(57)【要約】抗CD27抗体、その抗原結合性フラグメント、およびそのものの医学的使用である。さらに、抗CD27抗体のCDRを含むキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む薬学組成物、および抗ガン薬としてのそのものの使用を提供する。本発明は特に、ヒト抗CD27抗体およびCD27媒介疾患または障害を処置するための薬物の調製におけるその使用に関する。
2019531732.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の：
配列番号6、配列番号7、配列番号8；配列番号14、配列番号15または配列番号16から選ばれる配列において示される少なくとも一のLCDRが含まれる抗体軽鎖可変領域；および
配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号11、配列番号12または配列番号13から選ばれる配列において示される少なくとも一のHCDRが含まれる抗体重鎖可変領域
を含む、抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
抗体軽鎖可変領域には、配列番号6または配列番号14において示されるLCDR1が含まれる、請求項1に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
抗体軽鎖可変領域には、配列番号7または配列番号15において示されるLCDR2が含まれる、請求項1に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
抗体軽鎖可変領域には、配列番号8または配列番号16において示されるLCDR3が含まれる、請求項1に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
抗体重鎖可変領域には、配列番号3または配列番号11において示されるHCDR1が含まれる、請求項1に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項６】
抗体重鎖可変領域には、配列番号4または配列番号12において示されるHCDR2が含まれる、請求項1に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
抗体重鎖可変領域には、配列番号5または配列番号13において示されるHCDR3が含まれる、請求項1に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
抗体軽鎖可変領域には、配列番号6、配列番号7および配列番号8においてそれぞれ示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3が含まれる、請求項1に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
抗体軽鎖可変領域には、配列番号14、配列番号15および配列番号16においてそれぞれ示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3が含まれる、請求項1に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１０】
抗体重鎖可変領域には、配列番号3、配列番号4および配列番号5においてそれぞれ示されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3が含まれる、請求項1に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１】
抗体重鎖可変領域には、配列番号11、配列番号12および配列番号13においてそれぞれ示されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3が含まれる、請求項1に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１２】
抗体軽鎖可変領域には、次の：
配列番号6、配列番号7および配列番号8においてそれぞれ示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3；または
配列番号14、配列番号15および配列番号16においてそれぞれ示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3
が含まれ；
および、抗体重鎖可変領域には、次の：
配列番号3、配列番号4および配列番号5においてそれぞれ示されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3；または
配列番号11、配列番号12および配列番号13においてそれぞれ示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3
が含まれる、請求項1に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１３】
抗体軽鎖可変領域には、配列番号6、配列番号7および配列番号8においてそれぞれ示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3が含まれ；抗体重鎖可変領域には、配列番号3、配列番号4および配列番号5においてそれぞれ示されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3が含まれる、請求項12に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１４】
抗体軽鎖可変領域には、配列番号14、配列番号15および配列番号16においてそれぞれ示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3が含まれ；抗体重鎖可変領域には、配列番号11、配列番号12および配列番号13においてそれぞれ示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3が含まれる、請求項12に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１５】
抗体軽鎖可変領域の配列は配列番号2または配列番号10から選ばれ；重鎖可変領域の配列は配列番号1または配列番号9から選ばれる、請求項12に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１６】
抗体軽鎖可変領域の配列は配列番号2であり、重鎖可変領域の配列は配列番号1である、請求項12に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１７】
抗体軽鎖可変領域の配列は配列番号10であり、重鎖可変領域の配列は配列番号9である、請求項12に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１８】
抗体またはその抗原結合性フラグメントはネズミ抗体またはそのフラグメントである、請求項1ないし17のいずれか一項に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１９】
抗体またはその抗原結合性フラグメントはキメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項1ないし17のいずれか一項に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２０】
抗体またはその抗原結合性フラグメントはヒト化抗体またはそのフラグメントである、請求項1ないし17のいずれか一項に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２１】
抗体またはその抗原結合性フラグメントはヒト抗体またはそのフラグメントである、請求項1ないし17のいずれか一項に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２２】
抗体軽鎖可変領域配列の配列は配列番号2もしくは配列番号10またはそれらの異形であり；異形はなるべくなら軽鎖可変領域において0-10個のアミノ酸変動（群）をもつ、請求項21に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２３】
抗体重鎖可変領域の配列は配列番号1もしくは配列番号9またはそれらの異形であり；異形はなるべくなら重鎖可変領域において0-10個のアミノ酸変動（群）をもつ、請求項21に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２４】
請求項1-23のいずれか一項の抗体をコードするDNA配列。
【請求項２５】
請求項24のDNA配列を含む発現ベクター。
【請求項２６】
請求項25の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項２７】
宿主細胞は、細菌であり、なるべくならE. coli（エシェリキア・コリ）であることを特徴とする、請求項25に従う宿主細胞。
【請求項２８】
宿主細胞は、酵母であり、なるべくならpichia pastoris（ピキア・パストリス）であることを特徴とする、請求項25に従う宿主細胞。
【請求項２９】
宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、なるべくならチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはヒト胚腎臓（HEK）293細胞であることを特徴とする、請求項25に従う宿主細胞。
【請求項３０】
請求項1-17のいずれか一項の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含む、薬学組成物。
【請求項３１】
請求項1-17のいずれか一項に規定する軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、多特異性抗体。
【請求項３２】
請求項1-17のいずれか一項に規定する軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、一本鎖抗体。
【請求項３３】
抗体は請求項1-17のいずれか一項に規定する軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、抗体-薬物コンジュゲート。
【請求項３４】
請求項1ないし17のいずれか一項に従う抗CD27抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または請求項30に従う薬学組成物、または請求項31に従う多特異性抗体、または請求項32に従う一本鎖抗体、または請求項33に従う抗体-薬物コンジュゲートの、CD27媒介の疾患または状態を処置または妨げるための薬の調製における使用であり；疾患は、なるべくガンおよび自己免疫疾患であり；より一層なるべくならCD27発現ガンおよび自己免疫疾患であり；最もなるべくならガンは、直腸ガン、脳ガン、腎臓ガン、肺ガン、肝臓ガン、多発性骨髄腫およびメラニンであり；最もなるべくなら自己免疫疾患は、自己免疫性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、多発硬化および関節リウマチである、使用。
【請求項３５】
CD27媒介の疾患または状態を処置し、および妨げるにあたり、治療上有効な量の、請求項1ないし17のいずれか一項に従う抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント、または請求項30に従う薬学組成物、または請求項31に従う多特異性抗体、または請求項32に従う一本鎖抗体、または請求項33に従う抗体-薬物コンジュゲートを、それを必要とするペイシェントに対して施与することを含み；疾患は、なるべくガンおよび自己免疫疾患であり；より一層なるべくならCD27発現ガンおよび自己免疫疾患であり；最もなるべくならガンは、直腸ガン、脳ガン、腎臓ガン、肺ガン、肝臓ガン、多発性骨髄腫およびメラニンであり；最もなるべくなら自己免疫疾患は、自己免疫性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、多発硬化および関節リウマチである、方法。
【発明の詳細な説明】
【本発明の分野】
【０００１】
本発明は、CD27抗体、その抗原結合性フラグメント、CD27抗体のCDR領域を含むキメラ抗体またはヒト化抗体、ならびにヒトCD27抗体およびその抗原結合性フラグメントを含む薬学組成物、ならびに抗ガン薬としてのその使用に関する。
本発明の背景
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
腫瘍免疫療法は、長い間抗ガン薬の分野においてホットエリアであった。腫瘍免疫療法は、腫瘍ペイシェントにおいてキラーT細胞を十分に利用し、および動員することによって腫瘍を死滅させ、および破壊する。それはガンの処置のための最も効果的および最大に安全なやり方の一つであり得る。ヒトT細胞は、二つのシグナル伝達経路系を介してインビボで活性化され、そこでは、抗原提示細胞が、T細胞にMHC抗原ペプチドを提示して第一のシグナルを提供するために必要とされる。次いで、一連の共刺激分子（co-stimulatory molecules）は、第二のシグナルを提供してT細胞が正常な免疫応答を示すことを可能にさせるために必要とされる。
【０００３】
T細胞および抗原提示細胞間の相互作用は、免疫応答の発生を促進するさまざまなアクセサリー分子を必要とし、およびCD27はそれらのうちの重要なものの一つである。CD27は腫瘍壊死因子受容体（TNF-R）スーパーファミリーのメンバーであり、およびT細胞表面でCD70に結合する。CD27は、グリコシル化I型膜貫通タンパク質であり、通常、細胞外ドメインの膜近位領域に位置するジスルフィド架橋によって連結されるホモ二量体である（Camerini（カメリーニ）ら、J Immunol.（ジャーナル・オブ・イムノロジー）147：3165-69、1991）。T細胞上で架橋されるCD27抗原は共刺激シグナルを提供することができ、その一方でCD27がT細胞受容体と架橋されるとき、T細胞増殖および細胞性免疫活性化を誘導することができる。
【０００４】
CD27は成熟胸腺細胞、ほとんどのCD4+およびCD8+末梢血T細胞、ナチュラルキラー細胞およびB細胞上に発現され、およびまたB細胞非ホジキンリンパ腫およびB細胞性慢性リンパ性白血病においても高度に発現され；可溶性CD27タンパク質の上昇レベルはまた、血清において、または感染、例えば、寄生虫およびサイトメガロウイルス（CMV）、多発硬化、サルコイドーシス、ならびにB細胞性慢性リンパ性白血病などのようなものにおける疾患の活性部位にても観察される（Kobata（コバタ）Tら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ）1995（24）：11249-53；Ranheim（ランハイム）EAら、Blood．1995 85（12）：3556-65；Loenen（レーネン）WAら、Eur. J. Immunol.（ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー）1992 22：447）。
【０００５】
最近の研究は、抗CD27モノクローナル抗体アゴニストがT細胞応答を促進することができ、および潜在的な抗ガン治療用物質として使用することができることを示した（特許のWO2008051424、WO2011130434参照）。今日までに得られた結果はCD27を免疫療法のための有用な標的として識別したが、抗CD27モノクローナル抗体のどの特定の特徴が処置のために特に有益であるかは未知のままである。疾患に対してより一層効果的である潜在的に改善された抗CD27抗体をさらに得るために、抗CD27抗体のどの特定の機能的特性が治療上有効であるかを深く理解することが本技術において依然として必要である。
【０００６】
目下、若干の国際企業がCD27標的用の腫瘍抗体薬を開発している。US Celldex（USセルデックス）からの抗CD27抗体は第II相臨床試験中であり、Merck（メルク）、Aduro（アデュロ）およびApogenix（アポジェニックス）などのような会社からの関連生産物はまだ臨床前開発段階にある。
【０００７】
本発明は、高い親和性、高い選択性および高い生物学的活性を有し、望ましい有益な治療効果と関連付けることができる特定の機能的特性を有する抗CD27抗体を提供することを意図する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の概略
本発明は、次の：
配列番号6、配列番号7、配列番号8；配列番号14、配列番号15または配列番号16から選ばれる配列において示される少なくとも一のLCDRが含まれる抗体軽鎖可変領域；および
配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号11、配列番号12または配列番号13から選ばれる配列において示される少なくとも一のHCDRが含まれる抗体重鎖可変領域
を含む、抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
【０００９】
本発明の好適な実施態様において、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントでは、抗体軽鎖可変領域には、配列番号6または配列番号14において示されるLCDR1が含まれる。
【００１０】
本発明の好適な実施態様において、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントでは、抗体軽鎖可変領域には、配列番号7または配列番号15において示されるLCDR2が含まれる。
【００１１】
本発明の好適な実施態様において、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントでは、抗体軽鎖可変領域には、配列番号8または配列番号16において示されるLCDR3が含まれる。
【００１２】
本発明の好適な実施態様において、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントでは、抗体重鎖可変領域には、配列番号3または配列番号11において示されるHCDR1が含まれる。
【００１３】
本発明の好適な実施態様において、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントでは、抗体重鎖可変領域には、配列番号4または配列番号12において示されるHCDR2が含まれる。
【００１４】
本発明の好適な実施態様において、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントでは、抗体重鎖可変領域には、配列番号5または配列番号13において示されるHCDR3が含まれる。
【００１５】
本発明の好適な実施態様において、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントでは、抗体軽鎖可変領域には、配列番号6、配列番号7および配列番号8においてそれぞれ示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3が含まれる。
【００１６】
本発明の好適な実施態様において、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントでは、抗体軽鎖可変領域には、配列番号14、配列番号15および配列番号16においてそれぞれ示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3が含まれる。
【００１７】
本発明の好適な実施態様において、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントでは、抗体重鎖可変領域には、配列番号3、配列番号4および配列番号5においてそれぞれ示されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3が含まれる。
【００１８】
本発明の好適な実施態様において、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントでは、抗体重鎖可変領域には、配列番号11、配列番号12および配列番号13においてそれぞれ示されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3が含まれる。
【００１９】
本発明の好適な実施態様において、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントでは、抗体軽鎖可変領域には、次の：
配列番号6、配列番号7および配列番号8においてそれぞれ示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3；または
配列番号14、配列番号15および配列番号16においてそれぞれ示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3
が含まれ；
および、抗体重鎖可変領域には、次の：
配列番号3、配列番号4および配列番号5においてそれぞれ示されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3；または
配列番号11、配列番号12および配列番号13においてそれぞれ示されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3
が含まれる。
【００２０】
特に好適な抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントは、次のいずれかから選ぶことができる：
（1）抗体軽鎖可変領域には、配列番号6、配列番号7および配列番号8においてそれぞれ示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3が含まれ；抗体重鎖可変領域には、配列番号3、配列番号4および配列番号5においてそれぞれ示されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3が含まれる。
（2）抗体軽鎖可変領域には、配列番号14、配列番号15および配列番号16においてそれぞれ示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3が含まれ；抗体重鎖可変領域には、配列番号11、配列番号12および配列番号13においてそれぞれ示されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3が含まれる。
【００２１】
本発明の好適な実施態様において、抗体軽鎖可変領域の配列は配列番号2または配列番号10から選ばれ；重鎖可変領域の配列は配列番号1または配列番号9から選ばれる。
【００２２】
特に好適な抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントは、次のいずれかから選ぶことができる：
（1）抗体軽鎖可変領域の配列は配列番号2であり、重鎖可変領域の配列は配列番号1である。
（2）抗体軽鎖可変領域の配列は配列番号10であり、重鎖可変領域の配列は配列番号9である。
【００２３】
本発明の好適な実施態様において、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントでは、抗体またはその抗原結合性フラグメントはネズミ抗体またはそのフラグメントである。
【００２４】
本発明の好適な実施態様において、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントでは、抗体またはその抗原結合性フラグメントはキメラ抗体またはそのフラグメントである。
【００２５】
本発明の好適な実施態様において、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントでは、抗体またはその抗原結合性フラグメントはヒト化抗体またはそのフラグメントである。
【００２６】
本発明の好適な実施態様において、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントでは、抗体またはその抗原結合性フラグメントはヒト抗体またはそのフラグメントである。
【００２７】
本発明の好適な実施態様において、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントには、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4、またはそれらの異形（variant）から導き出される定常領域がさらに含まれ、なるべくならヒトIgG1、IgG2またはIgG4から導き出される定常領域が含まれる。IgG2またはIgG4はADCC毒性をもたないか、またはアミノ酸変異のため、ADCC（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性）を伴わないIgG1を使用することができる。
【００２８】
本発明の好適な実施態様において、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントでは、抗原結合性フラグメントはFab、Fv、sFv、F(ab')2である。
【００２９】
本発明は、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするDNA配列をさらに提供する。
【００３０】
本発明は、上記のDNA配列を含む発現ベクターをさらに提供する。
【００３１】
本発明は、上記の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞をさらに提供する。
【００３２】
本発明の好適な実施態様において、上記の宿主細胞では、宿主細胞は、細菌であり、なるべくなら大腸菌（E. coli（エシェリキア・コリ））であることを特徴とする。
【００３３】
本発明の好適な実施態様において、上記の宿主細胞は、酵母であり、なるべくならピキア・パストリス（pichia pastoris、Pichia pastoris）である。
【００３４】
本発明の好適な実施態様において、上記の宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、なるべくならチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはヒト胚腎臓（HEK）293細胞である。
【００３５】
本発明は、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含む、薬学組成物をさらに提供する。
【００３６】
本発明は、上記の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、多特異性（multispecific）抗体をさらに提供する。
【００３７】
本発明は、上記の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、一本鎖（single chain、単鎖とも言う）抗体をさらに提供する。
【００３８】
本発明は、上記の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む、抗体-薬物コンジュゲート（抗体薬物複合体とも言う）をさらに提供する。抗体-薬物コンジュゲートは本技術においてよく知られ、および抗体-リンカー-薬物（トキシン）の相互連結によって形成され、既知のリンカーには、開裂可能リンカー（cleavable linkers）、非開裂性リンカー（non-cleavable linkers）で、例えば、リンカーで、制限されないが、SMCC、SPDPなどが含まれるものなどのようなものが含まれ；毒素も本技術においてよく知られ、例えば、DM1、DM4、MMAE、MMAFおよびその他同種類のものなどのようなものである。
【００３９】
本発明は、上記の抗CD27抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、またはそのものを含む薬学組成物の、制限されないが、多特異性抗体、一本鎖抗体、抗体-薬物コンジュゲートの形態においてのものを含め、CD27媒介の疾患または状態を処置または妨げるための薬の調製における使用をさらに提供し；そこでは、疾患は、なるべくガンおよび自己免疫疾患であり；より一層なるべくならCD27発現のガンおよび自己免疫疾患であり；最もなるべくならガンは、直腸ガン、脳ガン、腎臓ガン、肺ガン、肝臓ガン、多発性骨髄腫およびメラニンであり；最もなるべくなら自己免疫疾患は、自己免疫性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス（全身紅斑性狼蒼とも言う）、多発硬化（多発性硬化症とも言う）および関節リウマチである。
【００４０】
本発明は、CD27媒介の疾患または状態を処置し、および妨げる方法をさらに提供し、本方法には、治療上有効な量の、上記の抗CD27抗体またはその抗原結合性フラグメント、またはそのものを含む薬学組成物で、制限されないが、多特異性抗体、一本鎖抗体、抗体-薬物コンジュゲートの形態においてのものを含むものを、それを必要とするペイシェントに対して施与することを含み；そこでは、疾患は、なるべくガンおよび自己免疫疾患であり；より一層なるべくならCD27発現のガンおよび自己免疫疾患であり；最もなるべくならガンは、直腸ガン、脳ガン、腎臓ガン、肺ガン、肝臓ガン、多発性骨髄腫およびメラニンであり；最もなるべくなら自己免疫疾患は、自己免疫性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、多発硬化および関節リウマチである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】抗CD27抗体mAb076およびmAb077の抗原への結合の親和性および速度論的パラメーターであり、それらは対応する例において記載された方法を用いてData Acquisition（データ・アクイジション）7.1ソフトウェアによって決定した。
【図２】ヒト抗CD27抗体mAb076およびmAb077の、HEK293細胞によって発現されるが、残りのTNFRスーパーファミリー受容体には結合しないヒトまたはマウスCD27抗原への結合を示すデータであり、フローサイトメトリーにより決定した（結合シグナルを有する細胞の割合で、セルの合計数に対する）。
【図３】抗CD27抗体mAb076の、HEK293細胞によって発現されたヒトまたはマウスCD27抗原への結合を示す勾配希釈滴定曲線であり、それらはフローサイトメトリーによって決定した。
【図４】ヒト抗CD27抗体mAb076およびmAb077の、マウスT細胞に対する結合を示すデータであり、それらはフローサイトメトリーによって決定した（結合シグナルを有する細胞の割合で、合計細胞に対する）。
【図５】抗体mAb076およびmAb077が、細胞上に発現されたCD27の、そのリガンドCD70への結合を効果的にブロックすることを示すデータであり、それらはフローサイトメトリーによって決定した（CD70特異的結合シグナルを有する細胞の割合で、合計細胞に対する）。
【図６】抗体mAb076およびmAb077によるNF-κBシグナル伝達経路の活性化の勾配希釈滴定曲線であり、ルシフェラーゼレポーター遺伝子法を用いて検出した。
【図７】フローサイトメトリーによって決定された抗体mAb076およびmAb077によって活性化したヒト末梢血単核T細胞のイメージである：（A）．T細胞のIFN-γ発現での1F5、mAb076およびmAb077の促進効果。（B）．mAb076抗体によるT細胞増殖の活性化。
【図８】抗CD27抗体mAb076およびmAb077の、FcγRI受容体への結合の親和性および速度論的パラメーターであり、それらは対応する例において記載された方法を用いてData Acquisition 7.1ソフトウェアによって決定した。
【図９】ビヒクル処置マウス、コントロールヒトIgG1抗体で処置したマウス、または抗CD27 mAb076-IgG抗体で処置したマウスにおけるE.G7-OVA移植Tリンパ腫の腫瘍サイズであり、腫瘍接種後の日数に関する（mm3において）。腫瘍増殖曲線は（A）において表し；マウスの体重の相対的な変化は（B）において表す。誤差は標準誤差として表す。
【図１０】PBS処置マウス、コントロールヒトIgG1抗体で処置したマウス、または抗CD27 mAb076-IgG抗体で処置したマウスにおけるヒトRaji（ラージ）移植リンパ腫の腫瘍サイズであり、腫瘍接種後の日数に関する（mm3において）。腫瘍増殖曲線は（A）において表し；マウスの体重での相対的な変化は（B）において表す。誤差は標準誤差として表す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明の詳細な記載
１．用語
【００４３】
本発明をより一層容易に理解するために、一定の技術的および科学的用語を以下に具体的に規定する。この文書においてどこかほかの所に具体的に指し示されない限り、ここに使用する他のすべての技術的および科学的用語は、この発明が属する技術において通常の熟練した者（one of ordinary skilled in the art）によって普通に理解される意味をもつ。
【００４４】
ここに使用するように、アミノ酸のための一文字コードおよび三文字コードは、J. Biol. Chem（ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー）、243、（1968）p3558に記載されるようなものである。
【００４５】
ここに使用するように、「抗体」は、免疫グロブリン、二つの同一の重鎖および二つの同一の軽鎖間のジスルフィド結合によって互いに接続した四つのペプチド鎖の構造物に言及する。異なる免疫グロブリンの重鎖定常領域は異なるアミノ酸組成および配列順序を見せ、ゆえに異なる種類の抗原性を提示する。したがって、免疫グロブリンは五つのカテゴリーに分類することができ、または免疫グロブリンアイソタイプ、すなわちIgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEと称され、それらの対応する重鎖はそれぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖およびε鎖である。そのヒンジ領域のアミノ酸組成ならびに重鎖ジスルフィド結合の数および位置に従って、同じタイプのIgを異なるサブカテゴリーに分類することができ、例えば、IgGをIgG 1、IgG 2、IgG 3、およびIgG 4に分類することができる。軽鎖は、異なる定常領域のために、κまたはλ鎖に分けることができる。五つのタイプのうちの各IgGはκまたはλ鎖をもつ。
【００４６】
本発明において、ここに言及する抗体軽鎖可変領域は、軽鎖定常領域をさらに含み、それには、ヒトまたはネズミのκ、λ鎖またはそれらの異形が含まれる。
【００４７】
本発明において、ここに言及する抗体重鎖可変領域は、重鎖定常領域をさらに含み、それには、ヒトまたはマウスのIgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはそれらの異形が含まれる。
【００４８】
抗体重鎖および軽鎖のN終端に近い約110アミノ酸の配列は大きく変化し、可変領域（V領域）として知られ；C終端に近いアミノ酸の残りの配列は比較的安定しており、定常領域（C領域）として知られる。可変領域は、三つの超可変領域（HVR）および比較的保存された配列を有する四つのフレームワーク領域（FR）を含む。三つの超可変領域が抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（CDR）としても知られる。各軽鎖可変領域（VL）および各重鎖可変領域（VH）は、三つのCDR領域および四つのFR領域から構成され、アミノ末端からカルボキシル末端への順番が次の：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4である。三つの軽鎖CDRsはLCDR1、LCDR2、およびLCDR3に言及し；三つの重鎖CDRsは、HCDR1、HCDR2およびHCDR3に言及する。ここでの抗体または抗原結合性フラグメント（抗原結合性断片とも言う）のVLおよびVH領域におけるCDRアミノ酸残基の数および位置は、既知のKabat（カバット）ナンバリング（番号付け）基準（LCDR1-3、HCDR2-3）に適合し、またはKabatおよびChothia（チョチア）ナンバリング基準（HCDR1）に適合する。
【００４９】
「抗原提示細胞」または「APC」という用語は、その表面にMHCと複合体を形成した外来抗原を提示する細胞である。T細胞は、T細胞受容体（TCR）を用いてこの複合体を認識する。APCsの例には、制限されないが、樹状細胞（DC）、末梢血単核細胞（PBMC）、単球、Bリンパ芽球および単球由来樹状細胞（DC）が含まれる。「抗原提示」という用語は、それによってAPCsが抗原を捕捉し、およびそれらがT細胞によって、例えば、MHC-I/MHC-IIコンジュゲートの成分として認識されることを可能にするプロセスに言及する。
【００５０】
「CD27」という用語は、TNF受容体スーパーファミリーの一員である細胞表面受容体に言及する。CD27は、T細胞免疫の生産および長期維持のために必須な分子であり、およびB細胞活性化および免疫グロブリン合成の調節において重要な役割を果たす。「CD27」という用語には、細胞によって自然に発現されるCD27の任意の異形またはアイソフォームが含まれる（例えば、GENBANK（ジェンバンク）にアクセッション（受入とも言う）番号AAH12160の下で登録されているヒュンマン（hunman）CD27）。本発明の抗体は、非ヒト種からのCD27と交差反応性であることができる。あるいはまた、抗体はヒトCD27に特異的でもあり得、および他の種との交差反応性を示さなくてよい。CD27またはその任意の異形（変異体と言うこともある）もしくはアイソフォームは、それらが自然に発現される細胞または組織から分離（単離と言うこともある）し、または本技術における普通の技術およびここに記載のものを用いて組換え技術によって生産することができる。なるべくなら、抗CD27抗体は、正常なグリコシル化パターンを有するヒトCD27を標的とする。
【００５１】
「ヒト抗体」という用語には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の可変および定常領域をもつ抗体が含まれる。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異などのようなもの）を含むことができる。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種、例えば、マウスなどのようなものの生殖系列から導き出されるCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体（すなわち「ヒト化抗体」）を含まない。
【００５２】
用語「ヒト化抗体」は、「CDR移植抗体」としても知られ、ネズミCDR配列をヒト抗体の可変領域フレームワーク中に移植することによって生成される抗体に言及する。ヒト化抗体は、大量のマウスタンパク質成分を保有するキメラ抗体によって誘発される強い抗体反応を克服する。免疫原性が低下することによって引き起こされる活性における低下を回避するために、ヒト抗体の可変領域を最小限の復帰変異に供して活性を維持する。
【００５３】
用語「キメラ抗体」は、ネズミ抗体誘導免疫応答を軽減させるように、ネズミ抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合させることによって形成される抗体である。キメラ抗体を確立するために、ハイブリドーマ分泌特異的ネズミモノクローナル抗体を最初に確立し、次いで可変領域遺伝子をネズミハイブリドーマ細胞からクローン化し、および次いでヒト抗体の定常領域遺伝子を要望どおりにクローン化し、ネズミ可変領域遺伝子を、ヒトベクターに挿入することができるキメラ遺伝子を形成するために、ヒト定常領域遺伝子と連結し、および最後にキメラ抗体分子を真核生物または原核生物の産業システムにおいて発現させる。ヒト抗体の定常領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4、またはそれらの異形から導き出される重鎖定常領域から選ばれ、およびなるべくヒトIgG2またはIgG4から導き出される重鎖定常領域を含み、またはADCC（抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性）を伴わない代替のIgG1として使用することができ、それはIgG1がアミノ酸変異を受けているからである。
【００５４】
ここに使用するように、「抗原結合性フラグメント」は、抗原結合活性を有するFabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、ならびにヒトCD27と結合性のFvフラグメントscFvフラグメントに言及し；それは、本発明において説明される抗体の一またはそれよりも多く（一以上とも言う）のCDR領域を含み、配列番号3ないし配列番号8からなる群より選ばれる。Fvフラグメントは、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、および定常領域を伴わないすべての抗原結合性部位を含む最小の抗体フラグメントである。大抵は、Fv抗体は、VHおよびVLドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、および抗原結合性にとって必要な構造を形成することが可能である。また、抗体の二つの可変領域を接続してポリペプチドで、一本鎖抗体または一本鎖Fv（sFv）と呼ばれるものを形成するために、異なるリンカーを使用することができる。ここに使用するように、用語「CD27との結合性（binding with CD27）」は、ヒトCD27と相互作用することが可能なことを意味する。ここに使用するように、本発明の「抗原結合性部位（antigen-binding site）」という用語は、抗原上の不連続な、三次元部位に言及し、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントによって認識される。
【００５５】
「多特異性抗体（multispecific antibody）」という用語は、マルチエピトープ特異性をもつ抗体を包含するために、その最も広い意味において使用される。これらの多特異性抗体には、制限されないが、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）を含む抗体で、そこでは、VH-VL単位は、マルチエピトープ特異性をもつもの；二以上のVLおよびVH領域をもつ抗体で、各VH-VL単位は異なる標的または同じ標的の異なるエピトープに結合するもの；二以上の単一可変領域をもつ抗体で、各単一可変領域は異なる標的または同じ標的の異なるエピトープに結合するもの；全長抗体、抗体フラグメント、ダイアボディ（diabodies、二特異性抗体）、二重特異性ダイアボディ（bispecific diabodies）およびトリアボディ（triabodies）、共有結合または非共有結合した抗体フラグメント、およびその他同種類のものなどが含まれる。
【００５６】
「抗体-薬物コンジュゲート」（ADC）という用語は、一以上の異種化学合成分子に言及し、制限されないが、細胞傷害性薬剤（cytotoxic agents）にコンジュゲートされる抗体または抗体フラグメントが含まれる。「単鎖（single-chain、一本鎖とも言う）抗体」は、抗体の重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）間でリンカーペプチドによって連結される単鎖組換えタンパク質である。それは十分な抗原結合部位を有する最小の抗体フラグメントである。
【００５７】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体によって特異的に結合される抗原上の部位に言及する。エピトープは、隣接するアミノ酸または隣接しないアミノ酸から形成され得るが、タンパク質の三次折り畳み（tertiary folding）によって並置され得る。隣接するアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒への曝露後に保持されるが、三次折り畳みを介して形成されるエピトープは変性溶媒での処理後に典型的に失われる。エピトープは通常、独特の空間的立体配置（spatial conformation）をもち、少なくとも3-15個のアミノ酸が含まれる。どのエピトープが与えられた抗体によって結合されるかを決定するための方法は、本技術においてよく知られ、免疫ブロッティングおよび免疫沈降アッセイ、およびその他同種類のものなどが含まれる。エピトープの空間的立体配置を決定するための方法には、本技術における技術およびここに記載される技術、例えば、X線結晶学および二次元核磁気共鳴およびその他同種類のものなどのようなものが含まれる。
【００５８】
ここで使用するように、用語「特異的に結合する」および「選択的に結合する」は、予め定める抗原上のエピトープへの抗体の結合に言及する。典型的には、組換えヒトCD27が分析物として使用され、および抗体がリガンドとして使用されるとき、抗体は、器械において表面プラズモン共鳴（SPR）技術によって測定される約10-7M以下の平衡解離定数（KD）にて予め定める抗原に結合する。予め定められる抗原への結合のためのその親和性は、予め定める抗原または密接に関連した抗原以外の非特異的抗原（例えば、BSA、などのようなもの）に対する結合のためのその親和性と比較するとき、少なくとも二倍である。「抗原を認識する抗体」という用語は、ここでは「特異的に結合した抗体」という用語と互換的に使用することができる。
【００５９】
「交差反応」という用語は、本発明の抗体が異なる種由来のCD27に結合する能力に言及する。例えば、ヒトCD27に結合する本発明の抗体は他の種由来のCD27にも結合することができる。交差反応性は、結合アッセイ（例えば、SPRおよびELISA）において精製した抗原との特異的反応性、または生理学的にCD27を発現する細胞との結合もしくは機能的相互作用を検出することによって測定される。交差反応性を決定するための方法には、ここに記載されるような標準的な結合アッセイ、例えば、表面プラズモン共鳴（SPR）分析、またはフローサイトメトリーなどのようなものが含まれる。
【００６０】
「抑制すること（inhibiting）」または「ブロッキング（ブロックすること）」という用語は、互換的に使用され、および部分的および十分な抑制/ブロッキングの両方を包含する。なるべくなら、CD70の抑制/ブロッキングは、CD70の結合が抑制またはブロッキングを伴わずに起こるとき、正常なレベルまたはタイプの活性を減少または変化させる。抑制およびブロッキングはまた、抗CD27抗体と接触させたときのCD70の結合親和性が、抗CD27抗体と接触させなかったときのものと比較して、任意の測定可能な減少を含むことが意図される。
【００６１】
用語「増殖を抑制すること」（例えば、細胞を含む）は、細胞増殖の任意の測定可能な減少が含まれることを意図する。
【００６２】
用語「免疫応答を誘導すること」および「免疫応答を増強すること」は互換的に使用され、および特定の抗原に対する免疫応答の刺激（すなわち、受動的または適応的なもの）に言及する。それがCDCまたはADCCになるとき、「誘導」という用語は特定の直接的な細胞傷害性機序の刺激に言及する。
【００６３】
ここに使用するように、用語「ADCC」、すなわち、抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）は、Fc受容体を発現する細胞が、抗体によって被覆された標的細胞を、抗体のFcセグメントを認識することによって直接的に死滅させる（キルする、勢いをそぐとも言う）ことに言及する。抗体のADCCエフェクター機能は、IgGのFcセグメントを修飾することによって減少または排除することができる。修飾は、抗体重鎖定常領域における変異、例えば、IgG1でのN297A、L234A、L235Aから選ばれる変異；IgG2/4キメラ；またはIgG4でのF235EまたはL234A/E235A変異などのようなものに言及する。
【００６４】
抗体および抗原結合性フラグメントを生産し、および精製するための方法は本技術においてよく知られ、および例えば、コールド・スプリング・ハーバーの抗体実験技術ガイド、第5-8および15章（Antibody Experimental Technology Guide of Cold Spring Harbor, Chapters 5-8 and 15）に見出すことができる。例えば、マウスはヒトCD27、またはそのフラグメントにより免疫性を与えることができ、および得られた抗体を次いで、本技術においてよく知られる慣習的な方法を使用することによって復元、精製および配列決定することができる。抗原結合性フラグメントはまた、慣習的な方法によって調製することができる。本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、一以上のヒトフレームワーク領域（FRs）を非ヒト由来のCDRに導入するために遺伝子操作される。ヒトFR生殖系列配列は、ImMunoGeneTics（IMGT）からそれらのウェブサイトhttp://imgt.cines.frを介して、またはザ・イムノグロブリン・ファクトブック（The Immunoglobulin FactsBook）、2001ISBN012441351から取得することができる。
【００６５】
本発明の操作された抗体または抗原結合フラグメントは、慣習的な方法を用いて調製および精製し得る。例えば、対応する抗体をコードするcDNA配列をクローン化し、およびGS発現ベクター中に組み換えてもよい。次いで、組換え免疫グロブリン発現ベクターはCHO細胞を安定的にトランスフェクトし得る。本技術においてよく知られるより一層推奨される方法として、哺乳動物発現系は、抗体のグリコシル化を、典型的にはFC領域において高度に保存されたN末端にてもたらすであろう。安定なクローンは、ヒト抗原に特異的に結合する抗体の発現を通して得られる。陽性クローンは、バイオリアクターにおける抗体生産のために無血清培養培地において増やし得る。抗体が分泌された培養培地は慣習的な技術によって精製および収集され得る。抗体は普通の技術を用いてろ過および濃縮し得る。可溶性混合物および凝集物は、普通の技術によって、サイズ排除またはイオン交換を含め、効果的に除去され得る。取得された生成物は、例えば、-70℃にて直ちに凍結し得、または凍結乾燥し得る。
【００６６】
本発明の抗体はモノクローナル抗体に言及される。本発明のモノクローナル抗体（mAb）は細胞株の単一クローンから得られる抗体に言及され、および細胞株は、真核生物、原核生物またはファージクローン細胞株に制限されることはない。モノクローナル抗体または抗原結合性フラグメントは、組換え的に、例えば、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術（例えば、CDR移植）、または先行技術における他の技術を用いて得ることができる。
【００６７】
「施与」および「処置」は、それが動物、人間、実験対象、細胞、組織、器官、または生物学的流体に適用されるように、外因性の薬、治療用物質、診断用薬剤、または組成物を、動物、人間、対象、細胞、組織、器官、または生物学的流体と接触させることに言及する。「施与」および「処置」は、例えば、治療、薬物動態学、診断、研究、および実験方法に言及することができる。細胞の処置は、試薬を細胞と接触させること、ならびに試薬を流体と接触させることを包含し、そこで流体は細胞と接触する。「施与」および「処置」はまた、インビトロおよびエキソビボでの処置で、例えば、細胞の、試薬、診断、結合性組成物によるか、または別の細胞によるものを意味する。「処置」は、それが人間、獣医学、または研究する対象に適用されるように、治療上の処置、予防上または防止的手段、研究および診断的適用に言及する。
【００６８】
「処置する」は、治療用薬剤、例えば、本発明の結合性化合物のいずれかを含む組成物などのようなものを、その薬剤が既知の治療上の活性をもつ一以上の疾患症状を有するペイシェント（人間では患者とも言う）に内部的にまたは外部的に施与することを意味する。典型的には、そのような症状（群、「群」は複数もあり得ることを示す）の後退を誘導することによってか、または任意の臨床的に測定可能な程度まで進行を抑制することによってかにかかわらず、薬剤は処置されたペイシェントまたは集団において一以上の疾患症状を軽減するために有効な量で施与される。任意の特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療用薬剤の量（「治療上有効な量」とも称する）は、因子、例えば、疾患状態、ペイシェントの齢、および重量、ならびにペイシェントにおいて望ましい反応を引き出す薬剤の能力などのようなものに従って変動し得る。疾患症状が軽減されたかどうかは、その症状の重症度または進行状態を評価するために医師または他の熟練したヘルスケアプロバイダーによって典型的に使用される任意の臨床的測定によって評価することができる。たとえ本発明の実施形態（例えば、処置方法または製造品）があらゆるペイシェントにおいて関心がある疾患症状（群）を軽減するのに有効ではないとしても、それは関心がある標的疾患症状（群）を、統計学的に有意な数のペイシェントにおいて、本技術で既知の任意の統計的検定、例えば、スチューデントのt検定（Student's t-test）、カイ二乗検定、マン・アンド・ホイットニー（Mann and Whitney）によるU検定、クラスカル・ワリス（Kruskal-Wallis）検定（H検定）、ヨンキー・テラプストラ（Jonckheere-Terpstra）検定およびウィルコクスン（Wilcoxon）検定などのようなものにより決定されるように、軽減する。
【００６９】
明細および請求の範囲を通して使用するように、「から本質的になる」という用語またはその変形は、そのような要素または要素の群をすべて含み、および随意に、要素と本質上類似またはそれと異なる他の要素を含み、前記他の要素は特定の投与計画、方法または組成の本質的または新規な特性を著しく変動させない。非制限的な例として、列挙されたアミノ酸配列から本質的になる結合性化合物はまた、本結合性化合物の特性に著しく影響を及ぼすことがない一以上のアミノ酸をも含み得る。
【００７０】
「自然発生性」という用語は、本発明に従って主題に適用されるとき、主題を自然界に見出すことができるという事実に言及する。例えば、自然な供給源から分離することができ、および実験室において意図的に人為的に修飾されていない有機体（ウイルスを含む）において存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、自然発生性である。
【００７１】
「有効な量」は、病状の症状または徴候を改善または防止するのに十分な量を包含する。有効な量はまた、診断を可能にするか、または容易にするのに十分な量を意味する。特定のペイシェントまたは獣医学の対象についての有効な量は、処置される状態、ペイシェントの全体的な健康状態、施与の経路および用量ならびに副作用の重症度などのような因子に応じて変動し得る。有効量は、重大な副作用または毒性作用を回避する最大の用量または投薬プロトコルであることができる。
【００７２】
「外因性」は、背景に応じて、有機体、細胞、または人体の外部で生産される物質に言及する。「内因性」は、背景に応じて、細胞、有機体、または人体の範囲内で生産される物質に言及する。
【００７３】
ここで使用するように、表現「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」は交換可能に使用され、およびすべてのそのような表示には、その子孫が含まれる。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語には、初代の対象細胞および導入の数を考慮せずにそれに由来する培養物が含まれる。計画的または偶発性の変異のために、すべての子孫がDNA含量の観点で正確に同一ではないかもしれないこともまた理解される。最初に形質転換された細胞のものと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫もまた含まれる。明確な表示が意図される場合、それは文脈から明らかであろう。
【００７４】
「随意の」または「随意に」は、それに続く事象または状況が必ずしも発生するとは限らないことを意味し、および説明はその事象または事情が発生するか、または発生しない事例を示すであろう。例えば、「1-3個の抗体重鎖可変領域を随意に含む」は、特定の配列を有する抗体重鎖可変領域が、必ずしも存在しなくてもよいことを意味する。
【００７５】
「薬学組成物」は、本発明に従う一以上の化合物またはその生理学的/薬学的に許容可能な塩もしくはプロドラッグ、ならびに他の化学成分、例えば、生理学的/薬学的に許容可能な担体および賦形剤などのようなものを含む混合物に言及する。薬学組成物は、有機体への施与を促進し、活性原料の吸収を容易にし、およびそれによって生物学的効果を発揮させることを目的とする。
【００７６】
以下、本発明を例に関してさらに説明する。しかしながら、本発明の範囲はそれらに制限されない。本発明の例では、一定の条件が示されないが、実験は大抵、コールド・スプリング・ハーバーの抗体技術研究所マニュアルおよび分子クローニングマニュアル（Antibody Technology Laboratory Manual and Molecular Cloning Manual of Cold Spring Harbor）に記載されているような慣習的な条件下で、あるいは材料または生産物の製造業者によって提案される指示の下で行われる。試薬の供給源が特に与えられていない場合、試薬は商業上入手可能な慣習的な試薬である。
【００７７】
例1：ヒトCD27抗原結合性抗体フラグメント（Fab）のスクリーニング
【００７８】
インビトロファージディスプレイシステムを、ヒトCD27抗原に対するヒト由来抗体フラグメントをスクリーニングするために用いた。使用した抗原には、CD27-HisFc（Sino Biological（シノ・バイオロジカル）#10039-H03H）、CD27-Fc（Sino Biological #10039-H31H）およびCD27-His（Sino Biological #10039-H08B1）が含まれた。抗原をMaxisorp（マキシソープ）96ウェルスクリーニングプレート（Thermo Scientific（サーモ・サイエンティフィク）446469）に直接吸収させ、および固定化するか、またはビオチン化した後にDynabeads（ダイナビーズ）微粒子（M280、Streptavidin（ストレプトアビジン）、Invitrogen（インビトロゲン）#60210）に吸収させ、スクリーニングはKingFisher（キングフィッシャー）（Thermo Scientific）自動スクリーニングワークステーションによって標準的なファージディスプレイスクリーニング手順を用いて行った。各抗原について3-4ラウンドを超えるスクリーニングを行い、およびバックグラウンドを排除するために各ラウンドにおいてヒト抗体Fcフラグメントを使用した。スクリーニングの最後のラウンドの後、単一コロニーをクローニングおよびインキュベーションのために選定し、上清を収集し、およびヒトCD27に結合する抗体フラグメントを主にELISAによって識別した。主要な選定基準は、ELISA読み取り値がバックグラウンドシグナルよりも少なくとも二倍高いことであった。
【００７９】
例2：バイオフィルム干渉（BLI）によるヒトCD27に対する抗体フラグメントの親和性の決定
【００８０】
C末端での抗体Fabフラグメントの各固有配列に対してヒスチジンタグを付加し、および抗体FabフラグメントをE. coli発現系において過剰発現させ、および次いでNi-NTAアフィニティー樹脂を用いることによって精製した。ヒトCD27に対するFabの親和性は、ForteBio Octet（フォルテバイオ・オクテット）RED96システムを用い以下の方法によって決定した：ヒトCD27-HisFc融合タンパク質を、BLIシステムのAHCセンサ（ヒトIgG抗体のFcフラグメントに特異的）を用いて最初に捕捉し、次いで5-10μg/mlの各精製Fabタンパク質を含有するアッセイ緩衝剤において浸した。収集したデータをData Acquisition 7.1ソフトウェアによって処理し、および1：1の組合せラングミュアモデル曲線（combined Langmuir model curve）に適合させた。抗体mAb076およびmAb077は最適な結合性を有する二つの抗体であり、およびさらなる分析および開発実験のために選んだ。CD27へのそれらの結合性についての速度定数を図1に示す。
【００８１】
ヒトmAb mAb076の重鎖および軽鎖可変領域についての配列は以下の通りである：
mAb076 VH
【化１】
2019531732.tif 000003
mAb076 VL
【化２】
2019531732.tif 000004
【００８２】
それらは以下のCDR配列を含む：
【表１】
2019531732.tif 000005
【００８３】
ヒトmAb mAb077の重鎖および軽鎖可変領域についての配列は以下の通りである：
mAb077 VH
【化３】
2019531732.tif 000006
mAb077 VL
【化４】
2019531732.tif 000007
【００８４】
それは以下のCDR配列を含む：
【表２】
2019531732.tif 000008
【００８５】
例3：抗体FabフラグメントのIgGへの変換およびその発現および精製
【００８６】
各抗体フラグメントをそれぞれ、IgG1サブタイプ抗体の軽鎖および重鎖を発現する哺乳動物細胞発現ベクター中にクローニングした。対になったベクターを、標準的な手順に従って一過性トランスフェクションマナーにおいてHEK293細胞中にトランスフェクトした。発現後に上清を収集し、および遠心分離およびろ過に供し、および次いで、IgGをプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。溶出したタンパク質を中和し、およびPB緩衝剤（20mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.0）中にイオン交換した。タンパク質濃度は紫外線分光光度計によって決定し、およびその純度および特性は変性、還元または非還元条件下で定める。
【００８７】
例4：異なる種由来のCD27への抗体の結合性の表面プラズモン共鳴（SPR）による測定
【００８８】
ヒトCD27への抗体結合の親和性および速度論的パラメーターは、Biacore（ビアコア）TM（トレードマーク）T200を用いて決定した。抗ヒトIgG（Fc）抗体をBiacoreシステムのCM5チップ上に最初に固定化し、およびmAb076、mAb077および参照抗体1F5のIgG1部分を捕捉した（流速10μL/分、12秒）。その後の速度論的実験において、異なる濃度のヒトCD27抗原（3.13、6.25、12.5、25、50、100nM）を30μL/分で300秒間分析し、および次いで300秒間解離させた。システム緩衝剤は、1×HBS-EP（10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005%v/v P2O界面活性剤、pH7.4、25℃、以下の実験においても同じ）であり、タンパク質を固定化しないチップを各実験のためのブランクコントロールとして設定した。各実験の終わりに、チップを30秒間30μL/分の流速にて10mMグリシン（pH1.5）により再生した。実験データをBIAevaluation（BIAエバリュエーション）3.2ソフトウェアによって処理し、および1：1の組合せラングミュアモデル曲線に適合させた。結果を図1に示す。
【００８９】
ヒトCD27に結合する抗体の親和性もまたSPRを用いて決定した。この実験では、ネズミCD27-FcHis融合タンパク質をアミノカップリングによりCM5チップ（600RU）上に直接固定化した。異なる濃度（0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100nM）での抗体を、1800秒の解離時間により30秒間、30μL/分の流速で負荷した。結果は、mAb076および077の両方がマウスCD27に対してpMレベルの親和性をもつのに対して、参照抗体1F5はそうではなかったことを示した。そのデータを図1に示す。
【００９０】
サルCD27に結合する抗体の親和性および速度論的パラメーターは、ForteBio Octet RED96を使用して決定した。各IgG抗体をビオチン化した後、抗体をEZ-Link Sulfo（EZ-リンク・スルホ）-NHS-ビオチン化キット（Thermo Fisher Scientific）を使ってストレプトアビジン含有バイオセンサにて固定化した。次いで、アカゲザルCD27-Fcタンパク質を含む緩衝剤において、センサを300秒間、結合のために浸漬し、およびその後、ブランク緩衝剤において300秒間解離させた。収集したデータをData Acquisition 7.1ソフトウェアによって処理し、および1：1の組合せラングミュアモデル曲線に適合させた。図1に示すように、mAb076およびmAb077の親和性は1F5のそれよりも高い。
【００９１】
例5：細胞上に発現されるヒト/ネズミCD27に対する抗体の特異的結合の決定
【００９２】
細胞表面で発現するヒトまたはネズミCD27への抗体の結合は、蛍光活性化細胞選別（FACS）によって定める。対応する抗原は、ベクタープラスミドを用いてHEK293細胞中に一過性にトランスフェクトし、および発現させた。48時間後、細胞を収穫し、および冷FACS緩衝剤（PBS、1%BSA）で1回洗浄し、および次いで、100nMの対応する抗体と共に氷上で1時間インキュベーションした。緩衝剤で二回洗浄した後、細胞をAlexa Fluor（アレクサ・フルーア）647コンジュゲートしたネズミ抗ヒトFc抗体に氷上で30分間結合させた。一度洗浄した後、細胞を検出のためにBeckman（ベックマン）(R)（商標）CytoFlex（サイトフレックス）フローサイトメーターにロードし、および結合シグナルを有する細胞の割合を算出した。図2に示すように、抗体mAb076およびmAb077は細胞表面上のヒトまたはネズミCD27にはかなりの数が結合するが、ヒトまたはネズミCD40、OX40、CD137、FAS、TNFRSF1Aを含む他のTNF受容体スーパーファミリーメンバー抗原タンパク質には結合しない。
【００９３】
細胞表面上に発現されるヒトまたはネズミCD27に結合するmAb076抗体のEC50を、1：3の段階的勾配希釈曲線（100nMないし0.05nM）によって決定した。図3に示すように、mAb076および参照抗体1F5は細胞表面上に発現するヒトCD27に強く結合し、その一方1F5はネズミCD27に弱くしか結合しない。
【００９４】
例6：マウスT細胞への抗体の結合の決定
【００９５】
この抗体結合アッセイは活性化マウス脾臓T細胞を用いて行った。Stemcell Technologies（ステムセル・テクノロジーズ）からのマウスT細胞分離キットを用いてBALB/c脾臓T細胞を精製し、および50ng/mlのPMAおよび1μg/mlのイオノマイシンで2日間活性化し、次いで105個の細胞を各サンプルから収集し、および1時間氷上で50μlの100nMの対応抗体と共にインキュベートした。細胞をFACS緩衝剤で一回洗浄し、および氷上で30分間、1：500希釈したマウス抗ヒトFc-APC（Biolegend（バイオレジェンド））の100μlにより染色した。細胞を緩衝剤によりもう一度洗浄し、および再懸濁し、次いで検出のためにCytoFlexフローサイトメーター上にロードし、および結合シグナルを有する細胞の割合を算出した。図4に示すように、mAb076およびmAb077は両方とも活性化マウスT細胞に強く結合する。
【００９６】
例7：抗体のCD27リガンドブロッキングアッセイ
【００９７】
抗体がCD27のそのリガンドCD70への結合をブロックするという試験は、免疫蛍光染色およびFACSによって検出した。HEK293細胞中へのCD27の一過性トランスフェクションはベクタープラスミドを用いて実行した。48時間後、細胞を収穫し、および冷FACS緩衝剤により一回洗浄し、および次いで100nMの対応する抗体と共に氷上で１時間インキュベートし、および16nMのビオチン化標識CD70を添加した。30分のインキュベーション後、細胞を緩衝剤で二回洗浄し、およびAlexa Fluor 647コンジュゲートしたストレプトアビジンと共に30分間インキュベートした。細胞を緩衝剤によりもう一度洗浄し、および再懸濁し、および次いで検出のためにCytoFlexフローサイトメーターにロードし、およびCD70特異的結合シグナルをもつ細胞の割合を算出した。図5に示すように、mAb076、mAb077および参照抗体はCD27のCD70への結合をブロックするのに有効である。
【００９８】
例8：抗CD27抗体によるNF-κB細胞シグナル伝達経路の活性化
【００９９】
細胞表面CD27分子の活性化は、NK-kBを含め、一連の下流シグナル伝達経路の活性化を誘発し、それはルシフェラーゼレポーター遺伝子法によって検出することができる。この例では、ヒトCD27遺伝子、NFkB-lucおよびウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子（Promega（プロメガ））を発現するプラスミドを、5×105個のHEK293T細胞中にトランスフェクトした。4時間後、HEK293T細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり2×104細胞でロードした。勾配希釈した対応する抗体をF(ab')2ヤギ抗ヒトIgG Fcγ二次抗体と予備混合した後、混合物をHEK293T細胞に加え、および5%CO2を伴う37℃インキュベーターにおいて18時間インキュベートした。細胞を溶解し、およびルシフェラーゼ強度をPromega's（プロメガの）Dual-luciferase（デュアル-ルシフェラーゼ）キット（kit）を用いてSpectraMax（スペクトラマックス）i3xプレートリーダーにて測定した。相対ルシフェラーゼ単位（RLU）を分析し、およびGraphPad Prism（グラフパッドプリズム）ソフトウェアを用いてマッピングした。図6に示すように、双方のmAb076およびmAb077はNF-κBレポーター遺伝子の活性化に対して有意な効果をもつ。
【０１００】
例9：抗CD27抗体のT細胞活性化アッセイ
【０１０１】
T細胞活性化機能実験において、96ウェル細胞培養プレートを100ulの0.5ug/ml抗CD3抗体および種々の濃度の試験抗体（30、10、3、1、0ug/ml）により4℃にて夜通し前処理した。ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を、Sigma（シグマ）からのHistopaque（ヒストパケ）1077キットを用いて分離し、次いでStemcell Technologiesの精製キットを用いて精製し、および10%FBSを含有するRPMI 1640培地において2.5×105/mlにて再懸濁した。上記細胞の200ul（5×104）を96ウェルプレートの各ウェル中に添加し、および5ug/mlの抗CD28刺激性抗体を陽性コントロールとして並行して使用した。5%CO2を伴う37℃インキュベーターにおいて4日間細胞をインキュベートした後、各ウェルの100μlを新しいサンプルプレートに移した（残りの細胞をIFN-γ検出のために使用した）。80ulのCellTiter-Glo(R)（セルタイター-Glo）試薬を添加し、および10分間インキュベートしてシグナルを安定化させ、次いでSpectraMax i3xプレートリーダーを使用して発光の強度を検出した。図7に示すように、IgG1の形態においてmAb076およびmAb077は、参照抗体1F5よりも多くのT細胞IFN-γの発現を促進した。別の実験において、mAb076抗体はまた、対応する1F5形態よりも多くのT細胞を活性化した。
【０１０２】
例10：SPRによるFcγR受容体への抗体の結合の決定
【０１０３】
抗体のFcγR受容体への結合はBiacoreTM T200でのSPR法によって検出した。プロテインLを抗体の捕捉のためにCM5センサーチップ上に固定化した（10μl/分、12秒間の負荷）。次いで、異なる濃度のFcγRI受容体（システム緩衝剤において0.39、0.78、1.56、3.13、6.25nM）を10μl/分で300秒間ロードし、および600秒間解離させた。FcγRIIa（CD32a）またはFcγRIIb（CD32b）受容体について、同じ方法を用いたが、25、50、100、200、400nMの濃度であった。収集したデータをData Acquisition 7.1ソフトウェアによって処理し、および1:1の組合せラングミュアモデル曲線に適合させた。mAb076およびmAb077はFcγRI受容体にだけ結合するが、FcγRIIaおよびFcγRIIbに対してはそうでない。結果のデータを図8に示す。
【０１０４】
例11：ネズミ腫瘍モデルにおけるmAb076-IgGの有効性
【０１０５】
40匹のC57BL/6マウス、雌、5-6週齢、18-20gを5つのグループ、各グループに8匹のマウスに分けた。E.G7-OVA細胞をインビトロで培養し、および無菌条件下でC57BL/6マウスに皮下移植し、および各マウスに1×104細胞を接種した。腫瘍接種日を0日目とした。初回の投与は接種後3日目に開始し、および次いで以下のように続けた。
G1：溶媒コントロールグループ；
G2：IgG1 0.2mg/マウス、i.p.（腹腔内）、N=8、Q2D、日数3、5、7、9、11、13；
G3：mAb 0.76-IgG 0.07mg/マウス、i.p.、N=8、Q2D、日数3、5、7、9、11、13；
G4：mAb076-IgG 0.2mg/マウス、i.p.、N=8、Q2D、日数3、5、7、9、11、13；
G5：mAb076-IgG 0.6mg/マウス、i.p.、N=8、Q2D、日数3、5、7、9、11、13；
投与後、動物の行動を合計27日間毎日モニターした。ノギス（副尺付きカリパスともいう）により腫瘍の長径および短径を測定した後、長さ×幅2/2によって腫瘍容量を算出した。腫瘍抑制率は、式TGI%=(1-T/C)×100%によって算出した。TおよびCは、それぞれ特定の時点での投与グループおよびコントロールグループの腫瘍容量（TV）を表す。体重での変化は、式RCBW%=(BWi-BW0)/BW0×100%を使用して算出し、BWiはマウスの現在の体重、およびBW0はグループ分けした日でのマウスの体重である。すべての実験結果は平均腫瘍容量±標準誤差（SEM）として表す。処置グループの腫瘍容量および腫瘍重量がコントロールグループのそれらと有意に異なるかどうかを比較するためにT-検定法を用いた。すべてのデータを、Graphpad（グラフパット）、有意差についてp<0.05を用いて分析した。図9に示すように、E.G7-OVA腫瘍モデルにおいて、mAb076-IgGは抗腫瘍効果を示し、および実験の終わりに各グループの平均腫瘍容量は次の：それぞれ1355.3mm3、1365.87mm3、0mm3、404.88mm3、0mm3であった。低、中および高用量グループの腫瘍増殖抑制（TGI）は、それぞれ100%、70.36%および100%であった。各々の投与グループにおいてC57BL/6マウスの体重での有意な減少はなく、C57BL/6マウスはこれらの用量でmAb076-IgGに対して耐容性良好であったことが示された。
【０１０６】
例12：異種移植腫瘍モデルにおけるmAb077-IgGの有効性
【０１０７】
45匹のCB17-SCIDマウス、雌、5-6週齢、18-20gを、ベイジン・バイタル・リバー（Beijing Vital River）から購入し、5グループ、各グループにおいて9匹のマウスに分けた。Raji細胞を、10%ウシ胎仔血清（FBS）を含有するRPMI-1640培地においてインビトロで培養した。指数増殖期にあるRaji細胞を収集し、および滅菌条件下でCB17-SCIDマウスに皮下移植し、および各マウスに2×106細胞を接種した。腫瘍接種日を0日目とした。最初の施与は接種後三日目に開始し、およびその後以下のように進めた：
グループ1：PBS溶媒、i.p.、N=9、Q2D、日数3、5、7、9、11、13、15；
グループ2：IgG1 30mg/kg、i.p.、N=9、Q2D、日数3、5、7、9、11、13、15；
グループ3：mAb077-IgG 3mg/kg、i.p.、N=9、Q2D、日数3、5、7、9、11、13、15；
グループ4：mAb077-IgG 10mg/kg、i.p.、N=9、Q2D、日数3、5、7、9、11、13、15；
グループ5：mAb077-IgG 30mg/kg、i.p.、N=9、Q2D、日数3、5、7、9、11、13、15；
投与後、動物の行動を合計18日間毎日モニターした。ノギスで腫瘍の長径および短径を測定した後、長さ×幅2/2によって腫瘍容量を算出した。腫瘍抑制率は式TGI%=(1-T/C)×100%によって算出した。TおよびCはそれぞれ特定の時点における投与グループおよびコントロールグループの腫瘍容量（TV）を表す。体重において変化は式RCBW%=(BWi-BW0)/BW0×100%を使用して算出し、BWiはマウスの現在の体重、およびBW0はグループ分けした日でのマウスの体重である。すべての実験結果は、平均腫瘍容量±標準誤差（SEM）として表した。処置グループの腫瘍容量および腫瘍重量がコントロールグループのそれらと有意に異なるかどうかを比較するためにT-検定法を用いた。すべてのデータはGraphpad、有意差についてp<0.05を用いて分析した。
【０１０８】
図10に示すように、mAb077-IgGは、Raji移植腫瘍モデルにおいて有意な抗腫瘍効果および用量依存的効果を示す。低、中および高用量グループにおける腫瘍増殖抑制（TGI）は、それぞれ41%、49%および70%であった。各々の投与グループにおいてマウスの体重での有意な減少はなく、マウスはこれらの用量でmAb077-IgGに対して耐容性良好であったことが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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