(57)【要約】  本開示は、ＤＮＡ中のアデノシンを脱アミノ化することが可能であるアデノシンデアミナーゼを提供する。本開示はまた、Ｃａｓ９（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）ドメインおよびＤＮＡ中のアデノシンを脱アミノ化するアデノシンデアミナーゼを含む融合蛋白質をも提供する。いくつかの態様において、融合蛋白質は、核局在配列（ＮＬＳ）、および／またはヌクレアーゼ不活性型イノシン特異的ヌクレアーゼ（ｄＩＳＮ）などの塩基修復の阻害剤をさらに含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）におけるデオキシアデノシンのアデニンを脱アミノ化することが可能なアデノシンデアミナーゼ。
【請求項２】
アデノシンデアミナーゼが、細菌からのものである、請求項１に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項３】
アデノシンデアミナーゼが、E. coli細菌またはS. aureus細菌からのものである、請求項１または２に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項４】
アデノシンデアミナーゼが、ＴａｄＡデアミナーゼである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項５】
ＴａｄＡデアミナーゼが、E. coli ＴａｄＡデアミナーゼ（ｅｃＴａｄＡ）である、請求項４に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項６】
アデノシンデアミナーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項７】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＤ１０８Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＤ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項８】
ＸがＧ、Ｎ、Ｖ、Ａ、またはＹである、請求項７に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項９】
ＸがＮである、請求項７に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１０】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＡ１０６Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＡ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１１】
Ｘが、Ｖ、Ｉ、またはＬである、請求項１０に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１２】
ＸがＶである、請求項１０に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１３】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＥ１５５Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＥ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１４】
Ｘが、Ｄ、Ｇ、またはＶである、請求項１３に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１５】
ＸがＶである、請求項１３に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１６】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＤ１４７Ｘ変異、または別のアデニンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＤ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１７】
ＸがＹ、またはＦである、請求項１６に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１８】
ＸがＹである、請求項１６に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１９】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＳ２Ａ、Ｈ８Ｙ、Ｉ４９Ｆ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｒ、Ｈ１２３Ｙ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６Ｆ、およびＫ１６０Ｓ変異からなる群から選択される１以上の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１以上の対応する変異を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項２０】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＬ８４Ｆ変異、または別のアデニンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項２１】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＨ１２３Ｙ変異、または別のアデニンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項２２】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＨ１５６Ｆ変異、または別のアデニンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項２３】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＥ２５Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＥ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項２４】
Ｘが、Ｍ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｖ、Ｓ、またはＹである、請求項２３に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項２５】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＲ２６Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＲ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項２６】
Ｘが、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｌ、またはＫである、請求項２５に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項２７】
ＸがＧである、請求項２５または２６に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項２８】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＲ１０７Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＲ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項２９】
Ｘが、Ｐ、Ｋ、Ａ、Ｎ、Ｗ、Ｈ、またはＳである、請求項２８に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項３０】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＡ１４２変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＡ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項３１】
Ｘが、Ｎ、Ｄ、またはＧである、請求項３０に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項３２】
ＸがＮである、請求項３０または３１に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項３３】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＡ１４３変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＡ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項３４】
Ｘが、Ｄ、Ｇ、Ｅ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ｓ、Ｑ、またはＲである、請求項３３に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項３５】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＨ３６Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＨ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項３６】
ＸがＬである、請求項３５に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項３７】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＮ３７Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＮ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項３８】
Ｘが、ＴまたはＳである、請求項３７に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項３９】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＰ４８Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＰ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項４０】
Ｘが、ＴまたはＬである、請求項３９に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項４１】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＲ５１Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＲ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜４０のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項４２】
Ｘが、ＨまたはＬである、請求項４１に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項４３】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＳ１４６Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＳ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項４４】
Ｘが、ＲまたはＣである、請求項４３に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項４５】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＬ１５７Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＬ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜４４のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項４６】
ＸがＮである、請求項４５に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項４７】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＡ１０６ＶおよびＤ１０８Ｎ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項４８】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＲ１０７ＣおよびＤ１０８Ｎ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項４９】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｓ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、およびＱ１５４Ｈ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項５０】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＨ８Ｙ、Ｒ２４Ｗ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項５１】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＤ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項５２】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｓ１２７Ｓ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項５３】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、およびＱ１５４Ｈ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項５４】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＨ８Ｙ、Ｒ２４Ｗ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項５５】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＡ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項５６】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＤ１０８Ｑ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項５７】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＤ１０８Ｍ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項５８】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＤ１０８Ｌ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項５９】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＤ１０８Ｋ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項６０】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＤ１０８Ｉ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項６１】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＤ１０８Ｆ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項６２】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＡ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、およびＤ１４７Ｙ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項６３】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＡ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｍ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項６４】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＥ５９Ａ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項６５】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＥ５９Ａ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項６６】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＬ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６Ｙ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項６７】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＲ２６Ｇ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｒ１０７Ｈ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ａ１４２Ｎ、Ａ１４３Ｄ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、およびＩ１５６Ｆ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項６８】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＥ２５Ｇ、Ｒ２６Ｇ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｒ１０７Ｈ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ａ１４２Ｎ、Ａ１４３Ｄ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、およびＩ１５６Ｆ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項６９】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＲ２６Ｑ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ａ１４２Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、およびＩ１５６Ｆ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項７０】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＥ２５Ｍ、Ｒ２６Ｇ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｒ１０７Ｐ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ａ１４２Ｎ、Ａ１４３Ｄ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、およびＩ１５６Ｆ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項７１】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＲ２６Ｃ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｒ１０７Ｈ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ａ１４２Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、およびＩ１５６Ｆ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項７２】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＬ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ａ１４２Ｎ、Ａ１４３Ｌ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、およびＩ１５６Ｆ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項７３】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＲ２６Ｇ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ａ１４２Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、およびＩ１５６Ｆ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項７４】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＥ２５Ａ、Ｒ２６Ｇ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｒ１０７Ｎ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ａ１４２Ｎ、Ａ１４３Ｅ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、およびＩ１５６Ｆ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項７５】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＥ２５Ｄ、Ｒ２６Ｇ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｒ１０７Ｋ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ａ１４２Ｎ、Ａ１４３Ｇ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、およびＩ１５６Ｆ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項７６】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＬ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６Ｆ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項７７】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＡ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１４２Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項７８】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＲ２６Ｇ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１４２Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項７９】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＥ２５Ｄ、Ｒ２６Ｇ、Ａ１０６Ｖ、Ｒ１０７Ｋ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１４２Ｎ、Ａ１４３Ｇ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項８０】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＲ２６Ｇ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｒ１０７Ｈ、Ａ１４２Ｎ、Ａ１４３Ｄ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項８１】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＥ２５Ｄ、Ｒ２６Ｇ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１４２Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項８２】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＡ１０６Ｖ、Ｒ１０７Ｋ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１４２Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項８３】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＡ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１４２Ｎ、Ａ１４３Ｇ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項８４】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＡ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１４２Ｎ、Ａ１４３Ｌ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項８５】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＨ３６Ｌ、Ｒ５１Ｌ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｓ１４６Ｃ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６Ｆ、およびＫ１５７Ｎ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項８６】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＰ４８Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＰ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜８５のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項８７】
Ｘが、Ｓ、Ｔ、またはＡである、請求項８６に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項８８】
ＸがＡである、請求項８７に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項８９】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＡ１４２Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＡ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項９０】
ＸがＮである、請求項８９に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項９１】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＷ２３Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＷ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜９０のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項９２】
Ｘが、ＲまたはＬである、請求項９１に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項９３】
ＸがＬである、請求項９１に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項９４】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＲ１５２Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＲ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜９３のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項９５】
Ｘが、ＰまたはＨである、請求項９４に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項９６】
ＸがＰである、請求項９４に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項９７】
ＴａｄＡデアミナーゼが、S. aureus ＴａｄＡデアミナーゼ（ｓａＴａｄＡ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項９８】
アデノシンデアミナーゼが、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４および９７のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項９９】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号８におけるＤ１０７Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＤ以外の任意のアミノ酸である、請求項９７〜９８のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１００】
ＸがＡである、請求項９９に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１０１】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号８におけるＤ１０８Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＤ以外の任意のアミノ酸である、請求項９７〜１００のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１０２】
ＸがＮである、請求項１０１に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１０３】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号８におけるＧ２６Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＧ以外の任意のアミノ酸である、請求項９７〜１０２のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１０４】
ＸがＰである、請求項１０３に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１０５】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号８におけるＳ１４２Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここで、ＸはＳ以外の任意のアミノ酸である、請求項９７〜１０４のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１０６】
ＸがＡである、請求項１０５に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１０７】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号８におけるＤ１０７ＡおよびＤ１０８Ｎ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項９７〜１０６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１０８】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号８におけるＤ１０７Ａ、Ｄ１０８Ｎ、およびＧ２６Ｐ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項９７〜１０６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１０９】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号８におけるＤ１０７Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ｇ２６Ｐ、およびＳ１４２Ａ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む、請求項９７〜１０６のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１１０】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１、６４〜８４、４２０〜４３７、および６７２〜６８４のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１１１】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１、６４〜８４、４２０〜４３７、および６７２〜６８４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１１２】
アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列が、配列番号１、６４〜８４、４２０〜４３７、および６７２〜６８４のいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１１３】
アデノシンデアミナーゼが、表４に示される変異または変異の組み合わせのいずれか、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）または変異（複数）を含む、請求項１〜１１２のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ。
【請求項１１４】
（ｉ）核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、および（ｉｉ）請求項１〜１１３のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼを含む、融合蛋白質。
【請求項１１５】
核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）が、Ｃａｓ９ドメイン、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、またはＣ２ｃ３である、請求項１１４に記載の融合蛋白質。
【請求項１１６】
Ｃａｓ９ドメインが、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、またはヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９である、請求項１１５に記載の融合蛋白質。
【請求項１１７】
Ｃａｓ９ドメインがヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である、請求項１１５または１１６に記載の融合蛋白質。
【請求項１１８】
ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）が、配列番号３４で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１１７に記載の融合蛋白質。
【請求項１１９】
Ｃａｓ９ドメインが、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である、請求項１１６に記載の融合蛋白質。
【請求項１２０】
Ｃａｓ９ニッカーゼが、配列番号３５で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１１９に記載の融合蛋白質。
【請求項１２１】
（ｉｉｉ）塩基修復（ＩＢＲ）の阻害剤をさらに含む、請求項１１４〜１２０のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１２２】
塩基修復（ＩＢＲ）の阻害剤が、塩基除去修復の阻害剤である、請求項１２１に記載の融合蛋白質。
【請求項１２３】
塩基修復の阻害剤が、イノシンに結合する蛋白質である、請求項１２１または１２２に記載の融合蛋白質。
【請求項１２４】
塩基修復の阻害剤が、触媒不活性型イノシン特異的ヌクレアーゼ（ｄＩＳＮ）である、請求項１２１〜１２３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１２５】
触媒不活性型イノシン特異的ヌクレアーゼ（ｄＩＳＮ）が、配列番号３２、または配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１２４に記載の融合蛋白質。
【請求項１２６】
核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）とアデノシンデアミナーゼとの間に１以上のリンカーをさらに含む、請求項１１４〜１２５のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１２７】
１以上のリンカーが、配列番号１０、３７〜４０、３８４〜３８６、および６８５〜６８８のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１２６に記載の融合蛋白質。
【請求項１２８】
１以上のリンカーが、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１２６または１２７に記載の融合蛋白質。
【請求項１２９】
１以上のリンカーが、配列番号３７で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１２６に記載の融合蛋白質。
【請求項１３０】
１以上の核局在配列（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項１１４〜１２９のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１３１】
ＮＬＳが、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１３０に記載の融合蛋白質。
【請求項１３２】
構造
［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］；
［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＬＳ］；
［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＩＢＲ］；または
［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＩＢＲ］−［ＮＬＳ］
を含み、ここで、ｎａｐＤＮＡｂｐは核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質であり、およびＩＢＲは塩基修復の阻害剤である、請求項１１４〜１３１のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１３３】
構造における各「−」が、任意のリンカー配列の存在を示す、請求項１３２に記載の融合蛋白質。
【請求項１３４】
ｎａｐＤＮＡｂｐがＣａｓ９ドメインである、請求項１３２または１３３に記載の融合蛋白質。
【請求項１３５】
Ｃａｓ９ドメインが、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９である、請求項１３４に記載の融合蛋白質。
【請求項１３６】
ＩＢＲがｄＩＳＮである、請求項１３２〜１３５のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１３７】
ｎａｐＤＮＡｂｐおよびＮＬＳが、アミノ酸配列
【化１】
2019536425.tif 000549
を含むリンカーを介して融合されている、請求項１３２〜１３６のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１３８】
ｎａｐＤＮＡｂｐおよびＩＢＲが、アミノ酸配列
【化２】
2019536425.tif 000550
を含むリンカーを介して融合されている、請求項１３２〜１３７のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１３９】
ＩＢＲおよびＮＬＳが、アミノ酸配列
【化３】
2019536425.tif 000551
を含むリンカーを介して融合されている、請求項１３２〜１３８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１４０】
構造
［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］；
［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＮＬＳ］；
［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＩＢＲ］；または
［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＩＢＲ］−［ＮＬＳ］
を含み、ここで、ｎａｐＤＮＡｂｐが核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質であり、およびＩＢＲが塩基修復の阻害剤である、請求項１１４〜１３１のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１４１】
構造における各「−」が、任意のリンカー配列の存在を示す、請求項１４０に記載の融合蛋白質。
【請求項１４２】
ｎａｐＤＮＡｂｐが、Ｃａｓ９ドメインである、請求項１４０または１４１に記載の融合蛋白質。
【請求項１４３】
Ｃａｓ９ドメインが、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９である、請求項１４２に記載の融合蛋白質。
【請求項１４４】
ＩＢＲがｄＩＳＮである、請求項１４０〜１４３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１４５】
アデノシンデアミナーゼおよびＮＬＳが、アミノ酸配列
【化４】
2019536425.tif 000552
を含むリンカーを介して融合されている、請求項１４０〜１４４のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１４６】
アデノシンデアミナーゼおよびＩＢＲが、アミノ酸配列
【化５】
2019536425.tif 000553
を含むリンカーを介して融合されている、請求項１４０〜１４５のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１４７】
ＩＢＲおよびＮＬＳが、アミノ酸配列
【化６】
2019536425.tif 000554
を含むリンカーを介して融合されている、請求項１４０〜１４６のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１４８】
ｎａｐＤＮＡｂｐおよびアデノシンデアミナーゼが、アミノ酸配列
【化７】
2019536425.tif 000555
を含むリンカーを介して融合されている、請求項１１４〜１４７のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１４９】
ｎａｐＤＮＡｂｐおよびアデノシンデアミナーゼが、アミノ酸配列
【化８】
2019536425.tif 000556
を含むリンカーを介して融合されている、請求項１１４〜１４８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１５０】
第２のアデノシンデアミナーゼをさらに含む、請求項１１４〜１４９のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１５１】
第２のアデノシンデアミナーゼが、請求項１〜１１３のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼである、請求項１５０に記載の融合蛋白質。
【請求項１５２】
構造
［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］；
［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］；または
［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］
を含み、ここで、ｎａｐＤＮＡｂｐは核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質である、請求項１５０または１５１に記載の融合蛋白質。
【請求項１５３】
構造
［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＬＳ］；
［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＩＢＲ］；または
［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＩＢＲ］−［ＮＬＳ］
を含み、ここで、ｎａｐＤＮＡｂｐは核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質であり、およびＩＢＲは塩基修復の阻害剤である、請求項１１４〜１５２のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１５４】
構造における各「−」が、任意のリンカー配列の存在を示す、請求項１５２または１５３に記載の融合蛋白質。
【請求項１５５】
ｎａｐＤＮＡｂｐが、Ｃａｓ９ドメインである、請求項１５２〜１５４のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１５６】
Ｃａｓ９ドメインが、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９である、請求項１５５に記載の融合蛋白質。
【請求項１５７】
ＩＢＲがｄＩＳＮである、請求項１５２〜１５６のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１５８】
第１のアデノシンデアミナーゼおよび／または第２のアデノシンデアミナーゼが、請求項１〜１１３のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼである、請求項１５２〜１５７のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１５９】
第１のアデノシンデアミナーゼおよび第２のアデノシンデアミナーゼが同じである、請求項１５２〜１５８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１６０】
第１のアデノシンデアミナーゼおよび第２のアデノシンデアミナーゼが異なる、請求項１５２〜１５８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１６１】
第１のアデノシンデアミナーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５２〜１６０のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１６２】
第１のアデノシンデアミナーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１５２〜１６１のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１６３】
第１のアデノシンデアミナーゼが、第２のアデノシンデアミナーゼに対してＮ末端にある、請求項１５２〜１６２のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１６４】
第１のアデノシンデアミナーゼおよび第２のアデノシンデアミナーゼが、アミノ酸配列
【化９】
2019536425.tif 000557
を含むリンカーを介して融合されている、請求項１５２〜１６３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１６５】
第１のアデノシンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐまたは第２のアデノシンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐが、アミノ酸配列
【化１０】
2019536425.tif 000558
を含むリンカーを介して融合されている、請求項１５２〜１６４のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１６６】
ｎａｐＤＮＡｂｐおよびＮＬＳが、アミノ酸配列
【化１１】
2019536425.tif 000559
を含むリンカーを介して融合されている、請求項１５３〜１６５のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１６７】
ｎａｐＤＮＡｂｐおよびＩＢＲが、アミノ酸配列
【化１２】
2019536425.tif 000560
を含むリンカーを介して融合されている、請求項１５３〜１６６のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１６８】
ＩＢＲおよびＮＬＳが、アミノ酸配列
【化１３】
2019536425.tif 000561
を含むリンカーを介して融合されている、請求項１５３〜１６７のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１６９】
配列番号１１〜２８、３８７〜３８８、４４０、および６９１〜７０６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５３〜１６８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１７０】
配列番号１１〜２８、３８７〜３８８、４４０、および６９１〜７０６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項１１４〜１６９のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１７１】
配列番号１１〜２８、３８７〜３８８、４４０、および６９１〜７０６のアミノ酸配列のいずれか１つからなる、請求項１１４〜１７０のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１７２】
表４の融合蛋白質のいずれか１つの構造を含む、請求項１１４〜１７１のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１７３】
表４の融合蛋白質のいずれか１つを含む、請求項１１４〜１７２のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１７４】
請求項１１４〜１７３のいずれか一項に記載の融合蛋白質および融合蛋白質の核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）に結合したガイドＲＮＡを含む、複合体。
【請求項１７５】
ガイドＲＮＡが、１５〜１００ヌクレオチド長であり、および標的配列に対して相補的である少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０ヌクレオチドの一続きの配列を含む、請求項１７４に記載の複合体。
【請求項１７６】
ガイドＲＮＡが、標的配列に対して相補的である１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチドの一続きの配列を含む、請求項１７４または１７５に記載の複合体
【請求項１７７】
ガイドＲＮＡが、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチド長である、請求項１７４〜１７６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１７８】
標的配列がＤＮＡ配列である、請求項１７５〜１７７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１７９】
標的配列が生物のゲノム中にある、請求項１７５〜１７８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１８０】
生物が原核生物である、請求項１７９に記載の複合体。
【請求項１８１】
原核生物が細菌である、請求項１８０に記載の複合体。
【請求項１８２】
生物が真核生物である、請求項１７９に記載の複合体。
【請求項１８３】
生物が植物または真菌である、請求項１８２に記載の複合体。
【請求項１８４】
生物が脊椎動物である、請求項１８２に記載の複合体。
【請求項１８５】
脊椎動物が哺乳動物である、請求項１８４に記載の複合体。
【請求項１８６】
哺乳動物が、マウス、ラット、またはヒトである、請求項１８５に記載の複合体。
【請求項１８７】
生物が細胞である、請求項１７９に記載の複合体。
【請求項１８８】
細胞が、マウス細胞、ラット細胞、またはヒト細胞である、請求項１８７に記載の複合体。
【請求項１８９】
細胞がＨＥＫ−２９３細胞である、請求項１８８に記載の複合体。
【請求項１９０】
核酸分子を請求項１１４〜１７３のいずれか一項に記載の融合蛋白質およびガイドＲＮＡと接触させることを含む方法であって、ガイドＲＮＡが、１５〜１００ヌクレオチド長であり、および標的配列に対して相補的である少なくとも１０ヌクレオチドの一続きの配列を含む、前記方法。
【請求項１９１】
核酸分子を請求項１７４〜１８９のいずれか一項に記載の複合体と接触させることを含む、方法。
【請求項１９２】
核酸がＤＮＡである、請求項１９０または１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
核酸が二本鎖ＤＮＡである、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９４】
標的配列が、疾患または異常に関連する配列を含む、請求項１９０〜１９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９５】
標的配列が、疾患または異常に関連する点変異を含む、請求項１９０〜１９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９６】
融合蛋白質、または複合体の活性が、点変異の修正をもたらす、請求項１９５に記載の方法。
【請求項１９７】
標的配列が、疾患または異常に関連するＧからＡへの点変異を含み、および変異Ａ塩基の脱アミノ化が疾患または異常に関連しない配列をもたらす、請求項１９０〜１９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９８】
標的配列が、疾患または異常に関連するＣからＴへの点変異を含み、およびＣからＴへの点変異のＴ塩基に相補的であるＡ塩基の脱アミノ化が、疾患または異常に関連しない配列をもたらす、請求項１９０〜１９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９９】
標的配列が蛋白質をコードし、および点変異がコドン中にあり、および野生型コドンと比較して変異コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらす、請求項１９７または１９８に記載の方法。
【請求項２００】
変異Ａの脱アミノ化が、変異コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらす、請求項１９９に記載の方法。
【請求項２０１】
変異Ａの脱アミノ化が、野生型アミノ酸をコードするコドンをもたらす、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０２】
ＣからＴへの点変異のＴ塩基に相補的であるＡ塩基の脱アミノ化が、変異コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらす、請求項１９９に記載の方法。
【請求項２０３】
ＣからＴへの点変異のＴ塩基に相補的であるＡ塩基の脱アミノ化が、野生型アミノ酸をコードするコドンをもたらす、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０４】
脱アミノ化が、終止コドンの除去をもたらす、請求項１９７〜２０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０５】
終止コドンが、核酸配列５’−ＴＡＧ−３’、５’−ＴＡＡ−３’、または５’−ＴＧＡ−３’を含む、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２０６】
脱アミノ化が、スプライス部位の導入をもたらす、請求項１９７〜２０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０７】
脱アミノ化が、スプライス部位の除去をもたらす、請求項１９７〜２０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０８】
脱アミノ化が、遺伝子プロモーターにおける変異の導入をもたらす、請求項１９７〜２０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０９】
変異が、遺伝子プロモーターに作動可能に連結されている遺伝子の転写の増加につながる、請求項２０８に記載の方法。
【請求項２１０】
変異が、遺伝子プロモーターに作動可能に連結されている遺伝子の転写の減少につながる、請求項２０８に記載の方法。
【請求項２１１】
脱アミノ化が、遺伝子リプレッサーにおける変異の導入をもたらす、請求項１９７〜２０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１２】
変異が、遺伝子リプレッサーに作動可能に連結されている遺伝子の転写の増加につながる、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１３】
変異が、遺伝子リプレッサーに作動可能に連結されている遺伝子の転写の減少につながる、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１４】
接触が、対象においてインビボで行われる、請求項１９０〜２１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１５】
接触が、インビトロで行われる、請求項１９０〜２１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１６】
対象が、疾患または異常と診断されている、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２１７】
標的配列が、ＤＮＡ配列５’−ＮＡＮ−３’を含み、ここで、ＮはＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧである、請求項１９０〜２１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１８】
５’−ＮＡＮ−３’配列の中央にあるＡが、脱アミノ化されている、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２１９】
５’−ＮＡＮ−３’配列の中央にあるＡが、Ｇへ変化している、請求項２１７または２１８に記載の方法。
【請求項２２０】
標的配列が、ＡＡＡ、ＡＡＴ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＴＡＡ、ＴＡＴ、ＴＡＣ、ＴＡＧ、ＣＡＡ、ＣＡＴ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＧＡＡ、ＧＡＴ、ＧＡＣ、およびＧＡＧからなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む、請求項２１７〜２１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２１】
２０％、１９％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、４％、２％、１％、０．５％、０．２％、または０．１％未満のインデル形成を引き起こす、請求項１９０〜２２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２２】
Ａを脱アミノ化する効率が、少なくとも５％である、請求項２１８〜２２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２３】
効率が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％である、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２４】
ＡからＧへ変化させる効率が、少なくとも５％である、請求項２１９〜２２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２５】
効率が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％である、請求項２２４に記載の方法。
【請求項２２６】
二本鎖ＤＮＡ配列の核酸塩基対を編集するための方法であって、
ａ．二本鎖ＤＮＡ配列の標的領域を核酸塩基編集因子およびガイド核酸を含む複合体に接触させること、ここで、標的領域は標的核酸塩基対を含む；
ｂ．前記標的領域の鎖分離を誘導すること；
ｃ．標的領域の単一鎖における前記標的核酸塩基対の第１の核酸塩基を第２の核酸塩基へ変換すること；および
ｄ．前記標的領域の１つの鎖だけを切ること；
を含み、ここで、第１の核酸塩基に相補的な第３の核酸塩基が、第２の核酸塩基に相補的な第４の核酸塩基によって置き換えられ、および二本鎖ＤＮＡ配列において２０％未満のインデル形成を引き起こす、前記方法。
【請求項２２７】
２０％、１９％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、４％、２％、１％、０．５％、０．２％、または０．１％未満のインデル形成を引き起こす、請求項２２６に記載の方法。
【請求項２２８】
第２の核酸塩基を、第４の核酸塩基に相補的である第５の核酸塩基で置き換え、それによって意図される編集された塩基対を生成することをさらに含む、請求項２２６または２２７に記載の方法。
【請求項２２９】
意図される編集された塩基対を生成する効率が、少なくとも５％である、請求項２２６〜２２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３０】
効率が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％である、請求項２２９に記載の方法。
【請求項２３１】
標的ヌクレオチドにおける意図される産物対意図されない産物の比が、少なくとも２：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、または２００：１である、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３２】
意図される点変異対インデル形成の比が、１：１、１０：１、５０：１、１００：１、５００：１、または１０００：１超である、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３３】
切られる単一鎖が、ガイド核酸にハイブリダイゼーションする、請求項２２６〜２３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３４】
切られる単一鎖が、第１の核酸塩基を含む鎖に対して反対である、請求項２２６〜２３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３５】
前記第１の塩基が、アデニンである、請求項２２６〜２３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３６】
第２の核酸塩基が、Ｇ、Ｃ、Ａ、またはＴではない、請求項２２６〜２３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３７】
前記第２の塩基がイノシンである、請求項２２６〜２３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３８】
核酸塩基編集因子が、塩基修復阻害活性を含む、請求項２２６〜２３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３９】
核酸塩基編集因子が、触媒不活性型イノシン特異的ヌクレアーゼ（ｄＩＳＮ）を含む、請求項２２６〜２３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４０】
核酸塩基編集因子が、ニッカーゼ活性を含む、請求項２２６〜２３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４１】
意図される編集された塩基対が、ＰＡＭ部位の上流である、請求項２２８〜２４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４２】
意図される編集された塩基対が、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド上流である、請求項２４１に記載の方法。
【請求項２４３】
意図される編集された塩基対が、ＰＡＭ部位の下流である、請求項２４２に記載の方法。
【請求項２４４】
意図される編集された塩基対が、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド下流である、請求項２４３に記載の方法。
【請求項２４５】
カノニカルなＰＡＭ部位を要求しない、請求項２２６〜２４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４６】
カノニカルなＰＡＭ部位がＮＧＧを含み、ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧである、請求項２４５に記載の方法。
【請求項２４７】
核酸塩基編集因子がリンカーを含む、請求項２２６〜２４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４８】
リンカーが１〜２５アミノ酸長である、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２４９】
リンカーが５〜２０アミノ酸長である、請求項２４７または２４８に記載の方法。
【請求項２５０】
リンカーが、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長である、請求項２４７〜２４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５１】
標的領域が、標的核酸塩基対を含む標的ウインドウを含む、請求項２２６〜２５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５２】
標的ウインドウが、１〜１０のヌクレオチドを含む、請求項２５１に記載の方法。
【請求項２５３】
標的ウインドウが、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１ヌクレオチド長である、請求項２５１に記載の方法。
【請求項２５４】
標的ウインドウが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長である、請求項２５１に記載の方法。
【請求項２５５】
意図される編集された塩基対が標的ウインドウ内に生じる、請求項２２６〜２５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５６】
標的ウインドウが意図される編集された塩基対を含む、請求項２２６〜２５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５７】
核酸塩基編集因子が、請求項１１４〜１７３のいずれか一項に記載の融合蛋白質のいずれか１つを含む、請求項２２６〜２５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５８】
二本鎖ＤＮＡ配列の核酸塩基対を編集するための方法であって、
ａ．二本鎖ＤＮＡ配列の標的領域を核酸塩基編集因子およびガイド核酸を含む複合体に接触させること、ここで、標的領域が標的核酸塩基対を含む；
ｂ．前記標的領域の鎖分離を誘導すること；
ｃ．標的領域の単一鎖における前記標的核酸塩基対の第１の核酸塩基を第２の核酸塩基へ変換すること；
ｄ．前記標的領域の１つの鎖だけを切ること；
ここで、第１の核酸塩基に相補的な第３の核酸塩基は、第２の核酸塩基に相補的な第４の核酸塩基によって置き換えられる；および
ｅ．第２の核酸塩基を第４の核酸塩基に相補的である第５の核酸塩基で置き換え、それによって意図される編集された塩基対を生成すること、
ここで、意図される編集された塩基対を生成する効率は少なくとも５％である、
を含む、前記方法。
【請求項２５９】
効率が、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％である、請求項２５８に記載の方法。
【請求項２６０】
１９％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、４％、２％、または１％未満のインデル形成を引き起こす、請求項２５８または２５９に記載の方法。
【請求項２６１】
標的ヌクレオチドにおける意図される産物対意図されない産物の比が、少なくとも２：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、または２００：１である、請求項２５８〜２６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６２】
意図される点変異対インデル形成の比が、１：１、１０：１、５０：１、１００：１、５００：１、または１０００：１超である、請求項２５８〜２６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６３】
切られる単一鎖がガイド核酸にハイブリダイゼーションする、請求項２５８〜２６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６４】
切られる単一鎖が第１の核酸塩基を含む鎖に対して反対である、請求項２５８〜２６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６５】
前記第１の塩基がアデニンである、請求項２５８〜２６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６６】
第２の核酸塩基がＧ、Ｃ、Ａ、またはＴではない、請求項２５８〜２６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６７】
前記第２の塩基がイノシンである、請求項２５８〜２６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６８】
核酸塩基編集因子が塩基修復阻害活性を含む、請求項２５８〜２６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６９】
核酸塩基編集因子が、触媒不活性型イノシン特異的ヌクレアーゼ（ｄＩＳＮ）を含む、請求項２５８〜２６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７０】
核酸塩基編集が、ニッカーゼ活性を含む、請求項２５８〜２６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７１】
意図される編集された塩基対がＰＡＭ部位の上流である、請求項２５８〜２７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７２】
意図される編集された塩基対が、ＰＡＭ部位．の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド上流である、請求項２７１に記載の方法。
【請求項２７３】
意図される編集された塩基対がＰＡＭ部位の下流である、請求項２５８〜２７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７４】
意図される編集された塩基対が、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド下流である、請求項２７３に記載の方法。
【請求項２７５】
カノニカルなＰＡＭ部位を要求しない、請求項２５８〜２７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７６】
カノニカルなＰＡＭ部位がＮＧＧを含み、ここで、ＮはＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧである、請求項２７５に記載の方法。
【請求項２７７】
核酸塩基編集因子がリンカーを含む、請求項２５８〜２７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７８】
リンカーが１〜２５アミノ酸長である、請求項２７７に記載の方法。
【請求項２７９】
リンカーが５〜２０アミノ酸長である、請求項２７７または２７８に記載の方法。
【請求項２８０】
リンカーが、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長である、請求項２７７〜２７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８１】
標的領域が、標的核酸塩基対を含む標的ウインドウを含む、請求項２７７〜２８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８２】
標的ウインドウが１〜１０のヌクレオチドを含む、請求項２８１に記載の方法。
【請求項２８３】
標的ウインドウが、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１ヌクレオチド長である、請求項２８１に記載の方法。
【請求項２８４】
標的ウインドウが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長である、請求項２８１に記載の方法。
【請求項２８５】
意図される編集された塩基対が標的ウインドウ内に生じる、請求項２８１〜２８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８６】
標的ウインドウが意図される編集された塩基対を含む、請求項２８１〜２８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８７】
核酸塩基編集因子が、請求項１１４〜１７３のいずれか一項に記載の融合蛋白質のいずれか１つを含む、請求項２８１〜２８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８８】
塩基除去修復の阻害剤にカップリングされた核酸誘導型アデノシンデアミナーゼ。
【請求項２８９】
ミスマッチ修復の開始因子を含む、請求項２８８に記載の核酸誘導型アデノシンデアミナーゼ。
【請求項２９０】
ニッカーゼを含む、請求項２８８または２８９に記載の核酸誘導型アデノシンデアミナーゼ。
【請求項２９１】
（ａ）請求項１〜１１３のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼをコードする核酸配列；および
（ｂ）（ａ）の配列の発現を駆動する異種プロモーター
を含む、核酸コンストラクトを含むキット。
【請求項２９２】
（ａ）請求項１１４〜１７３のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードする核酸配列；および
（ｂ）（ａ）の配列の発現を駆動する異種プロモーター
を含む、核酸コンストラクトを含むキット。
【請求項２９３】
ガイドＲＮＡバックボーンをコードする発現コンストラクトをさらに含み、ここで、当該コンストラクトが、ガイドＲＮＡバックボーン中への標的配列と同一または相補的な核酸配列のクローニングを許すように位置したクローニング部位を含む、請求項２９２に記載のキット。
【請求項２９４】
請求項１〜１１３のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ、または請求項１１４〜１７３のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２９５】
請求項２２９に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２９６】
ポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む、請求項２９５に記載のベクター。
【請求項２９７】
請求項１〜１１３のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ、または請求項１１４〜１７３のいずれか一項に記載の融合蛋白質を含む、細胞。
【請求項２９８】
請求項１７４〜１８９のいずれか一項に記載の複合体を含む、細胞。
【請求項２９９】
請求項１〜１１３のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼ、または請求項１１４〜１７３のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードする核酸分子を含む、細胞。
【請求項３００】
請求項１〜１１３のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼを含む、医薬組成物。
【請求項３０１】
請求項１１４〜１７３のいずれか一項に記載の融合蛋白質を含む、医薬組成物。
【請求項３０２】
請求項１７４〜１８９のいずれか一項に記載の複合体を含む、医薬組成物。
【請求項３０３】
薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項３００〜３０２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の背景
核酸配列の標的編集（例えば、標的切断またはゲノムＤＮＡ中への特異的改変の標的導入）は、遺伝子機能の研究にとって極めて有望なアプローチであり、またヒト遺伝子疾患のための新しい治療(therapies)を提供する見込みも有している。多くの遺伝子疾患は原理上、ゲノム中の特定の場所での特定のヌクレオチド変化をもたらすこと（例えば、遺伝子関連疾患の特定のコドンにおけるＡ→Ｇ変化またはＴ→Ｃ変化）によって処置され得るところ、かかる精密な遺伝子編集を達成するためのプログラム可能なやり方の開発は、強力で新しい研究ツールならびに遺伝子編集ベースの治療法(therapeutics)に対して見込みのある新しいアプローチの両方に代表される。
【０００２】
本発明の概要
本明細書に提供されるのは、組成物、キット、ならびにアデノシンデアミナーゼおよび核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（例として、Ｃａｓ９）を使用してポリヌクレオチド（例として、ＤＮＡ）を改変する方法である。本開示のいくつかの側面は、ＤＮＡという文脈において、アデノシンの加水分解的脱アミノ化を触媒する（イノシンが形成されるが、これはグアニン（Ｇ）などと塩基対合する）核酸塩基編集蛋白質を提供する。ＤＮＡに作用する天然のアデノシンデアミナーゼは知られていない。その代わりに、知られているアデノシンデアミナーゼは、ＲＮＡ（例として、ｔＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に作用する。この難点を克服するため、第１のデオキシアデノシンデアミナーゼは進化して、ＤＮＡ基質を受け入れ、デオキシアデノシン（ｄＡ）を脱アミノ化してデオキシイノシンにした。Escherichia coliからの、ｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ(adenosine deaminase acting on tRNA)（ＡＤＡＴ）（tRNA adenosine deaminase Aにちなんで、ＴａｄＡ）は、ｄＣａｓ９ドメインと共有結合的に融合されており、コンストラクトのデアミナーゼ部分に変異を含有するこの融合体のライブラリーが構築された。E. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）デアミナーゼがまた、ｅｃＴａｄＡのトランケーション体(truncations)も含むことは理解されるはずである。例えば、Ｎ末端でトランケートされた配列番号１に示されるｅｃＴａｄＡなどの、全長ｅｃＴａｄＡ（配列番号８４）のトランケーション体（例として、Ｎ末端トランケーション体）は、本発明における使用のために本明細書に提供される。さらに、S. aureus ＴａｄＡ変異体などの他のアデノシンデアミナーゼ変異体も、アデノシンを脱アミノ化することが可能であることが見出された。いずれの具体的な理論によっても拘束されることは望まないが、アデノシンデアミナーゼ（例として、ｅｃＴａｄＡ）のトランケーション体は、これらに対応する全長体(their full-length counterparts)と比較して、所望の可溶性および／または発現特性を有していることがある。
【０００３】
蛋白質を編集する核酸塩基のデアミナーゼドメイン中の変異は、アデノシンデアミナーゼを進化させることによってなされた。生産力のあるバリアントが、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（同時形質転換された選択プラスミド上にコードされている）中の活性部位ＨｉｓのコドンでのＡ→Ｇ復帰(reversion)についての、クロラムフェニコールの選択を介して同定された。進化の第１ラウンドは、ＤＮＡ中ＡをＧへ変換することが可能なｅｃＴａｄＡバリアント、ｅｃＴａｄＡ Ｄ１０８Ｘ（Ｘ＝Ｇ、Ｖ、またはＮ）を生み出した。いくつかの態様において、ｅｃＴａｄＡバリアントは、配列番号１におけるＤ１０８Ａ変異または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。進化の第１ラウンドはまた、ｅｃＴａｄＡバリアントであるｅｃＴａｄＡ Ａ１０６Ｖも生み出した。それに続く進化のラウンドは、別のバリアント、ｅｃＴａｄＡ Ｄ１０８Ｎ＿Ｅ１５５Ｘ（Ｘ＝Ｇ、Ｖ、またはＤ）をもたらしたが、これによって、E. coliが、高濃度のクロラムフェニコールの存在下でも生存した。追加のバリアントも、ｅｃＴａｄＡを進化させることによって同定された。例えば、ＤＮＡ中のアデノシンを脱アミノ化することが可能なｅｃＴａｄＡバリアントは、以下の変異：配列番号１のＤ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１４７、Ｅ１５５Ｖ、Ｌ８４Ｆ、Ｈ１２３Ｙ、およびＩ１５７Ｆのうち１以上を含む。しかしながら、相同な変異が他のアデノシンデアミナーゼにおいてなされることで、ＤＮＡ中のアデノシンを脱アミノ化することが可能なバリアントが生成され得ることは理解されるはずである。進化の追加のラウンドも、さらなるｅｃＴａｄＡバリアントを提供した。例えば、追加のｅｃＴａｄＡバリアントは、図１１、１６、９７、１０４〜１０６、１２５〜１２８、１１５および表４に示される。
【０００４】
本明細書に提供される例において、一般構造を有する例示的な核酸塩基編集因子は、ｅｃＴａｄＡ（Ｄ１０８Ｘ；Ｘ＝Ｇ、Ｖ、またはＮ）−ＸＴＥＮ−ｎＣａｓ９を進化させて、真核細胞などの細胞（例として、Ｈｅｋ２９３Ｔ哺乳動物細胞）においてＡ→Ｇ変移変異を触媒する。他の例において、例示的な核酸塩基編集因子は、２つのｅｃＴａｄＡドメインおよび核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）を含有する。例えば、核酸塩基編集因子は、一般構造ｅｃＴａｄＡ（Ｄ１０８Ｎ）−ｅｃＴａｄＡ（Ｄ１０８Ｎ）−ｎＣａｓ９を有していてもよい。本明細書に提供されるｅｃＴａｄＡバリアントを含有する核酸塩基編集因子の追加の例は、哺乳動物細胞における核酸塩基編集因子の性能が改善したことを実証する。例えば、あるアデノシン塩基編集因子は、配列番号１に示されるｅｃＴａｄＡまたは別のアデニンデアミナーゼにおいて、Ｄ１０８Ｘ（ここでＸ＝Ｇ、Ｖ、またはＮ）および／またはＥ１５５Ｘ（ここでＸ＝Ｂ、Ｖ、またはＤ）の変異を有するｅｃＴａｄＡを含む。ある態様において、変異体の核酸塩基編集因子は、触媒不活性型(catalytically dead)アルキルアデノシングリコシラーゼ（ＡＡＧ）と共有結合的に融合されているが、これは、反対鎖上のＴが、例えばミスマッチ修復（または他のＤＮＡ修復システム）を通してＣへ変化するまで、塩基除去修復（または他のＤＮＡ修復システム）から、編集されたイノシンを保護し得る。イノシンとは反対の塩基がいったんＣへ変化すると、イノシンはそのとき、細胞のＤＮＡ修復プロセスを通して、不可逆的および永久的にＧへ変化することがあり、これによってＡ：Ｔ塩基対からＧ：Ｃ塩基対への永久的な変化がもたらされる。
【０００５】
いずれの具体的な理論によっても拘束されることは望まないが、本明細書に記載のアデノシン核酸塩基編集因子は、ＤＮＡ中のＡ塩基を脱アミノ化するためにｅｃＴａｄＡバリアントを使用することにより動作するが、これによってイノシン形成を介するＡ→Ｇ変異が引き起こされる。イノシンは選好的にＣと水素結合するが、これによってＤＮＡ複製間にＡ→Ｇ変異がもたらされる。Ｃａｓ９（または別の核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質）に対して共有結合的に繋がれるとき、アデノシンデアミナーゼ（例として、ｅｃＴａｄＡ）は、目当ての遺伝子に局在化して、ｓｓＤＮＡ基質においてＡ→Ｇ変異を触媒する。この編集因子は、Ａ→Ｇ復帰が要求される疾患関連遺伝子において単一のヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）を標的にして復帰させるために使用され得る。この編集因子はまた、Ｔの反対のＡをＧへ変異させることによってＴ→Ｃ復帰を要求する疾患関連遺伝子において単一のヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）を標的にして復帰させるためにも使用され得る。Ｔは次いで、例えば塩基除去修復機構によって、Ｃに置き換えられてもよく、またはＤＮＡ複製のその後のラウンドにおいて変化されてもよい。
【０００６】
本開示のいくつかの側面は、操作された（例として、進化した）アデノシンデアミナーゼが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）基質中のアデノシンを脱アミノ化することが可能であるという発見に関する。いくつかの態様において、本開示は、かかるアデノシンデアミナーゼを提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼは、ＤＮＡ分子中のアデノシンを脱アミノ化することが可能である。本開示の他の側面は、Ｃａｓ９ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメイン（例えば、ＤＮＡ中アデノシンを脱アミノ化することが可能な操作されたデアミナーゼドメイン）を含む融合蛋白質を提供する。いくつかの態様において、融合蛋白質は、核局在配列（ＮＬＳ）、イノシン塩基除去修復（例として、ｄＩＳＮ）の阻害剤、および／またはリンカーのうち１以上を含む。
【０００７】
いくつかの側面において、本開示は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）基質中アデノシンを脱アミノ化することが可能なアデノシンデアミナーゼを提供する。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、細菌、例えば、E. coliまたはS. aureusからのものである。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼはＴａｄＡデアミナーゼである。いくつかの態様において、ＴａｄＡデアミナーゼは、E. coli ＴａｄＡデアミナーゼ（ｅｃＴａｄＡ）である。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＤ１０８Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここでＸは、その野生型蛋白質から見出されるアミノ酸以外のいずれのアミノ酸でもある。いくつかの態様において、Ｘは、Ｇ、Ｎ、Ｖ、Ａ、またはＹである。
【０００８】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＥ１５５Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含み、ここでＸは、その野生型蛋白質から見出されるアミノ酸以外のいずれのアミノ酸でもある。いくつかの態様において、Ｘは、Ｄ、Ｇ、またはＶである。本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼが、本明細書に提供される変異の１以上をいずれの組み合わせでも含有していてもよいことは理解されるはずである。
【０００９】
本開示のいくつかの側面は、（ｉ）Ｃａｓ９ドメイン、および（ｉｉ）本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかなどの、アデノシンデアミナーゼ：を含む融合蛋白質を提供する。いくつかの態様において、融合蛋白質のＣａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ不活性型(nuclease dead)Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、またはヌクレアーゼ活性(nuclease active)Ｃａｓ９である。いくつかの態様において、融合蛋白質は、イノシン塩基除去修復の阻害剤、例えばｄＩＳＮまたは一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質をさらに含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は、アデニンデアミナーゼ（例として、ｅｃＴａｄＡ）を核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（例として、Ｃａｓ９）へ付着させるために使用される１以上のリンカーを含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は、１以上の核局在配列（ＮＬＳ）を含む。
【００１０】
上の概要は、本明細書に開示の技術の態様、利点、特色、および使用のいくつかを、非限定的に説明することを意図する。本明細書に開示の技術の他の態様、利点、特色、および使用は、詳細な記載、図面、例、およびクレームから明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
図面の簡単な記載
【図１−１】図１は、様々なデアミナーゼを用いたハイスループットスクリーニングの結果を示す。ＡＰＯＢＥＣ（ＢＥ３）は陽性対照である；ＡＤＡＲはｍＲＮＡに作用し、ＡＤＡはデオキシアデノシンに作用し、およびＡＤＡＴはｔＲＮＡに作用する。未処置の群は、陰性対照である。配列は配列番号４５に対応する。
【図１−２】図１は、様々なデアミナーゼを用いたハイスループットスクリーニングの結果を示す。ＡＰＯＢＥＣ（ＢＥ３）は陽性対照である；ＡＤＡＲはｍＲＮＡに作用し、ＡＤＡはデオキシアデノシンに作用し、およびＡＤＡＴはｔＲＮＡに作用する。未処置の群は、陰性対照である。配列は配列番号４５に対応する。
【００１２】
【図２】図２は、脱アミノ化選択プラスミドの模式図(a schematic)である。
【００１３】
【図３】図３は、漸増濃度のクロラムフェニコール上にプレーティングされた(plated)Ｓ１０３０細胞における選択プラスミドの段階希釈を示す。
【００１４】
【図４−１】図４は、陽性対照としてｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９コンストラクトを用いたクロラムフェニコール選択の妥当性(the validation)を示す。配列は上から下へ、配列番号９５（ヌクレオチド配列）、９６（アミノ酸配列）、９７（ヌクレオチド配列）、９８（アミノ酸配列）、９５（ヌクレオチド配列）および９９（トランケートされたヌクレオチド配列）に対応する。
【図４−２】図４は、陽性対照としてｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９コンストラクトを用いたクロラムフェニコール選択の妥当性(the validation)を示す。配列は上から下へ、配列番号９５（ヌクレオチド配列）、９６（アミノ酸配列）、９７（ヌクレオチド配列）、９８（アミノ酸配列）、９５（ヌクレオチド配列）および９９（トランケートされたヌクレオチド配列）に対応する。
【００１５】
【図５】図５は、デアミナーゼ−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９コンストラクトの模式図である。
【００１６】
【図６】図６は、ＴａｄＡ−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９ライブラリーの第１ラウンドからのシーケンシング結果を示す。
【００１７】
【図７−１】図７は、選択プラスミドの配列を示す；ＡからＧへの復帰が観察された。配列は上から下へ、配列番号１００（ヌクレオチド配列）、１０１（アミノ酸配列）、１０２（ヌクレオチド配列）、１０３（アミノ酸配列）、１０４（ヌクレオチド配列）、および１００（ヌクレオチド配列）に対応する。
【図７−２】図７は、選択プラスミドの配列を示す；ＡからＧへの復帰が観察された。配列は上から下へ、配列番号１００（ヌクレオチド配列）、１０１（アミノ酸配列）、１０２（ヌクレオチド配列）、１０３（アミノ酸配列）、１０４（ヌクレオチド配列）、および１００（ヌクレオチド配列）に対応する。
【００１８】
【図８−１】図８は、デアミナーゼシーケンシングの結果を示すが、これによってＤ１０８残基での収斂(the convergence)が説明される。配列は上から下へ、配列番号５８９〜６０７に対応する。
【図８−２】図８は、デアミナーゼシーケンシングの結果を示すが、これによってＤ１０８残基での収斂(the convergence)が説明される。配列は上から下へ、配列番号５８９〜６０７に対応する。
【図８−３】図８は、デアミナーゼシーケンシングの結果を示すが、これによってＤ１０８残基での収斂(the convergence)が説明される。配列は上から下へ、配列番号５８９〜６０７に対応する。
【図８−４】図８は、デアミナーゼシーケンシングの結果を示すが、これによってＤ１０８残基での収斂(the convergence)が説明される。配列は上から下へ、配列番号５８９〜６０７に対応する。
【図８−５】図８は、デアミナーゼシーケンシングの結果を示すが、これによってＤ１０８残基での収斂(the convergence)が説明される。配列は上から下へ、配列番号５８９〜６０７に対応する。
【図８−６】図８は、デアミナーゼシーケンシングの結果を示すが、これによってＤ１０８残基での収斂(the convergence)が説明される。配列は上から下へ、配列番号５８９〜６０７に対応する。
【図８−７】図８は、デアミナーゼシーケンシングの結果を示すが、これによってＤ１０８残基での収斂(the convergence)が説明される。配列は上から下へ、配列番号５８９〜６０７に対応する。
【図８−８】図８は、デアミナーゼシーケンシングの結果を示すが、これによってＤ１０８残基での収斂(the convergence)が説明される。配列は上から下へ、配列番号５８９〜６０７に対応する。
【図８−９】図８は、デアミナーゼシーケンシングの結果を示すが、これによってＤ１０８残基での収斂(the convergence)が説明される。配列は上から下へ、配列番号５８９〜６０７に対応する。
【図８−１０】図８は、デアミナーゼシーケンシングの結果を示すが、これによってＤ１０８残基での収斂(the convergence)が説明される。配列は上から下へ、配列番号５８９〜６０７に対応する。
【図８−１１】図８は、デアミナーゼシーケンシングの結果を示すが、これによってＤ１０８残基での収斂(the convergence)が説明される。配列は上から下へ、配列番号５８９〜６０７に対応する。
【図８−１２】図８は、デアミナーゼシーケンシングの結果を示すが、これによってＤ１０８残基での収斂(the convergence)が説明される。配列は上から下へ、配列番号５８９〜６０７に対応する。
【図８−１３】図８は、デアミナーゼシーケンシングの結果を示すが、これによってＤ１０８残基での収斂(the convergence)が説明される。配列は上から下へ、配列番号５８９〜６０７に対応する。
【図８−１４】図８は、デアミナーゼシーケンシングの結果を示すが、これによってＤ１０８残基での収斂(the convergence)が説明される。配列は上から下へ、配列番号５８９〜６０７に対応する。
【図８−１５】図８は、デアミナーゼシーケンシングの結果を示すが、これによってＤ１０８残基での収斂(the convergence)が説明される。配列は上から下へ、配列番号５８９〜６０７に対応する。
【図８−１６】図８は、デアミナーゼシーケンシングの結果を示すが、これによってＤ１０８残基での収斂(the convergence)が説明される。配列は上から下へ、配列番号５８９〜６０７に対応する。
【００１９】
【図９】図９は、E. coli ＴａｄＡ結晶構造を示す。ここで留意すべきは、図中の残基の付番が消失しているため、図中Ｄ１１９がＤ１０８に対応することである。
【００２０】
【図１０−１】図１０は、ＴａｄＡ（S. aureusにおける）ｔＲＮＡの結晶構造およびこれとE. coliからのＴａｄＡとのアライメントを示す。配列は上から下へ、配列番号１０５〜１０７に対応する。
【図１０−２】図１０は、ＴａｄＡ（S. aureusにおける）ｔＲＮＡの結晶構造およびこれとE. coliからのＴａｄＡとのアライメントを示す。配列は上から下へ、配列番号１０５〜１０７に対応する。
【００２１】
【図１１−１】図１１は、ｅｃＴａｄＡ進化からの個々のコンストラクトの単離およびチャレンジ(challenge)の結果を示す。
【図１１−２】図１１は、ｅｃＴａｄＡ進化からの個々のコンストラクトの単離およびチャレンジ(challenge)の結果を示す。
【００２２】
【図１２】図１２は、漸増濃度のクロラムフェニコール上でチャレンジさせられた様々なコンストラクトのコロニー形成単位（Ｃ．Ｆ．Ｕ．）を示す。コンストラクト数は、図１１中に挙げられたものに対応する。
【００２３】
【図１３−１】図１３は、Ｄ１０８Ｎ変異を含有するコンストラクトからの進化の第２ラウンドからのデータを示す。配列は上から下へ、配列番号６０８〜６２３に対応する。
【図１３−２】図１３は、Ｄ１０８Ｎ変異を含有するコンストラクトからの進化の第２ラウンドからのデータを示す。配列は上から下へ、配列番号６０８〜６２３に対応する。
【図１３−３】図１３は、Ｄ１０８Ｎ変異を含有するコンストラクトからの進化の第２ラウンドからのデータを示す。配列は上から下へ、配列番号６０８〜６２３に対応する。
【図１３−４】図１３は、Ｄ１０８Ｎ変異を含有するコンストラクトからの進化の第２ラウンドからのデータを示す。配列は上から下へ、配列番号６０８〜６２３に対応する。
【図１３−５】図１３は、Ｄ１０８Ｎ変異を含有するコンストラクトからの進化の第２ラウンドからのデータを示す。配列は上から下へ、配列番号６０８〜６２３に対応する。
【図１３−６】図１３は、Ｄ１０８Ｎ変異を含有するコンストラクトからの進化の第２ラウンドからのデータを示す。配列は上から下へ、配列番号６０８〜６２３に対応する。
【図１３−７】図１３は、Ｄ１０８Ｎ変異を含有するコンストラクトからの進化の第２ラウンドからのデータを示す。配列は上から下へ、配列番号６０８〜６２３に対応する。
【図１３−８】図１３は、Ｄ１０８Ｎ変異を含有するコンストラクトからの進化の第２ラウンドからのデータを示す。配列は上から下へ、配列番号６０８〜６２３に対応する。
【図１３−９】図１３は、Ｄ１０８Ｎ変異を含有するコンストラクトからの進化の第２ラウンドからのデータを示す。配列は上から下へ、配列番号６０８〜６２３に対応する。
【図１３−１０】図１３は、Ｄ１０８Ｎ変異を含有するコンストラクトからの進化の第２ラウンドからのデータを示す。配列は上から下へ、配列番号６０８〜６２３に対応する。
【図１３−１１】図１３は、Ｄ１０８Ｎ変異を含有するコンストラクトからの進化の第２ラウンドからのデータを示す。配列は上から下へ、配列番号６０８〜６２３に対応する。
【図１３−１２】図１３は、Ｄ１０８Ｎ変異を含有するコンストラクトからの進化の第２ラウンドからのデータを示す。配列は上から下へ、配列番号６０８〜６２３に対応する。
【００２４】
【図１４−１】図１４は、哺乳動物細胞におけるＡ→Ｇ編集を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図１４−２】図１４は、哺乳動物細胞におけるＡ→Ｇ編集を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図１４−３】図１４は、哺乳動物細胞におけるＡ→Ｇ編集を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図１４−４】図１４は、哺乳動物細胞におけるＡ→Ｇ編集を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図１４−５】図１４は、哺乳動物細胞におけるＡ→Ｇ編集を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図１４−６】図１４は、哺乳動物細胞におけるＡ→Ｇ編集を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図１４−７】図１４は、哺乳動物細胞におけるＡ→Ｇ編集を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図１４−８】図１４は、哺乳動物細胞におけるＡ→Ｇ編集を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図１４−９】図１４は、哺乳動物細胞におけるＡ→Ｇ編集を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【００２５】
【図１５】図１５は、ＡＢＥの開発を示す模式図である。
【００２６】
【図１６】図１６は、第２ラウンド進化後にアッセイされたクローンの結果を示す表である。カラム１、８、および１０は、第１ラウンドの進化からの変異を表す。カラム１１および１４は、第２ラウンドの進化からのコンセンサス変異を表す。
【００２７】
【図１７−１】図１７は、個々のクローンの抗生物質チャレンジアッセイの結果を示す。コンストラクト数の同定は、図１６からのｐＮＭＧクローン数に対応する。
【図１７−２】図１７は、個々のクローンの抗生物質チャレンジアッセイの結果を示す。コンストラクト数の同定は、図１６からのｐＮＭＧクローン数に対応する。
【００２８】
【図１８】図１８は、開発された新しいコンストラクトの略図(schematic representations)を示す。新しいコンストラクトは、ＵＧＩドメイン、ＡＡＧ＊Ｅ１２５Ｑドメイン、およびＥｎｄｏＶ＊Ｄ３５Ａドメインを含む。
【００２９】
【図１９−１】図１９は、ｅｃＴａｄＡに単一の変異または二重の変異を含有する哺乳動物細胞中へのコンストラクトのトランスフェクションを示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図１９−２】図１９は、ｅｃＴａｄＡに単一の変異または二重の変異を含有する哺乳動物細胞中へのコンストラクトのトランスフェクションを示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図１９−３】図１９は、ｅｃＴａｄＡに単一の変異または二重の変異を含有する哺乳動物細胞中へのコンストラクトのトランスフェクションを示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図１９−４】図１９は、ｅｃＴａｄＡに単一の変異または二重の変異を含有する哺乳動物細胞中へのコンストラクトのトランスフェクションを示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図１９−５】図１９は、ｅｃＴａｄＡに単一の変異または二重の変異を含有する哺乳動物細胞中へのコンストラクトのトランスフェクションを示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図１９−６】図１９は、ｅｃＴａｄＡに単一の変異または二重の変異を含有する哺乳動物細胞中へのコンストラクトのトランスフェクションを示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【００３０】
【図２０−１】図２０は、アデノシン核酸塩基編集因子（ＡＢＥ）（Ｄ１０８Ｎ）へＵＧＩが付加されたコンストラクトのトランスフェクションを示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２０−２】図２０は、アデノシン核酸塩基編集因子（ＡＢＥ）（Ｄ１０８Ｎ）へＵＧＩが付加されたコンストラクトのトランスフェクションを示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２０−３】図２０は、アデノシン核酸塩基編集因子（ＡＢＥ）（Ｄ１０８Ｎ）へＵＧＩが付加されたコンストラクトのトランスフェクションを示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２０−４】図２０は、アデノシン核酸塩基編集因子（ＡＢＥ）（Ｄ１０８Ｎ）へＵＧＩが付加されたコンストラクトのトランスフェクションを示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２０−５】図２０は、アデノシン核酸塩基編集因子（ＡＢＥ）（Ｄ１０８Ｎ）へＵＧＩが付加されたコンストラクトのトランスフェクションを示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２０−６】図２０は、アデノシン核酸塩基編集因子（ＡＢＥ）（Ｄ１０８Ｎ）へＵＧＩが付加されたコンストラクトのトランスフェクションを示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【００３１】
【図２１−１】図２１は、ＡＢＥが、試験された６ゲノム部位のうちの１つに対して最も良く作動することを示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図２１−２】図２１は、ＡＢＥが、試験された６ゲノム部位のうちの１つに対して最も良く作動することを示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図２１−３】図２１は、ＡＢＥが、試験された６ゲノム部位のうちの１つに対して最も良く作動することを示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図２１−４】図２１は、ＡＢＥが、試験された６ゲノム部位のうちの１つに対して最も良く作動することを示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図２１−５】図２１は、ＡＢＥが、試験された６ゲノム部位のうちの１つに対して最も良く作動することを示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図２１−６】図２１は、ＡＢＥが、試験された６ゲノム部位のうちの１つに対して最も良く作動することを示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【００３２】
【図２２−１】図２２は、Ｈｅｋ−３部位での編集が、プロトスペーサーの位置８においても、Ｈｅｋ−２部位での編集と比べて、より低いことを示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２２−２】図２２は、Ｈｅｋ−３部位での編集が、プロトスペーサーの位置８においても、Ｈｅｋ−２部位での編集と比べて、より低いことを示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２２−３】図２２は、Ｈｅｋ−３部位での編集が、プロトスペーサーの位置８においても、Ｈｅｋ−２部位での編集と比べて、より低いことを示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２２−４】図２２は、Ｈｅｋ−３部位での編集が、プロトスペーサーの位置８においても、Ｈｅｋ−２部位での編集と比べて、より低いことを示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２２−５】図２２は、Ｈｅｋ−３部位での編集が、プロトスペーサーの位置８においても、Ｈｅｋ−２部位での編集と比べて、より低いことを示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２２−６】図２２は、Ｈｅｋ−３部位での編集が、プロトスペーサーの位置８においても、Ｈｅｋ−２部位での編集と比べて、より低いことを示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２２−７】図２２は、Ｈｅｋ−３部位での編集が、プロトスペーサーの位置８においても、Ｈｅｋ−２部位での編集と比べて、より低いことを示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２２−８】図２２は、Ｈｅｋ−３部位での編集が、プロトスペーサーの位置８においても、Ｈｅｋ−２部位での編集と比べて、より低いことを示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２２−９】図２２は、Ｈｅｋ−３部位での編集が、プロトスペーサーの位置８においても、Ｈｅｋ−２部位での編集と比べて、より低いことを示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【００３３】
【図２３−１】図２３は、コンストラクトｐＮＭＧ−１６４〜ｐＮＭＧ−１７３について、ｅｃＴａｄＡの不活性なＣ末端Ｃａｓ９融合を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２３−２】図２３は、コンストラクトｐＮＭＧ−１６４〜ｐＮＭＧ−１７３について、ｅｃＴａｄＡの不活性なＣ末端Ｃａｓ９融合を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２３−３】図２３は、コンストラクトｐＮＭＧ−１６４〜ｐＮＭＧ−１７３について、ｅｃＴａｄＡの不活性なＣ末端Ｃａｓ９融合を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２３−４】図２３は、コンストラクトｐＮＭＧ−１６４〜ｐＮＭＧ−１７３について、ｅｃＴａｄＡの不活性なＣ末端Ｃａｓ９融合を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【００３４】
【図２４−１】図２４は、コンストラクトｐＮＭＧ−１７４〜ｐＮＭＧ−１７７について、ｅｃＴａｄＡの不活性なＣ末端Ｃａｓ９融合を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２４−２】図２４は、コンストラクトｐＮＭＧ−１７４〜ｐＮＭＧ−１７７について、ｅｃＴａｄＡの不活性なＣ末端Ｃａｓ９融合を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２４−３】図２４は、コンストラクトｐＮＭＧ−１７４〜ｐＮＭＧ−１７７について、ｅｃＴａｄＡの不活性なＣ末端Ｃａｓ９融合を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２４−４】図２４は、コンストラクトｐＮＭＧ−１７４〜ｐＮＭＧ−１７７について、ｅｃＴａｄＡの不活性なＣ末端Ｃａｓ９融合を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【００３５】
【図２５−１】図２５は、ｅｃＴａｄＡ核酸塩基編集因子（ｐＮＭＧ−１４３、ｐＮＭＧ−１４４、ｐＮＭＧ−１６４、およびｐＮＭＧ−１７７）からの編集結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２５−２】図２５は、ｅｃＴａｄＡ核酸塩基編集因子（ｐＮＭＧ−１４３、ｐＮＭＧ−１４４、ｐＮＭＧ−１６４、およびｐＮＭＧ−１７７）からの編集結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２５−３】図２５は、ｅｃＴａｄＡ核酸塩基編集因子（ｐＮＭＧ−１４３、ｐＮＭＧ−１４４、ｐＮＭＧ−１６４、およびｐＮＭＧ−１７７）からの編集結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【００３６】
【図２６−１】図２６は、ｅｃＴａｄＡ核酸塩基編集因子（ｐＮＭＧ−１６４、ｐＮＭＧ−１７７、ｐＮＭＧ−１７８、ｐＮＭＧ−１７９、およびｐＮＭＧ−１８０）からの編集結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２６−２】図２６は、ｅｃＴａｄＡ核酸塩基編集因子（ｐＮＭＧ−１６４、ｐＮＭＧ−１７７、ｐＮＭＧ−１７８、ｐＮＭＧ−１７９、およびｐＮＭＧ−１８０）からの編集結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２６−３】図２６は、ｅｃＴａｄＡ核酸塩基編集因子（ｐＮＭＧ−１６４、ｐＮＭＧ−１７７、ｐＮＭＧ−１７８、ｐＮＭＧ−１７９、およびｐＮＭＧ−１８０）からの編集結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２６−４】図２６は、ｅｃＴａｄＡ核酸塩基編集因子（ｐＮＭＧ−１６４、ｐＮＭＧ−１７７、ｐＮＭＧ−１７８、ｐＮＭＧ−１７９、およびｐＮＭＧ−１８０）からの編集結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２６−５】図２６は、ｅｃＴａｄＡ核酸塩基編集因子（ｐＮＭＧ−１６４、ｐＮＭＧ−１７７、ｐＮＭＧ−１７８、ｐＮＭＧ−１７９、およびｐＮＭＧ−１８０）からの編集結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２６−６】図２６は、ｅｃＴａｄＡ核酸塩基編集因子（ｐＮＭＧ−１６４、ｐＮＭＧ−１７７、ｐＮＭＧ−１７８、ｐＮＭＧ−１７９、およびｐＮＭＧ−１８０）からの編集結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２６−７】図２６は、ｅｃＴａｄＡ核酸塩基編集因子（ｐＮＭＧ−１６４、ｐＮＭＧ−１７７、ｐＮＭＧ−１７８、ｐＮＭＧ−１７９、およびｐＮＭＧ−１８０）からの編集結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２６−８】図２６は、ｅｃＴａｄＡ核酸塩基編集因子（ｐＮＭＧ−１６４、ｐＮＭＧ−１７７、ｐＮＭＧ−１７８、ｐＮＭＧ−１７９、およびｐＮＭＧ−１８０）からの編集結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２６−９】図２６は、ｅｃＴａｄＡ核酸塩基編集因子（ｐＮＭＧ−１６４、ｐＮＭＧ−１７７、ｐＮＭＧ−１７８、ｐＮＭＧ−１７９、およびｐＮＭＧ−１８０）からの編集結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【００３７】
【図２７−１】図２７は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２７−２】図２７は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２７−３】図２７は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２７−４】図２７は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２７−５】図２７は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２７−６】図２７は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２７−７】図２７は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２７−８】図２７は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２７−９】図２７は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【００３８】
【図２８−１】図２８は、Ｈｅｋ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２８−２】図２８は、Ｈｅｋ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２８−３】図２８は、Ｈｅｋ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２８−４】図２８は、Ｈｅｋ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２８−５】図２８は、Ｈｅｋ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２８−６】図２８は、Ｈｅｋ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２８−７】図２８は、Ｈｅｋ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２８−８】図２８は、Ｈｅｋ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２８−９】図２８は、Ｈｅｋ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２８−１０】図２８は、Ｈｅｋ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２８−１１】図２８は、Ｈｅｋ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２８−１２】図２８は、Ｈｅｋ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２８−１３】図２８は、Ｈｅｋ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図２８−１４】図２８は、Ｈｅｋ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【００３９】
【図２９−１】図２９は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２９−２】図２９は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２９−３】図２９は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２９−４】図２９は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２９−５】図２９は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２９−６】図２９は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２９−７】図２９は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２９−８】図２９は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２９−９】図２９は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２９−１０】図２９は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２９−１１】図２９は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図２９−１２】図２９は、Ｈｅｋ−３部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【００４０】
【図３０−１】図３０は、Ｈｅｋ−４部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３０−２】図３０は、Ｈｅｋ−４部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３０−３】図３０は、Ｈｅｋ−４部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３０−４】図３０は、Ｈｅｋ−４部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３０−５】図３０は、Ｈｅｋ−４部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３０−６】図３０は、Ｈｅｋ−４部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３０−７】図３０は、Ｈｅｋ−４部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３０−８】図３０は、Ｈｅｋ−４部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３０−９】図３０は、Ｈｅｋ−４部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３０−１０】図３０は、Ｈｅｋ−４部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３０−１１】図３０は、Ｈｅｋ−４部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３０−１２】図３０は、Ｈｅｋ−４部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【００４１】
【図３１−１】図３１は、ＲＮＦ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３１−２】図３１は、ＲＮＦ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３１−３】図３１は、ＲＮＦ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３１−４】図３１は、ＲＮＦ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３１−５】図３１は、ＲＮＦ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３１−６】図３１は、ＲＮＦ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３１−７】図３１は、ＲＮＦ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３１−８】図３１は、ＲＮＦ−２部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【００４２】
【図３２−１】図３２は、ＦＡＮＣＦ部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３２−２】図３２は、ＦＡＮＣＦ部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３２−３】図３２は、ＦＡＮＣＦ部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３２−４】図３２は、ＦＡＮＣＦ部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３２−５】図３２は、ＦＡＮＣＦ部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３２−６】図３２は、ＦＡＮＣＦ部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３２−７】図３２は、ＦＡＮＣＦ部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３２−８】図３２は、ＦＡＮＣＦ部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３２−９】図３２は、ＦＡＮＣＦ部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３２−１０】図３２は、ＦＡＮＣＦ部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３２−１１】図３２は、ＦＡＮＣＦ部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３２−１２】図３２は、ＦＡＮＣＦ部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【００４３】
【図３３−１】図３３は、ＥＭＸ−１部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３３−２】図３３は、ＥＭＸ−１部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３３−３】図３３は、ＥＭＸ−１部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３３−４】図３３は、ＥＭＸ−１部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３３−５】図３３は、ＥＭＸ−１部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３３−６】図３３は、ＥＭＸ−１部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３３−７】図３３は、ＥＭＸ−１部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３３−８】図３３は、ＥＭＸ−１部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３３−９】図３３は、ＥＭＸ−１部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３３−１０】図３３は、ＥＭＸ−１部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３３−１１】図３３は、ＥＭＸ−１部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３３−１２】図３３は、ＥＭＸ−１部位での編集の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【００４４】
【図３４−１】図３４は、Ｈｅｋ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図３４−２】図３４は、Ｈｅｋ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図３４−３】図３４は、Ｈｅｋ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図３４−４】図３４は、Ｈｅｋ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図３４−５】図３４は、Ｈｅｋ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図３４−６】図３４は、Ｈｅｋ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図３４−７】図３４は、Ｈｅｋ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図３４−８】図３４は、Ｈｅｋ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図３４−９】図３４は、Ｈｅｋ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図３４−１０】図３４は、Ｈｅｋ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図３４−１１】図３４は、Ｈｅｋ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図３４−１２】図３４は、Ｈｅｋ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図３４−１３】図３４は、Ｈｅｋ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図３４−１４】図３４は、Ｈｅｋ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図３４−１５】図３４は、Ｈｅｋ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図３４−１６】図３４は、Ｈｅｋ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【００４５】
【図３５−１】図３５は、Ｈｅｋ−３部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図３５−２】図３５は、Ｈｅｋ−３部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図３５−３】図３５は、Ｈｅｋ−３部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図３５−４】図３５は、Ｈｅｋ−３部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図３５−５】図３５は、Ｈｅｋ−３部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図３５−６】図３５は、Ｈｅｋ−３部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図３５−７】図３５は、Ｈｅｋ−３部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図３５−８】図３５は、Ｈｅｋ−３部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図３５−９】図３５は、Ｈｅｋ−３部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図３５−１０】図３５は、Ｈｅｋ−３部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図３５−１１】図３５は、Ｈｅｋ−３部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図３５−１２】図３５は、Ｈｅｋ−３部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図３５−１３】図３５は、Ｈｅｋ−３部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図３５−１４】図３５は、Ｈｅｋ−３部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【００４６】
【図３６−１】図３６は、Ｈｅｋ−４部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３６−２】図３６は、Ｈｅｋ−４部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３６−３】図３６は、Ｈｅｋ−４部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３６−４】図３６は、Ｈｅｋ−４部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３６−５】図３６は、Ｈｅｋ−４部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３６−６】図３６は、Ｈｅｋ−４部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３６−７】図３６は、Ｈｅｋ−４部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３６−８】図３６は、Ｈｅｋ−４部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３６−９】図３６は、Ｈｅｋ−４部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３６−１０】図３６は、Ｈｅｋ−４部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３６−１１】図３６は、Ｈｅｋ−４部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３６−１２】図３６は、Ｈｅｋ−４部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３６−１３】図３６は、Ｈｅｋ−４部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３６−１４】図３６は、Ｈｅｋ−４部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３６−１５】図３６は、Ｈｅｋ−４部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図３６−１６】図３６は、Ｈｅｋ−４部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【００４７】
【図３７−１】図３７は、ＥＭＸ−１部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３７−２】図３７は、ＥＭＸ−１部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３７−３】図３７は、ＥＭＸ−１部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３７−４】図３７は、ＥＭＸ−１部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３７−５】図３７は、ＥＭＸ−１部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３７−６】図３７は、ＥＭＸ−１部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３７−７】図３７は、ＥＭＸ−１部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３７−８】図３７は、ＥＭＸ−１部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３７−９】図３７は、ＥＭＸ−１部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３７−１０】図３７は、ＥＭＸ−１部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３７−１１】図３７は、ＥＭＸ−１部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３７−１２】図３７は、ＥＭＸ−１部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３７−１３】図３７は、ＥＭＸ−１部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３７−１４】図３７は、ＥＭＸ−１部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３７−１５】図３７は、ＥＭＸ−１部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図３７−１６】図３７は、ＥＭＸ−１部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【００４８】
【図３８−１】図３８は、ＲＮＦ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３８−２】図３８は、ＲＮＦ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３８−３】図３８は、ＲＮＦ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３８−４】図３８は、ＲＮＦ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３８−５】図３８は、ＲＮＦ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３８−６】図３８は、ＲＮＦ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３８−７】図３８は、ＲＮＦ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３８−８】図３８は、ＲＮＦ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３８−９】図３８は、ＲＮＦ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３８−１０】図３８は、ＲＮＦ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３８−１１】図３８は、ＲＮＦ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３８−１２】図３８は、ＲＮＦ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３８−１３】図３８は、ＲＮＦ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図３８−１４】図３８は、ＲＮＦ−２部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【００４９】
【図３９−１】図３９は、ＦＡＮＣＦ部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３９−２】図３９は、ＦＡＮＣＦ部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３９−３】図３９は、ＦＡＮＣＦ部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３９−４】図３９は、ＦＡＮＣＦ部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３９−５】図３９は、ＦＡＮＣＦ部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３９−６】図３９は、ＦＡＮＣＦ部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３９−７】図３９は、ＦＡＮＣＦ部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３９−８】図３９は、ＦＡＮＣＦ部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３９−９】図３９は、ＦＡＮＣＦ部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３９−１０】図３９は、ＦＡＮＣＦ部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３９−１１】図３９は、ＦＡＮＣＦ部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３９−１２】図３９は、ＦＡＮＣＦ部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３９−１３】図３９は、ＦＡＮＣＦ部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３９−１４】図３９は、ＦＡＮＣＦ部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３９−１５】図３９は、ＦＡＮＣＦ部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図３９−１６】図３９は、ＦＡＮＣＦ部位でのＣ末端融合の結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【００５０】
【図４０−１】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−２】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−３】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−４】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−５】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−６】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−７】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−８】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−９】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−１０】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−１１】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−１２】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−１３】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−１４】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−１５】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−１６】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−１７】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−１８】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−１９】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−２０】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−２１】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−２２】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−２３】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−２４】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−２５】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−２６】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−２７】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−２８】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−２９】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−３０】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−３１】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−３２】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−３３】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−３４】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−３５】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【図４０−３６】図４０は、Ｈｅｋ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４１に対応する。
【００５１】
【図４１−１】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−２】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−３】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−４】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−５】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−６】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−７】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−８】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−９】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−１０】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−１１】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−１２】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−１３】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−１４】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−１５】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−１６】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−１７】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−１８】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−１９】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−２０】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−２１】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−２２】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−２３】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−２４】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−２５】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−２６】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−２７】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−２８】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−２９】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−３０】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−３１】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−３２】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−３３】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−３４】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−３５】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−３６】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−３７】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−３８】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−３９】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図４１−４０】図４１は、Ｈｅｋ−３部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【００５２】
【図４２−１】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−２】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−３】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−４】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−５】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−６】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−７】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−８】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−９】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−１０】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−１１】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−１２】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−１３】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−１４】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−１５】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−１６】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−１７】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−１８】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−１９】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−２０】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−２１】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−２２】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−２３】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−２４】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−２５】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−２６】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−２７】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−２８】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−２９】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−３０】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−３１】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−３２】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−３３】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−３４】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−３５】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−３６】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−３７】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−３８】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−３９】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−４０】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−４１】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−４２】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−４３】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−４４】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−４５】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−４６】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−４７】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−４８】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−４９】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−５０】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−５１】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−５２】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−５３】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−５４】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−５５】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−５６】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−５７】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−５８】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−５９】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−６０】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−６１】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−６２】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−６３】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−６４】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−６５】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−６６】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−６７】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−６８】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−６９】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−７０】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−７１】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−７２】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−７３】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−７４】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−７５】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−７６】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−７７】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−７８】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−７９】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−８０】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−８１】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−８２】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−８３】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−８４】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−８５】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−８６】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−８７】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−８８】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−８９】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−９０】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−９１】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−９２】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−９３】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−９４】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−９５】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【図４２−９６】図４２は、ＲＮＦ−２部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４４に対応する。
【００５３】
【図４３−１】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−２】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−３】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−４】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−５】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−６】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−７】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−８】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−９】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−１０】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−１１】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−１２】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−１３】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−１４】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−１５】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−１６】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−１７】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−１８】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−１９】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−２０】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−２１】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−２２】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−２３】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−２４】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−２５】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−２６】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−２７】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−２８】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−２９】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−３０】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−３１】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−３２】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−３３】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【図４３−３４】図４３は、Ｈｅｋ−４部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４３に対応する。
【００５４】
【図４４−１】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−２】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−３】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−４】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−５】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−６】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−７】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−８】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−９】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−１０】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−１１】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−１２】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−１３】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−１４】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−１５】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−１６】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−１７】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−１８】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−１９】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−２０】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−２１】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−２２】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−２３】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−２４】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−２５】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−２６】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−２７】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−２８】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−２９】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【図４４−３０】図４４は、ＥＭＸ−１部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４６に対応する。
【００５５】
【図４５−１】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−２】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−３】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−４】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−５】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−６】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−７】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−８】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−９】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−１０】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−１１】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−１２】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−１３】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−１４】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−１５】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−１６】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−１７】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−１８】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−１９】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−２０】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−２１】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−２２】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−２３】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−２４】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−２５】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−２６】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−２７】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−２８】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図４５−２９】図４５は、ＦＡＮＣＦ部位でのトランスフェクションの結果を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【００５６】
【図４６】図４６は、ｓｇＲＮＡのデアミナーゼ編集を示す。
【００５７】
【図４７】図４７は、様々な部位での融合のために開発されたコンストラクトを示す。
【００５８】
【図４８】図４８は、様々な部位での種々の融合のためのインデル率を示す。
【００５９】
【図４９】図４９は、上から下へ配列番号４６、４５、６、４２、４３、および４６８にそれぞれ示される塩基編集部位のプロトスペーサーおよびＰＡＭ配列を示す。
【００６０】
【図５０】図５０は、さらに変異したＤ１０８残基を使用して、様々な部位での融合のために開発されたコンストラクトを示す。
【００６１】
【図５１】図５１は、上から下へ配列番号６、４６、および４２それぞれに示される塩基編集部位のプロトスペーサーおよびＰＡＭ配列を示す。
【００６２】
【図５２−１】図５２は、変異したＤ１０８残基を使用することで、デアミナーゼにＲＮＡを基質として受け入れなくさせ、および編集成果(outcome)を変えるという結果(results)を示す。
【図５２−２】図５２は、変異したＤ１０８残基を使用することで、デアミナーゼにＲＮＡを基質として受け入れなくさせ、および編集成果(outcome)を変えるという結果(results)を示す。
【００６３】
【図５３−１】図５３は、変異したＤ１０８残基を使用することで、デアミナーゼにＲＮＡを基質として受け入れなくさせ、および編集成果を変えるという結果を示す。
【図５３−２】図５３は、変異したＤ１０８残基を使用することで、デアミナーゼにＲＮＡを基質として受け入れなくさせ、および編集成果を変えるという結果を示す。
【００６４】
【図５４】図５４は、様々な部位での融合のために開発されたコンストラクトを示す。
【００６５】
【図５５】図５５は、上から下へ配列番号６、３５８、３５９にそれぞれ示される塩基編集部位のプロトスペーサーおよびＰＡＭ配列を示す。
【００６６】
【図５６】図５６は、ＨＥＫ部位２上のＡＢＥの結果を示す。
【００６７】
【図５７−１】図５７は、ＨＥＫ部位２上のＡＢＥの結果を示す。
【図５７−２】図５７は、ＨＥＫ部位２上のＡＢＥの結果を示す。
【００６８】
【図５８】図５８は、様々なリンカー長を使用して様々な部位での融合のために開発されたコンストラクトを示す。
【００６９】
【図５９】図５９は、塩基編集機能に対するリンカー長の重要性を示す。
【００７０】
【図６０】図６０は、塩基編集機能に対するリンカー長の重要性を示す。
【００７１】
【図６１】図６１は、デアミナーゼのダイマー化を示す模式図である。
【００７２】
【図６２】図６２は、様々なリンカー長を使用して様々な部位での融合のために開発されたコンストラクトを示す。
【００７３】
【図６３】図６３は、現在の編集因子アーキテクチャ（上パネル）、in transダイマー化（下パネル、左）、およびin cisダイマー化（下パネル、右）を示す。
【００７４】
【図６４−１】図６４は、塩基編集からのダイマー化の結果を示す。
【図６４−２】図６４は、塩基編集からのダイマー化の結果を示す。
【００７５】
【図６５−１】図６５は、塩基編集からのダイマー化の結果を示す。
【図６５−２】図６５は、塩基編集からのダイマー化の結果を示す。
【００７６】
【図６６−１】図６６は、塩基編集からのダイマー化の結果を示す。
【図６６−２】図６６は、塩基編集からのダイマー化の結果を示す。
【００７７】
【図６７】図６７は、様々なｓｇＲＮＡ部位での融合のために開発されたコンストラクトを示す。
【００７８】
【図６８−１】図６８は、新しい選択配列に対するＡＢＥ編集因子の進化を示す。配列は上から下へ、および左から右へ配列番号７０７〜７１９にそれぞれ対応する。
【図６８−２】図６８は、新しい選択配列に対するＡＢＥ編集因子の進化を示す。配列は上から下へ、および左から右へ配列番号７０７〜７１９にそれぞれ対応する。
【００７９】
【図６９−１】図６９は、Ｑ４停止部位を標的にする現在の編集因子を示す。配列は上から下へ、配列番号６２４〜６２８に対応する。
【図６９−２】図６９は、Ｑ４停止部位を標的にする現在の編集因子を示す。配列は上から下へ、配列番号６２４〜６２８に対応する。
【００８０】
【図７０−１】図７０は、Ｗ１５停止部位を標的にする現在の編集因子を示す。配列は上から下へ、配列番号６２９〜６３３にそれぞれ対応する。
【図７０−２】図７０は、Ｗ１５停止部位を標的にする現在の編集因子を示す。配列は上から下へ、配列番号６２９〜６３３にそれぞれ対応する。
【００８１】
【図７１】図７１は、ＨＥＫ２９３部位２配列を示す。配列は、配列番号３６０に対応する。
【００８２】
【図７２−１】図７２は、図７１の配列を使用する様々なｅｄＴａｄＡ変異による第１のランの結果を示す。
【図７２−２】図７２は、図７１の配列を使用する様々なｅｄＴａｄＡ変異による第１のランの結果を示す。
【図７２−３】図７２は、図７１の配列を使用する様々なｅｄＴａｄＡ変異による第１のランの結果を示す。
【図７２−４】図７２は、図７１の配列を使用する様々なｅｄＴａｄＡ変異による第１のランの結果を示す。
【図７２−５】図７２は、図７１の配列を使用する様々なｅｄＴａｄＡ変異による第１のランの結果を示す。
【図７２−６】図７２は、図７１の配列を使用する様々なｅｄＴａｄＡ変異による第１のランの結果を示す。
【図７２−７】図７２は、図７１の配列を使用する様々なｅｄＴａｄＡ変異による第１のランの結果を示す。
【図７２−８】図７２は、図７１の配列を使用する様々なｅｄＴａｄＡ変異による第１のランの結果を示す。
【図７２−９】図７２は、図７１の配列を使用する様々なｅｄＴａｄＡ変異による第１のランの結果を示す。
【００８３】
【図７３−１】図７３は、図７１の配列を使用する様々なｅｄＴａｄＡ変異による第２のランの結果を示す。
【図７３−２】図７３は、図７１の配列を使用する様々なｅｄＴａｄＡ変異による第２のランの結果を示す。
【図７３−３】図７３は、図７１の配列を使用する様々なｅｄＴａｄＡ変異による第２のランの結果を示す。
【図７３−４】図７３は、図７１の配列を使用する様々なｅｄＴａｄＡ変異による第２のランの結果を示す。
【図７３−５】図７３は、図７１の配列を使用する様々なｅｄＴａｄＡ変異による第２のランの結果を示す。
【図７３−６】図７３は、図７１の配列を使用する様々なｅｄＴａｄＡ変異による第２のランの結果を示す。
【００８４】
【図７４】図７４は、ＦＡＮＣＦ配列を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【００８５】
【図７５−１】図７５は、様々なｅｄＴａｄＡ変異および図７４の配列を使用する第２のランの結果を示す。
【図７５−２】図７５は、様々なｅｄＴａｄＡ変異および図７４の配列を使用する第２のランの結果を示す。
【００８６】
【図７６−１】図７６は、すべての部位上の変異したＤ１０８の結果を示す。
【図７６−２】図７６は、すべての部位上の変異したＤ１０８の結果を示す。
【図７６−３】図７６は、すべての部位上の変異したＤ１０８の結果を示す。
【図７６−４】図７６は、すべての部位上の変異したＤ１０８の結果を示す。
【００８７】
【図７７−１】図７７は、先のラン（左パネル）、および超長リンカーによって妨げられるmut-mut融合からのin transデータを示す。
【図７７−２】図７７は、先のラン（左パネル）、および超長リンカーによって妨げられるmut-mut融合からのin transデータを示す。
【００８８】
【図７８】図７８は、ｍｕｔＴａｄＡをＡＢＥへ繋げた結果を示す。
【００８９】
【図７９】図７９は、試験されたすべての阻害剤のコンストラクトを示す。
【００９０】
【図８０】図８０は、ＡＡＧをＡＢＥへ繋げたときに使用されたコンストラクトを示す。
【００９１】
【図８１】図８１は、ＡＡＧをＡＢＥへ繋げたことを示す模式図である。
【００９２】
【図８２−１】図８２は、ＡＡＧをＡＢＥへ繋げた結果を示す。
【図８２−２】図８２は、ＡＡＧをＡＢＥへ繋げた結果を示す。
【００９３】
【図８３】図８３は、ＡＡＧを、ＴａｄＡのＮ末端をもつＡＢＥへ繋げたときに使用されたコンストラクトを示す。
【００９４】
【図８４】図８４は、ＡＡＧを、ＴａｄＡのＮ末端をもつＡＢＥへ繋げたことを示す模式図である。
【００９５】
【図８５】図８５は、ＡＡＧをＡＢＥへ繋げた結果を示す。
【００９６】
【図８６】図８６は、ＥｎｄｏＶをＡＢＥへ繋げたときに使用されたコンストラクトを示す。
【００９７】
【図８７】図８７は、ＥｎｄｏＶをＡＢＥへ繋げたことを示す模式図である。
【００９８】
【図８８−１】図８８は、ＥｎｄｏＶをＡＢＥへ繋げた結果を示す。
【図８８−２】図８８は、ＥｎｄｏＶをＡＢＥへ繋げた結果を示す。
【００９９】
【図８９】図８９は、ＵＧＩをＡＢＥへ繋げたときに使用されたコンストラクトを示す。
【０１００】
【図９０−１】図９０は、ＵＧＩをＡＢＥの末端へ繋げた結果を示す。
【図９０−２】図９０は、ＵＧＩをＡＢＥの末端へ繋げた結果を示す。
【０１０１】
【図９１−１】図９１は、Ａ→Ｇ編集を増加させた様々な阻害剤の結果を示す。
【図９１−２】図９１は、Ａ→Ｇ編集を増加させた様々な阻害剤の結果を示す。
【図９１−３】図９１は、Ａ→Ｇ編集を増加させた様々な阻害剤の結果を示す。
【図９１−４】図９１は、Ａ→Ｇ編集を増加させた様々な阻害剤の結果を示す。
【図９１−５】図９１は、Ａ→Ｇ編集を増加させた様々な阻害剤の結果を示す。
【図９１−６】図９１は、Ａ→Ｇ編集を増加させた様々な阻害剤の結果を示す。
【０１０２】
【図９２−１】図９２は、原核生物のＴａｄＡアミノ酸配列の配列アライメントを示す。配列は上から下へ、配列番号６３４〜６５７にそれぞれ対応する。
【図９２−２】図９２は、原核生物のＴａｄＡアミノ酸配列の配列アライメントを示す。配列は上から下へ、配列番号６３４〜６５７にそれぞれ対応する。
【０１０３】
【図９３】図９３は、ＴａｄＡアミノ酸配列の相対的な配列同一性分析の模式図を示す。
【０１０４】
【図９４】図９４は、例示的なアデノシン塩基編集プロセスの略図を示す。
【０１０５】
【図９５】図９５は、アデノシンを脱アミノ化してイノシンにする例示的なアデノシン塩基編集因子の略図を示す。
【０１０６】
【図９６】図９６は、例示的な塩基編集選択プラスミドの模式図を示す。
【０１０７】
【図９７】図９７は、ｅｃＴａｄＡにおいて同定された変異を含むクローンのリストを示す。
【０１０８】
【図９８−１】図９８は、生存クローンからの選択プラスミドの例示的なシーケンシング分析を示す。配列は上から下へ、配列番号６５８〜６６１にそれぞれ対応する。
【図９８−２】図９８は、生存クローンからの選択プラスミドの例示的なシーケンシング分析を示す。配列は上から下へ、配列番号６５８〜６６１にそれぞれ対応する。
【０１０９】
【図９９】図９９は、進化の第３ラウンドからの例示的なアデノシン塩基編集因子の模式図を示す。
【０１１０】
【図１００】図１００は、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞におけるＡ→Ｇ変換のパーセンテージを示す。
【０１１１】
【図１０１】図１０１は、例示的な塩基編集選択プラスミドの模式図を示す。
【０１１２】
【図１０２】図１０２は、S. aureus ＴａｄＡのバーダイン(verdine)結晶構造の略図を示す。S. aureus ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡの相同体）は、共結晶化されたそのｔＲＮＡ基質とともに示される。赤色矢は、ｔＲＮＡ基質における様々な核酸とのＨ結合接触である。Losey, H.C., et al., "Crystal structure of Staphylococcus sureus tRNA adenosine deaminase tadA in complex with RNA", Nature Struct. Mol. Biol. 2, 153-159 (2006)を参照。
【０１１３】
【図１０３】図１０３は、変異したｅｃＴａｄＡを同定する、ｅｃＴａｄＡ＿２．２およびｄＣａｓ９を含有するコンストラクトの模式図を示す。
【０１１４】
【図１０４】図１０４は、部位Ｅ２５およびＲ２６でのｅｃＴａｄＡ進化（進化＃４）の結果を示す。
【０１１５】
【図１０５】図１０５は、部位Ｒ１０７でのｅｃＴａｄＡ進化（進化＃４）の結果を示す。
【０１１６】
【図１０６】図１０６は、部位Ａ１４２およびＡ１４３でのｅｃＴａｄＡ進化（進化＃４）の結果を示す。
【０１１７】
【図１０７−１】図１０７は、生存コロニーからの選択プラスミドの例示的なシーケンシング分析を示す。配列は上から下へ、配列番号６６２〜６７１にそれぞれ対応する。
【図１０７−２】図１０７は、生存コロニーからの選択プラスミドの例示的なシーケンシング分析を示す。配列は上から下へ、配列番号６６２〜６７１にそれぞれ対応する。
【０１１８】
【図１０８−１】図１０８は、Ｈｅｋ−２部位で編集した結果の概要を示す。図中に提供されるＨｅｋ−２配列は、Ａ→Ｇ編集が起こるＤＮＡ鎖である配列番号４１の逆相補体を表す。配列は、配列番号６に対応する。
【図１０８−２】図１０８は、Ｈｅｋ−２部位で編集した結果の概要を示す。図中に提供されるＨｅｋ−２配列は、Ａ→Ｇ編集が起こるＤＮＡ鎖である配列番号４１の逆相補体を表す。配列は、配列番号６に対応する。
【図１０８−３】図１０８は、Ｈｅｋ−２部位で編集した結果の概要を示す。図中に提供されるＨｅｋ−２配列は、Ａ→Ｇ編集が起こるＤＮＡ鎖である配列番号４１の逆相補体を表す。配列は、配列番号６に対応する。
【図１０８−４】図１０８は、Ｈｅｋ−２部位で編集した結果の概要を示す。図中に提供されるＨｅｋ−２配列は、Ａ→Ｇ編集が起こるＤＮＡ鎖である配列番号４１の逆相補体を表す。配列は、配列番号６に対応する。
【０１１９】
【図１０９−１】図１０９は、Ｈｅｋ２−３部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６３に対応する。
【図１０９−２】図１０９は、Ｈｅｋ２−３部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６３に対応する。
【図１０９−３】図１０９は、Ｈｅｋ２−３部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６３に対応する。
【図１０９−４】図１０９は、Ｈｅｋ２−３部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６３に対応する。
【０１２０】
【図１１０−１】図１１０は、Ｈｅｋ２−６部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６４に対応する。
【図１１０−２】図１１０は、Ｈｅｋ２−６部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６４に対応する。
【図１１０−３】図１１０は、Ｈｅｋ２−６部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６４に対応する。
【図１１０−４】図１１０は、Ｈｅｋ２−６部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６４に対応する。
【０１２１】
【図１１１−１】図１１１は、Ｈｅｋ２−７部位で編集した結果の概要を示す。図中に提供されるＨｅｋ２−７配列は、Ａ→Ｇ編集が起こるＤＮＡ鎖の逆相補体を表す。配列は、配列番号３６５に対応する。
【図１１１−２】図１１１は、Ｈｅｋ２−７部位で編集した結果の概要を示す。図中に提供されるＨｅｋ２−７配列は、Ａ→Ｇ編集が起こるＤＮＡ鎖の逆相補体を表す。配列は、配列番号３６５に対応する。
【図１１１−３】図１１１は、Ｈｅｋ２−７部位で編集した結果の概要を示す。図中に提供されるＨｅｋ２−７配列は、Ａ→Ｇ編集が起こるＤＮＡ鎖の逆相補体を表す。配列は、配列番号３６５に対応する。
【図１１１−４】図１１１は、Ｈｅｋ２−７部位で編集した結果の概要を示す。図中に提供されるＨｅｋ２−７配列は、Ａ→Ｇ編集が起こるＤＮＡ鎖の逆相補体を表す。配列は、配列番号３６５に対応する。
【０１２２】
【図１１２−１】図１１２は、Ｈｅｋ２−１０部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６６に対応する。
【図１１２−２】図１１２は、Ｈｅｋ２−１０部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６６に対応する。
【図１１２−３】図１１２は、Ｈｅｋ２−１０部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６６に対応する。
【図１１２−４】図１１２は、Ｈｅｋ２−１０部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６６に対応する。
【０１２３】
【図１１３−１】図１１３は、Ｈｅｋ−３部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図１１３−２】図１１３は、Ｈｅｋ−３部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図１１３−３】図１１３は、Ｈｅｋ−３部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【０１２４】
【図１１４−１】図１１４は、ＦＡＮＣＦ部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図１１４−２】図１１４は、ＦＡＮＣＦ部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図１１４−３】図１１４は、ＦＡＮＣＦ部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【０１２５】
【図１１５−１】図１１５は、Ｈｅｋ−２部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６７に対応する。
【図１１５−２】図１１５は、Ｈｅｋ−２部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６７に対応する。
【図１１５−３】図１１５は、Ｈｅｋ−２部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６７に対応する。
【図１１５−４】図１１５は、Ｈｅｋ−２部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６７に対応する。
【図１１５−５】図１１５は、Ｈｅｋ−２部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６７に対応する。
【図１１５−６】図１１５は、Ｈｅｋ−２部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６７に対応する。
【０１２６】
【図１１６−１】図１１６は、Ｈｅｋ２−２部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６８に対応する。
【図１１６−２】図１１６は、Ｈｅｋ２−２部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６８に対応する。
【図１１６−３】図１１６は、Ｈｅｋ２−２部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６８に対応する。
【図１１６−４】図１１６は、Ｈｅｋ２−２部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６８に対応する。
【０１２７】
【図１１７−１】図１１７は、Ｈｅｋ２−３部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６３に対応する。
【図１１７−２】図１１７は、Ｈｅｋ２−３部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６３に対応する。
【図１１７−３】図１１７は、Ｈｅｋ２−３部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６３に対応する。
【０１２８】
【図１１８−１】図１１８は、Ｈｅｋ２−６部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６４に対応する。
【図１１８−２】図１１８は、Ｈｅｋ２−６部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６４に対応する。
【図１１８−３】図１１８は、Ｈｅｋ２−６部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６４に対応する。
【図１１８−４】図１１８は、Ｈｅｋ２−６部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６４に対応する。
【０１２９】
【図１１９−１】図１１９は、Ｈｅｋ２−７部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６５に対応する。
【図１１９−２】図１１９は、Ｈｅｋ２−７部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６５に対応する。
【図１１９−３】図１１９は、Ｈｅｋ２−７部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６５に対応する。
【図１１９−４】図１１９は、Ｈｅｋ２−７部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６５に対応する。
【０１３０】
【図１２０−１】図１２０は、Ｈｅｋ２−１０部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６６に対応する。
【図１２０−２】図１２０は、Ｈｅｋ２−１０部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６６に対応する。
【図１２０−３】図１２０は、Ｈｅｋ２−１０部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６６に対応する。
【図１２０−４】図１２０は、Ｈｅｋ２−１０部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号３６６に対応する。
【０１３１】
【図１２１−１】図１２１は、Ｈｅｋ−３部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【図１２１−２】図１２１は、Ｈｅｋ−３部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号４２に対応する。
【０１３２】
【図１２２−１】図１２２は、ＦＡＮＣＦ部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図１２２−２】図１２２は、ＦＡＮＣＦ部位で編集した結果の概要を示す。配列は、配列番号４５に対応する。
【０１３３】
【図１２３】図１２３は、ＨＥＫ２、ＨＥＫ２−２、ＨＥＫ２−３、ＨＥＫ２−６、ＨＥＫ２−７、およびＨＥＫ２−１０部位でのｅｃＴａｄＡ進化（進化＃４）の結果を示す。使用されたコンストラクトは、ｐＮＭＧ−３７０（進化＃２）、ｐＮＭＧ−３７１（進化＃３）、およびｐＮＭＧ３８２−３８９（進化＃４）であった。配列は上から下へ、配列番号７、３６８、３６３、３６４、３６９、および３７０にそれぞれ対応する。
【０１３４】
【図１２４】図１２４は、ｅｃＴａｄＡ進化（進化＃５）に使用されたｅｃＴａｄＡおよびｄＣａｓ９を含有するコンストラクトの模式図を示す。
【０１３５】
【図１２５−１】図１２５は、第５ラウンド進化（１２８ｕｇ／ｍＬ ｃｈｌｏｒ、７ｈ）後にアッセイされたクローンの結果を示す表である。
【図１２５−２】図１２５は、第５ラウンド進化（１２８ｕｇ／ｍＬ ｃｈｌｏｒ、７ｈ）後にアッセイされたクローンの結果を示す表である。
【０１３６】
【図１２６Ａ】図１２６Ａ〜１２６Ｅは、変動する条件下で第５ラウンド後にアッセイされたサブクローニングされ再形質転換されたクローンの結果を示す表である。
【図１２６Ｂ】図１２６Ａ〜１２６Ｅは、変動する条件下で第５ラウンド後にアッセイされたサブクローニングされ再形質転換されたクローンの結果を示す表である。
【図１２６Ｃ】図１２６Ａ〜１２６Ｅは、変動する条件下で第５ラウンド後にアッセイされたサブクローニングされ再形質転換されたクローンの結果を示す表である。
【図１２６Ｄ】図１２６Ａ〜１２６Ｅは、変動する条件下で第５ラウンド後にアッセイされたサブクローニングされ再形質転換されたクローンの結果を示す表である。
【図１２６Ｅ】図１２６Ａ〜１２６Ｅは、変動する条件下で第５ラウンド後にアッセイされたサブクローニングされ再形質転換されたクローンの結果を示す表である。
【０１３７】
【図１２７】図１２７は、第５ラウンド進化後にアッセイされたスペクチノマイシン選択クローンからの増幅産物の結果を示す表である。
【０１３８】
【図１２８−１】図１２８は、第５ラウンド進化後にアッセイされたクローンの結果を示す表である。
【図１２８−２】図１２８は、第５ラウンド進化後にアッセイされたクローンの結果を示す表である。
【０１３９】
【図１２９−１】図１２９は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、Ｈｅｋ−２部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。配列は、配列番号６に対応する。
【図１２９−２】図１２９は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、Ｈｅｋ−２部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。配列は、配列番号６に対応する。
【０１４０】
【図１３０−１】図１３０は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、Ｈｅｋ２−１部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。図中に提供されるＨｅｋ２−１配列は、ＡからＧへの編集が起こるＤＮＡ鎖を表す。配列は、配列番号４６５に対応する。
【図１３０−２】図１３０は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、Ｈｅｋ２−１部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。図中に提供されるＨｅｋ２−１配列は、ＡからＧへの編集が起こるＤＮＡ鎖を表す。配列は、配列番号４６５に対応する。
【０１４１】
【図１３１−１】図１３１は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、Ｈｅｋ２−２部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。配列は、配列番号３６８に対応する。
【図１３１−２】図１３１は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、Ｈｅｋ２−２部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。配列は、配列番号３６８に対応する。
【０１４２】
【図１３２】図１３２は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、Ｈｅｋ２−３部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。配列は、配列番号３６３に対応する。
【０１４３】
【図１３３】図１３３は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、Ｈｅｋ２−４部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。図中に提供されるＨｅｋ２−４配列は、Ａ→Ｇ編集が起こるＤＮＡ鎖を表す。配列は、配列番号４６６に対応する。
【０１４４】
【図１３４−１】図１３４は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、Ｈｅｋ２−６部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。配列は、配列番号３６４に対応する。
【図１３４−２】図１３４は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、Ｈｅｋ２−６部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。配列は、配列番号３６４に対応する。
【０１４５】
【図１３５−１】図１３５は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、Ｈｅｋ２−９部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。図中に提供されるＨｅｋ２−９配列は、Ａ→Ｇ編集が起こるＤＮＡ鎖を表す。配列は、配列番号４６７に対応する。
【図１３５−２】図１３５は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、Ｈｅｋ２−９部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。図中に提供されるＨｅｋ２−９配列は、Ａ→Ｇ編集が起こるＤＮＡ鎖を表す。配列は、配列番号４６７に対応する。
【０１４６】
【図１３６−１】図１３６は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、Ｈｅｋ２−１０部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。図中に提供されるＨｅｋ２−１０配列は、Ａ→Ｇ編集が起こるＤＮＡ鎖を表す。配列は、配列番号３７０に対応する。
【図１３６−２】図１３６は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、Ｈｅｋ２−１０部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。図中に提供されるＨｅｋ２−１０配列は、Ａ→Ｇ編集が起こるＤＮＡ鎖を表す。配列は、配列番号３７０に対応する。
【０１４７】
【図１３７−１】図１３７は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、Ｈｅｋ３部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。配列は、配列番号４２に対応する。
【図１３７−２】図１３７は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、Ｈｅｋ３部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。配列は、配列番号４２に対応する。
【０１４８】
【図１３８−１】図１３８は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、ＲＮＦ２部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。図中に提供されるＨｅｋ２−１０配列は、Ａ→Ｇ編集が起こるＤＮＡ鎖を表す。配列は、配列番号４６８に対応する。
【図１３８−２】図１３８は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、ＲＮＦ２部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。図中に提供されるＨｅｋ２−１０配列は、Ａ→Ｇ編集が起こるＤＮＡ鎖を表す。配列は、配列番号４６８に対応する。
【０１４９】
【図１３９−１】図１３９は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、ＦＡＮＣＦ部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。図中に提供されるＨｅｋ２−１０配列は、Ａ→Ｇ編集が起こるＤＮＡ鎖を表す。配列は、配列番号４５に対応する。
【図１３９−２】図１３９は、ｐＮＭＧ−３４６−３４９を含む、操作されたS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）を含有する塩基編集因子を使用して、ＦＡＮＣＦ部位で編集した結果の概要を示す。比較として、ｐＮＭＧ−３３９−３４１を含む操作されたE. coli ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）を含有する編集因子の結果が示される。図中に提供されるＨｅｋ２−１０配列は、Ａ→Ｇ編集が起こるＤＮＡ鎖を表す。配列は、配列番号４５に対応する。
【０１５０】
【図１４０−１】図１４０は、アデノシン塩基編集因子（ＡＢＥ）コンストラクトの様々な略図を示す。編集因子、例として「ｐＮＭＧ−３６７」のアイデンティティーは、表４中に示される。以下の変異は、以下のとおりに省略される：ｅｃＴａｄＡ１（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ２（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ Ｄ１４７Ｙ Ｅ１５５Ｖ）、ｅｃＴａｄＡ３（ｅｃＴａｄＡ２＋Ｌ８４Ｆ Ｈ１２３Ｙ Ｉ１５６Ｆ）、ｅｃＴａｄＡ３＋（ｅｃＴａｄＡ３＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｈ３６Ｌ Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ３（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｎ３７Ｓ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１２（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｃ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１４（ｅｃＴａｄＡ３＋ＲＳ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６０Ｅ）、およびｅｃＴａｄＡ５ａ１＋（ｅｃＴａｄＡ５ａ１＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ９（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｒ Ｋ１６１Ｔ）。上３つのＡＢＥ ５ａコンストラクトのヘテロダイマーが作製され、次いでホモダイマーと比べて試験された。ＡＢＥ編集因子のヘテロダイマー版は、典型的には、対応するホモダイマーのコンストラクトより良好に働く。ホモダイマーおよびヘテロダイマーの両コンストラクトは、図１４０に示される。
【図１４０−２】図１４０は、アデノシン塩基編集因子（ＡＢＥ）コンストラクトの様々な略図を示す。編集因子、例として「ｐＮＭＧ−３６７」のアイデンティティーは、表４中に示される。以下の変異は、以下のとおりに省略される：ｅｃＴａｄＡ１（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ２（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ Ｄ１４７Ｙ Ｅ１５５Ｖ）、ｅｃＴａｄＡ３（ｅｃＴａｄＡ２＋Ｌ８４Ｆ Ｈ１２３Ｙ Ｉ１５６Ｆ）、ｅｃＴａｄＡ３＋（ｅｃＴａｄＡ３＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｈ３６Ｌ Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ３（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｎ３７Ｓ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１２（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｃ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１４（ｅｃＴａｄＡ３＋ＲＳ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６０Ｅ）、およびｅｃＴａｄＡ５ａ１＋（ｅｃＴａｄＡ５ａ１＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ９（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｒ Ｋ１６１Ｔ）。上３つのＡＢＥ ５ａコンストラクトのヘテロダイマーが作製され、次いでホモダイマーと比べて試験された。ＡＢＥ編集因子のヘテロダイマー版は、典型的には、対応するホモダイマーのコンストラクトより良好に働く。ホモダイマーおよびヘテロダイマーの両コンストラクトは、図１４０に示される。
【図１４０−３】図１４０は、アデノシン塩基編集因子（ＡＢＥ）コンストラクトの様々な略図を示す。編集因子、例として「ｐＮＭＧ−３６７」のアイデンティティーは、表４中に示される。以下の変異は、以下のとおりに省略される：ｅｃＴａｄＡ１（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ２（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ Ｄ１４７Ｙ Ｅ１５５Ｖ）、ｅｃＴａｄＡ３（ｅｃＴａｄＡ２＋Ｌ８４Ｆ Ｈ１２３Ｙ Ｉ１５６Ｆ）、ｅｃＴａｄＡ３＋（ｅｃＴａｄＡ３＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｈ３６Ｌ Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ３（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｎ３７Ｓ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１２（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｃ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１４（ｅｃＴａｄＡ３＋ＲＳ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６０Ｅ）、およびｅｃＴａｄＡ５ａ１＋（ｅｃＴａｄＡ５ａ１＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ９（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｒ Ｋ１６１Ｔ）。上３つのＡＢＥ ５ａコンストラクトのヘテロダイマーが作製され、次いでホモダイマーと比べて試験された。ＡＢＥ編集因子のヘテロダイマー版は、典型的には、対応するホモダイマーのコンストラクトより良好に働く。ホモダイマーおよびヘテロダイマーの両コンストラクトは、図１４０に示される。
【図１４０−４】図１４０は、アデノシン塩基編集因子（ＡＢＥ）コンストラクトの様々な略図を示す。編集因子、例として「ｐＮＭＧ−３６７」のアイデンティティーは、表４中に示される。以下の変異は、以下のとおりに省略される：ｅｃＴａｄＡ１（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ２（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ Ｄ１４７Ｙ Ｅ１５５Ｖ）、ｅｃＴａｄＡ３（ｅｃＴａｄＡ２＋Ｌ８４Ｆ Ｈ１２３Ｙ Ｉ１５６Ｆ）、ｅｃＴａｄＡ３＋（ｅｃＴａｄＡ３＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｈ３６Ｌ Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ３（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｎ３７Ｓ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１２（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｃ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１４（ｅｃＴａｄＡ３＋ＲＳ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６０Ｅ）、およびｅｃＴａｄＡ５ａ１＋（ｅｃＴａｄＡ５ａ１＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ９（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｒ Ｋ１６１Ｔ）。上３つのＡＢＥ ５ａコンストラクトのヘテロダイマーが作製され、次いでホモダイマーと比べて試験された。ＡＢＥ編集因子のヘテロダイマー版は、典型的には、対応するホモダイマーのコンストラクトより良好に働く。ホモダイマーおよびヘテロダイマーの両コンストラクトは、図１４０に示される。
【図１４０−５】図１４０は、アデノシン塩基編集因子（ＡＢＥ）コンストラクトの様々な略図を示す。編集因子、例として「ｐＮＭＧ−３６７」のアイデンティティーは、表４中に示される。以下の変異は、以下のとおりに省略される：ｅｃＴａｄＡ１（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ２（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ Ｄ１４７Ｙ Ｅ１５５Ｖ）、ｅｃＴａｄＡ３（ｅｃＴａｄＡ２＋Ｌ８４Ｆ Ｈ１２３Ｙ Ｉ１５６Ｆ）、ｅｃＴａｄＡ３＋（ｅｃＴａｄＡ３＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｈ３６Ｌ Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ３（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｎ３７Ｓ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１２（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｃ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１４（ｅｃＴａｄＡ３＋ＲＳ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６０Ｅ）、およびｅｃＴａｄＡ５ａ１＋（ｅｃＴａｄＡ５ａ１＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ９（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｒ Ｋ１６１Ｔ）。上３つのＡＢＥ ５ａコンストラクトのヘテロダイマーが作製され、次いでホモダイマーと比べて試験された。ＡＢＥ編集因子のヘテロダイマー版は、典型的には、対応するホモダイマーのコンストラクトより良好に働く。ホモダイマーおよびヘテロダイマーの両コンストラクトは、図１４０に示される。
【図１４０−６】図１４０は、アデノシン塩基編集因子（ＡＢＥ）コンストラクトの様々な略図を示す。編集因子、例として「ｐＮＭＧ−３６７」のアイデンティティーは、表４中に示される。以下の変異は、以下のとおりに省略される：ｅｃＴａｄＡ１（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ２（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ Ｄ１４７Ｙ Ｅ１５５Ｖ）、ｅｃＴａｄＡ３（ｅｃＴａｄＡ２＋Ｌ８４Ｆ Ｈ１２３Ｙ Ｉ１５６Ｆ）、ｅｃＴａｄＡ３＋（ｅｃＴａｄＡ３＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｈ３６Ｌ Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ３（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｎ３７Ｓ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１２（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｃ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１４（ｅｃＴａｄＡ３＋ＲＳ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６０Ｅ）、およびｅｃＴａｄＡ５ａ１＋（ｅｃＴａｄＡ５ａ１＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ９（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｒ Ｋ１６１Ｔ）。上３つのＡＢＥ ５ａコンストラクトのヘテロダイマーが作製され、次いでホモダイマーと比べて試験された。ＡＢＥ編集因子のヘテロダイマー版は、典型的には、対応するホモダイマーのコンストラクトより良好に働く。ホモダイマーおよびヘテロダイマーの両コンストラクトは、図１４０に示される。
【図１４０−７】図１４０は、アデノシン塩基編集因子（ＡＢＥ）コンストラクトの様々な略図を示す。編集因子、例として「ｐＮＭＧ−３６７」のアイデンティティーは、表４中に示される。以下の変異は、以下のとおりに省略される：ｅｃＴａｄＡ１（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ２（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ Ｄ１４７Ｙ Ｅ１５５Ｖ）、ｅｃＴａｄＡ３（ｅｃＴａｄＡ２＋Ｌ８４Ｆ Ｈ１２３Ｙ Ｉ１５６Ｆ）、ｅｃＴａｄＡ３＋（ｅｃＴａｄＡ３＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｈ３６Ｌ Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ３（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｎ３７Ｓ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１２（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｃ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１４（ｅｃＴａｄＡ３＋ＲＳ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６０Ｅ）、およびｅｃＴａｄＡ５ａ１＋（ｅｃＴａｄＡ５ａ１＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ９（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｒ Ｋ１６１Ｔ）。上３つのＡＢＥ ５ａコンストラクトのヘテロダイマーが作製され、次いでホモダイマーと比べて試験された。ＡＢＥ編集因子のヘテロダイマー版は、典型的には、対応するホモダイマーのコンストラクトより良好に働く。ホモダイマーおよびヘテロダイマーの両コンストラクトは、図１４０に示される。
【図１４０−８】図１４０は、アデノシン塩基編集因子（ＡＢＥ）コンストラクトの様々な略図を示す。編集因子、例として「ｐＮＭＧ−３６７」のアイデンティティーは、表４中に示される。以下の変異は、以下のとおりに省略される：ｅｃＴａｄＡ１（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ２（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ Ｄ１４７Ｙ Ｅ１５５Ｖ）、ｅｃＴａｄＡ３（ｅｃＴａｄＡ２＋Ｌ８４Ｆ Ｈ１２３Ｙ Ｉ１５６Ｆ）、ｅｃＴａｄＡ３＋（ｅｃＴａｄＡ３＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｈ３６Ｌ Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ３（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｎ３７Ｓ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１２（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｃ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１４（ｅｃＴａｄＡ３＋ＲＳ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６０Ｅ）、およびｅｃＴａｄＡ５ａ１＋（ｅｃＴａｄＡ５ａ１＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ９（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｒ Ｋ１６１Ｔ）。上３つのＡＢＥ ５ａコンストラクトのヘテロダイマーが作製され、次いでホモダイマーと比べて試験された。ＡＢＥ編集因子のヘテロダイマー版は、典型的には、対応するホモダイマーのコンストラクトより良好に働く。ホモダイマーおよびヘテロダイマーの両コンストラクトは、図１４０に示される。
【図１４０−９】図１４０は、アデノシン塩基編集因子（ＡＢＥ）コンストラクトの様々な略図を示す。編集因子、例として「ｐＮＭＧ−３６７」のアイデンティティーは、表４中に示される。以下の変異は、以下のとおりに省略される：ｅｃＴａｄＡ１（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ２（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ Ｄ１４７Ｙ Ｅ１５５Ｖ）、ｅｃＴａｄＡ３（ｅｃＴａｄＡ２＋Ｌ８４Ｆ Ｈ１２３Ｙ Ｉ１５６Ｆ）、ｅｃＴａｄＡ３＋（ｅｃＴａｄＡ３＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｈ３６Ｌ Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ３（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｎ３７Ｓ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１２（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｃ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１４（ｅｃＴａｄＡ３＋ＲＳ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６０Ｅ）、およびｅｃＴａｄＡ５ａ１＋（ｅｃＴａｄＡ５ａ１＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ９（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｒ Ｋ１６１Ｔ）。上３つのＡＢＥ ５ａコンストラクトのヘテロダイマーが作製され、次いでホモダイマーと比べて試験された。ＡＢＥ編集因子のヘテロダイマー版は、典型的には、対応するホモダイマーのコンストラクトより良好に働く。ホモダイマーおよびヘテロダイマーの両コンストラクトは、図１４０に示される。
【図１４０−１０】図１４０は、アデノシン塩基編集因子（ＡＢＥ）コンストラクトの様々な略図を示す。編集因子、例として「ｐＮＭＧ−３６７」のアイデンティティーは、表４中に示される。以下の変異は、以下のとおりに省略される：ｅｃＴａｄＡ１（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ２（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ Ｄ１４７Ｙ Ｅ１５５Ｖ）、ｅｃＴａｄＡ３（ｅｃＴａｄＡ２＋Ｌ８４Ｆ Ｈ１２３Ｙ Ｉ１５６Ｆ）、ｅｃＴａｄＡ３＋（ｅｃＴａｄＡ３＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｈ３６Ｌ Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ３（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｎ３７Ｓ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１２（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｃ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１４（ｅｃＴａｄＡ３＋ＲＳ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６０Ｅ）、およびｅｃＴａｄＡ５ａ１＋（ｅｃＴａｄＡ５ａ１＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ９（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｒ Ｋ１６１Ｔ）。上３つのＡＢＥ ５ａコンストラクトのヘテロダイマーが作製され、次いでホモダイマーと比べて試験された。ＡＢＥ編集因子のヘテロダイマー版は、典型的には、対応するホモダイマーのコンストラクトより良好に働く。ホモダイマーおよびヘテロダイマーの両コンストラクトは、図１４０に示される。
【図１４０−１１】図１４０は、アデノシン塩基編集因子（ＡＢＥ）コンストラクトの様々な略図を示す。編集因子、例として「ｐＮＭＧ−３６７」のアイデンティティーは、表４中に示される。以下の変異は、以下のとおりに省略される：ｅｃＴａｄＡ１（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ２（Ａ１０６Ｖ Ｄ１０８Ｎ Ｄ１４７Ｙ Ｅ１５５Ｖ）、ｅｃＴａｄＡ３（ｅｃＴａｄＡ２＋Ｌ８４Ｆ Ｈ１２３Ｙ Ｉ１５６Ｆ）、ｅｃＴａｄＡ３＋（ｅｃＴａｄＡ３＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｈ３６Ｌ Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ３（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｎ３７Ｓ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１１（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｒ５１Ｌ Ｓ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１２（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｃ Ｋ１６１Ｔ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ１４（ｅｃＴａｄＡ３＋ＲＳ１４６Ｃ Ｋ１５７Ｎ Ｋ１６０Ｅ）、およびｅｃＴａｄＡ５ａ１＋（ｅｃＴａｄＡ５ａ１＋Ａ１４２Ｎ）、ｅｃＴａｄＡ５ａ９（ｅｃＴａｄＡ３＋Ｓ１４６Ｒ Ｋ１６１Ｔ）。上３つのＡＢＥ ５ａコンストラクトのヘテロダイマーが作製され、次いでホモダイマーと比べて試験された。ＡＢＥ編集因子のヘテロダイマー版は、典型的には、対応するホモダイマーのコンストラクトより良好に働く。ホモダイマーおよびヘテロダイマーの両コンストラクトは、図１４０に示される。
【０１５１】
【図１４１−１】図１４１は、様々なＡＢＥコンストラクトについての編集結果を示す。ＡＢＥプラスミド＃は、表４中に示されるとおりｐＮＭＧ数を指す。例えば３６７は、表４中コンストラクトｐＮＭＧ−３６７を指す。配列は上から下へ、配列番号４６９（ｐＮＭＧ−４６６）、４７０（ｐＮＭＧ−４６７）、４７１（ｐＮＭＧ−４６９）、４７２（ｐＮＭＧ−４７０）、４７３（ｐＮＭＧ−５０１）、４７４（ｐＮＭＧ−５０９）、および４７５（ｐＮＭＧ−５０２）にそれぞれ対応する。
【図１４１−２】図１４１は、様々なＡＢＥコンストラクトについての編集結果を示す。ＡＢＥプラスミド＃は、表４中に示されるとおりｐＮＭＧ数を指す。例えば３６７は、表４中コンストラクトｐＮＭＧ−３６７を指す。配列は上から下へ、配列番号４６９（ｐＮＭＧ−４６６）、４７０（ｐＮＭＧ−４６７）、４７１（ｐＮＭＧ−４６９）、４７２（ｐＮＭＧ−４７０）、４７３（ｐＮＭＧ−５０１）、４７４（ｐＮＭＧ−５０９）、および４７５（ｐＮＭＧ−５０２）にそれぞれ対応する。
【図１４１−３】図１４１は、様々なＡＢＥコンストラクトについての編集結果を示す。ＡＢＥプラスミド＃は、表４中に示されるとおりｐＮＭＧ数を指す。例えば３６７は、表４中コンストラクトｐＮＭＧ−３６７を指す。配列は上から下へ、配列番号４６９（ｐＮＭＧ−４６６）、４７０（ｐＮＭＧ−４６７）、４７１（ｐＮＭＧ−４６９）、４７２（ｐＮＭＧ−４７０）、４７３（ｐＮＭＧ−５０１）、４７４（ｐＮＭＧ−５０９）、および４７５（ｐＮＭＧ−５０２）にそれぞれ対応する。
【０１５２】
【図１４２−１】図１４２は、特定の部位での様々なＡＢＥコンストラクトについての編集結果を示す。上の列の数は、表４中に示されるとおりｐＮＭＧ数を示す。例えば１０７は、表４中コンストラクトｐＮＭＧ−１０７を指す。ある文脈において、ホモダイマーコンストラクトは、ヘテロダイマーコンストラクトより良好に動作することが示されたが、逆もまた同様に示されている（例えば、ホモダイマーのコンストラクト３７１対ヘテロダイマーのコンストラクト４７６を参照）。これらＡＢＥコンストラクトの模式図は図１４０に示され、コンストラクトアーキテクチャは表４に示される。配列は上から下へ、配列番号４７８、４７８、５１４、５１６、５１６、５２０、５２０、５２１、５２１、および５０９にそれぞれ対応する。
【図１４２−２】図１４２は、特定の部位での様々なＡＢＥコンストラクトについての編集結果を示す。上の列の数は、表４中に示されるとおりｐＮＭＧ数を示す。例えば１０７は、表４中コンストラクトｐＮＭＧ−１０７を指す。ある文脈において、ホモダイマーコンストラクトは、ヘテロダイマーコンストラクトより良好に動作することが示されたが、逆もまた同様に示されている（例えば、ホモダイマーのコンストラクト３７１対ヘテロダイマーのコンストラクト４７６を参照）。これらＡＢＥコンストラクトの模式図は図１４０に示され、コンストラクトアーキテクチャは表４に示される。配列は上から下へ、配列番号４７８、４７８、５１４、５１６、５１６、５２０、５２０、５２１、５２１、および５０９にそれぞれ対応する。
【０１５３】
【図１４３】図１４３は、図１４２からＡＢＥコンストラクトについて形成されたイデンルのパーセンテージを示す。
【０１５４】
【図１４４】図１４４は、特定の部位での様々なＡＢＥコンストラクトについての編集結果を示す。コンストラクトのアイデンティティーは上の列に示されており、表４のｐＮＭＧ参照数を指す。図１４４中の結果は、ｅｃＴａｄＡモノマーをＡＢＥコンストラクトへ加えても編集を改善しない場合もあることを示す。しかしながら、モノマー間に長いリンカーを加えることは、いくつかの部位では編集に役立つ場合がある（例えば、部位５０２、５０５、５０７でのｓｇＲＮＡコンストラクト２８５ｂ対２７７についての編集結果を参照）。ｓｇＲＮＡコンストラクトのアイデンティティーは表８に示され、これらの模式図は図１４０に示される。配列は上から下へ、配列番号４７８、４８０、４８０、５１４、５１７、５１７、５１７、５１７、５１９、および５２１にそれぞれ対応する。
【０１５５】
【図１４５】図１４５は、すべてのＮＡＮ部位でのＡＢＥコンストラクトの結果を示すが、ここで標的Ａは、プロトスペーサーおよびＰＡＭ配列の位置５にある。上の列に示されるＡＢＥコンストラクトのアイデンティティーは、表４中のｐＮＭＧ参照数を指す。数値は、編集された標的Ａ残基の％（例として、％編集効率）を表す。配列は上から下へ、配列番号５３７〜５５２にそれぞれ対応する。
【０１５６】
【図１４６】図１４６は、様々なＡＢＥコンストラクト（表４中これらの参照ｐＮＭＧ数によって参照されるとおり）について、Ｈｅｋ２部位でのＡ→Ｇ編集パーセントを示す。
【０１５７】
【図１４７】図１４７は、進化ラウンド＃５ｂの進化結果を示す。数値は、示される部位についてＡ→Ｇ編集の％を表す。配列は上から下へ、配列番号７、４６５、３６８、３６３、３６４、および３７０にそれぞれ対応する。
【０１５８】
【図１４８】図１４８は、進化の種々のラウンドから得られた様々なＡＢＥコンストラクトについて編集結果を示す（例として、ｅｖｏ３）。ＡＢＥコンストラクトについての一般の模式図もまた示される。表８に示されるｓｇＲＮＡのアイデンティティー、および表４に示される塩基編集因子のアイデンティティー（ｐＮＭＧ参照）が示される。数値は、示される部位についてＡ→Ｇ編集の％を表す。配列は上から下へ、配列番号４７８、５０３、５０６、５２１、５１３、５０５、５０７、および５０９にそれぞれ対応する。
【０１５９】
【図１４９】図１４９は、Ｈｅｋ−２配列以外のゲノム部位でのＡＢＥコンストラクトの検討を示す。Ｈｅｋ−２部位（ｓｇＲＮＡ２９９）は、星印によって表される。ｓｇＲＮＡのアイデンティティーは表８中に示される。配列は上から下へ、配列番号４７８、５１４、５１６、５１７、５１７、５１７、５１７、５１９、５２０、５２９、５２１にそれぞれ対応する。
【０１６０】
【図１５０】図１５０は、ＡＢＥ進化＃６として言及される、ヌクレオチド交換および切出技術(nucleotide exchange and excision technology)（ＮＥｘＴ）を使用するＤＮＡシャフリング実験の模式図を示す。このアプローチの目標は、より効率的な編集因子を集め、潜在的にエピスタシスの(epistatic)変異を除去することであった。様々な進化からのコンストラクトのＤＮＡシャフリングは、所望の変異について最適化するために、および編集効率および／または蛋白質安定性に負の影響を及ぼす変異を排除するために使用された。
【０１６１】
【図１５１−１】図１５１は、ＤＮＡシャッフル（ＮｅＸＴ）の模式図を示す。ｓｐｅｃｔ標的配列は、
【化１】
2019536425.tif 000002
であり、およびｃｈｌｏｒ標的配列は、
【化２】
2019536425.tif 000003
である。
【図１５１−２】図１５１は、ＤＮＡシャッフル（ＮｅＸＴ）の模式図を示す。ｓｐｅｃｔ標的配列は、上記のとおりであり、およびｃｈｌｏｒ標的配列は、上記のとおりである。
【０１６２】
【図１５２−１】図１５２は、ｓｐｅｃｔのみ（非ＹＡＣ標的）で生存する進化＃６からのクローンの配列同一性を示す。示される変異は、ｅｃＴａｄＡ（配列番号１）と比べてのものである。
【図１５２−２】図１５２は、ｓｐｅｃｔのみ（非ＹＡＣ標的）で生存する進化＃６からのクローンの配列同一性を示す。示される変異は、ｅｃＴａｄＡ（配列番号１）と比べてのものである。
【図１５２−３】図１５２は、ｓｐｅｃｔのみ（非ＹＡＣ標的）で生存する進化＃６からのクローンの配列同一性を示す。示される変異は、ｅｃＴａｄＡ（配列番号１）と比べてのものである。
【図１５２−４】図１５２は、ｓｐｅｃｔのみ（非ＹＡＣ標的）で生存する進化＃６からのクローンの配列同一性を示す。示される変異は、ｅｃＴａｄＡ（配列番号１）と比べてのものである。
【０１６３】
【図１５３−１】図１５３は、進化＃６からのクローンの富化を指す進化＃６．２を示す。示される変異は、ｅｃＴａｄＡ（配列番号１）と比べてのものである。Ａ１４２Ｎは、シーケンシングされたほぼすべてのクローンに存在し、Ｐｒｏ４８変異もまた富んでいる。クローンは、スペクチノマイシン部位中「ＧＡＴ」に対して選択された。選択標的配列は、
【化３】
2019536425.tif 000004
であった。
【図１５３−２】図１５３は、進化＃６からのクローンの富化を指す進化＃６．２を示す。示される変異は、ｅｃＴａｄＡ（配列番号１）と比べてのものである。Ａ１４２Ｎは、シーケンシングされたほぼすべてのクローンに存在し、Ｐｒｏ４８変異もまた富んでいる。クローンは、スペクチノマイシン部位中「ＧＡＴ」に対して選択された。選択標的配列は、上記のとおりであった。
【０１６４】
【図１５４】図１５４は、ＡＢＥ６コンストラクトの略図を示す。合計８つの新しいコンストラクトが開発された。Ｅｖｏ＃６中最高頻度の増幅産物の上位２つからの変異が、４つのアーキテクチャの各々において使用された。
【０１６５】
【図１５５−１】図１５５は、ＡＢＥについて収集するデータを示す：ステップ１−トランスフェクション＋６つのゲノム部位での重要中間体のＨＴＳ、ｎ＝３。トランスフェクションは、７５０ｎｇ ＡＢＥ＋２５０ｎｇ ｇＲＮＡを用いて行われ、ゲノムＤＮＡが抽出されＨＴＳを行う前に５日間インキュベートされた。ＡＢＥコンストラクトの各々の同一性は、表４に示されるとおりｐＮＭＧ参照数によって示される。配列は上から下へ、配列番号５０９、５１０、５１２、５２０、５３０、４７８にそれぞれ対応する。
【図１５５−２】図１５５は、ＡＢＥについて収集するデータを示す：ステップ１−トランスフェクション＋６つのゲノム部位での重要中間体のＨＴＳ、ｎ＝３。トランスフェクションは、７５０ｎｇ ＡＢＥ＋２５０ｎｇ ｇＲＮＡを用いて行われ、ゲノムＤＮＡが抽出されＨＴＳを行う前に５日間インキュベートされた。ＡＢＥコンストラクトの各々の同一性は、表４に示されるとおりｐＮＭＧ参照数によって示される。配列は上から下へ、配列番号５０９、５１０、５１２、５２０、５３０、４７８にそれぞれ対応する。
【図１５５−３】図１５５は、ＡＢＥについて収集するデータを示す：ステップ１−トランスフェクション＋６つのゲノム部位での重要中間体のＨＴＳ、ｎ＝３。トランスフェクションは、７５０ｎｇ ＡＢＥ＋２５０ｎｇ ｇＲＮＡを用いて行われ、ゲノムＤＮＡが抽出されＨＴＳを行う前に５日間インキュベートされた。ＡＢＥコンストラクトの各々の同一性は、表４に示されるとおりｐＮＭＧ参照数によって示される。配列は上から下へ、配列番号５０９、５１０、５１２、５２０、５３０、４７８にそれぞれ対応する。
【図１５５−４】図１５５は、ＡＢＥについて収集するデータを示す：ステップ１−トランスフェクション＋６つのゲノム部位での重要中間体のＨＴＳ、ｎ＝３。トランスフェクションは、７５０ｎｇ ＡＢＥ＋２５０ｎｇ ｇＲＮＡを用いて行われ、ゲノムＤＮＡが抽出されＨＴＳを行う前に５日間インキュベートされた。ＡＢＥコンストラクトの各々の同一性は、表４に示されるとおりｐＮＭＧ参照数によって示される。配列は上から下へ、配列番号５０９、５１０、５１２、５２０、５３０、４７８にそれぞれ対応する。
【図１５５−５】図１５５は、ＡＢＥについて収集するデータを示す：ステップ１−トランスフェクション＋６つのゲノム部位での重要中間体のＨＴＳ、ｎ＝３。トランスフェクションは、７５０ｎｇ ＡＢＥ＋２５０ｎｇ ｇＲＮＡを用いて行われ、ゲノムＤＮＡが抽出されＨＴＳを行う前に５日間インキュベートされた。ＡＢＥコンストラクトの各々の同一性は、表４に示されるとおりｐＮＭＧ参照数によって示される。配列は上から下へ、配列番号５０９、５１０、５１２、５２０、５３０、４７８にそれぞれ対応する。
【０１６６】
【図１５６−１】図１５６は、ＡＢＥ編集効率が進化の反復ラウンドとともに改善することを示す。上パネルは、進化した／操作されたＡＢＥコンストラクトを使用するＨｅｋ２９３Ｔ細胞中の標的にされた遺伝子座での代表的なＡからＧへの％編集を示す。配列は、配列番号５６１に対応する。下パネルは、進化および操作の反復ラウンドがＡＢＥを改善することを示す。ＡＢＥコンストラクトは、表４に示されるとおりそれらのｐＮＭＧ参照数によって示される。「５０８」標的配列は、配列番号５２０に対応する。
【図１５６−２】図１５６は、ＡＢＥ編集効率が進化の反復ラウンドとともに改善することを示す。上パネルは、進化した／操作されたＡＢＥコンストラクトを使用するＨｅｋ２９３Ｔ細胞中の標的にされた遺伝子座での代表的なＡからＧへの％編集を示す。配列は、配列番号５６１に対応する。下パネルは、進化および操作の反復ラウンドがＡＢＥを改善することを示す。ＡＢＥコンストラクトは、表４に示されるとおりそれらのｐＮＭＧ参照数によって示される。「５０８」標的配列は、配列番号５２０に対応する。
【図１５６−３】図１５６は、ＡＢＥ編集効率が進化の反復ラウンドとともに改善することを示す。上パネルは、進化した／操作されたＡＢＥコンストラクトを使用するＨｅｋ２９３Ｔ細胞中の標的にされた遺伝子座での代表的なＡからＧへの％編集を示す。配列は、配列番号５６１に対応する。下パネルは、進化および操作の反復ラウンドがＡＢＥを改善することを示す。ＡＢＥコンストラクトは、表４に示されるとおりそれらのｐＮＭＧ参照数によって示される。「５０８」標的配列は、配列番号５２０に対応する。
【０１６７】
【図１５７】図１５７は、１０の「最良な」ＡＢＥからのコアとなる６つのゲノム部位のＨＴＳ結果を示す。結果は、種々の編集因子が種々の局所配列選好性を有することを示す（下パネル）。グラフは、６つの異なる遺伝子座でのＡ→Ｇパーセント編集を示す。ＡＢＥコンストラクトは、表４に示されるとおりそれらのｐＮＭＧ参照数によって示される。配列は上から下へ、配列番号５０９、５１０、５１２、５２０、５３０、４７８にそれぞれ対応する。
【０１６８】
【図１５８−１】図１５８は、ＮＡＮ配列のどの組み合わせもカバーするすべてのゲノム部位での機能的な「上位１０」のＡＢＥのトランスフェクションを示す。データはｎ＝１を表す。配列は上から下へ、配列番号４８９、４９０、４９３、４９７、５０３、５０４、５０７、５０８、５１１、および５１３にそれぞれ対応する。
【図１５８−２】図１５８は、ＮＡＮ配列のどの組み合わせもカバーするすべてのゲノム部位での機能的な「上位１０」のＡＢＥのトランスフェクションを示す。データはｎ＝１を表す。配列は上から下へ、配列番号４８９、４９０、４９３、４９７、５０３、５０４、５０７、５０８、５１１、および５１３にそれぞれ対応する。
【０１６９】
【図１５９−１】図１５９は、どのＡが編集されたか同定するためのＡＢＥウインドウ実験（奇数の位置でのＡ）を示す。ＡＢＥ ｐＮＭＧ−４７７、ｐＮＭＧ−５８６、ｐＮＭＧ−５８８、ＢＥ３および未処置の対照が示される。編集のための配列は上に示される。配列は、配列番号５６２に対応する。
【図１５９−２】図１５９は、どのＡが編集されたか同定するためのＡＢＥウインドウ実験（奇数の位置でのＡ）を示す。ＡＢＥ ｐＮＭＧ−４７７、ｐＮＭＧ−５８６、ｐＮＭＧ−５８８、ＢＥ３および未処置の対照が示される。編集のための配列は上に示される。配列は、配列番号５６２に対応する。
【図１５９−３】図１５９は、どのＡが編集されたか同定するためのＡＢＥウインドウ実験（奇数の位置でのＡ）を示す。ＡＢＥ ｐＮＭＧ−４７７、ｐＮＭＧ−５８６、ｐＮＭＧ−５８８、ＢＥ３および未処置の対照が示される。編集のための配列は上に示される。配列は、配列番号５６２に対応する。
【０１７０】
【図１６０−１】図１６０は、どのＡが編集されたか同定するためのＡＢＥウインドウ実験（偶数の位置でのＡ）を示す。ＡＢＥ ｐＮＭＧ−４７７、ｐＮＭＧ−５８６、ｐＮＭＧ−５８８、ＢＥ３および未処置の対照が示される。編集のための配列は上に示される。配列は、配列番号５６３に対応する。
【図１６０−２】図１６０は、どのＡが編集されたか同定するためのＡＢＥウインドウ実験（偶数の位置でのＡ）を示す。ＡＢＥ ｐＮＭＧ−４７７、ｐＮＭＧ−５８６、ｐＮＭＧ−５８８、ＢＥ３および未処置の対照が示される。編集のための配列は上に示される。配列は、配列番号５６３に対応する。
【図１６０−３】図１６０は、どのＡが編集されたか同定するためのＡＢＥウインドウ実験（偶数の位置でのＡ）を示す。ＡＢＥ ｐＮＭＧ−４７７、ｐＮＭＧ−５８６、ｐＮＭＧ−５８８、ＢＥ３および未処置の対照が示される。編集のための配列は上に示される。配列は、配列番号５６３に対応する。
【図１６０−４】図１６０は、どのＡが編集されたか同定するためのＡＢＥウインドウ実験（偶数の位置でのＡ）を示す。ＡＢＥ ｐＮＭＧ−４７７、ｐＮＭＧ−５８６、ｐＮＭＧ−５８８、ＢＥ３および未処置の対照が示される。編集のための配列は上に示される。配列は、配列番号５６３に対応する。
【０１７１】
【図１６１−１】図１６１は、どのＡが編集されたか同定するためのＡＢＥウインドウ実験を示す。ＡＢＥ ｐＮＭＧ−５８６、ｐＮＭＧ−５６０、および未処置の対照が示される。編集のための配列は上に示される。配列は上から下へ、配列番号５４４および５４１にそれぞれ対応する。
【図１６１−２】図１６１は、どのＡが編集されたか同定するためのＡＢＥウインドウ実験を示す。ＡＢＥ ｐＮＭＧ−５８６、ｐＮＭＧ−５６０、および未処置の対照が示される。編集のための配列は上に示される。配列は上から下へ、配列番号５４４および５４１にそれぞれ対応する。
【図１６１−３】図１６１は、どのＡが編集されたか同定するためのＡＢＥウインドウ実験を示す。ＡＢＥ ｐＮＭＧ−５８６、ｐＮＭＧ−５６０、および未処置の対照が示される。編集のための配列は上に示される。配列は上から下へ、配列番号５４４および５４１にそれぞれ対応する。
【図１６１−４】図１６１は、どのＡが編集されたか同定するためのＡＢＥウインドウ実験を示す。ＡＢＥ ｐＮＭＧ−５８６、ｐＮＭＧ−５６０、および未処置の対照が示される。編集のための配列は上に示される。配列は上から下へ、配列番号５４４および５４１にそれぞれ対応する。
【図１６１−５】図１６１は、どのＡが編集されたか同定するためのＡＢＥウインドウ実験を示す。ＡＢＥ ｐＮＭＧ−５８６、ｐＮＭＧ−５６０、および未処置の対照が示される。編集のための配列は上に示される。配列は上から下へ、配列番号５４４および５４１にそれぞれ対応する。
【図１６１−６】図１６１は、どのＡが編集されたか同定するためのＡＢＥウインドウ実験を示す。ＡＢＥ ｐＮＭＧ−５８６、ｐＮＭＧ−５６０、および未処置の対照が示される。編集のための配列は上に示される。配列は上から下へ、配列番号５４４および５４１にそれぞれ対応する。
【０１７２】
【図１６２−１】図１６２は、どのＡが編集されたか同定するためのＡＢＥウインドウ実験を示す。ＡＢＥ ｐＮＭＧ−５７６、ｐＮＭＧ−５８６、および未処置の対照が示される。編集のための配列は上に示される。配列は、配列番号５６４に対応する。
【図１６２−２】図１６２は、どのＡが編集されたか同定するためのＡＢＥウインドウ実験を示す。ＡＢＥ ｐＮＭＧ−５７６、ｐＮＭＧ−５８６、および未処置の対照が示される。編集のための配列は上に示される。配列は、配列番号５６４に対応する。
【図１６２−３】図１６２は、どのＡが編集されたか同定するためのＡＢＥウインドウ実験を示す。ＡＢＥ ｐＮＭＧ−５７６、ｐＮＭＧ−５８６、および未処置の対照が示される。編集のための配列は上に示される。配列は、配列番号５６４に対応する。
【０１７３】
【図１６３−１】図１６３は、マルチＡ部位を編集する試みである進化＃７を示す。進化選択設計は、Ｋａｎ中のＤ２０８Ｎ復帰変異を作製するため、および終止コドンをＱへ復帰させるため、２つの分離ｇＲＮＡｓ：
【化４】
2019536425.tif 000005
および
【化５】
2019536425.tif 000006
を使用して同じ遺伝子中の２つの点変異を標的にすることであった。
【図１６３−２】図１６３は、マルチＡ部位を編集する試みである進化＃７を示す。進化選択設計は、Ｋａｎ中のＤ２０８Ｎ復帰変異を作製するため、および終止コドンをＱへ復帰させるため、上記のとおり２つの分離ｇＲＮＡｓを使用して同じ遺伝子中の２つの点変異を標的にすることであった。
【図１６３−３】図１６３は、マルチＡ部位を編集する試みである進化＃７を示す。進化選択設計は、Ｋａｎ中のＤ２０８Ｎ復帰変異を作製するため、および終止コドンをＱへ復帰させるため、上記のとおり２つの分離ｇＲＮＡｓを使用して同じ遺伝子中の２つの点変異を標的にすることであった。
【図１６３−４】図１６３は、マルチＡ部位を編集する試みである進化＃７を示す。進化選択設計は、Ｋａｎ中のＤ２０８Ｎ復帰変異を作製するため、および終止コドンをＱへ復帰させるため、上記のとおり２つの分離ｇＲＮＡｓを使用して同じ遺伝子中の２つの点変異を標的にすることであった。
【０１７４】
【図１６４−１】図１６４は、マルチＡ部位内のＡを標的にするために進化した進化＃７変異を示すが、それらは、Ａによって片側または両側にフランキングすることを意味する。配列番号１と比べた変異の同一性が示される。
【図１６４−２】図１６４は、マルチＡ部位内のＡを標的にするために進化した進化＃７変異を示すが、それらは、Ａによって片側または両側にフランキングすることを意味する。配列番号１と比べた変異の同一性が示される。
【０１７５】
【図１６５】図１６５は、残基Ｒ１５２およびＰ４８を同定するｅｃＴａｄＡの模式図を示す。
【０１７６】
【図１６６】図１６６は、代わりの細胞株において疾患関連変異上のＡＢＥ編集のＭｉＳｅｑ結果を示す。Lonzaキットを用いるNucleofectionが、３種の異なるnucleofection溶液×１６種の異なるエレクトロポレーション条件を用いて使用された（合計４８種の条件／細胞株）。配列は上から下へ、配列番号５２２〜５２４にそれぞれ対応する。
【０１７７】
【図１６７−１】図１６７は、様々なコンストラクトについて複数位置でのＡからＧへの編集の結果を示す。ＡＢＥコンストラクトは、表４に示されるとおりそれらのｐＮＭＧ参照数によって示される。上パネルにおいて、配列は上から下へ、配列番号４６９〜４７１、５６７、４７５、および４７４にそれぞれ対応する。下パネルにおいて、配列は上から下へ、配列番号４６９（ｐＮＭＧ−４６６）、４７０（ｐＮＭＧ−４６７）、４７１（ｐＮＭＧ−４６９）、５６７（ｐＮＭＧ−４７２）、および４７４（ｐＮＭＧ−５０９）にそれぞれ対応する。
【図１６７−２】図１６７は、様々なコンストラクトについて複数位置でのＡからＧへの編集の結果を示す。ＡＢＥコンストラクトは、表４に示されるとおりそれらのｐＮＭＧ参照数によって示される。上パネルにおいて、配列は上から下へ、配列番号４６９〜４７１、５６７、４７５、および４７４にそれぞれ対応する。下パネルにおいて、配列は上から下へ、配列番号４６９（ｐＮＭＧ−４６６）、４７０（ｐＮＭＧ−４６７）、４７１（ｐＮＭＧ−４６９）、５６７（ｐＮＭＧ−４７２）、および４７４（ｐＮＭＧ−５０９）にそれぞれ対応する。
【図１６７−３】図１６７は、様々なコンストラクトについて複数位置でのＡからＧへの編集の結果を示す。ＡＢＥコンストラクトは、表４に示されるとおりそれらのｐＮＭＧ参照数によって示される。上パネルにおいて、配列は上から下へ、配列番号４６９〜４７１、５６７、４７５、および４７４にそれぞれ対応する。下パネルにおいて、配列は上から下へ、配列番号４６９（ｐＮＭＧ−４６６）、４７０（ｐＮＭＧ−４６７）、４７１（ｐＮＭＧ−４６９）、５６７（ｐＮＭＧ−４７２）、および４７４（ｐＮＭＧ−５０９）にそれぞれ対応する。
【図１６７−４】図１６７は、様々なコンストラクトについて複数位置でのＡからＧへの編集の結果を示す。ＡＢＥコンストラクトは、表４に示されるとおりそれらのｐＮＭＧ参照数によって示される。上パネルにおいて、配列は上から下へ、配列番号４６９〜４７１、５６７、４７５、および４７４にそれぞれ対応する。下パネルにおいて、配列は上から下へ、配列番号４６９（ｐＮＭＧ−４６６）、４７０（ｐＮＭＧ−４６７）、４７１（ｐＮＭＧ−４６９）、５６７（ｐＮＭＧ−４７２）、および４７４（ｐＮＭＧ−５０９）にそれぞれ対応する。
【０１７８】
【図１６８−１】図１６８は、種々のリンカーによるＡＢＥを使用する様々なコンストラクトの編集結果を示す。ＡＢＥコンストラクトは、表４に示されるとおりそれらのｐＮＭＧ参照数によって示される。新しいリンカーＡＢＥの模式図もまた示される。配列は上から下へ、配列番号４６９（ｐＮＭＧ−４６６）、５６８（ｐＮＭＧ−４６８）、４７１（ｐＮＭＧ−４６９）、５６７（ｐＮＭＧ−４７２）、５７４（ｐＮＧＭ−５０９）、および５６９）（ｐＮＭＧ−５３９）にそれぞれ対応する。
【図１６８−２】図１６８は、種々のリンカーによるＡＢＥを使用する様々なコンストラクトの編集結果を示す。ＡＢＥコンストラクトは、表４に示されるとおりそれらのｐＮＭＧ参照数によって示される。新しいリンカーＡＢＥの模式図もまた示される。配列は上から下へ、配列番号４６９（ｐＮＭＧ−４６６）、５６８（ｐＮＭＧ−４６８）、４７１（ｐＮＭＧ−４６９）、５６７（ｐＮＭＧ−４７２）、５７４（ｐＮＧＭ−５０９）、および５６９）（ｐＮＭＧ−５３９）にそれぞれ対応する。
【図１６８−３】図１６８は、種々のリンカーによるＡＢＥを使用する様々なコンストラクトの編集結果を示す。ＡＢＥコンストラクトは、表４に示されるとおりそれらのｐＮＭＧ参照数によって示される。新しいリンカーＡＢＥの模式図もまた示される。配列は上から下へ、配列番号４６９（ｐＮＭＧ−４６６）、５６８（ｐＮＭＧ−４６８）、４７１（ｐＮＭＧ−４６９）、５６７（ｐＮＭＧ−４７２）、５７４（ｐＮＧＭ−５０９）、および５６９）（ｐＮＭＧ−５３９）にそれぞれ対応する。
【０１７９】
【図１６９】図１６９は、第４ラウンド進化を示す。進化は、モノマーコンストラクトを用いてなされた。内在性ＴａｄＡは、ＴａｄＡ−ｄＣａｓ９融合体を補完する。
【０１８０】
【図１７０】図１７０は、第４ラウンド進化の結果を示す。配列は上から下へ、配列番号７、３６８、３６３、３６４、３６９、および３７０にそれぞれ対応する。
【０１８１】
【図１７１−１】図１７１は、進化ラウンド＃５を示す。プラスミドおよび実験の概略が示される（上パネル）。グラフは、ｃｈｌｏｒ vs. スペクチノマイシン、「ＴＡＧ」vs.「ＧＡＴ」上の生存を説明するものである。ｃｈｌｏｒ標的配列は、
【化６】
2019536425.tif 000007
であり、およびｓｐｅｃｔ標的配列は、
【化７】
2019536425.tif 000008
である。
【図１７１−２】図１７１は、進化ラウンド＃５を示す。プラスミドおよび実験の概略が示される（上パネル）。グラフは、ｃｈｌｏｒ vs. スペクチノマイシン、「ＴＡＧ」vs.「ＧＡＴ」上の生存を説明するものである。ｃｈｌｏｒ標的配列は、上記のとおりであり、およびｓｐｅｃｔ標的配列は、上記のとおりである。
【０１８２】
【図１７２】図１７２は、ｃｈｌｏｒ部位およびｓｐｅｃｔ部位での編集結果を示す。進化＃４から同定されたコンストラクト（飽和した部位／ＮＮＫライブラリー）は、ｃｈｏｒ部位上よりむしろｓｐｅｃｔ部位上の方がより効率的に編集するように見える。ＡＢＥコンストラクトは、表４に示されるとおりそれらのｐＮＭＧ参照数によって示される。
【０１８３】
【図１７３】図１７３は第５ラウンド進化を示す（パートａ）。配列は、配列番号５７０に対応する。
【０１８４】
【図１７４】図１７４は、第５ラウンドヘテロダイマー（in trans）結果を示す。ラウンド＃５ａは、変異を同定し、両方の編集効率を改善し、基質特異性を広げた。配列は上から下へ、配列番号７、３６８、および３６３、３６４、３６９、および３７０にそれぞれ対応する。
【０１８５】
【図１７５】図１７５は、第５ラウンドヘテロダイマー（in cis）結果を示す。ラウンド＃５ａは、変異を同定し、両方の編集効率を改善し、基質特異性を広げたが、cisの結果は、より高い編集効率を与えた。ＡＢＥコンストラクトは、表４に示されるとおりそれらのｐＮＭＧ参照数によって示される。配列は上から下へ、配列番号７、５７１、４６５、３６８、３６３、４６６、３６４、３６９、５７２、および３７０にそれぞれ対応する。
【０１８６】
【図１７６】図１７６は、進化５についての様々なコンストラクトの編集結果を示す。
【０１８７】
【図１７７】図１７７は、進化５についての様々なコンストラクトの編集結果を示す。
【０１８８】
【図１７８】図１７８は、ＡＢＥについてのｇＲＮＡを示す。５ａコンストラクトは、１６すべてのＮＡＮ配列上、プロトスペーサー中、位置５でのＡによって特徴付けられる（左パネル）。配列は上から下へ、配列番号５７３〜５７８にそれぞれ対応する。「Ｇ」で始まる追加の配列は、生み出されるｇＲＮＡの合成においてバリエーションを最小化するために提案される（右パネル）。配列は上から下へ、配列番号５７９〜５８８にそれぞれ対応する。
【０１８９】
【図１７９】図１７９は、表８中に示されるｓｇＲＮＡ２９９およびＡＢＥコンストラクト（これらは、表４に示されるとおりこれらのｐＮＭＧ参照数によって示される）を使用するＡ５の％Ａ→Ｇ編集を示す。配列は、配列番号４７８に対応する。
【０１９０】
【図１８０】図１８０は、表８中に示されるｓｇＲＮＡ４６９およびＡＢＥコンストラクト（これらは、表４に示されるとおりこれらのｐＮＭＧ参照数によって示される）を使用するＡ５の％Ａ→Ｇ編集を示す。配列は、配列番号５０９に対応する。
【０１９１】
【図１８１】図１８１は、表８中に示されるｓｇＲＮＡ４７０およびＡＢＥコンストラクト（これらは、表４に示されるとおりこれらのｐＮＭＧ参照数によって示される）を使用するＡ５の％Ａ→Ｇ編集を示す。配列は、配列番号５１０に対応する。
【０１９２】
【図１８２】図１８２は、表８中に示されるｓｇＲＮＡ４７２およびＡＢＥコンストラクト（これらは、表４に示されるとおりこれらのｐＮＭＧ参照数によって示される）を使用するＡ５の％Ａ→Ｇ編集を示す。配列は、配列番号５１２に対応する。
【０１９３】
【図１８３】図１８３は、表８中に示されるｓｇＲＮＡ５０８およびＡＢＥコンストラクト（これらは、表４に示されるとおりこれらのｐＮＭＧ参照数によって示される）を使用するＡ５の％Ａ→Ｇ編集を示す。配列は、配列番号５２０に対応する。
【０１９４】
【図１８４】図１８４は、表８中に示されるｓｇＲＮＡ５３６およびＡＢＥコンストラクト（これらは、表４に示されるとおりこれらのｐＮＭＧ参照数によって示される）を使用するＡ５の％Ａ→Ｇ編集を示す。配列は、配列番号５３０に対応する。
【０１９５】
【図１８５】図１８５は、示される編集因子（これらは、表４に示されるとおりこれらのｐＮＭＧ参照数によって示される）の各々についてｓｇＲＮＡ：３１０、ｓｇＲＮＡ：３１１、ｓｇＲＮＡ：３１４、ｓｇＲＮＡ：３１８、ｓｇＲＮＡ：４６３、およびｓｇＲＮＡ：４６４を使用する、強調されたＡ（Ａ５）の％Ａ→Ｇ編集を示す。配列は左から右へ、および上から下へ、配列番号４８９、４９０、４９３、４９７、５０３および５０４にそれぞれ対応する。
【０１９６】
【図１８６】図１８６は、示される編集因子（これらは、表４に示されるとおりこれらのｐＮＭＧ参照数によって示される）の各々についてｓｇＲＮＡ：４６６、ｓｇＲＮＡ：４６７、ｓｇＲＮＡ：４６８、ｓｇＲＮＡ：４７１、ｓｇＲＮＡ：５０１、およびｓｇＲＮＡ：６０１を使用する、強調されたＡ（Ａ５）の％Ａ→Ｇ編集を示す。配列は左から右へ、および上から下へ、配列番号５０６、５０７、５０８、５１１、５１３、および５３５にそれぞれ対応する。
【０１９７】
定義
本明細書におよびクレームに使用されるとき、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈上明白に他に示される場合を除き、単数または複数を含む。よって、例えば、「an agent」への言及は、単数の剤および複数のかかる剤を含む。
【０１９８】
用語「デアミナーゼ」または「デアミナーゼドメイン」は、脱アミノ化反応を触媒する蛋白質または酵素を指す。いくつかの態様において、デアミナーゼは、アデニンまたはアデノシンの加水分解的脱アミノ化を触媒するアデノシンデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、アデノシンまたはデオキシアデノシンの加水分解的脱アミノ化をそれぞれ触媒してイノシンまたはデオキシイノシンにするアデノシンデアミナーゼである。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のアデニンまたはアデノシンの加水分解的脱アミノ化を触媒する。本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼ（例として、操作されたアデノシンデアミナーゼ、進化したアデノシンデアミナーゼ）は、細菌などのいずれの生物からのものであってもよい。いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、生物からの天然のデアミナーゼのバリアントである。いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、自然界に存在しない。例えば、いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、天然のデアミナーゼと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、E.coli、S. aureus、S. typhi、S. putrefaciens、H. influenzae、またはC. crescentusなどの細胞からのものである。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡデアミナーゼである。いくつかの態様において、ＴａｄＡデアミナーゼは、E. coli ＴａｄＡデアミナーゼ（ｅｃＴａｄＡ）である。いくつかの態様において、ＴａｄＡデアミナーゼは、トランケートされたE. coli ＴａｄＡデアミナーゼである。例えば、トランケートされたｅｃＴａｄＡは、全長ｅｃＴａｄＡと比べて、１個以上のＮ末端アミノ酸を失っていることがある。いくつかの態様において、トランケートされたｅｃＴａｄＡは、全長ｅｃＴａｄＡと比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＮ末端アミノ酸を失っていることがある。いくつかの態様において、トランケートされたｅｃＴａｄＡは、全長ｅｃＴａｄＡと比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のＣ末端アミノ酸を失っていることがある。いくつかの態様において、ecＴａｄＡデアミナーゼは、Ｎ末端メチオニンを含んでいない。
【０１９９】
いくつかの態様において、ＴａｄＡデアミナーゼは、Ｎ末端がトランケートされたＴａｄＡである。ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、アミノ酸配列：
【化８】
2019536425.tif 000009
を含む。
【０２００】
いくつかの態様において、ＴａｄＡデアミナーゼは、全長E. coli ＴａｄＡデアミナーゼである。例えば、ある態様において、アデノシンデアミナーゼは、アミノ酸配列：
【化９】
2019536425.tif 000010
を含む。
【０２０１】
しかしながら、本出願に有用な追加のアデノシンデアミナーゼが、当業者に明らかであろうし、本開示の範囲内にあることは、理解されるはずである。例えば、アデノシンデアミナーゼは、ＡＤＡＴの相同体であってもよい。例示的なＡＤＡＴ相同体は、限定せずに以下を含む：
【化１０】
2019536425.tif 000011
【化１１】
2019536425.tif 000012
【０２０２】
用語「塩基編集因子（ＢＥ）」、または「核酸塩基編集因子（ＮＢＥ）」は、核酸配列（例として、ＤＮＡまたはＲＮＡ）内の塩基（例として、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＵ）を改変させることが可能なポリペプチドを含む薬剤を指す。いくつかの態様において、塩基編集因子は、核酸内の塩基を脱アミノ化することが可能である。いくつかの態様において、塩基編集因子は、ＤＮＡ分子内の塩基を脱アミノ化することが可能である。いくつかの態様において、塩基編集因子は、ＤＮＡ中のアデニン（Ａ）を脱アミノ化することが可能である。いくつかの態様において、塩基編集因子は、アデノシンデアミナーゼと融合されている核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）を含む融合蛋白質である。いくつかの態様において、塩基編集因子は、アデノシンデアミナーゼと融合されているＣａｓ９蛋白質である。いくつかの態様において、塩基編集因子は、アデノシンデアミナーゼと融合されているＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である。いくつかの態様において、塩基編集因子は、ヌクレアーゼ不活性(nuclease-inactive)Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）アデノシンデアミナーゼと融合されている。いくつかの態様において、塩基編集因子は、塩基除去修復の阻害剤、例えばＵＧＩドメインまたはｄＩＳＮドメインと融合されている。いくつかの態様において、融合蛋白質は、デアミナーゼと融合されているＣａｓ９ニッカーゼ、およびＵＧＩまたはｄＩＳＮドメインなどの塩基除去修復の阻害剤を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質のｄＣａｓ９ドメインは、配列番号５２のＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０８〜３５７のいずれかにおける対応する変異を含むが、これらはＣａｓ９蛋白質のヌクレアーゼ活性を不活性化する。いくつかの態様において、融合蛋白質は、Ｄ１０Ａ変異を含み、および配列番号５２の残基８４０にてヒスチジン、または配列番号１０８〜３５７のいずれかにおける対応する変異を含むが、これらはＣａｓ９に対し、核酸二本鎖の一方の鎖のみを切断することを可能にする。Ｃａｓ９ニッカーゼの例は、配列番号３５に示される。
【０２０３】
用語「リンカー」は、本明細書に使用されるとき、２つの分子または部分、例えばヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９ドメインおよび核酸編集ドメイン（例として、アデノシンデアミナーゼ）などの、例として融合蛋白質の２つのドメインを連結する、結合（例として共有結合）、化学基、または分子を指す。いくつかの態様において、リンカーは、ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼのｇＲＮＡ結合ドメイン（Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインを含む）と、核酸編集蛋白質の触媒ドメインとを結び合わせる。いくつかの態様において、リンカーは、ｄＣａｓ９と核酸編集蛋白質とを結び合わせる。典型的には、リンカーは、２つの基、分子、もしくは他の部分の間に位置しているか、またはそれらによってフランキングされており、および共有結合を介して各々の一方に接続されており、よって２つを接続している。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸（例として、ペプチドまたは蛋白質）である。いくつかの態様において、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学的部分(chemical moiety)である。いくつかの態様において、リンカーは、５〜１００アミノ酸長、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０、または１５０〜２００アミノ酸長である。より長いかまたはより短いリンカーもまた企図される。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列
【化１２】
2019536425.tif 000013
を含むが、これはまた、ＸＴＥＮリンカーとも言及される。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列
【化１３】
2019536425.tif 000014
を含む。いくつかの態様において、リンカーは、
【化１４】
2019536425.tif 000015
または（XP）ｎモチーフ、またはこれらのいずれかの組み合わせも含み、ここでｎは、独立して、１と３０との間の整数であり、およびここでXは、いずれのアミノ酸でもある。いくつかの態様において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
【０２０４】
用語「変異」は、本明細書に使用されるとき、配列（例として、核酸配列またはアミノ酸配列）内の残基の別の残基との置換、または配列内の１以上の残基の欠失もしくは挿入を指す。変異は、典型的には、配列内の本来の残基の同定、その後に前記残基の位置の同定、および新たに置換された残基のアイデンティティーの同定が続くことによって、本明細書に記載される。本明細書に提供されるアミノ酸置換（変異）を作製するための様々な方法は、当該技術分野において周知であり、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))によって提供される。
【０２０５】
用語「塩基修復の阻害剤」または「ＩＢＲ」は、核酸修復酵素、例えば塩基除去修復酵素の活性を阻害することが可能な蛋白質を指す。いくつかの態様において、ＩＢＲは、イノシン塩基除去修復の阻害剤である。例示的な塩基修復の阻害剤は、ＡＰＥ１、Ｅｎｄｏ ＩＩＩ、Ｅｎｄｏ ＩＶ、Ｅｎｄｏ Ｖ、Ｅｎｄｏ ＶＩＩＩ、Ｆｐｇ、ｈＯＧＧ１、ｈＮＥＩＬ１、Ｔ７ ＥｎｄｏＩ、Ｔ４ＰＤＧ、ＵＤＧ、ｈＳＭＵＧ１、およびｈＡＡＧの阻害剤を含む。いくつかの態様において、ＩＢＲは、Ｅｎｄｏ ＶまたはｈＡＡＧの阻害剤である。いくつかの態様において、ＩＢＲは、触媒不活性型ＥｎｄｏＶまたは触媒不活性型ｈＡＡＧである。
【０２０６】
用語「ウラシルグリコシラーゼ阻害剤」または「ＵＧＩ」は、本明細書に使用されるとき、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害することが可能な蛋白質を指す。いくつかの態様において、ＵＧＩドメインは、野生型ＵＧＩまたは配列番号３に示されるＵＧＩを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供されるＵＧＩ蛋白質は、ＵＧＩの断片、およびＵＧＩまたはＵＧＩ断片と相同な蛋白質を含む。例えば、いくつかの態様において、ＵＧＩドメインは、配列番号３で示されるアミノ酸配列の断片を含む。いくつかの態様において、ＵＧＩ断片は、配列番号３に示されるアミノ酸配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＵＧＩは、配列番号３で示されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列、または配列番号３で示されるアミノ酸配列の断片と相同なアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＵＧＩもしくはＵＧＩの断片またはＵＧＩもしくはＵＧＩ断片の相同体を含む蛋白質は、「ＵＧＩバリアント」ととも言及される。ＵＧＩバリアントは、ＵＧＩまたはその断片との相同性を共有する。例えばＵＧＩバリアントは、野生型ＵＧＩまたは配列番号３に示されるＵＧＩと、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または少なくとも９９．９％同一である。いくつかの態様において、ＵＧＩバリアントは、ＵＧＩの断片を、前記断片が、野生型ＵＧＩまたは配列番号３に示されるＵＧＩの対応する断片と、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または少なくとも９９．９％同一であるように含む。いくつかの態様において、ＵＧＩは、以下のアミノ酸配列を含む：
【化１５】
2019536425.tif 000016
【０２０７】
用語「触媒不活性イノシン特異的ヌクレアーゼ」、または「不活性型イノシン特異的ヌクレアーゼ（ｄＩＳＮ）」は、本明細書に使用されるとき、イノシン特異的ヌクレアーゼを阻害することが可能な蛋白質を指す。いずれの具体的な理論によっても拘束されることは望まないが、触媒不活性イノシングリコシラーゼ（例として、アルキルアデニングリコシラーゼ［ＡＡＧ］）は、イノシンには結合するであろうが、脱塩基部位を作り出すことも、イノシンを除去することもないであろう。そしてこれによって、ＤＮＡ損傷／修復メカニズムから、新たに形成されたイノシン部分を立体的にブロックする。いくつかの態様において、触媒不活性イノシン特異的ヌクレアーゼは、核酸中のイノシンに結合することは可能である場合もあるが、核酸は切断しない。例示的な触媒不活性イノシン特異的ヌクレアーゼは、限定せずに、触媒不活性アルキルアデノシングリコシラーゼ（ＡＡＧヌクレアーゼ）（例えば、ヒトからの）、および触媒不活性エンドヌクレアーゼＶ（ＥｎｄｏＶヌクレアーゼ）（例えば、E. coliからの）を含む。いくつかの態様において、触媒不活性ＡＡＧヌクレアーゼは、配列番号３２に示されるＥ１２５Ｑ変異、または別のＡＡＧヌクレアーゼにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、触媒不活性ＡＡＧヌクレアーゼは、配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、触媒不活性ＥｎｄｏＶヌクレアーゼは、配列番号３２に示されるＤ３５Ａ変異、または別のＥｎｄｏＶヌクレアーゼにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、触媒不活性ＥｎｄｏＶヌクレアーゼは、配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含む。他の触媒不活性イノシン特異的ヌクレアーゼ（ｄＩＳＮｓ）が、当業者に明らかであろうし、本開示の範囲内であることは、理解されるはずである。
【０２０８】
【化１６】
2019536425.tif 000017
【０２０９】
【化１７】
2019536425.tif 000018
【０２１０】
用語「核局在配列」または「ＮＬＳ」は、細胞核中への蛋白質の移入を、例えば核輸送によって促進するアミノ酸配列を指す。核局在配列は、当該技術分野において知られており、当業者に明らかであろう。例えば、ＮＬＳ配列は、Plankらの、2000年11月23日に出願され、2001年5月31日にWO/2001/038547として公開された、国際ＰＣＴ出願PCT/EP2000/011690に記載されている（この内容は、例示的な核局在配列のそれらの開示について参照することにより本明細書に組み込まれる）。いくつかの態様において、ＮＬＳは、アミノ酸配列
【化１８】
2019536425.tif 000019
を含む。
【０２１１】
用語「核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質」または「ｎａｐＤＮＡｂｐ」は、ｎａｐＤＮＡｂｐを特異的な核酸配列へ誘導するガイド核酸などの核酸（例として、ＤＮＡまたはＲＮＡ）と結び付く蛋白質を指す。例えば、Ｃａｓ９蛋白質は、Ｃａｓ９蛋白質を、ガイドＲＮＡに相補性を有する特異的なＤＮＡ配列へ誘導するガイドＲＮＡと結び付き得る。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、クラス２微生物ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエフェクターである。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ドメイン、例えば、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９（nuclease active Cas9）、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、またはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質の例は、限定せずに、Ｃａｓ９（例として、ｄＣａｓ９およびｎＣａｓ９）、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２Ｃ３、およびアルゴノートを含む。しかしながら、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質がまた、ＲＮＡに結合する核酸プログラム可能な蛋白質も含むことは、理解されるはずである。例えば、ｎａｐＤＮＡｂｐは、ｎａｐＤＮＡｂｐをＲＮＡへ誘導する核酸に関連することがある。他の核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質もまた、本開示において具体的に挙げられていないとしても、本開示の範囲内にある。
【０２１２】
用語「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９ドメイン」は、Ｃａｓ９蛋白質、またはその断片（例として、Ｃａｓ９の活性型、不活性型、または部分的活性型のＤＮＡ切断ドメイン、および／またはＣａｓ９のドメインに結合するｇＲＮＡを含む蛋白質）を含むＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９ヌクレアーゼはまた、ときにｃａｓｎ１ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）関連ヌクレアーゼとも言及される。ＣＲＩＳＰＲは、可動性(mobile)遺伝子エレメント（ウイルス、転位性エレメント、および接合型プラスミド）に対する防御を提供する適応免疫システムである。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー、前駆(antecedent)可動性エレメントに相補的な配列、および核酸に侵入する標的(target invading nucleic acids)を含有する。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、転写されプロセシングされてＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）になる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて、プレｃｒＲＮＡ(pre-crRNA)の正しいプロセシングは、トランスにコードされた小型ＲＮＡ(trans-encoded small RNA)（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内在性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）、およびＣａｓ９蛋白質を要求する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、リボヌクレアーゼ３に補助される(aided)プレｃｒＲＮＡのプロセシングのためのガイドとして働く。その後、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡは、スペーサーに相補的な直鎖状または環状のｄｓＤＮＡ標的を、エンドヌクレアーゼ的に(endonucleolytically)切断する。ｃｒＲＮＡに相補的ではない標的鎖は、先ずエンドヌクレアーゼ的に切られ、次いで３’−５’エキソヌクレアーゼ的に(exonucleolytically)トリミングされる。自然界において、ＤＮＡ結合およびＤＮＡ切断は、典型的には、蛋白質および両方のＲＮＡを要求する。しかしながら、単一のガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」または単に「ｇＮＲＡ」）は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの両面を単一のＲＮＡ種に組み込むように操作され得る。例として、Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)を参照（この全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲリピート配列中の短いモチーフ（ＰＡＭまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識することで、自己対非自己を区別するのに役立つ。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列および構造は、当業者に周知である（例として、"Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)；"CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z. A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)；および"A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I, Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)を参照。これらの各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。Ｃａｓ９オーソログは、S. pyogenesおよびS. thermophilusを含むがこれらに限定されない様々な種において記載されている。追加の好適なＣａｓ９ヌク���アーゼおよび配列は、本開示に基づき当業者には明らかであろう。かかるＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737（この全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示される生物および遺伝子座からのＣａｓ９配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、不活性（例として、不活性化）ＤＮＡ切断ドメインを有する、つまりＣａｓ９は、ニッカーゼである。
【０２１３】
ヌクレアーゼ不活性化型Ｃａｓ９蛋白質は、交換可能に「ｄＣａｓ９」蛋白質（ヌクレアーゼ「不活性」なＣａｓ９）と言われ得る。不活性型ＤＮＡ切断ドメインを有するＣａｓ９蛋白質（またはその断片）を生成するための方法は公知である（例えば、Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression" (2013) Cell. 28; 152(5): 1173-83参照。そのそれぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。例えば、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインは、２つのサブドメイン、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよびＲｕｖＣ１サブドメインを包含することが公知である。ＨＮＨサブドメインはｇＲＮＡに対して相補的な鎖を切断するのに対して、ＲｕｖＣ１サブドメインは非相補鎖を切断する。これらのサブドメイン内の変異は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を抑制し得る。例えば、変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０ＡはS. pyogenes Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する（Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., Cell. 28; 152(5): 1173-83 (2013)）。いくつかの態様においては、Ｃａｓ９の断片を含む蛋白質が提供される。例えば、いくつかの態様において、蛋白質は、２つのＣａｓ９ドメイン：（１）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメイン；または（２）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインの１つを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９またはその断片を含む蛋白質は、「Ｃａｓ９バリアント」と言われる。Ｃａｓ９バリアントはＣａｓ９またはその断片との相同性を持ち合う。例えば、Ｃａｓ９バリアントは、野生型Ｃａｓ９と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９バリアントは、野生型Ｃａｓ９と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはより多くのアミノ酸変化を有し得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ９バリアントはＣａｓ９の断片（例えば、ｇＲＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ切断ドメイン）を含み、断片は、野生型Ｃａｓ９の対応する断片と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの態様において、断片は、対応する野生型Ｃａｓ９のアミノ酸長の少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一、���なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％である。
【０２１４】
いくつかの態様において、断片は少なくとも１００アミノ酸長である。いくつかの態様において、断片は、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、または１３００アミノ酸長である。いくつかの態様において、野生型Ｃａｓ９は、
【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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に対応する。
【０２１５】
いくつかの態様において、野生型Ｃａｓ９は、配列番号４９（ヌクレオチド）および／または配列番号５０（アミノ酸）に対応するか、またはそれを含む：
【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【０２１６】
いくつかの態様において、野生型Ｃａｓ９は、Streptococcus pyogenes由来のＣａｓ９（NCBI参照配列：NC_002737.2、配列番号５１（ヌクレオチド）；およびユニポート参照配列：Q99ZW2、配列番号５２（アミノ酸））に対応する。
【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
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【０２１７】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９は：Corynebacterium ulcerans（NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1）；Corynebacterium diphtheria（NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1）；Spiroplasma syrphidicola（NCBI Ref: NC_021284.1）；Prevotella intermedia（NCBI Ref: NC_017861.1）；Spiroplasma taiwanense（NCBI Ref: NC_021846.1）；Streptococcus iniae（NCBI Ref: NC_021314.1）；Belliella baltica（NCBI Ref: NC_018010.1）；Psychroflexus torquisl（NCBI Ref: NC_018721.1）；Streptococcus thermophilus（NCBI Ref: YP_820832.1）、Listeria innocua（NCBI Ref: NP_472073.1）、Campylobacter jejuni（NCBI Ref: YP_002344900.1）、もしくはNeisseria meningitidis（NCBI Ref: YP_002342100.1）からのＣａｓ９、または任意の他の生物からのＣａｓ９を言う。
【０２１８】
いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を不活性化する１つ以上の変異を有するＣａｓ９アミノ酸配列に対応するか、またはその一部または全部を含む。例えば、いくつかの態様において、ｄＣａｓ９ドメインは、配列番号５２のＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異、または別のＣａｓ９における対応する変異を含む。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。
ｄＣａｓ９（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）：
【化３１】
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【０２１９】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、Ｄ１０Ａ変異を含み、一方で、配列番号５２によって提供されるアミノ酸配列における位置８４０、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する位置の残基はヒスチジンのままである。いずれかの具体的な理論によって拘束されようとすることはないが、触媒残基Ｈ８４０の存在は、標的Ａの反対のＴを含有する、編集されない（例えば脱アミノ化されない）鎖を切断するＣａｓ９の活性を維持する。Ｈ８４０の回復（例えば、ｄＣａｓ９のＡ８４０から）は、Ａを含有する標的鎖の切断をもたらさない。かかるＣａｓ９バリアントは、ｇＲＮＡによって定義される標的配列に基づいて特定の場所に単一鎖のＤＮＡ切断（ニック）を生成する能力があり、編集されない鎖の修復に至り、最終的には編集されない鎖のＴからＣへの変化をもたらす。このプロセスの概略図は図９４に示されている。簡潔には、いずれかの具体的な理論によって拘束されようとすることはないが、Ａ−Ｔ塩基対のＡは、アデノシンデアミナーゼ、例えばＤＮＡにおけるアデノシンを脱アミノ化する、操作されたアデノシンデアミナーゼによってイノシン（Ｉ）に脱アミノ化され得る。Ｔを有する編集されない鎖にニックを入れることは、ミスマッチ修復メカニズムによるＴの除去を促す。ＵＧＩドメインまたは触媒不活性型イノシン特異的ヌクレアーゼ（catalytically inactive inosine-specific nuclease）（ｄＩＳＮ）はイノシン特異的ヌクレアーゼを（例えば、立体的に）阻害し、これはイノシン（Ｉ）の除去を防止する。
【０２２０】
他の態様においては、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ以外の変異を有するｄＣａｓ９バリアントが提供され、これは例えばヌクレアーゼ不活性化型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）をもたらす。かかる変異は、例として、Ｄ１０およびＨ８４０における他のアミノ酸置換、またはＣａｓ９のヌクレアーゼドメイン内の他の置換（例えば、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよび／またはＲｕｖＣ１サブドメインにおける置換）を包含する。いくつかの態様においては、ｄＣａｓ９のバリアントまたはホモログ（例えば、配列番号５３のバリアント）が提供され、これらは、配列番号１０と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの態様においては、ｄＣａｓ９のバリアント（例えば、配列番号５３のバリアント）が提供され、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００アミノ酸、またはより多くだけ配列番号１０よりも短いかまたは長いアミノ酸配列を有する。
【０２２１】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるＣａｓ９融合蛋白質は、Ｃａｓ９蛋白質の全長アミノ酸配列、例えば本明細書において提供されるＣａｓ９配列の１つを含む。しかしながら、他の態様において、本明細書において提供される融合蛋白質は、全長Ｃａｓ９配列ではなくその断片のみを含む。例えば、いくつかの態様において、本明細書において提供されるＣａｓ９融合蛋白質はＣａｓ９断片を含み、断片はｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに結合するが、例えばそれがヌクレアーゼドメインの短縮版のみを含むか、またはヌクレアーゼドメインを全く含まないという点で、機能的なヌクレアーゼドメインを含まない。
【０２２２】
好適なＣａｓ９ドメインおよびＣａｓ９断片の例示的なアミノ酸配列は本明細書において提供されており、Ｃａｓ９ドメインおよび断片の追加の好適な配列は当業者には明らかであろう。
【０２２３】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９は：Corynebacterium ulcerans（NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1）；Corynebacterium diphtheria（NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1）；Spiroplasma syrphidicola（NCBI Ref: NC_021284.1）；Prevotella intermedia（NCBI Ref: NC_017861.1）；Spiroplasma taiwanense（NCBI Ref: NC_021846.1）；Streptococcus iniae（NCBI Ref: NC_021314.1）；Belliella baltica（NCBI Ref: NC_018010.1）；Psychroflexus torquisI（NCBI Ref: NC_018721.1）；Streptococcus thermophilus（NCBI Ref: YP_820832.1）；Listeria innocua（NCBI Ref: NP_472073.1）；Campylobacter jejuni(NCBI Ref: YP_002344900.1）；またはNeisseria meningitidis（NCBI Ref: YP_002342100.1）からのＣａｓ９を言う。
【０２２４】
これらのバリアントおよびホモログを含む、追加のＣａｓ９蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（nuclease dead Cas9）（ｄＣａｓ９）、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、またはヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９）が、この開示の範囲内であることは、理解されるべきである。例示的なＣａｓ９蛋白質は、限定することなく、以下に提供されるものを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、アミノ酸配列（配列番号３４）を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である。いくつかの態様において、ｎＣａｓ９は、アミノ酸配列（配列番号３５）を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９である。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９は、アミノ酸配列（配列番号３６）を含む。
例示的な触媒不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）：
【化３２】
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【化３３】
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【化３４】
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【化３５】
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【０２２５】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、単細胞原核微生物のドメインおよび界を構成する古細菌（例えばナノ古細菌）由来のＣａｓ９を言う。いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、例えば、Burstein et al., "New CRISPR Cas systems from uncultivated microbes." Cell Res. 2017 Feb 21. doi: 10.1038/cr.2017.21（その内容全体は参照によってここで組み込まれる）において記載される、ＣａｓＸまたはＣａｓＹを言う。ゲノム解析メタゲノミクスを用いて、古細菌ドメインの生命において最初に報告されたＣａｓ９を含む、多数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが同定されている。この多様なＣａｓ９蛋白質は、活性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの一部として、ほとんど研究されていないナノ古細菌に見出だされた。細菌において、これまで知られていなかった２つのシステムであるＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＸおよびＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＹが発見され、これらはこれまでに発見されたものの中で最もコンパクトである。いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、ＣａｓＸ、またはＣａｓＸのバリアントを言う。いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、ＣａｓＹ、またはＣａｓＹのバリアントを言う。他のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合蛋白質が、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）として用いられてもよいこと、および本開示の範囲内であることは理解されるべきである。
【０２２６】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるいずれかの融合蛋白質の核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、ＣａｓＸまたはＣａｓＹ蛋白質であってもよい。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、ＣａｓＸ蛋白質である。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、ＣａｓＹ蛋白質である。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓＸまたはＣａｓＹ蛋白質と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓＸまたはＣａｓＹ蛋白質である。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、配列番号４１７〜４１９のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、配列番号４１７〜４１９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の細菌種由来のＣａｓＸおよびＣａｓＹが、本開示に従って、用いられてもよいことは理解されるべきである。
【化３６】
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【化３７】
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【０２２７】
本明細書において用いられる用語「有効量」は、所望の生物学的応答を誘起するために十分である生物活性物質の量を言う。例えば、いくつかの態様において、核酸塩基編集因子の有効量は、核酸塩基編集因子によって特異的に結合および変異される標的部位の変異を誘導するために十分である、核酸塩基編集因子の量を言い得る。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質、例えば核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質とデアミナーゼドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼドメイン）とを含む融合蛋白質の有効量は、融合蛋白質によって特異的に結合および編集される標的部位の編集を誘導するために十分である融合蛋白質の量を言い得る。当業者によって理解されるであろうが、物質、例えば融合蛋白質、核酸塩基編集因子、デアミナーゼ、ハイブリッド蛋白質、蛋白質二量体、蛋白質（または蛋白質二量体）とポリヌクレオチドとの複合体、またはポリヌクレオチドの有効量は、例えば所望の生物学的応答、例えば、編集されるべき特定のアレル、ゲノム、または標的部位、ターゲティングされようとする細胞または組織、および用いられようとする物質のような種々の因子に依存して変わり得る。
【０２２８】
本明細書において用いられる用語「核酸」および「核酸分子」は、核酸塩基と酸部分とを含む化合物、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーを言う。典型的には、ポリマー核酸、例えば３つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子は直鎖状分子であり、その中の隣接するヌクレオチド同士はホスホジエステル結合によって違いにリンクされている。いくつかの態様において、「核酸」は個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を言う。いくつかの態様において、「核酸」は、３つ以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を言う。本明細書において用いられる用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、ひとつながりの少なくとも３ヌクレオチド）を言うために交換可能に用いられ得る。いくつかの態様において、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本および／または二本鎖ＤＮＡを包摂する。核酸は、例えばゲノム、転写物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体、または他の天然に存在する核酸分子の文脈で天然に存在し得る。他方で、核酸分子は、天然に存在しない分子、例えば、組換体ＤＮＡもしくはＲＮＡ、人工染色体、操作されたゲノム、またはその断片、あるいは合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得、あるいは、天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオシドを包含する。さらにその上に、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および／または類似の用語は、核酸アナログ、例えばホスホジエステルバックボーン以外を有するアナログを包含する。核酸は、天然のソースから精製、組換発現システムを用いて産生および任意に精製、化学合成などされ得る。適切なところでは、例えば化学合成された分子のケースにおいては、核酸は、ヌクレオシドアナログ、例えば化学修飾された塩基または糖を有するアナログ、およびバックボーン改変を含み得る。核酸配列は、別様に示されない限り５’から３’方向に提示される。いくつかの態様において、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシドアナログ（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）；化学修飾された塩基；生物学的に改変された塩基（例えば、メチル化塩基）；インターカレーションされた塩基；修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合）であるか、またはそれを含む。
【０２２９】
本明細書において用いられる用語「増殖性疾患」は、細胞または細胞集団が異常に高まった増殖速度を見せるという点で細胞または組織ホメオスタシスが乱れているいずれかの疾患を言う。増殖性疾患は、過増殖性疾患、例えば前新生物性の過形成状態および新生物疾患を包含する。新生物疾患は細胞の異常な増殖を特徴とし、良性および悪性新生物両方を包含する。悪性新生物は癌ともまた言われる。
【０２３０】
用語「蛋白質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は本明細書においては交換可能に用いられ、ペプチド（アミド）結合によって一緒にリンクされたアミノ酸残基のポリマーを言う。用語は、いずれかのサイズ、構造、または機能の蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドを言う。典型的には、蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは少なくとも３アミノ酸の長さであろう。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々の蛋白質または蛋白質のコレクションを言い得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチド中のアミノ酸の１つ以上は、例えば、化学的実体、例えば炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化、または他の改変のためのリンカーなどの追加によって改変され得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、単分子でもまたあり得、または多分子複合体であり得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在する蛋白質またはペプチドの単に断片であり得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在、組換体、もしくは合成、またはそれらの組み合わせであり得る。本明細書において用いられる用語「融合蛋白質」は、少なくとも２つの異なる蛋白質からの蛋白質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを言う。１つの蛋白質は、融合蛋白質のアミノ末端（Ｎ末端）部分またはカルボキシ末端（Ｃ末端）部分（protein）に位置し得、それゆえにそれぞれ「アミノ末端融合蛋白質」または「カルボキシ末端融合蛋白質」を形成する。蛋白質は、異なるドメイン、例えば、核酸編集蛋白質の核酸結合ドメイン（例えば、標的部位への蛋白質の結合を導くＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメイン）および核酸切断ドメインまたは触媒ドメインを含み得る。いくつかの態様において、蛋白質は、蛋白質性の一部、例えば核酸結合ドメインを構成するアミノ酸配列と、有機化合物、例えば核酸切断物質として働き得る化合物とを含む。いくつかの態様において、蛋白質は、核酸、例えばＲＮＡとの複合体であるか、またはそれと会合している。本明細書において提供される蛋白質のいずれかは、当分野において公知のいずれかの方法によって産生され得る。例えば、本明細書において提供される蛋白質は、組換体蛋白質発現および精製によって産生され得、これはペプチドリンカーを含む融合蛋白質に特に適している。組換体蛋白質発現および精製のための方法は周知であり、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual （4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)）に記載されているものを包含し、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
用語「ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼ」および「ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ」は本明細書においては交換可能に用いられ、切断の標的ではない１つ以上のＲＮＡと複合体を形成する（例えば、それと結合または会合する）ヌクレアーゼを言う。いくつかの態様において、ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼは、ＲＮＡとの複合体であるときに、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体と言われ得る。典型的には、結合されたＲＮＡ（単数または複数）はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と言われる。ｇＲＮＡは、２つ以上のＲＮＡの複合体としてまたは単一のＲＮＡ分子として存在し得る。単一のＲＮＡ分子として存在するｇＲＮＡはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と言われ得るが、「ｇＲＮＡ」は、単分子としてまたは２つ以上の分子の複合体としてどちらかで存在するガイドＲＮＡを言うために交換可能に用いられる。典型的には、単一のＲＮＡ種として存在するｇＲＮＡは２つのドメイン：（１）標的核酸との相同性を持ち合う（例えば、かつ標的へのＣａｓ９複合体の結合を導く）ドメイン；および（２）Ｃａｓ９蛋白質に結合するドメインを含む。いくつかの態様において、ドメイン（２）は、ｔｒａｃｒＲＮＡとして公知の配列に対応し、ステムループ構造を含む。例えば、いくつかの態様において、ドメイン（２）は、Jinek et al., Science337:816-821(2012)によって提供されているｔｒａｃｒＲＮＡと同一または相同であり、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。ｇＲＮＡの他の例（例えば、ドメイン２を包含するもの）は、「Switchable Cas9 Nucleases And Uses Thereof」と題する２０１３年９月６日出願の米国仮特許出願U.S.S.N.61/874,682および「Delivery System For Functional Nucleases」と題する２０１３年９月６日出願の米国仮特許出願U.S.S.N.61/874,746に見出され得、それぞれの内容全体はそれらの全体が参照によってここで組み込まれる。いくつかの態様において、ｇＲＮＡはドメイン（１）および（２）の２つ以上を含み、「延長型ｇＲＮＡ」と言われ得る。例えば、延長型ｇＲＮＡは、例えば２つ以上のＣａｓ９蛋白質に結合し、本明細書に記載される２つ以上の別々の領域において標的核酸に結合するであろう。ｇＲＮＡは標的を相補するヌクレオチド配列を含み、これが前記標的部位へのヌクレアーゼ／ＲＮＡ複合体の結合を媒介し、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体の配列特異性を提供する。いくつかの態様において、ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼは（ＣＲＩＳＰＲ関連システム）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えばStreptococcus pyogenesからのＣａｓ９（Ｃｓｎ１）である（例えば、"Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J. J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)；"CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471 :602-607(2011)；および"A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I, Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)参照。そのそれぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２３１】
ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）は標的ＤＮＡ切断部位へのＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションを用いるので、原理的には、これらの蛋白質は、ガイドＲＮＡによって規定されるいずれかの配列にターゲティングされる能力がある。ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９を部位特異的切断に（例えば、ゲノムを改変するために）用いる方法は、当分野において公知である（例えば、Cong, L. et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013)；Mali, P. et al., RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)；Hwang, W.Y. et al., Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013)；Jinek, M. et al., RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013); Dicarlo, J.E. et al., Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013)；Jiang, W. et al., RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)参照；そのそれぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０２３２】
本明細書において用いられる用語「対象」は、個体生物、例えば個体哺乳動物を言う。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は非ヒト霊長動物である。いくつかの態様において、対象はげっ歯動物である。いくつかの態様において、対象は羊、山羊、畜牛、猫、または犬である。いくつかの態様において、対象は脊椎動物、両生類、爬虫類、魚類、昆虫、ハエ、または線虫である。いくつかの態様において、対象は研究動物である。いくつかの態様において、対象は遺伝子操作されており、例えば遺伝子操作された非ヒト対象である。対象は、どちらかの性、および発達のいずれかのステージであり得る。
【０２３３】
用語「標的部位」は、デアミナーゼまたはデアミナーゼを含む融合蛋白質（例えば、本明細書において提供されるｄＣａｓ９−アデノシンデアミナーゼ融合蛋白質）によって脱アミノ化される核酸分子中の配列を言う。
【０２３４】
用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載される疾患もしくは異常またはその１つ以上の症状を後戻りさせるか、軽減するか、その始まりを遅らせるか、またはその進行を阻害することを狙った臨床的介入を言う。本明細書において用いられる用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載される疾患もしくは異常またはその１つ以上の症状を後戻りさせるか、軽減するか、その始まりを遅らせるか、またはその進行を阻害することを狙った臨床的介入を言う。いくつかの態様において、処置は、１つ以上の症状が発生した後におよび／または疾患が診断された後に投与され得る。他の態様において、処置は、症状の不在下において、例えば、症状を防止するかもしくはその始まりを遅らせるか、または疾患の始まりもしくは進行を阻害するために投与され得る。例えば、処置は、（例えば、症状の既往に照らして、および／または遺伝学的または他の易罹患性因子に照らして）症状の始まりに先立って易罹患性の個体に投与され得る。処置は、症状が解消した後にもまた、例えばそれらの再発を防止するかまたは遅らせるために継続され得る。
【０２３５】
蛋白質または核酸の文脈において本明細書において用いられる用語「組換体」は、天然に存在せず、ヒトによる操作の産物である蛋白質または核酸を言う。例えば、いくつかの態様において、組換体蛋白質または核酸分子は、いずれかの天然に存在する配列と比較して少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの変異を含むアミノ酸またはヌクレオチド配列を含む。
【０２３６】
発明の詳細な説明
この開示のいくつかの側面は、核酸塩基アデニンを脱アミノ化する蛋白質に関する。この開示は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のデオキシアデノシン残基のアデニンを脱アミノ化すること（すなわち、アミン基を除去すること）が可能なアデノシンデアミナーゼ蛋白質を提供する。例えば、本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼは、ＤＮＡのデオキシアデノシン残基のアデニンを脱アミノ化することが可能である。本発明の前に、ＤＮＡ中のデオキシアデノシンを脱アミノ化することが可能であるアデノシンデアミナーゼは知られていないことは理解されるべきである。この開示の他の側面は、特定のヌクレオチド配列と結合することが可能である、アデノシンデアミナーゼ（例えば、本明細書に記載されるＤＮＡ中のデオキシアデノシンを脱アミノ化するアデノシンデアミナーゼ）およびドメイン（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１蛋白質）を含む融合蛋白質を提供する。アデノシンデアミナーゼによるアデノシンの脱アミノ化は、点変異を導き得、このプロセスは、核酸編集と明細書で言われる。例えば、アデノシンは、シトシン残基と典型的な塩基対を形成するイノシン残基と変換され得る。かかる融合蛋白質は、インビトロのＤＮＡの標的特異的編集に、例えば、変異体細胞または動物の生成に；標的の変異の導入に、例えば、エクスビボの細胞の、例えば爾後に同じまたは別の対象に再導入される対象から得られた細胞の遺伝子欠損の修正に；および標的の変異の導入、例えば、対象の疾患関連遺伝子の遺伝子欠損の修正または不活性化変異の導入に用いられ得る。例として、ＡからＧへ、またはＴからＣへの変異を作製することにより処置され得る疾患は、本明細書において提供される核酸塩基編集因子を用いることにより処置され得る。本発明は、デアミナーゼおよび核酸塩基編集因子を利用する、デアミナーゼ、融合蛋白質、核酸、ベクター、細胞、組成物、方法、キット、システムなどを提供する。
【０２３７】
いくつかの態様において、本明細書において提供される核酸塩基編集因子は、１以上の蛋白質ドメインを一緒に融合することにより作製され得、それによって融合蛋白質が生成される。ある態様において、本明細書において提供される融合蛋白質は、融合蛋白質の塩基編集活性（例えば、効率、選択性、および特異性）を改善する１以上の特徴を含む。例えば、本明細書において提供される融合蛋白質は、減少したヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９ドメインを含み得る。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質は、ヌクレアーゼ活性を有しないＣａｓ９ドメイン（ｄＣａｓ９）またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）とも称される、二本鎖ＤＮＡ分子の１つの鎖を切断するＣａｓ９ドメインを含み得る。いずれかの具体的な理論によって拘束されようとすることはないが、触媒残基（例えば、Ｈ８４０）の存在は、標的Ａの反対のＴを含有する、編集されない（例えば脱アミノ化されない）鎖を切断するＣａｓ９の活性を維持する。Ｃａｓ９の触媒残基の変異（例えば、Ｄ１０からＡ１０）は、標的Ａ残基を含有する、編集される鎖の切断を防止する。かかるＣａｓ９バリアントは、ｇＲＮＡによって定義される標的配列に基づいて特定の場所に単一鎖のＤＮＡ切断（ニック）を生成することができ、編集されない鎖の修復に至り、最終的には編集されない鎖のＴからＣへの変化をもたらす。いくつかの態様において、本明細書において提供されるいずれかの融合蛋白質は、イノシン塩基除去修復の阻害剤、例えば、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインまたは触媒不活性型イノシン特異的ヌクレアーゼ（ｄＩＳＮ）をさらに含む。いずれかの具体的な理論によって拘束されようとすることはないが、ＵＧＩドメインまたはｄＩＳＮは、脱アミノ化されたアデノシン残基（例えば、イノシン）の塩基除去修復を阻害または予防し、それは、塩基編集因子の活性または効率を改善し得る。
【０２３８】
アデノシンデアミナーゼs
開示のいくつかの側面は、アデノシンデアミナーゼを提供する。いくつかの態様において、本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼは、アデニンを脱アミノ化することが可能である。いくつかの態様において、本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼは、ＤＮＡのデオキシアデノシン残基中のアデニンを脱アミノ化することが可能である。アデノシンデアミナーゼは、任意の好適な生物（例えば、E. coli）に由来してもよい。いくつかの態様において、アデニンデアミナーゼは、本明細書において提供される変異（例えば、ｅｃＴａｄＡにおける変異）のいずれかに対応する１個以上の変異を含む天然に存在するアデノシンデアミナーゼである。当業者は、当該技術分野に知られている方法により、例えば配列アラインメントおよびホモログ残基の決定により、ホモログ蛋白質および各々コードする核酸において対応する残基を同定することができるだろう。したがって、当業者は、本明細書に記載される変異のいずれか、例えばｅｃＴａｄＡにおいて同定される変異のいずれかに対応する任意の天然に存在するアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡと相同性を有する）において変異を生成することができるだろう。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、原核生物に由来する。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、細菌に由来する。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、Escherichia coli、Staphylococcus aureus、Salmonella typhi、Shewanella putrefaciens、Haemophilus influenzae、Caulobacter crescentus、またはBacillus subtilisに由来する。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、E. coliに由来する。
【０２３９】
原核生物のＴａｄＡ蛋白質の例示的なアラインメントは、図９２に示される。青色で強調されている残基は、ｓｓＤＮＡ上のＡからＩへの脱アミノ化を触媒するのに重要である可能性がある残基である。したがって、本明細書において提供されるｅｃＴａｄＡにおいて同定されているいずれかの変異は、別のアデニンデアミナーゼ、例えば、別の細菌に由来するＴａｄＡデアミナーゼ中のいずれかのホモログ残基において作製され得ることは理解されるべきである。図９３は、相対的配列同一性解析（配列同一性のヒートマップ）を示す：
【０２４０】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１、６４〜８４、４２０〜４３７、６７２〜６８４に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ、または本明細書において提供されるいずれかのアデノシンデアミナーゼと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼが、１個以上の変異（例えば、本明細書において提供される変異のいずれか）を含んでもよいことは理解されるべきである。本開示は、本明細書に記載される、いずれかの変異またはそれらの組み合わせに加えて、ある特定の百分率の同一性を有する任意のデアミナーゼドメインを提供する。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１、６４〜８４、４２０〜４３７、６７２〜６８４に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ、または本明細書において提供されるいずれかのアデノシンデアミナーゼと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれより多くの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１、６４〜８４、４２０〜４３７、６７２〜６８４に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ、または本明細書において提供されるいずれかのアデノシンデアミナーゼと比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、または少なくとも１７０の同一の一続きのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０２４１】
進化＃１および＃２変異
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＤ１０８Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＤ１０８Ｇ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１０８Ｖ、Ｄ１０８Ａ、もしくはＤ１０８Ｙ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。デアミナーゼの例示的なアラインメントは、図９２に示される。しかしながら、追加のデアミナーゼは、本明細書において提供されるように変異され得る相同のアミノ酸残基を同定するために、同様にアラインメントされてもよいことは、理解されるべきである。
【０２４２】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＡ１０６Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＡ１０６Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２４３】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＥ１５５Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸの存在は野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＥ１５５Ｄ、Ｅ１５５Ｇ、もしくはＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２４４】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＤ１４７Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸの存在は野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＤ１４７Ｙ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２４５】
本明細書において提供されるいずれかの変異（例えば、配列番号１のｅｃＴａｄＡアミノ酸配列に基づく）は、S. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）など他のアデノシンデアミナーゼ、、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えば、細菌アデノシンデアミナーゼ）に導入されてもよいことは、理解されるべきである。ｅｃＴａｄＡ中の変異残基と相同である他のアデノシンデアミナーゼからアミノ酸残基をどのように同定するかは当業者に明らかであろう。したがって、ｅｃＴａｄＡにおいて同定された変異のいずれかは、相同なアミノ酸残基を有する他のアデノシンデアミナーゼにおいて作製され得る。本明細書で提供される任意の変異のいずれかは、ｅｃＴａｄＡまたは別のアデノシンデアミナーゼにおいて個々にまたは任意の組み合わせで作製され得ることもまた理解されるべきである。例えば、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１においてＤ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｅ１５５Ｖ、および／もしくはＤ１４７Ｙ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含有し得る。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１において以下の群の変異（変異の群は、「；」により分離されている）、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む：
Ｄ１０８ＮおよびＡ１０６Ｖ；Ｄ１０８ＮおよびＥ１５５Ｖ；Ｄ１０８ＮおよびＤ１４７Ｙ；Ａ１０６ＶおよびＥ１５５Ｖ；Ａ１０６ＶおよびＤ１４７Ｙ；Ｅ１５５ＶおよびＤ１４７Ｙ；Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、およびＥ５５Ｖ；Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、およびＤ１４７Ｙ；Ｄ１０８Ｎ、Ｅ５５Ｖ、およびＤ１４７Ｙ；Ａ１０６Ｖ、Ｅ５５Ｖ、およびＤ１４７Ｙ；ならびにＤ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｅ５５Ｖ、およびＤ１４７Ｙ。しかしながら、本明細書において提供される対応する変異の任意の組み合わせは、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）において作製されてもよいことは、理解されるべきである。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡおよびｓａＴａｄＡにおいて作製された個々の変異および変異の組み合わせを同定する、表４に示される１個以上の変異を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、表４に示される変異または変異の組み合わせを含む。
【０２４６】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１における、１個以上の、Ｈ８Ｘ、Ｔ１７Ｘ、Ｌ１８Ｘ、Ｗ２３Ｘ、Ｌ３４Ｘ、Ｗ４５Ｘ、Ｒ５１Ｘ、Ａ５６Ｘ、Ｅ５９Ｘ、Ｅ８５Ｘ、Ｍ９４Ｘ、Ｉ９５Ｘ、Ｖ１０２Ｘ、Ｆ１０４Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｒ１０７Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｋ１１０Ｘ、Ｍ１１８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ａ１３８Ｘ、Ｆ１４９Ｘ、Ｍ１５１Ｘ、Ｒ１５３Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｉ１５６Ｘ、および／もしくはＫ１５７Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する１個以上の変異、ここでＸの存在は野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１における、１個以上の、Ｈ８Ｙ、Ｔ１７Ｓ、Ｌ１８Ｅ、Ｗ２３Ｌ、Ｌ３４Ｓ、Ｗ４５Ｌ、Ｒ５１Ｈ、Ａ５６Ｅ、またはＡ５６Ｓ、Ｅ５９Ｇ、Ｅ８５Ｋ、またはＥ８５Ｇ、Ｍ９４Ｌ、Ｉ９５Ｉ、Ｖ１０２Ａ、Ｆ１０４Ｌ、Ａ１０６Ｖ、Ｒ１０７Ｃ、またはＲ１０７Ｈ、またはＲ１０７Ｐ、Ｄ１０８Ｇ、またはＤ１０８Ｎ、またはＤ１０８Ｖ、またはＤ１０８Ａ、またはＤ１０８Ｙ、Ｋ１１０Ｉ、Ｍ１１８Ｋ、Ｎ１２７Ｓ、Ａ１３８Ｖ、Ｆ１４９Ｙ、Ｍ１５１Ｖ、Ｒ１５３Ｃ、Ｑ１５４Ｌ、Ｉ１５６Ｄ、および／もしくはＫ１５７Ｒ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１個以上の対応する変異を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１に対応する図１１に提供される１個以上の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１個以上の対応する変異を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、図１１に示されるコンストラクト１〜１６、または配列番号１に対応する表４に示されるコンストラクトのいずれか１つの変異（単数）もしくは変異（複数）、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１個以上の対応する変異（単数）もしくは変異（複数）を含む。
【０２４７】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１における、１個以上の、Ｈ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、および／もしくはＮ１２７Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する１個以上の変異、ここでＸは任意のアミノ酸の存在を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１における、１個以上の、Ｈ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、および／もしくはＮ１２７Ｓ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１個以上の対応する変異を含む。
【０２４８】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１における、１個以上の、Ｈ８Ｘ、Ｒ２６Ｘ、Ｍ６１Ｘ、Ｌ６８Ｘ、Ｍ７０Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ａ１０９Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｒ１５２Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、Ｋ１６１Ｘ、Ｑ１６３Ｘ、および／もしくはＴ１６６Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する１個以上の変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１における、１個以上の、Ｈ８Ｙ、Ｒ２６Ｗ、Ｍ６１Ｉ、Ｌ６８Ｑ、Ｍ７０Ｖ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｔ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、Ｒ１５２Ｃ、Ｑ１５４ＨまたはＱ１５４Ｒ、Ｅ１５５ＧまたはＥ１５５ＶまたはＥ１５５Ｄ、Ｋ１６１Ｑ、Ｑ１６３Ｈ、および／もしくはＴ１６６Ｐ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１個以上の対応する変異を含む。
【０２４９】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｒ１５２Ｘ、およびＱ１５４Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、もしくは６個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ８Ｘ、Ｍ６１Ｘ、Ｍ７０Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、およびＱ１６３Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、およびＴ１６６Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、もしくは５個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ８Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、およびＫ１６１Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、もしくは６個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ８Ｘ、Ｒ１２６Ｘ、Ｌ６８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、およびＥ１５５Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ａ１０９Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、およびＥ１５５Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、もしくは５個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す、を含む。
【０２５０】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、Ｒ１５２Ｃ、およびＱ１５４Ｈからなる群から選択される１、２、３、４、５、もしくは６個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ８Ｙ、Ｍ６１Ｉ、Ｍ７０Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｑ１５４Ｒ、Ｅ１５５ＧおよびＱ１６３Ｈからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｅ１５５Ｖ、およびＴ１６６Ｐからなる群から選択される１、２、３、４、もしくは５個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ８Ｙ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｅ１５５Ｄ、およびＫ１６１Ｑからなる群から選択される１、２、３、４、５、もしくは６個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ８Ｙ、Ｒ１２６Ｗ、Ｌ６８Ｑ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｔ、Ｎ１２７Ｓ、およびＥ１５５Ｇからなる群から選択される１、２、３、４、もしくは５個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）を含む。
【０２５１】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１に対応する図１６に提供される１個以上の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１個以上の対応する変異を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１に対応する図１６コンストラクトｐＮＭＧ−１４９からｐＮＭＧ−１５４までのいずれか１つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＤ１０８Ｎ、Ｄ１０８Ｇ、もしくはＤ１０８Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＡ１０６ＶおよびＤ１０８Ｎ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＲ１０７ＣおよびＤ１０８Ｎ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、およびＱ１５４Ｈ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ８Ｙ、Ｒ２４Ｗ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＤ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、およびＳ１２７Ｓ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＡ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７ＹおよびＥ１５５Ｖ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２５２】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１における、１個以上の、Ｓ２Ｘ、Ｈ８Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ｌ８４Ｘ、Ｈ１２３Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｉ１５６Ｘおよび／もしくはＫ１６０Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する１個以上の変異、ここでＸの存在は野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１における、１個以上の、Ｓ２Ａ、Ｈ８Ｙ、Ｉ４９Ｆ、Ｌ８４Ｆ、Ｈ１２３Ｙ、Ｎ１２７Ｓ、Ｉ１５６Ｆおよび／もしくはＫ１６０Ｓ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１個以上の対応する変異を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１に対応する図９７に提供される１個以上の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１個以上の対応する変異を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１に対応する図９７に示されるクローン１〜３のいずれか１つの変異（単数）もしくは変異（複数）、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）を含む。
【０２５３】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＬ８４Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＬ８４Ｆ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２５４】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＨ１２３Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ１２３Ｙ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２５５】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＩ１５７Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＩ１５７Ｆ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２５６】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＬ８４Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｈ１２３Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、およびＩ１５６Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、もしくは７個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＳ２Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、およびＥ１５５Ｘからなる群から選択される１、２、３、４、５、もしくは６個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ８Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、およびＫ１６０Ｘからなる群から選択される１、２、３、４もしくは５個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す、を含む。
【０２５７】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＬ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、およびＩ１５６Ｆからなる群から選択される１、２、３、４、５、６もしくは７個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＳ２Ａ、Ｉ４９Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖからなる群から選択される１、２、３、４、５、もしくは６個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ８Ｙ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、およびＫ１６０Ｓからなる群から選択される１、２、３、４、もしくは５個の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）を含む。
【０２５８】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１における、１個以上の、Ｅ２５Ｘ、Ｒ２６Ｘ、Ｒ１０７Ｘ、Ａ１４２Ｘ、および／もしくはＡ１４３Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する１個以上の変異、ここでＸの存在は野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１における、１個以上の、Ｅ２５Ｍ、Ｅ２５Ｄ、Ｅ２５Ａ、Ｅ２５Ｒ、Ｅ２５Ｖ、Ｅ２５Ｓ、Ｅ２５Ｙ、Ｒ２６Ｇ、Ｒ２６Ｎ、Ｒ２６Ｑ、Ｒ２６Ｃ、Ｒ２６Ｌ、Ｒ２６Ｋ、Ｒ１０７Ｐ、Ｒ０７Ｋ、Ｒ１０７Ａ、Ｒ１０７Ｎ、Ｒ１０７Ｗ、Ｒ１０７Ｈ、Ｒ１０７Ｓ、Ａ１４２Ｎ、Ａ１４２Ｄ、Ａ１４２Ｇ、Ａ１４３Ｄ、Ａ１４３Ｇ、Ａ１４３Ｅ、Ａ１４３Ｌ、Ａ１４３Ｗ、Ａ１４３Ｍ、Ａ１４３Ｓ、Ａ１４３Ｑおよび／もしくはＡ１４３Ｒ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１個以上の対応する変異を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１に対応する表７に提供される１個以上の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１個以上の対応する変異を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１に対応する表７に示されるクローン１〜２２のいずれか１つの変異（単数）もしくは変異（複数）、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異（単数）もしくは変異（複数）を含む。
【０２５９】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＥ２５Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＥ２５Ｍ、Ｅ２５Ｄ、Ｅ２５Ａ、Ｅ２５Ｒ、Ｅ２５Ｖ、Ｅ２５Ｓ、またはＥ２５Ｙ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２６０】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＲ２６Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＲ２６Ｇ、Ｒ２６Ｎ、Ｒ２６Ｑ、Ｒ２６Ｃ、Ｒ２６Ｌ、もしくはＲ２６Ｋ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２６１】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＲ１０７Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＲ１０７Ｐ、Ｒ０７Ｋ、Ｒ１０７Ａ、Ｒ１０７Ｎ、Ｒ１０７Ｗ、Ｒ１０７Ｈ、もしくはＲ１０７Ｓ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２６２】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＡ１４２Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＡ１４２Ｎ、Ａ１４２Ｄ、Ａ１４２Ｇ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２６３】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＡ１４３Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＡ１４３Ｄ、Ａ１４３Ｇ、Ａ１４３Ｅ、Ａ１４３Ｌ、Ａ１４３Ｗ、Ａ１４３Ｍ、Ａ１４３Ｓ、Ａ１４３Ｑ、もしくはＡ１４３Ｒ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２６４】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１における、１個以上の、Ｈ３６Ｘ、Ｎ３７Ｘ、Ｐ４８Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ｒ５１Ｘ、Ｍ７０Ｘ、Ｎ７２Ｘ、Ｄ７７Ｘ、Ｅ１３４Ｘ、Ｓ１４６Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｋ１５７Ｘ、および／もしくはＫ１６１Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する１個以上の変異、ここでＸの存在は野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１における、１個以上の、Ｈ３６Ｌ、Ｎ３７Ｔ、Ｎ３７Ｓ、Ｐ４８Ｔ、Ｐ４８Ｌ、Ｉ４９Ｖ、Ｒ５１Ｈ、Ｒ５１Ｌ、Ｍ７０Ｌ、Ｎ７２Ｓ、Ｄ７７Ｇ、Ｅ１３４Ｇ、Ｓ１４６Ｒ、Ｓ１４６Ｃ、Ｑ１５４Ｈ、Ｋ１５７Ｎおよび／もしくはＫ１６１Ｔ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１個以上の対応する変異を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１に対応する図１２５〜１２８のいずれか１つに提供される１個以上の変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１個以上の対応する変異を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１に対応する図１２５〜１２８のいずれか１つに示されるクローン１〜１１のいずれか１つの変異（単数）もしくは変異（複数）、または別のアデノシンデアミナーゼにおける１個以上の対応する変異（単数）もしくは変異（複数）を含む。
【０２６５】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＨ３６Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＨ３６Ｌ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２６６】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＮ３７Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＮ３７Ｔ、もしくはＮ３７Ｓ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２６７】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＰ４８Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＰ４８Ｔ、もしくはＰ４８Ｌ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２６８】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＲ５１Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＲ５１Ｈ、もしくはＲ５１Ｌ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２６９】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＳ１４６Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＳ１４６Ｒ、もしくはＳ１４６Ｃ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２７０】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＫ１５７Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＫ１５７Ｎ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２７１】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＰ４８Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＰ４８Ｓ、Ｐ４８Ｔ、もしくはＰ４８Ａ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２７２】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＡ１４２Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＡ１４２Ｎ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２７３】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＷ２３Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＷ２３Ｒ、もしくはＷ２３Ｌ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２７４】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１におけるＲ１５２Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異、ここでＸは野生型アデノシンデアミナーゼにおける対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す、を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１におけるＲ１５２Ｐ、もしくはＲ５２Ｈ変異、または別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。
【０２７５】
アデノシンデアミナーゼ（例えば、第１のまたは第２のアデノシンデアミナーゼ）が、表４に示されるアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡアデノシンデアミナーゼ）のいずれかにおいて提供される１個以上の変異を含んでいてもよいことは理解されるべきである。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、表４に示されるアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡアデノシンデアミナーゼ）のいずれかの変異の組み合わせを含む。例えば、アデノシンデアミナーゼは、クローンｐＮＭＧ−４７７の第２のｅｃＴａｄＡ（配列番号１と比較して）に示されている、変異Ｈ３６Ｌ、Ｒ５１Ｌ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｓ１４６Ｃ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６Ｆ、およびＫ１５７Ｎを含んでいてもよい。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１と比較した以下の変異の組み合わせ、ここで組み合わせの各変異は「_」により分離され、変異の各組み合わせは、括弧の間にある、を含む：
【化３８】
2019536425.tif 000039
【化３９】
2019536425.tif 000040
【化４０】
2019536425.tif 000041
【化４１】
2019536425.tif 000042
【０２７６】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１、６４〜８４、４２０〜４３７、６７２〜６８４のいずれか１つ、または本明細書において提供されるいずれかのアデノシンデアミナーゼと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１、６４〜８４、４２０〜４３７、６７２〜６８４に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ、または本明細書において提供されるいずれかのアデノシンデアミナーゼと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれより多くの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１、６４〜８４、４２０〜４３７、６７２〜６８４に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ、または本明細書において提供されるいずれかのアデノシンデアミナーゼと比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、または少なくとも１６６個の同一の一続きのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１、６４〜８４、４２０〜４３７、６７２〜６８４のいずれか１つ、または本明細書において提供されるいずれかのアデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１、６４〜８４、４２０〜４３７、６７２〜６８４のいずれか１つ、または本明細書において提供されるいずれかのアデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列からなる。下に提供されるｅｃＴａｄＡ配列は、ｅｃＴａｄＡ（配列番号１）に由来し、Ｎ末端メチオニン（Ｍ）が存在しない。下に提供されるｓａＴａｄＡ配列は、ｓａＴａｄＡ（配列番号８）に由来し、Ｎ末端メチオニン（Ｍ）が存在しない。明確性のために、様々なアミノ酸変異を同定するために用いられるアミノ酸付番スキームは、E. coli ＴａｄＡのｅｃＴａｄＡ（配列番号１）およびS. aureus ＴａｄＡのｓａＴａｄＡ（配列番号８）に由来する。配列番号１（ｅｃＴａｄＡ）または配列番号８（ｓａＴａｄＡ）と比較したアミノ酸変異は、下線により示される。
【化４２】
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【化４３】
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【化４４】
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【化４５】
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【化４６】
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【化４７】
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【化４８】
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【化４９】
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【化５０】
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【化５１】
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【化５２】
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【０２７７】
核酸塩基編集因子のＣａｓ９ドメイン
いくつかの側面において、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、Ｃａｓ９ドメインである。限定することなく、例示的なＣａｓ９ドメインは、本明細書において提供される。Ｃａｓ９ドメインはヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９ドメイン、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９ドメイン、またはＣａｓ９ニッカーゼであり得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性ドメインである。例えば、Ｃａｓ９ドメインは、二本鎖核酸の両方の鎖（たとえば、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖）を切るＣａｓ９ドメインであり得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、配列番号：１０８〜３５７に示されるようなアミノ酸配列のいずれか１つを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、配列番号：１０８〜３５７に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、配列番号１０８〜３５７に示されているアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個以上、またはより多くの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、配列番号１０８〜３５７に示されているアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、または少なくとも１２００個の同一の一続きのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０２７８】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインはヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメイン（ｄＣａｓ９）である。例えば、ｄＣａｓ９ドメインは、二本鎖核酸分子のどちらかの鎖を切断することなしに、二本鎖核酸分子に（例えば、ｇＲＮＡ分子を介して）結合し得る。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ不活性型ｄＣａｓ９ドメインは、配列番号５２に示されているアミノ酸配列のＤ１０Ｘ変異およびＨ８４０Ｘ変異、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸変化である。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ不活性型ｄＣａｓ９ドメインは、配列番号５２に示されているアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異およびＨ８４０Ａ変異、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。１つの例として、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインは、配列番号５４に示されているアミノ酸配列を含む（クローニングベクターｐＰｌａｔＴＥＴ−ｇＲＮＡ２、アクセッションＮｏ．ＢＡＶ５４１２４）。
【化５３】
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【化５４】
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例えば、Qi et al., Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 2013; 152(5): 1173-83参照。その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０２７９】
追加の好適なヌクレアーゼ不活性型ｄＣａｓ９ドメインは、本開示の範囲内であり、本開示および当分野の知識に基づいて当業者には明らかであろう。かかる追加の例示的な好適なヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインは、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ、およびＤ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａ変異体ドメインを包含するが、これに限定されない（例えば、Prashant et al., CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838参照。その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９ドメインは、本明細書において提供されるｄＣａｓ９ドメインのいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、配列番号１０８〜３５７に示されているアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはより多くの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、配列番号１０８〜３５７に示されているアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、または少なくとも１２００個の一続きのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０２８０】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインはＣａｓ９ニッカーゼである。Ｃａｓ９ニッカーゼは、二本鎖核酸分子（例えば、二本鎖ＤＮＡ分子）の１つの鎖のみを切断することができるＣａｓ９蛋白質であり得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは二本鎖核酸分子の標的鎖を切断し、これは、Ｃａｓ９ニッカーゼが、Ｃａｓ９に結合しているｇＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）と塩基対形成する（それに対して相補的である）鎖を切断するということを意味する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは配列番号５２のＤ１０Ａ変異を含み、位置８４０のヒスチジン、または配列番号１０８〜３５７のいずれかにおける変異を有する。１つの例として、Ｃａｓ９ニッカーゼは、配列番号３５に示されているアミノ酸配列を含み得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、二本鎖核酸分子の非標的の塩基編集されない鎖を切断し、これは、Ｃａｓ９ニッカーゼが、Ｃａｓ９に結合しているｇＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）と塩基対形成しない鎖を切断するということを意味する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは配列番号５２のＨ８４０Ａ変異を含み、位置１０のアスパラギン酸残基、または配列番号１０８〜３５７のいずれかにおける対応する変異を有する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、本明細書において提供されるＣａｓ９ニッカーゼのいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。追加の好適なＣａｓ９ニッカーゼは本開示の範囲内であり、本開示および当分野の知識に基づいて当業者には明らかであろう。
【０２８１】
縮減されたＰＡＭ排他性を有するＣａｓ９ドメイン
本開示のいくつかの側面は、異なるＰＡＭ特異性を有するＣａｓ９ドメインを提供する。典型的には、Ｃａｓ９蛋白質、例えばS. pyogenesからのＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）は、具体的な核酸領域に結合するためにはカノニカルな（canonical）ＮＧＧ  ＰＡＭ配列を要求し、ここで「ＮＧＧ」中の「Ｎ」はアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）であり、Ｇはグアニンである。これは、ゲノム中の所望の塩基を編集する能力を限定し得る。いくつかの態様において、本明細書において提供される塩基編集融合蛋白質は、正確な場所に配置されることを必要とし得、例えば標的塩基は４塩基領域（例えば、「脱アミノ化ウインドウ」）内にあり、これがＰＡＭのおよそ１５塩基上流である。Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016)参照。その内容全体はここで参照によって組み込まれる。いくつかの態様において、脱アミノ化ウインドウは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基領域内にある。いくつかの態様において、脱アミノ化ウインドウは、ＰＡＭの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５塩基上流にある。従って、いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、カノニカルな（例えばＮＧＧ）ＰＡＭ配列を含有しないヌクレオチド配列に結合することができるＣａｓ９ドメインを含有し得る。非カノニカルなＰＡＭ配列に結合するＣａｓ９ドメインは当分野において記載されており、当業者には明らかであろう。例えば、非カノニカルなＰＡＭ配列に結合するＣａｓ９ドメインはKleinstiver, B. P., et al., "Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities" Nature 523, 481-485 (2015)；およびKleinstiver, B. P., et al., "Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition" Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)に記載されており；それぞれの内容全体はここで参照によって組み込まれる。
【０２８２】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインはStaphylococcus aureusからのＣａｓ９ドメインである（ＳａＣａｓ９）。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性なＳａＣａｓ９、ヌクレアーゼ不活性型ＳａＣａｓ９（ＳａＣａｓ９ｄ）、またはＳａＣａｓ９ニッカーゼ（ＳａＣａｓ９ｎ）である。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９はアミノ酸配列配列番号５５を含む。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９は、配列番号５５のＮ５７９Ｘ変異、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、ＸはＮ以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９は、配列番号５５のＮ５７９Ａ変異、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。
【０２８３】
いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９ドメイン、ＳａＣａｓ９ｄドメイン、またはＳａＣａｓ９ｎドメインは、非カノニカルなＰＡＭを有する核酸配列に結合し得る。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９ドメイン、ＳａＣａｓ９ｄドメイン、またはＳａＣａｓ９ｎドメインは、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭ配列を有する核酸配列に結合し得、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、およびＲ＝ＡまたはＧである。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９ドメインは、配列番号５５のＥ７８１Ｘ、Ｎ９６７Ｘ、およびＲ１０１４Ｘ変異の１つ以上、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９ドメインは、配列番号５５のＥ７８１Ｋ、Ｎ９６７Ｋ、およびＲ１０１４Ｈ変異の１つ以上、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける１つ以上の対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９ドメインは、配列番号５５のＥ７８１Ｋ、Ｎ９６７Ｋ、またはＲ１０１４Ｈ変異、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。
【０２８４】
いくつかの態様において、本明細書で提供される融合蛋白質のいずれかのＣａｓ９ドメインは、配列番号５５〜５７のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。いくつかの態様において、本明細書で提供される融合蛋白質のいずれかのＣａｓ９ドメインは、配列番号５５〜５７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書で提供される融合蛋白質のいずれかのＣａｓ９ドメインは、配列番号５５〜５７のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【０２８５】
【化５５】
2019536425.tif 000056
【０２８６】
下線部、太字の配列番号５５のＮ５７９残基を（例えばＡ５７９に）変異させて、ＳａＣａｓ９ニッカーゼを得ることができる。
【０２８７】
【化５６】
2019536425.tif 000057
【０２８８】
配列番号５５のＮ５７９から変異されてＳａＣａｓ９ニッカーゼを得ることができる、配列番号５６のＡ５７９残基を下線および太字で示す。
【０２８９】
【化５７】
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【化５８】
2019536425.tif 000059
【０２９０】
配列番号５５のＮ５７９から変異されてＳａＣａｓ９ニッカーゼを得ることができる、配列番号５７のＡ５７９残基を下線および太字で示す。配列番号５５のＥ７８１、Ｎ９６７、およびＲ１０１４から変異されてＳａＫＫＨ  Ｃａｓ９を得ることができる、配列番号５７のＫ７８１、Ｋ９６７、およびＨ１０１４残基を下線および斜体で示す。
【０２９１】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインはStreptococcus pyogenesからのＣａｓ９ドメインである（ＳｐＣａｓ９）。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインはヌクレアーゼ活性なＳｐＣａｓ９、ヌクレアーゼ不活性型ＳｐＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９ｄ）、またはＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（ＳｐＣａｓ９ｎ）である。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９はアミノ酸配列配列番号５８を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９は、配列番号５８のＤ９Ｘ変異、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、ＸはＤ以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９は、配列番号５８のＤ９Ａ変異、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメイン、ＳｐＣａｓ９ｄドメイン、またはＳｐＣａｓ９ｎドメインは、非カノニカルなＰＡＭを有する核酸配列に結合し得る。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメイン、ＳｐＣａｓ９ｄドメイン、またはＳｐＣａｓ９ｎドメインは、ＮＧＧ、ＮＧＡ、またはＮＧＣＧ  ＰＡＭ配列を有する核酸配列に結合し得る。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、配列番号５８のＤ１１３４Ｘ、Ｒ１３３４Ｘ、およびＴ１３３６Ｘ変異の１つ以上、または配列番号１０８〜３５によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、配列番号５８のＤ１１３４Ｅ、Ｒ１３３４Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異の１つ以上、または配列番号１０８〜３５によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、配列番号５８のＤ１１３４Ｅ、Ｒ１３３４Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異、または配列番号１０８〜３５によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、配列番号５８のＤ１１３４Ｘ、Ｒ１３３４Ｘ、およびＴ１３３６Ｘ変異の１つ以上、または配列番号１０８〜３５によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、配列番号５８のＤ１１３４Ｖ、Ｒ１３３４Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異の１つ以上、または配列番号１０８〜３５によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、配列番号５８のＤ１１３４Ｖ、Ｒ１３３４Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異、または配列番号１０８〜３５によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、配列番号５８のＤ１１３４Ｘ、Ｇ１２１７Ｘ、Ｒ１３３４Ｘ、およびＴ１３３６Ｘ変異の１つ以上、または配列番号１０８〜３５によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、配列番号５８のＤ１１３４Ｖ、Ｇ１２１７Ｒ、Ｒ１３３４Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異の１つ以上、または配列番号１０８〜３５によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、配列番号５８のＤ１１３４Ｖ、Ｇ１２１７Ｒ、Ｒ１３３４Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異、または配列番号１０８〜３５によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。
【０２９２】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのＣａｓ９ドメインは、配列番号５８〜６２のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのＣａｓ９ドメインは、配列番号５８〜６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのＣａｓ９ドメインは配列番号５８〜６２のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【化５９】
2019536425.tif 000060
【化６０】
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【化６１】
2019536425.tif 000062
【化６２】
2019536425.tif 000063
【０２９３】
配列番号５８のＤ１１３４、Ｒ１３３４、およびＴ１３３６から変異されてＳｐＥＱＲ  Ｃａｓ９を得ることができる、配列番号６０のＥ１１３４、Ｑ１３３４、およびＲ１３３６残基を下線および太字で示す。
【化６３】
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【０２９４】
配列番号５８のＤ１１３４、Ｒ１３３４、およびＴ１３３６から変異されてＳｐＶＱＲ  Ｃａｓ９を得ることができる、配列番号６１のＶ１１３４、Ｑ１３３４およびＲ１３３６残基を下線および太字で示す。
【化６４】
2019536425.tif 000065
【０２９５】
配列番号５８のＤ１１３４、Ｇ１２１７、Ｒ１３３４およびＴ１３３６から変異されてＳｐＶＲＥＲ  Ｃａｓ９を得ることができる、配列番号６２のＶ１１３４、Ｒ１２１７、Ｑ１３３４およびＲ１３３６残基を下線および太字で示す。
【０２９６】
ハイ・フィデリティＣａｓ９ドメイン
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供されるハイ・フィデリティＣａｓ９ドメイン核酸塩基編集因子を提供する。いくつかの態様において、ハイ・フィデリティＣａｓ９ドメインは、対応する野生型Ｃａｓ９ドメインと比較して、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖−リン酸バックボーンの間の静電相互作用が減少している、１つ以上の変異を含む編集されたＣａｓ９ドメインである。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、ＤＮＡの糖−リン酸バックボーンとの静電相互作用が減少したハイ・フィデリティＣａｓ９ドメインは、より少ないオフターゲット効果を有し得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメイン（例えば、野生型Ｃａｓ９ドメイン）は、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖−リン酸バックボーンとの間の会合を減少させる１つ以上の変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖−リン酸バックボーンとの間に、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、またはそれ以上会合の減少する１つ以上の変異を含む。
【０２９７】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるＣａｓ９融合蛋白質のいずれかは、配列番号５２によって提供されるアミノ酸配列のＮ４９７Ｘ、Ｒ６６１Ｘ、Ｑ６９５Ｘ、および／またはＱ９２６Ｘ変異の１つ以上、または配列番号１０８〜３５７において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、Ｘはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、本明細書において提供されるＣａｓ９融合蛋白質のいずれかは、配列番号５２によって提供されるアミノ酸配列のＮ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、および／もしくはＱ９２６Ａ変異の１つ以上、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは配列番号５２によって提供されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメイン（例えば、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかの）は、配列番号６２に示されているアミノ酸配列を含む。ハイ・フィデリティを有するＣａｓ９は当分野において公知であり、当業者には明らかであろう。例えば、ハイ・フィデリティを有するＣａｓ９ドメインは、Kleinstiver, B.P., et al. "High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects." Nature 529, 490-495 (2016)；およびSlaymaker, I.M., et al. "Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity." Science 351, 84-88 (2015)に記載されており、それぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２９８】
本明細書において提供される塩基編集因子のいずれか、例えば本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼ塩基編集因子のいずれかは、本明細書において記載されるＣａｓ９ドメインを改変することによってハイ・フィデリティ塩基編集因子に変換されて、ハイ・フィデリティ塩基編集因子、例えばハイ・フィデリティアデノシン塩基編集因子を生成し得ることは理解されるべきである。いくつかの態様において、ハイ・フィデリティＣａｓ９ドメインは、ｄＣａｓ９ドメインである。いくつかの態様において、ハイ・フィデリティＣａｓ９ドメインはｎＣａｓ９ドメインである。
【０２９９】
【化６５】
2019536425.tif 000066
【０３００】
核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質
本開示のいくつかの側面は、塩基編集因子などの蛋白質を、特異的核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列へとガイドするために用いられ得る、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質を提供する。核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質は、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９およびｎＣａｓ９）、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２Ｃ３、およびアルゴノートを包含するが、これに限定されない。Ｃａｓ９とは異なるＰＡＭ特異性を有する核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質の一例は、プレボテラ属（Prevotella）およびフランシセラ１（Francisella）由来のクラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回分配列リピート（Ｃｐｆ１）である。Ｃａｓ９と同様に、Ｃｐｆ１もまたクラス２ＣＲＩＳＰＲエフェクター（class 2 CRISPR effector）である。Ｃｐｆ１が、Ｃａｓ９とは別個の特徴との強固なＤＮＡ干渉を仲介することが示されている。Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠いている単一ＲＮＡ−誘導型エンドヌクレアーゼであり、Ｔ−リッチプロトスペーサー隣接モチーフ（ＴＴＮ、ＴＴＴＮ、またはＹＴＮ）を利用する。さらに、Ｃｐｆ１はスタガーＤＮＡの二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。１６のＣｐｆ１−ファミリー蛋白質の中で、AcidaminococcusおよびLachnospiraceae由来の２つの酵素がヒト細胞において効率的なゲノム編集活性を有することが示されている。Ｃｐｆ１蛋白質は、当分野において公知であり、例えば以前に、Yamano et al., "Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA." Cell (165) 2016, p. 949-962；に記載されており、その内容全体は参照として本明細書に組み込まれる。
【０３０１】
ガイドヌクレオチド配列−プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質ドメインとして使用され得るヌクレアーゼ−不活性Ｃｐｆ１（ｄＣｐｆ１）バリアントもまた本組成物および方法において役立つ。Ｃｐｆ１蛋白質は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインと同様であるＲｕｖＣ−様エンドヌクレアーゼドメインを有するが、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインは有しておらず、Ｃｐｆ１のＮ−末端がＣａｓ９のアルファ−ヘリックス認識ローブ（lobe）を有していない。Ｃｐｆ１のＲｕｖＣ−様ドメインが両ＤＮＡ鎖を切断する要因であることおよびＲｕｖＣ−様ドメインの不活性化がＣｐｆ１のヌクレアーゼ活性を不活性にすることがZetsche et al., Cell, 163, 759-771, 2015（参照により本明細書に組み込まれている）に示されていた。例えば、Francisella novicidaＣｐｆ１（配列番号３８２）におけるＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、またはＤ１２５５Ａに対応する変異は、Ｃｐｆ１のヌクレアーゼ活性を不活性にする。いくつかの態様において、本開示のｄＣｐｆ１は、配列番号３７６におけるＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ、またはＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａに対応する変異を含む。Ｃｐｆ１のＲｕｖＣドメインを不活性にするいずれかの変異、例えば、置換変異、欠失、または挿入は、本開示に従って使用され得る。
【０３０２】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかの核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、Ｃｐｆ１蛋白質であり得る。いくつかの態様において、Ｃｐｆ１蛋白質は、Ｃｐｆ１ニッカーゼ（ｎＣｐｆ１）である。いくつかの態様において、Ｃｐｆ１蛋白質は、ヌクレアーゼ不活性Ｃｐｆ１（ｄＣｐｆ１）である。いくつかの態様において、Ｃｐｆ１、ｎＣｐｆ１、またはｄＣｐｆ１は、配列番号３７６〜３８２のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも（at ease）９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｄＣｐｆ１は、配列番号３７６〜３８２のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも（at ease）９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号３７６におけるＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ、またはＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａに対応する変異を含む。いくつかの態様において、ｄＣｐｆ１は、配列番号３７６〜３８２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の細菌種に由来するＣｐｆ１もまた、本開示に従って使用され得ることは理解されるべきである。
【化６６】
2019536425.tif 000067
【化６７】
2019536425.tif 000068
【化６８】
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【化６９】
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【化７０】
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【化７１】
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【化７２】
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【０３０３】
いくつかの態様において、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、カノニカルな（ＮＧＧ）ＰＡＭ配列を要求しない核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質である。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐはアルゴノート蛋白質である。かかる核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質の一例は、Natronobacterium gregoryi由来のアルゴノート蛋白質（ＮｇＡｇｏ）である。ＮｇＡｇｏはｓｓＤＮＡ−誘導型エンドヌクレアーゼである。ＮｇＡｇｏは、約２４ヌクレオチドの５’リン酸化ｓｓＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に結合し、それをその標的部位にガイドし、ｇＤＮＡ部位においてＤＮＡ二本鎖切断を生じさせるであろう。Ｃａｓ９とは対照的に、ＮｇＡｇｏ−ｇＤＮＡシステムは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を要求しない。ヌクレアーゼ不活性ＮｇＡｇｏ（ｄＮｇＡｇｏ）を使用することは、標的化され得る塩基を大きく拡張することができる。ＮｇＡｇｏの特徴づけおよび使用は、Gao et al., Nat Biotechnol., 2016 Jul;34(7):768-73.  PubMed PMID: 27136078; Swarts et al., Nature.  507(7491) (2014):258-61；およびSwarts et al., Nucleic Acids Res.  43(10) (2015):5120-9に記載されており、それぞれ参照によって本明細書に組み込まれている。Natronobacterium gregoryiアルゴノートは配列番号４１６によって提供されている。
【化７３】
2019536425.tif 000074
【０３０４】
いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、アルゴノート蛋白質の原核生物ホモログである。アルゴノート蛋白質の原核生物ホモログは公知であり、例えば、Makarova K., et al., "Prokaryotic homologs of Argonaute proteins are predicted to function as key components of a novel system of defense against mobile genetic elements", Biol Direct. 2009 Aug 25;4:29. doi: 10.1186/1745-6150-4-29において記載されており、その内容全体は参照によって本明細書により組み込まれる。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Marinitoga piezophilaアルゴノート（ＭｐＡｇｏ）蛋白質である。ＣＲＩＳＰＲ−関連Marinitoga piezophilaアルゴノート（ＭｐＡｇｏ）蛋白質は、５’−リン酸化ガイドを使用して、単一鎖標的配列を切断する。５’ガイドは、すべての公知のアルゴノートにより用いられる。ＭｐＡｇｏ−ＲＮＡ複合体の結晶構造は、５’リン酸相互作用を妨げる残基を含むガイド鎖結合部位を示している。このデータは、５’−ヒドロキシル化ガイドについての非カノニカルな特異性を伴うアルゴノートサブクラスの進化を示唆している。例えば、Kaya et al., "A bacterial Argonaute with noncanonical guide RNA specificity", Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Apr 12;113(15):4057-62を参照し、その内容全体を参照によって本明細書に組み込まれる。他のアルゴノート蛋白質は、使用され得、本開示の範囲内にあることを理解されるべきである。
【０３０５】
いくつかの態様において、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、微生物ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの単一エフェクターである。微生物ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの単一エフェクターは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、およびＣ２ｃ３を包含するが、これに限定されない。典型的に、微生物ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、クラス１およびクラス２システムに分割される。Ｃｌａｓｓ１システムは、マルチサブユニットエフェクター複合体を有し、一方クラス２システムは、単一蛋白質エフェクターを有する。例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１はクラス２エフェクターである。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１に加えて、３つの別個のクラス２ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム（Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、およびＣ２ｃ３）が、Shmakov et al., "Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems", Mol. Cell, 2015 Nov 5; 60(3): 385-397に記載されており、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。Ｃ２ｃ１およびＣ２ｃ３の２つのシステムのエフェクターは、Ｃｐｆ１に関するＲｕｖＣ−様エンドヌクレアーゼドメインを含有する。第３のシステム、Ｃ２ｃ２は、２つのＨＥＰＮ  ＲＮａｓｅドメインに基づくエフェクターを含有する。成熟したＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡの生産は、Ｃ２ｃ１によるＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡの生産とは異なり、ｔｒａｃｒＲＮＡとは独立である。Ｃ２ｃ１は、ＤＮＡ切断についてＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方に依存している。細菌のＣ２ｃ２は、その活性型ＲＮＡ単一鎖ＲＮＡ分解活性とは別個にＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡの成熟について独特なＲＮａｓｅ活性を所有することを示されている。これらのＲＮａｓｅ機能は、互いにおよび、ＣＰｆ１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡプロセシング挙動とは異なる。例えば、East-Seletsky, et al., "Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide RNA processing and RNA detection", Nature, 2016 Oct 13;538(7624):270-273を参照し、その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。Leptotrichia shahiiにおけるＣ２ｃ２のインビトロ生化学的分析は、Ｃ２ｃ２が単一ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡによる誘導型であり、相補的プロトスペーサーを運搬するｓｓＲＮＡ標的を切断するようプログラムされ得ることを示している。２つの保存されたＨＥＰＮドメインにおける触媒残基は、切断を仲介する。触媒残基における変異は、触媒不活性型ＲＮＡ結合蛋白質を生成する。例えば、Abudayyeh et al., "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector", Science, 2016 Aug 5; 353(6299)を参照し、その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３０６】
Alicyclobaccillus acidoterrastris  Ｃ２ｃ１（ＡａｃＣ２ｃ１）の結晶構造は、キメラ単一−分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と複合していると報告されている。例えば、Liu et al., "C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism", Mol. Cell, 2017 Jan 19;65(2):310-322を参照し、その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。結晶構造はまた、Alicyclobacillus acidoterrestris  Ｃ２ｃ１において三重複合体として標的ＤＮＡに結合したものを報告している。例えば、Yang et al., "PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease", Cell, 2016 Dec 15;167(7):1814-1828を参照し、その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれている。標的および非標的ＤＮＡ鎖の両方で、ＡａｃＣ２ｃ１の触媒能力のあるコンホメーションは、捕捉され、標的ＤＮＡのスタガー７ヌクレオチド切断の結果生じるＣ２ｃ１−仲介切断と、単一ＲｕｖＣ触媒ポケット内に独立して位置する。Ｃ２ｃ１三重複合体と前もって同定されたＣａｓ９およびＣｐｆ１の対照物との間の構造の比較は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムにより使用されたメカニズムの多様性を説明している。
【０３０７】
いくつかの態様において、本明細書において提供される、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）のいずれかの融合蛋白質は、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、またはＣ２ｃ３蛋白質であり得る。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐはＣ２ｃ１蛋白質である。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐはＣ２ｃ２蛋白質である。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐはＣ２ｃ３蛋白質である。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に生じるＣ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、またはＣ２ｃ３蛋白質と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも（at ease）９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に生じるＣ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、またはＣ２ｃ３蛋白質である。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、配列番号４３８または４３９のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも（at ease）９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、配列番号４３８または４３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の細菌種由来のＣ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、またはＣ２ｃ３もまた、本開示に従って使用され得ることを理解されるべきである。
【化７４】
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【化７５】
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【化７６】
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【０３０８】
ヌクレアーゼプログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質およびアデノシンデアミナーゼを含む融合蛋白質
本開示のいくつかの側面は、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）およびアデノシンデアミナーゼを含む融合蛋白質を提供している。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、塩基編集因子である。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ドメイン、Ｃｐｆ１ドメイン、ＣａｓＸドメイン、ＣａｓＹドメイン、Ｃ２ｃ１ドメイン、Ｃ２ｃ２ドメイン、Ｃ２ｃ３ドメイン、またはアルゴノートドメインである。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書において提供されるいずれかのｎａｐＤＮＡｂｐである。本開示のいくつかの側面は、Ｃａｓ９ドメインおよびアデノシンデアミナーゼを含む融合蛋白質を提供する。Ｃａｓ９ドメインは、本明細書において提供されるＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ９蛋白質（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）であり得る。いくつかの態様において、本明細書において提供されるＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ９蛋白質（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）のいずれかは、本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと融合され得る。いくつかの態様において、融合蛋白質は以下の構造：
ＮＨ２−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ
を含む。
【０３０９】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９ドメイン）を含む融合蛋白質は、リンカー配列を包含しない。いくつかの態様において、リンカーは、アデノシンデアミナーゼドメインとｎａｐＤＮＡｂｐとの間に存在する。いくつかの態様において、上記の一般的な構成において使用される「−」は、任意のリンカーの存在を示す。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書において提供されている、リンカーのいずれかを介して融合されている。例えば、いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐは、「リンカー」と表題をつけられている以下のセクションにおいて提供されるリンカーのいずれかを介して融合されている。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐは、１〜２００のアミノ酸を含むリンカーを介して融合されている。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐは、１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、１〜６０、１〜８０、１〜１００、１〜１５０、１〜２００、５〜１０、５〜２０、５〜３０、５〜４０、５〜６０、５〜８０、５〜１００、５〜１５０、５〜２００、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜８０、１０〜１００、１０〜１５０、１０〜２００、２０〜３０、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜８０、２０〜１００、２０〜１５０、２０〜２００、３０〜４０、３０〜５０、３０〜６０、３０〜８０、３０〜１００、３０〜１５０、３０〜２００、４０〜５０、４０〜６０、４０〜８０、４０〜１００、４０〜１５０、４０〜２００、５０〜６０、５０〜８０、５０〜１００、５０〜１５０、５０〜２００、６０〜８０、６０〜１００、６０〜１５０、６０〜２００、８０〜１００、８０〜１５０、８０〜２００、１００〜１５０、１００〜２００、または１５０〜２００のアミノ酸長を含むリンカーを介して融合されている。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐは、４、１６、３２、または１０４のアミノ酸長を含むリンカーを介して融合されている。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐは、
【化７７】
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のアミノ酸配列を含むリンカーを介して融合されている。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐは、ＸＴＥＮリンカーとしてもまた呼ばれ得る、アミノ酸配列
【化７８】
2019536425.tif 000079
を含むリンカーを介して融合されている。いくつかの態様において、リンカーは、２４アミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列
【化７９】
2019536425.tif 000080
を含む。いくつかの態様において、リンカーは、４０アミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列
【化８０】
2019536425.tif 000081
を含む。いくつかの態様において、リンカーは６４アミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列
【化８１】
2019536425.tif 000082
を含む。いくつかの態様において、リンカーは９２アミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列
【化８２】
2019536425.tif 000083
を含む。
【０３１０】
塩基修復の阻害剤を含む融合蛋白質
本開示のいくつかの側面は、塩基修復の阻害剤（ＩＢＲ）を含む融合蛋白質を提供する。例えば、アデノシンデアミナーゼおよび核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質を含む融合蛋白質は、さらに塩基修復の阻害剤を含み得る。いくつかの態様において、ＩＢＲはイノシン塩基修復の阻害剤を含む。いくつかの態様において、ＩＢＲはイノシン塩基除去修復の阻害剤である。いくつかの態様において、イノシン塩基除去修復の阻害剤は、触媒不活性型イノシン特異的ヌクレアーゼ（ｄＩＳＮ）である。
【０３１１】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質は、さらに触媒不活性型イノシン特異的ヌクレアーゼ（ｄＩＳＮ）を含む。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９ドメイン、ヌクレアーゼ不活性ｄＣａｓ９ドメイン、またはＣａｓ９ニッカーゼ）およびアデノシンデアミナーゼを含む、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、さらに触媒不活性型イノシン特異的ヌクレアーゼ（ｄＩＳＮ）に直接またはリンカーを介してのどちらかで融合され得る。本開示のいくつかの側面は、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＤＮＡにおいてアデノシンを脱アミノ化するよう設計されたアデノシンデアミナーゼ）ｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）、およびｄＩＳＮを含む融合蛋白質を提供する。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、ヘテロ二本鎖ＤＮＡのＩ：Ｔの存在への細胞のＤＮＡ−修復応答は、細胞における核酸塩基編集効率の減少の要因となり得る。例えば、ＡＡＧは、細胞中のＤＮＡからイノシン（Ｉ）の除去を触媒し、最も多い結果として、Ｉ：Ｔ対をＡ：Ｔ対へと戻す、塩基除去修復を開始し得る。いくつかの態様において、触媒不活性型イノシン特異的ヌクレアーゼは、核酸中のイノシンに、核酸を切断することなく、結合することが可能であり、ＤＮＡ中のイノシン残基の除去（例えば、細胞のＤＮＡ修復メカニズムによる）を防止し得る。
【０３１２】
いくつかの態様において、ｄＩＳＮは、イノシン除去酵素がＤＮＡからイノシン残基を切除することを阻害する（例えば、立体障害により）。例えば、触媒作用が失われたイノシングリコシラーゼ（例えば、アルキルアデニングリコシラーゼ［ＡＡＧ］）は、イノシンに結合するが、脱塩基部位を作成したりイノシンを除去したりはせず、それによって潜在的なＤＮＡ損傷／修復メカニズムがイノシン部分の新たな形成を立体的に妨げる。従って、本開示は、ｎａｐＤＮＡｂｐおよびアデノシンデアミナーゼを含み、さらにｄＩＳＮに融合されている、融合蛋白質を企図する。本開示は、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ドメイン、触媒不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ドメイン、ハイ・フィデリティＣａｓ９ドメイン、またはＰＡＭ排他性を縮減されたＣａｓ９ドメインといった、いかなるＣａｓ９ドメインを含む融合蛋白質を企図する。ｄＩＳＮの使用がＡからＩへの変化を触媒することが可能なアデノシンデアミナーゼの編集効率を増加させ得ることは理解されるべきである。例えば、ｄＩＳＮドメインを含む融合蛋白質は、Ａ残基の脱アミノ化においてより効率的になり得る。いくつかの態様において、融合蛋白質は、以下の構造：
ＮＨ２−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ｄＩＳＮ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｄＩＳＮ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｄＩＳＮ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｄＩＳＮ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ｄＩＳＮ］−［アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２−［ｄＩＳＮ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ
を含む。
【０３１３】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質は、リンカーを含まない。いくつかの態様において、リンカーは２つのドメインまたは蛋白質（例えば、アデノシンデアミナーゼ、ｎａｐＤＮＡｂｐ、またはｄＩＳＮ）との間に存在している。いくつかの態様において、上記の一般的な構成において使用される「−」は、任意のリンカー配列の存在を示す。いくつかの態様において、ｄＩＳＮは、ヌクレアーゼ活性の縮減された、またはヌクレアーゼ活性を有さない、イノシン特異的ヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、ｄＩＳＮは、対応する（例えば、野生型）イノシン特異的ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性の１％まで、２％まで、３％まで、４％まで、５％まで、１０％まで、１５％まで、２０％まで、２５％まで、３０％まで、３５％まで、４０％まで、４５％まで、または５０％までを有する。いくつかの態様において、ｄＩＳＮは、野生型イノシン特異的ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を縮減または消失させる１つ以上の変異を含む野生型イノシン特異的ヌクレアーゼである。例示的な触媒不活性型イノシン特異的ヌクレアーゼは、触媒不活性型ＡＡＧヌクレアーゼおよび触媒不活性型ＥｎｄｏＶヌクレアーゼを包含するが、これに限定されない。いくつかの態様において、触媒不活性型ＡＡＧヌクレアーゼは、配列番号３２と比較したＥ１２５Ｑ変異、または別のＡＡＧヌクレアーゼにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、触媒不活性型ＡＡＧヌクレアーゼは、配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、触媒不活性型ＥｎｄｏＶヌクレアーゼは、配列番号３２と比較したＤ３５Ａ変異、または別のＥｎｄｏＶヌクレアーゼにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、触媒不活性型ＥｎｄｏＶヌクレアーゼは、配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含む。他の触媒不活性型イノシン特異的ヌクレアーゼ（ｄＩＳＮ）は、当業者にとって明らかであり、本開示の範囲内にあることを理解されるべきである。
【０３１４】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるｄＩＳＮ蛋白質は、ｄＩＳＮ蛋白質の断片およびｄＩＳＮまたはｄＩＳＮ断片の蛋白質ホモログを包含する。例えば、いくつかの態様において、ｄＩＳＮは、配列番号３２または３３で示されるアミノ酸配列の断片を含む。いくつかの態様において、ｄＩＳＮ断片は、配列番号３２または３３で示されるアミノ酸配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｄＩＳＮは、配列番号３２もしくは３３で示されるアミノ酸配列とホモログなアミノ酸配列、または配列番号３２もしくは３３で示されるアミノ酸配列の断片とホモログなアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｄＩＳＮまたはｄＩＳＮの断片またはｄＩＳＮもしくはｄＩＳＮ断片のホモログを含む蛋白質は、「ｄＩＳＮバリアント」と呼ばれる。ｄＩＳＮバリアントは、ｄＩＳＮまたはそれらの断片と相同性を共有する。例えば、ｄＩＳＮバリアントは、野生型ｄＩＳＮまたは配列番号３２もしくは３３に示されるｄＩＳＮと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または少なくとも９９．９％と同一である。いくつかの態様において、ｄＩＳＮバリアントは、断片が野生型ｄＩＳＮまたは配列番号３２もしくは３３に示されるｄＩＳＮの対応する断片と少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または少なくとも９９．９％同一であるようにｄＩＳＮ断片を含む。いくつかの態様において、ｄＩＳＮは以下のアミノ酸配列：
【化８３】
2019536425.tif 000084
を含む。
【０３１５】
好適なｄＩＳＮ蛋白質は、本明細書において提供され、追加の好適なｄＩＳＮ蛋白質は、当業者にとって公知であり、例えば、ＡＡＧ、ＥｎｄｏＶ、およびそれらのバリアントを包含する。イノシンの切除などの塩基除去修復を妨げるまたは阻害する追加の蛋白質もまた、本開示の範囲内であることを理解されるべきである。いくつかの態様において、ＤＮＡ中でイノシンに結合する蛋白質が使用される。
【０３１６】
本開示のいくつかの側面は、塩基修復の阻害剤として使用され得るＭＢＤ４、またはＴＤＧを含む融合蛋白質に関する。従って、本開示は、ＭＢＤ４またはＴＤＧにさらに融合されているｎａｐＤＮＡｂｐおよびアデノシンデアミナーゼを含む融合蛋白質を企図する。本開示は、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ドメイン、触媒不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ドメイン、ハイ・フィデリティＣａｓ９ドメイン、または縮減されたＰＡＭ排他性を有するＣａｓ９ドメインなどのいずれかのＣａｓ９ドメインを含む融合蛋白質を企図する。ＭＢＤ４またはＴＤＧの使用は、ＡからＩへの変化を触媒することが可能であるアデノシンデアミナーゼの編集効率を増加させ得ることを理解されるべきである。例えば、ＭＢＤ４またはＴＤＧを含む融合蛋白質は、Ａ残基の脱アミノ化においてよりよい効率であり得る。いくつかの態様において、融合蛋白質は以下の構造：
ＮＨ２−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＭＢＤ４またはＴＤＧ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＭＢＤ４またはＴＤＧ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＭＢＤ４またはＴＤＧ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＭＢＤ４またはＴＤＧ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＭＢＤ４またはＴＤＧ］−［アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２−［ＭＢＤ４またはＴＤＧ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ
を含む。
【０３１７】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質は、リンカーを含まない。いくつかの態様において、リンカーは、２つのドメインまたは蛋白質（例えば、アデノシンデアミナーゼ、ｎａｐＤＮＡｂｐ、ＭＢＤ４またはＴＤＧ）との間に存在する。いくつかの態様において、上記の一般的な構成において使用される「−」は、任意のリンカー配列の存在を示す。いくつかの態様において、ＭＢＤ４またはＴＤＧは、野生型のＭＢＤ４またはＴＤＧである。例示的に、ＭＢＤ４およびＴＤＧアミノ酸配列は、当業者にとっては明らかであり、以下に提供されるＭＢＤ４およびＴＤＧのアミノ酸配列を包含するが、これに限定されないだろう。
【化８４】
2019536425.tif 000085
【０３１８】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるＭＢＤ４またはＴＤＧ蛋白質は、ＭＢＤ４またはＴＤＧ蛋白質の断片およびＭＢＤ４またはＴＤＧ断片の蛋白質ホモログを包含する。例えば、いくつかの態様において、ＭＢＤ４またはＴＤＧ蛋白質は、配列番号６８９または６９０で示されるアミノ酸配列の断片を含む。いくつかの態様において、ＭＢＤ４またはＴＤＧ断片は、配列番号６８９または６９０で示されるアミノ酸配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＭＢＤ４またはＴＤＧ蛋白質は、配列番号６８９もしくは６９０で示されるアミノ酸配列とホモログなアミノ酸配列、または配列番号６８９もしくは６９０で示されるアミノ酸配列の断片とホモログなアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＭＢＤ４もしくはＴＤＧまたはＭＢＤ４もしくはＴＤＧの断片またはＭＢＤ４もしくはＴＤＧ断片のホモログを含む蛋白質は、「ＭＢＤ４バリアント」もしくは「ＴＤＧバリアント」と呼ばれる。ＭＢＤ４もしくはＴＤＧバリアントは、ＭＢＤ４もしくはＴＤＧ、またはそれらの断片と相同性を共有する。例えば、ＭＢＤ４もしくはＴＤＧバリアントは、野生型ＭＢＤ４もしくはＴＤＧまたは配列番号６８９もしくは６９０で示されるＭＢＤ４もしくはＴＤＧと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または少なくとも９９．９％と同一である。いくつかの態様において、ＭＢＤ４もしくはＴＤＧバリアントは、断片が野生型ＭＢＤ４もしくはＴＤＧまたは配列番号６８９もしくは６９０で示されるＭＢＤ４もしくはＴＤＧの対応する断片と少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または少なくとも９９．９％同一であるようにＭＢＤ４もしくはＴＤＧの断片を含む。いくつかの態様において、ｄＩＳＮは、以下のアミノ酸配列を含む。
【０３１９】
本開示のいくつかの側面は、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインを含む融合蛋白質に関する。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９ドメイン、ヌクレアーゼ不活性ｄＣａｓ９ドメイン、またはＣａｓ９ニッカーゼ）、およびアデノシンデアミナーゼを含む本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、直接またはリンカーを介してのいずれかでさらにＵＧＩドメインに融合されているだろう。本開示のいくつかの側面は、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＤＮＡ中のデオキシアデノシンを脱アミノ化する編集されたアデノシンデアミナーゼ）ｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）、およびＵＧＩドメインを含む融合蛋白質を提供する。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、ヘテロ二本鎖ＤＮＡのＩ：Ｔの存在への細胞のＤＮＡ−修復応答は、細胞における核酸塩基編集効率の減少の要因となり得る。例えば、アルキルアデノシングリコシラーゼ（ＡＡＧ）は、イノシン（Ｉ）関連ＤＮＡ修復に関係し、細胞中のＤＮＡからのＩの除去を触媒する。これは、最も多い結果としてＩ：Ｔ対からＡ：Ｔ対へ戻す、塩基除去修復を開始し得る。ＵＧＩドメインは、イノシン除去酵素がＤＮＡからイノシン残基を切除することを阻害し得る（例えば、立体障害により）。従って、本開示はＣａｓ９ドメインおよびアデノシンデアミナーゼドメインを含み、さらにＵＧＩドメインに融合されている融合蛋白質について企図する。本開示は、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ドメイン、触媒不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ドメイン、ハイ・フィデリティＣａｓ９ドメイン、または縮減されたＰＡＭ排他性を有するＣａｓ９ドメインなどのいかなる核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質を含む融合蛋白質を企図する。ＵＧＩドメインの使用は、ＡからＩへの変化を触媒することが可能なアデノシンデアミナーゼの編集効率を増加させ得ることを理解すべきである。例えば、ＵＧＩドメインを含む融合蛋白質は、アデノシン残基を脱アミノ化することにおいてより効率的であり得る。いくつかの態様において、融合蛋白質は、以下の構造：
ＮＨ２−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＵＧＩ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＵＧＩ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＵＧＩ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＵＧＩ］−［アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２−［ＵＧＩ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ
を含む。
【０３２０】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質は、リンカーを含まない。いくつかの態様において、リンカーは、ドメインまたは蛋白質（例えば、アデノシンデアミナーゼ、ｎａｐＤＮＡｂｐ、および／またはＵＧＩドメイン）のいずれかとの間に存在する。いくつかの態様において、上記の一般的な構成において使用される「−」は、任意のリンカーの存在を示す。
【０３２１】
いくつかの態様において、ＵＧＩドメインは、野生型ＵＧＩまたは配列番号３で示されるＵＧＩを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供されるＵＧＩ蛋白質は、ＵＧＩの断片およびＵＧＩまたはＵＧＩ断片のホモログ蛋白質を包含する。例えば、いくつかの態様において、ＵＧＩドメインは、配列番号３で示されるアミノ酸配列の断片を含む。いくつかの態様において、ＵＧＩ断片は、配列番号３で示されるアミノ酸配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＵＧＩは、配列番号３で示されるアミノ酸配列とホモログなアミノ酸配列または配列番号３で示されるアミノ酸配列の断片とホモログなアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＵＧＩまたはＵＧＩの断片またはＵＧＩもしくはＵＧＩ断片のホモログを含む蛋白質は、「ＵＧＩバリアント」と呼ばれる。ＵＧＩバリアントは、ＵＧＩまたはそれらの断片との相同性を共有する。例えば、ＵＧＩバリアントは、野生型ＵＧＩまたは配列番号３で示されるＵＧＩと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または少なくとも９９．９％と同一である。いくつかの態様において、ＵＧＩバリアントは、フラグメントが野生型ＵＧＩまたは配列番号３で示されるＵＧＩの対応する断片と少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または少なくとも９９．９％同一であるようにＵＧＩの断片を含む。いくつかの態様において、ＵＧＩは、以下のアミノ酸配列：
【化８５】
2019536425.tif 000086
を含む。
【０３２２】
好適なＵＧＩ蛋白質およびヌクレオチド配列が本明細書において提供され、追加の好適なＵＧＩ配列は当業者にとって公知であり、例えば、Wang et al., Uracil-DNA glycosylase inhibitor gene of bacteriophage PBS2 encodes a binding protein specific for uracil-DNA glycosylase. J. Biol. Chem. 264:1163-1171(1989);  Lundquist et al., Site-directed mutagenesis and characterization of uracil-DNA glycosylase inhibitor protein. Role of specific carboxylic amino acids in complex formation with Escherichia coli uracil-DNA glycosylase. J. Biol. Chem. 272:21408-21419(1997); Ravishankar et al., X-ray analysis of a complex of Escherichia coli uracil DNA glycosylase (EcUDG) with a proteinaceous inhibitor. The structure elucidation of a prokaryotic UDG.  Nucleic Acids Res. 26:4880-4887(1998)；およびPutnam et al., Protein mimicry of DNA from crystal structures of the uracil-DNA glycosylase inhibitor protein and its complex with Escherichia coli uracil-DNA glycosylase. J. Mol. Biol. 287:331-346(1999)におけるそれらの公開を包含し、それぞれの内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３２３】
イノシンの塩基切除のような塩基除去修復を妨げるまたは阻害する追加の蛋白質もまた、本開示の範囲内であることが理解されるべきである。いくつかの態様において、ＤＮＡに結合する蛋白質が使用される。別の態様において、ＵＧＩについて置換が使用される。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、単一鎖ＤＮＡに結合する蛋白質である。例えば、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、Erwinia tasmaniensis単一鎖結合蛋白質であり得る。いくつかの態様において、単一鎖結合蛋白質は、アミノ酸配列（配列番号２９）を含む。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤はウラシルに結合する蛋白質である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、ＤＮＡ中のウラシルに結合する蛋白質である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、触媒不活性型ウラシルＤＮＡ−グリコシラーゼ蛋白質である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、ＤＮＡからウラシルを切除しない触媒不活性型ウラシルＤＮＡ−グリコシラーゼ蛋白質である。例えば、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、ＵｄｇＸである。いくつかの態様において、ＵｄｇＸはアミノ酸配列（配列番号３０）を含む。別の例として、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、触媒不活性型ＵＤＧである。いくつかの態様において、触媒不活性型ＵＤＧはアミノ酸配列（配列番号３１）を含む。他のウラシルグリコシラーゼ阻害剤は当業者にとって明らかであり、本開示の範囲内であることが理解されるべきである。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、配列番号２９〜３１のいずれか１つとホモログな蛋白質である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、配列番号２９〜３１のいずれか１つと少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である蛋白質である。
【化８６】
2019536425.tif 000087
【０３２４】
核局在配列（ＮＬＳ）を含む融合蛋白質
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質は、１つ以上の核標的配列、例えば、核局在配列（ＮＬＳ）をさらに含む。いくつかの態様において、ＮＬＳは、ＮＬＳを含む、細胞核への蛋白質の移入を促進する（例えば、核輸送により）アミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、核局在配列（ＮＬＳ）さらに含む。いくつかの態様において、ＮＬＳは融合蛋白質のＮ−末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳは融合蛋白質のＣ−末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳはＩＢＲ（例えば、ｄＩＳＮ）のＮ−末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳはＩＢＲ（例えば、ｄＩＳＮ）のＣ−末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳはｎａｐＤＮＡｂｐのＮ−末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳはｎａｐＤＮＡｂｐのＣ−末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳはアデノシンデアミナーゼのＮ−末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳはアデノシンデアミナーゼのＣ−末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳは１つ以上のリンカーを介して融合蛋白質に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳはリンカーを用いないで融合蛋白質に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳは本明細書において提供される、または参照されるＮＬＳ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＮＬＳは配列番号４または配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む。追加の核局在配列は当分野において公知であり、当業者にとってあきらかである。例えば、ＮＬＳ配列はPlank et al., PCT/EP2000/011690において記載されており、その内容は例示的な核局在配列の開示についての参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、ＮＬＳは
【化８７】
2019536425.tif 000088
のアミノ酸配列を含む。
【０３２５】
いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐを伴う例示的な融合蛋白質の一般的な構成は、ＮＬＳが核局在配列である（例えば、本明細書において提供されるいずれかのＮＬＳ）、ＮＨ２が融合蛋白質のＮ−末端である、ＣＯＯＨが融合蛋白質のＣ−末端である、以下の構造のいずれか１つを含む。
【０３２６】
アデノシンデアミナーゼ、ｎａｐＤＮＡｂｐ、およびＮＬＳを含む融合蛋白質
ＮＨ２−［ＮＬＳ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＮＬＳ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＬＳ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＮＬＳ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＬＳ］−［アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＮＬＳ］−ＣＯＯＨ；
【０３２７】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質は、リンカーを含まない。いくつかの態様において、リンカーは、ドメインまたは蛋白質（例えば、アデノシンデアミナーゼ、ｎａｐＤＮＡｂｐ、および／またはＮＬＳ）の１つ以上との間に存在する。いくつかの態様において、上記の一般的な構成において使用される「−」は、任意のリンカーの存在を示す。
【０３２８】
アデノシンデアミナーゼ、ｎａｐＤＮＡｂｐ、および塩基修復の阻害剤（ＩＢＲ）を含む融合蛋白質
ＮＨ２−［ＩＢＲ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＩＢＲ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＩＢＲ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＩＢＲ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＩＢＲ］−［アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＩＢＲ］−ＣＯＯＨ；
【０３２９】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質はリンカーを含まない。いくつかの態様において、リンカーは、ドメインまたは蛋白質（例えば、アデノシンデアミナーゼ、ｎａｐＤＮＡｂｐ、および／またはＩＢＲ）の１つ以上との間に存在する。いくつかの態様において、上記の一般的な構成において使用される「−」は、任意のリンカーの存在を示す。
【０３３０】
アデノシンデアミナーゼ、ｎａｐＤＮＡｂｐ、塩基修復の阻害剤（ＩＢＲ）およびＮＬＳを含む融合蛋白質
ＮＨ２−［ＩＢＲ］−［ＮＬＳ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＮＬＳ］−［ＩＢＲ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＮＬＳ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＩＢＲ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＮＬＳ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＩＢＲ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＩＢＲ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＮＬＳ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＩＢＲ］−［ＮＬＳ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＮＬＳ］−［ＩＢＲ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＮＬＳ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＩＢＲ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＩＢＲ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＬＳ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＩＢＲ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＬＳ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＩＢＲ］−［ＮＬＳ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［アデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＬＳ］−［ＩＢＲ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＩＢＲ］−［ＮＬＳ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＮＬＳ］−［ＩＢＲ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＮＬＳ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＩＢＲ］−［アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＮＬＳ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＩＢＲ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＩＢＲ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＬＳ］−［アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＩＢＲ］−［ＮＬＳ］−［アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＬＳ］−［ＩＢＲ］−［アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＬＳ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＩＢＲ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＩＢＲ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＮＬＳ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＩＢＲ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＮＬＳ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＩＢＲ］−［ＮＬＳ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［アデノシンデアミナーゼ］−［ＮＬＳ］−［ＩＢＲ］−ＣＯＯＨ；
【０３３１】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質は、リンカーを含まない。いくつかの態様において、リンカーはドメインまたは蛋白質（例えば、アデノシンデアミナーゼ、ｎａｐＤＮＡｂｐ、ＮＬＳ、および／またはＩＢＲ）の１つ以上との間に存在する。いくつかの態様において、上記の一般的な構成において使用される「−」は、任意のリンカーの存在を示す。
【０３３２】
本開示のいくつかの側面は、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）および少なくとも２つのアデノシンデアミナーゼドメインを含む融合蛋白質を提供する。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、アデノシンデアミナーゼの二量体形成（例えば、ｃｉｓにおいてまたはｔｒａｎｓにおいて）は、例えば、アデニンの脱アミノ化のような、核酸塩基を修飾する融合蛋白質の能力（例えば、効率）を改善し得る。いくつかの態様において、融合蛋白質のいずれかは、２、３、４または５つのアデノシンデアミナーゼドメインを含み得る。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、２つのアデノシンデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかはアデノシンデアミナーゼを２つのみ含有する。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは同じである。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは、本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかである。いくつかの態様において、アデノシンデアミナーゼは異なる。いくつかの態様において、第１のアデノシンデアミナーゼは本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかであり、第２のアデノシンは本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかであるが、第１のアデノシンデアミナーゼと同一ではない。１つの例として、融合蛋白質は、両方が、ｅｃＴａｄＡ（配列番号１）からのＡ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異を含有する、配列番号７２のアミノ酸配列を含む第１のアデノシンデアミナーゼおよび第２のアデノシンデアミナーゼを含み得る。別の例として、融合蛋白質は、ｅｃＴａｄＡ（配列番号１）からのＡ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異を含有する、配列番号７２のアミノ酸配列を含む、第１のアデノシンデアミナーゼドメイン、およびｅｃＴａｄＡ（配列番号１）からのＬ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、およびＩ１５６Ｆ変異を含有する、配列番号４２１のアミノ酸配列を含む、第２のアデノシンデアミナーゼを含み得る。
【０３３３】
いくつかの態様において、融合蛋白質は、２つのアデノシンデアミナーゼ（例えば、第１のアデノシンデアミナーゼおよび第２のアデノシンデアミナーゼ）を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は、第１のアデノシンデアミナーゼおよび第２のアデノシンデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、融合蛋白質において、第１のアデノシンデアミナーゼは、第２のアデノシンデアミナーゼの、Ｎ末端にある。いくつかの態様において、融合蛋白質において、第１のアデノシンデアミナーゼは、第２のアデノシンデアミナーゼのＣ末端にある。いくつかの態様において、第１のアデノシンデアミナーゼおよび第２のデアミナーゼは、直接に融合され、またはリンカーを介して、融合されている。いくつかの態様において、リンカーは、本明細書において提供されるリンカーのいずれかであり、例としては、「リンカー」の項において、記載される任意のリンカーである。いくつかの態様において、リンカーは、配列番号：１０、３７〜４０、３８４〜３８６、または６８５〜６８８のアミノ酸配列のいずれか１つを含む。いくつかの態様において、第１のアデノシンデアミナーゼは、第２のアデノシンデアミナーゼと同じである。いくつかの態様において、第１のアデノシンデアミナーゼおよび第２のアデノシンデアミナーゼは、本明細書において記載されるアデノシンデアミナーゼのいずれかである。いくつかの態様において、第１のアデノシンデアミナーゼおよび第２のアデノシンデアミナーゼは異なる。いくつかの態様において、第１のアデノシンデアミナーゼは、本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかである。いくつかの態様において、第２のアデノシンデアミナーゼは、本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかであるが、しかし第１のアデノシンデアミナーゼと同一ではない。いくつかの態様において、第１のアデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡアデノシンデアミナーゼである。いくつかの態様において、第１のアデノシンデアミナーゼは、配列番号１、６４〜８４、４２０〜４３７、６７２〜６８４において掲げられるアミノ酸配列のいずれか１つ、または本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかに、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。いくつかの態様において、第１のアデノシンデアミナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、第２のアデノシンデアミナーゼは、配列番号１、６４〜８４、４２０〜４３７、６７２〜６８４において掲げられるアミノ酸配列のいずれか１つ、または本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかに、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。いくつかの態様において、第２のアデノシンデアミナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質の、第１のアデノシンデアミナーゼおよび第２のアデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ（配列番号：１）における変異を含み、表４（例えば、ｐＮＭＧ−３７１、ｐＮＭＧ−４７７、ｐＮＭＧ−５７６、ｐＮＭＧ−５８６、およびｐＮＭＧ−６１６）において提供されるいずれか１つのコンストラクトに示されるとおり、別のアデノシンデアミナーゼにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は、表４におけるコンストラクト（例えば、ｐＮＭＧ−３７１、ｐＮＭＧ−４７７、ｐＮＭＧ−５７６、ｐＮＭＧ−５８６、およびｐＮＭＧ−６１６）のいずれか１つのコンストラクト、２つのアデノシンデアミナーゼ（例えば、第１のアデノシンデアミナーゼおよび第２のアデノシンデアミナーゼ）を含む。
【０３３４】
いくつかの態様において、第１のアデノシンデアミナーゼ、第２のアデノシンデアミナーゼ、およびｎａｐＤＮＡｂｐを伴う模範的な融合蛋白質の一般的な構成は、以下の構造のいずれか１つを含み、そこでＮＬＳは、核局在配列（例えば、本明細書において提供される任意のＮＬＳ）である。
【０３３５】
第１のアデノシンデアミナーゼ、第２のアデノシンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐを含む融合蛋白質。
ＮＨ２−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［第２の アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２の アデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［第２の アデノシンデアミナーゼ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
【０３３６】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質は、リンカーを含まない。いくつかの態様において、リンカーは、１つ以上のドメインまたは蛋白質の間に存在する（例えば、第１のアデノシンデアミナーゼ、第２のアデノシンデアミナーゼ、および／またはｎａｐＤＮＡｂｐ）。いくつかの態様において、上の一般的な構成において使用される、「−」は、任意のリンカーの存在を示す。
【０３３７】
融合蛋白質は、第１のアデノシンデアミナーゼ、第２のアデノシンデアミナーゼ、ｎａｐＤＮＡｂｐ、およびＮＬＳを含む。
ＮＨ２−［ＮＬＳ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［ＮＬＳ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［ＮＬＳ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＬＳ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＮＬＳ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］［第２のアデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［ＮＬＳ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＬＳ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［ＮＬＳ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−[ＮＬＳ]−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＬＳ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［ＮＬＳ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
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ＮＨ２−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［ＮＬＳ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
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ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［第２のアデノシンデアミナーゼ］−［第１のアデノシンデアミナーゼ］−［ＮＬＳ］−ＣＯＯＨ；
【０３３８】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質は、リンカーを含まない。いくつかの態様において、リンカーは、１つ以上のドメイン、または蛋白質との間に存在する（例えば、第１のアデノシンデアミナーゼ、第２のアデノシンデアミナーゼ、ｎａｐＤＮＡｂｐ、および／またはＮＬＳ）。いくつかの態様において、上の一般的な構成において使用される、「−」は、任意のリンカーの存在を示す。
【０３３９】
本開示の融合蛋白質は、追加の特徴を１つ以上含んでもよいことが、正しく理解されるべきである。例としては、いくつかの態様において、融合蛋白質は、例えば細胞質局在配列、搬出配列、例えば核外移行配列、または他の局在配列、および融合蛋白質の可溶化、精製、もしくは検出に有用である配列タグを含んでもよい。本明細書において提供される好適な蛋白質タグは、ビオチンカルボキシラーゼキャリア蛋白質（BCCP）タグ、mycタグ、カルモジュリンタグ、FLAGタグ、ヘマグルチニン（HA）タグ、ヒスチジンタグまたはHisタグともまた言われるポリヒスチジンタグ、マルトース結合蛋白質（MBP）タグ、nusタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）タグ、緑色蛍光蛋白質（GFP）タグ、チオレドキシンタグ、Sタグ、Softag（例えば、Softag 1、Softag 3）、strepタグ、ビオチンリガーゼタグ、FlAsHタグ、V5タグ、およびSBPタグを包含するが、これに限定されない。追加の好適な配列は当業者には明らかであろう。いくつかの態様において、融合蛋白質は１つ以上のHisタグを含む。
【０３４０】
リンカー
ある種の態様においては、リンカーが、本発明のペプチドまたはペプチドドメインのいずれかをリンクするために用いられ得る。リンカーは共有結合ほども単純であり得、または、これは長さが多くの原子であるポリマーリンカーであり得る。ある種の態様において、リンカーはポリペプチド（polypeptide）であるか、またはアミノ酸に基づく。他の態様において、リンカーはペプチド様ではない。ある種の態様において、リンカーは共有結合である（例えば、炭素−炭素結合、ジスルフィド結合、炭素−ヘテロ原子結合など）。ある種の態様において、リンカーはアミド結合の炭素−窒素結合である。ある種の態様において、リンカーは、環状または非環状の、置換または無置換の、分岐または非分岐の、脂肪族またはヘテロ脂肪族リンカーである。ある種の態様において、リンカーはポリマー性である（例えば、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど）。ある種の態様において、リンカーはアミノアルカン酸のモノマー、二量体、またはポリマーを含む。ある種の態様において、リンカーはアミノアルカン酸を含む（例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータ−アラニン、３−アミノプロパン酸、４−アミノ酪酸、５−ペンタン酸など）。ある種の態様において、リンカーはアミノヘキサン酸（Ａｈｘ）のモノマー、二量体、またはポリマーを含む。ある種の態様において、リンカーは炭素環部分に基づく（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン）。他の態様において、リンカーはポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。他の態様において、リンカーはアミノ酸を含む。ある種の態様において、リンカーはペプチドを含む。ある種の態様において、リンカーはアリールまたはヘテロアリール部分を含む。ある種の態様において、リンカーはフェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドからリンカーへの求核剤の取り付けを促すための官能部分（例えば、チオール、アミノ）を包含し得る。いずれかの求電子剤がリンカーの一部として用いられ得る。例示的な求電子剤は、活性エステル、活性アミド、マイケルアクセプター、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アシルおよびイソチオシアネートを包含し、しかしこれらに限定されない。
【０３４１】
いくつかの態様において、リンカーはアミノ酸（単数）または、複数のアミノ酸（複数）（例えば、ペプチドまたは蛋白質）である。いくつかの態様において、リンカーは結合（例えば、共有結合）、有機分子群、ポリマー、または化学部位である。いくつかの態様において、リンカーは５〜１００アミノ酸長である。例としては、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５0、または１５０〜２００アミノ酸長である。より長いまたは短いリンカーもまた、想定される。いくつかの態様において、リンカーは、ＸＴＥＮリンカーとも言及されることのあるアミノ酸配列
【化８８】
2019536425.tif 000089
を含む。いくつかの態様において、リンカーはアミノ酸配列
【化８９】
2019536425.tif 000090
を含む。いくつかの態様において、リンカーは、
【化９０】
2019536425.tif 000091
または、（ＸＰ）ｎモチーフ、またはそれらのいずれの組み合わせを含み、ここで、ｎは、独立する１と３０との間の整数であり、およびここでＸは、任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。いくつかの態様において、リンカーは、
【化９１】
2019536425.tif 000092
を含む。いくつかの態様において、リンカーは、
【化９２】
2019536425.tif 000093
を含む。いくつかの態様において、リンカーは、
【化９３】
2019536425.tif 000094
を含む。いくつかの態様において、リンカーは、
【化９４】
2019536425.tif 000095
を含む。いくつかの態様において、リンカーは、２４アミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列
【化９５】
2019536425.tif 000096
を含む。いくつかの態様において、リンカーは４０アミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列
【化９６】
2019536425.tif 000097
を含む。いくつかの態様において、リンカーは、６４アミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列
【化９７】
2019536425.tif 000098
を含む。いくつかの態様において、リンカーは、９２アミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列
【化９８】
2019536425.tif 000099
を含む。本明細書に提供される任意のリンカーは、第１のアデノシンデアミナーゼと第２のアデノシンデアミナーゼ；アデノシンデアミナーゼ（例えば、第１のアデノシンデアミナーゼまたは第２のアデノシンデアミナーゼ）とｎａｐＤＮＡｂｐ、ｎａｐＤＮＡｂｐとＮＬＳ、またはアデノシンデアミナーゼ（例えば、第１のアデノシンデアミナーゼ、または第２のアデノシンデアミナーゼ）とＮＬＳの連結に使用されてもよいことが、正しく理解されるべきである。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれもお互いリンカーを介して融合される、アデノシンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐを含む。
【０３４２】
いくつかの態様において、本明細書に提供される融合蛋白質のいずれも、お互いリンカーを介して融合される、第１のアデノシンデアミナーゼ、および第２のアデノシンデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される融合蛋白質のいずれも、アデノシンデアミナーゼ、例えば、第１のおよび／または第２のアデノシンデアミナーゼ）に融合されてもよいＮＬＳ、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、および／または塩基修復（ＩＢＲ）の阻害剤を含む。特異的な適用のデアミナーゼ活性に最適な長さを達成する目的で、アデノシンデアミナーゼ（例えば、エンジニアされたｅｃＴａｄＡ）とｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９ドメイン）の間に、および／または第１のアデノシンデアミナーゼと第２のアデノシンデアミナーゼの間に、様々なリンカーの長さおよび柔軟性が用いられ得る（例えば、
【化９９】
2019536425.tif 000100
および（Ｇ）ｎの形状の、非常に柔軟なリンカーから、
【化１００】
2019536425.tif 000101
および（ＸＰ）ｎ）の形状のより硬いリンカーまでの範囲である）（例えば、本明細書全体に引用として組み込まれる；Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82を参照）。いくつかの態様において、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。いくつかの態様において、リンカーは、（ＧＧＳ）ｎモチーフを含み、ここにおいてｎは、１、３、または７である。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質、アデノシンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐ、および／または、第１のアデノシンデアミナーゼおよび第2のアデノシンデアミナーゼは、アミノ酸配列
【化１０１】
2019536425.tif 000102
を含むリンカーを介して融合される。いくつかの態様において、リンカーは、２４アミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列
【化１０２】
2019536425.tif 000103
を含む。いくつかの態様において、リンカーは、４０アミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列
【化１０３】
2019536425.tif 000104
を含む。いくつかの態様において、リンカーは、６４アミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列
【化１０４】
2019536425.tif 000105
を含む。いくつかの態様において、リンカーは、９２アミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列
【化１０５】
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を含む。
【０３４３】
本開示のいくつかの側面は、Ｃａｓ９ドメインおよびアデノシンデアミナーゼを含む融合蛋白質を、提供する。
【化１０６】
2019536425.tif 000107
【化１０７】
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【化１０８】
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【化１０９】
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【化１１０】
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【化１１１】
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【化１１２】
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【化１１３】
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【化１１４】
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【化１１５】
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【化１１６】
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【化１１７】
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【化１１８】
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【化１１９】
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【化１２０】
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【化１２１】
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【化１２２】
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【化１２３】
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【化１２４】
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【化１２５】
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【化１２６】
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【化１２７】
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【化１２８】
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【化１２９】
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【化１３０】
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【化１３１】
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【化１３２】
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【化１３３】
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【化１３４】
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【化１３５】
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【化１３６】
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【化１３７】
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【化１３８】
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【化１３９】
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【化１４０】
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【化１４１】
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【化１４２】
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【化１４３】
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【化１４４】
2019536425.tif 000145
【０３４４】
いくつかの態様において、融合蛋白質は、本明細書において提供される、配列番号：１１〜２８、３８７、３８８、４４０、６９１〜７０６において掲げられるアミノ酸配列のいずれか１つ、または融合蛋白質のいずれかに、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は、配列番号１１〜２８，３８７，３８８，４４０，６９１〜７０６において掲げられるアミノ酸配列のいずれか１つ、または本明細書において提供される任意の融合蛋白質と比較して、1、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはより多くの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は、配列番号１１〜２８、３８７、３８８、４４０、６９１〜７０６において掲げられるアミノ酸配列、または本明細書において提供される任意の融合蛋白質と比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００、少なくとも１５００、少なくとも１６００、少なくとも１７００、少なくとも１７５０、または少なくとも１８００の、一続きの同一であるアミノ酸残基を含む。
【０３４５】
核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、ガイド核酸と複合する
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれか、および融合蛋白質のｎａｐＤＮＡｂｐに結合したガイド核酸を含む複合体を提供する。本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される、任意の融合蛋白質、および融合蛋白質のＣａｓ９ドメイン（例えば、ｄＣａｓ９、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９、またはＣａｓ９ニッカ―ゼ）に結合したガイドＲＮＡを含む複合体を提供する。
【０３４６】
いくつかの態様において、ガイド核酸（例えば、ガイドRNA）は、１５〜１００ヌクレオチドの長さであり、標的配列に対して相補的である少なくとも１０個の一続きのヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、標的配列に対して相補的である１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の一続きのヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様において、標的配列はＤＮＡ配列である。いくつかの態様において、標的配列は、ＲＮＡ配列である。いくつかの態様において、標的配列は、哺乳動物のゲノムにおける配列である。いくつかの態様において、標的配列は、ヒトのゲノムの中の配列である。いくつかの態様において、標的配列の３’末端は、カノニカルなＰＡＭ配列（ＮＧＧ）に、直ちに隣接する。いくつかの態様において、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、疾患や異常に関連するガイド核酸に相補的である。いくつかの態様において、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、疾患または異常に関する配列に相補的であり、表１および２のいずれかにおいて開示される遺伝子から選ばれた遺伝子において、変異を有する。
【０３４７】
アデノシンアデアミナーゼと核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）ドメインを含む融合蛋白質を、使用する方法。
本開示の、いくつかの側面は、本明細書において提供される、融合蛋白質、またはガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）および核酸塩基編集因子を含む、複合体を使用する方法を提供する。本開示のいくつかの側面は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかと接触させる方法を提供し、および少なくとも１つのガイド核酸（ｅ．ｇ．ガイドＲＮＡ）を伴い、ここにおいて、該ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、約１５〜１００ヌクレオチド長であり、標的配列に対して相補的である、少なくとも１０の一続きのヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、標的配列の３’末端は、カノニカルなＰＡＭ配列（ＮＧＧ）に、直ちに隣接する。いくつかの態様において、標的配列の３’末端は、カノニカルなＰＡＭ配列（ＮＧＧ）に、直ちに隣接しない。いくつかの態様において、標的配列の３’末端は、ＡＧＣ、ＧＡＧ、ＴＴＴ、ＧＴＧ、またはＣＡＡ配列に、直ちに隣接する。
【０３４８】
いくつかの態様において、標的ＤＮＡ配列は、疾患または異常に関連する配列を含む。いくつかの態様において、標的ＤＮＡ配列は、疾患または異常に関連する一点変異を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質（例えば、アデアミナーゼおよびＣａｓ９ドメインを含む）の活性、または複合体は、点変異の修正をもたらす。いくつかの態様において、標的ＤＮＡ配列は、疾患または異常に関連するＧ→Ａの、点変異を含み、およびここにおいて、変異性のＡ塩基の脱アミノ化は、疾患または異常に関連しない配列という結果になる。いくつかの態様において、標的ＤＮＡ配列は、蛋白質をコードし、および、点変異は、コドンにおいてであり、および野生型コドンと比較し変異性のコドンによってコードされる、アミノ酸における変化をもたらす。いくつかの態様において、変異Ａの脱アミノ化は、変異コドンによってコードされるアミノに変化をもたらす。いくつかの態様において、変異Ａの脱アミノ化は、野生型アミノ酸をコードするコドンをもたらす。いくつかの態様において、接触は、対象に対してインビボである。いくつかの態様において、対象は疾患または異常を有するか、またはそれと診断されている。いくつかの態様において、疾患または異常は、フェニルケトン尿症、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＤ）、ＰＴＥＮまたはＢＲＣＡ１の変異に関連する新生細胞疾患、またはリー・フラウメニ症候群である。本明細書において提供される、核酸塩基編集因子を使用して、処置されてもよい、模範的な疾患および異常のリストは、表１に示される。表１は、標的遺伝子、訂正されるべき変異、関連する疾患、および関係するプロトスペーサーおよびＰＡＭのヌクレオチド配列をｍ包含する。
【表１】
2019536425.tif 000146
【０３４９】
いくつかの態様において，本明細書において提供される、ＤＮＡを編集する融合蛋白質を使用するための方法を、提供する。いくつかの態様において、融合蛋白質は、標的核酸塩基、例えばＣ残基を脱アミノ化することにより、核酸に点変異を導入するために用いられる。いくつかの態様において、標的核酸塩基の脱アミノ化は、遺伝子欠損の修正、例えば遺伝子産物の機能喪失に至る点変異の修正をもたらす。いくつかの態様において、遺伝子欠損は、疾患または異常、例えば、リソソーム蓄積異常または例えばＩ型糖尿病などの代謝疾患に関連する。例としては、いくつかの態様において、がん遺伝子の中に、ＤＮＡ編集する融合蛋白質を用いて非活性化する点変異を導入する方法（例えば、増殖性疾患の処置において）が、本明細書において提供される。非活性化する変異は、いくつかの態様において、コードする配列において、未熟な終止コドンを、生成することがあり、それは、例えば、完全な長さの蛋白質の機能を欠く、正常より短い蛋白質という、正常より短い遺伝子産物の発現をもたらす。
【０３５０】
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法の目的は、ゲノム編集をすることを介して、機能不全の遺伝子の機能を、取り戻すことである。本明細書において提供される、蛋白質を編集する核酸塩基は、例えば、ヒト細胞培養において、疾患に関係する変異を修正することによる遺伝子編集に基づくインビトロにおけるヒトの治療に、有効にされ得る。本明細書において提供される、核酸塩基編集する蛋白質、例えば、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（例えば、Ｃａｓ９）およびアデノシンデアミナーゼドメインを含む融合蛋白質が、ＧからＡまたはＣからＴの変異のいずれの一点を、修正することに使用され得ることは、当業者によって理解されるだろう。第１のケースにおいて、変異ＡからＩの脱アミノ化は、変異を修正し、および後者のケースにおいて、変異Ｔと塩基対とされるＡの脱アミノ化は、一順の複製に続き、変異を修正する。修正され得る模範的な点変異は、表１および２において、挙げられる。
【０３５１】
疾患関連遺伝子およびアレルの点変異の上首尾な修正は、治療および基礎研究に用途を有する遺伝子修正のための新たな戦略を開く。Ｃａｓ９とデアミナーゼ酵素またはドメインとの開示される融合体のような、部位特異的な一塩基改変システムは、「逆」遺伝子治療にもまた用途を有し、ある種の遺伝子機能が故意に抑圧または喪失される。それらのケースにおいて、Trp（TGG）、Gln（CAAおよびCAG)、またはArg（CGA）残基を未成熟ストップコドン（TAA、TAG、TGA）に部位特異的変異させることは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで蛋白質機能を喪失させるために用いられ得る。
【０３５２】
本開示は、本明細書において提供されるＣａｓ９ＤＮＡ編集融合蛋白質によって修正され得る点変異に関連する、またはそれによって引き起こされる疾患と診断された、対象の処置のための方法を提供する。例えば、いくつかの態様においては、かかる疾患、例えば上に記載されているＰＩ３ＫＣＡ点変異に関連する癌を有する対象に、点変異を修正または疾患関連遺伝子に不活性化変異を導入するＣａｓ９デアミナーゼ融合蛋白質の有効量を投与することを含む方法が提供される。いくつかの態様において、疾患は増殖性疾患である。いくつかの態様において、疾患は遺伝子疾患である。いくつかの態様において、疾患は新生物疾患である。いくつかの態様において、疾患は代謝疾患である。いくつかの態様において、疾患はリソソーム蓄積症である。点変異を修正または疾患関連遺伝子に不活性化変異を導入することによって処置され得る他の疾患は、当業者には公知であろう。本開示はこの点で限定されない。
【０３５３】
本開示は、追加の疾患または異常、例えば、デアミナーゼによって媒介される遺伝子編集によって修正され得る点変異に関連するかまたはそれによって引き起こされる疾患または異常の処置のための方法を提供する。いくつかのかかる疾患は本明細書に記載されており、本明細書において提供される戦略および融合蛋白質によって処置され得る追加の好適な疾患は、本開示に基づいて当業者には明らかであろう。例示的な好適な疾患および異常が下に挙げられている。それぞれの配列中の特定の位置または残基の付番は、具体的な蛋白質および用いられる付番スキームに依存するということは理解されるであろう。付番は、例えば成熟蛋白質の前駆体および成熟蛋白質それ自体では異なり得、種間の配列の違いは付番に影響し得る。当業者は、当分野において周知の方法によって、例えば配列アラインメントおよび相同な残基の決定によって、任意の相同な蛋白質およびそれぞれのコードする核酸中のそれぞれの残基を同定する能力があるであろう。模範的で、適切な疾患および異常は、限定することなしに、以下：２−メチル−３−ヒドロキシ酪酸尿症；３ベータ−ヒドロキシステロイド脱水素酵素欠損症；３−メチルグルタコン酸尿症；３−オキソ−５アルファ−ステロイドデルタ４−脱水素酵素欠損症；４６、ＸＹ性転換症、１、３型、および５、５−オキソプロリナーゼ欠損症；６−ピルボイル−テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症；アールスコッグ症候群；アーゼ症軟骨無発生症２型；色覚異常２および７；後天性ＱＴ延期症候群；アクロ脳症症候群、シンゼル型；大頭筋大腿骨異形成；ホルモン抵抗を伴う、またはなしのアクロディストーシス２；アクロエリスロ角皮症（Acroerythro角皮症）；アクロミクリック（Acromicric）異形成；治療非依存性大結節性副腎過形成２；活性化ＰＩ３Ｋ−デルタ症候群；急性間欠性ポルフィリン症；アシルＣｏＡ脱水素酵素ファミリー欠損症、メンバー９；アダムス−オリバー症候群５および６；アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症；アデニル酸キナーゼ欠損症；アデニルコハク酸リアーゼ欠損症が原因である溶血性貧血；青年期ネフロン癆；腎臓−肝臓−膵臓異形成；メッケル症候群７型；副腎白質ジストロフィー；成人性接合部型表皮水疱症；表皮水疱症、接合部型、localisata変異型；成人性神経セロイドリポフスチン症；成人性神経セロイドリポフスチン症；眼球運動失行症を伴う成人発症性運動失調症；ＡＤＵＬＴ症候群；無フィブリノーゲン血症および先天性無フィブリノーゲン血症；常染色体劣性無ガンマグロブリン血症２；加齢黄斑変性症３、６、１１、および１２；アイカルディ・グティエール症候群１、４、および５；チルバインループス１；アラギル症候群１および２；アレクサンダー疾患；アルカプトン尿症；アラン・ハーンドン・ダドリー症候群；先天性円形脱毛症；アルパース脳症；アルファ−１−アンチトリプシン欠損症；常染色体優性、常染色体劣性、およびＸ連鎖劣性アルポート症候群；アルツハイマー病、家族性、３、痙性対麻痺および失調症を伴う；アルツハイマー病、１、３および４型；低カルシウム沈着型、および低成熟型ＩＩＡ１遺伝性エナメル質形成不全症；アミノアシラーゼ１欠損症；アーミッシュ乳児てんかん症候群��アミロイド形成性トランスチレチンアミロイドーシス；アミロイド心筋症、トランスチレチン関連；心筋症；筋萎縮性側索硬化症１、６、１５（前頭側頭型認知症を伴うまたはなし）、２２（前頭側頭型認知症を伴うまたはなし）、および１０型；ＴＤＰ４３封入体を伴う前頭側頭型認知症、ＴＡＲＤＢＰ関連；アンダーマン症候群；アンダーセン・タウィル症候群；先天性ＱＴ延長症候群；Ｇ６ＰＤ欠乏症による、非球形溶血性、貧血；エンジェルマン症候群；小脳症を伴う重症新生児発症脳症；自閉症への感受性、Ｘ連結３；血管症、遺伝性、以下：腎症、動脈瘤および筋肉のけいれんを伴う；アンジオテンシン変換酵素、良性血清増加性；無虹彩症、小脳性運動失調症、および精神発達遅滞；アノニキア；アンチトロンビンＩＩＩ欠乏症；性器異常（anomalies）およびステロイド合成異常を伴うアントレー・ビクスラー症候群；大動脈瘤、家族性胸部４、６、および９；胸部大動脈瘤および大動脈解離；多系統性平滑筋機能障害症候群；もやもや疾患５；再生不良性貧血；見かけの鉱質コルチコイド過剰症候群；アルギナーゼ欠損症；アルギニノサクシネートリアーゼ欠損症；アロマターゼ欠損症；催不整脈性右室心筋症型５、８、および１０；原発性家族性肥大型心筋症；遠位X連結先天性多発性関節拘縮症；関節拘縮症腎臓機能障害胆汁うっ滞症候群；関節拘縮症、腎機能障害、および胆汁うっ滞２；アスパラギン合成酵素欠損症；神経細胞移動異常；ビタミンＥ欠乏症を伴う運動失調症；知覚性運動失調症、常染色体優性；毛細血管拡張性運動失調症候群；遺伝性がん素因症候群；トランスフェリン血症；家族性心房性細動１１、１２、１３、および１６；（房室伝導障害を伴うまたはなしの）心房中隔欠損２、４、および７；心房停止２；房室中隔欠損４；遺伝性眼球萎縮；ＡＴＲ−Ｘ症候群；耳介顆状症候群２；自己免疫疾患、多系統、乳児期発症；自己免疫性リンパ増殖性症候群、１ａ型；常染色体優性低汗性外胚葉異形成症；ミトコンドリアＤＮＡ欠失１および３を伴う常染色体優性進行性外眼筋麻痺；常染色体優性捻転ジストニア４；常染色体劣性中核性ミオパチー；常染色体劣性先天性魚鱗癬１、２、３、４Ａ、および４Ｂ；常染色体劣性皮膚弛緩症ＩＡおよび１Ｂ；常染色体劣性低発汗性外胚葉性異形成異常症候群；外胚葉異形成症１１ｂ；低汗／髪／歯型、常染色体劣性；常染色体劣性低リン血症性骨疾患；アクセンフェルト・リーガー症候群３型；ベインブリッジ・ローパー症候群；バナヤン・ライリー・ルバルカバ症候群；ＰＴＥＮ過誤腫腫瘍症候群；バイライト・ウィンター症候群１および２；バラカット症候群；バルデ・ビードル症候群１、１１、１６、および１９；裸リンパ球症候群２型、相補群Ｅ；出生前バーター症候群２型；バーター症候群３、および４型、３低カルシウム尿症を伴う、４、大脳基底核大脳基底核石灰化症、特発性；ビーズ髪（Beaded hair）；良性家族性血尿症；良性家族性新生児けいれん１および２；けいれん、良性家族性新生児、１および／またはミオキミア；早期乳児てんかん性脳症７；良性家族性新生児乳児けいれん；良性遺伝性舞踏病；心筋症を伴う良性肩甲骨腹膜筋ジストロフィー；バーナード・スーリエ症候群、A１およびA２型（常染色体優性）；ベストロフィノパシー（Bestrophinopathy）、常染色体劣性；ベータサラセミア；ベツレムミオパチーおよびベツレムミオパチー２；二角形結晶性角膜網膜ジストロフィー；胆汁酸合成欠陥、先天性、２；ビオチニダーゼ欠損症；バークバレル知覚障害異形症候群；眼瞼萎縮症、眼瞼下垂症、および表皮内転筋感染症；ブルーム症候群；ボージェソン・フォスマン・レーマン（Borjeson-Forssman-Lehmann）症候群；ブーシェノイハウザー症候群；短指症型A１およびA２；高血圧症を伴う短指症；出血を伴う脳小血管疾患；分岐鎖ケト酸脱水素酵素キナーゼ欠損症；鰓症候群２および３；乳がん、早期発症；乳房卵巣がん、家族性１、２、および４；脆性角膜症候群２；ブロディミオパチー；高塩化汗を伴うまたはなしの、気管支拡張症３；ブラウン・ヴィアレット・ヴァンレア（Brown Vialetto Van-Laere）症候群およびブラウン・ヴィアレット・ヴァンレア（Brown Vialetto Van-Laere）症候群２；ブルガダ症候群；ブルガダ症候群１；心室細動；発作性家族性心室細動；ブルガダ症候群とブルガダ症候群４；ＱＴ延長症候群；突然心臓死；ブルアイ（Bull eye）黄斑ジストロフィー；シュタルガルト疾患４；錐体杆体ジストロフィー１２；水疱性魚鱗癬赤紅皮症；バーン・マックタウン症候群；カンジダ症、家族性、２、５、６、および８；炭水化物欠乏グリコ蛋白質症候群ＩおよびＩＩ型；炭酸脱水酵素ＶＡ欠乏症、高アンモニア血症による；大腸がん；心不整脈；ＱＴ延長症候群、ＬＱＴ１亜類型；心脳筋症、致死小児性、チトクロムオキシダーゼ欠損症による；心臓・顔・皮膚症候群；心筋症；ダノン疾患；肥大型心筋症；左室非圧縮型心筋症；カーネベール症候群；カーニーコンプレックス、Ｉ型；カルニチンアシルカルニチントランスロカーゼ欠損症；カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩ（遅発）、およびＩＩ（乳児）欠損症；白内障１、４、常染色体優性、複数型、小角膜を伴う、コッポック類似、若年性、小角膜および糖尿症を伴う、および核拡散性非進行性；カテコールアミン作動性多形性心室頻拍；尾部退行症候群；Ｃｄ８欠乏症、家族性；中核疾患；染色体１、９および１６の動原体不安定性および免疫不全；進行性外眼筋麻痺および小脳性運動失調を伴う乳児小脳性運動失調症、精神発達遅滞、および平衡失調症候群２；脳アミロイド血管症；皮質下梗塞および白質脳症を伴う脳常染色体優性および劣性動脈症；脳海綿状奇形成２；脳血管顔面症候群２；脳顔面骨格症候群；石灰化と嚢胞を伴う脳網膜微小血管症；神経型セロイドリポフスチン沈着症２、６、７、および１０；チェディアック・東症候群、チェディアック・東症候群、成人型；シャルコー・マリー・トゥース病、１Ｂ、２Ｂ２、２Ｃ、２Ｆ、２Ｉ、２Ｕ（軸索の）、１Ｃ（脱髄性の）、常染色体優性中間体Ｃ、常染色体劣性中間体Ａ、２Ａ２、４Ｃ、４Ｄ、４Ｈ、ＩＦ、ＩＶＦ、およびＸ、肩甲骨腹膜脊髄性筋萎縮症；遠位脊髄性筋萎縮症、先天性非進行性；脊髄性筋萎縮症、遠位、常染色体劣性、５；チャージ連合；小児低ホスファターゼ症；成人低ホスファターゼ症；胆嚢炎；進行性家族性肝内胆汁うっ滞３；胆汁うっ滞、肝内、妊娠の３；コレスタノール貯蔵疾患；レステロールモノオキシゲナーゼ（側鎖切断）欠損症；軟骨異形成症ブロムチェーン（Blomchain）型；軟骨異形成症１、Ｘ連結劣性および２Ｘ連鎖性優性；チョップ症候群；慢性肉芽腫性疾患、常染色体劣性チトクロームｂ陽性、１および２型；チャドリー・マッカロー症候群；線毛機能不全症、原発性、７、１１、１５、２０および２２；シトルリン血症Ｉ型；シトルリン血症Ｉ型およびＩＩ型；頭蓋骨頭骨癒合症；C-like症候群；コケイン症候群Ａ型；コエンザイムＱ１０欠乏症、原発性１、４、および７；コフィン・シリス／知的障害；コフィン・ローリー症候群；コーエン症候群；風邪誘発性発汗症候群１；コール・カーペンター症候群２；肉芽腫を伴う合併型細胞性および体液性免疫障害；合併型ｄ−２およびｌ−２−ヒドロキシグルタル酸尿症；マロン酸とメチルマロン酸尿症の併用；酸化的リン酸化の欠乏１、３、４、１２、１５、および２５；合併型部分的および完全な１７−アルファ・ヒドロキシラーゼ／１７、２０−リアーゼ欠損症；一般的な可変免疫不全９；補体成分４、部分的な不全、機能不全のＣ１阻害剤による；補体因子Ｂの欠乏症；コーン単色性色覚；錐体杆体ジストロフィー２および６；錐体杆体ジストロフィーエナメル質形成不全症；先天性副腎過形成および先天性副腎低形成、Ｘ連結；先天性血球減少性血小板減少症；先天性無虹彩症；先天性中枢性低換気症候群；ヒルシュスプルング病３；先天性収縮性クモ膜症；四肢および顔面の先天性拘縮、筋緊張低下、および発達遅延；グリコシル化タイプ１Ｂ、１Ｄ、１Ｇ、１Ｈ、１Ｊ、１Ｋ、１Ｎ、１Ｐ、２Ｃ、２Ｊ、２Ｋ、ＩＩｍの先天異常；先天性赤血球造血性貧血、ＩおよびＩＩ型；顔面の先天性外胚葉異形成症；先天性赤血球造血性ポルフィリン症；先天性全身性リポジストロフィー２型；先天性心疾患、複数型、２；先天性心疾患；大動脈弓離断症；先天性脂肪腫過形成、血管奇形、および表皮母斑；非小細胞肺がん；卵巣の新生腫瘍；心臓伝導障害、非特異的；先天性微絨毛性萎縮症；先天性筋ジストロフィー；部分的なＬＡＭＡ２欠乏症が原因である先天性筋ジストロフィー；脳および眼の異常を伴う先天性筋ジストロフィー・ジストログリカノパチー、Ａ２、Ａ７、Ａ８、Ａ１１、およびＡ１４型；精神発達障害を伴う先天性筋ジストロフィー・ジストログリカノパチー、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、およびＢ１５型；精神発達障害なしの先天性筋ジストロフィー・ジストログリカノパチー、Ｂ５型；先天性筋肥大・
脳症候群；先天性筋無力症候群、アセタゾラミド反応；線維型不均衡を伴う先天性ミオパチー；先天性眼球コロボーマ；先天性静止型夜盲症、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｆ、および２Ａ型；コプロポルフィア；角膜プラーナ（cornea plana）２；角膜ジストロフィー、フックス内皮、４；角膜内皮ジストロフィー２型；角膜の脆弱性球状角膜（Corneal fragility keratoglobus）、青強膜、および関節過度可動性；コルネリア・デ・ランゲ症候群１および５；冠状動脈疾患、常染色体優性２；冠状動脈疾患；ハイパーアルファリポ蛋白血症２；他の脳形成異常５および６を伴う皮質異形成、複合；皮質形成異常、後頭の；コルチコステロイド結合グロブリン欠乏症；コルチコステロンメチルオキシダーゼ２型欠損症；コステロ症候群；コーデン症候群１；扁平股；頭蓋骨幹異形成、常染色体優性；頭蓋骨癒合症１および４；頭蓋骨癒合症および歯の異常；クレアチン欠乏症、Ｘ連結；クルゾン症候群；クリプトフタルモス症候群；陰唇症、片側性または両側性；クッシング指節癒合症；皮膚悪性黒色腫１；骨ジストロフィーおよび重度の肺、胃腸、および尿の異常を伴う皮膚弛緩症；シアン症、一過性新生児の、および非典型的腎症の；嚢胞性線維症；シスチン尿症；シトクロムC酸化酵素欠損症；シトクロムC酸化酵素欠損症；Ｄ−２−ヒドロキシグルタル酸尿症２；ダリエー病、分節；迷路性無形成症ミクロティアおよびミクロドンティア（ＬＡＭＭ）を伴う難聴；難聴、常染色体優性３ａ、４、１２、１３、１５、常染色体優性非症候性感音１７、２０、および６５；難聴、常染色体劣性１Ａ、２、３、６、８、９、１２、１５、１６、１８ｂ、２２、２８、３１、４４、４９、６３、７７、８６、および８９；近視および知的機能障害を伴う、前庭の関与なしの難聴、蝸牛、常染色体優性Ｘ連結２；２−メチルブチリルＣｏＡ脱水素酵素欠損症；３−ヒドロキシアシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症；アルファマンノシダーゼの欠損症；芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの欠損症；ビスホスホグリセレートムターゼの欠損症；ブチリルＣｏA脱水素酵素欠損症；フェロキシダーゼの欠損症；ガラクトキナーゼの欠損症；グアニジノ酢酸メチルトランスフェラーゼの欠損症；ヒアルロノグルコサミニダーゼの欠損症；リボース−５−リン酸イソメラーゼの欠損症；ステロイド１１−β−モノオキシゲナーゼの欠損症；ＵＤＰグルコース−ヘキソース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼの欠損症；キサンチンオキシダーゼの欠損症；デジェリン・ソッタス病；シャルコー・マリー・トゥース病、ＩＤおよびＩＶＦ；デジェリン・ソッタス症候群、常染色体優性；樹状細胞、単球、Ｂリンパ球、およびナチュラルキラーリンパ球欠乏症；デスブコイ形成異常２；デスブコイ症候群；ＤＦＮＡ２非症候性失聴；視神経萎縮および難聴を伴う真性糖尿病および尿崩症；糖尿病、２型、インスリン依存性、２０；ダイヤモンド・ブラックファン貧血１、５、８、および１０；下痢３（分泌性ナトリウム、先天性、症候群性）および５（房状腸症を伴う、先天性）；ジカルボン酸アミノ酸尿症；びまん性掌蹠角化症、ボスニア（Bothnia）型；デジトレノ脳症候群（Digitorenocerebral syndrome）；ジヒドロプテリジン還元酵素欠損症；拡張型心筋症１Ａ、１ＡＡ、１Ｃ、１Ｇ、１ＢＢ、１ＤＤ、１ＦＦ、１ＨＨ、１Ｉ、１ＫＫ、１Ｎ、１Ｓ、１Ｙ、および３Ｂ；左室不全３；シトクロムｐ４５０オキシドレダクターゼ欠損症による異常ステロイド産生；遠位関節喉頭症タイプ２Ｂ；遠位遺伝性運動神経障害、２Ｂ型；遠位ミオパチー、マーカスベリー・グレックス（Markesbery-Griggs）型；遠位脊髄性筋萎縮症、Ｘ連結３；識別性リンパ浮腫症候群；皮膚の不在を伴う優性ジストロフィー性表皮水疱症；優性遺伝性視神経萎縮症；ドンナイバロー症候群；ドーパミンベータヒドロキシラーゼ欠損症；ドーパミン受容体ｄ2の脳密度の減少；どーリングデゴス（Dowling-degos）疾患４；ドイン（Doyne）蜂巣状網膜ジストロフィー；マラティアレヴェンティネーゼ；デュアン症候群２型；ダビン・ジョンソン症候群；デュシェンヌ型筋ジストロフィー；べッカー筋ジストロフィー；異常フィブリノーゲン血症；先天性角化異常症、常染色体優性および常染色体優性３；先天性角化異常症、常染色体劣性、１、３、４、および５；先天性角化異常症、Ｘ連結；ジスキネジア、家族性、顔面けいれん；Dysplasminogenemia；ジストニア２（捻転、常染色体劣性）、３（捻転、Ｘ連結）、５（ドパ反応性）、１０、１２、１６、２５、２６（ミオクローヌス性）；けいれん、良性家族性乳児、２；早期乳児てんかん性脳症２、４、７、９、１０、１１、１３、および１４；非定型レット症候群；早期Ｔ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病；外胚葉異形成皮膚脆弱性症候群；外胚葉異形成合指症候群１；解離偏位水晶体、常染色体劣性および優性；欠指症、外胚葉異形成、および口唇口蓋裂症候群３；エーラース・ダンロス症候群７型（常染色体劣性）、古典型、２型（早老性）、ヒドロキシリジン欠乏症、４型、４型変異、およびテネイシンＸ欠乏症が原因である；アイクスフェルト型先天性筋ジストロフィー；内分泌−脳骨異形成（Endocrine-cerebroosteodisplasy）；増強エスコーン症候群（Enhanced s-cone syndrome）；拡大前庭水道症候群；エンテロキナーゼ欠損症；表皮異形成疣贅型（verruciformis）；単発性表皮水疱症および四肢帯型筋ジストロフィー、斑状色素沈着を伴う単一性、幽門閉鎖症を伴う単一性、単一性、常染色体劣性、および幽門閉鎖を伴う；表皮剥離性掌蹠角皮症；家族熱性けいれん８；てんかん、小児期不在２、１２（特発全身性、への感受性）５（夜間前頭葉）、夜間前頭葉１型、部分的、可変焦点を伴う、進行ミオクローヌス性３、およびＸ連結、可変の学習障害および行動異常を伴う；てんかん性脳症、小児期発症、乳児期早期、１、１９、２３、２５、３０および３２；骨端異形成、多発、近視および伝導性難聴；エピソード失調症２型；偶発性疼痛症候群、家族性、３；エプスタイン症候群；フェヒトナー症候群；赤血球産生性プロトポルフィリン症；エストロゲン耐性；滲出性硝子体網膜症６；ファブリー病およびファブリー病、心臓性変異；Ｈ、ＶＩＩ、Ｘ、ｖ、およびｖｉｉｉ因子、２の合併欠乏症、ｘｉｉｉ、サブユニット、欠乏症；家族性腺腫性ポリープ症１および３；じんましんおよび難聴を伴う家族性アミロイド腎症；家族性寒冷じんましん；小脳虫部の家族性形成不全；家族性良性天疱瘡；乳房の家族性がん；乳がん、への感受性；骨肉腫；膵臓がん３；家族性心筋症；家族性風邪自己��症症候群２；家族性大腸がん；家族性滲出性硝子体網膜症、Ｘ連結；家族性片麻痺性片頭痛１型および２型；家族性高コレステロール血症；家族性肥大型心筋症１、２、３、４、７、１０、２３および２４；家族性低カリウム血症−低マグネシウム血症；家族性低形成、糸球体腎炎；家族性乳児筋無力症；家族性若年性痛風；家族性地中海熱および家族性地中海熱、常染色体優性；家族性孔脳症；家族性晩発性皮膚ポルフィリン症；家族性肺毛細血管腫症；家族性腎糖尿症；家族性腎性低尿酸血症；家族性制限型心筋症１；家族性１型および３型の超リポ蛋白質血症；ファンコーニ貧血、補完グループＥ、Ｉ、Ｎ、およびＯ；ファンコーニビッケル症候群；ファビズム、への感受性；熱性けいれん、家族性、1１；ファインゴールド症候群１；胎児ヘモグロビン量的形質遺伝子座１；ＦＧ症候群およびＦＧ症候群４；眼球外筋の線維症、先天性、１、２、３ａ（眼球外病変を伴うまたはなしの）、３ｂ；魚眼疾患；フレック角膜ジストロフィー；フローティングハーバー症候群；精神発達障害を伴うまたはなしの発話異常を伴う焦点発作；巣状分節性糸球体硬化症５；前脳の欠陥；フランクテルハール症候群；Borrone Di Rocco Crovato症候群；フラジエ症候群；ウィルムス腫瘍１；フリーマン・シェルドン症候群；前頭骨幹端異形成１および３；前頭側頭型認知症；前頭側頭型認知症および／または筋萎縮性側索硬化症３および４；前頭側頭型認知症染色体３連結および前頭側頭型認知症ユビキチン陽性；フルクトース・ビホスファターゼ欠損症；フーマン症候群；ガンマアミノ酪酸トランスアミナーゼ欠損症；ガンストープ・ウォルファルト症候群；ゴーシェ病１型および亜急性神経障害；進行性脊柱側弯症を伴う視線麻痺、遺伝子水平性；全身優性ジストロフィー性表皮水疱症；熱性けいれんプラス３を伴う遺伝子活性化てんかん、１型、２型；レノックスガスト型てんかん性脳症；巨大軸索型神経障害；グランツマン血栓症；緑内障１、開放角、ｅ、Ｆ、およびＧ；緑内障３、原発性先天性、ｄ；先天性緑内障、先天性緑内障、先天性緑内障；緑内障、一次開放角、若年発症；神経膠腫の感受性１；グルコーストランスポーター１型欠損症症候群；グルコース６リン酸輸送障害；ＧＬＵＴ１欠損症症候群２；てんかん、特発全身性、への感受性、１２；グルタミン酸ホルミミノトランスフェラーゼ欠損症；グルタル酸血症ＩＩＡおよびＩＩＢ；グルタル酸尿症、１型；グルタチオン合成酵素欠損症；グリコーゲン貯蔵疾患０（筋肉）、ＩＩ（成人型）、ＩＸａ２、ＩＸｃ、１Ａ型；ＩＩ型、ＩＶ型、ＩＶ型（肝臓の、および筋障害性合併型）、Ｖ型、およびＶＩ型；ゴールドマン・ファーブル症候群；ゴードン症候群；ゴーリン症候群；全前脳症；全前脳症７；肉芽腫性疾患、慢性、Ｘ連結、変異；卵巣の顆粒膜細胞腫；グレー血小板症候群；Griscelli症候群３型；グレーノー角膜ジストロフィーＩ型；成長および精神遅滞、下顎顔面骨形成不全、小脳症、口蓋裂；下垂体異常を伴う成長ホルモン欠乏症；免疫不全を伴う成長ホルモン非感受性；ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ欠損症；ハイドゥーチェニー症候群；手足子宮症候群；聴覚障害；血管腫、毛細血管乳児；血液腫瘍；ヘモクロマトーシス１、２Ｂ、および３型；糖尿病７の微小���管合併症； トランスフェリン血清レベル量的形質遺伝子座２；ヘモグロビンＨ疾患、無欠失の；溶血性貧血、非球形性、グルコースリン酸イソメラーゼ欠損症が原因である；血球貪食性リンパ組織球増加症、家族性、２；血球貪食性リンパ組織球増加症、家族性、３；ヘパリン補因子ＩＩ欠乏症；遺伝性腸性肢端皮膚炎；遺伝性乳がんおよび卵巣がん症候群；毛細血管拡張性運動失調症；遺伝性びまん性胃がん；スフェロイドを伴う遺伝性びまん性白質脳症；遺伝因子ＩＩ、ＩＸ、ＶＩＩＩ欠乏症疾患；遺伝性出血性毛細血管拡張症２型；無汗症を伴う疼痛への遺伝的非感受性；遺伝性リンパ浮腫Ｉ型；視神経萎縮を伴う遺伝性運動神経障害および感覚神経障害；早期呼吸不全を伴う遺伝性ミオパチー；遺伝性神経性筋萎縮症；遺伝性非ポリープ性結腸直腸腫瘍；リンチ症候群IおよびII；遺伝性膵炎；膵炎、慢性、への感受性；遺伝性感覚および自律神経障害ＩＩＢ型およびＩＩＡ型；遺伝性の鉄芽球性貧血；ヘルマンスキー・パドラック症候群１、３、４、および６；内臓逆位、内臓、２、４、および６、常染色体；内臓逆位、内臓、Ｘ連結；異所形成；組織球性髄質網状症；組織球増殖症リンパ節腫大プラス症候群；ホロカルボキシラーゼ合成酵素欠損症、全前脳症２、３、７および９、およびホルト・オーラム症候群；ＭＴＨＦＲ欠乏症が原因であるホモシステイン血症、ＣＢＳ欠乏症、およびホモシスチン尿症、ピリドキシン応答性；コバラミン代謝における欠陥が原因であるホモシスチン尿症−巨赤芽球性貧血、ｃｂｌＥ補完型；ハウエル・エヴァンス（Howel-Evans）症候群；ハーラー症候群；ハチンソン・ギルフォード症候群；水頭症；高アンモニア血症、ＩＩＩ型；高コレステロール血症および高コレステロール血症、常染色体劣性；過剰驚愕症２および過剰驚愕症遺伝性；高フェリチン血症白内障症候群；高グリシン尿症；周期熱を伴う高免疫グロブリンＤ；メバロン酸尿症；高免疫グロブリンＥ症候群；高インスリン血症性低血糖症家族性３、４、および５；高インスリン血症−高アンモニア血症症候群；高リジン血症；ジストニアを伴う高マンガン血症、赤血球増加症および肝硬変；高オルニチン血症−高アンモニア血症−ホモシトルリン尿症症候群；副甲状腺機能亢進症１および２；副甲状腺機能亢進症、新生児重症；高フェニルアラニン血症、ｂｈ４欠乏症、ａ
、部分欠乏症に由来する欠乏症、ＢＨ４欠乏症、Ｄ、および非ｐｋｕ；精神発達障害症候群２、３、および４を伴う過リン酸血症症；多毛症骨軟骨ジストロフィー；低ベータリポ蛋白血症、家族性、ａｐｏｂ３２に関連する；低カルシウム血症、常染色体優性１；低カルシウム尿性高カルシウム血症、家族性、１および３型；低軟骨形成；鉄過負荷を伴う低色素性小球性貧血；肝臓におけるグリコーゲンシンテターゼの欠損症を伴う低血糖；無性腺症を伴うまたはなしの性腺機能低下性腺機能低下症１１；免疫不全を伴う発汗低下外胚葉異形成；低汗性Ｘ連結外胚葉異形成；低カリウム性周期性麻痺１および２；低マグネシウム血症１、腸；低マグネシウム血症、けいれん、および精神発達障害；低髄鞘形成性白質ジストロフィー７；低形成性左心症候群；房室中隔欠損と一般的な房室接合部；尿道下裂１および２、X連結；甲状腺機能低下症、先天性、非興奮性、１；低トリコピー症８および１２；多毛症−リンパ浮腫−毛細血管拡張症症候群；Ｉ式血液型；シーメンスの魚鱗癬角膜剥離症；剥脱性魚鱗癬；未熟児魚鱗癬症候群；特発性大脳基底核石灰化５；特発性線維化性肺胞炎、慢性形；先天性角化異常症、常染色体優性２および５；乳児の特発性高カルシウム血症；カルシウム流入障害２によるＴ細胞不活性化を伴う免疫機能障害；免疫不全１５、１６、１９、３０、３１Ｃ、３８、４０、８、高ＩｇＭ１および２型を伴う、ｃｄ３−ｚｅｔａの欠陥が原因であり、およびマグネシウム欠陥を伴うＸ連結、エプスタイン・バーウイルス感染、および腫瘍症；免疫不全セントロメア不安定性−顔面異常症候群２；封入体ミオパチー２および３；埜中ミオパチー；乳児のけいれんおよび発作性コレオアテトーゼ、家族性；乳児皮質骨増殖症；乳児ＧＭ１ガングリオシド蓄積症；乳児低ホスファターゼ症；乳児ネフロン癆；乳児眼振、Ｘ連結；乳児パーキンソニズムジストニア；多尾の精子および過度ＤＮＡに関連する不妊症；インシュリン抵抗性；インシュリン抵抗性糖尿病および黒色表皮腫；インシュリン依存性糖尿病分泌性下痢；間質性腎炎、巨大核性；子宮内発育遅延、骨幹端異形成、先天性副腎低形成、および性器異常；ヨードチロシルカップリング欠陥；ＩＲＡＫ4欠乏症；Iridogoniodysgenesis優性型および１型；脳における鉄蓄積；Ischiopatellar異形成；膵島細胞過形成；１７、２０リアーゼ単独欠損症；ルトロピン単独欠損症；イソバレリルＣｏＡ脱水素酵素欠損症；ヤンコビッチリベラ症候群；ジャーベルおよびランゲニールセン症候群２；ジューベール症症候群１、６、７、９／１５（二性）、１４、１６、および１７、および／またはofaciodigital症候群xiv；ヘルリッツの接合部表皮水疱症；若年性GM1ガングリオシド症；若年性ポリープ症症候群；若年性多発／遺伝性出血性毛細血管拡張症症候群；若年性網膜分離症；歌舞伎メーキャップ症候群；カルマン症候群１、２、および６；思春期遅発；神崎病；カラク症候群；カルタ遺伝子症候群；ケニーカフェイ症候群２型；ケッペンルビンスキー症候群；円錐角膜１；濾胞性角化症；掌蹠線条体角化症；キンドラー症候群；Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸尿；ラーセン症候群、優性型；ラティス角膜ジストロフィーＩＩＩ型；レーバー黒内障；ツェルヴェーガー症候群；ペ��オキシソーム形成異常；ツェルヴェーガー症候群スペクトラム；レーバー先天性黒内障１１、１２、１３、１６、４、７、および９；レーバー視神経萎縮症；アミノグリコシド誘発性難聴；難聴、非症候感音性、ミトコンドリアの；左室不全５；左室緻密化障害；リー疾患；ミトコンドリア短鎖エノイルＣｏＡヒドラターゼ欠損症；ミトコンドリア複合体欠乏が原因であるリー症候群；ライナー疾患；レリ・ワイル軟骨軟骨症；致死的先天性拘縮症候群６；白血球粘着不全症ＩおよびＩＩＩ型、白質ジストロフィー、低髄鞘形成、１１および６；運動失調を伴う白質脳症、脳幹および脊髄病変および乳酸上昇を伴う、白質消失を伴う、および進行性、卵巣不全を伴う；白斑症合計；レビー小体型認知症；リヒテンシュタインクノール症候群；リーフラウメニ症候群１；Ｌｉｇ４症候群；肢帯型筋ジストロフィー、タイプ１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｄ、Ｃ１、Ｃ５、Ｃ９、Ｃ１４；脳および眼の異常を伴う先天性筋ジストロフィー、ジストログリカノパチー、Ａ１４およびＢ１４型；リパーゼ欠損合併症；脂質蛋白症；脂肪異栄養症、家族性部分的、２および３型；Lissenphaly１、２（Ｘ連結）、３、６（小脳症あり）、Ｘ連結；皮質下層状異所形成、Ｘ連結；急性乳児肝不全；ロイス・ディーツ症候群１、２、３；ＱＴ延長症候群１、２、２／９、２／５、（二性）、３、５および５、後天性、への感受性；肺がん；リンパ浮腫、遺伝性、ｉｄ；リンパ浮腫、原発性、骨髄性異型；リンパ増殖性症候群１、１（Ｘ連結）、および２；リソソーム酸性リパーゼ欠損症；大頭症、巨人症、顔面異形症候群；黄斑変性症、卵黄様、成人発症；悪性高熱感受性１型；悪性リンパ腫、非ホジキン；悪性黒色腫；前立腺の悪性腫瘍；Mandibuloacral形成異常；ＡまたはＢ型脂肪異栄養症を伴う、Mandibuloacral異形成；下顎顔面骨形成不全、トリーチャーコリン型、常染色体劣性；マンノース結合蛋白質欠乏症；メープルシロップ尿症１Ａ型および３型；Marden Walker様症候群；マルファン症候群；マリネスコ・シェーグレン症候群；マルトソルフ症候群；若年者の成人発症糖尿病、１型、２型、１１型、３型、および９型；メイ−ヘグリン異常；ＭＹＨ９に関連する異常；セバスチャン症候群；マキューン・オルブライト症候群；成長ホルモン分泌腺腫；性索間質腫瘍；クッシング症候群；マックシック・カウフマン症候群；マクラウド神経アカントサイトーシス症候群；メッケル・グルーバー症候群；中鎖アシル補酵素Ａ脱水素酵素欠損症；髄芽腫；皮質下嚢胞１および２ａを伴う巨大脳白質脳症；先天性末梢血管拡張大理石様皮膚巨脳症；ＰＩＫ３ＣＡ関連過成長スペクトラム；巨大脳症−小脳症−多指症−頭症症候群２；糖尿病および感音性難聴を伴う巨赤芽球性貧血、チアミン反応性；Meier-Gorlin症候群１および４；メリックニードルズ症候群；髄膜腫；精神発達障害、Ｘ連結、３、２１、３０、および７２；脳橋や小脳低形成を伴う精神発達障害および小脳症；精神発達障害Ｘ連結症候群５；精神発達障害、上顎前突、および斜視；精神発達障害、常染色体優性１２、１３、１５、２４、３、３０、４、５、６、および９；精神発達障害、常染色体劣性１５、４４、４６、および５；精神発達障害、常同性運動、てんかん、および／または脳奇形成；精神発���障害、症候群性、クラウス・イェンセン型、Ｘ連結；精神発達障害、Ｘ連鎖、非特異的、症候群性、ヘデラ型、および症候群性、wu型；メロシン欠乏性先天性筋ジストロフィー；若年性異染性白質ジストロフィー、乳児後期、および成人型；異染性白質ジストロフィー；変態異形成；メトヘモグロビン血症１型および２型；メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ欠損症、常染色体優性；ホモシスチン尿症を伴うメチルマロン酸血症、メチルマロン酸尿症ｃｂｌＢ型、;メチルマロニルＣｏＡムターゼ欠損症によるメチルマロン酸尿症メチルマロン酸、ｍｕｔ（０）型；小頭骨異形成性原発性小人症２型；網脈絡膜症を伴うまたはなしの小脳症、リンパ浮腫、または精神発達障害；ヘルニアおよびネフローゼ症候群；小脳症；脳梁の発育不全；痙性対麻痺５０、常染色体劣性；全体の発育遅延；ＣＮＳミエリン形成不全；脳萎縮症；小脳症、正常知能および免疫不全；小脳症−毛細血管奇形症候群；小球性貧血；小眼球症症候群５、７、および９；小眼球症、単独３、５、６、８、およびコロボーマ６；ミクロスフェアファキア（Microspherophakia）；片頭痛、家族性脳底；ミラー症候群；外眼筋麻痺を伴うミニコアミオパチー；ミオパチー、コアと先天的；ミッチェルライリー症候群；ミトコンドリア３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡシンターゼ欠損症；ミトコンドリア複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩＩ（核型２、４、または８）欠乏症；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群１１、１２（心筋症型）、２、４Ｂ（ＭＮＧＩＥ型）、８Ｂ（ＭＮＧＩＥ型）；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群３および７、肝脳型、および１３（脳筋症型）；ミトコンドリアリン酸運搬体およびピルビン酸運搬体欠乏症；ミトコンドリア三機能性蛋白質欠乏症；長鎖３−ヒドロキシアシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症；三好筋ジストロフィー１；前脛骨発症を伴うミオパチー、遠位；モールトラネビャエル症候群；モリブデン補因子欠乏症、相補群Ａ；モワット−ウィルソン症候群；ムコリピドーシスＩＩＩガンマ；粘膜多糖症ＶＩ型、ＶＩ型（重症）、およびＶＩＩ型；粘膜多糖症、ＭＰＳ−Ｉ−Ｈ／Ｓ、ＭＰＳ−ＩＩ、ＭＰＳ−ＩＩＩ−Ａ、ＭＰＳ−ＩＩＩ−Ｂ、ＭＰＳ−ＩＩＩ−Ｃ、ＭＰＳ−ＩＶ−Ａ、ＭＰＳ−ＩＶ−Ｂ；網膜色素変性症７３；ガングリオシド症ＧＭ１型１（心臓の関与を伴う）；多中心性骨溶解性腎症；多中心性骨溶解症、結節症および関節症；複数の先天異常心房中隔欠損２；多発性先天異常−筋緊張低下−けいれん症候群３；複数の皮膚および粘膜の静脈形成；多発性内分泌腫瘍、１および４型；多発性骨端異形成５または優性；複数の消化管閉鎖症；多発性翼状片症症候群、Escobar型；多種スルファターゼ欠損症；多発性癒合症候群３；筋ＡＭＰデアミナーゼ欠損症；筋・眼・脳病；筋ジストロフィー、先天性、巨人型；筋無力症、家族性乳児、１；筋無力症候群、先天性、１１、アセチルコリン受容体欠乏症に関連する；筋無力症候群、先天性、１７、２Ａ（スローチャンネル）、４Ｂ（ファーストチャンネル）、および尿細管凝集塊なし；ミエロペルオキシダーゼ欠損症；ＭＹＨ関連ポリープ症；子宮内膜がん；心筋梗塞１；ミオクローヌスジストニア；ミヨクローヌ性アトニーてんかん；赤色ぼろ線維・ミオクロ���ヌスてんかん症候群；筋原線維性ミオパチー１およびＺＡＳＰ関連；ミオグロビン尿症、急性再発性、常染色体劣性；筋神経性胃腸脳症症候群；進行性外眼筋麻痺を伴う小脳性運動失調；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群４Ｂ、ＭＮＧＩＥ型；ミオパチー、中心核、１、先天性、過剰な筋紡錘を伴う、遠位、１、乳酸アシドーシス、および側芽細胞性貧血１、先天性白内障を伴う進行性のミトコンドリア、難聴、および発達遅延、ならびに尿細管凝集、２；近視６；筋硬化症、常染色体劣性；先天性筋緊張症（Myotonia congenital）；先天性筋緊張症、常染色体優性および劣性形；爪膝蓋骨症候群；ナンスホラン症候群；ナノフタルモス２；ナバホ神経障害；ネマリン性ミオパチー３および９；新生児低緊張症；知的障害；けいれん；発話と言語の発達遅延；精神発達障害、常染色体優性３１；シトリン欠乏により引き起こされる新生児肝内胆汁うっ滞；腎性尿崩症、腎性尿崩症、Ｘ連結；腎結石症／骨粗鬆症、低リン血症、２；ネフロン癆１３、１５、および４；不妊症；小脳橋−眼球−腎臓症候群（ネフロン癆、眼球運ドン失調症および小脳異常）；眼球異常を伴うまたはなしのネフローゼ症候群、３型、５型、７型、および９型；ネストールギジェルモ早老症症候群；Neu-Laxova症候群１；鉄蓄積４および６を伴う神経変性；神経フェリチン症；神経線維腫症、１型および２型；神経線維肉腫；神経下垂体性尿崩症；神経障害、遺伝性感覚、ＩＣ型；中性１アミノ酸輸送欠陥；ミオパチーを伴う中性脂質貯蔵病；好中球免疫不全症候群；Nicolaides-Baraitser症候群；ニーマンピック病Ｃ１、Ｃ２型、Ａ型、およびＣ１型、成人形；非ケトン性高グリシン血症；ヌーナン症候群１および４、ＬＥＯＰＡＲＤ症候群１；若年性骨髄単球性白血病を伴うまたはなしのヌーナン症候群様異常；正常カリウム血性周期性麻痺、カリウム感受性；ノルム病；てんかん、難聴、および精神発達障害症候群；精神発達障害、Ｘ連結１０２、および症候群性１３；肥満；眼白化症、タイプＩ；眼皮白化症１Ｂ型、３型、および４型；眼歯指異形成；Odontohypophosphatasia；Odontotrichomelic症候群；小口病；部分性無歯症−大腸がん症候群；オーピツＧ／ＢＢＢ症候群；視神経萎縮症９；口腔・顔面・指趾症候群；オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症；口腔顔面裂１１および７、口唇口蓋裂−外胚葉異形成症候群；Orstavi
k Lindemann Solberg症候群；軽度の軟骨異形成を伴う変形性関節症；離断性骨軟骨炎；正常強膜を伴う骨形成不全症１２型、５型、７型、８型、Ｉ型、ＩＩＩ型、、優性形、劣性周産期致死性；頭蓋硬化症を伴うオステオパチア線条体；骨粗鬆症常染色体優性１型および２型、劣性４、劣性１、劣性６；偽神経膠腫を伴う骨粗鬆症；耳口蓋指症候群、タイプＩおよびＩＩ；卵巣形成異常１；卵巣白質ジストロフィー；先天性爪肥厚症４および２型；骨のパジェット病、家族性；パリスターホール症候群；掌蹠角化症、表皮不溶解性、焦点またはびまん性；焦点またはびまん性非形成および先天性心疾患；パピヨン・ルフェーヴル（Papillon-Lefevre）症候群；傍神経節腫３；ヴォン・オイレンブルク（von Eulenburg）の先天性パラミオトニー；副甲状腺癌；パーキンソン病１４、１５．１９（若年性発症）、２，２０（早期発症）、６、（常染色体劣性、早期発症、および９； 網膜色素上皮のパターン化ジストロフィー；ＰＣ−Ｋ６ａ；ペリツェウス・メルツバッハ病；ペンドレッド症候群；末梢性脱髄性神経障害、中枢性髄鞘形成異常；ヒルシュスプルング病；恒久的な新生児糖尿病；神経学的特徴を伴う糖尿病、永続的な新生児；新生児インスリン依存性糖尿病；若年者の成人発症型糖尿病、２型；ペルオキシソーム形成異常１４Ｂ、２Ａ、４Ａ、５Ｂ、６Ａ、７Ａ、および７Ｂ；ペロー症候群４；ペリー症候群；乳児期の持続性高インスリン血症性低血糖；家族性高インスリン血症；表現型；フェニルケトン尿症；褐色細胞腫； 遺伝性傍神経節腫−褐色細胞腫症候群；傍神経節腫１；腸のカルチノイド腫瘍；コーデン症候群３；ホスホグリセリン酸脱水素酵素欠損症；ホスホグリセリン酸キナーゼ１欠損症；感光性トリコチオジストロフィー；フィタン酸貯蔵疾患；ピック病；ピアソン症候群；色素性網膜ジストロフィー；色素性結節性副腎皮質疾患、原発性、１；石灰化上皮腫；ピットホプキンス症候群；下垂体依存性副腎皮質機能亢進症；下垂体ホルモン欠乏症、１、２、３、および４合併症；プラスミノーゲン活性因子インヒビター１型欠乏症；プラスミノーゲン欠乏症、Ｉ型；血小板型出血異常１５および８；多形皮膚萎縮症、腱拘縮を伴う遺伝性線維症、ミオパチー、および肺線維症；多発性嚢胞腎２、成人型、および小児型；硬化性白質脳症を伴う多嚢胞性脂肪膜性骨異形成症；免疫不全を伴うまたはなしの、ポリグルコサンボディミオパチー１；多小脳回症、非対称、両側前頭頭頂骨；多発神経障害、難聴、運動失調、網膜色素変性症、および白内障；小脳小脳低形成症４型；膝窩部贅皮症候群；孔脳症２；汗孔角化症８；光線性型；ポルホビリノーゲンシンターゼ欠損症；晩発性皮膚ポルフィリン症；色素性網膜炎を伴う後柱失調症；後極白内障２型；プラダー・ヴィリ様症候群早発卵巣不全４、５、７、および９；原発性常染色体劣性小脳症１０、２、３、および５；一次繊毛ジスキネジア２４；原発性拡張型心筋症；膝窩翼状片症候群；孔脳症２；ポロケラトーシス８、播種性表在性光線型；左室不全６；４、左心室圧迫１０；発作性心房細動；原発性高シュウ酸尿症、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型；原発性肥大性骨関節症、常染色体劣性２；原発性低マグネシウム血症、原発性若年性緑内障１；原発性肺高血圧症；���リムローズ症候群；進行性家族性心臓ブロック１Ｂ型；進行性家族性肝内胆汁うっ滞２および３； 進行性肝内胆汁うっ滞；運動失調を伴う進行性ミオクローヌスてんかん；進行性偽関節リウマチ異形成；進行性硬化性ポリジストロフィー；プロリダーゼ欠損症；プロリン脱水素酵素欠損症；統合失調症４；プロパージン欠乏症、Ｘ連結；プロピオン酸血症；プロ蛋白質変換酵素１／３欠損症；前立腺癌、遺伝性、２；プロタン欠陥；蛋白尿症；フィンランド先天性ネフローゼ症候群；プロテウス症候群；乳腺がん；偽軟骨形成性脊椎骨端異形成症候群（Pseudoachondroplastic spondyloepiphyseal dystrophy syndrome）；偽性低アルドステロン症１型常染色体優性および劣性および２型；偽性副甲状腺機能低下症１Ａ型、偽性偽性副甲状腺機能低下症；偽性新生児副腎白質ジストロフィー；偽原発性高アルドステロン症；弾性線維性仮性黄色腫；乳児の全身動脈石灰化２；多発性凝固因子欠乏症を伴う弾性線維性仮性黄色腫様の異常；乾癬感受性２；ＰＴＥＮ過誤腫腫瘍症候群；遺伝性出血性毛細血管拡張症に関連した肺高血圧症；肺線維症および／または骨髄不全、テロメア関連、１および３；遺伝性出血性毛細血管拡張症に関する肺高血圧症；肺線維症および／または骨髄不全、テロメア関連、１および３；遺伝性出血性毛細血管拡張症を伴う肺高血圧症、原発性、１；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症；ピルビン酸脱水素酵素Ｅ１−アルファ欠損症；赤血球のピルビン酸キナーゼ欠損症；レイン症候群ラソパシー劣性異栄養性表皮水疱症；爪異常、先天性非症候群性、８；ライフェンシュタイン症候群；腎異形成；腎カルニチン輸送障害；腎コロボーマ症候群；腎異形成；腎異形成、網膜色素変性症、小脳性運動失調症および骨格異形成；腎尿細管性アシドーシス、遠位、常染色体劣性、遅発性感音難聴、または溶血性貧血を伴う；尿細管性アシドーシス、眼の異常および精神発達障害を伴う；網膜錐体ジストロフィー３Ｂ；網膜色素変性症；網膜色素変性症１０、１１、１２、１４、１５、１７、および１９；網膜色素変性症２、２０、２５、３５、３６、３８、３９、４、４０、４３、４５、４８、６６、７、７０、７２；網膜芽細胞腫；レット異常；ラブドイド腫瘍プレデポジション症候群２；裂孔原性網膜剥離、常染色体優性；根性点状軟骨異形成症２型および３型；ロバーツＳＣフォコメリア症候群；Robinow Sorauf症候群；ロビノー症候群、常染色体劣性、常染色体劣性、brachy-syn-polydactylyを伴う； ロスムントトムソン症候群；ラパジリーノ症候群；ＲＲＭ２Ｂ関連ミトコンドリア病；ルビンスタインタイビ症候群；サラ病；サンドホフ病、成人およびinfantil型；サルコイドーシス、早期発症；ブラウ症候群；シンドラー病、１型；裂脳症；統合失調症１５；Schneckenbecken異形成；神経鞘腫症２；シュワルツジャンペル症候群１型；Sclerocornea、常染色体劣性；硬化症；第２のアリール甲状腺機能低下症；瀬川病症候群、常染色体劣性；シニアローケン症候群４および５、感覚運動失調性神経障害、構音障害、および眼麻痺；セピアプテリン還元酵素欠損症；セサミ（sesame）症候群；ＡＤＡ欠損症が原因である重度合併免疫不全、小脳症を伴う、発育遅延、およびイオン化する放射線への感受性、���典型的、常染色体劣性、Ｔ細胞陰性、Ｂ細胞陽性、ＮＫ陽性のＮＫ細胞陰性；部分的アデノシンデアミナーゼ欠損症；重度先天性好中球減少症；重度先天性好中球減少症３、 乳児における重症ミオクロニーてんかん；熱性けいれんプラスを伴う全身性てんかん、１および２型；重度Ｘ連結筋細管ミオパチー；ＱＴ短縮症候群３；非特異的な骨格異常を伴う低身長；低身長、聴神経管閉鎖症、下顎発育不全、骨格異常；低身長、爪異形成、顔面異形症、および貧毛症；原始性低身長症；多指症を伴うまたはなしの仮肋骨（Short-rib）胸郭異形成１１または３；シアリドーシスＩ型およびＩＩ型；銀痙性対麻痺症候群；遅い神経伝導速度、常染色体優性；スミス・レムリ・オピッツ症候群；スナイダーロビンソン症候群；成長ホルモン分泌腺腫；プロラクチノーマ；家族性、下垂体腺腫プレでポジション、ソトス症候群１または２；痙性失調症５、常染色体劣性、シャルルヴォアサグネ型、１、１０、または１１、常染色体劣性；筋萎縮性側索硬化症５型；痙性対麻痺１５、２、３、３５、３９、４、常染色体優性５５、常染色体劣性、および５Ａ；胆汁酸合成欠陥、先天性、３；精子形成不全１１、３、および８；球状赤血球症４および５型；スフェロイド体ミオパチー；脊髄性筋萎縮症、下肢主（predominant）２、常染色体優性；脊髄性筋萎縮症、タイプＩＩ；脊髄小脳性運動失調症１４、２１、３５、４０、および６；脊髄小脳失調症常染色体劣性１および１６；脾臓発育不全；脊椎骨底足骨癒合症候群；脊椎指異形成（Spondylocheirodysplasia）、エーラース・ダンロス症候群様、免疫失調症を伴う、アグリカン型、先天性関節脱臼、短手型、Sedaghatian型、錐体杆体ジストロフィー、およびコズロスキー型；parastremmatic小人症；シュタルガルト疾患１型；錐体杆体ジストロフィー３；スティックラー症候群１型；クナイスト異形成；スティックラー症候群、１型（非症候眼性）および４；刺傷関連血管症、乳児期発症；ストルモーケン（Stormorken）症候群；スタージ・ウェーバー症候群、毛細血管奇形、先天性、１；サクシニルＣｏＡアセトアセテートトランスフェラーゼ欠損症；スクラーゼ−イソマルターゼ欠損症；乳幼児突然死症候群；亜硫酸オキシダーゼ欠損症、単離された；Supravalvar大動脈弁狭窄症；界面活性剤代謝機能障害、肺、２および３；交感神経、近位、１ｂ；合指症Cenani Lenz型；合指症３型；症候群性Ｘ連結精神発達障害１６；タリペス タンジール病；ＴＡＲＰ症候群；テイ・サックス病、Ｂ１変異、ＧＭ２ガングリオシドーシス（成人）、ＧＭ２ガングリオシドーシス（成人発症）；テタミー症候群；テノリオ症候群；末端骨異形成；テストステロン１７−ベータ−脱水素酵素欠損症；テトラアメリア、常染色体劣性；ファロー四徴症；左心低形成症候２；総動脈幹；心臓および大血管の奇形；心室中隔欠損１；ティールベーンケ角膜ジストロフィー；胸部大動脈瘤および大動脈解離；マルファン体質（Marfanoid habitus）；スリーＭ（Three M）症候群２；血小板減少症、血小板機能不全、溶血、および不均衡なグロビン合成；血小板減少症、Ｘ連結；血栓症、遺伝性、蛋白質Ｃ欠乏症が原因である、常染色体優性および劣性；甲状腺非形成；甲状腺がん、濾胞性；甲状腺ホルモン代謝、異常；甲状腺ホルモン耐性、全身性、常���色体優性；甲状腺中毒性周期性四肢麻痺および甲状腺中毒性周期性四肢麻痺２；甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン抵抗性；ティモシー症候群；ＴＮＦ受容体関連周期熱症候群（ＴＲＡＰＳ）；歯の非形成、選択的、３および４；多形性心室頻拍；Townes-Brocks-branchiootorenal様症候群；新生児の一過性水疱性皮膚炎；トリーチャー・コリンズ症候群；精神発達障害、小人症および網膜の色素変性症を伴う長睫毛症；Trichorhinophalangeal異形成Ｉ型；Trichorhinophalangeal症候群３型；トリメチルアミン尿症；結節性硬化症症候群；リンパ管筋腫症；結節性硬化症１および２；チロシナーゼ陰性眼皮膚白皮症；チロシナーゼ陽性眼皮膚白皮症；チロシン血症Ｉ型；ＵＤＰグルコース−４−エピメラーゼ欠損症；ウルリッヒ先天性筋ジストロフィー；尺骨および腓骨重度四肢欠乏症が存在しない（Ulna and fibula absence of with severe limb 欠乏症）；血栓性血小板減少性紫斑病（Upshaw-Schulman syndrome）；ウロカニン酸ヒドラターゼ欠損症；アッシャー症候群、１型、１Ｂ、１Ｄ、１Ｇ、２Ａ、２Ｃ、および２Ｄ；網膜色素変性症３９；紫外線感受性症候群；ファン・デル・ウンデ症候群；Van Maldergem症候群２；ヘネカムリンパ管拡張症−リンパ浮腫症候群２；異型ポルフィリン症；嚢胞腎を伴う心室肥大；ヴェルヘイ症候群；超長鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症；膀胱尿管逆流症８；内臓逆位５、常染色体；内臓ミオパチー；ビタミンＤ依存性くる病、１および２型；卵黄様ジストロフィー；フォン・ヴィルブランド病２Ｍ型および３型；ワールデンブルグ症候群１、４Ｃ、および２Ｅ型（神経障害を伴う）；クライン・ワールデンベルク症候群；Walker-Warburg先天性筋ジストロフィー；ワールブルグミクロ症候群２および４；いぼ、低ガンマグロブリン血症、感染症、骨髄性溶血症；ウィーバー症候群；ワイルマルケサニ症候群１および３；ワイルマルケサニ様症候群；Weissenbacher-Zweymuller症候群；Werdnig-Hoffmann疾患；シャルコー・マリー・トゥース病；ウェルナー症候群；ＷＦＳ１関連の異常； ヴィーデマン・シュタイナー症候群；ウィルソン病；ウルフラム様症候群、常染色体優性；Worth disease；Van Buchem病２型；色素性乾皮症、補体群ｂ、群Ｄ、群Ｅ、および群Ｇ；Ｘ連結無ガンマグロブリン血症；Ｘ連結遺伝
性運動と感覚神経障害；ステリルスルファターゼ欠損症を伴うＸ連結性魚鱗癬症；Ｘ連結脳室周囲異所形成；耳口蓋指の症候群、タイプＩ；Ｘ連結重症複合免疫不全症；ジマーマンラバン症候群およびジマーマンラバン症候群２；帯状白内障３；を包含する。
【０３５４】
本開示は、病原性のＧからＡまたはＣからＴの変異を含む遺伝子のリストを、提供する。そのような病原性のＧからＡまたはＣからＴへの変異は、本明細書において提供される方法および組成物を使用することによって、修正されてもよく、例としては、ＡからＧに変異させること、および／またはＴをＣに変異させること、それによって遺伝子の機能を回復する。表２は、本開示によって提供される核酸塩基編集因子を使用して、訂正され得る模範的な変異を、包含する。表２は、遺伝子の印、関連の遺伝型、訂正されるべき変異、および変異を修正されるために使用され得る、模範的ｇＲＮＡ配列を包含する。表２において提供されるＲＮＡ配列は、Ｃａｓ９または本明細書において提供される、塩基編集因子のいずれかを標的部位へ向け得るＲＮＡを、コードする配列である。例としては、表２において提供されるｇＲＮＡ配列は、Ｃａｓ９、または本明細書において提供される、塩基編集因子のいずれかを標的にするｇＲＮＡをコードするｐＦＹＦなどの、ｇＲＮＡ発現ベクターの中に、クローン化されてもよい。追加の変異は、ＧからＡまたはＣからＴの変異に関連する、追加の疾患を処置するために修正されてもよいことが、正しく理解されるべきである。さらにより追加のｇＲＮＡは、本開示および当該技術分野における知識に基づいて、デザインされてもよく、それらは、当業者によって正しく理解されるであろう。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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【表２−１４】
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【表２−１５】
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【表２−１６】
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【表２−１７】
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【表２−１８】
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【表２−１９】
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【表２−２０】
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【表２−２１】
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【表２−２２】
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【表２−２３】
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【表２−２４】
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【表２−２５】
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【表２−２６】
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【表２−２７】
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【表２−２８】
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【表２−２９】
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【表２−３０】
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【表２−３１】
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【表２−３２】
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【表２−３３】
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【表２−３４】
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【表２−３５】
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【表２−３６】
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【表２−３７】
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【表２−３８】
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【表２−３９】
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【表２−４０】
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【表２−４１】
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【表２−４２】
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【表２−４３】
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【表２−１７４】
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【表２−１７９】
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【表２−１８０】
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【表２−１８１】
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【表２−１８２】
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【表２−１８３】
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【表２−１８４】
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【表２−１８５】
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【表２−１８６】
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【表２−１８７】
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【表２−１８８】
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【表２−１８９】
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【表２−１９０】
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【表２−１９１】
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【表２−１９２】
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【表２−１９３】
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【表２−１９４】
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【表２−１９５】
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【表２−１９６】
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【表２−１９７】
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【表２−１９８】
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【表２−１９９】
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【表２−２００】
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【表２−２０１】
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【表２−２０２】
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【表２−２０３】
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【表２−２０４】
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【表２−２０６】
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【表２−２０７】
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【表２−２０８】
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【表２−２０９】
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【０３５５】
いくつかの態様において、融合蛋白質は、カノニカルなＰＡＭを認識し、したがって、隣接配列中のカノニカルなＰＡＭ、例えばＮＧＧでそれぞれ病原性のＧからＡまたはＣからＴへの変異を修正することができる。例えば、カノニカルなＰＡＭを認識するＣａｓ９蛋白質は、配列番号５２によって提供されるStreptococcus pyogenes Ｃａｓ９のアミノ酸配列または配列番号５２のＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含むそのフラグメントと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０３５６】
ここに開示されるように、Ｃａｓ９ドメインおよびアデノシンデアミナーゼを含む任意の融合蛋白質を標的部位、例えば編集される点変異を含む部位に標的化するために、例えばｓｇＲＮＡなどのガイドＲＮＡと共に融合蛋白質を共発現させることが通常必要であることは、当業者に明らかである。ここの他の箇所でより詳細に説明されるように、ガイドＲＮＡは、典型的には、Ｃａｓ９結合を可能にするｔｒａｃｒＲＮＡフレームワーク、およびＣａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合蛋白質に配列特異性を付与するガイド配列を含む。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、構造
【化１４５】
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を含み、ここで、ガイド配列は、標的配列に相補的である配列を含む。いくつかの態様において、ガイド配列は表２に提供されるヌクレオチド配列のいずれかを含む。ガイド配列は典型的には２０ヌクレオチド長である。Ｃａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合蛋白質を特定のゲノム標的部位に標的化するための好適なガイドＲＮＡの配列は、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。かかる好適なガイドＲＮＡ配列は、典型的には、編集される標的ヌクレオチドの上流または下流の５０ヌクレオチド以内の核酸配列に相補的であるガイド配列を含む。提供された融合蛋白質のいずれかを特定の標的配列に標的化するのに好適ないくつかの例示的なガイドＲＮＡ配列をここに提供する。その遺伝子座を含めて、追加のガイド配列を以下の表３に示す。
【表３−１】
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【表３−２】
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【０３５７】
塩基編集因子効率
本開示のいくつかの側面は、ここで提供される塩基編集因子のいずれかが、インデルの有意な割合を生成することなしに特定のヌクレオチド塩基を改変することができるという認識に基づく。ここで用いられる「インデル」は、核酸へのヌクレオチド塩基の挿入または欠失を言う。かかる挿入または欠失は、遺伝子のコード領域内のフレームシフト変異に至り得る。いくつかの態様においては、核酸中に多数の挿入または欠失（すなわちインデル）を生成することなしに、核酸中の特定のヌクレオチドを効率的に改変する（例えば変異させるかまたは脱アミノ化する）塩基編集因子を創ることが望ましい。ある種の態様において、ここで提供される塩基編集因子のいずれかは、インデルと比べて、意図される改変（例えば、点変異または脱アミノ化）のより高い割合を生成することができる。いくつかの態様において、ここで提供される塩基編集因子は、１：１超である意図される点変異対インデルの比を生成することができる。いくつかの態様において、ここで提供される塩基編集因子は、少なくとも１．５：１、少なくとも２：１、少なくとも２．５：１、少なくとも３：１、少なくとも３．５：１、少なくとも４：１、少なくとも４．５：１、少なくとも５：１、少なくとも５．５：１、少なくとも６：１、少なくとも６．５：１、少なくとも７：１、少なくとも７．５：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１２：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも２００：１、少なくとも３００：１、少なくとも４００：１、少なくとも５００：１、少なくとも６００：１、少なくとも７００：１、少なくとも８００：１、少なくとも９００：１、もしくは少なくとも１０００：１、またはより多くである意図される点変異対インデルの比を生成することができる。意図される変異およびインデルの数は、いずれかの好適な方法、例えば下の例に用いられている方法を用いて決定され得る。いくつかの態様において、インデル頻度を計算するために、インデルが生じる可能性があるウインドウの両側に隣接する２つの１０ｂｐ配列に対する正確な一致について、配列決定リードがスキャンされる。正確に一致するものが見つからない場合、リードは分析から除外される。このインデルウインドウの長さが参照配列と正確に一致する場合、リードはインデルを含まないものとして分類される。インデルウインドウが参照配列より２塩基以上長いかまたは短い場合、配列決定のリードはそれぞれ挿入または欠失として分類される。
【０３５８】
いくつかの態様において、ここに提供される塩基編集因子は、核酸のある領域におけるインデルの形成を限定することが可能である。いくつかの態様において、領域は、塩基編集因子によって標的化されるヌクレオチド、または塩基編集因子によって標的化されるヌクレオチドの２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド以内の領域である。いくつかの態様において、ここに提供される塩基編集因子のいずれかは、核酸のある領域におけるインデルの形成を、１％未満、１．５％未満、２％未満、２．５％未満、３％未満、３．５％未満、４％未満、４．５％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、または２０％未満に限定することが可能である。ある核酸領域において形成されるインデルの数は、核酸（例えば、細胞のゲノム中の核酸）が塩基編集因子に対して暴露される時間の量に依存し得る。いくつかの態様において、インデルの数または割合は、塩基編集因子に対する核酸（例えば、細胞のゲノム中の核酸）の暴露の少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１０日、または少なくとも１４日の後に決定される。
【０３５９】
本開示のいくつかの側面は、ここで提供される塩基編集因子のいずれかが、意図されない点変異などの意図されない変異の有意な数を生成することなしに、核酸（例えば、対象のゲノム中の核酸）中の点変異などの意図される変異を効率的に生成することができるという認識に基づく。いくつかの態様において、意図される変異は、意図される変異を創るように特異的に設計されたｇＲＮＡに結合した特異的な塩基編集因子によって生成する変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、疾患または異常に関連する変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、疾患または異常に関連するアデニン（Ａ）→グアニン（Ｇ）点変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、疾患または異常に関連するチミン（Ｔ）→シトシン（Ｃ）点変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、遺伝子のコード領域内のアデニン（Ａ）→グアニン（Ｇ）点変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、遺伝子のコード領域内のチミン（Ｔ）→シトシン（Ｃ）点変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、ストップコドン、例えば未成熟ストップコドンを遺伝子のコード領域内に創る点変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、ストップコドンを消去する変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、遺伝子のスプライシングを変改する変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、遺伝子の制御配列（例えば、遺伝子プロモーターまたは遺伝子リプレッサー）を変改する変異である。いくつかの態様において、ここで提供される塩基編集因子のいずれかは、１：１超である意図される変異対意図されない変異の比（例えば、意図される点変異：意図されない点変異）を生成することができる。いくつかの態様において、ここで提供される塩基編集因子のいずれかは、少なくとも１．５：１、少なくとも２：ｌ、少なくとも２．５：１、少なくとも３：ｌ、少なくとも３．５：１、少なくとも４：ｌ、少なくとも４．５：１、少なくとも５：１、少なくとも５．５：１、少なくとも６：１、少なくとも６．５：１、少なくとも７：１、少なくとも７．５：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１２：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも１５０：１、少なくとも２００：１、少なくとも２５０：１、少なくとも５００：１、もしくは少なくとも１０００：１、またはより多くである、意図される変異対意図されない変異の比（例えば、意図される点変異：意図されない点変異）を生成することができる。ここで「塩基編集因子効率」の項に記載されている塩基編集因子の性質が、ここで提供される融合蛋白質、または融合蛋白質を用いる方法のいずれかに適用され得るということは理解されるはずである。
【０３６０】
核酸を編集するための方法
本開示のいくつかの側面は、核酸を編集するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、核酸の核酸塩基（例えば、二本鎖ＤＮＡ配列の塩基対）を編集するための方法である。いくつかの態様において、方法は、ａ）核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ配列）の標的領域を、塩基編集因子（例えば、アデノシンデアミナーゼに融合したＣａｓ９ドメイン）およびガイド核酸（例えばｇＲＮＡ）を含む複合体と接触させ、標的領域が標的の核酸塩基対を含むステップと、ｂ）前記標的領域において鎖分離を誘導するステップと、ｃ）標的領域の単一鎖上の前記標的核酸塩基対の第１の核酸塩基を第２の核酸塩基に変換するステップと、ｄ）前記標的領域の１つの鎖だけを切るステップと、を含み、第１の核酸塩基に対して相補的な第３の核酸塩基が、第２の核酸塩基に対して相補的な第４の核酸塩基によって置き換えられる。いくつかの態様において、方法は、核酸中における２０％未満のインデル形成をもたらす。いくつかの態様においてステップｂが省かれるということは理解されるはずである。いくつかの態様において、第１の核酸塩基はアデニンである。いくつかの態様において、第２の核酸塩基は脱アミノ化されたアデニンまたはイノシンである。いくつかの態様において、第３の核酸塩基はチミンである。いくつかの態様において、第４の核酸塩基はシトシンである。いくつかの態様において、方法は、１９％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、４％、２％、１％、０．５％、０．２％未満、または０．１％未満のインデル形成をもたらす。いくつかの態様において、方法は、さらに、第４の核酸塩基に対して相補的である第５の核酸塩基によって第２の核酸塩基を置き換えることを含み、それによって、意図される編集された塩基対を生成する（例えば、Ａ：ＴからＧ：Ｃ）。いくつかの態様において、第５の核酸塩基はグアニンである。いくつかの態様においては、意図される塩基対の少なくとも５％が編集される。いくつかの態様においては、意図される塩基対の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％が編集される。
【０３６１】
いくつかの態様において、標的ヌクレオチド中の意図される産物対意図されない産物の比は、少なくとも２：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、もしくは２００：１、またはより多くである。いくつかの態様において、意図される点変異対インデル形成の比は、１：１、１０：１、５０：１、１００：１、５００：１、もしくは１０００：１超、またはより多くである。いくつかの態様において、切られる単一鎖（ニックが入る鎖）はガイド核酸にハイブリダイゼーションする。いくつかの態様において、切られる単一鎖は、第１の核酸塩基を含む鎖とは反対である。いくつかの態様において、塩基編集因子はＣａｓ９ドメインを含む。いくつかの態様において、第１の塩基はアデニンであり、第２の塩基はＧ、Ｃ、Ａ、またはＴではない。いくつかの態様において、第２の塩基はイノシンである。いくつかの態様において、第１の塩基はアデニンである。いくつかの態様において、第２の塩基はＧ、Ｃ、Ａ、またはＴではない。いくつかの態様において、第２の塩基はイノシンである。いくつかの態様において、塩基編集因子は、編集された鎖の塩基除去修復を阻害する。いくつかの態様において、塩基編集因子は、編集されない鎖を保護またはそれに結合する。いくつかの態様において、塩基編集因子はＵＧＩ活性を含む。いくつかの態様において、塩基編集因子は触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、塩基編集因子はニッカーゼ活性を含む。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対はＰＡＭ部位の上流である。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対は、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド上流である。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対はＰＡＭ部位の下流である。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対は、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド下流である。いくつかの態様において、方法はカノニカルな（例えばＮＧＧ）ＰＡＭ部位を要求しない。いくつかの態様において、核酸塩基編集因子はリンカーを含む。いくつかの態様において、リンカーは長さが１〜２５アミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは長さが５〜２０アミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸である。いくつかの態様において、標的領域は標的ウインドウを含み、標的ウインドウは標的核酸塩基対を含む。いくつかの態様において、標的ウインドウは１〜１０ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、標的ウインドウは長さが１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１ヌクレオチドである。いくつかの態様において、標的ウインドウは長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドである。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対は標的ウインドウ内にある。いくつかの態様において、標的ウインドウは、意図される編集された塩基対を含む。いくつかの態様において、方法は、ここで提供される塩基編集因子のいずれかを用いて行われる。いくつかの態様において、標的ウインドウは脱アミノ化ウインドウである。
【０３６２】
いくつかの態様において、本開示は、ヌクレオチドを編集するための方法を提供する。いくつかの態様において、本開示は、二本鎖ＤＮＡ配列の核酸塩基対を編集するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、ａ）二本鎖ＤＮＡ配列の標的領域を、塩基編集因子およびガイド核酸（例えばｇＲＮＡ）を含む複合体と接触させ、標的領域が標的核酸塩基対を含むこと、ｂ）前記標的領域において鎖分離を誘導すること、ｃ）標的領域の単一鎖上の前記標的核酸塩基対の第１の核酸塩基を第２の核酸塩基に変換すること、ｄ）前記標的領域の１つの鎖だけを切ること、を含み、第１の核酸塩基に対して相補的な第３の核酸塩基が、第２の核酸塩基に対して相補的な第４の核酸塩基によって置き換えられ、第２の核酸塩基が、第４の核酸塩基に対して相補的な第５の核酸塩基によって置き換えられ、それによって、意図される編集された塩基対を生成し、意図される編集された塩基対を生成する効率は少なくとも５％である。いくつかの態様においてステップｂが省かれるということは理解されるはずである。いくつかの態様においては、意図される塩基対の少なくとも５％が編集される。いくつかの態様においては、意図される塩基対の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％が編集される。いくつかの態様において、方法は、１９％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、４％、２％、１％、０．５％、０．２％未満、または０．１％未満のインデル形成を引き起こす。いくつかの態様において、標的ヌクレオチドにおける意図される産物対意図されない産物の比は、少なくとも２：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、もしくは２００：１、またはより多くである。いくつかの態様において、意図される点変異対インデル形成の比は、１：１、１０：１、５０：１、１００：１、５００：１、もしくは１０００：１超、またはより多くである。いくつかの態様において、切られる単一鎖はガイド核酸にハイブリダーゼーションする。いくつかの態様において、切られる単一鎖は、第１の核酸塩基を含む鎖とは反対である。いくつかの態様において、第１の塩基はアデニンである。いくつかの態様において、第２の核酸塩基はＧ、Ｃ、Ａ、またはＴではない。いくつかの態様において、第２の塩基はイノシンである。いくつかの態様において、塩基編集因子は編集された鎖の塩基除去修復を阻害する。いくつかの態様において、塩基編集因子は編集されない鎖を保護またはそれに結合する。いくつかの態様において、核酸塩基編集因子はＵＧＩ活性を含む。いくつかの態様において、塩基編集因子は触媒的に不活性なイノシン特異的ヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、核酸塩基編集因子はニッカーゼ活性を含む。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対はＰＡＭ部位の上流である。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対は、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド上流である。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対はＰＡＭ部位の下流である。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対は、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド下流である。いくつかの態様において、方法はカノニカルな（例えばＮＧＧ）ＰＡＭ部位を要求しない。いくつかの態様において、核酸塩基編集因子はリンカーを含む。いくつかの態様において、リンカーは長さが１〜２５アミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは長さが５〜２０アミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸である。いくつかの態様において、標的領域は標的ウインドウを含み、標的ウインドウは標的核酸塩基対を含む。いくつかの態様において、標的ウインドウは１〜１０ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、標的ウインドウは長さが１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１ヌクレオチドである。いくつかの態様において、標的ウインドウは長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドである。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対は、標的ウインドウ内に存在する。いくつかの態様において、標的ウインドウは意図される編集された塩基対を含む。いくつかの態様において、核酸塩基編集因子はここで提供される塩基編集因子のいずれか１つである。
【０３６３】
医薬組成物
本開示の他の態様は、ここに記載のアデノシンデアミナーゼ、融合蛋白質、または融合蛋白質−ｇＲＮＡ複合体のいずれかを含む医薬組成物に関する。ここで使用される用語「医薬組成物」は、医薬用途のために処方された組成物を指す。いくつかの態様において、医薬組成物は薬学的に許容可能な担体をさらに含む。いくつかの態様において、医薬組成物は追加の薬剤（例えば、特異的送達、半減期の延長、または他の治療用化合物用）を含む。
【０３６４】
ここで使用されるとき、用語「薬学的に許容可能な担体」は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、カルシウムまたは亜鉛ステアラート、ステアリン酸）などの薬学的に許容可能な材料、組成物またはビヒクル、または、化合物を身体の１つの部位（例えば送達部位）から別の部位（例えば器官、組織または身体の一部）に運搬または輸送することに関与する溶媒封入材料を意味する。薬学的に許容可能な担体は、製剤の他の成分と適合性であり、そして対象の組織に有害ではない（例えば、生理学的適合性、無菌性、生理学的ｐＨなど）という意味で「許容可能」である。薬学的に許容可能な担体として役立ち得る材料のいくつかの例は、以下を含む：（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（２）コーンスターチおよびポテトスターチなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルク等の潤滑剤；（８）カカオバター、座剤用ワックス等の賦形剤；（９）ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）ポリペプチドおよびアミノ酸などの増量剤；（２３）血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬなどの血清成分；（２２）エタノールなどのＣ２〜Ｃ１２アルコール；および（２３）医薬製剤に使用される他の非毒性適合性物質。湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐剤および酸化防止剤もまた製剤中に存在することができる。用語「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容可能な担体」などは、ここでは互換的に使用される。
【０３６５】
いくつかの態様において、医薬組成物は、例えば遺伝子編集のために、対象に送達するために製剤化される。ここに記載の医薬組成物の好適な投与経路は、限定されないが、局所、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、歯内、蝸牛内、経鼓室、臓器内、硬膜外、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼周囲、腫瘍内、脳内、および脳室内の投与を含む。
【０３６６】
いくつかの態様において、ここに記載の医薬組成物は罹患部位（例えば腫瘍部位）に局所投与される。いくつかの態様において、ここに記載の医薬組成物は、注射によって、カテーテルによって、座薬によって、またはインプラントによって対象に投与され、インプラントは多孔性、非多孔性、またはゼラチン状材料であり、シアラスティック膜などの膜、または繊維を含む。
【０３６７】
他の態様において、ここに記載の医薬組成物は制御された放出システムで送達される。一態様において、ポンプを使用することができる（例えば、Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照）。別の態様において、ポリマー材料を使用することができる。（例えば、Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照。またLevy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105も参照。）他の制御された放出系は、例えば、上記のLangerに論じられている。
【０３６８】
いくつかの態様において、医薬組成物は、対象、例えばヒトへの静脈内または皮下投与に適した組成物として日常的な手順に従って製剤化される。いくつかの態様において、注射による投与のための医薬組成物は、滅菌等張水性緩衝の溶液である。必要に応じて医薬は、可溶化剤、および、注射部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬も含み得る。一般に、成分は別々に供給されるか、または例えば活性薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器中の乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物などの単位剤形として一緒に混合されて供給される。医薬を注入により投与する場合、滅菌医薬品グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルを用いて投薬することができる。医薬組成物を注射により投与する場合、成分を投与前に混合することができるように、注射用滅菌水または食塩水のアンプルを提供することができる。
【０３６９】
全身投与用の医薬組成物は、液体、例えば、無菌食塩水、乳酸加リンガー液またはハンクス液であり得る。さらに、医薬組成物は固体形態であり、使用直前に再溶解または懸濁することができる。凍結乾燥形態もまた企図される。
【０３７０】
医薬組成物は、非経口投与にも適している、リポソームまたは微結晶などの脂質粒子またはベシクル内に含有させることができる。粒子は、組成物がその中に含まれている限り、単層または多層などの任意の好適な構造であり得る。 化合物は、フソジェニック脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、低レベル（５〜１０モル％）のカチオン性脂質を含有する「安定化プラスミド−脂質粒子」（ＳＰＬＰ）中に捕捉され、そしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングによって安定化され得る（Zhang Y. P. et al., Gene Ther. 1999, 6:1438-47）。Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルサルフェート、または「ＤＯＴＡＰ」などの正荷電脂質は、かかる粒子およびベシクルに特に好ましい。かかる脂質粒子の調製はよく知られている。例えば、米国特許第4,880,635号；第4,906,477号；第4,911,928号；第4,917,951号；第4,920,016号；および第4,921,757号を参照。これらのそれぞれは、参照によりここに組み込まれる。
【０３７１】
ここに記載の医薬組成物は、例えば単位用量として投与または包装することができる。本開示の医薬組成物に関して使用される場合の用語「単位用量」は、対象に対する単位投与量として好適な物理的に別々の単位を指し、各単位は、必要な希釈剤、すなわち、担体またはビヒクルに関連して、所望の治療効果を生じるように計算された既定量の活性材料を含む。
【０３７２】
さらに、医薬組成物は、（ａ）凍結乾燥形態の本発明の化合物を含有する容器、および（ｂ）注射用の薬学的に許容可能な希釈剤（例えば、滅菌水）を含有する第２の容器を含む医薬キットとして提供され得る。薬学的に許容可能な希釈剤は、本発明の凍結乾燥化合物の再構成または希釈に使用することができる。かかる容器（単数または複数）に任意に付随するのは、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知であり得、同通知は、人的管理のための製造、使用、または販売の機関による承認を反映する。
【０３７３】
別の態様において、上記の疾患の処置に有用な材料を含む製品が含まれる。いくつかの態様において、製品は容器およびラベルを含む。好適な容器は、例えば、瓶、バイアル、注射器、および試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。いくつかの態様において、容器は、ここに記載の疾患を処置するのに有効であり、無菌アクセスポートを有してもよい組成物を保持する。例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る。組成物中の活性剤は本発明の化合物である。いくつかの態様において、容器上のまたは容器に付随するラベルは、組成物が選択した疾患を処置するために使用されることを示す。製品はさらに、リン酸緩衝食塩水、リンガー液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容可能な緩衝液を含む第２の容器を含み得る。それはさらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器、および使用のための指示とともに添付文書を含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料を含み得る。
【０３７４】
キット、ベクター、細胞
本開示のいくつかの態様は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子中のアデノシンを脱アミノ化することが可能なアデノシンデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを含むキットを提供する。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、ここに提供されているアデノシンデアミナーゼのいずれかをコードする。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列はアデノシンデアミナーゼの発現を駆動する異種プロモーターを含む。
【０３７５】
本開示のいくつかの態様は、（ａ）アデノシンデアミナーゼに融合したｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９ドメイン）、またはｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９ドメイン）およびここに提供されるようなアデノシンデアミナーゼを含む融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列；および（ｂ）（ａ）の配列の発現を駆動する異種プロモーターを含む核酸コンストラクトを含むキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、ガイド核酸バックボーン（例えば、ガイドＲＮＡバックボーン）をコードする発現コンストラクトをさらに含み、同コンストラクトは、標的配列と同一または相補的な核酸配列のガイド核酸（例えばガイドＲＮＡバックボーン）へのクローニングを可能にするように位置するクローニング部位を含む。
【０３７６】
本開示のいくつかの態様は、ここに提供されるアデノシンデアミナーゼ、融合蛋白質、または複合体のいずれかを含む細胞を提供する。いくつかの態様において、細胞は、ここに提供されるアデノシンデアミナーゼまたは融合蛋白質のいずれかをコードするヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、細胞は、ここに提供されているヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む。
【０３７７】
上記のレポーターシステムの例示的な態様の説明は、例示目的でのみ提供されており、限定的であることを意味していない。追加のレポーターシステム、例えば、上に詳細に記載されている例示的なシステムの変形形態もまた、本開示に包含される。
【０３７８】
しかしながら、本開示および当技術分野における知識に基づいて、さらなる融合蛋白質が当業者に明らかとなることを理解されたい。
【０３７９】
本発明のこれらおよび他の態様の機能および利点は、以下の例からさらに十分に理解されるであろう。以下の例は、本発明の利点を説明することおよび特定の態様を説明することを意図しているが、本発明の全範囲を例示することを意図していない。したがって、例は本発明の範囲を限定することを意味しないことが理解されるだろう。
【０３８０】
例
以下の例に提供されるデータは、ＤＮＡの文脈でアデノシンの加水分解的脱アミノ化（グアニン（Ｇ）のように塩基対を形成するイノシンを形成）を触媒することが可能な塩基編集因子の操作を説明する。ＤＮＡに作用する既知の天然に存在するアデノシンデアミナーゼは存在しない。代わりに、既知のアデノシンデアミナーゼはＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に作用する。最初のデオキシアデノシンデアミナーゼは、ＤＮＡ基質を受け入れそしてデオキシアデノシン（ｄＡ）をデオキシイノシンに脱アミノ化するために進化した。一例として、ＤＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼを操作するために、Escherichia coli由来のｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）（ＴａｄＡ、ｔＲＮＡアデノシンデアミナーゼＡ）を用いて進化実験を行った。簡単に説明すると、ｅｃＴａｄＡをｄＣａｓ９ドメインに共有的に融合させ、この融合物のライブラリーをコンストラクトのデアミナーゼ部分に変異を含ませて組み立てた。下記の進化実験において、ｅｃＴａｄＡにおけるいくつかの変異は、ｅｃＴａｄＡがＤＮＡ中のアデノシンを脱アミノ化する能力を改善することが見出された。
【０３８１】
例１−アデノシン塩基編集因子の進化（進化＃１）
アデノシン塩基編集因子（ＡＢＥ）の進化は、編集因子のｅｃＴａｄＡ部分のみで変異誘発されたエラープローンＰＣＲを介してｅｃＴａｄＡ−ＸＴＥＮ−不活性型Ｃａｓ９コンストラクト（ｐＮＭＧ−１０４）のライブラリーを作製することによって達成された。抗生物質選択プラットフォームを使用するために、ＤＮＡに対するＡからＩへの脱アミノ化（ＡからＧへの復帰）を触媒することが可能な編集因子の選択を選択した。進化の第１のラウンド（進化＃１）では、アデノシン塩基編集因子（ＡＢＥ）ライブラリーを、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の活性部位変異を標的とするｇＲＮＡと共発現させた。これは、クロラムフェニコール選択培地におけるアセチルトランスフェラーゼ活性の回復およびその後の生存のためにＡからＧへの復帰を必要とする。選択プラスミドをＡＢＥライブラリーと共にＳ１０３０宿主株に同時形質転換する。進化＃１を実施し、変異Ｄ１０８ＮおよびＡ１０６Ｖを、ＤＮＡ上でＡからＧへの復帰を可能にする２つの変異として同定した。Ｄ１０８Ｎ変異は、Ａ１０６Ｖよりも効率的にＤＮＡのＡからＧへの復帰を誘導した。S. aureus ＴａｄＡを用いた配列アラインメント研究は、残基Ｄ１０８が野生型ｔＲＮＡ基質中のリボース糖の２’ＯＨとのＨ結合接触に関与することを明らかにした。ＤＮＡでは、この３’ＯＨは３’Ｈに置き換えられる。
【０３８２】
野生型アデノシンデアミナーゼおよびＡからＧへのデアミナーゼ
Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞への様々なＡからＧへのデアミナーゼ融合物（＋ＸＴＥＮ−ｎＣａｓ９）のトランスフェクションは、標的部位でＡからＧへのＳＮＰを引き起こさなかった。６つの異なる部位を標的としたが、野生型アデノシンデアミナーゼＣａｓ９融合物はいずれもＤＮＡ中に観察可能なＡからＧへの改変を生じなかった。ＢＥ３（ｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ）を陽性対照として用いた。以下の野生型デアミナーゼ−ｎＣａｓ９融合体を試験した：ＡＤＡＲ（ｍＲＮＡに作用）、ＡＤＡ（デオキシアデノシンに作用）、およびＡＤＡＴ（ｔＲＮＡに作用）（図１）。
【０３８３】
ＤＮＡに作用するＡからＧへのデアミナーゼを開発した。まず、抗生物質選択プラスミドを開発した。このプラスミドでは、抗生物質耐性遺伝子の活性部位残基の回復（ＡからＧへの復帰）により、宿主の抗生物質攻撃に対する耐性が得られた。高コピープラスミド（ＲＳＦ１０３０）を構築した。それは、野生型アミノ酸へのＳＴＯＰ復帰（Ｋａｎ）または活性部位残基回復（Ｃｈｌｏｒ）のいずれかを必要とした。具体的には、鋳型鎖上で、ＳＴＯＰはグルタミン酸に戻る必要があったか（Ｋａｎ）、またはチロシンがヒスチジン（カチオン性残基）に戻る必要があった（Ｃｈｌｏｒ）（図２）。
【０３８４】
最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、選択プラスミドによって決定した。ＡからＩへの選択プラスミドをＳ１０３０で増殖させ、様々な濃度のクロラムフェニコール上にプレーティングした。ＭＩＣは約１μｇ／ｍＬであることがわかった。Ｓ１０３０細胞（宿主株）中の選択プラスミドの段階希釈物を漸増濃度のｃｈｌｏｒ上にプレーティングした（図３）。１μｇ／ｍＬを超えるｃｈｌｏｒ濃度で生存するライブラリーメンバーを含む細胞は、ヒットの可能性があると考えた。
【０３８５】
陽性対照としてｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９コンストラクトを使用して、クロラムフェニコール（Ｃｈｌｏｒ）選択をさらに検証した。次いで、８μｇ／ｍＬの濃度で生存したコロニーの配列決定を行い、ＣからＴへの復帰をＤＮＡ中に観察した（図４）。アッセイは、選択プラスミドおよびデアミナーゼ融合を有する細胞をＯＤ６００ｎｍ〜０．３まで増殖させ、次いで終夜融合発現を誘導することによって行った。次いで、得られた培養物を漸増濃度のクロラムフェニコール上にプレーティングし、所望のＤＮＡ復帰をスクリーニングした。
【０３８６】
次いで、ＡからＩへのデアミナーゼライブラリーを生成した。ＰｒｅＣＲ対ＵＳＥＲ、エレクトロポレーション対化学組成物、ヌクレオフェクション対エレクトロポレーション、伸長時間、ＳＯＣ対ＤＲＭ、およびサブクローニング対直接形質転換を含む最適化されたアセンブリ／ライブラリー生成条件を調べた。ライブラリーのアセンブリ／エレクトロポレーション条件を最適化した後、次の２つのライブラリーを作製した：ＡＰＯＢＥＣ−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９およびＡＤＡＴ−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９。計算されたコロニー形成単位（ＣＦＵ）に基づいて、平均ライブラリーサイズは２〜４×１０６塩基であった。ＡＰＯＢＥＣ−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９ライブラリーは有用なヒットを生まなかった。ＡＤＡＴ−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９ライブラリーは成功した。使用されたＡＤＡＴは、E. coli中のＴａｄＡ（切断型）であった。
【０３８７】
デアミナーゼライブラリーのアーキテクチャ
デアミナーゼ−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９融合体は、クロロアムフェニコール部位を標的とするためのＳＣ１０１バックボーンおよびｇＲＮＡ（ｌａｃプロモーター）を含む（図５）。デアミナーゼのみをエラープローンＰＣＲに供し、アセンブリを２ピースのＰｒｅＣＲ（改変されたＵＳＥＲプロトコル）である。ｇＲＮＡはｌａｃプロモーターによって駆動し、Ｃｈｌｏｒ活性部位を標的にする。ＡからＧへの復帰は、Ｈｉｓ活性部位（チロシンからヒスチジンへの復帰）を回復するためにプロトスペーサーの９位に必要である。修復は必要であり、鋳型鎖を標的とする。ＡＰＯＢＥＣ／ＣＤＡを陽性対照として用いた。ＡからＩへのコンストラクトは以下のものを含んだ：ｍＡＤＡ、ＡＤＡＲ１、およびＡＤＡＴ２。
【０３８８】
ＴａｄＡ−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９ライブラリーも構築した。ＴａｄＡ酵素についてエラープローンＰＣＲのみを使用した。最適化されたプロトコルを使用し、得られたコンストラクトをサブクローニングした。Ｓ１０３０細胞（選択プラスミドを有する）をＴａｄＡ＊−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９ランダム化ライブラリーで形質転換した。蛋白質発現を回復期の後に誘導した。次の日に、ライブラリーを漸増濃度のクロラムフェニコール（０．５、１、２、および４μｇ／ｍＬ）上に別々の２４×２４ｃｍプレートにプレーティングし、終夜インキュベートした。ＴａｄＡ（ｗｔ）−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９を陰性対照として使用した。コロニーは４つのプレートすべてで増殖し、濃度が増加するにつれて、観察されるコロニーは少なくなった。陰性対照は、ライブラリーメンバーを有するプレートよりはるかに少ないコロニーを有した。８つの選択プラスミドを配列決定し、すべてのプラスミドが標的部位にＡからＧへの復帰を含んでいた。全部で１２０のコロニーをＰＣＲ増幅し、次いで配列決定した。第１ラウンドの配列決定の結果を図６に示す。ＡからＧへの復帰を有する選択プラスミドの例示的な配列を図７に示す。標的は鋳型鎖のＡからＧである（コードにおいてＴからＣとして観察される）。例は、サンガートレースで約５０％の復帰を示す（ＹからＨ）。
【０３８９】
残基Ｄ１０８での収束を観察した（図８）。E. coli ＴａｄＡの結晶図を図９に示す。図中のＤ１１９は、残基番号が相殺されているためＤ１０８である。その残基に多くの変異が生じることがわかった。図１０は、ＴａｄＡ（S. aureus）の結晶構造を示し、配列をE. coliのそれとアラインメントさせる。ｅｃＴａｄＡ残基１０８はS. aureus ＴａｄＡ残基１０４に相当し、これは２’ＯＨのリボース糖との重要なアスパラギン水素結合の一部である。
【０３９０】
進化実験で使用される選択プラスミドは、アデノシン塩基編集因子によって標的とされる様々な抗生物質耐性遺伝子に変異を含む。下記は、それぞれの抗生物質に対する耐性を回復するのに必要とされる標的アデニンが太字および下線で示されている、様々な抗生物質耐性遺伝子（配列番号４４１〜４４４）の標的配列である。使用したプラスミドは、ＲＳＦ１０３０起源を有する高コピープラスミドであった。
【化１４６】
2019536425.tif 000359
【０３９１】
哺乳動物コドン最適化コンストラクトは、遺伝子ブロックとしてIntegrated Dna Technologies（ＩＤＴ）からのｅｃＴａｄＡの哺乳動物コドン最適化バージョンを注文することによって作製した。この遺伝子ブロックを用いてｐＮＭＧ−１４２を作製し、これはその後のすべての哺乳動物コドン最適化コンストラクトの鋳型として役立った。表４を参照。様々な進化のラウンドから変異を同定した後、所望の変異（単数または複数）を哺乳動物コンストラクトに導入するために、プライマーを設計し、順序付けた。
【０３９２】
ｅｃＴａｄＡの進化およびチャレンジ
ｅｃＴａｄＡの進化からの個々のコンストラクトを単離し、チャレンジした。１６個のクローンをサブクローニングしたところ、第１ラウンドの進化がもたらされた。１６個のクローンのそれぞれを、選択プラスミドを用いてＳ１０３０細胞中で形質転換し、漸増用量のクロラムフェニコールでチャレンジした。同じ部位でＣからＴへの復帰を有するｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９を対照として使用した。結果を図１１および１２に示す。図１２は漸増濃度のクロラムフェニコールにチャレンジした様々なコンストラクトのＣ．Ｆ．Ｕ．を示す。コンストラクト３および４は、アッセイの条件下で最もよく機能した。Ｄ１０８Ｎは重要な変異である。
【０３９３】
ｅｃＴａｄＡの残基Ｄ１０８に変異を有する塩基編集因子は、アデニンの加水分解的脱アミノ化を介してＤＮＡ中にアデニンからグアニンへの変異を生成することが可能であり、これはアデニン部位でのイノシン形成をもたらす。イノシンは、ＤＮＡポリメラーゼによるグアニンとしてのリードである。図１８〜２２、および１２９〜１３９を参照。これらは、Ｈｅｋ２（図１９、２０、および１２９）、Ｈｅｋ２−１（図１３０）、Ｈｅｋ２−２（図１３１）、Ｈｅｋ２−３（図１３２）、Ｈｅｋ２−４（図１３３）、Ｈｅｋ２−６（図１３４）、Ｈｅｋ２−９（図１３５）、Ｈｅｋ２−１０（図１３６）、ＲＮＦ２（図１３８）、ＦＡＮＣＦ（図１３９）、ＥＭＸ１（図２１）、およびＨｅｋ３（図２２および１３７）などの、様々な標的ＤＮＡ配列中のＤＮＡにおいてアデニンからグアニンへの変異を生成する様々な塩基編集因子の能力を示す。これらの実験では、Ａ１０６Ｖ変異の追加がさらに効率を改善することで、Ｄ１０８Ｎ変異は、ＡからＧへの変異を生成するために最も効率的である。さらに、塩基編集因子は、試験した他のどの部位よりも効率的にＡからＧへの変異をＨｅｋ２部位で生成した。図中、ＢＥ３およびＢＥ２は、ＣからＧへの変異を誘導し、ＣからＧへの塩基編集のための陽性対照として作用する塩基編集因子を指す。
【０３９４】
以下により詳細に記載されている第２ラウンドの進化を行った。Ｄ１０８Ｎ変異を含むコンストラクトをランダム化した（プラスミドＮＭＧ−１２８）。選択アッセイを繰り返し、クローンを高濃度のクロラムフェニコールでチャレンジした。得られた材料をサブクローニングし、選択アッセイを繰り返した。次いで、高濃度のクロラムフェニコールで生存した得られたコロニーを配列決定した。位置Ｅ１５５での変異の濃縮を観察した（図１３）。
【０３９５】
哺乳動物細胞におけるＡからＧへの編集
ＡからＧへの編集を哺乳動物（Ｈｅｋ２９３Ｔ）細胞で調べた。図１４に示されるように、（ＡからＧへの）編集は、種々の進化したｅｃＴａｄＡコンストラクトにおいて生じたが、それは陰性対照においては生じなかった。ここに記載される実験において使用したコンストラクト（例えば、進化＃１〜＃７）を表４に示す。表４は、コンストラクト名、コンストラクト構造、およびｅｃＴａｄＡ変異を含む。表４において、ｐＣＭＶはコンストラクトを含む発現ベクターを指す。ｅｃＴａｄＡは、配列番号１のｅｃＴａｄＡを指すが、２つのｅｃＴａｄＡ配列を含むコンストラクトについては、第２（Ｃ末端から第１のｅｃＴａｄＡへの）ｅｃＴａｄＡ配列はＮ末端メチオニンを含まない。表４はまた、配列番号１と比較したｅｃＴａｄＡ中の変異を列挙する。２つのｅｃＴａｄＡドメインが存在するとき、両方のｅｃＴａｄＡドメイン中の変異は最初に示されるＮ末端ｅｃＴａｄＡと共に示される。２４ａ．ａ．のリンカーは、アミノ酸配列
【化１４７】
2019536425.tif 000360
を指し、３２ａ．ａ．のリンカーは、アミノ酸配列
【化１４８】
2019536425.tif 000361
を指し、４０ａ．ａ．のリンカーは、アミノ酸配列
【化１４９】
2019536425.tif 000362
を指し、６４ａ．ａ．のリンカーはアミノ酸配列
【化１５０】
2019536425.tif 000363
を指し、そして９２ａ．ａ．のリンカーは、アミノ酸配列
【化１５１】
2019536425.tif 000364
を指す。
【表４−１】
2019536425.tif 000365
【表４−２】
2019536425.tif 000366
【表４−３】
2019536425.tif 000367
【表４−４】
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【表４−５】
2019536425.tif 000369
【表４−６】
2019536425.tif 000370
【表４−７】
2019536425.tif 000371
【表４−８】
2019536425.tif 000372
【表４−９】
2019536425.tif 000373
【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【表４−１３】
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【表４−１４】
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【０３９６】
例２−ｅｃＴａｄＡのＤ１０８Ｎ変異を含むアデノシン塩基編集因子の進化（進化＃２）
Ｄ１０８Ｎ（ｐＮＭＧ−１２８）変異を有するｅｃＴａｄＡコンストラクトを進化＃１におけるようにエラープローンＰＣＲを介して変異誘発し、このライブラリーを同じクロラムフェニコール部位に対して選択したが、高濃度のクロラムフェニコールは選択の厳密性を高めるための選択培地に使用した。この選択のラウンドは、ＡＢＥの編集効率を改善する２つの新しい変異：Ｄ１４７ＹおよびＥ１５５Ｖを生じた。
【０３９７】
第１ラウンドの進化において、エラープローンＰＣＲを、ｅｃＴａｄＡ−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９融合コンストラクトのｅｃＴａｄＡデアミナーゼ部分について行い、続いてＵＳＥアセンブリを行い、ｅｃＴａｄＡ−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９変異体（デアミナーゼ部分でのみ変異）のライブラリーを作製した。これらのライブラリーメンバーを、クロラムフェニコール耐性遺伝子の活性部位部分に単一のＧからＡへの点変異を含む選択プラスミドを含むＳ１０３０細胞に形質転換した。細胞を終夜培養し、選択プラスミドを有するＳ１０３０細胞のＭＩＣよりも高い濃度のクロラムフェニコール上にプレーティングした。生き残ったコロニーをサブクローニングし、選択条件下で再チャレンジし、次いで生産的変異体の遺伝子型を同定するために配列決定した。サンガー配列決定分析は、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１０８Ｖ、およびＤ１０８Ｇ変異が所望の表現型（ＤＮＡ中のＡからＧへの遷移変異）を付与することを明らかにした。進化のこの第１ラウンドから単離された個々のクローンに関するその後の研究は、Ｄ１０８Ｎ変異がこの部位における最適な置換であることを実証した。
【０３９８】
第２ラウンドの進化は、Ｄ１０８Ｎ変異を含むｅｃＴａｄＡを進化させることによって行った（第１ラウンドの進化から同定された、図１１（ｐＮＭＧ−１２８）に列挙されているような、コンストラクト３、クローン５を参照）。ｐＮＭＧ−１２８も「ヒッチハイカー」変異である変異Ｈ８ＹおよびＮ１２７Ｓを含む。得られたライブラリーの進化したクローンを、３２、６４および１２８μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールでチャレンジした（１、２および４μｇ／ｍＬの第１ラウンドの進化よりも高い厳密性）。３２、６４および１２８μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールで生存したクローンをサブクローニングおよび再プレーティングし、この濃縮物からの個々のクローンを単離してアッセイした、各コンストラクトのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数、ｐＮＭＧ−１２８およびｐＮＭＧ １４９を、種々のクロラムフェニコールの濃度で図１７に示す。高い厳密性の条件での第２ラウンドの進化は、図１６にハイライトされている、ｅｃＴａｄＡのＤ１４７およびＥ１５５に高頻度の変異をもたらした。
【０３９９】
図２３〜２７は、編集因子を様々な遺伝子座に向けるためにｇＲＮＡを使用する、様々なＡＢＥコンストラクトのＨｅｋ２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションの結果を示す。図２３は、Ｈｅｋ−２でのｐＮＭＧ−１６４、１７１、１７２、および１７３の編集を示す。図２４は、Ｈｅｋ−２でのＮＭＧ−１７４−１７７編集を示す。図２５は、Ｈｅｋ−２でのｐＮＭＧ １４３、１４４、１６４、１７７編集を示す。図２６は、Ｈｅｋ−２でのｐＮＭＧ−１６４、ｐＮＭＧ−１７７、ｐＮＭＧ−１７８、ｐＮＭＧ−１７９、およびｐＮＭＧ−１８０編集を示す。図２７は、Ｈｅｋ−２でのｐＮＭＧ−１６４、１７７−１８０編集を示す。
【０４００】
図２８〜４５に関して、Ｄ１０８に変異を含むｅｃＴａｄＡの哺乳動物コドン最適化コンストラクト（いくつかの場合、変異は以下を含む：Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１０８Ｇ、Ｄ１０８Ｖ）を使用して、進化の第１ラウンドで同定されたＤ１０８変異が哺乳動物細胞におけるＡからＧへの復帰も触媒するかどうかを調べた。コンストラクトｐＮＭＧ−１４２〜１４７をＨｅｋ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、Ｈｅｋ−２部位の位置＃５において最大量のＡからＧへの編集効率を示し、任意の他の部位ではアデニンの編集は低から無であった。標的とされた例示的なＤＮＡ配列は、ＨＥｋ２（配列番号４１）、Ｈｅｋ３（配列番号４２）、Ｈｅｋ４（配列番号４３）、ＲＮＦ２（配列番号４４）、ＦＡＮＣＦ（配列番号４５）、およびおよびＥＭＸ１（配列番号４６）として以下に記載される。その後の実験および進化により編集効率が向上し、編集ウインドウは一般にプロトスペーサーの４〜６位におよび周囲の「ＹＡＣ」の配列と共に生じることを確認した。ここで、「Ｙ」はピリミジン（ＴまたはＣ）塩基であり、下の配列中の下線を引いたヌクレオチドはＰＡＭ配列である。以下に示されるＨｅｋ２配列（配列番号４１）については、プロトスペーサー位置は右から左に向かって１〜２０として示される。Ｈｅｋ２部位でのプロトスペーサーの５位はＴであり、これはここに記載のアデノシンデアミナーゼのいずれかによって編集され得るＡとは反対側のものである。以下に示されるＨｅｋ３、Ｈｅｋ４ ＲＮＦ２、ＦＡＮＣＦおよびＥＭＸ１配列（配列番号４２〜４６）については、プロトスペーサー位置は左から右に向かって１〜２０として示される。これらの配列について、Ｈｅｋ３部位（配列番号４１）の６位のＡなどの１以上のアデニン（Ａ）は、ここに記載のアデノシンデアミナーゼのいずれかによって編集され得る。ｐＮＭＧ−１４２（ｎＣａｓ９に融合した野生型ｅｃＴａｄＡ）のトランスフェクションは観察可能な量の編集をもたらさず、指向進化実験から生じる変異の実施の重要性および必要性を強調していることに留意すべきである。
例で使用される標的配列は以下に提供される（ＰＡＭ配列は太字で下線が引かれている）：
【化１５２】
2019536425.tif 000379
【化１５３】
2019536425.tif 000380
【０４０１】
イノシンからアデニンへの復帰を阻害するドメインを用いたアデノシン塩基編集因子の操作
例えば内因性ｈＡＡＧ活性の結果として、イノシンのアデニンへの復帰を阻止することは、塩基編集効率を改善し得ると仮定された。したがって、触媒不活性型アルキルアデノシングリコシラーゼをＡＢＥ編集因子のＣ末端に付加することの効果を調べるために実験を行った。これらのトランスフェクションにおける塩基編集因子３（ＢＥ３）は、ＣからＧへの塩基編集のための陽性対照として働き、ｐＮＭＧ−１４２は陰性対照であり、ｐＮＭＧ−１４３は進化ラウンド＃１コンストラクトであり、ｐＮＭＧ−１４４（Ｄ１０８Ｎ）は別の進化ラウンド＃１コンストラクト（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ）である。ｐＮＭＧ−１５６コンストラクト中の変異はすべて、第１ラウンドのｅｃＴａｄＡ細菌進化から生じる最高頻度のアンプリコンから同定された変異である（「ヒッチヒッカー」変異を含む）。ヒッチハイカー変異は、進化実験で同定された変異を指すが、アデノシン塩基編集に大きな影響はない可能性がある。ヒッチハイカー変異を同定するための方法は、復帰分析を行い、次いで変異が塩基編集に影響を与えるかどうかを決定するためにコンストラクトを再アッセイすることである。ｐＮＭＧ−１５６は、Ｃ末端ＵＧＩを含む、哺乳動物コドン最適化バージョンのｐＮＭＧ−１２８（選択において単離された細菌ベクターＩ）である。ｐＮＭＧ−１６０は触媒不活性型ＡＡＧ（Ｅ１２５Ｑ）を有するｐＮＭＧ−１４３と同等であり、ｐＮＭＧ−１６１は触媒不活性型エンドＶ（Ｄ３５Ａ）を有するｐＮＭＧ−１４３である。変異Ｅ１２５ＱおよびＤ３５Ａは、それぞれ触媒的に不活性なＡＡＧおよびエンドＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）における変異に対応する。ｐＮＭＧ−１６２は、それがＵＧＩを含まないことを除いて、ｐＮＭＧ−１５６と同じコンストラクト構造をとる。標的配列、ＨＥｋ２（配列番号４１）、Ｈｅｋ３（配列番号４２）、Ｈｅｋ４（配列番号４３）、ＲＮＦ２（配列番号４４）、ＦＡＮＣＦ（配列番号４５）、およびＥＭＸ１（配列番号４６）中のアデノシンを脱アミノ化するこれらのコンストラクトの能力をそれぞれ図２８〜３３に示す。概して、試験したコンストラクトについて、ｅｃＴａｄＡおよびＣａｓ９ドメインへのＵＧＩ、ＡＡＧ（Ｅ１２５Ｑ）、またはＥｎｄｏＶ（Ｄ３５Ａ）Ｃ末端の組み込みは、アデノシンからグアニンへの変異を起こす塩基編集因子の効率の有意な増加をもたらさないことがわかった。
【０４０２】
Ｃａｓ９ドメインに対するアデノシンデアミナーゼドメインの配置
アデノシン塩基編集因子におけるＣａｓ９ドメインに対するアデノシンデアミナーゼドメイン（例えば、ｅｃＴａｄＡ）の配置を試験した。例えば、Ｃａｓ９ドメインに対するアデノシンデアミナーゼのＮ末端またはＣ末端の配置が塩基編集効率に影響を与えるかどうかを試験した。さらに、ｅｃＴａｄＡの進化＃１およびｅｃＴａｄＡの進化＃２からの変異を含む実験を比較した。図３４〜３９を参照。一般に、進化＃２で同定された変異は進化＃１で同定されたＡＢＥ編集因子の編集効率を改善した。さらに、アデノシンデアミナーゼがＣａｓ９にＮ末端で配置されているとき、アデノシン塩基編集因子は活性（変異アデニンからグアニンへ）があることがわかった。アデノシンデアミナーゼがＣａｓ９にＣ末端で配置されているアデノシン塩基編集因子コンストラクトは、アデニンからグアニンへの観察可能な編集をほとんどまたは全く示さなかった。
【０４０３】
以下のＡＢＥコンストラクトをＨｅｋ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした；ｐＮＭＧ−１４２、陰性対照として機能（ｅｃＴａｄＡに変異なし）；ｐＮＭＧ−１４３（ｅｃＴａｄＡはＤ１０８Ｎ変異を有する）、ｐＮＭＧ−１４４（ｅｃＴａｄＡはＡ１０６Ｖ変異、およびＤ１０８Ｎ変異を有する）、およびｐＮＭＧ−１６４（ｅｃＴａｄＡはＤ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異を有する）。これらのコンストラクトは、進化＃１からの変異を有する哺乳動物コドン最適化コンストラクトであった。コンストラクトｐＮＭＧ−１７１は、ｐＮＭＧ−１７２〜ｐＮＭＧ−１７６のＣ末端ＴａｄＡ融合コンストラクトの対照として役立ち、これは種々のｅｃＴａｄＡ変異を含む。ｐＮＭＧ−１７１はｎＣａｓ９へのＣ末端野生型ｅｃＴａｄＡ融合を含み、一方ｐＮＭＧ−１７２〜１７６は進化＃１から同定されたＴａｄＡにおける変異を含む。ｐＮＭＧ−１７７およびｐＮＭＧ−１７８は、進化＃２から同定された変異を有する２つの哺乳動物コドン最適化プラスミドを表し、ここでｐＮＭＧ−１７８はＵＧＩドメインを含む。ｐＮＭＧ−１７９およびｐＮＭＧ−１８０はｐＮＭＧ−１７７と同じであるが、それぞれＣ末端触媒不活性型のＡＡＧ（Ｅ１２５Ｑ）、およびＵＧＩドメインが付加されている。標的配列、ＨＥｋ２（配列番号４１）、Ｈｅｋ３（配列番号４２）、Ｈｅｋ４（配列番号４３）、ＲＮＦ２（配列番号４４）、ＦＡＮＣＦ（配列番号４５）、およびＥＭＸ１（配列番号４６）中のアデノシンを脱アミノ化するこれらのコンストラクトの能力をそれぞれ図３４〜３９に示す。
【０４０４】
一般に、Ｃ末端とは対照的に、アデノシンデアミナーゼ（ｅｃＴａｄＡ）Ｎ末端をＣａｓ９に融合させると、アデニンのより効率的な塩基編集がもたらされることがわかった。変異Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖを含むｅｃＴａｄＡは、進化＃１および進化＃２で試験された他のｅｃＴａｄＡ変異よりも良好に機能した（例えば、アデニンをより効率的に編集した）こともわかった。さらに、試験したコンストラクトについて、これらのコンストラクト中にＵＧＩまたはＡＡＧ（Ｅ１２５Ｑ）を組み込んでも、アデノシンからグアニンへの変異を生成する塩基編集因子の効率の有意な増加をもたらさないことがわかった。
【０４０５】
図４０に示されるトランスフェクション実験は、４つの重要なポイントを決定するために行った：１つ目は、ｅｃＴａｄＡがガイドのＲＮＡ中のＡを脱アミノ化することによってｇＲＮＡ／Ｃａｓ９結合に干渉するかどうか；２つ目は、進化したデアミナーゼとＣａｓ９との間の短いリンカー（GGSのみ）または長いリンカー（配列番号２に対応する（SGGS）２−ＸＴＥＮ−（SGGS）２）（（SGGS）２））がウインドウサイズおよび／またはＡＢＥの全体的な編集効率に影響を及ぼすかどうか；３つ目は、進化したｅｃＴａｄＡの二量体化がＡＢＥ編集効率を改善するかどうか；4つ目は、ＴａｄＡのＤ１０８位の他の置換が編集効率をさらに高めることができるかどうか。ＡＢＥ編集因子は、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９結合に干渉しないこと、および、ｅｃＴａｄＡの二量体化は編集効率を改善することがわかった。ＡＢＥがｇＲＮＡ／Ｃａｓ９結合に干渉するかどうかを試験するために、ｎＣａｓ９を様々な進化したＡＢＥコンストラクト（ｐＮＭＧ−２４７−２５１）において野生型Ｃａｓ９と置き換え、インデル速度をＣａｓ９（ｗｔ）のみのインデル速度と比較した（図４８参照）。ＡからＧへの編集効率は、おそらく野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性に起因して、ｐＮＭＧ−２４７−２５１について図４０において検出不可能である。進化したｅｃＴａｄＡとｎＣａｓ９との間の長いリンカー（ｐＮＭＧ−１８３）は、ＸＴＥＮのみおよびＧＧＳのみのリンカーに対してより高い編集効率をもたらすこともまた決定された。最も際立ったことに、ＡＢＥのｅｃＴａｄＡ単位の二量体化は、等モル量のｅｃＴａｄＡ（進化からの変異を伴うまたは伴わない）をＡＢＥ編集因子ｐＮＭＧ−１４２（陰性対照）、ｐＮＭＧ−１７７（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）と同時トランスフェクションすること、および、２つの単位のｅｃＴａｄＡが（（ＳＧＧＳ）２−ＸＴＥＮ−（ＳＧＧＳ）２リンカーに）共有結合された編集因子を作製することによって、トランス（in trans）およびシス（in cis）の両方で試験した。トランス二量体化実験に使用したモノマー単位は、ｐＮＭＧ−２７４およびｐＮＭＧ−２７５である。ＡＢＥ編集因子における２つの単位のｅｃＴａｄＡの共有融合は、ｐＮＭＧ−２７６（陰性対照、ＡＢＥ編集因子における２つの単位の野生型ＴａｄＡ）およびｐＮＭＧ−２７７に表される。最後に、ｅｃＴａｄＡのＤ１０８位に変異を有するＡＢＥ編集因子を表すプラスミドｐＮＭＧ−２７８−２８３（例：Ｄ１０８Ｍ、Ｄ１０８Ｑ、Ｄ１０８Ｋなど）でのトランスフェクションは、ラウンド＃１の進化で最初に同定されたＤ１０８Ｎ置換がこの位置で変異を行う上で最良であることを示した。
【０４０６】
例３−アデノシン塩基編集因子の開発（進化＃３）
コンセンサス変異Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ（ｐＮＭＧ−１８４）およびＥ１５５Ｖを有するｅｃＴａｄＡコンストラクトをエラープローンＰＣＲで変異誘発し、得られたＡＢＥライブラリーを２つの別々のｇＲＮＡでカナマイシン耐性遺伝子の２つの異なる部位に標的化した。カナマイシン耐性を考慮するためには、２つのＡからＧへの復帰（両方とも未熟終止コドン中）が必要である。選択の厳密性を高めるために２ｇＲＮＡ／２標的アプローチを使用した。この進化は、以下の新しい変異の同定をもたらした：Ｌ８４Ｆ、Ｈ１２３ＹおよびＩ１５７Ｆ。
【０４０７】
デアミナーゼ編集ｓｇＲＮＡ
ＡＢＥの開発中に、デアミナーゼがｓｇＲＮＡを編集していたかどうか、そしてＴａｄＡが依然としてＲＮＡ活性を有するかどうかが疑問視された。図４８に示される結果に基づいて、融合はよく結合するように見えたが、ＡＢＥインデル百分率とＣａｓ９ インデル百分率との間に有意差はなかった。これは、ＡＢＥがｇＲＮＡ鎖に干渉していないことまたはｇＲＮＡ鎖を改変していないことを実証する。ｗｔＣａｓ９のみと野生型Ｃａｓ９に融合したＡＢＥとの違いは、ｇＲＮＡとのデアミナーゼ干渉を示唆するであろう。これはそうではなかった。
【０４０８】
また、デアミナーゼに基質としてのＲＮＡを拒絶させるためにＤ１０８残基をさらに変異させることができるかどうかについても疑問視された。ｓｇＲＮＡをコードする部位は、図５１に見出すことができる。結果は、ｅｃＴａｄＡにおけるＤ１０８Ｍ変異がアデノシン塩基編集因子の編集効率を有意に改善しないことを示している。
【０４０９】
さらなる単位の変異体ＴａｄＡをＡＢＥに結合することは、ＤＮＡの脱アミノ化のためのより高い編集効率をもたらすことがわかった。塩基除去修復酵素であるＡＡＧをＡＢＥに結合しても、塩基編集は有意には増強されなかった。触媒不活性型のE. ColiＤＮＡ修復酵素であるＥｎｄｏＶをＡＢＥに結合することもまた塩基編集を有意に増強しなかった。さらに、（イノシンをＡに戻す）ＡＡＧのノックアウト細胞株は、親株よりも優れた編集効率を有さなかった。
【０４１０】
次の目的は、試験した他の部位よりもＨＥＫ部位２において、なぜＡＢＥはより効率的に編集するのかを決定することであった。アデノシン塩基編集因子はすべての部位でうまく機能したが、Ｈｅｋ−２部位では最適に機能した。ＡＢＥは豊富なアデニン残基のためにＨＥＫ部位２で最もよく作用すると理論付けられた。図５７に示す結果は、これがそうではないことを示す。別の理論は、リンカーの長さが、ＡＢＥがＨＥＫ部位２に対してのみ作用する理由であり得るということであった。図５９および図６０に示される結果は、決定的ではないことが証明された。ｅｃＴａｄＡとＣａｓ９の間のＣａｓ９への最も長いリンカーは編集効率を高めたが、塩基編集ウインドウを拡大するようには見えなかった。また、ＡＢＥがＨｅｋ−２の類似部位を効率的に編集するかどうかを試験したところ、Ｈｅｋ−２の類似部位で非常に効率的な編集が行われていることがわかった。このデータから、それらが「ＹＡＣ」コンセンサス配列の一部であるとき、ＡＢＥがアデニンをより効率的に編集することがわかった。ここで、ＹはＣまたはＴである。また、ｅｃＴａｄＡのｔＲＮＡ基質はＹＡＣである「Ｕ−Ａ−Ｃ」の文脈にある。
【０４１１】
デアミナーゼの二量体化は塩基編集を改善し得ることが示唆されている。トランス二量体化およびシス二量体化における現在の編集因子の構造を図６３に示す（上部構造、左下構造、および右下構造）。図６４から図６６に示す結果は、デアミナーゼの二量体化が塩基編集を改善したことを示す。「ＹＡＣ」配列特異性に関して、データによって支持される１つの仮説は、プロトスペーサーの４〜６位のＡに対して、そして周囲の「ＹＡＣ」の配列を用いてＡＢＥが最もよく作用するということである。標的Ａは下線を引いた。ここでＹはＣまたはＴである。
【０４１２】
新しい選択配列に対する進化するＡＢＥ編集因子
次の目的は、ＡＢＥ編集因子の配列の優先を改変することであった。図６９に示すように、１つのＡＢＥがＱ４停止部位のみを標的とし、ＡからＧへの復帰が観察された。結果はまた、図７０に示すように編集因子がＷ１５停止部位のみを標的とし、ＡからＧへの復帰が観察されたことを示した。配列は、クロラムフェニコール活性部位であった元の進化標的とは異なっていた。新しい変異は動力学的に速い酵素をもたらし得る。第３ラウンドの進化は、カナマイシン遺伝子中のＱ４部位とＷ１５部位の両方を同時に標的とした。元のクロラムフェニコール遺伝子とは異なる配列同一性を有する部位を標的化することに加えて、同じ遺伝子中の２つの部位を修正することは、より大きな選択の厳密性を生み出す。進化＃３のために使用された鋳型は、２ｇＲＮＡ（カナマイシン中のＱ４停止およびＷ１５停止を標的とする）を含有する細菌プラスミドｐＮＭＧ−２８８であった。以下の変異を既に含むｐＮＭＧ−２８８のデアミナーゼ部分に対してエラープローンＰＣＲを行った：Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ。
【０４１３】
進化ラウンド＃３から生じる対応する変異体の哺乳動物コンストラクトを作製すると、ｐＮＭＧ−３４１およびｐＮＭＧ−３４０は一般に、進化＃２から最も高度に最適化されたコンストラクトであるｐＮＭＧ−２９０よりも優れていた。
【表５】
2019536425.tif 000381
【０４１４】
例３−ｅｃＴａｄＡのＡ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異を含むアデノシン塩基編集因子の進化（進化＃３）
コンセンサス変異Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ（ｐＮＭＧ−１８４）およびＥ１５５Ｖを有するｅｃＴａｄＡコンストラクトをエラープローンＰＣＲで変異誘発し、得られたＡＢＥライブラリーを２つの別々のｇＲＮＡを用いてカナマイシン耐性遺伝子中の２つの異なる部位に対して標的化した。カナマイシン耐性を付与するには、２つのＡからＧへの復帰（両方とも未熟終止コドン中）が必要である。選択の厳密性を高めるために２ｇＲＮＡ／２標的アプローチを使用した。図９６〜９９を参照。この進化は、以下の新しい変異の同定をもたらした：Ｌ８４Ｆ、Ｈ１２３ＹおよびＩ１５７Ｆ。
【０４１５】
細菌プラスミドｐＮＭＧ−２８８を鋳型として使用し、ｅｃＴａｄＡ（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）中の変異、および選択プラスミドｐＮＭＧ−２７−（Ｑ４ｔｅｒｍ＋Ｗ１５ｔｅｒｍ）中の標的終止コドンに対して発現させた２ｇＲＮＡを除いて、進化番号１および２と同様に進化＃３を実施した。ライブラリーを、ＭＩＣを超える濃度のカナマイシン上にプレーティングした。進化＃３からの最も効率的な塩基編集因子はｐＮＭＧ−３７１であり、これは変異Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、およびＩ１５６Ｆを含む２つのｅｃＴａｄＡドメインを含む。
【０４１６】
例４−非ＹＡＣ配列におけるアデニンの編集効率を高めるための、アデノシン塩基編集因子ｅｃＴａｄＡの残基Ｅ２５、Ｒ２６、Ｒ１０７、Ａ１４２、およびＡ１４３の進化（進化＃４）
１単位のｅｃＴａｄＡ、ＸＴＥＮリンカー、および触媒不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）で構成される、進化＃２からのコンセンサス変異、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７ＹおよびＥ１５５Ｖを有するｅｃＴａｄＡ細菌コドン最適化コンストラクトを、ｅｃＴａｄＡ中の部位（例えば、Ｅ２５、Ｒ２６、Ｒ１０７、Ａ１４２およびＡ１４３）を標的とするＮＮＫプライマーを使用して変異誘発し、部位飽和ＡＢＥライブラリーを生成した。ｅｃＴａｄＡの残基Ｅ２５、Ｒ２６、Ｒ１０７、Ａ１４２およびＡ１４３は、ｗｔ ｅｃＴａｄＡホモ二量体とともにｔＲＮＡ基質と接触すると仮定されている。ＮＮＫプライマーの場合、ＮはＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧであり、ＫはＧまたはＴである。プライマーは変異を含み、目的の５つの領域で結合するように設計され、全長の産物はＰＣＲオーバーラップ拡張プロトコルを使用して得られ、エラープローンなライブラリーアセンブリで以前に使用されたようにＵＳＥＲジャンクションを使用してアセンブリされる。標的とされたｅｃＴａｄＡの５つの残基はＥ２５、Ｒ２６、Ｒ１０７、Ａ１４２およびＡ１４３を含んでいた。この進化の目的は、アデノシン塩基編集因子の「ＹＡＣ」配列の優先を改変することであった。このラウンドの進化において、ＡＢＥのライブラリーは、その標的Ａが非ＹＡＣの文脈で提示されたスペクチノマイシン耐性遺伝子に対して選択した。図１０１〜図１２３を参照。このラウンドの進化からの結果はＲ２６ＧおよびＡ１４２Ｎの変異をもたらした。
【０４１７】
ｅｃＴａｄＡ＿２．２デアミナーゼコンストラクトをスペクチノマイシン中の標的活性部位残基に変異誘発させた（Ｔ８９）。ｇＲＮＡ標的領域：
【化１５４】
2019536425.tif 000382
は非「ＹＡＣ」配列に対応する。標的残基およびそれらのそれぞれの相互作用を表６に示す。
【表６】
2019536425.tif 000383
【０４１８】
ｅｃＴａｄＡ＿２．２デアミナーゼの鋳型を有するＮＮＫライブラリーは、１２８、２５６、３８４および５１２μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含有するプレートからの全部で約５００個のコロニーから生成した。編集因子コンストラクトをサブクローニングし、未改変のスペクチノマイシンＴ８９Ｉ選択プラスミドを用いてＳ１０３０に再形質転換し、そして漸増濃度のスペクチノマイシンで再チャレンジして、ランダムの復帰から真の陽性表現型を明らかにした。部位ＨＥＫ−２、ＨＥＫ２−３、ＨＥＫ２−６、ＨＥＫ２−７、ＨＥＫ２−１０、ＨＥＫ３、およびＦＡＮＣＦ部位における進化＃４変異体（ＮＮＫライブラリー）の編集結果を図１０８〜１２２に示す。＃４変異体は進化＃３変異体よりも良好には機能せず、「ＹＡＣ」配列に関して緩和された基質特異性を示さない。
【０４１９】
部位ＨＥＫ−２、ＨＥＫ２−２、ＨＥＫ２−３、ＨＥＫ２−６、ＨＥＫ２−７、およびＨＥＫ２−１０部位についての進化＃４の哺乳動物トランスフェクションの結果を図１２３に示す。ｅｃＴａｄＡ進化ラウンド＃４の変異は、編集効率を改善することも、基質耐性を広げることもしない。
【０４２０】
ｅｃＴａｄＡにおける標的部位（Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ）についての進化についての進化＃４の鋳型を表７に示す。これは同定された個々のクローンを同定する。
【表７】
2019536425.tif 000384
【０４２１】
例５−ｅｃＴａｄＡのＬ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、およびＩ１５７Ｆ変異を含むアデノシン塩基編集因子の進化（進化＃５）
進化＃３からの変異、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５７Ｆ（ｐＮＭＧ−３２５）を含むｅｃＴａｄＡコンストラクトをエラープローンＰＣＲで変異誘発し、得られたＡＢＥライブラリーを２つの別々のｇＲＮＡで２つの異なる抗生物質耐性遺伝子（クロラムフェニコールおよびスペクチノマイシン）における２つの異なる遺伝子座に標的化した。両方の標的配列は、非ＹＡＣの文脈で標的Ａを含んでいた。
【０４２２】
編集因子プラスミドは、２つの異なるｇＲＮＡ：ｃｈｌｏｒおよびｓｐｅｃｔをコードし、これらは両方とも「非ＹＡＣ」標的である。ｃｈｌｏｒ標的配列は
【化１５５】
2019536425.tif 000385
であり、位置「９」に標的「Ａ」を有する。ｓｐｅｃｔ標的配列は
【化１５６】
2019536425.tif 000386
であり、位置「６」に標的「Ａ」を有する。ｅｃＴａｄＡ進化（進化＃５）に使用されたｅｃＴａｄＡおよびｄＣａｓ９を含むコンストラクトの概略図を図１２４に示す。
【０４２３】
ライブラリーをＳ１０３０＋選択プラスミドに形質転換し、選択培地上にプレーティングする前に７時間ＡＢＥを発現させた：１２８μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（＋ｋａｎ／ｃａｒｂ）、１２８μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、１２８μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン（＋ｋａｎ／ｃａｒｂ）、１２８μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、２５６μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン（＋ｋａｎ／ｃａｒｂ）、１２８μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、３８４μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン（＋ｋａｎ／ｃａｒｂ）。第５ラウンドの進化＃５の後にアッセイしたクローンの結果を図１２５〜１２８に示す。生き残ったコロニーを示す。進化＃５の後にアッセイされたｓｐｅｃｔ選択クローンからのアンプリコンを図１２７に示す。二重選択プレートから配列決定されたすべてのコロニーは出発材料に対していかなる新しい変異も有さなかった。
【０４２４】
例６−S. aureus ＴａｄＡに導入された変異の検討
Losey HCらの"Crystal structure of Staphylococcus aureus tRNA adenosine deaminase TadA in complex with RNA," Nature Stuctural and Molecular Biology, 13, p.153-159 (2006)における公表されている結晶構造に基づいて、変異をS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）に導入した。その内容全体が参照によりここに組み込まれる。その天然のｔＲＮＡ基質に結合したS. aureus ＴａｄＡの結晶構造に基づいて、４つの残基を変異誘発のために選択し、それは基質のアンチコドンループとのＨ結合接触をなした。第１の目的は、ＤＮＡにＡからＧへの変異を誘導する可能性のある別のバージョンのＡＢＥ編集因子を作製できるかどうかを決定することであった。例えば、別の細菌種（例えばS. aureus）由来のＴａｄＡを使用することによる。第２の目的は、S. aureus 編集因子の配列特異性がｅｃＴａｄＡ編集因子と類似しているか異なるかを決定することであった。第３の目的は、S. aureus ＡＢＥ編集因子の編集効率がE. coli ＡＢＥ編集因子と比較して改善されているかどうかを試験することであった。手短に言えば、変異Ｄ１０４Ｎ、Ｄ１０３Ａ、Ｇ２２Ｐ、およびＳ１３８ＡをｓａＴａｄＡになした。表４のコンストラクトｐＮＭＧ−３４５−３５０を参照。部位ＨＥＫ−２、ＨＥＫ２−１、ＨＥＫ２−２、ＨＥＫ２−３、ＨＥＫ２−４、ＨＥＫ２−６、ＨＥＫ２−９、ＨＥＫ２−１０、ＨＥＫ３、ＲＮＦ２、およびＦＡＮＣＦ部位における塩基編集の編集結果を図１２９〜１３９に示す。これらの図は、ｅｃＴａｄＡにおいて同定された変異がS. aureus ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）においてなされ得、ＤＮＡ中のアデニンを脱アミノ化するｓａＴａｄＡの能力を付与し得ることを示す。図はまた、ＹＡＣ配列の優先がｓａＴａｄＡについてもｅｃＴａｄＡと同様であることを示している。
【０４２５】
例７−ｅｃＴａｄＡホモ二量体対ヘテロ二量体およびアデノシン塩基編集因子のリンカー長の試験。
アデノシン塩基編集因子コンストラクトを生成して、様々なリンカー長および様々な組み合わせのアデノシンデアミナーゼ（例えば、野生型ｅｃＴａｄＡおよび／または変異ｅｃＴａｄＡドメイン）ドメインを試験した。各コンストラクトについて、標的ＡをＧに変異させる効率を試験した。例えば、コンストラクトｐＮＭＧ−４９２−５００およびｐＮＭＧ−５１３−５１８を、細胞のＤＮＡ中でＡからＧへの変異を生じさせるそれらの能力について試験した。コンストラクトｐＮＭＧ−４９２−５００およびｐＮＭＧ−５１３−５５１の同一性を表４に示す。これらの試験の結果は、例えば図１４１〜１４９に示す。さらに、塩基編集因子のアデノシンデアミナーゼ内のアルギニン残基を変異させて、それらが標的配列特異性に影響を及ぼすかどうかを決定した。例えば５’−ＹＡＣ−３’配列の一部ではないＡを変異させるそれらの能力を試験した。ＹはＣまたはＴである。これらの試験の結果を例えば図１４１に示す。
【表８−１】
2019536425.tif 000387
【表８−２】
2019536425.tif 000388
【０４２６】
例８−上位変異を除去するための、ヌクレオチド交換および切除技術（ＮＥｘＴ）を使用するＤＮＡシャッフリング、進化＃６。
より効率的なアデノシン塩基編集因子を生成し、潜在的な上位変異を除去するために、進化４、５ａ、５ｂおよび２からのコンストラクトを、ヌクレオチド交換および切除技術（ＮＥｘＴ）を用いたＤＮＡシャッフル実験に供した。ＤＮＡシャッフリングの概略図を図１５０および１５１に示す。簡単に言うと、ＤＮＡシャッフルライブラリーを作製した。ＮＥｘＴシャッフルおよびＵＳＥＲアセンブリを、１０Ｂ細胞に形質転換した。単離したＤＮＡシャッフルライブラリーを、選択プラスミドを用いてＳ１０３０に形質転換した。７時間のアデノシン塩基編集因子の誘導の後、低ｃｈｌｏｒ、高ｃｈｌｏｒ、高ｓｐｅｃｔ、およびｃｈｌｏｒ＋ｓｐｅｃｔを含む４つの異なる選択条件を用いてプレーティングを行った。インキュベーションを３７℃で４８時間行い、次いでコロニーＰＣＲを生き残ったものに対して行った。図１５０および１５１を参照。
【０４２７】
進化＃６から得られたクローンの配列同一性を図１５２および１５３に示す。変異は配列番号１に対して与えられる。図１５４は進化＃６から誘導された塩基編集因子の略図を含む。進化＃６は、配列番号１と比較して、Ｐ４８における変異（例えば、Ｐ４８Ｔ、Ｐ４８ＳおよびＰ４８Ａ）およびＡ１４２における変異（例えば、Ａ１４２Ｎ）を同定した。これらの変異は、ＤＮＡ中のＡ残基をＧに変異させる塩基編集因子の効率を改善した。例えば、図１５５〜１５８の実験結果を参照。
【０４２８】
例９−複数のＡ部位を効率的に編集するための進化するアデノシン塩基編集因子、進化＃７。
複数のＡ残基を含む部位（例えば、５’−AAA−３’配列）内のＡを編集するのにより効率的な塩基編集因子を生成するために、複数のＡ部位を編集することが可能な塩基編集因子を進化させた。抗生物質（ｋａｎ）耐性である細胞の能力を付与する２つの点変異を修正することができる進化した塩基編集因子を同定することによって進化を行った。例えば、図１６３〜図１６５を参照。塩基編集効率および／または複数のＡ部位でＡを編集する能力を改善する変異を図１６４に示す。ここで変異は配列番号１に対して同定される。進化＃７は、Ｗ２３における変異（例えばＷ２３Ｒ、およＷ２３Ｌ）およびＲ１５２における変異（例えば、Ｒ１５２Ｐ、およびＲ１５２Ｈ）を同定した。様々な標的配列上の選択されたアデノシン塩基編集因子コンストラクトについての塩基編集効率の概要を図１７９〜１８６に示す。表９および１０は細菌選択プラスミドデータを含む。
【表９】
2019536425.tif 000389
【表１０−１】
2019536425.tif 000390
【表１０−２】
2019536425.tif 000391
【０４２９】
例１０−Ｃａｓ９バリアント配列
本開示は、Ｃａｓ９バリアント、例えば１つ以上の生物からのＣａｓ９蛋白質を提供し、これは１つ以上の変異を含み得る（例えば、ｄＣａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼを創るため）。いくつかの態様において、下でアステリスク（ａｓｔｅｒｅｋ）によって同定されているＣａｓ９蛋白質のアミノ酸残基の１つ以上は、変異させられ得る。いくつかの態様において、配列番号５２によって提供されるアミノ酸配列のＤ１０および／またはＨ８４０残基、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、変異している。いくつかの態様において、配列番号５２によって提供されるアミノ酸配列のＤ１０残基、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、Ｄ以外のいずれかのアミノ酸残基に変異している。いくつかの態様において、配列番号５２によって提供されるアミノ酸配列のＤ１０残基、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、Ａに変異している。いくつかの態様において、配列番号５２によって提供されるアミノ酸配列のＨ８４０残基、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する残基は、Ｈである。いくつかの態様において、配列番号５２によって提供されるアミノ酸配列のＨ８４０残基、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、Ｈ以外のいずれかのアミノ酸残基に変異している。いくつかの態様において、配列番号５２によって提供されるアミノ酸配列のＨ８４０残基、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、Ａに変異している。いくつかの態様において、配列番号５２によって提供されるアミノ酸配列のＤ１０残基、または配列番号１０８〜３５７によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する残基は、Ｄである。
【０４３０】
種々の種からのいくつものＣａｓ９配列をアラインメントして、配列番号５２または配列番号１０８のＤ１０およびＨ８４０の対応する相同なアミノ酸残基が他のＣａｓ９蛋白質中に同定され、相同なアミノ酸残基の対応する変異を有するＣａｓ９バリアントの生成を許し得るかどうかを決定した。アラインメントはNCBI Constraint-based Multiple Alignment Tool（COBALT（st-va.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobaltにおいてアクセス可能）を用いて、次のパラメータによって実施した。アラインメントパラメータ：Gap Penalties -11, -1；End-Gap Penalties -5, -1。ＣＤＤパラメータ：Use RPS BLAST on；Blast E-value 0.003；Find Conserved columns and Recompute on。クエリクラスタリングパラメータ：Use query clusters on；Word Size 4；Max cluster distance 0.8；Alphabet Regular。
【０４３１】
４つのＣａｓ９配列の例示的なアラインメントを下に提供する。アラインメント中のＣａｓ９配列は、配列１（Ｓ１）：配列番号１０８|WP_010922251|gi 499224711|II型CRISPR RNA誘導型エンドヌクレアーゼCas9 [Streptococcus pyogenes]；配列２（Ｓ２）：配列番号１０９|WP_039695303|gi 746743737|II型CRISPR RNA誘導型エンドヌクレアーゼCas9 [Streptococcus gallolyticus]；配列３（Ｓ３）：配列番号１１０|WP_045635197|gi 782887988|II型CRISPR RNA誘導型エンドヌクレアーゼCas9 [Streptococcus mitis]; 配列４（Ｓ４）：配列番号１１１|5AXW_A|gi 924443546|Staphylococcus Aureus Cas9である。ＨＮＨドメイン（太字かつ下線）およびＲｕｖＣドメイン（枠囲み）が４つの配列のそれぞれについて同定されている。Ｓ１中のアミノ酸残基１０および８４０とアラインメントされた配列中の相同なアミノ酸とは、それぞれのアミノ酸残基の次のアステリスクによって同定されている。
【化１５７】
2019536425.tif 000392
【化１５８】
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【化１５９】
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【０４３２】
アラインメントは、当分野において公知のアラインメントプログラムおよびアルゴリズムを用いて、参照配列または参照残基とアラインメントするアミノ酸配列または残基を同定することによって、参照Ｃａｓ９アミノ酸配列またはアミノ酸残基に対して相同であるアミノ酸配列およびアミノ酸残基が、異なる種からのＣａｓ９配列を包含するがこれに限定されないＣａｓ９配列バリアントから同定され得るということを実証している。本開示は、配列番号１０８〜１１１中のアステリスクによって同定されているアミノ酸残基の１つ以上（例えば、それぞれＳ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４）がここに記載されるように変異した、Ｃａｓ９バリアントを提供する。配列番号１０８〜１１１においてアステリスクによって同定されている残基に対応する配列番号５２のＣａｓ９の残基Ｄ１０およびＨ８４０は、ここにおいて「相同な」または「対応する」残基と言われる。かかる相同な残基は、例えば上に記載されているように配列アラインメントによって、参照配列または残基とアラインメントする配列または残基を同定することによって同定され得る。類似に、ここにおける配列番号５２中の同定された変異、例えば配列番号５２の残基１０および８４０の変異に対応するＣａｓ９配列の変異は、ここにおいて「相同な」または「対応する」変異と言われる。例えば、上の４つのアラインメントされた配列について、配列番号５２またはＳ１（配列番号１０８）のＤ１０Ａ変異に対応する変異は、Ｓ２ではＤ１１Ａ、Ｓ３ではＤ１０Ａ、Ｓ４ではＤ１３Ａであり；配列番号５２またはＳ１（配列番号１０８）のＨ８４０Ａに対応する変異は、Ｓ２ではＨ８５０Ａ、Ｓ３ではＨ８４２Ａ、Ｓ４ではＨ５６０Ａである。
【０４３３】
異なる種からの合計で２５０個のＣａｓ９配列（配列番号１０８〜３５７）を、上で概述されている同じアルゴリズムおよびアラインメントパラメータを用いてアラインメントした。配列番号５２の残基１０および８４０に対して相同なアミノ酸残基を、上で概述されている同じ様式で同定した。アラインメントは下に提供されている。ＨＮＨドメイン（太字かつ下線）およびＲｕｖＣドメイン（枠囲み）が４つの配列のそれぞれについて同定されている。配列番号５２のアミノ酸残基１０および８４０に対応する単一の残基はアラインメント中の配列番号１０８において枠囲みされており、アラインメントされた配列中の対応するアミノ酸残基の同定を許す。
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【表１１−４】
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【表１１−５】
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【表１１−６】
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【表１１−７】
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【表１１−８】
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【表１１−９】
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【表１１−１０】
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【表１１−１１】
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【表１１−１２】
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【表１１−１３】
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【表１１−１４】
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【表１１−１５】
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【表１１−１６】
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【表１１−１７】
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【表１１−１８】
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【表１１−１９】
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【表１１−２０】
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【表１１−２１】
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【表１１−２２】
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【表１１−２３】
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【表１１−２４】
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【表１１−２５】
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【表１１−２６】
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【表１１−２７】
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【表１１−２８】
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【表１１−５９】
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【表１１−６０】
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【表１１−６４】
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【表１１−６９】
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【表１１−７０】
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【表１１−７１】
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【表１１−７３】
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【表１１−７４】
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【表１１−７５】
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【表１１−７６】
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【表１１−７７】
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【表１１−７８】
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【表１１−７９】
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【表１１−８０】
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【表１１−８１】
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【表１１−８２】
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【表１１−８３】
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【表１１−８４】
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【表１１−８５】
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【表１１−８６】
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【表１１−８７】
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【表１１−８８】
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【表１１−９０】
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【表１１−９１】
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【表１１−９２】
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【表１１−９３】
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【表１１−９４】
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【表１１−９５】
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【表１１−９６】
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【表１１−９７】
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【表１１−９８】
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【表１１−９９】
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【表１１−１００】
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【表１１−１０１】
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【表１１−１０２】
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【表１１−１０３】
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【表１１−１０４】
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【表１１−１０５】
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【表１１−１０６】
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【表１１−１０７】
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【表１１−１０８】
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【表１１−１０９】
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【表１１−１１０】
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【表１１−１１１】
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【表１１−１１２】
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【表１１−１１３】
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【表１１−１１４】
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【表１１−１１５】
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【表１１−１１６】
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【表１１−１１７】
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【表１１−１１８】
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【表１１−１１９】
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【表１１−１２０】
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【表１１−１２１】
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【表１１−１２２】
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【表１１−１２３】
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【表１１−１２４】
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【表１１−１２５】
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【表１１−１２６】
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【表１１−１２７】
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【表１１−１２８】
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【表１１−１２９】
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【表１１−１３０】
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【表１１−１３１】
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【表１１−１３２】
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【表１１−１３３】
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【表１１−１３４】
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【表１１−１３５】
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【表１１−１３６】
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【表１１−１３７】
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【表１１−１３８】
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【表１１−１３９】
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【表１１−１４０】
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【表１１−１４１】
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【表１１−１４２】
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【表１１−１４３】
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【表１１−１４４】
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【表１１−１４５】
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【表１１−１４６】
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【表１１−１４７】
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【表１１−１４８】
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【表１１−１４９】
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【表１１−１５０】
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【表１１−１５１】
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【表１１−１５２】
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【表１１−１５３】
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【表１１−１５４】
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【０４３４】
均等物および範囲、参照による組み込み
当業者は、ここに記載されている発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを用いて確かめることができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ添付の請求項に記載の通りである。
【０４３５】
請求項において、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、そうでないと示されていない限り、または文脈から明らかでない限り、１以上を意味し得る。グループの１以上のメンバーの間の「or」を含む請求項または説明は、そうでないと示されていない限り、または文脈から明らかでない限り、１またはすべてのグループメンバーが所与の製品またはプロセスに存在し、用いられ、またはそうでなければ関連がある場合に満足すると考えられる。発明は、そのグループの正確に１のメンバーが所与の製品またはプロセスに存在し、用いられ、またはそうでなければ関連がある態様を含む。発明はまた、１より多く、またはすべてのグループメンバーが、所与の製品またはプロセスに存在し、用いられ、またはそうでなければ関連する態様も含む。
【０４３６】
さらに、発明は、１以上の請求項からの、または説明の関連する部分からの１以上の制限、要素、条項、説明用語などが別の請求項に導入される、すべての変形、組み合わせ、および並び換えを包含することを理解されたい。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項は、同じ基本請求項に従属する任意の別の請求項に見出される１以上の制限を含むように修正することができる。さらに、請求項が組成物を記載している場合、そうでないと示されていない限り、または矛盾または不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、ここに開示された目的のいずれかに組成物を使用する方法が含まれ、ここに開示された製造方法または当該技術分野において知られた他の方法のいずれかにしたがって組成物を製造する方法が含まれることを理解されたい。
【０４３７】
要素がリストとして、例えばマーカッシュグループフォーマットで提示されている場合、要素の各サブグループも開示されており、任意の要素（単数または複数）をそのグループから除去することができることを理解されたい。用語「含む(comprising)」は、開かれていることを意図しており、追加の要素またはステップを含めることを可能にすることにも留意されたい。一般に、発明または発明の態様が特定の要素、特徴、ステップなどを含むものとして言及されている場合、発明の所定の態様または発明の態様はかかる要素、特徴、ステップなどからなるかまたは本質的になることも理解されるべきである。簡潔にするために、それらの態様は、ここでこれらの言葉で具体的に説明されていない。したがって、１以上の要素、特徴、ステップなどを含む発明の各態様について、発明はまた、それらの要素、特徴、ステップなどからなるかまたは本質的になる態様を提供する。
【０４３８】
範囲が与えられているところでは、エンドポイントが包含される。さらにその上に、発明の種々の態様において、別様に示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表されている値は、記された範囲内のいずれかの特定の値を、文脈が明瞭に別様に述べていない限り範囲の下限の単位の十分の一までとり得るということは理解されるはずである。別様に示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表されている値は所与の範囲内のいずれかの部分範囲をとり得、部分範囲のエンドポイントは範囲の下限の単位の十分の一と同じ程度の正確度で表されるということもまた理解されるはずである。
【０４３９】
加えて、本発明のいずれかの具体的な態様が請求項のいずれか１つ以上から明示的に除外され得るということは理解されるであろう。範囲が与えられているところでは、範囲内のいずれかの値が請求項のいずれか１つ以上から明示的に除外され得る。本発明の組成物および／または方法のいずれかの態様、要素、特徴、用途、または側面は、いずれか１つ以上の請求項から除外され得る。簡潔性の目的のために、１つ以上の要素、特徴、目的、または側面が除外された態様の全てがここに明示的に示されているわけではない。
【０４４０】
上記に列挙したものを含む、ここに記載のすべての刊行物、特許および配列データベースの記載は、あたかも各個別の刊行物または特許が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されるように参照によりその全体がここに組み入れられる。矛盾がある場合、本明細書中の任意の定義を含む本出願が支配するであろう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図８−１０】
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【図８−１１】
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【図８−１２】
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【図８−１３】
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【図８−１４】
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【図８−１５】
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【図８−１６】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１３−８】
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【図１３−９】
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【図１３−１０】
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【図１３−１１】
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【図１３−１２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１４−７】
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【図１４−８】
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【図１４−９】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図１９−６】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２０−５】
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【図２０−６】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２１−５】
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【図２１−６】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２２−４】
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【図２２−５】
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【図２２−６】
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【図２２−７】
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【図２２−８】
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【図２２−９】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２６−１】
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【図８９】
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【図９０−１】
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【図９０−２】
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【図９１−１】
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【図９１−２】
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【図９１−３】
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【図９１−４】
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【図９１−５】
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【図９１−６】
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【図９２−１】
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【図９２−２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８−１】
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【図９８−２】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７−１】
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【図１０７−２】
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【図１０８−１】
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【図１０８−２】
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【図１０８−３】
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【図１０８−４】
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【図１０９−１】
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【図１０９−２】
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【図１０９−３】
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【図１０９−４】
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【図１１０−１】
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【図１１０−２】
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【図１１０−３】
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【図１１０−４】
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【図１１１−１】
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【図１１１−２】
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【図１１１−３】
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【図１１１−４】
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【図１１２−１】
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【図１１２−２】
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【図１１２−３】
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【図１１２−４】
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【図１１３−１】
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【図１１３−２】
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【図１１３−３】
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【図１１４−１】
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【図１１４−２】
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【図１１４−３】
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【図１１５−１】
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【図１１５−２】
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【図１１５−３】
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【図１１５−４】
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【図１１５−５】
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【図１１５−６】
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【図１１６−１】
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【図１１６−２】
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【図１１６−３】
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【図１１６−４】
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【図１１７−１】
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【図１１７−２】
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【図１１７−３】
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【図１１８−１】
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【図１１８−２】
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【図１１８−３】
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【図１１８−４】
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【図１１９−１】
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【図１１９−２】
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【図１１９−３】
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【図１１９−４】
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【図１２０−１】
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【図１２０−２】
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【図１２０−３】
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【図１２０−４】
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【図１２１−１】
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【図１２１−２】
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【図１２２−１】
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【図１２２−２】
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【図１２３】
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【図１２４】
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【図１２５−１】
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【図１２５−２】
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【図１２６Ａ】
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【図１２６Ｂ】
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【図１２６Ｃ】
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【図１２６Ｄ】
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【図１２６Ｅ】
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【図１２７】
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【図１２８−１】
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【図１２８−２】
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【図１２９−１】
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【図１２９−２】
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【図１３０−１】
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【図１３０−２】
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【図１３１−１】
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【図１３１−２】
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【図１３２】
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【図１３３】
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【図１３４−１】
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【図１３４−２】
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【図１３５−１】
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【図１３５−２】
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【図１３６−１】
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【図１３６−２】
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【図１３７−１】
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【図１３７−２】
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【図１３８−１】
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【図１３８−２】
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【図１３９−１】
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【図１３９−２】
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【図１４０−１】
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【図１４０−２】
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【図１４０−３】
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【図１４０−４】
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【図１４０−５】
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【図１４０−６】
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【図１４０−７】
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【図１４０−８】
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【図１４０−９】
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【図１４０−１０】
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【図１４０−１１】
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【図１４１−１】
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【図１４１−２】
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【図１４１−３】
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【図１４２−１】
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【図１４２−２】
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【図１４３】
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【図１４４】
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【図１４５】
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【図１４６】
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【図１４７】
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【図１４８】
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【図１４９】
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【図１５０】
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【図１５１−１】
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【図１５１−２】
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【図１５２−１】
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【図１５２−２】
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【図１５２−３】
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【図１５２−４】
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【図１５３−１】
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【図１５３−２】
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【図１５４】
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【図１５５−１】
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【図１５５−２】
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【図１５５−３】
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【図１５５−４】
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【図１５５−５】
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【図１５６−１】
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【図１５６−２】
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【図１５６−３】
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【図１５７】
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【図１５８−１】
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【図１５８−２】
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【図１５９−１】
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【図１５９−２】
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【図１５９−３】
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【図１６０−１】
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【図１６０−２】
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【図１６０−３】
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【図１６０−４】
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【図１６１−１】
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【図１６１−２】
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【図１６１−３】
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【図１６１−４】
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【図１６１−５】
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【図１６１−６】
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【図１６２−１】
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【図１６２−２】
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【図１６２−３】
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【図１６３−１】
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【図１６３−２】
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【図１６３−３】
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【図１６３−４】
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【図１６４−１】
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【図１６４−２】
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【図１６５】
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【図１６６】
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【図１６７−１】
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【図１６７−２】
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【図１６７−３】
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【図１６７−４】
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【図１６８−１】
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【図１６８−２】
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【図１６８−３】
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【図１６９】
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【図１７０】
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【図１７１−１】
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【図１７１−２】
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【図１７２】
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【図１７３】
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【図１７４】
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【図１７５】
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【図１７６】
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【図１７７】
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【図１７８】
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【図１７９】
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【図１８０】
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【図１８１】
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【図１８２】
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【図１８３】
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【図１８４】
2019536425.tif 001381
【図１８５】
2019536425.tif 001382
【図１８６】
2019536425.tif 001383
【配列表】
2019536425000001.app
【国際調査報告】
2019536425.tif 001384
2019536425.tif 001385