(57)【要約】免疫抑制療法を受けている対象におけるＪＣＶ活性化のリスクを除去する方法であって、ＪＣＶゲノムの少なくとも一つの標的配列に向けられた有効量の遺伝子編集組成物を投与するステップと、ＪＣＶゲノムの標的配列を切断するステップと、ＪＣＶゲノムを破壊するステップと、ＪＣＶ感染を除去するステップと、ＪＣＶ活性化のリスクを除去するステップと、対象を免疫抑制療法で処置するステップとによる、方法。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの単離された核酸配列と、ＪＣＶ  ＤＮＡの標的配列と相補的なスペーサー配列を有する少なくとも一つのｇＲＮＡとを含む医薬品組成物であって、単離された核酸配列は、少なくとも一つの発現ベクターに含まれる、組成物。ＪＣＶゲノムの少なくとも一つのヌクレオチド配列を標的とする少なくとも一つのＴＡＬＥＮ、少なくとも一つのＺＦＮまたは少なくとも一つのａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質をコードする少なくとも一つの単離された核酸配列を含む医薬品組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫抑制療法を受けている対象におけるジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ：Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  Ｖｉｒｕｓ）活性化のリスクを除去する方法であって、
潜伏的にＪＣＶに感染した対象に、ＪＣＶゲノムの少なくとも一つの標的配列に向けられた有効量の遺伝子編集組成物を投与するステップと；
前記ＪＣＶゲノムの前記標的配列を切断するステップと；
前記ＪＣＶゲノムを破壊するステップと；
ＪＣＶ感染を除去するステップと；
ＪＣＶ活性化のリスクを除去するステップと；
前記遺伝子編集組成物を投与するステップの前、投与するステップ中または投与するステップの後からなる群より選択される時点で、前記対象を免疫抑制療法で処置するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記投与するステップの前に、前記対象を潜伏ＪＣＶ感染につきスクリーニングするステップと、潜伏ＪＣＶ感染の存在を確認するステップとを追加的に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子編集組成物は、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの単離された核酸配列と、ＪＣＶ  ＤＮＡの標的配列と相補的なスペーサー配列を有する少なくとも一つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む有効量の医薬品組成物として定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９、ヒト最適化Ｃａｓ９、ニッカーゼ変異体Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５ａ）、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／ｒ１０６０Ａ）、またはＳｐＣａｓ９（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＪＣＶ  ＤＮＡの標的配列と相補的なスペーサー配列を有する少なくとも一つのｇＲＮＡは、前記ＪＣＶ  ＤＮＡのラージＴ抗原（Ｔ‐Ａｇ）コード領域の標的配列と相補的なスペーサー配列を有する少なくとも一つのｇＲＮＡとしてさらに定義される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＪＣＶ  ＤＮＡの前記Ｔ‐Ａｇコード領域の標的配列と相補的なスペーサー配列を有する少なくとも一つのｇＲＮＡは、前記Ｔ‐Ａｇコード領域のＴＭ１領域の標的配列と相補的なスペーサー配列を有するｇＲＮＡ、前記Ｔ‐Ａｇコード領域のＴＭ２領域の標的配列と相補的なスペーサー配列を有するｇＲＮＡ、前記Ｔ‐Ａｇコード領域のＴＭ３領域の標的配列と相補的なスペーサー配列を有するｇＲＮＡ、または前記ｇＲＮＡの任意の組み合わせを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＭ１領域の標的配列と相補的なスペーサー配列を有する前記ｇＲＮＡはｇＲＮＡ  ｍ１であり、前記ＴＭ２領域の標的配列と相補的なスペーサー配列を有する前記ｇＲＮＡはｇＲＮＡ  ｍ２であり、前記ＴＭ３領域の標的配列と相補的なスペーサー配列を有する前記ｇＲＮＡはｇＲＮＡ  ｍ３である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子編集組成物は、ＣＲＩＳＰＲ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１エンドヌクレアーゼ１（Ｃｐｆ１）をコードする少なくとも一つの単離された核酸配列と、ＪＣＶ  ＤＮＡの標的配列と相補的なスペーサー配列を有する少なくとも一つのｇＲＮＡとを含む医薬品組成物として定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも一つのｇＲＮＡは、配列番号１４〜配列番号２４９、またはこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される標的配列と相補的なスペーサー配列を有する少なくとも一つのｇＲＮＡを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子編集組成物は、前記ＪＣＶゲノムの少なくとも一つのヌクレオチド配列を標的とする、少なくとも一対のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む医薬品組成物として定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子編集組成物は、前記ＪＣＶゲノムの少なくとも一つのヌクレオチド配列を標的とする少なくとも一つの転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む医薬品組成物として定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子編集組成物は、少なくとも一つの発現ベクターに含まれる少なくとも一つの単離されたヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも一つの発現ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ベクター、ポックスウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫抑制療法は、ブレンツキシマブベドチン、リツキシマブ、ナタリズマブ、フィンゴリモド、エファリズマブ、ベドリズマブ、フマル酸ジメチル、ベラタセプト、タクロリムス、シロリムス、グルココルチコイド、メトトレキセート、アザチオプリン、シクロスポリン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ミコフェノール酸モフェチル、ダクリズマブおよびインフリキシマブより選択される組成物による処置としてさらに定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子編集組成物は、ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＪＣＶに感染した宿主細胞からジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）を除去するのに使用するための医薬品組成物であって、
ＣＲＩＳＰＲ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１エンドヌクレアーゼ１（Ｃｐｆ１）をコードする少なくとも一つの単離された核酸配列と、
ＪＣＶ  ＤＮＡの標的配列と相補的なスペーサー配列を有する少なくとも一つのｇＲＮＡと
を含み、
前記単離された核酸配列は、少なくとも一つの発現ベクターに含まれる、
組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも一つのｇＲＮＡは、配列番号１４〜配列番号２４９、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される標的配列と相補的なスペーサー配列を有する少なくとも一つのｇＲＮＡを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
ＪＣＶに感染した宿主細胞からジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）を除去するのに使用するための医薬品組成物であって、前記組成物は、ＪＣＶゲノムの少なくとも一つのヌクレオチド配列を標的とする少なくとも一つの転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）をコードする少なくとも一つの単離された核酸配列を含み、前記単離された核酸配列は、少なくとも一つの発現ベクターに含まれる、組成物。
【請求項１９】
ＪＣＶに感染した宿主細胞からジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）を除去するのに使用するための医薬品組成物であって、前記組成物は、ＪＣＶゲノムの少なくとも一つのヌクレオチド配列を標的とする少なくとも一つのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする少なくとも一つの単離された核酸配列を含み、前記単離された核酸配列は、少なくとも一つの発現ベクターに含まれる、組成物。
【請求項２０】
ＪＣＶに感染した宿主細胞からジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）を除去するのに使用するための医薬品組成物であって、前記組成物は、ＪＣＶゲノムの少なくとも一つのヌクレオチド配列を標的とする少なくとも一つのａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質をコードする少なくとも一つの単離された核酸配列を含み、前記単離された核酸配列は、少なくとも一つの発現ベクターに含まれる、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、潜伏ＪＣＶの活性化およびそれに伴う進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）の発症のリスクを除去するために、免疫抑制療法を施す前および免疫抑制療法中に宿主細胞からジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ：Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  Ｖｉｒｕｓ）を除去するための方法および組成物に関する。特に本発明は、ＪＣＶゲノム内の標的部位を切断するための、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼと一つ以上の特異的ガイドＲＮＡ配列とを含む組成物の投与によって、ＪＣＶを除去するための戦略に関する。本発明は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ：ｚｉｎｃ‐ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ：Ｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ‐ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｃｌｅａｓｅ）を含むＪＣＶ標的化組成物の投与を含む戦略にも関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、多発性硬化症；様々な癌、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎および関節リウマチ等の自己免疫性疾患；ならびに臓器移植拒絶等、以前には難治であった様々な疾患または状態を処置するための療法が開発されている。これらの療法およびその作用機序の一部のリストが、表１に示される。表１から、これらの療法は、免疫エフェクター細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、単核細胞、マクロファージ）の不活性化、阻害または固定化により、または免疫エフェクター細胞に対する細胞毒性副作用により免疫抑制を引き起こすことが分かる。
【０００３】
【表１】
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【０００４】
これらの療法の免疫抑制作用は、免疫系により通常は抑制されている日和見病原体の活性化のリスクをもつ。最も深刻なリスクの一つには、ヒト神経向性ポリオーマウイルスであるジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）の活性化のリスクがある。ＪＣＶは、致命的な脱髄疾患である進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）の病因因子である。中枢神経系（ＣＮＳ：ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ）のグリア細胞におけるＪＣＶの溶菌感染の結果、脳の神経細胞の髄鞘生成を担う細胞である乏突起膠細胞の死が生じる。これは、広範囲の軽度から重度の神経障害および最終的には死亡につながる（非特許文献１）。ＰＭＬにはいくつかの素因があるが、いずれもある程度の免疫系の障害を含む。
【０００５】
血清疫学的（Ｓｅｒｏｅｐｉｄｅｍｏｌｏｇｉｃａｌ）データは、人間の人口の７５〜８０％がＪＣＶに感染していることを示す。この感染の多くは、主に不明の経路により、幼年期の間に生じる（非特許文献２）。ウイルスは通常潜伏したままであり、症状を引き起こすことはない。免疫障害、特に細胞性免疫の障害の場合には、ウイルスが再活性化し、増殖してＰＭＬの症状を誘発しうる（非特許文献３）。潜伏ウイルスは、尿路および骨髄に、脾臓およびその他のリンパ系組織に、ならびにＣＮＳに維持されうる（非特許文献４）。免疫抑制中の再活性化は、ＣＮＳの潜伏ウイルスの再活性化、および再活性化したウイルスのＣＮＳへの血行性拡散を反映しうる（非特許文献５）。
【０００６】
ＪＣＶゲノムは、ウイルス感染初期すなわちＤＮＡ複製前と感染サイクル後期との二つのクラスのタンパク質をコードする、５．１ｋｂサイズの二本鎖環状ＤＮＡを含む（非特許文献６）。初期遺伝子と後期遺伝子との間に配置された双方向コード配列はウイルス遺伝子発現を担い、ウイルスＤＮＡ複製の起点を含む。ウイルス初期タンパク質、ラージＴ抗原（Ｔ‐Ａｇ）およびより小型のＴ‐Ａｇタンパク質のファミリーが、選択的スプライシングにより生成され、ウイルス複製サイクルの調整において調節的役割をもつ。特にラージＴ‐Ａｇは、ウイルスＤＮＡ複製の開始およびウイルス後期遺伝子転写の刺激を担い、したがってウイルスライフサイクルの全ての局面にとって重要である（概要は非特許文献７を参照）。Ｔ‐Ａｇは、ｐ５３およびｐＲｂ等のいくつかの細胞タンパク質に結合し、宿主細胞の増殖を調節不全にする。後期タンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３ならびにアグノタンパク質として知られる小さな調節タンパク質を含む（非特許文献８）。
【０００７】
ナタリズマブ（非特許文献９）、エファリズマブ（非特許文献１０）、およびリツキシマブ（非特許文献１１）を含む新規な治療用免疫調節性モノクローナル抗体による多発性硬化症および関節リウマチ等の自己免疫障害の処置が、ＰＭＬの素因として認められている（非特許文献１２）。ＪＣＶ活性化およびＰＭＬのリスクの結果、これらの処置、および表１にリストされた他の処置の多くは、大がかりな患者のモニタリングを伴って最適以下の濃度で投与されねばならない。場合によっては、ＰＭＬのリスクにより、市場からの免疫抑制剤が撤去され、それにより生命を救う可能性のある処置を患者が利用できなくなるほどである。
【０００８】
いくつかの処置のオプションがＰＭＬに適用されているが、主に成功していない（非特許文献１３）。多様なアプローチが、細胞侵入および複製等のウイルスライフサイクルの様々なポイントを標的としている。ＪＣＶとセロトニン２Ａ受容体（５‐ＨＴ２ＡＲ）との間の相互作用がウイルス侵入に必要であることが報告されているため（非特許文献１４）、５ＨＴ２ＡＲに結合するリスペリドンが試験されたが、効果がないことが分かっている（非特許文献１５）。シドホビル等のウイルス複製の小分子阻害剤が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで試験されているが、矛盾する結果が得られている（非特許文献１６、非特許文献１７）。この致命的な脱髄性疾患に対処するための代替的戦略が早急に必要である。
【０００９】
一つの潜在的に有効な戦略は、免疫抑制療法の開始前、または療法過程中および療法過程後に、患者の宿主細胞から潜伏ＪＣＶを除去することであろう。活性化される潜伏ウイルスがなければ、活性ＪＣＶ感染を処置する必要はない。ＪＣＶウイルスゲノムを標的とする新規な発展中の遺伝子編集システムは、ＪＣＶ除去に特に魅力的なツールであろう。例示的システムには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼシステムを含む（非特許文献１８）。
【００１０】
特に、ＣＲＩＳＰＲ／エンドヌクレアーゼＤＮＡ編集システムに基づくツールおよび技術は、ゲノム編集に対する先例のない制御を提供する（非特許文献１９、非特許文献２０）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ９）システムは、細菌および古細菌の適応免疫系から開発された。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、短いガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ：ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）を使用してＣａｓ９エンドヌクレアーゼによる特定の核酸標的配列の切断を誘導する（非特許文献２１）。切断は、通常は鈍端の二本鎖カットであり、不完全なＤＮＡ修復によるＤＮＡの区間の欠失、挿入および切除を引き起こしうる。近年には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して潜伏感染細胞からＪＣＶを除去し、新たなＪＣＶ感染を防止できることが報告された（非特許文献２２）。近年には、Ｃａｓ９により切断される配列とは異なる配列を標的とするためにＣａｓ９を誘導するｇＲＮＡとは異なるｇＲＮＡにより誘導される代替的なエンドヌクレアーゼＣｐｆ１を利用するＣＲＩＳＰＲシステムの導入により、標的の範囲が拡大されている（非特許文献２３）。免疫抑制処置の前に患者細胞から潜伏ＪＣＶを除去するための処置におけるこれらの遺伝子編集システムの利用のための組成物および方法が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｅｒｇｅｒ  ＪＲ．Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ＰＭＬ．Ｃｌｅｖｅ  Ｃｌｉｎ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１１；７８  Ｓｕｐｐｌ２：Ｓ８‐１２．
【非特許文献２】Ｓａｒｉｂａｓ  ＡＳ、Ｏｚｄｅｍｉｒ  Ａ、Ｌａｍ  Ｃ、Ｓａｆａｋ  Ｍ．ＪＣ  ｖｉｒｕｓ‐ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ．Ｆｕｔｕｒｅ  Ｖｉｒｏｌ  ２０１０，７：３１３‐３２３．
【非特許文献３】Ｗａｇｇｏｎｅｒ  Ｊ、Ｍａｒｔｉｎｕ  Ｔ，ＭＤ、Ｐａｌｍｅｒ，ＳＭ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｈｅｉｇｈｔｅｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｌｕｎｇ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ：Ａ  ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ．Ｊ．Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２００９，２８：３９５‐３９８．
【非特許文献４】Ｂａｙｌｉｓｓ  Ｊ、Ｋａｒａｓｏｕｌｏｓ  Ｔ  ＣＡＭｃＬｅａｎ．Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ＪＣ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ｌａｒｇｅ  Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＤＮＡ  ｌｏａｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２０１２，ＤＯＩ：１０．１０９３／ｉｎｆｄｉｓ／ｊｉｓ６６８．
【非特許文献５】Ｂａｇ  ＡＫ、Ｃｕｒｅ  ＪＫ、Ｃｈａｐｍａｎ  ＰＲ、Ｒｏｂｅｒｓｏｎ  ＧＨ、Ｓｈａｈ  Ｒ．ＪＣ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ．ＡＮＪＲ２０１０，３１：１５６４‐１５７６．
【非特許文献６】ＤｅＣａｐｒｉｏ  ＪＡ、Ｉｍｐｅｒｉａｌｅ  ＭＪ、Ｍａｊｏｒ  ＥＯ．Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ．Ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６ｔｈ、Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ  ａｎｄ  Ｈｏｗｌｅｙ  ＰＭ（Ｅｄｓ）．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；２０１３．ｐｐ．１６３３‐１６６１．
【非特許文献７】Ｗｈｉｔｅ  ＭＫ、Ｋｈａｌｉｌｉ  Ｋ．Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００４；３２４：１‐１６．
【非特許文献８】Ｋｈａｌｉｌｉ  Ｋ、Ｗｈｉｔｅ  ＭＫ、Ｓａｗａ  Ｈ、Ｎａｇａｓｈｉｍａ  Ｋ、Ｓａｆａｋ  Ｍ．Ｔｈｅ  ａｇｎｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ：ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｕｘｉｌｉａｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００５；２０４：１‐７．
【非特許文献９】Ｃｈａｌｋｌｅｙ  ＪＪ、Ｂｅｒｇｅｒ  ＪＲ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｃｕｒｒ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１３；１３：４０８．
【非特許文献１０】Ｓｃｈｗａｂ  Ｎ、Ｕｌｚｈｅｉｍｅｒ  ＪＣ、Ｆｏｘ  ＲＪ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ‐Ｈｏｈｅｎｄｏｒｆ  Ｔ、Ｋｉｅｓｅｉｅｒ  ＢＣ、Ｍｏｎｏｒａｎｕ  ＣＭ、Ｆａｔａｌ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｌｅｕｋｏｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａＬｂ２  ｉｎ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２０１２；７８：４５８‐４６７．
【非特許文献１１】Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  ＤＢ、Ａｎｃｅｓ  Ｂ、Ｃｏｓｔｅｌｌｏ  Ｃ、Ｒｏｓｅｎ‐Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｓ、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｍ、Ｐａｒｋｓ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．２０１１；６８：１１５６‐１１６４．
【非特許文献１２】Ｎａｇａｙａｍａ  Ｓ、Ｇｏｎｄｏ  Ｙ、Ａｒａｙａ  Ｓ、Ｍｉｎａｔｏ  Ｎ、Ｆｕｊｉｔａ‐Ｎａｋａｔａ  Ｍ、Ｋａｉｔｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ２６  ｙｅａｒｓ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．２０１３；１１５：１４８２‐１４８４．
【非特許文献１３】Ｔａｖａｚｚｉ  Ｅ、Ｗｈｉｔｅ  ＭＫ、Ｋｈａｌｉｌｉ  Ｋ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｐｅｃｔｓ．Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．２０１２；２２：２．
【非特許文献１４】Ｅｌｐｈｉｃｋ  ＧＦ、Ｑｕｅｒｂｅｓ  Ｗ、Ｊｏｒｄａｎ  ＪＡ、Ｇｅｅ  ＧＶ、Ｅａｓｈ  Ｓ、Ｍａｎｌｅｙ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ，ＪＣＶ，ｕｓｅｓ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４；３０６：１３８０‐１３８３．
【非特許文献１５】Ｃｈａｐａｇａｉｎ  ＭＬ、Ｓｕｍｉｂｃａｙ  Ｌ、Ｇｕｒｊａｖ  Ｕ、Ｋａｕｆｕｓｉ  ＰＨ、Ｋａｓｔ  ＲＥ、Ｎｅｒｕｒｋａｒ  ＶＲ．Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２Ａ  ｂｌｏｃｋｅｒ（ｒｉｓｐｅｒｉｄｏｎｅ）ｈａｓ  ｎｏ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＪＣ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．２００８；１４：４４８‐４５４．
【非特許文献１６】Ａｎｄｒｅｉ  Ｇ、Ｓｎｏｅｃｋ  Ｒ、Ｖａｎｄｅｐｕｔｔｅ  Ｍ、Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｑ  Ｅ．Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９７；４１：５８７‐５９３．
【非特許文献１７】Ｈｏｕ  Ｊ、Ｍａｊｏｒ  ＥＯ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｂｒａｉｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．１９９８；４：４５１‐４５６．
【非特許文献１８】Ｇａｊ  Ｔ、Ｇｅｒｓｂａｃｈ  ＣＡ、Ｂａｒｂａｓ  ＣＦ  ３ｒｄ．ＺＦＮ，ＴＡＬＥＮ，ａｎｄ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ‐ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；３１：３９７‐４０５．
【非特許文献１９】Ｍａｌｉ  Ｐ、Ｅｓｖｅｌｔ  ＫＭ、Ｃｈｕｒｃｈ  ＧＭ．Ｃａｓ９  ａｓ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３；１０：９５７‐９６３．
【非特許文献２０】Ｈｓｕ  ＰＤ、Ｌａｎｄｅｒ  ＥＳ、Ｚｈａｎｇ  Ｆ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ９  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  ２０１４，１５７：１２６２‐１２７８．
【非特許文献２１】Ｂｈａｙａ  Ｄ、Ｄａｖｉｓｏｎ  Ｍ、Ｂａｒｒａｎｇｏｕ  Ｒ．ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ａｒｃｈａｅａ：ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡｓ  ｆｏｒ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．２０１１；４５：２７３‐２９７．
【非特許文献２２】Ｗｏｌｌｅｂｏ  ＨＳ、Ｂｅｌｌｉｚｚｉ  Ａ、Ｋａｍｉｎｓｋｉ  Ｒ、Ｈｕ  Ｗ、Ｗｈｉｔｅ  ＭＫ、Ｋｈａｌｉｌｉ  Ｋ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ  ａｓ  ａｎ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＪＣ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２０１５，１０（９）：ｅ０１３６０４６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１３６０４６．
【非特許文献２３】Ｚｅｔｓｃｈｅ  Ｂ、Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ  ＪＳ．、Ａｂｕｄａｙｙｅｈ  ＯＯ、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  ＩＭ、Ｍａｋａｒｏｖａ  ＫＳ、Ｅｓｓｌｅｔｚｂｉｃｈｌｅｒ  Ｐ、Ｖｏｌｚ  ＳＥ、Ｊｏｕｎｇ  Ｊ、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｏｏｓｔ  Ｊ、Ｒｅｇｅｖ  Ａ、Ｋｏｏｎｉｎ  ＥＶ、Ｚｈａｎｇ  Ｆ、Ｃｐｆ１  Ｉｓ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  ＲＮＡ‐Ｇｕｉｄｅｄ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ  １６３，１‐１３  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２２，２０１５．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ＪＣＶゲノムの少なくとも一つの標的配列に向けられた有効量の遺伝子編集組成物を投与するステップと、ＪＣＶゲノムの標的配列を切断するステップと、ＪＣＶゲノムを破壊するステップと、ＪＣＶ感染を除去するステップと、ＪＣＶ活性化のリスクを除去するステップと、遺伝子編集組成物を投与するステップの前、投与するステップの間または投与するステップの後に対象を免疫抑制療法で処置するステップとにより、免疫抑制療法を受けている対象におけるＪＣＶ活性化のリスクを除去する方法を提供する。
【００１３】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの単離された核酸配列と、ＪＣＶ  ＤＮＡの標的配列と相補的なスペーサー配列を有する少なくとも一つのｇＲＮＡとを含む医薬品組成物であって、単離された核酸配列は、少なくとも一つの発現ベクターに含まれる、医薬品組成物も提供する。
【００１４】
本発明は、ＪＣＶゲノムの少なくとも一つのヌクレオチド配列を標的とする少なくとも一つのＴＡＬＥＮをコードする少なくとも一つの単離された核酸配列を含む医薬品組成物であって、単離された核酸配列は、少なくとも一つの発現ベクターに含まれる、医薬品組成物をさらに提供する。
【００１５】
本発明は、ＪＣＶゲノムの少なくとも一つのヌクレオチド配列を標的とする少なくとも一つのＺＦＮをコードする少なくとも一つの単離された核酸配列を含む医薬品組成物であって、単離された核酸配列は、少なくとも一つの発現ベクターに含まれる、医薬品組成物をさらに提供する。
【００１６】
本発明は、ＪＣＶゲノムの少なくとも一つのヌクレオチド配列を標的とする、少なくとも一つのａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質をコードする少なくとも一つの単離された核酸配列を含む、ＪＣＶに感染した宿主細胞からジョン・カニンガム・ウイルス（ＪＣＶ）を除去するのに使用するための医薬品組成物であって、単離された核酸配列は、少なくとも一つの発現ベクターに含まれる、医薬品組成物も提供する。
【００１７】
本発明のその他の利点は、以下の添付の図面と関連して考慮されるとき、以下の詳細な説明の参照によって本発明がよりよく理解されるのに伴って、容易に認められる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＪＣＶのラージＴ抗原をコードするヌクレオチド配列を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、免疫抑制療法の候補患者における潜伏ＪＣＶリザーバーの問題への遺伝子編集技術の最初の応用例を表す。リザーバーが遺伝子編集システムにより除去されると、ＪＣＶ活性化によるＰＭＬのリスクが取り除かれる。以前には潜伏ＪＣＶに面しての使用はリスクが高すぎると考えられた免疫抑制処置を、今ではリスクを減らすための慎重な過少処置を必要とせずに自由に施すことができる。本発明の方法および組成物は、表１にリストされた任意の処置の、および現存の処置と将来開発されることとなる処置とを含むＪＣＶを活性化しうる全ての免疫抑制処置の、併用治療法として役立ちうる。
【００２０】
免疫抑制療法中のＪＣＶ活性化のリスクを除去するためのＣＲＩＳＰＲ組成物および方法。
【００２１】
潜伏ＪＣＶを除去するための一つの好ましい遺伝子編集手段は、ＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ技術である。ＣＲＩＳＰＲシステムにおいては、ＣＲＩＳＰＲクラスターが、ウイルス核酸中のまたは標的とされるべき別の核酸中の標的配列（「プロトスペーサー」）と相補的な配列であるスペーサーをコードする。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、成熟ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）へと転写および処理される。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ：ＣＲＩＳＰＥＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質もコードする。ｃｒＲＮＡが標的ＤＮＡ配列に結合すると、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的配列でまたは標的配列に隣接して標的ＤＮＡを切断する。
【００２２】
一つの有用なＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９を含む。Ｃａｓ９は、約２０〜３０の塩基対（ｂｐ：ｂａｓｅ  ｐａｉｒ）のスペーサーを含む成熟ｃｒＲＮＡと、前駆ｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼＩＩＩによるプロセシングのためのガイドとして働くトランス活性化型小型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とによりガイドされる。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖は、ｃｒＲＮＡのスペーサーと標的ＤＮＡの標的配列との間の相補的塩基対合を介してＣａｓ９を標的ＤＮＡに誘導する。Ｃａｓ９は、トリヌクレオチド（ＮＧＧ）のフォトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ：Ｐｈｏｔｏｓｐａｃｅｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）を認識して、カット部位（ＰＡＭから３番目のヌクレオチド）を判断する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、別々に発現されるか、または合成ステムループ（ＡＧＡＡＡＵ）を介して人工キメラ小型ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）に設計されて天然ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を模倣しうる。このようなｓｇＲＮＡは、直接ＲＮＡトランスフェクションのために合成もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されるか、または例えばＵ６もしくはＨ１促進ＲＮＡ発現ベクターからｉｎ  ｓｉｔｕで発現されうる。「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）という用語は、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二体鎖またはｓｇＲＮＡを意味するために使用する。標的配列「と相補的なｇＲＮＡ」という用語は、スペーサー配列が標的配列と相補的であるｇＲＮＡを示すものと理解されたい。
【００２３】
使用できる他のＣＲＩＳＰＲシステムにはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１が含まれるが、これはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに類似のＤＮＡ編集技術であり、２０１５年にＢｒｏａｄ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅおよびＭＩＴのＦｅｎｇ  Ｚｈａｎｇのグループにより特徴づけられている。Ｃｐｆ１は、クラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。この獲得免疫機構は、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）およびフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）細菌に見られる。これは、ウイルスによる遣伝子損傷を防ぐ。Ｃｐｆ１遺伝子はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に関連し、ガイドＲＮＡを用いてウイルスＤＮＡを見つけ切断するエンドヌクレアーゼをコードする。Ｃｐｆ１はＣａｓ９よりも小型でシンプルなエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの限界のいくつかを克服する。Ｃｐｆ１は、以下でさらに説明する。
【００２４】
Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質も使用されうる。Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質は、ＰＩＷＩ（Ｐ  ｅｌｅｍｅｎｔ‐ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｉｍｐｙ  ｔｅｓｔｉｓ）ドメイン、ＭＩＤ（ｍｉｄｄｌｅ）ドメイン、ＰＡＺ（Ｐｉｗｉ‐Ａｒｇｏｎａｕｔｅ‐Ｚｗｉｌｌｅ）ドメイン、およびＮ末端ドメインを含む、ＰＩＷＩタンパク質スーパーファミリーのタンパク質である。Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質は、マイクロＲＮＡ、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）およびＰｉｗｉ相互作用ＲＮＡ等の小型ＲＮＡを結合することができる。Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質は、標的配列のｍＲＮＡを切断し、翻訳を阻害し、またはｍＲＮＡの劣化を誘発するために、これらのＲＮＡにより標的配列にガイドされうる。小型ＲＮＡに結合するＡＧＯ１、ＡＧＯ２、ＡＧＯ３およびＡＧＯ４を含め、いくつかの異なるヒトＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質がある。ＡＧＯ２は、スライサー能力を有する、すなわちエンドヌクレアーゼとして働く。Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質を、遺伝子編集のために用いることができる。Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質ファミリーの（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ  Ａｒｇｏｎａｕｔｅの）エンドヌクレアーゼも、オリゴヌクレオチドをガイドとして用いて侵入ゲノムを分解する。Ｇａｏらによる研究により、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ  Ａｒｇｏｎａｕｔｅ（ＮｇＡｇｏ）がヒト細胞のゲノム編集に適したＤＮＡガイドエンドヌクレアーゼであることが示されている。ＮｇＡｇｏは、約２４ヌクレオチドの５’リン酸化一本鎖ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をロードするとｇＤＮＡと結合して、部位特異的ＤＮＡ二本鎖損傷を効率的に生じる。ＮｇＡｇｏ‐ｇＤＮＡシステムは、Ｃａｓ９のようにプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ：ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ‐ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）を必要とせず、予備的特徴付けは、ガイド‐標的ミスマッチに対する低い寛容、および（Ｇ＋Ｃ）リッチなゲノム標的の編集の高い効率を示唆する。本発明で使用されるＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質エンドヌクレアーゼは、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  Ａｒｇｏｎａｕｔｅ（ＲｓＡｒｇｏ）とすることもできる。ＲｓＡｒｇｏは、Ｎ末端とＰＩＷＩドメインとの間でガイドＲＮＡの３’領域の塩基対合を維持することができるため、標的ＤＮＡ鎖とガイドＲＮＡとの安定した相互作用を提供することができる。ＲｓＡｒｇｏは、ガイドＲＮＡの５’塩基Ｕを特異的に認識することもでき、ガイドＲＮＡとＰＡＺドメインの二体鎖認識ループは、ＤＮＡサイレンシング活性において重要でありうる。他の原核生物Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質（ｐＡｇｏｓ：ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  Ａｒｇｏｎａｕｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が、ＤＮＡ干渉および切断に使用されることもできる。Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、アクウィフェクス・アエオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、ピ��ロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、サーマス・サーモフィルスＪＬ‐１８（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＪＬ‐１８）、サーマス・サーモフィルスＨＢ２７株、アクウィフェクス・アエオリカスＶＦ５株、アルカエオグロブス・フルギドゥス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、アノキシバチルス・フラビサーマス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ）、ハロゲオメトリカム・ボリンクエンセ（Ｈａｌｏｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｍ  ｂｏｒｉｎｑｕｅｎｓｅ）、ミクロキスティス・エルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ（Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｉｓ）  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、クロストリジウム・バルトレッティ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂａｒｔｌｅｔｔｉｉ）、ハロルブラム・ラクスプロファンディ（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ）、サーモシネココッカス・エロンガタス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、およびシネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）から得られる。エンドヌクレアーゼ的に不活性のＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質が用いられることもできるが、保存された触媒残基に対し、エンドヌクレアーゼとして活性化するために翻訳後修飾が行われうる。したがって本発明は、ＪＣＶゲノムの少なくとも一つのヌクレオチド配列を標的とする、少なくとも一つのａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質をコードする少なくとも一つの単離された核酸配列を含む医薬品組成物であって、単離された核酸配列は、少なくとも一つの発現ベクターに含まれる、医薬品組成物も提供する。
【００２５】
本発明の好ましい一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）からの配列でありうる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、野生型化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）配列と同一のヌクレオチド配列を有することもできる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、他の種、例えばサーモフィラス菌（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）等の他のレンサ球菌種、緑膿菌（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、もしくは他の配列決定された細菌ゲノムおよび古細菌、または他の原核微生物からの配列とすることもできる。あるいは、野生型化膿レンサ球菌Ｃａｓ９配列が改変されうる。好ましくは、核酸配列は、哺乳類細胞における効率的発現のためにコドン最適化すなわち「ヒト化」される。ヒト化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＫＭ０９９２３１．１  ＧＩ：６６９１９３７５７；ＫＭ０９９２３２．１  ＧＩ：６６９１９３７６１；またはＫＭ０９９２３３．１  ＧＩ：６６９１９３７６５にリストされた発現ベクターのいずれかによりコードされたＣａｓ９ヌクレアーゼ配列でありうる。あるいはＣａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）からのＰＸ３３０またはＰＸ２６０等、市販のベクターに含まれる配列でありうる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＫＭ０９９２３１．１  ＧＩ：６６９１９３７５７；ＫＭ０９９２３２．１  ＧＩ：６６９１９３７６１；またはＫＭ０９９２３３．１  ＧＩ：６６９１９３７６５のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ配列のいずれかの変異体もしくはフラグメントであるアミノ酸配列、またはＰＸ３３０もしくはＰＸ２６０（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のＣａｓ９アミノ酸配列を有しうる。
【００２６】
Ｃａｓ９ヌクレオチド配列は、Ｃａｓ９の生物学的に活性な変異体をコードするように改変されることができ、これらの変異体は、例えば、一つ以上の変異（例えば付加、欠失もしくは置換変異またはこのような変異の組み合わせ）を含むことによって野生型Ｃａｓ９と異なるアミノ酸配列を有するかまたは含むことができる。置換変異の一つ以上は、置換（例えば保存的アミノ酸置換）でありうる。例えば、Ｃａｓ９ポリペチドの生物学的に活性な変異体は、野生型Ｃａｓ９ポリペチドに対して少なくともまたは約５０％の配列同一性（例えば、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有しうる。保存的アミノ酸置換は、通常以下の群の中の置換を含む：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリンおよびスレオニン；リシン、ヒスチジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。
【００２７】
Ｃａｓ９アミノ酸配列中のアミノ酸残基は、天然に存在しないアミノ酸残基でありうる。天然に存在するアミノ酸残基は、遺伝暗号により天然にコードされるものに加え、非標準のアミノ酸（例えばＬ型ではなくＤ型のアミノ酸）を含む。本発明のペプチドは、標準的な残基の改変されたバージョンであるアミノ酸残基も含みうる（例えば、ピロリシンがリシンの代わりに使用され、セレノシステインがシステインの代わりに使用されうる）。天然に存在しないアミノ酸残基は、自然には見つかっていないが、アミノ酸の基本式に合致し、ペプチドに組み込まれうるものである。これらには、Ｄ‐アロイソロイシン（２Ｒ，３Ｓ）‐２アミノ‐３‐メチルペンタン酸およびＬ‐シクロペンチルグリシン（Ｓ）‐２‐アミノ‐２‐シクロペンチル酢酸を含む。他の例については、テキストまたはワールドワイドウェブ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより現在サイトが維持されており、機能タンパク質に良好に組み込まれた非天然アミノ酸の構造を表示する）を参照することができる。
【００２８】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、変異配列でありうる。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの、鎖特異的切断に関与する保存されたＨＮＨおよびＲｕｖＣドメインを変異させうる。例えば、ＲｕｖＣ触媒ドメインにおけるアスパルテートからアラニンへの（Ｄ１０Ａ）変異により、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体（Ｃａｓ９ｎ）がＤＮＡを切断するのではなくニックして一本鎖損傷を生成することができ、その後のＨＤＲ２２を通じた選択的修復は、オフターゲット二本鎖損傷からの望ましくないＩｎＤｅｌ変異の頻度を潜在的に減少させうる。
【００２９】
前述の野生型および変異体Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに加えて、本発明は、オフターゲット切断を激減させる「特異性増強」化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体（ｅＳｐＣａｓ９）を含むＣＲＩＳＰＲシステムも含む。これらの変異体は、非標的ＤＮＡ鎖と相互作用する溝内の正に帯電した部位を中和するためのアラニン置換により作製される。この改変は、Ｃａｓ９の非標的鎖との相互作用を減少させ、これにより標的鎖と非標的鎖との間の再ハイブリダイゼーションを促進する。この改変の影響により、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡ鎖との間のより厳密なワトソン・クリック対合が要求され、これによりオフターゲット切断が制限される（Ｓｌａｙｍａｋｅｒら、２０１５）。
【００３０】
特に好ましいのは、切断効率が最も高くオフターゲット効果が最も少ないことが分かった三つの変異体：ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５ａ）、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／ｒ１０６０Ａ）（別名ｅＳｐＣａｓ９  １．０）およびＳｐＣａｓ９（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）（別名ｅＳＰＣａｓ９  １．１）である。これらの特異性増強変異体のクローニングおよび細胞発現誘導のための技術は、全体として本明細書に組み込まれるＳｌａｙｍａｋｅｒら（２０１５）に見られる。本発明は、これらの変異体に決して限られず、Ｓｌａｙｍａｋｅｒら（２０１５）により開示されるすべてのＣａｓ９変異体も含む。
【００３１】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、上述の核酸配列のいずれかによりコードされたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペチドを含みうる。ポリペチドは、例えば、組み換え技術または化学合成を含む様々な方法により生成されうる。生成されると、ポリペチドは当技術分野で公知の手段により単離され、任意の所望の程度に精製されうる。例えば凍結乾燥を、例えば逆相（好ましくは）もしくは順相ＨＰＬＣ、またはセファデックスＧ‐２５等の多糖ゲル媒体によるサイズ排除クロマトグラフィもしくは分配クロマトグラフィの後に用いることができる。最終ポリペチドの組成は、標準手段によるペプチドの分解後のアミノ酸分析により、アミノ酸配列決定により、またはＦＡＢ‐ＭＳ技術により確認されうる。
【００３２】
例示的実施形態においては、本発明は、Ｃａｓ９とＪＣＶ  Ｔ‐Ａｇ配列と相補的な一つ以上のｇＲＮＡとを含む操作されたＣＲＩＳＰＲシステムを含む。例示的なＪＣＶゲノム配列は、Ｍａｄ‐１株、ＮＣＢＩ参照配列、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＣ＿００１６９９．１，ｐｕｂｌｉｃ  ＧＩである（Ｆｒｉｓｑｕｅら、１９８４）。Ｍａｄ１株において、Ｔ‐Ａｇコード領域は、５１３０ｎｔの環状Ｍａｄ‐１ＪＣＶゲノムのヌクレオチド（ｎｔ）５０１３で始まる。Ｔ‐Ａｇコード領域のヌクレオチド配列は、図１において配列番号１３として示される。
【００３３】
本発明は、免疫抑制療法中の患者におけるＪＣウイルス活性化のリスクを除去する方法を含み、この方法は、潜伏的または活性的にＪＣＶに感染した患者に、ＪＣＶゲノムの少なくとも一つの標的配列に向けられた有効量の遺伝子編集組成物を投与するステップと、ＪＣＶゲノムの標的配列を切断するステップと、ＪＣＶゲノムを破壊するステップと、ＪＣＶ感染を除去するステップと、ＪＣＶウイルス活性化のリスクを除去するステップと、遺伝子編集組成物の投与前、投与中、および投与後より選択される時に、患者に免疫抑制療法を施すステップとを含む。免疫抑制療法は様々な時点で施されうることが理解されねばならない。ＰＭＬは患者が免疫療法を受けるまで生じない可能性もあり、その時点で患者が免疫抑制療法を続けながらまたは一時的に中止して、遺伝子編集組成物が使用されうる。遺伝子編集組成物は、上述したもののいずれかでありうる。
【００３４】
好ましい実施形態では、本方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする単離された核酸と、ＪＣＶ  ＤＮＡの標的配列と相補的なスペーサー配列を含むｇＲＮＡを少なくともコードする少なくとも一つの単離された核酸とを含む有効量の医薬品組成物を投与するステップと、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと少なくとも一つのｇＲＮＡとを患者の細胞に発現させるステップと、ＪＣＶゲノムの標的配列を切断するステップと、ＪＣＶゲノムを破壊するステップと、ＪＣＶ感染を除去するステップと、ＪＣＶウイルス活性化のリスクを除去するステップと、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの投与前、投与中、および投与後より選択される時に、患者に免疫抑制療法を施すステップとを含む。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、上述したもののいずれかでありうる。
【００３５】
Ｗｏｌｌｅｂｏらは、宿主細胞におけるＪＣＶ複製およびＴ‐Ａｇ発現を阻害でき、ＪＣＶゲノムの完全性を損なう、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを開示している。これらの効果により、遊離エピソームウイルスおよび宿主ゲノムに取り込まれたウイルスの両方の切除が生じた。健全な遺伝子に対する有害なオフターゲット効果は生じなかった（全体として組み込まれるＷｏｌｌｅｂｏら、２０１５）。Ｗｏｌｌｅｂｏら（２０１５）により開示されるＣａｓ９およびｇＲＮＡ組成物は、本発明の方法の一実施形態において使用される。
【００３６】
仮想実施例１で、仮想的な例示的処置方法が本明細書に開示される。この例は、ＰＭＬ血清陽性患者のＰＭＬを誘発するリスクが１／１０００〜１３／１０００である、免疫抑制多発性硬化症薬物ナタリズマブ（ｎａｔｕｌｉｚｕｍａｂ）（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標））を含む（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ  Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）。例示的方法は、表１にリストされた薬物を含むがこれらに限定されない任意の免疫抑制薬物レジメンとともに用いるために容易に変更される変更点である。
【００３７】
実施例１のｇＲＮＡは、Ｗｏｌｌｅｂｏら（２０１５）により開示されるものであるが、本発明はこれらのｇＲＮＡに限定されないことが理解されよう。ｇＲＮＡは、ＴＭ１、ＴＭ２またはＴＭ３領域ＪＣＶ  Ｔ抗原配列と相補的なｇＲＮＡスペーサー配列を含む。標的配列は、長さが約２０〜４０ｎｔまたはそれ以上まで伸びうる。ＪＣＶの異なる株または突然変異体において、ＴＭ１、ＴＭ２およびＴＭ３と相同な配列が、周知の配列決定およびジェノミクス技術により直ちに同定されうることが理解されよう。
【００３８】
ＴＭ１中の例示的な標的配列には、配列番号１または逆平行鎖上のその補体、配列番号２が含まれる。各鎖のＰＡＭ配列（図１および以下で下付き文字で示す）が標的配列に含まれうるため、標的配列は、配列番号３または逆平行鎖上のその補体、配列番号４を含みうる。したがって、ｇＲＮＡ  ｍ１と表されるＴＭ１と相補的なｇＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４と相補的なスペーサー配列を含みうる。
【００３９】
ヌクレオチド配列は、以下の通りである：
ＡＡＡＴＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧ（配列番号１）
ＡＡＡＴＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧｇｇｇ（配列番号２）
ＣＡＣＣＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＴＴＣＴＴＴＧＣＡＴＴＴ（配列番号３）
ｃｃｃＣＡＣＣＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＴＴＣＴＴＴＧＣＡＴＴＴ（配列番号４）
【００４０】
ＴＭ２中の例示的な標的配列には、配列番号５または逆平行鎖上のその補体、配列番号６が含まれる。各鎖のＰＡＭ配列も標的配列に含まれうるため、標的配列は、配列番号７または逆平行鎖上のその補体、配列番号８を含みうる。したがって、ｇＲＮＡ  ｍ２と表されるＴＭ２と相補的なｇＲＮＡは、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８と相補的なスペーサー配列を含みうる。
【００４１】
ヌクレオチド配列は、以下の通りである：
ＧＡＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡＣＡＴＴＴＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴ（配列番号５）
ＧＡＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡＣＡＴＴＴＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴｇｇｇ（配列番号６）
ＡＣＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＡＴＧＴＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＣＣＣＡＴＴＣＡＴＣ（配列番号７）
ｃｃｃＡＣＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＡＴＧＴＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＣＣＣＡＴＴＣＡＴＣ（配列番号８）
【００４２】
ＴＭ３中の例示的な標的配列には、配列番号９または逆平行鎖上のその補体、配列番号１０が含まれる。各鎖のＰＡＭ配列も含まれうるため、標的配列は、配列番号１１またはその補体、配列番号１２を含みうる。したがって、ｍ３と表されるＴＭ３と相補的なｇＲＮＡは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２と相補的なスペーサー配列を含みうる。
【００４３】
ヌクレオチド配列は、以下の通りである：
ＡＡＧＧＴＡＣＴＧＧＣＴＡＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＣＡＡＴＡＧＡＣＡＧ（配列番号９）
ＡＡＧＧＴＡＣＴＧＧＣＴＡＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＣＡＡＴＡＧＡＣＡＧｔｇｇ（配列番号１０）
ＣＴＧＴＣＴＡＴＴＧＧＣＣＣＣＴＴＧＡＡＴＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＴ（配列番号１１）
ｃｃａＣＴＧＴＣＴＡＴＴＧＧＣＣＣＣＴＴＧＡＡＴＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＴ（配列番号１２）
【００４４】
本発明のｇＲＮＡは、標的配列と相補的でも相補的でなくてもよい追加的な５’および／または３’配列も含みうることが理解されよう。各ｇＲＮＡのスペーサーは、その標的配列に対する１００％未満の相補性、例えば９５％の相補性を有しうる。ＪＣＶのラージＴ‐Ａｇコード領域と相補的なもの以外のｇＲＮＡも、本発明の範囲内であることも理解されよう。これには、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３ならびにａｇｎｏｐｒｏｔｅｉｎをコードする領域内の標的配列と相補的なｇＲＮＡを含む。様々なＰＡＭに隣接する任意の既存の追加的配列も、本発明の範囲内である。
【００４５】
ｇＲＮＡは、単一の配列として、または、一つ以上の異なる配列の組み合わせ、例えばマルチプレックス形態として構成されうる。マルチプレックス形態は、二つ、三つまたはそれ以上の異なるｇＲＮＡの組み合わせを含みうる。組成物が発現ベクターにおいて投与されるときには、単一のベクターによりガイドＲＮＡがコードされうる。あるいは、それぞれが二つ以上の異なるガイドＲＮＡを含むように複数のベクターが操作されうる。切断部位間のウイルス配列の切除を引き起こし、ＪＣＶゲノムまたはＪＣＶタンパク質発現の除去（ａｂｌａｔｉｏｎ）をもたらすｇＲＮＡの組み合わせが特に有用である。切除領域は、一ヌクレオチドから数百ヌクレオチドまでサイズが変動しうる。
【００４６】
ＲＮＡ分子（例えばｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ）が、一つ以上の修飾核酸塩基を含むように操作されうる。例えば、ＲＮＡ分子の周知の修飾は、例えばＧｅｎｅｓ  ＶＩ，Ｃｈａｐｔｅｒ９（“Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ”），Ｌｅｗｉｎ，ｅｄ．（１９９７，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ＲＮＡ，ＧｒｏｓｊｅａｎおよびＢｅｎｎｅ，ｅｄｓ、（１９９８，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ）にみられる。修飾ＲＮＡ成分は、以下を含む：２’‐Ｏ‐メチルシチジン；Ｎ４‐メチルシチジン；Ｎ４‐２’‐Ｏ‐ジメチルシチジン；Ｎ４‐アセチルシチジン；５‐メチルシチジン；５，２’‐Ｏ‐ジメチルシチジン；５‐ヒドロキシメチルシチジン；５‐ホルミルシチジン；２’‐Ｏ‐メチル‐５ホルマイル（ｆｏｒｍａｙｌ）シチジン；３‐メチルシチジン；２‐チオシチジン；リシジン；２’‐Ｏ‐メチルウリジン；２チオウリジン；２‐チオ‐２’−Ｏ‐メチルウリジン；３，２’‐Ｏ‐ジメチルウリジン；３‐（３‐アミノ‐カルボキシプロピル）ウリジン；４‐チオウリジン；リボシルチミン；５，２’‐Ｏ‐ジメチルウリジン；５‐メチル‐２チオウリジン；５‐ヒドロキシウリジン；５‐メトキシウリジン；ウリジン５‐オキシ酢酸；ウリジン５‐オキシ酢酸メチルエステル；５‐カルボキシメチルウリジン；５‐メトキシカルボニルメチルウリジン；５メトキシカルボニルメチル‐２’‐Ｏ‐メチルウリジン；５‐メトキシカルボニルメチル‐２’‐チオウリジン；５‐カルバモイルメチルウリジン；５‐カルバモイルメチル‐２’‐Ｏ‐メチルウリジン；５‐（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン；５‐（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル；５‐アミノメチル‐２‐チオウリジン；５メチルアミノメチルウリジン；５‐メチルアミノメチル‐２‐チオウリジン；５‐メチルアミノメチル‐２セレノウリジン；５‐カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５‐カルボキシメチルアミノメチル‐２’‐Ｏメチル‐ウリジン；５‐カルボキシメチルアミノメチル‐２‐チオウリジン；ジヒドロウリジン；ジヒドロリボシルチミン；２’‐メチルアデノシン；２‐メチルアデノシン；Ｎ６‐メチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６‐ジメチルアデノシン；Ｎ６，２’‐Ｏ‐トリメチルアデノシン；２‐メチルチオ‐Ｎ６Ｎ‐イソペンテニルアデノシン；Ｎ６‐（シス‐ヒドロキシイソペンテニル）‐アデノシン；２‐メチルチオ‐Ｎ６‐（シスヒドロキシイソペンテニル）‐アデノシン；Ｎ６‐グリシニルカルバモイル）アデノシン；Ｎ６‐スレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６‐メチル‐Ｎ６スレオニルカルバモイルアデノシン；２‐メチルチオ‐Ｎ６‐メチル‐Ｎ６‐スレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；２‐メチルチオ‐Ｎ６‐ヒドロクス（ｈｙｄｒｏｘ）ノルバリルカルバモイルアデノシン；２‐Ｏ‐リボシルアデノシン（ホスフェート）；イノシン；２’Ｏ‐メチルイノシン；１‐メチルイノシン；１；２’‐Ｏ‐ジメチルイノシン；２’‐Ｏ‐メチルグ��ノシン；１‐メチルグアノシン；Ｎ２‐メチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２‐ジメチルグアノシン；Ｎ２，２’‐Ｏ‐ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，２’‐Ｏ‐トリメチルグアノシン；２’‐Ｏ‐リボシルグアノシン（ホスフェート）；７‐メチルグアノシン；Ｎ２；７‐ジメチルグアノシン；Ｎ２；Ｎ２；７‐トリメチルグアノシン；ワイオシン；メチルワイオシン；低修飾ヒドロキシワイブトシン；ワイブトシン；３０ヒドロキシワイブトシン；ペルオキシワイブトシン；キューオシン；エポキシキューオシン；ガラクトシル‐キューオシン；マンノシル‐キューオシン；７‐シアノ‐７‐デアザグアノシン；アラケオシン（ａｒａｃｈａｅｏｓｉｎｅ）［７‐ホルムアミド‐７‐デアザグアノシンとも呼ばれる］；および７‐アミノメチル‐７‐デアザグアノシン。本発明または従来技術の他の方法を用いて、さらなる修飾ＲＮＡ分子を同定しうる。
【００４７】
本発明のｇＲＮＡは、ＪＣＶ  Ｔ抗原のＴＭ１、ＴＭ２またはＴＭ３領域内に見られる配列と相補的なものに限定されない。好適に設計されたｇＲＮＡにより、ＪＣＶの他の領域がＣＲＩＳＰＲシステムの標的とされうる。化膿レンサ球菌Ｃａｓ９を利用するＣＲＩＳＰＲシステムでは、ＰＡＭ配列は、ＡＧＧ、ＴＧＧ、ＣＧＧまたはＧＧＧでありうる。候補標的配列は、ＡＧＧ、ＴＧＧ、ＣＧＧまたはＧＧＧ等、５’ＰＡＭに対する近接性により同定されうる。他のＣａｓ９オーソログは、異なるＰＡＭ特異性を有しうる。例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）からのＣａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ１では５’‐ＮＮＡＧＡＡ、およびＣＲＩＳＰＲ３では５’‐ＮＧＧＮＧを必要とし、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｇｉｄｉｔｉｓ）は５’‐ＮＮＮＮＧＡＴＴを必要とする。ｇＲＮＡの特異的配列は変動しうるが、有用なｇＲＮＡ配列は、高効率およびＪＣＶの完全な除去を達成するとともにオフターゲット効果を最小化するものである。候補ｇＲＮＡの効率およびオフターゲット効果は、Ｗｏｌｌｅｂｏら（２０１５）により開示されるアッセイにより測定されうる。
【００４８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組成物は、通常の技術を有する当業者に知られる様々な手法で調製されうる医薬品組成物として投与されるのが好ましい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組成物は、患者への投与のための組成物において、または場合によっては患者への養子移入のための培養患者細胞の処置のための組成物において処方される発現ベクターにコードされるのが好ましい。これらの組成物は、製薬技術において周知の仕方で調製され、様々な経路により投与されうる。潜伏ＪＣＶは、脳および他のＣＮＳ組織のグリア細胞、ならびに様々なリンパ系および非リンパ系末梢組織に存在しうるため、局所および全身の複数の経路による送達が所望されうる。
【００４９】
投与は、局所投与（眼投与ならびに鼻腔内、膣および直腸への送達を含む粘膜投与）、肺内投与（例えば、噴霧器による投与を含む粉末またはエアゾールの吸入または吹送による投与；気管内、鼻腔内、表皮、および経皮投与）、眼内投与、経口投与または非経口的投与でありうる。眼内送達のための方法は、局所投与（点眼）、結膜下、眼周囲もしくは硝子体内注射、またはバルーンカテーテルもしくは結膜嚢内に外科的に置かれた眼内挿入物による導入を含みうる。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射もしくは注入またはカテーテル処置；または例えばカニューレによる、頭蓋内、例えば髄腔内もしくは脳室内投与を含む。非経口投与は、単回ボーラス投与の形であってもよいし、または例えば連続注入ポンプによるものでもよい。局所投与のための医薬品組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、粉末および同様のものを含みうる。従来の医薬担体、水性基剤、粉末基剤もしくは油性基剤、増粘剤および同様のものが必要とされるかまたは所望されうる。遺伝子編集成分を形質導入したグリア細胞および間葉系細胞を用いて、これらの成分をＣＮＳの部位に導くことができる（Ｌｅｅら、２０１３、Ｓａｎ  Ｓｅｂａｓｔｉａｎら、２０１３）。
【００５０】
本発明は、活性成分として本明細書に記載の核酸、ベクター、エクソソームおよびナノクルー（ｎａｎｏｃｌｅｗ）を、一つ以上の薬学的に許容可能な担体と組み合わせて含む医薬品組成物も含む。「薬学的に許容可能な」（または「薬理学的に許容可能な」）という用語は、動物またはヒトに適宜投与されたときに有害反応、アレルギー性反応またはその他の不適切な反応を生じない分子実体および組成物をさすために使用する。本明細書で用いられるところの「薬学的に許容可能な担体」という用語は、薬学的に許容可能な物質の媒質として使用されうる、任意のまたは全ての溶剤、分散媒質、コーティング剤、抗菌剤、等張剤および吸収遅延剤、バッファ、賦形剤、結合剤、潤滑剤、ゲル、界面活性剤および同様のものを含む。本発明の組成物を作製する際には、活性成分が通常、賦形剤と混合され、賦形剤により希釈され、または例えばカプセル、錠剤、サシェ、紙またはその他の容器の形のこのような担体内に封入される。賦形剤が希釈剤として働くときには、活性成分のためのビヒクル、担体または媒質として作用する固体、半固体または液体材料（例えば生理食塩水）でありうる。このように組成物は、錠剤、丸薬、粉末、ロゼンジ、サシェ、カシェ、エリキシル、懸濁剤、エマルジョン、溶液、シロップ、（固体としての、または液体媒質中の）エアゾール、ローション、クリーム、軟膏、ゲル、ソフトおよびハードゼラチンカプセル、坐薬、滅菌注射可能溶液および滅菌包装粉末の形でありうる。周知のように、希釈剤のタイプは、意図される投与経路により変動しうる。得られる組成物は、保存剤等の追加の薬剤を含みうる。一部の実施形態では、担体は、脂質ベースまたはポリマーベースのコロイドであるかまたはこれを含みうる。一部の実施形態では、担体材料は、リポソーム、ヒドロゲル、微粒子、ナノ粒子またはブロックコポリマーミセルとして処方されるコロイドでありうる。前述のように、担体材料はカプセルを形成することができ、その材料がポリマーベースのコロイドであってもよい。例示的な薬学的に許容可能な担体および希釈剤、ならびに医薬製剤のさらなる説明は、この分野の標準テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、およびＵＳＰ／ＮＦに見られる。組成物を安定させるためおよび／または保存するために、他の物質が組成物に加えられてもよい。
【００５１】
本明細書で使用されるところの医薬品組成物の「有効量」という用語は、患者において所望の応答を誘発する一方で有意な毒性を誘発しない、任意の量を意味する。本発明では、遺伝子編集組成物の所望の効果は、宿主組織からのＪＣＶの除去である。量は、既知量の特定の組成物の投与後に患者の応答を評価することによって決定されうる。加えて、毒性のレベルは、毒性がある場合には、既知量の特定の組成物を投与する前後で患者の臨床症状を評価することによって決定されうる。患者に投与される特定の組成物の有効量は、所望の結果ならびに患者の応答および毒性のレベルにしたがって調節されうることに注意されたい。有意な毒性は、特定の患者ごとに変動する可能性があり、患者の病態、年齢および副作用に対する忍容性を含むがこれらに限定されない複数のファクターに依存する。
【００５２】
本発明の核酸配列は、対象の適切な細胞に送達されうる。これは例えば、マクロファージ等の食細胞による食作用を最適化するサイズの、ポリマー性生物分解可能微粒子またはマイクロカプセル送達ビヒクルの使用により達成されうる。例えば、直径約１〜１０μｍのＰＬＧＡ（ポリ‐ラクト‐コ‐グリコリド）微粒子が使用されうる。ポリヌクレオチドはこれらの微粒子に封入され、これらがマクロファージにより取り込まれ、細胞内で徐々に生分解され、これによりポリヌクレオチドを放出する。放出されると、ＤＮＡが細胞内で発現される。第二のタイプの微粒子は、細胞により直接取り込まれるのではなく、生分解を通じて微粒子から放出されたときにのみ細胞により取り込まれる核酸の徐放性リザーバーとして主に働くことが企図される。したがってこれらのポリマー粒子は、食作用を排除するために十分に大きくなければならない（すなわち５μｍより大きく、好ましくは２０μｍより大きい）。核酸の取り込みを達成する別の手法は、標準的方法により調製されたリポソームを使用することである。核酸は、これらの送達ビヒクルに単独で組み入れられるか、または組織特異的抗体、例えば、一般的なＨＩＶ感染の潜伏感染リザーバーである細胞型、例えば脳マクロファージ、小膠細胞、星状細胞および腸管関連リンパ細胞を標的とする抗体とともに組み入れられうる。あるいは、静電気的または共有結合的力によりポリ‐Ｌ‐リジンに結合したプラスミドまたは他のベクターからなる分子複合体を調製しうる。ポリ‐Ｌ‐リジンは、標的細胞上の受容体に結合できるリガンドに結合する。筋肉内、皮内または皮下部位への「裸のＤＮＡ」の（すなわち送達ビヒクルを用いない）送達は、ｉｎ  ｖｉｖｏ発現を達成するためのもう一つの手段である。関連のポリヌクレオチド（例えば発現ベクター）では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡとをコードする配列を含む単離核酸配列をコードする核酸配列が、プロモーターまたはエンハンサー‐プロモーターの組み合わせに操作可能にリンクされる。プロモーターおよびエンハンサーは上記した。
【００５３】
一部の実施形態では、本発明の組成物はナノ粒子として、例えばＤＮＡと合成されポリエチレングリコール修飾（ＰＥＧ化）低分子量ＬＰＥＩの殻により囲まれた高分子量直鎖状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ：ｌｉｎｅａｒ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）の核を含むナノ粒子として処方されうる。
【００５４】
核酸およびベクターは、デバイス（例えばカテーテル）の表面に施されるか、またはポンプ、パッチもしくは他の薬物送達デバイス内に含まれてもよい。本発明の核酸およびベクターは、単独でまたは混合物において、薬学的に許容可能な賦形剤または担体（例えば生理食塩水）の存在下で投与されうる。賦形剤または担体は、投与の様式および経路に基づいて選択される。医薬製剤用の適切な医薬担体および医薬必需品は、この分野の周知の参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ）、およびＵＳＰ／ＮＦ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ）に記載されている。
【００５５】
一部の実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９もしくは変異体Ｃａｓ９、もしくはＣｐｆ１もしくはＣｐｆ１の変異体、または任意の他の有効なｇ‐ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼと；標的ＨＩＶと相補的な少なくとも一つのｇＲＮＡ配列とをコードする核酸を封入するナノ粒子として処方されることができ；またはこれらの成分をコードするベクターを含むことができる。あるいは、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを封入するナノ粒子であって、ポリペチドが本発明の核酸組成物の一つ以上によりコードされる、ナノ粒子として処方されうる。
【００５６】
遺伝子編集処置は、処置が必要であると決定された患者、すなわち潜伏ＪＣＶ感染をもつと決定された患者だけに施されるのが好ましい。決定は、公知技術の任意の有効なスクリーニングテストによりなされうる。血液、血清、ＣＳＦまたはその他の体液における抗ＪＣＶ抗体のＥＬＩＳＡアッセイおよびＪＣＶ  ＤＮＡの定量的ＰＣＲが好ましい。封入体診断アッセイが代わりに使用されることもできる。したがって本発明の方法は、投与するステップの前に患者を潜伏または活性ＪＣＶ感染につきスクリーニングするステップを、投与するステップの前に含みうる。
【００５７】
免疫抑制療法の開始前に感染が消散したことを確認するために、潜伏または活性ＪＣＶ感染を有すると特定された患者がモニタリングされることも好ましい。免疫抑制療法が長期にわたり送達される場合には、例えば潜伏ウイルスの小さな未処置リザーバーの再活性化による、患者のＪＣＶ感染の再発をモニタリングすることも望ましい。モニタリングは、前述のＥＬＩＳＡおよびＰＣＲ方法等の任意の適切な方法により行われうる。したがって本発明の方法は、ＪＣＶゲノムを破壊するステップ後の任意の時点で、ＪＣＶ感染が消散したものと決定するステップも含みうる。
【００５８】
遺伝子編集組成物の投与量、毒性および治療効力は、例えばＬＤ５０（個体数の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（個体数の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための細胞培養物または実験動物における標準の薬学的手順により決定されうる。毒性と治療効果との間の用量比が治療係数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０と表されうる。高い治療係数を示すＣａｓ９／ｇＲＮＡ組成物が好ましい。オフターゲット効果またはその他の毒性副作用を示すＣａｓ９／ｇＲＮＡ組成物が使用されてもよいが、非感染細胞に対する潜在的損傷を最小限にし、これにより副作用を減らすために、このような組成物を罹患組織の部位に標的化する送達システムを設計するように注意しなければならない。副作用の制限は、発現ベクターに一つ以上の組織特異的プロモーターを含むことによっても達成されうる。加えて、投与された化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を改良するために、組成物がカプセル化され、リポソームの内腔に導入され、コロイドとして調製され、または組成物の延長された血清半減期を提供する他の従来技術が利用されてもよい。例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれるＳｚｏｋａら、米国特許第４，２３５，８７１号、４，５０１，７２８号および４，８３７，０２８号に記載されるように、リポソームを調製するために様々な方法が利用可能である。さらに、標的化された薬物送達システム中の、例えば組織特異的抗体で被覆されたリポソーム中の薬物を投与しうる。リポソームは、組織に標的化され、選択的に取り込まれる。
【００５９】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータが、ヒト用の投与量範囲を処方する際に使用されうる。このような組成物の投与量は一般に、毒性をほとんどまたは全く有しないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量はこの範囲内で、採用される投与形態および利用される投与経路に応じて変動しうる。本発明の方法で使用される任意の組成物について、治療的に有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定されうる。
【００６０】
ベクター。本発明は、例えば、一つ以上のｇＲＮＡおよびＣａｓ９等のＣａｓエンドヌクレアーゼ等のＣＲＩＳＰＲ成分の発現のための一つ以上のカセットを含むベクターを含む。ベクターは、従来技術において周知の、所望の発現カセットを発現するのに適した任意のベクターでありうる。従来技術において公知であり、本明細書に記載されるように、いくつかのベクターが遺伝子生成物の哺乳動物細胞への移入を媒介できることが知られている。「ベクター」（遺伝子送達または遺伝子移入「ビヒクル」と呼称される場合もある）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで宿主細胞に送達されるべきポリヌクレオチドを含む巨大分子または分子の複合体をいう。送達されるべきポリヌクレオチドは、遺伝子療法における目的のコード配列を含みうる。
【００６１】
好ましいベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、増殖細胞および休止細胞の両方の効率的な形質導入、宿主クロマチンへの組み込みによる送達遺伝子の安定発現、および既存のウイルス免疫による干渉の不存在を提供する利点がある。Ｗｏｌｌｅｂｏら、（２０１５）に開示される実験では、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ成分のための薬物誘導可能なレンチウイルス発現ベクターが、感染細胞におけるＪＣＶ  Ｔ‐Ａｇ発現の除去（ａｂｌａｔｉｎｇ）に有効であることが示された。例示的構成では、宿主細胞に、ドキシサイクリン誘導可能レンチウイルスベクター中のＣａｓ９または別の適切なＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが安定して形質導入された。ＪＣＶの除去が求められるときには、宿主細胞に一つ以上のｇＲＮＡが形質導入され、ドキシサイクリンで処置されて、Ｃａｓ９の発現が活性化され、ＪＣＶゲノムのガイド切断およびウイルスの不活性化が引き起こされた。あるいは、一つ以上のｇＲＮＡが薬物誘導可能な様式で安定して形質導入されることができ、またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとｇＲＮＡとの両方が同様に形質導入されうる。臨床場面では、本処置は、ＪＣＶ感染のリスクがある患者に使用され、ＣＲＩＳＰＲ成分が初期感染または再発感染の所見時に活性化されうる。
【００６２】
したがって、本発明は、宿主細胞からのＪＣＶの除去に使用するためのベクター組成物を含む。ベクター組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの単離された核酸配列と、ＪＣＶ  ＤＮＡの標的配列と相補的なスペーサー配列を有する少なくとも一つのｇＲＮＡとを含む。単離された核酸配列は、宿主細胞におけるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと少なくとも一つのｇＲＮＡとの発現を誘導する少なくとも一つの発現ベクターに含まれる。
【００６３】
本発明は、実施例１〜２に記載されるプラスミドおよびレンチウイルスベクターに決して限定されない。他の好ましいベクターには、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターを含む。これらは、宿主細胞ＤＮＡに組み込まれない利点がある。アデノウイルスは、大きなパッケージ容量を有するさらなる利点がある（Ｄｉｎｇら、２０１４）。小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）ベクター、ポックスウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターを含むがこれらに限定されない、多くの他の組み換えウイルスベクターも適切である。
【００６４】
「組み換えウイルスベクター」とは、一つ以上の異種遺伝子産物または配列を含むウイルスベクターをいう。多くのウイルスベクターがパッケージングに関連するサイズ制約を示すため、ウイルスゲノムの一つ以上の部分を置換することにより、異種遺伝子産物または配列が通常導入される。このようなウイルスは複製欠損になり、欠失した機能（単数または複数）が、（例えば、複製におよび／またはカプシド形成に必要な遺伝子産物を持つヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞株を使用することにより）ウイルス複製およびカプシド形成中にトランスにおいて提供されることが必要でありうる。送達されるべきポリヌクレオチドがウイルス粒子の外部に担持される、改変ウイルスベクターも記載されている。
【００６５】
レトロウイルスベクターは、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスおよびＨＩＶベースのウイルスを含む。一つの好ましいＨＩＶベースのウイルスベクターは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子がＨＩＶゲノムからのものであり、ｅｎｖ遺伝子が別のウイルスからのものである少なくとも二つのベクターを含む。ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。これらのベクターは、オルソポックスまたはアビポックスベクター等のポックスベクター、単純ヘルペスＩウイルス（ＨＳＶ：ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｉ  ｖｉｒｕｓ）ベクター等のヘルペスウイルスベクターを含む。
【００６６】
ポックスウイルスベクターは、細胞の細胞質に遺伝子を導入する。アビポックスウイルスベクターは、核酸の短期だけの発現を生じる。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）ベクターは、一部の発明実施形態に必要でありうる。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスよりも短期間（例えば約１ヵ月未満）の発現を生じ、一部の実施形態でははるかに長い発現を示しうる。選択される特定のベクターは、標的細胞および処置される状態による。適切なプロモーターの選択は、容易に達成されうる。一部の実施形態では、高発現プロモーターが使用されうる。適切なプロモーターの例は、７６３塩基対サイトメガロウイルス（ＣＭＶ：ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーターである。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ：Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）およびＭＭＴプロモーターが使用されてもよい。あるタンパク質は、それらの天然のプロモーターを用いて発現されうる。エンハンサーまたはｔａｔ遺伝子およびｔａｒ要素等の高レベルの発現をもたらすシステム等、発現を増強しうる他の要素も含まれうる。その後、このカセットがベクターに、例えば大腸菌の複製の起点を含む例えばｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２、または他の公知のプラスミドベクター等のプラスミドベクター等に、挿入されうる。マーカーポリペチドが処置される生物の代謝に悪影響を与えないという条件で、プラスミドベクターは、アンピシリン抵抗のためのβ‐ラクタマーゼ遺伝子等の選択可能マーカーも含みうる。カセットは、国際公開第９５／２２６１８号に開示されるシステム等の合成送達システムにおける核酸結合部分に結合されることもできる。
【００６７】
別の送達方法は、発現生成物を細胞内で生成することができる一本鎖ＤＮＡ生成ベクターを使用することである。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＣｈｅｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３４：１６７‐１７１（２００３）を参照。
【００６８】
発現は、発現のために選択される宿主において機能的である当技術分野において公知の任意のプロモーター／エンハンサー要素により制御されうる。実施例のセクションに記載されたプロモーターの他に、遺伝子発現のために用いられうる他のプロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列に含まれるプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列；β‐ラクタマーゼまたはｔａｃプロモーター等の原核生物の発現ベクター；Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター等の酵母または他の真菌類からのプロモーター要素；および組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されている動物の転写制御領域：膵臓の腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域；膵臓β細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパおよび肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域、肝臓で活性なα‐フェトプロテイン遺伝子制御領域、肝臓で活性なα１‐アンチトリプシン遺伝子制御領域、骨髄性細胞で活性なβ‐グロビン遺伝子制御領域、脳の希突起膠細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋で活性なミオシンＬ鎖‐２遺伝子制御領域、および視床下部で活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域を含むがこれらに限定されない。
【００６９】
多種多様な宿主／発現ベクターの組み合わせが、本発明の核酸配列の発現に利用されうる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体および合成のＤＮＡ配列セグメントからなりうる。適切なベクターには、ＳＶ４０の誘導体および公知の細菌性プラスミド、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ‐Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＭＢ９、およびこれらの誘導体、ＲＰ４等のプラスミド；ファージＤＮＡ、例えばファージ１の多数の誘導体、例えばＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３および繊維状一本鎖ファージＤＮＡ；２μプラスミドまたはその誘導体等の酵母プラスミド、昆虫または哺乳類細胞に有用なベクター等、真核細胞において有用なベクター；ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を利用するために改変されているプラスミド等、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせに由来するベクター；および同様のものが含まれる。
【００７０】
必要に応じて、本発明のポリヌクレオチドは、カチオン性リポソームおよび他の脂質含有複合体等のマイクロ送達ビヒクル、ならびに宿主細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介することができる他の巨大分子複合体とともに使用されてもよい。
【００７１】
ベクターは、遺伝子送達および／もしくは遺伝子発現をさらに調節する、または他の方法により標的細胞に有益な特性を提供する、他の成分または機能性も含みうる。そのような他の成分には、例えば、細胞への結合またはターゲティングに影響する成分（細胞型または組織特異的結合を媒介する成分を含む）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響する成分；取り込み後のポリヌクレオチドの細胞内局在化に影響する成分（核局在化を媒介する薬剤等）；およびポリヌクレオチドの発現に影響する成分を含む。このような成分は、ベクターにより送達される核酸を取り込んで発現している細胞を検出または選択するために使用されうる検出可能および／または選択可能マーカー等のマーカーも含みうる。このような成分は、ベクターの天然の特徴として提供されるか（結合および取り込みを媒介する成分または機能性を有するあるウイルスベクターの使用等）、またはベクターが改変されてそのような機能性が提供されうる。他のベクターには、Ｃｈｅｎら；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，５３４：１６７‐１７１（２００３）により記載されるものが含まれる。多様なこのようなベクターが当技術分野で公知であり、一般に利用可能である。
【００７２】
ベクターの送達は、エクソソームにより媒介されることもできる。エクソソームは、多くの細胞型により放出される脂質ナノ小胞である。エクソソームは、細胞間で核酸およびタンパク質を輸送することにより細胞間情報伝達を媒介する。エクソソームは、エンドサイトーシス経路から派生するＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびタンパク質を含む。これらは、エンドサイトーシス、融合または両方により標的細胞により取り込まれうる。通常、エンドソームの内容物の受け取りにより、受け取る細胞の機能が変更される（Ｌｅｅら、２０１２）。
【００７３】
エクソソームは、標的細胞に核酸を送達するために利用されうる。好ましい方法では、エクソソームは、プロデューサー細胞によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成され、精製され、エレクトロポレーションにより、または脂質トランスフェクション薬剤により核酸カーゴがロードされる（ＭａｒｃｕｓおよびＬｅｏｎａｒｄ、２０１３、Ｓｈｔａｍら、２０１３）。カーゴは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび一つ以上のｇＲＮＡのための発現構築物を含みうる。適切な技術は、Ｋｏｏｉｊｍａｎｓら（２０１２）、Ｌｅｅら（２０１２）、ＭａｒｃｕｓおよびＬｅｏｎａｒｄ（２０１３）、Ｓｈｔａｍら（２０１３）またはこれらの中の参考文献に見られる。エクソソームの生成およびロードのための例示的キットは、ＥｘｏＦｅｃｔ（商標）キット（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）である。
【００７４】
エクソソームは、特定の細胞型による優先取り込みのためにターゲティングされることもできる。本発明に特に有用なターゲティング戦略は、Ａｌｖａｒｅｚ‐Ｅｒｖｉｔｔｉら（２０１１）により開示される。そこに開示される技術を用いて、エクソソームが狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ：ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒａｌ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）ペプチドで装飾されうる。ＲＶＧを持つエクソソームは、脳に、特に神経細胞、乏突起膠細胞および小膠細胞に特異的に向かい、他の組織への非特異的蓄積はほとんどない。
【００７５】
本発明の発現構築物は、ナノクルーにより送達されることもできる。ナノクルーは、繭様のＤＮＡナノ複合体である（Ｓｕｎら、２０１４）。ナノクルーは、標的細胞による取り込みおよび標的細胞の細胞質における放出のために核酸がロードされうる。ナノクルーの構築、ナノクルーのロード、および放出分子の設計の方法は、Ｓｕｎら（２０１４）およびＳｕｎら（２０１５）に見られる。
【００７６】
本発明の遺伝子編集構築物は、宿主細胞による誘導発現によってではなく、直接送達によって、すなわちＣａｓ９タンパク質等のＣａｓヌクレアーゼタンパク質と一つ以上のｇＲＮＡとの送達によって送達されることもできる。エクソソームは、タンパク質およびＲＮＡの両方がロードされうるため、直接送達のための好適なビヒクルである（Ａｌｖａｒｅｚ‐Ｅｒｖｉｔｔｉら、２０１１；ＭａｒｃｕｓおよびＬｅｏｎａｒｄ、２０１３）。エクソソームへのタンパク質ロードの例示的方法は、エクソソーム生成細胞におけるラクトアドヘリン等のエンドソームのタンパク質との融合体としてのタンパク質の発現によってである。エクソソームの別の好ましい特徴は、前述のように、脳等の特定の部位にターゲティングできることである。ｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼタンパク質と同じエクソソームに、好ましくはＣａｓ／ｇＲＮＡ複合体の形でロードされうる。あるいはＣａｓエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡは、同時的送達または段階的送達のために別々のエクソソームにロードされることもできる。
【００７７】
遺伝子編集複合体の直接送達は、ナノクルーを用いて達成されることもできる。Ｓｕｎら（２０１５）は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を受け取る細胞への取り込みおよび放出のためにナノクルーにロードするための技術を開示する。
【００７８】
直接送達ビヒクルは、ｉ．ｖ．投与、ｉ．ｐ投与、直腸内投与、髄腔内投与、頭蓋内投与、吸入投与、および丸薬の形態での投与を含む経口投与を含むがこれらに限定されない任意の適切な経路により投与されうる。
【００７９】
本発明は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲシステムに限定されない。本発明は、ｇＲＮＡによるＰＡＭ部位への誘導後にウイルスゲノムを切断することができる任意のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの使用を伴う、組成物および方法も含む。例には、ファミリーＣｐｆ１（ＣＲＩＳＰＲ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１）のエンドヌクレアーゼが含まれる（Ｚｅｔｓｃｈｅら、２０１５）。これまでに二つのＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、培養ヒト腎臓細胞系において遺伝子編集に有効であることが示されている：アシダミノコッカスｓｐ．（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６  Ｃｐｆ１、およびラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６  Ｃｐｆ１。
【００８０】
Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９により認識されるシトシンリッチＰＡＭと異なるＰＡＭを認識するため、ＪＣＶおよび他のポリオーマウイルスにおける可能な標的の範囲を拡大する。Ｃｐｆ１は、コンセンサス配列ＴＴＮを持つチミンリッチＰＡＭを認識し、そのＰＡＭは標的配列の５’末端に位置する。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９システムよりも小型で単純なｇＲＮＡによりガイドされる。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む２ユニットｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの操作されたキメラハイブリッドの代わりに、Ｃｐｆ１はｇＲＮＡと称される単一のガイドＲＮＡによりガイドされる。また、Ｃｐｆ１分子はＣａｓ９分子よりも小さい。このより大きな単純性およびより小さなサイズにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの設計および使用、ならびに宿主細胞の核へのエンドヌクレアーゼ成分の送達が容易になる。
【００８１】
ＪＣＶ  Ｔ‐Ａｇゲノムにおける５’ＴＴＮ配列に対する３’隣接性に基づくＣｐｆ１の仮想標的配列は、仮想実施例の実施例２として開示される。免疫抑制療法レジーム中のＪＣＶ活性化のリスクを除去する仮想方法も、実施例２に開示される。したがって、本発明は、免疫抑制療法中の対象におけるＪＣＶ活性化のリスクを除去する方法を含み、この方法は、ＪＣＶに感染した対象に、Ｃｐｆ１をコードする少なくとも一つの単離された核酸配列と、ＪＣＶ  ＤＮＡの標的配列と相補的なスペーサー配列を有する少なくとも一つのｇＲＮＡとを含む有効量の遺伝子編集組成物を投与するステップと；ＪＣＶゲノムの標的配列を切断するステップと；ＪＣＶゲノムを破壊するステップと；ＪＣＶ感染を除去するステップと；ＪＣＶウイルス活性化のリスクを除去するステップと；対象に免疫抑制療法を施すステップとを含む。
【００８２】
本発明のｇＲＮＡは、Ｚｅｔｓｃｈｅらにより一般的に記載されるように合成される。宿主細胞における発現のためのベクターへのｇＲＮＡのクローニングは、いずれも全体として本明細書に組み込まれるＨｕら、２０１４およびＫｈａｌｉｌｉらに対する国際公開第２０１５／０３１７７５号に記載される通りである。Ｃｐｆ１／ｇＲＮＡの組み合わせの遺伝子編集活性に関するスクリーニングは、Ｈｕら、２０１４およびＫｈａｌｉｌｉらに対する国際公開第２０１５／０３１７７５号に開示されるように、ゲノム分析、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイならびにウイルス感染、活性化および発現のアッセイにより行われる。Ｃｐｆ１／ｇＲＮＡの組み合わせの使用の詳細技術は、提案されるベクターを含めて、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡの組み合わせにつき過去に記載されている。
【００８３】
本発明は、過去に開示されたＣａｓ９もしくはＣｐｆ１ヌクレアーゼまたはｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムに限定されない。本発明は、ＪＣＶ複製サイクルおよびその後のＰＭＬによる神経細胞の破壊を根絶するかまたは崩壊させることができる、現存のおよび将来発見される任意のｇＲＮＡによりガイドされるヌクレアーゼによるＪＣＶ除去のための全ての方法を含む。
【００８４】
免疫抑制療法中のＪＣＶ活性化のリスクを除去するためのＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ組成物および方法。
【００８５】
本発明は、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）およびＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）ファミリーの操作された制限酵素の組成物を含む。ＣＲＩＳＰＲシステムとは異なり、これらのヌクレアーゼはｇＲＮＡにより標的部位にガイドされず、特定の標的配列を認識して結合し、その後切断するように設計される。切断後に非相同末端結合が起こると、切断部位でランダムな挿入または欠失が発生して、対象遺伝子の機能的ノックアウトを通常引き起こす。
【００８６】
ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを制限エンドヌクレアーゼＦｏｋｌのヌクレアーゼドメインに由来するＤＮＡ切断ドメインと組み合わせたハイブリッドタンパク質である。二本鎖損傷を生成するために、一対のＺＦＮが投与され、それぞれが異なる１２〜１８塩基標的配列を認識し、標的配列は４〜７塩基対離れており、これにより活性Ｆｏｋｌ二量体の形成が可能になる。ＺＦＮは通常、標的細胞における発現のためにプラスミド、ウイルスまたは他のベクターにコードされる（Ｕｒｎｏｖら、２０１０）。ＪＣＶゲノムの標的配列に特異的なＺＦＮは、ＺｉＦｉＴ等の一般に利用可能なプログラムを用いて設計されうる（Ｓａｎｄｅｒら、２０１０）。
【００８７】
ＴＡＬＥＮは、それぞれが単一の塩基対を認識する一連の３３〜３５アミノ酸のリピートドメインから構成されるＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質である。モジュールＴＡＬＥＮリピートが結合されて、隣接するＤＮＡ配列を認識しうる。ＴＡＬＥＮリピートは、事実上任意の所望のＤＮＡ配列を認識し、切断するために組み合わせることができる。（Ｍｉｌｌｅｒら、２０１１）。ＪＣＶゲノムの標的配列に特異的なＴＡＬＥＮは、オンラインで自由に利用可能なＴＡＬＥ‐ＮＴ２．０ウェブインタフェース等の一般に利用可能な設計プログラムを用いて設計されうる（Ｄｏｙｌｅら、２０１２）。
【００８８】
本発明は、ＪＣＶゲノムを切断してウイルス複製サイクルを破壊し、ウイルスを根絶するために有用な、現存のまたは将来開発される全てのＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ分子ならびにこれらの変異体を含む。
【実施例】
【００８９】
実施例１：ナタリズマブとの併用治療処置としてのＪＣＶの除去のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組成物および方法。
【００９０】
ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標））は、細胞接着分子α４‐インテグリンに対するヒト化モノクローナル抗体である。併用治療処置レジームにおいては、潜伏ＪＣＶ感染をもつと分かった対象を、感染が除去されるまでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９医薬品組成物で処置する。その後患者を、多発性硬化症またはその他の自己免疫性疾患の療法としてナタリズマブで処置する。
【００９１】
対象を、血液または血清中の抗ＪＣＶ抗体のＥＬＩＳＡにより、ＪＣＶ感染の存在につきスクリーニングしうる。例示的なＥＬＩＳＡは、マサチューセッツ州ケンブリッジのＢｉｏｇｅｎから入手可能なＳＴＲＡＴＩＦＹ‐ＪＣＶ（登録商標）である。あるいはスクリーニングは、脳脊髄液、血液または尿等の体液中のＪＣＶ  ＤＮＡの定量的ＰＣＲ分析によってもよい。適切なＰＣＲ試験は、Ｖｉｒａｃｏｒ‐ＩＢＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ミズーリ州リーズ・サミット）から入手可能である。
【００９２】
対象がＪＣＶに感染していると分かった場合には、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの単離された核酸配列と、ＪＣＶ  ＤＮＡの標的配列と相補的なスペーサー配列を有する少なくとも一つのｇＲＮＡとを含む医薬品組成物の投与により、併用治療処置の過程を開始する。前述のように、好ましい標的配列は、ｍ１、ｍ２およびｍ３の任意の組み合わせを含む。
【００９３】
例えばＥＬＩＳＡまたは定量的ＰＣＲにより決定されるＪＣＶ感染の全ての所見が除去されるまで、処置は続く。その時点で、ナタリズマブ療法を開始する。ナタリズマブの通常の過程は、４週毎の３００ｍｇの２．６ｍｇ／ｍＬ溶液の１時間にわたる静脈内注入を含む（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）。ＪＣＶのスクリーニングは、ＰＭＬの症状が起こる前に新たなまたは隠れたウイルスリザーバーの再活性化に反応できるように、ナタリズマブ処置過程中に適切な間隔で繰り返すのが好ましい。
【００９４】
活性ＪＣＶ感染および症候性ＰＭＬを有する対象も、ナタリズマブでの処置が考慮される可能性がある。この場合には、スクリーニングテストがＪＣＶの存在のベースラインを確立する。それ以外には方法を前述のように行い、症状の解消および残余ＪＣＶの除去の両方の後にナタリズマブ処置を開始する。
【００９５】
実施例２：ナタリズマブとの併用治療処置としてのＪＣＶの除去のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１組成物および方法。
【００９６】
ＪＣＶ  Ｔ‐Ａｇゲノムにおける５’ＴＴＮ配列に対する３’隣接性に基づくＣｐｆ１の仮想標的配列が、標的配列ｃｍ１〜ｃｍ２３６として表２に開示される。本発明の遺伝子編集組成物は、リストされた標的配列のうちの一つと相補的な少なくとも一つのｇＲＮＡを含む。本発明のｇＲＮＡは、表２の各標的配列の５’末端の括弧内にリストされた、標的配列のＰＡＭ配列と相補的な配列を含んでも含まなくてもよい。ｇＲＮＡは、リストされた配列の短縮されたバリエーション、例えば３’末端で１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチドまたはそれ以上短縮されたものと相補的でありうる。ｇＲＮＡは、表２にリストされた標的配列との相補性が１００％未満でありうる。例えばｇＲＮＡは、リストされた標的配列に９５％相補的でありうる。ｇＲＮＡ配列は、標的配列と相補的でなくてもよい追加的な５’および／または３’配列を含みうる。本発明は、リストされた標的配列のそれぞれのアンチセンス鎖（図示せず）と相補的であるか、または１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチドもしくはそれ以上短縮されたアンチセンス配列と９５％相補的であるかまたは相補的であるｇＲＮＡを含む。ｇＲＮＡ配列は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の異なるｇＲＮＡの組み合わせを含むマルチプレックス形態において利用されうる。
【００９７】
表２は、ＪＣＶ  Ｔ‐Ａｇゲノムの標的配列の代表的サンプルだけを含むことが理解されよう。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３ならびにａｇｎｏｐｒｏｔｅｉｎをコードする領域等、ＪＣＶゲノムの他の領域の追加的配列も、本発明の範囲内である。様々なＰＡＭに隣接する任意の既存の追加的配列も、本発明の範囲内である。
【００９８】
ナタリズマブ療法の開始前に、表２にリストされた配列と相補的なｇＲＮＡのうちの一つまたは任意の組み合わせとＣｐｆ１とを含む有効量の組成物を、潜伏ＪＣＶの除去が必要な対象に投与する。ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１は、仮想実施例１に記載のように、適切な医薬品組成物において一つ以上の発現ベクターにコードされるのが好ましい。ナタリズマブ処置のプロトコルも、実施例１に記載の通りである。
【００９９】
表２．ＪＣＶゲノムのＣｐｆ１／ｇＲＮＡ標的配列
ｃｍ１：（ＴＴＡ）ＣＴＴＡＡＣＡＧＴＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＧＧ（配列番号１４）
ｃｍ２：（ＴＴＡ）ＴＴＴＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＴＧＧＴＴＴ（配列番号１５）
ｃｍ３：（ＴＴＡ）ＧＣＴＴＴＣＡＴＡＧＴＡＧＡＡＡＡＴＧＴＡＴＡＣ（配列番号１６）
ｃｍ４：（ＴＴＡ）ＴＴＴＣＴＡＡＡＴＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣ（配列番号１７）
ｃｍ５：（ＴＴＡ）ＧＴＧＡＴＴＴＴＣＴＣＡＧＧＴＡＧＧＣＣＴＴＴＧ（配列番号１８）
ｃｍ６：（ＴＴＡ）ＣＡＡＴＴＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧ（配列番号１９）
ｃｍ７：（ＴＴＡ）ＡＣＴＴＴＴＡＣＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号２０）
ｃｍ８：（ＴＴＡ）ＣＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＡＡＧＴＡＡＴＣＴＣＴＴＡ（配列番号２１）
ｃｍ９：（ＴＴＡ）ＡＧＣＡＡＴＣＡＡＧＧＴＴＧＣＴＴＡＴＧＣＣＡＴ（配列番号２２）
ｃｍ１０：（ＴＴＡ）ＴＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＧＡＡＧＧＴＡＡＡＴＣＣＣ（配列番号２３）
ｃｍ１１：（ＴＴＡ）ＣＡＴＣＣＴＣＡＡＡＴＡＣＡＡＣＣＡＴＡＡＡＣＴ（配列番号２４）
ｃｍ１２：（ＴＴＡ）ＡＴＣＴＴＴＣＴＡＡＴＧＧＣＡＴＡＴＴＡＡＣＡＴ（配列番号２５）
ｃｍ１３：（ＴＴＡ）ＡＣＡＴＴＴＡＡＴＧＡＣＴＴＴＣＣＣＣＣＡＣＡＧ（配列番号２６）
ｃｍ１４：（ＴＴＡ）ＡＴＧＡＣＴＴＴＣＣＣＣＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＡＡ（配列番号２７）
ｃｍ１５：（ＴＴＡ）ＡＴＡＣＡＡＴＧＣＡＴＴＴＴＡＧＡＡＡＧＴＣＡＴ（配列番号２８）
ｃｍ１６：（ＴＴＡ）ＡＧＴＣＣＡＴＴＴＴＡＴＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＡＴ（配列番号２９）
ｃｍ１７：（ＴＴＡ）ＴＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＣＡ（配列番号３０）
ｃｍ１８：（ＴＴＡ）ＡＡＧＴＧＡＴＴＴＧＧＣＴＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴ（配列番号３１）
ｃｍ１９：（ＴＴＡ）ＡＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＣＴＴＡＡＧＧＣＣＣＣＣＣ（配列番号３２）
ｃｍ２０：（ＴＴＡ）ＴＴＣＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡ（配列番号３３）
ｃｍ２１：（ＴＴＡ）ＣＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＣＴＡＡＡＧＧＴＡＣＡＴ（配列番号３４）
ｃｍ２２：（ＴＴＡ）ＡＡＡＡＡＣＴＡＡＡＧＧＴＡＣＡＴＡＧＴＴＴＴＴ（配列番号３５）
ｃｍ２３：（ＴＴＡ）ＴＴＡＡＴＴＧＣＴＧＡＣＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＴＡ（配列番号３６）
ｃｍ２４：（ＴＴＡ）ＡＴＴＧＣＴＧＡＣＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＴＡＴＧＴ（配列番号３７）
ｃｍ２５：（ＴＴＡ）ＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＧＡＣＣＣＣ（配列番号３８）
ｃｍ２６：（ＴＴＡ）ＴＡＡＡＡＧＴＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴＴＴＴＴＣＣＡ（配列番号３９）
ｃｍ２７：（ＴＴＡ）ＣＡＧＡＡＴＡＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＡＧＴＴＴＣＴ（配列番号４０）
ｃｍ２８：（ＴＴＡ）ＧＴＧＧＴＡＴＡＣＡＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＡ（配列番号４１）
ｃｍ２９：（ＴＴＡ）ＧＧＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＴＧＴＴＧＧＧＡＴＣＣＴ（配列番号４２）
ｃｍ３０：（ＴＴＡ）ＡＡＴＧＴＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＣＣＣＡＴ（配列番号４３）
ｃｍ３１：（ＴＴＡ）ＡＧＴＴＴＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＣ（配列番号４４）
ｃｍ３２：（ＴＴＡ）ＴＴＧＴＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＣＣＣＴＧＣＡ（配列番号４５）
ｃｍ３３：（ＴＴＡ）ＡＡＧＣＴＴＴＡＧＡＴＣＣＣＴＧＴＡＧＧＧＧＧＴ（配列番号４６）
ｃｍ３４：（ＴＴＡ）ＡＧＴＣＡＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡ（配列番号４７）
ｃｍ３５：（ＴＴＡ）ＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＡＴＧＣＣＴＴＡ（配列番号４８）
ｃｍ３６：（ＴＴＡ）ＧＣＡＴＧＣＡＣＡＴＴＡＡＡＣＡＧＧＧＧＣＡＡＴ（配列番号４９）
ｃｍ３７：（ＴＴＡ）ＡＡＣＡＧＧＧＧＣＡＡＴＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＡＴ（配列番号５０）
ｃｍ３８：（ＴＴＡ）ＧＴＧＧＣＡＣＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＴＴＣＣＴＴＧ（配列番号５１）
ｃｍ３９：（ＴＴＡ）ＧＧＣＣＡＴＴＣＣＴＴＧＣＡＡＴＡＡＡＧＧＧＴＡ（配列番号５２）
ｃｍ４０：（ＴＴＡ）ＧＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡＣＣＴＣＴ（配列番号５３）
ｃｍ４１：（ＴＴＡ）ＣＡＣＣＴＴＧＴＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＡ（配列番号５４）
ｃｍ４２：（ＴＴＡ）ＴＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＣＡＴＣ（配列番号５５）
ｃｍ４３：（ＴＴＡ）ＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＧ（配列番号５６）
ｃｍ４４：（ＴＴＡ）ＣＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＡＡＡＣＡＡＧＧＧ（配列番号５７）
ｃｍ４５：（ＴＴＡ）ＣＴＡＣＴＴＣＴＧＡＧＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧＣ（配列番号５８）
ｃｍ４６：（ＴＴＴ）ＡＣＴＴＡＡＣＡＧＴＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＧ（配列番号５９）
ｃｍ４７：（ＴＴＴ）ＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴ（配列番号６０）
ｃｍ４８：（ＴＴＴ）ＧＧＴＴＴＴＴＴＧＡＡＡＣＡＴＴＧＡＡＡＧＣＣＴ（配列番号６１）
ｃｍ４９：（ＴＴＴ）ＴＴＴＧＡＡＡＣＡＴＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡ（配列番号６２）
ｃｍ５０：（ＴＴＴ）ＣＣＴＧＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＡＧＧＣＴＴ（配列番号６３）
ｃｍ５１：（ＴＴＴ）ＣＡＴＡＧＴＡＧＡＡＡＡＴＧＴＡＴＡＣＡＴＧＣＴ（配列番号６４）
ｃｍ５２：（ＴＴＴ）ＣＴＡＡＡＴＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣＡＣＴ（配列番号６５）
ｃｍ５３：（ＴＴＴ）ＣＴＴＴＣＣＡＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＣＴＣＴＣＡＴ（配列番号６６）
ｃｍ５４：（ＴＴＴ）ＣＣＡＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＣＴＣＴＣＡＴＧＡＡＴ（配列番号６７）
ｃｍ５５：（ＴＴＴ）ＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＣＴＡＧＣＡＡＡＴ（配列番号６８）
ｃｍ５６：（ＴＴＴ）ＴＴＴＣＴＡＧＣＡＡＡＴＡＣＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣ（配列番号６９）
ｃｍ５７：（ＴＴＴ）ＣＴＡＧＣＡＡＡＴＡＣＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＴＡ（配列番号７０）
ｃｍ５８：（ＴＴＴ）ＴＣＴＣＡＧＧＴＡＧＧＣＣＴＴＴＧＧＴＣＴＡＡＡ（配列番号７１）
ｃｍ５９：（ＴＴＴ）ＧＧＴＣＴＡＡＡＡＴＣＴＡＴＣＴＧＣＣＴＴＡＣＡ（配列番号７２）
ｃｍ６０：（ＴＴＴ）ＴＧＴＴＴＴＧＧＴＧＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＡＡＡＴ（配列番号７３）
ｃｍ６１：（ＴＴＴ）ＴＣＴＣＴＣＴＡＡＡＴＴＡＡＣＴＴＴＴＡＣＡＣＴ（配列番号７４）
ｃｍ６２：（ＴＴＴ）ＴＡＣＡＴＣＣＴＣＡＡＡＴＡＣＡＡＣＣＡＴＡＡＡ（配列番号７５）
ｃｍ６３：（ＴＴＴ）ＡＡＴＣＴＴＴＣＴＡＡＴＧＧＣＡＴＡＴＴＡＡＣＡ（配列番号７６）
ｃｍ６４：（ＴＴＴ）ＣＴＡＡＴＧＧＣＡＴＡＴＴＡＡＣＡＴＴＴＡＡＴＧ（配列番号７７）
ｃｍ６５：（ＴＴＴ）ＡＡＴＧＡＣＴＴＴＣＣＣＣＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＡ（配列番号７８）
ｃｍ６６：（ＴＴＴ）ＧＣＣＡＣＴＧＴＣＴＡＴＴＧＧＣＣＣＣＴＴＧＡＡ（配列番号７９）
ｃｍ６７：（ＴＴＴ）ＴＴＴＧＧＡＡＴＧＴＴＴＡＡＴＡＣＡＡＴＧＣＡＴ（配列番号８０）
ｃｍ６８：（ＴＴＴ）ＴＴＧＧＡＡＴＧＴＴＴＡＡＴＡＣＡＡＴＧＣＡＴＴ（配列番号８１）
ｃｍ６９：（ＴＴＴ）ＴＧＧＡＡＴＧＴＴＴＡＡＴＡＣＡＡＴＧＣＡＴＴＴ（配列番号８２）
ｃｍ７０：（ＴＴＴ）ＡＡＴＡＣＡＡＴＧＣＡＴＴＴＴＡＧＡＡＡＧＴＣＡ（配列番号８３）
ｃｍ７１：（ＴＴＴ）ＴＡＧＡＡＡＧＴＣＡＴＡＡＡＴＡＡＣＡＧＴＧＴＣ（配列番号８４）
ｃｍ７２：（ＴＴＴ）ＧＡＧＧＣＡＧＣＡＡＧＣＡＡＴＧＡＡＴＣＣＡＧＧ（配列番号８５）
ｃｍ７３：（ＴＴＴ）ＴＡＴＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴ（配列番号８６）
ｃｍ７４：（ＴＴＴ）ＡＴＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＣ（配列番号８７）
ｃｍ７５：（ＴＴＴ）ＣＡＡＣＴＡＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＣＡ（配列番号８８）
ｃｍ７６：（ＴＴＴ）ＧＴＴＴＧＧＣＴＧＣＴＡＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧ（配列番号８９）
ｃｍ７７：（ＴＴＴ）ＧＧＣＴＧＣＴＡＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧ（配列番号９０）
ｃｍ７８：（ＴＴＴ）ＴＴＴＧＡＴＴＴＴＴＧＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＡ（配列番号９１）
ｃｍ７９：（ＴＴＴ）ＴＴＧＡＴＴＴＴＴＧＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＡＴ（配列番号９２）
ｃｍ８０：（ＴＴＴ）ＴＧＡＴＴＴＴＴＧＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＡＴＴ（配列番号９３）
ｃｍ８１：（ＴＴＴ）ＧＡＴＴＴＴＴＧＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＡＴＴＴ（配列番号９４）
ｃｍ８２：（ＴＴＴ）ＴＴＧＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＧＧＣＡ（配列番号９５）
ｃｍ８３：（ＴＴＴ）ＧＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＧＧＣＡＴＴ（配列番号９６）
ｃｍ８４：（ＴＴＴ）ＧＧＧＣＡＴＴＡＴＡＡＴＡＧＴＧＴＴＴＴＴＣＡＴ（配列番号９７）
ｃｍ８５：（ＴＴＴ）ＴＣＡＴＧＡＴＧＧＴＴＡＡＡＧＴＧＡＴＴＴＧＧＣ（配列番号９８）
ｃｍ８６：（ＴＴＴ）ＧＧＣＴＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＴ（配列番号９９）
ｃｍ８７：（ＴＴＴ）ＴＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴ（配列番号１００）
ｃｍ８８：（ＴＴＴ）ＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧ（配列番号１０１）
ｃｍ８９：（ＴＴＴ）ＴＴＣＡＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧ（配列番号１０２）
ｃｍ９０：（ＴＴＴ）ＴＴＣＡＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧ（配列番号１０３）
ｃｍ９１：（ＴＴＴ）ＴＣＡＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＧ（配列番号１０４）
ｃｍ９２：（ＴＴＴ）ＣＡＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴ（配列番号１０５）
ｃｍ９３：（ＴＴＴ）ＴＴＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＧ（配列番号１０６）
ｃｍ９４：（ＴＴＴ）ＴＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＧＡ（配列番号１０７）
ｃｍ９５：（ＴＴＴ）ＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡ（配列番号１０８）
ｃｍ９６：（ＴＴＴ）ＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡ（配列番号１０９）
ｃｍ９７：（ＴＴＴ）ＣＣＡＴＧＡＡＡＣＣＴＧＣＴＴＡＧＴＴＴＣＴＴＣ（配列番号１１０）
ｃｍ９８：（ＴＴＴ）ＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＴＡＡＡＧＴ（配列番号１１１）
ｃｍ９９：（ＴＴＴ）ＣＴＴＣＣＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＡＴＧＧＣＴＧＴＣ（配列番号１１２）
ｃｍ１００：（ＴＴＴ）ＡＣＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＣＴＡＡＡＧＧＴＡＣＡ（配列番号１１３）
ｃｍ１０１：（ＴＴＴ）ＴＴＧＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＴＧＣＴＧＡ（配列番号１１４）
ｃｍ１０２：（ＴＴＴ）ＴＧＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＴＧＣＴＧＡＣ（配列番号１１５）
ｃｍ１０３：（ＴＴＴ）ＧＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＴＧＣＴＧＡＣＡ（配列番号１１６）
ｃｍ１０４：（ＴＴＴ）ＴＴＣＣＡＴＡＡＧＴＴＴＣＴＴＡＴＡＴＡＡＡＡＴ（配列番号１１７）
ｃｍ１０５：（ＴＴＴ）ＴＣＣＡＴＡＡＧＴＴＴＣＴＴＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴ（配列番号１１８）
ｃｍ１０６：（ＴＴＴ）ＣＣＡＴＡＡＧＴＴＴＣＴＴＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＴ（配列番号１１９）
ｃｍ１０７：（ＴＴＴ）ＣＴＴＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＴＧＡＧＣＴＴＴＴＴＣ（配列番号１２０）
ｃｍ１０８：（ＴＴＴ）ＴＴＣＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＴＡＣＡＣＡＧＣＡＡＡ（配列番号１２１）
ｃｍ１０９：（ＴＴＴ）ＴＣＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＴＡＣＡＣＡＧＣＡＡＡＡ（配列番号１２２）
ｃｍ１１０：（ＴＴＴ）ＣＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＴＡＣＡＣＡＧＣＡＡＡＡＧ（配列番号１２３）
ｃｍ１１１：（ＴＴＴ）ＡＧＴＧＧＴＡＴＡＣＡＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣ（配列番号１２４）
ｃｍ１１２：（ＴＴＴ）ＡＧＧＧＴＣＴＴＣＴＡＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴ（配列番号１２５）
ｃｍ１１３：（ＴＴＴ）ＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＡＧＧＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧ（配列番号１２６）
ｃｍ１１４：（ＴＴＴ）ＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＡＧＧＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＴ（配列番号１２７）
ｃｍ１１５：（ＴＴＴ）ＴＴＴＣＴＴＴＴＴＡＧＧＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＴＧ（配列番号１２８）
ｃｍ１１６：（ＴＴＴ）ＴＴＣＴＴＴＴＴＡＧＧＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＴＧＴ（配列番号１２９）
ｃｍ１１７：（ＴＴＴ）ＴＣＴＴＴＴＴＡＧＧＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＴＧＴＴ（配列番号１３０）
ｃｍ１１８：（ＴＴＴ）ＣＴＴＴＴＴＡＧＧＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＴＧＴＴＧ（配列番号１３１）
ｃｍ１１９：（ＴＴＴ）ＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＡＡＡＣＡＴＴＴＣＴ（配列番号１３２）
ｃｍ１２０：（ＴＴＴ）ＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＡＡＡＣＡＴＴＴＣＴＴ（配列番号１３３）
ｃｍ１２１：（ＴＴＴ）ＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＣＣＣＴＧＣ（配列番号１３４）
ｃｍ１２２：（ＴＴＴ）ＡＧＡＴＣＣＣＴＧＴＡＧＧＧＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡ（配列番号１３５）
ｃｍ１２３：（ＴＴＴ）ＣＴＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣＴＴＧ（配列番号１３６）
ｃｍ１２４：（ＴＴＴ）ＴＣＴＧＴＴＴＣＴＡＴＧＣＣＴＴＡＡＴＴＴＴＡＧ（配列番号１３７）
ｃｍ１２５：（ＴＴＴ）ＴＡＧＣＡＴＧＣＡＣＡＴＴＡＡＡＣＡＧＧＧＧＣＡ（配列番号１３８）
ｃｍ１２６：（ＴＴＴ）ＴＡＣＡＣＣＴＴＧＴＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡ（配列番号１３９）
ｃｍ１２７：（ＴＴＴ）ＡＣＡＣＣＴＴＧＴＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴ（配列番号１４０）
ｃｍ１２８：（ＴＴＴ）ＴＴＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴ（配列番号１４１）
ｃｍ１２９：（ＴＴＴ）ＧＣＡＴＴＴＴＴＴＣＡＧＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＣＴ（配列番号１４２）
ｃｍ１３０：（ＴＴＴ）ＴＴＴＣＡＧＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＣＴＣＡＴＧＡＣ（配列番号１４３）
ｃｍ１３１：（ＴＴＴ）ＴＴＣＡＧＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＣＴＣＡＴＧＡＣＡ（配列番号１４４）
ｃｍ１３２：（ＴＴＴ）ＴＣＡＧＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＣＴＣＡＴＧＡＣＡＧ（配列番号１４５）
ｃｍ１３３：（ＴＴＴ）ＣＡＧＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＣＴＣＡＴＧＡＣＡＧＧ（配列番号１４６）
ｃｍ１３４：（ＴＴＴ）ＴＣＴＣＡＴＧＡＣＡＧＧＡＡＴＧＴＴＣＣＣＣＣＡ（配列番号１４７）
ｃｍ１３５：（ＴＴＴ）ＧＴＣＣＡＴＴＴＴＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＧＣＡＡ（配列番号１４８）
ｃｍ１３６：（ＴＴＴ）ＴＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣ（配列番号１４９）
ｃｍ１３７：（ＴＴＴ）ＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴ（配列番号１５０）
ｃｍ１３８：（ＴＴＴ）ＴＧＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＧＣＡＡＡＡＡ（配列番号１５１）
ｃｍ１３９：（ＴＴＴ）ＧＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＧＣＡＡＡＡＡＡ（配列番号１５２）
ｃｍ１４０：（ＴＴＴ）ＣＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＧＣＣＴＣＣＡ（配列番号１５３）
ｃｍ１４１：（ＴＴＣ）ＣＴＧＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣ（配列番号１５４）
ｃｍ１４２：（ＴＴＣ）ＴＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＴＧＡ（配列番号１５５）
ｃｍ１４３：（ＴＴＣ）ＴＧＣＴＴＣＡＧＡＡＴＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴＡＧＧ（配列番号１５６）
ｃｍ１４４：（ＴＴＣ）ＡＧＡＡＴＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴＡＧＧＡＡＡＧＴＣ（配列番号１５７）
ｃｍ１４５：（ＴＴＣ）ＣＴＣＴＣＴＡＧＧＡＡＡＧＴＣＡＡＧＡＡＴＧＧＧ（配列番号１５８）
ｃｍ１４６：（ＴＴＣ）ＴＴＴＣＣＡＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＣＴＣＴＣＡＴＧ（配列番号１５９）
ｃｍ１４７：（ＴＴＣ）ＴＡＧＣＡＡＡＴＡＣＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＴＡＧ（配列番号１６０）
ｃｍ１４８：（ＴＴＣ）ＴＣＡＧＧＴＡＧＧＣＣＴＴＴＧＧＴＣＴＡＡＡＡＴ（配列番号１６１）
ｃｍ１４９：（ＴＴＣ）ＴＡＧＧＣＡＣＴＧＡＡＴＡＴＴＣＡＴＴＣＡＴＧＧ（配列番号１６２）
ｃｍ１５０：（ＴＴＣ）ＡＴＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＴＴＣＣＡＧＧＴＧＧ（配列番号１６３）
ｃｍ１５１：（ＴＴＣ）ＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＴＴＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣ（配列番号１６４）
ｃｍ１５２：（ＴＴＣ）ＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＴＴＣＴＴＴ（配列番号１６５）
ｃｍ１５３：（ＴＴＣ）ＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＴＧＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＡ（配列番号１６６
ｃｍ１５４：（ＴＴＣ）ＴＣＴＣＴＡＡＡＴＴＡＡＣＴＴＴＴＡＣＡＣＴＴＣ（配列番号１６７）
ｃｍ１５５：（ＴＴＣ）ＣＡＴＣＴＡＡＧＴＡＡＴＣＴＣＴＴＡＡＧＣＡＡＴ（配列番号１６８）
ｃｍ１５６：（ＴＴＣ）ＡＡＡＧＴＴＴＡＡＴＣＴＴＴＣＴＡＡＴＧＧＣＡＴ（配列番号１６９）
ｃｍ１５７：（ＴＴＣ）ＡＡＡＧＴＴＴＡＡＴＣＴＴＴＣＴＡＡＴＧＧＣＡＴ（配列番号１７０）
ｃｍ１５８：（ＴＴＣ）ＴＡＡＴＧＧＣＡＴＡＴＴＡＡＣＡＴＴＴＡＡＴＧＡ（配列番号１７１）
ｃｍ１５９：（ＴＴＣ）ＣＣＣＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＡＡＧＴＡＡＡＧＣＴＧ（配列番号１７２）
ｃｍ１６０：（ＴＴＣ）ＡＡＣＴＡＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＣＡＴ（配列番号１７３）
ｃｍ１６１：（ＴＴＣ）ＴＣＴＧＧＴＣＡＴＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＴＣＡＡＣ（配列番号１７４）
ｃｍ１６２：（ＴＴＣ）ＡＴＧＡＴＧＧＴＴＡＡＡＧＴＧＡＴＴＴＧＧＣＴＧ（配列番号１７５）
ｃｍ１６３：（ＴＴＣ）ＣＴＧＡＡＡＧＴＣＴＡＡＧＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＴ（配列番号１７６）
ｃｍ１６４：（ＴＴＣ）ＣＡＴＧＡＡＡＣＣＴＧＣＴＴＡＧＴＴＴＣＴＴＣＴ（配列番号１７７）
ｃｍ１６５：（ＴＴＣ）ＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＴＡＡＡＧＴＣ（配列番号１７８）
ｃｍ１６６：（ＴＴＣ）ＴＧＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＴＡＡＡＧＴＣＡＴＧ（配列番号１７９）
ｃｍ１６７：（ＴＴＣ）ＴＴＣＴＧＧＧＴＴＡＡＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＣＴＴ（配列番号１８０）
ｃｍ１６８：（ＴＴＣ）ＴＧＧＧＴＴＡＡＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＣＴＴＡＡ（配列番号１８１）
ｃｍ１６９：（ＴＴＣ）ＣＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＡＴＧＧＣＴＧＴＣＴＡＣＡ（配列番号１８２）
ｃｍ１７０：（ＴＴＣ）ＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＣＴＡ（配列番号１８３）
ｃｍ１７１：（ＴＴＣ）ＣＡＴＡＡＧＴＴＴＣＴＴＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＴＧ（配列番号１８４）
ｃｍ１７２：（ＴＴＣ）ＴＴＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＴＧＡＧＣＴＴＴＴＴＣＴ（配列番号１８５）
ｃｍ１７３：（ＴＴＣ）ＴＡＴＴＡＣＴＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＴＧＡＣＴＧＡ（配列番号１８６）
ｃｍ１７４：（ＴＴＣ）ＴＡＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＡＧＧＴＧＧ（配列番号１８７）
ｃｍ１７５：（ＴＴＣ）ＴＴＴＴＴＡＧＧＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＴＧＴＴＧＧ（配列番号１８８）
ｃｍ１７６：（ＴＴＣ）ＴＴＴＴＴＡＧＧＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＴＧＴＴＧＧ（配列番号１８９）
ｃｍ１７７：（ＴＴＣ）ＡＴＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＡＡＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣ（配列番号１９０）
ｃｍ１７８：（ＴＴＣ）ＡＴＣＣＣＡＣＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＡＴＧＴＡＴＴ（配列番号１９１）
ｃｍ１７９：（ＴＴＣ）ＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＣＣＣＡＴＴＣＡＴＣＴＧＴＴ（配列番号１９２）
ｃｍ１８０：（ＴＴＣ）ＣＡＴＴＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＡＴＡＧＧＴＴＧＧ（配列番号１９３）
ｃｍ１８１：（ＴＴＣ）ＡＴＣＴＧＴＴＣＣＡＴＡＧＧＴＴＧＧＣＡＣＣＴＡ（配列番号１９４）
ｃｍ１８２：（ＴＴＣ）ＣＡＴＡＧＧＴＴＧＧＣＡＣＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１９５）
ｃｍ１８３：（ＴＴＣ）ＴＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣＴＴＧＧ（配列番号１９６）
ｃｍ１８４：（ＴＴＣ）ＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＡＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＡ（配列番号１９７）
ｃｍ１８５：（ＴＴＣ）ＴＴＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＡＴＧＣＣ（配列番号１９８）
ｃｍ１８６：（ＴＴＣ）ＴＧＴＴＴＣＴＡＴＧＣＣＴＴＡＡＴＴＴＴＡＧＣＡ（配列番号１９９）
ｃｍ１８７：（ＴＴＣ）ＣＴＴＧＣＡＡＴＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＡＧＡＡＴＴ（配列番号２００）
ｃｍ１８８：（ＴＴＣ）ＣＡＴＧＴＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＴＧＡ（配列番号２０１）
ｃｍ１８９：（ＴＴＣ）ＣＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴＣＡＴ（配列番号２０２）
ｃｍ１９０：（ＴＴＣ）ＡＴＴＣＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＧＴＣＴＴＣＧＴＣＣ（配列番号２０３）
ｃｍ１９１：（ＴＴＣ）ＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＧＴＣＴＴＣＧＴＣＣＣＣＡＣ（配列番号２０４）
ｃｍ１９２：（ＴＴＣ）ＡＴＣＴＴＧＴＣＴＴＣＧＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＴＡ（配列番号２０５）
ｃｍ１９３：（ＴＴＣ）ＧＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧ（配列番号２０６）
ｃｍ１９４：（ＴＴＣ）ＴＴＴＧＣＡＴＴＴＴＴＴＣＡＧＡＴＡＡＧＣＴＴＴ（配列番号２０７）
ｃｍ１９５：（ＴＴＣ）ＡＧＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＣＴＣＡＴＧＡＣＡＧＧＡ（配列番号２０８）
ｃｍ１９６：（ＴＴＣ）ＴＣＡＴＧＡＣＡＧＧＡＡＴＧＴＴＣＣＣＣＣＡＴＧ（配列番号２０９）
ｃｍ１９７：（ＴＴＣ）ＣＣＣＣＡＴＧＣＡＧＡＣＣＴＡＴＣＡＡＧＧＣＣＴ（配列番号２１０）
ｃｍ１９８：（ＴＴＣ）ＣＴＣＣＣＴＡＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＴＣＣＡＴ（配列番号２１１）
ｃｍ１９９：（ＴＴＣ）ＡＧＣＡＣＴＴＴＧＴＣＣＡＴＴＴＴＡＧＣＴＴＴＴ（配列番号２１２）
ｃｍ２００：（ＴＴＣ）ＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＧＣＣＴＣＣＡＣ（配列番号２１３）
ｃｍ２０１：（ＴＴＣ）ＴＧＡＧＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧ（配列番号２１４）
ｃｍ２０２：（ＴＴＧ）ＣＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴ（配列番号２１５）
ｃｍ２０３：（ＴＴＧ）ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＡ（配列番号２１６）
ｃｍ２０４：（ＴＴＧ）ＧＴＴＴＴＴＴＧＡＡＡＣＡＴＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴ（配列番号２１７）
ｃｍ２０５：（ＴＴＧ）ＡＡＡＣＡＴＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧ（配列番号２１８）
ｃｍ２０６：（ＴＴＧ）ＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＴＧＡＡＡＡＧＴ（配列番号２１９）
ｃｍ２０７：（ＴＴＧ）ＴＧＡＴＴＧＴＧＡＴＴＣＡＧＴＧＣＴＴＧＡＴＣＣ（配列番号２２０）
ｃｍ２０８：（ＴＴＧ）ＴＧＡＴＴＣＡＧＴＧＣＴＴＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＣ（配列番号２２１）
ｃｍ２０９：（ＴＴＧ）ＡＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡＧＡＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴ（配列番号２２２）
ｃｍ２１０：（ＴＴＧ）ＣＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＣＴＡＧＣＡＡＡＴＡ（配列番号２２３）
ｃｍ２１１：（ＴＴＧ）ＧＴＧＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＡＡＡＴＴＡＡＣＴＴＴ（配列番号２２４）
ｃｍ２１２：（ＴＴＧ）ＣＣＡＣＴＧＴＣＴＡＴＴＧＧＣＣＣＣＴＴＧＡＡＴ（配列番号２２５）
ｃｍ２１３：（ＴＴＧ）ＧＣＣＣＣＴＴＧＡＡＴＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＴＴ（配列番号２２６）
ｃｍ２１４：（ＴＴＧ）ＡＡＴＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡ（配列番号２２７）
ｃｍ２１５：（ＴＴＧ）ＧＡＡＴＧＴＴＴＡＡＴＡＣＡＡＴＧＣＡＴＴＴＴＡ（配列番号２２８）
ｃｍ２１６：（ＴＴＧ）ＡＧＧＣＡＧＣＡＡＧＣＡＡＴＧＡＡＴＣＣＡＧＧＣ（配列番号２２９）
ｃｍ２１７：（ＴＴＧ）ＣＣＡＴＧＴＧＣＣＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡＡＧＴＣＣ（配列番号２３０）
ｃｍ２１８：（ＴＴＧ）ＴＴＴＧＧＣＴＧＣＴＡＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣ（配列番号２３１）
ｃｍ２１９：（ＴＴＧ）ＧＣＴＧＣＴＡＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣ（配列番号２３２）
ｃｍ２２０：（ＴＴＧ）ＡＴＴＴＴＴＧＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧ（配列番号２３３）
ｃｍ２２１：（ＴＴＧ）ＣＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＧＧＣＡＴＴＡ（配列番号２３４）
ｃｍ２２２：（ＴＴＧ）ＧＧＣＡＴＴＡＴＡＡＴＡＧＴＧＴＴＴＴＴＣＡＴＧ（配列番号２３５）
ｃｍ２２３：（ＴＴＧ）ＧＣＴＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＴＴ（配列番号２３６）
ｃｍ２２４：（ＴＴＧ）ＣＴＧＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡＡＧＴＣＴＡＡ（配列番号２３７）
ｃｍ２２５：（ＴＴＧ）ＧＴＴＴＣＣＡＡＧＧＣＡＴＡＣＴＧＴＧＴＡＡＣＴ（配列番号２３８）
ｃｍ２２６：（ＴＴＧ）ＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＴＧＣＴＧＡＣＡＣ（配列番号２３９）
ｃｍ２２７：（ＴＴＧ）ＣＴＧＡＣＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＴＡＴＧＴＧＧＴＧ（配列番号２４０）
ｃｍ２２８：（ＴＴＧ）ＡＣＴＧＡＧＧＡＡＴＧＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＣ（配列番号２４１）
ｃｍ２２９：（ＴＴＧ）ＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＴＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴ（配列番号２４２）
ｃｍ２３０：（ＴＴＧ）ＧＧＴＴＡＡＧＴＣＡＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＡＴＴＧ（配列番号２４３）
ｃｍ２３１：（ＴＴＧ）ＴＣＴＧＡＡＧＣＡＡＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡ（配列番号２４４）
ｃｍ２３２：（ＴＴＧ）ＣＡＡＴＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＡＧＡＡＴＴＡＧＧＡ（配列番号２４５）
ｃｍ２３３：（ＴＴＧ）ＴＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴ（配列番号２４６）
ｃｍ２３４：（ＴＴＧ）ＴＣＴＴＣＧＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧ（配列番号２４７）
ｃｍ２３５：（ＴＴＧ）ＣＡＴＴＴＴＴＴＣＡＧＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＣＴＣ（配列番号２４８）
ｃｍ２３６：（ＴＴＧ）ＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号２４９）
【０１００】
本発明は例示的な仕方で説明されており、使用されている用語は、制限ではなく説明の性質を持つことが意図されていることが理解されねばならない。以上の教示に照らして、本発明の多数の変更および変化が可能であることが明らかである。したがって本発明は、添付の特許請求の範囲内で、特に記載されているのとは異なるやり方で実施されうることが理解されねばならない。
【０１０１】
参考文献：
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Ｂｈａｙａ  Ｄ，  Ｄａｖｉｓｏｎ  Ｍ，  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ  Ｒ．  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ａｒｃｈａｅａ：  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡｓ  ｆｏｒ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．  ２０１１；  ４５：  ２７３−２９７．
Ｃｈａｌｋｌｅｙ  ＪＪ，  Ｂｅｒｇｅｒ  ＪＲ．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ２０１３；  １３：  ４０８．
Ｃｈａｐａｇａｉｎ  ＭＬ，  Ｓｕｍｉｂｃａｙ  Ｌ，  Ｇｕｒｊａｖ  Ｕ，  Ｋａｕｆｕｓｉ  ＰＨ，  Ｋａｓｔ  ＲＥ，  Ｎｅｒｕｒｋａｒ  ＶＲ．  Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２Ａ  ｂｌｏｃｋｅｒ  （ｒｉｓｐｅｒｉｄｏｎｅ）  ｈａｓ  ｎｏ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＪＣ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．  ２００８；  １４：  ４４８−４５４．
Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  ＤＢ，  Ａｎｃｅｓ  Ｂ，  Ｃｏｓｔｅｌｌｏ  Ｃ，  Ｒｏｓｅｎ−Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｓ，  Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｍ，  Ｐａｒｋｓ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．  Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２０１１；  ６８：  １１５６−１１６４．
ＤｅＣａｐｒｉｏ  ＪＡ，  Ｉｍｐｅｒｉａｌｅ  ＭＪ，  Ｍａｊｏｒ  ＥＯ．  Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｉｎ：  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ  ａｎｄ  Ｈｏｗｌｅｙ  ＰＭ  （Ｅｄｓ）．  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；  ２０１３．  ｐｐ．  １６３３−１６６１．
Ｄｉｎｇ  Ｑ，  Ｓｔｒｏｎｇ  Ａ，  Ｐａｔｅｌ  ＫＡ，  Ｎｇ  ＳＬ，  Ｇｏｓｉｓ  ＢＳ，  Ｒｅｇａｎ  ＳＮ，  Ｃｏｗａｎ  ＣＡ，  Ｒａｄｅｒ  ＤＪ，  Ｍｕｓｕｎｕｒｕ  Ｋ．    Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＳＫ９  ｗｉｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．    Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ２０１４，  １１５：４８８−４９２．
Ｄｏｙｌｅ  ＥＬ，  Ｂｏｏｈｅｒ  Ｎ．，  Ｓｔａｎｄａｇｅ  ＤＳ，  Ｖｏｙｔａｓ  ＤＦ，  Ｂｒｅｎｄｅｌ  ＶＰ，  ＶａｎＤｙｋ，  ＪＫ，  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ＡＪ．  （２０１２）  ＴＡＬ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔａｒｇｅｔｅｒ  （ＴＡＬＥ−ＮＴ）  ２．０：  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ｄｏｉ：  １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｓ６０８．
Ｅｌｐｈｉｃｋ  ＧＦ，  Ｑｕｅｒｂｅｓ  Ｗ，  Ｊｏｒｄａｎ  ＪＡ，  Ｇｅｅ  ＧＶ，  Ｅａｓｈ  Ｓ，  Ｍａｎｌｅｙ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ，  ＪＣＶ，  ｕｓｅｓ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４；  ３０６：  １３８０−１３８３．
Ｆｒｉｓｑｕｅ  ＲＪ，  Ｂｒｅａｍ  ＧＬ，  Ｃａｎｎｅｌｌａ  ＭＴ．  Ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  １９８４；  ５１：  ４５８−４６９．
Ｇａｊ  Ｔ，  Ｇｅｒｓｂａｃｈ  ＣＡ，  Ｂａｒｂａｓ  ＣＦ  ３ｒｄ．  ＺＦＮ，  ＴＡＬＥＮ，  ａｎｄ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１３；  ３１：  ３９７−４０５．
Ｈｏｕ  Ｊ，  Ｍａｊｏｒ  ＥＯ．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｂｒａｉｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．  １９９８；  ４：  ４５１−４５６．
Ｈｓｕ  ＰＤ，  Ｌａｎｄｅｒ  ＥＳ，  Ｚｈａｎｇ  Ｆ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  Ｃｅｌｌ  ２０１４，  １５７：  １２６２−１２７８．
Ｈｕ  Ｗ，  Ｋａｍｉｎｓｋｉ  Ｒ，  Ｙａｎｇ  Ｆ，  Ｚｈａｎｇ  Ｙ，  Ｃｏｓｅｎｔｉｎｏ  Ｌ，  Ｌｉ  Ｆ，  ｅｔ  ａｌ．  ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｅｒａｄｉｃａｔｅｓ  ｌａｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｎｅｗ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１４；  １１１：  １１４６１−１１４６６．
Ｋｈａｌｉｌｉ  Ｋ，  Ｗｈｉｔｅ  ＭＫ，  Ｓａｗａ  Ｈ，  Ｎａｇａｓｈｉｍａ  Ｋ，  Ｓａｆａｋ  Ｍ．  Ｔｈｅ  ａｇｎｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ：  ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｕｘｉｌｉａｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００５；  ２０４：  １−７．
Ｋｏｏｉｊｍａｎｓ  ＳＡＡ，  Ｖａｄｅｒ  Ｐ，  Ｄｏｍｍｅｌｅｎ  ＳＭ，  ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅ  ＷＷ，  Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｍ  Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ  ＲＭ．    Ｅｘｏｓｏｍｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ．    Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｎａｎｏｍｅｄ．  ２０１２，  ７：  １５２５−１５４１．
Ｌａｎｄｅｒ  ＥＳ，  Ｚｈａｎｇ  Ｆ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  Ｃｅｌｌ  ２０１４，  １５７：  １２６２−１２７８．
Ｌｅｅ  ＨＫ，  Ｆｉｎｎｉｓｓ  Ｓ，  Ｃａｚａｃｕ  Ｓ，  Ｂｕｃｒｉｓ  Ｅ，  Ｚｉｖ−Ａｖ  Ａ，  Ｘｉａｎｇ  Ｃ，  Ｂｏｂｂｉｔｔ  Ｋ，  Ｒｅｍｐｅｌ  ＳＡ，  Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈ  Ｌ，  Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ  Ｔ，  Ｓｌａｖｉｎ  Ｓ，  Ｂｒｏｄｉｅ  Ｃ．  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｌｉｖｅｒ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｍｉｍｉｃｓ  ｔｏ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｇｌｉｏｍａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅｉｒ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ．  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．  ２０１３，  ４：３４６−６１．
Ｌｅｅ  Ｙ，  Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ＳＥ，  Ｗｏｏｄ  ＭＪＡ．    Ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ：  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．    Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１２，  ｄｏｉ：１０，１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｓ３１７．
Ｍａｌｉ  Ｐ，  Ｅｓｖｅｌｔ  ＫＭ，  Ｃｈｕｒｃｈ  ＧＭ．  Ｃａｓ９  ａｓ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３；  １０：９５７−９６３．
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Ｍｉｌｌｅｒ  ＪＣ，  Ｔａｎ  Ｓ，  Ｑｉａｏ  Ｇ，  Ｂａｒｌｏｗ  Ｋ，  Ｗａｎｇ  Ｊ，  Ｘｉａ  ＤＦ，  Ｍｅｎｇ  Ｘ，  Ｐａｓｃｈｏｎ  ＤＥ，  Ｌｅｕｎｇ  Ｅ，  Ｈｉｎｋｌｅｙ  ＳＪ，  Ｄｕｌａｙ  ＧＰ，  Ｈｕａ  ＫＬ，  Ａｎｋｏｕｄｉｎｏｖａ  Ｉ，  Ｃｏｓｔ  ＧＪ，  Ｕｒｎｏｖ  ＦＤ，  Ｚｈａｎｇ  ＨＳ，  Ｈｏｌｍｅｓ  ＭＣ，  Ｚｈａｎｇ  Ｌ，  Ｇｒｅｇｏｒｙ  ＰＤ，  Ｒｅｂａｒ  ＥＪ．    Ａ  ＴＡＬＥ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．    Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１１：  ２９：  １４３  −１５０．
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Ｓａｎ  Ｓｅｂａｓｔｉａｎ  Ｗ，  Ｓａｍａｒａｎｃｈ  Ｌ，  Ｋｅｌｌｓ  ＡＰ，  Ｆｏｒｓａｙｅｔｈ，  Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚ  ＫＳ．    Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．    Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （２０１３）  １０：４９８−５１０．
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Ｓａｒｉｂａｓ  ＡＳ，  Ｏｚｄｅｍｉｒ  Ａ，  Ｌａｍ  Ｃ，  Ｓａｆａｋ  Ｍ．    ＪＣ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ．    Ｆｕｔｕｒｅ  Ｖｉｒｏｌ  ２０１０，  ７：  ３１３−３２３．
Ｓｃｈｗａｂ  Ｎ，  Ｕｌｚｈｅｉｍｅｒ  ＪＣ，  Ｆｏｘ  ＲＪ，  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−Ｈｏｈｅｎｄｏｒｆ  Ｔ，  Ｋｉｅｓｅｉｅｒ  ＢＣ，  Ｍｏｎｏｒａｎｕ  ＣＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｆａｔａｌ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｌｅｕｋｏｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａＬｂ２  ｉｎ  ＪＣ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２０１２；  ７８：  ４５８−４６７．
Ｓｈｔａｍ  ＴＡ，  Ｋｏｖａｌｅｖ  ＲＡ，  Ｖａｒｆｏｌｏｍｅｅｖａ  ＥＹ，  Ｍａｋａｒｏｖ  ＥＭ，  Ｋｉｌ  ＹＶ，  Ｆｉｌａｔｏｖ  ＭＶ．    Ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ａｒｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｓｉＲＮＡ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．    Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ２０１３，  １１：８８  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｓｉｇｎａｌｉｎｇ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１１／１／８８）．
Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  ＩＭ，  Ｇａｏ  Ｌ，  Ｚｅｔｓｃｈｅ  Ｂ，  Ｓｃｏｔｔ  ＤＡ，  Ｙａｎ  ＷＸ，  Ｆｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ  Ｆ．    Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１５  ［ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５２２７］
Ｓｕｎ  Ｗ，  Ｊｉａｎｇ  Ｔ，  Ｙｕｅ  Ｌｕ  Ｙ，  Ｒｅｉｆｆ  Ｍ，  Ｍｏ  Ｒ，  Ｚｈｅｎ  Ｇｕ  Ｚ．    Ｃｏｃｏｏｎ−ｌｉｋｅ  ｓｅｌｆ−ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｎａｎｏｃｌｅｗ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．    Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２０１４，  １３６：１４７２２−１４７２５．
Ｓｕｎ  Ｗ，  Ｊｉ  Ｗ，  Ｈａｌｌ  ＪＭ，  Ｈｕ  Ｑ，  Ｗａｎｇ  Ｃ，  Ｂｅｉｓｅｌ  ＣＬ，  Ｇｕ  Ｚ．    Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ＤＮＡ  ｎａｎｏｃｌｅｗｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．    Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２０１５：  １２０２９−１２０３３．
Ｔａｖａｚｚｉ  Ｅ，  Ｗｈｉｔｅ  ＭＫ，  Ｋｈａｌｉｌｉ  Ｋ．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｐｅｃｔｓ．  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．  ２０１２；  ２２：２．
Ｕｒｎｏｖ  ＦＤ，  Ｒｅｂａｒ  ＥＪ，  Ｈｏｌｍｅｓ  ＭＣ，  Ｚｈａｎｇ  ＨＳ，  Ｇｒｅｇｏｒｙ  ＰＤ：  Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１０，  １１（９）：６３６−６４６．
Ｗａｇｇｏｎｅｒ  Ｊ，  Ｍａｒｔｉｎｕ  Ｔ，  ＭＤ，  Ｐａｌｍｅｒ，  ＳＭ．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｈｅｉｇｈｔｅｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｌｕｎｇ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ：  Ａ  ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ．    Ｊ．  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２００９，  ２８：  ３９５−３９８．
Ｗｈｉｔｅ  ＭＫ，  Ｋｈａｌｉｌｉ  Ｋ．  Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ：  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００４；  ３２４：  １−１６．
Ｗｈｉｔｅ  ＭＫ，  Ｋｈａｌｉｌｉ  Ｋ．  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ−ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ２０１１；  ２０３：  ５７８−５８６．
Ｗｏｌｌｅｂｏ  ＨＳ，  Ｂｅｌｌｉｚｚｉ  Ａ，  Ｋａｍｉｎｓｋｉ  Ｒ，  Ｈｕ  Ｗ，  Ｗｈｉｔｅ  ＭＫ，  Ｋｈａｌｉｌｉ  Ｋ．    ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ  ａｓ  ａｎ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ＪＣ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．    ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２０１５，  １０（９）：  ｅ０１３６０４６．  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１３６０４６．
Ｚｅｔｓｃｈｅ  Ｂ，  Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ  ＪＳ．，  Ａｂｕｄａｙｙｅｈ  ＯＯ，  Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  ＩＭ，  Ｍａｋａｒｏｖａ  ＫＳ，  Ｅｓｓｌｅｔｚｂｉｃｈｌｅｒ  Ｐ，  Ｖｏｌｚ  ＳＥ，  Ｊｏｕｎｇ  Ｊ，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｏｏｓｔ  Ｊ，  Ｒｅｇｅｖ  Ａ，  Ｋｏｏｎｉｎ  ＥＶ，  Ｚｈａｎｇ  Ｆ，  Ｃｐｆ１  Ｉｓ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍ．  Ｃｅｌｌ  １６３，  １−１３  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２２，  ２０１５．
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2019508364.tif 000005
2019508364.tif 000006
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