(57)【要約】  本発明は、植物における遺伝子発現の調整に有用な組換えＤＮＡ分子及びコンストラクト、ならびにそのヌクレオチド配列を提供する。また本発明は、異種性の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子組換え植物、植物細胞、植物部分及び種子、同様にその使用法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＤＮＡ分子であって、
ａ）配列番号１〜１５のいずれかに対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号１〜１５のいずれかを含む配列、及び
ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１〜１５のいずれかの断片からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含み、
前記配列が異種性の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されている、前記組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
前記配列が配列番号１〜１５のいずれかのＤＮＡ配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記配列が配列番号１〜１５のいずれかのＤＮＡ配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項２に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記配列が配列番号１〜１５のいずれかのＤＮＡ配列を含む、請求項３に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５】
前記ＤＮＡ配列が遺伝子調節活性を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６】
前記異種性の転写可能なＤＮＡ分子が農学的に重要な遺伝子を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項７】
前記農業的に重要な遺伝子が植物において除草剤抵抗性を付与する、請求項６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項８】
前記農業的に重要な遺伝子が植物において病虫害抵抗性を付与する、請求項６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項９】
遺伝子組換え植物細胞であって、
ａ）配列番号１〜１５のいずれかに対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号１〜１５のいずれかを含む配列、及び
ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１〜１５のいずれかの断片からなる群から選択される配列を含む組換えＤＮＡ分子を含み、
前記配列が異種性の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される前記遺伝子組換え植物。
【請求項１０】
前記遺伝子組換え植物細胞が単子葉の植物細胞である、請求項９に記載の遺伝子組換え植物細胞。
【請求項１１】
前記遺伝子組換え植物細胞が双子葉の植物細胞である、請求項９に記載の遺伝子組換え植物細胞。
【請求項１２】
遺伝子組換え植物、またはその一部であって、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含む、前記遺伝子組換え植物、またはその一部。
【請求項１３】
請求項１２に記載の遺伝子組換え植物の子孫植物、またはその一部であって、前記子孫植物またはその一部が前記組換えＤＮＡ植物を含む、前記子孫植物、またはその一部。
【請求項１４】
遺伝子組換え種子であって、前記種子が請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含む、前記遺伝子組換え種子。
【請求項１５】
商品生産物を産生する方法であって、請求項１２に記載の遺伝子組換え植物またはその一部を得ること及びそこから前記商品生産物を産生することを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記商品生産物がタンパク質濃縮物、タンパク質単離物、穀粒、デンプン、種子、ミール、粉末、バイオマスまたは種子油である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の遺伝子組換え植物を得ること及び植物の栽培を含む、転写可能なＤＮＡ分子を発現する方法であって、前記転写可能なＤＮＡが発現される、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は２０１６年３月１１日に出願された米国仮出願第６２／３０６，７９０号に対する利益を主張するものであり、その全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組込み
２０１７年３月６日に作成された、２９．４ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）にて計測）の「ＭＯＮＳ４１７ＷＯ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ」という名称のファイル内に含まれる配列表は、電子提出により本明細書と共に出願され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、植物分子生物学、及び植物遺伝子工学の分野に関する。より具体的には、本発明は植物における遺伝子発現を調節するために有用なＤＮＡ分子に関する。
【背景技術】
【０００４】
調節エレメントは、作動可能に連結される転写可能なＤＮＡ分子の転写を調整することによって遺伝子活性を調節する遺伝子エレメントである。このようなエレメントはプロモーター、リーダー、イントロン及び３’非翻訳領域を包含する場合があり、植物分子生物学及び植物遺伝子工学の分野において有用である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、植物において使用する新規の遺伝子調節エレメントを提供する。また本発明は、調節エレメントを含むＤＮＡコンストラクトを提供する。また本発明は、調節エレメントを含む遺伝子組換え植物細胞、植物及び種子を提供する。一実施形態では、調節エレメントは転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される。ある特定の実施形態では、転写可能なＤＮＡ分子は、調節配列に対して異種性であり得る。したがって、本発明により提供された調節エレメント配列は、特定の実施形態において、異種性の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されるとして定義され得る。また本発明は、調節エレメント、調節エレメントを含むＤＮＡコンストラクトならびに転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される調節エレメントを含む遺伝子組換え植物細胞、植物及び種子を作成及び使用する方法を提供する。
【０００６】
したがって、一態様において本発明は、（ａ）配列番号１〜１５のいずれかに対して、少なくとも約８５パーセントの配列同一性を有する配列、（ｂ）配列番号１〜１５のいずれかを含む配列、及び（ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１〜１５のいずれかの断片からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を含み、配列が異種性の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される組換えＤＮＡ分子を提供する。「異種性の転写可能なＤＮＡ分子」は、転写可能なＤＮＡ分子が、作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列に対して異種性であることを意味する。具体的な実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、配列番号１〜１５のいずれかのＤＮＡ配列に対して少なくとも約９０パーセント、少なくとも９１パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９３パーセント、少なくとも９４パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセントまたは少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は調節エレメントを含む。一部の実施形態では、調節エレメントはプロモーターを含む。さらに他の実施形態では、異種性の転写可能なＤＮＡ分子は、例えば植物における除草剤抵抗性の提供が可能な遺伝子、または植物における病虫害抵抗性の提供が可能な遺伝子などの農学的に重要な遺伝子を含む。さらに他の実施形態では、本発明は本明細書で提供される組換えＤＮＡ分子を含むコンストラクトを提供する。
【０００７】
別の態様では、本明細書において、（ａ）配列番号１〜１５のいずれかに対して、少なくとも約８５パーセントの配列同一性を有する配列、（ｂ）配列番号１〜１５のいずれかを含む配列、及び（ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１〜１５のいずれかの断片からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を含み、ＤＮＡ配列が、異種性の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される遺伝子組換え植物細胞を提供する。ある特定の実施形態では、遺伝子組換え植物細胞は単子葉植物細胞である。他の実施形態では、遺伝子組換え植物細胞は単子葉植物細胞または双子葉植物細胞である。
【０００８】
さらに別の態様では、本明細書において、ａ）配列番号１〜１５のいずれかに対し、少なくとも８５パーセントの配列同一性を有する配列、ｂ）配列番号１〜１５のいずれかを含む配列、及びｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１〜１５のいずれかの断片からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を含み、配列が異種性の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される、遺伝子組換え植物、またはその一部をさらに提供する。具体的な実施形態では、遺伝子組換え植物は、組換えＤＮＡ分子を含む任意の世代の子孫植物である。また本明細書において、生育時にこのような遺伝子組換え植物を産生する組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子組換え種子が提供される。
【０００９】
別の態様では、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有する遺伝子組換え植物またはその一部を得ること、及びそこから商品生産物を産生することを含む、商品生産物を産生する方法を提供する。一実施形態では、商品生産物は、加工された種子、穀粒、植物部分、油及びミールである。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、形質転換植物細胞を産生するため、本発明の組換えＤＮＡ分子を用いて植物細胞を形質転換すること、及び形質転換植物細胞から遺伝子組換え植物を再生することを含む、本発明の組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子組換え植物を産生する方法を提供する。
【００１１】
配列の簡単な説明
配列番号１は、天然のリーダーに５’が作動可能に連結される、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏの推定フェレドキシン２（Ｆｅ２）タンパク質遺伝子由来のプロモーターを含む、調節発現エレメント群（ＥＸＰ）のＤＮＡ配列である。
【００１２】
配列番号２は、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏの推定フェレドキシン２（Ｆｅ２）タンパク質遺伝子由来のプロモーター配列である。
【００１３】
配列番号３は、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏの推定フェレドキシン２（Ｆｅ２）タンパク質遺伝子由来のリーダー配列である。
【００１４】
配列番号４は、天然リーダーに５’が作動可能に連結される、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏのクロロフィルａ−ｂ結合タンパク質１３遺伝子由来のプロモーターを含む、ＥＸＰのＤＮＡ配列である。
【００１５】
配列番号５は、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏのクロロフィルａ−ｂ結合タンパク質１３遺伝子由来のプロモーター配列である。
【００１６】
配列番号６は、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏのクロロフィルａ−ｂ結合タンパク質１３遺伝子由来のリーダー配列である。
【００１７】
配列番号７は、天然リーダーに対して５’が作動可能に連結される、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏのＢボックス型ジンクフィンガータンパク質２４様遺伝子由来のプロモーターを含む、ＥＸＰのＤＮＡ配列である。
【００１８】
配列番号８は、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏのＢボックス型ジンクフィンガータンパク質２４様遺伝子由来のプロモーター配列である。
【００１９】
配列番号９は、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏのＢボックス型ジンクフィンガータンパク質２４様遺伝子由来のリーダー配列である。
【００２０】
配列番号１０は、天然リーダーに５’が作動可能に連結される、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａの集光性複合タンパク質ｂ２遺伝子由来のプロモーターを含む、ＥＸＰのＤＮＡ配列である。
【００２１】
配列番号１１は、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａの集光性複合タンパク質ｂ２遺伝子由来のプロモーター配列である。
【００２２】
配列番号１２は、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａの集光性複合タンパク質ｂ２遺伝子由来のリーダー配列である。
【００２３】
配列番号１３は、天然リーダーに５’が作動可能に連結される、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａの光化学系ＩＩ葉緑体前駆体遺伝子由来のプロモーターを含む、ＥＸＰのＤＮＡ配列である。
【００２４】
配列番号１４は、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａの光化学系ＩＩ葉緑体前駆体遺伝子由来のプロモーター配列である。
【００２５】
配列番号１５は、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａの光化学系ＩＩ葉緑体前駆体遺伝子由来のリーダー配列である。
【００２６】
配列番号１６は、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａの集光性複合タンパク質ｂ２遺伝子のプロモーターに由来するエンハンサー配列である。
【００２７】
配列番号１７は、プロセシング可能なイントロンを有するβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）のコード配列である。
【００２８】
配列番号１８は、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ  Ｅ６遺伝子に由来する３’ＵＴＲ配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、植物において遺伝子調節活性を有するＤＮＡ分子を提供する。これらのＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は、配列番号１〜１５として提供される。これらのＤＮＡ分子は、植物組織において作動可能に連結される転写可能なＤＮＡ分子の発現に影響を与えることが可能であり、したがって、遺伝子組換え植物において作動可能に連結される導入遺伝子の遺伝子発現を調節することが可能である。また本発明は、それらを改変、産生及び使用する方法を提供する。また本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有する遺伝子組換え植物細胞、植物、植物部分及び種子を包含する組成物、ならびにそれらを調製及び使用する方法を提供する。
【００３０】
以下の定義及び方法は、本発明をより明確に定義し、本発明の実践において当業者を導くために提供される。特に記載のない限り、用語は当業者による慣例的用法に従って理解されるものとする。
【００３１】
ＤＮＡ分子
本明細書で使用される用語「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」は、５’（上流）末端から３’（下流）末端までの読み取りが行われる、ゲノムのまたは合成起源の二本鎖ＤＮＡ分子、すなわち、デオキシリボヌクレオチド塩基のポリマーまたはＤＮＡ分子を意味する。本明細書で使用される用語「ＤＮＡ配列」は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。本明細書で使用される命名法は、米国連邦規則第３７編１条８２２項の命名法に対応し、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８）付属書２、表１及び３にある表に明記される。
【００３２】
本明細書で使用される「組換えＤＮＡ分子」は、人の介入がなければ自然に同時発生しないであろうＤＮＡ分子の組合せを含むＤＮＡ分子である。例えば、組換えＤＮＡ分子は、相互に異種性の少なくとも２つのＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子、自然に存在するＤＮＡ配列から逸脱したＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、または遺伝子形質転換もしくは遺伝子編集によって宿主細胞のＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子であり得る。
【００３３】
本明細書で使用される用語「配列同一性」は、２つの最適に整列させたポリヌクレオチド配列または２つの最適に整列させたポリペプチド配列が同一である程度を意味する。最適な配列アラインメントは、例えばリファレンス配列と別の配列を、適切な内部のヌクレオチド挿入、欠失またはギャップを有する配列アラインメントにおいて、ヌクレオチドの一致数を最大にするように２つの配列を手動で整列させることにより作成される。本明細書で使用される用語「リファレンス配列」は、配列番号１〜１５として提供されるＤＮＡ配列に対して提供されるＤＮＡ配列を意味する。
【００３４】
本明細書で使用される用語「配列同一性パーセント」または「同一性パーセント」または「同一性％」は、同一性比率に１００を乗じたものである。リファレンス配列を用いて最適に整列させた配列に対する「同一性比率」は、最適なアラインメントにおけるヌクレオチドの一致数を、例えば完全長のリファレンス配列全体内におけるヌクレオチドの総数など、リファレンス配列内のヌクレオチドの総数によって除算したものである。したがって、本発明の一実施形態は、リファレンス配列に対して最適に整列させるときに、リファレンス配列に対して少なくとも約８５パーセント、少なくとも約８６パーセント、少なくとも約８７パーセント、少なくとも約８８パーセント、少なくとも約８９パーセント、少なくとも約９０パーセント、少なくとも約９１パーセント、少なくとも約９２パーセント、少なくとも約９３パーセント、少なくとも約９４パーセント、少なくとも約９５パーセント、少なくとも約９６パーセント、少なくとも約９７パーセント、少なくとも約９８パーセント、少なくとも約９９パーセントまたは少なくとも約１００パーセントの同一性を有する、配列番号１〜１５として本明細書で提供される配列を含むＤＮＡ分子を提供する。
【００３５】
調節エレメント
例えばプロモーター、リーダー（５’ＵＴＲとしても知られる）、エンハンサー、イントロン及び転写終結領域（または３’ＵＴＲ）などの調節エレメントは、生細胞における遺伝子の全体的発現において不可欠な役割を果たす。本明細書で使用される用語「調節エレメント」は、遺伝子調節活性を有するＤＮＡ分子を意味する。本明細書で使用される用語「遺伝子調節活性」は、例えば作動可能に連結される転写可能なＤＮＡ分子の転写及び／または翻訳に影響を与えることにより、作動可能に連結される転写可能なＤＮＡ分子の発現に影響を与える能力を意味する。植物において機能する、例えばプロモーター、リーダー、エンハンサー、イントロン及び３’ＵＴＲなどの調節エレメントは、したがって遺伝子工学を介した植物表現型の改変に有用である。
【００３６】
本明細書で使用される「調節発現エレメント群」または「ＥＸＰ」配列は、例えばエンハンサー、プロモーター、リーダー及びイントロンなど、作動可能に連結される調節エレメントの群を意味し得る。したがって調節発現エレメント群は、例えば、リーダー配列に５’が作動可能に連結されるプロモーターを含み得る。本発明の実施において有用なＥＸＰは、１、４、７、１０及び１３を包含する。
【００３７】
調節エレメントは、例えば構成的発現または時間的、空間的、発生的、組織、環境的、生理学的、病理学的、細胞周期及び／または化学的応答による発現ならびにその任意の組合せなどの正及び／または負の作用など、その遺伝子の発現パターンならびに定量的または定性的指標によって特徴付けられ得る。本明細書で使用される「遺伝子の発現パターン」は、作動可能に連結されるＤＮＡ分子における転写されたＲＮＡ分子への任意の転写のパターンである。転写されたＲＮＡ分子は、タンパク質分子を産生するために翻訳され得るか、またはアンチセンスもしくは他の調節ＲＮＡ分子、例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などを提供し得る。
【００３８】
本明細書で使用される用語「タンパク質発現」は転写されたＲＮＡ分子におけるタンパク質分子への任意の翻訳のパターンである。タンパク質の発現は、時間的、空間的、発生的または形態学的性質、及び定量的または定性的指標によって特徴付けられ得る。
【００３９】
プロモーターは、作動可能に連結される転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整する調節エレメントとして有用である。本明細書で使用される用語「プロモーター」は一般的に、転写を開始するために、例えばトランス作用性転写因子など、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ及び他のタンパク質の認識及び結合に関与するＤＮＡ分子を意味する。プロモーターは、遺伝子のゲノムコピーにおける５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）から最初に単離され得る。あるいは、プロモーターは合成的に産生されたまたは操作されたＤＮＡ分子であり得る。またプロモーターは、キメラであり得る。キメラプロモーターは、２つ以上の異種性ＤＮＡ分子の融合を介して産生される。本発明の実施において有用なプロモーターは、配列番号２、５、８、１１及び１４またはその断片もしくは変異体のいずれかの中に含まれるプロモーターエレメントを包含する。本発明の具体的な実施形態では、本明細書に記載の請求項に係るＤＮＡ分子及びその任意の変異体または誘導体は、プロモーター活性を含むこと、すなわち、例えば遺伝子組換え植物などの宿主細胞内でプロモーターとして作用可能であるものとしてさらに定義される。さらに具体的な実施形態では、断片は、由来する開始プロモーター分子に保持されるプロモーター活性を示すものとして定義され得るか、または断片は、基底レベルの転写を提供し、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体を認識及び結合するためのＴＡＴＡボックス、他の既知の転写因子結合部位モチーフまたは等価なＤＮＡ配列を含む「最小プロモーター」を含み得る。
【００４０】
一実施形態では、本開示のプロモーター配列の断片が提供される。プロモーター断片は、上記の通りプロモーター活性を含む場合があり、単独においてまたは、例えばキメラプロモーターの構築などにおける他のプロモーター及びプロモーター断片との組合せにおいて、または他のＥＸＰ及びＥＸＰ断片との組合せにおいて有用である場合がある。具体的な実施形態では、本開示のプロモーター活性を有するＤＮＡ分子の少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２５、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約９００または少なくとも１０００の、またはより長い、連続したヌクレオチドを含むプロモーターの断片が提供される。ある特定の実施形態では、本発明は完全長配列の活性を有する配列番号１〜１５のうちの任意の１つの断片を提供する。開始プロモーター分子からこのような断片を産生する方法は、当該技術分野において周知である。
【００４１】
配列内または５’の欠失などの、配列番号２、５、８、１１及び１４のいずれかの中に含まれる任意のプロモーターエレメント由来の組成物は、例えば、発現に関する正もしくは負のいずれかの作用を有するエレメントの除去、発現に関する正もしくは負の作用を有するエレメントの複製、及び／または発現に関する組織もしくは細胞特異的作用を有するエレメントの複製もしくは除去を包含する、当該技術分野において公知の方法を用いて産生することにより発現を改善または変化させ得る。ＴＡＴＡボックスエレメントまたはその等価配列及び下流配列が除去された３’欠失を含む、配列番号２、５、８、１１及び１４のいずれかの中に含まれる任意のプロモーターエレメント由来の組成物は、例えばエンハンサーエレメントを作成するために使用され得る。発現に関して正または負の、組織特異的、細胞特異的またはタイミング特異的（例えば、これに限定されないが、概日リズムなど）作用を有する任意のエレメントを除去するため、さらに欠失が作成され得る。配列番号２、５、８、１１及び１４のいずれかの中に含まれる任意のプロモーターエレメントならびにそれ由来の断片またはエンハンサーは、キメラ転写調節エレメント組成物を作成するために使用され得る。
【００４２】
本発明によれば、プロモーターまたはプロモーター断片は、例えばＴＡＴＡボックス及び他の既知の転写因子結合部位モチーフなどの既知のプロモーターエレメントの有無、すなわち、ＤＮＡ配列の特性について解析され得る。このような既知のプロモーターエレメントの同定は、元のプロモーターに類似した発現パターンを有するプロモーターの変異体を設計するため、当業者に用いられ得る。
【００４３】
本明細書で使用される用語「リーダー」は、遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）から単離され、転写開始部位（ＴＳＳ）とタンパク質コード配列開始部位の間のヌクレオチドセグメントとして一般的に定義されるＤＮＡ分子を意味する。あるいは、リーダーは合成的に産生されたまたは操作されたＤＮＡエレメントであり得る。リーダーは、作動可能に連結される転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整する５’調節エレメントとして使用される可能性がある。リーダー分子は、異種性プロモーターまたはその天然のプロモーターと共に使用され得る。本発明の実施に有用なリーダーは、配列番号３、６、９、１２及び１５、または配列番号１、４、７、１０及び１３もしくはそのフラグメントもしくは変異体のいずれかの中に含まれる任意のリーダーエレメントを包含する。具体的な実施形態では、このようなＤＮＡ配列は、例えば、遺伝子組換え植物細胞などを包含する、宿主細胞内のリーダーとして作用可能であるものとして定義され得る。一実施形態では、このような配列はリーダー活性を含むものとして解読される。
【００４４】
配列番号３、６、９、１２及び１５として、または配列番号１、４、７、１０及び１３のいずれかの中に含まれる任意のリーダーエレメントとして示されるリーダー配列（５’ＵＴＲとも呼ばれる）は、調節エレメントを含み得るか、または作動可能に連結される転写可能なＤＮＡ分子の転写もしくは翻訳に影響を与え得る二次構造をとる場合がある。配列番号３、６、９、１２及び１５として、または配列番号１、４、７、１０及び１３のいずれかの中に含まれる任意のリーダーエレメントとして示されるリーダー配列は、作動可能に連結される転写可能なＤＮＡ分子の転写または翻訳に影響を与えるキメラ調節エレメントを作成するため、本発明により使用され得る。
【００４５】
本明細書で使用される用語「イントロン」は、遺伝子から単離または同定され得る、また翻訳前のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）プロセシングの間にスプライシング除去される領域として一般的に定義され得るＤＮＡ分子を意味する。あるいは、イントロンは合成的に産生されたまたは操作されたＤＮＡエレメントであり得る。イントロンは、作動可能に連結される遺伝子の転写を生じるエンハンサーエレメントを含有し得る。イントロンは、作動可能に連結される転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整する調節エレメントとして使用され得る。コンストラクトはイントロンを含む場合があり、イントロンは転写可能なＤＮＡ分子に対して異種性であっても異種性でなくてもよい。当該技術分野におけるイントロンの例として、イネアクチンイントロン及びトウモロコシＨＳＰ７０イントロンが含まれる。
【００４６】
植物では、遺伝子コンストラクト内にいくつかのイントロンを組み入れることにより、イントロン欠損コンストラクトと比較してｍＲＮＡ及びタンパク質の蓄積の増加につながる。この作用は、遺伝子発現の「イントロン媒介型増強」（ＩＭＥ）と名付けられている。植物における発現を刺激することが知られているイントロンは、トウモロコシ遺伝子内（例えば、ｔｕｂＡ１、Ａｄｈ１、Ｓｈ１、及びＵｂｉ１など）、イネ遺伝子内（例えば、ｔｐｉなど）、ならびにペチュニア由来（例えば、ｒｂｃＳなど）、ジャガイモ（例えば、ｓｔ−ｌｓ１など）及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来（例えば、ｕｂｑ３及びｐａｔ１など）などの双子葉類植物遺伝子内において同定されている。イントロンのスプライス部位内の欠失または変異は遺伝子発現を低減させることが認められており、スプライシングがＩＭＥに必要であり得ることを示唆している。しかし、双子葉類植物におけるＩＭＥが、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来ｐａｔ１遺伝子のスプライス部位内における点変異によって認められている。１つの植物における同一イントロンの多重使用は、不利益を示すことが認められている。その場合、適切な組換えＤＮＡエレメントを構築する基本的な調節領域を収集する必要がある。
【００４７】
本明細書で使用される、用語「３’転写終結分子」、「３’非翻訳領域」または「３’ＵＴＲ」は、ｍＲＮＡ分子の３’部位の非翻訳領域に転写の間、使用されるＤＮＡ分子を意味する。ｍＲＮＡ分子の３’非翻訳領域は、特異的切断及び３’ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ尾部としても知られている）によって生じ得る。３’ＵＴＲは、転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結され、かつその下流に位置する場合があり、ポリアデニル化シグナル及び、転写、ｍＲＮＡプロセシング、または遺伝子発現に影響を与えることが可能な他の調節シグナルを包含し得る。ポリＡ尾部は、ｍＲＮＡの安定性及び翻訳の開始において機能すると考えられている。当該技術分野における３’転写終結分子の例は、ノパリン合成酵素３’領域、コムギｈｓｐ１７  ３’領域、エンドウマメルビスコ小サブユニット３’領域、ワタＥ６  ３’領域、及びコイキシン３’ＵＴＲである。
【００４８】
３’ＵＴＲは、通常、特定のＤＮＡ分子の組換え発現において有益な使用法が認められている。３’ＵＴＲが弱い場合はリードスルーを生じる可能性があり、隣接する発現カセット内に位置するＤＮＡ分子の発現に影響を与え得る。転写終結を適切に制御することにより、下流に局在するＤＮＡ配列（例えば、他の発現カセット）へのリードスルーを防ぐ可能性があり、さらにＲＮＡポリメラーゼの効率的な再利用を可能にして遺伝子発現を改善する可能性がある。効率的な転写の終結（ＤＮＡからのＲＮＡポリメラーゼＩＩの放出）は、転写の再開に不可欠であるため、全体的な転写レベルに直接的に影響を与える。転写終結後、成熟ｍＲＮＡは合成部位から放出され、鋳型は細胞質に輸送される。真核生物のｍＲＮＡはｉｎ  ｖｉｖｏでポリ（Ａ）型として蓄積され、従来の方法による転写終結部位の検出を困難にしている。しかし、バイオインフォマティクス法による３’ＵＴＲの機能的かつ効率的な予測は、有効な３’ＵＴＲを容易に予測できる保存されたＤＮＡ配列が存在しないことから困難である。
【００４９】
実用的な観点から、通常は発現カセットで使用される３’ＵＴＲが次の特性を備えていることは有益である。３’ＵＴＲは効率的かつ効果的に導入遺伝子の転写を終結させ、１つのトランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）内に複数の発現カセットが存在する場合のように別の発現カセットを含み得る任意の隣接するＤＮＡ配列、またはＴ−ＤＮＡを挿入した隣接する染色体ＤＮＡに対して、転写産物のリードスルーを防ぐことが可能であるべきである。３’ＵＴＲは、ＤＮＡ分子の発現を駆動するために用いられるプロモーター、リーダー、エンハンサー及びイントロンによって付与される転写活性の低減を引き起こすべきではない。植物のバイオテクノロジーにおいて、多くの場合３’ＵＴＲは、形質転換植物から抽出された逆転写されたＲＮＡの増幅反応を始動するために用いられ、（１）植物染色体に組み込まれた後の発現カセットの転写活性または発現を評価するため、（２）植物ＤＮＡ内の挿入のコピー数を評価するため、及び（３）育種後に得られた種子の接合性を評価するために用いられる。また３’ＵＴＲは、挿入されたカセットの完全性を特徴付けるための、形質転換植物より抽出されたＤＮＡの増幅反応にも用いられる。
【００５０】
本明細書で使用される用語「エンハンサー」または「エンハンサーエレメント」は、シス作用性調節エレメント、別名シスエレメントを意味し、これは全体的な発現パターンの態様を与えるが、通常、作動可能に連結される転写可能なＤＮＡ分子の転写を単独で駆動するには不十分である。プロモーターとは異なり、エンハンサーエレメントは通常、転写開始部位（ＴＳＳ）もしくはＴＡＴＡボックスまたは等価なＤＮＡ配列を包含しない。プロモーターまたはプロモーター断片は、作動可能に連結されるＤＮＡ配列の転写に影響を与える１つ以上のエンハンサーエレメントを自然に含む場合がある。またエンハンサーエレメントは、キメラプロモーターシスエレメントを産生するため、プロモーターに融合される場合があり、これは、全体的な遺伝子発現調整の態様を与える。Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ集光性複合タンパク質ｂ２前駆体遺伝子プロモーター由来のエンハンサーエレメントの例として、配列番号１６を提供する。
【００５１】
多くのプロモーターエンハンサーエレメントが、ＤＮＡ結合タンパク質に結合し、及び／またはＤＮＡトポロジーに影響を与え、ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡ鋳型へのアクセスを選択的に許可または制限する、または転写開始部位の二重らせんを選択的にほどくことを促進する局所的構造を産生すると考えられている。エンハンサーエレメントは、転写を調整する転写因子に結合するために機能し得る。いくつかのエンハンサーエレメントは２つ以上の転写因子に結合し、転写因子は２つ以上のエンハンサードメインと、異なる親和性で相互作用し得る。エンハンサーエレメントは、欠失解析（すなわち、１つ以上のヌクレオチドを５’末端もしくは内部からプロモーターまで欠失させること）、ＤＮａｓｅ  Ｉフットプリント法を使用したＤＮＡ結合タンパク質解析、メチル化干渉法、電気泳動移動度シフトアッセイ、ライゲーションを介したポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によるｉｎ  ｖｉｖｏゲノムフットプリント法及び他の従来のアッセイを包含する数々の技術によって、または、例えばＢＬＡＳＴなど、従来のＤＮＡ配列比較法を用いて標的配列もしくは標的モチーフとして既知のシスエレメントモチーフもしくはエンハンサーエレメントを使用するＤＮＡ配列類似性解析によって同定され得る。エンハンサードメインの微細構造は、１つ以上のヌクレオチドの突然変異誘発（または置換）によって、または当該技術分野において公知の他の従来の方法によってさらに調査され得る。エンハンサーエレメントは、化学的合成またはこのようなエレメントを包含する調節エレメントからの単離によって得られる可能性があり、後の操作を容易にする有用な制限酵素部位を含有する追加の隣接ヌクレオチドを用いて合成され得る。したがって本開示の方法によって、作動可能に連結される転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整するためのエンハンサーエレメントの設計、構築及び使用は、本発明に包含される。
【００５２】
本明細書で使用される用語「キメラ（の）」は、第１のＤＮＡ分子を第２のＤＮＡ分子に融合させることによって産生される単一のＤＮＡ分子を意味し、ここで第１のＤＮＡ分子も第２のＤＮＡ分子も、通常はそのような構成、すなわちもう一方に融合されることが認められていない。したがってキメラＤＮＡ分子は、通常他の方法では自然に存在しない新規のＤＮＡ分子である。本明細書で使用される用語「キメラプロモーター」は、このようなＤＮＡ分子の操作を介して産生されるプロモーターを意味する。キメラプロモーターは、例えばプロモーターのエンハンサーエレメントへの融合など、２つ以上のＤＮＡ断片を組み合わせる場合がある。したがって本開示の方法によって、作動可能に連結される転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整するためのキメラプロモーターの設計、構築及び使用は、本発明に包含される。
【００５３】
キメラ調節エレメントは、例えば制限酵素による消化及びライゲーション、ライゲーション非依存性クローニング、増幅中のＰＣＲ産物のモジュールアセンブリまたは調節エレメントの直接的化学合成など、当該技術分野において公知の様々な方法及び当業者に既知の他の方法によって作動可能に連結され得る、様々な構成エレメントを含むように設計され得る。得られた様々なキメラ調節エレメントは、同一の構成エレメントまたはその変異体を含み得るが、構成部分が作動可能に連結されることを可能にする連結ＤＮＡ配列（複数可）を含む１つのＤＮＡ配列または複数のＤＮＡ配列において異なっている。本発明では、配列番号１〜１５として提供されるＤＮＡ配列は、調節エレメントのリファレンス配列を提供する場合があり、リファレンス配列を含む構成エレメントは、当該技術分野において公知の方法によって連結される場合があり、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、及び／もしくは挿入、または細菌及び植物細胞の形質転換において自然に発生する変異を含み得る。
【００５４】
本明細書で使用される用語「変異体」は、例えば調節エレメントなど、第１のＤＮＡ分子と構成が類似するが同一ではない第２のＤＮＡ分子を意味し、ここで第２のＤＮＡ分子は、依然として一般的機能性、すなわち、例えばおおよそ等価な転写活性を介して、第１のＤＮＡ分子と同一または類似の発現パターンを維持している。変異体は、第１のＤＮＡ分子のより短いまたは省略したバージョン及び／または第１のＤＮＡ分子の配列の改変したバージョン、例えば種々の制限酵素部位及び／または内部欠損、置換及び／または挿入を有する第１のＤＮＡ分子などであってもよい。同様に「変異体」は、リファレンス配列の１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／または挿入を含むヌクレオチド配列を有する調節エレメントを包含する可能性があり、ここで調節エレメントの誘導体は、対応する親調節分子とおおよそ等価な転写または翻訳活性を有する。同様に調節エレメントの「変異体」は、細菌及び植物細胞の形質転換において自然に発生する変異に起因する変異体を包含する。本発明では、配列番号１〜１５として提供されるポリヌクレオチド配列は、元の調節エレメントのＤＮＡ配列と構成が類似するが同一ではない変異体の作製に使用される場合があり、さらに一般的機能性、すなわち、元の調節エレメントと同一または類似の発現パターンを維持している。本発明のこのような変異体の産生は、本開示に照らして十分に当業者の技能の範囲内であり、本発明の範囲内に包含される。
【００５５】
本出願における「単離されたＤＮＡ分子」または同等の用語もしくは語句への言及は、ＤＮＡ分子が単独または他の組成物との組合せで存在するが、その自然環境内に存在しないことを意図する。例えば、コード配列、イントロン配列、非翻訳リーダー配列、プロモーター配列、転写終結配列など、生体ゲノム内のＤＮＡ中に自然に見られる核酸エレメントは、エレメントが生体ゲノム内にあり、それが自然に見られるゲノム内の位置にある限り、「単離された」とみなされない。しかし、これらの各エレメント及びこれらのエレメントのサブパートは、エレメントが生物ゲノム内になく、それが自然に見られるゲノム内の位置にない限り、本開示の範囲内において「単離された」ことになる。本開示の目的のため、任意の遺伝子組換えヌクレオチド配列、すなわち、植物もしくは細菌細胞のゲノムに挿入された、または染色体外ベクター中に存在するＤＮＡのヌクレオチド配列は、それが形質転換に使用されるプラスミドもしくは類似構造物内、植物もしくは細菌ゲノム内に存在するかどうか、または植物もしくは細菌由来の組織、子孫、生体試料もしくは商品生産物内に検出可能な量が存在するかどうかに関わらず、単離されたヌクレオチド配列であるとみなされる。
【００５６】
特定の導入遺伝子の望ましい発現態様に関して本明細書に記載の改変、複製または欠失の有効性は、例えば本明細書の実施例に記載されているように、開始ＤＮＡ分子においてなされる変化及び変化の目的によって変わり得る結果を検証するため、安定的及び一過的植物アッセイにおいて経験的に試験され得る。
【００５７】
コンストラクト
本明細書で使用される用語「コンストラクト」は、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス、ファージまたは直鎖状もしくは環状ＤＮＡまたはＲＮＡ分子など、任意の原料由来で、ゲノムの組込みまたは自律増殖が可能な、少なくとも１つのＤＮＡ分子が別のＤＮＡ分子に機能的に作動する手法で連結される、すなわち作動可能に連結されるＤＮＡ分子を含む、任意の組換えＤＮＡ分子を意味する。本明細書で使用される用語「ベクター」は、形質転換、すなわち異種性ＤＮＡまたはＲＮＡを宿主細胞へ導入することを目的として使用され得る任意のコンストラクトを意味する。コンストラクトは、通常１つ以上の発現カセットを包含する。本明細書で使用される用語「発現カセット」は、１つ以上の調節エレメント、通常少なくともプロモーター及び３’ＵＴＲに対して作動可能に連結される、転写可能なＤＮＡ分子を少なくとも含むＤＮＡ分子を意味する。
【００５８】
本明細書で使用される用語「作動可能に連結される」は、第１のＤＮＡ分子が第２のＤＮＡ分子に連結され、ここで第１及び第２のＤＮＡ分子は、第１のＤＮＡ分子が第２のＤＮＡ分子の機能に影響を与えるように配置されることを意味する。２つのＤＮＡ分子は単一の連続したＤＮＡ分子の一部であってもなくてもよく、隣接していてもしなくてもよい。例えば、プロモーターは、細胞内において対象とする転写可能なＤＮＡ分子の転写を調整する場合、転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される。リーダーは、例えば、ＤＮＡ配列の転写または翻訳に影響を与えることが可能である場合、ＤＮＡ配列に作動可能に連結される。
【００５９】
本発明のコンストラクトは、一実施形態では、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞によって与えられるトランスファー分子と共に、植物細胞のゲノムへのＴ−ＤＮＡの組込みを可能にする、Ｔ−ＤＮＡを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓから単離されたＴｉプラスミドの右境界（ＲＢまたはＡＧＲｔｕ．ＲＢ）及び左境界（ＬＢまたはＡＧＲｔｕ．ＬＢ）領域を有する二重腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド境界コンストラクトとして提供され得る（例えば、米国特許第６，６０３，０６１号を参照のこと）。コンストラクトは、細菌細胞における複製機能及び抗生物質セレクションを提供するプラスミド骨格ＤＮＡセグメント、例えばｏｒｉ３２２などのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ複製開始点、例えばｏｒｉＶまたはｏｒｉＲｉなどの広域宿主複製開始点及び、例えばＳｐｅｃ／Ｓｔｒｐなどのスペクチノマイシンもしくはストレプトマイシンに対する抵抗性を与えるＴｎ７アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）をコードする選択マーカー、またはゲンタマイシン（Ｇｍ、Ｇｅｎｔ）選択マーカー遺伝子のコード領域を含有し得る。植物の形質転換において、宿主菌株は多くの場合、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＡＢＩ、Ｃ５８またはＬＢＡ４４０４であるが、植物形質転換の当業者に公知の他の菌株は、本発明において機能し得る。
【００６０】
転写可能なＤＮＡ分子が、タンパク質として翻訳及び発現される機能的ｍＲＮＡ分子へと転写されるように、コンストラクトを構築して細胞に導入する方法は、当該技術分野において公知である。本発明の実施において、コンストラクト及び宿主細胞の調製及び使用を目的とする従来の組成物及び方法は、当業者に周知である。高等植物の核酸の発現に有用な通常のベクターは、当該技術分野において周知であり、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミド由来のベクター及びｐＣａＭＶＣＮトランスファーコントロールベクターを包含する。
【００６１】
様々な調節エレメントがコンストラクト内に包含され得、これらには本明細書で提供される任意の調節エレメントが包含される。このような調節エレメントは、いずれも他の調節エレメントとの組合せで提供され得る。このような組合せは、望ましい調節機能を産生するために設計または改変され得る。一実施形態では、本発明のコンストラクトは、３’ＵＴＲに作動可能に連結される転写可能なＤＮＡ分子に対して作動可能に連結される、少なくとも１つの調節エレメントを含む。
【００６２】
本発明のコンストラクトは、本明細書に提供されるまたは当該分野で公知の任意のプロモーターまたはリーダーを包含し得る。例えば、本発明のプロモーターは、異種性の非翻訳５’リーダー、例えばヒートショックタンパク質遺伝子由来のものなどに作動可能に連結されてもよい。あるいは、本発明のリーダーは、例えばＣａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ  ３５Ｓ転写プロモーターなどの異種性プロモーターに作動可能に連結されてもよい。
【００６３】
また発現カセットは、作動可能に連結されるタンパク質の、詳細には、葉緑体、白色体または他の色素体細胞小器官、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、液胞または細胞外部位の、細胞内ターゲティングに有用なペプチドをコードする輸送ペプチドコード配列を包含し得る。多くの葉緑体局在タンパク質は、核遺伝子から前駆体として発現され、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）によって葉緑体に標的化される。このような単離された葉緑体タンパク質の例には、限定されないが、リブロース−１，５，−二リン酸カルボキシラーゼ、フェレドキシン、フェレドキシン酸化還元酵素、集光性複合タンパク質Ｉ及びタンパク質ＩＩ、チオレドキシンＦならびにエノールピルビルシキミ酸リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）の小サブユニット（ＳＳＵ）に関連するものが包含される。葉緑体輸送ペプチドは、例えば、米国特許第７，１９３，１３３号に記載される。非葉緑体タンパク質は、非葉緑体タンパク質をコードする導入遺伝子に作動可能に連結される異種性ＣＴＰの発現によって、葉緑体に標的化され得ることが実証されている。
【００６４】
転写可能なＤＮＡ分子
本明細書で使用される用語「転写可能なＤＮＡ分子」は、限定されないが、タンパク質コード配列を有するＤＮＡ分子、及び遺伝子抑制に有用な配列を有するＲＮＡ分子を産生するＤＮＡ分子を包含する、ＲＮＡ分子に転写可能な任意のＤＮＡ分子を意味する。ＤＮＡ分子の種類は、限定されないが、例えば遺伝子のアンチセンスメッセージを含有するＤＮＡ分子、または導入遺伝子の人工的、合成的もしくは他の改変バージョンをコードするＤＮＡ分子などの同一植物由来のＤＮＡ分子、別の植物由来のＤＮＡ分子、異なる生物由来のＤＮＡ分子または合成ＤＮＡ分子を包含し得る。本発明のコンストラクト内への組込みを目的とする例示的な転写可能なＤＮＡ分子には、例えば、ＤＮＡ分子が組み込まれる種以外の種に由来するＤＮＡ分子もしくは遺伝子、または同一種に由来するもしくは同一種に存在するが、伝統的な育種技術ではなく遺伝子工学的手法によって受容細胞に組み込まれる遺伝子が含まれる。
【００６５】
「導入遺伝子」は、少なくとも宿主細胞ゲノム内のその位置に関して宿主細胞に対して異種性の転写可能なＤＮＡ分子及び／または現世代もしくは任意の前世代細胞内の宿主細胞ゲノムに人工的に組み込まれる転写可能なＤＮＡ分子を意味する。
【００６６】
調節エレメント、例えば本発明のプロモーターなどは、調節エレメントに関して異種性の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。本明細書で使用される用語「異種性（の）」は、２つ以上のＤＮＡ分子の組合せであって、このような組合せが通常自然に存在しない時の組合せを意味する。例として、例えば同一種由来の異なる遺伝子または異なる種由来の同一遺伝子のように、２つのＤＮＡ分子は異なる種に由来する場合がある、及び／または、２つのＤＮＡ分子は異なる遺伝子に由来する場合がある。したがって調節エレメントは、このような組合せが通常自然に存在しない、すなわち調節エレメントに作動可能に連結される転写可能なＤＮＡ分子が自然に発生しない場合、作動可能に連結される転写可能なＤＮＡ分子に対して異種性である。
【００６７】
転写可能なＤＮＡ分子は、一般的に転写の発現が望まれる任意のＤＮＡ分子であり得る。このような転写産物の発現は、得られたｍＲＮＡ分子の翻訳、ひいてはタンパク質発現をもたらし得る。あるいは、例えば転写可能なＤＮＡ分子は、最終的に特定の遺伝子またはタンパク質の発現減少を引き起こすように設計され得る。一実施形態では、これはアンチセンス方向に向いた転写可能なＤＮＡ分子を用いることによって達成され得る。当業者は、このようなアンチセンス技術の使用について精通している。任意の遺伝子をこのような手法で負に調節する場合があり、一実施形態において、転写可能なＤＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子の発現を介して特定の遺伝子を抑制するために設計される場合がある。
【００６８】
したがって、本発明の一実施形態は、コンストラクトが遺伝子組換え植物細胞のゲノムに組み込まれた場合に、転写可能なＤＮＡ分子の転写を望ましいレベルまたは望ましいパターンで調節するように、異種性の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される、例えば配列番号１〜１５として提供される、本発明の調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子である。一実施形態では、転写可能なＤＮＡ分子は遺伝子のタンパク質コード領域を含み、別の実施形態では、転写可能なＤＮＡ分子は遺伝子のアンチセンス領域を含む。
【００６９】
農学的に重要な遺伝子
転写可能なＤＮＡ分子は、農学的に重要な遺伝子であり得る。本明細書で使用される用語「農学的に重要な遺伝子」は、特定の植物組織、細胞または細胞の種類で発現されるとき、望ましい特性を与える転写可能なＤＮＡ分子を意味する。農学的に重要な遺伝子の産物は、植物形態学、生理学、生育、発生、収穫量、穀物組成、栄養的プロファイル、病害もしくは病虫害抵抗性及び/または環境耐性もしくは薬剤耐性に関して影響を及ぼすため植物内で作用し得るか、または植物表面に撒く餌に含まれる殺虫剤として作用し得る。本発明の一実施形態では、本発明の調節エレメントは、調節エレメントが、農学的に重要な遺伝子である転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されるように、コンストラクトに組み込まれる。このようなコンストラクトを含有する遺伝子組換え植物において、農学的に重要な遺伝子の発現は、有益な農学的特性を与える可能性がある。有益な農業的特性は、例えば、これに限定されないが、除草剤抵抗性、昆虫防除、収穫量改変、病害抵抗性、病原体抵抗性、植物の生育及び発生の改変、デンプン含有量の改変、油含有量の改変、脂肪酸含有量の改変、タンパク質含有量の改変、果実熟成の改変、動物及びヒトの栄養増強、生体高分子の産生、環境ストレス耐性、医薬品ペプチド、加工品質の改良、風味の改良、雑種種子産生の有用性、繊維産生の改良、ならびに望ましいバイオ燃料の産生が包含され得る。
【００７０】
当該技術分野において公知の農学的に重要な遺伝子の例として、除草剤抵抗性（米国特許第６，８０３，５０１号、同第６，４４８，４７６号、同第６，２４８，８７６号、同第６，２２５，１１４号、同第６，１０７，５４９号、同第５，８６６，７７５号、同第５，８０４，４２５号、同第５，６３３，４３５号、及び同第５，４６３，１７５号）、収穫量増加（米国再発行特許第３８，４４６号、同第６，７１６，４７４号、同第６，６６３，９０６号、同第６，４７６，２９５号、同第６，４４１，２７７号、同第６，４２３，８２８号、同第６，３９９，３３０号、同第６，３７２，２１１号、同第６，２３５，９７１号、同第６，２２２，０９８号、及び同第５，７１６，８３７号）、昆虫防除（米国特許第６，８０９，０７８号、同第６，７１３，０６３号、同第６，６８６，４５２号、同第６，６５７，０４６号、同第６，６４５，４９７号、同第６，６４２，０３０号、同第６，６３９，０５４号、同第６，６２０，９８８号、同第６，５９３，２９３号、同第６，５５５，６５５号、同第６，５３８，１０９号、同第６，５３７，７５６号、同第６，５２１，４４２号、同第６，５０１，００９号、同第６，４６８，５２３号、同第６，３２６，３５１号、同第６，３１３，３７８号、同第６，２８４，９４９号、同第６，２８１，０１６号、同第６，２４８，５３６号、同第６，２４２，２４１号、同第６，２２１，６４９号、同第６，１７７，６１５号、同第６，１５６，５７３号、同第６，１５３，８１４号、同第６，１１０，４６４号、同第６，０９３，６９５号、同第６，０６３，７５６号、同第６，０６３，５９７号、同第６，０２３，０１３号、同第５，９５９，０９１号、同第５，９４２，６６４号、同第５，９４２，６５８号、同第５，８８０，２７５号、同第５，７６３，２４５号、及び同第５，７６３，２４１号）、真菌病抵抗性（米国特許第６，６５３，２８０号、同第６，５７３，３６１号、同第６，５０６，９６２号、同第６，３１６，４０７号、同第６，２１５，０４８号、同第５，５１６，６７１号、同第５，７７３，６９６号、同第６，１２１，４３６号、同第６，３１６，４０７号、及び同第６，５０６，９６２号）、ウイルス抵抗性（米国特許第６，６１７，４９６号、同第６，６０８，２４１号、同第６，０１５，９４０号、同第６，０１３，８６４号、同第５，８５０，０２３号、及び同第５，３０４，７３０号）、線虫抵抗性（米国特許第６，２２８，９９２号）、細菌病抵抗性（米国特許第５，５１６，６７１号）、植物の生育及び発生（米国特許６，７２３，８９７号及び同第６，５１８，４８８号）、デンプン産生（米国特許第６，５３８，１８１号、同第６，５３８，１７９号、同第６，５３８，１７８号、同第５，７５０，８７６号、同第６，４７６，２９５号）、油産生の改変（米国特許第６，４４４，８７６号、同第６，４２６，４４７号、及び同第６，３８０，４６２号）、高い油産生量（米国特許第６，４９５，７３９号、同第５，６０８，１４９号、同第６，４８３，００８号、及び同第６，４７６，２９５号）、脂肪酸含量の改変（米国特許第６，８２８，４７５号、同第６，８２２，１４１号、同第６，７７０，４６５号、同第６，７０６，９５０号、同第６，６６０，８４９号、同第６，５９６，５３８号、同第６，５８９，７６７号、同第６，５３７，７５０号、同第６，４８９，４６１号、及び同第６，４５９，０１８号）、高いタンパク質産生量（米国特許第６，３８０，４６６号）、果実熟成（米国特許第５，５１２，４６６号）、動物及びヒトの栄養増強（米国特許第６，７２３，８３７号、同第６，６５３，５３０号、同第６，５４１２，５９号、同第５，９８５，６０５号、及び同第６，１７１，６４０号）、生体高分子（米国再発行特許第３７，５４３号、同第６，２２８，６２３号、及び同第５，９５８，７４５号、及び同第６，９４６，５８８号）、環境ストレス抵抗性（米国特許第６，０７２，１０３号）、医薬品ペプチド及び分泌性ペプチド（米国特許第６，８１２，３７９号、同第６，７７４，２８３号、同第６，１４０，０７５号、及び同第６，０８０，５６０号）、加工特性の改良（米国特許第６，４７６，２９５号）、消化性の改良（米国特許第６，５３１，６４８号）、低ラフィノース（米国特許第６，１６６，２９２号）、産業用酵素の生産（米国特許第５，５４３，５７６号）、風味の改良（米国特許第６，０１１，１９９号）、窒素固定（米国特許第５，２２９，１１４号）、雑種種子産生（米国特許第５，６８９，０４１号）、繊維産生（米国特許第６，５７６，８１８号、同第６，２７１，４４３号、同第５，９８１，８３４号、及び同第５，８６９，７２０号）ならびにバイオ燃料産生（米国特許第５，９９８，７００号）が包含される。
【００７１】
あるいは、農学において重要な遺伝子は、内在性遺伝子の遺伝子発現の標的とされた調節を引き起こすＲＮＡ分子をコードすることにより、例えば、アンチセンス（例えば米国特許第５，１０７，０６５号を参照のこと）、抑制性ＲＮＡ（「ＲＮＡｉ」、例えば米国特許出願公開第２００６／０２００８７８号及び同第２００８／００６６２０６号、ならびに米国特許出願第１１／９７４，４６９号に記載の、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、トランス作用性ｓｉＲＮＡ、及び段階的ｓＲＮＡを介した機序による遺伝子発現の調節を包含する）、または共抑制を介した機序によって、上記の植物の特徴または表現型に影響を与える可能性がある。ＲＮＡは、望ましい内在性ｍＲＮＡ産物を切断するように操作された触媒ＲＮＡ分子（例えばリボザイムまたはリボスイッチなど、例えば米国特許第２００６／０２００８７８号などを参照のこと）であってもよい。転写可能なＤＮＡ分子が遺伝子抑制を引き起こすことが可能な分子に転写されるような手法でコンストラクトを構築し、細胞に導入する方法は、当該分野で公知である。
【００７２】
選択マーカー
選択マーカー導入遺伝子を本発明の調節エレメントと共に用いてもよい。本明細書で使用される用語「選択マーカー導入遺伝子」は、遺伝子組換え植物、組織または細胞内でのその発現、またはその欠如に対し、何らかの方法によってスクリーニングまたはスコア化が可能である、任意の転写可能なＤＮＡ分子を意味する。本発明の実施において用いられる、選択マーカー遺伝子、ならびにそれに関連するセレクション及びスクリーニング技術は、当該技術分野において公知であり、限定されないが、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、抗生物質耐性を付与するタンパク質及び除草剤抵抗性を付与するタンパク質をコードする転写可能なＤＮＡ分子を包含する。選択マーカー導入遺伝子の例は、配列番号１７として提供される。
【００７３】
細胞形質転換
また本発明は、転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結される１つ以上の調節エレメントを含む形質転換細胞及び植物を産生する方法に関する。
【００７４】
本明細書で使用される用語「形質転換」は、受容宿主へのＤＮＡ分子の導入を意味する。本明細書で使用される用語「宿主」は、細菌、真菌、または植物のあらゆる細胞、組織、器官、または子孫を含む、細菌、真菌、または植物を意味する。特に重要な植物の組織及び細胞には、プロトプラスト、カルス、根、塊茎、種子、茎、葉、実生、胚、及び花粉が包含される。
【００７５】
本明細書で使用される用語「形質転換（された）」は、例えばコンストラクトなどの外来ＤＮＡ分子が導入された細胞、組織、器官、または生物を意味する。導入されたＤＮＡ分子は、導入されたＤＮＡ分子が後の子孫に遺伝されるように、受容細胞、受容組織、受容器官、または受容生物のゲノムＤＮＡに組み込まれ得る。また「遺伝子組換え」または「形質転換」細胞または生物には、細胞または生物の子孫、及びこのような遺伝子組換え生物を親として交配に使用する育種プログラムから産生され、外来ＤＮＡ分子の存在により得られる変化した表現型を示す子孫も包含され得る。また導入されたＤＮＡ分子は、導入されたＤＮＡ分子が後の子孫に遺伝されないように、一過的に受容細胞に導入され得る。用語「遺伝子組換え（の）」は、１つ以上の異種性ＤＮＡ分子を含有する細菌、真菌、または植物を意味する。
【００７６】
ＤＮＡ分子を植物細胞に導入するための、当業者に周知の多くの方法が存在する。プロセスは、一般的に、適切な宿主細胞を選択し、宿主細胞においてベクターを用いて形質転換し、形質転換された宿主細胞を得るという段階を含む。本発明の実施において植物コンストラクトを植物ゲノムに導入することにより植物細胞を形質転換する方法及び材料は、任意の周知かつ実証された方法を包含し得る。適切な方法としては、これに限定されないが、特に、細菌感染（例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍなど）、バイナリーＢＡＣベクター、ＤＮＡの直接的送達（例えば、ＰＥＧを介した形質転換、乾燥／阻害を介したＤＮＡの取り込み、エレクトロポレーション、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌、及びＤＮＡ被覆粒子の加速などによる）、遺伝子編集（例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムなど）を包含する。
【００７７】
宿主細胞は、例えば植物細胞、藻細胞、藻類、真菌細胞、真菌、細菌細胞、または昆虫細胞などの、任意の細胞または生物であってもよい。具体的な実施形態では、宿主細胞及び形質転換細胞は、収穫植物から得た細胞を包含し得る。
【００７８】
遺伝子組換え植物は後に、本発明の遺伝子組換え植物細胞から再生され得る。従来の育種技術または自家受粉を使用して、種子をこの遺伝子組換え植物から産生してもよい。このような種子、及びこのような種子から生育されて得られた子孫植物は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有し、したがって遺伝子組換え体になる。
【００７９】
本発明の遺伝子組換え植物は、自家受粉させることで、本発明のホモ接合性遺伝子組換え植物の（組換えＤＮＡ分子に関してホモ接合性である）種子を産生する可能性があり、または非遺伝子組換え植物あるいは異なる遺伝子組換え植物と交配することで、本発明のヘテロ接合性遺伝子組換え植物の（組換えＤＮＡ分子に関してヘテロ接合性である）種子を産生する可能性がある。本明細書において、このようなホモ接合性及びヘテロ接合性遺伝子組換え植物は、いずれも「子孫植物」を意味する。子孫植物は、元の遺伝子組換え植物の子孫であり、かつ本発明の組換えＤＮＡ分子を含有する遺伝子組換え植物である。本発明の遺伝子組換え植物を使用して産生された種子は、本発明のコンストラクトを含み農学的に重要な遺伝子を発現する遺伝子組換え植物の世代、すなわち本発明の子孫植物を生育するために収穫及び使用され得る。種々の作物に一般に使用される育種法の記載は、いくつかの参考文献のうちの１冊に提供される可能性があり、例えば、Ａｌｌａｒｄ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｕ．ｏｆ  ＣＡ，Ｄａｖｉｓ，ＣＡ，５０−９８（１９６０）、Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃｒｏｐ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，３６９−３９９（１９７９）、Ｓｎｅｅｐ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｋｓｅｎ，Ｐｌａｎｔ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ（ｅｄ），Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ（１９７９）、Ｆｅｈｒ，Ｓｏｙｂｅａｎｓ：Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ，１６：２４９（１９８７）、Ｆｅｈｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｖａｒｉｅｔｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，（Ｖｏｌ．１）及びＣｒｏｐ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｓｏｙｂｅａｎ（Ｖｏｌ．２），Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ＮＹ，３６０−３７６（１９８７）を参照のこと。
【００８０】
形質転換植物は、重要な遺伝子（複数可）の存在ならびに本発明の調節エレメントによって与えられた発現レベル及び／または発現プロファイルに関して解析され得る。当業者は、形質転換植物の解析に関して数多くの方法が利用可能であることを認識している。例えば、植物解析の方法は、これに制限されないが、サザンブロットまたはノーザンブロット、ＰＣＲベースの手法、生化学的解析、表現型スクリーニング法、現地評価及び免疫診断アッセイを包含する。転写可能なＤＮＡ分子の発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）試薬及びメーカーによって記載された方法ならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘを使用して決定されたＰＣＲサイクル時間を使用して測定され得る。あるいは、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）試薬及びメーカーによって記載された方法を使用して導入遺伝子の発現が評価され得る。
【００８１】
また本発明は、本発明の植物の部分も提供する。植物の部分には、限定されないが、葉、茎、根、塊茎、種子、胚乳、胚珠、及び花粉が包含される。本発明の植物の部分は、生育可能である、生育不可能である、再生可能である及び／または再生不可能であり得る。また本発明は、本発明のＤＮＡ分子を含む形質転換植物細胞を包含し、提供する。本発明の形質転換細胞または遺伝子組換え植物細胞は、再生可能な及び／または再生不可能な植物細胞を包含する。
【００８２】
また本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含む遺伝子組換え植物またはその一部から産生された商品生産物を提供する。本発明の商品生産物は、配列番号１〜１５からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む検出可能な量のＤＮＡを含有する。本明細書で使用される用語「商品生産物」は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有する遺伝子組換え植物、種子、植物細胞または植物の一部に由来する材料を含む、任意の組成物または製品を意味する。商品生産物は、限定されないが、加工された種子、穀粒、植物部分及びミールを包含する。本発明の商品生産物は、本発明の組換えＤＮＡ分子に対応する検出可能な量のＤＮＡを含有する。商品生産物の成分または原料を判断するため、試料中の１つ以上のこのＤＮＡの検出法が使用され得る。本開示に記載の検出方法を包含する、任意の標準的なＤＮＡ分子の検出方法が使用され得る。
【００８３】
本発明は指示のない限り、実例として提供されながら本発明の限定を意図しない以下の実施例の参照により、さらに容易に理解され得る。以下の実施例で開示される技術が、本発明の実施で十分に機能することが本発明者により認められた技術を表すことは、当業者に理解されるべきである。しかし、本開示に照らして、多くの変更が開示された具体的な実施形態において成される可能性があり、また依然として、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得る可能性があり、したがって、添付の図面に明記または示される全ての事項が、限定的な意味ではなく、実例として解釈されるべきであることは当業者に理解されるべきである。
【実施例】
【００８４】
実施例１
調節エレメントの同定及びクローニング
新規の転写性調節エレメント及び調節発現エレメント群（ＥＸＰ）を同定し、双子葉植物種Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ（ＷＳＨ−３９−１０７０ＡＮ）及びＭｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａのゲノムＤＮＡからクローニングした。
【００８５】
転写性調節エレメントは、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて実施する転写性プロファイリング実験から得た専有及び公的のマイクロアレイデータ、ならびに専有のＣｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏならびに専有及び公的のＭｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ配列に対するクエリとして既知の双子葉植物配列を使用した、相同性ベースの検索に基づいて選択された。
【００８６】
同定した配列を使用してバイオインフォマティクス解析を行い、増幅ＤＮＡ内にある調節エレメントを同定した。例えば、バイオインフォマティクス解析を行い、配列中に存在する転写開始部位（ＴＳＳ）及び任意の双方向性、イントロンまたは上流コード配列を同定した。この解析結果を使用して調節エレメントをＤＮＡ配列内で決定し、調節エレメントを増幅するためにプライマーを設計した。各調節エレメントに対応するＤＮＡ分子は、独自の制限酵素部位ならびにＣｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ及びＭｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａから単離したゲノムＤＮＡを含有するプライマーを用いて、標準的なポリメラーゼ連鎖反応条件を使用して増幅した。得られたＤＮＡ断片を、適合する制限部位の標準的な制限酵素消化及びＤＮＡライゲーション法を使用して、ベース植物発現ベクター内にライゲーションした。
【００８７】
調節エレメントＴＳＳ及びイントロン／エクソンスプライスジャンクションの解析は、形質転換植物組織を使用して実行され得る。簡潔には、植物を、異種性の転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に連結されるクローン化ＤＮＡ断片を含む植物発現ベクターを用いて形質転換させる。次に、５’  ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９２００８）を使用して、産生されるｍＲＮＡ転写物のＤＮＡ配列を解析することで、調節エレメントＴＳＳ及びイントロン／エクソンスプライスジャンクションを確認する。
【００８８】
リーダーエレメントに作動可能に連結されるプロモーターエレメントを含む、Ｃｕｃｕｍｉｓ及びＭｅｄｉｃａｇｏの転写調節発現エレメント群またはＥＸＰ配列をコードするＤＮＡ配列を、対応するプロモーター及びリーダーと共に表１に示す。
【００８９】
【表１】
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【００９０】
実施例２
安定的に形質転換されたダイズ植物におけるＧＵＳ発現を駆動する調節エレメントの解析
ダイズ植物において、ベクターを用いて、具体的には、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する試験用転写調節発現エレメントを含有する植物発現ベクターを用いて形質転換した。得られた植物をＧＵＳタンパク質発現に関して解析し、発現に関して選択された調節エレメントの作用を評価した。
【００９１】
ダイズ植物を、表２に記載された植物ＧＵＳ発現コンストラクトを用いて形質転換した。調節エレメントを、当該技術分野において公知の標準的な方法を用いてベース植物発現ベクターにクローニングした。得られた植物発現ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来の右境界領域（Ｂ−ＡＧＲｔｕ．右境界）、除草剤グリホサートまたは抗生物質スペクチノマイシンのいずれかへの抵抗性を付与する形質転換植物細胞において、そのセレクションに使用される第１の導入遺伝子セレクションカセット、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ  Ｅ６遺伝子（Ｔ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：３ｂ：１、配列番号１８）由来の３’末端領域に５’が作動可能に連結されるジャガイモ光誘導性組織特異的ＳＴ−ＬＳ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｘ０４７５３）由来のプロセシング可能なイントロンを含有するβ−グルクロニダーゼのコード配列（ＧＵＳ、ＧＯＩ−Ｅｃ．ｕｉｄＡ＋Ｓｔ．ＬＳ１：１：１、配列番号１７）に５’が作動可能に連結されるＥＸＰ配列を含む調節エレメントの活性を評価する第２の導入遺伝子カセット及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｂ−ＡＧＲｔｕ．左境界）由来の左境界領域を含有する。
【００９２】
【表２】
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【００９３】
ダイズ植物細胞は、当該技術分野で公知の方法を用いたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介した形質転換によって、上述のバイナリー形質転換ベクターコンストラクトを使用して形質転換された。得られた形質転換植物細胞を誘導して、ダイズ植物全体を形成した。
【００９４】
組織化学的なＧＵＳ解析を、形質転換植物の定性的及び定量的な発現解析に用いた。全組織切片をＧＵＳ染色溶液Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−グルクロニド）（１ミリグラム／ミリリットル）と共に適切な長さの時間でインキュベートし、すすぎ、青色着色について目視検査した。ＧＵＳ活性を、選択した植物器官及び組織を使用して、直接的目視検査または顕微鏡下での検査によって定性的に決定した。
【００９５】
ＧＵＳ発現の定量的分析については、総タンパク質を、形質転換ダイズ植物の選択された組織から抽出した。総タンパク質のうち１マイクログラムを、５０マイクロリットルの総反応体積で、蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）と共に使用した。反応生成物である、４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）は、高ｐＨで最大の蛍光性を示し、ヒドロキシル基はイオン化されている。炭酸ナトリウムの塩基性溶液の追加は同時にアッセイを停止し、蛍光産物を定量化するためにｐＨを調整する。蛍光は、Ｍｉｃｒｏｍａｘ  Ｒｅａｄｅｒと共にＦｌｕｏｒｏｍａｘ−３を使用して、３６５ｎｍの励起、４４５ｎｍの発光で測定し、スリット幅は、励起２ｎｍ及び発光３ｎｍに設定した。値は、総タンパク質ＧＵＳ／時間／ｍｇの単位で提供される。
【００９６】
Ｒ０世代において以下の組織、ステージＶｎ５のシンク葉、ソース葉及び根、ステージＲ１の葉柄、ソース葉、花及び子葉、ステージＲ３の鞘及び未成熟種子、ならびにステージ黄色鞘の胚及び子葉を、ＧＵＳ発現に関してサンプリングした。以下の表３及び４は、表２に示された調節エレメントによって駆動される各サンプリング組織についての平均定量的ＧＵＳ発現を示す。
【００９７】
【表３】
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【００９８】
【表４】
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【００９９】
表３及び４に見られるように、各調節エレメントは、採取された組織において独自の発現パターンを有する。ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｆｅ２：１（配列番号１）及びＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ＣｉｐＬｈｃｂ：１（配列番号４）は、共にＲ３鞘において高発現を示し、またＲ３未成熟種子、Ｖｎ５根、Ｒ５子葉ならびに黄色鞘ステージの胚及び子葉において最小の発現レベルを示す。ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｆｅ２：１によって駆動されるＧＵＳ発現は、Ｖｎ５ステージのシンク及びソース葉ならびにＲ１ステージの葉柄、ソース葉及び花においても高かった。調節エレメントＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｂｂｚ：１（配列番号７）はＶｎ５ステージのシンク及びソース葉ならびにＲ３ステージの鞘において最大の発現を示した。ＥＸＰ−Ｍｔ．Ｌｈｃｂ２：１：１（配列番号１０）によって駆動されるＧＵＳ発現は、Ｖｎ５ステージのソース葉及びＲ１葉柄において最大であった。ＥＸＰ−Ｍｔ．ＰＳＩＩ−Ｔ：１：１（配列番号１３）は、Ｒ１ステージのソース葉において最大の発現を示した。
【０１００】
各調節エレメントは、発現に関する望ましい組織選択に応じて、種々の導入遺伝子の発現に最適に駆動するよう使用され得る独自の発現パターンを提供する。
【０１０１】
実施例３
調節エレメント由来のエンハンサーエレメント
エンハンサーは、配列番号２、５、８、１１及び１４として示される、プロモーターエレメントに由来する。エンハンサーエレメントは、５’もしくは３’がプロモーターエレメントに作動可能に連結されるか、または５’もしくは３’が作動可能に、プロモーターに作動可能に連結される追加のエンハンサーエレメントに連結された場合、特定の細胞の種類もしくは植物器官で、または発生もしくは概日リズムにおける特定の時点で、転写可能なＤＮＡ分子の発現レベルを増強もしくは調整し得るか、または転写可能なＤＮＡ分子の発現を提供し得る、１つ以上のシス調節エレメントを含む場合がある。エンハンサーは、例えば配列番号２、５、８、１１及び１４として示される配列、またはその断片など、プロモーター配列から転写を開始させるＴＡＴＡボックスまたは機能的に類似のエレメント及びプロモーターより下流の任意の配列を除去することによって作成される。
【０１０２】
植物プロモーター中のＴＡＴＡボックスは、他のいくつかの真核生物のように高度に保存されていない。したがって、エンハンサーとしての断片を定義するために、まず、５’ＵＴＲが最初に転写される遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）を同定しなければならない。例えば、転写調節エレメントＥＸＰ−Ｍｔ．Ｌｈｃｂ２：１：１（配列番号１０）は、５’ＵＴＲまたはリーダーエレメントＬ−Ｍｔ．Ｌｈｃｂ２−１：２：１（配列番号１２）に作動可能に連結される、プロモーターエレメントＰ−Ｍｔ．Ｌｈｃｂ２−１：２：１（配列番号１１）を含む。１８３７ｂｐのプロモーターエレメントＰ−Ｍｔ．Ｌｈｃｂ２−１：２：１（配列番号１１）内で、推定コアＴＡＴＡ様エレメントがヌクレオチド１７９８〜１８０３の範囲に認められる。Ｐ−Ｍｔ．Ｌｈｃｂ２−１：２：１に由来するエンハンサー断片は、配列番号１１のヌクレオチド１〜１７９７を含み、最終的に配列番号１６（Ｅ−Ｍｔ．Ｌｈｃｂ２）として示される配列になり得る。プロモーターＰ−Ｍｔ．Ｌｈｃｂ２−１：２：１（配列番号１１）由来のエンハンサーは、Ｅ−Ｍｔ．Ｌｈｃｂ２（配列番号１６）のより小さい断片をさらに含み得る。プロモーターＰ−Ｍｔ．Ｌｈｃｂ２−１：２：１（配列番号１１）に由来するエンハンサーエレメントの有効性は、プロモーター及びリーダーに作動可能に連結され、安定的または一過的植物アッセイにおいて、例えばＧＵＳなどのような転写可能なＤＮＡ分子の発現の駆動に使用される、プロモーターＰ−Ｍｔ．Ｌｈｃｂ２−１：２：１（配列番号１１）に由来するエンハンサーを含む、キメラ転写調節エレメントを構築することによって経験的に決定される。
【０１０３】
エンハンサーエレメントのさらなる改良が必要とされる場合があり、経験的に検証される。さらに、キメラの転写調節エレメントの範囲内の各エレメントの順序が、各エレメントの相対的な位置に応じて様々な作用を与え得るため、キメラの転写調節エレメントの範囲内の他のエレメントに関連するエンハンサーエレメントの位置も、同様に経験的に決定される。一部のプロモーターエレメントは、複数のＴＡＴＡボックスまたはＴＡＴＡボックス様エレメント、及び複数の潜在的な転写開始部位を有する。このような状況下では、最初のＴＳＳがどこに位置するかを最初に特定し、また推定エンハンサーエレメント内で潜在的な転写開始が起こるのを防ぐため、最初のＴＳＳを使用したエンハンサー設計の開始が必要とされ得る。
【０１０４】
配列番号２、５、８、１１及び１４として示されるプロモーターエレメント由来のエンハンサーエレメントを、５’もしくは３’がプロモーターエレメントに作動可能に連結されるか、または５’もしくは３’が作動可能に、プロモーターに作動可能に連結される追加のエンハンサーエレメントに連結されるように、当該技術分野で公知の方法を使用してクローニングした。あるいは、エンハンサーエレメントを、２つ以上のエンハンサーのコピーを含む、より大きなエンハンサーエレメントを提供するため、当該技術分野で公知の方法を使用してクローニングする可能性があり、また、プロモーターエレメントに５’もしくは３’が作動可能に連結されるように、またはプロモーターに作動可能に連結される追加のエンハンサーエレメントに、５’もしくは３’が作動可能に連結されるように、当該技術分野で公知の方法を使用してクローニングし、キメラ転写調節エレメントを産生する可能性がある。またエンハンサーエレメントは、異なる種類の生物に由来するプロモーターエレメントに５’が作動可能に連結されるか、または同一もしくは異なる種類の生物のいずれかに由来するプロモーターに作動可能に連結される、他の種類に由来する追加のエンハンサーエレメントに、５’もしくは３’が作動可能に連結されるように、当該技術分野で公知の方法を使用してクローニングされ、キメラ転写調節エレメントを生じる。ＧＵＳ発現植物形質転換ベクターは、得られた植物発現ベクターがＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来の右境界領域（Ｂ−ＡＧＲｔｕ．右境界）、抗生物質スペクチノマイシンに抵抗性を付与する形質転換植物細胞のセレクションに使用される、第１の導入遺伝子セレクションカセット、ならびに、５’もしくは３’がプロモーターエレメントに作動可能に連結されるエンハンサーエレメントか、またはＧｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ  Ｅ６遺伝子（Ｔ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：３ｂ：１、配列番号１８）由来の３’末端領域に作動可能に連結されるジャガイモ光誘導性組織特異的ＳＴ−ＬＳ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｘ０４７５３）由来のプロセシング可能なイントロンを含有するβ−グルクロニダーゼのコード配列（ＧＵＳ、ＧＯＩ−Ｅｃ．ｕｉｄＡ＋Ｓｔ．ＬＳ１：１：１、配列番号１７）に作動可能に連結されるリーダーエレメントに５’が作動可能に連結されるプロモーターに作動可能に連結される追加のエンハンサーエレメントに５’もしくは３’が作動可能に連結されるエンハンサーエレメント、を含む、エンハンサーエレメントを試験するための第２の導入遺伝子カセット、及びＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来の左境界領域（Ｂ−ＡＧＲｔｕ．左境界）を含む、上の実施例２に記載されたコンストラクトに類似する、当該技術分野で公知の方法を使用して作成され得る。得られたプラスミドは、上記の方法により、ダイズ植物または他の種類の植物を形質転換するために使用される。あるいは、ダイズまたは他の種類の植物由来のプロトプラスト細胞を、一過的アッセイを行うために当該技術分野で公知の方法を使用して形質転換する。
【０１０５】
１つ以上のエンハンサーを含む調節エレメントにより駆動されるＧＵＳ発現は、転写可能なＤＮＡ分子の発現に関するエンハンサーエレメントの作用を決定する安定的または一過的植物アッセイにより評価される。１つ以上のエンハンサーエレメントに対する改変、または１つ以上のエンハンサーエレメントの複製は、経験的実験及び各調節エレメント組成物を使用することで観察される結果の遺伝子発現調節に基づいて実行され得る。得られた調節エレメントまたはキメラ調節エレメント中の１つ以上のエンハンサーの相対的な位置の変更は、調節エレメントまたはキメラ調節エレメントの転写活性または特異性に影響を与える場合があり、コーン植物または他の種類の植物の範囲において望ましい導入遺伝子発現プロファイルに対する最も優れたエンハンサーを同定するために経験的に決定される。
【０１０６】
本発明の原理を例示及び記載したことから、当業者には、このような原理から逸脱することなく、本発明を配置及び詳細について改変し得ることは明らかとなるはずである。本発明者らは、特許請求の範囲の趣旨及び範囲内にある全ての変更を主張する。本明細書で引用された全ての刊行物及び公開特許文献は、各々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることを具体的かつ個々に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【配列表】
2019508047000001.app
【国際調査報告】
2019508047.tif 000006
2019508047.tif 000007
2019508047.tif 000008
2019508047.tif 000009