(57)【要約】本発明は、シチコリンを生産するための組換え微生物及び当該組換え微生物を用いてシチコリンを生産する方法を提供する。シチコリン、コリン及びホスホコリンの分解及び利用遺伝子をノックアウトし、ＣＴＰ分解遺伝子によってコードされる５−ヒドロキシ−ＣＴＰジホスファターゼをノックアウトし、ＣＤＰの前駆体ＣＴＰの分流をブロックした。塩化コリンをホスホコリンにリン酸化するコリンキナーゼ、及び、ホスホコリンとＣＤＰとの反応を触媒してシチコリンを産生するコリンリン酸シチジルトランスフェラーゼを含む、シチコリン合成のための鍵酵素を適切に発現させた。また、ピリミジンヌクレオシド経路に対して遺伝子工学的形質転換を行い、合成経路におけるフィードバック抑制を排除した。生物発酵法により、組換え菌株を５リットルの発酵槽に添加して２０ｇ／Ｌ以上のシチコリンの収量に達成し、これにより、工業的な量産が実現されるとともに、シチコリンの生産コストが削減され、汚染が少なく、環境保護に役に立ち、普及及び利用価値が高い。
2019524050.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）シチコリン、コリン及びホスホコリンの少なくともいずれか１つの再利用に関与する酵素を産生しないこと、
２）塩化コリンからホスホコリンの生成を触媒するコリンキナーゼの活性が野生型微生物よりも高いこと、
３）ホスホコリンからシチコリンの生成を触媒するシチジルトランスフェラーゼの活性が野生型微生物よりも高いこと、及び
４）塩化コリンを細胞内に輸送する内膜タンパク質コリントランスポーターの活性が野生型微生物よりも高いこと、の１つ又は複数の特徴を有することを特徴とするシチコリンを生産するための組換え微生物。
【請求項２】
シチコリンの再利用に関与する前記酵素は、シチジン−５’−二リン酸アルコール加水分解酵素、及び、シチジン−５’−二リン酸−ジアシルグリセロールピロホスファターゼ、を含み、コリンの再利用に関与する前記酵素は、コリンデヒドロゲナーゼを含み、ホスホコリンの再利用に関与する前記酵素は、アルカリホスファターゼ及び酸性ホスファターゼを含むことを特徴とする請求項１に記載のシチコリンを生産するための組換え微生物。
【請求項３】
前記コリンキナーゼは、出芽酵母由来のＣＫＩ１若しくはＥＫＩ１、又は、レンサ球菌由来のＬｉｃＣを含むことを特徴とする請求項１に記載のシチコリンを生産するための組換え微生物。
【請求項４】
前記シチジルトランスフェラーゼは、出芽酵母由来のＰＣＴ１、ＣＤＳ１、ＥＣＴ１、大腸菌由来のＣｄｓＡ、ＩｓｐＤ、ＭｏｃＡ、ＫｄｓＢ、Ｃｃａ、レンサ球菌由来のＬｉｃＣ、又は、カンジダ由来のＣＤ３６＿４０６２０を含むことを特徴とする請求項１に記載のシチコリンを生産するための組換え微生物。
【請求項５】
前記コリントランスポーターは、大腸菌由来のＢｅｔＴを含むことを特徴とする請求項１に記載のシチコリンを生産するための組換え微生物。
【請求項６】
前記組換え微生物は、大腸菌を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のシチコリンを生産するための組換え微生物。
【請求項７】
前記大腸菌のピリミジン合成経路において、ウリジン−５’−一リン酸をウリジンに分解するウリジン−５’−一リン酸ホスホリラーゼは、もはや産生されず、前記ウリジン−５’−一リン酸ホスホリラーゼは、ＵｍｐＨ、ＵｍｐＧ、ＰｈｏＡ、ＡｐｈＡ、ＹｊｊＧを含むことを特徴とする請求項６に記載のシチコリンを生産するための組換え微生物。
【請求項８】
前記組換え微生物のピリミジン合成経路におけるリプレッサータンパク質のコード遺伝子に対して、ピリミジン合成経路における最終産物のフィードバック抑制をノックアウト及び／又は排除したことを特徴とする請求項６に記載のシチコリンを生産するための組換え微生物。
【請求項９】
前記大腸菌のピリミジン合成経路におけるリプレッサータンパク質のコード遺伝子に対して、
１）カルバモイルリン酸シンテターゼのコード遺伝子の転写抑制リプレッサータンパク質のコード遺伝子をノックアウトする、
２）カルバモイルリン酸シンテターゼの突然変異体Ｓ９４８Ｆを発現させる、
３）アスパラギン酸カルバモイルトランスフェラーゼのｐｙｒＩサブユニットのコード遺伝子をノックアウトする、
４）リボースリン酸ピロホスホキナーゼ又はその突然変異体Ｄ１２８Ａを発現させる、
５）ウリジン−５’−一リン酸キナーゼ又はその突然変異体Ｄ９３Ａを発現させる、及び
６）シチジン三リン酸シンテターゼ又はその突然変異体Ｄ１６０Ｅ，Ｅ１６２Ａ，Ｅ１６８Ｋを発現させる、という１つ以上の方法によって、ピリミジン合成経路におけるフィードバック抑制をノックアウト及び／又は排除したことを特徴とする請求項８に記載のシチコリンを生産するための組換え微生物。
【請求項１０】
前記カルバモイルリン酸シンテターゼのコード遺伝子の転写抑制リプレッサータンパク質のコード遺伝子は、ｐｕｒＲ、ｐｅｐＡ、ａｒｇＲの１つ又は複数を含むことを特徴とする請求項９に記載のシチコリンを生産するための組換え微生物。
【請求項１１】
前記シチコリンについて、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換え微生物により、塩化コリンを基質として添加して発酵させて前記シチコリンを得ることを特徴とする組換え微生物を利用してシチコリンを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー分野に属し、具体的には、シチコリンを生産するための組換え微生物に関する。組換え微生物を利用してシチコリンを生産し、当該組換え微生物を利用して生物学的方法によってシチコリンを生産する。
【背景技術】
【０００２】
シチコリン（Ｃｉｔｉｃｏｌｉｎｅ、ＣＤＰ−ｃｈｏｌｉｎｅ、略語ＣＤＰＣ）は、ヌクレオシドの誘導体であり、５’−シチジル酸及びホスホコリンから合成されている。分子式は、Ｃ14Ｈ26Ｎ4Ｏ11Ｐ2であり、相対分子質量は、４８８．３２３９６であり、沸点は、８５１．４℃である。シチコリンは、コリンからホスファチジルコリンへ生成する経路における中間体であり、すべての細胞に存在し、リン脂質合成の主な補酵素であり、レシチンの合成を促進することにより脳の機能を改善する。急性頭蓋脳外傷及び脳手術後の意識障害等の治療に用いられる。
【０００３】
シチコリンの生産は主に、化学的方法及び生物学的方法の２種類ある。化学合成法は、シチジル酸及びホスホコリンを基質とし、トルエンスルホニルクロリドを縮合剤として、Ｎ−ジメチルホルムアミドの作用下でシチコリンナトリウムを生成させる方法であるが、反応転化率が低く、副生成物が多く、コストが高く、且つ汚染が大きい。
【０００４】
生物学的方法は、シチコリンを生産する歴史が長く、主に、単一酵素／多酵素の触媒作用又は単一細菌／多細菌の形質転換という方法である。Ｓｈｏｊｉ  Ｓｈｉｒｏｔａらは、１９７５年に酵母によるシチコリンの合成及びその影響要因を研究していた（Ｓｈｏｊｉ  Ｓｈｉｒｏｔａ  １９７５、Ａｇｒ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｎ、３５（３）：１４６９−１４７４）。Ｔａｋａｔａ  Ｉｓａｏらは、１９８２年に複合Ｋ２カラギナンを用いてＣＤＰＣの生合成のためのフマラーゼ（Ｆｕｍａｒａｓｅ）酵素を固定化した（ＴａｋａｔａＪ１９８２、Ｆｅｒｍｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌ、６０（５）：４３１−４３７）。邱蔚然らは、１９９２年〜２００２年に固定化酵母細胞を用いてシチコリンを産生した（邱蔚然  １９９２、中国生化学薬物雑誌、６２（４）：３７−３９、余冬生  ２００２、無錫軽工業大学誌、２１（３）：２７７−２８０。）。近年、酵母菌又はブレビバクテリウム・アンモニアゲネス等を用いてオロチン酸及びホスホコリンを基質として、グルコースを添加してＡＴＰを産生する状況における発酵によるシチコリンの産生は、依然としてコストが高く、形質転換率が低いという問題を有し（應漢傑２０１５、コリンキナーゼ及びホスホコリンシチジルトランスフェラーゼを発現するための遺伝子組換え細菌、その構築方法及びその応用、２０１５１０１８４７０５．８）、大規模な工業生産の応用に寄与しない。
【０００５】
従って、シチコリンの製造コスト及び汚染を低減するために、シチコリンの大規模な工業生産を効果的に実現することができる、無汚染及び低コストのシチコリンの合成する方法を開発する必要がある。
【０００６】
現在、シチコリンの年間需要量は、中国国内だけで１０００トンに達しているが、現在供給できるのは、約５０トンしかない。本発明は、上記のニーズを満たしつつ、関連する優位性をも有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、シチコリンの合成及び蓄積のための高い生産能力を有する組換え微生物を設計及び生産し、且つ当該組換え微生物を用いて、塩化コリンを基質とするシチコリンの高収量の生物学的方法での生産を実現することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１、シチコリンを利用及び分解するための酵素コード遺伝子の除去
まず、微生物にシチコリン（ＣＤＰＣ）を蓄積させるために、細胞内のシチコリンを用いた酵素をコードする遺伝子をノックアウト又はブロックする。これらの酵素には、シチジン−５’−二リン酸−ジアシルグリセロールピロホスファターゼ（Ｃｄｈ）、及び、シチジン−５’−二リン酸アルコール加水分解酵素（ＵｓｈＡ）が含まれ、これらは、シチコリンを、シチジル酸及びホスホコリンを生成するように触媒することができる。
【０００９】
２、ホスホコリンのシチジンアシル化によるシチコリンの合成
自然界の生物において、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）を脱リン酸化し、且つホスホコリン（ＰＣ）とともにシチコリン及びピロリン酸を産生することができるシチジルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．７をＣＴａｓｅと総称）が存在する。例えば、出芽酵母由来のＰＣＴ１（ Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ  Ｙ  １９９１、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３（６）：２１３４−６）、ＣＤＳ１（Ｃａｒｔｅｒ１９６６，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ７（５）；６７８−８３．），ＥＣＴ１（ＶｉｓｅｄｏＧｏｎｚａｌｅｚ１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２６０（１）；２９９−３０１．）、大腸菌由来のＣｄｓＡ（Ｃａｒｔｅｒ１９６６，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ７（５）；６７８−８３．），ＩｓｐＤ（Ｒｏｈｄｉｃｈ１９９９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９９；９６（２１）；１１７５８−６３．），ＭｏｃＡ（Ｎｅｕｍａｎｎ２００９，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８４（３３）；２１８９１−８．），ＫｄｓＢ（Ｇｈａｌａｍｂｏｒ１９６６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９６６；２４１（１３）；３２１６−２１．），Ｃｃａ（Ｓｈｉ１９９８，ＥＭＢＯ  Ｊ  １７（１１）；３１９７−２０６．）、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ  Ｂ６）由来のＬｉｃＣ（ Ｄｅｎａｐａｉｔｅ  Ｄ２０１０ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．５（２）：ｅ９４２６．）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来の Ｐｃｙｔ１ａ（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１３０２６），Ｐｃｙｔ１ｂ（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２３６８９９）、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ  ＧＳ１１５由来のＰＡＳ＿ｃｈｒ２−２＿０４０１（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８１９９１０８）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ  ＣＤ３６）由来のＣＤ３６＿４０６２０、及び、ショウジョウバエ由来のＣｃｔ  １（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１１７３５３），Ｃｃｔ２（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：  ３８１８０）等がある。
【００１０】
ＣＴＰに対して特異性を有するこれらのＣＴａｓｅ及び／又はそれらの相同酵素をコードする遺伝子は、ＤＮＡ合成の方法によって得られてもよく、対応する生物から抽出したｍＲＮＡを鋳型として、ＰＣＲの方法によって直接得られてもよい。従って、上記で得られた遺伝子のいずれかを組換え細胞で発現させ、発現に成功したＣＴａｓｅは、組換え細胞においてＣＴＰ及びＰＣを基質としてＣＤＰＣを生成し、且つＣＤＰＣの収量を顕著に増加させることができる。
【００１１】
特異性のより高いＣＴａｓｅをさらに得るために、タンパク質工学技術によってＣＴＰに対する高い特異性を有するＣＴａｓｅ突然変異体を得て、組換え細胞内において大量のＣＤＰＣを生成する（例えば、タンパク質工学によってバシラス内のプルラナーゼの熱安定性を向上させる（ Ｃｈａｎｇ２０１６，  ＭＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．１１（１０）：ｅ０１６５００６．））ために用いることができる。
【００１２】
３、細胞内のコリン及びホスホコリンの供給の強化
より多くのホスホコリンを得るために、塩化コリンをより迅速に供給する必要がある。塩化コリンが細胞に入り、律速段階になることを防ぐために、我々は、より多くの  輸送タンパク質を得るために、コリントランスポーターＢｅｔＴを発現させた。
【００１３】
大部分の野生型生物は、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ（例えば、大腸菌が産生した酸性ホスファターゼ（ＡｐｈＡ）及びアルカリホスファターゼ（ＰｈｏＡ））のような複数種類のホスホリラーゼを生産することができる（参考ｈｔｔｐ：／／ｅｃｏｃｙｃ．ｏｒｇ／）。一方、細胞内のホスホコリンは、これらのホスファターゼによってコリン及びリン酸に加水分解される。コリンは、さらに脱水素化されてグリシンベタインを生成する。大腸菌のコリンデヒドロゲナーゼＢｅｔＡ、ＢｅｔＢ（Ｇａｄｄａ２００３，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６９（４）；２１２６−３２．）、及び、グリコレートオキシダーゼＧｌｃＤ、ＧｌｃＥ、ＧｌｃＦ（Ｌｏｒｄ１９７２，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９７２；２６７（２）；２２７−３７．）を含むコリンの脱水素酵素を分解することができる。
【００１４】
ＣＤＰＣの前駆体として、ホスホコリンの連続的供給が重要である。従って、１、コリンの細胞内に入る速度を促進するために、組換え細胞においてコリントランスポーターを発現又は過剰発現させる。２、一貫して安定したホスホコリンの供給を実現するために、細胞にホスホリラーゼの欠如をさせなければならない。３、組換え細胞においてコリンキナーゼ（ＣＫａｓｅ）を発現又は過剰発現させることにより、ホスホコリンを生成するコリンのリン酸化を促進する。関連するコリンキナーゼは、遺伝子組み換えされていない全ての細胞に存在していなくてもよい。現在知られている、コリンをリン酸化となるように触媒することができるコリンキナーゼは、出芽酵母由来のＣＫＩ１（ＥＣ２．７．１．３２  ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｙｃ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅ？ｏｒｇｉｄ＝ＹＥＡＳＴ＆ｉｄ＝ＹＬＲ１３３Ｗ−ＭＯＮＯＭＥＲ）（Ｗｉｔｔｅｎｂｅｒｇ１９５３，  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ，  ４３１−４４）、及び、ＥＫＩ１（エタノールアミンキナーゼ、ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｃｙｃ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅ？ｏｒｇｉｄ＝ＹＥＡＳＴ＆ｉｄ＝ＹＤＲ１４７Ｗ）（ＳＵＮＧ１９６７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１０５，４９７））、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来のＣｈｋａ（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：  １２６６０），Ｃｈｋｂ（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１２６５１）、ホモ・サピエンス由来のＣＨＫＡ（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１１１９）及びＣＨＫＢ（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１１２０）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＣＫ１（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８４３５００）、並びに、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）由来のＣｋａ−１（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１７７８０７）、Ｃｋａ−２（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１８０７０３）、Ｃｋｂ−１（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１８１９０４）、Ｃｋｂ−２（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１７５５６５）、Ｃｋｂ−４（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１８４８６４）等を含む。
【００１５】
本発明は、発酵期間中に基質としての塩化コリンを添加するため、基質の分解を防ぐために、コリンを分解可能な酵素をノックアウト又はブロックする必要がある。
【００１６】
４、ＣＤＰＣの前駆体ＣＴＰの濃度の増加
細胞内のＣＴＰは、ピリミジン合成経路における中間体であり、シチジン三リン酸合成酵素ＰｙｒＧの作用下でウリジン三リン酸ＵＴＰによって産生される。しかし、ＰｙｒＧは、その産物ＣＤＰによってフィードバック抑制され、当該酵素の、１６０番目のアスパラギン酸からグルタミン酸（Ｄ１６０Ｅ）へ、１６２番目のグルタミン酸からアラニン（Ｅ１６２Ａ）へ、又は、１６８番目のグルタミン酸からリシン（Ｅ１６８Ｋ）への突然変異に対して、ＣＤＰによるフィードバック抑制を効果的に排除することができる（Ｉｙｅｎｇａｒ  Ａ２００３、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３６９（Ｐｔ  ３）：４９７−５０７）。一方、ＣＴＰは、５−ヒドロキシ−ＣＴＰ  ピロホスファターゼＮｕｄＧの作用においてシチジル酸ＣＭＰを生成する。ＮｕｄＧのコード遺伝子をノックアウト又はブロックすることにより、ＣＴＰの分流が効果的に防止され、より高い濃度のＣＴＰを蓄積することができ、それにより、ＣＤＰＣの収量が増加する。
【００１７】
５、ウリジン二リン酸ＵＭＰの分流のブロック
大腸菌のピリミジン合成経路において、ＵＭＰは、シチコリン合成の中間体として、ＣＴＰによってシチコリンを合成するほか、５’−ヌクレオチダーゼの触媒作用においてウリジンを生成することもできる。５’−ヌクレオチダーゼをコードする遺伝子ｕｍｐＧ、ｕｍｐＨをブロック又はノックアウトすることにより、ＵＭＰの分流が解除され、ＵＭＰが専らＣＤＰＣ合成に用いられ得る。
【００１８】
６、ピリミジンヌクレオシド合成のフィードバック抑制及びフィードバック阻害の排除、ピリミジンヌクレオシド合成の代謝フラックス及びＣＤＰＣの収量の増加
ピリミジンヌクレオチド合成経路における触媒の第１段階は、カルバモイルリン酸シンテターゼＣａｒＡＢの触媒作用によってカルバモイルリン酸を合成することである。この酵素は、代謝最終産物プリン、ピリミジン及びアルギニンのそれぞれによってフィードバック阻害され（Ｄｅｖｒｏｅｄｅ  Ｎ２００６，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８（９）：３２３６−４５．）、対応するリプレッサータンパク質はそれぞれ、ＰｕｒＲ、ＰｅｐＡ及びＡｒｇＲである（Ｋｉｍ２０１５，Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ  １４：９８）。本発明は、リプレッサータンパク質をコードする遺伝子ＰｕｒＲ、ＰｅｐＡ及びＡｒｇＲをノックアウトすることにより、ＣａｒＡＢ転写の阻害を排除し、カルバモイルリン酸合成を加速させた。また、当該酵素は、ＵＭＰのフィードバック抑制をも受ける。文献（Ｄｅｌａｎｎａｙ  Ｓ１９９９，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２８６（４）：１２１７−２８）の報告によれば、当該酵素の１つのサブユニット（ＣａｒＢ）の９４８位のアミノ酸セリンを、フェニルアラニン（Ｓ９４８Ｆ）に突然変異させれば、ＵＭＰの抑制作用を効果的に解除することができる。本発明は、染色体におけるｃａｒＢ遺伝子を突然変異させることにより、ＣａｒＢ（Ｓ９４８Ｆ）をコードする突然変異遺伝子を担持する組換え菌株が得られる。
【００１９】
ピリミジンヌクレオチド合成経路における触媒の第２段階は、アスパラギン酸カルバモイルトランスフェラーゼの触媒作用によってカルバモイルアスパラギン酸を合成することである。当該酵素は、１つの調節サブユニット（ＰｙｒＩ）及び１つの触媒サブユニット（ＰｙｒＢ）から構成されており、ＣＴＰの濃度が高い場合、ＣＴＰはＰｙｒＩと結合して酵素活性を低下させる。アスパラギン酸カルバモイルトランスフェラーゼをコードする調節サブユニットを破壊する場合、そのコード遺伝子をノックアウトすれば、最終産物ＣＴＰによるフィードバック抑制が排除される  （Ｃｏｕｄｒａｙ  Ｌ２００９，  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  １７（２２）：７６８０−９）。
【００２０】
ピリミジンヌクレオチド合成経路におけるｐｙｒＥでコードされるオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、オロチン酸からオロチジン一リン酸の合成を触媒する。大腸菌Ｗ３１１０の宿主菌におけるｐｙｒＥ遺伝子上流のｒｐｈ遺伝子の終止コドン付近に、フレームシフト突然変異が存在する（Ｋａｊ  Ｆｒａｎｋ  Ｊｅｎｓｅｎ  １９９３、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、３４０１−３４０７）ため、一部のｒｐｈ遺伝子の転写が終了することができず、これにより、下流のｐｙｒＥ遺伝子の発現が影響され、宿主菌におけるオロチン酸の蓄積がもたらされる。ゲノム内のｐｙｒＥを補正することにより、副生成物であるオロチン酸の蓄積を効果的に排除することができる。
【００２１】
また、ピリミジンヌクレオチド合成において、リボースは、リボースリン酸ピロリン酸を前駆体としてヌクレオシドに合成されたものであり、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ（Ｐｒｓ）は、リボース−５−リン酸を、ＡＴＰと反応してリボースリン酸ピロリン酸ＰＲＰＰに合成するように触媒する。しかしながら、大腸菌由来のリボースリン酸ピロホスホキナーゼは、ＡＤＰによるフィードバック抑制を受けており、Ｐｒｓ上の１２８位のアスパラギン酸からアラニン（Ｄ１２８Ａ）までの突然変異は、ＡＤＰによるフィードバック抑制作用を効果的に排除することができる（Ｓｈｉｍａｏｋａ  ２００７Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０３（３）：２５５−６１．）。
【００２２】
ｐｙｒＨ遺伝子によってコードされたＵＭＰキナーゼは、ＵＭＰのリン酸化からウリジン二リン酸ＵＤＰの合成を触媒するが、当該酵素は、その産物であるＵＤＰのフィードバック抑制作用を受け、文献に報道されたように、当該酵素の９３位のアスパラギン酸からアラニンまでの突然変異（Ｄ９３Ａ）は、対応するフィードバック抑制作用を効果的に排除することができる（ Ｍｅｙｅｒ  Ｐ２００８，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８３（５１）：３６０１１−８．）。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の利点は下記の通りである。従来技術と比較すれば、本発明は、シチコリンを生産するための組換え微生物及び当該組換え微生物を利用して生物学的方法によってシチコリンの高収量を実現する生産方法により、無汚染且つ低コストのシチコリンの合成方法を開発した。当該方法は、以下の有益な効果を有する。微生物発酵の過程において、一定量のシチジン三リン酸が細胞内に蓄積され、遺伝子操作された生体材料を用いる方法により組換え微生物が確立され、代謝工学的方法によって微生物が形質転換され、微生物発酵の方法によってシチコリンの前駆体であるシチジン三リン酸が細胞内に濃縮され、最終的に、シチコリンの合成及びそれが増殖する基質内での蓄積が実現され、シチコリンの大規模な工業生産が効果的に達成され、それによって、シチコリンの生産コスト及び汚染が削減され、環境保護に役に立ち、普及及び利用価値が高い。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】大腸菌におけるシチコリンの代謝経路の概略図である。
【図２】シチコリン検出のＨＰＬＣチャートである。
【００２５】
ここで、ｃａｒｂａｍｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅはカルバモイルリン酸、ｃａｒｂａｍｏｙｌ  ａｓｐａｒｔａｔｅはカルバモイルアスパラギン酸、ｏｒｏｔａｔｅはオロチン酸、ＯＭＰはオロチジン５’−一リン酸、ＵＭＰはウリジン−５’−一リン酸、ＵＤＰはウリジン−５’−二リン酸、ＵＴＰはウリジン−５’−三リン酸、ＵｄＲ：ウリジン、ＣｄＲはシチジン、ＣＴＰはシチジン−５’−三リン酸、ＣＤＰはシチジン−５’−二リン酸、ＣＭＰはシチジン−５’−一リン酸、ＣＤＰＣはシチコリン、ＰＣはホスホコリン、ｃｈｏｌｉｎｅはコリン、ｇｌｙｃｉｎｅ  ｂｅｔａｉｎｅはグリシンベタイン、ＰｙｒＡはカルバモイルリン酸シンテターゼ、ＰｙｒＢ／Ｉはアスパラギン酸カルバモイルトランスフェラーゼ、ＰｙｒＥはオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＰｙｒＦはウリジン−５’リン酸デカルボキシラーゼ、ＰｙｒＨはウリジン−５’−一リン酸キナーゼ、ＰｙｒＧはシチジン三リン酸シンテターゼ、Ｃｍｋはシチジン−５’−一リン酸キナーゼ、ＣＴａｓｅはシチジルトランスフェラーゼ、ＣＫａｓｅはコリンキナーゼ、Ｎｄｋはヌクレオシド二リン酸キナーゼ、ＮｕｄＧは５−ヒドロキシ−シチジン三リン酸ジホスファターゼ、ＵＭＰはウリジン−５’−一リン酸、ＵｍｐＧは一般特異的ヌクレオチダーゼ／ポリホスファターゼ、ＵｍｐＨはウリジン５’ホスファターゼ、ＢｅｔＡはコリンデヒドロゲナーゼ、ＢｅｔＢはベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡｐｈＡは酸性ホスファターゼ、ＰｈｏＡはアルカリホスファターゼ、ＵｓｈＡはシチジン二リン酸リビトールヒドロラーゼ、Ｃｄｈはシチジン二リン酸  −ジアシルグリセロールピロホスファターゼである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、いくつかの特定の実施例により本発明をさらに説明する。これらの実施例は、課題を説明するためだけであり、限定するものではない。
【００２７】
＜実施例１：大腸菌における遺伝子ノックアウト方法＞
本発明は、Ｄａｔｓｅｎｋｏの方法を採用して大腸菌において遺伝子ノックアウトを行った（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＫＡ  ２０００、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９７（１２）：６６４０−６６４５）。対応する遺伝子ノックアウトプライマーについて、Ｂａｂａ  Ｔ２００６、Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  ２  （１）、０００８を参照されたい。
【００２８】
＜実施例２：振盪フラスコ発酵による組換え菌株の確認方法＞
振盪フラスコ発酵における組換え菌株がシチコリンを生産するための発酵培地を検証した。具体的には、培地１リットル当たりＹＣ溶液１００ｍｌ、グルコース２０ｇ、５倍の塩溶液２００ｍｌ、ＴＭ２溶液１ｍｌ、クエン酸鉄１０ｍｇ、無水硫酸マグネシウム１２０ｍｇ、塩化カルシウム１１１ｍｇ、チアミン１ｕｇを添加し、脱イオン水で定容した。ここで、５倍の塩溶液は、リン酸水素二ナトリウム３０ｇ／リットル、リン酸二水素カリウム１５ｇ／リットル、塩化ナトリウム２．５ｇ／リットル、塩化アンモニウム５．０ｇを添加して、イオン水で定容したものであった。ＴＭ２溶液は、塩化亜鉛四水和物２．０ｇ／リットル、塩化カルシウム六水和物２．０ｇ／リットル、モリブデン酸ナトリウムニ水和物２．０ｇ／リットル、硫酸銅五水和物１．９ｇ／リットル、ホウ酸０．５ｇ／リットル、塩酸１００ｍｌ／リットルを添加したものであった。発酵培地Ｍ９内のＹＣ溶液は、１００ｍｌの脱イオン水であり、発酵培地ＭＳ３．２内のＹＣ溶液は、４ｇのペプトン、４ｇの酵母粉末、１０ｇの塩化ナトリウム及び１００ｍｌの脱イオン水であった。上記の溶液を１２１℃で２０〜３０分間滅菌した。
【００２９】
振盪フラスコ発酵過程は、以下の通りである。まず、抗生物質を含む一定量のＬＢ培地に組換え菌株を接種（［米］Ｊ．サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）著、黄培堂訳、サブクローンガイド２００２、１５９５）し、３４℃のシェーカーに置いて２５０ｒｐｍで一晩培養した。一晩経った種を１００μｌ採取して抗生物質を含む２ｍｌのＬＢ培地に移し、３４℃のシェーカーにおいて、ＯＤ600値が１．５前後になるまで２５０ｒｐｍで４〜６ｈ培養した。次に、２ｍｌの第２段階の種の全てを、１８ｍｌの発酵培地を含んだ振盪フラスコに移し、３４℃のシェーカーに入れて、２５０ｒｐｍでの培養ＯＤ600値が１前後である場合、最終濃度が０．１ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、その後、最終濃度が４ｍＭになるまで塩化コリンを添加し、約２０時間培養を続けた後、発酵ブロスで遠心分離試験を行った。具体的な試験方法については、実施例４を参照されたい。
【００３０】
＜実施例３：組換え菌株を用いる５Ｌの発酵槽でのシチコリンの発酵生産方法＞
発酵槽における組換え菌株によるシチコリンの発酵生産のための発酵培地は、ＭＦ１．３２であることが検証された。具体的には、１リットルの培地には、２ｇの硫酸アンモニウム、８ｇの塩化ナトリウム、２ｇのリン酸二水素カリウム、１．６５ｇの塩化マグネシウム六水和物、１０ｇのグルコース、１０５ｍｇの塩化カルシウム、１０ｍｇの塩化亜鉛、１ｍＬのＴＭ２微量元素溶液、９４ｍｇのクエン酸鉄、６ｇのペプトン、６ｇの酵母粉末が含まれており、脱イオン水で定容した。ＴＭ２微量元素溶液は、塩化亜鉛１．３１ｇ、塩化カルシウム１．０１ｇ、モリブデン酸アンモニウム四水和物１．４６ｇ、硫酸銅１．９ｇ、ホウ酸０．５ｇ、及び塩酸１０ｍＬの、脱イオン水で定容したものである。フィード培地は、１リットルあたり６００ｇのグルコース、４０ｇのペプトン、及び４０ｇの酵母粉末を含む。
【００３１】
発酵過程は、以下の通りである。まず、種を調製する。ＬＢプレートからモノクローンを採取して抗生物質を含むＬＢ試験管において３４℃で一晩培養した。１％の接種量に従って１００ｍＬのＬＢを含む５００ｍＬの振盪フラスコに接種し、ＯＤが１．５〜２まで３４℃で４時間培養した。５％の接種量で１．５Ｌの発酵培地ＭＦ１．３２を含む５Ｌの発酵槽に接種し、３７℃で培養し、アンモニア水でｐＨを６．９に調整し、溶存酸素と回転速度とをカップリングし、溶存酸素を３０％に維持しながら３時間発酵させた。８ｇ／Ｌ／ｈの基質添加を開始し、５時間発酵させ、ＯＤ６００が１６〜２５までなった際に、３２℃まで温度を下げ、ＩＰＴＧを加え、最終濃度を０．５ｍｍｏｌ／Ｌになるように誘導し、１０時間発酵させ、回転速度を１０００ｒｐｍに固定した。溶存酸素が４０％を超えると、溶存酸素を３０％〜４５％に維持するように添加基質をカップリングし始めた。発酵の２７時間後にサンプリングを開始した。試験方法については、実施例４を参照されたい。
【００３２】
＜実施例４  発酵ブロス内のシチコリン及び関連副生成物についてのＨＰＬＣ測定＞
２００ｕｌの発酵ブロスを正確に吸収して８００ｕｌの脱イオン水内に入れ、１ｍｌの無水エタノールを添加し、５ｍｉｎボルテックスし、上清液を遠心分離して０．２２ｕｍのフィルターを通過させ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で検出した。ＨＰＬＣのパラメータは以下の通りである。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳＢ  Ｃ１８  ４．６＊１５０ｍｍ  ５ｕｍを使用し、移動相がメタノール及び１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ４．０）であり、移動相の比率が０．０１〜４．００分間の場合のメタノール比率は２％であり、移動相の比率が４．００〜５．００分間の場合のメタノール比率は２％から１０％に上昇し、移動相の比率が５．００〜５．０１分間の場合のメタノールの比率は１０％から２％に減少し、移動相の比率が５．１０〜１０．０分間の場合のメタノール比率は２％であった。紫外線検出器を使用して２７２ｎｍの波長を測定した。移動相の流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎであり、発酵ブロスのサンプルローディング量は５μＬであり、カラム温度は３０℃であった。ＣＤＰＣのピーク保持時間は２．７４５分間であり、スペクトルは図２に示されている。
【００３３】
＜実施例５  ＣＤＰＣを分解及び利用できない組換え大腸菌の構築＞
図１に示すように、大腸菌において、ＣＤＰＣは、シチジン二リン酸リビトールヒドロラーゼＵｓｈＡ、ＣＤＰ−ジアシルグリセロールピロホスファターゼＣｄｈによって触媒されて、ＣＭＰ及びホスホコリンを生成する。本発明は、大腸菌ＷＪ２（ＡＴＣＣ２７３２５ΔｌａｃＩｅｎｔＤＴ５）を出発菌株として、ＷＪ２においてＵｓｈＡ及びＣｄｈのコード遺伝子をノックアウトして組換え細菌を取得した。これらの菌株の、ＣＤＰＣを使用及び分解する能力が徐々に低下し、うちの組換え細菌ＨＱ２４ＷＪ２△ｕｓｈＡΔｕｍｐＧΔｕｍｐＨΔｐｙｒＩΔｃｄｈ）は、振盪フラスコ発酵においてＣＤＰＣを完全に利用及び分解することができない。例えば、２．０ｇ／Ｌのシチコリンを発酵培地に添加して２４時間後、ＷＪ２、ＷＪ３（ＷＪ２△ｕｓｈＡ）の残留ＣＤＰＣは、０．１５ｇ／Ｌ、１．０２ｇ／Ｌであることが検出された。［ＳＱ１５０９１６結果：０．３／１．９２］は、ｕｓｈＡのノックアウトがＣＤＰＣの分解を顕著に排除することができることを証明した。発酵培地に１ｇ／Ｌのシチコリンを添加して２４時間後、ＨＱ１９（（ＷＪ２△ｕｓｈＡΔｕｍｐＧΔｕｍｐＨ  ΔｐｙｒＩ）、ＨＱ２４（ＨＱ１９Δｃｄｈ）、ＨＱ２５（ＨＱ１９ΔｍａｚＧ）、ＨＱ２６（ＨＱ１９ΔｎｕｄＦ）の残留ＣＤＰＣは、０．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、０．４５ｇ／Ｌ、０．４６ｇ／Ｌであることが検出された。ｃｄｈノックアウトは、ＣＤＰＣの分解を完全に排除することができることが証明された。ＨＱ２４／ｐＹ０２２（ｐＨＳ０１−ＰＣＴ１−ＣＫＩ１−ｐｙｒＥ−ｐｒｓ128）が発酵槽において２６ｈ発酵した場合、１７ｇ／Ｌに達することができる。
【００３４】
ＨＱ２４／ｐＹ０２２の分類から、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．）と命名されている。当該菌株は、２０１７年０６月２６日に中国微生物菌種保管委員会一般微生物センター（住所は、北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所（郵便番号：１００１０１）である。）に保管（保管番号ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１４２７７）されている。
【００３５】
＜実施例６  コリンを分解できない組換え大腸菌の構築＞
本発明において、大腸菌の代謝によるシチコリンの生産は、外因的に添加された塩化コリンを基質とし、細胞自身のピリミジン合成経路で産生されたＣＴＰを用いてシチコリンを合成することである。これは、基質及び中間体の細胞内での代謝に関係している。基質であるコリンは、コリンデヒドロゲナーゼの作用において細胞膜の電子伝達に関与し且つベタインアルデヒドを生成し、さらに、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの作用においてグリシンベタインを生成した。
【００３６】
基質及び中間体の分解を防止するために、本発明は、コリンデヒドロゲナーゼのコード遺伝子ｂｅｔＡ／Ｂをノックアウトした。
【００３７】
ＨＱ３３（ＨＱ２４ΔｐｕｒＲΔｆｈｕＡ：：Ｔｒｃ−ｐｙｒＥ，ｃａｒＢ９４８）、ＨＱ３４（ＨＱ３３ΔｂｅｔＡＢ）をそれぞれ宿主として、プラスミドｐＹ０１２を発現させ、発酵槽において発酵させた後、４３ｈのＣＤＰＣ収量として、ＨＱ３３／ｐＹ０１２は１８．４０ｇ／Ｌであり、ＨＱ３４／ｐＹ０１２は２０．８７ｇ／Ｌであることが検出された。これは、コリンデヒドロゲナーゼのノックアウトが、塩化コリンがリン酸化に完全に使用されてホスホリルコリンを生成するように、基質である塩化コリンの分解をブロックすることができ、これにより、ＣＤＰＣの収量が増加することを示した。
【００３８】
＜実施例７  ホスホコリンを分解できない組換え大腸菌の構築＞
本発明において、シチコリンの生産は、外因的に添加された塩化コリンを基質とし、中間体であるホスホコリンをコリンキナーゼの触媒によって生成することである。一方、大腸菌内のホスホコリンは、細胞中に存在する酸性ホスファターゼ又はアルカリホスファターゼによってコリンに分解されてコリンに戻された。
【００３９】
中間体であるホスホコリンの分解を防止するために、本発明は、酸性ホスファターゼのコード遺伝子ａｐｈＡ及びアルカリホスファターゼのコード遺伝子ｐｈｏＡをノックアウトした。
【００４０】
ＨＱ３３（ＨＱ２４ΔｐｕｒＲΔｆｈｕＡ：：Ｔｒｃ−ｐｙｒＥ，ｃａｒＢ９４８）、ＨＱ３５（ＨＱ３３ΔａｐｈＡ）、ＨＱ３６（ＨＱ３３ΔｐｈｏＡ）をそれぞれ宿主として、プラスミドｐＹ０１２を発現させ、発酵培地において振盪フラスコ発酵させた後、ＨＱ３３／ｐＹ０１２のＣＤＰＣ収量は、それぞれ１．８２ｇ／Ｌ、１．８６ｇ／Ｌ、１．８７ｇ／Ｌであることが検出された。これは、ホスファターゼのノックアウトが、より多くのホスホコリンが産物の合成に入るように、中間体であるホスホコリンの分解を低減又はブロックすることができ、これにより、ＣＤＰＣの収量が増加することを示した。
【００４１】
＜実施例８  シチジルトランスフェラーゼ及び／又はコリンキナーゼを過剰発現させることによるＣＤＰＣ収量の増加＞
シチコリン及びその基質であるコリンの中間体ホスホコリンの分解遺伝子をノックアウトした後、ＣＤＰＣの収量が低くなった。これは、コリンによるＣＤＰＣ産生を触媒する細胞内の重要な酵素の発現量が不十分であることを示している。細胞内のＣＤＰＣの収量を増加させるために、本発明は、ＣＤＰＣの合成過程におけるＣＴａｓｅ及びＣＫａｓｅを適切に発現させた。担持コードが異なるＣＴａｓｅ及び／又はＣＫａｓｅ遺伝子が発現したプラスミドを大腸菌発現宿主に形質転換し、ＣＤＰＣの収量を様々な程度に増加させた。例えば、ＨＱ３３において、プラスミドｐＨＳ０１（ｐＣＬ１９２０ＰＬａｃ：：Ｐｔｒｃ、ＬＳ９  特許番号ＵＳ２０１３００２９３９５Ａ１を参照）、ｐＹ００８（ｐＨＳ０１−ＰＣＴ１−ＣＫＩ１）、ｐＹ０１２（ｐＨＳ０１−ＰＣＴ１−ＣＫＩ１−ｌｉｃＣ）をそれぞれ発現させ、振盪フラスコ発酵培養して２４時間経過後のＣＤＰＣの収量は、それぞれ０ｇ／Ｌ、１．４４ｇ／Ｌ及び１．５５ｇ／Ｌであった。
【００４２】
＜実施例９  コリントランスポーターの過剰発現によるＣＤＰＣ収量の増加＞
ＢｅｔＴは、ベタインコリン輸送体ＢＣＣＴファミリーに属する、水素イオンによって駆動されたコリントランスポーターである。当該タンパク質は、好気条件下において発現され、浸透圧によって誘導された。高い浸透圧がＢｅｔＴ転写を増強することと同様に、コリンの添加は、転写をさらに増強した。より多くのＣＤＰＣを得るために、塩化コリンをより迅速に供給する必要がある。塩化コリンが細胞に入り、律速段階になることを防ぐために、我々は、浸透圧が増加しない場合により多くの輸送タンパク質を得るために、ＢｅｔＴを過剰発現させた。ＨＱ３３を宿主として、ｐＹ０１２及びｐＹ０１２−ｂｅｔＴをそれぞれ発現させ、発酵培地において振盪フラスコ発酵させて２４ｈ後のＣＤＰＣの収量として、後者が前者の２．３６倍であることが検出された。これは、ｂｅｔＴの過剰発現により、ＣＤＰＣの収量が顕著に増加することができることを示した。
【００４３】
＜実施例１０  ＵＭＰ分解酵素のコード遺伝子のノックアウトによるＣＤＰＣ収量の増加＞
ウリジン一リン酸ＵＭＰは、ピリミジン合成経路の中間体であり、補充経路におけるウリジン５’−モノホスファターゼによってウリジン二リン酸ＵＤＰを産生してもよく、５’−ヌクレオチダーゼによってウリジンに分解されてもよい。より多くの生成物ＣＤＰＣを得るために、本発明において、５’−ヌクレオチダーゼのコード遺伝子ｕｍｐＧ及びｕｍｐＨをノックアウトした。ＷＪ３及びＨＱ１８（ＷＪ３ΔｕｍｐＧΔｕｍｐＨ）を宿主として、プラスミドｐＹ０２２（ｐＹ００８−ｐｙｒＥ−ｐｒｓ128）を形質転換し、発酵培地において振盪フラスコ発酵させて２４ｈ後のＣＤＰＣの収量は、それぞれ１．９ｇ／Ｌ及び１．９２ｇ／Ｌであることが検出された。菌株ＨＱ１８／ｐＹ０２２が発酵槽において２６ｈ発酵した場合、８．９３ｇ／Ｌに達することができる。
【００４４】
＜実施例１１  ＰｙｒＥの過剰発現によるＣＤＰＣ収量の増加＞
プラスミド及びゲノム上のｐｙｒＥ遺伝子を過剰発現させることにより、上流のｒｐｈ遺伝子のフレームシフト突然変異によって引き起こされた発現欠損を排除し、これにより、ＣＤＰＣの収量が増加した。例えば、ＨＱ０４（Ｗ３１１０  （ΔＤｅｏＡΔｕｎｇΔｐｕｒＲΔｕｓｈＡΔｂｅｔＡＢＩ，ｂｅｔＴＰtrc））を宿主として、ｐＹ００８及びｐＹ００９（ｐＹ００８−ｐｙｒＥ）をそれぞれ発現させ、発酵培地において振盪フラスコ発酵させ、ＣＤＰＣの収量が、０．６７ｇ／Ｌから０．８０ｇ／Ｌまで増加した。これは、ｐｙｒＥの過剰発現により、シチコリンの収量が顕著に増加することができることを示した。
【００４５】
＜実施例１２  Ｐｒｓ１２８の過剰発現によるＣＤＰＣ収量の増加＞
大腸菌のピリミジン合成経路において、リボースリン酸ピロリン酸（ＰＲＰＰ）は、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＰｙｒＥ）の作用下で、リン酸基をオロチン酸に転化させてオロチジン一リン酸（ＯＭＰ）を生成した。ＰＲＰＰの欠乏は、ピリミジン合成経路における律速段階になり、シチコリンの収量を低下させ、副生成物であるオロチン酸を蓄積させる。リボースリン酸ピロホスホキナーゼ（Ｐｒｓ）は、リボース−５−リン酸を、ＡＴＰと反応してＰＲＰＰに合成するように触媒した。しかしながら、ＰｒｓがＡＤＰのフィードバック抑制を受けているため、Ｐｒｓの第１２８位のアスパラギン酸をアラニンに突然変異させることによって得られたＰｒｓ１２８は、ＡＤＰのフィードバック抑制作用を解除することができる。例えば、ＷＪ３を宿主として、ｐＹ０１７（ｐＹ００９−ｐｒｓ）、ｐＹ０２２（ｐＹ００９−ｐｒｓ128）をそれぞれ発現させた後、発酵培地において振盪フラスコ発酵させ、ＣＤＰＣの収量が、１．８０ｇ／Ｌから１．９６ｇ／Ｌまで増加した。
【００４６】
＜実施例１３  ＰｙｒＩをコードする遺伝子のノックアウトによるＣＤＰＣ収量の増加＞
ピリミジンヌクレオチド合成経路における触媒の第２段階は、アスパラギン酸カルバモイルトランスフェラーゼの触媒作用によってカルバモイルアスパラギン酸を合成することである。当該酵素は、１つの調節サブユニット（ＰｙｒＩ）及び１つの触媒サブユニット（ＰｙｒＢ）から構成されており、ＣＴＰの濃度が高い場合、ＣＴＰはＰｙｒＩと結合して酵素活性を低下させる。本発明は、ＰｙｒＩのコード遺伝子をノックアウトすることにより、最終産物ＣＴＰのフィードバック抑制作用が排除された。例えば、ＨＱ１８、ＨＱ１９（ＨＱ１８ΔｐｙｒＩ）の宿主においてｐＹ０２２を発現させ、発酵培地において振盪フラスコ発酵させ、ＣＤＰＣの収量が、１．７４ｇ／Ｌから１．９２ｇ／Ｌまで増加した。これは、ｐｙｒＩ遺伝子のノックアウトが、アスパラギン酸カルバモイルトランスフェラーゼに対するＣＴＰのフィードバック抑制を排除することができ、それによってピリミジン合成経路の合成を促進し、ＣＤＰＣの収量を増加させることを示している。
【００４７】
＜実施例１４  リプレッサータンパク質ＰｕｒＲ、ＡｒｇＲをコードする遺伝子のノックアウトによるＣＤＰＣ収量の増加＞
ピリミジンヌクレオシド合成経路における第１段階は、カルバモイルリン酸シンテターゼの触媒作用によってカルバモイルリン酸を合成することである。当該酵素のコード遺伝子ｃａｒＡＢは、代謝最終産物であるプリン、ピリミジン及びアルギニンのフィードバック阻害作用を受けた。一方、プリンヌクレオチドは、ｐｕｒＲ遺伝子によってコードされるリプレッサータンパク質の阻害を受け、アルギニンは、ａｒｇＲ遺伝子によってコードされるリプレッサータンパク質の抑制を受けた。本発明は、ｐｕｒＲ及びａｒｇＲをノックアウトすることにより、ｃａｒＡＢ転写の阻害を排除し、カルバモイルリン酸の合成を加速させた。例えば、ＨＱ１９、ＨＱ２２（ＨＱ１９ΔｐｕｒＲ）、ＨＱ２０（ＨＱ１８ΔｐｕｒＲ）、ＨＱ２１（ＨＱ２０ΔａｒｇＲ）においてそれぞれｐＹ０２２を発現させ、発酵培地ＭＳ３．２において振盪フラスコ発酵させ、ＣＤＰＣの収量のそれぞれが、１．２５ｇ／Ｌ、１．５４ｇ／Ｌ、１．１５ｇ／Ｌ、１．３４ｇ／Ｌであった。これは、ｐｕｒＲ又はａｒｇＲ遺伝子のノックアウトが、ｃａｒＡＢに対するフィードバック阻害を排除することができ、それにより、ピリミジン経路の合成を促進し、ＣＤＰＣの収量を増加させることを示している。
【００４８】
上記の記載が発明に係るいくつかの実施例にすぎず、本発明が属する分野の当業者は、本発明の原理から逸脱しない限り、複数の改良をすることができる。これらの改良が本発明の保護範囲であることはみなされるべきである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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