(57)【要約】  本発明は、ターゲットＤＮＡのメチル化を多重検出する方法、およびターゲットＤＮＡのメチル化を検出するための組成物に関し、より詳細には、ターゲットＤＮＡと相補的に結合できるターゲット特異的配列、およびターゲットＤＮＡに相補的に結合しないユニバーサルプライマーを含むオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることで、ターゲットＤＮＡを線形増幅し、線形増幅されたターゲットＤＮＡを、線形増幅されたＤＮＡに相補的に結合できるオリゴヌクレオチド、ユニバーサルプライマー、およびプローブを用いて増幅することで、ターゲットＤＮＡのメチル化を検出する方法に関する。
2019536474.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のステップを含む ＤＮＡのメチル化状態を検出する方法：
（ａ）メチル化されたＤＮＡ部位と、非メチル化されたＤＮＡ部位とを互いに異ならせて修飾させる１つ以上の試薬で、ターゲットＤＮＡが含まれているサンプルを処理するステップと、
（ｂ）前記試薬で処理されたターゲットＤＮＡ配列に相補的に結合するように設計されたターゲット特異的配列、およびターゲットＤＮＡに相補的に結合しないユニバーサルプライマーを含むオリゴヌクレオチドを作製するステップと、
（ｃ）前記（ｂ）ステップで作製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、前記（ａ）ステップで試薬で処理されたターゲットＤＮＡを鋳型として用いて、一方向に（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）線形増幅するステップと、
（ｄ）前記（ｃ）ステップで線形増幅されたＤＮＡに相補的に結合できるオリゴヌクレオチドおよびユニバーサルプライマーを用いてターゲットＤＮＡを増幅するステップと、
（ｅ）前記（ｄ）ステップで増幅されたターゲットＤＮＡ配列に相補的にハイブリダイズできるプローブを用いてターゲットＤＮＡのメチル化を検出するステップ。
【請求項２】
前記試薬は、バイサルファイト（bisulfite）、ハイドロジェンサルファイト（hydrogen sulfite）、ジサルファイト（disulfite）または、これらの組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試薬処理によって少なくとも一つのシトシン塩基がウラシルにまたはシトシンと異なる塩基に変換されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
単一反応器内のサンプルの複数のターゲットＤＮＡのメチル化を検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ユニバーサルプライマーは、配列番号７、および３５〜４１で構成された群から選択される一つ以上の配列と５０％以上の相同性を有する配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ステップ（ｂ）のターゲット特異的配列は、ターゲットＤＮＡのメチル化部位および／または非メチル化部位に相補的に結合することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（ｂ）のターゲット特異的配列は、一つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップ（ｂ）のターゲット特異的配列は、配列番号２、５、９、１４、１７、２１、および２６で構成された群から選択される一つ以上の配列と５０％以上の相同性を有する配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記メチル化検出は、ＰＣＲ、メチル化特異ＰＣＲ （ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）、 リアルタイムメチル化特異ＰＣＲ（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用したＰＣＲ、メチル化ＤＮＡ特異的結合抗体を利用したＰＣＲ、定量ＰＣＲ、遺伝子チップ、シーケンシング、シーケンシングバイシンセシス（Sequencing-by-synthesis）、および シーケンシングバイライゲーション（Sequencing-by-ligation）で構成された群から選択される方法により行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｄ）のオリゴヌクレオチドは、一つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ（ｄ）のオリゴヌクレオチドは、配列番号１、４、８、１０〜１３、１５、１６、１８〜２０、２２〜２５、２７、および２８で構成された群から選択される一つ以上の配列と５０％以上の相同性を有する配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ（ｅ）のプローブは、一つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ステップ（ｅ）のプローブは、配列番号３、６、２９、３０、および３１〜３４で構成された群から選択される一つ以上の配列と５０％以上の相同性を有する配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ステップ（ｅ）のプローブは、リポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）または消光剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ステップ（ｄ）のオリゴヌクレオチドおよびステップ（ｄ）のユニバーサルプライマーは、自己レポーティング（ｓｅｌｆ−ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ）機能を有するか、またはエネルギー転移標識されたことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記リポーターは、FAM(6-carboxyfluorescein)、Texas red、HEX(2'、4'、5'、7'、-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein)、JOE、Cy3及びCy5で構成される群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記消光剤は、TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine)、BHQ1、BHQ2及びDabcylで構成される群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ターゲット遺伝子は、ＳＤＣ２であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ターゲットＤＮＡを含むサンプルを処理するのに用いられ、メチル化されたＤＮＡと非メチル化されたＤＮＡを互いに異ならせて修飾させる１つ以上の試薬と、
前記試薬で処理されたターゲットＤＮＡ配列に相補的に結合できるターゲット特異的配列およびターゲットＤＮＡにハイブリダイズしないユニバーサルプライマーを含むオリゴヌクレオチドと、
線形増幅されたＤＮＡに相補的に結合できるオリゴヌクレオチドおよびユニバーサルプライマーと、
前記増幅されたターゲットＤＮＡ配列に相補的にハイブリダイズできるプローブと、を含む、メチル化ＤＮＡ検出用組成物。
【請求項２０】
前記試薬は、バイサルファイト（bisulfite）、ハイドロジェンサルファイト（hydrogen sulfite）、ジサルファイト（disulfite）または、これらの組み合わせであることを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
単一反応器内のサンプルの複数のターゲットＤＮＡのメチル化を検出することを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ユニバーサルプライマーは、配列番号７、および３５〜４１で構成された群から選択される一つ以上の配列と５０％以上の相同性を有する配列を含むことを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
前記前記ターゲット特異的配列は、ターゲットＤＮＡのメチル化部位および／またはターゲットＤＮＡの非メチル化部位に相補的に結合することを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項２４】
前記前記ターゲット特異的配列は、一つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１９に記載の組成物。 
【請求項２５】
前記ターゲット特異的配列は、配列番号２、５、９、１４、１７、２１、および２６で構成された群から選択される一つ以上の配列と５０％以上の相同性を有する配列を含むことを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドは、一つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１、４、８、１０〜１３、１５、１６、１８〜２０、２２〜２５、２７、および２８で構成された群から選択される一つ以上の配列と５０％以上の相同性を有する配列を含むことを特徴とする請求項 １９に記載の組成物。
【請求項２８】
前記プローブは、一つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項２９】
前記プローブは、配列番号３、６、２９、３０、および３１〜３４で構成された群から選択される一つ以上の配列と５０％以上の相同性を有する配列を含むことを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項１９〜２９のいずれかに記載の組成物を含む、メチル化ＤＮＡの検出用キット。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ターゲットＤＮＡのメチル化を多重検出する方法、およびターゲットＤＮＡのメチル化を検出するための組成物に関し、より詳細には、ターゲットＤＮＡと相補的に結合できるターゲット特異的配列、およびターゲットＤＮＡに相補的に結合しない人工のプライマーを含むオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチドを一次プライマーとして用いることでターゲットＤＮＡを線形増幅（Ｌｉｎｅａｒ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：以下、ＬＴＥ）し、線形増幅されたターゲットＤＮＡに相補的に結合できるさらに他のオリゴヌクレオチドおよびニバーサルプライマーを用いて線形増幅されたターゲットＤＮＡを増幅し、増幅産物の有無を検出可能なプローブを用いることにより、ターゲットＤＮＡのメチル化有無を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類細胞のゲノムＤＮＡには、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの他に５番目の塩基が存在し、これはシトシン環の５番目の炭素にメチル基がついた５−メチルシトシン（５−ｍＣ）である。５−ｍＣは、常にＣＧジヌクレオチドのＣにだけつき（５’−ｍＣＧ−３’）、このようなＣＧをＣｐＧと表示する。ＣｐＧのＣは、多くはメチル基がついてメチル化されている。このようなＣｐＧのメチル化は、アル（ａｌｕ）や転移因子（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）と共にゲノム内に反復される塩基配列（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が発現できないように抑制して、哺乳類細胞で遺伝子外変化が最もよく現れる部位である。このようなＣｐＧの５−ｍＣは、自然に脱アミノ化（ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）されてＴに変わり、これに伴い、哺乳類ゲノム内ＣｐＧは正常に表れるべき頻度（１／４ｘ１／４＝６．２５％）よりずっと低い１％の頻度だけを示す。
【０００３】
ＣｐＧ中に例外的に密集して現れるものがあって、これをＣｐＧ島という。ＣｐＧ島は長さが０．２〜３ｋｂで、Ｃ及びＧ塩基の分布百分率が５０％を越え、ＣｐＧの分布百分率が３．７５％以上高く集中して現れる部位を示す。ＣｐＧ島は、全ヒト遺伝体に約４５、０００個が現れ、特に遺伝子の発現を調節するプロモーター部位に集中して現れる。実際にヒト遺伝子中約半分を占める重要遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ）のプロモーターにはＣｐＧ島が現れる(Cross, S. et al., Curr. Opin. Gene Develop., 5:309, 1995)。 異常なＤＮＡメチル化は、主に該当遺伝子の５’発現調節部位（５’ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎ）で 起きて該当遺伝子の発現を減少させると知られている。
【０００４】
ここで、遺伝子の５’発現調節部位としては、プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）、および５’非翻訳領域（５’  ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）などが相当する。 実際、血液や喀痰、唾、大便、小便等で腫瘍関連遺伝子のプロモーターメチル化を調べて種々の癌診療に使おうとする試みが最近盛んに行われている。
【０００５】
細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）または細胞壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）などの過程により流出されたＤＮＡらが血液内に流れ出て、血清（ｓｅｒｕｍ）や血漿（ｐｌａｓｍａ）内における腫瘍細胞遊離（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｔｕｍｏｒ）ＤＮＡとして存在し、この 腫瘍細胞遊離ＤＮＡにも、メチル化されたＤＮＡ片がともに存在することがよく知られており、このような異常なＤＮＡメチル化の存在を、癌を診断するマーカーとして活用している。
【０００６】
一方、通常、遺伝子のメチル化分析方法は、ＰＣＲの適正性とインプットＤＮＡの存在有無を確認するために、メチル化と関係のない対照群遺伝子をＰＣＲで検出し、それと併行してターゲットＤＮＡに対するメチル化検出ＰＣＲを実施することで行われる。
【０００７】
特に、リアルタイムＰＣＲによるメチル化分析方法としては、 ｉ）リアルタイムＰＣＲのためのプライマーとして、ターゲットＤＮＡのメチル化に非依存的な（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）プライマーを使用し、ＰＣＲ増幅産物の検出時に、メチル化されたターゲットＤＮＡとハイブリダイズできるメチル化特異的検出プローブを用いる方法、ｉｉ）リアルタイムＰＣＲのためのプライマーとして、ターゲットＤＮＡのメチル化特異的プライマーを使用し、ＰＣＲ増幅産物中にはメチル化に非依存的な配列を含み、この配列とハイブリダイズできる検出プローブを用いる方法、およびｉｉｉ）リアルタイムＰＣＲのためのプライマーとして、ターゲットＤＮＡのメチル化特異的プライマーを使用し、ＰＣＲ増幅産物の検出時に、メチル化されたターゲットＤＮＡとハイブリダイズできるメチル化特異的検出プローブを用いる方法が考慮され得る。
【０００８】
しかしながら、これらの方法はいずれも、富化されていないＤＮＡを直接鋳型として使用し、ターゲットＤＮＡを増幅するための２つの正方向と逆方向プライマーを必須に同時に使用する。そのため、１つのチューブ（単一反応器）で増幅すべきターゲットが増加する度に、一回に２つのプライマーがさらに必要となるという問題がある。
【０００９】
多重ＰＣＲのためのプライマーを設計する際には、単一チューブで互いに異なるプライマーが類似のハイブリダイズ特性を有するように設計することになる。アニール（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）温度とプライマー濃度は、ある程度までは計算して用いることもでき、経験的に用いることもできる。プライマー対が追加される度に非特異的ハイブリダイズが増加するため、各プライマー対が追加される度に、その反応条件を変化させなければならない。また、プライマー対の枯渇などにより、人為的結果（ａｒｔｉｆａｃｔ）が発生し得る。Ｗｅｉｇｈａｒｄｔら（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ  Ａｐｐ，１９９３，３：７７）は、５’に標識（ｔａｇ）されたオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応に用いると記述したことがある。しかし、このような増幅方法の主な特徴は、各プライマーのアニールとプライマー延長反応を分離するステップを含んでいるため、実際の多重ＰＣＲの概念には適していない。したがって、多重ＰＣＲのための完璧な条件を作り出すことは非常に難しいことであり、高いコストを要する過程である。したがって、互いに異なるプライマーの様々な特性にかかわらず、同一条件で、多数のターゲットを同時に同じ程度に増幅することができる多重ＰＣＲ方法の開発が必要である。
【００１０】
このような技術的背景下で、本出願の発明者らは、上記の問題を解決し、高い検出限度および正確度を有するメチル化ターゲットＤＮＡの検出方法を開発するために鋭意努力した結果、ユニバーサルプライマーが結合されたオリゴヌクレオチドを用いてターゲットＤＮＡを一方向に（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）線形増幅し、富化されたこれらのターゲットＤＮＡを鋳型として用いてターゲットＤＮＡを検出し、ターゲット特異的オリゴヌクレオチドにユニバーサルプライマーを連結する場合、従来と異なって、ターゲットＤＮＡの多重検出時に１つのプライマーのみを追加するだけで、目的する程度の高い敏感度および正確度でメチル化ＤＮＡを検出することができることを確認し、本発明を成すに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ニバーサルプライマーを用いてメチル化ＤＮＡを多重検出する方法を提供するところにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、ニバーサルプライマーを含む、メチル化ＤＮＡの多重検出用組成物を提供するところにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前記組成物を含む、メチル化ＤＮＡの多重検出用キットを提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的を達成するために、本発明は、次のステップを含む、メチル化ＤＮＡを検出する方法を提供する：（ａ）メチル化されたＤＮＡ部位と、非メチル化されたＤＮＡ部位とを互いに異ならせて修飾させる１つ以上の試薬で、ターゲットＤＮＡが含まれているサンプルを処理するステップと、（ｂ）前記試薬で処理されたターゲットＤＮＡ配列に相補的に結合するように設計されたターゲット特異的配列、およびターゲットＤＮＡに相補的に結合しないユニバーサルプライマーを含むオリゴヌクレオチドを作製するステップと、（ｃ）前記（ｂ）ステップで作製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い  、前記（ａ）ステップで試薬で処理されたターゲットＤＮＡを鋳型として用いて、一方向に（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）線形増幅するステップと、（ｄ）前記（ｃ）ステップで線形増幅されたＤＮＡに相補的に結合できるオリゴヌクレオチドおよびユニバーサルプライマーを用いてターゲットＤＮＡを増幅するステップと、（ｅ）前記（ｄ）ステップで増幅されたターゲットＤＮＡ配列に相補的にハイブリダイズできるプローブを用いてターゲットＤＮＡのメチル化を検出するステップ。
【００１５】
本発明はまた、ターゲットＤＮＡを含むサンプルを処理するのに用いられ、メチル化されたＤＮＡと非メチル化されたＤＮＡを互いに異ならせて修飾させる１つ以上の試薬と、前記試薬で処理されたターゲットＤＮＡ配列に相補的に結合できるターゲット特異的配列およびターゲットＤＮＡにハイブリダイズしないユニバーサルプライマーを含むオリゴヌクレオチドと、線形増幅されたＤＮＡに相補的に結合できるオリゴヌクレオチドおよびユニバーサルプライマーと、前記増幅されたターゲットＤＮＡ配列に相補的にハイブリダイズできるプローブと、を含む、メチル化ＤＮＡ検出用組成物を提供する。
【００１６】
本発明はまた、前記組成物を含む、メチル化ＤＮＡの検出用キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明のメチル化ターゲットＤＮＡの多重検出方法を図式化した概念図である。
【図２】本発明の方法と、一般の方法により検出したメチル化ＤＮＡに対する検出敏感度を比較した結果を示す。
【図３】本発明の方法に用いられるターゲットＤＮＡに対するプライマーおよびプローブを設計する過程を図式化した図である。
【図４】ターゲットＤＮＡに対するプライマーおよびプローブを用いて、本発明の方法と、一般の方法により検出したメチル化ＤＮＡに対する検出敏感度を比較した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１９】
一観点において、本発明は、次のステップを含む、メチル化ＤＮＡを検出する方法に関する：（ａ）メチル化されたＤＮＡ部位と、非メチル化されたＤＮＡ部位とを互いに異ならせて修飾させる１つ以上の試薬で、ターゲットＤＮＡが含まれているサンプルを処理するステップと、（ｂ）前記試薬で処理されたターゲットＤＮＡ配列に相補的に結合するように設計されたターゲット特異的配列、およびターゲットＤＮＡに相補的に結合しないユニバーサルプライマーを含むオリゴヌクレオチドを作製するステップと、（ｃ）前記（ｂ）ステップで作製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、前記（ａ）ステップで試薬で処理されたターゲットＤＮＡを鋳型として用いて、一方向に（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）線形増幅するステップと、（ｄ）前記（ｃ）ステップで線形増幅されたＤＮＡに相補的に結合できるオリゴヌクレオチドおよびユニバーサルプライマーを用いてターゲットＤＮＡを増幅するステップと、（ｅ）前記（ｄ）ステップで増幅されたターゲットＤＮＡ配列に相補的にハイブリダイズできるプローブを用いてターゲットＤＮＡのメチル化を検出するステップ。
【００２０】
本発明では、高い敏感度でメチル化ＤＮＡを検出し、疾病を早期診断することができる方法を開発して、その性能を確認しようとした。本発明の一実施例によると、ターゲットＤＮＡと相補的に結合できるターゲット特異的配列、および前記ターゲット特異的配列に結合されたターゲットＤＮＡに相補的に結合しないユニバーサルプライマーを用いて、内部コントロール遺伝子とターゲットＤＮＡを一次に線形増幅した後、ターゲットＤＮＡと相補的な配列に相補的に結合できるオリゴヌクレオチド、ターゲットＤＮＡ配列に相補的にハイブリダイズできるプローブ、およびユニバーサルプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲによりメチル化ＤＮＡを分析した。その結果、本発明の方法が、従来の方法に比べて高い敏感度および正確度でメチル化ＤＮＡを検出することができることを確認した。
【００２１】
具体的に、健常者由来の大便ＤＮＡと各ステップ毎の大腸癌患者由来の大便ＤＮＡをバイサルファイト（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）で処理し、非メチル化されたシトシンは全てウラシルに変換させた後、メチル化されたＳＤＣ２（ターゲットＤＮＡ）またはＣＯＬ２Ａ１（内部コントロール）にそれぞれ特異的に結合し、ユニバーサルプライマーが融合されたターゲットＤＮＡと相補的に結合できるオリゴヌクレオチドを用いて線形増幅した後、各ターゲットＤＮＡとハイブリダイズできる特異的プローブ、ターゲットＤＮＡと相補的な配列に相補的に結合できるオリゴヌクレオチド、およびユニバーサルプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲを行った（図１）。その結果、ユニバーサルプライマーを含んでいないプライマーを使用した従来のｑＭＳＰ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）に比べて、高い敏感度および正確度でメチル化ＤＮＡを検出することができることを確認することができた（図２および図４）。
【００２２】
本発明において、ステップ（ａ）は、メチル化されたＤＮＡ部位と、非メチル化されたＤＮＡ部位を互いに異ならせて修飾させる１つ以上の試薬で、ターゲットＤＮＡが含まれているサンプルを処理するステップである。
【００２３】
本発明における「メチル化」とは、シトシン（ｃｙｔｏｃｉｎｅ）塩基環の５番目の炭素原子にメチル基が付いて５−メチルシトシン（５−ｍＣ）を形成することを意味する。５−メチルシトシン（５−ｍＣ）は、常にＣＧジヌクレオチドのＣにだけつき（５’−ｍＣＧ−３’）、このようなＣＧをＣｐＧと表示する。ＣｐＧのＣは、多くはメチル基がついてメチル化されている。このようなＣｐＧのメチル化は、アル（ａｌｕ）や転移因子（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）と共にゲノム内に反復される塩基配列（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が発現できないように抑制して、哺乳類細胞で遺伝子外変化が最もよく現れる部位である。このようなＣｐＧの５−ｍＣは、自然に脱アミノ化（ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）されてＴに変わり、これに伴い、哺乳類ゲノム内ＣｐＧは正常に表れるべき頻度（１／４ｘ１／４＝６．２５％）よりずっと低い１％の頻度だけを示す。
【００２４】
ＣｐＧが例外的に密集して現れる領域があり、これをＣｐＧ島という。ＣｐＧ島は、長さが０．２〜３ｋｂであり、ＣおよびＧ塩基の分布百分率が５０％を越え、ＣｐＧの分布百分率が３．７５％以上と高く集中して現れる部位を示す。ＣｐＧ島は、全ヒトゲノムに約４５，０００個が存在し、特に、遺伝子の発現を調節するプロモーター部位に集中して現れる。実際に、ヒト遺伝子中の約半分を占めるハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ）のプロモーターにはＣｐＧ島が現れる。
【００２５】
前記ターゲットＤＮＡ中のＣｐＧメチル化の存在が、疾病の指標となり得る。例えば、ターゲットＤＮＡのプロモーター、５’非翻訳領域、およびイントロンの何れか一部位のＣｐＧメチル化を測定し得る。
【００２６】
ＣｐＧ−含有遺伝子は、通常、ＤＮＡである。しかし、本発明の方法は、例えば、ＤＮＡ、またはＤＮＡとｍＲＮＡを含むＲＮＡを含有する試料を適用することができ、ここで、ＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であってもよく、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含有する試料であることを特徴とする。
【００２７】
核酸混合物が用いられてもよい。本発明で用いられる「多重」は、一種の遺伝子内に検出されるべき特異的な核酸配列部位が複数個である場合と、１つのチューブ（単一反応器）内に複数のターゲットＤＮＡを含む場合を両方とも含む。検出されるべき特異的な核酸配列は、大きい分子の分画であってもよく、最初から特異配列が全体核酸配列を構成する、分離した分子の形態で存在してもよい。前記核酸配列が純粋な形態で存在する核酸である必要はなく、核酸は、全ヒトＤＮＡが含まれているもののように複雑な混合物中の少ない分画であってもよい。
【００２８】
具体的に、本発明は、単一反応器内のサンプルの複数のターゲットＤＮＡのメチル化を検出するためのものであって、前記サンプルは、複数の多重ターゲットＤＮＡを含んでもよい。ターゲットＤＮＡとしては、対照群遺伝子だけでなく、異常にメチル化されて発現が抑制される場合に、癌の発生または進行に影響を与える遺伝子であれば制限されずに利用可能である。
【００２９】
本発明において、前記サンプルは、人体から由来したことを特徴とし、例えば、肝癌、膠芽細胞腫、卵巣癌、大腸癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎臓細胞癌、胃癌、乳癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、および肺癌患者由来であってもよい。 前記サンプルとしては、固体または液体組織、細胞、糞便、小便、血液、血清または血しょうを使用してもよい。
【００３０】
前記メチル化されたＤＮＡと、非メチル化されたＤＮＡを互いに異ならせて修飾させる１つ以上の試薬は、非メチル化されたシトシン塩基と、メチル化されたシトシン塩基とを区別可能なものであれば制限されずに使用可能であるが、例えば、バイサルファイト、ハイドロジェンサルファイト、ジサルファイト、およびこれらの組み合わせから選択された一つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。具体的に、前記試薬により、メチル化されたシトシン塩基は変換せず、非メチル化されたシトシン塩基はウラシルにまたはシトシン以外の塩基に変換し得る。
【００３１】
本発明において、ステップ（ｂ）は、前記試薬で処理されたターゲットＤＮＡ配列に相補的に結合するように設計されたターゲット特異的配列、およびターゲットＤＮＡに相補的に結合しないユニバーサルプライマーを含むオリゴヌクレオチドを作製するステップである。
【００３２】
通常の多重ＰＣＲでは、検出しようとするターゲット（ｔａｒｇｅｔ）の数だけ、正方向および逆方向のプライマーを対として同時に用いなければならないが、これに比べて、本発明の方法は、多数の多重メチル化ＤＮＡを同時に検出するリアルタイムＰＣＲ過程で、ユニバーサルプライマーにより、ターゲットＤＮＡ配列に相補的に結合できるターゲット特異的配列（逆方向プライマー）は１個のみ用いればよく、線形増幅されたＤＮＡに相補的に結合できるオリゴヌクレオチド（正方向プライマー）のみを、検出しようとするターゲットの数だけ用いるため、多数のターゲットのメチル化を同時に検出しようとする際に、小数のプライマーのみを用いればよい。したがって、ＰＣＲの複雑性およびＰＣＲ効率のばらつきが減少する。
【００３３】
前記ターゲット特異的配列は、ターゲットＤＮＡ配列に相補的に結合できる配列であり、ターゲットＤＮＡのメチル化部位に相補的に結合できる配列だけでなく、ターゲットＤＮＡの非メチル化部位に相補的に結合できる配列も選択的に使用されてもよい。
【００３４】
前記ターゲット特異的配列は、例えば、一つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含んでもよい。 具体的に、前記ターゲット特異的配列は、配列番号２、５、９、１４、１７、２１、および２６で構成された群から選択される一つ以上の配列と５０％以上の相同性を有する配列、例えば、５５％以上、６０％ 以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上の相同性を有する配列を含んでもよい。
【００３５】
前記ユニバーサルプライマーは、ターゲットＤＮＡ配列に相補的に結合できるターゲット特異的配列（逆方向プライマー）または線形増幅されたＤＮＡに相補的に結合できるオリゴヌクレオチド（正方向プライマー）中いずれか一つまたは逆方向プライマーおよび正方向プライマー 二つともに連結されて使用されてもよい。
【００３６】
前記ユニバーサルプライマーは、ターゲットＤＮＡと関係なく増幅可能なターゲットＤＮＡに相補的に結合しない塩基配列であれば制限されずに用いることができるが、例えば、ヒトゲノムに存在しない塩基配列を含んでもよい。具体的に、前記ユニバーサルプライマーは、配列番号７の塩基配列と５０％以上の相同性を有する配列、例えば、５５％以上、６０％ 以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上の相同性を有する配列を含んでもよい。また、前記ユニバーサルプライマーは、Ｔ７、ＳＰ６、またはＭ１３などの配列を含んでもよいが、これらに制限されない。
【００３７】
また、前記ユニバーサルプライマーは、例えば、配列番号３５〜４１で構成された群から選択される一つ以上の配列であってもよい。前記ユニバーサルプライマーは、例えば、5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’ (配列番号 35)のT7配列, 5’-TATTTAGGTGACACTATAG-3’ (配列番号 36)のSP6配列, または 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3(配列番号 37: -20F), 5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’(配列番号 38: -40F), 5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’ (配列番号 39: -47F), 5’-GAAACAGCTATGACCATG-3’ (配列番号 40: R) または 5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’ (配列番号 41: -48R)のM13 配列であってもよい。
【００３８】
本発明の方法は、前記ステップ（ｂ）で作製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、前記ステップ（ａ）で試薬で処理されたターゲットＤＮＡを鋳型として用いて、一方向に（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）線形増幅するステップ（ｃ）を含む。
【００３９】
前記ステップ（ｃ）により、リアルタイムＰＣＲ過程でバイサルファイト処理されたＤＮＡを直ちに用いず、線形増幅されたＤＮＡを用いているため、検出率および検出敏感度が優れている（図２および図４）。
【００４０】
本発明では、メチル化されたターゲットＤＮＡのみを一方向に線形増幅し、これにより富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）が起こる。一実施例において、実施例において、ターゲット特異的配列の５’末端にユニバーサルプライマーが結合された構造を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、単一方向ＰＣＲ（ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＰＣＲ）により、メチル化されたターゲットＤＮＡを富化するための線形増幅を行うことができる。
【００４１】
前記線形増幅とは、二本鎖の変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、プライマーとアニールおよび核酸合成を含む増幅サイクルの数に対して増幅産物が線形に生産されることを意味し、増幅サイクル数に対して増幅産物を対数的（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）に生産する連鎖反応（ＰＣＲ）とは区別される。
【００４２】
本発明の方法は、次に、前記ステップ（ｃ）で線形増幅されたＤＮＡに相補的に結合できるオリゴヌクレオチドおよびユニバーサルプライマーを用いてターゲットＤＮＡを増幅するステップ（ｄ）を含む。
【００４３】
場合により、 前記ステップ（ｄ）で自己レポーティング（ｓｅｌｆ−ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ）機能を有するか、またはエネルギー転移標識されたプライマーを用いてターゲットＤＮＡのメチル化を検出するステップを含んでもよい。
【００４４】
本発明で使用される用語「自己レポーティング」は、「エネルギー転移標識（ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｌａｂｅｌ）」 とも命名され、本明細書で「エネルギー転移標識（ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｌａｂｅｌ）」と混用して使用することができる。本明細書で自己レポーティング（ｓｅｌｆ−ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ）機能を有するユニバーサルプライマーは、エネルギー転移標識プライマー（ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｌａｂｅｌｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）と混用されてもよい。
【００４５】
自己レポーティング（ｓｅｌｆ−ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ）機能またはエネルギー転移標識機能は、増幅が起こらないステップでは自己クエンチング（ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）により蛍光を発しないが、増幅が起こるとクエンチングが解除されて蛍光を発する、自己クエンチングまたは自己プロービング（ｓｅｌｆ−ｐｒｏｂｉｎｇ）できるようにすることを意味する(Nazarenko IA et al., Nulceic Acid Res, 1997, 25(12):2516-2521; Whitcombe D et al., Nat Biotechnol, 1999, 17(8):804-807; Myakishev MV et al., Genome Res, 2001, 11:163-169; Nazarenko IA et al., Nucleic Acid Res, 2002, 30(9):2089-2195; Bengra C et al., Clin Chem, 2002, 48(12):2131-2140; Murray JL et al., J Mol Diag, 2014, 16(6):627-638; Gao L et al., Mol Cell Probes, 2015, 29(6):438-441)。自己レポーティング機能を有する物質またはエネルギー転移標識機能を有する物質としては、ＴａｑＭａｎプローブ、フルオロフォア(fluorophore)または分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ）などが相当されてもよいが、これらに制限されない。
【００４６】
一実施例において、前記線形増幅されたＤＮＡに相補的に結合できるオリゴヌクレオチド（正方向プライマーは、ステップ（ｃ）で作製されたターゲットＤＮＡに相補的に結合して増幅することができる配列として、例えば、一つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含んでもよい。
【００４７】
具体的に、前記オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１、４、８、１０〜１３、１５、１６、１８〜２０、２２〜２５、２７、および２８で構成された群から選択される一つ以上の配列と５０％以上の相同性を有する配列、例えば、５５％以上、６０％ 以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上の相同性を有する配列を含んでもよい。
【００４８】
前記ユニバーサルプライマーについての説明は、上述したステップ（ｂ）と同様に適用される。
【００４９】
本発明の方法は、前記ステップ（ ｄ ）で増幅されたターゲットＤＮＡに相補的にハイブリダイズできるプローブを用いてターゲットＤＮＡのメチル化を検出するステップ（ｅ）を含む。
【００５０】
一実施例において、前記メチル化検出は、ＰＣＲ、メチル化特異ＰＣＲ （ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）、 リアルタイムメチル化特異ＰＣＲ（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）、 メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用したＰＣＲ、メチル化ＤＮＡ特異的結合抗体を利用したＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ＤＮＡチップアッセイ、シーケンシング、シーケンシングバイシンセシス、および シーケンシングバイライゲーションで構成された群から選択される方法により行われてもよい。 
【００５１】
メチル化検出方法
（１）メチル化特異ＰＣＲ （ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ） 
前記メチル化特異ＰＣＲによりメチル化を検出するためにゲノムＤＮＡにバイサルファイトを処理すると、５’−ＣｐＧ’−３部位のシトシンがメチル化された場合にはそのままシトシンで残っており、非メチル化された場合にはウラシルに変わることになる。従って、バイサルファイト処理後変換された塩基配列を対象に、５’−ＣｐＧ−３’塩基配列が存在する部位に該当するＰＣＲプライマーを作製した。プライマーを利用してＰＣＲを行うと、メチル化された場合にはメチル化された塩基配列に該当するプライマーを使ったものからＰＣＲ産物が作られることになり、メチル化の有無は、アガロースゲル電気泳動方法で定性的に確認することができる。ここで、前記メチル化 検出プローブは、ＴａｑＭａｎプローブ、分子ビーコンプローブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ ｐｒｏｂｅ）、または自己レポーティング（ｓｅｌｆ−ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ）機能またはエネルギー転移標識機能を有するプローブであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００５２】
（２）リアルタイムメチル化特異ＰＣＲ（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）
リアルタイムメチル化特異ＰＣＲは、メチル化特異ＰＣＲ方法をリアルタイム測定方法に変換したもので、ゲノムＤＮＡにバイサルファイトを処理した後、メチル化されたケースに該当するＰＣＲプライマーをデザインし、これらプライマーを利用してリアルタイムＰＣＲを行うことである。この時、増幅された塩基配列と相補的なＴａｎＭａｎプローブを利用して検出する方法とｍＳｙｂｅｒｇｒｅｅｎを利用して検出する方法の二方法がある。従って、リアルタイムメチル化特異ＰＣＲは、メチル化されたＤＮＡだけを選択的に定量分析することができる。この時、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡサンプルを利用して標準曲線を作成して、標準化のために塩基配列内に５'−ＣｐＧ−３'配列がない遺伝子を陰性対照群として共に増幅してメチル化程度を定量分析した。
【００５３】
（３）メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用したＰＣＲまたは定量ＰＣＲ及びＤＮＡチップアッセイ
メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用したＰＣＲまたはＤＮＡチップアッセ方法は、メチル化ＤＮＡにだけ特異的に結合する蛋白質をＤＮＡと混ぜると、メチル化ＤＮＡにだけ特異的に蛋白質が結合するため、メチル化ＤＮＡだけを選択的に分離することができる。
【００５４】
また、定量ＰＣＲ方法でもＤＮＡのメチル化可否を測定することができ、メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質から分離したメチル化ＤＮＡは、蛍光染料で標識して相補的なプローブが集積されたＤＮＡチップにハイブリダイゼーションさせることで前記ＤＮＡのメチル化可否を測定することができる。
【００５５】
(４) 差別的メチル化の検出−バイサルファイトシーケンス方法
メチル化ＣｐＧを含有した核酸を検出する他の方法は、核酸を含有した試料を非メチル化シトシンを修飾させる製剤と接触させる段階及びＣｐＧ−特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使って試料のＣｐＧ−含有核酸を増幅させる段階を含む。ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、修飾されたメチル化及び非メチル化核酸を区別してメチル化核酸を検出することを特徴とする。前記増幅段階は、選択的であり、好ましいが必須ではない。前記方法は、修飾された（例えば、化学的に修飾された）メチル化及び非メチル化ＤＮＡを区別するＰＣＲ反応に依存するものである。
【００５６】
(５) バイサルファイトシーケンス方法
メチル化ＣｐＧを含有した核酸を検出する他の方法は、核酸を含有した試料を非メチル化シトシンを修飾させる製剤と接触させる段階及びメチル化に非依存的な（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）オリゴヌクレオチドプライマーを使って試料のＣｐＧ−含有核酸を増幅させる段階を含む。ここで、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、修飾されたメチル化及び非メチル化核酸を区別して核酸を増幅することを特徴とする。
前記増幅された産物は、シーケンスプライマーを用いてサンガー法によるシーケンシングするか、あるいは、メチル化核酸の検出のためのバイサルファイト（ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）シーケンスと関連された次世代シーケンシング方法によるシーケンシングされてもよい。
【００５７】
(６) ここで、次世代シーケンシング方法は、シーケンシングバイシンセシス（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ-ｂｙ-ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）とシーケンシングバイライゲーション（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ-ｂｙ-ｌｉｇａｔｉｏｎ）方法により行うことを特徴とする。これらの方法の特徴は、ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｌｏｎｅを作る代わりに、単一ＤＮＡ断片を空間的に分離してインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で増幅し（ｃｌｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、シーケンシングを行うということにある。この際、数十万個の断片を同時に読み取ることから、超並列シーケンシング（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）方法とも呼ばれる。
【００５８】
基本的にはシーケンシングバイシンセシス（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）方法であって、モノもしくはジヌクレオチドを順に付けながらシグナルを得る方法を用いるが、ピロシーケンシング、ｉｏｎ  ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｓｏｌｅｘａ方法がこれに該当する。
【００５９】
シーケンシングバイシンセシスに基づくＮＧＳ装備としては、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社の４５４プラットホーム、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）社のＨｉＳｅｑプラットホーム、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社のＩｏｎ  ＰＧＭプラットホーム、最後に、パシフィックバイオサイエンス（Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）社のＰａｃＢｉｏプラットホームが挙げられる。４５４とＩｏｎ  ＰＧＭは、クローナル増幅（ｃｌｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方法としてｅｍｅｒｓｉｏｎ  ＰＣＲを用い、ＨｉＳｅｑはブリッジ増幅（Ｂｒｉｄｇｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を用いる。シーケンシングバイシンセシス方法は、１個のヌクレオシドを順に付けながらＤＮＡを合成させていく時に発生するリン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、水素イオン、もしくは予め付けておいた蛍光を検出して配列を読み取っていく。配列を検出する方法において、４５４はリン酸を用いるピロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｅｕｎｃｉｎｇ）方法を用い、Ｉｏｎ  ＰＧＭは水素イオンの検出を用いる。ＨｉＳｅｑとＰａｃＢｉｏは蛍光を検出して配列を解読する。
【００６０】
シーケンシングバイライゲーション（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ-ｂｙ-ｌｉｇａｔｉｏｎ）は、ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ）を用いるシーケンシング技術であって、ＤＮＡ塩基配列に存在する特定の位置のヌクレオシドを確認する技術である。殆どのシーケンシング技術で重合酵素を用いることと異なって重合酵素を用いず、ＤＮＡリガーゼがミスマッチ配列をライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）しない特徴を利用する。ＳＯＬｉＤシステムがこれに該当する。この手法では、間隔を置きながら２個ずつ塩基を読み取るが、このような読取動作は、プライマーリセット（ｐｒｉｍｅｒ  ｒｅｓｅｔ）過程により独立して５回を繰り返すため、最終的には各塩基を２回ずつ重複して読み取ることで正確度を高める。
【００６１】
シーケンシングバイライゲーション（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）の場合、１６個の組み合わせからなるジヌクレオチドプライマーセットのうち、該当塩基配列に対応するジヌクレオチドプライマーが順にライゲーションされ、このライゲーションの組み合わせを最終的に分析することにより、該当ＤＮＡの塩基配列が完成される。
【００６２】
ここで、次世代シーケンシング方法は、シーケンシングバイシンセシス（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ-ｂｙ-ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）とシーケンシングバイライゲーション（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ-ｂｙ-ｌｉｇａｔｉｏｎ）方法により行うことを特徴とする。ここで、メチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質は、 ＭＢＤ２ｂｔに制限されず、メチル化ＤＮＡ特異的結合抗体は、５’−メチル−シトシン（５’−ｍｅｔｈｙｌ−ｃｙｔｏｓｉｎｅ）抗体に制限されない。
【００６３】
本発明で用いられるプライマーにおいて、前記ステップ（ａ）に従って、試薬、例えば、バイサルファイトで処理すると、５’−ＣｐＧ’−３部位のシトシンがメチル化された場合には、そのままシトシンとして残り、非メチル化された場合にはウラシルに変わることになる。したがって、試薬、例えば、バイサルファイトで処理後、変換された塩基配列を対象として５’−ＣｐＧ−３’塩基配列が存在する部位に相当するプライマーを作製することができる。
【００６４】
前記プライマーは、ターゲットＤＮＡのうち、増幅されるべき座（ｌｏｃｕｓ）の各鎖と「概して」相補性を有するように作製されてもよい。これは、重合反応を行う条件で、プライマーが対応する核酸鎖とハイブリダイズされるにおいて十分な相補性を有することを意味する。
【００６５】
前記ステップ（ｄ）で線形増幅されたＤＮＡに相補的に結合できるオリゴヌクレオチドおよびユニバーサルプライマー により増幅された産物は、ターゲットＤＮＡ配列にハイブリダイズできるプローブを用いてメチル化を検出し、前記プローブは、ターゲットＤＮＡにハイブリダイズしてメチル化を検出できるものであれば制限されずに使用可能であるが、例えば、一つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含んでもよい。また、前記オリゴヌクレオチドまたはユニバーサルプライマーの他にも、自己レポーティング（ｓｅｌｆ−ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ）機能を有する蛍光物質またはエネルギー転移標識プライマーを用いて検出する方法がある。
【００６６】
具体的に、前記プローブは、配列番号３、６、２９、３０、および３１〜３４で構成された群から選択される一つ以上の配列と５０％以上の相同性を有する配列、例えば、５５％以上、６０％ 以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上の相同性を有する配列を含んでもよい。
【００６７】
場合により、前記プローブは、両末端にリポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）または消光剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合し得る。前記リポーターは、FAM(6-carboxyfluorescein)、Texas red、HEX(2'、4'、5'、7'、-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein)、JOE、Cy3及びCy5で構成される群から選択される一つ以上であってもよく、前記消光剤は、TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine)、BHQ1、BHQ2及びDabcylで構成される群から選択される一つ以上であってもよい。
【００６８】
本発明は、他の観点において、ターゲットＤＮＡを含むサンプルを処理するのに用いられ、メチル化されたＤＮＡと非メチル化されたＤＮＡを互いに異ならせて修飾させる１つ以上の試薬と、前記試薬で処理されたターゲットＤＮＡ配列に相補的に結合できるターゲット特異的配列およびターゲットＤＮＡにハイブリダイズしないユニバーサルプライマーを含むオリゴヌクレオチドと、線形増幅されたＤＮＡに相補的に結合できるオリゴヌクレオチドおよびユニバーサルプライマーと、前記増幅されたターゲットＤＮＡ配列に相補的にハイブリダイズできるプローブと、を含む、メチル化ＤＮＡ検出用組成物に関する。
【００６９】
本発明の組成物は、チル化されたＤＮＡと非メチル化されたＤＮＡを互いに異ならせて修飾させる１つ以上の試薬で処理し、試薬で処理されたターゲットＤＮＡを増幅し、ターゲットＤＮＡ配列に相補的に結合できるターゲット特異的配列およびターゲットＤＮＡにハイブリダイズしないユニバーサルプライマーを含むオリゴヌクレオチドを用いて線形増幅し、線形増幅されたＤＮＡに相補的に結合できるオリゴヌクレオチド、ユニバーサルプライマーおよびプローブを用いてメチル化ＤＮＡを検出することを含む、先述した構成と重なるため、これらの構成についての詳細な説明は省略する。
【００７０】
さらに他の観点において、本発明は、前記組成物を含む、ターゲットＤＮＡのメチル化検出用キットに関する。
【００７１】
一実施例において、前記キットは、サンプルを入れる仕切られたキャリア手段、試薬を含む容器、ターゲット ＤＮＡの５'−ＣｐＧ−３'塩基配列を増幅できるＰＣＲプライマーを含む容器、および増幅ＰＣＲ産物を検出するためのプローブを含む容器を含んでもよい。
【００７２】
キャリア手段は、便、チューブのような一つ以上の容器を含有するのに適しており、各容器は本発明の方法に使われる独立的構成要素を含有する。本発明の明細書で、当分野の通常の知識を有する者は、容器中の必要な製剤を容易に分配することができる。
【００７３】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００７４】
実施例１：細胞株由来のメチル化ＤＮＡを用いた検出限界の導出
ヒト大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、およびＨＴ−２９細胞株を韓国細胞株バンク（ソウル、韓国）から購入し、１０％のウシ胎児血清(JBI, Seoul, South Korea)、ペニシリン、およびストレプトマイシンが含まれたＲＰＭＩ１６４０培地(JBI, Seoul, South Korea)と、３７℃、５％の二酸化炭素培養器で培養した。
【００７５】
ＱｉａＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ(Qiagen, Hilden, Germany)を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ  ｋｉｔ(ZYMO Research, Irvine, USA)を用いて亜硫酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）で処理した。まとめると、６５℃で２．５時間バイサルファイトで処理した後、常温で２０分間放置して脱スルホン化（ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｉｏｎ）を行い、Ｚｙｍｏ−Ｓｐｉｎ  ＩＣカラム(Zymo Research, Irvine, USA)に結合させてから１０μｌの蒸留水で抽出して２０℃に保管した。
【００７６】
本発明の方法に対する検出限界を導出し、ＬＴＥ過程を含まないｍｅＳＤＣ２−ｑＭＳＰ分析法と比較するために、ＨＣＴ１１６細胞株由来のメチル化ＤＮＡを２００−１０ｐｇの単位で分注した後、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  Ｖ２  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ(GE Healthcare, Cleveland, USA)を用いて増幅した非メチル化ヒト白血球ゲノムＤＮＡ(BioChain Insititute Inc., Hayward, CA)２０ｎｇと混合して段階的に希釈した。
【００７７】
その後、配列番号２のＳＤＣ２特異的配列と結合された配列番号７のユニバーサルプライマーを含むオリゴヌクレオチド、および配列番号５のＣＯＬ２Ａ１特異的配列と結合された配列番号７のユニバーサルプライマーを含むオリゴヌクレオチドを用いて、９５℃５分；９５℃１５秒、６０℃１分、３５サイクルで線形増幅した後、配列番号３のプローブ；配列番号１の線形増幅されたＤＮＡに相補的に結合できるオリゴヌクレオチド；配列番号６のプローブ；配列番号４の線形増幅されたＤＮＡに相補的に結合できるオリゴヌクレオチド；および配列番号７のユニバーサルプライマーを用いて、９５℃５分；９５℃１５秒、６０℃１分、４０サイクルで、リアルタイムＰＣＲを行った（２４回繰り返して実験）（表１および図１）。その後、Ｃｔ（ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値をＲｏｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｑソフトウェアで分析した。
【００７８】
【表１】
2019536474.tif 000003
【００７９】
その結果、従来の方法は、２００ｐｇのＤＮＡでは１００％の検出率を示したが、２０ｐｇでは３７．５％、および１０ｐｇでは０％の検出率を示したのに対し、本発明の方法は、２００ｐｇ−２０ｐｇまでは何れも１００％の検出率を示し、１０ｐｇでも３３．３％の検出率を示すことを確認した（図２および表２）。
【００８０】
【表２】
2019536474.tif 000004
【００８１】
実施例２：ＬＴＥ−ｑＭＳＰとｑＭＳＰの比較
ＳＤＣ２遺伝子の大腸癌診断能力を評価するために、ＳＤＣ２遺伝子の全ＣｐＧ島を代弁することができる１８セットのメチル化特異的検出プライマーおよびプローブを設計し（表３）、ＬＴＥ−ｑＭＳＰを行った。そのために、健常者２５名および大腸癌患者２５名の大便からゲノムＤＮＡを分離(QIAamp DNA Stool Mini kit, Qiagen)し、前記ゲノムＤＮＡを、ＥＺ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ  ｋｉｔ(Zymo Research, USA)を用いてバイサルファイトで処理した後、滅菌蒸留水１０μｌで溶出してＬＴＥ−ｑＭＳＰ(Linear Target Enrichment-Methylation-specific real time PCR)に使用した。バイサルファイトで処理されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３で設計したメチル化ターゲット特異的配列（Ｒ）を用いて一方向に線形増幅（ＬＴＥ）を行った（図３）。ＬＴＥ反応は、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑ  ＰＣＲ装備（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、総２０μｌのＰＣＲ反応溶液（鋳型ＤＮＡ、１０μｌ；５Ｘ  ＡｐｔａＴａｑ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、４μｌ；ＣＯＬ２Ａ１ターゲット特異的配列、１μｌ（１  ｐｍｏｌｅ）；ＳＤＣ２ターゲット特異的配列、１μｌ（１  ｐｍｏｌｅ）；Ｄ．Ｗ．４μｌ）を準備し、ＰＣＲ条件を、９５℃、５分処理後、９５℃で１５秒、６０℃で１分として、総３５回行った。
【００８２】
ｑＭＳＰではＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑ  ＰＣＲ装備(Qiagen)を用いた。総４０μｌのＰＣＲ反応溶液（一次ＬＴＥ産物２０μｌ；５Ｘ  ＡｐｔａＴａｑ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ(Roche Diagnostics)８μｌ；ＤＮＡに相補的に結合できるＰＣＲプライマー１μｌ（１０  ｐｍｏｌｅ）；ＳＤＣ２に相補的に結合できるオリゴヌクレオチド１μｌ（１０  ｐｍｏｌｅ）；ＣＯＬ２Ａ１に相補的に結合できるオリゴヌクレオチド１μｌ（５  ｐｍｏｌｅ）；ユニバーサルプライマー（配列番号７）１μｌ（１０  ｐｍｏｌｅ）；ＳＤＣ２  ＴａｑＭａｎプローブ、１μｌ（５  ｐｍｏｌｅ）；ＣＯＬ２Ａ１  ＴａｑＭａｎプローブ、１μｌ（２．５  ｐｍｏｌｅ）；Ｄ．Ｗ．６μｌ）を準備し、ＰＣＲ条件を、９５℃、５分処理後、９５℃で１５秒、適当なアニール温度（５８℃〜６１℃）で１分として、総４０回行った。ＰＣＲ産物の増幅有無は、Ｃｔ（ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値を測定して確認した。メチル化および非メチル化の対照ＤＮＡとしてはＥｐｉＴｅｃｔ  ＰＣＲ対照ＤＮＡセット(Qiagen, cat. no. 59695)を用いて、サンプルＤＮＡとともに試験した。内部対照遺伝子としてはＣＯＬ２Ａ１遺伝子(Kristensen et al., 2008)を使用した。
【００８３】
【表３】
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【００８４】
Ａ．セット６に対するＬＴＥ−ｑＭＳＰとｑＭＳＰの比較結果
実施例１に記載の方法により、セット６に対するＬＴＥ−ｑＭＳＰ方法とｑＭＳＰ方法の検出敏感度を比較した。その結果、従来の方法は、２００ｐｇのＤＮＡでは１００％の検出率を示したが、２０ｐｇでは３７．５％および１０ｐｇでは０％の検出率を示したのに対し、本発明の方法は、２００ｐｇ−２０ｐｇまでは何れも１００％の検出率を示し、１０ｐｇでも３３．３％の検出率を示すことを確認した（図４ａおよび表４）。
【００８５】
【表４】
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【００８６】
Ｂ．セット１７に対するＬＴＥ−ｑＭＳＰとｑＭＳＰの比較結果
実施例１に記載の方法により、セット１７に対するＬＴＥ−ｑＭＳＰ方法とｑＭＳＰ方法の検出敏感度を比較した。その結果、ｑＭＳＰ方法は、２００ｐｇのＤＮＡでは１００％の検出率を示したが、２０ｐｇでは４５．０％および１０ｐｇでは０％の検出率を示したのに対し、本発明の方法は、２００ｐｇ−１００ｐｇまでは何れも１００％の検出率を示し、２０ｐｇで９１．７％、そして１０ｐｇでも２９．２％の検出率を示すことを確認した（図４ｂおよび表５）。
【００８７】
【表５】
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【００８８】
実施例３：大便におけるＬＴＥ−ｑＭＳＰを用いたＳＤＣ２遺伝子の大腸癌診断能力評価
表３中の各サンプルのメチル化程度はＣｔ値で測定し、ＲＯＣ  ｃｕｒｖｅ分析（ＭｅｄＣａｌｃプログラム、ベルギー）により、各プライマーおよびプローブセットの敏感度および特異度を計算した（表６）。
【００８９】
健常者および大腸癌患者の大便ＤＮＡを用いたＳＤＣ２遺伝子のメチル化検証結果、大腸癌診断に対する敏感度は７６％（１９／２５）〜８８．０％（２２／２５）、そして特異度は８８．０％（３／２５）〜１００％（０／２５）と優れていることを確認した。したがって、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化を用いて大腸癌を診断するにあたり、その有用性が高いことを確認した。
【００９０】
【表６】
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【００９１】
ＬＴＥ−ｑＭＳＰ方法のメチル化多重検出能力を再確認するために、前記セット１とセット１２を組み合わせ、１つのチューブで大便ＤＮＡを用いた大腸癌診断能力を評価した。
【００９２】
【表７】
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【００９３】
セット１とセット１２を組み合わせて臨床検証を行った結果、敏感度は８８％、そして特異度は９２％と非常に優れていた。したがって、１つのチューブで多数のメチル化標的を同時に増幅するＬＴＥ−ｑＭＳＰ方法を用いたメチル化検出が可能であることを再確認した。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明によるメチル化ＤＮＡを検出する方法は、ユニバーサルプライマーを用いるため、サンプルに含まれている種々の遺伝子を問わず１つのプライマーのみを追加使用するだけで、多重ターゲットＤＮＡの効率的な増幅が可能である。また、線形増幅によりメチル化の検出時に用いられるＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）における複雑性が減少し、且つＰＣＲ効率のばらつきが低減することができるため、著しく優れた検出敏感度を示して有用である。また、ターゲットＤＮＡを線形増幅するステップ（ＬＴＥステップ）で、メチル化されたターゲットＤＮＡをより高い特異度で富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）することができる利点がある。
【００９５】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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