(57)【要約】  本発明は、創傷治癒を必要とする患者において、創傷治癒を促進する方法であって、該患者の創傷を、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌されたエキソソームと接触させ、それにより該患者における創傷治癒を促進することを含む方法を提供する。また、本出願は、創傷治癒を必要とする患者において、創傷治癒を促進する方法であって、前記患者の創傷を、１つ又は複数のｍｉＲＮＡ及び薬学上許容可能な担体を含む組成物と接触させ、それにより前記患者における創傷治癒を促進する方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
創傷治癒を必要とする患者において、創傷治癒を促進する方法であって、該方法は、前記患者の創傷を、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ：ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）によって分泌されたエキソソームと接触させ、それにより前記患者における創傷治癒を促進することを含む方法。
【請求項２】
前記組成物は、薬学上許容可能な担体を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＵＣＢＭＮＣは、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球及び／又はＣＤ３４＋細胞を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＵＣＢＭＮＣは、虚血状態及び／又は低酸素状態に曝されなかった、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＵＣＢＭＮＣは、虚血状態及び／又は低酸素状態に曝された、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ｉ）前記エキソソームは、球状形態を示す、
ｉｉ）前記エキソソームは、１００ｎｍ〜２００ｎｍの平均粒子径を有する、
ｉｉｉ）前記エキソソームは、−１０ｍＶ〜−５０ｍＶの負のゼータ電位を有する、
ｉｖ）少なくとも１つの前記エキソソームは、マーカＣＤ９、ＣＤ３４、ＣＤ８１及び／又はＨｓｃ７０を発現する、又は、
ｖ）前記特徴ｉ）〜ｉｖ）の全て、２、３若しくは４つを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記エキソソームの少なくとも１つは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記エキソソームの少なくとも１つは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記エキソソームの少なくとも１つは、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを含有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記エキソソームは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを濃縮され、それにより、前記エキソソームにおける前記ｍｉＲＮＡの濃度を高める、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記エキソソームは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを濃縮され、それにより、前記エキソソームにおける前記ｍｉＲＮＡの濃度を高める、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記エキソソームは、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを濃縮され、それにより、前記エキソソームにおける前記ｍｉＲＮＡの濃度を高める、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物は、単回使用で投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物は、定期的に、毎日１回は投与されない、毎日１回投与される、又は毎日２回以上投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物は、局所投与又は皮下注射によって投与される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物におけるエキソソームの濃度は、０．０１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物におけるエキソソームの濃度は、約１．０μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬ又は３．０μｇ／ｍＬである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物は、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、  ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｌａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを更に含み、該ｍｉＲＮＡは、前記エキソソームに含有されない、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物は、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを更に含み、該ｍｉＲＮＡは、前記エキソソームに含有されない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物は、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを更に含み、前記ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐは、前記エキソソームに含有されない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
創傷治癒は、創傷治癒の速度を加速することによって、及び／又は血管新生を誘導することによって、促進される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ａ）創傷治癒は、ケラチノサイト及び／又は内皮細胞の生存を高めることによって促進される、
ｂ）創傷治癒は、線維芽細胞の増殖を高めることによって促進される、
ｃ）創傷治癒は、創傷の方への線維芽細胞及び／又はケラチノサイトの遊走を増加することによって促進される、及び／又は
ｄ）創傷治癒は、創傷部位で及び／又は付近で、内皮細胞によって管形成を増大することによって促進される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記エキソソームは、形成される血管の総数を増加させるのに、及び／又は形成される血管網の複雑さを増大させるのに有効である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ケラチノサイト、線維芽細胞、及び／又は内皮細胞は、虚血状態及び／又は低酸素状態に曝された、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
創傷治癒は、前記ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐによって促進される、請求項１２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐは、創傷の方へのケラチノサイトの遊走を増加させ、それにより創傷治癒を促進する、及び／又は線維芽細胞の生存を高め、それにより創傷治癒を促進する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
創傷治癒は、前記エキソソームの接触部位に対する局所的部位で促進される、又は創傷治癒は、前記エキソソームの接触部位から離れた部位で促進される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記創傷は、慢性創傷である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記創傷は、糖尿病性潰瘍、褥瘡性潰瘍、又は静脈性潰瘍である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記患者は、糖尿病に罹患している、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記糖尿病は、Ｉ型糖尿病又はＩＩ型糖尿病である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ａ）創傷治癒の加速速度は、前記エキソソームと接触された以外は同様な創傷のものと比べて、２日目までに、３日目までに、又は１０日目までに顕著である、
ｂ）創閉鎖は、前記エキソソームと接触された以外は同様な創傷のものと比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、又は１００％超、改善される、及び／又は
ｃ）完全な創閉鎖にかかる時間は、前記エキソソームと接触された以外は同様な創傷のものと比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、又は１００％超短縮される、請求項２１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
創傷治癒を必要とする患者において創傷治癒を促進するための、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌されるエキソソームを含む組成物。
【請求項３４】
臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌されるエキソソームを含む組成物を作製するプロセスであって、該プロセスは、ａ）前記ＵＣＢＭＮＣから前記エキソソームを分離するステップ、及びｂ）薬学上許容可能な担体に前記エキソソームを懸濁するステップを含む、プロセス。
【請求項３５】
前記薬学上許容可能な担体は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）である、請求項３４に記載のプロセス。
【請求項３６】
前記エキソソームは、遠心分離法によってＵＣＢＭＮＣから分離される、請求項３４又は３５に記載のプロセス。
【請求項３７】
前記プロセスは、ステップｂ）の前に、前記エキソソームを１つ又は複数のｍｉＲＮＡに関して濃縮するステップを更に含むプロセスであって、前記ｍｉＲＮＡは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３８】
前記ｍｉＲＮＡは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される、請求項３７に記載のプロセス。
【請求項３９】
前記ｍｉＲＮＡの１つは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐである、請求項３８に記載のプロセス。
【請求項４０】
前記組成物は、前記エキソソームに含有されない１つ又は複数のｍｉＲＮＡを更に含み、前記プロセスは、ｃ）前記ｍｉＲＮＡを、トランスフェクション剤と混合するステップ、及びｄ）該混合物を、前記薬学上許容可能な担体に懸濁するステップを更に含むプロセスであって、前記ｍｉＲＮＡは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−  ３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−  １８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項４１】
前記ｍｉＲＮＡは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される、請求項４０に記載のプロセス。
【請求項４２】
前記選択されたｍｉＲＮＡの１つは、ｈａｓ−ｍｉＲ−１５０−５ｐである、請求項４０に記載のプロセス。
【請求項４３】
請求項３４〜４２の何れか一項のプロセスで調製された臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌されるエキソソームを含む組成物。
【請求項４４】
創傷治癒を必要とする患者において、創傷治癒を促進する方法であって、該方法は、前記患者の創傷を、１つ又は複数のｍｉＲＮＡ及び薬学上許容可能な担体を含む組成物と接触させ、それにより前記患者における創傷治癒を促進し、前記ｍｉＲＮＡは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される、方法。
【請求項４５】
前記ｍｉＲＮＡの１つは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
創傷治癒を必要とする患者において、創傷治癒を促進するための１つ又は複数のｍｉＲＮＡ及び薬学上許容可能な担体を含む組成物であって、前記ｍｉＲＮＡは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐ選択される、組成物。
【請求項４７】
前記ｍｉＲＮＡの１つは、ｈａｓ−ｍｉＲ−１５０−５ｐである、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
１つ又は複数のｍｉＲＮＡ及び薬学上許容可能な担体を含む組成物を作製するプロセスであって、該プロセスは、ａ）前記ｍｉＲＮＡを、トランスフェクション剤と混合するステップ、及びｂ）該混合物を、前記薬学上許容可能な担体に懸濁するステップを含むプロセスであって、前記ｍｉＲＮＡは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される、プロセス。
【請求項４９】
前記ｍｉＲＮＡの１つは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐである、請求項４８に記載のプロセス。
【請求項５０】
請求項４８又は４９の前記プロセスで調製された１  つ又は複数のｍｉＲＮＡ及び薬学上許容可能な担体を含む組成物。
【請求項５１】
請求項３３、４３、４６、４７、及び５０のいずれか一項の前記組成物を含む創傷ケア製品。
【請求項５２】
請求項３３、４３、４６、４７、及び５０の何れか一項の前記組成物を含む密封パッケージ。
【請求項５３】
請求項３３、４３、４６、４７、及び５０のどれかの構成のそれの困った患者で創傷治癒を促進する使用。
【請求項５４】
創傷治癒を必要とする患者において創傷治癒を促進するための薬物を製造する際における請求項３３、４３、４６、４７及び５０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項５５】
組織修復を必要とする患者において、組織修復を促進する方法であって、該方法は、前記患者の組織を臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌されたエキソソームと接触させ、それにより前記患者における組織修復を促進することを含む、方法。
【請求項５６】
組織修復を必要とする患者において、組織修復を促進する方法であり、該方法は、前記患者の組織を、１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含む組成物と接触させ、それにより前記患者における組織修復を促進することを含む方法であって、前記ｍｉＲＮＡは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−  １８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年５月１６日に出願された米国仮出願第６２／３３６，９０７号及び２０１６年３月２４日に出願された米国の仮出願第６２／３１３，００２号の優先権を主張するものであり、該仮出願其々の全内容は、参照により本明細書に組込まれる。
【０００２】
本出願を通して、括弧内に参照されたものも含み、様々な刊行物が、参照される。括弧内に参照された刊行物に関する全引用については、本明細書の最後で、特許請求の範囲の直前に列挙されたものが見つかるであろう。全ての参照された刊行物に関する開示は、全体として、本発明が関係する技術水準について更に十分に説明するために、本出願に参照として組込まれる。
【背景技術】
【０００３】
慢性創傷は、３カ月で治癒しない創傷であると定義される（Ｎｕｎａｎ他、２０１４年）。創傷は、皮膚の正常な構造や機能の破壊である。急性創傷とは対照的に、慢性創傷は、皮膚の持続的な再建を齎すであろう規則的で適時な修復過程を経ない。
【０００４】
先進国では、人口の１〜２％が、在命中に慢性創傷を経験すると推定されている（Ｇｏｔｔｒｕｐ、２００４年）。更に、約１億５０００万人の糖尿病患者が世界中に存在し、その中約１５％が、非治癒の慢性創傷へと進展し得る足潰瘍を患っている（Ｂｏｕｌｔｏｎ他、２００５年）。
【０００５】
慢性的で非治癒な創傷は、急性創傷の治療と比較して、複数の治療が必要なために、特に費用がかかる。慢性創傷に起因する負担は、医療費の増加、高齢化、世界中の糖尿病や肥満の急増によって、世界中で大きくなっている（Ｓｅｎ、２００９年）。
【０００６】
最も一般的な種類の慢性創傷は：（ｉ）動脈性潰瘍、（ｉｉ）静脈性潰瘍、（ｉｉｉ）糖尿病性潰瘍、及び（ｉｖ）褥瘡性潰瘍である。
【０００７】
動脈性潰瘍は、高血圧、アテローム性動脈硬化症及び血栓症を伴う患者に形成され、その場合、血液の供給不足が、虚血状態を引起す。
【０００８】
静脈性潰瘍は、潰瘍例の半数以上を占め、主に下肢（主に脚）で発生し、深部静脈血栓症、拡張蛇行静脈及び静脈性高血圧と関連する（ＥｂｅｒｈａｒｄｔとＲａｆｆｅｔｔｏ、２００５年）。米国では、約５０万人の静脈性潰瘍患者が存在すると推定される（ＡｂｂａｄｅとＬａｓｔｏｒｉａ、２００５年）。
【０００９】
糖尿病性潰瘍は、低下した免疫機能、虚血（血行不良による）、及び神経障害（神経損傷）を持つ、真性糖尿病を患う個人に発生する。糖尿病の神経障害は、治療しなければ、下肢切断の可能性が高まる。２００４年では、約７万１千人の非外傷性下肢切断が、糖尿病を持つ人々で実施され（Ｓｅｎ、２００９年）、加齢に伴い、切断率は増大する。
【００１０】
褥瘡性潰瘍は、皮膚の破壊や潰瘍化を引起す可能性がある、体重から局所への定圧や摩擦により発生する。影響を受けやすい患者としては、高齢者、卒中の発作に見舞われた人、糖尿病又は認知症の患者、脊髄損傷の患者、車椅子の患者又は運動障害若しくは感覚障害がある患者が挙げられる。毎年、２５０万の褥瘡性潰瘍が、米国の救急治療施設だけでも治療されている（Ｒｅｄｄｙ他、２００６年）。
【００１１】
創傷治癒プロセス
創傷治癒は、４つの連続し、重複する段階：うっ血、炎症、増殖、及び組織再構築から成る動的プロセスである（Ｇｕｏ他、２０１０年）。最適な創傷治癒には、各段階中の現象が、正確に且つ規則的に発生しなければならない。プロセスにおける中断、異常（ａｂｅｒｒａｎｃｙ）、又は延長は、創傷治癒の遅れや非治癒の慢性創傷に繋がり得る（Ｇｕｏ他、２０１０年）。
【００１２】
創傷治癒のうっ血段階は、負傷直後に始まり、血管収縮、血小板凝集、脱顆粒、及びフィブリン血栓形成を特徴とする（Ｇｕｏ他、２０１０年）。具体的には、負傷部位の露出された細胞外マトリックスとの接触が原因で、血小板が凝固因子を放出して、血の塊が形成される。更に、この接触は、血小板に、炎症性サイトカイン、及び形質転換成長因子（ＴＧＦ）−β、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）等の成長因子も放出させるであろう。これらの分子は、好中球や大食細胞を活性化させて、引寄せ、その結果創傷治癒の炎症段階を開始させる。また、これらの分子は、内皮細胞や線維芽細胞も引寄せ、これら細胞は、後の増殖及び組織再構築の段階に影響を与えるであろう（Ｇｕｏ他、２０１０年；Ｖｅｌｎａｒ他、２００９年）。
【００１３】
創傷治癒の炎症段階は、好中球浸潤、単核球浸潤及び大食細胞への分化、及びリンパ球浸潤を特徴とする。好中球の主な機能は、創傷部位に侵入する細菌や細胞残屑を、タンパク質分解酵素及び活性酸素種（ＲＯＳ：ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）等の物質を生成することによって、食作用を介して、除去することである。大食細胞は、創傷治癒プロセスにおいて、サイトカインを放出して白血球を動員、活性化すること、及びアポトーシス細胞（好中球を含む）を除去することを含む、幾つかの機能を実行する。また、大食細胞は、ケラチノサイト、線維芽細胞、及び内皮細胞を活性化し、それにより創傷治癒の増殖段階を開始させる、ＴＧＦ−β及びＦＧＦ等の成長因子を放出する。また、リンパ球は、後期炎症段階中に、創傷へと遊走するが、リンパ球の創傷治癒に対する役割は、完全には理解されていない（Ｇｕｏ他、２０１０年；  Ｖｅｌｎａｒ他、２００９年）。
【００１４】
増殖段階は、上皮再形成、血管新生、コラーゲン合成、及び細胞外マトリックス形成を特徴とする。真皮の修復では、線維芽細胞と内皮細胞は、最も際立った存在の細胞の種類であり、負傷部位で、毛細血管の成長、コラーゲンの生成、及び肉芽組織の形成を支援する機能を果たす（Ｇｕｏ他、２０１０年；Ｖｅｌｎａｒ他、２００９年）。
【００１５】
組織再構築段階は、創傷治癒の最終段階であり、１年又は２年まで継続する可能性があり、時には、更に長期間に亘ることがある。組織再構築段階は、分解と合成との間での微妙なバランスであり、コラーゲン再構築や血管の成熟化及び退縮を特徴とする。具体的には、細胞外マトリックスは、正常な組織のものにアプローチする構造に再構築され、創傷は筋線維芽細胞によって仲介される収縮を受ける（Ｇｕｏ他、２０１０年；Ｖｅｌｎａｒ他、２００９年）。
【００１６】
真性糖尿病
真性糖尿病は、慢性的高血糖を特徴とする一連の代謝障害を示す。また、若年発症糖尿病としても知られるＩ型真性糖尿病は、インシュリンを分泌する膵臓β細胞の自己免疫破壊から生じる。また、成人発症糖尿病としても知られるＩＩ型真性糖尿病は、過度のインスリン分泌、組織インスリン耐性、及びその後のβ細胞機能障害を特徴とする（Ｇｏｕｔｏｓ他、２０１５年）。
【００１７】
創傷治癒プロセスでの真性糖尿病の影響
糖尿病の人々は、急性創傷の治癒不良を示し、糖尿病性足部潰瘍等の慢性創傷に進展する傾向がある（Ｇｕｏ他、２０１０年）。
【００１８】
真性糖尿病は、創傷治癒プロセスの幾つかの局面で有害な影響を及ぼす。例えば、糖尿病は、大食細胞の異なる表現型間のバランスを変化させ、それにより炎症細胞の数を増大させ、増殖段階への移行を妨げる。また、糖尿病は、創傷部位での成長因子レベルの低下、異常な細胞外マトリックスの沈着、及び血管新生の抑制にも関連している（Ｇｏｕｔｏｓ他、２０１５年；Ｇｕｏ他、２０１０年）。
【００１９】
エキソソーム
エキソソームは、殆どの種類の細胞によって分泌されるリポソーム様小胞（３０〜２００ｎｍ）であり、多小胞体（ＭＶＢ：ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｂｏｄｙ）と呼ばれる区画で分泌細胞内に形成され、次に、エンドソーム区画と原形質膜とが融合することで放出され、その結果、細胞外環境への内容物放出が生じる（Ｒａｐｏｓｏ及びＳｔｏｏｒｖｏｇｅｌ、２０１３年）。エキソソームは、分泌細胞と刺激の種類に応じて、細胞質内容物の無作為標本ではなく、タンパク質、脂質、及びＲＮＡの特異的なセットを含有する（Ｒａｐｏｓｏ及びＳｔｏｏｒｖｏｇｅｌ、２０１３年；  Ｍａｔｈｉｖａｎａｎ  Ｓ．及びＳｉｍｐｓｏｎ  Ｒ．Ｊ．、２００９年）。エキソソームは、エキソソームを有望な生物由来遺伝子送達システムへとプロモートする特徴の、ｍＲＮＡ及びｍｉｃｒｏＲＮＡの形をした、遺伝物質を担持する（Ｏ’Ｌｏｕｇｈｌｉｎ他、２０１２年）。
【００２０】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ：ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）又は造血幹細胞（ＨＳＣ：ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）等の傷害組織の実験的な再生に採用される細胞の種類は、エキソソームの宝庫であり、異なる障害モデルにおいて、細胞ベースの治療をうまく置換するために提案された（Ｂｉａｎ他、２０１４年；Ｓｈａｂｂｉｒ他、２０１５年；Ｚｈａｎｇ  Ｂ．他、２０１５年；Ｚｈａｎｇ  Ｊ．他；Ｌａｉ  ＲＣ、２０１０年；Ｚｈｏｕ  Ｙ．、２０１３年；Ｓａｈｏｏ  Ｓ．、２０１１年）。
【００２１】
ＭＳＣは、多能性で、非造血性の成体幹細胞であり、臍帯（Ｅｒｉｃｅｓ他、２０００年；Ｇａｎｇ他、２００４年）、胎盤組織又は脂肪組織、及び骨髄から単離できる。これらの細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞及び内皮細胞等の、幾つかの細胞の種類に分化できる（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ他、１９９９年；Ｃｒａｐｎｅｌｌ他、２０１３年）。分化による直接の再生能に加えて、これらの細胞は、エキソソーム分泌等のパラクリン刺激によって修復を誘導できることが、最近実証された（Ｌａｉ他、２０１１年；Ｌａｉ他、２０１０年）。ＭＳＣによって分泌されたエキソソームは、心筋梗塞（Ｌａｉ他、２０１０年）等の病気の異なるマウスモデルにおける修復だけでなく、創傷治癒（Ｚｈａｎｇ他、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０１４年；Ｓｈａｂｉｒ他、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ  ２０１５年；Ｚｈａｎｇ他、Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１５年）も誘導することが示された。
【００２２】
多くの論文で、ＭＳＣ由来のエキソソームが創傷治癒等の組織再生を誘導できることを実証しているにもかかわらず、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ：Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ）由来のエキソソームについては、実証されていない。更に、人間の臍帯血単核細胞によって分泌されたエキソソームの生理活性は、評価されておらず、慢性創傷の治療に対する治療可能性も評価されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２３】
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【発明の概要】
【００２４】
本発明は、創傷治癒を必要とする患者において、創傷治癒を促進する方法であって、該患者の創傷を、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌されたエキソソームと接触させ、それにより該患者における創傷治癒を促進することを含む方法を提供する。
【００２５】
また、本発明は、創傷治癒を必要とする患者において創傷治癒を促進するための、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌されるエキソソームを含む組成物も提供する。
【００２６】
また、本発明は、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌されるエキソソームを含む組成物を作製するプロセスも提供し、該プロセスは、ａ）ＵＣＢＭＮＣからエキソソームを分離するステップ、及びｂ）薬学上許容可能な担体にエキソソームを懸濁するステップを含む。
【００２７】
また、本発明は、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌されるエキソソームを含む創傷ケア製品も提供する。好適には、エキソソームは、ｍｉＲＮＡ  ｈａｓ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを含有する。
【００２８】
また、本発明は、創傷治癒を必要とする患者において、創傷治癒を促進する方法であって、該患者の創傷を、ｍｉＲＮＡ  ｈａｓ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを含む組成物と接触させ、それにより該患者における創傷治癒を促進することを含む方法も提供する。
【００２９】
また、本発明は、創傷治癒を必要とする患者において創傷治癒を促進するための、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ及び薬学上許容可能な担体を含む組成物も提供する。
【００３０】
また、本発明は、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ及び薬学上許容可能な担体を含む組成物を作製するプロセスも提供し、該プロセスは、ａ）ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを、トランスフェクション剤と混合するステップ、及びｂ）該混合物を、薬学上許容可能な担体に懸濁するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】血液分析器で分析された際の、臍帯血単核細胞の特徴及び凍結保存の影響であり、臍帯血中に存在する異なる白血球細胞の亜集団（リンパ球、単球、好中球、好酸球及び好塩基球）の詳細な組成。
【図１Ｂ】血液分析器で分析された際の、臍帯血単核細胞の特徴及び凍結保存の影響であり、総白血球細胞に対する臍帯血単核細胞（総リンパ球及び単球）の組成物における処理の影響。
【図２Ａ】臍帯血単核細胞によって分泌されたエキソソームの特徴であり、ＤＬＳによるエキソソームのサイズ分布。
【図２Ｂ】臍帯血単核細胞によって分泌されたエキソソームの特徴であり、ＤＬＳによって求めたエキソソームのゼータ電位。
【図２Ｃ】臍帯血単核細胞によって分泌されたエキソソームの特徴であり、  Ｃｌは、ＴＥＭによって求めた、ＵＣＢＭＮＣによって分泌されたエキソソームのサイズ及び形態；  Ｃ２は、ＴＥＭによって求めた、ＵＣＢＭＮＣによって分泌されたエキソソームのサイズ及び形態。
【図２Ｄ】臍帯血単核細胞によって分泌されたエキソソームの特徴であり、フローサイトメトリで分析された、低酸素状態と対照状態（酸素正常状態）でプレコンディショニングされたＵＣＢＭＮＣによって分泌されたエキソソームにおける表面マーカの発現。結果は、平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝３である。
【図２Ｅ】臍帯血単核細胞によって分泌されたエキソソームの特徴であり、低酸素状態（Ｅｘｏ＿Ｈｙｐ）と酸素正常状態（Ｅｘｏ＿Ｎｏｒ）でプレコンディショニングされたＵＣＢＭＮＣによって分泌されたエキソソームの、ＢｉｏＲａｄからのＤＣタンパク質アッセイで定量化された、総タンパク質含有量。結果は、平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝３である。統計的分析は、ｔテストで実行された。＊ｐ＜０．０５。
【図３Ａ】エキソソームの細胞毒性及びエキソソームの内皮細胞、線維芽細胞及びケラチノサイトへの取込みであり、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ／Ｈｏｅｃｈｓｔ染色によって求められた、ＨＵＶＥＣにおけるエキソソーム（３人の異なるドナーからの）の細胞毒性。細胞は、２４時間エキソソームに曝され、７２時間後に生存率が評価された。結果は、１ドナー当り平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝３である。約２０００細胞が、各画像で定量化された。
【図３Ｂ】エキソソームの細胞毒性及びエキソソームの内皮細胞、線維芽細胞及びケラチノサイトへの取込みであり、フローサイトメトリによって求められた、内皮細胞、線維芽細胞及びケラチノサイトによるエキソソームの取込み。結果は、平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝４〜６である。
【図３Ｃ】エキソソームの細胞毒性及びエキソソームの内皮細胞、線維芽細胞及びケラチノサイトへの取込みであり、エキソソーム除去済み培地内でＳｙｔｏ（登録商標）ＲＮＡＳｅｌｅｃｔ（登録商標）で標識されたエキソソーム（１〜２０ｇ／ｍｌ）に曝され、１６時間インキュベートされた皮膚細胞に関する共焦点顕微鏡。
【図３Ｄ】エキソソームの細胞毒性及びエキソソームの内皮細胞、線維芽細胞及びケラチノサイトへの取込みであり、ＨＵＶＥＣ、ＨａＣａＴ細胞及び線維芽細胞において  Ｓｙｔｏ（登録商標）ＲＮＡＳｅｌｅｃｔ（登録商標）で標識かされたエキソソームの定量化。結果は、平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝４である。
【図４Ａ】皮膚細胞における生理活性ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏであり、  ４Ａ１は、虚血プレコンディショニングされたＣＤ３４除去済みＵＣＢＭＮＣ細胞によって分泌されたエキソソーム（Ｅｘｏ＿Ｈｙｐ）は、線維芽細胞ではなく、内皮細胞とケラチノサイトの生存を高める。  ４Ａ２、４Ａ３、４Ａ４は、３名の異なるドナーから採取されたエキソソームに対して、結果が得られた。結果は、１ドナー当り平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝３である。血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬ）又は血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ、５０ｎｇ／ｍＬ）が、対照として使用された。
【図４Ｂ】皮膚細胞における生理活性ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏであり、  ４Ｂ１は、Ｅｘｏ＿Ｈｙｐ又はＥｘｏ＿Ｎｏｒで治療した際の内皮細胞、線維芽細胞及びケラチノサイトの増殖であり、    ４Ｂ２、４Ｂ３、４Ｂ４は、３名の異なるドナーから採取されたエキソソームに対して、結果が得られた。結果は、１ドナー当り平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝３である。＊ｐ＜０，０５；＊＊ｐ＜０，０１；＊＊＊ｐ＜０，００１。
【図５Ａ】皮膚細胞における生理活性ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏであり、  ５Ａ１は、Ｅｘｏ＿Ｈｙｐ又はＥｘｏ＿Ｎｏｒで治療後のケラチノサイト及び線維芽細胞における引掻きアッセイであり、  ５Ａ２、５Ａ３は、３名の異なるドナーから採取されたエキソソームに対して、結果が得られた。結果は、１ドナー当り平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝３である。＊ｐ＜０，０５；＊＊ｐ＜０，０１；＊＊＊ｐ＜０，００１。
【図５Ｂ】皮膚細胞における生理活性ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏであり、Ｍａｔｒｉｇｅｌでの内皮管アッセイ。ＨＵＶＥＣが、Ｅｘｏ＿Ｈｙｐ又はＥｘｏ＿Ｎｏｒで治療された。５Ａ２、５Ａ３は、及び５Ｂは、３名の異なるドナーから採取されたエキソソームに対して、結果が得られた。結果は、１ドナー当り平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝３である。＊ｐ＜０，０５；＊＊ｐ＜０，０１；＊＊＊ｐ＜０，００１。
【図６Ａ１】ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏ  ｍｉＲＮＡプロファイルの特徴であり、２名の異なるドナーにおいてＥｘｏ＿Ｈｙｐ及びＥｘｏ＿Ｎｏｒで特定されたｍｉＲＮＡ。６９の異なるｍｉＲＮＡが、分析される全エキソソームで２０リード超を数える、ＲＮＡＳｅｑによって、低酸素状態（ＨＹＰ）及び対照状態（ＮＯＲ）にされた２名の異なるドナー（Ａ及びＢ）からＣＤ３４除去済みｈＵＣＢＭＮＣによって分泌されたエキソソームで特定された。
【図６Ａ２】ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏ  ｍｉＲＮＡプロファイルの特徴であり、２名の異なるドナーにおいてＥｘｏ＿Ｈｙｐ及びＥｘｏ＿Ｎｏｒで特定されたｍｉＲＮＡ。両ドナーのｈＵＣＢＭＮＣを低酸素状態（ＨＹＰ）及び酸素正常状態（ＮＯＲ）でコンディショニングした後に得られたエキソソームに関して、５０リード超で、４４ｍｉＲを表したツリー表示。
【図６Ｂ１】ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏ  ｍｉＲＮＡプロファイルの特徴であり、１０名のドナーに関するｍｉＲＮＡの平均発現。（Ｂ１）低酸素状態にされたｈＵＣＢＭＮＣからのエキソソームの、ＲＮＡＳｅｑによって検出された、１５の最も発現されたｍｉＲＮＡの相対的発現。ＲＮＵ６は、対照として使用された。１０名の異なるドナーから採取されたエキソソームに対して、結果が得られた。結果は、１ドナー当り平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝３〜４である。
【図６Ｂ２】ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏ  ｍｉＲＮＡプロファイルの特徴であり、低酸素状態（ＨＹＰ）対酸素正常状態（ＮＯＲ）にされたｈＵＣＢＭＮＣからのエキソソームの、１２の最も発現したｍｉＲＮＡの相対的発現。ＲＮＵ６は、対照として使用された。１０名の異なるドナーから採取されたエキソソームに対して、結果が得られた。結果は、１ドナー当り平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝３〜４である。統計的分析は、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較検定を伴う一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）によって、実行された。＊ｐ＜０，０５；＊＊ｐ＜０，０１；＊＊＊ｐ＜０，００１。
【図７Ａ】ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏは、正常モデル、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病マウスモデルの創傷治癒を刺激し、  ７Ａ１は、ドナー１からのＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏ；  ７Ａ２は、ドナー２からのＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏ；  ７Ａ３は、非糖尿病動物に投与されたドナー１からのＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏ；  ７Ａ４は、遺伝的糖尿病動物（ｄｂ／ｄｂ）に投与されたドナー１からのＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏ。
【図７Ｂ】ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏは、正常モデル、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病マウスモデルの創傷治癒を刺激し、１０日目の対照創傷及び治療された創傷（Ｉ型糖尿病）のＨ＆Ｅ染色。
【図７Ｃ】ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏは、正常モデル、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病マウスモデルの創傷治癒を刺激し、ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏが、１日目に１回だけ（ＣＴ  Ｅｘｏ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ａｐ  ）、又は毎日２回（ＣＴ  Ｅｘｏ  １  Ｂｉ−ｄｉａｒｙ  Ａｐ  及びＣＴ  Ｅｘｏ  ２  Ｂｉ−ｄｉａｒｙ  Ａｐ）離れた創傷に適用される場合の、対照生理食塩水で治療された創傷（対照創傷）との創閉鎖率の比較。離れた切除創傷に毎日２回適用されたＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏは、対照創傷で創傷治癒を刺激する。
【図８Ａ１】ｍｉＲ−１５０−５ｐは、虚血に対する線維芽細胞の生存及びインビトロでのケラチノサイト遊走を促進し、インビボでの創傷治癒を促進し、虚血状態における生存である。
【図８Ａ２】ｍｉＲ−１５０−５ｐは、虚血に対する線維芽細胞の生存及びインビトロでのケラチノサイト遊走を促進し、インビボでの創傷治癒を促進し、内皮細胞、線維芽細胞及びケラチノサイトの増殖である。
【図８Ａ３】ｍｉＲ−１５０−５ｐは、虚血に対する線維芽細胞の生存及びインビトロでのケラチノサイト遊走を促進し、インビボでの創傷治癒を促進し、線維芽細胞及びケラチノサイトの引掻きアッセイである。
【図８Ａ４】ｍｉＲ−１５０−５ｐは、虚血に対する線維芽細胞の生存及びインビトロでのケラチノサイト遊走を促進し、インビボでの創傷治癒を促進し、Ｍａｔｒｉｇｅｌにおける内皮細胞の管形成に関する、ｍｉＲ−１５０−５ｐのインビトロ効果。血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬ）及び血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ、５０ｎｇ／ｍＬ）が、全アッセイに対して対照として使用された。結果は、平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝３〜６である。統計的分析は、マンホイットニー検定によって実行された。＊ｐ＜０，０５；＊＊ｐ＜０，０１；＊＊＊ｐ＜０，００１。
【図８Ｂ１】Ｃ５７Ｂ１／６に付けられた切除創傷の創傷治癒におけるｍｉＲ−１５０のインビボ効果。結果は、平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝５〜６である。統計的分析は、ｔテストで実行された。Ｓｃｒａｍｂｌｅ治療（Ｓｃｒａｍｂｌｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）に対してｐ＜０，０５（＊）；“非治療”＝ＰＢＳ（＃）。
【図８Ｂ２】ｍｉＲ−１５０−５ｐ、Ｓｃｒａｍｂｌｅ及びＰＢＳ（非治療）で治療された創傷の０日目；７日目及び１０日目の代表的画像。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、創傷治癒を必要とする患者において、創傷治癒を促進する方法であって、該患者の創傷を、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌されたエキソソームを含む組成物と接触させ、それにより該患者における創傷治癒を促進することを含む方法を提供する。
【００３３】
一実施形態では、該組成物は、薬学上許容可能な担体を更に含む。
【００３４】
一実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、リンパ球、単球、好中球、好酸球、及び／又は好塩基球を含む。
【００３５】
一実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、リンパ球を含む。一実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、リンパ球から成る。一実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、基本的にリンパ球から成る。
【００３６】
一実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは単球を含む。一実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、単球から成る。一実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、基本的には単球から成る。
【００３７】
一実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、好中球を含む。一実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、好酸球を含む。一実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、好塩基球を含む。
【００３８】
一実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、リンパ球及び単球を含む。一実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、基本的にはリンパ球及び単球から成る。一実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、リンパ球及び単球から成る。
【００３９】
一実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、リンパ球及び好中球を含む。一実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、単球及び好中球を含む。
【００４０】
一実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、ＣＤ３４＋細胞を含む。別の実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、ＣＤ３４＋細胞を含まない。
【００４１】
一実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、虚血状態に曝されなかった。別の実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、虚血状態に曝された。一実施形態では、ＵＣＢＭＮＣは、低酸素状態に曝された。一実施形態では、ＵＢＣＭＮＣは、低酸素状態に曝されなかった。
【００４２】
一実施形態では、虚血及び／又は低酸素状態に曝すことで、ＵＣＢＭＮＣからエキソソームの分泌を増大するように刺激する。別の実施形態では、虚血及び／又は低酸素状態に曝すことで、分泌されたエキソソームの生理活性を高めた。一実施形態では、生理活性は、生存促進性（ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）の生理活性である。別の実施形態では、生理活性は、増殖促進性（ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の生理活性である。別の実施形態では、生理活性は、遊走促進性（ｐｒｏ−ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）の生理活性である。
【００４３】
一実施形態では、エキソソームの少なくとも１つは、球状形態を示す。
【００４４】
一実施形態では、エキソソームは、１００ｎｍ〜２００ｎｍの平均粒子径を有する。一実施形態では、エキソソームは、１２０ｎｍ〜１７０ｎｍの平均粒子径を有する。一実施形態では、エキソソームは、１３０ｎｍ〜１５０ｎｍの平均粒子径を有する。一実施形態では、エキソソームは、１４０ｎｍの平均粒子径を有する。
【００４５】
一実施形態では、エキソソームは、−１０ｍＶ〜−５０ｍＶの負のゼータ電位を有する。一実施形態では、エキソソームは、−２０ｍＶ〜−４０ｍＶの負のゼータ電位を有する。一実施形態では、エキソソームは、−３０ｍＶの負のゼータ電位を有する。
【００４６】
一実施形態では、エキソソームの少なくとも１つは、マーカＣＤ９、ＣＤ３４、ＣＤ８１、及び／又はＨｓｃ７０を発現する。
【００４７】
一実施形態では、エキソソームの少なくとも１つは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及び  ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含有する。
【００４８】
一実施形態では、エキソソームの少なくとも１つは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含有する。
【００４９】
一実施形態では、エキソソームの少なくとも１つは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含有する。
【００５０】
一実施形態では、エキソソームの少なくとも１つは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含有する。
【００５１】
一実施形態では、エキソソームの少なくとも１つは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含有する。
【００５２】
一実施形態では、エキソソームの少なくとも１つは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含有する。
【００５３】
一実施形態では、エキソソームの少なくとも１つは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含有する。            
【００５４】
一実施形態では、エキソソームの少なくとも１つは、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを含有する。一実施形態では、エキソソームの少なくとも１０％は、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを含有する。一実施形態では、エキソソームの少なくとも２５％は、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを含有する。一実施形態では、エキソソームの少なくとも５０％は、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを含有する。一実施形態では、エキソソームの少なくとも７５％は、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを含有する。一実施形態では、エキソソームの少なくとも９０％は、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを含有する。
【００５５】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐは、エキソソームの如何なる他のｍｉＲＮＡの濃度より、エキソソームにおいて高濃度を有する。
【００５６】
一実施形態では、エキソソームは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを濃縮され、それにより、エキソソームにおけるｍｉＲＮＡの濃度を高める。
【００５７】
一実施形態では、エキソソームは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、  ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを濃縮され、それにより、エキソソームにおけるｍｉＲＮＡの濃度を高める。  
【００５８】
一実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを濃縮され、それにより、エキソソームにおけるｍｉＲＮＡの濃度を高める。
【００５９】
エキソソームは、当該技術分野で既知の従来の方法を使用して、ｍｉＲＮＡを濃縮されてもよく、該方法は、分画遠心法、密度勾配／クッション遠心法、サイズ排除クロマトグラフィ、沈殿、ビーズ上での免疫親和性捕捉、及び電気穿孔法、分泌細胞のウイルス感染、及び小胞タンパク質に融合された配列認識ドメインを介した特定のＲＮＡ配列を標的にした包埋に基づく技術等のＲＮＡ  Ｌｏａｄｉｎｇ技術を含むが、これらに限定されない。      
【００６０】
一実施形態では、組成物は、液体である。一実施形態では、組成物は、クリームである。一実施形態では、組成物は、ゲルである。
【００６１】
一実施形態では、組成物は、単回使用で投与される。別の実施形態では、組成物は、定期的に投与される。別の実施形態では、組成物は、毎日１回は投与されない。別の実施形態では、組成物は、毎日１回投与される。別の実施形態では、組成物は、毎日１回以上投与される。別の実施形態では、組成物は、毎日２回投与される。別の実施形態では、組成物は、毎日３回投与される。
【００６２】
一実施形態では、組成物は、局所的に適用される。一実施形態では、組成物は、皮下注射で適用される。一実施形態では、組成物は、皮膚注射で適用される。一実施形態では、組成物は、腹腔内注射で適用される。一実施形態では、組成物は、静脈注射で適用される。
【００６３】
一実施形態では、組成物におけるエキソソームの濃度は、０．０１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬである。一実施形態では、エキソソームの濃度は、１μｇ／ｍＬ〜３μｇ／ｍＬである。一実施形態では、エキソソームの濃度は、０．５μｇ／ｍＬ〜１．５μｇ／ｍＬである。一実施形態では、エキソソームの濃度は、約１μｇ／ｍＬである。一実施形態では、エキソソームの濃度は、０．０１μｇ／ｍＬである。一実施形態では、エキソソームの濃度は、０．２５μｇ／ｍＬである。一実施形態では、エキソソームの濃度は、０．５μｇ／ｍＬである。一実施形態では、エキソソームの濃度は、０．７５μｇ／ｍＬである。一実施形態では、エキソソームの濃度は、１．０μｇ／ｍＬである。一実施形態では、エキソソームの濃度は、１．２５μｇ／ｍＬである。一実施形態では、エキソソームの濃度は、１．５μｇ／ｍＬである。一実施形態では、エキソソームの濃度は、１．７５μｇ／ｍＬである。一実施形態では、エキソソームの濃度は、２．０μｇ／ｍＬである。一実施形態では、エキソソームの濃度は、２．２５μｇ／ｍＬである。一実施形態では、エキソソームの濃度は、２．５μｇ／ｍＬである。一実施形態では、エキソソームの濃度は、２．７５μｇ／ｍＬである。一実施形態では、エキソソームの濃度は、３．０μｇ／ｍＬである。一実施形態では、エキソソームの濃度は、５．０μｇ／ｍＬである。一実施形態では、エキソソームの濃度は、１０μｇ／ｍＬである。
【００６４】
一実施形態では、組成物は、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを更に含み、該ｍｉＲＮＡは、エキソソームに含有されない。
【００６５】
一実施形態では、組成物は、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、  ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを更に含み、該ｍｉＲＮＡは、エキソソームに含有されない。
【００６６】
一実施形態では、組成物は、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを更に含み、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐは、エキソソームに含有されない。
【００６７】
一実施形態では、創傷治癒は、創傷治癒の速度を加速することによって、促進される。一実施形態では、創傷治癒は、血管新生を誘導することによって、促進される。
【００６８】
一実施形態では、創傷治癒は、細胞の生存を高めることによって促進される。一実施形態では、創傷治癒は、ケラチノサイトの生存を高めることによって促進される。別の実施形態では、創傷治癒は、内皮細胞の生存を刺激することによって促進される。
【００６９】
一実施形態では、創傷治癒は、細胞の増殖を高めることによって促進される。一実施形態では、創傷治癒は、線維芽細胞の増殖を高めることによって促進される。
【００７０】
一実施形態では、創傷治癒は、創傷の方への細胞の遊走を増加することによって促進される。一実施形態では、創傷治癒は、創傷の方への線維芽細胞の遊走を増加することによって促進される。別の実施形態では、創傷治癒は、創傷の方へのケラチノサイトの遊走を増加することによって促進される。
【００７１】
一実施形態では、創傷治癒は、創傷部位で及び／又は付近で、管形成を増大させることによって促進される。一実施形態では、創傷治癒は、内皮細胞によって管形成を誘導することによって促進される。
【００７２】
一実施形態では、エキソソームは、形成される血管の総数を増加させるのに有効である。別の実施形態では、エキソソームは、形成される血管網の複雑さを増大させるのに有効である。一実施形態では、形成される血管網の複雑さは、分岐点の増加数によって評価される。
【００７３】
一実施形態では、ケラチノサイトは、虚血状態に曝された。一実施形態では、ケラチノサイトは、低酸素状態に曝された。一実施形態では、線維芽細胞は、虚血状態に曝された。一実施形態では、線維芽細胞は、低酸素状態に曝された。一実施形態では、内皮細胞は、虚血状態に曝された。一実施形態では、内皮細胞は、低酸素状態に曝された。
【００７４】
一実施形態では、虚血状態に曝されたエキソソームは、虚血状態に曝されていないエキソソームより、線維芽細胞の増殖を誘導するのに有効である。一実施形態では、虚血状態に曝されたエキソソームは、１μｇ／ｍＬの濃度で虚血状態に曝されていないエキソソームより、１μｇ／ｍＬの濃度で線維芽細胞の増殖を誘導するのに有効である。一実施形態では、虚血状態に曝されたエキソソームは、２μｇ／ｍＬの濃度で虚血状態に曝されていないエキソソームより、２μｇ／ｍＬの濃度で線維芽細胞の増殖を誘導するのに有効である。
【００７５】
別の実施形態では、低酸素状態に曝されたエキソソームは、線維芽細胞の増殖を誘導するのにより有効である。一実施形態では、低酸素状態に曝されたエキソソームは、１μｇ／ｍＬの濃度で線維芽細胞の増殖を誘導するのにより有効である。一実施形態では、低酸素状態に曝されたエキソソームは、２μｇ／ｍＬの濃度で線維芽細胞の増殖を誘導するのにより有効である。
【００７６】
一実施形態では、創傷治癒は、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐによって促進される。
【００７７】
別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐは、創傷の方へのケラチノサイトの遊走を増加させ、それにより創傷治癒を促進する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐは、線維芽細胞の生存を高め、それにより創傷治癒を促進する。
【００７８】
一実施形態では、創傷治癒は、エキソソームの接触部位に対する局所的部位で促進される。別の実施形態では、創傷治癒は、エキソソームの接触部位から離れた部位で促進される。
【００７９】
別の実施形態では、創傷は、慢性創傷である。
【００８０】
一実施形態では、創傷は、褥瘡性潰瘍である。別の実施形態では、創傷は、静脈性潰瘍である。別の実施形態では、創傷は、手術後の潰瘍である。別の実施形態では、創傷は、外傷性潰瘍である。別の実施形態では、創傷は、下肢の創傷である。別の実施形態では、創傷は、動脈性潰瘍である。
【００８１】
一実施形態では、創傷は、口腔内潰瘍である。
【００８２】
一実施形態では、創傷は、目の創傷又は角膜潰瘍である。
【００８３】
一実施形態では、患者は、糖尿病に罹患している。一実施形態では、患者は、糖尿病に罹患していない。
【００８４】
別の実施形態では、患者は、Ｉ型糖尿病に罹患している。別の実施形態では、患者は、ＩＩ型糖尿病に罹患している。
【００８５】
一実施形態では、創傷は、糖尿病性潰瘍である。一実施形態では、糖尿病性潰瘍は、糖尿病性足部潰瘍である。
【００８６】
一実施形態では、創傷は、開放創である。一実施形態では、開放創は、切り創傷である。一実施形態では、開放創は、裂創傷である。一実施形態では、開放創は、断裂である。一実施形態では、開放創は、擦過創傷である。一実施形態では、開放創は、剥離である。一実施形態では、開放創は、穿刺である。
【００８７】
一実施形態では、創傷は、切除創傷である。別の実施形態では、創傷は、感染性創傷である。別の実施形態では、創傷は、虚血性創傷である。別の実施形態では、創傷は、放射能中毒傷である。別の実施形態では、創傷は、手術創である。
【００８８】
一実施形態では、創傷は、火傷である。一実施形態では、火傷は、熱傷である。一実施形態では、火傷は、化学火傷である。一実施形態では、火傷は、放射線火傷である。
【００８９】
一実施形態では、創傷は、ざ瘡、乾癬、酒さ、皮膚炎、湿疹、膿痂疹、間擦疹、若しくは毛包炎等の創傷を含む皮膚の状態又は病気に関係する。
【００９０】
一実施形態では、創傷治癒の加速速度は、２日目までに顕著である。別の実施形態では、創傷治癒の加速速度は、３日目までに顕著である。別の実施形態では、創傷治癒の加速速度は、１０日目までに顕著である。
【００９１】
一実施形態では、創傷治癒は、創閉鎖によって評価される。一実施形態では、創閉鎖は、少なくとも１０％改善される。別の実施形態では、創閉鎖は、少なくとも２０％改善される。別の実施形態では、創閉鎖は、少なくとも３０％改善される。別の実施形態では、創閉鎖は、少なくとも５０％改善される。別の実施形態では、創閉鎖は、少なくとも８０％改善される。別の実施形態では、創閉鎖は、１００％超改善される。
【００９２】
一実施形態では、完全な創閉鎖にかかる時間は、少なくとも１０％短縮される。別の実施形態では、完全な創閉鎖にかかる時間は、少なくとも２０％短縮される。別の実施形態では、完全な創閉鎖にかかる時間は、少なくとも３０％短縮される。別の実施形態では、完全な創閉鎖にかかる時間は、少なくとも５０％短縮される。別の実施形態では、完全な創閉鎖にかかる時間は、少なくとも８０％短縮される。別の実施形態では、完全な創閉鎖にかかる時間は、１００％超短縮される。
【００９３】
本発明は、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌されるエキソソームを含む組成物を提供する。
【００９４】
本発明は、創傷治癒を必要とする患者において創傷治癒を促進する際に使用するための、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌されるエキソソームを含む組成物を提供する。
【００９５】
本発明は、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含有するエキソソームを含む組成物を提供する。
【００９６】
一実施形態では、エキソソームは、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌される。
【００９７】
一実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを含有する。
【００９８】
本発明は、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌されるエキソソームを含む組成物を作製するプロセスを提供し、該プロセスは、ａ）ＵＣＢＭＮＣからエキソソームを分離するステップ、及びｂ）薬学上許容可能な担体にエキソソームを懸濁するステップを含む。
【００９９】
一実施形態では、薬学上許容可能な担体は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）である。一実施形態では、薬学上許容可能な担体は、液体懸濁液である。一実施形態では、薬学上許容可能な担体は、ポリマである。一実施形態では、薬学上許容可能な担体は、ヒドロゲルである。一実施形態では、薬学上許容可能な担体は、タンパク質マトリックスである。一実施形態では、薬学上許容可能な担体は、リポソーム懸濁液である。一実施形態では、薬学上許容可能な担体は、泡である。
【０１００】
一実施形態では、エキソソームは、遠心分離法によってＵＣＢＭＮＣから分離される。一実施形態では、エキソソームは、分画遠心法によってＵＣＢＭＮＣから分離される。
【０１０１】
エキソソームを精製するのに最も一般的に使用される技術は、分画超遠心分離法であるが、密度勾配における超遠心分離法、高圧の液体クロマトグラフィ−ゲル排除クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ−ＧＥＣ：ｈｉｇｈ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｇｅｌ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、溶媒沈殿、限外濾過、免疫親和性捕捉（ＩＡＣ：ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃａｐｔｕｒｅ）、及びフィールドフロー分画（ＦＦＦ：ｆｉｅｌｄ  ｆｌｏｗ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）を含むが、これらに限定されない他の技術も、本発明に使用されてもよい。
【０１０２】
溶媒沈殿は、超遠心分離機なしで、比較的遅い回転速度でエキソソームを上手く分離する技術である。溶媒沈殿を使用する市販キットの３例は、Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥｘｏＱｕｉｃｋ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｅｘｏ−ｓｐｉｎ（登録商標）（Ｃｅｌｌ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）である。
【０１０３】
ＩＡＣは、抗体の、該抗体の特定の抗原に対する結合に依存する。エキソソームの小成分に関する知識が増加するにつれて、特にエキソソームを特異的に識別するのに使用できる、より多くの個々の抗原標的（通常、タンパク質）が、特定されている。
【０１０４】
ＦＦＦは、粒子が、層流速度勾配における粒子位置によって分離される技術である。非対称的な流れのフィールドフロー分画では、下方へのチャンネルフローに直交するクロスフローは、流路の境を示す膜へと粒子を駆動する。
【０１０５】
分散は、粒子を、クロスフローに対向して、膜から離れて移動させる。
【０１０６】
一実施形態では、プロセスは、ステップｂ）の前に、エキソソームを１つ又は複数のｍｉＲＮＡに関して濃縮するステップを更に含み、該ｍｉＲＮＡは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される。
【０１０７】
一実施形態では、プロセスは、ステップｂ）の前に、エキソソームを１つ又は複数のｍｉＲＮＡに関して濃縮するステップを更に含み、該ｍｉＲＮＡは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される。
【０１０８】
一実施形態では、プロセスは、ステップｂ）の前に、エキソソームをｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐに関して濃縮するステップを含む。  ．
【０１０９】
一実施形態では、組成物は、エキソソームに含有されない１つ又は複数のｍｉＲＮＡを更に含み、プロセスは、ｍｉＲＮＡを、トランスフェクション剤と混合するステップ、及び該混合物を、薬学上許容可能な担体に懸濁するステップを含み、該ｍｉＲＮＡは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される。
【０１１０】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される。
【０１１１】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｈａｓ−ｍｉＲ−１５０−５ｐである。
【０１１２】
また、本発明は、本明細書に記載されたプロセスによって調製された臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌されるエキソソームを含む組成物も提供する。
【０１１３】
また、本発明は、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌されるエキソソームを含む創傷ケア製品も提供する。
【０１１４】
本発明は、創傷治癒を必要とする患者において、創傷治癒を促進する方法であって、該患者の創傷を、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む方法を提供する。            
【０１１５】
本発明は、創傷治癒を必要とする患者において、創傷治癒を促進する方法であって、該患者の創傷を、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む方法を提供する。
【０１１６】
本発明は、創傷治癒を必要とする患者において、創傷治癒を促進する方法であって、該患者の創傷を、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む方法を提供する。
【０１１７】
本発明は、創傷治癒を必要とする患者において、創傷治癒を促進する方法であって、該患者の創傷を、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを含む組成物と接触させ、それにより該患者における創傷治癒を促進することを含む方法を提供する。        
【０１１８】
一実施形態では、適用されるｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐの量は、１００ｐｍｏｌ〜１ｎｍｏｌである。一実施形態では、適用されるｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐの量は、１００ｐｍｏｌ〜８００ｐｍｏｌである。一実施形態では、適用されるｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐの量は、３００ｐｍｏｌ〜５００ｐｍｏｌである。一実施形態では、適用されるｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐの量は、４００ｐｍｏｌである。
【０１１９】
本発明は、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択されるｍｉＲＮＡを含む、創傷治癒を必要とする患者において創傷治癒を促進するための組成物を提供する。
【０１２０】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡの１つは、ｈａｓ−ｍｉＲ−１５０−５ｐである。
【０１２１】
一実施形態では、組成物は、薬学上許容可能な担体を更に含む。
【０１２２】
本発明は、１つ又は複数のｍｉＲＮＡ及び薬学上許容可能な担体を含む組成物を作製するプロセスを提供し、該プロセスは、ａ）ｍｉＲＮＡを、トランスフェクション剤と混合するステップ、及びｂ）該混合物を、薬学上許容可能な担体に懸濁するステップを含み、該ｍｉＲＮＡは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される。
【０１２３】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡの１つは、ｈａｓ−ｍｉＲ−１５０−５ｐである。
【０１２４】
また、本発明は、本明細書に記載されたプロセスで調製されるｍｉＲＮＡ及び薬学上許容可能な担体を含む組成物も提供する。
【０１２５】
また、本発明は、本明細書に記載された組成物を含む創傷ケア製品も提供する。
【０１２６】
一実施形態では、創傷ケア製品は、手当用品又は製剤である。
【０１２７】
一実施形態では、手当用品又は製剤は、移植材料、パッチ、パッド、硬膏剤、フィルム、テープ、接着剤、ゲル、泡、クリーム、軟膏（ｓａｌｖｅ）、香油、塗布剤、軟膏剤、湿布、油薬、皮膚軟化薬、擦剤、頓服、軟膏（ｕｎｇｕｅｎｔ）、ローション、噴霧剤、懸濁剤、粉末、注射器、噴霧器又はエアゾール容器である。
【０１２８】
一実施形態では、創傷ケア製品は：
ａ）少なくとも１つの線維芽細胞層を含む移植材料；
ｂ）フィブリンマトリックス及び線維芽細胞を含むゲル又は移植材料；
ｃ）少なくとも１つの構造タンパク質のマトリックスを含む移植材料；
ｄ）架橋コラーゲン及びグルコサミノグリカンのマトリックスを含む移植材料；
ｅ）水中に分散された親水性ポリマのマトリックスを含むゲル、パッチ、パッド、硬膏剤、フィルム若しくは接着剤；
ｆ）ポリウレタン膜及び／又は泡；
ｇ）細胞外マトリックスタンパク質、アルギン酸及び水を含む製剤；又は
ｈ）上記エキソソームを含むエアゾールを含むエアゾール容器
である。
【０１２９】
一実施形態では、創傷ケア製品は、更に防腐剤又は抗菌剤を更に含む。
【０１３０】
また、本発明は、本明細書に記載された組成物を含む密封パッケージも提供する。
【０１３１】
また、本発明は、創傷治癒を必要とする患者において、創傷治癒を促進する方法であって、該患者の創傷を、本明細書に記載された組成物と接触させ、それにより該患者における創傷治癒を促進することを含む方法も提供する。    
【０１３２】
また、本発明は、創傷治癒を必要とする患者において、創傷治癒を促進するための、本明細書に記載された組成物の使用も提供する。
【０１３３】
また、本発明は、創傷治癒を必要とする患者において創傷治癒を促進するための薬物を製造する際における本明細書に記載された組成物の使用も提供する。
【０１３４】
本発明は、組織修復を必要とする患者において、組織修復を促進する方法であって、該患者の組織を臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌されたエキソソームと接触させ、それにより患者における組織修復を促進することを含む方法を提供する。
【０１３５】
また、本出願は、組織修復を必要とする患者において、組織修復を促進する方法であって、該患者の組織を、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含む方法も提供する。
【０１３６】
本発明は、組織修復を必要とする患者において、組織修復を促進する方法であって、該患者の組織をｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを含む組成物と接触させ、それにより患者における組織修復を促進することを含む方法を提供する。  
【０１３７】
本明細書に開示された各実施形態は、他の開示された実施形態其々に適用可能であると考えられる。従って、本明細書に記載された様々な要素のあらゆる組合せは、本発明の範囲内にある。
【０１３８】
用語
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【０１３９】
本明細書で使用される通り、及び文脈によって特に明記されない限り又は特に要求されない限り、次の用語其々は、以下に記載された定義を有するものとする。
【０１４０】
本明細書で使用される用語「創傷（ｗｏｕｎｄ）」は、任意の生体組織に対する損傷を指す。創傷は、行為によって、感染性疾患によって、又は基礎症状によって引き起こされる可能性がある。創傷は、慢性又は急性であるかもしれない。創傷の例として、切創、潰瘍、糖尿病性潰瘍、虚血性組織障害、虚血性心臓障害等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】
本明細書で言及された全ての刊行物及び他の参考文献は、個々の刊行物又は参考文献が、参照により組込まれるように明確に且つ個別に示されているかのごとく、全体として、参照により組込まれる。本明細書に記載された刊行物及び参考文献は、先行技術であるとは認められない。
【０１４２】
本発明は、次の実験詳細を参照することによって一層理解されるであろう。しかしながら、当業者は、詳述された特定の実験が、後述のクレームにおいて規定される本発明の例示に過ぎないことを容易に理解するであろう。
【０１４３】
実験詳細
実施例１  虚血プレコンディショニングは、エキソソームを分泌するように臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）を刺激し、該細胞の皮膚細胞に対する生理活性を高める。
ＵＣＢＭＮＣの全画分は、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（登録商標）を使用して単離され、該細胞は、血液分析器を使用して特徴付けられた。凍結保存後に、該集団は、リンパ球及び単球（ＭＮＣ：ｍｏｎｏｃｙｔｅ）を濃縮される一方で、好中球の大部分の画分は、失われる（図１Ａ及び図１Ｂ）。エキソソームの分泌に使用されるプールは、リンパ球と単球で主に構成される。
【０１４４】
実験では、虚血プレコンディショニング（０．５％のＯ２、５％のＣＯ２、０％のＦＢＳ、１８時間）で、ＵＣＢＭＮＣを刺激して、異なる種類の皮膚細胞（線維芽細胞、ケラチノサイト及び内皮細胞）による特定の動態で内部移行される生理活性エキソソームを分泌することを実証した。また、実験では、これらのエキソソーム（ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏ）が、インビトロで強力な再生促進効果（ｐｒｏ−ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ）を及ぼし、該効果は、皮膚細胞（線維芽細胞、ケラチノサイト、及び内皮細胞）の生存及び増殖促進性を高めるだけでなく、線維芽細胞及びケラチノサイトの遊走、及び内皮細胞による管形成を刺激することを伴うことも実証した。更に、実験では、１日２回のＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏの局所投与が、正常な動物モデル及びＩ型及びＩＩ型糖尿病の動物モデルにおける切除創傷の治癒を大幅に加速させることを実証した。  
【０１４５】
実施例１．１：エキソソームの特徴
実験手順：
エキソソームは、その全内容が本明細書に組込まれるＴｈｅｒｙ  Ｃ．他（２００６年）に記載された分画遠心法によって精製された。
【０１４６】
手短に言えば、上清は、細胞除去に３００ｇ（１０分）、壊死細胞片除去に２０００ｇ（２０分）、及び微小胞除去に２回１０，０００ｇ（３０分）を行う連続した遠心分離ステップにかけられた。ＳＷ４１Ｔｉ又はＳＷ３２Ｔｉ型スイングバケットロータ（Ｂｅｃｋｍａｎ社）内で１００，０００ｇで２時間遠心分離した後に、ペレットは、７ｍＬのＰＢＳで洗浄され、更に２時間、１００，０００ｇで遠心分離された。エキソソームを含有するペレットは、２５０ｕＬのＰＢＳに再懸濁された。エキソソームは、エキソソームのタンパク質含有量に基づいてＢｉｏＲａｄ（登録商標）からのＤＣタンパク質アッセイキットを使用して定量化された。
【０１４７】
ＵＣＢＭＮＣによって分泌されたエキソソームは、初めに、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ：ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ）及び動的光散乱（ＤＬＳ：ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を使用して特徴付けられた。ＤＬＳ分析は、ＺｅｔａＰｌｕｓ粒子径ソフトウェアＶ．２．２７（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含むＺｅｔａ  ＰＡＬＳゼータ電位分析器で、実行された。粒径に関して、エキソソーム（５０μＬ）は、ＰＢＳ（２００μＬ）で希釈され、サンプル当り５測定値が、ｎ＝１７に対して２５℃で取得された。ゼータ電位に関して、エキソソーム（５０μＬ）は、０．２μｍ細孔を通して濾過された生物学的分子グレード水で、２５倍に希釈された。各サンプルは、５回測定され、提示された結果は、算術平均がｎ＝４である。ＴＥＭ分析は、Ｊｅｏｌ  ＪＥＭ１４００透過型電子顕微鏡（Ｔｏｋｙｏ）で実行された。サンプルは、３００メッシュのｆｏｒｍｖａｒの銅格子に載置され、１％の酢酸ウラニルで染色された。画像は、ポルトガルのＰｏｒｔｏ大学のＨＥＭＳ／ＩＢＭＣ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）で、Ｇａｔａｎ社（米国、ペンシルベニア州、ウォーレンデール）製ＯＲＩＵＳ  ＳＣ１０００  ＣＣＤカメラを使用してデジタル的に記録され、フォトモンタージュが、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州サンノゼ市）を使用して実行された。
【０１４８】
結果：
我々の結果は、エキソソームが、１４０ｎｍの平均サイズ（図２Ａ）、負のゼータ電位（−３０ｍＶ）（図２Ｂ）、及び球状形態（図２Ｃ．１及び図２Ｃ．２）を有したことを示した。また、これらのエキソソームは、ＦＡＣＳによって分析した際、マーカＣＤ９、ＣＤ８１、及びＨＳＣ７０を発現した（図２Ｄ）。
【０１４９】
低酸素状態で分泌されたエキソソームの生物理学的特性と、酸素正常状態（対照状態）で分泌されたエキソソームの生物理学的特性との間には、著しい相違は全くなかった。しかしながら、データは、増加したタンパク質含有量から観察されるように（図２Ｅ）、低酸素状態が、ＵＣＢＭＮＣによるエキソソームの分泌増大を刺激したことを示唆したが、該エキソソームは、同数の分泌細胞に標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）され、等量の最終容量に再懸濁される。  
【０１５０】
実施例１．２：皮膚細胞によるエキソソームの取込み速度
１．２．１  皮膚細胞の割合
実験手順：
皮膚細胞は、ＵＣＢＭＮＣ由来のエキソソームを取込むが、取込み速度及び程度は、細胞の種類によって異なる。皮膚細胞によるエキソソームの取込み速度の相違を示すために、エキソソームは、初めに、蛍光染料（ＮＢＤ−ＤＰＰＥ及びＳｙｔｏ  ｇｒｅｅｎ）で標識された。手短に言えば、ＮＢＤ−ＤＰＰＥ（エタノール中１６μＭ）又はＳｙｔｏ  Ｇｒｅｅｎ（ＤＭＳＯ  中１０μＭ）染料が、エキソソーム懸濁液（１００μＬ；タンパク質濃度６０〜７０μｇ／ｍＬ）（ＤＭＳＯ及びＥｔＯＨ＜１％）に添加され、３７℃で３０分間インキュベートされた。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、１％、ｗ／ｖ）で反応をブロッキングした後に、エキソソームは、ＰＢＳ（６ｍＬ）で洗浄され、遊離色素は、１００，０００ｇで１  時間、超遠心分離することによって除去された。次に、エキソソームは、ＰＢＳ（１００μｌ）に再懸濁された。この手順は、常に新鮮なエキソソームで実行された。標識されたエキソソームは、直ちに内部移行実験に使用された。
【０１５１】
我々は、フローサイトメトリによって、４時間のインキュベート後にＵＣＢＭＮＣ由来のエキソソームを取込めた皮膚細胞の割合を評価した。ＨＵＶＥＣ（８０，０００細胞／ウェル）、ＨａＣａＴ細胞（１６０，０００細胞／ウェル）、及び線維芽細胞（５０，０００細胞／ウェル）は、２４ウェルプレートに播種され、成長のために１８〜２４時間放置された。コンフルエントな細胞は、ＮＢＤ−ＤＰＰＥで標識されたエキソソームと共に、４時間、ウシ胎児血清（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）無しの細胞培地で、最終濃度１、２及び３μｇ／ｍＬで、インキュベートされた。その後、細胞は、ＰＢＳで一度洗浄され、トリプシン（ＨＵＶＥＣ及びＮＤＨＦ）又はｔｒｉｐＬＥ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＨａＣａＴ）で解離され、ＰＢＳに二度洗浄され、Ｃｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が組込まれたＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ機器でフローサイトメトリによって分析された。  
【０１５２】
結果：
エキソソームは、内皮細胞に対して、濃度１０μｇ／ｍＬまでは、細胞毒性はない。（図３Ａ）。
【０１５３】
また、我々の結果は、１〜３μｇ／ｍＬのエキソソーム濃度に関して、より高い内部移行レベルが、より高濃度のエキソソームに対して観察されたことを示した（図３Ｂ）。更に、ケラチノサイトと線維芽細胞の両方共、内皮細胞より、エキソソームの内部移行に許容的であった。
【０１５４】
１．２．２：インキュベーション時間の効果
実験手順：
次に、我々は、共焦点顕微鏡を使用して、皮膚細胞によるエキソソームの取込み速度に関するインキュベーション時間及びエキソソーム濃度の影響を評価した（図３Ｃ）。スナップショット（図３Ｃ）は、Ｚｅｉｓｓ社製ＬＳＭ７１０共焦点走査装置で、４０５及び４８８の励起波長、及びプランアポクロマート４０ｘ／１．４油浸対物レンズを用いて、取得された。また、動態プロファイルも、ハイコンテント顕微鏡（Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｅｒ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して、２４時間の異なる時点で細胞質強度を分析することによって、得られた。顕微鏡は、加熱恒温装置を備え、該装置は、３７℃に設定され、ＣＯ２供給が５％に設定された。生細胞を顕微鏡検査する実験には、ＨＵＶＥＣ細胞が、２４時間、ＩＢＩＤＩ（登録商標）のμ−Ｓｌｉｄｅ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  プレートで成長された。Ｓｙｔｏ（登録商標）  ＲＮＡＳｅｌｅｃｔ（登録商標）で標識されたエキソソーム（１〜２０ｇ／ｍｌ）が、コンフルエントな細胞に、エキソソーム除去済み培地内で添加され、異なる時点でインキュベートされた。細胞は、ＰＢＳで２回洗浄され、実験の経過中に、ＦＢＳ含有培地内に保持された。
【０１５５】
結果：
我々の結果は、検査された３種類の細胞において、エキソソームが全細胞質に存在したことを示した。細胞質におけるエキソソームの蓄積は、接触後約１６時間でピークに達した（図３Ｄ）。
【０１５６】
１．２．３：エキソソームの機能的効果
実験手順：
皮膚細胞に対するエキソソームの機能的効果を判定するために、我々は、エキソソームの内部移行が、（ｉ）虚血状態下での細胞生存、（ｉｉ）細胞増殖、（ｉｉｉ）細胞遊走、及び（ｉｖ）内皮管形成（図４及び図５）を誘導できたか否かを評価した。
【０１５７】
細胞生存実験のために、ＨＵＶＥＣ（１ｘ１０４）は、２％ＦＢＳ  含有ＥＧＭ−２（Ｌｏｎｚａ社）で、培養され、ＮＤＨＦ（５ｘ１０３）及びＨａＣａＴ（２ｘ１０４）は、０．５％Ｐｅｎｓｔｒｅｐ及び１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で、９６プレートで培養された。２０時間後に、細胞は、ＰＢＳで洗浄され、エキソソーム除去済み培地単独（１００μＬ）で、又はエキソソーム含有培地（１００μＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ若しくは５μｇ／ｍＬを含有する）で４８時間、インキュベートされた。次に、細胞は、虚血状態で４８時間（ＨＵＶＥＣがＶＥＧＦ及びＦＢＳ非含有ＥＧＭ−２で；及びＨａＣａＴがＦＢＳ非含有ＤＭＥＭで、３７℃で、５％のＣＯ２、０．１％のＯ２）又は７２時間（線維芽細胞がＦＢＳ非含有ＤＭＥＭで、３７℃で、５％のＣＯ２、０．１％のＯ２）でインキュベートされた。最後に、細胞は、ハイコンテント顕微鏡でモニタされ、細胞生存率が、ｈｏｅｓｃｈｔ／ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）染色によって定量化された。細胞生存率は、以下の式に従い計算された：（細胞生存治療群−細胞生存対照群）／細胞生存対照群。
【０１５８】
以下の手順は、エキソソームの増殖誘導性を実証するために採用された。ＨＵＶＥＣ（１ｘ１０４）は、２％ＦＢＳ含有ＥＧＭ−２（Ｌｏｎｚａ社）で、培養され、線維芽細胞（５ｘ１０３）及びＨａＣａＴ（２．５ｘ１０３）は、０．５％Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ及び１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で、９６プレートで培養された。２０時間後に、細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔ（３３３４２、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１５分間染色され、ＰＢＳで洗浄され、エキソソーム除去済み培地単独（１００μＬ）で、又はエキソソーム含有培地（１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ）で、２４時間、インキュベートされた。次に、培地が交換され、細胞は、エキソソーム除去済み培地（２００μＬ）で、７２時間、インキュベートされた（３７℃で、５％のＣＯ２、０．１％のＯ２）。細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔで染色され、２４時間毎に撮影され（ＩＮ  Ｃｅｌｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、細胞数が、細胞核を計数することによって計算された。増殖率は、治療後７２時間での細胞数を、エキソソームと共にインキュベートした時点（時間ゼロ−Ｔ０）での細胞数で除算することによって求められた。
【０１５９】
線維芽細胞（１ｘ１０４）及びＨａＣａＴ細胞（２ｘ１０４）は、０．５％Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ及び１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で、９６プレートで培養された。２０時間後に、垂直なひっかき創傷が、２００μＬでウェルの中央に付けられ、細胞は、ＰＢＳで洗浄された。次に、エキソソーム除去済み培地単独（１００μＬ）又はエキソソーム補足培地（１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ）が、細胞に添加され、ウェルの画像（時間ゼロＴ０）が、ＩＮ  Ｃｅｌｌ分析器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で撮影された。４時間後、更にエキソソーム除去済み培地（１００μＬ）が添加され、細胞は、１８時間インキュベートされた。その後、細胞培地は、０．５％ＦＢＳ含有エキソソーム除去済みＤＭＥＭに交換され、細胞は、３７℃で、５％のＣＯ２、２０％のＯ２で４８時間インキュベートされた。写真が、引掻き後４８時間後に撮影され、創傷部が、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェア４．６．３（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＧｍｂＨ社）で測定された。
【０１６０】
内皮細胞における管形成に対するエキソソームの効果を判定するために、ＨＵＶＥＣ（５ｘ１０４／ウェル、３〜５継代）は、一晩、２４ウェルプレートでＥＧＭ−２（Ｌｏｎｚａ社）で培養された。２０時間後、細胞は、２００μＬのエキソソーム除去済み培地単独で、及びエキソソーム含有培地（１  μｇ／ｍＬ、２  μｇ／ｍＬ、３  μｇ／ｍＬ及び５  μｇ／ｍＬ）でインキュベートされた。４８時間後、細胞は、トリプシン処理され、１５ウェルＩＢＩＤＩプレート内で、重合化されたＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、１０μＬ／ウェル、３７℃で３０分）上から、ＥＢＭ−２に、播種された。細胞播種後１２時間、細胞は、位相差顕微鏡によって撮影され、管形成が、ＷｉｍＴｕｂｅソフトウェア（Ｗｉｍａｓｉｓ社）を使用して評価され、定量化された。
【０１６１】
結果：
我々の結果は、低酸素状態（Ｅｘｏ＿Ｈｙｐ）で、正常酸素圧ではない状態（Ｅｘｏ＿Ｎｏｒ）で培養されたＵＣＢＭＮＣから単離されたエキソソームは、４８時間、虚血状態で培養された内皮細胞生存を誘導するのに極めて効率的であることが示された（図４Ａ．１〜４）。
【０１６２】
我々の結果によると、生存は、２μｇ／ｍＬのエキソソーム濃度でピークに達した。興味深いことに、Ｅｘｏ＿ＨｙｐとＥｘｏ＿Ｎｏｒの両方共、虚血状態で培養されたケラチノサイトの生存を誘導するが、線維芽細胞の生存には全く効果がなかった。従って、我々の結果は、エキソソームの生存促進性は、細胞及び濃度に依存することを示している。
【０１６３】
我々の結果は、エキソソームが、Ｅｘｏ＿Ｈｙｐに対しては１μｇ／ｍＬ及び２μｇ／ｍＬの濃度で、Ｅｘｏ＿Ｎｏｒに対しては２μｇ／ｍＬ及び３μｇ／ｍＬの濃度で、線維芽細胞の増殖を誘導したことを示した（図４Ｂ．１−４）。興味深いことに、エキソソームは、内皮細胞及びケラチノサイトの増殖に関して有意な効果が全くなかったが、このことは、エキソソームによって誘導される特性が細胞及び濃度に依存するもう１種類を示している。
【０１６４】
我々の結果は、エキソソーム、特にＥｘｏ＿Ｈｙｐが、線維芽細胞及びケラチノサイト細胞の遊走性を大幅に高め、これらのエキソソームが、遊走促進性の生理活性も示すことを意味することを示した（図５Ａ．１〜３）。
【０１６５】
我々の結果は、ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏが、分岐点の増加数から観察すると、血管の総数及び形成された血管網の複雑さを大幅に増大させたことを示した（図５Ｂ）。
【０１６６】
実施例２  ＵＣＢＭＮＣ−ＥｘｏのＲＮＡ含有量の特徴
実験手順：
ＵＣＢＭＮＣ−ＥｘｏのＲＮＡ含有量は、ＲＮＡディープシークエンシングによって特徴付けられた。２名の異なるドナーから低酸素状態と酸素正常状態で分泌されたＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏが使用された。以下の方法が使用された。
【０１６７】
全ＲＮＡは、ｍｉＲＣＵＲＹ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ−Ｃｅｌｌ＆  Ｐｌａｎｔ（ＥＸＩＱＯＮ社）で、動物細胞培養プロトコールからライセート調製法を使用して、エキソソームペレットから抽出された。全ＲＮＡ及び低分子ＲＮＡの量及び品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で、ＲＮＡ６０００Ｐｉｃｏ  Ｋｉｔ及び低分子ＲＮＡ  Ｋｉｔを其々使用して評価された。サンプルは、Ｉｏｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔ  ｖ２ユーザガイド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に記載された全トランスクリプトーム（ＷＴ：Ｗｈｏｌｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）と低分子ＲＮＡライブラリプロトコールの両方を使用して、ｃＤＮＡライブラリ調製に進んだ。
【０１６８】
全手順は、ＲＮＡ断片化ステップを除いて、メーカの説明書に従い実施されたが、該ＲＮＡ断片化ステップは、出発物質が既に必要な長さであったため、全トランスクリプトームライブラリの調製時には省略された。
【０１６９】
手短に言えば、２．１〜４．５ｎｇの低分子ＲＮＡと２０ｎｇの全ＲＮＡが、小ライブラリとＷＴライブラリを其々構築するのに使用された。ＲＮＡアダプタは、１６℃で１６時間、小ライブラリに連結され、３０℃で１時間、ＷＴライブラリに連結された。第１及び第２ｃＤＮＡ鎖は、合成され、次に、精製されたｃＤＮＡは、特異的バーコード化プライマを用いてＰＣＲ法によって増幅され、その結果得られた断片は、適切な大きさのものが電磁ビーズで選択された。ｃＤＮＡライブラリは、定量化され、該ライブラリの質は、２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で、ＷＴ  ＲＮＡライブラリ用Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ及び小ライブラリ用Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ１０００Ａ  ｋｉｔを用いて評価された。２プールのバーコード化ライブラリ（ＷＴ及び低分子ＲＮＡ）は、調製され、Ｉｏｎ  ＰＩ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＯＴ２  ２００  ｋｉｔ  ｖ２及びＩｏｎ  ＯｎｅＴｏｕｃｈ  ２  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、エマルジョンＰＣＲ法によってクローン増幅され、陽イオン球粒子（Ｉｏｎ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ）は、Ｉｏｎ  ＯｎｅＴｏｕｃｈ  ＥＳ機（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で濃縮された。最後に、陽イオン球粒子は、単一のＩｏｎ  ＰＩ  チップｖ２に充填され、Ｇｅｎｏｉｎｓｅｑ社  （ポルトガル、カンタニェデ）において、Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で配列決定された。全手順は、メーカの説明書に従い実行された。Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎのアダプタ配列及び低品質な塩基は、Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｕｉｔｅソフトウェア（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、トリミングされた。
【０１７０】
次に、配列リードは、長さによってフィルタリングされ、１５ｂｐ未満のリードが小ライブラリから、１８ｂｐ未満のリードが大ライブラリから除去された。次に、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びｎｃＲＮＡは、ＴＭＡＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１を使用して、各サンプルからのリードを特異的ライブラリ（ｒＲＮＡ：５Ｓ−ＮＲ＿０２３３７９．１、５．８Ｓ−ＮＲ＿００３２８５．２、１８Ｓ−ＮＲ＿００３２８６．２、２８Ｓ−ＮＲ＿００３２８７．２；ｔＲＮＡ：ＵＣＳＣから得たｔＲＮＡのライブラリ；ｍｉｒ：ｍｉＲｂａｓｅ；ｍＲＮＡ：ＥｎｓｅｍｂｌからのＣＤＳライブラリ；  Ｅｎｓｅｍｂｌ及びＥＮＣＯＤＥからのｎｃＲＮＡライブラリ）と配列比較（ａｌｉｇｎ）することによって識別された。
【０１７１】
次に、我々は、１０人から採取されたエキソソームにおいてｑＲＴ−ＰＣＲ（定量的リアルタイムＰＣＲ）によって１５個のｍｉＲＮＡの発現について検証した（図  ６Ｂ１）。１０名の異なるドナーの単核細胞によって低酸素状態及び酸素正常状態で分泌されたエキソソームの全ＲＮＡを単離した後、サンプル中の全ｍｉＲＮＡは、ポリアデニル化され、ｃＤＮＡライブラリは、ＮＣｏｄｅ（登録商標）ｍｉＲＮＡ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ及びｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州カールスバッド市（Ｃａｒｌｓｂａｄ））を使用して構築され、ＲＮＡＳｅｑデータによって判定された、１５個の最も多く発現したｍｉｃｒｏＲＮＡの発現が、ＢｉｏＭａｒｋ（登録商標）システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ社、米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ市）で、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｒｒａｙを使用して、メーカの説明書に従い、ｑＲＴ−ＰＣＲによって確認された。各ｍｉｃｒｏＲＮＡの特異的プライマは、ＮＣｏｄｅ  Ｋｉｔ説明書に従い設計され、Ｕ６  ｓｎＲＮＡが、内在性対照として使用された（Ｗａｎｇ  Ｙ．他、２０１５年）。
【０１７２】
結果：
我々の結果は、Ｅｘｏ＿ＨｙｐとＥｘｏ＿Ｎｏｒの両方が、ｍｉＲＮＡの大規模プールを有する（図６Ａ）を示した。全リードに関して、両エキソソームの３０個の最も代表的なｍｉＲＮＡは：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐである。
【０１７３】
３０個の最も代表的なｍｉＲＮＡの受入番号及び成熟配列は、以下の表１に纏められる。
【０１７４】
ＵＣＢＭＮＣ  エキソソームにおける成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉＲＢＡＳＥ受入番号、及び配列
【０１７５】
【表１】
2019513414.tif 000002
成熟ｍｉＲＮＡ及びＲＮＵ６に対するｑＲＴ−ＰＣＲに使用される順方向プライマの配列は、以下の表２に纏められる。
【０１７６】
成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡ及びＲＮＵ６、受入番号（ｍｉＲＢａｓｅ及びＧｅｎＢａｎｋ）及びｑＲＴ−ＰＣＲに使用される順方向プライマの配列
【０１７７】
【表２】
2019513414.tif 000003
【０１７８】
また、我々の分析では、最も発現したｈａｓ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを、次に最も発現したｍｉｃｒｏＲＮＡであるｈａｓ−ｍｉＲ−３４２ａ−３ｐの約４倍超で発現されたものとして、確認した（図６Ｂ）。
【０１７９】
上記レポート（Ｇｒａｙ他、２０１５年）では、酸素正常状態と低酸素状態で培養された心筋前駆細胞から採取されたエキソソームで示差的に発現された７個のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ−２９２、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−１５ｂを特定した。この特許で特定されたｍｉＲＮＡの大部分（ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−１５ｂを除く）は、新規であり、以前に開示されていない点に注目することは、重要である。
【０１８０】
実施例３  ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏは、インビボで創傷治癒を加速する。
実験手順：
Ｉ型真性糖尿病は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社（米国マサチューセッツ州ウィルミントン市）から購入された雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（１０〜１２週齢）にストレプトゾトシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を腹腔内投与して誘導された。
【０１８１】
ＩＩ型糖尿病に関しては、ｄｂ／ｄｂの遺伝子改変マウスが、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社（米国マサチューセッツ州ウィルミントン市）から取得された。
【０１８２】
血糖値が３００ｍｇ／ｄｌ超となった（Ｉ型で糖尿病を誘導後６〜８週間）ことを確認した後、動物は、麻酔され、腰背の皮膚が剃毛され、消毒され、背側の２箇所に直径６ｍｍの全層に亘る切除創傷が、各動物に無菌生検パンチで付けられた。
【０１８３】
次に、創傷は、ＰＢＳ（１０μＬ；１日２回）、Ｅｘｏ＿Ｈｙｐ（２μｇ／ｍＬのエキソソーム懸濁液、１０μＬ；１日２回；従って、全１０日間の治療中創傷一カ所当たり０．４μｇ）又はＰＤＧＦ−ＢＢ（１００μｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社；４μｇ／ｃｍ２；１日１回）で被覆された。
【０１８４】
手術後、動物は、個々のケージ内で餌及び水を自由に取れる状態で、温度及び湿度を制御した環境で維持された。創傷は、毎日、１０〜１５日間測定された。研究の最後に、動物は、頸椎脱臼によって屠殺され、直径１０ｍｍの皮膚生検が、更なる分析のために採取された。
【０１８５】
結果：
我々の結果は、エキソソーム治療が、Ｉ型糖尿病の切除創傷の治癒を大幅に加速したこと（図７Ａ１及びＡ２）を示した。創傷治癒（創傷サイズの縮小）の加速が、２日目にはもう観察され、これは、ドナー２で統計的に顕著であった。１０日後に、ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏの適用時に創閉鎖に関して一貫して５５％の改善が、ドナーに関係無く、観察された（治療された創傷サイズは、対照のサイズの半分である）。同じ治療計画が、正常なマウスに適用され、創閉鎖の加速が、３日目から顕著になり、１０日目には全体的に３９％の改善を齎すことが観察された（図７Ａ３）。
【０１８６】
ＩＩ型糖尿病マウスモデル（ｄｂ／ｄｂ遺伝モデル）では、結果は、ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏが創傷治癒を加速し、２日目に顕著な効果を示し、１０日目には２０％改善し、総治癒時間が、対照の治療より４日早い１７日間であったことを示している（図７Ａ４）。
【０１８７】
また、これらの動物は、人間の糖尿病性潰瘍の治療用に市販されている既知の製品の活性薬剤（ＰＤＧＦ−ＢＢ）でも、推奨処方で（１日１回、最大濃度が推奨）治療された。驚いたことに、ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏは、より早く創閉鎖を加速し始め（５日目と比較して、２日目に）、１０日目にはより高改善を示し（ＰＤＧＦ−ＢＢで１０％と比べて２０％と）、より早く創傷を完全に閉鎖した（ＰＤＧＦ−ＢＢで１８日目と比べて１７日目）（図７Ａ４）ため、かなり効率的であった。興味深いことに、ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏが１日に２回、糖尿病のマウスの１つの創傷に適用されると、創傷治癒は、第１日目中に対照の離れた創傷において加速され、遠位部位でも治癒を刺激することを示唆している（図７Ｃ）。
【０１８８】
創傷の組織学的分析では、ＵＣＢＭＮＣ−Ｅｘｏ治療が、再上皮化を増大させ、線維性組織の形成を刺激し、創傷治癒に不可欠な大食細胞の浸潤増加を示すことがある細胞浸潤の増大と関連付けられたことを示している（図７Ｂ）。
【０１８９】
実施例４  ｍｉＲ−１５０−５ｐは、虚血に対する線維芽細胞の生存及びインビトロでのケラチノサイト遊走を促進する。
実験手順：
インビトロアッセイにおいて、内皮細胞、線維芽細胞及びケラチノサイトは、ｍｉＲ１５０−５ｐ（５ｎｍ、ｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｈｕｍａｎ  ｈｓａｍｉＲ１５０−５ｐ  ｍｉｍｉｃ  ＭＩＭＡＴ０００００８２、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、米国コロラド州ラファイエット市）、及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））で、１００μＬの完全培地において、４８時間（細胞生存及び管形成アッセイ）又は２４時間（細胞増殖及び引掻きアッセイ）、トランスフェクトされた。
【０１９０】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ単独でのトランスフェクションが、陰性対照として使用された。
【０１９１】
血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬ）及び血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ、５０ｎｇ／ｍＬ）が、陽性対照として使用された。
【０１９２】
全てのインビトロアッセイは、エキソソーム生理活性評価に関して記載したように、実行された。
【０１９３】
結果：
我々の結果では、ｍｉＲ−１５０−５ｐでトランスフェクトされた線維芽細胞は、トランスフェクトされない細胞より、７２時間虚血後の生存率が高いことを示している（図８Ａ）。内皮細胞やケラチノサイトには、同じではなかった。我々は、我々の分析を、遊走、増殖及び血管新生アッセイへと広げた。線維芽細胞ではなく、ｍｉＲ−１５０−５ｐでトランスフェクトされたケラチノサイトは、引掻きアッセイによって評価された際に、遊走性を改善した。増殖及び血管新生については、細胞間で、全く統計的差異が観察されなかった。
【０１９４】
実施例５  ＭｉＲ−１５０−５ｐは、インビトロで創傷治癒を促進する。
【０１９５】
我々は、非疾患創傷治癒モデルにおける、ｈａｓ−ｍｉＲ−１５０−５ｐのインビボ効果を評価した。
【０１９６】
実験手順：
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  （フランス）から購入された、体重２０〜３０ｇの雄Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス（８週齢）６匹は、麻酔され、其々が直径６ｍｍの、５ｃｍ離間した全層に亘る切除が、各動物の背側に無菌生検パンチで付けられた。
【０１９７】
ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１（１２０μＬ）ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、米国コロラド州ラファイエット市）と複合化された単一用量のｍｉＲ−１５０−５ｐ（５μΜ）が、創傷直後に創傷縁部に皮下注射された（２ｘ４０μＬ）。
【０１９８】
ｓｃｒａｍｂｌｅ  ｍｉＲ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｍｉｍｉｃ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、米国コロラド州ラファイエット市）及びＰＢＳが、陰性対照として使用された。
【０１９９】
動物は、個々のケージ内で餌及び水を自由に取れる状態で、飼育され、創傷部は、実験全期間中毎日、観察された。創傷部は、毎日アセテート紙にトレースされて、創傷後１０日目まで創閉鎖の割合を追跡した。創傷サイズは、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）で判定された。データは、元々の創傷（０日目）に対する割合として示された。動物は、創傷後１０日目に屠殺された。
【０２００】
結果：
我々の結果は、ｈａｓ−ｍｉＲ−１５０−５ｐで治療された創傷が、負のｍｉＲ対照（ｓｃｒａｍｂｌｅ）で治療された創傷及び非治療（ＰＢＳ）創傷より速く治癒したことを示した（図８Ｂ）。
【０２０１】
興味深いことには、ｈａｓ−ｍｉＲ−１５０−５ｐは、単核特異的なｍｉＲ（Ｌｉ他、２０１３年；Ａｌｌａｎｔａｚ他、２０１２年；Ｚｈａｎｇ他、２０１０年）である。以前の研究では、ｈａｓ−ｍｉＲ−１５０−５ｐがＶＥＧＦを標的にし、抗血管形成活性と血管形成促進活性の両方を有することを示している（Ｈｅ他、２０１６年；Ｙａｎｇ他、２０１５年；Ｌｉ他、２０１３年）。更にまた、ｈａｓ−ｍｉＲ−１５０−５ｐは、内皮細胞遊走（Ｙａｎｇ他、２０１５年；Ｚｈａｎｇ他、２０１０年）及び細胞の増殖とアポトーシス（Ｇｕ他、２０１４年；Ｓｈｉ他、２００７年）に関係するとも記述されている。我々の結果は、初めて、創傷治癒誘導ｍｉＲＮＡとしてｈａｓ−ｍｉＲ−１５０−５ｐの関与を示している。
【図１Ａ】
2019513414.tif 000004
【図１Ｂ】
2019513414.tif 000005
【図２Ａ】
2019513414.tif 000006
【図２Ｂ】
2019513414.tif 000007
【図２Ｃ】
2019513414.tif 000008
【図２Ｄ】
2019513414.tif 000009
【図２Ｅ】
2019513414.tif 000010
【図３Ａ】
2019513414.tif 000011
【図３Ｂ】
2019513414.tif 000012
【図３Ｃ】
2019513414.tif 000013
【図３Ｄ】
2019513414.tif 000014
【図４Ａ】
2019513414.tif 000015
【図４Ｂ】
2019513414.tif 000016
【図５Ａ】
2019513414.tif 000017
【図５Ｂ】
2019513414.tif 000018
【図６Ａ１】
2019513414.tif 000019
【図６Ａ２】
2019513414.tif 000020
【図６Ｂ１】
2019513414.tif 000021
【図６Ｂ２】
2019513414.tif 000022
【図７Ａ】
2019513414.tif 000023
【図７Ｂ】
2019513414.tif 000024
【図７Ｃ】
2019513414.tif 000025
【図８Ａ１】
2019513414.tif 000026
【図８Ａ２】
2019513414.tif 000027
【図８Ａ３】
2019513414.tif 000028
【図８Ａ４】
2019513414.tif 000029
【図８Ｂ１】
2019513414.tif 000030
【図８Ｂ２】
2019513414.tif 000031
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月28日(2018.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ：ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）によって分泌されるエキソソームを含む組成物。
【請求項２】
前記ＵＣＢＭＮＣは、リンパ球、単球、好中球、好酸球、及び／又は好塩基球を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＵＣＢＭＮＣは、基本的に、リンパ球、単球、好中球、好酸球、及び／又は好塩基球である、請求項１に記載の組成物、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記エキソソームの少なくとも１つは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含み、好適には、前記エキソソームは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含み、好適には、前記エキソソームは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｌａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含み、好適には、前記エキソソームは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈａｓ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含み、好適には、前記エキソソームは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含み、好適には、前記エキソソームは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを含み、好適には、前記エキソソームは、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記エキソソームは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−  ３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを濃縮され、それにより、前記エキソソームにおける前記ｍｉＲＮＡの濃度を高め、好適には、前記エキソソームは、以下から成る群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐから選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを濃縮され、それにより、前記エキソソームにおける前記ｍｉＲＮＡの濃度を高め、好適には、前記エキソソームは、ｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐを濃縮され、それにより、前記エキソソームにおける前記ｍｉＲＮＡの濃度を高める、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ＵＣＢＭＮＣによって分泌された前記エキソソームの少なくとも１つは、マーカＣＤ９、ＣＤ３４、ＣＤ８１及び／又はＨｓｃ７０を発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記エキソソーム組成物におけるタンパク質の濃度は、０．０１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬであり、好適には、前記エキソソーム組成物におけるタンパク質の濃度は、１μｇ／ｍＬ〜３μｇ／ｍＬであり、好適には、前記エキソソーム組成物におけるタンパク質の濃度は、０．５μｇ／ｍＬ〜１．５μｇ／ｍＬであり、更に一層好適には、前記エキソソーム組成物におけるタンパク質の濃度は、約１μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．７５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ、１．７５μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬ、２．２５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、２．７５μｇ／ｍＬ、３．０μｇ／ｍＬ、５．０μｇ／ｍＬ、又は１０μｇ／ｍＬである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
化粧品として使用する、請求項１〜７のいずれか一項に記載された、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ：ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）によって分泌されるエキソソームを含む組成物。
【請求項９】
薬物として使用する、請求項１〜７のいずれか一項に記載された、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ：ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）によって分泌されるエキソソームを含む組成物。
【請求項１０】
組織修復時に薬物として使用する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
皮膚組織修復時に薬物として使用する、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項１２】
切り傷、裂傷、断裂、擦過傷、剥離又は手術創等の皮膚開放創の治療時に使用する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
熱傷、化学火傷若しくは放射線火傷等の皮膚火傷の治療時に、及び／又はざ瘡、乾癬、酒さ、皮膚炎、湿疹、膿痂疹、間擦疹、若しくは毛包炎等の皮膚の状態又は病気時に使用する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
動脈性潰瘍、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、及び褥瘡性潰瘍、手術後の潰瘍、外傷性潰瘍、口腔内潰瘍、糖尿病性足部潰瘍又は角膜潰瘍等の創傷治療時に薬物として使用する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
組織修復時に予防薬として使用する、請求項１〜７のいずれか一項に記載された、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ：ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）によって分泌されるエキソソームを含む組成物。
【請求項１６】
請求項８〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含む製品であって、前記組成物は、液状、粉状、噴霧状、クリーム状、ジェル状又はヒドロゲルである、組成物。
【請求項１７】
前記組成物は、天然若しくは合成ポリママトリックス等の担持体、パッチ又は別の医療装置によって保持される、請求項１６に記載の製品組成物。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載された、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ：ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）によって分泌されるエキソソームを含む組成物を調製するプロセスであって、該プロセスは：
ａ）前記ＵＣＢＭＮＣから前記エキソソームを分離するステップ、及び
ｂ）前記エキソソームを適当な担体に懸濁するステップであって、前記担体を、好適にはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）とするステップを含む、プロセス。
【請求項１９】
前記ＵＣＢＭＮＣは、前記分離ステップ（ａ）の前に、虚血状態及び／又は低酸素状態に曝される、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記エキソソームは、請求項４又は５のどちらかに記載された群から選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡを濃縮される、請求項１８又は１９のどちらかに記載のプロセス。
【請求項２１】
請求項９〜１５のいずれか一項に記載された、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ：ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）によって分泌されるエキソソームを含む組成物を含む製品を調製するプロセスであって、該プロセスは：
ａ）請求項９〜１５のいずれか一項に記載された、前記ＵＣＢＭＮＣからの前記エキソソームを含む組成物の、ｂ）適当な薬学上許容可能な担体との接触を促進するステップを含む、プロセス。
【国際調査報告】
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