(57)【要約】  小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞、ならびにＳＭＳ細胞の培養方法、単離方法および使用方法を開示する。さらに、ＳＭＳ細胞を未分化な状態で長期間にわたって培養する方法、タンパク質や細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質などの様々な分子を製造するためにＳＭＳ細胞を使用する方法、およびマイクロ流体デバイスにおけるＳＭＳ細胞の使用を開示する。
2019513416.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞集団を培養する方法であって、
単離されたＳＭＳ細胞集団を、好ましくは未分化な状態で維持可能な条件下において、増殖培地中で懸濁培養することを含む方法。
【請求項２】
前記増殖培地が高糖濃度基礎培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記高糖濃度基礎培地が、仔ウシ血清、インスリンまたはその組み合わせをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記単離されたＳＭＳ細胞集団を５％ＣＯ２下、３７℃で培養する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記単離されたＳＭＳ細胞集団をポリプロピレン製チューブで培養し、それにより該ＳＭＳ細胞の接着を阻害する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記単離されたＳＭＳ細胞集団が臍帯血、末梢血、骨髄または固形組織から単離されたものであり、たとえば、ヒト、霊長類、ネコおよびイヌなどの家庭動物、またはラクダ、ウマ、ブタ、ウシなどの哺乳動物の末梢血から単離されたものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記固形組織が、胎盤、肝臓、心臓、脳、腎臓または消化管組織である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＳＭＳ細胞集団を、フラスコ、容器、チャンバー、流路、チューブ、ベッセル、ニッチまたはバイオリアクターに導入し、任意で、前記単離されたＳＭＳ細胞集団を培養するための前記増殖培地を流動および／または循環させる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記フラスコ、容器、チャンバー、流路、チューブ、ベッセル、ニッチまたはバイオリアクターの表面を前処理することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記前処理が、前記表面に所定の幾何学的形状をエッチングすることを含み、該幾何学的形状が前記ＳＭＳ細胞を組織化させるためのガイドとして機能する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記幾何学的形状が、線状、網状、溝状、隆起状またはその他の形状である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記流路が、マイクロ流体デバイスに組み込まれたマイクロ流路である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養後に遠心分離または濾過を行い、前記単離されたＳＭＳ細胞集団を単離または継代することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子産物をコードする遺伝子、好ましくは成長因子、サイトカイン、ペプチドホルモン、タンパク質ホルモン、酵素、タンパク質断片、細胞外マトリックスタンパク質などのタンパク質をコードする遺伝子を、前記単離されたＳＭＳ細胞集団にトランスフェクトすることをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子産物が、インスリン成長因子２、インターロイキン６、インスリン、副甲状腺ホルモン、コラゲナーゼ、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、アグリン、ニドゲンおよびエンタクチンからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子産物を単離または精製することさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記単離された懸濁状態のＳＭＳ細胞集団を接着細胞から分離する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記単離されたＳＭＳ細胞集団を５％ＣＯ２下、３７℃で培養する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
分化した細胞の塊を低速遠心分離によって除去することをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記単離された懸濁状態のＳＭＳ細胞集団を分画遠心法によって単離する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
分子を製造するために、単離された小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞集団を使用する方法であって、
単離されたＳＭＳ細胞集団、たとえば請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法によって得られる単離された懸濁状態のＳＭＳ細胞集団を提供すること；および
分子を産生するように、前記単離されたＳＭＳ細胞集団を誘導すること
を含む方法。
【請求項２２】
前記分子が、成長因子、サイトカイン、ペプチドホルモン、タンパク質ホルモン、細胞外マトリックスタンパク質などのタンパク質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記分子が、インスリン成長因子２、インターロイキン６、インスリン、副甲状腺ホルモン、コラゲナーゼ、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、アグリン、ニドゲンおよびエンタクチンからなる群から選択される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質が、第XIII凝固因子Ａ鎖、アポリポタンパク質Ｅ、アンチトロンビンIII、骨形成タンパク質１（BMP-1）、ビトロネクチン、acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A（ANP32A）、カルシニューリン様ホスホエステラーゼ、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、β−エノラーゼ、fermitin family homolog 1、微小管関連タンパク質RP/EB（MAPRE1）、熱ショックタンパク質、LIM and senescent cell antigen-like-containing domain protein 1（LIMS1）、ミオシン調節タンパク質、プロフィリン−１、グリコーゲンホスホリラーゼ、フラビンレダクターゼ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、チューブリン、細胞内クロライドチャネルタンパク質、wings apart-like protein homolog（WAPAL）、cell division control protein、オステオポンチン、BPI fold-containing、伸長因子、プラスミノゲン、アルド−ケトレダクターゼもしくはケラチン、または前記１種以上のタンパク質の断片である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞の誘導を１種以上の化学誘導物質を用いて行う、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記１種以上の化学誘導物質が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ブチルヒドロキシアニソール、β−メルカプトエタノール、アスコルビン酸−２−リン酸エステル、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸塩、ジメチルスルホキシド、インスリン、イソブチルメチルキサンチンもしくはインドメタシン、またはこれらの組み合わせである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記化学誘導物質が、０．１μＭのデキサメタゾン、０．０５ｍＭのアスコルビン酸−２−リン酸エステルおよび１０ｍＭのβ−グリセロリン酸塩を含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
単離された未分化の小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞集団を分化誘導する方法であって、
単離された未分化のＳＭＳ細胞集団、たとえば請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法によって得られる単離された懸濁状態のＳＭＳ細胞集団を提供すること；および
前記単離された未分化のＳＭＳ細胞集団を１種以上の化学誘導物質と接触させて、１種以上の分化細胞、組織、組織様構造、オルガノイドまたは器官に分化誘導すること
を含む方法。
【請求項２９】
前記１種以上の化学誘導物質が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ブチルヒドロキシアニソール、β−メルカプトエタノール、アスコルビン酸−２−リン酸エステル、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸塩、ジメチルスルホキシド、インスリン、イソブチルメチルキサンチンおよびインドメタシンからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
３Ｄバイオプリンティング装置を使用して、空間制御された細胞パターンを作製するプロセスのための基材として小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞を使用する方法であって、
単離された未分化のＳＭＳ細胞集団、たとえば請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法によって得られる単離された懸濁状態のＳＭＳ細胞集団を提供すること；および
基材としての前記単離された未分化のＳＭＳ細胞集団と３Ｄバイオプリンティング装置とを使用して、空間制御された細胞パターンを作製すること
を含む方法。
【請求項３１】
前記３Ｄバイオプリンティング装置が、BioBot1（登録商標）、3D-Bioplotter（登録商標）、3DS Alpha（登録商標）および3Dynamic Omega（登録商標）からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞を使用して、培養物中で細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を製造する方法であって、
単離された未分化のＳＭＳ細胞集団、たとえば請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法によって得られる単離された懸濁状態のＳＭＳ細胞集団を提供すること；および
ＥＣＭタンパク質を産生するように、前記単離された未分化のＳＭＳ細胞集団を誘導すること
を含む方法。
【請求項３３】
前記単離された未分化のＳＭＳ細胞集団と、ＥＣＭタンパク質の産生を誘導する１種以上の化学誘導物質とを接触させることによって、前記単離された未分化のＳＭＳ細胞集団におけるＥＣＭタンパク質の産生を誘導し、
前記１種以上の化学誘導物質が、たとえば、ヘッジホッグ阻害剤、ＴＧＦ／ＢＭＰ活性化因子、アスコルビン酸、前記増殖培地中に含まれている血清、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ブチルヒドロキシアニソール、β−メルカプトエタノール、アスコルビン酸−２−リン酸エステル、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸塩、ジメチルスルホキシド、インスリン、イソブチルメチルキサンチンおよびインドメタシンならびに／またはポリスチレンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記産生されたＥＣＭタンパク質が、懸濁状態のＥＣＭタンパク質と接着状態のＥＣＭタンパク質の一方または両方を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記懸濁状態のＥＣＭタンパク質を、たとえば遠心分離、濾過、沈殿などによって単離すること、および／または前記接着状態のＥＣＭタンパク質を、たとえば培養ベッセルから掻き取ることなどによって単離することをさらに含む、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記単離されたＥＣＭから残存細胞を溶解または除去することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＥＣＭタンパク質が、アグリン、ニドゲン、カドヘリン、クラスリン、コラーゲン、ディフェンシン、エラスチン、エンタクチン、フィブリリン、フィブロネクチン、ケラチン、ラミニン、微小管アクチン架橋因子１（microtubule-actin cross-linking factor 1）、SPARC様タンパク質、ネスプリン（ネスプリン−１、ネスプリン−２、ネスプリン−３）、fibrous sheath-interacting protein、ミオメシン、ネブリン、プラコフィリン、インテグリン、タリン、エクスポーチン、トランスポーチン、テネイシン、パールカン、ソルチリン関連受容体、テンシン、タイチン、トータルタンパク質および／または前記１種以上のタンパク質の断片からなる群から選択される、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＥＣＭタンパク質を、たとえば凍結、凍結乾燥、架橋、乾燥および／または微粉砕によって、改変することをさらに含む、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記改変されたＥＣＭタンパク質が、インビトロまたはインビボにおける細胞増殖または細胞分化の促進に適したものである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記単離された未分化のＳＭＳ細胞集団を足場上で培養し、該足場が好ましくは多孔性および／または移植可能な足場であり、たとえば、脱細胞化された天然の骨、脱細胞化された軟らかいコラーゲン、脱細胞化された器官、キトサン、脱灰化された骨基質、膜バリア同種移植片またはこれらの組み合わせを含む足場である、請求項３２〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記足場が、合成、半合成または天然の足場である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
軟部組織を製造する方法であって、
単離された未分化のＳＭＳ細胞集団、たとえば請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法によって得られる単離された懸濁状態のＳＭＳ細胞集団を末梢血の存在下で培養すること；
ゲル様構造を形成させること；
形成されたゲル様構造を凍結すること；
凍結したゲル様構造を解凍すること；および
解凍したゲル様構造を培養して軟部組織様構造を形成させること
を含む方法。
【請求項４３】
前記凍結工程が−２０℃で行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞の培養物から得られる１種以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を含む組成物。
【請求項４５】
前記１種以上のＥＣＭタンパク質が変性されたものである、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記１種以上のＥＣＭタンパク質が、アセチル化、アシル化、カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、脂質化、メチル化、ペグ化、リン酸化、プレニル化、硫酸化またはユビキチン化によって改変されたものである、請求項４４または４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記１種以上のＥＣＭタンパク質が、アグリン、ニドゲン、カドヘリン、クラスリン、コラーゲン、ディフェンシン、エラスチン、エンタクチン、フィブリリン、フィブロネクチン、ケラチン、ラミニン、微小管アクチン架橋因子１（microtubule-actin cross-linking factor 1）、SPARC様タンパク質、ネスプリン（ネスプリン−１、ネスプリン−２、ネスプリン−３）、fibrous sheath-interacting protein、ミオメシン、ネブリン、プラコフィリン、インテグリン、タリン、エクスポーチン、トランスポーチン、テネイシン、パールカン、ソルチリン関連受容体、テンシン、タイチン、トータルタンパク質および／または前記１種以上のタンパク質の断片からなる群から選択される、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記１種以上のＥＣＭタンパク質が、細菌および真菌などの微生物の増殖を抑制する化合物を含む、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記微生物の増殖を抑制する化合物が、コレクチン、Ｃ型レクチンファミリー４、セプチン１２および膵リボヌクレアーゼからなる群から選択される抗微生物タンパク質である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
エアロゾル剤、クリーム剤、乳剤、フォーム剤、起泡性液剤、ゲル剤、ローション剤、軟膏剤、ペースト剤、塗布剤、血清製剤、液剤またはスプレー剤として製剤化される、請求項４４〜４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
請求項４４〜５０のいずれか一項に従って調製された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を含む組成物を含む創傷被覆材を含む創傷治癒システム。
【請求項５２】
前記創傷被覆材が、包帯、ワイプ、ガーゼ、スポンジ、メッシュ、パッド、絆創膏または吸収性創傷被覆材である、請求項５１に記載のシステム。
【請求項５３】
前記ＥＣＭタンパク質が、アグリン、ニドゲン、カドヘリン、クラスリン、コラーゲン、ディフェンシン、エラスチン、エンタクチン、フィブリリン、フィブロネクチン、ケラチン、ラミニン、微小管アクチン架橋因子１（microtubule-actin cross-linking factor 1）、SPARC様タンパク質、ネスプリン（ネスプリン−１、ネスプリン−２、ネスプリン−３）、fibrous sheath-interacting protein、ミオメシン、ネブリン、プラコフィリン、インテグリン、タリン、エクスポーチン、トランスポーチン、テネイシン、パールカン、ソルチリン関連受容体、テンシン、タイチン、トータルタンパク質および／または前記１種以上のタンパク質の断片からなる群から選択される、請求項５１または５２に記載のシステム。
【請求項５４】
創傷を治療する方法であって、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の組成物または請求項５１〜５３のいずれか一項に記載のシステムに創傷を接触させることを含む方法。
【請求項５５】
タンパク質を製造する方法であって、
単離された未分化の小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞集団を、ベッセルに入れた増殖培地中で培養すること；および
タンパク質の産生を誘導すること
を含む方法。
【請求項５６】
前記細胞をＣＯ２の非存在下で培養する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞を抗生物質の非存在下で培養する、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞を３００ｍＬ〜５００Ｌの培地中で培養する、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記タンパク質が、第XIII凝固因子Ａ鎖、アポリポタンパク質Ｅ、アンチトロンビンIII、骨形成タンパク質１（BMP-1）、ビトロネクチン、acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A（ANP32A）、カルシニューリン様ホスホエステラーゼ、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、β−エノラーゼ、fermitin family homolog 1、微小管関連タンパク質RP/EB（MAPRE1）、熱ショックタンパク質、LIM and senescent cell antigen-like-containing domain protein 1（LIMS1）、ミオシン調節タンパク質、プロフィリン−１、グリコーゲンホスホリラーゼ、フラビンレダクターゼ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、チューブリン、細胞内クロライドチャネルタンパク質、wings apart-like protein homolog（WAPAL）、cell division control protein、オステオポンチン、BPI fold-containing、伸長因子、プラスミノゲン、アルド−ケトレダクターゼ、ケラチンもしくは細胞外マトリックスタンパク質（ＥＣＭ）、または前記１種以上のタンパク質の断片である、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＥＣＭタンパク質が、アグリン、ニドゲン、カドヘリン、クラスリン、コラーゲン、ディフェンシン、エラスチン、エンタクチン、フィブリリン、フィブロネクチン、ケラチン、ラミニン、微小管アクチン架橋因子１（microtubule-actin cross-linking factor 1）、SPARC様タンパク質、ネスプリン（ネスプリン−１、ネスプリン−２、ネスプリン−３）、fibrous sheath-interacting protein、ミオメシン、ネブリン、プラコフィリン、インテグリン、タリン、エクスポーチン、トランスポーチン、テネイシン、パールカン、ソルチリン関連受容体、テンシン、タイチン、トータルタンパク質および／または前記１種以上のタンパク質の断片である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ベッセルによって懸濁液中のＳＭＳ細胞の増殖が促進される、請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ベッセルが、ポリプロピレン製ベッセル、前処理されたシリコーン加工ベッセル、または懸濁液中のＳＭＳ細胞の増殖を促進するベッセルである、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ベッセルによって細胞接着が促進される、請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞の誘導を１種以上の化学誘導物質を用いて行う、請求項５５〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記１種以上の化学誘導物質が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ブチルヒドロキシアニソール、β−メルカプトエタノール、アスコルビン酸−２−リン酸エステル、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸塩、ジメチルスルホキシド、インスリン、イソブチルメチルキサンチンもしくはインドメタシンまたはこれらの組み合わせである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記化学誘導物質が、０．１μＭのデキサメタゾン、０．０５ｍＭのアスコルビン酸−２−リン酸エステルおよび１０ｍＭのβ−グリセロリン酸塩を含む、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
細管構造または脈管構造を製造する方法であって、
ＳＭＳ細胞に由来する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）とともに内皮細胞を培養することを含み、
該内皮細胞が前記ＳＭＳ由来ＥＣＭ内へと遊走して該ＳＭＳ由来ＥＣＭと相互作用し、その結果、細管構造または脈管構造が形成されることを特徴とする方法。
【請求項６８】
細胞集団による脈管形成、血管新生または動脈新生を誘導、促進または支援する薬剤または化合物を選択する方法であって、
ＳＭＳ細胞から産生された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、たとえば前記請求項のいずれか一項に従って製造されるＥＣＭなどを提供すること；
脈管形成能、血管新生能または動脈新生能を有する細胞（たとえば内皮細胞など）を含む第１の細胞集団に、前記ＳＭＳ細胞から産生された前記ＥＣＭを接触させること；
前記ＥＣＭと接触させた第１の細胞集団を薬剤または化合物と接触させること；および
前記薬剤または化合物と接触させた後の、前記ＥＣＭと接触させた第１の細胞集団における脈管形成、血管新生または動脈新生の質または量を、前記薬剤または化合物と接触させずに前記ＥＣＭ上で培養した好ましくは第１の細胞集団と同じ細胞腫の第２の細胞集団と比較することによって、前記薬剤または化合物が第１の細胞集団において脈管形成、血管新生または動脈新生を誘導、促進または支援するかどうかを判断すること
を含み、
第２の細胞集団と比較して、第１の細胞集団における脈管形成、血管新生または動脈新生の量が多く、またはそれらの質が高い場合、細胞集団による脈管形成、血管新生または動脈新生を誘導、促進または支援する薬剤または化合物として前記薬剤または化合物が選択されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2016年3月29日に出願された米国仮特許出願第62/314,874号に基づく優先権を主張するものであり、この出願の内容は参照により本明細書に明示的に援用される。
【０００２】
本開示は、概して、小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞として同定される幹細胞の集団を培養する方法、該幹細胞集団を単離する方法、および該幹細胞集団を使用する方法、ならびに該幹細胞集団を使用した組成物に関する。より具体的には、本開示は、ＳＭＳ細胞を未分化な状態で長期間培養する方法、ＳＭＳ細胞を使用して細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質などの様々な分子を製造する方法、およびマイクロ流体デバイスにおけるＳＭＳ細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
幹細胞は、細胞分裂によって長期間にわたり自己複製することができる未熟な未分化細胞である。特定の条件下では、幹細胞は成熟した機能性細胞へと分化することができる。
【０００４】
現在、医学研究において幹細胞やこの細胞から分化誘導された細胞の使用は大きな関心を集めており、特に、遺伝性疾患、遺伝性障害および／または遺伝性病態などの様々な要因によって損傷を受けた組織を治療するための薬剤の提供が期待されている。幹細胞は、非対称分裂能、自己複製能および様々な細胞腫への分化能を有する。理論上、幹細胞は、任意の生物種の損傷細胞や損傷組織を補填することができると考えられている。このような再生プロセスは、あらゆる多細胞生物に本質的に存在するものであり、様々な程度で見られる。しかし、ヒトでは、幹細胞の再生能や修復能は器官によって大幅に異なり、心臓や脳などの生命の維持に不可欠な器官の多くは、損傷を受けても自然に治癒することはほとんどない。
【０００５】
再生医療での使用を目的として、様々な組織からヒト幹細胞を単離および同定することに多大な努力が費やされてきた。骨髄移植が数十年間にわたり成功を収めていたことから、当初は骨髄から幹細胞を同定することに注力された。米国特許第5,750,397号では、リンパ球系細胞、赤血球系細胞および骨髄単球系細胞に分化できるとされているヒト造血幹細胞の単離および培養が開示されている。米国特許第5,736,396号では、単離されたヒト間葉系幹細胞を、適切な成長因子および／または分化因子の影響下で系統特異的に分化誘導する方法が開示されている。分化誘導された細胞は、間葉組織の再生または修復を目的として宿主に導入することができる。
【０００６】
さらに別の分野として、胚性幹（ＥＳ）細胞の使用も関心を集めている。マウスＥＳ細胞は、あらゆる種類のマウス細胞に分化する能力があることが示されている。マウスＥＳ細胞は、胚盤期マウスの初期胚から取り出した内部細胞塊に由来する。その他の万能性細胞および／または全能性細胞は胚組織（たとえば原始生殖細胞（ＰＧＣ））から単離されている。ヒトＥＳ（ｈＥＳ）細胞の開発は、残念ながらマウスＥＳ細胞ほどには成功を収めていない。
【０００７】
ｈＥＳ細胞の使用に付随する倫理的問題に加えて、再生治療おけるＥＳ細胞や他の万能性細胞の使用には他にも重大な課題が存在する。これらの万能性細胞を使用して対象を治療するためには、特定の細胞種へと増殖および分化させる必要があるが、その制御は簡単ではない。ＥＳ細胞の分化誘導における成長因子の作用については報告がいくつかなされている。たとえば、Schuldinerらは、ｈＥＳ細胞から様々な細胞への分化誘導における８種の成長因子の作用について報告している（Schuldiner et al. (2000) 97 PNAS USA 11307-11312）。この報告によれば、胚様体形成を経て分化が開始されたｈＥＳ細胞が、ｂＦＧＦ、ＴＧＦｐｉ、アクチビンＡ、ＢＭＰ−４、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＰＮＧＦまたはレチノイン酸の存在下で培養された。これらの成長因子はいずれも分化経路に対して特有の作用を示したが、ｈＥＳ細胞から１種の細胞のみへの分化を可能とした成長因子はなかった。さらに、現在のＥＳ細胞株（特にヒトＥＳ細胞株）の単離方法では、対象から細胞を単離して同じ対象へと戻す方法（自家移植）は検討されていない。対象自身の細胞を使用することができれば、移植に付随する免疫抑制療法が不要となり、免疫能を損なう恐れがなくなると考えられる。
【０００８】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）などのヒト成体幹細胞は、いくつかの系統へと分化する能力があることが示されており、たとえば、骨（Haynesworth et al. (1992) 13 Bone 81-88）、軟骨（Mackay et al. (1998) 4 Tissue Eng 415-28; Yoo et al. (1998) 80 J Bone Joint Surg Am 1745-57）、脂肪組織（Pittenger et al. (2000) 251 Curr Top Microbiol lmmunol 3-11）、腱（Young et al. (1998) 16 J Orthop Res 406-13）、筋肉および間質（Caplan et al. (2001) 7 Trends Mol Med 259-64）などに分化することができる。
【０００９】
別の細胞集団として、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）も骨髄から精製されている（BM; Reyes et al. (2001) 98 Blood 2615-2625; Reyes & Verfaillie (2001) 938 Ann NY AcadSci 231-235）。ＭＡＰＣは、１００回以上の集団倍加数までインビトロで増殖可能であることが示されている。また、ＭＡＰＣは、所定の培養状態下で様々な間葉系細胞（たとえば骨芽細胞、軟骨芽細胞、脂肪細胞および骨格筋芽細胞）や、内皮細胞、神経外胚葉細胞に分化誘導可能であることが示されており、最近では肝細胞にも分化誘導可能であることが報告されている（Schwartz et al. (2000) 109 J Clin Invest 1291-1302）。
【００１０】
ヒトにおけるインビボ実験では、ＣＤ３４＋末梢血（ＰＢ）幹細胞を移植すると、ドナー由来の肝細胞（Korbling et al. (2002) 346 N Engl J Med 738-746）、上皮細胞（Korbling et al. (2002) 346 N Engl J Med 738-746）および神経細胞（Hao et al. (2003) 12 J Hematother Stem Cell Res 23-32）が発生することが示された。さらに、ヒトＢＭ由来細胞は心筋梗塞を発症した心筋の再生に寄与することが示されている（Stamm et al. (2003) 361 Lancet 45-46）。現在、間葉系幹細胞などの成体幹細胞は、様々な疾患の臨床試験において広く検討されている（Ali et al. (2012) 2 (1) Stem Cell Discovery 15-23）。
【００１１】
極小胚様幹細胞（ＶＳＥＬ）は、非常に原始的な形態を持ち、マウスおよびヒトにおいて万能性幹細胞マーカー（たとえばOct4、NanogおよびSSEA-4）やScal+/CD133+Lin-CD45-の細胞表面表現型を発現するまれな細胞集団である。ＶＳＥＬは、急性心筋梗塞の発症後に末梢血中へと遊走することができ（Kucia et al. (2008) 26 Stem Cells 2083-2092）、心機能を向上させて心臓リモデリングを抑制することが報告されている（Dawn et al. (2008) 26 Stem cells 1646-55, Zuba-Surma et al. (2011) 15 J Cell Mol Med 1319-28）。
【００１２】
ＶＳＥＬを培養する試みは失敗に終わっており、このことから何人かの研究者の間ではヒト体内のＶＳＥＬの存在を疑問視する声が上がっている（Danova et al. (2012) 7 PLoS One e34899）。Guら（2013）や他の研究者は、通常の培養条件を使用してインビトロでヒトＶＳＥＬを増殖させたり培養したりすることは非常に困難であることを見出した。このように、ＶＳＥＬが、成体組織で見出される単なる発生段階の残余物であり、再生医療には効果的に利用できないものなのか、それとも再生医療に適した幹細胞集団として実際に存在するのかはいまだ不明である。
【００１３】
概して、骨髄以外の組織から成体幹細胞を得ることは依然として困難であり、特に、自家移植のために十分な量の成体幹細胞を提供することは難しい。これに対して、他人の幹細胞を移植する非自家細胞移植は、免疫拒絶反応に関連した問題が生じやすく、移植後に免疫抑制療法が必要とされる。十分な量の幹細胞を提供するための別の手段として、成体幹細胞のエクスビボ培養が行われている。しかしながら、成体幹細胞は培養条件に比較的敏感であり、培養を成功させるには培養条件の厳密な制御が必要となる（Bhattacharya et al, (2009) Frontiers of cord blood science, Springer-Verlag London Limited）。
【００１４】
近年、小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞が単離され、その特性が評価された。WO2014/200940では、ＳＭＳ細胞は直径４．５〜５．５μｍの接着細胞であると報告されており、臍帯、末梢血、骨髄、固形組織などの供給源から得られる。さらに、ＳＭＳ細胞は運動性が高い。
【００１５】
ＳＭＳ細胞は、薬理学および再生医療分野の基礎科学研究において大きな可能性を秘めているが、ＳＭＳ細胞を様々な用途に使用するためにはさらなる開発が待たれる。未分化ＳＭＳ細胞の増殖制御の改良や、分化を制御して特定の種類の成熟機能細胞からなる純粋培養を得るための方法およびツールの開発が必要である。
【００１６】
ＥＣＭは、高等脊椎動物由来の様々な細胞（たとえば、皮膚、筋肉、神経、結合組織、筋膜、硬膜または腹膜に由来する細胞）が接着して毒性や細胞複製阻害を引き起こすことなく増殖することが可能な化学材料または生化学材料から構成される構造、足場または土台である。ＥＣＭの成分としては、プロテオグリカン、糖タンパク質、プロテオグリカン以外の糖類、および線維が挙げられる。
【００１７】
生理学的観点から見れば、組織の再生や治癒にＥＣＭは必須である。たとえば、ヒト胎児では、ＥＣＭは幹細胞と共同して人体の各部位を成長および再生させており、胎児が子宮内でなんらかの障害を受けたとしても再生することができる。しかし、発達が完了するとＥＣＭはその機能を停止する。
【００１８】
ＥＣＭは医療用途でも有用であり、炎症を伴う損傷に対する免疫応答を抑制することによる損傷修復や組織再生に使用することができる。さらにＥＣＭは、瘢痕組織を形成する代わりに、周囲の細胞に作用して組織の修復を促すことができる。このような場合、ブタの膀胱などの供給源から抽出されたＥＣＭを脱細胞化して使用することが多い。同様の用途としては、潰瘍の治療、再建手術および損傷修復が挙げられる。また、ＥＣＭ粉末を組織再生に使用することもできる。
【００１９】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質は、幹細胞および前駆細胞を未分化な状態で維持培養したり、インビトロで上皮細胞、内皮細胞および平滑筋細胞への分化を誘導したりすることを目的として細胞培養系においてよく使用される。また、ＥＣＭタンパク質は、腫瘍発生のモデル化のためのインビトロ３Ｄ細胞培養の支持体として使用することもできる。
【００２０】
したがって、細胞療法分野において、様々な用途に適した移植可能な細胞集団を未分化な状態で維持するための新規な方法が依然として必要とされている。さらに、簡便で安価かつ効率的に、培養物中においてＥＣＭタンパク質が製造可能となることが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本開示は、小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞を、適切な条件下において未分化な状態で長期間維持可能であることを示す。このことから、分化誘導や様々な分子の発現が必要となるときまで、ＳＭＳ細胞を簡便に長期間培養することができる。
【００２２】
したがって、本開示は、ＳＭＳ細胞集団を、未分化な状態で維持可能な条件下において培養する方法に関する。この方法は、単離されたＳＭＳ細胞集団を、好ましくは未分化な状態で維持可能な条件下において、増殖培地中で懸濁培養することを含む。いくつかの実施形態において、前記ＳＭＳ細胞を培養するための増殖培地は高糖濃度基礎培地である。いくつかの実施形態において、前記高糖濃度基礎培地は、仔ウシ血清、インスリンまたはその両方をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたＳＭＳ細胞集団を５％ＣＯ２下、３７℃で培養する。前記ＳＭＳ細胞を表面に接着させずに培養するには、たとえば、ポリスチレン製ではなく、ポリプロピレン製のプラスチックなどの表面が必要である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、前記単離されたＳＭＳ細胞集団は、臍帯血、末梢血、骨髄または固形組織から単離されたものである。いくつかの実施形態において、前記固形組織は、胎盤、肝臓、心臓、脳、腎臓または消化管組織である。前記ＳＭＳ細胞集団は、ヒト、霊長類、ネコおよびイヌなどの家庭動物、またはラクダ、ウマ、ブタ、ウシなどの哺乳動物の末梢血から単離されたものであってもよい。
【００２４】
いくつかの実施形態において、遺伝子産物をコードするＳＭＳ細胞を培養する前記方法は、該遺伝子産物を単離または精製することをさらに含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、前記単離された懸濁状態のＳＭＳ細胞集団を接着細胞から分離する。いくつかの実施形態では、前記方法は、分化した細胞の塊を低速遠心分離によって除去することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記単離された懸濁状態のＳＭＳ細胞集団を分画遠心法によって単離する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ＳＭＳ細胞を未分化な状態で培養する前記方法は、前記培養後に遠心分離または濾過を行い、前記単離されたＳＭＳ細胞集団を単離または継代することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この遠心分離は、３０００×ｇ、３５００×ｇ、４０００×ｇ、４１００×ｇ、４２００×ｇ、４３００×ｇ、４５００×ｇもしくは５０００×ｇ、またはこれらの速度のいずれか２つによって定義される範囲内の速度で行い、遠心時間は、４２００×ｇで１５分間遠心分離を行った場合と同等となるように調整する。いくつかの実施形態において、前記濾過は分別濾過によって行い、孔径の大きいフィルターを使用して濾過を開始し、徐々にフィルターの孔径を小さくしていく。いくつかの実施形態では、約３〜５μｍの孔径を有するフィルターを使用してＳＭＳ細胞を捕捉する。特に、未分化のＳＭＳ細胞は懸濁液中で塊を形成しないことから、濾過によって容易に単離することができる。
【００２７】
いくつかの実施形態において、前記ＳＭＳ細胞集団を、フラスコ、容器、チャンバー、流路、チューブ、ベッセル、ニッチまたはバイオリアクターに導入し、任意で、培地を流動および／または循環させる。いくつかの実施形態では、前記ＳＭＳ細胞を、フラスコ、容器、チャンバー、流路、チューブ、ベッセル、ニッチまたはバイオリアクターで培養する。いくつかの実施形態では、前記ＳＭＳ細胞を、フラスコ、容器、チャンバー、流路、チューブ、ベッセル、ニッチまたはバイオリアクターに播種する。いくつかの実施形態では、前記ＳＭＳ細胞を、フラスコ、容器、チャンバー、流路、チューブ、ベッセル、ニッチまたはバイオリアクターに入れ、使用するまで凍結または保存しておく。いくつかの実施形態では、前記フラスコ、容器、チャンバー、流路、チューブ、ベッセル、ニッチまたはバイオリアクターの表面を前処理する。いくつかの実施形態において、前記フラスコ、容器、チャンバー、流路、チューブ、ベッセル、ニッチまたはバイオリアクターの表面に施される前記前処理は、該表面に１つ以上の所定の幾何学的形状をエッチングすることを含み、該１つ以上の幾何学的形状は前記ＳＭＳ細胞のガイドとして機能する。いくつかの実施形態において、前記表面に施されたエッチングによって、前記ＳＭＳ細胞の増殖および組織化が調整または誘導されるか、あるいは前記ＳＭＳ細胞の増殖および組織化を誘導するようなシグナルが出される。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の幾何学的形状は、線状、曲線状、網状、溝状、隆起状またはその他の形状である。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の幾何学的形状は、滑らかな形状または粗い形状である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、前記流路はマイクロ流路である。いくつかの実施形態において、前記マイクロ流路はマイクロ流体デバイスに組み込まれたものである。いくつかの実施形態において、前記マイクロ流体デバイスはマイクロ流体チップである。いくつかの実施形態において、前記マイクロ流体チップは、実験室で行われる１つ以上の操作を１枚のチップに組み込んだlab-on-a-chipデバイスである。いくつかの実施形態において、前記マイクロ流体デバイスは、細胞、組織、器官全体または器官系の活性、機構および生理反応を模擬したcell-on-a-chipデバイス、tissue-on-a-chipデバイスまたはorgan-on-a-chipデバイスである。
【００２９】
いくつかの実施形態において、前記ＳＭＳ細胞の培養方法は、遺伝子産物をコードする遺伝子、好ましくは成長因子、サイトカイン、ペプチドホルモン、タンパク質ホルモン、酵素、タンパク質断片、細胞外マトリックスタンパク質などのタンパク質をコードする遺伝子を、前記単離されたＳＭＳ細胞集団にトランスフェクトすることをさらに含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、前記遺伝子産物としては、たとえば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦおよびｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−II）、インターロイキンと呼ばれるサイトカイン群（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）、インターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦ）、インスリン、副甲状腺ホルモン、コラゲナーゼ、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、アグリン、ニドゲンおよびエンタクチン、もしくはこれらのバリアントならびに／またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３１】
いくつかの実施形態は、分子を製造するために、単離された小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞集団を使用する方法であって、
単離されたＳＭＳ細胞集団を提供すること、および
分子を産生するように、前記単離されたＳＭＳ細胞集団を誘導すること
を含む方法に関する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、前記分子は、成長因子、サイトカイン、ペプチドホルモン、タンパク質ホルモン、細胞外マトリックスタンパク質などのタンパク質である。
【００３３】
いくつかの実施形態において、前記分子としては、たとえば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦおよびｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−II）、インターロイキンと呼ばれるサイトカイン群（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）、インターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦ）、インスリン、副甲状腺ホルモン、コラゲナーゼ、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、アグリン、ニドゲンおよびエンタクチン、もしくはこれらのバリアントならびに／またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、第XIII凝固因子Ａ鎖、アポリポタンパク質Ｅ、アンチトロンビンIII、骨形成タンパク質１（BMP-1）、ビトロネクチン、acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A（ANP32A）、カルシニューリン様ホスホエステラーゼ、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、β−エノラーゼ、fermitin family homolog 1、微小管関連タンパク質RP/EB（MAPRE1）、熱ショックタンパク質、LIM and senescent cell antigen-like-containing domain protein 1（LIMS1）、ミオシン調節タンパク質、プロフィリン−１、グリコーゲンホスホリラーゼ、フラビンレダクターゼ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、チューブリン、細胞内クロライドチャネルタンパク質、wings apart-like protein homolog（WAPAL）、cell division control protein、オステオポンチン、BPI fold-containing、伸長因子、プラスミノゲン、アルド−ケトレダクターゼまたはケラチンである。
【００３５】
いくつかの実施形態において、前記細胞の誘導は１種以上の化学誘導物質を用いて行う。いくつかの実施形態において、前記１種以上の化学誘導物質は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ブチルヒドロキシアニソール、β−メルカプトエタノール、アスコルビン酸−２−リン酸エステル、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸塩、ジメチルスルホキシド、インスリン、イソブチルメチルキサンチンもしくはインドメタシン、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記化学誘導物質は、０．１μＭのデキサメタゾン、０．０５ｍＭのアスコルビン酸−２−リン酸エステルおよび１０ｍＭのβ−グリセロリン酸塩を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態は、単離された未分化の小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞集団を分化誘導する方法であって、
単離された未分化のＳＭＳ細胞集団を提供すること、および
前記単離された未分化のＳＭＳ細胞集団を１種以上の化学誘導物質と接触させて、１種以上の分化細胞、組織、組織様構造、オルガノイドまたは器官に分化誘導すること
を含む方法に関する。
【００３７】
いくつかの実施形態において、前記１つ以上の化学誘導物質としては、たとえば、アスコルビン酸−２−リン酸エステル、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸塩、ジメチルスルホキシドおよびブチルヒドロキシアニソールが挙げられる。
【００３８】
いくつかの実施形態は、３Ｄバイオプリンティング装置を使用して、空間制御された細胞パターンを作製するプロセスのための基材として小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞を使用する方法であって、
単離された未分化のＳＭＳ細胞集団を提供すること、および
基材としての前記単離された未分化のＳＭＳ細胞集団と３Ｄバイオプリンティング装置とを使用して、空間制御された細胞パターンを作製すること
を含む方法に関する。
【００３９】
いくつかの実施形態において、前記３Ｄバイオプリンティング装置としては、たとえば、BioBot1（登録商標）、3D-Bioplotter（登録商標）、3DS Alpha（登録商標）または3Dynamic Omega（登録商標）が挙げられる。
【００４０】
いくつかの実施形態は、小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞を使用して、培養物中で細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を製造する方法であって、
単離された未分化のＳＭＳ細胞集団を提供すること、および
ＥＣＭタンパク質を産生するように、前記単離された未分化のＳＭＳ細胞集団を誘導すること
を含む方法に関する。
【００４１】
いくつかの実施形態において、前記単離された未分化のＳＭＳ細胞集団と、ＥＣＭタンパク質の産生を誘導する１種以上の化学誘導物質とを接触させることによって、前記単離された未分化のＳＭＳ細胞集団におけるＥＣＭタンパク質の産生を誘導する。前記１種以上の化学誘導物質は、たとえば、ヘッジホッグ阻害剤、ＴＧＦ／ＢＭＰ活性化因子、アスコルビン酸、アスコルビン酸−２−リン酸エステル、前記増殖培地中に含まれている血清、および／またはポリスチレンである。
【００４２】
いくつかの実施形態において、前記産生されたＥＣＭタンパク質は、懸濁状態のＥＣＭタンパク質と接着状態のＥＣＭタンパク質の一方または両方を含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭタンパク質の製造方法は、前記懸濁状態のＥＣＭタンパク質を、たとえば遠心分離、沈殿、濾過などによって単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭタンパク質の製造方法は、前記接着状態のＥＣＭタンパク質を、たとえば培養ベッセルから掻き取ることなどによって単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＳＭＳ細胞からＥＣＭ成分またはＥＣＭタンパク質を単離する前記方法は、前記単離されたＥＣＭから残存細胞を溶解または除去することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ＥＣＭ成分としては、たとえば、アグリン、ニドゲン、カドヘリン、クラスリン、コラーゲン、ディフェンシン、エラスチン、エンタクチン、フィブリリン、フィブロネクチン、ケラチン、ラミニン、微小管アクチン架橋因子１（microtubule-actin cross-linking factor 1）、SPARC様タンパク質、ネスプリン（ネスプリン−１、ネスプリン−２、ネスプリン−３）、fibrous sheath-interacting protein、ミオメシン、ネブリン、プラコフィリン、インテグリン、タリン、エクスポーチン、トランスポーチン、テネイシン、パールカン、ソルチリン関連受容体、テンシン、タイチン、トータルタンパク質および／または前記１種以上のタンパク質の断片が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＳＭＳ細胞からＥＣＭタンパク質を単離する前記方法は、前記単離されたＥＣＭタンパク質を、たとえば凍結、凍結乾燥、架橋、乾燥および／または微粉砕によって改変することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記改変されたＥＣＭタンパク質は、インビトロまたはインビボにおける細胞増殖または細胞分化の促進に適したものである。
【００４３】
いくつかの実施形態において、ＳＭＳ細胞からＥＣＭタンパク質を単離する前記方法は、前記単離された未分化のＳＭＳ細胞集団を足場上で培養することを含む。いくつかの実施形態において、前記足場は多孔性および／または移植可能な足場であり、たとえば、脱細胞化された天然の骨、炭素材料、多孔質炭素、活性炭、脱細胞化された軟らかいコラーゲン、脱細胞化された器官、キトサン、脱灰化された骨基質、膜同種移植片および／もしくはバリア同種移植片またはこれらの組み合わせを含む足場である。いくつかの実施形態において、前記足場は、合成、半合成または天然の足場である。
【００４４】
いくつかの実施形態は、軟部組織を製造する方法であって、
単離された未分化のＳＭＳ細胞集団を末梢血の存在下で培養すること、
ゲル様構造を形成させること、
形成されたゲル様構造を凍結すること、
凍結したゲル様構造を解凍すること、および
解凍したゲル様構造を培養して軟部組織様構造を形成させること
を含む方法に関する。
いくつかの実施形態において、前記ゲル様構造は−２０℃で凍結される。
【００４５】
本明細書で提供される実施形態のいくつかは、小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞の培養物から得られる１種以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を含む組成物に関する。いくつかの実施形態において、前記１種以上のＥＣＭタンパク質は変性されたものである。いくつかの実施形態において、前記１種以上のＥＣＭタンパク質は、アセチル化、アシル化、カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、脂質化、メチル化、ペグ化、リン酸化、プレニル化、硫酸化またはユビキチン化によって改変されたものである。いくつかの実施形態において、前記１種以上のＥＣＭタンパク質は、アグリン、ニドゲン、カドヘリン、クラスリン、コラーゲン、ディフェンシン、エラスチン、エンタクチン、フィブリリン、フィブロネクチン、ケラチン、ラミニン、微小管アクチン架橋因子１（microtubule-actin cross-linking factor 1）、SPARC様タンパク質、ネスプリン（ネスプリン−１、ネスプリン−２、ネスプリン−３）、fibrous sheath-interacting protein、ミオメシン、ネブリン、プラコフィリン、インテグリン、タリン、エクスポーチン、トランスポーチン、テネイシン、パールカン、ソルチリン関連受容体、テンシン、タイチン、トータルタンパク質および／または前記１種以上のタンパク質の断片からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記１種以上のＥＣＭタンパク質は、微生物の増殖を抑制する分子、たとえば細菌および／または真菌の増殖を抑制する化合物を含む。いくつかの実施形態において、前記微生物の増殖を抑制する化合物は、コレクチン、Ｃ型レクチンファミリー４、セプチン１２および膵リボヌクレアーゼからなる群から選択される抗微生物タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記組成物は、エアロゾル剤、クリーム剤、乳剤、フォーム剤、起泡性液剤、ゲル剤、ローション剤、軟膏剤、ペースト剤、塗布剤、血清製剤、液剤またはスプレー剤として製剤化される。
【００４６】
本明細書で提供される実施形態のいくつかは、創傷治癒システムに関する。いくつかの実施形態において、この創傷治癒システムは創傷被覆材を含む。いくつかの実施形態において、前記創傷被覆材は、ＳＭＳ細胞から調製または誘導された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、前記創傷被覆材は、包帯、ワイプ、ガーゼ、スポンジ、メッシュ、パッド、絆創膏または吸収性創傷被覆材を含む。いくつかの実施形態において、前記創傷治癒システムまたは前記創傷被覆材に含まれる前記ＥＣＭタンパク質は、アグリン、ニドゲン、カドヘリン、クラスリン、コラーゲン、ディフェンシン、エラスチン、エンタクチン、フィブリリン、フィブロネクチン、ケラチン、ラミニン、微小管アクチン架橋因子１（microtubule-actin cross-linking factor 1）、SPARC様タンパク質、ネスプリン（ネスプリン−１、ネスプリン−２、ネスプリン−３）、fibrous sheath-interacting protein、ミオメシン、ネブリン、プラコフィリン、インテグリン、タリン、エクスポーチン、トランスポーチン、テネイシン、パールカン、ソルチリン関連受容体、テンシン、タイチン、トータルタンパク質および／または前記１種以上のタンパク質の断片からなる群から選択される。
【００４７】
本明細書で提供される実施形態のいくつかは、創傷を治療または改善する方法に関する。いくつかの実施形態において、創傷を治療または改善する該方法は、ＳＭＳ細胞から取得または誘導された１種以上のＥＣＭタンパク質を含む組成物に対象の創傷を接触させることを含む。好ましくは、前記ＳＭＳ細胞から取得または誘導された前記ＥＣＭタンパク質は抗微生物化合物を含むか、あるいは該ＥＣＭタンパク質自体が、抗ウイルス活性、抗細菌活性、抗真菌活性などの抗微生物活性を発揮または保持する。いくつかの実施形態において、創傷を治療または改善する前記方法は、創傷被覆材を含むシステムに対象の創傷を接触させることを含み、該創傷被覆材は、ＳＭＳ細胞から取得または誘導された１種以上のＥＣＭタンパク質を含み、好ましくは、抗ウイルス化合物、抗細菌化合物、抗真菌化合物などの抗微生物化合物を含む、前記ＳＭＳ細胞から取得または誘導されたＥＣＭタンパク質を含む。
【００４８】
本明細書で提供される実施形態のいくつかは、ＳＭＳ細胞からタンパク質を製造する方法に関する。いくつかの実施形態において、この方法は、単離された未分化の小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞集団を、ベッセルに入れた増殖培地中で培養することを含む。いくつかの実施形態において、ＳＭＳ細胞からタンパク質を製造する前記方法は、タンパク質を産生するように前記ＳＭＳ細胞を誘導することを含む。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記細胞はＣＯ２の非存在下で培養される。いくつかの実施形態において、前記細胞は抗生物質の非存在下で培養される。いくつかの実施形態において、前記細胞は、３００ｍＬ〜５００Ｌの培地、たとえば、３００ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、２０Ｌ、３０Ｌ、４０Ｌ、５０Ｌ、６０Ｌ、７０Ｌ、８０Ｌ、９０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、３００Ｌ、４００Ｌもしくは５００Ｌ、またはこれらの量のいずれか２つによって定義される範囲内の量の培地を含む容器中で培養される。前記タンパク質の製造方法の実施形態のいくつかにおいて、前記ＳＭＳ細胞によって産生されるタンパク質、または前記ＳＭＳ細胞からの産生が誘導されるタンパク質は、第XIII凝固因子Ａ鎖、アポリポタンパク質Ｅ、アンチトロンビンIII、骨形成タンパク質１（BMP-1）、ビトロネクチン、acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A（ANP32A）、カルシニューリン様ホスホエステラーゼ、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、β−エノラーゼ、fermitin family homolog 1、微小管関連タンパク質RP/EB（MAPRE1）、熱ショックタンパク質、LIM and senescent cell antigen-like-containing domain protein 1（LIMS1）、ミオシン調節タンパク質、プロフィリン−１、グリコーゲンホスホリラーゼ、フラビンレダクターゼ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、チューブリン、細胞内クロライドチャネルタンパク質、wings apart-like protein homolog（WAPAL）、cell division control protein、オステオポンチン、BPI fold-containing、伸長因子、プラスミノゲン、アルド−ケトレダクターゼ、ケラチンもしくは細胞外マトリックスタンパク質（ＥＣＭ）、または前記１種以上のタンパク質の断片である。いくつかの実施形態において、誘導下または非誘導下において前記ＳＭＳ細胞によって産生されるＥＣＭタンパク質は、アグリン、ニドゲン、カドヘリン、クラスリン、コラーゲン、ディフェンシン、エラスチン、エンタクチン、フィブリリン、フィブロネクチン、ケラチン、ラミニン、微小管アクチン架橋因子１（microtubule-actin cross-linking factor 1）、SPARC様タンパク質、ネスプリン（ネスプリン−１、ネスプリン−２、ネスプリン−３）、fibrous sheath-interacting protein、ミオメシン、ネブリン、プラコフィリン、インテグリン、タリン、エクスポーチン、トランスポーチン、テネイシン、パールカン、ソルチリン関連受容体、テンシン、タイチン、トータルタンパク質および／または前記１種以上のタンパク質の断片である。いくつかの実施形態において、ＳＭＳ細胞を増殖させるために使用される前記ベッセルは、懸濁液中でのＳＭＳ細胞の増殖を促進するものであるか、あるいは懸濁液中でのＳＭＳ細胞の増殖を促進するように構成されたものである。いくつかの実施形態において、前記ベッセルは、ポリプロピレン製ベッセル、前処理されたシリコーン加工ベッセル、または懸濁液中のＳＭＳ細胞の増殖を促進するように構成されたベッセル（たとえば、攪拌、振盪または旋回振盪によって培地を循環させることが可能なフラスコまたはバイオリアクター）である。いくつかの実施形態において、前記ベッセルによってＳＭＳ細胞の接着が促進される。いくつかの実施形態において、前記ＳＭＳ細胞の誘導は、１種以上の化学誘導物質を用いて行われる。いくつかの実施形態において、前記１種以上の化学誘導物質は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ブチルヒドロキシアニソール、β−メルカプトエタノール、アスコルビン酸−２−リン酸エステル、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸塩、ジメチルスルホキシド、インスリン、イソブチルメチルキサンチンもしくはインドメタシン、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記化学誘導物質は、０．１μＭのデキサメタゾン、０．０５ｍＭのアスコルビン酸−２−リン酸エステルおよび１０ｍＭのβ−グリセロリン酸塩を含む。
【００４９】
本明細書で提供される実施形態のいくつかは、細管構造または脈管構造を製造する方法であって、ＳＭＳに由来する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）とともに内皮細胞を培養することを含む方法に関する。いくつかの実施形態において、前記内皮細胞は、前記ＳＭＳ由来ＥＣＭ内へと遊走して該ＳＭＳ由来ＥＣＭと相互作用し、その結果、細管構造または脈管構造が形成される。
【００５０】
本明細書で提供される実施形態のいくつかは、細胞集団による脈管形成、血管新生または動脈新生を誘導、促進または支援する薬剤または化合物を選択する方法に関する。いくつかの実施形態において、この方法は、本明細書に記載のＳＭＳ細胞から産生された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を提供することを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、脈管形成能、血管新生能または動脈新生能を有する細胞（たとえば内皮細胞など）を含む第１の細胞集団に、前記ＳＭＳ細胞から産生された前記ＥＣＭを接触させることを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記ＥＣＭと接触させた第１の細胞集団を薬剤または化合物と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記薬剤または化合物と接触させた後の、前記ＥＣＭと接触させた第１の細胞集団における脈管形成、血管新生または動脈新生の質または量を、前記薬剤または化合物と接触させずに前記ＥＣＭ上で培養した好ましくは第１の細胞集団と同じ細胞腫の第２の細胞集団と比較することによって、前記薬剤または化合物が第１の細胞集団において脈管形成、血管新生または動脈新生を誘導、促進または支援するかどうかを判断することを含む。いくつかの実施形態において、第２の細胞集団と比較して、第１の細胞集団における脈管形成、血管新生または動脈新生の量が多く、またはそれらの質が高い場合、細胞集団による脈管形成、血管新生または動脈新生を誘導、促進または支援する薬剤または化合物として前記薬剤または化合物が選択される。
【００５１】
したがって、本発明の態様のいくつかは以下に関する。
【００５２】
１．小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞集団を培養する方法であって、
単離されたＳＭＳ細胞集団を、好ましくは懸濁状態および／または未分化な状態で維持可能な条件下において、増殖培地中で懸濁培養することを含む方法。
【００５３】
２．前記増殖培地が高糖濃度基礎培地である、前記態様１に記載の方法。
【００５４】
３．前記高糖濃度基礎培地が、仔ウシ血清、インスリンまたはその組み合わせをさらに含む、前記態様２に記載の方法。
【００５５】
４．前記単離されたＳＭＳ細胞集団を５％ＣＯ２下、３７℃で培養する、前記態様１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【００５６】
５．前記ＳＭＳ細胞の接着を阻害するように構成されたベッセル、たとえばポリプロピレン製のベッセルまたはチューブ中で、前記単離されたＳＭＳ細胞集団を培養する、前記態様１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【００５７】
６．前記単離されたＳＭＳ細胞集団が臍帯血、末梢血、骨髄または固形組織から単離されたものであり、たとえば、ヒト、霊長類、ネコおよびイヌなどの家庭動物、またはラクダ、ウマ、ブタ、ウシなどの哺乳動物の末梢血から単離されたものである、前記態様１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【００５８】
７．前記固形組織が、胎盤、肝臓、心臓、脳、腎臓または消化管組織である、前記態様６に記載の方法。
【００５９】
８．前記ＳＭＳ細胞集団を、フラスコ、容器、チャンバー、流路、チューブ、ベッセル、ニッチまたはバイオリアクターに導入し、任意で、前記単離されたＳＭＳ細胞集団を培養するための前記増殖培地を流動および／または循環させる、前記態様１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【００６０】
９．前記フラスコ、容器、チャンバー、流路、チューブ、ベッセル、ニッチまたはバイオリアクターの表面を前処理することをさらに含む、前記態様８に記載の方法。
【００６１】
１０．前記前処理が、前記表面に所定の幾何学的形状をエッチングすることを含み、該幾何学的形状が前記ＳＭＳ細胞を組織化させるためのガイドとして機能する、前記態様９に記載の方法。
【００６２】
１１．前記幾何学的形状が、線状、網状、溝状、隆起状またはその他の形状である、前記態様１０に記載の方法。
【００６３】
１２．前記流路が、マイクロ流体デバイスに組み込まれたマイクロ流路である、前記態様８に記載の方法。
【００６４】
１３．前記培養後に遠心分離または濾過を行い、前記単離されたＳＭＳ細胞集団を単離または継代することをさらに含む、前記態様１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【００６５】
１４．遺伝子産物をコードする遺伝子、好ましくは成長因子、サイトカイン、ペプチドホルモン、タンパク質ホルモン、酵素、タンパク質断片、細胞外マトリックスタンパク質などのタンパク質をコードする遺伝子を、前記単離されたＳＭＳ細胞集団にトランスフェクトすることをさらに含む、前記態様１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【００６６】
１５．前記遺伝子産物が、インスリン成長因子２、インターロイキン６、インスリン、副甲状腺ホルモン、コラゲナーゼ、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、アグリン、ニドゲンおよびエンタクチンからなる群から選択される、前記態様１４に記載の方法。
【００６７】
１６．前記遺伝子産物を単離または精製することさらに含む、前記態様１４に記載の方法。
【００６８】
１７．前記単離された懸濁状態のＳＭＳ細胞集団を接着細胞から分離する、前記態様１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【００６９】
１８．前記単離されたＳＭＳ細胞集団を５％ＣＯ２下、３７℃で培養する、前記態様１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【００７０】
１９．分化した細胞の塊を低速遠心分離によって除去することをさらに含む、前記態様１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【００７１】
２０．前記単離された懸濁状態のＳＭＳ細胞集団を分画遠心法によって単離する、前記態様１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【００７２】
２１．分子を製造するために、単離された小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞集団を使用する方法であって、
単離されたＳＭＳ細胞集団、たとえば前記態様１〜２０のいずれか１つに記載の方法によって得られる単離された懸濁状態のＳＭＳ細胞集団を提供すること；および
分子を産生するように、前記単離されたＳＭＳ細胞集団を誘導すること
を含む方法。
【００７３】
２２．前記分子が、成長因子、サイトカイン、ペプチドホルモン、タンパク質ホルモン、細胞外マトリックスタンパク質などのタンパク質である、前記態様２１に記載の方法。
【００７４】
２３．前記分子が、インスリン成長因子２、インターロイキン６、インスリン、副甲状腺ホルモン、コラゲナーゼ、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、アグリン、ニドゲンおよびエンタクチンからなる群から選択される、前記態様２１または２２に記載の方法。
【００７５】
２４．前記タンパク質が、第XIII凝固因子Ａ鎖、アポリポタンパク質Ｅ、アンチトロンビンIII、骨形成タンパク質１（BMP-1）、ビトロネクチン、acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A（ANP32A）、カルシニューリン様ホスホエステラーゼ、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、β−エノラーゼ、fermitin family homolog 1、微小管関連タンパク質RP/EB（MAPRE1）、熱ショックタンパク質、LIM and senescent cell antigen-like-containing domain protein 1（LIMS1）、ミオシン調節タンパク質、プロフィリン−１、グリコーゲンホスホリラーゼ、フラビンレダクターゼ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、チューブリン、細胞内クロライドチャネルタンパク質、wings apart-like protein homolog（WAPAL）、cell division control protein、オステオポンチン、BPI fold-containing、伸長因子、プラスミノゲン、アルド−ケトレダクターゼまたはケラチンである、前記態様２１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【００７６】
２５．前記細胞の誘導を１種以上の化学誘導物質を用いて行う、前記態様２１〜２４のいずれか１つに記載の方法。
【００７７】
２６．前記１種以上の化学誘導物質が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ブチルヒドロキシアニソール、β−メルカプトエタノール、アスコルビン酸−２−リン酸エステル、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸塩、ジメチルスルホキシド、インスリン、イソブチルメチルキサンチンもしくはインドメタシン、またはこれらの組み合わせである、前記態様２５に記載の方法。
【００７８】
２７．前記化学誘導物質が、０．１μＭのデキサメタゾン、０．０５ｍＭのアスコルビン酸−２−リン酸エステルおよび１０ｍＭのβ−グリセロリン酸塩を含む、前記態様２５または２６に記載の方法。
【００７９】
２８．単離された未分化の小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞集団を分化誘導する方法であって、
単離された未分化のＳＭＳ細胞集団、たとえば前記態様１〜２０のいずれか１つに記載の方法によって得られる単離された懸濁状態のＳＭＳ細胞集団を提供すること；および
前記単離された未分化のＳＭＳ細胞集団を１種以上の化学誘導物質と接触させて、１種以上の分化細胞、組織、組織様構造、オルガノイドまたは器官に分化誘導すること
を含む方法。
【００８０】
２９．前記１種以上の化学誘導物質が、アスコルビン酸−２−リン酸エステル、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸塩、ジメチルスルホキシドおよびブチルヒドロキシアニソールからなる群から選択される、前記態様２８に記載の方法。
【００８１】
３０．３Ｄバイオプリンティング装置を使用して、空間制御された細胞パターンを作製するプロセスのための基材として小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞を使用する方法であって、
単離された未分化のＳＭＳ細胞集団、たとえば前記態様１〜２０のいずれか１つに記載の方法によって得られる単離された懸濁状態のＳＭＳ細胞集団を提供すること；および
基材としての前記単離された未分化のＳＭＳ細胞集団と３Ｄバイオプリンティング装置とを使用して、空間制御された細胞パターンを作製すること
を含む方法。
【００８２】
３１．前記３Ｄバイオプリンティング装置が、BioBot1（登録商標）、3D-Bioplotter（登録商標）、3DS Alpha（登録商標）および3Dynamic Omega（登録商標）からなる群から選択される、前記態様３０に記載の方法。
【００８３】
３２．小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞を使用して、培養物中で細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を製造する方法であって、
単離された未分化のＳＭＳ細胞集団、たとえば前記態様１〜２０のいずれか１つに記載の方法によって得られる単離された懸濁状態のＳＭＳ細胞集団を提供すること；および
ＥＣＭタンパク質を産生するように、前記単離された未分化のＳＭＳ細胞集団を誘導すること
を含む方法。
【００８４】
３３．前記単離された未分化のＳＭＳ細胞集団と、ＥＣＭタンパク質の産生を誘導する１種以上の化学誘導物質とを接触させることによって、前記単離された未分化のＳＭＳ細胞集団におけるＥＣＭタンパク質の産生を誘導し、
前記１種以上の化学誘導物質が、たとえば、ヘッジホッグ阻害剤、ＴＧＦ／ＢＭＰ活性化因子、アスコルビン酸、アスコルビン酸−２−リン酸エステル、前記増殖培地中に含まれている血清、および／またはポリスチレンである、前記態様３２に記載の方法。
【００８５】
３４．前記産生されたＥＣＭタンパク質が、懸濁状態のＥＣＭタンパク質と接着状態のＥＣＭタンパク質の一方または両方を含む、前記態様３３に記載の方法。
【００８６】
３５．前記懸濁状態のＥＣＭタンパク質を、たとえば遠心分離、濾過、沈殿などによって単離すること、および／または前記接着状態のＥＣＭタンパク質を、たとえば培養ベッセルから掻き取ることなどによって単離することをさらに含む、前記態様３２〜３４のいずれか１つに記載の方法。
【００８７】
３６．前記単離されたＥＣＭから残存細胞を溶解または除去することをさらに含む、前記態様３５に記載の方法。
【００８８】
３７．前記ＥＣＭタンパク質が、アグリン、ニドゲン、カドヘリン、クラスリン、コラーゲン、ディフェンシン、エラスチン、エンタクチン、フィブリリン、フィブロネクチン、ケラチン、ラミニン、微小管アクチン架橋因子１（microtubule-actin cross-linking factor 1）、SPARC様タンパク質、ネスプリン（ネスプリン−１、ネスプリン−２、ネスプリン−３）、fibrous sheath-interacting protein、ミオメシン、ネブリン、プラコフィリン、インテグリン、タリン、エクスポーチン、トランスポーチン、テネイシン、パールカン、ソルチリン関連受容体、テンシン、タイチン、トータルタンパク質および／または前記１種以上のタンパク質の断片からなる群から選択される、前記態様３２〜３６のいずれか１つに記載の方法。
【００８９】
３８．前記ＥＣＭタンパク質を、たとえば凍結、凍結乾燥、架橋、乾燥および／または微粉砕によって、改変することをさらに含む、前記態様３２〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【００９０】
３９．前記改変されたＥＣＭタンパク質が、インビトロまたはインビボにおける細胞増殖または細胞分化の促進に適したものである、前記態様３８に記載の方法。
【００９１】
４０．前記単離された未分化のＳＭＳ細胞集団を足場上で培養し、該足場が好ましくは多孔性および／または移植可能な足場であり、たとえば、脱細胞化された天然の骨、脱細胞化された軟らかいコラーゲン、脱細胞化された器官、キトサン、脱灰化された骨基質、膜バリア同種移植片またはこれらの組み合わせを含む足場である、前記態様３２〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【００９２】
４１．前記足場が、合成、半合成または天然の足場である、前記態様４０に記載の方法。
【００９３】
４２．軟部組織を製造する方法であって、
単離された未分化のＳＭＳ細胞集団、たとえば前記態様１〜２０のいずれか１つに記載の方法によって得られる単離された懸濁状態のＳＭＳ細胞集団を末梢血の存在下で培養すること；
ゲル様構造を形成させること；
形成されたゲル様構造を凍結すること；
凍結したゲル様構造を解凍すること；および
解凍したゲル様構造を培養して軟部組織様構造を形成させること
を含む方法。
【００９４】
４３．前記凍結工程が−２０℃で行われる、前記態様４２に記載の方法。
【００９５】
４４．小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞の培養物から得られる１種以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を含む組成物。
【００９６】
４５．前記１種以上のＥＣＭタンパク質が変性されたものである、前記態様４４に記載の組成物。
【００９７】
４６．前記１種以上のＥＣＭタンパク質が、アセチル化、アシル化、カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、脂質化、メチル化、ペグ化、リン酸化、プレニル化、硫酸化またはユビキチン化によって改変されたものである、前記態様４４または４５に記載の組成物。
【００９８】
４７．前記１種以上のＥＣＭタンパク質が、アグリン、ニドゲン、カドヘリン、クラスリン、コラーゲン、ディフェンシン、エラスチン、エンタクチン、フィブリリン、フィブロネクチン、ケラチン、ラミニン、微小管アクチン架橋因子１（microtubule-actin cross-linking factor 1）、SPARC様タンパク質、ネスプリン（ネスプリン−１、ネスプリン−２、ネスプリン−３）、fibrous sheath-interacting protein、ミオメシン、ネブリン、プラコフィリン、インテグリン、タリン、エクスポーチン、トランスポーチン、テネイシン、パールカン、ソルチリン関連受容体、テンシン、タイチン、トータルタンパク質および／または前記１種以上のタンパク質の断片からなる群から選択される、前記態様４４〜４６のいずれか１つに記載の組成物。
【００９９】
４８．前記１種以上のＥＣＭタンパク質が、細菌および／もしくは真菌などの微生物の増殖を抑制する化合物を含むか、または該ＥＣＭタンパク質自体が、細菌および／もしくは真菌などの微生物の増殖を抑制する化合物として作用する、前記態様４４〜４７のいずれか１つに記載の組成物。
【０１００】
４９．前記微生物の増殖を抑制する化合物が、コレクチン、Ｃ型レクチンファミリー４、セプチン１２および膵リボヌクレアーゼからなる群から選択される抗微生物タンパク質である、前記態様４８に記載の組成物。
【０１０１】
５０．エアロゾル剤、クリーム剤、乳剤、フォーム剤、起泡性液剤、ゲル剤、ローション剤、軟膏剤、ペースト剤、塗布剤、血清製剤、液剤またはスプレー剤として製剤化される、前記態様４４〜４９のいずれか１つに記載の組成物。
【０１０２】
５１．前記態様４４〜５０のいずれか１つに従って調製された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を含む組成物を含む創傷被覆材を含む創傷治癒システム。
【０１０３】
５２．前記創傷被覆材が、包帯、ワイプ、ガーゼ、スポンジ、メッシュ、パッド、絆創膏または吸収性創傷被覆材である、前記態様５１に記載のシステム。
【０１０４】
５３．前記ＥＣＭタンパク質が、アグリン、ニドゲン、カドヘリン、クラスリン、コラーゲン、ディフェンシン、エラスチン、エンタクチン、フィブリリン、フィブロネクチン、ケラチン、ラミニン、微小管アクチン架橋因子１（microtubule-actin cross-linking factor 1）、SPARC様タンパク質、ネスプリン（ネスプリン−１、ネスプリン−２、ネスプリン−３）、fibrous sheath-interacting protein、ミオメシン、ネブリン、プラコフィリン、インテグリン、タリン、エクスポーチン、トランスポーチン、テネイシン、パールカン、ソルチリン関連受容体、テンシン、タイチン、トータルタンパク質および／または前記１種以上のタンパク質の断片からなる群から選択される、前記態様５１または５２に記載のシステム。
【０１０５】
５４．対象の創傷を治療もしくは緩和する方法、または対象の創傷の治癒を促進する方法であって、前記態様４４〜５０のいずれか１つに記載の組成物または前記態様５１〜５３のいずれか１つに記載のシステムに対象の創傷を接触させることを含む方法。
【０１０６】
５５．タンパク質を製造する方法であって、
単離された未分化の小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞集団を、タンパク質の産生を促進する増殖培地を入れたベッセル中で培養すること；
任意でタンパク質の産生を誘導すること；および
任意で前記タンパク質を単離または精製すること
を含む方法。
【０１０７】
５６．前記細胞をＣＯ２の非存在下で培養する、前記態様５５に記載の方法。
【０１０８】
５７．前記細胞を抗生物質の非存在下で培養する、前記態様５５または５６に記載の方法。
【０１０９】
５８．前記細胞を、ベッセルに入れた３００ｍＬ〜５００Ｌの培地中で培養する、前記態様５５〜５７のいずれか１つに記載の方法。
【０１１０】
５９．前記タンパク質が、第XIII凝固因子Ａ鎖、アポリポタンパク質Ｅ、アンチトロンビンIII、骨形成タンパク質１（BMP-1）、ビトロネクチン、acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A（ANP32A）、カルシニューリン様ホスホエステラーゼ、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、β−エノラーゼ、fermitin family homolog 1、微小管関連タンパク質RP/EB（MAPRE1）、熱ショックタンパク質、LIM and senescent cell antigen-like-containing domain protein 1（LIMS1）、ミオシン調節タンパク質、プロフィリン−１、グリコーゲンホスホリラーゼ、フラビンレダクターゼ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、チューブリン、細胞内クロライドチャネルタンパク質、wings apart-like protein homolog（WAPAL）、cell division control protein、オステオポンチン、BPI fold-containing、伸長因子、プラスミノゲン、アルド−ケトレダクターゼ、ケラチンもしくは細胞外マトリックスタンパク質（ＥＣＭ）、または前記１種以上のタンパク質の断片である、前記態様５５〜５８のいずれか１つに記載の方法。
【０１１１】
６０．前記ＥＣＭタンパク質が、アグリン、ニドゲン、カドヘリン、クラスリン、コラーゲン、ディフェンシン、エラスチン、エンタクチン、フィブリリン、フィブロネクチン、ケラチン、ラミニン、微小管アクチン架橋因子１（microtubule-actin cross-linking factor 1）、SPARC様タンパク質、ネスプリン（ネスプリン−１、ネスプリン−２、ネスプリン−３）、fibrous sheath-interacting protein、ミオメシン、ネブリン、プラコフィリン、インテグリン、タリン、エクスポーチン、トランスポーチン、テネイシン、パールカン、ソルチリン関連受容体、テンシン、タイチン、トータルタンパク質および／または前記１種以上のタンパク質の断片である、前記態様５９に記載の方法。
【０１１２】
６１．前記ベッセルによって懸濁液中のＳＭＳ細胞の増殖が促進されるか、または前記ベッセルが、懸濁液中のＳＭＳ細胞の増殖を促進するように構成されている、前記態様５５〜６０のいずれか１つに記載の方法。
【０１１３】
６２．前記ベッセルが、ポリプロピレン製ベッセル、前処理されたシリコーン加工ベッセル、または懸濁液中のＳＭＳ細胞の増殖を促進するように構成されたベッセルである、前記態様５５〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【０１１４】
６３．前記ベッセルによって細胞接着が促進される、前記態様５５〜６０のいずれか１つに記載の方法。
【０１１５】
６４．前記細胞の誘導を１種以上の化学誘導物質を用いて行う、前記態様５５〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【０１１６】
６５．前記１種以上の化学誘導物質が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ブチルヒドロキシアニソール、β−メルカプトエタノール、アスコルビン酸−２−リン酸エステル、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸塩、ジメチルスルホキシド、インスリン、イソブチルメチルキサンチンもしくはインドメタシンまたはこれらの組み合わせである、前記態様６４に記載の方法。
【０１１７】
６６．前記化学誘導物質が、０．１μＭのデキサメタゾン、０．０５ｍＭのアスコルビン酸−２−リン酸エステルおよび１０ｍＭのβ−グリセロリン酸塩を含む、前記態様６４または６５に記載の方法。
【０１１８】
６７．細管構造または脈管構造を製造する方法であって、
ＳＭＳ細胞に由来する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）とともに内皮細胞を培養することを含み、
該内皮細胞が前記ＳＭＳ由来ＥＣＭ内へと遊走して該ＳＭＳ由来ＥＣＭと相互作用し、その結果、細管構造または脈管構造が形成されることを特徴とする方法。
【０１１９】
６８．細胞集団による脈管形成、血管新生または動脈新生を誘導、促進または支援する薬剤または化合物を選択する方法であって、
ＳＭＳ細胞から産生された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、たとえば前記態様のいずれか１つに従って製造されるＥＣＭなどを提供すること；
脈管形成能、血管新生能または動脈新生能を有する細胞（たとえば内皮細胞など）を含む第１の細胞集団に、前記ＳＭＳ細胞から産生された前記ＥＣＭを接触させること；
前記ＥＣＭと接触させた第１の細胞集団を薬剤または化合物と接触させること；および
前記薬剤または化合物と接触させた後の、前記ＥＣＭと接触させた第１の細胞集団における脈管形成、血管新生または動脈新生の質または量を、前記薬剤または化合物と接触させずに前記ＥＣＭ上で培養した好ましくは第１の細胞集団と同じ細胞腫の第２の細胞集団と比較することによって、前記薬剤または化合物が第１の細胞集団において脈管形成、血管新生または動脈新生を誘導、促進または支援するかどうかを判断すること
を含み、
第２の細胞集団と比較して、第１の細胞集団における脈管形成、血管新生または動脈新生の量が多く、またはそれらの質が高い場合、細胞集団による脈管形成、血管新生または動脈新生を誘導、促進または支援する薬剤または化合物として前記薬剤または化合物が選択されることを特徴とする方法。
【０１２０】
前述した特徴以外のさらなる特徴や変形例は、以下の図面の説明および代表的な実施形態から容易に理解できるであろう。以下の図面は代表的な実施形態を示しており、本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】培養されたＳＭＳ細胞が、フラスコ底部で複数の不透明な細胞層からなる接着細胞層を形成した様子を示す。培地中にも浮遊した未分化ＳＭＳ細胞が含まれている。
【０１２２】
【図２】Ｔ２５フラスコで培養した浮遊分画から単離した後、懸濁培養した未分化ＳＭＳ細胞を示す、デジタル補正した顕微鏡写真である（４００×；スケールバー＝１５μｍ）。
【０１２３】
【図３】４２００×ｇで１５分間遠心分離したＳＭＳ細胞培養物を示す。写真に示したポリプロピレン製のバイオリアクターチューブを使用し、血清非添加（左）または血清添加（右）の条件において高グルコースＤＭＥＭ培地中でＳＭＳ細胞を培養した（各１０ｍＬ）。いずれの培養も遠心分離後に大きなペレットが得られ、ペレットの形がわずかに異なっていた。遠心分離後の各培養物の上清は透明である。
【０１２４】
【図４】Ｔ２５フラスコ中で培養したＳＭＳ細胞が、神経細胞、骨細胞または脂肪細胞への分化誘導によって様々な細胞株に分化可能であることを示す。
【０１２５】
【図５】６ウェルプレートに入れた骨芽細胞誘導培地中での培養によって分化したＳＭＳ細胞を示す。未分化ＳＭＳ細胞は、数倍の大きさの骨細胞前駆細胞株へと分化した（２００×；スケールバー＝３０μｍ）。
【０１２６】
【図６】６ウェルプレートに入れた骨芽細胞誘導培地中での培養によって分化したＳＭＳ細胞を示す。ＳＭＳ細胞は骨細胞前駆細胞株へと分化した（４００×；スケールバー＝１５μｍ）。
【０１２７】
【図７】培養条件を変えたところ、ＳＭＳ細胞の形態が大きく変化したことを示す。ＳＭＳ細胞と巨大化した細胞とが同時に存在していることがわかる。いずれの細胞も活発に分裂し、そのうちのいくつかは非対称な細胞分裂を示している。
【０１２８】
【図８Ａ】６ウェルプレートに入れた誘導培地中での培養によって分化したＳＭＳ細胞を示す。ＳＭＳ細胞は巨大化して形態変化し、隣り合う細胞と凝集塊を形成している（２００×；スケールバー＝３０μｍ）。
【０１２９】
【図８Ｂ−８Ｃ】血清除去後に巨大化したＳＭＳ由来細胞の走査型電子顕微鏡写真を示す。ＳＭＳ細胞は接着して徐々に形態が変化し、巨大化した。
【０１３０】
【図８Ｄ】６ウェルプレートに入れた誘導培地中での培養によって分化したＳＭＳ細胞を示す。細胞凝集塊が浮遊していることから、細胞がフラスコへの接着性を喪失したことがわかる。細胞は形態変化して立方体様となり、隣り合う細胞同士で接着したことから、細胞極性が変化したことが示された。上皮細胞のように頂部および基底面が形成された（４００×；スケールバー＝１５μｍ）。
【０１３１】
【図９Ａ】わずかに突出した外縁と透明な細胞質を有する、懸濁状態の大型円形細胞を示す。この細胞は、６ウェルプレートで培養したＳＭＳ細胞が全体的な形態変化を起こしたことによって得られた（４００×；スケールバー＝１５μｍ）。
【０１３２】
【図９Ｂ】わずかに突出した外縁と透明な細胞質を有する懸濁状態の大型円形細胞を示す。この細胞は、６ウェルプレートで培養したＳＭＳ細胞が全体的な形態変化を起こしたことによって得られた（４００×；スケールバー＝１５μｍ）。
【０１３３】
【図１０】透明な細胞質と扁平な形態を有する、浮力の小さい大型円形浮遊細胞を示す。この細胞は、６ウェルプレートで培養したＳＭＳ細胞が全体的な形態変化を起こしたことによって得られた（２００×；スケールバー＝３０μｍ）。
【０１３４】
【図１１】透明で伸長した細胞質突起を有する、不規則で扁平な形態の大型浮遊細胞を示す。この細胞は、６ウェルプレートに入れた誘導培地中で培養したＳＭＳ細胞に由来するものである（２００×；スケールバー＝３０μｍ）。
【０１３５】
【図１２】透明な細胞質を有し、外縁が平滑で、均一な形態の大型円形接着細胞を示す（矢印）。この細胞は、６ウェルプレートに入れた誘導培地中で培養したＳＭＳ細胞に由来するものである（４００×；スケールバー＝１５μｍ）。
【０１３６】
【図１３Ａ】伸長した突起を有する、いびつな形態の大型扁平接着細胞を示す。この細胞は、６ウェルプレートに入れた誘導培地中で培養したＳＭＳ細胞に由来するものである（４０×；スケールバー＝１５０μｍ）。
【０１３７】
【図１３Ｂ】伸長した突起を有する、いびつな形態の大型接着扁平細胞を示す。この細胞は、６ウェルプレートに入れた誘導培地中で培養したＳＭＳ細胞に由来するものである（１００×；スケールバー＝６０μｍ）。
【０１３８】
【図１３Ｃ】伸長した突起を有する、いびつな形態の大型接着扁平細胞を示す。この細胞は、６ウェルプレートに入れた誘導培地中で培養したＳＭＳ細胞に由来するものである（２００×；スケールバー＝３０μｍ）。
【０１３９】
【図１４Ａ】Ｔ２５フラスコにおけるＳＭＳ細胞と（同じ由来の）線維芽細胞との共培養を示す。整列したＳＭＳ細胞が、これよりも大きな線維芽細胞の整列を促していると見られる（４０×；スケールバー＝１５０μｍ）。
【０１４０】
【図１４Ｂ】Ｔ２５フラスコにおけるＳＭＳ細胞と（同じ由来の）線維芽細胞との共培養を示す。整列したＳＭＳ細胞が、これよりも大きな線維芽細胞の整列を促していると見られる（４０×；スケールバー＝１５０μｍ）。
【０１４１】
【図１５】Ｔ２５フラスコにおけるＳＭＳ細胞と（同じ由来の）線維芽細胞との共培養を示す。整列したＳＭＳ細胞が、これよりも大きな線維芽細胞の整列を促していると見られる（４００×；スケールバー＝１５μｍ）。
【０１４２】
【図１６】ヘッジホッグアンタゴニストを使用した、ＳＭＳ細胞からの細胞外基底膜の形成の促進を示す（左：１００×；右：４００×）。ヘッジホッグアンタゴニストによって細胞のシグナル伝達が制御されることから、様々な種類の細胞外マトリックスが大量に産生される。
【０１４３】
【図１７】膜状構造を有する細胞外マトリックスの形成の概要を示す。ＳＭＳ細胞を培養することによって、ヒツジ骨髄から得られる細胞外マトリックスと同等の高度に組織化された細胞外マトリックス層が得られる。実験において、膜状構造を有する細胞外マトリックスの形成を誘導した。培養フラスコの底に、ほとんど細胞を含んでいない密な構造のＥＣＭ層が形成される。ＥＣＭ層を掻き取って剥離すると、水よりも密度が小さいことがわかった。ＥＣＭ層を詳しく調べたところ、さらに３層に区別できることがわかった。第１層は、フラスコのプラスチック面と接した、細胞を含んでいない平滑な層であり、第２層も平滑な層であり、第３層は細胞を含み、粗面を有していた。異染性色素サフラニンを使用した分染法によって、第１層と第２層を明確に区別することができた。
【０１４４】
【図１８Ａ】主にコラーゲン線維からなる足場を使用したＳＭＳ細胞の初期培養（１〜２週間）を示す。ＳＭＳ細胞（矢印）は、ポリスチレン製の６ウェルプレートの底面でなく、コラーゲン線維に選択的に接着している（２００×；スケールバー＝３０μｍ）。
【０１４５】
【図１８Ｂ】６ウェルプレートにおいて主にコラーゲン線維からなる足場を使用したＳＭＳ細胞の後期培養（４週間）を示す。ＳＭＳ細胞（矢印）は、コラーゲン線維に選択的に接着し、増殖し、分化して、細胞外マトリックスを形成する（２００×；スケールバー＝３０μｍ）。
【０１４６】
【図１９Ａ】ＳＭＳ細胞との共培養を行う前の、脱細胞化された骨足場を示す。
【０１４７】
【図１９Ｂ】ＳＭＳ細胞とともに３週間培養した後の、脱細胞化された骨足場を示す。分化したＳＭＳ細胞が骨表面に接着している（１００×；スケールバー＝６０μｍ）。
【０１４８】
【図１９Ｃ】ＳＭＳ細胞とともに６週間培養した後の、脱細胞化された骨足場を示す。６週間後に、ＳＭＳ細胞に由来する軟部組織の増殖が骨表面で観察される（４０×；スケールバー＝１５０μｍ）。
【０１４９】
【図２０】細管からなる多孔構造を有する、ＳＭＳ細胞に由来した組織様構造を示す（２００×；スケールバー＝３０μｍ）。
【０１５０】
【図２１Ａ】誘導培地を使用したＳＭＳ細胞培養に由来する、骨片によく似た足場のde novo形成を示す（２００×；スケールバー＝３０μｍ）。
【０１５１】
【図２１Ｂ】誘導培地を使用したＳＭＳ細胞培養に由来する、骨片によく似た足場のde novo形成を示す（４００×；スケールバー＝１５μｍ）。
【０１５２】
【図２２】ＳＭＳ細胞を含む末梢血成分のみを使用して作製した軟部組織を示す。この組織はゲル状の透明な組織から暗色の強固な組織に変化する。
【０１５３】
【図２３】ＳＭＳ細胞を含む末梢血成分のみを使用して作製した軟部組織を示し、この軟部組織が細管構造を有することを示す（４０×；スケールバー＝１５０μｍ）。
【０１５４】
【図２４】トリクローム染色を使用した前記軟部組織の顕微鏡観察を示す。顕微鏡写真は、毛細血管様構造および脈管様構造が存在することを示しており、三次元方向への増殖、伸長および細管の融合がはっきりと示されている（４０×；スケールバー＝１５０μｍ）。
【０１５５】
【図２５】図２５Ａおよび図２５Ｂは、ヒト臍帯血管内皮細胞（矢印）が、ＳＭＳ細胞によって産生されたＥＣＭ内に遊走することを示す（１００×；スケールバー＝５０μｍ）。
【０１５６】
【図２６】図２６Ａ、図２６Ｂおよび図２６Ｃは、ＳＭＳ細胞によって産生されたＥＣＭ内でヒト臍帯血管内皮細胞（矢印）が活発に増殖することを示す（１００×）。
【０１５７】
【図２７】図２７Ａおよび図２７Ｂは、ＳＭＳ細胞によって産生されたＥＣＭ内でヒト臍帯血管内皮細胞が細管構造を形成することを示す（１００×）。
【０１５８】
【図２８】図２８Ａ、図２８Ｂおよび図２８Ｃは、ヒト臍帯血管内皮細胞（矢印）が整列し、壁様構造を形成することを示す。ＳＭＳ細胞によって産生されたＥＣＭの特徴的な組織化構造が、ヒト臍帯血管内皮細胞の整列のガイドとして機能したように見える。整列した内皮細胞（矢印）の境界の外側では、内皮細胞はほとんど見られない（両矢印）（図２８Ａおよび図２８Ｃ：１００×；図２８Ｂ：２００×）。
【０１５９】
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｄは、ヒト臍帯血管内皮細胞によって形成された脈管が、ＳＭＳ細胞由来ＥＣＭ内に埋没した接着内皮細胞層に強固に固着していることを示す（図２９Ａ：２００×；図２９Ｂ：１００×；図２９Ｃ：２００×；図２９Ｄ：４００×）。
【０１６０】
【図３０】図３０Ａおよび図３０Ｂは、ヒト角化細胞がＳＭＳ由来ＥＣＭの表面に接着し、典型的なコンフルエント細胞層を形成したことを示す（図３０Ａ：１００×；図３０Ｂ：４０×）。
【０１６１】
【図３１】図３１Ａおよび図３１Ｂは、ヒト皮膚線維芽細胞（矢印）が、ＳＭＳ細胞によって産生されたＥＣＭ内に遊走することを示す（１００×）。
【０１６２】
【図３２】図３２Ａおよび図３２Ｂは、ＳＭＳ細胞によって産生されたＥＣＭ内でヒト皮膚線維芽細胞（矢印）が活発に増殖することを示す（１００×）。
【０１６３】
【図３３】図３３Ａ、図３３Ｂおよび図３３Ｃは、神経細胞分化培地において分化誘導したＳＭＳ細胞を示す（図３３Ａ：２００×；図３３Ｂおよび図３３Ｃ：４００×）。
【発明を実施するための形態】
【０１６４】
以下の詳細な説明では、本明細書の一部を構成する添付の図面を参照しながら本発明を説明する。別段の記載がない限り、図面中の類似の記号は、通常、類似の構成要素を示す。詳細な説明、図面および請求項に記載の実施形態は例示を目的としたものであり、本発明をなんら限定するものではない。本明細書に記載の主題の要旨や範囲から逸脱することなく、その他の実施形態を採用してもよく、その他の変更を加えてもよい。本明細書に概説され、図面に示された本開示の態様は、様々な構成で配置、置換、合体、分離および設計することができることは容易に理解され、このような態様はいずれも明示的に本明細書に包含される。
【０１６５】
ＳＭＳ細胞は、運動性が高く、また、様々な体細胞や体組織などの様々に特殊化した系列への分化能が極めて高いことから、ユニークな幹細胞であると言える。このようなユニークな特性を有していることから、ＳＭＳ細胞は基礎科学研究分野、薬理学分野および再生医療分野において多岐にわたる用途に使用できると期待される。また、ＳＭＳ細胞株は、機能ゲノム研究、薬物スクリーニングおよび薬物探索を目的とした、ヒトの初期発生の分子生物学研究および細胞生物学研究に有用なインビトロモデルを提供することができる。ＳＭＳ細胞株は、毒性や催奇形性のハイスループットスクリーニングに使用することもできる。ＳＭＳ細胞は自己複製能および分化能を有することから、移植療法のための機能的に成熟した分化細胞または分化組織を得るための再生可能な供給源としても使用することができる。さらに、遺伝子治療において、遺伝子組換えされたＳＭＳ細胞を運搬手段として移植することによって標的器官に遺伝子を送達し、該標的器官において該遺伝子を発現させることもできる。重要なことに、ＳＭＳ細胞は、様々な遺伝子産物を産生させることを目的として使用することができ、ＥＣＭタンパク質の産生にも有用である。
【０１６６】
用語の定義
別段の記載がない限り、本明細書で使用されている技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有すると見なされる。たとえば、Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)；Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)を参照されたい。本発明の開示を目的として以下の用語を以下のように定義する。
【０１６７】
本明細書において冠詞「a」または「an」は、該冠詞の文法上の目的語となる１つまたは複数の（たとえば少なくとも１つの）ものを指すために使用される。たとえば、「an element」は１つの構成要素または複数の構成要素を意味する。
【０１６８】
「約」は、特定の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、大きさ、量、重量または長さが、対照としての数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、大きさ、量、重量または長さと比較して、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％の範囲で変動することを意味する。
【０１６９】
本明細書を通して、別段の記載がない限り、「含む」（comprise、comprisesおよびcomprising）という用語は、記載の工程もしくは構成要素または工程群もしくは構成要素群を包含すると理解されるが、記載されているもの以外の工程もしくは構成要素または工程群もしくは構成要素群を除外するものではない。
【０１７０】
「からなる」は、この用語の前に挙げられたもののみを含むことを意味する。したがって、「からなる」という用語は、この用語の前に挙げられた構成要素が必要または必須であることを示し、その他の構成要素は含まれていなくてもよいことを意味する。「本質的にからなる」は、この用語の前に挙げられた構成要素を含み、該構成要素の開示に関連して記載された活性または作用に対して阻害も寄与もしないその他の構成要素も含むことを意味する。したがって、「本質的にからなる」という用語は、この用語の前に挙げられた構成要素が必要または必須であることを示すが、その他の構成要素は任意であり、この用語の前に挙げられた構成要素の活性または作用に実質的な影響を与えるかどうかによって含まれていてもよく、含まれていなくてもよい。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、組成物中の任意の薬剤（たとえば抗体、ポリペプチド結合性薬剤）の「純度」は具体的に定義されていてもよい。たとえば、特定の組成物は、たとえば高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（化合物を分離、同定かつ定量するために生化学分野および分析化学分野において頻繁に使用される公知のカラムクロマトグラフィーの一種）（ただしこれに限定されない）などによって測定した場合に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の純度（各数値の間の小数値を含む）の薬剤を含んでいてもよい。
【０１７２】
本明細書において「機能」や「機能的」などの用語は、生物学的機能、酵素的機能または治療的機能を指す。
【０１７３】
「単離された」という用語は、天然の状態において通常含まれている成分が実質的または本質的に除去された材料を意味する。たとえば、本明細書において「単離されたポリヌクレオチド」は、天然の状態では該ポリヌクレオチドの両端に位置する配列から精製されたポリヌクレオチドを包含し、たとえば、特定のＤＮＡ断片から通常このＤＮＡ断片の両端に隣接する配列が除去されていることを意味する。あるいは、本明細書において「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などの用語は、天然の細胞環境やその他の細胞成分との関わりから、該ペプチド分子または該ポリペプチド分子がインビトロで単離および／または精製されたことを包含し、たとえば、インビボで見られる物質と有意な関連性がないことを指す。
【０１７４】
本開示の実施に当たって、別段の記載がない限り、当技術分野で従来公知の分子生物学的方法および組換えＤＮＡ技術が使用され、これらの方法の大部分は説明を目的として後述されている。このような技術は文献に詳述されている。たとえば、Sambrook, el al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2000)；DNA Cloning: A Practical Approach, vol. 1 & II (D. Glover, ed.)；Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984)；Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (P. Herdewijn, ed., 2004)；Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985)；Nucleic Acid Hybridization: Modern Applications (Buzdin and Lukyanov, eds., 2009)；Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984)；Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986)；Freshney, R.I. (2005) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 5th Ed. Hoboken NJ, John Wiley & Sons；B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (3rd Edition 2010)；Farrell, R., RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (3rd Edition 2005)を参照されたい。
【０１７５】
創傷治癒
「創傷」とは、生体成分の喪失を伴うことがある体組織の連続性の離断を意味し、一般に機械的損傷や物理的な細胞障害によって引き起こされる。創傷には、皮膚障害、熱傷、放射線損傷、日光皮膚炎、擦過創、裂創、切創、ただれ、刺創、貫通創、銃創および挫滅損傷が含まれる。また、創傷には、切断創、裂創、引っ掻き傷、擦過創、穿孔創、刺創、貫通創、挫滅創、鈍的外傷、挫傷などの機械的創傷が含まれていてもよい。また、創傷には、極端な熱や冷気の作用によって生じる熱傷および凍傷が含まれていてもよい。また、創傷には、特に酸やアルカリによる腐食のような、化学物質の作用によって生じる化学的損傷が含まれていてもよい。さらに、創傷には、たとえば紫外線および／または電離放射線などの化学線の照射によって生じる組織断裂または組織障害が含まれていてもよく、これらは放射線創傷と呼ばれる。創傷は、壊死創、感染創、慢性創傷、急性創傷のいずれであってもよい。
【０１７６】
本明細書において「創傷治癒」は、創傷が損傷状態から回復することを指す。創傷発生後の最初の数時間の、潜伏期あるいは炎症期と呼ばれる第１期において、体液（特に血液）が漏出し、創傷の開放部から異物、病原菌および死組織が除去される。次いで、流出した血液が凝固し、外部からの病原菌や異物の侵入から創傷を保護する役割を果たす痂皮が形成される。痂皮が形成された後、潜伏期の次の段階として再吸収期が始まり、自己細胞による異物の消化が行われ、創傷組織へのマクロファージの遊走や、創傷の開放部に形成された凝血塊中の異物に対する食作用が見られる。創傷に侵入した異物や微生物はこの段階で分解され、軽度から中程度の炎症症状を伴うことがある。さらに、この再吸収期において、基底上皮および肉芽組織が形成され始める。通常、創傷発生から約１〜３日後に潜伏期が終了し、増殖期あるいは肉芽形成期と呼ばれる第２期へと進む。この時期は通常、創傷発生後の４日目〜７日目に見られる。この第２期において同化修復が始まり、線維芽細胞によるコラーゲンの形成が起こる。修復期あるいは上皮化期と呼ばれる最終段階が創傷発生後の約８日目から始まり、瘢痕組織が最終的に形成され、皮膚扁平上皮が新生される。形成された瘢痕組織は皮脂腺も汗腺も有しておらず、皮膚上で白色〜乳白色を呈する。損傷を受けていない組織とは異なり、瘢痕組織中のコラーゲンは複雑に絡み合うことなく、平行に配列している。
【０１７７】
「創傷治癒」についてのさらに詳しい情報は、Pschyrembel-Clinical Dictionary, 257th edition, 1994, Verlag de Gruyter, Berlin/New Yorkに記載されており、この文献は引用によりその全体が明示的に本明細書に援用される。
【０１７８】
創傷治癒障害は疾患の経過で見られることのある主要な合併症の１つである。低酸素（酸素欠乏）、炎症、感染症、有害な活性酸素種（ＲＯＳ）の生成による酸化ストレスなどの様々なプロセスによって効率的な創傷治癒が阻害される。創傷治癒過程は本質的に複雑なものであることから、治癒過程の遅延に関与する単一のパラメータを標的とした治療法の大部分では、その有効性は限定的である。
【０１７９】
創傷治癒は、微生物感染によって正常なプロセスから逸脱する。様々な病原菌が創傷に感染する恐れがあり、それによって正常な治癒過程が悪影響を受ける。たとえば、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、緑膿菌、表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌などの様々な病原菌によって創傷感染が引き起こされる。微生物感染を緩和するために複数の抗生物質が開発されているが、様々な細菌株が耐性を獲得している。たとえば、黄色ブドウ球菌株の多くは、メチシリンやオキサシリンなどのβ−ラクタム系抗生物質に対して耐性を獲得しており、グリコペプチド系抗生物質、スルホンアミド系抗生物質、キノロン系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質などの、その他の様々な種類の抗生物質に対しても耐性を獲得している。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の創傷治癒製剤は、抗微生物性を有することから、創傷からの微生物の排除、創傷中の微生物の増殖の抑制、創傷中の微生物の増殖の阻害、または創傷中に存在しうる微生物の殺傷を行うことができる。
【０１８０】
本明細書において「創傷治癒化合物」または「創傷治癒システム」は、創傷を治癒することができる化合物またはシステムを指す。創傷治癒化合物は抗微生物性を有することから、創傷から微生物を排除することができ、創傷表面の微生物の成長および増殖を阻害することができる。いくつかの実施形態において、前記創傷治癒化合物は創傷の治癒を加速させることができる。いくつかの実施形態において、前記創傷治癒化合物は、エアロゾル剤、乳剤、フォーム剤、起泡性液剤、ペースト剤、軟膏剤、クリーム剤、スプレー剤、酒精剤、噴霧剤、液剤、塗布剤、血清製剤、ゲル剤、ローション剤、溶液剤などの形態の組成物として製剤化される。いくつかの実施形態において、前記製剤は、包帯、ワイプ、ガーゼ、スポンジ、メッシュ、パッド、絆創膏、吸収性創傷被覆材などの創傷被覆材に塗布される創傷治癒化合物を含むシステムとして構成される。本明細書に記載されているように、化合物は局所適用のために調製された局所製剤として製剤化してもよい。
【０１８１】
幹細胞
本明細書において「幹細胞」は、ある特化した機能を有する別の細胞腫（たとえば「完全に分化した」細胞）に、適切な条件下で分化することが可能であり、別の適切な条件下では、後述するように、未分化多能性または未分化万能性を維持したまま自己複製することが可能な細胞を指す。本明細書において「細胞」は、単一の細胞および細胞集団（たとえば２個以上の細胞を含む集団）を指す。細胞集団は、１種類の細胞のみを含む純粋な集団であってもよい。あるいは、細胞集団は２種以上の細胞を含んでいてもよい。幹細胞は、たとえば末梢血、臍帯血、骨髄、固形組織などから得られた小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞であることが好ましい。
【０１８２】
本明細書において「ＳＭＳ細胞」は、直径が約５μｍの接着細胞であるという特徴を有する細胞または細胞集団を指す。ＳＭＳ細胞は均一な大きさで、完全な放射対称であり、光学顕微鏡下では、コントラストが異なる球状体を中央に含む球状の核と半透明の細胞質とが観察される。さらに、ＳＭＳ細胞は、低温や高温、標準的な増殖培地中での凍結融解、脱水、高ｐＨ、イオン強度の変動などの様々な非生理学的条件に対して極めて高い耐性を示す。さらに、ＳＭＳ細胞は、最大で約１．５μｍ／秒という高い運動性を特徴とする。
【０１８３】
本明細書において「細胞培養」または「培養細胞」は、人工のインビトロ環境中で維持、培養または増殖された細胞または組織を指す。これらの用語には、連続継代性細胞株（たとえば不死化表現型細胞株）、初代細胞培養、有限寿命細胞株（たとえば非形質転換細胞）、およびインビトロで維持されるその他の細胞集団が含まれる。これに関連して、初代細胞は、培養を経ずに、ヒトなどの動物の組織または器官から直接得られた細胞である。初代細胞は、例外はあるものの、通常、老化および／または増殖停止までにインビトロで最大１０回にわたって継代することができる。
【０１８４】
本明細書において「未分化」とは、細胞集団中に含まれる細胞およびこれに由来する細胞の大部分（少なくとも２０％、場合によっては５０％または８０％を超える）が、胚または成体に由来する分化細胞と識別可能な、未分化細胞の形態学的特徴を示す培養細胞を指す。細胞数の少なくとも約５０％を維持したまま、少なくとも３週間の培養期間中に少なくとも１回の集団倍加を経た場合、または同じ割合の細胞が、同じ培養期間後に未分化細胞に特徴的なマーカーまたは形態学的特徴を示す場合に、細胞は未分化な状態で増殖していると見なされる。
【０１８５】
「維持」は、時として細胞数の増加を伴うことのある、細胞または細胞集団の生存の持続を意味する。「増殖」（proliferation、propagation、expansionおよびgrowth；これらの用語は互いに区別なく使用してもよい）は、細胞数の増加を指す。一実施形態によれば、この用語は、少なくとも６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、３２週間、４８週間、５２週間、１０４週間もしくはそれ以上の期間、またはこれらの期間のいずれか２つよって定義される範囲内の期間にわたって、細胞が生存を維持することを指す。別の一実施形態では、少なくとも２５代、２６代、２７代、２８代、２９代、３０代もしくはそれ以上の継代数、またはこれらの継代数のいずれか２つによって定義される範囲内の継代数にわたって、細胞は生存を維持する。
【０１８６】
本明細書において「細胞懸濁液」は、細胞の大部分が培地（通常、培養培地（培養系））中で自由に浮遊している状態の細胞培養を指し、細胞は、単一の細胞、細胞集塊および／または細胞凝集塊として浮遊している。換言すれば、細胞は、固体の基材または半固体の基材に接着することなく、培地中で生存を維持し増殖する。本明細書において「接着細胞」は、基材または表面に接着している細胞または細胞集団を指す。
【０１８７】
本明細書において「培養系」は、ＳＭＳ細胞またはこれに由来する体細胞の維持および増殖を支持するための培養条件、ならびに未分化のＳＭＳ細胞または分化したＳＭＳ細胞の分化誘導および増殖を支持するための選択された条件を指す。この用語は、基礎培地（塩、糖およびアミノ酸を含む所定の組成の基礎溶液を通常含む細胞培養培地）や、血清代替添加物などを含む構成成分の組み合わせを示す。培養系はさらに、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分、さらなる血清または血清代替物、培養（栄養）培地、およびその他の外部添加因子などの構成成分を含んでいてもよいが、培養系の構成成分はこれらに限定されず、これらの構成成分は共同して、ＳＭＳ細胞の増殖、細胞培養の維持、細胞の分化、様々な分子の発現を支持する適切な条件を提供する。これに関連して、「培養系」は、該培養系において培養された細胞を包含する。
【０１８８】
本明細書において「細胞外マトリックス（ＥＣＭ）」は、細胞によって分泌されるタンパク質および多糖類の複雑なネットワークからなる細胞外成分である。ＳＭＳ由来ＥＣＭとは、小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞によって産生されたＥＣＭを指す。本明細書で提供される実施形態のいくつかは、ＳＭＳ由来ＥＣＭの製造方法に関する。本明細書に記載の実施形態のいくつかは、内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、その他の細胞などの細胞を、ＳＭＳ由来ＥＣＭとともに培養する方法に関する。いくつかの実施形態において、たとえば内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、その他の細胞などの前記培養細胞は、ＳＭＳ由来ＥＣＭと相互作用する。いくつかの実施形態において、内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、その他の細胞などの前記培養細胞は、ＳＭＳ由来ＥＣＭ内に遊走する。いくつかの実施形態において、内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、その他の細胞などの前記培養細胞は、ＳＭＳ由来ＥＣＭ内で増殖する。いくつかの実施形態において、内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、その他の細胞などの前記培養細胞は、ＳＭＳ由来ＥＣＭ上に接着層を形成する。いくつかの実施形態において、内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、その他の細胞などの前記培養細胞は、ＳＭＳ由来ＥＣＭ上で安定な複合体または安定な結合を形成する。いくつかの実施形態において、内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、その他の細胞などの前記培養細胞は、ＳＭＳ由来ＥＣＭ上で長期間にわたって生存を維持し、たとえば、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年間またはこれよりも長い期間にわたって生存を維持する。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、前記培養細胞（たとえば内皮細胞など）は、前記ＳＭＳ細胞から得られたＥＣＭ上において細管または脈管構造を形成する。本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、前記ＳＭＳ細胞から得られたＥＣＭにおける細管または脈管構造の形成を抑制または促進する１種以上の薬剤または化合物の効果を測定する方法に関する。いくつかの実施形態において、ＳＭＳ由来ＥＣＭとの相互作用によって内皮細胞から形成された細管または脈管構造を、血管新生または動脈新生を抑制または促進する１種以上の薬剤または化合物と接触させる。いくつかの実施形態において、前記ＳＭＳ細胞から得られたＥＣＭと接触させた細胞（たとえば内皮細胞集団など）による血管新生または動脈新生の抑制または促進を、１種以上の薬剤または化合物を投与せずに前記ＳＭＳ細胞由来ＥＣＭ上で培養したコントロール細胞集団（たとえばコントロール内皮細胞集団など）と比較することによって、前記ＳＭＳ細胞由来ＥＣＭと接触させた前記細胞（たとえば内皮細胞など）による血管新生または動脈新生を抑制または促進するための前記１種以上の薬剤または化合物の効果を測定する。いくつかの実施形態において、前記血管新生または動脈新生の抑制または促進は、脈管の成長の程度および／または脈管形成の質を測定し、これらの特性を、前記１種以上の薬剤を投与していないコントロール試料と比較することによって判断する。
【０１９０】
本開示は、未分化ＳＭＳ細胞を未分化多能性または未分化万能性の状態で維持可能な培養系において、未分化ＳＭＳ細胞を維持するための、好ましくは増殖させるための培養系および方法に関する。本明細書で提供されるこの培養系は、未分化の幹細胞をラージスケールで長期間にわたり維持するのに特に適していることが判明している。
【０１９１】
「細胞外マトリックス」は当技術分野でよく知られている。細胞外マトリックスの成分としては、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン、トロンボスポンジン、エラスチン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリリン、メロシン、anchorin、コンドロネクチン、リンクタンパク質、骨シアロタンパク質、オステオカルシン、オステオポンチン、エピネクチン、ヒアルロネクチン、undulin、エピリグリンおよび／またはカリニンのうちの１種以上のタンパク質が挙げられる。「細胞外マトリックス」は、今後見出される可能性のある現在未知の細胞外マトリックスも包含し、当業者であれば、このような現在未知の細胞外マトリックスを細胞外マトリックスとして容易に特定することができる。
【０１９２】
本明細書において「遺伝子産物」は、細胞または細胞集団にトランスフェクトされる遺伝子産物を指す。たとえば、成長因子、サイトカイン、ペプチドホルモン、タンパク質ホルモン、酵素、タンパク質断片または細胞外マトリックスタンパク質などのタンパク質をコードする遺伝子をトランスフェクトすることができる。具体的には、たとえば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦおよびｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−II）、インターロイキンと呼ばれるサイトカイン群（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）、インターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦ）、インスリン、副甲状腺ホルモン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、トロンボスポンジン、ゼラチン、フィブリリン、メロシン、anchorin、コンドロネクチン、リンクタンパク質、骨シアロタンパク質、オステオカルシン、オステオポンチン、エピネクチン、ヒアルロネクチン、undulin、エピリグリン、カリニン、コラゲナーゼ、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、アグリン、ニドゲンおよび／もしくはエンタクチンもしくはこれらのバリアントならびに／またはこれらの組み合わせをコードする遺伝子をトランスフェクトすることができる。
【０１９３】
本明細書において「細胞マーカー」は、特定の細胞を特徴付けることが可能な表現型特性、または他の種類の細胞から特定の細胞を識別することが可能な表現型特性を指す。マーカーは、タンパク質（分泌タンパク質、細胞表面タンパク質、内部タンパク質など；細胞によって合成されたタンパク質または細胞内に取り込まれたタンパク質）、核酸（mRNAや、酵素活性を有する核酸分子など）、多糖類のいずれであってもよい。前記マーカーには、目的の細胞腫に特異的な抗体、レクチン、プローブ、または核酸増幅反応によって検出可能な、前述のような細胞成分の決定因子も含まれる。また、遺伝子産物の機能に基づく生化学的アッセイまたは酵素アッセイによってこれらのマーカーを同定することもできる。転写産物をコードする遺伝子およびマーカーの発現を引き起こす事象も各マーカーと関連している。マーカーが、（抗体またはPCRアッセイを使用して測定された遺伝子産物の総量として）少なくとも５倍の発現量または（細胞集団中の陽性細胞の頻度として）５倍の頻度で発現されている場合に、未分化細胞集団または分化細胞集団においてマーカーが差次的に発現されていると見なされる。10倍、100倍または10,000倍というようにマーカーの発現量または頻度が高くなればなるほどより好ましい。
【０１９４】
小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞は、Ｔ２５フラスコに入れた増殖培地中で（たとえば３７℃、５％ＣＯ２の条件のインキュベーター内で）簡便に培養することができる。このようにして培養されたＳＭＳ細胞集団は、未分化ＳＭＳ細胞とＳＭＳから分化した細胞とからなる不均一細胞集団を含んでいることがある。未分化ＳＭＳ細胞は浮遊分画および接着分画として存在し、浮遊分画の大部分は未分化ＳＭＳ細胞が占める（たとえば５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上もしくは９５％以上を未分化ＳＭＳ細胞が占め、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲内の量を未分化ＳＭＳ細胞が占める）。したがって、いくつかの態様は、未分化の非接着ＳＭＳ細胞の懸濁液に関し、好ましくは、細胞接着が阻害されるような方法（たとえばポリプロピレン製のベッセルまたはフラスコ）を使用して、液体培地中で培養された未分化の非接着ＳＭＳ細胞の懸濁液に関する。いくつかの態様において、未分化の浮遊ＳＭＳ細胞集団は、浮遊分画の５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上もしくは９５％以上を占め、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲内の量を占める。
【０１９５】
未分化ＳＭＳ細胞は分画遠心法によって単離または精製することができる。まず低速で遠心分離して細胞塊または分化細胞を除去し、次いで高速で遠心分離して未分化ＳＭＳ細胞を回収する。別の方法として、濾過によって未分化ＳＭＳ細胞を単離してもよく、たとえば、フィルターの孔径を３〜５μｍまで徐々に小さくしていく分別濾過によって単離してもよい。別の方法として、未分化ＳＭＳ細胞を、免疫結合（たとえばＳＭＳ細胞上の幹細胞受容体に特異的な結合パートナーを使用し、該結合パートナー（抗体など）がビーズ（磁気ビーズなど）に結合されていたり、あるいはＦＡＣＳセルソーティングによって検出されるもの）や、フィルターの孔径を３〜５μｍまで徐々に小さくしていく分別濾過によって単離してもよい。未分化ＳＭＳ細胞を単離した後、顕微鏡下で未分化ＳＭＳ細胞の均一性を確認する。前述の単離プロトコルの１つ以上を実施する前に未分化ＳＭＳ細胞を少なくとも２５代まで継代培養することによって（たとえば、２５代、２６代、２７代、２８代、２９代、３０代、３１代、３２代、３３代、３４代、３５代、３６代、３７代、３８代、３９代もしくは４０代、またはこれらの継代数のいずれか２つによって定義される範囲内の継代数まで継代培養することによって）、均一性の高いＳＭＳ細胞集団を得ることができる。
【０１９６】
ＳＭＳ細胞は、分化誘導化合物（たとえばインスリン）を添加または非添加の、様々な種類の血清含有培地または無血清培地を使用して増殖させることができる。週に１回、４２００×ｇで１５分間遠心分離してＳＭＳ細胞を沈殿させ、細胞増殖培地を交換する。遠心分離の速度は、３０００×ｇ、３５００×ｇ、４０００×ｇ、４１００×ｇ、４２００×ｇ、４３００×ｇ、４５００×ｇまたは５０００×ｇに変更してもよく、これらの速度のいずれか２つによって定義される範囲内の速度で遠心分離を行ってもよく、これに応じて遠心時間を調整する。このような条件下では、培地の量（細胞の密集度）によってＳＭＳ細胞の増殖が制限される。ＳＭＳ細胞の均一性は顕微鏡下で評価し、ＳＭＳ細胞の細胞数は、懸濁液の混濁度を分光光度計で測定することによって評価するか、かつ／または高速遠心分離後にペレットの大きさを測定することによって評価する。ＳＭＳ細胞を懸濁培養することによって、増殖培地を入れた新たなチューブに該細胞を分取および／または移動することが容易となり、培養細胞の移動およびクローニングが容易となる。また、既存の培養から新たな培養へと培養細胞を分取および／または移動させるこの方法は、培養ディッシュまたは基底細胞層から細胞を剥離するための酵素（たとえばトリプシン）を使用せずに行われる。ＳＭＳ細胞の大部分は細胞塊を形成することなく個々の細胞として増殖し、懸濁液中のＳＭＳ細胞は、細胞の移動操作が行われるにもかかわらず、未分化な状態のまま維持可能である。また、懸濁培養はスケールアップすることができ、培地の量を増加することによって得られる細胞の数を増やすことができる。
【０１９７】
ＳＭＳ細胞は、たとえば脂肪細胞前駆細胞、神経細胞前駆細胞、骨細胞前駆細胞などの様々な細胞へと分化誘導することができる。ＳＭＳ細胞をコンフルエントまで増殖させた後、適切な誘導培地中で培養する。該誘導培地には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ブチルヒドロキシアニソール、β−メルカプトエタノール、アスコルビン酸−２−リン酸エステル、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸塩、ジメチルスルホキシド、インスリン、イソブチルメチルキサンチン、インドメタシンまたはこれらの組み合わせが含まれていてもよい。いくつかの実施形態において、前記１種以上の化学誘導物質の添加量は、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％もしくは１０％、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲内の量であってもよい。いくつかの実施形態において、前記１種以上の化学誘導物質の添加量は、０．０００１ｍＭ、０．０００５ｍＭ、０．００１ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０７ｍＭ、０．０８ｍＭ、０．０９ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭもしくは１０ｍＭ、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲内の量であってもよい。いくつかの実施形態において、前記誘導培地に血清は含まれていない。したがって、いくつかの実施形態において、前記誘導培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ブチルヒドロキシアニソール、β−メルカプトエタノール、アスコルビン酸−２−リン酸エステル、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸塩、ジメチルスルホキシド、インスリン、イソブチルメチルキサンチンまたはインドメタシンの１種以上を含むが、血清は含んでいない。
【０１９８】
単一の理論に拘束されることを望むものではないが、いくつかの実施形態において、化学誘導物質として使用されるＤＭＳＯは、別の化合物のＳＭＳ細胞への到達を促す誘導物質として作用すると考えられる。また、単一の理論に拘束されることを望むものではないが、いくつかの実施形態において、β−メルカプトエタノールはＳＨ基を減少させる作用があると考えられる。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、ＳＭＳ細胞から分化した細胞は特異的なマーカーを発現する（たとえば、脂肪細胞前駆細胞は脂肪細胞前駆細胞に特異的なマーカーを発現し；神経細胞前駆細胞は神経細胞前駆細胞に特異的なマーカーを発現し；骨細胞前駆細胞は骨細胞前駆細胞に特異的なマーカーを発現する）。いくつかの実施形態において、脂肪細胞に分化したＳＭＳ細胞は、CD44、インテグリン、ICAM-1/CD54、その他の脂肪細胞分化マーカーなどの、脂肪細胞に特異的なマーカーを発現する。いくつかの実施形態において、神経細胞に分化したＳＭＳ細胞は、ダブルコルチンドメイン含有タンパク質２Ｃ（DCDC2）、ケラチン関連タンパク質（KRTAP）５−１、ネスチン、SOX2、ABCG2、FGF R4、frizzled-9、NCAM、Musashi-1、神経特異的クラスIIIβ−チューブリン、微小管関連タンパク質２、ニューロン特異的エノラーゼ、カルレチニン、チロシンヒドロキシラーゼ、コリンアセチルトランスフェラーゼ、カルビンジン、neuronal nuclei抗原、GABA、その他の神経細胞分化マーカーなどの、神経細胞に特異的なマーカーを発現する。いくつかの実施形態において、骨細胞前駆細胞に分化したＳＭＳ細胞は、アルカリホスファターゼ、Runt関連転写因子２、アネキシンＡ１および／またはＡ５、コリントランスポーター様タンパク質１、オステオカルシン、その他の骨細胞前駆細胞分化マーカーなどの、骨細胞に特異的なマーカーを発現する。
【０２００】
未分化のＳＭＳ細胞は、様々な治療方法、タンパク質の製造方法、創薬方法および診断方法に使用することができる。ＳＭＳ細胞の機能は、様々な分化誘導培地を使用して、ＳＭＳ細胞の分化能を試験することによって評価される。天然または遺伝子組換えのＳＭＳ細胞を使用して、様々な低分子化合物または高分子化合物を製造することができ、たとえば、成長因子や細胞外マトリックスタンパク質などのタンパク質を製造することができるが、製造できるものはこれらに限定されない。また、ＳＭＳ細胞は、分化誘導によって別の細胞を作製するため、または組織、組織様構造、オルガノイドもしくは器官を形成するために使用することができる。さらに、ＳＭＳ細胞は、３Ｄプリンティング（３Ｄバイオプリンティング）を使用して空間制御された細胞パターンを製造する方法のための基材として使用することができる。この方法は、本明細書に記載のＳＭＳ細胞と３Ｄバイオプリンタとを使用して実施することができ、３Ｄバイオプリンタとしては、たとえば、BioBot1（登録商標）、3D-Bioplotter（登録商標）、3DS Alpha（登録商標）、3Dynamic Omega（登録商標）などが挙げられる。さらに、（ＧＦＰなどのマーカーを含む）遺伝子組換えＳＭＳ細胞を使用して、細胞間相互作用、分化およびその他の細胞関連活性を追跡することができる。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、ＳＭＳ細胞はタンパク質の製造に使用される。いくつかの実施形態において、懸濁培養されたＳＭＳ細胞からタンパク質が差次的に発現されるようにＳＭＳ細胞を誘導する。ＳＭＳ細胞を培養する際の懸濁液の量は、０．００１Ｌ、０．００５Ｌ、０．０１０Ｌ、０．０５Ｌ、０．１Ｌ、０．２Ｌ、０．３Ｌ、０．４Ｌ、０．５Ｌ、０．６Ｌ、０．７Ｌ、０．８Ｌ、０．９Ｌ、１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、４Ｌ、５Ｌ、６Ｌ、７Ｌ、８Ｌ、９Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌ、３０Ｌ、４０Ｌ、５０Ｌ、６０Ｌ、７０Ｌ、８０Ｌ、９０Ｌ、１００Ｌ、１５０Ｌ、２００Ｌ、２５０Ｌ、３００Ｌ、３５０Ｌ、４００Ｌ、４５０Ｌ、５００Ｌ、６００Ｌ、７００Ｌ、８００Ｌ、９００Ｌもしくは１０００Ｌ、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲内の量であってもよい。いくつかの実施形態において、ＳＭＳ細胞は、０．００１Ｌ〜１０００Ｌの容量のバイオリアクターで培養される。いくつかの実施形態において、ＳＭＳ細胞が培養されるバイオリアクターの容量は、０．００１Ｌ、０．００５Ｌ、０．０１０Ｌ、０．０５Ｌ、０．１Ｌ、０．２Ｌ、０．３Ｌ、０．４Ｌ、０．５Ｌ、０．６Ｌ、０．７Ｌ、０．８Ｌ、０．９Ｌ、１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、４Ｌ、５Ｌ、６Ｌ、７Ｌ、８Ｌ、９Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌ、３０Ｌ、４０Ｌ、５０Ｌ、６０Ｌ、７０Ｌ、８０Ｌ、９０Ｌ、１００Ｌ、１５０Ｌ、２００Ｌ、２５０Ｌ、３００Ｌ、３５０Ｌ、４００Ｌ、４５０Ｌ、５００Ｌ、６００Ｌ、７００Ｌ、８００Ｌ、９００Ｌもしくは１０００Ｌ、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲内の容量である。いくつかの実施形態において、ＳＭＳ細胞はWAVEバイオリアクターで培養される。本明細書において「容器」はＳＭＳ細胞を培養するための容器を指し、バイオリアクター、培養ベッセル、フラスコ、試験管、ディッシュ、細胞培養物を培養可能なその他のベッセルなどが挙げられる。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、前記培養ベッセルによって、懸濁液中のＳＭＳ細胞の増殖が促進される。いくつかの実施形態において、前記培養ベッセルは、ポリプロピレン製ベッセル、前処理されたシリコーン加工ベッセル、培養物中のＳＭＳ細胞の増殖を促進可能なその他のベッセル、または培養物中のＳＭＳ細胞の増殖を促進するように構成されたベッセルである。いくつかの実施形態において、前記培養ベッセルによって、細胞接着が促進される。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、ＳＭＳ細胞は、ＳＭＳ細胞の濃度の増加、タンパク質の産生の増加またはこれらの両方を誘導可能な１種以上の化学誘導物質の存在下で培養される。いくつかの実施形態において、前記１種以上の化学誘導物質は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ブチルヒドロキシアニソール、β−メルカプトエタノール、アスコルビン酸−２−リン酸エステル、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸塩、ジメチルスルホキシド、インスリン、イソブチルメチルキサンチンおよびインドメタシンの１種以上を含む。いくつかの実施形態において、前記１種以上の化学誘導物質の添加量は、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％もしくは１０％、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲内の量であってもよい。いくつかの実施形態において、前記１種以上の化学誘導物質の添加量は、０．０００１ｍＭ、０．０００５ｍＭ、０．００１ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０７ｍＭ、０．０８ｍＭ、０．０９ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭもしくは１０ｍＭ、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲内の量であってもよい。いくつかの実施形態において、前記誘導培地に血清は含まれていない。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、懸濁液中においてＳＭＳ細胞を前記１種以上の化学誘導物質で誘導することによって、前記１種以上の誘導物質の非存在下で培養したＳＭＳ細胞と比較して、ＳＭＳ細胞の濃度が増加する。いくつかの実施形態において、前記１種以上の化学誘導物質で誘導したＳＭＳ細胞の濃度は、前記１種以上の化学誘導物質の非存在下で培養したＳＭＳ細胞コントロール集団と比較して、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、１００％以上、１５０％以上、２００％以上、３００％以上、４００％以上もしくは５００％以上増加し、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲内の割合で増加する。いくつかの実施形態において、前記１種以上の化学誘導物質で誘導したＳＭＳ細胞の濃度は、前記１種以上の化学誘導物質の非存在下で培養したＳＭＳ細胞コントロール集団と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍もしくは１０倍増加し、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲内の倍率で増加する。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、ＳＭＳ細胞は、１種以上のタンパク質の産生を誘導する１種以上の化学誘導物質の存在下で培養される。いくつかの実施形態において、ＳＭＳ細胞から産生が誘導される１種以上のタンパク質としては、第XIII凝固因子Ａ鎖、アポリポタンパク質Ｅ、アンチトロンビンIII、骨形成タンパク質１（BMP-1）、ビトロネクチン、acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A（ANP32A）、カルシニューリン様ホスホエステラーゼ、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、β−エノラーゼ、fermitin family homolog 1、微小管関連タンパク質RP/EB（MAPRE1）、熱ショックタンパク質、LIM and senescent cell antigen-like-containing domain protein 1（LIMS1）、ミオシン調節タンパク質、プロフィリン−１、グリコーゲンホスホリラーゼ、フラビンレダクターゼ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、チューブリン、細胞内クロライドチャネルタンパク質、wings apart-like protein homolog（WAPAL）、cell division control protein、オステオポンチン、BPI fold-containing、伸長因子、プラスミノゲン、アルド−ケトレダクターゼおよびケラチンの１種以上が挙げられる。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、培養物中のＳＭＳ細胞から産生が誘導された１種以上のタンパク質は、次いで濃縮、単離および／または精製される。いくつかの実施形態において、濃縮、単離および／または精製される前記タンパク質は、第XIII凝固因子Ａ鎖、アポリポタンパク質Ｅ、アンチトロンビンIII、骨形成タンパク質１（BMP-1）、ビトロネクチン、acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A（ANP32A）、カルシニューリン様ホスホエステラーゼ、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、β−エノラーゼ、fermitin family homolog 1、微小管関連タンパク質RP/EB（MAPRE1）、熱ショックタンパク質、LIM and senescent cell antigen-like-containing domain protein 1（LIMS1）、ミオシン調節タンパク質、プロフィリン−１、グリコーゲンホスホリラーゼ、フラビンレダクターゼ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、チューブリン、細胞内クロライドチャネルタンパク質、wings apart-like protein homolog（WAPAL）、cell division control protein、オステオポンチン、BPI fold-containing、伸長因子、プラスミノゲン、アルド−ケトレダクターゼおよびケラチンの１種以上である。いくつかの実施形態において、１種以上のタンパク質の産生はラージスケールで行ってもよく、たとえば１Ｌ以上の量で行ってもよく、１Ｌ以上、２Ｌ以上、３Ｌ以上、４Ｌ以上、５Ｌ以上、６Ｌ以上、７Ｌ以上、８Ｌ以上、９Ｌ以上、１０Ｌ以上、２０Ｌ以上、３０Ｌ以上、４０Ｌ以上、５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、１５０Ｌ以上、２００Ｌ以上、２５０Ｌ以上、３００Ｌ以上、３５０Ｌ以上、４００Ｌ以上、４５０Ｌ以上、５００Ｌ以上、６００Ｌ以上、７００Ｌ以上、８００Ｌ以上、９００Ｌ以上もしくは１０００Ｌ以上、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲内の量で行ってもよい。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、ＳＭＳ細胞は、該ＳＭＳ細胞の巨大化を促進する培地中で培養される。いくつかの実施形態において、ＳＭＳ細胞の巨大化を促進する培地としてMesenPRO基礎培地が挙げられる。いくつかの実施形態において、巨大化したＳＭＳ細胞は表面に接着する。いくつかの実施形態において、巨大化したＳＭＳ細胞は形態変化を遂げる。
【０２０８】
好ましい実施形態のいくつかにおいて、ＳＭＳ細胞を懸濁状態のまま、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の産生に利用する。いくつかの実施形態において、ＥＣＭタンパク質をコードする遺伝子で（懸濁状態または接着状態の）ＳＭＳ細胞を形質転換する。ＳＭＳ細胞（ＥＣＭタンパク質をコードする遺伝子で形質転換されたＳＭＳ細胞または天然のＳＭＳ細胞）は懸濁培養することができ、好ましくは未分化な状態で維持される。ＳＭＳ細胞を数代継代することによって、未分化ＳＭＳ細胞の均一な集団を懸濁状態で得ることができる（たとえば５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上もしくは９５％以上を未分化ＳＭＳ細胞が占め、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲内の量を未分化ＳＭＳ細胞が占める）。ＥＣＭタンパク質の産生を促す化学誘導物質（たとえばヘッジホッグ阻害剤および／またはＴＧＦ／ＢＭＰ活性化因子）を培養物に添加し、懸濁液中に産生されたＥＣＭを（たとえば濾過、遠心分離または免疫結合によって）回収する。同様に、本明細書に記載の接着状態のＳＭＳ細胞を使用してＥＣＭを産生させることもできる。この態様では、ＳＭＳ細胞（ＥＣＭタンパク質をコードする遺伝子で形質転換されたＳＭＳ細胞または天然のＳＭＳ細胞）を、Ｔ２５フラスコまたはプレート（たとえばポリスチレン製；物理的な誘導因子としての表面刺激）に播種し、接着細胞を数代にわたり継代培養することによって、未分化ＳＭＳ細胞の均一な集団を懸濁状態で得ることができる（たとえば５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上もしくは９５％以上を未分化ＳＭＳ細胞が占め、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲内の量を未分化ＳＭＳ細胞が占める）。所望の均一性が得られた後、たとえばヘッジホッグ阻害剤および／またはＴＧＦ／ＢＭＰ活性化因子などの、ＥＣＭの産生を促す化学誘導物質を培地に添加する。その後、懸濁液中に産生されたＥＣＭを（たとえば濾過、遠心分離または免疫結合によって）回収する。約２週後に浮遊状態のＥＣＭを高速遠心分離で回収することが好ましい。接着状態のＥＣＭもほぼ同時期に、フラスコまたはディッシュの底から掻き取って回収することができる。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、ＳＭＳ由来ＥＣＭは、１種以上の抗微生物化合物を産生するものであるか、あるいはＳＭＳ由来ＥＣＭタンパク質自体が、抗細菌特性、抗ウイルス特性、抗真菌特性などの抗微生物特性を有している。いくつかの実施形態において、ＳＭＳ細胞によって産生される前記抗微生物化合物または抗微生物特性を有する前記ＥＣＭタンパク質は、コレクチン、Ｃ型レクチンファミリー４、セプチン１２または膵リボヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態において、ＳＭＳ細胞は、抗微生物化合物を自己産生することから、抗生物質の非存在下で培養してもよい。
【０２１０】
本明細書に記載の実施形態のいくつかは、ＳＭＳ細胞の培養物から得られる１種以上のＥＣＭタンパク質を含む組成物に関する。いくつかの実施形態において、前記１種以上のＥＣＭタンパク質は改変されたものである。いくつかの実施形態において、前記改変されたＥＣＭタンパク質は、変性、アセチル化、アシル化、カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、脂質化、メチル化、ペグ化、リン酸化、プレニル化、硫酸化および／またはユビキチン化によって改変されたものである。いくつかの実施形態において、前記１種以上のＥＣＭタンパク質は、アグリン、ニドゲン、カドヘリン、クラスリン、コラーゲン、ディフェンシン、エラスチン、エンタクチン、フィブリリン、フィブロネクチン、ケラチン、ラミニン、微小管アクチン架橋因子１（microtubule-actin cross-linking factor 1）、SPARC様タンパク質、ネスプリン（ネスプリン−１、ネスプリン−２、ネスプリン−３）、fibrous sheath-interacting protein、ミオメシン、ネブリン、プラコフィリン、インテグリン、タリン、エクスポーチン、トランスポーチン、テネイシン、パールカン、ソルチリン関連受容体、テンシン、タイチン、トータルタンパク質および／または前記１種以上のタンパク質の断片のうちの１種以上を含む。いくつかの実施形態において、前記１種以上のＥＣＭタンパク質は、たとえばコレクチン、Ｃ型レクチンファミリー４、セプチン１２、膵リボヌクレアーゼなどの、微生物の増殖を抑制する化合物を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物は、エアロゾル剤、クリーム剤、乳剤、フォーム剤、起泡性液剤、ゲル剤、ローション剤、軟膏剤、ペースト剤、塗布剤、血清製剤、液剤またはスプレー剤として製剤化される。いくつかの実施形態において、前記組成物を創傷被覆材に塗布することによって創傷治癒システムが得られる。いくつかの実施形態において、前記創傷被覆材は、包帯、ワイプ、ガーゼ、スポンジ、メッシュ、パッド、絆創膏または吸収性創傷被覆材である。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、ＳＭＳ由来ＥＣＭは、懸濁培養されたＳＭＳ細胞から得られる。いくつかの実施形態において、ＳＭＳ由来ＥＣＭは、懸濁培養されたＳＭＳ細胞から得られる。いくつかの実施形態において、ＳＭＳ由来ＥＣＭとともに様々な細胞を培養し、該細胞をＳＭＳ由来ＥＣＭと相互作用させる。いくつかの実施形態において、ＳＭＳ由来ＥＣＭの存在下で内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞などの細胞を培養し、かつ／またはこれらの細胞をＳＭＳ由来ＥＣＭと相互作用させる。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、ＳＭＳ由来ＥＣＭとともに内皮細胞を培養し、該内皮細胞をＳＭＳ由来ＥＣＭと相互作用させる。いくつかの実施形態において、前記内皮細胞は、前記ＳＭＳ由来ＥＣＭ内へと遊走する（図２５Ａおよび図２５Ｂ）。いくつかの実施形態において、前記内皮細胞はＳＭＳ由来ＥＣＭｘ内で活発に増殖する（図２６Ａ〜図２６Ｃ）。いくつかの実施形態において、内皮細胞は細管に分化し、その状態で、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年間もしくはこれ以上の期間、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲内の期間にわたって生存が維持される（図２７Ａおよび図２７Ｂ）。いくつかの実施形態において、前記内皮細胞は、整列したＳＭＳ細胞の縁に沿って一時的に整列し、整列した細胞の一方の境界と他方の境界の内側には内皮細胞はほとんど見られない。内皮細胞がほとんど存在しないこの部分は比較的大きな細管（脈管）構造の痕跡である（図２８Ａ〜図２８Ｃ）。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、ＳＭＳ由来ＥＣＭとともに角化細胞を培養し、該角化細胞をＳＭＳ由来ＥＣＭと相互作用させる。いくつかの実施形態において、角化細胞はＳＭＳ由来ＥＣＭ上に接着層を形成する（図３０Ａおよび図３０Ｂ）。いくつかの実施形態において、ＳＭＳ由来ＥＣＭ上に形成されたこの角化細胞構造は安定な状態のまま、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年間もしくはこれ以上の期間、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲内の期間にわたって維持された。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、ＳＭＳ由来ＥＣＭとともに線維芽細胞を培養し、該線維芽細胞をＳＭＳ由来ＥＣＭと相互作用させる。いくつかの実施形態において、前記線維芽細胞は、前記ＳＭＳ由来ＥＣＭ内へと遊走する（図３１Ａおよび図３１Ｂ）。いくつかの実施形態において、線維芽細胞はＥＣＭ内へと遊走し、該ＥＣＭ内で増殖する（図３２Ａおよび図３２Ｂ）。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は数日間でコンフルエントに達する。いくつかの実施形態において、線維芽細胞はＳＭＳ由来ＥＣＭ内でその生存が、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年間もしくはこれ以上の期間、またはこれらの期間のいずれか２つによって定義される範囲内の期間にわたって維持された。
【０２１５】
いくつかの態様において、前記ＥＣＭは、（たとえば化学的方法、物理的方法および／または酵素的方法を使用して）脱細胞化される。脱細胞化方法は、ＥＣＭ足場の構造統合性および化学的統合性を維持したまま脱細胞化できる方法であることが好ましい。さらに、ＳＭＳ由来ＥＣＭの様々な分子成分を濃縮または単離することができる。ＳＭＳ細胞のインビトロ培養から得られたＥＣＭは、様々な器官の様々な組織に由来するＥＣＭと類似あるいは同一と見なすことができる。前述のＳＭＳ細胞によって産生されたＥＣＭを凍結乾燥して粉末化し、そのまま保存してもよい。粉末形態またはその他の形態のＥＣＭは、各種用途に使用することができ、たとえば、インビトロにおける細胞増殖または細胞分化の促進（たとえば３Ｄ細胞培養を目的としたもの）や、インビボにおける細胞増殖または細胞分化の促進（たとえば創傷治癒の促進を目的としたもの）（または腫瘍の増殖の抑制を目的としたもの）に使用することができる。
【０２１６】
いくつかの態様において、足場上で培養したＳＭＳ細胞からＥＣＭが産生される。ＳＭＳ細胞は、適切な増殖培地（たとえば血清含有ＤＭＥＭや無血清ＤＭＥＭ）中において様々な足場（たとえば、脱細胞化された天然の骨；脱細胞化された軟らかいコラーゲン；活性炭、カーボンブラック、炭素膜、炭素繊維布帛、ナノチューブもしくはマイクロチューブ、または炭素から構成された医療器具もしくはインプラント（ステントやシャントなど）などの炭素系支持体）上で培養される。いくつかの態様において、このような支持体は増殖培地中で自由に浮遊するものである。また、分化誘導化合物を添加してもよい。顕微鏡観察では、分化したＳＭＳ細胞が劇的な形態変化を遂げることが示されるが、このＳＭＳ細胞の分化は足場の特性および／または添加される化合物の種類に左右される。また、ＳＭＳ細胞の接着、増殖および分化は、培地の種類の影響も受ける。ＳＭＳ細胞およびこの細胞から分化した細胞は、足場に接着した状態の細胞外マトリックスおよび組織様構造を産生する。
【０２１７】
ＳＭＳ細胞を含む産生されたＥＣＭおよび組織様構造、またはＳＭＳ細胞から産生されたＥＣＭおよび組織様構造は、様々な細管構造が形成されていることから、高度に多孔性であり、よって、細胞に栄養分を供給するのに有利である。足場に接着したＳＭＳ細胞および分化細胞は培地中（５％ＣＯ２下、３７℃）で何ヶ月にもわたって生存可能である。様々な足場に接着させた状態の、ＳＭＳ細胞、この細胞から分化した細胞、ＳＭＳによって産生されたＥＣＭおよびこれらからなる構造物は、埋植された足場の生体適合性を向上させ、かつ埋植された足場による治癒プロセスを短縮するために使用することができる。
【０２１８】
さらに、ＳＭＳ細胞を使用して、構造化された足場をde novo形成させることができる。ＳＭＳ細胞は、インビトロ細胞培養において、秩序正しく位置し組織化する傾向がある。適切な分子で誘導されたＳＭＳ細胞は、高度に構造化された足場を形成し、適切な幾何学的形状を備えた立体物を形成することができる。いくつかの態様において、懸濁液中で増殖させたＳＭＳ細胞を、ポリスチレン製プレートに入れた誘導培地中で培養する。２週に１回培地を添加して約３週間にわたって培養すると、様々な形態の様々な足場が形成される。したがって、本発明の態様は、ＳＭＳ細胞から形成された３次元構造体に関する（たとえば、足場の存在下または非存在下で懸濁培養されたＳＭＳ細胞であり、該足場として、たとえば、活性炭、カーボンブラック、炭素膜、炭素繊維布帛、ナノチューブもしくはマイクロチューブ、または炭素から構成された医療器具もしくはインプラント（ステントやシャント）などの炭素系足場などが挙げられる）。
【０２１９】
いくつかの態様は、末梢血からの軟部組織培養物の作製に関する。この方法では、末梢血（抗擬固剤としてＡＣＤを含む）を低速で遠心分離し、上清を除去する。ＳＭＳ細胞をペレットに加え、適切なベッセル（たとえばプレートやフラスコなど）に入れた増殖培地中でこの混合物を培養する。ベッセルの底にＳＭＳ細胞を含むゲルが形成される。このゲルには白血球および赤血球が含まれる。フラスコからゲルを回収し、（たとえばハンクス緩衝液で２回）洗浄し、（たとえば−２０℃または−７０℃で）凍結することができる。数日後に、凍結したゲルを冷凍庫から取り出し解凍することができる。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を使用して、解凍したゲルを数回洗浄し、白血球および赤血球の大部分を除去することができる。白血球および赤血球は、凍結／解凍サイクルによって破壊されるが、ＳＭＳ細胞は影響を受けない。したがって、いくつかの態様は、ＳＭＳ細胞、白血球および赤血球を含むゲルと、生体内インプラントとしてのこのゲルの使用とを含む。埋植されるゲルは、インプラントのレシピエントとなる対象の末梢血から調製された自己由来ゲルであることが好ましい。また、ゲルは、標準的な条件において増殖培地中で培養することができ、時間が経つにつれてゲルは徐々に強固さを増し、さらに組織に近い構造を形成する。形成された組織様構造が組織化され、この組織化された構造は細管様構造および毛細血管様構造を有する。
【０２２０】
いくつかの態様において、ＳＭＳ細胞を様々な基材または表面上で増殖させることもできる。ＳＭＳ細胞は、たとえばフラスコ、容器、チャンバー、流路、チューブ、ベッセル、ニッチまたはバイオリアクターなどで培養することできる。この際、フラスコ、容器、チャンバー、流路、チューブ、ベッセル、ニッチまたはバイオリアクターの表面に、幾何学的形状のエッチングをあらかじめ施しておくことができる。これらの基材の表面は、たとえば所望の幾何学的形状が形成されるように、化学的処理または物理的処理で前処理してもよく、たとえば、ホウケイ酸塩、機械的研磨、ブラスト加工、炭化ケイ素、溶剤、酸、陽極酸化処理、炭素膜コーティング（たとば炭素蒸着など）などを使用してもよい。このような前処理によって、フラスコ、容器、チャンバー、流路、チューブ、ベッセル、ニッチまたはバイオリアクターなどのベッセルの表面上に幾何学的形状を形成したり、多孔性を高めたりすることができる。幾何学的形状としては、たとえば、線状、曲線状、網状、溝状、隆起状またはその他の形状の１つ以上を挙げることができる。前処理されたフラスコ、容器、チャンバー、流路、チューブ、ベッセル、ニッチまたはバイオリアクターに播種または導入されたＳＭＳ細胞は、設けられた幾何学的形状を増殖の際の組織化のためのガイドとして利用し、この幾何学的形状に沿って組織化する。
【０２２１】
いくつかの態様において、ＳＭＳ細胞はマイクロ流体デバイスに導入される。ＳＭＳ細胞（およびこの細胞から分化した細胞）をlab-on-a-chipデバイスに導入する（lab-on-a-chipデバイスとは、たとえば、実験室で行われる１つ以上の操作を１枚のチップに組み込んだデバイスであり、中空のマイクロ流路内で粒子を扱うものである）。いくつかの態様において、ＳＭＳ細胞はデバイス（たとえば、器官全体または器官系の活性、機構および生理反応を模擬したマルチチャネルの３Ｄマイクロ流体細胞培養チップ）中で使用され、薬物もしくは医薬品または治療プロトコルの影響の評価に利用される。したがって、いくつかの方法では、ＳＭＳ細胞をマイクロ流体デバイスに導入し、次いで薬物または医薬品を該マイクロ流体デバイスに導入して、ＳＭＳ細胞を薬物または医薬品と接触させる。ＳＭＳ細胞の生理的変化または形態学的変化を評価することができる。いくつかの態様では、評価対象を特定し、該対象の末梢血からＳＭＳ細胞を単離し、たとえば、該ＳＭＳ細胞が化合物、薬物、医薬品または治療プロトコルと接触するように、マイクロ流体デバイスに該ＳＭＳ細胞を導入し、次いで該デバイスに化合物、薬物、医薬品または治療プロトコルを導入することなどによって、ＳＭＳ細胞を化合物、薬物、医薬品または治療プロトコルと接触させる。化合物、薬物、医薬品または治療と接触させる前、接触中および／または接触後の、ＳＭＳ細胞の生理的評価および／または形態学的評価および／または診断的評価を行うことができる。
【０２２２】
柔軟性および回復力を備えたＳＭＳ細胞によって、（特に有効期間および費用、分化誘導性、特定の分子の作製の点において）マイクロ流体チップの利用がより容易となる。ＳＭＳ細胞をマイクロ流体回路に導入し、未分化の形態（柔軟性および回復力を備えた形態）のまま保存した後、特定の機能または分化を誘導してもよく、このような誘導は、設計された流路内のＳＭＳ細胞の位置に依存して選択的に行われてもよく、チップ内のいわゆる「チャンバー」と呼ばれる特定の区画に閉じ込められた細胞に、選択的な化学誘導物質またはその他の局所的な誘導因子（温度、表面構造、圧力など）を作用させ、選択された位置で細胞を変化させて所望の機能を誘導し、その位置において使用してもよい。
【０２２３】
本発明の様々な実施形態を説明するため、本明細書では概して肯定的な記載により本発明を開示している。本発明は、成分または材料、方法の工程および条件、プロトコルまたは操作などの要素が一部または完全に除外された実施形態も包含する。
【０２２４】
前述した本発明の実施形態の態様のいくつかを、以下の実施例においてさらに詳細に開示するが、以下の実施例は本発明の開示の範囲をなんら限定するものではない。詳細な説明および請求項に記載されているように、その他の多くの実施形態も本発明の範囲内に含まれることを、当業者であれば十分に理解できるであろう。
【実施例】
【０２２５】
実施例１
分化を阻止したＳＭＳ細胞の懸濁培養
以下の実施例では、ＳＭＳ細胞を未分化な状態で長期間にわたって培養する方法について示す。
【０２２６】
小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞を、Ｔ２５フラスコに入れた増殖培地中で培養する（５％ＣＯ２下、３７℃）。このようにして培養したＳＭＳ細胞集団は、未分化ＳＭＳ細胞とＳＭＳから分化した細胞とからなる不均一細胞集団を含んでいることがある。
【０２２７】
図１に示すように、未分化ＳＭＳ細胞は浮遊分画および接着分画として存在する。浮遊分画の大部分は未分化ＳＭＳ細胞が占める。
【０２２８】
浮遊した未分化ＳＭＳ細胞は、過去に報告されているように、特徴的な形態を有することから識別可能であり、Ｔ２５フラスコ中で培養したＳＭＳ細胞の培地中から得られる。
【０２２９】
未分化ＳＭＳ細胞は分画遠心法によって単離することができる。まず、低速で遠心分離して細胞塊または分化細胞を除去し、次いで高速で遠心分離して未分化ＳＭＳ細胞を回収する。別の方法として、濾過によって未分化細胞を単離してもよく、たとえば、フィルターの孔径を３〜５μｍまで徐々に小さくしていく分別濾過によって単離してもよい。未分化ＳＭＳ細胞を単離した後、顕微鏡下で未分化ＳＭＳ細胞の均一性を確認する。
【０２３０】
未分化ＳＭＳ細胞はポリプロピレン製チューブ（たとえばTechno Plastic Products AG（TPP）社によって提供されている１５ｍｌのバイオリアクターチューブ）中で培養する。
【０２３１】
増殖培地として、たとえば、高糖濃度基礎培地（ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、［＋］６ｇ／Ｌ Ｄ−グルコース、［−］ピルビン酸ナトリウム、［−］Ｌ−グルタミン、［−］フェノールレッド）に、１％GlutaMAXTM-I（１００×）、１０％仔ウシ血清および５μｇ／ｍＬヒトインスリンを添加したものを使用する。別の方法では、仔ウシ血清を含んでいない培地を使用することもできる。旋回振盪によって細胞を時折懸濁させる。
【０２３２】
週に１回、４２００×ｇで１５分間遠心分離してＳＭＳ細胞を沈殿させ、完全培地を交換する。遠心分離の速度は、３０００×ｇ、３５００×ｇ、４０００×ｇ、４１００×ｇ、４２００×ｇ、４３００×ｇ、４５００×ｇまたは５０００×ｇに変更してもよく、これらの速度のいずれか２つによって定義される範囲内の速度で遠心分離を行ってもよく、これに応じて遠心時間を調整する。
【０２３３】
このような条件下では、培地の量（細胞の密集度）によってＳＭＳ細胞の増殖が制限される。ＳＭＳ細胞の均一性は顕微鏡下で評価し（図２参照）、ＳＭＳ細胞の細胞数は、懸濁液の混濁度を分光光度計で測定することによって評価するか、かつ／または高速遠心分離後にペレットの大きさを測定することによって評価する（図３参照）。
【０２３４】
ＳＭＳ細胞の増殖能は、増殖培地を入れた新しいチューブに該細胞を接種することによって評価する。ＳＭＳ細胞の大部分は、細胞塊を形成することなく個々の細胞として増殖し、この条件下では未分化のまま増殖する。懸濁培養はスケールアップすることができ、培地の量を増加することによって得られる細胞の数を増やすことができる（図３参照）。
【０２３５】
実施例２
様々な分子の製造のためのＳＭＳ細胞の使用
未分化ＳＭＳ細胞は様々な用途に使用できる。本実施例では、ＳＭＳ細胞を様々な種類の細胞へと分化可能であることを示す。
【０２３６】
以下の表１および各項目に対応する図面（図４〜図１３）に示すように、ＳＭＳ細胞を様々な種類の細胞へと分化させることができる。
【表１】
2019513416.tif 000003
2019513416.tif 000004
【０２３７】
ポリスチレン製プレート（Ｔ２５フラスコまたは６ウェルプレート）に入れた好適な誘導培地の使用を含む表１に示した様々なアッセイを使用してＳＭＳ細胞の分化能を試験し、ＳＭＳ細胞の機能を評価する。
【０２３８】
また、天然または遺伝子組換えのＳＭＳ細胞を使用して、様々な低分子化合物または高分子化合物を製造することができ、たとえば、タンパク質などを製造することができるが、製造できるものはこれに限定されない。さらに、ＳＭＳ細胞は、別の細胞への分化、組織もしくは組織様構造またはオルガノイドもしくは器官の形成などの各種用途に使用することもできる。
【０２３９】
さらに、ＳＭＳ細胞は、３Ｄプリンティング（３Ｄバイオプリンティング）を使用して空間制御された細胞パターンを製造する方法のための基材として使用することができる。この方法は、たとえばBioBot1（登録商標）、3D-Bioplotter（登録商標）、3DS Alpha（登録商標）、3Dynamic Omega（登録商標）などの３Ｄバイオプリンタを使用して実施することができる。
【０２４０】
さらに、図１４Ａ、図１４Ｂおよび図１５に示すように、（マーカーを含む）遺伝子組換えＳＭＳ細胞を使用して、細胞間相互作用、分化およびその他の細胞関連活性を追跡することができる。
【０２４１】
実施例３
培養フラスコにおける細胞外マトリックスの製造
本実施例では、培養フラスコでのＳＭＳ細胞を使用した細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の製造手順を示す。
【０２４２】
実施例１に記載の、分化を抑制した最適な増殖条件下でＳＭＳ細胞を懸濁培養する。細胞を高速（たとえば４２００×ｇで１５分間）で遠心分離し、新たな増殖培地に懸濁して、ＳＭＳ細胞の培養培地を交換する。
【０２４３】
Ｔ２５またはプレート（ポリスチレン製；物理的な誘導因子としての表面刺激）にＳＭＳ細胞を接種し、増殖培地中で培養する（５％ＣＯ２下、３７℃）。増殖条件（５％ＣＯ２下、３７℃）において、ヘッジホッグ阻害剤やＴＧＦ／ＢＭＰ活性化因子などの、ＥＣＭの産生を促す化学誘導物質を培地に添加する。週２回、完全培地を添加または交換する。
【０２４４】
約２週間後に、浮遊状態のＥＣＭを高速遠心分離で回収する。接着状態のＥＣＭは、スクレーパーを使用して底から掻き取って回収する。図１６に示すように、誘導条件および増殖条件に応じて様々なＥＣＭが産生される。
【０２４５】
当技術分野で公知の様々な方法を使用してＥＣＭを脱細胞化する。たとえば、化学的方法、物理的方法および酵素的方法を使用して、ＥＣＭ足場の構造統合性および化学的統合性を維持したままＥＣＭを脱細胞化することができる。さらに、ＳＭＳ由来ＥＣＭの様々な分子成分を濃縮または単離する。図１７に示すように、ＳＭＳ細胞のインビトロ培養から得られたＥＣＭは、様々な器官の様々な組織に由来するＥＣＭと類似あるいは同一と見なすことができる。
【０２４６】
ＳＭＳ細胞によって産生されたＥＣＭを、凍結乾燥して粉末化し、そのまま保存してもよい。粉末形態またはその他の形態のＥＣＭは各種用途に使用することができ、たとえば、インビトロにおける細胞増殖または細胞分化の促進（たとえば３Ｄ細胞培養を目的としたもの）や、インビボにおける細胞増殖または細胞分化の促進（たとえば創傷治癒の促進を目的としたもの）（または腫瘍の増殖の抑制を目的としたもの）に使用することができる。
【０２４７】
実施例４
足場に接着させたＳＭＳ細胞からの細胞外マトリックスの産生
本実施例では、ＥＣＭ産生ＳＭＳ細胞およびこの細胞から分化した細胞を含む足場を作製するための基本手順を示す。
【０２４８】
様々な足場（脱細胞化された天然の骨や脱細胞化された軟らかいコラーゲンなど）の存在下でＳＭＳ細胞を培養すると、ＳＭＳ細胞は良好に足場に接着する。ＳＭＳ細胞を足場に接着させた後、様々な増殖培地中で培養（５％ＣＯ２下、３７℃）して増殖させ、分化させる。図１８Ａ、図１８Ｂ、図１９Ａ、図１９Ｂおよび図１９Ｃに示すように、ＳＭＳ細胞が分化してその形態が大きく変化し、このＳＭＳ細胞の分化は足場の特性に左右されることが顕微鏡観察からわかる。
【０２４９】
また、ＳＭＳ細胞の接着、増殖および分化は、培地の種類の影響を受ける。ＳＭＳ細胞およびこの細胞から分化した細胞は、足場に接着した状態の細胞外マトリックスおよび組織様構造を産生する。
【０２５０】
産生されたＥＣＭおよび組織様構造は、図２０に示すように様々な細管構造が形成されていることから、高度に多孔性であり、よって、細胞に栄養分を供給するのに有利である。足場に接着したＳＭＳ細胞および分化細胞は培地中（５％ＣＯ２下、３７℃）で何ヶ月にもわたって生存可能である。
【０２５１】
様々な足場に接着させた状態の、ＳＭＳ細胞、この細胞から分化した細胞、ＳＭＳによって産生されたＥＣＭおよびこれらからなる構造物は、埋植された足場の生体適合性を向上させ、かつ埋植された足場による治癒プロセスを短縮するために使用することができる。
【０２５２】
実施例５
ＳＭＳ細胞を使用した、構造化された足場のde novo産生
本実施例では、ＳＭＳ細胞を使用した、構造化された足場のde novo産生について詳述する。
【０２５３】
ＳＭＳ細胞は、インビトロ細胞培養において、秩序正しく位置し組織化する傾向がある。適切な分子で誘導されたＳＭＳ細胞は、高度に構造化された足場を形成し、適切な幾何学的形状を備えた立体物を構成する。
【０２５４】
懸濁液中で増殖させたＳＭＳ細胞を、ポリスチレン製プレートに入れた誘導培地中で培養する（５％ＣＯ２下、３７℃）。２週に１回培地を添加して約３週間にわたって培養すると、図２１Ａおよび図２１Ｂに示すように様々な形態の様々な足場が形成される。
【０２５５】
実施例６
末梢血からの軟部組織の製造
本実施例では、末梢血から軟部組織培養物を製造するための基本手順を提供する。
【０２５６】
末梢血（抗擬固剤としてＡＣＤを含む）を低速で遠心分離し、上清を除去する。ＳＭＳ細胞をペレットに加え、ポリスチレン製フラスコに入れた増殖培地中でこの混合物を４日間培養する（５％ＣＯ２下、３７℃）。
【０２５７】
培養フラスコの底にＳＭＳ細胞を含むゲルが形成される。このゲルには白血球および赤血球が含まれる。
【０２５８】
フラスコからゲルを回収し、ハンクス緩衝液で２回洗浄し、−２０℃で凍結する。数日後、凍結したゲルを取り出し解凍する。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を使用して、解凍したゲルを数回洗浄し、白血球および赤血球の大部分を除去する。白血球および赤血球は、凍結／解凍サイクルによって破壊されるが、ＳＭＳ細胞は影響を受けない。
【０２５９】
洗浄したゲルを小片に切断し、フラスコまたはプレートに入れた増殖培地中において標準的な条件（５％ＣＯ２下、３７℃）で培養する。ゲルは徐々に強固さを増し、さらに組織に近い構造を形成する。
【０２６０】
このようにして得られる組織様構造は組織化された構造を示し、細管様構造および毛細血管様構造を形成する。また、この組織様構造は白血球や赤血球を含んでいない。
【０２６１】
図２２、図２３および図２４に示すように、ＳＭＳ細胞およびＳＭＳ由来細胞が存在していることが顕微鏡観察および染色によってわかる。
【０２６２】
実施例７
表面上に播種したＳＭＳ細胞
本実施例では、基材または表面上でのＳＭＳ細胞の使用を示す。
【０２６３】
ＳＭＳ細胞を、フラスコ、容器、チャンバー、流路、チューブ、ベッセル、ニッチまたはバイオリアクターに導入する。この際、フラスコ、容器、チャンバー、流路、チューブ、ベッセル、ニッチまたはバイオリアクターの表面に、幾何学的形状のエッチングをあらかじめ施しておく。これらの表面は化学的処理または物理的処理で前処理してもよく、たとえば、ホウケイ酸塩、機械的研磨、ブラスト加工、炭化ケイ素、溶剤、酸、陽極酸化処理またはその他の前処理法を使用してもよい。このような前処理によって、フラスコ、容器、チャンバー、流路、チューブ、ベッセル、ニッチまたはバイオリアクターの表面上に幾何学的形状を形成する。幾何学的形状としては、たとえば、線状、曲線状、網状、溝状、隆起状またはその他の形状の１つ以上を挙げることができる。
【０２６４】
前処理されたフラスコ、容器、チャンバー、流路、チューブ、ベッセル、ニッチまたはバイオリアクターに播種または導入されたＳＭＳ細胞は、設けられた幾何学的形状を増殖の際の組織化のためのガイドとして利用し、この幾何学的形状に沿って組織化する。
【０２６５】
実施例８
マイクロ流体デバイスにおけるＳＭＳ細胞の使用
本実施例では、マイクロ流体デバイスにおけるＳＭＳ細胞の使用について示す。
【０２６６】
ＳＭＳ細胞（およびこの細胞から分化した細胞）をlab-on-a-chipデバイスに導入する（lab-on-a-chipデバイスとは、実験室で行われる１つ以上の操作を１枚のチップに組み込んだデバイスであり、中空のマイクロ流路内で粒子を扱うものである）。
【０２６７】
チップ上の細胞または組織または器官（器官全体または器官系の活性、機構および生理反応を模擬したマルチチャネルの３Ｄマイクロ流体細胞培養チップ）における使用も含まれる。
【０２６８】
柔軟性および回復力を備えたＳＭＳ細胞によって、（特に有効期間および費用、分化誘導性、特定の分子の作製の点において）マイクロ流体チップの利用がより容易となる。ＳＭＳ細胞をマイクロ流体回路に導入し、未分化の形態（柔軟性および回復力を備えた形態）のまま保存した後、特定の機能または分化を誘導してもよく、このような誘導は、設計された流路内のＳＭＳ細胞の位置に依存して選択的に行われてもよく、チップ内のいわゆる「チャンバー」と呼ばれる特定の区画に閉じ込められた細胞に、選択的な化学誘導物質またはその他の局所的な誘導因子（温度や圧力など）を作用させ、選択された位置で細胞を変化させて所望の機能を誘導し、その位置において使用してもよい。
【０２６９】
実施例９
懸濁液中のＳＭＳ細胞の濃度および収率の増加
本実施例では、懸濁液中の小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞の濃度を増加させる方法を示す。
【０２７０】
１０％ウシ胎仔血清（シグマ、カタログＮｏ．：F2442）、０．１μｍｏｌ／Ｌデキサメタゾン（シグマ、カタログＮｏ．：D4902）、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌアスコルビン酸−２−リン酸エステル（シグマ、カタログＮｏ．：49752）および１０ｍｍｏｌ／Ｌ β−グリセロリン酸塩（シグマ、カタログＮｏ．：G9422）を添加したＤＭＥＭ誘導増殖培地（Gibco、カタログＮｏ．：31053-0028）を使用して、ＳＭＳ細胞を５％ＣＯ２、最大湿度の条件において３７℃で数週間懸濁培養した。週１回、培地を交換した。
【０２７１】
この培地中で培養すると、ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ培地で培養したコントロール細胞集団と比較して細胞濃度が有意に増加した。
【０２７２】
実施例１０
ＳＭＳ由来ＥＣＭとの細胞間相互作用
本実施例では、内皮細胞、角化細胞または線維芽細胞とＳＭＳ細胞由来細胞外マトリックスとの相互作用について示す。
【０２７３】
ＳＭＳ由来ＥＣＭと内皮細胞の相互作用
懸濁培養したＳＭＳ細胞を、ＤＭＥＭ基礎培地（Gibco、カタログＮｏ．：11054-020）を使用して２回洗浄した。１０％ウシ胎仔血清（シグマ、カタログＮｏ．：F2442）を添加したＤＭＥＭ増殖培地（Gibco、カタログＮｏ．：11054-020）を入れた６ウェル培養プレート（TPP、カタログＮｏ．：92406）中において、ＳＭＳ細胞を５％ＣＯ２、最大湿度の条件において３７℃で２週間培養した。最初の１週間の培養後、週２回培地を交換した。ＳＭＳ細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）からなる安定した接着層を形成する。基礎培地200（Gibco、カタログＮｏ．：M200-500）でウェルを３回洗浄してから、内皮細胞との培養に使用した。
【０２７４】
ライフテクノロジーズ社から購入したヒト臍帯血管内皮細胞（カタログＮｏ．：C-003-5C、ロット：1786264）を各ウェル（100,000個）に加え、２％large vessel endothelial supplement（LVES；Gibco、カタログＮｏ．：14608-01）を添加した基礎培地200（Gibco、カタログＮｏ．：M200-500）からなる増殖培地２ｍＬを各ウェルに加えて、５％ＣＯ２および最大湿度の条件において３７℃で培養した。週２回培地を交換した。
【０２７５】
内皮細胞は、ＳＭＳ細胞によって産生された細胞外マトリックス内へと遊走し（図２５Ａおよび図２５Ｂ）、この細胞外マトリックス内で活発に増殖することが観察された（図２６Ａ〜図２６Ｃ）。数日後、内皮細胞のいくつかは細管状に分化し、実験期間（数週間）にわたってこの状態のまま生存を維持した（図２７Ａおよび図２７Ｂ）。この内皮細胞は、動物由来のＥＣＭマトリックスであるGeltrex（Gibco、カタログＮｏ．：A14132-02）においても細管を形成することができるが、数時間しか生存せず、アポトーシスを起こすと予想されたことから、この実験で得られた結果は予想外である。
【０２７６】
内皮細胞は、整列したＳＭＳ細胞の縁に沿って一時的に整列し、整列した細胞の一方の境界と他方の境界の内側には内皮細胞はほとんど見られなかった。内皮細胞がほとんど存在しなかったこの部分は比較的大きな細管（脈管）構造の痕跡である（図２８Ａ〜図２８Ｃ）。
【０２７７】
培養の開始から約２週後に、内皮細胞は長い安定した脈管を形成した。これらの脈管は、プレート上の接着細胞層に両端で強固に固着していたが、最終的には立体的に成長するか、細胞接着層から分離した（図２９Ａ〜図２９Ｄ）。
【０２７８】
ＳＭＳ由来ＥＣＭと角化細胞の相互作用
懸濁培養したＳＭＳ細胞を、ＤＭＥＭ基礎培地（Gibco、カタログＮｏ．：11054-020）を使用して２回洗浄した。１０％ウシ胎仔血清（シグマ、カタログＮｏ．：F2442）を添加したＤＭＥＭ増殖培地（Gibco、カタログＮｏ．：11054-020）を入れた６ウェル培養プレート（TPP、カタログＮｏ．：92406）中において、ＳＭＳ細胞を５％ＣＯ２、最大湿度の条件において３７℃で２週間培養した。週１回培地を交換した。ＳＭＳ細胞は、細胞外マトリックスからなる安定した接着層を形成する。
【０２７９】
ロンザ社から購入した正常新生児由来ヒト表皮角化細胞（カタログＮｏ．：00192906、ロット：0000357051）を各ウェル（100,000個）に加え、１５％ウシ胎仔血清（シグマ、カタログＮｏ．：F2442）を添加したＤＭＥＭ増殖培地（Gibco、カタログＮｏ．：11054-020）３ｍＬを各ウェルに加えて、５％ＣＯ２および最大湿度の条件において３７℃で培養した。週２回培地を交換した。
【０２８０】
角化細胞は、ＳＭＳ細胞によって産生された細胞外マトリックス上に接着層を形成した（図３０Ａおよび図３０Ｂ）。この構造は数週間にわたって安定に維持された。
【０２８１】
ＳＭＳ由来ＥＣＭと線維芽細胞の相互作用
懸濁培養したＳＭＳ細胞を、ＤＭＥＭ基礎培地（Gibco、カタログＮｏ．：11054-020）を使用して２回洗浄した。１０％ウシ胎仔血清（シグマ、カタログＮｏ．：F2442）を添加したＤＭＥＭ増殖培地（Gibco、カタログＮｏ．：11054-020）を入れた６ウェル培養プレート（TPP、カタログＮｏ．：92406）中において、ＳＭＳ細胞を５％ＣＯ２、最大湿度の条件において３７℃で２週間培養した。最初の１週間の培養後、週２回培地を交換した。ＳＭＳ細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）からなる安定した接着層を形成する。
【０２８２】
ロンザ社から購入した正常ヒト皮膚線維芽細胞（カタログＮｏ．：CC-2511、ロット：0000473428）を各ウェル（100,000個）に加え、１０％ウシ胎仔血清（シグマ、カタログＮｏ．：F2442）を添加したＤＭＥＭ増殖培地（Gibco、カタログＮｏ．：11054-020）２ｍＬを各ウェルに加えて、５％ＣＯ２および最大湿度の条件において３７℃で培養した。週２回培地を交換した。
【０２８３】
線維芽細胞は、ＳＭＳ細胞によって産生された細胞外マトリックス内へと遊走し（図３１Ａおよび図３１Ｂ）、この細胞外マトリックス内で遊走および増殖し（図３２Ａおよび図３２Ｂ）、数日間でコンフルエントに達したことが観察された。線維芽細胞は実験期間（数週間）にわたってこのままの状態で生存を維持した。
【０２８４】
実施例１１
ＳＭＳ細胞から神経細胞への分化
本実施例では、細胞培養における小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞から神経細胞への分化を示す。
【０２８５】
ＳＭＳ細胞を懸濁培養し、ＤＭＥＭ基礎培地（Gibco、カタログＮｏ．：31053-0028）を使用して２回洗浄した。１０％仔ウシ血清（シグマ、カタログＮｏ．：12133C）を添加したＤＭＥＭ増殖培地（Gibco、カタログＮｏ．：31053-0028）を入れた６ウェル培養プレート（TPP、カタログＮｏ．：92406）中において、ＳＭＳ細胞を５％ＣＯ２、最大湿度の条件において３７℃で２週間培養した。最初の１週間の培養後、週２回培地を交換した。次いで、β−メルカプトエタノール（シグマ、カタログＮｏ．：M3148）を加えてＳＭＳ細胞を２４時間培養し、ハンクス緩衝塩溶液（Gibco、カタログＮｏ．：14025-092）を使用して３回洗浄し、ＤＭＥＭ（Gibco、カタログＮｏ．：31053-0028）、２％ＤＭＳＯ（シグマ、カタログＮｏ．：D2438）および２００μＭブチルヒドロキシアニソール（シグマ、カタログＮｏ．：B1253）を含む神経細胞分化誘導培地を使用して５％ＣＯ２および最大湿度の条件において３７℃で培養した。週２回培地を交換した。
【０２８６】
２週後、細胞は劇的な形態変化を遂げ、神経細胞と一致する形態となった（図３３Ａ〜図３３Ｃ）。この細胞は、血清や添加物を含まない分化培地中において数ヶ月間にわたり安定なまま維持された。プロテオーム解析を実施したところ、ダブルコルチンドメイン含有タンパク質２Ｃ（DCDC2）やケラチン関連タンパク質（KRTAP）５−１などの神経特異的タンパク質の存在が示された。
【０２８７】
実施例１２
懸濁培養したＳＭＳ細胞からのタンパク質の差次的発現の誘導
本実施例では、懸濁培養した小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞から様々なタンパク質を差次的に発現させる方法を提供する。
【０２８８】
１０％仔ウシ血清（シグマ、カタログＮｏ．：12133C）、０．１μｍｏｌ／Ｌデキサメタゾン（シグマ、カタログＮｏ．：D4902）、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌアスコルビン酸−２−リン酸エステル（シグマ、カタログＮｏ．：49752）および１０ｍｍｏｌ／Ｌ β−グリセロリン酸塩（シグマ、カタログＮｏ．：G9422）を添加したＤＭＥＭ増殖誘導培地（Gibco、カタログＮｏ．：31053-0028）を使用して、ＳＭＳ細胞を５％ＣＯ２、最大湿度の条件において３７℃で数週間にわたり懸濁培養した。
【０２８９】
コントロールとして、１０％仔ウシ血清を添加したＤＭＥＭからなるコントロール培地中で細胞を培養した。増殖誘導培地中で培養した細胞から、第XIII凝固因子Ａ鎖、アポリポタンパク質Ｅ、アンチトロンビンIII、ＢＭＰ−１、ビトロネクチンなどの様々なタンパク質が差次的に産生された。
【０２９０】
実施例１３
ＳＭＳ細胞を使用した抗微生物タンパク質の産生
本実施例では、懸濁培養した小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞から抗微生物タンパク質を産生させる方法を提供する。
【０２９１】
ＳＭＳ細胞は、抗生物質無添加の標準的な条件下で何年にもわたって培養することができる。インビトロ培養したＳＭＳ細胞から産生されたＥＣＭのプロテオーム解析を実施することによって、抗微生物タンパク質（ＡＭＰ）であると見られる様々なタンパク質、すなわちコレクチン、Ｃ型レクチンファミリー４、セプチン１２および膵リボヌクレアーゼの存在が示される。
【０２９２】
実施例１４
ＳＭＳ細胞の巨大化
本実施例では、小型運動性幹（small mobile stem（ＳＭＳ））細胞を巨大化させる方法を提供する。
【０２９３】
懸濁培養したＳＭＳ細胞を、MesenPRO基礎培地（Gibco、カタログＮｏ．：127747-010）を使用して２回洗浄した。MesenPRO基礎培地（Gibco、カタログＮｏ．：127747-010）を入れた６ウェル培養プレート（TPP、カタログＮｏ．：92406）中において、ＳＭＳ細胞を５％ＣＯ２、最大湿度の条件において３７℃で培養した。ＳＭＳ細胞はプレートに接着し、徐々に形態が変化して巨大化した（図８Ｂおよび図８Ｃ）。
【０２９４】
前述の実施形態の少なくともいくつかにおいて、これらの実施形態において使用された１つ以上の構成要素は、技術的に不可能な場合を除き、別の実施形態の構成要素と入れ替えて使用することができる。請求項に記載された主題の範囲から逸脱することなく、前記の方法および構造に前述以外の様々な省略、付加および改変を行ってもよいことは、当業者であれば容易に理解できるであろう。このような改変や変更はいずれも、添付の請求項で定義されている本発明の主題の範囲内にあると見なされる。
【０２９５】
本明細書で使用されている実質的に複数形および／または単数形の用語は、当業者であれば、本明細書の記載および／または用途に適するように、複数形の用語を単数のものとして、かつ／または単数形の用語を複数のものとして解釈することができる。本発明を明確なものとするために、様々な単数形／複数形の用語が意図的に使い分けられている。
【０２９６】
当業者であれば、本明細書に記載の用語、特に添付の請求項（たとえば添付の請求項の本体部）に記載の用語は、通常、「オープンエンドな」用語であることを理解できるであろう（たとえば、「含んでいる（including）」という用語は、「含んでいるが、これらに限定されない」と解釈されるべきであり、「有する（having）」という用語は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む（include）」という用語は「含むが、これらに限定されない」と解釈されるべきである）。さらに、特定の数が請求項に記載されている場合、前述のような意図も請求項に明確に記載されており、特定の数が記載されていない場合はそのような意図も存在しないことも、当業者であれば理解できるであろう。具体的に説明をすれば、たとえば、後述の特許請求の範囲では、請求項を定義するために、「少なくとも１つ」や「１つ以上」といった前置きが記載されている場合がある。しかしながら、このような前置きが記載されているからといって、不定冠詞「１つ（aまたはan）」を使用して構成要素が記載された請求項を、１つのみの構成要素を含む実施形態に限定すべきではなく、たとえ同じ請求項内に「１つ以上」または「少なくとも１つ」といった前置きと「１つ（aまたはan）」といった不定冠詞とが含まれていたとしても、１つのみの構成要素を含む実施形態に限定すべきではない（たとえば、「１つ（aおよび／またはan）」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると解釈されるべきである）。これは、定冠詞を使用して記載された請求項でも同じである。また、請求項に特定の数が明確に記載されていたとしても、「少なくとも」記載されたその数であるということを当業者であれば理解できるであろう（たとえば、修飾語を伴わない「２つ」という記載は、「少なくとも２つ」または「２つ以上」を意味する）。さらに、「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つ」といった頻用語句が使用されている場合、通常、そのような語句は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている（たとえば「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢを有するシステム、ＡとＣを有するシステム、ＢとＣを有するシステム、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない）。また、「Ａ、ＢまたはＣのうちの少なくとも１つ」といった頻用語句が使用されている場合、通常、そのような語句は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている（たとえば「Ａ、ＢまたはＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢを有するシステム、ＡとＣを有するシステム、ＢとＣを有するシステム、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない）。さらに、２つ以上の選択肢を表すための選言的用語および／または選言的語句は、明細書、特許請求の範囲または図面のいずれにおいても、記載された用語のうちの１つ、記載された用語のいずれか、または記載された用語の両方を含む場合があると当業者であれば理解でき��であろう。たとえば「ＡまたはＢ」という表現は、「Ａのみ」または「Ｂのみ」または「ＡおよびＢ」を含む場合がある。
【０２９７】
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ形式で記載されている場合、当業者であれば、マーカッシュ形式で記載された各メンバーまたはそれらからなるサブグループについても記載されていると理解できるであろう。
【０２９８】
詳細な説明の提供などの何らかの目的で本明細書に記載された範囲はいずれも、あらゆる可能な部分範囲およびその組み合わせも包含することを、当業者であれば理解できるであろう。前記範囲はいずれも、同じ範囲を少なくとも等分、３等分、４等分、５等分、１０等分などに分割したものも十分に記載されており、このような分割された範囲で本発明を実施可能であることを容易に理解できるであろう。たとえば、本明細書に記載の範囲はいずれも、容易に、低域、中域、高域といった三等分などにすることができるが、これに限定されない。また、「以下」、「少なくとも」、「よりも大きい」、「未満」といった用語はいずれも、記載された数値を含むとともに、前述したように、部分範囲に分割可能な範囲も指すことを当業者であれば理解できるであろう。さらに、当業者であれば、本明細書に記載の範囲は各メンバーを含むことを理解できるであろう。したがって、たとえば、１〜３つのメンバーを有する群は、１つのメンバーを有する群、２つのメンバーを有する群または３つのメンバーを有する群を指す。同様に、１〜５つのメンバーを有する群は、１つのメンバーを有する群、２つのメンバーを有する群、３つのメンバーを有する群、４つのメンバーを有する群、または５つのメンバーを有する群などを指す。
【０２９９】
本明細書において様々な態様および実施形態を述べてきたが、当業者であればその他の態様および実施形態も容易に理解できるであろう。本明細書において開示された様々な態様および実施形態は本発明を説明することを目的としたものであり、本発明をなんら限定するものではなく、本発明の範囲および要旨は以下の請求項によって示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ−Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１Ａ−Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ−Ｂ】
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【図２６Ａ−Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ−Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９Ａ−Ｂ】
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【図２９Ｃ−Ｄ】
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【図３０Ａ−Ｂ】
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【図３１Ａ−Ｂ】
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【図３２Ａ−Ｂ】
2019513416.tif 000047
【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ−Ｃ】
2019513416.tif 000049
【国際調査報告】
2019513416.tif 000050
2019513416.tif 000051