(57)【要約】  本発明は、直ぐに使用できるスフェロイド形成癌細胞の集団を生成するための方法を提供し、方法は、直ぐに使用できるスフェロイド形成癌細胞の集団を生成する方法であって、（ｉ）１または複数の第１の低接着組織培養プレート上の第１の培地での懸濁培養において癌細胞を増殖させそれによって癌幹細胞が濃縮された癌細胞スフェロイドを形成すること；（ｉｉ）上記癌細胞スフェロイドを脱凝集させて癌幹細胞が濃縮された単一細胞の懸濁液を形成すること；（ｉｉｉ）１または複数の第２の低接着組織培養プレート上の第２の培地に上記単一細胞の懸濁液を播種すること；および（ｉｖ）上記１または複数の第２の組織培養プレート中の上記単一細胞の懸濁液を凍結すること、それによって直ぐに使用できるスフェロイド形成癌細胞の集団を生成することを含む。さらに、この方法によって生成される細胞集団および、試験化合物のスクリーングでの使用のためを含む、癌細胞スフェロイドを増殖させるためのキットも提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
直ぐに使用できるスフェロイド形成癌細胞の集団を生成するための方法であって、
（ｉ）１または複数の第１の低接着組織培養プレート上の第１の培地での懸濁培養において癌細胞を増殖させそれによって癌幹細胞が濃縮された癌細胞スフェロイドを形成すること；
（ｉｉ）前記癌細胞スフェロイドを脱凝集させて癌幹細胞が濃縮された単一細胞の懸濁液を形成すること；
（ｉｉｉ）１または複数の第２の低接着組織培養プレート上の第２の培地に前記単一細胞の懸濁液を播種すること；および
（ｉｖ）前記１または複数の第２の組織培養プレート中の前記単一細胞の懸濁液を凍結し、それによって直ぐに使用できるスフェロイド形成癌細胞の集団を生成すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記癌細胞が癌細胞株の細胞または腫瘍由来の初代細胞培養の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌細胞株がヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞；ヒト神経膠芽細胞腫Ｕ８７ＭＧ細胞；ヒト結腸癌ＨＣＴ１１６細胞；ヒト卵巣癌ＳＫ−ＯＶ−３細胞；ヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ４４６細胞；ヒト肺癌Ａ５４９細胞；ヒト膵臓癌ＰＡＮＣ１細胞；ヒト膵臓癌Ｃａｐａｎ−１細胞；ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞；ヒト乳癌ＢＴ４７４細胞；ヒト卵巣癌ＯＶＣＡＲ細胞；ヒト前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞；およびヒト結腸癌ＣａＣｏ２細胞からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記初代細胞培養が患者由来異種移植片（ＰＤＸ）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の培地がＢ２７サプリメント、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が補充された、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）とハムＦ−１２培地の混合物を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記培地がメチルセルロースを含まない、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＧＦおよびｂＦＧＦ補充物が培養開始時に一度だけ加えられかつその後は繰り返して加えられない、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１または複数の第１の低接着組織培養プレートおよび／または前記１または複数の第２の低接着組織培養プレートがポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリラートのコーティングを含むまたはＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔプレートを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記１または複数の第２の低接着組織培養プレートが前記１または複数の第１の低接着組織培養プレートよりも１プレートあたり多くのウェルを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記１または複数の第２の低接着組織培養プレートが９６ウェルプレートもしくは３８４ウェルプレートを含み、および／または
前記１または複数の第１の低接着組織培養プレートが６ウェルプレートもしくは１２ウェルプレートを含む、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の培地が細胞凍結保存培地を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞凍結保存培地がＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）細胞凍結培地を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｉ）において前記癌細胞を増殖させることが１０００細胞／ｍＬと１０００００細胞／ｍＬの間の密度で前記細胞を播種することを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌細胞が乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞を含みおよびステップ（ｉ）において前記癌細胞を増殖させることが１００００細胞／ｍＬと３００００細胞／ｍＬの間の密度で、任意選択で約２５０００細胞／ｍＬの密度で前記細胞を播種することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌細胞が神経膠芽細胞腫Ｕ８７ＭＧ細胞を含みおよびステップ（ｉ）において前記癌細胞を増殖させることが５０００細胞／ｍＬと１５０００細胞／ｍＬの間の密度で、任意選択で約１００００細胞／ｍＬの密度で前記細胞を播種することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｉｉｉ）において前記単一細胞の懸濁液を前記播種することが１０００細胞／ｍＬと２０００細胞／ｍＬの間の密度で、任意選択で約１６００細胞／ｍＬの密度で前記細胞を播種することを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌細胞が結腸癌ＨＣＴ１１６細胞または神経膠芽細胞腫Ｕ８７ＭＧ細胞を含む、請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌細胞がＰＤＸ細胞を含みおよびステップ（ｉｉｉ）において前記癌細胞を増殖させることが５０００細胞／ｍＬと１５０００細胞／ｍＬの間の密度で、任意選択で約１００００細胞／ｍＬの密度で細胞を播種することを含む、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｉｉｉ）において前記単一細胞の懸濁液を前記播種することが異なる細胞密度で複数のウェル中に前記細胞を播種することを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記１または複数の第２の低接着組織培養プレートの端でのウェルが空のままにされるまたは播種される端ではないウェルへの密度と異なる密度で細胞を播種される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
直ぐに使用できるスフェロイド形成癌細胞の凍結集団を含む前記１または複数の第２の組織培養プレートをパッキングする、ラベル付けするおよび／または出荷することをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
（ｖ）前記１または複数の第２の組織培養プレートのいくつかのもしくはすべてのウェルに第３の培地を加えることおよび少なくとも前記凍結細胞が解凍されるまで前記１または複数の第２の組織培養プレートを温めることによって直ちに使用できるスフェロイド形成癌細胞の前記凍結集団を解凍すること
をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第３の培地が前記第１の培地と同じである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ｖｉ）複数のスフェロイドが形成するまで前記解凍された直ぐに使用できるスフェロイド形成癌細胞の集団を増殖させること
をさらに含む、請求項２２または請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｖｉ）が５日間と７日間の間、任意選択で約６日間前記細胞をインキュベートすることを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記癌細胞がＰＤＸ細胞を含みおよびステップ（ｖｉ）が４日間と６日間の間前記細胞をインキュベートすることを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
スフェロイド形成に対する少なくとも１種の試験化合物の効果を評価するために前記スフェロイドの形成の前に前記１または複数のウェルに前記少なくとも１種の試験化合物を加えることを含む、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
スフェロイド生存度に対する少なくとも１種の試験化合物の効果を評価するためにスフェロイドが形成されたら前記１または複数のウェルに前記少なくとも１種の試験化合物を加えることを含む、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２１のいずれか１項に定義される方法によって生成されるまたは生成できる直ぐに使用できるスフェロイド形成癌細胞の集団。
【請求項３０】
前記細胞が１または複数の低接着マルチウェル組織培養プレート中で凍結される、請求項２９に記載の細胞集団。
【請求項３１】
前記１または複数のプレートが出荷のために密封されおよび／またはラベル付けされる、請求項３０に記載の細胞集団。
【請求項３２】
前記細胞がヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞；ヒト神経膠芽細胞腫Ｕ８７ＭＧ細胞；ヒト結腸癌ＨＣＴ１１６細胞；ヒト卵巣癌ＳＫ−ＯＶ−３細胞；ヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ４４６細胞；ヒト肺癌Ａ５４９細胞；ヒト膵臓癌ＰＡＮＣ１細胞；ヒト膵臓癌Ｃａｐａｎ−１細胞；ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞；ヒト乳癌ＢＴ４７４細胞；ヒト卵巣癌ＯＶＣＡＲ細胞；ヒト前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞；およびヒト結腸癌ＣａＣｏ２細胞からなる群から選択される細胞株の細胞である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項３３】
前記癌細胞がＰＤＸ細胞である、請求項２９〜３０のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項３４】
部品のキットであって、
請求項１〜２１のいずれか１項に定義される方法によって生成されるまたは生成できる直ぐに使用できるスフェロイド形成癌細胞の凍結集団がその中に播種されている１または複数の低接着マルチウェル組織培養プレート；および
癌細胞スフェロイドを増殖させるために適した細胞培養培地を含む密封される容器
を備える、キット。
【請求項３５】
前記細胞培養培地がＢ２７サプリメント、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が補充された、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）とハムＦ−１２培地の混合物を含む、請求項３４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌幹細胞が濃縮されたスフェロイド培養物を生成するための方法と、この培養物を含有するキットおよび関連生成物と、例えば薬物スクリーニングにおける、この培養物の使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌幹細胞（ＣＳＣ）の概念は、我々が発癌現象を理解するためにだけでなく、癌治療薬を開発するためにも重要な意味を有する。癌幹細胞が癌における化学療法および放射線抵抗性に寄与することを示す証拠が増加している。幹細胞自己再生を妨害する薬物の使用は、新規の有効な抗癌治療を選択する戦略を表すが、癌幹細胞およびそれらの正常な対応細胞が多くの経路を共有するので、大きな課題も表す。
【０００３】
癌幹細胞の生物学は、複雑であり有効な治療戦略に変換することは困難であることがわかっている。癌幹細胞に対する試験化合物の影響をモニターするために、マーカー、好ましくは測定し易い表面マーカーのパネルを定義する必要がある。しかし、これは厄介である。なぜならマーカーパネルが明確に定義されていない多くの腫瘍の症状について、重複しないことが多いマーカーの組み合わせが癌幹細胞活性または腫瘍開始能を有する細胞集団を定義するからである。これは、腫瘍細胞における幹細胞能力の変化する性質を反映する可能性が最も高い。
【０００４】
国際公開第２０１５／１５８７７７号は、３Ｄ組織培養用の細胞を調製するための方法を述べている。細胞を適切な表面に播種し、表面に接着しない細胞を破棄し、接着細胞を剥離し３Ｄ組織培養プロセスに移行する。
【０００５】
マンモスフィアアッセイは本来、乳房幹細胞を選択し増殖させる方法として、Ｄｏｎｔｕら［１］によって開発された。このアッセイの論文が発表されてからまもなく、研究者らは、組織試料、腫瘍および連続継代性細胞株由来の幹細胞および癌幹細胞活性のレポーターとしてこのアッセイを使用し始めた［２］、［３］、［４］。腫瘍発生の分子機序を研究するための様々なヒト細胞モデルがあり、これらの細胞株の大部分は腫瘍形成能力を有する機能性幹細胞特性を示す細胞の小さい亜集団を含有することが示されている［４］。さらに、乳癌細胞株におけるマンモスフィア形成はＥ−カドヘリンの発現に依存することが報告されている［５］。
【０００６】
癌幹細胞スフェロイドの必要性、具体的には薬物スクリーニングおよび他のアッセイのために簡単な形態または直ぐに使用できる形態で細胞を提供する必要性が満たされずに存在する。これに関連して、癌幹細胞スフェロイドが豊富な培養物、または癌幹細胞スフェロイドを形成する性質を有する培養物を調製する方法が必要とされている。本明細書にさらに詳述するように、本発明はこれらのおよび他の必要性に取り組むものである。
【発明の概要】
【０００７】
概して、本発明者らは、脱凝集させた３Ｄ培養物から形成される、癌幹細胞が濃縮された細胞集団を、マルチウェルプレート中で単一細胞調製物として凍結できることを見いだした。凍結細胞を次いで、温かい細胞培地を加えることによって容易に解凍し（例えば出荷後に）、細胞をスフェロイドに増殖させる。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、脱凝集させた癌幹細胞濃縮集団が「幹細胞性」を保持し、したがって３Ｄスフェロイドの調製を促進すると考える。
【０００８】
したがって、第１の態様において、本発明は直ぐに使用できるスフェロイドを形成する癌細胞の集団を生成するための方法を提供し、方法は
（ｉ）１または複数の第１の低接着組織培養プレート上の第１の培地での懸濁培養において癌細胞を増殖させ、それによって癌幹細胞が濃縮された癌細胞スフェロイドを形成すること；
（ｉｉ）上記癌細胞スフェロイドを脱凝集させて癌幹細胞が濃縮された単一細胞の懸濁液を形成すること；
（ｉｉｉ）１または複数の第２の低接着組織培養プレート上の第２の培地に上記単一細胞の懸濁液を播種すること；および
（ｉｖ）上記１または複数の第２の組織培養プレート中の上記単一細胞の懸濁液を凍結し、それによって直ぐに使用できるスフェロイド形成癌細胞の集団を生成すること
を含む。
【０００９】
場合によっては、上記癌細胞は、癌細胞株（例えば、不死化細胞株）の細胞、または腫瘍（例えば、ヒトもしくは他の動物の腫瘍または患者由来の異種移植片）に由来する初代細胞培養の細胞を含む。特に、癌細胞株は、ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３６；ヒト神経膠芽腫細胞Ｕ８７ＭＧ；ヒト結腸癌細胞ＨＣＴ１１６；ヒト卵巣癌細胞ＳＫ−ＯＶ−３；ヒト肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ４４６；ヒト肺癌細胞Ａ５４９；ヒト膵臓癌細胞ＰＡＮＣ１；ヒト膵臓癌細胞Ｃａｐａｎ−１；ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７；ヒト乳癌細胞ＢＴ４７４；ヒト卵巣癌細胞ＯＶＣＡＲ；ヒト前立腺癌細胞ＬＮＣａＰ；およびヒト結腸癌細胞ＣａＣｏ２からなる群から選択からされてよい。細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０，ＵＳＡから購入できる。
【００１０】
場合によっては、上記第１の培地は、Ｂ２７サプリメント、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を補充した、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）とハムＦ−１２培地との混合物を含む。第１の培地は、［１］に定義された「Ｄｏｎｔｕ培地」であってよい。場合によっては、第１の培地は、以下を含む：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：２の混合物）；
メチセルロース（最終的に５％）；
Ｂ２７サプリメント（最終的に２％）；
ＥＧＦ（最終的に２０ｎｇ／ｍＬ）；および
ｂＦＧＦ（最終的に２０ｎｇ／ｍＬ）。
【００１１】
いくつかの実施形態において、培地はメチルセルロースを含まない。
【００１２】
本発明の第１の態様によるいくつかの実施形態において、ＥＧＦおよびｂＦＧＦの補充物は、培養開始時に一度だけ加え、その後は繰り返して加えない。場合によっては、ＥＧＦおよびｂＦＧＦの補充は２日毎に行われる。
【００１３】
場合によっては、上記１または複数の低接着組織培養プレートおよび／または上記１または複数の第２の低接着組織培養プレートは、ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリラートのコーティングを含む。場合によっては、上記１または複数の第１の低接着組織培養プレートおよび／または上記１または複数の第２の低接着組織培養プレートは、超低接着プレート、例えばＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｓｐｈｅｒｏｉｄ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）を含む。超低接着プレートは市販されており、非細胞毒性でかつ生物学的に不活性である共有結合されるハイドロゲル表面を有する。
【００１４】
場合によっては、上記１または複数の第２の低接着組織培養プレートは、上記１または複数の第１の低接着組織培養プレートよりも１プレートあたり多くのウェルを含む。例えば、上記１または複数の第２の低接着組織培養プレートは９６ウェルプレートもしくは３８４ウェルプレートを含んでよく、および／または上記１または複数の第１の低接着組織培養プレートは６ウェルプレートもしくは１２ウェルプレートを含む。このように、第１のプレートはスフェロイドのバルク相の生成を開始するのに適し、一方で第２のプレートはスフェロイド形成および／またはスフェロイド生存度についてのアッセイ（例えば、試験化合物のスクリーニング）を実施するのに適している。
【００１５】
場合によっては、上記第２の培地は、細胞凍結保存培地を含む。例えば、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）細胞凍結培地は、ＡＭＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｕｒｏｐｅ）Ｌｔｄ，Ｍｉｌｔｏｎ  Ｐａｒｋ，ＵＫから市販されている。
【００１６】
場合によっては、ステップ（ｉ）において上記癌細胞を増殖させることは、１０００細胞／ｍＬと１０００００細胞／ｍＬの間の密度で細胞を播種することを含む。特に、本明細書の実施例２に記載のように、細胞株は、スフェロイド凝集を最小限に抑えながら、スフェロイド形成のための特定の最適な播種密度を示す。特定の実施形態において、癌細胞は乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞を含み、ステップ（ｉ）において上記癌細胞を増殖させることは、１００００細胞／ｍＬと３００００細胞／ｍＬの間の密度で、任意選択で約２５０００細胞／ｍＬの密度で細胞を播種することを含む。ある特定の実施形態において、癌細胞は神経膠芽細胞腫Ｕ８７ＭＧ細胞を含み、ステップ（ｉ）において上記癌細胞を増殖させることは、５０００細胞／ｍＬと１５０００細胞／ｍＬの間の密度で、任意選択で約１００００細胞／ｍＬの密度で細胞を播種することを含む。
【００１７】
本発明の第１の態様に従って場合によっては、ステップ（ｉｉｉ）において上記単一細胞の懸濁液を上記播種することは、１０００細胞／ｍＬと２０００細胞／ｍＬの間の密度で、任意選択で約１６００細胞／ｍＬの密度で細胞を播種することを含む。本発明の第１の態様に従って場合によっては、例えば上記癌細胞がＰＤＸ由来細胞を含むとき、ステップ（ｉｉｉ）において上記単一細胞の懸濁液を上記播種することは、５０００細胞／ｍＬ（標準の９６ウェルプレートのウェルサイズ）と１５０００細胞／ウェル（標準の９６ウェルプレートのウェルサイズ）の間の密度で、任意選択で約１００００細胞／ｍＬ（標準の９６ウェルプレートのウェルサイズ）の密度で細胞を播種することを含む。具体的には本明細書では、例えば９６ウェル形式よりも大きいまたは小さいプレート形式の場合、ウェルの表面積またはウェル容量のいずれかに比例してそれに応じて播種密度を調整し得ることが考えられる。例えば、播種密度は、およそ５００００細胞／ｍＬ（ウェル容量２００μＬの９６ウェルプレートに基づいて）、例えば４００００〜６００００細胞／ｍＬの範囲であってよい。１ウェルあたりの適切な細胞の数はしたがって、本発明の方法を実施するために選択されるプレートおよびウェルの既知寸法に従って同業者が選択できる。
【００１８】
特に、本明細書の実施例３に記載のように、細胞株は、スフェロイド形成を最小限に抑えながら、スフェロイド形成のための特定の最適な播種密度を示す。いくつかの実施形態において、癌細胞は結腸癌ＨＣＴ１１６細胞または神経膠芽細胞腫Ｕ８７ＭＧ細胞を含み、ステップ（ｉｉｉ）において播種密度は約１６００細胞／ｍＬである。特に、実施例４に記載のＰＤＸ実験は、Ｔ２（第２継代）ＰＤＸ由来細胞の場合、スフェロイド形成効率が２００００細胞／ウェルと比較して１００００細胞／ウェルの播種密度（ステップｉｉｉ）で優れていることを示した。この実験は、およそ２００μＬのウェル容量を有する９６ウェルプレートで行われた。これは、１００００細胞／ウェルの播種密度が約５００００細胞／ｍＬの密度と同等であることを意味する。したがって、例えば９６ウェル形式よりも大きいまたは小さいプレート形式の場合、ウェルの表面積またはウェル容量のいずれかに比例してそれに応じて播種密度を調整し得ることが考えられる。例えば、播種密度は、およそ５００００細胞／ｍＬ、例えば４００００〜６００００細胞／ｍＬの範囲であってよい。１ウェルあたりの適切な細胞の数はしたがって、本発明の方法を実施するために選択されるプレートおよびウェルの既知寸法に従って同業者が選択できる。
【００１９】
場合によっては、ステップ（ｉｉｉ）における単一細胞の上記懸濁液の播種は、細胞を異なる細胞密度で複数のウェルに播種することを含む。特に、１または複数の第２の低接着組織培養プレートの端のウェルは、空（すなわち細胞を含まない）のままにされる、またはプレートの端でないウェルへの密度と異なる密度で細胞が播種される。
【００２０】
本明細書では、単一プレート上に複数の細胞型（例えば複数の細胞株）を播種することも考えられる。例えば、「乳癌プレート」は２種以上の異なる乳癌細胞株を含んでよい。さらに、または代替的に、プレートは様々な癌、例えば、乳房、脳、肺、膵臓、結腸および／または卵巣の細胞株を含んでよい。したがって、本発明の第１の態様の方法は、ステップ（ｉｉｉ）において少なくとも、第１の癌細胞型の癌幹細胞が濃縮された単一細胞の第１の懸濁液と、第２の癌細胞型の癌幹細胞が濃縮された単一細胞の第２の懸濁液とを播種することを含んでよく、ここでは第１および第２の癌細胞型は別のウェルに播種される。好ましくは異なる細胞型の播種は、所定のパターンに従って行われる。
【００２１】
場合によっては、本発明の第１の態様の方法は、直ぐに使用できるスフェロイド形成癌細胞の凍結集団を含む１または複数の第２の組織培養プレートをパッキングする、ラベルをつける、および／または出荷することをさらに含む。一般的に、プレートは、それらの凍結状態を維持する容器中で密封され出荷される。
【００２２】
場合によっては、本発明の第１の態様の方法は、
（ｖ）第３の培地を１または複数の第２の組織培養プレートのいくつかのもしくはすべてのウェルに加えかつ少なくとも凍結細胞が解凍されるまで１または複数の第２の組織培養プレートを温めることによって直ちに使用できるスフェロイド形成癌細胞の凍結集団を解凍すること、をさらに含む。これは、温かい細胞培養培地をプレートに加えプレートを細胞培養インキュベーター（例えば３７℃で）中に置くことによって、簡便に実施できる。
【００２３】
場合によっては、第３の培地は、上記第１の培地に関連して定義される同じ組成を有する。
【００２４】
場合によっては、本発明の第１の態様の方法は、
（ｖｉ）複数のスフェロイドが形成するまで解凍された直ぐに使用できるスフェロイド形成癌細胞の集団を増殖させること、をさらに含む。これは場合によって、細胞を５〜７日間、任意選択で約６日間インキュベートすることを含み得る。本明細書の実施例３に示すように、培養６日目は、細胞株ＨＣＴ１１６およびＵ８７ＭＧについて凝集がわずかでありスフェロイド数に関して最適であることがわかった。あるいは、場合によって、例えば癌細胞がＰＤＸ由来細胞を含む場合など、方法は細胞を４日間〜６日間の間、任意選択で約５日間インキュベートすることを含んでよい。本明細書の実施例４に示すように、培養４日目は、培養９日目と比較してＰＤＸ由来細胞について凝集がわずかでありスフェロイド数に関してまさっていることがわかった。
【００２５】
場合によっては、本発明の第１の態様の方法は、少なくとも１種の試験化合物のスフェロイド形成に対する効果を評価するためにスフェロイド形成の前に少なくとも１種の試験化合物を１または複数のウェルに加えることをさらに含む。特に、スフェロイド形成が試験化合物の非存在下で観察されたものと比較して試験化合物によって遅れる、および／または妨げられる場合、これは試験化合物が抗癌効果、特に癌幹細胞の増殖の阻害および／または腫瘍の自己再生と再増殖の阻害を提示している可能性があることを示す。
【００２６】
場合によっては、本発明の第１の態様の方法は、少なくとも１種の試験化合物のスフェロイド生存度に対する効果を評価するために、スフェロイドが形成されたならば１または複数のウェルに少なくとも１種の試験化合物を加えることをさらに含む。特に、癌スフェロイドが試験化合物の非存在下で観察されたものと比較して試験化合物によって死滅する、またはサイズもしくは数が減少する場合、これは試験化合物が抗癌効果、特に３Ｄ腫瘍に侵入して死滅させる能力を提示している可能性があることを示す。
【００２７】
本発明の第２の態様において、本発明の第１の態様による方法によって生成される、または生成できる直ぐに使用できるスフェロイド形成癌細胞の集団を提供する。
【００２８】
本発明の第２の態様により場合によっては、細胞は１または複数の低接着マルチウェル組織培養プレート中で凍結される。１または複数のプレートは、出荷のために密封されおよび／またはラベルをつけられてよい。
【００２９】
場合によっては、細胞は、ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞；ヒト神経症膠芽腫Ｕ８７ＭＧ細胞；ヒト結腸癌ＨＣＴ１１６細胞；ヒト卵巣癌ＳＫ−ＯＶ−３細胞；ヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ４４６細胞；ヒト肺癌Ａ５４９細胞；ヒト膵臓癌ＰＡＮＣ１細胞；ヒト膵臓癌Ｃａｐａｎ−１細胞；ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞；ヒト乳癌ＢＴ４７４細胞；ヒト卵巣癌ＯＶＣＡＲ細胞；ヒト前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞；およびヒト結腸癌ＣａＣｏ２細胞からなる群から選択される細胞株細胞である。
【００３０】
場合によっては、癌細胞はＰＤＸ由来の細胞である。本発明の直ぐに使用できるスフェロイド形成癌細胞の集団、およびそのような細胞を生成する方法は、種々の供給源由来のＰＤＸ癌細胞で試験され検証されている。特に腫瘍モデルは結腸、乳房および膵臓の腫瘍源を用いて試験された。ある特定の場合において、ＰＤＸ由来細胞は、本発明のいずれの態様に従って、結腸直腸癌細胞、乳癌細胞または膵臓癌細胞の細胞型（例えば、結腸直腸、乳房または膵臓の原発腫瘍に由来する）であり得る。
【００３１】
場合によっては、単一マルチウェルプレートは、２種以上の癌細胞型を含む。例えば、プレートは上に列挙したヒト癌細胞株および／またはＰＤＸ細胞の２、３、４、５、６、７、８または９を含んでよい。
【００３２】
本発明の第３の態様において、本発明は、
本発明の第１の態様による方法によって生成されるまたは生成できる直ぐに使用できるスフェロイド形成癌細胞の凍結集団がその中に播種されている、１または複数の低接着マルチウェル組織培養プレートと、
癌細胞スフェロイドを増殖させるために適した細胞培養培地を含む密封容器と
を備える、部品のキットを提供する。
【００３３】
場合によっては、細胞培養培地は、本発明の第１の態様の第１の細胞培養培地に関連して上に定義されたとおりである。特に、細胞培養培地は、Ｂ２７サプリメント、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が補充された、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）とハムＦ−１２培地との混合物を含んでよい。
【００３４】
キットは、スフェロイド形成アッセイまたは１種もしくは複数種の試験化合物の３Ｄ細胞生存度アッセイにおける細胞の使用についての使用説明とともにインサート、ラベルまたはマニュアルをさらに含み得る。
【００３５】
本発明は、ある組み合わせが明らかに容認されない、または明白に回避すべきであると述べられている場合を除き、記載されている態様および好ましい特徴の組み合わせを含む。本発明のこれらのおよびさらなる態様と実施形態は、実施例および添付する図面を参照して以下にさらに詳述される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３６について異なる培地調合およびサプリメントスケジュールに対する１ｍＬあたりのスフィア数を示す。
【図２】乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３６について異なる培地調合およびサプリメントスケジュールに対するスフェロイド径（μｍ）を示す。
【図３】乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３６について異なる培地調合およびサプリメントスケジュールに対するスフェロイド円形度を示す。
【図４】神経膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７ＭＧについて異なる培地調合およびサプリメントスケジュールに対する１ｍＬあたりのスフィア数を示す。
【図５】神経膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７ＭＧについて異なる培地調合およびサプリメントスケジュールに対するスフェロイド径（μｍ）を示す。
【図６】神経膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７ＭＧについて異なる培地調合およびサプリメントスケジュールに対するスフェロイド円形度を示す。
【図７】乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３６について細胞密度（細胞／ｍＬ）に対してプロットしたスフィア数を示す。図に示すように、スフィア数は、最初は細胞密度とともに比較的直線的に増加するが、次いでおよそ２５０００細胞／ｍＬの播種密度でプラトーに達する。
【図８】乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３６について細胞播種密度に応じて形成されたスフェロイドの代表的な顕微鏡写真を示す。細胞密度は示される（１０００、５０００、１００００、２５０００、５００００、１０００００および２５００００細胞／ｍＬ）とおりである。
【図９】神経膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７ＭＧについて細胞密度（細胞／ｍＬ）に対してプロットしたスフィア数を示す。図に示すように、スフィア数は、最初は細胞密度とともに急勾配で増加するが、次いでおよそ１００００細胞／ｍＬの播種密度を超えると勾配は低下する。
【図１０】神経膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７ＭＧについて細胞播種密度に応じて形成されたスフェロイドの代表的な顕微鏡写真を示す。細胞密度は示される（２０００、５０００、１００００、２５０００、５００００および１０００００細胞／ｍＬ）とおりである。
【図１１】マルチウェルプレートに播種した細胞密度に対してプロットしたスフェロイド数を示す。図に示すように、結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を用いるマルチウェルプレート上のスフェロイド濃縮培養物から生成されたマルチウェルスフェロイド数に対する細胞播種密度の効果から、１６００細胞／ｍＬを最適密度として選択できる。
【図１２】結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を用いるマルチウェルプレート上のスフェロイド濃縮培養物について細胞播種密度に対してプロットしたスフェロイド径（μｍ）を示す。
【図１３】マルチウェルプレートに播種した細胞密度に対してプロットしたスフェロイド数を示す。図に示すように、神経膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７ＭＧを用いるマルチウェルプレート上のスフェロイド濃縮培養物から生成されたマルチウェルスフェロイド数に対する細胞播種密度の効果から、１６００細胞／ｍＬを最適密度として選択できる。この細胞株の場合、１６００細胞／ｍＬより高い播種密度は、存在するスフィアの凝集のためより少ないスフィアを生成した。
【図１４】神経膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７ＭＧを用いるマルチウェルプレート上のスフェロイド濃縮培養物について細胞播種密度に対してプロットしたスフェロイド径（μｍ）を示す。
【図１５】結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を用いるマルチウェルプレート上の１６００細胞／ｍＬの密度での播種後の培養の日数に対してプロットしたスフェロイド数を示す。図に示すように、最も高いスフェロイド数は、６日目に観察された。
【図１６】結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を用いるマルチウェルプレート上の１６００細胞／ｍＬの密度での播種後の培養の日数に対してプロットしたスフェロイド径（μｍ）を示す。
【図１７】神経膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７ＭＧを用いるマルチウェルプレート上の１６００細胞／ｍＬの密度での播種後の培養の日数に対してプロットしたスフェロイド数を示す。スフェロイド数は８日目まで増加し、次いで減少し、スフェロイドの凝集を示した。最適な記録日はしたがって６日目と選択された。
【図１８】神経膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７ＭＧを用いるマルチウェルプレート上の１６００細胞／ｍＬの密度での播種後の培養の日数に対してプロットしたスフェロイド径（μｍ）を示す。スフェロイド径は指数関数的に増加し、８日目を過ぎてスフェロイドの凝集を示した。
【図１９】本発明の一実施形態による、プロセスワークフローの概要を図式で示す。２Ｄ単一培養をバルク３Ｄ培養スフェロイドへと増殖させ、これを次いで脱凝集させて、細胞凍結に適した培地中で単一細胞調製物を形成した。癌幹細胞（ＣＳＣ）が濃縮された単一細胞集団を次いで９６ウェルプレート中に分配し、これを適切に包装してラベルをつけてから−８０℃で凍結した。凍結した直ぐに使用できるスフェロイド形成プレートを次いでエンドユーザーに発送できる。エンドユーザーは温かい細胞培養培地を加えることによってプレートを解凍し、細胞を５〜７日間増殖させる。細胞はスフェロイドを再形成する。
【図２０】本発明のいくつかの実施形態によるアッセイプロセスの概要を図式で示す。凍結した直ぐに使用できるスフェロイド形成プレートを、幹細胞培地を加えることによって解凍する。この時点で試験化合物を、スフェロイド形成に対するそれらの効果を評価するために加えることができる（左側の分枝図：「スフェロイド形成アッセイ」）。さらに、または代替的に、試験化合物を、３Ｄスフェロイド生存度に対するそれらの効果を評価するために、スフェロイドが形成されてから加えてもよい（右側の分枝図：「３Ｄ生存度アッセイ」）。
【図２１】１３日目に示される第１継代（Ｔ１）ＰＤＸ−由来細胞から取得した代表的なスフィアの顕微鏡写真を示す。直径バーは、１５０μｍ（左下）と１８２μｍ（右上）である。
【図２２】１００００細胞／ウェルで増殖させたスフェロイドの４日目の対照の（左側）および解凍された（右側）Ｃｅｌｌ２Ｓｐｈｅｒｅ（商標）プレートのウェル全体の代表的な再生画像（倍率２．５×）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明を説明するにあたり、以下の用語を使用し、これらを以下に示すように定義することを意図する。
【００３８】
「癌幹細胞」（「ＣＳＣ」）は、自己再生できる腫瘍形成癌細胞である。一般的に、ＣＳＣは懸濁培養液中で増殖し癌細胞スフェロイドを形成できる。
【００３９】
本明細書で用いる場合、「スフェロイド」は、一般的にＣＳＣが濃縮された癌細胞で形成される球状または球体状の構造体を指す。「腫瘍様塊」とも呼ばれ（Ｗｅｉｓｗａｌｄら，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，２０１５，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．１，ｐｐ．１−１５を参照されたい、その内容は参照によって本明細書に明白に組み込まれる）、スフェロイドは、特定の成長因子を補充した無血清培地を用いて低接着条件で培養される浮遊構造体であり得る。
【００４０】
本明細書で用いる場合、「スフェロイド形成細胞」は、適切な期間中適切な条件下で培養されるとスフェロイドを形成する傾向を示す、ＣＳＣを含む、癌細胞を指す。したがって、スフェロイド形成細胞は、スフェロイドの形である必要はない。一般的に、スフェロイド形成細胞は、例えば、単一細胞の懸濁液を得るための酵素的解離および／または機械的解離に続いて、スフェロイドから生じる。スフェロイド形成細胞は、ＣＳＣが濃縮されてよい。さらに、スフェロイド形成細胞は場合によって、例えば細胞凍結保存培地中で、凍結されてよい。
【００４１】
本明細書で用いる場合、「試験化合物」は、目的の細胞、組織、器官または系に影響を及ぼす任意の薬剤、または影響を及ぼす候補である任意の薬剤を指す。特に、試験化合物は、例えば、抗癌特性のスクリーニングで用いることができる、任意の薬物（小分子、タンパク質、生物、核酸または炭水化物にかかわらず）であってよい。特に、スフェロイド形成、スフェロイド増殖および／またはスフェロイド生存度に対して有効性を示す試験化合物が関心の対象である。
【００４２】
以下の実施例は、例として示すものであり、特許請求の範囲への限定として解釈されるべきではない。
【００４３】
実施例
実施例１−スフェロイド形成に対する細胞培地組成物および補充物の効果
方法
標準培地（ＳＭ）：
・ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：２の混合物）
・メチルセルロース（最終的に５％）
・Ｂ２７サプリメント（最終的に２％）
・ＥＧＦ（最終的に２０ｎｇ／ｍＬ）
・ｂＦＧＦ（最終的に２０ｎｇ／ｍＬ）
【００４４】
標準補充方法：
１．基本培地（ＤＭＥＭ＋Ｆ１２）を混合する
２．メチルセルロースを加える
３．Ｂ２７を加える
４．混合する
５．混合物中で細胞を再懸濁する。
２日毎に成長因子（ＥＧＦ＋ｂＦＧＦ）を培養ウェルに直接加える。
インキュベーション条件：３７℃、５％ＣＯ２。
【００４５】
スフェロイドの脱凝集／解離は、酵素的（３７℃で１：１トリプシン：ＤＭＥＭ溶液中で５分間）および機械的（２５Ｇニードルを介して（６ストローク））であった。
【００４６】
これまでに報告された（例えば［１］および［５］）ように、特定のヒト乳癌細胞株はスフェロイド（「マンモスフィア」）を形成できる。細胞を、細胞接着を防止するためにポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリラート（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で覆われた６ウェル組織培養プレート中の、Ｂ２７、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を補充した、血清を含まないＤＭＥＭ：Ｆ１２（２：１）培地中に１０００細胞／ｍＬの密度で播種した。細胞凝集を防止するために、メチルセルロースを０．５％の最終濃度で培地に含めた（［５］を参照されたい）。
【００４７】
結果
メチルセルロースを除去することおよび成長因子（ＥＧＦとｂＦＧＦ）の補充を培養開始時に一度へと変えることの効果を、乳癌と神経膠芽細胞腫の細胞株を用いてスフェロイド数、スフェロイドサイズおよびスフェロイド円形度に関して評価した。図１〜６に示すように、匹敵するスフェロイド数（標準培地および標準補充による手法と比較して）およびほぼ等しい径と円形度（標準培地および標準補充による手法と比較して）を依然として維持しつつ、メチルセルロースを標準培地から除去できかつ成長因子の補充を培養開始時に一度だけ実行できることが判明した。対照的に、メチルセルロースとＢ２７の両方の除去は、調査される細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３６およびＵ８７ＭＧ）のスフェロイド数の低下をもたらした。
【００４８】
実施例２−バルク相（第１相）スフェロイド生成のための条件の最適化
スフェロイド生成細胞のための細胞培養物を濃縮するために、単層（２Ｄ）で増殖させた単一細胞からスフェロイドをバルクで生成する。
【００４９】
細胞密度の最適化
細胞数／ｍＬを、生成されたスフェロイド数に対して調べた。ある密度で、スフェロイド数は比例して増加しないことが観察され、スフェロイドが凝集したことを示す。これは、図７〜１０に示される、乳癌および神経膠芽腫細胞株を用いるスフェロイド数と代表的な顕微鏡写真についての裏づけデータから確認できる。したがって、細胞密度はこのレベル未満で最適に維持され得る。これは各細胞株について特異的である。
【００５０】
図７および８に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞の播種密度は最適には、≦２５０００細胞／ｍＬであり得る。
【００５１】
図９および１０に示すように、Ｕ８７ＭＧ細胞の播種密度は最適には、≦１００００細胞／ｍＬであり得る。
【００５２】
実施例３−スフェロイド生成マルチウェルプレート（第２相）のための条件の最適化
本発明のある特定の実施形態に従って、第１相で調製したスフェロイド（上記実施例２に記載される）を機械的にかつ酵素的に脱凝集させ、濾過して単一細胞懸濁液を生成した。細胞を凍結培地（Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋｅｒ（登録商標），ＡＭＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｕｒｏｐｅ）Ｌｔｄ，Ｍｉｌｔｏｎ  Ｐａｒｋ，ＵＫ）中に再懸濁し、９６ウェルプレート中に２０μＬ／ウェルを分配した。プレートを次いで、貯蔵のために−８０℃で急速冷凍してもよい。細胞を、温かい標準培地（またはメチルセルロースを含まない標準培地）を加えることによって解凍し、５〜７日間の培養で増殖させてスフェロイドを形成する。
【００５３】
スフェロイド生成に対する播種細胞密度の効果を、異なる密度で細胞を播種し次いで７日間の培養後にスフェロイド数とスフェロイド径を測定することによって評価した。
【００５４】
図１１〜１４に示すように、生成されたスフェロイド数は播種細胞密度に比例して増加した。増加は、最初は直線的であったが、少なくともＵ８７ＭＧ細胞に関しては、存在するスフェロイドの凝集のために１６００細胞／ｍＬを超えて横ばい状態になった。したがって、最適な播種細胞密度はこの場合、およそ１６００細胞／ｍＬであると結論づけられた。
【００５５】
アッセイデータ記録のための最適日数を調べるために、１６００細胞／ｍＬの開始細胞播種密度を用いて細胞数と細胞サイズを毎日測定した。スフェロイド数は一定日数で安定し、このときすべてのスフェロイド形成細胞はスフェロイド状態に増殖していた。スフェロイド径は、スフェロイドが増殖するにつれて増加し続ける。
【００５６】
図１５〜１８に示すように、結腸癌および神経膠芽細胞腫の細胞株を用いるスフェロイドの数および径は、およそ６日間の培養で最適であることが判明した。ＨＣＴ１１６細胞およびＵ８７ＭＧ細胞について、この時点を過ぎると、スフェロイド凝集が明らかになった。
【００５７】
実施例４−マルチウェルプレートでの患者由来異種移植片（ＰＤＸ）細胞からのスフェロイド生成
結腸直腸腫瘍フラグメント試料を、到着時に単一細胞懸濁液へと処理し、生存細胞６２．２％の生存率を得た。癌幹細胞の濃縮のために、１２×１０６のスペア細胞をバルクプレート中のＣｅｌｌ２Ｓｐｈｅｒｅ（商標）培地中に２００００細胞／ｍＬの細胞密度で播種した（Ｔ１スフェロイド）。これは、上記実施例１で詳述される同じ培地である。１３日後に、スフェロイドを酵素的にかつ機械的に脱凝集させて、単一細胞懸濁液を得た。酵素的および機械的な脱凝集（トリプシン／ＤＭＥＭ＋２５Ｇニードル）の方法は、上記実施例１で詳述したものと同じであった。総計２３５３２のスフェロイドを収集した。
【００５８】
Ｔ１スフェロイドを次いで脱凝集させ、５．３×１０６生存細胞を収集し、これらを次いで２つの異なる細胞密度（１００００細胞／ウェルと２００００細胞／ウェル）でＰ９６プレートに播種し、計６プレートをもたらした。各セットのうち１プレートを対照として使用し、残りを貯蔵のために−８０℃で凍結した。
【００５９】
３日後に、Ｃｅｌｌ２Ｓｐｈｅｒｅ（商標）の説明書に従って、凍結プレートを解凍し、次いでプレートを４日目と９日目にスフィア数および生存率について解析した。画像解析は、上記実施例１〜３で細胞株について記載されるとおりであった。取得したデータを以下に要約する（表１）。これらを「Ｔ２」（第２継代）スフェロイドと名付ける。
【００６０】
【表１】
2019517278.tif 000002
【００６１】
Ｐ９６プレートからのウェルの代表的な画像を図２２に示す。
【００６２】
スフェロイドをＣｅｌｌ２Ｓｐｈｅｒｅ（商標）プレートで９日間増殖させるとスフェロイド凝集が観察された。これは４日目から９日目にスフェロイドの数が減少したことを説明する（上記表１を参照されたい）。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、４〜６日間がＰＤＸ由来のスフェロイド数に最適であると考える。
【００６３】
スフェロイド形成効率は、１００００細胞／ウェルでＴ１スフェロイドに関しては１／５１０、Ｔ２に関しては１／１４３として、および２００００細胞／ウェルでは１／２４４として算出された。したがって、試験した条件下での最良の濃縮は、Ｃｅｌｌ２Ｓｐｈｅｒｅ（商標）技術を用いて、Ｔ２において１００００細胞／ウェルで得られた。
【００６４】
本実験で見られた標準偏差は、比較的高かった（例えば、１００００細胞／ウェルで凍結４日目でのスフェロイド数は１９．７％−表１を参照されたい）。しかし、工業生産プロセスが適用されると、細胞数の変動、したがって標準偏差が減少することが予想される。
【００６５】
推定としてこれらの条件を用いて、新鮮な試料からの１２×１０６単一生存細胞から８プレートを生成できる。平均の試料が２０×１０６単一生存細胞／腫瘍グラムをもたらすことを考慮に入れると、新鮮な腫瘍組織１グラムあたり１３〜１４Ｃｅｌｌ２Ｓｐｈｅｒｅ（商標）プレートを生成することができよう。しかしながら、多少の差異が試料間で予想される。
【００６６】
結論
上記の結果を踏まえて、新鮮なＰＤＸ試料を用いて、ｅｘ  ｖｉｖｏでの薬物試験用のスフェロイド生成のための凍結した生存可能なＣｅｌｌ２Ｓｐｈｅｒｅ（商標）プレートを生成できると我々は結論づける。
【００６７】
参考文献
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［５］Ｍａｎｕｅｌ  Ｉｇｌｅｓｉａｓ  Ｊ，ら．Ｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｕｐｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ−ｃａｄｈｅｒｅｉｎ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１３；８（１０）；ｅ７７２８１．
【００６８】
本明細書に引用されているすべての参考文献は、それら全体を参照によって、およびそれぞれ個々の刊行物もしくは特許もしくは特許出願が参照によってその全体を組み込まれたことを具体的にかつ個々に示されている場合と同じ程度まであらゆる目的で本明細書に組み込まれる。
【００６９】
本明細書に記載の具体的な実施形態は、限定するためでなく、例として提供される。本明細書のいずれの副題も便宜上のみに含まれており、多少なりとも本開示を限定すると解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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