｃ１９Ｃ１９）、
ＰＮ＝ＣＮ−２ＤＢ
の式に従って炭素鎖長（ＣＮ）及び二重結合数（ＤＢ）に関連する各参照ＴＡＧの分配数（ＰＮ）に等しい値をｚａに割り当てることによって計算した。
【０１１２】
したがって、ｚはＣ９Ｃ９Ｃ９では２７、Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９では最大５７であり、ｎは６である。
【０１１３】
ＬＲＩデータベースは、ＣｒｏｍａｔｏｐｌｕｓＳｐｅｃｔｒａソフトウェア（Ｃｈｒｏｍａｌｅｏｎｔ、メッシーナ、イタリア）を使用して構築し、これもＣ９Ｃ９Ｃ９よりも早くＣ１９Ｃ１９Ｃ１９に続いて溶出した化合物のＬＲＩ値を外挿することができた。分析はＣｒｏｍａｔｏｐｌｕｓＳｐｅｃｔｒａソフトウェアを使用して処理され、それにより、各ピークについて自動計算されたＬＲＩを以前に作成されたＬＲＩデータベースのＬＲＩと直接マッチさせることを可能にした。
【０１１４】
方法の独立性の証拠：再現性研究
本発明の発明者らは、新規な保持指数システムの確立に成功し、それに基づくクロマトグラフィー法は、広範囲の脂質試料に対して最大の分解能を提供することができるだけでなく、選択されたクロマトグラフィー条件から独立しており、結果として、研究室内及び研究室間レベルの両方で再現可能である。
【０１１５】
方法の再現性に関して、本発明の発明者らは広範囲の実験条件下でのＬＲＩ安定性を評価するために系統的な研究も行った。特に、例えばカラム寸法、固定相充填、流速、オーブン温度、グラジエント、移動相組成など、クロマトグラフ分離に関与する全ての分析パラメータは、合計５４のＴＡＧを含む３種類の植物油（ルリヂサ油、亜麻仁油及びオリーブ油）を注入することによって正確に評価した。この再現性研究は選択された油に限定されず、むしろ本発明のクロマトグラフィー法が適している全ての脂質試料を代表するものである。
【０１１６】
カラムに関しては、２つの異なる固定相充填剤、すなわち、単分散２μｍ以下（粒径１．９μｍ）及び部分的多孔質（粒径２．７μｍ、２．０μｍ）の粒子を比較した。さらに、内径の影響を評価するために異なるカラム寸法を使用し、１００ｘ２．１ｍｍ（ＬｘＩＤ）を４００μＬ／分で操作し、１００ｘ４．６ｍｍ（ＬｘＩＤ）を１．８ｍＬ／分で操作した。２つの直列結合カラムを考慮することによって固定相床の長さも変えた。以下の表４に結果を報告し、表４にはＴＡＧのリストが各カラムのＰＮ及びＬＲＩ値と共に含まれている。試料間の平均とΔＬＲＩも提供されている。変動（ΔＬＲＩ）≦１５が得られたため、実験は本発明の方法がカラム寸法及び固定相充填の両方から独立していることを示す。
【表４−１】
2019536063.tif 000016
【表４−２】
2019536063.tif 000017
【０１１７】
以前の研究がより広口径のカラム（すなわち内径４．６ｍｍ以上）の使用を教示したにもかかわらず、狭口径のカラム（内径２．１ｍｍ）を使用し、より遅い流速で操作する本発明の方法は、著しい溶媒節約に加えて、ＭＳ検出器（使用する場合）とのより直接的な結合を可能にすることも注目に値する。
【０１１８】
次に、他のパラメータの効果を評価するために、部分的に多孔質の１００×２．１ｍｍ（Ｌ×ＩＤ）、２．０μｍｄｐのカラムを選択した。
【０１１９】
次に、３つの異なる流速、すなわち３００μＬ／分、４００μＬ／分、及び５００μＬ／分を３５℃のグラジエントモード（すなわち、０〜５２．５分、０〜５０％Ｂ（１０分保持））で比較した。以下の表５は、異なる流速で計算されたＬＲＩ値をその平均ΔＲＬＩと共に示し、全ての条件間の完全な一致が強調され（ΔＬＲＩ≦１０）、本発明の方法が流速からさえも独立しているという結論に導かれる。
【表５】
2019536063.tif 000018
【０１２０】
溶出相のグラジエントに関して、３つの異なるグラジエント勾配（％Ｂ／分）、すなわち０．９５％Ｂ／分、１．４％Ｂ／分、及び０．７０％Ｂ／分を比較した。以下の表６は、異なるグラジエント勾配で計算されたＬＲＩ値をその平均ΔＲＬＩと共に示し、本方法がこの変化によって有意に影響されないことを再度実証する（ΔＬＲＩ≦１５）。
【表６】
2019536063.tif 000019
【０１２１】
温度に関して、３０〜４０℃の範囲の３種類の異なるオーブン温度、すなわち３０℃、３５℃、及び４０℃を比較したところ、１０℃の変動はＬＲＩ値に影響を与えることができるが、５℃の違いはクロマトグラフィー法に大きな影響を与えることができない可能性があるという結論に至った。以下の表７は、３０〜３５℃及び３５〜４０℃の両方の平均をそのΔＬＲＩ値と共に示し、本発明の方法は、最大ΔＬＲＩ＝１３で温度差（最大５℃）がある場合でも信頼性がありかつ再現可能であることを再度示す。
【表７】
2019536063.tif 000020
【０１２２】
したがって、本発明の方法はクロマトグラフィー装置に含まれる全ての変数からほとんど独立していることが首尾よく実証された。
【０１２３】
新規同定法の頑健性を評価し実証するために、またＬＲＩデータベースを実験室内及び実験室間の両方のレベルで使用可能にするために、保持指数の再現性研究を実施した。
【０１２４】
ＭＳ分析による信頼性研究
表２に列挙した２２４の化合物のうち、植物油を代表する５４のＴＡＧがＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析によって明確に確認されたが、魚及び乳試料の同定を確認するためにＵＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析が必要となる。得られた結果は、本発明の方法の優れた信頼性を実証している。
【０１２５】
それにもかかわらず、完全に共溶出した場合、異なる化合物が同じＬＲＩを持つ可能性がある。しかしながら、それらが同じ質量スペクトルも示すことはありそうもない。この目的のために、ルリヂサ油、亜麻仁油及びオリーブ油のＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析を実施し、植物油に一般的な５４のＴＡＧについてＵＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ法による予備同定の確認を提供した。また、この場合、異なる機器設定、すなわちＵＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ及びＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳで計算されたＬＲＩ値間の比較は、ＬＲＩライブラリ検索の適切な機能、すなわち信頼できる同定を達成するためのＬＲＩデータベースの使用を検証するために必須であった。
【０１２６】
下記の表８は、３種類の油中に同定された最も豊富なＴＡＧの比較を平均値及びΔＬＲＩ値と共に含み、一方、図７は、平均値を各々対応するΔＬＲＩと共にヒストグラムで報告する。
【表８】
2019536063.tif 000021
【０１２７】
逆に、本発明のクロマトグラフィー法は、非常に類似又は同一の質量スペクトルを有する化合物を識別するためにも使用され得る。まとめると、ＭＳ、特にＥＩ−ＭＳ又はＡＰＩ−ＭＳと組み合わせたＬＣで保持指標を使用すると、第２の独立した実験値が得られるため、ピーク同定の信頼性が大幅に向上する。
【０１２８】
他の実施形態
本明細書に記載の実施形態及び例は例示目的のみを有し、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定することを意味しない。遊離脂肪酸、モノ−及びジアシルグリセロール、並びにステロール、カロテノイド及びワックスなどの他の脂質種の決定は、本発明の範囲内に含まれる。実際、本発明者らは近い将来、現実世界の様々な試料の全体的な脂質プロファイリングに適した方法を作成することを計画している。また、現実世界の様々な試料の全ての脂質種の保持挙動（例えば、ｔＲ及びＲＩ）の包括的なデータベースを得るために、他の脂質種の保持指数、例えば遊離脂肪酸、モノ−及びジアシルグリセロール、並びにステロール、カロテノイド及びワックスの保持指数などを含めることによって、本発明の保持指数データベースを拡張できることも明らかである。本発明者らはまた、リン脂質などの極性脂質の測定にも適したクロマトグラフィー法に保持指数システムを適用することも計画している。
【０１２９】
例
試料の調製
例１：野菜試料の調製
植物油試料は、１０ｍｇの油を１０ｍＬの２−プロパノールに溶解することによって調製したが、ルリヂサ油のみは１０ｍｇを同じ溶媒１ｍＬに溶解した。
【０１３０】
例２：乳試料の調製（Ｆｏｌｃｈ法）
１０ｍＬの乳を４０ｍＬのクロロホルム：メタノール混合物（１：２ｖ／ｖ）で処理し、３０分間磁気撹拌しながら氷浴に入れた。内容物を分液漏斗に移し、５分間激しく振盪した。その後、混合物を異なる試験管に集め、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。相の分離が得られたら、下相（脂質画分を含む）は合わせてプールし、上相（水性）は分離漏斗に再び加え、２０ｍＬのクロロホルム：メタノール混合物（２：１ｖ：ｖ）でさらに抽出した。最後の工程を再度繰り返した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムでろ過し、ロータリーエバポレーターを用いて蒸発させた。
【０１３１】
例３：魚試料の調製（Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法による）
１０ｇの魚組織を秤量し、小片にした。試料をクロロホルム：メタノール（１：２  ｖ：ｖ）の混合物３０ｍＬで抽出し、Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ装置を用いて１０分間均質化した。次に、１０ｍＬのクロロホルムと１８ｍＬの蒸留水を加え、１分間再び均質化した。この混合物を異なる試験管に集め、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。下層の有機相をプールし、一方、上層の水性相をクロロホルム中の１０％（ｖ／ｖ）メタノール２０ｍＬで再度抽出した。次に、全ての有機相を合わせてプールし、ロータリーエバポレーターを用いて無水濃縮でろ過した。
【０１３２】
機器及び好ましい分析条件
例４：ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ
分析は、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＱｕａｔｔｒｏマイクロＡＰＩベンチトップ三連四重極質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）に連結された、４ポンプ、オートサンプラー及びカラムサーモスタットからなるＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣ２６９５分離モジュールを用いて実施した。分離は、Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８  １００×２．１ｍｍ（Ｌ×ＩＤ）、２．０μｍ  ｄｐカラム（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）で実施した。移動相は、０〜５２．５分、０〜５５％Ｂ（１７．５分間保持）のグラジエント条件下で、（Ａ）アセトニトリル：１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液９５：５（ｖ：ｖ）及び（Ｂ）２−プロパノールであった。流速はオーブン温度３５℃で４００μＬ／分に設定した。注入量は２μＬであった。ＭＳ取得は、陽イオン化モードで動作するＺ−スプレーエレクトロスプレー（ＥＳＩ）源を用いて実施し、条件は、質量スペクトル範囲２５０〜１２５０ｍ／ｚ、イベント時間１秒、脱溶媒和ガス（Ｎ２）流７００．０Ｌ時−１、コーンガス不適用、ソース温度１５０℃、脱溶媒和温度２５０℃、キャピラリー電圧３ＫＶ、コーン電圧８０Ｖ、抽出器電圧３Ｖ、ＲＦレンズ０．２Ｖであった。
【０１３３】
例５：ＵＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ
分析は、ＣＢＭ−２０Ａコントローラ、２つのＬＣ−３０ＡＤ二重プランジャ平行流ポンプ（最大圧力１２０．０ＭＰａ）、ＤＧＵ−２０Ａ５Ｒデガッサ、ＣＴＯ−２０ＡＣカラムオーブン、ＳＩＬ−３０ＡＣオートサンプラー、及びＳＰＤ  Ｍ３０Ａ  ＰＤＡ検出器（１．８μＬ検出器フローセル容量）からなるＮｅｘｅｒａ  Ｘ２システム（島津製作所、京都、日本）を用いて実施した。ＵＨＰＬＣシステムをＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器）検出器（島津製作所）に連結した。分離は、直列に連結した２台のＴｉｔａｎ  Ｃ１８  １００×２．１ｍｍ（Ｌ×ＩＤ）、１．９μｍ  ｄｐカラム（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）で実施した。移動相は、０〜１０５分、０〜５０％Ｂ（２０分間保持）のグラジエント条件下で、（Ａ）アセトニトリル及び（Ｂ）２−プロパノールであった。流速はオーブン温度３５℃で４００μＬ／分に設定した。注入量は５μＬであった。ＥＬＳＤパラメータは、蒸発温度６０℃、噴霧ガス（Ｎ２）圧力２７０ｋＰａ、検出器利得＜１ｍＶ、サンプリング周波数１０Ｈｚを適用した。
【０１３４】
例６：現実世界の脂質試料の同定
クロマトグラフィーの実施形態及び本発明に記載のＬＲＩ法を使用して、異なる魚油及び植物油を注入し、明確に同定した。
【０１３５】
下記の図８は、スズキ脂質試料のクロマトグラムを示し、これは例３で報告した手順（Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法）に従って抽出し、例５で報告した機器設定及び分析条件（ＵＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ法）に従って分析した。ＬＲＩ同定法のみに基づくピーク同定は、クロマトグラムと表９の両方に報告されている。集計値と実験値の差ΔＬＲＩ≦１５である合計３０のＴＡＧが明確に同定された。さらに、同定された全ての化合物をＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析によって確認した。データベースの拡張は、多数の化合物の同定を確実にし得る。
表９：スズキ試料中の同定されたピークについて得られたＰＮ、ＬＲＩｔａｂ、ＬＲＩｅｘｐ及びΔ値
【表９】
2019536063.tif 000022
【図１】
2019536063.tif 000024
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
2019536063.tif 000030
【図７】
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【図８】
2019536063.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月29日(2018.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィーにおける保持指数システムとしての奇数鎖脂肪酸で構成された同族列のトリアシルグリセロールの使用。
【請求項２】
前記同族列が、トリヘプタノインからトリヘネイコサノインまでの範囲のトリアシルグリセロール、又はそれらのいずれかの部分を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記同族列が、
トリヘプタノイン（Ｃ７Ｃ７Ｃ７）からトリノナデカノイン（Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９）まで、又は
トリノナノイン（Ｃ９Ｃ９Ｃ９）からトリノナデカノイン（Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９）まで、又は
トリノナノイン（Ｃ９Ｃ９Ｃ９）からトリヘネイコサノイン（Ｃ２１Ｃ２１Ｃ２１）まで、又は
それらのいずれかの部分
の範囲のトリアシルグリセロールを含む、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
以下の工程を含む、保持指数システムとしての奇数鎖脂肪酸で構成された同族列のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）に基づく液体クロマトグラフィーにおける未知化合物の同定方法：
ａ．各参照ＴＡＧに対して保持指数値を帰属させる工程；
ｂ．ＴＡＧ参照混合物をクロマトグラフィー分離する工程；
ｃ．試料中の未知化合物をクロマトグラフィー分離する工程；
ｄ．分離された各未知化合物の前記保持指数値を決定する工程；
ｅ．前記未知化合物を同定する工程。
【請求項５】
前記クロマトグラフィー分離（工程ｂ及び工程ｃ）が、好ましくはアセトニトリル／２−プロパノール移動相中で行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記クロマトグラフィー分離が、グラジエント溶出で、好ましくは直線グラジエント溶出で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記保持指数値の決定（工程ｄ）が、以下の式を適用することによって実施される、請求項４に記載の方法：
【数１】
2019536063.tif 000033
ここで、
ｔＲｉは未知化合物ｉの保持時間であり、ｔＲｚ及びｔＲ（ｚ＋１）はそれぞれ前記未知化合物ｉの直前及び直後に溶出したＴＡＧの保持時間であり、ｚは前記未知化合物ｉの直前に溶出した化合物に関連する分配数（ＰＮ）であり、ｎは前記未知化合物ｉの直前及び直後に溶出した参照ＴＡＧ間のｚ単位の差を表す。
【請求項８】
前記同定工程ｅが、前記未知化合物について計算したＬＲＩ値を、列挙した化合物について以前に得られたＬＲＩ値と比較することによって行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記同定工程ｅはソフトウェアによって自動的に行われ、前記ソフトウェアは前記未知化合物のＬＲＩ値をＬＲＩライブラリのＬＲＩ値と自動的にマッチさせる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記得られた保持指数が、同じ質量断片化を有する分析物間の識別に使用される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記得られた保持指数が、前記未知化合物のベースでのピーク幅よりも小さい決定再現性を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
奇数鎖脂肪酸で構成された同族列のトリアシルグリセロールを含む、液体クロマトグラフィーにおける保持指数システムとして使用するためのキット。
【請求項１３】
前記同族列が、トリヘプタノインからトリヘネイコサノインまでの範囲のトリアシルグリセロール、又はそれらのいずれかの部分を含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記キットが、トリヘプタノイン（Ｃ７Ｃ７Ｃ７）、トリノナノイン（Ｃ９Ｃ９Ｃ９）、トリウンデカノイン（Ｃ１１Ｃ１１Ｃ１１）、トリトリデカノイン（Ｃ１３Ｃ１３Ｃ１３）、トリペンタデカノイン（Ｃ１５Ｃ１５Ｃ１５）、トリヘプタデカノイン（Ｃ１７Ｃ１７Ｃ１７）、トリノナデカノイン（Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９）及びトリヘネイコサノイン（Ｃ２１Ｃ２１Ｃ２１）からなる群より選択される少なくとも２つの隣接ＴＡＧを含むという条件で、前記同族列のいずれかの部分を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記同族列が、
トリヘプタノイン（Ｃ７Ｃ７Ｃ７）からトリノナデカノイン（Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９）まで、又は
トリノナノイン（Ｃ９Ｃ９Ｃ９）からトリノナデカノイン（Ｃ１９Ｃ１９Ｃ１９）まで、又は
トリノナノイン（Ｃ９Ｃ９Ｃ９）からトリヘネイコサノイン（Ｃ２１Ｃ２１Ｃ２１）まで、又は
それらのいずれか一部
の範囲のトリアシルグリセロールを含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記キットが、各々が参照ＴＡＧを含む個々のバイアルの形態で、又はＴＡＧ参照混合物を含む独自のバイアルとしてのいずれかで、ＴＡＧ同族列を含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１７】
前記キットが、各参照ＴＡＧ及び／又は前記ＴＡＧ参照混合物を固体乾燥形態で、又は前記ＬＣシステムに導入するためのすぐに使用可能な溶液として提供する、請求項１２に記載のキット。
【国際調査報告】
2019536063.tif 000034
2019536063.tif 000035
2019536063.tif 000036