(57)【要約】  本開示は、代謝物を産生する代謝経路であって、該代謝経路における補助因子使用の補助因子制御システムを有する代謝経路を提供する。【選択図】図１
2019531099.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質を生成物に変換する複数の酵素ステップを含む、組換え、人工的又は操作された代謝経路であって、経路が、補助因子の利用可能性に依存して、代謝物の産生の第1の補助因子経路と、代謝物の産生の第2の補助因子経路とを交互に又は同時に使用する、天然にはない分子レオスタットシステムを含む、上記代謝経路。
【請求項２】
経路が、
(a)第1の補助因子を使用して第1の代謝物を第2の代謝物に変換する第1の酵素ステップ、
(b)第1の補助因子と第2の補助因子、又は第2の補助因子を使用して第1の代謝物を第2の代謝物に変換する第2の酵素ステップ
を含み、第2の補助因子のレベルが低い場合に第1の酵素ステップが活性であり、第2の補助因子のレベルが高い場合に第2の酵素ステップが活性である、請求項1に記載の組換え、人工的又は操作された代謝経路。
【請求項３】
第1の補助因子が酸化/還元補助因子であり、第2の補助因子がPiである、請求項1又は2に記載の組換え、人工的又は操作された経路。
【請求項４】
酸化/還元補助因子がNAD+/NADH、NADP+/NADPH又はFAD+/FADHである、請求項3に記載の組換え、人工的又は操作された経路。
【請求項５】
第1の補助因子がNADP+/NADPHを含む、請求項2〜4のいずれか一項に記載の組換え、人工的又は操作された経路。
【請求項６】
代謝経路が、グリセルアルデヒド-3-リン酸の3-ホスホグリセリン酸への変換を含む、請求項1に記載の組換え、人工的又は操作された代謝経路。
【請求項７】
代謝経路が、イソブタノール、3-メチル-1-ブタノール、ロイシン及びバリンからなる群から選択される代謝物を産生する、請求項6に記載の組換え、人工的又は操作された代謝経路。
【請求項８】
経路が、グリセルアルデヒド-3-リン酸の1,3-ビスホスホグリセリン酸への、及び1,3-ビスホスホグリセリン酸の3-ホスホグリセリン酸への変換を含む、請求項6に記載の組換え、人工的又は操作された代謝経路。
【請求項９】
(i)グリセルアルデヒド-3-リン酸(G3P)及びNADP+を3-ホスホグリセリン酸(3PG)及びNADPHに変換する酵素；(ii)グリセルアルデヒド-3-リン酸(G3P)、NADP+及び遊離リン酸(Pi)を1,3-ビスホスホグリセリン酸(1,3BPG)に変換する酵素、並びに(iii)1,3-ビスホスホグリセリン酸(1,3BPG)及びADPを3-ホスホグリセリン酸及びATPに変換する酵素、を含む、請求項6、7又は8のいずれか一項に記載の組換え、人工的又は操作された代謝経路。
【請求項１０】
(i)の酵素が、NADP依存性グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GapN)を含む、請求項9に記載の組換え、人工的又は操作された代謝経路。
【請求項１１】
GapNがS.ミュータンスから得られる、請求項10に記載の組換え、人工的又は操作された代謝経路。
【請求項１２】
(ii)の酵素が、配列番号6と比較してD34A/L35R/T36K変異を含む変異型グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(mGap)を含む、請求項9に記載の組換え、人工的又は操作された代謝経路。
【請求項１３】
(ii)の酵素が、配列番号6と少なくとも95%同一であり、D34A/L35R/T36K変異を含む配列を有する変異型グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(mGap)を含む、請求項9に記載の組換え、人工的又は操作された代謝経路。
【請求項１４】
(iii)の酵素が、酵素番号(EC番号) EC2.7.2.3.を含む、請求項9に記載の組換え、人工的又は操作された代謝経路。
【請求項１５】
(iii)の酵素が、ホスホグリセリン酸キナーゼである、請求項9に記載の組換え、人工的又は操作された代謝経路。
【請求項１６】
ホスホグリセリン酸キナーゼが、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス由来のPgkである、請求項15に記載の組換え、人工的又は操作された代謝経路。
【請求項１７】
(iii)の酵素が、配列番号7と少なくとも95%同一の配列を有し、かつホスホグリセリン酸キナーゼ活性を有する、請求項15に記載の組換え、人工的又は操作された代謝経路。
【請求項１８】
分子レオスタットが、(i)NADP-依存性グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GapN)、(ii)NADP+を利用する変異型グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素、及び(iii)ホスホグリセリン酸キナーゼ、の酵素を含む、請求項9に記載の組換え、人工的又は操作された代謝経路。
【請求項１９】
経路が、
(i)グルコースからのグルコース-6-リン酸(G6P)の産生を触媒するポリペプチド;
(ii)グルコース-6-リン酸(G6P)からのフルクトース-6-リン酸(F6P)の産生を触媒するポリペプチド;
(iii)フルクトース-6-リン酸(F6P)のフルクトース-1,6-リン酸への変換/リン酸化を触媒するポリペプチド;
(iv)フルクトース-1,6-リン酸を2個のグリセルアルデヒド-3-リン酸(G3P)に変換するポリペプチド;
(v)
(a)グリセルアルデヒド-3-リン酸(G3P)及びNADP+を3-ホスホグリセリン酸(3PG)及びNADPHに変換する酵素、
(b)グリセルアルデヒド-3-リン酸(G3P)、NADP+及び遊離リン酸(Pi)を1,3-ビスホスホグリセリン酸(1,3BPG)に変換する酵素、及び
(c)1,3-ビスホスホグリセリン酸(1,3BPG)及びADPを3-ホスホグリセリン酸(3pG)及びATPに変換する酵素;
を含む分子レオスタット;
(vi)3-ホスホグリセリン酸(3PG)を2-ホスホグリセリン酸(2PG)に変換するポリペプチド;
(vii)2-ホスホグリセリン酸(2PG)をホスホエノールピルビン酸(PEP)に変換するポリペプチド;
(viii)ホスホエノールピルビン酸(PEP)をピルビン酸に変換するポリペプチド;
(ix)ピルビン酸をアセト乳酸に変換するポリペプチド;
(x)アセト乳酸及びNADPHを2,3ジヒドロキシ-3-メチルブタン酸及びNADP+に変換するポリペプチド;
(xi)2,3ジヒドロキシ-3-メチルブタン酸を3-メチル-2-オキソブタン酸に変換するポリペプチド;
(xii)3-メチル-2-オキソブタン酸をイソブタナールに変換するポリペプチド、並びに
(xiii)イソブタナール及びNADPHをイソブタノール及びNADP+に変換するポリペプチド
を含む、請求項1に記載の組換え、人工的又は操作された代謝経路。
【請求項２０】
経路が無細胞システムにおけるものである、請求項1、2、4、6、7、8、18又は19のいずれか一項に記載の組換え、人工的又は操作された経路。
【請求項２１】
配列番号6と少なくとも95%同一であり、D34A/L35R/T36K変異を含み、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素活性を有する配列を含む組換えポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、エネルギー省により認定された認可番号第DE-AR0000556の下で政府支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる2016年10月18日に出願された米国仮特許出願第62/409,731号の優先権を主張する。
【０００３】
配列リストの参照による組入れ
本出願は、2017年10月18日に作成され、56,906バイトのデータを有し、IBM-PC、MS-Windows操作システムに機械フォーマットされた「Sequence_ST25.txt」と名付けた配列リストとともに出願される。配列リストは、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
本開示は、ATPバランスのための分子レオスタットを使用する化学生産の操作された経路を提供する。
【背景技術】
【０００５】
過去数十年にわたって、我々を石油化学製品への依存から脱却させることができる「無公害」化学物質の産生のための細胞代謝の操作に強い関心が置かれている。1つの方法は、精製した酵素又は細胞抽出物により所望の生化学的変換を実施することである。無細胞代謝システムは、例えば連続的な生成物産生、生成物除去の容易さ、ほぼ100%の収率、及び細胞傷害性の課題がないことなど、in vivoでの努力に優る多くの利点がある。
【０００６】
細胞に存在する代謝制御システム無しで長時間の高いフラックスを無駄なく維持することができる無細胞経路の構築は、新しい設計原理、「合成生化学」と呼ばれる分野を必要とする。合成生化学システム設計における重要な検討事項は、高エネルギー補助因子、例えば、ATP、NADH、及びNADPHの生成、制御、及び再利用である。通常、高エネルギー補助因子は異化作用又は分解相(例えば解糖系)において生成され、次いで所望の化学物質が構築される同化作用又は構築相において利用及び再生される。合成生化学システムを設計する最も簡単な方法は、2個のATPが分解相で生成される場合は2個のATPが構築相で利用されるような、完全な化学量論を要求する。化学量論的システムは、一定期間経路を通るフラックスを可能にし得るが、熱力学の第二法則は、望ましくない副反応によってATPが加水分解され、又はNADHが酸化され、最終的に徐々に終わることを示している。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、基質を生成物に変換する複数の酵素ステップを含む、組換え、人工的又は操作された代謝経路を提供し、経路は、補助因子の利用可能性に依存して、代謝物の産生の第1の補助因子経路と、代謝物の産生の第2の補助因子経路を交互に用いる又は同時に使用する、天然にはない分子レオスタットシステムを含む。一実施形態では、経路は、(a)第1の補助因子を使用して第1の代謝物を第2の代謝物に変換する第1の酵素ステップ;(b)第1の補助因子と第2の補助因子又は第2の補助因子を使用して第1の代謝物を第2の代謝物に変換する第2の酵素ステップを含み、第2の補助因子のレベルが低い場合、第1の酵素ステップが活性であり、第2の補助因子のレベルが高い場合、第2の酵素ステップが活性である。別の又はさらなる実施形態では、第1の補助因子は酸化/還元補助因子であり、第2の補助因子はPiである。前述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、酸化/還元補助因子はNAD+/NADH、NADP+/NADPH又はFAD+/FADHである。前述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、第1の補助因子はNADP+/NADPHを含む。前述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、代謝経路は、グリセルアルデヒド-3-リン酸の3-ホスホグリセリン酸への変換を含む。前述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、代謝経路は、イソブタノール、3-メチル-1-ブタノール、ロイシン及びバリンからなる群から選択される代謝物を産生する。前述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、経路は、グリセルアルデヒド-3-リン酸の1,3-ビスホスホグリセリン酸への、及び1,3-ビスホスホグリセリン酸の3-ホスホグリセリン酸への変換を含む。前述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、経路は、(i)グリセルアルデヒド-3-リン酸(G3P)及びNADP+を3-ホスホグリセリン酸(3PG)及びNADPHに変換する酵素;並びに(ii)グリセルアルデヒド-3-リン酸(G3P)、NADP+及び遊離リン酸(Pi)を1,3-ビスホスホグリセリン酸(1,3BPG)に変換する酵素、並びに(iii)1,3-ビスホスホグリセリン酸(1,3BPG)及びADPを3-ホスホグリセリン酸及びATPに変換する酵素を含む。前述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、(i)の酵素はNADP依存性グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GapN)を含む。前述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、GapNはS.ミュータンス(S. mutans)から得られる。前述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、(ii)の酵素は、配列番号6と比較してD34A/L35R/T36K変異を含む変異型グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(mGap)を含む。前述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、(ii)の酵素は、配列番号6と少なくとも95%同一であり、D34A/L35R/T36K変異を含む配列を有する変異型グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(mGap)を含む。前述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、(iii)の酵素は、酵素番号(EC番号) EC2.7.2.3を含む。前述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、(iii)の酵素はホスホグリセリン酸キナーゼである。前述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、ホスホグリセリン酸キナーゼは、G. ステアロサーモフィルス(G. stearothermophilus)由来のPgkである。前述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、(iii)の酵素は、配列番号7と少なくとも95%同一の配列を有し、ホスホグリセリン酸キナーゼ活性を有する。前��の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、分子レオスタットは、(i)NADP-依存性グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GapN)、(ii)NADP+を利用する変異型グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素及び(iii)ホスホグリセリン酸キナーゼの酵素を含む。前述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、経路は、(i)グルコースからのグルコース-6-リン酸(G6P)の産生を触媒するポリペプチド;(ii)グルコース-6-リン酸(G6P)からのフルクトース-6-リン酸(F6P)の産生を触媒するポリペプチド;(iii)フルクトース-6-リン酸(F6P)のフルクトース-1,6-リン酸への変換/リン酸化を触媒するポリペプチド;(iv)フルクトース-1,6-リン酸を2個のグリセルアルデヒド-3-リン酸(G3P)に変換するポリペプチド;(v)(a)グリセルアルデヒド-3-リン酸(G3P)及びNADP+を3-ホスホグリセリン酸(3PG)及びNADPHに変換する酵素並びに(b)グリセルアルデヒド-3-リン酸(G3P)、NADP+及び遊離リン酸(Pi)を1,3-ビスホスホグリセリン酸(1,3BPG)に変換する酵素、並びに(c)1,3-ビスホスホグリセリン酸(1,3BPG)及びADPを3-ホスホグリセリン酸(3pG)及びATPに変換する酵素、を含む分子レオスタット;(vi)3-ホスホグリセリン酸(3PG)を2-ホスホグリセリン酸(2PG)に変換するポリペプチド;(vii)2-ホスホグリセリン酸(2PG)をホスホエノールピルビン酸(PEP)に変換するポリペプチド;(viii)ホスホエノールピルビン酸(PEP)をピルビン酸に変換するポリペプチド;(ix)ピルビン酸をアセト乳酸に変換するポリペプチド;(x)アセト乳酸及びNADPHを2,3ジヒドロキシ-3-メチルブタン酸及びNADP+に変換するポリペプチド;(xi)2,3ジヒドロキシ-3-メチルブタン酸を3-メチル-2-オキソブタン酸に変換するポリペプチド;(xii)3-メチル-2-オキソブタン酸をイソブタナールに変換するポリペプチド、並びに(xiii)イソブタナール及びNADPHをイソブタノール及びNADP+に変換するポリペプチド、を含む。前述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、経路は無細胞システムにおけるものである。前述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、ポリペプチドは無細胞システム内に存在する。
【０００８】
本開示は、配列番号6と少なくとも95%同一であり、D34A/L35R/T36K変異を含む配列を含み、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素活性を有する組換えポリペプチドも提供する。
【０００９】
本開示は、代謝システムが補助因子バランスに依存して2つの経路のうちの1つに優先的に進むことを可能にする分子レオスタットスイッチを提供する。例えば、一実施形態では、経路は、システム中の遊離リン酸(Pi)の量に依存して、ATPを産生しない酵素経路又はATPを産生する酵素経路へと進行する。選択は、mGAP酵素によって必要とされる遊離リン酸によって制御される。遊離リン酸は、システム中のADPに加水分解されるATPの量の代わりとなる。効果的に、ATP生成経路のフローは、Pi濃度に依存して増大又は低減する。生化学経路は、炭素源(例えばグルコース)からの様々な化学物質及びバイオ燃料の産生に使用され得る。
【００１０】
本開示の1つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に記載される。他の特徴、目的、及び利点は説明及び図面から、並びに特許請求の範囲から明らかである。
【００１１】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本開示の1つ以上の実施形態を示し、詳細な説明とともに本発明の原理及び実施の説明に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】グルコースからイソブタノールへのin vitro経路の図である。gapDH M6及びPGKは無機リン酸を除去し、システム中で加水分解されるATPを作り直す。
【図２】グルコースからイソブタノールへの化学量論的経路の結果を示す図である。(A)完全に精製されたシステムを使用する化学量論的経路からの経時的な産生を示す図である。最初の経時的な産生は、大量のATPアーゼ夾雑があり、11.96±1.57g/Lを産生した。2番目の経時的な産生は、少量のATPアーゼ活性があり、イソブタノール産生を14.26±0.57g/Lに増加させた。(B)24時間でのNADPH又はATP供給の48時間後の、化学量論的経路からのイソブタノール産生のヒストグラムを示す図である。
【図３】グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素での「分子レオスタット」の設計を示す図である。(A)解糖系における分子レオスタットの概要を示す図である。(B)gapDH M6結晶構造のモデルを示す図である。
【図４】ATPアーゼ活性モデルによるレオスタット経路のCopasiモデル(A-B)及びATPアーゼ活性モデルによる化学量論的経路のCopasiモデル(C-D)を示す図である。最初の条件は、4mMの無機リン酸で設定し、gapDH M6/PGK活性は一定に保ち、ATP加水分解は反応が止まるまで増加した。反応は、ATP加水分解が5:1より高い任意のgapDH M6比に達すると止まる。
【図５−１】イソブタノールの最終産生を示す図である。(A)は、化学量論的経路を使用するシステムにおける経時的なイソブタノール産生、グルコース消費、及びATPを示す図である。(B)は、ATPレオスタット反応における経時的なイソブタノール産生、グルコース消費、及びATPを示す図である。この反応は、600uMで定常状態のATPを作り出し、化学量論的経路の2倍量のイソブタノールを産生した。(C)化学量論的システム(gapNのみ)、過剰なATP産生システム(gapDH M6のみ)、及びレオスタットシステム(gapNとGapDH M6の両方)からのイソブタノール産生の24時間のヒストグラムである。
【図５−２】図５−１の続き。
【図６】化学量論的経路及びレオスタット経路の詳細な図式を提供する図である。
【図７】化学量論的システムにおけるヘキソキナーゼ及び解糖系のトープ(tope)のCaposiモデルを提供する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用する場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈により他にはっきりと示さない限り、複数形の指示物を含む。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド(a polynucleotide)」という言及は、複数のそのようなポリヌクレオチドを含み、「酵素(the enzyme)」という言及は、1つ以上の酵素への言及を含む等である。
【００１４】
他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料は、開示した方法及び組成物の実施において使用され得るが、例示的な方法、装置及び材料が本明細書に記載される。
【００１５】
また、「又は」の使用は、他に述べない限り「及び/又は」を意味する。同様に、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(include)」、「含む(includes)」、及び「含む(including)」は、交換可能であり、限定することを意図しない。
【００１６】
様々な実施形態の記載が用語「含む(comprising)」を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の例では、実施形態は言葉「本質的に〜からなる」又は「〜からなる」を使用して代わりに記載され得ることを理解するであろうと更に理解される。
【００１７】
上述及び本文において考察されている任意の公開物は、本出願の出願日より前にそれらが開示されたものとしてのみ提供される。本明細書のいずれの記載も、本発明者らが先の開示のためにそのような開示に先行する権利がないと承認するものと解釈されるべきではない。
【００１８】
本明細書で使用する場合、酵素の「活性」は、代謝物をもたらす反応を触媒する、すなわち、「機能する」その能力の尺度であり、反応の代謝物が産生される速度として表され得る。例えば、酵素活性は、単位時間あたりに又は単位酵素あたりに産生された代謝物の量(例えば濃度又は重量)として、又は親和性若しくは解離定数によって表され得る。
【００１９】
用語「生合成経路」は、「代謝経路」とも呼ばれ、1つの化学種を別のものに変換する(変える)ための同化又は異化生化学反応のセットを指す。遺伝子産物は、それらが並行して又は連続して同じ基質に作用し、同じ産物を産生し、又は同じ基質と代謝最終産物の間の代謝中間体(すなわち、代謝物)に作用する若しくはそれを産生する場合、同じ「代謝経路」に属する。本開示は、所望の産物又は中間体の産生のための代謝パージバルブを任意に含み得る分子レオスタットを含むin vitro生合成経路を提供する。本開示はまた、分子レオスタットを含む代謝的に操作された経路を有し、更に所望の産物又は中間体の産生のための代謝パージバルブを含み得る組換え微生物を提供する。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「補助因子」は、通常、タンパク質の生物活性に必要とされる化学化合物又は代謝物を指す。タンパク質は一般に酵素であり、補助因子は生化学的転換を補助する。補助因子は、限定はされないが、1つ以上の無機イオン、又は補酵素と呼ばれることがある複雑な有機若しくは金属有機分子を含み、そのほとんどは、ビタミン、及び少量の必須有機栄養素に由来する。いくつかの酵素又は酵素複合体は、いくつかの補助因子を必要とする。例えば、解糖系とクエン酸回路のジャンクションにおける多酵素複合体ピルビン酸脱水素酵素は、5つの有機補助因子及び1つの金属イオン:ゆるく結合したチアミンピロリン酸(TPP)、共有結合したリポアミド及びフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)、及び補助基質ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)及び補酵素A(CoA)、並びに金属イオン(Mg2+)を必要とする。有機補助因子はビタミンである又はビタミンから作られることが多い。多くは、例えばATP、補酵素A、FAD及びNAD+のように、それらの構造の一部としてヌクレオチドアデノシン一リン酸(AMP)を含有する。
【００２１】
「酵素」は、典型的には、多かれ少なかれ特異的に、1つ以上の化学又は生化学反応を触媒又は促進するタンパク質又はポリペプチドを形成するアミノ酸から完全に又は大部分なる任意の物質を意味する。
【００２２】
遺伝子又はポリヌクレオチドに関する、用語「発現」は、遺伝子又はポリヌクレオチドの転写、及び必要に応じて、生じるmRNA転写産物のタンパク質又はポリペプチドへの翻訳を指す。したがって、文脈から明らかであるように、タンパク質又はポリペプチドの発現はオープンリーディングフレームの転写及び翻訳から生じる。
【００２３】
「代謝物」は、代謝によって産生される任意の物質又は所望の代謝物、化学物質、アルコール又はケトンを生じる特定の代謝プロセスに必要な又は貢献する物質を指す。代謝物は、代謝の出発物質(例えば、炭水化物、糖リン酸、ピルビン酸等)、中間物質(例えば、アセチル-coA)、又は最終産物(例えば、イソブタノール、イソプレン又はPHB)である有機化合物であり得る。代謝物を使用して、より複雑な分子を構築することができ、又はより簡単なものに分解することができる。中間代謝物は、他の代謝物から合成され、おそらくは、しばしば化学エネルギーの放出を伴って、より複雑な物質を生成する、又はより簡単な化合物へと分解するために使用することができる。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「代謝的に操作された」又は「代謝操作」は、微生物における、所望の代謝物、例えばアセチル-CoA、高級アルコール又は他の化学物質の産生のための生合成遺伝子、オペロンと関連する遺伝子、及びそのようなポリヌクレオチドの調節エレメントの合理的な経路設計及びアセンブリー、又は無細胞システムにおける、所望の代謝物の産生のための生合成経路と補助因子の合理的な経路設計及びアセンブリーを含む。「代謝的に操作された」は、所望の経路をもたらす中間体と競合する競合代謝経路の減少、破壊、又はノックアウトを含む、遺伝的操作及び適切な培養条件を使用する転写、翻訳、タンパク質安定性及びタンパク質機能性の制御及び最適化による代謝フラックスの最適化をさらに含み得る。例えば、無細胞システムにおいて、無細胞システムで使用される1つ以上の酵素を発現する宿主細胞は、さらに操作されて競合経路の酵素を排除又は除去し、それにより破壊された又は無細胞調製物に存在し得る夾雑物又は酵素を除去することができる。
【００２５】
生合成遺伝子は、宿主に外来である、又は突然変異生成、組換え、及び/又は内在性宿主細胞における調節配列の異種発現との関連によって改変されることにより、宿主微生物とは異種性であり得る。一実施形態では、ポリヌクレオチドが宿主生物にとって遺伝的に異種である場合、ポリヌクレオチドはコドン最適化され得る。
【００２６】
「代謝パージバルブ」は、例えば、還元補助因子を酸化、したがって、「豊富な還元補助因子をパージする」等により、最初の代謝経路での使用のための代謝物又は補助因子のリサイクルをもたらす、過剰な代謝物及び/又は補助因子を「パージする」操作された代謝経路を指す。
【００２７】
「分子レオスタット」は、補助因子が酵素の代謝回転に十分なレベルである場合にのみ活性化される酵素ステップを指す。十分なレベルが無いと、経路は二次的な酵素ステップによって進行する。例えば、図1に示すように、分子レオスタットは、最終的にはグリセルアルデヒド-3-リン酸(G3P)を3-ホスホグリセリン酸(3PG)に転換する2つの競合する経路分岐で作製することができる。一方の分岐は、酸化/還元レベルによって制御されるG3Pの変換における補助因子を減少させるが、他方の分岐はATPを生成し、ATP生成分岐を通るフローはPiレベルによって制御される。最初の分岐は、1つの酵素、つまり、ATPを生成せずに、NADP+をNADPHに還元し、G3Pを直接3PGに変換する化学量論的経路において使用される非リン酸化GapNからなる。第二の経路は、2つの酵素、つまり、NADPH特異的、リン酸化グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GapDH)及びホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)からなり、NADPHも産生するが、まず、G3Pを1,3-ビスホスホグリセリン酸(1,3BPG)に、続いてPGKの作用により3PG及びATPに変換する。したがって、GapDH/PGK分岐は、GapNのみの分岐と比較してさらなるATPを産生する。レオスタットのATP生成分岐を通る相対的なフローは、ADP及びPiに加水分解されるATPの量の代わりとして作用する遊離Piによって調節される。レオスタットの機能を、外因性Piが反応に添加されない最も簡単な場合で図示する(図3A、左のパネル)。この場合、最初は遊離Piが無く、リン酸化GAPDHを通るフラックスが無いことがある。したがって、Piの非存在下では、全てのフラックスがGapN分岐を通過する。しかしながら、ATPがADP及びPiに加水分解されると、次いでリン酸化する分岐が利用される。したがって、レオスタットはATPの枯渇を感知し、リン酸化GAPDH分岐を利用することによってATPを回復するように作用する(図3A、右のパネル)。
【００２８】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」又は「組換え核酸」は、ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸(DNA)、及び適切な場合には、リボ核酸(RNA)を指す。
【００２９】
用語「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、本明細書において交換可能に使用され、ペプチド結合と呼ばれる化学結合によって一緒に結合されているアミノ酸と呼ばれる化学構成要素の1つ以上の鎖を含む。タンパク質又はポリペプチドは酵素として作用し得る。
【００３０】
用語「組換え微生物」及び「組換え宿主細胞」は、本明細書において交換可能に使用され、非発現若しくは過剰発現内在性ポリヌクレオチドを発現する、又は非内在性配列、例えばベクターに含まれるものを発現するように遺伝的に改変された微生物を指す。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のように所望の代謝物を産生する代謝経路に関与する標的酵素を通常コードするが、制御又は活性又は転写に必要なタンパク質因子も含み得る。したがって、本明細書に記載の組換え微生物は、親微生物によって以前は発現又は過剰発現されていない標的酵素を発現又は過剰発現するように遺伝的に操作されている。用語「組換え微生物」及び「組換え宿主細胞」は、特定の組換え微生物だけでなく、そのような微生物の子孫又は将来的な子孫も指すことが理解される。組換え微生物は、ポリペプチドの供給源として使用することができ、組換え微生物は、所望の代謝物の生成のための完全な経路を持つ必要がないことも理解されるべきである。むしろ、それぞれ全てではないが1つ以上の代謝経路のポリペプチドを有する複数の組換え微生物は、共培養して所望の代謝物を産生することができ、又は破壊して、無細胞環境を使用することができ、又は発現ポリペプチドをそれぞれの組換え微生物から単離することができる。
【００３１】
用語「基質」又は「好適な基質」は、酵素の作用によって別の化合物に変換される又は変換されることが意図される任意の物質又は化合物を指す。用語は、単一の化合物だけでなく、化合物の組合せ、例えば少なくとも1つの基質又はその誘導体を含有する溶液、混合物及び他の材料も含む。さらに、用語「基質」は、出発材料としての使用に好適な炭素源を供給する化合物だけでなく、本明細書に記載の経路で使用される中間体及び最終産物代謝物も包含する。さらに、基質は酸化若しくは還元された補助因子、又はリン酸化若しくは脱リン酸化される因子であり得る。
【００３２】
代謝操作及び合成生物学は、高価な化学物質の産生に用いられてきたが、大規模な汎用化学物質の製造の厳しい経済性を満たすことに関して、期待されたほどには成功していない。微生物システムは、競合経路による少ない収率、遅い増殖率又は経路最適化の困難によっておこる低生産性、夾雑微生物の増殖、生成物毒性、及び高価な生成物の単離を含めて、様々な技術的な難題に突き当たることが多く、このため、コスト競争力の達成が困難である。
【００３３】
本明細書で実証するように、これらの困難を克服する1つのアプローチは、細胞内ではなく反応容器又はフローシステム内で酵素の混合物を使用して複雑な生化学転換を実施することである。in vitroでの単一の、専用経路の構築は、細胞内で生じる副反応を排除することができ、そのためほぼ100%の収率及び速い反応時間が可能である。in vitroの生化学システムはまた、最適化のより正確な調節を可能にし、生成物の毒性問題はより簡単に診断及び緩和され得る。さらに、生成物の抽出はより容易になり得る。
【００３４】
伝統的に、in vitro経路の構築は、研究用ツールとして、又はキラル化合物及び他の高価な化学物質の産生のための1〜3個の酵素のみを必要とする適用における使用のためのものとされてきた。タンパク質発現及び安定な酵素へのアクセスの改善はより複雑なシステムを可能にした。in vitro生体内転換システムが近年報告され、これは、30個を超える酵素のシステムを含む。この領域の最新の研究の1つは、デンプンから水素を産生する人工的な経路であった。この概念は近年、ほぼ100%の収率でセロビオースから水素を生成する創造的なシステムによって進展した。別の研究では、超好熱性の解糖系の酵素が異種性に発現され、加熱精製され、アセンブルして82%の収率でグルコースをn-ブタノールに変換する。別の研究では、超好熱古細菌由来のエレガントに簡易化された非リン酸化Entner-Doudoroff経路が構築され、約55%の収率でエタノール及びイソブタノールを産生した。これらの先駆的な研究は、合成生化学のフレキシビリティ及び高収率の可能性を示す。
【００３５】
適切な補助因子バランスの維持は、フラックスの生成及び酵素経路を通る駆動力の提供の基本的な部分である。in vivoでは、補助因子NADH/NADPH及び/又はADP/ATPに対する酵素特異性が典型的に使用され、それぞれ異化作用及び同化作用経路を通過する炭素フラックスを調節する。生物は、典型的には、これらの補助因子の還元状態を感知し、これらの情報を使用して、環境変化に対応して異化作用及び同化作用経路を上方制御又は下方制御する。しかしながら、in vitroシステムは、この調節を促進する無数の末梢経路を持たない。さらに、NADH及びNADPHに対する天然の同化作用及び異化作用特異性は、in vitroでの生体内転換を複雑にする。合成生化学システムは、高価で犠牲的な代謝物の使用、単一の補助因子型のみが必要とされるように酵素を操作し直すこと、過剰な補助因子の添加、又は反応混合物への中間体の一定した添加によるプロセスの維持を通して、経路設計における補助因子の化学量論を注意深く検討することにより、しばしばこれらの問題に対処してきている。
【００３６】
本明細書に記載の方法、組成物及びシステムは特定の代謝産物を参照して記載されるが、方法、組成物及びシステムは、補助因子のリサイクルが重要である広範囲の組換え生化学経路に適用可能である。1つの例示的な操作された経路において、本開示はイソブタノールの産生を記載する(例えば、図1、6A及び6B参照)。
【００３７】
本開示は、化学的製造のin vitro経路及びin vivoシステムにおける補助因子バランスのための分子レオスタットシステムを記載する。例えば、本開示は、グルコースをイソブタノールに変換する経路を記載し、これは補助因子生成及び炭素使用への使用の完璧な化学量論的適合を必要としない、持続可能な還元補助因子バランスを維持する。
【００３８】
本開示は、自己制御及び自己平衡方法で、補助因子、例えばNADPH及びNADH及びATP及びADPの産生と消費のバランスを調節する堅固なノードを提供する。このin vitro経路は、炭素フラックスを確実にする補助因子の生成及び利用において化学量論への執着を必要とせずに、補助因子バランスを維持する。部分的に、システムは補助因子レベルに基づき酵素ステップ間を変更できるため、転換をほぼ完全に駆動する。
【００３９】
最終的には、本開示の方法及び組成物は、低コストの基質、例えばグルコース又は他の糖から有用な化学物質及びバイオ燃料への変換を組入れるように拡大し得る。
【００４０】
本開示は、無細胞酵素経路を使用した標準的な化学量論的設計を超える自己制御合成生化学経路の設計及び使用を実証する。本明細書に記載の例示的な経路である、イソブタノールの産生において、非レオスタット経路は、ATPの枯渇により反応が停止する前に約12g/Lのイソブタノールを産生した。本開示のレオスタットを使用して、システムは、必要に応じて過剰のATPを産生することができ、最終力価24g/Lまで改善した。
【００４１】
完全な化学量論に頼らない合成生化学システムは、補助因子の化学量論が制限されないため、より長く実行でき、より柔軟である。本開示はまた、本開示のレオスタットと組み合わせて分子パージバルブの使用も考えられる。例えば国際公開第2015/153929及び国際出願PCT/US2016/043260は、そのようなパージバルブシステムを記載する(その開示は、参照により本明細書に組み込まれる)。本明細書に記載のATP制御システムと一緒に、これらの合成経路は、個々に又は同時に、NAD(P)/NAD(P)HとATPの両方のバランスを必要とする無数のバイオベース産物の自立型in vitro経路の設計を可能にする。ATP及びNAD(P)/NAD(P)Hを調節できる、これらの自己調節ノードは、工業的な無細胞酵素合成のツール及び経路を提供する。
【００４２】
一実施形態では、本開示の経路は、低Piで第1の経路においてNADP+/NADPHを利用する並行な酵素ステップ、及び高PiでNADP+/NADPH及びADP-ATPサイクルを利用する第2の経路を提供する。
【００４３】
本開示は、多くの方法でin vitroで開発され得る経路を提供する。例えば、所望の酵素は微生物又は細胞にクローニング/操作され、発現され、次いで培養物から精製され得る。別の例では、酵素は発現され、細胞が破壊され、破壊された調製物が本開示の経路で使用され得る。別の実施形態では、酵素は精製され、代謝経路での使用のため、システム(例えば、マイクロ流体システム)中の基質につなぎ止められ得る。さらに別の実施形態では、所望の活性を有する好熱性酵素がクローニングされ、発現され、細胞及びそれらの調製物は、所望の酵素は活性なままであるが望ましくない酵素は変性される温度に加熱され得る。さらに別の実施形態では、酵素は市販で購入され、必要に応じて混合され得る。前述の全ての実施形態では、システムは、必要な基質及び補助因子（例えば、NAD-、NADP-、FAD-、AMP、ADP、ATPなど）と組み合わされる。
【００４４】
従って、本開示は、選択した宿主又は親微生物に遺伝物質を導入し、それにより微生物の細胞生理学及び生化学を改変又は変更することによって作製される「操作された」又は「改変された」微生物を提供する。遺伝物質の導入により、親微生物は新しい特性、例えば、新しい又は大量の細胞内代謝物を産生する能力を獲得する。親微生物に導入された遺伝物質は、生合成経路に関与する1つ以上の酵素をコードする遺伝子又は遺伝子の一部を含み、また分子レオスタットに関与する1つ以上の酵素をコードする遺伝子若しくは遺伝子の一部を単独で、又は所望の代謝物（例えばイソブタノール）の産生のために有用な経路である代謝パージバルブと組み合わせて含み、更にこれらの遺伝子の発現及び/又は発現の制御のための更なるエレメント、例えばプロモーター配列も含み得る。
【００４５】
操作された又は改変された微生物は、宿主又は親微生物への遺伝物質の導入の代わりに又は加えて、微生物の細胞生理学及び生化学を変える遺伝子又はポリヌクレオチドの分解、欠失、又はノックアウトも含み得る。遺伝子又はポリヌクレオチドの低減、分解又はノックアウトによって、微生物は新しい、又は改善された特性(例えば、新しい又は大量の細胞内代謝物を産生する能力、所望の経路を通る代謝物のフラックスを改善する能力、及び/又は望ましくない副産物の産生を減らす能力)を獲得する。例えば、競合経路の酵素を排除しながら代謝経路の酵素にとって望ましいセットを発現するように生物を操作することが望ましい場合がある。この操作は、in vitro（望ましくない酵素の破壊又は精製が存在しない）又はin vivoの双方で適用可能である。
【００４６】
「天然」若しくは「野生型」タンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子、又は細胞は、天然で生じるタンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子、又は細胞を意味する。
【００４７】
「親微生物」は、組換え微生物を生成するために使用される細胞を指す。用語「親微生物」は、一実施形態では、天然に生じる細胞、すなわち遺伝子改変されていない「野生型」細胞を指す。用語「親微生物」は更に、更なる操作のために「親」として役立つ細胞も指す。この後者の実施形態において、細胞は、遺伝的に操作されていても良いが、更なる遺伝子操作のための供給源として機能する。
【００４８】
例えば、野生型微生物は遺伝子改変され、NADH-ピルビン酸脱水素酵素などの第一の標的酵素を発現又は過剰発現することができる。この微生物は、第二の標的酵素を発現又は過剰発現するように改変された微生物の作製において、親微生物として機能し得る。本明細書において使用する場合、「発現」又は「過剰発現」とは、所望の遺伝子産物の表現型の発現を指す。一実施形態において、生物における天然の遺伝子は、異種プロモーター又は調節ドメインに連結するように遺伝子操作することができ、ここで調節ドメインは、その遺伝子の発現を生じさせ、それによって野生型生物と比較したその通常の発現を改変する。あるいはまた、生物は、遺伝子上のリプレッサー機能を除去又は低下させるように遺伝子操作し、それによってその発現を改変することができる。更に別の実施形態において、所望の発現調節／制御エレメントに機能的に連結した遺伝子配列を含むカセットを微生物中に遺伝子操作で入れることができる。
【００４９】
したがって、親微生物は、連続する遺伝子改変事象の参照細胞として機能する。各改変事象は、1種以上の核酸分子を参照細胞に導入することによって達成され得る。導入は、1種以上の標的酵素の発現若しくは過剰発現、又は1種以上の標的酵素の低減若しくは除去を促進する。用語「促進する」は、例えば親微生物のプロモーター配列などの遺伝子改変を通して、標的酵素をコードする内在性ポリヌクレオチドの活性化を包含することが理解される。用語「促進する」は更に、標的酵素をコードする外因性ポリヌクレオチドの親微生物への導入を包含することが理解される。
【００５０】
その相同体、変異体、断片、関連融合タンパク質、又は機能的等価物を含む、代謝物の生成に有用な酵素をコードするポリヌクレオチドは、適切な宿主細胞、例えば細菌又は酵母細胞などにおけるそのようなポリペプチドの発現を指示する組換え核酸分子に使用される。
【００５１】
本明細書に記載するポリヌクレオチドは「遺伝子」を含み、上述の核酸分子は「ベクター」又は「プラスミド」を含むことが理解される。したがって、用語「遺伝子」は、「構造遺伝子」とも呼ばれ、1種以上のタンパク質又は酵素の全て又は一部を含み、制御(非転写)DNA配列、例えば遺伝子が発現する条件を決定するプロモーター領域又は発現制御エレメントなどを含み得る、アミノ酸の配列を含む特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。遺伝子の転写領域は、イントロン、5'-非翻訳領域(UTR)、及び3'-UTR、並びにコード配列を含む非翻訳領域を含み得る。
【００５２】
当業者は、遺伝子コードの縮重性により、そのヌクレオチド配列の異なる様々なコドンが所与のアミノ酸をコードするために使用され得ることを認識するであろう。上述の生合成酵素又はポリペプチドをコードする特定のポリヌクレオチド又は遺伝子配列は、単に本開示の実施形態を例示するために本明細書において参照され、本開示は、本開示の方法で利用される酵素のポリペプチド及びタンパク質と同じアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする任意の配列のポリヌクレオチドを含む。同様に、ポリペプチドは、典型的には、所望の活性の喪失又は著しい喪失なく、そのアミノ酸配列における1つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び挿入を許容し得る。本開示は、アミノ酸配列の変更を有するそのようなポリペプチドを含み、本明細書に示したDNA配列によってコードされるアミノ酸配列は、本開示の例示的な実施形態を単に説明するものである。
【００５３】
本開示は、本明細書の他の場所で詳細に記載されるように、1種以上の標的酵素をコードする組換えDNA発現ベクター又はプラスミドの形態のポリヌクレオチドを提供する。一般に、そのようなベクターは、宿主微生物の細胞質内で複製するか、宿主微生物の染色体DNAへと組み込まれるかのいずれかであり得る。いずれの場合にも、ベクターは、安定ベクター(すなわち、選択圧のみであっても、多数回の細胞分裂にわたってベクターが存在したままである)又は一過性ベクター(すなわち、細胞分裂の回数が増加すると宿主微生物によりベクターが徐々に失われる)であってよい。本開示は、単離された(すなわち、純粋ではないが、天然には見出されない量及び/又は濃度で調製物中に存在する)、及び精製された(すなわち、夾雑物を実質的に含まない、又は対応するDNAと共に天然に見出される物質を実質的に含まない)形態のDNA分子を提供する。
【００５４】
本開示のポリヌクレオチドは、鋳型としてcDNA、mRNA、又は代わりにゲノムDNA、及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標準的なPCR増幅技術及び以下の実施例の節で記載される手順に従って増幅され得る。そのように増幅した核酸は、適切なベクター中にクローニングされ、DNA配列分析によって特徴付けられ得る。更に、ヌクレオチド配列に相当するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、例えば自動DNA合成装置の使用によって調製され得る。
【００５５】
本明細書に記載の酵素に相同なポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子は、1つ以上のアミノ酸置換、付加、又は欠失がコードされたタンパク質に導入されるように、特定のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に1つ以上のヌクレオチド置換、付加、又は欠失を導入することによって作製され得ることも理解される。変異は、部位特異的変異誘発及びPCR媒介変異誘発など、標準的な技術によってポリヌクレオチドに導入され得る。非保存的なアミノ酸置換を作製するのに望ましい位置と対照的に、いくつかの位置では保存的なアミノ酸置換を作製することが好ましい。
【００５６】
当業者によって理解されるように、特定の宿主においてその発現を増強するためにコード配列を改変することは有利であり得る。遺伝子コードは、64個の可能なコドンが重複しているが、ほとんどの生物は、典型的にはこれらのコドンのサブセットを使用する。ある種において最も多く利用されるコドンは適合コドンと呼ばれ、多くは利用されないものはまれな又は低使用コドンとして分類される。コドンは、宿主の好ましいコドン使用を反映して置換され、そのプロセスは時に、「コドン最適化」又は「種のコドンバイアスのための制御」と呼ばれる。
【００５７】
特定の原核又は真核宿主に好まれるコドンを含有する最適化コード配列(Murrayら、(1989) Nucl. Acids Res. 17:477〜508頁も参照)が調製され、例えば、翻訳速度を増加し、又は、例えば、非最適化配列から産生された転写物と比較して、より長い半減期など所望の特性を有する組換えRNA転写物を産生し得る。翻訳停止コドンも、宿主の好みを反映するように改変され得る。例えば、出芽酵母(S. cerevisiae)及び哺乳動物の典型的な停止コドンは、それぞれUAAとUGAである。単子葉植物の典型的な停止コドンはUGAであり、一方で昆虫及び大腸菌は一般的に停止コドンとしてUAAを使用する(Dalphinら、(1996) Nucl. Acids Res. 24: 216〜218頁)。植物での発現のためのヌクレオチド配列を最適化する方法論は、例えば米国特許第6,015,891号及びそこに引用される参考文献に提供される。
【００５８】
「形質転換」は、ベクターが宿主細胞に導入されるプロセスを指す。形質転換(又は形質導入、又はトランスフェクション)は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃(又は微粒子銃による送達)、又はアグロバクテリウムによる形質転換を含むいくつかの手段のいずれか1つによって達成され得る。
【００５９】
「ベクター」は通常、生物、細胞、又は細胞成分間で増幅及び/又は移動され得るポリヌクレオチドを指す。ベクターは、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、及び、YAC(酵母人工染色体)、BAC(細菌人工染色体)、及びPLAC(植物人工染色体)などの人工染色体を含み、それらは「エピソーム」、すなわち自律的に複製し、又は宿主細胞の染色体に組み込まれ得る。ベクターは、裸のRNAポリヌクレオチド、裸のDNAポリヌクレオチド、同じ鎖内にDNAとRNAの両方からなるポリヌクレオチド、ポリ-リジン-コンジュゲートDNA又はRNA、ペプチドコンジュゲートDNA又はRNA、リポソームコンジュゲートDNA等であってもよく、それらは天然ではエピソームではなく、1種以上の上記のポリヌクレオチド構築物を含む生物、例えばアグロバクテリウム又は細菌などであり得る。
【００６０】
発現ベクターの様々な構成成分は、ベクター、及びベクターが複製又は発現を駆動しようとする宿主細胞の意図する使用によって様々であってよい。大腸菌、酵母、ストレプトマイセス(Streptomyces)、及び他の一般に使用される細胞における、遺伝子の発現及びベクターの維持に好適な発現ベクターの構成成分は、広く知られており、市販されている。例えば、本開示の発現ベクターへの包含に好適なプロモーターは、真核又は原核宿主微生物で機能するものを含む。プロモーターは、宿主微生物の増殖に対して発現の制御を可能にする、又は化学的若しくは物理的な刺激に応答して遺伝子の発現をオン又はオフにする制御配列を含み得る。大腸菌及び特定の他の細菌宿主細胞では、生合成酵素、抗生物質耐性を付与する酵素、及びファージタンパク質の遺伝子由来のプロモーターが使用され、例えば、ガラクトース、ラクトース(lac)、マルトース、トリプトファン(trp)、ベータ-ラクタマーゼ(bla)、バクテリオファージラムダPL、及びT5プロモーターを含み得る。更に、合成プロモーター、例えばtacプロモーター(全体が参照により本明細書に組込まれる米国特許第4,551,433号)も使用され得る。大腸菌発現ベクターでは、pUC、p1P、p1、及びpBRからなど、大腸菌の複製起点を含むことが有用である。
【００６１】
したがって、組換え発現ベクターは少なくとも1つの発現システムを含有し、発現システムは、適合性の宿主細胞におけるコード配列の発現を引き起こすように作動するプロモーター及び場合により停止配列に作動可能に連結した遺伝子コード配列の少なくとも一部からなる。宿主細胞は、本開示の組換えDNA発現ベクターによる形質転換によって、染色体外エレメントとして又は染色体に組込まれた発現システム配列を含有するように改変される。
【００６２】
更に、また上述したように、代謝物の生成に有用な酵素の相同体は、本明細書で提供する微生物及び方法によって包含される。第一のファミリー又は種の元の酵素又は遺伝子に関して使用される用語「相同体」は、第二のファミリー又は種の異なる酵素又は遺伝子を指し、それらは機能、構造、又はゲノム分析によって第一のファミリー又は種の元の酵素又は遺伝子に相当する第二のファミリー又は種の酵素又は遺伝子であると決定される。ほとんどの場合、相同体は、機能、構造、又はゲノムの類似性を有するであろう。遺伝子プローブ及びPCRを使用して、酵素又は遺伝子の相同体が容易にクローニングされ得る技術が公知である。相同体としてクローニングした配列の同一性は、機能的アッセイを使用して及び/又は遺伝子のゲノムマッピングによって確かめられ得る。
【００６３】
タンパク質は、そのタンパク質をコードする核酸配列が、第二のタンパク質をコードする核酸配列と類似の配列を有する場合、第二のタンパク質に「相同性」を有する、又は「相同」である。或いは、2つのタンパク質が「類似の」アミノ酸配列を有する場合、タンパク質は第二のタンパク質に相同性を有する。(したがって、用語「相同タンパク質」は、2つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味するように定義される)。
【００６４】
本明細書で使用する場合、2つのタンパク質(又はタンパク質の領域)は、アミノ酸配列が少なくとも約30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一性を有する場合、実質的に相同である。2つのアミノ酸配列、又は2つの核酸配列の同一性の割合を決定するため、配列は、最適な比較目的のためにアラインされる(例えば、ギャップは、最適なアライメントのため、第一及び第二のアミノ酸又は核酸配列の一方又は双方に導入され、非相同配列は、比較目的のためには無視され得る)。一実施形態では、比較目的のためにアラインされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30%、典型的には少なくとも40%、より典型的には少なくとも50%、更により典型的には少なくとも60%、及び更により典型的には少なくとも70%、80%、90%、100%である。対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置でのアミノ酸残基又はヌクレオチドを次いで比較する。第一の配列の位置が、第二の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められる場合、分子はその位置で同一である(本明細書で使用する場合、アミノ酸又は核酸「同一性」はアミノ酸又は核酸「相同性」と等価である)。2つの配列間の同一性の割合は、2つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れて、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【００６５】
「相同」が、タンパク質又はペプチドに関して使用される場合、同一でない残基の位置が保存的アミノ酸置換で異なっていることが多いことが認識される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の化学的性質(例えば、電荷又は疎水性)を有する側鎖(R基)を持つ別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的性質を実質的に変更しないであろう。保存的置換によって2つ以上のアミノ酸配列が互いに異なる場合、配列同一性の割合又は相同性の程度は、置換の保存的性質に合わせて上方調整され得る。この調整を行う手段は当業者には周知である(例えば、参照により本明細書に組込まれるPearsonら、1994参照)。
【００６６】
いくつかの例では、「アイソザイム」は、同じ機能的変換/反応を行うが、構造が類似しておらず、典型的には「相同」ではないと決定されるものに使用され得る。
【００６７】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電の極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。以下の6つの群は、それぞれ互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：1)セリン(S)、スレオニン(T);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リシン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アラニン(A)、バリン(V)、及び6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
【００６８】
配列同一性％とも呼ばれ得るポリペプチドの配列相同性は、典型的には配列解析ソフトウェアを使用して測定される。例えば、Genetics Computer Group (GCG)、University of Wisconsin, Biotechnology Center、910 University Avenue、Madison、Wis. 53705の配列解析ソフトウェアパッケージを参照されたい。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠失、及び他の改変に割り当てられた相同性の尺度を使用して類似の配列をマッチングする。例えば、GCGは「Gap」及び「Bestfit」などのプログラムを含み、それらはデフォルトのパラメーターを用いて使用され、異なる種の生物からの、又は野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の相同ポリペプチドなど、近縁のポリペプチド間の配列相同性又は配列同一性を決定し得る。例えば、GCG Version 6.1参照。
【００６９】
分子配列を、異なる生物からの多くの配列を有するデータベースと比較するのに使用される典型的なアルゴリズムは、コンピュータープログラムBLAST(Altschul, 1990; Gish, 1993; Madden, 1996; Altschul, 1997; Zhang, 1997)、特にblastp又はtblastn(Altschul, 1997)である。BLASTpの典型的なパラメーターは: Expectation value: 10 (デフォルト); Filter: seg (デフォルト); Cost to open a gap: 11 (デフォルト); Cost to extend a gap: 1 (デフォルト); Max. alignments: 100 (デフォルト); Word size: 11 (デフォルト); No. of descriptions: 100 (デフォルト); Penalty Matrix: BLOWSUM62である。
【００７０】
多くの異なる生物からの配列を含むデータベースを検索する場合、典型的にはアミノ酸配列を比較する。アミノ酸配列を使用するデータベース検索は、当技術分野で公知のblastp以外のアルゴリズムによって測定され得る。例えば、ポリペプチド配列は、FASTA、GCG Version 6.1のプログラムを使用して比較され得る。FASTAは、クエリーと検索配列の間の最高のオーバーラップの領域のアライメント及び配列同一性の割合を提供する(Pearson, 1990、参照により本明細書に組込まれる)。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性の割合は、参照により本明細書に組込まれるGCG Version 6.1で提供される、そのデフォルトのパラメーター(word size 2及びPAM250 scoring matrix)を用いてFASTAを使用して決定され得る。
【００７１】
特定の実施形態では、代謝経路は炭素源を所望の中間体又は最終産物に変換する。例えば、炭素源はピルビン酸に変換され、これがアセチル-CoA又はイソブタノールに代謝され得る。好適な炭素源は糖であり得る。例えば、炭素源はバイオマス由来の糖であり得る。「バイオマス由来の糖」は、限定はされないが、グルコース、スクロース、マンノース、キシロース、及びアラビノースなどの分子を含む。用語「バイオマス由来の糖」は、通常微生物によって使用される1〜7個の炭素の好適な炭素基質、例えば限定はされないが、全てがD又はL形態のいずれかであるグルコース、ラクトース、ソルボース、フルクトース、イドース、ガラクトース、及びマンノースを含む三〜七炭糖、又は三〜七炭糖の組合せ、例えばグルコース及びフルクトース、及び/又は、限定はされないが、2-ケト-L-グロン酸、イドン酸(IA)、グルコン酸(GA)、6-ホスホグルコン酸、2-ケト-D-グルコン酸(2KDG)、5-ケト-D-グルコン酸、2-ケトグルコン酸リン酸、2,5-ジケト-L-グロン酸、2,3-L-ジケトグロン酸、デヒドロアスコルビン酸、エリソルビン酸(EA)、及びD-マンノン酸を含む六炭糖の酸を包含する。
【００７２】
セルロース及びリグノセルロースの供給原料及び廃棄物、例えば農作物残渣、木材、林業廃棄物、製紙からの廃泥、並びに都市及び産業廃棄物などは、化学物質、プラスチック、燃料、及び供給物の産生のための潜在的に大きな再生可能な供給原料を提供する。セルロース、ヘミセルロース、及びリグニンを含む炭水化物ポリマーからなる、セルロース及びリグノセルロースの供給原料及び廃棄物は、様々な化学的、機械的、及び酵素的手段によって通常処理され、主に六炭糖及び五炭糖を放出し得る。これらの糖は、次いで本明細書に更に記載のように経路に「供給」され、ピルビン酸を産生し得る。
【００７３】
本開示は、本明細書に記載された組換え微生物の生成において有用な種々の遺伝子、相同体及び変異体の受入番号を提供する。本明細書に記載の相同体及び変異体は、例示であり、非限定的であることが理解されるべきである。更なる相同体、変異体及び配列は、ワールドワイドウェブ上でアクセス可能な、例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)を含む様々なデータベースを使用して、当業者が入手可能である。
【００７４】
本明細書で提供する組換え微生物の増殖及び維持に好適な培養条件が当分野で公知である。
【００７５】
広範囲の微生物が、本開示の1種以上の酵素を発現するように操作され得ることが理解される。様々な微生物が、本明細書で提供する組換え微生物における使用に好適な標的酵素をコードする遺伝材料の「供給源」として機能し得ることも理解される。
【００７６】
用語「微生物」は、古細菌、細菌、及び真核生物ドメインからの原核及び真核微生物種を含み、後者は酵母及び糸状菌、原虫、藻類、又は高等原生生物を含む。用語「微生物細胞」及び「微生物（microbes）」は、用語「微生物」と交換可能に使用される。
【００７７】
用語「原核生物」は、当技術分野において認識され、核又は他の細胞小器官を含有しない細胞を指す。原核生物は通常2つのドメイン、細菌及び古細菌のどちらかに分類される。古細菌ドメインと細菌ドメインの生物間の決定的な違いは、16SリボソームRNAのヌクレオチド塩基配列における基本的な違いに基づく。
【００７８】
用語「古細菌」は、典型的には通常ではない環境で見出され、リボソームタンパク質の数及び細胞壁のムラミン酸の欠如を含むいくつかの基準によって残りの原核生物から区別されるメンドシクテス門の生物のカテゴリー分類を指す。ssrRNA分析に基づいて、古細菌は2つの系統的に異なる群:クレン古細菌門(Crenarchaeota)及びユリ古細菌門(Euryarchaeota)からなる。それらの生理学に基づき、古細菌は3つの型:メタン生成菌(メタンを産生する原核生物)、高度好塩菌(非常に高い塩[NaCl]濃度で生育できる原核生物)、及び超(高度)好熱菌(非常に高い温度で生育する原核生物)に組織化できる。細菌からそれらを区別する古細菌の特性(例えば、細胞壁のムレインがない、エステル結合膜脂質等)を統一するほかに、これらの原核生物は、それらの特定の生息場所にそれらを適応させる独特な構造又は生化学的な性状を示す。クレン古細菌門は主に高度好熱菌の硫黄依存性原核生物からなり、ユリ古細菌門はメタン菌及び高度好塩菌を含有する。
【００７９】
「細菌」又は「真正細菌」は、原核生物のドメインを指す。細菌は、以下に示す少なくとも11個の異なる群を含む:(1)グラム陽性(グラム+)細菌、これには2つの主な細分がある:(1)高G+C群(放線菌(Actinomycete)、マイコバクテリア(Mycobacteria)、ミクロコッカス(Micrococcus)、その他、(2)低G+C群(桿菌(Bacillus)、クロストリジウム菌(Clostridia)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、ブドウ球菌(Staphylococci)、連鎖球菌(Streptococci)、マイコプラズマ(Mycoplasmas));(2)プロテオバクテリア(Proteobacteria)、例えば紫色光合成+非光合成グラム陰性細菌(最も「一般的な」グラム陰性細菌を含む);(3)シアノバクテリア(Cyanobacteria)、例えば酸素性光栄養生物;(4)スピロヘータ(Spirochetes)及び関連種;(5)プランクトミセス(Planctomyces);(6)バクテロイデス(Bacteroides)、フラボバクテリア(Flavobacteria);(7)クラミジア(Chlamydia);(8)緑色硫黄細菌(Green sulfur bacteria);(9)緑色非硫黄細菌(Green non-sulfur bacteria)(嫌気性光栄養生物も);(10)放射線抵抗性小球菌及び近縁種;並びに(11)テルモトガ(Thermotoga)及びテルモシフォ  サーモフィルス(Thermosipho thermophiles)。
【００８０】
「グラム陰性細菌」は、球菌、非腸溶杆体、及び腸溶杆体を含む。グラム陰性細菌の属としては、例えば、ナイセリア(Neisseria)属、スピリルム(Spirillum)属、パスツレラ(Pasteurella)属、ブルセラ(Brucella)属、エルシニア(Yersinia)属、フランシセラ(Francisella)属、へモフィルス(Haemophilus)属、ボルデテラ(Bordetella)属、大腸菌(Escherichia)属、サルモネラ(Salmonella)属、赤痢菌(Shigella)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、プロテウス(Proteus)属、ビブリオ(Vibrio)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、バクテロイデス(Bacteroides)属、酢酸菌(Acetobacter)属、好気菌(Aerobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、窒素固定菌(Azotobacter)属、スピリルム(Spirilla)属、セラチア(Serratia)属、ビブリオ(Vibrio)属、根粒菌(Rhizobium)属、クラミジア(Chlamydia)属、リケッチア(Rickettsia)属、トレポネーマ(Treponema)属、及び紡錘菌(Fusobacterium)属が挙げられる。
【００８１】
「グラム陽性細菌」は、球菌、非芽胞性杆体、及び芽胞性杆体を含む。グラム陽性細菌の属としては、例えば、放線菌(Actinomyces)属、桿菌属、クロストリジウム(Clostridium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、エリシペロスリクス(Erysipelothrix)属、乳酸桿菌、リステリア(Listeria)属、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属、ミキソコッカス(Myxococcus)属、ノカルジア(Nocardia)属、ブドウ球菌(Staphylococcus)属、連鎖球菌(Streptococcus)属、及びストレプトマイセス属が挙げられる。
【００８２】
本開示は、グリセルアルデヒド-3-リン酸から3-ホスホグリセリン酸への代謝物変換を含むin vitro又はin vivoシステムにおけるATPレベルを調節する分子レオスタットを提供する。分子レオスタットは、異種ポリヌクレオチドの発現若しくは過剰発現、又は天然のポリヌクレオチドの過剰発現、又は(i)グリセルアルデヒド-3-リン酸(G3P)及びNADP+を3-ホスホグリセリン酸(3PG)及びNADPHに変換する酵素、並びに(ii)グリセルアルデヒド-3-リン酸(G3P)、NADP+及び遊離リン酸(Pi)を1,3-ビスホスホグリセリン酸(1,3BPG)に変換する酵素、並びに(iii)1,3-ビスホスホグリセリン酸(1,3BPG)及びADPを3-ホスホグリセリン酸及びATPに変換する酵素を含む酵素的in vitroシステムを伴う。一実施形態では、(i)の酵素は、NADP-依存性グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GapN)を含む。さらなる実施形態では、GapNはS.ミュータンスから得られる。別の実施形態では、(ii)の酵素は、野生型(配列番号6)と比較してD34A/L35R/T36K変異を含む変異型グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(mGap)を含む。別の実施形態では、(iii)の酵素は、酵素番号(EC番号) EC2.7.2.3を含む。さらなる実施形態では、酵素はホスホグリセリン酸キナーゼである。さらに別の実施形態では、ホスホグリセリン酸キナーゼは、G. ステアロサーモフィルス由来のPgkである。別の実施形態では、分子レオスタットは、NADP-依存性グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GapN)、NADP+を利用する変異型グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素及びホスホグリセリン酸キナーゼの酵素を含む。
【００８３】
別の実施形態では、本開示は、分子レオスタットを使用するイソブタノールの産生を実証する。経路は、1つ以上の異種ポリヌクレオチドの発現若しくは過剰発現、又は1つ以上の天然のポリヌクレオチドの過剰発現、又は(i)グルコースからのグルコース-6-リン酸(G6P)の産生を触媒するポリペプチド;(ii)グルコース-6-リン酸(G6P)からのフルクトース-6-リン酸(F6P)の産生を触媒するポリペプチド;(iii)フルクトース-6-リン酸(F6P)のフルクトース-1,6-リン酸への変換/リン酸化を触媒するポリペプチド;(iv)フルクトース-1,6-リン酸を2個のグリセルアルデヒド-3-リン酸(G3P)に変換するポリペプチド;(v)(a)グリセルアルデヒド-3-リン酸(G3P)及びNADP+を3-ホスホグリセリン酸(3PG)及びNADPHに変換する酵素並びに(b)グリセルアルデヒド-3-リン酸(G3P)、NADP+及び遊離リン酸(Pi)を1,3-ビスホスホグリセリン酸(1,3BPG)に変換する酵素並びに(c)1,3-ビスホスホグリセリン酸(1,3BPG)及びADPを3-ホスホグリセリン酸(3pG)及びATPに変換する酵素を含む分子レオスタット;(vi)3-ホスホグリセリン酸(3PG)を2-ホスホグリセリン酸(2PG)に変換するポリペプチド;(vii)2-ホスホグリセリン酸(2PG)をホスホエノールピルビン酸(PEP)に変換するポリペプチド;(viii)ホスホエノールピルビン酸(PEP)をピルビン酸に変換するポリペプチド;(ix)ピルビン酸をアセト乳酸に変換するポリペプチド;(x)アセト乳酸及びNADPHを2,3ジヒドロキシ-3-メチルブタン酸及びNADP+に変換するポリペプチド;(xi)2,3ジヒドロキシ-3-メチルブタン酸を3-メチル-2-オキソブタン酸に変換するポリペプチド;(xii)3-メチル-2-オキソブタン酸をイソブタナールに変換するポリペプチド、並びに(xiii)イソブタナールをイソブタノールに変換するポリペプチドを含む、酵素的in vitroシステムを含む。
【００８４】
上記で同定された様々な代謝物が、他の異化作用又は同化作用経路の基質として寄与し得ることは、当業者に認識されるであろう。
【００８５】
したがって、本開示は、アセチルリン酸、ピルビン酸、グリセルアルデヒド-3-リン酸、アセチル-CoA及び/又はそれらに由来する他の代謝物を産生し得るシステム及び組換え微生物を提供し、ここで、システム又は微生物は、分子レオスタット又は分子レオスタット及びパージバルブを含む。例えば、本開示は、分子レオスタット及びグルコキナーゼ(ポリリン酸依存性グルコキナーゼ、pfkAを含む、Glk又はその相同体の変異体)、ホスホケトラーゼ(例えば、Fpk、Xpk又はFpk/Xpk若しくはその相同体の変異体)、トランスアルドラーゼ(例えば、Tal又はその変異体)、トランスケトラーゼ(例えば、Tkt又はその相同体の変異体)、リボース-5-リン酸イソメラーゼ(例えば、Rpi又はその相同体の変異体)、リブロース-5-リン酸エピメラーゼ(例えば、Rpe又はその相同体の変異体)、トリオースリン酸イソメラーゼ(例えば、Tpi又はその相同体の変異体)、フルクトース1,6二リン酸アルドラーゼ(例えば、Fba又はその相同体の変異体)、ホスホグルコイソメラーゼ(例えば、Pgi又はその相同体の変異体)、エノラーゼ、脱炭酸酵素(例えば、KivD又は相同体)、アルコール脱水素酵素(例えば、NADPH依存性アルコール脱水素酵素、例えばYahK又は相同体)、ホスホグルコイソメラーゼ(例えば、Pgi又は相同体)、フルクトース1,6二リン酸イソメラーゼ(Fba又はその相同体)、ホスホグリセリン酸ムターゼ(例えば、Pgk又はその相同体)、ピルビン酸キナーゼ(Pyk又はその相同体)、ケトール酸レダクトイソメラーゼ(IlvC又はその相同体)、ジヒドロキシ酸脱水酵素(例えば、IlvD又はその相同体)、及びそれらの任意の組合せから選択される1つ以上の酵素を含み得る経路を提供する。表1は、酵素の供給源として使用され得る受入番号及び生物のリストを提供する。
【００８６】
表1:酵素及び供給源:
【表１】
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【００８７】
前述の1つ以上の酵素は、1,3-ビスホスホグリセリン酸への変換の中間ステップ有り又は無しで、グリセルアルデヒド-3-リン酸の3-ホスホグリセリン酸への変換を触媒する酵素と組み合わせて使用することができ、この中間ステップはリン酸のレベルによって制御される。
【００８８】
さらに、微生物は、親微生物と比較して、基質としてアセチル-coAを優先的に使用する、アルコール/アセトアルデヒド脱水素酵素(例えば、adhE遺伝子)の発現の破壊、欠失又はノックアウトを含み得る。いくつかの実施形態では、さらなるノックアウトは、乳酸脱水素酵素(例えば、ldh)及びfrdBCのノックアウトを含み得る。他の実施形態では、gapA、eda、edd及びmgsAの1つ以上の発現又は活性のノックアウト又は減少が実施され、微生物における他の解糖系経路を除き得る。ノックアウト又は発現低下され得る他の酵素は、Fbp、glpX、並びにその相同体及び変異体を含む。
【００８９】
1つ以上(全てではない)の前述の酵素を有するサブシステム又は生物が利用され、次いで経路の残りの酵素メンバーを含む生物又は他のサブシステムと組み合わされ得ることが理解されよう。
【００９０】
先に記載したように、本開示を通して記載される標的酵素は通常代謝物を産生する。さらに、本開示を通して記載される標的酵素は、ポリヌクレオチドによってコードされる。
【００９１】
したがって、一実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、グルコキナーゼ(Glk、ポリリン酸依存性グルコキナーゼ又はその相同体若しくは変異体)を含む。この発現は、分子レオスタットの酵素と組み合わされてよく、所望の代謝物の産生のためのさらなる下流の酵素をさらに含み得る。Glkは、G. ステアロサーモフィルスに由来し得る。別の実施形態では、Glkの操作された変異体は、グルコキナーゼ活性を有する限り使用され、グルコースをグルコース-6-リン酸に変換し得る。そのような操作された変異体は、部位特異的変異誘発、定方向進化などによって得ることができる。したがって、本開示内に含まれるのは、大腸菌(E.coli)由来のGlkの配列と少なくとも85〜99%同一であり、グルコキナーゼ活性を有するポリペプチドである。
【００９２】
別の又はさらなる実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、ホスホフルクトキナーゼ(Pfk、ポリリン酸依存性Pfk又はその相同体若しくは変異体)の発現を含む。この発現は、アセチルリン酸、アセチル-coA、又はそれらに由来する他の代謝物の産生のための代謝経路において他の酵素と組み合わされ得る。Pfkは、G. ステアロサーモフィルスに由来し得る。別の実施形態では、Pfkの操作された変異体は、ホスホグルコキナーゼ及び/又はホスホフルクトキナーゼ活性を有する限り使用され、フルクトース-6-リン酸をフルクトース-1,6-リン酸に変換し得る。そのような操作された変異体は、部位特異的変異誘発、定方向進化などによって得ることができる。したがって、本開示内に含まれるのは、G. ステアロサーモフィルス由来のPfkの配列と少なくとも85〜99%同一であり、6-ホスホフルクトキナーゼ活性を有するポリペプチドである(例えば、配列番号1と85〜100%同一である)。
【００９３】
別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、トリオースリン酸イソメラーゼを含む。この酵素は、上記及び下記に本明細書に記載のように、アセチルリン酸、ピルビン酸、アセチル-CoA、又はそれらに由来する他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素と組み合わされ得る。酵素は、フルクトース-1,6-リン酸からグリセルアルデヒド-3-リン酸を含む代謝物を産生する。トリオースリン酸イソメラーゼは、Tpi遺伝子、ポリヌクレオチド(polyncleotide)又はその相同体によってコードされ得る。Tpi遺伝子又はポリヌクレオチドは、G. ステアロサーモフィルス及び大腸菌を含む様々な微生物に由来し得る。
【００９４】
先に加えて、用語「トリオースリン酸イソメラーゼ」又は「Tpi」は、フルクトース-1,6-リン酸からのグリセルアルデヒド-3-リン酸の形成を触媒することができ、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出した場合、配列番号2と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列類似性を共有するタンパク質を指す。さらなる相同体は、G. ステアロサーモフィルス、ATCC12980、KOR95273(配列番号2);ラット(Rattus norvegicus) AAA42278.1;ホモサピエンス(Homo sapiens) AAH17917.1;枯草菌(Bacillus subtilis) BEST7613 NP_391272.1;シネココッカス・エロンガタス(Synechococcus elongatus)PCC 6301 YP_171000.1;及びチフス菌(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str.) AG3 ZP_06540375.1を含む。前述の受入番号と関連する配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９５】
別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、フルクトース1,6-二リン酸アルドラーゼを含む。この酵素は、上記及び下記に本明細書に記載のように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれらに由来する他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素による発現又は過剰発現と組み合わされ得る。酵素は、フルクトース-1,6-二リン酸からグリセルアルデヒド-3-リン酸を含む代謝物を産生する。フルクトース-1,6二リン酸アルドラーゼは、Fba遺伝子、ポリヌクレオチド又はその相同体によってコードされ得る。Fba遺伝子又はポリヌクレオチドは、黄色ブドウ球菌(S. aureus)を含む様々な微生物に由来し得る。
【００９６】
先に加えて、用語「フルクトース1,6二リン酸アルドラーゼ」又は「Fba」は、フルクトース1,6-二リン酸からのグリセルアルデヒド-3-リン酸の形成を触媒することができ、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出した場合、配列番号3と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列類似性を共有するタンパク質を指す。さらなる相同体は、黄色ブドウ球菌亜種アウレウス(S. aureus subsp. Aureus)、BAR10119(配列番号3);シネココッカス・エロンガタスPCC 6301 YP_170823.1;ビブリオ・ニグリパリクリチュード(Vibrio nigripulchritudo) ATCC 27043 ZP_08732298.1;メチロミクロビウム・アルバム(Methylomicrobium album) BG8 ZP_09865128.1;蛍光菌(Pseudomonas fluorescens) Pf0-1 YP_350990.1;及びメチロバクテリウム・ノデュランス(Methylobacterium nodulans) ORS 2060 YP_002502325.1を含む。前述の受入番号と関連する配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９７】
別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、ホスホグルコイソメラーゼを含む。この酵素は、上記及び下記に本明細書に記載のように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれらに由来する他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素による発現又は過剰発現と組み合わされ得る。酵素は、グルコース-6-リン酸からフルクトースリン酸を含む代謝物を産生する。ホスホグルコキナーゼは、Pgi遺伝子、ポリヌクレオチド又はその相同体によってコードされ得る。Pgi遺伝子又はポリヌクレオチドは、G. サーモデニトリフィカンス(G. thermodenitrificans)を含む様々な微生物に由来し得る。
【００９８】
先に加えて、用語「ホスホグルコイソメラーゼ」又は「Pgi」は、グルコース-6-リン酸からのフルクトース-6-リン酸の形成を触媒することができ、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出した場合、配列番号4と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列類似性を共有するタンパク質を指す。
【００９９】
別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、非リン酸化グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素を含む。この酵素は、上記及び下記に本明細書に記載のように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれらに由来する他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素による発現又は過剰発現と組み合わされ得る。酵素は、グリセルアルデヒド-3-リン酸から3-ホスホグリセリン酸を含む代謝物を産生する。非リン酸化グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素は、GapN遺伝子、ポリヌクレオチド又はその相同体によってコードされ得る。GapN遺伝子又はポリヌクレオチドは、S.ミュータンスを含む様々な微生物に由来し得る。
【０１００】
先に加えて、用語「非リン酸化グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素」又は「GapN」は、グリセルアルデヒド-3-リン酸からの3-ホスホグリセリン酸の形成を触媒することができ、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出した場合、配列番号5と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列類似性を共有するタンパク質を指す。
【０１０１】
別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、優先的にNADP+を使用した変異型リン酸化(phophorylating)グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素を含む。この酵素は、上記及び下記に本明細書に記載のように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれらに由来する他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素による発現又は過剰発現と組み合わされ得る。酵素は、グリセルアルデヒド-3-リン酸から1,3-ビスホスホグリセリン酸を含む代謝物を産生する。変異型リン酸化グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素は、GapDH遺伝子の変異型、ポリヌクレオチド又はその相同体によってコードされ、変異D34A/L35R/T36Kを含み得る。GapDH遺伝子又はポリヌクレオチドは、G. ステアロサーモフィルスを含む様々な微生物に由来し得る。
【０１０２】
先に加えて、用語「変異型リン酸化グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素」又は「mGap」は、グリセルアルデヒド-3-リン酸及びNADP+及び遊離リン酸(Pi)からの1,3-ビスホスホグリセリン酸の形成を触媒することができ、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出した場合、配列番号6と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を共有し、変異D34A/L35R/T36Kを含み、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列類似性を共有するタンパク質を指す。
【０１０３】
別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、ホスホグリセリン酸キナーゼを含む。この酵素は、上記及び下記に本明細書に記載のように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれらに由来する他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素による発現又は過剰発現と組み合わされ得る。酵素は、1,3-ビスホスホグリセリン酸及びADPから3-ホスホグリセリン酸を含む代謝物を産生する。ホスホグリセリン酸キナーゼは、Pgk遺伝子、ポリヌクレオチド又はその相同体によってコードされ得る。Pgk遺伝子又はポリヌクレオチドは、G. ステアロサーモフィルスを含む様々な微生物に由来し得る。
【０１０４】
先に加えて、用語「ホスホグリセリン酸キナーゼ」又は「Pgk」は、1,3-ビスホスホグリセリン酸及びADPからの3-ホスホグリセリン酸の形成を触媒することができ、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出した場合、配列番号7と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列類似性を共有するタンパク質を指す。
【０１０５】
別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、ホスホグリセリン酸ムターゼを含む。この酵素は、上記及び下記に本明細書に記載のように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれらに由来する他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素による発現又は過剰発現と組み合わされ得る。酵素は、3-ホスホグリセリン酸から2-ホスホグリセリン酸を含む代謝物を産生する。ホスホグリセリン酸ムターゼは、Pgm遺伝子、ポリヌクレオチド又はその相同体によってコードされ得る。Pgm遺伝子又はポリヌクレオチドは、G. ステアロサーモフィルスを含む様々な微生物に由来し得る。
【０１０６】
先に加えて、用語「ホスホグリセリン酸ムターゼ」又は「Pgm」は、3-ホスホグリセリン酸からの2-ホスホグリセリン酸の形成を触媒することができ、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出した場合、配列番号8と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列類似性を共有するタンパク質を指す。
【０１０７】
別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、エノラーゼを含む。この酵素は、上記及び下記に本明細書に記載のように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれらに由来する他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素による発現又は過剰発現と組み合わされ得る。酵素は、2-ホスホグリセリン酸からホスホエノールピルビン酸を含む代謝物を産生する。エノラーゼは、エノラーゼ遺伝子、ポリヌクレオチド又はその相同体によってコードされ得る。エノラーゼ遺伝子又はポリヌクレオチドは、大腸菌を含む様々な微生物に由来し得る。
【０１０８】
先に加えて、用語「エノラーゼ」は、2-ホスホグリセリン酸からのホスホエノールピルビン酸の形成を触媒することができ、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出した場合、配列番号9と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列類似性を共有するタンパク質を指す。
【０１０９】
別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、ピルビン酸キナーゼを含む。この酵素は、上記及び下記に本明細書に記載のように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれらに由来する他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素による発現又は過剰発現と組み合わされ得る。酵素は、ホスホエノールピルビン酸からピルビン酸を含む代謝物を産生する。ピルビン酸キナーゼは、Pyk遺伝子、ポリヌクレオチド又はその相同体によってコードされ得る。Pyk遺伝子又はポリヌクレオチドは、大腸菌を含む様々な微生物に由来し得る。
【０１１０】
先に加えて、用語「ピルビン酸キナーゼ」又は「Pyk」は、ホスホエノールピルビン酸からのピルビン酸の形成を触媒することができ、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出した場合、配列番号10と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列類似性を共有するタンパク質を指す。
【０１１１】
別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、アセト乳酸合成酵素を含む。この酵素は、上記及び下記に本明細書に記載のように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれらに由来する他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素による発現又は過剰発現と組み合わされ得る。酵素は、ピルビン酸からアセト乳酸を含む代謝物を産生する。アセト乳酸合成酵素は、AlsS遺伝子、ポリヌクレオチド又はその相同体によってコードされ得る。AlsS遺伝子又はポリヌクレオチドは、枯草菌(B. subtilis)を含む様々な微生物に由来し得る。一態様では、アセトヒドロキシ酸合成酵素は、大腸菌におけるilvIHオペロン、ilvBNオペロン、ilvGM、又は枯草菌由来のalsS遺伝子、又はその相同体に由来するポリヌクレオチドによってコードされ得る。ilvIHオペロンのilvI遺伝子はアセトヒドロキシ酸合成酵素大サブユニットポリペプチドをコードし、ilvIHオペロンのilvH遺伝子はアセトヒドロキシ酸合成酵素小サブユニットポリペプチドをコードする。
【０１１２】
先に加えて、用語「アセト乳酸合成酵素」又は「AlsS」は、ホスホエノールピルビン酸からのピルビン酸の形成を触媒することができ、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出した場合、配列番号11と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列類似性を共有するタンパク質を指す。
【０１１３】
別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼを含む。この酵素は、上記及び下記に本明細書に記載のように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれらに由来する他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素による発現又は過剰発現と組み合わされ得る。酵素は、アセト乳酸から2,3ジヒドロキシ-3-メチルブタン酸を含む代謝物を産生する。アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼは、IlvC遺伝子、ポリヌクレオチド又はその相同体によってコードされ得る。IlvC遺伝子又はポリヌクレオチドは、大腸菌を含む様々な微生物に由来し得る。アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼは、イソロイシン及びバリンの生合成の並行経路における第2の酵素である。IlvCは、大腸菌においてアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする。IlvCの相同体及び変異体が公知であり、例えば、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ(シゾサッカロミセス・ポンべ(Schizosaccharomyces pombe) 972h-) gi|162312317|ref|NP_001018845.2|(162312317);アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ(シゾサッカロミセス・ポンべ) gi|3116142|emb|CAA18891.1|(3116142);アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ(サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) YJM789) gi|151940879|gb|EDN59261.1|(151940879); Ilv5p:アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ(サッカロミセス・セレビシエ) gi|609403|gb|AAB67753.1|(609403); ACL198Wp (アシュバ・ゴシッピ(Ashbya gossypii) ATCC 10895) gi|45185490|ref|NP_983206.1|(45185490); ACL198Wp (アシュバ・ゴシッピATCC 10895) gi|44981208|gb|AAS51030.1|(44981208);アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ; Ilv5x (サッカロミセス・セレビシエ) gi|957238|gb|AAB33579.1||bbm|369068|bbs|165406(957238);アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ; Ilv5g (サッカロミセス・セレビシエ) gi|957236|gb|AAB33578.1||bbm|369064|bbs|165405(957236);及びケトール酸レダクトイソメラーゼ(シゾサッカロミセス・ポンべ) gi|2696654|dbj|BAA24000.1|(2696654)を含み、受入番号に関連する各配列は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
先に加えて、用語「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ」又は「IlvC」は、ホスホエノールピルビン酸からのピルビン酸の形成を触媒することができ、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出した場合、配列番号12と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列類似性を共有するタンパク質を指す。
【０１１５】
別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、ジヒドロキシ酸脱水酵素を含む。この酵素は、上記及び下記に本明細書に記載のように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれらに由来する他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素による発現又は過剰発現と組み合わされ得る。酵素は、2,3ジヒドロキシ-3-メチルブタン酸から3-メチル-2-オキソブタン酸を含む代謝物を産生する。ジヒドロキシ酸脱水酵素は、IlvD遺伝子、ポリヌクレオチド又はその相同体によってコードされ得る。IlvD遺伝子又はポリヌクレオチドは、大腸菌を含む様々な微生物に由来し得る。ジヒドロキシ酸脱水酵素は、イソロイシン及びバリンの生合成の第4のステップ、2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸のアルファ-ケトイソ吉草酸への脱水を触媒する。IlvD及びilv3は、ジヒドロキシ酸脱水酵素をコードする。ジヒドロキシ酸脱水酵素の相同体及び変異体が公知であり、例えば、IlvD(らい菌(Mycobacterium leprae)) gi|2104594|emb|CAB08798.1|(2104594);ジヒドロキシ酸脱水酵素(トロフェリマ・ホイップレイ(Tropheryma whipplei) TW08/27) gi|28410848|emb|CAD67234.1|(28410848);ジヒドロキシ酸脱水酵素(らい菌gi|13093837|emb|CAC32140.1|(13093837);ジヒドロキシ酸脱水酵素(ロドピレルーラ・バルティカ(Rhodopirellula baltica) SH 1) gi|32447871|emb|CAD77389.1|(32447871);及び推定のジヒドロキシ酸脱水酵素(黄色ブドウ球菌亜種アウレウス(Staphylococcus aureus subsp. aureus) MRSA252) gi|49242408|emb|CAG41121.1|(49242408)を含み、受入番号に関連する各配列は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
先に加えて、用語「ジヒドロキシ酸脱水酵素」又は「IlvD」は、ホスホエノールピルビン酸からのピルビン酸の形成を触媒することができ、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出した場合、配列番号13と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列類似性を共有するタンパク質を指す。
【０１１７】
別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、2-ケト酸脱炭酸酵素(ケト-イソ吉草酸脱炭酸酵素とも呼ばれる)を含む。この酵素は、上記及び下記に本明細書に記載のように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれらに由来する他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素による発現又は過剰発現と組み合わされ得る。酵素は、3-メチル-2-オキソブタン酸からイソブタナールを含む代謝物を産生する。2-ケト酸脱炭酸酵素は、kivD遺伝子、ポリヌクレオチド又はその相同体によってコードされ得る。kivD遺伝子又はポリヌクレオチドは、L. ラクティス(L. lactis)を含む様々な微生物に由来し得る。ジヒドロキシ酸脱水酵素は、イソロイシン及びバリンの生合成の第4のステップ、2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸のアルファ-ケトイソ吉草酸への脱水を触媒する。IlvD及びilv3は、ジヒドロキシ酸脱水酵素をコードする。2-ケト酸脱炭酸酵素は、2-ケト酸のそれぞれのアルデヒドへの変換を触媒する。例えば、2-ケトイソ吉草酸脱炭酸酵素は、2-ケトイソ吉草酸のイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する。多くの2-ケト酸脱炭酸酵素が公知であり、pdc、pdc1、pdc5、pdc6、aro10、thI3、kdcA、及びkivd遺伝子によって例示される。2-ケト酸のそれぞれのアルデヒドへの変換に有用な例示的な相同体及び変異体は、以下の受入番号によって示され、酵素活性が同定された配列を含む：gi|44921617|gb|AAS49166.1|分岐鎖アルファ-ケト酸脱炭酸酵素(ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)); gi|15004729|ref|NP_149189.1|ピルビン酸脱炭酸酵素(クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824); gi|82749898|ref|YP_415639.1|推定ピルビン酸脱炭酸酵素  (黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus) RF122); gi|77961217|ref|ZP_00825060.1| COG3961:ピルビン酸脱炭酸酵素及び関連チアミンピロリン酸要求酵素(エルシニア・モラレッティイ(Yersinia mollaretii) ATCC 43969); gi|71065418|ref|YP_264145.1|推定ピルビン酸脱炭酸酵素(サイクロバクター・アークティカス(Psychrobacter arcticus) 273-4); gi|16761331|ref|NP_456948.1|推定脱炭酸酵素(チフス菌CT18); gi|93005792|ref|YP_580229.1|ピルビン酸脱炭酸酵素(サイクロバクター・クリオハロレティス(Psychrobacter cryohalolentis) K5); gi|23129016|ref|ZP_00110850.1| COG3961:ピルビン酸脱炭酸酵素及び関連チアミンピロリン酸要求酵素(ノストック・パンクテフォルメ(Nostoc punctiforme) PCC 73102); gi|16417060|gb|AAL18557.1|AF354297_1  ピルビン酸脱炭酸酵素(サルシナ・ベントリクリ(Sarcina ventriculi); gi|15607993|ref|NP_215368.1|推定ピルビン酸又はインドール-3-ピルビン酸脱炭酸酵素Pdc (マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis) H37Rv); gi|41406881|ref|NP_959717.1| Pdc (マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) K-10); gi|91779968|ref|YP_555176.1|  推定ピルビン酸脱炭酸酵素(バークホリデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans) LB400); gi|15828161|ref|NP_302424.1|  ピルビン酸(又はインドールピルビン酸)脱炭酸酵素(らい菌TN); gi|118616174|ref|YP_904506.1|  ピルビン酸又はインドール-3-ピルビン酸脱炭酸酵素Pdc (マイコバクテリウム・アルセランス(Mycobacterium ulcerans) Agy99); gi|67989660|ref|NP_001018185.1|  仮想タンパク質SPAC3H8.01 (シゾサッカロミセス・ポンべ972h-); gi|21666011|gb|AAM73540.1|AF282847_1  ピルビン酸脱炭酸酵素PdcB (リゾプス・オリゼ(Rhizopus oryzae)); gi|69291130|ref|ZP_00619161.1|  ピル���ン酸脱炭酸酵素:ピルビン酸脱炭酸酵素(キネオコッカス・ラジオトレランス(Kineococcus radiotolerans) SRS30216); gi|66363022|ref|XP_628477.1|ピルビン酸脱炭酸酵素(クリプトスポリジウム・パルブム  Iowa II型(Cryptosporidium parvum Iowa II)); gi|70981398|ref|XP_731481.1|  ピルビン酸脱炭酸酵素(アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus) Af293); gi|121704274|ref|XP_001270401.1|  ピルビン酸脱炭酸酵素、推定(アスペルギルス・クラバタス(Aspergillus clavatus) NRRL 1); gi|119467089|ref|XP_001257351.1|  ピルビン酸脱炭酸酵素、推定(ネオサルトリア・フィシェリ(Neosartorya fischeri) NRRL 181); gi|26554143|ref|NP_758077.1|  ピルビン酸脱炭酸酵素(マイコプラズマ・ペネトランス(Mycoplasma penetrans) HF-2); gi|21666009|gb|AAM73539.1|AF282846_1  ピルビン酸脱炭酸酵素PdcA (リゾプス・オリゼ)。受入番号に関連する各配列は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
2-ケト酸脱炭酸酵素活性は、以下の遺伝子の1つによって提供され得る:サッカロミセス・セルビシエ由来のPDC6、ラクトコッカス・ラクティス由来のkivd、及びサッカロミセス・セルビシエ由来のTHI3(α-ケトイソカプロン酸脱炭酸酵素)及びクロストリジウム・アセトブチリカム由来のpdc。アルコール脱水素酵素(Adh)活性はサッカロミセス・セルビシエ由来のADH2によって提供され得る。
【０１１９】
先に加えて、用語「2-ケト酸脱炭酸酵素」又は「kivD」は、ホスホエノールピルビン酸からのピルビン酸の形成を触媒することができ、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出した場合、配列番号14と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列類似性を共有するタンパク質を指す。
【０１２０】
別の実施形態では、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、アルコール脱水素酵素を含む。この酵素は、上記及び下記に本明細書に記載のように、アセチルリン酸、アセチル-CoA、又はそれらに由来する他の代謝物の産生のための代謝経路における他の酵素による発現又は過剰発現と組み合わされ得る。酵素は、イソブタナールからイソブタノールを含む代謝物を産生する。アルコール脱水素酵素は、Yahk遺伝子、ポリヌクレオチド又はその相同体によってコードされ得る。Yahk遺伝子又はポリヌクレオチドは、大腸菌を含む様々な微生物に由来し得る。
【０１２１】
先に加えて、用語「アルコール脱水素酵素」又は「Yahk」は、ホスホエノールピルビン酸からのピルビン酸の形成を触媒することができ、デフォルトのパラメーターを使用してNCBI BLASTによって算出した場合、配列番号15と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性、又は少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列類似性を共有するタンパク質を指す。
【０１２２】
前述の実施形態の全てにおいて、本明細書で提供するシステム又は組換え微生物は、パージバルブを含み得る。パージバルブは、システム機能を維持するために、多くの過剰な補助因子をベントする/除去する又はそうでなければ排除する酵素反応を含む。例えば、一実施形態では、パージバルブはNADH酸化酵素(NoxE)を含む。NADH酸化酵素は、NoxE遺伝子、ポリヌクレオチド又はその相同体によってコードされ得る。NoxE遺伝子又はポリヌクレオチドは、L. ラクティスを含む様々な微生物に由来し得る。(例えば、受入番号YP_007507681参照)。
【０１２３】
先に述べたように、ベクター、プロモーター、及び多くの他の関連課題の使用を含む、本明細書で有用な分子生物学的技術を記載する一般的な文書は、Berger及びKimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology Volume 152, (Academic Press, Inc., San Diego, Calif.) ("Berger"); Sambrookら、Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 2d ed., Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 ("Sambrook")及びCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubelら編、Current Protocols、Greene Publishing Associates, Inc.とJohn Wiley & Sons, Inc.の合弁事業、(1999年に補足された) ("Ausubel")を含み、その各々は、その全体が参照により本明細書に組込まれる。
【０１２４】
例えば、本開示の相同な核酸の産生のためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Qβ-レプリカーゼ増幅法、及び他のRNAポリメラーゼ媒介技術(例えば、NASBA)を含む、in vitro増幅法を通して技術者を導くのに十分なプロトコールの例は、Berger、Sambrook、及びAusubel、並びにMullisら、(1987)米国特許第4,683,202号; Innisら編、(1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press Inc. San Diego, Calif.) ("Innis"); Arnheim & Levinson (1990年10月1日) C&EN 36〜47頁; The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81〜94頁; Kwohら(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173頁; Guatelliら(1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87: 1874頁; Lomellら(1989) J. Clin. Chem 35: 1826頁; Landegrenら、(1988) Science 241: 1077〜1080頁; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291〜294頁; Wu及びWallace (1989) Gene 4:560頁; Barringerら(1990) Gene 89:117頁;並びにSooknanan及びMalek (1995) Biotechnology 13:563〜564頁に見出される。
【０１２５】
in vitroで増幅した核酸のクローニングのための改善された方法は、Wallaceら、米国特許第5,426,039号に記載される。
【０１２６】
PCRによって大きな核酸を増幅するための改善された方法は、Chengら (1994) Nature 369: 684〜685頁及びそこに引用される文献に要約され、ここでは最大40kbのPCR増幅産物が生成される。当業者は、本質的に任意のRNAが、逆転写酵素及びポリメラーゼを使用して、制限分解、PCR増幅及びシーケンシングに好適な2本鎖DNAへと変換され得ることを認識するであろう。例えば、Ausubel、Sambrook及びBerger、上述の全てを参照されたい。
【０１２７】
本発明は、以下の実施例に例示され、それらは例示の目的で提供され、限定することを意図しない。
【０１２８】
[実施例]
Miller LB培地又はMiller LB-アガー(BD Difco)を、液体又は固体培地での細菌株の増殖に使用した。大腸菌BL21Gold(DE3) [B, F-, ompT, hsdSB, (rB-,mB-), dcm+,Tetr,galλ,(DE3) endA Hte] (Agilent)を、pETベクターを使用する組換えタンパク質のクローニングと発現の両方の宿主として使用した。大腸菌TOP10(DE3) [F- mcrA  Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)  Ψ80lacZΔM15  ΔlacX74 nupG recA1 araD139  Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1  λ-]を、pBAD/p15Aベクターからの組換えタンパク質の発現に使用した。プラスミドpET28a(+)及びpET22b(+)はNovagenから購入した。HotStart Taq Mastermix (Denville)を、ゲノム又はプラスミドDNAからの遺伝子増幅に使用した。Phusion DNAポリメラーゼ(Finnizymes)、Taq DNAリガーゼ(MCLab)、及びT5エクソヌクレアーゼ(Epicenter)は別々に購入し、クローニングに使用するアセンブリーマスターミックス(AMM)を作製するために使用した。ATP、ピルビン酸、及びNAD(P)+はSigmaから購入した。
【０１２９】
プラスミド構築。酵素の発現プラスミドは、Nde1及びSac1切断部位を使用してpET28aプラスミド骨格から構築し、精製のためのN末端6×Hisタグを有する構築物を作製した。大腸菌BL21-Gold細胞を、酵素発現の宿主株として使用した。全ての酵素は、50μg/mLカナマイシンを補充したLuria-Bertani(LB)培地中で発現し、対数期増殖の終わりに培地に添加した0.2mMイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシドによって誘導した。
【０１３０】
酵素精製。0.5Lの培養物からの細胞を遠心分離によって回収し、150mM Tris pH7.5、100mM NaCl中に再懸濁した。細胞は、超音波処理によって氷上で溶解し、細胞片を4℃で12,000×gの遠心分離によって除去した。上清は、次いで、5mLのニッケル-ニトリロ三酢酸(NTA)アガロースと混合し、30分後、アガローススラリーを重力カラムにロードし、5カラム容量の100mM Tris pH7.5、100mM NaCl、15mMイミダゾールで洗浄した。酵素は、次いで250mMイミダゾール、100mM Tris pH7.5で溶出した。得られた酵素を、50mM Tris pH7.5、50mM NaClに透析し、4℃で保存した。
【０１３１】
酵素活性及び最適化。本研究で使用した全ての酵素をアッセイした。酵素は、最終反応条件を反映する50mM Tris緩衝液pH7.5、5mM MgCl、及び5mM KCl中でアッセイした。NAD(P)H産生又は消費反応の活性を、340nmでモニターした。ATP消費酵素の活性を、340nmで、Zwf及びNADP+との組合せアッセイを使用してモニターした。
【０１３２】
酵素のATPアーゼアッセイは、5mM PEP、1mM ATP、1ul PK/LDH、0.25mM NADH及び5ulの所与の酵素で試験した。ATPアーゼ活性は、340nmでのNADH濃度の減少によって算出した。
【０１３３】
最終イソブタノール反応条件及び分析。グルコースのイソブタノールへの生体内転換のための最適な自己持続反応は、200μLの最終反応容積中、50mM Tris pH 7.5、5mM MgCl、5mM KCl、2mM NADP+、4mM ATP、1mMグルタチオン、0.25mM TPP、0.25mM MnCl、4 mM Pi、0.5mM 2,3 BPG、及び660mMグルコースからなる。反応は、最初の混合物からは除かれたグルコースの添加によって開始した。全ての反応は、室温で実施した。
【０１３４】
イソブタノールのアッセイのため、反応物をインキュベートし、0.3mLヘキサンで抽出した。1ulのヘキサン層を、HP 5890シリーズIIガスクロマトグラムを使用して、0.25ミクロンのHP-Innowaxカラムに適用した。GC方法は、35分かけて275℃まで上げる前に5分間50℃で維持する注入温度を使用した。ピーク強度を確かな標準と比較し、濃度を評価した。
【０１３５】
化学量論的イソブタノール経路。経路を設計及び実行し、高エネルギー補助因子の化学量論的リサイクルを用いてイソブタノールを生成した。2-ケト酸イソブタノール構築相は、2個のピルビン酸及び2個のNADPHを用い、ATPは用いないが、古典的な解糖系経路は、2個のピルビン酸、2個のNADH及び2個のATPを産生する。したがって、補助因子を化学量論的に使用するためには、経路は、(1)NADHよりも2個のNADPHの生成及び(2)正味のATP産生の排除、を必要とする。これらの制約を考え、グリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素(GAPDH)及びホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)が非リン酸化グリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素(GAPN)によって置き換えられている、図1及び6に示した14個の酵素経路を開発した。GAPNの使用により、2個のATPの産生を排除し、NADHではなくNADPHを生成する。経路全体がATPとNADPHの両方の産生及び消費に関して化学量論的になり、全体的な理論炭素収率は41%である。
【０１３６】
図1に示す全体の経路は、COPASIを使用して経路の重要な可能性のあるステップを同定するために最初に作られた。このモデルから、ヘキソキナーゼ及びホスホフルクトキナーゼの相対活性が、システムを通るフラックスの達成に有用であることが明らかになった。解糖系において、ヘキソキナーゼ及びホスホフルクトキナーゼは利用可能なATPに対して互いに競合するため、この結果は理にかなっている。したがって、ヘキソキナーゼの相対活性が高すぎる場合、グルコース-6-リン酸(G6P)の産生においてATPが急速に枯渇し、ホスホフルクトキナーゼ反応のために残るATPが不十分となり、最終的に、炭素フラックスを止め、反応を終わらせ得る。これを考慮して、最初の反応は、ヘキソキナーゼを律速酵素として設定した。グルコースからのイソブタノール産生を検出すると、補助因子及び酵素濃度は系統的に最適化され、図2Aに示す経時的な産生をもたらす。高い最初の生産性は18時間で急速に減少し、3日後、161±3mMイソブタノールの力価に上昇する(11.9±0.2g/L)。
【０１３７】
経路は、ATP産生及び消費に関して化学量論的に均衡が取れているため、反応速度の急激な減少は、システムにおけるATPアーゼ活性によるであろうと推測された。したがって、ATPアーゼ活性を経路の個々の酵素のそれぞれで測定し、エノラーゼ及びilvC酵素調製物が、システムの他の酵素よりも明らかに高いATPアーゼレベルを持つことが見いだされた。したがって、エノラーゼ及びilvCを再精製し、夾雑するATPアーゼ活性を減少させた。化学量論的反応を、再精製した酵素を用いて再設定したところ、これは、3日間にわたり192±8mMイソブタノールの改善した力価をもたらした(14.2±0.6g/L)。にもかかわらず、産生は依然として18時間後に減少した。
【０１３８】
試験を実施して、通常通り反応を開始し、次いで、24時間後に別のATP又はNADPHを添加することによって、補助因子の枯渇が問題であるかどうか分析した(図2B)。48時間後、NADPHを補充した反応はイソブタノール産生に変化を示さなかったが、ATPを補充した反応は、対照よりイソブタノール産生を41%増加させた。これらの結果は、ATPアーゼ夾雑又は受動的なATP加水分解のいずれかによるATP加水分解が、ATPアーゼ夾雑を精製により除く複数の試み後でさえも、この化学量論的経路におけるイソブタノール産生の律速因子であり得ることを示している。
【０１３９】
ATPレオスタットの設計。これまでのところ、結果は、ATPの枯渇が化学量論的反応システムの長期間の持続性の主要な問題であることを示している。この問題を解決する1つの方法は、全ての酵素を丁寧に精製し、いかなるATPアーゼ活性も排除することであろう。しかしながら、自然に生じる加水分解又は不完全なキナーゼ反応による加水分解を完全に排除することはできない可能性がある。さらに、完全に純粋な酵素調製物を必要とすることは、大規模では実現不可能である。したがって、システムの固有の特徴としてATPレベルを回復する方法が開発された。このため、分子レオスタットを使用した。
【０１４０】
分子レオスタット(図3A)は、最終的にグリセルアルデヒド-3-リン酸(G3P)を3-ホスホグリセリン酸(3PG)に転換する2つの競合する経路の分岐で構成されている。一方の分岐はATPを生成するが、ATP生成分岐を通るフローはPiレベルによって制御される。最初の分岐は、1つの酵素、化学量論的経路で使用される非リン酸化GapNで構成され、NADP+をNADPHに還元し、ATPを生成せずにG3Pを3PGに直接変換する。第2の経路は、2つの酵素、NADPH特異的、リン酸化グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GapDH)及びホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)からなり、NADPHも産生するが、まずG3Pを1,3-ビスホスホグリセリン酸(1,3BPG)へ、続いてPGKの作用により3PG及びATPへ変換する。したがって、GapDH/PGK分岐は、GapNのみの分岐と比較してさらなるATPを産生する。
【０１４１】
レオスタットのATP生成分岐を通る相対フローは、遊離Piによって調節され、これはADP及びPiへと加水分解されるATPの量の代わりとして作用する。レオスタットの機能は、最も簡単な場合で見るのが最も簡単であり、ここでは、外因性のPiが反応に添加されない(図3A)。この場合、最初は遊離Piが無く、リン酸化GAPDHを通るフラックスはあり得ない。したがって、Piの非存在下では、全てのフラックスはGapN分岐を通過する。ATPがADP及びPiに加水分解される場合のみ、リン酸化分岐が使用され得る。したがって、レオスタットはATPの枯渇を感知し、リン酸化GAPDH分岐を利用することによりATPを回復するように作用する。
【０１４２】
この設計の有効性を調べるため、COPASIを使用する分子レオスタットシステム有り又は無しで経路全体のコンピューターモデルを作成した(図4)。予想通り、GapNのみに依存する化学量論的経路は、任意の量のATP加水分解が導入されると徐々に終わり、実験的に観察されたのと非常に似ている。この経路のGapDH及びPGKを増加させて、分子レオスタットを完成させた場合、反応は定常状態に達し、完了に至る。このモデルでは、GapDH及びPGKを通るフラックスがモデル化したATPアーゼ活性よりも高いといつでも、分子レオスタットは定常状態に達する。この自己制御機能は、ノードが広範囲のATPアーゼ活性で操作し、システムを定常状態に到達させる特定の量のATP加水分解にシステムを完全に適合及び調和させる必要がないことを意味する。ATP産生のこの自己制御挙動は、使用が容易な、自己持続性in vitro酵素経路の設計のための重要な特徴である。さらに、この経路のモデル化は、コンピューターにより、一連の条件下でのレオスタット概念の迅速な試験を可能にし、Pi、ATP、及びヘキソキナーゼを増加させると、全体的な反応速度の増加をもたらすはずであることを決定する。
【０１４３】
Gap M6の操作。「分子レオスタット」モジュールを実行するため、効果的にNADP+を使用するようにGapDH酵素を操作した。大腸菌GapDH(EcGap)とG. ステアロサーモフィルスGapDH(GsGap)は両方とも、NADP+よりもNAD+を好むが、NADP+では、GsGapはEcGap(NAD+に絶対的に特異的である)より高い基礎活性を示す。GsGapの補助因子特異性は、配列ベースの設計により以前に調節されているが、変異型はわずかにのみNAD+よりもNADP+を好む。GsGapの補助因子特異性をより強く上げるため、結晶構造を調べ、塩基性残基をNAD+の2'OHに最も近いループ領域に導入し、これはNADP+の2'リン酸の結合の安定化を補助し得る。一連の突然変異を行って、配列番号6の残基D34、L35、及びT36を変更した。最適な酵素、D34A/L35R/T36K三重変異型(本明細書では、mGapと呼ぶ)、の動力学及び特異性が得られた。野生型GsGap酵素は、NADP+で中程度の活性を有するのみであるが、三重変異型mGAPは、NAD+の消費時にNADP+でかなり改善された活性を示した。
【０１４４】
【表２】
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【０１４５】
分子レオスタットによるイソブタノール産生。グルコースからのイソブタノールの産生のための分子レオスタットを実行するため、2つの酵素、mGap及びPGKを最適化された化学量論的反応に添加した。分子レオスタットによる十分なATP産生を確実にするため、反応におけるmGap及びPGK活性のユニットは、反応におけるATPアーゼ活性の総計よりも一桁大きいものとした。分子レオスタット有り及び無しでの反応を、並行で、72時間の時間経過で設定し、イソブタノールの産生、残りのグルコース及びATPを試験した(図5A-B)。分子レオスタット有りの反応は、理論収率91.5%で24.1±1.8g/Lのイソブタノールを産生し、最大生産性は1.4±0.3g/L/hであった。このイソブタノール産生は、化学量論的in vitro反応からの101.7%の改善を示し、複雑なin situイソブタノール除去の助け無しで、報告されたいかなるin vivoイソブタノール産生よりも高い。
【０１４６】
最終調製経路における酵素及び酵素濃度(例えば、図6A-B参照)を以下の表に示す。
【０１４７】
【表３】
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【０１４８】
分子レオスタットは予想通りの性能を示し、化学量論的にバランスを取った反応と比較してより高いATP濃度を維持した。レオスタット反応は、反応が停止し、ATP濃度が下がる前に、48時間にわたって約600μMの定常状態のATP濃度を保持した。反対に、化学量論的反応におけるATP濃度は、全実行を通して着実に下がった。両反応の最初の48時間にわたり、反応中のATPの濃度とイソブタノールの生産性の間に良好な相関がある。さらに、レオスタットシステムの各成分は、それらを反応から除去し、24時間後に産生されたイソブタノールを測定して試験した(図5C)。GapN又はmGap/PGKのいずれかを除去した場合、完全な分子レオスタットシステムと比較して、イソブタノールの産生が劇的に減少した。
【０１４９】
分子レオスタットを含むシステムは、自己持続反応を産生し、最初の48時間、ATPの定常状態を維持したが、反応は72時間の時点で停止した。分子レオスタットを用いる反応では、24時間後に沈殿物が形成し始めたことが認められ、これがイソブタノール産生の減少と同時に生じた。反応の完了時に、沈殿物を遠心分離によって回収し、SDS-PAGEによって分離して沈殿物中のタンパク質を同定した。沈殿物の主な構成成分としてヘキソキナーゼ、続いてKivD及びmGapが同定された。これらの結果から、おそらくイソブタノール濃度の増加により一部の酵素が経時的に変性したことが示唆された。
【０１５０】
イソブタノールに対する各システム成分の安定性を決定するため、経路の各酵素及び補助因子は、0%、4%、及び8%(飽和)のイソブタノール中で安定性を試験した。ヘキソキナーゼ、GapN、mGap、及びIlvCがイソブタノールの不活性化に最も感受性であったが、ほとんどの他の酵素及び補助因子が、飽和レベルのイソブタノールで30時間にわたり著しい活性を維持した。これらの結果は、システムの全体的な持続性を改善する、安定性の改善を標的化し得る少数の優先度が高い酵素をすばやく同定する。
【０１５１】
本発明のいくつかの実施形態を記載した。にもかかわらず、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく様々な変更が可能であることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態は以下の請求項の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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