(57)【要約】  本発明は、12〜18ヌクレオチドを含む免疫抑制復帰オリゴヌクレオチドであって、ヌクレオチドの少なくとも1つが修飾されており、オリゴヌクレオチドが、配列番号1 (ヒト)及び/又は配列番号2 (マウス)の配列の細胞外酵素(CD73)の核酸配列とハイブリダイズし、CD73発現の少なくとも50%を阻害する、オリゴヌクレオチドについて言及する。本発明は、このようなオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を更に対象とする。
2019531095.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
12〜18ヌクレオチドを含む免疫抑制復帰オリゴヌクレオチドであって、ヌクレオチドの少なくとも1つが修飾されており、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号1 (ヒト)の細胞外酵素(CD73)の核酸配列及び/又は配列番号2 (マウス)の配列とハイブリダイズし、CD73発現の少なくとも50%を阻害する、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
修飾ヌクレオチドが、架橋核酸、例えばLNA、cET、ENA、2'フルオロ修飾ヌクレオチド、2'O-メチル修飾ヌクレオチド及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47及びこれらの組合せからなる群から選択される配列を含む、配列番号1及び/又は配列番号2のCD73とハイブリダイズする、請求項1又は2に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
+G*+A*+T*T*T*C*C*C*A*G*T*G*C*+C*+A*+T (A05018HM)、
+G*+C*+T*G*T*G*C*A*C*G*T*C*+G*+T*+T (A05008HM)、
+T*+G*+A*T*T*T*C*C*C*A*G*T*G*C*+C*+A*+T (A05028HM)、
+G*+G*+C*T*G*T*G*C*A*C*G*T*C*+G*+T (A05009HM)、
+C*+T*+C*A*G*A*A*T*T*G*G*A*A*+A*+T*+T (A05019HM)、
+A*+C*+T*C*G*A*C*A*C*T*T*G*G*+T*+G*+C (A05026HM)、
+C*+T*+G*T*G*C*A*C*G*T*C*+G*+T*+T (A05001HM)、
+A*+G*C*A*C*G*T*T*G*G*G*T*+T*+C (A05002HM)、
+A*+C*+G*G*T*G*A*A*C*C*A*+G*+A*+T (A05003HM)、
+G*+C*+A*T*A*G*G*C*C*T*G*+G*+A*+C (A05004H)、
+C*+T*+C*G*A*C*A*C*T*T*G*G*+T*+G (A050005HM)、
+A*+C*+T*C*G*A*C*A*C*T*T*+G*+G*+T (A05006HM)、
+G*+G*+C*A*C*T*C*G*A*C*A*+C*+T*+T (A05007HM)、
+G*+T*+C*C*T*C*C*C*A*C*C*A*+C*+G*+A (A05010HM)、
+G*+T*C*C*T*C*C*C*A*C*C*A*C*G*+A (A05011HM)、
+T*+G*T*C*C*T*C*C*C*A*C*C*+A*+C*+G (A05012HM)、
+G*+A*G*T*G*T*C*C*T*C*C*C*A*C*+C (A05013HM)、
+T*+C*+G*A*C*A*C*T*T*G*G*T*+G*+C*+A (A05014HM)、
+C*+T*+C*G*A*C*A*C*T*T*G*G*+T*+G*+C (A05015HM)、
+A*+C*+T*C*G*A*C*A*C*T*T*+G*G*T*+G (A05016HM)、
+C*+A*+C*T*C*G*A*C*A*C*T*T*+G*+G*+T (A05017HM)、
+T*+G*+T*C*C*T*C*C*C*A*C*C*A*+C*+G*+A (A05020HM)、
+G*+T*G*T*C*C*T*C*C*C*A*C*C*+A*+C*+G (A05021HM)、
+G*+A*G*T*G*T*C*C*T*C*C*C*A*C*+C*+A (A05022HM)、
+G*T*+G*T*T*G*G*A*G*T*G*T*C*C*+T*+C (A05023HM)、
+C*+T*+C*G*A*C*A*C*T*T*G*G*T*+G*+C*+A (A05024HM)、
+C*+T*+C*G*A*C*A*C*T*T*G*G*T*G*+C*+A (A05025HM)、
+G*+C*+A*C*T*C*G*A*C*A*C*T*T*+G*+G*+T (A05027HM)、
+G*+T*+G*T*C*C*T*C*C*C*A*C*C*A*+C*+G*+A (A05029HM)、
+A*+G*+T*G*T*C*C*T*C*C*C*A*C*C*+A*+C*+G (A05030HM)、
+G*+A*G*T*G*T*C*C*T*C*C*C*A*C*C*A*+C (A05031HM)、
+G*A*G*T*G*T*C*C*T*C*C*C*A*C*+C*A*+C (A05032HM)、
+G*A*G*T*G*T*C*C*T*C*C*C*A*C*C*+A*+C (A05033HM)、
+A*+C*+T*C*G*A*C*A*C*T*T*G*G*T*+G*+C*+A (A05034HM)、
+A*+C*+T*C*G*A*C*A*C*T*T*G*G*T*G*+C*+A (A05035HM)、
+G*+G*+C*A*C*T*C*G*A*C*A*C*T*T*+G*+G*+T (A05036HM)、
+G*+G*CA*C*T*C*G*A*C*A*C*T*T*+G*+G*+T (A05037HM)、
+G*+C*T*G*T*G*C*A*C*G*T*C*+G*+T*+T (A05038HM)、
+C*G*+G*C*T*G*T*G*C*A*C*G*T*C*G*+T*+T (A05039HM)、
+G*+G*+C*T*G*T*G*C*A*C*G*T*C*+G*+T (A05040HM)、
+G*+A*+T*T*T*C*C*C*A*G*T*G*C*C*+A*+T (A05041HM)、
+G*+A*T*T*T*C*C*C*A*G*T*G*C*+C*+A*+T (A05042HM)、
+T*+G*+A*T*T*T*C*C*C*A*G*T*G*+C*C*+A*+T (A05043HM)、
+T*+G*+A*T*T*T*C*C*C*A*G*T*G*C*C*+A*+T (A05044HM)、
+C*+A*+T*G*A*T*T*T*C*C*C*A*G*T*G*+C*+C (A05045HM)、
及びこれらの組合せからなる群から選択され、
+がLNAヌクレオチドを示し、*がヌクレオチド間のホスホロチオエート(PTO)結合を示す、請求項1から3のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
CD73の発現をナノモル濃度で阻害する、請求項1から4のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項1から5のいずれか一項に記載の免疫抑制復帰オリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体、賦形剤及び/又は希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項７】
化学療法剤、例えば白金製剤、ゲムシタビン、別のオリゴヌクレオチド、抗体及び/又は低分子を更に含む、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項８】
他のオリゴヌクレオチド、抗体及び/又は低分子が、免疫抑制因子及び/又は免疫刺激因子を阻害又は刺激する、請求項7に記載の医薬組成物。
【請求項９】
免疫抑制因子がIDO1、IDO2、CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、VISTA、A2AR、CD39、CD73、STAT3、TDO2、TIM-3、TIGIT、TGF-ベータ、BTLA、MICA、NKG2A、KIR、CD160、Chop、Xbp1及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項8に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
免疫刺激因子が4-1BB、Ox40、KIR、GITR、CD27、2B4及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項8に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
CD73の不均衡が関与する障害を予防及び/又は治療する方法における使用のための、請求項1から5のいずれか一項に記載の免疫抑制復帰オリゴヌクレオチド又は請求項6から10のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
障害が、自己免疫障害、免疫障害、精神障害及び/又はがんである、請求項11に記載の使用のための免疫抑制復帰オリゴヌクレオチド又は医薬組成物。
【請求項１３】
がんが、乳がん、肺がん、悪性黒色腫、リンパ腫、皮膚がん、骨がん、前立腺がん、肝がん、脳がん、喉頭、胆嚢、膵臓、精巣、直腸、副甲状腺、甲状腺、副腎、神経組織、頭頸部、結腸、胃、気管支、腎臓のがん、基底細胞癌、扁平上皮癌、転移性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網肉腫、脂肪肉腫、骨髄腫、巨細胞種瘍、小細胞肺腫瘍、膵島細胞腫瘍、原発性脳腫瘍、髄膜腫、急性及び慢性リンパ球性及び顆粒球性腫瘍、急性及び慢性骨髄球性白血病、ヘアリー細胞腫瘍、腺腫、過形成、髄様癌、腸管神経節腫、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、平滑筋腫、子宮頸部異形成、網膜芽細胞腫、軟部組織肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚病変、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨原性肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫瘍、真性赤血球増加症、腺癌、未分化星状細胞腫、多形神経膠芽腫、白血病、又は類表皮癌である、請求項11に記載の使用のための免疫抑制復帰オリゴヌクレオチド又は医薬組成物。
【請求項１４】
局所投与又は全身投与に適する、請求項11から13のいずれか一項に記載の使用のための免疫抑制復帰オリゴヌクレオチド又は医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞外酵素（ectoenzye：外酵素、エクト型酵素）(NT5E又はCD73)の核酸配列とハイブリダイズする免疫抑制復帰オリゴヌクレオチドと、このような免疫抑制復帰オリゴヌクレオチド並びに薬学的に許容される担体、賦形剤及び/又は希釈剤(dilutant)を含む医薬組成物とについて言及する。
【背景技術】
【０００２】
近年、悪性腫瘍等のいくつかの異なる疾患の治療は、免疫療法を適用することにより、特に「免疫チェックポイント」と呼ばれる阻害物質により非常に成功した。このようなチェックポイントは、シグナルを強める(共刺激分子)か又は弱める免疫系の分子である。治療手法の概念は、内因性抗腫瘍免疫反応の活性化に基づいている。例えば、多くのがんは、それぞれ、T細胞及びNK細胞の活性を阻害することにより免疫系からがん自体を保護している。例えば、免疫チェックポイント調節物質、すなわち刺激物質又は阻害物質はCTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、VISTA、A2AR、BTLA、IDO、CD39、CD73、STAT3、TDO2、TIM-3、MICA、NKG2A、KIR、TIGIT、TGF-ベータ、Ox40、GITR、CD27、CD160、2B4及び4-1BBのうちの1つ又は複数を対象としている。
【０００３】
CD73は、種々の型のがんに対して免疫を向上させる1つの新規かつ有望な候補とみなす必要がある。CD73は、細胞外酵素(NTPdase)であり、AMPの免疫抑制アデノシンへの変換を触媒する。CD73は、ATPをADPへ及びADPをAMPへ変換することで知られるCD39と協調するがCD39の下流で作用する。アデノシンは、アデノシン受容体A1、アデノシン受容体A2A、アデノシン受容体A2B及びアデノシン受容体A3を介してその効果を発揮する。アデノシン受容体を発現し、それによりアデノシンの免疫調節作用により潜在的に影響される免疫細胞の範囲は、Tリンパ球、ナチュラルキラー(NK)細胞、NKT細胞、マクロファージ、DC、好中球、マスト細胞及びB細胞を含む。
【０００４】
CD73は、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、内皮細胞及び上皮細胞のサブセットを含む、ほとんどの組織及び多くの細胞型に見られる。低酸素症は、マウス微小血管内皮細胞におけるCD73 mRNA、タンパク質発現及びCD73活性の増加を誘導する。特には、CD73は、多くの種々のヒト(固形及び血液の)腫瘍において高度に発現し、その発現及び活性の上昇は、腫瘍の浸潤及び転移、並びに患者生存期間の短縮と関連する。CD73のRNA発現及び酵素活性は、種々の乳がん細胞株において変化する。
【０００５】
死にゆくがん細胞は、ATPを腫瘍微小環境内の細胞外腔へ放出する。生きている腫瘍細胞は、高レベルのCD39及びCD73発現することが多く、ATPを免疫抑制アデノシンに変換する。これにより、腫瘍細胞は、制御されずに増殖及び転移を遂げることが可能である。リンパ球上のA2A又はA2B受容体に結合することにより、アデノシンは、このような細胞に対して免疫抑制シグナルを媒介する。例えば、T細胞は、その増殖、細胞傷害性サイトカインの産生及び活性を阻害される。NK細胞は、細胞傷害能の低減を示す。アデノシンがマクロファージ(免疫抑制M2表現型)の代替的活性を誘導すると、炎症性サイトカインの産生は低減するが、免疫抑制サイトカインIL-10の産生は増加する。種々の腫瘍における適切な治療標的としてのCD73の重要な役割は、CD73又はA2A受容体ノックアウトマウスを使用する腫瘍モデルが疾患転帰の改善を示すという事実により強調される。
【０００６】
抗ヒトCD73モノクローナル抗体、例えば、Innate Pharma社の抗CD73抗体(例えば、Innate Pharma Poster #iph_poster_aarc2016_cd73)は現在、免疫腫瘍学細胞系アッセイにおいて前臨床研究下にある。しかし、立体障害のため、CD73に対するモノクローナル抗体は、腫瘍微小環境に局在化できない恐れがある。更に、CD73の非加水分解性低分子阻害物質、例えば、CD73活性を競合的に阻害するAMPCP (アデノシン5'-(α,β-メチレン)二リン酸;例えば、Structure 20、2161〜2173頁、2012年、12月5日) ADP類似体は、動物モデルにおいてin vitro及びin vivoで試験されているが、CD73酵素活性の遮断に成功するためには比較的高い濃度で反復投与することが必要である。
【０００７】
免疫療法は、結果的に長期寛解となるが、これまでのところ小規模な患者群のみの結果となっている。この理由は、多数の免疫チェックポイント及び任意選択で更なる免疫抑制機序が、例えば、免疫系と腫瘍細胞との間の相互作用に関与するためであり得る。免疫チェックポイントと潜在的な他の機序との組合せは、生体防御を逃れる腫瘍及び対象の個々の状態に応じて変化し得る。
【０００８】
いくつかの免疫抑制機序の阻害では、分子標的が細胞内に位置するか又は酵素活性を有さないため、抗体及び/又は低分子を使用する一般的手法は、適さないか又はほとんど適さない。したがって、CD73等の「免疫チェックポイント」機能の阻害することにおいて安全かつ有効である作用物質は、例えば、この酵素活性に影響を受ける疾患又は状態を患っている患者の治療に重要な追加となり得る。
【０００９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、CD73の発現及び活性それぞれの阻害に非常に成功している。オリゴヌクレオチドの作用機序は、抗体又は低分子の作用機序と異なっており、オリゴヌクレオチドは、例えば、
(i)固形腫瘍の腫瘍組織への浸潤、
(ii)標的の複数の機能及び活性それぞれの遮断、
(iii)オリゴヌクレオチド相互、又はオリゴヌクレオチドと抗体若しくは低分子との組合せ、及び
(iv)抗体が接触可能でないか又は低分子により阻害可能でない細胞内効果の阻害
に関して非常に有利である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO2014154843 A1
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Structure 20、2161〜2173頁、2012年、12月5日
【非特許文献２】Chackalamannil、Rotella、Ward、Comprehensive Modicinal Chemistry III Elsevier、03.06.2017
【非特許文献３】Zhangら、Gene Therapy、2011、18、326〜333頁
【非特許文献４】Stantonら、Nucleic Acid Therapeutics、Vol. 22、No. 5、2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、がん及び免疫細胞上のCD73発現をmRNAレベルでアンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的とすることは、例えば、種々のがん及び免疫疾患それぞれに対する免疫療法を発展及び向上させる有望な最先端の手法である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、約10〜20ヌクレオチドを含む、免疫抑制復帰オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドについて言及し、ヌクレオチドの少なくとも1つは修飾されている。オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号1 (ヒト)の細胞外酵素CD73の核酸配列及び/又は配列番号2 (マウス)の配列とハイブリダイズする。修飾ヌクレオチドは、例えば、架橋した核酸(例えば、LNA、cET、ENA、2'フルオロ修飾ヌクレオチド又は2'O-メチル修飾ヌクレオチド)からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、CD73発現の少なくとも50%を阻害し、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、CD73の発現をナノモル濃度で阻害する。
【００１４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNAiと比較して著しい利点を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、トランスフェクト試薬を用いずにin vitroでトランスフェクトすることができ、したがって、このトランスフェクションは、RNAiのトランスフェクションに不可欠であるトランスフェクト試薬を使用したトランスフェクションよりもin vivo条件に近い。アンチセンスオリゴヌクレオチドのin vivo全身投与は、種々の組織において可能であるが、RNAiのin vivoでの投与は、例えば肝臓におけるGalNAcのように送達システムに依存する。更に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNAiより短く、したがって、合成及び細胞内への取込みがそれほど複雑でない。RNAiは、RNAiを同様に開始し得る、パッセンジャー鎖のオフターゲット効果を規則的に示す。パッセンジャー鎖のRISCローディングは、パッセンジャー鎖が意図しない標的をRNAi活性の対象とし、有毒な副作用を生じ得るため、RNAi薬物についての重要な問題となっている(Chackalamannil、Rotella、Ward、Comprehensive Modicinal Chemistry III Elsevier、03.06.2017を参照)。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、パッセンジャー鎖を含まない。
【００１５】
本発明は、本発明の免疫抑制復帰オリゴヌクレオチド、並びに任意選択で薬学的に許容される担体、賦形剤及び/又は希釈剤を含む医薬組成物に更に関する。いくつかの実施形態では、この医薬組成物は、化学療法剤、例えば、白金製剤(platinum)又はゲムシタビン、別のオリゴヌクレオチド、抗体及び/若しくは例えば、腫瘍治療において有効な低分子を更に含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、別のオリゴヌクレオチド、抗体及び/又は低分子との組合せである。このような各化合物のいずれかは、分離又は医薬組成物中に組み合わされており、この場合、オリゴヌクレオチド、抗体及び/若しくは低分子は、免疫抑制因子、例えばIDO1、IDO2、CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、VISTA、A2AR、CD39、CD73、STAT3、TDO2、TIM-3、TIGIT、TGF-ベータ、BTLA、MICA、NKG2A、KIR、CD160、Chop及び/又はXbp1を阻害又は刺激する。これに加えて、又はこれに代えて、オリゴヌクレオチド、抗体及び/又は低分子は、免疫刺激因子、例えば4-1BB、Ox40、KIR、GITR、CD27及び/又は2B4を阻害又は刺激する。
【００１７】
更に、本発明は、CD73の不均衡が関与する障害を予防及び/又は治療する方法における本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物の使用に関する。いくつかの実施形態では、障害は、例えば、自己免疫障害、例えば自己免疫性関節炎又は自己免疫性胃腸疾患、例えば炎症性腸疾患(IBD)若しくは結腸炎、免疫障害、例えば慢性ウイルス感染、例えばHIV感染による免疫疲弊（immune exhaustion）、心血管障害、炎症性障害、例えば慢性気道炎症、細菌、ウイルス及び/又は真菌感染、例えば敗血症若しくはウシ結核菌(Mycobacterium bovis)感染、肝障害、慢性腎障害、精神障害並びに/或いはがんである。CD73は、多くの生理学的役割、例えば、バリア機能の調節、低酸素への順応、虚血プレコンディショニング、消炎、白血球の血管外遊出を有する。がん細胞上のCD73の発現及び活性は予後不良と関連し、転移を促進し得る。CD73は、ヒト乳がん細胞の接着、遊走、浸潤、及び神経膠芽腫細胞の増殖を促進し、このようなプロセスは、酵素によるアデノシンの産生に依存する。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、例えば、局所的又は全身的に投与される。
【００１８】
本明細書において引用又は参照する文献(「本明細書で引用する文献」)のすべて、及び本明細書で引用する文献において引用又は参照する文献のすべては、本明細書又は本明細書に参照により組み込む文献において言及する任意の製品のための任意の製造者の指示書、記述、製品仕様書、及び製品説明書と一緒に、これによって本明細書に参照により組み込み、本発明の実施において用いられ得る。より詳細には、参照する文献のすべては、個々の文献それぞれを参照により組み込むことを詳細かつ個別に示すことと同等に参照により組み込む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】配列番号1 (NM_002526.3)のhCD73 mRNA上の部位に結合するヒト(h)CD73アンチセンスオリゴヌクレオチドの分布、並びにこれらの修飾及び長さを示す図である。hCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドを配列番号1のhCD73 mRNA配列に対して整列させた。種々のグレースケールは種々のLNA修飾を示し、各記号は異なる長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドを示す。
【図２Ａ】第1のスクリーニングラウンドでのヒトがん細胞株A-172 (ヒト神経膠芽腫)におけるhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドのhCD73 mRNAノックダウン効力を示すグラフである。A-172細胞を10μMの各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処置した。対照として、CGTTTAGGCTATGTACTTの配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであるneg1 (WO2014154843 A1に記載)で細胞を処置した。無処置細胞と比較した残余ヒト又はマウスCD73 mRNA発現を示す。発現値をハウスキーピング遺伝子GAPDHの発現値に対して正規化した。3連のウェルの平均+/- SDを示す。
【図２Ｂ−１】第2のスクリーニングラウンドでのヒトがん細胞株A-172 (ヒト神経膠芽腫)におけるhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドのhCD73 mRNAノックダウン効力を示すグラフである(パート1)。A-172細胞を10μMの各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処置した。対照として、CGTTTAGGCTATGTACTTの配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであるneg1 (WO2014154843 A1に記載)で細胞を処置した。無処置細胞と比較した残余ヒト又はマウスCD73 mRNA発現を示す。発現値をハウスキーピング遺伝子GAPDHの発現値に対して正規化した。3連のウェルの平均+/- SDを示す。
【図２Ｂ−２】第2のスクリーニングラウンドでのヒトがん細胞株A-172 (ヒト神経膠芽腫)におけるhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドのhCD73 mRNAノックダウン効力を示すグラフである(パート2)。A-172細胞を10μMの各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処置した。対照として、CGTTTAGGCTATGTACTTの配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであるneg1 (WO2014154843 A1に記載)で細胞を処置した。無処置細胞と比較した残余ヒト又はマウスCD73 mRNA発現を示す。発現値をハウスキーピング遺伝子GAPDHの発現値に対して正規化した。3連のウェルの平均+/- SDを示す。
【図２Ｃ−１】1つのスクリーニングラウンドでのEFO-21 (ヒト卵巣嚢胞腺癌)におけるhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドのhCD73 mRNAノックダウン効力を示すグラフである(パート1)。EFO-21細胞を10μMの各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処置した。対照として、CGTTTAGGCTATGTACTTの配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであるneg1 (WO2014154843 A1に記載)で細胞を処置した。無処置細胞と比較した残余ヒト又はマウスCD73 mRNA発現を示す。発現値をハウスキーピング遺伝子HPRT1の発現値に対して正規化した。3つのウェルの平均+/- SDを示す。
【図２Ｃ−２】1つのスクリーニングラウンドでのEFO-21 (ヒト卵巣嚢胞腺癌)におけるhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドのhCD73 mRNAノックダウン効力を示すグラフである(パート2)。EFO-21細胞を10μMの各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処置した。対照として、CGTTTAGGCTATGTACTTの配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであるneg1 (WO2014154843 A1に記載)で細胞を処置した。無処置細胞と比較した残余ヒト又はマウスCD73 mRNA発現を示す。発現値をハウスキーピング遺伝子HPRT1の発現値に対して正規化した。3連のウェルの平均+/- SDを示す。
【図２Ｄ−１】1つのスクリーニングラウンドでの1つのマウス細胞株4T1 (乳がん)におけるにおけるhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドのhCD73 mRNAノックダウン効力を示すグラフである(パート1)。4T1細胞を10μMの各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処置した。対照として、CGTTTAGGCTATGTACTTの配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであるneg1 (WO2014154843 A1に記載)で細胞を処置した。無処置細胞と比較した残余ヒト又はマウスCD73 mRNA発現を示す。発現値をハウスキーピング遺伝子HPRT1の発現値に対して正規化した。3連のウェルの平均+/- SDを示す。
【図２Ｄ−２】1つのスクリーニングラウンドでのマウス細胞株4T1 (乳がん)におけるにおけるhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドのhCD73 mRNAノックダウン効力を示すグラフである(パート2)。4T1細胞を10μMの各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処置した。対照として、CGTTTAGGCTATGTACTTの配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであるneg1 (WO2014154843 A1に記載)で細胞を処置した。無処置細胞と比較した残余ヒト又はマウスCD73 mRNA発現を示す。発現値をハウスキーピング遺伝子HPRT1の発現値に対して正規化した。3連のウェルの平均+/- SDを示す。
【図２Ｅ】1つのスクリーニングラウンドでのヒトSKOV-3 (ヒト卵巣腺癌(ovarian adenocarcinoma cancer))細胞におけるhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドのhCD73 mRNAノックダウン効力を示すグラフである。SKOV-3細胞を10μMの各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処置した。対照として、CGTTTAGGCTATGTACTTの配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであるneg1 (WO2014154843 A1に記載)で細胞を処置した。無処置細胞と比較した残余ヒト又はマウスCD73 mRNA発現を示す。発現値をハウスキーピング遺伝子HPRT1の発現値に対して正規化した。3連のウェルの平均+/- SDを示す。
【図３Ａ】ヒトA-172細胞と比較したヒトEFO-21細胞におけるhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチド効力の相関分析を示すグラフである。
【図３Ｂ】マウス4T1細胞と比較したヒトA-172細胞におけるhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチド効力の相関分析を示すグラフである。
【図４Ａ】SKOV-3細胞における選択したhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチド(A05008HM (配列番号4)、A05009HM (配列番号6)、A05018HM (配列番号3)、A05026HM (配列番号8)、及びA05028HM (配列番号5))による濃度依存性hmCD73 mRNAノックダウンを示すグラフである。SKOV-3細胞を指示濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処置した。残余hCD73発現を無処置対照細胞(100として設定)と比較して示す。hCD73 mRNA発現値をハウスキーピング遺伝子HPRT1の発現に対して正規化した。3連のウェルの平均+/- SDを示す。SKOV-3細胞についてTable 7 (表7)に示すIC50値の算出に濃度依存性標的ノックダウンを使用した。
【図４Ｂ】EFO-21 (ヒト卵巣がん)における選択したhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチド(EFO-21細胞におけるA05018HM (配列番号3)、A05027HM (配列番号30)、A05028HM (配列番号5)、及びA05037HM (配列番号39))による濃度依存性hmCD73 mRNAノックダウンを示すグラフである。EFO-21細胞を指示濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処置した。残余hCD73発現を無処置対照細胞(100として設定)と比較して示す。hCD73 mRNA発現値をハウスキーピング遺伝子HPRT1の発現に対して正規化した。3連のウェルの平均+/- SDを示す。EFO-21細胞についてTable 8 (表8)に示すIC50値の算出に濃度依存性標的ノックダウンを使用した。
【図５Ａ】ヒト及びマウスがん細胞株におけるhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドのhmCD73 mRNAノックダウン効力を示すグラフである。EFO-21 (ヒト卵巣嚢胞腺癌)細胞を10μMの各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処置した。無処置細胞(1として設定)と比較した残余hmCD73 mRNA発現を示す。発現値をハウスキーピング遺伝子HPRT1の発現に対して正規化した。3連のウェルの平均+/- SDを示す。
【図５Ｂ】ヒト及びマウスがん細胞株におけるhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドのhmCD73 mRNAノックダウン効力を示すグラフである。SKOV-3 (ヒト卵巣腺癌)細胞を10μMの各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処置した。無処置細胞(1として設定)と比較した残余hmCD73 mRNA発現を示す。発現値をハウスキーピング遺伝子HPRT1の発現に対して正規化した。3連のウェルの平均+/- SDを示す。
【図５Ｃ】ヒト及びマウスがん細胞株におけるhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドのhmCD73 mRNAノックダウン効力を示すグラフである。4T1 (マウス乳がん)細胞を10μMの各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処置した。無処置細胞(1として設定)と比較した残余hmCD73 mRNA発現を示す。発現値をハウスキーピング遺伝子HPRT1の発現に対して正規化した。3連のウェルの平均+/- SDを示す。
【図６】指示濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処置したEFO-21細胞を示すグラフである。hCD73 mRNA発現値をハウスキーピング遺伝子HPRT1の発現に対して正規化した。無処置細胞(100として設定)と比較した残余hCD73 mRNA発現を示す。3連のウェルの平均+/- SDを示す。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、A05008HM (配列番号4)、A05018HM (配列番号3)及びA05028HM (配列番号5)による濃度依存性hCD73 mRNA及びタンパク質ノックダウンを示すグラフである。CD73 (図7A)及びSKOV-3細胞の7-AAD染色(図7B)のフローサイトメトリーによるタンパク質発現及び細胞生存率の分析を、指示するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置後、6日間実行した。対照として、細胞をneg1で同様に処置した。いずれのアンチセンスオリゴヌクレオチド(= 1)でも処置しない対照細胞の数と比較したCD73タンパク質発現(図7A)及び総死細胞(7-ADD陽性細胞) (図7B)の蛍光強度中央値を示す。
【図８】アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後、SKOV3及びEFO-21細胞上のCD73タンパク質発現のノックダウンを示すグラフである。両試験細胞株上のCD73タンパク質発現をA05018HM (配列番号3)による処置後、6日間分析した。対照として、細胞をneg1で同様に処置した。いずれのアンチセンスオリゴヌクレオチド(= 1)でも処置しない対照細胞の発現と比較したCD73タンパク質発現の蛍光強度中央値を示す。
【図９】図９Ａ〜図９Ｄは、SKOV-3及びEFO-21細胞による細胞外ピロリン酸レベル及び細胞生存率に対するhCD73ノックダウンの作用を示すグラフである。A05018HM (配列番号3)で6日間処置したEFO-21細胞(図9A)及びSKOV-3細胞(図9C)由来の細胞上清においてアデノシンの産生の間接的な尺度としてのピロリン酸の産生を分析した。測定前に500μMの外因性AMPを指示時点で細胞に加えた。EFO-21細胞(図9B)及びSKOV-3細胞(図9D)の細胞生存率に対するA05018HM (配列番号3)による処置の効果をcell titer blueアッセイを使用して試験した。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｃは、5μMのCD73特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドA05018HM (黒色棒グラフ)又は対照オリゴヌクレオチドS6 (白色棒グラフ)で6日の全処置時間の間処置したEFO-21細胞を示すグラフである。hCD73タンパク質発現をフローサイトメトリーにより分析した。図10Aは、無処置細胞(ドットの棒グラフ; 1として設定)と比較した残余hCD73発現を示す。細胞外AMPを分解する能力を分析するため、終了6.5時間前に300μMのAMPを細胞又は無細胞PBS (縞の棒グラフ)に加えた。図10Bは、無細胞のAMP添加PBS (1として設定)と比較した相対AMPレベルを示し、図10Cは、細胞上清(細胞調整PBS)におけるアデノシンの絶対濃度を示す。3つのウェルの平均値+/- SD又は無細胞PBSによる条件の単一値を示す。
【図１１Ａ】細胞増殖色素で標識し、抗CD3で活性化し、5μMのCD73特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドA05018HM (黒色棒グラフ)又は対照オリゴヌクレオチドS6 (白色棒グラフ)で5日の全処置時間の間処置したヒトCD4+ T細胞を示すグラフである。ビヒクル対照では(縞の棒グラフ)、細胞を抗CD3のみで活性化した。続いて、オリゴヌクレオチド処置の開始後3日目及び4日目に300μMのAMP又はビヒクルを細胞に加えた。図11Aは、オリゴヌクレオチド処置の開始後5日目にフローサイトメトリーを使用して分析したCD4+ T細胞のCD73タンパク質発現を示す。3連のウェルの平均+/- SDを示す。
【図１１Ｂ】細胞増殖色素で標識し、抗CD3で活性化し、5μMのCD73特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドA05018HM (黒色棒グラフ)又は対照オリゴヌクレオチドS6 (白色棒グラフ)で5日の全処置時間の間処置したヒトCD4+ T細胞を示すグラフである。ビヒクル対照では(縞の棒グラフ)、細胞を抗CD3のみで活性化した。続いて、オリゴヌクレオチド処置の開始後3日目及び4日目に300μMのAMP又はビヒクルを細胞に加えた。図11Bは、オリゴヌクレオチド処置の開始後5日目にフローサイトメトリーを使用して分析したCD4+ T細胞の増殖を示す。3連のウェルの平均+/- SDを示す。
【図１１Ｃ】細胞増殖色素で標識し、抗CD3で活性化し、5μMのCD73特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドA05018HM (黒色棒グラフ)又は対照オリゴヌクレオチドS6 (白色棒グラフ)で5日の全処置時間の間処置したヒトCD4+ T細胞を示すグラフである。ビヒクル対照では(縞の棒グラフ)、細胞を抗CD3のみで活性化した。続いて、オリゴヌクレオチド処置の開始後3日目及び4日目に300μMのAMP又はビヒクルを細胞に加えた。図11Cは、オリゴヌクレオチド処置の開始後5日目にフローサイトメトリーを使用して分析したCD4+ T細胞の絶対細胞数を示す。3連のウェルの平均+/- SDを示す。
【図１２】マウスの肝臓におけるmCD73 mRNA発現に対するhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチド(A05027HM)処置のin vivo作用を示すグラフである。図12に示す結果は、A05027HM処置又はビヒクル処置(白色棒グラフ)マウスの肝臓におけるmCD73 mRNAレベルを示す。
【図１３】配列番号1 (NM_002526.3)のhCD73 mRNAを示す配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、エクトヌクレオチダーゼCD73のmRNA配列とハイブリダイズし、例えば、腫瘍細胞又は腫瘍関連免疫細胞上のCD73の発現及び活性のそれぞれを阻害する、ヒト及びマウスのオリゴヌクレオチドを初めて提供する。その結果、ATPのレベルは増大し、その分解産物、例えばADP、AMP及び免疫抑制アデノシンのレベルは減少する。このような作用はすべて抗腫瘍免疫細胞、免疫活性化(例えば、細胞傷害性T細胞又はNK細胞を介して)並びに腫瘍細胞の認識及び排除それぞれの増大をもたらす。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、CD73発現及び活性がそれぞれ増加している障害を予防及び/又は治療する方法における使用のための興味深く非常に効果的なツールとなる。
【００２１】
以下において、本発明の要素をより詳細に記載する。このような要素を特定の実施形態と共に列挙するが、これらは任意の様式及び任意の数で組合せて、更なる実施形態を作り出すことが可能であることが理解されるべきである。様々に記載する実施例及び実施形態は、本発明を明示的に記載する実施形態のみに制限するものと解釈されるべきではない。本記載は、明示的に記載する実施形態を任意の数の開示された要素と組み合わせる実施形態を助け、包含するものと理解されるべきである。更に、本出願において記載する要素すべての任意の置換及び組合せは、文脈上他に指示しない限り、本出願の記載により開示するものとみなされるべきである。
【００２２】
本明細書及び特許請求の範囲を通じて、文脈上他に要求しない限り、語句「含む(comprise)」、並びに「含む(comprises)」及び「含んでいる(comprising)」等の変形は、記述するメンバー、整数若しくは工程、又はメンバー、整数若しくは工程の群を包含することを意味するが、他の任意のメンバー、整数若しくは工程、又はメンバー、整数若しくは工程の群を除外することを意味しないものと理解される。用語「1つの(a)」及び「1つの(an)」及び「その(the)」並びに本発明の記述に関して(特に、特許請求の範囲の文脈で)使用する類似の参照は、本明細書において他に指示しない限り、又は文脈が明示的に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、範囲内にある個別の値それぞれに個々に言及する簡潔な方法として機能することを単に意図する。本明細書において他に指示しない限り、個々の各値は、本明細書において個々に列挙する場合と同様に本明細書中に組み込む。本明細書において記載する方法はすべて、本明細書において他に指示しない限り、又は文脈が他に明示的に矛盾しない限り、任意の適した順序で実行することができる。本明細書において提供する任意及びすべての例、又は例示的言語(例えば、「等(such as)」、「例えば(for example)」)の使用は、本発明をより良く例示することを単に意図し、他に主張しない限り、本発明の範囲の制限を提起しない。本明細書における言語は、本発明の実施に不可欠な、主張していない任意の要素を示すものとして解釈されてはならない。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば10〜25ヌクレオチド、10〜15ヌクレオチド、15〜20ヌクレオチド、12〜18ヌクレオチド、又は14〜17ヌクレオチドからなる、又はこれを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、例えば10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は25ヌクレオチドからなる、又はこれを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾された、少なくとも1ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、例えば、架橋ヌクレオチド、例えばロックド核酸(LNA、例えば2',4'-LNA)、cET、ENA、2'フルオロ修飾ヌクレオチド、2'O-メチル修飾ヌクレオチド又はこれらの組合せである。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、同一の又は異なる修飾を有するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、リン酸が、例えばホスホロチオエート若しくはメチルホスホン酸又はこの両方である、修飾されたリン酸骨格を含む。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、1つ又は複数の修飾ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの3'及び/若しくは5'末端、並びに/又はオリゴヌクレオチド内の任意の位置に含み、ここで、修飾ヌクレオチドは1、2、3、4、5若しくは6修飾ヌクレオチドが連続するか、又は修飾ヌクレオチドは1つ若しくは複数の無修飾ヌクレオチドと組み合わせる。次のTable 1 (表1)は、修飾ヌクレオチド、例えば(+)で示すLNA及び(*)で示すホスホロチオエート(PTO)を含むオリゴヌクレオチドの実施形態を示す。Table 1 (表1)の配列からなる、又はこれを含むオリゴヌクレオチドは、他の任意の修飾ヌクレオチド並びに修飾及び無修飾ヌクレオチドの他の任意の組合せを含むことができる。Table 1 (表1)のオリゴヌクレオチドは、ヒト及びマウスCD73のmRNAとハイブリダイズする。
【００２５】
【表１Ａ】
2019531095.tif 000003
【００２６】
【表１Ｂ】
2019531095.tif 000004
【００２７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号1及び/又は配列番号2のヒト又はマウスCD73のmRNAとハイブリダイズする。このようなオリゴヌクレオチドは、CD73アンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ばれる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えばヒト又はマウスCD73等のCD73発現の少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%を阻害する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば細胞、組織、臓器、又は対象において免疫抑制を復帰させる、免疫抑制復帰オリゴヌクレオチドである。本発明のオリゴヌクレオチドは、ナノモル又はマイクロモル濃度で、例えば0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900若しくは950nM、又は1、10若しくは100μMの濃度でCD73の発現を阻害する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは1、3、5、9、10、15、27、30、40、50、75、82、100、250、300、500若しくは740nM又は1、2.2、3、5、6.6若しくは10μMの濃度で使用する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド並びに薬学的に許容される担体、賦形剤及び/又は希釈剤を含む医薬組成物について言及する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、化学療法剤、別のオリゴヌクレオチド、抗体及び/又は低分子を更に含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、障害を予防及び/又は治療する方法における使用のためのものである。いくつかの実施形態では、障害を予防及び/又は治療する方法における本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物の使用は、放射線療法と組み合わせる。放射線療法は、化学療法(例えば、白金製剤、ゲムシタビン)と更に組み合わせることができる。障害は、例えば、CD73の不均衡を特徴とする。すなわち、正常で健康な細胞、組織、臓器又は対象におけるレベルと比較してCD73のレベルが増大する。CD73レベルは、例えばCD73発現及び活性それぞれの増加により増大する。CD73レベルは、任意の標準的方法、例えば、当業者に公知の免疫組織化学検査、ウエスタンブロット、定量的リアルタイムPCR又はQuantiGeneアッセイにより測定することができる。
【００３２】
本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、局所的又は全身的に、例えば、経口的、舌下、経鼻的、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、髄腔内、経皮的及び/又は直腸内に投与する。代替的に又は組み合わせてex vivoで処置した免疫細胞を投与する。オリゴヌクレオチドは、単独で、又は別の本発明の免疫抑制復帰オリゴヌクレオチドと組み合わせて、並びに任意選択で別の化合物、例えば別のオリゴヌクレオチド、抗体、低分子及び/若しくは化学療法剤(例えば、白金製剤、ゲムシタビン)と組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、他のオリゴヌクレオチド(すなわち、本発明物の一部ではない)、抗体、及び/又は低分子は、自己免疫障害、例えば自己免疫性関節炎又は自己免疫性胃腸疾患、例えば炎症性腸疾患(IBD)若しくは結腸炎、免疫障害、例えば慢性ウイルス感染、例えばHIV感染による免疫疲弊、心血管障害、炎症性障害、例えば慢性気道炎症、細菌、ウイルス及び/又は真菌感染、例えば敗血症若しくはウシ結核菌感染、肝障害、慢性腎障害、精神障害(例えば、統合失調症、双極性障害、アルツハイマー病)及び/又はがんの予防及び/又は治療において有効である。
【００３３】
本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、例えば、固形腫瘍又は血液腫瘍を予防及び/又は治療する方法において使用する。本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物の使用により予防可能かつ/又は治療可能ながんの例は、乳がん、肺がん、悪性黒色腫、リンパ腫、皮膚がん、骨がん、前立腺がん、肝がん、脳がん、喉頭、胆嚢、膵臓、精巣、直腸、副甲状腺、甲状腺、副腎、神経組織、頭頸部、結腸、胃、気管支、腎臓のがん、基底細胞癌、扁平上皮癌、転移性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網肉腫、脂肪肉腫、骨髄腫、巨細胞種瘍、小細胞肺腫瘍、膵島細胞腫瘍、原発性脳腫瘍、髄膜腫、急性及び慢性リンパ球性及び顆粒球性腫瘍、急性及び慢性骨髄球性白血病、ヘアリー細胞腫瘍、腺腫、過形成、髄様癌、腸管神経節腫、ウィルムス腫瘍、精上皮腫（セミノーマ）、卵巣腫瘍、平滑筋腫(leiomyomater tumor)、子宮頸部異形成、網膜芽細胞腫、軟部組織肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚病変、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨原性肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫瘍、真性赤血球増加症（多血症）、腺癌、未分化星状細胞腫、多形神経膠芽腫、白血病、又は類表皮癌である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本発明の2つ以上のオリゴヌクレオチドは、例えば医薬組成物と同時点で、若しくは別々に、又は間隔をずらして共に投与する。他の実施形態では、本発明の1つ又は複数のオリゴヌクレオチドは、別の化合物、例えば、別のオリゴヌクレオチド(すなわち、本発明物の一部ではない)、抗体、低分子及び/又は化学療法剤と共に、例えば医薬組成物と同時点で、若しくは別々に、又は間隔をずらして投与する。このような組合せのいくつかの実施形態では、免疫抑制復帰オリゴヌクレオチドは、免疫抑制因子の発現及び活性のそれぞれを阻害し、他のオリゴヌクレオチド(すなわち、本発明物の一部ではない)、抗体及び/又は低分子は、同一の及び/若しくは別の免疫抑制因子並びに/又は免疫刺激因子を阻害(アンタゴニスト)又は刺激(アゴニスト)する。免疫抑制因子は、例えばIDO1、IDO2、CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、VISTA、A2AR、CD39、CD73、STAT3、TDO2、TIM-3、TIGIT、TGF-ベータ、BTLA、MICA、NKG2A、KIR、CD160、Chop、Xbp1及びこれらの組合せからなる群から選択される。免疫刺激因子は、例えば4-1BB、Ox40、KIR、GITR、CD27、2B4及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【００３５】
免疫抑制因子は、その発現及び/又は活性が、例えば、細胞、組織、臓器又は対象中で増加する因子である。免疫刺激因子は、そのレベルが、細胞、組織、臓器又は対象及びその個々の症状に応じて、細胞、組織、臓器又は対象中で増大又は減少する因子である。
【００３６】
本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物と組み合わせる抗体は、例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、又は二重特異性抗体である。本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物と組み合わせる低分子は、例えば、AMPCP (アデノシン5'-(α,β-メチレン)二リン酸;例えば、Structure 20、2161〜2173頁、2012年、12月5日)であり、これはADP類似体として作用し、したがってCD73活性の競合的阻害物質である。
【００３７】
本発明の対象は、例えば、哺乳動物、鳥類又は魚類である。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示するが、本発明は、これらの実施例に制限されない。以下の実験は、CD73を内因性に発現する細胞について実行する。すなわちこの細胞は、トランスフェクトされたレポーター構築物を含む人工系を表さない。このような人工系は、治療的に適切なin vivo系に近い内在系よりも高次の阻害及び低次のIC50値を一般に示す。更に、以下の実験では、トランスフェクション剤を使用しない。すなわち、ジムノシス送達(gymnotic delivery)を実行する。トランスフェクション剤は、IC50値に影響するオリゴヌクレオチドの活性を増加させることで知られている(例えば、Zhangら、Gene Therapy、2011、18、326〜333頁; Stantonら、Nucleic Acid Therapeutics、Vol. 22、No. 5、2012を参照)。人工系としてトランスフェクション剤を使用すると、治療手法に変換することが困難又は不可能となり、トランスフェクション製剤は、オリゴヌクレオチド用にはこれまでのところ認められていない。以下の実験は、いかなるトランスフェクション剤も使用せずに実行した。
【００３９】
(実施例1)
ヒトCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計
ヒト(h)CD73への特異性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計では、配列番号1 (NM_002526.3)を有するhCD73 mRNA配列及び配列番号2 (NM_0011851.4)を有するmCD73 mRNA配列を使用した。14、15、16及び17merを内部基準に従って設計し、neg1 (WO2014154843 A1に記載)を対照アンチセンスオリゴヌクレオチドとして実験のすべてにおいて使用した(Table 1 (表1))。hCD73 mRNA上の部位に結合するhCD73オリゴヌクレオチドの分布を図1に示す。
【００４０】
(実施例2)
ヒトがん細胞株におけるhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力スクリーニング
がん細胞株におけるhmCD73 mRNA発現のノックダウンに関する本発明のhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を分析するために、図2A、図2B、図2C及び図2Dに示すように、各アンチセンスオリゴヌクレオチドの単回投与(濃度: 10μM、いかなるトランスフェクション試薬も加えず;このプロセスはジムノシス送達(gymnotic delivery)と呼ばれる)でA-172 (ヒト神経膠芽腫、ATCC)、EFO-21 (ヒト卵巣嚢胞腺癌、DSMZ)及びマウス4T1 (マウス乳腺細胞、ATCC)細胞を処置した。hCD73、hGAPDH及びhHPRT1又はmCD73及びmHPRT1のmRNA発現を、QuantiGene Singleplexアッセイ(Affymetrix社製)を使用して3日後に分析した。hmCD73 mRNA発現値をhGAPDH (A-172)、hHPRT1 (EFO-21)又はmHPRT1 (4T1) mRNA発現値のそれぞれに対して正規化した。際立ったことには、図2A〜図2Dに示すように、>80%及び>60%それぞれのノックダウン効率は5 (A-172細胞)アンチセンスオリゴヌクレオチドについて観察され、>80%のノックダウン効率は7 (EFO-21細胞)アンチセンスオリゴヌクレオチドについて観察され、>90%のノックダウン効率は10 (4T1細胞)アンチセンスオリゴヌクレオチドについて観察された。
【００４１】
がん細胞株におけるCD73 mRNA発現に対するhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドの作用を更に分析するために、ヒトSKOV-3 (ヒト卵巣腺癌、ATCC)細胞を10μMの各アンチセンスオリゴヌクレオチドで、いかなるトランスフェクション試薬も加えずに3日間処置した。対照として、いかなるヒト又はマウスmRNAとも配列相補性を有しないオリゴヌクレオチドであるneg1で細胞を処置した。ビヒクル対照として、細胞を培地で処置した。CD73発現値をHPRT1値に対して正規化し、無処置細胞(1として設定)と比較して示す。際立ったことには、hCD73 mRNAレベルは、SKOV-3細胞において試験したアンチセンスオリゴヌクレオチド33のうち2つで≧80%低減した(図2E参照)。対照オリゴヌクレオチドneg1による処置では、3つの細胞株においてCD73 mRNAは低減しなかった。
【００４２】
無処置細胞と比較した、hmCD73の平均の正規化したmRNA発現の正確な値及びハウスキーピング遺伝子mRNAの対応する相対発現をA-172細胞(第1及び第2のスクリーニングラウンドに関するTable 2 (表2)及びTable 3 (表3))、EFO-21細胞(Table 4 (表4))、4T1細胞(Table 5 (表5))及びSKOV-3細胞(Table 6 (表6))について以下に示す。
【００４３】
【表２】
2019531095.tif 000005
【００４４】
【表３Ａ】
2019531095.tif 000006
【００４５】
【表３Ｂ】
2019531095.tif 000007
【００４６】
【表４Ａ】
2019531095.tif 000008
【００４７】
【表４Ｂ】
2019531095.tif 000009
【００４８】
【表５Ａ】
2019531095.tif 000010
【００４９】
【表５Ｂ】
2019531095.tif 000011
【００５０】
【表６】
2019531095.tif 000012
【００５１】
(実施例3)
A-172細胞と比較したヒトEFO-21及びマウス4T1細胞と比較したヒトA172におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド効力の相関分析
3つの試験細胞株、A-172、EFO-21及び4T1において最も高い活性を有する候補を更に選択するために、相関分析を実行した(データは図2B〜図2Dから得た)。図3A及び図3Bに示すように、A-172、EFO-21及び4T1細胞におけるIC50の決定のための5つの強力なアンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわちA05008HM (配列番号4)、A05009HM (配列番号6)、A05018HM (配列番号3)、A05026HM (配列番号8)及びA05028HM (配列番号5) (黒色でマーク)を選択した。重要なことには、対照アンチセンスオリゴヌクレオチドneg1は、3つの試験細胞株のすべてにおいてhmCD73の発現に対して悪影響を及ぼさなかった。
【００５２】
(実施例4)
SKOV-3細胞及びEFO-21細胞それぞれにおける選択したhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50決定(mRNAレベル)
hmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドA05008HM (配列番号4)、A05009HM (配列番号6)、A05018HM (配列番号3)、A05026HM (配列番号8)及びA05028HM (配列番号5)のIC50を決定するために、SKOV-3細胞(ヒト卵巣がん細胞、ATCC)を滴定量の各アンチセンスオリゴヌクレオチド(濃度: 10μM、3.3μM、1.1μM、370nM、120nM、41nM、14nM又は4.5nM)で処置した(図4A)。hmCD73 mRNA発現を3日後に分析した。図4A及び次のTable 7 (表7)に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドA05008HM (配列番号4)、A05018HM (配列番号3)及びA05028HM (配列番号5)は、それぞれ86%、88%及び75%の最大標的阻害を有する無処置細胞と比較して、hmCD73 mRNAの下方制御に関してSKOV-3細胞において最も高い効力を有した。SKOV-3細胞における濃度依存性標的ノックダウンをTable 7 (表7)に示すIC50値の算出に使用した。
【００５３】
【表７】
2019531095.tif 000013
【００５４】
選択したhmCD73特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50値をEFO-21細胞の更なる試験において決定した。したがって、EFO-21細胞を10μM、3.3μM、1.1μM、370nM、120nM、41nM、14nM又は4.5nMのA05018HM (配列番号3)、A05027HM (配列番号30)、A05028HM (配列番号5)及びA05037HM (配列番号39)で処置した。処置の3日後にhCD73 mRNA発現を分析した。図4Bは、hmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドによってhmCD73 mRNA発現が濃度依存的に低減したことを示す。GraphPad PrismによりIC50値を算出し、Table 8 (表8)に示す。
【００５５】
【表８】
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【００５６】
(実施例5)
ヒト及びマウスがん細胞株におけるhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドの第3のスクリーニングラウンド
第3のスクリーニングラウンドでは、新たなアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さ、mRNA上の正確な位置及び化学修飾パターンを修飾した第1のスクリーニングラウンド由来の効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドをベースとした。ヒトEFO-21 (卵巣嚢胞腺癌) (図5A)、ヒトSKOV-3 (卵巣腺癌) (図5B)及びマウス4T1 (乳がん) (図5C)細胞を10μMの各アンチセンスオリゴヌクレオチドで、いかなるトランスフェクション試薬も加えずに3日間処置した。対照として、いかなるヒト又はマウスmRNAとも配列相補性を有しないオリゴヌクレオチドであるS6で細胞を処置した。ビヒクル対照として、細胞を培地で処置した。第1のスクリーニングラウンドにおいて強力な活性を示したアンチセンスオリゴヌクレオチドA05008HM、A05018HM及びA05028HMを参照として使用した。無処置細胞(1として設定)と比較した、HPRT1に対して正規化したhmCD73の平均のmRNA発現 (図5A〜図5C)をEFO-21細胞(Table 9 (表9))、SKOV-3細胞(Table 10 (表10))及び4T1細胞(Table 11 (表11))について列挙した。際立ったことには、CD73 mRNAレベルは、EFO-21細胞において試験した13ASOのうち11ASOで≧80% (図5A参照)、SKOV-3細胞において試験した13ASOのうち7ASOで≧80% (図5B参照)、及び4T1細胞において試験した13ASOのうち9ASOで≧80%低減した(図5C参照)。対照オリゴヌクレオチドS6による処置では、3つの細胞株においてCD73 mRNAは強力には低減しなかった。
【００５７】
【表９】
2019531095.tif 000015
【００５８】
【表１０】
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【００５９】
【表１１】
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【００６０】
(実施例6)
第3のスクリーニングラウンドでのEFO-21細胞における選択したhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50決定(mRNAレベル)
hmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドA05038HM (配列番号42)、A05041HM (配列番号45)、A05042HM (配列番号45)及びA05044HM (配列番号46)は、3つの細胞株EFO-21、SKOV-3及び4T1において強力な単回投与の活性を示した。作用の濃度依存性を検討するため、及びIC50値を決定するために、10μM、3.3μM、1.1μM、370nM、120nM、41nM、14nM又は4.5nMの各アンチセンスオリゴヌクレオチドでEFO-21細胞を処置した。第1のスクリーニングラウンドにおける強力な活性を示したアンチセンスオリゴヌクレオチドA05018HMを参照として使用した。処置3日後にhCD73 mRNA発現を分析した。図6は、hmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドによってhCD73発現が濃度依存的に低減したことを示す。GraphPad Prismにより算出したIC50値をTable 12 (表12)に示す。
【００６１】
【表１２】
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【００６２】
(実施例7)
A05008HM (配列番号4)、A05018HM (配列番号3)及びA05028HM (配列番号5)によるCD73タンパク質発現及び細胞生存率に対する濃度依存性作用
高度に強力なhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドA05008HM (配列番号4)、A05018HM (配列番号3)及びA05028HM (配列番号5)は、種々の濃度における、hCD73タンパク質発現に対するこれらのノックダウン効力及び細胞生存率に対するこれらの影響によって詳細に特徴付けられた。したがって、SKOV-3細胞を種々の濃度の各アンチセンスオリゴヌクレオチドで3日間処置した。次いで、細胞を更に3日間、指示濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する新鮮なDMEM培地中で培養した。生存率を検討するためにCD73抗体(クローンAD2)及び7-AADを使用して、フローサイトメトリーによりタンパク質発現を分析した。図7Aに示すように、3つすべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、すべての指示濃度でhCD73タンパク質の強力な阻害を示すが、neg1による処置では、阻害作用を有しなかった。しかし、細胞生存率は、A05028HMにより部分的に影響された(図7B)。対照的に、A05008HM (配列番号4)及びA05018HM (配列番号3)は、いかなる試験条件においてもSKOV-3細胞の生存率に影響しなかった。Table 13 (表13)では、SKOV-3細胞における選択したヒトCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドA05008HM (配列番号4)、A05018HM (配列番号3)及びA05028HM (配列番号5)のタンパク質ノックダウン効率を要約する。
【００６３】
【表１３】
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【００６４】
(実施例8)
ヒトEFO-21及びSKOV-3細胞における細胞外ピロリン酸レベルに対するCD73タンパク質ノックダウンの作用
アデノシンは、hmCD73によるATP分解中に産生される主要な一免疫抑制分子である。アデノシンは、AMPからアデノシンへの分解中のピロリン酸の産生によって、比色分析リン酸アッセイキット(ab65622、abcam社)で間接的に検出することができる。したがって、ヒトSKOV-3及びEFO21細胞を5μMのアンチセンスオリゴヌクレオチドA05018HMで6日間(3+3)処置した。3日後、DMEM培地を5μMのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する新鮮なDMEM培地と交換した。6日後に両試験細胞株におけるCD73のタンパク質ノックダウンをフローサイトメトリーにより確認した(図8)。対照として、細胞をneg1で処置した(図8)。指示時点で500μMのAMPを細胞に添加後、細胞上清におけるEFO-21細胞(図9A)及びSKOV-3細胞(図9C)による遊離リン酸の産生を分析した。アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置では、cell titer blueアッセイで検討したようにEFO-21細胞(図9B)及びSKOV-3細胞(図9D)の細胞生存率に影響しなかった。際立ったことには、効力は、A05018HMによる処置の後、EFO-21及びSKOV-3細胞について明白に低減し(図9A、図9C)、結果として、陰性対照neg1で処置した細胞と比較して、及び無処置細胞と比較してリン酸濃度が約1,5倍低下した(図9A、図9C、Table 14 (表14))。したがって、抗CD73特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド処置により、がん細胞のアデノシン産生を効果的に遮断することができる。Table 14 (表14)では、A05018HMで処置したSKOV-3及びEFO21細胞の細胞上清由来のリン酸濃度、並びに対応する対照反応由来の濃度を示す。
【００６５】
【表１４】
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【００６６】
(実施例9)
ヒト卵巣がん細胞株による細胞外AMPの分解に対するhmCD73特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの作用及びアデノシンへの変換の検討
A05018HMは、ヒトがん細胞においてhCD73 mRNA及びタンパク質発現を抑制する有意な活性を示した。次の実験では、細胞外AMPを免疫抑制アデノシンに分解する能力に対するhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチド処置の作用をEFO-21細胞において検討した。
【００６７】
AMPレベル並びにアデノシンレベルは、質量分析により決定することができる。ヒトEFO-21細胞の細胞外AMPをアデノシンに変換する能力に対するhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチド処置の作用を分析するために、5μMのアンチセンスオリゴヌクレオチドA05018HM又は対照オリゴヌクレオチドS6で6日の全処置時間の間、細胞を処置した。ビヒクル対照として、培地のみで細胞を処置した。
【００６８】
処置の6日後、CD73タンパク質発現をフローサイトメトリーにより分析し、S6で処置した細胞(白色棒グラフ)と比較してA05018HMで処置した細胞(黒色棒グラフ)においてCD73タンパク質発現を有意に抑制した(図10A)。細胞外AMPを分解する能力を検討するために、処置の6日後、300μMのAMPを補充したPBSと細胞培養培地を交換し、6.5時間インキュベートした。細胞の非存在下でAMPの分解を検討するために、300μMのAMPを無細胞PBSに加え、6.5時間インキュベートした(ドットの棒グラフ)。
【００６９】
その後、AMPレベル及びアデノシンレベルを細胞上清(細胞調整PBS)及び無細胞PBSにおいて質量分析により決定した。無処置細胞の細胞上清におけるAMPレベル(ドットの棒グラフ)は、無細胞PBSにおけるAMPレベル(縞の棒グラフ)と比較して強力に低減した(図10B)が、アデノシンレベルは、上昇した(図10C)。これは、AMPをアデノシンに変換する細胞関連の能力が強力であることを示す。際立ったことには、S6処置細胞(白色棒グラフ)又はビヒクル処置細胞(ドットの棒グラフ)の上清と比較した場合、A05018HM処置EFO-21細胞の上清において(黒色棒グラフ)、AMPレベルは有意に増大し、アデノシンレベルは有意に減少した(図10B及び図10C、Table 15 (表15)及びTable 16 (表16))。したがって、このようなデータは、ヒトEFO-21細胞をA05018HMで処置すると、細胞外AMPを免疫抑制アデノシンに変換する細胞の能力を有意に阻害することを明白に示す。
【００７０】
【表１５】
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【００７１】
【表１６】
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【００７２】
(実施例10)
細胞外AMPの存在下又は非存在下のT細胞増殖に対するhmCD73特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の検討
本発明のこれまでの結果(実施例9を参照)は、ヒトがん細胞株をA05018HMで処置すると、細胞外AMPをアデノシンに変換するこれらの能力を有意に阻害することを明らかにした。CD39-CD73軸はT細胞機能において重要な役割を果たすため、細胞外AMPの存在下又は非存在下のヒトCD4+ T細胞の増殖に対するA05018HMの作用を検討した。したがって、ヒトCD4+ T細胞を細胞増殖色素で標識し、抗CD3で活性化し、5μMのアンチセンスオリゴヌクレオチドA05018HM (黒色棒グラフ)又は対照オリゴヌクレオチドS6(白色棒グラフ)で6日の全処置時間の間、処置した。ビヒクル対照では(縞の棒グラフ)、細胞を抗CD3のみで活性化した。続いて、オリゴヌクレオチド処置の開始後3日目及び4日目に300μMのAMP又はビヒクルを細胞に加えた。オリゴヌクレオチド処置の開始後5日目に、CD4+ T細胞のCD73タンパク質発現、増殖、及び絶対細胞数を、フローサイトメトリーを使用して分析した。
【００７３】
CD4+ T細胞をA05018HMで処置すると、CD73タンパク質発現を強力に抑制した(図11A)。細胞外AMPの非存在下では、A05018HM処置細胞、S6処置細胞及びビヒクル処置CD4+ T細胞の間で増殖(図11B上パネル)、又は絶対細胞数(図11C)に差は認められなかった。際立ったことには、300μMのAMPを補充すると、S6又はビヒクルで処置したCD4+ T細胞の増殖が損なわれ(図11B下パネル)、絶対数が有意に低減した(図11C)。対照的に、A05018HM処置CD4+ T細胞の増殖(図11B下パネル)は、AMPによる細胞培養培地の補充により損なわれなかった。したがって、絶対T細胞数(図11C)は、A05018HM処置細胞においてAMP補充によりほとんど低減しなかった。
【００７４】
要約すると、このような結果は、AMPによる細胞培養培地の補充は、CD4+ T細胞を発現するCD73の増殖及び絶対細胞数を有意に害することを明らかにした。際立ったことには、A05018HM処置によるCD73タンパク質ノックダウンによって、T細胞増殖に対する補充AMPの阻害作用が、免疫抑制アデノシン形成を阻害したことによりほぼ確実に復帰した。
【００７５】
(実施例11)
マウス肝臓におけるヒト/マウス交差反応性CD73アンチセンスオリゴヌクレオチド(A05027HM)によるin vivo mCD73 mRNAノックダウン
強力なhmCD73アンチセンスオリゴヌクレオチドA05027HMを選択し、非製剤化オリゴヌクレオチドの全身投与後のBalb/cマウスの肝臓においてmCD73 mRNA発現に対するその作用を検討した。したがって1、2、3、4、5、8、10及び12日目に20mg/kgの用量のA05027HMの皮下注射によりBalb/cマウスを処置した(5匹のマウス/群)。対照として、Balb/cマウスをビヒクル (生理食塩水、6匹のマウス/群)で処置した。最後のアンチセンスオリゴヌクレオチド処置から3日後(15日目)にマウスを屠殺し、mCD73 mRNAレベルを分析するために肝臓を試料採取した。図12に示す結果は、A05027HM処置マウス又はビヒクル処置マウスの肝臓におけるmCD73 mRNAレベルを示す(白色棒グラフ)。際立ったことには、マウスをA05027HMで処置すると、ビヒクル対照と比較した場合、mCD73 mRNAレベルは有意に低減した(p = 0.0043)。
【図１】
2019531095.tif 000023
【図２Ａ】
2019531095.tif 000024
【図２Ｂ−１】
2019531095.tif 000025
【図２Ｂ−２】
2019531095.tif 000026
【図２Ｃ−１】
2019531095.tif 000027
【図２Ｃ−２】
2019531095.tif 000028
【図２Ｄ−１】
2019531095.tif 000029
【図２Ｄ−２】
2019531095.tif 000030
【図２Ｅ】
2019531095.tif 000031
【図３Ａ】
2019531095.tif 000032
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2019531095.tif 000034
【図４Ｂ】
2019531095.tif 000035
【図５Ａ】
2019531095.tif 000036
【図５Ｂ】
2019531095.tif 000037
【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
2019531095.tif 000040
【図８】
2019531095.tif 000041
【図９】
2019531095.tif 000042
【図１０】
2019531095.tif 000043
【図１１Ａ】
2019531095.tif 000044
【図１１Ｂ】
2019531095.tif 000045
【図１１Ｃ】
2019531095.tif 000046
【図１２】
2019531095.tif 000047
【図１３】
2019531095.tif 000048
【配列表】
2019531095000001.app
【国際調査報告】
2019531095.tif 000049
2019531095.tif 000050
2019531095.tif 000051
2019531095.tif 000052
2019531095.tif 000053