(57)【要約】【解決手段】中空糸型バイオリアクターにおいて細胞を増殖する方法及びシステムに関する実施形態が記載される。実施形態において、細胞は、組み換え型成長因子の組み合わせを含む複数の成長因子に曝露される。他の実施形態において、細胞は、ヒト間葉系幹細胞のような他の細胞との共培養において成長される。実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞を含む。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３４＋細胞を含む第１の複数の細胞を、複数の中空糸を有する中空糸型バイオリアクターへ導入するステップと、
前記第１の複数の細胞を、成長条件へ曝露するステップと、
前記中空糸型バイオリアクターの前記複数の中空糸において前記第１の複数の細胞のうちの少なくとも一部の細胞を増殖させて、第２の複数の増殖細胞を生成するステップと、
前記中空糸型バイオリアクターから前記第２の複数の増殖細胞を取り出すステップと、
を有する細胞の増殖方法であって、
前記成長条件は、前記第１の複数の細胞を、成長因子の組み合わせに曝露することを含み、
前記成長因子は、組換えヒトＦｌｔ３リガンド（ｒｈＦｌｔ−３Ｌ）、組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）、組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）、組換えヒトグリア由来神経栄養因子、及びそれらの組み合わせのうちの１又は複数である、
細胞の増殖方法。
【請求項２】
請求項１記載の細胞の増殖方法において、前記第１の複数の細胞のうちの前記一部の細胞は、ＣＤ３４＋細胞を含む、
細胞の増殖方法。
【請求項３】
請求項１記載の細胞の増殖方法において、前記第１の複数の細胞は、臍帯血に由来する、
細胞の増殖方法。
【請求項４】
請求項１記載の細胞の増殖方法において、前記第１の複数の細胞は、追加の精製処理を行わずに、前記中空糸型バイオリアクターに付加される、
細胞の増殖方法。
【請求項５】
請求項１記載の細胞の増殖方法において、該方法は、前記導入する前記ステップの前に、第１の共培養細胞を成長させるステップを、さらに有する、
細胞の増殖方法。
【請求項６】
請求項５記載の細胞の増殖方法において、前記第１の共培養細胞は、ヒト間葉系幹細胞を含む、
細胞の増殖方法。
【請求項７】
請求項６記載の細胞の増殖方法において、前記ヒト間葉系幹細胞は、骨髄由来である、
細胞の増殖方法。
【請求項８】
請求項７記載の細胞の増殖方法において、該方法は、前記第２の複数の増殖細胞を、患者に投与して、前記患者における造血を再構築するステップを、さらに有する、
細胞の増殖方法。
【請求項９】
間葉系幹細胞を含む第１の複数の細胞を、複数の中空糸を有する中空糸型バイオリアクターの毛細管内側へ導入するステップと、
前記第１の複数の細胞を、第１の成長条件へ曝露するステップであって、前記第１の成長条件は、前記第１の複数の細胞を第１の成長培地へ曝露することを含むステップと、
ＣＤ３４＋細胞を含む第２の複数の細胞を、前記中空糸型バイオリアクターの前記毛細管内側へ導入するステップと、
前記第２の複数の細胞を、第２の成長条件へ曝露するステップであって、前記第２の成長条件は、前記第２の複数の細胞を複数の成長因子へ曝露することを含むステップと、
前記間葉系幹細胞との共培養で、前記複数の中空糸において前記第２の複数の細胞のうちの少なくとも一部の細胞を増殖させて、第３の複数の増殖細胞を生成するステップと、
前記中空糸型バイオリアクターから前記第３の複数の増殖細胞を取り出すステップと、
を有する、
細胞の増殖方法。
【請求項１０】
請求項９記載の細胞の増殖方法において、前記第１の複数の細胞を、前記第１の成長条件へ曝露する前記ステップは、前記中空糸型バイオリアクターの毛細管外側において基礎培地を循環させるステップを有する、
細胞の増殖方法。
【請求項１１】
請求項９記載の細胞の増殖方法において、前記第１の複数の細胞を、前記第１の成長条件へ曝露する前記ステップは、前記中空糸型バイオリアクターの前記毛細管内側において基礎培地を循環させるステップを有する、
細胞の増殖方法。
【請求項１２】
請求項９記載の細胞の増殖方法において、前記第２の複数の細胞を、前記第２の成長条件へ曝露する前記ステップは、前記中空糸型バイオリアクターの毛細管外側において基礎培地を循環させるステップを有する、
細胞の増殖方法。
【請求項１３】
請求項９記載の細胞の増殖方法において、前記第２の複数の細胞を、前記第２の成長条件へ曝露する前記ステップは、前記中空糸型バイオリアクターの前記毛細管内側において基礎培地を循環させるステップを有する、
細胞の増殖方法。
【請求項１４】
請求項９記載の細胞の増殖方法において、前記複数の成長因子は、組換えヒトグリア由来神経栄養因子を含む、
細胞の増殖方法。
【請求項１５】
請求項９記載の細胞の増殖方法において、前記第２の複数の細胞は、臍帯血に由来する、
細胞の増殖方法。
【請求項１６】
第１の複数の間葉系幹細胞を、静置型の成長チャンバーで成長させるステップと、
前記静置型の成長チャンバーでＣＤ３４＋細胞を、前記間葉系幹細胞との共培養において、成長させるステップと、
前記静置型の成長チャンバーから、ＣＤ３４＋細胞を含む第１の複数の細胞を取り出すステップと、
第２の複数の間葉系幹細胞を、複数の中空糸を有する中空糸型バイオリアクターへ導入するステップと、
前記第２の複数の細胞を、第１の成長条件へ曝露するステップと、
ＣＤ３４＋細胞を含む前記第１の複数の細胞を、前記中空糸型バイオリアクターへ導入するステップと、
ＣＤ３４＋細胞を含む前記第１の複数の細胞を、成長条件へ曝露するステップであって、前記成長条件は、前記第１の複数の細胞を成長因子の組み合わせへ曝露することを含み、前記成長因子は、組換えヒトグリア由来神経栄養因子を含むステップと、
前記中空糸型バイオリアクターにおける前記第２の複数の間葉系幹細胞との共培養で、前記中空糸型バイオリアクターの前記複数の中空糸において前記第１の複数の細胞のうちの少なくとも一部の細胞を増殖させて、複数の増殖細胞を生成するステップと、
前記中空糸型バイオリアクターから前記複数の増殖細胞を取り出すステップと、
を有する、
臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞の増殖方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞の増殖方法において、該方法は、前記第２の複数の間葉系幹細胞を、前記複数の中空糸を有する前記中空糸型バイオリアクターへ導入する前記ステップの前に、前記中空糸型バイオリアクターを糖タンパク質によってコーティングするステップをさらに有する、
臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞の増殖方法。
【請求項１８】
請求項１６記載の臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞の増殖方法において、前記第２の複数の間葉系幹細胞を、前記複数の中空糸を有する前記中空糸型バイオリアクターへ導入する前記ステップは、
ポンプによって、前記第２の複数の間葉系幹細胞を、前記中空糸型バイオリアクターの毛細管内側において循環させるステップと、
前記ポンプを停止して、前記第２の複数の間葉系幹細胞の第１の部分を、中空糸の内側の第１の部分に付着させるステップと、
前記中空糸型バイオリアクターを、初期位置から１８０度回転させるステップと、
前記ポンプによって、残りの前記第２の複数の間葉系幹細胞を、前記中空糸型バイオリアクターの毛細管内側において循環させるステップと、
前記ポンプを停止して、前記第２の複数の間葉系幹細胞の第２の部分を、前記中空糸の内側の第２の部分に付着させるステップと、
を有する、
臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞の増殖方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞の増殖方法において、該方法は、前記ポンプを停止して、前記第２の複数の間葉系幹細胞の前記第２の部分を、前記中空糸の内側の前記第２の部分に付着させる前記ステップの後に、前記中空糸型バイオリアクターを、１８０°回転して、前記初期位置へ戻すステップを、さらに有する、
臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞の増殖方法。
【請求項２０】
請求項１６記載の臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞の増殖方法において、前記成長因子はさらに、組換えヒトＦｌｔ３リガンド（ｒｈＦｌｔ−３Ｌ）、組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）、組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）、及び神経栄養因子を含む、
臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞の増殖方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
細胞増殖システム（ＣＥＳ）は、研究及び治療の目的のために用いられる種々の細胞を増殖・分化させるために使用される。一例として、ＣＤ３４＋前駆細胞の造血前駆幹細胞（ＨＳＣ）は、癌（例えば、リンパ腫、白血病、骨髄腫）等の疾患における可能な治療法として認められてきた。ＨＳＣは、骨髄、臍帯血、又は末梢血から採取される。有効量として最低限の数のＨＳＣを投与することが提案されてきた。従って、ＨＳＣは、初期量から少なくとも有効量と見なされる量まで増殖される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
本発明の実施形態は、上記の点及び他の点を考慮してなされた。しかしながら、ここで記載される課題は、本発明の実施形態の用途を、制限するものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本節は、本発明のいくつかの実施形態の態様を簡単な形式で説明するためのものであり、本発明の重要な又は必須の要素を特定することを意図していないし、また、請求項の範囲を制限することを意図しているものでもない。
【０００４】
実施形態は、細胞増殖システムのバイオリアクターにおいて細胞を成長させる細胞増殖システム（ＣＥＳ）及び方法に係る。実施形態では、中空糸型バイオリアクターのようなバイオリアクターにおいて細胞を増殖する方法が提供される。実施形態において、細胞（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）（例えば、ＣＤ３４＋細胞））は、複数の中空糸を含む中空糸型バイオリアクターに導入される。実施形態において、第１の複数の細胞は、成長条件に曝露される。成長条件は、第１の複数の細胞を、中空糸型バイオリアクターにおいて成長因子の組み合わせに曝露することを含む。実施形態において、成長条件は、限定はされないが、共培養された細胞及び成長因子の組み合わせを含む。細胞を成長条件に曝露した後、細胞を増殖して、第２の複数の増殖細胞を生成する。そして、第２の増殖細胞はバイオリアクターから取り出される。
【０００５】
非制限的且つ非包括的な実施形態が、添付図面を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、本発明の実施形態に係る中空糸型バイオリアクターの斜視図である。
【図２】図２は、本発明の実施形態に係る、予め設けられた流体移送装置を備えた細胞増殖システムの斜視図である。
【図３】図３は、本発明の実施形態に係る細胞増殖システムのハウジングの斜視図である。
【図４】図４は、本発明の実施形態に係る、予め設けられる流体移送装置の斜視図である。
【図５】図５は、本発明の実施形態に係る細胞増殖システムの概略図である。
【図６】図６は、本発明の実施形態に係る細胞増殖システムの他の実施形態の概略図である。
【図７】図７は、本発明の実施形態に係る細胞増殖プロセスのフローチャートである。
【図８】図８は、本発明の他の実施形態に係る細胞増殖プロセスのフローチャートである。
【図９】図９は、本発明のさらに他の実施形態に係る細胞増殖プロセスのフローチャートである。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｄは、実施形態に係る、バイオリアクター回転中の中空糸の断面図である。
【図１１】図１１は、本発明の実施形態を実施するために使用されるコンピュータシステムの構成要素を示す図である。
【図１２】図１２は、バイオリアクターシステムにおいて、ＣＤ３４＋細胞の増殖のための一実施形態に従って成長させた細胞の数の棒グラフである。
【図１３】図１３は、ＣＤ３４＋細胞の増殖のための一実施形態に係る、代謝プロファイルを示すグラフである。
【図１４】図１４は、ＣＤ３４＋細胞の増殖のための一実施形態に係る、代謝率を示すグラフである。
【図１５】図１５は、ＣＤ３４＋細胞の増殖のための一実施形態に係る、細胞数を示すグラフである。
【図１６】図１６は、ＣＤ３４＋細胞の増殖のための他の実施形態に係る、細胞数を示すグラフである。
【図１７】図１７は、ＣＤ３４＋細胞の増殖のための他の実施形態に係る、細胞数を示すグラフである。
【図１８】図１８は、実施形態に従って成長させた細胞の種々のタイプのバイオマーカーを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の原理は、以下の詳細な説明及び添付図面に示される実施形態を参照することで、さらに理解されよう。詳細な実施形態において具体的な特徴が示され説明されるが、本発明は、以下で説明される実施形態に限定されないと理解されるべきである。
【０００８】
以下では、添付図面に示される実施形態が詳細に言及され説明される。可能な限り、図面及び以下の記載において、同一又は同様な部分に対しては、同じ参照符号が使用される。
【０００９】
図１は、本発明と共に使用される中空糸型バイオリアクター１００の一例の正面図を示す。中空糸型バイオリアクター１００は、長手方向軸ＬＡ−ＬＡを有し、チャンバーハウジング１０４を備える。少なくとも１つの実施形態において、チャンバーハウジング１０４は、４つの開口部又は４つのポート、すなわち、毛細管内（ＩＣ）入口ポート１０８、ＩＣ出口ポート１２０、毛細管外（ＥＣ）入口ポート１２８、ＥＣ出口ポート１３２を有する。
【００１０】
本開示の実施形態において、第１循環路内の流体は、中空糸型バイオリアクター１００の第１の長手方向端１１２におけるＩＣ入口ポート１０８を通って中空糸型バイオリアクター１００に進入し、複数の中空糸１１６の毛細管内側（種々の実施形態において、中空糸膜の毛細管内（「ＩＣ」）側又は「ＩＣ空間」と呼ぶ）に進入して通過し、中空糸型バイオリアクター１００の第２の長手方向端１２４に位置するＩＣ出口ポート１２０を通って中空糸型バイオリアクター１００の外に出る。ＩＣ入口ポート１０８とＩＣ出口ポート１２０との間の流体経路は、中空糸型バイオリアクター１００のＩＣ部分１２６を定義する。第２循環路内の流体は、ＥＣ入口ポート１２８を通って中空糸型バイオリアクター１００に進入し、中空糸１１６の毛細管外側又は外側（該膜の「ＥＣ側」又は「ＥＣ空間」と呼ぶ）に接触して、ＥＣ出口ポート１３２を通って中空糸型バイオリアクター１００の外に出る。ＥＣ入口ポート１２８とＥＣ出口ポート１３２との間の流体経路は、中空糸型バイオリアクター１００のＥＣ部分１３６を構成する。ＥＣ入口ポート１２８を通って中空糸型バイオリアクター１００に入った流体は、中空糸１１６の外側に接触する。小分子（例えば、イオン、水、酸素、乳酸塩等）は、中空糸１１６を通じて中空糸の内部すなわちＩＣ空間から外部すなわちＥＣ空間へ、又はＥＣ空間からＩＣ空間へ拡散することができる。成長因子のような高分子量の分子は、大きすぎるため中空糸を通過できず、中空糸１１６のＩＣ空間内にとどまる。培地は、必要であれば交換補充してもよい。また、必要であれば、培地を、酸素供給装置又はガス移送モジュールを通じて循環させて、ガスを交換してもよい（例えば、細胞増殖システム５００（図５）や細胞増殖システム６００（図６）を参照）。細胞は、以下で説明されるように、第１循環路及び／又は第２循環路内に含有させることができ、該膜のＩＣ側及び／又はＥＣ側に存在させることができる。
【００１１】
中空糸膜を作製するのに用いられる材料は、中空糸に加工可能な任意の生体適合性高分子材料でよい。本開示の実施形態において、使用可能な一材料としては、合成ポリスルホン系材料が挙げられる。細胞を中空糸の表面に付着させるため、該表面は、少なくとも細胞成長表面をタンパク質（例えば、フィブロネクチンやコラーゲンのような糖タンパク質）でコーティングしたり或いは該表面に放射線を照射したりするような方法で、改質されてよい。膜表面をガンマ線処理することによって、膜に対してフィブロネクチン等による追加コーティングを行わずに、接着性細胞を付着させることが可能になる。ガンマ線処理を行った膜で作製されたバイオリアクターは、再利用することができる。本開示の実施形態において、細胞付着のための他のコーティング及び／又は他の処理を用いてもよい。
【００１２】
図２において、本開示の実施形態に係る、予め設けられた流体輸送組立体を有する細胞増殖システム２００の一実施形態が示される。ＣＥＳ２００は、細胞増殖装置２０２を有する。細胞増殖装置２０２は、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６と係合するハッチ又は開閉可能なドア２０４を有する。細胞増殖装置２０２内の内部空間２０８は、バイオリアクター１００を含む予め設けられた流体輸送組立体２１０を受容し係合固定できるような特徴を有する。予め設けられた流体輸送組立体２１０は、細胞増殖装置２０２に取り外し可能に取り付けられており、細胞増殖装置２０２において、使用された流体輸送組立体２１０を、新しい又は未使用の流体輸送組立体２１０に比較的迅速に交換できるようになっている。単一の細胞増殖装置２０２の動作によって、第１の流体輸送組立体２１０を用いて細胞の第１のセットを成長又は増殖させ、その後、第１の流体輸送組立体２１０を第２の流体輸送組立体２１０に交換する際に殺菌することなく、第２の流体輸送組立体２１０を用いて細胞の第２のセットを成長又は増殖させることができる。予め設けられた流体輸送組立体は、バイオリアクター１００と酸素供給器又はガス移送モジュール２１２を有する。実施形態において、流体輸送組立体２１０に接続される種々の培地用配管を受容する配管案内スロットが２１４として示される。
【００１３】
図３は、本開示の実施形態に係る、予め設けられた流体輸送組立体２１０（図２参照）を取り外し可能に取り付ける前の、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６を示す。開閉可能なドア２０４（図２参照）は、図３では省略されている。細胞増殖装置２０２の後側部分２０６には、流体輸送組立体２１０の構成要素と組み合わせて動作する複数の異なる構造が設けられている。詳細には、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６は、流体輸送組立体２１０におけるポンプループと協働する複数の蠕動ポンプ（ＩＣ循環ポンプ２１８、ＥＣ循環ポンプ２２０、ＩＣ入口ポンプ２２２、ＥＣ入口ポンプ２２４）を有する。また、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６は、複数のバルブ（ＩＣ循環バルブ２２６、試薬バルブ２２８、ＩＣ培地バルブ２３０、空気除去バルブ２３２、細胞入口バルブ２３４、洗浄バルブ２３６、分配バルブ２３８、ＥＣ培地バルブ２４０、ＩＣ廃棄バルブ２４２、ＥＣ廃棄バルブ２４４、収穫バルブ２４６）を有する。さらに、複数のセンサ（ＩＣ出口圧力センサ２４８、ＩＣ入口圧力／温度センサ２５０、ＥＣ入口圧力／温度センサ２５２、ＥＣ出口圧力センサ２５４）が、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６に関連付けられる。さらに、空気除去チャンバーのための光学センサ２５６が示されている。
【００１４】
実施形態に係る、バイオリアクター１００を回転させるための軸又はロッカー制御部２５８が、図３に示されている。軸又はロッカー制御部２５８と関連付けられた軸嵌合部２６０によって、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６に対して、流体輸送組立体２１０又は流体輸送組立体４００の軸アクセス開口部（例えば、配管収納部３００（図４）の開口部４２４（図４））の適切な位置合わせが行える。軸又はロッカー制御部２５８の回転によって、軸嵌合部２６０及びバイオリアクター１００に対して回転運動が付与される。従って、ＣＥＳ２００のオペレータ又はユーザが、新しい又は未使用の流体輸送組立体４００（図４）を、細胞増殖装置２０２に取り付ける際、位置合わせは、軸嵌合部２６０に対して、流体輸送組立体２１０又は流体輸送組立体４００の軸アクセス開口部４２４（図４）を適切に方向付けるといった比較的簡単な作業となる。
【００１５】
図４は、取り付け・取り外し自在の予め取り付けられる流体輸送組立体４００の斜視図である。予め取り付けられる流体輸送組立体４００は、細胞増殖装置２０２に取り外し可能に取り付けられており、細胞増殖装置２０２において、使用された流体輸送組立体４００を、新しい又は未使用の流体輸送組立体４００に比較的迅速に交換できるようになっている。図４に示されるように、バイオリアクター１００は、軸嵌合部４０２を含むバイオリアクターカップリングに取り付けられる。軸嵌合部４０２は、細胞増殖装置２０２の軸（図３に示されている例えば、軸２５８）を係合させるための１以上の（付勢された腕部又はバネ部材４０４のような）軸締結機構を有する。
【００１６】
実施形態において、軸嵌合部４０２及びバネ部材４０４には、バイオリアクター１００を回転させる細胞増殖システムの機構が接続される。例えば、いくつかの実施形態において、細胞増殖システムは、バイオリアクターを回転可能なＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）細胞増殖システム（ＣＥＳ）（コロラド州、レイクウッド、テルモＢＣＴ社製）の一部であってもよい。バイオリアクターを回転可能な細胞増殖システムの例としては、少なくとも、２０１３年３月１９日発行の米国特許第８，３９９，２４５号明細書（タイトル：細胞増殖システムの細胞成長チャンバーのための回転システム及びその使用方法）、２０１３年２月１３日発行の米国特許第８，８０９，０４３号明細書（タイトル：細胞増殖システムの細胞成長チャンバーのための回転システム及びその使用方法）、及び２０１５年６月１６日発行の米国特許第９，０５７，０４５号明細書（タイトル：細胞増殖システムのバイオリアクターにおける細胞の投入及び分散方法）に記載されている。上記米国特許出願の全体は、ここでの開示により明確に本出願に組み込まれる。
【００１７】
実施形態によれば、流体輸送組立体４００は、配管４０８Ａ、４０８Ｂ、４０８Ｃ、４０８Ｄ、４０８Ｅ等及び種々の管継手を有する。これらにより、以下で説明されるように、図５及び図６に示されるような流体路が提供される。ポンプループ４０６Ａ、４０６Ｂ、４０６Ｃも、ポンプ用に設けられる。細胞増殖装置２０２が配置される場所に、種々の培地が設けられてもよいが、実施形態において、プリマウントタイプの流体輸送組立体４００は、細胞増殖装置２０２の外部に延在する程度に十分な長さの配管を有することで、該配管に対して培地バッグに関連付けられた配管が接合されてもよい。
【００１８】
図５は、細胞増殖システム５００の実施形態の概略図である。図６は、他の実施形態である細胞増殖システム６００の概略図である。図５及び図６に示される実施形態では、以下で説明するように、細胞は、ＩＣ空間で成長される。しかしながら、本発明は、そのような例に限定されない。他の実施形態では、細胞はＥＣ空間で成長されてもよい。さらに他の実施形態では、細胞を共培養するような場合、第１の細胞をＥＣ空間で成長し、第２の細胞をＩＣ空間で成長してもよい。細胞の共培養は、第１の細胞及び第２の細胞をＥＣ空間で成長することにより行ってもよいし、第１の細胞及び第２の細胞をＩＣ空間で成長することにより行ってもよい。
【００１９】
図５は、実施形態に係るＣＥＳ５００を示している。ＣＥＳ５００は、第１流体循環路５０２（「毛細管内側ループ」又は「ＩＣループ」とも呼ぶ）と第２流体循環路５０４（「毛細管外側ループ」又は「ＥＣループ」とも呼ぶ）とを有する。第１流体流路５０６は、中空糸型バイオリアクター５０１に流体的に関連付けられて、少なくとも部分的に第１流体循環路５０２を構成する。流体は、ＩＣ入口ポート５０１Ａを介して中空糸型バイオリアクター５０１に流入し、中空糸型バイオリアクター５０１内の中空糸を通って、ＩＣ出口ポート５０１Ｂを介して流出する。圧力測定器５１０は、中空糸型バイオリアクター５０１を離れる培地の圧力を測定する。培地は、培地流量／循環流量を制御するために用いられるＩＣ循環ポンプ５１２を介して、流れる。ＩＣ循環ポンプ５１２は、第１方向（例えば、時計回り）又は第１方向の反対の第２方向（例えば、反時計回り）に、流体をポンピング可能である。出口ポート５０１Ｂは、逆方向では、入口として使用することができる。ＩＣループ５０２に流入する培地は、バルブ５１４を介して流入する。当業者であれば理解できるように、追加のバルブ及び／又は他の装置を種々の位置に配置して、流体経路の特定の部分に沿って、培地を隔離し及び／又は該培地の特性を測定することもできる。従って、示される概略図は、ＣＥＳ５００の複数の要素に対する１つの可能な構成を示すものであり、１以上の実施形態の範囲において、概略図は変形可能であると理解されるべきである。
【００２０】
ＩＣループ５０２に対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート５１６又はサンプルコイル５１８から得られる。第１流体循環路５０２に配置された圧力／温度測定器５２０によって、動作中において、培地の圧力及び温度が測定できる。そして、培地は、ＩＣ入口ポート５０１Ａに戻って、流体循環路５０２を完了する。中空糸型バイオリアクター５０１で成長／増殖した細胞は、中空糸型バイオリアクター５０１から流し出され、バルブ５９８を通って収穫バッグ５９９に入るか、中空糸内に再分配され、さらに成長される。
【００２１】
第２流体循環路５０４において、流体は、ＥＣ入口ポート５０１Ｃを介して、中空糸型バイオリアクター５０１に入り、ＥＣ出口ポート５０１Ｄを介して中空糸型バイオリアクター５０１を離れる。ＥＣループ５０４では、培地は、中空糸型バイオリアクター５０１の中空糸の外側と接触し、それによって、小分子の中空糸への及び中空糸からの拡散が可能となる。
【００２２】
培地が中空糸型バイオリアクター５０１のＥＣ空間に入る前に、第２流体循環路５０４に配置された圧力／温度測定器５２４によって、該培地の圧力及び温度が測定可能である。培地が中空糸型バイオリアクター５０１を離れた後、圧力測定器５２６によって、第２流体循環路５０４の培地の圧力が測定可能である。ＥＣループに対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート５３０から又はサンプルコイルから得られる。
【００２３】
実施形態において、中空糸型バイオリアクター５０１のＥＣ出口ポート５０１Ｄを離れた後、第２流体循環路５０４の流体は、ＥＣ循環ポンプ５２８を通って、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に至る。ＥＣ循環ポンプ５２８は、両方向に流体をポンピング可能である。第２流体流路５２２は、酸素供給器入口ポート５３４及び酸素供給器出口ポート５３６を介して酸素供給器又はガス移送モジュール５３２と流体的に関連付けられている。動作中は、流体培地は、酸素供給器入口ポート５３４を介して、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に流入し、酸素供給器出口ポート５３６を介して、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２から流出する。酸素供給器又はガス移送モジュール５３２は、ＣＥＳ５００における培地に対して、酸素を付加し、気泡を除去する。種々の実施形態において、第２流体循環路５０４における培地は、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に入るガスと平衡状態にある。酸素供給器又はガス移送モジュール５３２は、適当なサイズの任意の酸素供給器又はガス移送装置でよい。空気又はガスは、フィルタ５３８を介して酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に流入し、フィルタ５４０を介して、酸素供給器又はガス移送装置５３２から流出する。フィルタ５３８、５４０は、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２及び関連する培地の汚染を減少又は防止する。プライミングステップの一部を行っている際にＣＥＳ５００からパージされた空気又はガスは、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２を介して大気にベント可能である。
【００２４】
ＣＥＳ５００を図示した構成において、第１流体循環路５０２及び第２流体循環路５０４における流体培地は、同じ方向で（並流構成で）中空糸型バイオリアクター５０１を流れる。ＣＥＳ５００は、対向流で流れるように構成してもよい。
【００２５】
少なくとも１つの実施形態において、（バッグ５６２からの）細胞を含む培地及びバッグ５４６からの流体培地は、第１流体流路５０６を介して第１流体循環路５０２に導入される。流体容器５６２（例えば、細胞投入バッグ又は空気をシステム外にプライミングするための生理食塩水プライミング流体）は、バルブ５６４を介して、第１流体流路５０６及び第１流体循環路５０２に流体的に関連付けられる。
【００２６】
流体容器、すなわち培地バッグ５４４（例えば、試薬）は、バルブ５４８を介して第１流体入口路５４２に流体的に関連付けられ、流体容器、すなわち培地バッグ５４６（例えば、ＩＣ培地）は、バルブ５５０を介して第１流体入口路５４２に流体的に関連付けられ、又はバッグ５４４、５４６は、バルブ５４８、５５０、５７０を介して第２流体入口路５７４に流体的に関連付けられる。また、滅菌され密封可能な第１及び第２入力プライミング路５０８、５０９が設けられる。空気除去チャンバー（ＡＲＣ）５５６が、第１循環路５０２に流体的に関連付けられる。空気除去チャンバー５５６は、１以上の超音波センサを有してもよい。該センサには、空気除去チャンバー５５６内における特定の測定点において、空気、流体の不足、及び／又はガス／流体境界、例えば、空気／流体境界、を検知するための上部センサ及び下部センサが含まれる。例えば、空気除去チャンバー５５６の底部近傍及び／又は頂部近傍で、超音波センサを用いて、それらの場所における空気、流体、及び／又は空気／流体境界を検知することができる。実施形態において、本開示の範囲を逸脱しない範囲で、他のタイプのセンサを使用することができる。例えば、本開示の実施形態に従って、光学センサを使用してもよい。プライミングステップの一部又はその他のプロトコルを行っている際にＣＥＳ５００からパージされる空気又はガスは、空気除去チャンバー５５６と流体的に関連付けられたライン５５８を通って、エアバルブ５６０から大気中へベント可能である。
【００２７】
（バッグ５６８からの）ＥＣ培地又は（バッグ５６６からの）洗浄液が第１流体流路又は第２流体流路に加えられる。流体容器５６６は、バルブ５７０と流体的に関連付けられる。バルブ５７０は、分配バルブ５７２及び第１流体入口路５４２を介して第１流体循環路５０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ５７０を開け、分配バルブ５７２を閉じることにより、流体容器５６６は、第２流体入口路５７４及びＥＣ入口路５８４を介して第２流体循環路５０４と流体的に関連付けることができる。同様に、流体容器５６８は、バルブ５７６と流体的に関連付けられる。バルブ５７６は、第１流体入口路５４２及び分配バルブ５７２を介して第１流体循環路５０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ５７６を開け、分配バルブ５７２を閉じることにより、流体容器５６８は、第２流体入口路５７４と流体的に関連付けることができる。オプションとして、培地試薬又は洗浄液の導入用に熱交換器５５２を設けてもよい。
【００２８】
ＩＣループにおいて、流体はまず、ＩＣ入口ポンプ５５４によって送られる。ＥＣループでは、流体はまず、ＥＣ入口ポンプ５７８によって送られる。超音波センサのようなエア検知器５８０がＥＣ入口路５８４と関連付けられてもよい。
【００２９】
少なくとも１つの実施形態において、第１及び第２流体循環路５０２、５０４は、廃棄ライン５８８と接続される。バルブ５９０を開けると、ＩＣ培地は、廃棄ライン５８８を介して、廃棄バッグすなわち出口バッグ５８６に至る。同様に、バルブ５８２を開けると、ＥＣ培地は、廃棄ライン５８８を介して廃棄バッグすなわち出口バッグ５８６に流れる。
【００３０】
実施形態において、細胞は、細胞収穫路５９６を介して収穫される。中空糸型バイオリアクター５０１からの細胞は、細胞を含むＩＣ培地をポンピングすることにより、細胞収穫路５９６及びバルブ５９８を介して、細胞収穫バッグ５９９に収穫される。
【００３１】
ＣＥＳ５００の各部品は、細胞増殖装置２０２（図２及び図３）のような装置又はハウジング内に収容され、該装置は、細胞及び培地を所定温度に維持する。
【００３２】
図６は、細胞増殖システム６００の他の実施形態の概略図である。ＣＥＳ６００は、第１流体循環路６０２（「毛細管内側ループ」又は「ＩＣループ」とも呼ぶ）と第２流体循環路６０４（「毛細管外側ループ」又は「ＥＣループ」とも呼ぶ）とを有する。第１流体流路６０６は、中空糸型バイオリアクター６０１に流体的に関連付けられて、第１流体循環路６０２を構成する。流体は、ＩＣ入口ポート６０１Ａを介して中空糸型バイオリアクター６０１に流入し、中空糸型バイオリアクター６０１内の中空糸を通って、ＩＣ出口ポート６０１Ｂを介して流出する。圧力センサ６１０は、中空糸型バイオリアクター６０１を離れる培地の圧力を測定する。圧力の他に、実施形態において、センサ６１０は、作動中において、培地圧力及び培地温度を検知する温度センサであってもよい。
【００３３】
培地は、培地流量又は循環流量を制御するために用いられるＩＣ循環ポンプ６１２を介して、流れる。ＩＣ循環ポンプ６１２は、第１方向（例えば、反時計回り）又は第１方向の反対の第２方向（時計回り）に、流体をポンピング可能である。出口ポート６０１Ｂは、逆方向では、入口として使用することができる。ＩＣループに流入する培地は、バルブ６１４を介して流入することができる。当業者であれば理解できるように、追加のバルブ及び／又は他の装置を種々の位置に配置することにより、流体経路の特定の部分に沿って、培地を隔離し及び／又は該培地の特性を測定することもできる。培地のサンプルは、動作中に、サンプルコイル６１８から得られる。そして、培地は、ＩＣ入口ポート６０１Ａに戻って、流体循環路６０２を完了する。
【００３４】
中空糸型バイオリアクター６０１で成長／増殖した細胞は、中空糸型バイオリアクター６０１から流し出され、バルブ６９８及びライン６９７を介して収穫バッグ６９９に入る。或いは、バルブ６９８が閉じている場合、細胞は、中空糸型バイオリアクター６０１に再分配され、さらに成長される。示される概略図は、ＣＥＳ６００の複数の要素に対する１つの可能な構成を示すものであり、概略図に対する変更は、１以上の実施形態の範囲において可能であると理解されるべきである。
【００３５】
第２流体循環路６０４において、流体は、ＥＣ入口ポート６０１Ｃを介して、中空糸型バイオリアクター６０１に入り、ＥＣ出口ポート６０１Ｄを介して中空糸型バイオリアクター６０１を離れる。ＥＣループでは、培地は、中空糸型バイオリアクター６０１の中空糸の外側と接触し、それによって、一実施形態では、チャンバー６０１内における小分子の中空糸への及び中空糸からの拡散が可能となる。
【００３６】
培地が中空糸型バイオリアクター６０１のＥＣ空間に入る前に、第２流体循環路６０４に配置された圧力／温度センサ６２４によって、該培地の圧力及び温度を測定することができる。培地が中空糸型バイオリアクター６０１を離れた後に、センサ６２６によって、第２流体循環路６０４の培地の圧力及び／又は温度を測定することができる。ＥＣループに対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート６３０から又はサンプルコイルから得られる。
【００３７】
中空糸型バイオリアクター６０１のＥＣ出口ポート６０１Ｄを離れた後、第２流体循環路６０４の流体は、ＥＣ循環ポンプ６２８を通って、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に至る。実施形態において、ＥＣ循環ポンプ６２８もまた、両方向に流体をポンピング可能である。第２流体流路６２２は、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２の入口ポート６３２Ａ及び出口ポート６３２Ｂを介して酸素供給器又はガス移送モジュール６３２と流体的に関連付けられている。動作中は、流体培地は、入口ポート６３２Ａを介して、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に流入し、出口ポート６３２Ｂを介して、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２から流出する。酸素供給器又はガス移送モジュール６３２は、ＣＥＳ６００における培地に対して、酸素を付加し、気泡を除去する。
【００３８】
種々の実施形態において、第２流体循環路６０４における培地は、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に入るガスと平衡状態にある。酸素供給器又はガス移送モジュール６３２は、酸素供給又はガス移送に有用な、適当なサイズの任意の装置でよい。空気又はガスは、フィルタ６３８を介して酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に流入し、フィルタ６４０を介して、酸素供給器又はガス移送装置６３２から流出する。フィルタ６３８、６４０は、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２及び関連する培地の汚染を減少又は防止する。プライミングステップの一部を行っている際にＣＥＳ６００からパージされた空気又はガスは、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２を介して大気にベント可能である。
【００３９】
ＣＥＳ６００として示された該構成において、第１流体循環路６０２及び第２流体循環路６０４における流体培地は、同じ方向で（並流構成で）中空糸型バイオリアクター６０１を流れる。ある実施形態において、ＣＥＳ６００は、対向流で流れるように構成してもよい。
【００４０】
少なくとも１つの実施形態において、（細胞容器、例えばバッグのような供給源からの）細胞を含む培地は、取り付け点６６２に取り付けられ、培地源からの流体培地は、取り付け点６４６に取り付けられる。細胞及び培地は、第１流体流路６０６を介して第１流体循環路６０２に導入される。取り付け点６６２は、バルブ６６４を介して、第１流体流路６０６と流体的に関連付けられる。取り付け点６４６は、バルブ６５０を介して、第１流体流路６０６と流体的に関連付けられる。試薬源を、点６４４に流体的に接続して、バルブ６４８を介して流体入口路６４２に関連付けてもよいし、又はバルブ６４８及び６７２を介して第２流体入口路６７４に関連付けてもよい。
【００４１】
空気除去チャンバー（ＡＲＣ）６５６が、第１循環路６０２に流体的に関連付けられる。空気除去チャンバー６５６は、１以上のセンサを有してもよい。該センサには、空気除去チャンバー６５６内における特定の測定点において、空気、流体の不足、及び／又はガス／流体境界、例えば、空気／流体境界、を検知するための上部センサ及び下部センサが含まれる。例えば、空気除去チャンバー６５６の底部近傍及び／又は頂部近傍で、超音波センサを用いて、それらの場所における空気、流体、及び／又は空気／流体境界を検知することができる。実施形態において、本開示の範囲を逸脱しない範囲で、他のタイプのセンサを使用することができる。例えば、本開示の実施形態に従って、光学センサを使用してもよい。プライミングステップの一部又はその他のプロトコルを行っている際にＣＥＳ６００からパージされる空気又はガスは、空気除去チャンバー６５６と流体的に関連付けられたライン６５８を通って、エアバルブ６６０から大気中へベント可能である。
【００４２】
ＥＣ培地源が、ＥＣ培地取り付け点６６８に取り付けられる。洗浄液源が、洗浄液取り付け点６６６に取り付けられる。これにより、ＥＣ培地及び／又は洗浄液が第１流体流路又は第２流体流路に加えられる。取り付け点６６６は、バルブ６７０と流体的に関連付けられる。バルブ６７０は、バルブ６７２及び第１流体入口路６４２を介して第１流体循環路６０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ６７０を開け、バルブ６７２を閉じることにより、取り付け点６６６は、第２流体入口路６７４及び第２流体流路６８４を介して第２流体循環路６０４と流体的に関連付けることができる。同様に、取り付け点６６８は、バルブ６７６と流体的に関連付けられる。バルブ６７６は、第１流体入口路６４２及びバルブ６７２を介して第１流体循環路６０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ６７６を開け、分配バルブ６７２を閉じることにより、流体容器６６８を、第２流体入口路６７４と流体的に関連付けることができる。
【００４３】
ＩＣループにおいて、流体はまず、ＩＣ入口ポンプ６５４によって送られる。ＥＣループでは、流体はまず、ＥＣ入口ポンプ６７８によって送られる。超音波センサのようなエア検知器６８０がＥＣ入口路６８４と関連付けられてもよい。
【００４４】
少なくとも１つの実施形態において、第１及び第２流体循環路６０２、６０４は、廃棄ライン６８８に接続される。バルブ６９０を開けると、ＩＣ培地は、廃棄ライン６８８を通って、廃棄バッグ又は出口バッグ６８６に至る。同様に、バルブ６９２を開けると、ＥＣ培地は、廃棄バッグ又は出口バッグ６８６に流れる。
【００４５】
細胞が中空糸型バイオリアクター６０１にて成長された後、該細胞は、細胞収穫路６９７を介して収穫される。中空糸型バイオリアクター６０１からの細胞は、バルブ６９８を開けた状態において、細胞を含むＩＣ培地をポンピングすることにより、細胞収穫路６９７を介して、細胞収穫バッグ６９９に収穫される。
【００４６】
ＣＥＳ６００の各部品は、細胞増殖装置２０２（図２及び図３）のような装置又はハウジング内に収容され、該装置は、細胞及び培地を所定温度に維持する。さらに、実施形態において、ＣＥＳ６００とＣＥＳ５００（図５）の部品を組み合わせてもよい。他の実施形態において、ＣＥＳは、本開示の範囲内において、図５及び図６に示される部品よりも少ない数の部品を含んでもよいし、多い数の部品を含んでもよい。実施形態において、ＣＥＳ５００、ＣＥＳ６００のある部分は、テルモＢＣＴ社（コロラド州、レイクウッド）によって製造されるＱＵＡＮＴＵＭ（登録商標）細胞増殖システム（ＣＥＳ）の１以上の特徴によって実施される。
【００４７】
ＣＥＳ６００を使用する１つの特定の実施形態において、造血幹細胞（ＨＳＣ）（例えばＣＤ３４＋細胞）は、ＣＥＳ６００の実施形態において、増殖される。この実施形態では、白血球アフェレーシスプロセス又は手動プロセス（例えば、臍帯）を使用して収集することができるＨＳＣ（ＣＤ３４＋細胞を含む）をバイオリアクター６０１に導入する。ＨＳＣ（ＣＤ３４＋細胞を含む）は、循環路６０２を介してバイオリアクター６０１に導入することができる。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ＨＳＣ（ＣＤ３４＋細胞を含む）は、バイオリアクター６０１への導入の前に選択ステップ（例えば、精製ステップ）にかけられてもよい。このステップは、遠心分離機、精製カラム、磁気選択、化学的選択等の使用を伴うことができる。細胞選択／精製手順のいくつかの例としては、例えば、ドイツ国ベルギッシュグラートバッハのＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ製の単離カラムを使用して行うものが挙げられる。一例では、臍帯血は、細胞をバイオリアクター６０１に導入する前に、最初に、ＨＳＣ（ＣＤ３４＋細胞を含む）を選択する細胞選択プロセスにかけられる。他の例では、最初に収集されたときに（ＣＤ３４＋細胞を含む）ＨＳＣに含まれる可能性のある他の細胞を激減するためにアフェレーシス装置が利用される。例えば、ＨＳＣは、臍帯血、骨髄、又は末梢血から供給されてもよい。最初の収集後且つバイオリアクター６０１に導入する前に、ＣＤ３４＋細胞を含むある体積のＨＳＣを処理して、その体積から赤血球、特定の白血球、顆粒球、及び／又は他の細胞を激減させることができる。これらは単なる例示であり、本発明の実施形態はこれらに限定されない。
【００４９】
他の実施形態では、ＨＳＣ（ＣＤ３４＋細胞を含む）は、追加の精製を行わずに、収集後、バイオリアクター６０１に直接添加される。例えば、（ＨＳＣを含む）臍帯血はバイオリアクターに添加される。多くのタンパク質やその他の生物活性分子に加えて、臍帯血には、（ＣＤ３４＋細胞を含む）ＨＳＣ、赤血球、血小板、顆粒球、及び／又は白血球が含まれる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ＨＳＣは、プライミングステップの後、バイオリアクター６０１に加えられる。理解されるように、増殖される細胞は非接着性であり、従って、増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ／ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）のために、バイオリアクター６０１の中空糸壁に付着する必要がない。これらの実施形態では、付着を促進するためのコーティング剤（例えば、フィブロネクチン）で、中空糸の内側をコートする必要がない。これらの実施形態では、（精製された又は精製されていない）（ＣＤ３４＋細胞を含む）ＨＳＣは、バイオリアクターコーティングステップなしで、プライミングステップの後に、バイオリアクター６０１に導入される。細胞が接着性細胞の場合は、プライミングステップの後、ＨＳＣの導入前に、コーティングステップを実行する。
【００５１】
バイオリアクター６０１内に入ると、細胞は、成長因子、活性化剤、ホルモン、試薬、タンパク質、及び／又は細胞の増殖を補助する他の生物活性分子に曝露される。一例では、ＨＳＣ（ＣＤ３４＋細胞を含む）を増殖させるための条件を最適化するために、共培養細胞株がバイオリアクター６０１内で予め増殖／導入される。１つの特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞の増殖を促進するために、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）をＨＳＣ（ＣＤ３４＋細胞を含む）と共培養する。理論に縛られるものではないが、ＭＳＣは、ＨＳＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）と相互作用する因子（例えばＳＤＦ‐１因子）を放出し、該細胞の増殖を促進すると考えられる。いくつかの実施形態では、共培養ｈＭＳＣの使用は、ＨＳＣ（ＣＤ３４＋細胞を含む）をバイオリアクター６０１に導入する前に、ｈＭＳＣの増殖に最適化された条件下で最初に成長プロセスを行うことを伴ってもよい。ｈＭＳＣは、実施形態において、骨髄、末梢血、臍帯細胞、脂肪組織、及び／又は奇胎組織に由来する。
【００５２】
共培養細胞に加えて、ＨＳＣを成長及び増殖するために、１つ又は複数の成長因子、活性化剤、ホルモン、試薬、タンパク質、及び／又は他の生物活性分子を含むサプリメントをバイオリアクター６０１に添加してもよい。サプリメントは、単一容量の添加として、又はある期間にわたって（例えば、連続的に、断続的に、又は定期的なスケジュールで）添加することができる。一実施形態では、サイトカイン及び／又は他のタンパク質（例えば、組換えサイトカイン、ホルモン等）の組合せをサプリメントの一部として含めることができる。一例として、サプリメントは、組換えヒトＦｌｔ３リガンド（ｒｈＦｌｔ‐３Ｌ）、組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）、組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）、組換えヒト（ｒｈ）グリア由来神経栄養因子、及び／又はそれらの組み合わせのうちの１又は複数のものを含む。実施形態と共に使用することができるサプリメントの一例は、ＳＴＥＭＣＥＬＬ２ＭＡＸ（商標）サプリメント（ｓｔｅｍｃｅｌｌ２ＭＡＸ、カンタニデ、ポルトガル）である。
【００５３】
いくつかの実施形態において、因子の組み合わせは、細胞が懸濁されている培地に含まれてもよいことに留意されたい。例えば、ＨＳＣを培地に懸濁し、バイオリアクターに培地で導入することができる。実施形態において、培地は、ＨＳＣの増殖を助ける成長因子の組み合わせを含んでもよい。
【００５４】
細胞をサプリメント、共培養細胞、及び／又は細胞を増殖させるための他の材料と共にバイオリアクターに導入した後、細胞をバイオリアクター６０１内で増殖させる。増殖中に、バイオリアクター６０１に追加する又はバイオリアクター６０１から除去するいくつかの材料がある。一例として、追加のタンパク質（例えば、サイトカイン）がバイオリアクター６０１に添加される。いくつかの実施形態では、２つ以上のタンパク質又は他の生物活性剤を使用することができる。追加の材料は、個別に、又は同時に、又は異なる時間に、添加することができる。或いは、組み合わせて添加することができる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、例えば、ポート６１８を介して、バイオリアクター６０１により直接的に材料が追加される場合もある。しかしながら、他の実施形態では、バイオリアクター６０１に、よりゆっくりと灌流されるように、材料は、例えば、流路６０６を介して、所与の位置において追加される。
【００５６】
（ＣＤ３４＋細胞を含む）ＨＳＣの増殖を補助するための材料に加えて、ＨＳＣは、いくつかの栄養素を含む培地の添加等によってもフィーディングすることができる。いくつかの実施形態では、培地は、血清を含む市販の培地である。他の実施形態では、培地は、無血清であり、他の添加剤を含んでもよい。培地は、他の材料、塩、血清、タンパク質、試薬、生物活性分子、栄養素等を含むいくつかの非限定的な例の添加によって変性させてもよい。ＨＳＣ（ＣＤ３４＋細胞を含む）をフィーディングするために使用される培地の一例としては、ＣＥＬＬＧＲＯ（登録商標）無血清培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、フライブルク、ドイツ）が挙げられる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、共培養細胞はＩＣ空間内に位置しているが、フィーディングはＥＣ空間内で行うことができる。実施形態では、ＥＣ空間を介してフィーディングを行うことにより、ＩＣ空間内の循環流体から細胞が感じることがある力の量を減らすことができる。ＥＣ空間における培地の循環は、実施形態において、ＨＳＣ（ＣＤ３４＋細胞を含む）の増殖のために十分な栄養素を提供することができる。
【００５８】
ＨＳＣ（ＣＤ３４＋細胞を含む）の増殖の一部として、温度、ｐＨ、酸素濃度、二酸化炭素濃度、排出物濃度、代謝物濃度等のその他の条件は、バイオリアクター６０１内で調節される。いくつかの実施形態において、ＥＣ側（例えば、経路６０４）の流量を用いて、種々のパラメータが制御される。例えば、細胞成長が行われているＩＣ側の排出物濃度又は代謝物濃度を減らしたい場合、ＥＣ側の流量を増やすことで、中空糸を通過するＩＣ側からＥＣ側への移動によって、排出物及び／又は代謝物をＩＣ側から確実に除去することができる。
【００５９】
ＣＤ３４＋細胞を増殖させた後、該細胞は、バイオリアクター６０１から取り出される。ＣＤ３４＋細胞は容器６９９に集められる。実施形態において、収集されたＣＤ３４＋細胞は、造血を再構築するために、患者に投与される。そのような患者としては、非限定的な例であるが、造血に影響を及ぼし得る、様々な癌（例えば白血病、骨髄異形成、非ホジキンリンパ腫等）の治療を受けている患者等である。細胞は他の化合物又は分子と共に投与されてもよい。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ＣＥＳ６００の使用によって、従来のプロセスと比べて、（ＣＤ３４＋細胞を含む）ＨＳＣの増殖において、種々の利点が得られる。例えば、中空糸の使用によって、密接な細胞間通信が可能になり、その結果、ＣＤ３４＋細胞の成長が高められて、増殖を開始させ継続させることができる。また、バイオリアクター６０１のような中空糸型バイオリアクターの使用によって、細胞増殖のための表面積が拡大し、それによって、より高い濃度の又はより高い量のＣＤ３４＋細胞をもたらすことができる。
【００６１】
さらに、バイオリアクター６０１における条件は、ＣＥＳ６００のいくつかの異なる構成要素（ＩＣ流量及びＥＣ流量を含む）を使用して制御され得る。また、ＣＥＳ６００は、物質を添加するための様々な場所を提供することができる。これによって、サイトカインのバイオリアクター６０１への直接的な投入又は間接的な投入（例えば灌流）を行うことができる。
【００６２】
さらに、ＣＥＳ６００によって、閉鎖系システムが提供される。すなわち、ＣＤ３４＋細胞を成長するためのステップを、周囲環境に直接曝露することなく、実行することができる。従って、周囲環境によって該細胞が汚染されたり、或いは該細胞や該細胞成長に使用される物質によって周囲環境が汚染されたりすることがない。いくつかの実施形態では、増殖のためのＣＤ３４＋細胞の開始濃度を、他の方法／システムに比べて、小さい量にすることができると考えられる。これらの実施形態では、ＣＤ３４＋細胞増殖の収穫量を、他の方法／システムに比べて大きくできる。いくつかの実施形態は、有効量のＣＤ３４＋細胞を増殖させるための時間を短縮することができると考えられる。
【００６３】
図７〜図９は、実施形態に係る細胞（例えば、ＨＳＣ）成長のフローチャート７００、８００、９００を示す。以下では、フローチャート７００、８００、９００のステップを行うための特定の装置が説明されるが、本発明はそれらに限定されない。例えば、いくつかのステップは、細胞増殖システム（例えば、ＣＥＳ５００、６００）の一部又は、プロセッサ実行可能命令として与えられるソフトウェアに基づいてステップを実行可能なプロセッサ（例えば、図１１のコンピュータシステム１１００）によって行われるように記載されてもよい。これらはあくまでも例示の目的で行われるものであり、フローチャート７００、８００、９００は、特定の装置によって行われることに制限されない。
【００６４】
フローチャート７００はステップ７０４で始まり、細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞を含むＨＳＣ）を集める／準備するオプションとしてのステップ７０８へ進む。一例として、ステップ７０８は、アフェレーシスプロセス（例えば、白血球アフェレーシスプロセス）を含んでよい。一実施形態では、アフェレーシスプロセスが、ステップ７０８の一部として実行される。アフェレーシスプロセスにおいて、細胞を集めることが可能な装置としては、テルモＢＣＴ社（コロラド州、レイクウッド）製のＳＰＥＣＴＲＡ  ＯＰＴＩＡ（登録商標）アフェレーシス・システム、ＣＯＢＥ（登録商標）スペクトラ・アフェレーシス・システム、ＴＲＩＭＡ  ＡＣＣＥＬ（登録商標）自動血液収集システムが挙げられる。
【００６５】
他の実施形態では、任意のステップ７０８は、細胞を解凍するか、又は他の方法で、（例えば、臍帯血から）細胞を調製することを含んでもよい。いくつかの実施形態において、臍帯血細胞の調製は、ＣＤ３４＋細胞を選択する選択プロセスを通して臍帯血細胞を処理することを含んでもよい。このプロセスは、正の選択プロセス又は負の選択プロセスのいずれかであってよい。このプロセスは、精製カラム、磁気カラム、機能性磁気ビーズ、試薬、又は他の細胞からＣＤ３４＋細胞を分離する他の材料の使用を伴ってもよい。一例として、選択プロセスは、抗原で機能化された磁気ビーズ、及び分離を完了するために磁気カラムを利用するＣＬＩＮＩＭＡＣＳ  ＰＲＯＤＩＧＹ（登録商標）システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ベルギッシュグラートバッハ、ドイツ）等の装置の使用を伴ってもよい。
【００６６】
他の実施形態では、最初に収集されたときに細胞と共に含まれ得る他の細胞を激減させるためにアフェレーシス装置が使用される。例えば、該細胞は、臍帯血、骨髄、又は末梢血から供給されてもよい。最初の収集後且つバイオリアクターに導入する前に、所定体積のターゲット細胞を処理して、その体積から赤血球、特定の白血球、顆粒球、及び／又は他の細胞を激減させることができる。これらは単なる例示であり、本発明の実施形態においては、分離を実行するために他の材料又は他の装置を使用してもよい。
【００６７】
フロー７００は、ステップ７０８からステップ７１２へ進む。ステップ７１２では、細胞が細胞増殖システム（特に、細胞増殖システムのバイオリアクター）に投入される。上述のように、いくつかの実施形態では、フロー７００は、ステップ７１２から始まってもよい。実施形態において、バイオリアクターは、バイオリアクター１００（図１参照）のような中空糸型バイオリアクターである。これらの実施形態では、ステップ７１２では、細胞を１又は複数の中空糸に個別に流してもよい。ステップ７１２では、プロセッサ、ポンプ、バルブ、流体路等を用いて、細胞をバイオリアクターへ投入してもよい。一実施形態において、ステップ７１２は、バルブ（例えば、バルブ５６４、５１４、６６４、６１４）を開き、ポンプ（例えば、ポンプ５５４、６５４）を動作させてもよい。
【００６８】
ステップ７１２の後、フローチャート７００は、ステップ７１６へ進む。ステップ７１６では、細胞は、１又は複数の成長条件に曝露される。理解されるように、特定の細胞型は、増殖のための特定の成長条件が必要となる。成長条件としては、例えば、所定のタンパク質への曝露が挙げられる。この細胞型の例としては、ＣＤ３４＋細胞がある。ステップ７１６では、細胞の増殖・成長を促進するために、細胞を、必要な成長因子、タンパク質、試薬、栄養素等にさらす。
【００６９】
ステップ７１６は、ステップ７１６の一部として行われる或いはステップ７１６の前に行われる複数のステップを含んでよい。例えば、いくつかの実施形態では、ステップ７２０は、ターゲット細胞株の成長を促進する材料を生成し得る共培養細胞を成長させるために行われる。一実施形態では、ステップ７２０は、ステップ７１６の前、又はさらにはステップ７０８の前に、実行される。１つの具体的な例では、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）をバイオリアクターで増殖させることができる。これらの実施形態では、ステップ７２０は、ステップ７１６の間に共培養細胞がバイオリアクター内に存在することをもたらすいくつかのステップ（例えば、骨髄、末梢血、臍帯細胞、脂肪組織、及び／又は奇胎組織からのｈＭＳＣの収集）を含む。理解され得るように、これらのステップはステップ７１２の前に実行されてもよい。
【００７０】
共培養細胞を増殖させることに関して、共培養細胞を増殖させるためにバイオリアクターを調整するためのいくつかのステップを実施することができる。実施形態では、該ステップは、バイオリアクターをプライミングすること、（例えば、共培養細胞が接着性細胞である場合）共培養細胞の付着を促進する材料でバイオリアクターをコーティングすること、共培養細胞をバイオリアクターに導入する前に材料を除去するために洗浄すること、共培養細胞を付着させること、そして、共培養細胞を増殖させること、を含むことができる。
【００７１】
他の実施形態では、ステップ７１６は、成長因子をバイオリアクターに追加するステップ７２４を含むことができる。理解され得るように、いくつかの実施形態において、細胞増殖を促進するために、１つ以上の成長因子（例えばサイトカイン）が添加される。一例として、ＣＤ３４＋細胞を成長する際の成長因子は、組換えヒトＦｌｔ３リガンド（ｒｈＦｌｔ‐３Ｌ）、組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）、組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）、組換えヒト（ｒｈ）グリア由来神経栄養因子、及び／又はそれらの組み合わせのうちの１又は複数のものを含む。これは一例にすぎず、他の実施形態では、ステップ７２４の一部として、異なる成長因子、成長因子の組み合わせ、又は他のタンパク質を使用することができる。
【００７２】
一実施形態では、ステップ７１２で、成長因子の少なくとも一部が細胞と共に導入される。例えば、バイオリアクターに導入される際、細胞が入っている培地は、組換えヒトＦｌｔ３リガンド（ｒｈＦｌｔ‐３Ｌ）、組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）、組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）、組換えヒト（ｒｈ）グリア由来神経栄養因子、及び／又はそれらの組み合わせのうちの１又は複数のものを含む成長因子の組み合わせで調整することができる。これらの実施形態では、ステップ７１６及び任意選択のステップ７２４は、バイオリアクターにすでに添加されている成長因子を細胞で補足することを含んでもよい。
【００７３】
ステップ７１６の後、フローはステップ７２８へ進み、そこで細胞が成長、すなわち増殖される。ステップ７２８はいくつかのサブステップを含むことができる。例えば、サブステップ７３２において、細胞は、他の成長因子、タンパク質、生物活性分子等に曝される。この曝露によって細胞が増殖し続けることが可能になる。
【００７４】
実施形態では、ステップ７２８は、数時間又は数日又は数週間の期間にわたって行われる。この期間中、種々のサブステップ（例えば７３２、７３６、７４０）が、この期間中の様々な時点で実行されてもよい。例えば、この期間中、成長因子のような追加の物質をバイオリアクターに灌流するか直接注入して、補給を行い、成長因子への曝露を続けて、増殖を促進することができる。
【００７５】
ステップ７２８は、細胞フィーディングステップ７３６を含んでもよい。ステップ７３６は、グルコース、リン酸塩、塩等を含む様々な栄養素を加えることを含むことができる。ステップ７３６は、実施形態において、栄養素の濃度を感知すること、及び相対的に低い濃度に応答して、バイオリアクターに栄養素を添加することを含むことができる。ステップ７３６は、細胞に栄養補給するための栄養素を添加するためのプロセッサ、ポンプ、バルブ、流体導管等の使用を含むことができる。或いは、グルコース等の栄養素の添加は、所定のスケジュールに基づいて行われてもよい。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ステップ７２８は、ＥＣ空間内で培地を循環させることを含むことができる。培地はＣＤ３４＋細胞の増殖に必要な栄養素を含んでもよい。実施形態において、ＥＣ空間を介してのフィーディングは、培地がＩＣ空間内を循環している場合に細胞が感じる可能性がある力の量を減らすことができる。ＥＣ空間における培地の循環によって、中空糸を介した栄養素の拡散を通じて行われるＨＳＣ（ＣＤ３４＋細胞を含む）の増殖において、十分な栄養分（例えばグルコース）を提供することができる。他の実施形態では、ステップ７２８は、より直接的なフィーディングを行うために、栄養分（例えばグルコース）と共にＩＣ空間内で培地を循環させることを含んでもよい。
【００７７】
ステップ７４０は、バイオリアクターの成長環境を制御するステップを含んでよい。理解されるように、栄養素に加えて、細胞成長を最適化するための環境としては、複数の異なるパラメータがある。例えば、温度、ｐＨ、酸素濃度、二酸化炭素濃度、排出物濃度、代謝物濃度等が、ステップ７４０の一部として、モニター・制御される。一実施形態では、細胞増殖が行われている毛細管内側空間でのｐＨ、酸素濃度、二酸化炭素濃度、排出物濃度、代謝物濃度等の制御において、バイオリアクターの毛細管外側空間（ＥＣ）側を流れる流体の流量が利用される。
【００７８】
フローチャート７００は、ステップ７４０から、バイオリアクターから細胞を取り出すステップ７４４へ進む。ステップ７４４は、複数のサブステップを含んでよい。例えば、収穫プロセス７４８はそれ自身で複数のステップを含むが、ステップ７４４の一部として行うことができる。実施形態において、ステップ７４４は、バイオリアクターの毛細管内側空間（ＩＣ）側及び毛細管外側空間（ＥＣ）側の循環レートを変更するステップを含んでよい。他の実施形態において、ステップ７４４は、種々の物質を循環させ、中空糸の内側表面に付着した細胞を確実に剥離してバイオリアクターから取り出すステップを有してよい。一例として、プロテアーゼを付加することで、細胞が中空糸に結合することを助ける糖タンパク質のようなタンパク質が分解される。フローチャート７００はステップ７５２で終了する。
【００７９】
一実施形態では、収穫プロセス７４８の一部として、バイオリアクター内（例えば、毛細管内側空間）の流体を比較的高い流量で循環させる。流体の循環は、ステップ７２８で増殖した細胞の懸濁を促進することができる。増殖した細胞が流体中に確実に懸濁されて、バイオリアクターからできる限り多くを回収することができるように、循環は所定の期間にわたって行われる。フロー７００はステップ７５２で終了する。
【００８０】
フロー８００は、共培養において、ＣＤ３４＋細胞等の細胞を成長させるために実行される。実施形態では、共培養はＣＤ３４＋細胞の成長を改善することができる。フロー８００はステップ８０４で始まり、第１の細胞（例えば、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ））をバイオリアクターに導入するステップ８０８に進む。実施形態では、バイオリアクター（例えば、バイオリアクター１００（図１））は、多数の中空糸（例えば、中空糸１１６（図１））を含む中空糸型バイオリアクターである。
【００８１】
実施形態において、中空糸型バイオリアクター中の中空糸は、ステップ８０８の前に調整される。例えば、ｈＭＳＣが中空糸の内壁に付着することを可能にするために、中空糸は、例えば糖タンパク質（フィブロネクチン、コラーゲン）でコーティングされる。コーティングプロセスはいくつかのサブステップを含むことができる。
【００８２】
ステップ８０８で導入された細胞は、中空糸型バイオリアクターの毛細管内側空間（例えば、中空糸の内部）に導入されてもよい。ステップ８０８は、細胞をバイオリアクターに導入するために、プロセッサ（１１００、（図１１））、ポンプ、バルブ、流体導管等の使用を含むことができる。一実施形態では、ステップ８０８は、バルブ（例えば、５６４、５１４、６６４、６１４）を開き、ポンプ（例えば、５５４、６５４）を作動させることを含む。
【００８３】
他の実施形態では、ステップ８０８は、細胞を、中空糸型バイオリアクターの毛細管外側空間（例えば、中空糸の外側）に導入する。ステップ８０８は、細胞をバイオリアクターに導入するために、プロセッサ（１１００、（図１１））、ポンプ、バルブ、流体導管等の使用を含むことができる。一実施形態では、ステップ８０８は、バルブ（例えば、５７０、５７６、６７０、６７６）を開き、ポンプ（例えば、５７８、６７８）を作動させることを含む。
【００８４】
フローはステップ８０８からステップ８１２に進み、そこで第１の細胞が第１の成長条件にさらされる。第１の成長条件は、ステップ８０８で導入された第１の細胞を成長させるために最適化される。例えば、ステップ８１２は、第１の細胞を成長させるための栄養素を含む第１の成長培地で第１の細胞をフィーディングすることを含む（任意ステップ８１６）。成長培地は、グルコース、リン酸塩、塩等を含む種々の栄養素のうちの１つ以上を含むことができる。
【００８５】
所定期間（この期間は、バイオリアクター内で成長した第１の細胞の数に応じて決定される）の後、フロー８００は８２０に進み、そこで第２の細胞（例えば、ＨＳＣ、造血前駆細胞（ＣＤ３４＋）等）がバイオリアクターに導入される。実施形態では、第２の細胞は、第１の細胞と同じように毛細管内側空間に導入される。他の実施形態では、上記のように、第１の細胞は毛細管外側空間におかれ、一方、第２の細胞は毛細血管内側空間に導入されてもよい。
【００８６】
いくつかの実施形態では、第２の細胞を導入する前に、バイオリアクターから前の流体を除去するために洗浄手順が実施される。理解され得るように、バイオリアクター内の流体は、第１の細胞を増殖させるために調整された栄養素を含む。実施形態では、ステップ８２０の前に、又はステップ８２０の一部として、この流体をバイオリアクターから洗い流すこと、及び第２の細胞をバイオリアクターに導入することが行われる。
【００８７】
ステップ８２０は、第２の細胞をバイオリアクターに導入するために、プロセッサ（１１００、（図１１））、ポンプ、バルブ、流体導管等の使用を含むことができる。一実施形態では、ステップ８２０は、バルブ（例えば、５６４、５１４、６６４、６１４）を開き、ポンプ（例えば、５５４、６５４）を作動させることを含む。
【００８８】
フローはステップ８２０からステップ８２４へ進み、そこで第２の細胞が第２の成長条件にさらされる。第２の成長条件は、ステップ８２０で導入された第２の細胞を増殖させるために最適化される。例えば、ステップ８２０は、第２の細胞を増殖させるための栄養素を含む第２の成長培地で第２の細胞をフィーディングすること（任意ステップ８２８）を含む。第２の培地は、グルコース、リン酸塩、塩等を含む種々の栄養素のうちの１つ以上を含むことができる。
【００８９】
さらに、いくつかの実施形態では、ステップ８２０は、第２の細胞（例えばＣＤ３４＋細胞）の成長を促進する成長因子を添加する任意選択のステップ８３２を含む。実施形態では、成長因子（例えばサイトカイン）を添加して細胞の増殖を促進することができる。一例として、ＣＤ３４＋細胞を増殖させる場合、成長因子は、組換えヒトＦｌｔ３リガンド（ｒｈＦｌｔ‐３Ｌ）、組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）、組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）、組換えヒト（ｒｈ）グリア由来神経栄養因子、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。これは一例にすぎず、他の実施形態では、異なる成長因子、成長因子の組み合わせ、又は他のタンパク質が使用される。実施形態では、成長因子は、中空糸型バイオリアクターの毛細管内側空間に添加されてもよい。
【００９０】
実施形態では、ステップ８２０で、成長因子の少なくとも一部は、細胞と共に導入される。例えば、バイオリアクターに導入される際、細胞が入っている培地を、組換えヒトＦｌｔ３リガンド（ｒｈＦｌｔ‐３Ｌ）、組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）、組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）、組換えヒト（ｒｈ）グリア由来神経栄養因子、及びそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を含む成長因子の組み合わせで調整することができる。これらの実施形態では、ステップ８２０及び任意選択のステップ８３２は、バイオリアクターに細胞と共にすでに添加された成長因子を補給することを含む。
【００９１】
フローはステップ８２４からステップ８３６へ進み、そこで細胞は共培養において増殖される。ステップ８３６は、いくつかのオプションのサブステップを含むことができる。例えば、細胞は、任意のサブステップ８４０においてフィーディングされてもよい。それらが共培養で増殖される際、さらなるグルコース又は他の栄養素が細胞に提供されてもよい。サブステップ８４４では、細胞を増殖するために他の条件が制御される。例えば、細胞の増殖のための環境を制御するために、温度、ｐＨ、ガス濃度等がモニターされ、変更される。
【００９２】
フロー８００はステップ８３６からステップ８４８に進み、そこで細胞がバイオリアクターから取り出される。ステップ８４８は、いくつかのサブステップを含むことができる。例えば、それ自体がいくつかのステップを含む収穫プロセス８５２は、ステップ８４８の一部として実行されてもよい。実施形態では、ステップ８４８は、バイオリアクターの毛細管内側空間（ＩＣ）及び毛細管外側空間（ＥＣ）側の循環流量の変更を含む。他の実施形態では、ステップ８４８は、中空糸の内面に付着している細胞がバイオリアクターから剥離され取り出されることを確実にするために種々の材料を循環させることを含む。一例として、細胞の中空糸への結合を補助するための糖タンパク質（フィブロネクチン、コラーゲン）等のタンパク質を分解するために、プロテアーゼが添加される。
【００９３】
一実施形態では、収穫プロセス８５２の一部として、バイオリアクター（例えば、毛細管内側空間）内の流体を比較的高い流量で循環させる。流体の循環は、ステップ８３６で増殖した細胞の懸濁を促進することができる。増殖した細胞が流体中に確実に懸濁されて、バイオリアクターからできる限り多くを回収することができるように、循環は所定の期間にわたって行われる。フロー８００はステップ８５６で終了する。
【００９４】
フロー９００はステップ９０４で始まり、ステップ９０８に進み、そこで、第１の細胞（例えば、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ））を静置型の成長チャンバー内で成長させる。ステップ９０８は、流体がポンプによって動かされないフラスコ又はガス透過型リアクターの使用を含むことができる。詳細には、成長チャンバーは静置の状態のままであり、チャンバーに添加された後は、流体は流れない。
【００９５】
フロー９００は次にステップ９０８からステップ９１２に進み、そこで第２の細胞が静置型の成長チャンバー内において静置状態で成長される。実施形態では、第２の細胞は造血前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）である。ステップ９１２の後、静置型の成長チャンバー内で増殖させられた第２の細胞は、該成長チャンバーから取り出され、動的な細胞増殖システム（例えば、ＣＥＳ５００、６００）内でさらに増殖されてもよい。そこでは、流体を（例えば、自動的に）循環させながら細胞が増殖される。
【００９６】
フロー９００は次にステップ９２０に進み、そこで第１の細胞（例えば、ｈＭＳＣ）が、多数の中空糸を含む中空糸型バイオリアクターに導入される。ステップ９２０で導入された細胞は、中空糸の内部（内腔）に導入されてもよい。
【００９７】
実施形態において、中空糸型バイオリアクター中の中空糸は、ステップ９２０の前に調整される。例えば、ｈＭＳＣが中空糸の内壁に付着することを可能にするために、中空糸は、例えば糖タンパク質（フィブロネクチン、コラーゲン）でコーティングされる。コーティングプロセスは、いくつかのサブステップを含むことができる。
【００９８】
ステップ９２０は、第１の細胞をバイオリアクターに導入するために、プロセッサ（１１００（図１１））、ポンプ、バルブ、流体導管等の使用を含むことができる。一実施形態では、ステップ９２０は、バルブ（例えば、５６４、５１４、６６４、６１４）を開いて、ポンプ（例えば、５５４、６５４）を作動させることを含むことができる。
【００９９】
ステップ９２０は、いくつかのサブステップを含むことができる。実施形態では、中空糸型バイオリアクターに細胞を導入することの一部として、サブステップ９２２において、バイオリアクターを回転させることができる。例えば、第１の細胞をできるだけ多くの中空糸内部（内腔）に付着させるために、バイオリアクターを特定のパターンで回転させることができる。
【０１００】
図１０Ａ〜図１０Ｄは、第１の細胞を中空糸内部に導入し付着させるプロセス中の中空糸１０００（例えば、糸１１６（図１））の断面図である。図１０Ａでは、第１の細胞１００８を有する流体１００４は、ポンプを用いて、中空糸膜の毛細管内側空間を循環している（図５及び図６並びに上記の説明を参照）。図１０Ａに示すように、まず、細胞１００８は流体全体に分布している。
【０１０１】
次にポンプを停止し、その結果、第１の細胞は沈降し、しばらくすると、図１０Ｂに示すように、中空糸の内側１０１２の一部に付着する。実施形態において、中空糸は、細胞の中空糸壁内壁への付着を促進するために、ある化合物で予めコーティングされていてもよい。例えば、中空糸の内腔は、フィブロネクチンのような糖タンパク質でコーティングされてもよい。
【０１０２】
第１の細胞１００８が沈降付着した後、バイオリアクター（ひいては中空糸１０００）を１８０度回転させる。細胞を中空糸の内面により均一に分布させるために、細胞を投入する際、バイオリアクターを回転させる方法の例は、少なくとも、２０１７年４月１１日に発行された米国特許第９，６１７，５０６号明細書（タイトル「ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＣＥＬＬＳ  ＩＮ  Ａ  ＢＩＯＲＥＡＣＴＯＲ」）に記載されている。本明細書はこの参照により、その全体が本明細書に組み入れられる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、回転後、ポンプを再び作動させて、残りの付着していない第１の細胞１００８を、中空糸膜の毛細管内側空間において循環させる。他の実施形態では、ポンプは再作動されなくてもよい。
【０１０４】
図１０Ｃに示されるように、第１の細胞１００８の第２の部分は、その後、沈降し始め、中空糸１０００の内側１０１２の第２の部分に付着する。しばらくすると、図１０Ｄに示されるように、第１の細胞１００８の第２の部分が付着する。このようにして、第１の細胞１００８（例えば、ｈＭＳＣ）を、内側表面１０１２全体（例えば、中空糸内側の頂部と底部の両方）に、より均等に分布させることができる。
【０１０５】
再び図９を参照すると、フローはステップ９２０からステップ９２４に進み、そこで、第１の細胞が第１の成長条件にさらされる。第１の成長条件は、ステップ９２０で導入された第１の細胞を成長させるために最適化される。例えば、ステップ９２４は、第１の細胞を成長させるための栄養素を含む第１の成長培地を第１の細胞にフィーディングすることを含むことができる（任意のステップ９２８）。成長培地は、グルコース、リン酸塩、塩等を含む種々の栄養素のうちの１つ以上を含むことができる。
【０１０６】
所定期間（この期間は、バイオリアクター内で成長した第１の細胞の数に応じて決定される）の後、フロー９００は９３２に進み、そこで第２の細胞（例えば、ＨＳＣ、造血前駆細胞（ＣＤ３４＋）等）がバイオリアクターに導入される。実施形態では、第２の細胞は、第１の細胞と同じように毛細管内側空間に導入される。他の実施形態では、上記のように、第１の細胞は毛細管外側空間におかれ、一方、第２の細胞は毛細血管内側空間に導入されてもよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、第２の細胞を導入する前に、バイオリアクターから前の流体を除去するために洗浄手順が実施される。理解され得るように、バイオリアクター内の流体は、第１の細胞を成長させるために調整された栄養素を含む。実施形態では、ステップ９３２の前に、又はステップ９３２の一部として、この流体をバイオリアクターから洗い流すこと、及び第２の細胞をバイオリアクターに導入することが行われる。
【０１０８】
ステップ９３２は、第２の細胞をバイオリアクターに導入するために、プロセッサ（１１００、（図１１））、ポンプ、バルブ、流体導管等の使用を含むことができる。一実施形態では、ステップ９３２は、バルブ（例えば、５６４、５１４、６６４、６１４）を開き、ポンプ（例えば、５５４、６５４）を作動させることを含む。
【０１０９】
フローはステップ９３２からステップ９３６へ進み、そこで第２の細胞が第２の成長条件にさらされる。第２の成長条件は、ステップ９３２で導入された第２の細胞を成長させるために最適化される。例えば、ステップ９３６は、第２の細胞を成長させるための栄養素を含む第２の成長培地で第２の細胞をフィーディングすること（任意ステップ９４０）を含む。第２の培地は、グルコース、リン酸塩、塩等を含む種々の栄養素のうちの１つ以上を含むことができる。
【０１１０】
さらに、いくつかの実施形態では、ステップ９３６は、第２の細胞（例えばＣＤ３４＋細胞）の成長を促進する成長因子を添加するステップ９４４を含む。実施形態では、成長因子（例えばサイトカイン）を添加して細胞の増殖を促進することができる。一例として、ＣＤ３４＋細胞を増殖させる場合、成長因子は、組換えヒトＦｌｔ３リガンド（ｒｈＦｌｔ‐３Ｌ）、組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）、組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）、組換えヒト（ｒｈ）グリア由来神経栄養因子、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。これは一例にすぎず、他の実施形態では、異なる成長因子、成長因子の組み合わせ、又は他のタンパク質が使用される。実施形態では、成長因子は、中空糸型バイオリアクターの毛細管内側空間に添加されてもよい。
【０１１１】
実施形態では、ステップ９３６で、成長因子の少なくとも一部は、細胞と共に導入される。例えば、バイオリアクターに導入される際、細胞が入っている培地を、組換えヒトＦｌｔ３リガンド（ｒｈＦｌｔ‐３Ｌ）、組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）、組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）、組換えヒト（ｒｈ）グリア由来神経栄養因子、及びそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を含む成長因子の組み合わせで、調整することができる。これらの実施形態では、ステップ９３６及び任意選択のステップ９４４は、バイオリアクターに細胞と共にすでに添加された成長因子を補給することを含む。
【０１１２】
フローはステップ９３６からステップ９４８へ進み、そこで細胞は共培養において増殖される。ステップ９４８は、いくつかのオプションのサブステップを含むことができる。例えば、細胞は、任意のサブステップ９５２においてフィーディングされてもよい。それらが共培養で増殖される際、さらなるグルコース又は他の栄養素が細胞に提供されてもよい。サブステップ９５６では、細胞を増殖するために他の条件が制御される。例えば、細胞の増殖のための環境を制御するために、温度、ｐＨ、ガス濃度等がモニターされ、変更される。
【０１１３】
フロー９００はステップ９４８からステップ９６０に進み、そこで細胞がバイオリアクターから取り出される。ステップ９６０は、いくつかのサブステップを含むことができる。例えば、それ自体がいくつかのステップを含む収穫プロセス９６４は、ステップ９６０の一部として実行されてもよい。実施形態では、ステップ９６４は、バイオリアクターの毛細管内側空間（ＩＣ）及び毛細管外側空間（ＥＣ）側の循環流量の変更を含む。他の実施形態では、ステップ９６４は、中空糸の内面に付着している細胞がバイオリアクターから剥離され取り出されることを確実にするために種々の材料を循環させることを含む。一例として、細胞の中空糸への結合をアシストしている糖タンパク質等のタンパク質を分解するために、プロテアーゼが添加される。
【０１１４】
一実施形態では、収穫プロセス９６４の一部として、バイオリアクター（例えば、毛細管内側空間）内の流体を比較的高い流量で循環させる。流体の循環は、ステップ９４８で増殖した細胞の懸濁を促進することができる。増殖した細胞が流体中に確実に懸濁されて、バイオリアクターからできる限り多くを回収することができるように、循環は所定の期間にわたって行われる。フロー９００はステップ９６８で終了する。
【０１１５】
本開示の実施形態によれば、図７〜図９に示されるフロー７００、８００、９００において記述された動作ステップは、あくまで例示の目的であり、変更されてもよく、他のステップと組み合わせてもよく（例えば、ステップ９０８及び／又はステップ９１２をフロー７００及び／又はフロー８００に付加する等）、また他のステップと並行に行われてもよい。実施形態では、本開示の範囲から逸脱しなければ、ステップを減らしてもよいし、ステップを追加してもよい。また、例えば、ステップ（及びサブステップ）は、いくつかの実施形態では、例えば、メモリに記憶された予めプログラムされたタスクを実行するプロセッサ（１１００（図１１））によって、自動的に行ってもよい。ここでは、そのようなステップは、あくまでも例示の目的で提示されている。
【０１１６】
フロー７００、８００、９００に対して、種々のステップをある特定の順序で列挙して説明を行ったが、本開示は、そのような順序に制限されない。他の実施形態において、ステップ及びサブステップは、異なる順序で、或いは並行して、或いは部分的には図７〜図９に示された順序で、或いは図７〜図９に示されたシーケンスで行われてもよい。また、ステップ又はサブステップは特定の特徴又は特定の構造によって行われるように記載したが、これは本発明を制限することを意図していない。むしろ、それら記載は、あくまでも例示の目的で行われている。他の実施形態において、上記されていない他の構造や特徴を用いて、フロー７００、８００、９００のステップのうちの１又は複数のステップを行ってもよい。さらに、フロー７００、８００、９００は、オプションとしてのステップを含んでもよい。しかしながら、オプションとして示されていない上述のステップは、本発明において必須と考えるべきではなく、ある実施形態では実行され、他の実施形態では実行されない場合もある。
【０１１７】
図１１は、本発明の実施形態が実行されるコンピュータシステム１１００の構成要素例を示す。コンピュータシステム１１００は、例えば、細胞増殖システムがプロセッサを用いて、（上述のフロー７００、８００、９００に示されたプロセスのように、プロセスの一部として行われるカスタムタスクや予めプログラムされたタスクのような）タスクを実行する実施形態において、使用される。
【０１１８】
コンピュータシステム１１００は、ユーザインターフェース１１０２、処理システム１１０４、及び／又は記憶装置１１０６を有する。ユーザインターフェース１１０２は、当業者であればわかるように、出力装置１１０８、及び／又は入力装置１１１０を有する。出力装置１１０８は、１又は複数のタッチスクリーンを有してよい。タッチスクリーンは、１又は複数のアプリケーションウィンドウを提供するためのディスプレイ領域を有してよい。タッチスクリーンはまた、例えば、ユーザやオペレータからの物理的な接触を受容可能及び／又は取り込み可能な入力装置１１１０であってもよい。タッチスクリーンは、当業者であれば理解できるように、処理システム１１０４による接触位置の推定を可能とする静電容量構造の液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）でもよい。この場合、処理システム１１０４は、接触位置を、アプリケーションウィンドウの所定位置に表示されるユーザインターフェース（ＵＩ）要素に写すことができる。また、タッチスクリーンは、本発明に係る、１又は複数のその他の電子構造を介して接触を受容することもできる。他の出力装置１１０８としては、プリンター、スピーカ等が挙げられる。その他の入力装置１１１０としては、当業者であれば理解できるように、キーボード、その他のタッチ式入力装置、マウス、音声入力装置等が挙げられる。
【０１１９】
本発明の実施形態において、処理システム１１０４は、処理ユニット１１１２、及び／又はメモリ１１１４を有してもよい。処理ユニット１１１２は、メモリ１１１４に記憶された命令を実行するために動作可能な汎用プロセッサであってよい。処理ユニット１１１２は、本発明の実施形態では、単一のプロセッサ又は複数のプロセッサを含んでよい。さらに、実施形態では、各プロセッサは、個別に命令を読み込んで実行するための１又は複数のコアを有するマルチコアプロセッサでよい。プロセッサは、当業者であれば理解できるように、汎用プロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、その他の集積回路を含んでよい。
【０１２０】
本発明の実施形態において、メモリ１１１４は、データ及び／又はプロセッサ実行可能命令を短期に又は長期に記憶する任意の記憶装置を含んでよい。メモリ１１１４は、当業者であれば理解できるように、例えば、ランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）、リード・オンリ・メモリ（ＲＯＭ）、又は電気的消去・プログラム可能型リード・オンリ・メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）を含む。他の記憶媒体としては、例えば、当業者であれば理解できるように、ＣＤ−ＲＯＭ、テープ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、又は、その他の光学記憶装置、テープ、磁気ディスク記憶装置、磁気テープ、その他の磁気記憶装置等がある。
【０１２１】
記憶装置１１０６は、任意の長期データ記憶装置又は部品である。本発明の実施形態において、記憶装置１１０６は、メモリ１１１４と関連して記載されたシステムのうちの１又は複数のものを含んでよい。記憶装置１１０６は、常設してもよいし、取り外し可能でもよい。一実施形態において、記憶装置１１０６は、処理システム１１０４によって生成された又は与えられたデータを記憶する。
【０１２２】
実施例
実施形態の態様を実施することができるいくつかの例を以下に提供する。これらの実施例では特定の特徴を説明することがあるが、それらは単に例示及び説明を目的として提供されている。本発明は、以下に提供される実施例に限定されない。
【０１２３】
実施例１
３人のドナーからの未選択の臍帯血由来（ＣＢ）ＨＳＣ、ＣＤ３４＋細胞の初期増殖は、臍帯血のポジティブ免疫磁気選択によってＡｌｌＣｅｌｌｓ（登録商標）（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）から得られる。該細胞は、静止状態（５％ＣＯ２、３７．０℃）において、ＳｔｅｍＣｅｌｌ２ＭＡＸ（商標）サプリメント（ｒｈＦｌｔ−３Ｌ、ｒｈＳＣＦ、ｒｈＴＰＯ、ｒｈグリア由来神経栄養因子）を１：１００の濃度で添加した無血清培地ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）ＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）ＧＭＰ  ＳＣＧＭを用いて、骨髄由来ｈＭＳＣとの共培養において成長され、中空糸細胞増殖システム（例えば、Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）細胞増殖システム（ＣＥＳ））のための接種材料を成長させる。各Ｑｕａｎｔｕｍ  ＣＥＳバイオリアクターを５ｍｇのヒトフィブロネクチンで一晩コーティングし、ＨＳＣ導入の５日前に、３．０×１０３／ｃｍ２でアンマッチド（ｕｎｍａｔｃｈｅｄ）ｈＭＳＣを播種する。バイオリアクターには、ＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）ＧＭＰ  ＳＣＧＭ＋ＳｔｅｍＣｅｌｌ２ＭＡＸにＣＢ由来ＣＤ３４＋細胞が３．０×１０４／ｍＬの細胞密度で、総播種量が５．７×１０６の細胞数となるように播種される。そして、混合ガス（５％ＣＯ２、２０％Ｏ２、残りＮ２）を用いて、３７．０°Ｃで、６．６日間、共培養増殖される。細胞は、Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）ＣＥＳの自動タスクを使用して、バイオリアクターへ播種され、増殖され、収穫される。具体的には、細胞は、バイオリアクターの毛細管内側ループで成長され、ｈＭＳＣ−ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞相互作用を増強するために、システムの毛細管外側ループを通して基礎培地が添加される。代謝産物は、Ａｂｂｏｔｔ  ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）アナライザーで毎日定量される。細胞は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｖｉ−ＣＥＬＬ（商標）ＸＲ細胞生死数アナライザー（Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、５〜５０μｍの直径サイズ範囲で計数される。収穫した細胞は、ＢＤマウス抗ヒトＣＤ３４−ＦＩＴＣ、ＢＤマウス抗ヒトＣＤ３４−ＰＥ、ＢＤマウス抗ヒトＣＤ３８−ＡＰＣ、ＭＢ  ＣＤ１３３／１−ＰＥ、及びｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７８０で、表面バイオマーカーのために、着色され、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを備えたＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩを用いてフローサイトメトリーにより分析される。ＺＥＮ  ｐｒｏソフトウェアを備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ａ１顕微鏡を用いて、蛍光顕微鏡画像がキャプチャーされる。Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｈｕｍａｎ  ＣＦＵ  Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ（商標）Ａｓｓａｙを使用して、収穫したＣＢ由来ＣＤ３４＋細胞の分化を誘導する。
【０１２４】
【表１】
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【０１２５】
図１２は、上記表１に示したデータのいくつかの棒グラフ、すなわち、異なるドナーから収穫した細胞の平均数を示す棒グラフである。図１３は、異なるドナーについての代謝プロファイルを示すグラフである。図１４は、種々の実行に対する代謝率を示すグラフである。
【０１２６】
結果は、Ｑｕａｎｔｕｍ  ＣＥＳ中空糸膜バイオリアクターが自動ＣＥＳを用いた共培養におけるＣＢ由来ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−ＣＤ１３３＋前駆細胞の増殖をサポートすることができることを示唆している。ｒｈＦｌｔ−３Ｌ、ｒｈＳＣＦ、ｒｈＴＰＯ、ｒｈグリア由来神経栄養因子の成長因子サプリメントは、ＣＢ由来ＣＤ３４＋系統細胞の共培養をサポートし得る。増殖されたＣＢ由来のＣＤ３４＋細胞は、適切なサイトカイン及びサプリメント（ＳＣＦ、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐３、ＧＳＦ、ＥＰＯ）の存在下における系統分化を実証している。下記の表２はフローサイトメトリーの結果の要約を示す。
【０１２７】
【表２】
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【０１２８】
実施例２
ＣＤ３４＋増殖の培地コスト構造を改善するために、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）との単培養又は共培養にてＦＢＳ又はヒトＡＢ血清を補充したＩＭＤＭ培地を用いた場合における、ＡｌｌＣｅｌｌｓから得られるＩ‐Ｍａｇ選択されたヒトＨＳＣ  ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞（凍結ＣＢ００８Ｆ‐２）の培養が研究される。細胞培養装置には、Ｗｉｌｓｏｎ  Ｇ−Ｒｅｘ  １０ガス透過膜装置（Ｇａｓ  Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｅｖｉｃｅ）及び従来の組織培養ポリスチレンフラスコが含まれる。第１の実験の結果の後、細胞増殖及びバイオマーカーの発現を改善するため、修飾されたＩＭＤＭ（ＢＳＡ、ｒｈインスリン、トランスフェリン）とＦＢＳ又はヒト血清ＡＢ型を含むＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＰＥＭ  ＩＩ培地に切り替えると同時に細胞播種密度を上げることが決定される。
【０１２９】
実験１
Ｔ２５  ＴＣＰＳフラスコにおいて、Ｇｉｂｃｏ  ａｌｐｈａ−ＭＥＭ（カタログ番号３２５６１−０３７）完全培地（ＣＭ２２４）に１，０００細胞／ｃｍ２密度でｈＭＳＣ−Ｐ２Ｔ１を播種し、３７°Ｃ（５％ＣＯ２）でインキュベートし、解凍したＣＢ  ＣＤ３４＋細胞播種前の第６日目に８０％コンフルエントになるまで増殖させる。比較として、ウィルソンＧ−Ｒｅｘガス透過細胞培養装置にはｈＭＳＣは播種されていない。ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を２．０×１０４／ｍＬの濃度で播種し、７ｍＬのＧｉｂｃｏ  ＩＭＤＭ（カタログ番号３１９８０‐０３０）、２０％ＨｙＣｌｏｎｅ  ＦＢＳ（カタログ番号ＳＨ３００７０．０３）又は１８％Ａｋｒｏｎ  ＨＳ‐ＡＢ（カタログ番号ＡＫ９３４０−０１００）、及びＧｉｂｃｏペニシリン／ストレプトマイシン／ネオマイシン抗生物質（カタログ番号１５６４０−０５５）で、４日間、成長させる。ＣＤ３４＋細胞播種密度は、細胞濃度を３．０×１０４／ｍＬ以下に維持するための推奨に基づいている。培養容器を秤量して培養容積を決定し、０日目、２日目及び４日目に、較正されたＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｖｉ−Ｃｅｌｌ  ＸＲ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒで、細胞数を測定する。
【０１３０】
実験２
６つのＴ２５  ＴＣＰＳフラスコにおいて、Ｇｉｂｃｏ  ａｌｐｈａ−ＭＥＭ完全培地（ＣＭ２３１）中に８．４８×１０３／ｃｍ２でｈＭＳＣ−Ｐ２Ｔ１が播種され、３７°Ｃ（５％ＣＯ２）でインキュベートされ、解凍した（３７°Ｃ）ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ  ＣＢ−ＣＤ３４＋、カタログ番号ＣＢ００８Ｆ−２、ＩＤ  Ｎｏ．ＣＢＰ１４０１２９Ｃ）播種前の第３日目に８０％コンフルエントになるまで増殖させる。ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞（２．５ｍＬ）を２２．５ｍＬのＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ  ＩＩ培地に再懸濁し、５００×ｇで７分間遠心分離し、１０ｍＬのそれぞれの完全培地に再懸濁し、そして較正されたＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｖｉ‐Ｃｅｌｌ  ＮＲ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒで計数する。各フラスコ培地を、６ｍＬの滅菌濾過した（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ０．２２μｍＰＥＳ）ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ  ＩＩ完全培地２０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ  カタログ番号ＳＨ３００７０．０３）又は２０％ＨＳ−ＡＢ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号ＩＰＬＡ−ＳＥＲＡＢ‐ＯＴＣ‐１６１３８）、Ｇｉｂｃｏペニシリン／ストレプトマイシン／ネオマイシン抗生物質（カタログ番号１５６４０‐０５５）、と交換する。２０％ＦＢＳ又は２０％ＨＳ‐ＡＢのいずれかを補充したＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ  ＩＩ培地で、フラスコ当たり６ｍＬになるように、合計４つのＴ２５共培養フラスコに、３．００×１０４／ｍＬ又は３．００×１０５／ｍＬのＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を播種し、３７℃（５％ＣＯ２）で４日間インキュベートした。各フラスコからの懸濁細胞を２日目に取り出し、１５ｍＬの無菌遠心管に移し、５００×ｇで７分間遠心し、６ｍＬのそれぞれのＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ  ＩＩ完全培地に再懸濁し、そして、インキュベーションのために、Ｔ２５共培養フラスコに戻す。４日目に、懸濁細胞の画像を位相差顕微鏡（ＱＣａｐｔｕｒｅ  Ｐｒｏ  ６．０ソフトウェアを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ４１）によってキャプチャーし、フラスコの容積を決定するためにフラスコを秤量し、そして細胞を前述のように計数する。高細胞播種密度のアリコート（１．２５×１０５細胞）を、修正版のＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌを用いて、フローサイトメトリー染色（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ３４：カタログ番号５５５８２１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＦＩＴＣマウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール：カタログ番号５５５７４８、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ３８：カタログ番号５５５４６２、ＢＤ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎマウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール：カタログ番号５５５７５１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＰＥマウス抗ヒトＣＤ３４：カタログ番号５５５８２２、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＰＥマウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール：カタログ番号５５５７４９、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＣＤ１３３／１−ＰＥ：カタログ番号１８０−０８０−８０１）のために調製する。ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ（登録商標）ｖ６．１．３ソフトウェアを備えたＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）ＩＩフローサイトメーターを使用して、固定剤なしで、フローデータを取得し分析する。
【０１３１】
実験１は、２０％ＦＢＳ又は１８％ＨＳを補充したＩＭＤＭ基礎培地を使用して、総体積７ｍＬ中、２．００×１０４／ｍＬの低播種密度で、臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞の単培養及び共培養を評価し得る。Ｔ２５組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）フラスコ及びガス透過性Ｇ‐Ｒｅｘ‐１０容器を、一次静置培養環境として使用する。
【０１３２】
図１５は、ＦＢＳを用いた実験１から得られた細胞数を示すグラフである。図１６は、ヒト血清を用いた実験１から得られた細胞数を示すグラフである。
【０１３３】
ＦＢＳ及びＨＳ添加ＩＭＤＭの両方とも、２日目までに細胞数の増加を示す。しかしながら、４日目までに細胞濃度の減少もある。また、両方の補給培地において、ＦＢＳでは、８７％から７６．４％に、ＨＳでは８８．５％から７６．３％に、細胞膜の完全性（ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）が２日目から４日目に低下している。これは、３日目の培地交換の欠如又は２．００×１０５／ｍＬの低い細胞播種密度のためだと考えられる。要約すると、２０％ＦＢＳ添加培地の場合、４日目までに、フラスコ共培養で７．５〜７．６倍の増加、フラスコ単培養で７．１倍の増加、及びＧ‐Ｒｅｘ‐１０単培養で７．０〜７．２倍の増加を生じる。比較すると、１８％ＨＳ添加培地では、４日目までに、フラスコ共培養で７．３〜７．５倍の増加、フラスコ単培養で６．８倍の増加、及びＧ‐Ｒｅｘ１０単培養で６．７〜６．９倍の増加を生じる。
【０１３４】
実験２は、低播種密度と高播種密度の両方を評価することができる。図１７は、低播種密度条件と高播種密度条件の両方におけるＣＤ３４＋細胞を示すグラフを示す。２０％ＦＢＳを添加した６ｍＬのＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ  ＩＩにおける低密度（３．００×１０４／ｍＬ）と高密度（３．００×１０５／ｍＬ）のＣＢ  ＣＤ３４＋細胞播種密度において、４日目の浮遊細胞数はそれぞれ、５７％及び３６％、増加している。一方、２０％ＨＳ‐ＡＢ添加培地は、同じ期間の４日間の培養期間にわたって、懸濁細胞数は減少している。図１８は、フローサイトメトリーの結果を示す棒グラフを示す。これらのフローサイトメトリーの結果は、ＣＤ３４＋細胞の大部分が、高細胞播種条件で、ＦＢＳ及びＨＳ−ＡＢ添加培地のいずれでも、ＣＤ３８＋バイオマーカーを発現し得ることを示唆している。ＣＤ３８バイオマーカーは、初期前駆体ＣＤ３４＋細胞集団の指標となる。より成熟したＣＤ３４＋細胞は、４日目以降の短期間の培養での増殖中には、徐々にＣＤ３８（ｌｏｗ／−）になる。ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋血液前駆細胞は、自己末梢血幹細胞移植を受けている患者における血小板生着の推定マーカーとなり得る。これらのデータはまた、ＦＢＳ及びＨＳ−ＡＢ補充培地が静置共培養におけるＣＤ１３３＋細胞亜種（それぞれ３０％及び４７％）を裏付けることを示している。
【０１３５】
実施例３
以下は、実施形態において使用され得るプロトコルの一例である。このプロトコルは、細胞増殖システム（ＣＥＳ）を使用するときに利用される通常のプロトコルからの可能な修正を示す。
【０１３６】
ＣＥＳ細胞導入  修正３−循環分配及び回転を伴う導入
【０１３７】
通常の予め選択されたＭＳＣ増殖プロトコルは、下記の太字、下線、及び斜体を組み合わせて示される以下の修正が行われて、実行される。バイオリアクターを１８０度回転させ、細胞を、５分間、中空糸膜（ＨＦＭ）上に沈着させる。次にバイオリアクターを回転させて「ホーム」水平位置に戻し、増殖プロトコルを進める。修正の理由は、細胞をバイオリアクターの中空糸の全表面にわたって分布させることである（図１０Ａ〜図１０Ｄ）。
【０１３８】
０日目：回転による指示細胞の付着
【０１３９】
目的：接着性細胞をバイオリアクターに付着させ、同時にＥＣ循環ループでの流れを起こす。ＩＣループのポンプ流量はゼロに設定される。
【０１４０】
分配及び回転による細胞のＣＥＳへの導入の前に、以下の既存ステップ又は修正ステップを用いるカスタムタスク（Ｃｕｓｔｏｍ  Ｔａｓｋ）をインストールする（タッチスクリーンディスプレイ又はＧＵＩを介してＣｏｎｆｉｇ＞Ｔａｓｋ）。これらの溶液及び対応する体積は、カスタムタスクのデフォルト設定又は修正された設定に基づいている。
【０１４１】
【表３】
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【０１４２】
【表４】
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【０１４３】
２日目又は必要に応じて、通常の細胞フィーディングタスクに戻り、Ｆｅｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔａｓｋを用いて、前培養ｈＭＳＣ増殖プロトコルを続ける。
【０１４４】
５日目：回転させながら、ＣＢ  ＣＤ３４＋懸濁細胞を導入。
【０１４５】
ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞のためのＩＣ／ＥＣ培地交換及び調整。
【０１４６】
ＳＣＧＭ基礎培地をＩＣ培地ラインに取り付け。ＩＣ／ＥＣ洗浄タスク及び培地調整タスクを実行。
【０１４７】
ＳＣＧＭ（９８ｍＬ）及びＳｔｅｍＣｅｌｌ２ＭＡＸ  １００Ｘサプリメント（２ｍＬ）のＣＢ  ＣＤ３４＋細胞懸濁液が入った細胞投入バッグを、システムの細胞投入ラインに滅菌溶接機で取り付け。
【０１４８】
【表５】
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【０１４９】
収穫前に細胞の再懸濁
【０１５０】
循環タスクの目的は、収穫タスクを開始する前に、共培養中にｈＭＳＣ指示層に付着した細胞を再懸濁することである。
【０１５１】
【表６】
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【０１５２】
収穫
【０１５３】
修正を伴うＣＥＳ収穫タスク
【０１５４】
【表７】
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【０１５５】
当業者であれば、本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の方法及び構造に対して種々の変形及び変更を行えることは理解できよう。従って、本発明は、上記の特定の実施形態又は実施例に限定されないと理解されるべきである。むしろ、本発明は、以下の請求項及びそれらの等価物の範囲内において、変形形態及び変更形態をも含むことが意図されている。
【０１５６】
本発明の実施形態及び適用例が示され説明されてきたが、本発明は、上記した構成に制限されないと理解されるべきである。当業者に明らかな種々の変形、変更等は、本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の構成、動作、また方法及びシステムにおける詳細において行うことが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
2019517247.tif 000020
【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
2019517247.tif 000024
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2019517247.tif 000027
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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