(57)【要約】本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物であって、そのゲノムが、非ヒト動物に投与されたときのヒト赤血球の生存が延長されるように、前記非ヒト動物のマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含む、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物が提供される。そのような遺伝子改変免疫不全非ヒト動物において想定される治療剤の効果をアッセイする方法が本発明により提供される。一局面では、上記遺伝子改変免疫不全非ヒト動物は、Ｌｙｓｔｎｕｌｌ免疫不全マウスである。
2019532620.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変免疫不全非ヒト動物であって、そのゲノムが、前記非ヒト動物に投与されたときのヒト赤血球の生存が延長されるように、前記非ヒト動物のマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含む、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項２】
前記非ヒト動物は、そのゲノムが、前記非ヒト動物のマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含む、ＮＲＧマウス、ＮＳＧマウスまたはＮＯＧマウスである、請求項１に記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項３】
前記遺伝子改変は、前記非ヒト動物が機能的リソソーム輸送レギュレータータンパク質を発現せず、前記非ヒト動物のマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させるようなリソソーム輸送レギュレーター遺伝子の変異である、請求項１または２に記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項４】
前記非ヒト動物が、Ｌｙｓｔｎｕｌｌ免疫不全マウスである、請求項１、２または３に記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項５】
前記非ヒト動物が、ベージュ変異Ｌｙｓｔｂｇについてホモ接合であるＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウスである、請求項４に記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項６】
前記非ヒト動物が、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／Ｌｙｓｔ＜ｅｍ１Ｍｖｗ＞／Ｓｚ（ＮＳＧ  Ｌｙｓｔノックアウト）マウスである、請求項４に記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項７】
前記非ヒト動物が、ベージュ変異Ｌｙｓｔｂｇについてホモ接合であるＮＯＤ．Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍ１ＭｏｍＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウスである、請求項４に記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項８】
前記非ヒト動物が免疫不全マウスであり、前記遺伝子改変は、前記マウスがヒトＣＤ４７タンパク質を発現するようにヒトＣＤ４７をコードする導入遺伝子を含み、かつ前記マウスが機能的マウスＣＤ４７タンパク質を発現せず、前記マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させるようにマウスＣＤ４７遺伝子の変異をさらに含む、請求項１または２に記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項９】
前記非ヒト動物がＮＳＧマウスであり、前記遺伝子改変は、ヒトＣＤＣ４７をコードする導入遺伝子を含み、かつ前記非ヒト動物が機能的マウスＣＤ４７タンパク質を発現せず、前記非ヒト動物のマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させるようにマウスＣＤ４７遺伝子の変異をさらに含む、請求項８に記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項１０】
前記非ヒト動物がＮＲＧマウスであり、前記遺伝子改変は、ヒトＣＤＣ４７をコードする導入遺伝子を含み、かつ前記非ヒト動物が機能的マウスＣＤ４７タンパク質を発現せず、前記非ヒト動物のマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させるようにマウスＣＤ４７遺伝子の変異をさらに含む、請求項８に記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項１１】
前記非ヒト動物がＮＯＧマウスであり、前記遺伝子改変は、ヒトＣＤＣ４７をコードする導入遺伝子を含み、かつ前記非ヒト動物が機能的マウスＣＤ４７タンパク質を発現せず、前記非ヒト動物のマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させるようにマウスＣＤ４７遺伝子の変異をさらに含む、請求項８に記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項１２】
前記非ヒト動物が、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ＞Ｃｄ４７＜ｔｍ１Ｆｐｌ＞Ｉｌ２ｒｇ＜ｔｍ１Ｗｊｌ＞Ｔｇ（ＣＤ４７）２Ｓｚ／Ｓｚ（ＮＳＧ  Ｃｄ４７  ＫＯヒトＣＤ４７Ｔｇ）マウスである、請求項８に記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項１３】
前記非ヒト動物がマウスであり、前記マウスが、ヌクレオシドアナログと組み合わせると前記非ヒト動物のマクロファージを欠損させる単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼタンパク質を発現するように、前記遺伝子改変が単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼをコードする導入遺伝子を含む、請求項１または２に記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項１４】
前記ヌクレオシドアナログが、ガンシクロビル、アシクロビルまたはその組み合わせである、請求項１３に記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項１５】
前記遺伝子改変免疫不全非ヒト動物の前記ゲノムにおいてＬｙｓｔ遺伝子のエキソン５からの２５ｂｐ配列：ＧＡＧＣＣＧＧＴＡＧＣＴＴＴＧＧＴＴＣＡＡＣＧＧＡ（配列番号１）の欠失を含む、請求項１、２または３のいずれかに記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項１６】
前記動物がマウスである、請求項１から１５のいずれかに記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項１７】
前記非ヒト動物の血液系に投与されるヒト赤血球をさらに含む、請求項１から１６のいずれかに記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項１８】
生着したヒト造血細胞をさらに含む、請求項１から１７のいずれかに記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項１９】
前記非ヒト動物において、ヒト赤血球が、そのゲノムが前記遺伝子改変を含まない同じタイプの免疫不全非ヒト動物よりも長く生存する、請求項１から１８のいずれかに記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項２０】
ヒト赤血球が感染因子に感染している、請求項１から１９のいずれかに記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項２１】
ヒト赤血球に感染可能な感染因子の投与をさらに含む、請求項１から２０のいずれかに記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項２２】
前記感染因子が、プラスモディウム属寄生生物である、請求項２０または２１に記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項２３】
前記感染因子が、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）である、請求項２０、２１または２２に記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項２４】
前記感染因子が、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ（Ｐ．ｏｖａｌｅ）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）である、請求項２０、２１または２２に記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項２５】
前記ヒト赤血球が、個々のヒトまたはヒト個体の集団に由来しており、前記個々のヒトまたはヒト個体の集団が鎌状赤血球貧血を有する、請求項１から１９のいずれかに記載の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項２６】
想定される治療剤の効果をアッセイする方法であって、
請求項１７から２５のいずれか一項に記載のヒト赤血球を含む遺伝子改変免疫不全非ヒト動物に、所定量の前記想定される治療剤を投与するステップ、および前記想定される治療剤の効果を測定するステップ
を包含する、方法。
【請求項２７】
実質的に本明細書に記載されるまたは示される遺伝子改変免疫不全非ヒト動物。
【請求項２８】
実質的に本明細書に記載されるまたは示される想定される治療剤の効果をアッセイする方法。
【請求項２９】
実質的に本明細書に記載されるまたは示される想定される治療処置の効果をアッセイする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって授与された補助金番号第Ｒ２４  ＯＤＯ１８２５９のもとの政府支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の参照
本願は、２０１６年８月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／３７３，６７１号の優先権を主張し、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示の一般的態様は、免疫不全遺伝子改変動物におけるヒト赤血球の評価のための方法および組成物に関する。具体的な態様では、免疫不全遺伝子改変マウスにおけるヒト赤血球の評価のための方法および組成物が提供される。
【背景技術】
【０００４】
世界中の多くの人々、特にアフリカ系出身者が、マラリア、鎌状赤血球貧血および再生不良性貧血などの血液障害に罹っている。現在では、３２億人がマラリア伝染のリスクがある地域で暮らしており、３００万人が鎌状赤血球形質を有する（ＣＤＣ２０１６年）。これらのおよび他の血液障害の先進的処置は限られており、想定される医薬治療法および他の処置のアッセイのための非ヒト動物モデルの必要性が引き続き存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物であって、そのゲノムが、前記非ヒト動物に投与されたときのヒト赤血球の生存が延長されるように、前記非ヒト動物のマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含む、動物が提供される。
【０００６】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全マウスであって、そのゲノムが、マウスに投与されたときのヒト赤血球の生存が延長されるように、前記マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含む遺伝子改変免疫不全マウスが提供される。
【０００７】
本発明の態様によれば、遺伝子改変ＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧマウスであって、そのゲノムが、マウスに投与されたときのヒト赤血球の生存が延長されるように、前記マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含む遺伝子改変ＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧマウスが提供される。
【０００８】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物であって、そのゲノムが、非ヒト動物に投与されたときのヒト赤血球の生存が延長されるように、前記非ヒト動物のマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含み、ここで遺伝子改変は、非ヒト動物が機能的リソソーム輸送レギュレーター（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）タンパク質を発現せず、非ヒト動物のマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させるようなリソソーム輸送レギュレーター（Ｌｙｓｔ）遺伝子の変異である、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物が提供される。
【０００９】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全マウスであって、そのゲノムが、マウスに投与されたときのヒト赤血球の生存が延長されるように、前記マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含み、ここで遺伝子改変は、マウスが機能的リソソーム輸送レギュレータータンパク質を発現せず、マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させるようなマウスリソソーム輸送レギュレーター遺伝子の変異である、遺伝子改変免疫不全マウスが提供される。
【００１０】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全マウスであって、そのゲノムが、マウスに投与されたときのヒト赤血球の生存が延長されるように、前記マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含み、ここで遺伝子改変は、マウスが機能的リソソーム輸送レギュレータータンパク質を発現せず、マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させるようなマウスリソソーム輸送レギュレーター遺伝子の変異であり、ここで変異は、遺伝子改変免疫不全マウスのゲノムにおいてＬｙｓｔ遺伝子のエキソン５からの２５ｂｐ配列：ＧＡＧＣＣＧＧＴＡＧＣＴＴＴＧＧＴＴＣＡＡＣＧＧＡ（配列番号１）の欠失を含む、遺伝子改変免疫不全マウスが提供される。
【００１１】
本発明の態様によれば、遺伝子改変ＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧマウスであって、そのゲノムが、遺伝子改変ＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧに投与されたときのヒト赤血球の生存が延長されるように、前記遺伝子改変ＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧマウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含み、ここで遺伝子改変は、遺伝子改変ＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧが機能的リソソーム輸送レギュレータータンパク質を発現せず、遺伝子改変ＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させるようなマウスリソソーム輸送レギュレーター（Ｌｙｓｔ）遺伝子の変異である、遺伝子改変ＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧマウスが提供される。
【００１２】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全マウスは、Ｌｙｓｔｎｕｌｌ免疫不全マウスである。
【００１３】
本発明の態様によれば、遺伝子改変ＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧマウスはＬｙｓｔｎｕｌｌＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧマウスである。
【００１４】
本発明の態様によれば、遺伝子改変ＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧマウスは、ベージュ（ｂｅｉｇｅ）変異Ｌｙｓｔｂｇについてホモ接合であるＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧマウスである。
【００１５】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全マウスは、ベージュ変異Ｌｙｓｔｂｇについてホモ接合であるＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウスである。
【００１６】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全マウスは、ベージュ変異Ｌｙｓｔｂｇについてホモ接合であるＮＯＤ．Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍ１ＭｏｍＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウスである。
【００１７】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全マウスは、ベージュ変異Ｌｙｓｔｂｇについてホモ接合であるＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃマウスである。
【００１８】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全マウスは、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／Ｌｙｓｔ＜ｅｍ１Ｍｖｗ＞／Ｓｚ（ＮＳＧ  Ｌｙｓｔノックアウト）マウスである。
【００１９】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物であって、そのゲノムが、非ヒト動物に投与されたときのヒト赤血球の生存が延長されるように、前記非ヒト動物のマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含み、ここで遺伝子改変は、非ヒト動物がヒトＣＤ４７タンパク質を発現するようにヒトＣＤ４７をコードする導入遺伝子を含み、内因性ＣＤ４７が発現されず、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物のマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させるようにその内因性ＣＤ４７遺伝子の変異をさらに含む、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物が提供される。
【００２０】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全マウスであって、そのゲノムが、遺伝子改変免疫不全マウスに投与されたときのヒト赤血球の生存が延長されるように、前記マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含み、ここで遺伝子改変は、マウスがヒトＣＤ４７タンパク質を発現するようにヒトＣＤ４７をコードする導入遺伝子を含み、さらに、マウスＣＤ４７が発現されず、遺伝子改変免疫不全マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させるようにマウスＣＤ４７遺伝子の変異を含む、遺伝子改変免疫不全マウスが提供される。
【００２１】
本発明の態様によれば、遺伝子改変ＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧマウスであって、そのゲノムが、遺伝子改変ＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧマウスに投与されたときのヒト赤血球の生存が延長されるように、前記ＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含み、ここで遺伝子改変は、遺伝子改変ＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧマウスがヒトＣＤ４７タンパク質を発現するようにヒトＣＤ４７をコードする導入遺伝子を含み、さらに、マウスＣＤ４７が発現されず、遺伝子改変ＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧマウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させるようにマウスＣＤ４７遺伝子の変異を含む、遺伝子改変ＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧマウスが提供される。
【００２２】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全マウスは、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ＞Ｃｄ４７＜ｔｍ１Ｆｐｌ＞Ｉｌ２ｒｇ＜ｔｍ１Ｗｊｌ＞Ｔｇ（ＣＤ４７）２Ｓｚ／Ｓｚ（ＮＳＧ  Ｃｄ４７  ＫＯヒトＣＤ４７Ｔｇ）マウスである。
【００２３】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物であって、そのゲノムが、非ヒト動物に投与されたときのヒト赤血球の生存が延長されるように、前記非ヒト動物のマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含み、ここで遺伝子改変は、マウスが、ヌクレオシドアナログと組み合わせると非ヒト動物のマクロファージを欠損させる単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼタンパク質を発現するように、単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼをコードする導入遺伝子を含む、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物が提供される。
【００２４】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全マウスであって、そのゲノムが、遺伝子改変免疫不全マウスに投与されたときのヒト赤血球の生存が延長されるように、前記遺伝子改変免疫不全マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含み、ここで遺伝子改変は、遺伝子改変免疫不全マウスが、ヌクレオシドアナログと組み合わせると遺伝子改変免疫不全マウスのマクロファージを欠損させる単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼタンパク質を発現するように、単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼをコードする導入遺伝子を含む、遺伝子改変免疫不全マウスが提供される。ガンシクロビル、アシクロビルまたはその組み合わせなどのヌクレオシドアナログを使用することが可能である。
【００２５】
本発明の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物は、腹腔内（ＩＰ）または静脈内（ＩＶ）投与などにより、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物の血液系に投与されるヒト赤血球をさらに含む。
【００２６】
本発明の遺伝子改変免疫不全マウスは、腹腔内（ＩＰ）または静脈内（ＩＶ）投与などにより、遺伝子改変免疫不全マウスの血液系に投与されるヒト赤血球をさらに含む。
【００２７】
任意選択で、ヒト造血細胞（ＨＳＣ）は、遺伝子改変免疫不全マウスにおいてヒト赤血球が生成されるように、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに投与される。
【００２８】
ヒト赤血球は、そのゲノムが遺伝子改変を含まない同じタイプの免疫不全マウスなどの免疫不全非ヒト動物よりも、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスなどの遺伝子改変免疫不全非ヒト動物において長く生存する。例えば、ヒト赤血球は、そのゲノムが遺伝子改変を含まないＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧマウスよりも、本発明の遺伝子改変ＮＳＧ、ＮＲＧ、またはＮＯＧマウスにおいて長く生存する。
【００２９】
任意選択で、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスなどの、本発明の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物に存在するヒト赤血球は、感染因子に感染している。
【００３０】
任意選択で、ヒト赤血球に感染可能な感染因子は、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスなどの、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物に投与される。特定の態様によれば、感染因子は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ（Ｐ．ｏｖａｌｅ）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）などのプラスモディウム属寄生生物である。
【００３１】
任意選択で、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスなどの、本発明の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物に投与されるヒト赤血球は、個々のヒトまたはヒト個体の集団に由来しており、個々のヒトまたはヒト個体の集団は鎌状赤血球貧血を有する。
【００３２】
本発明の態様によれば、想定される治療剤の効果をアッセイする方法であって、ヒト赤血球を含む本発明の遺伝子改変免疫不全非ヒト動物に、所定量の想定される治療剤を投与すること、および想定される治療剤の効果を測定することを含む方法が提供される。
【００３３】
本発明の態様によれば、想定される治療剤の効果をアッセイする方法であって、ヒト赤血球を含む本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに、所定量の想定される治療剤を投与すること、および想定される治療剤の効果を測定することを含む方法が提供される。
【００３４】
ある特定の遺伝子改変免疫不全マウス系統について使用される略語：
ＭＤ１：ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／Ｌｙｓｔ＜ｅｍ１Ｍｖｗ＞／Ｓｚ（マウスＬｙｓｔ遺伝子からの配列番号１の欠失によりＬｙｓｔがノックアウトされたＮＳＧマウス系統）
ＭＤ２：ＮＳＧ  ＣＤ４７  ＫＯ  Ｔｇ（ｈＣＤ４７）（マウスＣＤ４７がノックアウトされヒトＣＤ４７をコードする導入遺伝子を含むＮＳＧマウス系統）
ＭＤ３：ＮＳＧ  ＣＳＦ１ｒ−ＨＴＫ（ＣＳＦ１ｒプロモーターがヘルペスチミジンキナーゼの発現を駆動する導入遺伝子を含むＮＳＧマウス系統）
ＭＤ４：Ｂ６．１２９Ｓ−Ｒａｇ１＜ｔｍ１Ｍｏｍ＞ＣＤ４７  ＫＯ  Ｉｌ２ｒｇ＜ｔｍ１Ｗｊｌ＞／Ｓｚ（マウスＩＬ２ｒｇがノックアウトされマウスＣＤ４７がノックアウトされたＢＬ／６マウス系統で、ＢＬ／６  Ｒａｇ１ｎｕｌｌＣＤ４７  ＫＯ  ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌとも呼ばれる）
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ＮＳＧ対照マウスと比較したＮＳＧ  Ｌｙｓｔ（ＭＤ１）ノックアウト（ＫＯ）マウスでのヒト赤血球（ＲＢＣ）の生存を示し、ヒト赤血球の投与後２４時間で免疫不全遺伝子改変マウスにおいて生き延びたヒト赤血球の数に２倍の増加があることを実証するグラフである。
【００３６】
【図２】図２は、ＮＳＧ対照マウスと比較したＮＳＧ  ＨＳＶ−１−ｔｋトランスジェニック（Ｔｇ）マウスからの結果を示し、ヒト赤血球の投与後２４時間までに免疫不全遺伝子改変マウスにおいて生き延びたヒト赤血球の数が有意に高いことを実証するグラフである。
【００３７】
【図３】図３は、ＮＳＧ対照マウスと比較したＢＬ／６  ＲａｇガンマＭＤ４マウスからの結果を示すグラフである。
【００３８】
【図４】図４は、ＮＳＧ対照マウスと比較したＮＳＧ  ＭＤ２マウスからの結果を示し、ヒト赤血球の投与後２４時間での免疫不全遺伝子改変マウスにおいて生き延びたヒト赤血球の数の増加が２倍よりも多く、ヒト赤血球の投与後４８、７２および９６時間でのＮＳＧ対照マウスと比較したＮＳＧ  ＭＤ２マウスにおける有意に多い数でのヒト赤血球の生存を実証するグラフである。
【００３９】
【図５】図５は、ＮＳＧ対照マウスと比較した本発明のいくつかの異なる遺伝子改変免疫不全系統におけるヒトＲＢＣ生存を比較した結果を示し、ＮＳＧ対照マウスと比較した免疫不全遺伝子改変ＭＤ１およびＭＤ２マウスにおいて生き延びたヒト赤血球の数の増加を実証するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本明細書で使用される科学用語および専門用語は、当業者が一般に理解している意味を有することが意図されている。そのような用語は、Ｊ．  ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；第３版、２００１年；Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ編、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；第５版、２００２年；Ｂ．  Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第４版、Ｇａｒｌａｎｄ、２００２年；Ｄ．Ｌ．  ＮｅｌｓｏｎおよびＭ．Ｍ．  Ｃｏｘ、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ、２００４年；Ａ．  Ｎａｇｙ、Ｍ．  Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ、Ｋ．  Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ、Ｒ．  Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；２００２年１２月１５日、ＩＳＢＮ−１０：  ０８７９６９５９１９；Ｋｕｒｓａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ（編）、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２００２年；１８５巻、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＩＳＢＮ：  ９７８０４７０１５１８０８；Ｃｈｕ，  Ｅ．およびＤｅｖｉｔａ，  Ｖ．Ｔ．編、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｄｒｕｇ  Ｍａｎｕａｌ、Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２００５年；Ｊ．Ｍ．  Ｋｉｒｋｗｏｏｄら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第４版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｇｒｏｕｐ、２００１年；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、第２１版、２００５年；Ｌ．Ｖ．  Ａｌｌｅｎ，  Ｊｒ．ら、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第８版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ：  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００４年；ならびにＬ．  Ｂｒｕｎｔｏｎら、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、第１２版、２０１１年を例示的に含む種々の標準参考文献において定義され、文脈中で使用されていることが見出される。
【００４１】
単数の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、そうではないことが明確に述べられていない限り、または文脈からそうではないことが明白に示されていない限り、限定的であることを意図しておらず、複数の指示物を含む。
【００４２】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物であって、そのゲノムが、非ヒト動物のマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含む、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物が提供される。遺伝子改変免疫不全非ヒト動物は、本発明の態様によるヒト赤血球をさらに含む。遺伝子改変免疫不全非ヒト動物の血液系に投与されるヒト赤血球は、そのゲノムが遺伝子改変を含まない同じタイプの免疫不全非ヒト動物よりも、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物において長く生存する。
【００４３】
用語「免疫不全非ヒト動物」は、Ｔ細胞およびＢ細胞などの機能的免疫細胞の欠如；ＤＮＡ修復欠陥；リンパ球上の抗原特異的受容体をコードする遺伝子の再配列の欠陥；ならびにＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＡなどの免疫機能分子の欠如のうちの１つまたは複数を特徴とする非ヒト動物を指す。
【００４４】
本発明の態様によれば、本発明の態様に従って提供されるそのゲノムが非ヒト動物のマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含む遺伝子改変免疫不全非ヒト動物は、マウスである。一方で、本明細書の記載は主に、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物がマウスである本発明の態様に言及するが、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物は、ラット、スナネズミ、モルモット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ヒツジ、または非ヒト霊長類などの哺乳動物でも可能である。
【００４５】
本明細書で使用される語句「遺伝子改変免疫不全マウス」は、そのゲノムが、免疫不全マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含む、免疫不全マウスを指す。
【００４６】
語句「マクロファージを欠損する」は、免疫不全マウスのマクロファージを欠損させる遺伝子変異を持たない匹敵する免疫不全マウスに存在するマクロファージの数と比較して、マクロファージの数が低減していることを指す。
【００４７】
用語「免疫不全マウス」は、Ｔ細胞およびＢ細胞などの機能的免疫細胞の欠如；ＤＮＡ修復欠陥；リンパ球上の抗原特異的受容体をコードする遺伝子の再配列の欠陥；ならびにＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＡなどの免疫機能分子の欠如のうちの１つまたは複数を特徴とするマウスを指す。免疫不全マウスは、Ｒａｇ１およびＲａｇ２などの免疫機能に関与している遺伝子の１つまたは複数の欠陥を特徴とすることが可能である（Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒ，  Ｍ．Ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８巻：１５１７〜１５２３頁、１９９０年；およびＳｃｈａｔｚ，  Ｄ．  Ｇ．ら、Ｃｅｌｌ、５９巻：１０３５〜１０４８頁、１９８９年）。免疫不全マウスは、マウスにおいて異常な免疫機能をもたらすこれらのまたは他の欠陥のいずれかを有していてもよい。
【００４８】
特に有用な免疫不全マウス系統は、以下の通りである：ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／Ｓｚｊ、これは、ＮＯＤｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスと一般に呼ばれ、Ｓｈｕｌｔｚ  ＬＤら、２００５年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７４巻：６４７７〜８９頁に詳細に記載されている；ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍ１ＭｏｍＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／Ｓｚｊ、Ｓｈｕｌｔｚ  ＬＤら、２００８年、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５４巻（２号）：２７０〜８４頁、ＮＲＧマウスと一般に呼ばれている；およびＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃ、これは、Ｉｔｏ，  Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １００巻、３１７５〜３１８２頁（２００２年）に詳細に記載され、ＮＯＧマウスと一般に呼ばれている。
【００４９】
用語「重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）」は、Ｔ細胞の非存在およびＢ細胞機能の欠如を特徴とする状態を指す。
【００５０】
ＳＣＩＤの一般形態は、ＩＬ２ＲＧ遺伝子におけるガンマ鎖遺伝子変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（−）を特徴とするＸ連鎖ＳＣＩＤ；ならびにＪａｋ３遺伝子変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（−）、ＡＤＡ遺伝子変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（−）ＮＫ（−）、ＩＬ−７Ｒアルファ鎖変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（＋）、ＣＤ３デルタまたはエプシロン変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（＋）、ＲＡＧ１／ＲＡＧ２変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（−）ＮＫ（＋）、アルテミス遺伝子変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（−）ＮＫ（＋）、ＣＤ４５遺伝子変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（＋）を特徴とする常染色体劣性ＳＣＩＤを含む。
【００５１】
さらなる態様では、遺伝子改変免疫不全マウスはＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニット（Ｐｒｋｄｃ）をコードするその内因性遺伝子に欠陥を有し、それにより、マウスは欠陥内因性ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニットおよび／もしくは減少した量の内因性ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニットを発現する、またはマウスは内因性ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニットを全く発現しないこともある。免疫不全マウスは任意選択で、機能的内因性Ｐｒｋｄｃ遺伝子を欠くように、Ｐｒｋｄｃ  ｎｕｌｌであり得る。
【００５２】
本発明の態様による遺伝子改変マウスは、重症複合免疫不全変異（Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ）を有し、これは一般にｓｃｉｄ変異と呼ばれる。ｓｃｉｄ変異は周知であり、Ｂｏｓｍａら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２９巻：５４〜５６頁、１９８９年に記載されるように、マウス第１６染色体上に位置している。ｓｃｉｄ変異についてホモ接合であるマウスは、機能的Ｔ細胞およびＢ細胞の非存在、リンパ球減少症、低グロブリン血症および正常な造血性微小環境を特徴とする。ｓｃｉｄ変異は、例えば、ＰＣＲまたはフローサイトメトリーなどの周知の方法を使用して、ｓｃｉｄ変異についてのマーカーの検出により検出可能である。
【００５３】
本発明の態様による遺伝子改変マウスは、ＩＬ２受容体ガンマ鎖欠損を有する。用語「ＩＬ２受容体ガンマ鎖欠損」は、減少したＩＬ２受容体ガンマ鎖を指す。減少したＩＬ２受容体ガンマ鎖は遺伝子欠失または変異に起因する可能性がある。減少したＩＬ２受容体ガンマ鎖は、例えば、周知の方法を使用する、ＩＬ２受容体ガンマ鎖欠失もしくは変異の検出および／または減少したＩＬ２受容体ガンマ鎖発現の検出により検出可能である。
【００５４】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全ＮＳＧマウスであって、そのゲノムが、マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含む、遺伝子改変免疫不全ＮＳＧマウスが提供される。
【００５５】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全ＮＲＧマウスであって、そのゲノムが、マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含む、遺伝子改変免疫不全ＮＲＧマウスが提供される。
【００５６】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全ＮＯＧマウスであって、そのゲノムが、マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含む、遺伝子改変免疫不全ＮＯＧマウスが提供される。
【００５７】
マクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損する免疫不全マウスを生産する遺伝子改変
【００５８】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全マウスであって、遺伝子改変は、マウスが機能的リソソーム輸送レギュレータータンパク質を発現せず、非ヒト動物のマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させるようなリソソーム輸送レギュレーター（Ｌｙｓｔ）遺伝子の変異である、遺伝子改変免疫不全マウスが提供される。遺伝子改変免疫不全非ヒト動物は本発明の態様によるヒト赤血球をさらに含む。遺伝子改変免疫不全非ヒト動物の血液系に投与されるヒト赤血球は、そのゲノムが遺伝子改変を含まない同じタイプの免疫不全非ヒト動物よりも、遺伝子改変免疫不全非ヒト動物において長く生存する。Ｌｙｓｔ遺伝子はマウスのＣｈｒ１３：１３５９０４０９−１３７７７４４０ｂｐ、＋鎖に位置しており、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、ラット、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、およびカエルを含む数多くの種で保存されている。
【００５９】
本発明の態様によれば、Ｌｙｓｔ遺伝子座に１つまたは複数の自然に起こるまたは誘導された変異を有し、マウスが機能的リソソーム輸送レギュレータータンパク質を発現せず、マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変免疫不全マウスが提供される。遺伝子改変免疫不全マウスは、本発明の態様によるヒト赤血球をさらに含む。遺伝子改変免疫不全マウスの血液系に投与されるヒト赤血球は、そのゲノムが遺伝子改変を含まない同じタイプの免疫不全マウスよりも、遺伝子改変免疫不全マウスにおいて長く生存する。
【００６０】
本発明の態様によれば、Ｌｙｓｔ遺伝子座のエキソン５に欠失を有し、マウスが機能的リソソーム輸送レギュレータータンパク質を発現せず、マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変免疫不全マウスが提供される。遺伝子改変免疫不全マウスは、本発明の態様によるヒト赤血球をさらに含む。遺伝子改変免疫不全マウスの血液系に投与されるヒト赤血球は、そのゲノムが遺伝子改変を含まない同じタイプの免疫不全マウスよりも、遺伝子改変免疫不全マウスにおいて長く生存する。
【００６１】
本発明の態様によれば、Ｌｙｓｔ遺伝子座のエキソン５に２５ｂｐの欠失を有し、マウスが機能的リソソーム輸送レギュレータータンパク質を発現せず、マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変免疫不全マウスが提供される。本発明の特定の態様によれば、２５ｂｐの欠失は、ヌクレオチド配列ＧＡＧＣＣＧＧＴＡＧＣＴＴＴＧＧＴＴＣＡＡＣＧＧＡ（配列番号１）を有する、Ｌｙｓｔ遺伝子座のエキソン５のゲノムＤＮＡの２５ｂｐのセグメントの欠失である。遺伝子改変免疫不全マウスは、本発明の態様によるヒト赤血球をさらに含む。遺伝子改変免疫不全マウスの血液系に投与されるヒト赤血球は、そのゲノムが遺伝子改変を含まない同じタイプの免疫不全マウスよりも、遺伝子改変免疫不全マウスにおいて長く生存する。
【００６２】
本発明の態様によれば、マウスがＬｙｓｔｎｕｌｌであるように、Ｌｙｓｔ遺伝子座に１つまたは複数の自然に起こるまたは誘導された変異を有し、マウスが機能的リソソーム輸送レギュレータータンパク質を発現せず、マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変免疫不全マウスが提供される。遺伝子改変免疫不全マウスは、本発明の態様によるヒト赤血球をさらに含む。遺伝子改変免疫不全マウスの血液系に投与されるヒト赤血球は、そのゲノムが遺伝子改変を含まない同じタイプの免疫不全マウスよりも、遺伝子改変免疫不全マウスにおいて長く生存する。
【００６３】
本発明の態様によれば、ベージュ変異Ｌｙｓｔｂｇについてホモ接合であり、マウスが機能的リソソーム輸送レギュレータータンパク質を発現せず、マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変免疫不全マウスが提供される。Ｌｙｓｔｂｇ再変異（ｒｅｍｕｔａｔｉｏｎ）（Ｌｙｓｔｂｇ−Ｊ）はジャクソンラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）でＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統において自然に起こった（Ｊ：５３１１）。この対立遺伝子はＬｙｓｔｂｇを用いた非相補的試験により定義される。これは、タンパク質のカルボキシ末端近くのコドン３７４１でイソロイシン欠失を引き起こすＬｙｓｔのエキソン５４での３ｂｐ欠失の結果である。この欠失はＷＤ４０ドメインに影響を及ぼす。遺伝子改変免疫不全マウスは、本発明の態様によるヒト赤血球をさらに含む。遺伝子改変免疫不全マウスの血液系に投与されるヒト赤血球は、そのゲノムが遺伝子改変を含まない同じタイプの免疫不全マウスよりも、遺伝子改変免疫不全マウスにおいて長く生存する。
【００６４】
本発明の態様によれば、ベージュ変異Ｌｙｓｔｂｇについてホモ接合であり、マウスが機能的リソソーム輸送レギュレータータンパク質を発現せず、マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウスが提供される。遺伝子改変免疫不全マウスは、本発明の態様によるヒト赤血球をさらに含む。遺伝子改変免疫不全マウスの血液系に投与されるヒト赤血球は、そのゲノムが遺伝子改変を含まない同じタイプの免疫不全マウスよりも、遺伝子改変免疫不全マウスにおいて長く生存する。
【００６５】
本発明の態様によれば、マウスが機能的リソソーム輸送レギュレータータンパク質を発現せず、マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／Ｌｙｓｔ＜ｅｍ１Ｍｖｗ＞／Ｓｚ（ＮＳＧ  Ｌｙｓｔノックアウト−ＭＤ１）マウスが提供される。遺伝子改変免疫不全マウスは、本発明の態様によるヒト赤血球をさらに含む。遺伝子改変免疫不全マウスの血液系に投与されるヒト赤血球は、そのゲノムが遺伝子改変を含まない同じタイプの免疫不全マウスよりも、遺伝子改変免疫不全マウスにおいて長く生存する。
【００６６】
本発明の態様によれば、ベージュ変異Ｌｙｓｔｂｇについてホモ接合であり、マウスが機能的リソソーム輸送レギュレータータンパク質を発現せず、マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍ１ＭｏｍＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウスが提供される。遺伝子改変免疫不全マウスは、本発明の態様によるヒト赤血球をさらに含む。遺伝子改変免疫不全マウスの血液系に投与されるヒト赤血球は、そのゲノムが遺伝子改変を含まない同じタイプの免疫不全マウスよりも、遺伝子改変免疫不全マウスにおいて長く生存する。
【００６７】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全マウスであって、遺伝子改変が、マウスがヒトＣＤ４７タンパク質を発現するようにヒトＣＤ４７をコードする導入遺伝子を含み、マウスが機能的マウスＣＤ４７タンパク質を発現せず、マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させるようにマウスのゲノムにマウスＣＤ４７遺伝子の変異をさらに含む、遺伝子改変免疫不全マウスが提供される。遺伝子改変免疫不全マウスは、本発明の態様によるヒト赤血球をさらに含む。遺伝子改変免疫不全マウスの血液系に投与されるヒト赤血球は、そのゲノムが遺伝子改変を含まない同じタイプの免疫不全マウスよりも、遺伝子改変免疫不全マウスにおいて長く生存する。
【００６８】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全ＮＳＧマウスであって、遺伝子改変が、マウスがヒトＣＤ４７タンパク質を発現するようにヒトＣＤ４７をコードする導入遺伝子を含み、マウスが機能的マウスＣＤ４７タンパク質を発現せず、マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させるようにマウスのゲノムにマウスＣＤ４７遺伝子の変異をさらに含む、遺伝子改変免疫不全ＮＳＧマウスが提供される。遺伝子改変免疫不全マウスは、本発明の態様によるヒト赤血球をさらに含む。遺伝子改変免疫不全マウスの血液系に投与されるヒト赤血球は、そのゲノムが遺伝子改変を含まない同じタイプの免疫不全マウスよりも、遺伝子改変免疫不全マウスにおいて長く生存する。
【００６９】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全ＮＲＧマウスであって、遺伝子改変が、マウスがヒトＣＤ４７タンパク質を発現するようにヒトＣＤ４７をコードする導入遺伝子を含み、マウスが機能的マウスＣＤ４７タンパク質を発現せず、マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させるようにマウスのゲノムにマウスＣＤ４７遺伝子の変異をさらに含む、遺伝子改変免疫不全ＮＲＧマウスが提供される。遺伝子改変免疫不全マウスは、本発明の態様によるヒト赤血球をさらに含む。遺伝子改変免疫不全マウスの血液系に投与されるヒト赤血球は、そのゲノムが遺伝子改変を含まない同じタイプの免疫不全マウスよりも、遺伝子改変免疫不全マウスにおいて長く生存する。
【００７０】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全ＮＯＧマウスであって、遺伝子改変が、マウスがヒトＣＤ４７タンパク質を発現するようにヒトＣＤ４７をコードする導入遺伝子を含み、マウスが機能的マウスＣＤ４７タンパク質を発現せず、マウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させるようにマウスのゲノムにマウスＣＤ４７遺伝子の変異をさらに含む、遺伝子改変免疫不全ＮＯＧマウスが提供される。遺伝子改変免疫不全マウスは、本発明の態様によるヒト赤血球をさらに含む。遺伝子改変免疫不全マウスの血液系に投与されるヒト赤血球は、そのゲノムが遺伝子改変を含まない同じタイプの免疫不全マウスよりも、遺伝子改変免疫不全マウスにおいて長く生存する。
【００７１】
本発明の態様によれば、遺伝子改変免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ＞Ｃｄ４７＜ｔｍ１Ｆｐｌ＞Ｉｌ２ｒｇ＜ｔｍ１Ｗｊｌ＞Ｔｇ（ＣＤ４７）２Ｓｚ／Ｓｚ（ＮＳＧ  Ｃｄ４７  ＫＯヒトＣＤ４７Ｔｇ）マウスが提供される。遺伝子改変免疫不全マウスは、本発明の態様によるヒト赤血球をさらに含む。遺伝子改変免疫不全マウスの血液系に投与されるヒト赤血球は、そのゲノムが遺伝子改変を含まない同じタイプの免疫不全マウスよりも、遺伝子改変免疫不全マウスにおいて長く生存する。
【００７２】
本発明の態様によれば、マウスが、ヌクレオシドアナログと組み合わせるとマウスのマクロファージを欠損させる単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼタンパク質を発現するように、遺伝子改変が単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼをコードする導入遺伝子を含む、遺伝子改変免疫不全マウスが提供される。単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼタンパク質と組み合わせた、マクロファージに毒性である任意のヌクレオシドアナログが使用可能であり、ガンシクロビル、アシクロビルまたはその組み合わせにより例示されるがこれらに限定されない。遺伝子改変免疫不全マウスは、本発明の態様によるヒト赤血球をさらに含む。遺伝子改変免疫不全マウスの血液系に投与されるヒト赤血球は、そのゲノムが遺伝子改変を含まない同じタイプの免疫不全マウスよりも、遺伝子改変免疫不全マウスにおいて長く生存する。
【００７３】
種々の方法のいずれかを使用して、そのゲノムが遺伝子改変を含む、マウスなどの遺伝子改変免疫不全非ヒト動物を生産することが可能である。遺伝子改変は、これらに限定されないが、化学的変異誘発、照射、相同組換えおよびアンチセンスＲＮＡのトランスジェニック発現などの遺伝子操作の標準的な方法を使用して生産される。そのような技法は当技術分野において周知であり、前核マイクロインジェクションおよび胚性幹細胞の形質転換をさらに含むがこれらに限定されない。そのゲノムが使用可能な破壊された遺伝子を含む遺伝子改変動物を生成するための方法は、Ｊ．  Ｐ．  ＳｕｎｄｂｅｒｇおよびＴ．  Ｉｃｈｉｋｉ編、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍｉｃｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；２００６年；Ｍ．  Ｈ．  ＨｏｆｋｅｒおよびＪ．  ｖａｎ  Ｄｅｕｒｓｅｎ編、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００２年；Ａ．  Ｌ．  Ｊｏｙｎｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００年；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；２００２年１２月１５日、ＩＳＢＮ−１０：  ０８７９６９５９１９；Ｋｕｒｓａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ（編）、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２００２年、１８５巻、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＩＳＢＮ：  ９７８０４７０１５１８０；Ｍｅｙｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１０７巻（３４号）、１５０２２〜１５０２６頁に記載される方法を含むがこれらに限定されない。
【００７４】
相同性ベースの組換え遺伝子改変戦略を使用して、外因性タンパク質（単数または複数）をコードする核酸、例えば、単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼをコードするヌクレオチド配列またはヒトＣＤ４７をコードするヌクレオチド配列を免疫不全マウスのゲノムに導入する「ノックイン」により免疫不全マウスを遺伝子改変することが可能である。同様に、相同性ベースの組換え遺伝子改変戦略を使用して、内因性タンパク質（単数または複数）をコードする遺伝子、例えば、マウスＣＤ４７またはマウスＬｙｓｔの「ノックアウト」または変異により免疫不全マウスを遺伝子改変することが可能である。
【００７５】
相同性ベースの組換え遺伝子改変戦略は、ホーミングエンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、メガヌクレアーゼ、トランスポゾン、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用するヌクレアーゼ媒介プロセス、転写活性化因子様（ＴＡＬ）、クラスター化した規則的配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓを使用するアプローチ、またはショウジョウバエ組換え関連タンパク質（ＤＲＡＰ）アプローチなどの遺伝子編集アプローチを含む。例えば、Ｃｅｒｂｉｎｉら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．、２０１５年；１０巻（１号）：ｅ０１１６０３２頁；Ｓｈｅｎら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８巻（１０号）：ｅ７７６９６頁；およびＷａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＆  Ｃｅｌｌ、２０１６年２月、７巻、２号、１５２〜１５６頁を参照されたい。
【００７６】
ゲノム編集は、例えば、本明細書に記載されるおよびＪ．  Ｐ．  ＳｕｎｄｂｅｒｇおよびＴ．  Ｉｃｈｉｋｉ編、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍｉｃｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；２００６年；Ｍ．  Ｈ．  ＨｏｆｋｅｒおよびＪ．  ｖａｎ  Ｄｅｕｒｓｅｎ編、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００２年；Ａ．  Ｌ．  Ｊｏｙｎｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００年；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；２００２年１２月１５日、ＩＳＢＮ−１０：  ０８７９６９５９１９；Ｋｕｒｓａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ（編）、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２００２年；１８５巻、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＩＳＢＮ：  ９７８０４７０１５１８０；Ｍｅｙｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、２０１０年、１０７巻（３４号）、１５０２２〜１５０２６頁；ならびにＤｏｕｄｎａ，  Ｊ．ら（編）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２０１６年、ＣＳＨＰに詳述される方法により実施される。いくつかのゲノム編集技法の簡単な説明が本明細書に記載されている。
【００７７】
マウスの遺伝子改変のためのヌクレアーゼ技法
【００７８】
これに限定されないが、ヌクレアーゼ遺伝子編集技法などの遺伝子改変方法、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、メガヌクレアーゼ、トランスポゾン、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用するヌクレアーゼ媒介プロセス、転写活性化因子様（ＴＡＬ）、クラスター化した規則的配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓ、またはショウジョウバエ組換え関連タンパク質（ＤＲＡＰ）を使用する方法を使用して、所望のＤＮＡ配列をゲノムの所定の標的部位に導入することが可能である。手短に言えば、使用可能である遺伝子改変方法は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、体細胞、受精卵母細胞または胚中に標的化ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲまたはＤＲＡＰをコードするＲＮＡ分子および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを導入し、次に所望の遺伝子改変を有するＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、体細胞、受精卵母細胞または胚を選択することを含む。
【００７９】
例えば、所望の核酸配列を、これらに限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬ（転写活性化因子様エフェクター法）、ジンクフィンガー媒介ゲノム編集またはＤＲＡＰなどのヌクレアーゼ技法によりマウスのゲノムの所定の標的部位に導入して、そのゲノムが、プロモーターに作動可能に連結したヒトＣＤ４７または単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼタンパク質をコードする核酸を含む本発明の実施形態に従って提供される遺伝子改変マウスを生産することが可能であり、動物はコードされたヒトＣＤ４７または単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼタンパク質を発現する。
【００８０】
本明細書で使用される場合、ヌクレアーゼ遺伝子編集技法の文脈における用語「標的部位」および「標的配列」は、染色体配列の編集されるべき部分を規定する核酸配列を指し、ヌクレアーゼは、結合に十分な条件が存在すればそれを認識して結合するように操作される。
【００８１】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム
【００８２】
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的配置の短い回文配列リピート）は、配列決定された細菌のおよそ４０％および配列決定された古細菌の９０％のゲノム中に見出され、外来ＤＮＡエレメントに対する抵抗性を与える複数の短いダイレクトリピートを含有する遺伝子座である。Ｈｏｒｖａｔｈ、２０１０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２７巻：１６７〜１７０頁；Ｂａｒｒａｎｇｏｕら、２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１５巻、１７０９〜１７１２頁；およびＭａｋａｒｏｖａら、２０１１年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．、９巻：４６７〜４７７頁を参照されたい。
【００８３】
ＣＲＩＳＰＲリピートはサイズが２４から４８塩基対に及ぶ。このリピートは通常、ある程度の二回転対称性（ｄｙａｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ）を示し、ヘアピンなどの二次構造の形成を意味するが、真の回文配列ではない。ＣＲＩＳＰＲリピートは類似の長さのスペーサーにより分離されている。
【００８４】
ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子はＣＲＩＳＰＲリピートスペーサーアレイに関連することが多い。４０を上回る異なるＣａｓタンパク質ファミリーが記載されてきた（Ｈａｆｔら、２００５年、ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．、１巻（６号）：ｅ６０頁）。ｃａｓ遺伝子とリピート構造の特定の組み合わせを使用して８つのＣＲＩＳＰＲサブタイプを定義し、その一部は、リピート関連ミステリアスタンパク質（ｒｅｐｅａｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＲＡＭＰ）をコードする追加の遺伝子モジュールと関連している。
【００８５】
異なる生物において多様なＣＲＩＳＰＲシステムが存在し、最も単純なシステムの１つは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣＲＩＳＰＲシステムＩＩ型であり；Ｃａｓ９タンパク質をコードする１つの遺伝子ならびに２つのＲＮＡ、すなわち、成熟ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および部分的相補性トランス作動性ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）だけが必要であり、外来ＤＮＡのＲＮＡガイドサイレンシングに十分である（Ｇａｓｉｕｎａｓら、２０１２年、ＰＮＡＳ  １０９巻：Ｅ２５７９〜Ｅ２５８６頁；Ｊｉｎｅｋら、２０１２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７巻：８１６〜８２１頁）。ｃｒＲＮＡの成熟にはｔｒａｃｒＲＮＡおよびＲＮａｓｅＩＩＩが必要である（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａら、２０１１年、Ｎａｔｕｒｅ  ４７１巻：６０２〜６０７頁）。しかし、この要件は、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体を模倣するデザインヘアピン（ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｈａｉｒｐｉｎ）を含有する操作されたスモールガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用することにより迂回することが可能である（Ｊｉｎｅｋら、２０１２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７巻：８１６〜８２１頁）。ｓｇＲＮＡと標的ＤＮＡ間の塩基対合により、Ｃａｓ９のエンドヌクレアーゼ活性に起因して二本鎖切断（ＤＳＢ）が引き起こされる。結合特異性は、ＤＮＡ相補領域に並置されたｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ塩基対合と短いＤＮＡモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ［ＰＡＭ］配列：ＮＧＧ）の両方により決定される（Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ  ＆  Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ、２０１０年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１巻：１８１〜１９０頁）。例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムは最小セットの２つの分子、Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡが必要であり、したがって、宿主非依存性遺伝子標的化プラットホームとして使用可能である。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲは、標的化挿入などの、部位選択性ＲＮＡガイドゲノム編集に利用可能である。（例えば、Ｃａｒｒｏｌｌ、２０１２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０巻：１６５８〜１６６０頁；Ｃｈａｎｇら、２０１３年、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３巻：４６５〜４７２頁；Ｃｈｏら、２０１３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１巻：２３０〜２３２頁；Ｃｏｎｇら、２０１３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９巻：８１９〜８２３頁；Ｈｗａｎｇら、２０１３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１巻：２２７〜２２９頁；Ｊｉａｎｇら、２０１３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１巻：２３３〜２３９頁；Ｍａｌｉら、２０１３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９巻：８２３〜８２６頁；Ｑｉら、２０１３年、Ｃｅｌｌ  １５２巻：１１７３〜１１８３頁；Ｓｈｅｎら、２０１３年、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３巻：７２０〜７２３頁；およびＷａｎｇら、２０１３年、Ｃｅｌｌ  １５３巻：９１０〜９１８頁を参照）。特に、Ｗａｎｇら、２０１３年、Ｃｅｌｌ  １５３巻：９１０〜９１８頁は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムをオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用する標的化挿入を記載している。
【００８６】
本発明の態様による遺伝子改変マウスの生成は、ＣＲＩＳＰＲにおいて使用するための、ｃａｓ９をコードする発現構築物および標的化される遺伝子に特異的なガイドＲＮＡをコードする発現構築物などの適切な核酸の、胚性幹（ＥＳ）細胞または誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞などの着床前胚または幹細胞中への注入またはトランスフェクションを含むことができる。任意選択で、ｃａｓ９およびガイドＲＮＡは単一の発現構築物にコードされている。
【００８７】
ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクター
【００８８】
転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターまたはＴＡＬＥ（転写活性化因子様エフェクター）は植物病原性細菌属キサントモナスに由来しており、これらのタンパク質は植物転写活性化因子を模倣しており、植物転写物を操作する。Ｋａｙら、２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８巻：６４８〜６５１頁を参照されたい。
【００８９】
ＴＡＬエフェクターは、タンデムリピートの集中化ドメインを含有し、それぞれのリピートがおよそ３４アミノ酸を含有し、これらのアミノ酸はこれらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとり極めて重要である。さらに、ＴＡＬエフェクターは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する。概論は、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋら、２００６年、Ｊ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１６３巻（３号）：２５６〜２７２頁；ＳｃｈｏｌｚｅおよびＢｏｃｈ、２０１１年、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１４巻：４７〜５３頁を参照されたい。
【００９０】
ＴＡＬエフェクターの特異性はタンデムリピートに見出される配列に依存している。繰り返し配列はおよそ１０２ｂｐを含み、リピートは典型的には、互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓら、１９８９年、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１８巻：１２７〜１３６頁）。リピートの多型性は通常、１２位および１３位に位置しており、１２位および１３位での超可変二残基の正体とＴＡＬエフェクター標的配列における隣接するヌクレオチドの正体との間には１対１の対応が存在すると思われる。ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ、２００９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６巻：１５０１頁；ならびにＢｏｃｈら、２００９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６巻：１５０９〜１５１２頁を参照されたい。２つの超可変残基はリピート可変二残基（ＲＶＤ）として知られており、それによれば、１つのＲＶＤはＤＮＡ配列の１つのヌクレオチドを認識し、それぞれのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ結合ドメインが大きな認識部位（１５〜３０ｎｔ）を極めて正確に標的化することができることを保証する。実験的には、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のためのコードは、１２位および１３位でのＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧはＴに結合し、ＮＩはＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮはＡまたはＧに結合し、ＩＧはＴに結合するように決定されている。これらのＤＮＡ結合リピートは、新しい組み合わせと多数のリピートを含むタンパク質に組立てられて、新しい配列と相互作用して植物細胞中でレポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工的な転写因子を作製する（Ｂｏｃｈら、２００９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６巻：１５０９〜１５１２頁）。これらのＤＮＡ結合ドメインは、すべての細胞型での標的化ゲノム編集または標的化遺伝子調節の分野で一般的な適用性を有することが明らかにされている。Ｇａｊら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０１３年、３１巻（７号）：３９７〜４０５頁を参照されたい。さらに、操作されたＴＡＬエフェクターは、ヌクレアーゼなどの外因性機能的タンパク質エフェクタードメインと関連して機能することが示されており、このヌクレアーゼは天然のキサントモナスＴＡＬエフェクターまたは哺乳動物細胞中のタンパク質には天然には見出されない。ＴＡＬヌクレアーゼ（ＴＡＬＮまたはＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬとヌクレアーゼ、例えば、Ｎ末端またはＣ末端のＦｏｋＩヌクレアーゼドメインと組み合わせることにより構築することが可能である。Ｋｉｍら、１９９６年、ＰＮＡＳ  ９３巻：１１５６〜１１６０頁；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、２０１０年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８６巻：７５７〜７６１頁；Ｌｉら、２０１１年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９巻：６３１５〜６３２５頁；および  Ｍｉｌｌｅｒら、２０１１年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９巻：１４３〜１４８頁。ＮＨＥＪにより欠失を引き起こすＴＡＬＥＮの機能性は、ラット、マウス、ゼブラフィッシュ、ツメガエル、メダカ、ラットおよびヒト細胞で示されている。Ａｎｓａｉら、２０１３年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９３巻：７３９〜７４９頁；Ｃａｒｌｓｏｎら、２０１２年、ＰＮＡＳ、１０９巻：１７３８２〜１７３８７頁；Ｈｏｃｋｅ���ｅｙｅｒら、２０１１年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２９巻：７３１〜７３４頁；Ｌｅｉら、２０１２年、ＰＮＡＳ、１０９巻：１７４８４〜１７４８９頁；Ｍｏｏｒｅら、２０１２年、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、７巻：ｅ３７８７７頁；Ｓｔｒｏｕｄら、２０１３年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２８８巻：１６８５〜１６９０頁；Ｓｕｎｇら、２０１３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１巻：２３〜２４頁；Ｗｅｆｅｒｓら、２０１３年、ＰＮＡＳ  １１０巻：３７８２〜３７８７頁。
【００９１】
ＴＡＬＥＮでは、そのようなものを作製する方法は、米国特許第８４２０７８２号、同第８４５０４７１号、同第８４５０１０７号、同第８４４０４３２号、同第８４４０４３１号、および米国特許出願公開第２０１３０１３７１６１号、同第２０１３０１３７１７４号にさらに記載されている。
【００９２】
他の有用なエンドヌクレアーゼは、例えば、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｂｇ／Ｉ、およびＡｌｗＩを含んでいてもよい。一部のエンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）はダイマーとしてのみ機能するという事実は、ＴＡＬエフェクターの標的特異性を増強するのに利用可能である。例えば、一部の場合、それぞれのＦｏｋＩモノマーを異なるＤＮＡ標的配列を認識するＴＡＬエフェクター配列に融合させることが可能であり、２つの認識部位が近接しているときだけ不活性なモノマー同士が一体となって機能的酵素を創出する。ヌクレアーゼを活性化するＤＮＡ結合を必要とすることにより、高度に部位特異的な制限酵素を創出することが可能になる。
【００９３】
一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは核局在化シグナルまたは配列（ＮＬＳ）をさらに含んでもよい。ＮＬＳは、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼタンパク質を核に標的化して、染色体の標的配列に二本鎖切断を導入することを促進するアミノ酸配列である。
【００９４】
核局在化シグナルは当技術分野において公知であり、例えば、Ｍａｋｋｅｒｈら、１９９６年、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．、６巻：１０２５〜１０２７頁を参照されたい。ＮＬＳはＳＶ４０ラージＴ抗原由来の配列ＰＫＫＫＲＫＶ、Ｋａｌｄｅｒｏｎ  １９８４年、Ｃｅｌｌ、３９巻：４９９〜５０９頁；ヌクレオプラスミン由来のＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫ（配列番号９）、Ｄｉｎｇｗａｌｌら、１９８８年、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０７巻、８４１〜９頁を含む。さらなる例は、ＭｃＬａｎｅおよびＣｏｒｂｅｔｔ、２００９年、ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ、６１巻、６９７〜７０頁；Ｄｏｐｉｅら、２０１２年、ＰＮＡＳ、１０９巻、Ｅ５４４〜Ｅ５５２頁に記載されている。
【００９５】
切断ドメインは任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから入手し得る。切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含むがこれらに限定されない。例えば、２００２〜２００３年Ｃａｔａｌｏｇ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．；およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加の酵素は公知であり、例えば、ＳＩヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵ＤｎａｓｅＩ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼがある。Ｌｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年も参照されたい。これらの酵素の１つもしくは複数、またはその機能的断片は切断ドメインの供給源として使用してもよい。
【００９６】
ジンクフィンガー媒介ゲノム編集
【００９７】
相同性特異的修復プロセス（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｐｒｏｃｅｓｓ）を介した標的化挿入のためなどの遺伝子編集のためのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の使用は確立している。例えば、Ｃａｒｂｅｒｙら、２０１０年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１８６巻：４５１〜４５９頁；Ｃｕｉら、２０１１年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２９巻：６４〜６８頁；Ｈａｕｓｃｈｉｌｄら、２０１１年、ＰＮＡＳ、１０８巻：１２０１３〜１２０１７頁；Ｏｒｌａｎｄｏら、２０１０年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３８巻：ｅ１５２〜ｅ１５２頁；およびＰｏｒｔｅｕｓ  ＆  Ｃａｒｒｏｌｌ、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２３巻：９６７〜９７３頁を参照されたい。
【００９８】
ＺＦＮ媒介プロセスの構成成分は、ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインを有するジンクフィンガーヌクレアーゼを含む。そのような構成成分は、例えば、Ｂｅｅｒｌｉら、（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０巻：１３５〜１４１頁；Ｐａｂｏら、（２００１年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７０巻：３１３〜３４０頁；Ｉｓａｌａｎら、（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９巻：６５６〜６６０頁；Ｓｅｇａｌら、（２００１年）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１２巻：６３２〜６３７頁；およびＣｈｏｏら、（２０００年）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．、１０巻：４１１〜４１６頁；ならびに米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号に記載されている。標的配列へのジンクフィンガー結合ドメインを設計し選択する方法は当技術分野において公知であり、例えば、Ｓｅｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００２年、４１巻、７０７４〜７０８１頁；米国特許第６，６０７，８８２号；同第６，５３４，２６１号および同第６，４５３，２４２号を参照されたい。
【００９９】
一部の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、核局在化シグナルまたは配列（ＮＬＳ）をさらに含んでもよい。ＮＬＳは、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質を核に標的化して、染色体の標的配列に二本鎖切断を導入することを促進するアミノ酸配列である。核局在化シグナルは当技術分野において公知である。例えば、Ｍａｋｋｅｒｈら、（１９９６年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６巻：１０２５〜１０２７頁を参照されたい。
【０１００】
切断ドメインは任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから入手し得る。切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含むがこれらに限定されない。例えば、２００２〜２００３年Ｃａｔａｌｏｇ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．；およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加の酵素は公知である（例えば、ＳＩヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵ＤｎａｓｅＩ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。Ｌｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年も参照されたい。これらの酵素の１つもしくは複数（またはその機能的断片）は切断ドメインの供給源として使用してもよい。切断ドメインは、上記のように、切断活性に二量体化を必要とする酵素またはその部分に由来していてもよい。
【０１０１】
それぞれのヌクレアーゼが活性酵素ダイマーのモノマーを含むので、切断には２つのジンクフィンガーヌクレアーゼが必要とされることがある。代わりに、単一のジンクフィンガーヌクレアーゼが活性酵素ダイマーを創出する両方のモノマーを含むことがある。制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在しており、ＤＮＡに（認識部位で）配列特異的結合をして、結合部位でまたはその近傍でＤＮＡを切断することができる。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）はＤＮＡを認識部位から取り除かれた部位で切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチドでおよびもう一方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉら、（１９９２年）ＰＮＡＳ  ８９巻：４２７５〜４２７９頁；Ｌｉら、（１９９３年）ＰＮＡＳ  ９０巻：２７６４〜２７６８頁；Ｋｉｍら、（１９９４年）ＰＮＡＳ  ９１巻：８８３〜８８７頁；Ｋｉｍら、（１９９４年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６９巻：３１，９７８〜３１，９８２頁を参照されたい。したがって、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメインおよび１つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメインを含んでいてもよく、これは操作されていてもされていなくてもよい。例示的なＩＩＳ型制限酵素は、例えば、国際公開第０７／０１４２７５号に記載されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。追加の制限酵素は分離可能な結合および切断ドメインも含有し、これらの酵素も本開示により企図されている。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３１巻：４１８〜４２０頁を参照されたい。切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素はダイマーとして活性である（Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら、１９９８年、ＰＮＡＳ  ９５巻：１０，５７０〜１０，５７５頁）。したがって、本開示の目的では、ＦｏｋＩ酵素のうちジンクフィンガーヌクレアーゼで使用される部分は切断モノマーと見なされる。したがって、ＦｏｋＩ切断ドメインを使用する標的化二本鎖切断では、それぞれがＦｏｋＩ切断モノマーを含む２つのジンクフィンガーヌクレアーゼは、活性酵素ダイマーを再構成するために使用してもよい。代わりに、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断モノマーを含有する単一のポリペプチド分子を使用してもよい。ある特定の実施形態では、切断ドメインは、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、および同第２００８０１３１９６２号（これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ホモ二量体化を最小限にするまたは妨げる１つまたは複数の操作された切断モノマーを含み得る。非限定的な例として、ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８��４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位のアミノ酸残基は、すべてＦｏｋＩ切断半ドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。偏性ヘテロダイマーを形成するＦｏｋＩの例示的に操作された切断モノマーは、第１の切断モノマーがＦｏｋＩのアミノ酸残基４９０位および５３８位に変異を含み、第２の切断モノマーがアミノ酸残基４８６位および４９９位に変異を含む対を含む。したがって、一実施形態では、アミノ酸４９０位の変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；アミノ酸残基５３８位の変異はＩｌｅ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；アミノ酸残基４８６位の変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置き換え；４９９位の変異はＩｌｅ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換える。具体的には、１つの切断モノマーで４９０位をＥからＫに、５３８位をＩからＫに変異させて「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と名付けた操作された切断モノマーを生産することにより、および別の切断モノマーで４８６位をＱからＥに、４９９位をＩからＬに変異させて「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と名付けた操作された切断モノマーを生産することにより、操作された切断モノマーを調製し得る。上記の操作された切断モノマーは、異常な切断が最小限にされるかまたは消失される偏性ヘテロダイマー変異体である。操作された切断モノマーは、適切な方法を使用して、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号に記載されている野生型切断モノマー（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異誘発により調製し得る。
【０１０２】
上記のジンクフィンガーヌクレアーゼは、組入れの標的化部位に二本鎖切断を導入するように操作し得る。二本鎖切断は組入れの標的化部位においてでもよく、または組入れ部位から１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００または１０００ヌクレオチドまで離れていてもよい。一部の実施形態では、二本鎖切断は、組入れ部位から１、２、３、４、５、１０、１５または２０ヌクレオチドまで離れていてもよい。他の実施形態では、二本鎖切断は、組入れ部位から１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドまで離れていてもよい。さらに他の実施形態では、二本鎖切断は、組入れ部位から５０、１００または１０００ヌクレオチドまで離れていてもよい。
【０１０３】
ＤＲＡＰ技術は米国特許第６５３４６４３号、米国特許第６８５８７１６号および米国特許第６８３０９１０号ならびにＷａｔｔら、２００６年に記載されている。
【０１０４】
そのゲノムがマウスのマクロファージおよび／またはマクロファージ抗ヒト赤血球活性を欠損させる遺伝子改変を含む遺伝子改変免疫不全マウスの生成は、遺伝子標的化ベクターを、胚性幹（ＥＳ）細胞または誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞などの着床前胚または幹細胞中へ導入することにより達成することが可能である。
【０１０５】
用語「遺伝子標的化ベクター」は、標的化遺伝子内への挿入または標的化遺伝子の置き換えなどにより、特定の染色体遺伝子座と組み換え、そしてこれを変異させるのに有効な二本鎖組換えＤＮＡ分子を指す。
【０１０６】
標的化遺伝子破壊または所望の核酸配列の導入では、遺伝子標的化ベクターは組換えＤＮＡ技法を使用して作製され、幹細胞内因性標的遺伝子に相同な５’および３’配列を含む。遺伝子標的化ベクターは任意選択でおよび好ましくは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンまたはピューロマイシンなどの選択可能マーカーを含む。当業者であれば、遺伝子標的化ベクターに含むための配列を選択し、ほんの慣例的な実験を用いてこれらの配列を使用することができる。遺伝子標的化ベクターは、周知の方法を使用して組換え的にまたは合成的に生成することが可能である。
【０１０７】
遺伝子標的化ベクターの着床前胚内へのＤＮＡ注入の方法では、遺伝子標的化ベクターは非ヒト着床前胚内への注入前に線状化される。遺伝子標的化ベクターは受精卵母細胞内へ注入されるのが好ましい。受精卵母細胞は、交配後の日（０．５ｄｐｃ）に過排卵雌から収集され、発現構築物を注入される。注入された卵母細胞は一晩培養されるまたは０．５日ｐ．ｃ．偽妊娠雌の輸卵管内に直接移植される。過排卵、卵母細胞の回収、遺伝子標的化ベクター注入および胚移植のための方法は当技術分野において公知であり、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；２００２年１２月１５日、ＩＳＢＮ−１０：  ０８７９６９５９１９に記載されている。子孫は、標的遺伝子破壊の存在について、ＰＣＲ、サザンブロットまたは配列決定などのＤＮＡ分析により試験することが可能である。破壊された標的遺伝子を有するマウスは、ＥＬＩＳＡもしくはウェスタンブロット分析を使用することなどにより標的タンパク質発現についておよび／またはＲＴ−ＰＣＲなどによりｍＲＮＡ発現について試験することが可能である。
【０１０８】
代わりに、遺伝子標的化ベクターは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿およびリポフェクションなどの周知の方法を使用して幹細胞（ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞）内にトランスフェクトし得る。
【０１０９】
マウスＥＳ細胞は特定の株用に最適化された培地で生育する。典型的にはＥＳ培地は、１５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）または合成もしくは半合成等価物、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸Ｎａ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシン、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノールならびに１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦ（加えて、一部の細胞株では分化の化学阻害剤）をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に含有する。詳細な説明は当技術分野において公知である（Ｔｒｅｍｍｌら、２００８年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１章：第１Ｃ．４項）。ＥＳ細胞分化の阻害剤の概論は、Ｂｕｅｈｒ，  Ｍ．ら（２００３年）、Ｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｂ：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３５８巻、１３９７〜１４０２頁を参照されたい。
【０１１０】
細胞は、ＰＣＲ、サザンブロットまたは配列決定などのＤＮＡ分析により、標的遺伝子破壊または所望の核酸配列の導入についてスクリーニングされる。標的遺伝子を破壊する正しい相同組換え事象を有する細胞は、ＥＬＩＳＡもしくはウェスタンブロット分析を使用することなどにより標的タンパク質発現についておよび／またはＲＴ−ＰＣＲなどによりｍＲＮＡ発現について試験することが可能である。所望される場合、選択可能マーカーは、幹細胞をＣｒｅリコンビナーゼを用いて処理することにより取り除くことが可能である。Ｃｒｅリコンビナーゼ処理後、細胞は標的タンパク質をコードする核酸の存在について分析される。
【０１１１】
標的遺伝子を破壊するまたは所望の核酸配列を導入する正しいゲノム事象を有する選択された幹細胞は、着床前胚内へ注入することが可能である。マイクロインジェクションでは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、トリプシンとＥＤＴＡの混合物を使用して単一の細胞にされ、続いてＥＳ培地に再懸濁される。単一の細胞の群は微細に引き延ばされたガラス針（内径２０〜２５マイクロメートル）を使用して選択し、マイクロマニピュレーターを装着した倒立顕微鏡を使用して胚透明帯を通じて胚盤胞腔（胞胚腔（ｂｌａｓｔｏｃｏｅｌ））に導入される。胚盤胞注入の代替として、幹細胞を初期胚（例えば、２細胞、４細胞、８細胞、プレ桑実胚（ｐｒｅｍｏｒｕｌａ）または桑実胚）中に注入することが可能である。注入は、穿孔させて透明帯を開くレーザーまたは圧力パルスを用いて支援してもよい。胚盤胞または８細胞期胚あたりおよそ９〜１０の選択された幹細胞（ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞）、４細胞期胚あたり６〜９幹細胞、および２細胞期胚あたり約６幹細胞が注入される。幹細胞導入に続いて、胚は、偽妊娠レシピエント雌に移植する前に、３７℃、窒素中５％ＣＯ２、５％Ｏ２で数時間回復させるまたは一晩培養する。幹細胞注入のさらなる代替では、幹細胞は桑実期胚と一緒に凝集させることが可能である。これらの方法はすべて十分確立しており、幹細胞キメラを生産するのに使用することが可能である。さらに詳細な説明は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版（Ａ．  Ｎａｇｙ、Ｍ．  Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ、Ｋ．  Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ、Ｒ．  Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；２００２年１２月１５日、ＩＳＢＮ−１０：  ０８７９６９５９１９、Ｎａｇｙら、１９９０年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１０巻、８１５〜８２１頁；米国特許第７５７６２５９号：Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ、米国特許第７６５９４４２号、米国特許第７，２９４，７５４号、Ｋｒａｕｓら、２０１０年、Ｇｅｎｅｓｉｓ  ４８巻、３９４〜３９９頁）を参照されたい。
【０１１２】
偽妊娠胚レシピエントは当技術分野で公知の方法を使用して調製される。手短に言えば、生後６〜８週間の繁殖力のある雌マウスを精管切除したまたは不稔雄と交配させて、外科的に導入された胚の支援を助長するホルモン状態を誘導する。性交後２．５日（ｄｐｃ）で、最大１５個の幹細胞含有胚盤胞を子宮輸卵管接合部に極めて近い子宮角に導入する。初期胚および桑実胚では、そのような胚はｉｎ  ｖｉｔｒｏで胚盤胞内に培養されるまたは胚胎期（ｅｍｂｒｙｏ  ｓｔａｇｅ）に応じて０．５ｄｐｃもしくは１．５ｄｐｃの偽妊娠雌の輸卵管に移植される。移植胚由来のキメラ仔は、移植時の胚年齢に応じて移植の１６〜２０日後に誕生する。キメラ雄は育種のために選抜される。子孫は、毛色（ｃｏａｔ  ｃｏｌｏｒ）およびＰＣＲ、サザンブロットまたは配列決定などの核酸分析によりＥＳ細胞ゲノムの伝達について分析することが可能である。さらに、標的遺伝子の発現は、タンパク質分析、例えば、イムノアッセイ、または機能アッセイなどにより標的ｍＲＮＡまたはタンパク質発現について分析し、標的遺伝子破壊を確認することが可能である。標的遺伝子破壊または所望の核酸配列の導入を有する子孫は交雑させて、標的遺伝子破壊または所望の核酸配列の存在についてホモ接合の非ヒト動物を創出する。トランスジェニックマウスは免疫不全マウスと交配させて、標的遺伝子破壊または所望の核酸配列の存在を有するコンジェニック免疫不全系統を創出する。
【０１１３】
マウスが標的遺伝子を発現させる能力を欠くように標的遺伝子が破壊されているかどうかまたはマウスが所望のコードされたタンパク質を発現するように所望の核酸配列が導入されているかどうかを決定するために遺伝子改変マウスを評価する方法は周知であり、核酸アッセイ、分光測定アッセイ、イムノアッセイおよび機能アッセイなどの標準技法を含む。
【０１１４】
１つまたは複数の標準を使用して、試料中の標的タンパク質の定量的決定が可能になる。
【０１１５】
標的遺伝子の想定される破壊を有する動物での機能的標的タンパク質の評価のためのアッセイを実施することが可能である。標的遺伝子の想定される破壊を有する動物での標的タンパク質の機能の評価のためのアッセイは当技術分野において公知であり、Ｄｅｅｒｉｎｇら、Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００６年１月、１３巻、１号、６８〜７６頁で例証されている。
【０１１６】
用語「野生型」は、天然に存在するまたは変異していない生物、タンパク質または核酸を指す。
【０１１７】
任意選択で、本発明の態様による遺伝子改変免疫不全マウスは選抜育種により生産される。第１の所望の遺伝子型を有する非ヒト動物の第１の親系統は、第２の所望の遺伝子型を有する非ヒト動物の第２の親系統と交配させて、第１および第２の所望の遺伝子型を有する遺伝子改変非ヒト動物である子孫を生産してもよい。例えば、免疫不全である第１のマウスは、Ｌｙｓｔの発現がないまたは低減するようにＬｙｓｔ遺伝子破壊を有する第２のマウスと交配させて、免疫不全でありＬｙｓｔの発現がないまたは低減するようにＬｙｓｔ遺伝子破壊を有する子孫を生産してもよい。さらなる例では、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウス、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍ１ＭｏｍＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウスまたはＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃマウスを、標的遺伝子の発現がないまたは低減するように標的遺伝子破壊を有するマウスと交配させて、免疫不全であり標的タンパク質の発現がないまたは低減されるように標的遺伝子破壊を有する子孫を生産してもよい。またさらなる例では、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウス、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍ１ＭｏｍＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウスまたはＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃマウスを、ゲノムに発現されるタンパク質をコードする導入された核酸を有するマウスと交配させて、免疫不全でありゲノムに導入された核酸によりコードされる所望のタンパク質を発現する子孫を生産してもよい。
【０１１８】
本発明の態様は、その細胞の実質的にすべてにおいて標的遺伝子破壊を含む遺伝子改変マウス、ならびに、すべての細胞ではなく、一部の細胞に標的遺伝子破壊を含む遺伝子改変マウスを提供する。
【０１１９】
本発明の実施形態は、その細胞の実質的にすべてにおいてヒトＣＤ４７または単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼなどの所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変免疫不全マウス、ならびに、すべての細胞ではなく、一部の細胞にヒトＣＤ４７または単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼなどの所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変免疫不全マウスを提供する。ヒトＣＤ４７または単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼなどの所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の１つまたは複数のコピー（コンカテマーなどの）を、本発明の態様による免疫不全マウスの細胞のゲノム内に組み入れることが可能である。
【０１２０】
ヒト赤血球を含むマウスモデル
【０１２１】
遺伝子改変免疫不全マウスは、本発明の態様によるヒト赤血球をさらに含む。
【０１２２】
ヒト赤血球は、これらに限定されないが、静脈内または腹腔内投与などの種々の経路を介して非ヒト動物に投与することが可能である。
【０１２３】
ヒト赤血球は遺伝子改変免疫不全マウスに１回または複数回投与することが可能である。本発明の遺伝子改変免疫不全マウスにおけるヒト赤血球の生存の増加により、ヒト赤血球の注射回数の低減を可能にし、本明細書に記載されるアッセイによるなどでのヒト赤血球の評価が可能になる。
【０１２４】
ヒト赤血球は、任意選択で、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスへの投与に先立って、他の血液構成成分を取り除くために洗浄される。ヒト赤血球の洗浄は、ヒト赤血球をペレットにするためのヒト全血試料の穏やかな遠心分離、バフィーコートおよび血漿の除去、ならびに等浸透圧緩衝液（ｉｓｏ−ｏｓｍｏｌａｒ  ｂｕｆｆｅｒ）などの適切な液体へのヒト赤血球の再懸濁によるなどの種々の周知の方法により達成される。任意選択で、洗浄されたヒト赤血球の再懸濁に使用される液体の体積は、洗浄されたヒト赤血球が「無希釈洗浄ヒト赤血球」と呼ばれるように、ヒト全血試料の元の体積に実質的に等しい（±５％）。
【０１２５】
本発明の態様によれば、ヒト赤血球は、ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）の投与により免疫不全遺伝子改変マウスに導入され、ＨＳＣは免疫不全マウスに生着してＨＳＣの分化によりヒト赤血球を生産する。
【０１２６】
本明細書で使用される用語「ヒト幹細胞」および「ヒトＨＳＣ」は、ｃ−Ｋｉｔ受容体を発現する多能性幹細胞を指す。ｃ−Ｋｉｔ受容体を発現する多能性幹細胞の例は造血幹細胞を含むがこれに限定されず、この幹細胞は血球始原細胞としても知られる。ｃ−Ｋｉｔ受容体は、例えば、Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ  ＧＲら、１９９２年、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃ−ｋｉｔ  ｇｅｎｅ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ７巻（７号）：１２５９〜６６頁；およびＥｄｌｉｎｇ  ＣＥ、Ｈａｌｌｂｅｒｇ  Ｂ、２００７年、ｃ−Ｋｉｔ−−ａ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、３９巻（１１号）：１９９５〜８頁に記載されるように、当技術分野において周知である。
【０１２７】
ヒトＨＳＣの単離、ヒトＨＳＣの宿主マウスへの投与およびその宿主マウスにおける生着を評価するための方法は当技術分野において周知である。
【０１２８】
免疫不全マウスへの投与用のヒトＨＳＣは、これらに限定されないが、臍帯血、骨髄、ＧＭ−ＣＳＦ動員末梢血および胎児肝臓などのヒトＨＳＣを含有する任意の組織から入手可能である。
【０１２９】
ヒトＨＳＣは、これらに限定されないが、心臓、肝臓および／または顔面静脈中などの種々の経路を介する投与により、新生仔マウスに投与することが可能である。ヒトＨＳＣは、これらに限定されないが、尾部静脈中への、大腿骨骨髄腔中へのまたは脾臓中への投与などの種々の経路により成体マウスに投与することが可能である。さらなる例では、ヒトＨＳＣを含有する胎児肝臓を腎被膜下に生着させることが可能である。
【０１３０】
ヒトＨＳＣをマウスに投与することは、ヒトＨＳＣを含む組成物をマウスに投与することを含むことが可能である。組成物は、例えば、水、張度調整剤（例えば、塩化ナトリウムなどの塩）、ｐＨ緩衝液（例えば、クエン酸塩）、および／または糖（例えば、グルコース）をさらに含むことが可能である。
【０１３１】
免疫不全マウスでのヒトＨＳＣの生着は、免疫不全マウスでの分化したヒト造血細胞の存在を特徴とする。ヒトＨＳＣの生着は、これらに限定されないが、ヒトＨＳＣの投与に続く１つまたは複数時点でのヒトＨＳＣが投与される動物の細胞のフローサイトメトリー分析などの種々の方法のいずれによっても評価することが可能である。
【０１３２】
ヒトＨＳＣの単離のための、ヒトＨＳＣの宿主マウスへの投与のための例示的な方法およびその生着を評価するための方法は、本明細書およびＴ．  Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８１巻：１５．２１．１〜１５．２１．２１頁、２００８年；Ｉｔｏ，  Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １００巻：３１７５〜３１８２頁；Ｔｒａｇｇｉａｉ，  Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４巻：１０４〜１０７頁；Ｉｓｈｉｋａｗａ，  Ｆ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １０６巻：１５６５〜１５７３頁；Ｓｈｕｌｔｚ，  Ｌ．  Ｄ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７４巻：６４７７〜６４８９頁；Ｈｏｌｙｏａｋｅ  ＴＬら、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．、１９９９年、２７巻（９号）：１４１８〜２７頁に記載されている。
【０１３３】
本発明の態様によれば、免疫不全マウスに投与されるヒトＨＳＣは、ヒトＨＳＣが濃縮された細胞の集団を得るための元の供給源材料から単離される。単離されたヒトＨＳＣは純粋であっても純粋でなくてもよい。態様によれば、ヒトＨＳＣは、ＣＤ３４などの細胞マーカーの選択により精製される。態様によれば、投与されるヒトＨＳＣは、ＣＤ３４＋細胞が全細胞の約１〜１００％を構成する細胞集団であるが、ＣＤ３４＋細胞が全細胞の１％未満しか構成しない細胞集団も使用可能である。実施形態によれば、投与されるヒトＨＳＣは、ＣＤ３４＋細胞が全細胞の約１〜３％を構成するＴ細胞枯渇臍帯血細胞、ＣＤ３４＋細胞が全細胞の約５０％を構成する系譜枯渇臍帯血細胞、またはＣＤ３４＋細胞が全細胞の約９０％を構成するＣＤ３４＋陽性選択細胞である。
【０１３４】
投与されるＨＳＣの数は、本発明の免疫不全遺伝子改変マウスでのヒト赤血球の生成に関して限定的だとは考えられていない。単一のＨＳＣは宿主免疫不全遺伝子改変マウスで赤血球を生成することが可能である。したがって、投与されるＨＳＣの数は一般に、レシピエントがマウスである場合、１×１０３から１×１０６（１，０００〜１，０００，０００）個のＣＤ３４＋細胞の範囲であるが、これよりも多くてもまたは少なくても使用可能である。
【０１３５】
したがって、本発明の態様による方法は、約１０３（１０００）から約１０６（１，０００，０００）、約１０３（１０００）から約１０５（１００，０００）、約１０４（１０，０００）から約１０６（１，０００，０００）、約１０５（１００，０００）から約１０７（１０，０００，０００）、約１×１０３（１，０００）から約１×１０４（１０，０００）、約５×１０３（５，０００）から約５×１０４（５０，０００）、約１×１０４（１０，０００）から約１×１０５（１００，０００）、約５×１０４（５０，０００）から約５×１０５（５００，０００）、約１×１０５（１００，０００）から約１×１０６（１，０００，０００）、約５×１０５（５００，０００）から約５×１０６（５，０００，０００）、約１×１０６（１，０００，０００）から約１×１０７（１０，０００，０００）、約２×１０４（２０，０００）から約５×１０５（５００，０００）、または約５×１０４（５０，０００）から約２×１０５（２００，０００）個のヒトＨＳＣを免疫不全遺伝子改変マウスに投与することを含むことが可能である。方法は、少なくとも約１×１０２、約２×１０２、約３×１０２、約４×１０２、約５×１０２、約６×１０２、約７×１０２、約８×１０２、約９×１０２、約１×１０３、約２×１０３、約３×１０３、約４×１０３、約５×１０３、約６×１０３、約７×１０３、約８×１０３、約９×１０３、約１×１０４、約２×１０４、約３×１０４、約４×１０４、約５×１０４、約６×１０４、約７×１０４、約８×１０４、約９×１０４、約１×１０５、約２×１０５、約３×１０５、約４×１０５、約５×１０５、約６×１０５、約７×１０５、約８×１０５、約９×１０５、約１×１０６、約２×１０６、約３×１０６、約４×１０６、約５×１０６、約６×１０６、約７×１０６、約８×１０６、約９×１０６、または約１×１０７個のヒトＨＳＣを免疫不全遺伝子改変マウスに投与することを含むことが可能である。当業者であれば、ほんの慣例的な実験を使用して特定のマウスに投与されるヒトＨＳＣの数を決定することができる。
【０１３６】
任意の投与された非ＨＳＣの大部分が変質した時点で、レシピエント免疫不全遺伝子改変マウスにおいてヒトＨＳＣおよび／またはヒトＨＳＣから分化した細胞が検出される場合には、生着は成功している。分化したＨＳＣの検出は、ヒトＨＳＣの投与に続いてマウスから得られる試料中のヒト赤血球の検出により達成することが可能である。
【０１３７】
本発明の態様による免疫不全遺伝子改変マウスでのヒトＨＳＣの生着は、例えば、一般に、ガンマ線を使用する高周波電磁放射線を用いたレシピエント動物の致死量以下の照射、またはブスルファンもしくはナイトロジェンマスタードなどの放射線様作用薬を用いた処置による、ヒトＨＳＣの投与に先立つ免疫不全遺伝子改変マウスの「コンディショニング」を含む。コンディショニングは、宿主造血細胞の数を低減し、ヒトＨＳＣの生着のための適切な微小環境要因を創出し、および／またはヒトＨＳＣの生着のための微小環境ニッチを創出すると考えられている。コンディショニングのための標準的な方法は当技術分野において公知であり、例えば、本明細書およびＪ．  Ｈａｙａｋａｗａら、２００９年、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２７巻（１号）：１７５〜１８２頁に記載されている。
【０１３８】
本発明の態様によれば、ヒトＨＳＣの投与に先立って免疫不全遺伝子改変マウスを「コンディショニング」することなく免疫不全遺伝子改変マウスにヒトＨＳＣを投与することを含む方法が、提供される。本発明の態様によれば、ヒトＨＳＣの投与に先立って免疫不全遺伝子改変マウスの放射線または放射線様作用薬による「コンディショニング」なしで免疫不全遺伝子改変マウスにヒトＨＳＣを投与することを含む方法が提供される。
【０１３９】
感染
【０１４０】
特定の態様によれば、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに投与されるヒト赤血球に感染因子を感染させる。
【０１４１】
特定の態様によれば、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに投与されるヒト赤血球にプラスモディウム属寄生生物を感染させる。プラスモディウム属寄生生物は、本発明の態様によるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）である。プラスモディウム属寄生生物は、本発明の態様によるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ（Ｐ．ｏｖａｌｅ）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）である。
【０１４２】
特定の態様によれば、感染因子は本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに投与され、遺伝子改変免疫不全マウスはヒトＲＢＣを含み、感染因子はヒトＲＢＣに感染可能である。特定の態様によれば、遺伝子改変免疫不全マウスに投与される感染因子は、プラスモディウム属寄生生物である。プラスモディウム属寄生生物は、本発明の態様によるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）である。プラスモディウム属寄生生物は、本発明の態様によるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ（Ｐ．ｏｖａｌｅ）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）である。
【０１４３】
疾患
【０１４４】
特定の態様によれば、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに投与されるヒト赤血球は障害または疾患に冒される。
【０１４５】
特定の態様によれば、本発明の遺伝子改変免疫不全マウスに投与されるヒト赤血球は、個々のヒトまたはヒト個体の集団（例えば、プールされた試料）に由来しており、個々のヒトまたはヒト個体の集団は鎌状赤血球貧血を有する。
【０１４６】
アッセイ
【０１４７】
本発明の態様によれば、想定される治療剤の効果をアッセイする方法であって、ヒト赤血球を含む遺伝子改変免疫不全マウスに、所定量の想定される治療剤を投与すること、および想定される治療剤の効果を測定することを含む方法が提供される。
【０１４８】
本発明の方法で使用される想定される治療剤は、例示的に、合成もしくは天然に存在する化合物または合成もしくは天然に存在する化合物の組み合わせ、小型の有機分子もしくは無機分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、オリゴ糖、脂質またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、任意の化学実体であり得る。
【０１４９】
本発明の態様によれば、想定される治療剤の効果をアッセイする方法であって、マウスをマクロファージ毒素で処置して、正常よりも少ないマクロファージを有する処置されたマウスを生産すること；処置されたマウスにヒト赤血球を投与すること；処置されたマウスに、所定量の想定される治療剤を投与すること；および想定される治療剤の効果を測定することを含む方法が提供される。マクロファージ毒素の非限定的な例は、これらに限定されないが、ゾレドロネート、クロドロネート、パミドロネートおよびイバンドロネートなどのビスホスホネートを含む。
【０１５０】
本発明の態様によれば、想定される治療剤の効果をアッセイする方法であって、本発明の態様による遺伝子改変免疫不全マウスである遺伝子改変免疫不全マウスをマクロファージ毒素で処置して、正常よりも少ないマクロファージを有する処置された遺伝子改変免疫不全マウスを生産すること；処置された遺伝子改変免疫不全マウスにヒト赤血球を投与すること；処置された遺伝子改変免疫不全マウスに、所定量の想定される治療剤を投与すること；および想定される治療剤の効果を測定することを含む方法が提供される。マクロファージ毒素の非限定的な例は、これらに限定されないが、ゾレドロネート、クロドロネート、パミドロネートおよびイバンドロネートなどのビスホスホネートを含む。
【０１５１】
本発明の態様によれば、ヒト赤血球を含む遺伝子改変免疫不全マウスに想定される治療処置を施すること；および想定される治療処置の効果を測定することを含む、想定される治療処置の効果をアッセイする方法が提供される。非限定的な例として、遺伝子改変免疫不全マウスは、赤血球の障害または疾患を処置する遺伝子治療などにより、さらに遺伝子改変することが可能である。赤血球の障害および疾患は、マラリアおよび赤血球の他の感染性疾患、鎌状赤血球貧血などを含むがこれらに限定されない。
【０１５２】
マラリアの処置のための治療剤はヒト赤血球を含む遺伝子改変免疫不全マウスに投与することが可能であり、ヒト赤血球は、本発明の態様によるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、またはＰ．ｍａｌａｒｉａｅなどのプラスモディウム属寄生生物が感染していてもよい。マラリアの処置のための治療剤の例は、アモジアキン；アルテミシニン；アーテスネート、アルテメテル、ジヒドロアルテミシニン、アルテリン酸（ａｒｔｅｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、およびアルテモチルなどのアルテミシニン誘導体；アトバコン；クロログアニド（プログアニル）；クロロキン；シンコニン（ｃｉｎｃｈｏｉｎｅ）；シンコニジン（ｃｉｎｃｈｏｎｉｄｉｎｅ）；クリンダマイシン；ドキシサイクリン；ハロファントリン、ヒドロキシクロロキン；ルメファントリン；メフロキン；ピペラキン；プリマキン、ピリメタミン；ピロナリジン（ｐｙｒｏｎａｒｉｄｉｎｅ）；キニーネ；キニジン；スルファドキシン；タフェノキン（ｔａｆｅｎｏｑｕｉｎｅ）；ならびにテトラサイクリンを含む。
【０１５３】
本発明の態様によれば、治療剤の効果を決定するために１つまたは複数の治療剤がヒト赤血球に組み込まれ、免疫不全遺伝子改変マウスに投与される。治療剤は、例えば、治療剤とＲＢＣを一緒にインキュベートし、ＲＢＣ内への治療剤の拡散もしくは能動的な取込みを可能にする、またはマイクロインジェクションによるなどの投与により、ヒトＲＢＣ内に組み込むことが可能である。治療剤は、これに限定されないが、リポソームなどのＲＢＣによる取込みを刺激する担体と会合させてもよい。
【０１５４】
アッセイに適した標準は当技術分野において周知であり、使用される標準は任意の適切な標準であり得る。
【０１５５】
アッセイ結果は、パラメトリックもしくはノンパラメトリック検定、分散分析、共分散分析、多変量分析のためのロジスティック回帰分析、フィッシャー直接検定、カイ二乗検定、スチューデントｔ検定、マン・ホイットニー検定、ウィルコクソン符号順位検定、マクネマー検定、フリードマン試験およびページＬ傾向試験（Ｐａｇｅ’ｓ  Ｌ  ｔｒｅｎｄ  ｔｅｓｔ）に例示される、種々の方法のいずれかにより統計分析を使用して分析可能である。これらのおよび他の統計検定は当技術分野において周知であり、Ｈｉｃｋｓ，  ＣＭ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｉｓｔｓ：  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ（出版元）；第５版、２００９年、およびＦｒｅｕｎｄ，  ＲＪら、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；第３版、２０１０年に記載されている。
【０１５６】
本発明の組成物および方法の実施形態は以下の実施例において例示される。これらの実施例は説明目的で提供され、本発明の組成物および方法の範囲を限定するものと考えられてはいない。
【実施例】
【０１５７】
実施例
【０１５８】
方法および材料
【０１５９】
動物
【０１６０】
本研究で使用されるマウスは、ＮＳＧまたはＣ５７ＢＬ／６系統バックグラウンドでありジャクソンラボラトリー（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）で飼育された。生後２から４か月の雄および雌マウスが使用された。ヒト血液の注射がプロジェクトの主構成要素であったことから、すべての動物がＢＳＬ２認定済み実験室に収容された。標準的な寝床、餌および水は、自由に利用できるようにした。ケージは２３℃、１２時間明／暗周期（６：００点灯）で維持された。ＮＳＧマウスは「標準」系統を表し、したがって、他の新たに開発された系統に対する対照として使用された。
【０１６１】
ヒト血液試料
【０１６２】
ヘパリン中のヒト血液試料は毎週受け取った。入手したら、血液は使用前にリンパ球性Ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓウイルス（ＬＣＭＶ）および細菌について試験された。
【０１６３】
試験手順
【０１６４】
それぞれの別々の実験は、５匹のＮＳＧマウスおよび５匹の次世代ＮＳＧマウスまたはＢＬ／６  ＲａｇガンマＣＤ４７（ＭＤ４）ＫＯマウスからなっていた。実験はすべて指定のＢＳＬ２認定済み実験室で行われた。２００μｌの洗浄した無希釈ヒト赤血球は静脈または腹腔内注射によりマウスに注入された。注入のタイプは各々それぞれの実験を通して一定に保たれた。それぞれの最初の注入後、マウスは所定の時点で尾部から採血した。
【０１６５】
ガンシクロビルの投与
【０１６６】
ガンシクロビル（ＧＶＣ）は、マクロファージの除去を誘導するためにＮＳＧ  ＭＤ３マウス系統に投与された。ＧＶＣは、実験の開始に先立って連続４日間５匹のマウスに投与された。
【０１６７】
抗体カクテル
【０１６８】
２つの異なる抗体混合物：１）ＡＰＣ  Ｔｅｒ−１１９と混合させたＦＩＴＣグリコホリンＡ（ＧＰＡ）およびＦＡＣＳ緩衝液ならびに２）ＡＰＣ  Ｔｅｒ−１１９、ＰＥグリコホリンＡと混合させたＦＩＴＣ  ＣＤ４１ｂおよびＦＡＣＳ緩衝液を使用した。前者を作製するために、ＦＩＴＣ  ＧＰＡは１：５００希釈で使用し、一方で、ＡＰＣ  Ｔｅｒ−１１９は１：５０希釈で使用した。後者はＦＩＴＣ  ＣＤ４１Ｂを１：２０希釈で、ＡＰＣ  Ｔｅｒ−１１９を１：５０希釈でおよびＰＥ  ＧＰＡを１：５００希釈で使用して作製された。混合物はすべてボルテックスして完全な混合を確実にした。
【０１６９】
フローサイトメトリー
【０１７０】
末梢血由来の細胞集団を定量化し分化させるため、２μｌの血液あたり５０μｌの抗体カクテルを用いて、試料ごとにヒトグリコホリンＡ（ＧＰＡ）では１：５００希釈で（Ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）では１：５０希釈でフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を使用する。抗体は血液と混合し、４℃で３０〜６０分間冷蔵して、十分な染色を確実にした。次に、血液は１ｍＬのＰＢＳアジドに再懸濁された。フローサイトメトリーは、製造業者のプロトコールによりＡｔｔｕｎｅフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して実施した。次に、試料は細胞分析ソフトウェアＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して定量化した。
【０１７１】
結果
【０１７２】
改良されたヒトＲＢＣ生存のためにマウスを遺伝子操作する
【０１７３】
ＮＳＧ  Ｌｙｓｔ（ＭＤ１）ＫＯマウス系統（ＮＳＧ  ＭＤ１マウス）
【０１７４】
このマウスは、変異される／存在しないとヒト疾患症候群をもたらすことがある遺伝子である、Ｌｙｓｔ遺伝子をノックアウトされている点で独特である。この遺伝子がないと、マウスの生得的な免疫系は損なわれて、リソソーム機能障害および免疫細胞機能障害をもたらす。
【０１７５】
免疫不全遺伝子改変マウス−ＮＳＧ  ＬｙｓｔノックアウトＭＤ１の生成
【０１７６】
ＮＳＧ  ＬｙｓｔノックアウトＭＤ１マウスは、Ｃａｓ９  ＲＮＡ（１００ｎｇ）および単一のガイド配列（５０ｎｇ）、ｓｇＲＮＡ−１５３７（ＡＴＣＣＧＴＴＧＡＡＣＣＡＡＡＧＣＴＡＣ、配列番号２）のＮＳＧ受精卵母細胞への前核注入によりジャクソンラボラトリーで生成された。
【０１７７】
ｓｇＲＮＡ−１５３７の場合：移植された５５の胚（３つは偽）、１４生産仔、２／１４（１４％）ＮＨＥＪ
【０１７８】
ＣＲＩＳＰＲ戦略により、マウスＬｙｓｔ遺伝子のエキソン５において２５塩基対欠失（ＧＡＧＣＣＧＧＴＡＧＣＴＴＴＧＧＴＴＣＡＡＣＧＧＡ、配列番号１）の特定の欠失を生じた。
【０１７９】
４つのプライマーは遺伝子型判定のために設計された：
プライマー番号１５７８
ＧＧＧＴＧＡＡＴＡＴＴＧＡＡＧＴＴＣＴＧＡＧＡＣ（配列番号３）
プライマー番号１５７９
ＣＡＴＴＴＧＡＡＴＣＣＴＧＴＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡ（配列番号４）
プライマー番号１５８０
ＧＣＣＡＣＣＡＡＡＧＡＡＣＡＧＧＴＣＣＴＴＴ（配列番号５）
プライマー番号１５８１
ＧＡＡＧＴＧＧＧＡＡＴＡＣＴＣＡＣＡＡＣＧＣ（配列番号６）
【０１８０】
ｓｇ１５３７標的化変異体の遺伝子型を判定するため、遺伝子型判定ＰＣＲおよび配列決定用にプライマー１５８０／１５８１を使用する。産物は約９０３ｂｐであるはずであり、ＮＥＢ標準Ｔａｑ（Ｍ０２７３）を使用する最適ＰＣＲプログラムは以下の通りである。
９５℃−３０秒間
９５℃−１５秒間｝
６０℃−３０秒間｝３０×サイクル
６８℃−１分間｝
６８℃−５分間
４℃−保持
【０１８１】
１５３７−ｓｇＲＮＡ標的化セットから同定された樹立変異体（Ｆｏｕｎｄｅｒ  ｍｕｔａｎｔｓ）は番号７および番号１２である。
【０１８２】
＞１５８０／１５８１アンプリコン（９０３ｂｐ）（配列番号７）
【化１】
2019532620.tif 000003
【０１８３】
＞１５７８／１５８１アンプリコン（１６２５ｂｐ）（配列番号８）
【化２】
2019532620.tif 000004
【０１８４】
生殖系列に改変対立遺伝子を保有する子孫を交配させて、ホモ接合遺伝子改変ゲノムを生成した。Ｆ１交配はすべて、遺伝子座のメンデル分配を伴う正常な産仔数を生じた。マウスの得られた近親交配系統はＮＳＧ  Ｌｙｓｔ（ＭＤ１）ＫＯマウス系統（ＮＳＧ  ＭＤ１マウス）と名付けられ、この系統は機能的Ｌｙｓｔタンパク質を発現しない。
【０１８５】
図１は、ＮＳＧ対照マウスと比較したこれらのＮＳＧ  Ｌｙｓｔ（ＭＤ１）ノックアウト（ＫＯ）マウス由来のヒトＲＢＣの保持を示す。ＮＳＧ  Ｌｙｓｔ（ＭＤ１）ＫＯはＮＳＧマウスよりも効率的にヒトＲＢＣを保持していると思われるが、この実験では２４時間を超えると統計的有意性は存在しない。
【０１８６】
図１：ＮＳＧ対ＮＳＧ  ＭＤ１。グラフは、ＮＳＧ  ＭＤ１ＫＯ（破線）と比較した場合のＮＳＧ（実線）内でのＲＢＣ生存を示す。ＮＳＧ  ＭＤ１マウスはＮＳＧよりも高い割合でヒトを保持していた。この実験ではデータは２４時間まで有意ではなかった（Ｐ値＞０．１）。腹腔内注射。
【０１８７】
ＣＳＦ１ｒプロモーターがヘルペスチミジンキナーゼの発現を駆動する導入遺伝子を含むＮＳＧマウス系統（ＮＳＧ−ＭＤ３マウス）
【０１８８】
マウス細胞は典型的には、ヘルペスウイルスの派生物である、単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−１−ｔｋ）を発現しない。しかし、そのマクロファージ上で細胞特異的ＨＳＶ−１−ｔｋを発現するマウスモデルを達成することにより、マクロファージの条件付き除去が達成された。ＨＳＶ−１−ｔｋ単独では哺乳動物細胞に致死性ではない。
【０１８９】
マクロファージコロニー刺激因子に対する受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）をコードする遺伝子は、もっぱら骨髄系譜の細胞ならびに栄養膜細胞で発現される。第２のイントロンの保存されたエレメント、Ｆｍｓイントロン調節エレメント（ＦＩＲＥ）は遺伝子のマクロファージ特異的転写に不可欠である。例えば、Ｓａｓｍｏｎｏ  Ｒ  Ｔら、Ｂｌｏｏｄ  ２００３年；１０１巻：１１５５〜１１６３頁を参照されたい。
【０１９０】
マウスＣｓｆ１ｒ遺伝子：ＲＰ２３−３０Ｇ１７を保有するＢＡＣクローンを使用して、マウスＣｓｆ１ｒプロモーターをベクターにクローニングし、次に、三方向ライゲーション（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）を使用して、ＰＣＲアンプリコンとして提供されるＩＲＥＳおよびＨＳＶ  ＴＫ遺伝子／ｐＡを導入し、ＨＳＶ  ＴＫが、単にｐＵＣ５７中のＣｓｆｒ１ｒにより駆動される発現構築物を生産した。この導入遺伝子の総サイズは、エキソン３の５’末端に延びるマウスＣｓｆ１ｒ５’隣接領域および配列の７，５１０ｂｐを含む９，８５０ｂｐである。ＨＳＶ  ＴＫ遺伝子はＩＲＥＳエレメントの３’側で発現され、ＨＳＶ  ＴＫ遺伝子転写はＴＫ  ｐＡ配列で終結される。
【０１９１】
これらのマウスの生成では、ＣＳＦ１ｒ（コロニー刺激因子１受容体）プロモーターの制御下でＨＳＶ−１−ｔｋをコードする発現構築物は、ＮＯＤ×ＮＯＤｓｃｉｄ受精卵に注入される。次に、トランスジェニック樹立系統はＮＳＧと交配されてＮＳＧ  ＨＳＶ−１−ｔｋ  Ｔｇ系統を樹立する。ＮＳＧ系統をＨＳＶ−１−ｔｋ導入遺伝子についてホモ接合にするためには、２つの系統を交雑させる。
【０１９２】
単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−１−ｔｋ）の細胞特異的発現は、トランスジェニックマウスでの標的化細胞型の条件付き除去を達成する簡単で高度に効率的な技法を提供する。除去は、ＨＳＶ−１−ｔｋを発現するトランスジェニック動物を抗ヘルペス薬のガンシクロビルで処置することにより誘導される。Ｃｓｆ１ｒプロモーターにより駆動されるＨＳＶ−１−ｔｋを発現するマウスの組織では、ガンシクロビルの投与により、マクロファージ系譜内の細胞が破壊されると予想される。ＨＳＶ−１−ｔｋを発現しない組織は薬物処置に非感受性である。
【０１９３】
ガンシクロビルは２’−デオキシグアノシンの合成アナログである。ガンシクロビルはまずウイルスキナーゼによりガンシクロビルモノホスフェートにリン酸化される。これに続いて、細胞キナーゼがガンシクロビルジホスフェートおよびガンシクロビルトリホスフェートの形成を触媒し、ガンシクロビルトリホスフェートはＣＭＶまたは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染細胞では非感染細胞での１０倍の濃度で存在している。ガンシクロビルトリホスフェートは、ＤＮＡへのデオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）組込みの競合的阻害剤であり、細胞ＤＮＡポリメラーゼよりも優先的にウイルスＤＮＡポリメラーゼを阻害する。さらに、ガンシクロビルトリホスフェートは、鎖伸張のための不十分な基質として働き、それによって第２の経路によりウイルスＤＮＡ合成を破壊する。トランスジェニックマウス（ＮＳＧ−Ｔｇ（Ｃｓｆ１ｒ−ＨＳＶ−１−ｔｋ））内のマクロファージは、ヘルペスウイルス感染細胞に類似してガンシクロビルにより死滅する。
【０１９４】
しかし、ＨＳＶ−１−ｋは特定のヌクレオシドアナログをリン酸化することができる。これらのヌクレオシドモノホスフェートは細胞キナーゼによりヌクレオシドトリホスフェートにリン酸化され、ＤＮＡに組み込まれて、このＤＮＡは次に細胞死をもたらす。マクロファージ死滅を誘導するため、ＮＳＧ−ＭＤ３マウスを、実験に先立って連続４日間抗ヘルペスガンシクロビルで処置した。図２は、ＮＳＧ対照マウスと比較したこれらのＨＳＶ−１−ｔｋ  Ｔｇマウスからの結果を図示する。再び、ＮＳＧ  ＭＤ３マウスにおいて生き延びたヒトＲＢＣの数は測定した時点でＮＳＧ対照よりも高かった。生データを対応ｔ検定にかけると、２４時間までのわずかな有意差（Ｐ＜０．０５）があった。
【０１９５】
図２：ＮＳＧ対ＮＳＧ  ＭＤ３。グラフは、ＮＳＧ  ＭＤ３（破線）と比較した場合のＮＳＧ内でのＲＢＣ生存（実線）を示す。ＮＳＧ  ＭＤ３マウスはＮＳＧよりも高い割合でヒトを保持していた。データは２４時間まで有意であった（Ｐ値＜０．０５）。腹腔内注射。
【０１９６】
Ｂ６．１２９Ｓ−Ｒａｇ１＜ｔｍ１Ｍｏｍ＞ＣＤ４７  ＫＯ  Ｉｌ２ｒｇ＜ｔｍ１Ｗｊｌ＞／Ｓｚ（ＢＬ／６  ＲａｇガンマＭＤ４）
【０１９７】
生成されたすべてのマウスの間で、これがＢＬ／６バックグラウンドの唯一のマウス系統であった。さらに、このマウスはそのゲノムからＣＤ４７がノックアウトされている。マウスＲＢＣは身体全体で遍在的に発現されるＣＤ４７を発現する。ＣＤ４７は阻害免疫受容体と相互作用する。これは制御シグナルを管理する係合であり、このシグナルは次に細胞の食作用を阻害する。本質的には、このタンパク質は「ｄｏｎ’ｔ−ｅａｔ−ｍｅ」シグナルとして機能する。ヒトＲＢＣはＣＤ４７を発現するが、これはマウスＣＤ４７と相同ではない。この相同性の欠如は主に、ヒトＲＢＣを外来性だと認識し、続いて排除する原因となるものである。図３は、ＮＳＧ対照マウスと比較した場合のこれらのＢＬ／６  ＲａｇガンマＭＤ４マウスを図示する。
【０１９８】
興味深いことに、ヒトＲＢＣは、ＮＳＧ対照よりもこれらのＢＬ／６  ＲａｇガンマＭＤ４マウス内において速く排除された。
【０１９９】
図３：ＮＳＧ対ＢＬ／６  ＲａｇガンマＭＤ４。グラフはＢＬ／６  ｒａｇガンマＭＤ４（破線）と比較した場合のＮＳＧ内でのＲＢＣ生存（実線）を示す。ＢＬ／６  ＲａｇガンマＭＤ４  ＫＯマウスはＮＳＧよりも高い割合でヒトを保持していなかった。データは有意であった（Ｐ値＞０．０１）。腹腔内注射。
【０２００】
ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ＞ＣＤ４７  ＫＯ  Ｉｌ２ｒｇ＜ｔｍ１Ｗｊｌ＞Ｔｇ（ｈＭＤ２）Ｓｚ／Ｓｚ（ＮＳＧ  ＭＤ２）
【０２０１】
ＢＬ／６  ＲａｇガンマＭＤ４マウスに類似して、ＮＳＧ  ＭＤ２マウスはＣＤ４７のマウスバージョンをコードする遺伝子がノックアウトされていた。この遺伝子改変に加えて、ＣＤ４７のヒトバージョンはそれぞれのゲノム内でノックアウトされている。
【０２０２】
これらのマウスの生成では、ＣＤ４７ノックアウト対立遺伝子（例えば、Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇら、Ｌｅｔｈａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ａｎｅｍｉａ  ｉｎ  ＣＤ４７−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｏｎｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  （ＮＯＤ）  ｍｉｃｅ、Ｂｌｏｏｄ、２００２年５月１５日；９９巻（１０号）：３５００〜４頁参照）をＮＳＧバックグラウンドに戻し交配して、ＮＳＧ  ＣＤ４７ノックアウトマウスを生成した。ヒトＣＤ４７をコードしている細菌人工染色体、ＢＡＣ  ＲＰ１１−１２１Ａ９を、ＮＯＤ×ＮＯＤｓｃｉｄ受精卵に注入した。３２個の潜在的樹立系統のうち１つのトランスジェニックが存在していた。この樹立系統はＮＳＧと交配されてＮＳＧヒトＣＤ４７Ｔｇ系統を樹立した。ＮＳＧ系統をマウスＣＤ４７  ＫＯおよびヒトＣＤ４７導入遺伝子についてホモ接合にするため、２つの系統を交雑させ、ＣＤ４７対立遺伝子のすべてをホモ接合性に固定した。
【０２０３】
図４は、ＮＳＧ対照マウスと比較した場合のこれらのＮＳＧ  ＭＤ２を図示する。
【０２０４】
マウスのＮＳＧ  ＭＤ２系統を用いた複数の実験では、有意なデータが得られ、ヒトＣＤ４７をＮＳＧマウスに遺伝子導入によって導入するとＲＢＣ生存が有効に改善された。図４にあるように、一方で、ＮＳＧマウスでのヒトＲＢＣ生存はわずかに４０時間を上回る時間しか続かなかったが、ＮＳＧ  ＭＤ２マウスでのヒトＲＢＣ生存はほぼ１００時間続いた（Ｐ値：０．００９）。
【０２０５】
図４：ＮＳＧ対ＮＳＧ  ＭＤ２。グラフは、ＮＳＧ  ＭＤ２マウス（破線）と比較した場合のＮＳＧ内でのＲＢＣ生存（実線）を示す。ＮＳＧ  ＭＤ２マウスはＮＳＧよりも高い割合でヒトを保持していた。データは有意であった（Ｐ値＜０．００１）。腹腔内注射。
【０２０６】
図５は、いくつかの異なる遺伝子改変免疫不全系統でのヒトＲＢＣ生存を比較している結果を示す。見られるように、データは、９６時間までＮＳＧ  ＭＤ１およびＭＤ２マウス内で循環するヒトＲＢＣを実証している。
【０２０７】
図５：ＮＳＧ対ＮＳＧ  ＭＤ１対ＮＳＧ  ＭＤ２対ＢＬ／６  ＲａｇガンマＭＤ４。比較は試験された複数の系統を一度に示す。腹腔内注射。
【０２０８】
本明細書で言及された任意の特許または刊行物は、あたかもそれぞれ個々の刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示される場合と同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０９】
本明細書に記載される組成物および方法は、現時点での好ましい実施形態の代表例であり、これらは例示的なものであって本発明の範囲を限定するものとして意図されない。当業者であれば、その中での変更および他の使用を思い付くものと予想される。特許請求の範囲で述べた本発明の範囲を逸脱することなく、そのような変更および他の使用を行うことが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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