(57)【要約】本発明は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）などの抗原レセプター、およびＰＤ−Ｌ１を標的とする抗体を発現する改変免疫細胞に関する。また、関連する核酸、ベクター、組成物、ならびに癌および病原体に対する免疫応答を増強するための方法も与える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）抗原レセプター、および
ｉｉ）ＰＤ−Ｌ１遮断抗体
を発現する改変免疫細胞。
【請求項２】
前記抗体が、ＣＤ８０とＰＤ−１の両方とのＰＤ−Ｌ１相互作用を阻害する、請求項１に記載の改変免疫細胞。
【請求項３】
前記抗体がヒト化されている、請求項１または２に記載の改変免疫細胞。
【請求項４】
前記免疫細胞が、
Ｔ細胞、
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞
ヒト胚性幹細胞、
造血幹細胞（ＨＳＣ）、または
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）
である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項５】
前記Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔリンパ球、炎症性Ｔリンパ球、ヘルパーＴリンパ球、またはガンマ−デルタＴ細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項６】
前記Ｔ細胞がＣＤ４＋またはＣＤ８＋またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の混合集団である、請求項４または５に記載の改変免疫細胞。
【請求項７】
前記抗原レセプターがＣＡＲであり、前記ＣＡＲが、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項８】
前記膜貫通ドメインがＣＤ３ゼータ、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ８アルファ、または４−１ＢＢ膜貫通ドメインである、請求項７に記載の改変免疫細胞。
【請求項９】
前記ＣＡＲが、１つ以上の共刺激ドメインをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項１０】
前記抗原レセプターが内因性ＴＣＲまたは改変ＴＣＲなどのＴＣＲである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項１１】
前記抗原レセプターが、組み換え発現される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項１２】
前記抗体が全長免疫グロブリンまたは抗体誘導体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項１３】
前記抗体が機能的Ｆｃドメインを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項１４】
前記抗体が、細胞傷害性免疫応答または補体活性化を誘発しないように改変されたＦｃドメインを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項１５】
前記抗体がＦｃドメインを含まない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項１６】
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖフラグメント、ナノボディ、ＶＨＨ、ｄＡｂ、最小認識ユニット、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、ＢｉＴＥ、またはＤＡＲＴからなる群から選択される抗体フラグメントである、請求項１５に記載の改変免疫細胞。
【請求項１７】
前記抗体が、１００ｐＭ未満のＫＤでヒトＰＤ−Ｌ１に結合する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項１８】
前記抗体が、
ｉ）それぞれ配列番号６、７、および８に示される可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ配列ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、もしくはＣＤＲ−Ｈ３、またはそれらの変異体のうちの１つ以上、
ｉｉ）それぞれ配列番号３、４、および５に示される可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ配列ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、もしくはＣＤＲ−Ｌ３、またはそれらの変異体のうちの１つ以上、
を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項１９】
前記抗体が、
ｉ）配列番号２の１つ以上のＶＨ配列、および／または
ｉｉ）配列番号１の１つ以上のＶＬ配列
を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項２０】
前記抗体が、配列番号９を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項２１】
ｉ）配列番号２の１つ以上のＶＨフレームワーク配列、および／または
ｉｉ）配列番号１の１つ以上のＶＬフレームワーク配列、
を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項２２】
前記抗体が、ＰＤ−Ｌ１への結合について請求項１７〜１９の抗体と競合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項２３】
前記抗体が前記細胞によって分泌され、かつ／またはその表面上に発現され、例えば分泌される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項２４】
前記細胞が、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、および／またはＭＩＰ−１アルファなどの１つ以上のサイトカイン、好ましくはヒトサイトカインをさらに発現し、かつ／または
トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、ＩＬ−１０、Ｆａｓ、ＣＤ４７、ＣＴＬＡ−４、Ｔｉｍ−３、ＬＡＧ−３、およびそれらのリガンドなどの免疫抑制分子を標的とする１つ以上の抗体をさらに発現する、
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項２５】
前記抗原レセプターが、腫瘍または病原体によって発現されるか、またはそれらに由来する抗原に結合する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項２６】
前記抗原が、ＧＤ２、ＷＴ−１、５Ｔ４、ＧＰＣ３、ＣＳＰＧ４、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＣＡ１Ｘ、ＣＥＡ、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ｐｐ６５またはＩＥ−１などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）タンパク質、Ｅ６またはＥ７などのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質、ＥＢＮＡ−１、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、またはＢＡＲＦ−１などのエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）タンパク質、ヘキソンなどのＡＤＶタンパク質、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３、ｅｒｂ−Ｂ４、ＦＢＰ、胎児性アセチルコリンレセプター、葉酸レセプター−ａ、ＧＤ３、Ｈｅｒ−１、ＨＥＲ−２、組み合わせでのＨＥＲ２−ＨＥＲ３、または組み合わせでのＨＥＲ１−ＨＥＲ２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ−１３Ｒ〜ａ２、Ｋ−軽鎖、ＤＲ、ＬｅＹ、ＬＩ細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ１０、メソテリン、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、変異ｒａｆ、変異ＲＡＣ１、ｂｃｒ／ａｂｌ融合体、ｃ−Ｍｅｔ、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原、前立腺特異抗原、メラノーマ関連抗原、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐｌ２０、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、メソテリン、ＨＥＲＶ−Ｋ、またはＥＲＢＢ２からなる群から選択される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗原レセプターおよび抗体をコードする核酸。
【請求項２８】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗原レセプターおよび／または抗体をコードする核酸を含む発現ベクター。
【請求項２９】
レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、プラスミド、トランスポゾン、および挿入配列、または人工染色体ベクターである、請求項２８に記載の発現ベクター。
【請求項３０】
バイシストロン性ベクターなどのマルチシストロン性ベクターである、請求項２８または２９に記載の発現ベクター。
【請求項３１】
１つ以上のＩＲＥＳ配列および／または１つ以上の自己切断配列、例えば２Ａ配列を含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項３２】
安全スイッチ、例えば誘導性自殺スイッチをさらに含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項３３】
請求項２７に記載の核酸を含むクローニングベクター。
【請求項３４】
（ａ）免疫細胞を与えるステップと、
（ｂ）前記抗原レセプターをコードする１つ以上の核酸および前記抗体をコードする１つ以上の核酸を前記細胞に導入するステップと、
（ｃ）前記細胞により前記核酸を発現させるステップと
を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の免疫細胞を作製する方法。
【請求項３５】
ステップ（ｂ）が、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の発現ベクターを前記細胞に導入することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
（ｉ）請求項３４に記載の抗原レセプターとは異なる抗原特異性を有する１つ以上の他の抗原レセプターを前記細胞に導入し；かつ／または請求項３４に記載の抗体とは異なる抗原特異性を有する１つ以上の他の抗体を前記細胞に導入するステップ。
をさらに含む、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
ｉ）有効量の請求項１〜２６のいずれか一項に記載の改変免疫細胞、または請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の発現ベクター、および
ｉｉ）薬剤的に許容できる賦形剤
を含む医薬組成物。
【請求項３８】
療法に使用するための、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の改変免疫細胞、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の発現ベクター、または請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記療法を、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法、および放射線療法の群から選択される１つ以上の療法と併用する、請求項３８に記載の改変免疫細胞、発現ベクター、または医薬組成物。
【請求項４０】
治療を必要とする対象を治療する方法であって、
（ａ）請求項１〜２６のいずれか一項に記載の改変免疫細胞を与えること、
（ｂ）前記対象に前記免疫細胞を投与すること
を含む前記方法。
【請求項４１】
前記免疫細胞が自己由来または同種異系である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
細胞を前記対象に１回以上投与する、請求項４０または４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
治療を必要とする対象を治療する方法であって、
（ａ）請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の発現ベクターまたは請求項３７に記載の医薬組成物を与えること、
（ｂ）前記発現ベクターまたは前記医薬組成物を前記対象に投与すること、
を含む前記方法。
【請求項４４】
抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法、および放射線療法の群から選択される１つ以上の療法と併用する、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
治療される状態が、前悪性または悪性の癌状態であり、例えば、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、尿路上皮癌、メラノーマ、腎細胞癌、ホジキンリンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、卵巣癌、胃腸癌、肝細胞癌、神経膠腫、乳癌、リンパ腫、小細胞肺癌、骨髄異形成症候群、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、非淡明細胞腎癌、結腸直腸癌、肉腫、結腸癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌または胃癌、皮膚癌、子宮癌、神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、肉腫、頭頸部癌、白血病、癌腫、メルケル細胞癌または腎細胞癌（ＲＣＣ）、血液癌、多発性骨髄腫、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞白血病、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、および卵巣癌;病原体感染、自己免疫障害である、請求項３８もしくは３９に記載の細胞もしくはベクター、または請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の改変免疫細胞、または請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の発現ベクター、および
使用説明書
を含む癌、病原体感染、自己免疫疾患の治療のためのキット。
【請求項４７】
誘導性自殺スイッチなどの安全スイッチの誘導因子をさらに含む、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記ＣＡＲが、１つ以上の共刺激ドメイン、例えばＣＤ２８，４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、もしくはＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはそれらの機能的フラグメントをさらに含む、請求項９に記載の改変免疫細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、抗原レセプターおよびＰＤ−Ｌ１遮断抗体を発現する改変細胞、ならびに癌および他の障害の治療のためのその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞などの抗原特異性免疫細胞による免疫療法は、様々な種類の疾患、例えば癌の治療のための有望なアプローチを与える。
【０００３】
１つの治療戦略は、腫瘍細胞を特異的に標的とし、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞レセプターＣＤ３−ゼータ鎖などに由来する細胞内シグナル伝達ドメインを通常含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現するように免疫細胞を改変することによるものである。シグナル伝達ドメインは、１つ以上の共刺激分子エンドドメインに連結されていてもよい。
【０００４】
さらなる別のアプローチは、規定の特異性を有する抗原特異性Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を免疫細胞へ導入することである。
【０００５】
細胞ベースの免疫療法は、このような遺伝子改変された免疫細胞が疾患の部位へ往来し、単回投与後でさえも増殖し、持続する可能性があるため、モノクローナル抗体をベースとする現在利用可能な免疫療法より大きな利点を有する。
【０００６】
癌細胞は、免疫系を逃れるために多数の経路を利用する。ＰＤ−Ｌ１は、しばしば腫瘍細胞上で発現され、ＰＤ−１に結合することによってＴ細胞媒介性破壊から腫瘍細胞を保護する。ＰＤ−Ｌ１レベルのアップレギュレートは、腫瘍の攻撃性の増加および死亡リスクの増加と相関する。
【０００７】
動物研究は、モノクローナル抗体によるＰＤ−Ｌ１：ＰＤ−１相互作用の遮断が、Ｔ細胞活性化を改善し、腫瘍の進行を低減することを実証した。臨床設定において、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかを遮断するモノクローナル抗体は、疾患の進行期および転移期であっても広範な癌サブタイプにわたって優れた活性を示している（Maute et al (2015), PNAS, 24; 112(47): E6506-E6514）。
【０００８】
したがって、抗ＰＤ−Ｌ１抗体との併用で抗原特異性免疫細胞を使用する治療アプローチが有望である。免疫細胞の作用部位における抗体の分泌は、抗体を不活性化から保護するので、ＴＣＲおよび／またはＣＡＲなどの抗原レセプターならびにＰＤ−Ｌ１に対する抗体の両方を発現する免疫細胞の作製が特に魅力的である。さらに、このような局所的抗体送達治療アプローチは、投与される薬剤の量および副作用の可能性に関して、全身的アプローチに比べて利点がある。
【０００９】
国際公開第２０１４１３４１６５号は、マウスＴ細胞におけるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）および抗マウスＰＤ−１  ｓｃＦｖの共発現を記載している。ｓｃＦｖは、米国第７，８５８，７４６号に記載されているアルメニアハムスター抗ＰＤ−１抗体クローンＪ４３由来であった。ｓｃＦｖコンストラクトは、ヒトＣＤ１９またはヒトＭＵＣ−ＣＤを標的とするＣＡＲを発現するレトロウイルス骨格にクローニングされた。一次マウスＴ細胞に、それぞれのコンストラクトが導入された。
【００１０】
Suarez E. et al, Oncotarget.2016 Jun 7; 7(23): 34341-34355および国際公開第２０１６１００９８５号は両方とも、ヒト抗炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）を標的とし、ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体を分泌する装甲（armored）ＣＡＲ  Ｔ細胞を記載している。腫瘍部位での局所抗体送達は、免疫チェックポイント経路の顕著な阻害をもたらした。マウスモデルにおいて、抗ＣＡＩＸ  ＣＡＲ  Ｔ細胞単独と比較した場合、腫瘍増殖は５倍減少し、腫瘍重量は５０〜８０％減少した。抗体はＩｇＧ１アイソタイプであり、そのためＡＤＣＣを媒介することができ、インビボモデルにおいて腫瘍部位へのヒトＮＫ細胞動員をもたらした。
【００１１】
しかしながら、治療薬がまだ商業化されていないので、抗原レセプターと免疫チェックポイントインヒビターに対する抗体の両方を発現する免疫細胞を含む効果的な併用療法薬を提供することには、依然として重要な満たされていない医学的必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１２】
したがって、一態様において、本発明は、
ｉ）抗原レセプター、および
ｉｉ）ＰＤ−Ｌ１に結合し、遮断する抗体
を発現する改変細胞を与える。
【００１３】
このような抗体は、ヒト化抗体または完全ヒト抗体であり得る。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号：３、４、５、６、７、および８に示されるＣＤＲ配列、またはそれらの変異体のうち１つ以上を含み得る。
【００１４】
前記抗体は、好ましくは、ＣＤ８０およびＰＤ−１の両方とのＰＤ−Ｌ１相互作用が阻害されるように、ＰＤ−Ｌ１上のエピトープに結合する。ＰＤ−１に加えて、ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞およびＢ細胞上に発現される膜レセプターであるＣＤ８０に結合するが、ＰＤ−Ｌ１のＣＤ８０に対する結合親和性は、ＰＤ−１に対してよりもはるかに低い。ＰＤ−１またはＣＤ８０のいずれかへのＰＤ−Ｌ１結合は、Ｔリンパ球への阻害シグナルを伝達し、Ｔ細胞遊走、増殖、および細胞傷害性メディエーターの分泌を抑制し、腫瘍細胞の殺滅を減少させる。しかし、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用はＴ細胞疲弊を誘発するが、ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ８０相互作用はＴ細胞アネルギーを誘発する。疲弊は、数週間または数ヶ月の期間にわたって進行性であり、慢性的な抗原刺激に依存し、一方、アネルギーは、適当な共刺激の非存在下で抗原刺激後に迅速に誘発されるので、これらは別個のプロセスである。
【００１５】
細胞は好ましくは治療用細胞である。好適な細胞は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ヒト胚性幹細胞、または造血幹細胞（ＨＳＣ）、または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）であり得る。本明細書において、抗原レセプターおよび抗体を発現する改変免疫細胞が与えられる。
【００１６】
一実施形態において、細胞はＴ細胞である。当該Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔリンパ球、炎症性Ｔリンパ球、ヘルパーＴリンパ球、またはガンマ−デルタＴ細胞であり得る。
【００１７】
一実施形態において、細胞はＮＫＴ細胞である。
【００１８】
一実施形態において、細胞はヒト起源である。一実施形態において、細胞は自己由来であり、一実施形態では、細胞は同種異系である。
【００１９】
一実施形態において、抗原レセプターは、癌抗原、例えば、癌細胞上でのみ発現されるか、または癌細胞上でアップレギュレートされる抗原に特異的である。
【００２０】
一実施形態において、抗原レセプターは、Ｔ細胞レセプター、例えば（例えば、刺激されて抗原に特異的となった、抗原に対するその特異性のために選択された）天然Ｔ細胞レセプター、または改変Ｔ細胞レセプターである。
【００２１】
一実施形態において、抗原レセプターは、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）である。
【００２２】
一実施形態において、抗原レセプターは膜に固定されている。
【００２３】
一実施形態において、本開示に係る免疫細胞は、ＴＣＲおよびＣＡＲ、例えば天然ＴＣＲおよびＣＡＲ（具体的には癌抗原に特異的）を含み得る。あるいは、本開示の免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞）は、改変ＴＣＲおよびＣＡＲを含み得る。
【００２４】
本明細書に記載の例示的な改変免疫細胞は、抗原レセプターのみを発現する改変免疫細胞と比較して、腫瘍殺滅活性の増強を示す。例えば、抗原レセプターと抗ＰＤ−Ｌ１抗体の両方をコードする免疫細胞は、抗原レセプターのみをコードする対応する細胞よりも長い期間、癌細胞を殺滅するのに有効であり得る。したがって、本開示に係る細胞は、特に腫瘍内微小環境において、疲弊の影響を受けにくい。
【００２５】
さらに、本明細書に記載の抗原レセプターおよび抗体をコードする核酸、ならびに当該核酸を含むベクターが与えられる。
【００２６】
本明細書に記載の免疫細胞を作製する方法であって、
（ａ）免疫細胞を与えるステップと、
（ｂ）前記抗原レセプターをコードする１つ以上の核酸および前記抗体をコードする１つ以上の核酸を前記細胞に導入するステップと、
（ｃ）前記細胞により前記核酸を発現させるステップと、
を含む前記方法も与えられる。
【００２７】
ｉ）有効量の本明細書に記載の改変免疫細胞、または発現ベクター、および
ｉｉ）薬剤的に許容できる賦形剤。
を含む医薬組成物もさらに与えられる。
【００２８】
療法に使用するための本明細書に記載の改変免疫細胞、発現ベクター、または医薬組成物も与えられる。治療を必要とする対象を治療する方法であって、
（ａ）本明細書に記載の組み換え免疫細胞を与えること、
（ｂ）前記対象に前記免疫細胞を投与すること
を含む前記方法がさらに与えられる。
【００２９】
本発明は、改変免疫細胞と精製チェックポイントインヒビター抗体との併用などの代替物よりも実質的な利点を与える。チェックポイントインヒビター抗体と組み合わせて改変免疫細胞を使用しようと試みる場合、当業者は、抗体送達のタイミングが重大な要素であることを認識するであろう。さらに、抗体の局所濃度もまた重要である。保護機能を与える抗体は、抗原レセプター発現細胞（エフェクター細胞）とそれらの標的細胞、例えば腫瘍部位との間で細胞接触が確立されるときに存在しなければならない。医師にとって、必須の癌部位に抗体を与えるように、従来の抗体製剤における全身的な抗体投与、例えば注入の正確なタイミングを決定することは事実上不可能である。さらに、全長抗体は通常血液脳関門を通過することができない。したがって、従来の（すなわち全長の）抗体製剤の全身送達は、通常、脳の癌に到達しないであろう。したがって、抗体は、高用量で全身投与され、そのため副作用の可能性が増大する。対照的に、本治療アプローチは、作用部位での抗体の放出制御を与え、それによって抗腫瘍効果療法を改善し、対象に対する副作用の可能性を減少させる。
【００３０】
本発明の療法または治療方法は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法、および放射線療法の群から選択される１つ以上の療法との併用であり得る。
【００３１】
本明細書に記載の改変免疫細胞または発現ベクターおよび使用説明書を含む癌、病原体感染、および／または自己免疫障害の治療のためのキットがさらに与えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】８５１０ｂｐを有するｓｃＦｖ抗ＰＤ−Ｌ１レトロウイルスコンストラクトＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰの設計を示す。５’末端のＮｃｏＩ制限部位、３’末端のＳｐｈＩ制限部位、およびＴＧＡ終止コドンを、ｓｃＦｖ抗ＰＤ−Ｌ１  ＤＮＡにＰＣＲによって付加した。ＰＣＲ産物をレトロウイルスベクターＳＦＧ（Ｉ）ｅＧＦＰにクローニングして、最終ベクターＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰを得た。ＩＲＥＳで発現されるレポーター遺伝子ｅＧＦＰを用いて、導入効率を評価する。ＬＴＲ：長い末端反復；ＳＤ：スプライシングドナー；ＰＳ：パッケージングシグナル；ＴＧＧ：切断ｇａｇｐｏｌ；ＳＡ：スプライシングアクセプター；ＳＰ：シグナルペプチド；ＶＬ：ｓｃＦｖの可変軽鎖；Ｌ：リンカー；ＶＨ：ｓｃＦｖの可変重鎖；ＩＲＥＳ：内部リボソーム導入部位；ｅＧＦＰ：増強緑色蛍光タンパク質。
【００３３】
【図２−１】ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞に、ＣＤ４／ＣＤ８比の変化なしにｓｃＦｖ抗ＰＤ−Ｌ１レトロウイルスコンストラクトを導入できたことを示す。ＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰベクターの導入効率は、ｅＧＦＰを発現するＣＤ４（図２Ａ）またはＣＤ８（図２Ｂ）Ｔ細胞のパーセンテージとして示されている。図２Ｃ：Ｔ細胞のＣＤ４／ＣＤ８比。平均およびｓ．ｄが示されている（ｎ＝４の独立した実験）対応のあるｔ検定により＊Ｐ＜０．１。ＮＴ：非導入Ｔ細胞−ＰＤ−Ｌ１：ＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰベクターのみが導入されたＴ細胞；ＣＡＲ．２８  ＰＤ−Ｌ１：ＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰベクターおよびＣＤ２８エンドドメインをコードするＧＤ２．ＣＡＲが同時導入されたＴ細胞；ＣＡＲ．ＢＢ  ＰＤ−Ｌ１：ＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰベクターおよび４−１ＢＢエンドドメインをコードするＧＤ２．ＣＡＲが同時導入されたＴ細胞。
【図２−２】同上。
【００３４】
【図３−１】二重レトロウイルス導入時にＴ細胞がＧＤ２．ＣＡＲおよびｅＧＦＰ抗ＰＤ−Ｌ１を同時発現したことを示す。図３Ａ：ＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰベクターの導入効率。示されているのは、ｅＧＦＰ陽性Ｔ細胞のパーセンテージである。図３Ｂ：ＣＤ２８エンドドメインまたは４−１ＢＢエンドドメインのいずれかをコードするＧＤ２．ＣＡＲの導入効率。図３Ｃ：ＲＦＩ（相対蛍光強度）として示されるＧＤ２．ＣＡＲの発現。図３Ｄ：ＧＤ２．ＣＡＲおよびｓｃＦｖ抗ＰＤ−Ｌ１レトロウイルスベクターが同時導入されたＴ細胞のパーセンテージ。図３Ｅ：Ｔ細胞の開始後１０日目のＴ細胞の代表的プロット。平均およびｓ．ｄが示されている（ｎ＝６の独立した実験）対応のあるｔ検定により＊Ｐ＜０．１、＊＊Ｐ＜０．０１。ＮＴ：非導入Ｔ細胞、ＣＡＲ．２８：ＣＤ２８エンドドメインをコードするＧＤ２．ＣＡＲのみが導入されたＴ細胞；ＣＡＲ．ＢＢ：４−１ＢＢエンドドメインをコードするＧＤ２．ＣＡＲのみが導入されたＴ細胞；−ＰＤ−Ｌ１：ＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰベクターのみが導入されたＴ細胞；ＣＡＲ．２８  ＰＤ−Ｌ１：ＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰベクターおよびＣＤ２８エンドドメインをコードするＧＤ２．ＣＡＲが同時導入されたＴ細胞；ＣＡＲ．ＢＢ  ＰＤ−Ｌ１：ＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰベクターおよび４−１ＢＢエンドドメインをコードするＧＤ２．ＣＡＲが同時導入されたＴ細胞。まとめると、これらの結果は、Ｔ細胞に、ＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰベクターおよびＧＤ２．ＣＡＲベクターを同時導入することができることと、ＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰベクターの導入はＧＤ２．ＣＡＲの発現レベルを変えないこととを示す。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【００３５】
【図４】ｓｃＦｖ抗ＰＤ−Ｌ１の導入がＴ細胞増殖に影響を与えなかったことを示す。Ｔ細胞が何倍の増加かは、導入の２日前のＴ細胞数で割った活性化後６日目（図４Ａ）および１２日目（図４Ｂ）のＴ細胞数として計算した。平均およびｓ．ｄが示されている（ｎ＝６の独立した実験）。ＮＴ：非導入Ｔ細胞、ＣＡＲ．２８：ＣＤ２８エンドドメインをコードするＧＤ２．ＣＡＲのみが導入されたＴ細胞；ＣＡＲ．ＢＢ：４−１ＢＢエンドドメインをコードするＧＤ２．ＣＡＲのみが導入されたＴ細胞；−ＰＤ−Ｌ１：ＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰベクターのみが導入されたＴ細胞；ＣＡＲ．２８  ＰＤ−Ｌ１：ＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰベクターおよびＣＤ２８エンドドメインをコードするＧＤ２．ＣＡＲが同時導入されたＴ細胞；ＣＡＲ．ＢＢ  ＰＤ−Ｌ１：ＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰベクターおよび４−１ＢＢエンドドメインをコードするＧＤ２．ＣＡＲが同時導入されたＴ細胞。
【００３６】
【図５−１】抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖの発現がＴ細胞サブセット組成に影響を与えなかったことを示す。図５Ａ：ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ９５の発現によって決定されるＴリンパ球亜集団のスキーム[ナイーブ（ＴＮ）ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５−、幹細胞メモリー（ＴＳＣＭ）ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋、セントラルメモリー（ＴＣＭ）ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−、エフェクターメモリー（ＴＥＭ）ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ−、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ＋］。固定化抗ＣＤ３／ＣＤ２８による刺激後１０日目のＴ細胞サブセット組成（図５Ｂ）、ＣＤ２７（図５Ｃ）、ＣＤ２８（図５Ｄ）、およびＰＤ−１（図５Ｅ）陽性細胞のパーセンテージ。平均およびｓ．ｄ．が示されている（ｎ＝４の独立した実験）。
【図５−２】同上。
【００３７】
【図６】抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖが導入Ｔ細胞によって放出されることを示す。図６Ａ：１０％ＦＢＳを含むＴ細胞培地中の非導入（ＮＴ）および抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ導入Ｔ細胞（ｓｃＦｖ  ＰＤ−Ｌ１）から放出された抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖの定量。Ｔ細胞を播種し、固定化抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で活性化した。上清を１８時間後に収集し、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖを特異的サンドイッチＥＬＩＳＡによって定量した。図６Ｂ：導入Ｔ細胞によって分泌された抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖは、ＰＤ−Ｌ１に結合する。非導入（ＮＴ）および抗ＰＤ−Ｌ１導入Ｔ細胞（ｓｃＦｖ  ＰＤ−Ｌ１）の細胞培養上清を、組み換えヒトＰＤ−Ｌ１へのそれらの結合について試験した。大腸菌で産生された抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖを基準対照（ｓｃＦｖ対照）として用いた。
【００３８】
【図７−１】抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖが導入された４−１ＢＢエンドドメインを有するＧＤ２．ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ｓｃＦＶ抗ＰＤ−Ｌ１を分泌していない４−１ＢＢエンドドメインを有するＧＤ２．ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、共培養の第２サイクルにおいて腫瘍細胞のより良好な殺滅を示すことを示す。図７Ａは、抗原刺激の第１サイクル（７日間）において、４−１ＢＢをコードするＧＤ２．ＣＡＲ−Ｔが効率的に腫瘍細胞を除去し、分泌された抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖの存在はＧＤ２．ＣＡＲ−Ｔ細胞傷害性機能障害を全く示さないことを示す。第２サイクル（１４日間）中、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖが導入された４−１ＢＢエンドドメインを有するＧＤ２．ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖを有しないＧＤ２．ＣＡＲ  Ｔ細胞よりも腫瘍細胞の殺滅の増強を示した。共培養の第１サイクル（培養７日目；図７Ｂ）および共培養の第２サイクル（培養１４日目；図７Ｃ）の終わりでのＴ細胞の代表的プロット（それぞれ、Ｔ細胞はＣＤ３＋として同定し、腫瘍細胞ＣＨＬＡ−２５５はＧＤ２＋細胞として同定した）。Ｅ：Ｔ比  １：５。ＣＨＬＡ：腫瘍細胞、Ｔ細胞：腫瘍細胞なしでＴ細胞単独、Ｔｃ  ＮＴ：非導入Ｔ細胞、Ｔｃ  ＰＤ−Ｌ１：ＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰベクターのみが導入されたＴ細胞；Ｔｃ  ＣＡＲ−４１ＢＢ：４−１ＢＢエンドドメインをコードするＧＤ２．ＣＡＲのみが導入されたＴ細胞；Ｔｃ  ＣＡＲ−４１ＢＢ  ＰＤ−Ｌ１：ＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰベクターおよび４−１ＢＢエンドドメインをコードするＧＤ２．ＣＡＲが同時導入されたＴ細胞。
【図７−２】同上。
【００３９】
【図８】抗原刺激の第１サイクル（７日間）において、４−１ＢＢをコードするＧＤ２．ＣＡＲ−Ｔが効率的にＩＦＮガンマを放出し、分泌された抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖの存在はＧＤ２．ＣＡＲ−Ｔ機能（ＩＦＮガンマ放出）障害を全く示さないことを示す。第２サイクル（１４日間）中、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖが導入された４−１ＢＢエンドドメインを有するＧＤ２．ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖを有しないＧＤ２．ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、ＩＦＮガンマの放出の増強を示した。第１（培養７日目；図８Ａ）および第２（培養１４日目；図８Ｂ）の腫瘍特異的刺激後最初の２４時間に産生されたＩＦＮガンマを定量するためのＩＦＮガンマＥＬＩＳＡアッセイ。
【００４０】
図面全体を通して使用されているように、「ＣＡＲ．ＢＢ」は「ＣＡＲ．４１ＢＢ」および「ＣＡＲ．４−１ＢＢ」を指す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
詳細な説明
別段の定義がない限り、説明、図、および特許請求の範囲で使用される全ての他の科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解されるような通常の意味を有する。本明細書で開示される改変細胞、抗体、抗原レセプター、核酸、ベクター、組成物、方法、および用途の実施または試験において、本明細書に記載された方法および材料と類似または均等の方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体で参照により援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。材料、方法、および実施例は、例示的なものに過ぎず、限定するものではない。
【００４２】
本明細書で使用される用語「改変免疫細胞」は、本明細書に記載のタンパク質を発現するように遺伝子改変された免疫細胞を指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「抗原レセプター」は、抗原結合に応答して免疫細胞を活性化することができるレセプターを指す。例示的な抗原レセプターは、内因性（すなわち、天然）もしくは組み換えＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）であり得る。ＴＣＲは、免疫細胞上に発現される膜固定型ヘテロ二量体タンパク質である。抗原提示細胞によって提示される抗原分子に結合すると、免疫細胞が活性化される。いくつかのＴＣＲは可変アルファおよびベータ鎖を含むが、他のＴＣＲはガンマおよびデルタ鎖を含み、鎖は不変ＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現される。アルファ鎖およびベータ鎖の各々は、両方とも細胞外に位置する可変領域および定常領域を含み得、各可変ドメインは、ペプチド／ＭＨＣ複合体へのＴＣＲの結合を可能にする３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。ベータ鎖の可変領域は、通常抗原に接触しないため、ＣＤＲとはみなされない別の超可変領域ＨＶ４を有する（例えば、Richman, S.A. et al, Mol Immunol.2009; 46(5): 902-916を参照されたい）。
【００４４】
ＣＡＲは、典型的には、細胞外ドメイン（外部ドメイン）、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン（エンドドメイン）を含む。外部ドメインは抗原認識を与え、最も一般的にはｓｃＦｖであるが、他の抗体フォーマットも使用され得る。ｓｃＦｖは、スペーサーを介して膜貫通ドメインに連結され、次いで膜貫通ドメインがエンドドメインに連結される。第一世代ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータを含む単純構造のエンドドメインを有していた。抗原結合に際して、レセプターがクラスター化し、活性化シグナルが細胞に伝達される。活性化シグナルを増加させるために、第２世代ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、および／または４−１ＢＢなどの共刺激ドメインをさらに含み、第３世代ＣＡＲは、２つ以上の共刺激ドメインを含む（Maus MV et al (2014) Blood, 123: 2625-2635）。ＣＤ３−ゼータの他に、ＩｇＥ−γドメインとしてＦｃレセプターを含む他のＩＴＡＭ含有ドメインが探索されている。
【００４５】
いくつかの実施形態において、抗原の抗原レセプターへの結合は、シグナル伝達の誘導または免疫細胞におけるタンパク質発現の変化によって免疫細胞を活性化し、免疫応答の開始をもたらす。
【００４６】
用語「内因性」は、組み換え技術なく、細胞または組織で通常発現される核酸またはポリペプチドに関する。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「ＰＤ−Ｌ１」は、「プログラム細胞死リガンド１」、「表面抗原分類２７４（すなわちＣＤ２７４）」、または「Ｂ７ホモログ１（すなわちＢ７−Ｈ１）」としても知られているタンパク質を指す。天然タンパク質は、２つの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む。当該用語は、全長および／またはプロセシングされていないＰＤ−Ｌ１、ならびに細胞内でのプロセシングから生じる中間体を包含する。ＰＤ−Ｌ１は、膜貫通タンパク質または可溶性タンパク質として存在し得る。したがって、本明細書で使用される当該用語は、当該タンパク質の全長または細胞外ドメインを指し得る。当該用語は、ＰＤ−Ｌ１の天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。当該タンパク質は、ｈｉｓタグまたはＦｃタグなどのタグをさらに含み得る。例示的なヒト全長ＰＤ−Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入れ番号ＮＰ＿０５４８６２で見ることができる。用語「ｈＰＤ−Ｌ１」は、ヒトＰＤ−Ｌ１を指し、天然ｈＰＤ−Ｌ１および組み換えヒトｒｈＰＤ−Ｌ１を含む。「ｒＰＤ−Ｌ１」は組み換えＰＤ−Ｌ１を指す。組み換えＰＤ−Ｌ１は、調製される方法に依存して、アミノ末端メチオニン残基を有すること、または有しないことがあり得る。「ｒｈＰＤ−Ｌ１」は組み換えヒトＰＤ−Ｌ１を指す。同様に、ＰＤ−Ｌ１は、ヒトまたはヒト以外の起源の生体試料から単離することによっても得ることができる。ｒｈＰＤ−Ｌ１は、例えば、米国のRnD Systemsよりカタログ番号156-B7で、または米国のPeprotechによりカタログ番号310-35で入手し得る。「サルＰＤ−Ｌ１」はアカゲザルのＰＤ−Ｌ１を指す。例示的なサルＰＤ−Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入れ番号ＮＰ＿００１０７７３５８で見ることができる。サルＰＤ−Ｌ１は、例えば、中国のSino Biologicalよりカタログ番号90251-C02Hで入手し得る。「ラットＰＤ−Ｌ１」は、ドブネズミ（ノルウェーラット）のＰＤ−Ｌ１を指す。例示的なラットＰＤ−Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入れ番号ＮＰ＿００１１７８８８３で見ることができる。ラットＰＤ−Ｌ１は、例えば、中国のSino Biologicalよりカタログ番号80450-R02Hで入手し得る。「マウスＰＤ−Ｌ１」は、ハツカネズミのＰＤ−Ｌ１を指す。例示的なマウスＰＤ−Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入れ番号ＮＰ＿０６８６９３で見ることができる。マウスＰＤ−Ｌ１は、例えば、中国のSino Biologicalよりカタログ番号50010-M03Hで、または米国のRnD Systemsよりカタログ番号1019-B7-100で入手し得る。
【００４８】
「ＰＤ−１」はプログラム細胞死タンパク質１であり、ＰＤ−Ｌ１の細胞表面レセプターであるＣＤ２７９としても知られている。ＰＤ−１は、２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に結合する。ＰＤ−１は、細胞外ドメインとそれに続く膜貫通領域および細胞内ドメインを含む膜貫通タンパク質である。当該用語は、全長および／またはプロセシングされていないＰＤ−１、ならびに細胞内でのプロセシングから生じる中間体を包含する。ＰＤ−１は、膜貫通タンパク質または可溶性タンパク質として存在し得る。したがって、本明細書で使用される当該用語は、当該タンパク質の全長または細胞外ドメインを指し得る。当該用語は、ＰＤ−１の天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。当該タンパク質は、ｈｉｓタグまたはＦｃタグなどのタグをさらに含み得る。例示的なヒトＰＤ−１タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入れ番号ＮＰ＿００５００９で見ることができる。用語「ｈＰＤ−１」は、ヒトＰＤ−１を指し、その天然型（ｈＰＤ−１）および組み換えヒト型（ｒｈＰＤ−１）を含む。「ｒＰＤ−１」は組み換えＰＤ−１を指す。
【００４９】
「ＣＤ８０」は、Ｂ７−１、Ｂ７．１、ＢＢ１、ＣＤ２８ＬＧ、ＣＤ２８ＬＧ１、ＬＡＢ７としても知られている表面抗原分類８０を指す。ＣＤ８０は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４ならびにＰＤ−Ｌ１に対する膜レセプターであり、細胞外ドメインとそれに続く膜貫通領域および細胞内ドメインを含む。当該用語は、全長および／またはプロセシングされていないＣＤ８０、ならびに細胞内でのプロセシングから生じる中間体を包含する。ＣＤ８０は、膜貫通タンパク質または可溶性タンパク質として存在し得る。したがって、本明細書で使用される当該用語は、当該タンパク質の全長または細胞外ドメインを指し得る。当該用語は、ＣＤ８０の天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。当該タンパク質は、ｈｉｓタグまたはＦｃタグなどのタグをさらに含み得る。例示的なヒトＣＤ８０タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入れ番号ＮＰ＿００５１８２で見ることができる。ＣＤ８０は、例えば、米国のRnD Systemsよりカタログ番号9050-B1-100で入手し得る。用語「ｈＣＤ８０」は、ヒトＣＤ８０を指し、その天然型（ｈＣＤ８０）および組み換えヒト型（ｒｈＣＤ８０）を含む。「ｒＣＤ８０」は組み換えＣＤ８０を指す。
【００５０】
「ＰＤ−Ｌ２」は、「プログラム細胞死１リガンド２」、「Ｂ７−ＤＣ」、または「ＣＤ２７３」（表面抗原分類２７３）としても知られているタンパク質を指す。本明細書で使用される当該用語は、全長および／またはプロセシングされていないＰＤ−Ｌ２、ならびに細胞内でのプロセシングから生じる中間体を包含する。ＰＤ−Ｌ２は、膜貫通タンパク質または可溶性タンパク質として存在し得る。したがって、本明細書で使用される当該用語は、当該タンパク質の全長または細胞外ドメインを指し得る。当該用語は、ＰＤ−Ｌ２の天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。当該タンパク質は、ｈｉｓタグまたはＦｃタグなどのタグをさらに含み得る。例示的なヒト全長ＰＤ−Ｌ２タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入れ番号ＮＰ＿０７９５１５で見ることができる。ＰＤ−Ｌ２は、例えば、米国のRnD Systemsよりカタログ番号1224-PLで入手し得る。用語「ｒｈＰＤ−Ｌ２」は組み換えヒトＰＤ−Ｌ２を指す。「Ｂ７−Ｈ３」は、ＣＤ２７６（表面抗原分類２７６）としても知られているタンパク質を指す。本明細書で使用される当該用語は、全長および／またはプロセシングされていないＢ７−Ｈ３、ならびに細胞内でのプロセシングから生じる中間体を包含する。Ｂ７−Ｈ３は、膜貫通タンパク質または可溶性タンパク質として存在し得る。したがって、本明細書で使用される当該用語は、当該タンパク質の全長または細胞外ドメインを指し得る。当該用語は、Ｂ７−Ｈ３の天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。当該タンパク質は、ｈｉｓタグまたはＦｃタグなどのタグをさらに含み得る。例示的なヒト全長Ｂ７−Ｈ３タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース受入れ番号ＮＰ＿０７９５１６で見ることができる。Ｂ７−Ｈ３は、例えば、米国のRnD Systemsよりカタログ番号1027-B3で入手し得る。用語「ｒｈＢ７−Ｈ３」は組み換えヒトＢ７−Ｈ３を指す。
【００５１】
本明細書で用いられるＴ細胞疲弊は、多くの慢性ウイルス感染、自己免疫、および癌の間に生じるＴ細胞機能不全の状態である。Ｔ細胞疲弊は、エフェクター機能の低下、阻害性レセプターの持続的発現、および機能的エフェクターまたはメモリーＴ細胞の転写状態とは異なる転写状態を特徴とする。疲弊は、感染状態および腫瘍の、すなわち特に慢性的な環境における最適な制御を妨げる。抗腫瘍Ｔ細胞は、腫瘍微小環境において抗原に持続的に曝露されるので、疲弊の影響を特に受けやすい。疲弊は、癌患者のＴ細胞機能不全に寄与する可能性が高い機構である。したがって、Ｔ細胞の疲弊は、メラノーマ患者ならびに卵巣癌および肝細胞癌を有する患者について報告されている。疲弊したＴ細胞は、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３を含む複数の阻害性レセプターを発現し、細胞傷害性および増殖能を徐々に失う。最終的に、疲弊したＴ細胞は、アポトーシスに及び得る。高レベルの阻害性レセプターの発現には、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン、およびムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ−３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、バンドＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、およびＴ細胞免疫グロブリン、および免疫レセプターチロシン系阻害性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）が含まれる。疲弊したＴ細胞の他の主な特徴は、エフェクターサイトカインを発現する能力の進行性喪失である。典型的には、インターロイキン−２（ＩＬ−２）産生および生体外殺滅能力が、疲弊の初期段階で失われる。中間段階では、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）産生が失われる。最後に、疲弊の進行段階では、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）およびグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）産生が失われる。疲弊したＴ細胞を腫瘍微小環境と結びつける最初の証拠は、プログラム細胞死リガンド１が過剰発現されたことであった。例えば、the review T-cell exhaustion in the tumor microenvironment, Jiang et al, Cell Death and Disease (2015) 6, el 792を参照されたい。
【００５２】
Ｔ細胞疲弊は慢性過剰刺激の結果であるが、Ｔ細胞アネルギーは、（ｉ）ＣＤ２８を介する適切な随伴性共刺激なしに、または（ｉｉ）高い共阻害分子シグナル伝達の存在下で、ＴＣＲを誘発することによって誘導される低応答性状態を通常指す。その結果、ＩＬ−２は効果的に転写されないが、代わりにネガティブフィードバックを介してＴＣＲシグナル伝達障害に寄与する、ＧＲＡＩＬなどのアネルギー関連遺伝子が発現される。
【００５３】
用語「単離」は、ペプチド、核酸分子、もしくは細胞などの物質が、その正常な生理環境、例えば天然源から取り出されたこと、またはペプチドもしくは核酸が合成されることを示す。用語「単離」の使用は、天然に存在する配列がその正常細胞（例えば、染色体または細胞）環境から取り出されたことを示す。したがって、配列は、無細胞溶液中に存在してもよく、または異なる細胞環境に置かれてもよい。ポリペプチドまたは核酸分子に関して「単離」とは、天然源から単離されるか、または合成されるポリペプチドまたは核酸分子を含む、互いに結合したアミノ酸（２つ以上のアミノ酸）またはヌクレオチドのポリマーを意味する。用語「単離」は、配列が、存在するアミノ酸鎖またはヌクレオチド鎖だけであることを意味するのではなく、配列が、それぞれ配列と自然に関連する非アミノ酸物質および／または非核酸物質などを実質的に含まないことを意味する。「単離細胞」は、細胞に自然に付随する分子および／または細胞成分から分離される細胞を指す。
【００５４】
「変異体」は、本明細書で開示される親配列の１つ以上の所望の活性を保持しながら、１つ以上のアミノ酸残基または核酸塩基の付加（挿入を含む）、欠失、修飾、および／または置換により親配列と異なるアミノ酸または塩基配列を指す。抗体の場合、このような所望の活性には特異的抗原結合が含まれ得る。同様に、変異体塩基配列は、1つ以上の核酸塩基の付加、欠失、および／または置換により親配列と比較して改変されていることがあり得るが、コードされる抗体は上記の所望の活性を保持する。変異体は、対立遺伝子またはスプライス変異体などの天然に存在するものであってもよく、または人工的に構築されるものであってもよい。
【００５５】
本明細書で使用される用語「同一性」は、２つのタンパク質または核酸間の配列の一致を指す。比較するタンパク質または塩基配列を、例えば、EMBOSS Needle（ペアワイズアラインメント；www.ebi.ac.ukで利用可能）などのバイオインフォマティクスツールを使用するか、またはマニュアルアラインメントおよび目視検査により、比較ウィンドウにわたって一致が最大となるようにアラインメントする。比較する配列中の同じ位置が同じ核酸塩基またはアミノ酸残基によって占められている場合、それぞれの分子はちょうどその位置で同一である。したがって、「同一性パーセント」は、一致位置の数を比較した位置の数で割って１００％を掛けた関数である。例えば、１０個の配列位置のうち６個が同一である場合、同一性は６０％である。一致が最大となるように配列をアラインメントするには、ギャップを導入する必要があり得る。２つのタンパク質配列間の同一性パーセントは、例えば、EMBOSS Needleに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Needlemann S.B. and Wunsch CD.A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins.J. Mol.Biol.1970, vol. 48, p.443)を使用して、BLOSUM62マトリックス、「ギャップオープンペナルティ」１０、「ギャップ伸長ペナルティ」０．５、偽「エンドギャップペナルティ」、「エンドギャップオープンペナルティ」１０、および「エンドギャップ伸長ペナルティ」０．５を用いて、または同一性を最大にする方法でギャップを手動で導入する配列整列方法によって決定することができる。同一の一次アミノ酸または塩基配列を有する２つの分子は、化学的および／または生物学的修飾にかかわらず同一である。例えば、同じ一次アミノ酸配列を有するが異なるグリコシル化パターンを有する２つの抗体は、この定義では同一である。核酸の場合、例えば、同じ配列を有するがリン酸の代わりにチオリン酸などの異なる結合成分を有する２つの分子は、この定義では同一である。同様に、環外修飾のためにのみ異なる核酸塩基、例えばシトシンおよび５−メチル−シトシンは、この定義では同一である。
【００５６】
いくつかの可変ドメインまたは１つ以上の定常ドメインを含むことなどにより本明細書で与えられるいずれの配列よりも長い配列は、比較ウィンドウにわたる配列同一性が示されている場合、本明細書に開示される基準配列となおも同一であるものとする。本明細書で使用される比較ウィンドウは、請求項に係る配列全体を含む。
【００５７】
用語「ＣＤＲ」は、抗原結合に主に寄与する抗体の超可変領域を指す。通常、抗原結合部位は、フレームワークスキャフォールドに埋め込まれた６つのＣＤＲを含む。ここで、ＶＬのＣＤＲはＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３と呼ばれ、ＶＨのＣＤＲはＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３と呼ばれる。これらは、KABAT, E.A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest.5th edition.Edited by U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES.NIH Publications, 1991. p. 91-3242に記載されているように同定することができる。しかしながら、本明細書中で使用されるＣＤＲ−Ｈ１は、位置２７で開始し、位置３６より前で終わる点でKabatの定義とは異なる（ＡＨｏ位置２８〜４２を含む）。
【００５８】
本明細書で使用される場合、抗体のＶＨおよびＶＬにおけるアミノ酸残基位置を同定するためのナンバリングシステムは、Honegger A.およびPliickthun A.によって記載された「ＡＨｏ」システムに対応する。免疫グロブリン可変ドメインのさらに別のナンバリングスキームはAn automatic modelling and analysis tool.J. Mol.Biol.2001, vol. 309, p.657である。この刊行物はさらに、ＡＨｏシステムとKabatシステムとの間の変換テーブルを与える（Kabat E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest.5th edition.Edited by U.S. Department of Health and Human Services.NIH Publications, 1991.No. 91-3242)。
【００５９】
用語「フレームワーク」（ＦＲ）は、可変抗体ドメインのスキャフォールドである、それぞれのＣＤＲを含む可変軽鎖（ＶＬ）または可変重鎖（ＶＨ）を指す。ＶＬおよび／またはＶＨフレームワークは、ＣＤＲ領域に隣接する４つのフレームワークセクション、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４を通常含む。したがって、当技術分野で知られているように、ＶＬは一般構造：（ＦＲ−Ｌ１）−（ＣＤＲ−Ｌ１）−（ＦＲ−Ｌ２）−（ＣＤＲ−Ｌ２）−（ＦＲ−Ｌ３）−（ＣＤＲ−Ｌ３）−（ＦＲ−Ｌ４）を有し、一方、ＶＨは一般構造：（ＦＲ−Ｈ１）−（ＣＤＲ−Ｈ１）−（ＦＲ−Ｈ２）−（ＣＤＲ−Ｈ２）−（ＦＲ−Ｈ３）−（ＣＤＲ−Ｈ３）−（ＦＲ−Ｈ４）を有する。本開示の様々な態様を、以下のサブセクションでさらに詳細に説明する。様々な実施形態、選好、および範囲は自由に組み合わせ得ることが了解される。さらに、特定の実施形態に応じて、選択された定義、実施形態、または範囲が適用されないこともある。
【００６０】
第１の態様において、本発明は、
ｉ）抗原レセプター、および
ｉｉ）ＰＤ−Ｌ１を遮断する抗体
を発現する改変免疫細胞を与える。
【００６１】
当該免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ヒト胚性幹細胞、または造血幹細胞（ＨＳＣ）、または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）であり得る。
【００６２】
前記Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔリンパ球、炎症性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球、またはガンマ−デルタＴ細胞であり得る。追加的または代替的に、前記Ｔ細胞はＣＤ４＋またはＣＤ８＋またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の混合集団である。
【００６３】
いくつかの実施形態において、抗原レセプターは、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）である。上述のように、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインとして作用する細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および抗原認識に役立つ細胞外ドメインを含む。細胞外ドメインは、ドメインの輸送を細胞表面に向けるために、シグナルペプチドに連結されていてもよい。前記シグナルペプチドは切断可能であってもよい。
【００６４】
通常、膜貫通ドメインと細胞外ドメインとの間にスペーサーまたはヒンジ領域が存在する。当該ヒンジ領域は、例えば、ＣＤ８ａヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ、またはＦｃｙＲｌｌヒンジからなる群から選択され得る。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ８アルファ、または４−１ＢＢ膜貫通ドメインを含む。
【００６６】
さらに、ＣＡＲは、例えばＣＤ２８，４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、またはＯＸ４０（ＣＤ１３４）共刺激ドメインからなる群から選択される１つ以上の共刺激ドメイン、またはそれらの機能的フラグメントを含み得る。好ましい実施形態において、ＣＡＲは、４−１ＢＢ共刺激ドメインまたはその機能的フラグメントを含む。ＣＤ２８および４−１ＢＢ共刺激ドメインの例示的な配列は、それぞれ配列番号４９および４７に示されている。
【００６７】
通常、細胞質ドメインはＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの例示的な配列は、配列番号４８に示されている。
【００６８】
対応する配列は周知であり、当技術分野で利用可能である。シグナルペプチド、ヒンジ領域、膜貫通ドメインの例示的な配列は、参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１６／０３４６６６号の図１に与えられている。前記配列の変異体もまた使用し得る。他のシグナルペプチド、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および／またはシグナル伝達ドメインも、本発明の範囲内で用いることができる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの構造は、参照により本明細書に援用される、Heczey A. et al, Blood.2014 Oct 30; 124(18):2824-33の図１に示されるとおりである。
【００７０】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＧＤ２、例えば１４ｇ２ａ  ｓｃＦｖ、もしくは１４ｇ２ａ可変ドメインを含む抗体、もしくは１４ｇ２ａ  ｓｃＦｖのＣＤＲを含む抗体、またはそれらの変異体を標的とする細胞外ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ２８共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＧＤ２、例えば１４ｇ２ａ  ｓｃＦｖ、１４ｇ２ａ可変ドメインを含む抗体、もしくは１４ｇ２ａ  ｓｃＦｖのＣＤＲを含む抗体、またはそれらの変異体を標的とする細胞外ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、および４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む。１４ｇ２ａ  ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬ配列は、例えば、ＰＤＢデータベースで受入れ番号４ＴＵＯ＿Ａおよび４ＴＵＯ＿Ｂの下で見ることができる（配列番号１３および１４も参照）。１４ｇ２ａ由来配列の変異体、特にフレームワーク変異、例えば可変軽鎖および／または重鎖に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の変異を有する変異体の使用も企図されている。好ましいのは、配列番号１３および１４に示されるＣＤＲ配列の少なくとも１つ、好ましくは全て、すなわち配列番号１６〜２１の少なくとも１つ、好ましくは全てのＣＤＲ配列を含む抗ＧＤ２−ＣＡＲである。例示的なＧＤ２特異的ＣＡＲコンストラクトは、Heczey A. et al, Blood.2014 Oct 30; 124(18):2824-33, in Pule、M A. et al, Mol Ther, 12(5), November 2005, 933-941（異なるレセプターの膜貫通ドメインおよびエンドドメインのアミノ酸配列については図１を参照）、および国際公開第ＷＯ２０１２０３３８８５号に記載されており、これら３つは全て参照により本明細書に援用される。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＳＰＧ４を標的とする細胞外ドメインを含む。好ましいのは、当該ＣＡＲが、配列番号２２〜２７の少なくとも１つ、好ましくは全てのＣＤＲを含むことである。いくつかの実施形態において、当該ＣＡＲは、配列番号２８のＶＬ配列、および／または配列番号２９のＶＨ配列を含む。例示的なＣＳＰＧ４特異的ＣＡＲコンストラクトは、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１５／０８０９８１号に記載されている。
【００７２】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＧＰＣ３を標的とする細胞外ドメインを含む。好ましいのは、当該ＣＡＲが、配列番号３０〜３５の少なくとも１つ、好ましくは全てのＣＤＲを含むことである。いくつかの実施形態において、当該ＣＡＲは、配列番号３６のＶＬ配列、ならびに／または配列番号３７および配列番号３８からなる群から選択されるＶＨ配列を含む。例示的なＧＰＣ３特異的ＣＡＲコンストラクトは、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１６／０４９４５９号に記載されている。
【００７３】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、５Ｔ４を標的とする細胞外ドメインを含む。好ましいのは、当該ＣＡＲが、配列番号３９〜４４の少なくとも１つ、好ましくは全てのＣＤＲを含むことである。いくつかの実施形態において、当該ＣＡＲは、配列番号４５のＶＬ配列、および／または配列番号４６のＶＨ配列を含む。例示的な５Ｔ４特異的ＣＡＲコンストラクトは、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１６／０３４６６６号に記載されている。
【００７４】
追加的または代替的に、抗原レセプターはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）である。ＴＣＲは、内因性（もしくは天然）ＴＣＲまたは改変ＴＣＲであり得る。内因性ＴＣＲは、例えば抗原に対するその特異性のために選択され得る。
【００７５】
一実施形態において、改変ＴＣＲは、その配列が免疫細胞において組み換えにより発現される天然のＴＣＲである。いくつかの実施形態において、改変ＴＣＲは、天然のＴＣＲに由来するが、点変異を含む。一実施形態において、改変ＴＣＲは、例えば参照により本明細書に援用される国際公開第２００６／０００８３０に開示されているように、定常領域にジスルフィド結合を含む。特に、定常領域に所定位置のジスルフィド結合が組み込まれる。
【００７６】
一実施形態において、改変ＴＣＲは、例えば参照により本明細書に援用される国際公開第２００６／１７０３２０に記載されているように、表面発現が増加するように改変されている。例えば、ＴＣＲは以下のアミノ酸残基：アルファ鎖のＬ９６；ベータ鎖のＲ９；ベータ鎖のＹ１０；アルファ鎖のＴ２４；アルファ鎖のＶ１９；アルファ鎖のＴ２０；アルファ鎖のＭ５０；アルファ鎖のＴ５；アルファ鎖のＱ８；アルファ鎖のＳ８６；アルファ鎖のＦ３９；アルファ鎖のＤ５５；ベータ鎖のＲ４３；アルファ鎖のＡ６６；ベータ鎖のＶ１  ９；ベータ鎖のＬ２１；ベータ鎖のＬ１０３；アルファ鎖のＴ３；アルファ鎖のＳ７；アルファ鎖のＰ９；アルファ鎖のＭ１１；アルファ鎖のＡ１６；アルファ鎖のＴ１８；アルファ鎖のＬ２１；アルファ鎖のＳ２２；アルファ鎖のＤ２６；アルファ鎖のＦ４０；アルファ鎖のＳ４７；アルファ鎖のＲ４８；アルファ鎖のＱ４９；アルファ鎖のＩ５１；アルファ鎖のＬ５２；アルファ鎖のＶ５３；アルファ鎖のＴ６７；アルファ鎖のＥ６８；アルファ鎖のＮ７４；アルファ鎖のＦ７６；アルファ鎖のＮ７９；アルファ鎖のＱ８１；アルファ鎖のＡ８３；アルファ鎖のＫ９０；アルファ鎖のＳ９２；アルファ鎖のＤ９３；およびアルファ鎖のＭ１０１のうち１つ以上を含む。好ましくは、前記１つ以上のアミノ酸残基は、対応する生殖細胞フレームワークＴＣＲアミノ酸配列に存在しない。
【００７７】
一実施形態において、改変ＴＣＲは、非ヒト定常領域、例えばマウス定常領域を含む。
【００７８】
一実施形態において、ＮＫＴ細胞の内因性ＴＣＲなどのＴＣＲは、腫瘍関連マクロファージに結合することができる。
【００７９】
一実施形態において、ＴＣＲはサバイビンに特異的である。サバイビン腫瘍抗原に特異的であるが、「標的外の腫瘍」毒性を有しない例示的なＴＣＲは、国際公開第２０１６／０７０１１９号に開示されている。当該サバイビン特異的ＴＣＲは、好ましくは、配列番号５０および５１のＣＤＲを含む。好ましくは、ＴＣＲは、配列番号５０のベータ鎖および／または配列番号５１のアルファ鎖を含む。
【００８０】
一実施形態において、ＴＣＲはＷＴ−１に特異的である。ＷＴ−１に特異的な例示的なＴＣＲは、国際公開第２００５０５６５９５号に開示されている。ＷＴ−１特異的ＴＣＲは、好ましくは、配列番号５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および５９からなる群からの１つ以上のＣＤＲを含む。一実施形態において、アルファ鎖は、配列番号５２、５３、および５４を含む。一実施形態において、アルファ鎖は、配列番号５２、５３、および５５を含む。一実施形態において、ベータ鎖は、配列番号５６、５７、および５８を含む。一実施形態において、ベータ鎖は、配列番号５６、５７、および５９を含む。当該ＴＣＲは、配列番号６０または６２のアルファ鎖を含み得る。追加的または代替的に、当該ＴＣＲは、配列番号６１または６３のベータ鎖を含み得る。したがって、一実施形態において、ＴＣＲは、配列番号６０および６１を含む。一実施形態において、ＴＣＲは、配列番号６０および６３を含む。一実施形態において、ＴＣＲは、配列番号６２および６１を含む。一実施形態において、ＴＣＲは、配列番号６２および６３を含む。
【００８１】
好ましい実施形態では、前記抗原レセプターは組み換え発現される。したがって、免疫細胞に前記抗原レセプターをコードするベクターを導入または移入する。
【００８２】
抗原レセプターが結合する抗原は、好ましくは、腫瘍もしくは病原体によって発現されるか、または腫瘍もしくは病原体に由来する。いくつかの実施形態において、特にＣＡＲを使用する場合、抗原レセプターは２つ以上の標的に結合し得る。また、２つ以上、例えば３、４、または５つの異なる組み換え抗原レセプターを発現する免疫細胞も企図される。抗原レセプターが結合する例示的な抗原には、限定はされないが、ＧＤ２、ＷＴ−１、５Ｔ４、ＧＰＣ３、ＣＳＰＧ４、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＣＡ１Ｘ、ＣＥＡ、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ  １０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ｐｐ６５またはＩＥ−１などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）タンパク質、Ｅ６またはＥ７などのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質、ＥＢＮＡ−１、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、またはＢＡＲＦ−１などのエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）タンパク質、ヘキソンなどのＡＤＶタンパク質、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３、ｅｒｂ−Ｂ４、ＦＢＰ、胎児性アセチルコリンレセプター、葉酸レセプター−ａ、ＧＤ３、Ｈｅｒ−１、ＨＥＲ−２、組み合わせでのＨＥＲ２−ＨＥＲ３、または組み合わせでのＨＥＲ１−ＨＥＲ２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ−１３Ｒ〜ａ２、Ｋ−軽鎖、ＤＲ、ＬｅＹ、ＬＩ細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ１０、メソテリン、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、変異ｒａｆ、変異ＲＡＣ１、ｂｃｒ／ａｂｌ融合体、ｃ−Ｍｅｔ、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原、前立腺特異抗原、メラノーマ関連抗原、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐｌ２０、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、メソテリン、ＨＥＲＶ−Ｋ、またはＥＲＢＢ２が含まれ得る。
【００８３】
抗体は、全長免疫グロブリンまたは抗体誘導体であり得る。過去数十年にわたり、全長免疫グロブリンが分析され、モジュールが、一価、二価、または多価誘導体および単一特異性、二重特異性、または多重特異性誘導体を作製するために使用されてきた。最初は、より小さな抗原結合フラグメントがタンパク質分解によって製造され、その後、遺伝子工学によって人工コンストラクトが製造されてきた。したがって、抗体誘導体は、場合によっては複数のコピーで全長免疫グロブリンの機能的部分または全体を含む組み換え分子である。例示的な抗体誘導体には、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖフラグメント、ナノボディ、ＶＨＨ、最小認識ユニット、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、線状二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ−ｓｃＤｂ）、環状二量体ｓｃＤｂ（ＣＤ−ｓｃＤｂ）、ＢｉＴＥ（またはタンデムジ−ｓｃＦｖもしくはタンデムｓｃＦｖ）、ＤＡＲＴ、タンデムトリ−ｓｃＦｖ、トリ（ア）ボディ、二重特異性Ｆａｂ２、ジミニ抗体、テトラボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ融合体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体、ジ−ダイアボディ、ＤＶＤ−Ｉｇ、CrossMab、DuoBody、ｓｃＦａｂ−Ｆｃ、ｓｃＦａｂ−Ｆｃ−ｓｃＦａｂ、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２−Ｆｃ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体（例えばｂｓＡｂ、Ｂｓ１Ａｂ、Ｂｓ２Ａｂ、Ｂｓ３Ａｂ、Ｔｓ１Ａｂ、Ｔｓ２Ａ）ｂ、Ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ（ＫｉＨｓ）、DuoBodyが含まれる（例えばHolliger P and Hudson J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains.Nature Biotechnol.2005, vol. 23, 9, p.1126; Dimasi N. et al (2009), JMB 393, 672-692)を参照されたい）。
【００８４】
抗体誘導体のサブグループは抗体フラグメントである。本明細書で使用される場合、用語「抗体フラグメント」は、（ｉ）抗体の可変重鎖および／または軽鎖または機能的フラグメントを含み、Ｆｃ部分を欠く一価かつ単一特異性抗体誘導体と、（ｉｉ）ＢｉＴＥ（タンデムｓｃＦｖ）、ＤＡＲＴ、ダイアボディ、および単鎖ダイアボディ（ｓｃＤＢ）とを指す。したがって、抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖフラグメント、ナノボディ、ＶＨＨ、ｄＡｂ、最小認識ユニット、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、ＢｉＴＥ、およびＤＡＲＴからなる群から選択される。列挙された抗体フラグメントは、６０ｋＤａ未満の分子量を有する。一実施形態において、抗体誘導体は抗体フラグメント、好ましくはヒト化抗体フラグメントである。
【００８５】
一実施形態において、抗体は、細胞傷害性免疫応答を媒介することができるＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインを含む抗体の非限定的な例は、全長免疫グロブリン、ＤＶＤ−Ｉｇ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、およびｓｃＦｖ−Ｆｃ．ｓｃＦｖ融合体、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−Ｆｃ、ｓｃＦａｂ−Ｆｃ−ｓｃＦａｂ、Ｆｖ２−Ｆｃ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体（例えば、ｂｓＡｂ、Ｂｓ１Ａｂ、Ｂｓ２Ａｂ、Ｂｓ３Ａｂ、Ｔｓ１Ａｂ、Ｔｓ２Ａｂ）、DuoBody、およびCrossMabである。
【００８６】
一実施形態において、抗体は、細胞傷害性免疫応答を誘発しない、かつ／または補体を活性化しないように改変されているＦｃドメインを含む。一実施形態において、抗体誘導体はＦｃドメインを欠いている。Ｆｃドメインを欠く例示的な抗体誘導体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖフラグメント、ナノボディ、ＶＨＨ、最小認識ユニット、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、線状二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ−ｓｃＤｂ）、環状二量体ｓｃＤｂ（ＣＤ−ｓｃＤｂ）、ＢｉＴＥ（タンデムジ−ｓｃＦｖもしくはタンデムｓｃＦｖとも呼ばれる）、タンデムトリ−ｓｃＦｖ、トリ（ア）ボディ、二重特異性Ｆａｂ２、ジミニ抗体、ジ−ダイアボディ、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、またはＤＡＲＴである。一実施形態において、抗体は、Ｋｎｏｂ  ｉｎｔｏ  Ｈｏｌｅｓ（ＫｉＨｓ）技術を用いて改変されたＦｃドメインを含む。
【００８７】
Ｆｃ部分は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、および／またはＣＤＣなどの細胞傷害性免疫応答を媒介するが、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１軸を標的とする場合、両方のタンパク質が抗腫瘍細胞傷害性Ｔ細胞の表面上に発現されるので、このようなＦｃ媒介効果は必要とされないか、または望ましくない。したがって、機能的Ｆｃ部分を有する全長モノクローナル抗体を投与すると、活性化しようとするリンパ球そのものが枯渇する可能性がある。抗ＰＤ−１抗体による治療は、患者における循環Ｔ細胞数の低下と相関することが分かった。ＰＤ−Ｌ１は非腫瘍細胞上にも発現され、これらの細胞を標的とし、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、および／またはＣＤＣを媒介することは望ましくないことである。
【００８８】
いくつかの実施形態において、抗体誘導体は、約５５ｋＤａ、５０ｋＤａ、４５ｋＤａ、４０ｋＤａ、３５ｋＤａ、３０ｋＤａ、もしくは２７ｋＤａ、またはそれ以下などの約６０ｋＤａ以下の分子量を有する。固形腫瘍は、しばしば全長免疫グロブリンが中心に浸透するのを妨げ、治療効果を低下させる、実質的な物理的障壁を有する（Christiansen, I, and Rajasekaran, A.K.(2004), Mol.Cancer Ther.3, 1493-1501）。対照的に、より小さい抗体誘導体は、腫瘍のより深くに浸透し得る。約６０ｋＤａ以下の分子量を有する例示的な抗体誘導体は、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖフラグメント、ナノボディ、ＶＨＨ、ｄＡｂ、最小認識ユニット、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、またはＤＡＲＴを含む抗体フラグメントである。
【００８９】
抗体のサイズおよび／または構造は、その半減期に関係がある。治療的設定において副作用を減少させるために、短い半減期を有する抗体を使用することが有利であり得る。これは、例えば、Ｆｃ部分を欠く抗体誘導体、より好ましくは例えば約６０ｋＤａ以下、例えば約５５ｋＤａ、５０ｋＤａ、４５ｋＤａ、４０ｋＤａ、３５ｋＤａ、３０ｋＤａ、もしくは２７ｋＤａ、またはそれ以下の低分子量を有する抗体誘導体を使用することによって達成され得る。
【００９０】
これらの特徴を有する好ましい抗体誘導体は、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖフラグメント、ナノボディ、ＶＨＨ、ｄＡｂ、最小認識ユニット、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、ＢｉＴＥ、またはＤＡＲＴである。
【００９１】
したがって、抗体は、一価または多価であること、すなわち１つ以上の抗原結合部位を有することができる。一価抗体、特に抗体誘導体の非限定的な例には、ｓｃＦｖ、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂ、ＶＨＨ、ナノボディ、または最小認識ユニットが含まれるが、これらに限定されない。多価抗体は、２、３、４、またはそれ以上の抗原結合部位を有することができる。全長免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、線状二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ−ｓｃＤｂ）、環状二量体ｓｃＤｂ（ＣＤ−ｓｃＤｂ）、ＢｉＴＥ（またはタンデムジ−ｓｃＦｖもしくはタンデムｓｃＦｖ）、ＤＡＲＴ、タンデムトリ−ｓｃＦｖ、トリ（ア）ボディ、二重特異性Ｆａｂ２、ジミニ抗体、テトラボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ融合体、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体、ジ−ダイアボディ、ＤＶＤ−Ｉｇ、CrossMab、DuoBody、ｓｃＦａｂ−Ｆｃ、ｓｃＦａｂ−Ｆｃ−ｓｃＦａｂ、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２−Ｆｃ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディは、多価抗体の非限定的な例であり、例示的な多価抗体は２つの結合部位を含み、すなわち抗体は２価である。
【００９２】
いくつかの実施形態において、抗体、特に抗体誘導体は二重特異性であり、すなわち、抗体誘導体は２つの異なる標的または１つの標的分子上の２つの異なるエピトープに対するものである。いくつかの実施形態において、抗体誘導体は多価であり、３つ以上の異なる結合部位、例えば３つまたは４つの異なる抗原それぞれに対しての３つまたは４つの異なる結合部位を含む。このような抗体は、それぞれ多価かつ多特異性、具体的には三重特異性または四重特異性である。
【００９３】
好ましくは、上記の抗体誘導体は、ｓｃＦｖ（「単鎖可変フラグメント」または「単鎖抗体」）である。ｓｃＦｖは、リンカーによって連結された抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む融合タンパク質である。従って、ｓｃＦｖは、全長抗体に存在する定常Ｆｃ領域が欠けている。ＶＨおよびＶＬドメインは、可動性リンカーによって、ＶＬ−リンカー−ＶＨまたはＶＨ−リンカー−ＶＬのいずれかの配向で連結されることができる。好ましい実施形態では、配向はＶＬ−リンカー−ＶＨであり、すなわち軽鎖可変領域はＮ末端にあり、重鎖可変領域はポリペプチドのＣ末端にある。リンカーは配列番号１０の配列を有し得るが、より短いまたはより長いリンカーまたは配列番号１０の変異体もまた使用され得る。
【００９４】
したがって、一実施形態では、本明細書で与えられる細胞は、本開示に係るＰＤ−Ｌ１遮断ｓｃＦｖおよび１つ以上のＣＡＲを発現するＴ細胞である。一実施形態では、本明細書で与えられる細胞は、本開示に係るＰＤ−Ｌ１遮断ｓｃＦｖおよび１つ以上のＴＣＲを発現するＴ細胞である。一実施形態では、本明細書で与えられる細胞は、本開示に係るＰＤ−Ｌ１遮断ｓｃＦｖおよび１つ以上のＣＡＲならびに１つ以上のＴＣＲを発現するＴ細胞である。
【００９５】
したがって、一実施形態では、本明細書で与えられる細胞は、本開示に係るＰＤ−Ｌ１遮断ｓｃＦｖおよび１つ以上のＣＡＲを発現するナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。一実施形態では、本明細書で与えられる細胞は、本開示に係るＰＤ−Ｌ１遮断ｓｃＦｖおよび１つ以上のＴＣＲを発現するＮＫＴ細胞である。一実施形態では、本明細書で与えられる細胞は、本開示に係るＰＤ−Ｌ１遮断ｓｃＦｖおよび１つ以上のＣＡＲならびに１つ以上のＴＣＲを発現するＮＫＴ細胞である。
【００９６】
したがって、一実施形態では、本明細書で与えられる細胞は、本開示に係るＰＤ−Ｌ１遮断ｓｃＦｖおよび１つ以上のＣＡＲを発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一実施形態では、本明細書で与えられる細胞は、本開示に係るＰＤ−Ｌ１遮断ｓｃＦｖおよび１つ以上のＴＣＲを発現するＮＫ細胞である。一実施形態では、本明細書で与えられる細胞は、本開示に係るＰＤ−Ｌ１遮断ｓｃＦｖおよび１つ以上のＣＡＲならびに１つ以上のＴＣＲを発現するＮＫ細胞である。
【００９７】
したがって、一実施形態では、本明細書で与えられる細胞は、本開示に係るＰＤ−Ｌ１遮断ｓｃＦｖおよび１つ以上のＣＡＲを発現するヒト胚性幹細胞である。一実施形態では、本明細書で与えられる細胞は、本開示に係るＰＤ−Ｌ１遮断ｓｃＦｖおよび１つ以上のＴＣＲを発現するヒト胚性幹細胞である。一実施形態では、本明細書で与えられる細胞は、本開示に係るＰＤ−Ｌ１遮断ｓｃＦｖおよび１つ以上のＣＡＲならびに１つ以上のＴＣＲを発現するヒト胚性幹細胞である。
【００９８】
したがって、一実施形態では、本明細書で与えられる細胞は、本開示に係るＰＤ−Ｌ１遮断ｓｃＦｖおよび１つ以上のＣＡＲを発現する造血幹細胞（ＨＳＣ）である。一実施形態では、本明細書で与えられる細胞は、本開示に係るＰＤ−Ｌ１遮断ｓｃＦｖおよび１つ以上のＴＣＲを発現する造血幹細胞である。一実施形態では、本明細書で与えられる細胞は、本開示に係るＰＤ−Ｌ１遮断ｓｃＦｖおよび１つ以上のＣＡＲならびに１つ以上のＴＣＲを発現する造血幹細胞である。
【００９９】
したがって、一実施形態では、本明細書で与えられる細胞は、本開示に係るＰＤ−Ｌ１遮断ｓｃＦｖおよび１つ以上のＣＡＲを発現する誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）である。
【０１００】
一実施形態では、本明細書で与えられる細胞は、本開示に係るＰＤ−Ｌ１遮断ｓｃＦｖおよび１つ以上のＴＣＲを発現する誘導多能性幹細胞である。一実施形態では、本明細書で与えられる細胞は、本開示に係るＰＤ−Ｌ１遮断ｓｃＦｖおよび１つ以上のＣＡＲならびに１つ以上のＴＣＲを発現する誘導多能性幹細胞である。
【０１０１】
本明細書で使用されるフレームワークを有する抗体は、ｓｃＦｖフォーマットにおいて驚くほど安定であると記載されている（例えば、国際公開第／２００９／１５５７２６号またはBorras et al, JBC, Vol. 285, no. 12, 9 March 2010, pages 9054-9066を参照）。したがって、抗体は、好ましくは、配列番号１および／または２に含まれるフレームワーク配列またはそれらの変異体を含む。変異体は、例えば、国際公開第２０１４／２０６５６１号に記載の改変、具体的に挙げると、国際公開第２０１４／２０６５６１号の配列番号１５〜２２のＶＬフレームワーク配列を含み得る。
【０１０２】
抗体は、タンパク質に対する免疫応答を回避するために、ヒト化されていることが、好ましい。「ヒト化」抗体は、非ヒト親抗体の１つ以上、典型的には全６つのＣＤＲ領域もしくはそれらの変異体、または合成ＣＤＲを含み、そのフレームワークが、例えば（ｉ）非ヒト親抗体の１つ以上のフレームワーク残基を含む可能性があるヒトフレームワーク、または（ｉｉ）天然に産生されるヒトフレームワークとの類似性を増加させるように改変された非ヒト抗体由来のフレームワークである抗体を指す。抗体をヒト化する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Leger O., and Saldanha J. Antibody Drug Discovery.Edited by Wood C. London: Imperial College Press, 2011.ISBN 1848166281. p.1-23を参照されたい。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、抗体は完全にヒト化されている。
【０１０４】
好ましい実施形態において、抗体は、ＣＤ８０およびＰＤ−１の両方とのＰＤ−Ｌ１相互作用が遮断されるように、ＰＤ−Ｌ１上のエピトープに結合する。ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合はＴ細胞疲弊を誘発し、ＣＤ８０へのＰＤ−Ｌ１の結合はＴ細胞アネルギーを誘発するので、ＰＤ−Ｌ１のＣＤ８０およびＰＤ−１への結合を同時に遮断することは、アネルギーを防ぎ、疲弊を回復させる。
【０１０５】
好ましい実施形態において、抗体は、
ｉ）それぞれ配列番号６、７、および８に示される可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ配列ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、もしくはＣＤＲ−Ｈ３、またはそれらの変異体のうちの１つ以上、
ｉｉ）それぞれ配列番号３、４、および５に示される可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ配列ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、もしくはＣＤＲ−Ｌ３、またはそれらの変異体のうちの１つ以上、
を含む。
【０１０６】
好ましくは、抗体は、
ｉ）配列番号２の１つ以上のＶＨ配列、および／もしくは
ｉｉ）配列番号１の１つ以上のＶＬ配列
またはそれぞれの変異体
を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、前記抗体は、配列番号９を含むｓｃＦＶまたはその変異体である。
【０１０８】
変異体は、いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列の１、２、３、４、５、またはそれ以上の位置において、所与の抗体と異なる抗体であり得る。このような違いは、例えば、置換、付加、修飾、または欠失であり得る。一実施形態において、変異体は、本明細書で開示される配列、特に配列番号１、２、または９と少なくとも８５％、より好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【０１０９】
本明細書に与えられる抗体の変異体は、抗体をコードする塩基配列に適当な改変を導入することによって作製し得る。得られる抗体が適当な方法を用いてスクリーニングすることができる所望の特性を有するならば、フレームワークまたはＣＤＲに、欠失、置換、付加、修飾、および挿入の任意の組み合わせをなすことができる。特に対象となるのは、置換であり、好ましくは保存的置換である。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「保存的置換」は、対応する基準に関して物理的、生物学的、化学的、および／または機能的に特性を維持する修飾および置換を指す。例えば、保存的置換を有する配列を含む分子は、類似のサイズ、形状、電荷、化学的特性、例えば共有結合もしくは水素結合を形成する同等の能力、および／または同等の極性を有し得る。このような保存的改変には、１つ以上の核酸塩基およびアミノ酸の置換、付加、および欠失が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
例えば、保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものが含まれる。例えば、抗原への結合に関して必須ではないアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換することができ、例えば、スレオニンをセリンで置換し得る。アミノ酸残基は、通常、以下のように、共通、類似の側鎖特性に基づいてファミリーに分けられる。
１．非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン）
２．非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、プロリン、システイン、トリプトファン）
３．塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン）
４．酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）
５．ベータ−分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および
６．芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）
【０１１２】
保存的置換は、上記の６つのグループのうちの１つに含まれる第１のアミノ酸を、６つのグループのうちの同じグループ内の他のアミノ酸により置換することとみなすことができる。好ましい保存的置換には、以下が含まれる。
１．アラニン（Ａ）をバリン（Ｖ）により置換すること
２．アルギニン（Ｒ）をリシン（Ｋ）により置換すること
３．アスパラギン（Ｎ）をグルタミン（Ｑ）により置換すること
４．アスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）により置換すること
５．システイン（Ｃ）をセリン（Ｓ）により置換すること
６．グルタミン酸（Ｅ）をアスパラギン酸（Ｄ）により置換すること
７．グリシン（Ｇ）をアラニン（Ａ）により置換すること
８．ヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）により置換すること
９．イソロイシン（Ｉ）をロイシン（Ｌ）により置換すること
１０．メチオニン（Ｍ）をロイシン（Ｌ）により置換すること
１１．フェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）により置換すること
１２．セリン（Ｓ）をスレオニン（Ｔ）により置換すること
１３．トリプトファン（Ｗ）をチロシン（Ｙ）により置換すること
１４．フェニルアラニン（Ｆ）をトリプトファン（Ｗ）により置換すること
および／または
１５．バリン（Ｖ）をロイシン（Ｌ）により置換すること
ならびにそれらの逆。プロリン（Ｐ）をアラニン（Ａ）により置換するなどの他の置換も許容され、経験的に、または他の公知の保存的置換もしくは非保存的置換を踏まえて決定することができる。保存的置換はまた、非天然アミノ酸の使用を伴い得る。
【０１１３】
本明細書に記載の抗体は、このような保存的置換を１つ以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上含み得る。
【０１１４】
別の実施形態では、非保存的置換が本明細書に開示されるいずれかの配列に導入されて変異体を生じる。一実施形態において、抗体は、このような非保存的置換を１つ以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上含む。
【０１１５】
特に好ましいタイプの変異体は、１つ以上のＣＤＲ全体が置換されているものである。通常、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３は、抗原結合に最も顕著に寄与する。例えば、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｈ１、および／またはＣＤＲ−Ｈ２全体を、天然または人工起源の異なるＣＤＲにより置き換え得る。いくつかの実施形態において、１つ以上のＣＤＲがアラニンカセットにより置き換えられている。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、変異体は、親抗体に対して改善を示さない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の変異体抗体は、
（ｉ）ＰＤ−Ｌ１、特にｈＰＤ−Ｌ１に対する特異的結合を保持し、好ましくはＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との間の相互作用を遮断し；かつ／または
（ｉｉ）KinExA（登録商標）により測定して５００ｐＭ未満、好ましくは２５０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、７５ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、４０ｐＭ未満、３０ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、より好ましくは１０ｐＭ未満のヒトＰＤ−Ｌ１に対するＫＤを有し；かつ／または
（ｉｖ）ＰＤ−Ｌ１への結合に関して本明細書に開示される抗体と競合し；かつ／または
（ｖ）本明細書に開示される配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくは９７％の配列同一性を有する。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、抗体は、ＰＤ−Ｌ１に対して高い親和性を有し、１００ｐＭ未満、例えば約７５ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、または１０ｐＭ未満のＫＤでｈＰＤ−Ｌ１に結合する。例えば、抗体は２価であり、KinExA（登録商標）により測定して１０ｐＭ未満、好ましくは５ｐＭ未満、より好ましくは約３ｐＭ、例えば２．９ｐＭ、２．８ｐＭ、または２．７ｐＭのＫＤでＰＤ−Ｌ１に結合する。いくつかの実施形態において、このような二価抗体は全長免疫グロブリンである。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、本明細書で与えられる抗体は一価であり、KinExA（登録商標）により測定して５０ｐＭ未満のＫＤでヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。前記ＫＤは、好ましくは、約１０ｐＭ未満、例えば約９ｐＭ未満、例えば９．０ｐＭ、８．９ｐＭ、８．８ｐＭ、または８．７ｐＭである。いくつかの実施形態において、前記一価抗体はｓｃＦｖである。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、本明細書で与えられる抗体は一価であり、KinExA（登録商標）により測定して５０ｐＭ未満のＫＤでサルＰＤ−Ｌ１に結合する。前記ＫＤは、KinExA（登録商標）により測定して、好ましくは約１０ｐＭ未満、より好ましくは約５ｐＭ未満、例えば約３．４ｐＭ、３．３ｐＭ、または３．２ｐＭである。
【０１２０】
このようなKinExA（登録商標）測定は、好ましくは室温で、より好ましくは実施例１に記載の条件下で行う。
【０１２１】
高親和性抗体は、少量の改変免疫細胞がその標的部位に存在し、それに応じて限られた量の抗体を発現する場合でさえ、保護効果を与えるために有利であり得る。
【０１２２】
また、ヒトＰＤ−Ｌ１およびサルＰＤ−Ｌ１に結合する抗体を発現する上記の改変免疫細胞も与えられる。好ましくは、サルＰＤ−Ｌ１に対する親和性は、ヒトＰＤ−Ｌ１に対する親和性より２倍以上強い。いくつかの実施形態において、サルＰＤ−Ｌ１に対する一価抗体、好ましくはｓｃＦｖの親和性ＫＤは、例えば室温で、好ましくは実施例１に示した条件下で測定して、KinExA（登録商標）により測定して約３．３ｐＭである。
【０１２３】
ＰＤ−Ｌ２およびＢ７−Ｈ３などのＢ７ファミリーの他の構成要素と交差反応性を持たない抗体がさらに与えられる。
【０１２４】
ＰＤ−Ｌ１への結合について本明細書に開示される抗体と競合する抗体を発現する、上記の改変免疫細胞がさらに企図される。
【０１２５】
本明細書に記載の改変免疫細胞は、抗体を分泌し、かつ／またはその表面に抗体を発現し得る。好ましい実施形態において、抗体が分泌される。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、細胞は、第２の抗体またはサイトカインなどの１つ以上の他のタンパク質化合物をさらに組み換え発現し得る。サイトカインは、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはＭＩＰ−１アルファからなる群から選択され、好ましくはヒト起源のもの、すなわちｈＩＬ−２、ｈＩＬ−４、ｈＩＬ−７、ｈＩＬ−１５、ｈＩＬ−２１、またはｈＭＩＰ−１アルファである。いくつかの実施形態において、当該細胞はｈＩＬ−１５を発現する。ＩＬ−１５は、ＣＡＲ  ＮＫＴ細胞のインビボ持続性および抗腫瘍活性を改善すると記載されている（国際公開第２０１３／０４０３７１号参照）。当該第２の抗体は、例えば、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、ＩＬ−１０、Ｆａｓ、ＣＤ４７、ＣＴＬＡ−４、Ｔｉｍ−３、ＬＡＧ−３、またはそれらのリガンドなどの免疫抑制分子を標的とし得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、改変免疫細胞は、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含むＣＡＲである抗原レセプターと、本明細書に記載の抗体と、さらにＩＬ−１５とを発現する。いくつかの実施形態において、改変免疫細胞は、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むＣＡＲである抗原レセプターと、本明細書に記載の抗体と、さらにＩＬ−１５とを発現する。
【０１２８】
したがって、天然のＴＣＲ、（特に腫瘍抗原に特異的な）キメラ抗原レセプター、および本開示に係るＰＤ−Ｌ１に対する抗体、特にｓｃＦｖを有するＮＫＴ細胞が与えられる。ＮＫＴ細胞は、ＩＬ−１５などのサイトカインをさらにコードする。
【０１２９】
さらに企図されるのは、本明細書に記載の抗原レセプターおよび／または抗体をコードする核酸である。タンパク質は、複数の塩基配列によってコードされていてもよい。いくつかの実施形態において、タンパク質は単一の塩基配列によってコードされる。典型的には、核酸は単離核酸である。
【０１３０】
抗体および／または抗原レセプターの配列が分かると、それぞれのポリペプチド配列をコードするｃＤＮＡは、当技術分野で周知の方法、例えば、遺伝子合成により作製できる。これらのｃＤＮＡは、標準的なクローニングおよび突然変異誘発技術によって、発現ベクターまたはクローニングベクターなどの適切なベクターにクローニングすることができる。したがって、さらに企図されるのは、本明細書に記載の抗原レセプターおよび／または抗体をコードするｃＤＮＡである。
【０１３１】
選択されたクローニング法に基づいて、遺伝子コンストラクトは、Ｎ末端またはＣ末端に１つ以上の追加の残基を有する抗体および／または抗原レセプターを生じ得る。したがって、本明細書中に開示される抗体は、開示される配列からなるのではなく、むしろ開示される配列を含むことが理解されるべきである。
【０１３２】
標準的なクローニング、突然変異誘発、および分子生物学的手法の基本的なプロトコールは、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual（Green M. and Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual.4th edition.Cold Spring Harbor Laboratory, 2012.ISBN 1936113422.）に記載されている。
【０１３３】
本明細書に記載の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離核酸がさらに企図される。
【０１３４】
また、発現ベクターまたはクローニングベクターなどの本明細書で与えられる核酸を含むベクターも与えられる。本明細書に記載の抗原レセプターおよび抗体をコードする１つ、２つ、またはそれ以上の核酸は、ベクターに含まれ得、当該ベクターは、同じベクター（バイシストロン性もしくはマルチシストロン性）または別個のベクターであり得る。発現ベクターは、例えば、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａ様配列、または二重プロモーターを使用するバイシストロン性ベクターなどのマルチシストロン性ベクターであり得る。
【０１３５】
発現ベクターは、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、または、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。発現ベクターは、プラスミド、トランスポゾン、挿入配列、または人工染色体を含む非ウイルスベクターでもあり得る。核酸分子は、いくつかの実施形態において、発現カセットを規定し得る。発現カセットは、適当な宿主細胞中の特定の塩基配列の発現を指示することができる核酸分子である。発現カセットは、１つ以上の終結シグナルに作動可能に連結されている目的の塩基配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。発現カセットはまた、塩基配列の適切な翻訳に必要とされる配列も含み得る。コード領域は、目的のポリペプチドをコードすることができる。発現カセット中の塩基配列の発現は、構成的プロモーター、または宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激に曝された場合にのみ転写を開始する誘導性プロモーターの制御下にあり得る。いくつかの実施形態において、抗体はレトロウイルスの５”末端ＬＴＲの制御下にある。抗原レセプターをコードする核酸および／または抗体をコードする核酸は、それぞれ、同じプロモーターまたは異なるプロモーターであり得るプロモーターに作動可能に連結され得る。
【０１３６】
核酸および／またはベクターは、シグナルペプチドをさらに含み得る。典型的には、シグナルペプチドは、分泌されるタンパク質のＮ末端に結合される５〜３０アミノ酸のペプチドであり、タンパク質分泌を増加させるために結合される。好ましい実施形態において、シグナルペプチドはヒトのシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはｈＩｇＧ１である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号１５を含む。
【０１３７】
追加的または代替的に、抗体は膜に固定されている。当該膜固定型抗体は、膜貫通ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、膜固定型抗体はシグナル伝達ドメインを含まない。一実施形態において、抗体が分泌され、膜固定型としても与えられる。
【０１３８】
遺伝子改変免疫細胞は、自殺スイッチなどの安全スイッチを含み得る。当該スイッチは、重大な副作用が現れた場合に細胞の活性を抑制するか、または健常組織を攻撃する場合に細胞を自己破壊させる。典型的には、当該スイッチは制御可能であり、そのため細胞上に追加のレセプターまたは他の標的を必要とする。当該安全スイッチは、対象に第２の薬剤を投与することによって制御される。したがって、いくつかの実施形態では、ベクターは、安全スイッチ、好ましくは自殺スイッチをコードする塩基配列を含む。
【０１３９】
本発明は、本明細書に記載の免疫細胞を作製する方法であって、
（ａ）免疫細胞を与えるステップと、
（ｂ）前記抗原レセプターをコードする１つ以上の核酸および前記抗体をコードする１つ以上の核酸を前記細胞に導入するステップと、
（ｃ）前記細胞により前記核酸を発現させるステップと、
を含む前記方法も与える。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）は、上記のような発現ベクターを前記細胞に導入することを含む。
【０１４１】
方法は、
（ｉ）ステップ（ｂ）に記載の抗原レセプターとは異なる抗原特異性を有する１つ以上の他の抗原レセプターを前記細胞に導入し；かつ／またはステップ（ｂ）に記載の抗体とは異なる抗原特異性を有する１つ以上の他の抗体を前記細胞に導入する追加のステップ、
を含み得る。
【０１４２】
本発明は、
ｉ）有効量の本明細書に記載の改変免疫細胞、または本明細書に記載の発現ベクター、および
ｉｉ）薬剤的に許容できる賦形剤
を含む医薬組成物にも関する。
【０１４３】
好適な「賦形剤」には、限定はされないが、（ｉ）緩衝剤、例えばリン酸、クエン酸、または他の有機酸；（ii）酸化防止剤、例えばアスコルビン酸およびトコフェロール；（ｉｉｉ）防腐剤、例えば３−ペンタノール、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、アルキルパラベン、カテコール、またはシクロヘキサノール；（ｉｖ）アミノ酸、例えばヒスチジン、アルギニン；（ｖ）ペプチド、好ましくは最大１０残基、例えばポリリシン；（ｖｉ）タンパク質、例えばウシまたはヒト血清アルブミン；（ｖｉｉ）親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；（ｖｉｉｉ）単糖類、二糖類、多糖類、および／または他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、アミノデキストラン、またはポリアミドアミン；（ｉｘ）キレート剤、例えばＥＤＴＡ；（ｘ）塩形成イオン、例えばナトリウム、カリウム、および／または塩化物；（ｘｉ）金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；（ｘｉｉ）イオン性および非イオン性界面活性剤、例えばTWEENＴＭ、PLURONICSＴＭ、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、（ｘｉｉｉ）凍結保存剤、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が含まれる。
【０１４４】
本明細書に記載の改変免疫細胞、本明細書に記載の発現ベクター、および／または本明細書に記載の医薬組成物は、治療に有用である。したがって、治療に有用な、本明細書に記載の改変免疫細胞、本明細書に記載の発現ベクター、および／または本明細書に記載の医薬組成物が、さらに与えられる。
【０１４５】
また、治療を必要とする対象を治療する方法であって、
（ａ）本明細書に記載の改変免疫細胞を与えること、および
（ｂ）前記対象に前記免疫細胞を投与すること
を含む前記方法も与えられる。
【０１４６】
追加的または代替的に、治療方法は、本明細書に記載の発現ベクターおよび／または本明細書に記載の医薬組成物の製造および投与を含む。
【０１４７】
本明細書で使用される用語「治療」および「治療する」は、治療効果を有し、かつ／または対象の生物における病的状態を含む異常な状態を予防、減速（緩和）、もしくは少なくとも部分的に緩和もしくは抑制する、予防的または防止的手段を含む。本開示に係る治療は、薬剤的に有効な量の本明細書中に記載の分子、核酸、ベクター、医薬組成物、および／または改変免疫細胞、すなわちとりわけ、本明細書に開示される細胞、ベクター、または組成物を、治療を必要とする対象に投与して、治療される状態の１つ以上の症状を予防、治癒、発症および／または進行の遅延、重症度の軽減、安定化、調節、治癒、または寛解することを含む。治療を必要とする者には、すでに障害を有する者および障害を有しやすい者、または障害を防止（予防）すべき者が含まれる。一般に、治療は、疾患または病的状態の存在および／または進行に関連する症状の進行を軽減、安定化、または阻害する。
【０１４８】
治療を必要とする対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。典型的には、対象は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、サル（monkey）、サル（ape）、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、モルモット、またはブタである。典型的な実施形態では、対象は、癌および／またはＰＤ−Ｌ１関連障害と診断されるか、またはこのような障害を獲得し得る。動物モデルの場合、このような障害を発症するように動物を遺伝子改変し得る。
【０１４９】
典型的には、有効量の本明細書に開示される細胞、ベクター、または組成物を対象に投与する。「有効量」は、単回用量としてまたは一連の用量の一部として、適用される投薬計画で所望の治療効果をもたらす、すなわち特定の治療目標に達する量である。治療有効量は、通常、関連する病的状態の治療もしくは管理において治療上の利益を与えるのに、または当該状態の存在に関連する１つ以上の症状を遅延もしくは最小限にするのに十分な量である。投与量は、患者および臨床学的因子（例えば、患者の年齢、体重、性別、病歴、障害の重症度、および／または治療に対する応答）、治療される障害の性質、投与される具体的な組成物、投与経路、ならびに他の因子に依存する。
【０１５０】
本明細書で使用される用語「投与」は、本明細書に記載の細胞、ベクター、または組成物などの物質を対象に移入、送達、導入、または輸送する任意の様式を指す。投与は、局所的または全身的投与であり得る。投与の好ましい様式には、非経口的、例えば、静脈内または全身的投与が含まれるが、これらに限定されない。１つ以上の治療薬などの他の物質との「併用」での投与には、同時（simultaneous）（同時（concurrent））および任意の順序での連続投与が含まれる。
【０１５１】
細胞、ベクター、または組成物は、１回以上前記対象に投与される。
【０１５２】
細胞、ベクター、または組成物は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法、および放射線療法の群から選択される１つ以上の療法との併用で投与され得る。本発明の療法は、数分から数週間の範囲の間隔で、他の薬剤治療に先行または後行し得る。
【０１５３】
細胞は、対象由来または同じ種の別の個体由来であり得る、すなわち細胞は自己由来または同種異系である。自己由来の養子移入は、患者の細胞の抽出と、例えば上記のように、前記細胞を遺伝子改変することと、同じ患者に前記細胞を戻す前にインビトロで前記細胞を培養することとを必要とする。各新規患者のためにこのように個々に調製することは、癌の治療における細胞免疫療法の適用を制限する。しかしながら、既製品として、健康なドナー由来の同種異系Ｔ細胞は、異物として患者の身体を認識するリスクがあり、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）と呼ばれる重篤な副作用を引き起こす可能性がある。健康なドナーから大量に得られるＣＡＲ改変ＮＫＴ細胞をベースとする既製治療薬は、大きな期待感を抱かせるものである。従来のＴ細胞のような強力な癌殺滅特性が付与されているが、インバリアントＮＫＴ細胞は、ＧｖＨＤに関連しない特殊なＴ細胞レセプターを発現する。したがって、同種異系ＮＫＴ細胞を使用して、最小限のＧｖＨＤのリスクで、複数の癌患者を治療することができる。
【０１５４】
治療を必要とする対象は、状態、前悪性または悪性の癌状態、例えば、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、尿路上皮癌、メラノーマ、腎細胞癌、ホジキンリンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、卵巣癌、胃腸癌、肝細胞癌、神経膠腫、乳癌、リンパ腫、小細胞肺癌、骨髄異形成症候群、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、非淡明細胞腎癌、結腸直腸癌、肉腫、結腸癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌または胃癌、皮膚癌、子宮癌、神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、肉腫、頭頸部癌、白血病、癌腫、メルケル細胞癌または腎細胞癌（ＲＣＣ）、多発性骨髄腫、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞白血病、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫;病原体感染、自己免疫障害を有し得るが、これらに限定はされない。
【０１５５】
本発明は、本明細書に記載の改変免疫細胞、本明細書に記載の発現ベクター、または本明細書に記載の医薬組成物、および使用説明書を含む、癌、病原体感染、自己免疫疾患の治療のためのキットをさらに与える。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、キットは、安全スイッチの誘導因子をさらに含み得る。
【０１５７】
配列
本明細書で開示される配列は以下である。
配列番号１−ｓｃＦＶのＶＬ
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEDIYSLLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNYGSSSSSSYGAVFGQGTKLTVLG
配列番号２−ｓｃＦＶのＶＨ
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGIDLSSYTMGWVRQAPGKGLEWVGIISSGGRTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRYTGYPYYFALWGQGTLVTVSS
配列番号３−ｓｃＦＶのＣＤＲ−Ｌ１
QASEDIYSLLA
配列番号４−ｓｃＦＶのＣＤＲ−Ｌ２
DASDLAS
配列番号５−ｓｃＦＶのＣＤＲ−Ｌ３
QGNYGSSSSSSYGAV
配列番号６−ｓｃＦＶのＣＤＲ−Ｈ１
IDLSSYTMG
配列番号７−ｓｃＦＶのＣＤＲ−Ｈ２
IISSGGRTYYASWAKG
配列番号８−ｓｃＦＶのＣＤＲ−Ｈ３
GRYTGYPYYFAL
配列番号９−ｓｃＦＶ
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEDIYSLLAWYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNYGSSSSSSYGAVFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGIDLSSYTMGWVRQAPGKGLEWVGIISSGGRTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRYTGYPYYFALWGQGTLVTVSS
配列番号１０−リンカー
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号１１−フォーワードプライマー
TAACCATGGAGTTTGGGCTGAG
配列番号１２−リバースプライマー
GACGCATGCTCAGCTCGACACGGTGACC
配列番号１３−１４ｇ２ａ  ｓｃＦｖのＶＬ配列
【化１】
2019513009.tif 000002
（太字で強調されたＣＤＲ配列）
配列番号１４−１４ｇ２ａ  ｓｃＦｖのＶＨ配列
【化２】
2019513009.tif 000003
（太字で強調されたＣＤＲ配列）
配列番号１５−ｈＩｇＧ１シグナルペプチド
MEFGLSWLFLVAILKGVQ
配列番号１６−抗ＧＤ２−ＣＡＲのＣＤＲ−Ｌ１
RSSQSLVHRNGNTYLH
配列番号１７−抗ＧＤ２−ＣＡＲのＣＤＲ−Ｌ２
KVSNRFS
配列番号１８−抗ＧＤ２−ＣＡＲのＣＤＲ−Ｌ３
SQSTHVPPLT
配列番号１９−抗ＧＤ２−ＣＡＲのＣＤＲ−Ｈ１
SSFTGYNMN
配列番号２０−抗ＧＤ２−ＣＡＲのＣＤＲ−Ｈ２
AIDPYYGGTSYNQKFKG
配列番号２１−抗ＧＤ２−ＣＡＲのＣＤＲ−Ｈ３
GMEY
配列番号２２−抗ＣＳＰＧ４  ＣＡＲのＣＤＲ−Ｌ１
RASQTIYKNLH
配列番号２３−抗ＣＳＰＧ４  ＣＡＲのＣＤＲ−Ｌ２
YGSDSIS
配列番号２４−抗ＣＳＰＧ４  ＣＡＲのＣＤＲ−Ｌ３
LQGYSTPWT
配列番号２５−抗ＣＳＰＧ４  ＣＡＲのＣＤＲ−Ｈ１
YTFTDYSMH
配列番号２６−抗ＣＳＰＧ４  ＣＡＲのＣＤＲ−Ｈ２
WINTATGEPTYADDFKG
配列番号２７−抗ＣＳＰＧ４  ＣＡＲのＣＤＲ−Ｈ３
YYDY
配列番号２８−抗ＣＳＰＧ４  ＣＡＲのＶＬ配列
LDIKLTQSPSILSVTPGETVSLSCRASQTIYKNLHWYQQKSHRSPRLLIKYGSDSISGIPSRFTGSGSGTDYTLNINSVKPEDEGIYYCLQGYSTPWTFGGGTKLEIKR
配列番号２９−抗ＣＳＰＧ４  ＣＡＲのＶＨ配列
QVKLKESGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKKTPGKGLKWLGWINTATGEPTYADDFKGRFAISLETSARTVYLQINNLRNEDTATYFCFSYYDYWGQGTTVTVSS
配列番号３０−抗ＧＰＣ３  ＣＡＲのＣＤＲ−Ｌ１
RSSQSLVHSNRNTYLH
配列番号３１−抗ＧＰＣ３  ＣＡＲのＣＤＲ−Ｌ２
KVSNRFS
配列番号３２−抗ＧＰＣ３  ＣＡＲのＣＤＲ−Ｌ３
SQNTHVPPT
配列番号３３−抗ＧＰＣ３  ＣＡＲのＣＤＲ−Ｈ１
YTFTDYEMH
配列番号３４−抗ＧＰＣ３  ＣＡＲのＣＤＲ−Ｈ２
ALDPKTGDTAYSQKFKG
配列番号３５−抗ＧＰＣ３  ＣＡＲのＣＤＲ−Ｈ３
FYSYTY
配列番号３６−抗ＧＰＣ３  ＣＡＲのＶＬ
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKR
配列番号３７−抗ＧＰＣ３  ＣＡＲのＶＨ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSS
配列番号３８−抗ＧＰＣ３  ＣＡＲのＶＨ
QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSA
配列番号３９−抗５Ｔ４  ＣＡＲのＣＤＲ−Ｌ１
YSFTGYYMH
配列番号４０−抗５Ｔ４  ＣＡＲのＣＤＲ−Ｌ２
RINPNNGVTLYNQKFKD
配列番号４１−抗５Ｔ４  ＣＡＲのＣＤＲ−Ｌ３
STMITNYVMDY
配列番号４２−抗５Ｔ４  ＣＡＲのＣＤＲ−Ｈ１
KASQSVSNDVA
配列番号４３−抗５Ｔ４  ＣＡＲのＣＤＲ−Ｈ２
YTSSRYA
配列番号４４−抗５Ｔ４  ＣＡＲのＣＤＲ−Ｈ３
QQDYNSPPT
配列番号４５−抗５Ｔ４  ＣＡＲのＶＬ
SIVMTQTPTFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPTLLISYTSSRYAGVPDRFIGSGYGTDFTFTISTLQAEDLAVYFCQQDYNSPPTFGGGTKLEIKR
配列番号４６−抗５Ｔ４  ＣＡＲのＶＨ
EVQLQQSGPDLVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSHGKSLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDKAILTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARSTMITNYVMDYWGQVTSVTVSS
配列番号４７−４１ＢＢ共刺激ドメイン
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
配列番号４８−ＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号４９−ＣＤ２８共刺激ドメイン
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
配列番号５０−サバイビン特異的ＴＣＲ、ベータ鎖
DAMVIQNPRYQVTQFGKPVTLSCSQTLNHNVMYWYQQKSSQAPKLLFHYYDKDFNNEADTPDNFQSRRPNTSFCFLDIRSPGLGDAAMYLCATSRGDSTAEPQHFGDGTRLSIL
配列番号５１−サバイビン特異的ＴＣＲ、アルファ鎖
GESVGLHLPTLSVQEGDNSIINCAYSNSASDYFIWYKQESGKGPQFIIDIRSNMDKRQGQRVTVLLNKTVKHLSLQIAATQPGDSAVYFCAETVTDSWGKLQFGAGTQVVVTPD
配列番号５２−ＷＴ−１特異的ＴＣＲ、ＣＤＲ１アルファ
SSYSPS
配列番号５３−ＷＴ−１特異的ＴＣＲ、ＣＤＲ２アルファ
YTSAATL
配列番号５４−ＷＴ−１特異的ＴＣＲ、ＣＤＲ３アルファ
WSPFSGGGADGLT
配列番号５５−ＷＴ−１特異的ＴＣＲ、ＣＤＲ３アルファ
SPFSGGGADGLT
配列番号５６−ＷＴ−１特異的ＴＣＲ、ＣＤＲ１ベータ
DFQATT
配列番号５７−ＷＴ−１特異的ＴＣＲ、ＣＤＲ２ベータ
SNEGSKA
配列番号５８−ＷＴ−１特異的ＴＣＲ、ＣＤＲ３ベータ
SARDGGEG
配列番号５９−ＷＴ−１特異的ＴＣＲ、ＣＤＲ３ベータ
RDGGEGSETQY
配列番号６０−ＷＴ−１特異的ＴＣＲ、アルファ鎖
MLLLLVPVLEVIFTLGGTRAQSVTQLDSHVSVSEGTPVLLRCNYSSSYSPSLFWYVQHPNKGLQLLLKYTSAATLVKGINGFEAEFKKSETSFHLTKPSAHMSDAAEYFCVVSPFSGGGADGLT
配列番号６１−ＷＴ−１特異的ＴＣＲ、ベータ鎖
MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSWVICKSGTXVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSARDGGEG
配列番号６２−ＷＴ−１特異的ＴＣＲ、アルファ鎖
MLLLLVPVLEVIFTLGGTRAQSVTQLDSHVSVSEGTPVLLRCNYSSSYSPSLFWYVQHPNKGLQLLLKYTSAATLVKGINGFEAEFKKSETSFHLTKPSAHMSDAAEYFCVVSPFSGGGADGLT
配列番号６３−ＷＴ−１特異的ＴＣＲ、ベータ鎖
MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSWVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSARDGGEGSETQY
【０１５８】
以下は、本明細書に開示される方法および組成物を例示する実施例である。上述の一般的な説明を考慮すると、様々な他の実施形態が実施され得ることが了解される。
【実施例】
【０１５９】
細胞株
２９３Ｔ細胞はＡＴＣＣから入手し、神経芽腫腫瘍細胞株ＣＨＬＡ−２５５はDr Leonid Metelitsa Baylor College of Medicine（テキサス州ヒューストン）から親切にも提供された。細胞を、１０％ＦＢＳ（Corning）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、および１％ペニシリン／ストレプトアビジン（Gibco）を含有し、２９３ＴについてはＩＭＤＭ（Gibco）を含み、ＣＨＬＡ−２５５についてはＲＰＭＩ  １６４０（Gibco）を含む培地で、３７℃で５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で維持した。
【０１６０】
実施例１−ｓｃＦｖのキャラクタリゼーション
ヒトＰＤ−Ｌ１の中和
抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ（配列番号９参照）は、ウサギＣＤＲを含むヒト化タンパク質である。ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻害するその能力を競合ＥＬＩＳＡによって試験した。簡潔に述べると、ｒｈＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ融合体を９６ウェルマイクロプレート上にコーティングした。ブロッキング後、ｓｃＦｖの段階希釈物をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。ｓｃＦｖ希釈液の半分をビオチン化ＰＤ−１  Ｆｃ融合体で置き換え、結合したＰＤ−１をストレプトアビジン−ＨＲＰで検出した。
【０１６１】
同様に、ＰＤ−Ｌ１のＣＤ８０への結合を阻害する能力を競合ＥＬＩＳＡによってｒｈＣＤ８０−Ｈｉｓを用いて試験した。ブロッキング後、５０ｎＭの一定濃度のｒｈＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ融合体を用いてｓｃＦｖの段階希釈液を調製した。この混合物をＣＤ８０でコーティングしたプレートで室温で２時間インキュベートした。ＰＤ−Ｌ１のＣＤ８０への結合がないことに対応するバックグラウンドレベルは、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃが存在しないｓｃＦｖ１の希釈系列を含めることによって測定した。結合したＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ融合体をヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰで検出した。このアッセイにおいて、ＰＤ−Ｌ１がＣＤ８０と相互作用する能力は、ｓｃＦｖによってバックグラウンドレベルまで効果的に中和される吸光シグナルを生じる。まとめると、これらの結果は、ｓｃＦｖがＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１およびＣＤ８０の両方との相互作用を遮断することを示している。
【０１６２】
安定性
ｓｃＦｖの安定性に影響し得る２つの異なるプロセスを観察することができる。第一に、ｓｃＦｖは二量体化されやすく、その後オリゴマー化され、さらに凝集および沈殿することもよくある。第二に、より小さいフラグメントをもたらすｓｃＦｖの分解は、時間が経つにつれて起こり得る。
【０１６３】
ＰＢＳ  ｐＨ７．２中で１０ｍｇ／ｍＬの濃度で調製したｓｃＦｖの様々な温度条件（４℃、２２℃、３７℃、および−２０℃）で保存した時の安定性を調べた。４℃、２２℃、および３７℃で２週間保存すると、ｓｃＦｖの二量体化または高分子量分子の形成は、わずかにしか観察されなかった。ｓｃＦｖは、３７℃で１または２週間保存した後、それぞれ最大１．８％および２．７％の二量体を形成した。
【０１６４】
熱安定性は、リアルタイムＰＣＲ装置（Corbett, Rotor-Gene）で示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）によって評価した。Rotor-Gene 6000 Series Software 1.7.を用いて計算したｓｃＦｖの中点融解温度（Ｔｒａ）は、８１．５℃であった。
【０１６５】
タンパク質性生物製剤は、凝集および分解を引き起こし得る、製造、保存、および輸送中の凍結／融解ストレスにさらされることになり得る。凍結／融解サイクル中の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖの安定性を評価するために、１．５ｍＬのポリプロピレンチューブ中で１０ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ  ｐＨ  ７．２で製剤化した。バイアルを液体窒素に浸し、続いて室温の水浴中でインキュベートした。遠心分離後、上清をＳＥ−ＨＰＬＣで分析した。ｓｃＦｖの実質的に１００％は、１０回の凍結／融解サイクル後に単量体のままであり、タンパク質の損失または沈殿は観察されなかった。
【０１６６】
ヒト血清（Sigma- Aldrich、カタログ番号H4522）中の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖの安定性をＥＬＩＳＡによって評価した。３７℃でヒト血清での２０時間までのインキュベーション後にｓｃＦｖの結合活性の喪失はなかった。
【０１６７】
ｓｃＦｖおよび全長抗体の結合平衡除外法（Kinetic Exclusion Assay）
ＰＤ−Ｌ１に対する一価抗体および二価抗体の親和性を、KinExA 3200（Sapidyne Instruments、米国、カタログ番号5001）を用いた結合平衡除外法（Kinetic Exclusion Assay）（KinExA（登録商標））によって測定した。KinExA（登録商標）は、溶液中の未改変分子間の平衡結合親和性および動態を測定する。測定は、溶液中の対応する結合パートナーの濃度を測定するためのプローブとしてのみ作用するように、固相上に１つの相互作用パートナーを固定化することを必要とする。
【０１６８】
ａ）一価抗体
ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合体に対するｓｃＦｖの親和性を、０．０２％アジ化ナトリウムを含むｐＨ７．４のＰＢＳ中で、室温で測定した。２つの曲線を測定したが、一方は２０ｐＭ  ｓｃＦｖ１を５時間のインキュベーション時間で使用し、もう一方は１０ｐＭ  ｓｃＦｖ１で９時間のインキュベーション時間で行った。ｓｃＦｖのＫＤ値は８．８ｐＭであり、KinExA（登録商標）Proソフトウェアバージョン4.1.9または4.2.10.の「ｎ曲線解析」を用いて計算した。
【０１６９】
ｂ）二価抗体
ｓｃＦｖをＩｇＧフォーマットに再フォーマットし、最初ATCCから得、懸濁培養で無血清増殖に適合させた懸濁液適合ＣＨＯ  Ｋ１細胞で発現させた。ＩｇＧ抗体をプロテインＡクロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓへの結合についてのＫＤを、０．０２％アジ化ナトリウムを含むｐＨ７．４のＰＢＳ中で、室温で２つの曲線を用いて計算した。一方の曲線は１００ｐＭのＩｇＧを５時間のインキュベーション時間で使用し、もう一方は１０ｐＭのＩｇＧを１０時間のインキュベーション時間で使用した。ヒトＰＤ−Ｌ１へのＩｇＧの結合について計算されたＫＤ値は２．７７ｐＭであった。結果は、ＩｇＧが、ＰＤ−Ｌ１に対するｓｃＦｖの親和性よりも約３倍強い親和性でＰＤ−Ｌ１に結合することを実証する。
【０１７０】
選択性
他の種からのＰＤ−Ｌ１に対するｓｃＦｖの交差反応性を、ヒト（RnD Systems、米国、カタログ番号156-B7）、ラット（Sino Biological、中国、カタログ番号80450-R02H）、またはサル（Sino Biological、中国、カタログ番号90251-C02H）由来のＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ融合体を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、ｓｃＦｖがヒトおよびサルＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するが、ラットＰＤ−Ｌ１には特異的に結合しないことを示した。サルＰＤ−Ｌ１に対する抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖの交差反応性を、KinExA（登録商標）を用いてさらに調べた。ＫＤ値を、０．０２％アジ化ナトリウムを含むｐＨ７．４のＰＢＳ中で、室温で２つの曲線を用いて計算した。一方の曲線は５０ｐＭのｓｃＦｖを６時間のインキュベーション時間で使用し、もう一方は１０ｐＭのｓｃＦｖを１６時間のインキュベーション時間で使用した。ｓｃＦｖについて計算されたＫＤ値は３．３ｐＭであった。結果は、ｓｃＦｖが、ヒトＰＤ−Ｌ１に対する結合よりも約２．７倍強い親和性でサルＰＤ−Ｌ１に結合することを実証する。
【０１７１】
ＰＤ−Ｌ１と配列類似性を共有する組み換えヒトタンパク質に対するｓｃＦｖの交差反応性を、ｒｈＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ融合体（RnD Systems、米国、カタログ番号156-B7）、ｒｈＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合体（RnD Systems、米国、カタログ番号1224-PL）、またはｒｈＢ７−Ｈ３  Ｆｃ融合体（RnD Systems、米国、カタログ番号1027-B3）を使用してＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、ｓｃＦｖがヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、ヒトＰＤ−Ｌ２またはＢ７−Ｈ３に対しては交差反応性がないことを示した。
【０１７２】
細胞表面ＰＤ−Ｌ１への結合
細胞表面上のＰＤ−Ｌ１に結合するｓｃＦｖの能力を、ＥＳ−２細胞（ATCC、米国、カタログ番号CRL-1978）の細胞外ＦＡＣＳ染色によって測定した。結果は、ｓｃＦｖが、細胞の表面上に発現された天然型のＰＤ−Ｌ１を特異的に認識することができることを実証する。
【０１７３】
細胞表面ＰＤ−Ｌ１へのｓｃＦｖの結合を、室温で０．０２％アジ化ナトリウムを含むｐＨ７．４のＰＢＳ中で、KinExA（登録商標）を用いてさらに調べた。５０ｐＭ  ｓｃＦｖおよび５時間のインキュベーション時間を使用して１つの曲線を構築した。ＥＳ−２細胞上の細胞表面に発現されたＰＤ−Ｌ１へのｓｃＦｖ結合の計算ＫＤ値は、１２．８ｐＭである。
【０１７４】
実施例２−抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖをコードするレトロウイルスコンストラクトの作製およびレトロウイルス産生
抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを、５’末端にＮｃｏＩ制限部位を（フォーワードプライマー）、３’末端に終止コドンＴＧＡおよび制限部位ＳｐｈＩを（リバースプライマー）付加するために、以下のプライマー：フォーワード：5'-TAACCATGG AGTTTGGGCTGAG-3'（配列番号１１）およびリバース：5'-GACGCATGCTCAGCTCGACACGGTGACC-3’（配列番号号１２）を用いて、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物およびレトロウイルス骨格ＳＦＧ（Ｉ）ｅＧＦＰをＮｃｏＩおよびＳｐｈＩで消化し、連結した。挿入物を配列決定して、クローニング中に変異が生じなかったことを確認した。最終ベクターをＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰと命名した（図１参照）。ＩＲＥＳで発現されるレポーター遺伝子ＧＦＰを用いて、導入効率を評価する。２９３Ｔ細胞にレトロウイルスベクターおよびｇａｇ−ｐｏｌとＲＤＦエンベロープをそれぞれコードする２つのプラスミドを移入することによって、一過性レトロウイルス上清を調製した。４８時間で収集した上清を使用して、健康なドナーから単離された活性化Ｔ細胞に導入した。ＣＤ２８（ＣＡＲ．ＣＤ２８もしくはＣＡＲ．２８）または４−１ＢＢ（ＣＡＲ．４１ＢＢもしくはＣＡＲ．ＢＢ）エンドドメインのいずれかを含むＧＤ２抗原を標的とするＣＡＲ（ＧＤ２．ＣＡＲ）をコードするレトロウイルスベクターは、以前に記載されている（Heczey A. et al, Blood.2014 Oct 30; 124(18):2824-33）。前記ＣＡＲは、配列番号１６〜２１のＣＤＲ配列を含む。
【０１７５】
実施例３−抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖを産生するＣＡＲ  Ｔ細胞の生成および増殖
健康なヒトドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Lymphoprep（Fresenius）密度勾配遠心分離によって単離した。一次Ｔ細胞を、４４％Click's培地（Irvine Scientific）、４４％ＲＰＭＩ  １６４０（Hyclone）、１０％ＦＢＳ（Hyclone）、１％Glutamax、および１％ペニシリン／ストレプトアビジンを含有する完全Ｔ細胞培地中でＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍＬ）（PeproTech製）の存在下で培養した。Ｔ細胞を、２４ウェルプレートで固定化抗ＣＤ３（１ｍｃｇ／ｍＬ）（Miltenyi、カタログ番号：130-093-387）および抗ＣＤ２８（１ｍｃｇ／ｍＬ）（BD Biociences、カタログ番号：555725）を用い、サイトカインを含まないＴ細胞培地中０．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で活性化した。刺激の２４時間後に、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を培地に添加した。２日目までに、Ｔ細胞に、レトロウイルス上清ＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰおよび／またはＧＤ２．ＣＡＲ（レトロネクチンでコーティングした２４ウェルプレート中１ｍＬ／ウェルのレトロウイルス上清）を導入した。ＧＤ２．ＣＡＲを発現し、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖを放出するＴ細胞を作製するために、両方のレトロウイルスコンストラクトによる同時導入を行った（１ｍＬ／ウェルのＧＤ２．ＣＡＲ上清プラス１ｍＬ／ウェルの抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖ）。非導入（ＮＴ）Ｔ細胞を、レトロネクチンでコーティングした非組織培養プレートに同じ濃度（０．２５×１０６細胞／ｍＬ）で播種した。導入の７２時間後、Ｔ細胞を洗浄し、計数し、ＩＬ−７／ＩＬ−１５を含む完全Ｔ細胞培地に１×１０６細胞／ｍＬで懸濁した。Ｔ細胞をインビトロで５日間増殖させ、次いで導入効率およびＴ細胞組成を評価するためにフローサイトメトリーによって分析した。開始の１１〜１２日後、Ｔ細胞を機能分析で試験した。
【０１７６】
実施例４−ＧＤ２．ＣＡＲおよびＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１ベクターを同時導入されたＴ細胞は、ＧＤ２．ＣＡＲおよび抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖの両方を発現する
Ｔ細胞の表現型を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６０Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＰＤ−Ｌ１のｍＡｂ（BD BioscienceまたはBiolegend）を用いて評価した。ＧＤ２．ＣＡＲ発現は、抗イディオタイプ１Ａ７  ｍＡｂを用いて検出し、続いて二次ラット抗マウスＩｇＧ１−ＰＥ  ｍＡｂ（BD Bioscience）で染色した。ＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１（Ｉ）ｅＧＦＰベクターの導入効率を、ＧＦＰ発現を測定することによって評価した。ＧＤ２．ＣＡＲ相対蛍光強度（ＲＦＩ）を、ＣＡＲ  Ｔ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を非導入Ｔ細胞のＭＦＩで割って算出した。図２に示すように、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞に、ＣＤ４／ＣＤ８比の変化なしに実施例２の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖレトロウイルスコンストラクトを成功裏に導入できた。二重レトロウイルス導入時に、Ｔ細胞は、ＧＤ２．ＣＡＲおよびｅＧＦＰ抗ＰＤ−Ｌ１を同時発現した（図３）。抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖの導入は、Ｔ細胞増殖に影響を与えなかった（図４）。さらに、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖの発現は、Ｔ細胞サブセット組成に影響を与えなかった（図５）。本実施例は、抗ＧＤ２  ＣＡＲおよび抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖを同時発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の生成を実証する。
【０１７７】
実施例５−ＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１ベクターが導入されたＴ細胞は、内因性ＴＣＲ／ＣＤ３複合体により活性化されると、機能的に活性な抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖを放出する
Ｔ細胞が抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖｓを分泌することができるかどうかを試験するために、内因性ＴＣＲにより細胞を刺激した。非導入Ｔ細胞または抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ導入Ｔ細胞を、固定化抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ、Miltenyi）および抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ、BD Bioscences）抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でコーティングされていない、またはコーティングされている組織培養処理２４ウェルプレートに、２ｍＬ／ウェルの１０％ＦＢＳを含むＴ細胞培地で０．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で播種した。１８時間後、特異的サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いてＴ細胞によって放出された抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖを定量するために、１ｍＬの上清を収集した。マウス由来の抗ｓｃＦｖモノクローナル抗体の対応対をこのサンドイッチＥＬＩＳＡに使用した。図６Ａに示すように、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖは、固定化抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体での刺激後に導入Ｔ細胞によって放出された。これらのＴ細胞は、それらの天然の内因性ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を発現する。この結果は、内因性ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介した導入Ｔ細胞の活性化が、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖの合成および細胞外分泌を誘発するのに十分であることを示唆している。定量的ＥＬＩＳＡは、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖが大量に分泌されたことを示した（図６Ａ）。非導入細胞はｓｃＦｖを分泌しなかった。抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖはレトロウイルスベクターの構成的に活性な５’ＬＴＲの制御下にあるので、コーティングされていないウェル上に播種した導入Ｔ細胞は、基礎レベルの抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖを放出したが、Ｔ細胞活性化時に有意に増加した。
【０１７８】
活性化Ｔ細胞によって産生された抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖは、固定化ＰＤ−Ｌ１に結合することができる（図６Ｂ）。簡潔に述べると、組み換えヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（R&D Systems）をＰＢＳ中のマイクロプレート上に２μｇ／ｍＬの濃度で固定化した。その後、５％脱脂粉乳でブロッキングし、濃度を増加させたｓｃＦｖを加え、Protein L-HRP（Sigma-Aldrich）によって検出した。図６Ｂは、Ｔ細胞によって産生された抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖが、基準対照である、大腸菌で産生された抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖと同様にＰＤ−Ｌ１に結合することを示す。これらのデータは、導入Ｔ細胞が、内因性ＴＣＲを介して活性化されると、機能的に活性な抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖを多量に放出することを実証する。これらのデータはまた、導入Ｔ細胞が、遺伝子改変ＴＣＲおよびＣＡＲを介して活性化されると、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖを直ちに分泌することを示唆する。
【０１７９】
実施例６−ＧＤ２．ＣＡＲ−４−１ＢＢおよびＳＦＧ．ｓｃＦｖ．抗ＰＤ−Ｌ１ベクターが同時導入されたＴ細胞は、腫瘍殺滅活性を増強した
導入および非導入Ｔ細胞（０．５×１０５細胞／ウェル）を、２４ウェルプレートで、外因性サイトカインの非存在下で、１：５のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で、腫瘍細胞株ＣＨＬＡ−２５５（２．５×１０５細胞／ウェル）と共培養した。共培養の７日後、Ｔ細胞を採取し、計数した。残留腫瘍細胞のパーセンテージが（フローサイトメトリーによって評価して）＜５％であった場合、共培養の第２サイクルのために、同じ１：５のＥ：Ｔ比で新鮮な腫瘍細胞とＴ細胞を再播種した。さらに７〜８日後、細胞を回収し、フローサイトメトリーで分析して、Ｔ細胞および残留腫瘍細胞を計数した。具体的には、ＣＤ３およびＧＤ２抗体を用いて、Ｔ細胞および腫瘍細胞をそれぞれ染色した。フローサイトメトリーによる細胞計数には、CountBrightビーズ（Invitrogen）を使用した。培養の２４時間後に上清も採取し、ＥＬＩＳＡ（R&D System）により製造業者の指示に従ってＩＦＮガンマの放出を測定した。
【０１８０】
抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖが導入された４−１ＢＢエンドドメインを有するＧＤ２．ＣＡＲ  Ｔ細胞は、共培養の第２サイクル（１４日間の培養）において腫瘍細胞のより良好な殺滅を示し（図７）、腫瘍細胞との共培養の第２サイクル（１４日間の培養）において（図８）抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｖＦｖを有しないＧＤ２．ＣＡＲ  Ｔ細胞よりもより高いレベルのＩＦＮガンマを産生した。したがって、繰り返し腫瘍細胞と結合するＧＤ２．ＣＡＲ  Ｔ細胞の疲弊は、４−１ＢＢ共刺激で起こるが、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖの存在は、ＣＡＲ  Ｔ細胞を疲弊から保護し、インビボで抗腫瘍活性を持続させ、腫瘍再発を予防し得る。
【０１８１】
本発明の現時点で好適な実施形態が示され記載されているが、本発明はこれらに限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲内で様々に具体化され、実施され得ることが理解されるべきである。本発明の多くの修正および代替の実施形態が当業者には容易に明らかとなるので、この説明は、単に例示的なものとして解釈されるべきであり、当業者に本発明を実施するための最良の形態を教示することを目的とするものである。したがって、全ての好適な修正および均等物は、以下の特許請求の範囲に含まれるとみなされ得る。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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