(57)【要約】【課題】  本発明は、例えばＥＤＳ−ＮＨＳ接合方法を使用する、細胞外マトリックス成分、例えばコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンもしくはＲＧＤ配列、又は成長因子、例えばＴＧＦベータでのセルロースナノ原繊維（CNF）の修飾と、ヒトの皮膚又は神経組織などの組織モデルの３Ｄバイオプリンティングのためのバイオインクの調製とに関する。【解決手段】  セルロースナノ原繊維は、３Ｄバイオプリントされた構築物への酸素の拡散及び栄養素の拡散にきわめて重要である、優れたプリンティングフィディリティーを提供する。表面に接合された細胞外マトリックス成分は、接着部位を提供すること又は分化プロセスを誘導することによって生物学的活性を誘導する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースナノ原繊維（CNF）を、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン又はＲＧＤ配列のような細胞外マトリックス成分、ラミニン、ＴＧＦベータのような成長因子、又は骨形成タンパク質で修飾する方法。
【請求項２】
例えばＥＤＳ−ＮＨＳ接合方法を使用して実施した、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
３Ｄプリンティングのためのバイオインクを調製するための、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載の前記修飾されたセルロースナノ原繊維（CNF）を含有するバイオインク。
【請求項５】
細胞と共に又は細胞なしで、細胞外マトリックス成分で修飾されたＣＮＦをバイオインクとして使用することを含む、３Ｄバイオプリンティング方法。
【請求項６】
組織様構築物を生成する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組織様構築物が、創薬、及び／もしくは化粧品の試験のために、ならびに／又は疾患モデルとして使用される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞外マトリックス成分で修飾されたＣＮＦがアルギン酸塩と一緒に使用される、請求項１〜３又は５もしくは６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記細胞外マトリックス成分で修飾されたＣＮＦがヒアルロン酸と一緒に使用される、請求項１〜３又は５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
細胞外マトリックス成分で修飾されたセルロースナノ原繊維（CNF）中に生きている線維芽細胞を含有する、３Ｄバイオプリントされた生きている組織。
【請求項１１】
バイオインクプリントされた格子間の空間が、栄養素、酸素、タンパク質、及び／又は成長因子の拡散を可能にする、請求項１０に記載の３Ｄバイオプリントされた生きている組織。
【請求項１２】
請求項１に記載の前記修飾されたセルロースナノ原繊維（CNF）を使用して調製された、請求項１０又は１１に記載の３Ｄバイオプリントされた生きている組織。
【請求項１３】
培地にＴＧＦベータを添加することによって線維芽細胞が刺激されている、３Ｄバイオプリントされた生きている真皮組織。
【請求項１４】
前記線維芽細胞が、細胞外マトリックス成分で修飾されたセルロースナノ原繊維（CNF）との組合せで存在する、請求項１３に記載の３Ｄバイオプリントされた生きている真皮組織。
【請求項１５】
前記セルロースナノ原繊維（CNF）が、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン又はＲＧＤ配列のような細胞外マトリックス成分、ラミニン、ＴＧＦベータのような成長因子、又は骨形成タンパク質で修飾されている、請求項１４に記載の３Ｄバイオプリントされた生きている真皮組織。
【請求項１６】
角化細胞がその上で培養されて表皮を築き、そのようにして皮膚様組織を形成する、請求項１０〜１５のいずれかに記載の３Ｄバイオプリントされた生きている組織。
【請求項１７】
請求項１に記載の修飾された前記セルロースナノ原繊維（CNF）を含む、３Ｄバイオプリントされた神経組織。
【請求項１８】
前記細胞外マトリックス成分で修飾された前記ＣＮＦが、細胞と共にもしくは細胞なしで３Ｄバイオプリンティングするためのバイオインクとして、創薬、及び／もしくは化粧品の試験のために使用されるべき組織様構築物として、ならびに／又は疾患モデル、及び／もしくは移植として使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
バイオインクプリントされた格子間の空間が栄養素、酸素、タンパク質、及び／又は成長因子の拡散を可能にする、生きている線維芽細胞を含有する３Ｄバイオプリントされた生きている組織。
【請求項２０】
角化細胞がその上で培養されて表皮を築き、そのようにして皮膚様組織を形成する、３Ｄバイオプリントされた生きている真皮組織。
【請求項２１】
３Ｄバイオプリントされた神経組織を調製するための、請求項１〜３又は５〜９に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに従って作製した組織の移植によって、組織欠損を患う動物及び／又はヒトを治療する方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれかに従って作製した３Ｄバイオプリントされた材料の移植によって、組織の欠失を患う動物及び／又はヒトを治療する方法。
【請求項２４】
それだけに限定されないが皮膚の欠損を含む組織を、請求項１〜２３のいずれかによって作製した３Ｄバイオプリントされた組織を使用して置き換えることによって、動物及び／又はヒトを治療する方法。
【請求項２５】
前記細胞外マトリックス成分で修飾されたＣＮＦを、ＵＶ架橋可能な基で修飾されたゼラチン又はコラーゲンと一緒に使用し、ＵＶ光によって架橋が生じる、請求項１〜３又は５〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
Ｉ型コラーゲンの産生を上方調節するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の３Ｄプリント可能なバイオインクの使用。
【請求項２７】
ＩＩ型コラーゲン及び／又はプロテオグリカンの産生を上方調節するための、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の３Ｄプリント可能なバイオインクの使用。
【請求項２８】
アルツハイマー病又はパーキンソン病など、それだけに限定されないが、神経組織の欠損を含む組織を、請求項１〜２７のいずれかによって作製した３Ｄバイオプリントされた組織を使用して置き換えることによって、動物及び／又はヒトを治療する方法。
【請求項２９】
細胞接着を向上させる又は低減させるための、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の３Ｄプリント可能なバイオインクの使用。
【請求項３０】
細胞生存率を向上させる又は低減させるための、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の３Ｄプリント可能なバイオインクの使用。
【請求項３１】
細胞増殖を向上させる又は低減させるための、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の３Ｄプリント可能なバイオインクの使用
【請求項３２】
幹細胞の分化の誘導を向上させる又は低減させるための、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の３Ｄプリント可能なバイオインクの使用。
【請求項３３】
間葉系幹細胞を含む幹細胞の増殖、及び細胞分化を刺激して軟骨細胞を形成するための、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の３Ｄプリント可能なバイオインクの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  本発明は、細胞外マトリックス（ECM）成分、例えばコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、又はペプチドモチーフ、例えばＲＧＤもしくはＧＲＧＤＳＰ、ラミニン、あるいは成長因子、例えばＴＧＦベータ又はＢＭＰ２又はＢＭＰ７で修飾されたセルロースナノ原繊維をベースとした材料と、接着、増殖及び／又は分化などの細胞の運命プロセスを制御する３Ｄバイオプリンティングバイオインクとしてのそれらの使用とに関する。修飾されたセルロースナノ原繊維をベースとしたバイオインクを、ヒト又は動物細胞を使用する３Ｄバイオプリンティングプロセスのために使用してもよい。細胞表面上でインテグリンと相互作用する細胞外マトリックス成分でナノセルロースを修飾する利点は、細胞運命プロセスを制御することである。ＥＣＭで修飾されたセルロースナノ原繊維は、細胞に指示を送る生体材料と同様の挙動を示す。生体不活性である未修飾のセルロースナノ原繊維（CNF）を細胞と一緒に使用する場合、細胞は、細胞の運命プロセスに影響を与えて細胞死をもたらす細胞接着性を欠如することが多い。対照的に、例えば、インテグリンを結合した細胞表面のための接着部位を与えることによって細胞と情報交換することができる分子で修飾されたＣＮＦは、良好な細胞生存率、及び増殖の増強をもたらす。さらに、分化プロセスを開始させるように、細胞への指示を与えることができ、続いて幹細胞は、例えば、軟骨細胞又は骨芽細胞となる。本発明の一態様において、セルロース原繊維の修飾は水性培地中で行われ、ＣＮＦのコロイド安定性に影響を与えない。修飾されたＣＮＦは、このように使用することができるか、又は未修飾のＣＮＦと混合して３Ｄバイオプリンティングのためのバイオインクを生成することができる。本明細書に記載の本発明によると、架橋を行うことができる、このようなバイオインク中の第２の成分を使用することが有益である。このような成分は、チラミンで接合されたヒアルロン酸であってもよく、これはホースラディッシュペルオキシダーゼ及び過酸化水素の添加後に共有結合で架橋される。架橋可能な成分の別の例としてはアルギン酸塩があり、これは塩化カルシウムを添加する条件で架橋される。別の成分はフィブリノーゲンであってもよく、これはトロンビンを添加する条件で架橋される。別の成分は、ＵＶ架橋可能な基で修飾されたゼラチン又はコラーゲンであってもよく、架橋はＵＶによって得られる。本発明に記載したバイオインクは、細胞と混合し、３Ｄバイオプリントされることができる。高い多孔性を有するプリントされた構築物をもたらすＣＮＦの剪断減粘性特性は、高い剪断速度下で粘性を低減させるために好都合であるため、最新の発明のもとでは良好なプリンティングフィディリティーが達成される。このことは、多孔性構造は酸素及び栄養素の良好な拡散を可能にするため、バイオリアクターでのインビトロの細胞培養のために又は動物及び／もしくはヒトにおける移植のためにきわめて重要である。本発明に記載したバイオインクは、細胞伸展、及びＩ型コラーゲン産生の増強をもたらす、ヒト線維芽細胞の付着を数カ所で示している。これは、移植用の皮膚を成長させるために、又は、化粧品、ヘルスケア製品もしくは薬剤を試験���るための皮膚様モデルを成長させるために重要である。本発明の別の適用は、損傷した神経を修復するために又はアルツハイマー病もしくはパーキンソン病などの疾患を調べるモデルとして使用することができる神経ネットワークの形成にきわめて重要な、神経細胞の接着である。別の適用は、生存率、増殖を制御し、幹細胞の分化を誘導することである。幹細胞は、骨髄由来（間葉系幹細胞、MSC）、もしくは脂肪組織由来（脂肪幹細胞、ASC）であってもよく、又は人工多能性幹細胞（iPSC）使用してもよい。本発明に記載したバイオインクは、接合された成長因子、例えばＴＧＦベータもしくはＢＭＰ、又は接着分子、例えばラミニンとの相互作用を通して、幹細胞分化に影響を与えることができる。様々な供給源のセルロースナノ原繊維が本発明に含まれる。これらは、木材の一次細胞壁に由来するものであってもよく、細菌によって産生してもよく、又は被嚢動物から単離してもよい。
【背景技術】
【０００２】
[0002]  ３Ｄバイオプリンティングは、健康に関連する多くの問題を解決することができる最先端技術である。３Ｄバイオプリンティングには、生物学的材料を積層することによっていかなる組織又は器官でも複製することができる可能性がある。３Ｄバイオプリンティングには、高解像度で細胞を堆積させることができ、またシグナル発生分子を添加することもできる、３Ｄバイオプリンターが必要である。しかし、細胞は単独では堆積することができない。細胞には、バイオインクと呼ばれる支持材料が必要である。バイオインクの機能は、所定のパターンの生細胞の堆積を容易にし、次いで、細胞がインビトロ又はインビボで培養される際の足場となることである。バイオインクの最も重要な特性の中に、流動学的特性がある。すべてのポリマー溶液は剪断減粘性であり、剪断減粘性とは、剪断速度が上がると粘性が低減することを意味する。セルロースナノ原繊維は、細菌によって産生されても又は植物体の一次もしくは二次細胞壁から単離されてもよく、直径は、８〜１０ｎｍで、マイクロメーター長まであってもよい。セルロースナノ原繊維は、親水性であり、したがって、その表面上に水を結合する。セルロースナノ原繊維は、固体含量が低い（１〜２％）ヒドロゲルを形成する。ＣＮＦは、剪断減粘性がきわめて高く、高いゼロ剪断粘度を有する。水に覆われたＣＮＦ表面の親水性の性質は、ＣＮＦがタンパク質を吸着するのを妨げ、ＣＮＦを生体不活性にしている。本明細書で教示したように、細胞はＣＮＦ表面を認識しないが、生体適合性に関する限り、異物反応がないのでこれは利点である。しかし、ＣＮＦは生体不活性であるため、細胞付着を促進しない。本明細書において開示したように、多くのタイプの細胞は、移動し、増殖し、分化し、細胞外マトリックスを作り出し、組織になるために、細胞外マトリックス成分の表面又はネットワークに付着されることが必要である。本発明によると、細胞付着を可能にする細胞外マトリックス成分は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、及びラミニンである。細胞のプロセスに影響を与える細胞外マトリックスの重要な成分の別の一群は、成長因子、例えばＴＧＦベータ及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ２又はＢＭＰ７）である。図１は、どのような様々なＥＣＭ成分が、バイオ接合プロセスを通してセルロース骨格上へ添加されうるかを示す。本出願において説明したように、これらは細胞増殖を刺激し、また細胞分化を誘導する。細胞外マトリックス成分はバイオインクに添加することができるが、これらは培地交換の間に容易に流れ落ちる、又はインビボ条件では拡散してしまう。したがって、これらをバイオインク中のＣＮＦネットワークに結合させることが好都合である。このようにして、プリンティングフィディリティーを提供するＣＮＦの独特な流動学的特性を所望の生物学的特性と組み合わせて、細胞機能を制御し、組織形成を促進する。ＥＣＭ成分で接合されたＣＮＦをベースとしたバイオインクは、細胞に指示を送る生体材料として挙動することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
[0003]  ＣＮＦを化学的に修飾（生体分子に関しては、接合又はバイオ接合）する様々な方法がある。バイオ接合にＣＮＦが達することができるかは、セルロース骨格のヒドロキシル基含量によって判定される。幾つかの化合物は、ヒドロキシル残基を、求核置換に好適な脱離基を有する、中間体である反応性誘導体へ転換することができる。最も一般的なセルロースのための活性化剤は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボニルジイミダゾール、エポキシド化合物、過ヨウ素酸ナトリウム、塩化トレシル及び塩化トシル、臭化シアン、塩化シアヌル、これらに加え、幾つかのクロロギ酸エステル誘導体である。ただし、活性化プロセスには、水溶液中の反応性中間生成物の加水分解を防止するために、乾燥ジオキサン、アセトン、ＴＵＦ、ＤＭＦ、又はＤＭＳＯなどの非水性溶液が必要である。水性の環境において無水物、クロロ酢酸を用いて、又は（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−イル）オキシダニルを用いるラジカル媒介の酸化によってヒドロキシル基を修飾して、架橋剤としてカルボジイミドを使用するさらなる接合のためのカルボキシレート官能基を生じさせることができる（１）。本出願では、ＥＣＭ成分の接合のために、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（NHS）を用いるカルボジイミ反応においてセルロース上のカルボン酸を使用した。利用可能なＣＮＦは、セルロースナノ原繊維が生成されるホモジネーションプロセスの前に導入されるカルボキシ基を含有する。カルボキシル化はまた、例えば、ＴＥＭＰＯ反応を使用して実施することができる。この３段階の反応によって、反応で最も重要な工程であるカルボジイミド単位との反応が開始する。ＥＤＣは、カルボン酸と反応して、活性Ｏ−アシルイソ尿素中間体を創出する。これは第一級アミンと直接反応することができるが、ＮＨＳを添加して行う一連の処理はより安定なＮＨＳエステルを形成する。ＮＨＳエステルもまた、第一級アミンと十分に反応するが、生理的ｐＨでカップリングを実施するという利点を有する。ＮＨＳを添加して行う一連の処理もまた収量を向上させる。また、さらに収量を向上させるためには、反応を通してｐＨの調節も行うべきである。ジイミドカップリングは、ｐＨ５．３〜５．５でより迅速に起こり、このｐＨ範囲で反応を開始させることが望ましい。既に述べたように、ＮＨＳが誘導するアミド形成は生理的ｐＨで行うことができ、ｐＨは、元に戻すよう調節すべきである。そうしないとタンパク質の立体構造に影響を与えうるからである。図２に、ＥＣＭ成分のＣＮＦへのバイオ接合のために本発明で用いた反応条件を概略的に示す。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
[0004]  本発明は、細胞外マトリックス成分、例えばコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、又はフィブロネクチンの代わりとなるＲＧＤペプチドで、ならびに接着成分、例えばラミニンで、ならびに成長因子、例えばＴＧＦベータ及びＢＭＰ２又はＢＭＰ７で接合されたセルロースナノ原繊維の調製を記載する。これらの接合された成分は、細胞接着を促進し、細胞生存率及び細胞増殖を向上させ、細胞分化を促進する。本発明において、ヒト皮膚線維芽細胞が、フィブロネクチン及びＲＧＤペプチドと接合されたＣＮＦへ強く付着することが示された。この付着によって、Ｉ型コラーゲン産生を誘導する細胞伸展がもたらされた。本発明に記載される別の修飾は、ＴＧＦベータをＣＮＦへ結合させることである。本明細書では、ＴＧＦベータを接合されたＣＮＦが、間葉系幹細胞を含む幹細胞の増殖、及び軟骨細胞に向かう細胞分化を刺激することを示す。別の例において、本出願は、ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化を示した、ラミニン５２１と接合されたＣＮＦを教示する。本出願におけるＥＤＳ−ＮＨＳ接合を、細胞外マトリックス成分の結合のために使用してきた。これに代えて他の接合方法を使用してもよい。
【０００５】
[0005]  添付図面は、本発明の幾つかの実施形態の特定の態様を示しており、本発明を限定又は定義するために使用されるべきものではない。記載の説明と併せて、これらの図は、本発明の特定の原理を説明するために役立つ。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】[0006]細胞外マトリックス成分、タンパク質、又はペプチドとのセルロースナノ原繊維の修飾を示す概略図である。
【図２】[0007]細胞外マトリックス成（ECM）、タンパク質、又はペプチドとのセルロースナノ原繊維のバイオ接合の反応を示す概略図である。
【図３】[0008]プリンティングフィディリティーを有する線維芽細胞担持バイオインク構築物を示す画像である。本発明によると、これは構築物中の細胞への栄養素及び酸素の輸送のために重要である。
【図４】[0009]ＲＧＤで修飾されたナノセルロースを有するプリントされた構築物中での細胞生存率を示す写真である。緑色のスポットは生細胞を表し、赤色のスポットは死細胞を表す。この例では、細胞生存率は８０％を超えている。
【図５】[0010]培養１日後及び７日後の、プリントされた構築物中の細胞形態を示す画像である。緑色のスポットは細胞骨格を表し、青色のスポットは細胞核を表す。ａ）未修飾のナノセルロース原繊維バイオインク  １日目ｂ）ＲＧＤで修飾されたナノセルロース原繊維  １日目ｃ）ＲＧＤで修飾されたナノセルロース原繊維  ７日目
【図６】[0011]ラミニン５２１をバイオ接合されたナノセルロースバイオインクにおけるｉＰＳＣ生存率を示すグラフである。
【図７】[0012]ラミニン５２１をバイオ接合されたナノセルロースバイオインクのｉＰＳＣ分化に対する効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
[0013]  本発明をより理解しやすくするために、幾つか実施形態の特定の態様の例を以下に示す。決して、以下の実施例が発明の範囲を限定又は定義すると解釈すべきではない。
【０００８】
[0014]  様々な特徴を有する特定の実施形態を参照にして、本発明を説明してきた。当業者には、本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく様々な改変及び変形形態を本発明の実施において行うことができることが明らかとなるであろう。当業者は、これらの特徴を、所与の適用又は設計の要件及び明細に基づき、単独で又は任意の組合せで使用してもよいことを認識するであろう。様々な特徴を含む実施形態はまた、これらの様々な特徴からなりうる、又は実質的にこれらの様々な特徴からなりうる。当業者には、本明細書を考慮し、本発明を実施することから、本発明のその他の実施形態が明らかとなるであろう。提供された本発明の説明は、本質的に例示にすぎず、したがって、本発明の本質から逸脱していない変形形態は本発明の範囲内にあると意図される。
【０００９】
[0015]  本発明の少なくとも１つの実施形態の詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に記載した又は図に示した成分の構成及び配置の詳細に限定されないことを理解されたい。本発明は、その他の実施形態が、又は様々な形で実施もしくは実行されることが可能である。また、本明細書において用いられた表現及び専門用語は、説明を目的とするものであり、限定とみなされるべきでないことを理解されたい。
【実施例】
【００１０】
[0016]  実施例１
[0017]  ＲＧＤペプチドとのバイオ接合、及び皮膚様モデルの３Ｄバイオプリンティング
[0018]  カルボキシメチル化されたセルロースナノ原繊維を、ＥＤＳ−ＮＨＳ接合方法を使用してＲＧＤペプチドで修飾した。その後、２４個の反応ＣＮＦを、カットオフ１０ｋＤの透析チューブの中に２週間置いた。精製した接合されたＣＮＦを、バイオインクの調製に使う未修飾のＣＮＦと混合した。２つの異なるバイオインクを調製した。第１のバイオインクは、ＲＧＤ−ＣＮＦと、塩化カルシウムの添加後に架橋を可能にするアルギン酸塩とから構成された。第２のバイオインクは、チラミンで修飾されたヒアルロン酸の添加によって調製され、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及び過酸化水素を用いて架橋された。いずれのバイオインクとも良好な印刷適性を有した。６００万個の初代ヒト線維芽細胞継代＃３を解凍し、２個の１５０ｃｍ２のＴ−フラスコへ播種した。培養物が約９０％コンフルエントに達したとき、ＴｒｙｐＬＥを使用して細胞を収集し、フラスコを静かに軽くたたいて細胞を表面から剥離させた。トリパンブルー染色を用いて細胞を数え（１．９Ｍ細胞／ｍＬ）、細胞生存率を算出して細胞が生きていることを保証した。次いで、細胞を遠心分離し、培地中に再懸濁した後、Ｔ１５０フラスコへ２，５００細胞／ｃｍ２で播種した。培地（フェノールレッド含有、１０％FBS、１％ペニシリン/ストレプトマイシン、１％GlutaMAXのDMEM）は、１週間当たり３回交換した。細胞をバイオインクと混合して最終濃度を５２０万細胞／ｍｌとし、次いで、プリンターのカートリッジへ注意深く移動した。ＣＥＬＬＩＮＫ  ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ、からの３ＤバイオプリンターＩＮＫＲＥＤＩＢＬＥを使用して、構築物を６ｍｍ×６ｍｍ×１ｍｍのサイズの３層の格子パターンでプリントした（圧力：２４ｋＰａ、供給速度：１０ｍｍ／ｓ）（図２を参照されたい）。プリンティング後、構築物を架橋した。
【００１１】
[0019]  構築物を、３７℃のインキュベーターで、１４日間、静的に培養し、培地を３日ごとに交換した。一部の構築物に、ＴＧＦベータを５ｎｇ／ｍｌ培地の濃度で添加した。１４日後、構築物を、細胞生存率、形態、及びコラーゲン産生について分析した。１日目、７日目、及び１４日目に、静置培養の各バイオインクから得た３つの構築物について、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ（R37601 Life Technologies）を使用してＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色を実施した。図３は、すべてのプリントされた構築物について良好な細胞生存率（７０％超）を示す。１日目及び７日目に、共焦点顕鏡を使用して静置培養構築物をイメージングした。ＦＩＴＣを使用して細胞骨格を可視化し（緑色）、ＤＡＰＩを使用して細胞の核を可視化した（青色）。４倍、１０倍、及び２０倍の拡大率で画像を取得して細胞形態を分析した。ＩｍａｇｅＪを使用して、細胞骨格と核との画像を重ね合わせた。図４ａ）は、未修飾のＣＮＦバイオインク中の線維芽細胞の形態を示す。細胞は丸く、全く伸展していなかった。図４ｂ）は、１日後の、アルギン酸塩を含むＲＧＤで修飾されたＣＮＦバイオインク中の線維芽細胞を示す。細胞は、ＣＮＦと接合されたＲＧＤペプチドに付着することができたため、伸展していた。図４ｃ）は、培養７日後の、アルギン酸塩を含むＲＧＤで修飾されたＣＮＦバイオインク中の線維芽細胞を示す。細胞増殖の増加及び伸展の継続ということに、最新の発明による重要な効果が認められる。これらの効果は、ＲＧＤで修飾されていないバイオインクでプリントされた細胞については認められなかった。構築物をＰＣＲで分析し、ＲＧＤで修飾されたＣＮＦを有する構築物ではＩ型コラーゲン産生のための遺伝子が上方調節されていることが示された。
【００１２】
[0020]  実施例２
[0021]  ナノセルロース原繊維とラミニン５２１との間のバイオ接合反応、及びｉＰＳＣを用いた３Ｄバイオプリンティング
[0022]  カルボジイミドカップリング方法を使用して、セルロース−ＥＣＭ接合を調製した。カルボキシメチル化ＣＮＦ、ＭＦＣ８（３重量％）（Stora Enso、Finland）をＭｉｌｉＱ水で希釈し（０．２重量％）、ウルトラタラックスで１０分間、１０，０００ｒｐｍで混合した。反応は、セルロースナノ原繊維上のすべてのカルボキシル基を活性化するのに過剰量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ＥＤＣ（Sigma Aldrich）、及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、ＮＨＳ（Sigma Aldrich）を用いて行った。ｐＨは、ＨＣｌで所望の５．３に調整した。次いで、ラミニン５２１（Biolamina、Sweden）などのＥＣＭを、ラミニンに対する乾燥セルロース質量の様々な重量比で添加した後、ｐＨをｐＨ７．２に調節し、反応物を氷上に置き、２４時間、反応を行った。
【００１３】
[0023]  カットオフ１０ｋＤの膜を使用して、分散体をＭｉｌｌｉＱ水で５日間透析した。透析水は、１日に２回、新たに注ぎ足した。次いで、試料を１０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。濃縮されたゲルから上清を分離した。ＣＮＦ−ラミニンゲルは、他のインク成分と混合する前に、２５ｋＧｙの電子ビーム（Herotron、Germany）で滅菌した。印刷適性を向上させるために、滅菌した試料を１０分間、４，０００ｒｐｍで遠心分離した。生理的モル浸透圧濃度を維持するために、４．６％マンニトール（Sigma Aldrich）をヒドロゲル溶液に添加した。
【００１４】
[0024]  細胞を、シリンジを各液体と接触させることによる混合プロセスでバイオインクと混合し、押したり引いたりすることにより混合を達成した。この手順は少なくとも５サイクル実施し、インクを任意の色に変える場合はさらなる混合を行った。細胞−インク混合物を用いた３Ｄバイオプリンティングを、３ＤバイオプリンターＩＮＫＲＥＤＩＢＬＥ（Cellink AB、Sweden）で実施し、７０％エタノールを使用して滅菌し、すべてのプリンティングを通して無菌ＬＡＦベンチに置いておき、コンタミネーションを排除した。プリンティングは、周囲温度及び湿度で実施した。プリンティング後の架橋は、０．１ＭのＣａＣｌ２（Sigma Aldrich）を添加して実施し、５分かけて架橋することができた。次いで、ＣａＣｌ２を細胞培養培地で置換し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに置き、培地を２日ごとに交換した。ｉＰＳＣ株は、ｍＲＮＡベースの初期化を使用して、余剰の軟骨細胞から作り出した。Ａ２Ｂ  ｉＰＳＣ株は、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＤＥＦ−ＣＳ（商標）（TaKaRa ClonTech、Sweden）中でフィーダーフリー条件下で維持した。このｉＰＳＣ株は、核型試験を行い、継代後期でも正常であり、多能性マーカーの発現に関して多能性で、すべての胚葉へ分化することができた。この株はまた、３Ｄペレット中に関節軟骨基質を生成する分化プロトコールにおいて優れていることが示され、その後の実験での３Ｄプリンティングのために使用された。さらに、条件培地中の単一細胞について生存率の上昇が注目されていたので、プリンティング後、コンフルエントのクローンＡ２Ｂ  ｉＰＳＣからのｉＰＳＣで条件づけられたＤＥＦ培地を使用した。共培養条件では、ｉＰＳＣと混合する前にヒトの余剰の軟骨細胞の照射（iChons）を行って、軟骨細胞の増殖を防止した。細胞数は、Ｖｉａｌ−Ｃａｓｅｔｔｅｓ（商標）を使用したヌクレオカウンターＮＣ−２００ＴＭ（ChemoMetec、Denmark）で数えた。プリンティング後、ｉＰＳ細胞の多能性を検証し、８日目に分化プロトコールを導入してｉＰＳ細胞を軟骨細胞に変換した。これらの細胞は体内では軟骨でみられ、そこで軟骨の主要タンパク質であるＩＩ型コラーゲンを産生している。分化プロトコールを開始すると、生存率及び細胞総数が低下することが予想される。しかし、本発明に従うと、高い生存率及び高増殖率をもって分化の前段階（ｐｒｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）が開始され、このことは、細胞は、以前に公表されたデータ及び未修飾のＣＮＦを使用するインクと比べて、目下特許請求されている接合されたインクをより好むことを示している。（例えば図６を参照されたい）。プリンティング後の多能性、及び軟骨細胞への分化を、ｐＣＲによって、また、ＯＣＴ４（多能性マーカー）、ＳＯＸ９（軟骨細胞分化の間にみられるタンパク質のマーカー）、及びＣＯＬ２（ＩＩ型コラーゲンの産生を指示する遺伝子）の遺伝子発現を調べることによって分析し、図７によると、ｐＣＲの分析から、ＯＣＴ４応答で示されたように、プリンティング後、細胞は依然として多能性であったことが示された。分化の６週間後、ほとんどの細胞は多能性を失っており、ＯＣＴ４の低下分が減じた。臨床的状況において多能性細胞が残存すると、腫瘍成長の可能性があるため、このことは重要である。本発明はまた、軟骨細胞分化の間に必要とされる因子である遺伝子ＳＯＸ９及びＣＯＬ２が活性化されていると結論づけることに役立つ。結論として、ラミニン５２１を接合されたＣＮＦバイオインクは、本明細書における試験、及び特許請求した創意に富むプロセス／生成物に従って、優れた細胞生存率を提供し、細胞分化を促進する。
【００１５】
[0025]  実施例３
[0026]  ＴＧＦベータ１とのバイオ接合、及び幹細胞を伴う軟骨組織の３Ｄバイオプリンティング
[0027]  セルロース−ＴＧＦベータ１（TGFB1）接合を、カルボジイミドカップリング方法を使用して調製した。カルボキシメチル化ＣＮＦであるＭＦＣ８（３重量％）（Stora Enso、Finland）をＭｉｌｉＱ水で希釈し（０．２重量％）、ウルトラタラックスで１０分間、１０，０００ｒｐｍで混合した。セルロースナノ原繊維上のすべてのカルボキシル基を活性化するのに過剰量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ＥＤＣ（Sigma Aldrich）及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、ＮＨＳ（Sigma Aldrich）を用いて、反応を行った。ｐＨは、ＨＣｌで所望の５．３に調整した。ＴＧＦベータ１（Termofisher、Sweden）などのＥＣＭを、ＴＧＦベータ１に対する乾燥セルロース質量の様々な重量比で添加した後、ｐＨをｐＨ７．２に調節し、反応物を氷上に置き、２４時間、反応を行った。
【００１６】
[0028]  カットオフ１０ｋＤの膜を使用して、分散体をＭｉｌｌｉＱ水で５日間透析した。透析水は、１日に２回、新たに注ぎ足した。次いで、試料を１０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。濃縮されたゲルから上清を分離した。ＴＧＦＢ１と（２０％）接合されたＣＮＦであるＣＮＦを（６０％）含有する３％乾燥物質を有するバイオインクを調製し、他のインク成分と混合する前に２５ｋＧｙの電子ビーム（Herotron、Germany）で滅菌した。架橋可能な成分の一例は、Ｎｏｖａ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｎｏｒｗａｙから入手したアルギン酸塩ＳＬＧ１００（２０％）であった。印刷適性を向上させるために、滅菌した試料を１０分間、４，０００ｒｐｍで遠心分離した。生理的モル浸透圧濃度を維持するために、４．６％マンニトール（Sigma Aldrich）をヒドロゲル溶液に添加した。
【００１７】
[0029]  ヒトの鼻中隔軟骨の生検は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｕｌｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、の耳鼻咽喉科学部での通常手術の間に得た。軟骨の採取はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｌｍ倫理委員会（第１５２／０８号）によって承認され、この試験に参加するする患者は、インフォームドコンセントに同意した。ドナーの年齢は２２〜５４歳の範囲で、平均年齢は３４歳であった。すべての軟骨試料は、まず、無菌条件下で、ウシ胎仔血清（FBS、１０％；Biochrom）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充した標準的な培養培地ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１、Biochrom）でリンスした。軟骨膜又は上皮などの接着性の非軟骨性組織は除去した。ヒト初代鼻軟骨細胞（hNC）を単離するために、軟骨試料を標準培養培地でリンスし、細かく刻み、消化培地（０．３％ＩＩ型コラーゲン分解酵素（Worthington）を含有した、FBSフリーの標準培養培地）に移し、振盪ウォーターバス中で、３７℃で１６時間、培養した。遠心分離後、全細胞数及び生存率をトリパンブルー色素排除法によって決定した。その後、ｈＮＣを増殖させるために、５×１０３細胞ｃｍ２の開始密度で播種した。８０〜９０％コンフルエントに達したとき、細胞を剥離し、数え、様々な患者から採取したすべてのｈＮＣについて同じ処置を保証するために凍結保存した。凍結保存したｈＮＣを解凍し、いったん単層に拡げた。８０〜９０％コンフルエントに達したとき、脂肪由来幹細胞（ASC）及びバイオインクと混合する前に、細胞を剥離し、数え、培養培地に再懸濁した。ＨＮＣ（３０×１０６細胞）を、バイオインク１ｍＬ当たり培養培地２００ｍＬに再懸濁し、遠心分離した後、バイオインクＣＮＦと共に、ｈＮＣ：ＡＳＣが２０：８０の比でＡＳＣ（RoosterBio、USA、より購入した、女性ドナーの細胞）と混合して、最終濃度が１０×１０６細胞／ｍＬのバイオインクを得た。この細胞担持ヒドロゲルを、均一な桃色が得られるまでミクロスパーテルを用いて混合し、その後、プリンター互換カートリッジへ充填した。細胞担持バイオインクを用いた３Ｄバイオプリンティングを、３ＤバイオプリンターＩＮＫＲＥＤＩＢＬＥ（Cellink AB、Sweden）で実施し、７０％エタノールを使用して滅菌し、すべてのプリンティングを通して無菌ＬＡＦベンチに置いておき、コンタミネーションを排除した。プリンティングは、周囲温度及び湿度で実施した。４１０μｍノズルを使用して、６×６×１ｍｍのサイズの格子、２層をプリントした。プリンティング後の架橋は、０．１ＭのＣａＣｌ２（Sigma Aldrich）を添加することによって実施し、５分かけて架橋することができた。次いで、ＣａＣｌ２を細胞培養培地で置換し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに置き、培地を２日ごとに交換した。培養には、還元された（ｒｅｄｕｃｅｄ）軟骨形成及び分化培地を、ＴＧＦＢ１と共に、またＴＧＦＢ１なしで使用した。ＴＧＦＢ１を接合されたバイオインクは、良好な印刷適性、良好な細胞生存率（８５％超）、及び軟骨細胞の増殖の増強を示した。ＡＣＳ細胞は、培養２１日後、細胞外マトリックス成分、例えばＩＩ型コラーゲン及びプロテオグリカンの産生によって判定すると、軟骨細胞へと分化していた。
【００１８】
[0030]  実施例４
[0031]  神経組織の３Ｄバイオプリンティング
[0032]  ラミニンで修飾されたＣＮＦを使用して、カーボンナノチューブを添加したバイオインクを調製した。かかる導電性バイオインクは、細胞接着、及び神経ネットワークの形成を示した。
【００１９】
[0033]  当業者は、開示された特徴を、所与の適用又は設計の必要条件及び仕様に基づき、単独で、任意の組合せで使用し、又は省略してもよいことを認識するであろう。実施形態が特定の特徴「を含むこと」を指す場合、実施形態は、代替的に、いずれか１つ又は複数の特徴「からなる」又は「実質的にからなる」のいずれかでありうることを理解されたい。本発明のその他の実施形態は、明細書を考慮し、本発明を実施することから当業者には明らかとなるであろう。
【００２０】
[0034]  本明細書の中で値の範囲が示されている場合、その範囲の上限と下限との間の各値もまた具体的に開示されていることを特に留意されたい。さらに、これらのより小さい範囲の上限及び下限を、その範囲の中で別個に含んでも又は除外してもよい。単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、そうでないことが内容から明らかでない限り、複数の指示対象を含む。明細書及び実施例は本質的に例示とみなされること、ならびに、本発明の本質から逸脱しない変形形態は本発明の範囲内にあることが意図されている。さらに、本開示において引用された参照のすべては、全体として本明細書に参照によりそれぞれ別々に組み入れられ、それによって、本発明の開示を可能にすることを補う効率的な方法を提供すること、ならびに、当技術分野における通常の技術レベルを詳述する背景技術を提供することが意図されている。
【００２１】
（要約）
本発明は、例えばＥＤＳ−ＮＨＳ接合方法を使用する、細胞外マトリックス成分、例えばコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンもしくはＲＧＤ配列、又は成長因子、例えばＴＧＦベータでのセルロースナノ原繊維（CNF）の修飾と、ヒトの皮膚又は神経組織などの組織モデルの３Ｄバイオプリンティングのためのバイオインクの調製とに関する。セルロースナノ原繊維は、３Ｄバイオプリントされた構築物への酸素の拡散及び栄養素の拡散にきわめて重要である、優れたプリンティングフィディリティーを提供する。表面に接合された細胞外マトリックス成分は、接着部位を提供すること又は分化プロセスを誘導することによって生物学的活性を誘導する。３ＤバイオプリントされたＣＮＦバイオインクをベースとしたバイオインクは、ヒト線維芽細胞の接着を誘導する能力、及びＩ型コラーゲン産生を刺激する能力が非常に大きかった。したがって、このようなバイオインクは、組織モデルの３Ｄバイオプリンティングに好適である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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