(57)【要約】本開示は、遺伝子発現をモジュレートする組成物および転写をモジュレートするための方法を提供する。特に、本開示は、遺伝子発現、細胞への送達（例えば、哺乳動物体細胞などの哺乳動物細胞；例えば、細胞膜を通る送達）をモジュレートするための様々な薬剤、組成物、および方法、ならびに関連する処置方法を提供する。本開示はまた、特に、遺伝的および／またはエピジェネティック的方法によってアンカー配列媒介接続を破壊する、および／または改変するように作用する部位特異的薬剤も提供する。
2019531763.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部位特異的破壊剤であって、それが細胞内の内因性核形成ポリペプチドの結合と競合する十分な親和性で、前記細胞内の１つまたは複数の標的アンカー配列に特異的に結合し、前記細胞内の非標的アンカー配列に結合しないＤＮＡ結合部分を含む部位特異的破壊剤。
【請求項２】
前記ＤＮＡ結合部分に付随するネガティブエフェクター部分をさらに含み、前記ＤＮＡ結合部分が前記１つまたは複数の標的アンカー配列に結合した場合、前記ネガティブエフェクター部分がそこに局在し、前記ネガティブエフェクター部分が、前記ネガティブエフェクター部分が存在しない場合と比較して存在する場合に、前記内因性核形成ポリペプチドの二量体化が減少することにより特徴付けられる、請求項１に記載の部位特異的破壊剤。
【請求項３】
前記ネガティブエフェクター部分が、前記内因性核形成ポリペプチドの二量体化ドメインのバリアント、またはその二量体化部分であるか、またはそれを含む、請求項２に記載の部位特異的破壊剤。
【請求項４】
前記ＤＮＡ結合部分がポリマーであるか、またはそれを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の部位特異的破壊剤。
【請求項５】
前記ポリマーがポリアミドであるか、またはそれを含む、請求項４に記載の部位特異的破壊剤。
【請求項６】
前記ポリマーがオリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の部位特異的破壊剤。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが前記標的アンカー配列の相補体を含む配列を有する、請求項６に記載の部位特異的破壊剤。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが化学的修飾を含む、請求項６または７に記載の部位特異的破壊剤。
【請求項９】
前記ポリマーがペプチド核酸である、請求項４に記載の部位特異的破壊剤。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ結合部分がペプチド核酸混合体であるか、またはそれを含む、請求項４に記載の部位特異的破壊剤。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ結合部分がペプチドまたはポリペプチドであるか、またはそれを含む、請求項４のいずれか一項に記載の部位特異的破壊剤。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが亜鉛フィンガーポリペプチドである、請求項１１に記載の部位特異的破壊剤。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ポリペプチドであるか、またはそれを含む、請求項１３に記載の部位特異的破壊剤。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ結合部分が低分子であるか、またはそれを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の部位特異的破壊剤。
【請求項１５】
第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、前記第１および／または第２のアンカー配列と、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の部位特異的破壊剤とを接触させるステップを含む、方法。
【請求項１６】
前記アンカー配列媒介接続が、少なくとも１つの内部転写制御配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記転写制御配列がエンハンシング配列である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記転写制御配列がサイレンシングまたは抑制配列である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子が、少なくとも３００塩基対だけ前記内部転写制御配列から離れている、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１および／または前記第２のアンカー配列が、外部転写制御配列の５００ｋｂ以内に位置する、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記外部転写制御配列がエンハンシング配列である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記外部転写制御配列がサイレンシングまたは抑制配列である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の第１のアンカー配列の１０ｋｂ以内の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、
前記第１および／または第２のアンカー配列と、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の部位特異的破壊剤とを接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項２４】
前記アンカー配列媒介接続が、少なくとも１つの内部転写制御配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記転写制御配列がエンハンシング配列である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記転写制御配列がサイレンシングまたは抑制配列である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記遺伝子が、少なくとも３００塩基対だけ前記内部転写制御配列から離れている、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１および／または前記第２のアンカー配列が、外部転写制御配列の５００ｋｂ以内に位置する、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記外部転写制御配列がエンハンシング配列である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記外部転写制御配列がサイレンシングまたは抑制配列である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
第１のアンカー配列、第２のアンカー配列、および内部エンハンシング配列を含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現を減少させる方法であって、
前記第１および／または第２のアンカー配列と、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の部位特異的破壊剤とを接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項３２】
前記第１および／または前記第２のアンカー配列が、外部サイレンシングまたは抑制配列の５００ｋｂ以内に位置する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記遺伝子が、少なくとも３００塩基対だけ前記内部エンハンシング配列から離れている、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記第１および／または前記第２のアンカー配列が外部エンハンシング配列の１０ｋｂ以内に位置し、
前記第１および／または第２のアンカー配列と、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の部位特異的破壊剤とを接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項３５】
前記アンカー配列媒介接続が、内部エンハンシング配列をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記遺伝子が少なくとも３００塩基対だけ前記内部エンハンシング配列から離れている、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
（ａ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の部位特異的破壊剤を哺乳動物細胞に送達するステップ
を含む方法。
【請求項３８】
前記哺乳動物細胞が体細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記哺乳動物細胞が一次細胞である、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記送達するステップがｅｘ  ｖｉｖｏで実行される、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記送達するステップの前に、対象から前記哺乳動物細胞を取り出すステップをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記送達するステップの後に、（ｂ）前記哺乳動物細胞を対象に投与するステップをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記送達するステップが、前記部位特異的破壊剤を含む組成物を対象に投与することを含む、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象が疾患または状態を有する、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記送達するステップが細胞膜を横断する送達を含む、請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
（ｉ）部位特異的標的化部分と、
（ｉｉ）脱アミノ化剤と
を含む融合分子であって、前記部位特異的標的化部分が、前記融合分子を、標的アンカー配列に標的化するが、少なくとも１つの非標的アンカー配列には標的化しない、融合分子。
【請求項４７】
前記標的アンカー配列がＣＴＣＦ結合モチーフを含む、請求項４６に記載の融合分子。
【請求項４８】
前記少なくとも１つの非標的アンカー配列もＣＴＣＦ結合モチーフを含む、請求項４７に記載の融合分子。
【請求項４９】
前記脱アミノ化剤がデアミナーゼである、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項５０】
前記部位特異的標的化部分が、Ｃａｓポリペプチドと部位特異的ガイドＲＮＡとを含む、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項５１】
前記Ｃａｓポリペプチドが酵素的に不活性である、請求項５０に記載の融合分子。
【請求項５２】
前記ＣａｓポリペプチドがＣａｓ９ポリペプチドである、請求項５０または５１に記載の融合分子。
【請求項５３】
前記脱アミノ化剤がオリゴヌクレオチドを含む、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項５４】
前記オリゴヌクレオチドが亜硫酸水素ナトリウムにコンジュゲートされている、請求項５３に記載の融合分子。
【請求項５５】
前記部位特異的標的化部分がポリマーである、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項５６】
前記ＤＮＡ結合部分がポリマーであるか、またはそれを含む、請求項４６〜５５のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項５７】
前記ポリマーがポリアミドであるか、またはそれを含む、請求項５６に記載の融合分子。
【請求項５８】
前記ポリマーがオリゴヌクレオチドである、請求項５６に記載の融合分子。
【請求項５９】
前記オリゴヌクレオチドが前記標的アンカー配列の相補体を含む配列を有する、請求項５８に記載の融合分子。
【請求項６０】
前記オリゴヌクレオチドが化学的修飾を含む、請求項５８または５９に記載の融合分子。
【請求項６１】
前記ポリマーがペプチド核酸である、請求項５６に記載の融合分子。
【請求項６２】
前記ＤＮＡ結合部分がペプチド核酸混合体であるか、またはそれを含む、請求項４６に記載の融合分子。
【請求項６３】
前記ＤＮＡ結合部分がペプチドまたはポリペプチドであるか、またはそれを含む、請求項５６に記載の融合分子。
【請求項６４】
前記ポリペプチドが亜鉛フィンガーポリペプチドである、請求項６３に記載の融合分子。
【請求項６５】
前記ポリペプチドが転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ポリペプチドであるか、またはそれを含む、請求項６３に記載の融合分子。
【請求項６６】
前記ＤＮＡ結合部分が低分子であるか、またはそれを含む、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項６７】
（ｉ）酵素的に不活性なＣａｓポリペプチドと、脱アミノ化剤とを含む融合ポリペプチド、または前記融合ポリペプチドをコードする核酸；および
（ｉｉ）前記融合ポリペプチドを、標的アンカー配列に標的化するが、少なくとも１つの非標的アンカー配列には標的化しないガイドＲＮＡ
を含む組成物。
【請求項６８】
第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、前記第１および／または第２のアンカー配列と、請求項４６〜６６のいずれか一項に記載の融合分子または請求項６７に記載の組成物とを接触させるステップを含む、方法。
【請求項６９】
前記アンカー配列媒介接続が、少なくとも１つの内部転写制御配列を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記転写制御配列がエンハンシング配列である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記転写制御配列がサイレンシングまたは抑制配列である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記遺伝子が、少なくとも３００塩基対だけ前記内部転写制御配列から離れている、請求項６９〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記第１および／または前記第２のアンカー配列が、外部転写制御配列の５００ｋｂ以内に位置する、請求項６９〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記外部転写制御配列がエンハンシング配列である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記外部転写制御配列がサイレンシングまたは抑制配列である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の第１のアンカー配列の１０ｋｂ以内の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、
前記第１および／または第２のアンカー配列と、請求項４６〜６６のいずれか一項に記載の融合分子または請求項６７に記載の組成物とを接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項７７】
前記アンカー配列媒介接続が、少なくとも１つの内部転写制御配列を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記転写制御配列がエンハンシング配列である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記転写制御配列がサイレンシングまたは抑制配列である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記遺伝子が、少なくとも３００塩基対だけ前記内部転写制御配列から離れている、請求項７７〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記第１および／または前記第２のアンカー配列が、外部転写制御配列の５００ｋｂ以内に位置する、請求項７６〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記外部転写制御配列がエンハンシング配列である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記外部転写制御配列がサイレンシングまたは抑制配列である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
第１のアンカー配列、第２のアンカー配列、および内部エンハンシング配列を含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現を減少させる方法であって、
前記第１および／または第２のアンカー配列と、請求項４６〜６６のいずれか一項に記載の融合分子または請求項６７に記載の組成物とを接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項８５】
前記第１および／または前記第２のアンカー配列が、外部サイレンシングまたは抑制配列の５００ｋｂ以内に位置する、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記遺伝子が、少なくとも３００塩基対だけ前記内部エンハンシング配列から離れている、請求項８４または８５に記載の方法。
【請求項８７】
第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記第１および／または前記第２のアンカー配列が外部エンハンシング配列の１０ｋｂ以内に位置し、
前記第１および／または第２のアンカー配列と、請求項４６〜６６のいずれか一項に記載の融合分子または請求項６７に記載の組成物とを接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項８８】
前記アンカー配列媒介接続が、内部エンハンシング配列をさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記遺伝子が少なくとも３００塩基対だけ前記内部エンハンシング配列から離れている、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
（ａ）請求項４６〜６６のいずれか一項に記載の融合分子または請求項６７に記載の組成物を哺乳動物細胞に送達するステップ
を含む方法。
【請求項９１】
前記哺乳動物細胞が体細胞である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記哺乳動物細胞が一次細胞である、請求項９０または９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記送達するステップがｅｘ  ｖｉｖｏで実行される、請求項９０〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記送達するステップの前に、対象から前記哺乳動物細胞を取り出すステップをさらに含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
（ｂ）前記哺乳動物細胞を対象に投与するステップをさらに含む、請求項９３または９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記送達するステップが、前記請求項４６〜６６のいずれか一項に記載の融合分子または請求項６７に記載の組成物を含む組成物を対象に投与することを含む、請求項９０〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記送達するステップが細胞膜を横断する送達を含む、請求項９０〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
（ａ）哺乳動物体細胞内のアンカー配列の１つまたは複数のヌクレオチドを置換する、付加する、または欠失させるステップ
を含む方法。
【請求項９９】
前記哺乳動物体細胞が一次細胞である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記置換する、付加する、または欠失させるステップが、ｉｎ  ｖｉｖｏで実行される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記置換する、付加する、または欠失させるステップが、ｅｘ  ｖｉｖｏで実行される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
前記哺乳動物体細胞が非胚細胞である、請求項９８〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記アンカー配列がゲノムアンカー配列である、請求項９８〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
哺乳動物体細胞を、疾患または状態を有する対象に送達するステップを含む方法であって、前記哺乳動物体細胞内のアンカー配列の１つまたは複数のヌクレオチドが置換されている、付加されている、または欠失している、方法。
【請求項１０５】
（ａ）哺乳動物体細胞を対象に投与するステップ
を含み、前記哺乳動物体細胞が前記対象から得られたものであり、請求項４６〜６６のいずれか一項に記載の融合分子または請求項６７に記載の組成物がｅｘ  ｖｉｖｏで前記哺乳動物細胞に送達されたものである、方法。
【請求項１０６】
前記対象が哺乳動物である、請求項９４〜９６または１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記対象が疾患または状態を有する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
（ｉ）部位特異的標的化部分および
（ｉｉ）エピジェネティック改変剤
を含む融合分子であって、前記部位特異的標的化部分が、前記融合分子を、標的アンカー配列に標的化するが、少なくとも１つの非標的アンカー配列には標的化しない、融合分子。
【請求項１０９】
前記標的アンカー配列がＣＴＣＦ結合モチーフを含む、請求項１０８に記載の融合分子。
【請求項１１０】
前記少なくとも１つの非標的アンカー配列もＣＴＣＦ結合モチーフを含む、請求項１０９に記載の融合分子。
【請求項１１１】
前記エピジェネティック改変剤が、ＤＮＡメチラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、およびその組合せからなる群から選択される、請求項１０８〜１１０のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項１１２】
前記部位特異的標的化部分が、Ｃａｓポリペプチドと部位特異的ガイドＲＮＡとを含む、請求項１０８〜１１１のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項１１３】
前記Ｃａｓポリペプチドが酵素的に不活性である、請求項１１２に記載の融合分子。
【請求項１１４】
前記ＣａｓポリペプチドがＣａｓ９ポリペプチドである、請求項１１２または１１３に記載の融合分子。
【請求項１１５】
前記部位特異的標的化部分がポリマーである、請求項１０８〜１１１のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項１１６】
前記ポリマーがポリアミドであるか、またはそれを含む、請求項１１５に記載の融合分子。
【請求項１１７】
前記ポリマーがオリゴヌクレオチドである、請求項１１５に記載の融合分子。
【請求項１１８】
前記オリゴヌクレオチドが前記標的アンカー配列の相補体を含む配列を有する、請求項１１６に記載の融合分子。
【請求項１１９】
前記オリゴヌクレオチドが化学的修飾を含む、請求項１１６に記載の融合分子。
【請求項１２０】
前記ポリマーがペプチド核酸である、請求項１１５に記載の融合分子。
【請求項１２１】
前記部位特異的標的化部分がペプチド核酸混合体であるか、またはそれを含む、請求項１０８に記載の融合分子。
【請求項１２２】
前記部位特異的標的化結合部分がペプチドまたはポリペプチドであるか、またはそれを含む、請求項１１５に記載の融合分子。
【請求項１２３】
前記ポリペプチドが亜鉛フィンガーポリペプチドである、請求項１２２に記載の融合分子。
【請求項１２４】
前記ポリペプチドが転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ポリペプチドであるか、またはそれを含む、請求項１２２に記載の融合分子。
【請求項１２５】
前記部位特異的結合部分が低分子であるか、またはそれを含む、請求項１０８〜１１０のいずれか一項に記載の融合分子。
【請求項１２６】
アンカー配列を含む標的核酸と相補的な標的化ドメインを含む部位特異的ガイドＲＮＡ。
【請求項１２７】
前記標的化ドメインが、前記アンカー配列を含む少なくとも１つの非標的核酸と相補的ではない、請求項１２６に記載の部位特異的ガイドＲＮＡ。
【請求項１２８】
前記アンカー配列がＣＴＣＦ結合モチーフを含む、請求項１２６または１２７に記載の部位特異的ガイドＲＮＡ。
【請求項１２９】
（ｉ）酵素的に不活性なＣａｓポリペプチドと、エピジェネティック改変剤とを含む融合ポリペプチド、または前記融合ポリペプチドをコードする核酸；および
（ｉｉ）前記融合ポリペプチドを、標的アンカー配列に標的化するが、少なくとも１つの非標的アンカー配列には標的化しないガイドＲＮＡ
を含む組成物。
【請求項１３０】
第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、
前記第１および／または第２のアンカー配列と、請求項１０８〜１２５のいずれか一項に記載の融合分子、請求項１２６〜１２８のいずれか一項に記載の部位特異的ガイドＲＮＡ、または請求項１２９に記載の組成物とを接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項１３１】
前記アンカー配列媒介接続が、少なくとも１つの内部転写制御配列を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記転写制御配列がエンハンシング配列である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記転写制御配列がサイレンシングまたは抑制配列である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３４】
前記遺伝子が、少なくとも３００塩基対だけ前記内部転写制御配列から離れている、請求項１３０〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記第１および／または前記第２のアンカー配列が、外部転写制御配列の５００ｋｂ以内に位置する、請求項１３０〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記外部転写制御配列がエンハンシング配列である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記外部転写制御配列がサイレンシングまたは抑制配列である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３８】
第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の第１のアンカー配列の１０ｋｂ以内の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、
前記第１および／または第２のアンカー配列と、請求項１０８〜１２５のいずれか一項に記載の融合分子、請求項１２６〜１２８のいずれか一項に記載の部位特異的ガイドＲＮＡ、または請求項１２９に記載の組成物とを接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項１３９】
前記アンカー配列媒介接続が、少なくとも１つの内部転写制御配列を含む、請求項１３８記載の方法。
【請求項１４０】
前記内部転写制御配列がエンハンシング配列である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記内部転写制御配列がサイレンシングまたは抑制配列である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
前記遺伝子が、少なくとも３００塩基対だけ前記内部転写制御配列から離れている、請求項１３９〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記第１および／または前記第２のアンカー配列が、外部転写制御配列の５００ｋｂ以内に位置する、請求項１３８〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記外部転写制御配列がエンハンシング配列である、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記外部転写制御配列がサイレンシングまたは抑制配列である、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４６】
第１のアンカー配列、第２のアンカー配列、および内部エンハンシング配列を含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現を減少させる方法であって、
前記第１および／または第２のアンカー配列と、請求項１０８〜１２５のいずれか一項に記載の融合分子、請求項１２６〜１２８のいずれか一項に記載の部位特異的ガイドＲＮＡ、または請求項１２９に記載の組成物とを接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項１４７】
前記第１および／または前記第２のアンカー配列が、外部サイレンシングまたは抑制配列の５００ｋｂ以内に位置する、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記遺伝子が、少なくとも３００塩基対だけ前記内部エンハンシング配列から離れている、請求項１４６または１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記第１および／または前記第２のアンカー配列が外部エンハンシング配列の１０ｋｂ以内に位置し、前記方法が、
前記第１および／または第２のアンカー配列と、請求項１０８〜１２５のいずれか一項に記載の融合分子、請求項１２６〜１２８のいずれか一項に記載の部位特異的ガイドＲＮＡ、または請求項１２９に記載の組成物とを接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項１５０】
前記アンカー配列媒介接続が、内部エンハンシング配列をさらに含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記遺伝子が少なくとも３００塩基対だけ前記内部エンハンシング配列から離れている、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
（ａ）請求項１０８〜１２５のいずれか一項に記載の融合分子、請求項１２６〜１２８のいずれか一項に記載の部位特異的ガイドＲＮＡ、または請求項１２９に記載の組成物を哺乳動物細胞に送達するステップ
を含む方法。
【請求項１５３】
前記哺乳動物細胞が体細胞である、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記哺乳動物細胞が一次細胞である、請求項１５２または１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記送達するステップがｅｘ  ｖｉｖｏで実行される、請求項１５２〜１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５６】
前記送達するステップの前に、対象から前記哺乳動物細胞を取り出すステップをさらに含む、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記送達するステップの後に、（ｂ）前記哺乳動物細胞を対象に投与するステップをさらに含む、請求項１５５または１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記送達するステップが、請求項１０８〜１２５のいずれか一項に記載の融合分子、請求項１２６〜１２８のいずれか一項に記載の部位特異的ガイドＲＮＡ、または請求項１２９に記載の組成物を含む組成物を対象に投与することを含む、請求項１５２〜１５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５９】
前記対象が疾患または状態を有する、請求項１５６、１５７または１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記送達するステップが細胞膜を横断する送達を含む、請求項１５２〜１５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
操作された部位特異的核形成剤であって、
それが細胞内の内因性核形成ポリペプチドの結合と競合する十分な親和性で、前記細胞内の１つまたは複数の標的配列に特異的に結合し、前記細胞内の非標的配列には結合しない、操作されたＤＮＡ結合部分；および
前記操作されたＤＮＡ結合部分に付随する核形成ポリペプチド二量体化ドメイン
を含み、前記操作されたＤＮＡ結合部分が前記少なくとも１つの標的配列で結合する場合、核形成ポリペプチド二量体化ドメインがそこに局在し、それぞれの少なくとも１つの標的配列が標的アンカー配列であり、
前記核形成ポリペプチド二量体化ドメインが前記標的アンカー配列に局在する場合、前記核形成ポリペプチド二量体化ドメインと核形成ポリペプチドとの相互作用がアンカー配列媒介接続を生成するように、前記少なくとも１つまたは複数の標的アンカー配列が、前記核形成ポリペプチドが結合するアンカー配列に対して配置されている、
操作された部位特異的核形成剤。
【請求項１６２】
前記標的アンカー配列がＣＴＣＦ結合モチーフを含まない、請求項１に記載の操作された部位特異的核形成剤。
【請求項１６３】
第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、
前記第１および／または第２のアンカー配列と、請求項１６１または１６２に記載の操作された部位特異的核形成剤とを接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項１６４】
前記アンカー配列媒介接続が、少なくとも１つの内部転写制御配列を含む、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記内部転写制御配列がエンハンシング配列である、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６６】
前記内部転写制御配列がサイレンシングまたは抑制配列である、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６７】
前記遺伝子が、少なくとも３００塩基対だけ前記内部転写制御配列から離れている、請求項１６３〜１６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
前記第１および／または前記第２のアンカー配列が、外部転写制御配列の５００ｋｂ以内に位置する、請求項１６３〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６９】
前記外部転写制御配列がエンハンシング配列である、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
前記外部転写制御配列がサイレンシングまたは抑制配列である、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７１】
第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の第１のアンカー配列の１０ｋｂ以内の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、
前記第１および／または第２のアンカー配列と、請求項１６１または１６２に記載の操作された部位特異的核形成剤とを接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項１７２】
前記アンカー配列媒介接続が、少なくとも１つの内部転写制御配列を含む、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
前記内部転写制御配列がエンハンシング配列である、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
前記内部転写制御配列がサイレンシングまたは抑制配列である、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７５】
前記遺伝子が、少なくとも３００塩基対だけ前記内部転写制御配列から離れている、請求項１７１〜１７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７６】
前記第１および／または前記第２のアンカー配列が、外部転写制御配列の５００ｋｂ以内に位置する、請求項１７１〜１７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７７】
前記外部転写制御配列がエンハンシング配列である、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
前記外部転写制御配列がサイレンシングまたは抑制配列である、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７９】
第１のアンカー配列、第２のアンカー配列、および内部エンハンシング配列を含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現を減少させる方法であって、
前記第１および／または第２のアンカー配列と、請求項１６１または１６２に記載の操作された部位特異的核形成剤とを接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項１８０】
前記第１および／または前記第２のアンカー配列が、外部サイレンシングまたは抑制配列の５００ｋｂ以内に位置する、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
前記遺伝子が、少なくとも３００塩基対だけ前記内部エンハンシング配列から離れている、請求項１７９または１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記第１および／または前記第２のアンカー配列が外部エンハンシング配列の１０ｋｂ以内に位置し、前記方法が、
前記第１および／または第２のアンカー配列と、請求項１６１または１６２に記載の操作された部位特異的核形成剤とを接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項１８３】
前記アンカー配列媒介接続が、内部エンハンシング配列をさらに含む、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記遺伝子が少なくとも３００塩基対だけ前記内部エンハンシング配列から離れている、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
（ａ）請求項１６１または１６２に記載の操作された部位特異的核形成剤を哺乳動物細胞に送達するステップ
を含む方法。
【請求項１８６】
前記哺乳動物細胞が体細胞である、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
前記哺乳動物細胞が一次細胞である、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１８８】
前記送達するステップがｅｘ  ｖｉｖｏで実行される、請求項１８５〜１８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８９】
前記送達するステップの前に、対象から前記哺乳動物細胞を取り出すステップをさらに含む、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記送達するステップの後に、（ｂ）前記哺乳動物細胞を対象に投与するステップをさらに含む、請求項１８８または１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
前記送達するステップが、請求項１６１または１６２に記載の操作された部位特異的核形成剤を含む組成物を哺乳動物細胞に対象に投与することを含む、請求項１８５〜１８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９２】
前記対象が疾患または状態を有する、請求項１８９、１９０または１９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９３】
前記送達するステップが細胞膜を横断する送達を含む、請求項１８５〜１９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９４】
発現ユニット中の標的遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、
前記標的遺伝子または前記遺伝子の転写に影響するその付随する転写制御配列、例えば、アンカー配列の外側の配列を標的にする、またはその一部ではない標的化部分を用いてアンカー配列媒介接続の形成を変化させることによって、前記標的遺伝子の発現をモジュレートすることを含む、方法。
【請求項１９５】
核酸配列、例えば、発現ユニット中の標的遺伝子の転写をモジュレートする方法であって、
前記アンカー配列媒介接続の形成を変化させるために、前記標的遺伝子または前記標的遺伝子の転写に影響するその付随する転写制御配列と非連続的な配列を標的にする標的化部分を用いてアンカー配列媒介接続の形成を変化させることを含む、方法。
【請求項１９６】
アンカー配列媒介接続のアンカー配列に結合し、前記アンカー配列媒介接続の形成を変化させる標的化部分を含む組成物であって、例えば、ヒト細胞中で、前記アンカー配列媒介接続に付随する標的遺伝子の転写をモジュレートする組成物を含む医薬調製物。
【請求項１９７】
アンカー配列媒介接続のアンカー配列に結合し、前記アンカー配列媒介接続の形成を変化させる（例えば、前記アンカー配列の、接続核形成分子に対する親和性を、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれよりも大きく変化させる）標的化部分を含む組成物。
【請求項１９８】
前記標的化部分が、
（ｉ）化学物質、例えば、シトシン（Ｃ）またはアデニン（Ａ）をモジュレートする化学物質（例えば、亜硫酸水素Ｎａ、亜硫酸水素アンモニウム）である、
（ｉｉ）酵素活性（メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）、デアミナーゼ）を有する、
（ｉｉｉ）前記アンカー配列媒介接続の形成を立体的に障害する、例えば、ｓｓＤＮＡオリゴ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば、核酸側鎖を有する膜透過移行ポリペプチド）、架橋核酸（ＢＮＡ）、ポリアミド、およびＤＮＡ結合分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートである、エフェクター部分を含む、請求項１９４〜１９７のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項１９９】
１つまたは複数の転写制御配列が、前記アンカー配列媒介接続、例えば、１型アンカー配列媒介接続の内部にある、請求項１９４〜１９８のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項２００】
１つまたは複数の転写制御配列が、例えば、２型アンカー配列媒介接続を含む前記アンカー配列媒介接続の外部にある、請求項１９４〜１９９のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項２０１】
１つまたは複数の転写制御配列が、例えば、エンハンシング配列の内部にあり、少なくとも部分的には、例えば、サイレンシング配列、前記アンカー配列媒介接続、例えば、３型アンカー配列媒介接続の外部にある、請求項１９４〜２００のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項２０２】
１つまたは複数の転写制御配列が、例えば、エンハンシング配列の内部にあり、少なくとも部分的には、例えば、エンハンシング配列、前記アンカー配列媒介接続、例えば、４型アンカー配列媒介接続の外部にある、請求項１９４〜２０１のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項２０３】
（ａ）標的化部分と、（ｂ）例えば、アンカー配列を含むＤＮＡ配列とを含む医薬組成物。
【請求項２０４】
ＤＮＡに対して作用するドメイン、例えば、酵素ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン、例えば、Ｃａｓ９ドメイン、例えば、ｄＣａｓ９ドメイン；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、デアミナーゼ）を含むタンパク質を、前記タンパク質を標的アンカー配列媒介接続のアンカー配列に標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドとの組合せで含む組成物であって、ヒト細胞中で、前記標的アンカー配列媒介接続を変化させるのに有効である組成物。
【請求項２０５】
アンカー配列媒介接続中のアンカー配列に結合して前記アンカー配列媒介接続のトポロジーを変化させる標的化部分、を含む組成物。
【請求項２０６】
Ｃａｓまたは改変Ｃａｓタンパク質ドメインを含む第１のポリペプチドと、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を有する［または脱メチル化もしくはデアミナーゼ活性を伴う］ポリペプチドを含む第２のポリペプチドとを含むタンパク質を、前記タンパク質を標的アンカー配列媒介接続のアンカー配列に標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドとの組合せで含む組成物であって、システムが、ヒト細胞中で、前記標的アンカー配列媒介接続を変化させるのに有効である、組成物。
【請求項２０７】
Ｃａｓタンパク質と、前記Ｃａｓタンパク質を、標的アンカー配列媒介接続のアンカー配列に標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む医薬組成物であって、前記Ｃａｓタンパク質が、前記標的アンカー配列に付随するアンカー配列媒介接続の形成を減少させる前記標的アンカー配列の突然変異を引き起こすのに有効である、医薬組成物。
【請求項２０８】
（ａ）Ｃａｓまたは改変Ｃａｓタンパク質を含む第１のポリペプチドドメインと、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を有する［または脱メチル化もしくはデアミナーゼ活性を伴う］ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含むタンパク質をコードする核酸；および
（ｂ）前記タンパク質を、標的細胞中の標的アンカー配列媒介接続のアンカー配列に標的化するための少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項２０９】
哺乳動物対象における［遺伝子発現を変化させる／アンカー配列媒介接続を変化させる］方法であって、前記対象に（別々に、または同じ医薬組成物中で）、
ａ）（ｉ）Ｃａｓもしくは改変Ｃａｓタンパク質を含む第１のポリペプチドドメインと、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を有する［または脱メチル化もしくはデアミナーゼ活性を伴う］ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含むタンパク質または（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を含む第１のポリペプチドドメインと、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を有する［または脱メチル化もしくはデアミナーゼ活性を伴う］ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含むタンパク質をコードする核酸、および
ｂ）アンカー配列媒介接続のアンカー配列を標的にする少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド
を投与することを含む、方法。
【請求項２１０】
アンカー配列媒介接続のトポロジー、例えば、ループを変化させて、核酸配列の転写をモジュレートすることを含み、
前記アンカー配列媒介接続の前記トポロジーの変化が、前記核酸配列の転写をモジュレートする、クロマチン構造、例えば、２次元構造を改変する方法。
【請求項２１１】
核酸配列の転写をモジュレートするために、複数のアンカー配列媒介接続のトポロジー、例えば、複数のループを変化させることを含み、
前記トポロジーの変化が、前記核酸配列の転写をモジュレートする、クロマチン構造、例えば、２次元構造を改変する方法。
【請求項２１２】
核酸配列の転写に影響する、アンカー配列媒介接続、例えば、ループを変化させることを含み、
前記アンカー配列媒介接続の変化が、前記核酸配列の転写をモジュレートする、核酸配列の転写をモジュレートする方法。
【請求項２１３】
アンカー配列媒介接続の標的化された変更を含む、操作された細胞。
【請求項２１４】
標的化された変更を有するアンカー配列媒介接続を含む、操作された核酸配列。
【請求項２１５】
前記請求項のいずれか一項に記載の操作された細胞または前記請求項のいずれか一項に記載の操作された核酸配列を含む医薬組成物。
【請求項２１６】
前記請求項のいずれか一項に記載の操作された細胞を含む複数の細胞。
【請求項２１７】
前記請求項のいずれか一項に記載の操作された核酸配列を含むベクター。
【請求項２１８】
標的化された変更をアンカー配列媒介接続に導入して、核酸配列の転写をモジュレートするための組成物であって、前記アンカー配列に結合する標的化部分を含む組成物。
【請求項２１９】
前記アンカー配列媒介接続内のアンカー配列に対する選択された結合親和性を有する合成接続核形成分子を含む組成物。
【請求項２２０】
複数のアンカー配列、遺伝子配列、および転写モディファイアー配列を含む合成核酸。
【請求項２２１】
前記請求項のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２２２】
前記請求項のいずれか一項に記載の核酸を含む細胞。
【請求項２２３】
前記請求項のいずれか一項に記載の核酸を含む医薬組成物。
【請求項２２４】
前記請求項のいずれか一項に記載の核酸を含む組成物を投与することによって遺伝子の発現をモジュレートする方法。
【請求項２２５】
選択された結合親和性を有する接続核形成分子を調製する方法。
【請求項２２６】
外因性接続核形成分子、前記接続核形成分子をコードする核酸、または配列標的化ポリペプチドと、接続核形成分子との融合物から選択される標的化部分であって、アンカー配列媒介接続を変化させる標的化部分を対象に投与することを含む、疾患または状態を処置する方法。
【請求項２２７】
ＡＢＸｎＣ（式中、Ａは、核酸側鎖を有する、疎水性アミノ酸またはアミド含有骨格、例えば、アミノエチル−グリシンから選択され；ＢおよびＣは、同じか、または異なっていてもよく、それぞれ独立に、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リシン、およびそれらのアナログから選択され；Ｘは、それぞれ独立に、疎水性アミノ酸であるか、またはＸは、それぞれ独立に、核酸側鎖を有する、アミド含有骨格、例えば、アミノエチル−グリシンであり；ｎは、１〜４の整数である）の少なくとも１つの配列をそれぞれ含む少なくとも１つのポリペプチドであって、
アンカー配列媒介接続内の核酸配列（例えば、アンカー配列媒介接続のアンカー配列、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフ、ＢＯＲＩＳ結合モチーフ、コヘシン結合モチーフ、ＵＳＦ１結合モチーフ、ＹＹ１結合モチーフ、ＴＡＴＡボックス、ＺＮＦ１４３結合モチーフなど）にハイブリダイズするポリペプチドをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物および方法。
【請求項２２８】
標的遺伝子の発現を改変する方法であって、
前記標的遺伝子に付随するアンカー配列媒介接続を変化させること
を含み、前記変更が、前記標的遺伝子の転写をモジュレートする、方法。
【請求項２２９】
標的遺伝子の発現を改変する方法であって、
前記請求項のいずれか一項に記載の組成物を、細胞、組織または対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項２３０】
核酸配列の転写をモジュレートする方法であって、
核酸配列の転写をモジュレートするアンカー配列媒介接続、例えば、ループを変化させるために、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、前記アンカー配列媒介接続の変化が、前記核酸配列の転写をモジュレートする、方法。
【請求項２３１】
標的遺伝子の発現を変化させる方法であって、ゲノムに、（ａ）標的化部分と、（ｂ）アンカー配列を含むＤＮＡ配列とを含む医薬組成物を投与することを含み、前記アンカー配列が、遺伝子発現因子（エンハンシング配列、サイレンシング／抑制配列）を、前記標的遺伝子と作動可能に連結させる接続の形成を促進する、方法。
【請求項２３２】
前記請求項のいずれか一項に記載の組成物を提供することを含む遺伝子発現をモジュレートする方法であって、例えば、前記標的化部分が、ＣｐＧ結合を阻害するエフェクター部分を含む、内因性エフェクターである、外因性エフェクターである、またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストである、方法。
【請求項２３３】
治療剤を送達する方法であって、
前記請求項のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含み、前記標的化部分が、前記治療剤であるエフェクター部分を含み、前記組成物が前記治療剤のみと比較して前記治療剤の細胞内送達を増加させ、前記組成物が遺伝子の転写をモジュレートする、方法。
【請求項２３４】
細胞上の膜タンパク質をモジュレートする方法であって、
前記細胞と、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物とを接触させることを含み、前記組成物が、前記細胞を標的にし、前記膜タンパク質をモジュレートする、方法。
【請求項２３５】
細胞と、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物とを接触させることを含み、前記組成物が前記細胞を標的にし、アポトーシスを誘導する、細胞死を誘導する方法。
【請求項２３６】
治療剤のバイオアベイラビリティを増大させる方法であって、
前記請求項のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、前記治療剤が異種部分である、方法。
【請求項２３７】
対象における疾患／障害／状態を処置する方法であって、
前記請求項のいずれかに記載の組成物を投与することを含み、前記組成物が転写をモジュレートして前記疾患／障害／状態を処置する、方法。
【請求項２３８】
前記請求項のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、急性または慢性感染を処置する方法。
【請求項２３９】
前記請求項のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、がんを処置する方法。
【請求項２４０】
前記請求項のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、神経疾患または障害を処置する方法。
【請求項２４１】
前記請求項のいずれか一項に記載の組成物を提供することを含む免疫寛容を誘導する方法であって、例えば、前記異種部分が抗原である、方法。
【請求項２４２】
Ｃａｓまたは改変Ｃａｓタンパク質を含む第１のポリペプチドドメインと、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を有する［または脱メチル化もしくはデアミナーゼ活性を伴う］ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含むタンパク質を、前記タンパク質を標的アンカー配列媒介接続のアンカー配列に標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドとの組合せで含む、薬学的使用のためのシステムであって、ヒト細胞中で、前記標的アンカー配列媒介接続を変化させるのに有効であるシステム。
【請求項２４３】
ヒト細胞中で、標的遺伝子の発現を変化させるためのシステムであって、
前記標的遺伝子に付随するアンカー配列と会合する標的化部分（例えば、ｇＲＮＡ、ＬＤＢ）、
任意選択で、前記標的化部分に作動可能に連結した異種部分（例えば、酵素、例えば、ヌクレアーゼまたは脱活性化されたヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９）、メチラーゼ、デメチラーゼ、デアミナーゼ）を含み、前記アンカー配列によって媒介される接続をモジュレートし、前記標的遺伝子の発現を変化させるのに有効である、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、米国仮出願第６２／３８４，６０３号（２０１６年９月７日提出）、同第６２／４１６，５０１号（２０１６年１１月２日提出）、同第６２／４３９，３２７号（２０１６年１２月２７日提出）および同第６２／５４２，７０３号（２０１７年８月８日提出）に対する優先権およびそれによる利益を主張する。これらの出願のそれぞれの内容は、参考により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
多くの疾患は、ある特定の遺伝子の発現の調節の欠陥によって引き起こされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
概要
特に、本開示は、遺伝子発現、細胞への送達（例えば、哺乳動物体細胞などの哺乳動物細胞；例えば、細胞膜を通る送達）をモジュレートするための様々な薬剤、組成物、および方法、ならびに関連する処置方法を提供する。本発明者らの知識に対して、本開示は、アンカー配列媒介接続（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ）を物理的に破壊する、および／または改変する部位特異的薬剤の初めての開示を提供する。本開示はまた、特に、遺伝的および／またはエピジェネティック的方法によってアンカー配列媒介接続を破壊する、および／または改変するように作用する部位特異的薬剤も提供する。
【０００４】
一部の実施形態では、本開示は、部位特異的破壊剤であって、それが細胞内の内因性核形成ポリペプチドの結合と競合する十分な親和性で、前記細胞内の１つまたは複数の標的アンカー配列に特異的に結合し、前記細胞内の非標的アンカー配列に結合しないＤＮＡ結合部分を含む部位特異的破壊剤を提供する。
【０００５】
一部の実施形態では、本開示は、第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、前記第１および／または第２のアンカー配列と、本明細書中に開示の部位特異的破壊剤とを接触させるステップを含む、方法を提供する。
【０００６】
一部の実施形態では、本開示は、第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の第１のアンカー配列の１０ｋｂ以内の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、前記第１および／または第２のアンカー配列と、本明細書中に開示される部位特異的破壊剤とを接触させるステップを含む、方法を提供する。
【０００７】
一部の実施形態では、本開示は、第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記第１および／または前記第２のアンカー配列が外部エンハンシング配列の１０ｋｂ以内に位置し、前記第１および／または第２のアンカー配列と、本明細書中に開示の部位特異的破壊剤とを接触させるステップを含む、方法を提供する。
【０００８】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書中に開示の部位特異的破壊剤を哺乳動物細胞に送達するステップを含む方法を提供する。
【０００９】
一部の実施形態では、本開示は、（ｉ）部位特異的標的化部分と、（ｉｉ）脱アミノ化剤とを含む融合分子であって、前記部位特異的標的化部分が、前記融合分子を、標的アンカー配列に標的化するが、少なくとも１つの非標的アンカー配列には標的化しない、融合分子を提供する。
【００１０】
一部の実施形態では、本開示は、（ｉ）酵素的に不活性なＣａｓポリペプチドおよび脱アミノ化剤を含む融合ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸；ならびに（ｉｉ）融合ポリペプチドを標的アンカー配列に標的化するが、少なくとも１つの非標的アンカー配列には標的化しないガイドＲＮＡを含む組成物を提供する。
【００１１】
一部の実施形態では、本開示は、第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、前記第１および／または第２のアンカー配列と、本明細書中に開示の部位特異的破壊剤とを接触させるステップを含む、方法を提供する。
【００１２】
一部の実施形態では、本開示は、第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の第１のアンカー配列の１０ｋｂ以内の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、前記第１および／または第２のアンカー配列と、本明細書中に開示の部位特異的破壊剤とを接触させるステップを含む、方法を提供する。
【００１３】
一部の実施形態では、本開示は、第１のアンカー配列、第２のアンカー配列、および内部エンハンシング配列を含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現を減少させる方法であって、前記第１および／または第２のアンカー配列と、本明細書中に開示の部位特異的破壊剤とを接触させるステップを含む、方法を提供する。
【００１４】
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）本明細書中に開示の融合分子または組成物を哺乳動物細胞に送達するステップを含む方法を提供する。
【００１５】
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）哺乳動物体細胞内のアンカー配列の１つまたは複数のヌクレオチドを置換する、付加する、または欠失させるステップを含む方法を提供する。
【００１６】
一部の実施形態では、本開示は、哺乳動物体細胞を、疾患または状態を有する対象に送達するステップを含む方法であって、前記哺乳動物体細胞内のアンカー配列の１つまたは複数のヌクレオチドが置換されている、付加されている、または欠失している、方法を提供する。
【００１７】
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）哺乳動物体細胞を対象に投与するステップを含み、前記哺乳動物体細胞が前記対象から得られたものであり、本明細書中に開示の融合分子または組成物がｅｘ  ｖｉｖｏで前記哺乳動物細胞に送達されたものである、方法を提供する。
【００１８】
一部の実施形態では、本開示は、（ｉ）部位特異的標的化部分および（ｉｉ）部位特異的標的化部分が融合分子を標的アンカー配列に標的化するが、少なくとも１つの非標的アンカー配列には標的化しない、エピジェネティック改変剤を含む融合分子を提供する。
【００１９】
一部の実施形態では、本開示は、アンカー配列を含む標的核酸と相補的な標的化ドメインを含む部位特異的ガイドＲＮＡを提供する。
【００２０】
一部の実施形態では、本開示は、（ｉ）酵素的に不活性なＣａｓポリペプチドと、エピジェネティック改変剤とを含む融合ポリペプチド、または前記融合ポリペプチドをコードする核酸；および（ｉｉ）前記融合ポリペプチドを、標的アンカー配列に標的化するが、少なくとも１つの非標的アンカー配列には標的化しないガイドＲＮＡを含む組成物を提供する。
【００２１】
一部の実施形態では、本開示は、第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、前記第１および／または第２のアンカー配列と、本明細書中に開示の融合分子または組成物とを接触させるステップを含む、方法を提供する。
【００２２】
一部の実施形態では、本開示は、第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の第１のアンカー配列の１０ｋｂ以内の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、前記第１および／または第２のアンカー配列と、本明細書中に開示の融合分子または組成物とを接触させるステップを含む、方法を提供する。
【００２３】
一部の実施形態では、本開示は、第１のアンカー配列、第２のアンカー配列、および内部エンハンシング配列を含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現を減少させる方法であって、前記第１および／または第２のアンカー配列と、本明細書中に開示の融合分子または組成物とを接触させるステップを含む、方法を提供する。
【００２４】
一部の実施形態では、本開示は、第１のアンカー配列と第２のアンカー配列とを含むアンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記第１および／または前記第２のアンカー配列が外部エンハンシング配列の１０ｋｂ以内に位置し、前記方法が、前記第１および／または第２のアンカー配列と、本明細書中に開示の融合分子または組成物とを接触させるステップを含む、方法を提供する。
【００２５】
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）本明細書に開示される融合分子または組成物を哺乳動物細胞に送達するステップを含む方法を提供する。
【００２６】
一部の実施形態では、本開示は、操作された部位特異的核形成剤であって、それが細胞内の内因性核形成ポリペプチドの結合と競合する十分な親和性で、前記細胞内の１つまたは複数の標的配列に特異的に結合し、前記細胞内の非標的配列には結合しない、操作されたＤＮＡ結合部分；および前記操作されたＤＮＡ結合部分に付随する核形成ポリペプチド二量体化ドメインを含み、前記操作されたＤＮＡ結合部分が前記少なくとも１つの標的配列で結合する場合、核形成ポリペプチド二量体化ドメインがそこに局在し、それぞれの少なくとも１つの標的配列が標的アンカー配列であり、前記核形成ポリペプチド二量体化ドメインが前記標的アンカー配列に局在する場合、前記核形成ポリペプチド二量体化ドメインと核形成ポリペプチドとの相互作用がアンカー配列媒介接続を生成するように、前記少なくとも１つまたは複数の標的アンカー配列が、前記核形成ポリペプチドが結合するアンカー配列に対して配置されている、操作された部位特異的核形成剤を提供する。
【００２７】
一態様では、本開示は、アンカー配列媒介接続のアンカー配列に結合し、アンカー配列媒介接続の形成を変化させる組成物であって、ヒト細胞中で、アンカー配列媒介接続に付随する標的遺伝子の転写をモジュレートする組成物を含む医薬調製物を含む。
【００２８】
一態様では、本開示は、アンカー配列媒介接続のアンカー配列に結合し、アンカー配列媒介接続の形成を変化させる（例えば、アンカー配列の、接続核形成分子への親和性を、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれよりも大きく変化させる）標的化部分を含む組成物を含む。
【００２９】
一態様では、本開示は、アンカー配列媒介接続のアンカー配列に結合し、アンカー配列媒介接続の形成を変化させる標的化部分を含む組成物であって、例えば、ヒト細胞中で、アンカー配列媒介接続に付随する発現ユニット中の標的遺伝子の転写をモジュレートする組成物を含む医薬調製物を含む。
【００３０】
本明細書で説明される本開示の様々な態様において、本明細書に記載されている様々な実施形態の１つまたは複数を組み合わせてもよい。
【００３１】
一部の実施形態では、標的化部分は、（ｉ）化学物質、例えば、シトシン（Ｃ）もしくはアデニン（Ａ）をモジュレートする化学物質（例えば、亜硫酸水素Ｎａ、亜硫酸水素アンモニウム）である；（ｉｉ）酵素活性（メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）、デアミナーゼ）を有する；または（ｉｉｉ）アンカー配列媒介接続の形成を立体的に障害するエフェクター部分を含む［例えば、膜透過移行ポリペプチド（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）＋ナノ粒子］。
【００３２】
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、１つまたは複数の転写制御配列に付随する。一実施形態では、１つまたは複数の転写制御配列は、アンカー配列媒介接続、例えば、１型アンカー配列媒介接続の内部にある。別の実施形態では、１つまたは複数の転写制御配列は、例えば、２型アンカー配列媒介接続を含むアンカー配列媒介接続の外部にある。別の実施形態では、１つまたは複数の転写制御配列は、例えば、エンハンシング配列の内部にあり、少なくとも部分的には、例えば、サイレンシング配列、アンカー配列媒介接続、例えば、３型アンカー配列媒介接続の外部にある。別の実施形態では、１つまたは複数の転写制御配列は、例えば、エンハンシング配列の内部にあり、少なくとも部分的には、例えば、エンハンシング配列、アンカー配列媒介接続、例えば、４型アンカー配列媒介接続の外部にある。
【００３３】
一部の実施形態では、組成物は、アンカー配列媒介接続の形成を破壊する（例えば、アンカー配列の、接続核形成分子への親和性を、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれよりも大きく低下させる）。一部の実施形態では、組成物は、アンカー配列媒介接続の形成を促進する（例えば、アンカー配列の、接続核形成分子への親和性を、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれよりも大きく増加させる）。一部の実施形態では、標的遺伝子は、アンカー配列媒介接続の内部にある。一部の実施形態では、標的遺伝子は、アンカー配列媒介接続の外部にある。一部の実施形態では、標的遺伝子は、アンカー配列媒介接続の内部および外部にある。一部の実施形態では、組成物は、アンカー配列媒介接続の形成を物理的に破壊する、例えば、組成物は、標的化とエフェクターの両方、例えば、膜透過移行ポリペプチドである。一部の実施形態では、組成物は、アンカー配列によって媒介される接続の形成をモジュレートするエフェクター部分に作動可能に連結した、アンカー配列に結合する標的化部分（例えば、ｇＲＮＡ、膜透過移行ポリペプチド）を含む。一部の実施形態では、エフェクター部分は、化学物質、例えば、シトシン（Ｃ）またはアデニン（Ａ）をモジュレートする化学物質（例えば、亜硫酸水素Ｎａ、亜硫酸水素アンモニウム）である。一部の実施形態では、エフェクター部分は、酵素活性（メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）、デアミナーゼ）を有する。一部の実施形態では、エフェクター部分は、アンカー配列媒介接続、例えば、膜透過移行ポリペプチドおよび／またはナノ粒子の形成を立体的に障害する。
【００３４】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている組成物または方法は、ＡＢＸｎＣ（式中、Ａは、核酸側鎖を有する、疎水性アミノ酸またはアミド含有骨格、例えば、アミノエチル−グリシンから選択され；ＢおよびＣは、同じか、または異なっていてもよく、それぞれ独立に、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リシン、およびそのアナログから選択され；Ｘは、それぞれ独立に、疎水性アミノ酸であるか、またはＸは、それぞれ独立に、核酸側鎖を有する、アミド含有骨格、例えば、アミノエチル−グリシンであり；ｎは、１〜４の整数である）の少なくとも１つの配列をそれぞれ含む少なくとも１つのポリペプチドであって、アンカー配列媒介接続内の核酸配列（例えば、アンカー配列媒介接続のアンカー配列、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフ、ＢＯＲＩＳ結合モチーフ、コヘシン結合モチーフ、ＵＳＦ１結合モチーフ、ＹＹ１結合モチーフ、ＴＡＴＡボックス、ＺＮＦ１４３結合モチーフなど）にハイブリダイズするポリペプチドをさらに含む。
【００３５】
上記態様の様々な実施形態に記載される組成物および方法を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【００３６】
一態様では、本開示は、アンカー配列を標的化することによって遺伝子の発現をモジュレートすることなどの、標的遺伝子または遺伝子の転写に影響するその付随する転写制御配列の外部にあるか、またはその一部ではない配列を標的化することを含む、アンカー配列媒介接続中の標的遺伝子の発現をモジュレートする方法を含む。
【００３７】
一態様では、本開示は、アンカー配列を標的化して、アンカー配列媒介接続の形成を変化させることなど、標的遺伝子または標的遺伝子の転写に影響するその付随する転写制御配列と非連続的である配列を標的化することを含む、標的遺伝子の転写をモジュレートする方法を含む。
【００３８】
一部の実施形態では、方法は、１つまたは複数の付随する遺伝子を含むアンカー配列媒介接続と、アンカー配列媒介接続内の１つまたは複数の転写制御配列とを含む。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、１つまたは複数の付随する遺伝子と、アンカー配列媒介接続の外部に存在する１つまたは複数の転写制御配列とを含む。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、１つまたは複数の付随する遺伝子と、少なくとも部分的に、アンカー配列媒介接続の内部および外部に存在する１つまたは複数の転写制御配列とを含む。例えば、１つまたは複数の抑制シグナルが、アンカー配列媒介接続の外部にあり、１つまたは複数のエンハンシング配列および標的遺伝子が、アンカー配列媒介接続の内部にあってもよい。別の例では、１つまたは複数のエンハンシング配列は、アンカー配列媒介接続の内部および外部に存在する。
【００３９】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、１つまたは複数のアンカー配列と非連続的である。遺伝子がアンカー配列と非連続的である一部の実施形態では、遺伝子は、約１００ｂｐ〜約５００Ｍｂ、約５００ｂｐ〜約２００Ｍｂ、約１ｋｂ〜約１００Ｍｂ、約２５ｋｂ〜約５０Ｍｂ、約５０ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１００ｋｂ〜約７５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、または約１７５ｋｂ〜約５００ｋｂだけアンカー配列から離れていてもよい。一部の実施形態では、遺伝子は、約１００ｂｐ、３００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、５５ｋｂ、６０ｋｂ、６５ｋｂ、７０ｋｂ、７５ｋｂ、８０ｋｂ、８５ｋｂ、９０ｋｂ、９５ｋｂ、１００ｋｂ、１２５ｋｂ、１５０ｋｂ、１７５ｋｂ、２００ｋｂ、２２５ｋｂ、２５０ｋｂ、２７５ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、１Ｍｂ、２Ｍｂ、３Ｍｂ、４Ｍｂ、５Ｍｂ、６Ｍｂ、７Ｍｂ、８Ｍｂ、９Ｍｂ、１０Ｍｂ、１５Ｍｂ、２０Ｍｂ、２５Ｍｂ、５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、またはその間の任意のサイズだけアンカー配列から離れている。
【００４０】
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、標的遺伝子を含み、１つまたは複数の転写制御配列、例えば、サイレンシング／抑制配列およびエンハンシング配列に付随する。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、１つまたは複数、例えば、２、３、４、５、またはそれよりも多くの遺伝子を含む。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、１つまたは複数、例えば、２、３、４、５、またはそれよりも多くの転写制御配列に付随する。
【００４１】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、１つまたは複数の転写制御配列と非連続的である。遺伝子が転写制御配列と非連続的である一部の実施形態では、遺伝子は、約１００ｂｐ〜約５００Ｍｂ、約５００ｂｐ〜約２００Ｍｂ、約１ｋｂ〜約１００Ｍｂ、約２５ｋｂ〜約５０Ｍｂ、約５０ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１００ｋｂ〜約７５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、または約１７５ｋｂ〜約５００ｋｂだけ転写制御配列から離れていてもよい。一部の実施形態では、遺伝子は、約１００ｂｐ、３００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、５５ｋｂ、６０ｋｂ、６５ｋｂ、７０ｋｂ、７５ｋｂ、８０ｋｂ、８５ｋｂ、９０ｋｂ、９５ｋｂ、１００ｋｂ、１２５ｋｂ、１５０ｋｂ、１７５ｋｂ、２００ｋｂ、２２５ｋｂ、２５０ｋｂ、２７５ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、１Ｍｂ、２Ｍｂ、３Ｍｂ、４Ｍｂ、５Ｍｂ、６Ｍｂ、７Ｍｂ、８Ｍｂ、９Ｍｂ、１０Ｍｂ、１５Ｍｂ、２０Ｍｂ、２５Ｍｂ、５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、またはその間の任意のサイズだけ転写制御配列から離れている。
【００４２】
一態様では、本開示は、（ａ）標的化部分と、（ｂ）例えば、アンカー配列を含むＤＮＡ配列とを含む医薬組成物を含む。
【００４３】
一態様では、本開示は、アンカー配列媒介接続のアンカー配列に結合し、アンカー配列媒介接続の形成を変化させる（例えば、アンカー配列の、接続核形成分子への親和性を、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれよりも大きく変化させる）標的化部分を含む組成物を含む。
【００４４】
一態様では、本開示は、ＤＮＡに対して作用するドメイン、例えば、酵素ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン、例えば、Ｃａｓ９ドメイン、例えば、ｄＣａｓ９ドメイン；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、デアミナーゼ）を含むタンパク質を、タンパク質を標的アンカー配列媒介接続のアンカー配列に標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドとの組合せで含み、組成物は、ヒト細胞中で、標的アンカー配列媒介接続を変化させるのに有効である。
【００４５】
一部の実施形態では、酵素ドメインは、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９である。一部の実施形態では、タンパク質は、２つの酵素ドメイン、例えば、ｄＣａｓ９およびメチラーゼまたはデメチラーゼドメインを含む。
【００４６】
上記態様の様々な実施形態に記載される組成物を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【００４７】
一態様では、本開示は、標的化された変更を、アンカー配列媒介接続に導入して、核酸配列の転写をモジュレートするための組成物であって、アンカー配列に結合する標的化部分を含む組成物を含む。
【００４８】
一部の実施形態では、標的化部分は、酵素、例えば、Ｃａｓ９などの配列標的化ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、標的化部分は、配列標的化ポリペプチドと、接続核形成分子との融合物、例えば、ｄＣａｓ９と、接続核形成分子との融合物を含む。一部のさらなる実施形態では、標的化部分は、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸をさらに含む。一部のさらなる実施形態では、標的化部分は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ｄＣａｓ９、組換え、トランスポゾンなどを介して、置換、付加または欠失のためにアンカー配列媒介接続内のアンカー配列の１つまたは複数のヌクレオチドを標的にする。一部の実施形態では、標的化部分は、アンカー配列媒介接続内の１つまたは複数のＤＮＡメチル化部位を標的にする。一部のさらなる実施形態では、標的化部分は、下記：少なくとも１つの外因性アンカー配列；接続核形成分子に対する結合親和性を変化させることなどによる、少なくとも１つの接続核形成分子結合部位における変更；ＣＴＣＦ結合モチーフ、ＹＹ１結合モチーフ、ＺＮＦ１４３結合モチーフ、または本明細書に記載の他の結合モチーフなどの、少なくとも１つの共通ヌクレオチド配列の向きの変化；およびＣＴＣＦ結合モチーフ、ＹＹ１結合モチーフ、ＺＮＦ１４３結合モチーフ、または本明細書に記載の他の結合モチーフなどの、少なくとも１つのアンカー配列における置換、付加または欠失のうちの少なくとも１つを導入する。
【００４９】
ある特定の実施形態では、組成物は、クロマチン構造を改変する。
【００５０】
一部の実施形態では、組成物は、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターなどの標的化部分を含むベクターを含む。
【００５１】
ある特定の実施形態では、標的化された変更は、アンカー配列媒介接続内のアンカー配列、選択的スプライシング部位、および非翻訳ＲＮＡのための結合部位に対する結合親和性などの、接続核形成分子のための結合部位の少なくとも１つを変化させる。
【００５２】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている組成物を含む医薬組成物を含む。
【００５３】
上記態様の様々な実施形態に記載される組成物を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【００５４】
一態様では、本開示は、標的アンカー配列媒介接続内のアンカー配列に対する選択された結合親和性を有する合成接続核形成分子を含む組成物を含む。
【００５５】
一部の実施形態では、結合親和性は、標的アンカー配列に付随する内因性接続核形成分子の親和性よりも少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれを超えて高いか、または低くてもよい。一部の実施形態では、合成接続核形成分子は、内因性接続核形成分子に対する約３０〜９０％、約３０〜８５％、約３０〜８０％、約３０〜７０％、約５０〜８０％、約５０〜９０％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００５６】
一部の実施形態では、接続核形成分子は、競合的結合などを介して、内因性接続核形成分子の、その結合部位への結合を破壊する。一部のさらなる実施形態では、接続核形成分子は、標的配列に結合するように操作される。
【００５７】
一部の実施形態では、組成物は、ポリマー担体または標的化部分、例えば、リポソーム、ペプチド、アプタマー、またはその組合せなどの担体をさらに含む。
【００５８】
ある特定の実施形態では、本開示は、選択された結合親和性を有する接続核形成分子を調製する方法を含む。
【００５９】
上記態様の様々な実施形態に記載される組成物を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【００６０】
一態様では、本開示は、特異的アンカー配列媒介接続に結合して、アンカー配列媒介接続のトポロジーを変化させる標的化部分を含む組成物を含む。
【００６１】
一部の実施形態では、標的化部分は、核酸配列、タンパク質、タンパク質融合物、または膜透過移行ポリペプチドである。一部の実施形態では、核酸配列は、ｇＲＮＡ、およびアンカー配列に対して相補的な配列またはそれに対する少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相補配列を含む配列からなる群から選択される。一部の実施形態では、核酸配列は、接続核形成分子またはコンセンサス配列のための結合モチーフに対して相補的な配列またはそれに対する少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相補配列を含む配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、接続核形成分子、例えば、ＣＴＣＦ、コヘシン、ＵＳＦ１、ＹＹ１、ＴＡＦ３、ＺＮＦ１４３、または別のポリペプチド、ドミナントネガティブ接続核形成分子、ＤＮＡ結合配列を含むタンパク質、例えば、転写因子、配列標的化ポリペプチドと接続核形成分子との融合物である。一部の実施形態では、膜透過移行ポリペプチドは、ＡＢＸｎＣ（式中、Ａは、核酸側鎖を有する、疎水性アミノ酸またはアミド含有骨格、例えば、アミノエチル−グリシンから選択され；ＢおよびＣは、同じか、または異なっていてもよく、独立に、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リシン、およびそのアナログから選択され；Ｘは、それぞれ独立に、疎水性アミノ酸であるか、またはＸは、それぞれ独立に、核酸側鎖を有する、アミド含有骨格、例えば、アミノエチル−グリシンであり；ｎは、１〜４の整数である）の少なくとも１つの配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、エピジェネティック酵素（ＤＮＡメチラーゼ（例えば、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＤＮＭＴＬ）、ＤＮＡデメチラーゼ（例えば、ＴＥＴファミリー）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３）、サーチュイン１、２、３、４、５、６、または７、リシン特異的ヒストンデメチラーゼ１（ＬＳＤ１）、ヒストン−リシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（Ｓｅｔｄｂ１）、真正染色質ヒストン−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９ａ）、ヒストン−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＳＵＶ３９Ｈ１）、ｚｅｓｔｅ相同体２のエンハンサー（ＥＺＨ２）、ウイルスリシンメチルトランスフェラーゼ（ｖＳＥＴ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＳＥＴ２）、およびタンパク質−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＳＭＹＤ２））、配列標的化ポリペプチドと接続核形成分子との融合物からなる群から選択される。
【００６２】
一部の実施形態では、標的化部分は、配列標的化ポリペプチド、例えば、Ｃａｓ９、配列標的化ポリペプチドの融合物、例えば、ｄＣａｓ９と接続核形成分子との融合物、または接続核形成分子を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、標的化された変更を、アンカー配列媒介接続に導入して、ヒト細胞中の、アンカー配列媒介接続中の遺伝子の転写をモジュレートする。
【００６３】
一部の実施形態では、標的化部分は、アンカー配列媒介接続のアンカー配列に結合し、標的化部分は、標的化された変更を、アンカー配列に導入して、ヒト細胞中の、アンカー配列媒介接続中の遺伝子の転写をモジュレートする。一部の実施形態では、標的化された変更は、例えば、アンカー配列中の１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加または欠失の少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、標的化された変更は、本明細書に記載されているものなどの、アンカー配列、例えば、接続核形成分子のための結合モチーフ中の１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加または欠失の少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、標的化された変更は、反対の向きの少なくとも１つの共通ヌクレオチド配列、例えば、接続核形成分子のための結合モチーフを含む。一部の実施形態では、標的化された変更は、アンカー配列媒介接続を形成または破壊する天然に存在しないアンカー配列を含む。
【００６４】
上記態様の様々な実施形態に記載の組成物を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【００６５】
一態様では、本開示は、Ｃａｓまたは改変されたＣａｓタンパク質ドメインを含む第１のポリペプチドと、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を有する［または脱メチル化もしくはデアミナーゼ活性を伴う］ポリペプチドを含む第２のポリペプチドとを含むタンパク質を、標的アンカー配列媒介接続のアンカー配列に標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドとの組合せで含む組成物であって、そのシステムが、ヒト細胞中の、標的アンカー配列媒介接続を変化させるのに有効である、組成物を含む。
【００６６】
一部の実施形態では、組成物は、ヒト細胞中の、標的アンカー配列媒介接続を変化させるのに有効である。
【００６７】
上記態様の様々な実施形態に記載の組成物を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【００６８】
一態様では、本開示は、Ｃａｓタンパク質と、Ｃａｓタンパク質を標的アンカー配列媒介接続のアンカー配列に標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む医薬組成物であって、Ｃａｓタンパク質が、標的アンカー配列に付随するアンカー配列媒介接続の形成を減少させる標的アンカー配列の突然変異を引き起こすのに有効である、医薬組成物を含む。
【００６９】
一態様では、本開示は、複数のアンカー配列、遺伝子配列、および転写制御配列を含む合成核酸を含む。
【００７０】
一部の実施形態では、遺伝子配列と、転写制御配列とは、複数のアンカー配列の間にある。一部の実施形態では、核酸は、順番に、（ａ）アンカー配列、遺伝子配列、転写制御配列、およびアンカー配列、または（ｂ）アンカー配列、転写制御配列、遺伝子配列、およびアンカー配列を含む。
【００７１】
一部の実施形態では、配列は、リンカー配列によって隔てられている。一部の実施形態では、アンカー配列は、７〜１００ｎｔ、１０〜１００ｎｔ、１０〜８０ｎｔ、１０〜７０ｎｔ、１０〜６０ｎｔ、１０〜５０ｎｔ、または２０〜８０ｎｔである。一部の実施形態では、核酸は、３，０００〜５０，０００ｂｐ、３，０００〜４０，０００ｂｐ、３，０００〜３０，０００ｂｐ、３，０００〜２０，０００ｂｐ、３，０００〜１５，０００ｂｐ、３，０００〜１２，０００ｂｐ、３，０００〜１０，０００ｂｐ、３，０００〜８，０００ｂｐ、５，０００〜３０，０００ｂｐ、５，０００〜２０，０００ｂｐ、５，０００〜１５，０００ｂｐ、５，０００〜１２，０００ｂｐ、５，０００〜１０，０００ｂｐまたはその間の任意の範囲である。
【００７２】
一部の実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されている核酸を含む。
【００７３】
一部の実施形態では、細胞は、本明細書に記載されている核酸を含む。
【００７４】
一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されている核酸を含む。
【００７５】
一部の実施形態では、組成物を投与することにより遺伝子の発現をモジュレートする方法は、本明細書に記載されている核酸を含む。
【００７６】
上記態様の様々な実施形態に記載の核酸を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【００７７】
一態様では、本開示は、（ａ）Ｃａｓまたは改変されたＣａｓタンパク質を含む第１のポリペプチドドメインと、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を有する［または脱メチル化もしくはデアミナーゼ活性を伴う］ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含むタンパク質をコードする核酸；および（ｂ）標的細胞中で、タンパク質を、標的アンカー配列媒介接続のアンカー配列に標的化するための少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むキットを含む。
【００７８】
一部の実施形態では、（ａ）および（ｂ）は、同じベクター、例えば、プラスミド、ＡＡＶベクター、ＡＡＶ９ベクター中に提供される。一部の実施形態では、（ａ）および（ｂ）は、別々のベクター中に提供される。
【００７９】
上記態様の様々な実施形態に記載のキットを、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【００８０】
一態様では、本開示は、選択された結合親和性を有する接続核形成分子を調製する方法を含む。
【００８１】
一態様では、本開示は、（別々に、または同じ医薬組成物中で）（ｉ）Ｃａｓもしくは改変されたＣａｓタンパク質を含む第１のポリペプチドドメインと、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を有する［または脱メチル化もしくはデアミナーゼ活性を伴う］ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含むタンパク質または（ｉｉ）Ｃａｓもしくは改変されたＣａｓタンパク質を含む第１のポリペプチドドメインと、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性における役割を有する［または脱メチル化もしくはデアミナーゼ活性を伴う］ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含むタンパク質、およびアンカー配列媒介接続のアンカー配列を標的にする少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸を対象に投与することを含む、哺乳動物対象における（遺伝子発現を変化させる／アンカー配列媒介接続を変化させる）方法を含む。
【００８２】
一部の実施形態では、アンカー配列は、配列番号１または配列番号２などの、ＣＴＣＦ結合モチーフであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、アンカー配列は、標的疾患遺伝子に付随するＣＴＣＦ結合モチーフであるか、またはそれを含む。
【００８３】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ｄＣａｓ９である；ｄＣａｓ９は、ヒトコドン最適化される。一部の実施形態では、メチルトランスフェラーゼは、ＤＮＭＴファミリーのメチルトランスフェラーゼである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＴＥＴファミリーの酵素である。一部の実施形態では、タンパク質は、第１および第２のポリペプチドの間にリンカーを有する。
【００８４】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、異なる疾患のためのｇＲＮＡから選択される。
【００８５】
上記態様の様々な実施形態に記載の方法を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【００８６】
一態様では、本開示は、アンカー配列媒介接続のトポロジーを変化させて、核酸配列の転写をモジュレートすることを含む、２次元構造などのクロマチン構造を改変する方法を含む。ループなどの、アンカー配列媒介接続のトポロジーの変化は、核酸配列の転写をモジュレートする。
【００８７】
別の態様では、本開示は、複数のアンカー配列媒介接続のトポロジーを変化させて、核酸配列の転写をモジュレートすることを含む、２次元構造などのクロマチン構造を改変する方法を含む。複数のループなどの、複数のアンカー配列媒介接続のトポロジーの変化は、核酸配列の転写をモジュレートする。
【００８８】
別の態様では、本開示は、核酸配列の転写に影響する、ループなどのアンカー配列媒介接続を変化させることを含む、核酸配列の転写をモジュレートする方法を含む。アンカー配列媒介接続は、核酸配列の転写をモジュレートする。
【００８９】
ある特定の実施形態では、アンカー配列媒介接続を変化させることは、クロマチン構造を改変する。例えば、アンカー配列媒介接続のアンカー配列内の１つまたは複数のヌクレオチドを置換する、付加する、または欠失させることによりクロマチン構造を改変することは、クロマチン構造を改変する。
【００９０】
上記態様または本明細書で説明される本開示の任意の他の態様の様々な実施形態においては、アンカー配列媒介接続内のアンカー配列の１つまたは複数のヌクレオチドを置換する、付加する、または欠失させることによって、トポロジーを変化させる。例えば、置換、付加または欠失される１つまたは複数のヌクレオチドは、接続核形成分子のための結合モチーフなどの、少なくとも１つのアンカー配列内にあってもよい。
【００９１】
一部の実施形態では、下記：アンカー配列媒介接続内の１つまたは複数の部位でＤＮＡメチル化をモジュレートすること；接続核形成分子のための結合モチーフなどの、少なくとも１つの共通ヌクレオチド配列の向きを変化させること；アンカー配列媒介接続内の空間的隔離を変化させること；アンカー配列媒介接続内の回転の自由エネルギーを変化させること；およびアンカー配列媒介接続内の位置の自由度を変化させることのうちの少なくとも１つによって、トポロジーを変化させる。
【００９２】
一部のさらなる実施形態では、下記：アンカー配列媒介接続を破壊すること、天然に存在しないアンカー配列媒介接続を形成させること、複数の天然に存在しないアンカー配列媒介接続を形成させること、および外因性アンカー配列を導入することのうちのいずれか１つまたは複数によって、トポロジーを変化させる。
【００９３】
ある特定の実施形態では、トポロジーを変化させて、少なくとも約１時間〜約３０日、または少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、もしくはそれより長い時間、またはその間の任意の時間にわたって持続するモジュレーションなどの、例えば、安定的な転写のモジュレーションをもたらす。
【００９４】
ある特定の実施形態では、トポロジーを変化させて、約３０分〜約７日以下、または約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日、５日、６日、７日以下、またはその間の任意の時間にわたって持続するモジュレーションなどの、例えば、一過的な転写のモジュレーションをもたらす。
【００９５】
一部の実施形態では、方法は、アンカー配列媒介接続と相互作用する、アンカー配列媒介接続内のアンカー配列に対する結合親和性などの、接続核形成分子をモジュレートすることをさらに含む。
【００９６】
ある特定の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、少なくとも第１のアンカー配列と、第２のアンカー配列とを含む。一実施形態では、アンカー配列媒介接続は、第１のアンカー配列に結合した第１の接続核形成分子、第２のアンカー配列に結合した第２の接続核形成分子、および第１と第２の接続核形成分子の間の会合によって媒介される。別の実施形態では、第１または第２の接続核形成分子は、変更の非存在下でのアンカー配列に対する結合親和性などの、参照値よりも高い、または低いアンカー配列に対する結合親和性を有する。
【００９７】
一部の実施形態では、第２のアンカー配列は、第１のアンカー配列と非連続的である。一実施形態では、アンカー配列媒介接続は、第１のアンカー配列に結合した第１の接続核形成分子、非連続的な第２のアンカー配列に結合した第２の接続核形成分子、および第１と第２の接続核形成分子の間の会合によって媒介される。別の実施形態では、第１または第２の接続核形成分子は、変更の非存在下でのアンカー配列に対する結合親和性などの、参照値よりも高い、または低いアンカー配列に対する結合親和性を有する。
【００９８】
アンカー配列が互いに非連続的である一部の実施形態では、第１のアンカー配列は、約５００ｂｐ〜約５００Ｍｂ、約７５０ｂｐ〜約２００Ｍｂ、約１ｋｂ〜約１００Ｍｂ、約２５ｋｂ〜約５０Ｍｂ、約５０ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１００ｋｂ〜約７５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、または約１７５ｋｂ〜約５００ｋｂだけ第２のアンカー配列から離れている。一部の実施形態では、第１のアンカー配列は、約５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、５５ｋｂ、６０ｋｂ、６５ｋｂ、７０ｋｂ、７５ｋｂ、８０ｋｂ、８５ｋｂ、９０ｋｂ、９５ｋｂ、１００ｋｂ、１２５ｋｂ、１５０ｋｂ、１７５ｋｂ、２００ｋｂ、２２５ｋｂ、２５０ｋｂ、２７５ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、１Ｍｂ、２Ｍｂ、３Ｍｂ、４Ｍｂ、５Ｍｂ、６Ｍｂ、７Ｍｂ、８Ｍｂ、９Ｍｂ、１０Ｍｂ、１５Ｍｂ、２０Ｍｂ、２５Ｍｂ、５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、またはその間の任意のサイズだけ第２のアンカー配列から離れている。
【００９９】
ある特定の実施形態では、第１のアンカー配列および第２のアンカー配列はそれぞれ、本明細書に記載されているものなどの、接続核形成分子のための結合モチーフなどの、共通ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のアンカー配列および第２のアンカー配列は異なる配列を含む、例えば、第１のアンカー配列は接続核形成分子のための結合モチーフを含み、第２のアンカー配列は別の分子、例えば、別の接続核形成分子のための結合モチーフを含む。
【０１００】
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、複数のアンカー配列を含む。一実施形態では、アンカー配列の少なくとも１つは、ＣＴＣＦ結合モチーフを含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、染色体内ループなどのループを含む。一実施形態では、ループは、第１のアンカー配列、核酸配列、エンハンシング配列またはサイレンシング配列などの転写制御配列、および第２のアンカー配列を含む。別の実施形態では、ループは、順番に、第１のアンカー配列、転写制御配列、および第２のアンカー配列；または第１のアンカー配列、核酸配列、および第２のアンカー配列を含む。さらに別の実施形態では、核酸配列と転写制御配列のいずれか一方または両方は、ループの内部または外部に位置する。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、複数のループを有する。一実施形態では、アンカー配列媒介接続は、複数のループを含み、アンカー配列媒介接続は、ループの１つまたは複数中にアンカー配列、核酸配列、および転写制御配列の少なくとも１つを含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、標的核酸配列の転写などの核酸配列の転写は、参照値、例えば、アンカー配列媒介接続の変化の非存在下での標的配列の転写と比較してモジュレートされる。
【０１０４】
一部の実施形態では、転写は、活性化ループの含有によって活性化される。一実施形態では、アンカー配列媒介接続は、核酸配列の転写を増加させるエンハンシング配列などの転写制御配列を含む。一部のさらなる実施形態では、転写は、抑制ループの排除によって活性化される。一実施形態では、アンカー配列媒介接続は、核酸配列の転写を減少させるサイレンシング配列などの転写制御配列を排除する。
【０１０５】
一部の実施形態では、転写は、抑制ループの含有によって抑制される。一実施形態では、アンカー配列媒介接続は、核酸配列の転写を減少させるサイレンシング配列などの転写制御配列を含む。一部のさらなる実施形態では、転写は、活性化ループの排除によって抑制される。一実施形態では、アンカー配列媒介接続は、核酸配列の転写を増加させるエンハンシング配列などの転写制御配列を排除する。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、アンカー配列媒介接続を、対象、例えば、ヒト対象などのｉｎ  ｖｉｖｏで変化させる。一部の実施形態では、本明細書で説明される方法は、外因性接続核形成分子、接続核形成分子をコードする核酸、および配列標的化ポリペプチドと接続核形成分子との融合物のうちの少なくとも１つから選択される標的化部分を対象に投与することをさらに含む。一実施形態では、接続核形成分子は、競合的結合などを介して、内因性接続核形成分子の、その結合部位への結合を破壊する。別の実施形態では、標的化部分は、酵素、例えば、Ｃａｓ９などの配列標的化ポリペプチドを含む。さらに別の実施形態では、標的化部分は、接続核形成分子をさらに含む。さらに別の実施形態では、標的化部分は、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸をさらに含む。
【０１０７】
一部の実施形態では、投与は、標的化部分、例えば、接続核形成分子をコードする核酸を含むウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターなどのベクターを投与することを含む。一部のさらなる実施形態では、投与は、ポリマー担体、例えば、リポソーム中で製剤化されたような製剤を投与することを含む。
【０１０８】
一態様では、本開示は、アンカー配列媒介接続中に標的化された変更を含む操作された細胞を含む。
【０１０９】
別の態様では、本開示は、標的化された変更を有するアンカー配列媒介接続を含む操作された核酸配列を含む。
【０１１０】
上記態様または本明細書で説明される本開示の任意の他の態様の様々な実施形態では、標的化された変更は、下記：アンカー配列媒介接続内のアンカー配列の１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加または欠失；少なくとも１つのアンカー配列、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフ中の１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加または欠失；アンカー配列媒介接続内の１つまたは複数のＤＮＡメチル化部位の変更；および少なくとも１つの外因性アンカー配列のうちのいずれか１つまたは複数を含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、標的化された変更は、接続核形成分子に対するその結合親和性の変化などの、少なくとも１つの接続核形成分子結合部位を変化させる。一部のさらなる実施形態では、標的化された変更は、少なくとも１つの共通ヌクレオチド配列、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフの向きを変化させる；アンカー配列媒介接続を破壊する；および天然に存在しないアンカー配列媒介接続を形成させる。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、少なくとも第１のアンカー配列および第２のアンカー配列を含む。一実施形態では、アンカー配列媒介接続は、第１のアンカー配列に結合した第１の接続核形成分子、第２のアンカー配列に結合した第２の接続核形成分子、および第１と第２の接続核形成分子の間の会合によって媒介される。別の実施形態では、第１または第２の接続核形成分子は、変更の非存在下でのアンカー配列に対する結合親和性などの、参照値よりも高い、または低いアンカー配列に対する結合親和性を有する。
【０１１３】
一部の実施形態では、第２のアンカー配列は、第１のアンカー配列と非連続的である。一実施形態では、アンカー配列媒介接続は、第１のアンカー配列に結合した第１の接続核形成分子、非連続的な第２のアンカー配列に結合した第２の接続核形成分子、および第１と第２の接続核形成分子の間の会合によって媒介される。別の実施形態では、第１または第２の接続核形成分子は、変更の非存在下でのアンカー配列に対する結合親和性などの、参照値よりも高い、または低いアンカー配列に対する結合親和性を有する。
【０１１４】
アンカー配列が互いに非連続的である一部の実施形態では、第１のアンカー配列は、約５００ｂｐ〜約５００Ｍｂ、約７５０ｂｐ〜約２００Ｍｂ、約１ｋｂ〜約１００Ｍｂ、約２５ｋｂ〜約５０Ｍｂ、約５０ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１００ｋｂ〜約７５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、または約１７５ｋｂ〜約５００ｋｂだけ第２のアンカー配列から離れている。一部の実施形態では、第１のアンカー配列は、約５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、５５ｋｂ、６０ｋｂ、６５ｋｂ、７０ｋｂ、７５ｋｂ、８０ｋｂ、８５ｋｂ、９０ｋｂ、９５ｋｂ、１００ｋｂ、１２５ｋｂ、１５０ｋｂ、１７５ｋｂ、２００ｋｂ、２２５ｋｂ、２５０ｋｂ、２７５ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、１Ｍｂ、２Ｍｂ、３Ｍｂ、４Ｍｂ、５Ｍｂ、６Ｍｂ、７Ｍｂ、８Ｍｂ、９Ｍｂ、１０Ｍｂ、１５Ｍｂ、２０Ｍｂ、２５Ｍｂ、５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、またはその間の任意のサイズだけ第２のアンカー配列から離れている。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、第１のアンカー配列および第２のアンカー配列はそれぞれ、ＣＴＣＦ結合モチーフなどの共通ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のアンカー配列および第２のアンカー配列は異なる配列を含む、例えば、第１のアンカー配列はＣＴＣＦ結合モチーフを含み、第２のアンカー配列はＣＴＣＦ結合モチーフ以外のアンカー配列を含む。
【０１１６】
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、複数のアンカー配列を含む。一実施形態では、アンカー配列の少なくとも１つは、ＣＴＣＦ結合モチーフを含む。
【０１１７】
一部のさらなる実施形態では、アンカー配列媒介接続は、染色体内ループなどのループを含む。一実施形態では、ループは、第１のアンカー配列、核酸配列、エンハンシング配列またはサイレンシング配列などの転写制御配列、および第２のアンカー配列を含む。別の実施形態では、ループは、順番に、第１のアンカー配列、転写制御配列、および第２のアンカー配列；または第１のアンカー配列、核酸配列、および第２のアンカー配列を含む。さらに別の実施形態では、核酸配列と転写制御配列のいずれか一方または両方は、ループの内部または外部に位置する。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、複数のループを有する。一実施形態では、アンカー配列媒介接続は、複数のループを含み、アンカー配列媒介接続は、ループの１つまたは複数中にアンカー配列、核酸配列、および転写制御配列の少なくとも１つを含む。
【０１１９】
一部の実施形態では、標的核酸配列の転写などの核酸配列の転写は、参照値、例えば、アンカー配列媒介接続の変化の非存在下での標的配列の転写と比較してモジュレートされる。
【０１２０】
一部の実施形態では、転写は、活性化ループの含有によって活性化される。一実施形態では、アンカー配列媒介接続は、核酸配列の転写を増加させるエンハンシング配列などの転写制御配列を含む。一部のさらなる実施形態では、転写は、抑制ループの排除によって活性化される。一実施形態では、アンカー配列媒介接続は、核酸配列の転写を減少させるサイレンシング配列などの転写制御配列を排除する。
【０１２１】
一部の実施形態では、転写は、抑制ループの含有によって抑制される。一実施形態では、アンカー配列媒介接続は、核酸配列の転写を減少させるサイレンシング配列などの転写制御配列を含む。一部のさらなる実施形態では、転写は、活性化ループの排除によって抑制される。一実施形態では、アンカー配列媒介接続は、核酸配列の転写を増加させるエンハンシング配列などの転写制御配列を排除する。
【０１２２】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている操作された細胞、または本明細書に記載されている操作された核酸配列を含む医薬組成物を含む。一部のさらなる実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている操作された細胞を含む複数の細胞を含む。一部のさらなる実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている操作された核酸配列を含むベクターを含む。
【０１２３】
一態様では、本開示は、外因性接続核形成分子、接続核形成分子をコードする核酸、および配列標的化ポリペプチドと接続核形成分子との融合物のうちの少なくとも１つから選択される標的化部分を対象に投与することを含む、疾患または状態を処置する方法を含む。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、接続核形成分子は、競合的結合などを介して、内因性接続核形成分子の、その結合部位への結合を破壊する。
【０１２５】
一部の実施形態では、標的化部分は、酵素、例えば、Ｃａｓ９などの配列標的化ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、標的化部分は、接続核形成分子をさらに含む。一部のさらなる実施形態では、標的化部分は、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸をさらに含む。一部のさらなる実施形態では、標的化部分は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ｄＣａｓ９、組換え、トランスポゾンなどを介して、置換、付加または欠失のためにアンカー配列媒介接続内のアンカー配列の１つまたは複数のヌクレオチドを標的にする。一部の実施形態では、標的化部分は、アンカー配列媒介接続内の１つまたは複数のＤＮＡメチル化部位を標的にする。一部のさらなる実施形態では、標的化部分は、下記：少なくとも１つの外因性アンカー配列；接続核形成分子に対する結合親和性を変化させることなどによる、少なくとも１つの接続核形成分子結合部位における変更；ＣＴＣＦ結合モチーフなどの、少なくとも１つの共通ヌクレオチド配列の向きの変化；およびＣＴＣＦ結合モチーフなどの、少なくとも１つのアンカー配列における置換、付加または欠失のうちの少なくとも１つを導入する。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、投与は、標的化部分、例えば、接続核形成分子をコードする核酸を含むベクター、例えば、ウイルスベクターを投与することを含む。一部のさらなる実施形態では、投与は、製剤、例えば、リポソームを投与することを含む。
【０１２７】
一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、トリヌクレオチドリピート（ハンチントン舞踏病、脆弱性Ｘ、全ての脊髄小脳失調、フリードライヒ運動失調症、筋強直性ジストロフィーなど）、常染色体優性状態、インプリンティング遺伝子の疾患（プラダーウィリ症候群、アンジェルマン症候群）、ハプロ不全の疾患、ドミナントネガティブ突然変異（重症先天性好中球減少症）、ウイルス疾患（ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶなど）、および環境誘導性転写−エピジェネティック変更（喫煙、母体の食事に由来する遺伝子発現に対する効果）からなる群から選択される。
【０１２８】
一態様では、本開示は、ＡＢＸｎＣ（式中、Ａは、核酸側鎖を有する、疎水性アミノ酸またはアミド含有骨格、例えば、アミノエチル−グリシンから選択され；ＢおよびＣは、同じか、または異なっていてもよく、それぞれ独立に、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リシン、およびそのアナログから選択され；Ｘは、それぞれ独立に、疎水性アミノ酸であるか、またはＸは、それぞれ独立に、核酸側鎖を有する、アミド含有骨格、例えば、アミノエチル−グリシンであり；ｎは、１〜４の整数である）の少なくとも１つの配列をそれぞれ含む、少なくとも１つのポリペプチド、例えば、膜透過移行ポリペプチドであって、アンカー配列媒介接続内の核酸配列（例えば、アンカー配列媒介接続のアンカー配列、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフ、ＢＯＲＩＳ結合モチーフ、コヘシン結合モチーフ、ＵＳＦ１結合モチーフ、ＹＹ１結合モチーフ、ＴＡＴＡボックス、ＺＮＦ１４３結合モチーフなど）にハイブリダイズすることができるポリペプチドを含む医薬組成物を含む。
【０１２９】
上記態様の様々な実施形態に記載された組成物を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されている１つまたは複数の実施形態の標的化部分は、膜透過移行ポリペプチド、例えば、本明細書に記載されているポリペプチドを含む。
【０１３０】
一部の実施形態では、疎水性アミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン（trytophan）、およびそのアナログから選択される。一部の実施形態では、Ｂは、アルギニンまたはグルタミンから選択される。一部の実施形態では、Ｃは、アルギニンである。一部の実施形態では、ｎは２である。
【０１３１】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、約５〜約５０アミノ酸単位長の範囲のサイズを有する。
【０１３２】
一部の実施形態では、組成物は、互いに連結された２つまたはそれよりも多くのポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、互いに連結される、例えば、一方のポリペプチド上のアミノ酸は、別のポリペプチド、分枝ポリペプチド上の１つもしくは複数のアミノ酸またはカルボキシもしくはアミノ末端と連結されるか、または新しいペプチド結合、線状ポリペプチドを介して連結される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に記載されているリンカーによって連結される。
【０１３３】
一部の実施形態では、核酸側鎖は、プリン側鎖、ピリミジン側鎖、および核酸アナログ側鎖からなる群から独立に選択される。一部の実施形態では、核酸側鎖は、核酸側鎖、例えば、ＰＮＡ、または核酸を含む異種部分にハイブリダイズする。
【０１３４】
一部の実施形態では、組成物は、膜透過移行ポリペプチドと、少なくとも１つの異種部分とを含む。一実施形態では、異種部分は、アンカー配列媒介接続と相互作用する接続核形成分子である。別の実施形態では、異種部分は、配列標的化ポリペプチド、例えば、Ｃａｓ９である。別の実施形態では、異種部分は、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸である。
【０１３５】
一部の実施形態では、異種部分は、低分子（例えば、薬物）、ペプチド（例えば、リガンド）、および核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ、改変されたＲＮＡ、ＲＮＡ）からなる群から選択される。別の実施形態では、異種部分は、生物活性をモジュレートすること、調節タンパク質に結合すること、酵素活性をモジュレートすること、基質結合をモジュレートすること、受容体活性化をモジュレートすること、タンパク質安定性／分解をモジュレートすること、および転写物安定性／分解をモジュレートすることからなる群から選択される少なくとも１つのエフェクター活性を有する。別の実施形態では、異種部分は、機能をモジュレートすること、分子（例えば、酵素、タンパク質または核酸）をモジュレートすること、および特定の位置に局在することからなる群から選択される少なくとも１つの標的化された機能を有する。別の実施形態では、異種部分は、タグまたは標識であり、例えば、切断性である。別の実施形態では、異種部分は、エピジェネティック改変剤、エピジェネティック酵素、二環性ペプチド、転写因子、ＤＮＡまたはタンパク質修飾酵素、ＤＮＡ挿入剤、排出ポンプ阻害剤、核受容体活性化因子または阻害剤、プロテアソーム阻害剤、酵素のための競合的阻害剤、タンパク質合成阻害剤、ヌクレアーゼ、タンパク質断片またはドメイン、タグまたはマーカー、抗原、抗体または抗体断片、リガンドまたは受容体、天然の生物活性ペプチドに由来する合成またはアナログペプチド、抗微生物ペプチド、孔形成ペプチド、標的化または細胞傷害性ペプチド、分解または自己破壊ペプチド、ＣＲＩＳＰＲ系またはその成分、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸、ナノ粒子、オリゴヌクレオチドアプタマー、ペプチドアプタマー、および薬物動態または薬力学（ＰＫ／ＰＤ）が低い薬剤からなる群から選択される。
【０１３６】
一部の実施形態では、組成物は、例えば、リンカーを介して、または直接的に、アミノ末端、カルボキシ末端、全ての末端、ポリペプチドの一部のカルボキシ末端と一部のアミノ末端の組合せ、ポリペプチドの１つもしくは複数のアミノ酸、またはそのいずれかの組合せの上で、ポリペプチドに連結された２つまたはそれよりも多くの異種部分をさらに含む。一部の実施形態では、異種部分は、例えば、リンカーを介して、または直接的に、アミノ末端、カルボキシ末端、両方の末端、またはポリペプチドの１つもしくは複数のアミノ酸上で、ポリペプチドの１つに連結される。
【０１３７】
一部の実施形態では、組成物は、例えば、ポリペプチドの間またはポリペプチドと異種部分との間にリンカーをさらに含む。リンカーは、化学結合、例えば、１つまたは複数の共有結合または非共有結合であってもよい。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカー（例えば、非ＡＢＸｎＣポリペプチド）である。そのようなリンカーは、２〜３０アミノ酸、またはそれより長いものであってもよい。リンカーは、本明細書に記載されている可撓性、剛性または切断性リンカーを含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、組成物は、アンカー配列媒介接続内の１つまたは複数の部位でＤＮＡメチル化をモジュレートする。
【０１３９】
一部の実施形態では、組成物は、転写を一過的にモジュレートする、例えば、約３０分〜約７日以下、または約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日、５日、６日、７日以下、またはその間の任意の時間にわたって持続するモジュレーションをもたらす。
【０１４０】
一部の実施形態では、組成物は、転写を安定的にモジュレートする、例えば、少なくとも約１時間〜約３０日、または少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、もしくはそれより長い時間、またはその間の任意の時間にわたって持続するモジュレーションをもたらす。
【０１４１】
一部の実施形態では、組成物は、接続核形成分子、例えば、アンカー配列媒介接続と相互作用する、アンカー配列媒介接続内のアンカー配列に対する結合親和性をモジュレートする。
【０１４２】
一部の実施形態では、組成物は、例えば、競合的結合によって、内因性接続核形成分子の、その結合部位への結合を破壊する。
【０１４３】
一態様では、本開示は、変更が標的遺伝子の転写をモジュレートする、標的遺伝子に付随するアンカー配列媒介接続を変化させることを含む、標的遺伝子の発現を改変する方法を含む。
【０１４４】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている組成物を細胞、組織または対象に投与することを含む、標的遺伝子の発現を改変する方法を含む。
【０１４５】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている組成物を投与して、核酸配列の転写をモジュレートするアンカー配列媒介接続、例えば、ループを変化させることを含み、アンカー配列媒介接続の変化が核酸配列の転写をモジュレートする、核酸配列の転写をモジュレートする方法を含む。
【０１４６】
上記態様の様々な実施形態に記載の方法を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【０１４７】
一部の実施形態では、組成物は、アンカー配列媒介接続内の１つまたは複数の部位でＤＮＡメチル化をモジュレートする。
【０１４８】
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続の変化は、転写の一過的モジュレーション、例えば、約３０分〜約７日以下、または約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日、５日、６日、７日以下、またはその間の任意の時間にわたって持続するモジュレーションをもたらす。
【０１４９】
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続の変化は、転写の安定的なモジュレーション、例えば、少なくとも約１時間〜約３０日、または少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、もしくはそれより長い時間、またはその間の任意の時間にわたって持続するモジュレーションをもたらす。
【０１５０】
一部の実施形態では、組成物は、接続核形成分子、例えば、アンカー配列媒介接続と相互作用する、アンカー配列媒介接続内のアンカー配列に対する結合親和性をモジュレートする。
【０１５１】
一部の実施形態では、組成物は、例えば、競合的結合によって、内因性接続核形成分子の、その結合部位への結合を破壊する。
【０１５２】
一部の実施形態では、異種部分は、配列標的化ポリペプチド、例えば、Ｃａｓ９である。一部の実施形態では、異種部分は、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸である。
【０１５３】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている組成物、例えば、ＣｐＧ結合を阻害する、内因性エフェクターである、外因性エフェクターである、またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストである異種部分を提供することを含む、遺伝子発現をモジュレートする方法を含む。
【０１５４】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている組成物を対象に投与することを含み、異種部分が治療剤であり、組成物が治療剤のみと比較して治療剤の細胞内送達を増加させる、治療剤を送達する方法を含む。
【０１５５】
上記態様の様々な実施形態に記載の方法を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【０１５６】
一部の実施形態では、組成物は、特定の細胞、または特定の組織に標的化される。例えば、組成物は、上皮、結合、筋肉、もしくは神経組織もしくは細胞、またはその組合せに標的化される。例えば、組成物は、特定の臓器系、例えば、心血管系（心臓、血管）；消化器系（食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸および肛門）；内分泌系（視床下部、下垂体、松果体または松果腺、甲状腺、副甲状腺、副腎）；排泄系（腎臓、尿管、膀胱）；リンパ系（リンパ、リンパ節、リンパ管、扁桃腺、アデノイド、胸腺、脾臓）；外皮系（皮膚、毛髪、爪）；筋肉系（例えば、骨格筋）；神経系（脳、脊髄、神経）；生殖器系（卵巣、子宮、乳腺、精巣、精管、精嚢、前立腺）；呼吸器系（咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜）；骨格系（骨、軟骨）、およびその組合せの細胞または組織に標的化される。一部の実施形態では、組成物は、血液脳関門、胎盤膜、または血液精巣関門を横断する。
【０１５７】
一部の実施形態では、組成物は、全身的に投与される。一部の実施形態では、投与は非非経口的であり、治療剤は非経口治療剤である。
【０１５８】
一部の実施形態では、組成物は、改善されたＰＫ／ＰＤ、例えば、治療剤のみと比較して標的化、吸収、または輸送の改善（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％またはそれよりも大きい改善）などの、薬物動態または薬力学の増大を示す。一部の実施形態では、組成物は、治療剤のみと比較して、非標的位置への拡散、オフターゲット活性、または毒性代謝の軽減（例えば、治療剤のみと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％またはそれよりも大きい軽減）などの、望ましくない効果の軽減を示す。一部の実施形態では、組成物は、治療剤のみと比較して、治療剤の有効性を増加させる、および／またはその毒性を低下させる（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％またはそれよりも大きく）。
【０１５９】
一態様では、本開示は、細胞と、本明細書に記載されている組成物とを接触させることを含み、異種部分が治療剤であり、組成物が治療剤のみと比較して治療剤の細胞内送達を増加させる、治療剤の細胞内送達の方法を含む。
【０１６０】
上記態様の様々な実施形態に記載の方法を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【０１６１】
一部の実施形態では、組成物は、治療剤のみと比較して示差的ＰＫ／ＰＤを有する。例えば、組成物は、治療剤のみと比較して、吸収または分布、代謝または排出の増加または減少（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％またはそれよりも大きい増加または減少）を示す。
【０１６２】
一部の実施形態では、組成物は、エンドサイトーシスを有意に増加させることなく、治療剤の細胞内送達を増加させるのに十分な用量、例えば、約５０％、４０％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、またはその間の任意のパーセンテージの用量で投与される。一部の実施形態では、組成物は、カルシウム流入を有意に増加させることなく、治療剤の細胞内送達を増加させるのに十分な用量、例えば、約５０％、４０％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、またはその間の任意のパーセンテージの用量で投与される。一部の実施形態では、組成物は、エンドソーム活性を有意に増加させることなく、治療剤の細胞内送達を増加させるのに十分な用量で、例えば、約５０％、４０％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、またはその間の任意のパーセンテージの用量で投与される。
【０１６３】
一態様では、本開示は、細胞と、本明細書に記載されている組成物とを接触させることを含み、組成物が遺伝子を標的とし、その転写をモジュレートする、細胞中の遺伝子の転写をモジュレートする方法を含む。
【０１６４】
上記態様の様々な実施形態に記載の方法を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【０１６５】
一部の実施形態では、組成物は、例えば、オフターゲット転写活性を有意に変化させることなく、異種部分のみと比較してオフターゲット転写活性が低下した治療剤の細胞内送達を行うのに十分な量で、かつ十分な時間にわたって投与される。
【０１６６】
一態様では、本開示は、細胞と、本明細書に記載されている組成物とを接触させることを含み、組成物が細胞を標的とし、膜タンパク質をモジュレートする、細胞上の、イオンチャネル、細胞表面受容体およびシナプス受容体などの膜タンパク質をモジュレートする方法を含む。
【０１６７】
一態様では、本開示は、細胞と、本明細書に記載されている組成物とを接触させることを含み、組成物が細胞を標的とし、アポトーシスを誘導する、細胞死を誘導する方法を含む。
【０１６８】
上記態様の様々な実施形態に記載の方法を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【０１６９】
一部の実施形態では、組成物は、ウイルスＤＮＡ配列または遺伝子中の突然変異を担持する細胞を標的にする。一実施形態では、細胞は、ウイルスに感染している。別の実施形態では、細胞は、遺伝的突然変異を担持する。一部の実施形態では、組成物は、壊死の初期段階にあり、例えば、壊死細胞マーカーに結合する、細胞を標的にする。
【０１７０】
一態様では、本開示は、治療剤が異種部分である、本明細書に記載されている組成物を投与することを含む、治療剤のバイオアベイラビリティを増大させる方法を含む。
【０１７１】
上記態様の様々な実施形態に記載の方法を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【０１７２】
一部の実施形態では、組成物は、治療剤のみと比較して、標的化、吸収、または輸送の改善などの、少なくとも１つのＰＫ／ＰＤパラメーターを改善する（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％またはそれよりも多く）。一部の実施形態では、組成物は、治療剤のみと比較して、非標的位置への拡散、オフターゲット活性、または毒性代謝の軽減などの、少なくとも１つの望ましくないパラメーターを減少させる（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％またはそれよりも大きく）。一部の実施形態では、組成物は、治療剤のみと比較して、治療剤の有効性を増加させる、および／またはその毒性を減少させる。
【０１７３】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている組成物を投与することを含む、急性または慢性感染を処置する方法を含む。
【０１７４】
上記態様の様々な実施形態に記載の方法を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【０１７５】
一部の実施形態では、組成物は、病原体を担持する感染した細胞を標的にする。一部の実施形態では、感染は、ウイルス、細菌、寄生虫、およびプリオンからなる群から選択される病原体によって引き起こされる。一部の実施形態では、組成物は、感染細胞における細胞死を誘導する、例えば、異種部分は、抗細菌性、抗ウイルス性、または抗寄生虫性治療剤である。
【０１７６】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている組成物を投与することを含む、がんを処置する方法を含む。
【０１７７】
上記態様の様々な実施形態に記載の方法を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【０１７８】
一部の実施形態では、異種部分は、１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現をモジュレートする治療剤である。
【０１７９】
一部の実施形態では、組成物は、遺伝子中に突然変異を担持するがん細胞を標的にする。一部の実施形態では、組成物は、がん細胞における細胞死を誘導し、例えば、異種部分は、化学療法剤である。
【０１８０】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている組成物を投与することを含む、神経疾患または障害を処置する方法を含む。
【０１８１】
上記態様の様々な実施形態に記載の方法を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【０１８２】
一部の実施形態では、組成物は、神経伝達物質、神経ペプチド、または神経受容体の神経受容体活性または活性化をモジュレートする。
【０１８３】
一部の実施形態では、神経疾患または障害は、ドラベ症候群である。
【０１８４】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている組成物を投与することを含み、組成物が転写をモジュレートして疾患／障害／状態を処置する、対象における疾患／障害／状態を処置する方法を含む。
【０１８５】
上記態様の様々な実施形態に記載の方法を、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【０１８６】
一部の実施形態では、疾患／障害／状態は、遺伝的疾患である。
【０１８７】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている組成物を提供することを含む、免疫寛容を誘導する方法を含み、例えば、異種部分は抗原である。
【０１８８】
一態様では、本開示は、ゲノムに、（ａ）標的化部分および（ｂ）アンカー配列を含むＤＮＡ配列を含む医薬組成物を投与することを含み、アンカー配列が、遺伝子発現因子（エンハンシング配列、サイレンシング／抑制配列）を標的遺伝子との作動可能な連結に持ち込む接続の形成を促進する、ゲノム中の標的遺伝子の発現を変化させる方法を含む。
【０１８９】
一態様では、本開示は、Ｃａｓまたは改変されたＣａｓタンパク質を含む第１のポリペプチドドメインと、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を有する［または脱メチル化もしくはデアミナーゼ活性を伴う］ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含むタンパク質を、タンパク質を標的アンカー配列媒介接続のアンカー配列に標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドとの組合せで含む薬学的使用のためのシステムであって、ヒト細胞中の、標的アンカー配列媒介接続を変化させるのに有効である、システムを含む。
【０１９０】
一態様では、本開示は、標的化部分に作動可能に連結した標的遺伝子に付随するアンカー配列と会合する標的化部分（例えば、ｇＲＮＡ、ＬＤＢ）、任意選択で、異種部分（例えば、酵素、例えば、ヌクレアーゼまたは脱活性化されたヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９）、メチラーゼ、デメチラーゼ、デアミナーゼ）を含む、ヒト細胞中での、標的遺伝子の発現を変化させるためのシステムであって、アンカー配列によって媒介される接続をモジュレートし、標的遺伝子の発現を変化させるのに有効であるシステムを含む。
【０１９１】
上記態様の様々な実施形態に記載のシステムを、本明細書で説明される任意の他の態様において利用することができる。
【０１９２】
一部の実施形態では、標的化部分とエフェクター部分が連結される。一部の実施形態では、システムは、標的化部分と異種部分とを含む合成ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、システムは、標的化部分および異種部分の少なくとも１つをコードする核酸ベクターまたは複数のベクターを含む。
【０１９３】
本明細書に記載されている態様を、本明細書で説明される実施形態のいずれか１つまたは複数と共に利用することができる。
【０１９４】
定義
本明細書で使用される場合、用語「アンカー配列」とは、アンカー配列媒介接続、例えば、ループを形成するために十分に結合する接続核形成剤（例えば、核形成タンパク質）によって認識される配列を指す。一部の実施形態では、アンカー配列は、１つまたは複数のＣＴＣＦ結合モチーフを含む。一部の実施形態では、アンカー配列は、遺伝子コード領域内に位置しない。一部の実施形態では、アンカー配列は、遺伝子間領域内に位置する。一部の実施形態では、アンカー配列は、エンハンサーまたはプロモーターのいずれかの中に位置しない。一部の実施形態では、アンカー配列は、任意の転写開始部位から少なくとも４００ｂｐ、少なくとも４５０ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも５５０ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも６５０ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも８５０ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも９５０ｂｐ、または少なくとも１ｋｂ離れて位置する。一部の実施形態では、アンカー配列は、ゲノムインプリンティング、単一対立遺伝子発現、および／または単一対立遺伝子エピジェネティックマークを伴わない領域内に位置する。本開示の一部の実施形態では、他のアンカー配列（例えば、異なる文脈で接続核形成剤（例えば、ＣＴＣＦ）結合モチーフを含有してもよい配列）を標的化することなく、特定の１つまたは複数のアンカー配列を特異的に標的化することができる技術が提供される；そのような標的化されたアンカー配列を、「標的アンカー配列」と呼ぶことができる。一部の実施形態では、標的アンカー配列の配列および／または活性はモジュレートされるが、標的化されたアンカー配列と同じ系（例えば、同じ細胞中、および／または一部の実施形態では、同じ核酸分子上、例えば、同じ染色体上）に存在してもよい１つまたは複数の他のアンカー配列の配列および／または活性はモジュレートされない。
【０１９５】
本明細書で使用される場合、語句「アンカー配列媒介接続」とは、アンカー配列間の空間的近接性および機能的連結を可能にするようにアンカー配列と結合する、核形成タンパク質などの１つもしくは複数のタンパク質、または１つもしくは複数のタンパク質および／もしくは核酸実体（ＲＮＡもしくはＤＮＡなど）によるＤＮＡ中の少なくとも２つのアンカー配列の物理的相互作用または結合により生じる、および／または維持されるＤＮＡ構造、一部の場合、ループを指す（図１を参照されたい）。
【０１９６】
本明細書で使用される場合、用語「に付随する」とは、アンカー配列媒介接続の形成または破壊が標的遺伝子の発現（例えば、転写）の変更を引き起こす場合、その遺伝子がアンカー配列媒介接続に付随することを指す。例えば、アンカー配列媒介接続の形成または破壊は、エンハンシングまたはサイレンシング／抑制配列を、その遺伝子に付随する、または付随しない状態にする。
【０１９７】
本明細書で使用される場合、語句「天然に存在しないアンカー配列媒介接続」とは、自然には存在しないアンカー配列媒介接続の形成を指す。天然に存在しないアンカー配列媒介接続の生成は、限定されるものではないが、１つまたは複数のアンカー配列の変更、付加または欠失、および１つまたは複数の接続核形成分子の変更によるものであってもよい。
【０１９８】
本明細書で使用される場合、用語「共通ヌクレオチド配列」とは、アンカー配列中の接続核形成分子結合部位を指す。共通ヌクレオチド配列の例としては、限定されるものではないが、ＣＴＣＦ結合モチーフ、ＵＳＦ１結合モチーフ、ＹＹ１結合モチーフ、ＴＡＦ３結合モチーフ、およびＺＮＦ１４３結合モチーフが挙げられる。
【０１９９】
本明細書で使用される場合、用語「接続核形成剤」とは、アンカー配列と直接的または間接的に会合し、１つまたは複数の接続核形成剤と相互作用して（アンカー配列または他の核酸と相互作用して）、互いに同一であってもよいか、または同一でなくてもよい、２つまたはそれよりも多くのそのような接続核形成剤を含む二量体（またはより高次の構造）を形成することができるタンパク質を指す。異なるアンカー配列と会合した接続核形成剤が互いに会合して、異なるアンカー配列が互いに物理的に近接した形で維持される場合、それによって生成される構造は、アンカー配列媒介接続である。すなわち、別の接続核形成分子−アンカー配列と相互作用する接続核形成分子−アンカー配列の密接な物理的近接性は、アンカー配列で始まり、終わるアンカー配列媒介接続（例えば、一部の場合では、ＤＮＡループ）を生成する（図２を参照されたい）。本明細書を読む当業者であればすぐに理解するように、「核形成ポリペプチド」、「核形成分子」、「接続核形成タンパク質」などの用語は、接続核形成剤を指すように使用され得ることもある。同様に、本明細書を読む当業者であればすぐに理解するように、２つまたはそれよりも多くの接続核形成剤の集合体（一部の実施形態では、同じ薬剤の複数のコピーを含んでもよい、および／または一部の実施形態では、複数の異なる薬剤のそれぞれの１つもしくは複数を含んでもよい）を、「複合体」、「二量体」、「多量体」などと呼ぶことができる。
【０２００】
用語「ループ」とは、アンカー配列媒介接続としての２つまたはそれよりも多くのアンカー配列の同時局在によって作出され得るクロマチン構造の型を指す。かくして、ループは、ＤＮＡ中の少なくとも２つのアンカー配列と、核形成タンパク質などの１つもしくは複数のタンパク質、またはアンカー配列に結合して、アンカー配列間の空間的近接性および機能的連結を可能にする１つもしくは複数のタンパク質および／もしくは核酸実体（ＲＮＡまたはＤＮＡなど）との相互作用の結果として形成される。本明細書を読む当業者であれば、そのような構造の２Ｄ表示を、例えば、図２に記載されるようなループとして提示することができることを理解するであろう。「活性化ループ」は、活発な遺伝子転写に対して開かれた構造、例えば、転写を増強する転写制御配列（エンハンシング配列）を含む構造である。「抑制ループ」は、活発な遺伝子転写に関して閉じている構造、例えば、転写を抑制する転写制御配列（サイレンシング配列）を含む構造である。
【０２０１】
本明細書で使用される場合、用語「配列標的化ポリペプチド」とは、標的配列を認識するか、またはそれに特異的に結合する、酵素、例えば、Ｃａｓ９などのタンパク質を指す。一部の実施形態では、配列標的化ポリペプチドは、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、ｄＣａｓ９などの触媒的に不活性なタンパク質である。
【０２０２】
本明細書で使用される場合、用語「対象」とは、生物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類、霊長類、実験動物、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、ネコ、またはイヌ）を指す。一部の実施形態では、ヒト対象は、成人、青年、または小児の対象である。一部の実施形態では、対象は、疾患または状態を有した。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害または状態、例えば、本明細書に提供されるように処置することができる疾患、障害または状態に罹患している。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態に罹患しやすい；一部の実施形態では、罹患しやすい対象は、疾患、障害または状態を発症する素因がある、および／または発症する高いリスク（参照の対象または集団において観察される平均リスクと比較した場合）を示す。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害または状態の１つまたは複数の症状を示す。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態の特定の症状（例えば、疾患の臨床徴候）または特徴を示さない。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態の任意の症状または特徴を示さない。一部の実施形態では、対象は、患者である。一部の実施形態では、対象は、診断および／または療法が投与される、および／または投与された個体である。
【０２０３】
本明細書で使用される場合、用語「標的化部分」または「標的化エレメント」とは、アンカー配列媒介接続の中にある、またはその周囲にある配列に特異的に結合する分子を指す。標的化部分の例としては、限定されるものではないが、酵素、例えば、Ｃａｓ９などの配列標的化ポリペプチド、配列標的化ポリペプチドと接続核形成分子との融合物、例えば、ｄＣａｓ９と接続核形成分子との融合物、またはＲＮＡ、ＤＮＡまたは改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡなどの、ガイドＲＮＡもしくは核酸が挙げられる。
【０２０４】
本明細書で使用される場合、用語「転写制御配列」とは、遺伝子の転写を増加させるか、または減少させる核酸配列を指す。「エンハンシング配列」は、遺伝子転写の可能性を増加させる。「サイレンシングまたは抑制配列」は、遺伝子転写の可能性を減少させる。エンハンサーおよびサイレンシング配列は、約５０〜３５００ｂｐの長さであり、最大で１Ｍｂ離れた遺伝子転写に影響し得る。
【０２０５】
本開示の実施形態の以下の詳細な記載は、付随図面と一緒に読むときにより良く理解される。本開示を図示する目的で、現在例示されている図面実施形態において示される。しかし、図面において示される実施形態の正確な構成および手段に本開示は限定されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】図１は、アンカー配列媒介接続を生成するための、１つの接続核形成分子−アンカー配列と別の接続核形成分子−アンカー配列との物理的相互作用または結合を表す図解である。
【図２】図２は、アンカー配列媒介接続、例えばループの標的化破壊および生成の方法を表す図解である。
【図３】図３は、天然に存在しないアンカー配列媒介接続の生成を通して遺伝子発現をモジュレートする一実施形態を表す図解である（ループ組入れ）。
【図４】図４は、遺伝子発現をモジュレートする方法を表す図解である。図の左側は、図１に示すのと同じ図解である。図の右側は、アンカー配列媒介接続の破壊である（ループ除外）。
【図５】図５は、新しいアンカー配列の組込みにより、天然に存在しないアンカー配列媒介接続の生成を通して遺伝子発現をモジュレートする別の実施形態を表す図解である。
【図６】図６は、アンカー配列媒介接続の型の一部を表す図解である。
【図７−１】図７は、ＭＹＣ発現レベルの下方制御につながる、ＭＹＣ遺伝子の上流のアンカー配列媒介接続の破壊を図示する。実施例１および２にさらに記載されるように、パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤはＭＹＣ発現の低減を図示し、パネルＥはｇＲＮＡ配列の地図を表す。
【図７−２】図７は、ＭＹＣ発現レベルの下方制御につながる、ＭＹＣ遺伝子の上流のアンカー配列媒介接続の破壊を図示する。実施例１および２にさらに記載されるように、パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤはＭＹＣ発現の低減を図示し、パネルＥはｇＲＮＡ配列の地図を表す。
【図８−１】図８は、ＦＯＸＪ３発現レベルの下方制御につながる、ＦＯＸＪ３遺伝子に付随するアンカー配列媒介接続の破壊を図示する。実施例３にさらに記載されるように、パネルＡはｇＲＮＡおよびＳＮＡ配列の地図を表し、パネルＢ、Ｃ、ＤおよびＥはＦＯＸＪ３レベルの低減を図示する。
【図８−２】図８は、ＦＯＸＪ３発現レベルの下方制御につながる、ＦＯＸＪ３遺伝子に付随するアンカー配列媒介接続の破壊を図示する。実施例３にさらに記載されるように、パネルＡはｇＲＮＡおよびＳＮＡ配列の地図を表し、パネルＢ、Ｃ、ＤおよびＥはＦＯＸＪ３レベルの低減を図示する。
【図８−３】図８は、ＦＯＸＪ３発現レベルの下方制御につながる、ＦＯＸＪ３遺伝子に付随するアンカー配列媒介接続の破壊を図示する。実施例３にさらに記載されるように、パネルＡはｇＲＮＡおよびＳＮＡ配列の地図を表し、パネルＢ、Ｃ、ＤおよびＥはＦＯＸＪ３レベルの低減を図示する。
【図９】図９は、ＴＵＳＣ５発現レベルの上方制御につながる、ＴＵＳＣ５遺伝子に付随するアンカー配列媒介接続の破壊を図示する。実施例４にさらに記載されるように、パネルＡはＴＵＳＣ５発現レベルの上方制御を表し、パネルＢはｇＲＮＡ配列の地図を表す。
【図１０】図１０は、ＤＡＮＤ５発現レベルの上方制御につながる、ＤＡＮＤ５遺伝子の上流のアンカー配列媒介接続の破壊を図示する。実施例５にさらに記載されるように、パネルＡはＤＡＮＤ５発現レベルの上方制御を表し、パネルＢはｇＲＮＡ配列の地図を表す。
【図１１】図１１は、ＳＨＭＴ２発現レベルの下方制御につながる、ＳＨＭＴ２遺伝子の上流または下流のアンカー配列媒介接続の破壊を図示した。実施例６にさらに記載されるように、パネルＢおよびＣはｇＲＮＡ配列の地図を表し、パネルＡおよびＤはＳＨＭＴ２発現レベルの下方制御を表す。
【図１２】図１２は、ＴＴＣ２１Ｂ発現レベルの上方制御につながる、ＴＴＣ２１Ｂ遺伝子の上流のアンカー配列媒介接続の破壊を図示する。実施例７にさらに記載されるように、パネルＡおよびＢはＴＴＣ２１Ｂ発現レベルの上方制御を表し、パネルＣはｇＲＮＡ配列の地図を表す。
【図１３】図１３は、ＣＤＫ６発現レベルの下方制御につながる、ＣＤＫ６遺伝子の下流のアンカー配列媒介接続の破壊を図示する。実施例１３にさらに記載されるように、パネルＡはＣＤＫ６発現レベルの下方制御を表し、パネルＢはｇＲＮＡ配列の地図を表す。
【図１４】図１４は、ｍｉＲ２９０ループのＣＴＣＦ部位にハイブリダイズしてＣＴＣＦのルーピング機能に物理的に干渉する（ポリペプチド主鎖およびポリヌクレオチド配列によって媒介される）、ポリペプチドベータの図解である。
【図１５】図１５は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーターにハイブリダイズしている多量体化ポリペプチドベータの図解である。
【図１６】図１６は、父方の対立遺伝子の１つの上で非メチル化ＣＴＣＦ結合モチーフを模倣して母方の型のループを形成するように、Ｈ１９−ＩＧＦ２遺伝子座への特異性を有する二本鎖の非メチル化ＣＴＣＦアンカー配列に連結されたポリペプチドベータの図解である。
【図１７】図１７は、アンカー配列媒介接続の標的化破壊のための、ある特定の実験データの要約を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０２０７】
詳細な説明
本明細書に記載されている組成物は、例えば、ＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡ中のアンカー配列媒介接続を改変することにより、２次元クロマチン構造（例えば、当業者であれば理解するように、直鎖よりも高次の構造を有するものとして２次元で図示することができるアンカー配列媒介接続）を変化させて、対象における遺伝子発現をモジュレートする。
【０２０８】
一態様では、本開示は、特定のアンカー配列媒介接続に結合して、アンカー配列媒介接続、例えば、接続核形成分子によって結合した２つまたはそれよりも多くのＤＮＡ遺伝子座の物理的相互作用を有するアンカー配列媒介接続のトポロジーを変化させる標的化部分を含む組成物を含む。
【０２０９】
アンカー配列媒介接続の形成は、遺伝子発現の調節因子に、強制的に標的遺伝子と相互作用させるか、または調節因子の活性を空間的に拘束する。アンカー配列媒介接続の変化は、モジュレートされる遺伝子のコード配列を変化させることなく、遺伝子療法、例えば、遺伝子発現のモジュレーションを可能にする。
【０２１０】
一部の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のアンカー配列と、接続核形成分子との間に物理的に干渉することによって、アンカー配列媒介接続に付随する遺伝子の転写をモジュレートする。例えば、ＤＮＡ結合低分子（例えば、副溝もしくは主溝結合剤）、ペプチド（例えば、亜鉛フィンガー、ＴＡＬＥＮ、新規もしくは改変ペプチド）、タンパク質（例えば、ＣＴＣＦ、ＣＴＣＦ結合および／もしくは凝集結合親和性が低下した改変ＣＴＣＦ）、または核酸（例えば、ｓｓＤＮＡ、改変ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート、ロックド核酸、架橋核酸、ポリアミド、および／もしくは三重らせん形成オリゴヌクレオチド）は、接続核形成分子が１つまたは複数のアンカー配列と相互作用して遺伝子発現をモジュレートするのを物理的に妨げることができる。
【０２１１】
一部の実施形態では、組成物は、アンカー配列の改変、例えば、エピジェネティック改変により、アンカー配列媒介接続に付随する遺伝子の転写をモジュレートする。例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、例えば、ｄＣａｓ９−メチルトランスフェラーゼ融合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド−酵素融合物によりメチル化修飾されるように、標的遺伝子を含むアンカー配列媒介接続に付随する１つまたは複数のアンカー配列を標的化して、遺伝子の発現をモジュレートすることができる。
【０２１２】
一部の実施形態では、組成物は、アンカー配列の改変、例えば、ゲノム改変により、アンカー配列媒介接続に付随する遺伝子の転写をモジュレートする。例えば、標的遺伝子を含むアンカー配列媒介接続に付随する１つまたは複数のアンカー配列を、脱アミノ化酵素（例えば、脱アミノ化オリゴヌクレオチド（例えば、オリゴ−亜硫酸水素ナトリウムコンジュゲート）、ｄＣａｓ−酵素融合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド−酵素融合物、脱アミノ化アンチセンスオリゴヌクレオチド−酵素融合物）により標的化して、遺伝子の発現をモジュレートすることができる。
【０２１３】
一部の実施形態では、組成物は、アンカー配列媒介接続に付随する遺伝子の転写をモジュレートする、例えば、転写を活性化または抑制する、例えば、クロマチンに対するエピジェネティック変化を誘導する。
【０２１４】
アンカー配列媒介接続
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、１つまたは複数のアンカー配列、１つまたは複数の遺伝子、およびエンハンシングまたはサイレンシング配列などの１つまたは複数の転写制御配列を含む。一部の実施形態では、転写制御配列は、アンカー配列媒介接続の内部、部分的に内部、または外部にある。
【０２１５】
一実施形態では、アンカー配列媒介接続は、染色体内ループなどのループを含む。ある特定の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、複数のループを有する。１つまたは複数のループは、第１のアンカー配列、核酸配列、転写制御配列、および第２のアンカー配列を含んでもよい。別の実施形態では、少なくとも１つのループは、順番に、第１のアンカー配列、転写制御配列、および第２のアンカー配列；または第１のアンカー配列、核酸配列、および第２のアンカー配列を含む。さらに別の実施形態では、核酸配列と転写制御配列のいずれか一方または両方は、ループの内部または外部に位置する。さらに別の実施形態では、ループの１つまたは複数は、転写制御配列を含む。
【０２１６】
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス、ＧＣボックス、またはＣＡＰ部位を含む。
【０２１７】
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、複数のループを含み、その場合、アンカー配列媒介接続は、ループの１つまたは複数中に、アンカー配列、核酸配列、および転写制御配列のうちの少なくとも１つを含む。
【０２１８】
一態様では、本明細書に記載されている組成物は、標的化された変更をアンカー配列媒介接続に導入して、アンカー配列に結合する標的化部分を有する核酸配列の転写をモジュレートするための組成物を含んでもよい。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続を、置換、付加または欠失のためのアンカー配列媒介接続内の１つまたは複数のヌクレオチドを標的化することによって変化させる。
【０２１９】
一部の実施形態では、転写は、活性化ループの含有または抑制ループの排除によって活性化される。１つのそのような実施形態では、アンカー配列媒介接続は、核酸配列の転写を増加させる転写制御配列を含む。別のそのような実施形態では、アンカー配列媒介接続は、核酸配列の転写を減少させる転写制御配列を排除する。
【０２２０】
一部の実施形態では、転写は、抑制ループの含有または活性化ループの排除によって抑制される。１つのそのような実施形態では、アンカー配列媒介接続は、核酸配列の転写を減少させる転写制御配列を含む。別のそのような実施形態では、アンカー配列媒介接続は、核酸配列の転写を増加させる転写制御配列を排除する。
【０２２１】
アンカー配列
それぞれのアンカー配列媒介接続は、１つまたは複数のアンカー配列、例えば、複数を含む。アンカー配列を操作するか、または変化させて、天然に存在するループを破壊するか、または新しいループを形成させる（例えば、外因性ループを形成させるか、または外因性もしくは変化したアンカー配列を有する天然に存在しないループを形成させる、図３、４、および５を参照されたい）ことができる。そのような変更は、ＤＮＡの２次元構造を変化させることによって遺伝子発現をモジュレートし、例えば、それによって、標的遺伝子が遺伝子調節および制御因子（例えば、エンハンシングおよびサイレンシング／抑制配列）と相互作用する能力をモジュレートする。一部の実施形態では、クロマチン構造を、アンカー配列媒介接続のアンカー配列内の１つまたは複数のヌクレオチドを置換、付加または欠失させることによって改変する。
【０２２２】
アンカー配列は、互いに非連続的であってもよい。非連続的アンカー配列を用いる実施形態では、第１のアンカー配列は、約５００ｂｐ〜約５００Ｍｂ、約７５０ｂｐ〜約２００Ｍｂ、約１ｋｂ〜約１００Ｍｂ、約２５ｋｂ〜約５０Ｍｂ、約５０ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１００ｋｂ〜約７５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、または約１７５ｋｂ〜約５００ｋｂだけ第２のアンカー配列から離れていてもよい。一部の実施形態では、第１のアンカー配列は、約５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、５５ｋｂ、６０ｋｂ、６５ｋｂ、７０ｋｂ、７５ｋｂ、８０ｋｂ、８５ｋｂ、９０ｋｂ、９５ｋｂ、１００ｋｂ、１２５ｋｂ、１５０ｋｂ、１７５ｋｂ、２００ｋｂ、２２５ｋｂ、２５０ｋｂ、２７５ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、１Ｍｂ、２Ｍｂ、３Ｍｂ、４Ｍｂ、５Ｍｂ、６Ｍｂ、７Ｍｂ、８Ｍｂ、９Ｍｂ、１０Ｍｂ、１５Ｍｂ、２０Ｍｂ、２５Ｍｂ、５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、またはその間の任意のサイズだけ第２のアンカー配列から離れている。
【０２２３】
一実施形態では、アンカー配列は、共通ヌクレオチド配列、例えば、ＣＴＣＦモチーフ：Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（Ｇ／Ａ／Ｔ）ＣＣ（Ａ／Ｔ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）ＡＧ（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ｔ）ＧＧ（Ｃ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｇ／Ａ／Ｃ）（配列番号１）（式中、Ｎは任意のヌクレオチドである）を含む。ＣＴＣＦ結合モチーフはまた、反対の向きにあってもよく、例えば、（Ｇ／Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ａ／Ｔ）ＧＧ（Ｇ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｔ／Ｇ）ＣＣ（Ｇ／Ａ／Ｔ）Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（配列番号２）であってもよい。一実施形態では、アンカー配列は、配列番号１もしくは配列番号２または配列番号１もしくは配列番号２のいずれかと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である配列を含む。
【０２２４】
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、少なくとも第１のアンカー配列および第２のアンカー配列を含む。第１のアンカー配列および第２のアンカー配列は、それぞれ、共通ヌクレオチド配列を含んでもよく、例えば、それぞれ、ＣＴＣＦ結合モチーフを含む。一部の実施形態では、第１のアンカー配列および第２のアンカー配列は、異なる配列を含み、例えば、第１のアンカー配列はＣＴＣＦ結合モチーフを含み、第２のアンカー配列はＣＴＣＦ結合モチーフ以外のアンカー配列を含む。一部の実施形態では、それぞれのアンカー配列は、共通ヌクレオチド配列および共通ヌクレオチド配列の一方または両方の側の１つまたは複数の隣接ヌクレオチドを含む。
【０２２５】
接続を形成し得る２つのＣＴＣＦ結合モチーフ（例えば、連続的または非連続的ＣＴＣＦ結合モチーフ）は、任意の向き、例えば、同じ向き（タンデム）に５’→３’（左タンデム、例えば、配列番号１を含む２つのＣＴＣＦ結合モチーフ）もしくは３’→５’（右タンデム、例えば、配列番号２を含む２つのＣＴＣＦ結合モチーフ）、または一方のＣＴＣＦ結合モチーフが配列番号１を含み、他方が配列番号２を含むコンバージェントな向きで、ゲノム中に存在してもよい。CTCFBSDB 2.0: Database For CTCF binding motifs And GenomeOrganization (http://insulatordb.uthsc.edu/)を使用して、標的遺伝子に付随するＣＴＣＦ結合モチーフを同定することができる。
【０２２６】
一部の実施形態では、アンカー配列は、標的疾患遺伝子に付随するＣＴＣＦ結合モチーフを含む。
【０２２７】
一部の実施形態では、クロマチン構造を、少なくとも１つのアンカー配列、例えば、接続核形成分子結合部位内の１つまたは複数のヌクレオチドを置換する、付加する、または欠失させることによって改変する。１つまたは複数のヌクレオチドを、例えば、アンカー配列、例えば、接続核形成分子結合部位内での置換、付加または欠失のための標的化された変更に特異的に標的化することができる。
【０２２８】
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続を、少なくとも１つの共通ヌクレオチド配列、例えば、接続核形成分子結合部位の向きを変化させることによって変化させる。
【０２２９】
一部の実施形態では、アンカー配列は、接続核形成分子結合部位、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフを含み、標的化部分は、少なくとも１つの接続核形成分子結合部位の変更、例えば、接続核形成分子に対する結合親和性の変化を導入する。
【０２３０】
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続を、外因性アンカー配列を導入することによって変化させる。天然に存在しない、または外因性のアンカー配列の付加は、例えば、核酸配列の転写を変化させる天然に存在しないループが形成するのを誘導することによって、天然に存在するアンカー配列媒介接続を形成または破壊する。
【０２３１】
アンカー配列媒介接続の型
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、１つまたは複数、例えば、２、３、４、５個またはそれよりも多くの遺伝子を含む。
【０２３２】
一部の実施形態では、本開示は、標的遺伝子または遺伝子の転写に影響する付随する転写制御配列の外部にある、またはその一部ではない、またはその中に含まれる配列を標的化すること、例えば、アンカー配列を標的化することによって、遺伝子の発現をモジュレートすることを含む、アンカー配列媒介接続中の標的遺伝子の発現をモジュレートする方法を含む。
【０２３３】
一部の実施形態では、本開示は、標的遺伝子と非連続的であるか、または標的遺伝子の転写に影響する付随する転写制御配列を標的化すること、例えば、アンカー配列を標的化することを含む、標的遺伝子の転写をモジュレートする方法を含む。
【０２３４】
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、１つまたは複数、例えば、２、３、４、５個またはそれよりも多くの転写制御配列と結合する。一部の実施形態では、標的遺伝子は、転写制御配列の１つまたは複数と非連続的である。遺伝子が転写制御配列と非連続的である一部の実施形態では、遺伝子は、約１００ｂｐ〜約５００Ｍｂ、約５００ｂｐ〜約２００Ｍｂ、約１ｋｂ〜約１００Ｍｂ、約２５ｋｂ〜約５０Ｍｂ、約５０ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１００ｋｂ〜約７５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、または約１７５ｋｂ〜約５００ｋｂだけ１つまたは複数の転写制御配列から離れていてもよい。一部の実施形態では、遺伝子は、約１００ｂｐ、３００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、５５ｋｂ、６０ｋｂ、６５ｋｂ、７０ｋｂ、７５ｋｂ、８０ｋｂ、８５ｋｂ、９０ｋｂ、９５ｋｂ、１００ｋｂ、１２５ｋｂ、１５０ｋｂ、１７５ｋｂ、２００ｋｂ、２２５ｋｂ、２５０ｋｂ、２７５ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、１Ｍｂ、２Ｍｂ、３Ｍｂ、４Ｍｂ、５Ｍｂ、６Ｍｂ、７Ｍｂ、８Ｍｂ、９Ｍｂ、１０Ｍｂ、１５Ｍｂ、２０Ｍｂ、２５Ｍｂ、５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、またはその間の任意のサイズだけ転写制御配列から離れている。
【０２３５】
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続の型は、アンカー配列媒介接続を変化させることにより、遺伝子発現をモジュレートする方法、例えば、標的化部分の選択を決定するのに役立ち得る。例えば、一部の型のアンカー配列媒介接続は、アンカー配列媒介接続内に１つまたは複数の転写制御配列を含む。アンカー配列媒介接続の形成を破壊すること、例えば、１つまたは複数のアンカー配列を変化させることにより、そのようなアンカー配列媒介接続の破壊は、アンカー配列媒介接続内の標的遺伝子の転写を減少させる可能性がある。
【０２３６】
１型
一部の実施形態では、標的遺伝子の発現は、アンカー配列媒介接続と付随する１つまたは複数の転写制御配列によって調節、モジュレート、または影響される。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、１つまたは複数の付随する遺伝子および１つまたは複数の転写制御配列を含む。例えば、標的遺伝子と１つまたは複数の転写制御配列は、少なくとも部分的には、アンカー配列媒介接続、例えば、１型アンカー配列媒介接続の内部に位置する。図６を参照されたい。図６に記載されるアンカー配列媒介接続を、「１型、ＥＰサブタイプ」と呼ぶこともできる。
【０２３７】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、例えば、その天然状態、例えば、疾患状態で、規定の状態の発現を有する。例えば、標的遺伝子は、高レベルの発現を有してもよい。アンカー配列媒介接続を破壊することにより、標的遺伝子の発現を減少させる、例えば、アンカー配列媒介接続内のそれまでは転写に対して開かれていたＤＮＡのコンフォメーション変化による転写の減少、例えば、標的遺伝子とエンハンシング配列との間のさらなる距離を作出するＤＮＡのコンフォメーション変化による転写の減少をもたらすことができる。一実施形態では、付随する遺伝子と、１つまたは複数の転写制御配列、例えば、エンハンシング配列は両方とも、アンカー配列媒介接続の内部に存在する。アンカー配列媒介接続の破壊は、遺伝子の発現を減少させる。一実施形態では、アンカー配列媒介接続に付随する遺伝子は、少なくとも部分的には、アンカー配列媒介接続の内部に存在する１つまたは複数の転写制御配列に接近しやすい。アンカー配列媒介接続の破壊は、遺伝子の発現を減少させる。
【０２３８】
例えば、１型アンカー配列媒介接続は、ＭＹＣをコードする遺伝子を含み、１型アンカー配列媒介接続の破壊は、遺伝子の発現およびＭＹＣタンパク質レベルを減少させる。別の例では、１型アンカー配列媒介接続は、Ｆｏｘｊ３をコードする遺伝子を含み、１型アンカー配列媒介接続の破壊は、遺伝子の発現およびＦｏｘｊ３タンパク質レベルを減少させる。
【０２３９】
２型
一部の実施形態では、標的遺伝子の発現は、アンカー配列媒介接続に付随するが、アンカー配列媒介接続のために接近できない１つまたは複数の転写制御配列によって調節、モジュレート、または影響される。例えば、遺伝子に付随するアンカー配列媒介接続は、１つまたは複数の転写制御配列が遺伝子の発現を調節する、モジュレートする、またはそれに影響する能力を破壊する。転写制御配列は、遺伝子から離れていてもよく、例えば、少なくとも部分的に、アンカー配列媒介接続に対して、遺伝子とは反対側に、例えば、内部または外部に存在する。例えば、遺伝子は、アンカー配列媒介接続の近接性のため、転写制御配列に接近できない。一部の実施形態では、１つまたは複数のエンハンシング配列は、アンカー配列媒介接続、例えば、２型アンカー配列媒介接続によって遺伝子から隔てられている。図６を参照されたい。
【０２４０】
一部の実施形態では、２型遺伝子は、アンカー配列媒介接続の内部に包含されるが、転写制御配列（例えば、エンハンシング配列）はアンカー配列媒介接続の内部に包含されない。２型のこのサブタイプを、「２型、サブタイプ１」と呼ぶことができる。
【０２４１】
一部の実施形態では、２型転写制御配列（例えば、エンハンシング配列）はアンカー配列媒介接続の内部に包含されるが、遺伝子はアンカー配列媒介接続の内部に包含されない。２型のこのサブタイプを、「２型、サブタイプ２」と呼ぶことができる。
【０２４２】
一部の実施形態では、遺伝子は、アンカー配列媒介接続のため、１つまたは複数の転写制御配列に接近できず、アンカー配列媒介接続の破壊により、転写制御配列は、遺伝子の発現を調節する、モジュレートする、またはそれに影響することができる。一実施形態では、遺伝子は、アンカー配列媒介接続の内部および外部にあり、１つまたは複数の転写制御配列に接近できない。アンカー配列媒介接続の破壊は、転写制御配列の接近を増加させて、遺伝子の発現を調節する、モジュレートする、またはそれに影響し、例えば、転写制御配列は、遺伝子の発現を増加させる。一実施形態では、遺伝子は、アンカー配列媒介接続の内部にあり、少なくとも部分的に、アンカー配列媒介接続の外部に存在する１つまたは複数の転写制御配列に接近できない。アンカー配列媒介接続の破壊は、遺伝子の発現を増加させる。一実施形態では、遺伝子は、少なくとも部分的には、アンカー配列媒介接続の外部にあり、アンカー配列媒介接続の内部に存在する１つまたは複数の転写制御配列に接近できない。アンカー配列媒介接続の破壊は、遺伝子の発現を増加させる。
【０２４３】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、例えば、その天然状態、例えば、疾患状態で、規定の状態の発現を有する。例えば、標的遺伝子は、中程度から低レベルの発現を有してもよい。アンカー配列媒介接続を破壊することにより、標的遺伝子の発現をモジュレートする、例えば、アンカー配列媒介接続内のそれまでは転写に関して閉じていたＤＮＡのコンフォメーション変化による転写の増加、例えば、エンハンシング配列を標的遺伝子とより密接に会合させるＤＮＡのコンフォメーション変化による転写の増加をもたらすことができる。
【０２４４】
例えば、２型アンカー配列媒介接続は、ＳＣＮ１ａをコードする遺伝子を含み、２型アンカー配列媒介接続の破壊は、遺伝子の発現およびＳＣＮ１ａタンパク質レベルを増加させる。別の例では、２型アンカー配列媒介接続は、Ｓｅｒｐｉｎ１ａをコードする遺伝子を含み、２型アンカー配列媒介接続の破壊は、遺伝子の発現およびＳｅｒｐｉｎ１ａタンパク質レベルを増加させる。別の例では、ＩＬ−１０遺伝子に付随するアンカー配列媒介接続を変化させることにより、ＩＬ−１０媒介性寛容化応答を惹起することができる、例えば、ＩＬ−１０の発現を増加させて、自己免疫状態を改善することができる。別の例では、ＩＬ−６の発現を、その付随するアンカー配列媒介接続を変化させて、１つまたは複数のエンハンシング配列をＩＬ−６遺伝子のごく近接に持って行くことによって増加させることができる。
【０２４５】
３型
一部の実施形態では、標的遺伝子の発現は、アンカー配列媒介接続に付随するが、互いにアンカー配列媒介接続の同じ側に必ずしも位置しない１つまたは複数の転写制御配列によって調節、モジュレート、または影響される。例えば、アンカー配列媒介接続は、１つまたは複数の遺伝子に付随するし、１つまたは複数の転写制御配列は、少なくとも部分的には、アンカー配列媒介接続の内部および外部に存在する。一部の実施形態では、１つまたは複数のエンハンシング配列は、アンカー配列媒介接続の内部に存在し、１つまたは複数の抑制シグナル、例えば、サイレンシング配列は、アンカー配列媒介接続、例えば、３型アンカー配列媒介接続の外部に存在する。図６を参照されたい。
【０２４６】
一部の実施形態では、遺伝子は、アンカー配列媒介接続のため、１つまたは複数の転写制御配列に接近できず、アンカー配列媒介接続の破壊により、転写制御配列は、遺伝子の発現を調節する、モジュレートする、またはそれに影響することができる。一実施形態では、遺伝子は、アンカー配列媒介接続の内部にあり、１つまたは複数の転写制御配列、例えば、アンカー配列媒介接続の外部に存在する、サイレンシング／抑制配列に接近できない。アンカー配列媒介接続の破壊は、遺伝子の発現を減少させる。一実施形態では、遺伝子は、アンカー配列媒介接続の内部および外部にあり、１つまたは複数の転写制御配列、例えば、サイレンシング／抑制配列、アンカー配列媒介接続の外部に存在するアンカー配列媒介接続に接近できない。アンカー配列媒介接続の破壊は、遺伝子の発現を減少させる。一実施形態では、遺伝子はアンカー配列媒介接続の外部にあり、１つまたは複数の転写制御配列、例えば、アンカー配列媒介接続の内部の、サイレンシング／抑制配列に接近できない。アンカー配列媒介接続の破壊は、遺伝子の発現を減少させる。
【０２４７】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、例えば、その天然状態、例えば、疾患状態で、規定の状態の発現を有する。例えば、標的遺伝子は、その天然状態で高レベルの発現を有してもよい。アンカー配列媒介接続を破壊することにより、標的遺伝子の発現をモジュレートする、例えば、標的遺伝子とエンハンシング配列との間のさらなる距離を作出するＤＮＡのコンフォメーション変化による転写の減少、例えば、アンカー配列媒介接続内のそれまでは転写に対して開かれていたＤＮＡのコンフォメーション変化による転写の減少、例えば、サイレンシング配列を標的遺伝子とより密接に会合させるＤＮＡのコンフォメーション変化による転写の減少、例えば、標的遺伝子とエンハンシング配列との間のさらなる距離を作出するＤＮＡのコンフォメーション変化による転写の減少をもたらすことができる。
【０２４８】
４型
一部の実施形態では、標的遺伝子の発現は、アンカー配列媒介接続に付随するが、アンカー配列媒介接続の内部に必ずしも位置しない１つまたは複数の転写制御配列によって調節、モジュレート、または影響される。例えば、アンカー配列媒介接続は、１つまたは複数の遺伝子に付随し、１つまたは複数の転写制御配列は、少なくとも部分的には、アンカー配列媒介接続、例えば、４型アンカー配列媒介接続の内部および外部に存在する。図６を参照されたい。
【０２４９】
一部の実施形態では、遺伝子は、アンカー配列媒介接続のため、１つまたは複数の転写制御配列に接近できず、アンカー配列媒介接続の破壊により、転写制御配列は、遺伝子の発現を調節する、モジュレートする、またはそれに影響することができる。一実施形態では、遺伝子は、アンカー配列媒介接続の内部にあり、アンカー配列媒介接続の外部に存在する１つまたは複数の転写制御配列に接近できない。アンカー配列媒介接続の破壊は、遺伝子の発現を増加させる。一実施形態では、遺伝子は、アンカー配列媒介接続の内部および外部にあり、１つまたは複数の転写制御配列、例えば、エンハンシング配列、アンカー配列媒介接続の外部に存在するアンカー配列媒介接続に接近できない。アンカー配列媒介接続の破壊は、遺伝子の発現を増加させる。一実施形態では、遺伝子はアンカー配列媒介接続の外部にあり、１つまたは複数の転写制御配列、例えば、アンカー配列媒介接続の内部の、エンハンシング配列に接近できない。アンカー配列媒介接続の破壊は、遺伝子の発現を増加させる。
【０２５０】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、例えば、その天然状態、例えば、疾患状態で、規定の状態の発現を有する。例えば、標的遺伝子は、その天然状態で高レベルの発現を有してもよい。アンカー配列媒介接続を破壊することにより、標的遺伝子の発現をモジュレートする、例えば、アンカー配列媒介接続内においてコンフォメーション変化がＤＮＡを転写に対して開くことによる転写の増加、例えば、１つまたは複数のエンハンシング配列を、標的遺伝子と会合させることによるＤＮＡのコンフォメーション変化による転写の増加をもたらすことができる。
【０２５１】
標的化部分
一部の実施形態では、本明細書に記載されている組成物、薬剤、融合分子、または他の分子は、本明細書に記載されている１つまたは複数の標的化部分を含む。標的化部分は、下記：少なくとも１つの外因性アンカー配列；接続核形成分子に対する結合親和性を変化させることなどによる、少なくとも１つの接続核形成分子結合部位の変更；ＣＴＣＦ結合モチーフなどの少なくとも１つの共通ヌクレオチド配列の向きの変化；およびＣＴＣＦ結合モチーフなどの、少なくとも１つのアンカー配列中の置換、付加または欠失のうちの少なくとも１つの変更のためにアンカー配列媒介接続を標的にすることができる。
【０２５２】
特定の種類の標的化部分の以下の例を読む当業者であれば、一部の実施形態では、標的化部分が部位特異的であることを理解するであろう。すなわち、一部の実施形態では、標的化部分は、１つまたは複数の標的アンカー配列（例えば、細胞内の）に特異的に結合し、非標的アンカー配列（例えば、同じ細胞内）には結合しない。
【０２５３】
標的化部分は、特定の機能をモジュレートし、特定の分子（例えば、酵素、タンパク質または核酸）をモジュレートし、局在のために特異的に結合することができる。標的化機能は、特定の分子、例えば、分子標的に対して作用することができる。例えば、標的化された治療剤は、特定の分子と相互作用して、その機能を増加させる、減少させる、またはそうでなければモジュレートすることができる。
【０２５４】
一部の実施形態では、標的化部分は、アンカー配列（例えば、ＤＮＡ配列）に結合する。本開示の様々な部分において、用語「ＤＮＡ結合部分」を、標的化部分を指すように使用することができる。
【０２５５】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている組成物、薬剤、融合分子、または他の分子は、アンカー配列に結合し、アンカー配列によって媒介される接続の形成をモジュレートするエフェクター部分に作動可能に連結した標的化部分（例えば、ｇＲＮＡ、アンチセンス、オリゴヌクレオチド、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート）を含む。標的化部分は、アンカー配列媒介接続のアンカー配列に結合し、アンカー配列媒介接続の形成を変化させることができる（例えば、アンカー配列の、接続核形成分子に対する親和性を、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれよりも大きく変化させる）。標的化部分は、本明細書に記載されている薬物動態が弱い低分子、ペプチド、核酸、ナノ粒子、アプタマー、および薬剤のいずれか１つであってもよい。
【０２５６】
標的化部分は、遺伝子編集システムなどにより、置換、付加または欠失のためのアンカー配列媒介接続内の、配列、例えば、アンカー配列、例えば、アンカー配列内の共通ヌクレオチド配列の１つまたは複数のヌクレオチドを標的にすることができる。一部の実施形態では、標的化部分は、アンカー配列媒介接続、例えば、アンカー配列媒介接続中のアンカー配列に結合し、アンカー配列媒介接続のトポロジーを変化させる。
【０２５７】
一部の実施形態では、標的化部分は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ｄＣａｓ９、オリゴヌクレオチド対形成、組換え、トランスポゾンなどにより、置換、付加または欠失のためのアンカー配列媒介接続内のアンカー配列の１つまたは複数のヌクレオチドを標的にする。一部の実施形態では、標的化部分は、アンカー配列媒介接続内の１つまたは複数のＤＮＡメチル化部位を標的にする。
【０２５８】
標的化部分は、置換、付加または欠失によるアンカー配列媒介接続内の、配列、例えば、アンカー配列、例えば、アンカー配列内の共通ヌクレオチド配列の１つまたは複数のヌクレオチドを、遺伝子編集システムなどによって変化させることができる。
【０２５９】
一部の実施形態では、標的化部分は、標的化された変更をアンカー配列媒介接続中に導入して、アンカー配列媒介接続中の遺伝子の、ヒト細胞中での転写をモジュレートする。標的化された変更は、１つまたは複数のヌクレオチド、例えば、アンカー配列媒介接続内のアンカー配列の置換、付加または欠失を含んでもよい。標的化部分は、アンカー配列媒介接続のアンカー配列に結合し、標的化部分は、標的化された変更をアンカー配列中に導入して、アンカー配列媒介接続中の遺伝子の、ヒト細胞中での転写をモジュレートすることができる。一部の実施形態では、標的化された変更は、例えば、アンカー配列媒介接続内のアンカー配列、選択的スプライシング部位、および非翻訳ＲＮＡのための結合部位に対する結合親和性を変化させて、接続核形成分子のための結合部位の少なくとも１つを変化させる。
【０２６０】
一部の実施形態では、標的化部分は、下記：少なくとも１つの外因性アンカー配列；接続核形成分子に対する結合親和性を変化させることなどによる、少なくとも１つの接続核形成分子結合部位の変更；ＣＴＣＦ結合モチーフなどの少なくとも１つの共通ヌクレオチド配列の向きの変化；およびＣＴＣＦ結合モチーフなどの少なくとも１つのアンカー配列における置換、付加または欠失のうちの少なくとも１つで、アンカー配列媒介接続を編集する。
【０２６１】
一部の実施形態では、標的化部分は、核酸配列、タンパク質、タンパク質融合物、または膜透過移行ポリペプチドである。一部の実施形態では、標的化部分は、外因性接続核形成分子、接続核形成分子をコードする核酸、または配列標的化ポリペプチドと接続核形成分子との融合物から選択される。
【０２６２】
本明細書でより詳細に説明されるように、一部の実施形態では、本明細書に記載されている標的化部分は、ポリマーまたはポリマー部分、例えば、ヌクレオチドのポリマー（オリゴヌクレオチドなど）、ペプチド核酸、ペプチド−核酸混合体、ペプチドまたはポリペプチド、ポリアミド、炭水化物などであるか、またはそれを含んでもよい。
【０２６３】
核酸配列
一部の実施形態では、標的化部分は、核酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸配列は、遺伝子または発現産物をコードする。
【０２６４】
本明細書を読む当業者であれば容易に理解するように、標的化部分は、遺伝子または発現産物をコードしない核酸配列を含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、標的化部分は、標的アンカー配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。例えば、一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの配列は、標的アンカー配列の相補体を含むか、または標的アンカー配列の相補体と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である配列を有する。
【０２６５】
核酸配列は、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、改変オリゴヌクレオチド（例えば、骨格結合、糖分子、および／または核酸塩基を変化させる改変などの、化学的修飾）、および人工核酸を含んでもよい。一部の実施形態では、核酸配列は、限定されるものではないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、ポリアミド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、改変ＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、改変ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡまたは他のＲＮＡもしくはＤＮＡ分子を含む。
【０２６６】
一部の実施形態では、核酸配列は、約２〜約５０００ｎｔ、約１０〜約１００ｎｔ、約５０〜約１５０ｎｔ、約１００〜約２００ｎｔ、約１５０〜約２５０ｎｔ、約２００〜約３００ｎｔ、約２５０〜約３５０ｎｔ、約３００〜約５００ｎｔ、約１０〜約１０００ｎｔ、約５０〜約１０００ｎｔ、約１００〜約１０００ｎｔ、約１０００〜約２０００ｎｔ、約２０００〜約３０００ｎｔ、約３０００〜約４０００ｎｔ、約４０００〜約５０００ｎｔ、またはその間の任意の範囲の長さを有する。
【０２６７】
一態様では、本開示は、複数のアンカー配列、遺伝子配列、および転写制御配列を含む合成核酸を含む。一部の実施形態では、遺伝子配列および転写制御配列は、複数のアンカー配列の間にある。一部の実施形態では、合成核酸は、順番に、（ａ）アンカー配列、遺伝子配列、転写制御配列、およびアンカー配列または（ｂ）アンカー配列、転写制御配列、遺伝子配列、およびアンカー配列を含む。一部の実施形態では、配列は、リンカー配列によって隔てられる。一部の実施形態では、アンカー配列は、７〜１００ｎｔ、１０〜１００ｎｔ、１０〜８０ｎｔ、１０〜７０ｎｔ、１０〜６０ｎｔ、１０〜５０ｎｔ、２０〜８０ｎｔ、またはその間の任意の範囲である。一部の実施形態では、核酸は、３，０００〜５０，０００ｂｐ、３，０００〜４０，０００ｂｐ、３，０００〜３０，０００ｂｐ、３，０００〜２０，０００ｂｐ、３，０００〜１５，０００ｂｐ、３，０００〜１２，０００ｂｐ、３，０００〜１０，０００ｂｐ、３，０００〜８，０００ｂｐ、５，０００〜３０，０００ｂｐ、５，０００〜２０，０００ｂｐ、５，０００〜１５，０００ｂｐ、５，０００〜１２，０００ｂｐ、５，０００〜１０，０００ｂｐまたはその間の任意の範囲である。
【０２６８】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されている核酸を含むベクターを含む。
【０２６９】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されている核酸を含む細胞または組織を含む。
【０２７０】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されている核酸を含む医薬組成物を含む。
【０２７１】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されている核酸を含む組成物を投与することによって遺伝子の発現をモジュレートする方法を含む。
【０２７２】
アナログ
核酸配列は、ヌクレオシド、例えば、プリンまたはピリミジン、例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルを含んでもよい。一部の実施形態では、核酸配列は、１つまたは複数のヌクレオシドアナログを含む。ヌクレオシドアナログとしては、限定されるものではないが、５−フルオロウラシル；５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、４−メチルベンズイミダゾール、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ジヒドロウリジン、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６−ジアミノプリン、３−ニトロピロール、イノシン、チオウリジン、クエオシン、ワイオシン、ジアミノプリン、イソグアニン、イソシトシン、ジアミノピリミジン、２，４−ジフルオロトルエン、イソキノリン、ピロロ［２，３−β］ピリジン、およびプリンまたはピリミジン側鎖と塩基対を形成することができる任意の他のものなどのヌクレオシドアナログが挙げられる。
【０２７３】
ｇＲＮＡ
一部の実施形態では、標的化部分は、核酸配列、例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む。ｇＲＮＡ短鎖合成ＲＮＡは、Ｃａｓ９結合にとって必要な「足場」配列およびゲノム標的のためのユーザーにより定義された約２０ヌクレオチドの標的化配列から構成される。実際には、ガイドＲＮＡ配列は、一般に、１７〜２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０、または２１ヌクレオチド）の長さを有するように設計され、標的化された核酸配列と相補的である。カスタムｇＲＮＡ生成器およびアルゴリズムは、有効なガイドＲＮＡの設計における使用のために商業的に入手可能である。遺伝子編集はまた、天然に存在するｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼに結合するため）と、少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集のために標的化された配列にヌクレアーゼを駆動するため）との両方を含有する操作された（合成）単一ＲＮＡ分子である、キメラ「単一ガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）を使用して達成されている。化学的に改変されたｓｇＲＮＡもまた、ゲノム編集において有効であることが示されている；例えば、Hendelら（２０１５年）Nature Biotechnol.、９８５〜９９１頁を参照されたい。
【０２７４】
一部の実施形態では、核酸配列は、アンカー配列と相補的な配列を含む。一実施形態では、アンカー配列は、ＣＴＣＦ結合モチーフまたはコンセンサス配列：Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（Ｇ／Ａ／Ｔ）ＣＣ（Ａ／Ｔ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）ＡＧ（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ｔ）ＧＧ（Ｃ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｇ／Ａ／Ｃ）（配列番号１）（式中、Ｎは任意のヌクレオチドである）を含む。ＣＴＣＦ結合モチーフまたはコンセンサス配列はまた、反対の向きにあってもよく、例えば、（Ｇ／Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ａ／Ｔ）ＧＧ（Ｇ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｔ／Ｇ）ＣＣ（Ｇ／Ａ／Ｔ）Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（配列番号２）であってもよい。一部の実施形態では、核酸配列は、ＣＴＣＦ結合モチーフまたはコンセンサス配列と相補的な配列を含む。
【０２７５】
一部の実施形態では、核酸配列は、アンカー配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的な配列を含む。一部の実施形態では、核酸配列は、ＣＴＣＦ結合モチーフまたはコンセンサス配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的な配列を含む。一部の実施形態では、核酸配列は、ｇＲＮＡ、およびアンカー配列と相補的な配列または少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的な配列を含む配列からなる群から選択される。
【０２７６】
一部の実施形態では、エピジェネティック改変剤は、ｇＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、またはＤＮＡ標的として使用される三重らせん形成オリゴヌクレオチドおよびアンカー配列の近くの立体的存在である。ｇＲＮＡは、特定のＤＮＡ配列（例えば、配列特異性を付与する配列が隣接するアンカー配列、ＣＴＣＦアンカー配列）を認識する。ｇＲＮＡは、接続核形成分子配列に干渉して、立体的遮断剤として作用するさらなる配列を含んでもよい。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、接続核形成分子に干渉する立体的存在として作用する、１つまたは複数のペプチド、例えば、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）と組み合わされる。
【０２７７】
タンパク質をコードする核酸
一部の実施形態では、ベクター、例えば、ウイルスベクターは、標的化部分、例えば、接続核形成分子をコードする核酸を含む。
【０２７８】
本明細書に記載されている核酸または本明細書に記載されているタンパク質、例えば、接続核形成分子またはエピジェネティック改変剤をコードする核酸を、ベクター中に組み込むことができる。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するものなどのベクターは、トランスジーンの長期的な、安定的な組込みおよび娘細胞中でのその増殖を可能にするため、長期的な遺伝子導入を達成するための好適な手段である。ベクターの例としては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターが挙げられる。発現ベクターを、ウイルスベクターの形態で細胞に提供することができる。ウイルスベクター技術は、当業界で周知であり、様々なウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用であるウイルスとしては、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的である複製起点、プロモーター配列、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つまたは複数の選択マーカーを含有する。
【０２７９】
天然または合成核酸の発現は、典型的には、目的の遺伝子をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結すること、および構築物を発現ベクター中に組み込むことによって達成される。ベクターは、真核生物中での複製および組込みにとって好適なものであってよい。典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、および所望の核酸配列の発現にとって有用なプロモーターを含有する。
【０２８０】
さらなるプロモーターエレメント、例えば、エンハンシング配列は、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらのものは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターは、同様に開始部位の下流に機能的エレメントを含有することが最近示されている。プロモーターエレメント間の空間は、可撓性であることが多く、従って、エレメントが互いに対して逆向きであっても、または移動していても、プロモーター機能は保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーターエレメント間の空間を、活性が低下し始める前に５０ｂｐ離して増大させることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは協同的に、または独立的に機能して、転写を活性化することができるように思われる。
【０２８１】
好適なプロモーターの一例は、極初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結した任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例は、伸長増殖因子−１α（ＥＦ−１α）である。しかしながら、限定されるものではないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、鳥白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス極初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに限定されるものではないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターなどの、他の構成的プロモーター配列を使用することもできる。
【０２８２】
さらに、本開示は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導的プロモーターも本開示の一部として企図される。誘導的プロモーターの使用は、ポリヌクレオチド配列の発現が所望される場合は、それが作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現のスイッチを入れるか、または発現が所望されない場合は発現のスイッチを切ることができる分子スイッチを提供する。誘導的プロモーターの例としては、限定されるものではないが、メタロチオニンプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。
【０２８３】
導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染されることが求められる細胞の集団に由来する発現細胞の同定および選択を容易にするための選択マーカー遺伝子またはリポーター遺伝子またはその両方を含有してもよい。他の態様では、選択マーカーを、別々のＤＮＡ小片上に担持させ、同時トランスフェクション手順において使用することができる。選択マーカーおよびリポーター遺伝子の両方に、適切な転写制御配列を隣接させて、宿主細胞中での発現を可能にすることができる。有用な選択マーカーとしては、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【０２８４】
リポーター遺伝子を、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定するため、および転写制御配列の機能を評価するために使用することができる。一般に、リポーター遺伝子は、レシピエント供給源中に存在しないか、またはそれによって発現されず、発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって示されるポリペプチドをコードする遺伝子である。リポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞中に導入された後の好適な時間でアッセイされる。好適なリポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子（例えば、Ui-Teiら、２０００年、FEBS Letters ４７９巻：７９〜８２頁）をコードする遺伝子を含んでもよい。好適な発現系は周知であり、公知の技術を使用して調製するか、または商業的に取得することができる。一般に、リポーター遺伝子の最も高レベルの発現を示す最小の５’隣接領域を有する構築物が、プロモーターとして同定される。そのようなプロモーター領域をリポーター遺伝子に連結し、これを使用して、プロモーター駆動性転写をモジュレートする能力について薬剤を評価することができる。
【０２８５】
ＲＮＡｉ
ある特定のＲＮＡ剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスにより遺伝子発現を阻害することができる。ＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡまたは典型的には、１５〜５０塩基対（約１８〜２５塩基対など）を含有し、細胞内の発現される標的遺伝子中のコード配列と同一の（相補的な）またはほぼ同一の（実質的に相補的な）核酸塩基配列を有するＲＮＡ様構造を含む。ＲＮＡｉ分子としては、限定されるものではないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メロ二本鎖（meroduplex）、およびＤｉｃｅｒ基質（米国特許第８，０８４，５９９号、第８，３４９，８０９号および第８，５１３，２０７号）が挙げられる。一実施形態では、本開示は、本明細書に記載されているポリペプチド、例えば、接続核形成分子またはエピジェネティック改変剤をコードする遺伝子の発現を阻害するための組成物を含む。
【０２８６】
ＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子の全部または断片と実質的に相補的な、または完全に相補的な配列を含む。ＲＮＡｉ分子は、イントロンとエクソンとの境界で配列を補完して、特定の遺伝子の新しく生成された核ＲＮＡ転写物の、転写のためのｍＲＮＡへの成熟を防止することができる。特定の遺伝子と相補的なＲＮＡｉ分子は、その遺伝子のためのｍＲＮＡとハイブリダイズし、その翻訳を防止することができる。アンチセンス分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその誘導体もしくはハイブリッドであってもよい。そのような誘導体分子の例としては、限定されるものではないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびデオキシリボ核グアニジン（ＤＮＧ）またはリボ核グアニジン（ＲＮＧ）などのホスホロチオエート系分子が挙げられる。
【０２８７】
ＲＮＡｉ分子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成された「即時使用可能な」ＲＮＡとして、または転写の際にＲＮＡｉ分子をもたらす細胞中にトランスフェクトされたアンチセンス遺伝子として、細胞に提供することができる。ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、ＲＮＡｓｅＨによるハイブリダイズした分子の分解および／または翻訳複合体の形成の阻害をもたらす。両方とも失敗に終わり、元の遺伝子産物を産生する。
【０２８８】
目的の転写物にハイブリダイズするＲＮＡｉ分子の長さは、約１０ヌクレオチド、約１５〜３０ヌクレオチド、または約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくはそれよりも多くのヌクレオチドであるべきである。アンチセンス配列と標的化された転写物との同一性の程度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％であるべきである。
【０２８９】
ＲＮＡｉ分子はまた、突出部、すなわち、典型的には、センス鎖とアンチセンス鎖との本明細書で定義される対のコア配列によって通常形成される二重らせん構造に直接関与しない、対形成していない、突出するヌクレオチドを含んでもよい。ＲＮＡｉ分子は、センス鎖とアンチセンス鎖のそれぞれとは無関係の約１〜５塩基の３’および／または５’突出部を含んでもよい。一実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖は両方とも、３’および５’突出部を含有する。一実施形態では、一方の鎖の３’突出部ヌクレオチドの１つまたは複数は、他方の鎖の１つまたは複数の５’突出部ヌクレオチドと対形成する。別の実施形態では、一方の鎖の３’突出部ヌクレオチドの１つまたは複数は、他方の鎖の１つまたは複数の５’突出部ヌクレオチドと塩基対を形成しない。ＲＮＡｉ分子のセンスおよびアンチセンス鎖は、同じ数のヌクレオチド塩基を含有しても、またはしなくてもよい。アンチセンス鎖とセンス鎖とは、５’末端だけが平滑末端を有する、３’末端だけが平滑末端を有する、５’と３’末端の両方が平滑末端である、または５’末端も３’末端も平滑末端ではない、二本鎖を形成し得る。別の実施形態では、突出部中のヌクレオチドの１つまたは複数は、チオホスフェート、ホスホロチオエート、デオキシヌクレオチド反転（３’から３’に連結された）ヌクレオチドを含有するか、または改変リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドである。
【０２９０】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子は、標的ｍＲＮＡの約１５〜約２５個の連続するヌクレオチドと同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ配列は、ジヌクレオチドＡＡで始まり、約３０〜７０％（約３０〜６０％、約４０〜６０％、または約４５％〜５５％）のＧＣ含量を含み、例えば、標準的なＢＬＡＳＴ検索によって決定された場合、導入される哺乳動物のゲノム中の標的以外の任意のヌクレオチド配列に対する高いパーセンテージの同一性を有しない。
【０２９１】
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、内因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子のプロセシング経路における中間体と類似する（Bartel、Cell １１６巻：２８１〜２９７頁、２００４年）。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとして、またその逆として機能することができる（Zengら、Mol Cell ９巻：１３２７〜１３３３頁、２００２年；Doenchら、Genes Dev １７巻：４３８〜４４２頁、２００３年）。マイクロＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様、ＲＩＳＣを使用して、標的遺伝子を下方調節するが、ｓｉＲＮＡと違って、多くの動物のｍｉＲＮＡはｍＲＮＡを切断しない。その代わりに、ｍｉＲＮＡは、翻訳抑制またはポリＡ除去およびｍＲＮＡ分解によってタンパク質出力を減少させる（Wuら、Proc Natl Acad Sci USA １０３巻：４０３４〜４０３９頁、２００６年）。公知のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡ  ３’ＵＴＲ内にある；ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの５’末端からヌクレオチド２〜８とほぼ完全な相補性を有する部位を標的にすると考えられる（Rajewsky, Nat Genet ３８巻、補遺：Ｓ８〜１３頁、２００６年；Limら、Nature ４３３巻：７６９〜７７３頁、２００５年）。この領域は、シード領域として公知である。ｓｉＲＮＡとｍｉＲＮＡは互換性であるため、外因性ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡに対するシード相補性を有するｍＲＮＡを下方調節する（Birminghamら、Nat Methods ３巻：１９９〜２０４頁、２００６年）。３’ＵＴＲ内の複数の標的部位は、より強力な下方調節を与える（Doenchら、Genes Dev １７巻：４３８〜４４２頁、２００３年）。
【０２９２】
公知のｍｉＲＮＡ配列の一覧を、特に、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、およびＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙなどの研究機関によって維持されるデータベース中に見出すことができる。公知の有効なｓｉＲＮＡ配列および同族結合部位も、関連文献中に十分に示されている。ＲＮＡｉ分子は、当業界で公知の技術によって容易に設計および産生される。さらに、有効かつ特異的な配列モチーフを発見する機会を増加させるコンピュータツールが存在する（Peiら、２００６年、Reynoldsら、２００４年、Khvorovaら、２００３年、Schwarzら、２００３年、Ui-Teiら、２００４年、Healeら、２００５年、Chalkら、２００４年、Amarzguiouiら、２００４年）。
【０２９３】
ＲＮＡｉ分子は、遺伝子によりコードされるＲＮＡの発現をモジュレートする。複数の遺伝子が互いにある程度の配列相同性を共有することができるため、一部の実施形態では、ＲＮＡｉ分子を、十分な配列相同性を有する遺伝子のクラスを標的にするように設計することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、異なる遺伝子標的間で共有されるか、または特定の遺伝子標的にとってユニークである配列に対する相補性を有する配列を含有してもよい。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ分子を、いくつかの遺伝子間で相同性を有し、それによって、遺伝子ファミリー中のいくつかの遺伝子（例えば、異なる遺伝子アイソフォーム、スプライスバリアント、突然変異遺伝子など）を標的にするＲＮＡ配列の保存された領域を標的にするように設計することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ分子を、単一の遺伝子の特定のＲＮＡ配列にとってユニークである配列を標的にするように設計することができる。
【０２９４】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、接続核形成分子、例えば、ＣＴＣＦ、コヘシン、ＵＳＦ１、ＹＹ１、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質関連因子３（ＴＡＦ３）、ＺＮＦ１４３、またはアンカー配列媒介接続の形成を促進する別のポリペプチド、またはエピジェネティック改変剤、例えば、限定されるものではないが、ＤＮＡメチラーゼ（例えば、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＤＮＭＴＬ）、ＤＮＡ脱メチル化（例えば、ＴＥＴファミリーの酵素は、５−メチルシトシンの５−ヒドロキシメチルシトシンおよびより高度に酸化的な誘導体への酸化を触媒する）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３）、サーチュイン１、２、３、４、５、６、または７、リシン特異的ヒストンデメチラーゼ１（ＬＳＤ１）、ヒストン−リシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（Ｓｅｔｄｂ１）、真正染色質ヒストン−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９ａ）、ヒストン−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＳＵＶ３９Ｈ１）、ｚｅｓｔｅ相同体２のエンハンサー（ＥＺＨ２）、ウイルスリシンメチルトランスフェラーゼ（ｖＳＥＴ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＳＥＴ２）、タンパク質−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＳＭＹＤ２）、およびその他などの翻訳後修飾に関与する酵素中の配列を標的にする。一実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、デアセチラーゼタンパク質、例えば、サーチュイン１、２、３、４、５、６、または７を標的にする。一実施形態では、本開示は、接続核形成分子、例えば、ＣＴＣＦを標的にするＲＮＡｉを含む組成物を含む。
【０２９５】
ペプチドまたはタンパク質部分
一部の実施形態では、標的化部分は、ペプチドまたはタンパク質部分、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ成分タンパク質、接続核形成分子、ドミナントネガティブ接続核形成分子、エピジェネティック改変剤、またはその任意の組合せを含む。
【０２９６】
ペプチドまたはタンパク質部分は、限定されるものではないが、細胞外受容体、ニューロペプチド、ホルモンペプチド、ペプチド薬、毒性ペプチド、ウイルスまたは微生物ペプチド、合成ペプチド、およびアゴニストまたはアンタゴニストペプチドなどの受容体に結合する、ペプチドリガンド、抗体断片、または標的化アプタマーを含んでもよい。
【０２９７】
ペプチドまたはタンパク質部分は、線状または分枝状であってもよい。ペプチドまたはタンパク質部分は、約５〜約２００アミノ酸、約１５〜約１５０アミノ酸、約２０〜約１２５アミノ酸、約２５〜約１００アミノ酸、またはその間の任意の範囲の長さを有してもよい。
【０２９８】
本明細書に記載されている方法および組成物中で使用される例示的なペプチドまたはタンパク質部分としては、限定されるものではないが、ユビキチン、ユビキチンリガーゼ阻害剤としての二環式ペプチド、転写因子、トポイソメラーゼなどのＤＮＡおよびタンパク質修飾酵素、トポテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＭＴファミリーなどのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（例えば、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＤＮＭＴＬ）、タンパク質メチルトランスフェラーゼ（例えば、ウイルスリシンメチルトランスフェラーゼ（ｖＳＥＴ）、タンパク質−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＳＭＹＤ２）、デアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ、ＵＧ１）、ｚｅｓｔｅ相同体２のエンハンサー（ＥＺＨ２）、ＰＲＭＴ１、ヒストン−リシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（Ｓｅｔｄｂ１）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＳＥＴ２）、真正染色質ヒストン−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９ａ）、ヒストン−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＳＵＶ３９Ｈ１）、およびＧ９ａなどのヒストンメチルトランスフェラーゼ）、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３）、ＤＮＡ脱メチル化における役割を有する酵素（例えば、ＴＥＴファミリーの酵素は、５−メチルシトシンの５−ヒドロキシメチルシトシンおよびより高度に酸化的な誘導体への酸化を触媒する）、ＫＤＭ１Ａおよびリシン特異的ヒストンデメチラーゼ１（ＬＳＤ１）などのタンパク質デメチラーゼ、ＤＨＸ９などのヘリカーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ（例えば、サーチュイン１、２、３、４、５、６、または７）、キナーゼ、ホスファターゼ、臭化エチジウム、ｓｙｂｒグリーン、およびプロフラビンなどのＤＮＡ挿入剤、フェニルアラニンアルギニルβ−ナフチルアミドまたはキノリン誘導体のようなペプチド模倣体などの排出ポンプ阻害剤、核受容体活性化因子および阻害剤、プロテアソーム阻害剤、リソソーム蓄積症に関与するものなどの酵素の競合的阻害剤、タンパク質合成阻害剤、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ９、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ）、その１つまたは複数の融合物（例えば、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ、ｄＣａｓ９−ＡＰＯＢＥＣ、ｄＣａｓ９−ＵＧ１）、ならびにＫＲＡＢドメインなどの、タンパク質に由来する特定のドメインが挙げられる。
【０２９９】
ペプチドの一部の例としては、限定されるものではないが、蛍光タグまたはマーカー、抗原、抗体、単一ドメイン抗体などの抗体断片、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ＧＬＰ−２受容体２、コレシストキニンＢ（ＣＣＫＢ）およびソマトスタチン受容体などのリガンドおよび受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）またはイオンチャネルなどの特定の細胞表面受容体に結合するものなどのペプチド治療剤、天然の生物活性ペプチドに由来する合成またはアナログペプチド、抗微生物ペプチド、孔形成ペプチド、腫瘍標的化または細胞傷害性ペプチド、ならびにアポトーシス誘導ペプチドシグナルまたは光増感ペプチドなどの分解または自己破壊ペプチドが挙げられる。
【０３００】
本明細書に記載されているペプチドはまた、低分子抗原結合ペプチド、例えば、一本鎖抗体、ナノボディ（例えば、Steelandら、２０１６年、Nanobodies as therapeutics:big opportunities for small antibodies. Drug Discov Today: ２１巻（７号）：１０７６〜１１３頁を参照されたい）などの抗原結合抗体または抗体様断片を含んでもよい。そのような低分子抗原結合ペプチドは、細胞質抗原、核抗原、オルガネラ内抗原に結合してもよい。
【０３０１】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されているタンパク質のいずれか１つを含む細胞または組織を含む。
【０３０２】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されているタンパク質を含む医薬組成物を含む。
【０３０３】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されているタンパク質を含む組成物を投与することによって遺伝子の発現をモジュレートする方法を含む。
【０３０４】
ＤＮＡ結合ドメイン
一部の実施形態では、標的化部分は、タンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含む。ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡへの結合において重要な役割を果たす異なる構造モチーフを有する。
【０３０５】
ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフは、リプレッサータンパク質における共通のＤＮＡ認識モチーフである。このモチーフは、１つはＤＮＡを認識し（いわゆる認識ヘリックス）、側鎖は結合の特異性を与える２つのヘリックスを含む。それらは発生プロセスを調節するタンパク質において共通である。時には、１つを超えるタンパク質が、同じ配列について競合するか、または同じＤＮＡ断片を認識することがある。それらは、それぞれ、Ｈ結合、塩架橋およびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ相互作用による、同じ配列、またはＤＮＡコンフォメーションに対するその親和性において異なっていてもよい。
【０３０６】
ＨｈＨ構造モチーフを有するＤＮＡ結合タンパク質は、タンパク質骨格窒素と、ＤＮＡリン酸基との間の水素結合の形成により生じる非配列特異的ＤＮＡ結合に関与してもよい。
【０３０７】
ＨＬＨ構造モチーフを有するＤＮＡ結合タンパク質は、転写調節タンパク質であり、原理的には、様々な発生プロセスと関連する。このモチーフは、残基に関して、他の２つのモチーフよりも長い。これらのタンパク質の多くは相互作用して、ホモおよびヘテロ二量体を形成する。この構造モチーフは、２つの長いヘリックス領域から構成され、Ｎ末端ヘリックスはＤＮＡに結合するが、ループ領域はタンパク質を二量体化させる。
【０３０８】
一部の転写因子では、ＤＮＡとの二量体結合部位は、ロイシンジッパーを形成する。このモチーフは、それぞれのサブユニットに由来する１つが互いに相互作用する２つの両親媒性ヘリックスを含み、左巻きのコイルドコイルスーパー二次構造をもたらす。ロイシンジッパーは、１つのヘリックス中の規則的な間隔のロイシン残基と、隣接するヘリックスに由来するロイシンとの相互嵌合である。多くの場合、ロイシンジッパーに関与するヘリックスは、残基ａおよびｄが疎水性であり、他は全て親水性である７個の配列（ａｂｃｄｅｆｇ）を示す。ロイシンジッパーモチーフは、ホモまたはヘテロ二量体形成を媒介することができる。
【０３０９】
一部の真核転写因子は、Ｚｎ＋＋イオンが２個のＣｙｓおよび２個のＨｉｓ残基によって配位される、Ｚｎ−フィンガーと呼ばれるユニークなモチーフを示す。この転写因子は、化学量論ββ’αを有する三量体を含む。Ｚｎ＋＋配位の見かけの効果は、疎水性コア残基の代わりに小さいループ構造の安定化である。それぞれのＺｎ−フィンガーは、コンフォメーション的に同一の様式で、二重らせんの主溝中の連続する３塩基対セグメントと相互作用する。タンパク質−ＤＮＡ相互作用は、２つの因子：（ｉ）α−ヘリックスとＤＮＡセグメントとの、多くの場合、Ａｒｇ残基とグアニン塩基とのＨ結合相互作用、（ｉｉ）ＤＮＡリン酸骨格、多くの場合、ＡｒｇおよびＨｉｓとのＨ結合相互作用によって決定される。代替的なＺｎ−フィンガーモチーフは、６個のＣｙｓを用いてＺｎ＋＋をキレートする。
【０３１０】
ＤＮＡ結合タンパク質はまた、クラスＩＩ開始因子ＴＦＩＩＤの成分として初めて同定された、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質を含む。それらは、それらのそれぞれにおいてサブユニットとして作用する３つ全部の核ＲＮＡポリメラーゼによる転写に参画する。ＴＢＰの構造は、８９〜９０アミノ酸の２つのα／β構造ドメインを示す。Ｃ末端またはコア領域は、高い親和性で、副溝決定基を認識し、ＤＮＡの湾曲を促進するＴＡＴＡコンセンサス配列（ＴＡＴＡａ／ｔＡａ／ｔ、配列番号ｘｘ）に結合する。ＴＢＰは、分子サドルに似ている。結合側は、１０鎖逆平行βシートの中央の８鎖と並ぶ。上表面は、４個のα−ヘリックスを含有し、転写機構の様々な成分に結合する。
【０３１１】
ＤＮＡは、窒素塩基の形態で塩基特異性を提供する。リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギンおよびグルタミンなどの塩基性残基を含む、アミノ酸のＲ基は、塩基対のＮＨ２およびＸ＝Ｏ基が、好ましくは、グルタミン、アスパラギン、アルギニンおよびリシンのアミノ酸残基と水素結合を形成することができる、Ａ：Ｔ塩基対のアデニン、およびＧ：Ｃ塩基対のグアニンと容易に相互作用することができる。
【０３１２】
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、転写因子である。転写因子（ＴＦ）は、塩基配列の特異的認識を担うＤＮＡ結合ドメインおよび転写を活性化するか、または抑制することができる１つまたは複数のエフェクタードメインを含有するモジュラータンパク質であってよい。ＴＦは、クロマチンと相互作用し、コアクチベーターまたはコリプレッサーとして働くタンパク質複合体を動員する。
【０３１３】
遺伝子編集システム
一部の実施形態では、標的化部分（例えば、部位特異的標的化部分）は、遺伝子編集システムの１つまたは複数の成分を含む。本明細書を読む当業者であれば理解できるように、また、本明細書でさらに説明されるように、遺伝子編集システムの成分を、限定されるものではないが、遺伝子編集などの様々な状況において使用することができる。例えば、そのような成分を使用して、標的アンカー配列を物理的に改変する、遺伝的に改変する、および／またはエピジェネティックに改変する薬剤を標的にすることができる。
一部の実施形態では、標的化部分は、置換、付加および／または欠失のためにアンカー配列媒介接続の１つまたは複数のヌクレオチドを標的にする。例示的な遺伝子編集システムとしては、クラスター化調節介在ショートパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）システム、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および転写活性化因子様エフェクターに基づくヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられる。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲに基づく方法は、例えば、Gajら、Trends Biotechnol. ３１巻、７号（２０１３年）：３９７〜４０５頁に記載されている；遺伝子編集のＣＲＩＳＰＲ法は、例えば、Guanら、Application of CRISPR-Cas system ingene therapy: Pre-clinical progress in animal model. DNA Repair ２０１６年７月３０日［印刷前に電子出版された］；Zhengら、Precise gene deletion and replacementusing the CRISPR/Cas9 system in human cells. BioTechniques、５７巻、３号、２０１４年９月、１１５〜１２４頁に記載されている。
【０３１４】
例えば、一部の実施形態では、部位特異的標的化部分は、本明細書にさらに記載されているような、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）および部位特異的ガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、本明細書にさらに記載されているような、酵素的に不活性な、例えば、ｄＣａｓ９である。
【０３１５】
一実施形態では、本明細書に記載されている方法および組成物を、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が遺伝子編集のためにクラスター化調節介在ショートパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムにおいて使用されるＣＲＩＳＰＲに基づく遺伝子編集と共に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲシステムは、細菌および古細菌において元々発見された適応防御システムである。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＲＩＳＰＲ関連または「Ｃａｓ」エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）と呼ばれるＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼを使用して、外来ＤＮＡを切断する。典型的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、エンドヌクレアーゼは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ配列を標的にする配列特異的な非コード「ガイドＲＮＡ」によって標的ヌクレオチド配列（例えば、配列編集されるゲノム中の部位）に方向付けられる。３つのクラス（Ｉ〜ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲシステムが同定されている。クラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムは、単一のＣａｓエンドヌクレアーゼ（複数のＣａｓタンパク質よりもむしろ）を使用する。１つのクラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）、およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）などのＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に対応する、典型的には、約２０ヌクレオチドのＲＮＡ配列である「ガイドＲＮＡ」を含有する。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに結合して、ＲＮａｓｅＩＩＩによって切断され、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドをもたらす部分的に二本鎖の構造を形成する領域も含有する。次いで、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに、標的ＤＮＡ配列を認識し、これを切断するように指令する。標的ＤＮＡ配列は、一般的には、所与のＣａｓエンドヌクレアーゼに特異的である「プロトスペーサー隣接モチーフ」（「ＰＡＭ」）に隣接していなければならない；しかしながら、ＰＡＭ配列は、所与のゲノム全体にわたって出現する。様々な原核生物種から同定されたＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ユニークなＰＡＭ配列要件を有する；ＰＡＭ配列の例としては、５’−ＮＧＧ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、５’−ＮＮＡＧＡＡ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ１）、５’−ＮＧＧＮＧ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ３）、および５’−ＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ）が挙げられる。一部のエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＧリッチＰＡＭ部位、例えば、５’−ＮＧＧと会合し、ＰＡＭ部位から３ヌクレオチド上流（５’側）の位置で標的ＤＮＡの平滑末端切断を実行する。別のクラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓ９よりも小さいＶ型エンドヌクレアーゼＣｐｆ１を含む；例としては、ＡｓＣｐｆ１（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．に由来する）およびＬｂＣｐｆ１（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｓｐ．に由来する）が挙げられる。Ｃｐｆ１結合ＣＲＩＳＰＲアレイは、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とすることなく、成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる；換言すれば、Ｃｐｆ１システムは、標的ＤＮＡ配列を切断するためにＣｐｆ１ヌクレアーゼおよびｃｒＲＮＡのみを必要とする。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ＴリッチＰＡＭ部位、例えば、５’−ＴＴＮと会合している。Ｃｐｆ１は、５’−ＣＴＡ  ＰＡＭモチーフを認識することもできる。Ｃｐｆ１は、４または５ヌクレオチドの５’突出部を有するオフセットまたは交互の二本鎖切断を導入すること、例えば、コード鎖上のＰＡＭ部位から１８ヌクレオチド下流（３’側）および相補鎖上のＰＡＭ部位から２３ヌクレオチド下流の位置で５−ヌクレオチドのオフセットまたは交互切断を有する標的ＤＮＡを切断することにより、標的ＤＮＡを切断する；そのようなオフセット切断の結果生じる５−ヌクレオチド突出部は、平滑末端に切断されたＤＮＡでの挿入よりも、相同組換えによるＤＮＡ挿入による、より正確なゲノム編集を可能にする。例えば、Zetscheら（２０１５年）、Cell、１６３巻：７５９〜７７１頁を参照されたい。
【０３１６】
様々なＣＲＩＳＰＲ結合（Ｃａｓ）遺伝子またはタンパク質を、本開示の方法において使用することができ、Ｃａｓタンパク質の選択は、方法の特定の条件に依存するであろう。Ｃａｓタンパク質の特定例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１、またはＣ２Ｃ３などのクラスＩＩシステムが挙げられる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、様々な原核生物種のいずれかに由来するものであってもよい。一部の実施形態では、特定のＣａｓタンパク質、例えば、特定のＣａｓ９タンパク質が、特定のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識するために選択される。一部の実施形態では、標的化部分は、酵素、例えば、Ｃａｓ９などの配列標的化ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質を、細菌もしくは古細菌から取得するか、または公知の方法を使用して合成することができる。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌に由来するものであってもよい。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｃｒｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、またはＭａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒに由来するものであってもよい。一部の実施形態では、２つもしくはそれよりも多くの異なるＣａｓタンパク質、または２つもしくはそれよりも多くのＣａｓタンパク質をコードする核酸を、細胞、受精卵、胚、または動物中に導入して、例えば、同じ、類似する、または異なるＰＡＭモチーフを含む部位の認識および改変を可能にすることができる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を、ヌクレアーゼ、例えば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９を脱活性化し、転写活性化因子またはリプレッサー、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｏｌ、ＶＰ６４のω−サブユニット、ｐ６５、ＫＲＡＢ、またはＳＩＤ４Ｘの活性化ドメインを動員して、エピジェネティック改変、例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼおよびデメチラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼおよびＤＮＡ脱メチル化における役割を有する酵素（例えば、ＴＥＴファミリーの酵素は、５−メチルシトシンの５−ヒドロキシメチルシトシンおよびより高度に酸化的な誘導体への酸化を触媒する）を誘導するように改変する。
【０３１７】
遺伝子編集のために、ＣＲＩＳＰＲアレイを、所望の標的ＤＮＡ配列に対応する１つまたは複数のガイドＲＮＡ配列を含有するように設計することができる；例えば、Congら（２０１３年）、Science、３３９巻：８１９〜８２３頁；Ranら（２０１３年）、Nature Protocols、８巻：２２８１〜２３０８頁を参照されたい。ＤＮＡ切断が起こるためには、少なくとも約１６または１７ヌクレオチドのｇＲＮＡ配列がＣａｓ９によって必要とされる；Ｃｐｆ１については、検出可能なＤＮＡ切断を達成するためには、少なくとも約１６ヌクレオチドのｇＲＮＡ配列が必要とされる。
【０３１８】
野生型Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡによって標的化される特定のＤＮＡ配列で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するが、改変された機能性を有するいくつかのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが利用可能であり、例えば、「ニッカーゼ」型のＣａｓ９は、一本鎖切断のみを生成する；触媒的に不活性なＣａｓ９（「ｄＣａｓ９」）は、標的ＤＮＡを切断しないが、立体障害によって転写に干渉する。ｄＣａｓ９を異種エフェクターとさらに融合させて、標的遺伝子の発現を抑制する（ＣＲＩＳＰＲｉ）または活性化する（ＣＲＩＳＰＲａ）ことができる。例えば、Ｃａｓ９を、転写サイレンサー（例えば、ＫＲＡＢドメイン）または転写活性化因子（例えば、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合物）に融合することができる。ＦｏｋＩヌクレアーゼに融合した触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）（「ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩ」）を使用して、２つのｇＲＮＡと相同な標的配列でＤＳＢを生成することができる。例えば、Ａｄｄｇｅｎｅリポジトリー（Ａｄｄｇｅｎｅ、７５  Ｓｉｄｎｅｙ  Ｓｔ．、Ｓｕｉｔｅ  ５５０Ａ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ  ０２１３９；ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ／）に開示され、そこから公共的に入手可能ないくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドを参照されたい。それぞれ別々のガイドＲＮＡによって指令される、２つの別々の二本鎖切断を導入する「ダブルニッカーゼ」Ｃａｓ９は、Ranら（２０１３年）、Cell、１５４巻：１３８０〜１３８９頁により、より正確なゲノム編集を達成するものとして記載されている。
【０３１９】
真核生物の遺伝子を編集するためのＣＲＩＳＰＲ技術は、米国特許出願公開第２０１６／０１３８００８Ａ１号および第ＵＳ２０１５／０３４４９１２Ａ１号、ならびに米国特許第８，６９７，３５９号、第８，７７１，９４５号、第８，９４５，８３９号、第８，９９９，６４１号、第８，９９３，２３３号、第８，８９５，３０８号、第８，８６５，４０６号、第８，８８９，４１８号、第８，８７１，４４５号、第８，８８９，３５６号、第８，９３２，８１４号、第８，７９５，９６５号、および第８，９０６，６１６号に開示されている。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼならびに対応するガイドＲＮＡおよびＰＡＭ部位は、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２４３Ａ１号に開示されている。
【０３２０】
一部の実施形態では、所望のゲノム改変は、標的ヌクレオチド配列中の１つまたは複数の二本鎖ＤＮＡ切断がＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡによって生成され、相同組換え機構を使用して切断が修復される（「相同組換え修復」）、相同組換えを含む。そのような実施形態では、二本鎖切断に挿入される、またはノックインされる所望のヌクレオチド配列をコードするドナー鋳型を、細胞または対象に提供する；好適な鋳型の例としては、一本鎖ＤＮＡ鋳型および二本鎖ＤＮＡ鋳型（例えば、本明細書に記載されているポリペプチドに連結される）が挙げられる。一般に、約５０ヌクレオチド未満の領域にわたるヌクレオチド変化をコードするドナー鋳型は、一本鎖ＤＮＡの形態で提供される；より大きいドナー鋳型（例えば、１００ヌクレオチドを超える）は、二本鎖ＤＮＡプラスミドとして提供されることが多い。一部の実施形態では、ドナー鋳型は、所望の相同組換え修復を達成するには十分であるが、所与の期間の後（例えば、１または複数の細胞分裂周期の後）に細胞または対象中で持続しない量で細胞または対象に提供される。一部の実施形態では、ドナー鋳型は、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０個、またはそれよりも多くのヌクレオチドだけ標的ヌクレオチド配列（例えば、相同内因性ゲノム領域）と異なるコアヌクレオチド配列を有する。このコア配列は、「相同性アーム」または標的ヌクレオチド配列と高い配列同一性を示す領域が隣接する；実施形態では、高い同一性の領域は、コア配列のそれぞれの側に少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７５０、または少なくとも１０００個のヌクレオチドを含む。ドナー鋳型が一本鎖ＤＮＡの形態にある一部の実施形態では、コア配列は、コア配列のそれぞれの側に少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、または少なくとも１００個のヌクレオチドを含む相同性アームが隣接する。ドナー鋳型が二本鎖ＤＮＡの形態にある実施形態では、コア配列は、コア配列のそれぞれの側に少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、または少なくとも１０００個のヌクレオチドを含む相同性アームが隣接する。一実施形態では、２つの別々の二本鎖切断を、「ダブルニッカーゼ」Ｃａｓ９（Ranら（２０１３年）、Cell、１５４巻：１３８０〜１３８９頁を参照されたい）を用いて細胞または対象の標的ヌクレオチド配列中に導入した後、ドナー鋳型を送達する。
【０３２１】
一部の実施形態では、組成物は、ｇＲＮＡおよび標的化されたヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、例えば、野生型Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９（例えば、Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ）、ｄｅａｄ  Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、ｅＳｐＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１、もしくはＣ２Ｃ３、またはそのようなヌクレアーゼをコードする核酸に連結された本明細書に記載されているポリペプチドを含む。ヌクレアーゼおよびｇＲＮＡの選択は、標的化された突然変異がヌクレオチドの欠失、置換、または付加であるかどうか、例えば、標的化された配列に対するヌクレオチドの欠失、置換、または付加であるかどうかによって決定される。（１つまたは複数の）エフェクタードメイン（例えば、限定されるものではないが、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＫＲＡＢドメイン、Ｔｅｔ１、ｐ３００、ＶＰ６４および上記の融合物を含むエピゲノムエディター）の全部または一部（例えば、生物活性部分）に繋ぎ止められた触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼ、例えば、ｄｅａｄ  Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９、例えば、Ｄ１０Ａ；Ｈ８４０Ａ）の融合は、１つまたは複数のＲＮＡ配列（例えば、限定されるものではないが、本明細書に記載されている亜鉛フィンガーアレイ、ｓｇＲＮＡ、ＴＡＬアレイ、ペプチド核酸などのＤＮＡ認識エレメント）により特定のＤＮＡ部位に組成物を誘導するためのポリペプチドに連結して、１つまたは複数の標的核酸配列の活性および／または発現をモジュレートする（例えば、ＤＮＡ配列をメチル化または脱メチル化する）ことができるキメラタンパク質を作出する。
【０３２２】
本明細書で使用される場合、「エフェクタードメインの生物活性部分」は、エフェクタードメインの機能を維持する（例えば、完全に、部分的に、最小限に）ポーション（例えば、「最小」または「コア」ドメイン）である。一部の実施形態では、ｄＣａｓ９と、エピジェネティック改変剤（ＤＮＡメチラーゼまたはＤＮＡ脱メチル化における役割を有する酵素、例えば、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ阻害剤、その組合せ、ＴＥＴファミリー酵素、タンパク質アセチルトランスフェラーゼもしくはデアセチラーゼ、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ／ＫＲＡＢ、ｄＣａｓ９／ＶＰ６４など）の１つまたは複数のエフェクタードメインの全部または一部との融合は、ポリペプチドに連結され、本明細書に記載されている方法において有用であるキメラタンパク質を作出する。したがって、一部の実施形態では、ｄＣａｓ９−メチラーゼ融合物をコードする核酸を、ポリペプチドに連結し、融合物をアンカー配列（ＣＴＣＦ結合モチーフなど）に標的化する部位特異的ｇＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドと共に、それを必要とする対象に投与することによって、アンカー配列が核形成タンパク質に結合する親和性または能力を低下させる。他の一部の実施形態では、ｄＣａｓ９−酵素融合物をコードする核酸を、融合物を接続アンカー配列（ＣＴＣＦ結合モチーフなど）に標的化する部位特異的ｇＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドと共にポリペプチドに連結し、それを必要とする対象に全てを投与することによって、アンカー配列が核形成タンパク質に結合する親和性または能力を増大させる。一部の実施形態では、１つまたは複数のメチルトランスフェラーゼ、または脱メチル化と関連する酵素のエフェクタードメインの全部または一部を、不活性ヌクレアーゼ、例えば、ｄＣａｓ９と融合し、ポリペプチドに連結する。本明細書に記載されている方法および組成物に適応可能である例示的なｄＣａｓ９融合法および組成物は、公知であり、例えば、Kearnsら、Functional annotation of nativeenhancers with a Cas9-histone demethylase fusion. Nature Methods １２巻、４０１〜４０３頁（２０１５年）；およびMcDonaldら、Reprogrammable CRISPR/Cas9-basedsystem for inducing site-specific DNA methylation. Biology Open ２０１６年：doi:10.1242/bio.019067に記載されている。
【０３２３】
他の態様では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれよりも多くのメチルトランスフェラーゼ、またはＤＮＡ脱メチル化における役割を有する酵素のエフェクタードメイン（全部もしくは生物活性部分）を、ｄＣａｓ９と融合し、ポリペプチドに連結する。本明細書に記載されているキメラタンパク質はまた、本明細書に記載されているリンカー、例えば、アミノ酸リンカーを含んでもよい。一部の態様では、リンカーは、２つまたはそれよりも多くのアミノ酸、例えば、１つまたは複数のＧＳ配列を含む。一部の態様では、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９）と、２つまたはそれよりも多くのエフェクタードメイン（例えば、ＤＮＡメチラーゼまたはＤＮＡ脱メチル化における役割を有する酵素の）との融合物は、ドメイン間に１つまたは複数の介在リンカー（例えば、ＧＳリンカー）を含み、ポリペプチドに連結される。一部の態様では、ｄＣａｓ９を、介在リンカーを含む複数（例えば、２〜５、例えば、２、３、４、５個）のエフェクタードメインと融合し、ポリペプチドに連結する。
【０３２４】
一部の実施形態では、標的化部分は、上記のＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数の成分を含む。
【０３２５】
例えば、一部の実施形態では、標的化部分は、標的アンカー配列を含む核酸にハイブリダイズする、および／または標的アンカー配列を含む核酸の相補体と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である配列を有する標的化ドメインを含むｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、その標的化ドメインが非標的アンカー配列を含む少なくとも１つの核酸にハイブリダイズしない部位特異的ｇＲＮＡである。
一部の実施形態では、部位特異的ｇＲＮＡは、構造Ｉ：
（Ｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ
（式中、ＸおよびＺは、それぞれ、標的ＣＴＣＦ結合モチーフのための５’および３’部位特異的標的化配列であり、Ｙは、
（ａ）配列番号１の配列と相補的なＲＮＡ配列；
（ｂ）配列番号１の配列と相補的なＲＮＡ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるＲＮＡ配列；
（ｃ）少なくとも１、２、３、４、５個であるが、１５、１２または１０個未満のヌクレオチドの付加、置換または欠失を有する配列番号１の配列と相補的なＲＮＡ配列；
（ｄ）配列番号２の配列と相補的なＲＮＡ配列；
（ｅ）配列番号２の配列と相補的なＲＮＡ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるＲＮＡ配列；
（ｆ）少なくとも１、２、３、４、５個であるが、１５、１２または１０個未満のヌクレオチドの付加、置換または欠失を有する配列番号２の配列と相補的なＲＮＡ配列
から選択される）
の配列を含む。
【０３２６】
一部の実施形態では、ＸおよびＺはそれぞれ、２〜５０ヌクレオチド長、例えば、２〜２０、２〜１０、２〜５ヌクレオチド長である。
【０３２７】
一部の実施形態では、がん遺伝子、腫瘍抑制因子、またはヌクレオチド反復と関連する疾患と関連するＣＴＣＦ結合モチーフを特異的に標的にするｇＲＮＡを含む組成物または方法が記載される。例えば、CTCFBSDB 2.0: Database For CTCF Binding Motifs And GenomeOrganization。
【０３２８】
一部の実施形態では、本明細書に記載されているガイドＲＮＡを含む医薬組成物が提供される。
【０３２９】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法は、上記の１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲシステム成分を、そのような成分を本明細書に記載されているポリペプチドに連結することによって、対象、例えば、対象の細胞または組織の核に送達する方法を含む。
【０３３０】
接続核形成分子
一部の実施形態では、標的化部分は、接続核形成分子、接続核形成分子をコードする核酸、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、第１のアンカー配列に結合した第１の接続核形成分子、非連続的な第２のアンカー配列に結合した第２の接続核形成分子、および第１と第２の接続核形成分子の間の会合によって媒介される。一部の実施形態では、接続核形成分子は、例えば、競合的結合によって、内因性接続核形成分子の、その結合部位への結合を破壊することができる。
【０３３１】
接続核形成分子は、例えば、ＣＴＣＦ、コヘシン、ＵＳＦ１、ＹＹ１、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質関連因子３（ＴＡＦ３）、ＺＮＦ１４３結合モチーフ、またはアンカー配列媒介接続の形成を促進する別のポリペプチドであってもよい。接続核形成分子は、内因性ポリペプチドまたは他のタンパク質、例えば、転写因子、例えば、自己免疫調節因子（ＡＩＲＥ）、別の因子、例えば、Ｘ−不活化特異的転写物（ＸＩＳＴ）、または例えば、配列認識のために亜鉛フィンガー、ロイシンジッパーもしくはｂＨＬＨドメインを有する、目的の特定のＤＮＡ配列を認識するように操作される、操作されたポリペプチドであってもよい。接続核形成分子は、アンカー配列媒介接続の内部または周囲でのＤＮＡ相互作用をモジュレートすることができる。例えば、接続核形成分子は、アンカー配列媒介接続の形成または破壊を変化させるアンカー配列に他の因子を動員することができる。
【０３３２】
接続核形成分子はまた、ホモまたはヘテロ二量体化のための二量体化ドメインを有してもよい。例えば、内因性の、および操作された、１つまたは複数の接続核形成分子は、相互作用して、アンカー配列媒介接続を形成してもよい。一部の実施形態では、接続核形成分子は、アンカー配列媒介接続を安定化するための安定化ドメイン、例えば、凝集相互作用ドメインをさらに含むように操作される。一部の実施形態では、接続核形成分子は、標的配列に結合するように操作され、例えば、標的配列結合親和性がモジュレートされる。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続内のアンカー配列に対する結合親和性が選択された接続核形成分子が選択または操作される。
【０３３３】
接続核形成分子およびその対応するアンカー配列を、ＣＴＣＦ中に不活化突然変異を担持する細胞およびＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅまたは３Ｃに基づく方法、例えば、Ｈｉ−Ｃまたは高効率配列決定の使用により同定して、ＣＴＣＦの非存在下で、トポロジー的に関連するドメイン、例えば、遠位ＤＮＡ領域または遺伝子座間のトポロジー的相互作用を検査することができる。長距離ＤＮＡ相互作用も同定することができる。さらなる分析は、ベイトと会合する複合体を同定するための、コヘシン、ＹＹ１またはＵＳＦ１、ＺＮＦ１４３結合モチーフ、およびＭＳなどのベイトを使用するＣｈＩＡ−ＰＥＴ分析を含んでもよい。
【０３３４】
一部の実施形態では、１つまたは複数の接続核形成分子は、参照値、例えば、変更の非存在下でのアンカー配列に対する結合親和性よりも高い、または低いアンカー配列に対する結合親和性を有する。
【０３３５】
一部の実施形態では、接続核形成分子、例えば、アンカー配列媒介接続内のアンカー配列に対する結合親和性をモジュレートして、アンカー配列媒介接続とのその相互作用を変化させる。
【０３３６】
一部の実施形態では、
【０３３７】
異種部分
一部の実施形態では、本明細書に記載されている組成物、薬剤、および／または融合分子は、１つまたは複数の異種部分を含んでもよい。異種部分は、エフェクター（例えば、薬物、低分子）、タグ（例えば、フルオロフォア、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄなどの光感受性薬剤）、または本明細書に記載されている編集部分もしくは標的化部分のいずれかであってもよい。
【０３３８】
一部の実施形態では、異種部分を、本明細書に記載されている膜透過移行ポリペプチドに連結してもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載されている膜透過移行ポリペプチドは、１つまたは複数の異種部分に連結される。
【０３３９】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている異種部分のいずれか１つを含む細胞または組織を含む。
【０３４０】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されている異種部分を含む医薬組成物を含む。
【０３４１】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されている異種部分を含む組成物を投与することによって遺伝子の発現をモジュレートする方法を含む。
【０３４２】
一態様では、異種部分は、クロマチンの２次元構造をモジュレートする（すなわち、その２次元表示を変化させる方法でクロマチンの構造をモジュレートする）標的化部分のいずれかである。
【０３４３】
一実施形態では、異種部分は、低分子（例えば、２０００ダルトン未満の分子量を有するペプチド模倣体もしくは低分子有機分子）、ペプチドもしくはポリペプチド（例えば、非ＡＢＸｎＣポリペプチド、例えば、抗体もしくはその抗原結合性断片）、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、改変ＤＮＡもしくはＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、タンパク質をコードする治療的ｍＲＮＡ）、ナノ粒子、アプタマー、またはＰＫ／ＰＤが低い薬剤である。
【０３４４】
一部の実施形態では、異種部分は、特異的タンパク質分解または酵素的切断により（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ、トロンビン、第Ｘａ因子またはエンテロペプチダーゼにより）（例えば、投与後に）ポリペプチドから切断され得る。
【０３４５】
エフェクター部分
異種部分は、エフェクター活性を有するエフェクター部分であってもよい。エフェクター部分は、生物活性をモジュレートする、例えば、酵素活性、遺伝子発現、細胞シグナル伝達、および細胞または臓器機能を増加または減少させることができる。エフェクター活性はまた、転写または翻訳などの、調節因子の活性をモジュレートするための結合調節タンパク質を含んでもよい。エフェクター活性はまた、本明細書に記載されている活性化因子または阻害剤（または「ネガティブエフェクター」）機能を含んでもよい。例えば、異種部分は、酵素における基質親和性の増加を誘発することによって酵素活性を誘導してもよく、例えば、フルクトース２，６−ビスリン酸は、ホスホフルクトキナーゼ１を活性化し、インスリンに応答して解糖の速度を増大させる。別の例では、異種部分は、受容体への基質結合を阻害し、その活性化を阻害してもよく、例えば、ナルトレキソンおよびナロキソンは、それらを活性化することなくオピオイド受容体に結合し、オピオイドに結合する受容体の能力を遮断する。エフェクター活性はまた、タンパク質の安定性／分解および／または転写物の安定性／分解をモジュレートすることを含んでもよい。例えば、タンパク質を、ポリペプチドコファクター、ユビキチンによる分解のために、タンパク質上に標的化して、それらを分解のためにマークすることができる。別の例では、異種部分は、酵素の活性部位を遮断することによって酵素活性を阻害し、例えば、メトトレキサートは、天然の基質よりも１０００倍固くジヒドロ葉酸リダクターゼに結合し、ヌクレオチド塩基合成を阻害する、ジヒドロ葉酸リダクターゼ酵素のためのコエンザイムである、テトラヒドロ葉酸の構造的アナログである。
【０３４６】
一部の実施形態では、組成物は、アンカー配列に結合し、アンカー配列により媒介される接続の形成をモジュレートするエフェクター部分に作動可能に連結した標的化部分（例えば、ｇＲＮＡ、膜透過移行ポリペプチド）を含む。
【０３４７】
一部の実施形態では、エフェクター分子は、化学物質、例えば、シトシン（Ｃ）またはアデニン（Ａ）をモジュレートする化学物質（例えば、亜硫酸水素Ｎａ、亜硫酸水素アンモニウム）である。一部の実施形態では、エフェクター部分は、酵素活性（メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）、デアミナーゼ）を有する。一部の実施形態では、エフェクター部分は、アンカー配列媒介接続の形成を立体的に障害する［例えば、膜透過移行ポリペプチド＋ナノ粒子（ｄｅｆ：１〜１００ｎｍ）］。
【０３４８】
エフェクター活性を有するエフェクター部分は、本明細書に記載されている低分子、ペプチド、核酸、ナノ粒子、アプタマー、およびＰＫ／ＰＤが低い薬剤のいずれか１つであってもよい。
【０３４９】
ネガティブエフェクター部分
一部の実施形態では、エフェクターは、阻害剤または「ネガティブエフェクター」である。アンカー配列媒介接続の形成をモジュレートするネガティブエフェクター部分の文脈において、一部の実施形態では、ネガティブエフェクター部分は、ネガティブエフェクター部分が存在しない場合と比較して存在する場合に、内因性核形成ポリペプチドの二量体化が減少することにより特徴付けられる。例えば、一部の実施形態では、ネガティブエフェクター部分は、内因性核形成ポリペプチドの二量体化ドメインのバリアント、またはその二量体化部分であるか、またはそれを含む。
【０３５０】
ドミナントネガティブ接続核形成分子
例えば、ある特定の実施形態では、アンカー配列媒介接続を、ドミナントネガティブエフェクター、例えば、アンカー配列（例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフ）を認識し、これに結合するが、不活性（例えば、突然変異した）二量体化ドメイン、例えば、機能的アンカー配列媒介接続を形成することができない二量体化ドメインを有するタンパク質の使用によって変化させる（例えば、破壊する）。例えば、ＣＴＣＦの亜鉛フィンガードメインを、それが特定のアンカー配列に結合する（隣接する核酸を認識する亜鉛フィンガーを付加することにより）が、ホモ二量体化ドメインが、操作されたＣＴＣＦと、内因性形態のＣＴＣＦとの相互作用を防止するために変化するように変化させることができる。このタンパク質をコードするＤＮＡを、それを必要とする対象に投与することができる。
【０３５１】
一部の実施形態では、組成物は、標的アンカー配列媒介接続内のアンカー配列に対する選択された結合親和性を有する合成接続核形成分子を含む（結合親和性は、標的アンカー配列と会合する内因性接続核形成分子の親和性よりも、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより高いもしくは低いものであってもよい。合成接続核形成分子は、内因性接続核形成分子に対して３０〜９０％、３０〜８５％、３０〜８０％、３０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％のアミノ酸配列同一性を有してもよい）。接続核形成分子は、競合的結合などにより、内因性接続核形成分子の、そのアンカー配列への結合を破壊することができる。一部のさらなる実施形態では、接続核形成分子を、アンカー配列媒介接続内の新規アンカー配列に結合するように操作する。
【０３５２】
一部の実施形態では、ドミナントネガティブエフェクターは、特定のＤＮＡ配列（例えば、配列特異性を付与する配列が隣接するアンカー配列、ＣＴＣＦアンカー配列）を認識するドメイン、およびアンカー配列の近くに立体的存在を提供する第２のドメインを有する。第２のドメインは、ドミナントネガティブ接続核形成分子もしくはその断片、接続核形成分子配列認識に干渉するポリペプチド（例えば、ペプチド／核酸もしくはＰＮＡのアミノ酸骨格）、立体干渉を付与する低分子にライゲーションされた核酸配列、またはＤＮＡ認識エレメントと立体的遮断剤との任意の他の組合せを含んでもよい。
【０３５３】
エピジェネティック改変剤
一部の実施形態では、異種部分は、エピジェネティック改変剤である。本明細書に記載されている方法および組成物において有用なエピジェネティック改変剤としては、例えば、ＤＮＡメチル化、ヒストンアセチル化、およびＲＮＡ関連サイレンシングに影響する薬剤が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法は、エピジェネティック酵素（例えば、エピジェネティックマーク、例えば、アセチル化および／またはメチル化を生成する、または除去する酵素）の配列特異的標的化を含む。本明細書に記載されているＣＲＩＳＰＲ法を使用してアンカー配列に標的化することができる例示的なエピジェネティック酵素としては、ＤＮＡメチラーゼ（例えば、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＤＮＭＴＬ）、ＤＮＡ脱メチル化（例えば、ＴＥＴファミリー）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３）、サーチュイン１、２、３、４、５、６、または７、リシン特異的ヒストンデメチラーゼ１（ＬＳＤ１）、ヒストン−リシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（Ｓｅｔｄｂ１）、真正染色質ヒストン−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９ａ）、ヒストン−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＳＵＶ３９Ｈ１）、ｚｅｓｔｅ相同体２のエンハンサー（ＥＺＨ２）、ウイルスリシンメチルトランスフェラーゼ（ｖＳＥＴ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＳＥＴ２）、およびタンパク質−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＳＭＹＤ２）が挙げられる。そのようなエピジェネティック改変剤の例は、例えば、de Grooteら、Nuc. Acids Res.（２０１２年）：１〜１８頁に記載されている。
【０３５４】
一部の実施形態では、本明細書において有用なエピジェネティック改変剤は、参照により本明細書に組み込まれる、Koferleら、Genome Medicine ７巻５９号（２０１５年）：１〜３頁（例えば、表１）に記載された構築物を含む。
【０３５５】
タグ付けまたはモニタリング部分
異種部分は、本明細書に記載されているポリペプチドまたはポリペプチドに連結された別の異種部分を標識またはモニタリングするためのタグであってもよい。タグ付けまたはモニタリング部分を、化学的薬剤またはタンパク質分解もしくはインテインスプライシングなどの酵素的切断によって除去することができる。親和性タグは、親和性技術を使用してタグ付けされたポリペプチドを精製するのに有用であり得る。一部の例としては、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、およびポリ（Ｈｉｓ）タグが挙げられる。可溶化タグは、Ｅ．ｃｏｌｉなどのシャペロン欠損種において発現される組換えタンパク質が、タンパク質の適切なフォールディングを補助し、それらを沈降から保護するのを助けるのに有用であり得る。一部の例としては、チオレドキシン（ＴＲＸ）およびポリ（ＮＡＮＰ）が挙げられる。タグ付けまたはモニタリング部分は、光感受性タグ、例えば、蛍光を含んでもよい。蛍光タグは、可視化にとって有用である。ＧＦＰおよびそのバリアントは、蛍光タグとして一般的に使用される一部の例である。タンパク質タグは、特異的酵素修飾（ビオチンリガーゼによるビオチン化など）または化学的修飾（蛍光イメージングのためのＦｌＡｓＨ−ＥＤＴ２との反応など）を起こさせてもよい。タンパク質を複数の他の成分に接続するためには、タグ付け部分とモニタリング部分を組み合わせることが多い。タグ付けまたはモニタリング部分を、特異的タンパク質分解または酵素的切断（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ、トロンビン、第Ｘａ因子もしくはエンテロペプチダーゼによる）によって除去することもできる。
【０３５６】
タグ付けまたはモニタリング部分は、低分子、ペプチド、核酸、ナノ粒子、アプタマー、または他の薬剤であってもよい。
【０３５７】
核酸
異種部分は、核酸であってもよい。核酸異種部分は、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および人工核酸を含んでもよい。核酸は、限定されるものではないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、改変ＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、改変ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ分子を含んでもよい。一実施形態では、核酸は、遺伝子発現産物を標的にするためのｓｉＲＮＡである。別の実施形態では、核酸は、本明細書に記載されている１つまたは複数のヌクレオシドアナログを含む。
【０３５８】
核酸は、約２〜約５０００ｎｔ、約１０〜約１００ｎｔ、約５０〜約１５０ｎｔ、約１００〜約２００ｎｔ、約１５０〜約２５０ｎｔ、約２００〜約３００ｎｔ、約２５０〜約３５０ｎｔ、約３００〜約５００ｎｔ、約１０〜約１０００ｎｔ、約５０〜約１０００ｎｔ、約１００〜約１０００ｎｔ、約１０００〜約２０００ｎｔ、約２０００〜約３０００ｎｔ、約３０００〜約４０００ｎｔ、約４０００〜約５０００ｎｔ、またはその間の任意の範囲の長さを有する。
【０３５９】
核酸の一部の例としては、限定されるものではないが、内因性遺伝子にハイブリダイズする核酸（例えば、本明細書の他の場所に記載されているｇＲＮＡまたはアンチセンスｓｓＤＮＡ）、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡなどの外因性核酸にハイブリダイズする核酸、ＲＮＡにハイブリダイズする核酸、遺伝子転写に干渉する核酸、ＲＮＡ翻訳に干渉する核酸、分解を標的にすることなどによりＲＮＡを安定化する、またはＲＮＡを脱安定化する核酸、その発現またはその機能の干渉によりＤＮＡまたはＲＮＡ結合因子に干渉する核酸、細胞内タンパク質に連結され、その機能をモジュレートする核酸、および細胞内タンパク質複合体に連結され、その機能をモジュレートする核酸が挙げられる。
【０３６０】
本開示は、本明細書に記載されている組成物において有用な異種部分としてのＲＮＡ治療剤（例えば、改変ＲＮＡ）の使用を企図する。例えば、目的のタンパク質をコードする改変されたｍＲＮＡを、本明細書に記載されているポリペプチドに連結し、対象中でｉｎ  ｖｉｖｏで発現させることができる。
【０３６１】
一部の実施形態では、本明細書に記載されているポリペプチドに連結された改変ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドは、改変ヌクレオシドまたはヌクレオチドを有する。そのような改変は公知であり、例えば、ＷＯ２０１２／０１９１６８に記載されている。さらなる改変は、例えば、ＷＯ２０１５０３８８９２；ＷＯ２０１５０３８８９２；ＷＯ２０１５０８９５１１；ＷＯ２０１５１９６１３０；ＷＯ２０１５１９６１１８およびＷＯ２０１５１９６１２８Ａ２に記載されている。
【０３６２】
一部の実施形態では、本明細書に記載されているポリペプチドに連結された改変ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の末端修飾、例えば、５’キャップ構造および／またはポリＡ尾部（例えば、１００〜２００ヌクレオチド長）を有する。５’キャップ構造を、ＣａｐＯ、Ｃａｐｌ、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎｌ−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、および２−アジド−グアノシンからなる群から選択することができる。一部の場合では、改変ＲＮＡはまた、少なくとも１つのＫｏｚａｋ配列を含む５’ＵＴＲ、および３’ＵＴＲも含有する。そのような修飾は公知であり、例えば、ＷＯ２０１２１３５８０５およびＷＯ２０１３０５２５２３に記載されている。さらなる末端修飾は、例えば、ＷＯ２０１４１６４２５３およびＷＯ２０１６０１１３０６、ＷＯ２０１２０４５０７５およびＷＯ２０１４０９３９２４に記載されている。
【０３６３】
少なくとも１つの化学的修飾を含んでもよいキャップ付ＲＮＡ分子（例えば、改変ｍＲＮＡ）を合成するためのキメラ酵素は、ＷＯ２０１４０２８４２９に記載されている。
【０３６４】
一部の実施形態では、改変ｍＲＮＡを、環化またはコンカテマー化して、ポリＡ結合タンパク質と、５’末端結合タンパク質との相互作用を補助する翻訳能力がある分子を生成することができる。環化またはコンカテマー化の機構は、少なくとも３つの異なる経路：１）化学的、２）酵素的、および３）リボザイム触媒によって生じてもよい。新しく形成される５’−／３’−結合は、分子内または分子間のものであってよい。そのような改変は、例えば、ＷＯ２０１３１５１７３６に記載されている。
【０３６５】
改変ＲＮＡを作製し、精製する方法は公知であり、当業界で開示されている。例えば、改変ＲＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）酵素的合成のみを使用して作製する。ＩＶＴポリヌクレオチドを作製する方法は、当業界で公知であり、ＷＯ２０１３１５１６６６、ＷＯ２０１３１５１６６８、ＷＯ２０１３１５１６６３、ＷＯ２０１３１５１６６９、ＷＯ２０１３１５１６７０、ＷＯ２０１３１５１６６４、ＷＯ２０１３１５１６６５、ＷＯ２０１３１５１６７１、ＷＯ２０１３１５１６７２、ＷＯ２０１３１５１６６７およびＷＯ２０１３１５１７３６．Ｓに記載されている。精製方法は、試料と、複数のチミジンもしくはその誘導体および／または複数のウラシルもしくはその誘導体（ポリＴ／Ｕ）に連結された表面とを、ＲＮＡ転写物が表面に結合する条件下で接触させること、ならびに表面から精製されたＲＮＡ転写物を溶出させること（ＷＯ２０１４１５２０３１）；拡大可能な方法により最大１０，０００ヌクレオチド長のより長いＲＮＡの分離を可能にするイオン（例えば、陰イオン）交換クロマトグラフィーを使用すること（ＷＯ２０１４１４４７６７）；および改変ＲＭＮＡ試料を、ＤＮＡｓｅ処理に付すこと（ＷＯ２０１４１５２０３０）によってポリＡ尾部を含むＲＮＡ転写物を精製することを含む。
【０３６６】
ヒト疾患、抗体、ウイルス、および様々なｉｎ  ｖｉｖｏ設定の分野においてタンパク質をコードする改変ＲＮＡが公知であり、例えば、国際公開第ＷＯ２０１３１５１６６６号、第ＷＯ２０１３１５１６６８号、第ＷＯ２０１３１５１６６３号、第ＷＯ２０１３１５１６６９号、第ＷＯ２０１３１５１６７０号、第ＷＯ２０１３１５１６６４号、第ＷＯ２０１３１５１６６５号、第ＷＯ２０１３１５１７３６号の表６；国際公開第ＷＯ２０１３１５１６７２号の表６および７；国際公開第ＷＯ２０１３１５１６７１号の表６、１７８および１７９；国際公開第ＷＯ２０１３１５１６６７号の表６、１８５および１８６に開示されている。前記のいずれかを、ＩＶＴポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチドとして合成し、本明細書に記載されているポリペプチドに連結することができ、それぞれ、１つまたは複数の改変ヌクレオチドまたは末端修飾を含んでもよい。
【０３６７】
ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート
異種部分は、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートであってもよい。ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ペプチド部分に連結された核酸部分を含むキメラ分子（ペプチド／核酸混合体など）を含む。一部の実施形態では、ペプチド部分は、本明細書に記載されている任意のペプチドまたはタンパク質部分を含んでもよい。一部の実施形態では、核酸部分は、本明細書に記載されている任意の核酸またはオリゴヌクレオチド、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または改変ＤＮＡもしくはＲＮＡを含んでもよい。
【０３６８】
一部の実施形態では、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ペプチドアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む。一部の実施形態では、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、化学的に改変された骨格を有する合成オリゴヌクレオチドである。ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、配列特異的様式でＤＮＡとＲＮＡ標的の両方に結合して、二本鎖構造を形成することができる。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＲＮＡ）標的に結合した場合、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、鎖侵入によって二本鎖中の一方のＤＮＡ鎖を置き換えて、三本鎖構造を形成し、押しのけられたＤＮＡ鎖は一本鎖Ｄ−ループとして存在し得る。
【０３６９】
一部の実施形態では、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、細胞および／または組織特異的標的化（オリゴ、ペプチド、および／またはタンパク質などに直接コンジュゲートすることができる）であってもよい。
【０３７０】
一部の実施形態では、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、膜透過移行ポリペプチド、例えば、本明細書の他の場所に記載されている膜透過移行ポリペプチドを含む。
【０３７１】
いくつかのペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートの固相合成が、例えば、Williamsら、２０１０年、Curr. Protoc. Nucleic AcidChem.、第４章第４１項、doi: 10.1002/0471142700.nc0441s42に記載されている。非常に短いペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成および特徴付けならびに新しい固相支持体上でのペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートの段階的固相合成が、例えば、Bongardtら、Innovation Perspect. Solid PhaseSynth. Comb. Libr.、Collect. Pap.、Int. Symp.、第５版、１９９９年、２６７〜２７０頁；Antopolskyら、Helv. Chim. Acta、１９９９年、８２巻、２１３０〜２１４０頁に記載されている。
【０３７２】
ナノ粒子
異種部分は、ナノ粒子であってもよい。ナノ粒子は、約１〜約１０００ナノメートル、約１〜約５００ナノメートルのサイズ、約１〜約１００ｎｍ、約３０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約７５ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約２００ｎｍ、およびその間の任意の範囲のサイズを有する無機材料を含む。ナノ粒子は、ナノ規模の寸法の複合構造を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、典型的には球状であるが、ナノ粒子組成に応じて、異なる形態も可能である。ナノ粒子に対して外部の環境と接触するナノ粒子のポーションは、一般的には、ナノ粒子の表面と同定される。本明細書に記載されているナノ粒子においては、サイズ制限を、２次元に限定することができ、したがって、ナノ粒子は、約１〜約１０００ｎｍの直径を有する複合構造を含み、ここで、特定の直径は、ナノ粒子組成および実験設計によるナノ粒子の意図される使用に依存する。例えば、治療適用において使用されるナノ粒子は、典型的には、約２００ｎｍまたはそれ未満のサイズを有する。
【０３７３】
表面電荷および立体的安定化などのナノ粒子のさらなる望ましい特性は、目的の特定の適用を考慮すると変化してもよい。がん処置などの臨床適用において望ましい場合がある例示的特性は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Davisら、Nature、２００８年、７巻、７７１〜７８２頁；Duncan、Nature、２００６年、６巻、６８８〜７０１頁；およびAllen、Nature、２００２年、２巻、７５０〜７６３頁に記載されている。さらなる特性は、本開示を読む際に、当業者によって同定可能である。ナノ粒子の寸法および特性を、当業界で公知の技術によって検出することができる。粒子寸法を検出するための例示的技術としては、限定されるものではないが、動的光散乱（ＤＬＳ）ならびに透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）および原子力顕微鏡（ＡＦＭ）などの様々な顕微鏡が挙げられる。粒子形態を検出するための例示的技術としては、限定されるものではないが、ＴＥＭおよびＡＦＭが挙げられる。ナノ粒子の表面電荷を検出するための例示的技術としては、限定されるものではないが、ゼータ電位法が挙げられる。他の化学的特性を検出するのに好適なさらなる技術は、１Ｈ、１１Ｂ、および１３Ｃおよび１９Ｆ  ＮＭＲ、ＵＶ／Ｖｉｓおよび赤外／ラマン分光法および蛍光分光法（ナノ粒子を蛍光標識と組み合わせて使用する場合）および当業者によって同定可能なさらなる技術を含む。
【０３７４】
低分子
一実施形態では、標的化部分は、アンカー配列媒介接続内の、１つまたは複数のＤＮＡメチル化部位を変化させる、例えば、メチル化システインをチミンに突然変異させる低分子である。例えば、亜硫酸水素化合物、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素アンモニウム、または他の亜硫酸水素塩を使用して、１つまたは複数のＤＮＡメチル化部位を変化させる、例えば、ヌクレオチド配列をシステインからチミンに変化させることができる。
【０３７５】
異種部分は、低分子であってもよい。低分子部分としては、限定されるものではないが、小ペプチド、ペプチド模倣体（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸アナログ、合成ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、一般的に、約５，０００グラム／モル未満の分子量を有する有機および無機化合物（ヘテロ有機および有機金属化合物を含む）、例えば、約２，０００グラム／モル未満の分子量を有する有機もしくは無機化合物、例えば、約１，０００グラム／モル未満の分子量を有する有機もしくは無機化合物、例えば、約５００グラム／モル未満の分子量を有する有機もしくは無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態が挙げられる。低分子は、限定されるものではないが、神経伝達物質、ホルモン、薬物、毒素、ウイルスまたは微生物粒子、合成分子、およびアゴニストまたはアンタゴニストを含んでもよい。
【０３７６】
好適な低分子の例としては、「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、GoodmanおよびGilman、McGraw-Hill、NewYork、N.Y.（１９９６年）、第９版、DrugsActing at Synaptic and Neuroeffector Junctional Sites; Drugs Acting on theCentral Nervous System; Autacoids: Drug Therapy of Inflammation; Water, Saltsand Ions; Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism;Cardiovascular Drugs; Drugs Affecting Gastrointestinal Function; DrugsAffecting Uterine Motility; Chemotherapy of Parasitic Infections; Chemotherapyof Microbial Diseases; Chemotherapy of Neoplastic Diseases; Drugs Used forImmunosuppression; Drugs Acting on Blood-Forming organs; Hormones and HormoneAntagonists; Vitamins, Dermatology; およびToxicologyのセクション（全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものが挙げられる。低分子の一部の例としては、限定されるものではないが、タクロリムスなどのプリオン薬、ヘクリンなどのユビキチンリガーゼまたはＨＥＣＴリガーゼ阻害剤、酪酸ナトリウムなどのヒストン改変薬、５−アザ−シチジンなどの酵素阻害剤、ドキソルビシンなどのアントラサイクリン、ペニシリンなどのベータ−ラクタム、抗細菌剤、化学療法剤、抗ウイルス剤、ＶＰ６４などの他の生物に由来するモジュレーター、および薬物動態が欠損した化学療法剤などの不十分なバイオアベイラビリティを有する薬物が挙げられる。
【０３７７】
一部の実施形態では、低分子は、例えば、de Grooteら、Nuc. Acids Res.（２０１２年）：１〜１８頁に記載されたものなどのエピジェネティック改変剤である。例示的な低分子エピジェネティック改変剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるLuら、J. Biomolecular Screening １７巻５号（２０１２年）：５５５〜７１頁、例えば、表１または２に記載されている。一部の実施形態では、エピジェネティック改変剤は、ボリノスタット、ロミデプシンを含む。一部の実施形態では、エピジェネティック改変剤は、クラスＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、および／またはＩＶヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤を含む。一部の実施形態では、エピジェネティック改変剤は、ＳｉｒＴＩの活性化因子を含む。一部の実施形態では、エピジェネティック改変剤は、ガルシノール、Ｌｙｓ−ＣｏＡ、Ｃ６４６、（＋）−ＪＱＩ、Ｉ−ＢＥＴ、ＢＩＣＩ、ＭＳ１２０、ＤＺＮｅｐ、ＵＮＣ０３２１、ＥＰＺ００４７７７、ＡＺ５０５、ＡＭＩ−Ｉ、ピラゾールアミド７ｂ、ベンゾ［ｄ］イミダゾール１７ｂ、アシル化ダプソン誘導体（例えば、ＰＲＭＴＩ）、メチルスタット、４，４’−ジカルボキシ−２，２’−ビピリジン、ＳＩＤ８５７３６３３１、ヒドロキサメートアナログ８、タニルシプロミー、ビスグアニジンおよびビグアニドポリアミンアナログ、ＵＮＣ６６９、Ｖｉｄａｚａ、デシタビン、酪酸フェニルナトリウム（ＳＤＢ）、リポ酸（ＬＡ）、ケルセチン、バルプロ酸、ヒドララジン、バクトリム、緑茶抽出物（例えば、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ））、クルクミン、スルフォラファンおよび／またはアリシン／ジアリルジスルフィドを含む。一部の実施形態では、エピジェネティック改変剤は、ＤＮＡメチル化を阻害する、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤である（例えば、５−アザシチジンおよび／またはデシタビンである）。一部の実施形態では、エピジェネティック改変剤は、ヒストン修飾、例えば、ヒストンアセチル化、ヒストンメチル化、ヒストンスモイル化、および／またはヒストンリン酸化を改変する。一部の実施形態では、エピジェネティック改変剤は、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤である（例えば、ボリノスタットおよび／またはトリコスタチンＡである）。
【０３７８】
一部の実施形態では、低分子は、薬学的に活性な薬剤である。一実施形態では、低分子は、代謝活性または成分の阻害剤である。有用なクラスの薬学的に活性な薬剤としては、限定されるものではないが、抗生物質、抗炎症薬、血管新生剤または血管作用剤、増殖因子および化学療法（抗新生物）剤（例えば、腫瘍抑制剤）が挙げられる。本明細書に記載されているカテゴリーおよび例に由来する、または（Orme-Johnson ２００７年、Methods Cell Biol. ２００７年；８０巻：８１３〜２６頁）に由来する分子の１つまたは組合せを使用することができる。一実施形態では、本開示は、抗生物質、抗炎症薬、血管新生剤もしくは血管作用剤、増殖因子または化学療法剤を含む組成物を含む。
【０３７９】
オリゴヌクレオチドアプタマー
異種部分は、オリゴヌクレオチドアプタマーであってもよい。アプタマー部分は、オリゴヌクレオチドまたはペプチドアプタマーである。オリゴヌクレオチドアプタマーは、高い親和性および特異性でタンパク質およびペプチドなどの予め選択された標的に結合することができる一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ（ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ）分子である。
【０３８０】
オリゴヌクレオチドアプタマーは、反復ラウンドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択または同等に、ＳＥＬＥＸ（指数的富化によるリガンドの体系的進化）により操作して、低分子、タンパク質、核酸、およびさらには細胞、組織および生物などの様々な分子標的に結合することができる核酸種である。アプタマーは、識別的分子認識を提供し、化学合成によって産生することができる。さらに、アプタマーは、望ましい保存特性を有し、治療適用において免疫原性をほとんど惹起しないか、または全く惹起しない。
【０３８１】
ＤＮＡとＲＮＡアプタマーの両方が、様々な標的に対するロバストな結合親和性を示す。例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡアプタマーは、リゾチーム、トロンビン、ヒト免疫不全ウイルスｔｒａｎｓ作用応答エレメント（ＨＩＶ  ＴＡＲ）、https://en.wikipedia.org/wiki/Aptamer - cite_note-10、ヘミン、インターフェロンγ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ドーパミン、および非古典的がん遺伝子、ヒートショック因子１（ＨＳＦ１）について選択されている。
【０３８２】
アプタマーに基づく血漿タンパク質プロファイリングのための診断技術は、アプタマー血漿プロテオミクスを含む。この技術は、疾患状態と健康な状態との診断的区別を助けることができる将来の多バイオマーカータンパク質測定を可能にするであろう。
【０３８３】
ペプチドアプタマー
異種部分は、ペプチドアプタマーであってもよい。ペプチドアプタマーは、１２〜１４ｋＤａの低分子量のペプチドを含む、１つ（または複数）の短い可変ペプチドドメインを有する。ペプチドアプタマーを、細胞内部でのタンパク質間相互作用に特異的に結合し、これに干渉するように設計することができる。
【０３８４】
ペプチドアプタマーは、特定の標的分子に結合するように選択または操作された人工タンパク質である。これらのタンパク質は、可変配列の１つまたは複数のペプチドループを含む。それらは典型的には、コンビナトリアルライブラリーから単離され、続いて、部位指定突然変異または可変領域突然変異誘発の周回および選択によって改善されることが多い。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ペプチドアプタマーは、細胞タンパク質標的に結合し、その標的分子と他のタンパク質との正常なタンパク質相互作用の干渉などの生物学的効果を発揮することができる。特に、転写因子結合ドメインに結合した可変ペプチドアプタマーループを、転写因子活性化ドメインに結合した標的タンパク質に対してスクリーニングする。この選択戦略によるペプチドアプタマーの、その標的へのｉｎ  ｖｉｖｏでの結合を、下流の酵母マーカー遺伝子の発現として検出する。そのような実験は、アプタマーが結合した特定のタンパク質、および表現型を引き起こす形でアプタマーが破壊するタンパク質相互作用を同定する。さらに、適切な機能的部分で誘導体化されたペプチドアプタマーは、その標的タンパク質の特異的な翻訳後修飾を引き起こすか、または標的の細胞内局在を変化させることができる。
【０３８５】
ペプチドアプタマーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで標的を認識することもできる。それらは、バイオセンサーにおける抗体の代わりに有用であり、不活性タンパク質形態と活性タンパク質形態の両方を含有する集団からタンパク質の活性アイソフォームを検出するために使用される。ペプチドアプタマーの「頭部」がユニークな配列二本鎖ＤＮＡ「尾部」に共有的に連結されるオタマジャクシとして公知の誘導体は、そのＤＮＡ尾部のＰＣＲ（例えば、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を使用する）による混合物中の稀な標的分子の数量化を可能にする。
【０３８６】
ペプチドアプタマー選択を、異なるシステムを使用して行うことができるが、現在、最も使用されているのは、酵母ツーハイブリッドシステムである。ペプチドアプタマーを、ファージディスプレイならびにｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイおよび酵母ディスプレイなどの他の表面ディスプレイ技術によって構築されたコンビナトリアルペプチドライブラリーから選択することもできる。これらの実験手順は、バイオパンニングとしても公知である。バイオパンニングから得られるペプチドのうち、ミモトープは、ペプチドアプタマーの一種と考えることができる。コンビナトリアルペプチドライブラリーからパンされたペプチドは全て、ＭｉｍｏＤＢという名称の特殊なデータベースに保存されている。
【０３８７】
薬剤
一実施形態では、異種部分は、望ましくない薬物動態または薬力学（ＰＫ／ＰＤ）パラメーターを有する薬剤である。異種部分をポリペプチドに連結することにより、異種部分の標的化、吸収、および輸送などの少なくとも１つのＰＫ／ＰＤパラメーターを改善するか、またはオフターゲット部位への拡散、および毒性代謝などの、少なくとも１つの望ましくないＰＫ／ＰＤパラメーターを軽減することができる。例えば、本明細書に記載されているポリペプチドを、標的化／輸送が少ない薬剤、例えば、ドキソルビシン、ペニシリンなどのベータ−ラクタムに連結することにより、その特異性が改善される。別の例では、本明細書に記載されているポリペプチドを、吸収特性が低い薬剤、例えば、インスリン、ヒト成長ホルモンに連結することにより、その最小用量が改善される。別の例では、本明細書に記載されているポリペプチドを、毒性代謝特性を有する薬剤、例えば、高用量のアセトアミノフェンに連結することにより、その最大用量が改善される。
【０３８８】
膜透過移行ポリペプチド
一態様では、組成物は、例えば、エンドソームとは無関係に、組成物が細胞内、例えば、対象内の標的位置に送達されるように、膜を通る移行を可能にする特性を有する本明細書に記載されているポリペプチドを含む。一部の実施形態では、標的化部分は、膜透過移行ポリペプチドを含む。
【０３８９】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている膜透過移行ポリペプチドのいずれか１つを含む細胞または組織を含む。
【０３９０】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されている膜透過移行ポリペプチドを含む医薬組成物を含む。
【０３９１】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されている膜透過移行ポリペプチドを含む組成物を投与することにより遺伝子の発現をモジュレートする方法を含む。
【０３９２】
一態様では、本開示は、膜透過移行ポリペプチドを用いて遺伝子発現を変化させるか、またはアンカー配列媒介接続を変化させる方法を含む。一部の実施形態では、膜透過移行ポリペプチドは、標的化部分である。一部の実施形態では、膜透過移行ポリペプチドは、本明細書に記載されている標的化部分の送達を助ける送達剤である。標的位置は、細胞内、例えば、細胞質またはオルガネラ内（例えば、標的ＤＮＡ配列またはクロマチン構造などの、核内）であってもよい。本明細書に記載されている治療組成物は、改善された標的化、吸収、もしくは輸送、または軽減されたオフターゲット活性、毒性代謝、もしくは毒性排出などの、さらに有利な特性を有してもよい。
【０３９３】
一実施形態では、組成物は、ＡＢＸｎＣ（式中、Ａは、核酸側鎖を有する、疎水性アミノ酸またはアミド含有骨格、例えば、アミノエチル−グリシンから選択され；ＢおよびＣは、同じか、または異なっていてもよく、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リシン、およびそのアナログから独立に選択され；Ｘは、それぞれ独立に、疎水性アミノ酸であるか、またはＸは、それぞれ独立に、核酸側鎖を有する、アミド含有骨格、例えば、アミノエチル−グリシンであり；ｎは、１〜４の整数である）の少なくとも１つの配列をそれぞれ含む少なくとも１つの膜透過移行ポリペプチドを含む。
【０３９４】
疎水性アミノ酸は、疎水性側鎖を有するアミノ酸を含み、限定されるものではないが、アラニン（ａｌａ、Ａ）、バリン（ｖａｌ、Ｖ）、イソロイシン（ｉｓｏ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、およびそのアナログが挙げられる。
【０３９５】
アミノ酸アナログとしては、限定されるものではないが、Ｄ−アミノ酸、デヒドロアラニンなどのα炭素上の水素を欠くアミノ酸、オルニチンおよびシトルリンなどの代謝中間体、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、および４−アミノ安息香酸などの非アルファアミノ酸、シスタチオニン、ランチオニン、ジエンコル酸およびジアミノピメリン酸などのツインα炭素アミノ酸、ならびに当業界で公知の任意の他のものが挙げられる。
【０３９６】
核酸側鎖
一実施形態では、膜透過移行ポリペプチドは、アミド骨格に連結された１つまたは複数の核酸側鎖を含む。ポリペプチド中の個々のアミノ酸単位は、アミド結合とその対応する側鎖とを含む。膜透過移行ポリペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸単位は、アミノ酸側鎖の代わりの核酸側鎖と共に、ペプチド骨格と同様、アミド含有骨格、例えば、アミノエチル−グリシンを有する。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、そのオリゴヌクレオチド対応物よりも高い親和性で相補的ＤＮＡおよびＲＮＡにハイブリダイズすることが公知である。ＰＮＡのこの特徴は、本開示のポリペプチドを、核酸側鎖との安定的なハイブリッドにするだけでなく、同時に、中性骨格および疎水性側鎖は、ポリペプチド内の疎水性単位をもたらす。
【０３９７】
核酸側鎖としては、限定されるものではないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルなどの、プリンまたはピリミジン側鎖が挙げられる。一実施形態では、核酸側鎖は、本明細書に記載されているヌクレオシドアナログを含む。
【０３９８】
サイズ
一部の実施形態では、膜透過移行ポリペプチドは、約５〜約５００、例えば、５〜４００、５〜３００、５〜２５０、５〜２００、５〜１５０、５〜１００アミノ酸単位長の範囲のサイズを有する。ポリペプチドは、約５〜約５０アミノ酸、約５〜約４０アミノ酸、約５〜約３０アミノ酸、約５〜約２５アミノ酸の範囲、または任意の他の範囲の長さを有してもよい。一実施形態では、ポリペプチドは、約１０アミノ酸の長さを有する。別の実施形態では、ポリペプチドは、約１５アミノ酸の長さを有する。別の実施形態では、ポリペプチドは、約２０アミノ酸の長さを有する。別の実施形態では、ポリペプチドは、約２５アミノ酸の長さを有する。別の実施形態では、ポリペプチドは、約３０アミノ酸の長さを有する。
【０３９９】
膜透過移行ポリペプチドは、その長さの範囲内のＡＢＸｎＣの１つを超える配列を有してもよい。それぞれのＡＢＸｎＣ配列を、１つまたは複数のアミノ酸によって別のＡＢＸｎＣ配列から分離することができる。一実施形態では、ポリペプチドは、ＡＢＸｎＣ配列を繰り返し、１つまたは複数のアミノ酸単位によって配列を分離する。別の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも２個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれよりも多い、例えば、２〜２０個、２〜１０個、２〜５個）のＡＢＸｎＣ配列を含み、１つまたは複数のアミノ酸単位によって配列を分離する。別の実施形態では、ＡＢＸｎＣ配列は、イソロイシンまたはロイシンなどの１つ（または複数）の疎水性アミノ酸によって分離される。
【０４００】
組成物は、同じか、または異なる複数のＡＢＸｎＣ配列を含んでもよい。一実施形態では、複数のうちの少なくとも２つは、配列および／または長さにおいて同一である。一実施形態では、複数のうちの少なくとも２つは、配列および／または長さにおいて異なる。一実施形態では、組成物は、複数のうちの少なくとも２つが同じであり、複数のうちの少なくとも２つが異なる、複数のＡＢＸｎＣ配列を含む。一実施形態では、膜透過移行ポリペプチド中のＡＢＸｎＣ配列は、配列もしくは長さまたはその組合せにおいて同一ではない。
【０４０１】
タンパク質またはポリペプチドの産生
本明細書に記載されている治療タンパク質またはポリペプチドを作製する方法は、当業界で日常的である。一般的には、SmalesおよびJames（編）、TherapeuticProteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)、Humana Press（２００５年）；およびCrommelin、SindelarおよびMeibohm（編）、Pharmaceutical Biotechnology: Fundamentals and Applications、Springer（２０１３年）を参照されたい。
【０４０２】
組成物のタンパク質またはポリペプチドを、標準的な固相技術を使用することによって生化学的に合成することができる。そのような方法としては、排他的固相合成、部分的固相合成法、断片縮合、古典的溶液合成が挙げられる。ペプチドが比較的短い（すなわち、１０ｋＤａ）場合、および／またはそれを組換え技術によって産生することができず（すなわち、核酸配列によってコードされない）、したがって、異なる化学反応を含む場合、これらの方法を使用することができる。
【０４０３】
固相合成手順は、当業界で周知であり、John Morrow StewartおよびJanis Dillaha Young、Solid Phase Peptide Syntheses、第２版、PierceChemical Company、１９８４年；およびCoin, I.ら、Nature Protocols、２巻：３２４７〜３２５６頁、２００７年によってさらに記載されている。
【０４０４】
より長いペプチドについては、組換え方法を使用することができる。組換え治療ポリペプチドを作製する方法は、当業界で日常的である。一般的には、SmalesおよびJames（編）、TherapeuticProteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)、Humana Press（２００５年）；およびCrommelin、SindelarおよびMeibohm（編）、Pharmaceutical Biotechnology: Fundamentals and Applications、Springer（２０１３年）を参照されたい。
【０４０５】
治療的薬学的タンパク質またはポリペプチドを産生するための例示的方法は、哺乳動物細胞中での発現を含むが、組換えタンパク質を、適切なプロモーターの制御下で昆虫細胞、酵母、細菌、または他の細胞を使用して産生することもできる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、好適なプロモーター、および他の５’または３’隣接非転写配列、ならびに必須リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、ならびに終結配列などの５’または３’非翻訳配列などの非転写エレメントを含んでもよい。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０オリジン、初期プロモーター、スプライス、およびポリアデニル化部位を使用して、異種ＤＮＡ配列の発現にとって必要な他の遺伝子エレメントを提供することができる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主と共に使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは、GreenおよびSambrook、MolecularCloning: A Laboratory Manual (第４版)、Cold Spring Harbor Laboratory Press（２０１２年）に記載されている。
【０４０６】
大量のタンパク質またはポリペプチドが所望される場合、それを、Brian Bray、Nature Reviews Drug Discovery、２巻：５８７〜５９３頁、２００３年；ならびにWeissbachおよびWeissbach、１９８８年、Methods for Plant Molecular Biology、AcademicPress、NY、第ＶＩＩＩ部、４２１〜４６３頁により記載されたものなどの技術を使用して生成することができる。
【０４０７】
様々な哺乳動物細胞培養系を使用して、組換えタンパク質を発現させ、製造することができる。哺乳動物発現系の例としては、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬＡおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。タンパク質治療剤の産生のための宿主細胞培養のプロセスは、ZhouおよびKantardjieff（編）、Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing (Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology)、Springer（２０１４年）に記載されている。本明細書に記載されている組成物は、組換えタンパク質をコードする、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターなどのベクターを含んでもよい。ベクター、例えば、ウイルスベクターは、組換えタンパク質をコードする核酸を含む。
【０４０８】
タンパク質治療剤の精製は、Franks、Protein Biotechnology: Isolation,Characterization, and Stabilization、Humana Press（２０１３年）；およびCutler、Protein Purification Protocols(Methods in Molecular Biology)、Humana Press（２０１０年）に記載されている。
【０４０９】
タンパク質治療剤の製剤化は、Meyer（編）、Therapeutic Protein Drug Products:Practical Approaches to formulation in the Laboratory, Manufacturing, and theClinic、Woodhead Publishing Series（２０１２年）に記載されている。
【０４１０】
リンカー
本明細書に記載されているタンパク質またはポリペプチドはまた、リンカーを含んでもよい。一部の実施形態では、例えば、Ｃａｓまたは改変Ｃａｓタンパク質を含む第１のポリペプチドドメインと、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を有する［または脱メチル化もしくはデアミナーゼ活性を伴う］ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含む、本明細書に記載されているタンパク質は、第１と第２のポリペプチドの間にリンカーを有する。一実施形態では、本明細書に記載されている１つまたは複数のポリペプチドは、リンカーを用いて連結される。リンカーは、化学的結合、例えば、１つまたは複数の共有結合または非共有結合であってもよい。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカー（例えば、非ＡＢＸｎＣペプチド）である。そのようなリンカーは、２〜３０アミノ酸、またはそれより長いものであってもよい。リンカーは、本明細書に記載されている可撓性、剛性または切断性のリンカーを含む。
【０４１１】
最も一般的に使用される可撓性リンカーは、主にＧｌｙおよびＳｅｒ残基のストレッチからなる配列を有する（「ＧＳ」リンカー）。可撓性リンカーは、ある特定の程度の移動または相互作用を必要とするドメインを連結するのに有用であり、小さい、非極性（例えば、Ｇｌｙ）または極性（例えば、ＳｅｒもしくはＴｈｒ）アミノ酸を含んでもよい。ＳｅｒまたはＴｈｒの組込みは、水分子と水素結合を形成することによって水性溶液中でのリンカーの安定性を維持し、したがって、リンカーとタンパク質部分との好ましくない相互作用を減少させることもできる。
【０４１２】
剛性リンカーは、ドメイン間の固定された距離を保持し、その独立した機能を維持するのに有用である。剛性リンカーはまた、ドメインの空間的隔離が、融合物中の１つまたは複数の成分の安定性または生物活性を保存するのに重要である場合にも有用であり得る。剛性リンカーは、アルファヘリックス構造またはＰｒｏリッチ配列、（ＸＰ）ｎ（式中、Ｘは任意のアミノ酸を示すが、好ましくは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、もしくはＧｌｕである）を有してもよい。
【０４１３】
切断性リンカーは、ｉｎ  ｖｉｖｏで遊離機能的ドメインを放出することができる。一部の実施形態では、リンカーを、還元試薬またはプロテアーゼの存在などの、特定の条件下で切断することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏの切断性リンカーは、ジスルフィド結合の可逆的性質を利用してもよい。一例は、２個のＣｙｓ残基間のトロンビン感受性配列（例えば、ＰＲＳ）を含む。ＣＰＲＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのトロンビン処理は、トロンビン感受性配列の切断をもたらすが、可逆性ジスルフィド結合はインタクトなままである。そのようなリンカーは公知であり、例えば、Chenら、２０１３年、Fusion Protein Linkers:Property, Design and Functionality. Adv Drug Deliv Rev. ６５巻（１０号）：１３５７〜１３６９頁に記載されている。融合物中のリンカーのｉｎ  ｖｉｖｏでの切断を、病態（例えば、がんまたは炎症）下、ｉｎ  ｖｉｖｏで、特定の細胞もしくは組織中で発現されるか、またはある特定の細胞区画内に拘束されるプロテアーゼによって実行することもできる。多くのプロテアーゼの特異性は、拘束された区画中でのリンカーのより遅い切断を提供する。
【０４１４】
連結分子の例としては、負に荷電したスルホネート基などの疎水性リンカー；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、その不飽和バリアント、その水酸化バリアント、そのアミド化もしくはそうでなければＮ含有バリアント、非炭素リンカーなどの、ポリ（−ＣＨ２−）炭化水素鎖などの脂質；炭水化物リンカー；ホスホジエステルリンカー、または２つもしくはそれよりも多くのポリペプチドを共有的に連結することができる他の分子が挙げられる。ポリペプチドが、例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、またはおそらく、アラニン、フェニルアラニンも、またはさらにはチロシン、メチオニン、グリシンもしくは他の疎水性残基に富む一連の残基などの、ポリペプチドの疎水性領域またはポリペプチドの疎水性伸長物を介して連結される、疎水性脂質小球などの、非共有的リンカーも含まれる。ポリペプチドの正に荷電した部分が別のポリペプチドまたは核酸の負電荷に連結されるような、電荷に基づく化学反応を使用して、ポリペプチドを連結することができる。
【０４１５】
ポリペプチドの多量体化
組成物は、例えば、本明細書に記載されているリンカーを介して一緒に連結された複数（２つまたはそれよりも多く）の膜透過移行ポリペプチドを含んでもよい。
【０４１６】
組成物は、同じか、または異なる複数の膜透過移行ポリペプチドを含んでもよい。一実施形態では、複数のうちの少なくとも２つは、配列および／または長さにおいて同一である。一実施形態では、複数のうちの少なくとも２つは、配列および／または長さにおいて異なる。一実施形態では、組成物は、複数のうちの少なくとも２つが同じであり、複数のうちの少なくとも２つが異なる、複数のポリペプチドを含む。一実施形態では、組成物中のポリペプチドは、配列もしくは長さまたはその組合せにおいて同一ではない。
【０４１７】
組成物は、例えば、リンカーによって、別の膜透過移行ポリペプチドに連結された膜透過移行ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、リンカーによって連結された２つまたはそれよりも多くのポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、リンカーによって連結された３つまたはそれよりも多くのポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、リンカーによって連結された４つまたはそれよりも多くのポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、リンカーによって連結された５つまたはそれよりも多くのポリペプチドを含む。リンカーは、化学的結合、例えば、１つまたは複数の共有結合または非共有結合、例えば、可撓性、剛性または切断性のペプチドリンカーであってもよい。そのようなリンカーは、２〜３０アミノ酸、またはそれより長いものであってもよい。さらなるリンカーは、本明細書の他の場所により詳細に記載されており、また、適用可能である。
【０４１８】
一実施形態では、２つまたはそれよりも多くの膜透過移行ポリペプチドは、ペプチド結合を介して連結され、例えば、一方のポリペプチドのカルボキシル末端は、別のポリペプチドのアミノ末端に結合される。別の実施形態では、一方のポリペプチド上の１つまたは複数のアミノ酸は、システイン側鎖間のジスルフィド結合などを介して、別のポリペプチド上の１つまたは複数のアミノ酸と連結される。別の実施形態では、一方のポリペプチド上の１つまたは複数のアミノ酸は、分枝状ポリペプチドを作出するなどのために、別のポリペプチド上のカルボキシルまたはアミノ末端と連結される。
【０４１９】
別の実施形態では、一方の膜透過移行ポリペプチド上の１つまたは複数の核酸側鎖は、グアノシンと偽対を形成するアルギニンなどを介して、別の膜透過移行ポリペプチド上の１つまたは複数のアミノ酸側鎖と相互作用する。別の実施形態では、一方の膜透過移行ポリペプチド上の１つまたは複数の核酸側鎖は、水素結合などを介して、別の膜透過移行ポリペプチド上の１つまたは複数の核酸側鎖と相互作用する。別の実施形態では、複数の膜透過移行ポリペプチドが相互作用して、核酸側鎖の配置中に特定の配列を作出する。例えば、一方のポリペプチドに由来するカルボキシ末端核酸側鎖は、別のポリペプチドに由来するアミノ末端核酸側鎖と相互作用して、偽−５’から偽−３’ヌクレオチド配列を作出する。別の例では、ポリペプチドは、それぞれのポリペプチド上のアミノ酸および／または末端などを介して、１つまたは複数のポリペプチドと連結され、そのそれぞれの核酸側鎖は整列して、偽−５’から偽−３’ヌクレオチド配列を作出する。偽配列は、アンカー配列媒介接続のアンカー配列、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフ、コヘシン結合モチーフ、ＵＳＦ１結合モチーフ、ＹＹ１結合モチーフ、ＴＡＴＡボックス、ＺＮＦ１４３結合モチーフなど、または転写制御配列、例えば、エンハンシングもしくはサイレンシング配列などの選択された標的配列に結合することができる。偽配列は、転写制御配列、例えば、エンハンシングまたはサイレンシング配列などの選択された標的配列に結合することができる。偽配列は、標的配列に結合することによって因子の結合および転写に干渉することができる。偽配列は、ｍＲＮＡなどの核酸配列とハイブリダイズして、遺伝子発現に干渉することができる。
【０４２０】
一実施形態では、膜透過移行ポリペプチドは、互いに連結され、連結されたポリペプチドは、アンカー配列媒介接続、例えば、ループ、または一方の接続核形成分子−アンカー配列と、別の接続核形成分子−アンカー配列との物理的相互作用もしくは結合によって生成される２次元ＤＮＡ構造を形成するのに十分なアビディティで結合する核形成タンパク質によって認識されるアンカー配列に結合する偽−５’から偽−３’ヌクレオチド配列を作出する。アンカー配列の例としては、限定されるものではないが、ＣＴＣＦ結合モチーフ、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフまたはコンセンサス配列：Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（Ｇ／Ａ／Ｔ）ＣＣ（Ａ／Ｔ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）ＡＧ（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ｔ）ＧＧ（Ｃ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｇ／Ａ／Ｃ）（配列番号１）（式中、Ｎは任意のヌクレオチドである）が挙げられる。連結されたポリペプチドは、反対の向きでＣＴＣＦ結合モチーフまたはコンセンサス配列に結合する偽−５’から偽−３’ヌクレオチド配列、例えば、（Ｇ／Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ａ／Ｔ）ＧＧ（Ｇ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｔ／Ｇ）ＣＣ（Ｇ／Ａ／Ｔ）Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（配列番号２）を作出してもよい。
【０４２１】
本明細書に記載されている膜透過移行ポリペプチドを、標準的なライゲーション技術を使用することにより、多量体化する、例えば、２つまたはそれよりも多くのポリペプチドを連結することができる。そのような方法としては、一般的な天然の化学的ライゲーション戦略（Siman, P.およびBrik, A. Org. Biomol. Chem. ２０１２年、１０巻：５６８４〜５６９７頁；Kent, S. B. H. Chem. Soc. Rev. ２００９年、３８巻：３３８〜３５１頁；ならびにHackenberger, C. P. R.およびSchwarzer, D.Angew. Chem., Int. Ed. ２００８年、４７巻：１００３０〜１００７４頁）、クリック修飾プロトコール（Tasdelen, M. A.; Yagci, Y. Angew. Chem., Int. Ed.２０１３年、５２巻：５９３０〜５９３８頁；Palomo, J. M. Org. Biomol. Chem. ２０１２年、１０巻：９３０９〜９３１８頁；Eldijk, M. B.; van Hest, J. C. M. Angew. Chem., Int. Ed. ２０１１年、５０巻：８８０６〜８８２７頁；およびLallana, E.; Riguera, R.; Fernandez-Megia, E. Angew. Chem., Int. Ed.２０１１年、５０巻：８７９４〜８８０４頁）、および生体直交型反応（King, M.; Wagner, A.Bioconjugate Chem.２０１４年、２５巻：８２５〜８３９頁；Lang, K.; Chin, J.W. Chem. Rev.２０１４年、１１４巻：４７６４〜４８０６頁；Patterson, D. M.;Nazarova, L. A.; Prescher, J. A. ACS Chem. Biol. ２０１４年、９巻：５９２〜６０５頁；Lang, K.; Chin, J. W. ACS Chem. Biol. ２０１４年、９巻：１６〜２０頁；akaoka, Y.; Ojida, A.; Hamachi, I. Angew. Chem., Int. Ed. ２０１３年、５２巻：４０８８〜４１０６頁；Debets, M. F.; van Hest, J. C. M.; Rutjes, F. P. J. T. Org. Biomol.Chem. ２０１３年、１１巻：６４３９〜６４５５頁；およびRamil, C. P.; Lin, Q.Chem. Commun. ２０１３年、４９巻：１１００７〜１１０２２頁）が挙げられる。
【０４２２】
一部の実施形態では、多量体中での膜透過移行ポリペプチドの順序付けは、特異的であるか、またはそれは、例えば、ポリペプチドが同一でない場合、無作為であってもよい。例えば、本明細書に記載されているポリペプチドは、鋳型駆動合成によって多量体化されるか、または多量体化は、物理的拘束もしくは鋳型、例えば、ＤＮＡ、タンパク質、ハイブリッドＤＮＡ−タンパク質へのハイブリダイゼーションにより順序付けられる。一実施形態では、鋳型、例えば、ＤＮＡ配列は、本明細書に記載されているポリペプチドに特異的にハイブリダイズする。ポリペプチドは、本明細書に記載されている方法の１つ、例えば、一般的な化学的ライゲーションによって別のポリペプチドに連結され、どのポリペプチドが連結されるかの選択は、鋳型にハイブリダイズする能力によって拘束され得る。かくして、特異的ポリペプチド多量体を、鋳型に特異的にハイブリダイズするその能力によって生成することができる。
【０４２３】
一部の実施形態では、多量体中での膜透過移行ポリペプチドの順序は、使用される化学的ライゲーション戦略によって決定される。一実施形態では、クリック化学反応および生体直交型反応などの化学的ライゲーション技術は、化学的ライゲーション戦略が、ライゲーション技術を進行させるために特定の実体が反応することを必要とするため、どのポリペプチドが連結されるかを指令する。例えば、一方のポリペプチドをフェニルアジドで標識し、別のポリペプチドをシクロオクチンで標識することができる。シクロオクチンとフェニルアジドは反応して、２つのポリペプチドを連結する。
【０４２４】
ハイブリダイゼーション
膜透過移行ポリペプチドが核酸側鎖を含む実施形態では、それは核酸と相互作用することができる。一実施形態では、ポリペプチド上の１つまたは複数の核酸側鎖は、核酸配列、例えば、ゲノムＤＮＡなどのＤＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡとハイブリダイズする。ポリペプチド上の核酸側鎖の１つまたは複数は、標的核酸配列中の１つまたは複数の核酸残基と特異的にハイブリダイズする。一実施形態では、ポリペプチドは互いに連結され、核酸側鎖は核酸配列（例えば、遺伝子座、ｍＲＮＡ、アンカー配列媒介接続のアンカー配列、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフ、コヘシン結合モチーフ、ＵＳＦ１結合モチーフ、ＹＹ１結合モチーフ、ＴＡＴＡボックス、ＺＮＦ１４３結合モチーフなど）にハイブリダイズする。
【０４２５】
核酸側鎖または核酸側鎖の偽配列は、核酸側鎖または核酸側鎖の偽配列と実質的に一致してハイブリダイズするか、またはそれと１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、もしくは７０％相補的である標的核酸配列にハイブリダイズすることができる。核酸側鎖または核酸側鎖の偽配列と、標的核酸配列とのハイブリダイゼーションを、最適化手順によって日常的に決定される好適なハイブリダイゼーション条件下で実行することができる。温度、成分の濃度、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の時間、緩衝剤成分、ならびにそのｐＨおよびイオン強度などの条件は、核酸側鎖または核酸側鎖の偽配列および相補的標的核酸配列の長さおよびＧＣ含量などの様々な因子に応じて変化してもよい。例えば、比較的短い長さの核酸側鎖または核酸側鎖の偽配列を使用する場合、より低いストリンジェントの条件を採用することができる。ハイブリダイゼーションのための詳細な条件を、Molecular Cloning, A laboratory manual、第４版（ColdSpring Harbor Laboratory Press、２０１２年）などに見出すことができる。
【０４２６】
ポリペプチドに連結された異種部分
組成物は、共有結合もしくは非共有結合または本明細書に記載されているリンカーなどを介して、標的化部分の膜透過移行ポリペプチドに連結された本明細書に記載されている異種部分を含んでもよい。一実施形態では、組成物は、ペプチド結合を介してポリペプチドに連結された異種部分を含む。例えば、ポリペプチドのアミノ末端を、任意選択のリンカーを用いるペプチド結合などを介して、異種部分に連結する。別の実施形態では、ポリペプチドのカルボキシル末端を、異種部分に連結する。
【０４２７】
一実施形態では、組成物は、２つの異種部分に連結された膜透過移行ポリペプチドを含む。例えば、ポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端を、同じか、または異なる異種部分であってよい、異種部分に連結する。
【０４２８】
別の実施形態では、膜透過移行ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸を、システイン側鎖間のジスルフィド結合、水素結合、または任意の他の公知の化学反応などを介して、異種部分と連結する。一方の異種部分は、生物活性を有するエフェクターであってもよく、他方の異種部分は、組成物を、受容体を発現する特定の細胞に標的化するためのリガンドまたは抗体であってもよい。例えば、トポイソメラーゼ阻害剤であるトポテカンなどの化学療法剤を、ポリペプチドの一方の末端に連結し、リガンドまたは抗体を、ポリペプチドの他方の末端に連結して、組成物を特定の細胞または組織に標的化する。別の例では、異種部分は、両方とも生物活性を有するエフェクターである。
【０４２９】
別の実施形態では、同じか、または異なる膜透過移行ポリペプチドである複数の膜透過移行ポリペプチドを、単一の異種部分に連結する。ポリペプチドは、大きい異種部分を取り囲み、その膜貫通を補助するコーティングとして作用してもよい。異種部分は、約５００グラム／モルまたはダルトンより大きい分子量を有してもよく、例えば、有機または無機化合物は、約１，０００グラム／モルより大きい分子量を有し、例えば、有機または無機化合物は、約２，０００グラム／モルより大きい分子量を有し、例えば、有機または無機化合物は、約３，０００グラム／モルより大きい分子量を有し、例えば、有機または無機化合物は、約４，０００グラム／モルより大きい分子量を有し、例えば、有機または無機化合物は、約５，０００グラム／モルより大きい分子量を有し、そのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態が含まれる。
【０４３０】
一実施形態では、組成物は、一方または両方の末端上の異種部分に連結された膜透過移行ポリペプチドおよびポリペプチド上の別の部位に連結された別の異種部分を含む。ポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端の一方または両方を、異種部分に連結し、アミノ酸または核酸のいずれかである、ポリペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸単位を、ジスルフィド結合または水素結合などを介して、１つまたは複数の異種部分に連結する。例えば、ＤＮＡ修飾酵素をポリペプチドに連結し、標的メチル化遺伝子と相補的である非メチル化ＣＴＣＦ結合モチーフを有する核酸を、ポリペプチドの核酸側鎖にハイブリダイズさせる。投与時に、組成物は、ＣＴＣＦゲノム結合モチーフを標的にして、遺伝子の転写をモジュレートする。別の例では、遺伝子特異的隣接配列と共に非メチル化ＣＴＣＦ結合モチーフを有する二本鎖核酸を、ポリペプチドに連結する。投与時に、非メチル化ＣＴＣＦ結合モチーフは、ＣＴＣＦタンパク質が結合するための代替的なアンカー配列として働く。別の例では、ユビキチンおよびエフェクターなどの別の異種部分を、ポリペプチドに連結する。投与時に、組成物は細胞膜を貫通し、エフェクターは機能を実行する。次いで、ユビキチンは、分解のための組成物を標的にする。
【０４３１】
一実施形態では、組成物は、共有結合を介して１つまたは複数の異種部分に連結された膜透過移行ポリペプチドおよびポリペプチド中の核酸に連結された別の異種部分を含む。例えば、タンパク質合成阻害剤を、ポリペプチドに共有的に連結し、ｓｉＲＮＡまたは他の標的特異的核酸を、ポリペプチド中の核酸にハイブリダイズさせる。投与時に、ｓｉＲＮＡは、組成物をｍＲＮＡ転写物に標的化し、タンパク質合成阻害剤およびｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの発現を阻害するように作用する。
【０４３２】
一部の実施形態では、医薬組成物は、構造Ｉ：
（ＩＩ）Ｘ−Ｙ−Ｚ
（式中、ＸおよびＺは、それぞれ、標的ＣＴＣＦ結合モチーフのための５’および３’部位特異的標的化配列であり、Ｙは、
（ａ）配列番号１の配列と相補的なＲＮＡ配列；
（ｂ）配列番号１の配列と相補的なＲＮＡ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるＲＮＡ配列；
（ｃ）少なくとも１、２、３、４、５個であるが、１５、１２または１０個未満のヌクレオチドの付加、置換または欠失を有する配列番号１の配列と相補的なＲＮＡ配列；
（ｄ）配列番号２の配列と相補的なＲＮＡ配列；
（ｅ）配列番号２の配列と相補的なＲＮＡ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるＲＮＡ配列；
（ｆ）少なくとも１、２、３、４、５個であるが、１５、１２または１０個未満のヌクレオチドの付加、置換または欠失を有する配列番号２の配列と相補的なＲＮＡ配列
から選択される）
の配列を含むｇＲＮＡに連結された膜透過移行ポリペプチドを含む。
【０４３３】
一部の実施形態では、ＸおよびＺはそれぞれ、２〜５０ヌクレオチド長、例えば、２〜２０、２〜１０、２〜５ヌクレオチド長である。
【０４３４】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、がん遺伝子、腫瘍抑制因子、またはヌクレオチド反復と関連する疾患と関連するＣＴＣＦ結合モチーフのための特異的標的化配列を含む。
【０４３５】
本明細書に記載されている膜透過移行ポリペプチドを、ポリペプチドを連結するための本明細書に記載されているものなどの、標準的なライゲーション技術を使用することにより、異種部分に連結することができる。
【０４３６】
小さい突然変異または単一点突然変異を導入するために、相同組換え（ＨＲ）鋳型を、膜透過移行ポリペプチドに連結することができる。一実施形態では、ＨＲ鋳型は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴまたはプラスミドである。ｓｓＤＮＡオリゴ設計のために、ほぼ中央に導入された突然変異を有する約１００〜１５０ｂｐの全体的相同性を使用し、５０〜７５ｂｐの相同性アームを得ることができる。
【０４３７】
一部の実施形態では、標的アンカー配列、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフを標的化するためのｇＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドを、
（ａ）配列番号１を含むヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１、２、３、４、５個であるが、１５、１２または１０個未満のヌクレオチドの付加、置換または欠失を有する配列番号１を含むヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号２を含むヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるヌクレオチド配列；少なくとも１、２、３、４、５個であるが、１５、１２または１０個未満のヌクレオチドの付加、置換または欠失を有する配列番号２を含むヌクレオチド配列
から選択されるＨＲ鋳型と共に膜透過移行ポリペプチドに連結する。
【０４３８】
本明細書に記載されているリンカーのいずれかを含有させて、膜透過移行ポリペプチドと異種部分とを共有的または非共有的に連結することができる。リンカーを使用して、例えば、異種部分からポリペプチドを離すことができる。例えば、リンカーを、ポリペプチドと異種部分との間に配置し、例えば、二次および三次構造の分子可撓性を提供することができる。一実施形態では、リンカーは、可撓性を提供するために少なくとも１つのグリシン、アラニン、およびセリンアミノ酸を含む。別の実施形態では、リンカーは、負に荷電したスルホネート基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、またはピロリン酸ジエステル基などの疎水性リンカーである。別の実施形態では、リンカーは切断性であり、ポリペプチドから異種部分を選択的に遊離するが、早期切断を防止するには十分に安定的である。
【０４３９】
投与後の結合
一部の実施形態では、本明細書に記載されている膜透過移行ポリペプチドは、例えば、投与後に、共有結合または非共有結合などを介して、他のポリペプチド、本明細書に記載されている異種部分、例えば、エフェクター分子、例えば、核酸、タンパク質、ペプチドもしくは他の分子、または他の薬剤、例えば、細胞内分子との結合を形成する能力を有する。一実施形態では、ポリペプチド上の１つまたは複数のアミノ酸は、グアノシンとの偽対を形成するアルギニンまたはヌクレオチド間リン酸結合またはポリマー間結合などを介して、核酸と連結することができる。一部の実施形態では、核酸は、ゲノムＤＮＡなどのＤＮＡ、ｔＲＮＡまたはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡである。別の実施形態では、ポリペプチド上の１つまたは複数のアミノ酸は、タンパク質またはペプチドと連結することができる。
【０４４０】
融合分子
一部の実施形態では、組成物は、ペプチドまたはポリペプチドを含む融合分子などの融合分子を含む。本明細書を読む当業者であれば、用語「タンパク質融合物」が「タンパク質」（またはペプチドもしくはポリペプチド）成分を含む融合分子を指してもよいことを理解する。一部の実施形態では、タンパク質融合物は、本明細書に記載されている部分の１つまたは複数、例えば、核酸配列、ペプチドもしくはタンパク質部分、膜透過移行ポリペプチド、標的化ペプチド／アプタマー、または本明細書に記載されている他の異種部分を含む。
【０４４１】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されているタンパク質融合物のいずれか１つを含む細胞または組織を含む。
【０４４２】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されているタンパク質融合物を含む医薬組成物を含む。
【０４４３】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されているタンパク質融合物を含む組成物を投与することによって遺伝子の発現をモジュレートする方法を含む。例えば、タンパク質融合物は、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ−３ａ−３Ｌ、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ−３ａ−３ａ、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ−３ａ−３Ｌ−３ａ、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ−３ａ−３Ｌ−ＫＲＡＢ、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ、ｄＣａｓ９−ＡＰＯＢＥＣ、ＡＰＯＢＥＣ−ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９−ＡＰＯＢＥＣ−ＵＧＩ、ｄＣａｓ９−ＵＧＩ、ＵＧＩ−ｄＣａｓ９−ＡＰＯＢＥＣ、ＵＧＩ−ＡＰＯＢＥＣ−ｄＣａｓ９、本明細書に記載されているタンパク質融合物の任意の変形形態、または本明細書に記載されているタンパク質もしくはタンパク質ドメインの他の融合物であってもよい。
【０４４４】
本明細書に記載されている方法および組成物に適応可能である例示的なｄＣａｓ９融合方法および組成物は公知であり、例えば、Kearnsら、Functional annotation of nativeenhancers with a Cas9-histone demethylase fusion. Nature Methods １２巻、４０１〜４０３頁（２０１５年）；およびMcDonaldら、Reprogrammable CRISPR/Cas9-basedsystem for inducing site-specific DNA methylation. Biology Open ２０１６年: doi:10.1242/bio.019067に記載されている。当業界で公知の方法を使用して、ｄＣａｓ９を、本明細書に記載されている様々な薬剤および／または分子のいずれかに融合することができる；そのように得られる融合分子は、様々な開示された方法において有用であり得る。
【０４４５】
一態様では、本開示は、ＤＮＡに対して作用するドメイン、例えば、酵素ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン、例えば、Ｃａｓ９ドメイン、例えば、ｄＣａｓ９ドメイン；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、デアミナーゼ）を含むタンパク質を、タンパク質を標的アンカー配列媒介接続のアンカー配列に標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドとの組合せで含む組成物であって、ヒト細胞中で、標的アンカー配列媒介接続を変化させるのに有効である組成物を含む。一部の実施形態では、酵素ドメインは、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９である。一部の実施形態では、タンパク質は、２つの酵素ドメイン、例えば、ｄＣａｓ９と、メチラーゼまたはデメチラーゼドメインとを含む。
【０４４６】
一部の実施形態では、標的化部分は、配列標的化ポリペプチドと、接続核形成分子との融合物、例えば、ｄＣａｓ９と、接続核形成分子、例えば、ヌクレアーゼと融合した１つのｇＲＮＡもしくはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドとの融合物、または融合物をコードする核酸を含む。（１つまたは複数の）エフェクタードメインおよび／または他の薬剤の全部または一部（例えば、その生物活性部分）に繋ぎ止められた触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼ、例えば、ｄｅａｄＣａｓ９（ｄＣａｓ９、例えば、Ｄ１０Ａ；Ｈ８４０Ａ）の融合は、１つまたは複数のＲＮＡ配列（ｓｇＲＮＡ）またはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドにより特定のＤＮＡ部位に誘導して、１つまたは複数の標的核酸配列の活性および／または発現をモジュレートする（例えば、ＤＮＡ配列をメチル化または脱メチル化する）ことができるキメラタンパク質または融合分子を作出する。
【０４４７】
本明細書で使用される場合、「エフェクタードメインの生物活性部分」は、エフェクタードメインの機能を（例えば、完全に、部分的に、最小限に）維持するポーション（例えば、「最小」または「コア」ドメイン）である。一部の実施形態では、ｄＣａｓ９と、エピジェネティック改変剤（ＤＮＡメチラーゼまたはＤＮＡ脱メチル化における役割を有する酵素、例えば、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ阻害剤、ＴＥＴファミリー酵素、およびその組合せ、またはタンパク質アセチルトランスフェラーゼもしくはデアセチラーゼなど）の１つまたは複数のエフェクタードメインの全部または一部との融合は、本明細書に記載されている方法において有用であるキメラタンパク質を作出する。したがって、一部の実施形態では、標的化部分は、ｄＣａｓ９−メチラーゼ融合物と共に、融合物を接続アンカー配列（ＣＴＣＦ結合モチーフなど）に標的化する部位特異的ｇＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、それによって、アンカー配列が接続核形成タンパク質に結合する親和性または能力を低下させる。他の一部の実施形態では、標的化部分は、ｄＣａｓ９−酵素融合物と共に、融合物を接続アンカー配列（ＣＴＣＦ結合モチーフなど）に標的化する部位特異的ｇＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、それによって、アンカー配列が接続核形成分子に結合する親和性または能力を増大させる。一部の実施形態では、１つまたは複数のエピジェネティック改変剤のエフェクタードメイン（例えば、ＤＮＡメチラーゼもしくは脱ＤＮＡメチル化における役割を有する酵素、またはタンパク質アセチルトランスフェラーゼもしくはデアセチラーゼ、またはデアミナーゼ）の全部または一部を、不活性ヌクレアーゼ、例えば、ｄＣａｓ９と融合する。他の態様では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれよりも多くのエフェクタードメイン（全部または生物活性部分）を、ｄＣａｓ９と融合する。
【０４４８】
本明細書に記載されているキメラタンパク質はまた、リンカー、例えば、アミノ酸リンカーを含んでもよい。一部の態様では、リンカーは、２つまたはそれよりも多くのアミノ酸、例えば、１つまたは複数のＧＳ配列を含む。一部の態様では、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９）と、２つまたはそれよりも多くのエフェクタードメイン（例えば、ＤＮＡメチラーゼまたはＤＮＡ脱メチル化における役割を有する酵素またはタンパク質アセチルトランスフェラーゼもしくはデアセチラーゼの）の融合物は、ドメインの間に１つまたは複数の介在リンカー（例えば、ＧＳリンカー）を含む。一部の態様では、ｄＣａｓ９は、介在リンカーを用いて２〜５個のエフェクタードメインと融合される。
【０４４９】
クロマチン構造の改変
本明細書に記載されている方法は、例えば、ＤＮＡ中のアンカー配列媒介接続を改変することにより、対象中での遺伝子発現をモジュレートするためにクロマチン構造（例えば、アンカー配列媒介接続）をモジュレートする。本明細書を読む当業者であれば、本明細書に記載されているモジュレーションが、その２次元表示を変化させる（例えば、ループまたは他のアンカー配列媒介接続を付加する、変化させる、または欠失させる）様式でクロマチン構造をモジュレートすることができることを理解するであろう；そのようなモジュレーションは、本明細書では、一般的な言い回しによれば、２次元構造のモジュレーションまたは改変と呼ばれる。
【０４５０】
一態様では、本明細書に記載されている方法は、アンカー配列媒介接続、例えば、ループのトポロジーを変化させて、核酸配列の転写をモジュレートすることによって２次元構造を改変することを含んでもよく、アンカー配列媒介接続の変化したトポロジーは、核酸配列の転写をモジュレートする。
【０４５１】
別の態様では、本明細書に記載されている方法は、複数のアンカー配列媒介接続、例えば、複数のループのトポロジーを変化させて、核酸配列の転写をモジュレートすることによって２次元構造のクロマチン構造を改変することを含んでもよく、変化したトポロジーは、核酸配列の転写をモジュレートする。
【０４５２】
別の態様では、本明細書に記載されている方法は、核酸配列の転写に影響する、アンカー配列媒介接続、例えば、ループを変化させることによって核酸配列の転写をモジュレートすることを含んでもよく、アンカー配列媒介接続の変化は、核酸配列の転写をモジュレートする。
【０４５３】
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続を変化させることは、クロマチン構造を改変すること、例えば、アンカー配列媒介接続のトポロジーを破壊すること［可逆的または不可逆的］、アンカー配列媒介接続中の１つもしくは複数のヌクレオチドを変化させること［配列を遺伝的に改変すること］、アンカー配列媒介接続をエピジェネティックに改変すること［１つもしくは複数の部位でＤＮＡメチル化をモジュレートすること］、または天然に存在しないアンカー配列媒介接続を形成することを含む。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続を変化させることは、クロマチン構造を改変することを含む。
【０４５４】
当業者であれば理解するように、アンカー配列の所与の対は、アンカー配列媒介接続の中および外に「呼吸する」ことができるが、アンカー配列の所与の対は、例えば、細胞型などの因子に応じて、多かれ少なかれ、多くの場合特定の状態（接続の中または外）にある傾向があってよい。
【０４５５】
「破壊」とは、アンカー配列媒介接続の形成および／または安定性が負に影響されることを意味する。
【０４５６】
可逆的破壊
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続を可逆的に破壊するための組成物および方法が本明細書に記載される。例えば、破壊は、転写を一過的にモジュレートしてもよく、例えば、約３０分〜約７日以下、または約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日、５日、６日、７日以下、またはその間の任意の時間にわたって持続するモジュレーションであってもよい。
【０４５７】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている標的化部分は、ＣＴＣＦとＣＴＣＦ結合モチーフとの相互作用を遮断することにより、例えば、ＣＴＣＦとＣＴＣＦ結合モチーフとによるループ形成に干渉する。一実施形態では、ＤＮＡを標的にし、アンカー配列の近くで立体的存在として作用する、ｇＲＮＡなどのエピジェネティック改変剤を用いてアンカー配列媒介接続を破壊するための組成物または方法が記載される。ｇＲＮＡは、特定のＤＮＡ配列（例えば、配列特異性を付与する配列が隣接するアンカー配列、ＣＴＣＦアンカー配列）を認識する。ｇＲＮＡは、接続核形成分子配列が立体的遮断剤として作用するのに干渉するさらなる配列を含んでもよい。一部の実施形態では、ｇＲＮＡを、１つまたは複数のペプチド、例えば、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）と組み合わせて、接続核形成分子に干渉する立体的存在として作用させる。ｇＲＮＡの分解は、立体的存在を除去し、それによって、接続核形成分子は、接続核形成分子配列への接近を獲得することができる。
【０４５８】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている標的化された変更は、アンカー配列媒介接続を可逆的に破壊する。一実施形態では、アンカー配列の近くのＤＮＡを標的にするために、遺伝子編集システムなどのエピジェネティック改変剤を用いてアンカー配列媒介接続を改変するための組成物または方法が記載される。ｇＲＮＡは、特定のＤＮＡ配列（例えば、配列特異性を付与する配列が隣接するアンカー配列、ＣＴＣＦアンカー配列）を認識し、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９は、転写リプレッサーを動員して、例えば、アンカー配列の近くでエピジェネティック改変を誘導する。転写活性化因子を、例えば、選択的に動員して、転写リプレッサーによって作製されたエピジェネティック改変を元に戻すことができる。
【０４５９】
別の実施形態では、外因性アンカー配列を導入して、アンカー配列媒介接続を変化させるための組成物または方法が記載される。天然に存在しないループを形成するか、または核酸配列の転写を変化させる天然に存在するアンカー配列媒介接続の形成を破壊する、天然に存在しない、または外因性のアンカー配列を導入する。外因性アンカー配列の除去は、天然に存在しないループの形成または天然に存在するアンカー配列媒介接続の再形成を防止する。
【０４６０】
一部の実施形態では、例えば、アンカー配列媒介接続内のアンカー配列、選択的スプライシング部位、または非翻訳ＲＮＡのための結合部位に対する、接続核形成分子の結合親和性を変化させる。一実施形態では、結合親和性が変化した操作された接続核形成分子を用いてアンカー配列媒介接続を破壊するための組成物または方法が記載され、例えば、接続核形成分子は、例えば、競合的結合により、内因性接続核形成分子の、その結合部位への結合を破壊する。操作された接続核形成分子の、内因性接続核形成分子との置き換えは、天然に存在するアンカー配列媒介接続を再形成する。
【０４６１】
一部の実施形態では、標的化部分である膜透過移行ポリペプチドを含む組成物または方法が記載される。一部の実施形態では、膜透過移行ポリペプチドは、本明細書に記載されている標的化部分の送達を補助する送達剤である。
【０４６２】
不可逆的破壊
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続を不可逆的に破壊するための組成物または方法が本明細書に記載される。例えば、破壊は、天然に存在しないアンカー配列媒介接続を形成する転写を安定にモジュレートし、例えば、少なくとも約１時間〜約３０日、または少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、もしくはそれより長い時間、またはその間の任意の時間にわたって持続するモジュレーションをもたらす。
【０４６３】
一部の実施形態では、接続核形成分子と、アンカー配列との相互作用を、標的化部分を用いて遮断する。一実施形態では、編集のためのアンカー配列の近くのＤＮＡを標的にするために、遺伝子編集システムなどのエピジェネティック改変剤を用いて、アンカー配列媒介接続を破壊するための組成物または方法が記載される。ｇＲＮＡは、特定のＤＮＡ配列（例えば、配列特異性を付与する配列が隣接するアンカー配列、ＣＴＣＦアンカー配列）を認識し、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼは、ＤＮＡ鎖中に切断、例えば、付加、欠失、相同組換えを導入する。
【０４６４】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている標的化された変更は、アンカー配列媒介接続を不可逆的に破壊する。一実施形態では、例えば、標的化部分、例えば、遺伝子編集システムを用いて、１つもしくは複数のヌクレオチドを置換すること、付加すること、もしくは欠失させること、または少なくとも１つの共通ヌクレオチド配列の向きを変化させることにより、アンカー配列媒介接続を変化させるための組成物または方法が記載される。一実施形態では、１つまたは複数のＤＮＡメチル化部位を変化させるため、例えば、標的化部分、例えば、低分子、例えば、亜硫酸水素化合物を用いて、アンカー配列媒介接続内のメチル化システインをチミンに突然変異させるための組成物または方法が記載される。
【０４６５】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている標的化された変更は、天然に存在するアンカー配列媒介接続を不可逆的に破壊し、天然に存在しないアンカー配列媒介接続を形成する。一部の実施形態では、外因性アンカー配列を付加して、天然に存在しないアンカー配列媒介接続を形成することによって、遺伝子編集システムなどのエピジェネティック改変剤を用いてアンカー配列媒介接続を破壊するための組成物または方法が記載される。
【０４６６】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている標的化された変更は、アンカー配列媒介接続を不可逆的に破壊する。一部の実施形態では、接続核形成分子の遺伝子を除去する、遺伝子編集システムなどのエピジェネティック改変剤を用いてアンカー配列媒介接続を破壊するための組成物または方法が記載される。
【０４６７】
一部の実施形態では、標的化部分は、例えば、ＣＴＣＦとＣＴＣＦ結合モチーフとの相互作用を遮断することによって、例えば、ＣＴＣＦとＣＴＣＦ結合モチーフとによるループ形成に永続的に干渉する。一実施形態では、立体的遮断剤として作用する接続核形成分子配列に共有結合するエピジェネティック改変剤を用いて、アンカー配列媒介接続を破壊するための組成物または方法が記載される。一部の実施形態では、エピジェネティック改変剤を１つまたは複数のペプチド、例えば、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）と組み合わせて、接続核形成分子に干渉する立体的存在として作用させる。
【０４６８】
物理的改変
一部の実施形態では、標的アンカー配列での部位特異的破壊によってアンカー配列媒介接続を変化させるための組成物、薬剤、融合分子、および／または方法が記載される。一部の実施形態では、そのような破壊は、アンカー媒介配列接続の形成および／または維持に物理的に干渉する、例えば、アンカー配列と核形成剤との結合に干渉する薬剤を使用して達成される。一部の実施形態では、薬剤は、立体的阻害によって、アンカー配列と、核形成剤との結合を破壊する。
【０４６９】
一部の実施形態では、本開示は、それが細胞内の内因性核形成ポリペプチドの結合と競合する十分な親和性で、細胞内の１つまたは複数の標的アンカー配列には特異的に結合し、細胞内の非標的化アンカー配列には結合しないＤＮＡ結合部分（本明細書に記載されているＤＮＡ結合部分または標的化部分など）を含む部位特異的破壊剤を提供する。
【０４７０】
様々な本明細書に記載されているＤＮＡ結合部分もしくは標的化部分またはその組合せのいずれかを使用することができる。例えば、可能性のあるＤＮＡ結合部分としては、限定されるものではないが、合成核酸（ＳＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、ポリアミド−ＳＮＡ／ＬＮＡ／ＢＮＡ／ＰＮＡコンジュゲート、ＤＮＡ挿入剤（例えば、ＳＮＡ／ＬＮＡ／ＢＮＡ／ＰＮＡコンジュゲート）、およびＤＮＡ配列特異的結合ペプチドまたはタンパク質−ＳＮＡ／ＬＮＡ／ＰＮＡ／ＢＮＡコンジュゲートが挙げられる。
【０４７１】
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合部分に付随するネガティブエフェクター部分（本明細書に記載されているネガティブエフェクター部分のいずれか１つ、またはその任意の組合せなど）をさらに含み、したがって、部位特異的破壊剤は、ＤＮＡ結合部分が１つまたは複数の標的アンカー配列で結合した場合、ネガティブエフェクター部分がそこに局在し、ネガティブエフェクター部分は、ネガティブエフェクター部分が存在しない場合と比較して、それが存在する場合に、内因性核形成ポリペプチドの二量体化が減少することにより特徴付けられる。
【０４７２】
遺伝子改変
一部の実施形態では、標的化された接続に付随するアンカー配列の部位特異的編集または突然変異により、アンカー配列媒介接続を変化させるための組成物、薬剤、融合分子、および／または方法が記載される。内因性の、または天然に存在するアンカー配列を変化させて、アンカー配列を不活化するか、もしくは欠失させる（例えば、それによって、アンカー配列媒介接続を破壊する）か、または変化させて、アンカー配列を突然変異させるか、もしくは置き換えて（例えば、親和性が変化した、例えば、親和性が低下した、もしくは親和性が増大した変化したアンカー配列を有するアンカー配列を、核形成タンパク質に突然変異させるか、もしくは置き換える）、標的化された接続の強度をモジュレートすることができる。例えば、１つまたは複数の外因性アンカー配列を、対象のゲノム中に組み込んで、例えば、標的遺伝子をサイレンシングするために、標的遺伝子を組み込む天然に存在しないアンカー配列接続を作出することができる。別の例では、外因性アンカー配列は、内因性アンカー配列とアンカー配列媒介接続を形成することができる。核形成タンパク質は、例えば、ＣＴＣＦ、コヘシン、ＵＳＦ１、ＹＹ１、ＴＡＦ３、ＺＮＦ１４３結合モチーフ、またはアンカー配列媒介接続の形成を促進する別のポリペプチドであってもよい。
【０４７３】
一実施形態では、ＣＴＣＦ結合モチーフ：Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（Ｇ／Ａ／Ｔ）ＣＣ（Ａ／Ｔ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）ＡＧ（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ｔ）ＧＧ（Ｃ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｇ／Ａ／Ｃ）（配列番号１）（式中、Ｎは任意のヌクレオチドである）であるアンカー配列を変化させるための組成物または方法が記載される。ＣＴＣＦ結合モチーフはまた、反対の向きに、例えば、（Ｇ／Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ａ／Ｔ）ＧＧ（Ｇ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｔ／Ｇ）ＣＣ（Ｇ／Ａ／Ｔ）Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（配列番号２）に変化させてもよい。
【０４７４】
変更を、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞の遺伝子中に導入することができる。
【０４７５】
一部の事例では、例えば、クロマチン構造の２次元表示がループのものから非ループのものへと変化し得る（またはループよりも非ループのほうが好ましい）、またはその逆であり得る、例えば、変更が、ＣＴＣＦ結合を廃止することによって、標的化された接続の形成を廃止するようにクロマチン構造を変化させて、標的化されたＣＴＣＦ結合モチーフを不活化するための組成物または方法が記載される。他の例では、変更は、ＣＴＣＦ結合を減弱させる（例えば、そのレベルを低下させる）ことによって、標的化された接続の形成を減少させる（例えば、核形成タンパク質により低い親和性で結合するようにＣＴＣＦ配列を変化させることによる）。一部の実施形態では、標的化された変更は、核形成タンパク質によるＣＴＣＦ結合を増加させる（例えば、核形成タンパク質により高い親和性で結合するようにＣＴＣＦ配列を変化させることによる）ことによって、標的化された接続の形成を促進する。核形成タンパク質は、例えば、ＣＴＣＦ、コヘシン、ＵＳＦ１、ＹＹ１、ＴＡＦ３、ＺＮＦ１４３結合モチーフ、またはアンカー配列媒介接続の形成を促進する別のポリペプチドであってもよい。
【０４７６】
当業者であれば理解できるように、本明細書に記載されている様々な組成物、薬剤、および／または融合分子が、アンカー配列、例えば、標的化されたアンカー配列を遺伝的に改変するのに好適であってよい。
【０４７７】
例えば、一部の実施形態では、部位特異的標的化部分（本明細書に記載されている標的化部分のいずれか１つなど）と、脱アミノ化剤とを含む融合分子であって、部位特異的標的化部分が、融合分子を、標的アンカー配列に標的化するが、少なくとも１つの非標的アンカー配列には標的化しない、融合分子が提供される。酵素活性を有しない脱アミノ化剤（例えば、亜硫酸水素ナトリウムなどの化学的薬剤）、および／または酵素活性を有する脱アミノ化剤（例えば、デアミナーゼもしくはその機能的部分）などの、様々な脱アミノ化剤を使用することができる。
【０４７８】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている融合分子を含む医薬組成物が提供される。
【０４７９】
一部の実施形態では、（ｉ）酵素的に不活性なＣａｓポリペプチドと、脱アミノ化剤とを含む融合分子、または融合分子をコードする核酸；および（ｉｉ）融合分子を、標的アンカー配列に標的化するが、少なくとも１つの非標的アンカー配列（本明細書にさらに記載されているものなどの「部位特異的ガイドＲＮＡ」）には標的化しない、ガイドＲＮＡを含む組成物（例えば、医薬組成物）が提供される。
【０４８０】
小さい突然変異または単一点突然変異を導入するために、相同組換え（ＨＲ）鋳型を使用することもできる。一実施形態では、ＨＲ鋳型は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴまたはプラスミドである。ｓｓＤＮＡオリゴの設計のために、ほぼ中央に導入された突然変異を有する約１００〜１５０ｂｐの全体的相同性を使用し、５０〜７５ｂｐの相同性アームを得ることができる。実施形態では、標的アンカー配列、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフを標的化するためのｇＲＮＡを、
（ａ）配列番号１を含むヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１、２、３、４、５個であるが、１５、１２または１０個未満のヌクレオチドの付加、置換または欠失を有する配列番号１を含むヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号２を含むヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一であるヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも１、２、３、４、５個であるが、１５、１２または１０個未満のヌクレオチドの付加、置換または欠失を有する配列番号２を含むヌクレオチド配列
から選択されるＨＲ鋳型と共に投与する。
【０４８１】
エピジェネティック改変
一部の実施形態では、部位特異的エピジェネティック改変（例えば、メチル化または脱メチル化）によってアンカー配列媒介接続を変化させるための組成物および方法が本明細書に記載される。内因性の、または天然に存在するアンカー配列を変化させて、そのメチル化を増加させる（例えば、それによって、核形成タンパク質の、アンカー配列への結合を減少させ、アンカー配列媒介接続を破壊もしくは防止する）、または変化させて、そのメチル化を減少させる（例えば、それによって、核形成タンパク質の、アンカー配列への結合を増加させ、アンカー配列媒介接続の強度を促進するか、もしくは増加させる）ことができる。核形成タンパク質は、例えば、ＣＴＣＦ、コヘシン、ＵＳＦ１、ＹＹ１、ＴＡＦ３、ＺＮＦ１４３結合モチーフ、またはアンカー配列媒介接続の形成を促進する別のポリペプチドであってもよい。
【０４８２】
当業者であれば理解できるように、本明細書に記載されている様々な組成物、薬剤、および／または融合分子は、アンカー配列、例えば、標的化されたアンカー配列をエピジェネティックに改変するのに好適であってよい。
【０４８３】
例えば、一部の実施形態では、部位特異的標的化部分（本明細書に記載されている標的化部分のいずれか１つなど）と、エピジェネティック改変剤とを含む融合分子であって、部位特異的標的化部分が、融合分子を、標的アンカー配列に標的化するが、少なくとも１つの非標的アンカー配列には標的化しない、融合分子が提供される。エピジェネティック改変剤は、本明細書に開示されるエピジェネティック改変剤のいずれか１つ、またはその任意の組合せであってもよい。
【０４８４】
例えば、（１つまたは複数の）エフェクタードメインの全部または一部（例えば、その生物活性部分）に繋ぎ止められた触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼ、例えば、ｄｅａｄＣａｓ９（ｄＣａｓ９、例えば、Ｄ１０Ａ；Ｈ８４０Ａ）の融合は、１つまたは複数のＲＮＡ配列（ｓｇＲＮＡ）により特定のＤＮＡ部位に誘導して、１つまたは複数の標的核酸配列の活性および／または発現をモジュレートする（例えば、ＤＮＡ配列をメチル化または脱メチル化する）ことができるキメラタンパク質を作出する。
【０４８５】
一部の実施形態では、ｄＣａｓ９と、エピジェネティック改変剤（ＤＮＡメチラーゼまたはＤＮＡ脱メチル化における役割を有する酵素など）の１つまたは複数のエフェクタードメインの全部または一部との融合は、本明細書に記載されている方法において有用であるキメラタンパク質を作出する。したがって、一部の実施形態では、ｄＣａｓ９−メチラーゼ融合物をコードする核酸を、融合物を接続アンカー配列（ＣＴＣＦ結合モチーフなど）に標的化する部位特異的ｇＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドと共に、それを必要とする対象に投与し、それによって、アンカー配列が接続核形成タンパク質に結合する親和性または能力を低下させる。他の一部の実施形態では、ｄＣａｓ９−酵素融合物をコードする核酸を、融合物を接続アンカー配列（ＣＴＣＦ結合モチーフなど）に標的化する部位特異的ｇＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドと共に、それを必要とする対象に投与し、それによって、アンカー配列が接続核形成タンパク質に結合する親和性または能力を増大させる。
【０４８６】
一部の実施形態では、１つまたは複数のメチラーゼ、またはＤＮＡ脱メチル化における役割を有する酵素のエフェクタードメインの全部または一部を、不活性ヌクレアーゼ、例えば、ｄＣａｓ９と融合する。他の態様では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれよりも多くのメチラーゼ、またはＤＮＡ脱メチル化における役割を有する酵素のエフェクタードメイン（全部または生物活性部分）を、ｄＣａｓ９と融合する。本明細書に記載されているキメラタンパク質はまた、リンカー、例えば、アミノ酸リンカーを含んでもよい。一部の態様では、リンカーは、２つまたはそれよりも多くのアミノ酸、例えば、１つまたは複数のＧＳ配列を含む。一部の態様では、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９）と２つまたはそれよりも多くのエフェクタードメイン（例えば、ＤＮＡメチラーゼまたはＤＮＡ脱メチル化における役割を有する酵素の）との融合物は、ドメイン間に１つまたは複数の介在リンカー（例えば、ＧＳリンカー）を含む。一部の態様では、ｄＣａｓ９を、介在リンカーを用いて２〜５個のエフェクタードメインと融合する。
【０４８７】
実施形態では、がん遺伝子、腫瘍抑制因子、またはヌクレオチド反復と関連する疾患と関連するＣＴＣＦ結合モチーフを特異的に標的化するｇＲＮＡを含む組成物または方法が記載される。
【０４８８】
本明細書に記載されている方法および組成物において有用なエピジェネティック改変剤としては、例えば、ＤＮＡメチル化、ヒストンアセチル化、およびＲＮＡ関連サイレンシングに影響する薬剤が挙げられる。実施形態では、本明細書に記載されている方法は、エピジェネティック酵素（例えば、エピジェネティックマーク、例えば、アセチル化および／またはメチル化を生成する、または除去する酵素）の配列特異的標的化を含む。本明細書に記載されているＣＲＩＳＰＲ法を使用してアンカー配列に標的化することができる例示的なエピジェネティック酵素としては、ＤＮＡメチラーゼ（例えば、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＤＮＭＴＬ）、ＤＮＡ脱メチル化における役割を有する酵素（例えば、ＴＥＴファミリーの酵素は、５−メチルシトシンの５−ヒドロキシメチルシトシンおよびより高度に酸化的な誘導体への酸化を触媒する）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３）、サーチュイン１、２、３、４、５、６、または７、リシン特異的ヒストンデメチラーゼ１（ＬＳＤ１）、ヒストン−リシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（Ｓｅｔｄｂ１）、真正染色質ヒストン−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９ａ）、ヒストン−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＳＵＶ３９Ｈ１）、ｚｅｓｔｅ相同体２のエンハンサー（ＥＺＨ２）、ウイルスリシンメチルトランスフェラーゼ（ｖＳＥＴ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＳＥＴ２）、およびタンパク質−リシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＳＭＹＤ２）が挙げられる。そのようなエピジェネティック改変剤の例は、例えば、Grooteら、Nuc. Acids Res.（２０１２年）：１〜１８頁に記載されている。
【０４８９】
実施形態では、本明細書において有用なエピジェネティック改変剤は、参照により本明細書に組み込まれる、Koferleら、Genome Medicine ７巻（５９号）、（２０１５年）：１〜３頁（例えば、表１）に記載の構築物を含む。
【０４９０】
本明細書に記載されている方法および組成物に適応可能である例示的なｄＣＡｓ９融合物の方法および組成物は公知であり、例えば、Kearnsら、Functional annotation of nativeenhancers with a Cas9-histone demethylase fusion. Nature Methods １２巻、４０１〜４０３頁（２０１５年）；およびMcDonaldら、Reprogrammable CRISPR/Cas9-basedsystem for inducing site-specific DNA methylation. Biology Open ２０１６年: doi:10.1242/bio.019067に記載されている。
【０４９１】
一部の実施形態では、（ｉ）酵素的に不活性なＣａｓポリペプチドと、エピジェネティック改変剤とを含む融合ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸；および（ｉｉ）融合分子を、標的アンカー配列に標的化するが、少なくとも１つの非標的アンカー配列（例えば、本明細書にさらに記載されているものなどの、「部位特異的ガイドＲＮＡ」）には標的化しないガイドＲＮＡを含む組成物（例えば、医薬組成物）が提供される。
【０４９２】
新しいアンカー配列媒介接続
一部の実施形態では、標的化された接続に付随する新しいアンカー配列を生成することによってアンカー配列媒介接続を変化させるための組成物、薬剤、融合分子、および／または方法が記載される。
【０４９３】
一部の実施形態では、それが細胞内の内因性核形成ポリペプチドの結合と競合する十分な親和性で、細胞内の１つまたは複数の標的配列に特異的に結合し、細胞内の非標的化配列に結合しない操作されたＤＮＡ結合部分；および操作されたＤＮＡ結合部分に付随する核形成ポリペプチド二量体化ドメインを含み、したがって、操作されたＤＮＡ結合部分が少なくとも１つの標的配列で結合する場合、核形成ポリペプチド二量体化ドメインがそこに局在し、それぞれの少なくとも１つの標的化された配列が標的アンカー配列であり、核形成ポリペプチド二量体化ドメインが標的アンカー配列に局在する場合、核形成ポリペプチド二量体化ドメインと核形成ポリペプチドとの相互作用がアンカー配列媒介接続を生成するように、少なくとも１つまたは複数の標的アンカー配列が、核形成ポリペプチドが結合するアンカー配列に対して配置されている、操作された部位特異的核形成剤が提供される。
【０４９４】
一部の実施形態では、標的アンカー配列は、ＣＴＣＦ結合モチーフを含まない。
【０４９５】
遺伝子操作
一態様では、本開示は、アンカー配列媒介接続に標的化された変更を有する操作された細胞を含む組成物および方法を含む。別の態様では、本開示は、標的化された変更を有するアンカー配列媒介接続を含む操作された核酸配列を含む。
【０４９６】
一部の実施形態では、標的化された変更は、少なくとも１つのアンカー配列、例えば、接続核形成分子結合配列、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフ中に１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加または欠失を含む。一部の実施形態では、標的化された変更は、アンカー配列媒介接続内に１つまたは複数のＤＮＡメチル化部位の変更を含む。
【０４９７】
一部の実施形態では、標的化された変更は、少なくとも１つの外因性アンカー配列を含む。一部の実施形態では、標的化された変更は、少なくとも１つの接続核形成分子結合部位を変化させる、例えば、接続核形成分子に対する結合親和性を変化させる。一部の実施形態では、標的化された変更は、少なくとも１つの共通ヌクレオチド配列の向きを変化させる。
【０４９８】
一部の実施形態では、標的化された変更は、染色体内ループなどの、天然に存在しないアンカー配列媒介接続を形成する。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、第１のアンカー配列に結合した第１の接続核形成分子、第２のアンカー配列に結合した第２の接続核形成分子、および第１と第２の接続核形成分子の間の会合によって媒介される。１つのそのような実施形態では、第１または第２の接続核形成分子は、参照値、例えば、変更の非存在下でのアンカー配列に対する結合親和性よりも高い、または低い、アンカー配列に対する結合親和性を有する。
【０４９９】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている、操作された細胞、例えば、複数の細胞、または操作された核酸配列、例えば、ベクターを含む医薬組成物を含む。
【０５００】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている操作された細胞または操作された核酸配列は、アンカー配列媒介接続を破壊する標的化された変更、例えば、可逆的または不可逆的破壊を含む。
【０５０１】
使用方法
本明細書に記載されている方法は、例えば、細胞中での遺伝子活性、送達、および浸透率の幅広い制御を可能にする。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、体細胞である。一部の実施形態では、細胞は、一次細胞である。例えば、一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物体細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物体細胞は、一次細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物体細胞は、非胚細胞である。
【０５０２】
一部の実施形態では、組成物、薬剤、または融合分子を細胞に送達するステップを含む方法が提供される。
【０５０３】
一部の実施形態では、送達するステップは、ｅｘ  ｖｉｖｏで実行される。一部の実施形態では、方法は、送達するステップの前に、対象から細胞（例えば、哺乳動物細胞）を取り出すステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、送達するステップの後に、（ｂ）細胞（例えば、哺乳動物細胞）を対象に投与するステップをさらに含む。
【０５０４】
一部の実施形態では、送達するステップは、組成物、薬剤、または融合分子を含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、対象は、疾患または状態を有する。
【０５０５】
一部の実施形態では、送達するステップは、細胞膜を横断する送達を含む。
【０５０６】
一部の実施形態では、（ａ）細胞、例えば、哺乳動物体細胞内のアンカー配列の１つまたは複数のヌクレオチドを置換する、付加する、または欠失させるステップを含む方法が提供される。
【０５０７】
一部の実施形態では、置換する、付加する、または欠失させるステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏで実行される。一部の実施形態では、置換する、付加する、または欠失させるステップは、ｅｘ  ｖｉｖｏで実行される。
【０５０８】
一部の実施形態では、アンカー配列は、アンカー配列が細胞のゲノム中に位置する点で、ゲノムアンカー配列である。
【０５０９】
一部の実施形態では、哺乳動物体細胞を、疾患または状態を有する対象に送達するステップを含む方法であって、哺乳動物体細胞内のアンカー配列の１つまたは複数のヌクレオチドが置換、付加、または欠失された、方法が提供される。
【０５１０】
一部の実施形態では、（ａ）哺乳動物体細胞を対象に投与するステップを含む方法であって、哺乳動物体細胞が対象から得られ、本明細書に記載されている組成物、薬剤、または融合分子が哺乳動物体細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで送達された、方法が提供される。
【０５１１】
一部の実施形態では、血液、肝臓、免疫系、神経系などのいずれか１つ、またはその組合せに影響する適応症を、哺乳動物対象においてアンカー配列媒介接続を変化させることによって遺伝子発現をモジュレートすることにより処置することができる。例えば、複数の自己免疫状態は、ＩＬ−１０媒介性寛容化応答が惹起される場合、改善する。しかしながら、組換えＩＬ−１０療法はまだ有効ではない。ＩＬ−１０遺伝子に付随するアンカー配列媒介接続を変化させることにより、ＩＬ−１０の発現を増加させて、自己免疫状態を改善することができる。別の例では、ＩＬ−６発現を、その付随するアンカー配列媒介接続を変化させることによって増加させて、ＩＬ−６遺伝子のごく近接にそのエンハンシング配列を持って行くことができる。
【０５１２】
一態様では、哺乳動物対象における遺伝子発現を変化させるか、またはアンカー配列媒介接続を変化させるための方法が記載される。この方法は、対象に（別々に、または同じ医薬組成物中の）：Ｃａｓもしくは改変Ｃａｓタンパク質を含む第１のポリペプチドドメインと、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を有する［または脱メチル化もしくはデアミナーゼ活性を伴う］ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含むタンパク質、またはＣａｓもしくは改変Ｃａｓタンパク質を含む第１のポリペプチドドメインと、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を有する［または脱メチル化もしくはデアミナーゼ活性を伴う］ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含むタンパク質をコードする核酸、およびアンカー配列媒介接続のアンカー配列を標的にする少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を投与することを含む。
【０５１３】
本明細書に記載されている方法および組成物は、アンカー配列媒介接続を安定に、もしくは一過的に変化させること、または核酸配列の転写をモジュレートすることによって疾患を処置する。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続のクロマチン構造またはトポロジーを変化させて、少なくとも約１時間〜約３０日、または少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、もしくはそれより長い時間、またはその間の任意の時間にわたって持続するモジュレーションなどの、転写の安定的なモジュレーションをもたらす。一部の他の実施形態では、アンカー配列媒介接続のクロマチン構造またはトポロジーを変化させて、約３０分〜約７日以下、または約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日、５日、６日、７日以下、またはその間の任意の時間にわたって持続するモジュレーションなどの、転写の一過的なモジュレーションをもたらす。
【０５１４】
一態様では、細胞、組織または対象に、本明細書に記載されている組成物、薬剤、および／または融合分子を投与することを含む、標的遺伝子の発現を改変する方法が提供される。
【０５１５】
一態様では、本開示は、標的遺伝子に付随するアンカー配列媒介接続を変化させることを含み、変更が標的遺伝子の転写をモジュレートする、標的遺伝子の発現を改変する方法を含む。
【０５１６】
別の実施形態では、アンカー配列媒介接続を変化させるための本明細書に記載されている方法および組成物は誘導性であってよい。アンカー配列媒介接続の誘導性変更の使用は、変更のスイッチを入れるか、またはそれが所望されない場合、変更のスイッチを切ることができる分子スイッチを提供する。変更を誘導するために使用されるシステムの例としては、限定されるものではないが、原核オペロン、例えば、ｌａｃオペロン、トランスポゾンＴｎ１０、テトラサイクリンオペロンなどに基づく誘導性標的化部分、および真核シグナル伝達経路、例えば、ステロイド受容体に基づく発現系、例えば、エストロゲン受容体またはプロゲステロンに基づく発現系、メタロチオネインに基づく発現系、エクジソンに基づく発現系に基づく誘導性標的化部分が挙げられる。別の実施形態では、本明細書に記載されている方法および組成物は、誘導性接続核形成分子またはアンカー配列媒介接続と相互作用する他のタンパク質を含む。
【０５１７】
一部の実施形態では、細胞または組織を対象から切り出し、遺伝子発現、例えば、内因性または外因性遺伝子発現をｅｘ  ｖｉｖｏで変化させた後、細胞または組織を対象に移植し戻すことができる。任意の細胞または組織を切り出し、再移植のために使用することができる。細胞および組織の一部の例としては、限定されるものではないが、幹細胞、脂肪細胞、免疫細胞、筋細胞、骨髄由来細胞、腎臓被膜に由来する細胞、線維芽細胞、内皮細胞、および肝細胞が挙げられる。例えば、患者に由来する脂肪組織をｅｘ  ｖｉｖｏで変化させて、エネルギー産生および脂質利用を増加させることができる。脂肪組織を切り出した後、それを本明細書に記載されている１つまたは複数の組成物で処理して、ＵＣＰ−１またはエネルギー産生経路のエントロピーを増大させるか、もしくはプロリル−４−ヒドロキシラーゼドメイン２（ＰＨＤ２）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）、およびペリリピンなどの脂質分解を増加させる任意の他のタンパク質を上方調節することができる。改変された脂肪細胞は、患者に戻され、「炉」として作用する、例えば、炉は循環から脂質を取り込み、それらをエネルギー産生のために使用する。別の例では、エフェクターを対象中に筋肉内注射して、ＧＬＵＴ−４ループを操作し、その発現を増加させて、循環から筋肉組織へのグルコース取込みを増加させることができる。
【０５１８】
別の実施形態では、細胞または組織を、本明細書に記載されている１つまたは複数の組成物を用いて変化させて、１つまたは複数の分泌因子を産生することができる。細胞または組織を、所望の分泌タンパク質を発現するように改変し、対象中に移植し戻す。例えば、脂肪組織を、エネルギー利用または脂質分解タンパク質を発現するように改変して、エネルギー産生を増加させることができる。別の例では、特定の細胞のホーミングまたは位置を、一度、対象中に導入されたら、標的部位で１つまたは複数の因子を分泌するように改変することができる。
別の実施形態では、細胞または組織を、本明細書に記載されている１つまたは複数の組成物を用いて変化させて、１つまたは複数の外因性を産生することができる。
【０５１９】
現在の送達技術はまた、不用意な効果、例えば、ＤＮＡからの転写因子のゲノムワイドな除去を有し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法は、オフターゲット、例えば、幅広い、またはゲノムワイドな効果、例えば、転写因子の除去なしに、膜を横断して本明細書に記載されている組成物を送達することによって遺伝子の転写をモジュレートする。一実施形態では、膜を横断する異種部分の貫通を増加させるのに十分な用量で本明細書に記載されている組成物を送達することは、オフターゲット転写活性を有意に変化させない、例えば、異種部分のみの送達後の活性と比較して、１つまたは複数のオフターゲットの転写活性の５０％、４０％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、またはその間の任意のパーセンテージの増加を示す。
【０５２０】
本開示はまた、本明細書に記載されている組成物を対象に送達する方法も含む。実施形態では、組成物は、細胞膜、例えば、形質膜、核膜、またはオルガネラ膜を横断して送達される。現在のポリマー送達技術は、ある特定の細胞型、通常、エンドサイトーシスを誘発するためにカルシウム流入に依拠するマクロファージおよびがん細胞などの、エンドサイトーシスを好ましく利用する細胞におけるエンドサイトーシス速度を増加させる。いかなる特定の理論によっても束縛されるものではないが、本明細書に記載されているポリペプチドは、典型的には、多くの薬剤が接近できない膜を横断する組成物の移動を補助すると考えられる。
【０５２１】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法は、エンドサイトーシス速度が低い細胞中への本明細書に記載されている膜を横断する異種部分の貫通を増加させるのに十分な用量で組成物を送達することを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法は、標的細胞中でのエンドサイトーシスを有意に増加させない。一実施形態では、膜を横断する異種部分の貫通を増加させるのに十分な用量での本明細書に記載されている組成物の送達は、エンドサイトーシスを有意に増加させない、例えば、異種部分のみの送達と比較して、エンドサイトーシスの約５０％、４０％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、またはその間の任意のパーセンテージの増加を示す。
【０５２２】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている膜透過移行ポリペプチドを投与する方法は、カルシウム流入を有意に増加させない。一実施形態では、方法は、膜を横断する異種部分の貫通を増加させるのに十分な用量で本明細書に記載されている組成物を送達することを含み、カルシウム流入を有意に増加させない、例えば、異種部分のみの送達と比較して、カルシウム流入の約５０％、４０％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下、またはその間の任意のパーセンテージの増加を示す。別の実施形態では、方法は、カルシウム移動があまり区画化されていない、例えば、異種部分のみの送達と比較して、約５０％、４０％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、またはその間の任意のパーセンテージの区画化されたカルシウム移動で膜を横断する異種部分の貫通を増加させるのに十分な用量で、本明細書に記載されている組成物を送達することを含む。
【０５２３】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている膜透過移行ポリペプチドを投与する方法は、エンドソームとは無関係に膜を横断して本明細書に記載されている組成物を送達する。一実施形態では、膜を横断する異種部分の貫通を増加させるのに十分な用量で本明細書に記載されている組成物を送達することは、エンドソーム活性を有意に増加させない、例えば、異種部分のみの送達と比較して、エンドソーム活性の５０％、４０％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、またはその間の任意のパーセンテージの増加を示す。
【０５２４】
一態様では、本開示は、組成物が治療的異種部分、例えば、薬物を含み、組成物が治療剤のみと比較して治療剤の細胞内送達を増加させる、組成物を送達する方法を含む。例えば、本明細書に記載されている膜透過移行ポリペプチドを含む組成物は、少なくとも血液脳関門、母体と胎児の血液を隔てる胎盤膜、輸精管中のセルトリ細胞と血液との間の血液−精巣関門を貫通することができる。本開示の組成物が浸透率またはバイオアベイラビリティが低い治療剤に連結されたポリペプチドを含む場合、組成物は、治療剤の浸透率またはバイオアベイラビリティを増加させる。別の例では、組成物は、血液脳関門排出ポンプの阻害剤、例えば、フェニルアラニン−アルギニンβ−ナフチルアミド（ＰＡβＮ）、ベラパミル（verampamil）、フェノチアジンなどの三環式化学増感剤である異種部分に連結されたポリペプチドを含む。組成物の投与は、Ｐ−糖タンパク質およびＯａｔ３などの、血液脳関門排出ポンプを選択的に阻害することによって血液脳関門貫通を補助する。
【０５２５】
一態様では、本開示は、特定の組織または細胞および治療的異種部分を標的にする、標的化異種部分、例えば、受容体リガンドを含む組成物を標的組織または細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、肝臓、終脳の尾状核および被殻）に送達する方法を含む。投与時に、組成物は、治療剤のみと比較して治療剤の標的化された送達を増加させる。本開示の組成物を、拡散またはオフターゲット効果に悩まされる現存の治療剤と共に使用する場合、治療剤の特異性が増大する。例えば、本明細書に記載されている組成物は、化学療法剤およびがん細胞上の受容体に特異的に結合するリガンド部分に連結されたポリペプチドを含む。組成物の投与は、リガンド受容体相互作用により、化学療法剤のがん細胞に対する特異性を増大させる。
【０５２６】
一態様では、本開示は、細胞または組織と、本明細書に記載されている組成物とを接触させることを含む、治療剤の細胞内送達のための方法を含む。一実施形態では、治療剤は、本明細書に記載されているポリペプチドに連結された異種部分であり、組成物は、治療剤のみと比較して、治療剤の細胞内送達を増加させる。
【０５２７】
一態様では、本開示は、細胞と、本明細書に記載されている組成物とを接触させることを含む、細胞死を誘導する方法を含む。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載されているトポテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤に連結されたポリペプチドと、ウイルスＤＮＡ配列または遺伝子中の突然変異などの標的細胞に特異的な核酸配列とを含む。ポリペプチドは細胞の核に移行し、ウイルスＤＮＡ配列または遺伝子突然変異に特異的に結合する。トポイソメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡ複製機構がゲノム中の二本鎖切断を修復するのを防止し、細胞は最終的にアポトーシスを誘導する。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載されているトポテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤に連結されたポリペプチドと、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）、壊死の初期に放出される細胞質ペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼなどの壊死細胞マーカーに特異的に結合する異種部分とを含む。ポリペプチドは、壊死細胞マーカーに結合することによって壊死の初期段階の細胞を標的にし、トポイソメラーゼ阻害剤は最終的にはアポトーシスを誘導して、壊死細胞をより効率的に消失させる。
【０５２８】
一態様では、本開示は、細胞と、本明細書に記載されている組成物とを接触させることによって、膜タンパク質をモジュレートする方法を含む。一実施形態では、膜タンパク質モジュレーターは、本明細書に記載されているポリペプチドに連結された異種部分であり、組成物と細胞との接触は、膜タンパク質モジュレーションをもたらす。
【０５２９】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている組成物を対象に投与して、イオンチャネル、細胞表面受容体およびシナプス受容体などの膜タンパク質をモジュレートする方法を含む。一実施形態では、膜タンパク質モジュレーターは、本明細書に記載されているポリペプチドに連結された異種部分であり、組成物の投与は、膜タンパク質モジュレーションをもたらす。
【０５３０】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている組成物を対象に非非経口的に投与して、非経口治療剤の有効性を増大させ、その毒性を低下させる方法を含む。一実施形態では、非経口治療剤は、本明細書に記載されているポリペプチドに連結された異種部分であり、組成物の投与は、非経口治療剤の有効性の増大およびその毒性の低下をもたらす。一実施形態では、方法は、組成物の経口送達を含む。別の実施形態では、非経口治療剤は、粘膜適応症を処置する。
【０５３１】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている組成物と、細菌または病原体とを接触させて、細菌または病原体の感染能力、毒性または生存能力を低下させる方法を含む。
【０５３２】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている組成物を提供することを含む、突然変異を担持する細胞中でアポトーシスを誘導する方法を含む。一実施形態では、本明細書に記載されているポリペプチドを、細胞中の突然変異配列に特異的に結合する核酸である１つの異種部分およびＦａｓ、Ｆａｓリガンド、ニューロトロフィン受容体、ＦＡＤＤ、ＢＩＤ、ＴＰＥＮ、ＢＡＭ７、シスプラチン、クラドリビン、ピューロマイシン、モネンシン、スリンダックスルホン、トリプトリド、ベツリン酸、ブファリン、ガンボギン酸、アピシジン、および他の公知の薬剤などの、アポトーシスを誘導する別の異種部分に連結する。
【０５３３】
別の態様では、（ａ）Ｃａｓまたは改変Ｃａｓタンパク質を含む第１のポリペプチドドメインと、第２のポリペプチドドメイン、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を有するか、または脱メチル化もしくはデアミナーゼ活性を伴うポリペプチドとを含むタンパク質をコードする核酸、および（ｂ）タンパク質を、標的細胞中の標的アンカー配列媒介接続のアンカー配列に標的化するための少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むキットが記載される。一部の実施形態では、タンパク質をコードする核酸とｇＲＮＡとは、同じベクター、例えば、プラスミド、ＡＡＶベクター、ＡＡＶ９ベクター中にある。別の実施形態では、タンパク質をコードする核酸とｇＲＮＡとは、別々のベクター中にある。
【０５３４】
製剤、送達、および投与
様々な実施形態では、本明細書に記載されている医薬組成物を、任意の投与経路による細胞および／または対象への送達のために製剤化することができる。対象への投与の様式は、注射、輸注、吸入、鼻内、眼内、局所送達、カニューレ間送達、または摂取を含んでもよい。注射としては、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室あ内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内注射および輸注が挙げられる。一部の実施形態では、投与は、例えば、噴霧を用いる、エアロゾル吸入を含む。一部の実施形態では、投与は、全身（例えば、経口、直腸、鼻、舌下、頬、もしくは非経口）、腸（例えば、全身に広がる効果であるが、消化管を介して送達される）、または局部（例えば、皮膚への局部適用、硝子体内注射）である。一実施形態では、組成物は全身的に投与される。別の実施形態では、投与は非非経口であり、治療剤は非経口治療剤である。
【０５３５】
組成物を、対象に１回投与するか、またはあるいは、複数回の投与を、一定期間にわたって実行することができる。例えば、２、３、４、５回、またはそれよりも多くの投与を、１回の処置の間に、または一定期間にわたって対象に与えることができる。一部の実施形態では、６、８、１０、１２、１５もしくは２０回またはそれよりも多くの投与を、処置レジメンとして、１回の処置の間に、または一定期間にわたって対象に与えることができる。
【０５３６】
一部の実施形態では、必要に応じて、例えば、疾患、障害または状態と関連する症状が持続する限り、投与を与えることができる。一部の実施形態では、対象の人生の残りにわたって反復投与を指示することができる。処置期間は変化してもよく、例えば、１日、２日、３日、１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、またはそれよりも長くてもよい。
【０５３７】
様々な実施形態では、本開示は、薬学的に許容される賦形剤を含む本明細書に記載されている医薬組成物を含む。薬学的に許容される賦形剤は、一般的に安全であり、非毒性的であり、望ましい医薬組成物の調製において有用である賦形剤を含み、獣医学的使用ならびにヒトでの薬学的使用にとって許容される賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、または、エアロゾル組成物の場合、気体であってもよい。
【０５３８】
本明細書に記載されている医薬組成物を、経口投与のために錠剤化するか、またはエマルジョンもしくはシロップ中で調製することもできる。薬学的に許容される固体または液体担体を添加して、組成物を増強もしくは安定化するか、または組成物の調製を容易にすることができる。液体担体としては、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、グリセリン、塩水、アルコールおよび水が挙げられる。固体担体としては、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム、二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天またはゼラチンが挙げられる。担体はまた、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの持続放出材料を、単独で、またはワックスと共に含んでもよい。
【０５３９】
医薬調製物は、必要に応じて、錠剤形態のために、粉砕、混合、顆粒化、および打錠；または硬質ゼラチンカプセル形態のために、粉砕、混合および充填を含む従来の製薬技術に従って作製される。液体担体を使用する場合、調製物は、シロップ、エリキシル剤、エマルジョンまたは水性もしくは非水性溶液もしくは懸濁液の形態にあるであろう。そのような液体製剤を、経口で直接的に投与することができる。
【０５４０】
本開示による医薬組成物を、治療有効量で送達することができる。正確な治療有効量は、組成物の量が所与の対象における処置の有効性に関して最も有効な結果をもたらすものである。この量は、限定されるものではないが、治療化合物の特徴（活性、薬物動態、薬力学、およびバイオアベイラビリティなど）、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患の型および段階、一般的な身体状態、所与の用量に対する応答性、および薬剤の型など）、製剤中の薬学的に許容される担体または複数の担体の性質、ならびに投与経路などの様々な因子に応じて変化するであろう。
【０５４１】
例えば、薬学的担体および／またはポリマー担体、例えば、リポソームなどの担体を含む本明細書に記載されている医薬組成物を製剤化し、公知の方法によってそれを必要とする対象（例えば、ヒトまたは非ヒト農業または家畜動物、例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、家禽）に送達することができる。そのような方法としては、トランスフェクション（例えば、脂質媒介性、カチオンポリマー、リン酸カルシウム）；電気穿孔または膜破壊の他の方法（例えば、ヌクレオフェクション）およびウイルス送達（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ）が挙げられる。送達方法はまた、例えば、Goriら、Delivery and Specificity ofCRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy. Human GeneTherapy. ２０１５年７月、２６巻（７号）：４４３〜４５１頁、doi:10.1089/hum.2015.074；およびZurisら、Cationic lipid-mediated delivery ofproteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.Nat Biotechnol. ２０１４年１０月３０日；３３巻（１号）：７３〜８０頁に記載されている。
【０５４２】
リポソームは、内部の水性区画を取り囲む単膜または多重膜脂質二重層と、比較的不浸透性の外部親油性リン脂質二重層とから構成される球状の小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性またはカチオン性であってもよい。リポソームは生体適合性であり、非毒性的であり、親水性と親油性の両方の薬物分子を送達し、その運搬物を血漿酵素による分解から保護し、その積載物を、生体膜および血液脳関門（ＢＢＢ）を通って輸送することができる（例えば、概説については、SpuchおよびNavarro、Journalof Drug Delivery、２０１１巻、論文ＩＤ４６９６７９、全１２頁、２０１１年、doi:10.1155/2011/469679を参照されたい）。
【０５４３】
小胞を、いくつかの異なる型の脂質から作製することができる；しかしながら、リン脂質が、薬物担体としてのリポソームを生成するために最も一般的に使用される。小胞は、限定されるものではないが、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＩＭ、ＤＤＡＢを、単独で、またはコレステロールと一緒に含み、ＤＯＴＭＡおよびコレステロール、ＤＯＴＡＰおよびコレステロール、ＤＯＴＩＭおよびコレステロール、ならびにＤＤＡＢおよびコレステロールを得ることができる。多重膜小胞脂質の調製方法は、当業界で公知である（例えば、多重膜小胞脂質調製に関する教示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６９３，０８６号を参照されたい）。脂質フィルムを水性溶液と混合する場合、小胞形成は自発的であってよいが、ホモジェナイザー、ソニケーター、または押出し装置を使用することにより、振とうの形態で力を印加することにより、それを促進することもできる（例えば、概説については、SpuchおよびNavarro、Journalof Drug Delivery、２０１１巻、論文ＩＤ４６９６７９、全１２頁、２０１１年、doi:10.1155/2011/469679を参照されたい）。押し出された脂質調製物に関する教示が参照により本明細書に組み込まれる、Templetonら、Nature Biotech、１５巻：６４７〜６５２頁、１９９７年に記載されるように、低下するサイズのフィルターを通して押し出すことにより、押し出された脂質を調製することができる。
【０５４４】
本明細書に記載されているように、添加剤を小胞に添加して、その構造および／または特性を改変することができる。例えば、コレステロールまたはスフィンゴミエリンを混合物に添加して、構造を安定化するのを助け、内部運搬物の漏出を防止することができる。さらに、小胞を、水素化卵ホスファチジルコリンまたは卵ホスファチジルコリン、コレステロール、およびリン酸ジセチルから調製することができる（例えば、概説については、SpuchおよびNavarro、Journalof Drug Delivery、２０１１巻、論文ＩＤ４６９６７９、全１２頁、２０１１年、doi:10.1155/2011/469679を参照されたい）。また、小胞を、担体細胞上の反応基と相補的な反応基を含むように、合成の間または後に表面改変することができる。そのような反応基としては、限定されるものではないが、マレイミド基が挙げられる。例として、小胞を、限定されるものではないが、ＤＳＰＥ−ＭａＬ−ＰＥＧ２０００などのマレイミドコンジュゲート化リン脂質を含むように合成することができる。
【０５４５】
小胞製剤は、１，２−ジステアロイル（distearoryl）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリンおよびモノシアロガングリオシドなどの天然のリン脂質および脂質から主に構成されていてもよい。リン脂質のみから構成される製剤は、血漿中であまり安定ではない。しかしながら、コレステロールを用いる脂質膜の操作は、封入された生物活性化合物の血漿中への迅速な放出を減少させるか、または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は安定性を増加させる（例えば、概説については、SpuchおよびNavarro、Journalof Drug Delivery、２０１１巻、論文ＩＤ４６９６７９、全１２頁、２０１１年、doi:10.1155/2011/469679を参照されたい）。
【０５４６】
別の実施形態では、脂質を使用して、脂質微粒子を形成することができる。脂質としては、限定されるものではないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ４、Ｃ１２−２００およびコリピドジステロイルホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−ＤＭＧが挙げられ、自発的小胞形成手順を使用して製剤化することができる（例えば、Novobrantseva、Molecular Therapy-NucleicAcids （２０１２年）、１巻、ｅ４頁; doi:10.1038/mtna.2011.3を参照されたい）。成分モル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはＣ１２−２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ）であってもよい。Ｔｅｋｍｉｒａ社は、米国および海外で、脂質微粒子および脂質微粒子製剤の様々な態様に関する、約９５の特許ファミリーのポートフォリオを有しており（例えば、米国特許第７，９８２，０２７号；第７，７９９，５６５号；第８，０５８，０６９号；第８，２８３，３３３号；第７，９０１，７０８号；第７，７４５，６５１号；第７，８０３，３９７号；第８，１０１，７４１号；第８，１８８，２６３号；第７，９１５，３９９号；第８，２３６，９４３号；および第７，８３８，６５８号ならびに欧州特許第１７６６０３５号；第１５１９７１４号；第１７８１５９３号；および第１６６４３１６号を参照されたい）、これらは全て、本開示において使用する、および／または適応させることができる。
【０５４７】
一部の小胞および脂質被覆ポリマー粒子は、細胞表面に自発的に吸着することができる。
【０５４８】
本明細書に記載されている方法および組成物は、疾患、障害または状態の症状を軽減するのに十分なレジメンによって投与される医薬組成物を含んでもよい。一態様では、本開示は、本明細書に記載されている組成物を投与することによって治療剤を送達する方法を含む。
【０５４９】
本明細書に記載されている組成物のいずれかを含む医薬組成物も記載される。一態様では、薬学的使用のためのシステムは、第１のポリペプチドドメイン、例えば、Ｃａｓまたは改変Ｃａｓタンパク質と、第２のポリペプチドドメイン、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を有するか、または脱メチル化もしくはデアミナーゼ活性を伴うポリペプチドを含むタンパク質を、タンパク質を標的アンカー配列媒介接続のアンカー配列に標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドとの組合せで含む。このシステムは、少なくともヒト細胞中で、標的アンカー配列媒介接続を変化させるのに有効である。
【０５５０】
一態様では、薬学的使用のためのシステムは、アンカー配列媒介接続のアンカー配列に結合し、アンカー配列媒介接続の形成を変化させる組成物であって、ヒト細胞中で、アンカー配列媒介接続に付随する標的遺伝子の転写をモジュレートする組成物を含む。
【０５５１】
一態様では、ヒト細胞中で、標的遺伝子の発現を変化させるためのシステムは、標的遺伝子に付随するアンカー配列と会合する標的化部分（例えば、ｇＲＮＡ、膜透過移行ポリペプチド）と、任意選択で、標的化部分に作動可能に連結した異種部分（例えば、酵素、例えば、ヌクレアーゼまたは脱活性化ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９）、メチラーゼ、デメチラーゼ、デアミナーゼ）とを含み、ここで、システムはアンカー配列により媒介される接続をモジュレートし、標的遺伝子の発現を変化させるのに有効である。標的化部分と異種部分とは連結されていてもよい。一部の実施形態では、システムは、標的化部分と異種部分とを含む合成ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、システムは、標的化部分と異種部分の少なくとも一方をコードする核酸ベクターまたは複数のベクターを含む。
【０５５２】
一態様では、医薬組成物は、アンカー配列媒介接続のアンカー配列に結合し、アンカー配列媒介接続の形成を変化させる組成物であって、ヒト細胞中で、アンカー配列媒介接続に付随する標的遺伝子の転写をモジュレートする組成物を含む。一部の実施形態では、組成物は、アンカー配列媒介接続の形成を破壊する（例えば、接続核形成分子に対するアンカー配列の親和性を、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれよりも大きく低下させる）。一部の実施形態では、組成物は、アンカー配列媒介接続の形成を促進する（例えば、接続核形成分子に対するアンカー配列の親和性を、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれよりも大きく増大させる）。「形成を破壊すること」または「形成を促進すること」は、接続核形成分子に対するアンカー配列の親和性の変更、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれよりも大きい破壊または促進を指す。
【０５５３】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、アンカー配列媒介接続の内部にある。一部の実施形態では、標的遺伝子は、アンカー配列媒介接続の外部にある。一部の実施形態では、標的遺伝子は、アンカー配列媒介接続の内部および外部にある。一部の実施形態では、組成物は、アンカー配列媒介接続の形成を物理的に破壊する。例えば、組成物は、標的化活性とエフェクター活性との両方、例えば、膜透過移行ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、アンカー配列に結合する標的化部分（例えば、ｇＲＮＡ、膜透過移行ポリペプチド）を含み、アンカー配列により媒介される接続の形成をモジュレートするエフェクター部分に作動可能に連結する。一部の実施形態では、エフェクター部分は、化学物質、例えば、シトシン（Ｃ）またはアデニン（Ａ）をモジュレートする化学物質（例えば、亜硫酸水素Ｎａ、亜硫酸水素アンモニウム）である。一部の実施形態では、エフェクター部分は、酵素活性（メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）、デアミナーゼ）を有する。一部の実施形態では、エフェクター部分は、アンカー配列媒介接続の形成を立体的に障害する［例えば、膜透過移行ポリペプチド＋ナノ粒子］。
【０５５４】
別の態様では、本開示は、（ａ）標的化部分と、（ｂ）アンカー配列を含むＤＮＡ配列とを含む医薬組成物を含む。
【０５５５】
別の態様では、本開示は、アンカー配列媒介接続のアンカー配列に結合し、アンカー配列媒介接続の形成を変化させる（例えば、アンカー配列の、接続核形成分子に対する親和性を、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれよりも大きく変化させる）標的化部分を含む組成物を含む。
【０５５６】
別の態様では、医薬組成物は、Ｃａｓタンパク質と、Ｃａｓタンパク質を標的アンカー配列媒介接続のアンカー配列に標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む。Ｃａｓタンパク質は、標的アンカー配列に付随するアンカー配列媒介接続の形成を減少させる標的アンカー配列の突然変異を引き起こすのに有効であるべきである。
【０５５７】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的化されたヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、例えば、野生型Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９（例えば、Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ）、ｄｅａｄＣａｓ９（ｄＣａｓ９）、ｅＳｐＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１、もしくはＣ２Ｃ３、またはそのようなヌクレアーゼをコードする核酸と共に投与される。ヌクレアーゼおよびｇＲＮＡの選択は、標的化された突然変異がヌクレオチドの欠失、置換、または付加、例えば、標的化されたアンカー配列、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフに対するヌクレオチドの欠失、置換、または付加であるかどうかによって決定される。例えば、一部の実施形態では、１つのｇＲＮＡを、例えば、アンカー配列、例えば、ＣＴＣＦ部位中に不活化インデル突然変異をもたらすために投与する、例えば、１つのｇＲＮＡを、ヌクレアーゼ、例えば、ｗｔＣａｓ９と共に投与する。別の例として、２つのｇＲＮＡを、例えば、標的化されたアンカー配列での置き換え配列をもたらすために、挿入カセットおよびヌクレアーゼをコードする核酸と共に投与する。置き換え配列は、核形成タンパク質に対する、より高い、またはより低い親和性を有してもよく、例えば、置き換え配列は、標的配列よりも配列番号１または配列番号２に対する高い親和性を有してもよく、例えば、標的配列よりも配列番号１または配列番号２に対するより強いループ、またはより低い同一性をもたらす、例えば、より弱いループをもたらす。一部の実施形態では、置き換え配列は、配列番号１または配列番号２に対する少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性を有する。他の実施形態では、置き換え配列は、配列番号１または配列番号２に対する７５％、８０％、８５％、９０％、９５％未満の同一性を有する。核形成タンパク質は、例えば、ＣＴＣＦ、コヘシン、ＵＳＦ１、ＹＹ１、ＴＡＦ３、ＺＮＦ１４３結合モチーフ、またはアンカー配列媒介接続の形成を促進する別のポリペプチドであってもよい。
【０５５８】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡ、ヌクレアーゼをコードする核酸配列、および挿入カセットを含む核酸を投与して、アンカー配列の向きを、例えば、パートナー配列とタンデムなものから、パートナー配列に対してコンバージェントなものに変化させる、例えば、より強いループを作出するために、例えば、ｇＲＮＡ、ヌクレアーゼおよび挿入カセットを投与して、コンセンサス配列番号１を有するアンカー配列と、コンセンサス配列、配列番号２を有する配列とを置き換える。他の実施形態では、ｇＲＮＡ、ヌクレアーゼをコードする核酸配列、および挿入カセットを投与して、アンカー配列の向きを、例えば、パートナー配列に対してコンバージェントなものから、パートナー配列とタンデムなものに変化させる、例えば、より弱いループを作出するために、例えば、ｇＲＮＡ、ヌクレアーゼおよび挿入カセットを投与して、コンセンサス配列番号２を有するアンカー配列と、コンセンサス配列、配列番号１を有する配列とを置き換える。
【０５５９】
一態様では、本開示は、それを必要とする対象に投与した場合、アンカー配列媒介接続のアンカー配列、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフ中に部位特異的変更（例えば、挿入、欠失（例えば、ノックアウト）、転座、逆位、単一点突然変異）を導入することによって、対象における遺伝子発現をモジュレートする核酸または核酸の組合せを含む組成物を含む。
【０５６０】
一態様では、本開示は、遺伝子編集のためのクラスター化調節介在ショートパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムにおける使用のためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む医薬組成物を含む。例えば、ｇＲＮＡを、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１もしくはＣａｓ９）、またはヌクレアーゼをコードする核酸と共に投与して、二本鎖ＤＮＡを特異的に切断することができる。相同修復鋳型の非存在下では、ｗｔＣａｓ９は、非相同的末端連結を引き起こし、標的配列、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフの破壊をもたらす。あるいは、相同修復鋳型を提供し、相同組換え修復経路を活用することにより、標的ＣＴＣＦ結合モチーフに対する正確な突然変異およびノックインを作製することができる。あるいは、Ｃａｓ９ニッカーゼ対を用いるダブルニッキングを使用して、交互の二本鎖切断を導入した後、相同組換え修復を受けて、部位特異的様式で標的ＣＴＣＦ結合モチーフ中にもう１つのヌクレオチドを導入することができる。カスタムｇＲＮＡ生成器およびアルゴリズムは、本明細書に記載されている方法および組成物の開発における使用のために商業的に利用可能である。
【０５６１】
一部の実施形態では、医薬組成物は、ＣＴＣＦ結合モチーフを標的にする（例えば、切断する）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、またはＺＦＮをコードするｍＲＮＡを含む。
【０５６２】
処置方法
本明細書に記載されている組成物および方法を使用して、ヒトおよび非ヒト動物における疾患を処置することができる。一態様では、本開示は、ゲノム中の標的遺伝子の発現を変化させる方法であって、ゲノムに、（ａ）標的化部分と、（ｂ）遺伝子発現因子（エンハンシング配列、サイレンシング／抑制配列）を、標的遺伝子と作動可能に連結させる接続の形成を促進するアンカー配列を含むＤＮＡ配列とを含む医薬組成物を投与することを含む、方法を含む。一態様では、疾患または状態を処置する方法は、外因性接続核形成分子、接続核形成分子をコードする核酸、および配列標的化ポリペプチドと、接続核形成分子との融合物のうちの少なくとも１つから選択される標的化部分を対象に投与することを含む。以下の表は、本開示を用いて標的化することができる疾患の遺伝型の例を記載する。
【０５６３】
【表１６】
2019531763.tif 000003
【０５６４】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている開示はまた、他の疾患、例えば、がんおよび神経変性を標的化するのに有用であってもよい。例えば、腫瘍適応症を、本開示の使用によって標的化して、がん遺伝子を抑制する、および／または腫瘍抑制因子を活性化することができる。ヌクレオチド反復、例えば、メチル化による遺伝子のサイレンシングが、症状を駆動するトリヌクレオチド反復により特徴付けられる疾患を、本開示の使用によって標的化して、影響された遺伝子を、アンカー配列媒介接続内のエンハンシング配列に繋ぎ止めることができる。そのような疾患の例としては、ＤＲＰＬＡ（歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症）、ＨＤ（ハンチントン病）、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症）、ＳＣＡ１（脊髄小脳失調１型）、ＳＣＡ２（脊髄小脳失調２型）、ＳＣＡ３（脊髄小脳失調３型またはマチャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ６（脊髄小脳失調６型）、ＳＣＡ７（脊髄小脳失調７型）、ＳＣＡ１７（脊髄小脳失調１７型）、ＦＲＡＸＡ（脆弱Ｘ症候群）、ＦＸＴＡＳ（脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群）、ＦＲＡＸＥ（脆弱ＸＥ精神遅滞）、ＦＲＤＡ（フリードライヒ失調症）、ＦＸＮまたはＸ２５、ＤＭ（筋強直性ジストロフィー）、ＳＣＡ８（脊髄小脳失調８型）およびＳＣＡ１２（脊髄小脳失調１２型）が挙げられる。さらに、Heroldら（Development、２０１２年）の表１に列挙されたゲノム遺伝子座は、ＣＴＣＦと関連することが見出され、この遺伝子座中の遺伝子と関連する疾患を、同様に本開示によって標的化することができる。
【０５６５】
療法
本明細書に記載されている組成物および方法を使用して、ヒトおよび非ヒト動物における疾患を処置することができる。一態様では、疾患または状態を処置する方法は、本明細書に記載されている組成物を対象に投与することを含む。
【０５６６】
一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、疾患または状態を有する。
【０５６７】
遺伝子発現のモジュレーション
一部の実施形態では、核酸配列の転写、例えば、標的核酸配列の転写は、参照値、例えば、アンカー配列媒介接続の変化の非存在下での標的配列の転写と比較してモジュレートされる。
【０５６８】
一部の実施形態では、第１のアンカー配列と、第２のアンカー配列とを含む、アンカー配列媒介接続に付随する遺伝子の発現をモジュレートする方法が提供される。アンカー配列媒介接続に付随する遺伝子は、少なくとも部分的には接続の内部にある（すなわち、第１と第２のアンカー配列の間に配列様式で位置する）か、またはそれは第１と第２のアンカー配列の間に配列様式で位置しないが、同じ染色体上に、また、その発現をアンカー配列媒介接続のトポロジーを制御することによってモジュレートすることができるように少なくとも第１または第２のアンカー配列の十分近接に位置するという点で接続の外部にあってもよい。当業者であれば、２つのエレメント間（例えば、遺伝子と、アンカー配列媒介接続との間）の３次元空間での距離が、一部の実施形態では、塩基対を単位とする距離よりも関連性が高い場合があることを理解するであろう。一部の実施形態では、外部であるが、付随する遺伝子は、第１または第２のアンカー配列の２Ｍｂ以内、１．９Ｍｂ以内、１．８Ｍｂ以内、１．７Ｍｂ以内、１．６Ｍｂ以内、１．５Ｍｂ以内、１．４Ｍｂ以内、１．３Ｍｂ以内、１．３Ｍｂ以内、１．２Ｍｂ以内、１．１Ｍｂ以内、１Ｍｂ以内、９００ｋｂ以内、８００ｋｂ以内、７００ｋｂ以内、５００ｋｂ以内、４００ｋｂ以内、３００ｋｂ以内、２００ｋｂ以内、１００ｋｂ以内、５０ｋｂ以内、２０ｋｂ以内、１０ｋｂ以内、または５ｋｂ以内に位置する。
【０５６９】
一部の実施形態では、遺伝子の発現をモジュレートすることは、転写制御配列の、遺伝子への接近可能性を変化させることを含む。転写制御配列は、アンカー配列媒介接続の内部または外部にあるにしろ、エンハンシング配列またはサイレンシング（または抑制）配列であってもよい。
【０５７０】
例えば、一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続内の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、第１および／または第２のアンカー配列と、本明細書に記載されている組成物、薬剤、および／または融合分子とを接触させるステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、それが少なくとも部分的には第１と第２のアンカー配列の間に配列様式で位置する点で、接続の「内部」にある少なくとも１つの転写制御配列を含む。かくして、一部の実施形態では、発現をモジュレートしようとする遺伝子（「標的遺伝子」）と、転写制御配列との両方が、アンカー配列媒介接続の内部にある。例えば、図６に記載の１型アンカー配列媒介接続を参照されたい。
【０５７１】
一部の実施形態では、遺伝子は、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、または少なくとも９００塩基対だけ内部転写制御配列から離れている。一部の実施形態では、遺伝子は、少なくとも１．０、少なくとも１．２、少なくとも１．４、少なくとも１．６、または少なくとも１．８ｋｂだけ内部転写制御配列から離れている。一部の実施形態では、遺伝子は、少なくとも２ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｋｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、または少なくとも１０ｋｂだけ内部転写制御配列から離れている。一部の実施形態では、遺伝子は、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、または少なくとも１００ｋｂだけ内部転写制御配列から離れている。一部の実施形態では、遺伝子は、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、または少なくとも５００ｋｂだけ内部転写制御配列から離れている。一部の実施形態では、遺伝子は、少なくとも６００ｋｂ、少なくとも７００ｋｂ、少なくとも８００ｋｂ、少なくとも９００ｋｂ、または少なくとも１Ｍｂだけ内部転写制御配列から離れている。
【０５７２】
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、それが第１と第２のアンカー配列の間に配列様式で位置しない点で接続に対して「外部」である少なくとも１つの転写制御配列を含む（例えば、図６に記載の２、３、および４型アンカー配列媒介接続を参照されたい）。一部の実施形態では、第１および／または第２のアンカー配列は、外部転写制御配列の１Ｍｂ以内、９００ｋｂ以内、８００ｋｂ以内、７００ｋｂ以内、６００ｋｂ以内、５００ｋｂ以内、４５０ｋｂ以内、４００ｋｂ以内、３５０ｋｂ以内、３００ｋｂ以内、２５０ｋｂ以内、２００ｋｂ以内、１８０ｋｂ以内、１６０ｋｂ以内、１４０ｋｂ以内、１２０ｋｂ以内、１００ｋｂ以内、９０ｋｂ以内、８０ｋｂ以内、７０ｋｂ以内、６０ｋｂ以内、５０ｋｂ以内、４０ｋｂ以内、３０ｋｂ以内、２０ｋｂ以内、または１０ｋｂ以内に位置する。一部の実施形態では、第１および／または第２のアンカー配列は、外部転写制御配列の９ｋｂ以内、８ｋｂ以内、７ｋｂ以内、６ｋｂ以内、５ｋｂ以内、４ｋｂ以内、３ｋｂ以内、２ｋｂ以内、または１ｋｂ以内に位置する。
【０５７３】
例えば、一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続に対して外部の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、第１および／または第２のアンカー配列と、本明細書に記載されている組成物、薬剤、および／または融合分子とを接触させるステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、少なくとも１つの内部転写制御配列を含む。
【０５７４】
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接続は、少なくとも１つの外部転写制御配列を含む。
【０５７５】
例えば、本明細書に記載されている組成物および方法を使用して、重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）を処置することができる。一部の実施形態では、この疾患を引き起こすＥｌａｎｅ遺伝子の発現を阻害する。標的化部分を投与して、変更のためにＥｌａｎｅ遺伝子に隣接する１つまたは複数のアンカー配列を標的にし、Ｅｌａｎｅ遺伝子を含む抑制ループを作出する。
【０５７６】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている医薬組成物を用いてＳＣＮを処置する方法を含む。一実施形態では、本明細書に記載されている組成物の投与は、Ｅｌａｎｅ遺伝子の遺伝子発現を阻害するなど、１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現をモジュレートして、ＳＣＮを処置する。
【０５７７】
本明細書に記載されている組成物および方法を使用して、鎌状赤血球貧血およびベータサラセミアを処置することができる。一部の実施形態では、正常ヘモグロビンレベルを回復させることが示された、ＨＢＧ遺伝子からのＨｂＦの発現が活性化される。標的化部分を投与して、ＨＢＢ遺伝子クラスターまたはＨＢＧ遺伝子に隣接する１つまたは複数のアンカー配列を標的にする。一実施形態では、ＨＢＢ遺伝子クラスターを含む阻害ループを作出する。別の実施形態では、ＨＢＧ遺伝子を含む活性化ループを作出する。ＢＣＬ１１Ａの下方調節は、ＨＢＢを下方調節し、ＨＢＧ発現を上方調節することも示された。一実施形態では、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子クラスターに付随する阻害アンカー配列媒介接続を作出する。
【０５７８】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている医薬組成物を用いて鎌状赤血球貧血およびベータサラセミアを処置する方法を含む。一実施形態では、本明細書に記載されている組成物の投与は、ＨＢＢ遺伝子クラスターまたはＨＢＧ遺伝子からの遺伝子発現をモジュレートするなど、１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現をモジュレートして、ＳＣＮを処置する。
【０５７９】
本明細書に記載されている組成物および方法を使用して、ＭＹＣ関連腫瘍、例えば、ＭＹＣ依存性がんを処置することができる。一部の実施形態では、腫瘍を引き起こすことが示されたＭＹＣの発現を阻害する。標的化部分を投与して、ＭＹＣ遺伝子に隣接する１つまたは複数のアンカー配列を標的にする。一実施形態では、ＭＹＣ遺伝子を含む阻害ループを作出する。別の実施形態では、ＭＹＣに結合したアンカー配列媒介接続を破壊することにより、ＭＹＣ発現を減少させる、例えば、アンカー配列媒介接続内での転写それまでは転写に対して開かれていたＤＮＡのコンフォメーション変化による転写の減少、例えば、ＭＹＣ遺伝子と、エンハンシング配列との間のさらなる距離を作出するＤＮＡのコンフォメーション変化による転写の減少をもたらす。
【０５８０】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている医薬組成物を用いてＭＹＣ関連腫瘍を処置する方法を含む。一実施形態では、本明細書に記載されている組成物の投与は、ＭＹＣ遺伝子からの遺伝子発現をモジュレートするなど、１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現をモジュレートして、ＭＹＣ関連腫瘍を処置する。
【０５８１】
本明細書に記載されている組成物および方法を使用して、乳児のミオクローヌスてんかん（ＳＭＥＩまたはドラベ症候群）を処置することができる。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に由来する、電位依存性の、Ｉ型、アルファサブユニット（ＳＣＮ１Ａ）の、ナトリウムチャネルとしても公知の、Ｎａｖ１．１における機能喪失突然変異は、重症のドラベ症候群を引き起こす。一実施形態では、標的化部分を投与して、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に隣接する１つまたは複数のアンカー配列を標的にする。別の実施形態では、標的化部分を投与して、ＳＣＮ３Ａ遺伝子に隣接する１つまたは複数のアンカー配列を標的にし、電位依存性の、ＩＩＩ型、アルファサブユニット（ＳＣＮ３Ａ）の、ナトリウムチャネルとしても公知の、Ｎａｖ１．３の発現を増加させる。別の実施形態では、標的化部分を投与して、ＳＣＮ５Ａ遺伝子に隣接する１つまたは複数のアンカー配列を標的にし、電位依存性の、Ｖ型、アルファサブユニット（ＳＣＮ５Ａ）の、ナトリウムチャネルとしても公知の、Ｎａｖ１．５の発現を増加させる。別の実施形態では、標的化部分を投与して、ＳＣＮ８Ａ遺伝子に隣接する１つまたは複数のアンカー配列を標的にし、電位依存性の、ＶＩＩＩ型、アルファサブユニット（ＳＣＮ８Ａ）の、ナトリウムチャネルとしても公知の、Ｎａｖ１．６の発現を増加させる。一実施形態では、Ｎａｖ１．１、Ｎａｖ１．３、Ｎａｖ１．５、およびＮａｖ１．６の発現を増加させるために、それぞれ、ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ３Ａ、ＳＣＮ５Ａ、およびＳＣＮ８Ａ遺伝子のいずれか１つを含む活性化ループを作出する。
【０５８２】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている医薬組成物を用いてドラベ症候群を処置する方法を含む。一実施形態では、本明細書に記載されている組成物の投与は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ３Ａ、ＳＣＮ５Ａ、およびＳＣＮ８Ａ遺伝子からの遺伝子発現をモジュレートするなど、１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現をモジュレートして、ドラベ症候群を処置する。別の実施形態では、ＧＡＢＡアゴニストに連結された膜透過移行ポリペプチドを含む組成物の投与により、ＧＡＢＡ活性を増加させる。
【０５８３】
本明細書に記載されている組成物および方法を使用して、家族性肢端紅痛症を処置することができる。一部の実施形態では、ＳＣＮ９Ａ遺伝子に由来する、電位依存性の、ＩＸ型、アルファサブユニット（ＳＣＮ９Ａ）の、ナトリウムチャネルとしても公知の、Ｎａｖ１．７における機能喪失突然変異は、重症の家族性肢端紅痛症を引き起こす。一実施形態では、標的化部分を投与して、ＳＣＮ９Ａ遺伝子に隣接する１つまたは複数のアンカー配列を標的にする。一実施形態では、Ｎａｖ１．７の発現を増加させるためにＳＣＮ９Ａ遺伝子を含む活性化ループを作出する。
【０５８４】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている医薬組成物を用いて家族性肢端紅痛症を処置する方法を含む。一実施形態では、本明細書に記載されている組成物の投与は、ＳＣＮ９Ａ遺伝子からの遺伝子発現をモジュレートするなど、１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現をモジュレートして、家族性肢端紅痛症を処置する。
【０５８５】
本明細書に記載されている方法はまた、現存の治療剤を改善して、バイオアベイラビリティを増大させる、および／またはトキシコキネティクスを軽減することもできる。
【０５８６】
バイオアベイラビリティ
一実施形態では、本明細書に記載されている組成物の投与は、異種部分のみと比較して、標的化、吸収、および輸送などの異種部分の少なくとも１つの薬物動態もしくは薬力学パラメーターを改善するか、または異種部分のみと比較して、非標的位置への拡散、オフターゲット活性、および毒性代謝などの、少なくとも１つのトキシコキネティックパラメーターを軽減する（例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれよりも大きく）。別の実施形態では、本明細書に記載されている組成物の投与は、異種部分の治療範囲を増大させる（例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれよりも大きく）。別の実施形態では、本明細書に記載されている組成物の投与は、異種部分のみと比較して、最小有効用量を減少させる（例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれよりも大きく）。別の実施形態では、本明細書に記載されている組成物の投与は、異種部分のみと比較して、最大許容用量を増加させる（例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれよりも大きく）。別の実施形態では、組成物の投与は、非経口治療剤の非非経口投与などの、治療剤の有効性を増加させるか、またはその毒性を低下させる。別の実施形態では、本明細書に記載されている組成物の投与は、異種部分のみを比較して、毒性を低下させながら、異種部分の治療範囲を増大させる（例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれよりも大きく）。
【０５８７】
がん療法
本明細書に記載されている組成物および方法を使用して、がんを処置することができる。本明細書に記載されている方法はまた、現存するがん治療剤を改善して、バイオアベイラビリティを増大させる、および／またはトキシコキネティクスを軽減することもできる。がんまたは新生物は、固形または液体がんを含み、良性または悪性腫瘍、および過形成を含み、消化管がん（非転移性または転移性結腸直腸がん、膵がん、胃がん、食道がん、肝細胞がん、胆管細胞がん、口腔がん、口唇がんなど）；泌尿生殖器がん（ホルモン感受性またはホルモン抵抗性前立腺がん、腎細胞がん、膀胱がん、陰茎がんなど）；婦人科がん（卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がんなど）；肺がん（小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんなど）；頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）；悪性神経膠腫、星状細胞腫、網膜芽腫および脳転移などのＣＮＳがん；悪性中皮腫；非転移性または転移性乳がん（例えば、ホルモン抵抗性転移性乳がん）；皮膚がん（悪性メラノーマ、基底細胞および扁平上皮皮膚がん、メルケル細胞癌、皮膚のリンパ腫、カポジ肉腫など）；甲状腺がん；骨および軟部組織肉腫；ならびに血液新生物（多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、ホジキンリンパ腫など）を含む。
【０５８８】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている医薬組成物を用いてがんを処置する方法を含む。例えば、本明細書に記載されている組成物の異種部分は、抗新生物剤、化学療法剤または他の抗がん治療剤であってもよい。一実施形態では、本明細書に記載されている組成物の投与は、がん遺伝子の遺伝子発現を阻害するなど、１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現をモジュレートして、がんを処置する。
【０５８９】
例えば、腫瘍適応症を、本開示の使用によって標的化して、がん遺伝子（例えば、ＭＹＣ、ＲＡＳ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＪＵＮ、ＦＯＳ、ＳＲＣ、ＲＡＦなど）を抑制する、および／または腫瘍抑制因子（例えば、Ｐ１６、Ｐ５３、Ｐ７３、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２など）を活性化することができる。
【０５９０】
別の例では、本明細書に記載されている組成物の投与は、細胞死のためにがん細胞を標的にする。ポリペプチドはトポテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤に連結され、ポリペプチド中の核酸側鎖へのハイブリダイゼーションなどにより、核酸に連結される。核酸配列は、がん突然変異に特異的に結合する相補配列を含む。投与時に、ポリペプチドは、核に移行して、がん突然変異に特異的に結合し、トポテカンは、ＤＮＡ複製機構がゲノム中の二本鎖切断を修復するのを妨げる。細胞は、最終的にはアポトーシスを誘導する。
【０５９１】
神経疾患または障害
本明細書に記載されている方法は、神経疾患を処置することもできる。本明細書で使用される場合、「神経疾患」または「神経障害」は、脳、脊髄、または末梢神経に影響する疾患を含む、対象の神経系に影響する疾患または障害である。神経疾患または障害は、神経細胞またはグリア細胞などの神経系の支持細胞に影響し得る。神経疾患または障害の原因としては、感染、炎症、虚血、傷害、腫瘍、または遺伝性の病が挙げられる。神経疾患または障害は、神経変性疾患および筋変性疾患も含む。神経変性疾患の一部の例としては、限定されるものではないが、対象における筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、ＴＤＰ−４３を伴う前頭側頭型認知症、第１７染色体と関連する前頭側頭型認知症、ピック病、パーキンソン病、ハンチントン病、ハンチントン舞踏病、軽度認知障害、レヴィー小体病、多系統萎縮症、進行性核上麻痺、α−シヌクレイノパチー、タウオパチー、ＴＤＰ−４３の細胞内蓄積と関連する病理、および大脳皮質基底核変性症が挙げられる。神経疾患または障害の一部の他の例としては、限定されるものではないが、耳鳴り、てんかん、抑鬱、脳卒中、多発性硬化症、片頭痛、および不安が挙げられる。
【０５９２】
多くの細菌（すなわち、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、ウイルス（すなわち、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エンテロウイルス、西ナイルウイルス、ジカウイルス）、真菌（すなわち、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、および寄生虫（すなわち、マラリア、シャーガス）感染は、神経系に影響し得る。神経症状は、感染自体に起因して、または免疫応答に起因して起こり得る。
【０５９３】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている医薬組成物を用いて神経疾患または障害を処置する方法を含む。例えば、本明細書に記載されている組成物の異種部分は、コルチコステロイド、抗炎症薬、ドーパミン作動薬、またはアセチルコリン阻害剤であってもよい。一実施形態では、本明細書に記載されている組成物の投与は、神経伝達物質、神経ペプチド、または神経受容体の活性化をモジュレートする。
【０５９４】
例えば、本開示の組成物を使用して、神経伝達物質、神経ペプチド、そのアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、アセチルコリン、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、セロトニン、メラトニン、シロダミン（cirodhamine）、オキシトシン、バソプレッシン、コレシストキニン、ニューロフィシン、神経ペプチドＹ、エンケファリン、オレキシン、ソマトスタチンなど）と共に神経受容体活性（例えば、アドレナリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、アセチルコリン受容体、ドーパミン受容体、セロトニン受容体、カンナビノイド受容体、コレシストキニン受容体、オキシトシン受容体、バソプレッシン受容体、コルチコトロピン受容体、セクレチン受容体、ソマトスタチン受容体など）をモジュレートすることができる。
【０５９５】
急性および慢性感染のための処置
本明細書に記載されている方法は、現存する急性および慢性感染治療剤を改善して、バイオアベイラビリティを増大させ、トキシコキネティクスを軽減することもできる。本明細書で使用される場合、「急性感染」とは、疾患または症状の急速な開始により特徴付けられる感染を指す。本明細書で使用される場合、「持続感染」または「慢性感染」は、感染性因子（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、マイコプラズマ、または真菌）が、免疫応答の誘導後でも感染宿主から消失しない、または除去されない感染を意味する。持続感染は、慢性感染、潜伏感染、または遅発性感染であってもよい。急性感染は比較的短時間であり（数日から数週間持続する）、免疫系によって体内から消散するが、持続感染は数ヶ月、数年、またはさらには生涯にわたって持続し得る。これらの感染はまた、細胞死滅を伴わず、またはさらには宿主細胞に過度の損傷をもたらすことなく、静止感染および増殖感染の段階を含む、長期間にわたって頻繁に再発し得る。哺乳動物は、当業界で公知の、また、例えば、米国特許第６，３６８，８３２号、第６，５７９，８５４号、および第６，８０８，７１０号に記載の任意の標準的な方法に従って、持続感染を有すると診断される。
【０５９６】
一部の実施形態では、感染は、以下の主要なカテゴリーの１つに由来する病原体によって引き起こされる：
ｉ）レンチウイルスなどのＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびデルタレトロウイルス（例えば、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ（ＨＴＬＶ−ＩＩ））；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ））、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ヒトアデノウイルス）、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）、帯状疱疹ウイルス）、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、パルボウイルスＢ１９）、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ＪＣウイルスおよびＢＫウイルス）、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、麻疹ウイルス）、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、風疹ウイルス）ならびにＤ型肝炎ウイルスなどの他のウイルスのメンバーを含むウイルス；
ｉｉ）以下の科：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  Ｔｙｐｈｉ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ｌｅｐｒａｅ）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ（例えば、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓに由来するものなどの細菌；
ｉｉｉ）Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ、またはＥｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎなどの寄生虫；ならびに
ｉｖ）プリオンタンパク質などのプリオン。
【０５９７】
一実施形態では、本明細書に記載されている組成物の投与は、１つまたは複数の遺伝子の転写を抑制する、またはその転写を活性化して、ウイルス感染などの感染を処置する。例えば、ウイルスＤＮＡ転写の阻害剤、例えば、アシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビル、デナビル、ファムシクロビル、ブロモビニルデオキシウリジン、ガンシクロビルなどのヌクレオシドアナログ；ヒドロキシカルバミドなどの生成物アナログまたはフォスカルネット、アロステリック阻害剤または核酸を挿入するか、もしくはそれと直接相互作用する阻害剤のようなピロリン酸アナログに連結されたポリペプチドを投与して、ウイルス感染を処置する。ポリペプチドは、抗ウイルス治療剤の標的化された送達のための細胞標的化リガンドをさらに含んでもよい。
【０５９８】
別の例では、本明細書に記載されている組成物の投与は、細胞死のためにウイルスに感染した細胞を標的にする。ポリペプチドは、トポテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤に連結され、ポリペプチド中の核酸側鎖へのハイブリダイゼーションなどにより、ウイルス配列に特異的に結合する核酸に連結される。核酸配列は、ゲノム中に組み込まれたウイルスＤＮＡに特異的に結合する相補配列を含む。投与時に、ポリペプチドは核に移行して、組み込まれたウイルスＤＮＡに特異的に結合し、トポテカンは、ＤＮＡ複製機構がゲノム中の二本鎖切断を修復するのを妨げる。細胞は、最終的にはアポトーシスを誘導する。
【０５９９】
他の疾患／障害／状態の処置
本明細書に記載されている組成物によって処置することができる一部のさらなる疾患としては、限定されるものではないが、インプリンティングまたは半接合性の単一対立遺伝子疾患、二対立遺伝子疾患、常染色体性劣性遺伝子疾患、常染色体性優性遺伝子疾患、およびヌクレオチド反復、例えば、メチル化による遺伝子のサイレンシングが、症状を駆動するトリヌクレオチド反復により特徴付けられる疾患が挙げられ、本開示の使用によって標的化して、影響された遺伝子の発現をモジュレートすることができる。そのような疾患の例としては、ヤコブセン症候群、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、およびテイサックス病、結節硬化症、マルファン症候群、神経線維腫症、網膜芽腫、ワーデンバーグ症候群、家族性高コレステロール血症、ＤＲＰＬＡ（歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症）、ＨＤ（ハンチントン病）、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、シルバー・ラッセル症候群、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症）、ＳＣＡ１（脊髄小脳失調１型）、ＳＣＡ２（脊髄小脳失調２型）、ＳＣＡ３（脊髄小脳失調３型またはマチャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ６（脊髄小脳失調６型）、ＳＣＡ７（脊髄小脳失調７型）、ＳＣＡ１７（脊髄小脳失調１７型）、ＦＲＡＸＡ（脆弱Ｘ症候群）、ＦＸＴＡＳ（脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群）、ＦＲＡＸＥ（脆弱ＸＥ精神遅滞）、ＦＲＤＡ（フリードライヒ失調症）、ＦＸＮまたはＸ２５、ＤＭ（筋強直性ジストロフィー）、ＳＣＡ８（脊髄小脳失調８型）、およびＳＣＡ１２（脊髄小脳失調１２型）が挙げられる。
【０６００】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている医薬組成物を用いて遺伝子疾患／障害／状態を処置する方法を含む。一実施形態では、本明細書に記載されている組成物の投与は、遺伝子の発現を活性化する、抑制する、またはモジュレートするなど、遺伝子疾患／障害／状態において示される１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現をモジュレートする。
【０６０１】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されている医薬組成物を用いて疾患／障害／状態を処置する方法を含む。一実施形態では、本明細書に記載されている組成物の投与は、遺伝子の発現を活性化する、抑制する、またはモジュレートするなど、１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現をモジュレートして、疾患／障害／状態を処置する。
【０６０２】
本明細書で引用される全ての参考文献および刊行物は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
【０６０３】
以下の実施例は、本開示の一部の実施形態をさらに例示するために提供されるが、本開示の範囲を限定することを意図するものではない；当業者には公知の他の手順、方法、または技術を代替的に使用することができることがその例示的な性質によって理解されるであろう。
【実施例】
【０６０４】
以下の実施例は、アンカー配列媒介接続に付随する遺伝子の発現をモジュレートするための、本開示の方法、試薬および組成物の使用を実証する。過去形で記載されていない限り、実験の記載は、実験が実際に実行されたことを伝えるものではない。
【０６０５】
本実施例は、とりわけ、培養細胞などの細胞における実験を記載する。しかし、本明細書を読む当業者は、本明細書が、開示される方法、薬剤および組成物の治療場面における、例えば、体細胞性、非胚性および／または非培養（例えば、一次）の哺乳動物細胞における適用（本明細書にさらに記載される）も教示することを理解する。
【０６０６】
（実施例１）
ＭＹＣ遺伝子の発現を低下させるための、遺伝子改変、エピジェネティック改変および物理的摂動によるＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊
【０６０７】
本実施例は、１型アンカー配列媒介接続内の遺伝子（この場合、ＭＹＣ）の発現を低下させる様々な戦略を実証する。中でも、本実施例は、例えば、ＣＴＣＦアンカー配列の改変および／または摂動を通したアンカー配列媒介接続の破壊により成功した遺伝子発現の低減を実証する。
【０６０８】
標的化部分の一部としてＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼドメインを使用することを含む本開示の方法を使用して、本実施例は、ガイドＲＮＡの組合せを使用するときの相乗作用の証拠も提供する。
【０６０９】
ＭＹＣ（ｃ−Ｍｙｃ）は、遺伝子転写の活性化および抑制を通して細胞周期進行、アポトーシスおよび細胞形質転換において役割を果たす転写因子をコードする調節因子遺伝子である。ヒトがんの約７０％は、ＭＹＣ発現の調節不全を有することが示された。ＭＹＣ阻害ががん治療薬として調査され、多少の腫瘍退行を実証した。しかし、ＭＹＣは、従来の薬理学的モダリティーを使用して細胞内で標的にするのが困難なままである。
【０６１０】
薬剤の生成：全てのプラスミドおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、民間の販売会社から化学的に合成されている。全ての薬剤は、無菌水で復元した。全ての配列は、材料および方法の節において提供される。
Ａ１）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による遺伝子改変
【０６１１】
この実施例は、遺伝子改変によるＭＹＣ遺伝子付随ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０６１２】
ＣＴＣＦアンカー配列はＭＹＣ遺伝子の上流に位置し、ループの中のエンハンサーがＭＹＣプロモーターに影響することを可能にする。ＭＹＣ遺伝子は、活性化エンハンサー−プロモーター（Ｅ−Ｐ）アンカー配列媒介接続に付随している。
【０６１３】
【表１】
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【０６１４】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｃａｓ９をコードするプラスミドをトランスフェクトし、非標的化ｇＲＮＡ（「非標的化」、ｇＲＮＡ配列はヒトゲノムに相同性を有しない）またはＣＴＣＦアンカー配列を標的にする、表１に掲載されるｇＲＮＡを同時にまたは連続的にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、Ｃａｓ９をコードするプラスミドを先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、アンカー配列を標的にする化学合成ｇＲＮＡまたは非標的化ｇＲＮＡ（「非標的化」、ガイドＲＮＡ配列はヒトゲノムに相同性を有しない）のいずれかを連続的にトランスフェクトした。
【０６１５】
トランスフェクションの７２時間後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用した。
【０６１６】
ＭＹＣ遺伝子に付随する、可能性があるＣＴＣＦ結合（黒色）の位置と一緒に、アンカー配列およびｇＲＮＡの位置を図７Ｅに示す。
【０６１７】
ＦＡＭ−ＭＧＢおよびＶＩＣ−ＭＧＢ色素をそれぞれ使用して、ＭＹＣ特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマー（アッセイＩＤ  Ｈｓ００１５３４０８＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＰＰＩＢ（アッセイＩＤ  Ｈｓ００１６８７１９＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＧＡＰＤＨ（アッセイＩＤ  Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかであった内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマーで多重化し、リアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって遺伝子発現をその後分析した。ＣＴＣＦアンカー配列に近位のガイドＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、７２時間後にＭＹＣ発現の低減を示した（図７Ａ、上パネル）。各技術的反復は、空のボックス記号によって表される。
【０６１８】
Ｃａｓ９生成遺伝子改変（インデル）を検出するために、ＰＣＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってアンカー配列ＤＮＡ領域を増幅する鋳型として、抽出したゲノムＤＮＡを使用した。生じるＰＣＲ生成物は、製造業者の使用説明書に従ってヌクレアーゼアッセイ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に次に付した。生じたＰＣＲ生成物をゲル電気泳動に付すことによって、Ｃａｓ９生成インデルを検出した（図７Ａ、下パネル）。ゲル電気泳動像は、ミスマッチＤＮＡ生成物を切断するヌクレアーゼアッセイに付したアンカー配列のＰＣＲ生成物を示す。図７Ａの下パネルの中の上の矢印は未切断ＰＣＲ生成物（無Ｃａｓ９生成インデル）を示し、下の矢印はＣａｓ９生成インデルによって引き起こされる切断されたＰＣＲ生成物を示す。ヌクレアーゼ切断生成物は、ＭＹＣインデルＣａｓ９試料の各々に存在する。文字Ａ、ＢおよびＣは、各実験の独立した生物学的反復を表す。空のボックス記号は、技術的反復を示す。
【０６１９】
図７Ａ上パネルに示すように、ＭＹＣ遺伝子発現の概ね４０％の低減が観察された。図７Ａ上パネルに示すように、ＭＹＣ遺伝子発現の概ね４０％の低減が観察された。
【０６２０】
非標的化対照ｇＲＮＡに対してｇＲＮＡの標的のアンカー配列における示差的ＣＴＣＦ結合を判定するために、ＣＴＣＦクロマチン免疫沈降−定量的ＰＣＲアッセイ（ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ）を実行する。トランスフェクションの７２時間後に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトリプシン処理し、１０％ウシ胎児血清および９０％リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の中で１％ホルムアルデヒドで固定する。固定のグリシンクエンチングの後、細胞を遠心分離によってペレットにし、洗浄し、次にＥ２２０展開機器（Ｃｏｖａｒｉｓ）を使用して超音波処理し、クロマチンを剪断する。別の遠心分離ステップの後、剪断したクロマチン上清を収集し、ＣＴＣＦ特異的抗体（Ａｂｃａｍ）と複合体を形成させた予めクリアした磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に加える。４℃で一晩のインキュベーションの後、ビーズに結合しているＣＴＣＦ−クロマチン複合体を洗浄し、溶出緩衝剤に再懸濁させる。その後、６５℃で１５分間、ＣＴＣＦ−クロマチン複合体をビーズから溶出させる。次に６５℃で一晩架橋を解除し、フェノール：クロロホルム抽出によってＤＮＡを精製する。生じるＤＮＡは、ＣＴＣＦ結合領域に隣接する配列特異的プライマー（ＩＤＴ）を使用したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ｑＰＣＲのための鋳型の役目をする。増幅反応のために使用されるプライマー配列は、以下の通りである：５’−ＧＣＴＧＧＡＡＡＣＣＴＴＧＣＡＣＣＴＣ−３’および５’−ＣＧＴＴＣＡＧＧＴＴＴＧＣＧＡＡＡＧＴＡ−３’。インプットで正規化した増幅の５％から１００％の減少は、標的化遺伝子改変により低減したＣＴＣＦ結合を示す。
【０６２１】
Ａ２）シチジンデアミナーゼ−ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９による遺伝子改変
【０６２２】
この実施例は、ＣＴＣＦアンカー配列でのおよびその近位での標的化シチジンデアミナーゼによるゲノム塩基編集による、ＭＹＣ遺伝子付随ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０６２３】
標的化シチジンデアミナーゼによって達成されるものなどの標的化塩基編集は、インデルを形成しないゲノム編集を可能にする。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、発明者らは、塩基編集がインデルの形成を含む方法に勝るある特定の利点を提供することができることを提案する。例えば、塩基編集は、突然変異が誘導されるより正確な制御を可能にすることができる。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、特に治療場面では、正確性の増加は特に安全性および／または規制の観点から価値を提供できると発明者らは認識する。
【０６２４】
【表２】
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【０６２５】
ｄＣａｓ９およびＵＧＩ、ウラシルグリコシラーゼ阻害タンパク質（ＡＰＯＢＥＣ１−ｄＣａｓ９−ＵＧＩ）に融合させた、ＡＰＯＢＥＣ１、シトシン（Ｃ）をＲＮＡ塩基（Ｕ）に変換するシチジンデアミナーゼからなる融合タンパク質をコードするプラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトする。それから８時間後に、アンカー配列（表２に掲載される）にもしくはその周囲に張られる化学合成ｇＲＮＡ、または非標的化ｇＲＮＡ（「非標的化」、ガイドＲＮＡ配列はヒトゲノムに相同性を有しない）を細胞にトランスフェクトする。
【０６２６】
トランスフェクションの７２時間後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用する。
【０６２７】
ウラシル（Ｕ）へのシトシン（Ｃ）の変換を分析するために、ＰＣＲキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってＣＴＣＦ結合ＤＮＡ領域を増幅する鋳型として、トランスフェクションの７２時間後に抽出したｇＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用する。ＡＰＯＢＥＣ１−ｄＣａｓ９−ＵＧＩ媒介塩基編集（Ｃ→Ｕ）は、生じたＰＣＲ生成物の配列決定によって判定する。生じたＰＣＲ生成物の配列を増幅されたＤＮＡ領域の元の参照配列と整列させることによって、ＡＰＯＢＥＣ１−ｄＣａｓ９−ＵＧＩによるＣからＵへの編集は同定され、ここで、チミジン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）の代わりに配列決定される。クロマトグラムの上の任意の数のゼロ以外のＣからＴへの配列決定コールは、ＡＰＯＢＥＣ１−ｄＣａｓ９−ＵＧＩによる遺伝子改変を示す。
【０６２８】
ＭＹＣ特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマーは、実施例１Ａ．１に記載の通りに、内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマーで多重化され、遺伝子発現はリアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってその後分析される。ＣＴＣＦアンカー配列のまたはその周囲のガイドＲＮＡは、シチジン脱アミノによるＤＮＡ編集の後にＭＹＣ発現の低減を示す。
【０６２９】
ＭＹＣ遺伝子に付随するＣＴＣＦアンカー配列でまたはその近くでＤＮＡを改変する酵素エフェクターは、非標的化対照と比較してＭＹＣのｍＲＮＡレベルを低下させるＭＹＣ遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証する。
【０６３０】
Ｂ）エピジェネティック改変
この実施例は、エピジェネティック改変によるＭＹＣ遺伝子付随ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０６３１】
【表３】
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【０６３２】
ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３Ｌ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼからの活性ドメインを含む融合タンパク質）またはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ（転写リプレッサー融合タンパク質）のいずれかをコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、アンカー配列（表３に掲載される）の周囲に張られた５つのｇＲＮＡのうちの１つ、またはアンカー配列の周囲に張られた全部で５つのｇＲＮＡの混合物を、連続的にトランスフェクトした（ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３Ｌは図７Ｂ；ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢは図７Ｃ）。
【０６３３】
トランスフェクションの７２時間後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用した。
【０６３４】
ＭＹＣ特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマーは、前の実施例に記載の通りに、内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマーで多重化され、遺伝子発現はリアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってその後分析した。ＣＴＣＦアンカー配列に近位のガイドＲＮＡは、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３Ｌ（図７Ｂ）またはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ（図７Ｃ）のいずれかによるメチル化の７２時間後にＭＹＣ発現の低減を示した。図７Ｂで、空のボックスは、異なる生物学的反復を表している。図７Ｃで、ＡおよびＢは生物学的反復を表し、空のボックスは各技術的反復の値を表す。
【０６３５】
図７Ａおよび７Ｂに示すように、転写抑制は、単一のガイドを使用して達成された。ｇＲＮＡの組合せを使用したとき、転写抑制の概ね４０％またはそれより多くの低減が観察された。図７Ｂに見られるように、「ＳＡＣＲ−００００２、０００１１、０００１５、０００１６、０００１７」の組合せで観察された低減の程度が、組合せの中のｇＲＮＡの各々で観察された低減の合計より大きかったという点で、ガイドＲＮＡの組合せで相乗作用が観察された。
【０６３６】
ＤＮＡメチル化を分析するために、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出したゲノムＤＮＡを重亜硫酸変換し、精製して、重亜硫酸変換したゲノムＤＮＡは、ＰＣＲキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によってＣＴＣＦ結合ＤＮＡ領域を増幅するための鋳型として使用する。ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３Ｌ媒介ＣｐＧメチル化は、生じたＰＣＲ生成物を配列決定（重亜硫酸配列決定）することによって判定する。生じたＰＣＲ生成物の配列を未変換の参照ＤＮＡ配列と整列させることによって、ＴがＣの代わりに配列決定されるチミジン（Ｔ）塩基コールによって非メチル化ＣｐＧを同定する。したがって、ＣｐＧメチル化は、任意の数のゼロ以外のＣ塩基コールと続くグアノシン（Ｇ）によって表される。ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３Ｌ媒介ＣｐＧメチル化の程度は、非標的化対照と比較したＭＹＣ標的化試料におけるＣ塩基コールの数および位置を比較することによってその後確認され、Ｃ塩基コールの整数増加は、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３Ｌ標的化ＣｐＧメチル化を示す。
【０６３７】
ＭＹＣ遺伝子に付随するＣＴＣＦアンカー配列でまたはその近くでエピジェネティック改変を標的にするエフェクターは、非標的化対照と比較してＭＹＣのｍＲＮＡレベルを低下させるＭＹＣ遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証した。
【０６３８】
いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、発明者らは、一部の実施形態では、そのような組合せは標的核酸の巻戻しの増加に寄与し、タンパク質への向上したアクセスを可能にし、および／またはヌクレオソームの物理的排除を可能にする点で、ｇＲＮＡの組合せが単一のｇＲＮＡより有効である可能性を提案する。標的核酸に及ぼすそのような作用は立体障害を低減することができ、それによって核酸を標的にするタンパク質の活性の強化をもたらすことができることを、発明者らは提案する。多量体（例えば、ダイマー、テトラマー等）として作用するかさもなければかさ高いＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌなどのエフェクターの場合、立体障害の低減は特に重要である可能性があることを、発明者らは提案する。ＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌなどの一部のエフェクターはヘリカーゼとして作用することができることを、発明者らは提案する。
【０６３９】
いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、ガイドＲＮＡの組合せは、一部の実施形態では、オフターゲット（非標的）活性（すなわち、オフターゲット部位での活性）の低減を可能にすることができることを、発明者らは提案する。複数のガイドＲＮＡで頑強な相乗作用を達成することができる方法（本明細書に開示されるような、エピジェネティック改変を含む方法など）が、オフターゲット活性の微調整および／または低減に特に適合することを、発明者らは提案する。オフターゲット活性のそのような低減は、例えば治療場面で安全性を向上させることができる。
【０６４０】
Ｃ１）合成核酸による物理的摂動
この実施例は、アンカー配列でのＣＴＣＦ結合を物理的に阻止することによるＭＹＣ遺伝子付随ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０６４１】
【表４】
2019531763.tif 000007
【０６４２】
製造業者の使用説明書に従って脂質に基づくトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、表４に掲載されるＭＹＣ遺伝子の上流もしくは下流のＣＴＣＦアンカー配列の周囲の近位に位置する合成核酸（ＳＮＡ）または非標的化ＳＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションの７２時間後に、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡ抽出のために細胞を収集し、ｃＤＮＡを合成する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲのための鋳型として使用する。
【０６４３】
ＭＹＣ特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマーは、前の実施例に記載の通りに、内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマーで多重化され、遺伝子発現はリアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってその後分析される。ＣＴＣＦアンカー配列に近位のＳＮＡをトランスフェクトした細胞は、ＭＹＣ発現の低減を示すと予想される。
【０６４４】
非標的化ＳＮＡに対してＳＮＡが標的にするアンカー配列における示差的ＣＴＣＦ結合の判定のために、ＳＮＡの様々な濃度をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＣＴＣＦ  ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲを実行する。実施例１Ａ．１に記載の通りに、ＣＴＣＦ  ＣｈＩＰプロトコールを実行する。フェノール：クロロホルム精製ＤＮＡは、ＣＴＣＦ結合配列領域に隣接する配列特異的プライマー（ＩＤＴ）を使用したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ｑＰＣＲのための鋳型の役目をする。ＳＮＡ投薬量の増加に従って、標的領域のインプット正規化増幅における対応した減少は、ＳＮＡ標的化物理的摂動によるアンカー配列からのＣＴＣＦの排除を実証する。
【０６４５】
Ｃ２）標的化タンパク質結合による物理的摂動
この実施例は、かさ高いエフェクター分子（この場合、融合タンパク質）を使用して、アンカー配列でのＣＴＣＦ結合を物理的に阻止することによる、ＭＹＣ遺伝子付随ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０６４６】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、２つの異なるｄＣａｓ９融合タンパク質をコードするプラスミドを先ずトランスフェクトし、それから８時間後にＣＴＣＦアンカー配列（表１に掲載される）を標的にするｇＲＮＡを連続的にトランスフェクトした。
【０６４７】
トランスフェクションの７２時間後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用した。
【０６４８】
ＭＹＣ特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマーは、前の実施例に記載の通りに、内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマーで多重化され、遺伝子発現はリアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってその後分析した。ＣＴＣＦアンカー配列に近位のガイドＲＮＡは、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３Ｌ（図７Ｂ）またはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ（図７Ｃ）のいずれかによるメチル化の７２時間後にＭＹＣ発現の低減を示した。文字ＡおよびＢは、各実験の独立した生物学的反復を表す。空のボックス記号は、技術的反復を示す。
【０６４９】
非標的化対照ｇＲＮＡおよびタンパク質融合体に対して標的化ｇＲＮＡおよびタンパク質融合体によるアンカー配列における示差的ＣＴＣＦ結合を判定するために、ＣＴＣＦクロマチン免疫沈降−定量的ＰＣＲアッセイ（ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ）を実行する。実施例１Ａ．１に記載の通りに、ＣＴＣＦ  ＣｈＩＰプロトコールを実行する。フェノール：クロロホルム精製ＤＮＡは、ＣＴＣＦ結合配列領域に隣接する配列特異的プライマー（ＩＤＴ）を使用したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ｑＰＣＲのための鋳型の役目をする。インプットで正規化した増幅の減少は、標的化物理的破壊により低減したＣＴＣＦ結合を示す。
【０６５０】
ＭＹＣ遺伝子に付随するＣＴＣＦアンカー配列においてＣＴＣＦ結合を物理的に破壊するかさ高いエフェクターは、ＭＹＣ遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証し、非標的化対照と比較してＭＹＣのｍＲＮＡレベルを低下させる。
【０６５１】
いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、発明者らは、一部の実施形態では、エフェクターのかさ高さが破壊の１つまたは複数の態様に寄与する可能性を提案する。例えば、図７Ｂに示す結果は、多量体として作用することができるかさ高い融合タンパク質（ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３Ｌ）を使用して得られた。
【０６５２】
したがって、本実施例は、１型ループの中の遺伝子の発現を実質的に低減するために、本開示の方法および薬剤を使用することができることを実証する。
【０６５３】
（実施例２）
ＭＹＣ遺伝子の発現を低下させるための、遺伝子改変、エピジェネティック改変および物理的摂動によるＹＹ１アンカー配列媒介接続の破壊
【０６５４】
本実施例は、１型アンカー配列媒介接続内の遺伝子（この場合、ＭＹＣ）の発現を低下させる様々な戦略を実証する。中でも、本実施例は、例えば、ＹＹ１アンカー配列の改変および／または摂動を通したアンカー配列媒介接続の破壊により成功した遺伝子発現の低減を実証する。
【０６５５】
本実施例は、とりわけ、アンカー配列媒介接続に付随する遺伝子の発現をモジュレートするために、１つより多い型のアンカー配列を改変するために、本開示の方法および薬剤を適用することができることを確認する。
【０６５６】
さらに、本実施例は、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼ方法との関連で、個々のガイドＲＮＡを使用して遺伝子発現においてかなりの変化を達成することができることを実証する。
【０６５７】
薬剤の生成：全てのプラスミドおよびガイドＲＮＡは、民間の販売会社から化学的に合成されている。全ての薬剤は、無菌水で復元した。全ての配列は、材料および方法の節において提供される。
【０６５８】
Ａ）遺伝子改変
ＹＹ１アンカー配列は、遠位のスーパーエンハンサーがＭＹＣプロモーターに影響する場所の近くの、ＭＹＣ遺伝子の上流に位置する。
【０６５９】
この実施例は、遺伝子改変によるＭＹＣ遺伝子付随ＹＹ１アンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０６６０】
【表５】
2019531763.tif 000008
【０６６１】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、Ｃａｓ９をコードするプラスミドを先ずトランスフェクトし、それから８時間後に非標的化ｇＲＮＡ（「非標的化」、ガイドＲＮＡ配列はヒトゲノムに相同性を有しない）、またはＹＹ１アンカー配列を標的にする、表５に掲載されるｇＲＮＡを連続的にトランスフェクトした。
【０６６２】
トランスフェクションの７２時間後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用した。
【０６６３】
実施例１に記載の通り、ＭＹＣ特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマー（アッセイＩＤ  Ｈｓ００１５３４０８＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＰＰＩＢ（アッセイＩＤ  Ｈｓ００１６８７１９＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマーで多重化し、リアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって遺伝子発現をその後分析した。ＹＹ１アンカー配列に近位のガイドＲＮＡは、７２時間後にＭＹＣ発現の低減を示した（図７Ｄ）。空のボックス記号は、各生物学的反復の値を表す。
【０６６４】
図７Ｄに示すように、ＭＹＣ遺伝子発現の概ね４０％およびそれを超えるかなりの低減が個々のガイドで得られた。
【０６６５】
非標的化ｇＲＮＡに対して標的化ｇＲＮＡによるアンカー配列における示差的ＹＹ１結合を判定するために、ＹＹ１クロマチン免疫沈降−定量的ＰＣＲアッセイ（ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ）を実行する。ＹＹ１  ＣｈＩＰプロトコールは、実施例１、Ａ１に記載の通りに実行される。フェノール：クロロホルム精製ＤＮＡは、ＹＹ１結合配列領域に隣接する配列特異的プライマー（ＩＤＴ）を使用したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ｑＰＣＲのための鋳型の役目をする。インプットで正規化した増幅の減少は、標的化エピジェネティック改変により低減したＹＹ１結合を示す。
【０６６６】
ＭＹＣ遺伝子に付随するＹＹ１アンカー配列でのまたはその近くでのエピジェネティック改変を標的にするエフェクターは、非標的化対照と比較してＭＹＣのｍＲＮＡレベルを低下させるＭＹＣ遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証する。
【０６６７】
ＭＹＣ遺伝子に付随するＹＹ１アンカー配列でまたはその近くでＤＮＡを改変する酵素エフェクターは、非標的化対照と比較してＭＹＣのｍＲＮＡレベルを低下させるＭＹＣ遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証した。
【０６６８】
Ｂ）エピジェネティック改変
この実施例は、エピジェネティック改変によるＭＹＣ遺伝子付随ＹＹ１アンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０６６９】
ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３Ｌ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼからの活性ドメインを含む融合タンパク質）またはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ（転写リプレッサー融合タンパク質）のいずれかをコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、アンカー配列の周囲に張られた５つのｇＲＮＡ（表３に掲載される）のうちの１つ、またはアンカー配列の周囲に張られた全部で５つのｇＲＮＡの混合物を連続的にトランスフェクトする。
【０６７０】
トランスフェクションの７２時間後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出する（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用する。
【０６７１】
ＭＹＣ特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマーは、前の実施例に記載の通りに、内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマーで多重化され、遺伝子発現はリアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってその後分析される。ＹＹ１アンカー配列に近位のガイドＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、ＹＹ１アンカー配列のメチル化の後にＭＹＣ発現の低減を示すと予想される。
【０６７２】
非標的化タンパク質融合体に対して標的化メチルトランスフェラーゼまたは転写リプレッサータンパク質によるアンカー配列における示差的ＹＹ１結合を判定するために、ＹＹ１クロマチン免疫沈降−定量的ＰＣＲアッセイ（ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ）を実行する。ＹＹ１  ＣｈＩＰプロトコールは、実施例１Ａ．１に記載の通りに実行される。フェノール：クロロホルム精製ＤＮＡは、ＹＹ１結合配列領域に隣接する配列特異的プライマー（ＩＤＴ）を使用したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ｑＰＣＲのための鋳型の役目をする。インプットで正規化した増幅の減少は、標的化エピジェネティック改変により低減したＹＹ１結合を示す。
【０６７３】
ＭＹＣ遺伝子に付随するＹＹ１アンカー配列でのまたはその近くでのエピジェネティック改変を標的にするエフェクターは、ＭＹＣ遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証し、非標的化対照と比較してＭＹＣのｍＲＮＡレベルを低下させる。
Ｃ）物理的摂動
【０６７４】
この実施例は、アンカー配列でのＹＹ１結合を物理的に阻止することによるＭＹＣ遺伝子付随ＹＹ１アンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０６７５】
製造業者の使用説明書に従って脂質に基づくトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、表４に掲載される合成核酸（ＳＮＡ）または非標的化ＳＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションの７２時間後に、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡ抽出のために細胞を収集し、ｃＤＮＡを合成する（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲのための鋳型として使用する。
【０６７６】
ＭＹＣ特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマーは、前の実施例に記載の通りに、内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマーで多重化され、遺伝子発現はリアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってその後分析する。ＹＹ１アンカー配列に近位のＳＮＡは、ＭＹＣ発現の低減を示す。
【０６７７】
非標的化ＳＮＡに対してＳＮＡが標的にするアンカー配列における示差的ＹＹ１結合の判定のために、ＳＮＡの様々な濃度をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＹＹ１  ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲを実行する。ＹＹ１  ＣｈＩＰプロトコールは、実施例１Ａ．１に記載の通りに実行される。フェノール：クロロホルム精製ＤＮＡは、ＹＹ１結合配列領域に隣接する配列特異的プライマー（ＩＤＴ）を使用したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ｑＰＣＲのための鋳型の役目をする。ＳＮＡ投薬量の増加に従って、標的領域のインプット正規化増幅における対応した減少は、ＳＮＡ標的化物理的摂動によるアンカー配列からのＣＴＣＦの排除を実証する。
【０６７８】
ＭＹＣ遺伝子に付随するＹＹ１アンカー配列においてＹＹ１結合を物理的に破壊するエフェクターは、非標的化対照と比較してＭＹＣのｍＲＮＡレベルを低下させるＭＹＣ遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証する。
【０６７９】
（実施例３）
ＦＯＸＪ３遺伝子の発現を低下させるための、遺伝子、エピジェネティックおよび物理的摂動によるＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊
【０６８０】
本実施例は、１型アンカー配列媒介接続内の遺伝子（この場合、ＦＯＸＪ３）の発現を低下させる様々な戦略を実証する。中でも、本実施例は、例えば、ＣＴＣＦアンカー配列の改変および／または摂動を通したアンカー配列媒介接続の破壊により成功した遺伝子発現の部位特異的モジュレーション（この場合、抑制）を実証する。
【０６８１】
卵巣がんは、米国において女性の間で最も一般的ながんおよび死因の１つである。フォークヘッドボックスＪ３（ＦＯＸＪ３）は、細胞の成長、増殖、分化および寿命に関与する遺伝子の発現の調節において重要な役割をする転写因子のファミリーに属する。ＦＯＸＪ３は卵巣がんの最高１０％において増幅されることが示されており、ＦＯＸＪ３遺伝子アンカー媒介接続の破壊およびＦＯＸＪ３遺伝子発現の低下が卵巣がんにおいて治療的である可能性を示唆する。
【０６８２】
ＦＯＸＪ３遺伝子は、１型アンカー配列媒介接続の中にある。アンカー配列媒介接続は、ＦＯＸＪ３をコードする遺伝子および付随する転写制御配列、例えばエンハンサーを含む。
【０６８３】
薬剤の生成：全てのプラスミドおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、民間の販売会社から化学的に合成されている。全ての薬剤は、無菌水で復元した。全ての配列は、材料および方法の節において提供される。
【０６８４】
Ａ）遺伝子摂動
この実施例は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９を使用した推定上のＣＴＣＦアンカー配列の遺伝的突然変異を通した、ＦＯＸＪ３遺伝子１型アンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０６８５】
【表６】
2019531763.tif 000009
【０６８６】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、製造業者の使用説明書に従ってトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、Ｃａｓ９をコードするプラスミドを先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、推定上のＣＴＣＦアンカー配列もしくはその近くを標的にする化学合成ｇＲＮＡ（表６）、または非標的化ｇＲＮＡ（「非標的化」、ガイドＲＮＡ配列はヒトゲノムに相同性を有しない）を連続的にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡ抽出のために細胞を収集し、ｃＤＮＡを合成した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために次に使用した。
【０６８７】
ＦＡＭ−ＭＧＢおよびＶＩＣ−ＭＧＢ色素をそれぞれ使用して、ＦＯＸＪ３特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマー（アッセイＩＤ：Ｈｓ００９６１５３６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、内部対照ＰＰＩＢプローブ／プライマー（アッセイＩＤ：Ｈｓ００１６８７１９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で多重化し、リアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって遺伝子発現をその後分析した。
【０６８８】
ＦＯＸＪ３遺伝子に付随する、可能性があるＣＴＣＦ結合（黒色）の位置と一緒に、アンカー配列（右上矢印、左下矢印）ｇＲＮＡ、およびＳＮＡの位置を図８Ａに示す。
【０６８９】
示したｇＲＮＡのトランスフェクションの７２時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＦＯＸＪ３遺伝子発現の平均的変化を、図８Ｂに示す。各生物学的反復は、空のボックス記号によって表される。アンカー配列に近位のガイドＲＮＡは、ＦＯＸＪ３のｍＲＮＡレベルの低減を示した。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ．有意でない。
【０６９０】
図８Ｂに示すように、ＣＴＣＦ結合部位により近い領域を標的にしたガイドＲＮＡで、発現のより大きな減少が観察された。
【０６９１】
ＦＯＸＪ３アンカー配列媒介接続を標的にすることが、別のアンカー配列媒介接続の中の別の遺伝子に影響しないかどうか判定するために、ＦＡＭ−ＭＧＢおよびＶＩＣ−ＭＧＢ色素をそれぞれ使用して、ＨＬＡ−Ａ特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマー（アッセイＩＤ：Ｈｓ０１０５８８０６＿ｇ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、内部対照ＰＰＩＢプローブ／プライマー（アッセイＩＤ：Ｈｓ００１６８７１９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で多重化し、リアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって遺伝子発現をその後分析した。
【０６９２】
ＨＬＡ−Ａ遺伝子発現は、３つの生物学的反復にわたって、示したＦＯＸＪ３  ｇＲＮＡのトランスフェクションの７２時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、発現の有意な変化を示さなかった。ｇＲＮＡの全ては、ＦＯＸＪ３アンカー配列媒介接続のアンカー配列を標的にし、ＨＬＡ−ＡのｍＲＮＡレベルに非特異的作用を示さない。
【０６９３】
ＦＯＸＪ３遺伝子に付随するＣＴＣＦアンカー配列でまたはその近くでＤＮＡを改変する酵素エフェクターは、ＦＯＸＪ３遺伝子アンカー媒介接続の部位特異的破壊を実証し、非標的化対照と比較してＦＯＸＪ３のｍＲＮＡレベルを低下させる。
【０６９４】
したがって、本実施例は、非標的遺伝子に影響することがない、標的遺伝子でのモジュレーションを実証する。
【０６９５】
Ｂ）エピジェネティック摂動
この実施例は、アンカー配列でのおよびその近くでのヘテロクロマチンの形成による、ＦＯＸＪ３遺伝子１型アンカー配列媒介接続の破壊を実証する。ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢは、アンカー配列におけるおよびその近位のゲノム領域、例えばｇＲＮＡ結合部位に特異的である酵素活性を有する転写リプレッサー融合タンパク質である。
【０６９６】
【表７】
2019531763.tif 000010
【０６９７】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、製造業者の使用説明書に従ってトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ、転写リプレッサー融合タンパク質をコードするプラスミドを先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、ＦＯＸＪ３の上流もしくは下流のアンカー配列の周囲の近位に位置する、表７に掲載される５つの化学合成ｇＲＮＡの混合物、または非標的化ｇＲＮＡ（「非標的化」、ガイドＲＮＡ配列はヒトゲノムに相同性を有しない）を連続的にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡ抽出のために細胞を収集し、ｃＤＮＡを合成した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲのための鋳型として使用した。
【０６９８】
ＦＡＭ−ＭＧＢおよびＶＩＣ−ＭＧＢ色素をそれぞれ使用して、ＦＯＸＪ３特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマー（アッセイＩＤ：Ｈｓ００９６１５３６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、内部対照ＰＰＩＢ定量的ＰＣＲプローブ／プライマー（アッセイＩＤ：Ｈｓ００１６８７１９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で多重化し、リアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して遺伝子発現を分析した。
【０６９９】
示したアンカー近位ｇＲＮＡまたは非標的化対照ｇＲＮＡのトランスフェクションの７２時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＦＯＸＪ３遺伝子発現の平均的変化を、図８Ｃに示す。空のボックスは、各生物学的反復の値を表す。アンカー配列および隣接する配列領域を標的にするガイドＲＮＡは、ＦＯＸＪ３のｍＲＮＡレベルの低減を示した。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【０７００】
ＦＯＸＪ３遺伝子に付随するＣＴＣＦアンカー配列でのまたはその近くでのエピジェネティック改変を標的にするエフェクターは、ＦＯＸＪ３遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証し、非標的化対照と比較してＦＯＸＪ３のｍＲＮＡレベルを低下させる。
【０７０１】
Ｃ）物理的摂動
この実施例は、アンカー配列でのＣＴＣＦ結合を物理的に阻止することによる、ＦＯＸＪ３遺伝子１型アンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０７０２】
【表８】
2019531763.tif 000011
【０７０３】
製造業者の使用説明書に従って脂質に基づくトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、表８に掲載されるＦＯＸＪ３遺伝子の上流もしくは下流のアンカー配列の周囲の近位に位置するＳＮＡ、または非標的化ＳＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡ抽出のために細胞を収集し、ｃＤＮＡを合成した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲのための鋳型として使用した。
【０７０４】
ＦＡＭ−ＭＧＢおよびＶＩＣ−ＭＧＢ色素をそれぞれ使用して、ＦＯＸＪ３特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマー（アッセイＩＤ：Ｈｓ００９６１５３６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、内部対照ＰＰＩＢ定量的ＰＣＲプローブ／プライマー（アッセイＩＤ：Ｈｓ００１６８７１９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で多重化し、リアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって遺伝子発現を分析した。
【０７０５】
示したＳＮＡのトランスフェクションの７２時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＦＯＸＪ３遺伝子発現の平均的変化を、図８Ｄに示す。各生物学的反復は、空のボックス記号によって表される。アンカー配列に近位のＳＮＡは、非標的化対照（「非標的化」、ＳＮＡ配列はヒトゲノムに相同性を有しない）と比較してＦＯＸＪ３のｍＲＮＡレベルの低減を示した。全ての標的特異的ＳＮＡがＦＯＸＪ３のｍＲＮＡ発現をモジュレートすることができるとは限らないので、遺伝子発現のこの減少は配列特異的である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５。トランスフェクション後の７２時間の間の様々な用量による非標的化ＳＮＡおよび３つのＦＯＸＪ３標的化ＳＮＡを使用した用量反応曲線は、ＦＯＸＪ３のｍＲＮＡの減少を示す（図８Ｅ）。
【０７０６】
ＦＯＸＪ３遺伝子に付随するＣＴＣＦアンカー配列でのＣＴＣＦ結合を物理的に破壊するエフェクターは、非標的化対照と比較してＦＯＸＪ３のｍＲＮＡレベルを低下させるＦＯＸＪ３遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証する。
【０７０７】
本実施例は、物理的破壊を使用した、標的遺伝子でのモジュレーションを実証する。非標的化対照を使用するとＦＯＸＪ３発現に及ぼす作用が観察されないこと、およびＦＯＸＪ３に特異的なＳＮＡを使用して得られる用量反応曲線は、破壊が部位特異的に達成されたという結論を裏付ける。さらに、観察された用量反応作用は、本開示の薬剤および方法を使用して遺伝子発現の低下の程度を調整することが可能であることを確認する。
【０７０８】
（実施例４）
ＴＵＳＣ５遺伝子の発現を増加させるための、遺伝子改変、エピジェネティック改変および物理的摂動によるＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊
【０７０９】
本実施例は、２型アンカー配列媒介接続内の遺伝子（この場合、ＴＵＳＣ５）の発現を増加させる様々な戦略を実証する。中でも、本実施例は、例えば、ＣＴＣＦアンカー配列の改変および／または摂動を通したアンカー配列媒介接続の破壊により成功した遺伝子発現のモジュレーションを実証する。
【０７１０】
腫瘍サプレッサー候補５（ＴＵＳＣ５）は、推定上の膜貫通タンパク質である。ＴＵＳＣ５は肺がんにおいて頻繁に欠失しており、したがって、腫瘍サプレッサーとして分類されている。ＴＵＳＣ５の上方制御は、がん増殖を阻害する可能性がある。したがって、本明細書で実証されるように、ＴＵＳＣ５の上方制御は潜在的な治療戦略を提供した。ＴＵＳＣ５は褐色脂肪組織においても高度に発現され、褐色脂肪細胞の分化に潜在的に関与する。
【０７１１】
ＴＵＳＣ５は、ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の中に位置する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、ＴＵＳＣ５は発現されず、この接続の外側の上流および下流両方に、複数の活性エンハンサーがある。この接続は、２型ループの例である。接続のいずれかの末端のＣＴＣＦアンカー配列の破壊は、接続の外側のエンハンサーにＴＵＳＣ５の発現を活性化させることが予想される。
【０７１２】
薬剤の生成：全てのプラスミドおよびガイドＲＮＡは、民間の販売会社から化学的に合成されている。全ての薬剤は、無菌水で復元した。全ての配列は、材料および方法の節において提供される。
【０７１３】
Ａ）遺伝子改変
この実施例は、遺伝子改変によるＴＵＳＣ５遺伝子付随ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０７１４】
【表９】
2019531763.tif 000012
【０７１５】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、Ｃａｓ９をコードするプラスミド、および非標的化ｇＲＮＡ（「非標的化」、ガイドＲＮＡ配列はヒトゲノムに相同性を有しない）、またはＴＵＳＣ５遺伝子を封入する接続の推定上のＣＴＣＦアンカー配列もしくはその近くを標的にする、表９に掲載されるｇＲＮＡのいずれかを連続的にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、Ｃａｓ９をコードするプラスミドを先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、アンカー配列を標的にする化学合成ｇＲＮＡまたは非標的化ｇＲＮＡ（「非標的化」、ガイドＲＮＡ配列はヒトゲノムに相同性を有しない）のいずれかをトランスフェクトした。
【０７１６】
トランスフェクションの７２時間後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用した。
【０７１７】
ＦＡＭ−ＭＧＢおよびＶＩＣ−ＭＧＢ色素をそれぞれ使用して、ＴＵＳＣ５特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマー（アッセイＩＤ  Ｈｓ００５４２６５９＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＰＰＩＢのための内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマー（アッセイＩＤ  Ｈｓ００１６８７１９＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で多重化し、リアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって遺伝子発現をその後分析した。
【０７１８】
示したｇＲＮＡのトランスフェクションの７２時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴＵＳＣ５遺伝子発現の平均的パーセンテージ変化を、図９Ａに示す。核生成剤結合領域の最も近位に位置するｇＲＮＡは、ＴＵＳＣ５遺伝子発現の上方制御において有効性を示した。ＳＡＣＲ００２１４からＳＡＣＲ−００２１９のガイドＲＮＡは、「非標的化」対照と比較して７２時間後にＴＵＳＣ５  ｍＲＮＡの５０００％を超える増加を示した。各生物学的反復は、空のボックス記号によって表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０７１９】
ＴＵＳＣ５遺伝子の上流の可能性があるＣＴＣＦ結合（黒色）の位置と一緒に、ｇＲＮＡの位置を図９Ｂに示す。
【０７２０】
ＴＵＳＣ５遺伝子に付随するＣＴＣＦアンカー配列でまたはその近くでＤＮＡを改変する酵素エフェクターは、ＴＵＳＣ５遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証し、非標的化対照と比較してＴＵＳＣ５のｍＲＮＡレベルを増加させた。
【０７２１】
本発明者らが知る限りでは、本実施例は、その遺伝子が付随するアンカー配列媒介接続を破壊することによって、この大きさの遺伝子発現の増加（５０００％を超える増加）を達成することができるとの最初の実証を提供する。
【０７２２】
Ｂ）エピジェネティック改変
この実施例は、エピジェネティック改変によるＴＵＳＣ５遺伝子付随ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０７２３】
ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３Ｌ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼからの活性ドメインを含む融合タンパク質）またはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ（転写リプレッサー融合タンパク質）のいずれかをコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、アンカー配列の周囲に張られたｇＲＮＡ（表９に掲載される）のうちの１つ、またはアンカー配列の周囲に張られたｇＲＮＡの混合物を、連続的にトランスフェクトする。
【０７２４】
トランスフェクションの７２時間後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出する（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用する。
【０７２５】
ＴＵＳＣ５特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマーは、本明細書に記載の通りに、内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマーで多重化され、リアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって遺伝子発現をその後分析する。ＣＴＣＦアンカー配列に近位のガイドＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３ＬまたはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢのいずれかによる改変の７２時間後にＴＵＳＣ５発現の増加を示すことが予想される。
【０７２６】
ＴＵＳＣ５遺伝子に付随するＣＴＣＦアンカー配列でのまたはその近くでのエピジェネティック改変を標的にするエフェクターは、ＴＵＳＣ５遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証し、非標的化対照と比較してＴＵＳＣ５のｍＲＮＡレベルを増加させる。
【０７２７】
Ｃ）物理的摂動
この実施例は、かさ高いエフェクター分子（この場合、融合タンパク質）を使用して、アンカー配列でのＣＴＣＦ結合を物理的に阻止することによる、ＴＵＳＣ５遺伝子付随ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０７２８】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、２つの異なるｄＣａｓ９融合タンパク質をコードするプラスミドを先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、アンカー配列の周囲に張られたｇＲＮＡ（表９に掲載される）のうちの１つ、またはアンカー配列の周囲に張られたガイドＲＮＡの混合物を連続的にトランスフェクトする。
【０７２９】
トランスフェクションの７２時間後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出する（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用する。
【０７３０】
ＴＵＳＣ５特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマーは、前の実施例に記載の通りに、内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマーで多重化され、遺伝子発現はリアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってその後分析する。ＣＴＣＦアンカー配列に近位のガイドＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３ＬまたはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢのいずれかによる改変の７２時間後にＴＵＳＣ５発現の増加を示すことが予想される。
【０７３１】
非標的化対照ｇＲＮＡおよびタンパク質融合体に対して標的化ｇＲＮＡおよびタンパク質融合体によるアンカー配列における示差的ＣＴＣＦ結合を判定するために、ＣＴＣＦクロマチン免疫沈降−定量的ＰＣＲアッセイ（ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ）を実行する。前の実施例に記載の通りに、ＣＴＣＦ  ＣｈＩＰプロトコールを実行する。フェノール：クロロホルム精製ＤＮＡは、ＣＴＣＦ結合配列領域に隣接する配列特異的プライマー（ＩＤＴ）を使用したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ｑＰＣＲのための鋳型の役目をする。インプットで正規化した増幅の減少は、標的化物理的破壊により低減したＣＴＣＦ結合を示す。
【０７３２】
ＴＵＳＣ５遺伝子に付随するＣＴＣＦアンカー配列でのＣＴＣＦ結合を物理的に破壊するかさ高いエフェクターは、ＴＵＳＣ５遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証し、非標的化対照と比較してＴＵＳＣ５のｍＲＮＡレベルを増加させる。
【０７３３】
（実施例５）
ＤＡＮＤ５遺伝子の発現を増加させるための、遺伝子改変、エピジェネティック改変および物理的摂動によるＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊
【０７３４】
本実施例は、２型アンカー配列媒介接続内の遺伝子（この場合、ＤＡＮＤ５）の発現を増加させる様々な戦略を実証する。中でも、本実施例は、例えば、ＣＴＣＦアンカー配列の改変および／または摂動を通したアンカー配列媒介接続の破壊により成功した遺伝子発現のモジュレーションを実証する。
【０７３５】
ＤＡＮドメインＢＭＰアンタゴニストファミリーメンバー５（ＤＡＮＤ５）は、ＢＭＰアンタゴニストである。ＤＡＮＤ５突然変異は、先天性の心臓欠損症と関連付けられている。
【０７３６】
ＤＡＮＤ５は、ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の中に位置する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、ＤＡＮＤ５は非常に低いレベルで発現され、ＤＡＮＤ５遺伝子の上流のこの接続の外側に活性エンハンサーがある。この接続は、２型ループの例である。ＤＡＮＤ５の上流の接続の末端のＣＴＣＦアンカー配列の破壊は、接続の外側のエンハンサーにＤＡＮＤ５と相互作用させてその発現を増加させることが予想される。
【０７３７】
薬剤の生成：全てのプラスミドおよびガイドＲＮＡは、民間の販売会社から化学的に合成されている。全ての薬剤は、無菌水で復元した。全ての配列は、材料および方法の節において提供される。
【０７３８】
Ａ）遺伝子改変
この実施例は、遺伝子改変によるＤＡＮＤ５遺伝子付随ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０７３９】
【表１０】
2019531763.tif 000013
【０７４０】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、Ｃａｓ９をコードするプラスミド、および非標的化ｇＲＮＡ（「非標的化」、ｇＲＮＡ配列はヒトゲノムに相同性を有しない）、またはＤＡＮＤ５遺伝子の上流の接続の末端の推定上のＣＴＣＦアンカー配列もしくはその近くを標的にする、表１０に掲載されるｇＲＮＡのいずれかを連続的にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、Ｃａｓ９をコードするプラスミドを先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、ＣＴＣＦアンカー配列を標的にする化学合成ｇＲＮＡまたは非標的化ｇＲＮＡ（「非標的化」、ｇＲＮＡ配列はヒトゲノムに相同性を有しない）のいずれかを連続的にトランスフェクトした。
【０７４１】
トランスフェクションの７２時間後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用した。
【０７４２】
ＦＡＭ−ＭＧＢおよびＶＩＣ−ＭＧＢ色素をそれぞれ使用して、ＤＡＮＤ５特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマー（アッセイＩＤ  Ｈｓ００５４１４８８＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＰＰＩＢのための内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマー（アッセイＩＤ  Ｈｓ００１６８７１９＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で多重化し、リアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって遺伝子発現をその後分析した。ガイドＲＮＡ  ＳＡＣＲ−００１８９は、「非標的化」対照と比較してＤＡＮＤ５発現の１２４％の増加を示した（図１０）。各生物学的反復は、空のボックス記号によって表される。
【０７４３】
示したｇＲＮＡのトランスフェクションの７２時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＤＡＮＤ５遺伝子発現の平均的パーセンテージ変化を、図１０Ａに示す。空のボックスは、各生物学的反復を表す。ＣＴＣＦ結合領域（ＳＡＣＲ−００１８９）のピークに最も近いｇＲＮＡは、ＤＡＮＤ５遺伝子発現の上方制御における有効性を示した。＊＊ｐ＜０．０１。
【０７４４】
図１０Ａに示すように、ＣＴＣＦ結合部位の中央を標的にする単一のガイドＲＮＡで、遺伝子発現に及ぼす頑強な作用（１００％を超える増加）が達成された。実施例４Ａに記載される結果と対照的に、ＣＴＣＦ結合部位の中央ではなくその近くの領域を標的にするガイドＲＮＡでは、有意な増加は観察されなかった。
【０７４５】
いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、発明者らは、ある特定の因子（例えば、特異的ガイドＲＮＡの標的化効率、近くの転写制御配列（例えば、エンハンサー）強度および／または型等）が、アンカー配列媒介接続の破壊によるモジュレーションへの特定の遺伝子座の感受性に影響することができることを提案する。
【０７４６】
図１０Ｂでは、ＤＡＮＤ５遺伝子の上流の可能性があるＣＴＣＦ結合（黒色）の位置を、ｇＲＮＡの位置と一緒に示す。
【０７４７】
ＤＡＮＤ５遺伝子に付随するＣＴＣＦアンカー配列でまたはその近くでＤＮＡを改変する酵素エフェクターは、ＤＡＮＤ５遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証し、非標的化対照と比較してＤＡＮＤ５のｍＲＮＡレベルを増加させる。
【０７４８】
Ｂ）エピジェネティック改変
この実施例は、エピジェネティック改変によるＤＡＮＤ５遺伝子付随ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０７４９】
ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３Ｌ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼからの活性ドメインを含む融合タンパク質）またはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ（転写リプレッサー融合タンパク質）のいずれかをコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、アンカー配列の周囲に張られたｇＲＮＡ（表１０に掲載される）のうちの１つ、またはアンカー配列の周囲に張られたｇＲＮＡの混合物を連続的にトランスフェクトする。
【０７５０】
トランスフェクションの７２時間後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出する（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用する。
【０７５１】
ＤＡＮＤ５特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマーは、本明細書に記載の通りに、内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマーで多重化され、リアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって遺伝子発現をその後分析する。ＣＴＣＦアンカー配列に近位のガイドＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３ＬまたはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢのいずれかによる改変の７２時間後にＤＡＮＤ５発現の増加を示すことが予想される。
【０７５２】
ＤＡＮＤ５遺伝子に付随するＣＴＣＦアンカー配列でのまたはその近くでのエピジェネティック改変を標的にするエフェクターは、ＤＡＮＤ５遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証し、非標的化対照と比較してＤＡＮＤ５のｍＲＮＡレベルを増加させる。
【０７５３】
Ｃ）物理的摂動
この実施例は、かさ高いエフェクター分子（この場合、融合タンパク質）を使用して、アンカー配列でのＣＴＣＦ結合を物理的に阻止することによる、ＤＡＮＤ５遺伝子付随ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０７５４】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、２つの異なるｄＣａｓ９融合タンパク質をコードするプラスミドを先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、アンカー配列の周囲に張られたｇＲＮＡ（表１０に掲載される）のうちの１つ、またはアンカー配列の周囲に張られたｇＲＮＡの混合物を連続的にトランスフェクトする。
【０７５５】
トランスフェクションの７２時間後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出する（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用する。
【０７５６】
ＤＡＮＤ５特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマーは、前の実施例に記載の通りに、内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマーで多重化され、遺伝子発現はリアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってその後分析する。ＣＴＣＦアンカー配列に近位のガイドＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３ＬまたはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢのいずれかによる改変の７２時間後にＤＡＮＤ５発現の増加を示すことが予想される。
【０７５７】
非標的化対照ｇＲＮＡおよびタンパク質融合体に対して標的化ｇＲＮＡおよびタンパク質融合体によるアンカー配列における示差的ＣＴＣＦ結合を判定するために、ＣＴＣＦクロマチン免疫沈降−定量的ＰＣＲアッセイ（ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ）を実行する。前の実施例に記載の通りに、ＣＴＣＦ  ＣｈＩＰプロトコールを実行する。フェノール：クロロホルム精製ＤＮＡは、ＣＴＣＦ結合配列領域に隣接する配列特異的プライマー（ＩＤＴ）を使用したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ｑＰＣＲのための鋳型の役目をする。インプットで正規化した増幅の減少は、標的化物理的破壊により低減したＣＴＣＦ結合を示す。
【０７５８】
ＤＡＮＤ５遺伝子に付随するＣＴＣＦアンカー配列でのＣＴＣＦ結合を物理的に破壊するかさ高いエフェクターは、ＤＡＮＤ５遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証し、非標的化対照と比較してＤＡＮＤ５のｍＲＮＡレベルを増加させる。
【０７５９】
（実施例６）
ＳＨＭＴ２遺伝子の発現を低下させるための、遺伝子改変、エピジェネティック改変および物理的摂動によるＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊
本実施例は、３型アンカー配列媒介接続内の遺伝子（この場合、ＳＨＭＴ２）の発現を低下させる様々な戦略を実証する。中でも、本実施例は、例えば、ＣＴＣＦアンカー配列の改変および／または摂動を通したアンカー配列媒介接続の破壊により成功した遺伝子発現のモジュレーションを実証する。
【０７６０】
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ２）は、グリシン合成経路に関与するミトコンドリアタンパク質である。ＳＨＭＴ２は神経膠芽腫のがん細胞において高度に発現され、酸素要求量を低減することによってこれらの細胞に生存利点を付与する。ＳＨＭＴ２は、潜在的腫瘍学標的である可能性がある。
【０７６１】
ＳＨＭＴ２は、ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の中に位置する。この接続の隣接領域の中のヌクレオソームは、抑制クロマチンマークＨ３ＫＫ２７ｍｅ３で特徴付けられる。したがって、この接続は、３型ループの例である。接続のいずれかの末端のＣＴＣＦアンカー配列の破壊は、ＳＨＭＴ２遺伝子への隣接抑制クロマチンマークの拡散を引き起こし、それによってその下方制御を引き起こすことが予想される。
【０７６２】
薬剤の生成：全てのプラスミドおよびガイドＲＮＡは、民間の販売会社から化学的に合成されている。全ての薬剤は、無菌水で復元した。全ての配列は、材料および方法の節において提供される。
【０７６３】
Ａ）遺伝子改変
この実施例は、遺伝子改変によるＳＨＭＴ２遺伝子付随ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０７６４】
【表１１】
2019531763.tif 000014
【０７６５】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、Ｃａｓ９をコードするプラスミド、および非標的化ｇＲＮＡ（「非標的化」、ｇＲＮＡ配列はヒトゲノムに相同性を有しない）、またはＳＨＭＴ２遺伝子を封入する接続のいずれかの末端の推定上のＣＴＣＦアンカー配列もしくはその近くを標的にする、表１１に掲載されるｇＲＮＡのいずれかを連続的にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、Ｃａｓ９をコードするプラスミドを先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、アンカー配列を標的にする化学合成ｇＲＮＡまたは非標的化ｇＲＮＡ（「非標的化」、ｇＲＮＡ配列はヒトゲノムに相同性を有しない）のいずれかを連続的にトランスフェクトした。
【０７６６】
トランスフェクションの７２時間後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用した。
【０７６７】
ＦＡＭ−ＭＧＢおよびＶＩＣ−ＭＧＢ色素をそれぞれ使用して、ＳＨＭＴ２特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマー（アッセイＩＤ  Ｈｓ０１０５９２６３＿ｇ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＰＰＩＢのための内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマー（アッセイＩＤ  Ｈｓ００１６８７１９＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で多重化し、リアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって遺伝子発現をその後分析した。ガイドＲＮＡＳＡＣＲ−００１４９およびＳＡＣＲ−００１５６をトランスフェクトした細胞は、７２時間後に「非標的化」対照と比較してＳＨＭＴ２発現の２４％および１７％の低減をそれぞれ示したが、ＳＡＣＲ−００１５１およびＳＡＣＲ−００１６５をトランスフェクトした細胞はそうしなかった（図１１Ａ）。各生物学的反復は、空のボックス記号によって表される。
【０７６８】
示したｇＲＮＡのトランスフェクションの７２時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳＨＭＴ２遺伝子発現の平均的パーセンテージ変化を、図１１Ａに示す。空のボックスは、各生物学的反復の値を表す。強力なＣＴＣＦアンカー配列が重複するガイドＲＮＡは、ＳＨＭＴ２遺伝子発現の下方制御において効果を示した。
【０７６９】
ＳＨＭＴ２遺伝子の上流（図１１Ｂ）および下流（図１１Ｃ）の可能性があるＣＴＣＦ結合（黒色）の位置を、ｇＲＮＡの位置と一緒に示す。
【０７７０】
ＳＨＭＴ２遺伝子に付随するＣＴＣＦアンカー配列でまたはその近くでＤＮＡを改変する酵素エフェクターは、非標的化対照と比較してＳＨＭＴ２のｍＲＮＡレベルを低下させる、ＤＡＮＤ５遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証した。
【０７７１】
したがって、本実施例は、アンカー配列媒介接続のいずれかの末端でアンカー配列を破壊することによって、遺伝子発現のモジュレーションを達成することができることを実証する。
【０７７２】
Ｂ）エピジェネティック改変
この実施例は、エピジェネティック改変によるＳＨＭＴ２遺伝子付随ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０７７３】
【表１２】
2019531763.tif 000015
【０７７４】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ（転写リプレッサー融合タンパク質）をコードするプラスミドを先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、ＣＴＣＦアンカー配列の周囲に張られた５つのｇＲＮＡ（表１２に掲載される）の２つの異なる混合物（セット１、セット２）を連続的にトランスフェクトした（図１１Ｂおよび１１Ｃ）。
【０７７５】
トランスフェクションの７２時間後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用した。
【０７７６】
ＳＨＭＴ２特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマーは、前の実施例に記載の通りに、内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマーで多重化し、リアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって遺伝子発現をその後分析した。５つのｇＲＮＡの２セットのいずれかをトランスフェクトした細胞は、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢによる抑制の７２時間後にＳＨＭＴ２発現の低減を示した（セット１：１８％、セット２：１３％）（図１１Ｄ）。空のボックスは、各生物学的反復の値を表す。
【０７７７】
示したｇＲＮＡのトランスフェクションの７２時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳＨＭＴ２遺伝子発現の平均的パーセンテージ変化を、図１１Ｄに示す。強力なＣＴＣＦアンカー配列に近位のガイドＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢによる処置の７２時間後にＳＨＭＴ２発現の低下を示した。空のボックスは、各生物学的反復の値を表す。＊＊ｐ＜０．０１
【０７７８】
ＳＨＭＴ２遺伝子に付随するＣＴＣＦアンカー配列でのまたはその近くでのエピジェネティック改変を標的にするエフェクターは、非標的化対照と比較してＳＨＭＴ２のｍＲＮＡレベルを低下させる、ＳＨＭＴ２遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証する。
【０７７９】
Ｃ）物理的摂動
この実施例は、アンカー配列でのＣＴＣＦ結合を物理的に阻止することによるＳＨＭＴ２遺伝子付随ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０７８０】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、２つの異なるｄＣａｓ９融合タンパク質をコードするプラスミドを先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、アンカー配列の周囲に張られたｇＲＮＡ（表１２に掲載される）のうちの１つ、またはアンカー配列の周囲に張られたｇＲＮＡの混合物を連続的にトランスフェクトする。
【０７８１】
トランスフェクションの７２時間後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出する（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用する。
【０７８２】
ＳＨＭＴ２特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマーは、前の実施例に記載の通りに、内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマーで多重化し、遺伝子発現はリアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってその後分析する。ＣＴＣＦアンカー配列に近位のガイドＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢによる処置の７２時間後にＳＨＭＴ２発現の低下を示すことが予想される。
【０７８３】
非標的化対照ｇＲＮＡおよびタンパク質融合体に対して標的化ｇＲＮＡおよびタンパク質融合体によるアンカー配列における示差的ＣＴＣＦ結合を判定するために、ＣＴＣＦクロマチン免疫沈降−定量的ＰＣＲアッセイ（ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ）を実行する。前の実施例に記載の通りに、ＣＴＣＦ  ＣｈＩＰプロトコールを実行する。フェノール：クロロホルム精製ＤＮＡは、ＣＴＣＦ結合配列領域に隣接する配列特異的プライマー（ＩＤＴ）を使用したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ｑＰＣＲのための鋳型の役目をする。インプットで正規化した増幅の減少は、標的化物理的破壊により低減したＣＴＣＦ結合を示す。
【０７８４】
ＳＨＭＴ２遺伝子に付随するＣＴＣＦアンカー配列においてＣＴＣＦ結合を物理的に破壊するかさ高いエフェクターは、ＳＨＭＴ２遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証し、非標的化対照と比較してＳＨＭＴ２のｍＲＮＡレベルを低下させる。
【０７８５】
（実施例７）
ＴＴＣ２１Ｂ遺伝子の発現を増加させるための、遺伝子改変によるＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊
【０７８６】
本実施例は、２型アンカー配列媒介接続（エンハンサーを含有する）の直ぐ外側の遺伝子（この場合、ＴＴＣ２１Ｂ）の発現を増加させる様々な戦略を実証する。中でも、本実施例は、例えば、ＣＴＣＦアンカー配列の改変および／または摂動を通したアンカー配列媒介接続の破壊により成功した遺伝子発現のモジュレーションを実証する。
【０７８７】
テトラトリコペプチド反復配列ドメイン含有タンパク質２１Ｂ（ＴＴＣ２１Ｂ）は、繊毛機能に関与する軸糸タンパク質である。ＴＴＣ２１Ｂの低次形態対立遺伝子は、腎ろうなどのヒト繊毛症と関連付けられ、この遺伝子の上方制御は疾患の重症度を減弱する可能性がある。
【０７８８】
ＴＴＣ２１Ｂは、ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の直ぐ外側に位置する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、ＴＴＣ２１Ｂは発現されず、近隣の接続の中に活性エンハンサーがある。この構成は、２型ループの例である。ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊は、接続の内側のエンハンサーにＴＴＣ２１Ｂの発現を活性化させることが予想される。
【０７８９】
薬剤の生成：全てのプラスミドおよびガイドＲＮＡは、民間の販売会社から化学的に合成されている。全ての薬剤は、無菌水で復元した。全ての配列は、材料および方法の節において提供される。
【０７９０】
Ａ）遺伝子改変
この実施例は、ＴＴＣ２１Ｂ遺伝子発現を増加させる遺伝子改変によるＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０７９１】
【表１３】
2019531763.tif 000016
【０７９２】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、Ｃａｓ９をコードするプラスミドをトランスフェクトし、非標的化ｇＲＮＡ（「非標的化」、ガイドＲＮＡ配列はヒトゲノムに相同性を有しない）、またはＴＴＣ２１Ｂ遺伝子を封入する接続のいずれかの末端の推定上のＣＴＣＦアンカー配列もしくはその近くを標的にする、表１３に掲載されるｇＲＮＡを同時にまたは連続的にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、Ｃａｓ９をコードするプラスミドを先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、アンカー配列を標的にする化学合成ｇＲＮＡまたは非標的化ｇＲＮＡ（「非標的化」、ｇＲＮＡ配列はヒトゲノムに相同性を有しない）のいずれかを連続的にトランスフェクトした。
【０７９３】
トランスフェクションの７２時間後および１４日後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用した。
【０７９４】
ＦＡＭ−ＭＧＢおよびＶＩＣ−ＭＧＢ色素をそれぞれ使用して、ＴＴＣ２１Ｂ特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマー（アッセイＩＤ  Ｈｓ０１０９５１９５＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＰＰＩＢのための内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマー（アッセイＩＤ  Ｈｓ００１６８７１９＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で多重化し、リアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって遺伝子発現をその後分析した。ｇＲＮＡ  ＳＡＣＲ−０００２４をトランスフェクトした細胞は、７２時間後にＴＴＣ２１Ｂ発現を上方制御する傾向を示した（図１２Ａ）。１４日後、ｇＲＮＡ  ＳＡＣＲ−０００２４をトランスフェクトした細胞は、「非標的化」対照と比較してＴＴＣ２１Ｂ発現の２９％の増加を示した（図１２Ｂ）。空のボックスは、各生物学的反復の値を表す。
【０７９５】
ＣＴＣＦアンカー配列でまたはその近くでＤＮＡを改変する酵素エフェクターは、アンカー媒介接続の破壊を実証し、非標的化対照と比較してＴＴＣ２１ＢのｍＲＮＡレベルを増加させた。
【０７９６】
Ｂ）エピジェネティック改変
この実施例は、ＴＴＣ２１Ｂ遺伝子発現を増加させるエピジェネティック改変によるＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０７９７】
ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３Ｌ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼからの活性ドメインを含む融合タンパク質）またはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ（転写リプレッサー融合タンパク質）のいずれかをコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、アンカー配列の周囲に張られたｇＲＮＡ（表１３に掲載される）のうちの１つ、または両ｇＲＮＡの混合物を連続的にトランスフェクトする。
【０７９８】
トランスフェクションの１４日後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出する（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用する。
【０７９９】
ＴＴＣ２１Ｂ特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマーは、本明細書に記載の通りに、内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマーで多重化し、リアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって遺伝子発現をその後分析する。ＣＴＣＦアンカー配列に近位のガイドＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３ＬまたはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢのいずれかによる改変の１４日後にＴＴＣ２１Ｂ発現の増加を示すことが予想される。
【０８００】
ＴＴＣ２１Ｂ遺伝子に近接したＣＴＣＦアンカー配列でのまたはその近くでのエピジェネティック改変を標的にするエフェクターは、遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証し、非標的化対照と比較してＴＴＣ２１ＢのｍＲＮＡレベルを増加させる。
【０８０１】
Ｃ）物理的摂動
この実施例は、アンカー配列でのＣＴＣＦ結合を物理的に阻止することによるＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０８０２】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、２つの異なるｄＣａｓ９融合タンパク質をコードするプラスミドを先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、アンカー配列の周囲に張られたガイドＲＮＡ（表１３に掲載される）のうちの１つ、または両ガイドＲＮＡの混合物を連続的にトランスフェクトする。
【０８０３】
トランスフェクションの１４日後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出する（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用する。
【０８０４】
ＴＴＣ２１Ｂ特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマーは、前の実施例に記載の通りに、内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマーで多重化し、遺伝子発現はリアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってその後分析する。ＣＴＣＦアンカー配列に近位のガイドＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３ＬまたはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢのいずれかによる改変の１４日後にＴＴＣ２１Ｂ発現の増加を示すことが予想される。
【０８０５】
非標的化対照ｇＲＮＡおよびタンパク質融合体に対して標的化ｇＲＮＡおよびタンパク質融合体によるアンカー配列における示差的ＣＴＣＦ結合を判定するために、ＣＴＣＦクロマチン免疫沈降−定量的ＰＣＲアッセイ（ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ）を実行する。前の実施例に記載の通りに、ＣＴＣＦ  ＣｈＩＰプロトコールを実行する。フェノール：クロロホルム精製ＤＮＡは、ＣＴＣＦ結合配列領域に隣接する配列特異的プライマー（ＩＤＴ）を使用したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ｑＰＣＲのための鋳型の役目をする。インプットで正規化した増幅の減少は、標的化物理的破壊により低減したＣＴＣＦ結合を示す。
【０８０６】
ＴＴＣ２１Ｂ遺伝子に近接したＣＴＣＦアンカー配列でのＣＴＣＦ結合を物理的に破壊するかさ高いエフェクターは、アンカー媒介接続の破壊を実証し、非標的化対照と比較してＴＴＣ２１ＢのｍＲＮＡレベルを増加させる。
【０８０７】
（実施例８）
ＣＤＫ６遺伝子の発現を低下させるための、遺伝子改変によるＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊
本実施例は、１型アンカー配列媒介接続内の遺伝子（この場合、ＣＤＫ６）の発現を低下させる様々な戦略を実証する。中でも、本実施例は、例えば、ＣＴＣＦアンカー配列の改変および／または摂動を通したアンカー配列媒介接続の破壊により成功した遺伝子発現のモジュレーションを実証する。
【０８０８】
サイクリン依存性キナーゼ６（ＣＤＫ６）は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）ファミリーのメンバーである。サイクリンは、細胞周期進行の重要な調節因子である。ＣＤＫ６は、細胞周期の中の制限点を制御することによって細胞増殖の調節に関与する。ＣＤＫ６における調節不全は、腫瘍の８０〜９０％において見出されており、ＣＤＫ６活性のモジュレーションががん療法にとって重要である可能性を示唆している。これまでは、ＣＤＫ６特異的小分子阻害剤の開発は、順調でなかった。
【０８０９】
ＣＤＫ６は、ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の中に見出される。この接続は、付随する転写制御配列、すなわちエンハンサーも含み、１型ループの例である。接続のＣＴＣＦアンカー配列の破壊は、ＣＤＫ６の下方制御をもたらすことが予想される。
【０８１０】
薬剤の生成：全てのプラスミドおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、民間の販売会社から化学的に合成されている。全ての薬剤は、無菌水で復元した。全ての配列は、材料および方法の節において提供される。
【０８１１】
Ａ）遺伝子摂動
この実施例は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９テクノロジーを使用した推定上のＣＴＣＦ部位の遺伝的突然変異を通した、ＣＤＫ６遺伝子１型アンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０８１２】
【表１４】
2019531763.tif 000017
【０８１３】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、Ｃａｓ９をコードするプラスミド、および非標的化ｇＲＮＡ（「非標的化」、ガイドＲＮＡ配列はヒトゲノムに相同性を有しない）、またはＣＤＫ６遺伝子に付随する推定上のＣＴＣＦアンカー配列もしくはその近くを標的にする、表１４に掲載されるｇＲＮＡのいずれかを連続的にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、Ｃａｓ９をコードするプラスミドを先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、アンカー配列を標的にする化学合成ｇＲＮＡまたは非標的化ｇＲＮＡ（「非標的化」、ガイドＲＮＡ配列はヒトゲノムに相同性を有しない）のいずれかをトランスフェクトした。
【０８１４】
トランスフェクションの７２時間後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用した。
【０８１５】
ＦＡＭ−ＭＧＢおよびＶＩＣ−ＭＧＢ色素をそれぞれ使用して、ＣＤＫ６特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマー（アッセイＩＤ  Ｈｓ０１０２６３７１＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＰＰＩＢのための内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマー（アッセイＩＤ  Ｈｓ００１６８７１９＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で多重化し、リアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって遺伝子発現をその後分析した。ガイドＲＮＡ  ＳＡＣＲ−０００４６をトランスフェクトした細胞は、「非標的化」対照と比較して７２時間後にＣＤＫ６のｍＲＮＡレベルの約３０％の低下を示した（図１３）。各生物学的反復は、空のボックス記号によって表される。
【０８１６】
ＣＤＫ６遺伝子に付随するＣＴＣＦアンカー配列でまたはその近くでＤＮＡを改変する酵素エフェクターは、ＣＤＫ６遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証し、非標的化対照と比較してＣＤＫ６のｍＲＮＡレベルを低下させる。
【０８１７】
Ｂ）エピジェネティック改変
この実施例は、エピジェネティック改変によるＣＤＫ６遺伝子付随ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０８１８】
ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３Ｌ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼからの活性ドメインを含む融合タンパク質）またはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ（転写リプレッサー融合タンパク質）のいずれかをコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、アンカー配列の周囲に張られたｇＲＮＡ（表１４に掲載される）のうちの１つ、またはアンカー配列の周囲に張られたｇＲＮＡの混合物を連続的にトランスフェクトする。
【０８１９】
トランスフェクションの７２時間後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出する（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用する。
【０８２０】
ＣＤＫ６特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマーは、本明細書に記載の通りに、内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマーで多重化し、リアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって遺伝子発現をその後分析する。ＣＴＣＦアンカー配列に近位のガイドＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３ＬまたはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢのいずれかによる改変の７２時間後にＣＤＫ６発現の減少を示すことが予想される。
【０８２１】
ＣＤＫ６遺伝子に付随するＣＴＣＦアンカー配列でのまたはその近くでのエピジェネティック改変を標的にするエフェクターは、非標的化対照と比較してＣＤＫ６のｍＲＮＡレベルを低下させる、ＣＤＫ６遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証する。
【０８２２】
Ｃ）物理的摂動
この実施例は、アンカー配列でのＣＴＣＦ結合を物理的に阻止することによるＣＤＫ６遺伝子付随ＣＴＣＦアンカー配列媒介接続の破壊を実証する。
【０８２３】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には、２つの異なるｄＣａｓ９融合タンパク質をコードするプラスミドを先ずトランスフェクトし、それから８時間後に、アンカー配列の周囲に張られたｇＲＮＡ（表１４に掲載される）のうちの１つ、またはアンカー配列の周囲に張られたｇＲＮＡの混合物を連続的にトランスフェクトする。
【０８２４】
トランスフェクションの７２時間後に、市販試薬およびプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のために細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出する（Ｑｉａｇｅｎ）。生じるｃＤＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために使用する。
【０８２５】
ＣＤＫ６特異的定量的ＰＣＲプローブ／プライマーは、前の実施例に記載の通りに、内部対照定量的ＰＣＲプローブ／プライマーで多重化し、リアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって遺伝子発現をその後分析する。ＣＴＣＦアンカー配列に近位のガイドＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３Ａ−３ＬまたはｄＣａｓ９−ＫＲＡＢのいずれかによる改変の７２時間後にＣＤＫ６発現の減少を示すことが予想される。
【０８２６】
非標的化対照ｇＲＮＡおよびタンパク質融合体に対して標的化ｇＲＮＡおよびタンパク質融合体によるアンカー配列における示差的ＣＴＣＦ結合を判定するために、ＣＴＣＦクロマチン免疫沈降−定量的ＰＣＲアッセイ（ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ）を実行する。前の実施例に記載の通りに、ＣＴＣＦ  ＣｈＩＰプロトコールを実行する。フェノール：クロロホルム精製ＤＮＡは、ＣＴＣＦ結合配列領域に隣接する配列特異的プライマー（ＩＤＴ）を使用したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ｑＰＣＲのための鋳型の役目をする。インプットで正規化した増幅の減少は、標的化物理的破壊により低減したＣＴＣＦ結合を示す。
【０８２７】
ＣＤＫ６遺伝子に付随するＣＴＣＦアンカー配列でのＣＴＣＦ結合を物理的に破壊するかさ高いエフェクターは、非標的化対照と比較してＣＤＫ６のｍＲＮＡレベルを低下させる、ＣＤＫ６遺伝子アンカー媒介接続の破壊を実証する。
【０８２８】
（実施例９）
アンカー配列媒介接続におけるＣＴＣＦ結合のエピジェネティック破壊
本実施例は、アンカー配列媒介接続においてＣＴＣＦ結合をエピジェネティックに破壊するために、開示される方法および薬剤を組み込む様々な治療戦略を実証する。
【０８２９】
Ａ）筋ジストロフィーの処置のための特異的ＣＴＣＦ結合モチーフの脱メチル化
シュタイナート病としても公知の１型筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１）は、重度の先天型およびより軽度の小児期発症型、ならびに成人発症型を有する。ＤＭ１に結び付けられる遺伝子はｄｍｐｋであり、その遺伝子産物は、ＭＲＣＫ  ｐ２１活性化キナーゼおよびＲｈｏファミリーのキナーゼに相同性のＳｅｒ／Ｔｈｒプロテインキナーゼである。この遺伝子の３’非翻訳領域は、５〜３７コピーのＣＴＧトリヌクレオチド反復配列を含有する。この不安定なモチーフの５０〜５，０００コピーへの増大は筋強直性ジストロフィーＩ型を引き起こし、それは、反復配列エレメントのコピー数の増加に伴って重症度が増加する。反復配列の増大は、この領域における遺伝子の発現を混乱させる局所のクロマチン構造の圧縮と関連する。健康なヒト細胞はｄｍｐｋ反復配列領域に隣接しているＣＴＣＦ部位に結合しているＣＴＣＦに富むが、ＤＭ１患者からの細胞はＣＴＣＦ結合を欠いている（Choら、Antisense Transcription and ShortArticle Heterochromatin at the DM1 CTG Repeats Are Constrained by CTCF.Molecular Cell、第２０巻、４８３〜４８９頁（２００５年））。
【０８３０】
この実施例では、ｄＣａｓ９−ＴＥＴ１融合構築物（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｄＣａｓ９を使用する）は、ＤＭ１遺伝子座の反復配列に隣接する特異的ＣＴＣＦ部位を標的にするように、ｓｇＲＮＡで設計する。構築物はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）系にパッケージされ、シュタイナート病の対象に全身（ＩＶ）投与される。投与の１週後に、部位特異的ＤＮＡメチル化レベルを対象で測定する：ゲノムＤＮＡ試料を対象からとり、重亜硫酸分析によって分析する（Pattersonら、DNA Methylation: BisulphiteModification and Analysis. J Vis Exp.２０１１年；（５６巻）：３１７０頁）。さらに、遺伝子座からのアンチセンスおよびセンス転写物の転写について試料を分析する。
【０８３１】
Ｂ）２型アンカー配列媒介接続をモジュレートするためのＣＴＣＦ相互作用の破壊による幼年期の重度のミオクローヌスてんかんをモデル化した細胞株におけるナトリウム電流の回復
脳における電位作動型Ｎａ＋チャネルは、３３から３６ｋＤａの補助βサブユニット（ｂ１〜ｂ４）と会合した２６０ｋＤａのαサブユニットの複合体である。αサブユニットは、それぞれは６つのα螺旋膜貫通セグメント（Ｓ１〜Ｓ６）およびＳ５とＳ６を接続する孔ループを有する４つの内部反復ドメイン（Ｉ〜ＩＶ）に電圧センサーおよびイオン伝導孔を含む。会合したβサブユニットは、ゲーティングのカイネティクスおよび電圧依存を改変し、これらのサブユニットは、細胞外マトリックス、他の細胞接着分子および細胞骨格と相互作用する細胞接着分子である。Ｉ型ナトリウムチャネルＮａＶ１．１は、哺乳動物における電位作動型ナトリウムチャネルファミリーのプロトタイプである。ＮａＶ１．１は、ニューロン細胞体に特異的に局在する。ＮａＶ１．１チャネルのレベルは出産後の第２週において急速に増加するので、ＮａＶ１．３は胎児および新生児の発生の間、ニューロンの細胞体において豊富であるが、成体齧歯動物では低下する。
【０８３２】
電位作動型ナトリウムチャネルは活動電位の開始および伝播において重要な役割を有し、ニューロン興奮性の重要な調節因子である。ＮａＶ１．１チャネル遺伝子ＳＣＮ１Ａの突然変異は、遺伝子的に異なるてんかん症候群を引き起こす。幼年期における重度のミオクローヌスてんかん（ＳＭＥＩ）は、ＮａＶ１．１チャネルのハプロ不全性につながる、ＳＣＮ１Ａ遺伝子における新規の機能喪失突然変異と関連付けられている。この稀なけいれん性障害は生後１年目に始まり、発熱をしばしば伴う発作を伴い、長期にわたるクラスター化または連続的発作に、およびてんかん重積状態に進行する。生後２年目の後、患者は精神運動の遅延、運動失調および認知障害を起こす。彼らは、抗てんかん薬療法が無効のために、好ましからぬ長期転帰を有する。
【０８３３】
ＳＣＮ１Ａ遺伝子はＣＴＣＦ結合ループの中の第２染色体に位置するが、上流アンカーは１６６，８００，０００〜１６６，８５０，０００（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９アセンブリー、下記を参照する）の中にあり、これは上流のエンハンシング配列からそれを分離する。ＣＴＣＦと座標１６６，８００，０００〜１６６，８５０，０００の上のそのアンカー部位の間の相互作用の破壊は、上流のエンハンシング配列がＳＣＮ１Ａと相互作用してその転写を上方制御することを可能にする。
【０８３４】
ＣＴＣＦと座標１６６，８００，０００〜１６６，８５０，０００の上のそのアンカー部位の間の相互作用を破壊するために、アンカー部位を標的化ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３ａによってメチル化する。ＭＣＦ７細胞およびＫ５６２では、第２染色体の中のＳＣＮ１ａ遺伝子の上流のＣＴＣＦは座標１６６８１０５４９〜１６６８１０９３９の中に位置し、下流のＣＴＣＦ部位は座標１６６９８１１７５〜１６６９９０１７９に位置する。
【０８３５】
ｐｃＤＮＡ３−ｈＤＮＭＴ３Ａ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：３５５２１）からのＰＣＲ増幅Ｄｎｍｔ３ａを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位を有する改変されたｐｄＣａｓ９プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：４４２４６）にクローニングする。ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｄｎｍｔ３ａをＰＣＲ増幅し、レンチウイルスをパッケージするためにＡｓｃＩおよびＥｃｏＲＩでＦＵＷベクター（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：１４８８２）にクローニングする。アニールされたオリゴを、ＡａｒＩ部位を有する改変されたｐｇＲＮＡプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：４４２４８）に挿入することによって、ｇＲＮＡ発現プラスミドをクローニングする。全ての構築物は、トランスフェクションの前に配列決定する。標準のパッケージングベクター（ｐＣＭＶ−ｄＲ８．７４およびｐＣＭＶ−ＶＳＶＧ）と一緒にＦＵＷ構築物またはｐｇＲＮＡ構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、続いて超遠心分離に基づく濃縮によって、ｄＣａｓ９−Ｄｎｍｔ３ａおよびｇＲＮＡを発現するレンチウイルスを生成する。ウイルス力価（Ｔ）は、２９３Ｔ細胞の感染効率に基づいて計算され、ここで、Ｔ＝（Ｐ＊Ｎ）／（Ｖ）、Ｔ＝力価（ＴＵ／μｌ）、ｐ＝蛍光マーカーによる感染陽性細胞の％、Ｎ＝形質導入時点の細胞数、Ｖ＝使用したウイルスの総体積。この実験のために、ＳＣＮ１ａ細胞株を使用する。
【０８３６】
簡潔には、細胞をウイルス感染のために培養する。この研究では、感染の３日後に細胞を分析する。
【０８３７】
ナトリウム電流は、電気生理学的記録によって測定する。電圧または電流固定構成においてＰＣＬＡＭＰ  ６ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）と一緒にＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、全細胞パッチクランプ記録を室温で実行する。電圧固定実験のために、細胞キャパシタンス（Ｃｍ）をＣｍ  １／４  Ｑ／Ｖから計算し、ここで、Ｑは、−７０ｍＶの保持電位からの過分極化１０ｍＶ電圧ステップ（Ｖ）によって呼び起こされる容量性電流を積分することによって測定される電荷である。他の記録のために、容量性電流は増幅器回路を使用して最小にする。７０％予測および９０％直列抵抗補償が通常使用される。残存一次容量および漏れ電流は、Ｐ／４減算によって消去される。
【０８３８】
細胞内溶液は、１７７ｍＭのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのホスホクレアチン−トリス、２ｍＭのＡＴＰ−トリス、０．２ｍＭのＮａ２ＧＴＰおよび０．１ｍＭのロイペプチンを含有し、Ｈ２ＳＯ４でｐＨ７．２に調整される。
【０８３９】
ピークＮａ＋電流の記録のための細胞外溶液は、２０ｍＭのＮａＣｌ、１１６ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＢａＣｌ２、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５５ｍＭのＣｓＣｌ２、１ｍＭのＣｄＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２および２０ｍＭの塩化テトラエチルアンモニウムを含有し、ＮａＯＨでｐＨ７．３５に調整される。
【０８４０】
コンダクタンス−電圧（ｇ−Ｖ）関係（活性化曲線）はｇ  １／４  ＩＮａ／（Ｖ−ＥＮａ）によって計算され、ここで、ＩＮａは電位Ｖで測定したピークＮａ＋電流であり、ＥＮａは計算された平衡電位である。正規化された活性化および不活性化曲線は、ｙ  １／４  １／（１＋ｅｘｐ［（Ｖ−Ｖ１／２）／ｋ］）＋Ａの形のボルツマン関係にあてはめられ、ここで、ｙは正規化されたｇＮａまたはＩＮａであり、Ａはベースラインのコンダクタンスまたは電流であり、Ｖは膜電位であり、Ｖ１／２は最大半減活性化（Ｖａ）または不活性化（Ｖｈ）の電圧であり、ｋは勾配係数である。活性化曲線のあてはめでは、Ａは０に固定される。Ｏｒｉｇｉｎ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）およびｐＣｌａｍｐ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して分析を実行する。
【０８４１】
電流固定実験のために、細胞を−８０ｍＶに保持し、持続性脱分極または過分極に応答したそれらのファイアリングパターンを記録する（期間、８００ミリ秒；増分、±１０ｐＡ）。入出力関係；活動電位閾値、半値幅、幅およびピーク、最小電圧；ならびに細胞のインプット抵抗を測定する。入出力関係は、電流注入の振幅への生成される活動電位の数の依存と規定される。脱分極プロトコールの間に、第１の活動電位のために閾値を活動電位波形の三次微分のピークに対応する電圧として測定する。活動電位の半値幅および幅は、それぞれ半値高さおよび閾値で測定する。入力抵抗は、一連の過分極化パルスのためのＩ−Ｖプロットの線形回帰の勾配として判定され、ここで、Ｉは電流振幅であり、Ｖは定常状態の電圧である。
【０８４２】
良好な介入は、過分極の後にナトリウム電流を増加させる。
【０８４３】
（実施例１０）
ＣＴＣＦとそのＤＮＡアンカー配列の間の物理的干渉
【０８４４】
本実施例は、アンカー配列媒介接続においてＣＴＣＦ結合を破壊するために、開示される方法および薬剤を組み込む様々な治療戦略を実証する。
【０８４５】
Ａ）物理的干渉によるｍｉＲ２９０アンカー配列媒介接続の破壊
【０８４６】
ポリペプチドベータ：ＰＦＤＩＬＹＱ−ＧＧ−ＲＧＱＧＤＣ（配列番号３）、およびｄＣａｓ９−ＴＥＴ１融合、Xuら、Cell Discovery、２０１５年、２巻）：１６００９頁；doi:10.1038/celldisc.2016.9に記載される。
【０８４７】
実験計画：
Ｓｙｍｐｈｏｎｙペプチドシンセサイザー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）でＦｍｏｃ固相合成化学を使用してペプチドを合成する。Ｆｍｏｃ基（Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル）を２０％ピペリジンによって除去し、０．４Ｍの４−メチルモルホリンを含有するＤＭＦ中の０．１ＭのＨＢＴＵを使用して、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を６０分間カップリングする。樹脂に結合したペプチドを脱保護し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用して樹脂から切断する。ＴＦＡ溶液からペプチドを沈殿させるために、エチルエーテルを加える。沈殿したペプチドは、次に凍結乾燥する。
【０８４８】
ＢｉｏＣａｄ  Ｓｐｒｉｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、逆相Ｖｙｄａｃ  ２１８ＴＰ１０１０  Ｃ１８カラム（Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）の上で未精製のペプチドを精製する。溶媒Ａ（脱イオン水に０．１％ＴＦＡ）および溶媒Ｂ（アセトニトリルに０．１％ＴＦＡ）による１０ｍＬ／分の流速を使用する。５％の溶媒Ｂでカラムを平衡させる。試料添加の後、５％の溶媒Ｂから１００％の溶媒Ｂまでの直線濃度勾配でカラムを６０分で溶出させる。マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）によって、純粋なペプチド分画を同定する。正しいアミノ酸配列と相関する質量ピークが観察される。
【０８４９】
クリック化学反応によって、ポリペプチドベータをｄＣａｓ９−ＴＥＴ１（Xuら、Cell Discovery、２０１５年、２巻）：１６００９頁；doi:10.1038/celldisc.2016.9）に連結する。
【０８５０】
クリック反応の準備のために、ポリペプチドをＤＢＣＯ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）で標識する。水または無水ＤＭＳＯに６０μＬにつき５．２ｍｇの濃度で、ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステルを溶解する。炭酸ナトリウム／重炭酸コンジュゲーション緩衝剤ｐＨ＝約９の中でアミノ改変ポリペプチドをコンジュゲートするために、この保存溶液を使用する。
【０８５１】
ポリペプチド０．２μｍｏｌの合成のために、ポリペプチドをコンジュゲーション緩衝剤５００μＬに溶解する。概ね６倍過剰（６μＬ）のＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル溶液を、溶解したポリペプチドに加える。混合物を撹拌し、２〜４時間から約一晩まで、室温でインキュベートする。塩および有機物を除去するために、脱塩カラム（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）の上でコンジュゲートポリペプチドを脱塩する。
【０８５２】
ｄＣａｓ９−ＴＥＴ１融合をコンジュゲーション緩衝剤５００μＬに再懸濁させる。概ね６倍過剰（６μＬ）のアジド溶液を、ｄＣａｓ９−ＴＥＴ１融合に加える。混合物を撹拌し、２〜４時間から約一晩まで、室温でインキュベートする。塩および有機物を除去するために、脱塩カラム（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）の上でコンジュゲート融合を脱塩する。
【０８５３】
クリック反応のために、１ｍｇのアジド融合をＤＭＳＯ  １５０μＬに溶解する。アジド融合を水１００μＬ中の１０ＯＤのＤＢＣＯコンジュゲートポリペプチドに加える。混合物を室温で一晩インキュベートする。塩および有機物を除去するために、脱塩カラム（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）の上でライゲーションした融合およびポリペプチドを脱塩する。
【０８５４】
この実施例は、遺伝子のＣｐＧジヌクレオチドを標的にするポリペプチドとの遺伝子発現の物理的干渉を実証する。
【０８５５】
遺伝子調節エレメントおよびそれらの標的遺伝子は、アンカー配列媒介接続、ＣＴＣＦタンパク質によって結合した２つのＤＮＡ部位の相互作用によって形成され、コヒーシン複合体によって占有される染色体ループ構造、の中に一般的に存在する。特異的エンハンシング配列−遺伝子相互作用のためのアンカー配列媒介接続は、正常な遺伝子活性化および抑制両方のために必須であり、発生を通してほとんど保存されている染色体足場を形成する。標的化の方法で遺伝子転写を変更するために、アンカー配列媒介接続を遺伝子的およびエピジェネティックに混乱させる。ＣＴＣＦ結合モチーフ（ＣＣＧＣＧＮＧＧＮＧＧＣＡＧ、配列番号４）の上のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化（ループ破壊）および脱メチル化（ループ形成を促進する）によって、ならびに前記の配列のゲノム編集によってこれは達成される。代わりに、ＣＴＣＦ−アンカー配列相互作用との物理的干渉によってループを破壊する。
【０８５６】
治療設計：
マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）において、超エンハンシング配列を有する、活性化極性があるループであるｍｉＲ２９０ループのＣＴＣＦアンカー配列を標的にすることによって、このアプローチは実験的に試験される。ｄＣａｓ９−ＴＥＴ１とのポリペプチドベータ融合は、ＣＴＣＦのルーピング機能に物理的に干渉する（ポリペプチド主鎖およびポリヌクレオチド配列によって媒介される）ために２つのＣＴＣＦ部位に結合する配列特異的ポリヌクレオチドを含む。図１４を参照する。
【０８５７】
実験計画：
この実験系では、マウス胚性幹細胞は、標準のＥＳＣ培地：１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０μｇの組換え白血病抑制因子（ＬＩＦ）、０．１ｍＭのｂ−ｍｅｒ−カプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭのＬ−グルタミンおよび１％非必須アミノ酸（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を追加した（５００ｍｌ）ＤＭＥＭにより、照射されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）で培養し、それらの増殖培地の中のポリペプチドに曝露させる。２、４、６時間の曝露の後、ｍＲＮＡを細胞から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによって転写物の数について分析する：製造業者の使用説明書に従ってＴｒｉｚｏｌおよび続いてＤｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、細胞を収集する。第１鎖ｃＤＮＡ合成（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ）を使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で定量的ＰＣＲ反応を調製し、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  ＡＢＩ機器で実行する。
【０８５８】
良好な干渉は、ｍｉＲ２９０ループの中に位置する遺伝子またはＡＵ０１８０９１およびＭｙａｄｍを含む他の近隣ループの中の遺伝子の発現に影響することなく、この超エンハンシング配列含有アンカー配列媒介接続の外側および標的化ＣＴＣＦ部位の隣にある、Ｎｌｒｐ１２遺伝子の上昇を引き起こす。
【０８５９】
Ｂ）物理的干渉によるＥＬＡＮＥ転写の核抑制
この実施例は、クリック化学反応によって複数のポリペプチドベータをライゲーションすることを実証する。
【０８６０】
クリック化学反応は、ヘテロ原子リンク（Ｃ−Ｘ−Ｃ）を通して小さい単位を連結することによる、化合物の迅速な生成を含む。クリック化学反応の主要な目的は、小規模および大規模な適用のために有益である、強力で、選択的でモジュール式のブロックのセットを開発することである。これらのクリック反応は生物直交性である、すなわち、それらは生来の生化学的プロセスに干渉することなく生物体の中に存在することができる。安定したトリアゾールを形成する、アジドリンカーとのジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）リンカーの反応。このクリック反応は室温で非常に速く、細胞傷害性Ｃｕ（Ｉ）触媒を必要とせず、安定したトリアゾールを形成する。この特異な共有結合は、１つの型の生体分子に組み込まれるＤＢＣＯが、第２の生体分子に組み込まれるアジドリンカーと反応するときに形成される。ＤＢＣＯの歪みによって促進される、または無Ｃｕ（Ｉ）［２＋３］環化付加戦略は、歪みのあるジベンジルシクロオクチンの使用に依存する。それらの使用は環化付加クリック反応のための活性化エネルギーを低下させるので、Ｃｕ（Ｉ）によって触媒されるライゲーションのそれより高い効率で、低温での触媒の必要性なしでそれを実行することを可能にする。
【０８６１】
ポリペプチドベータはジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）改変で改変され、別のポリペプチドベータはアジド改変で改変される。
【０８６２】
実験計画：
クリック反応では、無水ＤＭＳＯ（Ａｃｒｏｓ、Ｇｅｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）に、スクシンイミジルエステル（５／６−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルおよびスクシンイミジル−２−（ビオチンアミド）エチル−１，３−ジチオプロピオネート、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）を溶解する。０．０５％ドデシルマルトシドを含有する２０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝剤ｐＨ７．２の中で、一級アミン標識を４℃で１時間実行する。
【０８６３】
マレイミド、ジベンジルシクロオクチン−ＰＥＧ４−マレイミドおよびアジド−ＰＥＧ３−マレイミド（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、無水ＤＭＳＯに溶解する。０．０５％ドデシルマルトシドを含有する２０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝剤ｐＨ７．２の中で、スルフヒドリル標識を２５℃で２時間実行する。クリック化学反応による無銅カップリングを、同じ緩衝剤の中で４℃で１０時間実行する。
【０８６４】
５／６−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルおよびマレイミドとの反応の後、製造業者の使用説明書に従って、スピンカラム（Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏｓｐｉｎ  ＴＭ６カラム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）を使用して未反応標識から標識タンパク質を分離する。
【０８６５】
カップリングの後の反応生成物を、ＨＰＬＣによって分析する。０．０５％ドデシルマルトシドを含有する２０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝剤ｐＨ７．２により０．５ｍｌ／分の流速で溶出する分析カラム（３００ｍｍ×４．６０ｍｍ）を備えているクロマトグラフィー系の上で２０〜４０μｌの試料を注射、分離し、その後２８０ｎｍでの吸光が続く。ピークの吸収スペクトルは、積算スペクトル検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｇ１３１５Ｄダイオードアレイ検出器）から得られる。
【０８６６】
この実施例は、ＥＬＡＮＥ遺伝子に付随するアンカー配列を標的にするポリペプチドによる遺伝子発現の阻害を実証する。
【０８６７】
ＥＬＡＮＥ関連の好中球減少には重度の先天性好中球減少（ＳＣＮ）および周期性好中球減少があり、この両方は、再発性の発熱、皮膚および口咽頭炎症（すなわち、口潰瘍、歯肉炎、副鼻腔炎および咽頭炎）ならびに頸部のアデノパシーによって特徴付けられる原発性の血液学的障害である。感染性の合併症は、周期性好中球減少におけるより先天性好中球減少において一般的により重度であり、無処置の場合は死につながる可能性がある。ＳＣＮのほとんどの症例は、好中球数を増加させ、感染症の重症度および頻度を低下させる顆粒細胞コロニー刺激因子による処置に応答する。しかし、顆粒細胞コロニー刺激因子処置の１５年後に、脊髄形成異常（ＭＤＳ）または急性の骨髄性白血病ＡＭＬを発症するリスクは、概ね１５％〜２５％である。
【０８６８】
好中球エラスターゼ遺伝子ＥＬＡＮＥにおける突然変異は、重度の先天性好中球減少ならびに周期性好中球減少の最も一般的な原因である。ＥＬＡＮＥは１９ｐ１３．３１にマッピングされ、ＥＬＡＮＥ遺伝子の突然変異はＳＣＮの個体の概ね３５〜８４％で同定される。ＥＬＡＮＥの突然変異に続発性のＳＣＮおよび周期性好中球減少は、常染色体優性の状態として遺伝する。ＥＬＡＮＥは５つのエクソンからなり、好中球エラスターゼ（ＮＥ）として公知の２１８アミノ酸タンパク質をコードする。ＮＥはセリンプロテアーゼのクラスに属し、成熟した骨髄単球性細胞およびそれらの専門の未熟な前駆体（前骨髄球および前単球）において排他的に発現される。アズール顆粒の中で活性プロテアーゼとして保存されているＮＥは、炎症性刺激への好中球の曝露により放出される。細胞外環境では、ＮＥは細胞外マトリックスタンパク質を切断し、セリンプロテアーゼインヒビターはそのプロテイナーゼ活性に拮抗する。
【０８６９】
治療設計：
この実施例では、表現型は、好中球前駆体中のＥＬＡＮＥ遺伝子の転写を抑制することによって元に戻される。それを達成するために、多量体化されたポリペプチドベータをＥＬＡＮＥ遺伝子に付随するアンカー配列に相補性の核酸配列（例えば、ｃａａｃｇｇｃｃｇｇｇｃｃａａｇｇｃｔｇｔｃｇｃａａｇａａｃ、配列番号５）、図１５を参照、にハイブリダイズし、骨髄性単球、前骨髄球および前単球に送達する。ポリペプチド−オリゴヌクレオチドは細胞膜および核膜を通過して、その標的アンカー配列にハイブリダイズし、それによって、ＥＬＡＮＥ遺伝子を有するアンカー配列媒介接続を破壊し、ポリペプチド−オリゴヌクレオチドハイブリッドはアンカー配列媒介接続に物理的に干渉し、したがって、ＥＬＡＮＥの発現を低下させる。
【０８７０】
実験計画：
このアプローチは、ＳＣＮ患者に由来するｉＰＳＣにおいて試験される。ＥＬＡＮＥ突然変異の遺伝子補正が顆粒球形成の分化を回復するかどうか判定するために、ＥＬＡＮＥ  ＯＲＦを補う核酸配列またはスクランブルされた配列を含有するポリペプチドにＳＣＮ  ｉＰＳＣを曝露させ、このポリペプチドの組込みについて選択する。０．５％Ｎ２補助剤、ビタミンＡなしの１％Ｂ２７補助剤、０．５％ヒト血清アルブミン、１００μＭのモノチオグリセロール、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、１００ｎｇ／ｍｌの組換えＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３および１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含有する骨髄増殖培地（３：１の比のＩＭＤＭ＋ハムのＦ１２）での１０日間の培養までに、ｉＰＳＣはＣＤ４５＋ＣＤ３４＋造血前駆体に分化する。０．５％Ｎ２補助剤、ビタミンＡなしの１％Ｂ２７補助剤、０．５％ヒト血清アルブミン、１００μＭのモノチオグリセロール、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸および５０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎフィルグラスチム）を含有する顆粒球形成培養条件（３：１の比のＩＭＤＭ＋ハムのＦ１２）を使用して、培養をさらに５日間分化させる。顆粒球形成分化段階で、低い（５０ｎｇ／ｍｌ）または高い（１，０００ｎｇ／ｍｌ）Ｇ−ＣＳＦ用量で細胞を培養する。骨髄増殖および顆粒球形成の分化の間、２３０ｎＭ（ＮＥのＩＣ５０の約５倍）の濃度のシベレスタット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下または非存在下において細胞を培養する。顆粒球形成の分化の終わりに、細胞をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅスライド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の上へサイトスピンする。細胞をライト−ギムザ染色し、直立型顕微鏡（Ｍｏｔｉｃ  ＢＡ３１０）を使用して、骨髄性細胞型（前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、バンド、好中球および単球）について次にスコア評価する。前骨髄球を選別するために、骨髄増殖の終わりの細胞を、ＣＤ４５−パシフィックブルー、ＣＤ３４−ＰＥＣｙ７、ＣＤ３３−ＡＰＣ、ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣＣｙ７（カタログ５５７７５４、クローンＩＣＲＦ４４、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣＤ１５−ＦＩＴＣ（カタログ５６２３７０、クローンＷ６Ｄ３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のために染色する。前骨髄球／骨髄球集団（ＣＤ４５＋／ＣＤ３４−／ＣＤ３３＋／ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ１５ｄｉｍと規定される）を、ＦＡＣＳによって選択する。
【０８７１】
ＥＬＡＮＥの発現は、ＰＣＲによって定量的に測定され、未処置の細胞より大きいと判定される。
【０８７２】
（実施例１１）
新規アンカー配列媒介接続の生成
Ａ）外因性非メチル化ポリヌクレオチド−ポリペプチドエフェクターとのメチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーションによる新規アンカー配列媒介接続の生成
この実施例は、対立遺伝子特異的アンカー配列媒介接続を形成するための、遺伝子発現のモジュレーションを実証する。
【０８７３】
遺伝子調節エレメントおよびそれらの標的遺伝子は、アンカー配列媒介接続、ＣＴＣＦタンパク質によって結合した２つのＤＮＡ部位の相互作用によって形成され、コヒーシン複合体によって占有される染色体ループ構造、の中に一般的に存在する。アンカー配列媒介接続は特異的エンハンシング配列−遺伝子相互作用を可能にし、正常な遺伝子活性化および抑制両方のために必須であり、発生を通してほとんど保存されている染色体足場を形成する。標的化の方法で遺伝子転写を変更するために、アンカー配列媒介接続を遺伝子的およびエピジェネティックに混乱させる。ＣＴＣＦ結合モチーフ（ＣＣＧＣＧＮＧＧＮＧＧＣＡＧ、配列番号４）の上のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化（ループ破壊）および脱メチル化（ループ形成を促進する）によって、ならびに前記の配列のゲノム編集によってこれは達成される。代わりに、ループは特異的ＤＮＡ鎖の標的化、外因性送達によって生成され、ＣＴＣＦのためのアンカー配列の役目をする。
【０８７４】
Ｈ１９−ＩＧＦ２遺伝子座は、起点親特異的ループ立体配座を示す：母方の対立遺伝子の上のアンカー配列媒介接続は、Ｈ１９遺伝子を活性化するが、アンカー配列媒介接続から排除されるＩＧＦ２遺伝子を活性化しない、エンハンシング配列−プロモーター相互作用を可能にする。より大きなアンカー配列媒介接続が父方の対立遺伝子の上で形成され、ＩＧＦ２遺伝子を活性化するエンハンシング配列−プロモーター相互作用を可能にする。Ｈ１９プロモーター領域の中のＣＴＣＦ部位の父方の対立遺伝子特異的ＤＮＡメチル化はＣＴＣＦ結合を抑止し、したがって、Ｈ１９発現を低下させる示差的ＣＴＣＦ−ＣＴＣＦループ形成を引き起こす。これらの対立遺伝子特異的アンカー配列媒介接続を失う個体は、ベックウィズ−ヴィーデマン症候群（両対立遺伝子が父方の型のアンカー配列媒介接続を有するとき）またはシルバー−ラッセル症候群（両対立遺伝子が母方の型のアンカー配列媒介接続を有するとき）を起こす。
【０８７５】
治療設計：
１つのポリペプチドベータは、Ｈ１９−ＩＧＦ２遺伝子座のＣＴＣＦアンカー配列を標的にする特異性を有する二本鎖の非メチル化ＣＴＣＦアンカー配列を含有するように設計される。図１６を参照する。本明細書に記載されているポリペプチドは、父方の対立遺伝子の１つの上で非メチル化ＣＴＣＦ結合モチーフを模倣し、単為生殖二染色体性によって引き起こされるベックウィズ−ヴィーデマン症候群患者からの細胞において母方の型のループを形成する。
【０８７６】
実験計画：
この実験では、ベックウィズ−ヴィーデマン患者に由来する皮膚線維芽細胞を、標準の一次線維芽細胞培地：１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．１ｍＭのｂ−ｍｅｒ−カプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭのＬ−グルタミンおよび１％非必須アミノ酸（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を追加した（５００ｍｌ）ＤＭＥＭに平板培養し、それらの増殖培地の中のポリペプチドに曝露させる。２、４、６時間の曝露の後、ｍＲＮＡを細胞から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによって転写物の数について分析する：製造業者の使用説明書に従ってＴｒｉｚｏｌおよび続いてＤｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、細胞を収集する。第１鎖ｃＤＮＡ合成（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ）を使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で定量的ＰＣＲ反応を調製し、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  ＡＢＩ機器で実行する。
【０８７７】
良好な人為操作は、父方の対立遺伝子において通常抑制されているＨ１９遺伝子発現の上昇を引き起こす。
【０８７８】
Ｂ）新規アンカー配列媒介接続を形成することによる脆弱Ｘ症候群の処置
【０８７９】
脆弱Ｘは、遺伝性知的障害の主因である。それは、Ｘ染色体の上のＦＭＲ１遺伝子の中のＣＧＧ反復配列の増幅によって引き起こされる。増幅は、反復配列ならびに近隣配列の中のＣｐＧジヌクレオチドのＤＮＡメチル化、および遺伝子の発現の以降の減少を引き起こす。ＦＭＲ１遺伝子の転写抑制が、疾患の病理特徴の原因であると考えられている。
【０８８０】
この実施例では、ＦＭＲ１遺伝子は、エンハンシング配列を含むアンカー配列媒介接続にそれを動かすことによって活性化される。そのようなアンカー配列媒介接続を同定するために、ＣＴＣＦ結合ＤＮＡエレメントがゲノムの上にマッピングされる、ＣｈＩＡ−ＰＥＴ分析を先ず実行する。Ｈ３Ｋ２７のアセチル化およびＤＮＡｓｅＩ過敏性分析によって規定される通り、このデータはエンハンシング配列のゲノムワイド分析と次にオーバーレイされる（Kundajeら、２０１５年）。最も近く、最も強力なエンハンシング配列をＦＭＲ１遺伝子の直ぐ近位に持ってくるために除去する必要があるものを同定するために、ＦＭＲ１の近位にあるＣＴＣＦ結合モチーフの位置を次に分析する。標的ＣＴＣＦが同定されると、３つのアプローチのうちの１つを適用する。
【０８８１】
ＤＮＡメチル化によるＣＴＣＦ２アンカー配列の消滅：ｄＣａｓ９−ＤＮＭＴ３ａ融合は、メチル化するＣＴＣＦ部位を標的にするガイドまたはアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドで設計される。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９が使用され、構築物は、脆弱Ｘ患者に由来する細胞に、または脆弱Ｘ患者に電気穿孔によって導入される。ＤＮＭＴ３ａによる関連するＣＴＣＦアンカー配列の標的化メチル化は、エンハンシング配列と一緒にＦＭＲ１のルーピングおよび以降の活性化につながるだろう。電気穿孔の４８時間後に、電気穿孔された細胞からクロマチン、ゲノムＤＮＡおよび全ｍＲＮＡを調製する。ＦＭＲ遺伝子およびエンハンシング配列を包含するループが形成されたかどうか判定するために、ＣｈＩＡ−ＰＥＴ分析を実行する。標的ＣＴＣＦで、ならびにＦＭＲ１遺伝子の中でメチル化レベルを判定するために、重亜硫酸分析を次に使用する。細胞に由来する全ＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲによってＦＭＲ１の転写活性を調査する。
【０８８２】
ＣＴＣＦ２アンカー配列のゲノム編集および欠失：代わりに、ＣＴＣＦ２を突然変異させ、このようにＦＭＲ１を活性化アンカー配列媒介接続に導くために、ゲノム編集を使用する。この場合には、関連するＣＴＣＦを標的にするＳａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を設計し、細胞に、または脆弱Ｘ患者に電気穿孔によって組み込む。人為操作の４８時間後に、標的ＣＴＣＦが改変されたかどうか判定するために、ゲノムＤＮＡを抽出し、配列決定する。ＦＭＲ１転写は、全ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析によって判定される。
【０８８３】
ＣＴＣＦの優性陰性形の使用および結合の競合的阻害：優性陰性エフェクターによってＣＴＣＦ結合モチーフをブロックするために、ＣＴＣＦアンカー配列を認識して結合する能力で、しかし突然変異した二量体化ドメインで、タンパク質を設計する。この目的で、標的ＣＴＣＦ特異性を有し、二量体化ドメインを欠く優性陰性ＣＴＣＦタンパク質に融合しており、Ｆｌａｇペプチドを有する、ジンクフィンガーアレイを設計することができる。融合タンパク質をコードするＤＮＡは、細胞または脆弱Ｘ患者に電気穿孔によって導入する。標的ＣＴＣＦへの優性陰性エフェクターの結合を判定するために、電気穿孔の４８時間後にＣｈＩＰ分析をＦｌａｇ抗体で実行する。ＦＭＲ１転写レベルを判定するために、さらなる分析を上記の通り実行する。
【０８８４】
３つのアプローチの全ては、ＣＴＣＦ２の有効な消滅、および続く、最も近いエンハンシング配列のＦＭＲ１遺伝子との共ルーピングをもたらすことができる。
【０８８５】
（実施例１２）
例示的なアンカー配列
【０８８６】
明細書を読む当業者は、アンカー配列が、一部の実施形態では、公知のアンカー配列および／または本明細書に開示されるアンカー配列から多少異なってもよいことを理解する。例えば、一部の実施形態では、本明細書はＣＴＣＦ結合配列を、配列番号１または配列番号２の配列を有するポーションを有するか含むとして開示するが、一部の実施形態では、ＣＴＣＦが結合するアンカー配列は、配列番号１または配列番号２のバリアントである。例えば、下表は、ＣＴＣＦ結合性ドメインのための配列番号１の所与の位置での４つの塩基の各々の確率を示す。
【０８８７】
【表１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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