(57)【要約】【課題】ヒトプログラム化された細胞死蛋白質（Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ１；ＰＤ−１）に対する抗体又はその抗原結合断片、これをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換された組換え微生物、前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法、及びこれを含む癌予防又は治療用組成物を提供する。本発明のＰＤ−１に結合する新規な抗体又はその抗原結合断片はＰＤ−１に結合してその活性を抑制し得るので、ＰＤ−１に関連した様々な疾患の免疫治療剤の開発に有用である。【選択図】図１
2019531761.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜配列番号３０で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３１〜配列番号５６で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５７〜配列番号７９で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号１９８〜配列番号２２２で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２２３〜配列番号２４１で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２４２〜配列番号２６９で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＰＤ−１に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６２の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３６の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４０の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７２の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４３の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４７の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４８の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５６の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号３０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、又は
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
配列番号１９８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１９９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２００の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２７の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３２の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３７の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２２０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２２１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２２０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２２２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号２２０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
配列番号８０〜配列番号９５で構成された群から選ばれる重鎖可変領域ＦＲ１、
配列番号９６〜配列番号１１３で構成された群から選ばれる重鎖可変領域ＦＲ２、
配列番号１１４〜配列番号１３４で構成された群から選ばれる重鎖可変領域ＦＲ３、又は
配列番号１３５〜配列番号１４５で構成された群から選ばれる重鎖可変領域ＦＲ４を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
配列番号２７０〜配列番号２９４で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域ＦＲ１、
配列番号２９５〜配列番号３１５で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域ＦＲ２、
配列番号３１６〜配列番号３５５で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域ＦＲ３、又は
配列番号３５６〜配列番号３６７で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域ＦＲ４を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
配列番号１４６〜配列番号１９３で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
配列番号３６８〜配列番号４２０で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項９】
請求項８の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項１１】
次の段階を含むＰＤ−１に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法：
（ａ）請求項１０の細胞を培養する段階；及び
（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌予防又は治療用組成物。
【請求項１３】
前記癌は黒色腫、肺癌、肝癌、膠細胞腫、卵巣癌、大腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎臓細胞癌、胃癌、乳癌、転移癌、前立腺癌及び膵贓癌で構成された群から選ばれることを特徴とする、請求項１２に記載の癌予防又は治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトプログラム化された細胞死蛋白質（Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ１；ＰＤ−１）に対する抗体又はその抗原結合断片、これをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換された組換え微生物、前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法、及びこれを含む癌予防又は治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、広く使われている第１世代化学抗癌剤、第２世代標的抗癌剤の場合、抗癌剤の毒性による副作用と薬物の耐性危険が高く、特定遺伝子変異を有する患者にしか投与できない、という問題点がある。このような問題点を克服した第３世代抗癌剤と呼ばれる免疫抗癌剤は、免疫細胞の信号伝達経路に作用し、免疫細胞を活性化させて癌細胞を攻撃して治療効果を出す。既存の抗癌剤とは違い、我々の身体の兔疫体系を用いて治療する方法であって、癌を含む様々な疾病に適用することができ、副作用も既存の抗癌剤に比べて低いものと報告されている。
【０００３】
ＰＤ−１（ＣＤ２７９とも名付けられる。）は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４共同刺激／抑制受容体ファミリー（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ／ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ）に関連した５５ＫＤの受容体蛋白質である（Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ５４：３０７−３１４）。
【０００４】
ＰＤ−１をコードする遺伝子及びｃＤＮＡをクローニングしてマウス及びヒトにおける特徴を調べたことがある（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  ＥＭＢＯ  Ｊ１１：３８８７−３３９５；Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２３：７０４−７０６）。全長ＰＤ−１は２８８個のアミノ酸残基（ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＰ＿００５００９）を含む。細胞外ドメインは１〜１６７アミノ酸残基で構成され、細胞質Ｃ−末端尾は１９１〜２８８残基を含み、これは２個の仮設的免疫−調節モチーフである免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ；Ｖｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ１８：２８６−２９１）及び免疫受容体チロシンスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ；Ｃｈｅｍｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３：９４５−９５４）を含む。
【０００５】
今まで、２個の配列関連リガンドＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）及びＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）はＰＤ−１と特異的に相互作用して細胞内信号伝達を誘導し、ＣＤ３及びＣＤ２８媒介Ｔ−細胞活性化を阻害するものと確認され（Ｒｉｌｅｙ，２００９  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２２９：１１４−１２５）、結局、Ｔ−細胞活性を調節、例えば、その他成長因子及びサイトカイン分泌のみならず、細胞成長、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γ分泌を減少させる。
【０００６】
ＰＤ−１の発現はＴ−細胞、Ｂ−細胞、単核細胞及び自然殺害（ＮＫ）細胞のような免疫細胞において頻繁に確認され、その他人体組織、例えば筋肉、上皮、神経組織などではほとんど発現しない。また、高レベルのＰＤ−１発現はしばしば免疫細胞の活性と関連がある。例えば、ヒトＴ−細胞株であるＪｕｒｋａｔがＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）又はホルボールエステル（１２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ又はＴＰＡ）によって活性化されると、ウエスタンブロットから見られるように、ＰＤ−１の発現が上向き調節された。抗−ＣＤ３抗体の刺激によって、刺激されたマウスＴ−及びＢ−リンパ球と１次ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞において同じ現象が観察された。ＰＤ−１発現増加によって効果Ｔ細胞を刺激し、活性化された効果Ｔ細胞を枯渇及び減少した免疫活性の方向にさらに案内する。したがって、ＰＤ−１媒介阻害信号は免疫寛容に重要な役割をするものと知られている。
【０００７】
色々な癌において腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：ＴＩＬｓ）のＰＤ−１発現及び腫瘍細胞のＰＤ−１リガンド発現増加が報告されており、他の類型の組織及び器官、例えば、肺、肝、胃、腎臓、乳房、卵巣、膵臓、メラノサイト及び食道が含まれる。さらに頻繁に、このような癌においてＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の発現は患者生存結果に対する良くない予後と関連付けられる。ＰＤ−１遺伝子をノックアウトして異種移植（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）癌細胞成長を抑制した形質転換マウスを用いて、癌除去又は寛容のための免疫システム調節におけるＰＤ−１信号伝達に対する重要性を一層詳しく説明した。
【０００８】
ＰＤ−１信号伝達の上向き調節は免疫寛容の癌増殖につながるだけでなく、ヒトのウイルス感染及び拡張にもつながる。流行性肝感染ウイルスＨＢＶ及びＨＣＶは肝細胞においてＰＤ−１リガンドの過発現を誘導し、効果Ｔ細胞においてＰＤ−１信号伝達を活性化して、ウイルス感染に対するＴ−細胞枯渇及び寛容を引き起こす。同様に、ＨＩＶ感染は類似の機作でヒト免疫システムを頻繁に回避する。拮抗分子によってＰＤ−１信号伝達を治療的に調節して寛容から免疫細胞を回復することができ、再活性させて癌及び慢性ウイルス感染を除去することができる。
【０００９】
ＰＤ−１を標的とする薬物には単一クローン抗体であるニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）があり、悪性黒色腫及び非小細胞肺癌の治療剤として使われているが、生産単価が高いため患者の経済的負担が大きいことと、治療効能に対する正確な検証が必要であることが報告されている。そこで、既存薬物が持つ限界を克服した新しい概念のＰＤ−１標的治療剤の開発が切実に望まれている。
【００１０】
このような技術的背景の下で、本出願の発明者等はＰＤ−１に特異的に結合する坑癌治療用抗体を開発するために努力した。その結果、本発明者等はファージディスプレイ技術を用いて、ＰＤ−１に高い親和力で結合する抗−ＰＤ−１抗体を開発し、これらの抗−ＰＤ−１抗体がＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の複合体形成を顕著に阻害させ得ることを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ＰＤ−１に対する新規抗体又はその抗原結合断片を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、前記核酸を含むベクター、前記ベクターが導入された組換え微生物及びその製造方法を提供することにある。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む癌予防又は治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１〜配列番号３０で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１〜配列番号５６で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７〜配列番号７９で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１９８〜配列番号２２２で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２３〜配列番号２４１で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４２〜配列番号２６９で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＰＤ−１に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００１６】
本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。
【００１７】
本発明はまた、前記核酸を含む発現ベクターを提供する。
【００１８】
本発明はまた、前記発現ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【００１９】
本発明はまた、次の段階を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する：（ａ）前記細胞を培養する段階；及び、（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。
【００２０】
本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含有する癌予防又は治療用組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】カルボキシ−末端にヒトＦｃ又はマウスＦｃを融合させたＰＤ−１発現ベクターの模式図である。
【図２】ＰＤ−１蛋白質精製結果を示す図である：    図２Ａは、ＰＤ１−ｈＦｃの１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌ．ＲＥ（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）とＮＲ（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ）条件における蛋白質確認結果を示す図である。；    図２Ｂは、Ｇ−３０００  ＳＷＸＬ  ＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果を示す図である。流速は１ｍｌ／ｍｉｎであり、展開溶媒はＰＢＳである；    図２Ｃは、ＰＤ１−ｍＦｃの１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌ．ＲＥ（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）とＮＲ（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ）条件における蛋白質確認結果を示す図である；    図２Ｄは、Ｇ−３０００  ＳＷＸＬ  ＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果を示す図である。流速は１ｍｌ／ｍｉｎであり、展開溶媒はＰＢＳである。
【図３】パンニング回数によるＰＤ−１に対する抗体の結合力を示す図である。
【図４】ＰＤ１−Ｈｉｓに対するモノファージの結合能測定のためのＥＬＩＳＡ結果を示す図である。
【図５】ＰＤ−１抗体の純度確認のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。
【図６】ＰＤ−１抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効能評価結果を示す図である。
【図７】ＰＤ−１抗体の濃度依存的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ効能評価結果を示す図である。
【図８】細胞表面に過発現したヒトＰＤ−１に対して濃度依存的に結合した抗体の結合力をＭＦＩ（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を用いて示す図である。
【図９】ＰＤ１−ｈＦｃとＰＤ１−４５Ｄ６、４９Ａ２とのキネティクス（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）測定結果を図である。
【図１０】最適化単一クローンを選別した結果を示す図である。
【図１１】親抗体との発現率比較分析した結果を示す図である。
【図１２】本発明に係るＰＤ１抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効能を評価した結果を示す図である。
【図１３】本発明に係るＰＤ１抗体の濃度依存的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ効能を評価した結果を示す図である。
【図１４】選別されたＰＤ１抗体変異体に対する単一クローン抗体の細胞表面に発現されたＰＤ−１に対する結合を確認した結果を示す図である。
【図１５】選別されたＰＤ１抗体変異体に対する単一クローン抗体の細胞表面に発現されたＰＤ−１に対する結合を測定した結果を示す図である。
【図１６】選別された抗体において酵素免疫吸着を用いたＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１或いはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２複合体の形成を防ぐ抗体の阻害効果を確認した結果を示す図である。
【図１７】ＰＤ１−ｈＦｃ蛋白質とＰＤ１−４５Ｄ６、４９Ａ２及び４９Ａ２（２Ｂ９）とのキネティクス測定結果を示す図である。
【図１８】ＰＤ１変異体の模式図である。
【図１９】選別されたファージ（ｐｈａｇｅ）の酵素免疫吸着を用いたＰＤ−１変異体に対する結合力を確認した結果を示す図であり、結合力が低いほど低い値を表す。
【図２０】選別された抗体の酵素免疫吸着を用いたＰＤ−１変異体に対する結合力を確認した結果を示す図である。
【図２１】酵素免疫吸着を用いた結合特異性を確認した結果を示す図である。
【図２２】ＨＥＫ−２９３細胞における臨時発現生産性を比較した結果を示す図である。
【図２３】ＰＤ１単一クローン抗体によって異種ＭＬＲ（Ｍｉｘｅｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）において活性増加を示すことを確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
特別に定義されない限り、本明細書で使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われる命名法及び以下に記述する実験方法は本技術分野において周知であり、通常使われるものである。
【００２３】
本発明は一観点において、配列番号１〜配列番号３０で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１〜配列番号５６で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７〜配列番号７９で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１９８〜配列番号２２２で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２３〜配列番号２４１で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４２〜配列番号２６９で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＰＤ−１に結合する抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００２４】
本発明者等は様々な癌から発現するものと知られたＰＤ−１に結合する坑癌治療用抗体を開発するために努力した。その結果、ファージディスプレイ技術を用いてＰＤ−１に高い親和力で結合する抗−ＰＤ−１抗体を製造し、このような抗−ＰＤ−１抗体がＰＤ−１の活性を抑制させ得ることを確認した。
【００２５】
本発明において“プログラムされた細胞死蛋白質１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  １；ＰＤ−１）”は信号伝達蛋白質であり、Ｔ細胞の活性化及び機能を調節する役割を担うものと知られている。腫瘍微細環境内でＴ細胞のＰＤ−１と癌細胞から発現するリガンドであるＰＤ−Ｌ１との結合はＰＤ−１信号伝達経路を活性化させて、結果的にはＴ細胞の不活性化を誘導し、このような現象は悪性黒色腫、非小細胞肺癌、腎臓細胞癌などの様々な癌で発見されている。
【００２６】
本明細書で使われる用語、“抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）”は、ＰＤ−１に特異的に結合する抗−ＰＤ−１抗体を意味する。本発明の範囲にはＰＤ−１に特異的に結合する完全な抗体形態だけでなく、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。
【００２７】
完全な抗体は２個の全長軽鎖及び２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖不変領域はガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域はキャパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。
【００２８】
抗体の抗原結合断片又は抗体断片とは、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうち、Ｆａｂは軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域だけを持っている最小の抗体片であり、Ｆｖ断片を生成する組換え技術はＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ８８／１０６４９、ＷＯ８８／１０６６３０、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６及びＷＯ８８／０９３４４に開示されている。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ，ｓｃＦｖ）は一般にペプチドリンカーを通じて重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とが共有結合で連結されたり又はＣ−末端で直接連結されているので、二重鎖Ｆｖと同様に、ダイマーのような構造をなすことができる。このような抗体断片は蛋白質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる。）、遺伝子組換え技術を用いて作製することもできる。
【００２９】
一実施例において、本発明に係る抗体はＦｖ形態（例えば、ｓｃＦｖ）、Ｆａｂであるか、完全な抗体形態である。また、重鎖不変領域はガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）又はイプシロン（ε）のいずれか一つのアイソタイプから選択され得る。例えば、不変領域はガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）又はガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖不変領域はキャパ又はラムダ型であり得る。
【００３０】
本明細書で使われる用語、“重鎖”とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びその断片のいずれをも意味する。また、本明細書で使われる用語、“軽鎖”とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びその断片のいずれをも意味する。
【００３１】
本発明の抗体は単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド−結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）及び抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、又はこれら抗体のエピトープ−結合断片などを含むが、これに限定されるものではない。
【００３２】
前記単一クローン抗体は、実質的に同質的抗体集団から収得した抗体、すなわち集団を占めている個々の抗体が微量で存在し得る可能な天然発生的突然変異を除いては同じものを指す。単一クローン抗体は高度に特異的であり、単一抗原部位に対抗して誘導される。
【００３３】
前記“ヒト化”形態の非−ヒト（例：ｍｕｒｉｎｅ）抗体は、非−ヒト免疫グロブリンから由来した最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分の場合、ヒト化抗体は、受容者の超可変領域からの残基を、目的する特異性、親和性及び能力を保有している非−ヒト種（供与者抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギ又は非−ヒト霊長類の超可変領域からの残基に置き換えたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。
【００３４】
前記“ヒト抗体”とは、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であり、相補性決定領域、構造領域を含んだ抗体を構成する全てのアミノ酸配列全体がヒトの免疫グロブリンで構成されているものを意味する。
【００３５】
重鎖及び／又は軽鎖の一部が特別な種から由来したり、特別な抗体部類又は亜部類に属する抗体内の相応する配列と同一であるかそれと相同性である反面、残りの鎖は、他の種から由来したり、他の抗体部類又は亜部類に属する抗体内の相応する配列と同一であるかそれと相同性である“キメラ”抗体（免疫グロブリン）だけでなく、目的する生物学的活性を示す前記抗体の断片が含まれる。
【００３６】
本願に使われたような“抗体可変ドメイン”とは、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及び骨格領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖及び重鎖部分のことを指す。ＶＨは重鎖の可変ドメインのことを指す。ＶＬは軽鎖の可変ドメインのことを指す。
【００３７】
“相補性決定領域”（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、抗原結合のために必要な存在である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基のことを指す。各可変ドメインは典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として確認された３個のＣＤＲ領域を有する。
【００３８】
本発明において、前記ＰＤ−１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１〜配列番号３０で構成された群から選ばれる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号３１〜配列番号５６で構成された群から選ばれる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５７〜配列番号７９で構成された群から選ばれる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号１９８〜配列番号２２２で構成された群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号２２３〜配列番号２４１で構成された群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２４２〜配列番号２６９で構成された群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【００３９】
具体的に、前記ＰＤ−１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６２の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３６の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４０の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７０の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７２の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４３の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４７の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４８の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５６の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号２９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号３０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、又は
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができる。
【００４０】
また、前記ＰＤ−１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１９８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１９９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２００の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２７の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３２の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３７の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２２０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２１５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２２１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２２０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２２２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号２２０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【００４１】
具体的に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、次の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むことができる：
配列番号２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６２の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２７の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３６の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３７の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３２の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５１の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５３の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２１０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７２の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２１３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２１５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７６の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
配列番号８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４７の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２１８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
【００４２】
本発明の一実施例によって、最適化過程によって抗体を追加選別し、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は次の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むことができる：
配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２２０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２１５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２１８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２２１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４９の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２１５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５５の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２２０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２２１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２１５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２２０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２１５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５６の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２２０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
配列番号３０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２２０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
【００４３】
“骨格領域”（ＦＲ）はＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは典型的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として確認された４個のＦＲを有する。
【００４４】
本発明の一実施例によれば、配列番号８０〜配列番号９５で構成された群から選ばれる重鎖可変領域ＦＲ１、
配列番号９６〜配列番号１１３で構成された群から選ばれる重鎖可変領域ＦＲ２、
配列番号１１４〜配列番号１３４で構成された群から選ばれる重鎖可変領域ＦＲ３、又は
配列番号１３５〜配列番号１４５で構成された群から選ばれる重鎖可変領域ＦＲ４を含むことができる。
【００４５】
また、配列番号２７０〜配列番号２９４で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域ＦＲ１、
配列番号２９５〜配列番号３１５で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域ＦＲ２、
配列番号３１６〜配列番号３５５で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域ＦＲ３、又は
配列番号３５６〜配列番号３６７で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域ＦＲ４を含むことができる。
【００４６】
“Ｆｖ”断片は完全な抗体認識及び結合部位を含有する抗体断片である。このような領域は１個の重鎖可変ドメインと１個の軽鎖可変ドメインとが、例えばｓｃＦｖで強固に事実上共有的に連合した二量体からなる。
【００４７】
“Ｆａｂ”断片は軽鎖の可変及び不変ドメインと、重鎖の可変及び第１不変ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は一般的にそれらの間にヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端の近傍に共有的に連結される一対のＦａｂ断片を含む。
【００４８】
“単一鎖Ｆｖ”又は“ｓｃＦｖ”抗体断片は抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含むが、それらのドメインは単一ポリペプチド鎖内に存在する。ＦｖポリペプチドはｓｃＦｖが抗原結合のために目的する構造を形成できるようにするＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含むことができる。
【００４９】
ＰＤ−１抗体は一価又は二価であり、単鎖又は二重鎖を含む。機能的に、ＰＤ−１抗体の結合親和性は１０−５Ｍ〜１０−１２Ｍの範囲内にある。例えば、ＰＤ−１抗体の結合親和性は１０−６Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−７Ｍ、又は１０−５Ｍ〜１０−６Ｍである。
【００５０】
前記ＰＤ−１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１４６〜配列番号１９３で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含むことができる。前記ＰＤ−１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１４６〜配列番号１９３で構成された群から選ばれる重鎖可変領域を含むことができる。本発明の一実施例によれば、配列番号１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６３、１６５、１６６、１６８、１６９、又は１７１〜１８８の重鎖可変領域を含むことができる。
【００５１】
また、配列番号３６８〜配列番号４２０で構成された群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含むことができる。前記ＰＤ−１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３６８〜配列番号４２０で構成された群から選ばれる軽鎖可変領域を含むことができる。本発明の一実施例によれば、配列番号３７１〜３８０、３８３、３８５、３８６、３８８、３８９、又は３９１〜４１５の軽鎖可変領域を含むことができる。
【００５２】
本発明に係る具体的実施例において、配列番号１５１の重鎖可変領域及び配列番号３７１の軽鎖可変領域；
配列番号１５２の重鎖可変領域及び配列番号３７２の軽鎖可変領域；
配列番号１５３の重鎖可変領域及び配列番号３７３の軽鎖可変領域；
配列番号１５４の重鎖可変領域及び配列番号３７４の軽鎖可変領域；
配列番号１５５の重鎖可変領域及び配列番号３７５の軽鎖可変領域；
配列番号１５６の重鎖可変領域及び配列番号３７６の軽鎖可変領域；
配列番号１５７の重鎖可変領域及び配列番号３７７の軽鎖可変領域；
配列番号１５８の重鎖可変領域及び配列番号３７８の軽鎖可変領域；
配列番号１５９の重鎖可変領域及び配列番号３７９の軽鎖可変領域；
配列番号１６０の重鎖可変領域及び配列番号３８０の軽鎖可変領域；
配列番号１６３の重鎖可変領域及び配列番号３８３の軽鎖可変領域；
配列番号１６５の重鎖可変領域及び配列番号３８５の軽鎖可変領域；
配列番号１６６の重鎖可変領域及び配列番号３８６の軽鎖可変領域；
配列番号１６８の重鎖可変領域及び配列番号３８８の軽鎖可変領域；
配列番号１６９の重鎖可変領域及び配列番号３８９の軽鎖可変領域；
配列番号１７１の重鎖可変領域及び配列番号３９１の軽鎖可変領域；
配列番号１７２の重鎖可変領域及び配列番号３９２の軽鎖可変領域；
配列番号１７３の重鎖可変領域及び配列番号３９３の軽鎖可変領域；
配列番号１７４の重鎖可変領域及び配列番号３９４の軽鎖可変領域；
配列番号１７５の重鎖可変領域及び配列番号３９５の軽鎖可変領域；
配列番号１７６の重鎖可変領域及び配列番号３９６の軽鎖可変領域；
配列番号１７７の重鎖可変領域及び配列番号３９７の軽鎖可変領域；
配列番号１７８の重鎖可変領域及び配列番号３９８の軽鎖可変領域；
配列番号１７９の重鎖可変領域及び配列番号３９９の軽鎖可変領域；
配列番号１８０の重鎖可変領域及び配列番号４００の軽鎖可変領域；
配列番号１８１の重鎖可変領域及び配列番号４０１の軽鎖可変領域；
配列番号１８１の重鎖可変領域及び配列番号４０２の軽鎖可変領域；
配列番号１８１の重鎖可変領域及び配列番号４０３の軽鎖可変領域；
配列番号１８１の重鎖可変領域及び配列番号４０４の軽鎖可変領域；
配列番号１８１の重鎖可変領域及び配列番号４０５の軽鎖可変領域；
配列番号１８２の重鎖可変領域及び配列番号４０６の軽鎖可変領域；
配列番号１８２の重鎖可変領域及び配列番号４０７の軽鎖可変領域；
配列番号１８２の重鎖可変領域及び配列番号４０８の軽鎖可変領域；
配列番号１８２の重鎖可変領域及び配列番号４０９の軽鎖可変領域；
配列番号１８３の重鎖可変領域及び配列番号４１０の軽鎖可変領域；
配列番号１８４の重鎖可変領域及び配列番号４１１の軽鎖可変領域；
配列番号１８５の重鎖可変領域及び配列番号４１２の軽鎖可変領域；
配列番号１８６の重鎖可変領域及び配列番号４１３の軽鎖可変領域；
配列番号１８７の重鎖可変領域及び配列番号４１４の軽鎖可変領域；又は
配列番号１８８の重鎖可変領域及び配列番号４１５の軽鎖可変領域。
【００５３】
具体的実施例において、配列番号１５５の重鎖可変領域及び配列番号３７５の軽鎖可変領域；
配列番号１５８の重鎖可変領域及び配列番号３７８の軽鎖可変領域；
配列番号１６５の重鎖可変領域及び配列番号３８５の軽鎖可変領域；
配列番号１７１の重鎖可変領域及び配列番号３９１の軽鎖可変領域；
配列番号１７５の重鎖可変領域及び配列番号３９５の軽鎖可変領域；
配列番号１７６の重鎖可変領域及び配列番号３９６の軽鎖可変領域；
配列番号１７８の重鎖可変領域及び配列番号３９８の軽鎖可変領域；
配列番号１８１の重鎖可変領域及び配列番号４０１の軽鎖可変領域；又は
配列番号１８１の重鎖可変領域及び配列番号４０５の軽鎖可変領域を含むことができる。
【００５４】
本発明に係る配列でＸ又はＸａａと表示された部分は、特定されていないその他アミノ酸を表示し、任意のアミノ酸が含まれ得ることを表す。
【００５５】
“ファージディスプレイ”は、変異体ポリペプチドをファージ、例えば繊維状ファージ粒子の表面上に外皮蛋白質の少なくとも一部との融合蛋白質としてディスプレイする技術である。ファージディスプレイの有用性は、無作為化蛋白質変異体の大きなライブラリーを対象にして、標的抗原と高親和度で結合する配列を迅速且つ効率的に分類できるという事実にある。ペプチド及び蛋白質ライブラリーをファージ上にディスプレイすることは、特異的結合特性を持つポリペプチドを調べるために数百万個のポリペプチドをスクリーニングするのに用いられてきた。
【００５６】
ファージディスプレイ技術は、特定リガンド（例：抗原）と結合する新規蛋白質を生成及び選別するための強力な道具を提供した。ファージディスプレイ技術を用いて、蛋白質変異体の大きなライブラリーを生成させ、標的抗原と高親和性で結合する配列を速かに分類することができる。変異体ポリペプチドを暗号化する核酸をウイルス性外皮蛋白質、例えば遺伝子III蛋白質又は遺伝子III蛋白質を暗号化する核酸配列と融合させる。蛋白質又はポリペプチドを暗号化する核酸配列を遺伝子III蛋白質の一部を暗号化する核酸配列と融合させた一価ファージディスプレイシステムが開発された。一価ファージディスプレイシステムでは、遺伝子融合物が低レベルで発現し、野生型遺伝子III蛋白質もまた発現して粒子感染性が維持される。
【００５７】
繊維状ファージ表面上におけるペプチドの発現とＥ．ｃｏｌｉの周辺細胞質における機能性抗体断片の発現を立証することが抗体ファージディスプレイライブラリーを開発する上で重要である。抗体又は抗原結合性ポリペプチドのライブラリーは、数多くの方式、例えば無作為ＤＮＡ配列を挿入することによって単一遺伝子を変更させる方法又は関連遺伝子系列をクローニングする方法で製造した。ライブラリーを対象にして、目的する特徴を伴う抗体又は抗原結合性蛋白質の発現に関してスクリーニングすることができる。
【００５８】
ファージディスプレイ技術は目的する特徴を持つ抗体を製造するための通常のハイブリドーマ及び組換え方法に比べていくつかの利点を有する。このような技術は、動物を使用しなくとも短い時間で様々な配列を持つ大きい抗体ライブラリーを生成可能にする。ハイブリドーマの製造やヒト化抗体の製造は数カ月の製造期間を必要とすることがある。また、免疫が一切要求されないため、ファージ抗体ライブラリーは毒性又は低抗原性の抗原に対しても抗体を生成させることができる。ファージ抗体ライブラリーをさらに用いて新規の治療的抗体を生成及び確認することができる。
【００５９】
ファージディスプレイライブラリーを用いて免疫させた、非−免疫させたヒト、生殖細胞系配列、又は未感作Ｂ細胞Ｉｇレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｒｙ）からヒト抗体を生成させる技術を用いることができる。各種リンパ系組織を使用して、未感作又は非免疫抗原結合性ライブラリーを製造することができる。
【００６０】
ファージディスプレイライブラリーから高親和性抗体を確認及び分離し得る技術は治療用新規抗体分離に重要である。ライブラリーから高親和性抗体を分離することは、ライブラリーの大きさ、細菌性細胞中における生産効率及びライブラリーの多様性に左右され得る。ライブラリーの大きさは抗体又は抗原結合性蛋白質の不適切なフォールディングと停止コドンの存在による非効率的生産によって減少する。細菌性細胞における発現は抗体又は抗原結合性ドメインが適切にフォールディングされない場合には抑制され得る。発現は可変／不変界面の表面や選別されたＣＤＲ残基での残基を交互に突然変異させることによって改善させることができる。骨格領域の配列は細菌性細胞において抗体ファージライブラリーを生成させる場合に適切なフォールディングを提供するための一つの要素である。
【００６１】
高親和性抗体分離において抗体又は抗原結合性蛋白質の様々なライブラリーを生成させることが重要である。ＣＤＲ３領域はこれらがしばしば抗原結合に参加することが明らかになった。重鎖上のＣＤＲ３領域は大きさ、配列及び構造的立体形態面において非常に多様であるので、これを用いて様々なライブラリーを製造することができる。
【００６２】
また、各位置において２０個アミノ酸全てを用いて可変重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域を無作為化することによって多様性を発生させることができる。２０個の全てのアミノ酸を使用すれば多様性の大きい変異体抗体配列が生成され、新規の抗体を確認する機会が増加し得る。
【００６３】
本発明の抗体又は抗体断片は、ＰＤ−１を特異的に認識し得る範囲内で、本明細書に記載された本発明の抗−ＰＤ−１抗体の配列だけでなく、その生物学的均等物も含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他生物学的特性をより一層改善させるために抗体のアミノ酸配列に更なる変化を与えることができる。このような変形は例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。このようなアミノ酸変異はアミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいてなされる。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、模様及び種類に対する分析によって、アルギニン、リシン及びヒスチジンはいずれも陽電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシンとセリンは類似の大きさを有し；フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは類似の模様を有することがわかる。したがって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リシンとヒスチジン；アラニン、グリシンとセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは生物学的に機能均等物といえる。
【００６４】
本発明は他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸に関する。
【００６５】
本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を分離して抗体又はその抗原結合断片を組換え的に生産することができる。核酸を分離し、それを複製可能なベクター内に挿入してさらにクローニングしたり（ＤＮＡの増幅）又はさらに発現させる。これに基づいて、本発明はさらに他の観点において前記核酸を含むベクターに関するものである。
【００６６】
“核酸”はＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸において基本構成単位であるヌクレオチドは自然のヌクレオチドだけでなく、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸の配列は変形され得る。前記変形はヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。
【００６７】
本発明の抗体又はその抗原結合断片に対するアミノ酸配列又はこれをコードする核酸は、配列番号に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むと解釈される。前記の実質的な同一性は、前述した本発明の配列と任意の他の配列をできるだけ対応するようにアラインし、当業界において通常利用されるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、最小９０％の相同性、最も好ましくは最小で９５％の相同性、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示す配列を意味する。
【００６８】
これに基づいて、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、明細書に記載の明示された配列又は全体に比べて９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を有し得る。このような相同性は、当業界に公知である方法による配列比較及び／又は整列によって決定され得る。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ  ２．０）、手動整列、肉眼検査を用いて本発明の核酸又は蛋白質のパーセント配列相同性を決定することができる。
【００６９】
前記抗体を暗号化するＤＮＡは通常の過程を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖を暗号化するＤＮＡと特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に分離又は合成する。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分には一般に次の一つ以上が含まれるが、それに制限されない：信号配列、複製起点、一つ以上のマーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、及び転写終結配列。
【００７０】
本明細書で使われる用語、“ベクター”は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であり、プラスミドベクター；コスミドベクター；バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどを含む。前記ベクターで抗体をコードする核酸はプロモーターと作動的に連結されている。
【００７１】
“作動的に連結”は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との機能的な結合を意味し、これによって前記調節配列は前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節するようになる。
【００７２】
原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させ得る強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボゾーム結合座及び転写／解読終結配列を含むことが一般的である。また、例えば、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）を利用することができ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
【００７３】
場合によって、ベクターはそれから発現する抗体の精製を容易にするために他の配列と融合されてもよい。融合される配列は、例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合蛋白質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）及び６ｘ  Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などがある。
【００７４】
前記ベクターは選択標識として当業界において通常利用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えばアンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
【００７５】
本発明はさらに他の観点において、前記言及されたベクターで形質転換された細胞に関する。本発明の抗体を生成させるために使われた細胞は原核生物、酵母又は高等真核生物細胞であり得るが、これに制限されるものではない。
【００７６】
エスケリチアコライ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルスサブチリス及びバチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ））、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）及びスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカスカルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を利用することができる。
【００７７】
ただし、動物細胞への関心が最も高く、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ−７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＳＫ−Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、Ｕ２０Ｓ、又はＨＴ１０８０であり得るが、これに制限されるものではない。
【００７８】
本発明はさらに他の観点において、（ａ）前記細胞を培養する段階；及び（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法に関する。
【００７９】
前記細胞は、各種培地で培養することができる。市販用の培地はいずれも制限なく培養培地として使用することができる。当業者に公知であるその他全ての必須補充物が適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨなどが発現のために選別された宿主細胞と共に既に使用されており、これは当業者にとって明らかであろう。
【００８０】
本発明で用語“形質転換”は、標的蛋白質を暗号化する核酸を含むベクターを宿主細胞内に導入し、宿主細胞内で前記核酸が暗号化する蛋白質が発現し得るようにすることを意味する。形質転換された核酸は宿主細胞内に発現しさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置しようが染色体外に位置しようが、それらの全てを含む。また、前記核酸は標的蛋白質を暗号化するＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記核酸は宿主細胞内に導入されて発現し得るものであれば、いかなる形態で導入されても構わない。例えば、前記核酸は、独自で発現するのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入され得る。前記発現カセットは、通常、前記核酸に作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボゾーム結合部位及び翻訳終結信号を含む。前記発現カセットは自体複製が可能な発現ベクターの形態であり得る。また、前記核酸はそれ自体の形態で宿主細胞に導入されて、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。
【００８１】
前記抗体又はその抗原結合断片の回収は、例えば遠心分離又は限外ろ過によって不純物を除去し、その結果を例えば親和クロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。追加のその他精製技術、例えば陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどを用いることができる。
【００８２】
本発明はさらに他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌予防又は治療用組成物に関する。
【００８３】
本発明は例えば、（ａ）本発明に係るＰＤ−１に対する抗体又はその抗原結合断片の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む癌の予防又は治療用薬剤学的組成物であり得る。本発明はまた、患者に必要な有効量で本発明に係るＰＤ−１に対する抗体又はその抗原結合断片を投与する段階を含む癌の予防又は治療方法に関する。
【００８４】
本発明において、前記癌は黒色腫、肺癌、肝癌、膠細胞腫、卵巣癌、大腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎臓岩、胃癌、乳癌、転移癌、ホジキンリンパ腫、前立腺癌及び膵贓癌で構成された群から選ばれることを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【００８５】
本発明で用語“治療”とは、組成物の投与によって癌やそれに起因する一つ又はそれ以上の症状を抑制したり緩和することだけでなく、疾患の症状を反転させる癌の治療又は癌の進行を防止することを意味する。本発明で用語“予防”とは、組成物の投与によって癌を抑制させたり発病を遅延させる全ての行為を意味する。本発明で癌の予防又は治療は、本発明で確保した抗体がＰＤ−１と結合してなされることであり、ＰＤ−１に結合してその活性を有意に抑制し、癌を予防又は治療することである。
【００８６】
本発明で用語“薬学的に許容可能な担体”とは、生物体を刺激しなく、投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤のことを指す。液状溶液に製剤化される組成物において許容される薬剤学的担体には、滅菌及び生体に適したものとして、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら成分の一成分以上を混合して使用することができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤に製剤化することができる。
【００８７】
本発明の前記抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む癌予防又は治療用組成物は、それを有効成分として含むいかなる剤形でも適用可能であり、経口用又は非経口用剤形に製造することができる。本発明の薬学的剤形は口腔（ｏｒａｌ）、直腸（ｒｅｃｔａｌ）、鼻腔（ｎａｓａｌ）、局所（ｔｏｐｉｃａｌ；頬及び舌の下を含む。）、皮下、膣（ｖａｇｉｎａｌ）又は非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ；筋肉内、皮下及び静脈内を含む。）投与に適するもの又は吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）又は注入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）による投与に適する形態を含む。
【００８８】
本発明の組成物を有効成分として含む経口投与用剤形としては、例えば、錠剤、トローチ剤、ローゼンジ、水溶性又は油性懸濁液、調剤粉末又は顆粒、エマルジョン、ハード又はソフトカプセル、シロップ又はエリキシル剤に製剤化することができる。錠剤及びカプセルなどの剤形に製剤化するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロース又はゼラチンのような結合剤、ジカルシウムホスフェートのような賦形剤、トウモロコシ澱粉又はサツマイモ澱粉のような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウム又はポリエチレングリコールワックスのような潤滑油を含むことができ、カプセル剤形では前記言及した物質の他にも脂肪油のような液体担体をさらに含有することができる。
【００８９】
本発明の組成物を有効成分として含む非経口投与用剤形としては、皮下注射、静脈注射又は筋肉内注射などの注射用形態、坐剤注入方式又は呼吸器を通じて吸入可能にするエアゾール剤などのスプレー用に製剤化することができる。注射用剤形に製剤化するためには、本発明の組成物を安定剤又は緩衝剤と一緒に水で混合して溶液又は懸濁液にし、これをアンプル又はバイアルの単位投与用に製剤化できる。坐剤として注入するためには、ココアバター又は他のグリセリドなど通常の坐薬ベースを含む坐薬又は浣腸剤のような直腸投与用組成物に製剤化できる。エアゾール剤などのスプレー用に剤形化する場合、水分散された濃縮物又は湿潤粉末が分散されるように推進剤などが添加剤と共に配合され得る。
【００９０】
さらなる態様として、本発明は、前記抗体を含む癌予防又は治療用組成物を投与することを含む、癌を予防又は治療する方法に関する。
【００９１】
本発明で用語“投与”とは、いかなる適切な方法で患者に本発明の薬剤学的組成物を導入することを意味する。本発明の組成物の投与経路は目的組織に到達できるものであれば、経口又は非経口の様々な経路で投与することができ、具体的に、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻腔内、吸入、眼球内又は皮内経路を通じて通常の方式で投与することができる。
【００９２】
本発明の治療方法は、本発明の癌予防又は治療用組成物を薬学的有効量で投与することを含む。適当な総１日使用量は、正しい医学的判断範囲内で処置医によって決定され得るということは当業者に自明である。特定患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって他の製剤が使用されるか否かをはじめとする具体的組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共に使用されたり同時使用される薬物をはじめとする様々な因子と医薬分野によく知られた類似因子によって個別に適用することが好ましい。したがって、本発明の目的に適した癌の予防又は治療用組成物の有効量は前述の事項を考慮して決定することが好ましい。
【００９３】
また、本発明の治療方法は、ＰＤ−１の過度な活性によって腫瘍発達と新生血管生成などの疾病が発生し得る任意の動物に適用可能であり、動物はヒト及び霊長類だけでなく、牛、豚、羊、馬、犬及び猫などの家畜を含む。
【００９４】
さらに他の観点において、本発明は、本発明に係るＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片を含む癌診断用組成物である。本発明はまた、本発明に係るＰＤ−１抗体を又はその抗原結合断片を処理して癌を診断する方法に関する。
【００９５】
本発明に係るＰＤ−１に対する抗体を通じてサンプルにおけるＰＤ−１発現レベルを測定することによって癌を診断することができる。発現レベルは、通常の免疫分析方法によって測定でき、前記ＰＤ−１に対する抗体を用いた放射能免疫分析、放射能免疫沈殿、免疫沈殿、免疫組織化学染色、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ  ａｓｓａｙ）、キャプチャー−ＥＬＩＳＡ、抑制又は競合分析、サンドイッチ分析、流細胞分析（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、免疫蛍光染色及び免疫親和性精製によって測定できるが、これに限定されるものではない。
【００９６】
前記免疫分析過程による最終的なシグナルの強度を分析することによって癌を診断することができる。すなわち、生物学的試料で本発明のマーカーの蛋白質が高発現され、シグナルが正常生物学的試料（例えば、正常胃組織、血液、血漿又は血清）に比べて強く表れる場合には癌と診断される。
【００９７】
さらに他の観点において、本発明は、前記癌診断用組成物を含む癌診断用キットに関する。本発明に係るキットは、本発明に係るＰＤ−１に対する抗体を含み、試料と抗体が反応することによって表れるシグナルを分析して、癌を診断することができる。このとき、前記シグナルは、抗体に結合した酵素、例えばアルカリンフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ又はシトクロムＰ４５０を含むことができるが、これに制限されるものではなく、このとき、酵素に対する基質は、酵素としてアルカリンフォスファターゼが利用される場合には、基質としてブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスフェート（ｎａｐｈｔｈｏｌ−ＡＳ−Ｂ１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びＥＣＦ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）のような発色反応基質が利用され、ホースラディッシュペルオキシダーゼが利用される場合にはクロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ−ルシフェリン、ルシゲニン（ビス−Ｎ−メチルアクリジニウム硝酸塩）、レセルピンベンジルエーテル、ルミノール、アムプレックスレッド試薬（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン）、ＨＹＲ（ｐ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ  ａｎｄ  ｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ）、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（２，２’−Ａｚｉｎｅ−ｄｉ［３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）及びナフトール／ピロニン、グルコースオキシダーゼとｔ−ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）及びｍ−ＰＭＳ（ｐｈｅｎｚａｉｎｅ  ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）のような基質が利用され得るが、これに制限されるものではない。
【００９８】
また、本発明に係るキットは、検出可能なシグナルを発生させるラベルを含むことができ、該ラベルは化学物質（例えば、ビオチン）、酵素（アルカリンフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びシトクロムＰ４５０）、放射能物質（例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２及びＳ３５）、蛍光物質（例えば、フルオレセイン）、発光物質、化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）及びＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００９９】
癌診断のために用いられる酵素の活性測定又はシグナルの測定は、当業界に公知の様々な方法によって実施することができる。これによってＰＤ−１発現を定常的又は定量的に分析することができる。
【０１００】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がそれら実施例に制限されるものと解釈されないことは当業界で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【０１０１】
実施例１：ＰＤ−１抗原の発現及び精製
１．ＰＤ−Ｌ１蛋白質発現ベクターの作製
ＰＤ−１のクローニングはＪｕｒｋａｔ細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を用いて、細胞外ドメインだけを得るために５’と３’に制限酵素ＳｆｉＩサイトが含まれたＰＤ１に対するプライマ（表１）を用いて重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）によって増幅させた。増幅されたＰＣＲ産物はＮ２９３Ｆベクターを用いてカルボキシ−末端にヒトＦｃ（配列番号１９６）、マウスＦｃ（配列番号１９７）を融合させて作製した（図１）。
【０１０２】
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２．ＰＤ−１抗原の発現及び精製
抗原を動物細胞で発現させるために、ＨＥＫ−２９３Ｆ細胞にプラスミドＤＮＡを形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。形質感染を行うためのポリプレクス（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）反応液は、フリースタイル２９３発現培地３ｍｌにプラスミドＤＮＡを２５μｇ入れて混ぜた後、さらに２ｍｇ／ｍｌ  ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）（ｐｏｌｙｐｌＵＳＡ−形質感染、ＵＳＡ）５０μｌを入れて再び混ぜた。ポリプレクス反応液は１５分間常温で反応させた後、１Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに培養された４０ｍｌの培養液に入れ、１２０ｒｐｍで３７℃、８％  ＣＯ２で２４時間培養した。形質感染２４時間後に補強剤（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）のＳｏｙｔｏｎｅ（ＢＤ，ＵＳＡ）を最終濃度が１０ｇ／Ｌになるように添加する。７日間ＨＥＫ−２９３Ｆを用いた臨時発現システムを用いて抗体を生産した。培養液から抗原を得るために親和度クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行った。７日目に回収した培養液から細胞と細胞残余物（ｄｅｂｒｉｓ）を除去するために５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液を得た。上澄み液をＤＰＢＳで洗浄した組換え蛋白質Ａアガロースレジンと４℃で１６時間反応させた。
【０１０３】
組換え蛋白質Ａアガロースレジンを使用した場合、０．１Ｍグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）で蛋白質を溶出させ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５００μｌで中和させて１次精製し、１次精製された蛋白質はＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（１．５ｃｍ＊１００ｃｍ）ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて２次精製した。
【０１０４】
精製された蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌとサイズ排除クロマトグラフィー（ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ−３０００  ＳＷＸＬ  Ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＳＥＣ）（Ｔｏｓｏｈ））を用いて純度を確認した。
【０１０５】
その結果、図２Ａ〜図２Ｄに示すように、精製されたＰＤ１蛋白質は９５％以上の純度を有することが確認できた。
【０１０６】
実施例２：ＰＤ−１ヒト抗体の選別
１．抗原準備
実施例１で作製したＰＤ１−ｈＦｃ、ＰＤ１−ｍＦｃ及びＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から購入したＰＤ１−ｈｉｓ（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ，１０３７７−Ｈ０８Ｈ）蛋白質抗原５０ｕｇを免疫吸着（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂ）チューブにコーティングした後、ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を行った。
【０１０７】
２．バイオパンニング
ヒト抗体ライブラリーファージは２．７×１０１０の多様性を持つヒトｓｃＦｖライブラリーをバクテリアに感染させた後、バクテリアを３０℃で１６時間培養した。培養後に遠心分離して上澄み液をＰＥＧで濃縮した後、これをＰＢＳ緩衝溶液に溶かしてヒト抗体ライブラリーを準備した。免疫チューブにライブラリーファージを入れて室温で２時間反応させた後、１ＸＰＢＳ／Ｔと１ＸＰＢＳで洗浄後、抗原に特異的に結合したｓｃＦｖ−ファージだけを溶出した。
【０１０８】
溶出されたファージをさらに大腸菌に感染させて増幅させるパンニング過程によって陽性ファージのプール（ｐｏｏｌ）を得、最初ラウンドのパンニングで増幅されたファージを用いて、ＰＢＳＴ洗浄段階で回数を増やす以外は同一の方法によって２ラウンド及び３ラウンドパンニングを行った。
【０１０９】
その結果、表２に示すように、３ラウンドパンニングで抗原に結合したファージ数が、流入（ｉｎｐｕｔ）対結合（ｏｕｔｐｕｔ）が多少増加したことを確認した。
【０１１０】
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３．ポリファージＥＬＩＳＡ
実施例２の各ラウンドのパンニング過程で収得した陽性ポリｓｃＦｖ−ファージ抗体プールに対する抗原との特異性を調べるためにポリファージＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を行った。
【０１１１】
各１次から３次までパンニングして凍らせておいた細胞ストック（ｓｔｏｃｋ）を、５ｍｌの２ｘＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２培地にＯＤ６００で０．１となるように入れた後、３７℃で２〜３時間（ＯＤ６００＝０．５〜０．７）培養後にＭ１ヘルパーファージを感染し、２ｘＹＴＣＭＫ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  １ｍＭ  ＩＰＴＧ培地に３０℃で１６時間培養した。培養した細胞を遠心分離（４５００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ，４℃）後に上澄み液を新しいチューブに移した（１次〜３次パンニングｐｏｌｙ  ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅ）。９６ウェル免疫−プレート（ＮＵＮＣ４３９４５４）に２種類の抗原のそれぞれをウェル当たり１００ｎｇずつ４℃で１６時間程度コーティングバッファー（ｃｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）でコーティングした後、ＰＢＳに溶かした４％スキムミルク（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）を用いて各ウェルをブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。
【０１１２】
各ウェルごとにＰＢＳ／Ｔ  ０．２ｍｌを使って洗った後、１次〜３次パンニングポリｓｃＦｖ−ファージを各ウェルに１００μｌずつ入れて常温で２時間反応させた。また、各ウェルごとにＰＢＳ／Ｔ  ０．２ｍｌを使って４回洗った後、二次抗体である抗−Ｍ１３−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ２７−９４２１−０１）を１：２０００に希釈し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ／Ｔで洗った後にＯＰＤ  ｔａｂｌｅｔ（ｓｉｇｍａ．８７８７−ＴＡＢ）を、ＰＣバッファーを作って１００ｕｌ／ｗｅｌｌずつ入れて１０分間発色させた後、吸光度４９０ｎｍで分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ）で測定した。
【０１１３】
その結果を図３に示した。図３によれば、抗原に対する結合能が２種類のＰＤ１抗原に対して３次ポリｓｃＦｖ−ファージで増強（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）することをＥＬＩＳＡから確認した。
【０１１４】
４．陽性ファージ選別
結合能の大きい多クローンファージ抗体群（３次パンニング）から得たコロニーを２ｘＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２培地に入れた後、１ｍｌ  ９６−深ウェルプレート（パイオニア９００３０）に３７℃で１６時間培養した。このように育てた細胞からＯＤ６００で値が０．１となるように１００〜２００ｕｌを取って１ｍｌの２ｘＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２培地に入れた後、９６−深ウェルプレートに３７℃でＯＤ６００でその値が０．５〜０．７となるように２〜３時間培養した。Ｍ１ヘルパーファージをＭＯＩ値が１：２０となるように感染し、２ｘＹＴＣＭＫ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  １ｍＭ  ＩＰＴＧ培地に３０℃で１６時間培養した。
【０１１５】
９６ウェル免疫プレートに抗原ＰＤ１をウェル当たり１００ｎｇずつ４℃で１６時間コーティングした後、ＰＢＳに溶かした４％スキムミルクを用いて各ウェルをブロッキングした。各ウェルごとに０．２ｍｌ  ＰＢＳ／Ｔを使って洗った１６時間培養した単一クローンｓｃＦｖ−ファージ（それぞれ１００ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅ）を各ウェルに１００μｌずつ入れて常温で２時間反応させた。また、各ウェルごとに０．２ｍｌ  ＰＢＳ／Ｔを使って４回洗った後、２次抗体である抗−Ｍ１３−ＨＲＰを１／２０００に希釈し、室温で１時間反応させた。０．２ｍｌ  ＰＢＳ／Ｔで洗った後に発色して吸光度４９０ｎｍで測定した。
【０１１６】
その結果、図４に示すように、各抗原に対する結合能が強い単一ファージクローンは、ＰＤ１に対して総数十個の単一ファージクローンを得た。
【０１１７】
５．陽性ファージ抗体の塩基配列分析
前記選別された単一クローンに対してＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いてＤＮＡ−ｐｒｅｐを行ってＤＮＡを得、配列分析を依頼した（ソルジェント社）。配列分析結果から、選別された抗体のＶＨとＶＬのＣＤＲ部位を確認し、それらの抗体とジャームライン（ｇｅｒｍ  ｌｉｎｅ）抗体群の類似性をＮＣＢＩのウェブページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／のＩｇ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて調査した。その結果、１５種のＰＤ１に特異的なファージ抗体を得た。これを下記表３に整理して提示する。
【０１１８】
2019531761.tif 000005
選別された抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ、ＦＲ配列及びこれを含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体は次の表４及び表５の通りである。
【０１１９】
2019531761.tif 000006
2019531761.tif 000007
2019531761.tif 000008
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実施例３：ＰＤ−１ヒト抗体の生産
１．ｓｃＦｖ形態をＩｇＧ形態に転換（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）
選別された１５種のＰＤ１に対する単一クローンファージ抗体をファージからＩｇＧ全体ベクター（ｗｈｏｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ）に転換するために重鎖と軽鎖に対してＰＣＲ（ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ，ＢＩＯ−ＲＡＤ）を行った。その結果、重鎖と軽鎖を得、制限酵素でベクターと各クローンの重鎖、軽鎖を切断した。ベクターと重鎖はそれぞれＤＮＡ−ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）でＤＮＡを溶出した。ライゲーション（Ｌｉｇａｔｉｏｎ）はｖｅｃｔｏｒ  １ｕｌ（１０ｎｇ）重鎖（１００〜２００ｎｇ）１５ｕｌ、１０ｘ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２ｕｌ、ｌｉｇａｓｅ（１Ｕ／ｕｌ）１ｕｌ、蒸溜水を混合して室温で１〜２時間放置後、形質転換細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）（ＸＬ１−ｂｌｕｅ）に入れて氷に５分間置き、４２℃で９０秒間熱衝撃（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）を与えた。
【０１２０】
熱衝撃後に培地１ｍｌを入れて１時間３７℃で育てた後、ＬＢ  Ａｍｐプレートにスプレッド（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）して３７℃で１６時間培養した。こうして得たコロニーを取ってＬＢ  Ａｍｐ培地５ｍｌを接種し、３７℃で１６時間培養後にＤＮＡ−ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｎｕｃｌｏｇｅｎ）でＤＮＡ−ｐｒｅｐを行った。得られたＤＮＡは、配列分析を依頼した（ソルジェント社）。
【０１２１】
その結果、全体ＩｇＧに転換したＰＤ１に対する１５個のクローンの重鎖と軽鎖の配列が表３における１５個のクローンのファージ抗体の配列と一致することを確認した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質感染するために、全体ＩｇＧに転換した各クローンの重鎖と軽鎖はＬＢ  Ａｍｐ  １００ｍｌ培地で育て、ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ）を用いてＤＮＡを得た。
【０１２２】
２．ヒト抗体の生産
クローニングされたｐＮＡＴＶＨとｐＮＡＴＶＬベクターは６：４の割合でＨＥＫ２９３Ｆ細胞に同時形質感染（ｃｏ−形質感染）して７日目の上澄み液を回収し、遠心分離と０．２２μｍＴｏｐ−フィルターを用いて細胞と浮遊物を除去した後、上澄み液を集めて蛋白質Ａ親和度クロマトグラフィーを行ってＩｇＧ抗体を精製した。精製後にグリシンバッファー（ｇｌｙｃｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて抗体を分離し、最終再サスペンションバッファー（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）はＰＢＳとなるようにバッファーを交換した。精製された抗体をＢＣＡ及びナノドロップ（ｎａｎｏ  ｄｒｏｐ）を用いて定量し、１５種の抗体を還元、非還元条件で各５ｕｇずつローディングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析して精製蛋白質の純度及び移動度（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）状態を確認した（図５）。
【０１２３】
その結果、図５によれば、１５種の抗体とも非還元条件では１５０ｋＤａ以上の大きさで検出され、対照抗体として ニボルマブを生産した。
【０１２４】
実施例４：ＰＤ−１単一クローン抗体の特性
１．抗体の活性評価
選別された抗体の活性評価実験はＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１遮断バイオアッセイキット（ｐｒｏｍｅｇａ，Ｊ１２５０）を用いて進行した。ＰＤ−Ｌ１が高発現しているＣＨＯ細胞株を９６−ウェルプレートに塗抹し、１６時間以上培養後に、一定濃度に連続希釈された各抗体を処理して、ヒトＰＤ−１が高発現するＪｕｒｋａｔ細胞株を６時間一緒に培養した。抗体の阻害回復程度は、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）が基質を分解して生じる発光強度から分かり、分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５  ｓｐｅｃｔｒａｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国）で測定した。対照抗体を含む１６種のＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体形成によって減少していたシグナルを回復させる値から抗体の活性を確認し、４１Ｃ９、４５Ｄ６、４９Ａ２が対照抗体と類似した活性度を示した（図６）。
【０１２５】
ＰＤ−１抗体４１Ｃ９、４５Ｄ６、４９Ａ２の活性評価を濃度依存的に測定するために段階希釈をしてＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１遮断バイオアッセイを再び進行した結果、減少していたシグナルを濃度勾配依存的に回復させた。その回復程度はＥＣ５０（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＡｂ  ａｔ  ５０％  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｓｉｇｎａｌ）で表すことができ、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を用いて分析した。ＥＣ５０のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｆｆｉｃａｃｙ阻害回復能力は図７の通りである。
【０１２６】
２．過発現細胞に対するＰＤ１抗体の親和度
ＰＤ−１を高発現させる形質転換細胞プールは、ヒトＰＤ−１（ＮＭ＿００５０１８．２）を含んでいるｐｃＤＮＡ３．１プラスミドをＨＥＫ２９３Ｅに形質転換させ、１５０ｕｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎ（＃Ｒ２５００１，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）の入っている選択的培地で選別した。各細胞プールは各ａｎｔｉ−ＰＤ−１（＃５５７８６０，ＢＤ）を用いたＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）分析で確認されて選択され、ＦＡＣＳ結合アッセイやＦＡＣＳ競合アッセイのような機能評価法に使用された。
【０１２７】
ヒトＰＤ−１を高発現させる形質転換細胞プールのそれぞれを試料当たり０．５〜１×１０６の細胞を準備し、抗体をそれぞれ一定の希釈倍数で連続的に希釈して、準備した細胞と４℃で２０分間反応させた。その後、細胞は２％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）の含まれたＰＢＳ（＃ＬＢ００１−０２，ｗｅｌｇｅｎｅ）で３回洗浄し、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）蛍光物質が結合された抗−ヒトＩｇＧ抗体（＃ＦＩ−３０００、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ）を用いて４℃で２０分間反応後、同じ洗浄過程を経た後に０．５ｍｌの２％  ＦＢＳ（＃２６１４０−０７９，Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ）の入っているＰＢＳで懸濁させた後、流細胞分析機であるＦＡＣＳＣａｎｔｏ  II  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を用いて分析した。その結果、ＰＤ−１抗体３種とも特異的に結合したし、その結合力は、平衡解離定数（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｋｄ）をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６の分析関数を用いて求めた。
【０１２８】
その結果、図８によれば、細胞表面に過発現したヒトＰＤ−１に対して濃度依存的に結合した抗体の結合力がＭＦＩ（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）から分かる。
【０１２９】
３．陽性ファージ抗体からＰＤ１−４５Ｄ６、４９Ａ２類似配列を有するものを選別
活性度評価及びＦＡＣＳにおける結合力に優れたものと評価された４１Ｃ９の他にも４５Ｄ６及び４９Ａ２に対して追加の抗体選別を進行した。
【０１３０】
実施例２と同じ過程によってＰＤ１−４５Ｄ６、４９Ａ２類似配列を有するものをさらに選別した。次表６に特性を整理した。
【０１３１】
2019531761.tif 000013
４．ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６を用いたＰＤ１抗体の親和度
ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ）機器で行った。ＧＬＣセンサーチップ（ＢｉｏＲａｄ）を機器に装着し、ＰＢＳＴ緩衝溶液で洗浄をした後、ＥＤＣ／ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ混合液でカルボキシメチルデキストランの表面を活性化させた。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）緩衝液（ｐＨ５．０）に５ｕｇ／ｍｌ濃度で溶かしたＰＤ１−ｈＦｃを注入してＧＬＣセンサーチップに固定化させた。
【０１３２】
ＰＤ１蛋白質と反応しないで残っている活性化されたカルボキシグループを非活性化させるために１Ｍエタノールアミンを流し、センサーチップに結合していない蛋白質を洗浄するために１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．０を注入した。その後、ＰＢＳＴ緩衝液を用いて抗体を濃度別（３０ｎＭ〜０．１２３ｎＭ）に３０ｕｌ／ｍｉｎの流速で１０分間流しつつ、時間による結合と解離過程中のセンソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）データを収集した。
【０１３３】
平衡状態におけるセンソグラムデータを濃度によってプロッティング（ｐｌｏｔｔｉｎｇ）及びフィッティング（ｆｉｔｔｉｎｇ）して平衡解離定数（ＫＤ）計算した結果、４５Ｄ６は０．００１ｎＭ、４９Ａ２は０．０１９ｎＭであって、ＰＤ１抗原に対して高い親和度を示した（図９）。
【０１３４】
実施例５：ＰＤ１抗体４５Ｄ６、４９Ａ２に対する抗体最適化
１．ＰＤ１−４５Ｄ６、４９Ａ２抗体の最適化のためのライブラリーの作製
抗体最適化は、重鎖は固定し、ワイバイオロジックスで保有している１０５〜１０６軽鎖（ＬＣ）プール（ｐｏｏｌ）を入れて新しいＬＣシャフリングライブラリー（ＬＣ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｌｉｂｒａｒｙ）を作製し、ＬＣシャフリング、重鎖の疎水性コア（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｏｒｅ）、露出残基（ｅｘｐｏｓｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅ）、電荷クラスター（ｃｈａｒｇｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ）、塩ブリッジ（ｓａｌｔ  ｂｒｉｄｇｅ）などのように構造的に重要な部位の残基と比較分析をして保存された残基（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅ）に変異させた後にＬＣシャフリングを進行するコアパッキング（ｃｏｒｅ  ｐａｃｋｉｎｇ）＋ＬＣシャフリング、抗体可変領域（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のＤＮＡはｉｎ  ｖｉｖｏ親和度成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）過程で頻繁に変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）され得る変異ホットスポット（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｈｏｔ  ｓｐｏｔ）をランダムに変異させた後にＬＣシャフリングを進行するＣＤＲホットスポット＋ＬＣシャフリングなどの３つの方法で進行した。
【０１３５】
ＬＣシャフリングライブラリーを作製するために４５Ｄ６、４９Ａ２抗体のＬＣ遺伝子をＢｓｔＸ  Ｉで切断した後にベクターとして使用し、ワイバイオロジックスで保有しているライブラリープールをＢｓｔＸ  Ｉで切断してインサートとして使用した。リガーゼでライゲーション後に、電気穿孔形質転換用細胞を用いて形質転換を行った。方形皿（ｓｑｕａｒｅ  ｐｌａｔｅ）に形質転換された細胞を集めて抗体ライブラリーを製造した結果、約１．５×１０７の様々なライブラリーを得た。塩基配列分析の結果、ＨＣの配列はいずれも同じであり、また、ＬＣの配列が互いに異なることを確認した。
【０１３６】
コアパッキング＋ＬＣシャフリングライブラリーを作製するために、４５Ｄ６、４９Ａ２抗体のｆｒａｍｅ  ｗｏｒｋ（ＦＲ）部分を保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）アミノ酸配列に置換した後にＬＣ遺伝子をＢｓｔＸ  Ｉで切断してベクターとして使用し、ワイバイオロジックスで保有しているライブラリープールをＢｓｔＸ  Ｉで切断してインサートとして使用した。リガーゼでライゲーション後に、電気穿孔形質転換用細胞を用いて形質転換を行った。方形皿（ｓｑｕａｒｅ  ｐｌａｔｅ）に形質転換された細胞を集めて抗体ライブラリーを製造した結果、約８．４×１０６の様々なライブラリーを得た。塩基配列分析の結果、ＨＣのＦＲ部位が保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）アミノ酸配列に置換され、また、ＬＣの配列が互いに異なることを確認した。
【０１３７】
ＣＤＲホットスポット＋ＬＣシャフリングライブラリーを作製するために、４５Ｄ６抗体のｆｒａｍｅ  ｗｏｒｋ（ＦＲ）部分を保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）アミノ酸配列に置換した後にＣＤＲ１のホットスポットライブラリーをＳｆｉ  Ｉで切断してインサートとして使用し、ワイバイオロジックスで保有しているライブラリープールをＳｆｉ  Ｉで切断してベクターとして使用した。リガーゼでライゲーション後に、電気穿孔形質転換用細胞を用いて形質転換を行った。方形皿（ｓｑｕａｒｅ  ｐｌａｔｅ）に形質転換された細胞を集めて抗体ライブラリーを製造した結果、約５．６×１０６の様々なライブラリーを得た。塩基配列分析の結果、ＨＣのＦＲ部位が保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）アミノ酸配列に置換され、ＣＤＲ１のホットスポット配列のアミノ酸がランダムに変異され、また、ＬＣの配列が互いに異なることを確認した。
【０１３８】
実施例６：ＰＤ１ヒト抗体の選別
１．抗原準備
ワイバイオロジックスで生産したＰＤ１−ｈＦｃ、ＰＤ１−ｍＦｃとＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から購入したＰＤ１−ｈｉｓ（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ，１０３７７−Ｈ０８Ｈ）蛋白質抗原５０ｕｇを免疫吸着チューブでコーティングした後、ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を行った。
【０１３９】
２．バイオ−パンニング
ヒト抗体ライブラリーファージは、２．７×１０１０の多様性を持つヒトｓｃＦｖライブラリーをバクテリアに感染させた後、バクテリアを３０℃で１６時間培養した。培養後に遠心分離して上澄み液をＰＥＧで濃縮した後、これをＰＢＳ緩衝溶液に溶かしてヒト抗体ライブラリーを準備した。免疫チューブにライブラリーファージを入れて室温で２時間反応させた後、１ＸＰＢＳ／Ｔと１ＸＰＢＳで洗浄後に抗原に特異的に結合したｓｃＦｖ−ファージだけを溶出した。
【０１４０】
溶出されたファージをさらに大腸菌に感染させて増幅させるパンニング過程によって陽性ファージのプール（ｐｏｏｌ）を得、抗体最適化のためのパンニングは最初ラウンドだけ進行した。その結果、表７に示すように、１ラウンドパンニングで抗原に結合したファージ数が、流入（ｉｎｐｕｔ）対結合（ｏｕｔｐｕｔ）が多少増加したことを確認した。
【０１４１】
2019531761.tif 000014
３．陽性ファージ選別
パンニングから得たコロニーを２ｘＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２培地に入れた後、１ｍｌ  ９６−深ウェルプレート（９６−ｄｅｅｐ  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ：パイオニア９００３０）に３７℃で１６時間培養した。このように育てた細胞からＯＤ６００で値が０．１となるように１００〜２００ｕｌを取って１ｍｌの２ｘＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２培地に入れた後、９６−深ウェルプレートに３７℃でＯＤ６００でその値が０．５〜０．７となるように２〜３時間培養した。Ｍ１ヘルパーファージをＭＯＩ値が１：２０となるように感染し、２ｘＹＴＣＭＫ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  １ｍＭ  ＩＰＴＧ培地に３０℃で１６時間培養した。
【０１４２】
９６ウェル免疫プレートに抗原ＰＤ１をウェル当たり１００ｎｇずつ４℃で１６時間コーティングした後、ＰＢＳに溶かした４％スキムミルクを用いて各ウェルをブロッキングした。各ウェルごとに０．２ｍｌ  ＰＢＳ／Ｔを使って洗った１６時間培養した単一クローンｓｃＦｖ−ファージ（それぞれ１００ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅ）を各ウェルに１μｌずつ入れて常温で２時間反応させた。また、各ウェルごとに０．２ｍｌ  ＰＢＳ／Ｔを使って４回洗った後、２次抗体であるａｎｔｉ−Ｍ１３−ＨＲＰを１／２０００に希釈し、室温で１時間反応させた。０．２ｍｌ  ＰＢＳ／Ｔで洗った後に発色して吸光度４９０ｎｍで測定した。
【０１４３】
その結果、親抗体（４９Ａ２又は４５Ｄ６）に比べて、各抗原に対する結合能が強い数十個の単一ファージクローンを得た。それは図１０の通りである。
【０１４４】
４．陽性ファージ抗体の塩基配列分析
選別された単一クローンに対してＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いてＤＮＡ−ｐｒｅｐを行ってＤＮＡを得、配列分析を依頼した（ソルジェント社）。配列分析結果から、選別された抗体のＶＨとＶＬのＣＤＲ  ｒｅｇｉｏｎを確認し、それら抗体とジャームライン（ｇｅｒｍ  ｌｉｎｅ）抗体群の類似性をＮＣＢＩのウェブページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／のＩｇ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて調査し、その結果、２５種（４９Ａ２：１０種、４５Ｄ６：１５種）の親抗体よりも結合力の高い特異的なファージ抗体を得た。これを次表８に整理して提示する。
【０１４５】
2019531761.tif 000015
2019531761.tif 000016
選別された抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ、ＦＲ配列及びこれを含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体は、次の表９及び表１０の通りである。
【０１４６】
2019531761.tif 000017
2019531761.tif 000018
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実施例７：ＰＤ１ヒト抗体の生産
１．ｓｃＦｖ形態をＩｇＧ形態に転換（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）
選別された２５種のＰＤ１に対する単一クローンファージ抗体をファージからＩｇＧ全体ベクターに転換するために重鎖と軽鎖に対してＰＣＲ（ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ，ＢＩＯ−ＲＡＤ）を行った。その結果、重鎖と軽鎖を得、制限酵素でベクターと各クローンの重鎖、軽鎖を切断した。ベクターと重鎖はそれぞれＤＮＡ−ゲル抽出キット（ＤＮＡ−ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ：Ｑｉａｇｅｎ）でＤＮＡ溶出した。ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）はベクター１ｕｌ（１０ｎｇ）重鎖１５ｕｌ（１００〜２００ｎｇ）、１０ｘバッファー２ｕｌ、リガーゼ（１Ｕ／ｕｌ）１ｕｌ、蒸溜水を混合して室温で１〜２時間放置後、形質転換細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ：ＸＬ１−ｂｌｕｅ）に入れて氷に５分間置き、４２℃で９０秒間熱衝撃（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）を与えた。
【０１４７】
熱衝撃後に培地１ｍｌを入れて１時間３７℃で育てた後、ＬＢ  Ａｍｐプレートにスプレッドして３７℃で１６時間培養した。こうして得たコロニーを取ってＬＢ  Ａｍｐ培地５ｍｌを接種し、３７℃で１６時間培養後にＤＮＡ−ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｎｕｃｌｏｇｅｎ）を用いてＤＮＡ−ｐｒｅｐを行った。得られたＤＮＡは、配列分析を依頼した（ソルジェント社）。
【０１４８】
その結果、全体ＩｇＧに転換したＰＤ１に対する２５個のクローンの重鎖と軽鎖の配列がファージ抗体の配列と一致することを確認した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に形質感染するために、全体ＩｇＧに転換した各クローンの重鎖と軽鎖はＬＢ  Ａｍｐ  １００ｍｌ培地で育て、ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ）を用いてＤＮＡを得た。
【０１４９】
２．ヒト抗体の生産
クローニングされたｐＮＡＴＶＨとｐＮＡＴＶＬベクターは６：４の割合でＨＥＫ２９３Ｆ細胞に同時形質感染（ｃｏ−形質感染）して７日目の上澄み液を回収し、遠心分離と０．２２μｍＴｏｐ−フィルターを用いて細胞と浮遊物を除去した後、上澄み液を集めて蛋白質Ａ親和度クロマトグラフィーを行ってＩｇＧ抗体を精製した。精製後にグリシンバッファー（ｇｌｙｃｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて抗体を分離し、最終再サスペンションバッファー（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）はＰＢＳとなるようにバッファーを交換した。精製された抗体をＢＣＡ及びナノドロップ（ｎａｎｏ  ｄｒｏｐ）を用いて定量し、２５種の抗体を還元、非−還元条件で各５ｕｇずつローディングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析して精製蛋白質の純度及び移動度（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）状態を確認した。また、上澄み液の一部は親抗体との発現率を比較するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥにローディングしたし、大部分の抗体が親抗体に比べて発現率が増加した。その結果は図１１から確認できる。
【０１５０】
実施例８：ＰＤ１単一クローン抗体の特性
１．抗体の活性評価
選別された抗体の活性評価実験はＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１遮断バイオアッセイキット（ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｂｉｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ：ｐｒｏｍｅｇａ，Ｊ１２５０）を用いて進行した。ＰＤ−Ｌ１が高発現しているＣＨＯ細胞株を９６−ウェルプレートに塗抹し、１６時間以上培養後、一定濃度で連続希釈された各抗体を処理して、ヒトＰＤ−１が高発現するＪｕｒｋａｔ細胞株を６時間共に培養した。抗体の阻害回復程度は、ルシフェラーゼが基質を分解して生じる発光強度から分かり、分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５  ｓｐｅｃｔｒａｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国）で測定した。２４種のＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体形成によって減少していたシグナルを回復させる値で抗体の活性を確認した。その結果、４５Ｄ６抗体では４５Ｄ６−３Ｄ２、４５Ｄ６−３Ｈ７、４５Ｄ６−５Ｂ２、４５Ｄ６−５Ｂ５が、４９Ａ２抗体では４９Ａ２−１Ｂ２、４９Ａ２−１Ｈ８、４９Ａ２−２Ａ６、４９Ａ２−２Ｂ９が親抗体に比べて活性が増加したし、対照抗体と類似した活性度を示した（図１２）。
【０１５１】
ＰＤ−１抗体８種（４５Ｄ６−３Ｄ２、４５Ｄ６−３Ｈ７、４５Ｄ６−５Ｂ２、４５Ｄ６−５Ｂ５、４９Ａ２−１Ｂ２、４９Ａ２−１Ｈ８、４９Ａ２−２Ａ６、４９Ａ２−２Ｂ９）に対してさらに活性評価を濃度依存的に測定するために段階希釈をしてＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１遮断バイオアッセイを再び進行した結果、減少していたシグナルを濃度勾配依存的に回復させた。その回復程度はＥＣ５０（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＡｂ  ａｔ  ５０％  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｓｉｇｎａｌ）で表すことができ、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を用いて分析した。ＥＣ５０のＩｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｆｆｉｃａｃｙ阻害回復能力は４９Ａ２−１Ｂ２において最も高かった（図１３、表１１）。
【０１５２】
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２．過発現細胞に対するＰＤ１抗体の親和度
ヒトＰＤ−１を高発現させる形質転換細胞プールはヒトＰＤ−１（ＮＭ＿００５０１８．２）或いはヒトＰＤ−Ｌ１（ＮＭ＿０１４１４３．２）を含んでいるｐｃＤＮＡ３．１プラスミドをＨＥＫ２９３Ｅに形質転換させ、４００ｕｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎ（＃Ｒ２５００１，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）の入っている選択的培地で選別した。各細胞プールはそれぞれａｎｔｉ−ＰＤ−１（＃５５７８６０，ＢＤ）を用いたＦＡＣｓ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）分析によって確認されて選択され、ＦＡＣｓ結合アッセイやＦＡＣｓ競合アッセイ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）のような機能評価法に使用された。ヒトＰＤ１を高発現させる形質転換細胞プールのそれぞれを試料当たり０．５〜１×１０６の細胞を準備し、抗体をそれぞれ一定の希釈倍数で連続的に希釈して、準備した細胞と４℃で２０分間反応させた。その後、細胞は２％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）の含まれたＰＢＳ（＃ＬＢ００１−０２，ｗｅｌｇｅｎｅ）で３回洗浄し、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）蛍光物質が結合された抗−ヒトＩｇＧ抗体（＃ＦＩ−３０００、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ）を用いて４℃で２０分間反応後、同じ洗浄過程を経た後に０．５ｍｌの２％  ＦＢＳ（＃２６１４０−０７９，Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ）の入っているＰＢＳで懸濁させた後、流細胞分析機であるＦＡＣＳＣａｎｔｏ  II  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を用いて分析した。
【０１５３】
ヒトのＰＤ−１を高発現させる形質転換細胞プールのそれぞれを試料当たり０．５×１０６の細胞を準備し、抗体をそれぞれ一定の希釈倍数で連続的に希釈して、準備した細胞と４℃で２０分間反応させた。その後、細胞は２％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）の含まれたＰＢＳ（＃ＬＢ００１−０２，ｗｅｌｇｅｎｅ）で３回洗浄し、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）蛍光物質が結合された抗−ヒトＩｇＧ抗体（＃ＦＩ−３０００、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ）を用いて４℃で２０分間反応後、同じ洗浄過程を経た後に０．５ｍｌの２％  ＦＢＳ（＃２６１４０−０７９，Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ）の入っているＰＢＳで懸濁させた後、流細胞分析機であるＦＡＣｓＣａｎｔｏ  II  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を用いて分析した。結合力は平衡解離定数（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｋｄ）をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６の分析関数を用いて求めた。図１５によれば、細胞表面に過発現したヒトＰＤ−１に対して濃度依存的に結合した抗体の結合力をＭＦＩ（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）から分かる。図１４及び図１５によれば、４９Ａ２（Ｐａｒｅｎｔ４９Ａ２）以外の抗体が類似の結合力を示した。
【０１５４】
３．酵素免疫吸着を用いたＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１或いはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２複合体の形成を防ぐ抗体の阻害能力
ヒトＰＤ−１−Ｆｃ（Ｓ１４２０，Ｙ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）或いはＰＤ−Ｌ２−Ｆｃ（＃１０２９２−Ｈ０２Ｈ，Ｓｉｎｏ）を９６−ウェル免疫マイクロプレート（９６−ｗｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ：＃４３９４５４，Ｔｈｅｒｍｏ）のウェルに４℃で１６時間固定させ、０．０５％  ｔｗｅｅｎ−２０（＃Ｐ９４１６，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の入っているＰＢＳで３回洗浄後、４％スキムミルク（＃２３２１２０，Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）の含まれた洗浄液で常温に１時間放置することによって非特異的結合を遮断した。その間に一定希釈倍数で連続希釈された各抗体とヒトＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ（Ｓ１４７９，Ｙ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）或いはＰＤ−１−Ｈｉｓ（Ｓ１３５２，Ｙ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を常温に１時間反応させた後、準備したマイクロプレートに入れて常温に１時間放置する。同じ洗浄方法を適用した後、ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ−Ｈｉｓ抗体（＃ＭＡ１−２１３１５−ＢＴＩＮ，Ｔｈｅｒｍｏ）を１：２０００に希釈してマイクロプレートのウェルに入れて常温に１時間反応させ、同じ方法で洗浄した後にＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｐｏｌｙ−ＨＲＰ抗体（＃２１１４０、Ｐｉｅｒｃｅ）を１：５０００に希釈してマイクロプレートのウェルに入れて常温に１時間反応させた後、同じ方法で洗浄した。１００ｕｌ  ＴＭＢ基質溶液（＃Ｔ０４４０，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を入れた後、光を遮断して常温で３分間放置後に５０ｕｌ  ２．５Ｍ硫酸（＃Ｓ１４７８，Ｓａｍｃｈｕｎ）を入れて反応を中断させ、分光光度計（＃ＧＭ３０００、Ｇｌｏｍａｘ(登録商標)  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を図１６に示した。
【０１５５】
４．ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６を用いたＰＤ１抗体の親和度
ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ）機器で行った。ＧＬＣセンサーチップ（ＢｉｏＲａｄ）を機器に装着し、ＰＢＳＴ緩衝溶液で洗浄した後、ＥＤＣ／ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ混合液でカルボキシメチルデキストランの表面を活性化させた。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）緩衝液（ｐＨ５．０）に５ｕｇ／ｍｌ濃度で溶かしたＰＤ１−ｈＦｃを注入してＧＬＣセンサーチップに固定化させた。
【０１５６】
ＰＤ１蛋白質と反応しないで残っている活性化されたカルボキシグループを非活性化させるために１Ｍエタノールアミンを流し、センサーチップに結合していない蛋白質を洗浄するために１０ｍＭグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、ｐＨ２．０を注入した。その後、ＰＢＳＴ緩衝液を用いて抗体を濃度別（３０ｎＭ〜０．１２３ｎＭ）に３０ｕｌ／ｍｉｎ流速で１０分間流しつつ、時間による結合と解離過程中のセンソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）データを収集した。
【０１５７】
平衡状態におけるセンソグラムデータを濃度によってプロッティング（ｐｌｏｔｔｉｎｇ）及びフィッティング（ｆｉｔｔｉｎｇ）をして平衡解離定数（ＫＤ）を計算した結果、４９Ａ２（２Ｂ９）は０．００１ｎＭであって、ＰＤ１抗原に対して高い親和度を示した（図１７）。
【０１５８】
他の抗体のヒトＰＤ−１蛋白質に対する親和度、サルのＰＤ−１蛋白質に対する親和度及びマウスのＰＤ−１蛋白質に対する親和度は、表１２〜表１４に記載した通りである。
【０１５９】
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実施例９：ＰＤ１単一クローン抗体のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）決定
ＰＤ１抗原に結合する単一クローンｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅを２ｘＹＴＣＭ、２％グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２培地に３７℃で１６時間培養した。このように育てた細胞をＯＤ６００で値が０．１となるように２ｘＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２培地に入れた後、３７℃でＯＤ６００でその値が０．５〜０．７となるように２〜３時間培養した。Ｍ１ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）をＭＯＩ値が１：２０となるように感染し、２ｘＹＴＣＭＫ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  １ｍＭ  ＩＰＴＧ培地に３０℃で１６時間培養した。
【０１６０】
９６−ウェル免疫−プレートに抗原ＰＤ１野生型（ＰＤ１  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ：ＷＴ）又は多数の変異体（ｍｕｔａｎｔｓ：図１８）をウェル当たり１００ｎｇずつ４℃で１６時間コードした後、ＰＢＳに溶かした４％スキムミルクを用いて各ウェルを遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。各ウェルごとに０．２ｍｌ  ＰＢＳ／Ｔを使って洗った後、１６時間培養した単一クローンｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅ（ｅａｃｈ１００ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅ）を各ウェルに１００μｌずつ入れて常温で２時間反応させた。さらに、各ウェルごとに０．２ｍｌ  ＰＢＳ／Ｔを使って４回洗った後、２次抗体（ｓｅｃｏｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であるａｎｔｉ−Ｍ１３−ＨＲＰを１／２０００に希釈し、室温で１時間反応させた。０．２ｍｌ  ＰＢＳ／Ｔで洗った後に発色して吸光度４９０ｎｍで測定した。
【０１６１】
その結果、選択された単一クローンｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅ、対照ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅとＰＤ−１変異体に対して異なる結合態様を示すので、個別のエピトープを有することが確認できた（図１９）。
【０１６２】
９６−ウェル免疫−プレートに抗原ＰＤ１野生型（ＰＤ１  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ：ＷＴ）又は多数の変異体（図１８）をウェル当たり１００ｎｇずつ４℃で１６時間コーティングした後、ＰＢＳに溶かした４％スキムミルクを用いて各ウェルを遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。各ウェルごとに０．２ｍｌ  ＰＢＳ／Ｔを使って洗った後、１６時間培養した単一クローン抗体を各ウェルに１００μｌ（１ｕｇ／ｍｌ）ずつ入れて常温で２時間反応させた。また、各ウェルごとに０．２ｍｌ  ＰＢＳ／Ｔを使って４回洗った後、二次抗体であるａｎｔｉ−Ｆａｂを１／２０００に希釈し、室温で１時間反応させた。０．２ｍｌ  ＰＢＳ／Ｔで洗った後に発色して吸光度４９０ｎｍで測定した。
【０１６３】
その結果、対照抗体とＰＤ−１変異体に対して異なる結合態様を示すので、個別のエピトープを有することが確認できた（図２０）。
【０１６４】
実施例１０：ＰＤ１親抗体の特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）
ＰＤ１親抗体と対照抗体（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）に対してＰＤ１抗原以外の多数の抗原（表１５）との結合力を調べるために、精製された約９０個の不特定抗原を９６ウェル免疫−プレートにウェル当たり１００ｎｇずつ４℃で１６時間コーティングした後、ＰＢＳに溶かした４％スキムミルクを用いて各ウェルを遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。各ウェルごとに０．２ｍｌ  ＰＢＳ／Ｔを使って洗った後、親抗体及び対照抗体を各ウェルに１００ｎｇずつ入れて常温で２時間反応させた。さらに、各ウェルごとに０．２ｍｌ  ＰＢＳ／Ｔを使って４回洗った後、二次抗体であるａｎｔｉ−ｋａｐｐａ−ＨＲＰを１／１０００に希釈して室温で１時間反応させた。０．２ｍｌ  ＰＢＳ／Ｔで洗った後に発色して吸光度４９０ｎｍで測定した。
【０１６５】
［表１５］
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その結果、対照抗体、親抗体両方とも不特定抗原には結合せず、ＰＤ１抗原にのみ特異的に結合することが確認できた（図２１）。
【０１６６】
実施例１１：ＰＤ１単一クローン抗体の臨時発現システムでの生産性比較
最適化された抗体を臨時発現システムを用いて生産し、精製時に優れた物性によって比較的均一で且つ高い生産量を有することが分かる。一部の抗体は既存に商用化された抗体よりも高い生産を有することが分かる（図２２）。
【０１６７】
実施例１２：ＰＤ１単一クローン抗体の異種ＭＬＲ（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ＭＬＲ）反応での活性増加
個別のヒトから分離された単球由来樹状細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）にＴ細胞を１：１０の割合で混ぜ、５日培養後に培養液のインターフェロンガンマの量を測定すると、４５Ｄ６、４９Ａ２の親抗体を入れたものにおいて濃度に依存してインターフェロンガンマの量が増加することを確認した（図２３）。
【０１６８】
実施例１３：ＰＤ１単一クローン抗体の熱安定性テスト
抗体蛋白質をＤＰＢＳに希釈して３ｕＭ、４５ｕｌを作り、２００ｘ  ｓｙｐｒｏ  ｏｒａｎｇｅ  ｄｙｅ（＃Ｓ６６５０，Ｔｈｅｒｍｏ）５ｕｌと混ぜてｑＰＣＲ  Ｔｕｂｅ（＃Ｂ７７００９，Ｂ５７６５１，ｂｉｏｐｌａｓｔｉｃｓ）に５０ｕｌずつ分注する。Ｂｉｏｒａｄ  ＣＦＸ９６  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ機器を用いてｑＰＣＲを実施した。ｑＰＣＲ条件は次のように２５℃で３０秒間反応後、９９℃まで１度ずつ増加させるが、各温度で１分間反応させ、最後の２５℃で１０秒反応をさせて終えた。抗体構造が解かれる速度定数としてはＴｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、溶融温度）を使用した。その結果は次表１６の通りである。
【０１６９】
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【産業上の利用可能性】
【０１７０】
本発明のＰＤ−１に結合する新規な抗体又はその抗原結合断片はＰＤ−１に結合してその活性を抑制し得るので、ＰＤ−１に関連した様々な疾患の免疫治療剤の開発に有用である。
【０１７１】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界において通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は単に好適な実施態様に過ぎず、それらによって本発明の範囲が制限されるわけでないという点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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