(57)【要約】  本発明は、マルチモード吸着媒体、特にマルチモードクロマトグラフィー媒体、その製造方法、及び本発明による吸着媒体又は本発明により製造される吸着媒体の、生体分子の精製のための使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー型担体材料Ｔを含むマルチモード吸着媒体であって、前記ポリマー型担体材料Ｔに、以下の−Ｇ−（ＣＯ２Ｈ）ｎの構造のマルチモードリガンドが−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）基を介して共有結合されている、マルチモード吸着媒体：
【化１】
2019513549.tif 000022
（式中、Ｘは、−ＮＲ−、−Ｏ−又は−Ｓ−を示し、かつＲは、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール又は水素を示し、Ｇは、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ２〜Ｃ２０アルキル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つの芳香族置換基とを含み得る）、置換又は非置換のＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つの芳香族置換基とを含み得る）、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ２〜Ｃ２０アルケニル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つの芳香族置換基とを含み得る）、置換又は非置換のＣ６〜Ｃ２０アリール基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含み得る）、及び置換又は非置換のＣ４〜Ｃ２０ヘテロアリール基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含み得る）からなる群から選択される基を示し、ここで、ｎは１以上の整数である）。
【請求項２】
前記−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）基は、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）である、請求項１に記載のマルチモード吸着媒体。
【請求項３】
前記ポリマー型担体材料Ｔは、天然繊維又は合成繊維、（ポリマー）メンブレン、多孔性ポリマー型モノリス成形体、ポリマーゲル、フィルム、不織布、及び織物からなる群から選択される少なくとも１種の材料を含む、請求項１又は２に記載のマルチモード吸着媒体。
【請求項４】
前記マルチモードリガンドは、前記担体材料Ｔの表面にポリマー型スペーサー要素を介して結合されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のマルチモード吸着媒体。
【請求項５】
前記ポリマー型スペーサー要素は、Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）結合として前記マルチモードリガンドとアミド結合を形成する少なくとも１つの第一級アミノ基を有するポリアミンである、請求項４に記載のマルチモード吸着媒体。
【請求項６】
前記Ｇ基は、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ４〜Ｃ２０アルキル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つの芳香族置換基とを含み得る）、及び分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ３〜Ｃ２０アルケニル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つの芳香族置換基とを含み得る）からなる群から選択される基を示す、請求項１〜５のいずれか一項に記載のマルチモード吸着媒体。
【請求項７】
前記マルチモードリガンドは、以下の構造を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のマルチモード吸着媒体：
【化２】
2019513549.tif 000023
（式中、Ｇは、置換若しくは非置換のＣ２〜Ｃ３アルキル基、置換若しくは非置換のＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル基、置換若しくは非置換のＣ２〜Ｃ３アルケニル基、置換若しくは非置換のＣ６アリール基、又は置換若しくは非置換の５員若しくは６員の複素芳香族基であり、ここで、それらの置換基は、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ１〜Ｃ１０アルキル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つのヒドロキシル置換基、カルボニル置換基、カルボキシル置換基、無水カルボン酸置換基又は芳香族置換基とを含み得る）、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ２〜Ｃ１０アルケニル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つのヒドロキシル置換基、カルボニル置換基、カルボキシル置換基、無水カルボン酸置換基又は芳香族置換基とを含み得る）、Ｃ６〜Ｃ２０アリール基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つのヒドロキシル置換基、カルボニル置換基、カルボキシル置換基又は無水カルボン酸置換基とを含み得る）、及びＣ４〜Ｃ２０ヘテロアリール基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つのヒドロキシル置換基、カルボニル置換基、カルボキシル置換基又は無水カルボン酸置換基とを含み得る）、並びにヒドロキシ基、チオール基又はアミノ基からなる群から選択される）。
【請求項８】
Ｇは、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ３〜Ｃ１０アルケニル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つのヒドロキシル置換基、カルボニル置換基、カルボキシル置換基、無水カルボン酸置換基又は芳香族置換基とを含み得る）を示す、請求項７に記載のマルチモード吸着媒体。
【請求項９】
前記マルチモードリガンドは、以下の構造の１つを有する、請求項１〜５及び７のいずれか一項に記載のマルチモード吸着媒体：
【化３】
2019513549.tif 000024
（式中、Ｒ’は、それぞれ水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＯＨ、−ＮＨ２、ＳＨ、ＣＯ２Ｈ、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ１〜Ｃ１０アルキル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つのヒドロキシル置換基、カルボニル置換基、カルボキシル置換基、無水カルボン酸置換基又は芳香族置換基とを含み得る）、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ２〜Ｃ１０アルケニル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つのヒドロキシル置換基、カルボニル置換基、カルボキシル置換基、無水カルボン酸置換基又は芳香族置換基とを含み得る）、Ｃ６〜Ｃ２０アリール基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つのヒドロキシル置換基、カルボニル置換基、カルボキシル置換基又は無水カルボン酸置換基とを含み得る）、及びＣ４〜Ｃ２０ヘテロアリール基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つのヒドロキシル置換基、カルボニル置換基、カルボキシル置換基又は無水カルボン酸置換基とを含み得る）からなる群から選択され、ここで、ＡはＣ６アリール基又は５員若しくは６員の複素芳香族基であり、かつｍは１から３までの整数である）。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の吸着媒体の製造方法であって、以下の工程：
（ａ）共有結合−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）（ここで、Ｘは、−ＮＲ−、−Ｏ−又は−Ｓ−を示し、かつＲは、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール又は水素を示す）を形成しつつカルボン酸誘導体と反応可能である少なくとも１つの−ＸＨ基を有するポリマー型担体材料Ｔを準備する工程と、
（ｂ）前記ポリマー型担体材料Ｔの少なくとも１つの−ＸＨ基とマルチモードリガンドの前駆体としてのカルボン酸誘導体とを反応させることで、該マルチモードリガンドが該担体材料Ｔに結合される共有結合−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）を形成する工程と、
を含む、方法。
【請求項１１】
前記共有結合−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）は、前記リガンドの前駆体としての無水カルボン酸と前記担体材料Ｔのアミン基との反応により形成される第二級アミド結合であり、かつ前記マルチモードリガンドは、少なくとも１つの遊離のカルボン酸基を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のマルチモード吸着媒体又は請求項１０若しくは１１に記載の方法により製造される吸着媒体の、生体分子の精製のための使用。
【請求項１３】
前記生体分子は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ウイルス、ウイルス様粒子、及び／又はエンドトキシンである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記タンパク質は、抗体である、請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マルチモード吸着媒体、特にマルチモードクロマトグラフィー媒体、その製造方法、及び本発明による吸着媒体又は本発明により製造される吸着媒体の、生体分子の精製のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
用語「吸着媒体」は、流体の或る一定の成分と選択的に結合を形成し得る表面官能基（以下で、「リガンド」及び／又は「クロマトグラフィー活性中心」とも呼ばれる）を有する吸着剤を指す。本発明によれば、１種以上の標的物質及び／又は１種以上の混入物は「吸着物」と呼ばれ、その際、吸着物は、複数の異なる物質を指すこともある。吸着物は、個々の分子、不随物、又は粒子であることができ、その際、これらは、好ましくは生物由来のタンパク質又はその他の物質である。
【０００３】
吸着物の吸着剤への結合は、可逆的又は不可逆的であることができ、いずれにせよ、その結合により、例えば水性液体であり得る、以下で「媒体」と呼ばれる流体から上記吸着物を分離することが可能となる。脱着工程及び付随するすすぎ工程等は、用語「溶離」としてまとめられ、溶離のために使用される媒体は「溶離液」である。それらの成分は、１種若しくは複数種の標的物質及び／又は１種若しくは複数種の混入物であり得る。「標的物質」は、上記媒体から濃縮形又は純粋形で得られる有用物質である。例えば、標的物質は、モノクローナル抗体等の組換えタンパク質であり得る。「混入物」は、技術的理由、規制上の理由、又はその他の理由のために存在しないこと若しくは上記流体から除去することが必要であるか、又はそのことが望まれている物質である。例えば、混入物は、ウイルス、タンパク質、アミノ酸、核酸、エンドトキシン、タンパク質凝集物、リガンド、又はそれらの一部であり得る。「負の吸着」と呼ばれるプロセスである混入物の除去のために、吸着は、吸着剤が一度しか使用されるべきでない場合には不可逆的に行われ得る（行われてもよい）。１種以上の標的物質の吸着においては、その方法は可逆的に行われねばならない。単純な濃縮又は複数の標的物質への分離のいずれかを実施することができ、その際、後者の分離の場合には、吸着、脱着、又はその両方が選択的に行われ得る。
【０００４】
この方法は、吸着的物質分離又はクロマトグラフィーと呼ばれる。従来のクロマトグラフィー用吸着剤は、粒状であり、カラム中で充填物の形で使用されるか、又は通常メンブレン濾過で使用される形式に相当する形式を有するモジュール（例えば、巻きモジュール、積み重ねモジュール等）内に通常存在する吸着メンブレンの形のいずれかである。可能な限り低い非特異的吸着のための要求は、通常、全ての吸着剤に共通している。
【０００５】
数多くの合成リガンド及び天然リガンドは、従来技術において既知である。リガンドの担体への結合に先行して、担体の「活性化」、すなわちリガンドの自発的な結合を可能にする反応性官能基の導入が行われ得る。リガンド自体が反応性基を有することはより稀であり、その際の１つの例は、繊維産業で染料リガンドとして使用される反応性染料である。官能基の結合方法自体は、当業者に既知である（例えば、非特許文献１）。
【０００６】
タンパク質、アミノ酸、核酸、ウイルス又はエンドトキシン等の生体分子を液体媒体から濾過、精製又は除去することは、バイオ医薬品産業にとって非常に重要である。混入物除去用途の殆どで、現在、慣例的なクロマトグラフィーゲル又はクロマトグラフィーメンブレンが使用されている。
【０００７】
またイオン交換クロマトグラフィーは、生体分子の精製において重要な地位を獲得している。ミックスモードリガンド又はマルチモードリガンドを含むカチオン交換体は、従来技術において長い間知られている。例えば、特許文献１は、ベンジルリガンド等の疎水性リガンドが、第１のサイズ範囲の細孔中に固定されており、その一方で、イオン交換性リガンドが、上記疎水性リガンドとは空間的に隔離された第２のサイズ範囲の細孔中に固定されているマルチモードクロマトグラフィー分離媒体を開示している。同様に、特許文献２は、多孔性材料の細孔サイズ選択的な化学修飾のための方法であって、例えば疎水性リガンドが、第１のサイズ範囲の細孔中に固定されており、その一方で、カチオン交換性リガンドが、上記疎水性リガンドとは空間的に隔離された第２のサイズ範囲の細孔中に固定されている、方法を記載している。特許文献３は、第１の種類の疎水性リガンド及び第２の種類のイオン交換性リガンドの両方が、後者はいわゆるエクステンダーを介してクロマトグラフィーマトリックスへと結合されているクロマトグラフィー分離媒体を開示している。したがって、これらの系においては、異なる官能基が異なる分子鎖に存在し、それらは空間的に隔離されている。
【０００８】
既知のカチオン交換体の不利点は、該交換体が比較的低いイオン強度を有する物質としか結合を起こし得ないため、上記媒体を、しばしば吸着前に希釈せねばならないことである。したがって、既知の吸着媒体は、物質の結合にあたり高い塩濃度を許容しないため、こうして追加の希釈工程を必要とし、それに応じて大規模なクロマトグラフィー設備において大きな流体容量を必要とする。
【０００９】
特許文献４においては、カチオン交換性官能基及び疎水性官能基を有するマルチモードリガンドが固定されているクロマトグラフィーマトリックスであって、例えばリガンドが、フェニルアラニン又は６−アミノヘキサン酸から出発して担体材料の表面に結合される、クロマトグラフィーマトリックスが開示されている。特許文献５は、多孔性成形体、好ましくは無機ヒドロキシアパタイト又はフルオロアパタイトから得られる多孔性成形体を基礎とするクロマトグラフィーマトリックスであって、そこに疎水性リガンド及びカチオン交換性リガンドの両方が固定されている、クロマトグラフィーマトリックスを開示しており、ここでは、例えばＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ、いわゆる「ミックスモード」リガンドが述べられている。このＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣリガンドに匹敵するクロマトグラフィーマトリックスは、特許文献６にも開示されている。上記Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣリガンドは、ホモシステインチオラクトンと塩化ベンゾイルとを反応させ、引き続きチオラクトンを開環することにより得られる２−ベンゾイルアミノブタン酸残基を含む。Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣリガンドの固定相への結合は、その後にチオール基を介して求核置換又は開環により行われる。
【００１０】
特許文献７は、高い塩濃度でウシ血清アルブミンの高い回収率を可能にするカチオン交換性基及び疎水性基を有するリガンドを含むクロマトグラフィーマトリックスを開示している。これらのマルチモード系は、関連の刊行物である非特許文献２において非常に詳細に記載されており、そこでは、リガンドは、活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ上に２つの別形により固定化されている。多段階の合成法において、メルカプトプロピオン酸が、まず活性化された担体に結合される。次いで、酸官能基が、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化され、そして得られたエステルを、最後にアミノ酸誘導体と反応させることで、それに応じたカチオン交換性官能基が導入される。
【００１１】
その結果、従来技術において知られる系に関して、その製造は、一般的に複雑な工程、すなわち、
ｉ）反応性基をクロマトグラフィー担体上に結合させ、それを最適に活性化させる工程と、
ｉｉ）こうして製造された修飾された担体を、酸官能基を有するチオール化合物と反応させる工程と、
ｉｉｉ）その固体担体の酸官能基を、適切な試薬（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ））でジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ））の存在下にて有機溶剤中で活性化させる工程と、
ｉｖ）適切な残基Ｒを有するアミノ酸誘導体を添加することで、担体に結合された完成したリガンドを生成させる工程と、
を含むこととなる。
【００１２】
例えば、従来技術のＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣマトリックスの合成方法は、工程ｉ）において、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅとアリルグリシジルエーテルとを反応させ、引き続き得られた生成物を臭素で活性化させ、その後に工程ｉｉ）においてチオラクトンと反応させることを含む。
【００１３】
この方法においては、特に最後の工程の反応は完全には行われず、その結果として、工程（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）において不成功に終わった反応から生ずる酸官能基を有するチオエーテルリンカーと所望の最終生成物と含む、実際には２つの異なるリガンドを有する生成物が常に得られる。２つの異なるリガンドの混合物からなるクロマトグラフィー担体は、分離法において使用される場合に数多くの問題を引き起こし得る。種々のリガンドの比率はバッチ毎に変動し得るので、このようにして製造されるクロマトグラフィー媒体は、バッチに応じて異なる特性を有し、そのため、開発された分離法は、バッチが変更された場合には再現的ではない。さらに、異なる別々のリガンドの使用は、クロマトグラフィー媒体における種々のリガンドの不均一な分布という不利点をもたらし得る。
【００１４】
上記の慣例的な方法と関連したもう１つの問題は、しばしば十分に高いリガンド密度を得ることが不可能であることであり、それは、特に小さなタンパク質の結合能力にとって不利である。この問題は、クロマトグラフィーマトリックスの表面上に固定されるポリマー型スペーサーであって、それを介して追加のリガンドが上記マトリックスに結合され得るポリマー型スペーサーを使用して少なくとも部分的には解決され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第５４３１８０７号
【特許文献２】欧州特許第０６６５８６７号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１２／０２０２９７６号
【特許文献４】米国特許第８８７７９０４号
【特許文献５】米国特許第８０１７７４０号
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１３／０１０９８０７号
【特許文献７】米国特許第６８５２２３０号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Greg T. Hermanson, A. Krishna Mallia, Paul K. Smith, Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, Inc., 1992
【非特許文献２】B.-L. Johansson et al., Journal of Chromatography A, 1016 (2003), 35-49
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、本発明の課題は、簡単かつ再現的に製造することができるとともに、広い塩濃度範囲にわたり選択的に調節することができる高い結合能力を有するべきである吸着媒体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記課題は、特許請求の範囲において特徴が示された本発明の実施形態により解決される。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
特に、本発明によれば、ポリマー型担体材料Ｔを含むマルチモード吸着媒体、特にマルチモードクロマトグラフィー媒体であって、上記ポリマー型担体材料に、以下の−Ｇ−（ＣＯ２Ｈ）ｎの構造のマルチモードリガンドが−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）基を介して共有結合されている、マルチモード吸着媒体、特にマルチモードクロマトグラフィー媒体が提供される：
【化１】
2019513549.tif 000002
（式中、Ｘは、−ＮＲ−、−Ｏ−又は−Ｓ−を示し、かつＲは、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール又は水素を示し、Ｇは、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ２〜Ｃ２０アルキル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つの芳香族置換基とを含み得る）、置換又は非置換のＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つの芳香族置換基とを含み得る）、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ２〜Ｃ２０アルケニル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つの芳香族置換基とを含み得る）、置換又は非置換のＣ６〜Ｃ２０アリール基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含み得る）、及び置換又は非置換のＣ４〜Ｃ２０ヘテロアリール基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含み得る）からなる群から選択される基を示し、ここで、ｎは１以上の整数である）。
【００２０】
上記マルチモード吸着媒体の好ましい実施形態においては、上記Ｇ基は、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ４〜Ｃ２０アルキル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つの芳香族置換基とを含み得る）、及び分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ３〜Ｃ２０アルケニル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つの芳香族置換基とを含み得る）からなる群から選択される。
【００２１】
本発明の意味の範囲内において、用語「マルチモード」は、リガンドが２つ以上の異なる官能基を含み、そのため異なる化学的メカニズムに基づいて標的分子と相互作用し、それらの標的分子（latter）が吸着媒体に結合されることを意味すると理解される。本発明によれば、マルチモード吸着媒体又はマルチモードリガンドは、少なくともカチオン交換性の酸性基と同時に疎水性基を含む。疎水性のＧ基の選択により、標的物質との更なる相互作用、例えばチオフィリック相互作用、π−π相互作用、イオン交換相互作用、又は水素架橋結合を起こす更なる官能性が組み込まれ得る。
【００２２】
好ましくは、本発明による吸着媒体は、１種類だけのマルチモードリガンドを含み、それは上記構造の同一のリガンドだけがポリマー型担体材料に結合されていることを意味する。該マルチモードリガンド構造物は１種類だけの試薬を使用して製造されるので、以下で更に詳細に記載されるように、カルボン酸基と、更なる相互作用を可能にするＧ基との比率は、本発明による吸着媒体では一定に保たれる。この理由のため、２種の異なるリガンドを用いる修飾法又は不完全な反応による修飾法とは異なり、その製造方法の結果は常に再現的である。
【００２３】
本発明による吸着媒体の特に好ましい実施形態においては、上記Ｇ基は、ファンデルワールス相互作用又はπ−π相互作用を介して標的物質に結合することができる疎水性基である。
【００２４】
本発明による吸着媒体の製造は、少なくとも１つの−ＸＨ基（ここで、Ｘ＝−ＮＲ−、−Ｏ−又は−Ｓ−であり、かつＲ＝アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール又はＨである）を有し、共有結合−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）を形成しつつカルボン酸誘導体と反応可能であるポリマー型担体材料が出発材料として使用される新規の修飾プロトコルを基礎としている。その−ＸＨ基はリガンド前駆体と反応するので、得られたリガンドは、担体材料へと共有結合−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）を介して結合されるとともに、それぞれ少なくとも１つの遊離のカルボン酸基を有する。好ましくは、上記−ＸＨ基は、以下の図：
【化２】
2019513549.tif 000003
（式中、Ｘ、Ｇ及びｎは、先に定義した通りである）により図解され得るように、無水カルボン酸により官能化される。Ｇ基自体が置換基としてカルボン酸基−ＣＯＯＨを有しない場合に、無水カルボン酸の求核基−ＸＨによる開環反応からリガンドＧ−（ＣＯ２Ｈ）ｎ中に存在するカルボン酸基が１つだけ得られ、ｎは１と等しい。
【００２５】
Ｇ基自体が置換基として少なくとも１つのカルボン酸基−ＣＯＯＨを有する場合には、ｎは２以上であり、その際、上記カルボン酸基のうちの１つは、無水カルボン酸の求核基−ＸＨによる開環反応から得られる。
【００２６】
特に好ましくは、上記Ｇ基は、疎水性基である。
【００２７】
本発明の実施形態によれば、基−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）は、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）である。つまり、上記基−ＸＨは、第一級アミノ基であるので、得られる−Ｇ−（ＣＯ２Ｈ）ｎリガンドは、第二級アミド結合−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）を介して担体材料に結合される。
【００２８】
本発明によれば、固定相の担体材料としてクロマトグラフィー法に適するあらゆる材料が、ポリマー型担体材料として適している。クロマトグラフィーマトリックスとも呼ぶことができるポリマー型担体材料には、その表面に−ＸＨ基（ここで、Ｘ＝−ＮＲ−、−Ｏ−又は−Ｓ−であり、かつＲ＝アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール又はＨである）を有し、その基にマルチモードリガンドが結合し得る又は結合され得る限りは、特に限定は存在しない。これらの基は、担体材料の表面上に既に存在し得るか、又は適切に導入することができる。したがって、本発明によれば、当初から官能基を含むポリマー型担体材料（例えば、ポリエステル繊維）か、又は当業者に既知の表面修飾により適切な官能基が導入されたポリマー型担体材料のいずれかを使用することができる。この関連において、既知の表面修飾の例には、置換反応及び付加反応、官能性エポキシド、活性化酸若しくは活性エステルとの反応、プラズマ処理、電子線（電子線処理）、ガンマ照射による活性化、コーティング、加水分解、アミノ分解、酸化、還元、官能性カルベン類及び／又はニトレン類との反応等が含まれる。
【００２９】
本発明の実施形態によれば、上記ポリマー型担体材料は、天然繊維又は合成繊維、（ポリマー）メンブレン、多孔性ポリマー型モノリス成形体、ポリマーゲル、フィルム、不織布、及び織物からなる群から選択される少なくとも１種の材料を含む。
【００３０】
本発明による吸着媒体のポリマー型担体材料のための材料として使用することができる天然繊維又は合成繊維の例には、ポリエステル繊維（例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）で構成されたAllasso Industries社製の「Ｗｉｎｇｅｄ  Ｆｉｂｅｒｓ」、又はポリエチレンテレフタレートで構成されたFiber Innovation Technology社製の「４ＤＧ（商標）Ｆｉｂｅｒｓ」）、並びにセルロース、セルロース誘導体、ナイロン、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリアミド（ＰＡ）、スルホン（ＰＥＳ）、ポリ二フッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）及びポリスルホンを構造成分として含む繊維が含まれ、その際、それらの材料は、個別に又は相応の組み合わせで使用することができる。好ましくは、ポリエステル繊維、特にポリエチレンテレフタレート又はポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）で構成された繊維及びポリアミド繊維が使用される。
【００３１】
本発明による吸着媒体のポリマー型担体材料のための材料として使用することができる（ポリマー）メンブレンの例には、セルロース、セルロース誘導体、ナイロン、ポリエステル、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリアミド（ＰＡ）、スルホン（ＰＥＳ）、ポリ二フッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）及びポリスルホンを構造成分として含むメンブレンが含まれ、その際、それらの材料は、個別に又は相応の組み合わせで使用することができる。好ましくは、セルロース及びセルロース誘導体を基礎とするメンブレン、特に水和セルロースメンブレン又はポリエチレンメンブレンが使用される。
【００３２】
この場合には、精製されるべき溶液に依存して、出発メンブレンとして種々の細孔サイズを有する既知の（ポリマー）メンブレンを使用することができる。本発明によれば、出発メンブレンとして、例えば、０．１μｍ〜２０μｍ、好ましくは０．５μｍ〜１５μｍ、より好ましくは１μｍ〜１０μｍの細孔サイズを有し、当該技術分野で既知の通常の方法により鹸化されてもよく、任意に架橋されてもよいセルロースエステルメンブレンを使用することができる。その細孔サイズは、通常は、キャピラリーフローポロメトリー試験によってＣｏｕｌｔｅｒ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｆｌｏｗ  Ｐｏｒｏｍｅｔｅｒ  ６．０及びPorous Materials Inc.社製のＣＡＰＷＩＮソフトウェアシステムを使用して測定される。
【００３３】
本発明による吸着媒体のポリマー型担体材料のための材料として使用することができるポリマーゲルの例には、アガロース、デキストラン、セルロース、ポリメタクリレート、ポリビニルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリスチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、シリカデキストラン、アガロースアクリルアミド、及びデキストランアクリルアミドが含まれる。
【００３４】
フィルム及び織物の例には、（ポリマー）メンブレンのために使用することができる上述のポリマー材料で構成されたフィルム及び織物が含まれる。本発明による吸着媒体のポリマー型担体材料のための材料として使用することができる不織布の例には、ポリエステル／ポリプロピレン／ポリアミド不織布（例えば、Freudenberg社製の「Ｐｌｕｒａｔｅｘｘ  ２３１７  Ｓ」）及び（ポリマー）メンブレンのために使用することができる上記ポリマー材料が含まれる。
【００３５】
本発明による吸着媒体において、好ましくは、担体材料の表面にポリマー型スペーサー要素が結合されており、その際、上記担体材料の表面と上記スペーサー要素との間の結合は、好ましくはクロマトグラフィーマトリックスの官能基（当初から存在する又は表面修飾により生成される）を介して行われるか、又は行われている。本発明による吸着媒体において上記クロマトグラフィーマトリックスと上記マルチモードリガンドとの間の結合単位として働くポリマー型スペーサー要素によって、有利には、高いリガンド密度を得ることが可能であり、それにより、小さなタンパク質、例えばリゾチームに関する高い結合能力及び高い耐塩性が可能となる。
【００３６】
このようにして、高いリガンド密度及びマルチモード相互作用のため、高められた塩濃度でさえも高いタンパク質結合能力を示す耐塩性媒体を製造することができる。
【００３７】
本発明の意味の範囲内では、用語「ポリマー型スペーサー要素」（略して「スペーサー」）は、クロマトグラフィーマトリックスの内側物質及び外側物質をマルチモードリガンドに結合することができるポリマーを指すものと理解される。本発明のポリマー型スペーサー要素には、それらの要素がクロマトグラフィーマトリックスの表面に（好ましくは）化学的に結合することができるが、物理的にも結合することができる限りは、特に限定は存在しない。一般的に、上記ポリマー型スペーサー要素は、ポリアミン、ポリアルコール、ポリチオール、ポリ（メタ）アクリレート、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ−Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド及び上記ポリマーの２種以上のみからなるコポリマー、上記ポリマーの１種以上及び求核性官能基を有しないポリマーのみからなるコポリマーからなる群から選択され得る。
【００３８】
好ましい実施形態によれば、上記ポリマー型スペーサー要素は、少なくとも１つの第一級アミノ基を有するポリアミンである。それというのも、これにより更なる反応のためにポリマー型担体材料の表面の更なる官能化は必要とされないからである。第一級アミノ基によって、後にＸ−（Ｃ＝Ｏ）結合として多官能性リガンドとのアミド結合が形成される。
【００３９】
本発明の意味の範囲内のポリアミンの例には、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン（分岐状又は線状）、ポリ（４−アミノスチレン）、キトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ（Ｎ−メチルビニルアミン）、ポリ（Ｎ−メチルアリルアミン）、及びポリ（オレイルアミン）が含まれる。
【００４０】
この場合に、全ての適切なポリアミンを使用することができる。しかしながら、５００ｇ／ｍｏｌより大きい、特に８００ｇ／ｍｏｌ〜１００００００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有するポリアミンが好ましい。上記ポリマー型スペーサー要素は、特に好ましくは、３０００ｇ／ｍｏｌ〜１５００００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは１００００ｇ／ｍｏｌ〜１０００００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有する。
【００４１】
特に好ましい実施形態においては、上記ポリマー型スペーサー要素は、３０００ｇ／ｍｏｌ〜１５００００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは１００００ｇ／ｍｏｌ〜１０００００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有するポリアリルアミンの群から選択される。更に好ましい実施形態においては、上記ポリマー型スペーサー要素は、５０００ｇ／ｍｏｌ〜５０００００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは１００００ｇ／ｍｏｌ〜１０００００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有するポリビニルアミンの群から選択される。
【００４２】
本発明によれば、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、及び／又はポリエチレンイミンが特に好ましい。
【００４３】
本発明による吸着媒体においては、上記ポリマー型スペーサー要素は、存在するのであれば、クロマトグラフィーマトリックスの表面及びマルチモードリガンドの両方に結合される。マルチモードリガンドへの結合は、（上記クロマトグラフィーマトリックス又は上記スペーサー要素のいずれかの）−ＸＨ基の、リガンド前駆体としてのカルボン酸誘導体のカルボニル基への共有結合を介して、−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）結合（ここで、Ｘ＝−ＮＲ−、−Ｏ−又は−Ｓ−であり、かつＲ＝アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール又はＨである）を形成しつつ行われる。特に好ましい実施形態においては、マルチモードリガンドへの結合は、第二級アミド結合を介して、すなわち−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）型の結合を介して行われる。
【００４４】
本発明による吸着媒体のマルチモードリガンドのリガンド密度は、好ましくは少なくとも２５μｍｏｌ／ｍｌ、好ましくは１００μｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１５０μｍｏｌ／ｍｌ、特に好ましくは少なくとも２５０μｍｏｌ／ｍｌである。該リガンド密度は、本発明によれば滴定により測定され、それについての詳細は、以下の方法Ｍ２において示される。
【００４５】
ポリアミン官能化された吸着媒体の特に好ましい実施形態においては、ポリアミン官能化された吸着媒体のリガンド密度に相当する、マルチモードリガンドが固定化される前のアミノ基密度は、少なくとも２５μｍｏｌ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１５０μｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも２００μｍｏｌ／ｍｌ、特に好ましくは少なくとも４００μｍｏｌ／ｍｌである。該アミノ基密度は、本発明によれば滴定により測定され、それについての詳細は、以下の方法Ｍ１において示される。
【００４６】
本発明によれば、上記マルチモードリガンドは、以下の構造を有する：
【化３】
2019513549.tif 000004
（式中、Ｇは、好ましくは、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ２〜Ｃ１０アルキル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つの芳香族置換基とを含み得る）、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つの芳香族置換基とを含み得る）、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ２〜Ｃ１０アルケニル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つの芳香族置換基とを含み得る）、置換又は非置換のＣ６〜Ｃ１４アリール基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含み得る）、及び置換又は非置換のＣ４〜Ｃ１４ヘテロアリール基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含み得る）からなる群から選択される。本発明によるマルチモードリガンドは、上記基Ｇに結合されている少なくとも１つのカルボン酸基を有する。カルボン酸基の数に対して特に上限は存在しないが、その上限は、好ましくは５（ｎは、１から５までの整数である）、より好ましくは４（ｎは、１から４までの整数である）、特に好ましくは３（ｎは、１から３までの整数である）であるべきである）。
【００４７】
吸着媒体の好ましい実施形態においては、上記マルチモードリガンドは、以下の構造を有する：
【化４】
2019513549.tif 000005
（式中、Ｇは、置換若しくは非置換のＣ２〜Ｃ３アルキル基、置換若しくは非置換のＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル基、置換若しくは非置換のＣ２〜Ｃ３アルケニル基、置換若しくは非置換のＣ６アリール基、又は置換若しくは非置換の５員若しくは６員の複素芳香族基であり、ここで、それらの置換基は、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ１〜Ｃ１０アルキル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つのヒドロキシル置換基、カルボニル置換基、カルボキシル置換基、無水カルボン酸置換基又は芳香族置換基とを含み得る）、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ２〜Ｃ１０アルケニル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つのヒドロキシル置換基、カルボニル置換基、カルボキシル置換基、無水カルボン酸置換基又は芳香族置換基とを含み得る）、Ｃ６〜Ｃ２０アリール基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つのヒドロキシル置換基、カルボニル置換基、カルボキシル置換基又は無水カルボン酸置換基とを含み得る）、Ｃ４〜Ｃ２０ヘテロアリール基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つのヒドロキシル置換基、カルボニル置換基、カルボキシル置換基又は無水カルボン酸置換基とを含み得る）、及びヒドロキシ基、チオール基又はアミノ基からなる群から選択される）。
【００４８】
吸着媒体の特に好ましい実施形態においては、Ｇは、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ３〜Ｃ１０アルケニル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つのヒドロキシル置換基、カルボニル置換基、カルボキシル置換基、無水カルボン酸置換基又は芳香族置換基とを含み得る）である。
【００４９】
特に好ましい実施形態においては、上記マルチモードリガンドは、以下の構造の１つを有する：
【化５】
2019513549.tif 000006
（式中、各Ｒ’は、それぞれ水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＯＨ、−ＮＨ２、ＳＨ、ＣＯ２Ｈ、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ１〜Ｃ１０アルキル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つのヒドロキシル置換基、カルボニル置換基、カルボキシル置換基、無水カルボン酸置換基又は芳香族置換基とを含み得る）、分枝鎖状又は非分枝鎖状のＣ２〜Ｃ１０アルケニル基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つのヒドロキシル置換基、カルボニル置換基、カルボキシル置換基、無水カルボン酸置換基又は芳香族置換基とを含み得る）、Ｃ６〜Ｃ２０アリール基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つのヒドロキシル置換基、カルボニル置換基、カルボキシル置換基又は無水カルボン酸置換基とを含み得る）、及びＣ４〜Ｃ２０ヘテロアリール基（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びハロゲンから選択される１つ又は複数のヘテロ原子と、任意に少なくとも１つのヒドロキシル置換基、カルボニル置換基、カルボキシル置換基又は無水カルボン酸置換基とを含み得る）からなる群から選択され、ここで、ＡはＣ６アリール基又は５員若しくは６員の複素芳香族基であり、かつｍは１から３までの整数である）。上記マルチモードリガンドは、特に好ましくは、ポリマー型担体材料に結合され得るアミド結合以外の更なるアミド結合を有しない。
【００５０】
特に好ましいリガンドとして、以下の構造（１）〜（１５）を挙げることができる。
【化６】
2019513549.tif 000007
2019513549.tif 000008
【００５１】
本発明によれば、以下の構造：
【化７】
2019513549.tif 000009
のマルチモードリガンドは、好ましくはリガンド−Ｇ−（ＣＯ２Ｈ）ｎに関する上記一般構造に含まれない。
【００５２】
さらに、本発明は、本発明による吸着媒体の製造方法を提供する。したがって、本発明による吸着媒体に関する上記特記事項は、本発明による製造方法にも当てはまる。
【００５３】
本発明による吸着媒体の製造方法は、以下の工程：
（ａ）共有結合−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）（ここで、Ｘは、−ＮＲ−、−Ｏ−又は−Ｓ−を示し、かつＲは、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール又は水素である）を形成しつつカルボン酸誘導体と反応可能である少なくとも１つの−ＸＨ基を有するポリマー型担体材料Ｔを準備する工程と、
（ｂ）上記ポリマー型担体材料Ｔの少なくとも１つの−ＸＨ基とマルチモードリガンドの前駆体としてのカルボン酸誘導体とを反応させることで、該マルチモードリガンドが該担体材料に結合される共有結合−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）を形成する工程と、
を含む。
【００５４】
本発明による方法の特に好ましい実施形態においては、上記共有結合−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）は、上記リガンドの前駆体としての無水カルボン酸と上記担体材料のアミン基との反応により形成される第二級アミド結合であり、かつ上記マルチモードリガンドは、少なくとも１つの遊離のカルボン酸基を有する。
【００５５】
マルチモードリガンドがポリマー型スペーサー要素を介して担体材料の表面に結合されている好ましい実施形態によれば、該ポリマー型スペーサー要素は、工程（ｂ）の前にクロマトグラフィーマトリックスの表面上に固定化され、次いで工程（ｂ）により、該マルチモードリガンドは、−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）結合、特に好ましくは第二級アミド結合を形成しつつ、上記スペーサー要素の−ＸＨ基に固定化される。
【００５６】
本発明による方法の工程（ａ）においては、当初から官能基を含む（例えば、ポリエステル繊維）又は官能基が表面修飾により導入された上記のポリマー型担体材料が準備される。好ましくは、本発明による方法の更なる工程（ａ＊）においては、ポリマー型スペーサー要素は、クロマトグラフィーマトリックスの表面上に固定化され、すなわち上記スペーサー要素は、該クロマトグラフィーマトリックスの表面にそれらの官能基を介して（好ましくは）化学的に結合されるか、又は物理的にも結合される。本発明による固定化の工程に特に限定は存在せず、当業者に知られるあらゆる固定化法、例えば置換反応又は付加反応、エポキシ開環、アミノ分解、アミドカップリング反応、エステル化、還元的アミノ化、及び挿入反応を使用することができる。
【００５７】
本発明による方法の工程（ｂ）においては、任意にスペーサー要素を介して上記担体材料に固定化されている少なくとも１つの−ＸＨ基は、−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）結合が形成され、その結合を介して上記マルチモードリガンドが該担体材料に結合されるようにマルチモードリガンドの前駆体と反応される。その−Ｘ−（Ｃ＝Ｏ）結合は、好ましくは第二級アミド結合である。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記第二級アミド基は、無水カルボン酸と、上記担体材料のアミノ基との反応により形成される。これはアミノ基が、好ましくは、以下の図：
【化８】
2019513549.tif 000010
（式中、Ｇ及びｎは、先に定義した通りであり、−ＸＨは、ＮＨ２である）により図解され得るように、無水カルボン酸により官能化されることを意味する。
【００５９】
Ｇ基自体が置換基としてカルボン酸基−ＣＯＯＨを有しない場合に、無水カルボン酸の求核基−ＸＨによる開環反応からリガンドＧ−（ＣＯ２Ｈ）ｎ中に存在するカルボン酸基が１つだけ得られ、ｎは１と等しい。
【００６０】
Ｇ基自体が置換基として少なくとも１つのカルボン酸基−ＣＯＯＨを有する場合には、ｎは２以上であり、その際、上記カルボン酸基のうちの１つは、無水カルボン酸の求核基−ＸＨによる開環反応から得られる。
【００６１】
本発明によれば、上記構造のマルチモードリガンドを得ることができる限りは、無水カルボン酸に特に限定は存在しない。適切な無水カルボン酸の例には、無水コハク酸、無水グルタル酸、無水リンゴ酸（Ｄ−異性体及び／又はＬ−異性体）、無水イタコン酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、無水１，８−ナフタル酸、無水１，２，４−ベンゼントリカルボン酸、無水キノリン酸、無水トリメリト酸、無水ピロメリト酸、無水ピリジン−３，４−ジカルボン酸、無水（Ｓ）−Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸（Ｎ−（２，５−ジオキソテトラヒドロフラン−３−イル）アセトアミド）、無水Ｎ−ベンゾイルアスパラギン酸、無水３−（ｐ−トリルチオ）−コハク酸、４−（（２，５−ジオキソテトラヒドロフラン−３−イル）チオ）安息香酸、無水Ｎ−トリフルオロアセチル−Ｌ−アスパラギン酸（Ｎ−（２，５−ジオキソテトラヒドロフラン−３−イル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド）、無水シス−１，２，３，６−テトラヒドロフタル酸、無水１，２−シクロヘキサンジカルボン酸、無水２，３−チオフェンジカルボン酸、無水３，４−チオフェンジカルボン酸、無水テトラフルオロフタル酸、無水ヘキサフルオログルタル酸、無水アジピン酸、それらの誘導体又はそれらの混合物が含まれ、その際、好ましくはこれらの物質の１種類だけが使用される。
【００６２】
溶剤としては、ジメチルスルホキシド、２−ピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン若しくは１，４−ジオキサン、又はその他の極性の、好ましくは非プロトン性の溶剤を使用することができる。
【００６３】
さらに、本発明は、本発明による吸着媒体又は本発明の方法により製造される吸着媒体の、生体分子の精製のための使用を提供する。精製されるのに適切な生体分子の例には、タンパク質、例えば抗体、ペプチド、アミノ酸、核酸、ウイルス様粒子、ウイルス、及び／又はエンドトキシンが含まれる。
【００６４】
本発明による吸着媒体において上記クロマトグラフィーマトリックスと上記マルチモードリガンドとの間の結合単位として働くポリマー型スペーサー要素により、有利には、特に小さなタンパク質、例えばリゾチームに関する高い結合能力を有するリガンドの高い密度を達成することが可能である。高いリガンド密度及びマルチモード相互作用によって、５００ｍＭまでの高められた塩濃度（ＮａＣｌ濃度）でさえも高いタンパク質結合能力を有する耐塩性吸着媒体を本発明による方法を使用して製造することができる。上記無水物を選択することによって、上記カチオン交換型吸着媒体の最大結合能力を、広い塩濃度範囲にわたり選択的に調節することができる。該マルチモードリガンド構造物は、１種の試薬だけを使用して製造されるので、カルボン酸基と更なる相互作用を可能にする基との比率は、該吸着媒体で一定に保たれる。この理由のため、それぞれが別々に吸着媒体上に固定される２種の異なるリガンドを用いる修飾法又は不完全な反応による修飾法と比べて、その製造方法の結果は常に再現的である。したがって、本発明による吸着媒体は、大きな工業的需要のある生体分子の精製のために極めて適している。
【００６５】
以下の非限定的な実施例により、本発明をより詳細に説明する。ここで、図１〜図３は、得られたメンブレンの結合能力をまとめたグラフを示している。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】実施例で得られたメンブレンの結合能力をまとめたグラフである。
【図２】実施例で得られたメンブレンの結合能力をまとめたグラフである。
【図３】実施例で得られたメンブレンの結合能力をまとめたグラフである。
【実施例】
【００６７】
方法：
Ｍ１：アミン官能化された吸着媒体のリガンド／電荷密度の測定
３層のメンブレンを、メンブレンホルダー中に張着した。そのメンブレン積層物は、メンブレンホルダー中で１５ｃｍ２のメンブレン面積、５ｃｍ２の流入面積、及び７５０μｍのベッド高さ（メンブレン積層物の厚さ）を有していた。該メンブレンホルダー中のメンブレンに２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝７．４）を注入して、空気を排除し、その後にGeneral Electric Health Care社製のＡｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００  ＦＰＬＣユニットに接続した。次いで、上記メンブレン又はメンブレン積層物を、４つの工程を含む試験プログラムを使用して電荷密度について試験した。該試験プログラムの４つの工程を、以下に示す。
【００６８】
１．  メンブレンを２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）中の１ＭのＮａＣｌ溶液６ｍｌでコンディショニングする工程、
２．  メンブレンを逆浸透水中の１ＭのＮａＯＨ溶液６ｍｌで再生する工程、
３．  メンブレンを１００ｍｌの逆浸透水で洗浄する工程、及び、
４．  メンブレンに１３５ｍｌの１０ｍＭのＨＣｌをロードする工程。
【００６９】
それらの工程の全ては、１０ｍＬ／分の流速で実施した。それらの工程の全てにおいて、伝導性をメンブレンユニットの後方の検出器において測定した。こうして記録された曲線上の面積を、デッドボリュームを差し引いた後に積分し、そこから電荷密度を計算した。
【００７０】
Ｍ２：カチオン交換型吸着媒体のリガンド／電荷密度の測定
３層のメンブレンを、メンブレンホルダー中に張着した。そのメンブレン積層物は、メンブレンホルダー中で１５ｃｍ２のメンブレン面積、５ｃｍ２の流入面積、及び７５０μｍのベッド高さ（メンブレン積層物の厚さ）を有していた。該メンブレンホルダー中のメンブレンに２０ｍＭのＫＰｉバッファー（ｐＨ＝７）を注入して、空気を排除し、その後にGeneral Electric Health Care社製のＡｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００  ＦＰＬＣユニットに接続した。次いで、上記メンブレン又はメンブレン積層物を、４つの工程を含む試験プログラムを使用して電荷密度について試験した。該試験プログラムの４つの工程を、以下に示す。
【００７１】
１．  メンブレンを２０ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ＝７．０）中の１ＭのＮａＣｌ溶液６ｍｌでコンディショニングする工程、
２．  メンブレンを逆浸透水中の１ＭのＨＣｌ溶液６ｍｌで再生する工程、
３．  メンブレンを８８ｍｌの逆浸透水で洗浄する工程、及び、
４．  メンブレンに１３５ｍｌの１０ｍＭのＮａＯＨをロードする工程。
【００７２】
それらの工程の全ては、１０ｍＬ／分の流速で実施した。それらの工程の全てにおいて、伝導性をメンブレンユニットの後方の検出器において測定した。こうして記録された曲線上の面積を、デッドボリュームを差し引いた後に積分し、そこから電荷密度を計算した。
【００７３】
Ｍ３：破過曲線による修飾されたメンブレンのリゾチームについての結合能力の測定
３層のメンブレンを、メンブレンホルダー中に張着した。そのメンブレン積層物は、該メンブレンホルダー中で１５ｃｍ２のメンブレン面積、５ｃｍ２の流入面積、及び９００μｍのベッド高さ（メンブレン積層物の厚さ）を有していた。該メンブレンホルダー中のメンブレンに１０ｍＭのＫＰｉバッファー（ｐＨ＝７）を注入して、空気を排除し、その後にGeneral Electric Health Care社製のＡｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００  ＦＰＬＣユニットに接続した。次いで、上記メンブレン又はメンブレン積層物を、３つの工程を含む試験プログラムを使用してリゾチーム結合能力に関して試験した。その試験プログラムの３つの工程を、以下に示す。
【００７４】
１．  メンブレンを１０ｍＭのＫＰｉ（ｐＨ＝７．０）中の１ＭのＮａＣｌ溶液２０ｍｌでコンディショニングする工程、
２．  メンブレンを２０ｍｌの結合バッファー（１０ｍＭのＫＰｉ、ｐＨ＝７．０）で平衡化する工程、
３．  メンブレンに２５０ｍｌのリゾチーム溶液（結合バッファー中の０．２０％のリゾチーム）をロードする工程。
【００７５】
それらの工程の全ては、１０ｍＬ／分の流速で実施した。それらの工程の全てにおいて、２８０ｎｍでの吸収をメンブレンユニットの後方の検出器において測定した。こうして記録された曲線上の面積を、デッドボリュームを差し引いた後に積分し、そこから結合されたリゾチームの量を計算した。
【００７６】
Ｍ４：破過曲線による修飾されたメンブレンのγ−グロブリンについての結合能力の測定
３層のメンブレンを、メンブレンホルダー中に張着した。そのメンブレン積層物は、該メンブレンホルダー中で１５ｃｍ２のメンブレン面積、５ｃｍ２の流入面積、及び９００μｍのベッド高さ（メンブレン積層物の厚さ）を有していた。該メンブレンホルダー中のメンブレンに２０ｍＭのＮａＡｃ溶液（ｐＨ＝５）を注入して、空気を排除し、その後にGeneral Electric Health Care社製のＡｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００  ＦＰＬＣユニットに接続した。次いで、上記メンブレン又はメンブレン積層物を、３つの工程を含む試験プログラムを使用してγ−グロブリン結合能力に関して試験した。その試験プログラムの３つの工程を、以下に示す。
【００７７】
１．  メンブレンを２０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ＝５．０）中の１ＭのＮａＣｌ溶液２０ｍｌでコンディショニングする工程、
２．  メンブレンを２０ｍｌの結合バッファー（２０ｍＭのＮａＡｃ中の２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝５．０）で平衡化する工程、
３．  メンブレンに結合バッファー中の１ｍｇ／ｍＬ  γ−グロブリン溶液２５０ｍｌをロードする工程。
【００７８】
それらの工程の全ては、１０ｍＬ／分の流速で実施した。それらの工程の全てにおいて、２８０ｎｍでの吸収をメンブレンユニットの後方の検出器において測定した。こうして記録された曲線上の面積を、デッドボリュームを差し引いた後に積分し、そこから結合されたγ−グロブリンの量を計算した。その測定を、新しいメンブレン試料を使用して１５０ｍＭのＮａＣｌ及び３００ｍＭのＮａＣｌで繰り返した。
【００７９】
アミン修飾された出発マトリックス上に無水カルボン酸を固定化するための修飾プロトコル
水和セルロースメンブレンの修飾
１．  ポリアミン固定化
１ａ）ポリアリルアミン（ＰＡＡ）
スペーサーの固定化は、独国特許出願公開第１０  ２００８０５５  ８２１号（実施例２１及び２２）に記載された既知のプロトコルに基づくものである。この場合に、１５０００ｇ／ｍｏｌ〜１５００００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有するスペーサーが使用される。典型的な反応において、酢酸セルロース（ＣＡ）メンブレン（３μｍの細孔サイズ、Sartorius Stedim Biotech GmbH社）を、０．６Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（４ｇ／ｃｍ２）中にて室温で３０分間にわたり鹸化し、次いで０．２５Ｍの水酸化ナトリウム溶液（０．５ｇ／ｃｍ２）中で１０分間にわたり３回すすいだ。得られたメンブレンを、１５％の１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル及び８５％の０．２５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液からなる溶液（０．５ｇ／ｃｍ２）で３０分間にわたり処理し、次いで密閉された容器内で１８時間にわたり室温で貯蔵した。最後に、すすぎを、流水で３０分間にわたり実施した。
【００８０】
こうして得られたメンブレンを、逆浸透水中のポリアリルアミンの２０％溶液（１ｇ／ｃｍ２）にて５０℃で１時間にわたり処理した。次いで、そのメンブレンを、５％の硫酸溶液にて室温で５分間にわたり処理し、最後に流水で１０分間にわたりすすいだ。
【００８１】
上記メンブレン上のアミノ基密度を、滴定により測定した。
【００８２】
【表１】
2019513549.tif 000011
【００８３】
１ｂ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）
スペーサーの固定化は、独国特許出願公開第１０  ２００８０５５  ８２１号（実施例１５、１６及び１７）に記載された既知のプロトコルに基づいて実施する。典型的な反応において、ＣＡメンブレン（３μｍの細孔サイズ、Sartorius Stedim Biotech GmbH社）を、０．６Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（４ｇ／ｃｍ２）中にて室温で３０分間にわたり鹸化し、次いで０．２５Ｍの水酸化ナトリウム溶液（０．５ｇ／ｃｍ２）中で１０分間にわたり３回すすいだ。得られたメンブレンを、１５％の１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル及び８５％の０．２５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液からなる溶液（０．５ｇ／ｃｍ２）で３０分間にわたり処理し、次いで密閉された容器内で１８時間にわたり室温で貯蔵した。最後に、すすぎを、流水で３０分間にわたり実施した。こうして得られたメンブレンを、逆浸透水中のＬｕｐａｓｏｌ  ＷＦ（BASF AG社製のポリエチレンイミン、分子量２５０００ｇ／ｍｏｌ）の３０％溶液（１ｇ／ｃｍ２）にて５０℃で２時間にわたり処理した。次いで、そのメンブレンを、流水で３０分間にわたりすすぎ、５％の硫酸溶液で１０分間にわたり処理し、最後に流水で１０分間にわたりすすいだ。
【００８４】
上記メンブレン上のアミノ基密度を、滴定により測定した。
【００８５】
【表２】
2019513549.tif 000012
【００８６】
２．  リガンド固定化
典型的な反応において、１６ｇの無水カルボン酸を６４ｇのＤＭＳＯ（２０重量％）中に溶解させ、その溶液を６０℃に加熱した。ＰＡＡ修飾された水和セルロースメンブレンを、該反応溶液（０．５ｇ／ｃｍ２）中に入れ、６０℃で１時間にわたりかき混ぜた。次いで、該反応溶液を濾別し、そのメンブレンをエタノール（０．５ｇ／ｃｍ２）及び大過剰の逆浸透水で洗浄した。
【００８７】
リガンド構造物：
本明細書に列記されるカチオン交換体は、上記方法に従って以下の無水カルボン酸を使用して製造した。結果は、以下の表１〜表３及び図１〜図３に示されている。
【００８８】
【表３】
2019513549.tif 000013
【００８９】
比較として、従来技術において知られる強力なカチオン交換体型のメンブレン吸着体のＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ（スルホン酸リガンドを有する水和セルロースの強力なカチオン交換体、Sartorius Stedim Biotech GmbH社）を試験した。結果は、以下の表４及び図１〜図３に「参照」として示されている。
【００９０】
さらに、無水Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アスパラギン酸とＰＡＡ修飾された水和セルロースメンブレン（ＰＡＡのモル質量：１５０００ｇ／ｍｏｌ）との反応を、比較例１として実施し、こうして２−（ベンゾイルアミノ）ブタン酸リガンドを有するクロマトグラフィーマトリックスが得られ、従来技術から知られるＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣリガンドが再現された。
【００９１】
【表４】
2019513549.tif 000014
2019513549.tif 000015
【００９２】
【表５】
2019513549.tif 000016
【００９３】
【表６】
2019513549.tif 000017
【００９４】
【表７】
2019513549.tif 000018
【００９５】
【表８】
2019513549.tif 000019
【００９６】
ポリエチレンメンブレンの修飾
１．  リガンド固定化
ポリアリルアミン官能化されたポリエチレンメンブレンのＣｈｒｏｍａｓｏｒｂ（０．６５μｍの細孔サイズ、EMD Millipore社）を、リガンド固定化のための出発材料として使用した。典型的な反応において、１６ｇの無水カルボン酸を６４ｇのＤＭＳＯ（２０重量％）中に溶解させ、その溶液を６０℃に加熱した。上記ポリアリルアミン官能化されたポリエチレンメンブレンを、該反応溶液（０．５ｇ／ｃｍ２）中に入れ、６０℃で１時間にわたりかき混ぜた。次いで、該反応溶液を濾別し、そのメンブレンをエタノール（０．５ｇ／ｃｍ２）及び大過剰の逆浸透水で洗浄した。
【００９７】
本明細書に列記されるカチオン交換体は、上記方法に従って以下の無水カルボン酸を使用して製造した。結果は、以下の表５に示されている。
【００９８】
【表９】
2019513549.tif 000020
【００９９】
【表１０】
2019513549.tif 000021
【０１００】
結果の評価
結果は、図１〜図３にまとめられている。図１に示されるように、比較例１で得られたメンブレンと比較して、本発明によるマルチモードリガンドを有するメンブレンは、驚くべきことに、同等のリガンド密度で、リゾチーム等の小さな分子に対するより大幅に高い結合能力を示す。従来技術において知られる強力なカチオン交換体型のメンブレン吸着体のＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓについても同じことが当てはまる。
【０１０１】
さらに、実施例の全ては、広い塩範囲（２５ｍＭ〜３００ｍＭのＮａＣｌ）にわたってグロブリン等のより大きな分子に対して良好な結合特性を示す。この結合能力をより良く説明するために、グロブリンに対する平均結合能力ＢＣ（グロブリン）：
ＢＣ（グロブリン）＝（ＢＣ（グロブリン、２５ｍＭ  ＮａＣｌ）＋ＢＣ（グロブリン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）＋ＢＣ（グロブリン、３００ｍＭ  ＮａＣｌ））／３
が規定される。
【０１０２】
結果は、図２にまとめられている。
【０１０３】
数多くの使用に関する個々の実施例の性能についての結果を判定するために、以下で小さな分子（リゾチーム）及び大きな分子（グロブリン）の両方に対する結合能力を考慮する。このために、結合の指標ＢＣ（全体）：
ＢＣ（全体）＝（ＢＣ（リゾチーム）＋ＢＣ（グロブリン））／２
が規定される。
【０１０４】
結果は、図３にまとめられている。驚くべきことに、本発明によるメンブレンは、比較例１で得られたメンブレンと比較して、より大幅に高い結合の指標ＢＣ（全体）を示す。従来技術において知られる強力なカチオン交換体型のメンブレン吸着体のＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓについても同じことが当てはまる。
【図１】
2019513549.tif 000025
【図２】
2019513549.tif 000026
【図３】
2019513549.tif 000027
【国際調査報告】
2019513549.tif 000028
2019513549.tif 000029
2019513549.tif 000030
2019513549.tif 000031
2019513549.tif 000032
2019513549.tif 000033