(57)【要約】  本発明は、腫瘍浸潤Ｔ細胞集団を生成する方法を提供し、方法は、腫瘍細胞膜を溶解できる正電荷を有する両親媒性アミノ酸誘導体、ペプチド又はペプチド模倣物を対象に投与すること及び次いで上記対象内の腫瘍から細胞試料を収集すること及びそこからＴ細胞を分離することを含む。本発明はさらに、腫瘍浸潤Ｔ細胞集団を生成する方法を提供し、方法は、腫瘍細胞膜を溶解できる正電荷を有する両親媒性アミノ酸誘導体、ペプチド又はペプチド模倣物で処置された対象から採取される細胞腫瘍試料からＴ細胞を分離すること及び必要に応じて上記Ｔ細胞を培養することを含む。本発明はまた、腫瘍細胞を処置する又は腫瘍の増殖、確立、拡散若しくは転移を予防する又は低減するのに使用するための上記の腫瘍浸潤Ｔ細胞を提供する。【選択図】図１８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍浸潤Ｔ細胞集団を生成する方法であって、腫瘍細胞膜を溶解できる正電荷を有する両親媒性アミノ酸誘導体、ペプチド又はペプチド模倣物を対象に投与すること及び前記対象内の腫瘍から細胞試料を次いで収集しかつそこからＴ細胞を分離することを含む方法。
【請求項２】
腫瘍浸潤Ｔ細胞集団を生成する方法であって、腫瘍細胞膜を溶解できる正電荷を有する両親媒性アミノ酸誘導体、ペプチド又はペプチド模倣物で処置された対象から採取される細胞腫瘍試料からＴ細胞を分離すること及び必要に応じて前記Ｔ細胞を培養することを含む方法。
【請求項３】
前記Ｔ細胞をエクソビボで増殖させる工程をさらに含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｔ細胞集団からの１以上のクローン型の特定及び／又は単離をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
それらの対応する腫瘍特異的抗原又はネオ抗原を特定するために作製されたＴ細胞を分析する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記分析が、（ａ）Ｔ細胞がエクソビボで増殖された後に、又は（ｂ）インビボで作製されるＴ細胞上で直接行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項５又は請求項６に記載の方法によって得られる抗原又はネオ抗原。
【請求項８】
前記Ｔ細胞、抗原又はネオ抗原が、より免疫原性になるように改変されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法又は請求項７に記載の抗原若しくはネオ抗原。
【請求項９】
腫瘍細胞を処置する又は腫瘍の増殖、確立、拡散若しくは転移を予防する又は低減することにおける使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法によって得られるＴ細胞又は請求項７若しくは若しくは８に記載の抗原又はネオ抗原。
【請求項１０】
腫瘍細胞を処置する又は腫瘍の増殖、確立、拡散若しくは転移を予防する又は低減する方法であって、それを必要とする対象に請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法により得られるＴ細胞又は請求項７若しくは８に記載の抗原又はネオ抗原の治療的有効量を投与することを含む方法。
【請求項１１】
腫瘍細胞を処置する又は対象において腫瘍の増殖、確立、拡散若しくは転移を予防する又は低減するための医薬の製造における請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法により得られるＴ細胞又は請求項７若しくは８に記載の抗原又はネオ抗原の使用。
【請求項１２】
前記Ｔ細胞、前記抗原又は前記ネオ抗原が、チェックポイント阻害剤と共に投与される、請求項９に記載の使用のためのＴ細胞、抗原又はネオ抗原、請求項１０に記載の方法又は請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記アミノ酸誘導体、ペプチド又はペプチド模倣物が、少なくとも２つの環状基を含有する、請求項１〜６、８、１０若しくは１２のいずれか一項に記載の方法、請求項７若しくは請求項８に記載の抗原又はネオ抗原、請求項９若しくは請求項１２に記載の使用のためのＴ細胞、抗原若しくはネオ抗原又は請求項１１若しくは請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記アミノ酸誘導体、ペプチド又はペプチド模倣物が、少なくとも１つの正電荷及び１０以上の非水素原子の少なくとも１つの親油性基を含む、請求項１〜６、８、１０、１２若しくは１３のいずれか一項に記載の方法、請求項７、８若しくは１３に記載の抗原又はネオ抗原、請求項９、１２若しくは１３のいずれか一項に記載の使用のためのＴ細胞、抗原若しくはネオ抗原又は請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記ペプチド又はペプチド模倣物が、２〜２５個のアミノ酸からなる、請求項１〜６、８、１０若しくは１２〜１４のいずれか一項に記載の方法、請求項７、８、１３若しくは１４のいずれか一項に記載の抗原若しくはネオ抗原、請求項９若しくは１２〜１４のいずれか一項に記載の使用のためのＴ細胞、抗原若しくはネオ抗原又は請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記ペプチド又はペプチド模倣物が、
ａ）直鎖状配列の９個のアミノ酸からなる；
ｂ）これらの９個のアミノ酸のうち、５個はカチオンでありかつ４個は親油性Ｒ基を有する；
ｃ）前記９個のアミノ酸の少なくとも１個が遺伝子コードされないアミノ酸又は遺伝子コードされるアミノ酸の修飾誘導体であり；かつ必要に応じて、
ｄ）前記親油性及びカチオン性残基が、互いに隣接する残基のいずれかのタイプの２以下が存在するように配置されており；かつさらに必要に応じて、
ｅ）前記分子が２対の隣接するカチオン性アミノ酸及び１対又は２対の隣接する親油性残基を含む、
請求項１〜６、８、１０若しくは１２〜１５のいずれか一項に記載の方法、請求項７、８、若しくは１３〜１５のいずれか一項に記載の抗原若しくはネオ抗原、請求項９若しくは１２〜１５のいずれか一項に記載の使用のためのＴ細胞、抗原若しくはネオ抗原又は請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記アミノ酸誘導体、ペプチド又はペプチド模倣物が、少なくとも＋２の正味の正電荷を有しかつ二置換βアミノ酸を組み込んでおり、βアミノ酸の置換基の各々は、同一である又は異なっていてよく、少なくとも７個の非水素原子を含み、親油性でありかつ少なくとも１個の環状基を有し、置換基内の１以上の環状基が他の置換基内の１以上の環状基に結合又は融合されていてよくかつ２個の置換基について非水素原子の合計数が少なくとも１２であるように環状基が融合される、請求項１〜６、８、１０若しくは１２〜１４のいずれか一項に記載の方法、請求項７、８、１２〜１４のいずれか一項に記載の抗原若しくはネオ抗原、請求項９若しくは１２〜１４のいずれか一項に記載の使用のためのＴ細胞、抗原若しくはネオ抗原又は請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療及び関連調査の分野に関する。特に、本発明は、科学的な、診断上の又は治療的に関連性のあるＴ細胞集団を生成する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト及び動物の集団における癌の蔓延及び死亡率とのその関わりは、腫瘍及び腫瘍細胞に対抗するための新たな治療法の必要性が引き続き存在することを意味する。腫瘍の摘出、その大きさの低下、その支持血管系の破壊、又は血液若しくはリンパ系の中を循環している癌細胞の数を低下することは、様々な方法、例えば、痛み又は不快感を低減すること、転移を防止すること、手術介入又は延命を促進することによって有益であり得る。
【０００３】
腫瘍又は腫瘍から転移する細胞と戦うように設計される癌療法は、典型的には、細胞傷害活性に依存する。その活性は、活性剤それ自体が有する細胞傷害作用であるか、又は活性剤によって間接的に利用される作用、例えば、腫瘍に対する宿主免疫応答の上方制御である可能性がある。多かれ少なかれ、これらの療法は、正常で健康な細胞及び組織、又は少なくとも非癌性の細胞及び組織よりむしろ、標的（腫瘍又は腫瘍細胞）に対して選択的である。正常細胞は活性剤がその治療効果を発揮するために依存する細胞傷害活性に暴露されるので、選択性が低いこれらの療法は深刻な副作用と関連している。
【０００４】
癌の特徴である遺伝的でエピジェネティックな変化は、免疫系が認識しかつ腫瘍細胞とそれらの健康な同等物を区別するために使用できる抗原を生じる。原則として、これは、免疫系が腫瘍を制御する上で強力な武器であり得ることを意味する。しかしながら、免疫系は腫瘍細胞に対する強力な応答を通常提供しないのが現実である。癌との闘いにおいて免疫系を操作し、したがって、利用することは治療的に非常に興味深い（Ｍｅｌｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１１，ｖｏｌ．４８０，４８０−４８９）。
【０００５】
腫瘍と戦うために免疫系を助ける様々な試みが行われている。１つの初期のアプローチは、例えば腫瘍に対しても向けられる全身免疫応答を誘発するために細菌（生きたまま又は死滅した）の投与を介する、免疫系の全身刺激を伴った。これは、非特異的免疫とも呼ばれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
腫瘍特異的抗原を認識するように特異的に免疫系を支援することを目的とした最近のアプローチは、典型的にはアジュバント（免疫応答を引き起こす又は増強することが知られている物質）と組み合わせた対象への腫瘍特異的抗原の投与を伴う。多くの場合、全ての腫瘍特異的抗原が同定されているわけではなく、例えば乳癌において、既知の抗原は全腫瘍の２０〜３０％に見出される。腫瘍特異的ワクチン、癌ワクチンの使用は、これまでのところ成功は限られている。
【０００７】
腫瘍を処置するための代替方法及び二次性腫瘍の増殖又は形成を阻害するための代替方法が依然として必要である。
【０００８】
通常、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する強力な免疫応答の欠如は、要因の組み合わせのためであると認識されている。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による抗原認識を介して媒介される免疫応答において重要な役割を有し、それらは免疫チェックポイントとして知られる共刺激シグナルと阻害シグナルの間のバランスを調整する（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１２，１２巻，２５２−２６４）。阻害シグナルは、自己寛容の維持のためおよび免疫系が病原体感染に応答している時に損傷から組織を保護するために重要である免疫系を抑制する。しかしながら、免疫抑制は、本来は腫瘍の発生に対する身体による有用な応答であり得るものを低減する。サイトカイン、ＣｐＧなどの他の刺激分子（樹状細胞を刺激する）、Ｔｏｌｌ様受容体リガンド及び他の分子アジュバントは、免疫応答を増強する。Ｔ細胞が直接関与する共刺激相互作用は、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＣＤ２７及びＣＤ１３７を含む受容体に対するアゴニスト抗体を使用して高めることができる。これらは全て、癌免疫療法に対する「プッシュ」型アプローチである。
【０００９】
相補的な「プル」療法は、阻害細胞若しくは分子を遮断又は枯渇させ、免疫チェックポイントとして知られるものに対する拮抗抗体の使用を含み得る。免疫チェックポイントは、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１並びに当技術分野で公知のこれらに対する抗体を含む。イピリムマブは、転移性黒色腫の処置についてライセンスを取得し、最初にＦＤＡに承認された抗免疫チェックポイント抗体であり、これは細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）を阻止する（Ｎａｉｄｏｏら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（２０１４）１１１，２２１４−２２１９）。サブ細胞傷害用量で免疫抑制を低減できる古典的な化学療法剤とみなされる他の薬剤があり、これらは、シクロホスファミド及びドキソルビシンを含む。
【００１０】
Ｔ細胞は、癌に対する免疫応答の中枢であり、癌の処置及び理解において腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を使用する分野で関心がある。それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して、Ｔ細胞は、腫瘍内の特定の抗原に対して反応性がある。腫瘍細胞は遺伝的変異を保有し、その多くは悪性腫瘍に直接又は間接的に寄与する。発現される配列中の変異は典型的には、ネオ抗原をもたらし、この抗原は、免疫系に知られていないため異物として認識され、免疫応答を誘発できる。
【００１１】
ネオ抗原及びそれらの関与する変異は、腫瘍の種間で、及び同じ腫瘍を有する患者間でさえ様々であり、遺伝的変異の程度は変異負荷と呼ばれる。多数の変異を有する腫瘍は、より免疫原性であると予想され、免疫学的に「ホット」と見なされ得る。変異負荷の少ない腫瘍は、典型的には免疫原性が低いので、「コールド」である。免疫系がそのネオ抗原にアクセスできない場合、腫瘍はまた「コールド」のようにみえる。ＴＩＬの治療可能性に関心があるのと同様に、癌免疫療法におけるネオ抗原の理解及び利用に関心がある（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５，３４８巻，ｉｓｓｕｅ ６２３０，ｐｐ６９−７４）。
【００１２】
このように、腫瘍におけるＴＩＬ集団と利用できるネオ抗原との間に関係があり、多くのＴＩＬは特定のネオ抗原に特異的である。これは、養子Ｔ細胞療法などのいくつかの療法の道を開き、そこで、腫瘍試料が採取され、そこからＴ細胞が単離され、次いで、このＴＩＬのレパートリーからのクローンがインビトロで培養され、次いで、自然免疫応答を高めるために体内に戻される。ＴＩＬのコレクションに依存するこのような技術は、Ｌｉｎｎｅｍａｎｎらの、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１４，２５７巻：７７−８２によって説明されている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、細胞膜を乱し透過化することにより腫瘍細胞を溶解することが知られているいくつかのペプチドが、ミトコンドリア及びリソソームなどの細胞小器官を攻撃するのに非常に有効であり、それらの溶解を引き起こすこともできることを立証した。これは細胞膜の直接溶解を引き起こさない低濃度で達成できるが、細胞膜の完全性の喪失は最終的には低用量の投与でも見られる。より高い用量では、これらの分子は細胞膜の溶解を引き起こし、その後、細胞小器官の膜の溶解を引き起こし得る。これは、ＴＡＡのより完全なレパートリーの放出をもたらすと考えられる。
【００１４】
このオルガネラ膜の破壊はまた、強力な免疫刺激機能を有する化学物質をそこから放出させ、かかる化学物質は、一般的にＤＡＭＰ（損傷関連分子パターン分子）として知られており、ＡＴＰ、チトクロムＣ、ミトコンドリアのＣｐＧ ＤＮＡ配列、ミトコンドリアのホルミルペプチド、カテプシン（リソソームから）及びＨＭＧＢ１（核から）を含む。この作用は、ネオ抗原を含むＴＡＡに対するＴ細胞応答を高めることができる。例えば、ＤＡＭＰは、抗原提示細胞の活性化、漸加及びその後の成熟に重要な役割を果たす。図１に示すように、抗原提示細胞の成熟及びかかる細胞のリンパ節への移動は、Ｔ細胞への腫瘍抗原の提示に必須である。
【００１５】
本発明者らは現在、膜に作用する溶解性化合物で処置された腫瘍から単離できるＴＩＬ集団の分析が、腫瘍内の有用なネオ抗原を特定できると仮定している。したがって、膜に作用する溶解性化合物で処置された腫瘍から単離されるＴＩＬ集団は驚くべきことに、未処置の腫瘍から得られるＴＩＬ集団よりもはるかに有用である。この提案される有用性は、とりわけ、膜に作用する溶解性化合物で処置された腫瘍から得られるＴＩＬ集団が、未処置腫瘍からのＴＩＬ集団と比較して増加したクローン性を有するという、本明細書の実施例に記載の観察に基づいている。異なるクローン型にわたってＴ細胞の相対的存在量が均等に分散されていない場合クローン性は高く、すなわち特定のクローン型が全ＴＩＬ集団を支配する。ＴＩＬ集団中によく現れるクローン型は、腫瘍処置及び腫瘍細胞の溶解の結果としてより容易に利用可能になったネオ抗原に対して、反応性があると考えられる（これに関しては図１を参照されたい）。かかるクローン型は、例えば、自己Ｔ細胞療法で又はワクチン療法若しくはネオ抗原ライブラリーの生成で使用できるネオ抗原の特定のために使用できる。
【発明の効果】
【００１６】
したがって、第１の態様において、本発明は、腫瘍浸潤Ｔ細胞集団を生成する方法を提供し、この方法は、腫瘍細胞膜を溶解できる正電荷を有する両親媒性アミノ酸誘導体、ペプチド又はペプチド模倣物を対象に投与すること、次いで上記対象内の腫瘍から細胞試料を収集すること、およびそこからＴ細胞を分離することを含む。
【００１７】
Ｔ細胞又は個々のクローン型の分離は、他の細胞型又は細胞残屑からの単離又は部分的な単離を含んでよいことを理解されたい。得られる集団は、細胞型の点で８０、９０、９５、９８又は９９％純粋であり得る。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、腫瘍浸潤Ｔ細胞集団を生成する方法を提供し、この方法は、腫瘍細胞膜を溶解できる正電荷を有する両親媒性アミノ酸誘導体、ペプチド又はペプチド模倣物で処置される（された）対象から採取された細胞腫瘍試料からＴ細胞を分離すること、および必要に応じて、上記Ｔ細胞を培養することを含む。
【００１９】
収集されたＴ細胞集団は、典型的には、複数のＴ細胞クローン型を含む。必要に応じて、得られるＴ細胞集団は次いで、集団を維持する又は増殖するために培養される。必要に応じて、Ｔ細胞集団は、特定のクローン型について濃縮され、かつ／又は分画されて、１以上のクローン型、例えば、亜集団あたり１〜１０、１〜５又は１、２若しくは３種のクローン型を含むサブ集団にクローン型を分離できる。
【００２０】
細胞腫瘍試料は、固形腫瘍病巣の全部又は一部を含んでよく、典型的には腫瘍細胞及びＴＩＬを含み、その一部はＴ細胞である。腫瘍試料からＴ細胞を集める、すなわち、そのような試料からＴ細胞を分離する方法は、当技術分野で知られている。
【００２１】
生成されたＴ細胞集団は、本実施例に記載のとおり、例えば、クローン性を評価するために分析されてよい。Ｔ細胞は、特性を、例えば、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合親和性又は配列を調べるために分析されてよい。
【００２２】
理論に束縛されることなく、Ｔ細胞集団内のクローン型の一部は腫瘍ネオ抗原に反応性であり（特異的であり）、特に、最も高度に現れるクローンの一部は腫瘍ネオ抗原に反応性であると考えられる。したがって、本発明の方法はさらに、それらの対応する腫瘍ネオ抗原を特定するために、生成されたＴ細胞を分析する工程を含んでよい。
【００２３】
さらなる実施形態において、上述の腫瘍浸潤Ｔ細胞集団を生成する方法は、エクソビボでＴ細胞を増殖させるさらなる工程を含む。この増殖は、当技術分野で公知の標準的な細胞培養法を用いて行うことができる。さらなる態様において、本発明は、上で定義した方法によって得られる単離Ｔ細胞を提供する。
【００２４】
上で定義した方法から生成される腫瘍浸潤Ｔ細胞は、腫瘍に罹患している患者を処置するために、養子細胞移入療法戦略の一部として治療上使用できる。したがって、本発明の方法は、生成され必要に応じて増殖させたＴ細胞を対象に投与するさらなる工程を含んでよい。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、腫瘍細胞を処置すること又は対象における腫瘍の増殖、確立、拡散若しくは転移を予防する又は低減することにおける使用のための、上で定義したＴ細胞集団を提供する。
【００２６】
したがって、例えば、本発明は、腫瘍細胞を処置すること又は対象における腫瘍の増殖、確立、拡散若しくは転移を予防する又は低減することにおける使用のための、上で定義したエクソビボでの方法から生成される増殖Ｔ細胞集団を提供する。
【００２７】
かかる戦略は、当技術分野で公知であり、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５，３４８：６９−７４に記載されている。小規模で選択されるクローン型、例えば、１〜２０、１〜１５、１〜１０又は１〜５種のクローン型が、好ましくは投与される。
【００２８】
代替的に見て、本発明は、腫瘍細胞を処置する又は腫瘍の増殖、確立、拡散若しくは転移を予防する又は低減する方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に上で定義した方法から生成される治療的有効量のＴ細胞を投与することを含む。
【００２９】
代替的に見て、本発明は、腫瘍細胞を処置する又は対象における腫瘍の増殖、確立、拡散若しくは転移を予防する又は低減するための医薬の製造における、上で定義した方法から生成されるＴ細胞の使用を提供する。
【００３０】
処置される対象は、両親媒性アミノ酸誘導体、ペプチド又はペプチド模倣物を投与される対象と異なっていてよいが、好ましくは、対象は同じである。かかる戦略は、腫瘍の表面上に存在する抗原又はネオ抗原に対する対象の免疫系の感度を高め、したがって、免疫系が腫瘍組織を排除する可能性を高める。この戦略はまた、発達し得るその後の転移に対する免疫系の感度を高める。
【００３１】
Ｔ細胞はまた、Ｔ細胞に結合する腫瘍特異的抗原又はネオ抗原を特定するために使用できる。従って、本発明の方法は、腫瘍特異的抗原又はネオ抗原を特定するさらなる工程を含んでよい。この方法は、Ｔ細胞をエクソビボで増殖した後に行われるか、或いは、この方法は、インビボで生成されたＴ細胞上で直接行われてよい。さらなる態様において、本発明は、上記Ｔ細胞に結合できる腫瘍特異的抗原又はネオ抗原を特定することにおける、上で定義した方法から生成されるＴ細胞の使用を提供する。かかるネオ抗原を特定する方法は、当技術分野で公知であり、Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ Ｃら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２０１４，２５７：７２−８２に記載されている。簡単に説明すると、ネオ抗原は、変異を決定するために健康的な患者エクソームと癌エクソームを比較し、次いで癌エクソームで提示される変異に基づいて変異ペプチドを合成し、次いで生成されたＴ細胞に対して変異ペプチドをスクリーニングすることによって特定できる。或いは、抗原又はネオ抗原は、Ｔ細胞受容体に結合する可能性のあるペプチドモチーフを特定するためのＴ細胞集団の受容体の配列決定によって特定できる。本発明の方法によって生成される豊富な（例えば、最高１０、２０又は３０種の）クローン型のＴＣＲ配列決定を含む方法が、本発明の好ましいさらなる態様である。
【００３２】
さらなる態様において、本発明は、上で定義した方法によって得られる抗原又はネオ抗原を提供する。
【００３３】
好ましくは、腫瘍特異的抗原又はネオ抗原を特定する方法は、特定した抗原又はネオ抗原を合成し必要に応じて必要とする対象に抗原又はネオ抗原を投与し、それによって腫瘍細胞を処置する又は腫瘍の増殖、確立、拡散若しくは転移を予防する又は低減するさらなる工程を含んでよい。さらなる態様において、本発明は、腫瘍細胞を処置する又は腫瘍の増殖、確立、拡散若しくは転移を予防する又は低減することにおける使用のための、上で定義した方法を用いて特定される抗原又はネオ抗原を提供する。抗原又はネオ抗原の投与は、腫瘍の表面上に存在する同じ抗原又はネオ抗原に対する対象の免疫系を再び刺激し、したがって免疫系が腫瘍組織を排除する可能性を高める。この戦略はまた、その後発達し得る転移に対する免疫系の感度を高める。
【００３４】
抗原又はネオ抗原は、両親媒性アミノ酸誘導体、ペプチド又はペプチド模倣物を投与される対象だけでなく、腫瘍に罹患している他の対象にも投与されてよい。しかしながら、多くの抗原及びネオ抗原は、患者間の腫瘍の不均一性により個々の患者に特異的であるので、好ましくは抗原又はネオ抗原は、両親媒性アミノ酸誘導体、ペプチド又はペプチド模倣物を最初に投与される対象に投与される。
【００３５】
特定された抗原又はネオ抗原は、特定の腫瘍に特異的である免疫応答を刺激するワクチンとして作用する。したがって、抗原又はネオ抗原は、それらがより免疫原性になるように改変されてよい。例えば、抗原又はネオ抗原は、抗原又はネオ抗原の免疫原性を高めるために、主要組織適合遺伝子複合体タンパク質に結合される。加えて、上述した抗原若しくはネオ抗原、又は増殖Ｔ細胞は、免疫原性を再び高めるワクチンアジュバントと共に投与されてよい。
【００３６】
代替的に見て、本発明は、腫瘍細胞を処置する又は腫瘍の増殖、確立、拡散若しくは転移を予防する又は低減する方法を提供し、この方法は、上で定義した方法を用いて特定される治療的有効量の抗原又はネオ抗原を投与することを含む。
【００３７】
代替的に見て、本発明は、腫瘍細胞を処置する又は対象における腫瘍の増殖、確立、拡散若しくは転移を予防する又は低減するための医薬の製造における、上で定義した方法を用いて特定される抗原又はネオ抗原の使用を提供する。
【００３８】
上記の処置の方法は好ましくは、チェックポイント阻害剤との共投与を含む。
上記の方法は、Ｔ細胞クローン（クローン型）のライブラリー又は個々の若しくは特定の腫瘍型に特異的なネオ抗原を生成するために使用できる。
【００３９】
本発明の方法は、Ｔ細胞集団の生成を伴い、上記Ｔ細胞集団からの１以上のＴ細胞クローン型の特定及び／又は単離をさらに含んでよい。好ましくは、方法は、上記Ｔ細胞集団からの複数のＴ細胞クローン型の特定及び／又は単離を含む。
【００４０】
本明細書で定義される膜活性分子によって示される特性の特有の組み合わせは、特に有用なＴ細胞集団をもたらす。分子は好ましくは、細胞内膜、例えば、ミトコンドリア膜又はリソソーム膜又は核膜の完全性の喪失を引き起こすことができ、ミトコンドリア膜及びリソソーム膜が好ましい。この完全性の喪失は、細胞小器官の含有物の少なくとも一部を放出させるのに十分であり、膜の崩壊を含み得る。このプロセスでは、抗原は、これらの抗原に結合できる特異的Ｔ細胞の成熟を誘発する樹状細胞による認識のために利用可能にされる。これは、これらの新規の抗原に特異的なＴ細胞による腫瘍の浸潤を高める。ネオ抗原に対するＴ細胞応答は強く、腫瘍内でネオ抗原を認識できるクローン型の大部分を浸潤Ｔ細胞が含むことを意味する。以前は弱い免疫原性であった腫瘍について、細胞膜及び、特に、細胞内膜のこの破壊は、広範囲のＴＡＡ、特に以前は「隠れていた」腫瘍ネオ抗原の放出をもたらす。次にこれが、より大きなＴ細胞応答をもたらす。
【００４１】
細胞内膜の完全性の喪失について試験する、例えば、チトクロムＣの放出について試験する方法は、当技術分野で公知であり、適切な方法は実施例に記載されている。細胞溶解について試験する方法も当技術分野で公知であり、透過型電子顕微鏡の使用を含み、実施例に記載されている。
【００４２】
この非常に広範囲の放出され認識可能なＴＡＡは本質的に、腫瘍をはるかに免疫原性にし、したがって免疫系により検出できるようにし、これはその後、体内に存在する最初に処置される腫瘍及び他の腫瘍の退縮に寄与できる。
【００４３】
したがって、さらなる態様において、本発明は、腫瘍の処置における使用のための、腫瘍浸潤Ｔ細胞集団をインビボで生成するのに使用する、本明細書で定義されるアミノ酸誘導体、ペプチド又はペプチド模倣物を提供する。アミノ酸、ペプチド又はペプチド模倣物は、腫瘍を有する対象に投与され、好ましくは投与は腫瘍内投与である。生成されるＴ細胞集団は好ましくは、対象の免疫系によって以前は認識されない（治療に関連する程度に）抗原に対するクローン型を含む。
【００４４】
腫瘍細胞の溶解後に生成されるＴＩＬ集団は、より免疫原性にするために変更されてよく、すなわち腫瘍特異的抗原を検出する際に適応免疫応答を活性化する可能性がより高くなり得る。ＴＩＬ集団を改変する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｔ細胞の特異性を変化させ得るＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を遺伝的に変更する研究が行われている。これは、目的の腫瘍抗原に特異的なＴＣＲα鎖及びβ鎖を特定し、対応する核酸配列を単離し形質導入ベクター中にクローニングし、Ｔ細胞を形質導入することにより行われる。この技術は、ＴＣＲと抗原との間の相互作用（結合活性）をさらに向上させるために、α鎖及びβ鎖のインビトロ修飾を可能にする。
【００４５】
別の戦略は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を形成することである。これらのＣＡＲ Ｔ細胞は、抗体様の認識とＴ細胞活性化機能を両方兼ね備えている。ＣＡＲは、典型的にはモノクローナル抗体に由来する抗原結合ドメイン、Ｔ細胞にＣＡＲを固定する膜貫通ドメイン、及び腫瘍抗原がＣＡＲに結合した時に持続性、輸送及びエフェクター機能を誘導する１以上の細胞内シグナル伝達ドメインから構成されている。細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞の長期的な活性化をもたらす。上記のＴＩＬ集団の免疫原性を改善する概念は、Ｓｈａｒｐｅ＆Ｍｏｕｎｔ  Ｄｉｓ．Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ．２０１５，８：３３７−５０に概説されるように、当技術分野で公知である。
【００４６】
膜に作用する溶解性化合物での処置は、腫瘍内で有用なネオ抗原を特定するＴＩＬをもたらすことができる。これらのＴＩＬは、有用なＴＣＲ及びＣＡＲの開発を支援できることも認識される。特に、例えばＸ線結晶学を用いる、生じたＴＩＬのＴＣＲの分析は、抗原結合領域の構造を決定するために行われてよく、この構造解析は次いで、抗原結合を模倣するか、又はさらに向上する新しいＴＣＲ及びＣＡＲを開発するために使用できる。或いは、そのような新規のＴＣＲ及びＣＡＲは、ネオ抗原の構造を分析することにより開発できる。これらのＴＣＲ及びＣＡＲは、上述のように免疫細胞の活性化を向上させるために改変されてよい。次いで、これらの新規のＴＣＲ及びＣＡＲは、細胞がそれらを細胞膜上で発現するように、Ｔ細胞（腫瘍特異的であっても、そうでなくてもよい）中に遺伝的に導入できる。これらの新しいのＴＣＲ及びＣＡＲはまた、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞中にも遺伝的に導入できる。これらのＴ細胞は、有用なネオ抗原を特定するために使用されるＴＩＬと同じであってよい。
【００４７】
これらの遺伝的に改変されたＴ細胞又はＮＫ細胞は次いで、腫瘍を処置するために患者に投与できる。遺伝的に導入されるＴＣＲ又はＣＡＲは、処置のために遺伝的に改変されたＴ細胞又はＮＫ細胞を投与される同じ患者に由来し得るか、或いは、患者は異なり得る（好ましくは、患者は同じである）。
【００４８】
本発明の方法で使用する分子は、それらが親水性の、すなわちカチオン性の部分（複数可）、及び疎水性の部分（複数可）を有する点で両親媒性である。したがって、分子は、リン脂質膜の負電荷に引き寄せられ、それらの疎水基（複数可）を有する脂質膜の脂肪鎖と相互作用できる。
【００４９】
細胞又は細胞内のリン脂質膜を溶解する能力を有する両親媒性分子は、当技術分野で公知であり、溶解性分子と呼ばれ得る。溶解は、膜がその機能的完全性、並びに区画化する、例えば浸透圧又はｐＨ勾配又は他の濃度勾配を維持する正常な能力を失うような、膜の不安定化を含む。典型的には溶解は、脂質二重層の部分的又は完全な崩壊をもたらし、それは顕微鏡で観察され細胞質の喪失及び総細胞壁構造の喪失を含み得る。
【００５０】
使用されるアミノ酸は、それらが天然に存在するアミノ酸ではなく標準的なアミノ酸構造への修飾、例えば修飾されたカルボキシル基を典型的には含むような誘導体である。
本発明に従って使用する分子は、カチオン性抗菌ペプチド（ＣＡＰ）として一般に知られるペプチド群を含む。これらは正電荷を有する両親媒性ペプチドであり、この種のペプチドは多くの種に見出され、かつ先天性免疫系の一部を形成する。ＣＡＰラクトフェリシン（ＬｆｃｉｎＢ）は、ミトコンドリアに影響を与えることが示された２５個のアミノ酸ペプチドである（Ｅｌｉａｓｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．ｃａｎｃｅｒ（２００６）１１９，４９３−４５０）。９個のアミノ酸ペプチド（ＷＯ ２０１０／０６０４９７に記載の種類の）である、はるかに小さいペプチドＬＴＸ−３１５もまた、ミトコンドリアを標的とすることも見出された。
【００５１】
各分子は好ましくは、少なくとも２つの環状基を含有する。環状基は好ましくは、脂肪族又は芳香族、好ましくは芳香族であり得、かつ置換されていてもよい５又は６員環であり（より大きな環、例えば７、８、９又は１０個の非水素原子の環を使用できるが）、置換基は酸素、窒素、硫黄又はハロゲン、特に、フッ素、臭素又は塩素などのヘテロ原子を含み得る。好ましい置換基は、Ｃ1〜Ｃ4アルキル（特に、t−ブチル）、メトキシ、フルオロ及びフルオロメチル基を含む。環状基は、炭素原子の同素環又は複素環、好ましくは同素環であり得る。環状基は、連結又は縮合され、好ましくは、融合されていてよい。特に好ましい側鎖は、ナフタレン又はインドール基を含む。親油性側鎖のさらに好ましい基は、単置換若しくは非置換の環状基、好ましくはフェニル基又はシクロヘキシル基を有する。
【００５２】
単一アミノ酸誘導体は、それらが必要な両親媒性を有するという条件で使用できる。単一アミノ酸誘導体は、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの正電荷を保有し、適切なカチオン性を発揮するのは、修飾された、例えばアミド化又はエステル化され、おそらく６個以上の非水素原子の親油性基が付加されたＣ末端を典型的には有する。単一アミノ酸誘導体は、リン脂質膜を乱すことができる親油性基（複数可）、例えばトリブチルトリプトファンなどの１０個以上又は１２個以上の非水素原子の単一基を含有する必要がある。アミノ酸は、それぞれ少なくとも６個の非水素原子である、２個以上の親油基を含んでよい。好ましいアミノ酸誘導体は、以下にさらに詳細に記載されるように、二置換されたβアミノ酸である。
【００５３】
好ましいペプチドは２〜２５個（好ましくは２〜２０又は２〜１５、より通常は６〜１０個）のアミノ酸からなり、ｐＨ７.２〜７.６で正味の正電荷を有していてよい。好ましくは、（ｉ）２個以上（例えば、２又は３〜１５又は１８個）のアミノ酸がカチオン性側鎖を有し、かつ（ｉｉ）１個以上（例えば、１又は２〜６個）のアミノ酸が、例えば少なくとも１つの環状基及び少なくとも７個の非水素原子を組み込む、親油性側鎖を有する。
【００５４】
ペプチドは典型的には、少なくとも１個の環状基及び少なくとも７個の（環状基を含む）非水素原子を組み込む親油性側鎖を有する１個以上のアミノ酸を含む。好ましくは、ペプチドは、１〜６個、より好ましくは１〜４個、例えば１、２又は３個の親油性側鎖を含む。全てのかかるアミノ酸及びその側鎖は、便宜上「嵩高くかつ親油性の」アミノ酸／側鎖と呼ばれ得る。好ましくは、側鎖は、少なくとも８個、より好ましくは少なくとも１０個の非水素原子を含有する。上で定義される通り、好ましい親油性側鎖は、２個又は３個の環状基、好ましくは２個の環状基を組み込む。
【００５５】
遺伝子コードされるアミノ酸の中で、フェニルアラニン（７個の非水素原子）、トリプトファン（１０個の非水素原子）及びチロシン（８個の非水素原子）は、適切な嵩高くかつ親油性のアミノ酸である。トリプトファンは、その２つの縮合環構造及びさらなる嵩高さにより、特に好ましい。天然に存在し得る非遺伝的アミノ酸、並びにトリプトファン、フェニルアラニン及びチロシンの類似体、並びに上で定義される親油性基を組み込むように修飾されたアミノ酸も使用でき、例えばインドール環の１位、２位、５位及び／又は７位で置換されているトリプトファン残基、１位又は２位が好ましく例えば５' ヒドロキシトリプトファンを使用できる。嵩高くかつ親油性の特性を有する様々な他のアミノ酸誘導体が当業者に知られている。
【００５６】
好ましい遺伝子コードされない嵩高くかつ親油性のアミノ酸は、アダマンチルアラニン；３−ベンゾチエニルアラニン；ビフェニルアラニン、例えば４，４'−ビフェニルアラニン；ジフェニルアラニン、例えば３，３−ジフェニルアラニン；ビフェニルアラニン誘導体、例えばＢｉｐ（４−（２−ナフチル））、Ｂｉｐ（４−（１−ナフチル））、Ｂｉｐ（４−ｎ−Ｂｕ）、Ｂｉｐ（４−Ｐｈ）又はＢｉｐ（４−Ｔ−Ｂｕ）又はＰｈｅ（４−（２'−ナフチル））、Ｐｈｅ（４−（１’−ナフチル））、Ｐｈｅ（４−ｎ−ブチルフェニル）、Ｐｈｅ（４−４'−ビフェニル）又はＰｈｅ（４'−ｔ−ブチルフェニル）；ホモフェニルアラニン；２，６−ジクロロベンジルチロシン、シクロヘキシルチロシン；７−ベンジルオキシトリプトファン；トリブチルトリプトファン（Ｔｂｔ）、例えばトリ−ｔｅｒｔ−ブチルトリプトファン；ホモトリプトファン；３−（−アントラセニル）−Ｌ−アラニン；Ｌ−ｐ−イソ−プロピルフェニルアラニン；チロキシン；３，３'，５−トリヨード−Ｌ−チロニン；トリヨードチロシン；２−アミノ−３−（アントラセン−９−イル）プロパン酸；２−アミノ−３−（ナフタレン−２−イル）プロパン酸；２−アミノ−３−（ナフタレン−１−イル）プロパン酸；２−アミノ−３−[１，１’：４’，１”−テルフェニル−４−イル]−プロピオン酸；２−アミノ−３−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−インドール−３−イル）プロパン酸；２−アミノ−３−[１，１’：３’，１”−テルフェニル−４−イル]−プロピオン酸；２−アミノ−３−[１，１’：２’，１”−テルフェニル−４−イル]−プロピオン酸；２−アミノ−３−（４−ナフタレン−２−イル−フェニル）−プロピオン酸；２−アミノ−３−（４'−ブチルビフェニル−４−イル）プロパン酸；２−アミノ−３−[１，１’：３’，１”−テルフェニル−５'−イル]−プロピオン酸；及び２−アミノ−３−（４−（２，２−ジフェニルエチル）フェニル）プロパン酸を含む。
【００５７】
好ましいペプチドは、少なくとも１個の、例えば１〜４個の、典型的には１又は２個の遺伝子コードされないアミノ酸、例えばビフェニルアラニン又はジフェニルアラニンを含む。
【００５８】
親油性分子は、水溶液中で同じ種類のものと結合する分子であり、これは必ずしも親油性分子間の相互作用が親油性分子と水との間よりも強いためであるとは限らず、親油性分子と水との間の相互作用が水分子同士のもっと強い相互作用を破壊するためである。したがって好ましくは、親油性側鎖は多くの極性官能基を含有するべきでなく、例えば４個以下、好ましくは２個以下、例えば１個又はなしである。かかる基は、水性環境との結合相互作用を増加させ、それゆえ分子の親油性を低下させる。トリプトファンの側鎖のような側鎖のわずかな極性は許容され、実際に、トリプトファンは、第２のペプチド中に見出される好ましい、嵩高くかつ親油性のアミノ酸である。
【００５９】
標準的な化学保護基は、アミノ酸側鎖に結合されると、適切な嵩高くかつ親油性の側鎖を提供できる。適切なアミノ酸保護基は、当技術分野で周知であり、Ｐｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル）及びＰｂｆ（２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフランスルホニル）を含み、これらは芳香族アミノ酸、例えばフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンの嵩高さ及び親油性を都合よく増大させることができる。また、ｔｅｒｔ−ブチル基は、様々なアミノ酸に対する共通の保護基であり、特に芳香族側鎖を修飾する場合に、アミノ酸側鎖に嵩高くかつ親油性の基を提供できる。Ｚ基（カルボキシベンジル）は、嵩高くかつ親油性の基を提供するために使用できるさらなる保護基である。
【００６０】
少なくとも１つの環状基及び少なくとも７個の非水素原子を組み込むさらなる親油性基は、Ｎ又はＣ末端修飾として提示され、好ましい嵩高くかつ親油性の基の上述の議論は、必要な変更を加えて、この基に適用される。
【００６１】
さらなる嵩高くかつ親油性の基を提供するＮ末端修飾は、任意の都合のよい手段によってＮ末端アミンに直接結合されて、モノアルキル化、ジアルキル化及びおそらくカチオン性のトリアルキル化されたＮ末端アミンを形成できる。或いは、さらなる嵩高くかつ親油性の基（以下の段落で「Ｒ」）は、連結部分、例えばカルボニル基（ＲＣＯ）、例えばアダマンチル若しくはベンジル、カルバメート（ＲＯＣＯ）、又は尿素（ＲＮＨＣＯ）若しくは（Ｒ2ＮＣＯ）を形成するリンカーを介して、又はスルホンアミド、ボロンアミド又はホスホンアミドを形成するリンカーによって結合される。スルホンアミド形成リンカーは、より安定なペプチドが必要とされる場合に、特に有用であり得る。
【００６２】
上で定義される嵩高くかつ親油性の基はまた、Ｃ末端修飾基によって提供され得る。嵩高くかつ親油性の基は、Ｃ末端カルボキシ基に直接結合されて、ケトンを形成できる。或いは、嵩高くかつ親油性の基は、連結部分、例えばＣ末端でエステルを形成する（ＯＲ）、それぞれＣ末端で一級及び二級アミド基を形成する（ＮＨ−Ｒ）又は（ＮＲ2、ここで２つのＲ基は同一である必要はない）又はボロン酸エステル若しくはリン類似体を形成する基（Ｂ−（ＯＲ）2）を介して結合され得る。Ｄａｅ（ジアミノエチル）は、Ｃ末端に嵩高くかつ親油性の基、例えばカルボベンゾキシ（Ｚ）を結合するために使用できる、さらなる連結部分である。
【００６３】
カチオン性残基の数は、おそらくペプチドの長さに比例し、例えば残基の１／３〜３／４はカチオンであることを理解されたい。同様に、残基の１／４〜２／３は親油性である（好ましくは７個以上の非水素原子を有する）。
【００６４】
特定の実施形態において、ペプチドは、カチオン性側鎖を有する３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個のアミノ酸を含有できる。参照を容易にするために、これらのアミノ酸は、「カチオン性残基」として以下の節で参照される。
【００６５】
ペプチドが８、９、１０又は１１個のアミノ酸からなるさらなる実施形態において、ペプチドは、３〜１０個、例えば４〜９、５〜８、６〜７又は５個のカチオン性残基を含み得る。ペプチドが４、５、６又は７個のアミノ酸からなるさらなる実施形態において、ペプチドは、２〜６個、例えば、３又は４個のカチオン性残基を含み得る。
【００６６】
特定の実施形態において、ペプチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８個の嵩高くかつ親油性アミノ酸を含有してよい。
【００６７】
ペプチドが１６、１７、１８、１９又は２０個のアミノ酸からなる特定の実施形態において、ペプチドは３〜１７個、４〜１６、５〜１５、６〜１４、７〜１３、８〜１２、９〜１１又は１０個の嵩高くかつ親油性の残基を含んでよい。ペプチドが８、９、１０又は１１個のアミノ酸からなるさらなる実施形態において、ペプチドは、３〜８個、例えば、４〜７個の嵩高くかつ親油性の残基を含んでよい。ペプチドが４、５、６又は７個のアミノ酸からなるさらなる実施形態において、ペプチドは、２〜５個、例えば、３又は４個の嵩高くかつ親油性の残基を含んでよい。
【００６８】
ペプチド中の嵩高くかつ親油性及びカチオン性残基並びにさらなる嵩高くかつ親油性の基の配置は、本発明の機能に最も重要ではない。
「カチオン性側鎖を有するアミノ酸」とは、腫瘍細胞の細胞内ｐＨ、例えば約ｐＨ７.４で正味の正電荷を有する側鎖を有するアミノ酸を意味する。遺伝子コードされるアミノ酸の中で、これはリジン及びアルギニンを含むが、その側鎖上にかかる正味の正電荷を保有する任意の遺伝子コードされないアミノ酸又は修飾アミノ酸が使用され、例えばグアニジノ基又はアミン基又は別のカチオン性部分、例えばリジンの誘導体、及びアルギニンを有する側鎖を保有するそれらのアミノ酸を使用でき、プロトン化水素以外の側鎖中の任意の水素は、ハロゲン原子、例えばフッ素、塩素又は臭素、又は、直鎖、分枝鎖、脂肪族、不飽和又は飽和のＣ1〜Ｃ4アルキル又はアルコキシ基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、エチレン、プロピレン、ブチレン、ヒドロキシ、メトキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、イソ−プロピルオキシ、ブチルオキシ基、イソブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ又はハロゲン置換されたそのバージョンで置換される。
【００６９】
カチオン性側鎖を有する適切な遺伝子コードされないアミノ酸は、ホモリジン、オルニチン、ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸及びホモアルギニン並びにトリメチルリジン及びトリメチルオルニチン、４−アミノピペリジン−４−カルボン酸、４−アミノ−１−カルバムイミドイルピペリジン−４−カルボン酸及び４−グアニジノフェニルアラニンを含む。
【００７０】
アミノ酸は、グリシンを除いて、２種以上の立体異性体として存在し得る。特に、グリシン以外のアミノ酸のα−炭素は、キラル中心であるので、各アミノ酸の２つのエナンチオマー形態を生じる。これらの形態は、多くの場合、Ｄ及びＬ型、例えばＤ−アラニン及びＬ−アラニンと呼ばれる。さらなるキラル中心を有するアミノ酸は、４以上の可能性のある立体異性体に存在しており、例えばスレオニンは２つのキラル中心を有しているので、４つの立体異性体型のうちの１つに存在し得る。アミノ酸の任意の立体異性体形態は、本発明の分子で使用できる。本発明を説明する目的で、用語「遺伝子コードされない」がアミノ酸に適用される場合、これは、Ｌ型で天然に存在するアミノ酸のＤ型を含まない。
【００７１】
好ましくは、本発明の正電荷を有する両親媒性アミノ酸誘導体、ペプチド又はペプチド模倣物を、以下の節に記載されるようにさらに定義する。
【００７２】
溶解性ノナペプチド
特許公報ＷＯ２０１０／０６０４９７に記載されているように、溶解性ペプチド又はペプチド模倣物は、以下の特性を有してよい：
ａ）直鎖状配列の９個のアミノ酸からなる；
ｂ）これらの９個のアミノ酸のうち、５個はカチオンであり、４個は親油性Ｒ基を有する；
ｃ）上記９個のアミノ酸の少なくとも１個は、遺伝子コードされないアミノ酸又は遺伝子コードされるアミノ酸の修飾誘導体であり；必要に応じて、
ｄ）親油性及びカチオン性残基は、互いに隣接する２以下のいずれかのタイプの残基が存在するように配置されており；さらに必要に応じて、
ｅ）分子は、２対の隣接するカチオン性アミノ酸及び１対又は２対の隣接する親油性残基を含む。
【００７３】
同一である又は異なっていてよいカチオン性アミノ酸は、好ましくはリジン又はアルギニンであるが、ヒスチジン又はｐＨ７.０で正電荷を保有する任意の遺伝子コードされないアミノ酸又は修飾アミノ酸であり得る。
【００７４】
適切なカチオン性の遺伝子コードされないアミノ酸及び修飾されたカチオン性アミノ酸は、ホモリジン、オルニチン、ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸及びホモアルギニンなどのリジン、アルギニン及びヒスチジンの類似体、並びにトリメチルリジン及びトリメチルオルニチン、４−アミノピペリジン−４−カルボン酸、４−アミノ−１−カルバムイミドイルピペリジン−４−カルボン酸及び４−グアニジノフェニルアラニンを含む。
【００７５】
同一である又は異なっていてよい親油性アミノ酸（すなわち、親油性Ｒ基を有するアミノ酸）は全て、少なくとも７個、好ましくは少なくとも８又は９個、より好ましくは少なくとも１０個の非水素原子を有するＲ基を所有する。親油性Ｒ基を有するアミノ酸は、親油性アミノ酸と本明細書で呼ばれる。典型的には親油性Ｒ基は、縮合又は結合されていてよい、少なくとも１個、好ましくは２個の環状基を有する。
【００７６】
親油性Ｒ基は、Ｏ、Ｎ又はＳなどのヘテロ原子を含有できるが、典型的には１以下のヘテロ原子が存在し、好ましくはそれは窒素である。このＲ基は、好ましくは２以下の極性基、より好ましくは１つも無いか又は１個の極性基を有しており、最も好ましくは１つも無い。
【００７７】
トリプトファンは好ましい親油性アミノ酸であり、分子は、好ましくは１〜３個、より好ましくは２又は３個、最も好ましくは３個のトリプトファン残基を含む。組み込まれてよいさらなる親油性の遺伝子コードされるアミノ酸は、フェニルアラニン及びチロシンである。
【００７８】
好ましくは、親油性アミノ酸の１個は、遺伝子コードされないアミノ酸である。最も好ましくは分子は、３個の親油性の遺伝子コードされるアミノ酸、５個のカチオン性の遺伝子コードされるアミノ酸及び１個の親油性の遺伝子コードされないアミノ酸からなる。この文脈において、Ｄアミノ酸は、厳密には遺伝子コードされていないが、単に立体特異的ではなく、構造的に２０個の遺伝子コードＬアミノ酸と異ならなければならない「遺伝子コードされないアミノ酸」とはみなされない。本発明の分子は、Ｄ型で存在するアミノ酸のいくつか又は全てを有していてよいが、しかしながら好ましくは全てのアミノ酸はＬ型である。
【００７９】
分子が親油性の遺伝子コードされないアミノ酸（又はアミノ酸誘導体）を含む場合、そのアミノ酸のＲ基は、好ましくは３５個以下の非水素原子、より好ましくは３０個以下、最も好ましくは２５個以下の非水素原子を含有する。
【００８０】
好ましい遺伝子コードされないアミノ酸は、２−アミノ−３−（ビフェニル−４−イル）プロパン酸（ビフェニルアラニン）、２−アミノ−３，３−ジフェニルプロパノン酸（ジフェニルアラニン）、２−アミノ−３−（アントラセン−９−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（ナフタレン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（ナフタレン−１−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−[１，１'：４'，１”−テルフェニル−４−イル]−プロピオン酸、２−アミノ−３−（２，５，７−トリ−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−インドール−３−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−[１，１'：３，１”−テルフェニル−４−イル]−プロピオン酸、２−アミノ−３−[１，１'：２，１”−テルフェニル−４−イル]−プロピオン酸、２−アミノ−３−（４−ナフタレン−２−イル−フェニル）−プロピオン酸、２−アミノ−３−（４'−ブチルビフェニル−４−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−[１，１'：３，１”−テルフェニル−５’−イル]−プロピオン酸及び２−アミノ−３−（４−（２，２−ジフェニルエチル）フェニル）プロパン酸を含む。
【００８１】
好ましい実施形態において、本発明の化合物は、下記の式Ｉ〜Ｖの１つを有し、その中でＣは上で定義したカチオン性アミノ酸を表し、Ｌは上で定義した親油性アミノ酸を表す。アミノ酸は、好ましくは真のペプチドをもたらすペプチド結合により又はペプチド模倣物をもたらす他の結合により、共有結合される。これらの分子の遊離アミノ末端又はカルボキシ末端は修飾されてよく、カルボキシ末端は負電荷を取り除くために好ましくは修飾され、最も好ましくはカルボキシ末端はアミド化され、このアミド基は置換されていてよい。
ＣＣＬＬＣＣＬＬＣ（Ｉ）（配列番号１）
ＬＣＣＬＬＣＣＬＣ（ＩＩ）（配列番号２）
ＣＬＬＣＣＬＬＣＣ（ＩＩＩ）（配列番号３）
ＣＣＬＬＣＬＬＣＣ（ＩＶ）（配列番号４）
ＣＬＣＣＬＬＣＣＬ（Ｖ）（配列番号５）
【００８２】
β及びγアミノ酸並びにαアミノ酸は、用語「アミノ酸」に含まれ、Ｎ−置換グリシンもそうである。本発明の化合物は、ベータペプチド及びデプシペプチドを含む。
【００８３】
上述したように、本発明の化合物は、少なくとも１個、好ましくは１個の遺伝子コードされないアミノ酸を組み込む。この残基がＬ’で示される場合、好ましい化合物は以下の式で表される：
ＣＣＬ’ＬＣＣＬＬＣ（配列番号６）
ＣＣＬＬＣＣＬＬ’Ｃ（配列番号７）
ＣＣＬＬ’ＣＣＬＬＣ（配列番号８）
ＬＣＣＬＬ’ＣＣＬＣ（配列番号９）
【００８４】
特に好ましいのは、式Ｉ及びＩＩのペプチドであり、これらのうち、式Ｉのペプチドが特に好ましい。
【００８５】
表１に示すような以下のペプチドが最も好ましい。
【００８６】
【表１】
2019503696.tif 000003
【００８７】
ここで：
・標準の一文字コードが遺伝子コードされるアミノ酸のために使用される。
・小文字はＤアミノ酸を意味する。
・Ｄｉｐはジフェニルアラニンである。
・Ｂｉｐはビフェニルアラニンである。
・Ｏｒｎはオルニチンである。
・Ｄａｐは２，３−ジアミノプロピオン酸である。
・Ｄａｂは２，４−ジアミノ酪酸である。
・１−Ｎａｌは１−ナフチルアラニンである。
・２−Ｎａｌは２−ナフチルアラニンである。
・Ａｔｈは、２−アミノ−３−（アントラセン−９−イル）プロパン酸である。
・Ｐｈｅ（４，４'Ｂｉｐ）は２−アミノ−３−[１，１'：４'，１”−テルフェニル−４−イル]プロピオン酸である。
【００８８】
本明細書に記載の分子の全ては、塩、エステル又はアミドの形態であり得る。
したがって、本発明に従って提供されるのはまた、ＬＴＸ−３０１、ＬＴＸ−３０３〜ＬＴＸ−３１０、ＬＴＸ−３１２〜ＬＴＸ−３２１、ＬＴＸ−３２３〜ＬＴＸ−３２７、ＬＴＸ−３２９、ＬＴＸ−３３１〜ＬＴＸ−３３６、及びＬＴＸ−３３８、又はその塩、エステル若しくはアミドからなる群から選択される化合物である。したがって、本発明は、配列番号１０及び１２〜４２、又はその塩、エステル若しくはアミドからなる群から選択される式を有する化合物を提供する。特に好ましいのは、化合物ＬＴＸ−３１５である。
【００８９】
分子は好ましくはペプチドであり、好ましくは修飾された、特にアミド化されたＣ末端を有する。アミド化ペプチドは、それ自体が塩の形態であってよく、アセテート形態が好ましい。適切な生理学的に許容される塩は、当技術分野で周知であり、無機酸又は有機酸の塩を含み、トリフルオロ酢酸並びに酢酸及びＨＣｌと形成される塩を含む。
【００９０】
本明細書に記載される分子は本質的に両親媒性であり、αヘリックスの形成に向かう傾向があっても、又はなくてもよいそれらの２°構造は、生理学的条件下で両親媒性分子を提供する。
【００９１】
二置換βアミノ酸を有する分子
特許公報ＷＯ２０１１／０５１６９２に記載されているように、ペプチド、ペプチド模倣物又はアミノ酸誘導体は、少なくとも＋２の正味の正電荷を有していてよく、二置換βアミノ酸を組み込んでおり、βアミノ酸中の置換基の各々は、同一である又は異なっていてよく、少なくとも７個の非水素原子を含み、親油性であり、少なくとも１個の環状基を有し、置換基内の１以上の環状基は他の置換基内の１以上の環状基に結合及び融合されていてよく、その場合の環状基は、２置換基の非水素原子の合計数が少なくとも１２であるように融合される。βアミノ酸上の２つの置換基は好ましくは同一である。
【００９２】
親油性は、二相系、例えば１−オクタノール／水などの液体−液体中の分子の分布によって測定できる。ヒドロキシ、カルボキシ、カルボニル、アミノ及びエーテルなどの極性置換基は、それらが親油性を低下させるので、１−オクタノール／水などの二相系で分配係数を減少させることは当技術分野で周知であり；親油性置換基は、したがって好ましくは、２以下の、より好ましくは１個の極性基を含有するか、又はそのような極性基を含有しない。
【００９３】
βアミノ酸は、β炭素原子に結合されるアミノ基を有し；遺伝子コードされるアミノ酸は、アミノ基がα炭素原子に結合されるるαアミノ酸である。この配置は、１以上のβアミノ酸を組み込むペプチド主鎖のβアミノ酸あたり１個の原子分長い。この配置で、α及び／又はβ炭素原子は置換できる。α又はβ炭素原子は二置換されてよく；α炭素原子が二置換される場合はβ2,2アミノ酸が生じ、β炭素原子が二置換される場合はβ3,3アミノ酸が生成される。α又はβ炭素原子の各々上の１個の置換基は、β2,3アミノ酸をもたらす。β2,2及びβ3,3二置換アミノ酸が好ましく、β2,2二置換アミノ酸が特に好ましい。
【００９４】
βアミノ酸は、少なくとも７個の非水素原子を組み込む２個の基で置換される。好ましくは１個、より好ましくは両方の置換基が少なくとも８個、より好ましくは少なくとも１０個の非水素原子を含有する。これらの基は本質的に親油性であり、それらは異なっていてよいが、好ましくは同一である。それぞれは少なくとも１個の環状基、典型的には脂肪族又は芳香族、好ましくは芳香族であり得、置換されていてもよい６員環を含有し、置換基は酸素、窒素、硫黄又はハロゲン、特にフッ素又は塩素などのヘテロ原子を含んでよい。好ましい置換基は、Ｃ1〜Ｃ4アルキル（特に、t−ブチル）、メトキシ、フルオロ及びフルオロメチル基を含む。環状基は同素環又は複素環であり得、好ましくはそれらは炭素原子の同素環である。好ましい親油性置換基は、結合若しくは融合され得る、好ましくは融合され得る２又は３個の環状基、好ましくは２個の環状基を組み込む。特に好ましい置換基は、ナフタレン基を含む。
【００９５】
親油性置換基のさらに好ましい基は、単置換若しくは非置換の環状基、好ましくはフェニル基又はシクロヘキシル基を有する。
環状基又は複数の環状基は典型的には、１〜４個の、好ましくは１〜３個の原子の鎖だけペプチド主鎖から（すなわち、βアミノ酸のα又はβ炭素原子から）離間されており；これらの結合原子は、窒素及び／又は酸素を含んでよいが、典型的には炭素原子であり、好ましくは結合原子は置換されていない。これらのスペーサは、もちろん、本明細書で定義される置換基の一部である。
【００９６】
二置換βアミノ酸の各置換部分は、典型的には７〜２０個の非水素原子、好ましくは７〜１３個、より好ましくは８〜１２個、最も好ましくは９〜１１個の非水素原子を含む。
これらの分子は好ましくは、長さが１若しくは２〜１２個のアミノ酸又は同等のサブユニットのペプチド又はペプチド模倣物である。特に文脈から明らかでない限り、本明細書での「アミノ酸」への言及は、ペプチド模倣物中の同等のサブユニットを含む。好ましい分子は、１〜３又は４個のアミノ酸を有するが、代わりに長さが３〜１２個、好ましくは５〜１２個のアミノ酸であり得る。本発明に従って使用する分子は、単一のアミノ酸を単に含んでよいが、これは、電荷の要件を満たすために「修飾された」アミノ酸である。
【００９７】
単一アミノ酸並びにペプチド及びペプチド模倣物は、修飾されたＣ末端を好ましくは組み込んでおり、Ｃ末端修飾基は典型的には電荷反転を生じる、すなわちカルボキシル基の負電荷を取り除き、例えばアミノ基の存在を介して、正電荷を付加する。この修飾単独は、Ｎ末端が修飾されていないと仮定すると、全体的な＋２の正味の電荷を分子に与える。Ｃ末端が電荷反転を与えるために修飾されていようと、又は単にカルボキシル基の負電荷を取り除くために修飾されていようと、分子は、好ましくは１以上のカチオン性アミノ酸も含有する。したがって、分子の全体の電荷は、大きな分子については＋３、＋４又はそれより大きい。
【００９８】
好ましくは本質的にカチオン性である適切なＣ末端基は、典型的には１５個の非水素原子の最大の大きさを有する。Ｃ末端は好ましくはアミド化され、アミド基は、さらに置換されて、Ｎ−アルキル又はＮ，Ｎ−ジアルキルアミドを形成できる。１級及び２級アミド基が好ましい。アミド基を置換するのに適する基は、アミノアルキル、例えばアミノエチル又はジメチルアミノエチルを含み；アミド基の窒素原子は、環状基の一部、例えばピラゾリジン、ピペリジン、イミダゾリジン及びピペラジンを形成し、ピペラジンが好ましく、これらの環状基は、例えばアルキル基又はアミノアルキル基によって、それ自体置換されていてもよい。
【００９９】
ペプチドは好ましくは、１種以上のカチオン性アミノ酸を組み込んでおり、リジン、アルギニン、オルニチン及びヒスチジンが好ましいが、ｐＨ７.０で正電荷を保有する任意の遺伝子コードされないアミノ酸又は修飾アミノ酸を組み込むことができる。
【０１００】
適切なカチオン性の遺伝子コードされないアミノ酸及びカチオン性の修飾アミノ酸は、ホモリジン、オルニチン、ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸及びホモアルギニンなどのリジン、アルギニン及びヒスチジンの類似体並びにトリメチルリジン及びトリメチルオルニチン、４−アミノピペリジン−４−カルボン酸、４−アミノ−１−カルバムイミドイルピペリジン−４−カルボン酸及び４−グアニジノフェニルアラニンを含む。
【０１０１】
ジペプチドは、典型的には１個のカチオン性アミノ酸を組み込んでおり、より長いペプチドは通常、追加のカチオン性アミノ酸を組み込んでおり、したがって４又は５個のアミノ酸のペプチドは、２又は３個のカチオン性アミノ酸を有してよく、６〜９個のアミノ酸のペプチドは３〜６個のカチオン性アミノ酸を有してよい。
【０１０２】
分子の好ましい基は、Ｃ末端に結合されたβ2,2二置換アミノ酸を含み、この配置を有するＬ−アルギニンアミド残基及びジペプチドが特に好ましい。
３以上のアミノ酸を有するペプチドは典型的には、１以上の追加の親油性アミノ酸、すなわち親油性Ｒ基を有するアミノ酸を有する。典型的には親油性Ｒ基は、縮合又は結合されていてよい少なくとも１個の、好ましくは２個の環状基を有する。親油性Ｒ基は、Ｏ、Ｎ又はＳなどのヘテロ原子を含有できるが、典型的には１以下のヘテロ原子が存在し、好ましくはそれは窒素である。このＲ基は、好ましくは２以下の極性基を有し、より好ましくは１つも無いか又は１個有し、最も好ましくは１つも無い。
【０１０３】
トリプトファンは好ましい親油性アミノ酸であり、ペプチドは、好ましくは１〜３個のトリプトファン残基を含む。組み込まれ得る、さらなる親油性の遺伝子コードされるアミノ酸は、フェニルアラニン及びチロシンである。
【０１０４】
親油性アミノ酸は、遺伝的にコードされていなくてよいが、修飾されたＲ基を有する遺伝子コードされるアミノ酸を含む。
特に好ましいペプチド、ペプチド模倣物又は（修飾）アミノ酸は、少なくとも＋２の正味の正電荷を有し、式Ｉ：
【０１０５】
【化１】
2019503696.tif 000004
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4の任意の２個は水素原子であり、２個は同一である又は異なっていてよい置換基であり、少なくとも７個の非水素原子を含み、親油性であり、環状基を含み、上記環状基はα又はβのいずれかの炭素原子に直接取り付けられていないが必要に応じて他の置換基中の環状基に結合又は融合され、環状基が融合されている場合は２個の置換基の非水素原子の合計数は少なくとも１２であり、上記Ｘは、Ｏ、Ｃ、Ｎ又はＳを表す）
の基を組み込んでいる。
【０１０６】
Ｒ1〜4の２個の基の中の非水素原子の合計についての最小数１２は、各部分の環状基が融合される場合、融合されていない基の最小数を加え（７＋７＝１４）２を減算することによって得られるが、理由は、非水素原子の２個が各基における環形成に効果的に関与するためであることを理解されたい。好ましくは、Ｒ1〜4の２個の基の中の非水素原子の合計数は、各部分の環状基が融合される場合１４である。Ｃα又はＣβに取り付けられる２個の基が、置換基間における追加の架橋結合の有無に関わらず、融合された環状基の２対以上を含有し得る場合、複合融合基及び複合結合基を想定できる。それにもかかわらず、２個の置換基は好ましくは分子として融合又は結合されておらず、これらの基が動きの最大の柔軟性を有することが好ましい。
【０１０７】
式（Ｉ）の基の中の窒素原子は、もちろん、間接的にＣβ又はＣαを介することを除いて、好ましくは基Ｒ1〜4の任意の原子に結合されない。好ましくは上記主鎖（Ｎ−Ｃβ−Ｃα−Ｃ−Ｘ）中の５個の原子は、環状ではなく、線形でのみ相互に結合される。式（Ｉ）中のＸ及びＮがそれらの通常の原子価を有し、したがって典型的には、それらが化合物の他の部分、例えばさらなるアミノ酸又はＮ末端若しくはＣ末端キャッピング基に結合されるように、さらに置換されることを理解されたい。
【０１０８】
Ｒ1〜4の置換基は、一般的には本質的に親油性であり、好ましくは電荷を帯びておらず、好ましくは２以下、より好ましくは１以下の極性基を有する。Ｒ1〜4の置換基の一方又は両方は、好ましくは少なくとも８個、より好ましくは少なくとも９又は１０個の非水素原子、例えば７〜１３個、７〜１２個、８〜１２又は９〜１１個の非水素原子を含有する。これらの２個の置換基は、合成の容易さのためであっても、好ましくは同一である。好ましくは２個の置換基は、Ｒ1及びＲ2又はＲ3及びＲ4であり、Ｒ3及びＲ4が最も好ましい。
【０１０９】
上述したように、Ｒ1〜4の環状基は、それらが１〜４個、好ましくは１〜３個の原子の鎖だけ離間されているので、α又はβ炭素原子のいずれかに直接結合しておらず；これらの結合原子は、窒素及び／又は酸素を含んでよいが、典型的には炭素原子であり、好ましくは結合原子は置換されていない。Ｘは、置換されていても置換されていなくてもよく、好ましくはＮ原子であり、好ましくは置換されている。ＸがＮである場合には、それはさらなるアミノ酸とアミド結合の一部を形成できる。或いは、Ｎ原子は、例えばアミノアルキル基、例えばアミノエチル又はアミノプロピル又はジメチルアミノエチルによって置換されていてもよい。さらなる代替において、Ｎ原子は、それ自体がアルキル基又はアミノアルキル基で置換されていてよい、ピペラジンなどの環状基の一部を形成できる。
【０１１０】
式Ｉの基を組み込むペプチド又はペプチド模倣物は、修飾されたＣ末端を好ましくは有し、それは好ましくはアミド化され、かつ上述される。
βアミノ酸の好ましい置換基を定義する前の節は、変更すべきところは変更して、Ｒ1〜4の２個の置換基に適用される。式Ｉの基を組み込むペプチド及ペプチド模倣物は、本出願の前の方に記載される分子の好ましいサブセットであるので、分子の好ましい特徴、例えばそれらの長さ及びそれらが含有する他のアミノ酸を定義する全ての前の節も、式Ｉの基の組み込みによって定義されるこれらの分子に適用され、その逆もまたあり得る。特に好ましい分子は、１〜７又は８個（例えば、１〜５個）、より好ましくは１、２、３又は４個のアミノ酸長である。ペプチド模倣分子は同じ数のサブユニットを含むが、これらのサブユニットは典型的にはアミド結合模倣物によって結合され；好ましい結合は前述されており、エステル及びアミノメチル及びケトメチレンを含む。
【０１１１】
本発明のペプチド、ペプチド模倣物及びアミノ酸は、塩形態であり、環状の又はエステル化された、並びに上述の好ましいアミド化された誘導体であり得る。
【０１１２】
分子の好ましいクラスは、β、好ましくは、上で定義した２つの親油性側鎖を組み込む単一β2,2−アミノ酸を有するβ2,2−アミノ酸誘導体であり、二置換βアミノ酸には２個のカチオン基が隣接している。前述したように、２個の置換基は好ましくは同一であり、６員の環状基及び少なくとも８個の、好ましくは少なくとも１０個の非水素原子を含む。
好ましくは、分子はＬＴＸ−４０１である。
【０１１３】
ペプチド模倣物
上述したように、上で定義した分子は、ペプチド模倣物の形態であり得る。ペプチド模倣物は典型的には、そのペプチド同等物の極性、三次元サイズ及び機能性（生物活性）を保持することによって特徴づけられるが、ここでペプチド結合は多くの場合、より安定した結合で置換されている。「安定な」とは、加水分解酵素による酵素分解に対してより耐性であることを意味する。一般的には、アミド結合と置き換わる結合（アミド結合代用物）は、アミド結合の多くの特性、例えば立体構造、立体容積、静電的特徴、水素結合の可能性などを保つ。「薬物の設計と開発（Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」の第１４章、Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ，Ｌａｒｓｅｎ，Ｌｉｌｊｅｆｏｒｓ ａｎｄ Ｍａｄｓｅｎ（編）１９９６，Ｈｏｒｗｏｏｄ Ａｃａｄ．Ｐｕｂは、ペプチド模倣物の設計及び合成のための技術の一般的な説明を提供している。適切なアミド結合代用物は、以下の基を含む：Ｎ−アルキル化（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，１９９５，４６，４７）、レトロインバースアミド（Ｃｈｏｒｅｖ，Ｍ及びＧｏｏｄｍａｎ，Ｍ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ，１９９３，２６，２６６）、チオアミド（Ｓｈｅｒｍａｎ Ｄ．Ｂ．及びＳｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９０，１１２，４３３）、チオエステル、ホスホネート、ケトメチレン（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｖ．及びＫｉｍ，Ｈ．Ｏ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，６０，５１０７）、ヒドロキシメチレン、フルオロビニル（Ａｌｌｍｅｎｄｉｎｇｅｒ，Ｔ．ら，Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９０，３１，７２９７）、ビニル、メチレンアミノ（Ｓａｓａｋｉ，Ｙ及びＡｂｅ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９７ ４５，１３）、メチレンチオ（Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１９９３，１３，１９）、アルカン（Ｌａｖｉｅｌｌｅ，Ｓ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，１９９３，４２，２７０）及びスルホンアミド（Ｌｕｉｓｉ，Ｇ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９３，３４，２３９１）。
【０１１４】
ペプチド模倣化合物は、同等の溶解性ペプチドのサブユニットと大きさ及び機能がほぼ同等であるいくつかのサブユニットを有してよい。したがって、用語「アミノ酸」は、ペプチド模倣化合物の同等のサブユニットを指すために本明細書中で都合よく使用できる。また、ペプチド模倣物は、アミノ酸のＲ基と同等の基を有してよく、適切なＲ基の、並びにＮ及びＣ末端修飾基の本明細書の記載は、変更すべきところは変更して、ペプチド模倣化合物に適用される。
【０１１５】
「薬物の設計及び開発（Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄら，１９９６、及びアミド結合の置換に記載されているように、ペプチド模倣物は、ジペプチド模倣物又はトリペプチド模倣構造でのより大きな構造部分の置換を伴ってよく、この場合には、アゾール由来の模倣物などの、ペプチド結合を含む模倣物部分が、ジペプチド代替物として使用できる。上述されるように単にアミド結合が置換されているペプチド模倣物、ひいてはペプチド模倣物の主鎖が、しかしながら、好ましい。
【０１１６】
適切なペプチド模倣物は、還元剤、例えばボラン又はリチウムアルミニウムヒドリドなどの水素化物試薬での処理によりアミド結合がメチレンアミンに還元された還元ペプチドを含む。かかる還元は、分子の全体的なカチオン性を高める付加的な利点を有する。
【０１１７】
他のペプチド模倣物は、例えば、アミド官能ポリグリシンの段階的合成によって形成されたペプトイドを含む。いくつかのペプチド模倣物の主鎖は、完全メチル化されているペプチドなど、それらのペプチド前駆体から容易に利用可能であり、適切な方法は、Ｏｓｔｒｅｓｈ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４）９１，１１１３８−１１１４２によって記載されている。強塩基性条件は、Ｏ−メチル化よりもＮ−メチル化を優先し、ペプチド結合中の窒素原子及びＮ末端窒素の一部又は全てのメチル化をもたらす。
【０１１８】
好ましいペプチド模倣物の主鎖は、ポリエステル、ポリアミン及びそれらの誘導体、並びに置換されたアルカン及びアルケンを含む。ペプチド模倣物は好ましくは、本明細書で説明されるように修飾できるＮ及びＣ末端を有する。
好ましいものとして記載される全てのペプチドのペプチド模倣等価物もまた好ましい。
【０１１９】
分子の合成
本明細書に記載の溶解分子は、任意の便利な方法で合成できる。一般的に、存在する反応基（例えば、アミノ、チオール及び／又はカルボキシル）は、全合成中に保護される。合成での最後の工程はしたがって、本発明の保護された誘導体の脱保護である。
【０１２０】
ペプチドを構築する際に、原理的にはＣ末端又はＮ末端のいずれかで開始できるが、Ｃ末端で開始する手順が好ましい。
ペプチド合成の方法は当技術分野で周知であるが、本発明については、固相支持体上で合成を行うことが特に好都合であり得、かかる支持体は当技術分野で周知である。
【０１２１】
アミノ酸の保護基の幅広い選択肢は公知であり、適切なアミン保護基は、カルボベンジルオキシ（Ｚとも命名される）ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃとも命名される）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）及び９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃとも命名される）を含み得る。ペプチドがＣ末端から構築される場合、アミン保護基は、付加される各新規残基のα−アミノ基上に存在し、次のカップリング工程の前に選択的に除去される必要があることを理解されたい。
【０１２２】
例えば使用され得るカルボキシル保護基は、ベンジル（Ｂｚｌ）、ｐ−ニトロベンジル（ＯＮｂ）、又はt−ブチル（ＯｔＢｕ）基、並びに固体支持体上のカップリング基、例えばポリスチレンに結合されるリンクアミドなどの容易に切断されるエステル基を含む。
【０１２３】
チオール保護基は、ｐ−メトキシベンジル（Ｍｏｂ）、トリチル（Ｔｒｔ）及びアセトアミドメチル（Ａｃｍ）を含む。
【０１２４】
本発明の好ましいペプチドは、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ及びＤａｐのアミン側鎖のための、並びにトリプトファン残基のインドール窒素の保護のためのt−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基を用いて都合よく調製できる。Ｆｍｏｃは、α−アミノ基の保護のために使用できる。Ａｒｇを含有するペプチドについては、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニルがグアニジン側鎖の保護のために使用できる。
【０１２５】
アミン保護基及びカルボキシル保護基を除去するための様々な手順が存在する。これらは、しかしながら、使用される合成戦略と一致しなければならない。側鎖保護基は、次のカップリング工程の前に一時的なα−アミノ保護基を除去するために使用される条件に対し安定でなければならない。
【０１２６】
Ｂｏｃなどのアミン保護基及びｔＢｕなどのカルボキシル保護基は、例えばトリフルオロ酢酸での酸処理によって同時に除去できる。Ｔｒｔなどのチオール保護基は、ヨウ素などの酸化剤を用いて選択的に除去できる。
【０１２７】
ペプチド模倣化合物を合成するための参考文献及び技術は、上で提供され、当業者に周知である。
対象は、典型的にはヒト患者であるが、家庭用又は家畜動物などの非ヒト動物も処置されてよく、実験又は試験用の動物が処置されてよい。
【０１２８】
好ましい癌標的は、リンパ腫、白血病、神経芽腫及び神経膠芽腫（例えば脳由来の）、癌及び腺癌（特に、乳癌、結腸癌、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺及び皮膚由来の）並びに黒色腫である。
【０１２９】
投与される分子は、例えば、経口、局所、経鼻、非経口、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎａｌ）、腫瘍内、直腸又は局所（例えば、単離された四肢潅流）投与に適する形態で提示できる。投与は、典型的には非経口経路により、好ましくは皮下注射、筋肉内、関節内、脊髄内、腫瘍内又は静脈内経路による。腫瘍内投与が好ましい。
【０１３０】
本明細書で定義される分子は、錠剤、コーティング錠、鼻腔用スプレー、溶液、エマルジョン、リポソーム、散剤、カプセル剤又は持続放出形態などの投与の従来の薬理学的形態で提供できる。従来の医薬賦形剤及び通常の生成方法は、これらの形態の調製に使用できる。臓器特異的運搬システムもまた使用できる。
【０１３１】
注射溶液は、例えば、ｐ−ヒドロキシベンゾエートなどの保存剤又はＥＤＴＡなどの安定剤の添加によるなど、従来の方法で生成できる。溶液は次いで、注射バイアル又はアンプル中に充填される。
【０１３２】
好ましい製剤は生理食塩水中である。かかる製剤は、例えば注射又は灌流／注入による、局所投与、例えば腫瘍内投与に適する。
活性分子を含有する投与単位は好ましくは、０．１〜１０ｍｇの、例えば１．５ｍｇの本発明の抗腫瘍分子を含有する。
【０１３３】
かかる組成物を全身に使用するには、活性分子は、少なくとも約５μｇ／ｍｌの活性分子の血清レベルを達成する量で存在する。一般的には、血清レベルは、５００μｇ／ｍｌを超える必要はない。好ましい血清レベルは約１００μｇ／ｍｌである。かかる血清レベルは、１〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で全身投与される組成物中に生物活性分子を組み込むことによって達成され得る。一般に、分子（複数可）は、１００ｍｇ／ｋｇを超える用量で投与される必要はない。
【０１３４】
本発明の分子は塩形態を含む。ペプチド及び類似の分子のための適切な薬学的に許容される塩は、当業者に周知である。
本発明を、以下の実施例及び図面を参照しながらさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】上記の溶解性化合物のＴ細胞クローン性作用機序を示す。１）コールド腫瘍に対する溶解性化合物の投与は、強力な免疫刺激物質及び腫瘍特異的抗原の広いレパートリーの放出をもたらす；２）抗原提示細胞の活性化及び腫瘍特異的抗原の貪食；３）腫瘍特異的抗原の広いレパートリーの提示は、リンパ節で起こる；４）腫瘍特異的Ｔ細胞のクローン性が増強され、これらのＴ細胞は血液系を介して分配される；５）Ｔ細胞の浸潤及びクローン性の増加は、最初に注入された腫瘍と他の遠位の注入されていない腫瘍の両方をホットにする。
【図２】ＬＴＸ−３１５での処置後の骨肉腫細胞の細胞膜の崩壊を示す。（Ａ）溶解前の細胞を示し、（Ｂ）溶菌後の細胞を示す。
【図３】ミトコンドリア付近でのＬＴＸ−３１５の内部移行及び蓄積を示す。１．５μΜの蛍光標識ＬＴＸ−３１５で３０分間処置され、標識されたミトコンドリア及び核を有するＡ３７５細胞。ペプチドは内部移行し、ミトコンドリアに近接して検出された。Ａ：オーバーレイチャネル、Ｂ：近接撮影、Ｃ：ミトコンドリア、Ｄ：ペプチド。
【図４】内部移行は、ＬＴＸ−３１５などの９ｍｅｒの溶解性化合物でのみ生じ、非溶解性偽ペプチドＬＴＸ−３２８では生じないことを示す。３μΜのＬＴＸ−３１５又はＬＴＸ−３２８ペプチドで６０分間処置したＡ３７５細胞。ＬＴＸ−３１５は細胞質中で検出されたが、ＬＴＸ−３２８は内部移行しなかった。Ａ：ＬＴＸ−３１５での６０分間のインキュベーション、Ｂ：ＬＴＸ−３２８での６０分間のインキュベーション。
【図５】ＬＴＸ−３１５処置が微細構造変化を引き起こすことを示す。対照細胞と比較した、ＬＴＸ−３１５で６０分間処置したＡ３７５細胞のＴＥＭ像。Ａ＆Ｄ：未処置の対照細胞、Ｂ＆Ｅ：３，５μΜで処置した細胞、Ｃ＆Ｆ：１７μΜで処置した細胞。倍率１００００倍 Ａ〜Ｃ、３００００倍 Ｄ〜Ｆ、スケールバー５μｍ。
【図６】ＬＴＸ−３１５がミトコンドリア膜を崩壊することを示す。対照細胞と比較したＬＴＸ−３１５（１０μｇ／ｍｌ）で処置したヒトＡ５４７黒色腫細胞のＴＥＭ像。
【図７】ＬＴＸ−３１５処置後の細胞外ＡＴＰレベルを示す。Ａ３７５細胞を、異なる濃度で５分間ＬＴＸ−３１５で処置するか、又は制御された条件下で維持し、上清をルシフェラーゼ生物発光によってＡＴＰ分泌の定量について分析した。１回の代表的な実験の定量的データ（平均値±Ｓ．Ｄ．）を報告する。
【図８】ＬＴＸ−３１５で処置したヒト黒色腫細胞が上清中にチトクロムＣを放出することを示す。指定した時点（５、１５、４５分）後にＡ３７５のＬＴＸ−３１５処置後の上清中のチトクロムＣ放出を、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定した。
【図９】ＨＭＧＢ１がＬＴＸ−３１５処置後に上清中に放出されることを示す。Ａ３７５ヒト黒色腫細胞を３５μΜのＬＴＸ−３１５（上）又はＬＴＸ−３２８（下）で処置し、細胞溶解物（Ｌ）及び上清（Ｓ）をウェスタンブロットで分析し、ＬＴＸ−３１５処置細胞は細胞溶解物から細胞上清への段階的な移行を示した。対照細胞は培地単独で処置され、６０分後に移行を示さなかった。
【図１０】ＬＴＸ−３１５におけるＲＯＳ生成が細胞死を誘発したことを示す。Ａ３７５細胞を１５分間、異なる濃度のＬＴＸ−３１５で処置した。ペプチド処置後に、カルボキシ−Ｈ２ＤＣＦＤＡを試料に添加し、蛍光プレートリーダーを用いて蛍光を分析した。実験を二重で行い、バーは平均蛍光±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図１１】両親媒性の小さいβ（２，２）−アミノ酸由来の抗腫瘍分子ＬＴＸ−４０１（Ｍｗnet＝３６７．５３）の化学構造を示す。
【図１２】ＬＴＸ−４０１が、Ｂ１６Ｆ１黒色腫細胞において細胞死を急速に誘発することを示す。ＬＴＸ−４０１の２つの異なる濃度での短いインキュベーション後の細胞生存率の決定を、指定した時間（５、１５、３０、６０、９０、１２０及び２４０分）後に分析し、それはインキュベーションの６０分後での生存率の減少を明らかにした。データは、平均±ＳＥＭとして各時点について提示される３つ組みで行った３つの実験を表す。
【図１３】ＬＴＸ−４０１処置が空胞化を伴う微細構造変化を誘導することを示す。ＬＴＸ−４０１（１０８μΜ）で処置したＢ１６Ｆ１細胞の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真。未処置の対照細胞（ａ、ｂ）を、実験の終点（６０分）まで無血清ＲＰＭＩ １６４０単独で維持し、５分間（ｃ、ｄ）及び６０分間（ｅ、ｆ）の両方で処置した細胞と比較した。スケールバーは、ａ、ｃ、ｅについては１０μｍであり、ｂ、ｄ、ｆについては５μｍである。
【図１４】ＬＴＸ−４０１が危険シグナルの放出を誘発することを示す。（ａ）ウェスタンブロットを用いて決定されるＬＴＸ−４０１処置細胞の上清中へのＨＭＧＢ１の放出。細胞溶解物（Ｌ）から培養上清（Ｓ）への核タンパク質ＨＭＧＢ１の移行は、ＬＴＸ−４０１（１０８μΜ）での処置の３０分後に明らかであり、インキュベーションの９０分後には完全に移行した。対照細胞は、２４０分後に移行を示さなかった。実験を３回行い、この図は代表的なブロットのデジタル画像である；（ｂ）Ｂ１６Ｆ１細胞を、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて上清中のチトクロムＣの量を決定する前に、異なる時間（３０、６０、９０、１２０及び２４０分間）、ＬＴＸ−４０１（１０８μΜ）で処置した。結果を平均±ＳＥＭとして提示する；（ｃ）Ｂ１６Ｆ１細胞を、指定した時間（１０、３０、６０、９０及び１２０分間）、ＬＴＸ−４０１（５４μΜ）で処置した。ＡＴＰレベルの定量を、ルシフェラーゼ生物発光により行い、その結果を平均±ＳＥＭとして提示する。
【図１５】様々なレベルのクローン性を有するＴ細胞集団の頻度分布の一例を示す。（Ａ）０．０５のクローン性を有する集団の分布曲線を示す。（Ｂ）０．３２のクローン性を有する集団の分布曲線を示す。
【図１６】ＬＴＸ−３１５での処置後の腫瘍中のクローン性（Ａ）及び有核細胞当たりのＴ細胞の数（Ｂ）の増加を示す。０．００８のｐ値を、Ｕ検定を用いて計算した。
【図１７】ＬＴＸ−３１５で処置した後の腫瘍中のＴ細胞クローン数の増加を示す。０．００８のｐ値を、Ｕ検定を用いて計算した。
【図１８】ＬＴＸ−３１５での処置後の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のクローン性のわずかな増加を示す。ｐ＜０．０５であれば、ｐ値（０．１５）は有意ではない。
【図１９】１例の処置マウス（図１９ａ）及び未処置マウス（図１９ｂ）対象からの腫瘍（ｙ軸）とＰＢＭＣ（ｘ軸）のレパートリーの比較を示す。黒いドットは、図１９ａで標識される１つの外れ値を別として、ＰＢＭＣに比べて腫瘍の存在量が有意により高いクローンを表し、外れ値は腫瘍と比べてＰＢＭＣの存在量が有意により高かった。灰色のドットは、腫瘍又はＰＢＭＣについて有意な選好を示さないクローンを表す。
【図２０】さらなる１例の処置マウス（図２０ｂ）及び未処置マウス（図２０ａ）対象からの腫瘍組織（ｙ軸）とＰＢＭＣ（ｘ軸）のレパートリーの比較を示す。濃い灰色のドットは、ＰＢＭＣに比べて腫瘍の存在量が有意により高いクローンを表し、明るい灰色のドットは、腫瘍又はＰＢＭＣについて有意な選好を示さないクローンを表し、囲まれた濃い灰色のドットは、腫瘍に比べてＰＢＭＣの存在量が有意により高いクローンを表す。
【図２１】ＬＴＸ−３１５処置が、Ｂ１６黒色腫に対する免疫防御を誘発することを示す。未処置対照動物における腫瘍増殖（ａ）を、以前にＬＴＸ−３１５処置により治癒された動物と比較した（ｂ）及び（ｄ）。動物を、最初の腫瘍部位と反対側に５×１０4個のＢ１６Ｆ１生存細胞で皮内に再負荷する（ｂ）か、又は２×１０5個のＢ１６Ｆ１生存細胞で静脈内に再負荷した（ｄ）。皮内に再負荷された動物の生存曲線（ｃ）を、ログ・ランク（マンテル・コックス）検定を用いて分析し、有意に異なることを示した（ｐ＜０．０００１）。肺腫瘍病巣の数を、対応のないｔ検定を用いて分析し、未処置対照動物（ｄ）と、ＬＴＸ−３１５によって以前に治癒された静脈内再負荷動物を比較した時に、有意に異なる（ｐ＝０．００３）ことを示した。デジタル画像は、異なる群からの代表的な肺を示す（ｅ）。抗ＣＤ３での免疫標識によって示されるように（ｆ）、対照動物と比較して、ＬＴＸ−３１５によって以前に治癒された動物の腫瘍病巣はＣＤ３＋Ｔ細胞により高度に浸潤された。
【図２２】ＬＴＸ−３１５が、腫瘍床において細胞傷害性のＣＤ４+腫瘍浸潤性Ｔリンパ球（ＣＤ４+ＴＩＬ）を顕著に増加させたことを示す。ＬＴＸ−３１５（対ＰＢＳ）の７日後の新鮮なＭＣＡ２０５肉腫の解離後の、生細胞のゲートでのインターフェロンγ陽性（ＩＦＮγ+）ＣＤ４+  ＴＩＬ（Ａ）、インターロイキン１７陽性（ＩＬ−１７+）ＣＤ４+  ＴＩＬ（Ｂ）及び二重陽性ＩＦＮγ+ ＩＬ−１７+ ＣＤ４+ ＴＩＬ（Ｃ）のフローサイトメトリー決定。各点は１匹のマウスのデータを表し；少なくとも２つの実験を各グラフで集めた。スチューデントｔ検定：*＝Ｐ＜０．０５及び***＝Ｐ＜０．００１。
【図２３】ＬＴＸ−３１５が、腫瘍床において細胞傷害性ＣＤ８+ＴＩＬを顕著に増加させたことを示す。ＬＴＸ−３１５（対ＰＢＳ）の７日後の新鮮なＭＣＡ２０５肉腫の解離後の、生細胞のゲートでのＩＦＮγ  ＣＤ８+  ＴＩＬ（Ａ）、腫瘍壊死因子α陽性（ＴＮＦα+）ＣＤ８+ ＴＩＬ（Ｂ）及び二重陽性ＩＦＮγ+  ＴＮＦα+ ＣＤ８+ ＴＩＬ（Ｃ）のフローサイトメトリー決定。各点は１匹のマウスのデータを表し；少なくとも２つの実験を各グラフで集めた。スチューデントｔ検定：*＝Ｐ＜０．０５。
【図２４】Ｃ５７ＢＬ／６免疫適格マウスで発達する２０〜２５ｍｍ2の確立されたＭＣＡ２０５肉腫でのＬＴＸ−３１５の殺腫瘍活性に対する、ＣＤ４及びＣＤ８ａ分子を標的とする抗体を枯渇させる効果を示す。かかる特異的抗体（ＧＫ１．５及び５３〜６．７２、マウスあたり２００μｇ）又は注入されるアイソタイプ対照ｍＡｂの存在下又は非存在下での腫瘍増殖動態。３００μｇのＬＴＸ−３１５の毎日３回の腫瘍内連続注射を次いで行った。グループあたり６又は７匹のマウスを含む２グループからの代表的な実験を示す。スチューデントｔ検定：*＝Ｐ＜０．０５及びＮＳ＝有意ではない。
【図２５】転移性黒色腫患者におけるＬＴＸ−３１５投与後のＣＤ３+陽性細胞（Ｔリンパ球を示す）及びＣＤ８+陽性細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球を示す）のヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色並びに浸潤を示す（黒ドットで示す）。
【図２６】悪性黒色腫患者におけるＬＴＸ−３１５投与後のＣＤ８+陽性細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球を示す）のヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色並びに浸潤を示す（黒ドットで示す）。
【図２７】筋上皮腫患者におけるＬＴＸ−３１５投与後のＣＤ３+陽性細胞（Ｔリンパ球を示す）及びＣＤ８+陽性細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球を示す）のヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色並びに浸潤を示す（黒矢印で示す）。
【図２８】乳癌患者におけるＬＴＸ−３１５投与後のＣＤ３+陽性細胞（Ｔリンパ球を示す）及びＣＤ８+陽性細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球を示す）のヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色並びに浸潤を示す（黒ドットで示す）。
【図２９】デスモイド腫瘍患者におけるＬＴＸ−３１５投与後のＣＤ３+陽性細胞（Ｔリンパ球を示す）及びＣＤ８+陽性細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球を示す）のヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色並びに浸潤を示す（黒ドットで示す）。
【図３０】浸潤性リンパ球がＬＴＸ−３１５処置後の腫瘍中に動員されることを示す。ＬＴＸ−３１５処置後の細胞浸潤及び腫瘍における細胞組成の変更を研究するための実験のスケジュールを図３０ａに示す。ラットに、半日目に一方の側腹部で２００，０００個のラット形質転換間葉系幹細胞由来肉腫モデル細胞（ｒＴＭＳＣ）を皮下接種し、０日目に反対の側腹部で２０，０００個のｒＴＭＳＣを皮下接種した。予め確立された腫瘍を有するラット（ｎ＝８）に、連続３日間、毎日１ｍｇのＬＴＸ−３１５の病巣内注射を行った。対照群の腫瘍を有するラット（ｎ＝６）に、平行して生理食塩水注射を接種した。単一細胞懸濁液を、ＬＴＸ−３１５処置後１週間の異なる時点で新鮮な腫瘍組織から調製した。図３０ｂは、対照群（黒いバー）からの病巣と比較して、処置ラットの最初に処置された病巣（薄い灰色のバー）、二次病巣（濃い灰色のバー）におけるＴＩＬサブセットの比率を示す。グラフは平均±ＳＤを示す。スチューデントｔ検定により*Ｐ＜０．５、**Ｐ＜０．１。
【図３１】ＣＤ３又はＣＤ８（褐色）について染色しＤＡＰＩで対比染色した、未処置対照に対する処置ラットからの原発性並びに二次性腫瘍の代表的な画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１３６】
【実施例】
【０１３７】
実施例１
ＬＴＸ−３１５は骨肉腫細胞の細胞質膜を崩壊する
１．材料及び方法
ＦＯＲＶＥＩＬＬＥ Ｓ．ら，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ２０１５，１４：３５０６−１２に記載のように細胞膜を崩壊させた。
【０１３８】
１．１  化学物質及び細胞培養
細胞培養用の培地及び栄養補助剤をＧｉｂｃｏ−Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手し、Ｌｙｔｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ（Ｔｒｏｍｓｏ，Ｎｏｒｗａｙ）によって提供されたＬＴＸ−３１５（Ｋ−Ｋ−Ｗ−Ｗ−Ｋ−Ｋ−Ｗ−Ｄｉｐ−Ｋ−ＮＨ２）を除く化学物質をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。プラスチック製品はＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ（Ｍｏｎｒｏｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）からのものであった。
【０１３９】
ヒト骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したグルタマックス含有ＤＭＥＭ培地、及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中で培養した。細胞を、５％  ＣＯ2雰囲気下の加湿インキュベーター中にて３７℃で増殖させた。
【０１４０】
１．２  透過型電子顕微鏡
超微細構造研究のために、ヒト骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞を、１時間、１．６％のグルタルアルデヒド（０．１Ｍのリン酸緩衝液中ｖ／ｖ）中で固定し、掻き取りによって回収し、遠心分離し、ペレットを１％四酸化オスミウム（０．１Ｍのリン酸緩衝液中ｗ／ｖ）で後固定した。段階的エタノール系列を通して脱水した後、細胞をＥｐｏｎＴＭ ８１２中に包埋し、超薄切片を標準的な酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。画像を、Ｔｅｃｎａｉ １２電子顕微鏡（ＦＥＩ、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて取得した。
【０１４１】
２  結果
ＬＴＸ−３１５の投与後、細胞の大部分は、細胞質膜が崩壊した壊死形態をとった（図２）。
【０１４２】
実施例２
ＬＴＸ−３１５は内部移行し、ミトコンドリアと相互作用する
本研究では、ヒト黒色腫細胞に対するＬＴＸ−３１５の殺腫瘍効果を調べた。ペプチドは内部移行し、ミトコンドリアに付随して、最終的に溶解された細胞死に至ることが示された。ＬＴＸ−３１５ペプチドは、２段階の作用モードを介して腫瘍内注射で固形腫瘍を処置する。作用モードの第１は腫瘍自体の崩壊であり、第２は、瀕死の腫瘍細胞から放出される損傷関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）であり、これは再発及び転移に対するその後の免疫防御を誘発できる。
【０１４３】
１．材料及び方法
本研究を、ＥＩＫＥ  Ｌ−Ｖら，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１５，６：３４９１０−２３に記載の通りに行った。
【０１４４】
１．１  試薬
ＬＴＸ−３１５及びＬＴＸ−３２８（Ｋ−Ａ−Ｑ−Ｄｉｐ−Ｑ−Ｋ−Ｑ−Ａ−Ｗ−ＮＨ2）は、要求に応じてそれぞれＢａｃｈｅｍ  ＡＧ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及びＩｎｎｏｖａｇｅｎ（Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって作製された。ＬＴＸ−３１５パシフィックブルー及びＬＴＸ−３２８パシフィックブルーは、要求に応じてそれぞれＩｎｎｏｖａｇｅｎ（Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｎｏｒｕｄ（Ｔｒｏｍｓｏ，Ｎｏｒｗａｙ）から購入した。
【０１４５】
１．２  細胞培養
Ａ３７５細胞株Ａ３７５（ＥＣＡＣＣ、８８１１３００５）は、患者物質由来のヒト悪性黒色腫であり、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ（ＰＨＥ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ，Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ）から購入した。細胞を、抗生物質を含まない、１０％ＦＢＳ及び１％Ｌ−グルタミンを補充した高グルコース４．５％  ＤＭＥＭ（完全培地）中で単層培養として維持した。この細胞株を、３７℃にて加湿した５％ＣＯ2雰囲気中で増殖させ、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（Ｌｏｎｚａ）を用いてマイコプラズマの存在について定期的に試験した。
【０１４６】
１．３  共焦点顕微鏡
非標識細胞を用いた生細胞イメージング−Ａ３７５細胞を、２５μｇ／ｍｌのヒトフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）でプレコートしたＮｕｎｃ Ｌａｂ−Ｔｅｃ ８−ウェルチャンバーカバーガラス（Ｓｉｇｍａ）中の完全培地中に１０，０００細胞／ウェルで播種し、一晩接着させた。細胞を、無血清ＲＰＭＩで２回洗浄し、ＲＰＭＩ中に溶解したペプチドで処置し、６３Ｘ／１．２Ｗ対物レンズを用いて、多光子励起Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡を使用して調べた。この顕微鏡は、ＣＯ2及び温度制御を有するインキュベーションチャンバーを備えていた。
【０１４７】
固定細胞、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ―細胞を、生細胞イメージングのために播種し、ペプチド処置前に１５分間、１００ｎｍにてＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ ＣＭＨ２ＸＲＯＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した。細胞を１７μΜのＬＴＸ−３１５で処置し、陰性対照は血清を含まないＲＰＭＩのみで処置した。インキュベーションの６０分後に、細胞をＺｅｉｓｓの顕微鏡を用いて分析した。
【０１４８】
全ての共焦点イメージング実験をその後少なくとも２回実施し同様の結果を得た。
固定細胞、蛍光標識ペプチド―サブコンフルエントなＡ３７５細胞を、上記のように、８，０００細胞／ウェルで播種し、製造業者のプロトコルに従ってプラストランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にリポフェクタミンＬＴＸを用いて２日目にトランスフェクトした。ミトコンドリアを、ｐＤｓＲｅｄ２−Ｍｉｔｏを用いて標識し、核を、ＧＦＰ−ヒストン２Ｂプラスミド（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒｏｍｓｏ）を用いて標識した。トランスフェクションの翌日、細胞を無血清ＲＰＭＩで２回洗浄し、異なる濃度及び異なるインキュベーション期間で、ＬＴＸ−３１５パシフィックブルー又はＬＴＸ−３２８パシフィックブルーで処置した。ＭＴＴアッセイによって決定した場合、ＬＴＸ−３１５ ＰＢは、非標識ＬＴＸ−３１５と同様の細胞傷害プロファイルを示した。対照細胞を、非標識ＬＴＸ−３１５及び再び無血清ＲＰＭＩ単独で処置した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、ウェルをＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で覆った。細胞を、６９３、１．２Ｗ対物レンズを用いて、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡を使用してさらに分析した。パシフィックブルー、ＧＦＰ及びＤｓ Ｒｅｄを、４８８及び５６１レーザーと共にＵＶを用いて励起し、蛍光チャネルを、次のバンドパス：ＵＶ：４２０〜４８０ｎｍ（減衰で）、４８８：５０１〜５５０ｎｍ及び５６１：５７６〜６７６ｎｍを用いて順次検出した。
【０１４９】
１．４  ＴＥＭ電子顕微鏡
Ａ３７５細胞を、６ウェルプレート中にウェル当たり１×１０5細胞で播種し、培養物中で膜構造を最適化するために３日間増殖させ、培地を２日目に交換した。細胞を無血清ＲＰＭＩで２回洗浄し、その後、５、１０及び２５μｇ／ｍｌで無血清ＲＰＭＩ中に溶解したＬＴＸ−３１５で処置し、陰性対照として無血清ＲＰＭＩを用いた。細胞を次いでＰＢＳで２回洗浄し、その後、４℃で２４時間、ｐＨ７．８のＨｅｐｅｓ緩衝液中の４％ホルムアルデヒド及び１％グルタルアルデヒドで固定した。脱水及び後固定プロトコルは、５％緩衝タンニン酸中でのインキュベーション及び１％オスミウム低減フェロシアン化物中でのインキュベーションを含んだ。超薄切片を作製し、酢酸ウラニル（５％）及びレイノルズのクエン酸鉛を染色及び対比のために使用した。試料を、Ｊｅｏｌ ＪＥＭ−１０１０透過型電子顕微鏡で検査し、画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＭｏｒａｄａサイドマウントＴＥＭ ＣＣＤカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ ｓｏｆｔ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で取得した。
【０１５０】
１．５  活性酸素種（ＲＯＳ）の蛍光測定
ＤＣＦＤＡ細胞活性酸素種の検出アッセイキットを、ａｂｃａｍ（登録商標）から購入し、ＤＣＦＤＡアッセイ前にＡ３７５細胞を９６ウェルのＣｏｓｔａｒ黒色透明底プレートにウェルあたり２０，０００細胞で播種し、３７℃で１６時間インキュベートした。細胞を、１００μＬ／ウェルの予め温めたＰＢＳで１回洗浄し、細胞培養インキュベーター中３７℃で４５分間キット付属の緩衝液中で２０μΜのＤＣＦＤＡとインキュベートし、次いで１００μＬ／ウェルの緩衝液で再び洗浄した。細胞を次いで、１７μΜの濃度で緩衝液中に溶解した１００μＬ／ウェルのＬＴＸ−３１５ペプチドで３０分間刺激し、処置しなかった細胞を陰性対照として使用した。蛍光強度を、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙプレートリーダーで４８５ｎｍの励起波長及び５３０ｎｍの発光波長で測定した。
【０１５１】
１．６  ハイモビリティグループボックス１（ＨＭＧＢ１）の放出
Ａ３７５細胞を、６ウェルプレート中の完全培地に３×１０5個の細胞／ウェルで播種し、一晩接着させた。細胞を、３５μΜにてＬＴＸ−３１５又はＬＴＸ−３２８で処置し、３７℃および５％ＣＯ2で異なる時間（５、１０、１５、３０、６０分間）インキュベートし、陰性対照は無血清ＲＰＭＩ−１６５０であった。上清（Ｓ）を収集し、５分間１，４００ｇで遠心分離し、細胞溶解物（Ｌ）をＰＢＳで２回洗浄した後に収集し、その後、４×試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｎｕｍｂｅｒ）、０．１Ｍ ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ ｎｕｍｂｅｒ）及び水を用いて溶解した。上清をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ５０Ｋ遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＵＦＣ５０５０２４）を用いて濃縮し、細胞溶解物を超音波処理した。上清と溶解物の両方を煮沸し、１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、次いでポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気移動させた。膜を５％ミルク中でブロッキングし、ＨＭＧＢ１抗体（ウサギ、ポリクローナル、ａｂｃａｍ ａｂ １８２５６）とインキュベートした。膜を次いでＴＢＳＴで数回すすぎ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体（ａｂｃａｍ ａｂ６７２１）とインキュベートし、ＴＢＳＴで再度すすぎ、次いでＷＢルミノール試薬（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して発色させた。
【０１５２】
１．７  チトクロムＣの放出
Ａ３７５細胞を、ＨＭＧＢ１研究と同様に播種し、異なる時間（５、１５、４５）、３５μΜで処置した。ＨＭＧＢ１研究と同様に上清を収集し濃縮し、上清からの試料を、製造業者の説明に従って４．５時間固体形態チトクロムＣ−Ｅｌｉｓａキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ，♯ＤＣＴＣ０）を用いて分析した。その後すぐに、５０％希釈した試料を分析し、４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを用いて光学密度を決定し、この読み取りを次いで５４０ｎｍでの読取りから差し引いた。標準曲線を、アッセイした試料の各セットについて作製した。試料を４つ平行して実行し、上清中に放出されたチトクロムｃを、未処置細胞の上清中のチトクロムｃレベルに対する倍数として表した。
【０１５３】
１．８  ＡＴＰの放出
ＬＴＸ−３１５処置Ａ３７５細胞の上清を、Ｅｎｌｉｔｅｎ ＡＴＰルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用いて分析した。細胞を次いで、ＲＯＳアッセイと同様に播種し、２つ平行して１〜１５分の異なるインキュベーション時間で、ＬＴＸ−３１５で処置し、これを次いで３回行った。陰性対照は、無血清培地のみに暴露した未処置Ａ３７５細胞であった。試料を１：５０及び１：１００で希釈し、製造業者のプロトコルに従ってＬｕｍｉｎｏｓｃａｎ ＲＴルミノメーターで分析した。
【０１５４】
１．９  統計解析
全てのデータは、少なくとも２つ平行して行った少なくとも２つの独立した実験を表し、平均±ＳＤとして表した。チトクロムＣ放出及びＡＴＰ放出データを、一方向ＡＮＯＶＡ及び多重比較検定を用いて比較し、発明者らは、Ｐ値＜０．０５が統計的有意性を示すと考えた。
【０１５５】
２  結果
２．１ ＬＴＸ−３１５は内部移行し、ミトコンドリアを標的にする
細胞内でのペプチドの内部移行及び運命を調べるために、ＬＴＸ−３１５をパシフィックブルーで標識し、それぞれ３μΜ及び１．５μΜの濃度で細胞とインキュベートした。標識ＬＴＸ−３１５は形質膜を素早く貫通し、１．５μΜで、ペプチドは、インキュベーションの３０分後にミトコンドリアの周りに蓄積を示したが、細胞核中には検出されなかった（図３）。標識した非溶解性モック配列ペプチドＬＴＸ−３２８は、試験したいかなる濃度又はインキュベーション時間でも内部移行を示さなかった（図４）。
【０１５６】
２．２ ＬＴＸ−３１５は細胞における超微細構造的変化を誘導する
発明者らはさらに、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を実行することによって処置細胞における超微細構造的変化を評価し、その際Ａ３７５細胞を、培地中に直接溶解したペプチド又は培地単独のいずれかで処置した。低濃度（３．５μΜ）のＬＴＸ−３１５ペプチドで６０分間処置された多数の細胞は、空胞化、及びミトコンドリアの形態のある程度の変化を示した（図５）。ミトコンドリアは、より低い電子密度であるようにみえ、ある程度の再編成も示し、クリステはさらに離れて存在するか、又は全く見えなかった。これらの試料中の壊死細胞の数は５％未満であった。これらの低濃度において、細胞質の空胞化が観察された。これらの試料における別の一般的な知見は、末梢に位置する小胞であり、それは均質材料を含有する単一膜層で裏打ちされていた（図５Ｂ）。細胞をより高い濃度（１７μΜ）で６０分間処置した場合、それらの約４０％が、原形質膜完全性を喪失した壊死形態を示した（図５Ｃ＆Ｅ）。依然として無傷であった細胞は、微絨毛を有する正常な外観〜丸い外観の、かなりの異質性を示し、ミトコンドリアは明らかに影響を受けていた。この高い濃度では、調べた細胞のわずか４％が空胞化を示し、クロマチン凝縮は、試験したいかなるペプチド濃度でもこの物質中で見えなかった。これらの結果は、ＬＴＸ−３１５が溶解作用モードで腫瘍細胞を死滅させる、より低い濃度は、細胞に、空胞形成及び変化したミトコンドリア形態などの、超微細構造の変化を受けさせることを実証する。さらに、アポトーシス細胞死を示唆する有意な形態学的変化は観察されなかった。
【０１５７】
別の実験において、ヒトＡ５４７細胞（卵巣黒色腫細胞株）への１０μｇ／ｍｌでのＬＴＸ−３１５の曝露は、ミトコンドリア膜の崩壊をもたらした（図６）。
【０１５８】
２．３ ＬＴＸ−３１５処置は細胞外ＡＴＰ放出をもたらす
ＤＡＭＰは、細胞の損傷時に細胞内供給源から放出される分子である。ＤＡＭＰは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のパターン認識受容体（ＰＲＲ）への結合を介して免疫応答を開始及び永続化できる。一般的に知られているＤＡＭＰは、ＡＴＰ、ＨＭＧＢ１、カルレティキュリン、チトクロムＣ、ミトコンドリアＤＮＡ及び活性酸素種（ＲＯＳ）である。発明者らは次に、ＡＴＰがＬＴＸ−３１５処置細胞から上清中に放出されたかどうかを調べることを望んだ。したがって、処置細胞及び非処置細胞からの上清を、ルシフェラーゼ検出アッセイを用いて分析した。図７に示すように、ＡＴＰは、ＬＴＸ−３１５での処置後５分ほどで上清中に検出され、放出は濃度依存的であった。
【０１５９】
２．４ ＬＴＸ−３１５処置は上清中のチトクロムＣ放出を誘発する
ＬＴＸ−３１５処置細胞が培地中にチトクロムＣを放出するかどうかを評価するために、Ａ３７５細胞を異なる時間で（５、１５、４５分）、３５μΜのＬＴＸ−３１５で処置した。上清を続いて、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて分析した。３５μΜ値で処置した細胞は、未処置対照細胞と比較して、上清中に３倍超のチトクロムＣを有した。チトクロムＣの増加は、処置のわずか５分後に検出され、ペプチド処置の１５及び４５分後にもそれぞれ増加した（図８）。
【０１６０】
２．５ ＬＴＸ−３１５処置は、細胞外ＨＭＧＢ１放出をもたらす
ＨＭＧＢ１は、非ヒストン、クロマチン結合核タンパク質である。受動的に壊死細胞から放出されると、ＨＭＧＢ１は、いくつかの免疫賦活効果の中で樹状細胞の機能的成熟、サイトカイン刺激及び走化性を誘発できる。
【０１６１】
ＨＭＧＢ１は通常、細胞核中に見出され、健常細胞の細胞溶解物に存在することが予想されるが、培地（上清）中にはない。ＬＴＸ−３１５処置細胞からのＨＭＧＢ１の放出を評価するために、発明者らは、細胞溶解物内の核コンパートメントから細胞上清への移行及び遊離ＨＭＧＢ１を測定した。
【０１６２】
ＬＴＸ−３１５及びＬＴＸ−３２８で処置したＡ３７５黒色腫細胞の細胞溶解物と細胞上清の両方を、ウェスタンブロットを用いて分析した。細胞を、３５μΜのＬＴＸ−３１５又はＬＴＸ−３２８のいずれかで処置し、ＬＴＸ−３１５で処置した黒色腫細胞で細胞溶解物から上清への緩やかな移行が検出されたが、模擬配列ペプチドＬＴＸ−３２８又は無血清培地のみで処置した細胞では検出されなかった（図９）。
【０１６３】
２．６ ＬＴＸ−３１５処置はＡ３７５黒色腫細胞中で活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を引き起こす
ＬＴＸ−３１５処置後のＲＯＳ生成を、ＣＨ２ＤＣＦＤＡ蛍光定量アッセイによって測定した。著しい量のＲＯＳが、ＬＴＸ−３１５とのインキュベーションの１５分後に発生し、ＲＯＳレベルは濃度依存的であった（図１０）。
【０１６４】
３  考察
蛍光分子パシフィックブルーで標識したＬＴＸ−３１５は、Ａ３７５黒色腫細胞とのインキュベーション後数分以内に内部移行し、細胞質中に分布した（図３）。低濃度では、ミトコンドリア周囲のペプチド蓄積が明らかであったが、より高い濃度では、ペプチドは細胞質内により多く広がり、細胞膜付近に円形構造で蓄積した。ペプチドがミトコンドリア膜を攻撃するならば、ミトコンドリア膜電位の減少又はさらには完全な崩壊が予想される。膜電位依存性ミトコンドリア染色Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ ＣＭＸｈ２ＲＯＳでの細胞の共焦点画像は、ペプチド処置後短時間でミトコンドリアシグナルの喪失を示した（データ示さず）。シグナルの喪失は、ミトコンドリアとのペプチド相互作用が、ミトコンドリアの最も重要な細胞機能に不可欠である、ミトコンドリア膜電位の喪失を引き起こすことを示す。変化したミトコンドリア形態はまた、ＴＥＭを用いても実証された。ＬＴＸ−３１５で６０分間処置した細胞は、未処置細胞と比較して、クリステの組織が変化したより低い電子密度のミトコンドリア、及びミトコンドリア内の空胞化を有した（図６）。さらに、空胞化は、３．５μΜのＬＴＸ−３１５で処置した細胞の約２０％において明らかであった。ミトコンドリアが機能不全である場合、遊離酸素ラジカル（ＲＯＳ）が形成され、蛍光定量アッセイを使用することによって、発明者らはペプチド処置後数分以内のＲＯＳ形成を実証した（図１０）。
【０１６５】
本研究において、発明者らはＬＴＸ−３１５ペプチドでの処置が、処置後のＡ３７５黒色腫細胞でＲＯＳレベルの増大を引き起こすことを実証する。ペプチド処置後のＲＯＳのこれらのより高いレベルについての１つの説明は、ペプチドが細胞に入りミトコンドリアを標的とし、機能不全ミトコンドリアが次いでＲＯＳを放出するというものであり得る。ＥＬＩＳＡアッセイを介して、発明者らは、処置のわずか数分後にペプチド処置細胞の上清中でチトクロムＣの放出を検出した（図８）。チトクロムＣは、ミトコンドリア外膜が乱されたときに膜間腔から細胞質ゾル中に放出されるミトコンドリアタンパク質であり、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子−１（Ａｐａｆ−１）へ結合することにより、それは最終的にアポトーシスによる細胞死をもたらすアポトーシスカスケードの一部でもある。しかしながら、チトクロムＣが細胞外空間で見出される場合は、それは炎症促進性メディエーターとして作用し、ひいてはＮＦ−κＢを活性化しサイトカイン及びケモカイン生成を誘発することが報告されている。細胞区画から細胞外区画へのＨＭＧＢ１の移行を、ウェスタンブロットを用いて検出した（図９）。核タンパク質ＨＭＢＧ１は細胞外液中に放出されると、ＤＡＭＰとして機能し、ＰＲＲ  ＴＬＲとＲＡＧＥ受容体の両方に結合できる。これらの活性化は、炎症促進性サイトカインの転写などのいくつかの炎症反応をもたらし得る。発明者らはまた、ペプチドインキュベーション後に上清中に放出されるＡＴＰを検出し（図７）、細胞外でそれが、ＤＣ上のプリン性Ｐ２ＲＸ７受容体を活性化することによりＤＡＭＰとして機能することを提示した。この受容体は、ＡＴＰへの結合後に小さなカチオン及び後により大きな分子のために開く孔として機能するだけでなく、その活性化はまた、炎症促進性サイトカインＩＬ−１βのプロセシング及び放出を引き起こす。
【０１６６】
要約すると、発明者らのデータは、ＬＴＸ−３１５が、原形質膜上の直接攻撃だけでなく、原形質膜の完全性を即時に喪失させるには低すぎる濃度でのペプチドの内部移行後の健常な細胞内小器官への損傷の結果として、癌細胞で溶菌細胞死を誘発することを示唆する。発明者らは、ペプチド処置がＣｙｔＣ、ＡＴＰ、ＨＭＧＢ１及びＲＯＳなどのいくつかのＤＡＭＰの放出を引き起こすことを実証する。ＤＡＭＰは、いくつかの方法で損傷細胞の細胞完全性に影響を与える可能性があるが、いわゆる免疫原性細胞死にも関連している。細胞外コンパートメントへの腫瘍特異的抗原の放出は、ＡＴＰ、ＣｙｔＣ及びＨＭＧＢ１などの強力な免疫刺激分子（ＤＡＭＰ）と共に、強力な免疫応答を与えることができる。今度は、これらの因子が、ＤＣ及び適応免疫系の他のアクセサリー細胞の成熟並びに活性化をもたらす。
【０１６７】
実施例３
ＬＴＸ−４０１は黒色腫細胞中でＤＡＭＰ放出を誘発する
本研究において、発明者らは、癌細胞株中で細胞死を誘発するアミノ酸誘導体ＬＴＸ−４０１の能力、及びマウス黒色腫モデルにおいて退縮を誘発する能力を調べた。作用様式のインビトロ研究は、処置細胞での大規模な細胞質空胞化及び損傷されたリソソームが先行する、溶解細胞死及び危険関連分子パターン分子の放出を明らかにした。マウス黒色腫モデルの使用は、ＬＴＸ−４０１の腫瘍内注射で処置された動物の大部分が完全なかつ長期的な寛解を示したことを実証した。まとめると、これらの結果は、固形腫瘍の処置のための免疫療法剤としてのＬＴＸ−４０１の可能性を実証する。
【０１６８】
１  材料及び方法
１．１  試薬
ＬＴＸ−４０１（Ｍｗnet＝３６７．５３）は、要求に応じて、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａ ＡＳ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）によって合成された。化学構造を図１１に示す。
【０１６９】
１．２  細胞培養
ラット肝細胞癌ＪＭ１、いずれもヒト肝細胞癌であるＨｅｐＧ２及びＢＥＬ７４０２は、オスロ大学病院移植医学部のＤｒ．Ｐａｌ−Ｄａｇ Ｌｉｎｅディレクターの厚意により提供された。Ｂ１６Ｆ１（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−６３２３）、マウス皮膚悪性黒色腫、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ（ＨＴＢ−１２９）、乳癌転移に由来するヒト悪性黒色腫、Ｍａｌｍｅ−３Ｍ（ＨＴＢ−６４）、肺転移由来のヒト悪性黒色腫、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１７１）、正常ヒト肺線維芽細胞、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２１３７）、骨髄転移由来のヒト神経芽細胞腫細胞株、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−３８）、ヒト結腸直腸腺癌及びＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１７３０）、ヒト血管内皮細胞株は全て、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ−ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入した。ヒトのケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔは、Ｔｒｏｍｓｏ大学の宿主微生物相互作用学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）のＤｒ．Ｉｎｇｖｉｌｄ Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎの厚意により提供された。ヒト由来の悪性黒色腫細胞株Ａ３７５は、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ（ＰＨＥ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，Ｐｏｒｔｏｎ，Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ）から購入した。ＪＭ１、Ａ３７５、ＢＥＬ７４０２、ＨｅｐＧ２及びＢ１６Ｆ１は全て、ＤＭＥＭ（高グルコース）からなる培地中で維持され、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＨＴ−２９及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓは、２ｍＭのＬ−グルタミン及び重炭酸ナトリウムを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。Ｍａｌｍｅ−３Ｍは、４ｍＭのＬ−グルタミン及び２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含有するＲＰＭＩ−１６４０中で培養した。最後に、３つの非悪性細胞株ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ、ＭＲＣ−５及びＨａＣａＴをそれぞれ、基礎培地及び増殖因子を含有するＥＧＭ−２ Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ，ＭＡ）、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１％非必須アミノ酸も含有するＭＥＭ（正常グルコース）並びに２ｍＭＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭ（正常グルコース）を用いて培養した。溶液中２％ＦＢＳの最終濃度を得るために１０ｍｌのＦＢＳのアリコートで送達されるＥＧＭ−２ Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔを除いて、全ての培地に（特に断らない限り）１０％ＦＢＳを補充した。
【０１７０】
１．３  インビトロ細胞傷害性、ＭＴＴアッセイ
ＭＴＴアッセイを用いて、癌及び非悪性細胞株の両方の選択に対するＬＴＸ−４０１のインビトロ細胞傷害性を調べた。前培養した細胞を、１×１０4〜１．５×１０4細胞／ウェルの密度で播種し、実験をＣａｍｉｌｉｏ Ｋ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１４，６３：６０１〜１３で以前に記載されたように行った。結果を、それぞれ３連のウェルで、３回の実験の平均値を用いて計算し、５０％阻害濃度（ＩＣ50）として表した。
【０１７１】
１．４  死滅動態
ＬＴＸ−４０１の死滅動態を、それぞれ５４μΜ及び１０８μΜに対応する２×ＩＣ504hと４×ＩＣ504hの両方の値を使用して、Ｂ１６Ｆ１黒色腫細胞に対して研究した。細胞を、前にＭＴＴアッセイについて記載しされるように播種し、５、１５、３０、６０、９０、１２０及び２４０分間ＬＴＸ−４０１溶液とインキュベートした。細胞を、インキュベーション後に１００μｌの無血清ＲＰＭＩ−１６４０で１回洗浄し、さらに２時間、１０％のＭＴＴ溶液（無血清ＲＰＭＩ−１６４０で希釈した）中でさらにインキュベートした。
【０１７２】
１．５ ＴＥＭ電子顕微鏡
Ｂ１６Ｆ１細胞を、２ｍｌの培地容量中１×１０4細胞の密度で３５ｍｍ滅菌組織培養皿に播種し、３７℃にて、９５％超の湿度及び５％ＣＯ2条件で、細胞インキュベーター中で接着及び増殖させた。培養細胞が許容されるコンフルエンス（約８０〜９０％）に達した時、それらを異なる時間（５、１５、３０及び６０分間）、４×ＩＣ504h値のＬＴＸ−４０１（１０８μΜ）とインキュベートし、続いて０．０５％のマラカイトグリーンシュウ酸塩（Ｓｉｇｍａ）、０．５％のグルタルアルデヒド（ＧＡ，Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び４％のホルムアルデヒド（ＦＡ、電子顕微鏡科学）を含有するＰＨＥＭ緩衝（０．１Ｍ）溶液中で固定した。マラカイトグリーンは、試料処理と一般的に関連する脂質抽出を減少させるために、一次固定への添加剤としてより頻繁に使用されている。試料調製を数日から数時間に低減するので、従来のベンチ・プロトコルよりも有利であると考えられる新たに導入された方法であるＰＥＬＣＯ Ｂｉｏｗａｖｅ Ｐｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ社）を用いて、試料をすぐに添加し、一括処理した。全てのマイクロ波手順については、試料を５０℃カットアウト温度で、２３℃にてマイクロ波照射した。マラカイトグリーン／ＧＡ／ＦＡとオスミウム還元フェロシアン化物（０．８％のＫ3Ｆｅ（ＣＮ）6／１％のＯｓＯ4）の両方の固定工程は、真空で、２分オン、２分オフ（１００Ｗ）の「電源オン／オフ」サイクルで実行した。試料を、各工程の間に０．１Ｍ ＰＨＥＭ緩衝液で４回すすぎ（２５０Ｗで４０秒間、２回のベンチリンス及び２回の最終リンス）、その後、真空で、１分間オン、１分間オフ（１５０Ｗ）の「電源オン／オフ」サイクル下で、１％タンニン酸（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＰＡ，ＵＳＡ）及び１％水性酢酸ウラニル（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＰＡ，ＵＳＡ）で染色した。試料を、２５０Ｗ（真空オフ）で水中にて２回マイクロ波照射することに加えて、前に記載されるように各染色手順の間にすすいだ。試料の脱水は、段階的エタノール系列（２５％、５０％、７０％、９０％及び１００％）を通して生じ、各グレードで４０秒間２５０Ｗでマイクロ波照射し（真空オフ）、その後５０％エポン樹脂（ＡＧＡＲ、ＤＤＳＡ、ＭＮＡ及びＤＮＰ−３０）で、並びに２つの最終浸透工程については１００％に増加して、２５０Ｗでそれぞれ３分間（真空サイクル；２０秒オン、２０秒オフ）一括して浸漬した。試料を次いで６０℃で一晩重合させた。超薄切片（７０ｎｍ）を調製し、標準ホルムバール、炭素安定化銅グリッド上に置いた。次に、試料をＪＥＯＬ ＪＥＭ−１０１０透過型電子顕微鏡で検査し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＭｏｒａｄａサイドマウントＴＥＭ ＣＣＤカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ ｓｏｆｔ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像を取得した。
【０１７３】
１．６  ハイモビリティグループボックス１（ＨＭＧＢ１）の放出
Ｂ１６Ｆ１細胞を、６ウェルプレート中の完全培地に２×１０5細胞／ウェルの密度で播種し、一晩接着させた。細胞を１０８μΜのＬＴＸ−４０１（４×ＩＣ504h）で処置し、異なる時間（１０、３０、６０、９０及び１２０分間）、３７℃（９５％超の湿度及び５％ＣＯ2）でインキュベートした。無血清ＲＰＭＩ−１６４０を陰性対照として使用し、上清（Ｓ）を収集し、５分間１，４００ｇで遠心分離し、その後Ｕｌｔｒａｃｅｌ−５０膜（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ，Ｎｏｒｗａｙ）と共にＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−０．５遠心フィルターユニット（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔｓ）を用いて濃縮アップした。細胞溶解物（Ｌ）を２ｍＬの無血清ＲＰＭＩ−１６４０で洗浄した後に収集し、２×ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎｏｒｗａｙ）、１×ＮｕＰＡＧＥ試料還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｎｏｒｗａｙ）及び５０％滅菌水を含有する溶解緩衝液（ｍａｓｔｅｒｍｉｘ）に供した。上清と溶解物の両方を１０分間７０℃で煮沸し、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｎｏｒｗａｙ）上で分離し、その後ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気移動させた。膜を、ＴＢＳ−Ｔ中５％無脂肪乾燥ミルクを用いて１時間ブロッキングし、次にＨＭＧＢ１抗体（ＨＭＧＢ１に対するウサギポリクローナル、ＣｈＩＰグレード、Ａｂｃａｍ，ＵＫ）と一晩４℃でハイブリダイズさせ、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体（ヤギポリクローナル抗ウサギＩｇＧ，Ａｂｃａｍ，ＵＫ）と室温でさらに２時間ハイブリダイズさせた後に、ＷＢルミノール試薬（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して発色させ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ ４０００及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて画像化／スキャンした。
【０１７４】
１．７  チトクロムｃの放出
Ｂ１６Ｆ１細胞を、ＭＴＴアッセイについて前に記載されるように、９６ウェル培養プレート上にプレーティングした。細胞を、指定した時間（３０、６０、９０、１２０及び２４０分間）１０８μΜ（４×ＩＣ504h）で処置し、対照細胞は、実験の終点まで無血清ＲＰＭＩ−１６４０単独中で保存した。上清を収集し、無血清ＲＰＭＩ−１６４０中で１／５希釈し、その後製造業者の指示に従って、ラット／マウスのチトクロムｃのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を使用して評価した。チトクロムｃの濃度を、提供される標準曲線上の補間値により計算した。
【０１７５】
１．８  ＡＴＰの放出
Ｂ１６Ｆ１細胞を、ＭＴＴアッセイについて前に記載されるように播種し、異なる時間（１０、３０、６０、９０及び１２０分間）２×ＩＣ504h値のＬＴＸ−４０１（５４μΜ）で処置した。無血清ＲＰＭＩ−１６４０処置細胞は、それぞれ陰性対照及びブランク対照として機能した。ＡＴＰの細胞外レベルを、ルシフェリンベースのＥＮＬＩＴＥＮ ＡＴＰアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて実験の終了時に測定し、その際、ＡＴＰ駆動型化学発光を、発光マイクロプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ（登録商標），Ｆｉｎｌａｎｄ）で記録し、相対的光単位（ＲＬＵ）として表した。
【０１７６】
１．９  リソトラッカー（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ）
フローサイトメトリー：Ｂ１６Ｆ１細胞を６ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。細胞をその後６０分間、１×ＩＣ504hのＬＴＸ−４０１（２７μΜ）で処置し、４０ｎＭのリソトラッカーＤＮＤ−２６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を最後の５分で添加した。未処置細胞を対照として使用した。細胞をトリプシン処理し、ＦＡＣＳキャリバーフローサイトメーター上で調査し、結果をＦＬｏｗＪｏソフトソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いて処理した。損傷した原形質膜を有する細胞をゲーティングから外すために、ＰＩをいくつかの実験で利用した。
【０１７７】
共焦点顕微鏡：Ｂ１６Ｆ１細胞を、１×１０4細胞／ウェルで８ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に播種し、一晩接着させた。次に、細胞を６０分間２７μΜのＬＴＸ−４０１で処置し、５分間ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ ＤＮＤ−２６で標識し、核染色のためＨｏｅｃｓｈｔ３３３４２を用いた。細胞を、制御された温度及び雰囲気にて直ちにＺｅｉｓｓ共焦点顕微鏡で調べた。
【０１７８】
１．１０  統計解析
結果を、少なくとも２つの独立した実験の平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）又は標準偏差（ＳＤ）として示す。ＭＴＴアッセイを３つ並行して２回行い、チトクロムｃアッセイを２つ平行して２回行い、ＡＴＰアッセイを２つ平行して３回行った。チトクロムｃ放出データ及びＡＴＰ放出データを、一方向ＡＮＯＶＡ及び多重比較検定を用いて比較し、発明者らは０．０５以下のｐ値が統計学的に有意であるとみなした。
【０１７９】
２．  結果
２．１ ＬＴＸ−４０１は細胞死を急速に誘発する
本研究では、ＬＴＸ−４０１は、インビトロでいくつかの腫瘍細胞株の生存率を効果的に低下させた（データ示さず）。ＬＴＸ−４０１は、ヒト悪性黒色腫細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ（１３．５μΜ）に対して最高の細胞傷害活性を示し、ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２（３５．４μΜ）に対して最低の活性であった。残りの細胞株について、ＬＴＸ−４０１は、１９〜３２μΜの範囲内でわずかに変化する類似のＩＣ50値を示した。
【０１８０】
動態実験を行ってＢ１６黒色腫細胞に対するＬＴＸ−４０１の細胞傷害活性の時間経過を決定した。２×ＩＣ504h及び４×ＩＣ504hのＬＴＸ−４０１を表す２つの異なる濃度、すなわちそれぞれ５４μΜ及び１０８μΜを用いて、用量依存的効果を評価した。初期のパイロット研究によって明らかにされたように、より低い濃度はそのようなモダリティを誘発できなかったので、これらの２つの濃度をまた、インビトロ実験の大部分に、特にＤＡＭＰの放出を研究する時に使用した。
【０１８１】
ＬＴＸ−４０１（１０８μΜ）は迅速な死滅動態を示し、１５分後に５０％の死滅率、それに続いて処置の開始後２時間でほぼ１００％の細胞死を示した。対照的に、５４μΜのＬＴＸ−４０１とインキュベートされた細胞は、細胞生存率の緩やかな阻害をたどり、２時間後に５０％の細胞生存率であった（図１２）。
【０１８２】
２．２ ＬＴＸ−４０１処置は黒色腫細胞で超微細構造の変化を引き起こす
ＬＴＸ−４０１の細胞傷害活性の基礎をなす作用機序をさらに調べるために、Ｂ１６Ｆ１細胞を４×ＩＣ504hのＬＴＸ−４０１（１０８μΜ）とそれぞれ５分間及び６０分間インキュベートした。未処置細胞を対照とし、実験の終点（６０分）まで無血清ＲＰＭＩ−１６４０中で培養した。インキュベーション後に、全ての細胞をＴＥＭ研究用に固定し調製した。未処置Ｂ１６Ｆ１細胞のＴＥＭ画像は、原形質膜上の頻繁な微絨毛状突起により特徴付けられる粗い表面を明らかにした（図１３ａ、ｂ）。細胞質は、いくつかの電子密度の高いミトコンドリア、並びに視覚的に平滑なＥＲ及びゴルジ装置からなった（図１３ａ、ｂ）。ＬＴＸ−４０１処置細胞の大部分は、５分後にそれらの表面形態を失い、細胞の大部分は、細胞質のわずかな空胞化を除いて顕著な変化はなかった（図１３ｃ）。インキュベーションの６０分後に、処置した培養物は、高度に空胞化した細胞と大きな非空胞化細胞の両方を含む、細胞の不均一な集団を示した（図１３ｅ）。原形質膜の完全性の喪失及び細胞構成成分の漏れにより明らかにわかるように、細胞の大部分は壊死した（図１３ｅ、ｆ）。クロマチン構造は、いくつかの細胞でわずかに凝縮されたが、程度の差はあるもののＬＴＸ−４０１処置によって影響されなかった。さらに、より高い倍率は、対照（図１３ｇ）と比較して、ＬＴＸ−４０１処置細胞（図１３ｈ）の大部分のミトコンドリアでの顕著な超微細構造変化を示さなかった。６０分間処置した細胞（図１３ｈ）は、ある程度のミトコンドリアの膨潤を有するものの、無傷の内側と外側のミトコンドリア膜を示した。全体的に、これらの観察は、ＬＴＸ−４０１が、細胞腫脹、ミトコンドリアの膨張及び細胞質の空胞化を伴い、溶解性作用機序により死滅させることを実証する。
【０１８３】
２．３ ＬＴＸ−４０１処置は黒色腫細胞でＤＡＭＰの放出をもたらす
次に、発明者らは、ＤＡＭＰの放出を誘発するＬＴＸ−４０１の能力を特徴づけることを望んだ。ＨＭＧＢ１は、非ヒストン核タンパク質であり、細胞外に放出されると、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）又は終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）に結合することによってＤＡＭＰとして作用できる。Ｂ１６Ｆ１細胞から細胞培養上清へのＨＭＧＢ１の放出を、ウェスタンブロット分析により評価した。ＨＭＧＢ１の移行が検出され、ＨＭＧＢ１の放出は処置の３０分後に生じた。溶解物中のタンパク質の完全留置によりわかるように、非処置対照細胞は、上清中へのＨＭＧＢ１の放出を示さなかった（図１４ａ）。
【０１８４】
チトクロムｃは、ミトコンドリア由来のＤＡＭＰと考えられ、細胞外チトクロムｃは、ＮＦ−κＢの活性化及び炎症促進性サイトカインの放出を誘発することが報告されている。ＬＴＸ−４０１がＬＴＸ−４０１処置Ｂ１６Ｆ１細胞からのチトクロムｃの放出を誘発できるかどうかを調べるために、ＥＬＩＳＡアッセイを利用して、処置後の細胞培地中のチトクロムｃの量を測定した。定量分析は、処置の１２０分後に４×ＩＣ504h値のＬＴＸ−４０１（１０８μΜ）でのＬＴＸ−４０１処置後の上清中のチトクロムｃの存在を実証した（図１４ｂ）。チトクロムｃの放出は、時間をかけて徐々に増加し、実験の終点で約４０ｎｇ／ｍｌのピークに達した（図１４ｂ）。
【０１８５】
ＡＴＰは、従来の化学療法に屈した癌細胞を含む、死んでいく細胞及び／又はストレスを受けた細胞から放出される時に、免疫原性を有することが報告されている。ＬＴＸ−４０１がＢ１６Ｆ１細胞からのＡＴＰ放出を誘発できるかどうかを調べるために、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系反応アッセイを使用した。ＡＴＰの細胞外濃度は、処置開始後６０分で急速に上昇し、１２０分に向かって徐々に増加した（図１４ｃ）。
【０１８６】
２．４  ＬＴＸ−４０１での処置は黒色腫細胞でリソソーム完全性の喪失を誘導した
次に、発明者らは、ＬＴＸ−４０１がリソソーム完全性に何らかの変化を引き起こすかどうかを調べることを望んだ。フローサイトメトリー及び共焦点顕微鏡で示されるように、ＬＴＸ−４０１での処置は、好酸性染料リソトラッカーＤＮＤ−２６からのシグナルの喪失をもたらした。この染料は、リソソーム及びメラノソームなどの酸性オルガネラ中に蓄積する。同様の結果がリンパ腫細胞でも得られたので、この効果は、細胞型特異的ではないことが示された（データ示さず）。フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡の両方によって示されるように、２７μΜのＬＴＸ−４０１は、インキュベーションの６０分後に、Ｂ１６Ｆ１黒色腫細胞でシグナルを減少させた。
【０１８７】
３  考察
免疫監視を回避する癌細胞の能力は、癌の新たな特質として最近認められている。免疫原性細胞死（ＩＣＤ）は、危険関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）と呼ばれる免疫増強分子の放出として定義され、従って癌細胞に対する免疫応答を確立する上で重要である。ＩＣＤを誘導するいくつかの細胞増殖抑制化合物の能力に起因して、免疫系が従来の処置への応答として、癌撲滅に重要な役割を果たしていることも示されている。ＩＣＤはさらに、抗癌治療の長期的な成功のための決定要因として示唆されている。腫瘍溶解性療法は、癌細胞をその場で溶解しその後のＤＡＭＰの放出を伴う、固形腫瘍に対する新しい有望な治療的アプローチである。
【０１８８】
最近設計されたアミノ酸誘導体ＬＴＸ−４０１は、抗癌活性を示すことが報告されている。本研究では、発明者らは、ＬＴＸ−４０１が、Ｂ１６黒色腫を含む様々な癌細胞株に対して抗癌活性を発揮することを実証する。発明者らは以前に、ウシラクトフェリシン（ＬｆｃｉｎＢ）誘導体についての構造活性相関研究（ＳＡＲ）に基づきα−ヘリカルコイル構造をとる可能性を有するより短いペプチドを設計した。これらのペプチドは、インビトロ及びインビボの両方で、天然に存在するＬｆｃｉｎＢ（２５ｍｅｒ）よりも効果的に癌細胞を死滅させることが示されている。ＳＡＲ研究は、芳香族セクターの大きさ、ひいては全体的なより高い疎水性が、ペプチドの抗癌活性を増強する重要な因子であることを明らかにした（図１１）。
【０１８９】
経時的にＢ１６Ｆ１黒色腫細胞に対する異なる濃度のＬＴＸ−４０１の影響を研究するために、動態実験を行った。動態研究に用いた濃度は、２×ＩＣ504h値及び４×ＩＣ504h値であった。細胞の生存は、４×ＩＣ504h値（１０８μΜ）を使用して９０〜１２０分後に最小値に低下した（図１２）。これとは対照的に、一般的に使用される化学療法剤は、重要な抗癌効果を発揮するために、より長いインキュベーション期間を必要とする。
【０１９０】
ＬＴＸ−４０１処置癌細胞の形態学的変化を研究するために、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）研究を行った。これらの研究は、処置されたＢ１６Ｆ１細胞の表面形態の早期喪失及び細胞質のわずかな空胞化を明らかにした（図１３ｃ、ｄ）。細胞の大きさの増加もまた、ＬＴＸ−４０１処置の開始直後に明らかであった。処置される細胞のインキュベーション期間を延長すること（６０分まで）により、ＴＥＭ画像は空胞化の増加を示し、細胞膜の完全性の喪失及びその後の細胞内容物の細胞外環境への漏れをもたらす溶解作用機序によって細胞が死滅することを明らかにした（図１３ｅ、ｆ）。
【０１９１】
細胞質物質を含有する小胞の形成は、異なる細胞小器官にＬＴＸ−４０１により与えられる急性の細胞内ストレスに細胞が応答する過渡状態を構成し得る。ミトコンドリアは、実験の終点（６０分）で膨潤する証拠を示しながら、処置後５分では正常な形態を示した。Ｂ１６細胞株由来の細胞株は、スピンドル形状の細胞と上皮様細胞の両方の異種集団からなることが知られている。これらの異なる表現型は、ＬＴＸ−４０１を含む抗癌物質での処置に対しておそらく別々に応答でき、このことは処置細胞の異種形態を部分的に説明できる。
【０１９２】
免疫原性細胞死（ＩＣＤ）の概念が導入されたとき、癌細胞死のモードは、放射線療法及びいくつかの一般的に使用される化学療法レジメンを含む、選択された抗癌療法の結果及び成功を決定するのに重要な役割を果たしていと認識された。強力な抗腫瘍免疫応答の活性化は、表面に露出されるカルレティキュリン（ＣＲＴ）、分泌されるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び受動的に放出されるハイモビリティグループボックス１（ＨＭＧＢ１）を含む、死んでいく細胞及び／又はストレスを受けた腫瘍細胞からのＤＡＭＰの放出に至る細胞性の及び生化学的な一連の事象に依存することが示された。これらの３つの分子は、ＩＣＤの特徴と考えられる。それらのそれぞれの受容体と相互作用する時に、ＤＡＭＰは、腫瘍抗原と共に、腫瘍床への樹状細胞（ＤＣ）の動員及び活性化を調整でき、後に流入領域リンパ節へ戻って腫瘍特異的ＣＤ８+Ｔ細胞を活性化できる。本研究では、ＬＴＸ−４０１でインビトロ処置したＢ１６Ｆ１黒色腫細胞を、それぞれルシフェラーゼアッセイ及びウェスタンブロット分析を用いて、ＡＴＰ及びＨＭＧＢ１の放出についてスクリーニングした。これらの実験は、ＬＴＸ−４０１処置がＢ１６Ｆ１細胞でＨＭＧＢ１及びＡＴＰの放出を誘発したことを明らかにした（図１４ａ、ｃ）。細胞内区画から上清へのＨＭＧＢ１の移行は、ＬＴＸ−４０１で処置したＢ１６Ｆ１細胞において明らかであった。ポストアポトーシス細胞及び／又は壊死細胞からのＨＭＧＢ１の細胞外放出は、炎症性白血球の誘引並びにＴＮＦ−α及びＩＬ−６などの炎症促進性サイトカインの刺激により、抗腫瘍形成性環境を維持し増強できる。加えて、ＨＭＧＢ１は、ＤＣの成熟で重要な役割を果たし、プロセシング及びナイーブＴ細胞への腫瘍抗原の提示の両方に有利に働き、それによって先天性免疫応答と適応抗腫瘍免疫応答の間の関係を確立する。
【０１９３】
ＡＴＰが腫瘍細胞によって細胞外環境中に放出又は分泌されると、それは腫瘍床への免疫細胞の動員を促進するのに役立つプリン受容体に作用する。さらに、ＤＣ上のＰ2Ｘ7受容体に結合すると、ＡＴＰは、ＮＬＲＰ３インフラマソームのアセンブリを刺激し、腫瘍特異的ＣＤ８+Ｔ細胞を生成するＩＦＮ−γのプライミングに必要なサイトカインであるＩＬ−Ｉβの生成及び放出を最終的にもたらす一連の下流の事象を開始する。ＡＴＰは、実験期間中に増加しながらＢ１６Ｆ１から放出された。
【０１９４】
ミトコンドリアＤＡＭＰ（ｍｔＤＡＭＰ）は、ＡＴＰ、ミトコンドリアＤＮＡ、ホルミルペプチド、酸化カルジオリピン及びチトクロムｃを含む。ミトコンドリアは細菌に著しく似ているので、これらの分子は強力な免疫賦活剤であると考えられる。チトクロムｃは、アポトーシス細胞死の間の初期のイベントの１つを特徴づけ、ミトコンドリア膜間スペースからサイトゾルへのその放出はアポトソームのアセンブリ及びプロカスパーゼ９の活性化を制御し、ひいては細胞内危険シグナルのように作用する。チトクロムｃの放出はまた、壊死に屈した細胞から生じることも報告されている。さらに、細胞外チトクロムｃは、ＮＦ−κＢの活性化並びに他の炎症性サイトカイン及びケモカインの放出を誘発する。チトクロムｃの血清レベルの上昇は、ＳＩＲＳ患者で観察されており、生存不良と関係付けられる。チトクロムｃのＥＬＩＳＡアッセイを、ｍｔＤＡＭＰを放出するＬＴＸ−４０１の性能評価の手助けをするために実施した。ＬＴＸ−４０１での処置がインビトロでＢ１６Ｆ１黒色腫細胞からのチトクロムｃの細胞外放出を誘発することが示された（図１４ｂ参照）。興味深いことに、ＴＥＭ顕微鏡写真は６０分後にＢ１６Ｆ１細胞の溶解を確認したが、チトクロムｃの放出は１２０分後まで対照と著しく違わず、このことはミトコンドリアがまだ多少無傷で、細胞溶解後しばらくの間そのチトクロムｃを保持し続けることを示し得る。
【０１９５】
電子顕微鏡研究は、Ｂ１６Ｆ１細胞中のミトコンドリアが最初はＬＴＸ−４０１処置によって影響を受けず、チトクロムｃ放出のタイミングはミトコンドリアの溶解が細胞の溶解のため二次的に起こることを示唆し得るという概念を支持する。Ａｕｓｂａｕｃｈｅｒらによる以前の作用機序研究はこれらの知見を支持しており、ＴＭＲＥによって測定した場合にＬＴＸ−４０１はミトコンドリア膜電位を損なわなかった。
【０１９６】
しかしながら、ＬＴＸ−４０１は両親媒性構造を有する小分子であり、そのため原形質膜をバイパスする可能性を有し、続いて細胞内構造を標的とする。発明者らはしたがって、関係する他の潜在的な細胞内標的を調べることを望んだ。酸性オルガネラに対するＬＴＸ−４０１処置の効果を、リソソーム色素リソトラッカーＤＮＤ−２６の使用によって評価し、生細胞の共焦点画像は、ＬＴＸ−４０１処置が、全体的な形態学的変化が起きる前でさえ、好酸性色素リソトラッカーの蛍光を著しく変化させたことを示した。この観察は、同じ濃度及びインキュベーション時間でフローサイトメトリー分析を用いて確認された（データ示さず）。蛍光の喪失は、細胞中の酸性オルガネラが処置により損なわれることを示す。そうであっても、Ｂ１６Ｆ１細胞はまた、酸性リソソーム関連オルガネラであるメラノソームを有している。その結果、発明者らは、非メラニン細胞株（Ａ２０、マウスリンパ腫）で実験を繰り返し、同様の結果を得た（データ示さず）。これらの知見は、リソソームがＬＴＸ−４０１の細胞内標的の１つであることを示唆する。
【０１９７】
免疫療法は、腫瘍細胞に対する特異的Ｔ細胞応答を開始することを意図する。黒色腫に対する腫瘍内免疫療法は有望なアプローチであり、いくつかの前臨床及び臨床試験がエキサイティングな結果を報告している。発明者らの研究において、小さい溶菌アミノ酸誘導体ＬＴＸ−４０１の抗癌効果及び作用機序を検討した。ＡＴＰ、ＨＭＧＢ１及びチトクロムｃなどのＤＡＭＰの放出によって示されるように、ＬＴＸ−４０１で処置された黒色腫細胞は、免疫原性細胞死の特徴を示した。さらに、ＬＴＸ−４０１は、非常に侵襲性でかつ免疫原性の乏しいマウスＢ１６黒色腫の完全な退縮を誘発した。結論として、発明者らの結果は、有望な免疫療法剤としてのＬＴＸ−４０１の可能性を実証する。
【０１９８】
実施例４
ＬＴＸ−３１５はマウス黒色腫モデルにおいてＴ細胞クローン性を増加させる
１．材料及び方法
本研究は、Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）による「ｉｍｍｕｎｏＳＥＱ（商標）」Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパートリー特性評価プラットフォームを用いて行った。このプラットフォームは、高度に最適化されたプライマーセットを有する新規なマルチプレックスＰＣＲ１と、ＴＣＲ遺伝子のみを標的にするディープシーケンシング技術を兼ね備える。ｉｍｍｕｎｏＳＥＱプラットフォームは、研究者が例外的な深度及び特異性で適応免疫系を分析するのを可能にする。
【０１９９】
ほとんどのＴＣＲシーケンスは、個体における１つ又は少数の細胞でのみ見出される。しかしながら、免疫記憶の形成時に、細胞はクローン増殖を受ける。その結果、増殖及び記憶細胞への変換後に、過去の病原体に対する受容体配列が数千の細胞に存在し得る。受容体配列の大きな潜在的多様性は、ほとんどの場合、ヌクレオチドが同一の配列はクローン増殖を介することを除いて、細胞間で共有されないことを意味する。
【０２００】
観察される配列に寄与するインプット細胞の正確な数を定量することにより、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱアッセイは、研究者が、高度に増殖したクローンの特徴及びまた低頻度（特有の）細胞の特徴を分析するのを可能にする。
【０２０１】
１．１  腫瘍処置
マウスＢ１６黒色腫細胞を収集し、洗浄し、１０匹のマウスに皮内注射した。腫瘍注射後８日目に、５匹のマウスに１回又は２回、ＬＴＸ−３１５（１．０ｍｇのＬＴＸ−３１５／５０μｌ生理食塩水）の単回腫瘍内注射を用いて、ペプチド処置を開始した。生理食塩水のみのビヒクル対照（滅菌水中０．９％のＮａＣｌ）を、他の５匹のマウスに投与した。動物を次いで１５日目に安楽死させた。
【０２０２】
１．２ ＴＣＲレパートリーの特性
腫瘍組織（１０ｍｇ）及び全血（１５０〜２００μｌ）を、ＴＣＲレパートリー特性分析のために各マウスから採取した。血液試料は末梢における免疫レパートリーに関する情報を提供し、腫瘍試料はレパートリーの重点的な見解を提供する。
【０２０３】
配列分析を、組織試料に対して調査レベルの解像度で、及び血液試料に対して深いレベルの解像度で、Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）により行った。
【０２０４】
１．３  データ解析
クローン性は、クローン頻度分布の形状を測定することにより、モノクローナル又はオリゴクローナル増殖の程度を定量する。値は０〜１の範囲であり、１に近づく値は、ほぼモノクローナルの集団を示す。図１５は、０．０５（Ａ）及び０．３２（Ｂ）のクローン性を有する集団の例示的な分布曲線を提供する。
【０２０５】
クローン性は、以下の式を用いて計算される：
【０２０６】
【数１】
2019503696.tif 000005
ｐ値を、マン・ホイットニーＵ検定を用いて計算した。
【０２０７】
２  結果
結果の要約を以下の表２に示す。
【０２０８】
【表２】
2019503696.tif 000006
【０２０９】
堅牢なデータセットを、血液中で検出される１００，０００超の分子を用いて作成した。対照と比較して、クローン性（図１６Ａ）、有核細胞あたりのＴ細胞数（図１６Ｂ）及びＴ細胞クローン数（図１７）の有意な増加が、ＬＴＸ−３１５での処置後の腫瘍で見られた（ｐ＜０．０５）。対照と比較して処置後の血液においてクローン性の有意な増加は見られなかったが（図１８、Ｐ＜０．０５）、図１９及び図２０は、処置後に、Ｔ細胞クローンが、腫瘍組織と比較して末梢でより豊富であることを示す。この観察は、図２０においてより顕著である。
【０２１０】
実施例５
ＬＴＸ−３１５は防御免疫応答を誘発する
ＬＴＸ−３１５処置によって治癒された動物は、皮内及び静脈内の両方でのＢ１６腫瘍生細胞の再負荷に対して保護された。まとめると、データは、ＬＴＸ−３１５での腫瘍内処置が、局所腫瘍制御に続く防御免疫応答を提供でき、新しい免疫療法剤としての可能性を有することを示す。
【０２１１】
１  材料及び方法
本研究は、ＣＡＭＩＬＩＯ ＫＡら，ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１４，６３：６０１−１３に記載の通りに行った。
【０２１２】
１．１  試薬
ＬＴＸ−３１５及びＬＴＸ−３２８（Ｋ−Ａ−Ｑ−Ｄｉｐ−Ｑ−Ｋ−Ｑ−Ａ−Ｗ−ＮＨ２）を、要求に応じて、それぞれＢａｃｈｅｍ ＡＧ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及びＩｎｎｏｖａｇｅｎ（Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。ダカルバジン（Ｄ２３９０）、テモゾロミド（Ｔ２５７７）及びシスジアンミン白金(ＩＩ)ジクロリド（Ｐ４３９４）は全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０２１３】
１．２  細胞株
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の皮膚悪性黒色腫Ｂ１６Ｆ１（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−６３２３）、ヒト胎児肺線維芽細胞株ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１７１）及びヒト臍帯静脈内皮細胞株ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１７３０）は全て、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ−ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入した。Ａ３７５（ＥＣＡＣＣ、８８１１３００５）は、患者材料由来のヒト悪性黒色腫であり、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ（ＰＨＥ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ，Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ）から購入した。Ｂ１６Ｆ１及びＡ３７５細胞をＤＭＥＭ（高グルコース）中で培養し、ＭＲＣ−５細胞を、２ｍＭのｌ−グルタミン（全て）及び１％非必須アミノ酸（Ａ３７５のみ）を含有するＭＥＭ（正常グルコース）中で培養した。初代表皮メラニン細胞（ＡＴＣＣ、ＰＣＳ−２００−０１３）を、アダルトメラノサイト増殖キット（ＡＴＣＣ、ＰＣＳ−２００−０４２）を補充したＤｅｒｍａｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣ，ＰＣＳ−２００−０３０）中で培養した。ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃを、ＬｏｎｚａからのＥＧＭ−２ Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔを用いて培養し、全ての増殖培地は、抗生物質を含まず、１０％ＦＢＳを補充した（無血清初代メラノサイトを除いて）。細胞培養を、３７℃にて５％ＣＯ2及び９５％超湿度の加湿雰囲気中で維持し、マイコプラズマと他の病原体（Ｒａｐｉｄ−ＭＡＰＴＭ−２７，Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｅｕｒｏｐａ）の両方又はマイコプラズマ単独のいずれかについて試験した。
【０２１４】
１．３  動物
５〜６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスを、英国のＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから入手した。全てのマウスを、地方及びヨーロッパの倫理委員会のガイドラインに従って病原体を含まない動物施設内のケージに収容した。
【０２１５】
１．４  腫瘍処置
腫瘍細胞を収集し、ＲＰＭＩ−１６４０で洗浄し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹部の右側に皮内（ｉ．ｄ．）注射した（マウスあたり５×１０4個のＢ１６Ｆ１細胞／５０μｌのＲＰＭＩ−１６４０）。触知可能な腫瘍（２０〜３０ｍｍ2）を、生理食塩水中に溶解したＬＴＸ−３１５又はＬＴＸ−３２８（１．０ｍｇのペプチド／５０μｌの生理食塩水）の単回用量で３日間連続して１日１回、ｉ．ｔ．注射し、ビヒクル対照は生理食塩水のみであった（滅菌水中０．９％のＮａＣｌ）。腫瘍の大きさを、電子キャリパーを用いて測定し、楕円の面積として表した[（最大寸法／２）×（最小寸法／２）×Π]。垂直腫瘍寸法の積が１３０ｍｍ2に達した時、又は腫瘍潰瘍が発症した時に、動物を次いで安楽死させた。
【０２１６】
１．５  第２の腫瘍負荷
ＬＴＸ−３１５処置後に腫瘍が完全退縮（ＣＲ）した動物に、それらがＬＴＸ−３１５で治癒された４〜５週間後に、腹部の左手側（最初の腫瘍部位に対して反対側）に第２のｉ．ｄ．腫瘍細胞負荷（５×１０4個のＢ１６Ｆ１細胞）を与えた。このｉ．ｄ．腫瘍再負荷後に生存している動物に、その後、尾静脈を介して第２の腫瘍再負荷を静脈内で（ｉ．ｖ．）（２×１０5細胞）与えた。肺をｉ．ｖ．再負荷後１９日目に摘出した。全てのマウスを、腫瘍の大きさ及び生存について監視した。
【０２１７】
１．６  統計解析
全てのデータは、少なくとも３回の独立した実験を表し、平均値±標準偏差（ＳＤ）又は平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。動物の生存曲線（カプランマイヤープロット）を、ログ・ランク（マンテル・コックス）検定を用いて比較した。発明者らは、ｐ値≦０．０５が統計的有意性を示すとみなした。
【０２１８】
２  結果
ＬＴＸ−３１５での処置が、適応免疫応答を誘発できるかどうかを調べるために、治癒された動物（ｎ＝２５）に、非処置対照動物（ｎ＝６）と共に、ＣＲが達成された４〜５週間後に、最初の腫瘍部位に対して反対側の腹部に５×１０4個の生存腫瘍細胞をｉ．ｄ．で再負荷した。このｉ．ｄ．腫瘍再負荷後ＣＲに達した動物に、後に２回目のｉ．ｖ．再負荷を行った。ＬＴＸ−３１５により治癒された動物の大半は、成長阻害を示し、２５匹中１５匹の動物で腫瘍増殖はなかったが、全ての対照動物は、ｉ．ｄ．再負荷後に腫瘍を発症した（図２１ｃ）。以前にＬＴＸ−３１５のｉ．ｔ．注射によって治癒された動物（ｎ＝７）は、未処置対照動物（ｎ＝７）と比較して、ｉ．ｖ．再負荷後にＢ１６黒色腫に対する全身免疫防御を示した（図２１ｄ、ｅ）。ＬＴＸ−３１５治癒動物（腫瘍病巣の平均数＝１５．８６）は、未処置対照動物（腫瘍病巣の平均数＝１２３．３）と比較して、顕著により低い数の肺腫瘍病巣を示した。さらに、組織学的検査は、以前にＬＴＸ−３１５によって治癒された動物の肺腫瘍病巣が、未処置対照動物のあまり浸潤していない肺腫瘍病巣と比較して、ＣＤ３＋Ｔ細胞で顕著に浸潤されたことを明らかにした（図２１ｆ）。
【０２１９】
特許公報ＷＯ２００７／１０７７４８に示されるように、同様の適応免疫応答が、Ｄ型及びＬ型の溶解性ペプチドＬｆｃｉｎＢ（Ｈ2Ｎ−ＦＫＣＲＲＷＱＷＲＭＫＫＬＧＡＰＳＩＴＣＶＲＲＡＦ−ＣＯＯＨ）、モデル２８（Ｈ2Ｎ−ＫＡＡＫＫＡＡＫＡｂｉｐＫＫＡＡＫｂｉｐＫＫＡＡ−ＣＯＯＨ）、モデル３９（Ｈ2Ｎ−ＷＫＫＷｄｉｐＫＫＷＫ−ＣＯＯＨ）及びＣ１２（Ｈ2Ｎ−ＮＫＡＡＫＫＡｂｉｐＫＡＡＫＡｂｉｐＫＫＡＡ−ＣＯＯＨ）の投与後に観察された。Ｂｉｐ＝ビフェニルアラニン。
【０２２０】
３  考察
インビボでのＬＴＸ−３１５の免疫調節特性が長期防御免疫応答をもたらすかどうかを調べるために、動物を生存腫瘍細胞で再負荷した。全ての以前に治癒された動物は、有意な腫瘍増殖阻害を示し、生存細胞をｉ．ｄ．投与した動物の６０％で腫瘍取り込みは全く観察されなかった（図２１ａ〜ｃ）。癌に対する可能性のある長期的な全身保護及び実験的肺転移モデルでのその効果を調べるために、ｉ．ｄ．再負荷後に生存している動物にＬＴＸ−３１５処置後９ヶ月で、生存Ｂ１６黒色腫細胞をｉ．ｖ．再負荷した。ｉ．ｖ．再負荷された全ての動物は、抗ＣＤ３での免疫標識によって見られるように（図２１ｆ）、再負荷された肺腫瘍病巣へのＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤の量の増加に加えて、未処置対照動物（図２１ｄ、ｅ）と比較してＢ１６黒色腫に対する全身免疫防御を示した。これは、ＬＴＸ−３１５が、Ｔ細胞媒介性抗腫瘍免疫の持続性、ひいては腫瘍の再発及び肺腫瘍病巣に対する長期的な保護と共に、全身抗腫瘍免疫応答を誘発することを示している。ＬＴＸ−３１５の機構は、膜誘導性溶解及びＤＡＭＰの細胞外放出（ＨＭＧＢ１）を介してＢ１６黒色腫に対する長期的な特異的細胞性免疫を誘発することによるものであると考えられる。まとめると、インビトロ及びインビボでの発明者らの観察は、ＬＴＸ−３１５のｉ．ｔ．投与が、腫瘍細胞の細胞膜上のペプチドの直接的な破壊効果によって開始される広範な腫瘍壊死をもたらすことを示している。さらに、ＬＴＸ−３１５の壊死効果は、免疫応答及び腫瘍実質へのＴＩＬの浸潤を刺激するＤＡＭＰの放出をもたらし、これは、持続性の腫瘍免疫防御を誘発することにおけるそれらの可能性のある役割のため、固体Ｂ１６黒色腫の根絶に重要であり得る。
【０２２１】
実施例６
ＬＴＸ−３１５の投与後に作製されるＴ細胞はＴ細胞退縮に重要な役割を果たす
これから、発明者らは、ＬＴＸ−３１５が、多機能性Ｔヘルパータイプ１／タイプ１細胞傷害性Ｔ細胞の頻度を増加させることによって腫瘍の微小環境を急速に再プログラムすることを示す。この増加は、腫瘍退縮において重要な役割を果たしている。
【０２２２】
１．材料及び方法
１．１  化学物質及び細胞培養
細胞培養のための培地及び栄養補助剤をＧｉｂｃｏ−Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手し、Ｌｙｔｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ （Ｔｒｏｍｓｏ，Ｎｏｒｗａｙ）によって提供されたＬＴＸ−３１５を除く化学物質をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手し、プラスチック製品は、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＢＶ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）からのものであった。ＭＣＡ２０５を、１０％ウシ胎児血清、並びに２ｍＭのｌ−グルタミン、１００ ＩＵ／ｍｌのペニシリンＧナトリウム塩、１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１ｍＭの非必須アミノ酸を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。細胞を、５％  ＣＯ2雰囲気下にて加湿インキュベーター中で、３７℃で増殖させた。
【０２２３】
１．２  マウス
マウスを、１２時間の明と１２時間の暗のサイクルで温度制御環境にて特定の病原体を含まない条件下で維持し、食物及び水を自由に与えた。欧州連盟実験動物学協会（ＦＥＬＡＳＡ）ガイドラインに従う動物実験は、ＥＵ指令６３／２０１０に準拠しており、Ｇｕｓｔａｖｅ Ｒｏｕｓｓｙ Ｃａｎｃｅｒ Ｃａｍｐｕｓ（Ｖｉｌｌｅｊｕｉｆ，Ｆｒａｎｃｅ）の倫理委員会によって承認された。７週齢〜１４種齢のマウスを使用した。ＷＴ特異的病原体フリー（ＳＰＦ）Ｃ５７ＢＬ／６ Ｊを、Ｅｎｖｉｇｏ（Ｇａｎｎａｔ，Ｆｒａｎｃｅ）から入手し、Ｇｕｓｔａｖｅ Ｒｏｕｓｓｙ，Ｖｉｌｌｅｊｕｉｆ，フランスで、ＳＰＦ条件下で維持した。
【０２２４】
１．３  腫瘍モデル
マウスに、１×１０6個のＭＣＡ２０５細胞を右脇腹に皮下注射した。腫瘍細胞株を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに接種した。腫瘍表面（最長寸法×垂直寸法）を、日常的にキャリパーによって監視した。腫瘍が２０〜２５ｍｍ2の大きさに達したときに（０日目）、マウスに、３００μｇのＬＴＸ−３１５を３日連続、注射で毎日腫瘍内投与した。Ｔ細胞枯渇実験（図２４）において、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８モノクローナル抗体（ｍＡＢ）（それぞれＧＫ１．５及び５３〜６．７２；マウスあたり２００μｇ）又はそれらのアイソタイプ対照（それぞれＬＴＦ−２及び２Ａ３）を、最初のＬＴＸ−３１５の注入の３及び４日前に腹腔内注射し、７日おきに継続した。インビボでの使用のための全てのｍＡｂを、推奨されるアイソタイプ対照のｍＡｂを使用して、ＢｉｏＸｃｅｌｌ（Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ，ＵＳＡ）から入手した。
【０２２５】
１．４  フローサイトメトリー
腫瘍及び脾臓を、ＬＴＸ−３１５の最初の注射後７日目に摘出した。切除した腫瘍を小片に切断し、２５μｇ／ｍＬのリベラーゼ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂｏｕｌｏｇｎｅ−Ｂｉｌｌａｎｃｏｕｒｔ，Ｆｒａｎｃｅ）及び１５０  ＵＩ／ｍｌのＤＮアーゼ１（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で、３７℃で３０分間消化した。混合物をその後、１００μｍのセルストレーナーを通して継代した。２×１０6個の脾細胞（赤血球溶解後）又は腫瘍細胞を、膜染色前に、精製した抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（９３；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）と４℃で１５分間プレインキュベートした。細胞内染色のために、ＦｏｘＰ３染色キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。死んだ細胞を、生／死修正可能黄色死細胞染色キット（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｙｅｌｌｏｗ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））を使用して除外した。サイトカイン染色のために、細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、１μｇ／ｍｌのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、及びＢＤ Ｇｏｌｇｉ ＳＴＯＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて３７℃で４時間刺激した。抗ＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）及び抗ＴＮＦ−α（ＭＰ６−ＸＴ２２）を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。抗ＣＤ４（ＧＫ１．５）、抗ＣＤ８β（ＹＴＳ１５６７．７）を、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。８色のフローサイトメトリー分析を、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコエリトリンシアニン７、ペリジニンクロロフィルタンパク質−シアニン５．５、アロフィコシアニン−シアニン７、パシフィックブルー又はアロフィコシアニンに結合された抗体を用いて行った。全ての細胞を、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）ソフトウェアを使用して、ＣｙＡｎ ＡＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）フローサイトメーター上で分析した。
【０２２６】
１．５  統計解析
データを、マイクロソフト社のエクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏ．，Ｒｅｄｍｏｎｔ，ＷＡ，ＵＳＡ）及びプリズム５（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて分析した。データを平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表し、Ｐ値をスチューデントｔ検定又は一方向ＡＮＯＶＡ、その後、該当する場合、テューキー（Ｔｕｋｅｙ）検定によって計算した。カプランマイヤー生存曲線の比較を、ログランクマンテル・コックス検定を用いて行った。全ての報告した検定は、両側検定であり、Ｐ値＜０．０５で有意とみなした。
【０２２７】
２  結果
発明者らは、皮下肉腫モデルにおいてＬＴＸ−３１５投与後７日目に形作られた腫瘍微小環境を構成する主要エフェクターの動態を検討した。発明者らは、ＩＦＮγ+（Ｔヘルパー１型、Ｔｈ１）、ＩＬ−１７+（Ｔｈ１７）及び二重陽性ＩＦＮγ+ ＩＬ−１７+（ｐＴｈ１７）ＣＤ４+ＴＩＬ（図２２）、並びに多機能性ＩＦＮγ+ ＴＮＦα+ ＣＤ８+ Ｔ細胞（図２３）の蓄積を観察した。
【０２２８】
ＬＴＸ−３１５媒介性抗癌効果は、ＣＤ４+及びＣＤ８+ Ｔ細胞を枯渇させる抗体が完全に抗腫瘍効果を抑制する限りにおいてＴ細胞依存的であった（図２４）。
【０２２９】
３  考察
この前臨床研究において、発明者らは、ＬＴＸ−３１５が、典型的なアポトーシス又は調節された壊死性細胞死を誘発せずに、制御されていない免疫原性腫瘍細胞死を引き起こすことを見出した。この細胞死の少なくとも一部は、多機能性ＣＤ４+及びＣＤ８+  ＴＩＬの蓄積を促進することを含む。免疫原性作用機序は、Ｔリンパ球の非存在下で抗腫瘍効果が消失されたという事実によって、重要であることが示される。
【０２３０】
実施例７
ＬＴＸ−３１５の投与後の腫瘍へのＴ細胞浸潤の臨床組織学的証拠
１  材料及び方法
患者からのホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織切片を、キシレン及び段階的アルコールで脱パラフィンし、水和し、ＰＢＳで洗浄した。電子レンジでのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）中の抗原回復後に、内因性ペルオキシダーゼを０．３％のＨ2Ｏ2によって１５分間ブロッキングした。切片を、４℃で一晩、一次抗体；ウサギポリクローナル抗ＣＤ３（クローンＡ０４５２ Ｄａｋｏ）又はマウスモノクローナル抗ＣＤ８（ｃｌｏｎｅ ＯＸ８，ａｂ３３７８６，Ａｂｃａｍ）とインキュベートした。二次抗体として、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ＳｕｐｅｒＰｉｃＴｕｒｅポリマー検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はエンビジョンシステムＨＲＰ抗マウス（Ｄａｋｏ）を使用した。一致したアイソタイプ対照を、非特異的バックグラウンド染色の対照として使用した。
【０２３１】
２  結果
図２５〜２９は、転移性黒色腫、悪性黒色腫、ミオ上皮腫、乳癌及びデスモイド腫瘍患者の腫瘍への細胞傷害性Ｔ細胞の浸潤を示す。
【０２３２】
実施例８
ＬＴＸ−３１５処置は二次性及び原発性腫瘍への細胞傷害性Ｔ細胞浸潤をもたらす
１つの腫瘍病巣におけるＬＴＸ−３１５の腫瘍内注射が転移性疾患にも影響を与え得るかどうかを明らかにするために、ラット肉腫モデルにおいて腹腔内腫瘍及び２つの皮下腫瘍を確立した。その後、ＬＴＸ−３１５を皮下病巣の１つに注入し、腫瘍増殖をライブイメージングによって評価した。結果は、ＬＴＸ−３１５の処置が全３つの病巣を根絶し、動物が耐久性のある完全寛解状態に入ったことを示した。
【０２３３】
１  材料及び方法
１．１  動物実験
近交系Ｐｉｅｂａｌｄ Ｖｉｒｏｌ Ｇｌａｘｏ（ＰＶＧ.ＲＴ７ａ，略称ＰＶＧ）系統のラットを、ＰＶＧ．ＲＴ７Ｂ系統（本研究でＰＶＧと略す）と互換的に使用した。これらの系統は、白血球共通抗原（ＬＣＡ／ＣＤ４５）ファミリの１つの無関係なエピトープを除いて同一である。ＰＶＧラットは、Ｈａｒｌａｎ（ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入し、ＰＶＧ．７Ｂラットは、基礎医学科学研究所（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＩＭＢ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ））での自家繁殖から入手した。実験の間、２４０〜２７０ｇの重量の雄ラットを、１２時間の明／暗サイクル及び周囲温度で、気候制御された条件下にてケージ当たり２〜３匹の動物のグループで飼育した。ラットを、標準の齧歯類用固形飼料及び水を自由に利用できるようにして、強化された個別通気ケージ（ＩＶＣ）システムに収容した。動物を、実験手順中に、十分な程度の鎮静及び鎮痛を提供する、２．５％のイソフルランガス（Ｂａｘｔｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ ＡＢ）又はフェンタニル／フルアニゾン（Ｈｙｐｎｏｒｍ；ＶｅｔａＰｈａｒｍａ社）の皮下注射（０．４ｍｌ／ｋｇ）のいずれかで麻酔した。動物を毎日監視し、大きな腫瘍を有するラットをＣＯ2で安楽死させた。実行した全ての手順は、ＦＯＴＳ番号１９５７及び５９１７の下で行われ、ノルウェー農業省の実験動物委員会によって承認され、実験及び他の科学的な目的のために使用される脊椎動物の保護のための欧州条約を遵守した。実験動物施設は、日常の健康監視プログラムの対象となっており、欧州実験動物学会連合の勧告の改定に従って一般的な病原体についてスクリーニングした。
【０２３４】
１．２  腫瘍処置
前培養したラットの形質転換間葉系幹細胞由来の肉腫モデル細胞（ｒＴＭＳＣ）を、無血清ＲＰＭＩ−１６４０中に収集し、２００，０００個のｒＴＭＳＣを、半日目にＰＶＧラットの右脇腹に皮下接種し、２０，０００個のｒＴＭＳＣを０日目に反対の脇腹に皮下接種した。確立された腫瘍（平均の腫瘍の大きさ２５ｍｍ2）に、ＬＴＸ−３１５（０．９％  ＮａＣｌを有する滅菌水に溶解した）（ｎ＝８）又はビヒクル（０．９％  ＮａＣｌを有する滅菌水）（ｎ＝６）を病巣内注射した。２０ｍｇ／ｍｌにて５０μｌ（１ｍｇ）のＬＴＸ−３１５処置用量を、１ｍｌのシリンジ（Ｍｙｊｅｃｔｏｒ Ｕ−１００，Ｔｅｒｕｍｏ）、０．５×１６ｍｍ針（Ｆｉｎｅ−Ｊｅｃｔ；Ｈｅｎｋｅ−Ｓａｓｓ，Ｗｏｌｆ ＧｍｂＨ）を用いて与えた。注射を、３日連続して毎日提供した。腫瘍の大きさを、キャリパーを用いて週に３回測定し、楕円の面積[（最大寸法／２）×（最小寸法／２）]として表した。腫瘍が４００ｍｍ2を超えた場合に、動物の命を終了させた。
【０２３５】
１．３  固形腫瘍からの単一細胞懸濁液の調製
単一細胞懸濁液を、ＬＴＸ−３１５処置の翌週の間の異なる時点で、新鮮な腫瘍組織から調製した。腫瘍をかみそりの刃で穏やかにミンチし、小片（４ｍｍ2）に切断した。腫瘍組織を、３７℃で６０分間穏やかに撹拌しながら、１０ｍｌのＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中０．１８  Ｗｕｎｓｃｈ単位／ｍｌの濃度でのリベラーゼＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ Ｍｅｄｉｕｍ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）とインキュベートした。酵素消化を、４℃で２ｍｌのＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）の添加によって停止させた。細胞懸濁液を、７０μΜメッシュ（Ｃｅｌｌ Ｓｔｒａｉｎｅｒ；ＢＤ）を通して濾過し、ＰＢＳで洗浄し、細胞を次いでフローサイトメトリー染色のために直接使用した。
【０２３６】
１．４  抗体及びＦＡＣＳ分析
ＣＤ４（ＯＸ３８）及びＣＤ８（ＯＸ３８）に対するマウスモノクローナル抗体は、ハイブリドーマからの培養上清から単離され、英国オックスフォードのＭＲＣ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｔからの贈り物であった。それらを、標準的なプロトコルに従ってＩＭＢで結合させた。ＣＤ３に対する蛍光色素結合ｍＡｂ（Ｇ４．１８）を、ＰｅｒＣＰストレプトアビジンを含めて、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手した。ＦＩＴＣ／ＡＩ４８８、ＰＥ、ＰｅｒＣＰストレプトアビジン及びＡＩ６４７中の試薬からなる４色パネルを、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ）を備えたＦＡＣＳキャリバー（ＢＤ）上にアプライし分析した。ドットプロット及びヒストグラムゲートは、アイソタイプ対照抗体を使用して設定した。
【０２３７】
１．５  免疫組織化学
ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を、キシレン及び段階的アルコールで脱パラフィンし、水和して、ＰＢＳで洗浄した。電子レンジでクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）中の抗原を回収した後、内因性ペルオキシダーゼを０．３％のＨ2Ｏ2によって１５分間ブロッキングした。切片を、一次抗体；ウサギポリクローナル抗ＣＤ３（クローンＡ０４５２ Ｄａｋｏ）又はマウスモノクローナル抗ＣＤ８（クローンＯＸ８、ａｂ３３７８６、Ａｂｃａｍ）と４℃で一晩インキュベートした。二次抗体として、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ＳｕｐｅｒＰｉｃＴｕｒｅポリマー検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はエンビジョンシステムＨＲＰ抗マウス（Ｄａｋｏ）を使用した。一致したアイソタイプ対照を、非特異的バックグラウンド染色のための対照として使用した。
【０２３８】
１．６  統計
データを、平均±ＳＤとして表す。２つのグループ間の統計的優位性を、両側スチューデントｔ検定によって分析し、Ｐ＜０．０５を統計学的に有意であるとみなした。統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン６、ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて行った。
【０２３９】
２．  結果
ＬＴＸ−３１５媒介退縮及び長期防御免疫応答の基礎となる細胞メカニズムを調べるために、発明者らは、処置した腫瘍の細胞組成をフローサイトメトリー及び免疫組織化学によって分析した。最後の処置の翌週の間、腫瘍を異なる時点で切除し、その後ＬＴＸ−３１５処置動物及び未処置動物の両方で腫瘍浸潤白血球の表現型を決定した（図３０ａ）。
【０２４０】
増殖する腫瘍に応答して腫瘍浸潤Ｔリンパ球が、未処置ラットで観察された（図３０ｂ）。リンパ球の自発的な浸潤は、腫瘍増殖を阻害するには不十分であり、腫瘍制御は、腫瘍微小環境での適応免疫及びＣＤ８+Ｔ細胞の蓄積に依存した。Ｔ細胞の割合は、未処置腫瘍と比較してＬＴＸ−３１５処置後に顕著に増加した（処置；２８．３５±１１．７８、未処置；１３．５８±７．８４、Ｐ＜０．５）。同様に、二次腫瘍組織内のＴ細胞の割合は、未処置ラットに比べて３倍に増加した（処置；３９．８３±１７．４、未処置；１１．８３±１０．２５、Ｐ＜０．０１）。ＣＤ３+Ｔ細胞集団内で、ＣＤ８+細胞は、未処置ラットに対して、処置ラットの原発性及び二次性腫瘍において主要な画分を構成していた（処置ラットの原発性腫瘍；６２．７７±１３．３、未処置ラットの原発性腫瘍；３７．３３±３．４８、Ｐ＜０．０１、処置ラットの二次性腫瘍；４５．８±５．４、未処置ラットの二次性腫瘍；３４．６７±３．３６、Ｐ＜０．１）。
【０２４１】
未処置ラットと比較して、ＬＴＸ−３１５処置ラットのＦＡＣＳ分析は、腫瘍退縮と相関する主要な免疫エフェクター細胞集団であるＣＤ３+及びＣＤ８+の腫瘍浸潤Ｔ細胞の著しく高いレベルを明らかにした。免疫組織化学的分析は、ＬＴＸ−３１５処置ラットからの原発性及び二次性の腫瘍組織で観察されたＣＤ３+及びＣＤ８+細胞の浸潤の増加を実証するフローサイトメトリーデータと一致した（図３１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２１ｃ】
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【図２１ｄ】
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【図２１ｅ】
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【図２１ｆ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０ａ】
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【図３０ｂ】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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