(57)【要約】  本発明によれば、一般に、ペトリ皿に合うように適合されたマイクロ流体アリコート（ＭＡ）チップは、複数のマイクロチャネルによって複数のサイドウェル（注出口）に接続されたセンターウェル（注入口）を有する。いくつかの細胞を有する比較的大きな（例えば１２０μＬの）細胞懸濁液をＭＡチップの注入口に注入し、単一の細胞を、実質的に同時かつ均一に、正圧で駆動する流れを介して、単一の細胞を有するいくつか（例えば１２０個）のサイドウェルに一分未満で分散させうる。ＭＡチップは細胞回収効率が高い。単一の細胞の迅速な単離および容易な識別、高い細胞生存率、高い濃縮係数、およびサブマイクロリットル単一細胞懸濁液の簡便な移入のために、ＭＡチップは、血液、単一細胞クローニング、ＰＣＲおよびシークエンシングからのＣＴＣ単離とよく適合する。【選択図】図１
2019503197.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の細胞の単離を実行するためのマイクロ流体アリコート（ＭＡ）チップであって、該ＭＡチップは：
半径、中心、上面、底面、外縁および厚さを有するディスクの形態のチップと；
チップの実質的に中心に配置され、チップの上面へと伸長し、チップの上面からアクセス可能な単一のセンターウェル（注入口）と；
チップの環状外側部分に配置され、チップの上面へと伸長し、チップの上面からアクセス可能な複数のサイドウェル（注出口）と；
チップの底面へと伸長し、かつ、センターウェルからサイドウェルへ伸長し、センターウェルおよびサイドウェルと流体連通する、複数のチャネルと、を含む、ＭＡチップ。
【請求項２】
ＭＡチップは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ＰＭＭＡ（ポリ（メタクリル酸メチル））、ＰＳ（ポリスチレン）、およびＰＣ（ポリカーボネート）、からなる群から選択される可撓性または半剛性の材料の薄いシートを含む、請求項１に記載のＭＡチップ。
【請求項３】
ＭＡチップの厚さは約１ｍｍであること；
ＭＡチップは、ペトリ皿内に収まるサイズおよび形状であること；および、
チップの半径は約３ｃｍであること、
の少なくとも１つを特徴とする、請求項１に記載のＭＡチップ。
【請求項４】
センターウェルはチップを完全に貫通し、および、
サイドウェルはチップを完全に貫通する、
請求項１に記載のＭＡチップ。
【請求項５】
センターウェルの直径は約３ｍｍであること；および、
センターウェルの容量は約４μＬであること、
の少なくとも１つを特徴とする、請求項１に記載のＭＡチップ。
【請求項６】
サイドウェルの少なくともいくつかの直径はそれぞれ約１．５ｍｍであること；および、
サイドウェルの少なくともいくつかの容量はそれぞれ約１μＬであること、
の少なくとも１つを特徴とする、請求項１に記載のＭＡチップ。
【請求項７】
第１のセットの複数のサイドウェルは、チップの中心から第１の半径（ｒ１）上に配置され；および
第２のセットの複数のサイドウェルは、チップの中心から第２の半径（ｒ２）上に配置され；
第２の半径（ｒ２）は第１の半径（ｒ１）よりも大きい、請求項１に記載のＭＡチップ。
【請求項８】
第１および第２のセットのサイドウェルは、第２のセットのサイドウェルが第１のセットの６０個のサイドウェルの間の周方向位置に配置されるように交互に配置される、請求項７に記載のＭＡチップ。
【請求項９】
第１および第２のセットのサイドウェルは、チップの環状外側部分の周りに均等に分布している、請求項７に記載のＭＡチップ。
【請求項１０】
チップの環状外側部分は、チップの半径の少なくとも７０％から、チップの外縁へ伸長する、請求項１に記載のＭＡチップ。
【請求項１１】
チャネルはセンターウェルからサイドウェルへ放射状に伸長すること；
チャネルはチップへと部分的にのみ伸長すること；
チャネルの幅は約３０μｍであること；および、
チャネルはセンターウェルからサイドウェルへの単一の細胞の輸送に対応するサイズおよび形状であること、
の少なくとも１つを特徴とする、請求項１に記載のＭＡチップ。
【請求項１２】
顕微鏡での観察下でサイドウェルを一意に識別するために、サイドウェルの少なくともいくつかの内側に配置された比較的小さなμｍスケールのマーキング；および、
肉眼での観察下でサイドウェルを一意に識別するために、サイドウェルの少なくともいくつかの外側に配置された比較的大きなｍｍスケールのマーキング、
をさらに含む、請求項１に記載のＭＡチップ。
【請求項１３】
センターウェルへの細胞懸濁液の充填を容易にするために、使用中にセンターウェルの上に配置されるように適合された、貫通する穴を有するキャップをさらに含む、請求項１に記載のＭＡチップ。
【請求項１４】
キャップは円筒形であり、細胞懸濁液の充填中にキャップを決まった位置に一時的に固定するために、その底面からセンターウェル内に伸長する唇部または肩部を含む、請求項１３に記載のＭＡチップ。
【請求項１５】
キャップはチップと一体的に形成される、請求項１３に記載のＭＡチップ。
【請求項１６】
少数の細胞を有する細胞懸濁液から単一の細胞を単離する方法であって、該方法は：
単一のセンターウェルと、複数のマイクロチャネルによって単一のセンターウェルに接続される複数のサイドウェルと、を有するマイクロ流体アリコート（ＭＡ）チップの注入口に少数の細胞を有する細胞懸濁液を注入する工程；および
正圧で駆動する流れによってマイクロチャネルを介してサイドウェルへ単一の細胞を移動させる工程、を含む、方法。
【請求項１７】
血液から単一または希少な循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を識別および単離する工程であって、ここで、ＣＴＣは単一または多段階のＭＡチップ操作の後にサイドウェルに捕捉される、工程；および、
複雑なマトリックスから単一の細胞および対象を識別および単離する工程であって、マトリックスから細菌、ビーズ、粒子、ウイルスを含む単一の対象を単離することを含み、結核を単離することを含み、単一のクローンを単離するために特定の遺伝子型／表現型の酵母細胞を単離することを含む、工程、
の少なくとも１つをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
サイドウェルにおいて細胞を識別する工程；および、
単一の細胞のみを含むサイドウェルから細胞を回収する工程、
をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
単一の細胞の分析を実行する方法であって、該方法は：
中心および表面を有するディスクの形態のチップと；
チップの実質的に中央に配置された単一のセンターウェル（注入口）と；
チップの環状外側部分に配置された複数のサイドウェル（注出口）と；
センターウェルからサイドウェルへ伸長する複数のチャネルと；
を含むマイクロ流体アリコートチップを提供する工程を含み、
該方法は、さらに、
単一のセンターウェルと、複数のマイクロチャネルによってセンターウェルに接続される複数のサイドウェルと、を有するマイクロ流体アリコート（ＭＡ）チップの注入口に細胞懸濁液を注入する工程；および、
正圧で駆動する流れによって、マイクロチャネルを介してサイドウェルへ単一の細胞を移動させる工程、を含む、方法。
【請求項２０】
センターウェルに無細胞培地を添加して正の静水圧を発生させ、チャネル中に残る単一の細胞をサイドウェルへ流入させる工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、概して（処理または分析などのための）単一の細胞の単離のための方法および装置に関し、より詳細には、マイクロ流体技術を用いて単一の細胞を単離するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロ流体技術は、少量の流体を処理して多重、自動、高スループットのスクリーニングを実現するシステムの設計に実用的に適用される、工学、物理、化学、生化学、ナノテクノロジー、バイオテクノロジーに渡る、多くの学問領域の分野である。マイクロ流体技術の進歩は、酵素分析（例えば、グルコースおよび乳酸アッセイ）、ＤＮＡ分析（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応および高スループットなシークエンシング）、およびプロテオミクスのための分子生物学処理に革命をもたらしている。マイクロ流体バイオチップの基本的な考え方は、検出などのアッセイ操作と、サンプル前処理およびサンプル調製を１つのチップ上で統合することである。
【０００３】
細胞集団における表現型および遺伝子型の異種性が広く存在する証拠が増えている。個々の希少な細胞からの重要な情報が、バルク細胞分析によってマスクされることがある。したがって、単一の細胞の分析、特にＤＮＡおよびＲＮＡのシークエンシングは、クローン突然変異、腫瘍進化、胚発生、および免疫学的介入にとって非常に重要になっている。
【０００４】
そのような下流の単一の細胞の遺伝子分析のための初期および重要な工程は、不均一な細胞集団から対象の生単一細胞をサブマイクロリットルの培地容量に効果的に単離し、続いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）分析を行うことである。（ＰＣＲは、ＤＮＡの一部の単一または少数のコピーを数桁に増幅し、数千から数百万の特定のＤＮＡシークエンスのコピーを生成するために使用される、分子生物学における技術である）。
【０００５】
ホルマリン固定パラフィン包埋組織から単一の細胞を単離するために主に使用されるレーザー捕捉顕微解剖（ｌａｓｅｒ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）の他に、現在、細胞懸濁液から単一の細胞を単離するために、４つの主なアプローチがある。
−最も頻繁に使用される方法として、連続希釈がコロニー形成のために広く適用されているが、より良好な増幅反応のために単一の細胞をサブマイクロリットル懸濁液に単離するべきＰＣＲ分析には適していない。それでも、これらのコロニーは、９６ウェルプレートに播種した後に正確に計数することが非常に難しい単一の細胞に由来するかどうかを判断するためのさらなる分析に依然として必要とされている。
−マイクロマニピュレーションは、主にゲノム／トランスクリプトームシークエンシングのための単一の細胞を単離するために開発されている。しかしながら、時間のかかるプロセスおよび低いスループットという特徴が、数十および数百の単一の細胞（ｃｅｌｌｓ  １０）の迅速な調製といういや増す要求を満たすことを困難にする。さらに、単一の細胞を吸引するために研究者の口の力を使用する場合、個人的なスキルに非常に依存しているようである。
−フローサイトメトリーは、あらかじめ設定された蛍光ゲーティング戦略に基づく特異的細胞の高スループットな選別に特に適した、十分に確立された方法であるが、高い単一細胞生存率の維持は困難であり、貴重な臨床サンプルなどの限られた数の細胞が利用可能である場合には機能しない。
−マイクロチャネルおよび細胞の同等のサイズ寸法のために、最近開発されたマイクロ流体技術は、単一の細胞のマニュピュレーションのための重要な方法を提供する。しかしながら、マイクロ流体マニュピュレーションのためにされなるスキルが必要になること、既存の実験プラットフォームとの適合性の乏しさ、およびさらなる分析のためにマイクロチップから単離された単一の細胞を選択的に回収することができない／難しい、といった潜在的な欠点が、共通の実験室でのこれらの適用を大きく制限する。
【０００６】
参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６６３２６５６号（２００３−１０−１４；  Ｔｈｏｍａｓら）は、液体培地中で細胞増殖および細胞ベースのアッセイを実施するための装置および方法を開示する。この装置は、複数のマイクロチャネル要素を支持するベースプレートを備え、各マイクロチャネル要素は、細胞増殖チャンバと、液体サンプルをそこに供給するための注入口チャネルと、液体サンプルをそこから除去するための注出口チャネルとを含み、カバープレートはチャンバおよび接続チャネルを画定するベースプレート上に位置し、該カバープレートには、チャネルに接続するための穴が設けられている。細胞接着および細胞増殖のための手段が細胞増殖チャンバに組み込まれる。より詳細には、該明細書に示され、記載されているように：
図１ｂを参照すると、装置は、ディスクの中心に向かって配置されたサンプル導入ポートを提供するために微細加工され、かつ、放射状に分散された複数のマイクロチャネルアッセイ要素（６）に順に接続される環状サンプルリザーバ（９）に接続される、回転可能なディスク（１８）を含み、上記マイクロチャネル要素のそれぞれは、細胞増殖チャンバと、サンプル導入チンネルと、液体を除去するための注出口チャネルと、閉鎖されるチャンバおよび接続チャネルを画定するように前記ディスク上に配置されるカバープレートと、を含む。各マイクロチャネル要素は、一方の端部で中央サンプルリザーバ（９）に接続され、反対側の端部で共通の廃棄チャネル（１０）に接続される。
【０００７】
微細加工装置（図１ａに示される）の放射状に分布するマイクロチャネル要素（６）の各々は、その左側端部でリザーバ（９）に接続されるサンプル注入口チャネル（１）と、細胞を増殖させるための、チャネル（４）を介してアッセイチャンバ（３）に接続される細胞増殖チャンバ（２）と、その右側端部で廃棄チャネル（１０）に接続される注出口チャネル（５）と、を含む。
【０００８】
適切なように、ディスク（１８）は、１または２ピースの成形構造であり、一緒に組み立てられた別個の成形品によって任意に透明なプラスチックまたはポリマー材料で形成され、規定された位置に開口部を有する閉鎖構造を提供して、液体をデバイスに充填し、廃液を除去することを可能にする。最も単純な形態では、このデバイスは２つの相補的な部品として生産され、１つまたはそれぞれは、成形された構造体を担持し、これは、これらの部品を一緒に固定した時、一連の相互接続されたマイクロチャネル要素をソリッドディスクの本体内に形成する。あるいは、マイクロチャネル要素はマイクロマシニング法（ｍｉｃｒｏ−ｍａｃｈｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ）によって形成されてもよく、ここにおいて、マイクロチャネル要素を形成するマイクロチャネルおよびチャンバはディスクの表面に微細加工され、および、カバープレート、例えばプラスチックフィルムがチャネルおよびチャンバを囲むように表面に接着される。
【０００９】
デバイスの規模は、その使用によってある程度決定されるであろう。すなわち、デバイスは、真核細胞との使用に適合する大きさであろう。これは、細胞の移動を可能にするように設計された任意のチャネルに下限を課し、各アッセイに存在する細胞の数に応じて細胞の封じ込めまたは増殖の領域のサイズを決定するであろう。接着培養物として増殖する平均的な哺乳動物細胞は〜３００μｍ２の面積を有し；非接着細胞および付着していない接着細胞の球形直径は〜１０μｍである。結果として、デバイス内の細胞の移動のためのチャネルは、２０〜３０μｍまたはそれ以上の桁の寸法を有する可能性が高い。細胞保持領域のサイズは、アッセイを実施するのに必要とされる細胞の数に依存する（数は感受性要件および統計的要件の両方によって決定される）。典型的なアッセイでは、接着細胞が、１５０，０００〜３００，０００μｍ２の構造、すなわち直径約４００〜６００μｍの円形「ウェル」を必要とする、最小５００〜１０００個の細胞が必要であることが想定される。
【００１０】
マイクロチャネル要素の構成は、好ましくは、サンプル注入口ポートによってサンプルリザーバに流体培地中の細胞の懸濁液を適用することによって細胞増殖チャンバを同時に播種し、続いて、  遠心力によってディスクの外周に向かって細胞懸濁液を外向きに移動させるのに十分な速度で適切な手段によりディスク（１８）を回転させることを可能にするように選択される。液体の移動により、細胞懸濁液は注入口マイクロチャネル（１、８）のそれぞれに沿って細胞増殖チャンバ（２、７）に分配される。ディスクの回転速度は、液体が細胞増殖チャンバ（２、７）を満たすように流れるのを可能にするのに十分だが、液体が細胞増殖チャンバの反対側のより小さい半径の制限チャネル（４、１６）に入るには不十分な遠心力を提供するように選択される。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の目的は、単純で迅速で多目的な単一の細胞の単離のための技術（方法および装置）を提供することである。
【００１２】
アリコートとは、一般的に、より大量の物質、典型的には液体、から代表的なサンプルを採取することをいう。この場合、アリコートとは、多数の細胞を有する懸濁液から単一の細胞を単離することをいう。このプロセスは、マイクロ流体技術を使用して、液体環境で行われ、したがって、「マイクロ流体アリコート」と呼ばれる。
【００１３】
本発明によれば、一般に、ディスクの形態であり得、かつ、ペトリ皿に合うように改変され得る、マイクロ流体アリコート（ＭＡ）チップ（または、ＭＡチップ、ＭＡ−チップと呼ばれることがある物体）は、複数のサイド（または外側）ウェル（注出口）へと複数のマイクロチャネル（チャネル）に接続されるセンターウェル（注入口）を有する。操作上では、少数の（例えば約２〜１２０の）細胞を有する細胞懸濁液をＭＡチップの注入口へと注入し（ピペットにより正圧で駆動する流れでセンターウェルへと押し込まれる）、そして、単一の細胞は、正圧で駆動する流れを介してマイクロチャネルを通ってサイド（外側）ウェルのいくつかに移送（移動、輸送）され得る。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態（実施例）によれば、単一の細胞の単離を実行するためのマイクロ流体アリコート（ＭＡ）チップは：半径、中心、上面、底面、外縁および厚さを有するディスクの形態のチップと；チップの実質的に中心に配置され、チップの上面へと伸長し、チップの上面からアクセス可能な単一のセンターウェル（注入口）と；チップの環状外側部分に配置され、チップの上面へと伸長し、チップの上面からアクセス可能な複数のサイドウェル（注出口）と；チップの底面へと伸長し、かつ、センターウェルからサイドウェルへ伸長し、センターウェルおよびサイドウェルと流体連通する、複数のチャネルと、を含みうる。
【００１５】
該チップは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ＰＭＭＡ（ポリ（メタクリル酸メチル）、ＰＳ（ポリスチレン）、およびＰＣ（ポリカーボネート）、からなる群から選択される可撓性または半剛性の材料の薄いシートを含む。チップの厚さは約１ｍｍであってもよく、ペトリ皿に収まるサイズおよび形状であってもよく；チップの半径は約３ｃｍであってもよい。センターウェルはチップを完全に貫通してもよく；および、サイドウェルはチップを完全に貫通してもよい。
【００１６】
センターウェルの直径は約３ｍｍであってもよく、容量は約４μであってもよい。サイドウェルの少なくともいくつかの直径は、約１．５ｍｍであってもよく、容量は約１μであってもよい。
【００１７】
第１のセットの複数のサイドウェルは、チップの中心から第１の半径（ｒ１）上に配置されてもよく、第２のセットの複数のサイドウェルは、チップの中心から第２の半径（ｒ２）上に配置されてもよい。第２の半径（ｒ２）は第１の半径（ｒ１）よりも大きくてもよい。第１および第２のセットのサイドウェルは、第２のセットのサイドウェルが、第１のセットの６０個のサイドウェルの間の周方向位置に配置されるように交互に配置されてもよい。第１および第２のセットのサイドウェルは、チップの環状外側部分の周りに均等に分布してもよく、チップの環状外側部分は、チップの半径の少なくとも７０％から、チップの外縁へ伸長してもよい。
【００１８】
チャネルはセンターウェルからサイドウェルへ放射状に伸長してもよい。チャネルはチップへと部分的にのみ伸長してもよい。チャネルの幅は約３０μｍであってもよい。チャネルはセンターウェルからサイドウェルへの単一の細胞の輸送に対応するサイズおよび形状であってもよい。
【００１９】
ＭＡチップはさらに：顕微鏡での観察下でサイドウェルを一意に識別するために、サイドウェルの少なくともいくつかの内側に配置された比較的小さなμｍスケールのマーキング；および、肉眼での観察下でサイドウェルを一意に識別するために、サイドウェルの少なくともいくつかの外側に配置された比較的大きなｍｍスケールのマーキング、を含みうる。
【００２０】
ＭＡチップは、さらに、センターウェルへの細胞懸濁液の充填を容易にするために、使用中にセンターウェルの上に配置されるように適合され、キャップを貫通する穴を有するキャップをさらに含みうる。キャップは円筒形であってもよく、細胞懸濁液の充填中にキャップを決まった位置に一時的に固定するために、その底面からセンターウェル内に伸長する唇部または肩部を含みうる。キャップはチップと一体的に形成されうる。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態（実施例）によれば、少数の細胞を有する細胞懸濁液から単一の細胞を単離する工程は：単一のセンターウェルと、複数のマイクロチャネルによってセンターウェルに接続される複数のサイドウェルとを有するマイクロ流体アリコート（ＭＡ）チップの注入口に少数の細胞を有する細胞懸濁液を注入する工程；および正圧で駆動する流れによって、マイクロチャネルを介してサイドウェルへ単一の細胞を移動させる工程、を含みうる。
【００２２】
該方法は、血液から単一または希少な循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を識別および単離する工程であって、ここで、ＣＴＣは単一または多段階のＭＡチップ操作の後にサイドウェルに捕捉される、工程を含みうる。該方法は、複雑なマトリックスから単一の細胞および対象を識別および単離する工程であって、マトリックスから細菌、ビーズ、粒子、ウイルスを含む単一の対象を単離することを含み、結核を単離することを含み、単一のクローンを単離するために特定の遺伝子型／表現型の酵母細胞を単離することを含む、工程を含みうる。該方法は、サイドウェル内の細胞を識別し、単一の細胞のみを含むサイドウェルから細胞を回収する工程を含みうる。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態（実施例）によれば、単一の細胞の分析を実行する工程は：中心および表面を有するディスクの形態のチップと；チップの実質的に中央に配置された単一のセンターウェル（注入口）と；チップの環状外側部分に配置された複数のサイドウェル（注出口）と；センターウェルからサイドウェルへ伸長する複数のチャネルと、を含むマイクロ流体アリコート（ＭＡチップ）チップを提供する工程を含みうる。該方法はさらに：単一のセンターウェルと、複数のマイクロチャネルによってセンターウェルに接続される複数のサイドウェルとを有するマイクロ流体アリコート（ＭＡ）チップの注入口に細胞懸濁液を注入する工程；および正圧で駆動する流れによって、マイクロチャネルを介してサイドウェルへ単一の細胞を移動させる工程、を含みうる。該方法はさらに、センターウェルへ無細胞培地を添加して正の静水圧を発生させ、チャネル中に残る単一の細胞をサイドウェルへ流入させる工程を含みうる。
【００２４】
マイクロ流体アリコートは、本明細書に記述されるとおり、細胞のサイズ、形状、運動性と関係なく、簡便で、迅速で、識別可能な、損傷のない細胞単離を可能にしうる。単離された単一の細胞は、増殖してサイドウェル内でクローニングを形成することができ、または、その後のＰＣＲおよび配列分析のためのサブマイクロタイター単一の細胞の懸濁液としてサイドウェルから容易に回収することができる。高効率の濃縮能力のために、この方法は、血液から単一の癌細胞を単離するために適用することもできる。
【００２５】
平行分析のために、単一または複数チャネルのピペットによって限定された液体を等量の複数のアリコートに分割することは、生物学および化学の実験室での普遍的な実験プロセスであり、例えば、手動／自動ピペットを介して細胞懸濁液から単一の細胞を単離するために広く使用されてきた連続希釈がある。しかしながら、より多いアリコート量、および単一の細胞を正確に識別することの困難さにより、単一細胞遺伝子分析と適合しなくなり、また非常に時間がかかる。
【００２６】
これと比較して、マイクロ流体アリコートは、本明細書中に開示されるようにアリコートの量および労力の両方を低減することにおいて有意な利点を有する。いくつかの（１２０などの）サブマイクロリットルのアリコートは、１分以内に良好に調製することができ、単一の細胞を含む単一のウェルを、迅速かつ正確に一般的な倒立顕微鏡で（１ウェル／秒の速度などで）識別できる。
【００２７】
マイクロ流体アリコートは、サンプルの損失が最小（ウェル当たり約１８ｎＬ、単一のマイクロチャネル容量に実質的に等しい）でありながら複数のサブマイクロリットルのアリコートを迅速に得るための簡単で効果的な戦略を提供する。これは、複雑な機器、追加の訓練、さらにはマイクロ流体技術の背景知識さえも必要としない、簡単で経験を問わない方法である。
【００２８】
本明細書で記載されるＭＡチップのほか、ピペット、ペトリ皿、光学顕微鏡などのこのプロセスに関与する他のいくつかの機器は、通常、一般的な研究室においてすぐに利用可能になる。元の細胞懸濁液の導入および単一の細胞の懸濁液の移入を含む、全てのプロセス中の液体取り扱いは、ピペットによってのみ達成され、初心者にとってより利用しやすくなる。
【００２９】
単一の細胞の単離のためにＭＡチップを使用することのいくつかの特徴と利点は以下のものを含みうる。
−簡単な操作
単一の細胞の懸濁液の導入および回収の両方を、事前の訓練を必要とせずに、一般的に使用される空気置換ピペットを使用することのみによって完了しうる。
−早いサンプル導入
単一の細胞の懸濁液を１μｌの容積の１２０個のサイドウェルに分注することは、１分未満しか必要でないことがある。
−簡単な単一の細胞の識別
直径１．５ｍｍのサイドウェル内の単一の細胞は、一般的な光学顕微鏡下で非常に容易に識別することができる（１ウェル／秒）。
−サイドウェルの簡単な追跡
各１．５ｍｍ直径のサイドウェルは、顕微鏡での観察のための小さなマイクロスケールサイズの番号と、裸眼での観察のための大きなマクロスケールサイズの番号とによって同時にマークされる。
−単一細胞ＰＣＲとの適合性
単一の細胞を約１μＬ容量の液体に単離し、その後の単一細胞ＰＣＲおよび配列のために一般的に使用されるピペットによってバイアルに移すことができる。
−高い細胞生存率およびクローニング形成との適合性
単離された単細胞は健康であり、クローニングを形成するまでサイドウェル内で正常に増殖することができる。
−選択的な単一の細胞の単離
単一の細胞を、血液からの循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の単離など、サイズ、懸濁／接着形状、および蛍光に基づいて選択的に単離することができる。
−高スループット操作
１つのＭＡチップが、単一の細胞の単離および分析のために１２０個のサイドウェルを提供する。
−様々な細胞のサイズおよび形状との高い適合性
直径１μｍ〜３０μｍの単一の真核細胞および単一の原核細胞の両方を、１μＬ容量のサイドウェルに効果的に単離することができる。
−低コスト
大量生産では、各ＭＡチップのコストは１ドル未満になりうる。
−殺菌
ＭＡチップは、高圧滅菌器、アルコール浸漬、ＵＶ暴露などの標準的な方法で滅菌することができる。
【００３０】
本発明の他の特徴および態様は、本発明の実施形態による特徴を一例として示す添付の図面と併せて、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。概要は、添付の特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
本発明は、１つまたは複数の様々な実施形態に従って、以下の図を参照して詳細に説明される。これらの図面は、例示のみを目的として提供されており、本発明の典型的または例示的な実施形態を単に示している。これらの図面は、本発明の読者の理解を容易にするために提供されており、本発明の範囲、範囲または適用可能性の限定とみなされるべきではない。例証を明確かつ容易にするために、これらの図面は必ずしも一定の縮尺で作られていないことに留意されたい。
【００３２】
本明細書に含まれるいくつかの図は、異なる視角からの本発明の様々な実施形態を示す。付随する説明文は、このような図を「平面図」、「底面図」、または「側面図」などの図として称することがあるが、そのような参照は単に説明的なものであり、明示的に述べられていない限り、特定の空間的方向において本発明を実施または使用することを示したり必要としたりしない。
【図１】図１は、例示的なマイクロ流体アリコート（ＭＡ）チップを平面から見た図である。
【図１Ａ】図１Ａは、図１を線１Ａ−１Ａで切り取り、図１ＡのＭＡチップの一部を断面から見た図である。（図１Ａの図は、ＭＡチップの右端からセンターウェルのわずかに左に延びている）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１のＭＡチップの一部を拡大し平面から見た図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、図１のＭＡチップの一部を拡大し平面から見た図である。
【図２】マイクロ流体アリコートの方法のフロー図である。
【００３３】
これらの図は網羅的なものではなく、開示された正確な形態に本発明を限定するものではない。本発明は、修正および改変して実施することができ、本発明は特許請求の範囲およびその均等物によってのみ限定されることを理解されたい。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
時折、本発明は、例示的な環境に関して本明細書で記載される。これらの環境に関する説明は、本発明の様々な特徴および実施形態が例示的な適用の文脈において描写されることを可能にするために提供される。この説明を読めば、本発明が様々な代替的な環境においてどのように実施され得るかが当業者に明らかになるであろう。
【００３５】
別段の定めのない限り、本明細書に記載される技術的かつ科学的な用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３６】
本明細書で言及した全ての特許、出願、公開出願および他の刊行物は、その全体が参照により組み込まれる。このセクションに記載された定義が、参照により本明細書に組み込まれる、出願、公開出願、および他の刊行物に記載された定義に反するか又はそれと矛盾する場合、この文献に記載された定義は、参照により本明細書に組み込まれる定義よりも優先する。
【００３７】
本明細書に記載された任意の寸法は、明細書中に別段の指示がない限り、例示的および近似的であるとみなされるべきであり、記載され得る様々な要素の相対的なスケールを示すために解釈され得る。
【００３８】
本発明によれば、一般に、いくつかの細胞を有する比較的大きい（例えば１２０μＬ）細胞懸濁液は、１分未満で単一の細胞を有するいくつかの（例えば１２０などの）アリコートに実質的に同時に均一に分配される。無作為かつ信頼性のある単一の細胞の単離は、いくつかの個々のマイクロウェルを介して、いくつかの個々のサイドウェルと流体連通する単一のセンターウェルを有するマイクロ流体アリコートチップ（ＭＡチップ）を用いて達成されうる。ＭＡチップは、センターウェル内の少数（例えば、約２〜１２０個）の細胞から、正圧で駆動する流れによって、サイドウェル内の単一細胞を効果的に単離するために使用することができる。ＭＡチップは細胞回収効率が高い。単一の細胞の迅速な単離および容易な識別、高い細胞生存率、およびサブマイクロタイター単一細胞懸濁液の簡便な移入により、ＭＡチップは単一細胞のクローニング、ＰＣＲおよび配列決定と十分に適合する。
【００３９】
＜例示的なＭＡチップ＞
図１は、図１は、本明細書で「ＭＡチップ」と呼ばれうる例示的なマイクロ流体アリコート（ＭＡ）チップ（１００）の全体図を示す。図１Ａは、図１のＭＡチップの一部を示す。図１Ｂは、図１のＭＡチップの（拡大された）一部を示す。図１Ｃは、図１のＭＡチップの（拡大された）一部を示す。
【００４０】
ＭＡチップは、約１ｍｍの厚さを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの可撓性または半剛性の材料の薄いシート（１０２）を含みうる。ＭＡチップは、幾何学的中心（ＣＬ）および約６ｃｍの直径（約３ｃｍの半径）を有するディスクの全体的な形状を有してもよい。ＭＡチップの全重量は約１．７ｇであってもよい。ＭＡチップは約８．５ｃｍの直径を有するペトリ皿に合うように改変されるサイズおよび形状であってもよい。ＭＡチップを形成するシートは、ＭＡチップ全体の上面および底面に対応する上面（１０２ａ）および底面（１０２ｂ）をそれぞれ有してもよい。
【００４１】
ＭＡチップは、多角形などのディスクの形態以外であってもよい。主に、以下、ディスクであるＭＡチップについて説明する。
【００４２】
主に、以下、ＭＡチップを完全に貫通することを含む、ＭＡチップの上面及び底面に伸長する様々な特徴（センターウェル、サイドウェル、チャネル）について説明する。
【００４３】
ＭＡチップは、センターウェルから複数のサイドウェル（１１４ａ）、（１１４ｂ）（まとめて「１１４」と呼ぶことがある）に放射状に伸長する複数のチャネル（１１２ａ）、（１１２ｂ）（まとめて「１１２」と呼ぶことがある）によって接続される単一（１つ）のセンターウェル（１１０）を有する。チャネル（１１２）はセンターウェル（１１０）およびサイドウェル（１１４）と流体連通する。
【００４４】
センターウェル（１１０）は、注入口として機能し得、約５００μｍなど、少なくとも部分的にＭＡチップの上面に伸長する丸い穴の形態であってもよい。図１Ａで最もよく見られるように、センターウェルはＭＡチップを完全に貫通してもよい。センターウェルの直径は約３ｍｍであってもよい。センターウェルの容量は４μＬであってもよい。センターウェルはＭＡチップの幾何学的中心に配置されてもよい。センターウェルは、ＭＡチップに細胞懸濁液を充填するために、ＭＡチップの上面からユーザがアクセスすることができる。
【００４５】
サイド（または外側）ウェル（１１４）は、注出口として機能し得、約５００μｍなど、少なくとも部分的にＭＡチップの上面に伸長する丸い穴の形態であってもよい。図１Ａで最もよく見られるように、サイドウェルはＭＡチップを完全に貫通してもよい。サイドウェルの直径は約１．５ｍｍであってもよい。サイドウェルの容量はそれぞれ１μＬであってもよい。サイドウェルは、ＭＡチップの外側円周（または環状）部分（本明細書では「円周」と呼ぶことができる）の周りに分布していてもよい。サイドウェルは、ＭＡチップから単離された細胞を回収するために、ＭＡチップの上面からユーザがアクセスすることができる。
【００４６】
例えば、１２０個のサイドウェル（１１４）があってもよい。いくつかのサイドウェルは、ＭＡチップの中心から第１の半径（ｒ１）上に配置されたサイドウェルの第１のセット（１１４ａ）と、ＭＡチップの中心から第２の半径（ｒ２）上に配置されたサイドウェルの第２のセット（１１４ｂ）に配置されてもよい。例えば、サイドウェルの第１のセットは、ＭＡチップの幾何学的中心から２５ｍｍの半径（ｒ１）上のＭＡチップの円周の周りに均等に（６度ごとに）配置（配列、分配）された６０個のサイドウェルを含んでもよい。および、サイドウェルの第２のセットは、ＭＡチップの幾何学的中心から２８ｍｍの半径（ｒ２）上のＭＡチップの円周の周りに均等に（６度ごとに）配置（配列、分配）された６０個の（６０）サイドウェルを含んでもよい。第１および第２のセットのサイドウェルは、交互に配置されてもよく（ジグザグにされていてもよい）、その結果、第２のセットの６０個のサイドウェルは、第１のセットの６０個のサイドウェルの間の周方向位置に配置され、この場合、ＭＡチップの外側円周部分（または単に「円周」）の周りに３度ごとに均等に配置された１２０個のサイドウェルが存在するであろう。サイドウェルの他の数（多かれ少なかれ）と配置が可能である。図１では、例証を明瞭にするために、サイドウェル（１１４ａ）および（１１４ｂ）のうちのいくつかのみが（符号を付して）標識されている。図１Ａおよび１Ｂは、全体として、サイドウェルの第１のセット（１１４ａ）またはサイドウェルの第２のセット（１１４ｂ）のうちのいずれか１つでありうるサイドウェル（１１４）を指す。図１Ｃは、サイドウェル（１１４ａ）および（１１４ｂ）のうちの（１２０個のうちの）４つのみを示し、いくつかには参照番号が付されている。
【００４７】
ＭＡチップ（１００）は、中心および３ｃｍの半径を有するディスクの形態であってもよい。センターウェルは、ディスクの中心に配置されうる。サイドウェルは、ディスクの「外側円周部分」（または「外側環状部分」）と呼ばれる、ディスクの中心から２５ｍｍまたは２８ｍｍの半径上に配置されてもよい。ディスクのこの外側環状部分（サイドウェルが位置する）は、ディスクの少なくとも約５０％（外端に対するディスクの全体的な半径ｒ（１００％の半径の「ｒ」）の少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、最大でほぼ１００％まで、など）である半径ｒ３から伸長するディスクの部分として画定されうる。図１Ｃの要素（１０４）を参照。
【００４８】
ＭＡチップの外側円周部分（あるいは領域）は環帯であってもよい。環帯は２つの同心円によって囲まれた輪形の領域である。図１Ｃは、ディスク形状であることがあり、半径ｒを有する、ＭＡチップの一部を示す。（ＭＡチップの中心は図の外にある。）サイドウェルの第１のセット（１１４ａ）は、ＭＡチップの中心から半径ｒ１上に配置されてもよい。サイドウェルの第１のセット（１１４ｂ）は、ＭＡチップの中心から半径ｒ２上に配置されてもよく、ここで、ｒ２はｒ１より大きい（ｒ２＞ｒ１）。ＭＡチップの外側円周部分は、ＭＡチップの中心からの半径ｒ３から、ＭＡチップの中心からの半径ｒ上のＭＡチップの外端へ伸長してもよく、半径ｒ３は半径ｒ１未満であってもよい（ｒ３＜ｒ１）。
【００４９】
チャネル（１１２）は、本明細書では「マイクロチャネル」と呼ばれることがあり、細長く、長さと幅を有してもよく、および、（チップが厚さ１ｍｍである場合、部分的にのみ）３０μｍなど、ＭＡチップの底面へ少なくとも部分的に伸長してもよい。これは、図１Ａにおいて最もよく見ることができる。好ましくはＭＡチップを通じて部分的にのみ伸長するが、マイクロチャネルは完全にＭＡチップを貫通しても良い。マイクロチャネルの幅は３０μｍであってもよい。深さと幅の両方において、２０μｍ〜１００μｍの間のマイクロチャネルの寸法が許容される。
【００５０】
マイクロチャネル（１１２）は、センターウェルからサイドウェルまで、例えばセンターウェルの外端からサイドウェルの内端まで、放射状に伸長することができる。各サイドウェルにつき１つのマイクロチャネルがあってもよい。このように、例えば、単一の（１）センターウェルから１２０個のサイドウェルへ伸長する１２０個のマイクロチャネルがあってもよい。マイクロチャネルは、概して、センターウェル（注入口）およびサイドウェル（注出口）の間に、流体連通および細胞の移送（移動）を提供する。マイクロチャネルは、注出口に注入口を接続するためのチャネル、管、導管またはコネクターと見なされうる。各マイクロチャネルの一端は、センターウェルに接続（流体連通）しうる一方、各マイクロチャネルの他端は、複数のサイドウェルのうちの所定の１つに接続（流体連通）しうる。あるいは、マイクロチャネルは、（例えば、スポークホイールのハブからリムまで伸長するスポークのように）外側ウェルからサイドウェルに放射状以外で伸長してもよい。
【００５１】
サイドウェルがＭＡチップの中心から異なる半径（ｒ１、ｒ２）で配置されうるので、マイクロチャネルは、サイドウェルの第１のセット（１１４ａ）へ伸長する６０個のマイクロチャネルの第１のセット（１１２ａ）として、および、サイドウェルの第２のセット（１１４ｂ）へ伸長する６０個のマイクロチャネルの第２のセットとして、配置されうる。マイクロチャネルの第１のセットの長さは約２３ｍｍであってもよい。マイクロチャネルの第２のセットの長さは約２５ｍｍであってもよい。サイドウェルがジグザグになっている（ｒ１、ｒ２、ｒ１、ｒ２）ので、第２のセットのマイクロチャネルは、第１のセットのサイドウェル（１１４ａ）の隣接する２つの間を通る必要がありうる。（より短い第１のセットのマイクロチャネル（１１２ａ）は、第１のセットのサイドウェル（１１４ａ）まで伸長し、これらの間を通る必要はない）。図１では、例証の明瞭にするために、マイクロチャネル（１１２ａ）および（１１２ｂ）のいくつかのみが（参照符号で）標識される。図１Ａおよび１Ｂは、概して、マイクロチャネルの第１のセット（１１２ａ）またはマイクロチャネルの第２のセット（１１２ｂ）のうちのいずれか１つであり得るマイクロチャネル（１１２）を参照する。図１Ｃは、マイクロチャネル（１１２ａ）および（１１２ｂ）の（１２０個のうちの）４個のみを示し、いくつかは参照符号を付されている。
【００５２】
マイクロチャネルの幅（あるいは側方の長さ）は、約３０μｍであってもよい。マイクロチャネルはすべて、互いに同じ幅を有していても良い。マイクロチャネルは、断面が正方形であり、その幅と同様の深さ、および真っ直ぐな側壁を有していてもよい。マイクロチャネルは、テーパ状、または半円形などの他の断面であってもよい。一般に、マイクロチャネルは、センターウェルからサイドウェルへの単一の細胞の（流体中での）輸送に対応（および選択的に促進）するようなサイズおよび形状にすることができる。マイクロチャネルの容量はそれぞれ、約１８ｎＬであってもよい。
【００５３】
図１Ａは、（ＭＡチップが、例えば水平な卓上にあるペトリ皿中にあると仮定して）マイクロチップ（１１２）が水平であることを示している。マイクロチャネルは、センターウェルからサイドウェルへ正圧で駆動する流体の流れを助けるために、サイドウェル（１１４）の方へ傾斜していてもよく、言いかえれば、マイクロチャネルは、センターウェルの端ではより浅く、そしてサイドウェルの端ではより深くてもよい。マイクロチャネルの幅は、センターウェルからサイドウェルまでのその全範囲（長さ）に沿って均一であってもよく、またはその長さに沿って変化してもよい。概して、所与のＭＡチップ上のマイクロチャネルはすべて、互いに同じ幅と深さの寸法を有しているだろうが、いくつかのマイクロチャネルが他のものとは異なる幅および深さの寸法を有している場合がありうる（図１では、いくつかのマイクロチャネル（１１２ａ）は他のマイクロチャネル（１１２ｂ）よりも短い）。ＭＡチップは、互いに均一な幅（および深さ）のマイクロチャネルを有するように作製することができる。異なるサイズ（すなわち幅および／または深さ）だが、所与のＭＡチップに対して互いに均一な、マイクロチャネルを有するように異なるＭＡチップを生産することができる。
【００５４】
キャップ（１２０）はセンターウェル（１１０）上に配置されてもよい。キャップは、約５ｍｍの外径および約３．０ｍｍの内径（またはそれを貫通する穴）と、シリンダの一端から他端までの均一な口径とを有するシリンダの形態であってもよい。キャップの長さは約５ｍｍでもよい。キャップは、ＰＤＭＳなどのプラスチックで形成され、ＭＡチップ（１００）とは別個であり、ＭＡチップ（１００）と関連して使用される要素である。キャップは図中ではＭＡチップから間隔をあけて示される。キャップの容量は、約１１２μＬであってもよい。キャップを貫通する穴（口径）の直径は約１．５ｍｍであってもよい。キャップは、別個の部品としてではなく、ＭＡチップと一体的に形成することができる。
【００５５】
図１Ａの中で示されるように、クローニングまたは回収のために中に懸濁された細胞を有する少量（例えば、１μＬ）の懸濁液を含む多数（例えば、１２０個）のサイドウェルに、大量（例えば１２０μＬ）の細胞懸濁液を容易に充填するべく、１２０μＬの細胞懸濁液を含むピペットチップ（図示せず）を単一のセンターウェルに接続するために、キャップ（１２０）をセンターウェル（１１０）の上に配置することができる。
【００５６】
キャップ（１２０）はその上面および底面で開いている。キャップの底面は、センターウェルの上部内でわずかに伸びて、細胞懸濁液の充填中に一時的に所定の位置に固定されるように、その底面から（図示のように）伸長する唇部または肩部を備えて形成することができる。キャップは、使用中にセンターウェルの上に配置されるように適合され、（円錐形というよりも円筒形であるが）漏斗のように機能し、細胞懸濁液のセンターウェルへの充填を容易にする。キャップは、もちろん、その上面で閉じられておらず、煙突に類似しており、ガイドとして機能し、「樽」、「煙道」または「ダクト」と呼ばれることがある。
【００５７】
多くの個々のサイドウェルを識別し、かつ容易にこれらを互いに区別するために、印がＭＡチップの上面（１０２ａ）上に提供されうる。例えば、「１」から「１２０」の範囲の比較的小さなマイクロメー取るスケール（μｍスケール）の番号のセットが、個々のサイドウェルのそれぞれに（放射状に内側／内向きになど）密接に隣接してＭＡチップの上面に配置され、顕微鏡での観察下で対応するサイドウェルを示し（一意に識別する）てもよい。μｍスケールのマーキングは図１から省略されている。μｍスケールのマーキングのいくつかは図１Ｃで確認できる。加えて、「２」から「１２０」の範囲の偶数などの比較的大きなミリメートルスケール（ｍｍスケール）の番号のセット（またはサブセット）が、ＭＡチップの上面に、サイドウェルの１つおきに（例えば放射状に外側／外向きに）密接に隣接して配置されてもよく、言い換えれば、ＭＡチップの中心から、より大きい半径（ｒ２）のサイドウェル（１１２ｂ）の第２のセットの外側に放射状に配置されて、対応するサイドウェルを裸眼での観察下で示してもよい。奇数番号のサイドウェル（１１２ａ）のためのｍｍスケールのマーキングは、スペースを考慮して、製品から省略してもよい。（あるいは、サイドウェルの第１のセット（１１２ａ）の外側に「１」から「１１９」までの奇数のｍｍスケールの番号を配置し、偶数番目のサイドウェルのためのｍｍスケールのマーキングを省略してもよい。あるいは、スペースが許せば、すべてのサイドウェルのｍｍスケールの番号を含めてもよい。）これらのｍｍスケールのマーキングは、  図１Ａおよび図１Ｃで視認できる。ｍｍスケールの数は、所与のサイドウェルのμｍスケールの数に対応すべきである。他の印（例えばマーキング、文字、色、記号）が個々のサイドウェル（あるいはそのグループ）を識別し区別するために使用されてもよい。印のうちのいくつかまたはすべては、サイドウェルを識別するためにＭＡチップの底面に配置されてもよい。サイドウェルがＭＡチップを完全に貫通していない場合、その底には個々のサイドウェルを識別するマーキングが付いている可能性がある。
【００５８】
＜ＭＡチップの設計および製作＞
ＭＡチップは従来のフォトリソグラフィおよびポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）成形技術によって製作されうる。ＰＤＭＳは一般にシリコンと呼ばれる高分子有機ケイ素化合物のグループに属する。ＰＤＭＳは最も広く使用されるシリコンベースの有機ポリマーで、その特異な理論的（あるいはフロー）特性で特に知られる。ＰＤＭＳは光学的に透明であり、一般に、不活性、非毒性、および非可燃性である。また、これはジメチコンとも呼ばれ、いくつかのタイプのシリコンオイル（シロキサン重合）のうちの１つである。その適用はコンタクトレンズや医療デバイスからエラストマーにまで及ぶ。
【００５９】
ＭＡチップの設計は、ＡｕｔｏＣＡＤソフトウェア（Ａｕｔｏｄｅｓｋ）を使用して描き、４インチガラスフォトマスク（Ｐｈｏｔｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）としてプリントしてもよい。ＰＤＭＳのＭＡチップは標準的なフォトリソグラフィおよびエラストマー形成に製作されうる。簡潔に言うと、ＳＵ−８  ３０２５ネガティブフォトレジスト（ＳＵ−８  ３０２５  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｈｏｔｏｒｅｓｉｓｔ）（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．）を２０００ｒｐｍ（Ｌａｕｒｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）で４インチシリコンウエハ（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｑｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）上に１分間スピンコートして、３０μｍの厚さのシートを形成することができる。焼き付けた後、紫外線に露光し、現像して、混合ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ；  １０Ａ：  １Ｂ；  Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．）を、フォトレジストモールド上に注ぎ、２５分間８０度で加熱してもよい。硬化（ｃｕｒｉｎｇ）後、１ｍｍの厚さのＰＤＭＳシートを剥がし、（ウェルのための）穴をパンチャー（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ、Ｉｎｃ）によって穿孔することができる。円形のＰＤＭＳのＭＡチップは、気泡を発生させることなく、直径８．５ｃｍの市販のペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と自動的かつ密接に密封することができる。所望の場合、ＭＡチップは標準的なオートクレーブによって殺菌することができる。
【００６０】
ＰＤＭＳの他に、ＭＡチップはＰＭＭＡ（ポリ（メタクリル酸メチル））、ＰＳ（ポリスチレン）およびＰＣ（ポリカーボネート）を含む他の材料によって製作することもできる。
【００６１】
アクリルまたはアクリルガラスならびにＰｌｅｘｉｇｌａｓ、Ａｃｒｙｌｉｔｅ、ＬｕｃｉｔｅおよびＰｅｒｓｐｅｘという商品名でも知られているＰＭＭＡは、ガラスの代わりに軽量または粉砕耐性のあるシート状で使用される透明な熱可塑性物質であることが多い。
【００６２】
ＰＳはモノマースチレンから作られた合成芳香族高分子である。ＰＳは固体または発泡体でもよい。多目的ＰＳは透明で、固く、かなり脆い。これは単位重量当たりが安価な樹脂である。これは、酸素および水蒸気に対する障壁（ｂａｒｒｉｅｒ）がかなり不十分であり、融点が比較的低い。ＰＳは最も広く用いられているプラスチックのうちの１つである。
【００６３】
ＰＣは、その化学構造にカーボネート基を包含している熱可塑性ポリマーのグループである。工学において使用されるポリカーボネートは強く丈夫な材料であり、いくつかの等級は光学的に透明である。それらは容易に加工され、成形され、熱成形される。これらの特性のために、ポリカーボネートには多くの適用可能性がある。
【００６４】
＜単一の細胞の単離および回収＞
図２Ａ〜図２Ｅは、上述したＭＡチップ（１００）を用いて、単一の細胞の単離および回収（またはクローニング）を達成するために実行することができる、例示的なマイクロ流体アリコートの方法（２００）を示す。この方法または動作プロセスは、一連の工程で提示される。いくつかの工程またはその一部は、本明細書に記載された順序とは異なる順序で実行されてもよい。工程のそれぞれを実行する推定時間を述べることがある。
【００６５】
工程１（２０２、アセンブリ）：
ＭＡチップ（１００）は、ペトリ皿（図示せず、付録参照）中に配置されてもよい。ＭＡチップ（１００）の直径は６ｃｍであり得、ペトリ皿の直径は直径８．５であり得る。弾力性と柔軟性の薄いＰＤＭＳシートの優れた特性により、ＭＡチップは巻かれれた後でもその平らな形状を迅速に回復することができ、その後、気泡が発生することなく、ペトリ皿の底などの堅い平らな表面に密接に適合して封をすることができる。この工程は、完了までに０．１分（６秒）かかると推定される。
【００６６】
工程２（２０４、キャッピング）：
キャップ（１２０）は、センターウェル（１１０）の上、ＭＡチップ（１００）の上面上に配置することができる（図１Ａ参照）。キャップは、シリンダの形態でもよい。センターウェルの直径は約３ｍｍであってもよい。キャップは、５ｍｍのＯＤ（重複するには十分である／センターウェルよりも大きい）を有することができ、キャップを貫通する穴は１．５ｍｍの直径を有することができる。キャップは、ピペットを用いてセンターウェルに細胞懸濁液を導入することを可能にするために、センターウェル上の穴と位置合わせことができる。キャップの高さは５ｍｍでもよい。センターウェル上に配置されたＰＤＭＳキャップは、ピペットの使用によりＭＡチップに容易に液体（細胞懸濁液）を充填することを促進する。
この工程は完了までに０．１分（６秒）を必要とすると推定される。ＰＤＭＳキャップは、直径１．５ｍｍおよび深さ５ｍｍの貫通穴を含む。これらの寸法は、漏れなくＭＡチップに液体を充填するための１００−１０００μＬピペットチップと十分に適合する。
【００６７】
工程３（２０６、アリコート）：
１２０μＬの容量を有するような細胞懸濁液（図示せず）を、１００〜１０００μＬ（図示せず、付録参照のピペットチップを有するピペットを用いて、キャップを介して、ＭＡチップのセンターウェル（注入口）にアリコートするために注入することができる。この工程は完了までに１分（６０秒）を必要とすると推定される。
【００６８】
注入口の周りの均一な圧力分布のために、細胞懸濁液を多くの（例えば１２０個の）サイドウェル（１１４）に実質的に同時に均一に分配することができ、無作為かつ信頼できる単一細胞分離がもたらされる。正圧で駆動する流れは、センターウェル（注入口）（１１０）から、マイクロチャネル（１１２）（１１２ａ、１１２ｂ）を介して、サイドウェル（注出口）（１１４）（１１４ａ、１１４ｂ）に単一の細胞を押し込む（運ぶ、移動させる、輸送する）。これは「マイクロ流体アリコート」と呼ばれうる。
【００６９】
アリコート後、マイクロチャネル内の潜在的な単一の細胞（確率にして１．８％）を注出口（サイドウェル）に押し込むために、１００μＬの無細胞培地をセンターウェルに滴下した。言いかえれば、１２０μＬの細胞懸濁液をピペットでＭＡチップに充填した後、１つの単一の細胞がマイクロチャネルに残ることがある（確率は１．８％）。センターウェルに１００μＬの無細胞培地を添加することにより、正の静水圧がセンターウェルからサイドウェルへ生成される。正の静水圧は、サイドウェルに流れ込むために残余の単一の細胞を押すだろう。
【００７０】
工程４（２０８、識別）：
サイドウェル（１１４）内の単一の細胞は、１ウェル／秒の速度で倒立型顕微鏡下で識別され、次いで、サイドウェルの内側に位置し、顕微鏡観察のために特別に設計されたマイクロメートルスケールの番号に従って記録することができる。Ｘ１０対物レンズによる倒立顕微鏡の視野（直径２ｍｍ）は、ＭＡチップウェルのサイズ（直径１．５ｍｍ）よりも大きいので、単一の細胞のみを含む単一のサイドウェルを迅速に区別することができる。この工程は１ウェルあたり１秒、または、（１２０個のサイドウェルについて）完了するまでに合計２分（１２０秒）が必要と推定される。
【００７１】
１２３個の単離された単一の細胞のウェルへの分布は、マイクロ流体の影響下で、ほとんど全ての単一の細胞がマイクロチャネルの伸長方向に位置していることを示した。言い換えれば、センターウェルからサイドウェルへの正圧の効果で、全ての単一の細胞が最終的にサイドウェルに流入する可能性がある。各１．５ｍｍ直径のサイドウェルにおける各単一の細胞の正確な位置は、サイドウェルごとに、異なっていてもよい。しかし、細胞は、マイクロチャネルとサイドウェルの交差する領域（交差点）（すなわち、サイドウェルに接続するマイクロチャネルの端部をちょうど超える、サイドウェルの半径方向で最も内側の域内の領域）に位置する可能性が高い。
【００７２】
工程５（２１０、回収）：
サイドウェル（１１４ｂ）の外側に位置し、裸眼で観察するのに適切なサイズのミリメートルスケールの偶数の番号によれば、対象の単一の細胞は、ＭＡチップの上面からサイドウェルに挿入される０．１〜２．５μＬピペットチップを有するピペット（図示せず）によって簡便にかつ直接的に回収することができる。
【００７３】
最後に、細胞をペトリ皿から収集し、細胞懸濁液として分注し、顕微鏡で計数し、ＭＡチップに充填し、空気置換ピペット（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して単一細胞懸濁液として回収した。
【００７４】
以上、ＭＡチップを用いて単一の細胞を得るための全体的なプロセスを記載した。ＭＡチップに充填するための、既知の細胞数を有する単一細胞懸濁液を調製するプロセスは、以下の４つのステップを含みうる。
１）  ピペットでペトリ皿に１μＬの単一細胞懸濁液を滴下する。
２）  倒立顕微鏡の下で細胞の数を計数する。
３）  １１９μＬの無細胞培地を１μＬの単一細胞懸濁液に添加する。
４）  マイクロ流体アリコートのための既知の細胞の数を有する全ての単一細胞懸濁液を収集する。その後、上記の工程１−５セット（アセンブリ、キャッピング、アリコート、識別、回収）を実行してもよい。
【００７５】
キャップの代わりに、ＰＤＭＳ（または他の材料）のマットをＭＡチップ（「ＭＡ皿」（ＭＡ  ｄｉｓｈ）と呼ぶことができる）上に配置してもよい。マットの厚さは５ｍｍでもよく、マットの中心に直径１．５ｍｍの穴があってもよい。次の工程は例示的な手順で実行されうる。
１）  １２０ウェルのＭＡ皿を組織培養皿の表面に置く。
２）  マットをＭＡ皿上に置く。
直径１．５ｍｍの穴を、垂直方向で３ｍｍのセンターウェルと位置合わせする必要がある。
３）  １２０μＬ超の１細胞／μＬ未満の単一細胞懸濁液をピペットチップに吸引する。
４）  ピペット先端をマット穴に挿入する。
５）  ピペットボタンを押し下げて、１２０個のサイドウェルに単一細胞懸濁液を充填する。
６）  各サイドウェルを３０秒以内に１μＬの細胞懸濁液で満たすことができる。
７）  ピペットチップおよびマットを取り除く。
８）  各サイドウェルを識別し、単一の細胞を備えるすべてのサイドウェルをマークし、その後のＰＣＲ実験のために単一細胞をピペットでバイアルに移す。
９）  あるいは、単一の細胞を、細胞クローニングを形成するために培養するようにサイドウェル内においておくことができる。
【００７６】
＜いくつかのコメントおよび結論＞
細胞の大きさ、形状、および運動性とは無関係に、様々な単一の細胞を単離するためのマイクロ流体アリコートの技術、機能性および適用性が記載されている（かつ実証されている）。マイクロ流体アリコートは、少数の細胞から単一の細胞を選択的に単離することを可能にし、これは細胞数が限られている貴重な臨床サンプルにとって非常に重要であり、および、マイクロ流体アリコートは、何百万もの細胞から単一の細胞を選択的に単離することを可能にし、これは血液からＣＴＣ（循環腫瘍細胞）を単離するために使用される可能性がある。また、単一細胞の生存率が十分に維持される単一細胞クローニング、および、１０分以内に４０ナノリットルの単一細胞懸濁液を調製しうる単一細胞ＰＣＲとも非常に適合する。さらに、ＭＡチップは、１．７ｇ  ＰＤＭＳのコスト（約０．２ドル）に匹敵する低コストであり、結合剤（ｂｏｎｄｉｎｇ）およびバルブを必要とせずに大量生産を容易に実現し、一般的な研究室の単一の細胞の研究者にすぐに利用できるようにする。
【００７７】
高スループットアリコートの特徴、すなわち１操作あたり１２０のアリコートは、単一（１つ）のＭＡチップが１２０の濃縮係数（ＥＦ）を有することを結果としてもたらしうる。したがって、理論上、１つの標的細胞は３つまたは４つのＭＡチップを介して何百万の細胞から首尾よく単離でき、対応するＥＦは、それぞれ１．７×１０６および２．１×１０８であり得る。したがって、ＭＡチップは細胞回収効率が高い。
【００７８】
ＭＡチップは、ＭＡチップは、単一細胞を少数の細胞から効果的に単離（単一化）することができる。様々なサイズのマイクロチャネルを有する様々なＭＡチップは、細胞の大きさ、形状、および運動性とは無関係に、直径４μｍの単一の出芽酵母、直径８μｍの単一の懸濁されたＴ細胞、直径１６μｍの単一のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞、および、移動する長さ２２μｍ、幅３μｍのトリパノソーマ・ブルセイなどの、様々な細胞タイプと適合しうる。
【００７９】
幅と深さを含むチャネルのサイズは、細胞の直径より大きくあるべきである。これにより、マイクロチャネル内の移動の間の細胞損傷を減少させることができ、細胞は、センターウェルからサイドウェルへ容易に輸送され得る。この場合、マイクロチャネルの幅および深さは両方３０μｍであり、これは試験される細胞の直径よりも大きい。一般に、細胞直径より大きな寸法（幅および深さ）を有するマイクロチャネルが許容される。
【００８０】
元の懸濁液中に少数の細胞（例えば２〜２０細胞）しか存在しない場合でも、ＭＡチップは単一の細胞を単離する能力を有する。
【００８１】
細胞の生存率への無視できる損害であるため、懸濁液の状態で形態に明らかな違いがない場合でも、ＭＡチップを使用して、それらの付着状態に基づいて単一の細胞を選択的に単離することもできる。対応するウェルに小さなトリプシンを添加することによって所望の細胞を回収することができ、または、所望の細胞を正圧で駆動する流れに起因する溶解物の損失が無視できるほどの付着状態で直接溶解することができ、単一細胞レベルでの遺伝子型−表現型相関を研究する潜在的な方法を提供する。
【００８２】
単一の細胞の迅速な単離および容易な識別、高い細胞生存率、およびサブマイクロタイター単一細胞懸濁液の簡便な移入により、ＭＡチップは単一細胞のクローニング、ＰＣＲおよび配列決定と十分に適合する。ワイルドタイプ（ＷＴ）およびＰＴＥＮノックアウト（ＫＯ）ＳＵＭ１５９細胞を概念実証実験として使用した。ＰＴＥＮ（ホスファターゼおよびテンシンホモログ）およびＣａｓ９タンパク質を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドをＳＵＭ１５９細胞に一時的にトランスフェクトすることにより、ＰＴＥＮ  ＫＯ細胞を生成した。ＭＡチップによる単一の細胞の単離の後、細胞は正常に増殖し、示された時点での細胞数が測定された。結果は、ＰＴＥＮ  ＫＯ細胞が、２８．９時間のＷＴ細胞の平均倍加時間よりも短い２５．９時間の平均倍加時間を有することを示し、これは、ＰＴＥＮの枯渇が細胞増殖を促進し得るという以前の研究と一致した。
【００８３】
本明細書に開示される方法および装置は、複雑なマトリックスから単一の細胞を、例えば血液から単一のＣＴＣを、識別および単離するために使用され得、ここで、ＣＴＣは、単一または多段階のＭＡチップ操作後にサイドウェルに捕捉される。本明細書に開示される方法および装置は、複雑なマトリックスから単一の細胞および対象を識別および単離するために、例えば細菌、ビーズ、粒子、ウイルスを含む単一の対象をマトリックスから単離するために、例えば結核細胞を単離するために、および、単一のクローンを単離するために、例えば特定の遺伝子型／表現型の酵母細胞を単離するために、使用されることができる。
【００８４】
＜米国特許第６，６３２，６５６号との区別＞
本発明のＭＡチップ（１００）は、前述の米国特許第６，６３２，６５６号（以下「Ｔｈｏｍａｓ」）の回転可能なディスク（１８）とのいくつかの類似点を持つ。それらは、両方とも全体としてディスクの形態である。Ｔｈｏｍａｓのチャネルの幅は、２０−３０μｍである。マイクロチャネル（１１２）の幅は、約３０μｍでありうる。
【００８５】
本発明のＭＡチップ（１００）は、前述の米国特許６，６３２，６５６号（「Ｔｈｏｍａｓ」）の回転可能なディスク（１８）と、とりわけ、以下のように、判別されうる：
−Ｔｈｏｍａｓのチャンバ（２、３、７）は、そのディスクの中央の部分に位置しているように見える。そのディスクの外側部分は廃棄チャネル（１０）によって占められている。
本明細書に開示されるＭＡチップのサイドウェル１１４（１１４ａ、１１４ｂ）は、ＭＡチップの外側部分に位置する。
−Ｔｈｏｍａｓのチャネル（６）は注入口チャネル（１）を含み、続いてチャンバ（２）、続いて別のチャネル（４）、続いてチャンバ（３）、続いて廃棄チャネル（１０）に接続されたチャネル（５）を含む。本明細書に開示されるＭＡチップのチャネル（１１２）（１１２ａ、１１２ｂ）は、センターウェル（注入口）からサイドウェル（注出口）に伸長し、これらの間に何も（他のチャンバまたはウェルも）配置されない。
−Ｔｈｏｍａｓは、そのチャネル中の細胞を移動させるために、チャンバからチャンバへと、回転と遠心力を使用する。本明細書に開示されるＭＡチップを使用する、本明細書に開示されるプロセス（２００）は、センターウェル（注入口）からサイドウェル（注出口）へ細胞を移動させるために主として正圧に依存する。
−Ｔｈｏｍａｓのチャンバは、その中で細胞は遠心力によって移動させられ、閉鎖されている。本明細書に記載のサイドウェルは、その中で細胞が主として正圧で駆動する流れによって移動させられ、開いている（および、ＭＡチップの上面からからアクセス可能である）。
−Ｔｈｏｍａｓのデバイスでは、液体と細胞はチャネルを通じてデバイスから流れるだろう。しかしながら、本明細書に記載のＭＡチップは、注入口（センターウェル）からの細胞を含む充填された液体はすべて、注出口（サイドウェル）へと採取され保存される。
デバイスからの液体の流出はない。サンプル（液体と細胞）を収集する方法は全く異なる。
−本明細書に記述されたＭＡチップは、アリコート（サンプルを、同じボリュームでサンプルの損失のない多くの等量に分割すること）に焦点を当てる。これに対して、Ｔｈｏｍａｓのデバイスは、フィルタリング、閉鎖チャンバへの細胞の捕捉、デバイスからの液体の流出を可能にすること、に焦点を当てている。
−Ｔｈｏｍａｓは、デバイスに液体を充填するために、特定の遠心分離機によって提供される遠心力を使用する。本発明は、細胞懸濁液などの液体をＭＡチップに容易に充填するための共通の空気置換ピペット（すべての研究室にある）のみを使用する。これにより、遠心分離機などの外部機器へのデバイスの依存性が著しく低減される。
−本明細書に開示されるサイドウェルのサイズは直径およそ１．５ｍｍである。この寸法は、顕微鏡でのサイドウェル内の単一細胞の容易な識別、およびサイドウェル内の液体の０．１−２．５μＬピペットチップによる容易な回収にとって重要である。Ｘ１０対物レンズ（直径２ｍｍ）による倒立顕微鏡の視野は、ＭＡチップウェル（直径１．５ｍｍ）のサイズよりも大きいので、単一の細胞のみを含む単一のウェルを迅速に区別することができる（１ウェル／秒）。Ｔｈｏｍａｓのチャンバ（２、３、７）は、ＭＡチップのサイドウェルより著しく大きい。Ｔｈｏｍａｓは、約４００−６００μｍの直径の循環「ウェル」を記載している。Ｔｈｏｍａｓは、本明細書に記載のマイクロチャネルよりも著しく大きい（特に、流れに関係する断面積において）、５０μｍまたは１００μｍの深さおよび１００μｍの幅を有するチャネルを記載している。
−Ｔｈｏｍａｓのデバイスは、細胞増殖、および、例えば薬物スクリーニングといった分析を行なうために主として使用される。対象は多数の細胞であり、その目的は多くの細胞に基づく薬物スクリーニングである。本明細書に開示されるＭＡチップは、単一の細胞の選別および単離のために主として使用され、その対象は個々の細胞であり、その目的は、単一の細胞のクローニング、ＰＣＲおよび配列決定を含む単一の細胞に基づく分析である。
−本明細書に開示されるＭＡチップは、標的細胞の分離、または、血液から単一のＣＴＣ（循環腫瘍細胞）を選別し単離するなどの細胞集団からの選別において、優れた能力を持っている。対照的に、Ｔｈｏｍａｓのデバイスにはこの機能、または標的細胞を分離する（個々の細胞を単離する）能力がない。
【００８６】
本発明は、様々な例示的な実施形態および実施形態の観点から上述されているが、個々の実施形態の１つ以上に記載された様々な特徴、態様、および機能は、それらが記載された特定の実施形態への適用に限定されず、代わりに、そのような実施形態が記載されているかどうか、および、そのような特徴が記載された実施形態の一部であると提示されているか否かを問わず、単独または様々な組み合わせで、本発明の他の実施形態の１つ以上に適用されることができる、ということが理解されるべきである。したがって、本発明の幅および範囲は、上記の例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきではない。
【図１】
2019503197.tif 000003
【図１Ａ】
2019503197.tif 000004
【図１Ｂ】
2019503197.tif 000005
【図１Ｃ】
2019503197.tif 000006
【図２】
2019503197.tif 000007
【国際調査報告】
2019503197.tif 000008
2019503197.tif 000009