(57)【要約】  本発明は、安定な融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質（またはその断片）、前記タンパク質を含む組成物、ならびにＲＳＶ感染を防止および／または治療するためのその使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質。
【請求項２】
前記融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的な少なくとも１種のエピトープを含み、前記少なくとも１種のエピトープは、配列番号４の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３領域および配列番号７の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号９の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体、ならびに／または配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ３領域および配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体によって認識される、請求項１に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片。
【請求項３】
前記タンパク質は三量体である、請求項１または２に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片。
【請求項４】
請求項１、２または３に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸分子。
【請求項５】
前記核酸分子は哺乳動物細胞における発現用にコドン最適化されている、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項４または５に記載の核酸分子。
【請求項７】
請求項４、５または６に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項８】
請求項１、２または３に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片、請求項４、５または６に記載の核酸分子、および／あるいは請求項７に記載のベクターを含む組成物。
【請求項９】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答の誘導に使用するための請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ＲＳＶ感染の予防および／または治療に使用するための請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１、２または３に記載の融合前ＲＳＶタンパク質またはその断片、請求項４、５または６に記載の核酸分子、および／あるいは請求項７に記載のベクターを含むＲＳＶワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬の分野に関する。本発明は、特に、組換え融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、および、例えばワクチンとしてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、毎年約２００，０００人の小児死亡の原因であると考えられている気道の伝染性が高い小児病原体である。２歳未満の小児では、ＲＳＶは呼吸器感染症による入院の約５０％を占め、入院のピークは月齢２〜４ヶ月で生じる。ほとんどすべての小児が２歳までにＲＳＶ感染を経験し、生涯にわたる反復感染は自然免疫の低さに起因すると報告されている。高齢者では、ＲＳＶ疾患の負担は、一般的なインフルエンザＡ感染によって引き起こされるものと類似している。
【０００３】
宿主細胞に感染するために、ＲＳＶは、インフルエンザウイルスおよびＨＩＶなどの他のエンベロープウイルスのように、宿主細胞膜とウイルス膜の融合を必要とする。ＲＳＶの場合、保存的な融合タンパク質（ＲＳＶ  Ｆタンパク質）が、ウイルスと宿主細胞の細胞膜を融合させる。パラミクソウイルス研究に基づく現行のモデルでは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、最初に、「融合前」コンフォメーションにフォールディングする。準安定な構造が、安定化する中和抗体Ｆａｂフラグメントとの複合体で最近解明された（ＭｃＬｅｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０（６１３６）：１１１３−７，２０１３）。細胞侵入中に、融合前コンフォメーションは、リフォールディングし、その「融合後」コンフォメーションにコンフォメーション変化する（ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ８５（１５）：７７８８−９６，２０１０；Ｓｗａｎｓｏｎ，ＰＮＡＳ  １０８（２３）：９６１９−２４，２０１１）。したがって、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、準安定な形態（融合前コンフォメーション）に最初フォールディングすることにより、不可逆的なタンパク質リフォールディングと膜並置を連結することによる膜融合を駆動する準安定なタンパク質であり、これは、その後、よりエネルギーの低いコンフォメーションへの不連続的／段階的なコンフォメーション変化を起こす。これらの観察は、融合前および融合後のＲＳＶ  Ｆタンパク質が抗原的に異なることを示唆する（Ｃａｌｄｅｒ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７１，１２２−１３１（２０００））。ＲＳＶ−Ｆの電子顕微鏡から、融合前と融合後のＦ三量体との間に大きな構造的差異が存在することが明らかであり、これは結晶学によって最近確認されており（ＭｃＬｅｌｌａｎ  Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０（６１３６）：１１１３−７（２０１３）およびＭｃＬｅｌｌａｎ  Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４２（６１５８）：５９２−８（２０１３））、ＲＳＶ陽性個体の血清中の中和抗体のほとんどが融合前Ｆに結合していることが示された（Ｎｇｗｕｔａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７（３０９）：３０９ｒａ１６２，１−９）。
【０００４】
ＲＳＶ感染に対するワクチンは、現在入手可能ではなく、所望されている。ＲＳＶ  Ｆタンパク質に基づくワクチン候補は、例えば安定性、純度、再現性、および効力に関する問題のために失敗している。上記の指摘のように、結晶構造から、融合前状態と融合後状態との間にコンフォメーションの大きな変化があることが明らかになっている。再配列の規模から、ＲＳＶ−Ｆの融合後コンフォメーションに対する抗体の一部しか、ウイルス表面上で融合前スパイクの生得コンフォメーションと交差反応できないことが示唆された。したがって、ＲＳＶに対するワクチンを作製する努力が、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前形態を含有するワクチンの開発に集中している（例えば、国際公開第２０１０１１４９７４５号パンフレット、国際公開第２０１０／１１４９７４３号パンフレット、国際公開第２００９／１０７９７９６号パンフレット、国際公開第２０１２／１５８６１３号パンフレットを参照）。しかしながら、これらの努力によっても、ヒトで試験するための候補として使用することができる安定な融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質を得るまでに至っていない。
【０００５】
したがって、ＲＳＶに対する効果的なワクチンおよびワクチン接種方法、特に融合前コンフォメーション状態のＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むワクチンおよび方法が依然として要望されている。本発明は、ＲＳＶに対するそのようなワクチンおよび安全で効果的にワクチン接種するための方法を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は安定な組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質、すなわち、融合前コンフォメーションで安定化された可溶性形態（すなわち、膜に結合していない）組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質を提供するものであり、このＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその断片を含む。
【０００７】
ある実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片は融合前コンフォメーションのＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含み、その少なくとも１つのエピトープは、配列番号４の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３領域および配列番号７の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号９の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体、ならびに／または配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ３領域および配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体によって認識される。
【０００８】
ある実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は三量体である。
【０００９】
本発明はまた、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸分子、およびそのような核酸分子を含むベクターを提供する。
【００１０】
本発明はまた、前記ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質（またはその断片）を含む組成物、好ましくは免疫原性組成物、前記ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質をコードする核酸分子、およびＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答の誘導におけるその使用、特にワクチンとしてのその使用に関する。本発明はまた、対象に抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）免疫応答を誘導するための方法であって、有効量の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸分子、および／または前記核酸分子を含むベクターを対象に投与することを含む方法に関する。好ましくは、誘導される免疫応答は、ＲＳＶに対する中和抗体および／またはＲＳＶに対する防御免疫を特徴とする。特定の態様では、本発明は、対象に抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質中和抗体を誘導するための方法であって、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸分子、および／または前記核酸分子を含むベクターを含む有効量の免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＲＳＶ  Ｆ変異体の模式図。ＳＣＤＭ−一本鎖二重変異体、ＳＣＴＭ−一本鎖三重変異体、ＰＲＱＭ−プロセシングされた四重変異体およびＰＲＰＭ−プロセシングされた五重変異体。分泌タンパク質を、シグナルペプチドおよびｐ２７断片なしで示す。Ｆ１およびＦ２ドメイン、ならびに融合ペプチド（ＦＰ）、フィブリチン三量化ドメイン（フォルドン）、およびＦ２とＦ１の間の一本鎖タンパク質のリンカー（ＧＳＧＳＧ）が示されている。３つの安定化変異（Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５ＰおよびＤ３８６Ｎ）（黒の菱形）。循環株に対する抗原マッチを改善するための２つの変異（Ｋ６６ＥおよびＩ７６Ｖ）（灰色の菱形）。残基の位置は、シグナルペプチドを含む完全長野生型タンパク質におけるように番号付けされている。
【図２】複数のアミノ酸置換を有するプロセシングされたＲＳＶ  Ｆ  ＰＲ−Ａ２変異体のタンパク質発現レベルおよび融合前安定性。細胞培養上清におけるタンパク質発現レベルを、トランスフェクションの７２時間後に、ＣＲ９５０１およびＣＲ９５０３（左のバー）による定量オクテット（Ｑ−オクテット）、ならびに採取日および４℃での指示された期間の保存後の融合前特異的ＣＲ９５０１抗体に結合するＲＳＶ  Ｆタンパク質の画分（右のバー）によって試験した。バーは２〜４回の測定値の平均を表し、線は値の範囲を表す。
【図３】精製したＲＳＶ−Ｆタンパク質の融点（Ｔｍ）。各測定値は点で表されている。
【図４】Ｋ６６ＥおよびＩ７６Ｖアミノ酸による置換は、Ｆタンパク質発現レベルおよび融合前の安定性に影響を及ぼさなかった。細胞培養上清におけるタンパク質発現レベルを、トランスフェクションの９６時間後に、ＣＲ９５０１およびＣＲ９５０３（左のバー）によるＱ−オクテット、ならびに採取日および４℃での指示された期間の保存後の融合前特異的ＣＲ９５０１抗体に結合するＲＳＶ  Ｆタンパク質の画分（右のバー）によって試験した。バーは２回の測定値の平均を表し、線は値の範囲を表す。
【図５】ＣＨＯ細胞培養上清におけるＦタンパク質変異体の融合前安定性。細胞培養上清におけるタンパク質発現レベルを、トランスフェクションの９６時間後に、ＣＲ９５０１およびＣＲ９５０３によるＱ−オクテット、ならびに採取日および４℃での指示された期間の保存後の融合前特異的ＣＲ９５０１抗体に結合するＲＳＶ  Ｆタンパク質の画分によって試験した。バーは２回の測定値の平均を表し、線は値の範囲を表す。ＰＲＱＭ―Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６ＥおよびＩ７６Ｖを含むＰＲ−Ａ２；ＰＲＰＭ―Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６ＶおよびＤ４８６Ｎを含むＰＲ−Ａ２。
【図６−１】本発明のＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ｐＨ５のＣＨＯ細胞培養上清中で無傷のままである。Ｆタンパク質変異体を含む細胞培養上清のｐＨをｐＨ５に調整し、７日目に試料をプロテアーゼ阻害剤と共に、またはプロテアーゼ阻害剤なしでインキュベートした。試料を還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。各ゲルの第１レーンは分子量標準マーカーであり、標準タンパク質のサイズを示す。試料：１−  ０日目の試料；２−  ４℃でインキュベートした７日目の試料；３−  ４℃でプロテアーゼ阻害剤と共にインキュベートした７日目の試料；４−  ０日目の試料；５−  室温でインキュベートした７日目の試料；６−  プロテアーゼ阻害剤と共に室温でインキュベートした７日目の試料；７−  ０日目の試料；８−  ３７℃でインキュベートした７日目の試料；９−  プロテアーゼ阻害剤と共に３７℃でインキュベートした７日目の試料。プロセシングされたタンパク質試料では、下のバンドはＦ１ドメインを表し、上のバンドは部分的にプロセシングされたタンパク質（Ｆ１＋ｐ２７）またはプロセシングされていないタンパク質Ｆ１＋Ｆ２）を表す。一本鎖タンパク質試料では、バンドはＦ１＋Ｆ２ドメインである。ＰＲＱＭ―Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６ＥおよびＩ７６Ｖを含むＰＲ−Ａ２；ＰＲＰＭ―Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６ＶおよびＤ４８６Ｎを含むＰＲ−Ａ２。ＬＮＲ：Ｋ６８３−０６５。
【図６−２】本発明のＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ｐＨ５のＣＨＯ細胞培養上清中で無傷のままである。Ｆタンパク質変異体を含む細胞培養上清のｐＨをｐＨ５に調整し、７日目に試料をプロテアーゼ阻害剤と共に、またはプロテアーゼ阻害剤なしでインキュベートした。試料を還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。各ゲルの第１レーンは分子量標準マーカーであり、標準タンパク質のサイズを示す。試料：１−  ０日目の試料；２−  ４℃でインキュベートした７日目の試料；３−  ４℃でプロテアーゼ阻害剤と共にインキュベートした７日目の試料；４−  ０日目の試料；５−  室温でインキュベートした７日目の試料；６−  プロテアーゼ阻害剤と共に室温でインキュベートした７日目の試料；７−  ０日目の試料；８−  ３７℃でインキュベートした７日目の試料；９−  プロテアーゼ阻害剤と共に３７℃でインキュベートした７日目の試料。プロセシングされたタンパク質試料では、下のバンドはＦ１ドメインを表し、上のバンドは部分的にプロセシングされたタンパク質（Ｆ１＋ｐ２７）またはプロセシングされていないタンパク質Ｆ１＋Ｆ２）を表す。一本鎖タンパク質試料では、バンドはＦ１＋Ｆ２ドメインである。ＰＲＱＭ―Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６ＥおよびＩ７６Ｖを含むＰＲ−Ａ２；ＰＲＰＭ―Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６ＶおよびＤ４８６Ｎを含むＰＲ−Ａ２。ＬＮＲ：Ｋ６８３−０６５。
【図６−３】本発明のＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ｐＨ５のＣＨＯ細胞培養上清中で無傷のままである。Ｆタンパク質変異体を含む細胞培養上清のｐＨをｐＨ５に調整し、７日目に試料をプロテアーゼ阻害剤と共に、またはプロテアーゼ阻害剤なしでインキュベートした。試料を還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。各ゲルの第１レーンは分子量標準マーカーであり、標準タンパク質のサイズを示す。試料：１−  ０日目の試料；２−  ４℃でインキュベートした７日目の試料；３−  ４℃でプロテアーゼ阻害剤と共にインキュベートした７日目の試料；４−  ０日目の試料；５−  室温でインキュベートした７日目の試料；６−  プロテアーゼ阻害剤と共に室温でインキュベートした７日目の試料；７−  ０日目の試料；８−  ３７℃でインキュベートした７日目の試料；９−  プロテアーゼ阻害剤と共に３７℃でインキュベートした７日目の試料。プロセシングされたタンパク質試料では、下のバンドはＦ１ドメインを表し、上のバンドは部分的にプロセシングされたタンパク質（Ｆ１＋ｐ２７）またはプロセシングされていないタンパク質Ｆ１＋Ｆ２）を表す。一本鎖タンパク質試料では、バンドはＦ１＋Ｆ２ドメインである。ＰＲＱＭ―Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６ＥおよびＩ７６Ｖを含むＰＲ−Ａ２；ＰＲＰＭ―Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６ＶおよびＤ４８６Ｎを含むＰＲ−Ａ２。ＬＮＲ：Ｋ６８３−０６５。
【図７−１】ＣＨＯ細胞培養上清におけるＲＳＶ  Ｆタンパク質の温度安定性。上清試料を温度４５〜６５℃で３０分間熱処理した。試料中の融合前タンパク質の量を、ＣＲ９５０１抗体を用いたＥＬＩＳＡで測定した。値を未処理試料（２０℃）に対して正規化した。各タンパク質の曲線を個別に示し、すべての曲線の重ね合わせを示す（右下）。各点は反復測定を表す。２つのアッセイを、それぞれ２回の技術的反復により実施した。曲線は、非線形回帰可変勾配方程式（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を用いてフィッティングし、融点（Ｔｍ）をＩＣ５０値として計算した。ＰＲＱＭ―Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６ＥおよびＩ７６Ｖを含むＰＲ−Ａ２；ＰＲＰＭ―Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６ＶおよびＤ４８６Ｎを含むＰＲ−Ａ２。
【図７−２】ＣＨＯ細胞培養上清におけるＲＳＶ  Ｆタンパク質の温度安定性。上清試料を温度４５〜６５℃で３０分間熱処理した。試料中の融合前タンパク質の量を、ＣＲ９５０１抗体を用いたＥＬＩＳＡで測定した。値を未処理試料（２０℃）に対して正規化した。各タンパク質の曲線を個別に示し、すべての曲線の重ね合わせを示す（右下）。各点は反復測定を表す。２つのアッセイを、それぞれ２回の技術的反復により実施した。曲線は、非線形回帰可変勾配方程式（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を用いてフィッティングし、融点（Ｔｍ）をＩＣ５０値として計算した。ＰＲＱＭ―Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６ＥおよびＩ７６Ｖを含むＰＲ−Ａ２；ＰＲＰＭ―Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６ＶおよびＤ４８６Ｎを含むＰＲ−Ａ２。
【図７−３】ＣＨＯ細胞培養上清におけるＲＳＶ  Ｆタンパク質の温度安定性。上清試料を温度４５〜６５℃で３０分間熱処理した。試料中の融合前タンパク質の量を、ＣＲ９５０１抗体を用いたＥＬＩＳＡで測定した。値を未処理試料（２０℃）に対して正規化した。各タンパク質の曲線を個別に示し、すべての曲線の重ね合わせを示す（右下）。各点は反復測定を表す。２つのアッセイを、それぞれ２回の技術的反復により実施した。曲線は、非線形回帰可変勾配方程式（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を用いてフィッティングし、融点（Ｔｍ）をＩＣ５０値として計算した。ＰＲＱＭ―Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６ＥおよびＩ７６Ｖを含むＰＲ−Ａ２；ＰＲＰＭ―Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６ＶおよびＤ４８６Ｎを含むＰＲ−Ａ２。
【図８−１】ＲＳＶ  Ａ２のチャレンジから５日後の肺および鼻におけるＲＳＶ力価。ＲＳＶ  Ａ２のチャレンジから５日後の肺（上のパネル）および鼻（下のパネル）におけるＲＳＶ力価。検出下限（ＬＯＤ）を点線で示す。平均力価（組織１ｇ当たりのｌｏｇ１０ｐｆｕ）を横棒で示す。Ｃｏｃｈｒａｎ−Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ検定により、アジュバント添加ＰＲＰＭ群とアジュバント非添加ＰＲＰＭ群を用量で比較し、統計的な差を図に示す。ｉ．ｍ．：筋肉内；ｉ．ｎ：鼻腔内。
【図８−２】ＲＳＶ  Ａ２のチャレンジから５日後の肺および鼻におけるＲＳＶ力価。ＲＳＶ  Ａ２のチャレンジから５日後の肺（上のパネル）および鼻（下のパネル）におけるＲＳＶ力価。検出下限（ＬＯＤ）を点線で示す。平均力価（組織１ｇ当たりのｌｏｇ１０ｐｆｕ）を横棒で示す。Ｃｏｃｈｒａｎ−Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ検定により、アジュバント添加ＰＲＰＭ群とアジュバント非添加ＰＲＰＭ群を用量で比較し、統計的な差を図に示す。ｉ．ｍ．：筋肉内；ｉ．ｎ：鼻腔内。
【図９】プライミング後４９日目のコットンラット血清中のＲＳＶ  Ａ  Ｌｏｎｇに対するＲＳＶ中和力価。プライミング後４９日目のコットンラット血清におけるＲＳＶ  Ａ  Ｌｏｎｇに対するＲＳＶ中和力価（ＩＣ５０（ｌｏｇ２））を、ＥＬＩＳＡからの読み出しを用いて、決定した。各群の平均を水平棒で示す。検出限界（ＬＯＤ）を３．０（ｌｏｇ２、破線で示す）に設定する。アジュバント添加とアジュバント非添加のＰＲＰＭにより誘導されたＶＮＡ力価をＡＮＯＶＡにより用量で比較し、結果を図に示す。ｉ．ｍ．：筋肉内；ｉ．ｎ：鼻腔内。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の融合タンパク質（Ｆ）は、宿主細胞膜とウイルス膜の融合に関与し、感染に必要とされる。ＲＳＶ  Ｆ  ｍＲＮＡはＦ０と呼ばれる５７４のアミノ酸前駆体タンパク質に翻訳され、これは小胞体中のシグナルペプチダーゼによって除去されるＮ末端の２６アミノ酸からなるシグナルペプチド配列を含む。Ｆ０は、トランスゴルジにおいて、細胞フーリン様プロテアーゼにより２つの部位（アミノ酸残基１０９／１１０間および１３６／１３７間）で切断され、アミノ酸残基１１０〜１３６を含む短いグリコシル化介在配列（ｐ２７領域とも呼ばれる）が除去され、Ｆ１およびＦ２と称される２つのドメインまたはサブユニットが生成される。Ｆ１ドメイン（アミノ酸残基１３７〜５７４）は、そのＮ末端に疎水性融合ペプチドを有し、Ｃ末端に膜貫通（ＴＭ）（アミノ酸残基５３０〜５５０）領域および細胞質領域（アミノ酸残基５５１〜５７４）を有する。Ｆ２ドメイン（アミノ酸残基２７〜１０９）は、２つのジスルフィド架橋によりＦ１に共有結合する。Ｆ１−Ｆ２ヘテロ二量体は、ビリオン中でホモ三量体として集合している。
【００１３】
ＲＳＶ感染に対するワクチンは、現在入手可能ではないが所望されている。
ワクチン製造に有望な１つのアプローチは、精製されたＲＳＶ  Ｆタンパク質に基づくサブユニットワクチンである。しかしながら、このアプローチの場合、精製されたＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前状態のコンフォメーションに類似したコンフォメーションにあり、経時的に安定であり、かつ十分な量で製造できることが望ましい。加えて、サブユニットベースのワクチンの場合、ＲＳＶ  Ｆタンパク質を、膜貫通（ＴＭ）領域および細胞質領域の欠失により短縮して、可溶性分泌型Ｆタンパク質（ｓＦ）を生成させる必要がある。ＴＭ領域は膜アンカリングおよび三量体形成を担うため、アンカーなしの可溶性Ｆタンパク質は、完全長タンパク質よりもかなり不安定であり、融合後最終状態に容易にリフォールディングするであろう。したがって、高い発現レベルおよび高い安定性を示す安定な融合前コンフォメーションの可溶性Ｆタンパク質を得るために、融合前コンフォメーションを安定化する必要がある。
【００１４】
融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質を安定化するいくつかの変異は、既に国際公開第２０１４／１７４０１８号パンフレットおよび国際公開第２０１４／２０２５７０号パンフレットに記載されている。本発明によるＲＳＶ  Ｆタンパク質は、２つのさらなる変異と組み合わせて、先に記載された変異の特有かつ特異的なサブセットを含む。本発明によれば、本発明の変異のこの特有の組み合わせが、ＲＳＶ  Ｆタンパク質発現レベルを増加させ、かつ融合前コンフォメーションの安定をもたらすことが示された。
【００１５】
したがって、本発明は新規の安定な可溶性融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、すなわち、融合前コンフォメーションで安定化された可溶性ＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片を提供する。本発明によるＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
本発明に至る研究では、前記の安定な可溶性融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質を得るために、ヘテロ三量体化ドメインと共に特有の変異の組み合わせを導入した。本発明の安定な融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、融合前コンフォメーションで存在する、すなわち、それらは、融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含む（示す）。融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的なエピトープは、融合後コンフォメーションでは現れないエピトープである。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションは、天然ＲＳＶビリオンで発現するＲＳＶ  Ｆタンパク質のものと同じエピトープを含有することができ、したがって、予防的中和抗体を誘発する利点を備え得ると考えられる。
【００１７】
ある実施形態では、本発明のＲＳＶ融合前Ｆタンパク質（またはその断片）は、配列番号４の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号６の重鎖ＣＤＲ３領域および配列番号７の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号９の軽鎖ＣＤＲ３領域（以下、ＣＲ９５０１という）を含む融合前特異的モノクローナル抗体、ならびに／または配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ３領域および配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ３領域（ＣＲ９５０２という）を含む融合前特異的モノクローナル抗体により認識される、少なくとも１つのエピトープを含む。ＣＲ９５０１およびＣＲ９５０２は、それぞれ抗体５８Ｃ５および３０Ｄ８の重鎖および軽鎖可変領域を含み、したがって、それらの抗体の結合特異性を有するが、それらの抗体は、融合後コンフォメーションではなく、融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的に結合することが以前より示されている（国際公開第２０１２／００６５９６号パンフレットに開示されているように）。
【００１８】
ある実施形態では、組換え融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は三量体である。
【００１９】
本出願の全体にわたって使用される場合、当該技術分野での慣例として、ヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で提示され、アミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端の方向で提示される。
【００２０】
上記のように、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質の断片もまた、本発明に含まれる。断片はアミノ末端（例えば、シグナル配列を切断することにより）およびカルボキシ末端欠失のいずれかまたは両方から生じ得る。この断片は、Ｆタンパク質の免疫学的に活性な断片、すなわち、対象に免疫応答を生じさせる部分を含むように選択され得る。これは、当業者にはすべてルーチン的である、インシリコ、インビトロ、および／またはインビボの方法を使用して容易に決定することができる。
【００２１】
ある実施形態では、本発明によるコード化タンパク質は、配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸１〜２６に対応する、リーダー配列またはシグナルペプチドとも呼ばれるシグナル配列を含む。シグナル配列は、通常、分泌経路に向かう、新たに合成された大部分のタンパク質のＮ末端に存在する短い（例えば、５〜３０アミノ酸長）アミノ酸配列であり、一般に、シグナルペプチダーゼによって切断されて、遊離のシグナルペプチドと成熟タンパク質を生成する。
【００２２】
ある実施形態では、本発明によるタンパク質はシグナル配列を含まない。
【００２３】
本発明は、さらに、本発明によるＲＳＶ融合前Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸分子を提供する。
【００２４】
好ましい実施形態では、本発明によるＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸分子は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞における発現用にコドン最適化されている。コドン最適化の方法は既知であり、これまでに記述されている（例えば、国際公開第９６／０９３７８号パンフレット）。野生型配列と比べて少なくとも１つの好ましくないコドンがより好ましいコドンで置換される場合に、配列はコドン最適化されると考えられる。本明細書では、好ましくないコドンとは、生物において、同じアミノ酸をコードする別のコドンと比べて使用される頻度が低いコドンであり、より好ましいコドンとは、生物において、好ましくないコドンと比べて使用される頻度が高いコドンである。特定の生物におけるコドン使用の頻度は、コドン頻度表、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎに見出すことができる。好ましくは、２つ以上の好ましくないコドン、好ましくは、ほとんどまたはすべての好ましくないコドンが、より好ましいコドンに置き換えられる。好ましくは、生物で最も高頻度に使用されるコドンがコドン最適化配列に使用される。好ましいコドンに置き換えられると、概して発現が高くなる。
【００２５】
多くの異なるポリヌクレオチドおよび核酸分子が、遺伝子コードの縮重の結果として同じタンパク質をコードし得ることは当業者に理解されるであろう。また、当業者が慣例の技術を使用して、タンパク質を発現させることになる任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するように、核酸分子がコードするタンパク質配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行い得ることも、理解される。したがって、特に指定しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含んでも含まなくてもよい。
【００２６】
核酸配列は、慣例の分子生物学技術を使用してクローン化することができ、またはＤＮＡ合成により新規に作製することができ、それは、ＤＮＡ合成および／または分子クローニングの分野の事業を有するサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）により、慣例の手順を使用して行われ得る。
【００２７】
ある実施形態では、核酸分子は配列番号２１、２２または２３のヌクレオチド配列を含む。
【００２８】
本発明はまた、上記の核酸分子を含むベクターを提供する。したがって、ある実施形態では、本発明による核酸分子はベクターの一部である。このようなベクターは、当業者によく知られた方法により容易に操作することができ、例えば、原核細胞および／または真核細胞において複製できるように設計することができる。加えて、多くのベクターは、真核細胞の形質転換に使用することができ、そのような細胞のゲノムに全体としてまたは部分的に組み込まれ、その結果、そのゲノムに所望の核酸を含む安定な宿主細胞が得られる。使用されるベクターは、ＤＮＡのクローニングに適し、目的の核酸の転写に使用することができるものであれば、いかなるベクターでもよい。当業者は、好適な発現ベクターを選択し、本発明の核酸配列を機能的に挿入することができる。
【００２９】
融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞もまた本発明の一部を形成する。融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、腫瘍細胞株、ＢＨＫ細胞、ヒト細胞株、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、もしくは酵母、真菌、昆虫細胞など、またはトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物における分子の発現を含む組換えＤＮＡ技術によって生成することができる。ある実施形態では、細胞は多細胞生物由来であり、ある実施形態では、細胞は脊椎動物または無脊椎動物起源である。ある実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。ある実施形態では、細胞はヒト細胞である。一般に、宿主細胞における、本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質などの組換えタンパク質の生成は、発現可能形式でそのタンパク質をコードする異種核酸分子の宿主細胞への導入、核酸分子の発現に資する条件下での細胞の培養、および前記細胞におけるタンパク質発現を可能にすることを含む。発現可能形式でタンパク質をコードする核酸分子は、発現カセットの形態であってもよく、通常、エンハンサー、プロモーター、ポリアデニル化シグナルなど、核酸の発現をもたらすことができる配列を必要とする。当業者は、宿主細胞内での遺伝子の発現を得るのに様々なプロモーターが使用可能であることを認識している。プロモーターは構成的であっても調節的であってもよく、ウイルス、原核生物、もしくは真核生物の供給源を含む種々の供給源から入手すること、または人為的に設計することが可能である。
【００３０】
細胞培養培地は種々のベンダーから入手可能であり、好適な培地は、宿主細胞が目的のタンパク質、ここでは融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現するようにルーチン的に選択することができる。好適な培地は血清を含有しても含有しなくてもよい。
【００３１】
「異種核酸分子」（本明細書では「導入遺伝子」とも呼ぶ）は、宿主細胞に天然には存在しない核酸分子である。それは、例えば、標準の分子生物学技術によりベクターに導入される。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列と作動可能に連結される。これは、例えば、導入遺伝子をコードする核酸をプロモーターの制御下に置くことで実施され得る。さらなる調節配列を加えることもできる。導入遺伝子の発現のために多くのプロモーターが使用可能であり、それらは当業者に知られており、例えば、それらは、ウイルス、哺乳動物、合成のプロモーターなどを含んでもよい。真核細胞内での発現を得るのに好適なプロモーターの非限定的な例としては、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号明細書）、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、例えばＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー／プロモーターからのｎｔ．−７３５〜＋９５を含むものが挙げられる。ポリアデニル化シグナル、例えばウシ成長ホルモンのポリＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号明細書）を導入遺伝子の後に存在させることができる。あるいは、いくつかの広く使用されている発現ベクターが当該技術分野および商用供給源から入手可能であり、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡおよびｐＥＦベクター系列、ＢＤ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのｐＭＳＣＶおよびｐＴＫ−Ｈｙｇ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔなどがあり、これらは、目的のタンパク質を組換えにより発現させるために、または好適なプロモーターおよび／もしくは転写ターミネーター配列、ポリＡ配列などを得るために使用することができる。
【００３２】
細胞培養は、付着細胞培養、例えば培養容器の表面またはマイクロキャリアに付着した細胞、および懸濁培養など、任意のタイプの細胞培養であってよい。大抵の大規模懸濁培養は、操作およびスケールアップが最も簡単であるため、バッチ法または流加法として操作される。最近では、灌流原理に基づく連続法がより一般的になりつつあり、また好適でもある。好適な培養培地も当業者に周知であり、一般に、商用供給源から大量に得ること、または標準プロトコルにしたがって注文生産することが可能である。培養は、例えば、バッチ、流加、連続システムなどを使用して、シャーレ、ローラーボトルまたはバイオリアクター内で行うことができる。細胞を培養する好適な条件は知られている（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３），およびＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ  ０−４７１−３４８８９−９）を参照）。
【００３３】
本発明は、上記の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、および／または核酸分子、および／またはベクターを含む組成物をさらに提供する。したがって、本発明は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションには存在するが、融合後コンフォメーションには存在しないエピトープを示す融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片を含む組成物を提供する。本発明はまた、そのような融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸分子および／またはベクターを含む組成物を提供する。組成物は、好ましくは、上記の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質および／または核酸分子および／またはベクターを含む免疫原性組成物である。本発明はまた、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導するための、安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質または本発明の前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸分子の使用を提供する。さらに、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導するための方法であって、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質および／または核酸分子および／またはベクターを対象に投与することを含む方法を提供する。また、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導する際に使用するための、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、核酸分子および／またはベクターを提供する。さらに、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導する際に使用する薬剤を製造するための、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質および／または核酸分子および／またはベクターを提供する。
【００３４】
本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、核酸分子、またはベクターは、ＲＳＶ感染の防止（予防）および／または治療に使用することができる。ある実施形態では、防止および／または治療は、ＲＳＶ感染に罹りやすい患者群を標的にすることができる。そのような患者群としては、以下に限定されるものではないが、例えば、高齢者（例えば、５０歳以上、６０歳以上、および好ましくは６５歳以上）、若齢者（例えば、５歳以下、１歳以下）、入院患者、および抗ウイルス性化合物で治療されたが、十分な抗ウイルス応答を示さなかった患者が挙げられる。
【００３５】
本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、核酸分子、および／またはベクターは、例えば、ＲＳＶを原因とする疾患もしくは病態の単独の治療および／または予防に、あるいは（既存または将来の）ワクチン、抗ウイルス剤および／またはモノクローナル抗体など、他の予防的治療および／または療法的治療と組み合わせて使用することができる。
【００３６】
本発明は、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、核酸分子、および／またはベクターを利用して、対象のＲＳＶ感染を防止および／または治療するための方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、対象のＲＳＶ感染を防止および／または治療するための方法は、上記のような融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、核酸分子、および／またはベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。治療有効量は、ＲＳＶによる感染から生じる疾患または病態を防止、寛解および／または治療するのに効果のあるタンパク質、核酸分子、またはベクターの量を指す。防止は、ＲＳＶの伝播の阻害もしくは低減、またはＲＳＶによる感染に関連した症状の１つもしくは複数の発症、進展、もしくは進行を阻害もしくは低減することを包含する。本明細書で使用される寛解は、目に見える、もしくは認知できる疾患の症状、ウイルス血症、またはインフルエンザ感染の他の任意の計測可能な徴候の低減を指し得る。
【００３７】
ヒトなどの対象に投与するために、本発明は、本明細書に記載する融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、核酸分子、および／またはベクターと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を使用することができる。この場合、「薬学的に許容される」という用語は、担体もしくは賦形剤が、使用する用量および濃度で、それらを投与する対象に望ましくない、または有害な効果を引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容される担体および賦形剤は、当該技術分野でよく知られている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照）。ＲＳＶ  Ｆタンパク質または核酸分子は、凍結乾燥製剤を利用することも可能であり得るが、滅菌溶液として製剤化し、投与することが好ましい。滅菌溶液は、滅菌濾過または当該技術分野でそれ自体知られている他の方法によって調製される。その後、溶液は凍結乾燥されるか、または医薬投与容器に充填される。溶液のｐＨは一般に、ｐＨ３．０〜９．５、例えばｐＨ５．０〜７．５の範囲である。ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、通常、薬学的に許容される好適な緩衝剤を含む溶液中に存在し、組成物はまた塩を含有してもよい。任意選択により、アルブミンなどの安定剤が含まれ得る。ある実施形態では、洗浄剤が添加される。ある実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は注射剤に製剤化することができる。
【００３８】
ある実施形態では、本発明による組成物は、１種または複数種のアジュバントをさらに含む。適用される抗原決定基に対する免疫応答をさらに高めるアジュバントは当該技術分野で知られている。「アジュバント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書では同義的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１種または複数種の物質と定義される。これに関連して、アジュバントは、本発明のＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を増強するために使用される。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；油−エマルジョン組成物（または水中油型組成物）、例えば、ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルション（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照）；サポニン製剤、例えばＱＳ２１および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）など（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照）；細菌または微生物の派生物（これらの例には、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧ−モチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ−リボシル化細菌毒素またはその変異体、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴなどがある）；真核生物のタンパク質（例えば、抗体もしくはその断片（例えば、抗原自体またはＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８０に向けられたもの）および受容体へのリガンド（例えば、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦなど）（これらは受容細胞と相互作用すると、免疫応答を刺激する））が挙げられる。ある実施形態では、本発明の組成物は、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウムアルミニウム、またはそれらの組み合わせの形態のアルミニウムを、１用量当たり０．０５〜５ｍｇ、例えば０．０７５〜１．０ｍｇのアルミニウム含有量の濃度で、アジュバントとして含む。
【００３９】
融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質はまた、例えばポリマー、リポソーム、ビロソーム、ウイルス様粒子または自己集合性タンパク質粒子などのナノ粒子と組み合わせて、またはそれにコンジュゲートさせて投与することができる。融合前Ｆタンパク質は、アジュバンドを含む、または含まないナノ粒子と組み合わせるか、その中に封入するか、またはそれにコンジュゲートさせることができる。リポソーム内への封入は、例えば米国特許第４，２３５，８７７号明細書に記載されている。高分子へのコンジュゲーションは、例えば米国特許第４，３７２，９４５号明細書または米国特許第４，４７４，７５７号明細書に開示されている。
【００４０】
他の実施形態では、組成物はアジュバントを含まない。
【００４１】
ある実施形態では、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンを作製する方法であって、本発明による組成物を準備する工程、およびそれを薬学的に許容される組成物中に製剤化する工程を含む方法を提供する。「ワクチン」という用語は、ある特定の病原体または疾患に対して対象にある程度の免疫を誘導するのに有効な活性成分を含有する薬剤または組成物を指し、これにより、その病原体または疾患による感染に関連する症状の重症度、期間、または他の徴候が少なくとも低減（最大で完全消失）する。本発明では、ワクチンは、有効量の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、および／または融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸分子、および／または前記核酸分子を含むベクターを含み、これにより、ＲＳＶのＦタンパク質に対する免疫応答がもたらされる。これは、入院に至る重篤な下気道疾患を防止し、対象のＲＳＶ感染および複製による肺炎および細気管支炎などの合併症の頻度を低減する方法を提供する。本発明による「ワクチン」という用語は、それが医薬組成物であり、したがって、通常、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含むことを意味する。それは、さらなる活性成分を含んでも含まなくてもよい。ある実施形態では、それは、例えばＲＳＶの他のタンパク質および／または他の感染因子に対する免疫応答を誘導する他の成分をさらに含む組み合わせワクチンであってもよい。さらなる活性成分の投与は、例えば、別個の投与によって行われても、本発明のワクチンとさらなる活性成分の組み合わせ製剤を投与することによって行われてもよい。
【００４２】
組成物は、対象、例えばヒト対象に投与することができる。単回投与のための組成物中のＲＳＶ  Ｆタンパク質の総用量は、例えば約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ、例えば１μｇ〜１ｍｇ、例えば１０μｇ〜１００μｇとすることができる。推奨用量の決定は実験により行われ、当業者にはルーチン的である。
【００４３】
本発明による組成物の投与は、標準の投与経路を使用して実施することができる。非限定的実施形態としては、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、または例えば鼻腔内、口腔内などの粘膜投与などの非経口投与が挙げられる。一実施形態では、組成物は筋肉内注射により投与される。当業者は、ワクチン中の抗原に対する免疫応答を誘導するために、例えばワクチンなどの組成物を投与する様々な可能性を認識している。
【００４４】
本明細書で使用する対象は、好ましくは哺乳動物、例えば、マウス、コットンラットなどのげっ歯類、または非ヒト霊長類、またはヒトである。対象は、好ましくは、ヒト対象である。
【００４５】
タンパク質、核酸分子、ベクター、および／または組成物はまた、初回免疫としてまたは追加免疫として、同種または異種初回免疫−追加免疫レジメンで投与することができる。追加免疫ワクチン接種を実施する場合、通常、そのような追加免疫ワクチン接種は、最初に対象に組成物を投与した後（このような場合には「初回ワクチン接種」と呼ばれる）、１週〜１年、好ましくは２週〜４ヶ月のある時点で同じ対象に投与される。ある実施形態では、投与は初回免疫投与および少なくとも１回の追加免疫投与を含む。
【００４６】
加えて、本発明のタンパク質は、例えば、本発明のタンパク質に結合可能な抗体が個体の血清中にあるか否かを確定することにより、個体の免疫状態を検査するための診断ツールとして使用することができる。したがって、本発明はまた、患者のＲＳＶ感染の存在を検出するためのインビトロ診断方法であって、ａ）前記患者から得られた生体試料を本発明によるタンパク質と接触させる工程と、ｂ）抗体−タンパク質複合体の存在を検出する工程とを含む方法に関する。
【実施例】
【００４７】
実施例１：安定な融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質の生成
いくつかの融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質変異体を生成し、これを図１に模式的に示す。すべての候補は、ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ１ドメインのアミノ酸残基４９５に連結した、フィブリチン三量体化ドメイン（フォルドン）（ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ；配列番号２０）を含む。
【００４８】
ＲＳＶ  Ｆのプロセシングバージョン（すなわち、ｐ２７領域を切断して除去したバージョン）では、Ｎ６７Ｉ置換は発現レベルおよび安定性の両方に対して最大の効果を有したが、完全に安定な融合前Ｆタンパク質は６７および２１５の置換が組み合わされた場合にのみ得られ、２０倍の発現レベルの増加を生じた（図２）。第三のアミノ酸置換を追加しても、発現レベルも４℃における保存安定性で測定される安定性も改善されなかった。しかしながら、ＲＳＶ  Ｆタンパク質を精製し、さらにキャラクタリゼーションを行うと、追加の第３の置換は、より厳密な温度安定性試験による（示差走査蛍光測定アッセイ−ＤＳＦによる）測定で、融合前Ｆタンパク質を有意に安定化させることが判明した（図３）。
【００４９】
先に報告された（国際公開第２０１４／１７４０１８号パンフレットおよび同第２０１４／２０２５７０号パンフレット）ＲＳＶ  Ｆタンパク質変異体の親配列として使用されたＡ２株は、頂点Ｋ６６およびＩ７６）に２つの特有かつ稀な変異を蓄積した細胞株適合実験室株であるため、これらの２つの残基を天然の臨床分離株（Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６Ｖ）にマッチするように変異させることを決定した。配列を天然のウイルス分離株により近づけるために、Ｋ６６ＥおよびＩ７６Ｖ変異が、新たなプロセシングされたタンパク質設計に含まれた。選択された安定化変異体でＫ６６Ｅ＋Ｉ７６Ｖ置換を試験し、これらのアミノ酸置換がタンパク質発現に対しても安定性に対しても負の影響を有しないことを示した。タンパク質は、細胞培養上清中で２週間を超えて安定であることが示された。Ｆタンパク質の発現レベルに負の影響がないどころか、Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６ＥおよびＩ７６Ｖ変異を有するＲＳＶ  Ｆ蛋白質は、Ｎ６７ＩおよびＳ２１５Ｐのみを有する蛋白質よりも高レベルで発現した（図４）。
【００５０】
Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６ＥおよびＩ７６Ｖ（プロセシングされた四重変異体をＰＲＱＭと命名）ならびにＮ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６ＶおよびＤ４８６Ｎ（プロセシングされた五重変異体をＰＲＰＭと命名）を有するプロセシングされたＲＳＶ  Ｆタンパク質を精製し、さらにキャラクタリゼーションを行った。
【００５１】
浮遊ＨＥＫ細胞（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ）でＲＳＶ  Ｆタンパク質の安定化変異のスクリーニングを行った。これらの細胞は単純なトランスフェクションプロトコルに適合しており、高レベルでタンパク質を発現するので、研究室で使用するのに便利である。大規模のＧＭＰタンパク質産生では、ＣＨＯ細胞はしばしば選択される細胞系である。したがって、いくつかの好ましいＦタンパク質設計の発現および安定性は、浮遊ＣＨＯ細胞（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＣＨＯ−Ｓ）で試験した。ＣＨＯ−Ｓ細胞はトランスフェクトするのが困難であり、したがって、全体的な発現レベルは、ＨＥＫ細胞よりも低いと予想された。したがって、分析の間、本発明者らはタンパク質の相対的発現およびそれらの安定性に焦点を当てた。
【００５２】
５つのプロセシングされたタンパク質を試験用に選択した。５つの変異体はすべて、Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６Ｖ、Ｎ６７ＩおよびＳ２１５Ｐの置換を含んだ。上記のように、後者の２つは、融合前コンフォメーションのタンパク質を安定化するために必要であり；前者の２つは天然の分離株により近い配列とするために含めた（前節の記載のように）。これらのタンパク質は、追加の変異Ｅ１６１Ｐ、Ｄ４８６ＮおよびＥ４８７Ｑによって異なった。これらは、高い発現レベル、貯蔵安定性、および抗原性に対する影響の低さから選択された。すべてのタンパク質が、ＣＨＯ細胞で発現し、同等の貯蔵安定性を有した。細胞培養上清中、４℃で２週間の保存した際、融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質は安定であった（図５）。また、ＣＨＯ細胞培養上清中のＲＳＶ  Ｆタンパク質のｐＨ５での安定性を試験した。図６に示すように、タンパク質試料を異なる温度で７日間インキュベートした後も分解は検出されなかった。
【００５３】
結論として、本発明のＲＳＶ  Ｆタンパク質はＣＨＯ細胞で発現し、細胞培養上清中で安定であった。さらに、タンパク質の温度安定性を試験した。細胞培養上清を熱処理し、試料中の融合前タンパク質の量を、ＣＲ９５０１抗体を用いたＥＬＩＳＡで測定した（図７）。
【００５４】
Ｄ４８６Ｎを有する変異体（ＰＲＰＭタンパク質）は、温度ストレスに対して最も安定であった。Ｋ４９８Ｒ変異の追加は、最小量の修飾を有するタンパク質（ＰＲＱＭ）と比較して利点を有さないようであった。Ｅ１６１Ｐ変異を有する変異体は、最も高い発現レベルを有した（データは示さず）。しかし、このアミノ酸置換の欠点は、残基１６１がタンパク質の表面に位置し、かつＣＲ９５０１抗体に対するエピトープの縁に位置することであった。
【００５５】
したがって、本発明によれば、最小限必要な配列修飾を有するプロセシングされた融合前タンパク質として、ＰＲＰＭ（フィブリチンのフォルドン三量体化ドメインならびに変異Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６ＶおよびＤ４８６Ｎを有するＲＳＶ  Ｆタンパク質、配列番号１）およびＰＲＱＭ（フィブリチンのフォルドン三量体化ドメインならびにＮ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｋ６６ＥおよびＩ７６Ｖを有するＲＳＶ  Ｆタンパク質、配列番号２）、ならびにＰＲＱＭ＋Ｓ４６ＧまたはＰＲＰＭ＋Ｓ４６Ｇ変異体はすべて、前融合コンフォメーションで安定化され、高いＴｍを有することが示された（表１）。Ｓ４６Ｇ置換を有する後者の変異体は、有意に高い発現レベルを有する。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
実施例２：アジュバントを併用するおよび併用しないＰＲＰＭによって誘導される免疫原性および防御
同種ＲＳＶ−Ａ２チャレンジコットンラットモデルにおいて、アジュバントの存在下または非存在下での組換えＰＲＰＭタンパク質の免疫原性および予防の有効性を決定する実験を行った。０日目および２８日目に、２用量のＰＲＰＭ（５および０．５μｇ）を、アジュバント非添加、または１００μｇＡｄｊｕｐｈｏｓをアジュバントとして添加して、動物にｉ．ｍ．により免疫を付与した。４９日目に動物に１０５（ｐｆｕ）のＲＳＶ  Ａ２でチャレンジした。チャレンジの５日後に動物を屠殺し、肺および鼻で力価を測定した。
【００５８】
結果
アジュバントを添加したＰＲＰＭによる免疫化は、鼻で無効であった１匹の動物を除いて、肺および鼻で完全な防御を誘導した。５および０．５μｇのアジュバント非添加ＰＲＰＭを接種された動物のほとんどは、肺および鼻で無効を示し、アジュバント添加タンパク質およびアジュバント非添加タンパク質を接種された群の間に有意差があった（図８）。アジュバント化タンパク質は、非アジュバント化タンパク質と比較して、免疫から４９日後に有意に高いＶＮＡ力価を誘導した（図９）。
【００５９】
【表２】
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【００６０】
配列
配列番号１：ＰＲＰＭ
【化１】
2019513377.tif 000004
配列番号２  ＰＲＱＭ
【化２】
2019513377.tif 000005
配列番号３  ＰＲＰＭ＋Ｓ４６Ｇ
【化３】
2019513377.tif 000006
ＣＲ９５０１重鎖（配列番号１６）：
【化４】
2019513377.tif 000007
ＣＲ９５０１軽鎖（配列番号１７）：
【化５】
2019513377.tif 000008
ＣＲ９５０２重鎖（配列番号１８）：
【化６】
2019513377.tif 000009
ＣＲ９５０２軽鎖（配列番号１９）：
【化７】
2019513377.tif 000010
ＰＲＰＭ（配列番号２０）をコードするヌクレオチド配列：
【化８】
2019513377.tif 000011
ＰＲＱＭ（配列番号２１）をコードするヌクレオチド配列：
【化９】
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ＰＲＰＭ＋Ｓ４６Ｇ（配列番号２２）をコードするヌクレオチド配列：
【化１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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