(57)【要約】本発明は、ＣＤ３およびＥｐＣＡＭに特異的に結合する多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質（ＭＳＦＰ）を提供する。本発明は、医薬組成物の調製のためのＭＳＦＰの使用、がんを処置する方法およびＭＳＦＰを含むキットをさらに提供する。また、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。本発明の一態様では、個体においてがんを処置するための方法であって、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメインとを含む有効量の多重特異性（例えば、二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を前記個体に投与するステップを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体においてがんを処置するための医薬の調製における多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の使用であって、前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメインとを含み、前記結合ドメインが、前記Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇの用量で投与される、使用。
【請求項２】
前記結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１のｓｃＦｖと、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含み、前記第１のｓｃＦｖが、前記Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、前記第２のｓｃＦｖが、前記Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、静脈内投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、低頻度で投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、前記個体に第１の期間の間第１の用量で投与され、引き続いて、前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、前記個体に第２の期間の間第２の用量で投与され、前記第２の用量が、前記第１の用量を超える、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記個体にグルココルチコイドを投与することをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記グルココルチコイドが、デキサメタゾンである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記個体が、ヒト個体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記Ｆａｂ断片が、ＣＤ３イプシロンのＮ末端に特異的に結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記Ｆａｂ断片が、ＣＤ３イプシロンのアミノ酸１〜２７内のエピトープに特異的に結合する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記Ｆａｂ断片のＶＨが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記Ｆａｂ断片のＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記Ｆａｂ断片のＶＨが、配列番号７および３９〜４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または前記Ｆａｂ断片のＶＬが、配列番号８および４４〜４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１１または請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記Ｆａｂ断片が、配列番号９のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖定常領域１（ＣＨ１）を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記Ｆａｂ断片が、配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒトラムダ軽鎖定常領域を含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記Ｆａｂ断片のＣＨ１およびＣＬが、１つまたは複数のジスルフィド結合により接続している、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記Ｆａｂ断片が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドおよび／または配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記がんが、ＥｐＣＡＭ陽性固形がんである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
前記ＥｐＣＡＭ陽性固形がんが、癌腫または腺癌である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記がんが、小腸がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮頸がん、肝臓がん、胃がん、膵臓がん、皮膚がん、腎がん、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、乳がん、胆管がんおよび頭頸部がんからなる群より選択される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記がんが、結腸直腸腺癌である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記がんが、肺腺癌である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
前記ｓｃＦｖのＶＨが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記ｓｃＦｖのＶＬが、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項２〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
前記ｓｃＦｖのＶＨが、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、かつ／または前記ｓｃＦｖのＶＬが、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項２〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
前記ｓｃＦｖが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、配列番号２２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドを含み、かつ／または前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、配列番号２３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
個体においてがんを処置する方法であって、前記個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメインとを含む有効量の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、前記結合ドメインが、前記Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇの用量で投与される、方法。
【請求項２８】
（１）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（２）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（３）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域と、（１）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（２）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（３）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片。
重鎖可変ドメイン配列が、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨを含み、かつ／または軽鎖可変ドメイン配列が、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項２８に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２９】
多重特異性抗体である、請求項２７または請求項２８に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体。
【請求項３０】
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項２７または請求項２８に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体の抗原結合性断片。
【請求項３１】
前記ｓｃＦｖが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体の抗原結合性断片。
【請求項３２】
請求項２７〜２９および３０〜３１のいずれか一項に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片を含む、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
【請求項３３】
ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片の第１のコピーと、抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片の第２のコピーとを含み、前記抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片の前記第１のコピーが、前記Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、前記抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片の前記第２のコピーが、前記Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している、請求項３２に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
【請求項３４】
前記Ｆａｂ断片のＶＨが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記Ｆａｂ断片のＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項３３に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
【請求項３５】
配列番号２２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドおよび配列番号２３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む、請求項３４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
【請求項３６】
請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体もしくはその抗原結合性断片または多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項３７】
個体においてがんを処置するための医薬の調製における、請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体もしくはその抗原結合性断片または多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年３月１５日に出願された中国特許出願第２０１６１０１４７２２７．８号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：コンピュータ読み取り可能形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：７２０６２２０００８４１ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１７年３月１３日、サイズ：４８ＫＢ）。
【０００３】
本発明は、ＣＤ３およびＥｐＣＡＭに特異的に結合する多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質（ＭＳＦＰ）に関する。ＭＳＦＰを含む医薬組成物、ＭＳＦＰを使用してがんを処置する方法およびＭＳＦＰを含むキットが、本明細書でさらに提供される。
【背景技術】
【０００４】
腫瘍組織において、一部の抗原は、過剰発現されるか、変異誘発されるか、または選択的に変異誘発される。それゆえ、がん細胞の表面上の特異的抗原を標的にする抗体は、がん治療薬として使用することができる。上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３２６）は、１７−１Ａ、ＥＳＡ、ＡＵＡ１、ＥＧＰ４０などとしても公知であり、３１４個のアミノ酸から構成される４０ｋＤの膜貫通糖タンパク質である。ＥｐＣＡＭは、様々な種類の上皮細胞および主要な種類のヒト悪性疾患において特異的に発現される。例えば、ＥｐＣＡＭは、結腸がん、肺がん、前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、乳がんおよび卵巣がんで高く発現される。したがって、ＥｐＣＡＭは、がん療法における関心の高い標的になっており、ワクチン、マウスまたはヒトモノクローナル抗体および細菌毒素または化学療法薬にコンジュゲートした抗体、例えばＥｐＣＡＭ特異的抗体ＩＮＧ−１、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、エドレコロマブなどが含まれる。
【０００５】
３本の異なるポリペプチド鎖（ε、δおよびγ鎖）を含むＣＤ３は、Ｔ細胞により発現される抗原である。３本のＣＤ３ポリペプチド鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびζ鎖と会合して、ＴＣＲ複合体を形成し、これはＴ細胞においてシグナル伝達カスケードを活性化する機能を有する。現在、多くの治療戦略が、抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体を使用して疾患を処置するためにＴＣＲシグナル伝達を標的にしている。ＣＤ３特異的抗体ＯＫＴ３は、ヒト治療的使用に承認された最初のモノクローナル抗体であり、同種異系間移植拒絶の処置のための免疫調節剤として臨床的に使用されている。
【０００６】
過去２０年間で、二重特異性抗体の分野における努力は、徐々に臨床的成功を収めてきた。２００９年には、カツマキソマブ（抗ＣＤ３、抗ＥｐＣＡＭ三機能性抗体）が、症候性悪性腹水の処置のために欧州連合で承認された。しかしながら、二重特異性抗体は、がん細胞を有効に殺滅することにおいて可能性を有することを示したが、これらの分子の、全身性免疫活性化を含む重度の有害効果、免疫原性（抗薬物抗体効果）および一般的に乏しい製造可能性は、この種類の薬物の広範な適用を大いに限定した。ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）融合タンパク質（ブリナツモマブ）の別の欠点は、この薬物をその短い半減期および皮下投与との不適合性のために毎日静脈内（ｉ．ｖ．）投与する必要があることである。しかし、神経学的効果、例えば失見当識、混乱、発話および言語障害、振戦または痙攣は、依然として臨床試験中に起こった（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１巻：９７４〜９７７頁、２００８年）。これらの不必要な有害効果をより良く制御するために、二重特異性単鎖抗体（ＢｉＴＥ）を、より長期間にわたり持続注入により静脈内投与した。ＵＳ２０１２０２４４１６１は、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３二重特異性ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（ＭＴ１１０）のステージＩ臨床試験を開示しており、ここでは、低投与量（１〜１２μｇ／ｋｇ／２４時間）の持続静脈内注入が長期間にわたり適用され、グルココルチコイドがＭＴ１１０注入または投与量増大前に投与された。さらに、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は、凝集傾向を有する。
現在の形式の二重特異性抗体の欠点は、依然として優れた効力および安全性での、がん患者の処置におけるそれらの広範な適用に対する大きな困難である。それゆえ、改善された効力、安定性、安全性および製造可能性を有する新しい二重特異性抗体または処置レジメンの開発について、本分野において緊急の要求がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／０２４４１６１号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＣＤ３およびＥｐＣＡＭに特異的に結合する多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質（例えば二重特異性Ｆａｂ融合タンパク質またはＢＳＦＰ）ならびにＭＳＦＰを使用してがんを処置する方法を提供する。
【０００９】
本発明の一態様では、個体（例えば、ヒト個体）においてがんを処置するための方法であって、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメインとを含む有効量の多重特異性（例えば、二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を前記個体に投与するステップを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、結合ドメインはｓｃＦｖである。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１のｓｃＦｖと、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含み、第１のｓｃＦｖが、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖが、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは同じ配列を有する。
【００１０】
上記の方法のいずれかに従う一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度（例えば、１、２、３、４、６、９または１２か月毎に約１回未満のいずれか、例えば単回用量）で投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、カニクイザルについて約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ（例えば、約０．３μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇまたは約５μｇ／ｋｇ〜約２０μｇ／ｋｇ）に等しい用量で投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、サイトカインストームを誘導しない用量で投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、カニクイザルについて約３０μｇ／ｋｇ以下（例えば、約２０μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇまたは１μｇ／ｋｇ以下）に等しい用量で投与される。一部の実施形態では、個体はヒト個体である。
【００１１】
上記の方法のいずれかに従う一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、個体に第１の期間の間第１の用量で投与され、その後、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、個体に第２の期間の間第２の用量で投与され、第２の用量が、第１の用量を超える。一部の実施形態では、第２の期間は前記第１の期間を超える。一部の実施形態では、第１の期間は少なくとも約７日間である。一部の実施形態では、第２の期間は少なくとも約２週間である。一部の実施形態では、第１の用量は約１μｇ／ｋｇ以下である。一部の実施形態では、第２の用量は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１０μｇ／ｋｇである。
【００１２】
上記の方法のいずれかに従う一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイドを投与することをさらに含む。一部の実施形態では、グルココルチコイドは、デキサメタゾンである。一部の実施形態では、グルココルチコイドは、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の第１の用量の前に投与される。一部の実施形態では、グルココルチコイドは、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【００１３】
上記の方法のいずれかに従う一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端、例えば、ＣＤ３イプシロンのアミノ酸１〜２７内のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片のＶＨは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片のＶＬは、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片のＶＨは、配列番号７および３９〜４３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片のＶＬは、配列番号８および４４〜４７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号９のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖定常領域１（ＣＨ１）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒトラムダ軽鎖定常領域を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片のＣＨ１およびＣＬは、１つまたは複数のジスルフィド結合により接続している。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む。
【００１４】
上記の方法のいずれかに従う一部の実施形態では、がんは、ＥｐＣＡＭ陽性固形がんである。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ陽性固形がんは、癌腫または腺癌である。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ陽性固形がんは、小腸がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮頸がん、肝臓がん、胃がん、膵臓がん、皮膚がん、腎がん、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、乳がん、胆管がんおよび頭頸部がんからなる群より選択される。一実施形態では、がんは、結腸直腸腺癌である。一実施形態では、がんは、肺腺癌である。
【００１５】
上記の方法のいずれかに従う一部の実施形態では、結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、Ｎ−ＶＨ−ＶＬ−Ｃ融合ポリペプチドを含む。一実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一実施形態では、ｓｃＦｖのＶＬが、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。一実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨは、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ｓｃＦｖのＶＬは、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１６】
上記の方法のいずれかに従う一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む。一実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドを含む。
【００１７】
本発明は、抗ＥｐＣＡＭ抗体をさらに提供する。一部の実施形態では、（１）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（２）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（３）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域と、（１）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（２）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（３）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。一部の実施形態では、重鎖可変ドメイン配列は、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨを含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメイン配列は、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００１８】
上記の抗ＥｐＣＡＭ抗体のいずれか１つに従う一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ヒトＩｇＧのＦｃ配列を含む。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体は、二重特異性抗体などの多重特異性抗体である。
【００１９】
上記の抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片のいずれか１つに従う一部の実施形態では、抗原結合性断片は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２０】
一部の実施形態では、上記の抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片のいずれか１つを含む、多重特異性（例えば、二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質が提供される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片の第１のコピーと、抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片の第２のコピーとを含み、抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片の第１のコピーが、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片の前記第２のコピーが、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端、例えば、ＣＤ３イプシロンのアミノ酸１〜２７内のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片のＶＨは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片のＶＬは、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片のＶＨは、配列番号７および３９〜４３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片のＶＬは、配列番号８および４４〜４７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号９のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖定常領域１（ＣＨ１）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒトラムダ軽鎖定常領域を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片のＣＨ１およびＣＬは、１つまたは複数のジスルフィド結合により接続している。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％（例えば約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドおよび配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％（例えば約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む。
【００２１】
一部の実施形態では、上記の抗ＥｐＣＡＭ抗体もしくはその抗原結合性断片または多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質のいずれかおよび薬学的に許容される担体を含む組成物が提供される。一部の実施形態では、個体に有効量の組成物を投与することを含む、個体においてがんを処置する方法が提供される。
【００２２】
上記のＭＳＦＰ、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片をコードする単離された核酸分子、単離された核酸分子をコードする発現ベクター、発現ベクターを含む単離された宿主細胞および単離された宿主細胞を培養し、細胞培養物からＭＳＦＰ、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片を回収することを含む、ＭＳＦＰ、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片を産生する方法がさらに提供される。
【００２３】
また、上記の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質または抗ＥｐＣＡＭ抗体もしくはその抗原結合性断片のいずれかを含む、使用、組成物（例えば医薬組成物）、キットおよび製造物品が、本明細書で提供される。
【００２４】
がんを処置するための医薬の調製における上記の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質のいずれかまたは上記の抗ＥｐＣＡＭ抗体もしくはその抗原結合性断片のいずれかの使用が、本明細書でさらに提供される。
【００２５】
本発明のこれらおよび他の態様ならびに利点は、次の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかになる。本明細書に記載の様々な実施形態の特性の１つ、一部または全てを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成してもよいことが理解されるべきである。
【００２６】
本明細書で参照される全ての出版物、特許、特許出願および公開された特許出願の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、例示的ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の構造を示す。
【００２８】
【図２Ａ】図２Ａは、非還元条件下での精製された例示的ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質（本明細書では以降、ＩＴＡＢ１００２と呼ぶ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、この精製タンパク質について、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の理論分子量と同様の、約１００ｋＤの分子量を示す。
【００２９】
【図２Ｂ】図２Ｂは、還元条件下での精製ＩＴＡＢ１００２のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、この精製タンパク質の見掛けの分子量が約４５ｋＤ〜約６６ｋＤの間であることを示す。
【００３０】
【図３Ａ】図３Ａは、非還元条件下での精製ＩＴＡＢ１００２のＣＥ−ＳＤＳ分析結果を示す。非還元ＣＥ−ＳＤＳ分析は、泳動時間約２１．５９分に単一タンパク質ピークを示す。
【００３１】
【図３Ｂ】図３Ｂは、還元条件下での精製ＩＴＡＢ１００２のＣＥ−ＳＤＳ分析結果を示す。還元ＣＥ−ＳＤＳ分析は、Ｆａｂ融合タンパク質の軽鎖および重鎖にそれぞれ対応する泳動時間約１８．３７分および約１８．８４分に２つの単一タンパク質ピークを示す。
【００３２】
【図４Ａ】図４Ａは、ＩＴＡＢ１００２と細胞表面抗原ＣＤ３を発現するヒトＰＢＭＣとの結合親和性を示す。
【００３３】
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＩＴＡＢ１００２と細胞表面抗原ＣＤ３を発現するカニクイザルＰＢＭＣとの結合親和性を示す。
【００３４】
【図５】図５は、ＩＴＡＢ１００２とＳＷ４８０細胞との、および細胞表面抗原ＥｐＣＡＭを発現するＣｙＥｐＣＡＭ−ＣＨＯ細胞との、結合親和性を示す。
【００３５】
【図６Ａ】図６Ａは、様々な条件下でＣＤ４＋ヒトＰＢＭＣを活性化する際のＩＴＡＢ１００２およびＯＫＴ３の能力を示す。
【００３６】
【図６Ｂ】図６Ｂは、様々な条件下でＣＤ８＋ヒトＰＢＭＣを活性化する際のＩＴＡＢ１００２およびＯＫＴ３の能力を示す。
【００３７】
【図６Ｃ】図６Ｃは、様々な条件下でＣＤ４＋ヒトＰＢＭＣの増殖を刺激する際のＩＴＡＢ１００２の能力を示す。
【００３８】
【図６Ｄ】図６Ｄは、様々な条件下でＣＤ８＋ヒトＰＢＭＣの増殖を刺激する際のＩＴＡＢ１００２の能力を示す。
【００３９】
【図７】図７は、ＳＷ４８０腫瘍細胞に対するＩＴＡＢ１００２媒介ヒトまたはカニクイザルＰＢＭＣ細胞傷害性を示す。
【００４０】
【図８】図８は、様々な代表的がん細胞株に対するＩＴＡＢ１００２媒介ヒトＰＢＭＣ細胞傷害性を示す。
【００４１】
【図９Ａ】図９Ａは、ヒトＰＢＭＣを共接種（ｃｏ−ｉｎｏｃｕｌａｔｅ）したマウスにおける皮下ＳＷ４８０異種移植片に対する様々な投与量のＩＴＡＢ１００２の増殖阻害効果を示す。
【００４２】
【図９Ｂ】図９Ｂは、実験の最後の時点での様々な処置群のマウスからの腫瘍の写真を示す。
【００４３】
【図１０Ａ】図１０Ａは、ヒトＰＢＭＣを用いて免疫系を再構築した免疫不全マウスにおけるＳＷ４８０異種移植片に対する様々な投与量のＩＴＡＢ１００２の増殖阻害効果を示す。
【００４４】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、実験の最後の時点での様々な処置群のマウスからの腫瘍の写真を示す。
【００４５】
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、実験の最後の時点でのマウスの白血球試料中のヒトＣＤ３＋細胞の百分率を示す。
【００４６】
【図１１】図１１は、ヒトＰＢＭＣを用いて免疫系を再構築した免疫不全マウスにおけるＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植片に対するＩＴＡＢ１００２の増殖阻害効果を示す。
【００４７】
【図１２Ａ】図１２Ａは、様々な投与量でのＩＴＡＢ１００２の静脈内投与後のカニクイザルの血液中のＣＤ４＋Ｔ細胞数の経時変化を示す。Ｘ軸：Ｈ＝時間、Ｄ＝日。
【００４８】
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、様々な投与量でのＩＴＡＢ１００２の静脈内投与後のカニクイザルの血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞数の経時変化を示す。Ｘ軸：Ｈ＝時間、Ｄ＝日。
【００４９】
【図１３Ａ】図１３Ａは、様々な投与量でのＩＴＡＢ１００２の静脈内投与後のカニクイザルの血清中のＩＬ−２濃度の経時変化を示す。
【００５０】
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、様々な投与量でのＩＴＡＢ１００２の静脈内投与後のカニクイザルの血清中のＩＬ−４濃度の経時変化を示す。
【００５１】
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、様々な投与量でのＩＴＡＢ１００２の静脈内投与後のカニクイザルの血清中のＩＬ−５濃度の経時変化を示す。
【００５２】
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、様々な投与量でのＩＴＡＢ１００２の静脈内投与後のカニクイザルの血清中のＩＬ−６濃度の経時変化を示す。
【００５３】
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、様々な投与量でのＩＴＡＢ１００２の静脈内投与後のカニクイザルの血清中のＴＮＦ濃度の経時変化を示す。
【００５４】
【図１３Ｆ】図１３Ｆは、様々な投与量でのＩＴＡＢ１００２の静脈内投与後のカニクイザルの血清中のＩＦＮ−γ濃度の経時変化を示す。
【００５５】
【図１４】図１４は、種々の投与量におけるＩＴＡＢ１００２の単回静脈内投与の後のカニクイザルの血清中のＩＴＡＢ１００２の濃度の変化を示す。
【００５６】
【図１５】図１５は、ＳＷ４８０腫瘍細胞に対するＩＴＡＢ１００２媒介ヒトＰＢＭＣ細胞傷害性とＩＴＡＢ１０１２媒介ヒトＰＢＭＣ細胞傷害性とを比較する。
【００５７】
【図１６】図１６は、デキサメタゾン（ＤＸＭ）の存在または非存在下でのＭＳＦＰ媒介ＳＷ４８０細胞殺滅活性を示す。
【００５８】
【図１７】図１７は、デキサメタゾン（ＤＸＭ）の存在または非存在下でのヒトＴ細胞によるＭＳＦＰ媒介ＩＬ−６放出を示す。
【００５９】
【図１８Ａ】図１８Ａは、ＩＴＡＢ１００２のみで処置したサルにおけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清中レベルを示す。
【００６０】
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、デキサメタゾン（ＤＸＭ）で前処置してＩＴＡＢ１００２で処置したサルにおけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清中レベルを示す。
【００６１】
【図１９Ａ】図１９Ａは、ＩＴＡＢ１００２のみで処置したサルにおける全ビリルビン（ＴＢｉｌ）の血清中レベルを示す。
【００６２】
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、デキサメタゾン（ＤＸＭ）で前処置してＩＴＡＢ１００２で処置したサルにおける全ビリルビン（ＴＢｉｌ）の血清中レベルを示す。
【００６３】
【図２０Ａ】図２０Ａは、ＩＴＡＢ１００２のみで処置したサルにおけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の血清中レベルを示す。
【００６４】
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、デキサメタゾン（ＤＸＭ）で前処置してＩＴＡＢ１００２で処置したサルにおけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の血清中レベルを示す。
【００６５】
【図２１Ａ】図２１Ａは、ＩＴＡＢ１００２のみで処置したサルにおけるＩＬ−６レベルを示す。
【００６６】
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、デキサメタゾン（ＤＸＭ）で前処置してＩＴＡＢ１００２で処置したサルにおけるＩＬ−６レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本発明は、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質（ＭＳＦＰ）を使用してがんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドのＮ末端各々が、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖに融合している抗ＣＤ３  Ｆａｂ断片を含む。乏しい製造可能性、凝集、短い半減期、重度の有害効果および長い注入時間に苦しむ本分野における現在の抗がん二重特異性抗体とは異なり、本明細書に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、改善された安定性および安全性プロファイルを有し、このことは、より低い投与量および減少した投与頻度を使用し、望ましくない有害効果、例えばサイトカインストームの誘導を避ける処置方法を可能にした。投与頻度の減少および注入時間の短縮は、患者の生活の質を改善する助けとなり、患者の処置を促進する。例えば、驚くべきことに、本明細書に記載のＭＳＦＰは、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ、例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇの用量で投与することができることが分かった。新規の抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片がさらに提供される。
【００６８】
本明細書に記載のＭＳＦＰは、本分野で公知の他の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質と比較して以下の利点を有する。ＭＳＦＰは、より高い安定性およびがん細胞を殺滅することにおける強化された効力を有する。本ＭＳＦＰの延長された半減期は、より低い投与頻度およびより短い注入時間を可能にし、患者にとってより便利である。霊長類、例えばカニクイザルとの本ＭＳＦＰの交差反応性は、毒性学研究を促進する。本ＭＳＦＰは、カニクイザルにおけるより少ない有害効果（減少した神経効果を含む）、優れた安全性および耐容性を有する。
【００６９】
したがって、一態様では、本発明は、個体においてがんを処置するための方法であって、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば、二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を前記個体に投与するステップを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法を提供する。
【００７０】
別の態様では、本発明は、（１）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（２）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（３）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域と、（１）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（２）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（３）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００７１】
また、本明細書に記載の方法に有用なキットおよび製造物品が提供される。
Ｉ．定義
【００７２】
本発明の実施は、反対の事項が具体的に示されない限り、本分野の技術内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来法を用い、その多くを、例示の目的のために以下に説明する。そのような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｒ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．（２００９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９５；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｖｏｌ．  Ｉ  ＆  ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｎ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）および他の同様の参考文献を参照のこと。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、「処置」という用語は、臨床的病理学の過程中に、処置される個体または細胞の自然な過程を変更するために設計される臨床的介入を指す。望ましい処置の効果は、疾患進行速度の減少、疾患状態の好転（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）または緩和および寛解または予後の改善を含む。例えば、がん性細胞の増殖の低減（または破壊）、疾患から生じる症状の減少、疾患を患う人の生活の質の増大、疾患を処置するために必要とされる他の薬物治療の用量の減少および／または個体の生存の延長を含むが、これらに限定されない、がんと関連付けられる１つまたは複数の症状が軽減または排除された場合、個体はうまく「処置される」。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、「有効量」は、被験体において疾患または障害を処置するために有効な薬剤または薬物の量を指す。がんの場合、有効量の薬剤は、がん細胞の数を低減し、腫瘍サイズを低減し、末梢器官へのがん細胞浸潤を阻害し（すなわち、ある程度まで遅延させ、好ましくは停止させ）、腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度まで遅延させ、好ましくは停止させ）、腫瘍成長をある程度まで阻害し、かつ／またはがんと関連付けられる症状の１つもしくは複数をある程度まで和らげ得る。臨床的状況で理解されるように、有効量の薬物、化合物または医薬組成物は、別の薬物、化合物または医薬組成物と共に達成されてもよく、または達成されなくてもよい。したがって、「有効量」は、１つまたは複数の治療剤を投与する状況において考慮してもよく、１つまたは複数の他の薬剤と共に望ましい結果が達成され得るか、または達成される場合、単一の薬剤は、有効量で与えられると考えてもよい。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、「個体」または「被験体」は、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類または霊長類を含むが、これらに限定されない哺乳動物を指す。一部の実施形態では、個体はヒトである。
【００７６】
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的にモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）および所望の生物学的活性または機能を示す限り抗体断片を包含する。本明細書で使用されるとき、「免疫グロブリン」（Ｉｇ）および「抗体」という用語は、相互変換可能に使用される。
【００７７】
「ネイティブ抗体」、「全長抗体」、「インタクトな抗体」および「全抗体」という用語は、以下に定義される抗体断片ではなく、実質的にインタクトな形態の抗体を指すために本明細書で相互変換可能に使用される。用語は特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。ネイティブ抗体は通常、２本の同一な軽（Ｌ）鎖および２本の同一な重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有結合的ジスルフィド結合により重鎖に連結され、一方でジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。また、各重鎖および軽鎖は、一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）および他方の末端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間で界面を形成すると考えられている。
【００７８】
「定常ドメイン」という用語は、抗原結合部位を含有する免疫グロブリンの他の部分、可変ドメインと比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（集合的に、ＣＨ）ならびに軽鎖のＣＨＬ（またはＣＬ）ドメインを含有する。
【００７９】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは、「ＶＨ」と称され得る。軽鎖の可変ドメインは、「ＶＬ」と称され得る。これらのドメインは一般的に、抗体の最も可変性の部分であり、抗原結合部位を含有する。
【００８０】
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分が抗体間で配列において大規模に異なり、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体を通して均一に分布していない。それは、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方における超可変領域（ＨＶＲ、ＣＤＲとも称される）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高く保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブ重鎖および軽鎖の可変ドメイン各々は、４つのＦＲ領域を含み、主として、３つのＨＶＲにより接続しているベータシート配置を取り、ＨＶＲはベータシート構造を接続する、一部の場合ベータシート構造の部分を形成する、ループを形成する。各鎖のＨＶＲは、ＦＲ領域により近接して一緒に保持され、他の鎖からのＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）を参照のこと）。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接的には関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性における抗体の参加を示す。
【００８１】
任意の哺乳動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（「κ」）およびラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明確に別個の種類の１つに割り当てることができる。
【００８２】
ＩｇＧ「アイソタイプ」または「サブクラス」という用語は、本明細書で使用されるとき、それらの定常領域の化学的特徴および抗原性特徴により定義される免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。
【００８３】
抗体（免疫グロブリン）は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、様々なクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの様々なクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、γ、ε、γおよびμと呼ばれる。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置は周知であり、一般的に例えば、Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版（Ｗ．Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｃｏ．、２０００年）に記載されている。抗体は、１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの抗体の共有結合的または非共有結合的会合により形成される、より大きな融合分子の部分であり得る。
【００８４】
「抗体断片」は、好ましくはその抗原結合性領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体断片は、抗原結合性断片である。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００８５】
抗体のパパイン消化は、各々単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一な抗原結合性断片と、残りの「Ｆｃ」断片とを産生し、「Ｆｃ」断片の名称は、それが容易に結晶化できることを反映する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、まだ抗原を架橋結合できるＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。
【００８６】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含有する最小限の抗体断片である。一実施形態では、２本鎖Ｆｖ種は、緊密な非共有結合的会合にある１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとのダイマーからなる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖および重鎖が２本鎖Ｆｖ種のものと類似する「ダイマー」構造で会合し得るように、可撓性ペプチドリンカーにより共有結合的に連結され得る。各可変ドメインの３つのＨＶＲがＶＨ−ＶＬダイマーの表面上の抗原結合部位を画定するように相互作用するのは、この配置である。集合して、６つのＨＶＲは、抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、全結合部位より低い親和性ではあるが、抗原を認識および結合する能力を有する。
【００８７】
Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含有し、また軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する、２本のポリペプチド鎖を有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端の数個の残基の付加によりＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書での名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。また、抗体断片の他の化学的カップリングが公知である。
【００８８】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概略については、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、１９９４年、２６９〜３１５頁を参照のこと。
【００８９】
「Ｆｃ」断片は、ジスルフィドにより一緒に保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列により決定され、またこの領域は、ある特定の種類の細胞で見られるＦｃ受容体（ＦｃＲ）により認識される部分である。
【００９０】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用されるとき、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体を指し、例えば、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある変異、例えば天然に存在する変異を除いては同一である。したがって、修飾語「モノクローナルの」は、別個の抗体の混合物ではない、抗体の性質を示す。一部の実施形態では、そのようなモノクローナル抗体は典型的に、標的を結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、標的結合性ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合性ポリペプチド配列の選択を含むプロセスにより得られた。例えば、選択プロセスは、複数のクローン、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローンまたは組換えＤＮＡクローンのプールからの独特のクローンの選択であり得る。選択された標的結合性配列は、例えば標的に対する親和性を改善するために、標的結合性配列をヒト化するために、細胞培養物におけるその産生を改善するために、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその免疫原性を低減させるために、多重特異性抗体を創出するためになど、さらに変更することができること、およびまた、変更された標的結合性配列を含む抗体は、本発明のモノクローナル抗体であることが理解されるべきである。典型的に様々な決定基（エピトープ）に指向された様々な抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に指向されている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、それらが典型的に他の免疫グロブリンにより汚染されていない点で有利である。
【００９１】
修飾語「モノクローナルの」は、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体の性質を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするとは解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７（１９７５）；Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １４（３）：２５３−２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８１））、組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；およびＬｅｅら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）を参照のこと）、およびヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座または遺伝子の部分または全てを有する動物におけるヒトまたはヒト様抗体を産生するための技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３；ＷＯ１９９６／３４０９６；ＷＯ１９９６／３３７３５；ＷＯ１９９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；および同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４：８２６（１９９６）；およびＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３：６５−９３（１９９５）を参照のこと）を含む様々な技術により作製することができる。
【００９２】
本明細書のモノクローナル抗体は、具体的に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、または相同であり、一方で鎖（複数可）の残りの部分が、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、または相同である「キメラ」抗体、ならびに所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片を含む（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年）を参照のこと）。キメラ抗体は、抗体の抗原結合領域が、例えば目的の抗原でマカクザルを免疫化することにより、産生された抗体に由来する、ＰＲＩＭＡＴＴＺＥＤ（登録商標）抗体を含む。
【００９３】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲからの残基が、所望の特異性、親和性および／または能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のＨＶＲからの残基により置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するために行われ得る。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。また、ヒト化抗体は任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２：５９３−５９６  （１９９２）を参照のこと。また、例えば、ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ，  Ａｎｎ．  Ａｌｌｅｒｇｙ，  Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １：１０５−１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８（１９９５）；ＨｕｒｌｅおよびＧｒｏｓｓ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ５：４２８−４３３（１９９４）；ならびに米国特許第６，９８２，３２１号および同第７，０８７，４０９号も参照のこと。
【００９４】
「ヒト抗体」は、ヒトにより産生され、かつ／または本明細書で開示されるヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製された、抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は具体的に、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト化抗体を除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、本分野で公知の様々な技術を使用して産生することができる。ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７巻：３８１頁（１９９１年）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２巻：５８１頁（１９９１年）。また、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ、７７巻（１９８５年）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７巻（１号）：８６〜９５頁（１９９１年）に記載されている方法は、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。また、ｖａｎ  Ｄｉｊｋおよびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５巻：３６８〜７４頁（２００１年）を参照のこと。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように改変したが、それらの内因性遺伝子座は無効にしたトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウス（ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）に抗原を投与することにより調製することができる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術について米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号を参照のこと）。また、例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により発生するヒト抗体についてＬｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０３巻：３５５７〜３５６２頁（２００６年）を参照のこと。
【００９５】
「超可変領域」、「ＨＶＲ」または「ＨＶ」という用語は、本明細書で使用されるとき、配列において超可変性であり、かつ／または構造的に規定されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲ：ＶＨの３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬの３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ネイティブ抗体では、Ｈ３およびＬ３は、６つのＨＶＲの中で最大の多様性を示し、Ｈ３は特に、抗体に微細な特異性を与えることにおいて独特の役割を果たすと考えられている。例えばＸｕら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３巻：３７〜４５頁（２０００年）；ＪｏｈｎｓｏｎおよびＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８巻：１〜２５頁（Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．、２００３年）を参照のこと。実際に、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体は、軽鎖の非存在下で機能的および安定である。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３巻：４４６〜４４８頁（１９９３年）；Ｓｈｅｒｉｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ３巻：７３３〜７３６頁（１９９６年）を参照のこと。また、ＨＶＲは、「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」とも称される。
【００９６】
免疫グロブリン可変領域の構造および位置は、現在インターネット上で入手可能な（ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  第４版、米国保健福祉省、１９８７年およびその更新版を参照して決定することができる。
【００９７】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００９８】
本明細書で使用されるとき、「結合する」、「〜に特異的に結合する」または「〜に特異的」であるという用語は、生物学的分子を含む不均質な分子集団の存在下で標的の存在を決定する、測定可能かつ再現性のある相互作用、例えば標的と抗体との間の結合を指す。例えば、標的（エピトープであり得る）に結合するか、または特異的に結合する抗体は、他の標的に結合するより大きな親和性、アビディティで、より容易に、かつ／またはより長い持続期間でこの標的に結合する抗体である。一実施形態では、非関連標的への抗体の結合の程度は、例えば放射免疫測定法（ＲＩＡ）により測定される標的への抗体の結合の約１０％未満である。一部の実施形態では、標的に特異的に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。一部の実施形態では、抗体は、異なる種からのタンパク質の中で保存されているタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。別の実施形態では、特異的結合は、排他的な結合を含み得るが、これを必要としない。
【００９９】
本明細書で使用されるとき、ペプチド、ポリペプチドまたは抗体配列についての「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」および「相同性」は、最大パーセント配列同一性を達成するように配列を整列し、必要に応じてギャップを導入し、配列同一性の部分として任意の保存的置換を考慮しなかった後に、特定のペプチドまたはポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の百分率として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための整列は、例えば、公に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、本分野の技術の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたる最大整列を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【０１００】
アミノ酸置換は、ポリペプチド中の１つのアミノ酸の、別のアミノ酸での置き換えを含み得るが、これに限定されない。例示的な置換を、表Ａに示す。アミノ酸置換を目的の抗体に導入してもよく、生成物を所望の活性、例えば抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善についてスクリーニングしてもよい。
【表Ａ】
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【０１０１】
アミノ酸は、共通の側鎖特性：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅに従ってグループ分けすることができる。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスで交換することを伴う。
【０１０２】
本明細書で使用されるとき、「Ｆａｂ融合タンパク質」は、Ｆａｂ断片と比較して異なる特徴を有する１つまたは複数の結合ドメインに共有結合的に連結されたＦａｂ断片を有するタンパク質を指す。特徴は、生物学的特徴、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ活性であってもよい。また、特徴は、単純な化学的特性または物理的特性、例えば標的分子への結合、触媒反応などであってもよい。Ｆａｂ断片および１つまたは複数の結合ドメインは、単一のペプチド結合により直接接続しても、ペプチドリンカーにより接続してもよいが、互いにインフレーム様式である。
【０１０３】
「多重特異性」という用語は、抗体（例えばＦａｂ融合タンパク質）に関連して使用されるとき、ポリエピトープ特異性を有する（すなわち、１つの生物学的分子上の２つ、３つもしくはそれよりも多い異なるエピトープに特異的に結合することができるか、または２つ、３つもしくはそれよりも多い異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる）抗体（例えばＦａｂ融合タンパク質）を指す。
【０１０４】
「二重特異性」という用語は、抗体（例えばＦａｂ融合タンパク質）に関連して使用されるとき、１つの生物学的分子上の２つの異なるエピトープに特異的に結合することができるか、または２つの異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる抗体（例えばＦａｂ融合タンパク質）を指す。別に示されない限り、二重特異性抗体により結合される抗原が二重特異性抗体またはＦａｂ融合タンパク質の名称で列挙される順序は任意である。すなわち、「抗ＣＤ３／ＥｐＣＡＭ」、「抗ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３」、「ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３」および「ＣＤ３×ＥｐＣＡＭ」という用語は、ＣＤ３およびＥｐＣＡＭの両方に特異的に結合する二重特異性抗体（例えば二重特異性Ｆａｂ融合タンパク質）に言及するために相互変換可能に使用することができる。
【０１０５】
「多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質」および「ＭＳＦＰ」という用語は、ポリエピトープ特異性を有するＦａｂ融合タンパク質に言及するために本明細書で相互変換可能に使用される。
【０１０６】
本明細書で使用されるとき、ポリペプチドの「Ｃ末端」は、ポリペプチドの最後のアミノ酸残基を指し、このアミノ酸残基はそのアミン基を、それと隣接したアミノ酸残基のカルボキシル基とペプチド結合を形成するために提供する。ポリペプチドの「Ｎ末端」は、本明細書で使用されるとき、ポリペプチドの最初のアミノ酸を指し、このアミノ酸はそのカルボキシル基を、それと隣接したアミノ酸残基のアミン基とペプチド結合を形成するために提供する。
【０１０７】
「ベクター」という用語は、本明細書で使用されるとき、それが連結される別の核酸を増やすことができる核酸分子を指す。用語は、自己複製核酸構造としてのベクターおよびベクターが導入された宿主細胞のゲノム内に組み込まれるベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結された核酸の発現を指向させることができる。そのようなベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。
【０１０８】
「細胞」という用語は、初代被験体細胞およびその子孫を含む。
【０１０９】
「サイトカインストーム」という用語は、「サイトカインカスケード」または「高サイトカイン血症（ｈｙｐｅｒｃｙｔｏｋｉｎｅｍｉａ）」としても公知であり、非常に高レベルの様々なサイトカイン（例えばＩＮＦ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＣＣＬ２など）を伴う、典型的にサイトカインと免疫細胞との間の正のフィードバックループからなる潜在的に致死性の免疫反応である。
【０１１０】
本明細書に記載の本発明の実施形態は、実施形態「からなる」、および／または実施形態「から本質的になる」ことを含むと理解される。
【０１１１】
本明細書で「約」の付いた値またはパラメータについての言及は、その値またはパラメータそれ自体に指向された変動を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。
【０１１２】
本明細書で使用されるとき、ある値またはパラメータ「でない」ことについての言及は一般的に、値またはパラメータ「以外」を意味し、記載する。例えば、「方法はＸ型のがんを処置するために使用されない」は、方法がＸ以外の型のがんを処置するために使用されることを意味する。
【０１１３】
本明細書で使用される「約Ｘ〜Ｙ」という用語は、「約Ｘ〜約Ｙ」と同じ意味を有する。
【０１１４】
本明細書で使用されるとき、および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ｏｒ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別に示さない限り、複数の指示物を含む。
ＩＩ．がんを処置する方法
【０１１５】
本出願の一態様は、個体（例えば、ヒト）においてがんを処置するための方法であって、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば、二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を個体に投与するステップを含み、結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）が、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法を提供する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、サイトカインストームを誘導しない用量で投与される。
【０１１６】
一部の実施形態では、個体（例えば、ヒト）においてがん細胞を殺傷するための方法であって、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば、二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を個体に投与するステップを含み、結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）が、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、ＭＳＦＰによって媒介される腫瘍細胞死滅率は、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより多くのいずれかである。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、サイトカインストームを誘導しない用量で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１１７】
一部の実施形態では、個体（例えば、ヒト）においてがん細胞の増殖を阻害するための方法であって、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば、二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を個体に投与するステップを含み、結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）が、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、サイトカインストームを誘導しない用量で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１１８】
一部の実施形態では、個体（例えば、ヒト）において末梢Ｔ細胞の再分布を誘導するための方法であって、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば、二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を個体に投与するステップを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、サイトカインストームを誘導しない用量で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１１９】
一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、ＣＤ３およびＥｐＣＡＭに特異的に結合する二重特異性Ｆａｂ融合タンパク質である。
【０１２０】
一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、２つを超える（例えば３つまたはそれよりも多い）エピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、ＥｐＣＡＭではない細胞表面タンパク質、例えば腫瘍抗原に特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）をさらに含む三重特異性Ｆａｂ融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、多重特異性（例えば二重特異性）結合ドメインを含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する単一の結合ドメインを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、単一のポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、ｓｃＦｖである。一部の実施形態では、単一の結合ドメインは、Ｆａｂ断片の重鎖ポリペプチドのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、単一の結合ドメインは、Ｆａｂ断片の軽鎖ポリペプチドのＮ末端に融合している。
【０１２２】
一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する２つの結合ドメインを含む。一部の実施形態では、２つの結合ドメインは、ＥｐＣＡＭの同じエピトープを標的にする。一部の実施形態では、２つの結合ドメインは、同じアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、２つの結合ドメインは、異なるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、２つの結合ドメインは、ＥｐＣＡＭの異なるエピトープを標的にする。一部の実施形態では、２つの結合ドメインの各々は、単一のポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、２つの結合ドメインの各々は、ｓｃＦｖである。一部の実施形態では、一方の結合ドメインは、Ｆａｂ断片の重鎖ポリペプチドのＮ末端に融合しており、他方の結合ドメインは、Ｆａｂ断片の軽鎖ポリペプチドのＮ末端に融合している。
【０１２３】
したがって、一部の実施形態では、個体（例えば、ヒト）においてがんを処置する方法であって、個体に、（１）ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、（２）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と、（３）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含む、有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、第１のｓｃＦｖはＦａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖはＦａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合しており、多重特異性（例えば、二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）および第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は同じ配列を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１２４】
一部の実施形態では、個体（例えば、ヒト）においてがん細胞を殺傷する方法であって、個体に、（１）ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、（２）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と、（３）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含む、有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、第１のｓｃＦｖはＦａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖはＦａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合しており、多重特異性（例えば、二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）および第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は同じ配列を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１２５】
一部の実施形態では、個体（例えば、ヒト）においてがん細胞の増殖を阻害する方法であって、個体に、（１）ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、（２）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と、（３）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含む、有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、第１のｓｃＦｖはＦａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖはＦａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合しており、多重特異性（例えば、二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）および第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は同じ配列を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１２６】
一部の実施形態では、個体（例えば、ヒト）において末梢Ｔ細胞の再分布を誘導する方法であって、個体に、（１）ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、（２）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と、（３）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含む、有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、第１のｓｃＦｖはＦａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖはＦａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合しており、多重特異性（例えば、二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）および第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は同じ配列を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１２７】
Ｆａｂ断片は、本分野で公知の任意の好適な抗ＣＤ３抗体に由来してもよい。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端に特異的に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのアミノ酸１〜２７内のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＳＰ３４に由来する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＳＰ３４の重鎖可変領域の任意の１つ、２つまたは３つのＨＶＲ（またはＣＤＲ）、例えば配列番号１〜３のアミノ酸配列を含むＨＶＲを含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＳＰ３４の軽鎖可変領域の任意の１つ、２つまたは３つのＨＶＲ（またはＣＤＲ）、例えば配列番号４〜６のアミノ酸配列を含むＨＶＲを含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＳＰ３４のＶＨ、例えば配列番号７および３９〜４３から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＳＰ３４のＶＬ、例えば配列番号８および４４〜４７から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域１（ＣＨ１）、例えば配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＨ１を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片のＣＨ１およびＣＬは、１つまたは複数のジスルフィド結合により接続している。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む。
【０１２８】
したがって、一部の実施形態では、個体においてがんを処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含む、有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＦａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号７および３９〜４３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号８および４４〜４７から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドおよび／または配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１２９】
一部の実施形態では、個体（例えばヒト）においてがんを処置する方法であって、個体に、（１）ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片であって、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、Ｆａｂ断片と、（２）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と、（３）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含む、有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）が、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）が、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合しており、多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）および第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号７および３９〜４３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号８および４４〜４７から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドおよび／または配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１３０】
一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（本明細書でＥｐＣＡＭ結合ドメインとも称される）は、抗ＥｐＣＡＭ抗体の抗原結合性断片である。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、抗ＥｐＣＡＭ抗体の単鎖抗原結合性断片である。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ｓｃＦｖである。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ−ＶＨ−ＶＬ−Ｃ融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１３〜１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＨＶＲの任意の１つ、２つまたは３つを含む、本発明のＥｐＣＡＭ抗体に由来する。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１６〜１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＨＶＲの任意の１つ、２つまたは３つを含む。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１３１】
したがって、一部の実施形態では、個体（例えばヒト）においてがんを処置する方法であって、個体に、（１）ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片（例えば、ＣＤ３イプシロンのＮ末端１〜２７アミノ酸）と、（２）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１のｓｃＦｖと、（３）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含む、有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、第１のｓｃＦｖが、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖが、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合しており、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１３２】
一部の実施形態では、個体（例えばヒト）においてがんを処置する方法であって、個体に、（１）ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片であって、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、Ｆａｂ断片と、（２）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１のｓｃＦｖと、（３）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含む、有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、第１のｓｃＦｖが、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖが、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合しており、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号７および３９〜４３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号８および４４〜４７から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドおよび／または配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１３３】
ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、リンカー、例えば可撓性ペプチドリンカー、例えばグリシンおよびセリンを含むペプチドリンカーによりＦａｂ断片の重鎖ポリペプチドのＮ末端および／または軽鎖ポリペプチドのＮ末端に融合してもよい。一部の実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む。
【０１３４】
したがって、一部の実施形態では、個体においてがんを処置する方法であって、個体に、配列番号２２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドおよび配列番号２３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む、有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１３５】
本明細書で提供される方法は、補助療法の設定（ａｄｊｕｖａｎｔ  ｓｅｔｔｉｎｇ）において実行してもよい。一部の実施形態では、方法は、新補助療法の設定（ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ  ｓｅｔｔｉｎｇ）において実行される、すなわち、方法は、主要な／最終的な療法の前に行ってもよい。一部の実施形態では、方法は、以前に処置された個体を処置するために使用される。本明細書で提供される処置方法のいずれも、以前に処置されていない個体を処置するために使用され得る。一部の実施形態では、方法は、第１選択療法として使用される。一部の実施形態では、方法は、第２選択療法として使用される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１３６】
本明細書に記載の方法は、がん処置の種々の態様のために有用である。一部の実施形態では、個体において細胞増殖（例えば、腫瘍成長）を阻害する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、少なくとも約１０％の（例えば少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のいずれかを含む）細胞増殖が阻害される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１のｓｃＦｖとＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１３７】
一部の実施形態では、個体において腫瘍転移を阻害する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、少なくとも約１０％の（例えば少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のいずれかを含む）転移が阻害される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１のｓｃＦｖとＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、個体において既存の腫瘍転移（例えば、リンパ節への転移）を低減（例えば、根絶）する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、少なくとも約１０％の（例えば少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のいずれかを含む）転移が低減される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１のｓｃＦｖとＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１３９】
一部の実施形態では、個体において既存の腫瘍転移（例えば、リンパ節への転移）の発生または負荷を低下させる方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１のｓｃＦｖとＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１４０】
一部の実施形態では、個体において腫瘍サイズを減少させる方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍サイズは、少なくとも約１０％の（例えば少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のいずれかを含む）減少する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１のｓｃＦｖとＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１４１】
一部の実施形態では、個体においてがんの疾患進行までの時間を延長する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２週間のいずれかだけ疾患進行までの時間を延長する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１のｓｃＦｖとＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１４２】
一部の実施形態では、がんを有する個体の生存を延長する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８または２４か月間のいずれかだけ個体の生存を延長する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１のｓｃＦｖとＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１４３】
一部の実施形態では、がんを有する個体において１つまたは複数の症状を軽減する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１のｓｃＦｖとＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１４４】
本明細書に記載の方法は、固形がんおよび液状がんの両方を含む、様々ながんを処置するために好適である。方法は、初期がん、非転移性がん、原発がん、進行がん、局所進行がん、転移性がんまたは寛解中のがんを含む、全てのステージのがんに適用可能である。本明細書に記載の方法は、補助療法の設定または新補助療法の設定において、第１の療法、第２の療法、第３の療法または本分野で公知の他の種類のがん療法、例えば化学療法、手術、放射線、遺伝子療法、免疫療法、骨髄移植、幹細胞移植、標的化療法、凍結療法、超音波療法、光ダイナミック療法、ラジオ波焼灼などとの組合せ療法として使用することができる。一部の実施形態では、がんは、以前の療法について難治性であった。
【０１４５】
本発明の方法により処置され得るがんの例として、副腎皮質癌（ａｄｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＡＩＤＳ関連がん（例えばＡＩＤＳ関連リンパ腫）、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫（例えば小脳および大脳の）、基底細胞癌、胆管がん（例えば肝外の）、膀胱がん、骨がん（骨肉腫および悪性線維性組織球腫）、脳腫瘍（例えば神経膠腫、脳幹神経膠腫、小脳または大脳星状細胞腫（例えば重細胞性星状細胞腫、びまん性星状細胞腫、未分化（悪性）星状細胞腫）、悪性神経膠腫、上衣腫、乏突起神経膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｇｌｉｏｍａ）、髄膜腫、頭蓋咽頭腫、血管芽腫（ｈａｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、髄芽腫、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、視路および視床下部神経膠腫ならびに神経膠芽腫）、乳がん、気管支腺腫／カルチノイド、カルチノイド腫瘍（例えば消化管カルチノイド腫瘍）、原発不明癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、慢性骨髄増殖性障害、子宮内膜がん（例えば子宮がん）、上衣腫、食道がん、ユーイング腫瘍ファミリー、眼がん（例えば眼内黒色腫および網膜芽細胞腫）、胆嚢がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍（例えば頭蓋外、性腺外、卵巣）、妊娠性絨毛腫瘍、頭頸部がん、肝細胞（肝臓）がん（例えば肝癌および肝細胞腫（ｈｅｐｔｏｍａ））、下咽頭がん、膵島細胞癌（膵内分泌部）、喉頭がん、喉頭がん、白血病、口唇および口腔（ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ）がん、口腔（ｏｒａｌ）がん、肝臓がん、肺がん（例えば小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌）、リンパ系新生物（例えばリンパ腫）、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性頸部扁平上皮がん、口腔（ｍｏｕｔｈ）がん、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、中咽頭がん、卵巣がん（卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍（ｏｖａｒｉａｎ  ｌｏｗ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｕｍｏｒ））、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、腹膜のがん、咽頭（ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ）がん、褐色細胞腫、松果体芽腫およびテント上未分化神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫（小膠細胞腫）、直腸がん、腎がん、腎盂および尿管がん（移行上皮がん）、横紋筋肉腫、唾液腺がん、皮膚がん（例えば非黒色腫（例えば扁平上皮癌）、黒色腫およびメルケル細胞癌）、小腸がん、扁平上皮がん、精巣がん、咽頭（ｔｈｒｏａｔ）がん、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、尿道がん、膣がん、外陰がん、ウィルムス腫瘍および移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、母斑症と関連付けられる異常血管増殖、浮腫（例えば脳腫瘍と関連付けられる浮腫）ならびにメグズ症候群が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
一部の実施形態では、方法は、がん細胞の表面上にＥｐＣＡＭを過剰発現するがん、例えばＥｐＣＡＭ陽性固形がんを処置するために好適である。一部の実施形態では、個体のがん細胞は、正常細胞と比較して少なくとも約２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００倍を超えるもののいずれか、またはそれよりも多いＥｐＣＡＭを発現する。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ陽性固形がんは、癌腫または腺癌である。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ陽性固形がんは、小腸がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮頸がん、肝臓がん、胃がん、膵臓がん、皮膚がん、腎がん、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、胆管がんおよび頭頸部がんからなる群より選択される。
【０１４７】
したがって、一部の実施形態では、個体においてＥｐＣＡＭ陽性固形がん（例えば癌腫または腺癌）を処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含む、有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ陽性固形がんは、小腸がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮頸がん、肝臓がん、胃がん、膵臓がん、皮膚がん、腎がん、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、胆管がんおよび頭頸部がんからなる群より選択される。
【０１４８】
一部の実施形態では、個体においてＥｐＣＡＭ陽性固形がん（例えば癌腫または腺癌）を処置する方法であって、個体に、（１）ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、（２）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と、（３）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含む、有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、第１のｓｃＦｖが、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖが、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合しており、多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）および第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、同じ配列を有する。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ陽性固形がんは、小腸がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮頸がん、肝臓がん、胃がん、膵臓がん、皮膚がん、腎がん、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、胆管がんおよび頭頸部がんからなる群より選択される。
【０１４９】
一部の実施形態では、個体においてＥｐＣＡＭ陽性固形がん（例えば癌腫または腺癌）を処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含む、有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号７および３９〜４３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号８および４４〜４７から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドおよび／または配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ陽性固形がんは、小腸がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮頸がん、肝臓がん、胃がん、膵臓がん、皮膚がん、腎がん、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、胆管がんおよび頭頸部がんからなる群より選択される。
【０１５０】
一部の実施形態では、個体（例えばヒト）においてＥｐＣＡＭ陽性固形がん（例えば癌腫または腺癌）を処置する方法であって、個体に、（１）ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片（例えば、ＣＤ３イプシロンのＮ末端１〜２７アミノ酸）、（２）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１のｓｃＦｖと、（３）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含む、有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、第１のｓｃＦｖが、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖが、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合しており、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ陽性固形がんは、小腸がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮頸がん、肝臓がん、胃がん、膵臓がん、皮膚がん、腎がん、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、胆管がんおよび頭頸部がんからなる群より選択される。
【０１５１】
一部の実施形態では、個体（例えばヒト）においてＥｐＣＡＭ陽性固形がん（例えば癌腫または腺癌）を処置する方法であって、個体に、（１）ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片であって、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、Ｆａｂ断片と、（２）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１のｓｃＦｖと、（３）ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含む、有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、第１のｓｃＦｖが、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖが、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合しており、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号７および３９〜４３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号８および４４〜４７から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドおよび／または配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ陽性固形がんは、小腸がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮頸がん、肝臓がん、胃がん、膵���がん、皮膚がん、腎がん、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、胆管がんおよび頭頸部がんからなる群より選択される。
【０１５２】
一部の実施形態では、個体においてＥｐＣＡＭ陽性固形がん（例えば癌腫または腺癌）を処置する方法であって、個体に、配列番号２２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドおよび配列番号２３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む、有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ陽性固形がんは、小腸がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮頸がん、肝臓がん、胃がん、膵臓がん、皮膚がん、腎がん、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、胆管がんおよび頭頸部がんからなる群より選択される。
【０１５３】
一部の実施形態では、個体において小腸がんを処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１のｓｃＦｖとＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１５４】
一部の実施形態では、個体において結腸直腸がん（例えば、結腸直腸腺癌）を処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、結腸直腸がんは、腺癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫（ｌｅｉｏｍｙｓａｒｃｏｍａ）、黒色腫または扁平上皮癌である。
【０１５５】
一部の実施形態では、個体において肺がんを処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、肺がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。ＮＳＣＬＣの例として、大細胞癌、腺癌、神経内分泌肺腫瘍および扁平上皮癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５６】
一部の実施形態では、個体において子宮頸がんを処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。
【０１５７】
一部の実施形態では、個体において肝臓がんを処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、肝臓がんは、肝臓細胞癌、肝細胞癌の線維層板型バリアント（ｆｉｂｒｏｌａｍｅｌｌａｒ  ｖａｒｉａｎｔ）または混合型肝細胞胆管癌である。
【０１５８】
一部の実施形態では、個体において胃がんを処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、胃がんは、腺癌、リンパ腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、カルチノイド腫瘍、扁平上皮癌、小細胞癌または平滑筋肉腫である。
【０１５９】
一部の実施形態では、個体において膵臓がんを処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、膵臓がんは、漿液性嚢胞性新生物（ｓｅｒｏｕｓ  ｃｙｓｔｉｃ  ｎｅｏｐｌａｓｍ）、粘液性嚢胞性新生物（ｍｕｃｉｎｏｕｓ  ｃｙｓｔｉｃ  ｎｅｏｐｌａｓｍ）、膵管内乳頭状粘液性新生物（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｍｕｃｉｎｏｕｓ  ｎｅｏｐｌａｓｍ）、膵臓腺癌、腺扁平上皮癌、扁平上皮癌、印環細胞癌、未分化癌、巨細胞を伴う未分化癌、固形偽乳頭状新生物（ｓｏｌｉｄ  ｐｓｅｕｄｏｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｎｅｏｐｌａｓｍ）、膨大部がん（ａｍｐｕｌ��ａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）または膵内分泌腫瘍である。一部の実施形態では、膵臓がんは、膵臓腺癌である。
【０１６０】
一部の実施形態では、個体において皮膚がんを処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、皮膚がんは、黒色腫である。一部の実施形態では、黒色腫は、表在拡大型黒色腫、悪性黒子由来黒色腫（ｌｅｎｔｉｇｏ  ｍａｌｉｇｎａ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、結節性黒色腫、粘膜黒色腫、ポリープ状黒色腫（ｐｏｌｙｐｏｉｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、線維形成性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、軟組織黒色腫または末端部黒子黒色腫である。
【０１６１】
一部の実施形態では、個体において腎臓がんを処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、がんは、腎細胞癌である。一部の実施形態では、腎細胞癌は、腺癌である。一部の実施形態では、腎細胞癌は、腎明細胞癌、乳頭状腎細胞癌（色素親和性腎細胞癌とも呼ばれる）、嫌色素性腎細胞癌、集合尿細管腎細胞癌（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  ｄｕｃｔ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、顆粒状腎細胞癌、混合型顆粒状腎細胞癌、腎血管筋脂肪腫または紡錘腎細胞癌（ｓｐｉｎｄｌｅ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）である。
【０１６２】
一部の実施形態では、個体において膀胱がんを処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、膀胱がんは、低悪性度膀胱がんである。一部の実施形態では、膀胱がんは、高悪性度膀胱がんである。一部の実施形態では、膀胱がんは、筋肉浸潤性（例えばＴ２、Ｔ３またはＴ４）である。一部の実施形態では、膀胱がんは、非浸潤性（例えばＴａ、Ｔ１  Ｃｉｓ、Ｔａおよび／またはＴ１を伴うＣｉｓ）である。一部の実施形態では、膀胱がんは、移行上皮癌または尿路上皮癌（例えば転移性尿路上皮癌）であり、乳頭状腫瘍および扁平癌（ｆｌａｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を含むが、こ���らに限定されない。一部の実施形態では、膀胱がんは、扁平上皮癌、非扁平上皮癌、腺癌または小細胞癌である。
【０１６３】
一部の実施形態では、個体において甲状腺がんを処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、甲状腺がんは、乳頭状癌、濾胞状癌、ヒュルトレ細胞癌、甲状腺髄様癌、退形成癌、甲状腺リンパ腫、甲状腺肉腫または副甲状腺がんである。
【０１６４】
一部の実施形態では、個体において前立腺がんを処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、前立腺がんは、腺癌である。一部の実施形態では、前立腺がんは、肉腫、神経内分泌腫瘍、小細胞がん、腺管がんまたはリンパ腫である。
【０１６５】
一部の実施形態では、個体において卵巣がんを処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、サイトカインストームを誘導しない。一部の実施形態では、卵巣がんは、卵巣上皮がんである。
【０１６６】
一部の実施形態では、個体において子宮内膜がんを処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、子宮内膜がんは、腺癌、癌肉腫、扁平上皮癌、未分化癌、小細胞癌または移行性癌である。
【０１６７】
一部の実施形態では、個体において乳がんを処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、乳がんは、初期乳がん、非転移性乳がん、進行乳がん、ＩＶ期乳がん、局所進行乳がん、転移性乳がん、寛解中の乳がん、補助療法の設定における乳がんまたは新補助療法の設定における乳がんである。一部の実施形態では、乳がんは、線維腺腫または管内乳頭腫である。一部の実施形態では、乳がんは、ＨＥＲ２陽性またはＨＥＲ２陰性である。一部の実施形態では、乳がんは、トリプルネガティブ乳がんである。
【０１６８】
一部の実施形態では、個体において胆管がんを処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、胆管がんは、肝内胆管がん、肺門周囲胆管がん（ｐｅｒｉｈｉｌａｒ  ｂｉｌｅ  ｄｕｃｔ  ｃａｎｃｅｒ）、遠位胆管がんである。一部の実施形態では、胆管がんは、胆管癌、肉腫、リンパ腫または小細胞がんである。
【０１６９】
一部の実施形態では、個体において頭頚部がんを処置する方法であって、個体に、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片とＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）とを含む有効量の多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を投与することを含み、結合ドメインが、Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ（例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇまたは約２．５μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ）の用量で投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞を殺滅すること、（２）がん細胞の増殖を阻害することおよび（３）末梢Ｔ細胞の再分布を誘導することの１つまたは複数を有する。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）とを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、第２のｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端（例えばＮ末端の１〜２７個のアミノ酸）に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｃＦｖおよび／または第２のｓｃＦｖが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、静脈内投与される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、低頻度で投与される。一部の実施形態では、方法は、個体にグルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、頭頸部がんは、頭頸部の扁平上皮癌である。一部の実施形態では、頭頸部がんは、下咽頭がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、潜在性原発性の転移性頸部扁平上皮がん（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｏｃｃｕｌｔ  ｐｒｉｍａｒｙ）、鼻咽頭がん、中咽頭がん、副鼻腔および鼻腔がんまたは唾液腺がんである。
【０１７０】
例示的な多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質（ＭＳＦＰ）の投与経路として、経口、静脈内、体腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、腫瘍内、動脈内、筋内、皮下、非経口、経粘膜、経皮、眼、局所、腹腔内、頭蓋内、胸膜内および表皮の経路が挙げられるが、これらに限定されず、またはリンパ節、体腔、がん細胞を含有することが知られている器官もしくは組織に送達される。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、静脈内投与される。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、注入により投与される。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、皮下投与される。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、注射により投与される。
【０１７１】
一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、静脈内注射によって投与される。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、個体に約２４時間、２０時間、１５時間、１０時間、８時間、６時間、３時間、２時間、１時間、３０分間、またはそれ未満のいずれか以下の期間にわたって注入され得る。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、約３０分間〜約１時間、約１時間〜約２時間、約２時間〜約４時間、約４時間〜約６時間、約６時間〜約８時間、約８時間〜約１０時間、約１０時間〜約１２時間、約１２時間〜約１８時間、約１８時間〜約２４時間、約３０分間〜約２時間、約２時間〜約５時間、約５時間〜約１０時間、約１０時間〜約２０時間、約３０分間〜約１０時間、または約３０分間〜約２０時間のいずれか１つの期間にわたって個体に注入される。ＭＳＦＰは、個体に任意の好適な速度で注入され得る。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、約０．０１μｇ／ｋｇ／ｈｒ、０．０２μｇ／ｋｇ／ｈｒ、０．０５μｇ／ｋｇ／ｈｒ、０．１μｇ／ｋｇ／ｈｒ、０．２μｇ／ｋｇ／ｈｒ、０．５μｇ／ｋｇ／ｈｒ、０．６μｇ／ｋｇ／ｈｒ、０．７μｇ／ｋｇ／ｈｒ、０．８μｇ／ｋｇ／ｈｒ、０．９μｇ／ｋｇ／ｈｒ、１μｇ／ｋｇ／ｈｒ、１．５μｇ／ｋｇ／ｈｒ、２μｇ／ｋｇ／ｈｒ、３μｇ／ｋｇ／ｈｒ、４μｇ／ｋｇ／ｈｒ、５μｇ／ｋｇ／ｈｒ、１０μｇ／ｋｇ／ｈｒ、１５μｇ／ｋｇ／ｈｒ、２０μｇ／ｋｇ／ｈｒ、２５μｇ／ｋｇ／ｈｒ、５０μｇ／ｋｇ／ｈｒ、７５μｇ／ｋｇ／ｈｒ、１００μｇ／ｋｇ／ｈｒまたはそれより多くのいずれかより大きな速度で注入され得る。
【０１７２】
個体に投与されるＭＳＦＰの投与レジメンは、特定のＭＳＦＰ組成物、投与方法ならびに処置されるがんの特定の種類およびステージにより変動し得る。一部の実施形態では、ＭＳＦＰの有効量は、組成物が個体に投与されたときに、毒性学的効果（すなわち、臨床的に許容されるレベルの毒性を超える効果）を誘導するレベル未満であるか、または潜在的な副作用が制御され得るか、もしくは許容され得るレベルである。
【０１７３】
一部の実施形態では、ＭＳＦＰの有効量は、中枢神経系で有害効果を誘導するレベル未満である。例えば、抗体療法で観察される有害効果は、注入関連副作用、例えばサイトカイン放出症候群（「ＣＲＳ」）の発生であり、サイトカイン放出症候群の重度の症例は、「サイトカインストーム」として公知である。「サイトカインストーム」が誘導されると、健康な個体の免疫系が活性化され、大量の炎症促進性サイトカイン、例えばＩＮＦ−γ、ＣＣＬ２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６などを放出する。それは、非常に高レベルの様々なサイトカインを伴う、典型的にサイトカインと免疫細胞との間の正のフィードバックループからなる潜在的に致死性の免疫反応である。ＣＲＳと関連付けられると説明されている他の有害副作用は、疲労、嘔吐、頻脈、高血圧、背痛であるが、また、中枢神経系反応（ＣＮＳ反応）、例えば発作、脳症、脳浮腫、無菌性髄膜炎および頭痛もある。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、サイトカイン放出症候群、例えばサイトカインストームを誘導しない用量で投与される。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＴＮＦおよびＩＮＦ−γからなる群より選択される１つまたは複数のサイトカインの顕著な放出を誘導しない用量で投与される。一部の実施形態では、サイトカインの顕著な放出は、少なくとも約１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間のいずれかまたはそれよりも長い過程にわたるサイトカインの持続放出である。一部の実施形態では、サイトカインの顕著な放出は、少なくとも約１、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００ｐｇ／ｍＬのいずれかまたはそれよりも高い濃度のサイトカインの血清レベルまたは血液レベルである。任意の理論に束縛されるものではないが、本明細書に記載のＭＳＦＰは、Ｔ細胞を動員および活性化するために、標的腫瘍細胞上のＥｐＣＡＭへの結合を必要とする。そのような要件は、所望の標的腫瘍細胞の非存在下での不必要なサイトカインストーム、および不必要なＴ細胞活性化を大いに低減し得る。
【０１７４】
一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、約０．０１μｇ／ｋｇ、０．０５μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇのいずれか１つ以下の用量で投与される。一部の実施形態では、ＭＳＦＰの用量は、以下の範囲のいずれか以内であり、この範囲は、０．０５μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇのいずれかの上限、および、０．０１μｇ／ｋｇ、０．０５μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇまたは９００μｇ／ｋｇのいずれかの独立して選択される下限を有し、下限は上限未満である。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約０．０５μｇ／ｋｇ、約０．０５μｇ／ｋｇ〜約０．１μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約０．５μｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約０．１μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ〜約１０μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１５μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ〜約２０μｇ／ｋｇ、約２０μｇ／ｋｇ〜約２５μｇ／ｋｇ、約２５μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ〜約１５μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇ、約３０μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇ、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇ、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１０μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１０μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約２０μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ、約２５０μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ〜約１０００μｇ／ｋｇまたは約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１０００μｇ／ｋｇのいずれか１つの用量で投与される。本明細書に記載の用量は、カニクイザルに好適な用量、その等価なヒト用量または特定の種の個体についての等価な用量を指し得る。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、カニクイザルについて約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ（例えば約０．３μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇまたは約５μｇ／ｋｇ〜約２０μｇ／ｋｇ）に等価な用量で投与される。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、カニクイザルについて約３０μｇ／ｋｇ以下（例えば約２０、１５または１０μｇ／ｋｇ以下）に等価な用量で投与される。
【０１７５】
一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１０μｇ／ｋｇ、例えば約０．３、０．５、０．６、１、１．２、２、２．４、３．６または４μｇ／ｋｇのいずれか１つの用量で投与される。
【０１７６】
有効量のＭＳＦＰは、単回用量で、または複数回用量で投与することができる。複数回用量でのＭＳＦＰの投与を含む方法について、例示的な投与頻度として、毎日、絶え間なく毎日、毎週、絶え間なく毎週、３週のうちの２週について毎週、４週のうちの３週について毎週、３週毎に１回、２週毎に１回、毎月、６カ月毎、毎年などが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、約２週毎に１回、３週毎に１回、４週毎に１回、６週毎に１回または８週毎に１回投与される。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、１週間に少なくとも約１回、２回、３回、４回、５回、６回または７回（すなわち毎日）のいずれかで投与される。一部の実施形態では、各投与の間の間隔は、約３年間、２年間、１２か月間、１１か月間、１０か月間、９か月間、８か月間、７か月間、６か月間、５か月間、４か月間、３か月間、２か月間、１か月間、４週間、３週間、２週間、１週間、６日間、５日間、４日間、３日間、２日間または１日間のいずれか未満である。一部の実施形態では、各投与の間の間隔は、約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８か月間、９か月間、１０か月間、１１か月間、１２か月間、２年間または３年間のいずれかより大きい。一部の実施形態では、投与スケジュール中に中断はない。
【０１７７】
一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、第１の期間の間第１の用量で投与され、引き続いて、ＭＳＦＰは、第２の期間の間第２の用量で投与され、第２の用量は、第１の用量を超える。第１の期間および第２の期間は、例えば約１、２、３、４、５、６週間のいずれか１つまたはそれよりも長い期間を含む、任意の好適な長さのものであってもよい。一部の実施形態では、第２の期間は、第１の期間を超える。一部の実施形態では、第１の期間は、少なくとも約７日間である。一部の実施形態では、第２の期間は、少なくとも約２週間、３週間、４週間、５週間、６週間のいずれか１つまたはそれよりも長い。第１の用量および第２の用量は、上記の任意の好適な用量のものであってもよい。一部の実施形態では、第１の用量は、約２、１．５、１、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１μｇ／ｋｇのいずれか１つ以下またはそれ未満である。一部の実施形態では、第２の用量は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１０μｇ／ｋｇ、例えば約０．３μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、第２の用量は、約０．３、０．６、１．２、２．４または３．６μｇ／ｋｇのいずれか１つである。
【０１７８】
一部の実施形態では、ＭＳＦＰは低頻度で、例えば、１か月毎に１回、２か月毎に１回、３か月毎に１回、４か月毎に１回、５か月毎に１回、６か月毎に１回、７か月毎に１回、８か月毎に１回、９か月毎に１回、１０か月毎に１回、１１か月毎に１回、１年毎に１回、１８か月毎に１回、２年毎に１回、３年毎に１回、またはそれ未満のいずれか１つ以下で投与される。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、単回用量で投与される。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、毎週２回投与される。
【０１７９】
ＭＳＦＰの投与は、延長された期間、例えば、１日間〜約１週間、約１週間〜約１か月間、約１か月間〜約１年間、約１年間〜約数年間にわたって延長されてもよい。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、少なくとも約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、１か月間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８か月間、９か月間、１０か月間、１１か月間、１２か月間、１年間、２年間、３年間、４年間、またはそれより長くのいずれかの期間にわたって投与される。
【０１８０】
一部の実施形態では、方法は、１つまたは複数のグルココルチコイドの投与をさらに含む。グルココルチコイド（ＧＣ）は、ヒトを含む、ほとんど全ての脊椎動物細胞に存在する、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）に結合するステロイドホルモンのクラスである。これらの化合物は、炎症の原因にかかわらず、強い抗炎症剤である。一部の実施形態では、グルココルチコイドは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＦＮ−γからなる群より選択される１つまたは複数のサイトカインの放出を抑制する。好適なグルココルチコイドとして、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、コルチゾール、クロプレドノール、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デフラザコート、フルドロコルチゾン、トリアムシノロン、デキサメタゾンおよびベタメタゾンが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、グルココルチコイドは、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、コルチゾール、クロプレドノール、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デフラザコート、フルドロコルチゾン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾンおよびこれらの薬学的に許容されるエステル、塩または複合体からなる群より選択される。一部の実施形態では、グルココルチコイドは、デキサメタゾンである。一部の実施形態では、グルココルチコイドは、デキサメタゾンの薬学的に許容されるエステル、塩または複合体である。
【０１８１】
グルココルチコイドは、個体にＭＳＦＰと同時に投与しても、ＭＳＦＰの投与前に投与してもよい。グルココルチコイドは、ＭＳＦＰの投与から約３時間、２時間、１時間、３０分のいずれか１つ以下またはそれ未満の時間に投与され得る。一部の実施形態では、グルココルチコイドは、ＭＳＦＰの各用量と同時に、またはそれより前に投与される。一部の実施形態では、グルココルチコイドは、ＭＳＦＰの第１の用量と同時に、またはそれより前に投与される。ＭＳＦＰが第１の期間の間第１の用量で投与され、引き続いて、ＭＳＦＰが第２の期間の間第２の用量で投与される一部の実施形態では、グルココルチコイドは、第１の期間の間ＭＳＦＰの第１の投与前（例えば約１時間前）に投与され、グルココルチコイドは、第２の期間の間ＭＳＦＰの第１の投与前（例えば約１時間前）に投与される。一部の実施形態では、個体が高い肝臓酵素レベル（例えばＡＬＴ、ＴＢｉｌおよび／またはＡＬＰ）および／または高いサイトカインレベル（例えばＩＬ−６）を有する場合、グルココルチコイドは、ＭＳＦＰの投与前に投与される。グルココルチコイドは、例えば少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５ｍｇ／ｋｇのいずれか１つまたはそれよりも多く含む、任意の好適な投与量で投与され得る。一部の実施形態では、グルココルチコイドは、少なくとも約１、２、５、１０、１５、２０、２５ｍｇのいずれか１つまたはそれよりも多い用量で投与される。
【０１８２】
一部の実施形態では、グルココルチコイドは、デキサメタゾンである。一部の実施形態では、方法は、ＭＳＦＰの第１の用量の投与前に個体にデキサメタゾンを投与することを含む。一部の実施形態では、デキサメタゾンは、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質
【０１８３】
本明細書に記載の方法で使用される多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質（ＭＳＦＰ）は、Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端で第１のＥｐＣＡＭ結合ドメインおよび／またはＦａｂ断片のＶＬのＮ末端で第２のＥｐＣＡＭ結合ドメインに融合した抗ＣＤ３  Ｆａｂ断片を含む。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖである。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、リンカーにより抗ＣＤ３  Ｆａｂ断片のＶＨまたはＶＬに接続している。本発明の方法に有用な例示的な二重特異性Ｆａｂ融合タンパク質を図１に示す。
Ｆａｂ断片
【０１８４】
本明細書に記載のＭＳＦＰのＦａｂ断片は、ＣＤ３、例えばヒトＣＤ３に特異的に結合する。「ＣＤ３」は、６本の鎖の多タンパク質複合体として本分野で公知である（ＡｂｂａｓおよびＬｉｃｈｔｍａｎ、２００３年；Ｊａｎｅｗａｙら、１７２および１７８頁、１９９９年を参照のこと）。哺乳動物では、複合体は、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、２本のＣＤ３イプシロン鎖およびＣＤ３ゼータ鎖のホモダイマーを含む。ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタおよびＣＤ３イプシロン鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連する細胞表面タンパク質である。ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタおよびＣＤ３イプシロン鎖の膜貫通領域は、負に荷電しており、これは、これらの鎖が、正に荷電しているＴ細胞受容体鎖と会合することを可能にする特徴である。ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタおよびＣＤ３イプシロン鎖の細胞内尾部各々は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知の単一の保存されたモチーフを含有し、一方で、各ＣＤ３ゼータ鎖は３つを有する。理論に束縛されるものではないが、ＩＴＡＭは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能に重要であると考えられる。ＣＤ３は、本明細書で使用されるとき、ヒト、霊長類、マウス、ラットまたは他の哺乳動物を含む、様々な動物種からであってもよい。
【０１８５】
一部の実施形態では、ＭＳＦＰのＦａｂ断片は、個々のＣＤ３鎖、例えばＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖またはＣＤ３イプシロン鎖に特異的に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、２本またはそれよりも多い個々のＣＤ３鎖から形成される複合体（例えば１本を超えるＣＤ３イプシロン鎖の複合体、ＣＤ３ガンマおよびＣＤ３イプシロン鎖の複合体、ＣＤ３デルタおよびＣＤ３イプシロン鎖の複合体）に特異的に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロン鎖に特異的に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのＮ末端に特異的に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３イプシロンのアミノ酸１〜２７に特異的に結合する。
【０１８６】
Ｆａｂ断片は、本分野で公知の様々な方法により発生させることができる（例えば米国特許第６，２９１，１６１号、同第６，２９１，１５８号を参照のこと）。Ｆａｂの供給源は、ヒト、ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダまたはラマから；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ、３６３巻：４４６頁およびＮｇｕｙｅｎら（１９９８年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２７５巻：４１３頁）、サメ（Ｒｏｕｘら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  ９５巻：１１８０４頁）、魚類（Ｎｇｕｙｅｎら（２００２年）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、５４巻：３９頁）、げっ歯類、鳥類またはヒツジを含む、様々な種からのモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ヒトまたはヒト化抗体に由来する。
【０１８７】
一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ヒトおよび非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）ＣＤ３の両方に特異的に結合する。サルＣＤ３と交差反応性を有する例示的な抗ヒトＣＤ３抗体として、ＳＰ３４マウスモノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｐｒｅｓｓａｎｏ，  Ｓ．  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ４：３３７−３４４，  １９８５；Ａｌａｒｃｏｎ，  Ｂ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：９０３−９１２，  １９９１；Ｓａｌｍｅｒｏｎ  Ａ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：３０４７−５２，  １９９１；Ｙｏｓｈｉｎｏ  Ｎ．ら、Ｅｘｐ．  Ａｎｉｍ  ４９：９７−１１０，  ２０００；Ｃｏｎｒａｄ  Ｍ  Ｌ．ら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ７１Ａ：９２５−３３，  ２００７；およびＹａｎｇら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：１０９７−１１００：  １９８６を参照のこと）。サルＣＤ３と交差反応性を有する抗ＣＤ３  Ｆａｂ断片を有するＭＳＦＰは、非ヒト霊長類における毒性研究を促進することができ、このことは、チンパンジーにおける毒性研究を行う、または代理分子を使用することなく、ヒト臨床試験候補物質についてのより関連のある安全性評価を提供し得る。
【０１８８】
一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、非ヒト霊長類と交差反応性を有しない抗ＣＤ３抗体に由来する。例示的な抗ＣＤ３抗体として、Ｃｒｉｓ−７モノクローナル抗体（Ｒｅｉｎｈｅｒｚ，  Ｅ．  Ｌ．ら（編）、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９８６））、ＢＣ３モノクローナル抗体（Ａｎａｓｅｔｔｉら（１９９０）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７２：１６９１）、ＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ（１９８５）  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３１３：３３７）およびその誘導体、例えば、ＯＫＴ３  ａｌａ−ａｌａ（Ｈｅｒｏｌｄら（２００３）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１：４０９）、ビシリズマブ（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら（２００２）  Ｂｌｏｏｄ  ９９：２７１２）、および１４５−２Ｃ１１モノクローナル抗体（Ｈｉｒｓｃｈら（１９８８）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４０：  ３７６６）が挙げられる。本明細書で企図されるさらなるＣＤ３結合分子として、ＵＣＨＴ−１（Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，  Ｐ  Ｃ  ａｎｄ  Ｃａｌｌａｒｄ，  Ｒ．  Ｅ．（１９８１）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１：  ３２９−３３４）およびＷＯ２００４／１０６３８０；ＷＯ２０１０／０３７８３８；ＷＯ２００８／１１９５６７；ＷＯ２００７／０４２２６１；ＷＯ２０１０／０１５０９１８に記載されるＣＤ３結合分子が挙げられる。
【０１８９】
一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、免疫グロブリン重鎖の１つの定常領域および１つの可変領域ならびに免疫グロブリン軽鎖の１つの定常領域および１つの可変領域を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域および可変領域は、軽鎖可変領域および定常領域とヘテロダイマー化し、重鎖定常領域と軽鎖定常領域との間のジスルフィド結合により共有結合的に連結している。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、基本構造ＮＨ２−ＶＬ−ＣＬ−Ｓ−Ｓ−ＣＨ１−ＶＨ−ＮＨ２を有する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片のＣＨ１およびＣＬは、１つまたは複数のジスルフィド結合により接続している。一部の実施形態では、Ｆａｂの重鎖の第１の定常領域（ＣＨ１）と軽鎖定常（ＣＬ）との間のジスルフィド結合の数は、少なくとも１つ、例えば２つ、３つ、４つまたはそれよりも多い。一部の実施形態では、ジスルフィド結合を導入するために、システイン残基を、Ｆａｂ断片内（例えばＣＨ１およびＣＬ領域内）に作出する。
【０１９０】
一部の実施形態では、ＭＳＦＰのＦａｂ断片は、ジスルフィド結合を含まない。例えば、ジスルフィド結合を必要とすることなく安定的に相互作用するように、重鎖および軽鎖を作出してもよい。一部の実施形態では、重鎖または軽鎖を作出して、システイン残基を除去してもよく、ここで重鎖および軽鎖はそれでもＦａｂとして安定的に相互作用および機能する。一部の実施形態では、重鎖と軽鎖との間の安定な相互作用を促進するために、変異が行われる。例えば「ノブイントゥーホール（ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ）」作出戦略は、Ｆａｂの重鎖と軽鎖との間のダイマー化を促進するために使用され得る（例えば１９９６年  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９巻：６１７〜６２１頁を参照のこと）。特定の目的のために設計されたバリアントＦａｂ断片、例えばＣＨ１および／またはＣＬの定常ドメイン内のアミノ酸変化ならびにジスルフィド結合の除去または精製のためのタグの付加などもまた、本明細書における使用に企図される。
【０１９１】
一部の実施形態では、Ｆａｂ断片内の可変領域および定常領域の配置は、ネイティブＦａｂで見られる配置とは異なってもよい。一部の実施形態では、可変領域および定常領域の配向は、１本の鎖でＶＨ−ＣＬ、および別の鎖でＶＬ−ＣＨ１であってもよい（例えばＳｈａｅｆｅｒら（２０１１年）、ＰＮＡＳ、１０８巻：１１１８７０〜９２頁を参照のこと）。
【０１９２】
一部の実施形態では、ＭＳＦＰのＦａｂ断片は、モノクローナル抗体に由来する。好適なモノクローナル抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥならびにそれらのサブタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意の種類のモノクローナル抗体であってもよい。軽鎖ドメインは、カッパまたはラムダ鎖に由来し得る。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、組換えで設計される。
【０１９３】
一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ヒト免疫グロブリンＣＨ１を含む。一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリンＣＨ１は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ヒトラムダ軽鎖定常領域を含む。一実施形態では、ヒトラムダ軽鎖定常領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【化１】
2019513701.tif 000003
【０１９４】
ＭＳＦＰのＦａｂ断片は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域と（ＶＨとＶＬと）の間に形成される抗原結合部位を介してＣＤ３に特異的に結合する。抗原結合部位は、免疫グロブリン重鎖の少なくとも１つ（例えば１つ、２または３つ）のＨＶＲおよび／または免疫グロブリン軽鎖の少なくとも１つ（例えば１つ、２または３つ）のＨＶＲを含む。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、ＣＤ３に特異的に結合する全長抗体のＶＨおよびＶＬ配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ全てのＨＶＲを含む。
【０１９５】
一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＳＰ３４に由来する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、米国特許第８，８４６，０４２号に記載されているＣＤ３  Ｆａｂ断片である。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号７からの１つ、２つもしくは３つのＨＶＲ（またはＣＤＲ）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号８からの１つ、２つもしくは３つのＨＶＲ（またはＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号７からの３つのＨＶＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号８からの３つのＨＶＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１〜３から選択される１つ、２つもしくは３つのＨＶＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号４〜６から選択される１つ、２つもしくは３つのＨＶＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号７および３９〜４３からなる群より選択される配列と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号８および４４〜４７からなる群より選択される配列と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するＶＨまたはＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、その配列を含むＦａｂ断片は、ＣＤ３に結合する能力を保持する。一部の実施形態では、ＨＶＲの任意の１つまたは複数において、１つまたは２つのアミノ酸が置換、挿入および／または欠失している。一部の実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）起こる。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号７および３９〜４３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号８および４４〜４���から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドおよび／または配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む。
【化２−１】
2019513701.tif 000004
【化２−２】
2019513701.tif 000005
【０１９６】
一部の実施形態では、抗ＣＤ３  Ｆａｂ断片の特定のＶＨおよび／またはＶＬを使用して、望ましい特性、例えばＣＤ３に対する増大した親和性を有するＶＨ／ＶＬを特定するために相補的可変領域のライブラリーをスクリーニングしてもよい。そのような方法は、例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）  １５０：８８０−８８７；Ｃｌａｒｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）  ３５２：６２４−６２８；およびＫｌｉｍｋａら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２０００）  ８３：２５２−２６０；Ｂｅｉｂｏｅｒら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（２０００）  ２９６：８３３−８４９；およびＲａｄｅｒら、ＰＮＡＳ（１９９８）  ９５：８９１０−８９１５に記載されている。
ＥｐＣＡＭ結合ドメイン
【０１９７】
本明細書に記載のＭＳＦＰは、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する１つまたは２つの結合ドメインを含む。上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３２６）は、１７−１Ａ、ＥＳＡ、ＡＵＡ１、ＥＧＰ４０などとしても公知であり、３１４個のアミノ酸から構成される４０ｋＤの膜貫通糖タンパク質である。ＥｐＣＡＭは、細胞シグナル伝達、遊走、増殖および分化に関連する。ＥｐＣＡＭは、様々な種類の上皮細胞および主要な種類のヒト悪性疾患において特異的に発現される。例えば、ＥｐＣＡＭは、結腸がん、肺がん、前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、乳がんおよび卵巣がんで高く発現され、したがって、多様ながんのための診断マーカーとして使用することができる。ＥｐＣＡＭはまた、ワクチン、マウス化またはヒト化モノクローナル抗体および細菌毒素または化学療法薬にコンジュゲートした抗体、例えばＥｐＣＡＭ特異的抗体ＩＮＧ−１、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、エドレコロマブなどを含む、免疫療法戦略のための潜在的な標的である。
【０１９８】
ＭＳＦＰ内の、ＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む、結合ドメインは、追加の結合特異性および特性の向上（例えば血清半減期の増大または免疫活性化カスケードの活性化）を提供するのみでなく、ＶＨおよび／またはＶＬ鎖のＮ末端への融合に起因して、立体障害を創出してＣＤ３へのＦａｂ断片の結合親和性を顕著に低減させる。これは、他のＦａｂ融合タンパク質、例えばＦａｂ断片のＣ末端で追加の結合ドメインに融合しているＴＲＩＢＯＤＩＥＳ（商標）とは全く対照的である（例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０００年、１６５巻：７０５０〜７０５７頁を参照のこと）。結合ドメインは、他の公知の融合タンパク質、例えばＷＯ２００８／０２４１８８およびＷＯ２００９／１４９１８５に記載されているものとは異なり、ダイマー化することが意図されていない。ＭＳＦＰのさらに際立った特徴は、ＭＳＦＰが腫瘍細胞上の細胞表面標的、例えばＥｐＣＡＭに結合していない場合、結合ドメインがＣＤ３へのＦａｂの結合親和性を低減することである。
【０１９９】
一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、抗ＣＤ３  Ｆａｂ単独と比較して、延長されたｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する。一部の実施形態では、ＭＳＦＰの半減期は、抗ＣＤ３  Ｆａｂ断片単独の半減期の少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍のいずれかまたはそれよりも長い。
【０２００】
ＥｐＣＡＭを含む結合ドメインは、抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖまたはｓｃＴＣＲ、受容体の細胞外ドメイン、細胞表面分子／受容体のリガンドまたはその受容体結合ドメインおよび腫瘍結合タンパク質から選択してもよい。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、ドメイン抗体バリアント（ｄＡｂ）、ラクダ科抗体（ＶＨＨ）、フィブロネクチン３ドメインバリアント、アンキリン反復バリアントおよび他のタンパク質スキャフォールドに由来する他の抗原特異的結合ドメインから選択される。
【０２０１】
一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに特異的に結合するｓｃＦｖ（本明細書で抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖとも称される）である。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬは、ペプチドリンカー、例えばグリシンおよび／またはセリンを含む可撓性リンカーを介して互いに接続している。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬは、互いに直接的に接続している。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、Ｎ−ＶＨ−ＶＬ−Ｃ融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、Ｎ−ＶＬ−ＶＨ−Ｃ融合ポリペプチドを含む。
【０２０２】
ＥｐＣＡＭ結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）は、任意の好適な抗ＥｐＣＡＭ抗体に由来してもよい。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ヒトおよび非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）の両方に特異的に結合する。一部の実施形態では、ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ヒトＥｐＣＡＭを特異的に認識するが、非ヒト霊長類との交差反応性を有しない。例示的な抗ＥｐＣＡＭ抗体は、本分野で公知であり、例えば米国特許第８，８８４，６０２号を参照されたい。抗ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、免疫グロブリン重鎖の少なくとも１つ（例えば１つ、２つまたは３つ）のＨＶＲおよび／または免疫グロブリン軽鎖の少なくとも１つ（例えば１つ、２つまたは３つ）のＨＶＲを含み得る。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する全長抗体のＶＨおよびＶＬ配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ全てのＨＶＲを含む。
【０２０３】
一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、配列番号１９からの１つ、２つもしくは３つのＨＶＲ（またはＣＤＲ）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号２０からの１つ、２つもしくは３つのＨＶＲ（またはＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、配列番号１９からの３つのＨＶＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号２０からの３つのＨＶＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、配列番号１３〜１５から選択される１つ、２つもしくは３つのＨＶＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号１６〜１８から選択される１つ、２つもしくは３つのＨＶＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、配列番号１９の配列と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および／または配列番号２０の配列と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖ、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
【化３】
2019513701.tif 000006
リンカー
【０２０４】
本明細書に記載のＭＳＦＰは、Ｆａｂ断片のＶＨまたはＶＬと結合ドメインとの間に位置するリンカー（例えばペプチドリンカー）を含み得る。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片のＶＨと第１の結合ドメインとの間のリンカーは、Ｆａｂ断片のＶＬと第１の結合ドメインとの間のリンカーと同じである。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片のＶＨと第１の結合ドメインとの間のリンカーは、Ｆａｂ断片のＶＬと第１の結合ドメインとの間のリンカーとは異なる。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間に位置するリンカー（例えばペプチドリンカー）を含み、これは、Ｆａｂ断片のＶＨおよびＶＬと結合ドメインとの間のリンカーのいずれかと同じであっても、異なっていてもよい。
【０２０５】
リンカーは、任意の長さのペプチドリンカーであり得る。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、１アミノ酸〜１０アミノ酸長、２アミノ酸〜１５アミノ酸長、３アミノ酸〜１２アミノ酸長、４アミノ酸〜１０アミノ酸長、５アミノ酸〜９アミノ酸長、６アミノ酸〜８アミノ酸長または１アミノ酸〜２０アミノ酸長である。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長のいずれかである。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０アミノ酸長のいずれかである。一部の実施形態では、ペプチドリンカーのＮ末端は、結合ドメインのＣ末端に共有結合的に連結しており、ペプチドリンカーのＣ末端は、Ｆａｂ断片のＶＨまたはＶＬのＮ末端に共有結合的に連結している。
【０２０６】
一部の実施形態では、リンカーは、可撓性リンカーである。例示的な可撓性リンカーとして、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎおよび（ＧＧＧＳ）ｎを含み、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマーおよび本分野で公知の他の可撓性リンカーが挙げられる。グリシンおよびグリシン−セリンポリマーは比較的不定形であり、それゆえ構成要素間の中間テザーとして働くことができ得る。グリシンは、アラニンよりいっそう顕著にｐｈｉ−ｐｓｉ空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに少なく制限される（Ｓｃｈｅｒａｇａ、Ｒｅｖ．  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  １１巻、１７３〜１４２頁（１９９２年）を参照のこと）。例示的な可撓性リンカーとして、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号２４）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２５）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号２６）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２７）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号２８）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号２９）などが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、抗ＣＤ３  Ｆａｂ断片のＶＨとＥｐＣＡＭ結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）との間のリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙである。一部の実施形態では、抗ＣＤ３  Ｆａｂ断片のＶＬとＥｐＣＡＭ結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）との間のリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙである。当業者は、ＭＳＦＰの設計は、リンカーが可撓性リンカー部分およびあまり可撓性のない構造を与える１つまたは複数の部分を含んで、所望のＭＳＦＰ構造を提供し得るように、全てまたは部分的に可撓性であるリンカーを含み得ることを認識する。
【０２０７】
一部の実施形態では、Ｆａｂと結合ドメインとの間のリンカーは、安定なリンカーである（プロテアーゼ、とりわけＭＭＰにより切断可能でない）。
【０２０８】
一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、Ｆａｂ  ＶＨまたはＶＬと結合ドメインとの間のリンカーは、プロテアーゼ基質切断配列、例えばＭＭＰ基質切断配列を含む。基質中の周知のＰＬＧＬＡＧペプチド配列（配列番号３０）は、ほとんどのＭＭＰにより切断することができる。ＭＭＰにより切断され得る基質配列は、広範に研究されている。例えば、ＰＬＧＬＡＧ配列（配列番号３０）は、ほとんどのＭＭＰにより切断することができる。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９またはこれらの組合せにより認識される。
【０２０９】
一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＭＳＦＰは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドおよび配列番号２３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む。配列番号２２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドおよび配列番号２３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む、ＭＳＦＰおよびその組成物（例えば医薬組成物）がさらに提供される。
【化４】
2019513701.tif 000007
ＩＩＩ．ＥｐＣＡＭ抗体
【０２１０】
本出願によりさらに提供されるのは、抗ＥｐＣＡＭ抗体に由来する抗原結合性断片を含む多重特異性（例えば、二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質を含む、新規抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片である。当技術分野において公知の抗ＥｐＣＡＭ抗体および断片と比較して、本明細書に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体およびそれらの抗原結合性断片は、向上した安定性および被発現能力を有する。加えて、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体およびそれらの抗原結合性断片は、ヒトおよび非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）両方からのＥｐＣＡＭに対して交差反応性を有し、これは、ＥｐＣＡＭ抗体またはそれらの誘導体（例えば、ＭＳＦＰ）を評価するためのヒト臨床研究への、サルにおける毒性および有効性研究からの結果の外挿に有益である。
【０２１１】
本発明の抗体は、ＥｐＣＡＭエピトープに、≦１μＭ、例えば、≦１００ｎＭ、好ましくは≦１０ｎＭ、より好ましくは≦１ｎＭの平衡結合定数（Ｋｄ）で結合する。例えば、本明細書で提供される抗ＥｐＣＡＭ抗体は、おおよそ≦１ｎＭ〜約１ｐＭの間の範囲のＫｄを示す。
【０２１２】
本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体は、広く分布しているＥｐＣＡＭの機能活性を、完全にまたは部分的に、調節する、遮断する、阻害する、低下させる、それに対して拮抗する、それを中和する、またはそれに対して別様に干渉するのに役立つ。ＥｐＣＡＭ抗体は、本明細書に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体との結合の非存在下でのＥｐＣＡＭ機能活性レベルと比較してＥｐＣＡＭ抗体の存在下でのＥｐＣＡＭ機能活性レベルが少なくとも９５％、例えば、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％減少された場合、ＥｐＣＡＭ機能活性を、完全に、調節する、遮断する、阻害する、低下させる、それに対して拮抗する、それを中和する、またはそれに対して別様に干渉すると考えられる。抗ＥｐＣＡＭ抗体は、本明細書に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体との結合の非存在下でのＥｐＣＡＭ活性レベルと比較して抗ＥｐＣＡＭ抗体の存在下でのＥｐＣＡＭ活性レベルが少なくとも５０％、例えば、５５％、６０％、７５％、８０％、８５％または９０％減少された場合、ＥｐＣＡＭ機能活性を、有意に、遮断する、阻害する、低下させる、それに対して拮抗する、それを中和する、またはそれに対して別様に干渉すると考えられる。抗ＥｐＣＡＭ抗体は、本明細書に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体との結合の非存在下でのＥｐＣＡＭ活性レベルと比較して抗ＥｐＣＡＭ抗体の存在下でのＥｐＣＡＭ活性レベルが９５％未満、例えば、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％または９０％減少された場合、ＥｐＣＡＭ機能活性を、部分的に、調節する、遮断する、阻害する、低下させる、それに対して拮抗する、それを中和する、またはそれに対して別様に干渉すると考えられる。
【０２１３】
一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体部分は、細胞の表面に存在するＥｐＣＡＭに特異的に結合する。一部の実施形態では、細胞は、その表面に、異常に高レベルのＥｐＣＡＭを提示する。一部の実施形態では、細胞は、がん細胞である。一部の実施形態では、がん細胞は、固形腫瘍である。一部の実施形態では、がん細胞は、転移性がん細胞である。
【０２１４】
一部の実施形態での抗ＥｐＣＡＭ抗体部分は、特異的配列を含むか、またはそのような配列のある特定のバリアントを含む。一部の実施形態では、バリアント配列におけるアミノ酸置換は、ＥｐＣＡＭに結合する抗ＥｐＣＡＭ抗体部分の能力を実質的に低下させない。例えば、ＥｐＣＡＭ結合親和性を実質的に低減させない変更を加えることができる。ＥｐＣＡＭ結合親和性を実質的に向上させる変更、あるいは何らかの他の特性、例えば、特異性、免疫原性、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣ、および／またはＥｐＣＡＭの関連バリアントとの交差反応性に影響を与える変更も、企図される。
【０２１５】
一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１９からの１つ、２つもしくは３つのＨＶＲ（またはＣＤＲ）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号２０からの１つ、２つもしくは３つのＨＶＲ（またはＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１９からの３つのＨＶＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号２０からの３つのＨＶＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２１６】
一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および／または配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２１７】
一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体または抗原結合性断片は、（１）配列番号１３の１つもしくは２つのアミノ酸置換を有するＨＶＲ−Ｈ１、（２）配列番号１４の１つもしくは２つのアミノ酸置換を有するＨＶＲ−Ｈ２、および／または（３）配列番号１５の１つもしくは２つのアミノ酸置換を有するＨＶＲ−Ｈ３を含むＶＨを含む。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体または抗原結合性断片は、（１）配列番号１６の１つもしくは２つのアミノ酸置換を有するＨＶＲ−Ｌ１、（２）配列番号１７の１つもしくは２つのアミノ酸置換を有するＨＶＲ−Ｌ２、および／または（３）配列番号１８の１つもしくは２つのアミノ酸置換を有するＨＶＲ−Ｌ３を含むＶＬを含む。
【０２１８】
一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２１９】
一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１９の配列と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および／または配列番号２０の配列と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するＶＨまたはＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、その配列を含むＦａｂ断片は、ＥｐＣＡＭに結合する能力を保持する。一部の実施形態では、ＨＶＲの任意の１つまたは複数において、１つまたは２つのアミノ酸が置換、挿入および／または欠失している。一部の実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）起こる。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２２０】
一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体は、完全長抗体である。一部の実施形態では、完全長抗ＥｐＣＡＭ抗体は、免疫グロブリン、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、からのＦｃ配列を含む。一部の実施形態では、完全長抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のいずれかのＦｃ配列を含む。一部の実施形態では、完全長抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ヒト免疫グロブリンのＦｃ配列を含む。一部の実施形態では、完全長抗ＥｐＣＡＭ抗体は、増強された抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）エフェクター機能を有するように変更されたまたは別様に変化したＦｃ配列を含む。
【０２２１】
本明細書に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体のいずれかと、ＥｐＣＡＭとの結合について競合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片も提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体のいずれかと同じエピトープに結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片が提供される。所望の特異性を有する抗体のスクリーニング方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および当技術分野の中で公知の他の免疫学的に媒介される技法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２２】
あるモノクローナル抗体が、本発明のモノクローナル抗体（例えば、配列番号１９の可変重鎖と配列番号２０の可変軽鎖とを有する抗ＥｐＣＡＭ抗体）と同じ特異性を有するかどうかを、過度の実験なしに、そのモノクローナル抗体が、本発明のモノクローナル抗体のＥｐＣＡＭへの結合を妨げるかどうかを確かめることにより、決定することが可能であることは、当業者には分かるであろう。試験されるモノクローナル抗体が、本発明のモノクローナル抗体による結合の減少により示されるように、本発明のモノクローナル抗体と競合する場合には、それら２つのモノクローナル抗体は、同じエピトープに結合するか、または密接に関連しているエピトープに結合する。
【０２２３】
あるモノクローナル抗体が、本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを決定する代替方法は、本発明のモノクローナル抗体を可溶性ＥｐＣＡＭタンパク質（本発明のモノクローナル抗体と通常は反応性である）とプレインキュベートし、次いで、試験されるモノクローナル抗体を添加して、試験されるモノクローナル抗体のＥｐＣＡＭに結合する能力が阻害されるかどうかを決定する方法である。試験されるモノクローナル抗体が阻害された場合には、ほとんど確実に、試験されるモノクローナル抗体は、本発明のモノクローナル抗体と同じまたは機能的に等価のエピトープ特異性を有する。
【０２２４】
一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体は、モノクローナル抗体、例えば、一価抗体である。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ断片、ダイアボディ、または線形抗体の形態である。
【０２２５】
一部の実施形態では、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖが提供される。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
【０２２６】
一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＥｐＣＡＭに結合するが１つまたは複数の他の標的にも結合し、任意選択でそれらの機能を阻害する、多重特異性抗体である。多重特異性抗体は、２つまたはそれより多くの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくは、ヒトまたはヒト化抗体（例えば、少なくとも２つの抗原に対する結合特異性を有する二重特異性抗体）である。例えば、結合特異性の一方は、ＥｐＣＡＭタンパク質に対する結合特異性であってもよく、他方の結合特異性は、任意の他の抗原に対する結合特異性であってもよい。一部の実施形態では、他の抗原は、細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットである。例えば、細胞表面タンパク質は、ＣＤ３、例えば、ＣＤ３イプシロンであってもよい。したがって、一実施形態によれば、本発明の二重特異性抗体は、ＥｐＣＡＭと例えば第２の細胞表面受容体との両方に結合することができる。
【０２２７】
一部の実施形態では、多重特異性抗ＥｐＣＡＭ分子は、例えば、ダイアボディ（Ｄｂ）、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、直鎖状ダイマーｓｃＤｂ（ＬＤ−ｓｃＤｂ）、環状ダイマーｓｃＤｂ（ＣＤ−ｓｃＤｂ）、ジダイアボディ、タンデムｓｃＦｖ、タンデムジｓｃＦｖ（例えば、二重特異性Ｔ細胞係合剤（ｅｎｇａｇｅｒ））、タンデムトリｓｃＦｖ、トリ（ア）ボディ、二重特異性Ｆａｂ２、ジミニ抗体（ｄｉ−ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ融合体、二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）抗体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）抗体、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｖ２−Ｆｃ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体、ドックアンドロック（ｄｏｃｋ  ａｎｄ  ｌｏｃｋ）（ＤＮＬ）抗体、ノブイントゥーホール（ＫｉＨ）抗体（ＫｉＨ技術により調製された二重特異性ＩｇＧ）、ＤｕｏＢｏｄｙ（ＤｕｏＢｏｄｙ技術により調製された二重特異性ＩｇＧ）、ヘテロマルチマー抗体、またはヘテロコンジュゲート抗体である。一部の実施形態では、多重特異性抗ＥｐＣＡＭ分子は、タンデムｓｃＦｖ（例えば、二重特異性Ｔ細胞係合剤などのタンデムジｓｃＦｖ）である。
【０２２８】
上記の抗ＥｐＣＡＭ抗体またはそれらの抗原結合性断片のうちのいずれかを含む、融合タンパク質、コンジュゲートまたは単離された細胞が、さらに提供される。
【０２２９】
一部の実施形態では、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、多重特異性（例えば二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質が提供される。
【０２３０】
一部の実施形態では、多重特異的Ｆａｂ融合タンパク質は、Ｆａｂ断片の重鎖ポリペプチドまたはＦａｂ断片の軽鎖ポリペプチドのＮ末端に融合している、単一の抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、２つの抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片を含むか、または２コピーの抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片を含む。
【０２３１】
一部の実施形態では、Ｆａｂ断片と抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片とを含む多重特異性（例えば、二重特異性）Ｆａｂ融合タンパク質であって、Ｆａｂ断片の重鎖ポリペプチドのＮ末端または軽鎖ポリペプチドのＮ末端が、抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片に融合しており、抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片が、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３とを含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および／または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が提供される。一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、Ｆａｂ断片、第１の抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片、および第２の抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片を含み、Ｆａｂ断片の重鎖ポリペプチドのＮ末端は、第１の抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片に融合しており、Ｆａｂ断片の軽鎖ポリペプチドのＮ末端は、第２の抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片に融合している。一部の実施形態では、第１の抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片は、第２の抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片と同じ配列を有する。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖなどの、ｓｃＦｖである。
【０２３２】
本明細書に記載の１つまたは複数の抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片を含む多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、上記のセクションＩＩ「がんを処置する方法」のサブセクション「多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質」に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の１つまたは複数の特徴をさらに含むことができる。
【０２３３】
一部の実施形態では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、免疫エフェクター分子に特異的に結合するＦａｂ断片を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、Ｔ細胞受容体に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３ε鎖に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ−４、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＧＩＴＲ、ＬＴβＲ、ＴＬＲ、ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、およびＥｒｂＢ３から選択される細胞表面標的に結合する。
【０２３４】
一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、ＣＤ３、例えば、ＣＤ３イプシロンのＮ末端、例えば、ＣＤ３イプシロンのＮ末端１〜２７アミノ酸に、特異的に結合する。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、配列番号７および３９〜４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに／または配列番号８および４４〜４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。実施形態の一部では、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、配列番号２３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドとを含む。
【０２３５】
一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片は、治療剤（例えば、細胞傷害性薬剤、放射性同位体および化学療法剤）とコンジュゲートされるか、またはイメージングにより患者試料中もしくはｉｎ  ｖｉｖｏでＥｐＣＡＭを検出するための標識（例えば、放射性同位体、蛍光色素および酵素）とコンジュゲートされる。一部の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片は、毒素とコンジュゲートされる。
【０２３６】
一部の実施形態では、ａ）本明細書に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体または抗原結合性断片のうちのいずれかを含む細胞外ドメインおよびｂ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む、抗ＥｐＣＡＭキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。膜貫通ドメインが細胞外ドメインと細胞内ドメインの間に存在していてもよい。抗ＥｐＣＡＭ  ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間に、または抗ＥｐＣＡＭ  ＣＡＲの細胞内ドメインと膜貫通ドメインの間に、スペーサードメイン、例えば、ペプチドリンカー（例えば、可撓性ペプチドリンカー）があってもよい。本発明の抗ＥｐＣＡＭ  ＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するように協調的に作用する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質側配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアント、ならびに同じ機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられる。ＣＡＲを作製するための任意の方法が本明細書において使用することができる。例えば、ＵＳ６，４１０，３１９、ＵＳ７，４４６，１９１、ＵＳ７，５１４，５３７、ＷＯ２００２／０７７０２９、ＵＳ２０１０／０６５８１８、ＵＳ２０１０／０２５１７７、ＵＳ２００７／０５９２９８、およびＢｅｒｇｅｒ  Ｃ．ら、Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１８：  １  ２９４−３０８（２００８）を参照のこと。
【０２３７】
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体または抗原結合性断片のうちのいずれかを含む細胞外ドメインを含む、抗ＥｐＣＡＭ組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が提供される。ＴＣＲを作出する方法は、例えば、Ｓｔｏｎｅ  Ｊ．Ｄ．ら、Ｔ  Ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０１２年）５０３巻：１８９〜２２２頁に記載されており、それを参照されたい。
【０２３８】
抗ＥｐＣＡＭ  ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する単離された細胞、例えば、ＣＡＲ−ＴまたはＴＣＲ−Ｔ細胞も提供され、その抗ＥｐＣＡＭ  ＣＡＲもしくはＴＣＲ、または抗ＥｐＣＡＭもしくはそのＴＣＲを発現する細胞を使用して、疾患（例えば、がん）を処置する方法も提供される。
【０２３９】
本明細書に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体または抗原結合性断片を、様々な治療および診断方法に使用することができる。個体のがんを処置する方法であって、上記の抗ＥｐＣＡＭ抗体もしくはその抗原結合性断片またはそれらの医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む方法がさらに提供される。例えば、頭頸部がん、膵臓がん、結腸直腸がんおよび肺がんを含むがこれらに限定されない、異常なＥｐＣＡＭ発現を特徴とする疾患の処置に、抗ＥｐＣＡＭ抗体（またはそれらの抗原結合性断片）を単独で使用または他の薬剤と併用することができる。本明細書で提供される抗体は、患者におけるまたは患者試料中のＥｐＣＡＭタンパク質を検出するために使用することもできる。
モノクローナル抗体
【０２４０】
本発明のモノクローナル抗体のスクリーニングを、例えば、ＥｐＣＡＭ媒介シグナル伝達を測定し、試験モノクローナル抗体が、ＥｐＣＡＭ媒介シグナル伝達を調節する、遮断する、阻害する、低減させる、それに対して拮抗する、それを中和する、またはそれに対して別様に干渉することができるかどうかを決定することによって、行うこともできる。これらのアッセイは、競合結合アッセイを含むことができる。加えて、これらのアッセイは、生物学的読み出しを測定することができる。
【０２４１】
当技術分野の中で公知の様々な手順を、ＥｐＣＡＭに対する、またはその誘導体、断片、アナログ、ホモログもしくはオルソログに対する、モノクローナル抗体の産生に使用することができる。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ  ＥおよびＬａｎｅ  Ｄ、１９８８年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照されたい）。完全ヒト抗体は、ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖両方の全配列がヒト遺伝子から生じる、抗体分子である。そのような抗体は、本明細書では「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と呼ばれる。ヒトモノクローナル抗体は、例えば、下記で提供される実施例に記載の手順を使用して、調製される。トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３年、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４巻：７２頁を参照されたい）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら、１９８５年、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、７７〜９６頁を参照されたい）を使用することによって、ヒトモノクローナル抗体を調製することもできる。ヒトハイブリドーマの使用（Ｃｏｔｅら、１９８３年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０巻：２０２６〜２０３０頁を参照されたい）により、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのエプスタイン・バーウイルスを用いるヒトＢ細胞の形質転換（Ｃｏｌｅら、１９８５年、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、７７〜９６頁を参照されたい）により、ヒトモノクローナル抗体を利用することおよび産生することができる。
【０２４２】
抗体は、免疫血清のＩｇＧ画分を主としてもたらす、プロテインＡまたはプロテインＧを使用するアフィニティクロマトグラフィなどの、周知の技法により精製される。その後、またはその代わりに、求められている免疫グロブリンの標的である特異的抗原またはそのエピトープをカラム上に固定化して、イムノアフィニティクロマトグラフィにより免疫特異的抗体を精製してもよい。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、出版元Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，  Ｉｎｃ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡ、１４巻、８号（２０００年４月１７日）、２５〜２８頁）により論じられている。
【０２４３】
本発明のＥｐＣＡＭ抗体は、モノクローナル抗体である。ＥｐＣＡＭ媒介細胞シグナル伝達を調節する、遮断する、阻害する、低減させる、それに対して拮抗する、それを中和する、またはそれに対して別様に干渉するモノクローナル抗体は、例えば、膜結合および／または可溶性ＥｐＣＡＭ、例えば、ヒトＥｐＣＡＭまたはその免疫原性断片、誘導体もしくはバリアントなどを用いて動物を免疫化することにより、生成される。あるいは、動物は、ＥｐＣＡＭが発現され、トランスフェクトされた細胞の表面と会合するように、ＥｐＣＡＭをコードする核酸分子を含有するベクターがトランスフェクトされた細胞を用いて免疫化される。あるいは、抗体は、抗体または抗原結合ドメイン配列を含有するライブラリーをＥｐＣＡＭとの結合についてスクリーニングすることにより得られる。このライブラリーは、例えば、バクテリオファージにおいて、組み立てられたファージ粒子の表面で発現され、ファージ粒子内に含有されているＤＮＡ配列にコードされているバクテリオファージコートタンパク質との、タンパク質またはペプチド融合体として調製される（すなわち、「ファージディスプレイライブラリー」である）。その後、骨髄腫／Ｂ細胞融合の結果として得られるハイブリドーマがＥｐＣＡＭとの反応性についてスクリーニングされる。
【０２４４】
モノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）により記載されたものなどのハイブリドーマ法を使用して調製される。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスターまたは他の適切な宿主動物は、典型的に、免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を惹起するために免疫化剤を用いて免疫化される。あるいは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでリンパ球を免疫化することができる。
【０２４５】
免疫化剤は、典型的に、タンパク質抗原、その断片またはそれらの融合タンパク質を含むことになる。一般に、ヒト起源の細胞が所望される場合には末梢血リンパ球が使用され、または非ヒト哺乳動物供給源が所望される場合には脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が使用される。その後、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞を形成するために好適な融合剤、例えば、ポリエチレングリコールを使用して不死化細胞株と融合させる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６年）５９〜１０３頁）。不死化細胞株は、通常は、形質転換された哺乳動物細胞、特に、齧歯動物、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウス骨髄腫細胞株が利用される。ハイブリドーマ細胞は、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つまたは複数の物質を好ましくは含有する好適な培養培地において培養することができる。例えば、親細胞に酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）がない場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含むことになり（「ＨＡＴ培地」）、これらの物質が、ＨＧＰＲＴ欠乏細胞の増殖を防止する。
【０２４６】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの発現を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性であるものである。より好ましい不死化細胞株はマウス骨髄腫系統であり、これは、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手することができる。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫細胞株も、モノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）  ｐｐ．  ５１−６３）を参照のこと）。
【０２４７】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法によって、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。そのような技法およびアッセイは、当技術分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７巻：２２０頁（１９８０年）のスキャッチャード分析によって決定することができる。さらに、モノクローナル抗体の治療適用では、標的抗原に対する高い程度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することが重要である。
【０２４８】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈手順によりサブクローニングし、標準的方法により増殖させることができる。（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６年）５９〜１０３頁を参照されたい）。このために好適な培地としては、例えば、ダルベッコ変性イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を哺乳動物において腹水としてｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させることができる。
【０２４９】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、培養培地または腹水液から従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティクロマトグラフィなどによって、単離または精製することができる。
【０２５０】
モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載のものなどの、組換えＤＮＡ法により作製することもできる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離およびシークエンシングすることができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離したら、ＤＮＡを発現ベクター内に配置することができ、これらのベクターが、その後、他に免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、サルＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６  、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、または骨髄腫細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成が得られる。ＤＮＡは、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を使用することにより改変することもでき（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８巻、８１２〜１３頁（１９９４年）を参照されたい）、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を共有結合により連結させることによって改変することもできる。そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに使用することができ、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに使用してキメラ二価抗体を創出することができる。
ヒト抗体、および抗体のヒト化
【０２５１】
本発明のモノクローナル抗体は、完全ヒト抗体またはヒト化抗体を含む。これらの抗体は、ヒトへの投与に好適であり、投与された免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を生じさせない。
【０２５２】
抗ＥｐＣＡＭ抗体は、当技術分野において公知の任意の手順を使用して生成することができる。例えば、マウスにおける改良ＲＩＭＭＳ（複数部位の反復免疫化（Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｉｔｅｓ））の免疫化戦略およびその後のハイブリドーマ生成を使用して、抗ＥｐＣＡＭ抗体を同定することができる。他の代替方法では、例えば、ヒト配列のみを含有する抗体を使用するファージディスプレイ方法を使用して、抗ＥｐＣＡＭ抗体を発生させる。そのようなアプローチは、当技術分野において、例えば、参照により本明細書に組み込まれているＷＯ９２／０１０４７および米国特許第６，５２１，４０４号において周知である。このアプローチでは、ＥｐＣＡＭまたはその断片の天然または組換え供給源を使用して、ランダムな軽鎖と重鎖の対を有するファージのコンビナトリアルライブラリーがスクリーニングされる。別のアプローチでは、その少なくとも１つのステップが、ヒトＥｐＣＡＭタンパク質を用いてトランスジェニック非ヒト動物を免疫化することを含むプロセスによって、抗ＥｐＣＡＭ抗体を産生させることができる。このアプローチでは、この異種非ヒト動物の内在性重鎖および／またはカッパ軽鎖遺伝子座の一部は無効にされており、免疫グロブリンをコードする遺伝子を抗原に応答して生成するために必要な再配列を行うことができない。加えて、少なくとも１つのヒト重鎖遺伝子座および少なくとも１つのヒト軽鎖遺伝子座は、動物に安定にトランスフェクトされている。したがって、投与された抗原に応答して、ヒト遺伝子座が再配列して、抗原に対して免疫特異的なヒト可変領域をコードする遺伝子をもたらす。そのため、免疫化すると、ゼノマウスは、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。
【０２５３】
異種非ヒト動物を産生させる様々な技法が当技術分野において周知である。例えば、米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号を参照されたく、これらの特許文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれている。この一般戦略は、１９９４年に発表された最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）系統の生成に関連して実証された。その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７巻：１３〜２１頁（１９９４年）を参照されたい。また、米国特許第６，１６２，９６３号；同第６，１５０，５８４号；同第６，１１４，５９８；６，０７５，１８１号；および同第５，９３９，５９８号、ならびに日本特許３０６８１８０Ｂ２、３０６８５０６Ｂ２および３０６８５０７Ｂ２、ならびに欧州特許ＥＰ０４６３１５１Ｂ１ならびに国際特許出願ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ００／７６３１０ならびに関連するファミリーメンバーを参照のこと。
【０２５４】
代替アプローチで、「小遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」アプローチを利用した者もおり、このアプローチでは、Ｉｇ遺伝子座からの小片（個々の遺伝子）を含めることによって外因性Ｉｇ遺伝子座が模倣される。したがって、１つまたは複数のＶＨ遺伝子、１つまたは複数のＤＨ遺伝子、１つまたは複数のＪＨ遺伝子、ミュー定常領域、および第２の定常領域（好ましくは、ガンマ定常領域）が、動物への挿入用の構築物内に形成される。例えば、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５４５，８０７号；同第５，５９１，６６９号；同第５，６１２，２０５号；同第５，６２５，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６４３，７６３号；同第５，６６１，０１６号；同第５，７２１，３６７号；同第５，７７０，４２９号；同第５，７８９，２１５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７７；３９７号；同第５，８７４，２９９号；同第６，０２３，０１０号；および同第６，２５５，４５８号；ならびに欧州特許０５４６０７３Ｂ１；ならびに国際特許出願ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／２２６４７、ＷＯ９２／２２６７０、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／００５６９、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／１４４３６、ＷＯ９７／１３８５２およびＷＯ９８／２４８８４ならびに関連するファミリーメンバーを参照のこと。
【０２５５】
微小核体融合によって大きい染色体片または全染色体が導入されたマウスからのヒト抗体の生成も実証されている。欧州特許出願第７７３２８８号および同第８４３９６１号を参照されたい。
【０２５６】
ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答は、業界をキメラ抗体または他の方法でヒト化された抗体を調製するように導いた。キメラ抗体は、ヒト定常領域および免疫可変領域を有するが、特に、抗体の慢性または複数回用量利用の際に、ある特定のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答が観察されると予想される。したがって、ＨＡＭＡまたはＨＡＣＡ応答の懸念および／または影響を低下させるまたは別様に緩和するためにＥｐＣＡＭに対する完全ヒト抗体を提供することが望ましいであろう。
【０２５７】
免疫原性が低下した抗体の産生は、適切なライブラリーを使用するヒト化、キメラ化およびディスプレイ法によっても果たされる。当技術分野において周知の技法を使用してマウス抗体または他の種からの抗体をヒト化または霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅ）することができることは、理解されるであろう。例えば、ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４巻：４３  ４６  （１９９３年）ならびにＷｒｉｇｈｔら、Ｃｒｉｔ，  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２１２５−１６８  （１９９２年）を参照されたい。目的の抗体を、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメインおよび／またはフレームワークドメインを対応するヒト配列で置換するような組換えＤＮＡ法によって、作出することができる（ＷＯ９２１０２１９０ならびに米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７９２号、同第５，７１４，３５０号および同第５，７７７，０８５号を参照されたい）。また、キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのＩｇ  ｃＤＮＡの使用は、当技術分野において公知である（Ｌｉｕら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ８４巻：３４３９頁（１９８７年）およびＪ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３９巻：３５２１頁（１９８７年））。ｍＲＮＡは、抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞から単離され、ｃＤＮＡを産生させるために使用される。目的のｃＤＮＡを、特異的プライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応により増幅させることができる（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）。あるいは、目的の配列を単離するために、ライブラリーが作製され、スクリーニングされる。次いで、抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列が、ヒト定常領域配列に融合される。ヒト定常領域遺伝子の配列は、Ｋａｂａｔら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｎ．Ｉ．Ｈ．発行番号９１−３２４２において見つけることができる。ヒトＣ領域遺伝子は、公知のクローンから容易に入手することができる。アイソタイプの選択は、所望のエフェクター機能、例えば、補体結合、または抗体依存性細胞傷害性の活性によって導かれることになる。好ましいアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域、カッパまたはラムダのいずれかを使用することができる。その後、キメラ、ヒト化抗体は、従来の方法により発現される。
【０２５８】
抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂをインタクトなタンパク質の切断により、例えば、プロテアーゼまたは化学的切断により、調製することができる。あるいは、短縮された遺伝子が設計される。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片の一部分をコードするキメラ遺伝子は、Ｈ鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含み、続いて、短縮された分子を生じさせるために翻訳終結コドンを含むことになる。
【０２５９】
ＨおよびＬ  Ｊ領域のコンセンサス配列は、Ｖ領域セグメントのヒトＣ領域セグメントへのその後の連結に有用な制限部位をＪ領域に導入するためのプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドを設計するために使用することができる。Ｃ領域ｃＤＮＡを、部位特異的変異誘発によって制限部位をヒト配列の類似位置に配置するように改変することができる。
【０２６０】
発現ベクターは、プラスミド、レトロウイルス、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームおよびこれらに類するものを含む。好都合なベクターは、任意のＶＨまたはＶＬ配列を容易に挿入および発現することができるように作出された適切な制限部位を有する、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターでは、スプライシングは、通常、挿入されたＪ領域内のスプライスドナー部位とヒトＣ領域の前にあるスプライスアクセプター部位との間で起こり、ヒトＣＨエクソン内に存在するスプライス領域でも起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流のネイティブ染色体部位で起こる。結果として得られるキメラ抗体を、いずれの強力なプロモーターと連結させてもよく、そのようなプロモーターとしては、レトロウイルスＬＴＲ、例えばＳＶ−４０初期プロモーター（Ｏｋａｙａｍａら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏ．  ３巻：２８０頁（１９８３年））、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ７９巻：６７７７頁（１９８２年））、およびモロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、Ｃｅｌｌ  ４１巻：８８５頁（１９８５年））が挙げられる。また、理解されるであろうが、ネイティブＩｇプロモーターおよびこれに類するものを使用してもよい。
【０２６１】
さらに、当技術分野において周知の技法を使用して、限定ではないがファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイおよび他の技法を含む、ディスプレイ型の技法によってヒト抗体または他の種からの抗体を生成することができ、結果として得られる分子を、そのような技術が当技術分野において周知であるように、親和性成熟などのさらなる成熟に付すことができる。Ｗｒｉｇｈｔら、Ｃｒｉｔ，  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２１２５−１６８（１９９２），  Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９４：４９３７−４９４２（１９９７）（リボソームディスプレイ）、Ｐａｒｍｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  ７３：３０５−３１８（１９８８）（ファージディスプレイ）、Ｓｃｏｔｔ，  ＴＩＢＳ，  ｖｏｌ．  １７：２４１−２４５（１９９２）、Ｃｗｉｒｌａら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２（１９９０）、Ｒｕｓｓｅｌら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１０８１−１０８５（１９９３）、Ｈｏｇａｎｂｏｏｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０：４３−６８（１９９２）、Ｃｈｉｓｗｅｌｌ  ａｎｄ  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ＴＩＢＴＥＣＨ；  １０：８０−８Ａ（１９９２）および米国特許第５，７３３，７４３号。ディスプレイ技術を利用してヒト抗体でない抗体を産生した場合、そのような抗体を上で説明したようにヒト化することができる。
【０２６２】
これらの技法を使用して、ＥｐＣＡＭ発現細胞、可溶性形態のＥｐＣＡＭ、それらのエピトープまたはペプチドに対する抗体、およびそれらの発現ライブラリーを生成することができ（例えば、米国特許第５，７０３，０５７号を参照されたい）、その後、それらを本明細書に記載の活性について上で説明したようにスクリーニングすることができる。
【０２６３】
本発明のＥｐＣＡＭ抗体を、上記の単鎖抗体をコードするＤＮＡセグメントを含有するベクターにより発現させることができる。
【０２６４】
これらは、ベクター、リポソーム、裸のＤＮＡ、アジュバント補助ＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテルなどを含み得る。ベクターには、標的化部分（例えば、細胞表面受容体に対するリガンド）および核酸結合部分（例えば、ポリリジン）を有する化学的コンジュゲート、例えばＷＯ９３／６４７０１に記載されているもの；ウイルスベクター（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスベクター）；融合タンパク質、例えば、標的部分（例えば、標的細胞に特異的な抗体）および核酸結合部分（例えば、プロタミン）を含有する融合タンパク質であるＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０（ＷＯ９５／２２６１８）に記載されているもの；プラスミド；ファージなどが含まれる。ベクターは、染色体ベクターであってもよく、非染色体ベクターであってもよく、または合成ベクターであってもよい。
【０２６５】
好ましいベクターとしては、ウイルスベクター、融合タンパク質および化学的コンジュゲートが挙げられる。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスを含む。ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。これらのベクターには、ポックスベクター、例えば、オルソポックスまたはトリポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター、例えば、単純ヘルペスＩウイルス（ＨＳＶ）ベクターが含まれる（Ｇｅｌｌｅｒ，  Ａ．  Ｉ．ら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，  ６４：４８７（１９９５）；Ｌｉｍ，  Ｆ．ら、ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｄ．  Ｇｌｏｖｅｒ編（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ，  Ａ．  Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．：  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０：７６０３（１９９３）；Ｇｅｌｌｅｒ，  Ａ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：１１４９（１９９０）を参照のこと）、アデノウイルスベクター（ＬｅＧａｌ  ＬａＳａｌｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５９：９８８（１９９３）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ  ３：２１９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６９：２００４（１９９５）を参照のこと）およびアデノ随伴ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ，  Ｍ．  Ｇ．ら、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ８：１４８（１９９４）を参照のこと）。
【０２６６】
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞の細胞質に導入する。トリポックスウイルスベクターは、核酸のほんの短期の発現しかもたらさない。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、神経細胞への核酸の導入に好ましい。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（約４カ月）より短期の発現（約２カ月）をもたらし、そしてまたアデノ関連ウイルスは、ＨＳＶベクターより短い。選択される特定のベクターは、標的細胞および処置される状態に依存することになる。導入は、標準的技法、例えば、感染、トランスフェクション、形質導入または形質転換により得る。遺伝子移入様式の例としては、例えば、裸のＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合法、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、およびウイルスベクターが挙げられる。
【０２６７】
ベクターを利用して、本質的にあらゆる所望の標的細胞を標的とすることができる。例えば、定位注射を使用して、ベクター（例えば、アデノウイルス、ＨＳＶ）を所望の位置に指向させることができる。加えて、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍなどのミニポンプ注入システムを使用して脳室内（ｉｃｖ）注入により粒子を送達することができる。対流と呼ばれる、総体流（ｂｕｌｋ  ｆｌｏｗ）に基づく方法も脳の拡張エリアへの大型分子の送達に有効であることが証明されており、標的細胞へのベクターの送達に有用であり得る。（Ｂｏｂｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１巻：２０７６〜２０８０頁（１９９４年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２６６巻：２９２〜３０５頁（１９９４年）を参照されたい）。使用することができる他の方法には、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内および皮下注射、ならびに経口または他の公知の投与経路が含まれる。
【０２６８】
これらのベクターは、様々な方法で使用することができる大量の抗体を発現させるために使用することができる。例えば、試料中のＥｐＣＡＭの存在を検出するために。抗体は、ＥｐＣＡＭに結合してＥｐＣＡＭ媒介シグナル伝達を妨害することを試みるために使用することもできる。
【０２６９】
本発明の抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生に技法を適合させることができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい）。加えて、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に方法を適合させて（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６巻：１２７５〜１２８１頁を参照されたい）、タンパク質またはその誘導体、断片、アナログもしくはホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速で有効な同定を可能にすることができる。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体断片は、当技術分野において公知の技法により産生させることができ、これらに限定されないが、（ｉ）抗体分子のペプシン消化により産生されるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成されるＦａｂ断片、（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤での抗体分子の処理により生成されるＦａｂ断片、および（ｉｖ）Ｆｖ断片を含む。
【０２７０】
本発明は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２抗ＥｐＣＡＭ断片、単鎖ＥｐＣＡＭ抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ナノボディまたはＶＨＨ）、多重特異性（例えば、二重特異性）抗ＥｐＣＡＭ抗体、ならびにヘテロコンジュゲート抗ＥｐＣＡＭ抗体も含む。
【０２７１】
二重特異性抗体の作製方法は、当技術分野において公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産生は、２本の重鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づく（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻：５３７〜５３９頁（１９８３年））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな取り合わせのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的混合物を生じさせ、そのうちの１個だけが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常はアフィニティクロマトグラフィステップにより果たされる。同様の手順が、１９９３年５月１３日に発行されたＷＯ９３／０８８２９において、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０巻：３６５５〜３６５９頁（１９９１年）において開示されている。
【０２７２】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させることができる。好ましくは、融合は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。融合体の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡおよび必要に応じて免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、好適な宿主生物に共トランスフェクトされる。二重特異性抗体の生成に関するさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１巻：２１０号（１９８６年）を参照されたい。
【０２７３】
ＷＯ９６／２７０１１に記載の別のアプローチによれば、１対の抗体分子間の界面を、組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーの百分率を最大にするように作出することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面からの１つまたは複数の小さいアミノ酸側鎖が、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えられる。大きい側鎖と同一のまたは同様のサイズの代償的「空洞」が、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることによって第２の抗体分子の界面に創出される。これは、他の望ましくない最終生成物、例えばホモダイマーより、ヘテロダイマーの収量を増加させるメカニズムを提供する。
【０２７４】
二重特異性抗体を完全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。抗体断片から二重特異性抗体を生成する技法は、文献に記載されている。例えば、化学連結を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９巻：８１頁（１９８５年）には、インタクトな抗体をタンパク質分解的に切断してＦ（ａｂ’）２断片を生成する手順が記載されている。これらの断片は、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、近接ジチオールを安定させ、分子内ジスルフィド形成を防止する。生成されたＦａｂ’断片は、その後、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一方がメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再変換され、等モル量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて、二重特異性抗体が形成される。生じた二重特異性抗体を酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
【０２７５】
加えて、Ｆａｂ’断片をＥ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的にカップリングさせて二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７５巻：２１７〜２２５頁（１９９２年）には、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生が記載されている。各Ｆａｂ’断片をＥ．ｃｏｌｉから別々に分泌させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで指向性化学的カップリングに付して、二重特異性抗体を形成した。
【０２７６】
組換え細胞培養物から二重特異性抗体断片を直接作製および単離する様々な技法も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生された。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８巻（５号）：１５４７〜１５５３頁（１９９２年）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合させた。抗体ホモダイマーをヒンジ領域において還元してモノマーを形成し、次いで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法を抗体ホモダイマーの産生に利用することもできる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）により記載された「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替メカニズムを提供した。これらの断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続している重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、ある断片のＶＨおよびＶＬドメインは、別の断片の相補的ＶＬおよびＶＨドメインと対合するように強いられ、その結果、２つの抗原結合部位が形成される。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を作製する別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２巻：５３６８頁（１９９４年）を参照されたい。
【０２７７】
２価より大きい価数を有する抗体も企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７巻：６０頁（１９９１年）。
【０２７８】
例示的二重特異性抗体は、少なくとも一方が本発明のタンパク質抗原に由来する２つの異なるエピトープに結合することができる。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームと、白血球上の誘発分子、例えば、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８もしくはＢ７）、またはＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームとを組み合わせて、特定の抗原を発現する細胞に細胞防御メカニズムを集中させることができる。二重特異性抗体を使用して、特定の抗原を発現する細胞に細胞傷害性薬剤を指向させることもできる。これらの抗体は、抗原結合アームと、細胞傷害性薬剤または放射性核種キレート剤、例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡもしくはＴＥＴＡに結合するアームとを有する。目的の別の二重特異性抗体は、本明細書に記載のタンパク質抗原に結合し、さらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０２７９】
ヘテロコンジュゲート抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合で連結している２つの抗体から構成される。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号を参照されたい）、およびＨＩＶ感染症の処置のために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、ＥＰ０３０８９を参照されたい）、提案された。架橋剤を含むものを含む、合成タンパク質化学において公知の方法を使用して、抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製することができることも企図される。例えば、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を構築することができる。このために好適な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートならびに例えば米国特許第４，６７６，９８０号において開示されているものが挙げられる。
【０２８０】
本発明の抗体を、エフェクター機能に関して、例えば、異常なＥｐＣＡＭシグナル伝達に関連する疾患および障害を処置する際の抗体の有効性を増強するように、改変することが望ましいこともある。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入することによって、この領域内での鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にすることができる。このようにして生成されたホモダイマー抗体は、向上した内在化能力ならびに／または増大した補体媒介細胞殺滅および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有することができる。（Ｃａｒｏｎら、Ｊ．  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．、１７６巻：１１９１〜１１９５頁（１９９２年）およびＳｈｏｐｅｓ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８巻：２９１８〜２９２２頁（１９９２年）を参照されたい）。あるいは、二重Ｆｃ領域を有し、その結果、増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有することができる抗体を、作出することができる。（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、３巻：２１９〜２３０頁（１９８９年）を参照）。
【０２８１】
本発明は、細胞傷害性薬剤、例えば、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素またはその断片）とコンジュゲートしている抗体、または放射性同位体とコンジュゲートしている抗体（すなわち、ラジオコンジュゲート（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））を含む、イムノコンジュゲートにも関する。
【０２８２】
使用することができる酵素的に活性な毒素およびその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、体外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからのもの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン類が挙げられる。様々な放射性核種がラジオコンジュゲート抗体の産生に利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅが挙げられる。
【０２８３】
抗体と細胞傷害性薬剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジプイミデートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス活性（ｂｉｓ−ａｃｔｉｖｅ）フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製される。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８巻：１０９８頁（１９８７年）に記載されているようにリシン免疫毒素を調製することができる。炭素１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするための例示的キレート剤である。（ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい）。
【０２８４】
可能性のある多種多様な部分を本発明の結果としての抗体とカップリングさせることができることは、当業者には分かるであろう。（例えば、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．  Ｍ．  ＣｒｕｓｅおよびＲ．  Ｅ．  Ｌｅｗｉｓ，  Ｊｒ（編集）、Ｃａｒｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８９年）を参照されたく、この参考文献の全内容は参照により本明細書に組み込まれている）。
【０２８５】
抗体および他の部分がそれらのそれぞれの活性を保持する限り、２つの分子を結合させるいかなる化学反応によってカップリングを果たしてもよい。この連結は、多くの化学的機構、例えば、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合および錯化を含み得る。しかし、好ましい結合は、共有結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接縮合または外部の架橋分子の組込みのいずれかによって達成することができる。多くの二価または多価結合剤が、本発明の抗体などのタンパク質分子を他の分子とカップリングさせるのに有用である。例えば、代表的なカップリング剤としては、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼンおよびヘキサメチレンジアミンなどの、有機化合物を挙げることができる。この列挙は、当技術分野において公知のカップリング剤の様々なクラスを網羅することを意図したものではなく、むしろ、より一般的なカップリング剤の典型例である。（ＫｉｌｌｅｎおよびＬｉｎｄｓｔｒｏｍ、Ｊｏｕｒ．  Ｉｍｍｕｎ．  １３３巻：１３３５〜２５４９頁（１９８４年）；Ｊａｎｓｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６２巻：１８５〜２１６頁（１９８２年）；およびＶｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８巻：１０９８頁（１９８７年）を参照されたい）。
【０２８６】
好ましいリンカーは、文献に記載されている。（例えば、ＭＢＳ（Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの使用を記載しているＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，  Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４４巻：２０１〜２０８頁（１９８４年）を参照されたい）。オリゴペプチドリンカーにより抗体とカップリングされたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用を記載している米国特許第５，０３０，７１９号も参照されたい。特に好ましいリンカーとしては、（ｉ）ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩、（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）−トルエン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｃａｔ．（２１５５８Ｇ））、（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ番号２１６５１Ｇ）、（ｉｖ）Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ番号２１６５−Ｇ）、および（ｖ）ＥＤＣとコンジュゲートしているｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミド：Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ番号２４５１０）が挙げられる。
【０２８７】
上記のリンカーは、異なる特質を有する成分を含有し、したがって、異なる物理化学的特性を有するコンジュゲートをもたらす。例えば、アルキルカルボキシレートのｓｕｌｆｏ−ＮＨＳエステルは、芳香族カルボキシレートのｓｕｌｆｏ−ＮＨＳエステルより安定性が高い。リンカーを含有するＮＨＳエステルは、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳエステルより溶解性が低い。さらに、リンカーＳＭＰＴは、立体障害ジスルフィド結合を含有し、安定性が増したコンジュゲートを形成することができる。ジスルフィド連結は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで切断されるため、一般に、他の連結より安定性が低く、その結果、それほど多くのコンジュゲートを得ることができない。ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳは、特に、カルボジイミドカップリングの安定性を増強することができる。カルボジイミドカップリング（例えば、ＥＤＣ）は、ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳと併用された場合、単独でのカルボジイミドカップリング反応よりも加水分解に対する抵抗性の高いエステルを形成する。
【０２８８】
本明細書で開示される抗体をイムノリポソーム（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）として製剤化することもできる。抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８２巻：３６８８頁（１９８５年）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７７巻：４０３０頁（１９８０年）；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載されているものなどの、当技術分野において公知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号において開示されている。
【０２８９】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法により生成することができる。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを生じさせるために、画定された孔径のフィルターに通して押し出される。本発明の抗体のＦａｂ’断片を、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２５７巻：２８６〜２８８頁（１９８２年）に記載されているようなリポソームと、ジスルフィド交換反応によってコンジュゲートさせることができる。
ＥｐＣＡＭに対する抗体の使用
【０２９０】
本発明による治療用実体は、好適な担体、賦形剤、ならびに改善された移入、送達、耐容性およびこれらに類するものをもたらすために製剤に組み込まれる他の薬剤と共に投与されることになることは、理解されるであろう。多くの適切な製剤を、全ての薬剤師に公知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ  （１９７５年））、特に、その中のＢｌａｕｇ、Ｓｅｙｍｏｕｒによる８７章において見いだすことができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、（カチオン性またはアニオン性）脂質含有小胞（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、エマルジョンカルボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール類）、半固体ゲル、ならびにカルボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。前述のいずれの混合物も、本発明による処置および治療に適したものであり得るが、ただし、その製剤中の活性成分が製剤化により不活性化されないこと、およびその製剤が投与経路に生理学的に適合し、生理学的に許容されることを条件とする。Ｂａｌｄｒｉｃｋ  Ｐ．、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：  ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ．」、Ｒｅｇｕｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３２巻（２号）：２１０〜８頁（２０００年）、Ｗａｎｇ  Ｗ．、「Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．」、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  ２０３巻（１−２巻）：１〜６０頁（２０００年）、Ｃｈａｒｍａｎ  ＷＮ、「Ｌｉｐｉｄｓ，  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｒｕｇｓ，  ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ．」、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．  ８９巻（８号）：９６７〜７８頁（２０００年）、Ｐｏｗｅｌｌら、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」、ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ５２巻：２３８〜３１１頁（１９９８年）およびこれらの中の薬剤師に周知の製剤、賦形剤および担体に関する追加情報についての引用も参照されたい。
【０２９１】
一実施形態では、本発明のモノクローナル抗体を含む、本発明の抗体を、治療剤として使用することができる。そのような薬剤は、被験体における異常なＥｐＣＡＭ発現、活性および／またはシグナル伝達に関連する疾患または病理を診断、予後判定（ｐｒｏｇｎｏｓｅ）、モニター、処置、軽減および／または予防するために一般に利用されることになる。治療レジメンは、異常なＥｐＣＡＭ発現、活性および／またはシグナル伝達に関連する疾患または障害、例えば、がんまたは他の新生物障害に罹患している（またはそのような疾患もしくは障害を発症するリスクがある）被験体、例えば、ヒト患者を、標準的な方法を使用して同定することにより、行われる。抗体調製物、好ましくは、その標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有するものが、被験体に投与され、そのような抗体調製物には、一般に、標的とのその結合に起因して効果がある。抗体の投与は、標的（例えば、ＥｐＣＡＭ）の発現、活性および／もしくはシグナル伝達機能をなくすもくしは阻害することができ、またはそのような発現、活性および／もしくはシグナル伝達機能に干渉することができる。抗体の投与は、標的（例えば、ＥｐＣＡＭ）とそれが自然に結合する内因性リガンドとの結合をなくすもしくは阻害することができ、またはそのような結合に干渉することができる。例えば、抗体は、標的に結合し、ＥｐＣＡＭ発現、活性および／もしくはシグナル伝達を調節するか、遮断するか、阻害するか、低減させるか、ＥｐＣＡＭ発現、活性および／もしくはシグナル伝達に拮抗するか、ＥｐＣＡＭ発現、活性および／もしくはシグナル伝達を中和するか、またはＥｐＣＡＭ発現、活性および／もしくはシグナル伝達に別様に干渉する。
【０２９２】
異常なＥｐＣＡＭ発現、活性および／またはシグナル伝達に関係する疾患または障害としては、非限定的な例として、血液がんおよび／または固形腫瘍が挙げられる。血液がんは、例えば、白血病、リンパ腫および骨髄腫を含む。ある特定の形態の白血病としては、非限定的な例として、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性障害／新生物（ＭＰＤＳ）、および脊髄形成異常症候群が挙げられる。ある特定の形態のリンパ腫としては、非限定的な例として、ホジキンリンパ腫、低悪性度および侵襲性両方の非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）が挙げられる。ある特定の形態の骨髄腫としては、非限定的な例として、多発性骨髄腫（ＭＭ）、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫、および軽鎖またはベンス・ジョーンズ骨髄腫が挙げられる。固形腫瘍としては、例えば、乳腺腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、メラノーマ腫瘍（ｍｅｌａｎｏｍａ  ｔｕｍｏｒ）、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、頭頸部腫瘍、膀胱腫瘍、食道腫瘍、肝臓腫瘍および腎臓腫瘍が挙げられる。
【０２９３】
がんおよび他の新生物障害に関連する症状としては、例えば、炎症、発熱、全身倦怠感、発熱、疼痛（炎症部に局在することが多い）、食欲減退、体重減少、浮腫、頭痛、疲労、発疹、貧血、筋力低下、筋疲労、および腹部症状、例えば、腹痛、下痢または便秘が挙げられる。
【０２９４】
本発明の抗体の治療有効量は、一般に、治療目的を達成するために必要な量に関係する。上で述べたように、この治療目的は、抗体とその標的抗原間の結合相互作用であり得、この相互作用は、ある特定の場合には標的の機能に干渉する。投与すべき必要量は、抗体のその特異的抗原に対する結合親和性にさらに依存することになり、投与される抗体がその投与を受ける他の被験体の自由体積から枯渇される速度にも依存することになる。本発明の抗体または抗体断片の治療有効投与の一般的範囲は、非限定的な例として、体重１ｋｇ当り約０．１ｍｇ〜体重１ｋｇ当り約１００ｍｇであり得る。一般的な投与頻度は、例えば、１日２回〜週１回の範囲であり得る。
【０２９５】
処置の有効性は、特定の炎症関連障害を診断または処置する任意の公知の方法に関連して決定される。炎症関連障害の１つまたは複数の症状の軽減は、抗体が臨床的有益性を付与することを示す。
【０２９６】
別の実施形態では、ＥｐＣＡＭに対する抗体は、ＥｐＣＡＭの局在定位（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）および／または定量に関する当技術分野の中で公知の方法において（例えば、適切な生理学的試料中のＥｐＣＡＭのレベルの測定に使用するために、診断方法において使用するために、タンパク質のイメージングに使用するために、など）使用することができる。所与の実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的な抗体、または抗体由来の抗原結合ドメインを含有する抗体の誘導体、断片、アナログもしくはホモログは、薬理学的活性化合物（本明細書では以降「治療薬」と称される）として利用される。
【０２９７】
別の実施形態では、ＥｐＣＡＭに対して特異的な抗体を使用して、免疫親和性、クロマトグラフィまたは免疫沈降法などの標準的技法により、ＥｐＣＡＭポリペプチドを単離することができる。ＥｐＣＡＭタンパク質（またはその断片）に対する抗体を診断的に使用して、例えば、所与の処置レジメンの有効性を決定するために、例えば、臨床試験手順の一部として、組織内のタンパク質レベルをモニターすることができる。抗体を検出可能な物質とカップリングする（すなわち、物理的に結合させる）ことにより、検出を助長することができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、および放射性材料が挙げられる。好適な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光材料の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ、好適な放射性材料の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０２９８】
さらに別の実施形態では、本発明による抗体は、試料中のＥｐＣＡＭ（またはそのタンパク質断片）の存在を検出するための薬剤として使用することができる。一部の実施形態では、抗体は、検出可能な標識を含有する。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくはモノクローナルである。インタクトな抗体、またはその断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、もしくはＦ（ａｂ’）２）が使用される。プローブまたは抗体に関して、用語「標識された」は、検出可能な物質をプローブまたは抗体とカップリングする（すなわち、物理的に連結させる）ことによりプローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに直接標識されている別の試薬との反応性によりプローブまたは抗体を間接的に標識することも包含する。間接標識することの例は、蛍光標識された二次抗体を使用する一次抗体の検出；および蛍光標識されたストレプトアビジンでビオチンを検出することができるようにビオチンでＤＮＡプローブの末端を標識することを含む。用語「生体試料」は、被験体から単離された組織、細胞および生体液、ならびに被験体内に存在する組織、細胞および流体も含むことを意図したものである。したがって、用語「生体試料」の用法の範囲には、血液および血液の画分または成分（血清、血漿もしくはリンパ液を含む）が含まれる。つまり、本発明の検出方法を使用して、生体試料中の検体ｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏならびにｉｎ  ｖｉｖｏで検出することができる。例えば、検体ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検出法としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。検体タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検出法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降法、および免疫蛍光法が挙げられる。検体ゲノムＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検出法としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。イムノアッセイを行うための手順は、例えば、「ＥＬＩＳＡ：  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、４２巻、Ｊ．  Ｒ．  Ｃｒｏｗｔｈｅｒ（編集）  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１９９５年；「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」、Ｅ．  ＤｉａｍａｎｄｉｓおよびＴ．  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｕｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９６年；ならびに「Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」、Ｐ．  Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８５年に記載されている。さらに、検体タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏでの検出法は、標識された抗検体タンパク質抗体を被験体に導入することを含む。例えば、被験体内のその存在または位置を標準的なイメージング法により検出することができる放射性マーカーを用いて抗体を標識することができる。
ＩＶ．調製方法
【０２９９】
本明細書に記載のＭＳＦＰまたは抗ＥｐＣＡＭ抗体（もしくはその抗原結合性断片）は、当技術分野において公知のタンパク質発現および精製方法のいずれによって調製してもよい。
【０３００】
一部の実施形態では、本出願は、本明細書に記載のＭＳＦＰまたは抗ＥｐＣＡＭ抗体（もしくはその抗原結合性断片）のいずれか１つについてのポリペプチド鎖の１つまたは複数をコードする、単離された核酸を提供する。一部の実施形態では、単離された核酸は、配列番号３１または配列番号３２の核酸配列を含む。単離された核酸は、ＤＮＡであってもよく、またはＲＮＡであってもよい。
【化５】
2019513701.tif 000008
【０３０１】
一部の実施形態では、単離された核酸は、ベクター、例えば、発現ベクター、ウイルスベクターまたはクローニングベクターに挿入される。核酸の発現のために、ベクターを宿主細胞に導入して、宿主細胞内での核酸の発現を可能にすることができる。発現ベクターは、発現を制御するための様々なエレメントを含有することができ、そのようなエレメントとしては、限定ではないが、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択マーカー、およびシグナル配列が挙げられる。これらのエレメントを当業者は必要に応じて選択することができる。例えば、ベクター内のポリヌクレオチドの転写を促進するためにプロモーター配列を選択してもよい。好適なプロモーター配列としては、限定ではないが、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＣＭＶプロモーター、およびＳＶ４０プロモーターが挙げられる。核酸の転写を増進させるためにエンハンサー配列を選択してもよい。ベクターが挿入された宿主細胞を挿入されていないものから選択できるようにするために選択マーカーを選択してもよく、例えば、選択マーカーは、抗生物質耐性を付与する遺伝子であってもよい。発現されたポリペプチドを宿主細胞の外に輸送できるようにするためにシグナル配列を選択してもよい。一部の実施形態では、単離された核酸は、シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３４の核酸配列を含む。
【化６】
2019513701.tif 000009
【０３０２】
一部の実施形態では、上記のベクターを含有する、単離された宿主細胞が提供される。ベクターを含有する宿主細胞は、単離された核酸の発現またはクローニングに有用であり得る。好適な宿主細胞としては、限定ではないが、原核細胞、真菌細胞、酵母細胞、または高等真核細胞、例えば哺乳動物細胞を挙げることができる。Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における抗体および抗原結合性断片の発現は、当技術分野において十分に確立されている。総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９巻：５４５〜５５１頁（１９９１年）を参照されたい。培養での真核細胞における発現も、抗体またはそれらの抗原結合性断片の産生の選択肢として当業者は利用できる。最近の総説、例えば、Ｒｅｆ，  Ｍ．Ｅ．  （１９９３年）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ４巻：５７３〜５７６頁；Ｔｒｉｌｌ  Ｊ．  Ｊ．ら（１９９５年）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ６巻：５５３〜５６０頁を参照されたい。高等真核細胞、特に、多細胞生物に由来するものを、グリコシル化ポリペプチドの発現に使用することができる。好適な高等真核細胞としては、限定ではないが、無脊椎動物細胞および昆虫細胞、ならびに脊椎動物細胞が挙げられる。
【０３０３】
当技術分野において公知のいずれの好適な方法を使用してベクターを宿主細胞に導入してもよく、そのような方法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介送達、リン酸カルシウム沈殿法、カチオン性脂質媒介送達、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、受容体媒介遺伝子送達、ポリリジン、ヒストン、キトサンおよびペプチドにより媒介される送達が挙げられるが、これらに限定されない。目的のベクターの発現のための細胞の標準的なトランスフェクションおよび形質転換方法は、当技術分野において周知である。一部の実施形態では、宿主細胞は、第１のポリペプチドをコードする第１のベクター、および第２のポリペプチドをコードする第２のベクターを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドをコードする単離された核酸を含む単一のベクターを含む。
【０３０４】
一部の実施形態では、本出願は、本明細書に記載のＭＳＦＰまたは抗ＥｐＣＡＭ抗体（もしくはその抗原結合性断片）のいずれかを発現させる方法であって、ベクターを含有する単離された宿主細胞を培養するステップ、および細胞培養物からＭＳＦＰまたは抗ＥｐＣＡＭ抗体（もしくはその抗原結合性断片）を回収するステップを含む方法を提供する。単離された宿主細胞は、ベクターに挿入された単離された核酸の発現を可能にする条件下で培養される。ポリヌクレオチドの発現に好適な条件としては、限定ではないが、好適な培地、培養培地中の宿主細胞の好適な密度、必要栄養素の存在、補足因子の存在、好適な温度および湿度、ならびに微生物夾雑物の非存在を挙げることができる。当業者は、発現のために必要に応じて好適な条件を選択することができる。
【０３０５】
一部の実施形態では、宿主細胞において発現されたポリペプチドは、ダイマーを形成することができ、したがって、本明細書に記載のＭＳＦＰまたは抗ＥｐＣＡＭ抗体（もしくはその抗原結合性断片）を産生することができる。一部の実施形態では、宿主細胞において発現されたポリペプチドは、ホモダイマーであるポリペプチド複合体を形成することができる。宿主細胞が第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを発現する一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、ヘテロダイマーであるポリペプチド複合体を形成することができる。
【０３０６】
一部の実施形態では、ポリペプチド複合体（例えば、ＭＳＦＰまたは抗ＥｐＣＡＭ抗体もしくはその抗原結合性断片）を宿主細胞内で形成することができる。例えば、適切な酵素および／または補因子の補助のもと、宿主細胞内でダイマーを形成することができる。一部の実施形態では、ポリペプチド複合体を細胞から外に分泌させることができる。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、宿主細胞から外に分泌され、宿主細胞の外部でダイマー（例えば、ＭＳＦＰまたは抗ＥｐＣＡＭ抗体もしくはその抗原結合性断片）を形成することができる。
【０３０７】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを好適な条件下で別々に発現させ、ダイマー化させて、ＭＳＦＰまたは抗ＥｐＣＡＭ抗体（もしくはその抗原結合性断片）を形成することができる。例えば、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを好適な緩衝液中で併せ、第１のタンパク質モノマーおよび第２のタンパク質モノマーを疎水性相互作用など適切な相互作用によってダイマー化させることができる。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのダイマー化を促進することができる酵素および／または補因子を含有する好適な緩衝液中で、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを併せることができる。一部の実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを好適なビヒクル中で併せ、好適な試薬および／または触媒の存在下で互いに反応させることができる。
【０３０８】
発現されたポリペプチド（複数可）および／またはポリペプチド複合体を、任意の好適な方法を使用して収集することができる。ポリペプチド（複数可）および／またはポリペプチド複合体を細胞内で細胞膜周辺腔において発現させることができ、または細胞の外部の培地に分泌させることができる。ポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体が細胞内で発現された場合、ポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体を含有する宿主細胞を溶解することができ、遠心分離または限外濾過により望ましくない残屑を除去することによってポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体を溶解物から単離することができる。ポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体が、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に分泌された場合、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）などの薬剤の存在下で約３０分間解凍し、細胞残屑を遠心分離により除去することができる（Ｃａｒｔｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０巻：１６３〜１６７頁（１９９２年））。ポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体が、培地に分泌された場合、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｎｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して、細胞培養物の上清を収集し、濃縮することができる。プロテアーゼ阻害剤および／または抗生物質を収集および濃縮ステップに含めて、タンパク質分解および／または夾雑微生物の増殖を阻害することができる。
【０３０９】
一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを好適な条件下で別々に発現させ、ダイマー化させて、ＭＳＦＰまたは抗ＥｐＣＡＭ抗体（もしくはその抗原結合性断片）を形成することができる。例えば、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを好適な緩衝液中で併せ、第１のタンパク質モノマーおよび第２のタンパク質モノマーを疎水性相互作用など適切な相互作用によってダイマー化させることができる。一部の実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのダイマー化を促進することができる酵素および／または補因子を含有する好適な緩衝液中で、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを併せることができる。一部の実施形態では、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを好適なビヒクル中で併せ、好適な試薬および／または触媒の存在下で互いに反応させることができる。
【０３１０】
一部の実施形態では、ポリペプチドおよび／またはポリペプチドダイマー複合体をアフィニティクロマトグラフィにより精製することができる。一部の実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィまたはプロテインＡ／Ｇ（プロテインＡとプロテインＧの融合タンパク質）クロマトグラフィは、抗体ＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインに由来する成分を含むポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体の精製に有用であり得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ６２巻：１〜１３頁（１９８３年）；Ｚｅｔｔｌｉｔ，  Ｋ．  Ａ．、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｐａｒｔ  Ｖ、５３１〜５３５頁、２０１０年）。一部の実施形態では、プロテインＧクロマトグラフィは、ＩｇＧγ３重鎖を含むポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体の精製に有用であり得る（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ５巻：１５６７  １５７５頁（１９８６年））。一部の実施形態では、プロテインＬクロマトグラフィは、κ軽鎖を含むポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体の精製に有用であり得る（Ｓｕｄｈｉｒ，  Ｐ．、Ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２６章、出版元Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５年；Ｎｉｌｓｏｎ，  Ｂ．  Ｈ．  Ｋ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６７巻、２２３４〜２２３９頁（１９９２年））。アフィニティリガンドが結合されるマトリクスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリクスも利用可能である。機械的に安定なマトリクス、例えば、細孔制御ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースで達成することができるものより速い流量および短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。
Ｖ．医薬組成物、単位投与量、製造物品、およびキット
【０３１１】
本出願によりさらに提供されるのは、本明細書に記載のＭＳＦＰまたは抗ＥｐＣＡＭ抗体（もしくはそれらの抗原結合性断片）のいずれか１つと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
【０３１２】
医薬組成物は、例えば全身投与または限局投与を含む、本明細書に記載の様々な投与様式に好適であり得る。一部の実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与用に製剤化される。一部の実施形態では、医薬組成物は、皮下投与用に製剤化される。一部の実施形態では、医薬組成物は、腫瘍部位への局所投与用に製剤化される。一部の実施形態では、医薬組成物は、腫瘍内注射用に製剤化される。
【０３１３】
本明細書で使用される「担体」は、用いられる投与量および濃度でそれに曝露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を含む。生理的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。許容される担体、賦形剤または安定剤は、用いられる投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；保存薬（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルもしくはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む）；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【０３１４】
一部の実施形態では、医薬組成物は、例えば、５．０〜約８．０、約６．５〜約７．５、または約６．５〜約７．０のうちのほぼいずれか１つのｐＨ範囲を含む、約４．５〜約９．０の範囲のｐＨを有するように製剤化される。一部の実施形態では、グリセロールなどの好適な張度調節物質（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）の添加により、医薬組成物を血液と等張にすることもできる。
【０３１５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用されることになる医薬組成物は、一般に、無菌の、実質的に等張性のものとして、かつアメリカ食品医薬品局の全ての適正製造基準（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ＧＭＰ）を完全に順守して製剤化される。無菌性は、滅菌濾過膜による濾過によって容易に果たされる。一部の実施形態では、組成物は病原体を含まない。注射のために、医薬組成物は、例えば、ハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合性の緩衝液中の、液体溶液の形態であり得る。加えて、医薬組成物は、固体形態であり得、使用の直前に再溶解または再懸濁され得る。凍結乾燥組成物も含まれる。
【０３１６】
一部の実施形態では、医薬組成物は、静脈内、腹腔内または硝子体内注射に適合された医薬組成物として、通例の手順に従って製剤化される。典型的に、注射用の組成物は、無菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物は、可溶化剤、および注射部位の疼痛を和らげるための局所麻酔薬、例えばリグノカインも含むことがある。一般に、成分は、別々にまたは一緒に混合されて、単位剤形で、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたはサッシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密封容器内の乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給される。組成物が注入によって投与されることになる場合、医薬品グレードの滅菌水または食塩水を含む注入ボトルで組成物を分配することができる。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合することができるように注射用滅菌水または食塩水用のアンプルを提供することができる。
【０３１７】
一部の実施形態では、医薬組成物は、ヒトへの投与に好適である。一部の実施形態では、医薬組成物は、単回使用密封バイアルなどの単回使用バイアルに収容されている。一部の実施形態では、医薬組成物は、複数回使用バイアルに収容されている。一部の実施形態では、医薬組成物は、バルクで容器に収容されている。一部の実施形態では、医薬組成物は、凍結保存される。
【０３１８】
ＭＳＦＰ、抗ＥｐＣＡＭ抗体（またはその抗原結合断片）、またはその組成物の単位剤形もまた提供される。それぞれの投与量は、約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ、例えば、約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ、約０．０１μｇ〜約５ｍｇ、約０．０１μｇ〜約１ｍｇ、約０．１μｇ〜約３００μｇ、約０．１μｇ〜約２００μｇ、約０．１μｇ〜約１００μｇ、約０．１μｇ〜約９０μｇ、約０．１μｇ〜約８０μｇ、約０．１μｇ〜約７０μｇ、約０．１μｇ〜約６０μｇ、約０．１μｇ〜約５０μｇ、約０．１μｇ〜約４０μｇ、約０．１μｇ〜約３０μｇ、約０．１μｇ〜約２０μｇ、約０．１μｇ〜約１０μｇ、約０．１μｇ〜約５μｇまたは約０．１μｇ〜約１μｇのいずれかを含み得る。一部の実施形態では、ＭＳＦＰ、抗ＥｐＣＡＭ抗体（またはその抗原結合断片）、またはその組成物の単位剤形は、以下のいずれかの範囲内であり、この範囲は、０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．６μｇ、０．７μｇ、０．８μｇ、０．９μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、ｏｒ３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、３５０μｇ、４００μｇ、４５０μｇ、５００μｇ、５５０μｇ、６００μｇ、６５０μｇ、７００μｇ、７５０μｇ、８００μｇ、８５０μｇ、９００μｇ、１０００μｇ、１５００μｇ、２０００μｇ、２５００μｇ、３０００μｇ、６０００μｇまたは１００００μｇのいずれかの上限、および０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．６μｇ、０．７μｇ、０．８μｇ、０．９μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、ｏｒ３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、３５０μｇ、４００μｇ、４５０μｇ、５００μｇ、５５０μｇ、６００μｇ、６５０μｇ、７００μｇ、７５０μｇ、８００μｇ、８５０μｇ、９００μｇ、１０００μｇ、１５００μｇ、２０００μｇ、２５００μｇ、３０００μｇ、６０００μｇまたは１００００μｇのいずれかの独立して選択される下限を有し、下限は上限未満である。用語「単位剤形」は、各々の単位が、所望の治療効果を生じさせるように計算された所定量の活性物質を好適な医薬担体、希釈剤または賦形剤と会合した状態で含有する、個体への単位投与量として好適な物理的に個別の単位を意味する。これらの単位剤形を、単一のまたは複数の単位投薬量で好適なパッケージング内に保管することができ、さらに滅菌および密封することもできる。
【０３１９】
本出願は、好適なパッケージング内の本明細書に記載の組成物（例えば、医薬組成物）を含む、製造物品をさらに提供する。本明細書に記載の組成物（例えば、ＭＳＦＰまたは抗ＥｐＣＡＭ抗体組成物）のための好適なパッケージングは、当技術分野において公知であり、例えば、バイアル（例えば、密封バイアル）、器、アンプル、ボトル、ジャー、可撓性パッケージング（例えば、密封マイラーまたはプラスチックバッグ）およびこれらに類するものを含む。これらの製造物品をさらに滅菌および／または密封することができる。
本出願は、本明細書に記載の組成物（例えば、医薬組成物）を含むキットであって、本明細書に記載の使用などの、組成物の使用の方法に関する指示をさらに含むこともあるキットも提供する。本明細書に記載のキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、および本明細書に記載するいずれかの方法を行うための指示を伴う添付文書をはじめとする、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含むこともある。
例示的実施形態
【０３２０】
本発明は、以下の実施形態を提供する：
【０３２１】
１．個体においてがんを処置するための方法であって、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメインとを含む有効量の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質を前記個体に投与するステップを含み、前記結合ドメインが、前記Ｆａｂ断片のＮ末端に融合しており、前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇの用量で投与される、方法。
【０３２２】
２．前記結合ドメインが、ｓｃＦｖである、実施形態１に記載の方法。
【０３２３】
３．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１のｓｃＦｖと、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含み、前記第１のｓｃＦｖが、前記Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、前記第２のｓｃＦｖが、前記Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している、実施形態２に記載の方法。
【０３２４】
４．前記第１のｓｃＦｖおよび前記第２のｓｃＦｖが、同じ配列を有する、実施形態３に記載の方法。
【０３２５】
５．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、静脈内投与される、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【０３２６】
６．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、低頻度で投与される、実施形態１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【０３２７】
７．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、毎週２回投与される、実施形態６に記載の方法。
【０３２８】
８．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、カニクイザルについて約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇに等しい用量で投与される、実施形態１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【０３２９】
９．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、サイトカインストームを誘導しない用量で投与される、実施形態１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【０３３０】
１０．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、カニクイザルについて約３０μｇ／ｋｇ以下に等しい用量で投与される、実施形態９に記載の方法。
【０３３１】
１１．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、前記個体に第１の期間の間第１の用量で投与され、引き続いて、前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、前記個体に第２の期間の間第２の用量で投与され、前記第２の用量が、前記第１の用量を超える、実施形態１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【０３３２】
１２．前記第２の期間が前記第１の期間を超える、実施形態１１に記載の方法。
【０３３３】
１３．前記第１の期間が少なくとも約７日間である、実施形態１１または実施形態１２に記載の方法。
【０３３４】
１４．前記第２の期間が少なくとも約２週間である、実施形態１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【０３３５】
１５．前記第１の用量が約１μｇ／ｋｇ以下である、実施形態１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【０３３６】
１６．前記第２の用量が、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１０μｇ／ｋｇである、実施形態１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【０３３７】
１７．前記個体にグルココルチコイドを投与することをさらに含む、実施形態１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【０３３８】
１８．前記グルココルチコイドが、デキサメタゾンである、実施形態１７に記載の方法。
【０３３９】
１９．前記グルココルチコイドが、前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の前記第１の用量の前に投与される、実施形態１７または実施形態１８に記載の方法。
【０３４０】
２０．前記グルココルチコイドが、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【０３４１】
２１．前記個体が、ヒト個体である、実施形態１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【０３４２】
２２．前記Ｆａｂ断片が、ＣＤ３イプシロンのＮ末端に特異的に結合する、実施形態１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【０３４３】
２３．前記Ｆａｂ断片が、ＣＤ３イプシロンのアミノ酸１〜２７内のエピトープに特異的に結合する、実施形態２２に記載の方法。
【０３４４】
２４．前記Ｆａｂ断片のＶＨが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、実施形態２３に記載の方法。
【０３４５】
２５．前記Ｆａｂ断片のＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、実施形態２３または実施形態２４に記載の方法。
【０３４６】
２６．前記Ｆａｂ断片のＶＨが、配列番号７および３９〜４３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【０３４７】
２７．前記Ｆａｂ断片のＶＬが、配列番号８および４４〜４７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【０３４８】
２８．前記Ｆａｂ断片が、配列番号９のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖定常領域１（ＣＨ１）を含む、実施形態２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【０３４９】
２９．前記Ｆａｂ断片が、配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒトラムダ軽鎖定常領域を含む、実施形態２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【０３５０】
３０．前記Ｆａｂ断片のＣＨ１およびＣＬが、１つまたは複数のジスルフィド結合により接続している、実施形態２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【０３５１】
３１．前記Ｆａｂ断片が、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドを含む、実施形態３０に記載の方法。
【０３５２】
３２．前記Ｆａｂ断片が、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む、実施形態３０または実施形態３１に記載の方法。
【０３５３】
３３．前記がんが、ＥｐＣＡＭ陽性固形がんである、実施形態１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【０３５４】
３４．前記ＥｐＣＡＭ陽性固形がんが、癌腫または腺癌である、実施形態３３に記載の方法。
【０３５５】
３５．前記がんが、小腸がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮頸がん、肝臓がん、胃がん、膵臓がん、皮膚がん、腎がん、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、乳がん、胆管がんおよび頭頸部がんからなる群より選択される、実施形態１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【０３５６】
３６．前記がんが、結腸直腸腺癌である、実施形態３５に記載の方法。
【０３５７】
３７．前記がんが、肺腺癌である、実施形態３５に記載の方法。
【０３５８】
３８．前記ｓｃＦｖが、Ｎ−ＶＨ−ＶＬ−Ｃ融合ポリペプチドを含む、実施形態２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【０３５９】
３９．前記ｓｃＦｖのＶＨが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、実施形態２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【０３６０】
４０．前記ｓｃＦｖのＶＬが、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、実施形態２〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【０３６１】
４１．前記ｓｃＦｖのＶＨが、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【０３６２】
４２．前記ｓｃＦｖのＶＬが、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２〜４１に記載の方法。
【０３６３】
４３．前記ｓｃＦｖが、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態４２に記載の方法。
【０３６４】
４４．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドを含む、実施形態１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【０３６５】
４５．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む、実施形態１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【０３６６】
４６．（１）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（２）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（３）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域と、（１）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（２）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（３）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片。
【０３６７】
４７．重鎖可変ドメイン配列が、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨを含む、実施形態４６に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片。
【０３６８】
４８．軽鎖可変ドメイン配列が、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態４６または実施形態４７に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片。
【０３６９】
４９．抗ＥｐＣＡＭ抗体が、ヒトＩｇＧのＦｃ配列を含む、実施形態４６〜４８のいずれか１項に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその抗原結合性断片。
【０３７０】
５０．多重特異性抗体である、実施形態４６〜４９のいずれか一項に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体。
【０３７１】
５１．単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、実施形態４６〜４８のいずれか一項に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体の抗原結合性断片。
【０３７２】
５２．前記ｓｃＦｖが、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５１に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体の抗原結合性断片。
【０３７３】
５３．実施形態４６〜４８および５１〜５２のいずれか一項に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片を含む、多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
【０３７４】
５４．ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片の第１のコピーと、抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片の第２のコピーとを含み、前記抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片の前記第１のコピーが、前記Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、前記抗ＥｐＣＡＭ抗原結合性断片の前記第２のコピーが、前記Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している、実施形態５３に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
【０３７５】
５５．前記Ｆａｂ断片が、ＣＤ３イプシロンのＮ末端に特異的に結合する、実施形態５４に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
【０３７６】
５６．前記Ｆａｂ断片が、ＣＤ３イプシロンのアミノ酸１〜２７内のエピトープに特異的に結合する、実施形態５５に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
【０３７７】
５７．前記Ｆａｂ断片のＶＨが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、実施形態５６に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
【０３７８】
５８．前記Ｆａｂ断片のＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、実施形態５６または実施形態５７に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
【０３７９】
５９．前記Ｆａｂ断片のＶＨが、配列番号７および３９〜４３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５６〜５８のいずれか一項に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
【０３８０】
６０．前記Ｆａｂ断片のＶＬが、配列番号８および４４〜４７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５６〜５９のいずれか一項に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
【０３８１】
６１．前記Ｆａｂ断片が、配列番号９のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖定常領域１（ＣＨ１）を含む、実施形態５３〜６０のいずれか一項に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
【０３８２】
６２．前記Ｆａｂ断片が、配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒトラムダ軽鎖定常領域を含む、実施形態５３〜６１のいずれか一項に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
【０３８３】
６３．前記Ｆａｂ断片のＣＨ１およびＣＬが、１つまたは複数のジスルフィド結合により接続している、実施形態５３〜６２のいずれか一項に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
【０３８４】
６４．前記Ｆａｂ断片が、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドを含む、実施形態５６〜６３のいずれか一項に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
【０３８５】
６５．前記Ｆａｂ断片が、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む、実施形態５６〜６４のいずれか一項に記載の多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質。
【０３８６】
６６．実施形態４６〜６５のいずれか１項に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体もしくはその抗原結合性断片または多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【０３８７】
６７．実施形態６６に記載の単離された核酸分子をコードする、発現ベクター。
【０３８８】
６８．実施形態６７に記載の発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。
【０３８９】
６９．抗ＥｐＣＡＭ抗体もしくはその抗原結合性断片または多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質を産生させる方法であって、実施形態６８に記載の単離された宿主細胞を培養するステップ、および細胞培養物から抗ＥｐＣＡＭ抗体もしくはその抗原結合性断片または多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質を回収するステップを含む、方法。
【０３９０】
７０．実施形態４６〜６５のいずれか一項に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体もしくはその抗原結合性断片または多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【０３９１】
７１．個体においてがんを処置する方法であって、実施形態７０に記載の組成物の有効量を個体に投与するステップを含む、方法。
【０３９２】
７２．個体においてがんを処置するための医薬の調製における、実施形態４６〜６５のいずれか一項に記載の抗ＥｐＣＡＭ抗体もしくはその抗原結合性断片または多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の使用。
【０３９３】
７３．個体においてがんを処置するための医薬の調製における多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の使用であって、前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ断片と、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する結合ドメインとを含み、前記結合ドメインが、前記Ｆａｂ断片のＮ末端に融合している、使用。
【０３９４】
７４．前記結合ドメインが、ｓｃＦｖである、実施形態７３に記載の使用。
【０３９５】
７５．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第１のｓｃＦｖと、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する第２のｓｃＦｖとを含み、前記第１のｓｃＦｖが、前記Ｆａｂ断片のＶＨのＮ末端に融合しており、前記第２のｓｃＦｖが、前記Ｆａｂ断片のＶＬのＮ末端に融合している、実施形態７４に記載の使用。
【０３９６】
７６．前記第１のｓｃＦｖおよび前記第２のｓｃＦｖが、同じ配列を有する、実施形態７５に記載の使用。
【０３９７】
７７．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、静脈内投与される、実施形態７３〜７６のいずれか一項に記載の使用。
【０３９８】
７８．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、低頻度で投与される、実施形態７３〜７７のいずれか一項に記載の使用。
【０３９９】
７９．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、毎週２回投与される、実施形態７８に記載の使用。
【０４００】
８０．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、約０．１μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形７３〜７９のいずれか一項に記載の使用。
【０４０１】
８１．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、カニクイザルについて約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇに等しい用量で投与される、実施形態８０に記載の使用。
【０４０２】
８２．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、サイトカインストームを誘導しない用量で投与される、実施形態６３〜８１のいずれか一項に記載の使用。
【０４０３】
８３．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、前記個体に第１の期間の間第１の用量で投与され、引き続いて、前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、前記個体に第２の期間の間第２の用量で投与され、前記第２の用量が、前記第１の用量を超える、実施形態６３〜８２のいずれか一項に記載の使用。
【０４０４】
８４．前記第２の期間が前記第１の期間を超える、実施形態８３に記載の使用。
【０４０５】
８５．前記第１の期間が少なくとも約７日間である、実施形態８３または実施形態８４に記載の使用。
【０４０６】
８６．前記第２の期間が少なくとも約２週間である、実施形態８３〜８５のいずれか一項に記載の使用。
【０４０７】
８７．前記第１の用量が約１μｇ／ｋｇ以下である、実施形態８３〜８６のいずれか一項に記載の使用。
【０４０８】
８８．前記第２の用量が、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１０μｇ／ｋｇである、実施形態８３〜８７のいずれか一項に記載の使用。
【０４０９】
８９．前記個体にグルココルチコイドを投与することをさらに含む、実施形態８３〜８８のいずれか一項に記載の使用。
【０４１０】
９０．前記グルココルチコイドが、デキサメタゾンである、実施形態８９に記載の使用。
【０４１１】
９１．前記グルココルチコイドが、前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の前記第１の用量の前に投与される、実施形態８９または実施形態９０に記載の使用。
【０４１２】
９２．前記グルココルチコイドが、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態８９〜９１のいずれか一項に記載の使用。
【０４１３】
９３．前記個体が、ヒト個体である、実施形態７３〜９２のいずれか一項に記載の使用。
【０４１４】
９４．前記Ｆａｂ断片が、ＣＤ３イプシロンのＮ末端に特異的に結合する、実施形態７３〜９３のいずれか一項に記載の使用。
【０４１５】
９５．前記Ｆａｂ断片が、ＣＤ３イプシロンのアミノ酸１〜２７内のエピトープに特異的に結合する、実施形態９４に記載の使用。
【０４１６】
９６．前記Ｆａｂ断片のＶＨが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、実施形態９５に記載の使用。
【０４１７】
９７．前記Ｆａｂ断片のＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、実施形態９５または実施形態９６に記載の使用。
【０４１８】
９８．前記Ｆａｂ断片のＶＨが、配列番号７および３９〜４３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態９５〜９７のいずれか一項に記載の使用。
【０４１９】
９９．前記Ｆａｂ断片のＶＬが、配列番号８および４４〜４７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態９５〜９８のいずれか一項に記載の使用。
【０４２０】
１００．前記Ｆａｂ断片が、配列番号９のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖定常領域１（ＣＨ１）を含む、実施形態９５〜９９のいずれか一項に記載の使用。
【０４２１】
１０１．前記Ｆａｂ断片が、配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒトラムダ軽鎖定常領域を含む、実施形態９５〜１００のいずれか一項に記載の使用。
【０４２２】
１０２．前記Ｆａｂ断片のＣＨ１およびＣＬが、１つまたは複数のジスルフィド結合により接続している、実施形態９５〜１０１のいずれか一項に記載の使用。
【０４２３】
１０３．前記Ｆａｂ断片が、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドを含む、実施形態１０２に記載の使用。
【０４２４】
１０４．前記Ｆａｂ断片が、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む、実施形態１０２または実施形態１０３に記載の使用。
【０４２５】
１０５．前記がんが、ＥｐＣＡＭ陽性固形がんである、実施形態７３〜１０４のいずれか一項に記載の使用。
【０４２６】
１０６．前記ＥｐＣＡＭ陽性固形がんが、癌腫または腺癌である、実施形態１０５に記載の使用。
【０４２７】
１０７．前記がんが、小腸がん、結腸直腸がん、肺がん、子宮頸がん、肝臓がん、胃がん、膵臓がん、皮膚がん、腎がん、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、乳がん、胆管がんおよび頭頸部がんからなる群より選択される、実施形態７３〜１０６のいずれか一項に記載の使用。
【０４２８】
１０８．前記がんが、結腸直腸腺癌である、実施形態１０７に記載の使用。
【０４２９】
１０９．前記がんが、肺腺癌である、実施形態１０７に記載の使用。
【０４３０】
１１０．前記ｓｃＦｖが、Ｎ−ＶＨ−ＶＬ−Ｃ融合ポリペプチドを含む、実施形態７４〜１０９のいずれか一項に記載の使用。
【０４３１】
１１１．前記ｓｃＦｖのＶＨが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、実施形態７４〜１１０のいずれか一項に記載の使用。
【０４３２】
１１２．前記ｓｃＦｖのＶＬが、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、実施形態７４〜１１１のいずれか一項に記載の使用。
【０４３３】
１１３．前記ｓｃＦｖのＶＨが、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７４〜１１２のいずれか一項に記載の使用。
【０４３４】
１１４．前記ｓｃＦｖのＶＬが、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７４〜１１３に記載の使用。
【０４３５】
１１５．前記ｓｃＦｖが、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１１４に記載の使用。
【０４３６】
１１６．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドを含む、実施形態７３〜１１５のいずれか一項に記載の使用。
【０４３７】
１１７．前記多重特異性Ｆａｂ融合タンパク質が、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約８５％（例えば、約１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む、実施形態７３〜１１６のいずれか一項に記載の使用。
【実施例】
【０４３８】
下記の実施例は、本発明の単なる典型例であることを意図したものであり、したがって、いかなる点においても本発明を限定するものと考えるべきではない。以下の実施例および詳細な説明は、実例として提供するものであり、限定として提供するものではない。実験方法の詳細を記載しない実施形態については、そのような方法を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）に記載のものなどの従来の条件に従って行うか、または製造業者によって示唆される通りに行う。
（実施例１：例示的二重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の発現および精製）
１．一過性発現
【０４３９】
標準的プロトコールを使用して、Ｆａｂ断片またはＦａｂ融合タンパク質を発現させた。Ｆａｂ融合タンパク質の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ断片を発現ベクターｐｃＤＮＡにクローニングして、軽鎖および重鎖を発現する構築物を生成した。構築物は、軽鎖および重鎖タンパク質の分泌を助長するためのシグナルペプチドをコードする配列も含有した。シークエンシング結果は、正しい遺伝子挿入を示した。構築物をＥ．ｃｏｌｉに形質転換して、トランスフェクショングレードのプラスミドＤＮＡを得た。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＥＸＰＩ２９３（商標）発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖させた。トランスフェクションのために、プラスミドＤＮＡと２５ｋＤポリエチレンイミン（ＰＥＩ；１：３のＤＮＡ／直鎖状２５ｋＤ  ＰＥＩ重量比）を含有する１０ｍＬの培地を９０ｍＬの細胞培養物に添加した。トランスフェクトされた細胞を約６日間、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ）において培養し、その後、上清を収集した。
２．安定発現
【０４４０】
例示的ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質（以降、ＩＴＡＢ１００２と呼ぶ）の軽鎖をコードするＤＮＡ断片（配列番号３２）を、ハイグロマイシン耐性遺伝子を有する発現ベクターにクローニングした。ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の重鎖をコードするＤＮＡ断片（配列番号３１）を、ピューロマイシン耐性遺伝子を有する発現ベクターにクローニングした。Ｆａｂ融合タンパク質の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ断片は、各々、コザック配列およびシグナルペプチド配列（アミノ酸配列を配列番号３３として示し、核酸配列を配列番号３４として示す）も含み、ＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位とＮｏｔＩ制限酵素部位の間にクローニングして、軽鎖および重鎖を発現する構築物をそれぞれ生成した。重鎖遺伝子または軽鎖遺伝子をそれぞれ有する４０μｇのＤＮＡプラスミドを、対数増殖期のＣＨＯ−Ｓ懸濁細胞に、細胞数が約８×１０８になったら、エレクトロポレーション（ＭａｘＣｙｔｅ）によってトランスフェクトした。２４時間後に細胞を計数した。次いで、トランスフェクトされた細胞を、５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（ＨｙＣｌｏｎｅ）を含有するＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、細胞約１．５×１０６個／ｍＬの密度で播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ）において培養した。トランスフェクトされた細胞が正常な増殖速度に戻るまで２〜３日ごとに新鮮培地を交換し、その後、対数増殖期の細胞を収集し、安定にトランスフェクトされた細胞集団を保管し、限界希釈により単一細胞クローンを得た。安定にトランスフェクトされた細胞集団を、１×グルタミン酸および１ｇ／ＬのＰＦ６８を補充したＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した（３７℃、５％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ）。細胞密度が、少なくとも細胞３×１０６個／ｍＬに達したら、細胞を３２℃インキュベーション（ＨＦ５１１  ２．５％、ＨＦ５０２  ０．２％、ＭｅｄｎａＢｉｏ）に移し、培地を２日ごとに交換した。２〜４回の培地交換後、上清を収集した。
【０４４１】
細胞培養上清をＩｇＧ−ＣＨ１アフィニティクロマトグラフィ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で精製して、標的タンパク質を得た。細胞培養上清を０．２２μｍ滅菌膜に通して濾過し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．５）で平衡させたＩｇＧ−ＣＨ１アフィニティマトリクスにロードし、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭ  ＮａＡｃ緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出した。溶出物を２Ｍ  Ｔｒｉｓ溶離液で７．２のｐＨに調整し、１０ｋＤの分子量カットオフを有するＶｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮機（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で濃縮した。精製されたタンパク質を４℃で保管した。４〜２０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して非還元および／または還元（５％β−メルカプトエタノール）条件下でタンパク質を分析した。分析結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。非還元および／または還元キャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＰＡ  ８００プラス）を行って、精製Ｆａｂ融合タンパク質を分析した。結果を図３Ａおよび３Ｂに示す。ＨＰＬＣ分析は、精製Ｆａｂ融合タンパク質の純度が＞９０％であることを示した。
【０４４２】
図２Ａおよび２Ｂは、精製ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す。図２Ａは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。レーン１は、上から下に分子量が２００、１５０、１２０、１００、８５、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０ｋＤである、タンパク質分子量標準ＰＡＧＥＲＵＬＥＲ（商標）未染色タンパク質ラダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む。レーン２は、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の理論分子量に類似の、約１００ｋＤの分子量を有する精製タンパク質を含む。図２Ｂは、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。レーン１は、上から下に分子量が１１６、６６．２、４５、３５、２５、１８．４、１４．４である、タンパク質分子量標準ＰＩＥＲＣＥ（商標）未染色タンパク質ＭＷマーカー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む。レーン２は、分子量が４５〜６６ｋＤの間である、精製タンパク質を含む。
【０４４３】
図３Ａおよび３Ｂは、精製ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質のキャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）の結果を示す。図３Ａは、泳動時間約２１．５９分に単一タンパク質ピークを示す、非還元ＣＥ−ＳＤＳ結果を示す。図３Ｂは、Ｆａｂ融合タンパク質の軽鎖および重鎖にそれぞれ対応する泳動時間約１８．３７分および約１８．８４分に２つの単一タンパク質ピークを示す、還元ＣＥ−ＳＤＳ結果を示す。
（実施例２：ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の結合親和性の決定）
抗原結合親和性
【０４４４】
例示的ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質（すなわち、ＩＴＡＢ１００２）の抗ＥｐＣＡＭおよび抗ＣＤ３ドメインと対応するヒトおよびカニクイザル抗原との結合親和性を、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅと抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  Ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＨＣ）バイオセンサーを使用して測定した。ヒトＥｐＣＡＭ抗原構築物（ｈｕＥｐＣＡＭ．Ｆｃ）およびカニクイザルＥｐＣＡＭ抗原構築物（ｃｙｎｏＥｐＣＡＭ．Ｆｃ）は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃに融合している完全長ＥｐＣＡＭタンパク質を有した。ヒトＣＤ３抗原構築物（ＣＤ３εＡＡ  １−２７．Ｆｃ）およびカニクイザルＣＤ３抗原構築物（ｃｙｎｏＣＤ３εＡＡ  １−２７．Ｆｃ）は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃに融合しているＣＤ３イプシロンのアミノ酸１〜２７からなるペプチドを有した。抗原構築物の発現は、米国特許第８，８４６，０４２号に記載されている。抗原構築物を希釈液（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０５％ＮａＮ３）で０．０２ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いで、抗ｈＩｇＧ  Ｆｃ  Ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＨＣ）バイオセンサーに固定化した。ＩＴＡＢ１００２を様々な濃度に希釈し、黒色マイクロプレートに２００μＬ／ウェルで添加した。ＰＢＳのみを含有する対照ウェルも設定した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｄａｔａ  ＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎおよびＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して、検出結果を分析した。
【０４４５】
表１に示すように、抗ＥｐＣＡＭおよび抗ＣＤ３ドメインは、ヒトおよびカニクイザルＥｐＣＡＭおよびＣＤ３構築物両方に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性をそれぞれ有した。これは、ヒトおよびカニクイザルにおけるＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の交差反応性を示す。
【表１】
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細胞結合親和性
【０４４６】
例示的ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質（すなわち、ＩＴＡＢ１００２）と標的抗原を発現する細胞との結合親和性を決定するために、以下の結合アッセイを行った。
【０４４７】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、ＩＴＡＢ１００２とヒトおよびカニクイザル末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣまたはｃｙｎｏＰＢＭＣ）との結合親和性を決定した。
【０４４８】
ｈＰＢＭＣ調製：健常な成人からの白血球濃縮物試料をＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）で希釈し、密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により遠心分離してＰＢＭＣを得、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで室温、１０００ｇで１０分間、遠心分離した。細胞を収集し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁させた。
【０４４９】
ｃｙｎｏＰＢＭＣ調製：カニクイザルからの全血試料をＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）で希釈し、密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により遠心分離してＰＢＭＣを得、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで室温、１０００ｇで１０分間、遠心分離した。細胞を収集し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁させた。
【０４５０】
ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＢＳを含有するＰＢＳ）を使用してＩＴＡＢ１００２を様々な濃度に希釈し、約３．６×１０５個のｈｕＰＢＭＣと混合し、その後、室温で４５分間インキュベートした。ＩＴＡＢ１００２を含有しない対照群（１％ＦＢＳ／ＰＢＳ＋ｈＰＢＭＣ）も設定した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、ＣＤ４抗体（ＲＦＴ−４ｇ）ＡＰＣ−Ｃｙ７（登録商標）コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰＥマウス抗ヒト軽鎖λ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））を補充した５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、室温で４５分間インキュベートした。１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液を最後に添加し、ＡＣＣＵＲＩ（登録商標）Ｃ６  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して試料を分析した。検出結果を図４Ａに示す。
【０４５１】
５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＢＳを含有するＰＢＳ）中にＩＴＡＢ１００２を様々な濃度に希釈し、約４×１０５個のｃｙｎｏＰＢＭＣと混合し、その後、室温で６０分間インキュベートした。ＩＴＡＢ１００２を含有しない陰性対照群も設定した。細胞を、ＣＤ４抗体（ＲＦＴ−４ｇ）ＡＰＣ−Ｃｙ７（登録商標）コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰＥマウス抗ヒト軽鎖λ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））で染色し、室温で４５分間インキュベートした。１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液を最後に添加し、ＡＣＣＵＲＩ（登録商標）Ｃ６  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して試料を分析した。検出結果を図４Ｂに示す。
【０４５２】
図４Ａおよび４Ｂに示されているように、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質は、ヒトおよびカニクイザルＰＢＭＣとの強力な結合親和性を示したが、陰性対照群は、ヒトＰＢＭＣまたはカニクイザルＰＢＭＣとの結合親和性を実質的に有さなかった。
【０４５３】
加えて、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質（すなわち、ＩＴＡＢ１００２）とＥｐＣＡＭ＋細胞との結合親和性を決定するために、以下の結合アッセイを行った。
【０４５４】
ヒト結腸がん細胞株ＳＷ４８０（Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびカニクイザルＥｐＣＡＭをトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（本明細書では以降、ＣｙＥｐＣＡＭ−ＣＨＯと呼ぶ）を使用して、ＩＴＡＢ１００２とＥｐＣＡＭの結合親和性を決定した。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いてＳＷ４８０細胞およびＣｙＥｐＣＡＭ−ＣＨＯ細胞をトリプシン処理し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。ＦＡＣＳ緩衝液を使用してＩＴＡＢ１００２を様々な濃度に希釈し、約１×１０５個のＳＷ４８０細胞またはＣｙＥｐＣＡＭ−ＣＨＯ細胞とそれぞれ等体積で混合し、その後、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。マウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ二次抗体ＰＥコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、４℃で３０分間インキュベートした。１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液を最後に添加し、ＡＣＣＵＲＩ（登録商標）Ｃ６  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して試料を分析した。検出結果を図５に示す。
【０４５５】
図５に示されているように、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質は、ヒトＥｐＣＡＭを発現するＳＷ４８０細胞（ＥＣ５０＝４１１．２ｎｇ／ｍＬ）およびカニクイザルＥｐＣＡＭを細胞表面で発現するＣＨＯ細胞（ＣｙＥｐＣＡＭ−ＣＨＯ、ＥＣ５０＝１０７．６ｎｇ／ｍＬ）両方に対する強力な結合親和性を示した。
【０４５６】
したがって、例示的ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質ＩＴＡＢ１００２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトおよびカニクイザル抗原に対して交差反応性を示した。二重特異性Ｆａｂ融合タンパク質の交差反応性は、カニクイザルでの毒性および有効性研究結果のヒト臨床研究への外挿を助長することができる。
（実施例３：ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質によるヒトＰＢＭＣの腫瘍依存性活性化）
【０４５７】
ＣＤ４およびＣＤ８は、典型的なＴ細胞表面抗原であり、このことからＴ細胞をＣＤ４＋サブタイプとＣＤ８＋サブタイプに分けることができる。ＣＤ６９は、Ｔ細胞活性化によってアップレギュレートされる、細胞表面受容体である。ＣＤ４＋ＣＤ６９＋およびＣＤ８＋ＣＤ６９＋サブタイプの百分率は、Ｔ細胞の活性化状態の有効な指標として役立ち得る。ＦＡＣＳに基づくＴ細胞活性化アッセイを行って、Ｔ細胞活性化における例示的ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質（すなわち、ＩＴＡＢ１００２）の能力を決定した。
【０４５８】
実施例２で説明した方法に従ってヒトＰＢＭＣを調製し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁させた。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いてＳＷ４８０細胞をトリプシン処理し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地に再懸濁させた。５０μＬ／ウェルの細胞混合物を、９６ウェルプレートの各ウェルに、ＳＷ４８０細胞１０，０００個／ウェルおよび１ウェル当り１００，０００個のＰＢＭＣの最終密度で添加した。ＩＴＡＢ１００２またはＯＫＴ３（Ｓｉｇｍａ）をＲＰＭＩ  １６４０培地で様々な濃度に希釈し、５０μＬの希釈されたＩＴＡＢ１００２またはＯＫＴ３を各ウェルに添加した。ＳＷ４８０細胞を含有しない対照ウェル（ＰＢＭＣ＋ＩＴＡＢ１００２）も設定した。全ての試料を２４時間、３７℃でインキュベートした。その後、上清を廃棄し、細胞を５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。抗体のＣＤ４抗体（ＲＦＴ−４ｇ）ＡＰＣ−Ｃｙ７（登録商標）コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ８抗体（３Ｂ５）ＲＰＥコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ６９（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））を再懸濁細胞に添加し、室温で３０分間インキュベートした。１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、ＡＣＣＵＲＩ（登録商標）Ｃ６  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して試料を分析した。検出結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。
【０４５９】
図６Ａおよび６Ｂに示されているように、ＳＷ４８０細胞の存在下で、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質は、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団とＣＤ８＋Ｔ細胞集団の両方においてＣＤ６９発現を用量依存的にアップレギュレートした（ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＥＣ５０＝１４９．６ｎｇ／ｍＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＥＣ５０＝６８．７８ｎｇ／ｍＬ）。ＳＷ４８０細胞の非存在下では、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質は、Ｔ細胞上でのＣＤ６９発現を有意にはアップレギュレートしなかった。その一方で、ＯＫＴ３は、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団とＣＤ８＋Ｔ細胞集団の両方においてＣＤ６９発現をアップレギュレートした。
【０４６０】
加えて、Ｋｉ−６７は、増殖についての細胞表面マーカーである。ＣＤ４＋細胞中のＣＤ４＋Ｋｉ−６７＋サブタイプの百分率、およびＣＤ８＋細胞中のＣＤ８＋Ｋｉ−６７＋サブタイプの百分率は、Ｔ細胞の増殖状態の有効な指標として役立ち得る。ＦＡＣＳに基づくＴ細胞増殖アッセイを行って、Ｔ細胞増殖に関する例示的ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質（すなわち、ＩＴＡＢ１００２）の能力を決定した。
【０４６１】
実施例２で説明した方法に従ってヒトＰＢＭＣを調製し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁させた。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いてＳＷ４８０細胞をトリプシン処理し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地に再懸濁させた。細胞混合物を、９６ウェルプレートの各ウェルに、ＳＷ４８０細胞２０，０００個／ウェルおよび１ウェル当り３００，０００個のＰＢＭＣの最終密度で添加した。ＩＴＡＢ１００２を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地で様々な濃度に希釈し、細胞に添加した。ＰＢＭＣおよびＩＴＡＢ１００２のみを含有するウェル（ＰＢＭＣ＋ＩＴＡＢ１００２）、ＰＢＭＣおよびＳＷ４８０細胞のみを含有するウェル（ＰＢＭＣ＋ＳＷ４８０）、ならびにＰＢＭＣのみを含有するウェルを対照として設定した。３７℃で７２時間のインキュベーションを行った。その後、上清を廃棄し、Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中で２０分間、４℃で細胞を固定して透過性にし、次いで５０μＬのＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）緩衝液に再懸濁させた。ＣＤ４抗体（ＲＦＴ−４ｇ）ＡＰＣ−Ｃｙ７（登録商標）コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ８抗体（３Ｂ５）ＲＰＥコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＦＩＴＣ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｋｉ−６７  Ｓｅｔ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））を用いて３０分間、暗所で細胞を染色した。ＡＣＣＵＲＩ（登録商標）Ｃ６  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して試料を分析した。検出結果を図６Ｃおよび６Ｄに示す。
【０４６２】
図６Ｃおよび６Ｄに示されているように、ＳＷ４８０細胞の存在下で、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質は、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団とＣＤ８＋Ｔ細胞集団の両方においてＫｉ−６７発現を用量依存的にアップレギュレートした。ＳＷ４８０細胞の非存在下では、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質は、Ｔ細胞上でのＫｉ−６７発現を有意にはアップレギュレートしなかった。
【０４６３】
上記データは、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質によるＴ細胞活性化が特異的であり、その腫瘍抗原標的に依存することを実証する。
（実施例４）
腫瘍細胞に対するＥｐＣＡＭ×ＣＤ３媒介ＰＢＭＣ細胞傷害性（細胞傷害性アッセイ）
【０４６４】
実施例２で説明した方法に従ってヒトおよびカニクイザルＰＢＭＣを調製し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁させた。
【０４６５】
０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いてＳＷ４８０細胞（標的細胞）をトリプシン処理し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地に再懸濁させた。５０μＬ／ウェルの細胞混合物を、９６ウェルプレートの各ウェルに、ＳＷ４８０細胞１０，０００個／ウェルおよび１ウェル当り１００，０００個のＰＢＭＣの最終密度で添加した。例示的ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質（すなわち、ＩＴＡＢ１００２）を実験設計に従う濃度で細胞に添加した。薬物なしのウェル（ＰＢＭＣ＋標的細胞）、標的細胞のみを含有するウェル、ＰＢＭＣのみを含有するウェル、および培地のみを含有するウェルを、対照として設定した。５％ＣＯ２で３７℃での約１８時間のインキュベーションを行った。ＣＹＴＯＴＯＸ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を行って乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を測定し、ＥＬＩＳＡ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｖｅｒｓａ  Ｍａｘ）を使用してＯＤ４９０を測定した。次の式を使用してＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質媒介細胞傷害性を算出した：
死滅率＝（ＯＤ試料ウェル−ＯＤ薬物なしの対照ウェル）／（ＯＤ最大溶解を有する標的細胞対照ウェル−ＯＤ自発的放出がある標的細胞対照ウェル）×１００％
【０４６６】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０ソフトウェアをデータ分析に使用した。死滅率をｙ軸として設定し、薬物濃度をｘ軸として設定した。４パラメータロジスティックモデルを使用して曲線をフィットさせＥＣ５０を決定した。アッセイ結果を図７に示す。ＳＷ４８０細胞に対するＩＴＢ１００２媒介ヒトＰＢＭＣ細胞傷害性のＥＣ５０は、４１．４ｎｇ／ｍＬであった。ＳＷ４８０細胞に対するＩＴＢ１００２媒介カニクイザルＰＢＭＣ細胞傷害性のＥＣ５０は、３５．５ｎｇ／ｍＬであった。
【０４６７】
図７に示されているように、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質は、カニクイザルＰＢＭＣまたはヒトＰＢＭＣによるＳＷ４８０細胞などの腫瘍細胞の殺滅を媒介することができた。ヒトおよびカニクイザルＰＢＭＣについての腫瘍細胞に対する細胞傷害性は、同等であった。
（実施例５：腫瘍細胞に対するＥｐＣＡＭ×ＣＤ３媒介ヒトＰＢＭＣ細胞傷害性（細胞傷害性アッセイ））
【０４６８】
実施例２で説明した方法に従ってヒトＰＢＭＣを調製し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁させた。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて腫瘍細胞（標的細胞）をトリプシン処理し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地に再懸濁させた。５０μＬ／ウェルの細胞混合物を、９６ウェルプレートの各ウェルに、腫瘍細胞１０，０００個／ウェルおよび１ウェル当り１００，０００個のＰＢＭＣの最終密度で添加した。例示的ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質（すなわち、ＩＴＡＢ１００２）を実験設計に従う濃度で細胞に添加した。薬物なしのウェル（ＰＢＭＣ＋標的細胞）、標的細胞のみを含有するウェル、ＰＢＭＣのみを含有するウェル、および培地のみを含有するウェルを、対照として設定した。５％ＣＯ２で３７℃での約１８時間（Ｈ１９７５およびＮ８７細胞については４８時間）のインキュベーションを行った。ＣＹＴＯＴＯＸ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を行ってＬＤＨ放出を測定し、ＥＬＩＳＡ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＶｅｒｓａＭａｘ）を使用してＯＤ４９０を測定した。次の式を使用してＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質媒介細胞傷害性を算出した：
死滅率＝（ＯＤ試料ウェル−ＯＤ薬物なしの対照ウェル）／（ＯＤ最大溶解を有する標的細胞対照ウェル−ＯＤ自発的放出がある標的細胞対照ウェル）×１００％
【０４６９】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０ソフトウェアをデータ分析に使用した。死滅率をｙ軸として設定し、薬物濃度をｘ軸として設定した。４パラメータロジスティックモデルを使用して曲線をフィットさせＥＣ５０を決定した。アッセイ結果を表２および図８に示す。
【表２】
2019513701.tif 000011
（実施例６：免疫不全マウスにおける皮下ヒト結腸腫瘍異種移植片の殺滅におけるＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の有効性アッセイ）
【０４７０】
ヒト結腸腫瘍異種移植片の増殖の阻害に対する例示的ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質（すなわち、ＩＴＡＢ１００２）の効果を調査するために、ＳＷ４８０腫瘍細胞を移植した免疫不全マウスを用いてｉｎ  ｖｉｖｏ薬物有効性アッセイを行った。
【０４７１】
雌免疫不全マウスＮＯＤ  ＳＣＩＤ（ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＮｃｒＣｒｌ）をＳｈａｎｇｈａｉ  Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入し、ＳＰＦレベルの動物施設で飼育した。
【０４７２】
ヒト結腸がん細胞ＳＷ４８０をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養して収集し、氷上で予冷した無血清Ｌ−１５培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いて再懸濁させ、後の使用のために氷上に置いた。健常ヒトドナーにより提供された白血球濃縮物を収集し、密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により遠心分離してＰＢＭＣを得、氷上で予冷したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁させ、後の使用のために氷上に置いた。腫瘍細胞とヒトＰＢＭＣを等体積で混合し、ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスに皮下接種した（動物１匹当りＳＷ４８０細胞約５．０×１０６個およびヒトＰＢＭＣ約５．０×１０６個）。
【０４７３】
接種の１時間後、無作為に割り当てた群のマウスに薬物を与えた。マウス３０匹の各セットを１群当りマウス６匹を有する５群に分け、それぞれ、ビヒクル対照群、２．５μｇ／ｋｇ  ＩＴＡＢ１００２処置群、２５μｇ／ｋｇ  ＩＴＡＢ１００２処置群、２５０μｇ／ｋｇ  ＩＴＡＢ１００２処置群、およびセツキシマブ３０ｍｇ／ｋｇ  対照群と名付けた。接種および群分けの日をＤ０と定義した。試験されるＩＴＡＢ１００２を、ビヒクル（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０）を使用して必要な濃度に希釈し、２．５μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇおよび２５０μｇ／ｋｇの用量で動物の尾部にそれぞれ静脈内投与した。投与体積は、体重１０ｇ当り０．１ｍＬであった。動物に連続５日間（Ｄ０〜Ｄ４）、１日１用量を投与した。ビヒクル対照群の動物には同じ体積のビヒクルを投与した。ビヒクルを使用して対照薬物セツキシマブ（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）を必要な濃度に希釈し、体重１０ｇ当り０．１ｍＬの体積である３０ｍｇ／ｋｇの用量で、連続３週間、１週間に２用量で、動物の尾部に静脈内投与した。
【０４７４】
一方、動物にヒトＰＢＭＣを接種しない対照処置群を設定した。ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスにはＳＷ４８０腫瘍細胞約５．０×１０６個を皮下接種した。接種の１時間後、マウスを無作為に群に割り当て、様々な用量のＩＴＡＢ１００２をそれらの動物の尾部にそれぞれ静脈内投与した。
【０４７５】
動物の体重および腫瘍サイズを毎週検査した。腫瘍体積は、式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×０．５に従って算出した。腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ％）を使用して薬物有効性を評価した。ＴＧＩ％＝［１−（ａｖＴｉ−ａｖＴ０）／（ａｖＣｉ−ａｖＣ０）］×１００（式中、ａｖＴｉ−ａｖＴ０は、処置群についてのｉ日目の平均腫瘍サイズ−０日目の平均腫瘍サイズであり、ａｖＣｉ−０は、ビヒクル対照群についてのｉ日目の平均腫瘍サイズ−０日目の平均腫瘍サイズである）。腫瘍体積評価結果を図９Ａに示す。実験の最後にマウスから単離したＳＷ４８０腫瘍の写真を図９Ｂに示す。
【０４７６】
図９Ａおよび９Ｂに示されているように、ビヒクル対照群では、ＳＷ４８０腫瘍細胞およびヒトＰＢＭＣの共接種後、腫瘍細胞は正常に増殖し、接種後５６日目の平均腫瘍サイズは１４１４．０６ｍｍ３であった。ＩＴＡＢ１００２の投与は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＷ４８０腫瘍の増殖を用量依存的に有効に阻害した。５６日目のＴＧＩ％は、２．５μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇおよび２５０μｇ／ｋｇ  ＩＴＡＢ１００２処置群において、それぞれ、４６．９３％、８９．９０％および９９．３５％であった。３０ｍｇ／ｋｇ  セツキシマブ群における５６日目のＴＧＩ％は、−１６．９７％であった。これは、ＳＷ４８０のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖の阻害がないことを示唆する。対照的に、ヒトＰＢＭＣの共接種がないと、腫瘍細胞は正常に増殖し、いずれの対照処置群も腫瘍退縮の徴候を示さなかった（データを示さない）。したがって、マウスにおけるＳＷ４８０異種移植片に対する例示的ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の細胞傷害性は、ヒトＰＢＭＣに依存する。
【０４７７】
これらの結果は、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質が、免疫細胞に腫瘍細胞を殺滅するように再指示（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）することができ、腫瘍増殖をｉｎ  ｖｉｖｏで用量依存的に有意に阻害することができることを示した。
（実施例７：免疫再構築マウスモデルにおける皮下ヒト結腸腫瘍異種移植片の殺滅におけるＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の有効性アッセイ）
【０４７８】
ヒト結腸腫瘍異種移植片の増殖の阻害に対する例示的ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質（すなわち、ＩＴＡＢ１００２）の効果を調査するために、ヒトリンパ球を用いて免疫系を再構築してＳＷ４８０腫瘍細胞を移植した免疫不全マウスを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物有効性アッセイを行った。
【０４７９】
雌免疫不全マウスＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＩ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＣｒｌ）をＢｅｉｊｉｎｇ  Ｗｅｉｔｏｎｇ  Ｌｉｈｕａ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入し、ＳＰＦレベルの動物施設で飼育した。
【０４８０】
ＮＯＧマウスが２０ｇの体重に達した後、実験を開始した。マウスを先ずブスルファン（Ｓｉｇｍａ）で処置して、骨髄細胞を根絶させた。２日目に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養したヒト結腸がんＳＷ４８０細胞を収集し、入念に混合し、氷上で予冷した無血清Ｌ−１５培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いて再懸濁させ、ＮＯＧマウスに皮下接種した（各動物に腫瘍細胞約２．５×１０６個を接種した）。接種日をＤ０と定義した。２週間後、健常な人々により供与された白血球濃縮物試料を収集し、密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により遠心分離してＰＢＭＣを得、氷上で予冷したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁させ、ＮＯＧマウスに皮下接種した（各動物に腫瘍細胞約３．０×１０６個を接種した）。腫瘍体積が１５０〜２５０ｍｍ３に達したら、マウスを無作為に群に割り当て、薬物を投与した。４０匹の動物を、モデル群、２．５μｇ／ｋｇ  ＩＴＡＢ１００２処置群、２５μｇ／ｋｇ  ＩＴＡＢ１００２処置群、２５０μｇ／ｋｇ  ＩＴＡＢ１００２処置群および３０ｍｇ／ｋｇ  セツキシマブ対照群を含む５群（１群当り８匹）に分けた。
【０４８１】
試験されるＩＴＡＢ１００２を、滅菌濾過したビヒクル（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０）を使用して様々な濃度に希釈し、体重１０ｇ当り０．１ｍＬの体積（２．５μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇおよび２５０μｇ／ｋｇの用量にそれぞれ対応する）で、連続２５日間、毎日マウスに腹腔内投与した。滅菌濾過したビヒクル（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０）を使用して対照薬物セツキシマブ（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）を必要な濃度に希釈し、３０ｍｇ／ｋｇの用量で連続２５日間、週２回、マウスに腹腔内投与した。モデル群の動物には同じ体積のビヒクルを投与した。
【０４８２】
動物を体重および腫瘍サイズについて毎週評価した。腫瘍体積は、式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×０．５に従って算出した。腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ％）を使用して薬物有効性を評価した。ＴＧＩ％＝［１−（ａｖＴｉ−ａｖＴ０）／（ａｖＣｉ−ａｖＣ０）］×１００（式中、ａｖＴｉ−ａｖＴ０は、処置群についてのｉ日目の平均腫瘍サイズ−０日目の平均腫瘍サイズであり、ａｖＣｉ−０は、ビヒクル対照群についてのｉ日目の平均腫瘍サイズ−０日目の平均腫瘍サイズである）。実験の最後に、抗凝固処理全血試料を収集し、ＰＥ−Ｃｙ（商標）５マウス抗ヒトＣＤ３（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。赤血球を溶解した。ＦＡＣＳを使用して、血液試料中のヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の百分率を分析した。図１０Ａは、腫瘍体積評価結果を示す。図１０Ｂは、実験の最後にマウスから単離したＳＷ４８０腫瘍の写真を示す。
【０４８３】
図１０Ａおよび図１０Ｂは、ヒトＰＢＭＣを接種した免疫再構築ＮＯＧマウスにおける皮下ＳＷ４８０異種移植腫瘍に対するＩＴＡＢ１００２の増殖阻害効果を示す。これらの結果は、ヒトＰＢＭＣを用いて免疫再構築されたＮＯＧマウスへのＳＷ４８０腫瘍細胞の皮下接種後に腫瘍細胞が正常に増殖することができたことを実証する。接種の４６日後、平均腫瘍体積は、７３８．７８ｍｍ３に達した。ＩＴＡＢ１００２の投与は、ＳＷ４８０腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を有効に阻害し、腫瘍退縮をもたらすことができた。２．５μｇ／ｋｇ  ＩＴＡＢ１００２処置群において、４０日目のＴＧＩ％は、１３．２９％であった。２５μｇ／ｋｇ  ＩＴＡＢ１００２処置群において、４６日目のＴＧＩ％は、６８．５５％であった。２５０μｇ／ｋｇ  ＩＴＡＢ１００２処置群において、４６日目のＴＧＩ％は、１３１．６５％であった。３０ｍｇ／ｋｇ  セツキシマブ処置群において、セツキシマブは、ＳＷ４８０腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害することができず、４６日目のＴＧＩ％は、８．９１％であった。図１０Ｃに示されているように、マウスの全白血球中のヒトＴ細胞の平均百分率は２６．８４％であった。これは、ＮＯＧマウスにおけるヒトＴ細胞免疫系の成功裏の再構築を示す。
【０４８４】
したがって、ＮＯＧマウスの骨髄のブスルファンコンディショニング、およびヒトＰＢＭＣを使用する免疫系の再構築後、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の投与は、マウスにおけるヒト結腸がん細胞ＳＷ４８０のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を有効に阻害することができた。これは、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫細胞による腫瘍細胞殺滅を媒介することができ、腫瘍増殖を用量依存的に有意に阻害することができたことを示す。
（実施例８：免疫再構築マウスモデルにおける皮下ヒト肺腫瘍異種移植片の殺滅におけるＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の有効性アッセイ）
【０４８５】
ヒト肺腫瘍異種移植片の増殖の阻害に対する例示的ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質（すなわち、ＩＴＡＢ１００２）の効果を調査するために、ヒトＰＢＭＣを用いて免疫系を再構築してヒト肺がん腫瘍細胞（ＮＣＩ−Ｈ１９７５）を移植した免疫不全マウスを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物有効性アッセイを行った。
【０４８６】
雌免疫不全マウスＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＩ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＣｒｌ）をＢｅｉｊｉｎｇ  Ｗｅｉｔｏｎｇ  Ｌｉｈｕａ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入し、ＳＰＦレベルの動物施設で飼育した。
【０４８７】
ＮＯＧマウスが２０ｇの体重に達した後、実験を開始した。マウスを先ずブスルファン（Ｓｉｇｍａ）で処置して、骨髄細胞を根絶させた。２日目に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養したヒト肺がん細胞ＮＣＩ−Ｈ１９７５を収集し、入念に混合し、氷上で予冷した無血清Ｌ−１５培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いて再懸濁させ、ＮＯＧマウスに皮下接種した（各動物に腫瘍細胞約２．５×１０６個を接種した）。接種日をＤ０と定義した。２日目に、健常ヒトドナーにより供与された白血球濃縮物試料を収集し、密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により遠心分離してＰＢＭＣを得、氷上で予冷したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁させ、ＮＯＧマウスに皮下接種した（対照群の動物を除き、各動物にＰＢＭＣ約３．０×１０６個を接種した）。腫瘍体積が１００〜１５０ｍｍ３に達したら、対照群（腫瘍細胞を接種する群、ｎ＝６）、モデル群（腫瘍細胞およびＰＢＭＣを接種する群、ｎ＝５）および２５０μｇ／ｋｇ  ＩＴＡＢ１００２処置群（腫瘍細胞およびＰＢＭＣを接種する群、ｎ＝７）を含む３群に、１８匹のマウスを無作為に割り当て、薬物を投与した。
【０４８８】
試験されるＩＴＡＢ１００２を、滅菌濾過したビヒクル（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０）を使用して必要な濃度に希釈し、体重１０ｇ当り０．１ｍＬの体積（２５０μｇ／ｋｇの用量に対応する）で、連続２５日間、毎日処置群のマウスに腹腔内投与した。モデル群および対照群の動物には同じ体積のビヒクルを投与した。動物を体重および腫瘍サイズについて毎週評定した。
【０４８９】
図１１は、ヒトＰＢＭＣを接種した免疫再構築ＮＯＧマウスにおける皮下ＮＣＩ−Ｈ１９７５異種移植腫瘍に対するＩＴＡＢ１００２の増殖阻害効果を示す。結果は、腫瘍細胞が対照群およびビヒクル群両方において正常に増殖することができ、接種の２８日後にそれぞれ１３８２．６３ｍｍ３および１４３２．１５ｍｍ３の平均腫瘍体積に達したことを実証する。２５０μｇ／ｋｇでのＩＴＡＢ１００２の投与は、ＮＣＩ−Ｈ１９７５腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を完全に阻害することができ、完全腫瘍退縮をもたらした。２５０μｇ／ｋｇ  ＩＴＡＢ１００２処置群における３４日目の平均腫瘍体積は、７．７７ｍｍ３であった。
【０４９０】
したがって、例示的ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の投与は、ヒトＰＢＭＣを用いて免疫再構築したＮＯＧマウスにおけるヒト肺がん細胞ＮＣＩ−Ｈ１９７５のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を有効に阻害することができた。これは、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質が、免疫細胞による腫瘍細胞殺滅を媒介することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖を有意に阻害することができたことを示す。
（実施例９：カニクイザルにおけるＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の誘導Ｔ細胞再分布、サイトカイン放出および薬物動態）
【０４９１】
カニクイザル（通常グレード）、年齢：３〜５歳、体重：３．０〜５．０ｋｇ。１６匹のカニクイザルを、例示的ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質（すなわち、ＩＴＡＢ１００２）の投与のために４群に分け、それぞれ、０．５μｇ／ｋｇ投与量群（ｎ＝３）、５μｇ／ｋｇ投与量群（ｎ＝４）、１５μｇ／ｋｇ投与量群（ｎ＝６）および５０μｇ／ｋｇ投与量群（ｎ＝３）と名付けた。
【０４９２】
試験されるＩＴＡＢ１００２をビヒクル（ＰＢＳ＋０．５％サル血清）で様々な濃度に希釈し、体重１ｋｇ当り２．０ｍＬの体積で投与した。０．５μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇおよび５０μｇ／ｋｇの投与量をそれぞれ用いて、１時間にわたる前腕への静脈内注入、単回用量によって、ＩＴＡＢ１００２を投与した。動物の症状、行動、精神状態、糞便などを毎日観察した。
【０４９３】
全血採取：薬物注入前に、および薬物注入後の様々な時点で、ＥＤＴＡ−Ｋ２被覆ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）抗凝固性採血管（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、０．３ｍＬ血液試料を採取した。採取した抗凝固性血液試料を、２つの部分に分け、血液の一方の部分（１００μＬ）は、自動血球計数器（Ｓｉｅｍｅｎｓ、ＡＤＶＩＡ（登録商標）２１２０）を使用してリンパ球亜型について分析し、血液のもう一方の部分（２００μＬ）は、ＣＤ４およびＣＤ８抗原について染色し（ＡＰＣ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４およびＰＥ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ８、ＢＤ  ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ（商標））、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ  ５００）を使用してＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球亜型の分析に付した。
【０４９４】
血清採取：薬物注入前に、および薬物注入後の様々な時点で、抗凝固剤なしの採血管も使用して１．２ｍＬ血液試料を採取した。凝固後に血清を収集し、−８０℃で保管した。Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｔｈ１／Ｔｈ２  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｋｉｔ（ＢＤ  ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ（商標））を使用して、血清中のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＴＮＦおよびＩＦＮ−γサイトカインの分泌を検出した。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、血清中の薬物濃度を測定した。ＰＫ  Ｓｏｌｖｅｒ  ２．０ソフトウェアを使用して、薬物動態パラメータを算出した。
【０４９５】
実験期間中にいずれのサル群においても、死亡も瀕死も観察されなかった。全てのサル群は、正常な自発行動、良好な精神状態、清潔な皮膚および毛髪を有した。注入部に刺激もただれも観察されなかった。ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質は、カニクイザルにおいて良好な安全性および耐容性を示した。
【０４９６】
図１２Ａは、様々な投与量のＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の単回静脈内投与後のカニクイザルの血液中のＣＤ４＋Ｔ細胞数の経時変化のプロットを示す（ｘ軸の「Ｈ」は時間であり、「Ｄ」は、日である）。薬物投与後、血液中のＣＤ４＋Ｔ細胞の数は減少し、最小細胞数が薬物注入の８時間後に観察され、その後、細胞数は徐々に回復し始めた。
【０４９７】
図１２Ｂは、様々な投与量のＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の単回静脈内投与後のカニクイザルの血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞数の経時変化のプロットを示す（ｘ軸の「Ｈ」は時間であり、「Ｄ」は、日である）。薬物投与後、血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞の数は減少し、最小細胞数が薬物注入の８時間後に観察され、その後、細胞数は徐々に回復し始めた。
【０４９８】
図１３Ａ〜１３Ｆは、様々な投与量でのＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の単回静脈内投与後のカニクイザルの血清中のＩＬ−２（図１３Ａ）、ＩＬ−４（図１３Ｂ）、ＩＬ−５（図１３Ｃ）、ＩＬ−６（図１３Ｄ）、ＴＮＦ（図１３Ｅ）およびＩＦＮ−γ（図１３Ｆ）の濃度の経時変化を示す。これらの結果は、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の単回静脈内投与後、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦおよびＩＦＮ−γの血清中濃度が様々な程度に増加し、そしてピーク濃度に達した後、減少してベースラインレベルに戻り、用量依存的関係を示すこと、その一方でＩＬ−４およびＩＬ−５の血清中濃度が有意には変化しないことを示した。
【０４９９】
図１４は、様々な投与量でのＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の単回静脈内投与後のカニクイザルの血清中の薬物濃度の経時的変化を示す。
【０５００】
これらの結果は、３つの投与量群（５μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇおよび５０μｇ／ｋｇ）全てについて、薬物の血清中濃度がＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の単回静脈内投与の１時間後にピークレベルに達し、その後、徐々に減少することを示した。ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質は、カニクイザルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ半減期増加を示した。
【０５０１】
ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３融合タンパク質の詳細な薬物動態パラメータを表３に示す。
【表３】
2019513701.tif 000012
（実施例１０：腫瘍細胞に対するＩＴＡＢ１００２媒介ＰＢＭＣ細胞傷害性とＩＴＡＢ１０１２媒介ＰＢＭＣ細胞傷害性の比較）
【０５０２】
ＩＴＡＢ１０１２は、ＩＴＡＢ１００２のＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖ中のＨＶＲとは異なるＨＶＲを有するＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖを含む、ＥｐＣＡＭＡ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質である。ＩＴＡＢ１０１２を実施例１で説明したように一過的に発現させ、精製した。ＩＴＡＢ１０１２の重鎖は、配列番号３５のアミノ酸配列を有し、配列番号３７の核酸配列によりコードされている。ＩＴＡＢ１０１２の軽鎖は、配列番号３６のアミノ酸配列を有し、配列番号３８の核酸配列によりコードされている。下記の配列中のＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖ断片のＨＶＲに下線を引く。ＩＴＡＢ１０１２のＥｐＣＡＭ  ｓｃＦｖは、以前に米国特許第８，８４６，０４２号に記載されている。
【化７−１】
2019513701.tif 000013
【化７−２】
2019513701.tif 000014
【０５０３】
実施例５で説明したヒトＰＢＭＣを使用する細胞傷害性アッセイでＩＴＡＢ１００２およびＩＴＡＢ１０１２を試験した。結果を図１５に示す。ＳＷ４８０細胞に対するＩＴＡＢ１００２媒介ヒトＰＢＭＣ細胞傷害性のＥＣ５０は、３．５４ｎｇ／ｍＬであった。比較して、ＳＷ４８０細胞に対するＩＴＡＢ１０１２媒介ヒトＰＢＭＣ細胞傷害性のＥＣ５０は、２２３．３ｎｇ／ｍＬであった。したがって、ＩＴＡＢ１００２は、腫瘍細胞に対するヒトＰＢＭＣ細胞傷害性の媒介について、ＩＴＡＢ１０１２と比較して有意に高い活性を示した。
【０５０４】
加えて、例示的ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質（すなわち、ＩＴＡＢ１００２およびＩＴＡＢ１０１２）の抗ＥｐＣＡＭおよび抗ＣＤ３ドメインとヒト抗原との結合親和性を、実施例２で説明した方法を使用して測定した。表４に示すように、ＩＴＡＢ１０１２と比較して、ＩＴＡＢ１００２は、ＥｐＣＡＭとの強い結合親和性を示したが、ＣＤ３とのその結合親和性は弱い。
【表４−１】
2019513701.tif 000015
（実施例１１：ステロイドの存在下での腫瘍細胞に対するＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質媒介ヒトＰＢＭＣ細胞傷害性。）
【０５０５】
ＩＴＡＢ１００２により誘導されるヒトＴ細胞による腫瘍細胞殺滅活性およびサイトカイン放出に対するステロイド前処置の効果を評価するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ予備的アッセイを行った。
【０５０６】
細胞傷害性アッセイは、実施例５で説明した通りに行った。ＰＢＭＣを健常ドナーから単離し、３μＭの濃度でのデキサメタゾン（ＤＸＭ）とともに１時間インキュベートし、その後、９６ウェルプレートのウェルに１ウェル当りＳＷ４８０細胞３０，０００個およびＰＢＭＣ  ３００，０００個の最終密度で添加した。混合した細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、０．１５μＭの最終ＤＸＭ濃度で、約１８時間インキュベートした。細胞殺滅を乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイにより測定し、算出した。同じアッセイで、サイトカイン（すなわち、ＩＬ−６）放出を、ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ  Ｓｅｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。
【０５０７】
図１６は、ＩＴＡＢ１００２媒介ＳＷ４８０細胞殺滅活性に対するデキサメタゾン（ＤＸＭ）の効果を示す。ＩＴＡＢ１００２は、デキサメタゾンの存在下で、単独でのＩＴＡＢ１００２と比較して同等の殺滅活性をＳＷ４８０細胞に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで示した。
【０５０８】
図１７は、サイトカイン放出アッセイからの結果を示す。ＩＬ−６は、ＩＴＡＢ１００２によって誘導されて活性化Ｔ細胞により放出された。しかし、ＩＬ−６放出は、デキサメタゾンの存在下ではほぼ完全に阻害された。これは、ＤＸＭ処置がＩＴＡＢ１００２を受容する患者においてサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を制御するための有効な前投薬戦略であり得ることを示唆する。
【０５０９】
（実施例１２：カニクイザルにおけるＥｐＣＡＭ×ＣＤ３  Ｆａｂ融合タンパク質の前臨床研究）
ＩＴＡＢ１００２処置を受けたカニクイザルにおいて起こり得る毒性の軽減に対するデキサメタゾン前処置の効果を評価するために予備的研究を行った。６匹のサル（ＩＴＡＢ１００２＋ＤＸＭ）を第１週目に０．５μｇ／ｋｇのＩＴＡＢ１００２で週２回（１日目および４日目に）静脈内（ＩＶ）注入によって処置した。第２週目には、動物を１．０μｇ／ｋｇのＩＴＡＢ１００２で週２回（８日目および１１日目）、ＩＶ注入により処置した。第３週目には、動物を２．０μｇ／ｋｇのＩＴＡＢ１００２で週２回（１５日目および１８日目）、ＩＶ注入により処置した。第４週目および第５週目には、動物を４．０μｇ／ｋｇのＩＴＡＢ１００２で週２回（２２、２５、２９および３２日目）、ＩＶ注入により処置した。１ｍｇ／ｋｇの用量のデキサメタゾンを各動物に、各用量レベルでの１回目の注入の約１時間前に、静脈内注射（ＩＶ）によって投与した。５週目にデキサメタゾンを２ｍｇ／ｋｇに増加させた。ＤＸＭ前処置なしの群（ｎ＝１０）には、いずれのＤＸＭ前処置も用いずに、各サルにＩＴＡＢ１００２を２．０μｇ／ｋｇで週２回、静脈内注入によって投与した。異なる時点で血液試料を採取し、血清化学パラメータを分析した。血清中ＩＬ−６レベルをｈｕｍａｎ  ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ  Ｓｅｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。
【０５１０】
ＩＴＡＢ１００２の前のＤＸＭでの前処置は、血清中ＡＬＴ（図１８Ａ〜１８Ｂ）、ＴＢｉｌ（図１９Ａ〜１９Ｂ）およびＡＬＰレベル（図２０Ａ〜２０Ｂ）を著しく低下させ、ＤＸＭ前処置なしでの処置と比較してＩＬ−６放出を阻害した（図２１Ａ〜２１Ｂ）。これらの結果は、ＩＴＡＢ１００２で処置したサルにおけるＩＬ−６放出の早期誘導および肝臓での副作用をＤＸＭ前処置によって好転させることができることを実証した。
【０５１１】
（実施例１３：ヒトがん患者におけるＩＴＡＢ１００２の臨床試験）
ＩＴＡＢ１００２の安全性および有効性をヒトがん患者における臨床治験で評価した。この治験の目的は、標準治療が存在しない、または標準治療に効果がないもしくは耐えられないことが証明された、局所進行性または転移性固形腫瘍を有する成人被験体において、ＩＴＡＢ１００２の安全性、耐容性、薬物動態、免疫原性および抗腫瘍活性を評価することである。０．３、０．６、１．２、２．４および３．６μｇ／ｋｇの５つの用量レベルを用量漸増により評価する。従来の３＋３デザイン（１用量コホート当り患者３名で、毒性をさらに評価するために同じコホートに追加の患者３名を加える可能性がある）を用量漸増およびＭＴＤ決定に適用する。１群当り患者約６名を有する５つのコホートを登録する。
【０５１２】
全ての患者に、第１週目に、０．３μｇ／ｋｇのコンディショニング用量のＩＴＡＢ１００２を２回（１日目および４日目に）静脈内（ＩＶ）注入によって与える。次の３週間には、５つのコホートの患者に週２回、ＩＶ注入により次の用量のうちの１つのＩＴＡＢ１００２をそれぞれ与える：０．３μｇ／ｋｇ、０．６μｇ／ｋｇ、１．２μｇ／ｋｇ、２．４μｇ／ｋｇおよび３．６μｇ／ｋｇ。２０ｍｇの用量のデキサメタゾンを、ＩＴＡＢ１００２の初回コンディショニング用量および初回増加用量（０．３μｇ／ｋｇから３．６μｇ／ｋｇへ）の１時間前に与える。ＩＴＡＢ１００２の後続用量の前のデキサメタゾンの投与は、臨床評価に基づいて２０ｍｇまたは１０ｍｇのどちらかで与える。下の表４は、この研究における５つのコホートの投与スケジュールを示す。
【表４−２】
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【０５１３】
本発明で述べた全ての参考文献は、それらの参考文献の各々が個々に参照により組み込まれたかのごとく、参照により本明細書に組み込まれている。本明細書は、特定の実施形態に言及したものであるが、これらの特定の詳細の変形形態を用いて本発明を実施することができることは、当業者には明らかであろう。したがって、本発明を本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈すべきではない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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