(57)【要約】  本発明は、ヘッジホッグ経路アンタゴニスト活性を持つキラル複素環式化合物、及びその製造方法、並びに応用を提供する。当該ヘッジホッグ経路アンタゴニスト活性を持つキラル複素環式化合物は、式（Ｉ）で表される構造をもつ。2019524678.tif 000073  本発明は、さらに、医薬組成物及び薬物併用組成物を提供する。本発明は、さらに、ヘッジホッグ経路シグナルを阻害する式（ＩＩ）で表される新たな分子を提供し、悪性腫瘍の治療、腫瘍再発の予防、化学放射線療法の増感、及びヘッジホッグシグナルに関連する他の疾患の治療応用を提供する。2019524678.tif 000074
2019524678.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で表される構造を有する、ヘッジホッグ経路アンタゴニスト活性を持つキラル複素環式化合物、及びその薬学的に許容される塩。
【化１】
2019524678.tif 000053
【請求項２】
請求項１に記載のヘッジホッグ経路アンタゴニスト活性を持つキラル複素環式化合物の製造方法において、化合物
【化２】
2019524678.tif 000054
のメチルチオを酸化し、また、４−ヒドロキシピペリジンで置換し、キラル複素環式化合物
【化３】
2019524678.tif 000055
を得るステップを含む、製造方法。
【請求項３】
前記化合物
【化４】
2019524678.tif 000056
は、化合物
【化５】
2019524678.tif 000057
と化合物
【化６】
2019524678.tif 000058
とのカップリング反応により調製される、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記化合物
【化７】
2019524678.tif 000059
は、(１Ｓ，２Ｓ)−(+)−Ｎ−ｐ-トルエンスルホニル−１，２−ジフェニルエチレンジアミン、ジクロロ(ｐ-メチルイソプロピルベンゼン)ルテニウム(ＩＩ)ダイマー、アミン、及びギ酸−アセトニトリル溶液を混合し、混合液を得、化合物
【化８】
2019524678.tif 000060
のアセトニトリル溶液を前記混合液と混合し、反応させ、飽和炭酸水素ナトリウムで系のｐＨを約８に調整し、抽出し、精製するステップにより調製される、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
ギ酸のアセトニトリル溶液中のギ酸の濃度は、約２．０〜約３．５ｍｍｏｌ／ｍＬであり、化合物
【化９】
2019524678.tif 000061
のアセトニトリル溶液中の化合物
【化１０】
2019524678.tif 000062
の濃度は、約０．１〜約１．０ｍｍｏｌ／ｍＬである、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載のヘッジホッグ経路アンタゴニスト活性を持つキラル複素環式化合物の、抗腫瘍薬或抗腫瘍医薬組成物の調製における応用において、前記腫瘍は、肝癌、肺癌、直腸癌、子宮頸癌、膵臓癌、乳癌、胃癌、口腔癌、食道癌、鼻咽頭癌、皮膚がん、骨がん、脳がん、腎臓癌、及び血液がんの１種又は複数種の組み合わせを含む、応用。
【請求項７】
請求項１に記載のヘッジホッグ経路アンタゴニスト活性を持つキラル複素環式化合物とその薬学的に許容される塩の少なくとも２種とを混合した組成物を含む、抗腫瘍医薬組成物。
【請求項８】
シスプラチン、パクリタキセル、カンプトテシン、トラスツズマブ、グリベック、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びラパティニブの１種又は複数種の組み合わせと請求項１に記載のヘッジホッグ経路アンタゴニスト活性を持つキラル複素環式化合物との併用を含む、抗腫瘍薬併用組成物。
【請求項９】
シスプラチン、パクリタキセル、カンプトテシン、トラスツズマブ、グリベック、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びラパティニブの１種又は複数種の組み合わせと請求項７に記載の抗腫瘍組成物との併用を含む、抗腫瘍薬併用組成物。
【請求項１０】
式（ＩＩ）で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩、立体異性体又は溶媒和物。
【化１１】
2019524678.tif 000063
（ここで、Ｘ、Ｙ及びＹ’は、独立して、Ｃ１−３アルキル基、ＣＤ３、ＣＦ３、ＣＮ、ハロゲン化物、又はＯＭｅであり、
Ｒ２及びＲ’２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−３アルキル基、ＣＤ３又はＣＦ３であり、ただし、Ｒ２及びＲ’２の少なくとも１つはＨではなく、
Ｒ１は、−ＮＲｘＲｙであり、ここで、Ｒｘ及びＲｙは、独立して、Ｈ、アルキル基、シクロアルキル基、アルキルシクロアルキル基、Ｃ(Ｏ)Ｒ”であり、或いは、−ＮＲｘＲｙは一緒になって４乃至７員複素環を形成してもよく、ここで、４乃至７員の複素環は、置換または非置換であり、
Ｒ”は、Ｃ１−５アルキル基であり、
Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４、Ｗ５、Ｗ６、Ｗ７、Ｗ８、及びＷ９は、独立して、Ｈ又はＤであり、且つ
Ａは、Ｎ又はＣＨである。）
【請求項１１】
Ｙ及びＹ’は、独立して、ＣＨ３、ＣＤ３、ＣＦ３、Ｃｌ又はＦである、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｘは、ハロゲン、ＣＦ３、ＣＤ３又はＣＨ３である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ１は
【化１２】
2019524678.tif 000064
であり、
且つ、Ｗ１０は、Ｈ又はＤである、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ’２は、Ｈ又はＤであり、且つ、Ｒ２は、Ｃ１−３アルキル基又はＣＦ３である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ’２は、Ｈ又はＤであり、且つ、Ｒ２は、ＣＨ３又はＣＤ３である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ１は、
【化１３】
2019524678.tif 000065
であり、
且つ、Ｗ１０は、Ｈ又はＤである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ａは、Ｎである、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
式（ＩＩＩ）で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩、立体異性体又は溶媒和物。
【化１４】
2019524678.tif 000066
（ここで、Ｒ２及びＲ’２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−３アルキル基、ＣＤ３、又はＣＦ３であり、ただし、Ｒ２及びＲ’２の少なくとも１つがＨではなく、
Ｒ１は、−ＮＲｘＲｙであり、ここで、Ｒｘ及びＲｙは、独立して、Ｈ、アルキル基、シクロアルキル基、アルキルシクロアルキル基、Ｃ(Ｏ)Ｒ”であり、或いは、−ＮＲｘＲｙは一緒になって４乃至７員複素環を形成してもよく、ここで、４乃至７員複素環は、置換または非置換であり、
Ｒ”は、Ｃ１−５アルキル基であり、
Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４、Ｗ５、Ｗ６、Ｗ７、Ｗ８、及びＷ９は、独立して、Ｈ又はＤであり、且つ
Ａは、Ｎ又はＣＨである。）
【請求項１９】
Ｒ１は、
【化１５】
2019524678.tif 000067
であり、
かつ、Ｗ１０は、Ｈ又はＤである、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ’２は、Ｈ又はＤであり、且つ、Ｒ２は、Ｃ１−３アルキル基又はＣＦ３である、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ’２は、Ｈ又はＤであり、且つ、Ｒ２は、ＣＨ３又はＣＤ３である、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ１は、
【化１６】
2019524678.tif 000068
であり、
且つ、Ｗ１０は、Ｈ又はＤである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
Ａは、Ｎである、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
式（ＩＶ）で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩、又は溶媒和物。
【化１７】
2019524678.tif 000069
（ここで、Ｒ２は、Ｃ１−３アルキル基、ＣＤ３或ＣＦ３、
Ｒ１は、−ＮＲｘＲｙであり、ここで、Ｒｘ及びＲｙは、独立して、Ｈ、アルキル基、シクロアルキル基、アルキルシクロアルキル基、Ｃ(Ｏ)Ｒ”であり、或いは、−ＮＲｘＲｙは一緒になって４乃至７員複素環を形成してもよく、ここで、４乃至７員複素環は、置換または非置換であり、
Ｒ”は、Ｃ１−５アルキル基であり、
Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４、Ｗ５、Ｗ６、Ｗ７、Ｗ８及びＷ９は、独立して、Ｈ又はＤである。）
【請求項２５】
Ｒ１は、
【化１８】
2019524678.tif 000070
であり、
且つ、Ｗ１０は、Ｈ又はＤである、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ２は、Ｃ１−３アルキル基又はＣＦ３である、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒ２は、ＣＨ３又はＣＤ３である、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ１は、
【化１９】
2019524678.tif 000071
であり、
且つ、Ｗ１０は、Ｈ又はＤである、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
前記化合物は、
【化２０】
2019524678.tif 000072
から選ばれる、請求項１０に記載の化合物。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の化合物と薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項３１】
有効量の、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の化合物であるヘッジホッグ経路阻害剤を含む組成物を患者に投与することにより、患者細胞におけるヘッジホッグ経路の活性化を減少させることを含む、過剰増殖性疾患と診断された患者中のヘッジホッグ経路の活性化を阻害するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、２０１６年７月４日に中国特許庁へ提出された、出願番号がＣＮ２０１６１０５１１９１７．７、発明の名称が「ヘッジホッグ経路アンタゴニスト活性を持つキラル複素環式化合物、及びその製造方法、並びに応用」である中国特許出願に基づき優先権を主張し、その全内容は、援用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ヘッジホッグ経路アンタゴニスト活性を持つキラル複素環式化合物、及びその製造方法、並びに応用の分野に関し、医薬技術分野に属する。具体的には、本発明は、細胞シグナル及びがん治療の分野に有用な新規複素環式化合物に関する。より具体的には、本発明は、哺乳動物におけるヘッジホッグシグナル伝達経路により媒介される疾患（例えば、癌）を標的とする治療法に関する。
【背景技術】
【０００３】
悪性腫瘍は、ヒトの健康を危険にさらす最も重篤な疾患の１つであり、毎年悪性腫瘍と新たに診断された症例は、約１０９０万であり、悪性腫瘍により死亡した患者は、毎年約６７０万である[１]。したがって、腫瘍の予防及び治療は、また医薬分野において重要な問題であり、そのうち、抗腫瘍薬の研究開発は、数年の研究・探索を経た後、劇的な変化を遂げる。過去に、臨床的治療では一般的に使用されている抗腫瘍薬は、主に細胞毒性薬であり、そのような抗腫瘍薬は、選択性が低く、毒性・副作用が強く、薬剤耐性を生じやすいなどの欠点がある。近年、生命科学研究の急速な進歩に伴い、悪性腫瘍細胞のシグナル伝達、細胞周期制御、アポトーシスの誘発、血管新生、および細胞と細胞外マトリックスとの相互作用などの基本的過程が徐々に解明されている。従って、薬物スクリーニング標的として、腫瘍細胞の分化・増殖に関与する細胞シグナル伝達経路の重要な酵素を使用し、これらの特定の標的に対して選択的に作用するとともに、効率よく、低毒性である新規リード化合物は、現在の抗腫瘍薬研究・開発の重要な方向になる。トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、及びエルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）などの分子標的薬の成功した登場は、典型的な例である。[２]。
【０００４】
転移及び再発は、悪性腫瘍の特徴だけでなく、悪性腫瘍の治療における難題でもある。次世代の分子標的薬でさえ腫瘍の転移移及び再発に対する治療効果も非常に低い。それにより、近年、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ(Ｈｈ)シグナル伝達経路−ヘッジホッグ経路の研究が科学界からますます注目を集め、これは、Ｈｈシグナル伝達経路の異常活性化が、基底細胞癌、脳腫瘍、乳癌、前立腺癌およびいくつかの消化器系悪性腫瘍を含む多くの腫瘍の発生および発達において重要な役割を果たす[３−１１]からだけでなく、より重要なのは、Ｈｈシグナル伝達経路は、胚発生において腫瘍幹細胞を調節して、腫瘍の転移および再発を制御する上で重要な役割を果たす胚発生経路であるからである。
【０００５】
Ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達経路は、高度に保存された細胞間シグナル伝達系であり、１９８０に、ショウジョウバエでは、ショウジョウバエの当該経路における遺伝子突然変異のために、幼虫が多くのヘッジホッグのような突起を示したことが発見されるので、ヘッジホッグ経路（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ(Ｈｈ) ｐａｔｈｗａｙ）と命名された[１２]。Ｈｈシグナル伝達経路は、Ｈｈリガンド、２つの膜貫通タンパク質受容体であるｐａｔｃｈｅｄ膜受容体(ＰＴＣＨ)及びｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ膜貫通タンパク質受容体(ＳＭＯ)、並びに下流の転写因子Ｇｌｉタンパク質などからなる[１３]。ＰＴＣＨ及びＳＭＯは、標的細胞膜上にある、２種類の膜貫通タンパク質であり、中でも、ＰＴＣＨは、由腫瘍抑制遺伝子ＰＴＣＨによりコードされる１２回膜貫通タンパク質であり、Ｈｈの単離および形質導入の二重の役割を有する細胞表面受容体である。ＳＭＯは、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーと構造的に非常に類似し、Ｈｈシグナル伝達を変換する効果を有する７回膜貫通タンパク質である。ＰＴＣＨ及びＳＭＯは、Ｈｈシグナル伝達において受容体として働き、ここで、ＰＴＣＨは、Ｈｈの受容体であり、Ｈｈが存在しない場合には、ＰＴＣＨがＳＭＯの細胞膜への転座を妨げ、それによりＳＭＯの活性を阻害し、さらに、下流の遺伝子の転写発現を阻害する。Ｈｈシグナルが存在する場合には、Ｈｈは、ＰＴＣＨと結合し、ＳＭＯのカルボキシ末端に複数のセリン／トレオニン残基のリン酸化を誘導し、細胞表面へのＳＭＯの凝集及び活性化をもたらし、活性化されたＳＭＯは、キネシン様分子Ｃｏｓｔａｌ２(Ｃｏｓ２)、セリン／トレオニンキナーゼｆｕｓｅｄ(Ｆｕｓ)、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｆｕｓｅｄ(Ｓｕｆｕ)と複合体を形成して微小管から解離する。ＳＭＯは、完全長形態全長フォームで転写活性化において機能し、最終的にジンクフィンガー型転写因子Ｇｌｉの活性化を導くが、後者は、細胞核内に移行して標的遺伝子の転写を引き起こす。従って、Ｈｈシグナル伝達経路において、Ｈｈは、このシグナル伝達経路の出発点であり、Ｇｌｉは、転写因子としてこのシグナル伝達経路の終わりであり、Ｈｈ及びＳＭＯは活性化因子として、ＰＴＣＨは抑制因子として、シグナル伝達経路の活性を調節する[１２，１４]。
【０００６】
膜貫通タンパク質受容体ＳＭＯは、Ｈｈシグナル伝達経路の重要なメンバーとして、Ｈｈシグナル伝達経路での情報変換器であり、細胞外のＨｈシグナルを細胞内のＧｌｉ１シグナルに変換でき、核内遺伝子の転写を開始させ、Ｈｈシグナル伝達経路を活性化する作用を有する[１５]。Ｈｈ経路活性化に関連するほとんどの腫瘍細胞の発生及び発達中には、ＳＭＯの機能的変異が存在する。ＳＭＯタンパク質小分子アンタゴニストは、ＳＭＯをブロックすることによりＨｈシグナル伝達経路を特異的にブロックするが、正常な成体では成人Ｈｈシグナル伝達経路が不活性であるため、アンタゴニストは、成体の他の部分に副作用を持たなく、これは腫瘍の標的治療の実現可能性の理論的基礎である。従って、ＳＭＯタンパク質は、現在の抗腫瘍薬の開発において最も注目される標的の１つとなっている。ＳＭＯタンパク質を標的とする小分子アンタゴニストの合成も世界の主要製薬企業の研究開発のホットスポットとなっている。現在、臨床試験においてＳＭＯタンパク質を標的とする小分子アンタゴニストは、少なくとも５つ存在する。中でも、米国Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社及びＣｕｒｉｓ社により共同開発した小分子ＳＭＯアンタゴニストＧＤＣ−０４４９は、２０１２年１月に進行した基底細胞癌患者の治療ために米食品医薬品局ＦＤＡによって承認された[１６]。これは、小分子ＳＭＯアンタゴニストが抗腫瘍薬の研究開発として良好な適用価値および市場見通しを有することが明らかになる。
【０００７】
ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路は、胚発生中の細胞構成、成長及び移動の調節に関与する。成体細胞において、Ｈｈシグナル伝達経路は、は組織の維持および修復に限定される。しかしながら、この経路は、組織修復・再生中に再活性化される。正常な条件下で、内因性リガンドであるソニック・ヘッジホッグ、インディアン・ヘッジホッグ、及びデザート・ヘッジホッグがその受容体Ｐａｔｃｈｅｄ（ＰＴＣＨ）と結合し、これは、逆に、下流タンパク質ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（ＳＭＯ）に対するＰＴＣＨの阻害効果を減軽させる。ＳＭＯの活性化は、最終的にＧｌｉファミリー転写因子によって媒介される特異的遺伝子発現をもたらす（ＪｉａｎｇａｎｄＨｕｉ，Ｄｅｖ．ＣｅｌｌＲｅｖｉｅｗ (２００８) １５：８０１−８１２）。異常なＨｈシグナルは、多数のヒト癌に関連する。阻害経路成分の変異失活は、Ｈｈシグナル伝達経路の構成的リガンド非依存的活性化を起こし、基底細胞癌、髄芽腫（Ｘｉｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ (１９９８) ３９１：９０−９２）、及び膠芽腫などの癌（Ｂａｒｅｔａｌ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ (２００７) ２５(１０)：２５２４−３３; Ｆｉｌｂｉｎｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ (２０１３) １９：１５１８−１５２３ｄｉｏ：１０．１０．３８／ｎｍ．３３２８）を生じる。Ｈｈシグナルのリガンド依存的活性化は、前立腺癌（Ｓａｎｃｈｅｚｅｔａｌ．ＰＮＡＳ１０１(２００４) (３４)：１２５６１−５６６）、膵臓癌（Ｔｈａｙｅｒｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ (２００３) ４２３：８５１−８５６）、乳がん（Ｋｕｂｏｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ． (２００３) ６４：６０７１−６０７４）、非小細胞肺癌（Ｙｕａｎｅｔａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ (２００７) ２６：１０４６−１０５５）、小細胞肺癌（Ｗａｔｋｉｎｓｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ (２００３) ４２２：３１３−３１７）及び幾つかの血癌（Ｓｃａｌｅｓｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ． (２００９) ３０：３０３−３１２）にも関連する。従って、異常なＨｈシグナルに対する阻害は、がん治療に対する有望なアプローチを提供する（ＰｅｕｋｅｒｔａｎｄＭｉｌｌｅｒ−Ｍｏｓｌｉｎ，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ (２０１０) ５：５００−５１２）。
【０００８】
ヘッジホッグシグナルは、ＡＢＣトランスポーターの多剤耐性タンパク質−１（ＭＤＲ１、ＡＢＣＢ１、Ｐ−糖タンパク質）、及び（ＢＣＲＰ、ＡＢＣＧ２）の発現を調節でき、小分子干渉ＲＮＡがＨｈで誘発された化学療法抵抗性を部分的に逆転させることによりＭＤＲ１及びＢＣＲＰ発現を標的化ノックアウトすることが分かっている。これは、Ｈｈ経路は、ＭＤＲを克服し、化学療法に対する応答を増加させる目標になる可能性がある（Ｓｉｍｓ−Ｍｏｕｒｔａｄａｅｔａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ (２００７) ２６：５６７４−７９）ことを示している。また、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路のブロックは、膵臓癌細胞（Ｈｕｅｔａｌ．ＡｃｔａＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ． (２００７) ２８１２２４−３０）及び前立腺癌細胞（Ｍｉｍｅａｕｌｔｅｔａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ (２００６) １１８：１０２２−３１）中のＥＧＦＲ阻害剤の増殖抑制効果を増強する。
【０００９】
ヘッジホッグ経路は、化学放射線治療後の腫瘍再発、及び放射線応答を改善する潜在的な標的にも関連する（Ｓｉｍ−Ｍｏｕｒｔａｄａｅｔａｌ．Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ． (２００６) １２：６５６５−６５７２）。
ヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害は、炎症、上皮細胞過形成、組織線維化、または免疫系障害に関連する一連の疾患の治療にに有用であることも報告されている（Ｌａｍｂｅｔａｌ．ＥＰ１１８３０４０）。
【化１】
2019524678.tif 000003
【００１０】
シクロパミン（Ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ）は、天然に存在するアルカロイドであり、最初に報道されたＨｈシグナル伝達経路阻害剤であり（Ｃｏｏｐｅｒｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ (１９９８) ２８０：１６０３−１６０７）、その後、ＳＭＯアンタゴニストと同定された（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ． (２００２) １６：２７４３−２７４８）。シクロパミン誘導体ＩＰＩ−９２６は、シクロパミンよりも優れた活性、安定性、及び他の薬物の物理的・化学的性質を示し、すでに臨床開発階段に入った（Ｔｒｅｍｂｌｅｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． (２００９) ５２：４４００−４４１８）。ＧＤＣ−０４４９は、胚性経路阻害剤（Ｒｏｂａｒｇｅｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ． (２００９) １９：５５７６-５５８１）として、２０１２年１月に米食品医薬品局ＦＤＡによって手術に適さない基底細胞癌の治療のために米食品医薬品局ＦＤＡで承認された。
【００１１】
それらの化合物は、一定の進展を取得しているものの、多くの問題がある。例えば、ＧＤＣ−０４４９では、１つのメチル基の炭素原子の以外は、全ての炭素原子はいずれもＳｐ２混成炭素を保有するめに、比較的に高い融点（２５１℃）と低い溶解度（９．５μｇ／ｍＬ）を有するが、右側のベンゼン環にオルト位の塩素原子を導入することにより、ある程度右側のベンゼン環とアミドとの平面性を低下させることができ、その化合物の溶解度を改善する（Ｒｏｂａｒｇｅｅｔａｌ．）。また、臨床試験では、ＳＭＯの変異を引き起こし、少なくとも１人の患者において急速な腫瘍再発を引き起こすことができることも見出した（Ｙａｕｃｈｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ (２００９) ３２６：５７２−５７４）。
【００１２】
本発明者らは、先の特許（ＷＯ２０１４１１３１９１Ａ１）に一連の化合物を開示し、中でも、代表的な化合物（Ａ−５５及びＡ９７）は、以下の構造を持ち、Ｈｈシグナル伝達経路に対する阻害活性（ＮＩＨ３Ｔ３−ＧＲＥ−ＬｕｃのＩＣ５０）がそれぞれ５．５ｎＭ（参照ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂ  ８．８ｎＭ、比率１．６倍）、及び８４ｎＭ（参照ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂ  ４５ｎＭ、比率０．５４倍）である。
【化２】
2019524678.tif 000004
ＷＯ２０１４１１３１９１Ａ１に係る一連の化合物（式（Ｉ））のＲ５及びＲ６が水素である場合には、活性がより良い。しかしながら、その後の薬物動態学的研究により、前記化合物のメチレン基部分（ＷＯ２０１４１１３１９１Ａ１の式（Ｉ）において、Ｒ５及びＲ６中、水素である）は、酸化代謝に対して感受性であることが明らかになる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】１．Ｊｅｍａｌ，Ａ．;Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．;Ｗｅｉｎｇｅｒｇ．Ｒ．Ａ．Ｃａｎｃｅｒｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１０．ＣＡ．．ＣａｎｃｅｒＪ．Ｃｌｉ．，２０１０，１４４，２７７−３００．
【非特許文献２】２．Ｗｏｒｋｍａｎ，Ｐ．;Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｉ．ＭｏｄｅｒｎＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙ：ＩｎｔｅｇｒａｔｉｎｇＴａｒｇｅｔｓ，ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓａｎｄＴｒｅａｔｍｅｎｔｓ．ＩｎＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎａｎｄＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，１ｓｔｅｄ．;Ｎｅｉｄｌｅ，Ｓ．，Ｅｄ．;Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：ＮｅｗＹｏｒｋ，２００８;ｐｐ３−３８．
【非特許文献３】３．ｄｉＭａｇｌｉａｎｏ，Ｍ．Ｐ．;Ｈｅｂｒｏｋ，Ｍ．Ｈｅｄｇｅｈｏｇｓｉｇｎａｌｌｉｎｇｉｎｃａｎｃｅｒｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ２００３，３，９０３−９１１．
【非特許文献４】４．Ｂｅａｃｈｙ，Ｐ．Ａ．;Ｋａｒｈａｄｋａｒ，Ｓ．Ｓ．;Ｂｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｍ．Ｔｉｓｓｕｅｒｅｐａｉｒａｎｄｓｔｅｍｃｅｌｌｒｅｎｅｗａｌｉｎｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ２００４，４３２，３２４−３３１．
【非特許文献５】５．Ｄａｈｍａｎｅ，Ｎ．;Ｌｅｅ，Ｊ．;Ｒｏｂｉｎｓ，Ｐ．;Ｈｅｌｌｅｒ，Ｐ．;ＲｕｉｚｉＡｌｔａｂａ，Ａ．ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＧｌｉ１ａｎｄｔｈｅｓｏｎｉｃＨｅｄｇｅｈｏｇｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｉｎｓｋｉｎｔｕｍｏｕｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ１９９７，３８９，８７６−８８１．
【非特許文献６】６．Ｈｕｔｃｈｉｎ，Ｍ．Ｅ．;Ｋａｒｉａｐｐｅｒ，Ｍ．Ｓ．Ｔ．;Ｇｒａｔｃｈｔｃｈｏｕｋ，Ｍ．;Ｗａｎｇ，Ａ．;Ｗｅｉ，Ｌ．;Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｄ．;Ｌｉｕ，Ｊ．;Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｌ．Ｒ．;Ｇｌｉｃｋ，Ａ．;Ｄｌｕｇｏｓｚ，Ａ．Ａ．ＳｕｓｔａｉｎｅｄＨｅｄｇｅｈｏｇｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｂａｓａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｓｋｉｎｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓｔｈｅｈａｉｒｇｒｏｗｔｈｃｙｃｌｅ．ＧｅｎｅｓＤｅｖ．２００４，１９，２１４−２２４．
【非特許文献７】７．Ｋｕｂｏ，Ｍ．;Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．;Ｔａｓａｋｉ，Ａ．;Ｙａｍａｎａｋａ，Ｎ．;Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｈ．;Ｎｏｍｕｒａ，Ｍ．;Ｋｕｒｏｋｉ，Ｓ．;Ｋａｔａｎｏ，Ｍ．Ｈｅｄｇｅｈｏｇｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｉｓａｎｅｗｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｔａｒｇｅｔｆｏｒｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００４，６４，６０７１−６０７４．
【非特許文献８】８．Ｂｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｍ．;Ｋａｒｈａｄｋａｒ，Ｓ．Ｓ．;Ｍａｉｔｒａ，Ａ．;ＭｏｎｔｅｓｄｅＯｃａ，Ｒ．;Ｇｅｒｓｔｅｎｂｌｉｔｈ，Ｍ．Ｒ．;Ｂｒｉｇｇｓ，Ｋ．;Ｐａｒｋｅｒ，Ａ．Ｒ． ;Ｓｈｉｍａｄａ，Ｙ．;Ｅｓｈｌｅｍａｎ，Ｊ．Ｒ．;Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｄ．Ｎ．;Ｂｅａｃｈｙ，Ｐ．Ａ．ＷｉｄｅｓｐｒｅａｄｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｆｏｒＨｅｄｇｅｈｏｇｌｉｇａｎｄｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｇｒｏｗｔｈｏｆｄｉｇｅｓｔｉｖｅｔｒａｃｔｔｕｍｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ２００３，４２５，８４６−８５１．
【非特許文献９】９．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｌ．Ｖ．;Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．Ｐ．ＨｅｄｇｅｈｏｇａｎｄＰａｔｃｈｅｄｉｎｎｅｕｒａｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｎ１９９８，２１，１２４３−１２５７．
【非特許文献１０】１０．Ｓｔｅｃｃａ，Ｂ．;Ｍａｓ．，Ｃ．;Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｖ．;Ｚｂｉｎｄｅｎ，Ｍ．;Ｃｏｒｒｅａ，Ｒ．;Ｐｉｇｕｅｔ，Ｖ．;Ｂｅｅｒｍａｎｎ，Ｆ．;Ｒｕｉｚ，Ａ．ＭｅｌａｎｏｍａｓｒｅｑｕｉｒｅＨｅｄｇｅｈｏｇ−ＧｌｉｓｉｇｎａｌｉｎｇｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎＧｌｉ１ａｎｄｔｈｅＲＡＳ−ＭＥＫ／ＡＫＴｐａｔｈｗａｙｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００７，１０４，５８９５−５９００．
【非特許文献１１】１１．Ｔｈａｙｅｒ，Ｓ．Ｐ．;ＰａｓｃａｄｉＭａｇｌｉａｎｏ，Ｍ．;Ｈｅｉｓｅｒ，Ｐ．Ｗ．;Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｃ．Ｍ．;Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｊ．;Ｌａｕｗｅｒｓ，Ｇ．Ｙ．;Ｑｉ，Ｙ．Ｐ．;Ｇｙｓｉｎ，Ｓ．;Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−ｄｅｌＣａｓｔｉｌｌｏ，Ｃ．;Ｙａｊｎｉｋ，Ｖ．;Ａｎｔｏｎｉｕ，Ｂ．;ＭｃＭａｈｏｎ，Ｍ．;Ｗａｒｓｈａｗ，Ａ．Ｌ．;Ｈｅｂｒｏｋ，Ｍ．Ｈｅｄｇｅｈｏｇｉｓａｎｅａｒｌｙａｎｄｌａｔｅｍｅｄｉａｔｏｒｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ２００３，４２５，８５１−８５６．
【非特許文献１２】１２．Ｌｕｍ，Ｌ．;Ｂｅａｃｈｙ，Ｐ．Ａ．ＴｈｅＨｅｄｇｅｈｏｇｒｅｓｐｏｎｓｅｎｅｔｗｏｒｋ：ｓｅｎｓｏｒｓ，ｗｉｔｃｈｅｓ，ａｎｄｒｏｕｔｅｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００４，３０４，１７５５−１７５９．
【非特許文献１３】１３．Ｂｅａｃｈｙ，Ｐ．Ａ．;Ｋａｒｈａｄｋａｒ，Ｓ．Ｓ．;Ｂｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｍ．Ｔｉｓｓｕｅｒｅｐａｉｒａｎｄｓｔｅｍｃｅｌｌｒｅｎｅｗａｌｉｎｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ２００４，４３２，３２４−３３１．
【非特許文献１４】１４．ＰａｓｃａｄｉＭａｇｌｉａｎｏ，Ｍ．;Ｈｅｂｒｏｋ，Ｍ．Ｈｅｄｇｅｈｏｇｓｉｇｎａｌｌｉｎｇｉｎｃａｎｃｅｒｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ２００３，３，９０３−９１１．
【非特許文献１５】１５．Ｒｏｍｅｒ，Ｊ．Ｔ．;Ｋｉｍｕｒａ，Ｈ．;Ｍａｇｄａｌｅｎｏ，Ｓ．;Ｓａｓａｉ，Ｋ．;Ｆｕｌｌｅｒ，Ｃ．;Ｂａｉｎｅｓ，Ｈ．;Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｍ．;Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｃ．Ｆ．;Ｇｏｕｌｄ，Ｓ．;Ｒｕｂｉｎ，Ｌ．Ｌ．;Ｃｕｒｒａｎ，Ｔ．ＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＳｈｈｐａｔｈｗａｙｕｓｉｎｇａｓｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｅｌｉｍｉｎａｔｅｓｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａｉｎＰｔｃ１(+／−)ｐ５３(−／−) ｍｉｃｅ．ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ２００４，６，２２９−２４０．
【非特許文献１６】１６．ＣｕｒｉｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓｐｒｅｓｓｒｅｌｅａｓｅ：ｈｔｔｐ：／／ｉｎｖｅｓｔｏｒｓ．ｃｕｒｉｓ．ｃｏｍ／ｒｅｌｅａｓｅｄｅｔａｉｌ．ｃｆｍ?ＲｅｌｅａｓｅＩＤ＝６４３７５６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、上記従来技術の欠陥に鑑み、ヘッジホッグ経路アンタゴニスト活性を持つキラル複素環式化合物、及びその製造方法、並びに応用を提供することを目的とする。その化合物は、ヘッジホッグ経路をブロックでき、それによって細胞の異常増殖を阻害でき、腫瘍細胞の転移及び再発をブロックする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の目的は、以下の技術案により達成される。
式（Ｉ）で表される構造を有する、ヘッジホッグ経路アンタゴニスト活性を持つキラル複素環式化合物、及びその薬学的に許容される塩。
【化３】
2019524678.tif 000005
【００１６】
化合物
【化４】
2019524678.tif 000006
のメチルチオ基を酸化して得られたメチルスルホニル基中間体を４−ヒドロキシピペリジンと反応させ、化合物（Ｉ）を得ることを含む、ヘッジホッグ経路アンタゴニスト活性を持つキラル複素環式化合物の製造方法。
上記製造方法において、前記化合物
【化５】
2019524678.tif 000007
は、化合物
【化６】
2019524678.tif 000008
と化合物
【化７】
2019524678.tif 000009
とをカップリング反応させることにより調製されることができる。
上述製造方法において、前記化合物
【化８】
2019524678.tif 000010
は、(１Ｓ，２Ｓ)−(+)−Ｎ−ｐ-トルエンスルホニル−１，２−ジフェニルエチレンジアミン、ジクロロ(ｐ-メチルイソプロピルベンゼン)ルテニウム(ＩＩ)ダイマー、アミン、及びギ酸−アセトニトリル溶液を混合し、混合液を得；化合物
【化９】
2019524678.tif 000011
のアセトニトリル溶液を前記の得られた混合液を混合し、反応させ；飽和炭酸水素ナトリウムで系のｐＨを８に調整し、抽出し、精製して得られるステップにより調製されることができる。
上述製造方法において、ギ酸のアセトニトリル溶液中のギ酸の濃度が約２．０〜３．５ｍｍｏｌ／ｍＬであり、化合物
【化１０】
2019524678.tif 000012
のアセトニトリル溶液中の化合物
【化１１】
2019524678.tif 000013
の濃度が約０．１〜１．０ｍｍｏｌ／ｍＬである。
【００１７】
本発明は、ヘッジホッグ経路拮抗活性を持つキラル複素環式化合物の抗腫瘍薬又は抗腫瘍医薬組成物の製造における応用をさらに提供する。前記腫瘍は、肝癌、肺癌、直腸癌、子宮頸癌、膵臓癌、乳癌、胃癌、口腔癌、食道癌、鼻咽頭癌、皮膚がん、骨がん、脳がん、腎臓癌、及び血液がん、またはそれらの複数種の組み合わせを含む。
【００１８】
本発明は、さらに、前記のヘッジホッグ経路アンタゴニスト活性を持つキラル複素環式化合物と少なくとも２つのその薬学的に許容される塩とを混合した組成物を含む、抗腫瘍医薬組成物を提供する。
【００１９】
本発明は、さらに、シスプラチン、パクリタキセル、カンプトテシン、トラスツズマブ、グリベック、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びラパティニブの１種または複数種の組み合わせと前記のッジホッグ経路アンタゴニスト活性を持つキラル複素環式化合物との併用を含む、抗腫瘍薬併用組成物を提供する。
【００２０】
本発明は、さらに、シスプラチン、パクリタキセル、カンプトテシン、トラスツズマブ、グリベック、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びラパティニブの１種または複数種の組み合わせと前記の抗腫瘍医薬組成物との併用を含む、抗腫瘍薬併用組成物を提供する。
【００２１】
本発明に係るヘッジホッグ経路アンタゴニスト活性を持つキラル複素環式化合物は、構造において、Ｒ配置を有するキラル炭素を１つ持つ新規な抗腫瘍化合物である。ラセミ化合物と比較して、そのキラル化合物は、ヘッジホッグ経路に対する阻害活性が３倍向上した。ｉｎｖｉｔｒｏＣＹＰ阻害試験では、ラセミ化合物のＣＹＰ−２Ｃ９に対する阻害活性が１０μＭで５２％であるが、そのキラル化合物のＣＹＰ−２Ｃ９に対する阻害活性がが１０μＭでわずか２６％であり、より良い安全性を示す。ラットの薬物動態学的試験では、ラセミ化合物と比較して、そのキラル化合物のバイオアベイラビリティは、ほぼ倍増して１００％に達した。さらに、曲線下面積などのパラメータも有意に向上した。マウス腫瘍モデルにおいて、ラセミ化合物は、１００ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍増殖を停止することができるだけであるが、そのキラル化合物は、腫瘍体積をほぼ消失させるように収縮させることができ、強い抗腫瘍効果を有する。従来特許（ＷＯ２０１４１１３１９１Ａ１）に係るＡ−５５（脱メチル化類似体）よりも、キラル化合物は、ヘッジホッグ経路に対する阻害活性が約１２倍増加することができる。ラットの薬物動態学的試験では、化合物Ａ−５５よりも、そのキラル化合物は、バイオアベイラビリティがほぼ倍増して１００％に達し、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期も向上し、薬物曝露量（曲線下面積ＡＵＣ）が有意に向上することができる。キラル化合物は、対応する脱メチル化類似体よりも、異常な細胞増殖の阻害、及び腫瘍細胞の転移および再発の阻害に対してより顕著で予期しない効果を奏し、例えば、より良い活性、より良いバイオアベイラビリティなどの多くの利点があることを示し、腫瘍治療へのより良い応用見通しを有する。
【００２２】
本発明の有益な効果は、ヘッジホッグ経路アンタゴニスト活性を持つキラル複素環式化合物がヘッジホッグ経路をブロックすることにより、異常細胞の増殖を阻害し、腫瘍細胞の転移・再発をブロックすることができる。本発明に係るキラル複素環式化合物は、その脱メチル化類似体よりも、より良い生物学的活性及び薬物動態学的特性を持ち、腫瘍治療の応用のより良い見通しを有する。
【００２３】
以下、本発明に係る技術案をより容易に理解し掌握するように、実施例及び図面を参照しながら、本発明の具体的な実施形態をさらにより詳細に説明する。
一つの側面において、本発明は、式（ＩＩ）で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩、立体異性体又は溶媒和物を提供する。
【化１２】
2019524678.tif 000014
（ここで、Ｘ、Ｙ及びＹ’は、独立して、Ｃ１−３アルキル基、ＣＤ３、ＣＦ３、ＣＮ、ハロゲン化物又はＯＭｅであり；
Ｒ２及びＲ’２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−３アルキル基、ＣＤ３又はＣＦ３であり、ただし、Ｒ２及びＲ’２の少なくとも１つがＨではなく
Ｒ１は、−ＮＲｘＲｙであり、ここで、Ｒｘ及びＲｙは、独立して、Ｈ、アルキル基、シクロアルキル基、アルキルシクロアルキル基、Ｃ(Ｏ)Ｒ”、或いは、−ＮＲｘＲｙは一緒になって４乃至７員複素環を形成してもよく、ここで、４乃至７員複素環は、置換または非置換であり;
Ｒ”は、Ｃ１−５アルキル基であり;
Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４、Ｗ５、Ｗ６、Ｗ７、Ｗ８、及びＷ９は、独立して、Ｈ又はＤであり、且つ
Ａは、Ｎ又はＣＨである。）
【００２４】
幾つかの実施形態において、Ｙ及びＹ’は、独立して、ＣＨ３、ＣＤ３、ＣＦ３、Ｃｌ又はＦである。幾つかの実施形態において、Ｘは、ハロゲン、ＣＦ３、ＣＤ３、又はＣＨ３である。幾つかの実施形態において、Ｒ１は、
【化１３】
2019524678.tif 000015
であり、且つ、Ｗ１０は、Ｈ又はＤである。幾つかの実施形態において、Ｒ’２は、Ｈ又はＤであり、且つ、Ｒ２は、Ｃ１−３アルキル基、又はＣＦ３である。幾つかの実施形態において、Ｒ’２は、Ｈ又はＤであり、且つ、Ｒ２は、ＣＨ３、又はＣＤ３である。幾つかの実施形態において、Ａは、Ｎである。幾つかの実施形態において、前記化合物は、
【化１４】
2019524678.tif 000016
から選ばれる。
【００２５】
他の側面において、本発明は、式（ＩＩＩ）で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩、立体異性体や溶媒和物を提供する。
【化１５】
2019524678.tif 000017
（ここで、Ｒ２及びＲ’２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−３アルキル基、ＣＤ３、又はＣＦ３であり、ただし、Ｒ２及びＲ’２の少なくとも１つがＨではなく；
Ｒ１は、−ＮＲｘＲｙであり、ここで、Ｒｘ及びＲｙは、独立して、Ｈ、アルキル基、シクロアルキル基、アルキルシクロアルキル基、Ｃ(Ｏ)Ｒ”であり、或いは、−ＮＲｘＲｙは、一緒になって４乃至７員複素環を形成してもよく、ここで、４乃至７員複素環は、置換または非置換であり；
Ｒ”は、Ｃ１−５アルキル基であり；
Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４、Ｗ５、Ｗ６、Ｗ７、Ｗ８及びＷ９は、独立して、Ｈ又はＤであり、且つ、
Ａは、Ｎ又はＣＨである。）
【００２６】
幾つかの実施形態において、Ｒ１は、
【化１６】
2019524678.tif 000018
であり、且つ、Ｗ１０は、Ｈ又はＤである。幾つかの実施形態において、Ｒ’２は、Ｈ又はＤであり、且つ、Ｒ２は、Ｃ１−３アルキル基、又はＣＦ３である。幾つかの実施形態において、Ｒ’２は、Ｈ又はＤであり、且つ、Ｒ２は、ＣＨ３、又はＣＤ３である。幾つかの実施形態において、Ａは、Ｎである。
【００２７】
他の側面において、本発明は、式（ＩＶ）で表される化合物、その薬学的に許容される塩、又は溶媒和物を提供する。
【化１７】
2019524678.tif 000019
（ここで、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−３アルキル基、ＣＤ３、又はＣＦ３であり；
Ｒ１は、−ＮＲｘＲｙであり、ここで、Ｒｘ及びＲｙは、独立して、Ｈ、アルキル基、シクロアルキル基、アルキルシクロアルキル基、Ｃ(Ｏ)Ｒ”であり、或いは、−ＮｒｘＲｙは一緒になって４乃至７員複素環を形成してもよく、ここで、４乃至７員複素環は、置換または非置換であり；
Ｒ”は、Ｃ１−５アルキル基であり、且つ、
Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４、Ｗ５、Ｗ６、Ｗ７、Ｗ８、及びＷ９は、独立して、Ｈ又はＤである。）
【００２８】
幾つかの実施形態において、Ｒ１は、
【化１８】
2019524678.tif 000020
であり、且つ、Ｗ１０は、Ｈ又はＤである。幾つかの実施形態において、Ｒ２は、Ｃ１−３アルキル基、又はＣＦ３である。幾つかの実施形態において、Ｒ２は、ＣＨ３、又はＣＤ３である。
【００２９】
一つの側面において、本発明は、式（ＩＩ）〜（ＩＶ）のいずれかの化合物と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
他の側面において、本発明は、有効量の式（ＩＩ）〜（ＩＶ）のいずれかの化合物であるヘッジホッグ経路阻害剤を含む組成物を患者に投与し、患者細胞におけるヘッジホッグ経路の活性化を減少させることを含む、過剰増殖性疾患と診断された患者中のヘッジホッグ経路の活性化を阻害する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、実施例１の中間体Ｂ１−３のＤ−酒石酸塩の単結晶回折パターンである。
【図２】図２は、実施例３における化合物Ｂ１のＨｈ経路に対する阻害活性を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例３における化合物ＢのＨｈ経路に対する阻害活性を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例３における化合物Ｂ２のＨｈ経路に対する阻害活性を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例５における化合物Ｂ１の薬物動態プロファイルを示すグラフである。
【図６】図６は、実施例５における化合物Ｂの薬物動態プロファイルを示すグラフである。
【図７】図７は、実施例６における腫瘍体積阻害の比較を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例６における腫瘍体積阻害の比較を示す写真である。
【図９】図９は、単結晶Ｘ線回折により測定された実施例７の中間体Ｂ１−３のＤ−酒石酸塩の構造である。
【図１０】図１０は、主なアッセイにおける標準化合物ＡのＩＣ５０曲線を描く。
【図１１】図１１は、主なアッセイにおける化合物Ｂ１のＩＣ５０曲線を描く。
【図１２】図１２は、主なアッセイにおける化合物ＢのＩＣ５０曲線を描く。
【図１３】図１３は、主なアッセイにおける化合物Ｂ２のＩＣ５０曲線を描く。
【図１４】図１４は、実施例１４の化合物Ｂ１のラットに対する代謝曲線を示す。
【図１５】図１５は、実施例１４の化合物Ｂのラットに対する代謝曲線を示す。
【図１６】図１６は、実施例１５における腫瘍体積の経時変化のグラフを示す。
【図１７】図１７は、実施例１５における異なる時点の腫瘍写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳しく説明する前に、以下の詳細な説明は本質的に例示的なものに過ぎず、本発明又はその応用及び用途を限定するものではないことを理解すべきである。従って、本発明は、説明の便宜のために、ある例示的な実施形態に示されるように図示および説明されているが、本発明は、様々な他のタイプの実装形態および等価物ならびに様々な他のシステムおよび環境において実施され得ることを理解すべきである。さらに、前記の背景技術または以下の詳細な説明で提示された理論に縛られることを意図するものではない。
【００３２】
本明細書は、一般的に標準的な命名法を用いて化合物を命名する。不斉中心を有する化合物については、（特に明記しない限り）すべての光学異性体及びそれらの混合物を含むことを理解すべきである。さらに、炭素−炭素二重結合を有する化合物は、Ｚ−型及びＥ−型として存在してもよく、特に明記しない限り、係る化合物のいずれかの異性体も本発明に含まれる。化合物が様々な互変異性体の形態で存在する場合には、列挙された化合物は、いずれかの特定の互変異性体に限定されず、全ての互変異性形態を含むことが意図される。
本明細書で使用されるように、「アルキル基」という用語とは、直鎖又は分岐鎖の飽和脂肪族炭化水素を指す。アルキル基には、１〜８個の炭素原子（Ｃ１−８アルキル基）、１〜６個の炭素原子（Ｃ１−６アルキル基）、及び１〜４個の炭素原子（Ｃ１−４アルキル基）を有する基が含まれ、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、２−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、２−ヘキシル基、３−ヘキシル基、及び３−メチルペンチル基を含む。ある場合には、アルキル基の置換基が具体的に示される。例えば、「シアノアルキル基」とは、少なくとも１つのシアノ基で置換されたアルキル基を指す。
「アルケニル基」とは、少なくとも１つの不飽和炭素−炭素二重結合を含む直鎖又は分岐鎖のアルケニル基を指す。アルケニル基は、Ｃ２−８アルケニル基、Ｃ２−６アルケニル基、及びＣ２−４アルケニル基を含み、それらはそれぞれ２〜８個、２〜６個、又は２〜４個の炭素原子を有し、例えば、ビニル基、アリル基、又はイソプロペニル基を含む。「アルキニル基」とは、１つ以上の炭素−炭素不飽和結合を持ち、その少なくとも１つが三重結合である、直鎖又は分岐鎖のアルキニル基を指す。アルキニル基は、Ｃ２−８アルキニル基、Ｃ２−６アルキニル基、及びＣ２−４アルキニル基を含み、それらは、それぞれ２〜８個、２〜６個、又は２〜４個の炭素原子を有する。
【００３３】
「シクロアルキル基」とは、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、アダマンタン基を含む、全ての環構成原子は炭素である、１つ以上の飽和環を含む基である。シクロアルキル基は、芳香環又は複素環を含まない。あるシクロアルキル基は、Ｃ３−７シクロアルキル基であり、ここで、シクロアルキル基は、３〜７個の環構成原子を有する単環を含み、その全ての環構成原子は、炭素である。「シクロアルケニル基」とは、全ての環構成原子は炭素である１つ以上の不飽和環を含む基である。
「アルコキシ基」とは、酸素橋（−Ｏ−）を介して連結した上記のアルキル基である。アルコキシ基は、Ｃ１−６アルコキシ基、及びＣ１−４基を含み、ここで、それらは、それぞれ１〜６個、又は１〜４個の炭素原子を有する。代表的なアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペントキシ基、２−ペントキシ基、３−ペントキシ基、イソペントキシ基、ネオペントキシ基、ヘキソキシ基、２−ヘキソキシ基、３−ヘキソキシ基、及び３−メチルペントキシ基が挙げられる。
「アルキルアミノ基」とは、一般式構造として−ＮＨ−アルキル基又は−Ｎ(アルキル基)(アルキル基)を持つ第二級アミン又は第三級アミンであり、ここで、各アルキル基は、独立して、アルキル基、シクロアルキル基、及び(シクロアルキル)アルキル基から選ばれる。それらの基は、例えば、モノ−及びジ−(Ｃ１−６アルキル基)アミン基を含み、ここで、各Ｃ１−６アルキル基は同じであっても異なっていてもよい。「アルキルアミノ基」という用語に使用される「アルキル基」の定義は、シクロアルキル基及び(シクロアルキル)アルキル基を含む、他の全てのアルキル基を含む基に使用される「アルキル基」の定義と異なることが明らかになる。
【００３４】
「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素を意味する。「ハロアルキル基」とは、１つ以上の独立して選ばれるハロゲンで置換されたアルキル基（例えば、１〜６個の炭素原子、及び少なくとも１つのハロゲンを有する「Ｃ１−６ハロアルキル基」）である。ハロアルキル基の具体例は、モノ−、ジ−又はトリ−フルオロメチル基；モノ−、ジ−又はトリ−クロロメチル基；モノ−、ジ−、トリ−、テトラ−又はペンタ−フルオロエチル基；モノ−、ジ−、トリ−、テトラ−又はペンタ−クロロエチル基；及び１，２，２，２−テトラフルオロ−１−（トリフルオロメチル）−エチル基を含むが、これらに限定されない。
「ヘテロアリール基」とは、少なくとも１つの芳香環が、Ｎ、Ｏ及びＳから選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子を含む芳香族基である。ヘテロアリール基は、例えば、５〜１２員のヘテロアリール基を含む。具体例は、イミダゾール、フラン、フラザン、イソチアゾール、イソキサゾール、オキサジアゾール、オキサゾール、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、テトラゾール、チアゾール、及びチオフェンを含むが、これらに限定されない。
「複素環式（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ）」又は「複素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅ）」という用語とは、少なくとも１つの環原子が、炭素であり、且つ、少なくとも１つの環原子が、Ｎ、Ｏ及びＳから選ばれるヘテロ原子である、３〜１２個の環原子を含む環状構造を指す。複素環基は、芳香族または非芳香族であってもよい。ピペリジン及びオキセタンは、非芳香族複素環の非制限的な具体例である。チアゾール及びピリジンは、芳香族複素環の非制限的な具体例である。
【００３５】
本明細書が使用する「置換基」及び「置換された」とは、分子部分が目的分子内の原子に共有結合していることを意味する。例えば、環置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル基、ハロアルキル基、又は環構成原子とする原子（好ましくは、炭素又は窒素原子）に共有結合した他の基の部分であってもよい。芳香族基の置換基は、一般的に、環式炭素原子に共有結合している。類似するように、鎖置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル基、ハロアルキル基、又は鎖構成原子とする原子（好ましくは、炭素又は窒素原子）に共有結合した他の基の部分であってもよい。
式（ＩＩ）〜（ＩＶ）に基づく化合物を使用する場合には、「薬学的に許容される」という用語とは、対象への投与に安全な化合物の形態を指すことを意図する。例えば、式（ＩＩ）〜（ＩＶ）の化合物の遊離塩基、塩形態、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、又は誘導体形態は、例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）などの管理当局または規制当局によって、経口投与またはいずれの他の投与経路により哺乳動物に投与することが承認されていることは、薬学的に許容されるものである。
式（ＩＩ）〜（ＩＶ）で表される化合物において、遊離塩基化合物の薬学的に許容される塩形態が含まれる。「薬学的に許容される塩」という用語は、アルカリ金属塩を形成し、及び遊離酸又は遊離塩基の付加塩を形成するために一般的に用いられる塩を含み、それは、規制当局によって承認されている。塩は、イオン会合、電荷-電荷相互作用、共有結合、錯体形成、配位などにより形成される。塩の性質は、薬学的に許容される限り、重要ではない。
【００３６】
幾つかの実施形態において、式（ＩＩ）〜（ＩＶ）で表される化合物は、医薬組成物として化合物を投与することにより対象を治療するために用いられる。そのために、１つの実施形態において、化合物を１種又は複数種の薬学的に許容される賦形剤（担体、希釈剤又はアジュバントを含む）を組み合わせ、本明細書でより詳細に記載される適当な組成物を形成する。
本明細書が使用する「賦形剤」という用語とは、活性医薬成分（ＡＰＩ）以外の任意の薬学的に許容される添加剤、担体、アジュバント又は他の適切な成分を指し、それが製剤及び/又は投与目的のために一般的に含まれる。「希釈剤」及び「アジュバント」は、以下で定義される。
本明細書が使用する「治療する」、「治療し」、「治療作用」および「療法」という用語とは、治癒的治療、予防的治療及び防止的治療を含むが、これらに限定されない治療を指す。予防的治療は、一般に、障害の発症を予防するが、又は個体における疾患の前臨床的に明らかな段階の発症を遅らせることを構成する。
【００３７】
「有効量」という用語は、各薬剤の量を定量化することを目的とし、代替療法に一般的に伴う有害な副作用を回避しつつ、障害の重症度および各薬剤自体の治療頻度を改善するという目標を達成する。一実施形態において、有効量は、単一の剤形又は複数の剤形で投与される
選択された投与経路にかかわらず、本発明に係る化合物（適当な水和物形態で使用可能）及び／又は本発明に係る医薬組成物を薬学的に許容される剤形として調製し、又は他の当業者に知られている他の方法を利用する。
本発明に係る医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルを変動させることにより、患者に毒性を与えずに特定の患者、組成物及び投与方式に対する所望の治療応答を達成するための有効量の活性成分を得ることができる。
【００３８】
選択された用量レベルは、使用される本発明に係る特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、治療の持続期間、使用される特定のヘッジホッグ阻害剤と併用される他の薬物、化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、病態、全般的な健康状態、過去の病歴などの医療分野で知られている要因を含む、様々な因子に依存する。
当分野の通常の知識をもつ医師または獣医師であれば、所望の医薬組成物の有効量を容易に決定し処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低レベルで医薬組成物に用いられる本発明の化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を漸増することができる。
一般に、本発明に係る化合物の適切な１日用量は治療効果を生じるために有効な最低用量である。このような有効用量は一般に上記の因子に依存する。一般に、患者に投与するための本発明の化合物の静脈内、脳室内および皮下投与量は、1日あたり約０．０００１〜約１００ｍｇ /ｋｇ体重の範囲である。投与方式は、用量に大きな影響を及ぼす。局所的な送達経路にはより高い用量を使用することができる。
必要に応じて、活性化合物の有効１日用量は、１日を通して適切な間隔で、場合により単位剤形で、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上のサブ用量（ｓｕｂ-ｄｏｓｅｓ）として別々に投与され得る。用量レベルが具体的な化合物、症状の重症度及び副作用に対する被験体の感受性により変化し得ることは、当業者にとっては明らかになる。本明細書に開示された所定の化合物の用量は、当業者によって様々な手段で容易に決定することができる。
【００３９】
新規化合物
ＷＯ２０１４１１３１９１Ａ１に係る一連の化合物には、以下に示すような化合物Ａ−５５及びＡ−９７を開示している。化合物Ａ−５５及びＡ−９７は、Ｈｈシグナル伝達経路に対する阻害活性（ＮＩＨ３Ｔ３−ＧＲＥ−ＬｕｃのＩＣ５０）がそれぞれ５．５ｎＭ（参照ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂ  ８．８ｎＭ、約１．６倍）及び８４ｎＭ（参照ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂ  ４５ｎＭ、約０．５４倍）であることが報道されている。しかしながら、脱メチル化化合物Ａ−５５は、テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン環のＣ−５位メチレン基でのベンジル位の酸化により代謝されやすいことが報道されている。その酸化的代謝は、ジヒドロイソキノリニウム類代謝産物の生成をもたらす可能性があり、毒性を引き起こし得る（ＤＭＤ３４：１３１０−１３１６，２００６）。従って、テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン環においてその酸化部位をブロックする必要がある。
【化１９】
2019524678.tif 000021
【００４０】
ある場合には、本発明は、式（ＩＩ）に示されるヘッジホッグ経路阻害剤、又はその薬学的に許容される塩、立体異性体又は溶媒和物を調製した。
【化２０】
2019524678.tif 000022
（ここで、Ｘ、Ｙ及びＹ’は、独立して、Ｃ１−３アルキル基、ＣＤ３、ＣＦ３、ＣＮ、ハロゲン化物又はＯＭｅであり；
Ｒ２及びＲ’２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−３アルキル基、ＣＤ３又はＣＦ３であり、ただし、Ｒ２及びＲ’２の少なくとも１つはＨではなく;
Ｒ１は、−ＮＲｘＲｙであり、ここで、Ｒｘ及びＲｙは、独立して、Ｈ、アルキル基、シクロアルキル基、アルキルシクロアルキル基、Ｃ(Ｏ)Ｒ”であり、或いは、−ＮＲｘＲｙは、一緒になって４乃至７員複素環を形成してもよく、ここで、４乃至７員複素環は、置換または非置換であり;
Ｒ”は、Ｃ１−５アルキル基であり;
Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４、Ｗ５、Ｗ６、Ｗ７、Ｗ８及びＷ９は、独立して、Ｈ又はＤであり、且つ
Ａは、Ｎ又はＣＨである。）
【００４１】
ある場合には、本発明は、式（ＩＩ）に示されるヘッジホッグ経路阻害剤、又はその薬学的に許容される塩、立体異性体又は溶媒和物を調製した。
【化２１】
2019524678.tif 000023
（ここで、Ｘ、Ｙ及びＹ’は、独立して、Ｃ１−３アルキル基、ＣＤ３、ＣＦ３、ＣＮ、ハロゲン化物又はＯＭｅであり；
Ｒ２及びＲ’２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−３アルキル基、ＣＤ３又はＣＦ３であり、ただし、Ｒ２及びＲ’２の少なくとも１つはＨではなく;
Ｒ１は、−ＮＲｘＲｙであり、ここで、Ｒｘ及びＲｙは、独立して、Ｈ、アルキル基、シクロアルキル基、アルキルシクロアルキル基、Ｃ(Ｏ)Ｒ”であり、或いは、−ＮｒｘＲｙは一緒になって４乃至７員複素環を形成してもよく、ここで、４乃至７員複素環は、置換または非置換であり;
Ｒ”は、Ｃ１−５アルキル基であり;
Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４、Ｗ５、Ｗ６、Ｗ７、Ｗ８及びＷ９は、独立して、Ｈ又はＤであり、且つ
Ａは、Ｎ又はＣＨである。）
【００４２】
ある場合には、本発明は、式（ＩＶ）に示されるヘッジホッグ経路阻害剤、又はその薬学的に許容される塩、又は溶媒和物を調製した。
【化２２】
2019524678.tif 000024
（ここで、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−３アルキル基、ＣＤ３又はＣＦ３であり；
Ｒ１は、−ＮＲｘＲｙであり、ここで、Ｒｘ及びＲｙは、独立して、Ｈ、アルキル基、シクロアルキル基、アルキルシクロアルキル基、Ｃ(Ｏ)Ｒ”であり、或いは、−ＮＲｘＲｙは、一緒になって４乃至７員複素環を形成してもよく、ここで、４乃至７員複素環は、置換または非置換であり；
Ｒ”は、Ｃ１−５アルキル基であり；
Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４、Ｗ５、Ｗ６、Ｗ７、Ｗ８及びＷ９は、独立して、Ｈ又はＤである。）
【００４３】
ある場合には、本発明は、式（ＩＩ）〜（ＩＶ）で表される化合物の調製方法を提供する。例えば、以下のスキーム１には、式（ＩＶ）で表される化合物を調製するために用いられる工程を述べた。幾つかの態様において、中間体Ａのチオメチル基は、酸化されてメチルスルホニル基中間体を生成することができ、それは、ＮＨＲｘＲｙで置換されて式（ＩＶ）で表される化合物を生成することができる。
【化２３】
2019524678.tif 000025
【００４４】
ある場合には、中間体Ａは、以下のスキーム２に示すように、中間体Ｂと中間体Ｃとのカップリング反応により調製することができる。
【化２４】
2019524678.tif 000026
ある場合には、中間体Ｃは、以下のスキーム３に示すように、中間体Ｄの還元反応により調製することができる。
【化２５】
2019524678.tif 000027
【００４５】
ある場合には、ギ酸が約２ｍｍｏｌ／ｍＬ〜約３．５ｍｍｏｌ／ｍＬに保持される場合には、スキーム３の還元を行うことができる。ある場合には、中間体Ｄが約０．１ｍｍｏｌ／ｍＬ至〜１．０ｍｍｏｌ／ｍＬに保持される場合には、スキーム３の還元を行うことができる。
ある場合には、本発明は、テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン環のＣ−５位にＲ配置のキラル炭素を含む式（ＩＶ）で表されるキラル化合物を開示している。例えば、表５に示す化合物Ｂ１（下記参照）は、その活性が対応するラセミ体である化合物Ｂよりも約３倍高い。ある場合には、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）でシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）阻害試験では、ラセミ化合物Ｂ（１０μＭ）が約５２％のＣＹＰ−２Ｃ９阻害を示し得るが、キラル化合物Ｂ１（１０μＭ）が約２６％のＣＹＰ−２Ｃ９阻害を示した。ラセミ化合物Ｂと比較して、キラル化合物Ｂ１は、ＣＹＰ−２Ｃ９で代謝された薬物との薬物 - 薬物相互作用（DDI）可能性がより低い可能性がある。
【００４６】
ある場合には、薬物動態学的試験では、ラセミ化合物Ｂよりも、キラル化合物Ｂ１のバイオアベイラビリティは、約１００％に倍増できることが示された。さらに、キラル化合物Ｂ１は、ラセミ化合物Ｂに対して曲線下面積（ＡＵＣ）の測定も改善されることができる。
ある場合には、ラセミ化合物Ｂは、マウス腫瘍モデルにおいて１００ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍増殖を阻害できる。逆に、マウス腫瘍モデルにおいて、キラル化合物Ｂは、経時的に腫瘍のサイズを縮小させることができ、選択された場合には、腫瘍のサイズを大幅に縮小し、認識できないサイズに近いレベルに達することができる。
ある場合には、化合物Ａ−５５（化合物Ｂ１の脱メチル化類似体）と比較する場合には、キラル化合物Ｂ１は、薬物のバイオアベイラビリティをほぼ２倍に増やし、動物体内の薬物の半減期を延長し、ＡＵＣを増加させることができる。
【００４７】
医薬組成物／製剤
一実施形態は、式（ＩＩ）〜（ＩＶ）で表される化合物、又はその立体異性体、互変異性体、水和物、溶媒和物又は薬学的に許容される塩、及び少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
幾つかの実施形態において、本発明は、ヘッジホッグ経路を調節するための方法を提供する。その方法は、哺乳動物被験体に治療的有効量の少なくとも１種の式（ＩＩ）〜（ＩＶ）で表される化合物を投与することを含む。その方法は、基底細胞癌、乳がん、子宮頸癌、結腸直腸癌、神経膠腫、肝細胞癌、白血病、肺癌、リンパ腫、髄芽腫、多発性骨髄腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、上部消化管癌、食道癌、鼻咽頭癌、皮膚がん、骨がん、腎臓癌及び肉腫の治療又は予防を含む。
【００４８】
幾つかの実施形態において、本明細書に係る化合物を医薬組成物として調製する。１種又は複数種の薬学的に許容される不活性成分を使用し、常法により医薬組成物を調製し、上記不活性成分は、活性化合物を薬学的に許容される製剤に加工するのに寄与する。適当な製剤は、選択された投与経路に依存する。本明細書に係る医薬組成物の概要は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＮｉｎｅｔｅｅｎｔｈＥｄ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ (１９９５); Ｈｏｏｖｅｒ，ＪｏｈｎＥ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ (１９７５); Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄＬａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｃｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ． (１９８０); 和ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓａｎｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ，ＳｅｖｅｎｔｈＥｄ．，ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ&Ｗｉｌｋｉｎｓ (１９９９)に示され、上記の開示されている内容は参照より本願にに組み込まれる。
本明細書で使用する医薬組成物とは、式（ＩＩ）で表される化合物と他の化学成分（即ち、薬学的に許容される不活性成分）との混合物を指し、上記他の化学成分は、例えば、担体、賦形剤、結合剤、充填剤、懸濁剤、香味剤、甘味料、崩壊剤、分散剤、界面活性剤、潤滑剤、着色剤、希釈剤、可溶化剤、湿潤剤、可塑剤、安定剤、浸透促進剤、湿潤剤、消泡剤、酸化防止剤、防腐剤の１種又は複数種の組み合わせである。医薬組成物は、化合物を生体に投与するのに役立つ。本願が提供する治療方法又は用途を施す場合には、治療的有効量の本願に記載の化合物を医薬組成物として治療される疾患、障害又は病気に罹る哺乳動物に投与する。幾つかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。治療的有効量は、疾患の重篤度、対象の年齢および相対的な健康状態、使用される化合物の薬力学的活性、および他の要因に応じて広く変わることができる。その化合物は、単独で、又は１種又は複数種の混合物の成分としての治療剤と組み合わせて使用することができる。
【００４９】
本明細書に係る医薬品製剤は、経口、非経口（例えば、静脉内、皮下、筋肉内）、鼻腔内、頬側、局所、直腸又は経皮透皮投与経路を含むがこれらに限定されない適切な投与経路により被験者に投与される。本明細書に係る医薬品製剤は、水性分散液、自己乳化型分散体、固溶体、リポソーム分散体、エアロゾル、固形剤、粉末、即放性製剤、放出制御製剤、迅速溶解型製剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、遅延放出型製剤、徐放性製剤、パルス放出型製剤、多粒子製剤、及び混合即放性製剤及び放出制御型製剤を含むが、これらに限定されない。
経口投与に適用する全ての製剤は、このような投与に適する用量である。このような用量単位の具体例は、錠剤又はカプセル剤である。幾つかの実施例において、それらの物質は、活性成分を約１〜２０００ｍｇ含み、約１〜５００ｍｇの含有は有利に作用し、通常、５〜１５０ｍｇである。ヒト又は他の哺乳動物については、適切な１日投与量は、患者の状態および他の要因に応じて広く変化するが、再度常法及び実践により決定されることができる。
【００５０】
通常の製剤技術は、例えば、（１）乾式混合、（２）直接打錠、（３）研磨、（４）乾式又は非水造粒、（５）湿式造粒、または（６）融着（ｆｕｓｉｏｎ）の１つ以上の組み合わせを含む。他の方法は、例えば、噴霧乾燥、パンコーティング、溶融造粒、造粒、流動層噴霧乾燥又はコーティング（例えば、ワースターコーティング）、タンジェンシャルスプレー、トップスプレー、打錠、押出などを含む。
本明細書に記載の固体剤形に適した担体は、アラビアゴム、ゼラチン、コロイダルシリカ、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、カゼイン酸ナトリウム、大豆レシチン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸水素二カリウム、ステアロイル乳酸ナトリウム、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、スクロース、微結晶セルロース、ラクトース、マンニトールなどを含むが、これらに限定されない。
【００５１】
本明細書に記載の固体剤形に適した充填剤は、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶セルロース、セルロース粉末、デキストロース、デキストレート、デキストラン、デンプン、アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート（ＨＰＭＣＡＳ）、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなどを含むが、これらに限定されない。
本明細書に記載の固体剤形に適した崩壊剤は、天然デンプン、例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルファー化デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム；セルロース、例えば、メチル結晶セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、カルボキシカルメロース（ｃｒｏｓｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ）；架橋セルロース、例えば、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースまたは架橋カルボキシセルロース；架橋デンプン、例えば、デンプングリコール酸ナトリウム；架橋ポリマー、例えば、クロスポビドン、架橋ポリビニルピロリドン；アルギン酸またはアルギン酸の塩、例えば、アルギン酸ナトリウム；ガム、例えば、寒天、グアーガム、イナゴマメ、カラヤ、ペクチンまたはトラガカント；デンプングリコール酸ナトリウム、ベントナイト、ラウリル硫酸ナトリウムおよびコンビネーション澱粉中のラウリル硫酸ナトリウムを含むが、これらに限定されない。
【００５２】
結合剤は、固体経口剤形の製剤に凝集性を付与し、粉末を充填するカプセル製剤については、軟質または硬質シェルカプセルに充填可能な塞栓プラグの形成に役たち、また、錠剤製剤については、圧縮後に錠剤が無傷であることを保証するとともに、圧縮又は充填の工程前の混合均一性を保証することに寄与する。本明細書に記載の固体剤形に適した結合剤の材料はカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、微結晶デキストロース、アミロース、マグネシウムアルミニウムシリケート、多糖酸、ベントナイト、ゼラチン、ポリビニルピロリドン・酢酸ビニル共重合体、クロスポビドン、ポビドン、デンプン、アルファー化デンプン、トラガント、デキストリン、糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、糖蜜、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、ラクトース）、天然又は合成ガム（例えば、アラビアゴム、トラガント、ガティガム、イサポール皮粘液）、澱粉、ポリビニルピロリドン、カラマツアラビノガラクタン（ｌａｒｃｈ  ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ）、ポリエチレングリコール、ワックス、アルギン酸ナトリウムなとを含むが、これらに限定されない。
一般的に、粉末を充填するゼラチンカプセル製剤には２０〜７０％のレベルで結合剤を使用する。直接打錠、湿式造粒、ローラー圧縮、または他の賦形剤の使用（例えば、充填剤自体を中等度の結合剤として使用可能）に関わらず、錠剤処方における結合剤の用量レベルが様々である。錠剤処方における結合剤含有量は、７０％と高いことが一般的である。
【００５３】
本明細書に記載の固体剤形に適した潤滑剤又はグライダントは、ステアリン酸、水酸化カルシウム、タルク、コーンスターチ、ステアリルフマル酸ナトリウム、アルカリ金属およびアルカリ土類金属塩（例えば、アルミニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩）、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ワックス、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコールまたはメトキシポリエチレングリコール、例えばＣａｒｂｏｗａｘ（商標）、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ６０００、プロピレングリコール、オレイン酸ナトリウム、ベヘン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセリル、安息香酸グリセリル、ラウリル硫酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウムなどを含むが、これらに限定されない。
本明細書に記載の固体剤形に適した希釈剤は、糖（ラクトース、スクロースおよびデキストロースを含む）、多糖（デキストレートおよびマルトデキストリンを含む）、ポリオール（マンニトール、キシリトールおよびソルビトールを含む）、シクロデキストリンなどを含むが、これらに限定されない。
本明細書に記載の固体剤形に適した湿潤剤は、例えば、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、第４級アンモニウム化合物（例えば、Ｐｏｌｙｑｕａｔ１０（商標））、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、ドクサートナトリウム、トリアセチン、ビタミンＥＴＰＧＳなどを含む。
【００５４】
本明細書に記載の固体剤形に適した界面活性剤は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、モノオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート、ポロキサマー（ｐｏｌａｘｏｍｅｒｓ）、胆汁酸塩、グリセリルモノステアレート、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとの共重合体、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標）（ＢＡＳＦ）なとを含む。
本明細書に記載の固体剤形に適した懸濁剤は、ポリビニルピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５又はポリビニルピロリドンＫ３０、ポリエチレングリコール；例えば、分子量で約３００〜約６０００、約３３５０〜約４０００、又は約７０００〜約５４００であってよい；ビニルピロリドン・酢酸ビニル共重合体（Ｓ６３０）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム；ガム類、例えば、トラガントガム及びアラビアゴム、グアーガム、キサンタンガム；、糖類；セルロース、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース；ポリソルベート-８０、アルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポビドンなどを含むが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明に係る方法は、種々の細胞、組織、器官の修復及び／又は機能的特性の調節におけるヘッジホッグシグナリングを阻害する、少なくとも１種の式（ＩＩ）〜（ＩＶ）で表される化合物の使用を含み、且つ以下の治療的および化粧的用途、即ち、神経組織の調節、骨および軟骨の形成および修復、精子形成の調節、平滑筋の調節、原腸に由来する肺、肝臓および他の器官の調節、造血機能の調節、皮膚および育毛の調節を有する。従って、本発明に係る方法及び組成物は、ヘッジホッグタンパク質の阻害剤に用いられる全ての用途に関する本発明に係る阻害剤の用途を含む。さらに、本発明に係る方法は、培養物（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）または動物細胞全体（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で提供される細胞に対して実施することができる。
【実施例】
【００５６】
以下に提供される実施例及び調製は、本明細書に記載の化合物およびそのような化合物を調製する方法を例示して説明する。一般的に、本明細書に記載の化合物は、一般的な化学技術分野で公知の方法により調製することができる。
本発明の化合物は、様々な合成経路（以下に記載するものを含む）により市販の材料から出発して調製することができる。本発明の原料は、既知で、市販可能であり、或いは、当技術分野で公知の方法又はそれに類似する方法により合成することができる。多くの原料は、既知の方法に従って調製することができ、特に実施例に記載の方法により調製することができる。原料を合成する場合には、場合によっては、必要に応じて官能基を適切な保護基で保護することがある。官能基は、当該分野で公知の方法に従って除去することができる。
【００５７】
材料及び方法
全ての試薬及び溶媒は、いずれも商業的に得られた。必要に応じて、全ての試薬及び溶媒はいずれも標準的な技術で精製し、即ち、ナトリウムからの蒸留によりテトラヒドロフランを精製した。全ての薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析は、シリカゲル（青島海洋化学有限公司）上で行い、且つ２５４ｎｍ、及びヨウ素蒸気又はリンモリブデン酸での紫外線可視化によりスポットを示した。図に示すように、全ての核磁気共鳴スペクトルは、ＶａｒｉａｎｕｎｉｔｙＩＮＯＶＡ４００ＮＢ分光装置を使用して４００ＭＨｚで記録し、又はＶａｒｉａｎＶｎｍｒｓ分光装置を使用して３００ＭＨｚで記録した。ＬＣ−ＭＳは、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００システムを用いてＡｇｅｌａＤｕｒａｓｈｅｌｌ  Ｃ１８  カラム（３．５μｍ，４．６×５０ｍｍ）で行った。指定された実行時間にわたって０．１  トリフルオロ酢酸エチル／水及びアセトニトリルを使用して５／９５〜９５／５の勾配で行った。
以下、本発明に係る技術案は、本発明の技術的特徴、目的および利点をより明らかに理解するために詳細に説明するが、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。以下の実施例に記載の実験方法は、特に明記しない限り、常法であり、試薬及び材料は、特記しない限り、市販されている。使用する溶媒及び薬物は、分析的純度又は化学的純度であり、溶媒は使用前に再蒸留し、無水溶媒は標準または文書化された方法に従って処理した。カラムクロマトグラフィー用シリカゲル（１００〜２００メッシュ）及び薄層クロマトグラフィー用シリカゲル（ＧＦ２５４）は、青島海洋化工場及び煙台化工場からの製品である。指定しない場合には、溶離液は、石油エーテル（６０℃〜９０℃）／酢酸エチル（ｖ／ｖ）であり、発色試薬は、ヨウ素又はリンモリブデン酸−エタノール溶液であり、全ての抽出溶媒は、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する。Ｂｒｕｃｋ−４００核磁気共鳴分光計で１Ｈ−ＮＭＲを記録し、内部標準物質としてＴＭＳを使用した。ＬＣ−ＭＳは、高速液体クロマトグラフィー−イオントラップ型質量分析計（ＬＣ−ＭＳＤＴｒａｐ）、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）、検出波長２１４ｎｍ及び２５４ｎｍ、イオントラップ質量分析計（ＥＳＩ）を用いて記録した。ＨＰＬＣカラムは、ＡｇｅｌａＤｕｒａｓｈｅｌｌＣ１８（４．６×５０ｍｍ，３．５μｍ）であり、移動相は、０．１％  ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液：アセトニトリル（５分間内で、５：９５〜９５：５）であり、流速は、１．８ｍＬ／分間であった。
【００５８】
実施例１
本実施例は、Ｒ配置を有するヘッジホッグ経路拮抗活性を持つキラル複素環式化合物（Ｂ１）を提供した。その化合物は、以下の方法により調製した。
【化２６】
2019524678.tif 000028
１）中間体Ｂ１−２の合成：
Ｂ１−１(４．３ｇ，１４．５７６ｍｍｏｌ)をテトラヒドロフラン４０ｍＬに溶解させ、−６０℃でメチルマグネシウムクロリド(ＴＨＦ中、３．０Ｍ，５．３ｍＬ，１５．９ｍｍｏｌ)の溶液を加えた。２時間反応させた後、反応混合物に水（３０ｍＬ）を加えてクエンチし、酢酸エチル（３０ｍＬ×３）で抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて濃縮した。残留物をジクロロメタン２０ｍＬ及びトリフルオロ酢酸エチル１０ｍＬに溶解させ、反応液を室温で５時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで留出し、水１０ｍＬを加えた。飽和炭酸水素ナトリウムで系のｐＨを８〜９に調整した。水相をジクロロメタン(２０ｍＬ×３)で抽出して乾燥させ、濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝４：１）により精製し、黄色固体Ｂ１−２を得た（１．７ｇ，６０％）。Ｂ１−２のＮＭＲデータは、以下の通りである。
１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ（ｐｐｍ）８．５０(ｓ，１Ｈ)，３．８５(ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ)，２．８２ (ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ)，２．６０(ｓ，３Ｈ)，２．３７(ｓ，３Ｈ)。
【００５９】
２）中間体Ｂ１−３の合成
(１Ｓ，２Ｓ)−(+)−Ｎ−ｐ-トルエンスルホニル−１，２−ジフェニルエチレンジアミン（２０９ｍｇ，０．５７ｍｍｏｌ）とジクロロ(ｐ-メチルイソプロピルベンゼン)ルテニウム(ＩＩ)ダイマー（１７４ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を２５０ｍＬフラスコに加え、窒素ガス保護下、トリエチルアミン（２．３ｇ，２２．８ｍｍｏｌ）とギ酸（２．６ｇ，５６．５ｍｍｏｌ）とのアセトニトリル（２０ｍＬ）溶液を加えた。１０分間撹拌された後、中間体Ｂ１−２（２．２ｇ，１１．４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（４０ｍＬ）溶液を加えた。反応液を室温で一晩撹拌した。水１０ｍＬを加えて反応をクエンチし、飽和炭酸水素ナトリウムでｐＨを８に調整した。アセトニトリルをロータリーエバポレーターで留出した後、ジクロロメタン（４０ｍＬ×５）を加え、有機相を合わせて乾燥させた。濃縮後、カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝１００：１〜５０：１）により精製し、粗生成物を得た（１．４ｇ）。粗生成物をメタノール２０ｍＬに溶解させ、Ｄ(−)−酒石酸（１．４ｇ，９．３ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１５ｍＬ）を加えた。７０℃で１０時間還流し、室温でろ過した。固体をメタノールで再結晶化し、中間体Ｂ１−３のＤ−酒石酸塩（１．１ｇ）を得た。単結晶Ｘ線回折測定の結果は、図１に示され、それはＲ配置を有することを確認した。
得られた中間体Ｂ１−３のＤ−酒石酸塩を水（１０ｍＬ）に溶解させ、ｐＨを８に調整した。水相をジクロロメタン(３０ｍＬ×５)で抽出し、乾燥し濃縮した後、Ｂ１−３を得た（４８３ｍｇ，２１％）。１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ (ｐｐｍ)８．２９(ｓ，１Ｈ)，４．１４(ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ)，３．４２〜３．３５(ｍ，１Ｈ)，３．１５〜３．０９(ｍ，１Ｈ)，３．０１〜２．９３(ｍ，１Ｈ)，２．８７〜２．８０(ｍ，１Ｈ)，２．５５(ｓ，３Ｈ)，１．５１(ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ)。
【００６０】
３）中間体Ｂ１−５の合成：
中間体Ｂ１−３（１３０ｍｇ，０．６７ｍｍｏｌ）、Ｂ１−４（１６８ｍｇ，０．６７ｍｍｏｌ）及びナトリウムｔｅｒｔ-ブトキシド（１２８ｍｇ，１．３３ｍｍｏｌ）をトルエン１０ｍＬに溶解させ、窒素ガス保護下、Ｐｄ(ｄｂａ)２(３８ｍｇ，０．０６７ｍｍｏｌ)とＢＩＮＡＰ(４２ｍｇ，０．０６７ｍｍｏｌ)を加えた。反応液を１２０℃で一晩撹拌した。冷却後、反応溶液をろ過した。濾液を濃縮した後カラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝５：１）により精製し、黄色油状物Ｂ１−５を得た（５０ｍｇ，１８％）。
４）生成物Ｂ１の合成：
５０ｍＬシールドチューブには中間体Ｂ１−５（３５ｍｇ，０．０８５ｍｍｏｌ）及びｔｅｒｔ-ブタノール２ｍＬを加えた後、ペルオキシ一硫酸カリウム（６５ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）を加えて５時間反応させた。４−ヒドロキシピペリジン(８６ｍｇ，０．８５ｍｍｏｌ)を５ｍＬのｔｅｒｔ-ブタノールに溶解させて反応に加え、９０℃に加熱して一晩反応させた。冷却後、溶媒をロータリーエバポレーターで留出し、食塩水(ｃｏｍｍｏｎ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ ，２０ｍＬ)を加え、酢酸エチル(１０ｍＬ×３)で抽出した。有機相を合わせて乾燥させ、濃縮した後、カラムクロマトグラフィーにより（石油エーテル：酢酸エチル＝２：１）精製し、白色固体（１１ｍｇ、２４％）Ｂ１を得た。その構造式は、以下の通りである。
【化２７】
2019524678.tif 000029
Ｂ１の１ＨＮＭＲデータは、以下の通りである。１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ (ｐｐｍ)８．３５(ｓ，１Ｈ)，８．２１(ｓ，１Ｈ)，８．１０(ｓ，１Ｈ)，７．４３(ｓ，１Ｈ)，６．６０(ｓ，１Ｈ)，５．３５(ｓ，１Ｈ)，４．４７〜４．３１(ｍ，３Ｈ)，３．９８〜３．８８(ｍ，１Ｈ)，３．４５〜３．３６(ｍ，１Ｈ)，３．３０〜３．２４(ｍ，２Ｈ)，２．９３〜２．８５(ｍ，１Ｈ)，２．７８〜２．７２(ｍ，１Ｈ)，２．３８(ｓ，３Ｈ)，２．１８(ｓ，３Ｈ)，２．００〜１．９０(ｍ，２Ｈ)，１．５４〜１．５０(ｍ，２Ｈ)，１．４２(ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ); ｅｅ＝９７％; [α]２５．９Ｄ＝−５０．０ (ｃ＝０．５，ＣＨＣｌ３)。
【００６１】
実施例２
本実施例は、Ｓ配置を有するヘッジホッグ経路拮抗活性を持つキラル複素環式化合物（Ｂ１）を提供する。その化合物は、以下の方法により調製した。
【化２８】
2019524678.tif 000030
１）中間体Ｂ２−２の合成：
Ｂ２−１（１．８ｇ，８．９ｍｍｏｌ）、テトラエチルチタネート（６ｇ，２６ｍｍｏｌ）和Ｓ−ｔｅｒｔ−ブチルスルフィンアミド（２．１４ｇ，１７．７ｍｍｏｌ）無水ジオキサン（４０ｍＬ）に溶解させ、９０℃に加熱して２時間反応させた。反応液を室温まで冷却し、溶媒を除去した。残留物を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で希釈し、その後、少量の水でクエンチした。ろ過により固体を除去し、濾液を濃縮した後、中間体Ｂ２−２を得、それを次の工程に直接使用した。中間体Ｂ２−２の１ＨＮＭＲデータは、以下の通りである。１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ(ｐｐｍ) ８．５１(ｓ，１Ｈ)，２．７６(ｓ，３Ｈ)，２．６０(ｓ，３Ｈ)，１．３１(ｓ，９Ｈ)。
２）中間体Ｂ２−３の合成：
中間体Ｂ２−２（５００ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（２５ｍＬ）に溶解させ、０℃で水素化リチウムトリ-ｔｅｒｔ-ブトキシアルミニウム（１．２４５ｇ，４．９ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。同温度で４０分間反応し続けた。水で反応をクエンチし、酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えて希釈し、ろ過した。濾液を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝５：１）により精製し、黄色油状物Ｂ２−３を得た（２２０ｍｇ，４３％）。１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ (ｐｐｍ)８．５４(ｓ，１Ｈ)，４．８５〜４．７８(ｍ，１Ｈ)，３．７７(ｓ，１Ｈ)，２．５６(ｓ，３Ｈ)，１．５８(ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ)，１．２４(ｓ，９Ｈ)。
３）中間体Ｂ２−４の合成：
中間体Ｂ２−３（２１ｍｇ，０．０１８ｍｍｏｌ）、テレフタル酸カリウム（７２ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム（２１ｍｇ，０．０１８ｍｍｏｌ）及びフッ化バリウム（１０８ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）をジオキサン（１０ｍＬ）と水（２ｍＬ）との混合溶媒に加えた。窒素ガス保護下、反応液を１０５℃に加熱して２時間反応させた。反応溶液を室温まで冷却し、ろ過し、濾液を酢酸エチル（４０ｍＬ）で希釈した。有機相を飽和食塩水で洗浄した後、乾燥させた。濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝５：１）により精製し、黄色油状物Ｂ２−４を得た（１００ｍｇ，９３％）。１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ (ｐｐｍ)８．５６(ｓ，１Ｈ)，７．０８〜７．０１(ｍ，１Ｈ)，６．７４〜６．７０(ｍ，１Ｈ)，５．７４〜５．７１(ｍ，１Ｈ)，４．８４〜４．７７(ｍ，１Ｈ)，３．４１(ｓ，１Ｈ)，２．５９(ｓ，３Ｈ)，１．５７(ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ)，１．２３(ｓ，９Ｈ)。
【００６２】
４）中間体Ｂ２−５の合成：
中間体Ｂ２−４（３３０ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）を酢酸エチル４ｍＬに溶解させ、２Ｍ  塩化水素の酢酸エチル（２ｍＬ）溶液を加えた。反応液を室温で５時間撹拌した後、溶媒をロータリーエバポレーターで留出し、残留物を水（１０ｍＬ）に溶解させ、その後、炭酸カリウム（３０５ｍｇ，２．２ｍｍｏｌ）とヨウ化カリウム（１８３ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）とを加え、反応液を１００℃で１６時間撹拌し、反応液をジクロロメタン（２０ｍＬ×４）で抽出し、有機相を合わせて乾燥させ、濃縮した後、黄色油状物Ｂ２−５を得た（８８ｍｇ，４０％）。１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)  δ (ｐｐｍ)８．３０(ｓ，１Ｈ)，４．２０〜４．１３(ｍ，１Ｈ)，３．４４〜３．３７(ｍ，１Ｈ)，３．１８〜３．１０(ｍ，１Ｈ)，３．０４〜２．９６(ｍ，１Ｈ)，２．９１〜２．８２(ｍ，１Ｈ)，２．５５(ｓ，３Ｈ)，１．５３(ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ)。
５）中間体Ｂ２−６の合成：
中間体Ｂ２−５（８８ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）、Ｂ１−４（１３７ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）及びナトリウムｔｅｒｔ-ブトキシド（８６ｍｇ，０．９０ｍｍｏｌ）をトルエン１０ｍＬに溶解させ、窒素ガス保護下、Ｐｄ(ｄｂａ)２(２６ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ)とＢＩＮＡＰ(２８ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ)とを加え、反応液を１２０℃で一晩撹拌した。冷却後、反応液をろ過した。濾液を濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝５：１）により精製し、黄色油状物Ｂ２−６を得た（４０ｍｇ，２１％）。その１ＨＮＭＲデータは、以下の通りである。１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ (ｐｐｍ)８．３６(ｓ，１Ｈ)，８．３２(ｓ，１Ｈ)，８．２２(ｓ，１Ｈ)，７．４３(ｓ，１Ｈ)，６．６４(ｓ，１Ｈ)，５．５４(ｓ，１Ｈ)，４．４１〜４．３３(ｍ，１Ｈ)，３．４６〜３．３９(ｍ，１Ｈ)，３．０７〜２．９８(ｍ，１Ｈ)，２．９４〜２．８６(ｍ，１Ｈ)，２．５６(ｓ，３Ｈ)，２．３８(ｓ，３Ｈ)，２．１８(ｓ，３Ｈ)，１．４８(ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ)。
６）生成物Ｂ２の合成：
５０ｍＬシールドチューブに中間体Ｂ２−６（４０ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）及び１０ｍＬのｔｅｒｔ-ブタノールを加えた後、ペルオキシ一硫酸カリウム（７６ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を加えて５時間反応させた。４−ヒドロキシピペリジン(４０ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ)を加えて９０℃に加熱し、一晩反応させた。冷却後、溶媒をロータリーエバポレーターで留出し、食塩水(ｃｏｍｍｏｎ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ ，２０ｍＬ)を加え、酢酸エチル(２０ｍＬ×３)で抽出した。有機相を合わせて乾燥させ、濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝２：１〜１：１）により精製し、白色固体（１１ｍｇ，２４％）Ｂ２を得た。その１ＨＮＭＲデータは、以下の通りである。１ＨＮＭＲ(４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ８．３５(ｓ，１Ｈ)，８．２１(ｓ，１Ｈ)，８．１０(ｓ，１Ｈ)，７．４２(ｓ，１Ｈ)，６．６１(ｓ，１Ｈ)，５．３５(ｓ，１Ｈ)，４．４８−４．３８(ｍ，２Ｈ)，４．３５−４．２７(ｍ，１Ｈ)，３．９９−３．８７(ｍ，１Ｈ)，３．５０−３．３６(ｍ，１Ｈ)，３．３２−３．２１(ｍ，２Ｈ)，２．９６−２．８４(ｍ，１Ｈ)，２．７９−２．７０(ｍ，１Ｈ)，２．３７ (ｓ，３Ｈ)，２．１８(ｓ，３Ｈ)，１．９９−１．９０(ｍ，２Ｈ)，１．５４−１．４８(ｍ，２Ｈ)，１．４３(ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ); ９７％ｅｅ; [α]２６．７Ｄ＝+５４．０(ｃ＝０．２，ＣＨＣｌ３)。
【００６３】
実施例３
本実施例において、実施例１〜２で得られた化合物Ｂ１、Ｂ２及び対応するラセミ化合物に対してＮＩＨ３Ｔ３−ＧＲＥ−Ｌｕｃルシフェラーゼレポーターアッセイに供して、得られた化合物のヘッジホッグ経路に対する阻害効果を有することを確認した。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＣＲＬ−１６５８，ＡＴＣＣ）を１０％ＦＢＳ(Ｈｙｃｌｏｎｅ)を含有するＤＭＥＭ(Ｇｉｂｉｃｏ)において培養した。ＧＲＥ−Ｌｕｃプラスミドは、８×ＧＬＩ−１応答エレメント（ＧＲＥ）をｐＧＬ４．２６ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の多重クローニング部位に挿入して得られたものである。ＧＲＥ−Ｌｕｃルシフェラーゼレポータープラスミドでトランスフェクションした後、ハイグロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の選択によりＮＩＨ３Ｔ３−ＧＲＥ−Ｌｕｃレポーター細胞株を構築した。単一のクローンは、ソニックヘッジホッグ（ｓＨｈ）の組換え体タンパク質又は小分子アゴニストＳＡＧ（ＡＢＩＮ６２９３４６）により確認された。選ばれたクローンは、Ｈｈシグナルの検出に用いられる。
ＮＩＨ３Ｔ３−ＧＲＥ−Ｌｕｃ細胞を完全培地（４ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｎ、１．５ｇ／Ｌ  炭酸水素ナトリウム及び１００μｇ／ｍＬハイグロマイシン及び１０％ＦＢＳを補充した４．５ｇ／Ｌグルコースを含むＤＭＥＭ）に培養した。コンフルエントになったら、細胞をトリプシン処理し、アッセイ培地（０．５％血清含有ＤＭＥＭ）に再懸濁した。細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに加えた後（最終的な細胞濃度が１５，０００個の細胞／ウェル）、細胞をさらに４８時間培養し、その後、化合物を加えた。
【００６４】
化合物をＤＭＳＯで連続的に希釈し、アッセイ培地でさらに希釈した。一実施形態において、アッセイ培地中に１０ｎＭ  ＳＡＧをＨｈシグナルのアゴニストとして加えた。化合物とアゴニストとを調製した後、慎重に培地を除去した。化合物とアゴニストとを含むアッセイ培地１００μＬを細胞中に注意深く加えた。さらに、細胞培養プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。
４８時間インキュベートした後、４０μＬ／ウェルのルシフェラーゼ培地（Ｂｒｉｇｈ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞中に加えた。培養プレートを室温で５分間穏やかに振盪しながらインキュベートした。プレートリーダー（ＰＨＥＲＡｓｔａｒＦＳ、ＢＭＧ）で発光シグナルを測定した。発光シグナルへの阻害に基づいて化合物の活性を算出した。
本実施例において、上記のＮＩＨ３Ｔ３−ＧＲＥ−Ｌｕｃルシフェラーゼレポーターアッセイに準拠して、実施例中の化合物Ｂ１、Ｂ２及びラセミ化合物Ｂの生物学的活性を測定した。小分子ＳＭＯアンタゴニストＧＤＣ−０４４９を対照薬物として使用した。結果は、表１及び図２〜４に示した。
【００６５】
【表１】
2019524678.tif 000031
結果は、Ｓ配置の化合物Ｂ２は、Ｈｈ経路に対する阻害活性が比較的低く、Ｈｈシグナル伝達経路に関連する疾患の治療には重要ではない。Ｒ配置の化合物Ｂ１は、Ｈｈ経路への阻害活性がラセミ化合物Ｂよりも３倍向上し、Ｓ配置の化合物Ｂ２より２０倍優れた、最適な化合物であることを示した。ラセミ化合物Ｂ及びＳ配置の化合物Ｂ２よりも、Ｒ配置の化合物Ｂ１は、Ｈｈシグナル伝達経路をより良好に阻害でき、したがって、Ｈｈシグナル伝達経路に関連する疾患に対してより良好な治療適用見込みを有し、且つＳ配置の化合物Ｂ２の存在による潜在的副作用リスクを回避することができる。
【００６６】
実施例４
本実施例において、実施例１で得られたＲ配置の化合物Ｂ１及びラセミ化合物Ｂに対してＣＹＰ薬物代謝酵素阻害試験を行い、Ｒ配置の化合物Ｂ１及びラセミ化合物Ｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ安全性を評価した。
実験手順
５種類の主なＣＹＰアイソザイム及びそれらの各々のプローブ基質は、ＣＹＰ−１Ａ２（フェナセチン（ｐｈｅｎａｃｅｔｉｎ），３０μＭ）、ＣＹＰ−２Ｃ９（トルブタミド，１００μＭ）、ＣＹＰ−２Ｃ１９（４０μＭ）、ＣＹＰ−２Ｄ６（デキストロメトルファン（ｄｅｘｔｒｏｍｅｔｈｏｒｐｈａｎ），５μＭ）及びＣＹＰ−３Ａ４（ミダゾラム（ｍｉｄａｚｏｌａｍ），１μＭ）である。全てのプローブはそのＫＭＳ濃度に近く又はそれ未満で使用した。混合物（２００μＬ）は、３７℃の恒温水浴においてインキュベートした。その混合物は、ＨＬＭ（０．２ｍｇ／ｍＬ）、リン酸塩緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．４）、ＮＡＤＰＨ（１μＭ）、被験化合物（１０μＭ）及び各々のＣＹＰプローブ基質を含む。ＮＡＤＰＨと反応する前に、混合物を１０分間プレインキュベートし、阻害剤-酵素相互作用を行った。その後、特定の期間（ＣＹＰ−１Ａ２、２Ｄ６及び３Ａ４は、１０分間、ＣＹＰ−２Ｃ９及び２Ｃ１９は、３０分間）で反応させた後、適量の冷アセトニトリルを含む溶液１００μＬに加えてクエンチした。そして、反応系を遠心分離してＬＣ−ＭＳ／ＭＳに注入し、基質とＣＹＰ酵素とから形成した特定の代謝物の濃度を定量した。各被験化合物は、少なくとも３回独立して試験した。実験結果は、表２に示した。
【００６７】
【表２】
2019524678.tif 000032
結果は、Ｒ配置の化合物Ｂ１及びラセミ化合物Ｂは、５つの主なＣＹＰアイソザイムのうち、４つへの阻害率が互に似ている。但し、Ｂは、１０μＭの濃度で、ＣＹＰ−２Ｃ９に対する阻害率が５０％を超え、潜在的な薬物間相互作用のリクスがあるが、Ｒ配置の化合物Ｂ１は、１０μＭの濃度で、ＣＹＰ−２Ｃ９に対する阻害率が２６％であり、良い安全性を示すことを示した。
【００６８】
実施例５
本実施例において、実施例１で得られたＲ配置の化合物Ｂ１、対応するラセミ化合物Ｂ、及び特許ＷＯ２０１４１１３１９１Ａ１に開示された脱メチル化類似体に対して薬物代謝アッセイに供して、それらの薬物動態学的特性を測定した。
具体的な実験手順
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（体重：２２０ｇ〜２５０ｇ）はＳｌａｃＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓ（上海）から購入された。全ての化合物の濃度はいずれも１ｍｇ／ｍＬであり、静脈内投与は、尾静脈内投与による用量が１ｍＬ／ｋｇであり、経口投与用量は、１０ｍＬ／ｋｇである。後眼窩静脈から採血し、採取された血液サンプルを、ＥＤＴＡ（抗凝固剤として）が加えられたチューブに入れ、冷却遠心機により遠心分離した後、−８０℃の環境に保管した。血液サンプル（２５μＬの倍率）を取り出し、それに内部標準物質を含む冷アセトニトリル（１００μＬ）を加えた。１０分間遠心して血漿タンパク質を沈殿させた。最後に、上清（１０μＬ）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに注入して分析した。
【００６９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法は、全てのサンプルはいずれも、ＬＣ−２０ＡＤ及びＣＢＭ−２０Ａコントローラー、ＤＧＵ−２０Ａ溶媒脱気装置、並びにＳＩＬ−２０Ａオートサンプラー（日本島津、コロンビア、ＭＤ、ＵＳＡ）を備えたＡＰＩ４０００ＱＴＲＡＰ質量分析計のＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムにより分析した。Ｂｏｎｎａ−Ａｇｅｌａ  Ｖｅｎｕｓｉｌ  ＸＢＰ  Ｃ１８クラム（５０×２．１ｍｍ，フィラーが粒度で５μｍ）は、ＨＰＬＣの単離に用いられた。カラム温度は、４０℃に維持した。流速は、０．３ｍＬ／ｍｉｎであり、全実行時間は、６分間である。
ＭＳ／ＭＳの定量は、上記ＡＰＩ４０００  ＱＴＲＡＰ質量分析計は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を備えたＥＳＩのポジティブモードで実行された。全ての化合物及び内部標準物質は、滞留時間１００ミリ秒で監視されるように設定した。他のＭＳ／ＭＳパラメータは、３０ｐｓｉにおける霧化ガス（ＧＳ１）、タービン圧力５５ポンド、イオンスプレー電圧４５００Ｖ、イオン源温度５００℃として設定した。選定されたイオンの遷移については、各被験物は、デクラスタリングポテンシャル（ＤＰ）及び衝突エネルギー（ＣＥ）の最適感度で試験した。最後に、ＡＢ  ＳＣＩＥＸ  Ａｎａｌｙｓｉｓｔ  １．５．２データ収集・統合ソフトウェアを使用してデータを収集し処理した。
実験で得られた結果は、以下の表３及び図５、図６に示した。
【００７０】
【表３】
2019524678.tif 000033
結果は、ラセミ化合物Ｂよりも、Ｒ配置の化合物Ｂ１は、曲線下面積がほぼ倍増し、バイオアベイラビリティも５３％から１００％まで向上したことを示し。この実験データにより、ラセミ化合物Ｂよりも、動物体内でＲ配置の化合物Ｂ１は、吸収率がより高いことを示し、同じ用量では、Ｒ配置の化合物Ｂ１は、動物体内で血中濃度がより安定して維持し、持続時間もより長くなる。経口投与量が１０ｍｇ／ｋｇであると、Ｒ配置の化合物Ｂ１は、８時間後の血中濃度が６２３ｎｇ／ｍＬになり、分子量換算で１３４０ｎＭになり、そのＩＣ５０（０．８ｎＭ）の１６７５倍であり、血漿タンパク質結合を差し引いた後、依然としてＨｈ経路を阻害する役割をよく果たすことができる。ラセミ化合物Ｂは、８時間後の血中濃度が８３ｎｇ／ｍＬであり、分子量換算で１７８ｎＭになり、そのＩＣ５０（２．７ｎＭ）の６６倍であり、さらに血漿タンパク質の結合を差し引くが、Ｈｈ経路を阻害するのに十分な血中濃度ではない。脱メチル化類似体Ａ−５５と比較して、キラル化合物Ｂ１は、バイオアベイラビリティがほぼ倍増し、半減期が増加し、且つ薬物曝露量（曲線下面積ＡＵＣ）が有意に増加した。従って、薬物動態学的試験の結果は、Ｒ配置の化合物Ｂ１は、脱メチル化類似体及びラセミ化合物よりも、Ｈｈシグナル伝達経路をよりよくより一貫して阻害することができ、Ｈｈシグナル伝達経路に関連する疾患に対してより良好な治療適用見込みを有することを示した。
【００７１】
実施例６
本実施例において、実施例１で得られたＲ配置の化合物Ｂ１及び対応するラセミ化合物Ｂはマウス腫瘍モデルで調べて、Ｈｈ経路関連腫瘍に対するＲ配置の化合物Ｂ１及びラセミ化合物Ｂの阻害效果を試験した。
具体的な実験手順
Ｐａｔｃｈｅｄ(ＰＴＣＨ)+／−，ｐ５３−／−マウスの原発性髄芽腫に由来する腫瘍細胞をＳＣＩＤマウスの右側へ皮下注射した。移植の約７日後、腫瘍体積が平均２００ｍｍ３になる場合には、治療を開始した。動物は、ブランク群、化合物Ｂ投与群及び化合物Ｂ１投与群に無作為に分けられた。化合物Ｂ１及びラセミ化合物Ｂの用量は、１００ｍｇ／ｋｇ／日であった。腫瘍体積（ｍ３）及び体重（ｇ）を、２日ごとに記録した。投与１４日後、マウスを屠殺し、腫瘍を取り出した。実験結果は、図７及び図８に示した。
用量１００ｍｇ／ｋｇでは、ラセミ化合物Ｂは、腫瘍増殖を停止させたに過ぎず、Ｂ１は、腫瘍体積をほぼ消失させるまで収縮させることができる。実験結果は、Ｒ配置の化合物Ｂ１は、より顕著で予想外の抗腫瘍効果を有することを示した。
上記実施例から分かるように、本発明の実施例１のキラル化合物Ｂ１は、ヘッジホッグ経路をブロックできることにより、細胞の異常増殖を阻害し、腫瘍細胞の転移・再発をブロックすることができる。ラセミ化合物Ｂよりも、キラル化合物Ｂ１は、より優れたＨｈ経路抑制活性、より優れた安全性、より優れたバイオアベイラビリティを有する。生体内で、キラル化合物Ｂ１は、より顕著で予想外の、細胞の異常増殖を阻害し、腫瘍細胞の転移・再発をブロックする效果を有し、腫瘍治療のより良い応用見込みを有する。
【００７２】
合成
実施例７：(Ｒ)−１−(６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン−２−イル)ピペリジン−４−オール(Ｂ１)の調製
【化２９】
2019524678.tif 000034
合成経路Ａ：
【化３０】
2019524678.tif 000035
５−メチル−２−(メチルチオ)−７，８−ジヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン（Ｂ１−２）。
Ｎ２雰囲気下、−６０℃で、メチルマグネシウムクロリド（３．０Ｍ  ＴＨＦ溶液，５．３ｍＬ，１５．９ｍｍｏｌ）を２−(メチルチオ)−５−オキソ−７，８−ジヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン−６（化合物Ｂ１−１，４．３ｇ，１４．５７６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４０ｍＬ）に滴下した。同温度で２時間撹拌した後、反応混合物をブライン（３０ｍＬ）でクエンチした。得られた混合物をろ過し、濾液をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過した。濾液を減圧下で濃縮した。残留物を２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、ＴＦＡ（１０ｍＬ）を加えた。混合物を室温で５ｈ撹拌して減圧下で濃縮した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加えて残留物をｐＨ８〜９に調整し、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過した。濾液を濃縮した後カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃｖ：ｖ＝１／３）により精製し、化合物Ｂ１−２を黄色固体として得た（１．７ｇ，６０％）。１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ (ｐｐｍ) ８．５０ (ｓ，１Ｈ)，３．８５ (ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ)，２．８２ (ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ)，２．６０ (ｓ，３Ｈ)，２．３７ (ｓ，３Ｈ)。
【００７３】
(Ｒ)−５−メチル−２−(メチルチオ)−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン(Ｂ１−３)。
(１Ｓ，２Ｓ)−(+)−Ｎ−(４−トルエンスルホニル)−１，２−ジフェニルエチレンジアミン（２０９ｍｇ，０．５７１ｍｍｏｌ）とジクロロ(ｐ-メチルイソプロピルベンゼン)ルテニウム（ＩＩ）ダイマー（１７４ｍｇ，０．２８４ｍｍｏｌ）とを丸底フラスコ（２５０ｍＬ）に入れた。そして、Ｎ２雰囲気下でＴＥＡ（２．３ｇ，２２．７７２ｍｍｏｌ）とギ酸（２．６ｇ，５６．５２２ｍｍｏｌ）とのアセトニトリル（２０ｍＬ）溶液を加え、混合物を室温で１０分間撹拌した。５−メチル−２−(メチルチオ)−７，８−ジヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン（２．２ｇ，１１．４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（４０ｍＬ）溶液を加え、Ｎ２雰囲気下、室温でその混合物を一晩撹拌した。反応溶液を水（１０ｍＬ）でクエンチし、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加えてｐＨ８〜９に調整した。混合物を減圧下で濃縮して大部分のアセトニトリルを除去し、ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ×５）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過した。濾液を濃縮した後カラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨｖ：ｖ＝１００／１乃至５０／１）により精製し、褐色固体を得（１．４ｇ，ｅｅ＝６０％）、その固体を２０ｍＬのＭｅＯＨに溶解させた後、７０℃でＤ−酒石酸（１．４ｇ，９．３３３ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（５ｍＬ）溶液を加えた。混合物を同温度で２時間撹拌した。得られた沈殿物をろ過により分離し、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）で洗浄した。固体を１５ｍＬのＭｅＯＨに加え、７０℃で１０時間撹拌した。室温まで冷却した後、懸濁液をろ過した。固体をＭｅＯＨ（１５ｍＬ）に加え、さらに７０℃で１０ｈ撹拌した。反応を室温まで冷却してろ過し、Ｄ−酒石酸塩である白色固体（１．２ｇ）を得、それを１０ｍＬ水に溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加えてｐＨ８〜９に調節した。ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）で水溶液を抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過した。濾液を減圧下で濃縮し、化合物Ｂ１−３を白色固体として得た（４８３ｍｇ，２２％）。[α]２８Ｄ＝+６４．８ (ｃ＝０．５，ＣＨＣｌ３)．１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ (ｐｐｍ) ８．２９ (ｓ，１Ｈ)，４．１４ (ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ)，３．４２−３．３５ (ｍ，１Ｈ)，３．１５−３．０９ (ｍ，１Ｈ)，３．０１−２．９３ (ｍ，１Ｈ)，２．８７−２．８０ (ｍ，１Ｈ)，２．５５ (ｓ，３Ｈ)，１．５１ (ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ)。
(Ｒ)−６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−５−メチル−２−(メチルチオ)−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン (Ｂ１−５)
(Ｒ)−５−メチル−２−(メチルチオ)−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン（１３０ｍｇ，０．６７ｍｍｏｌ）と２'，５'−ジクロロ−３，５−ジメチル−２，４'−ビピリジン（Ｂ１−４，１６８ｍｇ，０．０．６７ｍｍｏｌ）とナトリウムｔｅｒｔ-ブトキシド (１２８ｍｇ，１．３３ｍｍｏｌ)とＰｄ(ｄｂａ)２（３８ｍｇ，０．０７ｍｍｏｌ）とＢＩＮＡＰ (４２ｍｇ，０．０７ｍｍｏｌ)とのトルエン（１０ｍＬ）溶液を、Ｎ２雰囲気下、１２０℃で一晩反応させた。室温まで冷却した後、反応混合物をろ過し、濾液をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で洗浄した。濾液を濃縮した後、残留物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃｖ：ｖ＝５／１）により精製し、化合物Ｂ１−５を黄色油状物として得た（５０ｍｇ，１８％）[α]２６Ｄ＝−８８．４ (ｃ＝０．５，ＣＨＣｌ３)。
【００７４】
(Ｒ)−１−(６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン−２−イル)ピペリジン−４−オール (Ｂ１)
１０ｍＬシールドチューブに(Ｒ)−６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−５−メチル−２−(メチルチオ)−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン（化合物Ｂ１−５，５０ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）及びｔ−ＢｕＯＨ（５ｍＬ）を加えた。室温でペルオキシ一硫酸カリウム（ｏｘｏｎｅ）（９３ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１ｍＬ）溶液を徐々に加え、５時間撹拌した。そして、４−ヒドロキシピペリジン（６１ｍｇ，０．６１ｍｍｏｌ）を反応溶液に加え、混合物を９０℃で３６時間撹拌した。溶媒を除去した後、残留物を飽和食塩水（２０ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾液を濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃｖ：ｖ＝１／１）により精製し、化合物Ｂ１を黄色固体として得た（１５ｍｇ，２６％）。[α]２６Ｄ＝−５０．０ (ｃ＝０．５，ＣＨＣｌ３); ９７％ｅｅ．１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ (ｐｐｍ)８．３５ (ｓ，１Ｈ)，８．２１ (ｓ，１Ｈ)，８．１０ (ｓ，１Ｈ)，７．４３ (ｓ，１Ｈ)，６．６０ (ｓ，１Ｈ)，５．４０−５．３１ (ｍ，１Ｈ)，４．４７−４．３１ (ｍ，３Ｈ)，３．９８−３．８８ (ｍ，１Ｈ)，３．４５−３．３６ (ｍ，１Ｈ)，３．３０−３．２４ (ｍ，２Ｈ)，２．９３−２．８５ (ｍ，１Ｈ)，２．７８−２．７２ (ｍ，１Ｈ)２．３８ (ｓ，３Ｈ)，２．１８ (ｓ，３Ｈ)，２．００−１．９０ (ｍ，２Ｈ)，１．５４−１．５０ (ｍ，２Ｈ)，１．４２ (ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ)．１３ＣＮＭＲ (１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ(ｐｐｍ) １６３．８８，１６０．５３，１５６．４０，１５５．９２，１５２．８８，１４８．３９，１４７．３８，１４７．３６，１３８．７２，１３３．１５，１３１．３６，１２０．３７，１１８．３７，１０７．５１，６８．４４，４８．２８，４１．６３，３７．４３，３４．３３，３１．８２，２０．４４，１８．６２，１８．２５．ＨＲＭＳ (ＥＳＩ)：算出値Ｃ２５Ｈ２９ＣｌＮ６Ｏ [Ｍ+Ｈ]+４６５．２１６４，実測値４６５．２１６６。
【００７５】
実施例８：(Ｓ)−１−(６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン−２−イル)ピペリジン−４−オール (Ｂ２)の調製
【化３１】
2019524678.tif 000036
合成路径Ｂ：
【化３２】
2019524678.tif 000037
(Ｓ，Ｅ)−Ｎ−(１−(４−クロロ−２−(メチルチオ)ピリミジン−５−イル)エチリデン)−２−メチルプロパン−２−スルフィンアミド(Ｂ２−２)。
１−(４−クロロ−２−(メチルチオ)ピリミジン−５−イル)エタン−1−オン（化合物Ｂ２−１，１．８ｇ，８．８７ｍｍｏｌ）とＴｉ(ＯＥｔ)４（６ｇ，２６．３２ｍｍｏｌ）と(Ｓ)−(−)−２−メチル−２−プロパンスルフィンアミド(２．１４ｇ，１７．６９ｍｍｏｌ)との１，４−ジオキサン（４０ｍＬ）の混合物をＮ２雰囲気下、９０℃で２時間反応させた。反応を室温まで冷却し、減圧下で濃縮した。残留物に１５０ｍＬの酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）を加えた後、撹拌しながらＨ２Ｏ（１ｍＬ）を加えた。得られた混合物を室温で０．５時間撹拌した後、ろ過した。濾液をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過した。濾液を濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ、ｖ：ｖ＝３／１）により精製し、化合物Ｂ２−２（１．９ｇ、７０％）を赤色油状物として得た。１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ(ｐｐｍ) ８．５１ (ｓ，１Ｈ)，２．７６ (ｓ，３Ｈ)，２．６０ (ｓ，３Ｈ)，１．３１ (ｓ，９Ｈ)。
(Ｓ)−Ｎ−((Ｓ)−１−(４−クロロ−２−(メチルチオ)ピリミジン−５−イル)エチル)−２−メチルプロパン−２−スルフィンアミド(Ｂ２−３)。
０℃で(Ｓ，Ｅ)−Ｎ−(１−(４−クロロ−２−(メチルチオ)ピリミジン−５−イル)エチリデン)−２−メチルプロパン−２−スルフィンアミドの２５ｍＬ  乾燥ＴＨＦ溶液にＬｉＡｌＨ[ＯＣ(ＣＨ３)３]３ (１．２４ｇ，４．９ｍｍｏｌ) 分割して加え、混合物を同温度で４０分間撹拌した。そして、混合物をＨ２Ｏ（１ｍＬ）で処理し、減圧下で濃縮して大部分のＴＨＦを除去した。残留物にＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）を加え、混合物を室温で０．５時間撹拌した。ろ過し、濾液をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過した。濾液を濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃｖ：ｖ＝５／１）により精製し、化合物Ｂ２−３を黄色油状物として得た（２２０ｍｇ，４３％）。[α]２７Ｄ＝+１９．２ (ｃ０．５，ＣＨＣｌ３)．１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ (ｐｐｍ)８．５４ (ｓ，１Ｈ)，４．８５−４．７８ (ｍ，１Ｈ)，３．７７ (ｓ，１Ｈ)，２．５６ (ｓ，３Ｈ)，１．５８ (ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ)，１．２４ (ｓ，９Ｈ)。
【００７６】
(Ｓ)−２−メチル−Ｎ−((Ｓ)−１−(２−(メチルチオ)−４−ビニルピリミジン−５−イル)エチル)プロパン−２−スルフィンアミド(Ｂ２−４)。
(Ｓ)−Ｎ−((Ｓ)−１−(４−クロロ−２−(メチルチオ)ピリミジン−５−イル)エチル)−２−メチルプロパン−２−スルフィンアミド（１１０ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）とカリウムビニルトリフルオロボラート（７２ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）とＰｄ(ＰＰｈ３)４（２１ｍｇ，０．０１８ｍｍｏｌ）とＣｓＦ（１０８ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）との１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）と水（２ｍＬ）との混合溶液中の混合物をＮ２雰囲気下、１０５℃で２時間反応させた。反応を室温まで冷却し、減圧下で濃縮し、１，４−ジオキサンを除去した。残留物をＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過した。濾液を濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃｖ：ｖ＝５／１）により精製し、化合物Ｂ２−４を黄色油状物として得た（１００ｍｇ，９３％）。[α]２７Ｄ＝+１２．０ (ｃ０．５，ＣＨＣｌ３)．１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ (ｐｐｍ)８．５５ (ｓ，１Ｈ)，７．０８−７．０１ (ｍ，１Ｈ)，６．７１ (ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ)，５．７２ (ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ)，４．８５−４．７３ (ｍ，１Ｈ)，３．４５ (ｓ，１Ｈ)，２．５８ (ｓ，３Ｈ)，１．５６ (ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ)，１．２２ (ｓ，９Ｈ)。
(Ｓ)−５−メチル−２−(メチルチオ)−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン(Ｂ２−５)。
(Ｓ)−２−メチル−Ｎ−((Ｓ)−１−(２−(メチルチオ)−４−ビニルピリミジン−５−イル)エチル)プロパン−２−スルフィンアミド（３３０ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）のＥｔＯＡｃ (４ｍＬ)溶液に２Ｎ  ＨＣｌ (４ｍｍｏｌ)のＥｔＯＡｃ (２ｍＬ)溶液を加えた。混合物を室温で５時間撹拌し、減圧下で濃縮した。残留物を水（１０ｍＬ）に溶解させた後、Ｋ２ＣＯ３（３０５ｍｇ，２．２ｍｍｏｌ）とＫＩ（１８３ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１００℃で一晩撹拌した。室温まで冷却した後、ろ過した。濾液をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ×４）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過した。濃縮し、化合物Ｂ２−５を黄色油状物として得た（８８ｍｇ，０．４５１ｍｍｏｌ、４０％）。[α]２５Ｄ＝−４８．０ (ｃ０．５，ＣＨＣｌ３)．１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ ８．３０ (ｓ，１Ｈ)，４．２０−４．１３ (ｍ，１Ｈ)，３．４４−３．３７ (ｍ，１Ｈ)，３．１８−３．１０ (ｍ，１Ｈ)，３．０４−２．９６ (ｍ，１Ｈ)，２．９１−２．８２ (ｍ，１Ｈ)，２．５５ (ｓ，３Ｈ)，１．５３ (ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ)。
【００７７】
(Ｓ)−６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−５−メチル−２−(メチルチオ)−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン（Ｂ２−６）
(Ｓ)−５−メチル−２−(メチルチオ)−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン（８８ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）、２'，５'−ジクロロ−３，５−ジメチル−２，４'−ビピリジン（１３７ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）、ナトリウムｔｅｒｔ-ブトキシド（８６ｍｇ，０．９ｍｍｏｌ）、ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム(０)（Ｐｄ(ｄｂａ)２，２６ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ）及び２,２'-ビス（ジフェニルホスフィノ）-１,１'-ビナフチル（ＢＩＮＡＰ，２８ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ）をトルエン（１０ｍＬ）にＮ２雰囲気下、１２０℃で一晩反応させた。室温まで冷却した後、反応混合物をろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で洗浄した。濾液を濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃｖ／ｖ＝５／１）により精製し、化合物Ｂ２−６を黄色油状物として得た（４０ｍｇ，２１％）。[α]２２Ｄ＝+８８．０ (ｃ０．２，ＣＨＣｌ３)．１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ (ｐｐｍ)８．３６ (ｓ，１Ｈ)，８．３２ (ｓ，１Ｈ)，８．２２ (ｓ，１Ｈ)，７．４３ (ｓ，１Ｈ)，６．６４ (ｓ，１Ｈ)，５．６０−５．５１ (ｍ，１Ｈ)，４．４１−４．３３ (ｍ，１Ｈ)，３．４６−３．３９ (ｍ，１Ｈ)，３．０７−２．９８ (ｍ，１Ｈ)，２．９４−２．８６ (ｍ，１Ｈ)，２．５６ (ｓ，３Ｈ)，２．３８ (ｓ，３Ｈ)，２．１８ (ｓ，３Ｈ)，１．４８ (ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ)。
(Ｓ)−１−(６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン−２−イル)ピペリジン−４−オール (Ｂ２)。
１０ｍＬシールドチューブに(Ｓ)−６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−５−メチル−２−(メチルチオ)−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン（４０ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）とｔ−ＢｕＯＨ (５ｍＬ)を加えた。室温でペルオキシ一硫酸カリウム（７５ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（ １ｍＬ）溶液を徐々に加え，５時間撹拌した。そして、４−ヒドロキシピペリジン（４０ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）を反応溶液に加え、混合物を９０℃で一晩撹拌した。溶媒を除去した後，残留物を食塩水（２０ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過した。濾液を濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃｖ／ｖ＝１／１）により精製し、化合物Ｂ２を黄色固体として得た（１１ｍｇ，２４％）。[α]２７Ｄ＝+５４．０ (ｃ＝０．２，ＣＨＣｌ３); ９９％ｅｅ．１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ (ｐｐｍ)８．３５ (ｓ，１Ｈ)，８．２１ (ｓ，１Ｈ)，８．１０ (ｓ，１Ｈ)，７．４２ (ｓ，１Ｈ)，６．６１ (ｓ，１Ｈ)，５．４０−５．３１ (ｍ，１Ｈ)，４．５０−４．２９ (ｍ，３Ｈ)，３．９９−３．８７ (ｍ，１Ｈ)，３．５０−３．３６ (ｍ，１Ｈ)，３．３２−３．２１ (ｍ，２Ｈ)，２．９６−２．８４ (ｍ，１Ｈ)，２．７９−２．７０ (ｍ，１Ｈ)，２．３７ (ｓ，３Ｈ)，２．１８ (ｓ，３Ｈ)，１．９９−１．９０ (ｍ，２Ｈ)，１．５４−１．４８ (ｍ，２Ｈ)，１．４３ (ｓ，３Ｈ)．１３ＣＮＭＲ (１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ (ｐｐｍ)１６３．８８，１６０．５３，１５６．４０，１５５．９２，１５２．８５，１４８．３７，１４７．３６，１３８．７３，１３３．１６，１３１．３７，１２０．３７，１１８．３６，１０７．５２，６８．４３，４８．２８，４１．６３，３７．４３，３４．３２，３１．８１，２０．４３，１８．６１，１８．２４．ＨＲＭＳ (ＥＳＩ)：計算値Ｃ２５Ｈ２９ＣｌＮ６Ｏ [Ｍ+Ｈ]+４６５．２１６４，実測値４６５．２１６５。
【００７８】
実施例９：(５Ｓ)−６−[５−クロロ−４−(３，５−ジメチル−２−ピリジル)−２−ピリジル]−Ｎ−シクロプロピル−５−メチル−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−ピリド[４，３−ｄ]ピリミジン−２−アミン(Ｂ３)の調製
【化３３】
2019524678.tif 000038
合成路径Ｃ：
【化３４】
2019524678.tif 000039
(Ｓ)−６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−Ｎ−シクロプロピル−５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン−２−アミン（Ｂ３）。
１０ｍＬシールドチューブに(Ｓ)−６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−５−メチル−２−(メチルチオ)−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン（化合物Ｂ２−６，４０ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）とｔ−ＢｕＯＨ（５ｍＬ）を加えた。室温でペルオキシ一硫酸カリウム（７５ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１ｍＬ）溶液を加え，５時間撹拌した。そして、シクロプロピルアミン（５７ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を反応溶液に加え，混合物を９０℃で３６時間撹拌した。溶媒を除去した後，残留物を飽和食塩水（２０ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ，ろ過した。濾液を濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃｖ／ｖ＝２／１〜１／１）により精製し、化合物Ｂ３を黄色固体として得た（１４ｍｇ，３４％）。[α]２２Ｄ＝+８６．０ (ｃ０．２，ＣＨＣｌ３); ９９％ｅｅ．１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ (ｐｐｍ)８．３６ (ｓ，１Ｈ)，８．２１ (ｓ，１Ｈ)，８．１７ (ｓ，１Ｈ)，７．４３ (ｓ，１Ｈ)，６．６１ (ｓ，１Ｈ)，５．４５−５．３６ (ｍ，１Ｈ)，５．２６ (ｓ，１Ｈ)，４．４３−４．３１ (ｍ，１Ｈ)，３．４６−３．３６ (ｍ，１Ｈ)，２．９６−２．８６ (ｍ，１Ｈ)，２．８０−２，７１ (ｍ，２Ｈ)，２．３８ (ｓ，３Ｈ)，２．１８ (ｓ，３Ｈ)，１．４４ (ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，３Ｈ)，０．８４−０．７９ (ｍ，２Ｈ)，０．５７−０．５０ (ｍ，２Ｈ)。
【００７９】
実施例１０：(Ｒ)−６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−Ｎ−シクロプロピル−５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン−２−アミン(Ｂ４)
【化３５】
2019524678.tif 000040
合成路径Ｄ：
【化３６】
2019524678.tif 000041
(Ｒ)−６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−Ｎ−シクロプロピル−５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン−２−アミン(Ｂ４)。
１０ｍＬシールドチューブに(Ｒ)−６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−５−メチル−２−(メチルチオ)−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン（化合物Ｂ１−５，３５ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）とｔ−ＢｕＯＨ（５ｍＬ）を加えた。室温でペルオキシ一硫酸カリウム（６５ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１ｍＬ）溶液を加え，５時間撹拌した。そして、シクロプロピルアミン（４８ｍｇ，０．８５ｍｍｏｌ）を反応溶液に加え，混合物を９０℃で３６時間撹拌した。溶媒を除去した後，残留物を飽和食塩水（２０ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ，ろ過した。濾液を濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃｖ／ｖ＝２／１〜１／１）により精製し、化合物Ｂ４を黄色固体として得た（７ｍｇ，２０％）。[α]２２Ｄ＝−７６．４ (ｃ０．５，ＣＨＣｌ３); ９７％ｅｅ．１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ (ｐｐｍ)８．３５ (ｓ，１Ｈ)，８．２１ (ｓ，１Ｈ)，８．１６ (ｓ，１Ｈ)，７．４２ (ｓ，１Ｈ)，６．６１ (ｓ，１Ｈ)，５．４４−５．３５ (ｍ，１Ｈ)，５．２２ (ｓ，１Ｈ)，４．４２−４．３０ (ｍ，１Ｈ)，３．４４−３．３７ (ｍ，１Ｈ)，２．９７−２．８５ (ｍ，１Ｈ)，２．８０−２．７０ (ｍ，２Ｈ)，２．３７ (ｓ，３Ｈ)，２．１７ (ｓ，３Ｈ)，１．４４ (ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ)，０．８６−０．７９ (ｍ，２Ｈ)，０．５４−０．５１ (ｍ，２Ｈ)。
【００８０】
実施例１１：(Ｒ)−Ｎ−(６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン−２−イル)プロピオンアミド(Ｂ５)の調製。
【化３７】
2019524678.tif 000042
合成路径Ｅ：
【化３８】
2019524678.tif 000043
(Ｒ)−６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン−２−アミン(Ｂ５−１)。
４５ｍＬシールドチューブに(Ｒ)−６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−５−メチル−２−(メチルチオ)−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン（化合物Ｂ１−５，５５０ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）とｔ−ＢｕＯＨ（２０ｍＬ）を加えた。室温でペルオキシ一硫酸カリウム（８２０ｍｇ，２．６ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（５ｍＬ）溶液を徐々に加え，５時間撹拌した。そして、ＮＨ４ＯＨ（２５−２８％，３ｍＬ）を反応溶液に加え，混合物を９０℃で３６時間撹拌した。溶媒を除去した後，残留物を飽和食塩水（２０ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ，ろ過した。濾液を濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃｖ／ｖ＝１／１〜２／１）により精製し、化合物Ｂ５−１を黄色固体として得た（２００ｍｇ，３９％）。
(Ｒ)−Ｎ−(６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン−２−イル)プロピオンアミド(Ｂ５)。
(Ｒ)−６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン−２−アミン（Ｂ５−１，５０ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１４１ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）との１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２溶液にプロピオニルクロリド（１２０ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で５時間撹拌した。反応終了後，混合物を飽和食塩水（２０ｍＬ）で処理し、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）で抽出した。有機層を濃縮し，残留物を１０ｍＬのＴＨＦに溶解させた。そして、ＮＨ４ＯＨ（２５〜２８％，２ｍＬ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。反応を飽和食塩水（２０ｍＬ）で希釈し，ＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ，ろ過し。濾液を濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃｖ／ｖ＝１／１）により精製し、化合物Ｂ５を白色固体として得た（２０ｍｇ，３５％）。１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ (ｐｐｍ)８．３８ (ｓ，１Ｈ)，８．３５ (ｓ，１Ｈ)，８．２２ (ｓ，１Ｈ)，８．０４ (ｓ，１Ｈ)，７．４３ (ｓ，１Ｈ)，６．６４ (ｓ，１Ｈ)，５．６２−５．５０ (ｍ，１Ｈ)，４．４１−４．３８ (ｍ，１Ｈ)，３．４６−３．３９ (ｍ，１Ｈ)，３．０７−２．９８ (ｍ，１Ｈ)，２．９０−２．８６ (ｍ，１Ｈ)，２．８０−２．６６ (ｍ，２Ｈ)，２．３８ (ｓ，３Ｈ)，２．１８ (ｓ，３Ｈ)，１．４８ (ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ)，１．２３ (ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ)。
【００８１】
実施例１２：(Ｒ)−Ｎ−(６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン−２−イル)ピバルアミド（ｐｉｖａｌａｍｉｄｅ）(Ｂ６)の調製。
【化３９】
2019524678.tif 000044
合成路径Ｆ：
【化４０】
2019524678.tif 000045
(Ｒ)−Ｎ−(６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン−２−イル) ピバルアミド(Ｂ６)
(Ｒ)−６−(５'−クロロ−３，５−ジメチル−[２，４'−ビピリジン]−２'−イル)−５−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロピリド[４，３−ｄ]ピリミジン−２−アミン（１００ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）とトリメチルアセチルクロライド（１５７ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（２０１ｍｇ，１．５６ｍｍｏｌ）との５ｍＬの１，４−ジオキサンの混合物を１００℃で一晩撹拌した。反応を２Ｍ  ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ×２）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過した。濾液を濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃｖ／ｖ＝２／１）により精製し、化合物Ｂ６を白色固体として得た（４０ｍｇ，３２％）。１ＨＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３) δ (ｐｐｍ) ８．４１ (ｓ，１Ｈ)，８．３５ (ｓ，１Ｈ)，８．２２ (ｓ，１Ｈ)，８．０３ (ｓ，１Ｈ)，７．４３ (ｓ，１Ｈ)，６．６３ (ｓ，１Ｈ)，５．６５−５．４３ (ｍ，１Ｈ)，４．４７−４．２７ (ｍ，１Ｈ)，３．４８−３．３０ (ｍ，１Ｈ)，３．０９−３．０１ (ｍ，１Ｈ)，２．９４−２．８６ (ｍ，１Ｈ)，２．３７ (ｓ，３Ｈ)，２．１８ (ｓ，３Ｈ)，１．４７ (ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ)，１．３３ (ｓ，９Ｈ)。
【００８２】
実施例１３：シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）阻害のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
ＣＹＰ阻害試験において化合物Ｂ及びＢ１を試験した。
ＣＹＰ阻害試験
５つの主なＣＹＰアイソザイム及びそれらの対応する基質は、それぞれＣＹＰ−１Ａ２（フェナセチン，３０μＭ）、ＣＹＰ２Ａ６（トルブタミド，１００μＭ）、ＣＹＰ２Ｃ９（トルブタミド水酸化）、ＣＹＰ２Ｃ１９ （Ｓ−メフェニトイン，４０μＭ）、ＣＹＰ２Ｄ６（デキストロメトルファン，５μＭ）及びＣＹＰ３Ａ４（ミダゾラム，１μＭ）である。全てのプローブはいずれもそのＫＭＳ濃度に近く又はそれ未満で使用された。
混合物（２００μＬ）を３７℃でインキュベートした。その混合物は、ＨＬＭ（０．２ｍｇ／ｍＬ）、リン酸塩緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ約７．４）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ＮＡＤＰＨ（１μＭ）、被験化合物（化合物Ｂ又は化合物Ｂ１）及び各々の試験用のＣＹＰアイソザイムの基質を含む。
ＮＡＤＰＨと反応する前に、上記混合物を１０分間プレインキュベートし、阻害剤と酵素との相互作用を行った。その後、特定の期間（ＣＹＰ−１Ａ２、２Ｄ６及び３Ａ４が１０分間、ＣＹＰ−２Ｃ９及び２Ｃ１９が３０分間）で約１００μＬの冷アセトニトリルを加えて反応をクエンチした。その後、クエンチした混合物を遠心分離した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより混合物のアリコートを分析して各ＣＹＰアイソザイムの特定代謝産物の濃度を定量することができる。各被験化合物は、少なくとも３つの独立した試験を完成した測定された。ＣＹＰ阻害試験の結果は、以下の表６に示した。
【００８３】
【表４】
2019524678.tif 000046
表６により、濃度１０μＭでは、化合物Ｂは、ＣＹＰ−２Ｃ９の５０％を超える阻害率を示したが、化合物Ｂ１は、ＣＹＰ−２Ｃ９の約２６％の阻害率を示した。
【００８４】
実施例１４：化合物Ｂ、Ｂ１及びＡ−５５の薬物動態学的試験
被験化合物Ｂ、Ｂ１及びＡ−５５の薬物動態学的評価は、以下のように試験した。。
薬物動態学的試験：
被験者は、ＳｌａｃＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓ（上海，中国）から購入されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（体重約２２０ｇ〜約２５０ｇ）である。全ての被験化合物の濃度はいずれも１ｍｇ／ｍＬであり、１群の被験者は、用量１ｍＬ／ｋｇで尾静脈内に静脈内投与し、又は別の群の被験者は、用量１０ｍＬ／ｋｇで経口投与した。次いで、注射／投与後の時間間隔で後眼窩静脈叢穿刺により血液サンプルのアリコートを収集した。血液サンプルを、ＥＤＴＡが加えられたチューブに入れ、遠心分離し、分析前に−８０℃の環境に保管した。化合物でラットを処理する前に、同様な方法によりブランク血漿を収集した。保管された血液サンプルから約２５μＬを除去することにより分析用の血漿サンプルを取得し、冷アセトニトリル（約１００μＬ）を内部標準物質として加え、１０分間遠心して血漿タンパク質を沈殿させ、約１０μＬの上清を収集し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム分析に使用した。
【００８５】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析方法：
全てのサンプルは、日本島津ＬＣ−２０ＡＤポンプ、日本島津ＣＢＭ−２０Ａコントローラー、ＳＩＬ−２０Ａオートサンプラー及びＤＧＵ−２０Ａ脱気装置（日本島津，コロンビア，ＭＤ，ＵＳＡ）を備えたＡＰＩ４０００ＱＴＲＡＰ（商標） ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムにより分析した。ＶｅｎｕｓｉｌＸＢＰＣ１８ＨＰＬＣカラム（２．１×５０ｍｍ;５ μｍ）（Ｂｏｎｎａ−Ａｇｅｌａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、ＨＰＬＣ単離に用いられ、カラム温度が４０℃の恒温である。流速は、０．３ｍＬ／ｍｉｎにｖ、全実行時間は、６分間である。
多重反応モニタリング（ＭＲＭ）及びエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ+）モードを備えた上記ＡＰＩ４０００ＱＴＲＡＰ質量分析計を使用し、ＭＳ／ＭＳにより定量した。全ての化合物及び内部標準物質は、滞留時間１００ミリ秒で監視されるように設定した。最後に、データの全ての操作、取得および分析は、Analyst（バージョン1.5.2、AB Sciex、USA）によって制御された。他のＭＳ／ＭＳパラメータは、３０ｐｓｉにおける霧化ガス（ＧＳ１）、タービン圧力が５５ポンド、イオンスプレー電圧が４５００Ｖ、イオン源温度が５００℃であるようにに設定した。各被分析物に対して最適化されたデクラスタリングポテンシャル（ＤＰ）およびエントランスポテンシャル（ＥＰ）値を用いた被分析物のＭＲＭ測定を行った。最後に、全ての操作、データ収集及び分析は、いずれもＡｎａｌｙｓｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．５．２，ＡＢＳｃｉｅｘ，ＵＳＡ）により御製した。
実験結果は、以下の表７及び図１４〜１５に示した。
【００８６】
【表５】
2019524678.tif 000047
結果は、キラル化合物Ｂ１は、ＡＵＣ（ほぼ倍増）及びバイオアベイラビリティ（５３％から約１００％まで向上）の測定においてラセミ化合物Ｂよりもより優れたことを示した。さらに、、動物体内でキラル化合物Ｂ１はラセミ化合物Ｂよりも、吸収率がより高い。キラル化合物B1は、IC50値（0.8nM）の約1340nM、約1675倍であり得る8時間の時点で623ng / mLの血漿濃度を維持することができる。キラル化合物Ｂ１は、ラセミ化合物Ｂよりも、より安定な血中レベル及びより長い持続時間を有する。経口投与量１０ｍｇ／ｋｇでは、キラル化合物Ｂ１は、８時間の時点で血中濃度を６２３ｎｇ／ｍＬに維持し、それは、約１３４０ｎＭであり、そのＩＣ５０値の約１６７５倍（０．８ｎＭ）である。血漿タンパク質の吸収を考慮しても、キラル化合物Ｂ１は、ヘッジホッグシグナルの所望の阻害作用も奏することができる。逆に、ラセミ化合物Ｂは、８時間の時点で血中濃度が８３ｎｇ／ｍＬであり、又は約１７８ｎＭであり、そのＩＣ５０値（２．７ｎＭ）の約６６倍である。
【００８７】
実験結果はまた、脱メチル化化合物Ａ−５５よりも，キラル化合物Ｂ１は、バイオアベイラビリティ（Ｂ１が１００％，Ａ−５５が６２％）を改善し得、動物のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期がより長く、薬物曝露量がよりよい（Ｂ１はＡ−５５よりもＡＵＳが１２２％増加）ことを示し。
総合的には、実験結果は、脱メチル化化合物Ａ−５５及びラセミ化合物Ｂと比較して、キラル化合物Ｂ１は、Ｈｈシグナル伝達経路をよりよく、より長く阻害することにより、Ｈｈシグナル伝達経路に関連する疾患の治療においてより良く適用することができる。
【００８８】
実施例１５：マウスにおける腫瘍抑制
マウスにおける腫瘍抑制試験において被験化合物Ｂ及びＢ１の測定は、以下のように試験した。
腫瘍抑制実験：
Ｐａｔｃｈｅｄ(ＰＴＣＨ)+／−，ｐ５３−／−マウス由来の原発性髄芽腫をＳＣＩＤマウスの右側へ静脈注射した。移植後の約７日目に、腫瘍体積が平均２００ｍｍ３になる場合には、治療を開始した。被験者は、ブランク群、化合物Ｂ治療群及び化合物Ｂ１治療群にに無作為に分けられた。化合物Ｂ及びＢ１は、用量約１００ｍｇ／ｋｇ／日で投与された。被験者の腫瘍体積及び体重は、２日ごとに記録された。投与１４日後、被験者を屠殺し、腫瘍を取り出した。実験結果は、図１６及び図１７に示した。
ラセミ化合物Ｂは、用量１００ｍｇ／ｋｇで腫瘍増殖を止めることができる。逆に，キラル化合物Ｂ１は、用量１００ｍｇ／ｋｇで腫瘍体積を減少させ、腫瘍が除去されたとみなすことができるように腫瘍サイズを大幅に減少させることができる。
【００８９】
【表６】
2019524678.tif 000048
2019524678.tif 000049
2019524678.tif 000050
【００９０】
生物学的活性
主なアッセイは、ＮＩＨ３Ｔ３−ＧＲＥ−Ｌｕｃレポーター遺伝子アッセイに基づくものである。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＣＲＬ−１６５８， ＡＴＣＣ）を１０％ＦＢＳ(Ｈｙｃｌｏｎｅ)を補充したＤＭＥＭ(１１９６５，Ｇｉｂｉｃｏ)において培養した。ＧＲＥ−Ｌｕｃプラスミドは、８×ＧＬＩ−１応答エレメント（ＧＲＥ）をｐＧＬ４．２６のＭＣＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングすることによって生成した。ＧＲＥ−Ｌｕｃルシフェラーゼレポータープラスミドによるトランスフェクションの後、ハイグロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の選択によりＮＩＨ３Ｔ３−ＧＲＥ−Ｌｕｃレポーター細胞株を構築した。単一のクローンは、ソニックヘッジホッグ（ｓＨｈ）の組換え体タンパク質又は小分子アゴニストＳＡＧのＮ末端フラグメント（ＡＢＩＮ６２９３４６）によるアッセイ品質により確認された。選ばれたクローンは、Ｈｈシグナルの検出に用いられた。
ＮＩＨ３Ｔ３−ＧＲＥ−Ｌｕｃ細胞を完全培地（４ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｎ、１．５ｇ／Ｌ  炭酸水素ナトリウム及び１００μｇ／ｍＬハイグロマイシン及び１０％ＦＢＳを補充した４．５ｇ／Ｌグルコースを含むＤＭＥＭ）に培養した。コンフルエントになったら、細胞をトリプシン処理し、コンフルエントになったら、細胞をトリプシン処理し、アッセイ培地（０．５％血清含有ＤＭＥＭ）に再懸濁した。細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに加えた後（最終的な細胞濃度が１５，０００個の細胞／ウェル）、細胞をさらに４８時間培養し、その後、化合物を加えた。
【００９１】
化合物をＤＭＳＯで連続的に希釈し、アッセイ培地でさらに希釈した。一実施形態において、アッセイ培地中に１０ｎＭ  ＳＡＧをＨｈシグナルのアゴニストとして加えた。化合物とアゴニストとを調製した後、慎重に培地を除去した（真空の代わりにピペットを使用して培地を吸引する。そのようにしなければ、ＮＩＨ３Ｔ３細胞単層は分離されてしまう）。化合物とアゴニストとを含むアッセイ培地１００μＬを細胞中に注意深く加えた。さらに、細胞培養プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。
４８時間インキュベートした後、４０μＬ／ウェルのルシフェラーゼ培地（Ｂｒｉｇｈ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞中に加えた。培養プレートを室温で５分間穏やかに振盪しながらインキュベートした。プレートリーダー（ＰＨＥＲＡｓｔａｒＦＳ、ＢＭＧ）で発光シグナルを測定した。発光シグナルへの阻害に基づいて化合物の活性を算出した。主なアッセイを使用する時に、標準的なＧＤＣ−０４４９（ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂ）のＩＣ５０測定曲線は、図１０に示した。
【化４１】
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ＧＤＣ−０４４９（ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂ）
【００９２】
確証アッセイは、アドレナリン−シクロパミン（Ｂｏｄｉｐｙ−Ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ）結合アッセイに基づくものである。
アドレナリン−シクロパミン結合アッセイは、Ｓｍｏアゴニスト結合を分析するための、蛍光に基づくアッセイである。ＳＭＯ−ＨＡ−ｐＬＶＸプラスミドによるトランスフェクション後，ピューロマイシン（１ｕｇ／ｍＬ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の選択によりＨｅｋ２９３−ＳＭＯの安定なクローンを構築した。Ｈｅｋ２９３−ＳＭＯ細胞を完全培地（４ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｎ、１．５ｇ／Ｌ  炭酸水素ナトリウム及び１００μｇ／ｍＬ  ハイグロマイシン及び１０％ＦＢＳを補充した４．５ｇ／Ｌ  グルコースを含むＤＭＥＭ）に培養した。ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）及び細胞免疫蛍光によりＳＭＯの発現を確認した。アドレナリン−シクロパミンは、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入され、メタノールに溶解された。
【００９３】
Ｈｅｋ２９３−ＳＭＯ細胞を９６ウェルプレート（３３４０，Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、最終的な細胞濃度は、１００μｌの１％血清含有ＤＭＥＭにおいて１５，０００個の細胞／ウェルである。さらに、培養プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。
Ｈｅｋ２９３−ＳＭＯプレートをＰＢＳで洗浄し，室温で４％  パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳを２０分間固定した。ＰＦＡ緩衝液を除去した後、細胞をＤＡＰＩ／ＰＢＳ（５μｇ／ｍＬ）で１０分間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後、細胞を室温で１００ｎＭ  アドレナリン−シクロパミン、及び０〜１０μＭ濃度範囲の競合的結合ための化合物を含む結合緩衝液（ＨＢＳＳＷ／Ｏ  Ｃａ２+及びＭｇ２+）において２時間インキュベートした。インキュベートした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。高含量蛍光イメージングシステム（ＡｒｒａｙｓｃａｎＶＴＩ，Ｔｈｅｒｍｏ）により蛍光画像を自動的に捕捉して分析した。ＧＤＣ−０４４９を参照化合物として用いてデータを標準化した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用してＳ字型用量-反応関数からＩＣ５０値を算出した。Ｋｉは、Ｃｈｅｎｇ-Ｐｒｕｓｏｆｆ方程式Ｋｉ＝ＩＣ５０／[１+[アドレナリン−シクロパミン]／Ｋｄ)]に従って算出した。ＷＴ−Ｓｍｏに使用したアドレナリン−シクロパミンのＫｄは、３．５±０．８ｎＭである。
上記アッセイにおいて、上記化合物及び複数の他の化合物を試験し、データを表５に一括した。標準化合物は、Ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂであり、その効能は、対照として第４欄に挙げられた。その比率は、同様なアッセイにおいて被験化合物のＩＣ５０値に対するＶｉｓｍｏｄｅｇｉｂのＩＣ５０値の比である。幾つかの試験曲線は、図１１〜１３に示した。
【００９４】
【表７】
2019524678.tif 000052
【図１】
2019524678.tif 000075
【図２】
2019524678.tif 000076
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2019524678.tif 000080
【図７】
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【図８】
2019524678.tif 000082
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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