(57)【要約】本発明は、ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子を有効成分として含む幹細胞活性促進用組成物に関するものであって、幹細胞に低濃度のヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子を処理した場合、幹細胞の活性が卓越して向上した。特に、プライミングされたＭＳＣｓは、細胞培養条件において、細胞移動、コロニー形成活性及び抗炎症能を促進させるが、これは、高血圧、炎症疾患または免疫疾患の治療効果を向上させので、有用な治療戦略になりうると予想される。
2019532081.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子を有効成分として含む幹細胞活性促進用組成物。
【請求項２】
前記ヒストン脱アセチル化阻害剤は、バルプロ酸（ＶＰＡ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、ニコチンアミド（ＮＡＤ）、及びサーチノールからなる群から選択された何れか１つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の幹細胞活性促進用組成物。
【請求項３】
前記プライミング因子は、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）、セラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）、カテリシジン（ＬＬ−３７）、及びピオグリタゾンからなる群から選択された何れか１つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の幹細胞活性促進用組成物。
【請求項４】
前記ＶＰＡは、０．１〜１．０ｍＭの濃度で含まれることを特徴とする請求項２に記載の幹細胞活性促進用組成物。
【請求項５】
前記Ｓ１Ｐは、１０〜５０ｎＭの濃度で含まれることを特徴とする請求項３に記載の幹細胞活性促進用組成物。
【請求項６】
前記幹細胞は、神経幹細胞、肝幹細胞、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、表皮幹細胞、胃腸管幹細胞、内皮幹細胞、筋肉幹細胞、間葉幹細胞及び膵腸幹細胞からなる群から選択されることを特徴とする請求項１から請求項５のうち何れか一項に記載の幹細胞活性促進用組成物。
【請求項７】
前記幹細胞活性は、細胞移動性、コロニー形成能及び抗炎症活性であることを特徴とする請求項１から請求項５のうち何れか一項に記載の幹細胞活性促進用組成物。
【請求項８】
分離された幹細胞にヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子を処理する段階を含む幹細胞活性促進方法。
【請求項９】
前記ヒストン脱アセチル化阻害剤は、バルプロ酸（ＶＰＡ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、ニコチンアミド（ＮＡＤ）、及びサーチノールからなる群から選択された何れか１つ以上であることを特徴とする請求項８に記載の幹細胞活性促進方法。
【請求項１０】
前記プライミング因子は、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）、セラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）、カテリシジン（ＬＬ−３７）、及びピオグリタゾンからなる群から選択された何れか１つ以上であることを特徴とする請求項８に記載の幹細胞活性促進方法。
【請求項１１】
前記ＶＰＡは、０．１〜１．０ｍＭの濃度で処理されることを特徴とする請求項９に記載の幹細胞活性促進方法。
【請求項１２】
前記Ｓ１Ｐは、１０〜５０ｎＭの濃度で処理されることを特徴とする請求項１０に記載の幹細胞活性促進方法。
【請求項１３】
ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子で処理された幹細胞またはその培養液を有効成分として含む高血圧の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１４】
前記ヒストン脱アセチル化阻害剤は、バルプロ酸（ＶＰＡ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、ニコチンアミド（ＮＡＤ）、及びサーチノールからなる群から選択された何れか１つ以上であることを特徴とする請求項１３に記載の高血圧の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１５】
前記プライミング因子は、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）、セラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）、カテリシジン（ＬＬ−３７）、及びピオグリタゾンからなる群から選択された何れか１つ以上であることを特徴とする請求項１３に記載の高血圧の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１６】
前記高血圧は、特発性肺動脈性高血圧；家族性肺動脈性高血圧；コラーゲン血管疾患、先天性体肺短絡、門脈高血圧、ＨＩＶ感染、薬物または毒素と関連した肺動脈性高血圧；甲状腺障害、グリコーゲン貯蔵疾患、ゴーシェ疾患、遺伝性出血性毛細血管拡張、血色素病症、骨髓増殖障害または脾臟切除術と関連した肺動脈性高血圧；肺毛細管血管腫症と関連した肺動脈性高血圧；新生児の持続性肺高血圧；慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、低酸素症誘導肺胞低換気障害、低酸素症誘導睡眠障害呼吸または高い高度での慢性露出と関連した肺高血圧；発達異常と関連した肺高血圧；及び遠位肺動脈の血栓塞栓性閉鎖による肺高血圧からなる群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の高血圧の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１７】
ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子で処理された幹細胞またはその培養液を有効成分として含む炎症疾患または免疫疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１８】
前記ヒストン脱アセチル化阻害剤は、バルプロ酸（ＶＰＡ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、ニコチンアミド（ＮＡＤ）、及びサーチノールからなる群から選択された何れか１つ以上であることを特徴とする請求項１７に記載の炎症疾患または免疫疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１９】
前記プライミング因子は、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）、セラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）、カテリシジン（ＬＬ−３７）、及びピオグリタゾンからなる群から選択された何れか１つ以上であることを特徴とする請求項１７に記載の炎症疾患または免疫疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２０】
前記炎症疾患または免疫疾患は、骨関節炎、リウマチ性関節炎、膀胱炎、間質性膀胱炎、喘息、皮膚炎、アトピー、乾癬、嚢胞性線維症、固形臓器移植後期及び慢性拒否症、移植片対宿主疾患、移植拒否疾患、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、橋本甲状腺、多発性筋炎、強皮症、アジソン病、白斑症、悪性貧血、糸球体腎炎及び肺線維症、炎症性腸疾患、クローン病、自己免疫性糖尿病、糖尿病網膜症、鼻炎、虚血再灌流損傷、血管形成術後の再狭窄、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、グレーブス病、胃腸管アレルギー、結膜炎、アテローム硬化症、冠状動脈疾患、狭心症、癌転移、小動脈疾患及びミトコンドリア疾患からなる群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の炎症疾患または免疫疾患の予防または治療用薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）因子を有効成分として含む幹細胞活性促進用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣｓ）は、骨髓（ｂｏｎｅ−ｍａｒｒｏｗ；ＢＭ）、脂肪、歯髄（ｄｅｎｔａｌ  ｐｕｌｐ）、臍帯（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ−ｃｏｒｄ；ＵＣ）及び臍帯血（ＵＣ−ｂｌｏｏｄ；ＵＣＢ）から分離された多能性前駆細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）である。ＭＳＣの投与は、損傷された器官の臓器組織を修復して治療効果を提供する。ＭＳＣの効能は、サイトカインによって調節される細胞保護効果（ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ）と前血管形成（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）及び前動脈形成（ｐｒｏ−ａｒｔｅｒｉｏｇｅｎｉｃ）の効果のような傍分泌因子（ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｆａｃｔｏｒ）に起因する。しかし、現在ＭＳＣ治療は、治療有効性、特に、生体内生着（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）及び移植された細胞の生存率が低くて限界がある。ほとんど（≧９９％）は、ＭＳＣｓを肺付近に静脈注射するが、これらのうち、単に２〜３％のみが循環系に放出される。したがって、組織修復過程において、ＭＳＣｓの移動及び生着に対する正確な機作を理解する必要がある。
【０００３】
幾つかのケモカイン、例えば、間質細胞由来因子−１（ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１；ＳＤＦ−１）及び成長因子、例えば、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ−ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ−ｆａｃｔｏｒ；ＰＤＧＦ）または肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ−ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）は、成体ＭＳＣｓの移動及び生着に重要な役割を果たす。これらのうち、ＳＤＦ−１及びその受容体であるＣＸＣＲ４軸（ａｘｉｓ）は、幹細胞のホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）／生着に重要な因子である。実に、骨髓において、ＳＤＦ−１勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）によって造血幹細胞／前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ；ＨＳＰＣｓ）の生着は、移植のための前処置（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）（例えば、全身放射線照射及び骨髓切除式抗癌治療）後に骨髓で上向き調節される。ＳＤＦ−１勾配に対するＨＳＰＣｓの敏感性／反応性は、損傷された組織に豊かな分子集合によって肯定的な影響を及ぼす（「ｐｒｉｍｅｄ」）。これには、生体活性脂質［例えば、スフィンゴシン−１−リン酸（ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｓ１Ｐ）及びセラミド−１−リン酸（ｃｅｒａｍｉｄｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｃ１Ｐ）］、好中球由来の陽イオン性ペプチドカテリシジン（ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）（ＬＬ−３７）、β２−ディフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎ）及び水溶性膜攻撃複合体（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｔｔａｃｋ  ｃｏｍｐｌｅｘ；ｓＭＡＣ）（Ｃ５ｂ−９）を含む。
【０００４】
最近、本発明者らは、ＨＳＰＣｓ過程で観察されるプライミング現象が、Ｓ１Ｐ及びＣＰ１生体活性脂質及び陽イオン性ペプチドであるＬＬ−３７でプライミングされたＭＳＣｓでも類似して起こるということを確認した。特に、プライミングされたＭＳＣｓは、細胞培養条件において、細胞移動、コロニー形成活性及び抗炎症能を促進させるが、これは、肺動脈性高血圧（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ；ＰＡＨ）の治療効果を向上させる。しかし、プライミングされたＭＳＣｓは、依然として損傷された組織で制限された生体内生着を示す。その上に、ＭＳＣ投与前、集中的な洗浄過程にも拘らず、否定的な炎症反応を触発させる残余プライミング因子を完全に除去するのに失敗した。これにより、低濃度でのプライミング戦略開発が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子（ｐｒｉｍｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）を有効成分として含む幹細胞活性促進用組成物、それを通じる幹細胞活性促進方法を提供することである。
【０００６】
また、本発明の他の目的は、ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子で処理された幹細胞またはその培養液を有効成分として含む高血圧の予防または治療用薬学組成物を提供することである。
【０００７】
また、本発明のさらに他の目的は、ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子で処理された幹細胞またはその培養液を有効成分として含む炎症疾患または免疫疾患の予防または治療用薬学組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子を有効成分として含む幹細胞活性促進用組成物を提供する。
【０００９】
また、本発明は、分離された幹細胞にヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子を処理する段階を含む幹細胞活性促進方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子で処理された幹細胞またはその培養液を有効成分として含む高血圧の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００１１】
また、本発明は、ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子で処理された幹細胞またはその培養液を有効成分として含む炎症疾患または免疫疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００１２】
また、本発明は、幹細胞活性促進のためのヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子の用途を提供する。
【００１３】
また、高血圧の予防または治療のための薬物の製造において、ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子で処理された幹細胞またはその培養液の用途を提供する。
【００１４】
また、炎症疾患または免疫疾患の予防または治療のための薬物の製造において、ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子で処理された幹細胞またはその培養液の用途を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子を有効成分として含む幹細胞活性促進用組成物に関するものであって、幹細胞に低濃度のヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子を処理した場合、幹細胞の活性が卓越して向上した。特に、プライミングされたＭＳＣｓは、細胞培養条件において、細胞移動、コロニー形成活性及び抗炎症能を促進させるが、これは、高血圧、炎症疾患または免疫疾患の治療効果を向上させので、有用な治療戦略になりうると予想される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｓ１ＰでプライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓで５−アザシチジン（５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ；５−Ａｚａ）の否定的影響に対する結果を示す。（Ａ）１μＭ  ５−Ａｚａまたは０．５ｍＭ  ＶＰＡで２４時間処理したヒトＵＣ−ＭＳＣｓでのＣＸＣＲ４に対するＲＱ−ＰＣＲ分析結果である。表示された遺伝子の相対的発現レベルは、未処理のＭＳＣｓ（ＮＴ）の数値と比較して倍率変化として示し、ｍｅａｎｓ±ＳＥＭ（ｎ＝４）、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｔｅｓｔで示した。（Ｂ）１μＭ  ５−Ａｚａ及び５０ｎＭ  Ｓ１Ｐで２４時間プライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓで、表示されたＭＳＣ表面（ＣＤ２９、ＣＤ７３及びＣＤ９０）及び造血系統（ＣＤ１４、ＣＤ３４、及びＣＤ４５）タンパク質の発現を柔細胞分析した結果である。（Ｃ）５−Ａｚａ＋Ｓ１ＰでプライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓを使用して軟骨細胞、骨細胞または脂肪細胞の分化分析した代表的なイメージを示す。軟骨細胞生成、骨細胞生成及び脂肪細胞生成は、アルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ）、アリザリンレッドＳ（Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ  Ｓ）及びオイルレッドＯ（Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ）染色を通じてそれぞれ測定した。５−Ａｚａ＋Ｓ１Ｐで２４時間プライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓの（Ｄ）細胞増殖（ｎ＝３）、（Ｅ）ＳＤＦ−１に対する化学走性（ｎ＝６）及び（Ｆ）ＣＦＵ−Ｆ分析（ｎ≧６）の結果を示す。あらゆる結果は、ｍｅａｎｓ±ＳＥＭで示した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ｎｏｎ−ｐｒｉｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ（ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔｅｓｔ）。移動した細胞（Ｅ）または染色されたコロニー（Ｆ）に対する代表的なイメージは、右側パネルに示した。
【図２】Ｓ１ＰでプライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓでＶＰＡの効果に対する結果を示す。（Ａ及びＢ）０．５ｍＭ  ＶＰＡ単独（ＶＰＡ）または５０ｎＭ  Ｓ１Ｐとの組合わせ（ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐ）で２４時間プライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓの表面抗原（Ａ）に対する柔細胞分析結果と多能性（Ｂ）分析結果とを示す。
【図３】ＶＰＡ＋Ｓ１ＰでプライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓでＳＤＦ−１に対する向上した反応性に対する結果を示す。（Ａ及びＢ）０．５ｍＭ  ＶＰＡ単独（ＶＰＡ）、５０ｎＭ  Ｓ１Ｐ単独（Ｓ１Ｐ）または５０ｎＭ  Ｓ１Ｐとの組合わせ（ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐ）に２４時間露出されたＭＳＣｓの１５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１に対する化学走性の分析結果を示す。（Ａ）移動分析でトランズウェルインサート（ｉｎｓｅｔｓ）の代表的なイメージを示す。（Ｂ）移動に対する相対的な量は、移動した細胞数に対する倍率変化として定量し、ｍｅａｎｓ±ＳＥＭ（ｎ＝６）で示した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ｎｏｎｐｒｉｍｅ  ｃｅｌｌｓ（ＮＴ）（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）。（Ｃ）リン酸化された−（ｐ−）または全体ＡＫＴ及びＭＡＰＫｐ４２／４４のウェスタンブロットの分析結果を示す。ＶＰＡ＋Ｓ１ＰでプライミングされたＭＳＣｓは、血清欠乏状態で１２時間処理した後、１５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１に表示された時間の間に処理された。
【図４】Ｓ１ＰでプライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓでＶＰＡの効果に対する結果を示す。（Ａ及びＢ）ＶＰＡ、Ｓ１Ｐ単独またはＶＰＡ＋Ｓ１Ｐで２４時間プライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓの細胞増殖分析（Ａ、ｎ＝３）及びＣＦＵ−Ｆ分析（Ｂ、ｎ＝６）結果を示す。ＣＦＵ−Ｆ分析のために、６０個の細胞を６ウェル培養プレートに接種し、１４日間培養し、コロニー数を定量した。付着細胞の代表的な染色されたコロニーは、右側パネルに示した。（Ｃ）表示された細胞から収獲された条件培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ；ＣＭ）の存否によって、ＬＰＳで５時間刺激されたラット肺胞大食細胞株から分泌されたＴＮＦ−αタンパク質（ｎ＝４）の定量結果を示す。あらゆる結果は、ｍｅａｎｓ±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ｎｏｎｐｒｉｍｅ  ｃｅｌｌｓ（ＮＴ）、＃ｐ＜０．０５、＃＃＃ｐ＜０．００１  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐ  ｐｒｉｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｔｅｓｔで示した。
【図５】ＭＳＣｓの治療効果と関連しているＶＰＡ＋Ｓ１Ｐ上向き調節された遺伝子を示す。（Ａ−Ｄ）０．５ｍＭ  ＶＰＡ単独（ＶＰＡ）、５０ｎＭ  Ｓ１Ｐ単独（Ｓ１Ｐ）または５０ｎＭ  Ｓ１Ｐとの組合わせ（ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐ）で２４時間プライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓでのＭＭＰ１２（Ａ）、成長因子（Ｂ）、血管新生（Ｃ）及び抗炎症（Ｄ）関連遺伝子の発現レベルを示す。発現レベルは、プライミングされていないＵＣ−ＭＳＣｓ（ＮＴ）に対するプライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓの数値比率として計算された。結果は、ｍｅａｎｓ±ＳＥＭ（ｎ≧４）；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ＮＴ  ｇｒｏｕｐ、＃ｐ＜０．０５、＃＃＃ｐ＜０．００１  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐ（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）で示した。
【図６】多様なＶＰＡ及びＳ１Ｐ濃度によるＳＤＦ−１ａに対する走化性（Ｃｈｅｍｏ
【図７】ＨＣｌ−ＩＣラットモデルで膀胱機能回復と関連して、ＶＰＡ＋Ｓ１ＰプライミングされたＵＣ−ＭＳＣの治療可能性の向上を示す結果である。（ａ）無麻酔下の膀胱内圧測定術（ａｗａｋｅ  ｃｙｓｔｏｍｅｔｒｙ）の結果を示す。（ｂ）対照群（ｎａｉｖｅ）またはＶＰＡ＋Ｓ１ＰプライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓ（各グループ当たり独立した５匹動物）を２．５×１０５（２５０Ｋ）細胞数（Ｋ＝１，０００）で注入し、１週間後の膀胱排尿パラメータの定量的結果を示す。ＩＶＰ；膀胱内圧（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、ＩＡＰ；腹腔内圧（ｉｎｔｒａ−ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）。Ｓｈａｍ：偽手術群（ｓｈａｍ−ｏｐｅｒａｔｅｄ）。あらゆる結果は、ｍｅａｎｓ±ＳＥＭ；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＨＣｌ−ＩＣ  ｇｒｏｕｐ；＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．００１、＃＃＃ｐ＜０．００１  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｎａｉｖｅ  ＵＣ−ＭＳＣ  ｇｒｏｕｐ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔで示した。
【図８】ＨＣｌ誘導された膀胱損傷において、ＵＣ−ＭＳＣ投与効果に対する組織学的分析の結果を示す。（ａ）ＰＢＳまたは２５０Ｋ細胞数を投与し、１週間後、ＵＣ−ＭＳＣｓ  ＨＣｌ−ＩＣラットの膀胱組織での（ｉ）サイトケラチン（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）免疫染色（倍率×４０、ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝１００μｍ）、（ｉｉ）トルイジンブルー（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  ｂｌｕｅ）（倍率×２００、ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝１００μｍ）、（ｉｉｉ）マッソントリクローム染色（Ｍａｓｓｏｎ´ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）（倍率×２００、ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝１００μｍ）及び（ｉｖ）ＴＵＮＥＬ分析（倍率×４００、ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝１００μｍ）の結果を示す。矢印は、浸潤された肥満細胞を示す。Ｓｈａｍ：偽手術群。核は、Ｍａｙｅｒ´ｓ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（ｉ、ｉｉ及びｉｉｉ）またはＤＡＰＩ（ｂｌｕｅ、ｉｖ）で染色した。（ｂ）組織学的実験を定量化した結果である。データは、ｓｈａｍ  ｇｒｏｕｐ（ｎ＝１５）から標準化した。結果は、ｍｅａｎ±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＨＣｌ−ＩＣ  ｇｒｏｕｐ；＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．００１、＃＃＃ｐ＜０．００１  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｎａｉｖｅ  ＵＣ−ＭＳＣ  ｇｒｏｕｐ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔで示した。
【図９】ＭＣＴ誘導されたＰＡＨラットモデルで、ＵＣＢ−ＭＳＣｓ及びＶＰＡ＋Ｓ１ＰプライミングされたＭＳＣｓ（ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐ−ＭＳＣ）の効果を示す。（ａ）ＭＣＴは、ＲＶＳＰレベルの増加を誘導し、ＭＣＴ注入し、２週後にＶＰＡ＋Ｓ１ＰプライミングされたＵＣ−ＭＳＣを投与した結果、このような上昇を非常に減少させた（左側パネル）。ＭＣＴは、ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）の重量比率を増加させ、ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐ−ＵＣ−ＭＳＣは、前記効果を非常に減少させた（右側パネル）。（ｂ）ＭＣＴは、肺組織炎症及び中膜（ｍｅｄｉａｌ  ｗａｌｌ）厚さ指数（血管直径当たり血管壁の厚さ）を増加させ、ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐ−ＭＳＣは、前記増加を非常に減少させた（上部パネル）。プライミングしていないＵＣＢ−ＭＳＣは、ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）及び中膜厚さ指数の改善効果をほとんど示さなかった。肺動脈でα−ＳＭＡ＋平滑筋細胞の免疫蛍光染色の結果を示す（下部パネル）（倍率４００×）。ＲＶＳＰ、収縮期右心室圧（ｒｉｇｈｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）；ＣＴＬ、対照群；ＭＳＣ、ヒト臍帯間葉幹細胞（ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）；Ｓ１Ｐ−ＭＳＣ、スフィンゴシン−１−リン酸プライミングされたヒト臍帯間葉幹細胞；ＲＶ、右心室（ｒｉｇｈｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）；ＬＶ＋Ｓ、左心室及び心室中隔（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｓｅｐｔｕｍ）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ＭＣＴ  ａｌｏｎｅ（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
幹細胞プライミングの主要標的であるＣＸＣＲ４の発現は、ＤＮＡ脱メチル化剤である５−アザシチジン（５−Ａｚａ）及びヒストン脱アセチル化阻害剤であるバルプロ酸（ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ；ＶＰＡ）によって上向き調節される。これにより、本発明者らは、ＭＳＣプライミングを向上させて、治療効果を促進させるための戦略において、前記後成遺伝的（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ）調節子の役割を確認し、本発明を完成した。
【００１８】
本発明は、ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子を有効成分として含む幹細胞活性促進用組成物を提供する。
【００１９】
望ましくは、前記ヒストン脱アセチル化阻害剤は、バルプロ酸（ＶＰＡ）、酪酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒａｔｅ；ＮａＢ）、ニコチンアミド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ；ＮＡＤ）またはサーチノール（ｓｉｒｔｉｎｏｌ）であり得るが、これらに制限されるものではない。
【００２０】
望ましくは、前記プライミング因子は、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）、セラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）、カテリシジン（ＬＬ−３７）またはピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）であり得るが、これらに制限されるものではない。
【００２１】
望ましくは、前記ＶＰＡは、０．１〜１．０ｍＭの濃度で含まれ、前記Ｓ１Ｐは、１０〜５０ｎＭの濃度で含まれうるが、これらに制限されるものではない。
【００２２】
本明細書で使われる用語「プライミング」は、幹細胞の治療効能を増進させるために、反応性（活性）が向上する現象を意味し、本発明では、前記プライミングを誘導するヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子を用いて当該幹細胞の活性を促進させる。
【００２３】
本発明において、「幹細胞活性」は、幹細胞の細胞移動性、細胞増殖能、多能性（軟骨細胞、骨細胞または脂肪細胞系統への生体外分化）、コロニー形成能または抗炎症活性などを意味する。
【００２４】
本発明において、活性促進またはプライミング誘導は、幹細胞にヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子を直接処理した場合、幹細胞のプライミングが誘導されるものだけではなく、前記プライミング処理（前処理）によって幹細胞の活性が向上した幹細胞を用いて他の分化が誘導されるものも含む。
【００２５】
また、前記活性促進用組成物は、治療のための細胞治療剤と混合して生体内注入することにより、細胞治療剤の生体内効果を増進させるだけではなく、幹細胞自体に本組成物を処理した後、機能が増加した細胞治療剤を生体内移植する方法でも使われる。
【００２６】
例えば、本発明のプライミングは、幹細胞の細胞移動性、コロニー形成能及び抗炎症活性を含めた幹細胞性に関連した機能を向上させるものである。
【００２７】
本明細書で使われる用語「幹細胞」は、自己複製能を有しながら、２つ以上の細胞に分化する能力を有する細胞を言い、万能幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、多分化能幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）に分類することができる。
【００２８】
本発明の幹細胞は、目的によって適切に制限なしに選択され、ヒトを含んだ哺乳動物、望ましくは、ヒト由来の公知のあらゆる組織、細胞などの成体細胞から由来し、例えば、骨髓、臍帯血、胎盤（または、胎盤組織細胞）、脂肪（または、脂肪組織細胞）などから由
【００２９】
例えば、前記幹細胞は、骨髓、脂肪組織、筋肉組織、ｅｘ  ｖｉｖｏ培養された自己組織肝葉幹細胞、同種異系肝葉幹細胞、臍帯血、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児及び思春期皮膚、そして、血液から制限なしに得られる幹細胞であり、胎児または出生直後または成人由来の幹細胞であり得る。
【００３０】
本発明の望ましい具現例において、前記幹細胞は、神経幹細胞、肝幹細胞、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、表皮幹細胞、胃腸管幹細胞、内皮幹細胞、筋肉幹細胞、間葉幹細胞及び膵腸幹細胞からなる群から選択され、より望ましくは、肝幹細胞、造血幹細胞、臍帯血幹細胞及び間葉幹細胞からなる群から選択されうるが、これらに制限されるものではない。
【００３１】
また、本発明は、分離された幹細胞にヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子を処理する段階を含む幹細胞活性促進方法を提供する。
【００３２】
望ましくは、前記ヒストン脱アセチル化阻害剤は、バルプロ酸（ＶＰＡ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、ニコチンアミド（ＮＡＤ）またはサーチノールであり得るが、これらに制限されるものではない。
【００３３】
望ましくは、前記プライミング因子は、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）、セラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）、カテリシジン（ＬＬ−３７）またはピオグリタゾンであり得るが、これらに制限されるものではない。
【００３４】
望ましくは、前記ＶＰＡは、０．１〜１．０ｍＭの濃度で含まれ、前記Ｓ１Ｐは、１０〜５０ｎＭの濃度で含まれうるが、これらに制限されるものではない。
【００３５】
また、本発明は、ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子で処理された幹細胞またはその培養液を有効成分として含む高血圧の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００３６】
一方、プライミングを通じて幹細胞が活性化されれば、高血圧を含めた心血関疾患に効果を示すが、プライミングされた幹細胞の心血関疾患関連の作用機作に対しては、さまざまな報告がある（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１５）６：２１８；Ｓｔｒｏｋｅ．２０１１；４２：２９３２−２９３９；Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ  １７，Ｎｏ  ５，２０１３  ｐｐ．６１７−６２５；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２０１５  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ６８５３８３）。
【００３７】
また、本発明は、ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子で処理された幹細胞またはその培養液を有効成分として含む炎症疾患または免疫疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００３８】
一方、プライミングを通じて幹細胞が活性化されれば、免疫調節及び炎症反応に関与して多様な炎症疾患及び免疫疾患に応用され、プライミングされた幹細胞の免疫調節及び炎症反応関連作用機作に対しては、さまざまな報告がある（Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ．２０１６  Ａｐｒ  ６，１−１２；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ  ａｎｄ  Ｒｅｐ（２０１４）１０：３５１−３７５；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２０１６  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ９３６４２１３）。
【００３９】
望ましくは、前記ヒストン脱アセチル化阻害剤は、バルプロ酸（ＶＰＡ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、ニコチンアミド（ＮＡＤ）またはサーチノールであり得るが、これらに制限されるものではない。
【００４０】
望ましくは、前記プライミング因子は、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）、セラミド−１−リン酸（Ｃ１Ｐ）、カテリシジン（ＬＬ−３７）またはピオグリタゾンであり得るが、これらに制限されるものではない。
【００４１】
本発明において「培養液」は、生体外で幹細胞成長及び生存を支持可能にする培地、前記培地に含まれた培養された幹細胞の分泌物などを含む。培養に使われる培地は、幹細胞の培養に適切な当分野で使われる通常の培地をいずれも含む。細胞の種類によって培地と培養条件とを選択することができる。培養に使われる培地は、望ましくは、細胞培養最小培地（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ：ＣＣＭＭ）であって、一般的に炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。このような細胞培養最小培地には、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ´ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、αＭＥＭ（α  Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ´ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｉｓｃｏｖｅ´ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ  Ｍｅｄｉｕｍなどがあるが、これらに制限されるものではない。
【００４２】
また、前記培地は、ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）などの抗生剤を含みうる。
【００４３】
一方、本発明は、前記幹細胞、その分泌物、培地成分をいずれも含む形態、分泌物及び培地成分のみを含む形態、分泌物のみを分離して単独で、または幹細胞と共に使用する形態、または幹細胞のみを投与して体内で分泌物を生成する形態で使用することもいずれも可能である。
【００４４】
前記幹細胞は、通常の当業者に公知の所定の方法を用いて獲得することができる。
【００４５】
本発明のヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子で処理された幹細胞は、特定疾患の治療のための細胞治療剤として用いられ、前記処理は、前記分子の直接的な処理または前処理であり得る。
【００４６】
前記「細胞治療剤」とは、細胞と組織の機能を復元するために、生きている自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）、異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）細胞を体外で増殖、選別するか、その他の方法で細胞の生物学的特性を変化させるなど一連の行為を通じて治療、診断、予防目的として使われる医薬品を意味する。
【００４７】
前記細胞治療剤は、目的組織に到逹することができる限り、所定の一般的な経路を通じて人体に投与される。
【００４８】
本発明の望ましい具現例において、前記高血圧は、特発性肺動脈性高血圧；家族性肺動脈性高血圧；コラーゲン血管疾患、先天性体肺短絡、門脈高血圧、ＨＩＶ感染、薬物または毒素と関連した肺動脈性高血圧；甲状腺障害、グリコーゲン貯蔵疾患、ゴーシェ（Ｇａｕｃｈｅｒ）疾患、遺伝性出血性毛細血管拡張、血色素病症、骨髓増殖障害または脾臟切除術と関連した肺動脈性高血圧；肺毛細管血管腫症と関連した肺動脈性高血圧；新生児の持続性肺高血圧；慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、低酸素症誘導肺胞低換気障害、低酸素症誘導睡眠障害呼吸または高い高度での慢性露出と関連した肺高血圧；発達異常と関連した肺高血圧；及び遠位肺動脈の血栓塞栓性閉鎖による肺高血圧からなる群から選択され、より望ましくは、特発性肺動脈性高血圧、家族性肺動脈性高血圧または慢性閉塞性肺疾患であり、最も望ましくは、特発性肺動脈性高血圧である。
【００４９】
本発明の望ましい具現例において、前記炎症疾患または免疫疾患は、骨関節炎、リウマチ性関節炎（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、膀胱炎、間質性膀胱炎、喘息（Ａｓｔｈｍａ）、皮膚炎（Ｄｅｒｍｉｔｉｔｉｓ）、アトピー、乾癬（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、嚢胞性線維症（Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、固形臓器移植後期及び慢性拒否症（Ｐｏｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｌａｔｅ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｓｏｌｉｄ  ｏｒｇａｎ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、移植片対宿主疾患（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）、移植拒否疾患、多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、全身性紅斑性狼瘡（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、橋本甲状腺（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、多発性筋炎（ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ）、強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、アジソン病（Ａｄｄｉｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、白斑症（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）、悪性貧血（ｐｅｒｎｉｃｉｏｕｓ  ａｎｅｍｉａ）、糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）及び肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｅｓｅｓｅ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、自己免疫性糖尿病（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ）、糖尿病網膜症（Ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、鼻炎（Ｒｈｉｎｉｔｉｓ）、虚血再灌流損傷（Ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ）、血管形成術後の再狭窄（Ｐｏｓｔ−ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、慢性閉塞性肺疾患（Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＣＯＰＤ）、グレーブス病（Ｇｒａｖｅｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、胃腸管アレルギー（Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｌｌｅｒｇｙ）、結膜炎（Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ）、アテローム硬化症（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、冠状動脈疾患（Ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、狭心症（Ａｎｇｉｎａ）、癌転移、小動脈疾患またはミトコンドリア疾患（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）であり得るが、これらに制限されるものではない。
【００５０】
本発明の薬学組成物は、有効成分の以外に薬剤学的に適し、生理学的に許容される補助剤を使用して製造可能であり、前記補助剤としては、賦形剤、崩壊剤、甘味剤、結合剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤または香味剤などの可溶化剤を使用することができる。本発明の薬学組成物は、投与のために、有効成分の以外にさらに薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで医薬組成物として望ましく製剤化することができる。液状溶液で製剤化される組成物において、許容可能な薬剤学的担体としては、滅菌及び生体に適したものであって、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち、１成分以上を混合して使用し、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液のような注射用剤型、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤で製剤化することができる。
【００５１】
本発明の医薬組成物の薬剤の製剤形態は、顆粒剤、散剤、被覆錠、錠剤、カプセル剤、座剤、シロップ、汁、懸濁剤、乳剤、点滴剤または注射可能な液剤及び活性化合物の徐放出型製剤などになりうる。本発明の医薬組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、腹腔内、胸骨内、経皮、鼻側内、吸入、局所、直腸、経口、眼球内または皮内経路を通じて通常の方式で投与することができる。本発明の医薬組成物の有効成分の有効量は、疾患の予防または治療に要求される量を意味する。したがって、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分及び他の成分の種類及び含量、剤型の種類及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、同時使われる薬物を含めた多様な因子によって調節される。
【００５２】
また、本発明は、幹細胞活性促進のためのヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子の用途を提供する。
【００５３】
また、高血圧の予防または治療のための薬物の製造において、ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子で処理された幹細胞またはその培養液の用途を提供する。
【００５４】
また、炎症疾患または免疫疾患の予防または治療のための薬物の製造において、ヒストン脱アセチル化阻害剤及びプライミング因子で処理された幹細胞またはその培養液の用途を提供する。
【００５５】
以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【００５６】
＜実験例＞
【００５７】
下記の実験例は、本発明によるそれぞれの実施例に共通して適用される実験例を提供するためのものである。
【００５８】
１．ヒト臍帯由来ＭＳＣｓの培養
【００５９】
大韓民国の峨山病院の生命倫理審議委員会によって承認されたガイドラインによって親の書面同意を受けて、元気な正常満朔新生児からヒトＵＣを得た。ＵＣ収集前にあらゆる産婦から同意書を受けた。ＵＣ−由来ＭＳＣｓ（ＵＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＭＳＣｓ；ＵＣ−ＭＳＣｓ）は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２０ｍＭ  ４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．３）、最小必須培地（ｍｉｎｉｍｕｍ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ；ＭＥＭ）非必須アミノ酸溶液、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）、１ｍｇ／ｍｌアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０％熱不活性化されたウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ）、５ｎｇ／ｍＬヒト上皮細胞成長因子（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１０ｎｇ／ｍｌ基本線維芽細胞成長因子及び５０ｍｇ／ｍｌ  ｌｏｎｇ−Ｒ３インスリン類似成長因子−１（ＰｒｏＳｐｅｃ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ）が添加されたｌｏｗ−ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ´ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）で５％  ＣＯ２大気条件、３７℃に培養した。多能性を保持するために、５回以下に継代して確張したＵＣ−ＭＳＣｓを使用した。表面タンパク質の発現は、以前に報告した通りに分析した（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．２４（２０１５）１６５８−１６７１）。
【００６０】
２．細胞移動分析
【００６１】
８μｍポリカーボネート膜を１．０％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）５０μｌに１時間コーティングした。ＵＣ−ＭＳＣｓは、ＶＰＡ（０．５ｍＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）または５−Ａｚａ（１μＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）単独または５０ｎＭ  Ｓ１Ｐと混合して、１日間プライミングさせた。ＵＣ−ＭＳＣｓは、ＴｒｙｐＬＥ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  ＰＡ）で分離させた後、洗浄し、０．５％  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を含有したＤＭＥＭに再懸濁して、３Ｘ１０４細胞／ウェル密度でトランズウェルインサート（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｉｎｓｅｒｔｓ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）の上部チャンバに接種した。下部チャンバには、０．５％  ＢＳＡを含有したＤＭＥＭに入れた１５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で満たした。１日後、トランズウェルプレートからインサートを除去した。上部チャンバに残っている細胞を脱脂綿で掻き出し、移動した細胞をホスフェート緩衝された食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）に溶かした４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ；ＰＦＡ）溶液で固定した後、０．５％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  ５．０  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）でデジタルイメージを分析して、膜の下部面にある染色された細胞を定量した。
【００６２】
３．ＭＳＣｓの生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）特性分析
【００６３】
ＭＳＣｓの細胞増殖、線維芽細胞コロニー形成単位（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＣＦＵ−Ｆ）、多能性（軟骨細胞、骨細胞または脂肪細胞系統への生体外分化）及び生体外抗炎症分析は、以前に報告した通りに行った（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．２４（２０１５）１６５８−１６７１）。
【００６４】
４．ウェスタンブロット及びリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ；ＲＱ−ＰＣＲ）
【００６５】
５０ｎＭ  Ｓ１Ｐ及び０．５ｍＭ  ＶＰＡでプライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓは、０．５％  ＢＳＡを含有するＤＭＥＭで３７℃に１２時間欠乏（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）させ、１５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１で５、１０、２０または３０分間刺激した後、３０μｇ-細胞抽出物を使用してマイトジェン活性化されたタンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ４２／４４及びＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）のリン酸化をウェスタンブロットを通じて分析した。遺伝子の発現分析のために、表示された細胞から得た全体ＲＮＡは、逆転写させ、表示された転写体は、ＲＱ−ＰＣＲを通じて定量した。
【００６６】
５．統計分析
【００６７】
統計的有意性の差を確認するために、データは、ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔｅｓｔまたはｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔを使用して分析した。本発明者らは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して、あらゆる分析を行い、統計的有意性は、ｐ＜０．０５、０．０１、または０．００１に定義した。
【００６８】
６．実験デザイン
【００６９】
本発明の目的は、ラットモデルで間質性膀胱炎／膀胱疼痛症侯群（Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｙｓｔｉｔｉｓ／ｂｌａｄｄｅｒ  ｐａｉｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＩＣ／ＢＰＳ）を治療するために、Ｖ１Ｐ＋Ｓ１Ｐでプライミングされたヒト臍帯由来ＭＳＣｓ（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＭＳＣｓ；ＵＣ−ＭＳＣｓ）の効果を測定することだけではなく、移植された細胞の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）細胞的特性も広範囲に観測しようとした。対照群またはＶ１Ｐ＋Ｓ１ＰプライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓを膀胱が損傷されたラットに投与し、膀胱排尿機能、尿路上皮剥離（ｕｒｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｄｅｎｕｄａｔｉｏｎ）、肥満細胞浸潤、組織線維化、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）及び腫瘍形成に対する影響を測定した。あらゆる実験において、グループ当たり５匹の独立した動物に対して、２回の独立した実験を行った。これらは、損傷グループ、細胞移植またはビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）投与グループ及び膀胱内圧測定術（Ｃｙｓｔｏｍｅｔｒｙ）グループに任意に配分して処理した。手術過程に関与した研究者には、投与された細胞の形態及び投与量についての情報を知らせなかった。あらゆる膀胱内圧測定、組織学及び遺伝子発現測定は、処理群についての情報が分からない研究者によって行われた。膀胱損傷またはカテーテル挿入によって予想しないように死んだ動物は、あらゆる分析でいずれも除外した。あらゆる動物実験は、大韓民国の蔚山大学校医科大学の動物実験倫理委員会のガイドライン及び規定によって行った（ＩＡＣＵＣ−２０１４−１４−１６７）。
【００７０】
７．動物モデル及びＵＣ−ＭＳＣｓの移植
【００７１】
ＨＣｌ注入ＩＣ／ＢＰＳラットモデルは、以前に報告された（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２４，２０１５，１６４８−１６５７）。ＨＣｌ損傷一週間後、下腹部を切開し、５００μｍシリンジ及び２６ケージ針を用いて、２．５×１０５（２５０Ｋ）ＵＣ−ＭＳＣｓまたはＰＢＳを膀胱の全壁外層及び天井に直接投与した。幹細胞投与一日前から、ＷｎｔまたはＩＧＦ−媒介信号伝逹を遮断するために、インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ；ＰＭＧ  Ｐｈａｒｍ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ａｎｓａｎ、Ｋｏｒｅａ；ｅｖｅｒｙ  １２  ｈ  ａｔ  ２．５ｍｇ／ｋｇ）またはゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ；ｅｖｅｒｙ  ｄａｙ  ａｔ  ５ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ皮下注入した。
【００７２】
８．無麻酔（Ｕｎａｎｅｓｔｈｅｔｉｚｅｄ）及び非抑制（ｕｎｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ）膀胱内圧測定度収集（無麻酔下の膀胱内圧測定術）
【００７３】
膀胱内圧測定（Ｃｙｓｔｏｍｅｔｒｏｇｒａｍｓ）は、代謝ケージ内の無麻酔及び非抑制されたラットで行われた。膀胱内圧（ＩＶＰ）及び腹腔内圧（ＩＡＰ）の記録測定のために、膀胱内圧測定３日前にカテーテルを同時に挿入した。簡単に説明すれば、麻酔誘導後、腹腔切開を通じてカフ（ｃｕｆｆ）が付いたポリエチレンカテーテル（ＰＥ−５０；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を膀胱天井に挿入した。ＩＡＰを記録するために、カテーテルチップのカフ付近腹腔バルーン（Ｌａｔｅｘ；Ｄａｅｗｏｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｉｎｃｈｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を膀胱近位部に位置させ、シルクスレッド（ｔｈｒｅａｄ）が付いた他のカテーテルに縛った。ポリエチレンカテーテル（ＰＥ−５０）を暖かい水で加熱した、挿入部のチップを元の長さの〜１．５倍程度伸ばし、ヘパリン処理した食塩水（１００ＩＵ／ｍＬ）で満たした。膀胱カテーテルが移植されれば、伸ばされたカテーテルが大腿静脈内に挿入された。次いで、前記カテーテルは、皮下空間を通じて突き抜けて通り過ぎ、動物の背中を通じて抜け出されて、背中の皮膚に付着された。手術後、それぞれのラットは、個別的に飼育され、同じ方式で保持された。
【００７４】
無麻酔下の膀胱内圧測定分析（ａｗａｋｅ  ｃｙｓｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）のために、圧力変換器（ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｄｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ；Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）及びｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｐｕｍｐ（ＰＨＤ２２／２０００  ｐｕｍｐ；Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に連結されたＴチューブを通じて二重弁で膀胱に留置カテーテル（ｉｎｄｗｅｌｌｉｎｇ  ｃａｔｈｅｔｅｒ）を連結した。ＩＡＰを記録するために、体液が満たされた腹腔バルーンが連結された他の留置カテーテルは、他の圧力変換器に連結した。滅菌された食塩水を膀胱内に０．４ｍＬ／ｍｉｎの速度で注入し、ｆｏｒｃｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｄｅ  Ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ；Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）が連結された体液収集器を通じて排尿量を記録し続けた。５０Ｈｚのサンプリング速度でＡｃｑ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ３．８．１  ｓｏｆｔｗａｒｅが装着されたＭＰ１５０  ｄａｔａ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｐａｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｏｌｅｔａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＩＶＰ、ＩＡＰ及び排尿量を記録し続けた。各動物から８分間測定されたあらゆる排尿周期数値を評価に使用した。
【００７５】
尿排出なしに、基準値から１５ｃｍ  Ｈ２Ｏを超えるようにＩＶＰが増加すれば、非排尿収縮（ｎｏｎ−ｖｏｉｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ；ＮＶＣ）で測定した。ＢＰは、膀胱が満たされる間に最低膀胱圧力を意味し、ＭＰは、排尿周期の間に最高膀胱圧力を意味し、ＭＶは、尿排出時の尿量を意味し、ＲＶは、尿排出後、残余尿量を意味する。ＢＣは、ＭＶ＋ＲＶとして定義され、ＭＩは、排尿収縮の間の間隔を意味する。
【００７６】
９．肺動脈高血圧（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ；ＰＡＨ）動物モデル
【００７７】
モノクロタリン（ｍｏｎｏｃｒｏｔａｌｉｎｅ；ＭＣＴ）誘導されたＰＡＨラットモデルは、以前の報告によって確立した（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２４，２０１５，１６５８−１６７１）。雄の特定病源菌のフリールイスラット（８週齢、２５０〜２８０ｇ）は、飼育温度及び光（１２時間明暗周期）の調節下で、食べ物及び水の制限なしに飼育された。ＭＣＴ（６０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ）の皮下投与を通じてＰＡＨを誘導した。対照群のラットは、同じ体積のＰＢＳを投与した。ＭＣＴまたはＰＢＳ投与２週後、プライミング誘導していないＵＣ−ＭＳＣｓまたはＶＰＡ＋Ｓ１Ｐで前処理したＵＣ−ＭＳＣｓを２００μｌ  ＰＢＳ当たり２．５×１０５細胞密度でしっぽ静脈を通じて投与した。溶媒のみ処理した対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）には、細胞なしに２００μｌ  ＰＢＳを投与した。注入前、細胞を暖かいＰＢＳで２回洗い、７−ＡＡＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）排除染色を通じるＦＡＣＳ分析を用いて投与した細胞の生存能を観測した。
【００７８】
１０．収縮期右心室圧（ＲＶＳＰ）及び右心室肥大症（ｒｉｇｈｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ；ＲＶＨ）測定
【００７９】
ＭＣＴまたはＰＢＳ投与４週後、人工呼吸器（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）を通じる呼吸保持と、ゾレチル（ｚｏｌｅｔｉｌ；４０ｍｇ／ｋｇ）及びロムプン（ｒｏｍｐｕｎ；１０ｍｇ／ｋｇ）による麻酔下で、患者モニタ（ＭＤＥ  Ｅｓｃｏｒｔ  ＩＩ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｍｏｎｉｔｏｒ、Ａｒｌｅｔａ）が連結された２６Ｇ針を使用した横隔膜の直接穿刺を通じて収縮期右心室圧を測定した。右心室圧（Ｒｉｇｈｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＲＶＰ）は、人工呼吸器を通じて呼吸を保持させた。ＲＶＨを測定するために、心臓の右心室を心室中隔から分離させ、右心室（ＲＶ）及び心室中隔を含む左心室（ＬＶ＋Ｓ）の重量を測定した。
【００８０】
１１．組織学及び遺伝子の発現分析
【００８１】
膀胱組織の組織学的分析のために、サイトケラチンに対する免疫染色を通じて上皮細胞剥離、トルイジンブルー染色（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ；８５４４−４１２５；Ｄａｅｊｕｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＆  Ｍｅｔａｌｓ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を通じて肥満細胞浸潤、マッソントリクローム染色（Ｍａｓｓｏｎ´ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ；Ｊｕｎｓｅｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を通じて組織線維化及びＴＵＮＥＬ染色（１  ６８４  ７９５；Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を通じて細胞死を測定した。肺組織に対しては、Ｈ＆Ｅ−またはα−平滑筋アクチン（α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ；α−ＳＭＡ）−染色された部位で４μｍの厚さ及び２５〜１００μｍの直径を有した任意に選択された血管の任意に選択された領域に対して少なくとも５回以上、４００×倍率でキャプチャーした。抗α−ＳＭＡ（１：１００、Ａｂｃａｍ）を製造社の推薦プロトコルによって適用し、反応させた。核は、４’，６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（４’，６’−ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ；Ｄ９５４２；ＤＡＰＩ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で対比染色した。ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪ  ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を使用して、中膜の厚さを測定した。中膜厚さ指数は、外部直径に対する外部直径−内部直径の比率で定義される。
【００８２】
遺伝子の発現分析のために、全体ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して準備し、ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して逆転写を行い、ＰｉｋｏＲｅａｌ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用してリアルタイム定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ；ＲＱ−ＰＣＲ）を行った。処理群当たり５匹の独立した動物において、各スライドから任意に選択された３部分の領域（ｎ＝１５）は、デジタルイメージの定量に使われた。同様に、グループ当たり任意に選択された５匹動物からＲＱ−ＰＣＲを２回繰り返して（ｎ＝１０）、遺伝子発現データを得た。
【００８３】
＜実施例１＞Ｓ１ＰによるヒトＵＣ−ＭＳＣｓプライミングにおいて、５−Ａｚａの影響
【００８４】
５−Ａｚａ及びＶＰＡの低濃度処理（１μＭ及び０．５ｍＭ）は、ＵＣ−ＭＳＣｓでＣＸＣＲ４の発現を非常に増加させる（図１Ａ）。次いで、本発明者らは、ＵＣ−ＭＳＣｓの基本特徴に対する前記後成遺伝的調節子の効果を確認した。５０ｎＭ  Ｓ１Ｐのプライミングとは独立して、５−Ａｚａ及びＶＰＡは、いずれも表面マーカータンパク質（ＣＤ２９、ＣＤ７３及びＣＤ９０陽性、ＣＤ３４及びＣＤ４５陰性）の発現にはあまり影響を及ぼさなかった（図１Ｂ及び図２Ａ）。また、５−Ａｚａ（５−Ａｚａ＋Ｓ１Ｐ）またはＶＰＡ（ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐ）を共に処理したＳ１Ｐプライミングは、多系統分化能にはほとんど影響を及ぼさなかったが、多系統分化能は、グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ；アルシアンブルー）、無機質沈着（ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ；アリザリンレッドＳ）及び脂質蓄積（ｌｉｐｉｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ；オイルレッドＯ染色）のレベル増加をそれぞれ測定することにより、軟骨細胞、骨細胞及び脂肪細胞系統のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化分析を基にした（図１Ｃ及び図２Ｂ）。
【００８５】
ＣＸＣＲ４の上向き調節とは矛盾して（図１Ａ）、トランズウェル移動分析において、５−Ａｚａ＋Ｓ１ＰでプライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓは、ＳＤＦ−１反応に対する移動活性がプライミングされていない細胞よりも約３０％程度減少した（図１Ｅ）。また、５−Ａｚａ＋Ｓ１Ｐプライミングは、クローン原性（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ）前駆細胞に自己再生される頻度を示すクローン原性ＣＦＵ−Ｆの活性を激しく損傷させた（図１Ｆ）。ＭＳＣｓの細胞増殖は、５−Ａｚａ＋Ｓ１Ｐのプライミングによってほとんど変化がなかった（図１Ｄ）。
【００８６】
＜実施例２＞低濃度のＳ１Ｐ処理時に、ＵＣ−ＭＳＣｓプライミングを強化させるＶＰＡ
【００８７】
次いで、本発明者らは、低濃度のＳ１Ｐ処理時に、ＵＣ−ＭＳＣｓのプライミングにＶＰＡが及ぼす影響を調査した。このために、本発明者らは、脂肪−及びＵＣＢ−由来ＭＳＣｓのプライミングのために使われる最適容量（２００ｎＭ）よりも４倍少ない５０ｎＭ  Ｓ１Ｐを適用した。ＶＰＡ単独処理とＳ１Ｐ単独処理時とは異なって、ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐ処理時に、ＵＣ−ＭＳＣｓプライミングは、ＳＤＦ−１に対する化学走性（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）をプライミングされていない細胞よりも２〜３倍高く増加させた（図３Ａ及び図３Ｂ）。ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐプライミングによって強化されたＳＤＦ−１に対する反応は、５−Ａｚａ＋Ｓ１Ｐプライミングの場合とは完全に異なって表われた。次いで、本発明者らは、ＨＳＰＣｓの移動と関連した信号伝逹経路の状態を確認した。化学走性の分析結果と一致するように、ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐに露出されたＵＣ−ＭＳＣｓは、ＭＡＰＫｐ４２／４４及びＡＫＴタンパク質のリン酸化を増加させたが、これは、信号伝逹経路の活性化を示す（図３Ｃ）。前記結果は、５−Ａｚａとは異なって、ＶＰＡが低濃度のＳ１ＰでもＭＡＰＫｐ４２／４４及びＡＫＴ信号伝逹経路を活性化させて、ＵＣ−ＭＳＣｓのプライミングを促進することができるということを示す。
【００８８】
＜実施例３＞ＶＰＡ＋Ｓ１ＰでプライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓの治療能力向上
【００８９】
本発明者らは、ＭＳＣｓの治療効果と関連した他の細胞活性に対するＶＰＡ＋Ｓ１Ｐプライミングの効果を試験した。５−Ａｚａ＋Ｓ１Ｐとは異なって（図１）、ＶＰＡ＋Ｓ１ＰでプライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓは、細胞増殖（図４Ａ）及びクローン原性ＣＦＵ−Ｆ活性（図４Ｂ）いずれも向上した。しかし、ＶＰＡ単独処理とＳ１Ｐ単独処理したＵＣ−ＭＳＣｓでは、細胞増殖能とＣＦＵ−Ｆ活性増加とが観察されていない（図４Ａ及び図４Ｂ）。ＭＳＣｓは、抗炎症及び免疫調節能力に影響を及ぼすので、本発明者らは、ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐプライミングが、ＵＣ−ＭＳＣｓの抗炎症効果に影響を及ぼすかを試験した。これにより、本発明者らは、プライミングされていないＵＣ−ＭＳＣｓまたはＶＰＡ単独であるか、ＶＰＡ＋Ｓ１ＰでプライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓから収集された条件培地を準備し、条件培地がリポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）で刺激された肺胞大食細胞（ａｌｖｅｏｌａｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｃｅｌｌ）であるＭＨ−Ｓ細胞から腫瘍壊死因子−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α；ＴＮＦ−α）の分泌を抑制することができるか否かを試験した。ＵＣ−ＭＳＣｓから収集された条件培地は、ＬＰＳ刺激されたＭＨ−Ｓ細胞からＴＮＦ−αの分泌の減少に効果的であった（図４Ｃ）。特に、ＶＰＡ＋Ｓ１ＰプライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓから収集された条件培地は、プライミングされていないＵＣ−ＭＳＣｓまたはＶＰＡ単独でプライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓよりもＴＮＦ−α分泌をさらに抑制した。本発明者らは、ヒト肺線維芽細胞であるＩＭＲ９０で収集したＣＭを対照群として使用したが、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗炎症分析でＴＮＦ−α分泌をさらに増加させると表われた。
【００９０】
ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐプライミングの効果に対する分子学的機転を確認するために、本発明者らは、ＭＳＣｓによって分泌される成長因子、前炎症サイトカイン及び抗炎症因子の発現を試験した。前述した細胞学的特性の実験結果と一致するように、ＶＰＡ＋Ｓ１ＰでプライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓは、成長因子及びその受容体［ｅ．ｇ．、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＢ、ｃＭＥＴ］（図５Ｂ）、前血管新生−［ｅ．ｇ．、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２］（図５Ｃ）、抗炎症−［ｅ．ｇ．、ＬＩＦ、ＴＳＧ６、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２］（図５Ｄ）及び幹細胞移動−［ｅ．ｇ．、ＭＭＰ１２］（図５Ａ）関連因子の発現を非常に上向き調節した。しかし、ＶＰＡ単独処理とＳ１Ｐ単独処理したＵＣ−ＭＳＣｓでは、前述した遺伝子発現に有意な変化が観察されていない（図４Ａ及び図４Ｂ）。また、５−Ａｚａ＋Ｓ１Ｐプライミングは、ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐプライミングによって影響を及ぼした前述した遺伝子を下向き調節した。総合すれば、前記結果は、最小濃度のＶＰＡ及びＳ１Ｐ処理を通じたＭＳＣｓのプライミングがＭＳＣｓの移動、増殖、自己再生及び抗炎症能を効果的に促進させるということを示すが、これは、ＭＳＣｓの治療潜在力に重要な役割を果たす。
【００９１】
＜実施例３＞多様なＶＰＡ及びＳ１Ｐ濃度によるＳＤＦ−１ａに対する走化性の分析
【００９２】
本発明者らは、多様なＶＰＡ及びＳ１Ｐ濃度によるＳＤＦ−１ａに対する走化性の分析を行って、ＶＰＡ及びＳ１Ｐの最下濃度を決定しようとした。
【００９３】
図６に示すように、ＶＰＡは、０．５ｍＭに固定し、Ｓ１Ｐ濃度を５〜５０ｎＭに実験した結果、Ｓ１Ｐの最下濃度は、１０ｎＭに決定された（図６ａ）。また、Ｓ１Ｐは、５０ｎＭに固定し、ＶＰＡ濃度を０．０５〜０．５ｍＭに実験した結果、ＶＰＡの最下濃度は、０．１ｎＭに決定された（図６ｂ）。
【００９４】
＜実施例４＞ＩＣ／ＢＰＳ治療において、ＶＰＡ＋Ｓ１ＰプライミングされたＵＣ−ＭＳＣの生体内治療可能性の確認
【００９５】
次いで、本発明者らは、ＨＣｌ注入で確立されたＩＣ／ＢＰＳ動物モデルを使用してＵＣ−ＭＳＣｓの生体内効果を確認した。無麻酔下の膀胱内圧測定術を使用した膀胱機能分析結果、ＨＣｌ注入誘導されたＩＣ／ＢＰＳラット（ＨＣｌ−ＩＣ  ｇｒｏｕｐ）は、対照群（ｓｈａｍ−ｏｐｅｒａｔｅｄ；ｓｈａｍ）ラットに比べて、不規則な排尿を示し、排尿間隔（ｍｉｃｔｕｒｉｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｖａｌ；ＭＩ）が減っただけではなく、排尿量（ｍｉｃｔｕｒｉｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ；ＭＶ）、最大圧力、排尿圧力（ｍｉｃｔｕｒｉｔｉｏｎ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＭＰ）及び膀胱容量（ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｐａｃｉｔｙ；ＢＣ）も低くなったと表われた（図７ａ及び図７ｂ）。２．５×１０５細胞数の対照群（ｎａｉｖｅ）ＵＣ−ＭＳＣｓ（ＵＣ−ＭＳＣ  ２５０Ｋ）またはＶＰＡ＋Ｓ１Ｐプライミングされた細胞（ＵＣ−ＭＳＣ  ２５０Ｋ＋ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐ）の単一移植は、損傷された排尿パラメータを改善させた。重要にも、ＶＰＡ＋Ｓ１ＰプライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓが対照群細胞よりも優れた効果を示した（図７ａ及び図７ｂ）。特に、ＨＣｌ−ＩＣグループの動物で非排尿期間（ｎｏｎ−ｖｏｉｄｉｎｇ  ｐｅｒｉｏｄｓ；ＮＶＣ）の間に収縮頻度が増加すると表われたが、このような症状は、ＶＰＡ＋Ｓ１ＰプライミングされたＵＣ−ＭＳＣｓで非常に改善されたが、対照群ＵＣ−ＭＳＣｓでは、あまり改善されていない（図７ａ及び図７ｂ）。無麻酔下の膀胱内圧測定術の結果も、前記機能改善効果と一致したが、対照群またはＶＰＡ＋Ｓ１Ｐプライミングされた２．５×１０５ＵＣ−ＭＳＣｓの投与によってラットモデルで深刻な尿路上皮剥離、肥満細胞浸潤、線維化、細胞死のような非正常な組織学的現象が回復されると表われた（図８ａ及び図８ｂ）。このような非正常な組織学的現象は、ヒトＩＣ／ＢＰＳ膀胱でも表われる特徴である。特に、組織学的変形の回復は、対照群細胞に比べて、ＶＰＡ＋Ｓ１ＰプライミングされたＵＣ−ＭＳＣが移植された膀胱組織でさらに優れた改善効果を示した。総合すれば、前記結果は、ＩＣ膀胱治療において、ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐプライミングが、ＵＣ−ＭＳＣｓの治療可能性を非常に改善させうるということを示した。
【００９６】
＜実施例５＞ＰＡＨ動物モデルでＵＣ−ＭＳＣのＶＰＡ＋Ｓ１Ｐ−媒介治療可能性の向上
【００９７】
次いで、本発明者らは、ＭＣＴで誘導されたＰＡＨ動物モデルを使用して生体内条件下でＶＰＡ＋Ｓ１Ｐプライミングの効果を確認した。以前の報告と類似に、ＲＶＳＰは、ＭＣＴ投与４週後に非常に増加した。対照群（ｎａｉｖｅ）ＵＣ−ＭＳＣ（ＰＡＨ＋ＭＳＣグループ）とは異なって、ＶＰＡ＋Ｓ１ＰでプライミングされたＵＣ−ＭＳＣ（ＰＡＨ＋ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐ−ＭＳＣグループ）の投与は、ＭＣＴ−誘導ＲＶＳＰの上昇を非常に減少させた（図９ａ）。また、ＭＣＴ投与後、ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）も増加したが、ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐ−ＭＳＣは、ＲＶ肥大症（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）を非常に減少させ、プライミングしていないＵＣ−ＭＳＣは、あまり効果がなかった（図９ａ）。また、ＶＰＡ＋Ｓ１Ｐ−ＭＳＣ投与は、ＭＣＴによって誘導された肺組織炎症、中膜厚さ指数及びα−ＳＭＡ＋平滑筋細胞の増加を減少させた（図９ｂ）。総合すれば、前記結果は、ＶＰＡ＋Ｓ１ＰによるＵＣ−ＭＳＣのプライミングが新生血管形成を促進させ、炎症反応を抑制する微小環境を誘導することができるということを示した。
【００９８】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者にとって、このような具体的な記述は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。
【図１】
2019532081.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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2019532081.tif 000014
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2019532081.tif 000016
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