(57)【要約】新規コンジュゲートおよびその調製方法を開示する。アルケン-ホスホンアミデートまたはアルキン-ホスホンアミデートの調製方法は、（I）式（III）の化合物を式（IV）のアジドと反応させて式（V）の化合物を調製する段階、式（V）の化合物を式（VI）のチオール含有分子と反応させて式（VII）の化合物を生成させる段階を含む。2019532041.tif 000436
2019532041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、アルケン-ホスホンアミデートまたはアルキン-ホスホンアミデートの調製方法：
（I）式（III）の化合物
2019532041.tif 000359
［式中、
2019532041.tif 000360
は二重結合または三重結合を表し；
Xは、
2019532041.tif 000361
が三重結合である場合にR3-Cを表すか；または
Xは、
2019532041.tif 000362
が二重結合である場合に(R3R4)Cを表し；
R1は独立に、置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基、例えばフェニルを表し；
任意で、R1は、nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1〜C8アルコキシ)n、F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1〜C8アルキル)H、-NH2、-N(C1〜C8アルキル)2、=O、C3〜C8シクロアルキル、-S-S-(C1〜C8アルキル)、nが1、2、3、4、5もしくは6であるヒドロキシ-(C1〜C8アルコキシ)n、C2〜C8アルキニル、または置換されていてもよいフェニルのうちの少なくとも1つで置換されていてもよい、C1〜C8アルキル、例えば
2019532041.tif 000363
［式中、#は式（III）中のOの位置を表す］を表し、；あるいは
任意で、R1は、C1〜C8アルキル、nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1〜C8アルコキシ)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1〜C8アルキル)H、-NH2、または-N(C1〜C8アルキル)2のうちの少なくとも1つで独立に置換されていてもよい、フェニルを表し；あるいは
任意で、R1は、5または6員ヘテロ芳香族系、例えばピリジルを表し；
好ましくは、R1は、C1〜C8アルキル、-S-S-(C1〜C8アルキル)で置換されたC1〜C8アルキル、nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1〜C8アルコキシ)nで置換されたC1〜C8アルキル、置換されていてもよいフェニルで置換されたC1〜C8アルキル、フェニル、または-NO2で置換されたフェニルを表し；
R3は、HまたはC1〜C8アルキルを表し；かつ
R4は、HまたはC1〜C8アルキルを表す］
を、式（IV）のアジド
2019532041.tif 000364
［式中、●は、脂肪族または芳香族残基を表す］
と反応させて、式（V）の化合物
2019532041.tif 000365
［式中、●、
2019532041.tif 000366
、R1、およびXは、前記の定義のとおりである］
を調製する段階；
（II）式（V）の化合物を、式（VI）のチオール含有分子
2019532041.tif 000367
［式中、
2019532041.tif 000368
は、置換されていてもよいC1〜C8アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリマーを表す］
と反応させて、式（VII）の化合物
2019532041.tif 000369
［式中、
2019532041.tif 000370
は、式（V）の化合物中の
2019532041.tif 000371
が二重結合を表す場合に結合を表すか；または
2019532041.tif 000372
は、式（V）の化合物中の
2019532041.tif 000373
が三重結合を表す場合に二重結合を表し；かつ
2019532041.tif 000374
、●、R1、およびXは、前記の定義のとおりである］
を生成させる段階。
【請求項２】
段階（I）の前に段階a）を含む、請求項1記載の方法：
a）式（I）の化合物
2019532041.tif 000375
［式中、R1は、前記の定義のとおりであり；
Halは、Cl、Br、Iからなる群より選択されるハロゲン、好ましくはClを表す］
を、アルファ位に二重結合または三重結合を含む式（II）のアルファ不飽和化合物
2019532041.tif 000376
［式中、
2019532041.tif 000377
は二重結合または三重結合を表し；
Xは、
2019532041.tif 000378
が三重結合である場合にR3-Cを表すか；または
Xは、
2019532041.tif 000379
が二重結合である場合に(R3R4)Cを表し；
R3は、HまたはC1〜C8アルキルを表し；かつ
R4は、HまたはC1〜C8アルキルを表す］
と反応させて、式（III）の化合物
2019532041.tif 000380
［式中、
2019532041.tif 000381
、XおよびR1は、前記の定義のとおりである］
を形成させる段階；あるいは
式（I'）の化合物
2019532041.tif 000382
［式中、
R5は独立に、C1〜C8アルキルを表し；
Halは、Cl、Br、Iからなる群より選択されるハロゲン、好ましくはClを表す］
を、アルファ位に二重結合または三重結合を含む式（II）のアルファ不飽和化合物
2019532041.tif 000383
［式中、
2019532041.tif 000384
は二重結合または三重結合を表し；
Xは、
2019532041.tif 000385
が三重結合である場合にR3-Cを表すか；または
Xは、
2019532041.tif 000386
が二重結合である場合に(R3R4)Cを表し；
R3は、HまたはC1〜C8アルキルを表し；かつ
R4は、HまたはC1〜C8アルキルを表す］
と反応させて、式（III'）の化合物
2019532041.tif 000387
を形成させ；かつ
該式（III'）の化合物をR1-OHと反応させて、
式（III）の化合物
2019532041.tif 000388
［式中、
2019532041.tif 000389
およびXは前記の定義のとおりであり、かつR1は前記の定義のとおりであるが、個別には選択されない］
を形成させる段階。
【請求項３】
以下の段階を含む、アルケン-ホスホンアミデートの調製方法：
（I）式（III）の化合物
2019532041.tif 000390
［式中、
Vは、C1〜C8アルキル、好ましくはメチル、エチル、またはプロピル、より好ましくはメチルを表し；
R1は独立に、置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基、例えばフェニルを表し；
任意で、R1は、nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1〜C8アルコキシ)n、F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1〜C8アルキル)H、-NH2、-N(C1〜C8アルキル)2、=O、C3〜C8シクロアルキル、-S-S-(C1〜C8アルキル)、nが1、2、3、4、5もしくは6であるヒドロキシ-(C1〜C8アルコキシ)n、C2〜C8アルキニル、または置換されていてもよいフェニルのうちの少なくとも1つで置換されていてもよい、C1〜C8アルキル、例えば
2019532041.tif 000391
［式中、#は式（III*）中のOの位置を表す］を表し；あるいは
任意で、R1は、C1〜C8アルキル、nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1〜C8アルコキシ)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1〜C8アルキル)H、-NH2、または-N(C1〜C8アルキル)2のうちの少なくとも1つで独立に置換されていてもよい、フェニルを表し；あるいは
任意で、R1は、5または6員ヘテロ芳香族系、例えばピリジルを表し；
好ましくは、R1は、C1〜C8アルキル、-S-S-(C1〜C8アルキル)で置換されたC1〜C8アルキル、nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1〜C8アルコキシ)nで置換されたC1〜C8アルキル、置換されていてもよいフェニルで置換されたC1〜C8アルキル、フェニル、または-NO2で置換されたフェニルを表し；
R3は、HまたはC1〜C8アルキルを表し；かつ
R4は、HまたはC1〜C8アルキルを表す］
を、式（IV）のアジド
2019532041.tif 000392
［式中、●は、脂肪族または芳香族残基を表す］
と反応させて、式（V*）の化合物
2019532041.tif 000393
［式中、●、V、およびR1は、前記の定義のとおりであり；
Xは、(R3R4)Cであり；かつ
R3およびR4は、前記の定義のとおりである］
を調製する段階；
（II）式（V*）の化合物を、式（VI）のチオール含有分子
2019532041.tif 000394
［式中、
2019532041.tif 000395
は、置換されていてもよいC1〜C8アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリマーを表す］
と反応させて、式（VII*）の化合物
2019532041.tif 000396
［式中、
2019532041.tif 000397
、●、V、R1、およびXは、前記の定義のとおりである］
を生成させる段階。
【請求項４】
R1が独立に、メチル、エチル、プロピル、またはブチル、より好ましくはメチルまたはエチルを表す、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
R1が
2019532041.tif 000398
［式中、R10およびR11は独立に、水素またはC1〜C8アルキルを表し；かつ#はOの位置を表す］を表す、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
R1が、フェニルで置換されたC1〜C8アルキルを表し、該フェニルが
2019532041.tif 000399
［式中、Zは、OまたはNH、好ましくはOであり、かつ#は該フェニルの位置を表す］でさらに置換されている、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
R1が、フェニルで置換されたC1〜C8アルキルを表し、該フェニルが
2019532041.tif 000400
［式中、#は該フェニルの位置を表す］でさらに置換されている、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
R1が、ヒドロキシエチルまたはホモプロパルギルを表す、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
2019532041.tif 000401
が二重結合を表し、Xが(R3R4)Cを表し、R3およびR4が独立に、HまたはC1〜C8アルキルを表し、かつ
2019532041.tif 000402
が結合を表す、請求項1、2、4、5、6、7または8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
2019532041.tif 000403
が三重結合を表し、XがR3-Cを表し、R3がHまたはC1〜C8アルキルを表し、かつ
2019532041.tif 000404
が二重結合を表す、請求項1、2、4、5、6、7または8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
●が、置換されていてもよいC1〜C8アルキル、好ましくは
2019532041.tif 000405
；
置換されていてもよいフェニル、好ましくは
2019532041.tif 000406
；
放射性または非放射性核種、ビオチン、レポーター酵素、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、CY5またはEDANSなどのフルオロフォア、アミノ酸、ペプチド、置換されていてもよい5または6員ヘテロ芳香族系を表す、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
●が、
構造（VIII）の環状RGDペプチド（c(RGDfK)）
2019532041.tif 000407
［式中、*はN3基の位置を表す］；
ビオチン；
CY5またはEDANS；
C1〜C8アルキル、C1〜C8アルコキシ、ハロゲン、-CN、-NO2、-NH2、-N(C1〜C8アルキル)、-N(C1〜C8アルキル)2 -COOH、-COO(C1〜C8アルキル)、-O-C(O)-(C1〜C8アルキル)、-C(O)N-(C1〜C8アルキル)、-N(H)-C(O)-(C1〜C8アルキル)からなる群より独立に選択される1、2、3、4または5つの置換基で、好ましくは、C1〜C8アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8アルキル)、およびNO2からなる群より選択される1つの置換基で置換されていてもよい、フェニル；
C3〜C8シクロアルキル；ヘテロ原子がN、O、Sから選択される、3つ〜8つの環構成員を有するヘテロシクリル；C1〜C8アルコキシ；ハロゲン；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1〜C8アルキル)；-N(C1〜C8アルキル)2；-COOH；-COO(C1〜C8アルキル)；-O-C(O)-(C1〜C8アルキル)；-CONH2；-C(O)N(C1〜C8アルキル)2；-C(O)NH-(C1〜C8アルキル)；-N(H)-C(O)-(C1〜C8アルキル)、好ましくは、C1〜C8アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8アルキル)、およびNO2、フェニル、またはヘテロ芳香族系、単糖、多糖、ペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリマー、アミノ酸、フルオロフォア、タンパク質タグからなる群より選択される少なくとも1つの置換基（置換基第1世代）で置換されていてもよい、C1〜C8アルキルであって、ここで置換基第1世代は、C3〜C8シクロアルキル；ヘテロ原子がN、O、Sから選択される、3つ〜8つの環構成員を有するヘテロシクリル；C1〜C8アルコキシ；ハロゲン；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1〜C8アルキル)；-N(C1〜C8アルキル)2；-COOH；-COO(C1〜C8アルキル)；-O-C(O)-(C1〜C8アルキル)；-CONH2；-C(O)N(C1〜C8アルキル)2；-C(O)NH-(C1〜C8アルキル)；-N(H)-C(O)-(C1〜C8アルキル)、好ましくは、C1〜C8アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8アルキル)、およびNO2、フェニル、またはヘテロ芳香族系（置換基第2世代）でさらに置換されていてもよく、かつここで置換基第2世代は、同じ群から選択される少なくとも1つの置換基でさらに置換されていてもよく、かつここでそのような置換は第3、4、5、6、7、8、9、または10世代まで及んでいてもよい、C1〜C8アルキル
を表す、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
●が、置換されていてもよいC1〜C8アルキル、例えば、リンカー、薬物、またはリンカー-薬物コンジュゲートを表す、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
●が、置換されていてもよいフェニル、例えば、リンカー、薬物、またはリンカー-薬物コンジュゲートを表す、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
2019532041.tif 000408
が、抗体、好ましくはIgG抗体、より好ましくはセツキシマブまたはトラスツズマブ；ペプチド、好ましくは、GFPタンパク質またはeGFPタンパク質、トリペプチド、より好ましくは、#がSの位置を表す式（IX）のペプチド
2019532041.tif 000409
；置換されていてもよいC1〜C8アルキル、好ましくは、#がSの位置を示す置換C1〜C8アルキル
2019532041.tif 000410
を表す、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
2019532041.tif 000411
および
2019532041.tif 000412
が同じ分子内にある、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
式（V）の化合物
2019532041.tif 000413
式中、●、
2019532041.tif 000414
、R1、およびXは、前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである。
【請求項１８】
式（V*）の化合物
2019532041.tif 000415
式中、●、V、R1、およびXは、前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである。
【請求項１９】
式（VII）の化合物
2019532041.tif 000416
式中、
2019532041.tif 000417
は、式（V）の化合物中の
2019532041.tif 000418
が二重結合を表す場合に結合を表すか；または
2019532041.tif 000419
は、式（V）の化合物中の
2019532041.tif 000420
が三重結合を表す場合に二重結合を表し；かつ
2019532041.tif 000421
、●、R1、およびXは、前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである。
【請求項２０】
式（VII*）の化合物
2019532041.tif 000422
式中、
2019532041.tif 000423
、●、V、R1、およびXは、前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである。
【請求項２１】
2019532041.tif 000424
が抗体を表し、かつ
●が、タンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、またはタンパク質を表す、請求項19または20記載の化合物。
【請求項２２】
2019532041.tif 000425
がタンパク質を表し、かつ
●が、タンパク質タグ、またはCY5もしくはEDANSなどのフルオロフォア、抗体、またはタンパク質を表す、請求項19または20記載の化合物。
【請求項２３】
2019532041.tif 000426
がタンパク質を表し、かつ
●がタンパク質を表す、請求項19または20記載の化合物。
【請求項２４】
2019532041.tif 000427
が抗体を表し、かつ
●が、リンカー、薬物、またはリンカー-薬物コンジュゲートを表す、請求項19または20記載の化合物。
【請求項２５】
式（VIIa）の化合物
2019532041.tif 000428
式中、
2019532041.tif 000429
は、式（III）の化合物中の
2019532041.tif 000430
が二重結合を表す場合に結合を表すか；または
2019532041.tif 000431
は、式（III）の化合物中の
2019532041.tif 000432
が三重結合を表す場合に二重結合を表し；かつ
2019532041.tif 000433
、●、R1、およびXは、前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである。
【請求項２６】
式（VII*a）の化合物
2019532041.tif 000434
式中、
2019532041.tif 000435
、●、V、R1、およびXは、前記請求項のいずれか一項において定義されたとおりである。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
タンパク質の部位特異的修飾のための強力なツールとして、化学選択的反応および生体直交型反応が明らかになってきた（1、2）。これらの反応により、タンパク質の翻訳後修飾に類似の、フルオロフォアおよび他の分光学的標識、ポリマー、毒素ならびに小分子およびタンパク質のような機能性モジュールを有する、様々なタンパク質コンジュゲートおよび抗体コンジュゲートが入手可能となった。それにより、化学選択的タンパク質修飾技術は、タンパク質の生物学的機能の調査、および新しい画像処理技術の開発から、診断学における有望な新しい薬物的アプローチ、タンパク質ベースの薬剤の設計、および薬物の標的指向性送達におよぶ基礎研究に大いに貢献してきた。
【０００２】
近年、研究者らは、タンパク質修飾のための生体直交型反応の工学技術において、主に2つの異なる局面に集中してきた（3）。一方では、多くの努力が、タンパク質側鎖にある特有の官能基の変換のために、反応性の高い出発原料を必要とする高速反応に充てられてきた（4、5）。このアプローチは、部位特異的標識を達成するための高度なアンバーサプレッション技術によるものであり、いくつかの遺伝子によりコードされる高反応性生体直交型レポーターが、歪み促進型アルキン-アジド付加環化または逆電子要求型ディールス・アルダー反応を含む、様々な型の付加環化反応を起こす結果となった（6、7）。他方で、研究者らは、特に大量の機能性タンパク質コンジュゲートと、理想的には定量的変換が望まれる場合、不可能でなければ単調な精製段階を避けるために、高収率のタンパク質修飾反応を開発し、適用することに焦点を当ててきた（1）。これを達成するためには、高収率のタンパク質発現が特に重要である。アンバーサプレッションは発現タンパク質の量の低下を引き起こし得るため、多くの場合、標準的な栄養要求性発現系が好ましい。標準的なタンパク質発現と組み合わせて部位特異的標識を達成するための一般的なシナリオは、部位特異的変異誘発による選択したタンパク質における特有のCys残基の配置と、続くCys修飾戦略である（8）。または、アジドもしくはアルキン含有アミノ酸を、栄養要求性発現系を用いて組み込むこともでき（9）、これはシュタウディンガー連結およびCu触媒によるアジド-アルキン付加環化（CuAAC）を用いて修飾することができる（10、11）。
【０００３】
これらの局面はいずれも、近年、顕著な進歩を見ているが、無金属の化学選択的修飾反応のための高反応性かつ複雑な機能性モジュールの一般的で組み立て式の到達可能性は、難解なままであることが多い。これは、用いる生体直交型機能の高反応性および不安定性を考慮して問題であり得る、反応性生体直交型構築ブロックの合成において、さらなる保護基操作が必要なためである。例えば、分子画像法のためのXe-クリプトファンを有する高反応性シクロオクチン含有蛍光ペプチドの合成は、直交型保護基の洗練されているが低収率の使用が必要であった（12）。
【０００４】
2013年に、CuAACをシュタウディンガー-ホスホニト反応（SPhR）と組み合わせることによる、2つのアジド構築ブロックの段階的カップリングのための組み立て式化学選択的方法が開発された（13）。水性系においてアジド含有ペプチドおよびタンパク質の化学選択的標識のためにSPhRを導入し、ボラン保護ビスエトキシアルキン-ホスホニトを介してタンパク質-ホスホンアミデート-コンジュゲートを生成することは、（14）から公知である。
【０００５】
Cys残基のコンジュゲーションのための以前の技術は、主にマレイミドコンジュゲーションに依拠しているが、これは多くの場合、加水分解される傾向にあり、高チオール濃度下でチオール交換を受けやすい。Cysコンジュゲーション技術についての最近の総説は（22）に記載されている。WO 2015/169784は、C2-ジスルフィド-架橋ペプチドおよびタンパク質の調製のための方法を開示しており、ここで架橋はアルキンとのチオール-イン-反応によって達成される。US2535174は、飽和脂肪族メルカプタンのエテンホスホン酸のエステルへのアルカリ触媒付加を記載している。しかし、本明細書において開示するアルキン-ホスホンアミデートおよびアルケン-ホスホンアミデートのチオールコンジュゲートは報告もされておらず、また先行技術によって予想もされていない。
【発明の概要】
【０００６】
定義
当業者であれば、本出願において用いられる用語「a」または「an」は、状況に応じて、「1つ」「1つもしくは複数」または「少なくとも1つ」を意味し得ることを理解するであろう。
【０００７】
ハロゲンは、そうではないと定義されないかぎり、VII族典型元素であり、好ましくは、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素であり、より好ましくは、フッ素、塩素、および臭素であり、Mgとの組み合わせでさらにより好ましくは臭素である。
【０００８】
アルキルは、他所でそうではないと定義されないかぎり、好ましくは、(C1〜C8)-、(C1〜C6)-、または(C1〜C4)-炭素原子を有する、飽和直鎖または分枝炭化水素基である。例：メチル、エチル、プロピル、1-メチルエチル、ブチルなど。
【０００９】
アルケニルは、他所でそうではないと定義されないかぎり、二重結合を有する、不飽和直鎖または分枝炭化水素基である。アルケニルは、好ましくは、(C2〜C8)-、(C2〜C6)-、または(C2〜C4)-アルケニルである。例：エテニル、1-プロペニル、3-ブテニルなど。
【００１０】
アルキニルは、他所でそうではないと定義されないかぎり、三重結合を有する、不飽和直鎖または分枝炭化水素基である。アルキニルは、好ましくは、(C2〜C8)-、(C2〜C6)-、または(C2〜C4)-アルキニルである。例：エチニル、1-プロピニルなど。
【００１１】
アルコキシ（アルキル基-O-）は、他所でそうではないと定義されないかぎり、酸素原子（-O-）を介して基本構造に結合されているアルキル基である。アルコキシは、好ましくは、(C1〜C8)-、(C1〜C6)-、または(C1〜C4)-アルコキシである。例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、1-メチルエトキシなど。
【００１２】
同様に、アルケノキシおよびアルキノキシは、他所でそうではないと定義されないかぎり、それぞれ-O-を介して基本構造に結合されているアルケニル基およびアルキニル基である。アルケノキシは、好ましくは、(C2〜C8)-、(C2〜C6)-または(C2〜C4)-アルケノキシである。アルキノキシは、好ましくは、(C3〜C10)-、(C3〜C6)-または(C3〜C4)-アルキノキシである。
【００１３】
アルキルカルボニル（アルキル基-C(=O)-）は、そうではないと定義されないかぎり、好ましくは、(C1〜C8)-、(C1〜C6)-、または(C1〜C4)-アルキルカルボニルである。ここで、炭素原子の数はアルキルカルボニル基におけるアルキル基を指す。
【００１４】
同様に、アルケニルカルボニルおよびアルキニルカルボニルは、他所でそうではないと定義されないかぎり、それぞれ-C(=O)-を介して基本構造に結合されているアルケニル基およびアルキニル基である。アルケニルカルボニルは、好ましくは、(C2〜C8)-、(C2〜C6)-、または(C2〜C4)-アルケニルカルボニルである。アルキニルカルボニルは、好ましくは、(C2〜C8)-、(C2〜C6)-、または(C2〜C4)-アルキニルカルボニルである。
【００１５】
アルコキシカルボニル（アルキル基-O-C(=O)-）は、他所でそうではないと定義されないかぎり、好ましくは、(C1〜C8)-、(C1〜C6)-、または(C1〜C4)-アルコキシカルボニルである。ここで、炭素原子の数はアルコキシカルボニル基におけるアルキル基を指す。
【００１６】
同様に、アルケノキシカルボニルおよびアルキノキシカルボニルは、他所でそうではないと定義されないかぎり、それぞれ-O-C(=O)-を介して基本構造に結合されているアルケニル基およびアルキニル基である。アルケノキシカルボニルは、好ましくは、(C2〜C8)-、(C2〜C6)-、または(C2〜C4)-アルケノキシカルボニルである。アルキノキシカルボニルは、好ましくは、(C3〜C8)-、(C3〜C6)、または(C3〜C4)-アルキノキシカルボニルである。
【００１７】
アルキルカルボニルオキシ（アルキル基-C(=O)-O-）は、他所でそうではないと定義されないかぎり、カルボニルオキシ基（-C(=O)-O-）を介して酸素により基本構造に結合されているアルキル基である。アルキルカルボニルオキシは、好ましくは、(C1〜C8)-、(C1〜C6)-、または(C1〜C4)-アルキルカルボニルオキシである。
【００１８】
同様に、アルケニルカルボニルオキシおよびアルキニルカルボニルオキシは、他所でそうではないと定義されないかぎり、それぞれ(-C(=O)-O-)を介して基本構造に結合されているアルケニル基およびアルキニル基である。アルケニルカルボニルオキシは、好ましくは、(C2〜C8)-、(C2〜C6)-、または(C2〜C4)-アルケニルカルボニルオキシである。アルキニルカルボニルオキシは、好ましくは、(C2〜C8)-、(C2〜C6)-、または(C2〜C4)-アルキニルカルボニルオキシである。
【００１９】
アルキルチオは、他所でそうではないと定義されないかぎり：-S-を介して基本構造に結合されているアルキル基である。アルキルチオは、好ましくは、(C1〜C8)-、(C1〜C6)-、または(C1〜C4)-アルキルチオである。
【００２０】
同様に、アルケニルチオおよびアルキニルチオは、他所でそうではないと定義されないかぎり、それぞれ-S-を介して基本構造に結合されているアルケニル基およびアルキニル基である。アルケニルチオは、好ましくは、(C2〜C8)-、(C2〜C6)-、または(C2〜C4)-アルケニルチオである。アルキニルチオは、好ましくは、(C3〜C8)-、(C3〜C6)-、または(C3〜C4)-アルキニルチオである。
【００２１】
他所でそうではないと定義されないかぎり、用いられる用語「置換されている」は、非常に広範な置換パターンを意味する。本発明の開示から見られるとおり、特に位置R1、
2019532041.tif 000003
および●は、多くの有機（高）分子による置換を可能にする。これらの分子の構造は、本開示の方法および得られるコンジュゲートに関連がないと言える。したがって、この新しく革新的な概念の原理をいくつかの分子だけに限定するとすれば、それは過度の限定であろう。それにもかかわらず、この用語は、それぞれ有機置換基またはその塩を意味し、これらはそれぞれ、さらなる有機置換基またはその塩でさらに数回置換されていてもよい。そのような複雑な置換基の例が生成され、本出願において示す（例えば、スキーム5、6、7、11、13、15、19、20、21、22、23、および24を参照のこと）。好ましくは、用語：置換されているは、ニトロ、シアノ、Cl、F、Cl、Br、-NH-R、NR2、COOH、-COOR、-OC(O)R  -NH2、-OH、-CONH2 CONHR、CON(R)2、-S-R、-SH、-C(O)H、-C(O)R、(C1〜C20)-アルキル、(C1〜C20)-アルコキシ、(C2〜C20)-アリル、3〜8員の（複素）環（存在する場合、ヘテロ原子は、N、O、およびSから独立に選択される）、5〜12個の環原子を有する（複素）芳香族系（例えば、フェニル、ピリジル、ナフチルなど）から選択される1つまたは複数の置換基で置換されている基を意味し、ここでRは、これらの置換基のうちのいずれかを表すことができ、置換は数回繰り返されることができ、例えば、置換は1、2、3、4、5、6、7、8、9または10回繰り返されることができ；例えば、スキーム11の●置換基：
2019532041.tif 000004
［式中、#は、N3の位置を表すか、または●がすでに式（VII）の化合物の一部である場合はNの位置を表す］を参照されたい。しかし、当業者であれば、40単位の多糖で置換されているアルキル鎖は、一般的な置換パターンで単純に記載し得ないことに同意するであろう。
【００２２】
本明細書において用いられる用語「ペプチド」は、ペプチド結合（アミド結合）によって共有結合された2つ以上のアミノ酸を含む有機化合物を意味する。ペプチドは構成アミノ酸の数に関して言及されてもよく、すなわち、ジペプチドは2つのアミノ酸残基を含み、トリペプチドは3つを含み、他も同様である。10個以下のアミノ酸を含むペプチドをオリゴペプチドと呼んでもよいが、10個より多くのアミノ酸残基を有するものはポリペプチドである。アミノ酸は、少なくとも1つの環、または分枝もしくは非分枝鎖、あるいはそれらの組み合わせを形成することができる。タンパク質および抗体はペプチドであり、したがってこの用語に含まれるが、それらの重要度ゆえに別に命名されることもある。
【００２３】
本明細書において用いられる用語「アミノ酸」は、-CH(NH3)-COOH基を有する有機化合物を意味する。1つの態様において、用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸であるアルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、およびグリシンを意味する。しかし、この用語は、そのより広い意味において非天然アミノ酸も含む。
【００２４】
本発明のアミノ酸およびペプチドは、官能基において修飾されることもできる。非限定例は、糖類、例えば、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）；または保護基、例えば、フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）-修飾もしくはエステルである。
【００２５】
用語「タンパク質」は、アミノ酸残基の1つまたは複数の長鎖を含むペプチドを意味する。タンパク質は、代謝反応の触媒、DNA複製、刺激への反応、および分子の輸送、反応の触媒を含む、インビボおよびインビトロでの多くの機能を実施する。タンパク質は特定の3次元構造に折り畳まれる。タンパク質中の残基は（例えば、翻訳後修飾によって）化学的に修飾されることが多く、それによって物理化学的性質、折り畳み、安定性、活性、および最終的にはタンパク質の機能が変わる。タンパク質に非ペプチド性の族/基（これは補欠分子族または補助因子と呼ばれ得る）が結合している場合もある。複数のタンパク質（酵素および補酵素を含む）が特定の機能を達成するように共に作用することもでき、これらは会合して安定なタンパク質複合体を形成することが多い。これらの形態はすべて用語「タンパク質」に含まれる。
【００２６】
本明細書において用いられる用語「タンパク質タグ」は、様々な目的のために本発明のリンカーを介してタンパク質または他のチオール含有化合物に結合し得る、ペプチド配列を意味する。タンパク質タグの非限定例は、アフィニティータグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープタグ、およびレポーター酵素である。
【００２７】
アフィニティータグは、例えば、アフィニティー技術を用いて精製することができるように、本発明のリンカーを介してタンパク質および他のチオール含有化合物に付加される。これらには、例えば、キチン結合タンパク質（CBP）、マルトース結合タンパク質（MBP）、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、またはポリ(His)タグが含まれる。
【００２８】
可溶化タグは、タンパク質の適切な折り畳みを補助し、これらが沈澱しないように維持するために用いることができる。これらには、チオレドキシン（TRX）およびポリ(NANP)が含まれる。いくつかのアフィニティータグ（例えば、MBPおよびGST）は、可溶化剤としての二重の役割を有する。
【００２９】
クロマトグラフィータグは、特定の分離技術において異なる分解能を提供するために、タンパク質のクロマトグラフィ特性を変えるために用いられる。多くの場合、これらはポリアニオン性アミノ酸からなる（例えば、FLAG-タグ）。
【００３０】
エピトープタグは、多くの異なる種において高親和性抗体が確実に産生され得るために選択される、短いペプチド配列である。これらは通常はウイルス遺伝子に由来する。エピトープタグには、V5-タグ、Myc-タグ、HA-タグ、およびNE-タグが含まれる。これらのタグは、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光および免疫沈降実験、ならびに抗体精製のために特に有用である。
【００３１】
本明細書において用いられる用語「レポーター酵素」は、生化学的検出においてシグナルの増大を可能にする任意の公知の酵素を意味する。非限定例は、アルカリホスファターゼ（AP）、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）またはグルコースオキシダーゼ（GOX）などの色素生成酵素；緑色蛍光タンパク質（GFP）、レドックス感受性GFP（RoGFP）、AzuriteまたはEmeraldなどの蛍光タンパク質；ルシフェラーゼ、すなわち生物発光を生じる酸化酵素のクラス（例えば、ホタルルシフェラーゼ（EC 1.13.12.7））；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）；β-ガラクトシダーゼ；またはβ-グルクロニダーゼである。
【００３２】
タンパク質タグの非限定例は下記である：AviTag、酵素BirAによるビオチン化を可能にするペプチドであり、したがってタンパク質をストレプトアビジンによって単離することができる
2019532041.tif 000005
；カルモジュリン-タグ、タンパク質カルモジュリンに結合されるペプチド
2019532041.tif 000006
；ポリグルタミン酸タグ、Mono-Qなどのアニオン交換樹脂に効率的に結合するペプチド（EEEEEE）；E-タグ、抗体によって認識されるペプチド
2019532041.tif 000007
；FLAG-タグ、抗体によって認識されるペプチド（DYKDDDDK）；HA-タグ、抗体によって認識されるヘマグルチニン由来ペプチド（YPYDVPDYA）；His-タグ、ニッケルまたはコバルトキレートによって結合される5〜10個のヒスチジン（HHHHHH）；Myc-タグ、抗体によって認識されるc-myc由来ペプチド（EQKLISEEDL）；NE-タグ、モノクローナルIgG1抗体によって認識される新規18アミノ酸合成ペプチドであり、ウェスタンブロッティング、ELISA、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、免疫沈降、および組換えタンパク質のアフィニティ精製を含む広範囲の用途において有用である
2019532041.tif 000008
；S-タグ、リボヌクレアーゼA由来ペプチド
2019532041.tif 000009
；SBP-タグ、ストレプトアビジンに結合するペプチド
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；Softag 1、哺乳動物発現用
2019532041.tif 000011
；Softag 3、原核生物発現用（TQDPSRVG）；Strep-tag、ストレプトアビジン、またはstreptactinと呼ぶ改変ストレプトアビジンに結合するペプチド（Strep-tag II: WSHPQFEK）；TCタグ、FlAsHおよびReAsH二ヒ素化合物によって認識されるテトラシステインタグ（CCPGCC）；V5タグ、抗体によって認識されるペプチド
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；VSV-タグ、抗体によって認識されるペプチド
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；Xpressタグ（DLYDDDDK）；Isopepタグ、pilin-Cタンパク質に共有結合するペプチド
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；SpyTag、SpyCatcherタンパク質に共有結合するペプチド
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；SnoopTag、SnoopCatcherタンパク質に共有結合するペプチド
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；BCCP（ビオチンカルボキシル担体タンパク質（Biotin Carboxyl Carrier Protein））、BirAによってビオチン化されて、ストレプトアビジンによる認識を可能にするタンパク質ドメイン；グルタチオン-S-トランスフェラーゼ-タグ、固定グルタチオンに結合するタンパク質；緑色蛍光タンパク質-タグ、自然蛍光性であり、ナノボディによって結合され得るタンパク質；Halo-タグ、HaloLink(商標) Resin（Promega）に共有結合する変異ヒドロラーゼ；マルトース結合タンパク質-タグ、アミロースアガロースに結合するタンパク質；Nus-タグ；チオレドキシン-タグ；Fc-タグ、免疫グロブリンFcドメインに由来し、二量体化および可溶化を可能にし、Protein-A Sepharoseでの精製に用いることができる；無秩序さを促進するアミノ酸（disorder promoting amino acid）（P、E、S、T、A、Q、G、..）を含有するDesigned Intrinsically Disorderedタグ；アルカリホスファターゼ（AP）；西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）グルコースオキシダーゼ（GOX）；緑色蛍光タンパク質（GFP）；レドックス感受性GFP（RoGFP）；Azurite；Emerald；ホタルルシフェラーゼ（EC 1.13.12.7））；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）；β-ガラクトシダーゼ；β-グルクロニダーゼ；チューブリン-チロシンリガーゼ（TTL）。
【００３３】
本明細書において用いられる用語「抗体」は、好ましくは4つのポリペプチド鎖、典型的にはジスルフィド結合によって相互連結された2つの重（H）鎖および2つの軽（L）鎖からなる免疫グロブリン分子を指すことが意図されている。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてVHと略す）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、例えば、3つのドメインCH1、CH2、およびCH3を含み得る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてVLと略す）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、1つのドメイン（CL）からなる。VHおよびVL領域は、フレームワーク領域（FR）と呼ばれる、より保存された領域が点在する、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。各VHおよびVLは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端へと、例えば、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配列された、3つのCDRおよび最大4つのFRからなる。
【００３４】
本明細書において用いられる用語「相補性決定領域」（CDR；例えば、CDR1、CDR2、およびCDR3）は、抗原との結合に必要な存在である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を意味する。各可変ドメインは、典型的には、CDR1、CDR2、およびCDR3として特定される3つのCDR領域を有する。各相補性決定領域は、Kabatによって定義された「相補性決定領域」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変領域におけるおよその残基24〜34（L1）、50〜56（L2）、および89〜97（L3）、ならびに重鎖可変領域における31〜35（H1）、50〜65（H2）、および95〜102（H3）；ならびに/または「超可変ループ」からの残基（例えば、軽鎖可変領域におけるおよその残基26〜32（L1）、50〜52（L2）、および91〜96（L3）、ならびに重鎖可変領域における26〜32（H1）、53〜55（H2）、および96〜101（H3））を含み得る。いくつかの場合に、相補性決定領域は、Kabatの定義のCDR領域および超可変ループの両方からのアミノ酸を含み得る。
【００３５】
インタクトな抗体を、それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて異なる「クラス」に割り付けることができる。インタクトな抗体には、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMという5つの主なクラスがあり、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分類され得る。本発明において用いるのに好ましい免疫グロブリンのクラスは、IgGである。
【００３６】
異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常領域は、それぞれ［アルファ］、［デルタ］、［イプシロン］、［ガンマ］、および［ミュー］と呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置は周知である。本明細書において用いられる抗体は、慣習的に公知の抗体およびその機能性断片である。
【００３７】
本明細書における抗体/免役グロブリンの「機能性断片」または「抗原結合性の抗体断片」は、抗原結合領域を保持する抗体/免役グロブリンの断片（例えば、IgGの可変領域）と定義される。抗体の「抗原結合領域」は、典型的には、抗体の1つまたは複数の超可変領域、例えば、CDR1、-2、および/または-3領域において見出されるが；可変「フレームワーク」領域も、CDRの骨格を提供するなどにより、抗原結合において重要な役割を果たし得る。好ましくは、「抗原結合領域」は、少なくとも可変軽（VL）鎖のアミノ酸残基4〜103および可変重（VH）鎖のアミノ酸残基5〜109、より好ましくはVLのアミノ酸残基3〜107およびVHのアミノ酸残基4〜111を含み、特に好ましいのはVLおよびVH鎖全体（VLのアミノ酸1〜109位およびVHのアミノ酸1〜113位；WO 97/08320による番号付け）である。
【００３８】
本発明の「機能性断片」、「抗原結合性の抗体断片」、または「抗体断片」には、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、およびFv断片；二重特異性抗体；単一ドメイン抗体（DAb）、線状抗体；単鎖抗体分子（scFv）；ならびに抗体断片から形成された多重特異性（例えば、二重および三重特異性）抗体が含まれるが、それらに限定されない。「多重特異性」または「多機能性」抗体以外の抗体は、その結合部位それぞれが同じであることが理解される。CH1ドメインとCLドメインとの間で起こる分子間ジスルフィド相互作用を最小限にするかまたは完全に除去するように、F(ab')2またはFabを操作してもよい。
【００３９】
本明細書における用語「Fc領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む免役グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然配列Fc領域およびバリアントFc領域を含む。1つの態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Cys226またはPro230から重鎖のカルボキシル末端におよぶ。しかし、Fc領域のC末端リジン（Lys447）は存在しても、しなくてもよい。本明細書において特に記載がないかぎり、Fc領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、EUインデックスとも呼ばれるEU番号付けシステムによる。
【００４０】
本発明において企図される抗体または抗原結合性の抗体断片のバリアントは、抗体または抗原結合性の抗体断片の結合活性が維持されている分子である。
【００４１】
本発明において企図される「結合タンパク質」は、例えば、Affibody、Adnectin、Anticalin、DARPin、Avimer、Nanobodyなどの抗体類似物質である。
【００４２】
本明細書における「ヒト」抗体またはその抗原結合断片は、キメラではなく（例えば、「ヒト化」されておらず）、かつ非ヒト種由来ではない（全体または部分のいずれでも）ものと定義される。ヒト抗体またはその抗原結合断片は、ヒト由来であり得、または合成ヒト抗体であり得る。本明細書における「合成ヒト抗体」は、その全体または一部が、インシリコでの公知のヒト抗体配列の分析に基づく合成配列に由来する配列を有する、抗体と定義される。ヒト抗体配列またはその断片のインシリコ設計は、例えば、ヒト抗体または抗体断片配列のデータベースを解析し、それから得たデータを用いてポリペプチド配列を考案することにより達成され得る。ヒト抗体またはその抗原結合断片の別の例は、ヒト起源の抗体配列のライブラリ（例えば、ヒト天然原料から得た抗体に基づいているライブラリ）から単離された核酸によってコードされるものである。
【００４３】
「ヒト化抗体」またはそのヒト化抗原結合断片は本明細書において、（i）非ヒト原料（例えば、異種免疫系を有するトランスジェニックマウス）に由来し、その抗体はヒト生殖系配列に基づく；（ii）非ヒト抗体のフレームワーク領域のアミノ酸が遺伝子操作によってヒトアミノ酸配列に部分的に交換されている、または（iii）可変領域のCDRは非ヒト起源に由来するが、可変領域の1つまたは複数のフレームワークはヒト起源のものであり、（あれば）定常領域はヒト起源のものである、CDRが移植されたものと定義される。
【００４４】
「キメラ抗体」またはその抗原結合断片は本明細書において、可変領域が非ヒト起源に由来し、いくつかまたはすべての定常領域がヒト起源に由来するものと定義される。
【００４５】
本明細書において用いられる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同種の抗体の集団から得た抗体を意味し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかに存在し得る可能な変異（例えば、自然発生変異）以外は同一である。したがって、用語「モノクローナル」は、抗体の特徴が別々の抗体の混合物ではないことを示す。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する抗体である。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体製剤は、典型的には他の免役グロブリンが混入していないために有利である。用語「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の産生が必要であると解釈されるべきではない。用語：モノクローナル抗体は、特にキメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体を含む。
【００４６】
「単離された」抗体は、同定され、それを発現した細胞の構成要素から分離されたものである。細胞の混入構成要素は、抗体の診断的または治療的使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。
【００４７】
本明細書において用いられる場合、抗体が関心対象の抗原（例えば、腫瘍関連ポリペプチド抗原標的）に「特異的に結合する」、該抗原に「特異的である」、または該抗原を「特異的に認識する」とは、該抗体が、該抗原を発現する細胞または組織を標的とする場合に治療剤として有用であり、かつ他のタンパク質と著しく交差反応しない、または前述の抗原標的のオルソログおよびバリアント（例えば、変異型、スプライスバリアント、またはタンパク質分解により切断された型）以外のタンパク質と著しく交差反応しないような十分な親和性で、抗原と結合するものである。本明細書において用いられる特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープを「特異的に認識する」またはそれに「特異的に結合する」またはそれに対して「特異的である」という用語は、抗体またはその抗原結合断片の抗原に対する一価のKDが、例えば、約10-4M未満、または約10-5M未満、または約10-6M未満、または約10-7M未満、または約10-8M未満、または約10-9M未満、または約10-10M未満、または約10-11M未満、または約10-12M未満、またはそれ未満であることによって示され得る。抗体が抗原と1つまたは複数の基準抗原とを識別し得る場合、そのような抗体はそのような抗原に「特異的に結合する」、該抗原に「特異的である」または該抗原を「特異的に認識する」。その最も一般的な形態で、「特異的結合」、「特異的に結合する」、「特異的である」、または「特異的に認識する」とは、抗体が関心対象の抗原と無関係の抗原とを識別する能力を意味し、例えば、以下の方法のうちの1つにより判定される。そのような方法には、表面プラズモン共鳴法（SPR）、ウェスタンブロット、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-試験およびペプチドスキャンが含まれるが、それらに限定されない。例えば、標準的なELISA検定を実施することができる。スコア化は標準的な発色（例えば、二次抗体と西洋わさびペルオキシダーゼおよびテトラメチルベンジジンと過酸化水素）によって実施してもよい。一定のウェル中の反応を、例えば、450nmの光学密度によりスコア化する。典型的バックグラウンド（＝陰性反応）は0.1 ODであり得；典型的陽性反応は1 ODであり得る。これは、陽性/陰性の差が5倍よりも大きい、10倍よりも大きい、50倍よりも大きい、好ましくは100倍よりも大きいことを意味する。典型的には、結合特異性の判定は、単一の基準抗原ではなく、粉乳、BSA、トランスフェリンなどの、約3〜5つの無関係の抗原のセットを用いて実施する。
【００４８】
「結合親和性」または「親和性」とは、分子の1つの結合部位とその結合相手との間の非共有相互作用の合計の強さを意味する。特に記載がないかぎり、本明細書において用いられる「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）の構成員の間の1：1相互作用を反映する、固有の結合親和性を意味する。解離定数「KD」は一般に、分子（例えば抗体）とその結合相手（例えば抗原）との間の親和性、すなわち、リガンドが特定のタンパク質にいかにしっかりと結合するかを述べる。リガンド-タンパク質親和性は、2つの分子間の非共有分子間相互作用によって影響される。親和性は、本明細書に記載のものを含む、当技術分野において公知の一般的方法によって測定することができる。1つの態様において、本発明の「KD」または「KD値」は、Biacore T100、Biacore T200、Biacore 2000、Biacore 4000、Biacore 3000のようなBiacore機器（GE Healthcare Biacore, Inc.）、またはProteOn XPR36機器（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を含むが、それらに限定されない、適切な装置を用いての表面プラズモン共鳴検定を用いて測定する。
【００４９】
本明細書において用いられる用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオシド部分」は、糖基および複素環塩基を含む核酸サブユニット、ならびにそのようなサブユニットの類縁体、例えば、修飾もしくは天然デオキシリボヌクレオシドもしくはリボヌクレオシドまたはその任意の化学修飾体を意味する。他の基（例えば、保護基）をヌクレオシドの任意の構成要素に結合することができる。ヌクレオシドの修飾には、2'-、3'-および5'-位糖修飾、5-および6-位ピリミジン修飾、2-、6-および8-位プリン修飾、環外アミンの修飾、5-ブロモ-ウラシルの置換などが含まれるが、それらに限定されない。ヌクレオシドホスホロアミダイトモノマー、H-ホスホネートカップリング、またはリン酸トリエステルカップリングを用いての固相自動合成などの、当技術分野において公知の方法によるオリゴヌクレオチド合成を可能にするよう、ヌクレオシドを適切に保護し、誘導体化することができる。
【００５０】
「ヌクレオチド」または「ヌクレオチド部分」とは、リン酸基、糖基、および複素環塩基を含む核酸のサブユニット、ならびにそのようなサブユニットの類縁体を意味する。他の基（例えば、保護基）をヌクレオチドの任意の構成要素に結合することもできる。用語「ヌクレオチド」は、修飾または天然デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを意味してもよい。ヌクレオチドは、いくつかの場合、プリンおよびピリミジンを含み、これらはチミジン、シチジン、グアノシン、アデニン、およびウリジンを含む。用語「ヌクレオチド」は、公知のプリンおよびピリミジン塩基（例えば、アデニン（A）、チミン（T）、シトシン（C）、グアニン（G）、またはウラシル（U））を含有する部分だけでなく、修飾されている他の複素環塩基を含有する部分も含むことが意図される。そのような修飾体には、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、アルキル化リボースまたは他の複素環が含まれる。そのような修飾には、例えば、ジアミノプリンおよびその誘導体、イノシンおよびその誘導体、アルキル化プリンもしくはピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、チオール化プリンもしくはピリミジンなど、またはアセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル、ベンゾイル、9-フルオレニルメトキシカルボニル、フェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジブチルホルムアミジン、ジメチルアセトアミジン、N,N-ジフェニルカルバメートなどの保護基の付加が含まれる。プリンまたはピリミジン塩基は前述のものの類縁体であってもよく；適切な類縁体は当業者には公知であり、関連する教科書および文献中に記載されている。一般的な類縁体には、1-メチルアデニン、2-メチルアデニン、N6-メチルアデニン、N6-イソペンチルアデニン、2-メチルチオ-N6-イソペンチルアデニン、N,N-ジメチルアデニン、8-ブロモアデニン、2-チオシトシン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、5-エチルシトシン、4-アセチルシトシン、1-メチルグアニン、2-メチルグアニン、7-メチルグアニン、2,2-ジメチルグアニン、8-ブロモグアニン、8-クロログアニン、8-アミノグアニン、8-メチルグアニン、8-チオグアニン、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、5-エチルウラシル、5-プロピルウラシル、5-メトキシウラシル、5-ヒドロキシメチルウラシル、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)ウラシル、5-(カルボキシメチルアミノメチル)-ウラシル、2-チオウラシル、5-メチル-2-チオウラシル、5-(2-ブロモビニル)ウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、シュードウラシル、1-メチルシュードウラシル、キューオシン、イノシン、1-メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、2-アミノプリン、6-ヒドロキシアミノプリン、6-チオプリンおよび2,6-ジアミノプリンが含まれるが、それらに限定されない。
【００５１】
本明細書において用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、前記の定義の複数の連結ヌクレオチド単位から形成されるポリヌクレオチドを意味する。ヌクレオチド単位はそれぞれ、リン酸連結基、またはその類縁体を介して一緒に連結されたヌクレオシド単位を含む。オリゴヌクレオチドなる用語は、ホスホロチオエート連結またはスクアラミド連結などのリン酸連結以外の連結を介して一緒に連結された複数のヌクレオチドも意味する。オリゴヌクレオチドは天然または非天然であり得る。いくつかの場合に、オリゴヌクレオチドはリボヌクレオチドモノマーを含んでもよく（すなわち、オリゴリボヌクレオチドであってもよく）、かつ/またはデオキシリボヌクレオチドモノマーを含んでもよい。
【００５２】
本明細書において用いられる用語「単糖」は、mが3、4、5、6、7または8であり、かつnが2、3、4、5 6、7または8である、一般式Cm(H2O)nの鎖状または環式化合物を意味する。しかし、この用語は、OH基がNH2基で置き代えられたこれらの塩基性化合物誘導体（例えば、グルコサミン）、少なくとも1つのOH基がHで置き代えられたデオキシ糖（例えば、デオキシリボース）も含む。単糖の好ましい例は、D-(+)-グリセリンアルデヒド；D-(-)-エリトロース；D-(-)-トレオース；D-(-)-リボース；D-(-)-アラビノース；D-(+)-キシロース；D-(-)-リキソース；D-(+)-アロース；D-(+)-アルトロース；D-(+)-グルコース；D-(+)-マンノース；D-(-)-グロース；D-(-)-イドース；D-(+)-ガラクトース；D-(+)-タロース；ジヒドロキシアセトン；D-エリトルロース；D-リブロース；D-キシルロース；D-プシコース；D-フルクトース；D-ソルボース；D-タガトースである。用語：単糖は、1、2、3または4つのヒドロキシル基が置換されている単糖も含む。
【００５３】
用語「多糖」は、グリコシド結合を介して連結された少なくとも2個、好ましくは少なくとも5個、より好ましくは少なくとも10個の単糖を含む分子を意味する。
【００５４】
本明細書において用いられる糖質は、単糖および多糖ならびにその誘導体を含む。
【００５５】
本明細書において用いられるポリマーは、多くの反復有機サブユニットからなるが、多糖、オリゴヌクレオチド、またはペプチドではない高分子を意味する。ポリマーの例は、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリオキシエチレン（PEO）またはポリグリセロール（例えば、ポリリシノール酸ポリグリセロール（PGPR））である。
【００５６】
用語「フルオロフォア」は当業者に周知であり、光励起後に光を再放射する化学化合物を意味する。非限定例は、CY5、EDANS、キサンテン誘導体（例えば、フルオレセイン、ローダミン、Oregon green、エオシン、Texas red）、シアニン誘導体（例えば、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、メロシアニン）、スクアライン誘導体（例えば、Seta、Se Tau、Square色素）、ナフタレン誘導体（例えば、ダンシルまたはプロダン誘導体）、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体、アントラセン誘導体（例えば、DRAQ5、DRAQ7、CyTRAK Orangeなどのアントラキノン）、ピレン誘導体（例えば、cascade blue）、オキサジン誘導体（例えば、Nile red、Nile blue、Cresyl violet）、アクリジン誘導体（例えば、Proflavin、Acridine Orange、Acridine Yellow）、アリールメチン誘導体（例えば、オーラミン、Crystal Violet、Malachite Green）、またはテトラピロール誘導体（例えば、Parphin、Phthal ocyanine、Bilirubin）である。
【００５７】
本明細書において用いられる用語「脂肪族または芳香族残基」は、脂肪族置換基、例えば、アルキル残基であるが、さらなる脂肪族および/または芳香族置換基で置換され得る残基を意味し、例えば、脂肪族残基は、核酸、ペプチド、タンパク質、酵素、補酵素、抗体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、単糖、多糖、ポリマー、フルオロフォア、置換されていてもよいベンゼンなどであり得る（そのような分子のコア構造への直接連結（R1の場合、例えば、式（III）または（V）の化合物のそれぞれの酸素への直接連結）が脂肪族であるかぎりにおいて）。芳香族残基は、置換基であって、コア構造への該置換基の直接連結が芳香族系の一部である、置換基、例えば、置換されていてもよいフェニルもしくはピリジルもしくはペプチド（コア構造へのペプチドの直接連結が、例えばフェニル残基を介する直接連結である場合）である。
【００５８】
用語「抗体薬物コンジュゲート」または略してADCは、当業者には周知であり、本明細書において用いられるとおり、抗体またはその抗原結合断片が薬物（例えば、化学療法剤、毒素、免疫療法剤、造影プローブなど）と連結されたものを意味する。本明細書において用いられる用語「リンカー」は、抗体またはその抗原結合断片を薬物に共有結合する任意の化学部分である。本明細書において用いられる用語「リンカー薬物コンジュゲート」は、本明細書において前に定義したリンカー、および薬物を含むかまたはそれらからなる分子または化学基を意味する。これに関して、用語「リンカー薬物コンジュゲート」は一般には、抗体薬物コンジュゲートの一部分であって、抗体またはその抗原結合断片ではない部分を意味する。一般に、リンカー薬物コンジュゲートにおいて、リンカーは薬物に共有結合されている。
【００５９】
本明細書において同様に記載するのは、「抗体フルオロフォアコンジュゲート」または略してAFCであり、これは抗体またはその抗原結合断片がフルオロフォア（例えばCy5）と連結されたものを意味する。フルオロフォアは、リンカー（例えば、抗体薬物コンジュゲートの文脈において前述したリンカー）を介して抗体またはその抗原結合断片に連結されてもよい。抗体フルオロフォアコンジュゲートは「リンカーフルオロフォアコンジュゲート」を含んでもよい。本明細書において用いられる用語「リンカーフルオロフォアコンジュゲート」は、本明細書において前に定義したリンカー、およびフルオロフォアを含むかまたはそれらからなる分子または化学基を意味する。これに関して、用語「リンカーフルオロフォアコンジュゲート」は一般には、抗体薬物コンジュゲートの一部分であって、抗体またはその抗原結合断片ではない部分を意味する。一般に、リンカーフルオロフォアコンジュゲートにおいて、リンカーはフルオロフォアに共有結合されている。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【発明を実施するための形態】
【００６１】
詳細な説明
本発明は、（無保護）ペプチド、タンパク質（例えば、酵素および補酵素（例えば、補酵素A））、抗体、または他のチオール含有化合物におけるCys残基と、アルケン-ホスホンアミデートまたはアルキン-ホスホンアミデートとの、新しい化学選択的反応を提供する。1つの態様において、ペプチド、タンパク質、抗体、または他のチオール含有化合物は保護されていない。別の態様において、アルケン-ホスホンアミデートまたはアルキン-ホスホンアミデートは、電子不足アルケン-ホスホンアミデートまたは電子不足アルキン-ホスホンアミデートである。得られるコンジュゲートは以前に文献で記載されたことがない。
【００６２】
スキーム1は、エテニルホスホニトまたはエチニルホスホニトの例であり、本発明の合成のための一般戦略を記載する。R1は置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基を表す。
【００６３】
スキーム1
2019532041.tif 000017
【００６４】
スキーム2は、当技術分野において公知の方法（例えば、15）と本発明の方法との間の差を示す  A）アルキンホスホニトを用いての逐次アジド-アジドカップリング；B）本発明によるCys残基修飾のためのシュタウディンガー誘導チオール付加（例えば、スキーム2Bのとおり、チオール付加は「マイケル付加」と表示してもよい）。単に例として、エテニルおよびエチニル（ジエチル）ホスホニトを用いた。
【００６５】
スキーム2
2019532041.tif 000018
【００６６】
本明細書に記載の方法は、位置R1
2019532041.tif 000019
および●において大量の異なる有機化合物を組み合わせることを可能にすると考えられる。
【００６７】
さらに、本発明は、2つの複雑な分子のバイオコンジュゲーションのための方法：タンパク質へのコンジュゲーションのための第二の化学選択的反応を誘導する化学選択的反応に関する。この概念は、アジド構築ブロックの無保護アルキンまたはアルケンホスホニトとの、シュタウディンガー-ホスホニト反応（SPhR）を介しての独特の反応性に基づき、好ましくは電子不足二重結合または三重結合を生成することになる（スキーム1および2B）。得られる求電子系は続いてチオール含有タンパク質および抗体またはさらなるチオール含有化合物との反応に用いられて、抗体コンジュゲートまたはタンパク質コンジュゲートなどの機能性コンジュゲートを提供することができる。
【００６８】
以下の結合結果が示される：
・異なるアルケンホスホニトおよびアルキンホスホニトの合成
・アルケンホスホニトおよびアルキンホスホニトとの（化学選択的）シュタウディンガー反応
・アルケン-ホスホンアミデートまたはアルキン-ホスホンアミデートの、（小分子、ペプチド、タンパク質、および抗体を含む）チオール含有分子とのコンジュゲーション反応
・水性系におけるアルキン-ホスホンアミデートへのチオール付加は、Z-生成物の生成に対して高いジアステレオ選択性を示した
・生理的に適切な条件下でのこれらのコンジュゲートの安定性
・切断可能な基を含むコンジュゲートの合成。
【００６９】
本発明は、新規コンジュゲーション化学により、特に複雑なペイロードおよびいくつかの官能基を含む標識との、抗体コンジュゲートまたはタンパク質コンジュゲートなどのコンジュゲートの利用可能性をさらに容易にする、いくつかの革新的な局面を特徴とする：
・小分子、ポリマー、タンパク質、および抗体におけるチオールを修飾するための新しい反応、その結果として
・Cys部分における前例のない化学構造
・2つの複雑な分子（例えば、ペプチドおよびタンパク質、またはペプチドおよび抗体）を直接の段階的化学選択的コンジュゲーションにより連結可能
・化学選択的ハンドル（すなわち、好ましくは電子不足アルケン-ホスホンアミデートまたは電子不足アルキン-ホスホンアミデート）の組み込み後、または化学選択的コンジュゲーション後の、最終保護基操作の必要性なし
・多様なリンカー（様々なP-置換基が可能、リン中心の様々なO-置換基、切断可能な基を含むO-置換基）
・通常のマレイミド試薬とは対照的なコンジュゲートの高い安定性；迅速なコンジュゲーション反応
・アルキン-ホスホンアミデートへのチオール付加の高い立体選択性。
【００７０】
概して、本発明の方法を実施して、小分子（例えば、置換されていてもよいアルキル、フェニル、または複素環）、タンパク質、抗体、オリゴヌクレオチド、または多糖などの種々の化合物を、タグ、タンパク質、オリゴヌクレオチドなどとコンジュゲートすることができる。このカップリングを達成するために、本発明は、第一の局面において、以下の段階を含む式（VII）のコンジュゲートの調製方法に関する：
（I）式（III）の化合物
2019532041.tif 000020
［式中、
2019532041.tif 000021
は二重結合または三重結合を表し；
Xは、
2019532041.tif 000022
が三重結合である場合にR3-Cを表す
（したがって、構造は
2019532041.tif 000023
である）か；または
Xは、
2019532041.tif 000024
が二重結合である場合に(R3R4)Cを表し
（したがって、構造は
2019532041.tif 000025
である）；
R1は独立に、置換されていてもよい脂肪族もしくは芳香族残基（例えばフェニル）；nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1〜C8アルコキシ)nで、Fで、Clで、Brで、Iで、-NO2で、-N(C1〜C8アルキル)Hで、-NH2で、-N(C1〜C8アルキル)2で、=Oで、C3〜C8シクロアルキルで、置換されていてもよいフェニルで置換された、C1〜C8アルキル、例えば
2019532041.tif 000026
；または任意で、C1〜C8アルキル、(C1〜C8アルコキシ)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1〜C8アルキル)H、-NH2、-N(C1〜C8アルキル)2で独立に置換された、フェニル；または5もしくは6員ヘテロ芳香族系（例えばピリジル）を表し；好ましくは、C1〜C8アルキル、(C1〜C8アルコキシ)nで置換されたC1〜C8アルキル、フェニル、または-NO2で置換されたフェニルを表し；
これは、窒素環原子のうちの1つにおいて、ビオチンあるいは任意の他のペプチド、酵素もしくは補酵素（例えば、補酵素A）などのタンパク質、抗体、タンパク質タグ、フルオロフォア、オリゴヌクレオチド、または多糖でさらに置換されていてもよく、かつ式中、#はOの位置を表し；
R3は、HまたはC1〜C8アルキルを表し；
R4は、HまたはC1〜C8アルキルを表す］
を、式（IV）のアジド
2019532041.tif 000027
［式中、●は、脂肪族または芳香族残基を表す］
と反応させて、式（V）の化合物
2019532041.tif 000028
［式中、●、
2019532041.tif 000029
、R1、およびXは、前記の定義のとおりである］
を調製する段階；
（II）式（V）の化合物を、式（VI）のチオール含有分子
2019532041.tif 000030
［式中、
2019532041.tif 000031
は、置換されていてもよいC1〜C8アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリマーを表す］
と反応させて、式（VII）の化合物
2019532041.tif 000032
［式中、
2019532041.tif 000033
は、式（V）の化合物中の
2019532041.tif 000034
が二重結合を表す場合に結合を表すか；または
2019532041.tif 000035
は、式（V）の化合物中の
2019532041.tif 000036
が三重結合を表す場合に二重結合を表し；かつ
2019532041.tif 000037
、●、R1、およびXは、前記の定義のとおりである］
を生成させる段階。
【００７１】
本発明は、前述の方法の段階（I）の前に段階（a）を含む方法にも関する。したがって、そのような方法は以下の段階を含む：
a）式（I）の化合物
2019532041.tif 000038
［式中、R1およびHalは、前記の定義のとおりである］
を、アルファ位に二重結合または三重結合を含む式（II）のアルファ不飽和化合物
2019532041.tif 000039
［式中、
2019532041.tif 000040
は二重結合または三重結合を表し；
Xは、
2019532041.tif 000041
が三重結合である場合にR3-Cを表すか；または
Xは、
2019532041.tif 000042
が二重結合である場合に(R3R4)Cを表し；
R3は、HまたはC1〜C8アルキルを表し；かつ
R4は、HまたはC1〜C8アルキルを表す］
と反応させて、式（III）の化合物
2019532041.tif 000043
［式中、
2019532041.tif 000044
、XおよびR1は、前記の定義のとおりである］
を形成させる段階；
または、式（I'）の化合物
2019532041.tif 000045
［式中、
R5は独立に、C1〜C8アルキルを表し；
Halは、Cl、Br、Iからなる群より選択されるハロゲン、好ましくはClを表す］
を、アルファ位に二重結合または三重結合を含む式（II）のアルファ不飽和化合物
2019532041.tif 000046
［式中、
2019532041.tif 000047
は二重結合または三重結合を表し；
Xは、
2019532041.tif 000048
が三重結合である場合にR3-Cを表すか；または
Xは、
2019532041.tif 000049
が二重結合である場合に(R3R4)Cを表し；
R3は、HまたはC1〜C8アルキルを表し；かつ
R4は、HまたはC1〜C8アルキルを表す］
と反応させて、式（III'）の化合物
2019532041.tif 000050
を形成させ；
かつ該式（III'）の化合物をR1-OHと反応させて、式（III）の化合物
2019532041.tif 000051
［式中、
2019532041.tif 000052
およびXは前記の定義のとおりであり、かつR1は前記の定義のとおりであるが、個別には選択されない］
を形成させる段階；
（I）式（III）の化合物を、式（IV）のアジド
2019532041.tif 000053
［式中、●は、脂肪族または芳香族残基を表す］
と反応させて、式（V）の化合物
2019532041.tif 000054
［式中、●、
2019532041.tif 000055
、R1およびXは、前記の定義のとおりである］
を調製する段階；
（II）式（V）の化合物を、式（VI）のチオール含有分子
2019532041.tif 000056
［式中、
2019532041.tif 000057
は、置換されていてもよいC1〜C8アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリマーを表す］
と反応させて、式（VII）の化合物
2019532041.tif 000058
［式中、
2019532041.tif 000059
は、式（V）の化合物中の
2019532041.tif 000060
が二重結合を表す場合に結合を表すか；または
2019532041.tif 000061
は、式（V）の化合物中の
2019532041.tif 000062
が三重結合を表す場合に二重結合を表し；かつ
2019532041.tif 000063
、●、R1、およびXは、前記の定義のとおりである］
を生成させる段階。
【００７２】
好ましくは、本方法において、
2019532041.tif 000064
は三重結合を表す。
【００７３】
1つの態様において、好ましくは
2019532041.tif 000065
が二重結合を表す、式（III）の化合物のP-原子は、（例えば、精製のために）シュタウディンガー反応に先だってBH3により保護することができ、シュタウディンガー反応の前に容易に脱保護することができる：
b）式（III）の化合物
2019532041.tif 000066
［式中、XおよびR1は、前記の定義のとおりである］
を、BH3と反応させて、式（III'）の化合物
2019532041.tif 000067
［式中、XおよびR1は、前記の定義のとおりである］
を形成させる段階。
【００７４】
式（III'）のボラン保護ホスホニトを脱保護して反応性P(III)種を生成することは、DABCO（1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン＝トリエチレンジアミン（TEDA））などの弱塩基の添加によって容易に達成することができる。
【００７５】
式（III）の化合物は、PCl3から出発して合成することもできる：
2019532041.tif 000068
［式中、R1は本明細書の定義のとおりである］。
【００７６】
本明細書に記載の方法は、化合物（III）の代わりに式（III*）の化合物
2019532041.tif 000069
［式中、VはC1〜C8アルキル、好ましくはメチル、エチル、またはプロピル、より好ましくはメチルを表し；かつR1、R2、およびR3は、前述の化合物（III）についての定義のとおりである］
で実施することもできる。式（III*）の化合物の調製のために、式（II*）の化合物
2019532041.tif 000070
［式中、V、R3およびR4は本明細書の定義のとおりである］
を用いることができる。
【００７７】
化合物（III*）による本発明の方法は、式（V*）の化合物
2019532041.tif 000071
［式中、VはC1〜C8アルキル、好ましくはメチル、エチル、またはプロピル、より好ましくはメチルを表し；●およびR1は、化合物（V）についての定義のとおりである］
および式（VII*）の化合物
2019532041.tif 000072
［式中、VはC1〜C8アルキル、好ましくはメチル、エチル、またはプロピル、より好ましくはメチルを表し；●、
2019532041.tif 000073
およびR1は化合物（VII）についての定義のとおりである］
を生じる。式（V）および（VII）の化合物についての本明細書に記載の方法のすべての段階は、式（V*）および（VII*）の化合物についても同様に実施することができる。
【００７８】
したがって、本発明は、以下の段階を含むアルケン-ホスホンアミデートの調製方法にも関する：
（I）式（III）の化合物
2019532041.tif 000074
［式中、
Vは、C1〜C8アルキル、好ましくはメチル、エチル、またはプロピル、より好ましくはメチルを表し；
R1は独立に、置換されていてもよい脂肪族もしくは芳香族残基（例えばフェニル）；nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1〜C8アルコキシ)nで、Fで、Clで、Brで、Iで、-NO2で、-N(C1〜C8アルキル)Hで、-NH2で、-N(C1〜C8アルキル)2で、=Oで、C3〜C8シクロアルキルで、置換されていてもよいフェニルで置換された、C1〜C8アルキル、例えば
2019532041.tif 000075
；または任意で、C1〜C8アルキル、(C1〜C8アルコキシ)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1〜C8アルキル)H、-NH2、-N(C1〜C8アルキル)2で独立に置換された、フェニル；または5もしくは6員ヘテロ芳香族系（例えばピリジル）を表し；好ましくは、C1〜C8アルキル、(C1〜C8アルコキシ)nで置換されたC1〜C8アルキル、フェニル、または-NO2で置換されたフェニルを表し；
これは、窒素環原子のうちの1つにおいて、ビオチンあるいは任意の他のペプチド、酵素もしくは補酵素（例えば、補酵素A）などのタンパク質、抗体、タンパク質タグ、フルオロフォア、オリゴヌクレオチド、または多糖でさらに置換されていてもよく、かつ式中、#はOの位置を表し；
R3は、HまたはC1〜C8アルキルを表し；
R4は、HまたはC1〜C8アルキルを表す］
を、式（IV）のアジド
2019532041.tif 000076
［式中、●は、脂肪族または芳香族残基を表す］
と反応させて、式（V*）の化合物
2019532041.tif 000077
［式中、●、V、およびR1は、前記の定義のとおりであり；
Xは(R3R4)Cであり；かつ
R3およびR4は、前記の定義のとおりである］
を調製する段階；
（II）式（V*）の化合物を、式（VI）のチオール含有分子
2019532041.tif 000078
［式中、
2019532041.tif 000079
は、置換されていてもよいC1〜C8アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリマーを表す］
と反応させて、式（VII*）の化合物
2019532041.tif 000080
［式中、
2019532041.tif 000081
、●、V、R1、およびXは、前記の定義のとおりである］
を生成させる段階。
【００７９】
本発明の1つの態様は、式（V*）および（VII*）の化合物にも関する。
【００８０】
本明細書に記載の本発明の方法において、段階（I）で得られる化合物（V）または（V*）は、段階（II）で式（VI）のチオール含有分子と反応させるために用いる化合物（V）または（V*）と正確に同じ構造を有する必要はない。この局面において、化合物（V）または（V*）の●、R1および/またはX部分を、段階（II）において化合物（V）または（V*）を式（VI）のチオール含有分子と反応させるために用いる前に修飾してもよい。そのような修飾は、修飾後の●、R1および/またはX部分が本明細書において上で開示した定義にまだ包含されるかぎり、実施してもよい。単なる実例として、以下の反応スキームに示すとおり、段階（I）で得られる式（V）の化合物Aの●部分を修飾して式（V）の化合物Bを得、これを次いで段階（II）において式（VI）のチオール含有分子と反応させるために用いてもよい：
2019532041.tif 000082
ここでTFA-はトリフルオロ酢酸であり、Cy5は蛍光色素Cy5であり、HATUは(1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスフェート)であり、DIPEAはN,N-ジイソプロピルエチルアミンであり、かつDMFはN,N-ジメチルホルムアミドである。
【００８１】
本発明の方法の1つの好ましい態様において、R1は独立に、メチル、エチル、プロピル、ブチル、フェニル、ニトロ置換フェニル、nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1〜C2アルコキシ)n、より好ましくは2-(2-メトキシエトキシ)エチル、フェニル、ベンジルもしくはニトロ置換ベンジル、メチルまたはエチル、さらにより好ましくはメチルまたはエチルを表す。さらにより好ましい態様において、R1は同じである。
【００８２】
別の好ましい態様において、R1は、チオール添加（段階（II））の後に修飾されることもでき、例えば、置換基R1は
2019532041.tif 000083
におけるとおり、三重結合を含み得る。
【００８３】
これは任意の所望の有機化合物-N3（例えば、ペプチド-N3、酵素-N3もしくは補酵素-N3（例えば、補酵素A-N3）などのタンパク質-N3、抗体-N3、タンパク質タグ-N3、フルオロフォア-N3、オリゴヌクレオチド-N3、または多糖-N3、例えばビオチン-N3）と反応して、トリアゾール架橋複合体、例えば、
2019532041.tif 000084
を生成し得る。
【００８４】
したがって、R1は
2019532041.tif 000085
を表してもよく、式中、「化合物」は、ペプチド、タンパク質、酵素、補酵素（例えば、補酵素A）、抗体、タンパク質タグ、フルオロフォア、オリゴヌクレオチド、多糖、またはビオチンを表してもよく；#はOの位置を表す。
【００８５】
別の好ましい態様において、R1は、置換されていてもよい脂肪族もしくは芳香族残基（例えばフェニル）；nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1〜C8アルコキシ)nで、Fで、Clで、Brで、Iで、-NO2で、-N(C1〜C8アルキル)Hで、-NH2で、-N(C1〜C8アルキル)2で、=Oで、C3〜C8シクロアルキルで、置換されていてもよいフェニルで置換された、C1〜C8アルキル、例えば
2019532041.tif 000086
；または任意で、C1〜C8アルキル、(C1〜C8アルコキシ)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1〜C8アルキル)H、-NH2、-N(C1〜C8アルキル)2で独立に置換された、フェニル；または5もしくは6員ヘテロ芳香族系（例えばピリジル）であり；好ましくは、C1〜C8アルキル、(C1〜C8アルコキシ)nで置換されたC1〜C8アルキル、フェニル、または-NO2で置換されたフェニルである。
【００８６】
したがって、R1は独立に、置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基（例えばフェニル）を表してもよい。「置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基」における「置換されていてもよい」とは、脂肪族または芳香族残基の独立に任意の可能な残基による任意の置換を意味する。
【００８７】
R1は、nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1〜C8アルコキシ)n、F、Cl、Br、I、-NO2、-N(C1〜C8アルキル)H、-NH2、-N(C1〜C8アルキル)2、=O、C3〜C8シクロアルキル、-S-S-(C1〜C8アルキル)、nが1、2、3、4、5もしくは6であるヒドロキシ-(C1〜C8アルコキシ)n、C2〜C8アルキニル、または置換されていてもよいフェニルのうちの少なくとも1つで置換されていてもよい、C1〜C8アルキル、例えば
2019532041.tif 000087
［式中、#は、式（III）または式（III*）中のOの位置を表す］
を表してもよい。
【００８８】
R1は、C1〜C8アルキル、nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1〜C8アルコキシ)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1〜C8アルキル)H、-NH2、または-N(C1〜C8アルキル)2のうちの少なくとも1つで独立に置換されていてもよい、フェニルを表してもよい。
【００８９】
R1は、5または6員ヘテロ芳香族系、例えばピリジルを表してもよい。
【００９０】
R1は、C1〜C8アルキル、-S-S-(C1〜C8アルキル)で置換されたC1〜C8アルキル、nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1〜C8アルコキシ)nで置換されたC1〜C8アルキル、置換されていてもよいフェニルで置換されたC1〜C8アルキル、フェニル、または-NO2で置換されたフェニルを表してもよい。
【００９１】
いくつかの態様において、R1は、-S-S-(C1〜C8アルキル)で置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基を表す。好ましい態様において、R1は
2019532041.tif 000088
を表し、式中、R10およびR11は独立に、水素またはC1〜C8アルキルを表し；かつ#はOの位置を表す。より好ましい態様において、R10およびR11は独立に、水素、メチルまたはエチルを表す。さらにより好ましい態様において、R1は
2019532041.tif 000089
を表し、式中、R10およびR11は独立に、水素、メチルまたはエチルを表し；かつ#はOの位置を表す。これらの態様のうちのいくつかにおいて、R10およびR11はいずれも水素である。これらの態様のうちのいくつかにおいて、R10は水素であり、かつR11はC1〜C6アルキルである。これらの態様のうちのいくつかにおいて、R10は水素であり、かつR11はメチルまたはエチルである。好ましくは、これらの態様において、両方のR1は同じである。
【００９２】
いくつかの態様において、R1は、フェニルで置換されたC1〜C8アルキルを表し、該フェニルは
2019532041.tif 000090
でさらに置換されており、式中、ZはOまたはNHであり、かつ#は該フェニルの位置を表す。いくつかの態様において、ZはOである。いくつかの態様において、ZはNHである。
2019532041.tif 000091
中のC1〜C8アルキルは、例えば、メチル、エチル、プロピルまたはブチル；好ましくはメチル、エチル、またはプロピル；より好ましくはメチルまたはエチル；最も好ましくはメチルであってもよい。好ましい態様において、R1は
2019532041.tif 000092
を表し、式中、C1〜C8アルキルは、例えば、メチル、エチル、プロピルまたはブチル；好ましくは、メチル、エチル、またはプロピル；より好ましくは、メチルまたはエチル；最も好ましくはメチルであってもよく；ZはOまたはNHであり、かつ#はOの位置を表す。別の好ましい態様において、R1は
2019532041.tif 000093
を表し、式中、C1〜C8アルキルは、例えば、メチル、エチル、プロピルまたはブチル；好ましくは、メチル、エチル、またはプロピル；より好ましくは、メチルまたはエチル；最も好ましくはメチルであってもよく；ZはOまたはNHであり、かつ#はOの位置を表す。好ましくは、これらの態様において、両方のR1は同じである。
【００９３】
いくつかの態様において、R1は、フェニルで置換されたC1〜C8アルキルを表し、該フェニルは
2019532041.tif 000094
［式中、#は該フェニルの位置を表す］でさらに置換されている。いくつかの態様において、R1は、フェニルで置換されたC1〜C8アルキルを表し、該フェニルは
2019532041.tif 000095
［式中、#は該フェニルの位置を表す］でさらに置換されている。好ましい態様において、R1は
2019532041.tif 000096
［式中、#はOの位置を表す］を表す。別の好ましい態様において、R1は
2019532041.tif 000097
［式中、#はOの位置を表す］を表す。好ましくは、これらの態様において、両方のR1は同じである。
【００９４】
いくつかの態様において、R1は、nが1、2、3、4、5または6であるヒドロキシ-(C1〜C8アルコキシ)nで置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基を表す。好ましい態様において、R1は、ヒドロキシエトキシエチル、より好ましくは-(CH2)2-O-(CH2)2-OHである。
【００９５】
いくつかの態様において、R1は、C2〜C8アルキニルで置換されていてもよい脂肪族または芳香族残基を表す。好ましい態様において、R1はホモプロパルギルである。
【００９６】
本発明の方法の別の好ましい態様において、
2019532041.tif 000098
は二重結合を表し、Xは(R3R4)Cを表し、R3およびR4は独立に、HまたはC1〜C8アルキルを表し、かつ
2019532041.tif 000099
は結合を表す。別の好ましい態様において、R3およびR4はそれぞれHを表す。
【００９７】
本発明の方法の別の好ましい態様において、
2019532041.tif 000100
は三重結合を表し、XはR3-Cを表し、R3は、HまたはC1〜C8アルキル、より好ましくはHを表し、かつ
2019532041.tif 000101
は二重結合を表す。
【００９８】
本発明の方法の別の好ましい態様において、●は、
2019532041.tif 000102
などの置換されていてもよいC1〜C8アルキル、または
2019532041.tif 000103
などの置換されていてもよいフェニル［式中、#は、式（IV）の化合物の-N3基の位置を表す］；放射性もしくは非放射性核種、ビオチン、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリマー、糖質、アミノ酸、ペプチド、置換されていてもよい5もしくは6員ヘテロ芳香族系、タンパク質タグ、またはフルオロフォア（例えば、CY5もしくはEDANS）を表す。
【００９９】
本発明の方法の別の好ましい態様において、●は、
構造（VIII）の環状RGDペプチド（c(RGDfK)）
2019532041.tif 000104
［式中、*はN3基の位置を表す］；
ビオチン；
CY5またはEDANS；
C1〜C8アルキル、C1〜C8アルコキシ、ハロゲン、-CN、-NO2、-NH2、-N(C1〜C8アルキル)、-N(C1〜C8アルキル)2 -COOH、-COO(C1〜C8アルキル)、-O-C(O)-(C1〜C8アルキル)、-C(O)N-(C1〜C8アルキル)、-N(H)-C(O)-(C1〜C8アルキル)からなる群より独立に選択される1、2、3、4または5つの置換基で、好ましくは、C1〜C8アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8アルキル)、およびNO2からなる群より選択される1つの置換基で置換されていてもよい、フェニル；
C3〜C8シクロアルキル；ヘテロ原子がN、O、Sから選択される、3つ〜8つの環構成員を有するヘテロシクリル；C1〜C8アルコキシ；ハロゲン；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1〜C8アルキル)；-N(C1〜C8アルキル)2；-COOH；-COO(C1〜C8アルキル)；-O-C(O)-(C1〜C8アルキル)；-CONH2；-C(O)N(C1〜C8アルキル)2；-C(O)NH-(C1〜C8アルキル)；-N(H)-C(O)-(C1〜C8アルキル)、好ましくは、C1〜C8アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8アルキル)、およびNO2、フェニル、またはヘテロ芳香族系、単糖、多糖、ペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリマー、アミノ酸、フルオロフォア、タンパク質タグからなる群より選択される少なくとも1つの置換基（置換基第1世代）で置換されていてもよい、C1〜C8アルキルであって、置換基第1世代は、C3〜C8シクロアルキル；ヘテロ原子がN、O、Sから選択される、3つ〜8つの環構成員を有するヘテロシクリル；C1〜C8アルコキシ；ハロゲン；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1〜C8アルキル)；-N(C1〜C8アルキル)2；-COOH；-COO(C1〜C8アルキル)；-O-C(O)-(C1〜C8アルキル)；-CONH2；-C(O)N(C1〜C8アルキル)2；-C(O)NH-(C1〜C8アルキル)；-N(H)-C(O)-(C1〜C8アルキル)、好ましくは、C1〜C8アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8アルキル)、およびNO2、フェニル、またはヘテロ芳香族系（置換基第2世代）でさらに置換されていてもよく、置換基第2世代は、同じ群から選択される少なくとも1つの置換基でさらに置換されていてもよく、そのような置換は第3、4、5、6、7、8、9、または10世代まで及んでいてもよい、C1〜C8アルキル
を表す。
【０１００】
本発明の方法の別の好ましい態様において、●は、
構造（VIII）の環状RGDペプチド（c(RGDfK)）
2019532041.tif 000105
［式中、*はN3基の位置を表す］；
ビオチン；
CY5またはEDANS；
C1〜C8アルキル、C1〜C8アルコキシ、ハロゲン、-CN、-NO2、-NH2、-N(C1〜C8アルキル)、-N(C1〜C8アルキル)2 -COOH、-COO(C1〜C8アルキル)、-O-C(O)-(C1〜C8アルキル)、-C(O)N-(C1〜C8アルキル)、-N(H)-C(O)-(C1〜C8アルキル)からなる群より独立に選択される1、2、3、4または5つの置換基で、好ましくは、C1〜C8アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8アルキル)、およびNO2からなる群より選択される1つの置換基で置換されていてもよい、フェニル；
1、2、3、4または5つの置換基で置換されていてもよいC1〜C8アルキルであって、該置換基が、
C1〜C8アルキル、C1〜C8アルコキシ、ハロゲン、-CN、-NO2、-NH2、-N(C1〜C8アルキル)、-N(C1〜C8アルキル)2 -COOH、-COO(C1〜C8アルキル)、-O-C(O)-(C1〜C8アルキル)、-C(O)N-(C1〜C8アルキル)、-N(H)-C(O)-(C1〜C8アルキル)からなる群より独立に選択される1、2、3、4または5つの置換基で、好ましくは、C1〜C8アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8アルキル)、およびNO2からなる群より選択される1つの置換基で置換されていてもよい、フェニル；C1〜C8アルコキシ；ハロゲン；-CN；-NO2；-NH2；-N(C1〜C8アルキル)；-N(C1〜C8アルキル)2；-COOH；-COO(C1〜C8アルキル)；-O-C(O)-(C1〜C8アルキル)；-C(O)N-(C1〜C8アルキル)；-N(H)-C(O)-(C1〜C8アルキル)、好ましくは、C1〜C8アルコキシ、-COOH、-COO(C1〜C8アルキル)、NO2
からなる群より独立に選択される、C1〜C8アルキル；
2019532041.tif 000106
［式中、#はNの位置を表す］
を表す。
【０１０１】
本発明の方法の別の好ましい態様において、●は、
2019532041.tif 000107
などの置換されていてもよいフェニル［式中、#は-N3基の位置を表し、TFA-はトリフルオロ酢酸である］を表す。
【０１０２】
本発明の方法の別の好ましい態様において、●は、リンカー、薬物、またはリンカー-薬物コンジュゲートなどの置換されていてもよいC1〜C8アルキルを表す。
【０１０３】
本発明の方法の別の好ましい態様において、●は、リンカー、薬物、またはリンカー-薬物コンジュゲートなどの置換されていてもよいフェニルを表す。
【０１０４】
本発明の方法の別の好ましい態様において、
2019532041.tif 000108
は、セツキシマブもしくはトラスツズマブなどの抗体（好ましくはIgG抗体）；GFPタンパク質、eGFPタンパク質、トリペプチド（例えば、式（IX）のペプチド
2019532041.tif 000109
［式中、#はSの位置を表す］）などのペプチド；または
2019532041.tif 000110
［式中、#はSの位置を示す］
などの置換されていてもよいC1〜C8アルキルを表す。
【０１０５】
本発明の方法の別の好ましい態様において、
2019532041.tif 000111
は
2019532041.tif 000112
［式中、#はSの位置を表す］を表す。
【０１０６】
本発明の方法の1つの態様において、
2019532041.tif 000113
および
2019532041.tif 000114
は同じ分子内にある。
【０１０７】
したがって、本発明は、式（XX）の化合物
2019532041.tif 000115
（式中、
2019532041.tif 000116
および
2019532041.tif 000117
は、●と
2019532041.tif 000118
とを連結している弧によって示されるとおり、同じ分子内にある）
を本明細書の定義のとおりの式（III）の化合物と反応させて、式（VIIa）の化合物：
2019532041.tif 000119
［式中、
2019532041.tif 000120
は、式（III）の化合物中の
2019532041.tif 000121
が二重結合を表す場合に結合を表すか；または
2019532041.tif 000122
は、式（III）の化合物中の
2019532041.tif 000123
が三重結合を表す場合に二重結合を表し；かつ
2019532041.tif 000124
、●、R1、およびXは本明細書の定義のとおりである］
を得る方法にも関する。
【０１０８】
したがって、本発明は、式（XX）の化合物
2019532041.tif 000125
［式中、
2019532041.tif 000126
および
2019532041.tif 000127
は、●と
2019532041.tif 000128
とを連結している弧によって示されるとおり、同じ分子内にある］
を本明細書の定義のとおりの式（III*）の化合物と反応させて、式（VII*a）の化合物：
2019532041.tif 000129
［式中、
2019532041.tif 000130
、●、V、R1、およびXは本明細書の定義のとおりである］
を得る方法にも関する。
【０１０９】
いくつかの態様において、同じ分子内に
2019532041.tif 000131
および
2019532041.tif 000132
を有する化合物（XX）は、例えば、BCL9ペプチドなどのペプチドである。したがって、この方法によって得られる式（VIIa）または（VII*a）の化合物は、例えば、BCL9ペプチド由来の環状ペプチドなどの、環状ペプチドであってもよい。
【０１１０】
式（V）、（V*）、（VII）および（VII*）の化合物について本明細書に記載する方法のすべての段階は、式（VIIa）および（VII*a）の化合物と同様に実施することができる。
【０１１１】
アジドおよびチオール両方の同じ分子内への組み込みは、以下のスキーム：
2019532041.tif 000133
に例示的に示すとおり、分子内環化を実現することができる分子内シュタウディンガー誘導チオール付加を提供する。
【０１１２】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、まずアジドが電子豊富アルキン/アルケン-ホスホニトと反応し、それによりホスホンアミデートが生成し、次いでSH部分と迅速な分子内チオール付加を起こす電子不足アルキン/アルケン-ホスホンアミデートが生成すると推定される。
【０１１３】
本発明の1つの態様は、式（VIIa）および（VII*a）の化合物にも関する。
【０１１４】
化合物
本発明は、式（V）の化合物
2019532041.tif 000134
［式中、R1およびXおよび●は、前記の定義のとおりである］にも関する。
【０１１５】
本発明は、式（V*）の化合物
2019532041.tif 000135
［式中、●、V、R1、およびXは、前記の定義のとおりである］にも関する。
【０１１６】
好ましくは、式（V）または（V*）の化合物において、●は、
2019532041.tif 000136
などの置換されていてもよいC1〜C8アルキル；
2019532041.tif 000137
などの置換されていてもよいフェニル［式中、#はNの位置を表す］；放射性もしくは非放射性核種、ビオチン、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリマー、糖質、アミノ酸、ペプチド、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい5または6員ヘテロ芳香族系、置換されていてもよいC1〜C8アルキル、タンパク質タグ、またはフルオロフォア（例えばCY5）を表す。
【０１１７】
好ましくは、式（V）または（V*）の化合物において、●は、
2019532041.tif 000138
などの置換されていてもよいフェニル［式中、#はNの位置を表し、TFA-はトリフルオロ酢酸である］を表す。
【０１１８】
好ましくは、式（V）または（V*）の化合物において、●は、リンカー、薬物、またはリンカー-薬物コンジュゲートなどの置換されていてもよいC1〜C8アルキルを表す。
【０１１９】
好ましくは、式（V）または（V*）の化合物において、●は、リンカー、薬物、またはリンカー-薬物コンジュゲートなどの置換されていてもよいフェニルを表す。
【０１２０】
本発明は、式（VII）の化合物
2019532041.tif 000139
［式中、
2019532041.tif 000140
は結合を表し、かつXは(R3R4)Cを表すか；または
2019532041.tif 000141
は二重結合を表し、かつXはR3-Cを表し；
R3は、HまたはC1〜C8アルキルを表し；
R4は、HまたはC1〜C8アルキルを表し；
2019532041.tif 000142
は、置換されていてもよいC1〜C8アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリマーを表し；
●は、脂肪族または芳香族残基を表し；
R1は独立に、置換されていてもよい脂肪族もしくは芳香族残基（例えばフェニル）；nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1〜C8アルコキシ)nで、Fで、Clで、Brで、Iで、-NO2で、-N(C1〜C8アルキル)Hで、-NH2で、-N(C1〜C8アルキル)2で、=Oで、C3〜C8シクロアルキルで、置換されていてもよいフェニルで置換された、C1〜C8アルキル、例えば
2019532041.tif 000143
；または任意で、C1〜C8アルキル、(C1〜C8アルコキシ)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1〜C8アルキル)H、-NH2、-N(C1〜C8アルキル)2で独立に置換された、フェニル；または5もしくは6員ヘテロ芳香族系（例えばピリジル）であり；好ましくは、C1〜C8アルキル、(C1〜C8アルコキシ)nで置換されたC1〜C8アルキル、フェニル、または-NO2で置換されたフェニルである］
にも関する。
【０１２１】
本発明は、式（VII*）の化合物
2019532041.tif 000144
［式中、
2019532041.tif 000145
は、置換されていてもよいC1〜C8アルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい芳香族5または6員複素環系、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリマーを表し；
●は、脂肪族または芳香族残基を表し；
R1は独立に、置換されていてもよい脂肪族もしくは芳香族残基（例えばフェニル）；nが1、2、3、4、5もしくは6である(C1〜C8アルコキシ)nで、Fで、Clで、Brで、Iで、-NO2で、-N(C1〜C8アルキル)Hで、-NH2で、-N(C1〜C8アルキル)2で、=Oで、C3〜C8シクロアルキルで、置換されていてもよいフェニルで置換された、C1〜C8アルキル、例えば
2019532041.tif 000146
；または任意で、C1〜C8アルキル、(C1〜C8アルコキシ)n、F、Cl、I、Br、-NO2、-N(C1〜C8アルキル)H、-NH2、-N(C1〜C8アルキル)2で独立に置換された、フェニル；または5もしくは6員ヘテロ芳香族系（例えばピリジル）であり；好ましくは、C1〜C8アルキル、(C1〜C8アルコキシ)nで置換されたC1〜C8アルキル、フェニル、または-NO2で置換されたフェニルであり；
Vは、C1〜C8アルキル、好ましくはメチル、エチル、またはプロピル、より好ましくはメチルを表し；
Xは、(R3R4)Cを表し；
R3は、HまたはC1〜C8アルキルを表し；かつ
R4は、HまたはC1〜C8アルキルを表す］
にも関する。
【０１２２】
好ましくは、式（VII）または（VII*）の化合物中、●は
2019532041.tif 000147
などの置換されていてもよいC1〜C8アルキル；
2019532041.tif 000148
などの置換されていてもよいフェニル；放射性もしくは非放射性核種、ビオチン、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリマー、糖質、アミノ酸、ペプチド、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよい5もしくは6員ヘテロ芳香族系、置換されていてもよいC1〜C8アルキル、タンパク質タグ、またはフルオロフォア（例えば、CY5もしくはEDANS）を表す。
【０１２３】
好ましくは、式（VII）または（VII*）の化合物中、●は
2019532041.tif 000149
などの置換されていてもよいフェニル［式中、#はNの位置を表し、TFA-はトリフルオロ酢酸である］を表す。
【０１２４】
好ましくは、式（VII）または（VII*）の化合物中、●は、リンカー、薬物またはリンカー-薬物コンジュゲートなどの置換されていてもよいC1〜C8アルキルを表す。
【０１２５】
好ましくは、式（VII）または（VII*）の化合物中、●は、リンカー、薬物またはリンカー-薬物コンジュゲートなどの置換されていてもよいフェニルを表す。
【０１２６】
好ましくは、式（VII）または（VII*）の化合物中、
2019532041.tif 000150
は、抗体、好ましくはIgG抗体、より好ましくはセツキシマブもしくはトラスツズマブ；ペプチド、好ましくはGFPタンパク質もしくはeGFPタンパク質もしくはトリペプチド、より好ましくは式（IX）のペプチドまたはC1〜C8アルキルを表す。
【０１２７】
好ましくは、式（VII）または（VII*）の化合物中、
2019532041.tif 000151
は
2019532041.tif 000152
［式中、#はSの位置を表す］を表す。
【０１２８】
式（VII）または式（VII*）の好ましいコンジュゲートは、
2019532041.tif 000153
が抗体を表し、かつ
●が、タンパク質タグ、フルオロフォア（CY5もしくはEDANS）、またはタンパク質を表す、コンジュゲートである。
【０１２９】
式（VII）のさらなる好ましいコンジュゲートは、
2019532041.tif 000154
がタンパク質を表し、かつ
●が、タンパク質タグ、フルオロフォア（CY5もしくはEDANS）、抗体、またはタンパク質を表す、コンジュゲートである。
【０１３０】
1つの好ましい態様は、式（VII）のコンジュゲートであって、
2019532041.tif 000155
がタンパク質を表し、かつ
●がタンパク質を表す、コンジュゲートである。
【０１３１】
さらに、式（VII）または式（VII*）の好ましいコンジュゲートは、
2019532041.tif 000156
が抗体を表し、かつ
●が、リンカー、薬物、またはリンカー-薬物コンジュゲートを表す、コンジュゲートである。
【０１３２】
本発明は、式（VIIa）の化合物
2019532041.tif 000157
［式中、●および
2019532041.tif 000158
は、●と
2019532041.tif 000159
とを連結している弧によって示されるとおり、同じ分子内にあり、かつここで●、
2019532041.tif 000160
、X、およびR1は本明細書の定義のとおりであり、特に化合物（VII）についての定義のとおりである］にも関する。好ましくは、化合物（VIIa）は、例えば、BCL9ペプチド由来の環状ペプチドなどの、環状ペプチドである。
【０１３３】
本発明は、式（VII*a）の化合物
2019532041.tif 000161
［式中、●および
2019532041.tif 000162
は、●と
2019532041.tif 000163
とを連結している弧によって示されるとおり、同じ分子内にあり、かつここで●、
2019532041.tif 000164
、V、X、およびR1は本明細書の定義のとおりであり、特に化合物（VII*）についての定義のとおりである］にも関する。好ましくは、化合物（VII*a）は、例えば、BCL9ペプチド由来の環状ペプチドなどの、環状ペプチドである。
【０１３４】
以下の式（VII）の化合物：
2019532041.tif 000165
［式中、左側のタンパク質は、GFPタンパク質、好ましくはeGFPタンパク質である］；
2019532041.tif 000166
；式（X）の蛍光標識したASGP-R指向Cy5コンジュゲート［これは、ビニルホスホンアミデートへのモジュール式付加：
2019532041.tif 000167
2019532041.tif 000168
により生成することができる］
も好ましい。
【０１３５】
以下の式（VII）の化合物：
2019532041.tif 000169
［式中、LDは構造
2019532041.tif 000170
を有するリンカー薬物コンジュゲートを表し、かつ#はNの位置を表す］；および
2019532041.tif 000171
も好ましい。
【０１３６】
さらに、実施例の項で式（VII）の化合物の例として本明細書に提供する化合物も好ましい。
【０１３７】
当業者であれば、本発明の態様は、任意の自然法則に矛盾する組み合わせは除外されることを条件として、互いに組み合わせ得ることを理解するであろう。
【０１３８】
式（V）のホスホンアミデートの合成
段階a）
シュタウディンガー-ホスホニト反応によるアルケニルまたはアルキニルホスホンアミデート調製のための一般手順は、式（II）の臭化アルケニルまたはアルキニルマグネシウムと式（I）のジアルキルハロゲンクロロホスファイト（ハロゲンクロロ亜リン酸ジエチル）、好ましくはクロロホスホニトとの、-20℃未満、例えば、-100℃〜-40℃の間、好ましくは-90℃〜-50℃の間（例えば、約87℃）での反応を必要とする。好ましくは、反応はアルゴンなどの不活性ガス雰囲気下で実施する。この場合の「不活性」とは、所与の反応条件下で、この反応の抽出物または生成物のいずれとも反応しないガスを意味する。当然のことながら、反応時間は反応体積および物質の量に依存することになる。しかし、指針として、反応時間は2分〜4時間の範囲とすべきである。式（I）および（II）の化合物の量は、2：1〜1：2、例えば、約1：1などの、5：1〜1：5の範囲とすべきである。
【０１３９】
段階（I）
式（III）の化合物と式（IV）のアジドとの反応は、室温、すなわち、約25℃で実施することができる。しかし、反応は0℃〜50℃の範囲の温度でも実施することができる。反応時間は反応体積および物質の量に依存する。しかし、指針として、反応は1時間〜72時間の時間枠内で実施すべきである。式（III）および（IV）の化合物の量は、2：1〜1：2、例えば、約1：1などの、5：1〜1：5の範囲とすべきである。
【０１４０】
本明細書に記載の段階（I）のために好ましい溶媒は、テトラヒドロフラン（THF）、ジメチルホルムアミド（DMF）、アセトニトリル（MeCN）、アセトン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、酢酸エチル（EtOAc）、N-メチルピロリドンもしくはその混合物などの極性非プロトン性溶媒系、好ましくはTHF、DMF、MeCN、THF/DMF、THF/MeCN；または極性非プロトン性溶媒と、ヘキサン、トルエン、ベンゼン、1,4-ジオキサン、クロロホルム、ジエチルエーテルもしくはジクロロメタン（DCM）などの非極性溶媒との混合物、好ましくはTHF/トルエン中で実施する。段階（I）は水性媒質中、例えば、水中または、例えば、リン酸緩衝化食塩水（PBS）、トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン（TRIS）もしくは炭酸水素塩などの水性緩衝液中で実施してもよい。
【０１４１】
電子不足ホスホンアミデートアルキンの塩基によるヒドロチオール化の手順
段階（II）
式（V）のホスホンアミデートおよび塩基（および必要な場合は添加剤）をそれぞれの溶媒中に懸濁することができる。次いで、式（VI）のチオールを、例えば、マイクロリットルシリンジで加えることができ、混合物を室温、すなわち、約25℃で反応させる。しかし、反応は0℃〜50℃の範囲の温度でも実施することができる。反応時間は反応体積および物質の量に依存する。しかし、指針として、反応は0.1時間〜10時間の時間枠内、例えば、0.1時間〜3時間の時間枠内または0.1時間〜1時間の間の時間枠内で実施すべきである。
【０１４２】
好ましい態様において、本明細書に記載の段階（II）は弱塩基存在下で実施する。好ましい弱塩基は、アンモニウム(NH4)2CO3、Na2CO3、Rb2CO3、K2CO3、もしくはCs2CO3などの炭酸塩またはその相関する炭酸水素塩（例えば、NaHCO3など）；およびトリエチルアミンEt3N（25℃でpKa 10.76）などの窒素含有弱塩基である。好ましくは、pKa値が7.5〜11.5の範囲内の塩基を用いる。
【０１４３】
溶媒（系）は、広範な溶媒から選択することができる。溶媒は、テトラヒドロフラン（THF）、ジメチルホルムアミド（DMF）、アセトニトリル（MeCN）、アセトン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、酢酸エチル（EtOAc）、N-メチルピロリドンもしくはその混合物などの極性非プロトン性溶媒系、好ましくはTHF、DMF、DMSO；ヘキサン、トルエン、ベンゼン、1,4-ジオキサン、クロロホルム、ジエチルエーテルもしくはジクロロメタン（DCM）などの非極性溶媒、好ましくはDCM；水、エタノール、イソプロパノール、メタノール、n-ブタノールなどの極性プロトン性溶媒、好ましくはエタノール（erthanol）；またはその混合物、例えば、DMF/水であり得る。溶媒は、例えば、水または、例えば、リン酸緩衝化食塩水（PBS）、トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン（TRIS）もしくは炭酸水素塩などの水性緩衝液などの、水性媒質であってもよい。
【実施例】
【０１４４】
アルキニルホスホンアミデート調製のための一般手順
火炎乾燥したシュレンク管中、アルゴン雰囲気下で、臭化エチニルマグネシウムの溶液（THF中0.5M、2mL、1mmol）をドライアイス/アセトン浴中で-78℃に冷却した。クロロ亜リン酸ジエチル（157mg、144μL、1mmol）をシリンジから滴加した。溶液を-78℃で30分間撹拌し、次いで室温に戻し、続いてさらに1.5時間撹拌した。その後、3mLの無水THFおよびアジド（1mmol）を加え、溶液を室温で24時間撹拌した。次いで、H2O（5mL）を加え、溶液を空気に開放してさらに24時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した後、粗製混合物を31P NMRで分析した。
【０１４５】
ビニルホスホニトの合成
三塩化リンからのビニルホスホニト合成のための一般手順A
火炎乾燥したシュレンク管に20mlの無水トルエン中1.50mmol（1.0当量）の三塩化リンを加え、-78℃に冷却した。3.3mmolのピリジン（2.2当量）および5mlのEt2O中3.3mmolのアルコール（2.2当量）を滴加した。得られた懸濁液を室温に戻し、さらに30分間撹拌し、再度-78℃に冷却した。1.65mmol（1.1当量）のビニルグリニャール（THF中1.0M）を加え、反応混合物を室温で2時間撹拌した。最後に、2.25mmol（1.5当量）のボラン（THF中1.0M）を0℃で加え、さらに1時間撹拌した。粗生成物を精製のためにシリカカラムに乾燥充填した。
【０１４６】
ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのビニルホスホニト合成のための一般手順B
火炎乾燥したシュレンク管に200μlの無水THFに溶解した1.5mmol（1.0当量）ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンを加え、-78℃に冷却した。1.65mmol（1.1当量）のビニルグリニャール（THF中1.0M）を加え、反応混合物を室温で30分間撹拌した。1mlの無水THFまたはMeCN中3.3mmolの真空乾燥したアルコール（2.2当量）および3.3mmol（2.2当量）のテトラゾール（MeCN中0.45M）の溶液を加えた。得られた懸濁液を室温で終夜撹拌した。最後に、2.25mmol（1.5当量）のボラン（THF中1.0M）を0℃で加え、さらに1時間撹拌した。粗生成物を精製のためにシリカカラムに乾燥充填した。
【０１４７】
クロロ亜リン酸ジエチル、ビニルグリニャール試薬および異なるアジドからのビニルホスホンアミデート合成のための一般手順C
25-mlシュレンク管に1.71mlの臭化ビニルマグネシウム（THF中0.7M、1.20mmol、1.2当量）をアルゴン雰囲気下で加え、-78℃に冷却し、140μlのクロロ亜リン酸ジエチル（1.00mmol、1.0当量）を滴加した。帯黄色溶液を0℃まで戻し、さらに2時間撹拌し、3.2mlのTHFに溶解した1.00mmolのアジド（1.0当量）を加え、室温で終夜撹拌した。5mlの水を加え、さらに24時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィで精製した。
【０１４８】
エチル-N-フェニル-P-エチニル-ホスホンアミデート
2019532041.tif 000172
エチルN-フェニル-P-エチニル-ホスホンアミデートを、「アルケニルまたはアルキニルホスホンアミデート調製のための一般手順」後にフェニルアジド（595mg、5mmol）から5mmolスケールで調製した。粗製混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィにより、ヘキサン/酢酸エチルで溶出して精製した。生成物を無色固体として430mg（2.1mmol、42％）の収率で得た。
2019532041.tif 000173
【０１４９】
エチル-N-ベンジル-P-エチニル-ホスホンアミデート
2019532041.tif 000174
エチルN-ベンジル-P-エチニル-ホスホンアミデートを、「アルケニルまたはアルキニルホスホンアミデート調製のための一般手順」後にベンジルアジド（133mg、125μL、1mmol）から調製した。粗製混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィにより、ヘキサン/酢酸エチルで溶出して精製した。生成物を無色固体として37mg（0.17mmol、17％）の収率で得た。
2019532041.tif 000175
【０１５０】
エチル-N-フェニル-P-ビニル-ホスホンアミデート
2019532041.tif 000176
化合物を、一般手順Cに従い、1.15mlのクロロ亜リン酸ジエチル（8mmol）から合成した。純粋なホスホンアミデートをフラッシュカラムクロマトグラフィ（EtOAc）により精製し、白色固体で得た。（675mg、3.20mmol、40.0％）
2019532041.tif 000177
【０１５１】
エチル-N-(4-カルボキシ-フェニル)-P-ビニル-ホスホンアミデート
2019532041.tif 000178
化合物を、一般手順Cに従い、288μlのクロロ亜リン酸ジエチル（2mmol）から合成した。純粋なホスホンアミデートをフラッシュカラムクロマトグラフィ（CH2Cl2/MeOH、9：1〜4：1）により精製し、白色固体で得た。（173mg、0.68mmol、34.0％）
2019532041.tif 000179
【０１５２】
エチル-N-ベンジル-P-ビニル-ホスホンアミデート
2019532041.tif 000180
化合物を、一般手順Cに従い、290μlのクロロ亜リン酸ジエチル（2mmol）から合成した。純粋なホスホンアミデートをフラッシュカラムクロマトグラフィ（EtOAc）により精製し、無色油状物で得た。（155mg、0.69mmol、34.3％）
2019532041.tif 000181
【０１５３】
エチル-N-(2-ニトロ-ベンジル)-P-ビニル-ホスホンアミデート
2019532041.tif 000182
化合物を、一般手順Cに従い、120μlのクロロ亜リン酸ジエチル（0.83mmol）から合成した。純粋なホスホンアミデートをフラッシュカラムクロマトグラフィ（2％MeOH/CH2Cl2）により精製し、褐色油状物で得た。（125mg、0.46mmol、55.4％）
2019532041.tif 000183
【０１５４】
エチル-N-(3-フェニル-プロピル)-P-ビニル-ホスホンアミデート
2019532041.tif 000184
化合物を、一般手順Cに従い、290μlのクロロ亜リン酸ジエチル（2mmol）から合成した。純粋なホスホンアミデートをフラッシュカラムクロマトグラフィ（EtOAc）により精製し、無色油状物で得た。（165mg、0.65mmol、32.5％）
2019532041.tif 000185
【０１５５】
エチル-N-シクロヘキシル-P-ビニル-ホスホンアミデート
2019532041.tif 000186
化合物を、一般手順Cに従い、140μlのクロロ亜リン酸ジエチル（1mmol）から合成した。純粋なホスホンアミデートをフラッシュカラムクロマトグラフィ（1.5％MeOH/CH2Cl2）により精製し、無色油状物で得た。（70mg、0.32mmol、32.2％）
2019532041.tif 000187
【０１５６】
アルキニル-ホスホニトによるシュタウディンガー誘導チオール付加：
ジエチル-アルキニル-ホスホニトの合成および異なるアジドとの反応（段階b）
ジエチル-アルキニル-ホスホニトを、発表されたプロトコル（13）に従って合成し、異なる脂肪族および芳香族アジドと反応させた（スキーム3）。所望のアルキニル-ホスホンアミデートの生成を31P-NMRによってモニターした（異なるアジド基質の変換について表1参照）。
【０１５７】
スキーム3：ジエチル-アルキニルホスホニトのR-N3（Rは表1参照）とのシュタウディンガー-ホスホニト反応
2019532041.tif 000188
【０１５８】
（表１）ジエチル-アルキニル-ホスホニトのシュタウディンガー-ホスホニト反応のための基質範囲（値は％）n. d. = 検出されない）；31P-NMRにより決定
2019532041.tif 000189
【０１５９】
N-フェニル-およびN-ベンジル-ホスホンアミデートをカラムクロマトグラフィにより、それぞれ41％および17％の収率で単離した。最も高い変換はTHF中で得られた（表2）。
【０１６０】
（表２）ジエチル-アルキニル-ホスホニトとフェニルアジドとの間のシュタウディンガー-ホスホニト反応に対する溶媒の影響
2019532041.tif 000190
【０１６１】
ホスホンアミデートアルキンまたはアルケンの塩基によるヒドロチオール化の一般手順
キャップしたバイアルに、エチルN-フェニル-P-エチニル-ホスホンアミデート（10mg、0.05mmol）およびそれぞれの塩基（および必要な場合は添加剤）を加えた。混合物を200μLのそれぞれの溶媒に懸濁した。次いで、エタンチオール（3.1mg、3.6μL、0.05mmol）をマイクロリットルシリンジから加え、混合物を室温で3時間撹拌した。その後、混合物をCH2Cl2（5mL）で希釈し、H2O（5mL）を加えた。抽出後、相を分離し、水層をCH2Cl2（5mL）で3回抽出した。合わせた有機層をH2O（5mL）で2回と食塩水（5mL）で洗浄した。溶媒を除去した後、粗製混合物を1H NMRおよび31P NMRで分析した。アルケンホスホンアミデートの調製は、アルキンホスホンアミデートの調製と類似である。
【０１６２】
エチル-N-フェニル-P-(2-エチルスルファニル)-エテニル-ホスホンアミデート
2019532041.tif 000191
キャップしたバイアルに、エチルN-フェニル-P-エチニル-ホスホンアミデート（10mg、0.05mmol）および炭酸カリウム（2.8mg、0.02mmol）を加えた。混合物をDMF/H2Oの1：1混合物（200μL）に懸濁した。次いで、エタンチオール（3.1mg、3.6μL、0.05mmol）をマイクロリットルシリンジから加え、混合物を室温で3時間撹拌した。その後、混合物をCH2Cl2（5mL）で希釈し、H2O（5mL）を加えた。抽出後、相を分離し、水層をCH2Cl2（5mL）で3回抽出した。合わせた有機層をH2O（5mL）で2回と食塩水（5mL）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去した後、生成物を12mg（0.044mmol、89％）の収率で得た。
2019532041.tif 000192
【０１６３】
(エチル-N-フェニル-P-エテニル-ホスホンアミデート)-S-グルタチオンコンジュゲート
2019532041.tif 000193
キャップしたバイアルに、エチルN-フェニル-P-エチニル-ホスホンアミデート（31mg、0.15mmol）および炭酸カリウム（7mg、0.05mmol）を加えた。混合物をDMF/H2Oの1：1混合物（500μL）に懸濁した。次いで、(2S)-2-アミノ-4-{[(1R)-1-[(カルボキシメチル)カルバモイル]-2-スルファニルエチル]カルバモイル}-ブタン酸（31mg、0.1mmol）を加え、混合物を室温で3時間撹拌した。その後、混合物をH2O（5mL）で希釈し、CH2Cl2（5mL）を加えた。抽出後、相を分離し、有機層をH2O（5mL）で3回抽出した。水層をCH2Cl2（5mL）で3回洗浄した。その後、溶媒を減圧下で除去した。粗製混合物を分取HPLCにより、アセトニトリルおよび酢酸アンモニウム緩衝液で溶出して精製した。生成物を酢酸アンモニウム塩として35.5mg（0.061mmol、61％）の収率で得た。
2019532041.tif 000194
【０１６４】
エタンチオールおよびグルタチオンのアルキニル-ホスホンアミデートへのチオール付加
脂肪族モデル基質としてエタンチオールを選択した。すべての実験を、0.1mmolスケールで、400μLの溶媒を用い、室温で3時間実施した。変換およびジアステレオ選択性を31P-NMRおよび1H-NMRで決定した（スキーム4）。
【０１６５】
スキーム4：反応条件のスクリーニングのためのモデル反応
2019532041.tif 000195
【０１６６】
最初の実験はE-およびZ-配座異性体両方の生成を確認した。ジアステレオマー混合物の1H NMRにおける主要ジアステレオマーのビシナルH-Hカップリング定数＝12.5Hzおよび少量ジアステレオマーの21.7Hzは、Z-異性体がすべての反応条件の主要生成物であることを示す（表3参照）。
【０１６７】
（表３）電子不足アルキニルホスホンアミデートの塩基によるヒドロチオール化のための溶媒のスクリーニング
2019532041.tif 000196
【０１６８】
次いで、チオール付加に対する溶媒の影響をさらに調査し、あらゆる試験溶媒でチオール付加物の定量的生成が明らかとなった。完全な変換が試験溶媒のすべてで達成された。DMSOは最も低いジアステレオ選択性を示した（12％E-生成物）。したがって、塩基の影響をDMSOおよびDMF/H2O（1：1）でさらに調査した（表4）。
【０１６９】
（表４）電子不足アルキニルホスホンアミデートのDMSOおよびDMF/H2O（1：1）中でのヒドロチオール化のための塩基のスクリーニング
2019532041.tif 000197
【０１７０】
DMSO中での反応のジアステレオ選択性は適用する塩基に依存することが判明した。これに対し、水性系における反応は常に主要生成物としてZ-アルケンを生じた。
【０１７１】
結論として、モデル反応の反応条件を最適化することが可能であった。反応は水性溶媒系で適用することができ、緩和な炭酸塩基を用い、室温で3時間後に定量的変換を達成することができた。副反応は観察されなかった。
【０１７２】
次の段階において、これらの最適化した反応条件を、水溶性グルタチオンホスホンアミデートコンジュゲートの合成に適用した（スキーム5）。
【０１７３】
スキーム5：グルタチオン-ホスホンアミデートコンジュゲートの合成
2019532041.tif 000198
【０１７４】
コンジュゲートを半分取HPLCにより、塩基性条件下で、ジアステレオマー混合物として61％の収率で単離することができた。この水溶性ホスホンアミデートコンジュゲートの妥当な量が得られたため、リン-窒素結合の加水分解特性を判定するために試験を実施することができた。これらの試験のために、水性緩衝液中のコンジュゲートおよび標準の臭化テトラメチルホスホニウム（1.2μM）の3μM溶液を調製し、ホスホンアミデートの加水分解を、24時間にわたって31P NMRにより標準に対してコンジュゲートの崩壊をモニターすることで特徴づけた。結果を図1に示し、ここで酸性条件下でのGSH-ホスホンアミデートコンジュゲートの加水分解による崩壊が見られる。
【０１７５】
強酸性条件（1M HCL、pH0.36）下で、ホスホンアミデートは急速な分解を示し、これは下の曲線（丸）で表される。わずかに酸性の条件（150mM NH4OAc緩衝液、pH4.76）について、青色の曲線で示すとおり、化合物は測定の期間中ずっと安定であった（四角）。
【０１７６】
反応の速度をHPLCで決定した。グルタチオンを、わずかに塩基性のpHで水性緩衝液中のエチル-N-フェニルアルキニルホスホンアミデートの溶液に加えた。いくつかの時点の後に酸性緩衝液の添加により反応を停止し、HPLC-UVにより内部標準としてイノシンを参照して分析した。図2は、pH8.5でのグルタチオンとの反応におけるエチル-N-フェニルアルキニルホスホンアミデートの消費に関する。HPLC UVトレースを異なる時点で取った。実験は三つ組で行った。
【０１７７】
図2が示すとおり、発明者らは、pH8.5で15分後にアルキニルホスホンアミデート出発原料の95％を超える非常に迅速な変換を達成した。
【０１７８】
RGDペプチドのGFPへのシュタウディンガー誘導チオール付加
原理試験の次の証明において、発明者らは、癌細胞において過剰発現されたインテグリンに結合することが公知の、アジド含有環状RGDペプチド（c(RGDfK)）を合成した。この環状アジド-ペプチドをビスエトキシアルキン-ホスホニトと反応させて、高度に反応性のホスホンアミデートを、HPLC後に53％の単離収率で生成し、副産物の生成は観察されなかった（スキーム6）。
【０１７９】
スキーム6：環状アジド-RGD-ペプチドのGSHへのシュタウディンガー誘導チオール付加
2019532041.tif 000199
【０１８０】
c(RGDfK)-アジドの合成
2019532041.tif 000200
環状RGDfK-アジドペプチドをNovaSynTGTアルコール樹脂上、0.26mmol/gのローディングで手動により合成した。まず、480.7mgの樹脂を2.5mlのトルエンおよび480μlの塩化アセチル中、60℃で3時間撹拌することにより、樹脂を活性化した。Fmoc-Asp(OAll)-OH（123.56mg、0.3125mmol、2.5当量）の二重カップリングをDCM中、活性化塩基としてDIPEA（212.6μl、1.25mmol、10当量）を用い、それぞれ1時間で実施した。さらなるアミノ酸カップリングを、DMF中でアミノ酸（0.25mmol、2当量）、HATU（0.25mmol、2当量）およびDIPEA（0.5mmol、4当量）を混合し、30分で1回と1時間で1回カップリングさせることにより実施した。Fmoc脱保護をDMF中の20％ピペリジンで行った。最終のアミノ酸カップリング後、樹脂をクロロホルム/酢酸/NMM（体積比37：2：1）中Pd(P(Ph3)4)（433mg、0.375mmol、3当量）により、アルゴン雰囲気下で2時間処理してalloc脱保護を行い、続いてFmoc脱保護と、DMF中HATU（0.25mmol、2当量）およびDIPEA（0.5mmol、4当量）により16時間の環化を実施した。リジン残基上に芳香族アジドを設置可能にするために、Fmoc-Lys(dde)-OHを固相合成において用い、DMF中2％ヒドラジンを3分間×3回用いて樹脂上で直交性に脱保護し、続いて4-アジド安息香酸（81.65mg、0.5mmol、4当量）のカップリングをDMF中HATU（190mg、0.5mmol、4当量）およびDIPEA（1mmol、8当量）で2時間行った。樹脂からの切断をTFA/DCM（体積比75：25）を用いて2.5時間で実施した。冷無水エーテル中で沈澱させた。粗生成物をUPLC-MSで分析し、続くシュタウディンガー反応で粗生成物として用いるか、または分取逆相C18 HPLC（0〜5分95/5、水（0.1％TFA）/MeCN（0.1％TFA）；5〜60分10/90、水（0.1％TFA）/MeCN（0.1％TFA））により精製した。生成物を白色粉末として得（8.0mg、11.0μmol、収率8.5％）、分析UPLC（RP-C18カラム、0.1％TFAを含む5〜95％アセトニトリル/水）により分析した。c(RGDfK)-アジドのUPLCクロマトグラムを図7に示す。LRMS: m/z: 749.67 [M+H]+ (calcd. m/z: 749.3485)。
【０１８１】
c(RGDfK)-ホスホンアミデートアルキンの合成
ビスエトキシアルキン-ホスホニト合成
2019532041.tif 000201
THF中の臭化エチニルマグネシウム（5M、2ml、1mmol、1当量）を、火炎乾燥したシュレンク管中で-78℃に冷却し、クロロ亜リン酸ジエチル（0.143ml、1mmol、1当量）を加えた。溶液を-78℃で10分間撹拌し、室温に戻し、さらに90分間撹拌した。出発原料の完全消費を31P-NMR（生成物126.73ppm；図6参照：粗製ビスエトキシアルキン-ホスホニト合成は図9参照）でチェックし、粗生成物のままで続くアジド-c(RGDfK)とのシュタウディンガー反応に用いた。
【０１８２】
c(RGDfK)-アジドに対するシュタウディンガー反応
2019532041.tif 000202
粗製ペプチドを用いる場合、それ（66mg、88.2μmol、1当量）をDMSO（4ml、22mM)に溶解し、火炎乾燥したフラスコ中で1時間乾燥した後、ビスエトキシアルキン-ホスホニト（NMRにより決定した生成物のパーセンテージに応じた量、132.3μmol、1.5当量）を加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌した後、4mlの水を加え、6時間撹拌し、その後凍結乾燥した。粗生成物を半分取逆相C18 HPLC（0〜5分95/5、水（0.1％TFA）/MeCN（0.1％TFA）；5〜60分10/90、水（0.1％TFA）/MeCN（0.1％TFA））で精製し、生成物を白色粉末で得た（6.2mg、6.64μmol、全収率5.3％）。
【０１８３】
精製したc(RGDfK)-アジドペプチド（6.9mg、9.14μmol、1当量）を用いて、それをDMSO（1.5ml、6mM）に溶解し、火炎乾燥したフラスコ中で1時間乾燥した後、ビスエトキシアルキン-ホスホニト（NMRにより決定した生成物のパーセンテージに応じた量、36.56μmol、4当量）を加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌した後、1.5mlの水を加え、再度6時間撹拌し、その後凍結乾燥した。粗生成物を半分取逆相C18 HPLC（0〜5分95/5、水（0.1％TFA）/MeCN（0.1％TFA）；5〜60分10/90、水（0.1％TFA）/MeCN（0.1％TFA））で精製し、生成物を白色粉末で得た（4.1mg、4.89μmol、収率53.5％）。
【０１８４】
最終生成物をLC-UV：室温、5.0分（RP-C18カラムで0〜1分95/5、水（0.1％TFA）/MeCN（0.1％TFA）；1〜16.5分5/95、水（0.1％TFA）/MeCN（0.1％TFA））および質量分析により分析した。c(RGDfK)-アルキンのクロマトグラムを図8に示す。HRMS: m/z: 839.3636 [M+H]+ (calcd. m/z: 839.3606)
【０１８５】
電子不足c(RGDfK)-ホスホンアミデートアルキンのヒドロチオール化
グルタチオンとのモデル反応
2019532041.tif 000203
グルタチオン（1mg、3.25μmol、1当量）およびc(RGDfK)-ホスホンアミデートアルキン（1.24mg、3.25μmol、1当量）を135μlの10mM炭酸水素アンモニウム緩衝液pH9.2および15μlのアセトニトリル中で混合した（c＝21.6mM）。10分間振盪した後、LC-UV/MSにより付加生成物への定量的変換が観察された。
【０１８６】
最終生成物をLC-UV：室温、4.3/4.4分（RP-C18カラムで0〜1分95/5、水（0.1％TFA）/MeCN（0.1％TFA）；1〜16.5分5/95、水（0.1％TFA）/MeCN（0.1％TFA））により分析した。
2019532041.tif 000204
【０１８７】
チオールとの反応のための第一の試験基質として、発明者らはグルタチオン（GSH）を用い、pH8.8のわずかに塩基性条件下、室温で10分後に、ほぼ定量的変換でチオールのホスホンアミデート-アルキンへの迅速かつ高収率の付加を観察した（図3：環状アジド-RGD-ペプチドのGSHへのシュタウディンガー誘導チオール付加）。
【０１８８】
このモデル付加生成物に対し、発明者らは、異なるpHならびに中性および塩基性pHでのMesNaおよびDTTのようなチオール付加の下で、安定性試験を実施した。生成物はpH2.3〜pH9.0までの広いpH範囲で安定であることが判明した（図4：c(RGDfK)-グルタチオンのpH安定性）。
【０１８９】
また、生成物は、生理的pH（PBS緩衝液；pH7.4）でDTTおよびMesNaの高濃度（0.2M、100当量）に対しても安定である。pH9.0で、MesNaは生成した二重結合にゆっくり付加する（4日後に10％の付加生成物が生じた）。これに対して、DTTは速やかに付加生成物を生じ（30時間後に42％）、その後経時的に分解する。
【０１９０】
GFPタンパク質のシュタウディンガー誘導チオール付加
次の段階で、発明者らは、Cys含有モデルタンパク質によるシュタウディンガー誘導コンジュゲーション反応を調査した。ここで、発明者らは環状RGD-ホスホンアミデートへのチオールコンジュゲーションのために利用可能なシステインを1つだけ有する変異eGFPを用いた。
【０１９１】
GFP C70M S147Cとの反応
2019532041.tif 000205
GFP C70M S147C（3.13nmol、1当量）を100μlの10mM炭酸水素アンモニウムpH8.4に再緩衝化し、c(RGDfK)-ホスホンアミデートアルキン（0.08mg、93.9nmol、30当量）を加えた。反応混合物を37℃、800rpmで3時間振盪した。最後に、混合物を10kDa MWCOのAmicon Spinフィルターを用いてスピンろ過した。試料を14000rpm、5分間で10回スピンろ過し、新鮮10mM炭酸水素アンモニウム緩衝液を加えた後、MALDI-TOF分析を行い、GFP C70M S147Cの所望の生成物への全変換を検証した。
MALDI TOF: 予想 (in Da): 28605.31 (M+H+), 14303.16 (M+2H+); 実測 (in Da): 28608.46 (M+H+), 14294.46 (M+2H+)
【０１９２】
このアプローチにより、発明者らは、31μMの濃度でタンパク質レベルでのこの反応の実現可能性を確証することができ、ここで、消化されたタンパク質コンジュゲートのMALDI-MS分析およびMS/MS分析により検証して、コンジュゲートは実質的に定量的変換で生成した（図5：チオール含有eGFPへのシュタウディンガー誘導チオール付加）。
【０１９３】
c(RGDfK)-グルタチオンの安定性試験
c(RGDfK)-グルタチオンを異なる溶媒（0.1M HCl、pH1；0.1％TFAを含む30％アセトニトリル/水、pH2.3；PBS緩衝液、pH7.4；酢酸アンモニウム緩衝液、pH9.0；0.05M NaOH、pH12）中に2mMの濃度で溶解し、0.5mMのイノシンを内部標準として加えた。次いで、出発原料の安定性を3日間にわたってモニターした。
【０１９４】
競合するチオール存在下での安定性試験、c(RGDfK)-グルタチオンをPBSまたは1M Tris HCl、pH9.0のいずれかに2mMの濃度で溶解し、10当量のDTTまたはMesNaを加えた。混合物を数日間にわたってモニターした。
【０１９５】
アルキンホスホンアミデートとの抗体コンジュゲーション
まず、実験を、ヒト上皮成長因子に対するモノクローナルIgG1抗体、セツキシマブで実施した。抗体をビオチンホスホンアミデートで修飾し、非還元条件下でのSDS-PAGEと、続いて抗ビオチンウェスタンブロッティングにより分析した（スキーム7）。
【０１９６】
スキーム7：ビオチン修飾アルキニルホスホンアミデートによるシステイン選択的抗体修飾のための2段階還元およびアルキル化アプローチ
2019532041.tif 000206
【０１９７】
インタクトな抗体を、50mMホウ酸塩含有PBS（pH8.0）中、37℃でDTTとインキュベートすることにより還元した。反応後に過剰のDTTをサイズ排除カラムカラムにより除去し、還元した抗体断片を50mM炭酸水素アンモニウム緩衝液（pH8.5）中、ビオチンホスホンアミデート（チオールに対し1.1当量）と共にインキュベートした。EDTA（1mM）を反応混合物に加えて、ジスルフィド生成を促進する重金属イオンを錯化した。
【０１９８】
ウェスタンブロット分析により、抗体断片の修飾が確認されたが、残っているシステインの再酸化によりインタクトな抗体は再生成されない。これは、高度の修飾によって説明することができよう。ジスルフィド結合の事前の還元なしに、修飾は検出され得なかった。したがって、これらの化合物の遊離システイン残基に対する高い選択性がさらに確認される。さらなる実験は、修飾の程度の決定および修飾抗体の機能性を証明する実験を含むことになる（図10：非還元SDS-PAGE後のウェスタンブロット分析参照。SM：セツキシマブ出発原料。1：5分、2：1時間、3：2時間、4：20時間のビオチン修飾ホスホンアミデートとのインキュベーション。ジスルフィドを事前に還元した（左）および還元しない（右）反応）。
【０１９９】
システイン選択的修飾を、セツキシマブホスホンアミデートコンジュゲートのトリプシン消化と、続くMS/MS分析によってさらに確認した。MS/MSスペクトルを単純化するために、修飾を前述の条件下、構造的により単純なエチル-N-フェニルアルキニルホスホンアミデートで実施した。重鎖のCys 263および軽鎖のCys 214の修飾をMS/MS（HCD断片化）によって確認することができたが、ジスルフィド結合の事前の還元なしに修飾は検出されなかった。
【０２００】
ビニルホスホニトによるシュタウディンガー誘導チオール付加：
a）様々なボラン保護ビニルホスホニトの合成
ジエチルビニルホスホニトを、以前に発表されたプロトコルに基づき、クロロ亜リン酸ジエチルの臭化ビニルマグネシウムによるアルキル化と、続くボラン付加により合成した（13）（スキーム8）。所望のホスホニトを37％の収率で単離した。
【０２０１】
スキーム8：ボラン保護ジエチルビニルホスホニトの合成
2019532041.tif 000207
【０２０２】
異なるO-置換基を有するビニルホスホニトを、三塩化リンから出発し、2つの塩素のピリジン存在下、対応するアルコールでの置換により合成した。生成したモノクロロ亜リン酸エステルをビニルグリニャール試薬と反応させ、ボランで保護した。これらすべての段階をワンポット戦略で実施した。
【０２０３】
スキーム9：様々なボラン保護ジエチルビニルホスホニトのPCl3からの合成および単離収率
2019532041.tif 000208
【０２０４】
いくつかのアルコールはその後のグリニャール試薬の付加に適合性でないため、発明者らはこれらのアルコール由来のホスホニトの合成に、ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンから出発する、代替経路を適用した。第1段階におけるビス(ジイソプロピルアミノ)ビニルホスフィンへのアルキル化は、第2段階のアセトニトリルのような、より極性の高い溶媒中でのアルコールのテトラゾールによる付加を可能にした。すべてのホスホニトをボランによりインサイチューで処理し、フラッシュクロマトグラフィで精製した。
【０２０５】
スキーム10：様々なボラン保護ビニルホスホニトのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからの合成および単離収率
2019532041.tif 000209
2019532041.tif 000210
【０２０６】
IIa）の実験部分
ジエチルビニルホスホニトボラン
2019532041.tif 000211
25-mlシュレンク管に2.14mlの臭化ビニルマグネシウム（THF中0.7M、1.50mmol、1.5当量）をアルゴン雰囲気下で加え、-78℃に冷却し、140μlのクロロ亜リン酸ジエチル（1.00mmol、1.0当量）を滴加した。帯黄色溶液を0℃まで戻し、さらに2時間撹拌し、1.00mlのボラン（THF中1.0M、1.00mmol、1.0当量）を加え、0℃でさらに1時間撹拌した。有機溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン/EtOAc、9：1）で精製して、所望の化合物を無色油状物で得た。（60mg、0.37mmol、37.0％）
2019532041.tif 000212
NMRデータは文献中に報告されたものに一致している。18
【０２０７】
ジ(2-ニトロベンジル)ビニルホスホニトボラン
2019532041.tif 000213
化合物を、一般手順Aに従い、PCl3（260μl、3.00mmol）から合成した。純粋なボラン保護ホスホニトをフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン/EtOAc、4：1）により精製し、帯黄色固体で得た。（555mg、1.48mmol、49.2％）
2019532041.tif 000214
【０２０８】
ジ(2-(2-メトキシエトキシ)エチル)ビニルホスホニトボラン
2019532041.tif 000215
化合物を、一般手順Aに従い、PCl3（130μl、1.50mmol）から合成した。純粋なボラン保護ホスホニトをフラッシュカラムクロマトグラフィ（CH2Cl2/MeOH、19：1〜9：1）により精製し、無色油状物で得た。（34mg、0.11mmol、7.3％）
2019532041.tif 000216
【０２０９】
ジフェニルビニルホスホニトボラン
2019532041.tif 000217
化合物を、一般手順Aに従い、PCl3（393μl、4.50mmol）から合成した。純粋なボラン保護ホスホニトをフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン/EtOAc、4：1）により精製し、無色油状物で得た。（700mg、2.71mmol、60.3％）
2019532041.tif 000218
【０２１０】
ビス(4-(2-ニトロ-5-(オキシプロパルギル)ベンジルオキシ)フェニル)ビニルホスホニトボラン
2019532041.tif 000219
化合物を、一般手順Bに従い、ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン（71mg、0.27mmol）から合成した。純粋なボラン保護ホスホニトをフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン/CH2Cl2、1：1）により精製し、帯黄色固体で得た。（75mg、0.11mmol、41.9％）
2019532041.tif 000220
【０２１１】
ビス(2-ニトロ-5-(オキシプロパルギル)ベンジル)ビニルホスホニトボラン
2019532041.tif 000221
化合物を、一般手順Bに従い、ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン（513mg、1.92mmol）から合成した。純粋なボラン保護ホスホニトをフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン/CH2Cl2、4：1）により精製し、帯黄色固体で得た。（704mg、1.45mmol、75.6％）
2019532041.tif 000222
【０２１２】
ビス(2,2,2-トリフルオロエチル)ビニルホスホニトボラン
2019532041.tif 000223
化合物を、一般手順Bに従い、ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン（266mg、1.00mmol）から合成した。純粋なボラン保護ホスホニトをフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン/CH2Cl2、9：1〜4：1）により精製し、無色液体で得た。（87mg、0.32mmol、32.2％）
2019532041.tif 000224
【０２１３】
ビス-(4-ヒドロキシフェニル)ビニルホスホニトボラン
2019532041.tif 000225
化合物を、一般手順Bに従い、ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン（534mg、2.00mmol）およびヒドロキノン（2.20g、10当量）から合成した。純粋なボラン保護ホスホニトをフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン/EtOAc、4：1〜1：1）により精製し、無色固体で得た。（280mg、0.96mmol、48.3％）
2019532041.tif 000226
【０２１４】
ジ(4-ニトロベンジル)ビニルホスホニトボラン
2019532041.tif 000227
化合物を、一般手順Bに従い、ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン（533mg、2.00mmol）から合成した。純粋なボラン保護ホスホニトをフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン/CH2Cl2、9：1〜4：1）により精製し、白色固体で得た。（540mg、1.44mmol、71.8％）
2019532041.tif 000228
【０２１５】
2-ニトロ-5-(オキシプロパルギル)ベンジルアルコール
2019532041.tif 000229
5mlマイクロ波チューブに200mgの5-ヒドロキシ-2-ニトロベンジルアルコール（1.18mmol、1.0当量）、245mgのK2CO3（1.77mmol、1.5当量）、132μlの臭化プロパルギル（トルエン中80重量％溶液）および4mlのDMFを加えた。得られた懸濁液を100℃で1時間照射した。室温まで冷却した後、5mlの水を加えた。得られた沈澱をろ過し、水で3回洗浄し、真空乾燥して、179mgの淡褐色固体を得た。（0.87mmol、73.2％）
NMRデータは文献中に報告されたものに一致している。19
【０２１６】
4-(2-ニトロ-5-(オキシプロパルギル)ベンジルオキシ)フェノール
2019532041.tif 000230
火炎乾燥したシュレンク管、400mgの2-ニトロ-5-(オキシプロパルギル)ベンジルアルコール（1.93mmol、1.0当量）を、850mgのヒドロキノン（7.72mmol、4.0当量）および750mgのトリフェニルホスフィン（2.90mmol、1.5当量）と共に10mlの無水THFに溶解した。溶液を0℃に冷却し、1.33mlのアゾジカルボン酸ジエチル（トルエン中40％溶液）（2.90mmol、1.5当量）を滴加し、反応混合物を室温に戻して終夜反応させた。粗生成物を精製のためにシリカカラムに乾燥充填し、ヘキサン/EtOAc（7：3〜3：2）で溶出して、505mgの黄色固体を得た。（1.68mmon、87.5％）
2019532041.tif 000231
【０２１７】
小分子試験：無保護アルケンホスホニトの異なるアジドとの反応
まずビニルホスホニトによるシュタウディンガー-ホスホニト反応を、やや単純なジエチル誘導体により調べた。これらを市販のクロロ亜リン酸ジエチルのアルキル化により合成し、異なる脂肪族および芳香族アジドとインサイチューで反応させた。ホスホンイミデートの加水分解の後に、所望のホスホンアミデートをカラムクロマトグラフィで単離した。
【０２１８】
スキーム11：ジエチルビニルホスホニトの異なるアジドとのシュタウディンガー-ホスホニト反応および単離収率
2019532041.tif 000232
【０２１９】
ホスホンアミデートのO-置換基を変動させることで、チオール付加の反応性の細かい調節ならびに第三の官能基の系への設置が可能となる。エチル以外の官能基を有するホスホンアミデートを、それぞれのホスホニトのシュタウディンガー-ホスホニト反応により合成した。単離したボラン保護ホスホニトをDABCOで処理して、反応性P(III)種を生成し、インサイチューでアジドと反応させて、ホスホンアミデートを生成した。その後、水を加えて加水分解することにより、所望のホスホンアミデートを中等度の収率で得た。
【０２２０】
スキーム12：ビニルホスホニトボラン付加物のDABCOによる脱保護後のインサイチューシュタウディンガー-ホスホニト反応
2019532041.tif 000233
【０２２１】
2-ニトロ-ベンジル基は感光性の置換基として広く公知で、UV照射後に結合された分子を遊離することが明らかにされている。20ホスホンアミデート化学における発明者らの専門知識から、我々はホスホンアミデートのP-N-結合はホスホンアミデートエステルが切断されると非常に不安定であることを知っていた。したがって、発明者らは、チオール付加コンジュゲートからのアミンの制御された光による遊離を可能にする、2-ニトロベンジル置換ホスホンアミデートを合成したいと考えた。
【０２２２】
スキーム13：2-ニトロ-ベンジルビニルホスホニトと様々なアジドとの間のシュタウディンガー-ホスホニト反応の単離収率
2019532041.tif 000234
【０２２３】
光切断可能なビオチンならびにCy5-色素およびDABCYLクエンチャーバリアントを含む、いくつかの2-ニトロ-ベンジル置換ホスホンアミデートを合成することができた。2-ニトロベンジル基における追加のアルキンは、第三の官能基の銅触媒クリックケミストリーによる系への設置を可能にし、これはまた光照射によって切断することができる。
【０２２４】
スキーム14：2つの異なるアルキン修飾2-ニトロ-ベンジルビニルホスホニトとフェニルアジドとの間のシュタウディンガー-ホスホニト反応の単離収率
2019532041.tif 000235
【０２２５】
その後のチオール付加の反応性のさらなる細かい調節を、ホスホンアミデートの電子特性を変えることにより達成した。したがって、異なるフェニル-ならびにトリフルオロエチル誘導体を合成した。
【０２２６】
スキーム15：様々なビニルホスホニトと異なるアジドとの間のシュタウディンガー-ホスホニト反応の単離収率
2019532041.tif 000236
【０２２７】
いくつかのホスホニトは、それらの対応するアルコールがボラン付加に適合性でないため、ボラン保護基を付加して単離することができなかった。スキーム16に示すとおり、発明者らは、ホスホニトを単離することなく、アジドとのインサイチュー合成においてこれらのホスホニトを用い得ることを示すことができた。
【０２２８】
スキーム16：ピリジルホスホニトのワンポット合成とその後のフェニルアジドとのシュタウディンガー-ホスホニト反応
2019532041.tif 000237
【０２２９】
ホスホンアミデートの異なるpHに対する安定性を、水性緩衝液中、室温での31P-NMRにより証明した。最初の実験において、安定性の測定のためにエチル-N-フェニル-P-ビニル-ホスホンアミデートを選択した。化合物は広いpH範囲で安定であることが判明した。P-N-結合の切断が強酸性条件下で起こった（図11：異なるpHに対するエチル-N-フェニル-P-ビニル-ホスホンアミデートの経時的安定性）。
【０２３０】
小分子チオールおよびグルタチオンのビニルホスホンアミデートへのチオール付加
最初の試験において、ビニルホスホンアミデートを異なる小分子チオールと、アルキニルホスホンアミデートに対して以前にうまくはたらいた反応条件下で反応させた。炭酸カリウム存在下、1当量のチオールで3時間処理した後に、ホスホンアミデート出発原料の完全変換を観察することができた。
【０２３１】
スキーム17：異なる小分子チオールのエチルビニルホスホンアミデートへのチオール付加
2019532041.tif 000238
【０２３２】
次の段階において、水溶性グルタチオンホスホンアミデートコンジュゲートを合成するために、これらの反応条件をここで適用した。水溶性4-カルボキシフェニル-ホスホンアミデートの場合、いかなる有機溶媒も加えずに反応が進行した。半分取HPLCにより、わずかに塩基性の勾配で、極性の高い生成物が単離された。
【０２３３】
スキーム18：グルタチオンのエチルビニルホスホンアミデートへの付加および単離収率（半分取HPLC）
2019532041.tif 000239
【０２３４】
チオール付加物の異なるpHに対する安定性を、水性緩衝液中、室温での31P-NMRにより証明した。コンジュゲートは広いpH範囲ですぐれた安定性を示した。P-N-結合の切断が強酸性条件下で起こった。逆チオール付加と呼ばれるチオールの脱離は観察されなかった（図12：異なるpHに対するグルタチオンホスホンアミデート付加物の経時的安定性）。
【０２３５】
反応速度に対するO-置換基の影響を、pH8.5の炭酸水素アンモニウム緩衝液中の様々なN-フェニルアルキニルホスホンアミデートの溶液にグルタチオンを加えることによって調査した。異なるホスホンアミデートの経時的変換を図11に示す。
【０２３６】
発明者らは、ビニルホスホンアミデートはチオールとの反応が、それらの対応するアルキニル誘導体よりもはるかに遅いことを見出した。発明者らは、ホスホンアミデートの電子供与性エチル基をより電子求引性の置換基に交換することで、親電子性がさらに高まり、したがってチオール付加の速度が上がると考えた。エチルをフェニル基に交換することで、反応中の出発原料の半減期t1/2は10時間から1時間へとすでに短縮している。トリフルオロエチルはt1/2を30分へとさらに短縮するが、2-ニトロベンジルは2時間で50％まで反応する（図13：pH8.5でのグルタチオンとの反応における様々なN-フェニルビニルホスホンアミデートの消費。HPLC UVトレースを異なる時点で取った。実験は三つ組で行った。
【０２３７】
タンパク質レベルでのビニルホスホンアミデートへのチオール付加
タンパク質レベルでのアルケンホスホンアミデートによる最初の実験を、水溶性エチル-N-(4-カルボキシ-フェニル)-P-ビニル-ホスホンアミデートで行った。以前の試験は、炭酸塩基がチオール付加の促進において非常によくはたらくことを示したため、pH9.0の炭酸水素アンモニウム緩衝液を最初の実験のために選択した。利用可能なシステインを1つだけ有する変異eGFPバリアントを、試験のために選択した。
【０２３８】
スキーム19：1つの利用可能なシステインを有するeGFPへの水溶性ビニルホスホンアミデートの付加
2019532041.tif 000240
【０２３９】
タンパク質を50当量のホスホンアミデートと37℃でインキュベートした。16時間後の反応混合物のMALDI/MS分析はまだ未反応のタンパク質を示したが、発明者らは所望のタンパク質コンジュゲートの生成を観察して非常に満足した。
【０２４０】
さらなるeGFPコンジュゲーション実験を、蛍光Cy5-ホスホンアミデートで実施し、Cy5-チャネルのゲル内蛍光測定により観察した。
【０２４１】
スキーム20：1つの利用可能なシステインを有するeGFPのCy5ホスホンアミデート標識。SDS Page後のゲル内蛍光読み取りは選択的Cy5標識を確認する。
2019532041.tif 000241
反応のシステイン残基に対する選択性を、この実験で確認することができた。ホスホンアミデートとインキュベートしたいかなる利用可能なシステインも持たないeGFPバリアント、またはCys含有eGFPへのCy5アジド付加のいずれも、蛍光標識を示さなかった。反応混合物への5％DMSO（ライン1）またはアセトニトリル（ライン3）の添加はいずれも、反応自体に影響をおよぼすことなく色素を可溶化するのに十分であった。
【０２４２】
光切断可能な三重コンジュゲーション
発明者らは以前、CuAACのための追加のアルキンハンドルを有するo-ニトロベンジル置換基を有するホスホンアミデートを合成し得ることに言及した。これらの化合物に対する1つの可能な適用は、タンパク質コンジュゲートを精製するためのアルキンへのビオチンの設置である。発明者らは、ビオチンがストレプトアビジンビーズに結合し、非結合材料を洗浄することができ、純粋なタンパク質を光照射により溶出し得ると考えた。
【０２４３】
タンパク質レベルでの最初の実験において、O-置換光切断可能アルキンを有する単純なN-フェニルホスホンアミデートをまず、発明者らの単一システイン含有eGFPと、以前に最適化した条件下で反応させた。この段階の後、アジド修飾ビオチンを作成物に、CuACCにより連結し、コンジュゲートを抗ビオチンウェスタンブロッティングにより分析した。
【０２４４】
スキーム21：1つの利用可能なシステインを有するeGFPの光切断可能アルキン標識と、その後のCuACCによるビオチン標識およびウェスタンブロット分析
2019532041.tif 000242
【０２４５】
ウェスタンブロット分析は、ビオチンのeGFP作成物へのコンジュゲーションが成功したことを確認した。ホスホンアミデートが結合していないeGFPをCuACC反応において用いた場合、ビオチンは検出されなかった。銅非存在下でも同じである。
【０２４６】
ストレプトアビジンビーズ上のさらなる固定化実験を、アジド含有ペプチドおよび単一システイン含有ユビキチンから合成したホスホンアミデートで行った。高分子量のペプチドはSDSゲルにおいてタンパク質のシフトを誘導し、コンジュゲーション収率の推定を可能にする。
【０２４７】
スキーム22：1つの利用可能なシステインを有するユビキチンの光切断可能アルキン標識と、その後のCuACCによるビオチン標識。ストレプトアビジンビーズ上の固定化後のウェスタンブロット分析。1：ユビキチン出発原料、2：CuACC後の反応混合物、3：反応混合物のストレプトアビジンアガロースとのインキュベーション後の上清、4：ストレプトアビジンアガロース洗浄後の通過画分、5：煮沸ビーズ、6：照射ビーズ
2019532041.tif 000243
【０２４８】
ペプチドのタンパク質へのコンジュゲーション収率は60％と推定することができた。最終作成物はストレプトアビジンビーズ上にうまく固定された。SDS緩衝液中でビーズを煮沸し、それによりインタクトなタンパク質ペプチドコンジュゲートを遊離するか、またはUV光照射のいずれかにより、作成物を遊離することができた。後者の方法はホスホンアミデートエステルを切断し、P-N-結合の不安定性と、したがって、コンジュゲートされていないタンパク質の遊離を引き起こす。光照射後にインタクトなエステルを生成して、光照射後にコンジュゲートされた作成物を遊離するホスホンアミデートで、さらなる実験を実施する。
【０２４９】
b）ビニルホスホンアミデートとの抗体コンジュゲーション
ビニルホスホンアミデートを、モノクローナル抗体の修飾のためにも適用した。発明者らは、2-ニトロ-ベンジル置換ビニルホスホンアミデートがチオール付加においてより速やかに反応することを見いだしたため、ビオチン修飾したこれらのホスホンアミデートを選択した。
【０２５０】
スキーム23：抗体ジスルフィドの還元と、その後のビオチンビニルホスホンアミデートによる修飾
2019532041.tif 000244
【０２５１】
発明者らは、より低い温度がジスルフィド形成を減速し、したがってより高いコンジュゲーション収率をもたらすことを見出したため、チオール付加を4℃にした以外は、前述の還元-アルキル化手順と同じ反応条件を選択した。
【０２５２】
ウェスタンブロット分析は、抗体のシステイン選択的修飾を確認した。遊離システイン残基に対する高い選択性を、ジスルフィド結合を事前に還元していない抗ビオチンウェスタンブロットではシグナルが見られないことによって観察することができた。アルキニルホスホンアミデートによる標識実験とは対照的に、今回は抗体断片の再編成を観察することができた（図14：非還元SDS-PAGE後のウェスタンブロット分析。SM：セツキシマブ出発原料。1：5分、2：1時間、3：2時間、4：4時間、5：20時間のビオチン修飾ホスホンアミデートとのインキュベーション。ジスルフィドを事前に還元した（左）および還元しない（右）反応）。
【０２５３】
システイン選択的修飾を、セツキシマブホスホンアミデートコンジュゲートのトリプシン消化と、続くMS/MS分析によってさらに確認した。MS/MSスペクトルを単純化するために、修飾を前述の条件下、構造的により単純なフェニル-N-フェニルアルキニルホスホンアミデートで実施した。重鎖のCys 264およびCys 146の修飾をMS/MS（HCD断片化）によって確認することができたが、ジスルフィド結合の事前の還元なしに修飾は検出されなかった。
【０２５４】
ASGP-R指向薬物コンジュゲートの合成におけるアルケンホスホニト
発明者らはさらに、我々のモジュール式コンジュゲーションアプローチを標的指向性の薬物コンジュゲートの合成に適用したいと考えた。Khorev et alは以前に、末端アミノ修飾を有するASGP-R指向三価リガンドの合成を記載した。この経路に基づき、発明者らは末端チオール修飾を有する同じリガンドを合成した（20）。
【０２５５】
スキーム24：ビニルホスホンアミデートへのモジュール式付加による蛍光標識したASGP-R指向Cy5コンジュゲートの合成
2019532041.tif 000245
【０２５６】
チオール修飾し、完全に脱保護したリガンドにより、発明者らは作成物を我々の蛍光Cy5-ホスホンアミデートにうまくコンジュゲートした。このコンジュゲートで、FACS分析および蛍光顕微鏡法により肝細胞への十分な取り込みをモニターすることができる。
【０２５７】
図15は、本記載中で言及する配列を示す。
【０２５８】
アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入
スキーム25に示すアミノ修飾誘導体N2またはNHS-エステルN1としての一般構築ブロックは、アルキン-ホスホンアミデート部分を機能性分子にアミド結合形成反応によって導入することができる。
【０２５９】
スキーム25：Cys残基の化学選択的修飾のためのアルキン-ホスホンアミデート。一般構築ブロックN1およびN2による化学選択的シュタウディンガー-ホスホニト反応またはアミドカップリングを介しての導入。
2019532041.tif 000246
【０２６０】
このアプローチは、不安定なP(III)化合物を扱わなくてもよいため、好都合であり得る。さらに、これらの一般構築ブロックを用いることにより高収率を達成し得ることが明らかにされており、これは高価な出発原料のために特に重要である。
【０２６１】
スキーム26：アルキン-ホスホンアミデート部分の機能性蛍光色素へのアミド結合を介しての高収率結合の2つの例
2019532041.tif 000247
【０２６２】
アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順
分取HPLC
分取HPLCをGilson PLC 2020システム（Gilson Inc, WI, Middleton, USA）でVP 250/32 Macherey-Nagel Nucleodur C18 HTec Spumカラム（Macherey-Nagel GmbH & Co. Kg, Germany）を用いて実施した。本開示のすべての項を通して以下の勾配を用いた：方法C：（A＝H2O＋0.1％TFA（トリフルオロ酢酸）、B＝MeCN（アセトニトリル）＋+0.1％TFA、流速30ml/分、5％B 0〜5分、5〜90％B 5〜60分、90％B 60〜65分。方法D：（A＝H2O＋0.1％TFA、B＝MeCN＋+0.1％TFA）、流速30ml/分、5％B 0〜5分、5〜25％B 5〜10分、25％〜45％B 10〜50分、45〜90％ 50〜60分、90％B 60〜65分。
【０２６３】
半分取HPLC
半分取HPLCを、CBM20A通信バスモジュール、FRC-10Aフラクションコレクター、2ポンプLC-20AP、およびSPD-20A UV/VIS検出器を備えたShimadzu prominence HPLCシステム（Shimadzu Corp., Japan）でVP250/21 Macherey-Nagel Nucleodur C18 HTec Spumカラム（Macherey-Nagel GmbH & Co. Kg, Germany）を用いて実施した。本開示のすべての項を通して以下の勾配を用いた：方法E：（A＝H2O＋0.1％TFA、B＝MeCN＋+0.1％TFA）、流速10ml/分、5％B 0〜5分、5〜99％B 5〜65分、99％B 65〜75分。
【０２６４】
芳香族アジドの合成のための一般手順1
500-ml丸底フラスコに10mmolの芳香族アミンを加え、15mlの水に懸濁し、0℃に冷却した。5mlの濃HCl水溶液を加え、続いて10mlの水中1.27gの亜硝酸ナトリウム（15.00mmol、1.50当量）溶液を滴加した。混合物を0℃で20分間撹拌し、100mlのEtOAc（酢酸エチル）を加え、5mlの水中0.98gのアジ化ナトリウム（15.00mmol、1.5当量）溶液を滴加した。溶液を室温に戻し、さらに1時間撹拌した。相を分離し、水相をEtOAcで2回抽出し、合わせた有機分画を水で2回洗浄し、乾燥（MgSO4）し、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。
【０２６５】
クロロ亜リン酸ジエチルからのO-エチル-アルキニルホスホンアミデートの合成のための一般手順2
25-mlシュレンク管に173μlのクロロ亜リン酸ジエチル（1.20mmol、1.2当量）をアルゴン雰囲気下で加え、-78℃に冷却し、2.40mlの臭化エチニルマグネシウム溶液（THF中0.5M、1.20mmol、1.2当量）を滴加した。帯黄色溶液を室温に戻し、3.0mlのTHFまたはDMFに溶解した1.00mmolのアジド（1.0当量）を加え、室温で終夜撹拌した。5mlの水を加え、さらに2時間撹拌した。反応混合物をEtOAcで抽出し、合わせた有機分画を乾燥（MgSO4）し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィまたは分取逆相HPLCにより精製した。
【０２６６】
4-アジド安息香酸
2019532041.tif 000248
化合物を、一般手順1に従い、2.00gの4-アミノ安息香酸（14.58mmol）から合成し、帯黄色固体で得た。（2.00g、12.26mmol、84.1％）
2019532041.tif 000249
NMRデータは文献値に一致していた（23）。
【０２６７】
4-アジド安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル
2019532041.tif 000250
50-ml丸底フラスコ中、500mgの4-アジド安息香酸（3.056mmol、1.00当量）、705mgのN-ヒドロキシスクシンイミド（6.112mmol、2.00当量）および20mgの4-ジメチルアミノピリジン（0.164mmol、0.05当量）を10mlの無水CH2Cl2に懸濁した。1.172gのEDC・HCl（1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩、6.112mmol、2.00当量）を0℃でゆっくり加え、反応混合物を室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィ（50％EtOAc/ヘキサン）により精製し、白色固体で得た（763mg、2.934mmol、96.0％）
2019532041.tif 000251
NMRデータは文献値に一致していた（24）。
【０２６８】
エチル-N-(4-(2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル)オキシ-カルボニル-フェニル)-P-エチニルホスホンアミデート
2019532041.tif 000252
化合物を、一般手順2に従い、173μlのクロロ亜リン酸ジエチル（1.20mmol、1.20当量）、2.40mlの臭化エチニルマグネシウム溶液（THF中0.5M（テトラヒドロフラン）、1.20mmol、1.20当量）および260mgの4-アジド安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（1.00mmol、1.00当量）から合成した。粗製ホスホンアミデートをシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（100％EtOAc）により精製し、帯黄色固体で得た。（225mg、0.643mmol、64.3％）
2019532041.tif 000253
【０２６９】
2-(4-アジドフェニル)-エタノール
2019532041.tif 000254
化合物を、一般手順1に従い、1.00gの2-(4-アミノフェニル)-エタノール（7.21mmol）から合成し、褐色油状物で得た（0.50g、3.06mmol、42.5％）。
2019532041.tif 000255
NMRデータは文献値に一致していた（25）。
【０２７０】
2-(4-アジドフェニル)-エチル-4-トルエンスルホネート
2019532041.tif 000256
50-ml丸底フラスコに455mgの2-(4-アジドフェニル)-エタノール（2.79mmol、1.00当量）を加え、8mlのピリジンに溶解し、0℃に冷却した。787mgの固体塩化トシル（4.18mmol、1.50mmol）を分割して加え、混合物を室温で4時間撹拌し、10mlの飽和NaCl溶液および10mlの水を加え、黄色溶液をEtOAcで3回抽出し、合わせた有機分画を1N HClで2回、飽和NaHCO3溶液で2回および水で1回洗浄した。有機層を乾燥（MgSO4）し、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。生成物を黄色油状物で得た（0.72g、2.44mmol、87.4％）。
2019532041.tif 000257
NMRデータは文献値に一致していた（26）。
【０２７１】
2-(4-アジドフェニル)-エチルフタルイミド
2019532041.tif 000258
50-ml丸底フラスコに4.11gの2-(4-アジドフェニル)-エチル-4-トルエンスルホネート（12.95mmol、1.00当量）を、3.60gのフタルイミドカリウム（19.42mmol、1.50当量）と共に加え、60mlのDMF（N,N-ジメチルホルムアミド）に溶解した。褐色溶液を100℃で終夜撹拌した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、50mlの水を加え、EtOAcで3回抽出し、合わせた有機分画を水で2回洗浄し、有機層を乾燥（MgSO4）し、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。生成物をそれ以上精製せずに次の段階で用いた。純粋な生成物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（10％〜20％EtOAc/n-ヘキサン）により黄色固体で得た（1.75g、5.99mmol、46.2％）。
2019532041.tif 000259
【０２７２】
2-(4-アジドフェニル)-エチルアミン塩酸塩
2019532041.tif 000260
100-ml丸底フラスコに722mgの2-(4-アジドフェニル)-エチルフタルイミド（2.47mmol、1.00当量）、144μlのヒドラジン水和物（2.96mmol、1.20当量）を加え、20mlの無水エタノールにアルゴン雰囲気下で溶解し、溶液を4時間還流した。ほとんどの溶媒を減圧下で除去し、50mlの水を加え、懸濁液を1N NaOHで塩基性化した。EtOAcで3回抽出し、合わせた有機分画を水で2回洗浄し、有機層を乾燥（MgSO4）し、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。純粋な生成物を、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（10％MeOH（メタノール）/DCM（ジクロロメタン）＋0.5％N,N-エチルジメチルアミン）およびHClからの凍結乾燥により、帯黄色固体で得た（224mg、1.14mmol、2段階で46.2％）。
2019532041.tif 000261
NMRデータは文献値に一致していた（27）。
【０２７３】
エチル-N-(4-(2-アミノエチル)フェニル)-P-エチニルホスホンアミデートTFA塩
2019532041.tif 000262
化合物を、一般手順2に従い、181μlのクロロ亜リン酸ジエチル（1.26mmol、1.20当量）、2.52mlの臭化エチニルマグネシウム溶液（THF中0.5M、1.26mmol、1.20当量）および322mgの2-(4-アジドフェニル)エチルアミン塩酸塩（1.05mmol、1.00当量）から合成した。粗製ホスホンアミデートを分取RP-HPLC（前述の方法C）により精製し、褐色油状物で得た。（209mg、0.57mmol、54.5％）
2019532041.tif 000263
【０２７４】
5-((2-(O-エチル-P-エチニル-ホスホンアミダト-N-ベンゾイル)エチル)アミノ)ナフタレン-1-スルホン酸
2019532041.tif 000264
反応をDMF中で実施した。エチル-N-(4-(2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル)オキシ-カルボニル-フェニル)-P-エチニルホスホンアミデートの100mM溶液265μl（0.0265mmol、1.00当量）および5-((2-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホネートの50mM溶液1.06ml（0.0530mmol、2.00当量）を795μlのDMFと共にあらかじめ混合し、200mM DIPEA溶液530μl（0.1060mmol、4.00当量）を加えた。混合物を室温で2時間振盪し、すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗製混合物を分取HPLCにより前述の方法Cを用いて精製し、所望の化合物を凍結乾燥後に白色固体で得た。（9.30mg、0.0186mmol、70.0％）
2019532041.tif 000265
【０２７５】
Cy5-O-エチル-P-アルキニル-ホスホンアミデート
2019532041.tif 000266
Cy5-COOHを、発明者らの研究室が以前に発表した手順に従って合成した（28）。5-ml丸底フラスコに33.2mgのCy5-COOH（0.0628mmol、1.00当量）、35.8mgのHATU（(1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスフェート）、0.0942mmol、1.5当量）および200μlのDMFを加えた。濃青色溶液を0℃に冷却し、32μlのDIPEA（N,N-ジイソプロピルエチルアミン、0.1884mmol、3.0当量）を加えた。5分後、300μl DMF中の23mgのエチル-N-(4-(2-アミノエチル)フェニル)-P-エチニルホスホンアミデートTFA塩（0.0628mmol、1.00当量）の溶液を滴加した。溶液を室温に戻し、2時間撹拌した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（0％〜5％MeOH/DCM）で精製して、青色固体で得た。（45mg、0.0590mmol、93.9％）。
2019532041.tif 000267
【０２７６】
抗体薬物コンジュゲート（ADC）生成のためのアルキニルホスホニトによるシュタウディンガー誘導チオール付加
本明細書において前述したとおり、発明者らは全長IgG抗体のアルキン-およびアルケン-ホスホンアミデートによる修飾が可能であることを示すことができた。前述の実施例において、発明者らはモデル抗体としてセツキシマブを用い、鎖間ジスルフィドをビオチン化ホスホンアミデート（phorsphonamidate）により、Senterら（29）により以前に記載された還元およびアルキル化プロトコルを介して修飾した。この概念は、非常に強力なチューブリン結合細胞毒のMMAEおよびHer2結合抗体のトラスツズマブのホスホンアミデート仲介性コンジュゲーションによるADC生成のための実行可能なシステムへとさらに展開された。
【０２７７】
発明者らのセツキシマブによる前記試験と同様に、我々はトラスツズマブの鎖間ジスルフィドをジチオスレイトール（DTT）で還元し、マレイミド、ヨードアセトアミドおよびアルキン-ホスホンアミデート（ホスホンアミデート-標識）を含む異なる親電子ビオチン誘導体とのCysコンジュゲーション反応を実施して、最先端技術との直接比較を行った。後者をシュタウディンガー-ホスホニト反応プロトコルにより72％の全収率で合成した。抗体標識反応を、ジスルフィド結合の事前の還元あり、およびなしで実施して、Cysコンジュゲーション反応の化学選択性を調べた（図16）。ウェスタンブロット分析により、還元トラスツズマブで試験したビオチン誘導体のすべてについて十分な標識が示された。最も衝撃的なことに、発明者らは、非還元トラスツズマブとのマレイミドの高い反応性を観察し、これはトリプシン消化およびMS/MS分析によりさらに確認された。これに対し、ホスホンアミデート-標識はCys-残基に顕著な選択性を示した（図16）。
【０２７８】
図16：A：3つの異なるCys-反応性ビオチン誘導体によるトラスツズマブ修飾。ジスルフィド還元を50mMホウ酸塩含有PBS中、1000当量のDTTにより、37℃で30分間実施した。過剰のDTTをサイズ排除クロマトグラフィで除去した。標識を35当量ビオチン誘導体により、アミデートの場合は50mM NH4HCO3および1mM EDTA含有緩衝液、pH8.5中、および他の2つの化合物の場合は1mM EDTA含有PBS、pH7.4中、最終DMSO含有量1％で行った。B：ウェスタンブロット分析。レーン1および5：未処理抗体。レーン2〜4：事前にDTT処理しての反応。レーン6〜8：事前のDTT処理なしの対照反応。
【０２７９】
ホスホンアミデート連結ADCを、非常に効率的な抗有糸分裂毒素MMAFおよびFDA承認されたHer2指向抗増殖抗体トラスツズマブから生成した（図17）。毒性ペイロードの遊離を調べるために、抗体と毒素との間にカテプシンB切断部位（バリン-シトルリンリンカーVC）を有するADCを調製した。アミデート-VC-PAB-MMAF作成物を、スキーム27に示す通り、前述の手順に基づいて合成した。
【０２８０】
スキーム27：ホスホンアミデート連結、カテピス（cathepis）B切断可能モノメチルオーリスタチンF（MMAF）コンジュゲート作成のための合成経路。VC：バリン-シトルリンジペプチド、PAB：p-アミノベンジル、PNP：p-ニトロフェニルカーボネート。
2019532041.tif 000268
【０２８１】
トラスツズマブへのコンジュゲーションを、鎖間ジスルフィド結合のDTTによる還元およびZeba(商標) Spin脱塩カラムによる過剰の還元剤の除去後に、50mM炭酸水素アンモニウム緩衝液、ｐH8.5中、14℃で16時間実施した。
【０２８２】
図17：ホスホンアミデート修飾、カテプシン切断可能MMAF（アミデート-VC-PAB-MMAF）によるトラスツズマブ修飾。A：鎖間ジスルフィドの還元およびアルキル化の反応スキーム。B：反応のSDS-PAGE分析。C. PNGアーゼFによる脱グリコシル（deglaycosylation ）およびDTTによる還元後の抗体断片のデコンボリューション処理したMSスペクトル。LC：軽鎖；HC：重鎖；mod：アミデート-VC-PAB-MMAF。
【０２８３】
脱グリコシルおよび還元後のESI-MSにより、抗体あたり4.6薬物分子の平均ローディングが認められた。発明者らは、異なる修飾度を有する重鎖および軽鎖種の質量シグナルの強度により、薬物-抗体比（DAR）を概算した。
【０２８４】
得られたホスホンアミデート-ADCコンジュゲートを、以前に確立したHer2に基づく増殖検定において、2つの異なるHer2過剰発現細胞株BT474およびSKBR3により評価した（30）。Her2選択性を試験するために、対照としてHer2非過剰発現細胞株MDAMB468を用いた。ホスホンアミデート連結コンジュゲートを、マレイミド連結カテプシンB切断可能トラスツズマブMMAFコンジュゲートと比較した。これらの実験は明らかに、ホスホンアミデート標識MMAF-ADCはHer2過剰発現細胞の十分かつ選択的殺滅を可能にすることを示している。測定したIC50値は、比較したマレイミド対照と少なくとも同程度に良好であった（図18）。ホスホンアミデート標識の利点は、マレイミド化学に比べた場合に、インビトロ細胞殺滅効率においてプラスの効果を有すると期待すべきではないことに留意することが重要である。
【０２８５】
図18：MMAF連結トラスツズマブの、2つの異なるHer2過剰発現細胞株（BT474およびSKBR3）および1つの対照（MDAMB468）に対する抗増殖効力増大。プロットは、抗体処理4日後の、抗体濃度に依存しての、増殖細胞の数を示す。トラスツズマブ単独（ピンク）、トラスツズマブ-ホスホンアミデート-MMAF（青）およびトラスツズマブ-マレイミド-MMAF（緑）。
【０２８６】
抗体薬物コンジュゲート（ADC）生成のためのアルキニルホスホニトによるシュタウディンガー誘導チオール付加の手順
N-(4-アジドベンゾイル)-L-バリン
2019532041.tif 000269
50-mlシュレンク管に1.00gの4-アジド安息香酸（6.13mmol、1.00当量）を加え、8.5mlの無水DCM（ジクロロメタン）に1滴のDMF（N,N-ジメチルホルムアミド）と共に、アルゴン雰囲気下で懸濁した。630μlの塩化オキサリルを0℃で滴加し、反応混合物を室温で2時間、溶液が澄明になるまで撹拌した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、対応する固体を4mlのDMFに再溶解した。対応する溶液を、8mlの水中720mgのL-バリン（6.13mmol、1.00当量）および612mgの水酸化ナトリウム（15.33mmol、2.50当量）の溶液に0℃で滴加し、さらに2時間撹拌した。溶液を1N HClで酸性化し、ジエチルエーテルで3回抽出した。有機分画を集め、乾燥（MgSO4）し、溶媒を減圧下で除去した。純粋な生成物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（30％EtOAc、0.5％ギ酸/n-ヘキサン）により無色ヒュームで得た。（954mg、4.96mmol、80.9％）
2019532041.tif 000270
【０２８７】
N-(4-アジドベンゾイル)-L-バリン-無水物
2019532041.tif 000271
100-ml丸底フラスコ中、954mgのN-(4-アジドベンゾイル)-L-バリン（3.64mmol、1.00当量）、750mgのジシクロヘキシルカルボジイミド（3.64mmol、1.00当量）、418mgのN-ヒドロキシスクシンイミド（3.64mmol、1.00当量）および9mgの4-(ジメチルアミノ)-ピリジン（0.07mmol、0.02当量）を25mlのTHFに溶解し、室温で終夜撹拌した。反応混合物をろ過し、固体をTHFで数回洗浄し、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（20〜40％EtOAc/n-ヘキサン）で精製した。化合物を白色粉末として単離した（513mg、1.01mmol、55.7％）
2019532041.tif 000272
【０２８８】
N-(4-アジドベンゾイル)-L-バリン-L-シトルリン
2019532041.tif 000273
50-ml丸底フラスコ中、380mgのN-(4-アジドベンゾイル)-L-バリン-無水物（0.75mmol、1.00当量）を2mlの1,2-ジメトキシエタンに溶解し、0℃に冷却した。4mlのH2Oおよび2mlのTHF（テトラヒドロフラン）中の351mgのL-シトルリン（1.50mmol、2.00当量）および144mgの炭酸水素ナトリウム（2.25mmol、3.00当量）の溶液を滴加し、室温で終夜撹拌した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（10％MeOH、0.5％ギ酸/CH2Cl2）で精製した。化合物を無色油状物として単離した（312mg、0.74mmol、99.0％）。
2019532041.tif 000274
【０２８９】
N-(4-アジドベンゾイル)-L-バリン-L-シトルリン-4-アミノベンジルアルコール
2019532041.tif 000275
50-ml丸底フラスコ中、330mgのN-(4-アジドベンゾイル)-L-バイン（vaine）-L-シトルリン（0.787mmol、1.0当量）および107mgの4-アミノベンジルアルコール（0.866mmol、1.10当量）を8mlのCH2Cl2および4mlのMeOH（メタノール）にアルゴン雰囲気下で溶解し、0℃に冷却した。390mgのN-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキノリン（1.574mmol、2.00当量）を分割して加え、得られた溶液を室温に戻して終夜反応させた。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（10％〜15％MeOH/CH2Cl2）により単離して、白色固体で得た（164mg、0.313mmol、39.8％）。鏡像異性的に純粋な化合物を分取HPLC（「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法D）により単離し、凍結乾燥後に白色固体で得た。
2019532041.tif 000276
【０２９０】
N-(4-(O-エチル-P-エチニル-ホスホンアミダト-N-ベンゾイル)-L-バリン-L-シトルリン-4-アミノベンジルアルコール
2019532041.tif 000277
化合物を、一般手順に従い、230μlのクロロ亜リン酸ジエチル（0.925mmol、5.0当量）、1.85mlの臭化エチニルマグネシウム（THF中0.5M、0.925mmol、5.0当量）および97mgのN-(4-アジドベンゾイル)-L-バリン-L-シトルリン-4-アミノベンジルアルコール（0.185mmol、1.0当量）から合成した。粗製ホスホンアミデートを分取HPLC（「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法C）により単離し、凍結乾燥後に白色固体で得た。（60mg、0.098mmol、52.9％）。
2019532041.tif 000278
【０２９１】
N-(4-(O-エチル-P-エチニル-ホスホンアミダト-N-ベンゾイル)-L-バリン-L-シトルリン-4-アミノベンジル-4-ニトロフェニルカーボネート
2019532041.tif 000279
5-ml丸底フラスコに31mgのN-(4-(O-エチル-P-エチニル-ホスホンアミダト-N-ベンゾイル)-L-バリン-L-シトルリン-4-アミノベンジルアルコール（0.050mmol、1.00当量）および31mgのビス(4-ニトロフェニル)カーボネート（0.101mmol、2.00当量）を加えた。固体を140μlのDMF（N,N-ジメチルホルムアミド）に溶解し、17.4μlのDIPEA（N,N-ジイソプロピルエチルアミン、0.101mmol、2.00当量）を加えた。黄色溶液を室温で1時間撹拌し、溶液を30mlの氷冷ジエチルエーテルに加えた。沈澱を遠心沈降により回収し、DMFに再溶解し、再度エーテルで沈澱させた。手順を合計3回行い、最後に固体を高真空条件下で乾燥した。化合物を定量的収率および次の段階のために十分な純度で単離した。分析的に純粋な材料を分取HPLCにより、「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法Cを用いて精製した。
2019532041.tif 000280
【０２９２】
アミデート-Val-Cit-Pab-MMAF
2019532041.tif 000281
15-mLファルコンチューブに14.35mgのN-(4-(O-エチル-P-エチニル-ホスホンアミダト-N-ベンゾイル)-L-バリン-L-シトルリン-4-アミノベンジル-4-ニトロフェニルカーボネート（0.0184mmol、1.00当量）、0.50mgの1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（0.0037mmol、0.20当量）および13.15mgのMMAF（モノメチルオーリスタチンF、0.0184mmol、1.00当量）を加えた。固体を250mlの無水DMFおよび25mlのピリジンに溶解し、60℃で終夜加熱した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗生成物を半分取HPLCにより、「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法Eを用いて精製し、所望の化合物を凍結乾燥後に白色固体として得た。（4.84mg、0.0035mmol、19.2％）。HR-MS for C69H104N11O16P2+ [M+2H]2+ calcd：686.8695、found 686.8694。
【０２９３】
図19は、ホスホンアミデート-Val-Cit-Pab-MMAFのUPLC-UV純度を示す。
【０２９４】
トラスツズマブ生成
トラスツズマブ発現および精製を、GEからのSuperdex 200 Increase 10/300上、リン酸緩衝化食塩水（PBS）および流速0.75ml/分でのゲルろ過による最終精製を追加して、以前に発表したとおりに実施した（30）。
【０２９５】
トラスツズマブの還元/アルキル化プロトコルによる修飾のための一般手順
2019532041.tif 000282
トラスツズマブ修飾を、新しく発現した抗体（c＝0.55mg/ml）を全体積80μlのPBS中に50mMホウ酸ナトリウムおよび4mM DTTを含む緩衝液（pH8.0）中、37℃で40分間インキュベートすることにより実施した。その後、過剰のDTT除去ならびに50mM NH4HCO3および1mM EDTA含有溶液（pH8.5）への緩衝液交換を、7K MWCOのZeba(商標) Spin Desalting Columns（Thermo Fisher Scientific, Waltham, United States）0.5mLを用いて行った。DMSO中に13mMアミデートを含む溶液1.60μlを急速に加えた。混合物を800rpm、14℃で16時間撹拌した。過剰のアミデートを再度、7K MWCOのZeba(商標) Spin Desalting Columns 0.5mLを用いての滅菌PBSへの緩衝液交換により除去した。
【０２９６】
細胞抗増殖検定
抗増殖検定を、以下のわずかな変更を加え、以前に報告したとおりに実施した（30）：
− 100μLの培地を加えた96穴光学細胞培養プレートの各ウェルに、少量の2×103個のMDAMB468細胞を播種した。
− 20×高NA対物レンズを備えたOperetta High-Content Imaging system（PerkinElmer, Waltham, MA, USA）で画像を取得した。
− 細胞数を二つ組の試験から計算した。
【０２９７】
抗体フルオロフォアコンジュゲート（AFC）生成のためのアルキニルホスホニトによるシュタウディンガー誘導チオール付加
同様の様式で、「抗体薬物コンジュゲート（ADC）生成のためのアルキニルホスホニトによるシュタウディンガー誘導チオール付加」において前述したとおり、蛍光色素Cy5をトラスツズマブにコンジュゲートして、抗体-フルオロフォアコンジュゲートを生成した。Cy5-O-エチル-P-アルキニル-ホスホンアミデートの合成を、「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入」において前述したとおりに実施した。得られたホスホンアミデート-AFCコンジュゲートを、2つの異なるHer2過剰発現細胞株BT474およびSKBR3の免疫染色により評価した。Her2選択性を試験するために、対照としてHer2非過剰発現細胞株MDAMB468を用いた。細胞固定後の十分な膜染色が2つのHer2発現細胞株で観察されたが、Her2非発現細胞株は蛍光増大を示さなかった。
【０２９８】
図20：示すのは、細胞表面受容体Her2を過剰発現する（BT474およびSKBR3）または低いHer2発現レベルを示す（MDAMB468）固定細胞の免疫染色である。AFCトラスツズマブ-アミデート-Cy5は、Her2+細胞株では形質膜への明らかな局在化を示し、Her2-細胞では染色は見られない。マージした画像はDAPIシグナルを青で、Tras-ホスホンアミデート-Cy5シグナルを赤で示す。スケールバーは10μmを表す。
【０２９９】
抗体フルオロフォアコンジュゲート（AFC）生成のためのアルキニルホスホニトによるシュタウディンガー誘導チオール付加の手順
2019532041.tif 000283
トラスツズマブ-Cy5コンジュゲートを、以下のわずかな変更を加え、「抗体薬物コンジュゲート（ADC）生成のためのアルキニルホスホニトによるシュタウディンガー誘導チオール付加」において前述した、一般手順に従って合成した：アミデートの当量を130に上げ、DMSO（ジメチルスルホキシド）含有量を5％（より正確には、2％から5％）に上げて、Cy5を可溶化した。
【０３００】
AFC撮像手順：
BT474、SKBR3およびMDAMB468を滅菌カバーストリップに播種し、細胞接着のために37℃、5％CO2で終夜インキュベートした。細胞を1×PBSで3回洗浄した後、1×PBS/4％PFA（ホルムアルデヒド）中で10分間固定した。固定を等量の1×PBST（PBS＋0.05％トゥイーン20）の添加により停止し、続いてPBSTでさらに2回洗浄した。AFCを最終濃度5μg/mLまで加え、室温で1時間インキュベートした。非結合AFCを、PBSで3回洗浄して除去した。
【０３０１】
画像を、63×1.40油浸レンズを備えたLeica SP5共焦点顕微鏡システム上で取得した。レーザーライン405nmおよび594nmを、標準DAPIおよびCy5フィルター設定と組み合わせて用いた。画像処理を、Fiji処理パッケージにより拡張したImageJ 1.5.1hソフトウェアで実施した。
【０３０２】
ホスホンアミデート連結の安定性試験
細胞溶解物または血清のような複雑な系におけるホスホンアミデート結合の安定性を試験するために、ホスホンアミデート結合の切断後に蛍光シグナルを生成する色素-クエンチャーの対を合成した。コンジュゲートは蛍光色素EDANS、クエンチャーDABCYLおよびコンジュゲートの水溶性を確実にするための連結ペプチドからなる(図21）。マレイミド連結コンジュゲートを比較実験のために合成した(図21B）。
【０３０３】
図21：A：ホスホンアミデート連結FRETコンジュゲートの構造。B：マレイミド連結FRETコンジュゲートの構造C：蛍光-クエンチャーに基づく読み出しの原理。コンジュゲートを10μMの濃度で室温でインキュベートした。測定を96穴プレートで少なくとも三つ組で実施した。D：蛍光増大を経時的にモニターした。HCl試料は測定前に中和した。溶解物をHeLa-細胞から、PBS中で溶解して新しく調製した。血清はヒト血液由来であった。E：PBS中1000等量のグルタチオンへの曝露中の、ホスホンアミデート-およびマレイミド-連結色素-クエンチャー対の比較
【０３０４】
図21に示すとおり、ホスホンアミデート付加物はPBS、HeLa細胞溶解物およびヒト血清中で高い安定性を示すが、強酸性条件（1N HCl）だけはホスホンアミデート結合切断を引き起こす。FRET-コンジュゲートを大過剰のグルタチオンにも曝露した。1000当量のグルタチオンと生理的pHで2日間インキュベートした後、15％のマレイミド連結が切断されたが、ホスホンアミデート付加物の99％は以前としてインタクトであった（図21C）。
【０３０５】
次の実験において、ADCの数日間の安定性は血流における循環中に重要であるため、発明者らは、ホスホンアミデート標識またはマレイミド標識ADCの修飾要素がチオール存在下で血清タンパク質に移行するかどうかを調べた。異なるビオチン誘導体で修飾したトラスツズマブ（図22）を0.5mMの血清様アルブミン濃度に曝露し、37℃でインキュベートし、抗体から血清タンパク質への修飾の移行をウェスタンブロッティングによりモニターした（図22B）。ビオチンの血清濃度でのBSA（ウシ血清アルブミン）への顕著な移行が、マレイミド連結で観察されたが、ホスホンアミデート連結は試験した条件下で安定であった。まとめると、これらの安定性実験は、マレイミド標識ADCに比べてホスホンアミデート標識ADCのすぐれた安定性を明らかに示し、おそらくは通常のマレイミド連結コンジュゲートに比べて非特異的毒性の低減につながる。
【０３０６】
図22：抗体修飾の血清タンパク質への移行。A：トラスツズマブ-ビオチンコンジュゲートを3μMの濃度で、PBS中500μM BSAと共に37℃でインキュベートした。B：ビオチンのアルブミンへの移行を、ウェスタンブロット分析によりモニターした。レーン1：未処理マレイミドコンジュゲート。レーン2〜5：BSA曝露マレイミド付加物の0、1、2および5日後の分析。レーン6：未処理アミデートコンジュゲート。レーン6〜10：BSA曝露アミデート付加物の0、1、2および5日後の分析。
【０３０７】
ホスホンアミデート連結の安定性試験の手順
DABCYl-Cysペプチド
2019532041.tif 000284
DABCYl-Cysペプチドを、手動カップリングによる直線的合成で標準的なFmoc化学により合成した。0.1mmolのRinkアミド樹脂（subst：0.4mmol/g）を反応容器に加え、合成を5倍のアミノ酸過剰で実施した。Fmoc脱保護を、DMF中20％ピペリジンで5分間の樹脂処理を2回行うことにより達成した。カップリングをDMF中HOBt/HBTU/DIPEA（5当量/5当量/10当量）を加えて45分間反応させることにより達成した。最終Cysカップリングの後、DMF中で5当量のDABCYL酸を5当量のHATUおよび10当量のDIPEAと45分間カップリングした。ペプチドを樹脂から、TFA/DTT/TIS（95/2.5/2.5、重量比）の添加により3時間以内に切断した。その後、ペプチドを氷冷ジエチルエーテルを加えて沈澱させた。沈澱を遠心沈降により回収し、乾燥し、分取HPLC（「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法C）により精製した。ペプチドを赤色固体として35.8％の収率で得た（38.2mg、35.8μmol）。ESI-MS for C48H66N12O14S+ [M+2H]+ calcd: 533.23, found 533.34。
【０３０８】
DABCYl-CysペプチドホスホンアミデートEDANS付加物
2019532041.tif 000285
1.5-mlエッペンドルフチューブに50mM NH4HCO3、pH8.5中のDABCYl-Cysペプチド（20mM）の溶液263μlを加えた。158μlの50mM NH4HCO3、pH8.5および105μlのDMF中のEDANSアミデートの溶液（100mM）を加えて、最終濃度を20％DMF/緩衝液中20mMペプチドおよび10mMアミデートとした。チューブを800rpm、室温で3時間振盪した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗生成物を半分取HPLC（「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法E）により精製した。ペプチドを赤色固体として得た。ESI-MS for C71H90N15O20PS2+ [M+2H]+ calcd:783.78, found 784.47。
【０３０９】
DABCYl-CysペプチドマレイミドEDANS付加物
2019532041.tif 000286
1.5-mlエッペンドルフチューブにPBS中のDABCYl-Cysペプチド（20mM）の溶液188μlを加えた。DMF中のEDANSマレイミド（40mM)の溶液188μlを加えて、最終濃度を50％DMF/緩衝液中10mMペプチドおよび20mMマレイミドとした。チューブを800rpm、室温で3時間振盪した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗生成物を半分取HPLC（「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法E）により精製した。ペプチドを赤色固体として得た。ESI-MS for C66H83N15O20S2+ [M+2H]+ calcd 734.77:, found. 734.79
【０３１０】
Dabcyl-EDANS付加物の安定性実験
安定性試験を96穴プレート（Corning 3615、黒色、透明平底）で、少なくとも三つ組で行った。Dabcyl-EDANS付加物の200μM保存溶液5μlおよびそれぞれの試験溶液95μlを各ウェルに加えた。
【０３１１】
HeLa細胞溶解物を、400μlのPBS中で超音波処理により溶解した約1×107細胞から生成した。細胞を75cm2細胞培養プレート上で成長させ、PBSで2回洗浄し、細胞スクレーパーで回収した。ヒト血清はSigma Aldrichから購入した。グルタチオンをPBS中10mMの濃度で溶解し、pHを7.4に調節した。1N HCl試験を200μMで実施し、pH7に中和し、10μMに希釈した後、蛍光測定を行った。
【０３１２】
蛍光をTecan Safireプレートリーダーで測定した。励起：336nm、発光：490nm、バンド幅：5nm、20℃。
【０３１３】
トラスツズマブ-ビオチンコンジュゲートのBSAとのインキュベーション
トラスツズマブ-ビオチンコンジュゲートをPBS中3μMの濃度で、最終濃度0.5mMのBSAと共に37℃でインキュベートした。試料を0、1、2および5日後に採取し、液体窒素中で急速冷凍し、最終的にSDS/Pageおよびウェスタンブロット分析にかけた。
【０３１４】
チオール付加のさらなる動力学的調査
低濃度でのアルキン-ホスホンアミデートへのチオール付加の動力学を試験するために、蛍光EDANS系ホスホンアミデートを、1.1.章に記載の通りに合成した。モデル基質としてのグルタチオンの付加を、蛍光HPLCにより経時的に調べた。ピークの積分および内部標準としてのコンジュゲートされていないEDANSに対する正規化を適用して、反応の二次速度定数をもとめた。測定された二次速度定数は37.32±0.41 l/mol・sであった。
【０３１５】
図23：チオール付加の二次速度定数の決定。A： EDANSホスホンアミデートのグルタチオンとの反応。B：30分の反応時間後の蛍光HPLCトレース。C：ホスホンアミデートの経時的低減のモニタリング。D：反応時間に対する濃度の逆数のプロット。誤差バーは3回の反復実験の平均を表す（n＝3）。
【０３１６】
チオール付加のさらなる動力学的調査の手順
EDANS-ホスホンアミデートへのグルタチオン付加を、pH8.5で1mM EDTAおよび1％DMFを含む50mM NH4HCO3緩衝液中、0.1mMアミデート、0.1mMグルタチオンおよび内部標準としての0.02mM EDANSの最終濃度で実施した。DMF中EDANS-ホスホンアミデートの20mM保存溶液2.5μlを、緩衝液488μlならびにDMFおよび緩衝液1：1混合物中のEDANSの2mM保存溶液5μlとあらかじめ混合した。緩衝液中グルタチオンの10mM溶液5μlを加えることによって反応を開始した。試料10μlを0、15、30、60、120、240および480分の時点で採取し、10mM NaOAc緩衝液（pH5.0）190μlで酸性化し、蛍光HPLC分析にかけた。
【０３１７】
さらなるホスホニトの合成
さらに、アルキンホスホニトのO-置換基はスキームE2に示すとおり多様で、電子豊富ホスホニトE1〜E5を合成した：
【０３１８】
スキーム28：ビス-(ジイスプロピル（diispropyl）)-アミノ-クロロ-ホスホニトからのホスホニト合成。示すのはそれぞれのホスホニトE1〜E5の単離収率である。
2019532041.tif 000287
【０３１９】
さらなるホスホニトE1〜E5合成の手順
ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホンアミデート合成のための一般手順
2019532041.tif 000288
25-mlシュレンク管に267mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン（1.00mmol、1.00当量）をアルゴン雰囲気下で加え、0℃に冷却し、2.20mlの臭化エチニルマグネシウム溶液（THF中0.5M、1.10mmol、1.10当量）を滴加した。帯黄色溶液を室温に戻し、さらに30分間撹拌した。5.56mlの1H-テトラゾール溶液（MeCN中0.45M、2.50mmol）に溶解したそれぞれのアルコールを加え、白色懸濁液を室温で終夜撹拌した。反応混合物をシリカゲルフラッシュカラムに直接載せた。
【０３２０】
ジ-(2-(2-ヒドロキシエトキシ)エチル)エチニルホスホニト（化合物E1）
2019532041.tif 000289
化合物を、前記「ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホンアミデート合成のための一般手順」に従い、267mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン（1.00mmol、1.00当量）、2.20mlの臭化エチニルマグネシウム溶液（THF中0.5M、1.10mmol、1.10当量）、1.06gの2-(2-ヒドロキシエトキシ)エタン-1-オール（10.00mmol、10.00当量）、5.56mlの1H-テトラゾール溶液（MeCN中0.45M、2.50mmol）から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（5％MeOH/CH2Cl2）で精製した。化合物を帯黄色油状物で得た。（112mg、0.421mmol、42.1％）。
2019532041.tif 000290
【０３２１】
ジ-(3-ブチニル)エチニルホスホニト（化合物E2）
2019532041.tif 000291
化合物を、前記「ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホンアミデート合成のための一般手順」に従い、267mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン（1.00mmol、1.00当量）、2.20mlの臭化エチニルマグネシウム溶液（THF中0.5M、1.10mmol、1.10当量）、189μlの3-ブチン-1-オール（2.50mmol、2.50当量）、5.56mlの1H-テトラゾール溶液（MeCN中0.45M、2.50mmol）から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（10％EtOAc/n-ヘキサン）で精製した。化合物を無色油状物で得た。（152mg、0.774mmol、77.4％）。
2019532041.tif 000292
【０３２２】
化合物E3、E4およびE5の合成の手順を、本明細書において以下に「O-置換基上に切断可能な基を有する化合物合成のための手順」で提供する。
【０３２３】
ホスホニトE1およびE2とのシュタウディンガー-ホスホニト反応
電子豊富ホスホニトの非常に安定な性質を、水性溶媒中でアルキン-ホスホニトとのシュタウディンガー-ホスホニト反応を実施することにより、さらに活用した。図24に示すとおり、純粋な水性系においてアルキンホスホニトE1から所望の生成物の生成が観察された。
【０３２４】
図24：トリス緩衝液中でのアジド修飾ペプチドの水溶性ホスホニトE1との反応。A：反応スキーム。B：HPLC-トレース；橙：出発原料；青：2時間後の反応。
【０３２５】
ホスホニトE1およびE2とのシュタウディンガー-ホスホニト反応
ペプチドE9
ペプチドE9を、手動カップリングによる直線的合成で標準的なFmoc化学により合成した。0.1mmolのRinkアミド樹脂（subst：0.4mmol/g）を反応容器に加え、合成を5倍のアミノ酸過剰で実施した。Fmoc脱保護を、DMF中20％ピペリジンで5分間の樹脂処理を2回行うことにより達成した。カップリングをDMF中HOBt/HBTU/DIPEA（5当量/5当量/10当量）を加えて45分間反応させることにより達成した。最終Glyカップリングの後、DMF中で5当量の4-アジド安息香酸を5当量のHATUおよび10当量のDIPEAと45分間カップリングした。ペプチドを樹脂から、TFA/TIS/H2O（95/2.5/2.5、重量比）の添加により3時間以内に切断した。その後、ペプチドを氷冷ジエチルエーテルを加えて沈澱させた。沈澱を遠心沈降により回収し、乾燥し、分取HPLC（「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法C）により精製した。ESI-MS for C37H50N11O13+ [M+H]+ calcd: 856.36, found 856.36。
【０３２６】
塩基性トリス緩衝液中でのペプチドE9のアミデートE1とのシュタウディンガー-ホスホニト反応
100mMトリス-緩衝液（pH9.0）中のペプチドE9の50mM保存溶液10μlを、100mMトリス-緩衝液（pH9.0）80μlに加えた。同じ緩衝液中の500mMホスホニトE1の溶液10μlを加え、800RPM、37℃で2時間振盪した。試料10μlを採取し、90μlのH2O中1％TFAで希釈し、UPLC-MS分析にかけた。
【０３２７】
E6の合成
2019532041.tif 000293
一般手順：5mlのDMF中、1.00mmolの有機アジド（1.00当量）を1.00mmolのアルキニルホスホニト（1.00当量）と共に終夜撹拌した。有機溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカのカラムクロマトグラフィで精製した。この一般手順の後、37mgのジ-(3-ブチニル)エチニルホスホニト（化合物E2）（0.192mmol、1.00当量）および50mgの4-アジド安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（0.162mmol、1.00当量） を1mlのDMF中で混合し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（70％EtOAc/ヘキサン）で精製した。化合物を無色油状物で得た。（55mg、0.147mmol、76.6％）。
2019532041.tif 000294
【０３２８】
O-置換基上に切断可能な基を有する化合物の合成および切断実験
O-置換基上の切断可能な基の導入
切断可能なジスルフィドを用いて、還元条件下で特定のペイロードを遊離し得ることが以前に記載されている。例えば、このアプローチは、細胞環境内での抗体薬物コンジュゲート（ADC）からの細胞毒性ペイロードの特異的遊離に適用されている（31）。この状況において、ベータ位に脱離基を有するジスルフィドはジスルフィド切断後にチイランへの環化を起こし、所与のペイロードを遊離することを示すことができよう（32）。
【０３２９】
本発明のために、スキーム29に示す、切断可能ジスルフィド含有O-置換基を有するコンジュゲートの合成が想定された。
【０３３０】
スキーム29：切断可能ジスルフィド含有O-置換基を有するコンジュゲートのシュタウディンガー-ホスホニト反応による合成
2019532041.tif 000295
O-置換基上に切断可能な基Rを有する以下の化合物を合成し、切断実験にかけた：
2019532041.tif 000296
式中、Rは
2019532041.tif 000297
である。
【０３３１】
O-置換基上に切断可能な基を有する化合物合成のための手順
2-ヒドロキシエチルジスルフィド合成のための一般手順1
2019532041.tif 000298
250ml丸底フラスコに10mmol（1.00当量）のそれぞれのチオール、10mmolの2-メルカプトエタノール（1.00当量）、0.1mmolのヨウ化ナトリウムおよび20mlのEtOAcを加えた。混合物を急速に撹拌し、10mmolの水中30％H2O2溶液を滴加した。混合物を室温で1時間撹拌し、揮発性物質を減圧下で除去し、ジスルフィドをカラムクロマトグラフィで単離した。
【０３３２】
2-ヒドロキシエチルエチルジスルフィド
2019532041.tif 000299
化合物を、前記「2-ヒドロキシエチルジスルフィド合成のための一般手順1」に従い、2.00mlのエタンチオール（27.74mmol、1.00当量）、1.96mlの2-メルカプトエタノール（27.74mmol、1.00当量）、41mgのヨウ化ナトリウム（0.28mmol、0.01当量）および3.14mlの過酸化水素溶液（水性、30％）（27.74mmol、1.00当量）から合成した。ジスルフィドをシリカのカラムクロマトグラフィ（20％EtOAc/ヘキサン）により無色油状物として単離した。収率：2.15g（15.53mmol、56.0％）。
2019532041.tif 000300
【０３３３】
2-ヒドロキシエチルイソプロピルジスルフィド
2019532041.tif 000301
化合物を、前記「2-ヒドロキシエチルジスルフィド合成のための一般手順1」に従い、2.00mlのイソプロピルチオール（21.53mmol、1.00当量）、1.52mlの2-メルカプトエタノール（21.53mmol、1.00当量）、32mgのヨウ化ナトリウム（0.21mmol、0.01当量）および2.44mlの過酸化水素溶液（水性、30％）（21.53mmol、1.00当量）から合成した。ジスルフィドをシリカのカラムクロマトグラフィ（10％EtOAc/ヘキサン）により無色油状物として単離した。収率：1.10g（7.22mmol、33.6％）。
2019532041.tif 000302
【０３３４】
2-ヒドロキシエチルtert-ブチルジスルフィド
2019532041.tif 000303
化合物を、前記「2-ヒドロキシエチルジスルフィド合成のための一般手順1」に従い、2.00mlのtert-ブチルチオール（17.74mmol、1.00当量）、1.24mlの2-メルカプトエタノール（17.74mmol、1.00当量）、26mgのヨウ化ナトリウム（0.18mmol、0.01当量）および2.04mlの過酸化水素溶液（水性、30％）（17.74mmol、1.00当量）から合成した。ジスルフィドをシリカのカラムクロマトグラフィ（10％EtOAc/ヘキサン）により無色油状物として単離した。収率：0.90g（5.41mmol、30.5％）。
2019532041.tif 000304
NMRデータは文献値に一致していた（33）。
【０３３５】
2-(3-ヒドロキシプロピル)イソプロピルジスルフィド
2019532041.tif 000305
500-ml丸底フラスコに2.00mlのチオール酢酸（23.55mmol、1.00当量）および150mlの無水THFを加えた。0℃で、1.60gの水素化アルミニウムリチウム（47.10、2.0当量）を分割して加えた。混合物を室温で1時間撹拌し、再度0℃に冷却し、6N HClで注意深く反応停止した。水相を100mlのEtOAcで2回抽出し、有機分画を集め、乾燥（MgSO4）し、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。得られた無色油状物を20mlのEtOHに再溶解し、2.18mlのイソブチルチオール（23.55mmol、1.00当量）、55mgのヨウ化ナトリウム（0.24mmol、0.01当量）および2.70mlの過酸化水素溶液（水性、30％）（23.55mmol、1.00当量）を加えた。帯黄色溶液をさらに1時間撹拌した。揮発性物質を減圧下で除去し、前記ジスルフィドをシリカのカラムクロマトグラフィ（20％EtOAc/ヘキサン）により無色油状物として単離した。収率：1.15g（6. 928mmol、29.4％）。
2019532041.tif 000306
【０３３６】
1-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-2-フェニルジアゼン
2019532041.tif 000307
化合物を以前に発表された手順に従って合成し、橙色固体として単離した（34）。
1H NMR (300 MHz, クロロホルム-d) δ = 8.03 - 7.86 (m, 4H), 7.68 - 7.42 (m, 5H), 4.81 (s, 2H)。NMRデータは文献値に一致していた（34）。
【０３３７】
ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホニト合成のための一般手順2
2019532041.tif 000308
25-mlシュレンク管に267mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン（1.00mmol、1.00当量）をアルゴン雰囲気下で加え、0℃に冷却し、2.20mlの臭化エチニルマグネシウム溶液（THF中0.5M、1.10mmol、1.10当量）を滴加した。帯黄色溶液を室温に戻し、さらに30分間撹拌した。5.56mlの1H-テトラゾール溶液（MeCN中0.45M、2.50mmol）に溶解したそれぞれのアルコールを加え、白色懸濁液を室温で終夜撹拌した。反応混合物をシリカゲルフラッシュカラムに直接載せた。
【０３３８】
ジ-(エチルジスルフィド)エチル)エチニルホスホニト
2019532041.tif 000309
化合物を、前記「ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホニト合成のための一般手順2」に従い、116mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン（0.44mmol、1.00当量）、0.96mlの臭化エチニルマグネシウム溶液（THF中0.5M、0.48mmol、1.10当量）、150mgの2-ヒドロキシエチルエチルジスルフィド（1.10mmol、2.50当量）、2.42mlの1H-テトラゾール溶液（MeCN中0.45M、1.10mmol、2.50当量）から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（10％〜20％EtOAc/ヘキサン）で精製した。化合物を帯黄色油状物で得た。（112mg、0.34mmol、77.0％）。
2019532041.tif 000310
【０３３９】
ジ-(2-イソプロピルジスルフィド)エチル)エチニルホスホニト
2019532041.tif 000311
化合物を、前記「ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホニト合成のための一般手順2」に従い、213mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン（0.80mmol、1.00当量）、1.76mlの臭化エチニルマグネシウム溶液（THF中0.5M、0.88mmol、1.10当量）、370mgの2-ヒドロキシエチルイソプロピルジスルフィド（2.00mmol、2.50当量）、4.44mlの1H-テトラゾール溶液（MeCN中0.45M、2.00mmol、2.50当量）から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（10％EtOAc/ヘキサン）で精製した。化合物を帯黄色油状物で得た。（183mg、0.51mmol、63.9％）。
2019532041.tif 000312
【０３４０】
ジ-(2-tert-ブチルジスルフィド)エチル)エチニルホスホニト
2019532041.tif 000313
化合物を、前記「ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホニト合成のための一般手順2」に従い、167mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン（0.63mmol、1.00当量）、1.38mlの臭化エチニルマグネシウム溶液（THF中0.5M、0.69mmol、1.10当量）、260mgの2-ヒドロキシエチルtert-ブチルジスルフィド（1.57mmol、2.50当量）、3.48mlの1H-テトラゾール溶液（MeCN中0.45M、1.57mmol、2.50当量）から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（10％EtOAc/ヘキサン）で精製した。化合物を帯黄色油状物で得た。（190mg、0.49mmol、78.5％）。
2019532041.tif 000314
【０３４１】
ジ-((2-イソプロピルジスルフィド)-3-プロピル)エチニルホスホニト
2019532041.tif 000315
化合物を、前記「ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホニト合成のための一般手順2」に従い、267mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン（1.00mmol、1.00当量）、2.20mlの臭化エチニルマグネシウム溶液（THF中0.5M、1.10mmol、1.10当量）、415mgの2-(3-ヒドロキシプロピル)イソプロピルジスルフィド（2.50mmol、2.50当量）、5.55mlの1H-テトラゾール溶液（MeCN中0.45M、2.50mmol、2.50当量）から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（0〜10％EtOAc/ヘキサン）で精製した。化合物をジアステレオマー混合物として帯黄色油状物で得た。（91mg、0.235mmol、23.5％）。
2019532041.tif 000316
【０３４２】
ジ-(4-アセトキシベンジル)エチニルホスホニト
2019532041.tif 000317
化合物を、前記「ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホニト合成のための一般手順2」に従い、267mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン（1.00mmol、1.00当量）、2.20mlの臭化エチニルマグネシウム溶液（THF中0.5M、1.10mmol、1.10当量）、415mgの2-(3-ヒドロキシプロピル)イソプロピルジスルフィド（2.50mmol、2.50当量）、5.55mlの1H-テトラゾール溶液（MeCN中0.45M、2.50mmol、2.50当量）から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（30％EtOAc/ヘキサン）で精製した。化合物を無色油状物で得た。（118mg、0.306mmol、30.6％）。
2019532041.tif 000318
【０３４３】
ジ(4-(ジアゾフェニル)-ベンジル)エチニルホスホニト
2019532041.tif 000319
化合物を、前記「ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィンからのO-置換アルキニルホスホニト合成のための一般手順2」に従い、98mgのビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン（0.37mmol、1.00当量）、0.80mlの臭化エチニルマグネシウム溶液（THF中0.5M、0.4mmol、1.10当量）、195mgの1-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-2-フェニルジアゼン（0.93mmol、2.50当量）、2.00mlの1H-テトラゾール溶液（MeCN中0.45M、0.93mmol、2.50当量）から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（0〜10％EtOAc/ヘキサン）で精製した。化合物を橙色固体で得た。（82mg、0.171mmol、46.3％）。
2019532041.tif 000320
【０３４４】
アルキニルホスホニトおよびアジドからのO-置換アルキニルホスホンアミデート合成のための一般手順3
2019532041.tif 000321
1.00mmolの有機アジド（1.00当量）を1.00mmolのアルキニルホスホニト（1.00当量）と共に5mlのDMF中で終夜撹拌した。有機溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカのカラムクロマトグラフィで精製した。
【０３４５】
2-イソプロピル-ジスルフィド-エチル-N-(4-安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)-P-エチニルホスホンアミデート
2019532041.tif 000322
化合物を、前記「アルキニルホスホニトおよびアジドからのO-置換アルキニルホスホンアミデート合成のための一般手順3」に従い、147mgのジ-(2-イソプロピルジスルフィド)エチル)エチニルホスホニト（0.411mmol、1.00当量）および106mgの4-アジド安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（0.411mmol、1.00当量）から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（60％EtOAc/ヘキサン）で精製した。化合物を無色油状物で得た。（80mg、0.175mmol、42.6％）。
2019532041.tif 000323
【０３４６】
2-tert-ブチル-ジスルフィド-エチル-N-(4-安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)-P-エチニルホスホンアミデート
2019532041.tif 000324
化合物を、前記「アルキニルホスホニトおよびアジドからのO-置換アルキニルホスホンアミデート合成のための一般手順3」に従い、50mgのジ-(2-tert-ブチルジスルフィド)エチル)エチニルホスホニト（0.129mmol、1.00当量）および33mgの4-アジド安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（0.129mmol、1.00当量）から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（70％EtOAc/ヘキサン）で精製した。化合物を無色固体で得た。（29mg、0.0638mmol、47.4％）。
2019532041.tif 000325
【０３４７】
2-イソプロピルジスルフィド-3-プロピル-N-(4-安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)-P-エチニルホスホンアミデート
2019532041.tif 000326
化合物を、前記「アルキニルホスホニトおよびアジドからのO-置換アルキニルホスホンアミデート合成のための一般手順3」に従い、61mgのジ-((2-イソプロピルジスルフィド)3-プロピル)エチニルホスホニト（0.158mmol、1.00当量）および40mgの4-アジド安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（0.158mmol、1.00当量）から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（70％EtOAc/ヘキサン）で精製した。化合物をジアステレオマーの混合物として無色油状物で得た。（32mg、0.068mmol、43.0％）。
2019532041.tif 000327
【０３４８】
4-アセトキシ-ベンジル-N-(4-安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)-P-エチニルホスホンアミデート
2019532041.tif 000328
化合物を、前記「アルキニルホスホニトおよびアジドからのO-置換アルキニルホスホンアミデート合成のための一般手順3」に従い、103mgのジ-(4-アセトキシベンジル)エチニルホスホニト（0.267mmol、1.00当量）および69mgの4-アジド安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（0.267mmol、1.00当量）から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（70％EtOAc/ヘキサン）で精製した。化合物を無色油状物で得た。（36mg、0.077mmol、28.7％）。
2019532041.tif 000329
【０３４９】
4-ジアゾフェニル-ベンジル-N-(4-安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)-P-エチニルホスホンアミデート
2019532041.tif 000330
化合物を、前記「アルキニルホスホニトおよびアジドからのO-置換アルキニルホスホンアミデート合成のための一般手順3」に従い、71mgのジ(4-(ジアゾフェニル)-ベンジル)エチニルホスホニト（0.148mmol、1.00当量）および39mgの4-アジド安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（0.148mmol、1.00当量）から合成し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィ（50％EtOAc/ヘキサン）で精製した。化合物を橙色固体で得た。（58mg、0.112mmol、75.8％）。
2019532041.tif 000331
【０３５０】
ホスホンアミデート-NHSエステルとEDANSとの間のアミド結合形成のための一般手順4
2019532041.tif 000332
0.1mmolのNHS-ホスホンアミデート（1.00当量）および0.12mmolの5-((2-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸ナトリウム塩（1.20当量）を10mLのDMFに溶解した。0.40mmolのDIPEA（4.0当量）を加え、混合物を室温で3時間撹拌した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗製混合物を分取HPLCにより、「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法Eを用いて精製した。
【０３５１】
5-((2-(O-(2-イソプロピル-ジスルフィド-エチル)-P-エチニル-ホスホンアミダト-N-ベンゾイル)エチル)アミノ)ナフタレン-1-スルホン酸
2019532041.tif 000333
化合物を、前記「ホスホンアミデート-NHSエステルとEDANSとの間のアミド結合形成のための一般手順4」に従い、72mgの2-イソプロピル-ジスルフィド-エチル-N-(4-安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)-P-エチニルホスホンアミデート（0.157mmol、1.00当量）、54mgの5-((2-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸ナトリウム塩（0.188mmol、1.20当量）および109μlのDIPEA（0.628mmol、4.0当量）から合成し、半分取HPLC（「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法E） により精製した。化合物を白色固体で得た。（62mg、0.102mmol、64.9％）。
2019532041.tif 000334
【０３５２】
5-((2-(O-(2-tert-ブチル-ジスルフィド-エチル)-P-エチニル-ホスホンアミダト-N-ベンゾイル)エチル)アミノ)ナフタレン-1-スルホン酸
2019532041.tif 000335
化合物を、前記「ホスホンアミデート-NHSエステルとEDANSとの間のアミド結合形成のための一般手順4」に従い、10mgの2-tert-ブチル-ジスルフィド-エチル-N-(4-安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)-P-エチニルホスホンアミデート（0.021mmol、1.00当量）、7mgの5-((2-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸ナトリウム塩（0.025mmol、1.20当量）および15μlのDIPEA（0.084mmol、4.0当量）から合成し、半分取HPLC（「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法E） により精製した。化合物を白色固体で得た。（8mg、0.013mmol、62.3％）。
2019532041.tif 000336
【０３５３】
5-((2-(O-2-イソプロピルジスルフィド-3-プロピル)-P-エチニル-ホスホンアミダト-N-ベンゾイル)エチル)アミノ)ナフタレン-1-スルホン酸
2019532041.tif 000337
化合物を、前記「ホスホンアミデート-NHSエステルとEDANSとの間のアミド結合形成のための一般手順4」に従い、29mgの2-イソプロピル-ジスルフィド-3-プロピル-N-(4-安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)-P-エチニルホスホンアミデート（0.061mmol、1.00当量）、21mgの5-((2-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸ナトリウム塩（0.073mmol、1.20当量）および42μlのDIPEA（0.244mmol、4.0当量）から合成し、半分取HPLC（「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法E） により精製した。化合物をジアステレオマーの混合物として白色固体で得た。（15mg、0.024mmol、39.5％）。
2019532041.tif 000338
【０３５４】
5-((2-(O-(4-アセトキシベンジル)-P-エチニル-ホスホンアミダト-N-ベンゾイル)エチル)アミノ)ナフタレン-1-スルホン酸
2019532041.tif 000339
化合物を、前記「ホスホンアミデート-NHSエステルとEDANSとの間のアミド結合形成のための一般手順4」に従い、36mgの4-アセトキシ-ベンジル-N-(4-安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)-P-エチニルホスホンアミデート（0.076mmol、1.00当量）、22mgの5-((2-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸ナトリウム塩（0.095mmol、1.20当量）および53μlのDIPEA（0.284mmol、4.0当量）から合成し、半分取HPLC（「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法E） により精製した。化合物を白色固体で得た。（14mg、0.023mmol、30.4％）。
2019532041.tif 000340
【０３５５】
5-((2-(O-(4-ジアゾフェニル-ベンジル)-P-エチニル-ホスホンアミダト-N-ベンゾイル)エチル)アミノ)ナフタレン-1-スルホン酸
2019532041.tif 000341
化合物を、前記「ホスホンアミデート-NHSエステルとEDANSとの間のアミド結合形成のための一般手順4」に従い、27mgの4-ジアゾフェニル-ベンジル-N-(4-安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)-P-エチニルホスホンアミデート（0.053mmol、1.00当量）、15mgの5-((2-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸ナトリウム塩（0.064mmol、1.20当量）および37μlのDIPEA（0.212mmol、4.0当量）から合成し、半分取HPLC（「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法E） により精製した。化合物を橙色固体で得た。（18mg、0.027mmol、50.9％）。
2019532041.tif 000342
【０３５６】
Cys-モデルペプチドの異なるO-置換EDANSホスホンアミデートへの付加のための一般手順5
2019532041.tif 000343
DMF中のそれぞれのEDANS-ホスホンアミデートの5mM溶液および100mM NH4HCO3-緩衝液（pH8.5）中の前記DABCYL-修飾Cys-ペプチドの5mM溶液の等しい量を新しく調製し、混合して、室温で1時間振盪した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、チオール付加物を半分取HPLC（「アルキン-ホスホンアミデート部分の一般構築ブロックによるアミド結合を介しての導入の手順」において前述した方法E） により単離した。単離したコンジュゲートを以下の表5および図25に示すとおりHPLC-MSにより分析した。
【０３５７】
（表５）
2019532041.tif 000344
2019532041.tif 000345
【０３５８】
ジスルフィド含有アミデート付加物のTCEPによる切断の手順
2019532041.tif 000346
リン酸緩衝食塩水（PBS）中のそれぞれのペプチド（SM1〜3）の1mM保存溶液10μlを、80μlのPBSとあらかじめ混合した。PBS中のトリス-(2-カルボキシエチル)-ホスフィン（TCEP）の10mM保存溶液10μlを加え、溶液を37℃で1時間振盪した。その後試料15μlを採取し、水中2％トリフルオロ酢酸（TFA）溶液15μlで希釈し、UPLC-MS分析にかけた。UPLC-MS分析を図26A〜Cに示す。赤線はTCEPとのインキュベーション、黒はPBSだけとのインキュベーションを示す。ピークをMSにより同定した。結果は、ジスルフィド含有O-置換基が切断され、EDANS含有部分が出発原料から遊離されることを示している。
【０３５９】
エステル含有アミデート付加物の細胞溶解物による切断の手順
2019532041.tif 000347
PBS中のペプチドSM4の1mM保存溶液10μlを、新しく調製したPBS中のHeLa-溶解物90μlとあらかじめ混合した。溶液を37℃で1時間振盪した。その後試料15μlを採取し、水中2％TFA溶液15μlで希釈し、UPLC-MS分析にかけた。UPLC-MS分析を図27に示す。赤線は細胞溶解物とのインキュベーション、黒はPBSだけとのインキュベーションを示す。ピークをMSにより同定した。結果は、エステル部分を含むリン上のO-置換基が切断され、EDANS含有部分が出発原料から遊離されることを示している。
【０３６０】
ジアゾ含有アミデート付加物の亜ジチオン酸ナトリウムによる手順
2019532041.tif 000348
PBS中のペプチドSM5の1mM保存溶液10μlを、80μlのPBSとあらかじめ混合した。PBS中のTCEPの200mM保存溶液10μlを加え、溶液を37℃で1時間振盪した。その後試料15μlを採取し、水中2％TFA溶液15μlで希釈し、UPLC-MS分析にかけた。UPLC-MS分析を図28に示す。赤線はTCEPとのインキュベーション、黒はPBSだけとのインキュベーションを示す。ピークをMSにより同定した。結果は、ジアゾ部分を含むリン上のO-置換基が切断され、EDANS含有部分が出発原料から遊離されることを示している。
【０３６１】
したがって、リン上のO置換基として様々な切断可能な基を有するアミデートの切断が可能であることが判明した。
【０３６２】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、リン上のジスルフィド含有基について、切断のメカニズムはスキーム31に例示するとおりに、すなわち、ジスルフィドを還元的切断し、チイランへと環化して、遊離ホスホンアミド酸を生成し、これはP-N-加水分解を受けて遊離アミンとしてのペイロードを放出することにより進行すると考えられる。
【０３６３】
スキーム30：還元的切断および脱離メカニズム
2019532041.tif 000349
【０３６４】
タンパク質コンジュゲーションのためのジスルフィド置換ホスホニト
環状細胞透過性ペプチドc(Tat)をeGFPに、ジスルフィド置換ホスホニトとのシュタウディンガー誘導チオール付加によってコンジュゲートした。
【０３６５】
まず、発明者らは環状Tat-ペプチドを固相ペプチド合成（SPPS）によって合成した（スキーム32参照）。N-末端を4-アジド安息香酸でキャッピングすることにより、発明者らはアジド部分を有する化合物E11を得た。分取HPLCによる精製後、E11のジスルフィド含有アルキンホスホニトとのシュタウディンガー-ホスホニト反応をDMF中で実施して、化合物E12およびE13を得、これらを再度分取HPLCにより精製した。
【０３６６】
スキーム31：アルキン官能基化環状TatのSPPS
2019532041.tif 000350
【０３６７】
アルキン官能基化ペプチドを得て、発明者らは、図29に示すとおり、システイン含有eGFPへのチオール付加をさらに試験した。eGFP C70M S147Cは、その1つだけが利用可能な2つだけのシステインを示す変異体である。
【０３６８】
tert-ブチル-ジスルフィド置換基（E13）について、チオール付加反応はeGFPを6当量のホスホニトとPBS中、63μMのタンパク質濃度で、37℃で16時間インキュベートした後、完了した。同じ反応条件をイソプロピル-ジスルフィド置換基（E12）で適用した場合、図29に示すとおり、生成物をMALDI分析により約50％の変換で得た。
【０３６９】
図29：アルキン-c(Tat)のeGFP C70M S147Cへのチオール付加。
【０３７０】
タンパク質コンジュゲーションのためのジスルフィド置換ホスホニトの手順
c(Tat)-アジドの合成
c(Tat)を0.1mmolスケールでRinkアミド樹脂上、0.78mm/gのローディングで合成した。合成をPTI合成機により、DMF中各アミノ酸の単一カップリング（10当量アミノ酸で40分）で実施した。最終の構築ブロックカップリングの後、まだFmoc保護されたペプチドを4mlの無水DCM中、Pd(PPh3)4（24mg、20μmol、20mol％）およびフェニルシラン（308μl、2.5mmol、2.5当量）で1時間処理して、allocおよびアリル保護基を1段階で切断した。試験切断により完全な脱保護を確認した後、2当量のHATU 4当量のDIPEAによる環化をDMF中で終夜実施した。
【０３７１】
次いで、DMF中20％ピペリジンを用いてペプチドをFmoc-脱保護し、4-アジド安息香酸（81.6mg、0.5mmol、5当量）をN-末端にHATU（190.1mg、0.5mmol、5当量）およびDIPEA（170μl、1.0mmol、10当量）で1時間カップリングした。最後に、ペプチドを樹脂から4mlのTFA：TIS：H2O（95：2.5：2.5）で3時間処理することにより切断し、冷ジエチルエーテル中で沈澱させた。粗製ペプチドを分取逆相C18 HPLC（0〜5分：95/5、水（0.1％TFA）/MeCN（0.1％TFA）；5〜60分：10/90、水（0.1％TFA）/MeCN（0.1％TFA））により精製した。生成物を白色粉末で得（30.0mg、11.4μmol、収率11.4％）、分析UPLC（RP-C18カラム、0.1％TFAを含む5〜95％アセトニトリル/水）により分析した。LRMS: m/z: 648.49 [M+3H]3+ (calcd. m/z: 648.0569)。
【０３７２】
c(Tat)-ホスホンアミデートアルキンの合成：c(Tat)-アジドに対するシュタウディンガー反応
精製したc(Tat)-アジドペプチド（5mg、1.9μmol、1当量）を両方のジスルフィド置換ホスホニトと一般プロトコルに従って反応させた。粗製ペプチドを分取逆相C18 HPLCにより精製した。生成物を白色粉末で得、MALDI-TOFにより分析した。
【０３７３】
電子不足c(Tat)-ホスホンアミデートアルキンのヒドロチオール化：
GFP C70M S147Cとの反応
2019532041.tif 000351
PBS中のeGFP C70M S147C（2.7nmol、1当量）を40μlまで濃縮し、c(Tat)-ホスホンアミデートアルキン（0.05mg、16.2 nmol、6当量）を加えた。反応混合物を37℃、800rpmで終夜振盪した後、MWCOが7kDaのZebaSpinフィルターで精製した。生成物をMALDI-TOFにより分析した。ペプチドE12のコンジュゲーションについて、生成物への約50％の変換が観察されたが、これとは対照的にペプチドE13のコンジュゲーションは完全な変換を示した。
E14のMALDI TOF: 予想生成物 (単位Da): 29919 (M+H+), 14960(M+2H+); 実測 (単位Da): 29933 (M+H+), 14967 (M+2H+)
E15のMALDI TOF: 予想生成物 (単位Da): 29933 (M+H+), 14967 (M+2H+); 実測値 (単位Da): 29940 (M+H+), 14965 (M+2H+)
【０３７４】
ペプチド環化のための分子内シュタウディンガー誘導チオール付加
アジドならびにチオールの複雑な分子、例えば、ペプチドへの組み込みは、以下のスキームに示すとおり、分子内環化を実現し得る分子内シュタウディンガー誘導チオール付加の方法につながる：
2019532041.tif 000352
【０３７５】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、まずアジドが電子豊富アルキン/アルケンホスホニトと反応し、その後ホスホンアミデートが生成し、電子不足アルキン/アルケンホスホンアミデートが生成して、これはペプチド構造中のシステインと速やかな分子内チオール付加を起こすと考えられる。
【０３７６】
まず、発明者らは、標準的な固相ペプチド合成により、BCL-9のタンパク質配列から取ったペプチドを合成し、このペプチドにアミノ酸3つ離れたアジドホモアラニンおよびシステインを組み込んだ。固相からの切断および分取HPLCによる精製後に、発明者らはペプチドを得た。これにより、シュタウディンガー誘導チオール付加による分子内環化を調べることができた。
【０３７７】
発明者らは、無水DMSO中で可溶化ペプチドをジエチル-エチニルホスホニトまたはジエチル-ビニルホスホニトのいずれかと24時間反応させた。分取HPLCの後、環化ペプチドを得、これをエルマン試験によって確認した。
【０３７８】
ペプチド環化のための分子内シュタウディンガー誘導チオール付加の手順
BCL9-アジドの合成
2019532041.tif 000353
BCL9-アジドを0.1mmolスケールでRinkアミド樹脂上、0.78mm/gのローディングで合成した。合成をPTI合成機により、DMF中各アミノ酸の単一カップリング（5当量アミノ酸で40分）で実施した。最後に、ペプチドを樹脂から4mlのTFA：TIS：H2O（95：2.5：2.5）で2時間処理することにより切断し、冷ジエチルエーテル中で沈澱させた。粗製ペプチドを分取逆相C18 HPLC（0〜5分：95/5、水（0.1％TFA）/MeCN（0.1％TFA）；5〜60分：10/90、水（0.1％TFA）/MeCN（0.1％TFA））により精製した。生成物を白色粉末で得（35.0mg、11.5μmol、収率11.5％）、分析UPLC（RP-C18カラム、0.1％TFAを含む5〜95％アセトニトリル/水）により分析した。LRMS: m/z: [M+3H]3+ 759.86 (calcd. m/z: 759．6590)。
【０３７９】
分子内シュタウディンガー誘導チオール付加
アルキン-ホスホンアミデート
2019532041.tif 000354
【０３８０】
BCL9-アジドに対するシュタウディンガー反応
ペプチド1（20mg、6.55μmol、1当量）を無水DMSO（1.5ml、4.4mM）に溶解した。あらかじめ火炎乾燥したフラスコ中、高真空下で乾燥した後、ビスエトキシアルキン-ホスホニトを反応混合物に加えた（NMRにより決定した生成物のパーセンテージによる量、39.3μmol 、6当量）。反応混合物を50℃に加熱し、24時間撹拌した。水を加えた後、反応混合物を塩基性（10mM酢酸アンモニウム緩衝液pH9.0/MeCN）半分取逆相C18 Nucleodur HPLC（0〜5分：95/5、緩衝液/MeCN；5〜70分：10/90、緩衝液/MeCN）で精製し、環化生成物を白色粉末で得た（3.82mg、1.22μmol、全収率18.7％）。生成物をエルマン試験でさらに分析し、システインの97％が反応したことが判明した。最終生成物2をLC-UV：室温、5.0分（RP-C18カラムで0〜1分：95/5、水（0.1％TFA）/MeCN（0.1％TFA）；1〜16.5分： 5/95、水（0.1％TFA）/MeCN（0.1％TFA））および質量分析で分析した。LRMS: m/z: [M+3H]3+ 1049.19 (calcd. m/z: 1048.5349)。
【０３８１】
アルケン-ホスホンアミデート
2019532041.tif 000355
BCL9-アジドに対するシュタウディンガー反応
ペプチド3（34mg、11.55μmol、1当量）を無水DMSO（4ml、2.9mM）に溶解した。あらかじめ火炎乾燥したフラスコ中、高真空下で乾燥した後、ビスエトキシビニル-ホスホニトを反応混合物に加えた（NMRにより決定した生成物のパーセンテージによる量、39.3μmol 、6当量）。反応混合物を室温で24時間撹拌した。水を加えた後、反応混合物を分取逆相C18 HPLC（0〜5分：95/5、水（0.1％TFA）/MeCN（0.1％TFA）；5〜60分：10/90、水（0.1％TFA）/MeCN（0.1％TFA））で精製した。生成物を白色粉末で得（14.9mg、4.8μmol、収率41.3％）、分析UPLC（RP-C18カラム、0.1％TFAを含む5〜95％アセトニトリル/水）により分析した。LRMS: m/z: [M+4H]4+ 782.89 (calcd. m/z: 782.6660)。生成物4をエルマン試験でさらに分析し、システインの99％が反応したことが判明した。
【０３８２】
引用文献：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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