(57)【要約】本明細書において、被験体のがんまたは不健康な組織に対して特異的である少なくとも１つのフレームシフト変異を含む核酸配列によってコードされる１つまたは複数のネオエピトープに関連するフレームシフト変異由来ペプチドを発現する遺伝子発現構築物を含む、治療ワクチン送達ベクターを含む、疾患または状態を有する被験体のための個別化免疫療法組成物、およびそのような組成物を作製する方法を開示する。本開示の送達ベクターは、被験体から得られた疾患を有する生物試料中に存在する１つまたは複数のネオエピトープを含む１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドを含む１つまたは複数の融合タンパク質を含むＬｉｓｔｅｒｉａ細菌ベクターを含む、細菌ベクター、またはウイルスベクター、またはペプチドワクチンベクター、またはＤＮＡワクチンベクターを含む。
2019503186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の異種ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含む組換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を含む免疫療法送達ベクターであって、前記１つまたは複数の異種ペプチドが、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドを含む、免疫療法送達ベクター。
【請求項２】
前記１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドが、少なくとも１つの疾患特異的または状態特異的フレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされている、請求項１に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項３】
前記供給源核酸配列が、１つまたは複数のマイクロサテライト不安定性領域を含む、請求項２に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項４】
前記少なくとも１つのフレームシフト変異が、遺伝子の最後から２番目のエクソンまたは最後のエクソン内に存在する、前記請求項のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項５】
前記１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドのそれぞれが、約８〜１０、１１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、または８〜５００アミノ酸の長さである、前記請求項のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項６】
前記１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドが翻訳後切断部位をコードしない、前記請求項のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項７】
前記１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープがＴ細胞エピトープを含む、前記請求項のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項８】
前記１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドが、がん関連もしくは腫瘍関連ネオエピトープ、またはがん特異的もしくは腫瘍特異的ネオエピトープを含む、前記請求項のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項９】
前記腫瘍またはがんが、乳がんもしくは乳房腫瘍、子宮頸がんもしくは子宮頸部腫瘍、Ｈｅｒ２発現がんもしくは腫瘍、黒色腫、膵臓がんもしくは腫瘍、卵巣がんもしくは腫瘍、胃がんもしくは腫瘍、膵臓の癌性病変、肺腺癌、多形神経膠芽腫、結腸直腸腺癌、肺扁平上皮腺癌、胃腺癌、卵巣表層上皮腫瘍（ｏｖａｒｉａｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｍ）、口腔扁平上皮癌、非小細胞肺癌、子宮内膜癌、膀胱がんもしくは腫瘍、頭頸部がんもしくは腫瘍、前立腺癌、腎臓がんもしくは腫瘍、骨がんもしくは腫瘍、血液のがん、または脳がんもしくは腫瘍、または前記がんもしくは腫瘍のいずれか１つの転移を含む、請求項８に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項１０】
前記１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドが、感染疾患関連または感染疾患特異的ネオエピトープを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項１１】
前記組換えポリペプチドが約１〜２０のネオエピトープを含む、前記請求項のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項１２】
前記１つまたは複数の異種ペプチドが、作動可能にタンデムに連結された複数の異種ペプチドを含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが前記複数の異種ペプチドのうちの１つに融合されている、前記請求項のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項１３】
前記組換えポリペプチドが複数のフレームシフト変異由来ペプチドを含み、それぞれのフレームシフト変異由来ペプチドが異なる、請求項１２に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項１４】
前記複数の異種ペプチドが介在配列なしで互いに直接融合されている、請求項１２または１３に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項１５】
前記複数の異種ペプチドが、１つもしくは複数のペプチドリンカーまたは１つもしくは複数の４×グリシンリンカーを介して互いに作動可能に連結されている、請求項１２または１３に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項１６】
前記ＰＥＳＴ含有ペプチドがＮ末端の異種ペプチドに作動可能に連結されている、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項１７】
前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、変異したリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、切断型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列である、前記請求項のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項１８】
前記組換えポリペプチドのＣ末端がタグに作動可能に連結されている、前記請求項のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項１９】
前記組換えポリペプチドのＣ末端が、ペプチドリンカーまたは４×グリシンリンカーによってタグに作動可能に連結されている、請求項１８に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項２０】
前記タグが、６×ヒスチジンタグ、２×ＦＬＡＧタグ、３×ＦＬＡＧタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに作動可能に連結された６×ヒスチジンタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに作動可能に連結された３×ＦＬＡＧタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに作動可能に連結された２×ＦＬＡＧタグ、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１８または１９に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項２１】
前記組換えポリペプチドをコードする前記オープンリーディングフレームが、前記タグをコードする配列の後に２つの終止コドンを含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項２２】
前記組換えポリペプチドをコードする前記オープンリーディングフレームが、ｈｌｙプロモーターに作動可能に連結され、Ｎ末端からＣ末端まで、ｔＬＬＯ−［異種ペプチド］ｎ−（ペプチドタグ（複数可））−（２×終止コドン）を含む成分をコードし、ｎ＝２〜２０であり、少なくとも１つの異種ペプチドがフレームシフト変異由来ペプチドであるか、または
前記組換えポリペプチドをコードする前記オープンリーディングフレームが、ｈｌｙプロモーターに作動可能に連結され、Ｎ末端からＣ末端まで、ｔＬＬＯ−［（異種ペプチド）−（グリシンリンカー（４×））］ｎ−（ペプチドタグ（複数可））−（２×終止コドン）を含む成分をコードし、ｎ＝２〜２０であり、少なくとも１つの異種ペプチドがフレームシフト変異由来ペプチドである、前記請求項のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項２３】
前記１つまたは複数の異種ペプチドが１つまたは複数の非同義ミスセンス変異由来ペプチドをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項２４】
前記１つまたは複数の非同義ミスセンス変異由来ペプチドが、少なくとも１つの疾患特異的または状態特異的非同義ミスセンス変異を含む供給源核酸配列によってコードされている、請求項２３に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項２５】
前記１つまたは複数の非同義ミスセンス変異由来ペプチドのそれぞれが、約５〜５０アミノ酸の長さ、または約８〜２７アミノ酸の長さである、請求項２３または２４に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項２６】
組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株である、前記請求項のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項２７】
前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が前記組換えポリペプチドを発現および分泌する、請求項２６に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項２８】
前記組換えポリペプチドをコードする前記オープンリーディングフレームが、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａのゲノムに組み込まれている、請求項２６または２７に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項２９】
前記組換えポリペプチドをコードする前記オープンリーディングフレームが、プラスミドに存在する、請求項２６または２７に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項３０】
前記プラスミドが、抗生物質選択の非存在下で前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株において安定に維持されている、請求項２９に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項３１】
前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株である、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項３２】
前記弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａが１つまたは複数の内因性遺伝子において変異を含む、請求項３１に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項３３】
前記内因性遺伝子の変異が、ａｃｔＡ遺伝子変異、ｐｒｆＡ変異、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ二重変異、ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子二重変異、ｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ遺伝子三重変異、またはその組み合わせから選択され、前記変異が前記遺伝子または複数の遺伝子の不活化、切断、欠失、置換、または破壊を含む、請求項３２に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項３４】
前記組換えポリペプチドをコードする前記オープンリーディングフレームを含む前記核酸が、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含むか、または前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が代謝酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む第２の核酸をさらに含む、請求項２６〜３３のいずれか一項に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項３５】
前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項３４に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項３６】
前記ＬｉｓｔｅｒｉａがＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項３７】
前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌ、およびｄａｔの欠失またはそれらにおける不活化変異を含み、前記組換えポリペプチドをコードする前記オープンリーディングフレームを含む前記核酸がエピソームプラスミドに存在し、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、ならびに前記ＰＥＳＴ含有ペプチドがＬＬＯのＮ末端断片である、請求項３６に記載の免疫療法送達ベクター。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載の少なくとも１つの免疫療法送達ベクターを含む免疫原性組成物。
【請求項３９】
アジュバントをさらに含む、請求項３８に記載の免疫原性組成物。
【請求項４０】
前記アジュバントが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、またはＬＬＯの解毒化非溶血性形態（ｄｔＬＬＯ）を含む、請求項４９に記載の免疫原性組成物。
【請求項４１】
請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を被験体に投与することを含む、被験体における疾患または状態を処置、抑制、防止、または阻害する方法であって、１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドが、前記被験体の疾患を有するまたは状態を有する生物試料からの供給源核酸配列によってコードされている、方法。
【請求項４２】
前記被験体において個別化された抗疾患または抗状態免疫応答を誘発し、前記個別化された免疫応答が前記１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドに標的化される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４３】
前記疾患または状態ががんまたは腫瘍である、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
ブースター処置を投与することをさらに含む、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
疾患または状態を有する被験体のために個別化された、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の免疫療法送達ベクターを作製するためのプロセスであって：
（ａ）前記被験体の疾患を有するまたは状態を有する生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、健康な生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦと比較するステップであって、前記比較によって、前記疾患を有するまたは状態を有する生物試料からの前記１つまたは複数のＯＲＦ内でコードされる１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列が同定され、前記１つまたは複数の核酸配列のうちの少なくとも１つが、１つまたは複数のフレームシフト変異を含み、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドをコードする、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された前記１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つまたは複数のペプチドを含む組換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を含む免疫療法送達ベクターを生成するステップと
を含む、プロセス。
【請求項４６】
前記被験体に投与するための前記免疫療法送達ベクターを、既定の期間内、保存するステップをさらに含む、請求項４５に記載のプロセス。
【請求項４７】
前記被験体に前記免疫療法ベクターを含む組成物を投与するステップをさらに含み、前記投与によって、前記疾患または状態に対する個別化されたＴ細胞免疫応答が生成される、請求項４５または４６に記載のプロセス。
【請求項４８】
前記疾患を有するまたは状態を有する生物試料が、前記疾患または状態を有する前記被験体から得られる、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項４９】
前記健康な生物試料が、前記疾患または状態を有する前記被験体から得られる、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５０】
前記疾患を有するまたは状態を有する生物試料および前記健康な生物試料がそれぞれ、組織、細胞、血液試料、または血清試料を含む、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５１】
ステップ（ａ）における前記比較が、前記疾患を有するまたは状態を有する生物試料から抽出した前記核酸配列における前記１つまたは複数のＯＲＦを、前記健康な生物試料から抽出した前記核酸配列における前記１つまたは複数のＯＲＦと比較するために、スクリーニングアッセイ、またはスクリーニングツール、および関連するデジタルソフトウェアを使用することを含み、
前記関連するデジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性可能性を同定するために前記疾患を有するまたは状態を有する生物試料から抽出した前記核酸配列における前記ＯＲＦ内の変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、請求項４５〜５０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５２】
前記疾患を有するまたは状態を有する生物試料から抽出した前記核酸配列、および前記健康な生物試料から抽出した前記核酸配列が、エクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを使用して決定される、請求項４５〜５１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５３】
前記１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドが、前記１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドから１つまたは複数の異なるペプチド配列を生成することによって、ネオエピトープに関して特徴付けられる、請求項４５〜５２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５４】
前記１つまたは複数の異なるペプチド配列のそれぞれをスコア付けするステップ、およびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける分泌性を予測するヒドロパシー閾値より下のスコアを有しなければペプチド配列を除外するステップをさらに含む、請求項５３に記載のプロセス。
【請求項５５】
前記スコア付けが、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのヒドロパシー指標の２１アミノ酸ウィンドウによるものであり、約１．６のカットオフを超えるスコアを有するあらゆるペプチド配列は、除外されるかまたは前記カットオフ未満のスコアを有するように改変される、請求項５４に記載のプロセス。
【請求項５６】
前記１つまたは複数の異なるペプチド配列のそれぞれをスクリーニングするステップ、およびＴ細胞受容体が結合するＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩによる結合に関して選択するステップをさらに含む、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５７】
それぞれ１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープの異なる組を含む複数の免疫療法送達ベクターを作製するために繰り返される、請求項４５〜５６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５８】
前記複数の免疫療法送達ベクターが、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、または４０〜５０の免疫療法送達ベクターを含む、請求項５７に記載のプロセス。
【請求項５９】
前記複数の免疫療法送達ベクターの組み合わせが、約５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、または１００〜２００の免疫原性ネオエピトープを含む、請求項５７または５８に記載のプロセス。
【請求項６０】
前記疾患または状態が、前記健康な生物試料に存在しない１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０未満の非同義ミスセンス変異を有する腫瘍である、請求項４５〜５９のいずれか一項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年１月２７日に出願された米国出願第６２／２８７，８７１号（これは、全ての目的のためにその全体が本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
ＥＦＳ  ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出した配列表に関する言及
ファイル４９０９７０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記載の配列表は１８０ｋｂであり、２０１７年１月２７日に作成され、参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００３】
個別化医療の前では、ある特定のタイプおよび病期のがんを有するほとんどの患者が同じ処置を受けていた。しかし、一部の処置は一部の患者に奏効するが、他の患者には奏効しないことは医師および患者に明らかとなってきている。このため、有効な、特定の腫瘍に対して有効な個別化がんワクチンを開発する必要がある。個別化処置戦略は、標準的な処置について予想されるより有効で、より少ない副作用を引き起こしうる。
【０００４】
腫瘍は、個人のＤＮＡにおける変異により生じ、それによって宿主によって産生される対応する正常なタンパク質内に存在しないネオエピトープ（ｎｅｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）を含む変異したまたは異常なタンパク質の産生を引き起こし得る。これらのネオエピトープの多くは、Ｔ細胞応答を刺激し、それによって免疫系による初期段階のがん性細胞の破壊が起こる。しかし、確立されたがんの場合、免疫応答は不十分である。他の例では、がんにおける腫瘍抗原を標的とするが、そのネオエピトープを特異的に標的化しない有効な長期のワクチンの開発は難しいことが証明されている。この主な理由は、腫瘍の自己抗原に対して特異的なＴ細胞が寛容のメカニズムを通して除去または不活化されるためである。
【０００５】
ネオエピトープは、疾患、例えばがんに関連するタンパク質内に存在するエピトープであり、特異的な「ネオエピトープ」は、疾患または体内に疾患を有する組織を有しない被験体に関連する対応する正常なタンパク質内には存在しない。ネオエピトープは同定することが困難であり得るが、そうすることによって、それらを標的とする処置を開発することは、それらがまれで人によって変化し得ることから、個別化処置戦略において使用するために有用であると予想される。一部のネオエピトープは、フレームシフト変異などの変異の結果であり、それによって無意味な（ｎｏｎｓｅｎｓｉｃａｌ）ペプチドの発現が起こり得る。無意味なペプチドは、おそらく発現された免疫原性のネオエピトープを有し、したがって個別化処置のためのワクチンの設計において有用であり得る。
【０００６】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）は、リステリア症を引き起こすグラム陽性の通性細胞内病原体である。その細胞内ライフサイクルにおいて、Ｌｍは、食作用によって、または非食細胞の能動的侵入によって宿主細胞に入る。内部移行後、Ｌｍは、細菌が宿主細胞の細胞質に入るのを可能にするいくつかの細菌ビルレンス因子、主に孔形成タンパク質であるリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の分泌によって、膜結合ファゴソーム／液胞からの自身の逃避を媒介し得る。細胞質において、Ｌｍは複製し、細菌アクチン重合化タンパク質（ＡｃｔＡ）によって促進される運動性に基づいて隣接する細胞へと広がる。細胞質において、Ｌｍ分泌タンパク質は、プロテアソームによって分解され、ペプチドへとプロセシングされ、これらは小胞体でＭＨＣクラスＩ分子に会合する。この独自の特徴により、Ｌｍは、腫瘍抗原がＭＨＣクラスＩ分子に提示されて、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化することができるという点において、非常に魅力的ながんワクチンベクターとなる。細胞質ゾルに存在する間、細菌は、様々な細胞内受容体、例えば核オリゴマー化ドメイン様受容体によるペプチドグリカンの認識、およびＤＮＡセンサーＡＩＭ２によるＬｍ  ＤＮＡの認識によって認識され、炎症性および免疫調節性カスケードを活性化させ得る。
【０００７】
さらに、内部移行後、Ｌｍは、ファゴリソソーム区画でプロセシングされ、ペプチドはＭＨＣクラスＩＩ上で提示され、Ｌｍ特異的ＣＤ４−Ｔ細胞応答を活性化させる。炎症応答と、ＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ経路への抗原の効率的な送達とのこの組み合わせにより、Ｌｍは、腫瘍を処置するため、腫瘍に対して保護するため、および腫瘍に対する免疫応答を誘導するための強力なワクチンベクターとなる。
【０００８】
Ｔ細胞応答をさらに刺激するまたは他の治療と組み合わせて使用されるＬｉｓｔｅｒｉａベースのワクチンの成分としての、被験体のがんに対して特異的なネオエピトープの標的化は、被験体のがんに対して個別化され、がんの処置において有効であるワクチンを提供し得る。抗原の免疫原性を増加させる、または寛容機構から逃避したＴ細胞を刺激するワクチンの能力を増加させる抗原融合戦略は、免疫療法として特定の潜在性を有し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、被験体の異常なまたは不健康な組織内の潜在的ネオエピトープを標的化するための、個別化免疫療法組成物およびその使用を提供し、免疫療法は、これらのネオエピトープを標的とする免疫応答を増強するために、これらのネオエピトープを含むペプチドおよび／または融合ポリペプチドを発現させるための送達および免疫療法ベクターとしての組換えＬｉｓｔｅｒｉａワクチンまたは別の免疫療法送達ベクターの使用を含む。作製された個別化免疫療法は、被験体における疾患、例えばがんを有効に処置する、防止する、またはその発生数を低減させ得る。さらに、本開示の免疫療法送達ベクターおよび組換えＬｉｓｔｅｒｉａは、他の抗疾患または抗がん治療と組み合わせて有効に使用することができる。
【００１０】
１つの態様において、本明細書に開示されるのは、１つまたは複数の異種ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含む組換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を含む免疫療法送達ベクターであって、１つまたは複数の異種ペプチドが、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドを含む、免疫療法送達ベクターである。そのような免疫療法送達ベクターは、例えば組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であり得る。フレームシフト変異由来ペプチドは、例えば疾患特異的または状態特異的であり得る。
【００１１】
別の態様において、本明細書に開示の少なくとも１つの免疫療法送達ベクターを含む免疫原性組成物を本明細書に開示する。そのような免疫原性組成物は、例えばアジュバントをさらに含み得る。
【００１２】
別の態様において、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示の免疫療法送達ベクターまたは本明細書に開示の免疫原性組成物を被験体に投与することを含む、被験体における疾患または状態を処置、抑制、防止、または阻害する方法であって、１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドが、被験体の疾患を有するまたは状態を有する生物試料からの供給源核酸配列によってコードされている、方法である。そのような方法は、例えば、被験体において個別化された抗疾患または抗状態免疫応答を誘発することができ、個別化された免疫応答は１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドに標的化される。
【００１３】
別の態様において、本明細書に開示されるのは、疾患または状態を有する被験体のための個別化された免疫療法を作製するためのプロセスであって：（ａ）被験体の疾患を有するまたは状態を有する生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、健康な生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦと比較するステップであって、比較によって、疾患を有するまたは状態を有する生物試料からの１つまたは複数のＯＲＦ内でコードされる１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列が同定され、１つまたは複数の核酸配列のうちの少なくとも１つが、１つまたは複数のフレームシフト変異を含み、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドをコードする、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で同定された１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のペプチドを含む組換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を含む免疫療法送達ベクターを生成するステップとを含む、プロセスである。任意選択で、そのようなプロセスは、被験体に投与するための免疫療法送達ベクターまたはＤＮＡ免疫療法またはペプチド免疫療法を、既定の期間内、保存することをさらに含み得る。任意選択で、そのようなプロセスは、免疫療法ベクターを含む組成物を被験体に投与することをさらに含むことができ、投与によって、疾患または状態に対する個別化されたＴ細胞免疫応答が生成される。
【００１４】
１つの態様において、本開示は、それぞれの核酸配列が、免疫原性ポリペプチドに融合した１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、前記１つまたは複数の無意味なペプチドが少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、前記１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれが、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、かつ前記供給源は、被験体の疾患を有するまたは状態を有する生物試料から得られる、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株に関する。
【００１５】
別の関連する態様において、前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、免疫原性ポリペプチドに融合した１つまたは複数のペプチドを含む１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列をさらに含み、前記１つまたは複数ペプチドは１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む。別の態様において、前記１つまたは複数ペプチドは無意味なペプチドである。
【００１６】
別の態様において、本開示は、それぞれの核酸配列が、免疫原性ポリペプチドに融合した１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列を含む免疫療法送達ベクターであって、前記１つまたは複数の無意味なペプチドが少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、前記１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれが、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、かつ前記供給源は、被験体の疾患を有するまたは状態を有する生物試料から得られる、免疫療法送達ベクターに関する。
【００１７】
別の関連する態様において、前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、免疫原性ポリペプチドに融合した１つまたは複数のペプチドを含む１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列をさらに含み、前記１つまたは複数ペプチドは１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む。別の態様において、前記１つまたは複数ペプチドは無意味なペプチドである。
【００１８】
関連する態様において、フレームシフト変異を、健康な生物試料の供給源核酸配列（ｓｏｕｒｃｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と比較する。
【００１９】
別の関連する態様において、少なくとも１つのフレームシフト変異は、複数のフレームシフト変異を含み、複数のフレームシフト変異は、同じ遺伝子内に存在する。別の関連する態様において、少なくとも１つのフレームシフト変異は、複数のフレームシフト変異を含み、複数のフレームシフト変異は、同じ遺伝子内に存在しない。
【００２０】
別の関連する態様において、少なくとも１つのフレームシフト変異は、遺伝子のエクソンコード領域内にある。別の関連する態様では、エクソンは、遺伝子の最後のエクソンである。関連する態様では、１つまたは複数の無意味なペプチドのそれぞれは、非常に短い（例えば、約１０アミノ酸配列）から非常に長い（例えば、１００を超えるアミノ酸配列）の範囲であり得る。関連する態様では、１つまたは複数の無意味なペプチドのそれぞれは、約６０〜１００アミノ酸の長さである。関連する態様では、１つまたは複数の無意味なペプチドのそれぞれは、約８〜１０、１１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００または８〜５００あるいはより多くのアミノ酸の長さである。別の関連する態様では、１つまたは複数の無意味なペプチドは、疾患を有するまたは状態を有する生物学的試料において発現される。
【００２１】
別の関連する態様において、１つまたは複数の無意味なペプチドは、翻訳後切断部位をコードしない。別の関連する態様において、供給源核酸配列は、１つまたは複数のマイクロサテライト不安定性領域を含む。別の関連する態様において、１つまたは複数のネオエピトープは、Ｔ細胞エピトープを含む。
【００２２】
関連する態様において、１つまたは複数のネオエピトープは、疾患または状態に関連する自己抗原を含み、自己抗原は、がんもしくは腫瘍関連ネオエピトープ、またはがん特異的もしくは腫瘍特異的ネオエピトープを含む。別の関連する態様において、１つまたは複数のネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドは、感染疾患関連または疾患特異的ネオエピトープを含む。別の関連する態様において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａは、１つまたは複数の組換えポリペプチドを発現および分泌する。別の関連する態様において、組換えポリペプチドのそれぞれは、約１〜２０のネオエピトープを含む。
【００２３】
関連する態様において、１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片はそれぞれ、免疫原性ポリペプチドに融合されている。別の関連する態様において、１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片は、Ｎ末端からＣ末端まで、複数の作動可能に連結された無意味なペプチドまたはその断片を含み、免疫原性ポリペプチドは、複数の無意味なペプチドまたはその断片の１つに融合されている。別の関連する態様において、免疫原性ポリペプチドは、Ｎ末端の無意味なペプチドに作動可能に連結されている。別の関連する態様において、免疫原性ポリペプチドは、変異したリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、切断型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列である。
【００２４】
関連する態様において、１つまたは複数の組換えポリペプチドは、任意選択でリンカー配列を介してＣ末端でタグに作動可能に連結される。別の関連する態様において、リンカー配列は、４×グリシンリンカーをコードする。別の関連する態様において、タグは、６×ヒスチジンタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド、６×ヒスチジンに作動可能に連結された６×ヒスチジンタグ、およびその任意の組み合わせを含む群より選択される。別の関連する態様において、組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、タグをコードする配列の後に２つの終止コドンを含む。
【００２５】
関連する態様において、組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、ｐＨｌｙ−ｔＬＬＯ−［無意味なペプチドまたはその断片−グリシンリンカー（４×）−無意味なペプチドまたはその断片−グリシンリンカー（４×）］ｎ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓタグ−２×終止コドンを含む成分をコードし、無意味なペプチドまたはその断片が２１アミノ酸の長さであり、ｎ＝１〜２０である。別の関連する態様において、無意味なペプチドまたはその断片は、同じまたは異なり得る。
【００２６】
関連する態様において、組換えポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａのゲノムに組み込まれている。別の関連する態様において、組換えポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列は、プラスミドに存在する。別の関連する態様において、プラスミドは、抗生物質選択の非存在下でＬｉｓｔｅｒｉａ株において安定に維持されている。
【００２７】
関連する態様において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株である。別の関連する態様において、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａは１つまたは複数の内因性遺伝子において変異を含む。関連する態様において、内因性遺伝子の変異は、ａｃｔＡ遺伝子変異、ｐｒｆＡ変異、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ二重変異、ｄａｌ／ｄａｌ遺伝子二重変異、もしくはｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ遺伝子三重変異、またはその組み合わせから選択される。別の関連する態様において、変異は、遺伝子または複数の遺伝子の不活化、切断、欠失、置換、または破壊を含む。別の関連する態様において、組換えポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列は、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含むか、またはＬｉｓｔｅｒｉａ株が代謝酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む第２の核酸配列を含む。別の関連する態様において、代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。
【００２８】
関連する態様において、ＬｉｓｔｅｒｉａはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。
【００２９】
関連する態様において、無意味なペプチドは、疾患を有する生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、健康な生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦとの比較によって得られ、比較により、核酸配列内の１つまたは複数のフレームシフト変異が同定され、ここで、変異を含む核酸配列は、疾患を有する生物試料からの前記１つまたは複数のＯＲＦ内でコードされる１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドをコードする。
【００３０】
関連する態様において、比較は、疾患を有する生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦを、健康な生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦと比較するために、スクリーニングアッセイまたはスクリーニングツール、および関連するデジタルソフトウェアを使用することを含む。
【００３１】
関連する態様において、比較は、公知のおよび予想されるがんまたは腫瘍抗原をコードする核酸配列、腫瘍またはがん関連抗原をコードする核酸配列、公知のまたは予想される腫瘍またはがんタンパク質マーカーをコードする核酸配列、公知のおよび予想される感染疾患または状態関連遺伝子をコードする核酸配列、疾患を有する生物試料において発現される遺伝子をコードする核酸配列、マイクロサテライト不安定性領域を含む核酸配列、ならびにその任意の組み合わせを含む群より選択される既定の遺伝子の組のオープンリーディングフレームエクソームを比較することを含む。
【００３２】
関連する態様において、疾患を有する生物試料は、疾患または状態を有する被験体から得られる。別の関連する態様において、健康な生物試料は、疾患または状態を有する被験体から得られる。別の関連する態様において、生物試料は、組織、細胞、血液試料、または血清試料を含む。
【００３３】
関連する態様において、無意味なペプチドは、（ｉ）無意味なペプチドから１つまたは複数の異なるペプチド配列を生成すること、および任意選択で（ｉｉ）（ｉ）で生成されたそれぞれのペプチドをスクリーニングして、Ｔ細胞受容体が結合するＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩによる結合に関して選択すること、によってネオエピトープに関して特徴付けられる。
【００３４】
１つの態様において、本開示は、本開示のＬｉｓｔｅｒｉａ株のいずれか１つの少なくとも１つを含む免疫原性組成物に関する。別の関連する態様において、免疫原性組成物は、追加のアジュバントをさらに含む。別の関連する態様において、追加のアジュバントは、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。
【００３５】
１つの態様において、本開示は、本開示の免疫原性組成物を被験体に投与することを含む、疾患または状態を有する被験体において個別化された標的化免疫応答を誘発する方法であって、個別化された免疫応答が、被験体の疾患または状態を有する生物試料中に存在する１つまたは複数のネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片に標的化される、方法に関する。
【００３６】
１つの態様において、本開示は、本開示の免疫原性組成物を被験体に投与することを含む、被験体における疾患または状態を処置、抑制、防止、または阻害する方法に関する。
【００３７】
１つの態様において、本開示は、本開示の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む、被験体の脾臓および腫瘍におけるＴエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比率を増加させる方法であって、Ｔエフェクター細胞が、被験体の疾患または状態を有する生物試料中に存在する１つまたは複数のネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドに標的化される、方法に関する。
【００３８】
１つの態様において、本開示は、本開示の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む、被験体におけるネオエピトープ特異的Ｔ細胞を増加させるための方法に関する。
【００３９】
１つの態様において、本開示は、本開示の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む、腫瘍を有する、またはがんに罹っている、または感染疾患に罹っている被験体の生存期間を増大させるための方法に関する。
【００４０】
１つの態様において、本開示は、本開示の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む、被験体における腫瘍または転移のサイズを低減させる方法に関する。
【００４１】
関連する態様において、本開示の方法は、ブースター処置を投与することをさらに含む。
【００４２】
関連する態様において、本開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株またはその組成物を投与することは、被験体における個別化されて増強された抗感染疾患免疫応答を誘発する。別の関連する態様において、方法は、個別化された抗がんまたは抗腫瘍免疫応答を誘発する。
【００４３】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、実施例および図面から明らかとなると予想される。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本開示の好ましい実施形態を示しているが、本開示の趣旨および範囲内の様々な変化および変更が、本詳細な説明から当業者に明らかとなると予想されることから、単なる例としてのみ提供されることを理解すべきである。
【００４４】
本開示における主題は、明細書の結論部分において特に指摘され、明確に主張されている。しかし、本開示は、添付の図面を閲覧するとき以下の詳細な説明を参照することによって、構成及び操作方法のいずれに関しても、その目的、特徴および利点と一緒に最も良く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】図１Ａは、ｋｌｋ３の組み込みおよびａｃｔＡの欠失後の、Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の染色体領域の概略図を示す。
【００４６】
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｋｌｋ３遺伝子がＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ染色体に組み込まれることを示す。ｋｌｋ３特異的プライマーを使用した各構築物の染色体ＤＮＡ調製物のＰＣＲによって、野生型タンパク質の分泌シグナル配列を欠如したｋｌｋ３遺伝子に対応する７１４ｂｐのバンドを増幅する。
【００４７】
【図２Ａ】図２Ａは、ｐＡＤＶ１３４プラスミドのマップを示す。
【００４８】
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＬｍｄｄＡ−１３４培養上清由来のタンパク質を沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗Ｅ７モノクローナル抗体を使用したウェスタンブロットによって検出したＬＬＯ−Ｅ７タンパク質を示す。抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモーター、切断型ＬＬＯおよびヒトＰＳＡ遺伝子（ｋｌｋ３）のＯＲＦからなる。
【００４９】
【図２Ｃ】図２Ｃは、ｐＡＤＶ１４２プラスミドのマップを示す。
【００５０】
【図２Ｄ】図２Ｄは、抗ＰＳＡおよび抗ＬＬＯ抗体を使用したウェスタンブロットによって示されたＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現を示す。
【００５１】
【図３Ａ】図３Ａは、選択圧（Ｄ−アラニン）をかけて、およびかけないで培養した場合のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるプラスミド安定性を示す。株および培養条件を最初に挙げ、ＣＦＵ決定のために使用したプレートを後に挙げる。
【００５２】
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのクリアランスおよびこの期間中にプラスミドが喪失する可能性の評価を示す。細菌をｉ．ｖ．注射して、指示した時点で脾臓から単離した。ＣＦＵは、ＢＨＩおよびＢＨＩ＋Ｄ−アラニンプレートで決定した。
【００５３】
【図４Ａ】図４Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１０８ＣＦＵを投与した後のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるクリアランスを示す。ＣＦＵの数は、ＢＨＩ／ｓｔｒプレートに播種することによって決定した。この方法の検出限界は１００ＣＦＵであった。
【００５４】
【図４Ｂ】図４Ｂは、１０４０３Ｓ、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡおよびＸＦＬ７株によるＪ７７４細胞の細胞感染アッセイを示す。
【００５５】
【図５Ａ】図５Ａは、ナイーブおよびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスの、ブースター投与量の後、６日目の脾細胞におけるＰＳＡ４量体特異的細胞を示す。
【００５６】
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＰＳＡペプチドで５時間刺激した、ナイーブおよびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスの脾細胞におけるＩＦＮ−γの細胞内サイトカイン染色を示す。
【００５７】
【図５Ｃ】図５Ｃおよび５Ｄは、カスパーゼをベースにしたアッセイ（図５Ｃに示す）およびユーロピウムをベースにしたアッセイ（図５Ｄに示す）を使用して、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスおよびナイーブマウス由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて刺激したエフェクターＴ細胞による、ＰＳＡペプチドでパルスしたＥＬ４細胞の比溶解を、様々なエフェクター／標的比で示す。
【図５Ｄ】図５Ｃおよび５Ｄは、カスパーゼをベースにしたアッセイ（図５Ｃに示す）およびユーロピウムをベースにしたアッセイ（図５Ｄに示す）を使用して、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスおよびナイーブマウス由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて刺激したエフェクターＴ細胞による、ＰＳＡペプチドでパルスしたＥＬ４細胞の比溶解を、様々なエフェクター／標的比で示す。
【００５８】
【図５Ｅ】図５Ｅは、ＰＳＡペプチドの存在下で、またはペプチドなしで２４時間刺激した後に得られたナイーブおよび免疫化脾細胞におけるＩＦＮγスポットの数を示す。
【００５９】
【図６ＡＢ】図６Ａ〜６Ｃは、ＬｍｄｄＡ−１４２による免疫化がＴｒａｍｐ−Ｃ１−ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）腫瘍の退縮を誘導することを示す。マウスは未処置のままにするか（ｎ＝８）（図６Ａ）、またはＬｍｄｄＡ−１４２（１ｘ１０８ＣＦＵ／マウス）（ｎ＝８）（図６Ｂ）もしくはＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ｎ＝８）、（図６Ｃ）で７、１４および２１日目にｉ．ｐ．免疫化する。腫瘍サイズは各個体の腫瘍について測定し、値は平均直径をミリメートルで表した。各線は個々のマウスを表す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、ＬｍｄｄＡ−１４２による免疫化がＴｒａｍｐ−Ｃ１−ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）腫瘍の退縮を誘導することを示す。マウスは未処置のままにするか（ｎ＝８）（図６Ａ）、またはＬｍｄｄＡ−１４２（１ｘ１０８ＣＦＵ／マウス）（ｎ＝８）（図６Ｂ）もしくはＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ｎ＝８）、（図６Ｃ）で７、１４および２１日目にｉ．ｐ．免疫化する。腫瘍サイズは各個体の腫瘍について測定し、値は平均直径をミリメートルで表した。各線は個々のマウスを表す。
【００６０】
【図７Ａ】図７Ａは、未処置マウスおよびＬｍ対照株またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ−１４２）のいずれかで免疫化したマウスの脾臓および浸潤性Ｔ−ＰＳＡ−２３腫瘍におけるＰＳＡ−４量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の分析を示す。
【００６１】
【図７Ｂ】図７Ｂは、未処置マウスおよびＬｍ対照株またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのいずれかで免疫化したマウスの脾臓および浸潤性Ｔ−ＰＳＡ−２３腫瘍における、ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋として定義されるＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の分析を示す。
【００６２】
【図８Ａ】図８Ａは、ｋｌｋ３の組み込みおよびａｃｔＡの欠失後の、Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の染色体領域の概略図を示す。
【００６３】
【図８Ｂ】図８Ｂは、ｋｌｋ３遺伝子がＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ染色体に組み込まれることを示す。ｋｌｋ３特異的プライマーを使用した各構築物の染色体ＤＮＡ調製物からのＰＣＲによって、ｋｌｋ３遺伝子に対応する７６０ｂｐのバンドを増幅する。
【００６４】
【図９Ａ】図９Ａは、Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３がＬＬＯ−ＰＳＡタンパク質を分泌することを示す。細菌培養上清由来のタンパク質を沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＬＬＯおよびＬＬＯ−ＰＳＡタンパク質を抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体を使用したウェスタンブロットによって検出した。
【００６５】
【図９Ｂ】図９Ｂは、Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３によって産生されたＬＬＯが溶血活性を保持していることを示す。ヒツジ赤血球細胞を、連続希釈した細菌培養上清とともにインキュベートし、５９０ｎｍの吸光度によって溶血活性を測定した。
【００６６】
【図９Ｃ】図９Ｃは、Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３がマクロファージ様Ｊ７７４細胞の内部で生育することを示す。Ｊ７７４細胞を細菌で１時間インキュベートし、次いでゲンタマイシン処理して細胞外細菌を殺滅した。細胞内生育は、指示した時点で得られたＪ７７４溶解物の連続希釈物を播種することによって測定した。Ｌｍ１０４０３Ｓは、これらの実験の対照として使用した。
【００６７】
【図１０】図１０は、Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３によるマウスの免疫化がＰＳＡ特異的免疫応答を誘導することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを１週間間隔で１×１０８ＣＦＵのＬｍｄｄ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４３またはＬｍｄｄＡ−１４２で２回免疫化し、７日後に脾臓を採取した。脾細胞はモネンシンの存在下でＰＳＡ６５〜７４ペプチド１μＭで５時間刺激した。細胞はＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ６２Ｌおよび細胞内ＩＦＮ−γで染色し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ血球計数器で分析した。
【００６８】
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、ＡＤＸＳ３１−１６４の構築に関する。図１１Ａは、ｐＡｄｖ１６４のプラスミドマップを示しており、ＬｍｄｄＡ株における染色体ｄａｌ−ｄａｔ欠失の補完のために、構成型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｐ６０プロモーターの制御下にｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｄａｌ遺伝子を有する。これは、３個の断片Ｈｅｒ２／ｎｅｕ：ＥＣ１（ａａ４０〜１７０）、ＥＣ２（ａａ３５９〜５１８）およびＩＣＩ（ａａ６７９〜８０８）の直接融合によって構築された切断型ＬＬＯ（１〜４４１）のキメラヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子への融合物も含有する。図１１Ｂは、抗ＬＬＯ抗体でブロットしたＴＣＡ沈殿細胞培養上清のウェスタンブロット分析によって、ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌がＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８）およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）において検出されたことを示す。約１０４ＫＤの特異なバンドはｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に対応する。内因性ＬＬＯは５８ＫＤバンドとして検出される。Ｌｉｓｔｅｒｉａ対照はＣｈＨｅｒ２発現を欠如していた。
【００６９】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、ＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性特性を示す。図１２Ａは、免疫化したマウスの脾細胞において、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  Ｌｉｓｔｅｒｉａベースのワクチンによって誘発された細胞傷害性Ｔ細胞応答を、ステミュレーターとしてＮＴ−２細胞、標的として３Ｔ３／ｎｅｕ細胞を使用して試験したことを示す。Ｌｍ対照は、あらゆる点で同一であるが、無関係な抗原（ＨＰＶ１６−Ｅ７）を発現するＬｍｄｄＡバックグラウンドをベースにした。図１２Ｂは、マイトマイシンＣ処理ＮＴ−２細胞でｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて２４時間刺激した後の、免疫化したＦＶＢ／Ｎマウスの脾細胞によって細胞培養培地中に分泌され、ＥＬＩＳＡによって測定されたＩＦＮ−γを示す。図１２Ｃは、タンパク質の様々な領域のペプチドとのｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションに応答した、キメラワクチンで免疫化したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの脾細胞によるＩＦＮ−γ分泌を示す。組換えＣｈＨｅｒ２タンパク質は陽性対照として使用し、無関係なペプチドまたはペプチドなしの群を図脚注に列挙したように陰性対照を構成した。ＩＦＮ−γ分泌は、７２時間共インキュベーションした後に採取した細胞培養上清を使用して、ＥＬＩＳＡアッセイによって検出した。各データ点は、３連のデータの平均＋／−標準誤差である。＊Ｐ値＜０．００１。
【００７０】
【図１３】図１３は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ−ＣｈＨｅｒ２／ｎｅｕワクチンの腫瘍予防研究を示す。Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスに各組換えＬｉｓｔｅｒｉａ−ＣｈＨｅｒ２または対照Ｌｉｓｔｅｒｉａワクチンを６回注射した。免疫化は６週齢から開始し、３週間毎に２１週まで継続した。腫瘍の出現は、週１回の頻度でモニターし、腫瘍を有さないマウスの百分率で表した。＊ｐ＜０．０５、Ｎ＝群当たり９。
【００７１】
【図１４】図１４は、脾臓におけるＴｒｅｇの％に対するＡＤＸＳ３１−１６４による免疫化の効果を示す。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６個のＮＴ−２細胞をｓ．ｃ．接種し、各ワクチンで１週間間隔で３回免疫化した。脾臓は、第２の免疫化の７日後に採取した。免疫細胞を単離した後、Ｔｒｅｇを検出するために抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３抗体で染色した。ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を示す代表的実験のＴｒｅｇのドットプロットは、様々な処置群にわたる全ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率として表した。
【００７２】
【図１５Ａ】図１５Ａおよび１５Ｂは、ＮＴ−２腫瘍における腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの％に対するＡＤＸＳ３１−１６４による免疫化の効果を示す。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６個のＮＴ−２細胞をｓ．ｃ．接種し、各ワクチンで１週間間隔で３回免疫化した。腫瘍は、第２の免疫化の７日後に採取した。免疫細胞を単離した後、Ｔｒｅｇを検出するために抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３抗体で染色した。図１５Ａは、代表的実験のＴｒｅｇのドットプロットを示す。図１５Ｂは、様々な処置群にわたる全ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率（左図）および腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（右図）として表した、ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を示す。データは、２回の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび１５Ｂは、ＮＴ−２腫瘍における腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの％に対するＡＤＸＳ３１−１６４による免疫化の効果を示す。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６個のＮＴ−２細胞をｓ．ｃ．接種し、各ワクチンで１週間間隔で３回免疫化した。腫瘍は、第２の免疫化の７日後に採取した。免疫細胞を単離した後、Ｔｒｅｇを検出するために抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３抗体で染色した。図１５Ａは、代表的実験のＴｒｅｇのドットプロットを示す。図１５Ｂは、様々な処置群にわたる全ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率（左図）および腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（右図）として表した、ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を示す。データは、２回の独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。
【００７３】
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、ＡＤＸＳ３１−１６４によるワクチン接種が脳における乳がん細胞株の生育を遅延させることができることを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスをＡＤＸＳ３１−１６４または対照Ｌｉｓｔｅｒｉａワクチンで３回免疫化した。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞（５，０００個）を麻酔したマウスの頭蓋内に注射した。図１６Ａは、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｘ−１００ＣＣＤカメラを使用して指示した日に実施したマウスのｅｘ  ｖｉｖｏ画像化を示す。図１６Ｂは、１秒当たり表面積１ｃｍ２当たりの光子の数としてグラフ化したピクセル強度を示し、これは平均ラジアンスとして示されている。図１６Ｃは、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体を使用したウェスタンブロットによって検出した、ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞、４Ｔ１−ＬｕｃおよびＮＴ−２細胞株によるＨｅｒ２／ｎｅｕの発現を示す。マウスマクロファージ様細胞株であるＪ７７４．Ａ２細胞を陰性対照として使用した。
【００７４】
【図１７】図１７Ａ〜Ｃは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａタンパク質ミニ遺伝子構築物の概略マップを示す。図１７Ａは、オボアルブミン由来ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを生成する構築物（配列番号１）を示す。図１７Ｂは、ＰＣＲクローニングによってＧＢＭ由来ペプチドがＳＩＩＮＦＥＫＬの代わりに導入された同等の組換えタンパク質を示す。図１７Ｃは、Ｌｉｓｔｅｒｉａの株の４の別々のペプチド抗原を発現するように設計された構築物を示す。
【００７５】
【図１８】図１８は、プラスミドｐＡｄｖ２１１、ｐＡｄｖ２２３およびｐＡｄｖ２２４を作製するためのプラスミド骨格ｐＡｄｖ１４２（図１Ｃ参照）中における様々なＡｃｔＡ  ＰＥＳＴ領域のクローニングを示す概略図を示す。この概略図は、様々なＡｃｔＡコーディング領域が、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで制限された骨格プラスミドｐＡｄｖ１４２中のＬｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ  Ｏシグナル配列にインフレームでクローニングされたことを示す。
【００７６】
【図１９Ａ】図１９Ａは、移植可能な腫瘍モデルとしてＴＰＳＡ２３を使用した腫瘍退縮研究を示す。マウス８匹の３群に０日目に１×１０６個の腫瘍細胞を移植し、６、１３および２０日目に１０８ＣＦＵの様々な治療：ＬｍｄｄＡ１４２、ＬｍｄｄＡ２１１、ＬｍｄｄＡ２２３およびＬｍｄｄＡ２２４で処置した。ナイーブマウスにはいかなる処置も施さなかった。腫瘍は毎週モニターし、腫瘍の平均直径が１４〜１８ｍｍになったらマウスを屠殺した。グラフ中の印はそれぞれ、個々のマウスの腫瘍サイズを表す。実験を２回反復したところ、類似の結果が得られた。
【００７７】
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、実験の異なる日におけるナイーブマウスおよび免疫化したマウスの生存百分率を示す。
【００７８】
【図２０Ａ】図２０Ａ〜Ｂは、４量体染色（図２０Ａ）およびＩＦＮ−γの細胞内サイトカイン染色（図２０Ｂ）によって調べたＰＳＡ特異的免疫応答を示す。マウスを３回１０８ＣＦＵの様々な治療：ＬｍｄｄＡ１４２（ＡＤＸＳ３１−１４２）、ＬｍｄｄＡ２１１、ＬｍｄｄＡ２２３およびＬｍｄｄＡ２２４で１週間間隔で免疫化した。免疫アッセイのために、脾臓を２回目のブースト後６日目に採取した。マウス２匹／群の脾臓をこの実験のためにプールした。図２０Ａでは、ナイーブ、ＬｍｄｄＡ１４２、ＬｍｄｄＡ２１１、ＬｍｄｄＡ２２３およびＬｍｄｄＡ２２４で免疫化したマウスの脾臓におけるＰＳＡ特異的Ｔ細胞を、ＰＳＡ−エピトープ特異的４量体染色を使用して検出した。細胞をマウス抗ＣＤ８（ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ３（Ｐｅｒｃｐ−Ｃｙ５．５）、抗ＣＤ６２Ｌ（ＡＰＣ）およびＰＳＡ４量体−ＰＥで染色し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒによって分析した。図２０Ｂでは、細胞内サイトカイン染色によって、ＰＳＡ特異的Ｈ−２Ｄｂペプチド（ＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬ；配列番号５９）１μＭで５時間刺激した後のナイーブおよび免疫化したマウスにおけるＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞の百分率を検出した。
【図２０Ｂ】図２０Ａ〜Ｂは、４量体染色（図２０Ａ）およびＩＦＮ−γの細胞内サイトカイン染色（図２０Ｂ）によって調べたＰＳＡ特異的免疫応答を示す。マウスを３回１０８ＣＦＵの様々な治療：ＬｍｄｄＡ１４２（ＡＤＸＳ３１−１４２）、ＬｍｄｄＡ２１１、ＬｍｄｄＡ２２３およびＬｍｄｄＡ２２４で１週間間隔で免疫化した。免疫アッセイのために、脾臓を２回目のブースト後６日目に採取した。マウス２匹／群の脾臓をこの実験のためにプールした。図２０Ａでは、ナイーブ、ＬｍｄｄＡ１４２、ＬｍｄｄＡ２１１、ＬｍｄｄＡ２２３およびＬｍｄｄＡ２２４で免疫化したマウスの脾臓におけるＰＳＡ特異的Ｔ細胞を、ＰＳＡ−エピトープ特異的４量体染色を使用して検出した。細胞をマウス抗ＣＤ８（ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ３（Ｐｅｒｃｐ−Ｃｙ５．５）、抗ＣＤ６２Ｌ（ＡＰＣ）およびＰＳＡ４量体−ＰＥで染色し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒによって分析した。図２０Ｂでは、細胞内サイトカイン染色によって、ＰＳＡ特異的Ｈ−２Ｄｂペプチド（ＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬ；配列番号５９）１μＭで５時間刺激した後のナイーブおよび免疫化したマウスにおけるＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞の百分率を検出した。
【００７９】
【図２１】図２１Ａ〜Ｃは、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２（ＬＡ２２９）融合ＰＳＡおよびｔＬＬＯ融合ＰＳＡを使用することによってＣ５７ＢＬ６マウスにおける免疫応答生成研究をするために、腫瘍モデルＴＰＳＡ２３を使用したことを示す。マウス５匹の４群に０日目に１×１０６個の腫瘍細胞を移植し、６および１４日目に１０８ＣＦＵの様々な治療：ＬｍｄｄＡ２７４、ＬｍｄｄＡ４２（ＡＤＸＳ３１〜１４２）およびＬｍｄｄＡ２１１で処置した。ナイーブマウスにはいかなる処置も施さなかった。最後の免疫化後６日目に、脾臓および腫瘍を各マウスから収集した。図２１Ａは、免疫化後１３日目の腫瘍体積を示す表である。ＰＳＡ特異的免疫応答は、脾臓（図２１Ｂ）および腫瘍（図２１Ｃ）において５量体染色によって調べた。免疫アッセイのために、マウス２匹／群またはマウス３匹／群から脾臓をプールし、マウス５匹／群から腫瘍をプールした。細胞をマウス抗ＣＤ８（ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ３（Ｐｅｒｃｐ−Ｃｙ５．５）、抗ＣＤ６２Ｌ（ＡＰＣ）およびＰＳＡ５量体−ＰＥで染色し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒによって分析した。
【００８０】
【図２２】図２２は、全ネオ抗原および患者ＨＬＡ型を含有する出力データを使用した、送達ベクター、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおいて使用するための１つまたは複数のネオエピトープを含む個別化プラスミドベクターのＤＮＡ配列を生成する方法（手動または自動）の流れ図を示す。
【００８１】
【図２３Ａ】図２３Ａは、Ｌｍ  Ｎｅｏ構築物による処置を含むＢ１６Ｆ１０腫瘍実験のタイムラインを示す。
【００８２】
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、陰性対照として使用したＰＢＳを含めた、ＬｍｄｄＡ２７４、Ｌｍ−Ｎｅｏ−１２およびＬｍ−Ｎｅｏ−２０による腫瘍退縮を示す。
【００８３】
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、陰性対照として使用したＰＢＳを含めた、ＬｍｄｄＡ２７４、Ｌｍ−Ｎｅｏ−１２またはＬｍ−Ｎｅｏ−２０で処置した後のＢ１６Ｆ１０腫瘍を有するマウスの生存を比較する。
【００８４】
【図２４ＡＢ】図２４Ａ〜Ｃは、ＰＳＡ−サバイビン−ＳＩＩＮＦＥＫＬ（図２４Ａ）、ＳＩＩＮＦＥＫＬを含まないＰＳＡ−サバイビン（図２４Ｂ）およびＮｅｏ２０−ＳＩＩＮＦＥＫＬ（図２４Ｃ）の発現および分泌レベルを示す。
【図２４Ｃ】図２４Ａ〜Ｃは、ＰＳＡ−サバイビン−ＳＩＩＮＦＥＫＬ（図２４Ａ）、ＳＩＩＮＦＥＫＬを含まないＰＳＡ−サバイビン（図２４Ｂ）およびＮｅｏ２０−ＳＩＩＮＦＥＫＬ（図２４Ｃ）の発現および分泌レベルを示す。
【００８５】
【図２５】図２５は、Ｎｅｏ２０抗原（Ｃ末端ＳＩＩＮＦＥＫＬタグを含む）または陰性対照に対するＣＤ８Ｔ細胞応答を示す。グラフは、各条件のＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答パーセントを示す。
【００８６】
【図２６Ａ】図２６Ａは、陰性対照として使用したＰＢＳを含めた、ＬｍｄｄＡ２７４、Ｌｍ−Ｎｅｏ−１２、Ｌｍ−Ｎｅｏ−２０およびＬｍ−Ｎｅｏ３０による腫瘍退縮を示す。
【００８７】
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、陰性対照として使用したＰＢＳを含めた、ＬｍｄｄＡ２７４、Ｌｍ−Ｎｅｏ−１２、Ｌｍ−Ｎｅｏ−２０およびＬｍ−Ｎｅｏ３０で処置した後のＢ１６Ｆ１０腫瘍を有するマウスの生存を比較する。
【００８８】
【図２７】図２７は、前立腺腺癌（ＰＲＡＤ）、膵臓腺癌（ＰＡＡＤ）、浸潤性乳癌（ＢＲＣＡ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ＯＶ）および甲状腺癌（ＴＨＣＡ）におけるフレームシフト変異によるペプチドの分析を示す。
【００８９】
【図２８】図２８は、Ｌｍ構築物で免疫化した、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞から得られたフレームシフト変異（フレームシフト１またはフレームシフト２）を分泌するＢ１６Ｆ１０腫瘍を有するマウスでは、空のベクター陰性対照（ＬｍｄｄＡ−２７４）のみで処置した腫瘍を有する動物と比較して、腫瘍生育が減少したことを示す。Ｎｅｏ１２構築物を陽性対照として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
例示を単純かつ明確にするために、図で示したエレメントは一定の拡大縮小率で描画する必要はないことを理解されたい。例えば、エレメントのいくつかの寸法は明確にするためにその他のエレメントに対して誇張されていてもよい。さらに、適切であるとみなされる場合、参照した数字は、対応する、または類似するエレメントを示すために図の間で繰り返してもよい。
【００９１】
以下の詳細な説明において、本開示の十分な理解を提供するために、複数の特定の詳細を述べる。しかし、これらの特定の詳細がなくとも本開示を実践できることは当業者によって理解されると予想される。他の例において、周知の方法、手順、および成分は、本開示をあいまいにしないために詳細には記載していない。
【００９２】
ネオ抗原は、それによって非同義変異が起こる、腫瘍細胞ＤＮＡ（または他の疾患もしくは状態）における変異に由来する。これらの変異のほとんどによって、単一のアミノ酸置換が起こり、これはＭＨＣクラスＩ分子に結合して、提示され、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識され得る。しかし、一部の例において、１つまたは２つのヌクレオチドの挿入または欠失（インデル）によって、宿主免疫系によって異物として認識され、潜在的なネオ抗原性配列に富む供給源を表す全く独自のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするフレームシフト変異が産生され得る。しかし、Ｔ細胞標的化免疫療法のためのこれらのフレームシフト由来ポリペプチド配列の使用は制限されている。これらの制限のうちの１つは、フレームシフト変異に由来するｍＲＮＡ配列に関連する翻訳レベルが限定的であることである。これは、一般的にフレームシフト変異に存在する早期の終止コドンを有するｍＲＮＡ配列が、わずか１または２ラウンドの翻訳後に分解される、ナンセンス依存性崩壊として知られる現象の結果である。したがって、フレームシフトエラーを含むヌクレオチド配列に由来するタンパク質は、極めて限定的な量で産生され、フレームシフト由来タンパク質に存在し得る抗原性ペプチドに対するＴ細胞応答の交差プライミングでのその利用能を重度に制限する。この理由から、Ｔ細胞媒介免疫療法の標的としてフレームシフト由来タンパク質の研究に費やされた努力はごく限定的であった。
【００９３】
ほとんどの腫瘍細胞などの非専門的な抗原提示細胞において発現されるタンパク質に由来する抗原に対するＴ細胞プライミングには、十分量のタンパク質が樹状細胞などの専門的な抗原提示細胞に移動する必要がある。このプロセスは、交差提示と呼ばれ、交差提示に起因するＴ細胞プライミングは、交差プライミングと呼ばれる。ナンセンス依存性崩壊は、フレームシフト関連配列の翻訳を１または２ラウンドのみに制限することから、交差提示および交差プライミングに利用できるタンパク質の量は不十分である可能性がある。そのため、内因性のＴ細胞プライミングに依存するいかなる免疫療法（例えば、チェックポイント調節剤、養子Ｔ細胞治療など）も、フレームシフト由来抗原にとって有効である可能性は低い。しかし、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答がプライミングされたら、それを破壊の標的とするように細胞表面上に十分な抗原性ペプチドを提示するために必要なタンパク質発現レベルは、交差プライミングに必要なレベルより極めて低い。したがって、本明細書に開示のＬｉｓｔｅｒｉａプラットフォームなどの組換え発現系を使用してフレームシフト関連抗原性配列を導入することによって、Ｔ細胞プライミング事象を達成することができれば、腫瘍細胞によって発現されるフレームシフト由来抗原を標的とすることが可能となる（例えば、本明細書に開示の実施例２２を参照されたい）。
【００９４】
１つの態様において、本明細書に開示されるのは、１つまたは複数の異種ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含む組換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を含む免疫療法送達ベクターであって、１つまたは複数の異種ペプチドが、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドを含む、免疫療法送達ベクターである。そのような免疫療法送達ベクターは、例えば組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であり得る。フレームシフト変異由来ペプチドは、例えば疾患特異的または状態特異的であり得る。
【００９５】
別の態様において、本明細書に開示の少なくとも１つの免疫療法送達ベクターを含む免疫原性組成物を本明細書に開示する。そのような免疫原性組成物は、例えばアジュバントをさらに含み得る。
【００９６】
別の態様において、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示の免疫療法送達ベクターまたは本明細書に開示の免疫原性組成物を被験体に投与することを含む、被験体における疾患または状態を処置、抑制、防止、または阻害する方法であって、１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドが、被験体の疾患を有するまたは状態を有する生物試料からの供給源核酸配列によってコードされている、方法である。そのような方法は、例えば、被験体において個別化された抗疾患または抗状態免疫応答を誘発することができ、個別化された免疫応答は１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドに標的化される。
【００９７】
別の態様において、本明細書に開示されるのは、疾患または状態を有する被験体のための個別化された免疫療法を作製するためのプロセスであって：（ａ）被験体の疾患を有するまたは状態を有する生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、健康な生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦと比較するステップであって、比較によって、疾患を有するまたは状態を有する生物試料からの１つまたは複数のＯＲＦ内でコードされる１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列が同定され、１つまたは複数の核酸配列のうちの少なくとも１つが、１つまたは複数のフレームシフト変異を含み、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドをコードする、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で同定された１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のペプチドを含む組換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を含む免疫療法送達ベクターを生成するステップとを含む、プロセスである。任意選択で、そのようなプロセスは、被験体に投与するための免疫療法送達ベクターまたはＤＮＡ免疫療法またはペプチド免疫療法を、既定の期間内、保存することをさらに含み得る。任意選択で、そのようなプロセスは、免疫療法ベクターを含む組成物を被験体に投与することをさらに含むことができ、投与によって、疾患または状態に対する個別化されたＴ細胞免疫応答が生成される。
【００９８】
１つの実施形態において、本明細書に開示されるのは、それぞれの核酸配列が、免疫原性ポリペプチドに融合した１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、前記１つまたは複数の無意味なペプチドが少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、前記１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれが、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、かつ前記供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から得られる、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株である。別の実施形態において、フレームシフト変異を、健康な生物試料から得られた供給源核酸配列と比較する。
【００９９】
別の実施形態において、前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、免疫原性ポリペプチドに融合した１つまたは複数のペプチドを含む１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列をさらに含み、前記１つまたは複数ペプチドは１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む。別の実施形態において、前記１つまたは複数ペプチドは無意味なペプチドである。
【０１００】
別の実施形態において、本開示は、それぞれの核酸配列が、免疫原性ポリペプチドに融合した１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列を含む免疫療法送達ベクターであって、前記１つまたは複数の無意味なペプチドが少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、前記１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれが、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、かつ前記供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から得られる、免疫療法送達ベクターに関する。
【０１０１】
別の実施形態において、前記免疫療法送達ベクターは、免疫原性ポリペプチドに融合した１つまたは複数のペプチドを含む１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列をさらに含み、前記１つまたは複数ペプチドは１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む。別の実施形態において、前記１つまたは複数ペプチドは無意味なペプチドである。
【０１０２】
別の実施形態において、本明細書に開示の少なくとも１つのフレームシフト変異は、複数のフレームシフト変異を含み、複数のフレームシフト変異は、同じ遺伝子内に存在する。別の実施形態において、本明細書に開示の少なくとも１つのフレームシフト変異は、複数のフレームシフト変異を含み、複数のフレームシフト変異は、同じ遺伝子内に存在しない。
【０１０３】
別の実施形態において、本明細書に開示の少なくとも１つのフレームシフト変異は、遺伝子のエクソンコード領域内にある。別の実施形態では、エクソンは、遺伝子の最後のエクソンである。別の実施形態では、本明細書に開示の１つまたは複数の無意味なペプチドは、疾患または状態を有する生物学的試料において発現される。別の実施形態において、本明細書に開示の１つまたは複数の無意味なペプチドは、翻訳後切断部位をコードしない。別の実施形態において、供給源核酸配列は、１つまたは複数のマイクロサテライト不安定性領域を含む。
【０１０４】
別の実施形態において、本明細書に開示の１つまたは複数のネオエピトープは、Ｔ細胞エピトープを含む。
【０１０５】
別の実施形態において、本明細書に開示の１つまたは複数のネオエピトープは、がんまたは腫瘍関連ネオエピトープを含む。別の実施形態において、腫瘍関連ネオエピトープのがんは、疾患または状態に関連する自己抗原を含み、自己抗原は、がんもしくは腫瘍関連ネオエピトープ、またはがん特異的もしくは腫瘍特異的ネオエピトープを含む。別の実施形態において、１つまたは複数のネオエピトープを含む本明細書に開示の１つまたは複数の無意味なペプチドは、感染疾患関連または疾患特異的ネオエピトープを含む。
【０１０６】
別の実施形態において、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａは、一つまたは複数の組換えポリペプチドを発現および分泌する。
【０１０７】
別の実施形態において、本明細書に開示の１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片はそれぞれ、免疫原性ポリペプチドに融合されている。別の実施形態において、本明細書に開示の１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片は、Ｎ末端からＣ末端まで、複数の作動可能に連結された無意味なペプチドまたはその断片を含み、免疫原性ポリペプチドは、複数の無意味なペプチドまたはその断片の１つに融合されている。
【０１０８】
別の実施形態において、本明細書に開示の１つまたは複数のペプチドまたはその断片はそれぞれ、免疫原性ポリペプチドに融合される。別の実施形態において、本明細書に開示の１つまたは複数のペプチドまたはその断片は、Ｎ末端からＣ末端まで、複数の作動可能に連結されたペプチドまたはその断片を含み、免疫原性ポリペプチドは、複数のペプチドまたはその断片の１つに融合される。
【０１０９】
一実施形態において、本明細書に開示のペプチドは、意味のあるペプチドである。別の実施形態において、ペプチドは、無意味なペプチドである。
【０１１０】
別の実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、変異したリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、切断型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列である。免疫原性ポリペプチドは、例えば、ＰＥＳＴ含有ペプチドを含み得る。
【０１１１】
別の実施形態において、本明細書に開示の１つまたは複数の組換えポリペプチドは、任意選択でリンカー配列を介してＣ末端でタグに作動可能に連結される。別の実施形態において、タグは、６×ヒスチジンタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド、６×ヒスチジンに作動可能に連結された６×ヒスチジンタグ、およびその任意の組み合わせを含む群より選択される。
【０１１２】
別の実施形態において、組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、ｐｈｌｙ−ｔＬＬＯ−［無意味なペプチドまたはその断片−グリシンリンカー（４×）−無意味なペプチドまたはその断片−グリシンリンカー（４×）］ｎ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓタグ−２×終止コドンを含む成分をコードし、無意味なペプチドまたはその断片が約２１アミノ酸の長さであり、ｎ＝１〜２０である。
【０１１３】
別の実施形態において、組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、ｐｈｌｙ−ｔＬＬＯ−［ペプチドまたはその断片−グリシンリンカー（４×）−ペプチドまたはその断片−グリシンリンカー（４×）］ｎ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓタグ−２×終止コドンを含む成分をコードし、ペプチドまたはその断片が約２１アミノ酸の長さであり、ｎ＝１〜２０である。
【０１１４】
別の実施形態において、本明細書に開示の組換えポリペプチドをコードする本明細書に開示の少なくとも１つの核酸配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａのゲノムに組み込まれている。別の実施形態において、組換えポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列は、プラスミドに存在する。
【０１１５】
別の実施形態において、本明細書に開示のＬｉｓｔｅｒｉａ株は、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株である。別の実施形態において、ＬｉｓｔｅｒｉａはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。
【０１１６】
別の実施形態において、本明細書に開示の弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａは１つまたは複数の内因性遺伝子において変異を含む。別の実施形態において、内因性遺伝子の変異は、ａｃｔＡ遺伝子変異、ｐｒｆＡ変異、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ二重変異、ｄａｌ／ｄａｌ遺伝子二重変異、もしくはｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ遺伝子三重変異、またはその組み合わせから選択される。
【０１１７】
別の実施形態において、組換えポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列は、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含むか、またはＬｉｓｔｅｒｉａ株が代謝酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む第２の核酸配列を含む。別の実施形態において、代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。
【０１１８】
別の実施形態において、本明細書に開示の無意味なペプチドは、疾患を有する生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、健康な生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦとを比較することよって得られ、比較により、核酸配列内の１つまたは複数のフレームシフト変異が同定され、ここで、変異を含む核酸配列は、疾患を有する生物試料からの前記１つまたは複数のＯＲＦ内でコードされる１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドをコードする。
【０１１９】
別の実施形態において、本明細書に開示の疾患を有する生物試料は、疾患または状態を有する被験体から得られる。別の実施形態において、健康な生物試料は、疾患または状態を有する被験体から得られる。
【０１２０】
別の実施形態において、無意味なペプチドは、（ｉ）無意味なペプチドから１つまたは複数の異なるペプチド配列を生成すること、および任意選択で（ｉｉ）（ｉ）で生成されたそれぞれのペプチドをスクリーニングして、Ｔ細胞受容体が結合するＭＨＣクラスＩ複合体またはＭＨＣクラスＩＩ複合体による結合に関して選択すること、によってネオエピトープに関して特徴付けられる。
【０１２１】
１つの実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載される通りのＬｉｓｔｅｒｉａ株のいずれか１つの少なくとも１つを含む免疫原性組成物である。
【０１２２】
別の実施形態において、本明細書に開示の免疫原性組成物は、追加のアジュバントをさらに含む。
【０１２３】
１つの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載される通りの免疫原性組成物を被験体に投与することを含む、疾患または状態を有する被験体において個別化された標的化免疫応答を誘発する方法であって、免疫応答が、被験体の疾患または状態を有する生物試料中に存在する１つまたは複数のネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片に標的化される、方法である。
【０１２４】
１つの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載される通りの免疫原性組成物を被験体に投与することを含む、被験体における疾患または状態を処置、抑制、防止、または阻害する方法である。
【０１２５】
１つの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載される通りの免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む、被験体の脾臓および腫瘍におけるＴエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比率を増加させる方法であって、Ｔエフェクター細胞が、被験体の疾患または状態を有する生物試料中に存在する１つまたは複数のネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドに標的化される、方法である。
【０１２６】
１つの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載される通りの免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む、被験体におけるネオエピトープ特異的Ｔ細胞を増加させるための方法である。
【０１２７】
１つの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載される通りの免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む、腫瘍を有する、またはがんに罹っている、または感染疾患に罹っている被験体の生存期間を増大させるための方法である。
【０１２８】
１つの実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載される通りの免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む、被験体における腫瘍または転移のサイズを低減させる方法である。
【０１２９】
別の実施形態において、本明細書に開示される方法は、ブースター処置を投与することをさらに含む。
【０１３０】
別の実施形態において、本明細書に開示される方法は、被験体における個別化されて増強された抗感染疾患免疫応答を誘発する。別の実施形態において、方法は、個別化された抗がんまたは抗腫瘍免疫応答を誘発する。
Ｉ．個別化された免疫療法
【０１３１】
本明細書に開示されるのは、個別化された免疫療法、例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株である。例えば、そのような免疫療法送達ベクターは、１つまたは複数の異種ペプチドに融合されたＰＥＳＴ含有ペプチドを含む組換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を含むことができ、１つまたは複数の異種ペプチドは、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープ（例えば、Ｔ細胞エピトープ）を含む一つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドを含む。１つまたは複数のまたは全てのフレームシフト変異は、疾患特異的または状態特異的でありうる（すなわち、疾患または状態を有する生物試料からの供給源核酸配列には存在するが、健康な生物試料からの供給源核酸配列には存在しない）。疾患または状態からの供給源核酸配列は、例えば１つまたは複数のマイクロサテライト不安定性領域を含み得る。
【０１３２】
免疫療法送達ベクターは、任意の好適な免疫療法送達ベクター、例えば、ＤＮＡ免疫療法、ペプチド免疫療法もしくは組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または他の細菌株であり得る。
【０１３３】
フレームシフト変異は、遺伝子（例えば、タンパク質コード遺伝子）内の任意の場所に存在し得る。例えば、フレームシフト変異は、遺伝子の最後から２番目のエクソンまたは最後のエクソンに存在し得る。フレームシフト変異にコードされるフレームシフト変異由来ペプチドは任意の長さであり得る。例えば、そのようなフレームシフト変異由来ペプチドは、約８〜１０、１１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００または８〜５００アミノ酸の長さであり得る。一部のそのようなフレームシフト変異由来ペプチドは、翻訳後切断部位をコードしない。
【０１３４】
疾患または状態は、ネオエピトープを含む任意の疾患または状態であり得る。一例として、疾患または状態はがんまたは腫瘍であり得、１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドは、がん関連もしくは腫瘍関連ネオエピトープ、またはがん特異的もしくは腫瘍特異的ネオエピトープを含む。例えば、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープは、疾患または状態に関連する自己抗原を含むことができ、自己抗原は、がん関連もしくは腫瘍関連ネオエピトープまたはがん特異的もしくは腫瘍特異的ネオエピトープを含む。特定の腫瘍またはがんの例を、本明細書において他所で開示する。例えば、腫瘍またはがんは、黒色腫、肺がん（例えば、肺扁平上皮癌、肺腺癌、小細胞肺がん）、膀胱がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ（ｇａｓｔｒｉｃ）ｃａｎｃｅｒ）、食道がん（例えば、食道腺癌）、結腸直腸がん、子宮がん（子宮内膜がんまたは子宮のがん）、頭頸部がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多形神経膠芽腫、卵巣がん、腎細胞がん（腎細胞癌、例えば乳頭状腎細胞癌、明細胞腎細胞癌、および嫌色素性腎細胞癌）、多発性骨髄腫、膵臓がん、乳がん、低グレード神経膠腫、慢性リンパ球性白血病、前立腺がん、神経芽腫、カルチノイド腫瘍、髄芽腫、急性骨髄性白血病、甲状腺がん、急性リンパ芽球性白血病、ユーイング肉腫、またはラブドイド腫瘍であり得る。同様に、腫瘍またはがんは、膵臓がん（例えば、膵臓腺癌）、前立腺がん（例えば、前立腺腺癌）、乳がん（浸潤性乳癌）、卵巣がん（例えば、卵巣漿液性嚢胞腺癌）、または甲状腺がん（例えば、甲状腺癌）であり得る。他のタイプの腫瘍またはがんも同様に可能である。一部の例において、腫瘍は、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、もしくは１０未満の腫瘍関連もしくは腫瘍特異的（すなわち、健康な生物試料には存在しない）非同義ミスセンス変異を有する腫瘍であるか、またはがんは、異なる患者にわたる腫瘍関連もしくは腫瘍特異的（すなわち健康な生物組織には存在しない）非同義ミスセンス変異の数の平均値もしくは中央値が、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、もしくは１０未満の非同義ミスセンス変異であるタイプのがんであるか、またはがんは、そのタイプのがんを有する患者の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは１００％が、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、もしくは１０未満の腫瘍関連もしくは腫瘍特異的（すなわち、健康な生物試料には存在しない）非同義ミスセンス変異を有する腫瘍を有するがんである。別の例として、疾患または状態は、感染疾患であり得る。例えば１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドは、感染疾患関連または感染疾患特異的ネオエピトープを含む。
【０１３５】
組換えポリペプチドは、任意の数のネオエピトープを含み得る。例えば、組換えポリペプチドは、約１〜２０のネオエピトープを含み得る。他の可能性は本明細書において他所で開示する。
【０１３６】
１つまたは複数の異種ペプチドは、複数の異種ペプチドを含み得る。例えば、それらは、ＰＥＳＴ含有ペプチドが複数の異種ペプチドのうちの１つに融合されている、作動可能にタンデムに連結された複数の異種ペプチドを含み得る。同様に、組換えポリペプチドは、複数のフレームシフト変異由来ペプチドを含むことができ、それぞれのフレームシフト変異由来ペプチドは同じであるか、または異なる。２つのペプチドは、それらが少なくとも１つのアミノ酸が異なる場合、異なる。一部の例において、複数の異種ペプチドは、介在配列なしで互いに作動可能に連結される（例えば、ペプチド結合を介して互いに直接融合される）。あるいは、複数の異種ペプチドは、１つもしくは複数のペプチドリンカーまたは１つもしくは複数の４×グリシンリンカーなどの、１つまたは複数のリンカーを介して互いに作動可能に連結することができる。そのようなリンカーは、本明細書において他所で開示される。
【０１３７】
複数の異種ペプチドを含む一部のそのような組換えポリペプチドにおいて、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、Ｎ末端異種ペプチドに作動可能に連結される。これは、介在配列なしで直接連結することができ（例えば、ペプチド結合を介して互いに直接融合する）、あるいは１つもしくは複数のペプチドリンカーまたは１つもしくは複数の４×グリシンリンカーなどの、１つまたは複数のリンカーを介して連結することができる。そのようなリンカーは本明細書において他所で開示される。ＰＥＳＴ含有ペプチドの例には、変異したリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、切断型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列が挙げられる。他の例は、本明細書において他所で開示される。
【０１３８】
組換えポリペプチドはさらに、１つまたは複数のタグを含み得る。タグは、Ｎ末端、Ｃ末端、または本明細書において他所で開示される組換えポリペプチド内のいずれかに存在し得る。例えば、組換えポリペプチドのＣ末端を、タグに作動可能に連結させることができる。これは、介在配列なしで直接連結させることができ（例えば、ペプチド結合を介して互いに直接融合する）、あるいは１つもしくは複数のペプチドリンカーまたは１つもしくは複数の４×グリシンリンカーなどの、１つもしくは複数のリンカーを介して連結させることができる。そのようなリンカーは、本明細書において他所で開示される。タグの例として、６×ヒスチジンタグ、２×ＦＬＡＧタグ、３×ＦＬＡＧタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに作動可能に連結された６×ヒスチジンタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに作動可能に連結された３×ＦＬＡＧタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに作動可能に連結された２×ＦＬＡＧタグ、およびその任意の組み合わせが挙げられる。
【０１３９】
任意選択で、組換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、３’末端で２つの終止コドンを含む（例えば、タグをコードする配列の後）。そのようなオープンリーディングフレームの一例は、ｈｌｙプロモーターに作動可能に連結され、Ｎ末端からＣ末端まで、ｔＬＬＯ−［異種ペプチド］ｎ−（ペプチドタグ（複数可））−（２×終止コドン）を含む成分をコードし、ｎ＝２〜２０であり、少なくとも１つの異種ペプチドがフレームシフト変異由来ペプチドである。そのようなオープンリーディングフレームの別の例は、ｈｌｙプロモーターに作動可能に連結され、Ｎ末端からＣ末端まで、ｔＬＬＯ−［（異種ペプチド）−（グリシンリンカー（４×））］ｎ−（ペプチドタグ（複数可））−（２×終止コドン）を含む成分をコードし、ｎ＝２〜２０であり、少なくとも１つの異種ペプチドがフレームシフト変異由来ペプチドである。
【０１４０】
１つまたは複数の異種ペプチドは、フレームシフト変異にコードされるフレームシフト変異由来ペプチドではないペプチドをさらに含み得る。例えば、１つまたは複数の異種ペプチドは、１つまたは複数の非同義ミスセンス変異由来ペプチドをさらに含み得る。例として、一つまたは複数の異種ペプチドは、少なくとも１つの疾患特異的または状態特異的非同義ミスセンス変異を含む供給源核酸配列にコードされる一つまたは複数のペプチドをさらに含み得る。非同義−ミスセンス−変異由来ペプチドは、陽性免疫応答を誘発するのに十分である（例えば、Ｌｍ技術を使用して陽性免疫応答を誘発するのに十分である）任意の長さであり得る。例えば、それは、約５〜５０アミノ酸の長さ、約８〜２７アミノ酸の長さまたは約２１アミノ酸の長さであり得る。
【０１４１】
一部のそのような免疫療法送達ベクターは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の変種の例は、本明細書において他所で開示される。
【０１４２】
一実施形態において、本明細書に開示されるのは、それぞれの核酸配列が、免疫原性ポリペプチドに融合した１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、前記１つまたは複数の無意味なペプチドが少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、前記１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれが、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、かつ前記供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から得られる、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株である。
【０１４３】
一実施形態において、無意味なペプチドは、少なくとも１つの免疫原性ネオエピトープを含む。別の実施形態において、免疫原性ネオエピトープは、免疫系によってこれまで認識されていないエピトープを含む。ネオエピトープは、腫瘍抗原に関連し、腫瘍形成細胞において見出され得る。ネオエピトープは、タンパク質が生化学経路内で、グリコシル化、リン酸化、またはタンパク質分解などのさらなる修飾を受ける場合に形成され得る。すなわち、タンパク質またはその一部の構造を変化させることによって、新規のまたは「ネオ」エピトープまたはネオエピトープが産生され得る。
【０１４４】
体細胞変異もしくは変異または配列の差を発現するペプチドは、「ネオエピトープ」を含み得ることは、当業者に理解されると予想される。
【０１４５】
用語「ネオエピトープ」は、一実施形態において、正常な非がん性または生殖系列細胞または組織などの、参照試料中に存在しないエピトープを包含することができ、ネオエピトープは、疾患を有する組織、例えばがん細胞において見出されることは、当業者であればさらに認識しているものと予想される。例えば、正常な非がん性または生殖系列細胞はエピトープを含み得るが、がん細胞における１つまたは複数の変異により、エピトープの配列は変化し、それによって免疫原性のネオエピトープが起こり得る。別の実施形態において、ネオエピトープは、変異したエピトープを含む。別の実施形態において、ネオエピトープは、エピトープのいずれかの側に変異していない配列を有する。
【０１４６】
別の実施形態において、ネオエピトープは、免疫原性である。別の実施形態において、一つまたは複数のネオエピトープの少なくとも１つは、免疫原性である。
【０１４７】
別の実施形態において、本明細書に開示の一つまたは複数のネオエピトープは、ＭＨＣＩ分子上に存在する。別の実施形態において、１つまたは複数のネオエピトープは、ＭＨＣＩＩ分子上に存在する。さらに別の実施形態において、１つまたは複数のネオエピトープは、ＭＨＣＩ分子およびＭＨＣＩＩ分子の両方に存在する。
【０１４８】
一実施形態において、ネオエピトープは、直線状のエピトープである。別の実施形態において、ネオエピトープは、溶媒に曝露されており、そのためＴ細胞抗原受容体と接触可能であると考えられる。別の実施形態において、ネオエピトープは、コンホメーション的なエピトープである。
【０１４９】
別の実施形態において、ネオエピトープは、Ｔ細胞エピトープを含む。別の実施形態において、ネオエピトープは、適応免疫応答エピトープを含む。別の実施形態において、ネオエピトープネオエピトープまたはこれを含む抗原に対するＴ細胞免疫応答の誘導をもたらすことができる。別の実施形態において、本明細書に開示の１つまたは複数のネオエピトープは、免疫抑制性Ｔ−制御性ネオエピトープを含まないさらなる実施形態において、一つまたは複数のネオエピトープを含む、無意味なペプチドまたはその断片をコードする供給源核酸配列は、免疫抑制性エピトープをコードしない。
【０１５０】
別の実施形態において、本明細書に開示の一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープは、Ｋｙｔｅ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅのヒドロパシープロット上で最大１．６までのスコアを有する。
【０１５１】
別の実施形態において、ネオエピトープは、被験体の疾患もしくは状態に関連する。別の実施形態において、ネオエピトープは、被験体の疾患もしくは状態の原因となる。別の実施形態において、ネオエピトープは、疾患を有する生物学的試料内に存在する。別の実施形態において、ネオエピトープは、疾患を有する生物学的組織内に存在するが、疾患もしくは状態の原因となることもなく、これと関連もしない。別の実施形態において、疾患もしくは状態は、がんまたは腫瘍の生育を含む。さらに別の実施形態において、疾患もしくは状態は、感染性疾患または自己免疫疾患を含む。
【０１５２】
別の実施形態において、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドは、がんもしくは腫瘍関連ネオエピトープまたはがんもしくは腫瘍特異的ネオエピトープを含む。
【０１５３】
別の実施形態において、免疫原性ネオエピトープまたはその断片は、抗原、例えば、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）−１６−Ｅ６抗原、ＨＰＶ−１６−Ｅ７抗原、ＨＰＶ−１８−Ｅ６抗原、ＨＰＶ−１８−Ｅ７抗原、Ｈｅｒ／２−ｎｅｕ抗原、キメラＨｅｒ２抗原、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、二価ＰＳＡ抗原、ＥＲＧ抗原、アンドロゲン受容体（ＡＲ）抗原、ＰＡＫ６抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原、角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）抗原、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ−１）、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ抗原、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）抗原、プロテナーゼ３抗原、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）抗原、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、滑膜肉腫抗原、Ｘ（ＳＳＸ）−２抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、黒色腫関連抗原Ｅ（ＭＡＧＥ−Ａ、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４）、インターロイキン−１３受容体アルファ（ＩＬ１３−Ｒアルファ）抗原、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）抗原、サバイビン抗原、ＧＰ１００抗原、血管新生抗原、ｒａｓタンパク質抗原、ｐ５３タンパク質抗原、ｐ９７黒色腫抗原、ＫＬＨ抗原、ＭＡＲＴ１抗原、ＴＲＰ−２抗原、ＨＳＰ−７０抗原、ベータ−ＨＣＧ抗原、またはテスチシン（Ｔｅｓｔｉｓｉｎ）抗原の少なくとも一部を含む。
【０１５４】
別の実施形態において、ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ−３１である。別の実施形態において、ＨＰＶは、ＨＰＶ−３５である。別の実施形態において、ＨＰＶは、ＨＰＶ−３９である。別の実施形態において、ＨＰＶは、ＨＰＶ−４５である。別の実施形態において、ＨＰＶは、ＨＰＶ−５１である。別の実施形態において、ＨＰＶは、ＨＰＶ−５２である。別の実施形態において、ＨＰＶは、ＨＰＶ−５８である。別の実施形態において、ＨＰＶは、高リスク型ＨＰＶである。別の実施形態において、ＨＰＶは、粘膜型ＨＰＶである。
【０１５５】
別の実施形態において、ＨＰＶ  Ｅ６抗原は、ＨＰＶ媒介疾患、障害、または症状を処置または改善するために、本明細書に開示の組成物または方法においてＥ７抗原の代わりにまたはＥ７抗原に加えて利用される。別の実施形態において、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７は、ＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７の代わりにまたはＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７と組み合わせて利用される。そのような実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａは、染色体からＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７、ならびにプラスミドからＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７を発現し得るか、またはその逆も同様に発現し得る。別の実施形態において、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７抗原は、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａに存在するプラスミドから発現される。別の実施形態において、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７抗原は、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａの染色体から発現される。別の実施形態において、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８  Ｅ６およびＥ７抗原は、それぞれのＨＰＶ株からのそれぞれのＥ６およびＥ７抗原がプラスミドまたは染色体のいずれかから発現される場合を含む、上記の実施形態の任意の組み合わせで発現される。
【０１５６】
別の実施形態において、本明細書に開示の１つまたは複数のネオエピトープは、疾患または状態に関連する自己抗原を含み、自己抗原は、がんもしくは腫瘍関連ネオエピトープ、またはがん特異的もしくは腫瘍特異的ネオエピトープを含む。本明細書に開示の組成物および方法によって処置され得るがんまたは腫瘍は、本明細書に開示のがんまたは腫瘍に必ずしも限定されず、むしろ、当技術分野で公知の液体または固体の任意のがんまたは腫瘍を包含することは当業者であれば認識しているものと予想される。
【０１５７】
別の実施形態において、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドは、感染疾患関連または疾患特異的ネオエピトープを含む。別の実施形態において、本明細書に開示の感染疾患は、ウイルスまたは細菌感染症を含む。別の実施形態において、感染疾患は、以下の病原体：リーシュマニア、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（アメーバ症を引き起こす）、鞭虫、ＢＣＧ／結核、マラリア、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス、季節性インフルエンザ、Ａ（Ｈ１Ｎ１）型インフルエンザ汎発流行、麻疹および風疹、ムンプス、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、経口ポリオワクチン、一価、二価、および三価、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素（ボツリヌス中毒）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（ペスト）、Ｖａｒｉｏｌａ  ｍａｊｏｒ（天然痘）および他の関連ポックスウイルス、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス（Ｇｕａｎａｒｉｔｏ  ｖｉｒｕｓ）、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｒｕｓｅｓ）（デング熱）、フィロウイルス（エボラ、マールブルク）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ（Ｑ熱）、ブルセラ種（ブルセラ症）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ（鼻疽）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ（オウム病）、リシン毒素（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのイプシロン毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、チフス熱（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、他のリケッチア、食品および水媒介病原体、細菌（下痢原性Ｅ．Ｃｏｌｉ、病原性ビブリオ、赤痢菌種、サルモネラＢＣＧ／、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ウイルス（カリシウイルス、Ａ型肝炎、西ナイルウイルス、ラクロス、カリフォルニア脳炎、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌル森林ウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ））、原生動物（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙａｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、トキソプラズマ）、真菌（微胞子虫）、黄熱、薬物耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖａｇｉｎｏｓｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、Ｇｒａｎｕｌｏｍａ  ｉｎｇｕｉｎａｌｅ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、またはＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓのうちの１つによって引き起こされる。
【０１５８】
一実施形態において、本明細書に開示の１つまたは複数のネオエピトープは、本明細書に開示の異種抗原の少なくとも一部を含む。用語「異種」は、細菌から天然にまたは通常発現されない抗原またはその一部を包含し得ることは当業者であれば認識しているものと予想される。一実施形態において、異種抗原は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株から天然にまたは通常発現されない抗原を含む。
【０１５９】
本明細書に開示の用語「異種」は、参照種とは異なる種に由来する核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を包含することは、当業者であればさらに認識しているものと予想される。このため、例えば一実施形態において異種ポリペプチドを発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に対してネイティブもしくは内因性でないポリペプチドを発現するか、または別の実施形態においてＬｉｓｔｅｒｉａ株によって通常発現されないポリペプチドを発現するか、または別の実施形態においてＬｉｓｔｅｒｉａ株以外の供給源からのポリペプチドを発現すると予想される。別の実施形態において、異種は、同じ種内の異なる生物に由来する何かを記載するために使用され得る。別の実施形態において、異種抗原は、組換え株が哺乳動物細胞に感染した際に、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株によって発現され、プロセシングされて、細胞傷害性Ｔ細胞に提示される。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種によって発現される異種抗原は、それによって、哺乳動物において天然に発現される非改変抗原またはタンパク質を認識するＴ細胞応答が起こる限り、腫瘍細胞または感染物質における対応する非改変抗原またはタンパク質と正確に一致する必要はない。
【０１６０】
用語「異種抗原」は、本明細書において「抗原性ポリペプチド」、「異種タンパク質」、「異種タンパク質抗原」、「タンパク質抗原」、「抗原断片」、「抗原の一部」、「ポリペプチド」、「免疫原性ポリペプチド」、「無意味なペプチド」、「免疫原性ネオエピトープ」、「抗原」、および「ネオエピトープ」、またはその文法的同等物などを指すことができ、被験体に投与した場合に、または別の実施形態において宿主によって検出される場合に、プロセシングされて、前記被験体の細胞に存在するＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子上に提示され、免疫応答が開始される、本明細書に記載のポリペプチド、ペプチド、無意味なペプチド、または組換えペプチドを包含し得ることは当業者であれば認識しているものと予想される。一実施形態において、抗原は宿主に対して外来性であり得る。別の実施形態において、抗原は宿主に存在し得るが、宿主は、免疫寛容のために、それに対して免疫応答を誘発しない。別の実施形態において、抗原は、１つまたは複数のネオエピトープを含むネオ抗原である。
【０１６１】
一実施形態において、本明細書に開示される疾患は、感染性疾患である。一実施形態において、感染性疾患は、これらに限定されないが、以下の病原体：リーシュマニア、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（アメーバ症を引き起こす）、鞭虫、ＢＣＧ／結核、マラリア、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス、季節性インフルエンザ、Ａ（Ｈ１Ｎ１）型インフルエンザ汎発流行、麻疹および風疹、ムンプス、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、経口ポリオワクチン、一価、二価、および三価、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素（ボツリヌス中毒）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（ペスト）、Ｖａｒｉｏｌａ  ｍａｊｏｒ（天然痘）および他の関連ポックスウイルス、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス（Ｇｕａｎａｒｉｔｏ  ｖｉｒｕｓ）、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｒｕｓｅｓ）（デング熱）、フィロウイルス（エボラ、マールブルク）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ（Ｑ熱）、ブルセラ種（ブルセラ症）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ（鼻疽）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ（オウム病）、リシン毒素（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのイプシロン毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、チフス熱（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、他のリケッチア、食品および水媒介病原体、細菌（下痢原性Ｅ．Ｃｏｌｉ、病原性ビブリオ、赤痢菌種、サルモネラＢＣＧ／、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ウイルス（カリシウイルス、Ａ型肝炎、西ナイルウイルス、ラクロス、カリフォルニア脳炎、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌル森林ウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ））、原生動物（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙａｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、トキソプラズマ）、真菌（微胞子虫）、黄熱、薬物耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖａｇｉｎｏｓｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、Ｇｒａｎｕｌｏｍａ  ｉｎｇｕｉｎａｌｅ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓまたはここで記載されていない当技術分野において公知の任意の他の感染性疾患のうちのいずれか１つによって引き起こされるものである。
【０１６２】
一実施形態において、病原性原生動物および蠕虫感染症には、アメーバ症；マラリア；リーシュマニア症；トリパノソーマ症；トキソプラズマ症；ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ；バベシア症；ジアルジア鞭毛虫症；旋毛虫症；フィラリア症；住血吸虫症；線虫、吸虫または吸虫類、および条虫（サナダムシ）感染症が挙げられる。
【０１６３】
一実施形態において、ＨＰＶ抗原、例えば、本明細書に開示のＥ６またはＥ７抗原は、ＨＰＶ６株、およびＨＰＶ１１株、ＨＰＶ１６株、ＨＰＶ−１８株、ＨＰＶ−３１株、ＨＰＶ−３５株、ＨＰＶ−３９株、ＨＰＶ−４５株、ＨＰＶ−５１株ＨＰＶ−５２株、ＨＰＶ−５８株またはＨＰＶ−５９株から選択される。別の実施形態において、ＨＰＶ抗原は、高リスクＨＰＶ株から選択される。別の実施形態において、ＨＰＶ株は、粘膜型ＨＰＶである。別の実施形態において、ＨＰＶ抗原は、いぼおよび異形成を引き起こす６、１１型などの非腫瘍形成性ＨＰＶを含む全てのＨＰＶ株から選択することができる。
【０１６４】
別の実施形態において、抗原は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕである。別の実施形態において、抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１である。別の実施形態において、抗原は、ＬＭＰ−１である。別の実施形態において、抗原は、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）である。別の実施形態において、抗原は、ＰＳＭＡである。別の実施形態において、抗原は、ＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態において、抗原は、ＨＩＶ−１  Ｇａｇである。別の実施形態において、抗原は、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）である。別の実施形態において、抗原は、二価ＰＳＡである。別の実施形態において、抗原は、ＥＲＧである。別の実施形態において、抗原は、ＥＲＧ構築物ＩＩＩ型である。別の実施形態において、抗原は、ＥＲＧ構築物ＶＩ型である。別の実施形態において、抗原は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）である。別の実施形態において、抗原は、ＰＡＫ６である。別の実施形態において、抗原は、ＰＡＫ６のエピトープリッチ領域を含む。別の実施形態において、抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＣＣＥ、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＥＧＦＲ−ＩＩＩ、アポトーシスリピート含有バキュロウイルス阻害剤５（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ５）（ＢＩＲＣ５）、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｍｕｃ１、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、またはその組み合わせから選択される。別の実施形態において、抗原は、抗原の野生型形態を含む。別の実施形態において、抗原は抗原の変異体形態を含む。
【０１６５】
別の実施形態において、Ｈｅｒ−２タンパク質は、「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ」、「Ｅｒｂｂ２」、「ｖ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｃ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｎｅｕ」、または「ｃＮｅｕ」と呼ばれるタンパク質である。
【０１６６】
一実施形態において、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は、がん遺伝子のＭＨＣクラスＩエピトープのクラスターを示すＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原の２つの細胞外断片と１つの細胞内断片とを有し、別の実施形態において、キメラタンパク質は、３個のＨ２ＤｑおよびＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原（断片ＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１）のマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも１７個を有する。別の実施形態において、キメラタンパク質は、マッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ２およびＩＣ１）のうちの少なくとも１３個を有する。別の実施形態において、キメラタンパク質は、マッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ１およびＩＣ１）のうちの少なくとも１４個を有する。別の実施形態において、キメラタンパク質は、マッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ１およびＩＣ２）のうちの少なくとも９個を有する。
【０１６７】
一実施形態において、本明細書に開示の無意味なペプチドが由来する抗原は、真菌病原体、蠕虫、またはウイルスに由来する。他の実施形態において、本明細書に開示の無意味なペプチドが由来する抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスの血液凝集素分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶｇｐ１２０、ＨＩＶｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インスリンペプチドＢ、Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ抗原、ビブリオ（ｖｉｂｒｉｏｓｅ）抗原、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ抗原、肺炎球菌抗原、ＲＳウイルス抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ外膜タンパク質、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉウレアーゼ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓピリン、Ｎ．  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅピリン、黒色腫関連抗原チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５、もしくは−４５型ヒト乳頭腫ウイルスに由来するヒト乳頭腫ウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、メソテリン、またはＥＧＦＲＶＩＩＩから選択される。
【０１６８】
他の実施形態において、無意味なペプチドは、以下の疾患：コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、ムンプス、百日咳、天然痘、肺炎球菌肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、チフス、水痘−帯状疱疹、百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ）、黄熱病、アジソン病の免疫原および抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルトン症候群、固形腫瘍および血液媒介性腫瘍を含むがん、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓、心臓、膵臓、肺、骨、および肝臓移植片などの移植片の拒絶、グレーヴス病、多内分泌腺自己免疫疾患（ｐｏｌｙｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、肝炎、顕微鏡的多発動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ病、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節炎、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ウェゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン症候群、強膜、上強膜、ぶどう膜炎、慢性皮膚粘膜カンジダ症、蕁麻疹、乳児の一過性の低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、ウィスコット−アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ワルデンストレームマクログロブリン血症、アミロイドーシス、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、ならびにＬｉｓｔｅｒｉａ症のうちの１つに関連する抗原に由来する。別の実施形態において、本明細書に開示の状態は、異形成である。別の実施形態において、疾患は新生物である。別の実施形態において、疾患は、肛門上皮内新生物（ＡＩＮ）である。別の実施形態において、疾患は、膣上皮内新生物（ＶＩＮ）である。別の実施形態において、疾患は、子宮頸部上皮内新生物（ＣＩＮ）である。
【０１６９】
別の実施形態において、本明細書に開示の状態は、前悪性状態、または無処置のまま放置すれば慢性もしくは急性疾患の発症へと進行する状態である。
【０１７０】
別の実施形態において、本明細書に開示のペプチドが由来する抗原は、腫瘍関連抗原であり、一実施形態において、以下の腫瘍抗原：進行がんに関連するｒａｓペプチドまたはｐ５３ペプチド、のうちの１つである。当技術分野で公知の他の腫瘍関連抗原もまた、本開示において企図される。
【０１７１】
一実施形態において、無意味なペプチドは、全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第９，０８４，７４７号に記載のキメラＨｅｒ２抗原に由来する。
【０１７２】
「免疫原性ネオエピトープ」は、被験体に、単独で、または本明細書に開示の組成物とりわけしくはワクチンの一部として投与した場合に、免疫応答を誘発するエピトープであることは当業者であれば認識しているものと予想される。そのようなネオエピトープは、液性免疫応答および／または適応免疫応答のいずれかを誘発するために必要なエピトープを含む。一実施形態において、１つまたは複数の無意味なペプチド内に含まれる１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープは、被験体に投与した場合に液性免疫応答を誘発する。別の実施形態において、１つまたは複数の無意味なペプチド内に含まれる１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープは、被験体に投与した場合に適応免疫応答を誘発する。さらに別の実施形態において、１つまたは複数の無意味なペプチド内に含まれる１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープは、被験体に投与した場合に、液性免疫応答と適応免疫応答の両方を誘発する。
【０１７３】
別の実施形態において、本明細書に開示のネオエピトープ配列は、腫瘍特異的、転移特異的、細菌感染症特異的、ウイルス感染症特異的、またはその任意の組み合わせである。さらにまたはあるいは、ネオエピトープ配列は、炎症特異的、免疫調節分子エピトープ特異的、Ｔ細胞特異的、自己免疫疾患特異的、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）特異的、またはその任意の組み合わせである。さらなる実施形態において、ネオエピトープ配列は、腫瘍、がん、転移、細菌感染症、ウイルス感染症、炎症、免疫調節分子、Ｔ細胞、自己免疫疾患、またはその任意の組み合わせに関連する。それぞれの可能性は、本開示の別個の実施形態を表す。
【０１７４】
別の実施形態において、疾患または状態を有する生物試料中のネオエピトープを含む候補遺伝子には、アステロイドホモログ１（Ａｓｔｅｒｏｉｄ  Ｈｏｍｏｌｏｇ  １）（ＡＳＴＥ１）、ＨＮＦ１ホメオボックスＡ（ＨＮＦ１Ａ）、Ｆａｍｉｌｙ  Ｗｉｔｈ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  １１１、メンバーＢ（ＦＡＭ１１１Ｂ）、ＩＮＯ８０Ｅ、ＴＣＰ１含有シャペロニン、サブユニット８（シータ）−様１（ＣＣＴ８Ｌ１）、グロビン転写因子１（ＧＡＦＡ１）、ａｂｓｅｎｔ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ２（ＡＩＭ２）、シナプトネマ構造タンパク質１（ＳＹＣＰ１）、システイン／ヒスチジンリッチ１（ＣＹＨＲ１）、グアニル酸結合タンパク質３（ＧＢＰ３）、ＬＯＣ１００１２７９５０、ＬＯＣ１００１３１０８９、三要素モチーフ含有５９（Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｍｏｔｉｆ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ５９）（ＴＲＩＭ５９）、Ｏ−結合Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）トランスフェラーゼ（ＯＧＴ）、Ｄ０７０、Ｆｍｓ−関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、ＨＰＤＭＰＫ、Ｓｅｃ６３、ＭＡＣ３０Ｘ  ＴＴＫタンパク質キナーゼＴＴＫ、コイルドコイルドメイン含有４３（ＣＣＤＣ４３）、カリウムチャンネル四量体化ドメイン含有１６（ＫＣＴＤ１６）、メディエーター複合体サブユニット８（ＭＥＤ８）、Ｅｍｏｐａｍｉｌ結合タンパク質様（ＥＢＰＬ）、シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリーメンバー１（ＳＬＡＭＦ１）、ＳＦＲＳ１１２ＩＰ１、Ｆｍｓ−関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３ＬＧ）、Ａｂｓｅｎｔ、Ｓｍａｌｌ、Ｏｒ  Ｈｏｍｅｏｔｉｃ）様１（ＡＳＨ１Ｌ）、Ｇ−タンパク質シグナル伝達の調節因子２２（ＲＧＳ２２）、ＧＩＮＳ１、Ｆ−Ｂｏｘおよびロイシンリッチリピートタンパク質３（ＦＢＸＬ３）、ＫＩＡＡ２０１８、アンキリンリピートドメイン４９（ＡＮＫＲＤ４９）、ＢＥＮドメイン含有５（ＢＥＮＤ５）、Ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  Ｗｉｔｈ  ＲＢＰＪ  １（ＣＩＲ１）、ホメオボックスＡ１１（ＨＯＸＡ１１）、ＬＯＣ６４３６７７、ＬＯＣ１００１２８１７５、リラキシン／インスリン様ファミリーペプチド受容体２（ＲＸＦＰ２）、除去修復交差相補群（Ｅｘｃｉｓｉｏｎ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｃｒｏｓｓ−Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ）１（ＥＲＣＣＳ）、ＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ１（ＤＭＴ１）、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、アルストレーム症候群タンパク質１（ＡＬＭＳ１）、第６染色体オープンリーディングフレーム８９（Ｃ６ＯＲＦ８９）、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン含有３Ｂ（ＦＮＤＣ３Ｂ）、ベータ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲ２）、トランスフォーミング増殖因子、ベータ受容体Ｉ（ＴＧＦβＲ１）、ミリストイル化アラニンリッチＣ−キナーゼ基質−１（ＭＡＲＣＫＳ−１）、ミリストイル化アラニンリッチＣ−キナーゼ基質−２（ＭＡＲＣＫＳ−２）、Ｃａｕｄａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ２（ＣＤＸ２）、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質関連因子１Ｂ（ＴＡＦ１Ｂ）、Ｐｅｃａｎｅｘ様２（ＰＣＮＸＬ２／ＦＬＪ１１３８３）、Ｂａｘα＋１、アクチビン２型受容体（ＡＣＶＲ２）、Ｃ１４ｏｒｆ１０６／ＦＬＪ１１１８６、カスパーゼ５、転写因子７様２（ＴＣＦ７Ｌ２／ＴＣＦ−４）、ｐ２１／ｒａｓ、インスリン様成長因子ＩＩ受容体（ＩＧＦＩＩＲ）、ヒトミスマッチ結合因子ＭｕｔＳホモログ３（ｈＭＳＨ３）、またはＭｕｔＳホモログ６（ｈＭＳＨ６）が挙げられ得る。それぞれの可能性が、本開示の別個の実施形態を表す。
【０１７５】
別の実施形態において、ネオエピトープまたはその一部は、遺伝子の少なくとも一部によってコードされ得る。別の実施形態において、ネオエピトープまたはその一部は、本明細書において言及した腫瘍またはがんにおける変異に関連する候補遺伝子の１つまたは複数によってコードされ得る。このため、ネオエピトープは、遺伝子によって完全にコードされ得るか、または遺伝子によって部分的にコードされ得る。
【０１７６】
別の実施形態において、１つまたは複数のネオエピトープまたはその一部は、ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子の少なくとも一部によってコードされ得る。別の実施形態において、１つまたは複数のネオエピトープは、細胞周期調節関連遺伝子の少なくとも一部によってコードされ得る。別の実施形態において、１つまたは複数のネオエピトープは、アポトーシス調節関連遺伝子の少なくとも一部によってコードされ得る。別の実施形態において、１つまたは複数のネオエピトープは、血管新生関連遺伝子の少なくとも一部によってコードされ得る。別の実施形態において、１つまたは複数のネオエピトープは、増殖因子または増殖因子受容体関連遺伝子の少なくとも一部によってコードされ得る。別の実施形態において、１つまたは複数のネオエピトープは、コーディングモノヌクレオチドリピート（ｃＭＮＲ）を含む遺伝子によってコードされ得る。
【０１７７】
用語「ゲノム」が生物の染色体における遺伝情報の全量を含み得ることは、当業者であれば認識しているものと予想される。同様に、用語「エクソーム」は、ゲノムのコード領域を包含し得ること、および用語「トランスクリプトーム」が全てのＲＮＡ分子の組を包含し得ることは、当業者であれば認識しているものと予想される。
【０１７８】
別の実施形態において、ネオエピトープは、疾患を有する組織または細胞のエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを使用して決定される。別の実施形態において、全エクソームを野生型エクソームまたは疾患を有しない正常な組織もしくは細胞に存在するエクソームと比較することにより、ネオエピトープが同定される。別の実施形態において、ネオエピトープを同定するために、選択した遺伝子の組を比較する。別の実施形態において、遺伝子の組は、腫瘍／がんタイプ特異的、臓器特異的、感染疾患特異的、免疫状態特異的、または細胞機能特異的である。別の実施形態において、遺伝子の組は、アポトーシス関連遺伝子、増殖因子関連遺伝子、ＤＮＡミスマッチ修復関連遺伝子、細胞周期調節関連遺伝子、およびｃＭＮＲ接触遺伝子から選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。ある特定の実施形態において、野生型として表される遺伝子または健康な組織もしくは細胞からの遺伝子と比較を行う。
【０１７９】
別の実施形態において、ネオエピトープを同定するために疾患を有する試料と健康な試料との間で比較される遺伝子のセットは、本明細書において言及される遺伝子のいずれかの１つまたは複数を含む。なお別の実施形態において、一つまたは複数のネオエピトープを含む無意味なペプチドを同定するために疾患を有する試料と健康な試料との間で比較される遺伝子のセットは、本明細書において言及される遺伝子のいずれかの１つまたは複数を含む。
【０１８０】
一実施形態において、無意味なペプチドに含まれる一つまたは複数のネオエピトープは、健康な試料内に存在する核酸配列と比較して一つまたは複数の核酸配列変異を含む核酸配列にコードされる。別の実施形態において、１つまたは複数のネオエピトープは、オープンリーディングフレーム（遺伝子エクソン）を含む核酸配列にコードされる。別の実施形態において、変異は、遺伝子エクソン内にコードされる。別の実施形態において、ネオエピトープは、翻訳後切断部位を含まない。
【０１８１】
別の実施形態において、本明細書に開示の変異は、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、反復配列伸長変異、１つまたは複数のヌクレオチドの重複、一つまたは複数のヌクレオチドの置換、フレームシフト変異、およびその任意の組み合わせを含む。別の実施形態において、本明細書に開示のネオエピトープは、少なくとも１つのフレームシフト変異を含む配列にコードされる。
【０１８２】
当業者は、本明細書に開示の核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、またはリボ核酸（ＲＮＡ）、より好ましくはＲＮＡ、最も好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ（ΓνＲＮＡ）または合成ＲＮＡを包含し得ることを認識していると予想される。本明細書に開示の核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換えにより産生されたおよび化学合成された分子を含む。別の実施形態において、核酸は、一本鎖または二本鎖および直線状または共有結合により環を閉じた分子として存在し得る。
【０１８３】
別の実施形態において、核酸は単離されている。当業者は、用語「単離された核酸」が、（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介してｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換えにより産生された、（ｉｉｉ）例えば、切断およびゲル電気泳動による分離によって精製された、または（ｉｖ）例えば、化学合成によって合成された、核酸を包含し得ることを認識していると予想される。核酸は、特にＤＮＡ鋳型からｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって調製することができるＲＮＡの形態で細胞に導入するために、すなわちトランスフェクションのために使用され得る。ＲＮＡを、安定化配列、キャッピング、およびポリアデニル化によって適用の前に改変してもよい。
【０１８４】
用語「変異」は、参照配列と比較した核酸配列における変化または差（ヌクレオチド置換、付加、または欠失、早期終止、または終止）を包含し得ることは当業者によって理解されると予想される。例えば、疾患を有しない健康な生物試料において見出されない、疾患または状態を有する被験体から得られた生物試料中に存在する変化または差である。
【０１８５】
「体細胞変異」は、生殖細胞（精子および卵子）を除く体の任意の細胞において起こり得ることから、子供には受け継がれない。これらの変化は、がんまたは他の疾患もしくは状態を引き起こし得る（が、必ずしもそうとは限らない）。一実施形態において、変異は、非同義変異である。用語「非同義変異」は、それによって翻訳産物においてアミノ酸置換などのアミノ酸の変化が起こる変異、好ましくはヌクレオチド置換を包含する。
【０１８６】
異常なまたは疾患試料が腫瘍またはがん組織である場合、一実施形態において、変異は、「がん変異シグネチャ」を包含し得る。用語「がん変異シグネチャ」は、非がん性参照細胞と比較した場合に、がん細胞に存在する変異の組を指す。前がん性または異形成組織、およびそれらの体細胞変異が含まれる。
【０１８７】
一実施形態において、フレームシフト変異は、付加または除去されるヌクレオチドの数が３の倍数ではないことを条件として、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入または欠失によって、コドンの正常な配列が破壊される場合に生じる。例として、１つのみのヌクレオチドが配列から欠失される場合、変異を含むおよび変異の後のコドンの全てが、破壊された読み取り枠を有する。これによって、多くの不正確なアミノ酸がタンパク質に組み込まれ得る。これに対し、３つのヌクレオチドが挿入または欠失される場合、コドンの読み取り枠のシフトが起こらず、最終的なタンパク質において１つの余分なまたは１つの欠失したアミノ酸のいずれかが起こる。したがって、フレームシフト変異によって、正常なタンパク質より長いまたはより短いかのいずれかであり得る不正確なアミノ酸配列を有する異常なタンパク質産物が起こる。したがって、本明細書に開示のフレームシフト変異は、配列が読み取られる仕方または読み取られる配列の枠をシフトさせる、核酸配列（例えばＤＮＡ／ＲＮＡ）における欠失または挿入によって引き起こされる遺伝子変異を包含し得ること、およびそのような変異が、変異部位からアミノ酸配列を変化させることは当業者であれば認識しているものと予想される。一実施形態において、フレームシフト変異を含む核酸は、変異部位から無意味なアミノ酸配列をコードする。
【０１８８】
ある実施形態において、健康な試料と比較して疾患もしくは状態を有する試料に見出される核酸配列変異の数は、約１〜２０、１〜５０、１〜８０、１〜１０２、１〜１０３、１〜１０４または１〜１０５の範囲であり得る。そのような変異は、フレームシフト変異、ミスセンス変異、非同義ミスセンス変異または他のタイプの変異であり得る。例えば、健康な試料と比較して疾患もしくは状態を有する試料に見出されるフレームシフト変異の数、ミスセンス変異の数、非同義ミスセンス変異の数または合計の変異の数は、約１〜２０、１〜５０、１〜８０、１〜１０２、１〜１０３、１〜１０４または１〜１０５の範囲であり得る。別の実施形態において、健康な試料と比較して疾患もしくは状態を有する試料に見出される核酸変異の数は、約１〜１０、１０〜２０、２０〜４０、４０〜６０、６０〜８０、８０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜１０００、１０００〜１５００、１５００〜５０００、５０００〜１００００または１００００〜１０００００の範囲であり得る。それぞれの可能性が、本開示の別個の実施形態を表す。
【０１８９】
別の実施形態において、健康な試料と比較して疾患もしくは状態を有する試料において見出される核酸変異の数は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００、５００００または１０００００である。そのような変異は、フレームシフト変異、ミスセンス変異、非同義ミスセンス変異または他のタイプの変異であり得る。例えば、健康な試料と比較して疾患もしくは状態を有する試料において見出されるフレームシフト変異の数、ミスセンス変異の数、非同義ミスセンス変異の数または合計の変異の数は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００、５００００または１０００００であり得る。それぞれの可能性が、本開示の別個の実施形態を表す。
【０１９０】
別の実施形態において、見出される核酸変異の数は、腫瘍のタイプに相関する。別の実施形態において、健康な試料と比較して疾患または状態を有する試料中に発見される変異の数は、見出される核酸配列変異の量が真である可能性を評価するチェックポイント値としての役割を果たす。
【０１９１】
挿入または挿入変異は、少なくとも１つの核酸の配列への付加／挿入によって引き起こされる核酸配列におけるＤＮＡ塩基の数の変化を包含し得ることは当業者であれば認識しているものと予想される。別の実施形態において、挿入または挿入変異は、フレームシフト変異を含む。別の実施形態において、核酸配列によってコードされるアミノ酸配列は、適切に機能しない。別の実施形態において、アミノ酸配列は、ペプチドまたはポリペプチドに含まれる。別の実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドは無意味なペプチドを含む。
【０１９２】
欠失または欠失変異は、配列内の少なくとも１つの核酸の除去によって引き起こされるＤＮＡ塩基／核酸の数の変化を包含し得ることは、当業者であれば認識しているものと予想される。別の実施形態において、欠失は、遺伝子内の１つまたは少数の塩基対を除去する。別の実施形態において、欠失は、遺伝子全体またはいくつかの隣接する遺伝子を除去する。別の実施形態において、欠失または欠失変異は、フレームシフト変異を含む。別の実施形態において、欠失を含む核酸配列は、コードされるアミノ酸配列の機能を変化させる。別の実施形態において、アミノ酸配列は、ペプチドまたはポリペプチドに含まれる。別の実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、無意味なペプチドを含む。
【０１９３】
重複または重複変異は、核酸配列内で１回または複数回、異常にコピーされた少なくとも１つの核酸の複製を包含し得ることは当業者であれば認識しているものと予想される。別の実施形態において、重複または重複変異は、フレームシフト変異を含む。別の実施形態において、重複変異は、コードされるアミノ酸配列の機能を変化させる。別の実施形態において、アミノ酸配列は、ペプチドまたはポリペプチドに含まれる。別の実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、無意味なペプチドを含む。
【０１９４】
反復配列伸長（ｒｅｐｅａｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）は、短い配列が反復される回数を増加させる変異を包含し得ることは当業者であれば認識しているものと予想される。別の実施形態において、反復配列伸長変異は、フレームシフト変異を含む。一実施形態において、このタイプの変異は、コードされるアミノ酸配列を不適切に機能させる。別の実施形態において、アミノ酸配列はペプチドまたはポリペプチドに含まれる。別の実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、無意味なペプチドを含む。
【０１９５】
フレームシフト変異は、ＤＮＡ塩基（核酸）の付加または喪失が、コードしている核酸配列の読み取り枠、例えばオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を変化させる場合に起こる変異を包含することは、当業者であれば認識しているものと予想される。読み取り枠は、３つの塩基（コドン）の群からなり、それぞれのコドンは１つのアミノ酸をコードする。一実施形態において、フレームシフト変異は、これらの塩基の群分けをシフトさせて、アミノ酸配列をコードしているコドンを変化させる。別の実施形態において、得られたアミノ酸配列は非機能的である。代替の実施形態において、得られたアミノ酸配列は部分的機能性を有する。さらに別の実施形態において、得られたアミノ酸配列は完全に機能的である。別の実施形態において、アミノ酸配列はペプチドまたはポリペプチドを含む。別の実施形態において、非機能的であるか、または部分的機能性を有するペプチドまたはポリペプチドは、無意味なペプチドを含む。
【０１９６】
別の実施形態において、フレームシフト変異は、スプライス部位の変異もしくは中断、核酸配列の読み過ごしもしくは遺伝子融合をもたらす終止配列のキャンセル、配列への少なくとも１つの核酸の挿入、少なくとも１つの核酸の重複もしくは欠失、または代替の翻訳開始部位に至る変異の結果である核酸配列を含む。それぞれの可能性が、本開示の別の実施形態を表す。
【０１９７】
一実施形態において、フレームシフト変異は、少なくとも１つのエクソンの核酸配列内でコードされる。別の実施形態において、フレームシフト変異は、遺伝子の最後のエクソンの核酸配列内でコードされる。
【０１９８】
別の実施形態において、フレームシフト変異は、無意味なタンパク質をコードする。別の実施形態において、フレームシフト変異は、タンパク質の未成熟終止部位をコードする。別の実施形態において、フレームシフト変異は、コードされるアミノ酸配列を、フレームシフト変異の部位から３プライム方向（コードされるアミノ酸配列においてＣ末端方向）に前進するように変化させる。
【０１９９】
別の実施形態において、少なくとも１つのフレームシフト変異は、複数のフレームシフト変異を含む。別の実施形態において、複数のフレームシフト変異は、同じ遺伝子内に存在する。別の実施形態において、複数のフレームシフト変異は、同じ遺伝子内に存在しない。
【０２００】
別の実施形態において、フレームシフト変異は、マイクロサテライト不安定性の結果であり得る。別の実施形態において、フレームシフトは、マイクロサテライト不安定性コード領域内に存在する。
【０２０１】
当業者は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）が、マイクロサテライト（核酸の短い反復配列）の反復の数が、それが遺伝されたときに核酸配列に存在する反復の数とは異なる、ある特定の細胞（例えば腫瘍細胞）の核酸配列に起こる変化を包含し得ることを認識していると予想される。一実施形態において、マイクロサテライト不安定性は、ＤＮＡが細胞においてコピーされる場合に作製される誤りの修復能の欠陥を含む。別の実施形態において、マイクロサテライト不安定性は、正常な結腸ＤＮＡと比較して腫瘍ＤＮＡ内で５つのコンセンサスモノヌクレオチド反復配列（ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２２、およびＮＲ２４）のうちの少なくとも２つに影響を及ぼす不安定性を含む。別の実施形態において、本明細書に開示の核酸配列は、マイクロサテライト不安定性を有する任意の腫瘍またはがんにおいて見出される核酸配列を包含する。
【０２０２】
別の実施形態において、フレームシフト変異は、遺伝子の最後のエクソン内に位置する。別の実施形態において、フレームシフト変異は、遺伝子の最後から２番目のエクソン内でコードされる。フレームシフト変異に起因する未成熟終止コドンを有する一部の異常なｍＲＮＡは、ナンセンス依存性ｍＲＮＡ崩壊（ＮＭＤ）系による分解を受けないことは、当業者であれば認識しているものと予想される。フレームシフト変異に起因する未成熟終止コドンを有する他の異常なｍＲＮＡは、ナンセンス依存性ｍＲＮＡ崩壊（ＮＭＤ）系による分解を受ける。一実施形態において、ネオエピトープの選択は、最後のエクソン、または最後から２番目のエクソンに位置するネオエピトープおよび／または無意味なペプチドを選択することをさらに含む。一実施形態において、プロセスは、第１のエクソン内または特定の遺伝子のエクソンの任意の既定の上限内でコードされるフレームシフト変異に由来するネオエピトープおよび／または無意味なペプチドを除去することをさらに含む。
【０２０３】
別の実施形態において、フレームシフト変異は、健康な生物試料の供給源核酸配列と比較される。
【０２０４】
別の実施形態において、少なくとも１つのフレームシフト変異は、遺伝子のエクソンコード領域内に存在する。別の実施形態において、エクソンは遺伝子の最後のエクソンである。
【０２０５】
別の実施形態において、試料中に見出されるフレームシフト変異の数は、約１〜５、５〜１０、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、２０〜４０、１〜２０、１〜４０、１〜６０、４０〜６０、６０〜８０、８０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜４００または４００〜１０００の範囲である。別の実施形態において、試料中に見出されるフレームシフト変異の数は、約１０３〜１０４の範囲である。別の実施形態において、試料中に見出されるフレームシフト変異の数は、最大約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０３、１０４または１０５までである。別の実施形態において、試料中に見出されるフレームシフト変異の数は、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００未満であるか。または約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００より多くである。それぞれの可能性が、本開示の別の実施形態を表す。
【０２０６】
別の実施形態において、ネオエピトープは、核酸配列におけるフレームシフトの結果として発現された無意味なペプチド配列から生成される。
【０２０７】
当業者は、用語「無意味なペプチド」が、フレームシフト変異を有する配列から翻訳されたペプチドを包含することを認識していると予想される。そのようなペプチドの少なくとも一部または全ては、フレームシフト変異後の配列によってコードされる。同等の用語は「フレームシフト変異由来ペプチド」または「フレームシフトペプチド」を含む。別の実施形態において、無意味なペプチドは、健康な試料ペプチドと比較して新規アミノ酸配列を含む。別の実施形態において、無意味なペプチドは、少なくとも部分的に機能的である。別の実施形態において、無意味なペプチドは、少なくとも１つの変化した特性を有するタンパク質を含む。別の実施形態において、無意味なペプチドは、機能的ペプチドである。「意味のあるペプチド」は、無意味なペプチドではない（すなわち、フレームシフト変異由来ペプチドではなく、かつフレームシフト変異後の任意の配列によってコードされない）ペプチドである。
【０２０８】
別の実施形態において、核酸配列を含むベクターは、完全長の無意味なペプチドをコードする。別の実施形態において、核酸配列は、無意味なペプチドの少なくとも断片をコードする。
【０２０９】
別の実施形態において、無意味なペプチドは、約１〜１０アミノ酸、５〜１０アミノ酸、１０〜２０アミノ酸、２０〜４０アミノ酸、４０〜６０アミノ酸、２０〜５０アミノ酸、６０〜８０アミノ酸、８０〜１００アミノ酸、８０〜１１０アミノ酸、１００〜２００アミノ酸、２００〜３００アミノ酸、１〜２００アミノ酸、２００〜５００アミノ酸、５００〜１０００アミノ酸、１０００〜５０００アミノ酸、５０００〜１００００アミノ酸、１〜１０４アミノ酸または１〜１０５アミノ酸の範囲を含む。それぞれの可能性が、本開示の別の実施形態を表す。
【０２１０】
別の実施形態において、１つまたは複数の無意味なペプチドのそれぞれは、約６０〜１００アミノ酸の長さである。別の実施形態において、１つまたは複数の無意味なペプチドのそれぞれは、非常に短い（例えば、約１０アミノ酸配列）から非常に長い（例えば、１００を超えるアミノ酸配列）の範囲であり得る。別の実施形態において、１つまたは複数の無意味なペプチドのそれぞれは、約８〜１０、１１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００または８〜５００、あるいはそれより多くのアミノ酸の長さである。例えば、それぞれの無意味なペプチドは、約１０〜４５０、１０〜４２５、１０〜４００、１０〜３７５、１０〜３５０、１０〜３２５、１０〜３００、１０〜２７５、１０〜２５０、１０〜２２５、１０〜２００、１０〜１７５、１０〜１５０、１０〜１２５、１０〜１００、１０〜７５、１０〜５０、１０〜４５、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１５〜４５０、１５〜４２５、１５〜４００、１５〜３７５、１５〜３５０、１５〜３２５、１５〜３００、１５〜２７５、１５〜２５０、１５〜２２５、１５〜２００、１５〜１７５、１５〜１５０、１５〜１２５、１５〜１００、１５〜７５、１５〜５０、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、１５〜２５または１５〜２０アミノ酸の長さであり得る。一部の実施形態において、それぞれの無意味なペプチドは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸の長さである。
【０２１１】
別の実施形態において、無意味なペプチドは、最大約５アミノ酸、６アミノ酸、８アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、３０アミノ酸、４０アミノ酸、５０アミノ酸、６０アミノ酸、７０アミノ酸、８０アミノ酸、１００アミノ酸、１５０アミノ酸、１０３、１０４または１０５アミノ酸を含む。それぞれの可能性が、本開示の別個の実施形態を表す。
【０２１２】
別の実施形態において、それぞれのネオエピトープアミノ酸配列は、約２１アミノ酸の長さであるか、または「２１マー」のネオエピトープ配列である。別の実施形態において、１つまたは複数のまたはそれぞれのネオエピトープアミノ酸配列は、約１〜１００、５〜１００、５〜７５、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５または５〜１０アミノ酸の長さである。さらに別の実施形態において、１つまたは複数のあるいはそれぞれのネオエピトープアミノ酸配列は、１〜１００、１〜７５、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５または１〜１０アミノ酸の長さである。さらに別の実施形態において、１つまたは複数のまたはそれぞれのネオエピトープアミノ酸配列は、約８〜１１または１１〜１６アミノ酸の長さである。
【０２１３】
一実施形態において、ネオエピトープは、１つの変異を含むヌクレオチド配列によってコードされる。別の実施形態において、ネオエピトープは、少なくとも１つの変異を含むヌクレオチド配列によってコードされる。別の実施形態において、ネオエピトープは複数の変異を含むヌクレオチド配列によってコードされる。別の実施形態において、変異は、挿入変異を含む。別の実施形態において、変異は、欠失変異を含む。さらなる実施形態において、変異は、重複変異を含む。別の実施形態において、変異は、反復配列伸長変異を含む。さらに別の実施形態において、変異は、フレームシフト変異を含む。
【０２１４】
一実施形態において、一つまたは複数のネオエピトープは、それぞれ約８〜約２７アミノ酸、５〜５０アミノ酸、８〜１０アミノ酸または８〜１２アミノ酸を含む。別の実施形態において、１つまたは複数のネオエピトープは、それぞれ約２１アミノ酸、８アミノ酸または２７アミノ酸を含む。別の実施形態において、１つまたは複数のネオエピトープは、それぞれ約５アミノ酸、それぞれ６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０アミノ酸を含む。それぞれの可能性が、本開示の別個の実施形態を表す。
【０２１５】
一実施形態において、ネオエピトープは、無意味なアミノ酸配列に、Ｎ末端、Ｃ末端または両方のいずれかで隣接する約５〜３０アミノ酸を含む。別の実施形態において、ネオエピトープは、無意味なアミノ酸配列のそれぞれの側に隣接する約１１アミノ酸を含む。別の実施形態において、ネオエピトープは、無意味なアミノ酸配列のそれぞれの側に隣接する約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０アミノ酸を含む。それぞれの可能性が、本開示の別個の実施形態を表す。別の実施形態において、ネオエピトープは、変異を含み、約１〜５０アミノ酸が無意味なアミノ酸配列のそれぞれの側に隣接する。
【０２１６】
一実施形態において、ネオエピトープは、フレームシフト変異由来ペプチドの約５〜３０または１〜５０アミノ酸あるいはフレームシフト変異後の遺伝子の配列にコードされる約５〜３０または１〜５０アミノ酸を含む。別の実施形態において、ネオエピトープは、フレームシフト変異由来ペプチドの約１１アミノ酸あるいはフレームシフト変異後の遺伝子の配列にコードされる約１１アミノ酸を含む。別の実施形態において、ネオエピトープは、フレームシフト変異由来ペプチドのまたはフレームシフト変異後の遺伝子の配列にコードされる約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０アミノ酸を含む。それぞれの可能性が、本開示の別個の実施形態を表す。
【０２１７】
一部の実施形態において、フレームシフト変異由来ペプチドは、フレームシフト変異の下流の遺伝子配列によってコードされる配列のみを含む。他の実施形態において、フレームシフト変異由来ペプチドは、フレームシフト変異の上流の遺伝子配列によってコードされる一部のアミノ酸（例えば、フレームシフト変異の上流の遺伝子配列によってコードされる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、または１〜５アミノ酸）をさらに含む。
【０２１８】
非同義ミスセンス変異由来ペプチドに関して、ネオエピトープは、例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその両方でミスセンス変異によってコードされる変異したアミノ酸に隣接する約５〜３０アミノ酸を含み得る。別の実施形態において、ネオエピトープは、ミスセンス変異によってコードされる変異したアミノ酸のそれぞれの側に隣接する約１１アミノ酸を含む。別の実施形態において、ネオエピトープは、ミスセンス変異にコードされる変異したアミノ酸のそれぞれの側に隣接する約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０アミノ酸を含む。それぞれの可能性が、本開示の別個の実施形態を表す。別の実施形態において、ネオエピトープは、非同義ミスセンス変異由来ペプチドを含み、約１〜５０アミノ酸が、ミスセンス変異によってコードされる変異したアミノ酸のそれぞれの側に隣接する。
【０２１９】
別の実施形態において、隣接配列は、アミノ酸の長さに関して対称である。例えば、非同義ミスセンス変異由来ペプチドは、ミスセンス変異を有する遺伝子によってコードされるペプチドを含み得、ペプチドは、遺伝子によってコードされる、変異したアミノ酸と隣接配列とを含み、隣接配列は、それぞれの側に同じ長さの配列である。別の実施形態において、それぞれの側の隣接配列は、アミノ酸の長さに関して非対称である。さらにまたはあるいは、様々なサイズのネオエピトープ挿入物は、約８〜２７アミノ酸配列の範囲の長さである。さらにまたはあるいは、約５〜５０アミノ酸配列の範囲の長さの様々なサイズのネオエピトープが挿入される。さらにまたはあるいは、１０〜３０、１０〜４０、１５〜３０、１５〜４０、または１５〜２５アミノ酸の範囲の長さの様々なサイズのネオエピトープ挿入物（すなわち、ネオエピトープをコードするペプチド）が挿入される。別の実施形態において、それぞれのネオエピトープ挿入物は、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０または３０〜４０アミノ酸長である。別の実施形態において、ネオエピトープ挿入物は、１〜１００、５〜１００、５〜７５、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５または５〜１０アミノ酸長である。さらに別の実施形態において、ネオエピトープアミノ酸配列は、１〜１００、１〜７５、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５または１〜１０である。別の実施形態において、それぞれのネオエピトープ挿入物は、２１アミノ酸の長さであるか、または「２１マー」のネオエピトープ配列である。さらに別の実施形態において、ネオエピトープアミノ酸挿入物は、約８〜１１または１１〜１６アミノ酸長である。
【０２２０】
別の実施形態において、ネオエピトープは、健康な生物試料または野生型アミノ酸配列と比較して完全に新規の配列を含む。別の実施形態において、ネオエピトープは、健康な試料中の同様な配列とは少なくとも部分的に異なるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ネオエピトープは、健康な試料中の同様な配列とは完全に異なるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ネオエピトープと健康な試料からの同様なアミノ酸配列との間の同一性は、約０〜９９．９９９％の範囲である。別の実施形態において、ネオエピトープと健康な試料からの同様なアミノ酸配列との間の同一性は、最大約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％まで、最大９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％までである。それぞれの可能性が、本開示の別個の実施形態を表す。
【０２２１】
別の実施形態において、ネオエピトープをコードする核酸配列は、翻訳後タンパク質分解切断によって影響を受けないアミノ酸配列をコードする。別の実施形態において、ネオエピトープをコードする核酸配列は、翻訳後のユビキチン化によって影響を受けるアミノ酸配列をコードし、分解のためにプロテオームに向けられる。別の実施形態において、分解されたタンパク質部分は、疾患または状態を有する組織の細胞上に表示され得る。
【０２２２】
当業者は、用語「約」が、表記の数字または数字の範囲から０．０００１〜５％の間の逸脱を包含することを認識していると予想される。一実施形態において、用語「約」は、表記の数字または数字の範囲から１〜１０％の間の逸脱を含む。一実施形態において、用語「約」は、表記の数字または数字の範囲から最大２５％までの逸脱を含む。
【０２２３】
一実施形態において、無意味なペプチドは、免疫原性ネオエピトープを同定するために免疫原性について選択および特徴付けされる。別の実施形態において、選択された無意味なペプチドは、５、８、１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００より多いアミノ酸を含む。それぞれの可能性が、本開示の別個の実施形態を表す。
【０２２４】
別の実施形態において、特徴付けは、無意味なペプチドから全ての可能なネオエピトープアミノ酸配列を生成することを含む。
【０２２５】
一実施形態において、無意味なペプチドは、少なくとも１つの免疫原性ネオエピトープを含む。別の実施形態において、無意味なペプチドは、約１のネオエピトープ、２、３、４、５、１〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜５００、５００〜１０３または１０３〜１０４のネオエピトープの範囲のネオエピトープを含む。それぞれの可能性が、本明細書に開示の別個の実施形態を表す。
【０２２６】
別の実施形態において、無意味なペプチドは、最大５までのネオエピトープ、２０のネオエピトープ、５０のネオエピトープ、１００のネオエピトープ、１５０のネオエピトープ、２００のネオエピトープまたは５００のネオエピトープを含む。それぞれの可能性が、本明細書に開示の別個の実施形態を表す。
【０２２７】
別の実施形態において、無意味なペプチドまたはその断片は、本明細書に開示の腫瘍またはがんにおける変異の１つまたは複数の候補遺伝子を含む遺伝子の少なくとも断片によってコードされる。
【０２２８】
別の実施形態において、無意味なペプチドまたはその断片は、ＤＮＡミスマッチ修復遺伝子の少なくとも断片によってコードされる。別の実施形態において、無意味なペプチドは、細胞周期調節関連遺伝子の少なくとも断片によってコードされる。別の実施形態において、無意味なペプチドは、アポトーシス調節関連遺伝子の少なくとも断片によってコードされる。別の実施形態において、無意味なペプチドは、血管新生関連遺伝子の少なくとも断片によってコードされる。別の実施形態において、無意味なペプチドは、増殖因子または増殖因子受容体関連遺伝子の少なくとも断片によってコードされる。別の実施形態において、無意味なペプチドは、コーディングモノヌクレオチド反復配列（ｃＭＮＲ）を含む遺伝子によってコードされる。別の実施形態において、本開示は、無意味なペプチドを同定するためにエクソーム全体を比較する。別の実施形態において、本開示は、無意味なペプチドを同定するために、選択された遺伝子の組を比較する。別の実施形態において、遺伝子の組は、腫瘍／がんタイプ特異的、臓器特異的、感染疾患特異的、および免疫状態特異的、または細胞機能特異的である。別の実施形態において、遺伝子の組は、アポトーシス関連遺伝子、増殖因子関連遺伝子、ＤＮＡミスマッチ修復関連遺伝子、細胞周期調節関連遺伝子、およびｃＭＮＲ接触遺伝子、から選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。それぞれの可能性が、本明細書に開示の別個の実施形態を表す。
【０２２９】
別の実施形態において、１つまたは複数のネオエピトープをコードする核酸配列は、疾患または状態を有する生物試料において発現される。別の実施形態において、１つまたは複数の無意味なペプチドをコードする核酸配列は、疾患または状態を有する生物試料において発現される。用語「発現された」は、転写および翻訳された核酸配列を包含することは、当業者であれば認識しているものと予想される。
【０２３０】
一実施形態において、無意味なペプチドおよび／またはネオエピトープは、疾患または状態を有する試料細胞において高度に発現される。用語「高度に発現された」は、エクソーム全体の発現レベルの中央値より高い発現レベルを包含することは、当業者であれば認識しているものと予想される。別の実施形態において、「高度に発現された」は、生物試料細胞において発現された遺伝子のうち１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％の発現レベルを上回る発現レベルを含む。それぞれの可能性が、本明細書に開示の別個の実施形態を表す。別の実施形態において、高い発現レベルは、１つまたは複数の選択された遺伝子マーカーの発現レベルより高い発現レベルを含む。
【０２３１】
一実施形態において、フレームシフトによって産生される無意味なペプチドまたはその断片は、転写および翻訳される。
【０２３２】
別の実施形態において、無意味なペプチドは、疾患を有する生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、健康な生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦとを比較することによって同定され、比較によって、核酸配列内の１つまたは複数のフレームシフト変異が同定され、変異を含む核酸配列は、疾患を有する生物試料からの１つまたは複数のＯＲＦ内でコードされる１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドをコードする。
【０２３３】
別の実施形態において、比較は、公知のおよび予想されるがんまたは腫瘍抗原をコードする核酸配列、腫瘍またはがん関連抗原をコードする核酸配列、公知のまたは予想される腫瘍またはがんタンパク質マーカーをコードする核酸配列、公知のおよび予想される感染疾患または状態関連遺伝子をコードする核酸配列、疾患を有する生物試料において発現される遺伝子をコードする核酸配列、マイクロサテライト不安定性領域を含む核酸配列、ならびにその任意の組み合わせを含む群より選択される既定の遺伝子の組のオープンリーディングフレームエクソームを比較することを含む。
【０２３４】
一実施形態において、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、少なくとも１つの核酸配列を含み、核酸配列は、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む一つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする。免疫原性ポリペプチドは、例えば、ＰＥＳＴ含有ペプチドであり得る。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む少なくとも１つの組換えポリペプチドを発現および分泌する。
【０２３５】
別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む一つまたは複数の組換えポリペプチドを、被験体の感染の間に発現および分泌する。
【０２３６】
別の実施形態において、それぞれのＬｉｓｔｅｒｉａ株は、複数の核酸配列を含み、それぞれの核酸配列は、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む一つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする。別の実施形態において、それぞれのＬｉｓｔｅｒｉａ株は、１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含み、組換えポリペプチドは、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む。
【０２３７】
別の実施形態において、無意味なペプチドは、疾患を有する組織または細胞のエクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを使用して決定される。別の実施形態において、無意味なペプチドは、無意味なペプチドから部分的または完全に得られる選択されたアミノ酸配列を含むネオエピトープをコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、免疫原性エピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドは、Ｋｙｔｅ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅのヒドロパシープロット上で最大１．６までのスコアを有する。
【０２３８】
一実施形態において、一つまたは複数のネオエピトープは、供給源核酸配列にコードされ、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される。
【０２３９】
別の実施形態において、本明細書に開示される通りのペプチド、ポリペプチドまたは組換えポリペプチドは、本明細書に開示される通りの一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む。
【０２４０】
一実施形態において、組換えポリペプチドは、少なくとも１つのネオエピトープを含む一つまたは複数のポリペプチドをコードする一つまたは複数のオープンリーディングフレームをコードする核酸構築物によってコードされるポリペプチドを含む。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、少なくとも１つのネオエピトープおよび少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含む。免疫原性ポリペプチドは、例えば、ＰＥＳＴ含有ペプチドであり得る。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、少なくとも１つのネオエピトープを含む一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片をコードする一つまたは複数のオープンリーディングフレームをコードする核酸構築物によってコードされるポリペプチドを含む。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む融合ポリペプチドを含む。
【０２４１】
一実施形態において、供給源は、疾患または状態を有する生物試料から得られる。別の実施形態において、本明細書に開示の組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、プラスミド挿入物である。一実施形態において、核酸配列はゲノムに少なくとも部分的に組み込まれる。別の実施形態において、挿入物は、組換えポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む。別の実施形態において、オープンリーディングフレームは、本明細書に開示の１つまたは複数のネオエピトープを含む１つまたは複数の組換えポリペプチドに融合された免疫原性ポリペプチドまたはその断片を含む。
【０２４２】
別の実施形態において、核酸配列は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株内のプラスミドに存在する。別の実施形態において、プラスミドは組み込みプラスミドである。別の実施形態において、プラスミドは染色体外マルチコピープラスミドである。別の実施形態において、プラスミドは、抗生物質選択の非存在下でＬｉｓｔｅｒｉａ株において安定に維持される。別の実施形態において、プラスミドは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａに対して抗生物質耐性を付与しない。
【０２４３】
別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａゲノムにおける単一の位置で１つまたは複数のネオエピトープを含む核酸分子を含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノムにおける複数の位置で１つまたは複数のネオエピトープを含む核酸分子を含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、１つのプラスミドにおいて１つまたは複数のネオエピトープを含む少なくとも１つの核酸分子を含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が並行して有する少なくとも２つの異なるプラスミドにおいてネオエピトープを含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が並行して有する複数の異なるプラスミドにおいてネオエピトープを含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノムにおける１つまたは複数の位置および１つまたは複数の異なるプラスミドにおいてネオエピトープを含む。それぞれにおけるネオエピトープは、同じまたは異なり得る。
【０２４４】
別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａのそれぞれは、１つまたは複数の組換えポリペプチドを発現し、組換えポリペプチドのそれぞれは、約１〜２０のネオエピトープを含む。
【０２４５】
別の実施形態において、ネオエピトープの発現および分泌の効率を決定するために、それぞれの核酸配列における構築物の数  対  変異荷重（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｕｒｄｅｎ）の決定を実施する。別の実施形態において、Ｔ細胞受容体に関するネオエピトープの提示を提供するための分子の最良の三次元フォールディングを決定するために、組換えポリペプチドあたりのネオエピトープの量の決定を実施する。別の実施形態において、直線状のネオエピトープの範囲が試験され、組換えポリペプチドまたは核酸配列当たり約２、５、１０、２０、５０、１００のエピトープによって開始される。別の実施形態において、直線状のネオエピトープの範囲が試験され、組換えポリペプチドまたは核酸配列当たり約１〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜５０、５０〜７０、７０〜９０、９０〜１１０、１１０〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、３００〜３５０または４００〜５００のエピトープによって開始される。それぞれの可能性が、別個の実施形態を表す。
【０２４６】
別の実施形態において、組換えポリペプチドあたりのネオエピトープの数または使用される組換えポリペプチドをコードする核酸配列の数は、単一の分子からの複数のエピトープの翻訳および／もしくは分泌の効率を考慮して、ならびに／またはネオエピトープの数を参照して決定される。
【０２４７】
別の実施形態において、組換えポリペプチドは、１つのネオエピトープを含む。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、少なくとも１のネオエピトープ、２のネオエピトープ、３のネオエピトープ、４のネオエピトープ、５のネオエピトープ、６のネオエピトープ、７のネオエピトープ、８のネオエピトープ、９のネオエピトープ、１０またはより多くのネオエピトープを含む。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００のネオエピトープを含む。別の実施形態において、本明細書に開示の組換えポリペプチドは、約４０のネオエピトープ、５０のネオエピトープ、１〜１０のネオエピトープ、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、１〜６０、１〜７０、１〜８０または１〜１００のネオエピトープを含む。
【０２４８】
一実施形態において、組換えポリペプチドは、少なくとも１つの無意味なペプチドまたはその断片を含む。一実施形態において、核酸配列は、少なくとも１つの無意味なペプチドまたはその断片をコードする。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、少なくとも２つの異なるネオエピトープアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、同じアミノ酸配列の１つまたは複数のネオエピトープ反復を含む。
【０２４９】
一実施形態において、組換えポリペプチドは、複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む。一実施形態において、核酸配列は、複数の無意味なペプチドまたはその断片をコードする。
【０２５０】
一実施形態において、組換えポリペプチドは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の無意味なペプチドまたはその断片を含む。一実施形態において、組換えポリペプチドは、約１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜５０、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００または２００〜５００の範囲の一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む。一実施形態において、組換えポリペプチドは、最大約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００の無意味なペプチドまたはその断片を含む。それぞれの可能性が別個の実施形態を表す。
【０２５１】
一実施形態において、核酸配列は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の無意味なペプチドまたはその断片をコードする。
【０２５２】
別の実施形態において、核酸配列は、約１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜５０、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００または２００〜５００の範囲の一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片をコードする。別の実施形態において、核酸配列は、最大約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００の無意味なペプチドまたはその断片をコードする。別の実施形態において、核酸配列は、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００より多くの無意味なペプチドまたはその断片をコードする。それぞれの可能性が別個の実施形態を表す。
【０２５３】
別の実施形態において、組換えポリペプチドは、免疫原性ポリペプチドを含む。免疫原性ポリペプチドは、例えば、ＰＥＳＴ含有ペプチドであり得る。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドを含む。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、複数の免疫原性ポリペプチドを含む。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の免疫原性ポリペプチドを含む。
【０２５４】
別の実施形態において、一つまたは複数の無意味なペプチドを含む組換えポリペプチドは、免疫原性ポリペプチドに融合されている。例えば、一つまたは複数のペプチドのそれぞれは、異なる免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合されてもよいし、または一つまたは複数のペプチドの組み合わせは、免疫原性ポリペプチドまたはその断片（例えば、免疫原性ポリペプチドは第１のネオエピトープに連結されており、これは第２のネオエピトープに連結されており、これは第３のネオエピトープに連結されており、など）に融合されてもよい。別の実施形態において、複数の無意味なペプチドは、少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドに融合されている。例えば、１つまたは複数の無意味なペプチドは、互いにタンデムに連結または融合されていることができ、Ｎ末端またはＣ末端無意味なペプチドは、免疫原性ポリペプチドに連結または融合されている。別の実施形態において、１つの無意味なペプチドは、免疫原性ポリペプチドに融合されている。別の実施形態において、少なくとも１つまたは複数の無意味なペプチドは、少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドに融合されている。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、免疫原性ポリペプチドまたはその断片に作動可能に融合された一つまたは複数の免疫原性無意味なペプチドを含む一つまたは複数のペプチドを含む。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に作動可能に連結された一つまたは複数の無意味なペプチドを含み、免疫原性ポリペプチドは、１つまたは複数の無意味なペプチドのうちの１つに融合されている。別の実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、Ｎ末端無意味なペプチドに作動可能に融合されている。別の実施形態において、連結は、ペプチド結合である。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、それぞれ免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数のネオエピトープもしくはその断片を含む。
【０２５５】
別の実施形態において、一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む組換えポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に作動可能に連結された複数の無意味なペプチドまたはその断片を含み、免疫原性ポリペプチドは、複数の無意味なペプチドまたはその断片のうちの１つに融合されている。別の実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、Ｎ末端無意味なペプチドに作動可能に連結されている。別の実施形態において、連結は、ペプチド結合である。
【０２５６】
別の実施形態において、組換えポリペプチドは、１つまたは複数の無意味なペプチドを含み、それぞれの無意味なペプチドは、同じベクター上でコードされる次の無意味なペプチドにリンカー配列によって接続されている。別の実施形態において、リンカーは４×グリシンＤＮＡ配列である。別の実施形態において、リンカーはポリグリシンである。当技術分野で公知の他のリンカー配列を、本明細書に開示の方法および組成物において使用してもよいことは当業者であれば認識しているものと予想される（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｒｅｄｄｙ  Ｃｈｉｃｈｉｌｉ，  Ｖ．  Ｐ．、Ｋｕｍａｒ，  Ｖ．およびＳｉｖａｒａｍａｎ，  Ｊ．（２０１３年）、Ｌｉｎｋｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２巻：１５３〜１６７頁を参照されたい）。さらに別の実施形態において、リンカーは、配列番号４６〜５６、またはその任意の組み合わせを含む群より選択される。
【０２５７】
別の実施形態において、異なるリンカー配列が、反復配列を最小限にするために無意味なペプチドの間に分布している。別の実施形態において、無意味なペプチドの間に異なるリンカー配列を分布させることは、二次構造を低減させ、それによってＬｍ組換えベクター株集団内で挿入物を含むプラスミドの効率的な転写、翻訳、分泌、維持、または安定化を可能にする。
【０２５８】
別の実施形態において、一つまたは複数の無意味なペプチドを含む一つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、少なくとも１つの第１の無意味なペプチドまたはその断片と、少なくとも１つの第２の無意味なペプチドまたはその断片との間に組み込まれた１つまたは複数のリンカー配列を含む。別の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１つの第１の無意味なペプチドまたはその断片と、少なくとも１つの第２の無意味なペプチドまたはその断片〜少なくとも１つの第３の無意味なペプチドまたはその断片との間に組み込まれた少なくとも２つの異なるリンカー配列を含む。
【０２５９】
別の実施形態において、１つまたは複数のリンカーは、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、および配列番号５６に示される通りのヌクレオチド配列を含む群から選択される。それぞれの可能性が、本明細書に開示の別個の実施形態を表す。
【０２６０】
別の実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、変異したリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、切断型ＡｃｔＡタンパク質、ＡｃｔＡ−ＰＥＳＴ２融合またはＰＥＳＴアミノ酸配列である。免疫原性ポリペプチドは、例えば、ＰＥＳＴ含有ペプチドを含み得る。
【０２６１】
別の実施形態において、ＡｃｔＡ−ＰＥＳＴ２融合タンパク質は、配列番号１７に示される。別の実施形態において、ｔＬＬＯタンパク質は、配列番号４に示される。別の実施形態において、ＡｃｔＡは、配列番号１２〜１８および２０〜２１のいずれか１つに示される。別の実施形態において、ＰＥＳＴアミノ酸配列は、配列番号６〜１１に示される配列から選択される。
【０２６２】
別の実施形態において、変異したＬＬＯは、コレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）に変異を含む。別の実施形態において、変異は、配列番号３の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１またはＷ４９２の置換、またはその任意の組み合わせを含む。
【０２６３】
別の実施形態において、核酸配列によってコードされる最終のネオエピトープまたは最終の無意味なペプチドを、その後に終止コドンが続くタグ配列に融合させる。タグは、例えばＬｍベクターからの分泌の際に、または特異的Ｔ細胞に対する親和性、もしくは抗原提示細胞による提示に関して構築物を試験する場合に、融合ポリペプチドまたはキメラタンパク質の容易な検出を可能にし得ることは、当業者であれば認識しているものと予想される。
【０２６４】
別の実施形態において、１つまたは複数の組換えポリペプチドは、任意選択でリンカー配列を介してＣ末端でタグに作動可能に連結されている。別の実施形態において、リンカー配列は、４Ｘグリシンリンカーをコードする。別の実施形態において、リンカーは、本明細書に記載される通りである。
【０２６５】
別の実施形態において、タグ配列は、ネオエピトープまたは無意味なペプチドの容易な検出を可能にするアミノ酸または核酸配列である。別の実施形態において、タグ配列は、本明細書に開示のネオエピトープまたは無意味なペプチドの分泌を確認するために使用されるアミノ酸または核酸配列である。タグの配列を、プラスミドまたはファージベクター上の融合ペプチド配列に組み込んでもよいことは、当業者であれば認識しているものと予想される。これらのタグを発現させて、抗原性エピトープを提示させてもよく、それによって、医師は、これらの「タグ」配列ペプチドに対する免疫応答を追跡することによって、分泌された組換えポリペプチドまたは無意味なペプチドの免疫原性を追跡することができる。そのような免疫応答は、これらのタグに対して特異的なモノクローナル抗体およびＤＮＡまたはＲＮＡプローブを含むがこれらに限定されない多数の試薬を使用してモニターすることができる。
【０２６６】
別の実施形態において、タグは、６×ヒスチジンタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド、６×ヒスチジンに作動可能に連結された６×ヒスチジンタグ、ポリヒスチジンタグ、およびその任意の組み合わせを含む群より選択される。別の実施形態において、タグは、Ｃ末端ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ｓ−６×ＨＩＳタグであり得る。別の実施形態において、本明細書に開示の組換えポリペプチドは、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）およびポリ（ＮＡＮＰ）が挙げられるがこれらに限定されない当技術分野で公知の任意の他のタグを含む。一実施形態において、タグは、６×ヒスチジンタグ、２×ＦＬＡＧタグ、３×ＦＬＡＧタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに作動可能に連結された６×ヒスチジンタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに作動可能に連結された３×ＦＬＡＧタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに作動可能に連結された２×ＦＬＡＧタグ、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される。２×ＦＬＡＧタグとＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、３×ＦＬＡＧタグとＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、または６×ＨｉｓタグとＳＩＩＮＦＥＫＬタグなどの、２つまたはそれよりも多いタグを共に使用することができる。２つまたはそれよりも多いタグを使用する場合、それらは、組換えポリペプチド内の任意の場所に任意の順序で存在することができる。例えば、２つのタグは組換えポリペプチドのＣ末端に存在することができ、２つのタグは組換えポリペプチドのＮ末端に存在することができ、２つのタグは組換えポリペプチド内の内部に存在することができ、１つのタグが組換えポリペプチドのＣ末端に存在して１つのタグがＮ末端に存在することができ、１つのタグが組換えポリペプチドのＣ末端に存在して１つが内部に存在することができ、または１つのタグが組換えポリペプチドのＮ末端に存在して１つのタグが内部に存在することができる。
【０２６７】
別の実施形態において、本明細書に開示される核酸配列は、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ポリヒスチジンタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ｓ−６×ＨＩＳタグ、６×ヒスチジンタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、およびポリ（ＮＡＮＰ）が挙げられるがこれらに限定されない、当技術分野で公知の他の任意のタグをコードする。
【０２６８】
別の実施形態において、核酸配列は、コードされる無意味なペプチドに融合されるタグをコードする少なくとも１つの配列を含む。別の実施形態において、タグは、配列番号５７に記載のアミノ酸配列を含む。
【０２６９】
別の実施形態において、１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、タグをコードする配列の後に２つの終止コドンを含む。
【０２７０】
別の実施形態において、１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、ｐｈｌｙ−ｔＬＬＯ−［無意味なペプチドまたはその断片−グリシンリンカー（４×）−無意味なペプチドまたはその断片−グリシンリンカー（４×）］ｎ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓタグ−２×終止コドンを含む成分をコードし、無意味なペプチドまたはその断片は、約２１アミノ酸の長さであり、ｎ＝１〜２０である。別の実施形態において、無意味なペプチドまたはその断片は、任意のｎで表される同じまたは異なる配列であり得る。
【０２７１】
別の実施形態において、１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、ｐｈｌｙ−ｔＬＬＯ−［ネオエピトープ−グリシンリンカー（４×）−ネオエピトープ−グリシンリンカー（４×）］ｎ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓタグ−２×終止コドンを含む成分をコードし、ネオエピトープは、約２１アミノ酸の長さであり、ｎ＝１〜２０である。別の実施形態において、ネオエピトープは、任意のｎで表される同じまたは異なる配列であり得る。
【０２７２】
別の実施形態において、組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、ｐｈｌｙ−ｔＬＬＯ−［ネオエピトープ／無意味なペプチド−グリシンリンカー（４×）−ネオエピトープ／無意味なペプチド−グリシンリンカー（４×）］ｎ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓタグ−２×終止コドンを含む成分をコードし、ネオエピトープ／無意味なペプチドは、約２１アミノ酸の長さであり、ｎ＝１〜２０である。別の実施形態において、ネオエピトープ／無意味なペプチドは、任意のｎで表される同じまたは異なる配列であり得る。
【０２７３】
別の実施形態において、ｎは、任意の整数を表す。別の実施形態において、ｎは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０を表し得る。別の実施形態において、１≦ｎ≦５、１≦ｎ≦１０、１≦ｎ≦２０、１≦ｎ≦３０、１≦ｎ≦４０、１≦ｎ≦５０、１≦ｎ≦６０、１≦ｎ≦７０、１≦ｎ≦８０、１≦ｎ≦９０、１≦ｎ≦１００、１≦ｎ≦２００、１≦ｎ≦３００、１≦ｎ≦４００、１≦ｎ≦５００、ｎ＜５、ｎ＜１０、ｎ＜２０、ｎ＜３０、ｎ＜４０、ｎ＜５０、ｎ＜６０、ｎ＜７０、ｎ＜８０、ｎ＜９０、ｎ＜１００、ｎ＜２００、ｎ＜３００、ｎ＜４００、ｎ＜５００、ｎ＞５、ｎ＞１０、ｎ＞２０、ｎ＞３０、ｎ＞４０、ｎ＞５０、ｎ＞６０、ｎ＞７０、ｎ＞８０、ｎ＞９０、ｎ＞１００、ｎ＞２００、ｎ＞３００、ｎ＞４００またはｎ＞５００である。それぞれの可能性が、別個の実施形態を表す。
【０２７４】
一実施形態において、本明細書において以下の要素：第１のネオエピトープのアミノ酸配列（例えば、フレームシフト変異由来ペプチド）に融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含む組換えポリペプチドをコードする核酸構築物が開示され、第１のネオエピトープ配列は、第２のネオエピトープのアミノ酸配列に作動可能に連結され（例えば、直接またはリンカー配列を介して融合され）、第２のネオエピトープ配列は、少なくとも１つの追加のネオエピトープのアミノ酸配列に作動可能に連結される（例えば、直接またはリンカー配列を介して融合される）。任意選択で、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、Ｎ末端切断型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）である。任意選択で、最後のネオエピトープは、Ｃ末端でタグ（例えば、３×ＦＬＡＧタグ、２×ＦＬＡＧタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドと組み合わせた３×ＦＬＡＧタグ、またはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドと組み合わせた２×ＦＬＡＧタグ）に作動可能に連結される（例えば、直接またはリンカー配列を介して融合される）。任意選択で、核酸構築物は、Ｃ末端をコードする配列の後に（例えばタグをコードする配列の後に）少なくとも１つの終止コドン（例えば、２つの終止コドン）を含む。別の実施形態において、組換えポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列構築物は、以下の要素：第１の無意味なペプチドアミノ酸配列に融合したＮ末端切断型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）を含み、前記第１の無意味なペプチドアミノ酸配列は、リンカー配列を介して第２の無意味なペプチドアミノ酸配列に作動可能に連結され、前記第２の無意味なペプチドアミノ酸配列は、リンカー配列を介して少なくとも１つのさらなる無意味なペプチドアミノ酸配列に作動可能に連結され、および最後の無意味なペプチドは、リンカー配列を介してＣ末端でヒスチジンタグに作動可能に連結される。別の実施形態において、前記要素は、Ｎ末端からＣ末端まで配置されるかまたは作動可能に連結される。別の実施形態において、それぞれの核酸構築物は、前記６×ヒスチジン（ＨＩＳ）タグをコードする配列の後に少なくとも１つの終止コドンを含む。別の実施形態において、それぞれの核酸構築物は、前記６×ヒスチジン（ＨＩＳ）タグをコードする配列の後に２つの終止コドンを含む。別の実施形態において、前記６×ヒスチジンタグは、Ｎ末端でＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに作動可能に連結される。別の実施形態において、前記リンカーは、４×グリシンリンカーである。本明細書に開示される構築物が、ネオエピトープを含む無意味なペプチドまたはその断片を含み得ることは当業者であれば認識しているものと予想される。別の実施形態において、本明細書に開示される構築物は、ネオエピトープからなる無意味なペプチドまたはその断片を含む。
【０２７５】
別の実施形態において、少なくとも１つの核酸配列構築物は、リンカー配列が隣接する無意味なペプチドの２１アミノ酸配列に融合されたＮ末端切断型ＬＬＯ、その後に別のリンカーが隣接し、ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓタグおよびオープンリーディングフレームを閉じる２つの終止コドンによって終止する少なくとも１つの第２のネオエピトープを含む、組換えポリペプチド：ｐＨｌｙ−ｔＬＬＯ−２１マー＃１−４×グリシンリンカーＧ１−２１マー＃２−４×グリシンリンカーＧ２−・・・−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓタグ−２×終止コドンをコードする。別の実施形態において、上記の構築物の発現は、ｈｌｙプロモーターによって駆動される。
【０２７６】
用語「異常な」、「疾患の」、または「不健康な生物試料」は、「疾患を有する生物試料」、「疾患を有する試料」、または「疾患または状態を有する生物試料」を包含し、それらと互換的に使用され得ることは当業者であれば認識しているものと予想される。一実施形態において、生物試料は組織、細胞、血液、血清、リンパ球を含む被験体から得られた任意の試料、疾患を有する細胞を含む被験体から得られた任意の試料、または健康である被験体から得られたが、同じ被験体もしくは類似の個体から得られた疾患を有する試料と同等でもある任意の試料である。別の実施形態において、生物試料は、組織、細胞、血液試料、または血清試料を含む。
【０２７７】
一実施形態において、異常なまたは不健康な生物試料は、腫瘍組織またはがん組織またはその一部を含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは固形腫瘍であり得る。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、固形の腫瘍またはがんではなく、例えば腫瘍を形成しない血液のがんまたは乳がんである。別の実施形態において、腫瘍またはがんは液性の腫瘍またはがんである。
【０２７８】
別の実施形態において、腫瘍試料は、腫瘍またはがん細胞を含むまたは含むことが予想される患者由来の身体試料などの任意の試料に関する。身体試料は、血液、原発腫瘍もしくは腫瘍転移から得られた組織試料、または腫瘍もしくはがん細胞を含む他の任意の試料などの、任意の組織試料であり得る。さらに別の実施形態において、身体試料は血液、唾液からの細胞、または脳脊髄液からの細胞である。別の実施形態において、腫瘍試料は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの１つもしくは複数の単離された腫瘍もしくはがん細胞、または循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの１つもしくは複数の単離された腫瘍もしくはがん細胞を含む試料に関する。
【０２７９】
別の実施形態において、本明細書に開示の組成物、ワクチン、免疫療法またはプロセスを投与することによって処置される腫瘍またはがんは、乳がんもしくは乳房腫瘍を含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、子宮頸がんもしくは子宮頸部腫瘍を含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、Ｈｅｒ２含有腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、黒色腫腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、膵臓腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、卵巣腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、胃腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、膵臓の癌性病変を含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、肺腺癌の腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、多形神経膠芽腫の腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、結腸直腸腺癌の腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、肺扁平上皮腺癌の腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、胃腺癌の腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、卵巣表層上皮腫瘍の（例えば、その良性、増殖性または悪性型）腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、口腔扁平上皮癌の腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、非小細胞肺癌の腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、子宮内膜癌の腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、膀胱腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、頭頸部腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、前立腺癌の腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、胃腺癌の腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、口腔咽頭腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、肺腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、肛門腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、結腸直腸腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、食道腫瘍またはがんを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんは、中皮腫腫瘍またはがんを含む。腫瘍またはがんの他の好適なタイプとして、黒色腫、肺がん（例えば、肺扁平上皮癌、肺腺癌、小細胞肺がん）、膀胱がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ（ｇａｓｔｒｉｃ）ｃａｎｃｅｒ）、食道がん（例えば、食道腺癌）、結腸直腸がん、子宮がん（子宮内膜がんまたは子宮のがん）、頭頸部がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多形神経膠芽腫、卵巣がん、腎細胞がん（腎細胞癌、例えば乳頭状腎細胞癌、明細胞腎細胞癌、および嫌色素性腎細胞癌）、多発性骨髄腫、膵臓がん、乳がん、低グレード神経膠腫、慢性リンパ球性白血病、前立腺がん、神経芽腫、カルチノイド腫瘍、髄芽腫、急性骨髄性白血病、甲状腺がん、急性リンパ芽球性白血病、ユーイング肉腫、またはラブドイド腫瘍であり得る。同様に、腫瘍またはがんは、膵臓がん（例えば、膵臓腺癌）、前立腺がん（例えば、前立腺腺癌）、乳がん（浸潤性乳癌）、卵巣がん（例えば、卵巣漿液性嚢胞腺癌）、または甲状腺がん（例えば、甲状腺癌）が挙げられる。他のタイプの腫瘍またはがんも同様に可能である。一部の例において、腫瘍は、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、もしくは１０未満の腫瘍関連もしくは腫瘍特異的（すなわち、健康な生物試料には存在しない）非同義ミスセンス変異を有する腫瘍であるか、またはがんは、異なる患者にわたる腫瘍関連もしくは腫瘍特異的（すなわち健康な生物組織には存在しない）非同義ミスセンス変異の数の平均値もしくは中央値が、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、もしくは１０未満の非同義ミスセンス変異であるタイプのがんであるか、またはがんは、そのタイプのがんを有する患者の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは１００％が、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、もしくは１０未満の腫瘍関連もしくは腫瘍特異的（すなわち、健康な生物試料には存在しない）非同義ミスセンス変異を有する腫瘍を有するがんである。
【０２８０】
別の実施形態において、疾患を有する生物試料は、疾患もしくは状態を示す１つの位置から取得される。別の実施形態において、疾患を有する生物試料は、疾患もしくは状態を示す２つの異なる位置から取得される。別の実施形態において、疾患を有する生物試料は、疾患もしくは状態を示す約２〜５の異なる位置または疾患もしくは状態を有する組織を示す約２〜１０の異なる位置の範囲から取得される。別の実施形態において、１つの疾患を有する生物試料は、少なくとも１つの原発腫瘍および少なくとも第２の試料は、転移から取得される。別の実施形態において、疾患を有する生物試料は、原発腫瘍から取得される。別の実施形態において、疾患を有する生物試料は、転移から取得される。別の実施形態において、１つの疾患を有する生物試料は、少なくとも１つの転移から取得され、少なくとも１つの第２の試料は、異なる転移から取得される。別の実施形態において、少なくとも１つの疾患を有する生物試料は、少なくとも１つの疾患もしくは状態を有する組織から取得され、少なくとも２分の１は、血液または血清から取得される。
【０２８１】
別の実施形態において、異常なまたは不健康な生物試料は、非腫瘍またはがん性組織を含む。別の実施形態において、異常なまたは不健康な生物試料は、血液試料から単離された細胞、唾液からの細胞、または脳脊髄液からの細胞を含む。別の実施形態において、異常なまたは不健康な生物試料は、異常または不健康であると考えられる任意の組織またはその一部の試料を含む。
【０２８２】
一実施形態において、本明細書に開示のプロセスに従う分析のために疾患を有する生物試料を得ることができる、感染疾患を含む他の非腫瘍または非がん性疾患が、本開示に包含される。別の実施形態において、感染疾患はウイルス感染症を含む。別の実施形態において、感染疾患は、慢性ウイルス感染症を含む。別の実施形態において、感染疾患は、ＨＩＶなどの慢性ウイルス病を含む。別の実施形態において、感染疾患は、細菌感染症を含む。別の実施形態において、感染疾患は寄生生物感染症である。
【０２８３】
一実施形態において、病原性の原生動物および蠕虫感染症は、アメーバ症；マラリア；リーシュマニア症；トリパノソーマ症；トキソプラズマ症；ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ；バベシア症；ジアルジア鞭毛虫症；旋毛虫症；フィラリア症；住血吸虫症；線虫、吸虫または吸虫類、および条虫（サナダムシ）感染症を含む。
【０２８４】
別の実施形態において、感染疾患は、家畜の感染疾患である。別の実施形態において、家畜の疾患は、ヒトに伝播することがあり得、「人畜共通感染症」と呼ばれる。別の実施形態において、これらの疾患には、口蹄疫、西ナイルウイルス、狂犬病、イヌパルボウイルス、ネコ白血病ウイルス、ウマインフルエンザウイルス、感染性ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ）、仮性狂犬病、ブタコレラ（ＣＳＦ）、ウシのウシ１型ヘルペスウイルス（ＢＨＶ−１）感染によって引き起こされるＩＢＲ、およびブタの仮性狂犬病（アウエスキー病）、トキソプラズマ症、炭疽、水疱性口内炎ウイルス、ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ、野兎病、ペスト（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、トリコモナスが挙げられるがこれらに限定されない。それぞれの可能性が、本開示の別個の実施形態を表す。
【０２８５】
一実施形態において、他の非腫瘍または非がん性疾患は、分析のために疾患を有する生物試料を得ることができる自己免疫疾患を含む。用語「自己免疫疾患」は、個体自身の組織、臓器に対する免疫反応により生じる疾患もしくは状態、またはその症状発現もしくはそこから結果として生じた状態を包含することは、当業者であれば認識しているものと予想される。用語「自己免疫疾患」は、自己の組織に対する抗体が疾患状態に必ずしも関係していないがなおも診断において重要であるがんおよび他の疾患状態を包含することは、当業者であれば認識しているものと予想される。さらに、一実施形態において、自己免疫疾患は、正常な体組織および抗原と反応性である抗体のＢ細胞による自己抗体の産生に起因するか、または産生によって悪化する状態を含む。他の実施形態において、自己免疫疾患は、自己抗原（例えば、核抗原）からのエピトープに対して特異的である自己抗体の分泌を伴う疾患を含む。
【０２８６】
当技術分野で周知の慣例的な生検手順を使用して生物試料を得てもよい。生検は、熟練した医師、例えば病理医による被験体からの細胞または組織の取り出しを含み得る。多くの異なるタイプの生検手順が存在する。最も一般的なタイプには：（１）組織試料のみを取り出す切開生検；（２）塊または疑われる領域全体を取り出す切除生検；および（３）組織または体液の試料を針によって取り出す針生検、が挙げられる。太い針を使用する場合、手順をコア生検と呼ぶ。細い針を使用する場合、手順を、細針吸引生検と呼ぶ。
【０２８７】
一実施形態において、本明細書に開示の生物試料は、切開生検によって得られる。別の実施形態において、生物試料は、切除生検によって得られる。別の実施形態において、生物試料は針生検を使用して得られる。別の実施形態において、針生検は、コア生検である。別の実施形態において、生検は細針吸引生検である。別の実施形態において、生物試料は、血液試料の一部から得られる。別の実施形態において、生物試料は、頬スワブの一部として得られる。別の実施形態において、生物試料は唾液試料採取の一部として得られる。別の実施形態において、生物試料は組織生検の全てまたは一部を含む。別の実施形態において、組織生検を採取し、その組織試料からの細胞が収集され、細胞は本開示の生物試料を含む。別の実施形態において、本開示の生物試料は、細胞生検の一部として得られる。別の実施形態において、複数の生検を、同じ被験体から採取してもよい。別の実施形態において、同じ被験体からの生検を、同じ組織または細胞から収集してもよい。別の実施形態において、同じ被験体からの生検を、被験体内の細胞供給源の異なる組織から収集してもよい。
【０２８８】
一実施形態において、生検は、骨髄組織を含む。別の実施形態において、生検は、血液試料を含む。別の実施形態において、生検は、胃腸組織、例えば食道、胃、十二指腸、直腸、結腸、および回腸末端部の生検を含む。別の実施形態において、生検は肺組織を含む。別の実施形態において、生検は前立腺組織を含む。別の実施形態において、生検は、肝組織を含む。別の実施形態において、生検は、神経系の組織、例えば脳生検、神経生検、または髄膜生検を含む。別の実施形態において、生検は、尿生殖器組織、例えば腎生検、子宮内膜生検、または子宮頸部円錐切除を含む。別の実施形態において、生検は、乳房生検を含む。別の実施形態において、生検はリンパ節生検を含む。別の実施形態において、生検は筋生検を含む。さらに別の実施形態において、生検は皮膚生検を含む。別の実施形態において、生検は骨生検を含む。別の実施形態において、疾患組織の診断を確認するために、各試料の疾患を有する試料病理学を調べる。別の実施形態において、健康組織の診断を確認するために、健康な組織を調べる。
【０２８９】
一実施形態において、正常または健康な生物試料は、被験体から得られる。別の実施形態において、正常または健康な生物試料は、被験体に由来する身体試料などの任意の試料に関連する非腫瘍形成試料である。試料は、本明細書に開示の生物試料から得られる健康な細胞などの任意の組織試料であり得る。別の実施形態において、正常または健康な生物試料は、一実施形態において、近縁の個体である別の個体から得られる。別の実施形態において、別の個体は、被験体と同じ種の個体である。別の実施形態において、別の個体は、疾患を有する生物試料を含まないまたは含まないと予想される健康な個体である。別の実施形態において、別の個体は、腫瘍またはがん細胞を含まないまたは含まないと予想される健康な個体である。健康な個体を、当技術分野で公知の方法を使用して、個体が健康であることを決定するために、疾患の存在に関してスクリーニングしてもよいことは、当業者であれば認識しているものと予想される。疾患を有する生物試料および健康な生物試料はいずれも、同じ組織（例えば、腫瘍組織と周辺の正常組織の両方を含む組織切片）から得ることができる。好ましくは、健康な生物試料は正常な健康な細胞から本質的にまたは完全になり、疾患を有する生物試料（例えば、がん細胞または特定のタイプのがん細胞を含むと考えられる試料）と比較して使用することができる。好ましくは、試料は同じタイプの試料である（例えば、いずれも血液であるか、またはいずれも血清である）。例えば、疾患を有する生物試料が細胞を含む場合、好ましくは健康な生物試料中の細胞は、疾患を有する生物試料（例えば、肺または脳）中の疾患を有する細胞と同じ組織起源を有し、同じ細胞タイプ（例えば、神経、上皮、間葉、造血）から生じる。
【０２９０】
別の実施形態において、正常または健康な生物試料は、疾患を有する生物試料と同時に得られる。当業者は、用語「正常または健康な生物試料」が、用語「参照試料」または「参照組織」を包含すること、および全体を通して全て同じ意味および性質を有し、互換的に使用され得ることを認識していると予想される。別の実施形態において、参照試料を使用して、腫瘍標本から得られた結果を相関させて比較する。別の実施形態において、参照試料は、同じ種からの十分に多数の正常標本を試験することによって経験的に決定される。別の実施形態において、正常または健康な生物試料は異なる時期に得られ、時期は、正常または健康な試料が、異常なもしくは不健康な試料を得る前に得られる、またはその後に得られるような時期であり得る。得る方法は、生検または血液収集に関して当技術分野で日常的に使用される方法を含む。別の実施形態において、試料は凍結試料である。別の実施形態において、試料は組織パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織ブロックとして含まれる。
【０２９１】
別の実施形態において、疾患を有する生物試料は、疾患または状態を有する被験体から得られる。別の実施形態において、健康な生物試料は、疾患または状態を有する被験体から得られる。
【０２９２】
一実施形態において、正常なまたは健康な生物試料を得た後、試料を、当技術分野で周知の技術および方法論を使用して核酸を抽出するために処理する。別の実施形態において、抽出した核酸はＤＮＡを含む。別の実施形態において、抽出した核酸はＲＮＡを含む。別の実施形態において、ＲＮＡはｍＲＮＡである。別の実施形態において、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ライブラリーを調製する。次世代シーケンシングライブラリーを構築して、エクソームまたは標的化遺伝子捕捉を行ってもよい。別の実施形態において、当技術分野で公知の技術を使用して、例えば全体が本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２０１４０１４１９９２号を参照して、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを作製する。
【０２９３】
ＩＩ．組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株
本明細書において、個別化免疫療法送達ベクターとして使用するために組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を提供する。例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、１つまたは複数の異種ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含む組換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸であって、１つまたは複数の異種ペプチドが、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドを含む、核酸を含み得る。そのような組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、組換えポリペプチドを発現および分泌することができる。これらの要素のそれぞれに関して異なる可能性は、本明細書の他所において免疫療法送達ベクターに関して一般的に記載したとおりである。
【０２９４】
そのような組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株において、組換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、Ｌｉｓｔｅｒｉａのゲノムに組み込まれている。代替的に、組換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、プラスミドに存在する。プラスミドは、例えば、抗生物質選択の非存在下で組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株において安定に維持され得る。同様に、そのような２つのオープンリーディングフレーム、１つはＬｉｓｔｅｒｉａゲノムにゲノムとして組み込まれたもの、および１つはプラスミドに存在するものを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を有することも可能である。２つのオープンリーディングフレームは、同じであり得る（すなわち、同じ組換えポリペプチドをコードする）か、または異なり得る（すなわち、２つの異なる組換えポリペプチドをコードする）。
【０２９５】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株であり得る。例えば、それは、１つまたは複数の内因性遺伝子において変異を含み得る。そのような変異は、例えば、ａｃｔＡ遺伝子変異、ｐｒｆＡ変異、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ二重変異、ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子二重変異、ｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ遺伝子三重変異、またはその組み合わせから選択され得る。変異は、例えば、遺伝子または複数の遺伝子の不活化、切断、欠失、置換、または破壊を含み得る。
【０２９６】
そのような組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株において、組換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸は、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含む。同様に、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、代謝酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む第２の核酸をさらに含み得る。例として、代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素であり得る。
【０２９７】
具体的な例として、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、ａｃｔＡ、ｄａｌ、およびｄａｔの欠失またはそれらにおける不活化変異を含み、組換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸がエピソームプラスミドに存在し、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、ならびにＰＥＳＴ含有ペプチドがＬＬＯのＮ末端断片である、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり得る。
【０２９８】
一実施形態において、本明細書に開示されるのは、それぞれの核酸配列が、免疫原性ポリペプチドに融合した１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、前記１つまたは複数の無意味なペプチドが少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、前記１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれが、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、かつ前記供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から得られる、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株である。
【０２９９】
別の実施形態において、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は少なくとも１つの核酸配列を含み、核酸配列は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、融合ポリペプチドは、一つまたは複数のネオエピトープを含む一つまたは複数の無意味なペプチドに融合された切断型リステリオリシンＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、切断型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。１つまたは複数のネオエピトープを含む、本明細書に開示の１つまたは複数の無意味なペプチドは、まず第１に免疫原性であり得るが、その免疫原性を、ｔＬＬＯ、切断型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列などの免疫原性ポリペプチドと融合させることによって、または混合することによって増強させることができることは当業者によって理解されると予想される。そのような免疫原性ポリペプチドは、例えばＰＥＳＴ含有ペプチドであり得る。
【０３００】
一実施形態において、切断型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質は、推定のＰＥＳＴ配列を含む。一実施形態において、切断型ＡｃｔＡタンパク質は、ＰＥＳＴ含有アミノ酸配列を含む。別の実施形態において、切断型ＡｃｔＡタンパク質は、推定のＰＥＳＴ含有アミノ酸配列を含む。
【０３０１】
一実施形態において、ＰＥＳＴアミノ酸（ＡＡ）配列は、切断型ＬＬＯ配列を含む。別の実施形態において、ＰＥＳＴアミノ酸配列は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号２）を含む。別の実施形態において、抗原と、Ｌｉｓｔｅｒｉａ由来の他のＬＭ  ＰＥＳＴ  ＡＡ配列との融合物もまた、無意味なペプチドの免疫原性を増強すると予想される。別の実施形態において、ネオエピトープとＬｉｓｔｅｒｉａ由来の他のＬＭ  ＰＥＳＴ  ＡＡ配列との融合物もまた、ネオペプチドの免疫原性を増強すると予想される。
【０３０２】
本明細書に開示の方法および組成物のＮ末端ＬＬＯタンパク質断片は、別の実施形態において、配列番号４を含む。別の実施形態において、断片は、ＬＬＯシグナルペプチドを含む。別の実施形態において、断片は、配列番号４を含む。別の実施形態において、断片は、おおよそ配列番号４からなる。別の実施形態において、断片は配列番号４から本質的になる。別の実施形態において、断片は、配列番号４に対応する。別の実施形態において、断片は、配列番号４と相同である。別の実施形態において、断片は、配列番号４の断片と相同である。一実施形態において、使用される切断型ＬＬＯは、シグナル配列を除外する。別の実施形態において、切断型ＬＬＯは、シグナル配列を含む。活性化ドメインを含まない、特にシステイン４８４を含まない任意の切断型ＬＬＯが本明細書に開示の方法および組成物にとって適していることは当業者に明らかと予想される。別の実施形態において、異種抗原と、ＰＥＳＴ  ＡＡ配列、配列番号２を含む任意の切断型ＬＬＯとの融合物は、抗原の細胞媒介性免疫および抗腫瘍免疫を増強する。別の実施形態において、無意味なペプチドと、ＰＥＳＴ  ＡＡ配列、配列番号２を含む任意の切断型ＬＬＯとの融合物は、無意味なペプチドの細胞媒介性免疫および抗腫瘍免疫を増強する。
【０３０３】
本明細書に開示の組換えポリペプチドを構築するために利用されるＬＬＯタンパク質は、別の実施形態において、配列番号３に記載の配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ１３１２８；核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１５１２７に記載される）を有する。この配列に対応するプロタンパク質の最初の２５のＡＡは、シグナル配列であり、細菌から分泌される際にＬＬＯから切断される。このため、この実施形態において、完全長の活性なＬＬＯタンパク質は、５０４残基の長さである。別の実施形態において、上記のＬＬＯ断片は、本明細書に開示の組換えポリペプチドまたはワクチンに組み込まれているＬＬＯ断片の供給源として使用される。
【０３０４】
別の実施形態において、本明細書に開示の組成物および方法に利用されるＬＬＯタンパク質のＮ末端断片は、配列番号４に記載の配列を有する。
【０３０５】
別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、本明細書において利用されるＬＬＯタンパク質の約２０〜４４２位のＡＡに対応する。
【０３０６】
別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、配列番号５に記載の配列を有する。
【０３０７】
用語「Ｎ末端切断型ＬＬＯタンパク質」、「Ｎ末端ＬＬＯ断片」、「切断型ＬＬＯタンパク質」、「△ＬＬＯ」、またはその文法上の同等物は、本明細書において互換的に使用され、非溶血性であるＬＬＯの断片を包含することは、当業者であれば認識しているものと予想される。別の実施形態において、用語は、推定のＰＥＳＴ配列を含むＬＬＯ断片を包含する。
【０３０８】
別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、活性化ドメインの欠失または変異によって非溶血性となる。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、システイン４８４位を含む領域の欠失または変異によって非溶血性となる。別の実施形態において、ＬＬＯは、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第８，７７１，７０２号に詳述されるコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の欠失または変異によって非溶血性となる。
【０３０９】
一実施形態において、本明細書に開示の組換えタンパク質またはポリペプチドは、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質を含み、ＬＬＯタンパク質は、ＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、Ｗ４９２、またはその組み合わせの変異を含む。一実施形態において、Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２残基は、配列番号３の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２であるが、別の実施形態において、それらは、当業者に公知であるように、配列アラインメントを使用して推定することができる対応する残基である。一実施形態において、残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２は、変異している。一実施形態において、変異は置換であり、別の実施形態において欠失である。一実施形態において、ＣＢＤ全体が変異しており、別の実施形態において、ＣＢＤの一部が変異しているが、別の実施形態において、ＣＢＤ内の特定の残基のみが変異している。
【０３１０】
別の実施形態において、本明細書に開示の方法および組成物のＬＬＯ断片の長さは、少なくとも４８４のＡＡを含む。別の実施形態において、長さは４８４のＡＡを超える。別の実施形態において、長さは少なくとも４８９のＡＡである。別の実施形態において、長さは４８９を超える。別の実施形態において、長さは少なくとも４９３のＡＡである。別の実施形態において、長さは４９３を超える。別の実施形態において、長さは少なくとも５００のＡＡである。別の実施形態において、長さは５００を超える。別の実施形態において、長さは少なくとも５０５のＡＡである。別の実施形態において、長さは５０５を超える。別の実施形態において、長さは少なくとも５１０のＡＡである。別の実施形態において、長さは５１０を超える。別の実施形態において、長さは少なくとも５１５のＡＡである。別の実施形態において、長さは５１５を超える。別の実施形態において、長さは少なくとも５２０のＡＡである。別の実施形態において、長さは５２０を超える。別の実施形態において、長さは少なくとも５２５のＡＡである。別の実施形態において、長さは５２０を超える。本明細書におけるＬＬＯ断片の長さを参照する場合には、シグナル配列が含まれている。このため、ＣＢＤにおける最初のシステインの番号付けは４８４であり、ＡＡ残基の総数は５２９である。
【０３１１】
用語「融合ペプチド」、「融合ポリペプチド」、「組換えポリペプチド」、「キメラタンパク質」、または「組換えタンパク質」は、ペプチド結合または他の化学結合によって共に連結された、２つもしくはそれよりも多いアミノ酸配列または２つもしくはそれよりも多いタンパク質を含むペプチドまたはポリペプチドを包含することは、当業者であれば認識しているものと予想される。別の実施形態において、タンパク質は、ペプチド結合または他の化学結合によって直接共に連結される。別の実施形態において、タンパク質は、２つまたはそれよりも多いタンパク質の間の１つまたは複数のＡＡ（例えば「スペーサー」）によって共に連結される。
【０３１２】
別の実施形態において、切断型ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の４４１のＡＡを含む。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯの最初の４２０のＡＡを含む。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、野生型ＬＬＯタンパク質の非溶血性形態である。
【０３１３】
別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、約残基１〜２５からなる。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、約残基１〜５０からなる。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、約残基１〜７５からなる。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、約残基１〜１００からなる。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、約残基１〜１２５からなる。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、約残基１〜１５０からなる。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、約残基１１７５からなる。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、約残基１〜２００からなる。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、約残基１〜２２５からなる。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、約残基１〜２５０からなる。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、約残基１〜２７５からなる。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、約残基１〜３００からなる。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、約残基１〜３２５からなる。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、約残基１〜３５０からなる。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、約残基１〜３７５からなる。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、約残基１〜４００からなる。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、約残基１〜４２５からなる。
【０３１４】
別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、上記のＡＡ範囲の１つに対応する相同なＬＬＯタンパク質の残基を含む。残基の番号は、別の実施形態において、上記で列挙した残基の番号と正確に対応する必要はない；例えば、相同なＬＬＯタンパク質が、本明細書において利用されるＬＬＯタンパク質と比較して挿入または欠失を有する場合、残基の番号をそれに従って調節することができる。別の実施形態において、ＬＬＯ断片は、当技術分野で公知の任意の他のＬＬＯ断片である。
【０３１５】
相同なタンパク質の対応する残基を同定するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、配列アライメントが挙げられる。一実施形態において、相同なＬＬＯは、７０％より多くの本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。別の実施形態において、相同なＬＬＯは、７２％より多くの本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。別の実施形態において、相同なＬＬＯは、７５％より多くの本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。別の実施形態において、相同なＬＬＯは、７８％より多くの本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。別の実施形態において、相同なＬＬＯは、８０％より多くの本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。別の実施形態において、相同なＬＬＯは、８２％より多くの本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。別の実施形態において、相同なＬＬＯは、８３％より多くの本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。別の実施形態において、相同なＬＬＯは、８５％より多くの本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。別の実施形態において、相同なＬＬＯは、８７％より多くの本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。別の実施形態において、相同なＬＬＯは、８８％より多くの本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。別の実施形態において、相同なＬＬＯは、９０％より多くの本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。別の実施形態において、相同なＬＬＯは、９２％より多くの本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。別の実施形態において、相同なＬＬＯは、９３％より多くの本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。別の実施形態において、相同なＬＬＯは、９５％より多くの本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。別の実施形態において、相同なＬＬＯは、９６％より多くの本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。別の実施形態において、相同なＬＬＯは、９７％より多くの本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。別の実施形態において、相同なＬＬＯは、９８％より多くの本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。別の実施形態において、相同なＬＬＯは、９９％より多くの本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。別の実施形態において、相同なＬＬＯは、１００％の本明細書に開示のＬＬＯ配列を包含する。
【０３１６】
用語「ＰＥＳＴアミノ酸配列」、「ＰＥＳＴ配列」、「ＰＥＳＴ配列ペプチド」、「ＰＥＳＴペプチド」、または「ＰＥＳＴ配列含有タンパク質またはペプチド」は、互換的に使用され、一実施形態においてＮ末端ＬＬＯであるか、または別の実施形態において切断型ＡｃｔＡタンパク質である、切断型ＬＬＯタンパク質を包含し得ることを、当業者は認識していると予想される。ＰＥＳＴ配列ペプチドは当技術分野で公知であり、その両方の全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第７，６３５，４７９号および米国特許出願公開第２０１４／０１８６３８７号に記載されている。
【０３１７】
別の実施形態において、原核生物のＰＥＳＴ配列は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに関して、ＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｂｅｒｔｓ（ＴＢＳ  ２１巻：２６７〜２７１頁、１９９６年）に記載されているような方法に従って日常的に同定することができる。あるいは、他の原核生物からのＰＥＳＴアミノ酸配列もまた、この方法に基づいて同定することができる。ＰＥＳＴアミノ酸配列を含むことが予想される他の原核生物には、他のＬｉｓｔｅｒｉａ種が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓタンパク質ＡｃｔＡは、４つのそのような配列を含む。これらは、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号６）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号７）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号８）、およびＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号９）である。同様に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．のストレプトリシンＯもＰＥＳＴ配列を含む。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのストレプトリシンＯは、アミノ酸３５〜５１位でＰＥＳＴ配列：ＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号１０）を含み、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓのストレプトリシンＯは、アミノ酸３８〜５４位でＰＥＳＴ様配列：ＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号１１）を含む。さらに、ＰＥＳＴ配列は、抗原性タンパク質内に埋もれることができると考えられる。当業者は、ＰＥＳＴ配列融合物に関連する場合の本明細書に開示の用語「融合物」が、抗原、例えば無意味なペプチドと、抗原の１つの末端に連結されているかまたは抗原内に埋もれているＰＥＳＴアミノ酸配列との両方を含む抗原性タンパク質を包含することを認識していると予想される。他の実施形態において、ＰＥＳＴ配列またはＰＥＳＴ含有ポリペプチドは、融合タンパク質の一部ではなく、ポリペプチドは異種抗原を含まない。
【０３１８】
当業者は、用語「核酸配列」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸構築物」が、本明細書において互換的に使用され得ること、ならびに原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、およびさらには合成ＤＮＡ配列を包含し得るがこれらに限定されない、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を包含し得ることを認識していると予想される。用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかを含む配列を包含する。用語はまた、一連の少なくとも２つの塩基−糖−ホスフェートの組み合わせを包含し得る。用語はまた、核酸ポリマーの単量体単位を包含し得る。ＲＮＡは、一実施形態において、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（低分子核ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびリボザイムの形態であり得る。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを使用することが記述されている（Ｃａｕｄｙ  ＡＡら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ  １６巻：２４９１〜９６頁、およびその中で引用されている参考文献）。ＤＮＡはプラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、直線状ＤＮＡ、もしくは染色体ＤＮＡ、またはこれらの群の誘導体の形態であり得る。さらに、これらの形態のＤＮＡおよびＲＮＡは、一本鎖、二本鎖、三本鎖、または四本鎖であり得る。用語はまた、他のタイプの骨格を含むが同じ塩基を含み得る人工核酸を包含し得る。一実施形態において、人工核酸はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡは、ペプチド骨格と、ヌクレオチド塩基とを含み、一実施形態において、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の両方に結合することができる。別の実施形態において、ヌクレオチドは、オキセタン修飾されている。別の実施形態において、ヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合に置換することにより修飾されている。別の実施形態において、人工核酸は、当技術分野で公知のネイティブ核酸のホスフェート骨格の任意の他の改変体を含む。ホスホロチオエート核酸およびＰＮＡを使用することは、当業者に公知であり、例えば、Ｎｅｉｌｓｅｎ  ＰＥ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９巻：３５３〜５７頁；およびＲａｚ  ＮＫら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２９７巻：１０７５〜８４頁に記載されている。核酸の産生および使用は当業者に公知であり、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、（２００１年）、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ編、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ（２００３年）ＰｕｒｃｈｉｏおよびＧ．  Ｃ．  Ｆａｒｅｅｄに記載されている。
【０３１９】
別の実施形態において、本明細書に開示の核酸分子は、エピソームまたはプラスミドベクターから発現される。別の実施形態において、プラスミドは、抗生物質選択の非存在下で組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株において安定に維持される。別の実施形態において、プラスミドは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａに対して抗生物質耐性を付与しない。
【０３２０】
一実施形態において、本明細書に開示の免疫原性ポリペプチドまたはその断片は、ＡｃｔＡタンパク質またはその断片である。一実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１２に記載の配列を含む。
【０３２１】
この配列に対応するプロタンパク質の最初の２９のＡＡは、シグナル配列であり、それが細菌から分泌される際にＡｃｔＡタンパク質から切断される。一実施形態において、ＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは、シグナル配列、すなわち上記の配列番号１２の１〜２９位のＡＡを含む。別の実施形態において、ＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは、シグナル配列、すなわち上記の配列番号１２の１〜２９位のＡＡを含まない。
【０３２２】
一実施形態において、切断型ＡｃｔＡタンパク質は、ＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片を含む。別の実施形態において、切断型ＡｃｔＡタンパク質は、ＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片である。一実施形態において、切断型ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１３に示される配列を含む。
【０３２３】
別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、配列番号１３に示される配列を含む。
【０３２４】
別の実施形態において、切断型ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１４に示される配列を含む。
【０３２５】
別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、当該技術分野において公知の任意の他のＡｃｔＡ断片である。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、免疫原性断片である。
【０３２６】
別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１５に示される配列配列を含む。この配列に対応するプロタンパク質の最初の２９のＡＡはシグナル配列であり、細菌によって分泌される際にＡｃｔＡタンパク質から切断される。一実施形態において、ＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは、シグナル配列、配列番号１５の１〜２９位のＡＡを含む。別の実施形態において、ＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは、シグナル配列、配列番号１５の１〜２９位のＡＡを含まない。
【０３２７】
別の実施形態において、切断型ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１６に示される配列を含む。別の実施形態において、配列番号１６に示される通りの切断型ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ１と呼ばれる。別の実施形態において、切断型ＡｃｔＡは、完全長のＡｃｔＡ配列の最初の３０からアミノ酸１２２までを含む。別の実施形態において、配列番号１６は、完全長のＡｃｔＡ配列の最初の３０からアミノ酸１２２までを含む。別の実施形態において、切断型ＡｃｔＡは、配列番号１５の最初の３０からアミノ酸１２２までを含む。別の実施形態において、配列番号１６は、配列番号１５の最初の３０からアミノ酸１２２までを含む。
【０３２８】
別の実施形態において、切断型ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１７に示される配列を含む。別の実施形態において、配列番号１７に示される通りの切断型ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２と呼ばれる。別の実施形態において、配列番号１７に示される通りの切断型ＡｃｔＡは、ＬＡ２２９と呼ばれる。別の実施形態において、切断型ＡｃｔＡは、完全長のＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０からアミノ酸２２９までを含む。別の実施形態において、配列番号１７は、完全長のＡｃｔＡ配列の約アミノ酸３０から約アミノ酸２２９までを含む。別の実施形態において、切断型ＡｃｔＡは、配列番号１５の約アミノ酸３０からアミノ酸２２９までを含む。別の実施形態において、配列番号１７は、配列番号１５のアミノ酸３０からアミノ酸２２９までを含む。
【０３２９】
別の実施形態において、本明細書に開示の切断型ＡｃｔＡ配列は、Ｎ末端でｈｌｙシグナルペプチドにさらに融合されている。別の実施形態において、ｈｌｙシグナルペプチドに融合された切断型ＡｃｔＡは、配列番号１８を含む。
【０３３０】
別の実施形態において、ｈｌｙシグナルペプチドに融合された切断型ＡｃｔＡは、配列番号１９を含む配列によってコードされる。別の実施形態において、配列番号１９は、シグナル配列後の異なるポリペプチド、異種抗原などをクローニングすることができるように、ＸｂａＩの独自の制限酵素部位を作製するために使用されるリンカー領域をコードする配列（配列番号１９のヌクレオチド７３〜７８位）を含む。したがって、シグナルペプチダーゼがリンカー領域の前の配列に作用して、シグナルペプチドを切断することは、当業者であれば認識しているものと予想される。
【０３３１】
別の実施形態において、切断型ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号２０に示される配列を含む。別の実施形態において、配列番号２０に示される通りの切断型ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ３と呼ばれる。別の実施形態において、この切断型ＡｃｔＡは、完全長のＡｃｔＡ配列の最初の３０からアミノ酸３３２までを含む。別の実施形態において、配列番号２０は、完全長のＡｃｔＡ配列の最初の３０からアミノ酸３３２までを含む。別の実施形態において、切断型ＡｃｔＡは、配列番号１５の約最初の３０からアミノ酸３３２までを含む。別の実施形態において、配列番号２０は、配列番号１５の最初の３０からアミノ酸３３２までを含む。
【０３３２】
別の実施形態において、切断型ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号２１に示される配列を含む。別の実施形態において、配列番号２１に示される通りの切断型ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ４と呼ばれる。別の実施形態において、この切断型ＡｃｔＡは、完全長のＡｃｔＡ配列の最初の３０からアミノ酸３９９までを含む。別の実施形態において、配列番号２１は、完全長のＡｃｔＡ配列の最初の３０からアミノ酸３９９までを含む。別の実施形態において、切断型ＡｃｔＡは、配列番号１５の最初の３０からアミノ酸３９９までを含む。別の実施形態において、配列番号１８は、配列番号１５の最初の３０からアミノ酸３９９までを含む。
【０３３３】
別の実施形態において、「切断型ＡｃｔＡ」または「ΔＡｃｔＡ」は、ＰＥＳＴドメインを含むＡｃｔＡの断片を包含する。別の実施形態において、この用語は、ＰＥＳＴ配列を含むＡｃｔＡ断片を包含する。別の実施形態において、切断型ＡｃｔＡタンパク質をコードする組換えヌクレオチドは、配列番号２２に示される配列を含む。
【０３３４】
別の実施形態において、組換えヌクレオチドは、配列番号２２に示される配列を有する。別の実施形態において、組換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意の他の配列を含む。
【０３３５】
別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、ＡｃｔＡタンパク質のおよそ最初の１００のＡＡからなる。
【０３３６】
別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜２５からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜５０からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜７５からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜１００からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜１２５からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜１５０からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜１７５からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜２００からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜２２５からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜２５０からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜２７５からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜３００からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜３２５からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜３３８からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜３５０からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜３７５からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜４００からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜４５０からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜５００からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜５５０からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜６００からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜６３９からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基３０〜１００からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基３０〜１２５からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基３０〜１５０からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基３０〜１７５からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基３０〜２００からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基３０〜２２５からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基３０〜２５０からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基３０〜２７５からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基３０〜３００からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基３０〜３２５からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基３０〜３３８からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基３０〜３５０からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基３０〜３７５からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基３０〜４００からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基３０〜４５０からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基３０〜５００からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基３０〜５５０からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基１〜６００からなる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、約残基３０〜６０４からなる。
【０３３７】
別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は、上記のＡＡ範囲の１つに対応する相同なＡｃｔＡタンパク質の残基を含む。残基の番号は、別の実施形態において、上記で列挙した残基の番号と正確に一致する必要はなく、例えば相同なＡｃｔＡタンパク質が、本明細書において利用されるＡｃｔＡタンパク質と比較して挿入または欠失を有する場合、残基の番号をそれに従って調節することができる。別の実施形態において、ＡｃｔＡ断片は当技術分野で公知の任意の他のＡｃｔＡ断片である。
【０３３８】
本明細書に開示の任意の核酸配列を参照する場合の用語「相同性」は、対応するネイティブ核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列におけるヌクレオチドの百分率を包含し得ることは、当業者であれば認識しているものと予想される。
【０３３９】
相同性は、一実施形態において、当技術分野で十分に記載されている方法によって、配列アラインメントに関するコンピューターアルゴリズムによって決定される。例えば、核酸配列相同性に関するコンピューターアルゴリズム分析は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｕｔｉｌｉｔｙ）、ＧＥＮＰＥＰＴおよびＴＲＥＭＢＬパッケージなどの利用可能な多くのソフトウェアパッケージを利用することを含み得る。
【０３４０】
別の実施形態において、「相同性」は、本明細書に開示の配列から選択される配列に対する６８％超の同一性を指す。別の実施形態において、「相同性」は、本明細書に開示の配列から選択される配列に対する７０％超の同一性を指す。別の実施形態において、「相同性」は、本明細書に開示の配列から選択される配列に対する７２％超の同一性を指す。別の実施形態において、同一性は、７５％より高い。別の実施形態において、同一性は、７８％より高い。別の実施形態において、同一性は、８０％より高い。別の実施形態において、同一性は、８２％より高い。別の実施形態において、同一性は、８３％より高い。別の実施形態において、同一性は、８５％より高い。別の実施形態において、同一性は、８７％より高い。別の実施形態において、同一性は、８８％より高い。別の実施形態において、同一性は、９０％より高い。別の実施形態において、同一性は、９２％より高い。別の実施形態において、同一性は、９３％より高い。別の実施形態において、同一性は、９５％より高い。別の実施形態において、同一性は、９６％より高い。別の実施形態において、同一性は、９７％より高い。別の実施形態において、同一性は、９８％より高い。別の実施形態において、同一性は、９９％より高い。別の実施形態において、同一性は、１００％である。
【０３４１】
別の実施形態において、相同性は、候補となる配列ハイブリダイゼーションの決定を介して決定され、その方法は当技術分野で十分に記載されている（例えば、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．、およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．編、（１９８５年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．；およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙを参照されたい）。例えば、ハイブリダイゼーション方法は、ネイティブカスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの相補体に対して中等度からストリンジェントな条件下で実行することができる。ハイブリダイゼーション条件は例えば、１０〜２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩のインキュベーションである。
【０３４２】
一実施形態において、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、抗生物質耐性遺伝子を欠如している。
【０３４３】
一実施形態において、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａは、ファゴリソソームから逃避することができる。一実施形態において、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａは、ファゴソームから逃避することができる。
【０３４４】
別の実施形態において、本明細書に開示のＬｉｓｔｅｒｉａ株に含まれる内因性の遺伝子変異は、ａｃｔＡ遺伝子変異、ｐｒｆＡ変異、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ二重変異、ｄａｌ／ｄａｌ遺伝子二重変異、もしくはｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ遺伝子三重変異またはその組み合わせから選択される。
【０３４５】
一実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノムは、一実施形態においてビルレンス因子である内因性のａｃｔＡ遺伝子の欠失を含む。一実施形態において、異種抗原または抗原性ポリペプチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ染色体においてＬＬＯとインフレームで組み込まれる。別の実施形態において、組み込まれた核酸分子は、ＡｃｔＡとインフレームでａｃｔＡ座に組み込まれる。別の実施形態において、ＡｃｔＡをコードする染色体核酸は、抗原をコードする核酸分子に置換されている。
【０３４６】
一実施形態において、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａは、１つまたは複数の無意味なペプチドを含む組換えポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸分子を含み、１つまたは複数の無意味なペプチドは１つまたは複数のネオエピトープを含む。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、本明細書に開示の無意味なペプチドまたはその断片に融合した、切断型ＬＬＯタンパク質、切断型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴ配列をさらに含む。
【０３４７】
別の実施形態において、本明細書に開示の細菌シグナル配列は、別の実施形態においてｈｌｙまたはａｃｔＡシグナル配列である、Ｌｉｓｔｅｒｉａシグナル配列である。別の実施形態において、細菌シグナル配列は、当技術分野で公知の任意の他のシグナル配列である。
【０３４８】
一実施形態において、本明細書に開示の組換えポリペプチドをコードする核酸はまた、シグナルペプチドまたはシグナル配列を含む。一実施形態において、本明細書に開示の核酸構築物または核酸分子によってコードされる細菌分泌シグナル配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ分泌シグナル配列である。別の実施形態において、本開示の方法および組成物の融合タンパク質は、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）からのＬＬＯシグナル配列を含む。本明細書に開示の１つまたは複数のネオエピトープを含む抗原またはペプチドは、シグナル配列、例えばＬｉｓｔｅｒｉａシグナル配列、例えばヘモリシン（ｈｌｙ）シグナル配列またはａｃｔＡシグナル配列を使用することによって発現され得ることは、当業者であれば認識しているものと予想される。あるいは、例えば融合タンパク質を作製することなく、外来性遺伝子をＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓプロモーターの下流で発現させることができる。別の実施形態において、シグナルペプチドは細菌性（Ｌｉｓｔｅｒｉａまたは非Ｌｉｓｔｅｒｉａ）である。一実施形態において、シグナルペプチドは細菌に対してネイティブである。別の実施形態において、シグナルペプチドは細菌に対して外来性である。別の実施形態において、シグナルペプチドは、ｓｅｃＡ１シグナルペプチドなどのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのシグナルペプチドである。別の実施形態において、シグナルペプチドは、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓのＵｓｐ４５シグナルペプチド、またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの保護抗原シグナルペプチドである。別の実施形態において、シグナルペプチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのｐ６０シグナルペプチドなどのｓｅｃＡ２シグナルペプチドである。さらに、組換え核酸分子は任意選択で、ｐ６０をコードする第３のポリヌクレオチド配列、またはその断片を含む。別の実施形態において、シグナルペプチドは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＴａｔシグナルペプチド（例えば、ＰｈｏＤ）などのＴａｔシグナルペプチドである。一実施形態において、シグナルペプチドは、組換えポリペプチドをコードする同じ翻訳読み取り枠に存在する。
【０３４９】
別の実施形態において、分泌シグナル配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａタンパク質に由来する。別の実施形態において、分泌シグナルはＡｃｔＡ３００分泌シグナルである。別の実施形態において、分泌シグナルはＡｃｔＡ１００分泌シグナルである。
【０３５０】
一実施形態において、本明細書に開示の核酸分子は、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含む。別の実施形態において、代謝酵素は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の染色体において欠如している内因性の遺伝子を補完する。別の実施形態において、代謝酵素は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の染色体において変異している内因性の遺伝子を補完する。別の実施形態において、第２のオープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素（ｄａｌ）である。別の実施形態において、第２のオープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素（ｄａｔ）である。別の実施形態において、本明細書に開示のＬｉｓｔｅｒｉａ株は、内因性のｄａｌ／ｄａｔ遺伝子において変異を含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａはｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を欠如する。
【０３５１】
別の実施形態において、本明細書に開示の方法および組成物の核酸分子は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結される。別の実施形態において、本明細書に開示の方法および組成物の第１のオープンリーディングフレームは、プロモーター／調節配列に作動可能に連結される。別の実施形態において、本明細書に開示の方法および組成物の第２のオープンリーディングフレームは、プロモーター／調節配列に作動可能に連結される。別の実施形態において、オープンリーディングフレームのそれぞれは、プロモーター／調節配列に作動可能に連結される。
【０３５２】
当業者は、用語「代謝酵素」が宿主細菌によって必要とされる栄養素の合成に関係する酵素を包含し得ることを認識していると予想される。一実施形態において、用語は、宿主細菌が必要とする栄養素の合成にとって必要な酵素を包含する、別の実施形態において、用語は、宿主細菌が利用する栄養素の合成に関係する酵素を包含する。別の実施形態において、用語は、宿主細菌の持続的な生育にとって必要な栄養素の合成に関係する酵素を包含する。別の実施形態において、酵素は栄養素の合成にとって必要である。
【０３５３】
別の実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａは、弱毒化された栄養要求株である。
【０３５４】
一実施形態において、弱毒化株は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）である。別の実施形態において、弱毒化株は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ）である。ＬｍｄｄＡは、ビルレンス遺伝子ａｃｔＡの欠失により弱毒化され、ｄａｌ遺伝子の補完によりｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の異種抗原または切断型ＬＬＯ発現に関してプラスミドを保持するＬｉｓｔｅｒｉａワクチンベクターに基づく。
【０３５５】
別の実施形態において、弱毒化株は、ＬｍｄｄＡである、別の実施形態において、弱毒化株は、Ｌｍ△ａｃｔＡである。別の実施形態において、弱毒化株は、Ｌｍ△ＰｒｆＡである。別の実施形態において、弱毒化株は、Ｌｍ△ＰｒｆＡ＊である。別の実施形態において、弱毒化株は、Ｌｍ△ＰｌｃＢである。別の実施形態において、弱毒化株は、Ｌｍ△ＰｌｃＡである。別の実施形態において、株は、上記の株のいずれかの二重変異体または三重変異体である。別の実施形態において、この株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａベースのワクチンの固有の特性である強いアジュバント効果を発揮する。別の実施形態において、この株は、ＥＧＤ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ骨格から構築される。別の実施形態において、本明細書に開示の株は、非溶血性ＬＬＯを発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株である。
【０３５６】
別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、ビタミン合成遺伝子をコードする遺伝子が欠損している。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、パントテン酸シンターゼをコードする遺伝子が欠損している。
【０３５７】
一実施形態において、本明細書に開示のＤアラニンが欠損しているＬｉｓｔｅｒｉａ株の生成は、例えば、欠失変異誘発、挿入変異誘発、およびフレームシフト変異が生成される変異誘発、タンパク質の未成熟終止を引き起こす変異、または遺伝子発現に影響を及ぼす調節配列の変異を含む、当業者に周知である多数の方法で達成することができる。別の実施形態において、変異誘発は、組換えＤＮＡ技術を使用して、または変異促進性化学物質もしくは放射線を使用し、その後変異体の選択を行う従来の変異誘発技術を使用して達成することができる。別の実施形態において、付随する栄養要求性表現型の復帰変異の確率が低いために、欠失変異体が好ましい。別の実施形態において、本明細書に提示のプロトコールに従って生成されたＤ−アラニンの変異体を、単純な実験培養アッセイにおいてＤ−アラニンの非存在下での生育能に関して試験してもよい。別の実施形態において、この化合物の非存在下で生育することができない変異体を、さらなる試験のために選択する。
【０３５８】
別の実施形態において、上記のＤ−アラニン関連遺伝子に加えて、本明細書に開示の代謝酵素の合成に関係する他の遺伝子を、Ｌｉｓｔｅｒｉａの変異誘発の標的として使用してもよい。
【０３５９】
別の実施形態において、代謝酵素は、組換え細菌株の染色体の残りが欠如している内因性の代謝遺伝子を補完する。一実施形態において、内因性の代謝遺伝子は、染色体において変異している。別の実施形態において、内因性の代謝遺伝子は、染色体から欠失している。別の実施形態において、代謝酵素は、アミノ酸代謝酵素である。別の実施形態において、代謝酵素は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株において細胞壁合成のために使用されるアミノ酸の形成を触媒する。別の実施形態において、代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素である。別の実施形態において、代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。
【０３６０】
一実施形態において、栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の栄養要求性を補完する代謝酵素を含むエピソーム発現ベクターを含む。別の実施形態において、構築物は、エピソーム様式でＬｉｓｔｅｒｉａ株に含まれる。別の実施形態において、外来性抗原は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が有するプラスミドベクターから発現される。別の実施形態において、エピソーム発現プラスミドベクターは、抗生物質耐性マーカーを欠如する。一実施形態において、本明細書に開示の方法および組成物の抗原は、ＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドに融合される。
【０３６１】
別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株はアミノ酸（ＡＡ）代謝酵素を欠失している。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株はＤ−グルタミン酸シンターゼ遺伝子を欠失している。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株はｄａｔ遺伝子を欠失している。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株はｄａｌ遺伝子を欠失している。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株はｄｇａ遺伝子を欠失している。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、ジアミノピメリン酸の合成に係る遺伝子であるＣｙｓＫを欠失している。別の実施形態において、遺伝子は、ビタミンＢ１２非依存性メチオニンシンターゼである。別の実施形態において、遺伝子は、ｔｒｐＡである。別の実施形態において、遺伝子は、ｔｒｐＢである。別の実施形態において、遺伝子は、ｔｒｐＥである。別の実施形態において、遺伝子は、ａｓｎＢである。別の実施形態において、遺伝子は、ｇｌｔＤである。別の実施形態において、遺伝子は、ｇｌｔＢである。別の実施形態において、遺伝子は、ｌｅｕＡである。別の実施形態において、遺伝子は、ａｒｇＧである。別の実施形態において、遺伝子は、ｔｈｒＣである。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は１つまたは複数の本明細書に開示の遺伝子を欠失している。
【０３６２】
別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株はシンターゼ遺伝子を欠失している。別の実施形態において、遺伝子は、ＡＡ合成遺伝子である。別の実施形態において、遺伝子は、ｆｏｌＰである。別の実施形態において、遺伝子は、ジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質である。別の実施形態において、遺伝子は、ｉｓｐＤである。別の実施形態において、遺伝子は、ｉｓｐＦである。別の実施形態において、遺伝子は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼである。別の実施形態において、遺伝子は、ｈｉｓＦである。別の実施形態において、遺伝子は、ｈｉｓＨである。別の実施形態において、遺伝子は、ｆｌｉＩである。別の実施形態において、遺伝子は、リボソーム巨大サブユニットプソイドウリジンシンターゼである。別の実施形態において、遺伝子は、ｉｓｐＤである。別の実施形態において、遺伝子は、二機能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質である。別の実施形態において、遺伝子は、ｃｏｂＳである。別の実施形態において、遺伝子は、ｃｏｂＢである。別の実施形態において、遺伝子は、ｃｂｉＤである。別の実施形態において、遺伝子は、ウロポルフィリン−ＩＩＩ  Ｃ−メチルトランスフェラーゼ／ウロポルフィリノーゲン−ＩＩＩシンターゼである。別の実施形態において、遺伝子は、ｃｏｂＱである。別の実施形態において、遺伝子は、ｕｐｐＳである。別の実施形態において、遺伝子は、ｔｒｕＢである。別の実施形態において、遺伝子は、ｄｘｓである。別の実施形態において、遺伝子は、ｍｖａＳである。別の実施形態において、遺伝子は、ｄａｐＡである。別の実施形態において、遺伝子は、ｉｓｐＧである。別の実施形態において、遺伝子は、ｆｏｌＣである。別の実施形態において、遺伝子は、クエン酸シンターゼである。別の実施形態において、遺伝子は、ａｒｇＪである。別の実施形態において、遺伝子は、３−デオキシ−７−ホスホヘプツロネート（ｐｈｏｓｐｈｏｈｅｐｔｕｌｏｎａｔｅ）シンターゼである。別の実施形態において、遺伝子は、インドール−３−グリセロール−ホスフェートシンターゼである。別の実施形態において、遺伝子は、アントラニレートシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼ成分である。別の実施形態において、遺伝子は、ｍｅｎＢである。別の実施形態において、遺伝子は、メナキノン特異的イソコリスミメートシンターゼである。別の実施形態において、遺伝子は、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩまたはＩＩである。別の実施形態において、遺伝子は、ホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサイミド（ｓｕｃｃｉｎｏｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）シンターゼである。別の実施形態において、遺伝子は、ｃａｒＢである。別の実施形態において、遺伝子は、ｃａｒＡである。別の実施形態において、遺伝子は、ｔｈｙＡである。別の実施形態において、遺伝子は、ｍｇｓＡである。別の実施形態において、遺伝子は、ａｒｏＢである。別の実施形態において、遺伝子は、ｈｅｐＢである。別の実施形態において、遺伝子は、ｒｌｕＢである。別の実施形態において、遺伝子は、ｉｌｖＢである。別の実施形態において、遺伝子は、ｉｌｖＮである���別の実施形態において、遺伝子は、ａｌｓＳである。別の実施形態において、遺伝子は、ｆａｂＦである。別の実施形態において、遺伝子は、ｆａｂＨである。別の実施形態において、遺伝子は、プソイドウリジンシンターゼである。別の実施形態において、遺伝子は、ｐｙｒＧである。別の実施形態において、遺伝子は、ｔｒｕＡである。別の実施形態において、遺伝子は、ｐａｂＢである。別の実施形態において、遺伝子は、ａｔｐシンターゼ遺伝子（例えば、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ−２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ−２など）である。
【０３６３】
別の実施形態において、遺伝子は、ｐｈｏＰである。別の実施形態において、遺伝子は、ａｒｏＡである。別の実施形態において、遺伝子は、ａｒｏＣである。別の実施形態において、遺伝子は、ａｒｏＤである。別の実施形態において、遺伝子は、ｐｌｃＢである。
【０３６４】
別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株はペプチドトランスポーターを欠失している。別の実施形態において、遺伝子は、ＡＢＣトランスポーター／ＡＴＰ結合／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態において、遺伝子は、オリゴペプチドＡＢＣトランスポーター／オリゴペプチド結合タンパク質である。別の実施形態において、遺伝子は、オリゴペプチドＡＢＣトランスポーター／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態において、遺伝子は、ジンクＡＢＣトランスポーター／ジンク結合タンパク質である。別の実施形態において、遺伝子は、糖ＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、ホスフェートトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、ＺＩＰジンクトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、ＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬剤耐性トランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、スルフェートトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、プロトン依存性オリゴペプチドトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、マグネシウムトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、ホルメート／ニトリルトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、スペルミジン／プトレシンＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、Ｎａ／Ｐｉ−共トランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、糖ホスフェートトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、グルタミンＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、メジャーファシリテーター（ｍａｊｏｒ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）ファミリートランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、グリシンベタイン／Ｌ−プロリンＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、モリブデンＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、タイコ酸（ｔｅｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）ＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、コバルトＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、アンモニウムトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、アミノ酸ＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、細胞分裂ＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、マンガンＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、鉄化合物ＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、マルトース／マルトデキストリンＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、Ｂｃｒ／ＣｆｌＡファミリーの薬剤耐性トランスポーターである。別の実施形態において、遺伝子は、本明細書に開示のタンパク質の１つのサブユニットである。
【０３６５】
一実施形態において、本明細書において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａに到達するために、Ｌｉｓｔｅｒｉａを形質転換するために使用される核酸分子が開示される。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａを形質転換するために使用される本明細書に開示の核酸は、ビルレンス遺伝子を欠如する。別の実施形態において、核酸分子は、Ｌｉｓｔｅｒｉａゲノムに組み込まれ、非機能的なビルレンス遺伝子を有する。別の実施形態において、ビルレンス遺伝子は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａにおいて変異している。さらに別の実施形態において、核酸分子はＬｉｓｔｅｒｉａゲノムに存在する内因性の遺伝子を不活化するために使用される。さらに別の実施形態において、ビルレンス遺伝子は、ａｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌＡ遺伝子、およびｉｎｌＢ遺伝子、ｉｎｌＣ遺伝子、ｉｎｌＪ遺伝子、ｐｌｂＣ遺伝子、ｂｓｈ遺伝子、またはｐｒｆＡ遺伝子である。ビルレンス遺伝子は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａにおいてビルレンスに関連する当技術分野で公知の任意の遺伝子であり得ることは当業者によって理解されるべきである。
【０３６６】
さらに別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、ｉｎｌＡ変異体、ｉｎｌＢ変異体、ｉｎｌＣ変異体、ｉｎｌＪ変異体、ｐｒｆＡ変異体、ａｃｔＡ変異体、ｄａｌ／ｄａｔ変異体、ｐｒｆＡ変異体、ｐｌｃＢ欠失変異体、またはｐｌｃＡおよびｐｌｃＢもしくはａｃｔＡおよびｉｎｌＢの両方を欠如する二重変異体である。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、これらの遺伝子の欠失または変異を個別にまたは組み合わせて含む。別の実施形態において、本明細書に開示のＬｉｓｔｅｒｉａは、遺伝子のそれぞれ１つを欠如する。別の実施形態において、本明細書に開示のＬｉｓｔｅｒｉａは、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、およびｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を含む、本明細書に開示の任意の遺伝子の少なくとも１つおよび最大１０個までを欠如する。別の実施形態において、ｐｒｆＡ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ変異体は、Ｄ１３３Ｖ変異を含むＰｒｆＡ変異体タンパク質をコードする核酸配列を含むプラスミドによって完成され得る。
【０３６７】
一実施形態において、代謝遺伝子、ビルレンス遺伝子などは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の染色体において欠如、欠失、または変異している。別の実施形態において、代謝遺伝子、ビルレンス遺伝子などは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の染色体および任意のエピソーム遺伝子要素において欠如、欠失、または変異している。別の実施形態において、代謝遺伝子、ビルレンス遺伝子などは、ビルレンス株のゲノムにおいて欠如、欠失、または変異している。
【０３６８】
一実施形態において、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、弱毒化されている。別の実施形態において、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、内因性のａｃｔＡおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活化変異を含む。別の実施形態において、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、本明細書に開示の内因性のａｃｔＡ、ｉｎｌＢ、およびｉｎｌＣ遺伝子の不活化変異を含む。別の実施形態において、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、以下の遺伝子：ａｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｐｒｆＡ、ｐｌｃＡ、ｐｌｃＢの任意の単一の遺伝子または組み合わせにおいて不活化変異を含む。
【０３６９】
用語「変異」およびその文法上の同等物は、配列（核酸またはアミノ酸配列）に対する任意のタイプの変異または改変を包含し、欠失変異、切断、不活化、破壊、挿入、重複、フレームシフト、または転座を包含することは、当業者であれば認識しているものと予想される。これらのタイプの変異は当技術分野で容易に公知である。
【０３７０】
一実施形態において、本明細書に開示の代謝酵素をコードするプラスミドまたは補完性遺伝子を含む栄養要求性細菌を選択するために、形質転換された栄養要求性細菌を、アミノ酸代謝遺伝子または補完性遺伝子の発現に関して選択する培地上で生育させる。別の実施形態において、Ｄ−グルタミン酸合成に関して栄養要求性である細菌を、Ｄ−グルタミン酸合成に関する遺伝子を含むプラスミドによって形質転換すると、栄養要求性細菌はＤ−グルタミン酸の非存在下で生育するが、プラスミドによって形質転換されていないまたはＤ−グルタミン酸合成に関するタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養要求性細菌は、生育しない。別の実施形態において、Ｄ−アラニン合成に関して栄養要求性の細菌は、プラスミドがＤ−アラニン合成のアミノ酸代謝酵素をコードする単離核酸を含む場合に本開示のプラスミドで形質転換され、このプラスミドを発現する場合には、Ｄ−アラニンの非存在下で生育する。必要な増殖因子、補充物質（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、アミノ酸、ビタミン、抗生物質などを含むまたは欠如する適切な培地を作製するためのそのような方法は、当技術分野で周知であり、市販されている（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）。それぞれの方法は、本開示の別個の実施形態を表す。
【０３７１】
別の実施形態において、本明細書に開示のプラスミドを含む栄養要求性細菌が適切な培地上で選択されると、細菌は、選択圧の存在下で繁殖する。そのような繁殖は、栄養要求性因子を含まない培地中で細菌を生育させることを含む。栄養要求性細菌におけるアミノ酸代謝酵素を発現するプラスミドの存在により、プラスミドが細菌と共に複製し、このようにしてプラスミドを有する細菌に関して連続的に選択することを確実にする。当業者は、本開示および本明細書に記載の方法を備えると、プラスミドを含む栄養要求性細菌が生育する培地の体積を調節することによって、Ｌｉｓｔｅｒｉａワクチンベクターの産生を容易に規模拡大できると予想される。
【０３７２】
当業者は、別の実施形態において、他の栄養要求株および補完系が本明細書に開示の使用のために採用されることを認識していると予想される。
【０３７３】
一実施形態において、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および無意味なペプチドは、互いに直接融合されている。別の実施形態において、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および無意味なペプチドをコードする遺伝子は、互いに直接融合されている。別の実施形態において、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および無意味なペプチドは、リンカーペプチドを介してに作動可能に付着されている。別の実施形態において、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および無意味なペプチドは、異種ペプチドを介して付着されている。別の実施形態において、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片は、無意味なペプチドに対してＮ末端である。別の実施形態において、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片は、単独で、すなわち融合されていない形態で発現され使用される。別の実施形態において、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片は、融合タンパク質の最Ｎ末端部分である。別の実施形態において、切断型ＬＬＯは、Ｃ末端で切断されて、Ｎ末端ＬＬＯに達している。別の実施形態において、切断型ＬＬＯは、非溶血性ＬＬＯである。
【０３７４】
一実施形態において、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および無意味なペプチドは、互いに直接融合されている。別の実施形態において、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および無意味なペプチドをコードする遺伝子は、互いに直接融合されている。別の実施形態において、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および無意味なペプチドは、リンカーペプチドを介してに作動可能に付着されている。別の実施形態において、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および無意味なペプチドは、異種ペプチドを介して付着されている。別の実施形態において、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は、無意味なペプチドに対してＮ末端である。別の実施形態において、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は、単独で、すなわち融合されていない形態で発現され使用される。別の実施形態において、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は、融合タンパク質の最Ｎ末端部分である。別の実施形態において、切断型ＡｃｔＡは、Ｃ末端で切断されて、Ｎ末端ＡｃｔＡに達している。
【０３７５】
一実施形態において、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、組換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。別の実施形態において、本明細書に開示の組換え核酸は、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株におけるプラスミドにある。別の実施形態において、プラスミドは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の染色体に組み込まれないエピソームプラスミドである。別の実施形態において、プラスミドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の染色体に組み込まれる組み込みプラスミドである。別の実施形態において、プラスミドは、マルチコピープラスミドである。
【０３７６】
別の実施形態において、無関係なＬｉｓｔｅｒｉａワクチンを注射したナイーブ動物またはマウスにおいてＣＴＬ活性は検出されない（図１２Ａ）。別の実施形態において、本明細書に開示の弱毒化された栄養要求株は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスの脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌を刺激することができる（図１２Ｂおよび１２Ｃ）。
【０３７７】
別の実施形態において、構築物または核酸分子は、トランスポゾン挿入を使用してＬｉｓｔｅｒｉａ染色体に組み込まれる。トランスポゾン挿入技術は、当技術分野で周知であり、とりわけ、ＤＰ−Ｌ９６７の構築において、Ｓｕｎら（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９０年、５８巻：３７７０〜３７７８頁）によって記載されている。
【０３７８】
ＩＩＩ．送達ベクター
一実施形態において、本明細書に開示のベクターは、プラスミドまたはファージベクターを含む、当技術分野で公知のベクターである。別の実施形態において、構築物または核酸分子は、ファージ組み込み部位を含むファージベクターを使用してＬｉｓｔｅｒｉａ染色体に組み込まれる（Ｌａｕｅｒ  Ｐ、Ｃｈｏｗ  ＭＹら、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００２年；１８４巻（１５号）：４１７７〜８６頁）。この方法のある特定の実施形態において、インテグラーゼ遺伝子およびバクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）の結合部位を使用して、異種遺伝子を、ゲノムにおける任意の適切な部位（例えば、ｃｏｍＫまたはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子の３’末端）であり得る対応する結合部位に挿入する。別の実施形態において、内因性のプロファージを、構築物または異種遺伝子の組み込み前に利用する結合部位から溶原性除去する（ｃｕｒｅ）。別の実施形態において、この方法によって、シングルコピー組み込み体が得られる。別の実施形態において、本開示は、ｄ−アラニンラセマーゼを含むがこれに限定されない必須の酵素に対して栄養要求性である宿主株、例えばＬｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）を使用することができる、臨床適用のためにファージベースの染色体組み込み系をさらに含む。別の実施形態において、「ファージ溶原性除去ステップ」を回避するために、ＰＳＡに基づくファージ組み込み系を使用する。これは、別の実施形態において、組み込まれた遺伝子を維持するために抗生物質による連続的な選択を必要とする。このため、別の実施形態において、本開示は、抗生物質による選択を必要としないファージベースの染色体組み込み系の確立を可能にする。その代わりに、栄養要求性宿主株を補完することができる。
【０３７９】
一実施形態において、１つまたは複数のネオエピトープを含む、１つもしくは複数のペプチドもしくはその断片、または１つもしくは複数の無意味なペプチドもしくはその断片をコードする核酸の送達のために使用されるベクターは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株に限定されず、核酸またはペプチドを哺乳動物被験体に送達するために有用であることが当技術分野で公知の任意の送達ベクターを包含する。別の実施形態において、本明細書に開示のベクターは、細菌送達ベクター、ＤＮＡワクチン送達ベクター、ＲＮＡワクチン送達ベクター、ウイルス送達ベクター、ウイルス様粒子、リポソーム送達ベクター、または核酸負荷ナノ粒子を含む、当技術分野で公知の送達ベクターである。用語「送達ベクター」は、宿主細胞において１つもしくは複数のネオエピトープまたは１つもしくは複数のネオエピトープを含むペプチドを送達することができる、およびある特定の実施形態において発現することができる構築物を指すことは当業者であれば認識しているものと予想される。そのようなベクターの代表的な例には、ウイルスベクター、核酸発現ベクター、裸のＤＮＡ、およびある特定の真核細胞（例えば、産生細胞）が挙げられる。一実施形態において、送達ベクターは、プラスミドまたはファージベクターとは異なる。別の実施形態において、本開示の送達ベクターおよびプラスミドまたはファージベクターは、同じである。別の実施形態において、本明細書に開示の方法および組成物において使用される細菌送達ベクターは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、別の実施形態において、送達ベクターは細菌ベクター、ウイルスベクター、ペプチド免疫療法もしくはワクチンベクター、またはＤＮＡ免疫療法もしくはワクチンベクターである。
【０３８０】
一実施形態において、ウイルス送達ベクターは、以下から選択され得る：レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）、レンチウイルス、または当技術分野で公知の他の任意のウイルス送達ベクター。
【０３８１】
一実施形態において、免疫療法送達ベクターはナノ粒子である。別の実施形態において、ナノ粒子は陽イオンポリマーまたは陽イオン脂質によってコーティングされる。別の実施形態において、コーティングされたナノ粒子は、本明細書に開示の組換え核酸配列を含むナノ粒子を、所望の組織または腫瘍細胞に標的化する標的化リガンドをさらに含む。
【０３８２】
一実施形態において、本明細書に開示のリポソーム送達ベクターは、陽イオンリポソームである。
【０３８３】
別の実施形態において、本明細書に開示の免疫療法送達ベクターは、全身投与後に循環する際に細網内皮系（ＲＥＳ）を回避し、いくつかの障壁を横切った後、疾患を有する組織または腫瘍細胞などの標的細胞の細胞質または核に達する。
【０３８４】
本明細書に開示の方法および組成物の一実施形態において、用語「組換え部位」または「部位特異的組換え部位」は、組換え部位に隣接する核酸セグメントの交換または切除を媒介するリコンビナーゼ（一部の例において、関連するタンパク質と共に）によって認識される核酸分子中の塩基の配列を指す。リコンビナーゼおよび関連タンパク質は、集合的に「組換えタンパク質」と呼ばれ、例えばＬａｎｄｙ，  Ａ．、（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）３巻：６９９〜７０７頁；１９９３年）を参照されたい。
【０３８５】
「ファージ発現ベクター」、「ファージベクター」、または「ファージミド」は、本明細書に開示の方法および組成物の核酸配列を、原核細胞、酵母、真菌、植物、昆虫、または哺乳動物細胞を含む任意の細胞において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、構成的または誘導的に発現する目的のための、任意のファージベースの組換え発現系を指す。ファージ発現ベクターは、典型的には、細菌細胞において再生することができ、および適切な条件下ではファージ粒子を産生することができる。用語は、直線状または環状発現系を含み、エピソームとして留まるかまたは宿主細胞ゲノムに組み込まれるファージベースの発現ベクターの両方を包含する。
【０３８６】
一実施形態において、本明細書において使用される用語「作動可能に連結された」は、転写および翻訳調節核酸が、転写が開始されるように任意のコード配列に関連して位置することを意味する。一般的に、このことは、プロモーターおよび転写開始または開始配列がコード領域に対して５’に位置することを意味する。
【０３８７】
一実施形態において、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、タンパク質をおそらくコードし得る塩基の配列を含む生物のゲノムの部分である。別の実施形態において、ＯＲＦの開始および終止末端は、ｍＲＮＡの末端とは等価ではなく、それらは通常ｍＲＮＡ内に含まれる。一実施形態において、ＯＲＦは、１つの遺伝子の開始コード配列（開始コドン）と終止コドン配列（終止コドン）の間に位置する。このため、一実施形態において内因性のポリペプチドと共にオープンリーディングフレームとしてゲノムに作動可能に組み込まれている核酸分子は、内因性のポリペプチドと同じオープンリーディングフレームでゲノムに組み込まれている核酸分子である。
【０３８８】
別の実施形態において、送達ベクターは、１つまたは複数の免疫調節分子をコードする１つまたは複数のオープンリーディングフレームを含む核酸構築物をさらに含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、１つまたは複数の免疫調節分子をコードする１つまたは複数のオープンリーディングフレームを含む核酸構築物をさらに含む。そのような分子の例には、インターフェロンガンマ、サイトカイン、ケモカイン、Ｔ細胞刺激剤、およびその任意の組み合わせが挙げられる。
【０３８９】
別の実施形態において、免疫調節分子は、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株から発現および分泌され、前記分子は、インターフェロンガンマ、サイトカイン、ケモカイン、Ｔ細胞刺激剤、およびその任意の組み合わせを含む群より選択される。
【０３９０】
一実施形態において、本開示は、リンカー配列を含む融合ポリペプチドを提供する。一実施形態において、「リンカー配列」は、２つの異種ポリペプチド、またはその断片もしくはドメインを連結するアミノ酸配列を指す。一般的に、本明細書において使用されるように、リンカーは、ポリペプチドを共有結合により連結して融合ポリペプチドを形成するアミノ酸配列である。リンカーは典型的に、ディスプレイプラスミドベクターからのレポーター遺伝子の除去後に残りの組換えシグナルから翻訳され、オープンリーディングフレームによってコードされたアミノ酸配列とディスプレイタンパク質とを含む融合タンパク質を作製するアミノ酸を含む。当業者によって認識されるように、リンカーは、グリシンおよび他の小型中性アミノ酸などの追加のアミノ酸を含み得る。
【０３９１】
用語「内因性」は、参照生物内で発生したもしくは起源とする、または参照生物内の原因から生じた物品を包含し得ることは当業者であれば認識しているものと予想される。別の実施形態において、内因性はネイティブを指す。
【０３９２】
「安定に維持された」は、一実施形態において、１０世代の間、選択（例えば、抗生物質選択）の非存在下で、検出可能に失われることのない核酸分子またはプラスミドの維持を指す。別の実施形態において、期間は１５世代である。別の実施形態において、期間は２０世代である。別の実施形態において、期間は２５世代である。別の実施形態において、期間は３０世代である。別の実施形態において、期間は４０世代である。別の実施形態において、期間は５０世代である。別の実施形態において、期間は６０世代である。別の実施形態において、期間は８０世代である。別の実施形態において、期間は１００世代である。別の実施形態において、期間は１５０世代である。別の実施形態において、期間は２００世代である。別の実施形態において、期間は３００世代である。別の実施形態において、期間は５００世代である。別の実施形態において、期間は数世代より長い。別の実施形態において、核酸分子またはプラスミドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば、培養において）安定に維持される。別の実施形態において、核酸分子またはプラスミドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定に維持される。別の実施形態において、核酸分子またはプラスミドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で安定に維持される。
【０３９３】
別の実施形態において、本明細書において、内因性のＡｃｔＡ配列と共にオープンリーディングフレームとしてＬｉｓｔｅｒｉａゲノムに作動可能に組み込まれる核酸分子を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が開示される。別の実施形態において、本明細書に開示の方法および組成物の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、ＡｃｔＡまたは切断型ＡｃｔＡに融合した抗原を含む融合タンパク質をコードする核酸分子を含むエピソーム発現プラスミドベクターを含む。一実施形態において、抗原の発現および分泌は、ａｃｔＡプロモーターおよびａｃｔＡシグナル配列の制御下にあり、これはＡｃｔＡの１〜２３３アミノ酸（切断型ＡｃｔＡまたはｔＡｃｔＡ）との融合物として発現される。別の実施形態において、切断型ＡｃｔＡは、全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第７，６５５，２３８号に記載の野生型ＡｃｔＡタンパク質の最初の３９０アミノ酸からなる。別の実施形態において、切断型ＡｃｔＡは、米国特許出願公開第２０１４／０１８６３８７号に記載の、ＡｃｔＡ−Ｎ１００、またはＰＥＳＴモチーフが欠失しており、かつ非保存的ＱＤＮＫＲ（配列番号６０）置換を含むその改変バージョン（ＡｃｔＡ−Ｎ１００＊と呼ぶ）である。
【０３９４】
一実施形態において、本明細書に開示の断片は機能的断片である。別の実施形態において、「機能的断片」は、被験体に単独でまたは本明細書に開示のワクチン組成物において投与した場合に免疫応答を誘発することができる免疫原性断片である。別の実施形態において、機能的断片は、当業者によって理解され、および本明細書においてさらに開示される生物活性を有する。
【０３９５】
一実施形態において、本明細書に開示のＬｉｓｔｅｒｉａ株は、弱毒化株である。別の実施形態において、本明細書に開示のＬｉｓｔｅｒｉａ株は、組換え株である。別の実施形態において、本明細書に開示のＬｉｓｔｅｒｉａ株は、生きた弱毒化組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株である。
【０３９６】
本開示の方法および組成物の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、別の実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ株である。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ株である。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ株である。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｕｒｒａｙｉ株である。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ株である。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、当該技術分野において公知の任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ種の組換え株である。
【０３９７】
別の実施形態において、本開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、動物宿主を通して継代されている。別の実施形態において、継代は、ワクチンベクターとしての株の有効性を最大限にする。別の実施形態において、継代は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の免疫原性を安定化させる。別の実施形態において、継代は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株のビルレンスを安定化させる。別の実施形態において、継代は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の免疫原性を増加させる。別の実施形態において、継代は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株のビルレンスを増加させる。別の実施形態において、継代は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の不安定な亜株を除去する。別の実施形態において、継代は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の不安定な亜株の出現（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）を低減させる。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、抗原含有組換えペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入を含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、抗原含有組換えペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを有する。別の実施形態において、継代は、本明細書に記載されるように実施される。別の実施形態において、継代は、当該分野で公知の任意の他の方法によって行われる。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは継代されていない。
【０３９８】
別の実施形態において、本開示の組換え核酸は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株におけるコードされるペプチドの発現を駆動するプロモーター／調節配列に作動可能に連結されている。遺伝子の構成的発現を駆動するために有用なプロモーター／調節配列は、当技術分野において周知であり、例えばＬｉｓｔｅｒｉａのＰｈｌｙＡ、ＰＡｃｔＡ、およびｐ６０プロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのｂａｃプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓのｓｇｉＡプロモーター、ならびにＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのｐｈａＺプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３９９】
別の実施形態において、本開示のペプチドをコードする核酸の誘導型および組織特異的発現は、ペプチドをコードする核酸を誘導型または組織特異的プロモーター／調節配列の制御下に置くことによって達成される。この目的にとって有用である組織特異的または誘導型プロモーター／調節配列の例には、ＭＭＴＶ  ＬＴＲ誘導型プロモーター、およびＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。別の実施形態において、金属、グルココルチコイドなどの誘導剤に応答して誘導されるプロモーターを利用する。このため、本開示は、公知または未知のいずれかであり、それに作動可能に連結された所望のタンパク質の発現を駆動することができる任意のプロモーター／調節配列の使用を含むと認識されると予想される。用語「エピソーム発現ベクター」は、直線状または環状であり得、通常二本鎖の形態であり、宿主細菌または細胞のゲノムに組み込まれるのではなく宿主細菌または細胞の細胞質に存在するという点において染色体外である、核酸プラスミドベクターを包含することは当業者であれば認識しているものと予想される。一実施形態において、エピソーム発現ベクターは、目的の遺伝子を含む。別の実施形態において、エピソームベクターは、細菌の細胞質において複数のコピーで存続し、それによって目的の遺伝子の増幅が起こり、別の実施形態において、ウイルストランス作用因子が必要に応じて供給される。別の実施形態において、エピソーム発現ベクターは、本明細書においてプラスミドと呼ばれ得る。別の実施形態において、「組み込みプラスミド」は、宿主ゲノムへのその挿入またはその中に含まれる目的の遺伝子の挿入を標的化する配列を含む。別の実施形態において、挿入された目的の遺伝子は、中断されず、また細胞ＤＮＡへの組み込みによりしばしば起こる調節性の制約にも供されない。別の実施形態において、挿入された異種遺伝子の存在によって、細胞自身の重要な領域の再配列または中断は起こらない。別の実施形態において、安定なトランスフェクション手順において、エピソームベクターの使用はしばしば、染色体組み込みプラスミドの使用よりトランスフェクション効率が高い（Ｂｅｌｔ，  Ｐ．Ｂ．Ｇ．Ｍ．ら、（１９９１年）、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  （ＨＰＲＴ２）  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９巻、４８６１〜４８６６頁；Ｍａｚｄａ，  Ｏ．ら、（１９９７年）、Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｌｙｍｐｈｏ−ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０４巻、１４３〜１５１頁）。一実施形態において、本明細書に開示の方法および組成物のエピソーム発現ベクターは、ＤＮＡ分子を細胞に送達するために使用される多様な任意の方��によってｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に送達され得る。プラスミドベクターはまた、単独で送達されてもよく、または被験体の細胞への送達を増強する医薬組成物の形態で送達されてもよい。
【０４００】
一実施形態において、用語「融合した」は、共有結合による作動可能な連結を指す。一実施形態において、用語は、（核酸配列またはそのオープンリーディングフレームの）組換え融合物を含む。別の実施形態において、用語は、化学コンジュゲーションを含む。一実施形態において、用語「融合した」は、単一の読み取り枠が形成されるように接続された核酸配列を指す。一実施形態において、用語「融合した」は、複数の読み取り枠が形成されるように接続された核酸配列を指す。一実施形態において、用語「融合した」は、プロモーター配列がオープンリーディングフレームに機能的に接続されるように接続された核酸配列を指す。一実施形態において、用語「融合した」は、第２の核酸配列のＮ末端に接続された核酸配列を指す。別の実施形態において、用語「融合した」は、第２の核酸配列のＣ末端に接続された核酸配列を指す。
【０４０１】
一実施形態において、「形質転換すること」は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子を取り込むように細菌細胞を操作することを指す。別の実施形態において、「形質転換すること」は、プラスミドの遺伝子または他の異種ＤＮＡ分子を発現するように細菌細胞を操作することを指す。それぞれの可能性が、本明細書に開示の方法および組成物の別個の実施形態を表す。一実施形態において、形質転換は、プラスミドまたはファージベクターを使用して達成される。
【０４０２】
別の実施形態において、コンジュゲーションは、遺伝物質および／またはプラスミドを細菌に導入するために使用される。コンジュゲーション方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ  Ｊ．ら（Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｎｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ  ｂｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．  Ｐｌａｓｍｉｄ．  ２００６年１１月；５６巻（３号）：２２３〜７頁）およびＡｕｃｈｔｕｎｇ  ＪＭら（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｍｏｂｉｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００５年８月３０日；１０２巻（３５号）：１２５５４〜９頁）に記載されている。それぞれの方法は、本明細書に開示の方法および組成物の別個の実施形態を表す。
【０４０３】
一実施形態において、用語「弱毒化」は、細菌が動物において疾患を引き起こす能力の減少を指す。言い換えれば、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の病原性特徴は、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａと比較して弱められているが、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａは、培養において生育および維持することができる。一例として使用して、弱毒化ＬｉｓｔｅｒｉａをＢａｌｂ／ｃマウスに静脈内接種すると、接種した動物の５０％が生存する致死用量（ＬＤ５０）は、好ましくは野生型ＬｉｓｔｅｒｉａのＬＤ５０より少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、より好ましくは少なくとも約１，０００倍、さらにより好ましくは少なくとも約１０，０００倍、および最も好ましくは少なくとも約１００，０００倍増加している。Ｌｉｓｔｅｒｉａの弱毒化株は、このようにそれが投与される動物を死亡させない株であるか、または投与した細菌数が、同じ動物を死亡させるために必要な野生型の非弱毒化細菌の数より非常に多い場合に限って動物を死亡させる株である。弱毒化細菌はまた、その生育にとって必要な栄養素がその中に存在しないことから、一般的な環境で複製することができない株を意味すると解釈すべきである。このため、細菌は、必要な栄養素が提供される制御された環境での複製に制限されている。したがって、本開示の弱毒化株は、それらが制御されない複製を行うことができないという点において、環境に対して安全である。
【０４０４】
別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ当たり約１〜１００ネオエピトープの範囲のネオエピトープを含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ当たり１００〜２００の範囲のネオエピトープを含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ当たり最大約１０までのネオエピトープを含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ当たり最大約２０までのネオエピトープを含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ当たり最大約５０までのネオエピトープを含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ当たり最大約２００までのネオエピトープを含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ当たり最大約３００までのネオエピトープを含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ当たり最大約４００までのネオエピトープを含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ当たり最大約５００までのネオエピトープを含む。あるいは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、約１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、５〜１５、５〜２０、５〜２５、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、２０〜２５、２０〜３５、２０〜４５、３０〜４５、３０〜５５、４０〜５５、４０〜６５、５０〜６５、５０〜７５、６０〜７５、６０〜８５、７０〜８５、７０〜９５、８０〜９５、８０〜１０５または９５〜１０５の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、約１〜１００、５〜１００、５〜７５、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５または５〜１０の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、約１〜１００、１〜７５、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５または１〜１０の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ当たり約５０〜１００の範囲のネオエピトープを含む。あるいは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ当たり最大約１００までのネオエピトープを含む。あるいは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、最大約１０まで、最大約２０まで、最大約３０まで、最大約４０までまたは最大約５０までのネオエピトープを含む。それぞれの可能性が、本明細書に開示の別個の実施形態を表す。
【０４０５】
別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ当たり約１００より多くのネオエピトープを含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ当たり約５００より多くのネオエピトープを含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、１つのネオエピトープを含む。あるいは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ当たり約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００のネオエピトープを含む。
【０４０６】
別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、切断型ＬＬＯ、切断型ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列との融合タンパク質の文脈における一つまたは複数の無意味なペプチドを含むかまたは発現し、前記１つまたは複数の無意味なペプチドは、任意の数の上記実施形態に開示のネオエピトープを含む。
【０４０７】
ＩＶ．免疫療法を個別化するプロセス
同様に、本明細書において、免疫療法を個別化するためのプロセスが開示される。一実施形態において、本開示のプロセスは個別化免疫療法を作製する。別の実施形態において、疾患または状態を有する被験体のために個別化免疫療法を作製するプロセスは、患者の疾患に対して特異的である変異した抗原および改変体抗原（ネオ抗原）内のネオエピトープを同定および選択することを含む。別の実施形態において、本開示のプロセスは、無意味なペプチドまたは無意味であるポリペプチドの一部の翻訳が起こる、少なくとも１つのフレームシフト変異を有する核酸分子を同定することを含む。別の実施形態において、被験体のために個別化免疫療法を作製するプロセスは、被験体に処置を提供するためである。別の実施形態において、個別化免疫療法は、がん、自己免疫疾患、臓器移植拒絶、細菌感染症、ウイルス感染症、およびＨＩＶなどの慢性ウイルス病などの疾患を処置するために使用され得る。
【０４０８】
別の実施形態において、個別化免疫療法を作製するための本開示のプロセスは、正常なまたは健康な試料と比較して異常なまたは不健康な試料に存在する体細胞変異または核酸配列の差を同定するために、異常なまたは不健康な試料から抽出した核酸と、正常なまたは健康な参照試料から抽出した核酸とを使用することを含むことができ、体細胞変異または差を有するこれらの配列は、発現されたアミノ酸配列をコードする。別の実施形態において、体細胞変異または配列の差を発現するペプチドは、ある特定の実施形態において、本明細書を通して「ネオエピトープ」と呼ばれ得る。少なくとも１つのフレームシフト変異を含むヌクレオチド配列から発現されたペプチドは、ある特定の実施形態において、「無意味なペプチド」と呼ぶことができ、これらの無意味なペプチドは１つまたは複数のネオエピトープを含む。
【０４０９】
疾患または状態を有する被験体のための個別化された免疫療法を作製するためのそのようなプロセスの例は、（ａ）被験体の疾患を有するまたは状態を有する生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、健康な生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦと比較するステップであって、比較によって、疾患を有するまたは状態を有する生物試料からの１つまたは複数のＯＲＦ内でコードされる１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープ（例えば、Ｔ細胞エピトープ）を含む１つまたは複数のペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列が同定され、１つまたは複数の核酸配列のうちの少なくとも１つが、１つまたは複数のフレームシフト変異を含み、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドをコードする、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で同定された１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のペプチドを含む組換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を含む免疫療法送達ベクターを生成するステップとを含む。免疫療法送達ベクターは、任意のタイプの免疫療法送達ベクターであり得る。例えば、そのようなプロセスは、ＤＮＡ免疫療法、ペプチド免疫療法、または免疫療法のために使用される組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株もしくは他の細菌株を作製するために使用することができる。
【０４１０】
一実施形態において、１つまたは複数のネオエピトープは、複数のネオエピトープを含む。任意選択で、ステップ（ｂ）は、ステップ（ｂ）の核酸配列内の複数のネオエピトープを含む１つまたは複数のペプチドの順序を無作為化することを１回または複数回反復することをさらに含むことができる。そのような無作為化は、例えば複数のネオエピトープを含む１つまたは複数のペプチドの完全な組の順序を無作為化することを含み得るか、または複数のネオエピトープのサブセットを含む１つまたは複数のペプチドのサブセットの順序を無作為化することを含み得る。例えば、核酸配列が、２０のネオエピトープを含む２０（１〜２０番）のペプチドを含む場合、無作為化は、２０全てのペプチドの順序を無作為化することを含み得るか、またはペプチドのサブセット（例えば、ペプチド１〜５番または６〜１０番）のみの順序を無作為化することを含み得る。そのような順序の無作為化は、ネオエピトープおよびそれぞれの個々の領域の分泌および提示を促進することができる。
【０４１１】
そのような方法は、被験体に投与するための免疫療法送達ベクターを、既定の期間内、保存するステップをさらに含み得る。同様に、そのような方法は、被験体に免疫療法ベクター、ＤＮＡ免疫療法またはペプチド免疫療法を含む組成物を投与するステップをさらに含み得、投与によって、疾患または状態に対する個別化されたＴ細胞免疫応答が生成される。
【０４１２】
疾患を有するまたは状態を有する生物試料は、疾患または状態を有する被験体から得ることができる。同様に、健康な生物試料は、疾患または状態を有する被験体から得ることができる。健康な生物試料はまた、その被験体以外の誰かから得ることもできる。適した生物試料の例には、組織、細胞、血液試料、または血清試料が挙げられる。
【０４１３】
ステップ（ａ）における比較は、任意の好適な手段によるものであり得る。例えば、それは、疾患を有するまたは状態を有する生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦを、健康な生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦと比較するために、スクリーニングアッセイ、またはスクリーニングツール、および関連するデジタルソフトウェアを使用することを含み得る。そのような関連するデジタルソフトウェアは、ネオエピトープの免疫原性可能性を同定するために疾患を有するまたは状態を有する生物試料から抽出した核酸配列におけるＯＲＦ内の変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含み得る。
【０４１４】
疾患を有するまたは状態を有する生物試料から抽出した核酸配列および健康な生物試料から抽出した核酸配列は、任意の手段によって決定することができる。例えば、疾患を有するまたは状態を有する生物試料から抽出した核酸配列、および健康な生物試料から抽出した核酸配列は、エクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを使用して決定され得る。
【０４１５】
そのようなプロセスは、１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドを、１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドから１つまたは複数の異なるペプチド配列を生成することによって、ネオエピトープに関して特徴付けすることをさらに含み得る。１つまたは複数の異なるペプチド配列は、陽性の免疫応答を誘発するために十分な（例えば、Ｌｍ技術を使用して陽性の免疫応答を誘発するために十分な）任意の長さの配列であり得、フレームシフト変異由来ペプチドの任意の部分に由来し得る。１つまたは複数の異なるペプチド配列を、さらに特徴付けすることができる。例えば、１つまたは複数の異なるペプチド配列、および本明細書で他所に開示のＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける分泌性（ｓｅｃｒｅｔａｂｉｌｉｔｙ）を予測するヒドロパシー閾値より下のスコアを示さないペプチド配列を除外する。一例において、スコア付けは、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのヒドロパシー指標の２１アミノ酸ウィンドウによるものであり、約１．６のカットオフを超えるスコアを有するあらゆるペプチド配列は、除外されるかまたはカットオフ未満のスコアを有するように改変される。１つまたは複数の異なるペプチド配列はまた、Ｔ細胞受容体が結合するＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩによる結合に関してスクリーニングおよび選択され得る。
【０４１６】
フレームシフト変異は、タンパク質コード遺伝子内のどこかに存在し得る。例えば、フレームシフト変異は、遺伝子の最後から２番目のエクソンまたは最後のエクソンに存在し得る。フレームシフト変異によってコードされる無意味なペプチドは、陽性の免疫応答を誘発するために十分な（例えば、Ｌｍ技術を使用して陽性の免疫応答を誘発するために十分な）任意の長さのペプチドであり得る。例えば、無意味なペプチドの１つまたは複数またはそれぞれは、約８〜１０、１１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、または８〜５００アミノ酸の長さであり得る。一部のそのような無意味なペプチドは、翻訳後切断部位をコードしない。
【０４１７】
疾患または状態は、ネオエピトープが存在する任意の疾患または状態であり得る。例えば、疾患または状態はがんまたは腫瘍であり得る。一例として、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープは、疾患または状態に関連する自己抗原を含むことができ、自己抗原は、がん関連もしくは腫瘍関連ネオエピトープ、またはがん特異的もしくは腫瘍特異的ネオエピトープを含む。腫瘍またはがんの例は本明細書において他所で提供する。例えば、疾患または状態は、健康な生物試料には存在しない１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０未満の非同義ミスセンス変異を有する腫瘍であり得る。疾患または状態はまた、感染疾患でもあり得る。例えば、１つまたは複数の無意味なペプチドは、感染疾患関連または感染疾患特異的ネオエピトープを含み得る。
【０４１８】
そのようなプロセスによって産生することができる免疫療法送達ベクター（例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株）を、本明細書において他所でさらに詳細に説明する。プロセスは、それぞれが１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープの異なる組を含む、複数の免疫療法送達ベクターを作製するために反復することができる。例えば、複数の免疫療法送達ベクターは、約２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０または４０〜５０の免疫療法送達ベクターを含み得る。別の例として、複数の免疫療法送達ベクターの組み合わせは、約５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００または１００〜２００の免疫原性ネオエピトープを含み得る。
【０４１９】
一実施形態において、本明細書において、疾患または状態を有する被験体のために個別化免疫療法を作製するプロセスが開示され、このプロセスは、（ａ）疾患を有する生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、健康な生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦと比較するステップであって、比較によって、少なくとも１つのフレームシフト変異を含み、疾患を有する試料からの前記１つまたは複数のＯＲＦ内にコードされる１つまたは複数のネオエピトープを含む１つまたは複数のペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列が同定される、ステップ、（ｂ）ａにおいて同定された１つまたは複数のネオエピトープを含む１つまたは複数のペプチドをコードする核酸配列を含むベクターによって弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を形質転換するステップ、およびあるいは被験体に投与するための弱毒化組換えＬｉｓｔｅｒｉａを既定の期間保存するか、または弱毒化組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む組成物を被験体に投与するステップであって、投与によって、前記疾患または前記被験体に対する個別化されたＴ細胞免疫応答が生成されるステップ、任意選択で（ｃ）Ｔ細胞免疫応答からのＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む被験体からの第２の生物試料を得て、前記Ｔ細胞上のＴ細胞受容体に結合する１つまたは複数のネオエピトープを含む特異的ペプチドを特徴付けするステップであって、前記１つまたは複数のネオエピトープが免疫原性である、ステップ、（ｄ）（ｃ）において同定された１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のペプチドをコードする核酸構築物をスクリーニングおよび選択するステップ、ならびに（ｅ）１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のペプチドをコードする核酸配列を含むベクターによって、第２の弱毒化組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を形質転換するステップ、およびあるいは被験体に投与するための前記第２の弱毒化組換えＬｉｓｔｅｒｉａを既定の期間保存するか、または第２の弱毒化組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む第２の組成物を前記被験体に投与するステップを含み、このプロセスにより、被験体の個別化免疫療法が作製される。別の実施形態において、ステップ（ａ）は、疾患を有する生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、健康な生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦと比較することを含み、比較により、少なくとも１つのフレームシフト変異を含む１つまたは複数の核酸配列が同定され、フレームシフト変異を含む核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を、疾患を有する試料からの前記１つまたは複数のＯＲＦ内でコードされる１つまたは複数のネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドに関してスクリーニングすることができる。
【０４２０】
一実施形態において、使用されるベクター（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａベクター）の数は、以下の既定の群：循環腫瘍細胞において見出される既知の腫瘍関連変異；既知のがん「ドライバー」変異；および／または既知の化学療法耐性変異を考慮に入れて、ならびに２１アミノ酸配列ペプチド選択においてこれらの優先性を与えることによって決定される（実施例１９を参照されたい）。別の実施形態において、これは、ＣＯＳＭＩＣ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ、ｃａｎｃｅｒ．Ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）、またはがんゲノム分析、または他の類似のがん関連遺伝子データベースに対して、同定された変異遺伝子をスクリーニングすることによって達成することができる。さらに、別の実施形態において、免疫抑制性エピトープ（Ｔ−ｒｅｇエピトープ、ＩＬ−１０誘導Ｔヘルパーエピトープなど）に関するスクリーニングを、除外する（ｄｅ−ｓｅｌｅｃｔ）ために、またはベクターに対する免疫抑制性の影響を回避するために利用する。
【０４２１】
別の実施形態において、疾患を有する生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、健康な生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦと比較するステップは、疾患を有する生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦを、健康な生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦと比較するためのスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールおよび関連するデジタルソフトウェアを使用することをさらに含み、関連するデジタルソフトウェアは、ネオエピトープの免疫原性可能性を同定するために疾患を有する生物試料から抽出した核酸配列におけるＯＲＦ内の変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む。
【０４２２】
一実施形態において、疾患を有する試料および健康な試料からの核酸配列を、フレームシフト変異を同定するために比較する。一実施形態において、フレームシフト配列改変体は、本明細書に記載のネオエピトープを含む、新規のまたは少なくとも部分的に新規の無意味なペプチドを作製し得る。
【０４２３】
別の実施形態において、無意味なペプチドまたはフレームシフト変異由来ペプチド配列を選択することができる。次に、選択されたペプチドを、潜在的組換えポリペプチドに関する１つまたは複数の候補順に配置させることができる。単一のプラスミドに適合することができるより多くの使用可能なペプチドが存在する場合、異なるペプチドに、必要に応じて／望ましければ優先順位を割り当てるか、および／または異なるペプチドを、異なる組換えポリペプチドに分割することができる（例えば、異なる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株に含めるため）。優先順位は、翻訳されたポリペプチドの相対的サイズ、転写の優先性、および／または全体的な疎水性などの要因によって決定することができる。ペプチドは、リンカーなしで直接、または本明細書において他所でより詳細に開示されるように、任意の数のペプチド対の間でリンカーの任意の組み合わせによって連結するように配置させることができる。含まれる直線状ペプチドの数は、必要とされる構築物の数  対  変異荷重、単一のプラスミドからの複数のエピトープの翻訳および分泌の効率、またはプラスミドを含むそれぞれの細菌もしくはＬｍに必要なＭＯＩの検討に基づいて決定することができる。例えば、直線状の抗原性ペプチドの範囲は、例えば、プラスミドあたり約５０、４０、３０、２０、または１０の抗原性ペプチドによって開始することができる。
【０４２４】
本開示の別の実施形態において、本明細書のいずれかに開示の方法は、１つまたは複数のネオエピトープ、１つまたは複数のネオエピトープを含む無意味なペプチド、あるいは１つまたは複数のネオエピトープを含む組換えポリペプチドを、疎水性および親水性に関してスクリーニングするステップを含む。
【０４２５】
別の実施形態において、本明細書に開示される通りのプロセスはさらに、親水性である１つまたは複数のネオエピトープを含む組換えポリペプチド、無意味なペプチド、あるいは１つまたは複数のネオエピトープを選択するステップを含む。
【０４２６】
別の実施形態において、本明細書に開示される通りのプロセスは、Ｋｙｔｅ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅのヒドロパシープロットにおいて最大１．６までのスコアを有する１つまたは複数のネオエピトープ、１つまたは複数のネオエピトープを含むペプチド、無意味なペプチド、あるいは１つまたは複数のネオエピトープを含む組換えポリペプチドを選択するステップを含む。
【０４２７】
一実施形態において、疎水性Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｋｙｔｅ  Ｊ，  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ＲＦ（Ｍａｙ  １９８２）．「Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ．」Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５７（１）：１０５−３２）または他の好適なヒドロパシープロットあるいはＲｏｓｅら（Ｒｏｓｅ，  Ｇ．Ｄ．およびＷｏｌｆｅｎｄｅｎ，  Ｒ．（１９９３）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．，  ２２，  ３８１−４１５．）；Ｋａｌｌｏｌ  Ｍ．  Ｂｉｓｗａｓ，  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．  ＤｅＶｉｄｏ，  Ｊｏｈｎ  Ｇ．  Ｄｏｒｓｅｙ（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，１０００，  ６３７−６５５，  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  Ｄ（Ｊｕｌｙ  １９８４）．  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５３：５９５−６２３．）；Ａｂｒａｈａｍ  Ｄ．Ｊ．，  Ｌｅｏ  Ａ．Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２：１３０−１５２（１９８７）；Ｓｗｅｅｔ  Ｒ．Ｍ．，  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  Ｄ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １７１：４７９−４８８（１９８３）；Ｂｕｌｌ  Ｈ．Ｂ．，  Ｂｒｅｅｓｅ  Ｋ．  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  １６１：６６５−６７０（１９７４）；Ｇｕｙ  Ｈ．Ｒ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．  ４７：６１−７０（１９８５）；Ｍｉｙａｚａｗａ  Ｓ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １８：５３４−５５２（１９８５）；Ｒｏｓｅｍａｎ  Ｍ．Ａ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２００：５１３−５２２（１９８８）；Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ  Ｒ．Ｖ．  ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０：８４９−８５５（１９８１）；Ｗｉｌｓｏｎ  Ｋ．Ｊ；Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １９９：３１−４１（１９８１）；Ｃｏｗａｎ  Ｒ．，  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｒ．Ｇ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：７５−８０（１９９０）；Ａｂｏｄｅｒｉｎ  Ａ．Ａ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２：５３７−５４４（１９７１）；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  Ｄ．  ら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １７９：１２５−１４２（１９８４）；Ｈｏｐｐ  Ｔ．Ｐ．，  Ｗｏｏｄｓ  Ｋ．Ｒ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７８：３８２４−３８２８（１９８１）；Ｍａｎａｖａｌａｎ  Ｐ．，  Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ  Ｐ．Ｋ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６７３−６７４（１９７８）．；Ｂｌａｃｋ  Ｓ．Ｄ．，  Ｍｏｕｌｄ  Ｄ．Ｒ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９３：７２−８２（１９９１）；Ｆａｕｃｈｅｒｅ  Ｊ．−Ｌ．，  Ｐｌｉｓｋａ  Ｖ．Ｅ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １８：３６９−３７５（１９８３）；Ｊａｎｉｎ  Ｊ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：４９１−４９２（１９７９）；Ｒａｏ  Ｍ．Ｊ．Ｋ．，  Ａｒｇｏｓ  Ｐ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ８６９：１９７−２１４（１９８６）；Ｔａｎｆｏｒｄ  Ｃ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８４：４２４０−４２７４（１９６２）；Ｗｅｌｌｉｎｇ  Ｇ．Ｗ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  １８８：２１５−２１８（１９８５）；Ｐａ��ｋｅｒ  Ｊ．Ｍ．Ｒ．  ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５４２５−５４３１（１９８６）；Ｃｏｗａｎ  Ｒ．，  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｒ．Ｇ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：７５−８０（１９９０）（これらのうちの全ては、その全体が参考として本明細書に援用される）によって開示されるものが挙げられるが、これらに限定されない他の適切なスケールを使用してスケール化される。別の実施形態において、規模に適した手段上で、効率的に分泌されるには十分高レベルではない疎水性を有するとのスコアを有する全てのエピトープを、リストから移動させるか、または除外する。別の実施形態において、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅのプロット上で、効率的に分泌されるには十分高レベルではない疎水性、例えば１．６またはそれよりも高いレベルを有するとのスコアを有する全てのエピトープスコア付けを、リストから移動させるか、または除外する。別の実施形態において、それぞれのネオエピトープが被験体のＨＬＡに結合する能力を、ｎｅｔＭＨＣｐａｎ、ＡＮＮ、ＳＭＭＰＭＢＥＣ．ＳＭＭ、ＣｏｍｂＬｉｂ＿Ｓｉｄｎｅｙ２００８、ＰｉｃｋＰｏｃｋｅｔ、ｎｅｔＭＨＣｃｏｎｓを含む、免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）分析リソースを使用して採点する。他の供給源は、ＴＥｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｐｒｅｄｉｃｔ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）または当技術分野で入手可能な代替のＭＨＣ結合測定スケールを含む。
【０４２８】
一実施形態において、ネオエピトープまたは無意味なペプチドが同定されたら、ネオエピトープまたは無意味なペプチドをＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのヒドロパシー指標の２１アミノ酸ウィンドウによってスコア付けし、別の実施形態において、特定のカットオフ（およそ１．６）を超えるスコアを有するネオエピトープは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって分泌可能である可能性が低いために除外する。一実施形態において、１つもしくは複数の異種ペプチドを含む組換えポリペプチドの部分、１つもしくは複数の無意味なもしくはフレームシフト変異由来ペプチドを含む組換えポリペプチドの部分、または組換えポリペプチドを、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのヒドロパシー指標の２１アミノ酸ウィンドウによってスコア付けする。任意の領域のスコアがカットオフ（例えば、およそ１．６）を超える場合、ペプチドを、抗原性ペプチドの許容可能な順序が見出されるまで（すなわち、カットオフを超える領域スコアが存在しないペプチド）、選択されたパラメータを使用して、または無作為化を使用して組換えポリペプチド内で再び順序付けるかまたはシャッフルすることができる。あるいは、あらゆる問題のあるペプチドを除去するか、または異なるサイズのペプチドとなるように、もしくはペプチドに含まれるタンパク質の配列をシフトさせるように再設計することができる。あるいは、またはさらに、本明細書において他所で開示のペプチド間の１つまたは複数のリンカーを、疎水性を変化させるために付加または修飾することができる。別の実施形態において、カットオフは、以下の範囲１．２〜１．４、１．４〜１．６、１．６〜１．８、１．８〜２．０、２．０〜２．２  ２．２〜２．５、２．５〜３．０、３．０〜３．５、３．５〜４．０または４．０〜４．５から選択される。一実施形態において、どのエピトープがリストから移動させられ、または除外されるかを決定するために使用されるカットオフスコアは、１．６である。別の実施形態において、カットオフは、１．４、１．５、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．３、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４または４．５である。それぞれの可能性が、本明細書に開示の別個の実施形態を表す。別の実施形態において、使用される送達ベクターの属に応じてカットオフは異なる。別の実施形態において、使用される送達ベクターの種に応じてカットオフは異なる。
【０４２９】
一実施形態において、ネオエピトープまたは無意味なペプチドまたはフレームシフト変異由来ペプチドを、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのヒドロパシー指標の２１アミノ酸スライディングウィンドウによってスコア付けする。一実施形態において、ネオエピトープ、無意味なペプチド、フレームシフト変異由来ペプチド、１つもしくは複数の異種ペプチドを含む組換えポリペプチドの一部、１つもしくは複数の無意味なもしくはフレームシフト変異由来ペプチドを含む組換えポリペプチドの一部、または組換えポリペプチドを、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのヒドロパシー指標の２１アミノ酸スライディングウィンドウによってスコア付けする。別の実施形態において、スライディングウィンドウのサイズは、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１アミノ酸を含む群から選択される。別の実施形態において、スライディングウィンドウのサイズは、９〜１１アミノ酸、１１〜１３アミノ酸、１３〜１５アミノ酸、１５〜１７アミノ酸、１７〜１９アミノ酸または１９〜２１アミノ酸である。それぞれの可能性が、本明細書に開示の別個の実施形態を表す。
【０４３０】
別の実施形態において、それぞれのネオエピトープまたは無意味なペプチドが被験体のＨＬＡに結合する能力を、免疫エピトープデータベース（ＩＥＤ）または他の任意の代替データベースおよび当技術分野で公知の関連するデジタルソフトウェアを使用して採点する。別の実施形態において、使用される他の結合予測サービスおよび関連データベースには、ＮｅｔＭＨＣｐａｎサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｐａｎ／）、ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／）、Ｂｉｍａｓ−ＨＬＡペプチド結合予測（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｃｉｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）、Ｒａｎｋｐｅｐ：クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子へ結合するペプチドの予測（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｅｄ．ｍｅｄ．ｕｃｍ．ｅｓ／Ｔｏｏｌｓ／ｒａｎｋｐｅｐ．ｈｔｍｌ）、ＭＨＣリガンドおよびペプチドモチーフのＳＹＦＰＥＩＴＨＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／）、ならびに人工ニューラルネットワーク（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ）（ＡＮＮ）（ｈｔｔｐ：／／ａｎｎ．ｔｈｗｉｅｎ．ｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｔｉｔｌｅ＝Ｍａｉｎ＿Ｐａｇｅ）が挙げられる。それぞれの可能性が、本明細書に開示の別個の実施形態を表す。
【０４３１】
別の実施形態において、腫瘍組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉおよび／またはＩＩ結合親和性は、全ての可能な９マーおよび１０マーのペプチドにわたって予測される。別の実施形態において、親和性は、変異を含む、またはフレームシフトによって形成される無意味なペプチドをコードする配列から生成され得る全ての可能なネオエピトープにわたって予測した。別の実施形態において、約２１アミノ酸のサイズ（２１マー）の配列に関して実施される。別の実施形態において、予測は、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０アミノ酸を含む配列に関して実施される。それぞれの可能性が、本明細書に開示の別個の実施形態を表す。別の実施形態において、予測は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０アミノ酸長である配列に関して実施される。それぞれの可能性が、本明細書に開示の別個の実施形態を表す。別の実施形態において、予測は、約８〜１２アミノ酸、５〜１０、５〜１２、５〜１５、５〜２５、５〜３５、８〜１５の範囲または約５〜５０アミノ酸の範囲の配列に関して実施される。それぞれの可能性が、本明細書に開示の別個の実施形態を表す。別の実施形態において、予測は、可変または類似のアミノ酸長の配列に関して実施される。
【０４３２】
別の実施形態において、複数の腫瘍にわたるネオエピトープの推定アバンダンス（およびＨＬＡ対立遺伝子の広いアレイ）は、点変異あたりＩＣ５０＜５００ｎＭで約１．５のＨＬＡ結合ペプチドおよびフレームシフト変異あたり約４の結合ペプチドである。
【０４３３】
別の実施形態において、異なる無意味なペプチドの特異的ＭＨＣ分子に対する相対的結合能は、競合実験によって直接評価することができることは当業者であれば認識しているものと予想される。値ＩＣ５０は、一実施形態において、標準ペプチドの５０％阻害が起こるペプチド濃度を指し、相対的結合エネルギーは標準ペプチドのＩＣ５０と試験ペプチドのＩＣ５０の間の比率として記載することができる。別の実施形態において、これらの値は、予測ＨＬＡペプチド結合に相関し得る。
【０４３４】
別の実施形態において、ＨＬＡペプチド結合予測の分野における結合予測基準は、強力な結合剤としてＩＣ５０＜１５０ｎＭ、中程度〜弱い結合剤として１５０〜５００ｎＭのＩＣ５０、非結合剤としてＩＣ５０＞５００ｎＭを有するペプチドと定義され得ることが当業者に理解される。別の実施形態において、ＨＬＡ結合ペプチドに関するカットオフは、約ＩＣ５０＜５０ｎＭ、ＩＣ５０＜１００ｎＭ、ＩＣ５０＜１５０ｎＭ、ＩＣ５０＜２００ｎＭ、ＩＣ５０＜２５０ｎＭ、ＩＣ５０＜３００ｎＭ、ＩＣ５０＜３５０ｎＭ、ＩＣ５０＜４００ｎＭ、ＩＣ５０＜４５０ｎＭ、ＩＣ５０＜５００ｎＭ、ＩＣ５０＜５５０ｎＭ、ＩＣ５０＜６００ｎＭ、ＩＣ５０＜６５０ｎＭ、ＩＣ５０＜７００ｎＭまたはＩＣ５０＜７５０ｎＭである。それぞれの可能性が、本明細書に開示の別個の実施形態を表す。
【０４３５】
別の実施形態において、ＨＬＡ結合ペプチドに関するカットオフは、約０＜ＩＣ５０＜１５０ｎＭ、０＜ＩＣ５０＜２００ｎＭ、０＜ＩＣ５０＜２５０ｎＭ、０＜ＩＣ５０＜３５０ｎＭ、０＜ＩＣ５０＜４００ｎＭ、０＜ＩＣ５０＜４５０ｎＭ、０＜ＩＣ５０＜５５０ｎＭ、０＜ＩＣ５０＜６００ｎＭ、０＜ＩＣ５０＜６５０ｎＭ、０＜ＩＣ５０＜７００ｎＭ、０＜ＩＣ５０＜７５０ｎＭ、０＜ＩＣ５０＜８００ｎＭの範囲である。それぞれの可能性が、本明細書に開示の別個の実施形態を表す。
【０４３６】
一実施形態において、疾患を有する試料から同定されたネオエピトープまたは無意味なペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ分子（ＭＨＣＩ）上に提示され得る。一実施形態において、ネオエピトープ変異を含むペプチドは免疫原性であり、適応免疫系によって「非自己」ネオ抗原として認識される。別の実施形態において、ペプチド、組換えポリペプチド、または融合ポリペプチドに含まれる１つまたは複数のネオエピトープ配列を使用することは、標的化免疫療法を提供し、これはある特定の実施形態において、疾患または状態に対するＴ細胞免疫応答を治療的に活性化し得る。別の実施形態において、無意味なペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチドに含まれる１つまたは複数のネオエピトープ配列を使用することは、標的化免疫療法を提供し、これはある特定の実施形態において、疾患または状態に対する適応免疫応答を治療的に活性化し得る。
【０４３７】
別の実施形態において、プロセスは、免疫抑制性エピトープに関して１つもしくは複数のネオエピトープまたは無意味なペプチドをスクリーニングするステップ、および同定されたネオエピトープからそれらを除去するステップを含む。一実施形態において、これらの免疫抑制性エピトープは、配列の中で提示されるか、またはエピトープ配列およびリンカーと共にスプライシングの結果として人工的に作製される。
【０４３８】
別の実施形態において、プロセスは、Ｔ調節活性化エピトープに関して１つもしくは複数のネオエピトープまたは無意味なペプチドをスクリーニングするステップ、および同定されたネオエピトープからそれらを除去するステップを含む。
【０４３９】
別の実施形態において、プロセスは、疾患または状態を有する生物試料によって発現されたエピトープに関して１つもしくは複数のネオエピトープまたは無意味なペプチドをスクリーニングするステップ、および同定されたネオエピトープから発現されていないエピトープを除去するステップを含む。
【０４４０】
別の実施形態において、プロセスは、翻訳後切断部位を含まないエピトープに関して、１つもしくは複数のネオエピトープまたは無意味なペプチドをスクリーニングするステップを含む。
【０４４１】
別の実施形態において、プロセスは、フレームシフト変異を含む１つまたは複数の核酸配列に関してスクリーニングするステップを含む。別の実施形態において、プロセスは、遺伝子の最後のエクソンにおいてコードされるフレームシフト変異を同定するステップを含む。
【０４４２】
別の実施形態において、本明細書に開示のプロセスは、１つまたは複数の発現された無意味なペプチドに関してスクリーニングするステップをさらに含む。
【０４４３】
別の実施形態において、本明細書に開示のプロセスは、発現されたエピトープに関して１つもしくは複数のネオエピトープまたは無意味なペプチドをスクリーニングするステップ、および同定されたネオエピトープから、発現されていないエピトープを除去するステップをさらに含む。
【０４４４】
別の実施形態において、無意味なペプチドおよび／またはネオエピトープを選択するステップは、高度に発現された無意味なペプチドおよび／またはネオエピトープに関してスクリーニングするステップをさらに含む。
【０４４５】
一実施形態において、無意味なペプチドもしくはその断片、および／またはネオエピトープは、疾患または状態を有する試料において蓄積し得る。別の実施形態において、本開示は、疾患または状態を有する生物試料においてある特定の閾値まで蓄積していない無意味なペプチドまたはその断片を除去することをさらに含む。一実施形態において、ネオエピトープ含有ペプチドは、疾患または状態を有する試料において蓄積し得る。別の実施形態において、本開示は、疾患または状態を有する生物試料においてある特定の閾値まで蓄積していないネオエピトープ含有ペプチドを除去することをさらに含む。一実施形態において、蓄積は、ＥＬＩＳＡ、タンパク質チップ、ウェスタンブロット、蛍光標識法、およびその他などの当技術分野で公知のタンパク質検出手段によって検出可能である。
【０４４６】
別の実施形態において、本明細書に開示のプロセスは、疾患を有する生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、健康な生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦと比較することによって、前記無意味なペプチドを獲得するステップを含み、比較により、前記核酸配列内の１つまたは複数のフレームシフト変異が同定され、変異を含む核酸配列は、疾患を有する生物試料からの１つまたは複数のＯＲＦ内でコードされる１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドをコードする。
【０４４７】
全ての試料を、ＯＲＦ内の新規遺伝子シーケンシングに関して分析する。疾患を有する生物試料および健康な生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を比較するための方法は、スクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールおよび関連するデジタルソフトウェアを使用することを含む。バイオインフォマティクス分析を実施する方法は当技術分野で公知であり、例えば全体が参照により本出願に組み込まれている、米国特許出願公開第２０１３／０２１０６４５号、米国特許出願公開第２０１４／００４５８８１号、および国際公開第２０１４／０５２７０７号を参照されたい。
【０４４８】
本開示の別の実施形態に従って、配列を比較することは、全エクソームのオープンリーディングフレームを比較することを含む。さらにまたはあるいは、配列を比較することは、全プロテオームを比較することを含む。
【０４４９】
ヒト腫瘍は典型的に、顕著な数の体細胞変異を有する。しかし、任意の特定の遺伝子における同一の変異が、腫瘍にわたり見出されることはまれである（および最も一般的なドライバー変異に関してさえ低い頻度である）。このため、一実施形態において、患者特異的腫瘍フレームシフト変異を包括的に同定する本開示のプロセスは、個別化免疫療法の標的を提供する。
【０４５０】
別の実施形態において、本明細書に開示されるプロセスは、公知のおよび予想されるがんまたは腫瘍抗原をコードする核酸配列、腫瘍またはがん関連抗原をコードする核酸配列、公知のまたは予想される腫瘍またはがんタンパク質マーカーをコードする核酸配列、公知のおよび予想される感染疾患または状態関連遺伝子をコードする核酸配列、疾患を有する生物試料において発現される遺伝子をコードする核酸配列、マイクロサテライト不安定性領域を含む核酸配列、ならびにその任意の組み合わせを含む群より選択される既定の遺伝子の組のオープンリーディングフレームエクソームを比較するステップを含む。
【０４５１】
別の実施形態において、個別化免疫療法を作製するプロセスにおけるステップは、疾患または状態を有する被験体から異常なまたは不健康な生物試料を得ることである。別の実施形態において、疾患は感染疾患または腫瘍もしくはがんである。別の実施形態において、疾患、腫瘍、がん、状態は、本開示を通して開示される。別の実施形態において、疾患は局所疾患である。別の実施形態において、疾患は腫瘍またはがん、自己免疫疾患、感染疾患、ウイルス感染疾患、または細菌感染疾患である。
【０４５２】
別の実施形態において、以下のステップを含む、本明細書に開示の方法が開示される：（ａ）疾患に応答するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を同定、単離、および増大させるステップ、ならびに（ｂ）Ｔ細胞上のＴ細胞受容体に結合する特異的ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子上に負荷された１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドに関してスクリーニングおよび同定するステップ。
【０４５３】
別の実施形態において、スクリーニングおよび同定するステップは、Ｔ細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースのフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを含む。別の実施形態において、シーケンシングは、関連するデジタルソフトウェアおよびデータベースを使用することを含む。
【０４５４】
一実施形態において、本開示に従って得られたそれぞれの試料の三連物（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）をＤＮＡエクソームシーケンシングによってシーケンシングする。フレームシフト変異によって作製された無意味なペプチドは、終止コドンまでコードされる変異ペプチドの完全な配列を示す。さらにまたはあるいは、フレームシフト変異は、ネオエピトープの少なくとも一部を含む無意味なペプチドをコードする。別の実施形態において、フレームシフト変異は、少なくとも１つのネオエピトープを含む無意味なペプチドをコードする。別の実施形態において、無意味なペプチドは、潜在的ネオエピトープとして複数の異なるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、潜在的ネオエピトープに、本開示の手段および方法によって、スクリーニング、特徴付け、採点、選択、およびその任意の組み合わせを行う。
【０４５５】
別の実施形態において、ネオエピトープは、独自の腫瘍またはがんネオエピトープ、がん特異的または腫瘍特異的エピトープを含む。別の実施形態において、ネオエピトープは免疫原性である。別の実施形態において、ネオエピトープは、Ｔ細胞によって認識される。別の実施形態において、１つまたは複数のネオエピトープを含むペプチドは、腫瘍またはがんに対するＴ細胞応答を活性化させ、応答は被験体に対して個別化される。別の実施形態において、ネオエピトープは、感染疾患に関連する独自のエピトープを含む。一実施形態において、感染疾患エピトープは、疾患に直接相関する。代替の実施形態において、感染疾患エピトープは、感染疾患に関連する。
【０４５６】
別の実施形態において、ネオエピトープ配列間にリンカー配列を含めるステップである。リンカーは、当技術分野で公知の任意のリンカー配列である。別の実施形態において、リンカーは、４×グリシンを含む。別の実施形態において、リンカーは、ポリグリシンを含む。さらに別の実施形態において、リンカーは、したがって配列番号４６〜５６およびその任意の組み合わせを含む群より選択される。
【０４５７】
別の実施形態において、ネオエピトープまたは無意味なペプチドに本明細書に記載のタグを接続するステップである。別の実施形態において、タグは当技術分野で公知の任意のタグである。別の実施形態において、タグは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ｓ−６×ＨＩＳタグ、６×ＨＩＳタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、任意のポリヒスチジンタグから選択される。一実施形態において、タグは、組換えポリペプチドのＣ末端またはＮ末端または核酸配列に対して接続する。一実施形態において、タグを核酸配列に接続することは、タグをコードして、ネオエピトープまたは無意味なペプチド、ならびに任意選択でリンカーおよび任意選択で免疫原性ポリペプチドを含むオープンリーディングフレームを生成することを含む。一実施形態において、タグは、６×ヒスチジンタグ、２×ＦＬＡＧタグ、３×ＦＬＡＧタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに作動可能に連結された６×ヒスチジンタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに作動可能に連結された３×ＦＬＡＧタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに作動可能に連結された２×ＦＬＡＧタグ、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される。２つまたはそれよりも多いタグ、例えば２×ＦＬＡＧタグとＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、３×ＦＬＡＧタグとＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、または６×ＨＩＳタグとＳＩＩＮＦＥＫＬタグを共に使用することができる。２つまたはそれよりも多いタグを使用する場合、それらは、組換えポリペプチド内の任意の位置に任意の順序で存在することができる。例えば、２つのタグは、組換えポリペプチドのＣ末端に存在することができ、２つのタグは組換えポリペプチドのＮ末端に存在することができ、２つのタグは組換えポリペプチドの内部に位置することができ、１つのタグが組換えポリペプチドのＣ末端に存在して１つのタグがＮ末端に存在することができ、１つのタグが組換えポリペプチドのＣ末端に存在して１つのタグが内部に存在することができ、または１つのタグが組換えポリペプチドのＮ末端に存在して１つのタグが内部に存在することができる。
【０４５８】
別の実施形態において、タグに接続されたリンカー配列を、ネオエピトープまたは無意味なペプチドに接続するステップである。
【０４５９】
別の実施形態において、検出ステップで、ネオエピトープ、ペプチド、または組換えポリペプチド（融合物／キメラ）の分泌は、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグまたはＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ｓ−６×ＨＩＳタグに特異的に結合するタンパク質、分子、または抗体（またはその断片）を使用して検出される。別の実施形態において、検出ステップで、ネオエピトープ、ペプチド、または組換えポリペプチド（融合物／キメラ）の分泌は、２×ＦＬＡＧタグまたは３×ＦＬＡＧタグまたは本明細書に開示の他の任意のタグに特異的に結合するタンパク質、分子、または抗体（またはその断片）を使用して検出される。
【０４６０】
別の実施形態において、ペプチドワクチンは、一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む一つまたは複数の無意味なペプチドを含み、それぞれの無意味なペプチドは、免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合されているかまたはこれと混合されている。別の実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、変異したリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、切断型ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列である。別の実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、本開示を通して記載される通りである。例えば、免疫原性ポリペプチドは、ＰＥＳＴ含有ペプチドを含み得る。
【０４６１】
一実施形態において、システムまたはプロセスは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を培養し、Ｔ細胞ネオエピトープの発現および分泌を確認するように特徴付けることををさらに含む。一実施形態において、システムまたはプロセスは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を培養し、適応免疫応答ネオエピトープの発現および分泌を確認するように特徴付けることををさらに含む。一実施形態において、システムまたはプロセスは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を培養し、１つまたは複数の無意味なペプチドの発現および分泌を確認するように特徴付けることをさらに含む。
【０４６２】
別の実施形態において、本明細書に開示のプロセスは、疾患を有する被験体において、個別化されて増強された抗疾患、または抗感染症、または抗感染疾患、または抗腫瘍免疫応答を生成することを可能にする。別の実施形態において、プロセスは、被験体における疾患、または感染症もしくは感染疾患、または腫瘍もしくはがんの個別化処置または予防を可能にする。別の実施形態において、プロセスは、疾患、または感染症もしくは感染疾患、または腫瘍もしくはがんを有する被験体における生存期間を増大させる。
【０４６３】
一実施形態では本開示は、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株、本明細書に開示の組換えポリペプチドまたは本明細書に開示の核酸配列、および薬学的に許容可能な担体を含む免疫原性組成物を生成するステップを含む。一実施形態において、本開示は、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株、本明細書に開示の組換えポリペプチド、および本明細書に開示の核酸配列の任意の一つまたは複数の、薬学的に許容可能な担体との組み合わせを含む免疫原性組成物を生成するステップを含む。
【０４６４】
Ｖ．組成物およびその使用方法
一実施形態において、本明細書に開示の組成物は、免疫原性組成物である。そのような免疫原性組成物は、本明細書に開示の少なくとも１つの免疫療法送達ベクター、または本明細書に開示の少なくとも１つの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含み得る。そのような免疫原性組成物は、アジュバントもさらに含み得る。
【０４６５】
一部のそのような免疫原性組成物は、本明細書に開示される通りの複数の免疫療法送達ベクターまたは複数の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む。それぞれの免疫療法送達ベクターまたは組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、本明細書に開示される通りの異なる組換えポリペプチドを含むかまたはコードすることができ、または一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープの異なるセットを含むことができる。例えば、複数の免疫療法送達ベクターまたは組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、例えば、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０または４０〜５０の免疫療法送達ベクターまたは組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含み得る。同様に、複数の免疫療法送達ベクターまたは組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、例えば、約５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００または１００〜２００の免疫原性ネオエピトープを含み得る。
【０４６６】
免疫原性組成物、免疫療法送達ベクターまたは組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、被験体における疾患または状態を処置、抑制、予防または阻害する方法において使用することができ、方法は、免疫原性組成物、免疫療法送達ベクターまたは組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を被験体に投与するステップを含み、１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドは、被験体由来の疾患を有するまたは状態を有する生物試料からの供給源核酸配列にコードされる。そのような方法は、被験体において個別化された抗疾患または抗状態免疫応答を誘発することができ、個別化された免疫応答は、１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドに標的化される。例えば、疾患もしくは状態は、状態または腫瘍であり得る。本明細書の他のいずれかの箇所に開示されるように、そのような方法は、ブースター処置を被験体に投与するステップを含むことができる。
【０４６７】
一実施形態において、本明細書に開示のＬｉｓｔｅｒｉａは、一実施形態において、抗血管新生特性を有する、インターフェロン−ガンマの強い生得の刺激を誘導する（全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｄｏｍｉｎｉｅｃｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２００５年５月：５４巻（５号）：４７７〜８８頁：電子出版２００４年１０月６日；全体が参照により本明細書に組み込まれている、ＢｅａｔｔｙおよびＰａｔｅｒｓｏｎ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００１年２月１５日；１６６巻（４号）：２２７６〜８２頁）。一実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの抗血管新生特性は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介される（ＢｅａｔｔｙおよびＰａｔｅｒｓｏｎ、２００１年）。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの抗血管新生特性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａワクチン接種の結果としてのＩＦＮ−ガンマの分泌は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＣ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞またはその組み合わせによって媒介される。
【０４６８】
別の実施形態において、本明細書に開示の組成物の投与は、１つまたは複数の抗血管新生タンパク質または因子の産生を誘導する。一実施形態において、抗血管新生タンパク質はＩＦＮ−ガンマである。別の実施形態において、抗血管新生タンパク質は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）；アンジオスタチン；エンドスタチン；ｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ｓＦｌｔ）−１；または可溶性エンドグリン（ｓＥｎｇ）である。一実施形態において、本開示のＬｉｓｔｅｒｉａは、抗血管新生因子の放出に関係し、したがって一実施形態において、被験体に抗原を導入するためのプラスミドベクターとしてのその役割に加えて治療的役割を有する。それぞれのＬｉｓｔｅｒｉａ株およびそのタイプは、本開示の別個の実施形態を表す。
【０４６９】
本明細書に開示される通りの方法および組成物によって誘導される免疫応答は、別の実施形態において、Ｔ細胞応答である。別の実施形態において、免疫応答は、Ｔ細胞応答を含む。別の実施形態において、応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態において、応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。それぞれの可能性が、本明細書に開示される別個の実施形態を表す。別の実施形態において、投与は、疾患もしくは状態に対する個別化されたＴ細胞免疫応答の生成をもたらす。
【０４７０】
別の実施形態において、本明細書に開示の組成物の投与は、抗原特異的Ｔ細胞の数を増加させる。別の実施形態において、組成物の投与は、Ｔ細胞上の共刺激受容体を活性化させる。別の実施形態において、組成物の投与は、メモリーおよび／またはエフェクターＴ細胞の増殖を誘導する。別の実施形態において、組成物の投与は、Ｔ細胞の増殖を増加させる。別の実施形態において、組成物の投与は、被験体において増強された抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発する。別の実施形態において、組成物の投与は、被験体における腫瘍媒介免疫抑制を阻害するためである。別の実施形態において、組成物の投与は、被験体の脾臓および腫瘍におけるＴエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比率を増加させる。
【０４７１】
別の実施形態において、被験体への組成物の投与により、被験体において、個別化されて増強された抗疾患、または抗状態免疫応答が生成される。別の実施形態において、免疫応答は、抗がんまたは抗腫瘍応答を含む。別の実施形態において、免疫応答は、抗感染疾患応答を含む。
【０４７２】
本明細書を通して、用語「組成物」および「免疫原性組成物」は、全て同じ意味および質を有し、互換的である。
【０４７３】
別の実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含み、それぞれの成分の併用または逐次投与のために抗体またはその機能的断片をさらに含む本明細書に開示の免疫原性組成物はまた、「組み合わせ治療」とも呼ばれる。組み合わせ治療はまた、さらなる成分、抗体、治療などを含み得ることは当業者によって理解されるべきである。
【０４７４】
当業者は、用語「医薬組成物」が、薬学的使用、例えばそれを必要とする被験体に投与するために適した組成物を包含し得ることを認識していると予想される。
【０４７５】
一実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【０４７６】
別の実施形態において、本明細書に開示されるのは、それぞれの核酸配列が、免疫原性ポリペプチドに融合した１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、前記１つまたは複数の無意味なペプチドが少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、前記１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれが、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、かつ前記供給源は、被験体の疾患を有するまたは状態を有する生物試料から得られる、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
【０４７７】
別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａに関連して使用する場合の「Ｌｉｓｔｅｒｉａワクチン」または「ワクチン」は、本明細書において「Ｌｉｓｔｅｒｉａ免疫療法」または「免疫療法」と互換的に使用される。別の実施形態において、本明細書に開示の免疫療法は、本明細書に開示の少なくとも１つの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株および薬学的に許容される担体を含む。
【０４７８】
別の実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１つの核酸配列を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、それぞれの核酸配列は、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む一つまたは複数の組換えポリペプチドをコードし、ネオエピトープの一つまたは複数は、少なくとも１つの変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株、および薬学的に許容される担体を含む。例えば、少なくとも１つの変異は、非同義ミスセンス変異または体細胞非同義ミスセンス変異であり得る。
【０４７９】
別の実施形態において、本明細書に開示されるのは、少なくとも１つの核酸配列を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、それぞれの核酸配列は、一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む一つまたは複数の組換えポリペプチドをコードし、ネオエピトープの一つまたは複数は、供給源核酸配列によってコードされ、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【０４８０】
別の実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示の核酸配列分子、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。別の実施形態において、本開示は、本明細書に開示の核酸配列分子、および薬学的に許容される担体を含むＤＮＡワクチンを提供する。
【０４８１】
別の実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示のワクシニアウイルス株またはウイルス様粒子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【０４８２】
別の実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示の一つまたは複数のネオエピトープを含む組換えポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。別の実施形態において、ペプチドワクチンは、本明細書に開示の一つまたは複数のネオエピトープを含む一つまたは複数の組換えポリペプチド、および薬学的に許容される担体を含む。
【０４８３】
別の実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示の一つまたは複数のネオエピトープを含む無意味なペプチドまたはその断片および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。別の実施形態において、本明細書に開示のペプチドワクチン、ＤＮＡワクチン、ワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子または組換えＬｉｓｔｅｒｉａは、本明細書に開示の一つまたは複数のネオエピトープおよび薬学的に許容される担体を含む一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含むかまたは発現する（適用可能な場合）。
【０４８４】
用語「医薬組成物」は、１つまたは複数の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株、少なくとも１つのネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドを含む１つまたは複数の組換えポリペプチド、１つまたは複数のネオエピトープをコードする少なくとも１つの核酸配列、１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片、本明細書に開示の全て、およびその任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、治療有効量の活性成分または複数の活性成分を、薬学的に許容される担体または希釈剤と共に包含することを、当業者は認識していると予想される。用語「治療有効量」は、所定の条件および投与レジメンに関して治療効果を提供する量を指すと理解すべきである。
【０４８５】
別の実施形態において、本明細書において同様に開示されたヌクレオチド酸配列分子（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む組換えワクチンベクターが本明細書に開示される。別の実施形態において、ベクターは発現ベクターである。別の実施形態において、発現ベクターはプラスミドである。別の実施形態において、本開示は、本開示のヌクレオチド分子を細胞に導入する方法を提供する。組換えベクターを構築および利用する方法は、当技術分野で周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＢｒｅｎｔら（２００３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている。別の実施形態において、ベクターは細菌ベクターである。他の実施形態において、ベクターは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．、ＢＣＧ、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、およびＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉから選択される。別の実施形態において、１つまたは複数のペプチドは、ファゴリソソーム融合から逃避して、細胞の細胞質において生存するように改変された組換え細菌ベクターによって送達される。別の実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。他の実施形態において、ベクターは、ワクシニア、トリポックス（ａｖｉｐｏｘ）、アデノウイルス、ＡＡＶ、ワクシニアウイルスＮＹＶＡＣ、改変ワクシニア株Ａｎｋａｒａ（ＭＡ）、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレトロウイルスから選択される。別の実施形態において、ベクターは裸のＤＮＡベクターである。別の実施形態において、ベクターは当技術分野で公知の他の任意のベクターである。それぞれの可能性が、本明細書に開示の別個の実施形態を表す。
【０４８６】
別の実施形態において、本明細書に開示のＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む組成物は、アジュバントをさらに含む。別の実施形態において、本開示の一つまたは複数の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株、一つまたは複数のネオエピトープを含む一つまたは複数の組換えポリペプチド、一つまたは複数のネオエピトープをコードする少なくとも１つの核酸配列、一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のうちの少なくとも１つを含む組成物は、アジュバントをさらに含む。一実施形態において、本開示の組成物は、アジュバントをさらに含む。
【０４８７】
別の実施形態において、免疫原性組成物は、免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む組換えポリペプチドを含む核酸配列を含むベクター、およびアジュバントを含む。別の実施形態において、免疫原性組成物は、免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む組換えポリペプチド、およびアジュバントを含む。
【０４８８】
一実施形態において、組成物は、当技術分野で公知のまたは本明細書に開示のアジュバントを含む。本開示の方法および組成物において利用されるアジュバントは、別の実施形態において、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質、ＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、ＳＢＡＳ２、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、免疫刺激サイトカイン、免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子、クイルグリコシド（ｑｕｉｌｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、細菌マイトジェン、または細菌毒素である。適したアジュバントのさらに別の例は、解毒化リステリオリシンＯ（ｄｔＬＬＯ）タンパク質である。アジュバントとして使用するために適したｄｔＬＬＯの一例は、配列番号６７によってコードされる。配列番号６７と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列によってコードされるｄｔＬＬＯも同様に、アジュバントとして使用するために適している。それぞれの可能性が、本明細書に開示の別個の実施形態を表す。別の実施形態において、アジュバントは、当技術分野で公知の他の任意のアジュバントであるか、またはそれを含む。
【０４８９】
一実施形態において、本明細書に開示の免疫原性組成物は、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む。
【０４９０】
一実施形態において、組成物は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）株を含む。一実施形態において、免疫原性組成物は、少なくとも１つの核酸配列を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含み、それぞれの核酸配列は、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む一つまたは複数の組換えポリペプチドをコードし、一つまたは複数の無意味なペプチドは、少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれは一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される。別の実施形態において、無意味なペプチドまたはその断片は、切断型ＬＬＯ、切断型ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ配列に融合されている。
【０４９１】
一実施形態において、免疫原性組成物は、少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含み、それぞれの核酸配列は、一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む一つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする、ネオエピトープの一つまたは複数は、少なくとも１つの変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される。
【０４９２】
一実施形態において、免疫原性組成物は、少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含み、それぞれの核酸配列は、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む一つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする、ネオエピトープの一つまたは複数は、少なくとも１つの変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される。
【０４９３】
別の実施形態において、免疫原性組成物は、免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む組換えポリペプチドを含む核酸配列を含むベクターを含む。別の実施形態において、本開示の免疫原性組成物は、少なくとも１つの核酸配列を含み、それぞれの核酸配列は、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む一つまたは複数の組換えポリペプチドをコードし、一つまたは複数の無意味なペプチドは、少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれは一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される。
【０４９４】
一実施形態において、本明細書に開示の免疫原性組成物は、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む一つまたは複数の組換えポリペプチドを含み、一つまたは複数の無意味なペプチドは、少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれは一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、ネオエピトープの一つまたは複数は、供給源核酸配列によってコードされ、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される。
【０４９５】
一実施形態において、免疫原性組成物は、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される。
【０４９６】
一実施形態において、本明細書に開示の免疫原性組成物は、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ、送達ベクターまたは発現ベクターを含む。一実施形態において、供給源核酸は、疾患もしくは状態を有する生物試料から取得される。さらに別の実施形態において、本明細書に開示の疾患もしくは状態は、感染性疾患、自己免疫疾患、臓器移植拒絶、腫瘍またはがんである。別の実施形態において、感染性疾患は、ウイルスまたは細菌感染症を含む。
【０４９７】
別の実施形態において、本明細書に開示の免疫原性組成物のそれぞれの成分は、本明細書に開示の免疫原性組成物の別の成分の前に、それと並行して、またはその後に投与される。
【０４９８】
本明細書に開示の組成物は、別の実施形態において、非経口、がん近傍（ｐａｒａｃａｎｃｅｒａｌｌｙ）、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内（ｉｎｔｒａ−ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｌｙ）、頭蓋内、膣内、または腫瘍内などの当業者に公知の任意の方法によって被験体に投与される。
【０４９９】
別の実施形態において、組成物は経口投与され、このため経口投与にとって適した形態、すなわち固体または液体調製物として製剤化される。適した固体経口製剤には、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、ペレットなどが挙げられる。適した液体経口製剤には、液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤、油などが挙げられる。本開示の別の実施形態において、活性成分は、カプセル剤中に製剤化される。本実施形態に従って、本開示の組成物は、活性化合物および不活性担体または希釈剤に加えて、硬ゼラチンカプセルを含む。
【０５００】
別の実施形態において、組成物は、液体調製物の静脈内、動脈内、または筋肉内注射によって投与される。適した液体製剤には、液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤、油などが挙げられる。一実施形態において、医薬組成物は静脈内に投与され、このため静脈内投与にとって適した形態に製剤化される。別の実施形態において、医薬組成物は、動脈内に投与され、このため動脈内投与にとって適した形態に製剤化される。別の実施形態において、医薬組成物は筋肉内に投与され、このため筋肉内投与にとって適した形態に製剤化される。
【０５０１】
一実施形態において、被験体は、被験体の疾患もしくは状態に標的化された免疫応答の意図された誘発を達成するために、本開示の組成物のいずれかの用量を、１〜２週間毎、２〜３週間毎、３〜４週間毎、４〜５週間毎、６〜７週間毎、７〜８週間毎または９〜１０週間毎に投与される。一実施形態において、被験体は、被験体の疾患もしくは状態に標的化された免疫応答の意図された誘発を達成するために、本開示の組成物のいずれかの用量を、１〜２月毎、２〜３月毎、３〜４月毎、４〜５月毎、６〜７月毎、７〜８月毎または９〜１０月毎に投与される。
【０５０２】
一実施形態において、本開示の組成物またはワクチンの反復投与（ブースター投与量）は、腫瘍の退縮を達成するために、処置の第１コースの直後にまたは数日、数週間、もしくは数ヶ月の間隔の後に行ってもよい。別の実施形態において、反復用量は、腫瘍生育の抑制を達成するために、処置の第１コースの直後にまたは数日、数週間、もしくは数ヶ月の間隔の後に行ってもよい。評価は、画像化技術、血清腫瘍マーカーの分析、生検、または腫瘍関連症状の存在、非存在、もしくは改善などの診断方法を含む、当技術分野で公知の任意の技術によって決定することができる。
【０５０３】
一実施形態において、被験体は、意図された抗腫瘍応答を達成するために、ブースター用量を、１〜２週間毎、２〜３週間毎、３〜４週間毎、４〜５週間毎、６〜７週間毎、７〜８週間毎または９〜１０週間毎に投与される。一実施形態において、被験体は、被験体の疾患もしくは状態に標的化された免疫応答の意図された誘発を達成するために、ブースター用量を、１〜２月毎、２〜３月毎、３〜４月毎、４〜５月毎、６〜７月毎、７〜８月毎または９〜１０月毎に投与される。
【０５０４】
同様に、本明細書にさらに開示されるように、そのような組成物の投与は、免疫応答を増強させるか、またはＴエフェクター細胞  対  制御性Ｔ細胞の比率を増加させるか、または抗腫瘍免疫応答を誘発することを理解すべきである。一実施形態において、記載のＬｉｓｔｅｒｉａ株を含み、抗体またはその機能的断片をさらに含む組成物を投与することを含む、使用方法が本明細書において開示される。別の実施形態において、使用方法は、同じまたは別個の組成物に存在し得る、およびＬｉｓｔｅｒｉａと同じ組成物または異なる組成物に存在し得る、本明細書に開示の１つより多い抗体を投与することを含む。それぞれの可能性が、本明細書に開示される方法の異なる実施形態を表す
【０５０５】
用語「投与すること」は、被験体に本開示の組成物を接触させることを包含することは、当業者によって理解されると予想される。一実施形態において、投与はｉｎ  ｖｉｔｒｏ、すなわち試験管内で、またはｉｎ  ｖｉｖｏ、すなわち生きている生物、例えばヒトの細胞もしくは組織内で行うことができる。一実施形態において、本明細書に開示の方法は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株およびその組成物を被験体に投与することを包含する。
【０５０６】
一実施形態において、ワクチンは、本明細書に開示の組成物を含む。別の実施形態において、ワクチンはアジュバント、および／または薬学的担体をさらに含む。
【０５０７】
別の実施形態において、本明細書に開示の方法は、本明細書に開示の組成物、ワクチン、および／またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の少なくとも単回投与を含み、別の実施形態において、方法は、組成物、ワクチン、および／またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の複数回投与を含む。それぞれの可能性が、本明細書に開示される方法の異なる実施形態を表す。
【０５０８】
一実施形態において、本明細書に開示の方法は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａの単回投与を含む。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、２回投与される。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、３回投与される。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、４回投与される。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、４回より多く投与される。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、複数回投与される。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、定期的な間隔で投与され、これは、一実施形態において、毎日、毎週、２週間毎、３週間毎、または月毎であり得る。それぞれの可能性が、本明細書に開示される方法の別個の実施形態を表す。
【０５０９】
一実施形態において、方法は、本明細書に開示の組成物を単回投与することを含む。別の実施形態において、組成物は、２回投与される。別の実施形態において、組成物は、３回投与される。別の実施形態において、組成物は、４回投与される。別の実施形態において、組成物は、４回より多く投与される。別の実施形態において、組成物は、複数回投与される。別の実施形態において、組成物は、定期的な間隔で投与され、これは、一実施形態において、毎日、毎週、２週間毎、３週間毎、または月毎であり得る。それぞれの可能性が、本明細書に開示される方法の別個の実施形態を表す。
【０５１０】
一実施形態において、方法は、ワクチンを単回投与することを含む。別の実施形態において、ワクチンは、２回投与される。別の実施形態において、ワクチンは３回投与される。別の実施形態において、ワクチンは、４回投与される。別の実施形態において、ワクチンは、４回より多く投与される。別の実施形態において、ワクチンは、複数回投与される。別の実施形態において、ワクチンは、定期的な間隔で投与され、これは、一実施形態において、毎日、毎週、２週間毎、３週間毎、または月毎であり得る。それぞれの可能性が、本明細書に開示される方法の別個の実施形態を表す。
【０５１１】
用語「被験体」は、状態もしくはその続発症のために治療を必要とする、または状態もしくはその続発症に対して感受性がある、成人のヒトまたはヒト小児、１０代、または青年を含む哺乳動物を包含し得ること、同様に非ヒト哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウスを含み得ることは、当業者によって理解されると予想される。同様に、用語は、家畜を包含し得ると認識されると予想される。用語「被験体」は、全ての点において正常である個体を除外しない。
【０５１２】
一実施形態において、送達ベクターは、本明細書に開示される通りの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ、本明細書に開示される通りの一つまたは複数の無意味なペプチドまたはネオエピトープ、本明細書に開示される通りの一つまたは複数の無意味なペプチドまたはネオエピトープを含む組換えポリペプチドをコードする核酸配列、本明細書に開示される通りの一つまたは複数の無意味なペプチドを含む本明細書に開示される通りの一つまたは複数の無意味なペプチドまたは組換えポリペプチドをコードする核酸配列を指す。
【０５１３】
別の実施形態において、本明細書に開示の組成物は、異なるまたは同じ送達ベクターの少なくとも１つの送達ベクターおよびその組み合わせを含む。
【０５１４】
一実施形態において、ＤＮＡ分子または核配列分子は、これに限定されないが、一つまたは複数のネオエピトープを含む組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含む、一つまたは複数のプラスミドまたは人工染色体を指す。
【０５１５】
一実施形態において、ＤＮＡ分子または核配列分子は、これに限定されないが、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数のネオエピトープを含む組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含む、一つまたは複数のプラスミドまたは人工染色体を指す。
【０５１６】
一実施形態において、ＤＮＡ分子または核酸配列分子は、免疫原性ポリペプチドに融合された１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含む、１つまたは複数のプラスミドまたは人工染色体を指すがこれらに限定されず、無意味なペプチドは１つまたは複数のネオエピトープを含む。
【０５１７】
一実施形態において、本明細書に開示の個別化免疫療法組成物は、本明細書に開示の１つまたは複数の送達ベクターを含む。一実施形態において、本明細書に開示の個別化免疫療法組成物は、上記のいずれかに開示の１つまたは複数のＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む。別の実施形態において、個別化免疫療法組成物は、それぞれのベクターが１つまたは複数のネオエピトープを発現する、１〜２、１〜５、１〜１０、１〜２０、または１〜４０の組換え送達ベクターの混合物を含む。別の実施形態において、混合物は、それぞれの送達ベクターが１つまたは複数のネオエピトープの異なる組を含む、複数の送達ベクター（例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株）を含む。第１の組のネオエピトープは、第２の組が含まない１つのネオエピトープを含む場合、第２の組とは異なり得る。同様に、第１の組のネオエピトープは、第２の組が含むネオエピトープを含まない場合、第２の組と異なり得る。例えば、第１の組と第２の組のネオエピトープは、１つまたは複数の同じネオエピトープを含むことができ、それでもなお異なる組であり得るか、または第１の組は同じネオエピトープのいずれも含まないという点において第２の組のネオエピトープとは異なり得る。別の実施形態において、個別化免疫療法組成物は、それぞれのベクターが１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を発現する、１〜２、１〜５、１〜１０、１〜２０、または１〜４０の組換え送達ベクターの混合物を含む。それぞれの可能性が、別個の実施形態を表す。
【０５１８】
別の実施形態において、個別化免疫療法組成物は、それぞれのベクターが、切断型ＬＬＯタンパク質、切断型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列との融合タンパク質の状況で１つまたは複数のネオエピトープを発現する、１〜２、１〜５、１〜１０、１〜２０、または１〜４０の組換え送達ベクターの混合物を含む。一実施形態において、送達ベクターの混合物に存在する個々の送達ベクターは、治療の一部として併用して被験体に投与される。別の実施形態において、送達ベクターの混合物に存在する個々の送達ベクターは、治療の一部として被験体に逐次的に投与される。それぞれの可能性が、別個の実施形態を表す。
【０５１９】
一実施形態において、本明細書に開示のプロセスによって産生された１つまたは複数の組換え送達ベクターを含む免疫原性組成物が本明細書に開示される。一実施形態において、本明細書に開示のプロセスによって産生された１つまたは複数の組換え送達ベクターを含む組成物の免疫原性混合物が本明細書に開示される。別の実施形態において、前記混合物中の前記送達ベクターのそれぞれは、１つまたは複数のネオエピトープを含む組換えポリペプチドまたはキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む。
【０５２０】
用語「組換え送達ベクター」は、本明細書に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株送達ベクター、ポリペプチド送達ベクター、またはＤＮＡ分子送達ベクターを包含することは、当業者であれば認識しているものと予想される。
【０５２１】
別の実施形態において、組成物のそれぞれ混合物は、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０または８０〜１００の送達ベクターを含む。それぞれの可能性が、別個の実施形態を表す。
【０５２２】
一実施形態において、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示のプロセスによって作製される一つまたは複数の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む組成物の免疫原性混合物である。別の実施形態において、混合物における前記Ｌｉｓｔｅｒｉａのそれぞれは、１つまたは複数のネオエピトープを含む組換えポリペプチドまたはキメラタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。別の実施形態において、それぞれの混合物は、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０または４０〜５０または５０〜１００の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む。それぞれの可能性が、別個の実施形態を表す。
【０５２３】
別の実施形態において、組成物は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の複数または組み合わせを含み、それぞれの株は、少なくとも１つのネオエピトープを含む一つまたは複数のペプチドをコードする一つまたは複数のオープンリーディングフレームを含む核酸構築物を含む。別の実施形態において、組成物は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の複数または組み合わせを含み、それぞれの株は、一つまたは複数のネオエピトープを含む一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片をコードする一つまたは複数のオープンリーディングフレームを含む核酸構築物を含む。
【０５２４】
別の実施形態において、組成物は、複数のネオエピトープを含み得る。別の実施形態において、組成物は、少なくとも２つの異なるネオエピトープアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、組成物は、少なくとも２つの異なるネオエピトープアミノ酸配列を発現する。
【０５２５】
別の実施形態において、組成物は、約１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００または５００〜１０００のネオエピトープの範囲のネオエピトープを含む。それぞれの可能性が、別個の実施形態を表す。別の実施形態において、組成物は、約５０〜１００のネオエピトープの範囲のネオエピトープを含む。別の実施形態において、組成物は、約１〜１００のネオエピトープの範囲のネオエピトープを含む。別の実施形態において、組成物は、約１００を超えるネオエピトープを含む。別の実施形態において、組成物は、最大約１０までのネオエピトープを含む。別の実施形態において、組成物は、最大約２０までのネオエピトープを含む。別の実施形態において、組成物は、最大約５０までのネオエピトープを含む。別の実施形態において、組成物は、最大約１００までのネオエピトープを含む。別の実施形態において、組成物は、最大約５００までのネオエピトープを含む。別の実施形態において、組成物は、最大約１０００までのネオエピトープを含む。別の実施形態において、組成物は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０のネオエピトープを含む。それぞれの可能性が、別個の実施形態を表す。別の実施形態において、組成物は、約５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００のネオエピトープを含む。それぞれの可能性が、別個の実施形態を表す。
【０５２６】
一実施形態において、本明細書に記載のＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む任意の組成物を、本明細書に開示の方法において使用してもよい。
【０５２７】
別の実施形態において、組成物は、少なくとも１つの免疫調節分子をさらに含み、分子は、インターフェロンガンマ、サイトカイン、ケモカイン、Ｔ細胞刺激剤、およびその任意の組み合わせを含む群より選択される。
【０５２８】
一実施形態において、前記疾患もしくは状態を有する被験体にＬｉｓｔｅｒｉａ株を投与することは、被験体の疾患もしくは状態に標的化された免疫応答を生成する。別の実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、前記被験体の疾患もしくは状態に標的化された、前記被験体のための個別化された免疫療法ベクターである。別の実施形態において、個別化された免疫療法は、疾患もしくは状態を有する被験体において生存時間を増大させる。別の実施形態において、個別化された免疫療法は、疾患もしくは状態を有する被験体において腫瘍のサイズまたは転移のサイズを低減させる。別の実施形態において、個別化された免疫療法は、疾患もしくは状態を有する被験体において転移から保護する。
【０５２９】
一実施形態において、腫瘍を有するまたはがんに罹っている、あるいは感染性疾患に罹っている被験体の生存期間を増大させるための方法は、本開示を通して記載される通りの免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０５３０】
別の実施形態において、腫瘍を有するまたはがんに罹っている、あるいは感染性疾患に罹っている被験体の生存期間を増大させるための方法は、本明細書に開示の個別化された免疫療法組成物またはワクチンを被験体に投与するステップを含む。
【０５３１】
別の実施形態において、本明細書に開示されるのは、がんに罹っているまたは腫瘍を有する被験体の生存を増大させる方法は、核酸分子を含む本明細書に開示される通りの組換えＬｉｓｔｅｒｉａワクチン株を含む免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含み、核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、融合ポリペプチドは、一つまたは複数のネオエピトープあるいは一つまたは複数のネオエピトープを含む無意味なペプチドまたはその断片に融合された切断型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断型ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む、方法である。
【０５３２】
別の実施形態において、腫瘍を有するまたはがんに罹っている、あるいは感染性疾患に罹っている被験体の生存期間を増大させるための方法は、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０５３３】
別の実施形態において、本明細書に開示されるのは、腫瘍を有するまたはがんに罹っている、あるいは感染性疾患に罹っている被験体の生存期間を増大させるための方法であって、この方法は、少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含み、それぞれの核酸配列は、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む一つまたは複数の組換えポリペプチドをコードし、該一つまたは複数の無意味なペプチドは、少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、該一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれは一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される方法である。
【０５３４】
一実施形態において、疾患もしくは状態を有する被験体において個別化された標的化免疫応答を誘発する方法であって、免疫応答が、被験体の疾患もしくは状態を有する生物試料内に存在する一つまたは複数のネオエピトープを含む一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片に標的化される、方法は、被験体本明細書に記載される通りの免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０５３５】
別の実施形態において、本明細書に開示されるのは、疾患もしくは状態を有する被験体において個別化されたに標的化免疫応答を誘発する方法であって、免疫応答が、被験体内の疾患もしくは状態を有する組織に存在する一つまたは複数のネオエピトープを含む無意味なペプチドまたはその断片に標的化され、少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含み、それぞれの核酸配列は、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む一つまたは複数の組換えポリペプチドをコードし、該一つまたは複数の無意味なペプチドは、少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、該一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれは一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される、方法である。
【０５３６】
一実施形態において、疾患もしくは状態を有する被験体において疾患もしくは状態を有する組織もしくは細胞に存在する少なくとも１つのネオエピトープに標的化された免疫応答を誘発する方法は、本明細書に開示される通りの個別化された免疫療法組成物またはワクチンを被験体に投与するステップを含む。
【０５３７】
一実施形態において、疾患もしくは状態を有する被験体において標的化免疫応答を誘発する方法は、本明細書に開示される通りの免疫原性組成物またはワクチンを被験体に投与するステップを含み、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を投与することは、被験体の疾患もしくは状態に標的化された個別化された免疫療法を生成する。
【０５３８】
一実施形態において、被験体において疾患または状態を処置、抑制、防止、または阻害する方法、は、本明細書に記載される通りの免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０５３９】
一実施形態において、被験体において疾患もしくは状態を処置、抑制、または阻害する方法は、疾患もしくは状態を標的化するために本明細書に記載される通りの個別化された免疫療法組成物またはワクチンを投与するステップを含む。
【０５４０】
別の実施形態において、本明細書に開示されるのは、被験体における疾患もしくは状態を処置、抑制、防止、または阻害方法であって、少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含み、それぞれの核酸配列は、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む一つまたは複数の組換えポリペプチドをコードし、一つまたは複数の無意味なペプチドは、少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、該一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれは一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される、方法である。
【０５４１】
別の実施形態において、被験体において腫瘍またはがんまたは感染症または感染性疾患を処置するステップを含む方法は、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０５４２】
一実施形態において、被験体脾臓および腫瘍のにおいて制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＴエフェクター細胞の比を増大させる方法であって、Ｔエフェクター細胞が、被験体の疾患もしくは状態を有する生物試料内に存在する一つまたは複数のネオエピトープを含む一つまたは複数の無意味なペプチドに標的化される、方法は、本明細書に記載される通りの免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０５４３】
別の実施形態において、本明細書に開示されるのは、被験体の脾臓および腫瘍の微小環境において制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＴエフェクター細胞の比を増大させる方法であって、本明細書に開示の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法である。別の実施形態において、被験体の脾臓および腫瘍の微小環境において制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＴエフェクター細胞の比を増大させることは、被験体におけるより大きな抗腫瘍応答を可能にする。
【０５４４】
別の実施形態において、被験体の脾臓および腫瘍において制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＴエフェクター細胞の比を増大させる方法であって、Ｔエフェクター細胞が、被験体の疾患もしくは状態を有する組織内に存在するネオエピトープに標的化される、方法は、本明細書に開示される通りの個別化された免疫療法組成物またはワクチンを被験体に投与するステップを含む。
【０５４５】
別の実施形態において、本明細書に開示されるのは、被験体の脾臓および腫瘍において制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＴエフェクター細胞の比率を増大させる方法であって、Ｔエフェクター細胞が、被験体の疾患もしくは状態を有する組織内に存在する一つまたは複数のネオエピトープを含む一つまたは複数の無意味なペプチドに標的化され、この方法は、少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含み、それぞれの核酸配列は、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む一つまたは複数の組換えポリペプチドをコードし、該一つまたは複数の無意味なペプチドは、少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、該一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれは一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される、方法である。
【０５４６】
別の実施形態において、Ｔエフェクター細胞は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞を含む。別の実施形態において、Ｔエフェクター細胞は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞である。別の実施形態において、Ｔエフェクター細胞は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。別の実施形態において、Ｔエフェクター細胞は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態において、制御性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。
【０５４７】
別の実施形態において、免疫応答は、Ｔ細胞応答である。別の実施形態において、Ｔ細胞応答は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答である。別の実施形態において、Ｔ細胞応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態において、Ｔ細胞応答は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。
【０５４８】
本明細書に開示の免疫原性組成物の投与後、本明細書に開示の方法は、末梢リンパ系臓器におけるＴエフェクター細胞の増大を誘導し、それによって腫瘍部位でのＴエフェクター細胞の存在の増強が起こる。別の実施形態において、本明細書に開示の方法は、末梢リンパ系臓器におけるＴエフェクター細胞の増大を誘導し、それによって、末梢でのＴエフェクター細胞の存在の増強が起こる。Ｔエフェクター細胞のそのような増大によって、末梢および腫瘍部位で、Ｔｒｅｇの数に影響を及ぼすことなく、Ｔエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞に対する比率の増加が起こる。末梢リンパ系臓器には、脾臓、パイエル板、リンパ節、アデノイドなどが挙げられるがこれらに限定されないことは当業者であれば認識しているものと予想される。一実施形態において、Ｔエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞に対する比率の増加が、Ｔｒｅｇの数に影響を及ぼすことなく末梢で起こる。別の実施形態において、Ｔエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞に対する比率の増加は、末梢、リンパ系臓器、および腫瘍部位で、これらの部位でのＴｒｅｇの数に影響を及ぼすことなく起こる。別の実施形態において、Ｔエフェクター細胞の比率の増加は、Ｔｒｅｇの頻度を減少させるが、これらの部位でのＴｒｅｇの総数は減少させない。
【０５４９】
一実施形態において、被験体においてネオエピトープ特異的Ｔ細胞を増加させる方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０５５０】
別の実施形態において、本明細書に開示されるのは、被験体においてネオエピトープ特異的Ｔ細胞を増大させるための方法であって、この方法は、少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含み、それぞれの核酸配列は、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む一つまたは複数の組換えポリペプチドをコードし、該一つまたは複数の無意味なペプチドは、少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、該一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれは一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される、方法である。
【０５５１】
別の実施形態において、本明細書に開示されるのは、がんに罹っているまたは腫瘍を有する被験体において抗原特異的Ｔ細胞を増大させる方法は、本明細書に開示される通りの免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含み、融合ポリペプチドは、一つまたは複数のネオエピトープまたは一つまたは複数のネオエピトープを含む無意味なペプチドまたはその断片に融合された切断型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断型ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む、方法である。
【０５５２】
別の実施形態において、被験体における抗原特異的Ｔ細胞を増大させるための方法は、被験体個別化された免疫療法組成物またはワクチンを被験体に投与するステップを含み、組換えポリペプチドは、１つまたは複数のネオエピトープまたは無意味なペプチドまたはその断片を含む。
【０５５３】
別の実施形態において、被験体において抗原特異的Ｔ細胞を増大させるための方法は、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０５５４】
一実施形態において、被験体において腫瘍または転移のサイズを低減させる方法は、本明細書に記載される通りの免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０５５５】
別の実施形態において、本明細書に開示されるのは、被験体において腫瘍または転移のサイズを低減させる方法であって、この方法は、少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含み、それぞれの核酸配列は、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む一つまたは複数の組換えポリペプチドをコードし、該一つまたは複数の無意味なペプチドは、少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、該一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれは一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される方法である。
【０５５６】
別の実施形態において、感染性疾患から被験体を保護する方法は、本明細書に開示される通りの個別化された免疫療法組成物またはワクチンを被験体に投与するステップを含む。
【０５５７】
別の実施形態において、腫瘍またはがんから被験体を保護する方法は、本明細書に開示の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０５５８】
別の実施形態において、被験体においてがんの発生を阻害または遅延する方法は、本明細書に開示される通りの個別化された免疫療法組成物またはワクチンを被験体に投与するステップを含む。
【０５５９】
一実施形態において、方法は、個別化された抗がんまたは抗腫瘍免疫応答を誘発する。
【０５６０】
一実施形態において、本明細書に開示されるのは、被験体において増強された抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発する方法であり、この方法は、少なくとも１つの核酸配列を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む有効量の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含み、それぞれの核酸配列は、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む一つまたは複数の組換えポリペプチドをコードし、一つまたは複数の無意味なペプチドは、少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれは一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得され、方法は、免疫チェックポイント阻害剤アンタゴニストを含む組成物の有効量を投与するステップをさらに含む。
【０５６１】
一実施形態において、本明細書に開示されるのは、被験体において増強された抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発する方法であり、この方法は、核酸分子を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む有効量の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含み、核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、融合ポリペプチドは、一つまたは複数のネオエピトープ、あるいは一つまたは複数のネオエピトープを含む無意味なペプチドまたはその断片に融合された切断型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断型ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、方法は、免疫チェックポイント阻害剤アンタゴニストを含む組成物の有効量を投与するステップをさらに含む。
【０５６２】
一実施形態において、組成物は、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤を含む。別の実施形態において、チェックポイント阻害剤は、１つまたは複数の抗体を含み得る。別の実施形態において、１つまたは複数の抗体は、抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体またはその断片；抗ＰＤ−１抗体またはその断片；抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその断片；抗Ｂ７−Ｈ４抗体またはその断片；およびその任意の組み合わせを含み得る。他の免疫チェックポイント阻害剤アンタゴニストには、ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害剤、ＣＤ８０／８６およびＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路阻害剤、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）シグナル伝達経路阻害剤、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）シグナル伝達経路阻害剤、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）シグナル伝達経路阻害剤、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）シグナル伝達経路阻害剤、ＣＤ４０シグナル伝達経路阻害剤、または他の任意の抗原提示細胞／Ｔ細胞シグナル伝達経路阻害剤が挙げられる。
【０５６３】
一実施形態において、組成物は、Ｔ細胞受容体共刺激分子、共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体、またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに結合する抗体もしくはその機能的断片などの１つまたは複数のＴ細胞刺激剤を含む。Ｔ細胞受容体共刺激分子は、例えば、ＣＤ２８またはＩＣＯＳを含み得る。共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体は、例えばＣＤ８０受容体、ＣＤ８６受容体、またはＣＤ４６受容体を含み得る。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、例えばグルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４受容体）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７受容体）、またはＴＮＦＲ２５を含み得る。例えば、そのそれぞれの全体が全ての目的に関して参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２０１６１００９２９号、国際公開第２０１６０１１３６２号、および国際公開第２０１６０１１３５７号を参照されたい。
【０５６４】
一実施形態において、本明細書に開示の組成物の反復投与（用量）は、腫瘍の退縮を達成するために、処置の第１コースの直後、または数日、数週間、もしくは数ヶ月の間隔の後に行ってもよい。別の実施形態において、反復用量は、腫瘍生育の抑制を達成するために、処置の第１コースの直後、または数日、数週間、もしくは数ヶ月の間隔の後に行ってもよい。評価は、画像化技術、血清腫瘍マーカーの分析、生検、または腫瘍関連症状の存在、非存在、もしくは改善などの診断方法を含む、当技術分野で公知の任意の技術によって決定してもよい。
【０５６５】
一実施形態において、腫瘍のエスケープ変異を防止しながら、異種抗原発現腫瘍を防止、処置、およびそれに対してワクチン接種するための、ならびに異種抗原のサブドミナントエピトープに対する免疫応答を誘導するための方法および組成物が本明細書に開示される。
【０５６６】
一実施形態において、異種抗原発現腫瘍を防止、処置、およびそれに対してワクチン接種するための方法および組成物は、切断型リステリオリシン（ｔＬＬＯ）タンパク質を使用することを含む。別の実施形態において、本明細書に開示の方法および組成物は、ｔＬＬＯを過剰発現する組換えＬｉｓｔｅｒｉａを含む。別の実施形態において、ｔＬＬＯは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ内のプラスミドから発現される。
【０５６７】
一実施形態において、用語「処置すること」は、疾患を治癒することを指す。別の実施形態において、「処置すること」は、疾患を防止することを指す。別の実施形態において、「処置すること」は、疾患の発生率を低減させることを指す。別の実施形態において、「処置すること」は、疾患の症状を改善させることを指す。別の実施形態において、「処置すること」は、患者の無増悪生存期間（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）、または全生存期間を増大させることを指す。別の実施形態において、「処置すること」は、疾患の進行を安定化させることを指す。別の実施形態において、「処置すること」は、寛解を誘導することを指す。別の実施形態において、「処置すること」は、疾患の進行を遅らせることを指す。別の実施形態において、「処置すること」は、とりわけ進行を遅らせる、寛解を促進する、寛解を誘導する、寛解を増強する、回復を早める、代替治療の有効性を増加させるもしくは代替治療に対する抵抗性を減少させる、またはその組み合わせを指す。用語「低減すること」、「抑制すること」、および「阻害すること」は、別の実施形態において、弱めるまたは減少させることを指す。別の実施形態において、用語「阻害すること」および「抑制すること」は、目的が、本明細書において上記の標的化された病態または疾患を防止するかまたは弱めることである、予防的または防止的手段を指す。別の実施形態において、処置することは、疾患、障害、または状態、および／または関連する症状に直接影響を及ぼすか、または治癒することを含み得るが、抑制することまたは阻害することは、疾患、障害、または状態、またはその組み合わせを防止する、それらの重症度を低減する、それらの発症を遅らせる、それらに関連する症状を低減することを含み得る。一実施形態において、「予防」、「予防的」、「防止すること」、または「阻害すること」は、とりわけ症状の発生を遅らせる、疾患の再発を防止する、再発エピソードの回数もしくは頻度を減少させる、症候性エピソード間の潜伏期を増加させる、またはその組み合わせを指す。一実施形態において、「抑制すること」は、とりわけ症状の重症度を低減させる、急性エピソードの重症度を低減させる、症状の数を低減させる、疾患関連症状の発生率を低減させる、症状の潜伏期を低減させる、症状を改善する、二次症状を低減させる、二次感染症を低減させる、患者の生存を延長させる、またはその組み合わせを指す。それぞれの可能性は別個の実施形態を表し得る。
【０５６８】
一実施形態において、ワクチン、組成物、または組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、治療有効量で投与される。腫瘍の処置に関連する用語「治療有効量」は、以下の効果：（１）減速および完全な生育停止を含む、腫瘍生育のある程度の阻害；（２）腫瘍細胞数の低減；（３）腫瘍サイズの低減；（４）末梢臓器への腫瘍細胞浸潤の阻害（すなわち、低減、減速、または完全な停止）；（５）転移の阻害（すなわち、低減、減速、または完全な停止）；（６）腫瘍の退縮もしくは拒絶が起こり得るが、必ずしも起こる必要はない、抗腫瘍免疫応答の増強；ならびに／または（７）障害に関連する１つもしくは複数の症状のある程度の緩和のうちの１つまたは複数を誘発することができる量を包含することを当業者は認識していると予想される。腫瘍の処置の目的のための本明細書に開示のワクチンの「治療有効量」は、経験的におよび日常的に決定され得る。
【０５６９】
別の実施形態において、被験体における腫瘍の退縮を誘導する方法は、本明細書に開示の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む。別の実施形態において、腫瘍またはがんの発生または再発を低減させる方法は、本明細書に開示の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む。別の実施形態において、被験体における腫瘍の形成を抑制する方法は、本明細書に開示の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む。別の実施形態において、被験体においてがんの寛解を誘導する方法は、本明細書に開示の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０５７０】
一実施形態において、方法は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａを追加の療法と共投与するステップを含む。別の実施形態において、追加の療法は、手術、化学療法、免疫療法、放射線療法、抗体ベースの免疫療法、またはその組み合わせである。別の実施形態において、追加の療法は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａの投与に先立つ。別の実施形態において、追加の療法は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａの投与の後である。別の実施形態において、追加の療法は、抗体療法である。別の実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａは、制御性Ｔ細胞に対するＴエフェクター細胞の比率を増大させ、より強力な抗腫瘍免疫応答を生成するために増大用量で投与される。抗腫瘍免疫応答は、腫瘍を有する被験体に、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、および当技術分野で細胞免疫応答を増強することが公知の他のサイトカインを含むがこれらに限定されないサイトカインを提供することによってさらに強化することができることは当業者によって認識され、その一部は、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第６，９９１，７８５号に見出されうる。
【０５７１】
一実施形態において、本明細書に開示の方法は、本明細書に開示の免疫原性組成物をインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）経路阻害剤と同時投与するステップをさらに含む。本開示において使用するためのＩＤＯ経路阻害剤には、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、ネクロスタチン−１、ピリドキサルイソニコチノイルヒドラゾン、エブセレン、５−メチルインドール−３−カルボキシアルデヒド、ＣＡＹ１０５８１、抗ＩＤＯ抗体または低分子ＩＤＯ阻害剤が挙げられるがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意のＩＤＯ経路阻害剤が挙げられる。別の実施形態において、本明細書に開示の組成物および方法はまた、化学療法または放射線療法レジメンと共に、その前に、またはその後に使用される。別の実施形態において、ＩＤＯ阻害は、化学療法剤の効率を増強する。
【０５７２】
一実施形態において、本明細書に開示の免疫原性混合組成物を被験体に併用してまたは逐次的に投与するステップを含む、被験体における個別化された抗腫瘍応答を誘発する方法が本明細書において開示される。別の実施形態において、本明細書に開示される組成物の免疫原性混合物を被験体に併用してまたは逐次的に投与するステップを含む、被験体における腫瘍を防止または処置する方法が本明細書において開示される。一実施形態において、組成物の混合物から選択される少なくとも１つの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む組成物を、組成物の前記混合物から選択される少なくとも別の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株と同時に（すなわち、同じ医薬中で）、それと並行して（すなわち、任意の順序で互いに直後に投与される別個の医薬中で）、または任意の順序で逐次的に投与することができる。逐次的な投与は、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む薬物が異なる剤形（１つの薬剤が錠剤またはカプセル剤であり、別の薬剤が滅菌液体である）に存在する場合、および／または異なる投与スケジュールで投与される場合、例えば１つのＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む組成物の混合物からの１つの組成物を少なくとも毎日投与し、他方を１週間に１回、２週間毎に１回、または３週間毎に１回などのより少ない頻度で投与する場合、特に有用である。
【０５７３】
別の実施形態において、個別化された免疫療法組成物は、１つまたは複数のネオエピトープに対して標的化された免疫応答を誘発する。別の実施形態において、個別化された免疫療法組成物は、１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片に対して標的化された免疫応答を誘発する。
【０５７４】
自己免疫疾患を有する被験体を処置する努力において、自己反応性ネオエピトープを同定するための免疫原性組成物およびプロセスが本明細書に開示され、方法またはプロセスは、抗体、または免疫抑制性細胞、例えばＴｒｅｇもしくはＭＤＳＣによって媒介される寛容を誘導するために、自己免疫疾患を有する被験体を、これらの自己反応性ネオエピトープに対して免疫化する方法を含む。
【０５７５】
一実施形態において、自己免疫疾患は、全身性の自己免疫疾患を含む。用語「全身性の自己免疫疾患」は、１つより多い臓器に影響を及ぼす自己免疫反応によって引き起こされる、疾患、障害、または症状の組み合わせを指す。別の実施形態において、全身性の自己免疫疾患には、抗ＧＢＭ腎炎（グッドパスチャー病）、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、多発性筋炎（ＰＭ）、またはセリアック病が挙げられるがこれらに限定されない。
【０５７６】
一実施形態において、自己免疫疾患は、結合組織病を含む。当業者は、用語「結合組織病」が、身体の結合組織に影響を及ぼす自己免疫反応によって引き起こされる疾患、状態、または症状の組み合わせを包含することを認識していると予想される。別の実施形態において、結合組織病には、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、多発性筋炎（ＰＭ）、全身性硬化症、または混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０５７７】
一実施形態において、他の非腫瘍または非がん性疾患は、疾患を有する生物試料を本明細書に開示のプロセスに従う分析のために得ることができる臓器移植の拒絶を含む。別の実施形態において、拒絶される臓器は、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、腸、胃、精巣、角膜、皮膚、心臓弁、血管または骨を含むがこれらに限定されない固形臓器である。別の実施形態において、拒絶される臓器には、血液組織、骨髄、またはランゲルハンス島細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【０５７８】
移植された臓器の拒絶を有するか、または移植片対宿主病（ＧＶｈＤ）を経験している移植被験体を処置する努力において、一実施形態において、自己反応性ネオエピトープを同定する方法が本明細書に開示され、プロセスは、抗体または免疫抑制性細胞、例えばＴｒｅｇもしくはＭＤＳＣによって媒介される寛容を誘導するために、自己免疫疾患を有する被験体を、これらの自己反応性ネオエピトープに対して免疫化する方法を含む。
【０５７９】
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法は、ブースター処置を投与することをさらに含む。別の実施形態において、投与は、被験体において個別化されて増強された抗感染疾患免疫応答を誘発する。別の実施形態において、投与は、被験体において、増強されて個別化された抗感染疾患、または抗状態免疫応答を誘発する。別の実施形態において、方法は、個別化された抗がんまたは抗腫瘍免疫応答を誘発する。別の実施形態において、方法は、本明細書に開示の弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物によって被験体をブーストすることをさらに含む。別の実施形態において、方法は、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物のブースター投与量を投与するステップを含む。別の実施形態において、ブースターは、本明細書に記載の１つまたは複数のＤＮＡ分子／核酸配列／核酸構築物／核酸ベクターを含む。別の実施形態において、ブースターは、本明細書に記載の１つまたは複数の組換えポリペプチド／キメラタンパク質／ペプチド／融合ペプチドを含む。
【０５８０】
別の実施形態において、ブースターは、少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含み、それぞれの核酸配列は、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む一つまたは複数の組換えポリペプチドをコードし、該一つまたは複数の無意味なペプチドは、少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれは一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される。
【０５８１】
別の実施形態において、ブースターは、少なくとも１つの核酸配列を含み、それぞれの核酸配列は、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む一つまたは複数の組換えポリペプチドをコードし、該一つまたは複数の無意味なペプチドは、少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれは一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される。
【０５８２】
別の実施形態において、ブースターは、免疫原性ポリペプチドに融合された一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む一つまたは複数の組換えポリペプチドを含み、該一つまたは複数の無意味なペプチドは、少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれは一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される。
【０５８３】
別の実施形態において、ブースターは、一つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む一つまたは複数の組換えポリペプチドを含み、ネオエピトープの一つまたは複数は、ネオエピトープの一つまたは複数は、少なくとも１つの変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から取得される。
【０５８４】
別の実施形態において、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または抗体もしくはその機能的断片によって被験体をブーストするステップをさらに含む。別の実施形態において、ブースター接種に使用される組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、初回「プライミング」接種に使用した株と同じである。別の実施形態において、ブースター株は、プライミング株とは異なる。別の実施形態において、ブースター接種に使用した抗体は、初回「プライミング」接種に使用した抗体と同じ抗原に結合する。別の実施形態において、ブースター抗体は、プライミング抗体とは異なる。
【０５８５】
別の実施形態において、プライミングおよびブースト接種に同じ用量を使用する。別の実施形態において、ブースターにはより高用量を使用する。別の実施形態において、ブースターにはより低用量を使用する。
【０５８６】
別の実施形態において、本明細書に開示の方法は、ブースターワクチン接種を被験体に投与するステップをさらに含む。一実施形態において、ブースターワクチン接種は、単一のプライミングワクチン接種の後である。別の実施形態において、単一のブースターワクチン接種が、プライミングワクチン接種後に投与される。別の実施形態において、２つのブースターワクチン接種が、プライミングワクチン接種後に投与される。別の実施形態において、３つのブースターワクチン接種が、プライミングワクチン接種後に投与される。
【０５８７】
別の実施形態において、ブースター用量は、免疫原性組成物の代替的形態である。別の実施形態において、方法は、ブースター免疫原性組成物を被験体に投与するステップをさらに含む。一実施形態において、ブースター用量は、免疫原性組成物の単一のプライミング用量の後である。別の実施形態において、単一のブースター用量が、プライミング用量の後に投与される。別の実施形態において、２つのブースター用量が、プライミング用量の後に投与される。別の実施形態において、３つのブースター用量が、プライミング用量の後に投与される。一実施形態において、本明細書に開示の弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａを含む免疫原性組成物のプライム用量とブースト用量との間の期間は、当業者によって実験的に決定される。別の実施形態において、用量は、当業者によって実験的に決定される。別の実施形態において、プライムとブースト用量との間の期間は、１週間であり、別の実施形態において、これは２週間であり、別の実施形態において、これは３週間であり、別の実施形態において、これは４週間であり、別の実施形態において、これは５週間であり、別の実施形態において、これは６〜８週間であり、さらに別の実施形態において、ブースト用量は、免疫原性組成物のプライム用量の８〜１０週間後に投与される。
【０５８８】
異種「プライムブースト」戦略は、多数の病原体に対する免疫応答および保護を増強するために有効である。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １７０巻：２９〜３８頁（１９９９年）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｈ．  Ｌ．、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２巻：２３９〜５０頁（２００２年）；Ｇｏｎｚａｌｏ，  Ｒ．  Ｍ．ら、Ｓｔｒａｉｎ  ２０巻：１２２６〜３１頁（２００２年）；Ｔａｎｇｈｅ，  Ａ．、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．６９巻：３０４１〜７頁（２００１年）。プライミングおよびブースト注射に異なる形態の抗原を提供することは、抗原に対する免疫応答を最大限にするように思われる。ＤＮＡ株のプライミング後に、アジュバント中のタンパク質によるブースト、または抗原をコードするＤＮＡのウイルスベクター送達を行うことは、抗原特異的抗体およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答をそれぞれ改善する最も有効な方法であるように思われる。Ｓｈｉｖｅｒ  Ｊ．  Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４１５巻：３３１〜５頁（２００２年）；Ｇｉｌｂｅｒｔ，  Ｓ．  Ｃ．ら、Ｓｔｒａｉｎ、２０巻：１０３９〜４５頁（２００２年）；Ｂｉｌｌａｕｔ−Ｍｕｌｏｔ，  Ｏ．ら、Ｓｔｒａｉｎ、１９巻：９５〜１０２頁（２０００年）；Ｓｉｎ，  Ｊ．  Ｉ．ら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８巻：７７１〜９頁（１９９９年）。サルのワクチン接種研究からの最近のデータは、ＣＲＬ１００５ポロキサマー（１２ｋＤａ、５％ＰＯＥ）を、ＨＩＶ  ｇａｇ抗原をコードするＤＮＡに付加すると、サルをＨＩＶ  ｇａｇ  ＤＮＡプライミングによってワクチン接種した後にＨＩＶ  ｇａｇを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ５−ｇａｇ）によってブーストした場合に、Ｔ細胞応答を増強することを示唆している。ＤＮＡ／ポロキサマープライミング後のＡｄ５−ｇａｇブーストに対する細胞免疫応答は、ＤＮＡ（ポロキサマーなし）プライミング後にＡｄ５−ｇａｇブースト、またはＡｄ５−ｇａｇのみによって誘導した応答より大きかった。Ｓｈｉｖｅｒ，  Ｊ．  Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４１５巻：３３１〜５頁（２００２年）。米国特許出願公開第２００２／０１６５１７２Ａ１号は、免疫応答が生成されるように、抗原の免疫原性部分をコードするベクター構築物と、抗原の免疫原性部分を含むタンパク質とを同時投与することを記載している。この文書は、Ｂ型肝炎抗原およびＨＩＶ抗原に限定されている。その上、米国特許第６，５００，４３２号は、目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同時投与によって核酸ワクチン接種の免疫応答を増強する方法に関する。この特許に従うと、同時投与は、同じ免疫応答の間、好ましくは互いに０〜１０日または３〜７日以内でのポリヌクレオチドとポリペプチドの投与を意味する。上記の参考文献は全て、全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０５８９】
一実施形態において、本開示によって包含される処置プロトコールは治療的である。別の実施形態において、プロトコールは予防的である。別の実施形態において、本明細書に開示の組成物は、当業者に理解されるように、これらのタイプの病気に対する素因となる家族性の遺伝的状況または他の状況のために、乳がんまたは他のタイプの腫瘍などのがんのリスクを有する人を保護するために使用される。別の実施形態において、本明細書に開示の免疫療法またはワクチンは、手術による腫瘍生育の減量、従来の化学療法、または放射線処置後のがん免疫療法として使用される。そのような処置後、腫瘍抗原に対するＣＴＬ応答が、残存している転移を破壊して、がんからの寛解を延長させるように、免疫療法またはワクチンを投与する。別の実施形態において、免疫療法またはワクチンは、既に確立された腫瘍の生育に影響を及ぼすためおよび存在する腫瘍細胞を死滅させるために使用される。
【０５９０】
別の実施形態において、ペプチド、組換えポリペプチドまたは融合ポリペプチドに含まれる１つまたは複数のネオエピトープ配列を使用して治療抗腫瘍または抗がんＴ細胞免疫応答を提供する。別の実施形態において、ペプチド、組換えポリペプチドまたは融合ポリペプチドに含まれる１つまたは複数のネオエピトープ配列の使用は、標的化免疫療法を提供し、これは、ある特定の実施形態において、抗腫瘍または抗がん適応免疫応答を治療的に活性化し得る。別の実施形態において、ペプチド、組換えポリペプチドまたは融合ポリペプチドに含まれる１つまたは複数のネオエピトープ配列を使用して治療自己免疫疾患Ｔ細胞免疫応答を提供する。別の実施形態において、ペプチド、組換えポリペプチドまたは融合ポリペプチドに含まれる１つまたは複数のネオエピトープ配列の使用は、標的化免疫療法を提供し、これは、ある特定の実施形態において、自己免疫疾患適応免疫応答を治療的に活性化し得る。別の実施形態において、ペプチド、組換えポリペプチドまたは融合ポリペプチドに含まれる１つまたは複数のネオエピトープ配列を使用して治療抗感染性疾患Ｔ細胞免疫応答を提供する。別の実施形態において、ペプチド、組換えポリペプチドまたは融合ポリペプチドに含まれる１つまたは複数のネオエピトープ配列の使用は、標的化免疫療法を提供し、これは、ある特定の実施形態において、抗感染性疾患適応免疫応答を治療的に活性化し得る。別の実施形態において、ペプチド、組換えポリペプチドまたは融合ポリペプチドに含まれる１つまたは複数のネオエピトープ配列を使用して治療抗臓器移植拒絶Ｔ細胞免疫応答を提供する。別の実施形態において、ペプチド、組換えポリペプチドまたは融合ポリペプチドに含まれる１つまたは複数のネオエピトープ配列の使用は、標的化免疫療法を提供し、これは、ある特定の実施形態において、抗臓器移植拒絶適応免疫応答を治療的に活性化し得る。
【０５９１】
別の実施形態において、免疫原性応答の存在は、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープの存在と相関する。別の実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａは、Ｔ細胞エピトープまたは適応免疫応答エピトープ、またはその任意の組み合わせを含むネオエピトープをコードする核酸を含む。
【０５９２】
別の実施形態において、ペプチド、組換えポリペプチドまたは融合ポリペプチドに含まれる１つまたは複数の無意味なペプチド配列を使用して治療抗腫瘍または抗がんＴ細胞免疫応答を提供する。別の実施形態において、ペプチド、組換えポリペプチドまたは融合ポリペプチドに含まれる１つまたは複数の無意味なペプチド配列の使用は、標的化免疫療法を提供し、これは、ある特定の実施形態において、抗腫瘍または抗がん適応免疫応答を治療的に活性化し得る。別の実施形態において、１つまたは複数の無意味なペプチド配列を使用して治療自己免疫疾患Ｔ細胞免疫応答を提供する。別の実施形態において、１つまたは複数の無意味なペプチド配列を使用して自己免疫疾患適応免疫応答を活性化する。別の実施形態において、１つまたは複数の無意味なペプチド配列を使用して治療抗感染性疾患Ｔ細胞免疫応答を提供する。別の実施形態において、１つまたは複数の無意味なペプチド配列は、抗感染性疾患適応免疫応答の活性化にし寄す有れる。別の実施形態において、１つまたは複数の無意味なペプチド配列を使用して治療抗臓器移植拒絶Ｔ細胞免疫応答を提供する。別の実施形態において、ペプチド、組換えポリペプチドまたは融合ポリペプチドに含まれる１つまたは複数の無意味なペプチド配列は、標的化免疫療法を提供し、これは、ある特定の実施形態において、抗臓器移植拒絶適応免疫応答を活性化するために治療的に使用される。
【０５９３】
別の実施形態において、免疫原性応答の存在は、一つまたは複数の免疫原性無意味なペプチドの存在と相関する。別の実施形態において、組換えＬｉｓｔｅｒｉａは、Ｔ細胞エピトープまたは適応免疫応答エピトープ、またはその任意の組み合わせを含む一つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片をコードする核酸を含む。
【０５９４】
本明細に使用されるように、単数形「１つの」、「１つの（ａｎ）」、および「その」は、文脈がそれ以外であることを明らかに示していない限り、複数形を含む。例えば、「１つの化合物」、または「少なくとも１つの化合物」という用語は、その混合物を含む、複数の化合物を含み得る。
【０５９５】
本明細書を通して、様々な実施形態が範囲の形式で提示され得る。範囲の形式での記載は、単に便宜上で簡潔にするためであり、本開示の範囲に対する確固たる制限として解釈すべきではないと理解すべきである。したがって、範囲の記述は、全ての起こり得る小範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考えるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記述は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの小範囲、ならびにその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５、および６を具体的に開示していると考えるべきである。このことは、範囲の幅によらず当てはまる。
【０５９６】
数値範囲が本明細書に示されている場合は常に、記載の範囲内の引用されている任意の数値（分数または整数）を含むことを意味する。第１の数値と第２の数値の「間の範囲／範囲」、および第１の数値「から」第２の数値「までの範囲／範囲」は、本明細書において互換的に使用され、第１および第２の記載の数値ならびにその間の全ての分数および整数を含むことを意味する。
【０５９７】
当業者は、用語「方法」が、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の熟練者に公知であるか、または公知の様式、手段、技術、および手順から容易に開発されたそれらの様式、手段、技術、および手順を含むがこれらに限定されない、所定の作業を達成するための様式、手段、技術、および手順を包含することを認識していると予想される。
【０５９８】
用語「複数」は、１より大きい整数を包含し得ることは当業者であれば認識しているものと予想される。一実施形態において、この用語は、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０または９０〜１００の範囲を指す。それぞれの可能性が、別個の実施形態を表す。
【０５９９】
上記または下記で引用する全ての特許の提出、ウェブサイト、他の刊行物、受託番号などは、それぞれの個々の項目が具体的および個別に参照により本明細書に組み込まれていることが示されているのと同じ程度に、全ての目的に関して全体が参照により本明細書に組み込まれている。異なるバージョンの配列が異なる時期の受託番号に関連している場合、本出願の有効な提出日での受託番号に関連するバージョンを意味する。有効な提出日は、実際の提出日または必要に応じて受託番号に言及する優先権出願の提出日のより早いほうを意味する。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェブサイトなどが、異なる時期に公表されている場合、特に明記されていない限り、出願の有効な提出日に公表された直近のバージョンを意味する。本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様は、具体的に他所で示されていない限り、他の任意と組み合わせて使用することができる。本発明は、明快および理解の目的のために例証および例によっていくぶん詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲内で、ある特定の変化および改変を実践してもよいことは明らかと予想される。
［０００１］
実施形態の一覧
本明細書に開示の主題は、以下の実施形態を含むがこれらに限定されない。
［０００２］
１．  それぞれの核酸配列が、免疫原性ポリペプチドに融合した１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、前記１つまたは複数の無意味なペプチドが少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、前記１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれが、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、かつ前記供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から得られる、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［０００３］
２．  前記フレームシフト変異が、健康な生物試料の供給源核酸配列と比較される、実施形態１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［０００４］
３．  前記少なくとも１つのフレームシフト変異が、複数のフレームシフト変異を含み、前記複数のフレームシフト変異が前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株において同じ遺伝子内に存在する、実施形態１〜２のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［０００５］
４．  前記少なくとも１つのフレームシフト変異が複数のフレームシフト変異を含み、前記複数のフレームシフト変異が前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株において同じ遺伝子内に存在しない、実施形態１〜２のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［０００６］
５．  前記少なくとも１つのフレームシフト変異が、遺伝子のエクソンコード領域内に存在する、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［０００７］
６．  前記エクソンが前記遺伝子の最後のエクソンである、実施形態７に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［０００８］
７．  前記１つまたは複数の無意味なペプチドのそれぞれが、約６０〜１００アミノ酸の長さである、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［０００９］
８．  前記１つまたは複数の無意味なペプチドが、前記疾患または状態を有する生物試料において発現される、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００１０］
９．  前記１つまたは複数の無意味なペプチドが、翻訳後切断部位をコードしない、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００１１］
１０．  前記供給源核酸配列が、１つまたは複数のマイクロサテライト不安定性領域を含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００１２］
１１．  前記１つまたは複数のネオエピトープが、Ｔ細胞エピトープを含む、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００１３］
１２．  前記１つまたは複数のネオエピトープが、前記疾患または状態に関連する自己抗原を含み、前記自己抗原が、がんもしくは腫瘍関連ネオエピトープ、またはがん特異的もしくは腫瘍特異的ネオエピトープを含む、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００１４］
１３．  前記腫瘍またはがんが、乳がんもしくは乳房腫瘍、子宮頸がんもしくは子宮頸部腫瘍、Ｈｅｒ２発現がんもしくは腫瘍、黒色腫、膵臓がんもしくは腫瘍、卵巣がんもしくは腫瘍、胃がんもしくは腫瘍、膵臓の癌性病変、肺腺癌、多形神経膠芽腫、結腸直腸腺癌、肺扁平上皮腺癌、胃腺癌、卵巣表層上皮腫瘍（ｏｖａｒｉａｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｍ）、口腔扁平上皮癌、非小細胞肺癌、子宮内膜癌、膀胱がんもしくは腫瘍、頭頸部がんもしくは腫瘍、前立腺癌、腎臓がんもしくは腫瘍、骨がんもしくは腫瘍、血液のがん、または脳がんもしくは腫瘍、または前記がんもしくは腫瘍のいずれか１つの転移を含む、実施形態１４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００１５］
１４．  前記１つまたは複数の無意味なペプチドが、感染疾患関連または疾患特異的ネオエピトープを含む１つまたは複数のネオエピトープを含む、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００１６］
１５．  前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａが、前記１つまたは複数の組換えポリペプチドを発現および分泌する、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００１７］
１６．  前記組換えポリペプチドのそれぞれが、約１〜２０の前記ネオエピトープを含む、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００１８］
１７．  前記１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片がそれぞれ、免疫原性ポリペプチドに融合されている、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００１９］
１８．  前記１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片が、Ｎ末端からＣ末端まで、複数の作動可能に連結された無意味なペプチドまたはその断片を含み、前記免疫原性ポリペプチドが、前記複数の無意味なペプチドまたはその断片の１つに融合されている、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００２０］
１９．  前記免疫原性ポリペプチドが、Ｎ末端の無意味なペプチドに作動可能に連結されている、実施形態１８に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００２１］
２０．  前記連結がペプチド結合である、実施形態２２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００２２］
２１．  前記免疫原性ポリペプチドが、変異したリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、切断型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列である、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００２３］
２２．  前記１つまたは複数の組換えポリペプチドが、任意選択でリンカー配列を介して、Ｃ末端でタグに作動可能に連結されている、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００２４］
２３．  前記リンカー配列が、４×グリシンリンカーをコードしている、実施形態２２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００２５］
２４．  前記タグが、６×ヒスチジンタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド、６×ヒスチジンに作動可能に連結された６×ヒスチジンタグ、およびその任意の組み合わせを含む群より選択される、実施形態２２〜２３のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００２６］
２５．  前記組換えポリペプチドをコードする前記核酸配列が、前記タグをコードする配列後に２つの終止コドンを含む、実施形態２２〜２４のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００２７］
２６．  前記組換えポリペプチドをコードする前記核酸配列が、ｐＨｌｙ−ｔＬＬＯ−［無意味なペプチドまたはその断片−グリシンリンカー（４×）−無意味なペプチドまたはその断片−グリシンリンカー（４×）］ｎ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓタグ−２×終止コドンを含む成分をコードし、前記無意味なペプチドまたはその断片が２１アミノ酸の長さであり、ｎ＝１〜２０である、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００２８］
２７．  前記無意味なペプチドまたはその断片が、同じまたは異なり得る、実施形態２６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００２９］
２８．  前記組換えポリペプチドをコードする前記少なくとも１つの核酸配列が、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａのゲノムに組み込まれている、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００３０］
２９．  前記組換えポリペプチドをコードする前記少なくとも１つの核酸配列が、プラスミドに存在する、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００３１］
３０．  前記プラスミドが、抗生物質選択の非存在下で前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株において安定に維持されている、実施形態２９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００３２］
３１．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株である、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００３３］
３２．  前記弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａが１つまたは複数の内因性遺伝子において変異を含む、実施形態３１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００３４］
３３．  前記内因性遺伝子の変異が、ａｃｔＡ遺伝子変異、ｐｒｆＡ変異、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ二重変異、ｄａｌ／ｄａｌ遺伝子二重変異、もしくはｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ遺伝子三重変異、またはその組み合わせから選択される、実施形態３２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００３５］
３４．  前記変異が、前記遺伝子または複数の前記遺伝子の不活化、切断、欠失、置換、または破壊を含む、実施形態３２〜３３のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００３６］
３５．  前記組換えポリペプチドをコードする前記少なくとも１つの核酸配列が、前記変異が、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含むか、または前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が代謝酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む第２の核酸配列を含む、実施形態１〜３４のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００３７］
３６．  前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、実施形態３５に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００３８］
３７．  前記ＬｉｓｔｅｒｉａがＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである、実施形態１〜３６のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００３９］
３８．  前記無意味なペプチドが、前記疾患を有する生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、健康な生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦとの比較によって得られ、前記比較により、前記核酸配列内の１つまたは複数のフレームシフト変異が同定され、前記変異を含む前記核酸配列が、前記疾患を有する生物試料からの前記１つまたは複数のＯＲＦ内でコードされる１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドをコードする、実施形態１〜３７のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００４０］
３９．  前記疾患を有する生物試料が、前記疾患または状態を有する前記被験体から得られる、実施形態１〜３８のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００４１］
４０．  前記健康な生物試料が、前記疾患または状態を有する前記被験体から得られる、実施形態２および３８のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００４２］
４１．  前記生物試料が、組織、細胞、血液試料、または血清試料を含む、実施形態１〜４０のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００４３］
４２．  前記無意味なペプチドが
［００４４］
（ｉ）前記無意味なペプチドから１つまたは複数の異なるペプチド配列を生成すること、および任意選択で
［００４５］
（ｉｉ）（ｉ）で生成されたそれぞれの前記ペプチドをスクリーニングして、Ｔ細胞受容体が結合するＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩによる結合に関して選択すること、
によってネオエピトープに関して特徴付けられる、実施形態１〜４１のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００４６］
４３．  免疫原性ポリペプチドに融合した１つまたは複数のペプチドを含む１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含み、前記１つまたは複数のペプチドが１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む、実施形態１〜４２のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００４７］
４４．  前記１つまたは複数のペプチドまたはその断片が、Ｎ末端からＣ末端まで、複数の作動可能に連結されたペプチドまたはその断片を含み、前記免疫原性ポリペプチドが前記複数のペプチドまたはその断片のうちの１つに融合されている、実施形態４３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００４８］
４５．  前記免疫原性ポリペプチドが、変異したリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、切断型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列である、実施形態４３〜４４のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００４９］
４６．  前記１つまたは複数の組換えポリペプチドが、任意選択でリンカー配列を介して、Ｃ末端でタグに作動可能に連結されている、実施形態４３〜４５のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００５０］
４７．  前記リンカー配列が、４×グリシンリンカーをコードしている、実施形態４６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００５１］
４８．  前記タグが、６×ヒスチジンタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド、６×ヒスチジンに作動可能に連結された６×ヒスチジンタグ、およびその任意の組み合わせを含む群より選択される、実施形態４６〜４７のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００５２］
４９．  前記組換えポリペプチドをコードする前記核酸配列が、前記タグをコードする配列の後に２つの終止コドンを含む、実施形態４６〜４８のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００５３］
５０．  前記組換えポリペプチドをコードする前記核酸配列が、ｐＨｌｙ−ｔＬＬＯ−［ペプチドまたはその断片−グリシンリンカー（４×）−ペプチドまたはその断片−グリシンリンカー（４×）］ｎ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓタグ−２×終止コドンを含む成分をコードし、前記ペプチドまたはその断片が約２１アミノ酸の長さであり、ｎ＝１〜２０である、実施形態４３〜４９のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００５４］
５１．  前記ペプチドまたは断片が異なるアミノ酸配列を含む、実施形態５０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
［００５５］
５２．  実施形態１〜５１のいずれか１つに記載のＬｉｓｔｅｒｉａ株のいずれか１つの少なくとも１つを含む免疫原性組成物。
［００５６］
５３．  追加のアジュバントをさらに含む、実施形態５２に記載の免疫原性組成物。
［００５７］
５４．  前記追加のアジュバントが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態５３に記載の免疫原性組成物。
［００５８］
５５．  実施形態５２〜５４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を被験体に投与することを含む、疾患または状態を有する被験体において個別化された標的化免疫応答を誘発する方法であって、前記個別化された免疫応答が、前記被験体の疾患または状態を有する生物試料中に存在する１つまたは複数のネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片に標的化される、方法。
［００５９］
５６．  実施形態５２〜５４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を被験体に投与することを含む、被験体における疾患または状態を処置、抑制、防止、または阻害する方法。
［００６０］
５７．  実施形態５２〜５４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む、被験体の脾臓および腫瘍におけるＴエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比率を増加させる方法であって、前記Ｔエフェクター細胞が、被験体の疾患または状態を有する生物試料中に存在する１つまたは複数のネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドに標的化される、方法。
［００６１］
５８．  実施形態５２〜５４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む、被験体におけるネオエピトープ特異的Ｔ細胞を増加させるための方法。
［００６２］
５９．  実施形態５２〜５４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む、腫瘍を有する、またはがんに罹っている、または感染疾患に罹っている被験体の生存期間を増大させるための方法。
［００６３］
６０．  実施形態５２〜５４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む、被験体における腫瘍または転移のサイズを低減させる方法。
［００６４］
６１．  ブースター処置を投与することをさらに含む、実施形態５２〜５４のいずれか１つに記載の方法。
［００６５］
６２．  前記投与が、前記被験体における個別化されて増強された抗感染疾患免疫応答を誘発する、実施形態５２〜５４のいずれか１つに記載の方法。
［００６６］
６３．  個別化された抗がんまたは抗腫瘍免疫応答を誘発する、実施形態５２〜５４のいずれか１つに記載の方法。
［００６７］
６４．  それぞれの核酸配列が、免疫原性ポリペプチドに融合した１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片を含む１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列を含む免疫療法送達ベクターであって、前記１つまたは複数の無意味なペプチドが少なくとも１つのフレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされ、前記１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片のそれぞれが、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含み、かつ前記供給源は、被験体の疾患または状態を有する生物試料から得られる、免疫療法送達ベクター。
［００６８］
６５．  前記フレームシフト変異が、健康な生物試料の供給源核酸配列と比較される、実施形態６４に記載の組換え免疫療法送達ベクター。
［００６９］
６６．  前記少なくとも１つのフレームシフト変異が、複数のフレームシフト変異を含み、前記複数のフレームシフト変異が前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株において同じ遺伝子内に存在する、実施形態６４〜６５のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００７０］
６７．  前記少なくとも１つのフレームシフト変異が複数のフレームシフト変異を含み、前記複数のフレームシフト変異が前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株において同じ遺伝子内に存在しない、実施形態６４〜６５のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００７１］
６８．  前記少なくとも１つのフレームシフト変異が、遺伝子のエクソンコード領域内に存在する、実施形態６４〜６７のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００７２］
６９．  前記エクソンが前記遺伝子の最後のエクソンである、実施形態６８に記載の免疫療法送達ベクター。
［００７３］
７０．  前記１つまたは複数の無意味なペプチドのそれぞれが、約６０〜１００アミノ酸の長さである、実施形態６４〜６９のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００７４］
７１．  前記１つまたは複数の無意味なペプチドが、前記疾患または状態を有する生物試料において発現される、実施形態６４〜７０のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００７５］
７２．  前記１つまたは複数の無意味なペプチドが、翻訳後切断部位をコードしない、実施形態６４〜７１のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００７６］
７３．  前記供給源核酸配列が、１つまたは複数のマイクロサテライト不安定性領域を含む、実施形態６４〜７２のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００７７］
７４．  前記１つまたは複数のネオエピトープが、Ｔ細胞エピトープを含む、実施形態６４〜７３のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００７８］
７５．  前記１つまたは複数のネオエピトープが、前記疾患または状態に関連する自己抗原を含み、前記自己抗原が、がんもしくは腫瘍関連ネオエピトープ、またはがん特異的もしくは腫瘍特異的ネオエピトープを含む、実施形態６４〜７４のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００７９］
７６．  前記腫瘍またはがんが、乳がんもしくは乳房腫瘍、子宮頸がんもしくは子宮頸部腫瘍、Ｈｅｒ２発現がんもしくは腫瘍、黒色腫、膵臓がんもしくは腫瘍、卵巣がんもしくは腫瘍、胃がんもしくは腫瘍、膵臓の癌性病変、肺腺癌、多形神経膠芽腫、結腸直腸腺癌、肺扁平上皮腺癌、胃腺癌、卵巣表層上皮腫瘍（ｏｖａｒｉａｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｍ）、口腔扁平上皮癌、非小細胞肺癌、子宮内膜癌、膀胱がんもしくは腫瘍、頭頸部がんもしくは腫瘍、前立腺癌、腎臓がんもしくは腫瘍、骨がんもしくは腫瘍、血液のがん、または脳がんもしくは腫瘍、または前記がんもしくは腫瘍のいずれか１つの転移を含む、実施形態７５に記載の免疫療法送達ベクター。
［００８０］
７７．  前記１つまたは複数の無意味なペプチドが、感染疾患関連または疾患特異的ネオエピトープを含む１つまたは複数のネオエピトープを含む、実施形態６４〜７６のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００８１］
７８．  前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａが、前記１つまたは複数の組換えポリペプチドを発現および分泌する、実施形態６４〜７７のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００８２］
７９．  前記１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片がそれぞれ、免疫原性ポリペプチドに融合されている、実施形態６４〜７８のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００８３］
８０．  前記１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片が、Ｎ末端からＣ末端まで、複数の作動可能に連結された無意味なペプチドまたはその断片を含み、前記免疫原性ポリペプチドが、前記複数の無意味なペプチドまたはその断片の１つに融合されている、実施形態６４〜７９のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００８４］
８１．  前記免疫原性ポリペプチドが、Ｎ末端の無意味なペプチドに作動可能に連結されている、実施形態８０に記載の免疫療法送達ベクター。
［００８５］
８２．  前記連結がペプチド結合である、実施形態８１に記載の免疫療法送達ベクター。
［００８６］
８３．  前記免疫原性ポリペプチドが、変異したリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、切断型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列である、実施形態６４〜８２のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００８７］
８４．  前記１つまたは複数の組換えポリペプチドが、任意選択でリンカー配列を介して、Ｃ末端でタグに作動可能に連結されている、実施形態６４〜８３のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００８８］
８５．  前記リンカー配列が、４×グリシンリンカーをコードしている、実施形態８４に記載の免疫療法送達ベクター。
［００８９］
８６．  前記タグが、６×ヒスチジンタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド、６×ヒスチジンに作動可能に連結された６×ヒスチジンタグ、およびその任意の組み合わせを含む群より選択される、実施形態８４〜８５のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００９０］
８７．  前記組換えポリペプチドをコードする前記核酸配列が、前記タグをコードする配列後に２つの終止コドンを含む、実施形態８４〜８６のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００９１］
８８．  前記組換えポリペプチドをコードする前記核酸配列が、ｐＨｌｙ−ｔＬＬＯ−［無意味なペプチドまたはその断片−グリシンリンカー（４×）−無意味なペプチドまたはその断片−グリシンリンカー（４×）］ｎ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓタグ−２×終止コドンを含む成分をコードし、前記無意味なペプチドまたはその断片が２１アミノ酸の長さであり、ｎ＝１〜２０である、実施形態６４〜８７のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００９２］
８９．  前記無意味なペプチドが、前記疾患を有する生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、健康な生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦとの比較によって得られ、前記比較により、前記核酸配列内の１つまたは複数のフレームシフト変異が同定され、前記変異を含む前記核酸配列が、前記疾患を有する生物試料からの前記１つまたは複数のＯＲＦ内でコードされる１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドをコードする、実施形態６４〜８８のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００９３］
９０．  前記疾患を有する生物試料が、前記疾患または状態を有する前記被験体から得られる、実施形態６４〜８９のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００９４］
９１．  前記健康な生物試料が、前記疾患または状態を有する前記被験体から得られる、実施形態６５および８９のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００９５］
９２．  前記生物試料が、組織、細胞、血液試料、または血清試料を含む、実施形態６４〜９１のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００９６］
９３．  前記無意味なペプチドが
［００９７］
（ｉ）前記無意味なペプチドから１つまたは複数の異なるペプチド配列を生成すること、および任意選択で
［００９８］
（ｉｉ）（ｉ）で生成されたそれぞれの前記ペプチドをスクリーニングして、Ｔ細胞受容体が結合するＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩによる結合に関して選択すること、
によってネオエピトープに関して特徴付けられる、実施形態６４〜９２のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００９９］
９４．  免疫原性ポリペプチドに融合した１つまたは複数のペプチドを含む１つまたは複数の組換えポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含み、前記１つまたは複数のペプチドが１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む、実施形態６４〜９３のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１００］
９５．  前記１つまたは複数のペプチドまたはその断片が、Ｎ末端からＣ末端まで、複数の作動可能に連結されたペプチドまたはその断片を含み、前記免疫原性ポリペプチドが前記複数のペプチドまたはその断片のうちの１つに融合されている、実施形態９４に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１０１］
９６．  前記免疫原性ポリペプチドが、変異したリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、切断型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列である、実施形態９４〜９５のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１０２］
９７．  前記１つまたは複数の組換えポリペプチドが、任意選択でリンカー配列を介して、Ｃ末端でタグに作動可能に連結されている、実施形態９４〜９６のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１０３］
９８．  前記リンカー配列が、４×グリシンリンカーをコードしている、実施形態９７に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１０４］
９９．  前記タグが、６×ヒスチジンタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド、６×ヒスチジンに作動可能に連結された６×ヒスチジンタグ、およびその任意の組み合わせを含む群より選択される、実施形態９７〜９８のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１０５］
１００．  前記組換えポリペプチドをコードする前記核酸配列が、前記タグをコードする配列の後に２つの終止コドンを含む、実施形態９７〜９９のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１０６］
１０１．  前記組換えポリペプチドをコードする前記核酸配列が、ｐＨｌｙ−ｔＬＬＯ−［ペプチドまたはその断片−グリシンリンカー（４×）−ペプチドまたはその断片−グリシンリンカー（４×）］ｎ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓタグ−２×終止コドンを含む成分をコードし、前記ペプチドまたはその断片が約２１アミノ酸の長さであり、ｎ＝１〜２０である、実施形態９４〜１００のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１０７］
１０２．  前記ペプチドまたは断片が異なるアミノ酸配列を含む、実施形態１０１に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１０８］
１０３．  実施形態６４〜１０２のいずれか１つに記載のＬｉｓｔｅｒｉａ株のいずれか１つの少なくとも１つを含む免疫原性組成物。
［００１０９］
１０４．  追加のアジュバントをさらに含む、実施形態１０３に記載の免疫原性組成物。
［００１１０］
１０５．  前記追加のアジュバントが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態１０４に記載の免疫原性組成物。
［００１１１］
１０６．  実施形態１０３〜１０５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を被験体に投与することを含む、疾患または状態を有する被験体において個別化された標的化免疫応答を誘発する方法であって、前記個別化された免疫応答が、前記被験体の疾患または状態を有する生物試料中に存在する１つまたは複数のネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドまたはその断片に標的化される、方法。
［００１１２］
１０７．  実施形態１０３〜１０５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を被験体に投与することを含む、被験体における疾患または状態を処置、抑制、防止、または阻害する方法。
［００１１３］
１０８．  実施形態１０３〜１０５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む、被験体の脾臓および腫瘍におけるＴエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比率を増加させる方法であって、前記Ｔエフェクター細胞が、被験体の疾患または状態を有する生物試料中に存在する１つまたは複数のネオエピトープを含む１つまたは複数の無意味なペプチドに標的化される、方法。
［００１１４］
１０９．  実施形態１０３〜１０５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む、被験体におけるネオエピトープ特異的Ｔ細胞を増加させるための方法。
［００１１５］
１１０．  実施形態１０３〜１０５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む、腫瘍を有する、またはがんに罹っている、または感染疾患に罹っている被験体の生存期間を増大させるための方法。
［００１１６］
１１１．  実施形態１０３〜１０５のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を被験体に投与するステップを含む、被験体における腫瘍または転移のサイズを低減させる方法。
［００１１７］
１１２．  ブースター処置を投与することをさらに含む、実施形態１０６〜１１１のいずれか１つに記載の方法。
［００１１８］
１１３．  前記投与が、前記被験体における個別化されて増強された抗感染疾患免疫応答を誘発する、実施形態１０６〜１１１のいずれか１つに記載の方法。
［００１１９］
１１４．  個別化された抗がんまたは抗腫瘍免疫応答を誘発する、実施形態１０６〜１１１のいずれか１つに記載の方法。
［００１２０］
本明細書に開示の主題は、以下の実施形態も含むがこれらに限定されない。
［００１２１］
１．  １つまたは複数の異種ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含む組換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を含む免疫療法送達ベクターであって、前記１つまたは複数の異種ペプチドが、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドを含む、免疫療法送達ベクター。
［００１２２］
２．  前記１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドが、少なくとも１つの疾患特異的または状態特異的フレームシフト変異を含む供給源核酸配列によってコードされている、実施形態１に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１２３］
３．  前記供給源核酸配列が、１つまたは複数のマイクロサテライト不安定性領域を含む、実施形態２に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１２４］
４．  前記少なくとも１つのフレームシフト変異が、遺伝子の最後から２番目のエクソンまたは最後のエクソン内に存在する、前記実施形態のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１２５］
５．  前記１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドのそれぞれが、約８〜１０、１１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、または８〜５００アミノ酸の長さである、前記実施形態のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１２６］
６．  前記１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドが翻訳後切断部位をコードしない、前記実施形態のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１２７］
７．  前記１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープがＴ細胞エピトープを含む、前記実施形態のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１２８］
８．  前記１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドが、がん関連もしくは腫瘍関連ネオエピトープ、またはがん特異的もしくは腫瘍特異的ネオエピトープを含む、前記実施形態のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１２９］
９．  前記腫瘍またはがんが、乳がんもしくは乳房腫瘍、子宮頸がんもしくは子宮頸部腫瘍、Ｈｅｒ２発現がんもしくは腫瘍、黒色腫、膵臓がんもしくは腫瘍、卵巣がんもしくは腫瘍、胃がんもしくは腫瘍、膵臓の癌性病変、肺腺癌、多形神経膠芽腫、結腸直腸腺癌、肺扁平上皮腺癌、胃腺癌、卵巣表層上皮腫瘍（ｏｖａｒｉａｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｍ）、口腔扁平上皮癌、非小細胞肺癌、子宮内膜癌、膀胱がんもしくは腫瘍、頭頸部がんもしくは腫瘍、前立腺癌、腎臓がんもしくは腫瘍、骨がんもしくは腫瘍、血液のがん、または脳がんもしくは腫瘍、または前記がんもしくは腫瘍のいずれか１つの転移を含む、実施形態８に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１３０］
１０．  前記１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドが、感染疾患関連または感染疾患特異的ネオエピトープを含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１３１］
１１．  前記組換えポリペプチドが約１〜２０のネオエピトープを含む、前記実施形態のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１３２］
１２．  前記１つまたは複数の異種ペプチドが、作動可能にタンデムに連結された複数の異種ペプチドを含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが前記複数の異種ペプチドのうちの１つに融合されている、前記実施形態のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１３３］
１３．  前記組換えポリペプチドが複数のフレームシフト変異由来ペプチドを含み、それぞれのフレームシフト変異由来ペプチドが異なる、実施形態１２に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１３４］
１４．  前記複数の異種ペプチドが介在配列なしで互いに直接融合されている、実施形態１２または１３に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１３５］
１５．  前記複数の異種ペプチドが、１つもしくは複数のペプチドリンカーまたは１つもしくは複数の４×グリシンリンカーを介して互いに作動可能に連結されている、実施形態１２または１３に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１３６］
１６．  前記ＰＥＳＴ含有ペプチドがＮ末端の異種ペプチドに作動可能に連結されている、実施形態１２〜１５のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１３７］
１７．  前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、変異したリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、切断型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、切断型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列である、前記実施形態のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１３８］
１８．  前記組換えポリペプチドのＣ末端がタグに作動可能に連結されている、前記実施形態のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１３９］
１９．  前記組換えポリペプチドのＣ末端が、ペプチドリンカーまたは４×グリシンリンカーによってタグに作動可能に連結されている、実施形態１８に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１４０］
２０．  前記タグが、６×ヒスチジンタグ、２×ＦＬＡＧタグ、３×ＦＬＡＧタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに作動可能に連結された６×ヒスチジンタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに作動可能に連結された３×ＦＬＡＧタグ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに作動可能に連結された２×ＦＬＡＧタグ、およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、実施形態１８または１９に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１４１］
２１．  前記組換えポリペプチドをコードする前記オープンリーディングフレームが、前記タグをコードする配列の後に２つの終止コドンを含む、実施形態１８〜２０のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１４２］
２２．  前記組換えポリペプチドをコードする前記オープンリーディングフレームが、ｈｌｙプロモーターに作動可能に連結され、Ｎ末端からＣ末端まで、ｔＬＬＯ−［異種ペプチド］ｎ−（ペプチドタグ（複数可））−（２×終止コドン）を含む成分をコードし、ｎ＝２〜２０であり、少なくとも１つの異種ペプチドがフレームシフト変異由来ペプチドであるか、または
［００１４３］
前記組換えポリペプチドをコードする前記オープンリーディングフレームが、ｈｌｙプロモーターに作動可能に連結され、Ｎ末端からＣ末端まで、ｔＬＬＯ−［（異種ペプチド）−（グリシンリンカー（４×））］ｎ−（ペプチドタグ（複数可））−（２×終止コドン）を含む成分をコードし、ｎ＝２〜２０であり、少なくとも１つの異種ペプチドがフレームシフト変異由来ペプチドである、前記実施形態のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１４４］
２３．  前記１つまたは複数の異種ペプチドが１つまたは複数の非同義ミスセンス変異由来ペプチドをさらに含む、前記実施形態のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１４５］
２４．  前記１つまたは複数の非同義ミスセンス変異由来ペプチドが、少なくとも１つの疾患特異的または状態特異的非同義ミスセンス変異を含む供給源核酸配列によってコードされている、実施形態２３に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１４６］
２５．  前記１つまたは複数の非同義ミスセンス変異由来ペプチドのそれぞれが、約５〜５０アミノ酸の長さ、または約８〜２７アミノ酸の長さである、実施形態２３または２４に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１４７］
２６．  組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株である、前記実施形態のいずれかに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１４８］
２７．  前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が前記組換えポリペプチドを発現および分泌する、実施形態２６に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１４９］
２８．  前記組換えポリペプチドをコードする前記オープンリーディングフレームが、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａのゲノムに組み込まれている、実施形態２６または２７に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１５０］
２９．  前記組換えポリペプチドをコードする前記オープンリーディングフレームが、プラスミドに存在する、実施形態２６または２７に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１５１］
３０．  前記プラスミドが、抗生物質選択の非存在下で前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株において安定に維持されている、実施形態２９に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１５２］
３１．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株である、実施形態２６〜３０のいずれか一項に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１５３］
３２．  前記弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａが１つまたは複数の内因性遺伝子において変異を含む、実施形態３１に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１５４］
３３．  前記内因性遺伝子の変異が、ａｃｔＡ遺伝子変異、ｐｒｆＡ変異、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ二重変異、ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子二重変異、ｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ遺伝子三重変異、またはその組み合わせから選択され、前記変異が前記遺伝子または複数の遺伝子の不活化、切断、欠失、置換、または破壊を含む、実施形態３２に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１５５］
３４．  前記組換えポリペプチドをコードする前記オープンリーディングフレームを含む前記核酸が、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含むか、または前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が代謝酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む第２の核酸をさらに含む、実施形態２６〜３３のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１５６］
３５．  前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、実施形態３４に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１５７］
３６．  前記ＬｉｓｔｅｒｉａがＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである、実施形態２６〜３５のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクター。
［００１５８］
３７．  前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌ、およびｄａｔの欠失またはそれらにおける不活化変異を含み、前記組換えポリペプチドをコードする前記オープンリーディングフレームを含む前記核酸がエピソームプラスミドに存在し、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、ならびに前記ＰＥＳＴ含有ペプチドがＬＬＯのＮ末端断片である、実施形態３６に記載の免疫療法送達ベクター。
［００１５９］
３８．  実施形態１〜３７のいずれか１つに記載の少なくとも１つの免疫療法送達ベクターを含む免疫原性組成物。
［００１６０］
３９．  アジュバントをさらに含む、実施形態３８に記載の免疫原性組成物。
［００１６１］
４０．  前記アジュバントが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、またはＬＬＯの解毒化非溶血性形態（ｄｔＬＬＯ）を含む、実施形態４９に記載の免疫原性組成物。
［００１６２］
４１．  実施形態３８〜４０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を被験体に投与することを含む、被験体における疾患または状態を処置、抑制、防止、または阻害する方法であって、１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドが、前記被験体の疾患を有するまたは状態を有する生物試料からの供給源核酸配列によってコードされている、方法。
［００１６３］
４２．  前記被験体において個別化された抗疾患または抗状態免疫応答を誘発し、前記個別化された免疫応答が前記１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドに標的化される、実施形態４２に記載の方法。
［００１６４］
４３．  前記疾患または状態ががんまたは腫瘍である、実施形態４１または４２に記載の方法。
［００１６５］
４４．  ブースター処置を投与することをさらに含む、実施形態４１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
［００１６６］
４５．  疾患または状態を有する被験体のために個別化された、実施形態１〜３７のいずれか１つに記載の免疫療法送達ベクターを作製するためのプロセスであって：
［００１６７］
（ａ）前記被験体の疾患を有するまたは状態を有する生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、健康な生物試料から抽出した核酸配列における１つまたは複数のＯＲＦと比較するステップであって、前記比較によって、前記疾患を有するまたは状態を有する生物試料からの前記１つまたは複数のＯＲＦ内でコードされる１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列が同定され、前記１つまたは複数の核酸配列のうちの少なくとも１つが、１つまたは複数のフレームシフト変異を含み、１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドをコードする、ステップと、
［００１６８］
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された前記１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープを含む前記１つまたは複数のペプチドを含む組換えポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を含む免疫療法送達ベクターを生成するステップと
を含む、プロセス。
［００１６９］
４６．  前記被験体に投与するための前記免疫療法送達ベクターを、既定の期間内、保存するステップをさらに含む、実施形態４５に記載のプロセス。
［００１７０］
４７．  前記被験体に前記免疫療法ベクターを含む組成物を投与するステップをさらに含み、前記投与によって、前記疾患または状態に対する個別化されたＴ細胞免疫応答が生成される、実施形態４５または４６に記載のプロセス。
［００１７１］
４８．  前記疾患を有するまたは状態を有する生物試料が、前記疾患または状態を有する前記被験体から得られる、実施形態４５〜４７のいずれか１つに記載のプロセス。
［００１７２］
４９．  前記健康な生物試料が、前記疾患または状態を有する前記被験体から得られる、実施形態４５〜４８のいずれか１つに記載のプロセス。
［００１７３］
５０．  前記疾患を有するまたは状態を有する生物試料および前記健康な生物試料がそれぞれ、組織、細胞、血液試料、または血清試料を含む、実施形態４５〜４９のいずれか１つに記載のプロセス。
［００１７４］
５１．  ステップ（ａ）における前記比較が、前記疾患を有するまたは状態を有する生物試料から抽出した前記核酸配列における前記１つまたは複数のＯＲＦを、前記健康な生物試料から抽出した前記核酸配列における前記１つまたは複数のＯＲＦと比較するために、スクリーニングアッセイ、またはスクリーニングツール、および関連するデジタルソフトウェアを使用することを含み、
［００１７５］
前記関連するデジタルソフトウェアが、前記ネオエピトープの免疫原性可能性を同定するために前記疾患を有するまたは状態を有する生物試料から抽出した前記核酸配列における前記ＯＲＦ内の変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む、実施形態４５〜５０のいずれか１つに記載のプロセス。
［００１７６］
５２．  前記疾患を有するまたは状態を有する生物試料から抽出した前記核酸配列、および前記健康な生物試料から抽出した前記核酸配列が、エクソームシーケンシングまたはトランスクリプトームシーケンシングを使用して決定される、実施形態４５〜５１のいずれか１つに記載のプロセス。
［００１７７］
５３．  前記１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドが、前記１つまたは複数のフレームシフト変異由来ペプチドから１つまたは複数の異なるペプチド配列を生成することによって、ネオエピトープに関して特徴付けられる、実施形態４５〜５２のいずれか１つに記載のプロセス。
［００１７８］
５４．  前記１つまたは複数の異なるペプチド配列のそれぞれをスコア付けするステップ、およびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける分泌性を予測するヒドロパシー閾値より下のスコアを有しなければペプチド配列を除外するステップをさらに含む、実施形態５３に記載のプロセス。
［００１７９］
５５．  前記スコア付けが、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのヒドロパシー指標の２１アミノ酸ウィンドウによるものであり、約１．６のカットオフを超えるスコアを有するあらゆるペプチド配列は、除外されるかまたは前記カットオフ未満のスコアを有するように改変される、実施形態５４に記載のプロセス。
［００１８０］
５６．  前記１つまたは複数の異なるペプチド配列のそれぞれをスクリーニングするステップ、およびＴ細胞受容体が結合するＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩによる結合に関して選択するステップをさらに含む、実施形態５３〜５５のいずれか１つに記載のプロセス。
［００１８１］
５７．  それぞれ１つまたは複数の免疫原性ネオエピトープの異なる組を含む複数の免疫療法送達ベクターを作製するために繰り返される、実施形態４５〜５６のいずれか１つに記載のプロセス。
［００１８２］
５８．  前記複数の免疫療法送達ベクターが、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、または４０〜５０の免疫療法送達ベクターを含む、実施形態５７に記載のプロセス。
［００１８３］
５９．  前記複数の免疫療法送達ベクターの組み合わせが、約５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、または１００〜２００の免疫原性ネオエピトープを含む、実施形態５７または５８に記載のプロセス。
【０６００】
６０．  前記疾患または状態が、前記健康な生物試料に存在しない１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０未満の非同義ミスセンス変異を有する腫瘍である、実施形態４５〜５９のいずれか１つに記載のプロセス。
【０６０１】
ある特定の特徴を本明細書において例証し説明してきたが、多くの改変、置換、変更および同等物が当業者に想起されると予想される。したがって、添付の特許請求の範囲はそのような改変および変化の全てを含むと意図されると理解すべきである。
【０６０２】
以下の実施例において、本明細書における開示の十分な理解を提供するために、多数の特定の詳細を記載する。他の例において、周知の方法、手順、および成分は、本開示を曖昧にしないために詳細には記載していない。
【実施例】
【０６０３】
（実施例１：弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株−ＬｍｄｄΔａｃｔＡの構築ならびにＬｍｄｄおよびＬｍｄｄａ株におけるｈｌｙ遺伝子に対してインフレームでのヒトｋｌｋ３遺伝子の挿入）
材料および方法
前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍の退縮と関連がある強力なＰＳＡ特異的免疫応答を誘発する、ｔＬＬＯに融合したＰＳＡ（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）を分泌する組換えＬｍを開発し、ｔＬＬＯ−ＰＳＡの発現は、ベクターに抗生物質耐性を付与するｐＧＧ５５をベースにしたプラスミド（表１）から得られる。近年、抗生物質耐性マーカーを有さず、ＬｍｄｄＡ−１４２と称する、ｐＡＤＶ１４２プラスミド（表１）をベースにしたＰＳＡワクチンの新たな株を開発した。この新たな株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡよりも１０倍弱毒化されている。さらに、ＬｍｄｄＡ−１４２は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡよりも免疫原性がわずかに高く、ＰＳＡを発現する腫瘍の退縮に著しく効果的である。
【０６０４】
【表１】
2019503186.tif 000003
【０６０５】
プラスミドｐＡｄｖ１４２（６５２３ｂｐ）の配列を配列番号２３に示した。このプラスミドは、２−２０−０８にＧｅｎｅｗｉｚ施設でＥ．ｃｏｌｉ株からシーケンシングされた。
【０６０６】
Ｌｍｄａｌｄａｔ（Ｌｍｄｄ）株は、ビルレンス因子、ＡｃｔＡの不可逆的欠失によって弱毒化した。Ｌｍｄａｌｄａｔ（Ｌｍｄｄ）バックグラウンドにおけるａｃｔＡのインフレーム欠失は、下流遺伝子の発現に対するいかなる極性効果も回避するために構築した。ＬｍｄａｌｄａｔΔａｃｔＡは、Ｎ末端に最初の１９アミノ酸およびＣ末端に２８アミノ酸残基を含有し、ＡｃｔＡの５９１のアミノ酸を欠失している。
【０６０７】
ａｃｔＡ欠失変異体は、ａｃｔＡの上流（６５７ｂｐ−オリゴＡｄｖ２７１／２７２）および下流（６２５ｂｐ−オリゴＡｄｖ２７３／２７４）部分に対応する染色体領域の増幅およびＰＣＲによる結合によって産生した。この増幅のために使用したプライマーの配列を表２に挙げる。ａｃｔＡの上流および下流ＤＮＡ領域をｐＮＥＢ１９３中のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ制限部位にクローニングし、このプラスミドからＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩをさらに温度感受性プラスミドｐＫＳＶ７にクローニングし、ΔａｃｔＡ／ｐＫＳＶ７（ｐＡｄｖ１２０）を得た。
【０６０８】
【表２】
2019503186.tif 000004
【０６０９】
遺伝子のその染色体位置からの欠失は、図１Ａおよび図１Ｂにおいてプライマー３（Ａｄｖ  ３０５−ｔｇｇｇａｔｇｇｃｃａａｇａａａｔｔｃ、配列番号２８）およびプライマー４（Ａｄｖ３０４−ｃｔａｃｃａｔｇｔｃｔｔｃｃｇｔｔｇｃｔｔｇ、配列番号２９）として示した、ａｃｔＡ欠失領域の外側に結合するプライマーを使用して確認した。ＰＣＲ分析は、ＬｍｄｄおよびＬｍｄｄΔａｃｔＡから単離した染色体ＤＮＡで実施した。Ｌｍｄｄ染色体ＤＮＡにおいてプライマー対１／２および３／４の２つの異なる組での増幅後のＤＮＡ断片のサイズは、３．０ｋｂおよび３．４ｋｂであることが予測される。他方で、ＬｍｄｄΔａｃｔＡについてプライマー対１／２および３／４を使用したＰＣＲの予測サイズは、１．２ｋｂおよび１．６ｋｂであった。したがって、図１Ａおよび図１ＢにおけるＰＣＲ分析によって、ＬｍｄｄΔａｃｔＡ株ではａｃｔＡの１．８ｋｂ領域が欠失していることが確認された。ＬｍｄｄΔａｃｔＡ株におけるａｃｔＡ含有領域の欠失を確認するために、ＰＣＲ生成物に対するＤＮＡシーケンシングも実施した。
【０６１０】
（実施例２：Ｌｍベクターによる抗原送達のための抗生物質非依存性エピソーム性発現系の構築）
Ｌｍベクター（ｐＡｄｖ１４２）による抗原送達のための抗生物質非依存性エピソーム性発現系は、次世代の抗生物質不使用のプラスミドｐＴＶ３（Ｖｅｒｃｈら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、２００４年７２巻（１１号）：６４１８〜２５頁、参照として本明細書に組み込まれる）である。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株Ｌｍｄｄは染色体中に１コピーのｐｒｆＡ遺伝子を含有するので、ビルレンス遺伝子転写活性化因子の遺伝子ｐｒｆＡをｐＴＶ３から欠失した。さらに、ＮｈｅＩ／ＰａｃＩ制限部位におけるｐ６０−Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｄａｌのためのカセットは、ｐ６０−Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｄａｌに置換して、プラスミドｐＡｄｖ１３４（図２Ａ）をもたらした。ＬｉｓｔｅｒｉａおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｄａｌ遺伝子の類似性は約３０％で、プラスミドとＬｍｄｄ染色体におけるｄａｌ遺伝子の残存断片との間の組換えの可能性は実質的に排除される。プラスミドｐＡｄｖ１３４は、抗原発現カセットｔＬＬＯ−Ｅ７を含有した。ＬｍｄｄＡ株をｐＡＤＶ１３４プラスミドで形質転換し、選択したクローンからのＬＬＯ−Ｅ７タンパク質の発現をウェスタンブロットによって確認した（図２Ｂ）。１０４０３Ｓ野生株から得られたＬｍｄｄ系は、Ｌｍｄｄストレプトマイシン耐性以外の抗生物質耐性マーカーを欠如している。
【０６１１】
さらに、ｐＡｄｖ１３４はヒトＰＳＡ、ｋｌｋ３をクローニングするためにＸｈｏＩ／ＸｍａＩで制限し、プラスミドｐＡｄｖ１４２をもたらした。新たなプラスミド、ｐＡｄｖ１４２（図２Ｃ、表１）は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｐ６０プロモーターの制御下にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｄａｌ（Ｂ−Ｄａｌ）を含有する。シャトルプラスミドｐＡｄｖ１４２は、外因性Ｄ−アラニンの非存在下でのＥ．ｃｏｌｉ  ａｌａ  ｄｒｘ  ＭＢ２１５９ならびにＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株Ｌｍｄｄの生育を補完した。プラスミドｐＡｄｖ１４２中の抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモーターおよびＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質からなる（図２Ｃ）。
【０６１２】
プラスミドｐＡｄｖ１４２は、Ｌｉｓｔｅｒｉａバックグラウンド株ＬｍｄｄａｃｔＡ株に形質転換し、Ｌｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡをもたらした。Ｌｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株によるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現および分泌は、抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体を使用したウェスタンブロットによって確認された（図２Ｄ）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて２回継代した後、Ｌｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株によってＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質は安定的に発現し分泌された。
【０６１３】
（実施例３：ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性）
プラスミドのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける安定性は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を選択圧の存在下または非存在下で８日間培養することによって調べた。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株の選択圧はＤ−アラニンである。したがって、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株をＢｒａｉｎ−Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）およびＢＨＩ＋Ｄ−アラニン１００μｇ／ｍｌ中で継代した。ＣＦＵは、選択培地（ＢＨＩ）および非選択培地（ＢＨＩ＋Ｄ−アラニン）に播種した後、毎日決定した。プラスミドの喪失は、非選択培地（ＢＨＩ＋Ｄ−アラニン）に播種した後に高いＣＦＵを引き起こすことが予測された。図３Ａに示したように、選択培地および非選択培地中で、ＣＦＵの数の間に差はなかった。このことは、実験が終了したとき、プラスミドｐＡｄｖ１４２が少なくとも５０世代にわたり安定であることを示唆している。
【０６１４】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるプラスミドの維持は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ  ５×１０７ＣＦＵを静脈内注射することによって決定した。生存する細菌は、ＰＢＳ中でホモゲナイズした脾臓から２４時間および４８時間で単離した。各試料のＣＦＵは、各時点でＢＨＩプレートおよびＢＨＩ＋Ｄ−アラニン１００ｍｇ／ｍｌで決定した。選択培地および非選択培地に脾細胞を播種した後、２４時間後にコロニーを回収した。この株は高度に弱毒化されているので、細菌負荷はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて２４時間で除去された。選択プレートおよび非選択プレートでＣＦＵの顕著な差は検出されず、単離された細菌全てにおいて組換えプラスミドの安定した存在が示された（図３Ｂ）。
【０６１５】
（実施例４：ＬｍｄｄＡ−１４２（ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）株のｉｎ  ｖｉｖｏにおける継代、ビルレンスおよびクリアランス）
ＬｍｄｄＡ−１４２は、エピソームによって発現したｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質を分泌する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株である。安全な用量を決定するために、マウスを様々な用量のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化し、毒性効果を決定した。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡが引き起こす毒性効果は最低限であった（データは示さず）。この結果は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ  １０８ＣＦＵの用量はマウスによって十分に耐えられることを示唆した。ビルレンスの研究によって、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株は高度に弱毒化されていることが示される。
【０６１６】
ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡをＣ５７ＢＬ／６マウスに安全な用量、１０８ＣＦＵで腹腔内投与した後のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるクリアランスを決定した。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化して２日後のマウスの肝臓および脾臓では、検出可能なコロニーは認められなかった。この株は高度に弱毒化されているので、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて４８時間で完全に除去された（図４Ａ）。
【０６１７】
ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの弱毒化が、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株がマクロファージに感染し、細胞内で生育する能力を減衰させるかどうかを決定するために、細胞感染アッセイを実施した。Ｊ７７４Ａ．１などのマウスマクロファージ様細胞株をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＬｉｓｔｅｒｉａ構築物で感染させ、細胞内生育を定量した。陽性対照株、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ株１０４０３Ｓは細胞内で生育し、陰性対照ＸＦＬ７、ｐｒｆＡ変異体は、ファゴリソソームから逃げることができず、したがってＪ７７４細胞中では生育しない。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの細胞質内生育は、この株が細胞から細胞に広がる能力を喪失しているため、１０４０３Ｓよりも遅い（図４Ｂ）。この結果は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡがマクロファージに感染し、細胞質内で生育する能力を有することを示す。
【０６１８】
（実施例５：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株の免疫原性）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて構築物ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡによって誘発されたＰＳＡ特異的免疫応答は、ＰＳＡ４量体染色を使用して決定した。マウスは、１週間間隔でＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで２回免疫化し、ブースト後６日目に脾細胞をＰＳＡ４量体について染色した。脾細胞のＰＳＡ特異的４量体による染色によって、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡがＰＳＡ４量体＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞の２３％を誘発することが示された（図５Ａ）。ＰＳＡペプチドで５時間刺激した後ＰＳＡ特異的Ｔ細胞がＩＦＮ−γを分泌する機能的能力は、細胞内サイトカイン染色を使用して調べた。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ群ではナイーブマウスと比較して、ＰＳＡペプチドで刺激されたＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＩＦＮ−γ分泌細胞の百分率が２００倍増加しており（図５Ｂ）、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株は非常に免疫原性であり、脾臓においてＰＳＡに対して、高レベルの機能的活性のあるＰＳＡ  ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激することが示された。
【０６１９】
ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡでマウスを免疫化した後、ＰＳＡに対して生成した細胞傷害性Ｔ細胞の機能的活性を決定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ＰＳＡ特異的ＣＴＬがＨ−２Ｄｂペプチドでパルス処理した細胞、ＥＬ４細胞を溶解する能力を試験した。ＦＡＣＳベースのカスパーゼアッセイ（図５Ｃ）およびユーロピウム放出（図５Ｄ）を使用して細胞溶解を測定した。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスの脾細胞は、標的抗原としてＰＳＡペプチドを提示する細胞に対して高い細胞溶解活性を備えたＣＴＬを含有した。
【０６２０】
抗原で２４時間刺激した後、エフェクターＴ細胞がＩＦＮ−γを分泌する機能的能力を決定するためにエリスポットを実施した。エリスポットを使用すると、特異的ペプチドで刺激した、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウス由来の脾細胞におけるＩＦＮ−γのスポットの数は、ナイーブマウスの脾細胞と比較したとき２０倍増加したことが観察された（図５Ｅ）。
【０６２１】
（実施例６：ＬｍｄｄＡ−１４２株による免疫化は、ＰＳＡを発現する腫瘍の退縮およびＰＳＡ特異的ＣＴＬによる腫瘍の浸潤を誘導する）
構築物ＬｍｄｄＡ−１４２（ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）の治療有効性は、ＰＳＡを発現するように操作された前立腺腺癌細胞株（Ｔｒａｍｐ−Ｃ１−ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）；Ｓｈａｈａｂｉら、２００８年）を使用して決定した。マウスに２×１０６個のＴＰＳＡ細胞を皮下移植した。腫瘍接種後６日目に腫瘍が触知可能なサイズ４〜６ｍｍに達したとき、マウスに１週間間隔で１０８ＣＦＵのＬｍｄｄＡ−１４２、１０７ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（陽性対照）で３回免疫化するか、または未処置のままにした。ナイーブマウスでは徐々に腫瘍が発達した（図６Ａ）。ＬｍｄｄＡ−１４２で免疫化したマウスは全て３５日目まで腫瘍はなく、８匹のうち３匹のマウスが徐々に腫瘍を発達させたが、ナイーブマウスと比較してはるかにゆっくりした速度で生育した（図６Ｂ）。８匹のうち５匹のマウスは７０日間を通じて腫瘍はないままであった。予測通り、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡでワクチン接種したマウスはナイーブ対照よりも腫瘍が少なく、対照よりも腫瘍ははるかにゆっくり発達した（図６Ｃ）。したがって、構築物ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡはＴＰＳＡ細胞株によって確立された腫瘍の６０％を退縮させ、その他のマウスにおいては腫瘍の生育を遅くした。腫瘍がないまま治癒したマウスは６８日目にＴＰＳＡ腫瘍で再度チャレンジした。
【０６２２】
ＬｍｄｄＡ−１４２によるマウスの免疫化は、実験動物の６０％超においてＰＳＡを発現するように操作され７日で確立されたＴｒａｍｐ−Ｃ１腫瘍の生育を制御し、退縮を誘導することができたが（図６Ｂ）、それに比較して未処置群では一切できなかった（図６Ａ）。ＬｍｄｄＡ−１４２は、高度に弱毒化されたベクター（ＬｍｄｄＡ）およびプラスミドｐＡＤＶ１４２を使用して構築した（表１）。
【０６２３】
さらに、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ構築物によって生成したＰＳＡ特異的ＣＤ８リンパ球が腫瘍に浸潤する能力を調査した。マウスに腫瘍およびマトリゲルの混合物を皮下移植し、その後７日間隔でナイーブまたは対照（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）ＬｉｓｔｅｒｉａまたはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで２回免疫化した。腫瘍を２１日目に切除し、腫瘍中に浸潤するＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＰＳＡ４量体＋およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の集団を分析した。
【０６２４】
ナイーブおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７対照で免疫化したマウスの両方に存在するＰＳＡに特異的なＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＰＳＡ４量体＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の数が非常に少ないことが観察された。しかし、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスでは、ＰＳＡ特異的ＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＰＳＡ４量体＋ＴＩＬの百分率が１０〜３０倍増加していた（図７Ａ）。興味深いことに、脾臓におけるＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＰＳＡ４量体＋細胞の集団は、腫瘍におけるものの７．５分の１であった（図７Ａ）。
【０６２５】
さらに、未処置マウスおよびＬｉｓｔｅｒｉａで免疫化したマウスの腫瘍におけるＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／Ｆｏｘｐ３＋Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）の存在を決定した。興味深いことに、Ｌｉｓｔｅｒｉａによる免疫化によって、腫瘍におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ−ｒｅｇの数のかなりの減少が引き起こされたが、脾臓では減少しなかった（図７Ｂ）。しかし、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ構築物は、ナイーブおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７免疫化群と比較したとき、腫瘍中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ−ｒｅｇの頻度の減少に強い影響を及ぼした（図７Ｂ）。
【０６２６】
したがって、ＬｍｄｄＡ−１４２ワクチンは、腫瘍部位に浸潤することができるＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することができる（図７Ａ）。興味深いことに、ＬｍｄｄＡ−１４２による免疫化は、腫瘍中の制御性Ｔ細胞数の減少と関連があり（図７Ｂ）、おそらく、効率的な抗腫瘍ＣＴＬ活性のためにより好ましい環境を作り出すのだろう。
【０６２７】
（実施例７：Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３は、ＰＳＡ融合にもかかわらず機能的なＬＬＯを分泌する）
Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３は完全長ヒトｋｌｋ３遺伝子を含有し、これは、相同組換えによって染色体中のｈｌｙ遺伝子の下流にインフレームで挿入されたＰＳＡタンパク質をコードする。これらの構築物は、温度感受性レプリコンを有し、ｈｌｙ−ｋｌｋ３−ｍｐｌ組換えカセットを有するｐＫＳＶ７プラスミドを使用した相同組換えによって作製された（ＳｍｉｔｈおよびＹｏｕｎｇｍａｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．１９９２年；７４巻（７〜８号）７０５〜７１１頁）。第２の組換え事象後にプラスミドを切り出すので、組み込み選択のために使用した抗生物質耐性マーカーはなくなる。さらに、ａｃｔＡ遺伝子はＬｍｄｄＡ−１４３株では欠失されている（図８Ａ）。染色体中にｈｌｙにｋｌｋ３がインフレームで挿入されたことは、ＰＣＲ（図８Ｂ）および両構築物のシーケンシング（データは示さず）によって確認された。
【０６２８】
これらの染色体構築物の重要な一態様は、ＬＬＯ−ＰＳＡの産生が、ファゴソームからのＬｉｓｔｅｒｉａの回避、細胞質ゾル侵入およびＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって生成する効率的免疫に必要なＬＬＯの機能を完全には消失させないことである。Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３培養上清から分泌したタンパク質のウェスタンブロット分析によって、ＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質に対応する約８１ｋＤａバンドおよびＬＬＯの予測サイズである約６０ｋＤａバンドが明らかになり（図９Ａ）、ＬＬＯはＬＬＯ−ＰＳＡ融合から切断されるか、または染色体中の融合遺伝子にも関わらずＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって単一のタンパク質として依然として産生されることが明らかになった。Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３によって分泌されたＬＬＯは、野生型Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ１０４０３Ｓと比較して５０％の溶血活性を保持していた（図９Ｂ）。これらの結果と一致して、Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３はいずれもマクロファージ様Ｊ７７４細胞株中において細胞内で複製することができた（図９Ｃ）。
【０６２９】
（実施例８：Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３はいずれもＰＳＡ抗原に対して細胞媒介性免疫応答を誘発する）
Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３がいずれもＬＬＯに融合したＰＳＡを分泌することができることが示された後、これらの株がｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＰＳＡ特異的免疫応答を誘発することができるかどうかという問題を調査した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを未処置のままにするか、またはＬｍｄｄ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４３もしくはＬｍｄｄＡ−１４２で２回免疫化した。ＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＰＳＡ６５〜７４ペプチドで脾細胞を刺激し、ＩＦＮ−γについて細胞内染色することによって測定した。図１０に示したように、染色体およびプラスミドをベースにしたベクターによって誘導された免疫応答は類似している。
【０６３０】
材料および方法（実施例９〜１５）
オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって合成され、ＤＮＡシーケンシングはＧｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪによって実施された。フローサイトメトリー試薬は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。細胞培養培地、補充物質およびその他の試薬は全て、指示がない限りＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ、ＭＯ）から入手した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕＨＬＡ−Ａ２ペプチドはＥＺｂｉｏｌａｂｓ（Ｗｅｓｔｆｉｅｌｄ、ＩＮ）によって合成された。完全ＲＰＭＩ１６４０（Ｃ−ＲＰＭＩ）培地は、グルタミン２ｍＭ、非必須アミノ酸０．１ｍＭおよびピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｈｅｐｅｓ（２５ｍＭ）を含有した。ポリクローナル抗ＬＬＯ抗体は以前に記載されており、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体はＳｉｇｍａから購入した。
【０６３１】
マウスおよび細胞株
動物実験は全て、ＩＡＣＵＣによって承認されたプロトコールに従って、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａまたはＲｕｔｇｅｒｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおいて実施された。ＦＶＢ／ＮマウスはＪａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。ラットＨｅｒ２／ｎｅｕ腫瘍性タンパク質を過剰発現するＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの動物中央施設に収容して飼育した。ラットＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を高レベルで発現するＮＴ−２腫瘍細胞株はこれらのマウスにおいて自然発生乳房腫瘍から得られ、以前に記載したように生育させた。ＤＨＦＲ−Ｇ８（３Ｔ３／ｎｅｕ）細胞はＡＴＣＣから入手し、ＡＴＣＣの推奨に従って生育させた。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞株はＤｒ．Ｊｏｈｎ  Ｏｈｌｆｅｓｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＭＮ）から恵与され、完全Ｃ−ＲＰＭＩ培地で生育させた。生物発光実験は、Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＳＡＩＦ）の指針に基づいてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）において実施された。
【０６３２】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ構築物および抗原発現
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−ｐＧＥＭ７Ｚは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＤｒ．Ｍａｒｋ  Ｇｒｅｅｎｅから恵与され、ｐＧＥＭ７Ｚプラスミドにクローニングされたヒト完全長Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ｈＨｅｒ２）遺伝子を含有した（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）。このプラスミドは、ｈＨｅｒ−２／ｎｅｕの３つのセグメント、すなわち、ＥＣ１、ＥＣ２およびＩＣ１をｐｆｘＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および表３に示したオリゴを使用したＰＣＲによって増幅するための鋳型として使用した。
【０６３３】
【表３】
2019503186.tif 000005
【０６３４】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕキメラ構築物は、ＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法および鋳型としてのそれぞれ別々のｈＨｅｒ−２／ｎｅｕセグメントによる直接融合によって生成した。プライマーは表４に示す。
【０６３５】
【表４】
2019503186.tif 000006
【０６３６】
ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限酵素を使用してｐＡｄｖ１３８から切除し、Ｌｍｄｄシャトルベクター、ｐＡｄｖ１３４中のＬＬＯの切断型非溶血性断片にインフレームでクローニングした。挿入物、ＬＬＯおよびｈｌｙプロモーターの配列は、ＤＮＡシーケンシング分析によって確認した。このプラスミドをエレクトロコンピテントａｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅ株、ＬｍｄｄＡにエレクトロポレーションし、陽性クローンはストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍｌ）を含有するＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）寒天プレートで選択した。いくつかの実験では、ｈＨｅｒ２／ｎｅｕ（Ｌｍ−ｈＨｅｒ２）断片を発現する類似のＬｉｓｔｅｒｉａ株を比較のために使用した。全研究において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの免疫系に対する抗原とは独立した効果を明らかにするために、無関係なＬｉｓｔｅｒｉａ構築物（Ｌｍ対照）を含めた。Ｌｍ対照は、ＡＤＸＳ３１−１６４（ＬｍｄｄＡ−ＣｈＨｅｒ２）と同じＬｉｓｔｅｒｉａプラットフォームに基づいているが、ＨＰＶ１６−Ｅ７またはＮＹ−ＥＳＯ−１などの異なる抗原を発現する。融合タンパク質のＬｉｓｔｅｒｉａからの発現および分泌を試験した。各構築物をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて２回継代した。
【０６３７】
細胞傷害性アッセイ
３〜５匹のＦＶＢ／Ｎマウスの群を１週間間隔で１×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、Ｌｍ−ｈＨｅｒ２  ＩＣＩもしくはＬｍ対照（無関係な抗原を発現する）で３回免疫化するか、またはナイーブのままにした。ＮＴ−２細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて生育させ、トリプシンによって脱離させ、マイトマイシンＣ（無血清Ｃ−ＲＰＭＩ培地中２５０μｇ／ｍｌ）で３７℃で４５分間処理した。５回洗浄した後、免疫化した、またはナイーブ動物から採取した脾細胞と一緒に１：５（ステミュレーター：レスポンダー）の比で３７℃および５％ＣＯ２で５日間共インキュベートした。標準的細胞傷害性アッセイは、標的としてユーロピウム標識３Ｔ３／ｎｅｕ（ＤＨＦＲ−Ｇ８）細胞を使用して、以前に記載した方法に従って実施した。殺滅した標的細胞から放出されたユーロピウムは、４時間インキュベーションした後、分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｖｉｃｔｏｒ２）を使用して５９０ｎｍで測定した。比溶解パーセントは、（実験群における溶解−自然発生溶解）／（最大溶解−自然発生溶解）と定義した。
【０６３８】
免疫化したマウスに由来する脾細胞によるインターフェロン−γ分泌
３〜５匹のＦＶＢ／ＮまたはＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの群は、１週間間隔で１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、陰性Ｌｉｓｔｅｒｉａ対照（無関係な抗原を発現する）で３回免疫化するか、またはナイーブのままにした。ＦＶＢ／Ｎマウスの脾細胞は、最後の免疫化の１週間後に単離し、Ｃ−ＲＰＭＩ培地中でマイトマイシンＣ処理ＮＴ−２細胞の存在下で、２４ウェルプレートにおいて５×１０６細胞／ウェルで共培養した。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの脾細胞は、ＨＬＡ−Ａ２特異的ペプチド１μＭまたはＥ．ｃｏｌｉで産生し、ニッケルベースのアフィニティクロマトグラフィー系によって精製した組換えＨｉｓタグＣｈＨｅｒ２タンパク質１μｇ／ｍｌの存在下でインキュベートした。上清の試料を２４または７２時間後に得て、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の存在下でマウスＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して製造者の推奨に従って試験した。
【０６３９】
Ｈｅｒ２トランスジェニック動物における腫瘍研究
６週齢ＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウス（９〜１４匹／群）を５×１０８ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４またはＬｍ対照で６回免疫化した。自然発生乳房腫瘍（電子ノギスを使用して測定した）の出現に関して、週２回５２週間まで観察した。平均直径が１ｃｍ２のサイズに達したエスケープ腫瘍を切除し、ＲＮＡｌａｔｅｒ中で−２０℃で保存した。これらの腫瘍のエスケープに対するＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質中における変異の効果を決定するために、ゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ単離キットを使用して抽出し、シーケンシングした。
【０６４０】
脾臓および腫瘍中の制御性Ｔ細胞に対するＡＤＸＳ３１−１６４の効果
マウスに１×１０６個のＮＴ−２細胞を皮下（ｓ．ｃ．）移植した。７、１４および２１日目に、１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、ＬｍｄｄＡ対照で免疫化するか、またはナイーブのままにした。腫瘍および脾臓を２８日目に取り出し、ＦＡＣＳ分析によってＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの存在を試験した。手短に言うと、脾細胞は、Ｃ−ＲＰＭＩ培地中で２枚のガラススライドの間で脾臓をホモゲナイズすることによって単離した。腫瘍は、滅菌したカミソリの刃を使用して刻み、ＰＢＳ中にＤＮａｓｅ（１２Ｕ／ｍｌ）およびコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍｌ）を含有する緩衝液で消化した。撹拌しながらＲＴで６０分間インキュベーションした後、細胞をピペットで激しく吸引排出することによって分離した。赤血球をＲＢＣ溶解緩衝液によって溶解し、次いで１０％ＦＢＳを含有する完全ＲＰＭＩ−１６４０培地で数回洗浄した。ナイロンメッシュで濾過した後、腫瘍細胞および脾細胞をＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ）中に再懸濁し、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ２５−ＡＰＣ抗体で染色し、次いで透過処理して抗Ｆｏｘｐ３−ＰＥで染色した。フローサイトメトリー分析は、４色ＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）を使用して実施し、データはｃｅｌｌ  ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ）を使用して分析した。
【０６４１】
統計学的分析
ログランクカイ２乗検定を生存データに、スチューデントｔ検定をＣＴＬおよびＥＬＩＳＡアッセイに使用し、いずれも３連で実施した。０．０５未満のｐ値（＊で示した）は、これらの分析において統計学的に有意とみなした。統計学的分析は全て、ＰｒｉｓｍソフトウェアＶ．４．０ａ（２００６年）またはＳＰＳＳソフトウェアＶ．１５．０（２００６年）のいずれかで実施した。ＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック研究では全て、群当たり８〜１４匹のマウスを使用し、野生型ＦＶＢ／Ｎ研究では全て、他に記載がなければ群当たり少なくとも８匹のマウスを使用した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスモデルにおける長期腫瘍研究以外、研究は全て少なくとも１回反復した。
【０６４２】
（実施例９：Ｈｅｒ−２断片に融合したＬＬＯ断片を分泌するＬ．Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株の生成）：ＡＤＸＳ３１−１６４の構築）
キメラＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子（ＣｈＨｅｒ２）の構築は以下の通りであった。手短に言うと、ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法によるＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の２個の細胞外断片（ａａ４０〜１７０およびａａ３５９〜４３３）および１個の細胞内断片（ａａ６７８〜８０８）の直接融合によって生成された。キメラタンパク質は、タンパク質の公知のヒトＭＨＣクラスＩエピトープのほとんどを有する。ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、プラスミド、ｐＡｄｖ１３８（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２を構築するために使用した）から切り出し、ＬｍｄｄＡシャトルプラスミドにクローニングして、プラスミドｐＡｄｖ１６４をもたらした（図１１Ａ）。これら２つのプラスミド骨格の間には２つの主要な違いがある。１）ｐＡｄｖ１３８は組換え細菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択のためにクロラムフェニコール耐性マーカー（ｃａｔ）を使用するが、ｐＡｄｖ１６４はｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのＤ−アラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択およびｄａｌ−ｄａｔ遺伝子を欠如したＬｍｄｄＡ株中でのｉｎ  ｖｉｖｏにおけるプラスミド保持のために代謝補完経路を使用する。このワクチンプラットフォームは、操作されたＬｉｓｔｅｒｉａワクチン株の抗生物質耐性についてのＦＤＡの懸念に対処するために設計され、開発された。２）ｐＡｄｖ１３８とは異なり、ｐＡｄｖ１６４はプラスミド中に１コピーもｐｒｆＡ遺伝子を有さない（以下の配列および図１１Ａを参照のこと）。なぜなら、これはＬｍｄｄ株のｉｎ  ｖｉｖｏにおける補完のために必要ではないからである。ＬｍｄｄＡワクチン株はまた、ａｃｔＡ遺伝子（Ｌｉｓｔｅｒｉａの細胞内移動および細胞から細胞への拡散に関与する）を欠如しており、したがってこの骨格から得られた組換えワクチン株は、その親株であるＬｍｄｄから得られたワクチンの１００分の１のビルレンスである。ＬｍｄｄＡベースのワクチンはまた、Ｌｍｄｄベースのワクチンよりもはるかに速く（４８時間未満で）免疫化したマウスの脾臓から除去される。約１０４ＫＤのバンドがウェスタンブロット分析を使用して抗ＬＬＯ抗体によって検出されたので、この株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生育の８時間後のＴＣＡ沈殿した細胞培養上清中のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２と同程度であった（図１１Ｂ）。ｔＬＬＯのみを発現するＬｉｓｔｅｒｉａ骨格株を陰性対照として使用した。
【０６４３】
ｐＡｄｖ１６４配列（７０７５塩基対）（図１１Ａおよび１１Ｂを参照のこと）は配列番号５８に示す。
【０６４４】
（実施例１０：ＡＤＸＳ３１−１６４はＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２と同程度の免疫原性である）
抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的細胞傷害性Ｔ細胞の生成におけるＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性特性を、標準ＣＴＬアッセイにおいてＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２ワクチンの特性と比較した。いずれのワクチンも、３Ｔ３／ｎｅｕ標的細胞によって発現したＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原への、強力だが、同程度の細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発した。したがって、ＬＬＯに融合したＨｅｒ２の細胞内断片のみを発現するＬｉｓｔｅｒｉａで免疫化したマウスは、より多くのＭＨＣクラスＩエピトープを含有するキメラよりも低い溶解活性を示した。ＣＴＬ活性は、ナイーブ動物または無関係なＬｉｓｔｅｒｉａワクチンを注射したマウスにおいては検出されなかった（図１２Ａ）。ＡＤＸＳ３１−１６４はまた、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスの脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌を刺激することができた（図１２Ｂ）。これは、高レベルのＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原を発現する、マイトマイシンＣで処理したＮＴ−２細胞と共培養したこれらの細胞の培養上清で検出された（図１２Ｃ）。
【０６４５】
ＡＤＸＳ３１−１６４で免疫化した後のヒトＭＨＣクラスＩエピトープの適切なプロセシングおよび提示をＨＬＡ−Ａ２マウスで試験した。免疫化したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックの脾細胞をＨｅｒ２／ｎｅｕ分子の細胞外ドメイン（ＨＬＹＱＧＣＱＶＶ配列番号４２もしくはＫＩＦＧＳＬＡＦＬ配列番号４３）または細胞内ドメイン（ＲＬＬＱＥＴＥＬＶ配列番号４４）に位置するマッピングされたＨＬＡ−Ａ２制限エピトープに対応するペプチドと７２時間、共インキュベートした（図１２Ｃ）。組換えＣｈＨｅｒ２タンパク質は、陽性対照として使用し、無関係なペプチドまたはペプチドなしを陰性対照として使用した。この実験のデータは、ＡＤＸＳ３１−１６４が、標的化された抗原の様々なドメインに位置するヒトエピトープに対して抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的免疫応答を誘発することができることを示す。
【０６４６】
（実施例１１：ＡＤＸＳ３１−１６４は、自然発生乳房腫瘍の発生の予防においてＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２よりも効果的であった）
２０〜２５週齢でゆっくり成長する自然発生乳房腫瘍を発症するＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物において、ＡＤＸＳ３１−１６４の抗腫瘍効果をＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の効果と比較した。無関係なＬｉｓｔｅｒｉａ対照ワクチンで免疫化した動物は全て、２１〜２５週以内で乳腺腫瘍を発症し、３３週前に屠殺した。対照的に、Ｌｉｓｔｅｒｉａ−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ組換えワクチンは、乳房腫瘍の形成において著しい遅延をもたらした。４５週目に、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２で免疫化したマウスの２５％と比較して、ＡＤＸＳ３１−１６４をワクチン接種したマウスの５０％超（９匹のうち５匹）は、依然として腫瘍がなかった。５２週目に、ＡＤＸＳ３１−１６４で免疫化したマウスの８匹中２匹は依然として腫瘍がなく、一方、その他の実験群のマウスは全て既にそれらの疾患のために死亡していた（図１３）。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４は、より弱毒化されてはいるが、Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物における自然発生乳房腫瘍の発生の予防においてＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２よりも効果的であることを示している。
【０６４７】
（実施例１２：ＡＤＸＳ３１−１６４で免疫化したときのＨＥＲ２／Ｎｅｕ遺伝子の変異）
Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＭＨＣクラスＩエピトープの変異は、小断片ワクチンまたはＨｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメインにおけるエピトープを標的とするモノクローナル抗体、トラスツズマブ（ハーセプチン）による免疫化からの腫瘍のエスケープに関与すると考えられたことがある。これを評価するために、ゲノム物質をトランスジェニック動物におけるエスケープ腫瘍から抽出し、キメラまたは対照ワクチンで免疫化した腫瘍におけるｎｅｕ遺伝子の対応する断片をシーケンシングした。ワクチンを接種したいかなる腫瘍試料でもＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子内に変異は認められず、代わりのエスケープ機構があることが示唆された（データは示さず）。
（実施例１３）
ＡＤＸＳ３１−１６４は、腫瘍内制御性Ｔ細胞の著しい減少を引き起こす
【０６４８】
脾臓および腫瘍における制御性Ｔ細胞の頻度に対するＡＤＸＳ３１−１６４の効果を解明するために、マウスにＮＴ−２腫瘍細胞を移植した。３回免疫化した後に脾細胞および腫瘍内リンパ球を単離し、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞と定義されたＴｒｅｇについて染色したが、別々に分析するとＦｏｘＰ３またはＣＤ２５マーカーのいずれかで同程度の結果が得られた。この結果は、無関係なＬｉｓｔｅｒｉａワクチンまたはナイーブ動物と比較して、ＡＤＸＳ３１−１６４による免疫化は脾臓におけるＴｒｅｇの頻度に影響を及ぼさないことを示した（図１４）。対照的に、Ｌｉｓｔｅｒｉａワクチンによる免疫化は、腫瘍におけるＴｒｅｇの存在に対してかなりの影響を引き起こした（図１５Ａ）。未処置の腫瘍における全ＣＤ３＋Ｔ細胞の平均１９．０％がＴｒｅｇである一方、この頻度は無関係なワクチンでは４．２％、ＡＤＸＳ３１−１６４では３．４％に低減され、腫瘍内Ｔｒｅｇの頻度は５分の１に低減された（図１５Ｂ）。ＬｍｄｄＡワクチンのいずれかで処置したマウスの腫瘍内Ｔｒｅｇの頻度の減少は、腫瘍のサイズの違いに起因しないものと予想される。代表的な実験では、ＡＤＸＳ３１−１６４で免疫化したマウスの腫瘍［平均直径（ｍｍ）±ＳＤ、６．７１±０．４３、ｎ＝５］は、未処置のマウス（８．６９±０．９８、ｎ＝５、ｐ＜０．０１）または無関係なワクチンで処置したマウス（８．４１±１．４７、ｎ＝５、ｐ＝０．０４）よりも有意に小さく、一方、これら後者２群の比較では腫瘍サイズには統計学的に有意な差は示されなかった（ｐ＝０．７３）。ＬｍｄｄＡワクチンで処置した腫瘍におけるＴｒｅｇの低い頻度は、腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加を引き起こし、より好ましい腫瘍の微少環境がＬｍｄｄＡワクチンによる免疫化後に得られることが示唆された。しかし、標的抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＡＤＸＳ３１−１６４）を発現するワクチンのみが腫瘍生育を低減することができ、Ｔｒｅｇの減少は腫瘍における抗原特異的応答の存在のみに影響を及ぼすことを示唆している。
【０６４９】
（実施例１４：ＡＤＸＳ３１−１６４による末梢免疫化は、脳における転移性乳がん細胞株の生育を遅延させることができる）
マウスをＡＤＸＳ３１−１６４または無関係なＬｍ対照ワクチンでＩＰ免疫化し、次にルシフェラーゼおよび低レベルのＨｅｒ２／ｎｅｕを発現する５，０００個のＥＭＴ６−Ｌｕｃ腫瘍細胞を頭蓋内に移植した（図１６Ａ）。腫瘍は接種後様々な時点で、麻酔したマウスをｅｘ  ｖｉｖｏ画像化することによってモニターした。腫瘍接種後の８日目に、腫瘍は全対照動物で検出されたが、ＡＤＸＳ３１−１６４群のマウスではいずれも検出可能な腫瘍は示されなかった（図１６Ａおよび１６Ｂ）。腫瘍接種後の１１日目に陰性対照群の全マウスは既に腫瘍のために死亡していたが、ＡＤＸＳ３１−１６４群の全マウスは、依然として生存しており、腫瘍生育のわずかな徴候のみが示されたので、ＡＤＸＳ３１−１６４は明らかにこれらの腫瘍の発生を遅延させることができた。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４の末梢投与によって得られた免疫応答は、おそらく中枢神経系に到達することができ、ＬｍｄｄＡをベースにしたワクチンは、ＣＮＳ腫瘍の処置のための潜在的用途を有し得ることを強く示唆する。
【０６５０】
（実施例１５：ペプチド「ミニ遺伝子」発現系）
材料および方法
この発現系は、カルボキシ末端に特有のペプチド部分を含有する組換えタンパク質のパネルのクローニングを容易にするために設計する。これは、鋳型としてＳＳ−Ｕｂ−ペプチド構築物の１つをコードする配列を利用する簡単なＰＣＲ反応によって達成する。Ｕｂ配列のカルボキシ末端領域に伸長するプライマーを使用し、プライマーの３’末端に所望するペプチド配列のコドンを導入することによって、新たなＳＳ−Ｕｂ−ペプチド配列を１回のＰＣＲ反応において生成することができる。細菌プロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列の最初の数ヌクレオチドをコードする５’プライマーは、全構築物で同じである。この戦略を使用して生成した構築物の概略を図１７Ａ〜１７Ｃに表す。この実施例では、２つの構築物について説明する。１つは、マウスＭＨＣクラスＩに提示されたモデルペプチド抗原を含有し、第２の構築物はヒト神経膠芽腫（ＧＢＭ）ＴＡＡから得られたペプチドなどの治療上関係のあるペプチドが置換されたことを示している。明確にするために、図１７Ａ〜Ｃで図示した構築物をＡｃｔＡ１−１００分泌シグナルを含有するものとして示した。しかし、ＬＬＯベースの分泌シグナルは、等しい効果を有して置換することができた。
【０６５１】
提案した系の利点の１つは、単一のＬｉｓｔｅｒｉａベクター構築物を使用して複数のペプチドを細胞に負荷することが可能となることである。複数のペプチドは、前述した単一のペプチド発現系の改変を使用して、組換え弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、ｐｒｆＡ変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａまたはｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ変異体Ｌｉｓｔｅｒｉａ）に導入する。逐次的なＳＳ−Ｕｂ−ペプチド配列に由来する複数の特有のペプチドをコードするキメラタンパク質は、１つの挿入物でコードされた。シャイン−ダルガーノリボソーム結合部位は、ペプチド構築物のそれぞれの別々の翻訳を可能にするために、各ＳＳ−Ｕｂ−ペプチドコーディング配列の前に導入する。図１７Ｃは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａの１株から４つの別々のペプチド抗原を発現するように設計された構築物の概略図を示す。これは厳密には一般的な発現戦略の代表であるので、公知のマウスまたはヒト腫瘍関連もしくは感染疾患抗原から得られた４つの特有のＭＨＣクラスＩ結合ペプチドを含めた。
【０６５２】
材料および方法（実施例１６〜１８）
プラスミドｐＡｄｖ１４２およびＬｍｄｄＡ１４２株は実施例１で前述した。さらなる詳細は以下に示す。
【０６５３】
プラスミドｐＡｄｖ１４２およびＬｍｄｄＡ１４２株の構築
このプラスミドは、Ｖｅｒｃｈらによって以前に構築された抗生物質不使用の次世代プラスミド、ｐＴＶ３である。Ｌｍ−ｄｄＡは染色体中に１コピーのｐｒｆＡ遺伝子を含有するので、ビルレンス遺伝子転写活性化因子、ｐｒｆＡの不必要なコピーはプラスミドｐＴＶ３から欠失させた。したがって、ｄａｌを含有するプラスミドにおけるｐｒｆＡ遺伝子の存在は必須ではなかった。さらに、ＮｈｅＩ／ＰａｃＩ制限部位におけるｐ６０−Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｄａｌのためのカセットは、ｐ６０−Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｄａｌ（ｄａｌＢ３）によって置換して、プラスミドｐＡｄｖ１３４をもたらした。さらに、ｐＡｄｖ１３４はヒトＰＳＡ、ｋｌｋ３をクローニングするためにＸｈｏＩ／ＸｍａＩで制限し、プラスミド、ｐＡｄｖ１４２をもたらした。新たなプラスミド、ｐＡｄｖ１４２（図２Ｃ）はｄａｌＢｓを含有し、その発現はＬｍｐ６０プロモーターの制御下にあった。シャトルプラスミドｐＡｄｖ１４２は、Ｄ−アラニンの外因性添加が存在しない場合、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｌａ  ｄｒｘ  ＭＢ２１５９ならびにＬｍｄｄの両方の生育を補完することができた。プラスミドｐＡｄｖ１４２中の抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモーターおよびｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質からなる（図１８）。
【０６５４】
プラスミドｐＡｄｖ１４２は、Ｌｉｓｔｅｒｉａバックグラウンド株ＬｍｄｄＡ株に形質転換し、ＬｍｄｄＡ１４２またはＡＤＸＳ３１−１４２をもたらした。ＡＤＸＳ３１−１４２株によるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現および分泌は、抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体を使用したウェスタン分析によって確認され、図２Ｄに示した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて２回のｉｎ  ｖｉｖｏ継代した後、ＡＤＸＳ３１−１４２株によるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現および分泌は安定していた。
【０６５５】
ＬｍｄｄＡ２１１、ＬｍｄｄＡ２２３およびＬｍｄｄＡ２２４株の構築
ＡｃｔＡタンパク質の異なる切断断片を含有する３つの異なるプラスミドｐＡｄｖ２１１、ｐＡｄｖ２２３およびｐＡｄｖ２２４を作製するために、様々なＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ領域をプラスミドｐＡｄｖ１４２にクローニングした。
【０６５６】
ＬＬＯシグナル配列（ＬＬＯｓｓ）−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２（ｐＡｄｖ２１１）／ＬｍｄｄＡ２１１。最初の２つの断片ＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−ＸｂａＩ（８１７ｂｐのサイズ）およびＬＬＯｓｓ−ＸｂａＩ−ＡｃｔＡ−ＰＥＳＴ２（６０２ｂｐのサイズ）を増幅して、次に２５塩基を重複させてＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法を使用することによって一緒に融合した。ここで、このＰＣＲ生成物は７６２ｂｐのサイズの断片ＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２−ＸｈｏＩを含有する。新たなＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２−ＸｈｏＩ  ＰＣＲ生成物およびｐＡｄｖ１４２（ＬｍｄｄＡ−ＰＳＡ）プラスミドをＰｓｉＩ／ＸｈｏＩ制限酵素で消化して精製した。ライゲーションを行い、ＭＢ２１５９エレクトロコンピテント細胞に形質転換し、ＬＢ寒天プレートに播種した。ＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２／ｐＡｄｖ１４２（ＰＳＡ）クローンを選択し、挿入物特異的ＰＣＲ反応によってスクリーニングした。ＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２／ｐＡｄｖ１４２（ＰＳＡ）クローン、＃９、１０は陽性で、プラスミドはミニ調製によって精製した。ＰＣＲスクリーニングによってクローンをスクリーニングした後、陽性クローンの挿入物をシーケンシングした。ｐＡｄｖ２１１．１０と称するプラスミドＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２／ｐＡｄｖ１４２（ＰＳＡ）は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ＬｍｄｄＡ変異エレクトロコンピテント細胞に形質転換し、ＢＨＩ／ｓｔｒｅｐ寒天プレートに播種した。得られたＬｍｄｄＡ２１１株はコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。いくつかのＬｉｓｔｅｒｉａコロニーを選択し、内因性ＬＬＯおよびＡｃｔＡＰＥＳＴ２−ＰＳＡ（ＬＡ２２９−ＰＳＡ）タンパク質の発現および分泌をスクリーニングした。マウスにおいて２回ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて継代した後、ＡｃｔＡＰＥＳＴ２−ＰＳＡ融合タンパク質の発現は安定していた。
【０６５７】
ＬＬＯｓｓ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ３およびＰＥＳＴ４。ＡｃｔＡＰＥＳＴ３およびＡｃｔＡＰＥＳＴ４断片はＰＣＲ法によって作製した。ＬＬＯｓｓ−ＸｂａＩ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ３−ＸｈｏＩ（８３９ｂｐのサイズ）およびＬＬＯｓｓ−ＸｂａＩ−  ＡｃｔＡＰＥＳＴ４−ＸｈｏＩ断片（１１４６ｂｐのサイズ）を含有するＰＣＲ生成物をｐＡｄｖ１４２にクローニングした。得られたプラスミドｐＡｄｖ２２３（ＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ３−ＸｈｏＩ／ｐＡｄｖ１４２）およびｐＡｄｖ２２４（ＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ４／ｐＡｄｖ１４２）クローンを選択し、挿入物特異的ＰＣＲ反応によってスクリーニングした。プラスミドｐＡｄｖ２２３およびｐＡｄｖ２２４をＬｍｄｄＡ骨格に形質転換し、ＬｍｄｄＡ２２３およびＬｍｄｄＡ２２４それぞれをもたらした。いくつかのＬｉｓｔｅｒｉａコロニーを選択し、内因性ＬＬＯ、ＡｃｔＡＰＥＳＴ３−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ２２３）またはＡｃｔＡＰＥＳＴ４−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ２２４）タンパク質の発現および分泌をスクリーニングした。マウスにおいて２回ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて継代した後、融合タンパク質ＡｃｔＡＰＥＳＴ３−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ２２３）またはＡｃｔＡＰＥＳＴ４−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ２２４）の発現および分泌は安定していた。
【０６５８】
実験計画１
ＴＰＳＡ２３（ＰＳＡ発現腫瘍モデル）を使用したＡｃｔＡ−ＰＥＳＴ−ＰＳＡ（ＰＥＳＴ３、ＰＥＳＴ２およびＰＥＳＴ４配列）およびｔＬＬＯ−ＰＳＡの治療有効性を評価し、比較した。未処置のマウスを対照群として使用した。並行して、インターフェロン−ガンマの細胞内サイトカイン染色およびＰＳＡ４量体染色も使用して免疫応答を評価した。
【０６５９】
腫瘍退縮研究。８匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（７週齢雄）の１０群に、０日目に１×１０６個のＴＰＳＡ２３細胞を皮下移植した。６日目に免疫化を行い、その後、１週間おきに２回ブースター投与量を与えた。サイズが平均直径１．２ｃｍに達するまで、腫瘍生育を毎週モニターした。
【０６６０】
免疫原性の研究。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週齢雄）の２群に以下の表に挙げたワクチンで１週間間隔で３回免疫化した。最後のブースト注射の６日後、マウスを屠殺し、脾臓を採取し、免疫応答を４量体染色および細胞内サイトカイン染色によるＩＦＮ−γ分泌について試験した。
【０６６１】
実験計画２
この実験は、実験計画１の反復であるが、ナイーブ、ｔＬＬＯ、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２−ＰＳＡおよびｔＬＬＯ−ＰＳＡ群のみを含めた。実験計画１と同じように、治療有効性はＴＰＳＡ２３（ＰＳＡ発現腫瘍モデル）を使用して評価した。群当たり５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに、０日目に１×１０６個のＴＰＳＡ２３細胞を皮下移植した。６日目に、免疫化（１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）を行い、次いで１週間後にブースターを行った。脾臓及び腫瘍を最後の処置後６日目に収集した。免疫応答は、脾臓及び腫瘍の両方においてＰＳＡ５量体染色を使用してモニターした。
【０６６２】
材料および方法。ＴＰＳＡ２３細胞は、完全培地中で培養する。マウスに腫瘍細胞を移植する２日前に、ＴＰＳＡ２３細胞を完全培地で継代培養した。実験当日（０日目）に、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を計数し、注射用に１×１０６細胞／ＰＢＳ２００μｌ／マウスの濃度で再懸濁した。腫瘍細胞を各マウスの側腹部に皮下注射した。
【０６６３】
ＴＰＳＡ２３細胞用の完全培地。ＴＰＳＡ２３細胞用の完全培地は、グルコースを含むＤＭＥＭ４３０ｍｌ、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）４５ｍｌ、Ｎｕ−ＳｅｒｕｍＩＶ  ２５ｍｌ、１００×Ｌ−グルタミン５ｍｌ、１００ｍＭピルビン酸Ｎａ５ｍｌ、１０，０００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン５ｍｌを混合することによって調製した。細胞を分割する間、ウシインスリン０．００５ｍｇ／ｍｌおよびデヒドロイソアンドロステロン１０ｎＭをフラスコに添加した。
【０６６４】
脾細胞用の完全培地（ｃ−ＲＰＭＩ）。完全培地は、ＲＰＭＩ１６４０  ４５０ｍｌ、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）５０ｍｌ、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ５ｍｌ、１００×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）５ｍｌ、１００×Ｌ−グルタミン５ｍｌ、１００ｍＭピルビン酸Ｎａ５ｍｌ、１０，０００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン５ｍｌおよび１４．６Ｍ  ２−メルカプトエタノール  １２９μｌを混合することによって調製した。
【０６６５】
単離した脾細胞の調製
作業はバイオハザードフード内で実施した。脾臓は実験マウス群および対照マウス群から滅菌ピンセットおよびハサミを使用して採取した。脾臓を、ＰＢＳ１０ｍｌを含有する１５ｍｌ試験管に入れて研究室に輸送した。各マウスの脾臓は別々に処理した。脾臓を滅菌したペトリ皿に取り、３ｍＬシリンジのプランジャーの背部を使用してすりつぶした。脾臓細胞を、ＲＰＭＩ１６４０  １０ｍｌを含有する１５ｍｌ試験管に移した。４℃で１，０００ＲＰＭで５分間の遠心分離によって細胞をペレットにした。上清を１０％漂白剤中に廃棄した。軽くたたいて細胞ペレットを穏やかに崩した。細胞ペレットに脾臓当たりＲＢＣ溶解緩衝液２ｍｌを添加することによってＲＢＣを溶解した。ＲＢＣ溶解は２分間行った。すぐに、ｃ−ＲＰＭＩ培地１０ｍｌを細胞懸濁液に添加してＲＢＣ溶解緩衝液を不活化した。４℃で１，０００ＲＰＭで５分間の遠心分離によって細胞をペレットにした。上清を廃棄し、細胞ペレットをｃ−ＲＰＭＩ  １０ｍｌに再懸濁してセルストレーナーに通過させた。細胞は血球計数計を使用して計数し、生存度は細胞懸濁液１０μｌをトリパンブルー染色液９０μｌと混合することによって調べた。約２×１０６細胞を５量体染色用に使用した。（注意：各脾臓から１〜２×１０８細胞が生じるだろう）。
【０６６６】
Ｍｉｌｔｅｎｙｉマウス腫瘍分離キットを使用した腫瘍からの単一細胞懸濁液の調製
酵素混合物は、ＲＰＭＩ１６４０  ２．３５ｍＬ、酵素Ｄ  １００μＬ、酵素Ｒ  ５０μＬおよび酵素Ａ  １２．５μＬをｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｃ試験管に添加することによって調製した。腫瘍（０．０４〜１ｇ）を２〜４ｍｍの小片に切断し、酵素混合物を含有するｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｃ試験管に移した。試験管をｇｅｎｔｌｅ  ＭＡＣＳ分離器のスリーブに逆さまに取り付け、Ｐｒｏｇｒａｍ  ｍ＿ｉｍｐＴｕｍｏｒ＿０２を作動させた。プログラム終了後、Ｃ試験管をｇｅｎｔｌｅ  ＭＡＣＳ分離器から取り外した。ＭＡＣＳｍｉｘ試験管回転装置を使用して連続的に回転しながら、試料を３７℃で４０分間インキュベートした。インキュベーション完了後、Ｃ試験管をｇｅｎｔｌｅ  ＭＡＣＳ分離器のスリーブに再度逆さまに取り付け、ｐｒｏｇｒａｍ  ｍ＿ｉｍｐＴｕｍｏｒ＿０３を２回作動させた。細胞懸濁液を、１５ｍＬ試験管上に置いた７０μｍフィルターで濾過した。フィルターはまた、ＲＰＭＩ１６４０  １０ｍＬで洗浄した。細胞を３００×ｇで７分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞をＲＰＭＩ１６４０  １０ｍｌに再懸濁した。この時点で、細胞を５量体染色用に分割することができる。
【０６６７】
脾細胞の５量体染色
ＰＳＡ特異的Ｔ細胞は、市販のＰｒｏＩｍｍｕｎｅ社製ＰＳＡ−Ｈ−２Ｄｂ５量体を使用して、製造者の推奨したプロトコールを用いて検出した。脾細胞を、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ３および５量体について染色した。一方、腫瘍細胞を、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５および５量体について染色した。ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＰＳＡ５量体＋細胞の頻度を決定するために、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞をゲーティングした。染色した細胞を取得し、ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒでＣｅｌｌ  ｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。
【０６６８】
５量体染色のために必要な材料。脾細胞（前述した調製物）、ＰＥにコンジュゲートしたＰｒｏ５（登録商標）組換えＭＨＣ  ＰＳＡ５量体。（注意：保存用５量体は蓋で密封して一貫して暗所において４℃で確実に保存する）、ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５にコンジュゲートした抗ＣＤ３抗体、ＦＩＴＣにコンジュゲートした抗ＣＤ８抗体およびＡＰＣにコンジュゲートした抗ＣＤ６２Ｌ抗体、洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ）および固定溶液（ＰＢＳ中１％熱不活化ウシ胎仔血清（ＨＩ−ＦＣＢＳ）、２．５％ホルムアルデヒド）。
【０６６９】
標準染色プロトコール。Ｐｒｏ５（登録商標）ＰＳＡ５量体は、冷却したマイクロ遠心分離機で１４，０００×ｇで５〜１０分間遠心分離して、溶液中に存在するあらゆるタンパク質凝集物を除去した。これらの凝集物は、もし試験体積中に含まれていると、非特異的染色に寄与し得る。２×１０６脾細胞を染色条件毎に配分し、洗浄緩衝液１ｍｌを試験管毎に添加した。細胞を４℃に冷却した遠心分離器中で５００×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを残存体積（約５０μｌ）中に再懸濁した。その後のステップでは全て、指示がなければ、全試験管を氷上で冷却した。標識した５量体１０μｌを細胞に添加し、ピペットで吸引排出することによって混合した。細胞を室温（２２℃）で１０分間インキュベートして、光を遮蔽した。細胞を試験管当たり洗浄緩衝液２ｍｌで洗浄して、残存する液体（約５０μｌ）に再懸濁した。抗ＣＤ３、抗ＣＤ８および抗ＣＤ６２Ｌ抗体の最適量を添加し（１：１００希釈）、ピペットで吸引排出することによって混合した。単一染色対照試料もこの時点で製作した。試料を氷上で２０分間インキュベートして、光を遮蔽した。細胞を試験管当たり洗浄緩衝液２ｍｌで２回洗浄した。細胞ペレットを残存体積（約５０μｌ）中に再懸濁した。固定溶液２００μｌを各試験管に添加し、ボルテックスした。試験管は、データ取得の用意ができるまで、冷蔵庫中で暗所保存した。（注意：固定後の細胞の形態変化のため、データ取得を進める前に試料を３時間放置することが望ましい。試料は、最長２日間保存することができる）。
【０６７０】
細胞内サイトカイン染色（ＩＦＮ−γ）プロトコール。２×１０７細胞／ｍｌの脾細胞をＦＡＣＳ試験管に取り、ブレフェルジンＡ（ＢＤ  Ｇｏｌｇｉ  Ｐｌｕｇ）１００μｌをこの試験管に添加した。刺激のために、ペプチド２μＭを試験管に添加して、細胞を室温で１０〜１５分間インキュベートした。陽性対照試料として、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）（２×）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）（２×）を対応する試験管に添加した。各処理から培地１００μｌをＵ底９６ウェルプレートの対応するウェルに添加した。細胞１００μｌを対応するウェルに添加した（最終体積２００μｌ−培地＋細胞）。プレートを６００ｒｐｍで２分間遠心分離して、３７℃５％ＣＯ２で５時間インキュベートした。プレートの内容物をＦＡＣＳ試験管に移した。ＦＡＣＳ緩衝液１ｍｌを各試験管に添加し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄した。２．４Ｇ２上清２００μｌおよびウサギ血清１０μｌを細胞に添加し、室温で１０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液１ｍＬで洗浄した。１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって細胞を収集した。細胞を、蛍光色素をコンジュゲートしたモノクローナル抗体（ＣＤ８  ＦＩＴＣ、ＣＤ３  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ６２Ｌ  ＡＰＣ）を含有するＦＡＣＳ緩衝液５０μｌ中に懸濁し、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液１ｍＬで２回洗浄し、４％ホルマリン溶液２００μｌ中に再懸濁し、４℃で２０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液１ｍＬで２回洗浄し、ＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（０．２５ｍｌ／試験管）で１５分間再懸濁した。細胞を遠心分離によって収集し、蛍光色素をコンジュゲートした、目的のサイトカイン（ＩＦＮｇ−ＰＥ）に対するモノクローナル抗体を含有するＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液５０μｌに再懸濁した。細胞を暗所で４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、ＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（試験管当たり１ｍｌ）を使用して２回洗浄し、分析前にＦＡＣＳ緩衝液２００μｌ中に再懸濁した。
【０６７１】
結果
（実施例１６：組換えＬｉｓｔｅｒｉａ構築物によるワクチン接種は腫瘍退縮を導く）
データによって、１週目までに全群が平均サイズ２〜３ｍｍの腫瘍を発達させたことが示された。３週目（２０日目）に、ＰＳＡに融合したｔＬＬＯを発現するＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２（「ＬＡ２２９」としても公知である）−ＰＳＡ、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ３−ＰＳＡおよびＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ３−ＰＳＡおよびＬｍｄｄＡ−１４２（ＡＤＸＳ３１−１４２）で免疫化したマウスは、腫瘍退縮を示し、腫瘍生育が減速した。６週目までに、ナイーブの全マウスおよびＡｃｔＡＰＥＳＴ４−ＰＳＡ処置群のほとんどが大きな腫瘍を有し安楽死させる必要があった（図１９Ａ）。しかし、ＬｍｄｄＡ−１４２、ＡｃｔＡ−ＰＥＳＴ２およびＡｃｔＡ−ＰＥＳＴ３マウス群は、より良好な腫瘍退縮および生存率を示した（図１９Ａおよび１９Ｂ）。
【０６７２】
（実施例１７：組換えＬｉｓｔｅｒｉａによるワクチン接種は、高レベルの抗原−特異的Ｔ細胞を生成する）
ＬｍｄｄＡ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２−ＰＳＡワクチンは、ＬｍｄｄＡ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ（３もしくは４）−ＰＳＡまたはＬｍｄｄＡ−１４２と比較して、高レベルのＰＳＡ特異的Ｔ細胞応答を生成した（図２０Ａ）。ＰＳＡ特異的ワクチンにおけるＰＳＡ４量体特異的Ｔ細胞の大きさは、ナイーブマウスよりも３０倍大きかった。同様に、ＰＳＡ特異的抗原による刺激に応答して高レベルのＩＦＮ−γ分泌がＬｍｄｄＡ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２−ＰＳＡワクチンで認められた（図２０Ｂ）。
【０６７３】
（実施例１８：ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２（ＬＡ２２９）によるワクチン接種は、脾臓において多数の抗原−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する）
ＰＳＡに融合したＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２を発現するＬｍは、ＰＳＡに融合したｔＬＬＯを発現するＬｍまたはｔＬＬＯ処置群と比較して、脾臓において多数のＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成することができた。腫瘍に浸潤するＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、Ｌｍ−ｔＬＬＯ−ＰＳＡおよびＬｍ−ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２−ＰＳＡ免疫化マウスの両方で類似していた（図２１Ｂおよび２１Ｃ）。また、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２−ＰＳＡを発現するＬｍの腫瘍退縮能力は、ｔＬＬＯ−ＰＳＡを発現するＬｍｄｄＡ−１４２で認められたものと類似していた（図２１Ａ）。
【０６７４】
（実施例１９：ネオエピトープ発現ベクターの構築）
１つまたは複数のネオエピトープを含むＬｍベクターの構築は、以下に詳述したステップを使用して実施する。
【０６７５】
全ゲノムシーケンシング
まず、腫瘍細胞の約＞２０％中に存在する非同義変異の位置を特定することを含む比較全ゲノムシーケンシングを実施し、結果はＦＡＳＴＡ形式で示す。全エクソームから一致した正常／腫瘍試料は外部業者によってシーケンシングされ、出力データは、２１アミノ酸配列ペプチド（例えば、１つの変異体アミノ酸の両方の側に１０の非変異体アミノ酸を有するペプチド）として全ネオ抗原を列挙する、好ましいＦＡＳＴＡ形式で得られる。患者のＨＬＡ型も含まれる。
【０６７６】
ヒト組織（または任意の非ヒト動物）から得られた生物試料のＤＮＡおよびＲＮＡは、３連で抽出した。ネオ抗原の別の供給源は、転移または循環腫瘍細胞のシーケンシングに由来してもよい。それらは、最初の生検中には存在しないが、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＣ）またはシーケンシングした一次生検とは異なって変異した転移を特異的に標的とするベクターに含まれ得るさらなる変異を含有していてもよい。各試料の三連物を、ＤＮＡエクソームシーケンシングによってシーケンシングした。手短に言うと、精製したゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）３μｇを超音波装置を使用して約１５０〜２００ｂｐに断片化した。断片の末端を修復し、５’リン酸化し、３’アデニル化し、次いでＩｌｌｕｍｉｎａ  ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄアダプターを製造者の指示に従ってｇＤＮＡ断片にライゲーションした。濃縮した事前捕捉（ｐｒｅ  ｃａｐｔｕｒｅ）およびフローセル特異的配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＰＥ  ＰＣＲプライマーを使用して添加する。アダプター約５００ｎｇをライゲーションし、ＰＣＲ濃縮したｇＤＮＡ断片をビオチン化したエクソーム（ヒトエクソームまたは任意のその他の非ヒト動物エクソーム、例えば、マウス、モルモット、ラット、イヌ、ヒツジ）にハイブリダイズする。ＲＮＡライブラリーを６５℃で２４時間ベイトにする（ｂａｉｔ）。ハイブリダイズしたｇＤＮＡ／ＲＮＡベイト複合体を次に、ストレプトアビジンをコーティングした磁気ビーズを使用して除去し、洗浄し、ＲＮＡベイトを切断する。これらの溶出したｇＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅して、次にＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシング装置でシーケンシングする。
【０６７７】
ＲＮＡ遺伝子発現プロファイリング（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）
バーコード化ｍＲＮＡ−ｓｅｑ  ｃＤＮＡライブラリーを全ＲＮＡの総量約５μｇから３連で調製し、次に、手短に言うと、ｍＲＮＡを単離して断片化した。次に、ｍＲＮＡ断片をｃＤＮＡに変換し、特異的Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターに接続し、クラスター化して、標準ｉｌｌｕｍｉｎｅプロトコールに従ってシーケンシングする。出力した配列読み取りを参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）に整列させる。ゲノムアラインメントおよびトランスクリプトームアラインメントを行う。読み取りはまた、エクソン−エクソン接合部まで整列させる。発現値は、読み取り座標とＲｅｆＳｅｑ転写物の座標とを交差させ、重複するエクソンおよびエクソン接合部の読み取りを計数し、ＲＰＫＭ発現単位（マッピングされた１００万の読み取り当たり１キロ塩基の転写物当たりのマッピングされる読み取り）などの標準的正規化単位に正規化することによって決定する。
【０６７８】
変異の検出
疾患または状態を有する組織試料から単離したｇＤＮＡの断片を、製造業者の利用可能なソフトウェア、例えば、Ｓａｍｔｏｏｌｓ、ＧＡＴＫおよびＳｏｍａｔｉｃ  Ｓｎｉｐｅｒによって、健康な組織の参照となる一致したｇＤＮＡに整列させる。
【０６７９】
異なるＨＬＡ  ＴＣＲ読み取り枠の少なくとも一部を提供するために、検出した変異の各側に約１０の隣接アミノ酸を組み込んでクラス１ＭＨＣ−１提示に適応させる。
【０６８０】
表５は、５０のネオエピトープペプチドの試料リストを示し、各変異は太字のアミノ酸文字で示し、各側に１０アミノ酸が隣接しており、２１アミノ酸ペプチドネオエピトープを提供する。
【０６８１】
【表５】
2019503186.tif 000007
【０６８２】
出力されたＦＡＳＴＡファイルを使用して、手動で、またはプログラムされたスクリプトによって、以下に詳細を示した１つまたは複数の基準に従って患者特異的構築物を設計した。プログラムされたスクリプトは、一連のプロトコールを使用して、各被験体について１つまたは複数のネオエピトープを含有する個別化血漿構築物の作製を自動化する（図２２）。出力されたＦＡＳＴＡファイルを入力し、プロトコールを実行後、１つまたは複数のネオエピトープを含むＬＭベクターのＤＮＡ配列を出力する。被験体それぞれのための個別化免疫療法を作製するためのソフトウェアプログラムは、有用である。
【０６８３】
構築物に組み込むためのネオエピトープの優先順位付け
ネオエピトープは、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのヒドロパシー指標２１アミノ酸ウィンドウによってスコア付けし、カットオフ（約１．６）を超えるスコアを有するものは全て、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが分泌することができないと考えられるので除外する。次に、残存する２１アミノ酸長ペプチドが患者ＨＬＡに結合する能力をスコア付けして（例えば、ＩＥＤＢ、免疫エピトープデータベースおよび分析情報源、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／を使用することによって）、２１アミノ酸配列ペプチドそれぞれの最も良いＭＨＣ結合スコアによって順位付けする。カットオフは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａなどの異なる発現ベクターでは異なることがある。
【０６８４】
ネオエピトープの発現および分泌の効率を決定するために構築物の数  対  変異荷重の決定を実施する。ベクター当たり約５０のエピトープから開始して、直鎖状ネオエピトープの範囲を試験する。ある特定の場合において、構築物はベクター当たり少なくとも１のネオエピトープを含むこととなる。使用するベクターの数は、例えば、単一ベクターからの複数のエピトープの翻訳および分泌の効率ならびに特異的ネオエピトープを有するＬｍベクターそれぞれに必要なＭＯＩを考慮して、またはネオエピトープの数を参照にして決定する。もう１つ考慮すべきことは、腫瘍関連変異／循環腫瘍細胞において見いだされる公知の変異／公知のがん「ドライバー」変異／公知の化学療法耐性変異の群を予め定義し、それらに２１アミノ酸配列ペプチド選択における優先度を与えることにより得る。これは、同定した変異遺伝子をＣＯＳＭＩＣ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ、ｃａｎｃｅｒ．Ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）またはＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓまたはその他の類似のがん関連遺伝子データベースに対してスクリーニングすることによって達成することができる。さらに、ベクターに対する免疫抑制の影響を除外または回避するために、免疫抑制エピトープ（Ｔ−ｒｅｇエピトープ、ＩＬ−１０誘導Ｔヘルパーエピトープなど）のスクリーニングを利用する。選択したコドンは、特定のＬｉｓｔｅｒｉａ株によって効率的に翻訳され分泌されるようにコドン最適化される。当該分野で公知のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに最適化したコドンの例を表６に示す。
【０６８５】
【表６】
2019503186.tif 000008
【０６８６】
残存する２１アミノ酸ペプチドネオエピトープをｐＡｄｖ１３４−ＭＣＳ（配列番号４５）プラスミド、または任意選択でｐＡｄｖ１３４に組み立て、上記の実施例８で示したＬＬＯ−Ｅ７カセットを交換し、ｔＬＬＯ−ネオエピトープタグ融合ポリペプチドを作製する。アミノ酸配列として適合性のある挿入物および挿入物全体をＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅの試験で再試験して、構築物全体にわたってヒドロパシー問題がないことを確認する。必要があれば、挿入物の順番を再配列するか、または問題の２１アミノ酸配列ペプチドを構築物から除去する。
【０６８７】
ＤＮＡ合成／ｐＡｄｖ１３４−ＭＣＳ（配列番号４５）へのクローニングのために、構築物のアミノ酸配列を対応するＤＮＡ配列に逆翻訳する。ヌクレオチド２４００〜２４５３は、外部業者によってマルチクローニングサイトと称される。個々の２１アミノ酸ペプチド配列およびＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×ＨｉｓタグＤＮＡ配列（例えば、配列番号５７）は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現および分泌のために最適化し、４×グリシンリンカー配列は、予め設定した１１のＤＮＡ配列（Ｇ１〜Ｇ１１、配列番号４６〜５６）の１つである。過剰な反復を回避してＤＮＡ合成をより可能にするために、リンカー配列コドンは変化させる。４×グリシンリンカーのための異なる配列コドン（Ｇ１〜Ｇ１１、配列番号４６〜５６）の例を表７に示す。
【０６８８】
【表７】
2019503186.tif 000009
【０６８９】
各ネオエピトープは、リンカー配列で、同じベクターでコードされる次のネオエピトープに接続される。挿入物中の最後のネオエピトープは、終止コドンが続くＴＡＧ配列に融合させる。融合したＴＡＧは配列番号５７、Ｃ末端ＳＩＩＮＦＥＫＬおよび６×Ｈｉｓアミノ酸配列に示す。ＴＡＧは、例えば、Ｌｍベクターからの分泌中あるいは構築物の特異的Ｔ細胞への親和性または抗原提示細胞による提示を試験するときのｔＬＬＯ−ネオエピトープの容易な検出を可能にする。リンカーは、Ｇ１〜Ｇ１１（配列番号４６〜５６）、したがって、またはそれらの任意の組み合わせを含む群より選択される４×グリシンＤＮＡ配列である。
【０６９０】
単一のプラスミドに適合し得る（現在試験されている最大負荷量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｐａｙｌｏａｄ））よりも使用できる２１アミノ酸ペプチドがあるならば、異なる２１アミノ酸ペプチドを、必要／所望するならば優先順位によって１番目、２番目などの構築物に指定する。所望するネオエピトープ一式を構成する複数のベクターの１つに割り当てる優先度は、相対的サイズ、転写の優先度および翻訳されたポリペプチドの全体的疎水性などの要因をベースにして決定する。
【０６９１】
一実施形態において、本明細書で開示した構築物構造には、リンカー配列に隣接し、別のリンカーに隣接した少なくとも１つの第２のネオエピトープが続き、ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓタグおよびオープンリーディングフレームを閉じる２つの終止コドンによって終止する、１つまたは複数の２１マーのネオエピトープアミノ酸配列に融合したＮ末端切断型ＬＬＯ：ｐＨｌｙ−ｔＬＬＯ−２１マー＃１−４×グリシンリンカーＧ１−２１マー＃２−４×グリシンリンカーＧ２−・・・−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−６×Ｈｉｓタグ−２×終止コドンをコードする核酸配列が含まれる。別の実施形態において、前記構築物の発現は、ｈｌｙ遺伝子プロモーター配列または当該分野において公知で、本明細書でさらに開示したその他の適切なプロモーター配列によって駆動される。各２１マーのネオエピトープ配列はまた、本明細書で開示したｔＬＬＯ、切断型ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴアミノ酸配列などの免疫原性ポリペプチドに融合することができることを当業者は理解するだろう。
【０６９２】
反復を最小限にするために、様々なリンカー配列をネオエピトープ間に分散させる。これによって、可能性のある２次構造を低減させ、それによって挿入物を含むプラスミドのＬｍ組換えベクター株集団内での効率的な転写、翻訳、分泌、維持または安定化を可能にする。
【０６９３】
ＤＮＡ合成は、少なくとも１つのネオエピトープに融合したｔＬＬＯまたはｔＡｃｔＡまたはＡｃｔＡまたはＰＥＳＴアミノ酸配列を含むオープンリーディングフレームを含む構築物を含むヌクレオチド配列を業者に注文することによって達成する。さらに、または代わりに、複数のネオエピトープを１つまたは複数のリンカー４×グリシン配列によって分離する。さらに、または代わりに、所望する配列を含むために、分子生物学的技術：例えば、特異的な重複プライマーおよび特異的プライマーによるソーイングＰＣＲ、または適切な酵素（例えば、リガーゼ）による様々なヌクレオチド配列のライゲーション、任意選択でその後の制限酵素による切断（ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）およびそれらの任意の組み合わせによって、挿入物を構築する。
【０６９４】
一実施形態において、反復を最小限にするために、様々なリンカー配列をネオエピトープ間に分散させる。これによって、可能性のある２次構造を低減し、それによって挿入物を含むプラスミドのＬｍ組換えベクター株集団内での効率的な転写、翻訳、分泌、維持または安定化を可能にする。
【０６９５】
選択したＤＮＡ挿入物は、当該分野の標準技術（例えば、ＰＣＲ、ＤＮＡ複製、−バイオ複製（ｂｉｏ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、オリゴヌクレオチド化学合成）によって合成し、例えば、実施例８で提示したようなプラスミドにクローニングする。プラスミドは、次にトランスフェクトされるかまたはＬｍベクターにコンジュゲートされる。さらに、または代わりに、挿入物をファージベクターに組み込み、ファージ感染によってＬｍベクターに挿入する。構築物の確認は、当該分野で公知の技術、例えば、挿入物特異的プライマーによる細菌コロニーＰＣＲまたはプラスミドの精製および少なくとも挿入物を含む部分のシーケンシングを利用して実施する。
【０６９６】
（実施例２０：Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫モデルにおけるＬｍネオ抗原構築物の治療効果）
対応する健康な細胞には存在しない非同義変異をがん細胞中で同定した後、治療標的を選択する基礎を形成するために、典型的には、がんドライバー対パッセンジャー状態などの変異による機能的影響を決定することに多大な努力が注がれている。しかし、これらの変異の免疫原性を定義するか、またはそれらが誘発する免疫応答を特徴付けることには、ほとんど注意が払われていない。免疫学的展望から、中心的免疫寛容に影響されないネオ抗原を作製することができるので、変異は特に強力なワクチン接種の標的となり得る。これらの変異の免疫原性を定義するか、またはそれらが誘発する免疫応答を特徴付けるために注意を払った場合、典型的には、免疫化のためにペプチド中に含まれる単一の変異に非同義変異を絞ることに努力が向けられる。例えば、Ｃａｓｔｌｅらでは、Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞中で９６２の非同義点変異が同定され、発現した遺伝子中ではそれらの変異のうち５６３が同定された。低偽陽性率（ＦＤＲ）信頼値、発現した遺伝子中における位置、予測免疫原性を含む選択基準に基づいて、これらの変異のうち５０を選択した。これらの５０のうち１６のみが免疫化したマウスにおいて免疫応答を誘発し、この１６のうち１１のみが変異したエピトープを優先的に認識する免疫応答を誘導した。次に、変異のうち２が腫瘍生育阻害を誘導することが見いだされた。例えば、本明細書にあらゆる目的のために全体を参考として組み込んだＣａｓｔｌｅら（２０１２年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７２巻（５号）：１０８１〜１０９１頁を参照のこと。しかし、以下の実験において記載した構築物において、Ｎｅｏ２０およびＮｅｏ３０が腫瘍生育の制御においてより良いことがデータによって示唆される。これらの構築物において、Ｎｅｏ−１２は１２の最も免疫原性のエピトープを含有する。Ｎｅｏ１２は、両方の腫瘍制御エピトープ（Ｍｕｔ３０およびＭｕｔ４４、実施例１９の表５において前記で開示した通り）を含有する。Ｎｅｏ２０は、Ｍｕｔ３０−Ｍｕｔ２−Ｍｕｔ３−Ｍｕｔ３−Ｍｕｔ４・・・Ｍｕｔ１９を含有する。Ｎｅｏ３０は、Ｍｕｔ３０−Ｍｕｔ２−Ｍｕｔ３・・・Ｍｕｔ−２９を含有する。Ｎｅｏ２０およびＮｅｏ３０は、Ｃａｓｔｌｅによって同定された腫瘍制御エピトープの１つ（Ｍｕｔ３０）しか含有せず、次にこれらは免疫原性および非免疫原性エピトープの両方を含有する。複数の腫瘍制御エピトープを有さず、多くの非腫瘍制御エピトープおよびさらには非免疫原性エピトープを含有するにも関わらず、データによって、Ｎｅｏ２０およびＮｅｏ３０が腫瘍生育の制御においてより良いことが示唆される。
【０６９７】
実験１
Ｌｍネオ抗原構築物によって生成する治療応答を決定するために、Ｂ１６Ｆ１０  Ｃ５７Ｂｌ／６マウス黒色腫モデルにおいて腫瘍生育に対するこのような構築物の治療効果を調べる腫瘍退縮研究を設計した。具体的に、Ｌｍネオ抗原ベクターをＣａｓｔｌｅらによって同定され、実施例１９の表５に示すような１２のネオ抗原（Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ１２、これは、Ｍｕｔ３０、Ｍｕｔ５、Ｍｕｔ１７、Ｍｕｔ２０、Ｍｕｔ２２、Ｍｕｔ２４、Ｍｕｔ２５、Ｍｕｔ４４、Ｍｕｔ４６、Ｍｕｔ４８およびＭｕｔ５０を含有する）または２０のネオ抗原（Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ２０、これは、Ｍｕｔ３０、Ｍｕｔ２、Ｍｕｔ３、Ｍｕｔ４、Ｍｕｔ５、Ｍｕｔ６、Ｍｕｔ７、Ｍｕｔ８、Ｍｕｔ９、Ｍｕｔ１０、Ｍｕｔ１１、Ｍｕｔ１２、Ｍｕｔ１３、Ｍｕｔ１４、Ｍｕｔ１５、Ｍｕｔ１６、Ｍｕｔ１７、Ｍｕｔ１８、Ｍｕｔ１９およびＭｕｔ２０を含有する）で設計した。例えば、本明細書にあらゆる目的のために全体を参考として組み込まれるＣａｓｔｌｅら（２０１２年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７２巻（５号）：１０８１〜１０９１頁を参照のこと。
【０６９８】
腫瘍細胞株増大。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞株を、１０％ＦＢＳ（５０ｍＬ）および１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（５ｍＬ）を含有するｃ−ＲＰＭＩ中で培養した。ｃ−ＲＰＭＩ培地は以下の成分を含む：
【表Ａ】
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【０６９９】
腫瘍接種。０日目に、Ｂ１６Ｆ１０細胞をトリプシン処理し、培地で２回洗浄した。細胞を計数し、注射用に１×１０５細胞／ＰＢＳ  ２００μｌの濃度で再懸濁した。次に、Ｂ１６Ｆ１０細胞を各マウスの側腹部に皮下移植した。マウスは研究３日目にワクチン接種した。腫瘍は、サイズが直径１２ｍｍに達するまで、週に２回測定して記録した。一旦腫瘍が屠殺基準に合致したら、マウスを安楽死させ、腫瘍を切除して測定した。
【０７００】
免疫療法処置。３日目に、免疫療法および処置を開始した。群をＬｍ（ＩＰ）で処置し、２回ブーストした。詳細を表８に挙げる。
【０７０１】
【表８】
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【０７０２】
免疫療法処置の調製
１．ＰＢＳのみ−２００μＬ／マウス  ＩＰ。
２．ＬｍｄｄＡ−２７４（力価：１．５×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）
ａ．−８０℃からのバイアル１本を３７℃水浴中で解凍。
ｂ．１４，０００ｒｐｍで２分間回転して、上清を廃棄。
ｃ．ＰＢＳ１ｍＬで２回洗浄してＰＢＳを廃棄。
ｄ．ＰＢＳに再懸濁して、最終濃度５×１０８ＣＦＵ／ｍＬにする。
３．Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ１２（力価：１．５９×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）およびＬｍ−Ｃａｓｔｌｅ２０（力価：１．６×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）
ａ．−８０℃からのバイアル１本を３７℃水浴中で解凍。
ｂ．１４，０００ｒｐｍで２分間回転して、上清を廃棄。
ｃ．ＰＢＳ１ｍＬで２回洗浄してＰＢＳを廃棄。
ｄ．ＰＢＳに再懸濁して、最終濃度５×１０８ＣＦＵ／ｍＬにする。
【０７０３】
図２３Ｂに示したように、腫瘍の生育は対照群（ＰＢＳおよびＬｍｄｄＡ２７４）と比較してＬｍ−Ｎｅｏ１２およびＬｍ−Ｎｅｏ２０によって阻害された。ＬｍｄｄＡ２７４はｌｉｓｔｅｒｉａ対照で、空のベクターである。これは、切断型ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）を含むが、ネオエピトープは付着していない。さらに、２０のネオ抗原を含有するＬｍ−Ｎｅｏ２０は、１２のネオ抗原を含有するＬｍ−Ｎｅｏ１２よりも大きな程度まで腫瘍生育を阻害した。同様に、Ｌｍ−Ｎｅｏ２０およびＬｍ−Ｎｅｏ１２はそれぞれ、対照群と比較すると生存期間の延長を引き起こし、Ｌｍ−Ｎｅｏ２０は最も予防効果が大きかった（図２３Ｃ）。これらのデータは、ネオエピトープを有するＬｍによるワクチン接種は抗腫瘍効果をもたらすことができ、ネオエピトープの数が増加するにつれて抗腫瘍効果が増大することを示す。
【０７０４】
実験２
異なるＬｍネオ抗原構築物によって生成する治療応答をさらに比較するために、Ｂ１６Ｆ１０  Ｃ５７Ｂｌ／６マウス黒色腫モデルにおいて腫瘍生育に対するこのような構築物の治療効果を調べる腫瘍退縮研究を設計した。具体的に、Ｌｍネオ抗原ベクターをＣａｓｔｌｅらによって同定された１２のネオ抗原（Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ１２）、２０のネオ抗原（Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ２０）または３９のネオ抗原（Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ３９；リンカーなし、２０〜２９なし（Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ３０））で設計した。例えば、本明細書にあらゆる目的のために参考として全体を組み込んだＣａｓｔｌｅら（２０１２年）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７２巻（５号）：１０８１〜１０９１頁を参照のこと。
【０７０５】
腫瘍細胞株増大。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞株を、１０％ＦＢＳ（５０ｍＬ）および１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（５ｍＬ）を含有するｃ−ＲＰＭＩ中で培養した。
【０７０６】
腫瘍接種。０日目に、Ｂ１６Ｆ１０細胞をトリプシン処理し、培地で２回洗浄した。細胞を計数し、注射用に１×１０５細胞／ＰＢＳ  ２００μｌの濃度で再懸濁した。次に、Ｂ１６Ｆ１０細胞を各マウスの右側腹部に皮下移植した。研究４日目にマウスにワクチン接種した。サイズが１５００ｍｍ３の体積に達するまで、週に２回腫瘍を測定して記録した。一旦腫瘍が屠殺基準に合致したら、マウスを安楽死させ、腫瘍を切除して測定した。
【０７０７】
免疫療法処置。４日目に、免疫療法および処置を開始した。研究が終了するまで、動物を７日に１回に処置した。群を表９に詳細を示したＰＢＳ、ＬｍｄｄＡ２７４、Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ１２、Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ２０、リンカーなし２０〜２９なしのＬｍ−Ｃａｓｔｌｅ３９のいずれかで処置した。
【０７０８】
【表９】
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【０７０９】
免疫療法処置の調製
１．ＰＢＳのみ−２００μＬ／マウス  ＩＰ。
２．ＬｍｄｄＡ−２７４（力価：１．７×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）
ａ．−８０℃からのバイアル１本を３７℃水浴中で解凍。
ｂ．１４，０００ｒｐｍで２分間回転して、上清を廃棄。
ｃ．ＰＢＳ１ｍＬで２回洗浄してＰＢＳを廃棄。
ｄ．ＰＢＳに再懸濁して、最終濃度５×１０８ＣＦＵ／ｍＬにする。
３．Ｌｍ−Ｃａｓｔｌｅ１２（力価：１．５９×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）およびＬｍ−Ｃａｓｔｌｅ２０（力価：１．６×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）およびＬｍ−Ｃａｓｔｌｅ３９（力価：１×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）
ａ．−８０℃からのバイアル１本を３７℃水浴中で解凍。
ｂ．１４，０００ｒｐｍで２分間回転して、上清を廃棄。
ｃ．ＰＢＳ１ｍＬで２回洗浄してＰＢＳを廃棄。
ｄ．ＰＢＳに再懸濁して、最終濃度５×１０８ＣＦＵ／ｍＬにする。
【０７１０】
採取の詳細。各マウスの脾臓を、ｃ−ＲＰＭＩ培地５ｍｌを含有する個々の試験管に収集した。詳細なステップを以下に記載する。研究の終了時に全腫瘍を切除して測定した。
１．滅菌したピンセットおよびハサミを使用して脾臓を採取する。
２．２枚のスライドガラスまたは３ｍＬシリンジのプランジャーの背部を使用して、各脾臓を洗浄培地（ＲＰＭＩのみ）中ですりつぶす。
３．培地中の細胞を１５ｍＬ試験管に移す。
４．室温で１，０００ＲＰＭで５分間、細胞をペレットにする。
５．上清を廃棄し、残存する洗浄緩衝液中で穏やかに細胞を再懸濁し、細胞ペレットに脾臓当たりＲＢＣ溶解緩衝液２ｍＬを添加する。試験管を軽くたたいて細胞を溶解緩衝液で穏やかに混合し、１分間待つ。
６．すぐにｃ−ＲＰＭＩ培地１０ｍＬを細胞懸濁液に添加して溶解緩衝液を不活化する。
７．室温で１，０００で５分間、細胞を回転させる。
８．細胞をセルストレーナーに通過させ、ｃ−ＲＰＭＩ  １０ｍＬでもう１回洗浄する。
９．血球計数計／ｍｏｘｉ  ｆｌｏｗを使用して細胞を計数し、トリパンブルー染色によって生存度を調べる。各脾臓から約１〜２×１０８細胞が生じるだろう。
１０．染色用に細胞を分割する。
１１．ｉｍｍｕｄｅｘデキストラマー染色のプロトコールに従うが、染色緩衝液の代わりに２．４Ｇ２中に細胞表面抗体（ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ）を添加することは唯一例外である（ｗｗｗ．ｉｍｍｕｄｅｘ．ｃｏｍ／ｍｅｄｉａ／１２１３５／ｔｆ１００３．０３＿ｇｅｎｅｒａｌ＿ｓｔａｉｎｉｎｇ＿ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ＿ｍｈｃ＿ｄｅｘｔｒａｍｅｒ．ｐｄｆ）。
【０７１１】
ＣＤ８＋Ｔ細胞応答。抗原提示細胞中においてＬｍ−Ｎｅｏ２０構築物の発現および分泌を測定するために、２５Ｄアッセイを上記で説明したように実施する。図２４Ａは陽性対照（ＰＳＡ−サバイビン−ＳＩＩＮＦＥＫＬ）であり、図２４Ｂは陰性対照（ＳＩＩＮＦＥＫＬを含まないＰＳＡ−サバイビン）であり、図２４ＣはＬｍ−Ｎｅｏ２０（Ｃ末端にＳＩＩＮＦＥＫＬタグを含む）である。図２４に示したように、Ｌｍ−Ｎｅｏ２０が発現して分泌されるが、陽性対照と比較して低いレベルしかない。しかし、これらの低レベルの分泌にも関わらず、ＳＩＩＮＦＥＫＬに対して特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が認められた。図２５は、「低分泌」Ｌｍ−Ｎｅｏ２０構築物に対するＳＩＩＮＦＥＫＬ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。図２５に示したように、ＣＤ８＋Ｔ細胞の約２０％がＬｍ  Ｎｅｏ２０構築物中の抗原に特異的である。
【０７１２】
抗腫瘍効果。図２６Ａに示したように、腫瘍の生育は対照群（ＰＢＳおよびＬｍｄｄＡ２７４）と比較してＬｍ−Ｎｅｏ１２、Ｌｍ−Ｎｅｏ２０およびＬｍ−Ｎｅｏ３０によって阻害された。さらに、３０のネオ抗原を含有するＬｍ−Ｎｅｏ３０は、２０のネオ抗原を含有するＬｍ−Ｎｅｏ２０よりも大きな程度まで腫瘍生育を阻害し、Ｌｍ−Ｎｅｏ２０は、１２のネオ抗原を含有するＬｍ−Ｎｅｏ１２よりも大きな程度まで腫瘍生育を阻害した。同様に、Ｌｍ−Ｎｅｏ３０、Ｌｍ−Ｎｅｏ２０およびＬｍ−Ｎｅｏ１２はそれぞれ、対照群と比較すると生存期間の延長を引き起こし、Ｌｍ−Ｎｅｏ３０は最も予防効果が大きく、Ｌｍ−Ｎｅｏ２０は次に予防効果が大きかった（図２３Ｃ）。これらのデータは、ネオエピトープを有するＬｍによるワクチン接種は抗腫瘍効果をもたらすことができ、ネオエピトープの数が増加するにつれて抗腫瘍効果が増大することを示す。
【０７１３】
（実施例２１：フレームシフト変異によって生じた可能性のあるネオ抗原の同定）
非同義体細胞ミスセンス変異をベースにしたネオエピトープのレベルは、適応症間および適応症内で著しく変化する。適応症間および適応症内での変動の例を表１０に示す。
【０７１４】
【表１０】
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【０７１５】
ネオエピトープの存在が多いことが応答にとって重要な要因で有り得、ネオエピトープの少ない腫瘍は応答しにくい可能性がある。腫瘍特異的、非同義、体細胞、ミスセンス変異の数が少ない腫瘍についての潜在的なネオエピトープの数を増加させるために、腫瘍特異的フレームシフト変異を有する遺伝子によってコードされる無意味なペプチドを使用することができる。前立腺腺癌（ＰＲＡＤ）、膵臓腺癌（ＰＡＡＤ）、浸潤性乳癌（ＢＲＣＡ）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（ＯＶ）および甲状腺癌についての変異データは、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）から得られた。これらの疾患コホートにおける患者は、単一のヌクレオチド改変体（ＳＮＶ）の低変異率（低ミスセンス変異率）によって特徴付けられる。フレームシフト変異から生成したネオ抗原の同定によって、Ｌｍ技術の標的を拡大することができる。その目的のため、ＴＣＧＡ疾患コホート内の各患者の全フレームシフト変異を同定し、得られたネオ抗原ペプチドを計算した（表１１、図２７）。フレームシフト変異のネオ抗原ペプチドの平均数は、甲状腺癌の１．５６から膵臓腺癌の２０．０２までの範囲であった。ペプチド配列の長さの平均は、膵臓腺癌の２６．９０から甲状腺癌の３１．１０までの範囲であった。コホート全体にわたるペプチドの最大の長さは４０３アミノ酸長であった。ＭＨＣクラスＩ分子は、アミノ酸長８〜１１のペプチドに結合することができる。フレームシフト変異によって生成した非自己ペプチド配列は、Ｌｍ技術で陽性免疫応答を誘発することとなる数多くのペプチド断片を提示する能力を有する。
【０７１６】
【表１１】
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【０７１７】
（実施例２２：腫瘍特異的フレームシフト変異によって得られたネオ抗原は腫瘍生育を制御することができる）
フレームシフト変異によって得られたネオ抗原を含有するＬｍ構築物が腫瘍生育を制御することができるかどうかを決定するために、空のベクター陰性対照株ＬｍｄｄＡ−２７４と比較したＬｍネオ抗原ベクター（Ｌｍ  Ｎｅｏ１２、Ｌｍフレームシフト１およびＬｍフレームシフト２）の治療効果を調べる腫瘍退縮研究を実施した。Ｌｍ  Ｂ１６Ｆ１０フレームシフト１キメラタンパク質は、配列番号６１（配列番号６２によってコードされる）に示す。Ｌｍ  Ｂ１６Ｆ１０フレームシフト２キメラタンパク質は、配列番号６３（配列番号６４によってコードされる）に示す。第３のＬｍ  Ｂ１６Ｆ１０フレームシフトキメラタンパク質は、配列番号６５（配列番号６６によってコードされる）に示す。
【０７１８】
腫瘍細胞株増大：Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を、１０％ＦＢＳ（５０ｍＬ）および１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（５ｍＬ）を含有するｃ−ＲＰＭＩ中で培養した。
【０７１９】
腫瘍接種：０日目（２０１６年９月２６日）に、Ｂ１６Ｆ１０細胞をトリプシン処理し、培地で２回洗浄した。細胞を計数し、注射用に１×１０５細胞／ＰＢＳ  ２００μｌの濃度で再懸濁した。Ｂ１６Ｆ１０細胞を各マウスの右側腹部に皮下移植した。全動物を、無作為化された群に入れた。マウスは研究３日目（２０１６年９月２９日）にワクチン接種した。
【０７２０】
ワクチン／Ｌｍ処置：ワクチンおよび処置を３日目に開始した。群をＬｍ（２００μＬ／ＩＰ／マウス）で処置し、時期を定めずにブーストした（詳細は表１２に挙げた）。
【０７２１】
ワクチン／処置の調製：
ａ．−８０℃からのバイアル１本を３７℃水浴中で解凍。
ｂ．１４，０００ｒｐｍで２分間回転して、上清を廃棄。
ｃ．ＰＢＳ１ｍＬで２回洗浄してＰＢＳを廃棄。
ｄ．ＰＢＳに再懸濁して、最終濃度５×１０８ＣＦＵ／ｍＬにする。
【０７２２】
【表１２】
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【０７２３】
結果：図２８で示したように、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞から得られたフレームシフト変異（フレームシフト１またはフレームシフト２）を分泌する、Ｌｍ構築物で免疫化したＢ１６Ｆ１０腫瘍を有するマウスは、空のベクター陰性対照（ＬｍｄｄＡ−２７４）のみで処置した腫瘍を有する動物と比較して、腫瘍生育が減少した。Ｎｅｏ１２は陽性対照として使用した。
【０７２４】
開示のある種の特徴を本明細書に例示して記載するが、当業者であれば、多くの改変、置換、変化および同等物に想到するものと予想される。したがって、添付の特許請求の範囲は、本開示の精神の範囲内にあるこのような改変および変化全てを包含するためのものであることを理解されたい。
【図１Ａ】
2019503186.tif 000016
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
2019503186.tif 000020
【図２Ｄ】
2019503186.tif 000021
【図３Ａ】
2019503186.tif 000022
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2019503186.tif 000024
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
2019503186.tif 000030
【図６ＡＢ】
2019503186.tif 000031
【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４ＡＢ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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