(57)【要約】本開示は、１つ以上の修飾核酸塩基を含むｍＲＮＡを含む、Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達またはＮＦκＢシグナル伝達を活性化するポリペプチドのような、目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする単離されたｍＲＮＡを特徴とする。本開示はまた、それを使用する方法であって、例えば、抗がん免疫応答または抗病原体免疫応答を刺激するなどの、目的の抗原（複数可）と一緒に投与した場合の免疫応答を増強するための方法も特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における目的の抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であって、前記免疫応答は、以下：
（ｉ）Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉ）ＮＦκＢ経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉｉ）炎症反応を刺激すること；
（ｉｖ）サイトカイン産生を刺激すること；
（ｖ）樹状細胞の発達、活性または動員を刺激すること；及び
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）のいずれかの組み合わせ
によって特徴付けられる細胞性免疫応答または体液性免疫応答を含む、ｍＲＮＡ。
【請求項２】
前記ポリペプチドが少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の下流で機能し、それによって免疫応答を増強する、請求項１に記載のｍＲＮＡ。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答及び／またはＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激する、請求項１または２に記載のｍＲＮＡ。
【請求項４】
前記ポリペプチドがＩ型ＩＦＮ応答を刺激し、前記ポリペプチドがＳＴＩＮＧ、ＭＡＶＳ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＴＢＫ１、ＩＫＫα、ＩＫＫｉ、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＭ、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ４、ＴＲＩＦ、ＩＰＳ−１、ＲＩＧ−１、ＤＡＩ及びＩＦＩ１６からなる群より選択される、請求項３に記載のｍＲＮＡ。
【請求項５】
前記ポリペプチドがＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激し、かつ前記ポリペプチドがＳＴＩＮＧ、ｃ−ＦＬＩＰ、ＩＫＫβ、ＲＩＰＫ１、Ｂｔｋ、ＴＡＫ１、ＴＡＫ−ＴＡＢ１、ＴＢＫ１、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４、ＴＡＢ２、ＴＡＢ３、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＭ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６及びＭＫＫ７からなる群より選択される、請求項３に記載のｍＲＮＡ。
【請求項６】
前記ポリペプチドが細胞内アダプタータンパク質である、請求項１または２に記載のｍＲＮＡ。
【請求項７】
細胞内アダプタータンパク質が、ＳＴＩＮＧ、ＭＡＶＳ及びＭｙＤ８８からなる群より選択される、請求項６に記載のｍＲＮＡ。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、ＴＬＲシグナル伝達経路の細胞内シグナル伝達タンパク質である、請求項２に記載のｍＲＮＡ。
【請求項９】
前記細胞内シグナル伝達タンパク質が、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＴＡＫ１、ＴＡＢ２、ＴＡＢ３、ＴＡＫ−ＴＡＢ１、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＴＲＡＭ、ＴＲＩＦ、ＲＩＰＫ１、及びＴＢＫ１からなる群より選択される、請求項８に記載のｍＲＮＡ。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが転写因子である、請求項２に記載のｍＲＮＡ。
【請求項１１】
前記転写因子がＩＲＦ３またはＩＲＦ７である、請求項１０に記載のｍＲＮＡ。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、ネクロトーシスまたはネクロトソーム形成に関与する、請求項２に記載のｍＲＮＡ。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、ＭＬＫＬ、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３、ＤＩＡＢＬＯ及びＦＡＤＤからなる群より選択される、請求項１２に記載のｍＲＮＡ。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、パイロトーシスまたはインフラマソーム形成に関与する、請求項２に記載のｍＲＮＡ。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、カスパーゼ１、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ１１、ＧＳＤＭＤ、ＮＬＲＰ３、Ｐｙｒｉｎドメイン、及びＡＳＣ／ＰＹＣＡＲＤからなる群より選択される、請求項１４に記載のｍＲＮＡ。
【請求項１６】
１つ以上の修飾核酸塩基を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子。
【請求項１８】
目的の抗原をコードするｍＲＮＡをさらに含む、請求項１７に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１９】
対象における目的の抗原に対する免疫応答を増強する第１のポリペプチドをコードする第１のｍＲＮＡ、対象における目的の抗原に対する免疫応答を増強する第２のポリペプチドをコードする第２のｍＲＮＡ、及び必要に応じて対象における目的の抗原に対する免疫応答を増強する第３のポリペプチドをコードする第３のｍＲＮＡを含む組成物であって、前記第１、第２及び第３のポリペプチドが少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の下流で機能し、それによって免疫応答を増強し、ここで、前記免疫応答は、以下：
（ｉ）Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉ）ＮＦκＢ経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉｉ）炎症反応を刺激すること；
（ｉｖ）サイトカイン産生を刺激すること；
（ｖ）樹状細胞の発達、活性または動員を刺激すること；及び
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）のいずれかの組み合わせ。
によって特徴付けられる細胞性免疫応答または体液性免疫応答を含む、組成物。
【請求項２０】
請求項１９記載の組成物であって、
（ｉ）前記第１のポリペプチドがＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を刺激し、かつ前記第２のポリペプチドがＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激するか；
（ｉｉ）前記第１のポリペプチドがＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を刺激し、かつ前記第２のポリペプチドがネクロトーシスまたはネクロトソーム形成に関与するか；
（ｉｉｉ）前記第１のポリペプチドがＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を刺激し、かつ前記第２のポリペプチドがパイロトーシスまたはインフラマソーム形成に関与するか；
（ｉｖ）前記第１のポリペプチドがＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激し、かつ前記第２のポリペプチドがネクロトーシスまたはネクロトソーム形成に関与するか；
（ｖ）前記第１のポリペプチドがＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激し、かつ前記第２のポリペプチドがパイロトーシスまたはインフラマソーム形成に関与するか；
（ｖｉｉ）前記第１のポリペプチドがＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を刺激し、前記第２のポリペプチドがＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激し、かつ前記第３のポリペプチドがネクロトーシスまたはネクロトソーム形成に関与するか；あるいは
（ｖｉｉｉ）前記第１のポリペプチドがＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を刺激し、前記第２のポリペプチドがＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激し、かつ前記第３のポリペプチドがパイロトーシスまたはインフラマソーム形成に関与する、組成物。
【請求項２１】
前記第１のポリペプチドがＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を刺激し、かつＳＴＩＮＧ、ＭＡＶＳ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＴＢＫ１、ＩＫＫα、ＩＫＫｉ、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＭ、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ４、ＴＲＩＦ、ＩＰＳ−１、ＲＩＧ−１、ＤＡＩ及びＩＦＩ１６からなる群より選択され；かつ前記第２のポリペプチドが、ＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激し、ＳＴＩＮＧ、ｃ−ＦＬＩＰ、ＩＫＫβ、ＲＩＰＫ１、Ｂｔｋ、ＴＡＫ１、ＴＡＫ−ＴＡＢ１、ＴＢＫ１、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４、ＴＡＢ２、ＴＡＢ３、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＭ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６及びＭＫＫ７からなる群より選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記第１のポリペプチドが構成的に活性なＩＲＦ３であり、かつ前記第２のポリペプチドが構成的に活性なＩＫＫαである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
構成的に活性なＩＲＦ７ポリペプチドをコードするｍＲＮＡをさらに含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記第１のポリペプチドがＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を刺激し、かつＳＴＩＮＧ、ＭＡＶＳ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＴＢＫ１、ＩＫＫα、ＩＫＫｉ、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＭ、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ４、ＴＲＩＦ、ＩＰＳ−１、ＲＩＧ−１、ＤＡＩ及びＩＦＩ１６からなる群より選択され；前記第２のポリペプチドが、ネクロトーシスまたはネクロトソーム形成に関与し、そしてＭＬＫＬ、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３、ＤＩＡＢＬＯ及びＦＡＤＤからなる群より選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記第１のポリペプチドが構成的に活性なＳＴＩＮＧであり、かつ前記第２のポリペプチドがＭＬＫＬポリペプチドである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記第１のポリペプチドがＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激し、ＳＴＩＮＧ、ｃ−ＦＬＩＰ、ＩＫＫβ、ＲＩＰＫ１、Ｂｔｋ、ＴＡＫ１、ＴＡＫ−ＴＡＢ１、ＴＢＫ１、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４、ＴＡＢ２、ＴＡＢ３、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＭ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６及びＭＫＫ７からなる群より選択され；かつ前記第２のポリペプチドがパイロトーシスまたはインフラマソーム形成に関与し、かつカスパーゼ１、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ１１、ＧＳＤＭＤ、ＮＬＲＰ３、Ｐｙｒｉｎドメイン及びＡＳＣ／ＰＹＣＡＲＤからなる群より選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２７】
前記第１のポリペプチドが構成的に活性なＩＫＫβであり、前記第２のポリペプチドがカスパーゼ−１ポリペプチドである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
カスパーゼ−４ポリペプチドをコードするｍＲＮＡをさらに含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記第１、第２、及び／または第３のｍＲＮＡが、１つ以上の修飾核酸塩基を含む、請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の組成物を含む脂質ナノ粒子。
【請求項３１】
目的の抗原をコードするｍＲＮＡをさらに含む、請求項３０に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項３２】
前記処置が前記脂質ナノ粒子または組成物を、必要に応じて第２の組成物と組み合わせて投与することを包含し、必要に応じて前記第２の組成物はチェックポイント阻害剤ポリペプチド及び任意の薬学的に許容される担体を含む、個体における免疫応答を増強するのに使用するための、請求項１７、１８、３０または３１のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、ならびに請求項２９に記載の任意の薬学的に許容される担体、または組成物、ならびに任意の薬学的に許容される担体。
【請求項３３】
個体における免疫応答を増強するための医薬の製造における、請求項１７、１８、３０または３１のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子及び任意の薬学的に許容される担体の使用であって、前記医薬が前記脂質ナノ粒子及び任意の薬学的に許容される担体を含み、前記処置が前記医薬を、必要に応じて、チェックポイント阻害剤ポリペプチド及び任意の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせて、投与することを包含する、使用。
【請求項３４】
請求項１７、１８、３０、または３１のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、及び任意の薬学的に許容される担体、または請求項２９に記載の組成物、ならびに任意の薬学的に許容される担体を含む容器、ならびに個体における免疫応答を増強するための前記脂質ナノ粒子または組成物の投与のための説明書を含む添付文書を備える、キット。
【請求項３５】
前記添付文書が、チェックポイント阻害剤ポリペプチド及び個体における免疫応答を増強するための任意の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせた、前記脂質ナノ粒子または組成物の投与のための説明書をさらに備える、請求項３４記載のキット。
【請求項３６】
請求項１７、１８、３０及び３１のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、任意の薬学的に許容される担体、または請求項２９に記載の組成物、及び任意の薬学的に許容される担体を含む医薬、ならびに単独で、またはチェックポイント阻害剤ポリペプチド及び個体における免疫応答を増強するための任意の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせて前記医薬を投与するための説明書を含む添付文書を備える、キット。
【請求項３７】
前記キットが、個体における免疫応答を増強するための第２の薬剤の投与の前、それと同時、またはその後の第１の薬剤の投与のための説明書を含む添付文書をさらに備える、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、またはそれらの組み合わせを阻害する、請求項１７、１８、３０もしくは３１のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、請求項２９の組成物、請求項３３に記載の使用、または請求項３６〜３７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３９】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが抗体である、請求項１７、１８、３０もしくは３１のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、請求項２９に記載の組成物、請求項３３に記載の使用、または請求項３６〜３７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４０】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ１に特異的に結合する抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、及びそれらの組み合わせから選択された抗体である、請求項１７、１８、３０または３１のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、請求項２９に記載の組成物、請求項３３に記載の使用または請求項３６〜３７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４１】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブから選択される抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項１７、１８、３０もしくは３１のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、請求項２９に記載の組成物、請求項３３に記載の使用または請求項３６〜３７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４２】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、トレメリムマブまたはイピリムマブから選択される抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項１７、１８、３０もしくは３１のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、請求項２９に記載の組成物、請求項３３に記載の使用または請求項３６〜３７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４３】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、ニボルマブまたはペムブロリズマブから選択される抗ＰＤ１抗体である、請求項１７、１８、３０もしくは３１のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、請求項２９に記載の組成物、請求項３３に記載の使用または請求項３６〜３７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４４】
対象において目的の抗原に対する免疫応答を増強する方法であって、前記目的の抗原に対する免疫応答が増強されるように、請求項１８または請求項３１に記載の脂質ナノ粒子を前記対象に投与することを包含する、方法。
【請求項４５】
少なくとも１つの免疫増強剤ｍＲＮＡ、及び目的の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含む組成物であって、前記免疫増強剤が少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の下流で機能し、それによって免疫応答を増強し、前記免疫応答は、以下：
（ｉ）Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉ）ＮＦκＢ経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉｉ）炎症反応を刺激すること；
（ｉｖ）サイトカイン産生を刺激すること；
（ｖ）樹状細胞の発達、活性または動員を刺激すること；及び
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）のいずれかの組み合わせ。
によって特徴付けられる細胞性免疫応答または体液性免疫応答を含む、組成物。
【請求項４６】
前記免疫増強剤がＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を刺激した、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記免疫増強剤がＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激する、請求項４５または４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記免疫増強剤がＩ型ＩＦＮ応答を刺激し、かつＳＴＩＮＧ、ＭＡＶＳ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＴＢＫ１、ＩＫＫα、ＩＫＫｉ、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＭ、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ４、ＴＲＩＦ、ＩＰＳ−１、ＲＩＧ−１、ＤＡＩ、ＩＦＩ１６、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記免疫増強剤がＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激し、ＳＴＩＮＧ、ｃ−ＦＬＩＰ、ＩＫＫβ、ＲＩＰＫ１、Ｂｔｋ、ＴＡＫ１、ＴＡＫ−ＴＡＢ１、ＴＢＫ１、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４、ＴＡＢ２、ＴＡＢ３、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＭ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４７に記載の組成物。
【請求項５０】
前記免疫増強剤が細胞内アダプタータンパク質である、請求項４５または４６に記載の組成物。
【請求項５１】
前記免疫増強タンパク質が、ＳＴＩＮＧ、ＭＡＶＳ、ＭｙＤ８８、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記免疫増強剤が、ＴＬＲシグナル伝達経路の細胞内シグナル伝達タンパク質である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５３】
前記細胞内シグナル伝達タンパク質が、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＴＡＫ１、ＴＡＢ２、ＴＡＢ３、ＴＡＫ−ＴＡＢ１、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＴＲＡＭ、ＴＲＩＦ、ＲＩＰＫ１、ＴＢＫ１、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５２記載の組成物。
【請求項５４】
前記免疫増強剤が転写因子である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５５】
前記転写因子がＩＲＦ３、ＩＲＦ７またはそれらの組み合わせである、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記免疫増強剤がネクロトーシスまたはネクロトソーム形成に関与する、請求項４６記載の組成物。
【請求項５７】
前記免疫増強剤が、ＭＬＫＬ、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３、ＤＩＡＢＬＯ、ＦＡＤＤ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記免疫増強剤が、パイロトーシスまたはインフラマソーム形成に関与している、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５９】
前記免疫増強剤が、カスパーゼ１、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ１１、ＧＳＤＭＤ、ＮＬＲＰ３、Ｐｙｒｉｎドメイン、ＡＳＣ／ＰＹＣＡＲＤ及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５８記載の組成物。
【請求項６０】
前記免疫増強剤が、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドを含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項６１】
前記構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドが、Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｅ３１５Ｑ、Ｒ３７５Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の変異を含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドがＶ１５５Ｍ変異を含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドが、変異Ｒ２８４Ｍ／Ｖ１４７Ｌ／Ｎ１５４Ｓ／Ｖ１５５Ｍを含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６４】
ＭＬＫＬポリペプチドをコードする第２の免疫増強剤ｍＲＮＡをさらに含む、請求項６０〜６３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記免疫増強剤がＭＡＶＳポリペプチドである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項６６】
前記免疫増強剤が構成的に活性なＩＲＦ３ポリペプチドである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項６７】
前記構成的に活性なＩＲＦ３ポリペプチドがＳ３９６Ｄ変異を含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
第２の免疫増強剤ｍＲＮＡをさらに含み、ここで前記第２の免疫増強剤ｍＲＮＡが構成的に活性なヒトＩＲＦ７ポリペプチドをコードする、請求項６６〜６７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６９】
前記構成的に活性なヒトＩＲＦ７ポリペプチドが、Ｓ４７５Ｄ、Ｓ４７６Ｄ、Ｓ４７７Ｄ、Ｓ４７９Ｄ、Ｌ４８０Ｄ、Ｓ４８３Ｄ、Ｓ４８７Ｄ、アミノ酸２４７〜４６７の欠失、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の変異を含む、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
第３の免疫増強剤ｍＲＮＡをさらに含み、前記第３の免疫増強剤ｍＲＮＡが、ＩＫＫβポリペプチドをコードする、請求項６８〜６９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７１】
前記目的の抗原が１つ以上の腫瘍抗原である、請求項４５〜７０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７２】
前記目的の抗原が１つ以上の病原体抗原であり、かつ前記病原体がウイルス、細菌、原生動物または寄生生物である、請求項４５〜７０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７３】
前記目的の抗原が、１つ以上の個別化されたがん抗原である、請求項４５〜７０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７４】
前記個別化されたがん抗原が、２〜１００個のペプチドエピトープから構成されるコンカテマーがん抗原である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
前記コンカテマーがん抗原が、以下：
ａ）前記２〜１００個のペプチドエピトープに切断感受性部位が点在しているか；
ｂ）各ペプチドエピトープをコードする前記ｍＲＮＡがリンカーなしで互いに直接結合されているか；
ｃ）各ペプチドエピトープをコードする前記ｍＲＮＡが、単一のヌクレオチドリンカーを用いて互いに連結されているか；
ｄ）各ペプチドエピトープは２５〜３５個のアミノ酸を含み、中央に位置するＳＮＰ変異を含むか；
ｅ）前記ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象由来のクラスＩＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有するか；
ｆ）少なくとも３０％の前記ペプチドエピトープが、対象由来のクラスＩＩＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有するか；
ｇ）前記ペプチドエピトープの少なくとも５０％が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及び／またはＤＲＢ１に対してＩＣ＞５００ｎＭという推定結合親和性を有するか；
ｈ）前記ｍＲＮＡは２０個のペプチドエピトープをコードするか；
ｉ）５０％の前記ペプチドエピトープが、クラスＩＭＨＣに対する結合親和性を有し、５０％の前記ペプチドエピトープがクラスＩＩＭＨＣに対する結合親和性を有するか；及び／または
ｊ）前記ペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡは、前記ペプチドエピトープが疑似エピトープを最小にするために順序付けられるように配置される、
のうちの１つ以上を含む、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
各ペプチドエピトープが３１個のアミノ酸を含み、ＳＮＰ変異の両側に１５個の隣接アミノ酸を有する、中央に位置するＳＮＰ変異を含む、請求項７５記載の組成物。
【請求項７７】
前記ペプチドエピトープが、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、またはＴ細胞エピトープとＢ細胞エピトープとの組み合わせである、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７８】
前記ペプチドエピトープが少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ及び少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７９】
前記エピトープの少なくとも３０％がＭＨＣクラスＩエピトープであるか、または前記エピトープの少なくとも３０％がＭＨＣクラスＩＩエピトープである、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８０】
前記増強された免疫応答が、細胞性免疫応答、体液性免疫応答、またはその両方である、請求項４５〜７９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８１】
前記増強された免疫応答がＴ細胞応答であり、前記Ｔ細胞応答が抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、またはその両方である、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８２】
前記増強された免疫応答がＢ細胞応答であり、ここで前記Ｂ細胞応答が抗原特異的抗体応答である、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８３】
前記増強された免疫応答がサイトカイン産生を刺激するか、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激するか、抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパー細胞応答を刺激するか、エフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞集団を増大させるか、Ｂ細胞活性を刺激するか、もしくは抗原特異的抗体産生を刺激するか、または前述の応答の任意の組み合わせである、請求項４５〜７９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８４】
前記増強された免疫応答が、サイトカイン産生を刺激することを含み、ここで前記サイトカインがＩＦＮ−γもしくはＴＮＦ−α、またはその両方である、請求項８３に記載の組成物。
【請求項８５】
前記増強された免疫応答が、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の刺激を含み、前記抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生またはその両方を含む、請求項８３に記載の組成物。
【請求項８６】
ＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生が、少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％増大する、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８７】
抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答がＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を含み、かつ全Ｔ細胞集団のうちＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％増大する、請求項８５記載の組成物。
【請求項８８】
前記抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのエフェクターメモリーＣＤ６２Ｌｌ０Ｔ細胞の割合の増大を含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８９】
前記目的の抗原に対する免疫応答が、前記免疫増強剤の非存在下での前記抗原に対する前記免疫応答と比較して倍の大きさに増大する、請求項４５〜７９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９０】
前記免疫応答が、０．３〜１０００倍、１〜７５０倍、５〜５００倍、７〜２５０倍、または１０〜１００倍増大する、請求項８９に記載の組成物。
【請求項９１】
前記免疫応答が２倍、３倍、４倍、５倍、７．５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、またはそれを超えて増大する、請求項８９記載の組成物。
【請求項９２】
前記目的の抗原（「Ａｇ」）をコードする前記ｍＲＮＡ及び前記免疫増強剤ｍＲＮＡ（「ＩＰ」）が、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１または２０：１というＡｇ：ＩＰ質量比で処方される、請求項４５〜９１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９３】
前記Ａｇ：ＩＰ質量比が、１：１、３：１または５：１である、請求項９２に記載の組成物。
【請求項９４】
各ｍＲＮＡが完全に修飾されている、請求項４５〜９３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９５】
前記ｍＲＮＡが、シュードウリジン（Ψ）、シュードウリジン（Ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２−チオウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）またはＮ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９６】
前記ｍＲＮＡが、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、または２’−Ｏ−メチルウリジン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９７】
前記ｍＲＮＡが、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（Ψ）、α−チオ−グアノシンもしくはα−チオ−アデノシン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９８】
請求項４５〜９７のいずれか１項に記載の組成物を含む脂質ナノ粒子。
【請求項９９】
前記脂質ナノ粒子が、約２０〜６０％のイオン性アミノ脂質：５〜２５％のリン脂質：２５〜５５％のステロール：及び０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質というモル比を含む、請求項９８に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１００】
前記イオン性アミノ脂質が、例えば、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）からなる群より選択される、請求項９９に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１０１】
前記脂質ナノ粒子が、化合物２５、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−ＤＭＧを含む、請求項９９に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１０２】
前記脂質ナノ粒子が、約２０〜６０％の化合物２５：５〜２５％のＤＳＰＣ：２５〜５５％のコレステロール；及び０．５〜１５％のＰＥＧ−ＤＭＧというモル比を含む、請求項１０１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１０３】
前記脂質ナノ粒子が、約５０％の化合物２５：約１０％のＤＳＰＣ：約３８．５％のコレステロール：約１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧというモル比を含む、請求項１０２に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１０４】
９８〜１０３のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、及び薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項１０５】
前記処置が、前記脂質ナノ粒子または組成物を、必要に応じて第２の組成物と組み合わせて投与することを包含し、必要に応じて前記第２の組成物はチェックポイント阻害剤ポリペプチド及び任意の薬学的に許容される担体を含む、個体における免疫応答を増強するための、請求項９８〜１０３のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、ならびに任意の薬学的に許容される担体、または請求項１０４に記載の組成物、及び任意の薬学的に許容される担体。
【請求項１０６】
前記医薬が、前記脂質ナノ粒子及び任意の薬学的に許容される担体を含み、かつ前記処置が、必要に応じてチェックポイント阻害剤ポリペプチド及び任意の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせた前記医薬の投与を含む、個体における免疫応答を増強するための医薬の製造における、請求項９８〜１０３のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子及び任意の薬学的に許容される担体の使用。
【請求項１０７】
請求項９８〜１０３のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、及び任意の薬学的に許容される担体、または請求項１０４に記載の組成物、及び任意の薬学的に許容される担体を含む容器、ならびに個体における免疫応答を増強するための前記脂質ナノ粒子または組成物の投与のための指示書を含む添付文書を備えるキット。
【請求項１０８】
前記添付文書が、チェックポイント阻害剤ポリペプチド及び個体における免疫応答を増強するための任意の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせた、前記脂質ナノ粒子または組成物の投与のための説明書をさらに含む、請求項１０７記載のキット。
【請求項１０９】
請求項９８〜１０３のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、及び任意の薬学的に許容される担体、または請求項１０４に記載の組成物、及び任意の薬学的に許容される担体を含む医薬、ならびに単独で、またはチェックポイント阻害剤ポリペプチド及び個体における免疫応答を増強するための任意の薬学的に許容される担体を含む組成物との組み合わせで前記医薬を投与するための説明書を含む添付文書を備えるキット。
【請求項１１０】
前記キットが、個体における免疫応答を増強するための前記第２の医薬の投与の前、それと同時、またはその後の前記第１の医薬の投与のための説明書を含む添付文書をさらに備える、請求項１０９に記載のキット。
【請求項１１１】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドがＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、またはそれらの組み合わせを阻害する、請求項９８〜１０３のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、請求項１０４の組成物、請求項１０６に記載の使用、または請求項１０８〜１１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１２】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが抗体である、請求項９８〜１０３のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、請求項１０４に記載の組成物、請求項１０６に記載の使用、または請求項１０８〜１１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１３】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドがＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ１に特異的に結合する抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、及びそれらの組み合わせから選択される抗体である、請求項９８〜１０３のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、請求項１０４に記載の組成物、請求項１０６に記載の使用または請求項１０８〜１１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１４】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブから選択される抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項９８〜１０３のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、請求項１０４に記載の組成物、請求項１０６に記載の使用または請求項１０８〜１１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１５】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドがトレメリムマブまたはイピリムマブから選択される抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項９８〜１０３のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、請求項１０４に記載の組成物、請求項１０６に記載の使用または請求項１０８〜１１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１６】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、ニボルマブまたはペンブロリズマブから選択される抗ＰＤ１抗体である、請求項９８〜１０３のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子、請求項１０４に記載の組成物、請求項１０６に記載の使用または請求項１０８〜１１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１７】
目的のある抗原に対する免疫応答を増強するための方法であって、前記目的の抗原に対する免疫応答が対象で増強されるように、請求項９８〜１０３のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子または請求項１０４に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを包含する、方法。
【請求項１１８】
前記増強された免疫応答が、細胞性免疫応答、体液性免疫応答またはその両方である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記増強された免疫応答が、Ｔ細胞応答であり、前記Ｔ細胞応答が抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、またはその両方である、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記増強された免疫応答が、Ｂ細胞応答であり、前記Ｂ細胞応答が抗原特異的抗体応答である、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記増強された免疫応答が、サイトカイン産生を刺激するか、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激するか、抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパー細胞応答を刺激するか、エフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞集団を増大させるか、Ｂ細胞活性を刺激するかもしくは抗原特異的抗体産生を刺激するか、または前述の応答の任意の組み合わせである、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２２】
前記増強された免疫応答が、サイトカイン産生を刺激することを包含し、ここで前記サイトカインがＩＦＮ−γもしくはＴＮＦ−α、またはその両方である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記増強された免疫応答が、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激することを包含し、前記抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生またはその両方を含む、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２４】
ＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生が、少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％増大する、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を含み、かつ全Ｔ細胞集団のうちのＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％増大する、請求項１２３記載の方法。
【請求項１２６】
前記抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのエフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞の割合の増大を含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２７】
前記目的の抗原に対する免疫応答が、前記免疫増強剤の非存在下での前記抗原に対する前記免疫応答と比較して倍の大きさに増大する、請求項１１７〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記免疫応答が、０．３〜１０００倍、１〜７５０倍、５〜５００倍、７〜２５０倍、または１０〜１００倍増大する、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記免疫応答が２倍、３倍、４倍、５倍、７．５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、またはそれ以上増大する、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３０】
前記目的の抗原に対する免疫応答が、１０日超、１５日超、２０日超、２５日超、３０日超、４０日超、５０日超、６０日超、７０日超、８０日超、または９０日超の間維持される、請求項１１７〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年１０月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／４１２，９３３号；２０１７年３月３日に出願された米国仮特許出願第６２／４６７，０３４号；２０１７年４月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／４９０，５２２号；及び２０１７年９月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／５５８，２０６号の利益を主張する。上記に参照された出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
開示の背景
免疫応答を調節する能力は、がん及び病原性感染症の処置を含む様々な臨床状況において、ならびに防御免疫を提供するためにワクチン応答を増強することにおいて有益である。がん及び病原性感染症などの疾患に関与する、生物学的経路及び／または分子の機能を調節するための多数の治療ツールが存在する。これらのツールとしては、例えば、低分子阻害剤、サイトカイン及び治療用抗体が挙げられる。これらのツールのいくつかは、免疫系内の細胞の活性を調節するサイトカイン、または免疫チェックポイント阻害剤抗体、例えば、免疫応答の調節を調整する、抗ＣＴＬＡ−４もしくは抗ＰＤ−Ｌ１のような抗ＰＤ−Ｌ１抗体のような、対象における免疫応答の調節を通して機能する。
【０００３】
さらに、ワクチンは、病原体の抗原に対する免疫応答を刺激し、それによってその後の病原体への曝露に対する防御免疫を提供するために長い間使用されてきた。最近になって、腫瘍細胞上に見出される抗原を用いてワクチンが開発され、それによって抗腫瘍免疫応答性が増強されている。ワクチンに使用される抗原（複数可）に加えて、他の因子をワクチン調製物に含めるか、またはワクチン調製物と組み合わせて使用して、ワクチンに対する免疫応答をさらにブーストしてもよい。ワクチン応答性を増強するそのような因子は、当該技術分野においてアジュバントと呼ばれている。一般的に使用されるワクチンアジュバントの例としては、アルミニウムゲル及び塩、モノホスホリルリピドＡ、ＭＦ５９水中油型エマルジョン、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、界面活性剤及び植物サポニンが挙げられる。これらのアジュバントは典型的には、タンパク質またはペプチドベースのワクチンと共に使用される。ＲＮＡベースのワクチンなどの代替型のワクチンが現在開発されている。
【０００４】
当該技術分野において、目的の抗原に対する免疫応答を増強するさらなる有効な因子の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
開示の概要
本開示は、本明細書において免疫増強剤構築物と呼ばれる、目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を提供する。特定の実施形態では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、化学的に修飾されており、本明細書では修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）と呼ばれ、ここでｍｍＲＮＡは、１つ以上の修飾核酸塩基を含む。あるいは、このｍＲＮＡは、完全に未修飾核酸塩基を含み得る。一実施形態では、免疫増強剤構築物は、対象における目的の抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）（場合により、このようなｍＲＮＡは１つ以上の修飾核酸塩基を含む）に関し、この免疫応答は、以下によって特徴付けられる細胞性免疫応答または体液性免疫応答を含む：
（ｉ）Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉ）ＮＦκＢ経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉｉ）炎症反応を刺激すること；
（ｉｖ）サイトカイン産生を刺激すること；または
（ｖ）樹状細胞の発達、活性または動員を刺激すること；及び
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかの組み合わせ。
【０００６】
特定の実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物（または免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物の組み合わせ）は、例えば、免疫増強因子の非存在下での抗原に対する免疫応答と比較して、または抗原に対する免疫応答を増強する低分子アゴニストと比較して、目的の抗原に対する免疫応答を数倍増強する。例えば、様々な実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、目的の抗原に対する免疫応答を、例えば、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物の非存在下での抗原に対する免疫応答と比較して、または例えば、抗原に対する免疫応答の低分子アゴニストの存在下における抗原に対する免疫応答と比較して０．３〜１０００倍、１〜７５０倍、５〜５００倍、７〜２５０倍、または１０〜１００倍増強する。いくつかの実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、目的の抗原に対する免疫応答を、例えば、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物の非存在下での抗原に対する免疫応答と比較して、または例えば、抗原に対する免疫応答の低分子アゴニストの存在下での抗原に対する免疫応答と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、７．５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍またはそれ以上増強する。
【０００７】
目的の抗原は、対象における内因性抗原（例えば、内因性腫瘍抗原）または免疫増強剤構築物と共に対象に提供される外因性抗原（例えば、ワクチン抗原を含む外因性腫瘍抗原または病原体抗原）であってもよい。したがって、本開示の免疫増強剤ｍＲＮＡは、がんの処置における腫瘍抗原、または病原性疾患の処置もしくはそれに対する予防接種における病原体抗原などの目的の抗原に対するインビボでの免疫応答を刺激または増強するのに有用である。
【０００８】
一実施形態では、目的の抗原は腫瘍抗原などの内因性抗原であり、ｍＲＮＡ免疫増強剤構築物は、それを必要とする対象に提供されて、腫瘍抗原に対する免疫応答を刺激または増強する。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ免疫増強剤構築物は、例えば、ネクロトーシスまたはパイロトーシスなどによる、免疫原性細胞死を誘導することによって、内因性抗原の放出を促進するために、１つ以上のさらなる因子、例えば、ｍＲＮＡ構築物と組み合わせて投与される。したがって、別の態様において、本発明は、ネクロトーシスまたはパイロトーシスなどの免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ構築物（例えば、ｍｍＲＮＡ）を提供する。いくつかの態様では、ｍＲＮＡによって誘導される免疫原性細胞死は、細胞性抗原（例えば、内因性腫瘍抗原）に対する免疫応答がインビボで刺激されるように細胞（例えば、腫瘍細胞）から細胞質ゾル構成要素の放出をもたらす。
【０００９】
他の態様において、目的の抗原は、免疫増強剤構築物と同じｍＲＮＡ上に提供されるか、または免疫増強剤として異なるｍＲＮＡ構築物上に提供される、化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）などのｍＲＮＡによってコードされる外因性抗原である。免疫増強剤及び抗原ｍＲＮＡを、それを必要とする対象に処方（または共処方）及び投与して（同時にまたは連続して）、対象における抗原に対する免疫応答を刺激する。
【００１０】
いくつかの態様では、本開示は、例えば、Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達の刺激、ＮＦκＢ経路シグナル伝達の刺激、炎症応答の刺激、サイトカイン産生の刺激、または樹状細胞の発達、活性化もしくは動員を刺激することによって免疫応答を増強するポリペプチドをコードする免疫増強剤ｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ構築物）を提供する。免疫増強剤ｍＲＮＡによる目的の抗原に対する免疫応答の増強は、例えば、サイトカイン産生の刺激、細胞性免疫の刺激（Ｔ細胞応答）、例えば、抗原特異的ＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋Ｔ細胞応答、及び／または体液性免疫（Ｂ細胞応答）、例えば、抗原特異的抗体応答、または前述の応答の任意の組み合わせの刺激を生じる。
【００１１】
いくつかの態様では、本開示は、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の下流で機能し、それによって免疫応答を増強するポリペプチドをコードする免疫増強剤ｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）を提供し、その例は本明細書に示されている。いくつかの態様では、本開示は、Ｉ型インターフェロン応答を刺激するポリペプチドをコードする免疫増強剤ｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）を提供し、その例は本明細書に示されている。いくつかの態様では、本開示は、ＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激するポリペプチドをコードしている免疫増強剤ｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）を提供し、その例は本明細書に示されている。いくつかの態様では、本開示は、細胞内アダプタータンパク質であるポリペプチドをコードする免疫増強剤ｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）を提供し、その例は本明細書に提供される。いくつかの態様では、本開示は、細胞内シグナル伝達タンパク質であるポリペプチドをコードしている免疫増強剤ｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）を提供し、その例は本明細書に示されている。いくつかの態様では、本開示は、転写因子であるポリペプチドをコードしている免疫増強剤ｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）を提供し、その例は本明細書に示されている。いくつかの態様では、本開示は、ネクロトーシスまたはネクロトソーム形成に関与するポリペプチドをコードしている免疫増強剤ｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）を提供し、その例は本明細書に示されている。いくつかの態様では、本開示は、パイロトーシスまたはインフラマソーム形成に関与するポリペプチドをコードする免疫増強剤ｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）を提供し、その例は本明細書に示されている。（同じクラス型または異なるクラス型の）２つ以上の免疫増強剤ｍＲＮＡの組み合わせを含む組成物もまた提供される。
【００１２】
いくつかの態様では、本開示は、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードしている免疫増強剤ｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）を提供する。一態様では、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドは、Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｅ３１５Ｑ、Ｒ３７５Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の変異体を含む。いくつかの態様では、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドは、Ｖ１５５Ｍ変異体（例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号１９９、１３１９もしくは１３２０に示されるヌクレオチド配列によりコードされる）を含む。いくつかの態様では、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドは、変異体Ｖ１４７Ｌ／Ｎ１５４Ｓ／Ｖ１５５Ｍを含む。他の態様では、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドは、変異体Ｒ２８４Ｍ／Ｖ１４７Ｌ／Ｎ１５４Ｓ／Ｖ１５５Ｍを含む。他の態様では、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドは、配列番号１〜１０及び２２４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。別の態様では、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドは、配列番号１９９〜２０８、２２５、１３１９、１３２０、１４４２〜１４５０及び１４６６のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列によってコードされる。
【００１３】
他の態様では、本開示は、構成的に活性なヒトＩＲＦ３ポリペプチドをコードしている免疫増強剤ｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）を提供する。一態様では、構成的に活性なヒトＩＲＦ３ポリペプチドは、Ｓ３９６Ｄ変異体を含む。一態様では、構成的に活性なヒトＩＲＦ３ポリペプチドは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２１０もしくは配列番号１４５２に記載のヌクレオチド配列によりコードされる。一態様では、構成的に活性なＩＲＦ３ポリペプチドは、マウスＩＲＦ３ポリペプチドであり、例えば、配列番号１２に記載のアミノ酸配列、または配列番号２１１もしくは配列番号１４５３に示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
さらに他の態様では、本開示は、構成的に活性なヒトＩＲＦ７ポリペプチドをコードしている免疫増強剤ｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）を提供する。一態様では、構成的に活性なヒトＩＲＦ７ポリペプチドは、Ｓ４７５Ｄ、Ｓ４７６Ｄ、Ｓ４７７Ｄ、Ｓ４７９Ｄ、Ｌ４８０Ｄ、Ｓ４８３Ｄ、Ｓ４８７Ｄ、及びそれらの組み合わせ；アミノ酸２４７〜４６７の欠失；ならびに前述の変異体及び／または欠失の組み合わせ、からなる群より選択される１つ以上の変異体を含む。一実施形態では、構成的に活性なヒトＩＲＦ７ポリペプチドは、配列番号１４〜１８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、構成的に活性なヒトＩＲＦ７ポリペプチドは、配列番号２１３〜２１７及び１４５４〜１４５９のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列によってコードされる。
【００１５】
さらに他の態様では、本開示は、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＭ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＴＢＫ１、ＩＫＫｉ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ６、ｃ−ＦＬＩＰ、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＲＩＰＫ１、ＴＡＫ−ＴＡＢ１融合、ＤＩＡＢＬＯ、Ｂｔｋ、自己活性化カスパーゼ−１及びＦｌｔ３からなる群より選択されるポリペプチドをコードしている免疫増強剤ｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）を提供する。
【００１６】
他の態様では、本開示は、目的の抗原（複数可）をコードする１つ以上のｍＲＮＡ構築物（例えば、ｍｍＲＮＡ構築物）を含むｍＲＮＡ組成物（例えば、ｍｍＲＮＡ組成物）及び目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するポリペプチドを提供し、ここで、この抗原（複数可）及びポリペプチドは、同じｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）構築物または共処方されてもよく、そして同時にもしくは連続してそれを必要とする対象に投与され得る、別々のｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）構築物によってコードされる。本明細書に記載の任意の免疫増強剤ｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）は（単独でまたは組み合わせて）、目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するための１つ以上の組成物において有用である。
【００１７】
したがって、いくつかの態様では、本開示は、免疫応答を増強するポリペプチドをコードする第１のｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）及び少なくとも１つの目的の抗原をコードする第２のｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）を含む組成物を提供し、必要に応じて、ここでこのような第１及び第２のｍＲＮＡは、１つ以上の修飾核酸塩基を含み、ここで、組成物が対象に投与されると、このポリペプチドは少なくとも１つの目的の抗原に対する免疫応答を増強する。一態様では、この組成物は、少なくとも１つの目的の抗原と、少なくとも１つの目的の抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドとの両方をコードする単一のｍＲＮＡ構築物（例えば、ｍｍＲＮＡ）を含む。別の態様では、この組成物は、２つのｍＲＮＡ構築物（例えば、ｍｍＲＮＡ）を含み、一方は、少なくとも１つの目的の抗原をコードし、もう一方は少なくとも１つの目的の抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、この組成物が２つのｍＲＮＡ構築物を含む場合、２つのｍＲＮＡ構築物（例えば、ｍｍＲＮＡ）を同じ組成物（例えば、脂質ナノ粒子など）中に共処方し、そして対象に同時投与される。他の態様では、２つ以上のｍＲＮＡ構築物が提供される場合、そのようなｍＲＮＡ構築物は、異なる組成物（例えば、２つ以上の脂質ナノ粒子など）に処方し、それを必要とする対象に（例えば、同時にまたは連続して）投与してもよい。
【００１８】
他の態様では、本開示は、免疫応答を増強するポリペプチドをコードする第１のｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）及び少なくとも１つの目的の抗原をコードする第２のｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）を含む組成物を提供し、ここで目的の少なくとも１つの抗原は、少なくとも１つの腫瘍抗原である。一態様では、少なくとも１つの腫瘍抗原は、少なくとも１つの変異体ＫＲＡＳ抗原である。一態様では、少なくとも１つの変異体型ＫＲＡＳ抗原は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｃ及びそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの変異体を含む。一態様では、少なくとも１つの変異体ヒトＫＲＡＳ抗原は、配列番号９５〜１０６及び１３１〜１３２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。他の態様では、この組成物は、少なくとも１つの変異体型ヒトＫＲＡＳ抗原及び構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするｍＲＮＡ構築物を含み、例えば、ｍＲＮＡは、配列番号１０７〜１３０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列をコードする。少なくとも１つの変異体型ヒトＫＲＡＳ抗原及び構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードする構築物についての例示的なｍＲＮＡヌクレオチド配列は、配列番号２２０〜２２３及び１４６２〜１４６５に示される。他の態様では、腫瘍抗原は、オンコウイルス抗原（例えば、ＨＰＶ１６  Ｅ６もしくはＨＰＶ  Ｅ７抗原、またはそれらの組み合わせなどのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原）である。
【００１９】
本開示の組成物の他の態様では、目的の少なくとも１つの抗原は少なくとも１つの病原体抗原である。一態様では、少なくとも１つの病原体抗原は、ウイルス、細菌、原生動物、真菌及び寄生生物からなる群より選択される病原体に由来する。一実施形態では、少なくとも１つの病原体抗原は少なくとも１つのウイルス抗原である。一態様では、少なくとも１つのウイルス抗原は、少なくとも１つのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原である。一態様では、このＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ１６  Ｅ６もしくはＨＰＶ  Ｅ７抗原、またはそれらの組み合わせである。一態様では、ＨＰＶ抗原は、配列番号３６〜９４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。本開示の組成物の他の態様では、少なくとも１つの病原体抗原は少なくとも１つの細菌性抗原である。一実施形態では、少なくとも１つの細菌抗原は多価抗原である。
【００２０】
一実施形態では、目的の抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）またはメルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）などの発がん性ウイルスの１つ以上の抗原である。一態様では、発がん性ウイルスの目的の抗原は、ｍＲＮＡ（例えば、化学修飾ｍＲＮＡ）によってコードされ、免疫増強剤構築物と同じｍＲＮＡ上に提供されるか、または免疫増強剤として異なるｍＲＮＡ構築物上に提供される。いくつかの態様では、免疫増強剤及びウイルス抗原（複数可）ｍＲＮＡを、それを必要とする対象において処方し（または共処方し）そして投与し（同時にまたは連続的に）、その対象における発がん性ウイルス抗原（複数可）に対する免疫応答を刺激する。免疫増強剤と共に使用するのに適した発がん性ウイルス抗原は、本明細書に記載されている。
【００２１】
一実施形態では、目的の抗原とは、個別化されたがんワクチンを含む１つ以上の腫瘍抗原である。一態様では、本開示は、ネオエピトープと呼ばれる、がんの対象に特異的な１つ以上のがん抗原をコードするｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）を免疫増強剤構築物と共に含むワクチン調製物を提供し、ここでこのがん抗原及び免疫増強剤は、同じまたは異なるｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）によってコードされている。がん対象に特異的ながん抗原を選択し、それに基づいて個別化されたがんワクチンを設計する方法が本明細書に記載されている。したがって、一態様では、本開示は、１つ以上のｍＲＮＡ（例えば、化学修飾ｍＲＮＡ）によってコードされる、がん対象に特異的な１つ以上の腫瘍抗原（例えば、１つ以上のネオエピトープ）を含む個別化がんワクチンを提供し、ここでこのがんネオエピトープは、同じｍＲＮＡまたは異なるｍＲＮＡによってコードされる（例えば、各がんネオエピトープは別々のｍＲＮＡ構築物にコードされる）。いくつかの態様では、このがんネオエピトープ（複数可）は、免疫増強剤構築物と同じｍＲＮＡ構築物にコードされるか、または免疫増強剤として異なるｍＲＮＡ構築物にコードされる。免疫増強剤及びがん抗原（複数可）ｍＲＮＡを、それを必要とする対象に処方（または共処方）及び投与（同時または順次）して、対象におけるがん抗原（複数可）に対する免疫応答を刺激してもよい。
【００２２】
一態様では、ｍＲＮＡ構築物は、２〜１００個のペプチドエピトープから構成されるコンカテマーがん抗原である、個別化されたがん抗原をコードする。別の態様では、このコンカテマーがん抗原は、以下のうちの１つ以上を含む：ａ）２〜１００個のペプチドエピトープに切断感受性部位が点在しているか；ｂ）各ペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡが、リンカーなしで互いに直接連結されているか；ｃ）各ペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡが、単一のヌクレオチドリンカーを用いて互いに連結されているか；ｄ）各ペプチドエピトープが２５〜３５個のアミノ酸を含み、中央に位置するＳＮＰ変異体を含むか；ｅ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象由来のクラスＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有するか；ｆ）少なくとも３０％のペプチドエピトープが、対象由来のクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有するか；ｇ）ペプチドエピトープの少なくとも５０％が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及び／またはＤＲＢ１に対してＩＣ＞５００ｎＭという推定結合親和性を有するか；ｈ）ｍＲＮＡは２０個のペプチドエピトープをコードするか；ｉ）５０％のペプチドエピトープがクラスＩ  ＭＨＣに対する結合親和性を有し、５０％のペプチドエピトープがクラスＩＩ  ＭＨＣに対する結合親和性を有するか；及び／またはｊ）ペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡが、ペプチドエピトープが疑似エピトープを最小にするように順序付けられるように配置される。
【００２３】
いくつかの態様では、コンカテマーがん抗原は、２〜１００個のペプチドエピトープを含み、各ペプチドエピトープは、３１個のアミノ酸を含み、ＳＮＰ変異の両側に１５個の隣接アミノ酸を有する中央に位置するＳＮＰ変異を含む。いくつかの態様では、ペプチドエピトープは、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、またはＴ細胞エピトープとＢ細胞エピトープの組み合わせである。いくつかの態様では、ペプチドエピトープは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ及び少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む。いくつかの態様では、少なくとも３０％のエピトープが、ＭＨＣクラスＩエピトープであるか、または少なくとも３０％のエピトープがＭＨＣクラスＩＩエピトープである。
【００２４】
一実施形態では、目的の抗原は、少なくとも１つの細菌抗原、例えば、同じまたは別々のｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）上にコードされる少なくとも１つの細菌抗原及び免疫増強剤構築物を含む細菌ワクチンである。一態様では、本開示は、免疫増強剤構築物と共に１つ以上の細菌抗原をコードするｍＲＮＡを含む細菌ワクチンを提供し、ここで細菌抗原及び免疫増強剤は、同じまたは異なるｍＲＮＡによってコードされる。したがって、一態様では、本開示は、１つ以上の細菌抗原を含む細菌ワクチン（例えば、多価ワクチン）（例えば、１つ以上の化学修飾ｍＲＮＡによってコードされる）を提供し、ここでこの細菌抗原は、同じｍＲＮＡまたは異なるｍＲＮＡによってコードされる（例えば、各細菌抗原は別々のｍＲＮＡ構築物にコードされている）。いくつかの態様では、細菌抗原は、免疫増強剤構築物と同じｍＲＮＡ構築物にコードされるか、または免疫増強剤として異なるｍＲＮＡ構築物にコードされる。免疫増強剤及び細菌性抗原（複数可）ｍＲＮＡを、それを必要とする対象に処方（または共処方）及び投与（同時または順次）して、その対象において細菌性抗原（複数可）に対する免疫応答を刺激してもよい。
【００２５】
いくつかの実施形態では、細菌ワクチンは、予防的処置を提供する（すなわち感染を予防する）ために対象に投与される。いくつかの実施形態では、細菌ワクチンを対象に投与して、治療的処置を提供する（すなわち感染を処置する）。いくつかの実施形態では、細菌ワクチンは対象において体液性免疫応答（すなわち、目的の細菌性抗原に特異的な抗体の産生）を誘導する。いくつかの実施形態では、細菌ワクチンは対象において適応免疫応答を誘導する。適切な細菌の非限定的な例としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが挙げられる。
【００２６】
一実施形態では、目的の抗原は多価抗原であり（すなわち、この抗原は、同じかまたは異なるエピトープを含む複数の抗原性ペプチドなどの複数の抗原性エピトープを含み）、それによって多価抗原に対する免疫応答を増強する。一態様では、多価抗原はコンカテマー抗原である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡワクチンは、２〜１００個のペプチドエピトープ（例えば、同じまたは異なるエピトープ）から構成されるコンカテマー抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む。一実施形態では、多価抗原はがん抗原である。別の実施形態では、多価抗原は細菌抗原である。多価抗原の非限定的な例は、本明細書に記載されている。
【００２７】
本開示のｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）構築物（例えば、免疫増強剤ｍＲＮＡ、抗原コードｍＲＮＡ、またはそれらの組み合わせ）は、例えば、５’ＵＴＲ、ポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ及び連結されたヌクレオシドの３’テーリング領域を含み得る。一実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位をさらに含む。
【００２８】
一実施形態では、本開示の修飾ｍＲＮＡ構築物は、完全に修飾されている。例えば、一実施形態では、ｍｍＲＮＡは、シュードウリジン（Ψ）、シュードウリジン（Ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２−チオウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）またはＮ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。別の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、または２’−Ｏ−メチルウリジン、またはそれらの組み合わせを含む。さらに別の実施形態では、ｍｍＲＮＡは、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（Ψ）、α−チオ−グアノシン、またはα−チオ−アデノシン、またはそれらの組み合わせを含む。
【００２９】
別の態様では、本開示は、本開示のｍＲＮＡ（例えば、修飾ｍＲＮＡ）を含む脂質ナノ粒子に関する。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、リポソームである。別の実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性及び／またはイオン性脂質を含む。一実施形態では、カチオン性及び／またはイオン性脂質は、２，２−ジリノレイル−４−メチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）またはジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）である。一実施形態では、この脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子の外面にコンジュゲートした標的化部分をさらに含む。
【００３０】
別の態様では、本開示は、本開示のｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）または本開示の脂質ナノ粒子、ならびに薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物に関する。
【００３１】
いくつかの態様では、本開示は、各ｍＲＮＡが同じまたは異なる脂質ナノ粒子担体中に処方されている、上記または関連の実施形態のいずれか１つの免疫調節治療用組成物を提供する。いくつかの態様では、目的の抗原（複数可）（例えば、がん抗原、ウイルス抗原、細菌抗原）をコードする各ｍＲＮＡを、同じまたは異なる脂質ナノ粒子担体中に処方する。いくつかの態様では、目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強する免疫増強剤をコードする各ｍＲＮＡを、同じまたは異なる脂質ナノ粒子担体中に処方する。いくつかの態様では、目的の抗原（複数可）をコードする各ｍＲＮＡを、同じ脂質ナノ粒子担体に処方し、免疫増強剤をコードする各ｍＲＮＡを異なる脂質ナノ粒子担体に処方する。いくつかの態様では、目的の抗原（複数可）をコードする各ｍＲＮＡを、同じ脂質ナノ粒子担体中に処方し、免疫増強剤をコードする各ｍＲＮＡを、目的の抗原（複数可）をコードする各ｍＲＮＡと同じ脂質ナノ粒子担体中に処方する。いくつかの態様では、目的の抗原（複数可）をコードする各ｍＲＮＡを、異なる脂質ナノ粒子担体に処方し、免疫増強剤をコードする各ｍＲＮＡを、目的の各抗原（複数可）（例えば、がん抗原、ウイルス抗原、細菌抗原）をコードする各ｍＲＮＡと同じ脂質ナノ粒子担体に処方する。
【００３２】
いくつかの態様では、本開示は、免疫調節治療組成物が脂質ナノ粒子中に処方され、この脂質ナノ粒子が約２０〜６０％のイオン性アミノ脂質：５〜２５％のリン脂質：２５〜５５％のステロール；及び０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質というモル比を含む、前述の実施形態のうちのいずれか１つの免疫調節治療組成物を提供する。いくつかの態様では、イオン性アミノ脂質は、例えば、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカン二酸（Ｌ３１９）からなる群より選択される。
【００３３】
いくつかの態様では、本開示は、各ｍＲＮＡが少なくとも１つの化学修飾を含む、上記または関連の実施形態のいずれか１つの免疫調節治療用組成物を提供する。いくつかの態様では、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メチルウリジン、５−メチルウリジン、５−メトキシウリジン、及び２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群より選択される。
【００３４】
他の態様では、本開示は、薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子担体を提供し、ここで、この薬学的組成物は、以下を含む：
（ｉ）ＨＰＶ抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；またはＨＰＶ１６抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；または
ＨＰＶ１８抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；または
少なくとも１つのＨＰＶ  Ｅ６抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；または
少なくとも１つのＨＰＶ  Ｅ７抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；または
少なくとも１つのＨＰＶ  Ｅ６抗原及び少なくとも１つのＨＰＶ  Ｅ７抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；ならびに
（ｉｉ）構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；ならびに
薬学的に許容される担体または賦形剤。
【００３５】
前述の脂質ナノ粒子担体のいくつかの態様では、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドは、変異体Ｖ１５５Ｍを含む。いくつかの態様では、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、少なくとも１つのｍｉＲ−１２２マイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲを含む。いくつかの態様では、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号１９９、１３１９または１３２０に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００３６】
いくつかの態様では、本開示は、約２０〜６０％のイオン性アミノ脂質：５〜２５％のリン脂質：２５〜５５％のステロール；及び０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質というモル比を含む、前述の実施形態のうちのいずれか１つの脂質ナノ粒子を提供する。いくつかの態様では、イオン性アミノ脂質は、例えば、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカン二酸（Ｌ３１９）からなる群より選択される。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、化合物２５（イオン性アミノ脂質として）、ＤＳＰＣ（リン脂質として）、コレステロール（ステロールとして）、及びＰＥＧ−ＤＭＧ（ＰＥＧ修飾脂質として）を含む。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約２０〜６０％の化合物２５：５〜２５％のＤＳＰＣ：２５〜５５％のコレステロール；及び０．５〜１５％のＰＥＧ−ＤＭＧのモル比を含む。一実施形態では、この脂質ナノ粒子は、約５０％の化合物２５：約１０％のＤＳＰＣ：約３８．５％のコレステロール：約１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧというモル比（すなわち、化合物２５：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧを約５０：１０：３８．５：１．５の比率）を含む。一実施形態では、この脂質ナノ粒子は、５０％の化合物２５：１０％のＤＳＰＣ：３８．５％のコレステロール：１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧというモル比（すなわち、化合物２５：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧ＝５０：１０：３８．５：１．５の比率）を含む。
【００３７】
いくつかの態様では、本開示は、治療、例えば、予防的または治療的処置（例えば、がん療法）で使用するための前述の、または関連する脂質ナノ粒子担体のいずれかを含むワクチンなどの医薬品を、必要に応じてそのような治療における使用説明書と共に提供する。
【００３８】
前述の医薬品またはワクチンに関するいくつかの態様では、本開示は、薬学的組成物を含む第１の脂質ナノ粒子担体を提供し、ここでこの薬学的組成物は、少なくとも１つの目的の第１の抗原（少なくとも１つのがん抗原、ウイルス抗原、細菌抗原）をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【００３９】
いくつかの態様では、本開示は、薬学的組成物を含む第２の脂質ナノ粒子担体を提供し、この薬学的組成物は、少なくとも１つの目的の第２の抗原（例えば、少なくとも１つのがん抗原、ウイルス抗原、細菌抗原））をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【００４０】
いくつかの態様では、本開示は、薬学的組成物を含む第３の脂質ナノ粒子担体を提供し、ここで、この薬学的組成物は、少なくとも１つの目的の第３の抗原（例えば、少なくとも１つのがん抗原、ウイルス抗原、細菌抗原）をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【００４１】
いくつかの態様では、本開示は、薬学的組成物を含む第４の脂質ナノ粒子担体を提供し、ここで、この薬学的組成物は、少なくとも１つの目的の第４の抗原（例えば、少なくとも１つの、例えば、がん抗原、ウイルス抗原、細菌抗原）をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【００４２】
他の態様では、本開示は、薬学的組成物を含む第１の脂質ナノ粒子担体を提供し、ここで、この薬学的組成物は、少なくとも１つのＨＰＶ抗原（例えば、少なくとも１つのＥ６抗原及び／または少なくとも１つのＥ７抗原）をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【００４３】
いくつかの態様では、本開示は、薬学的組成物を含む第２の脂質ナノ粒子担体を提供し、ここで、この薬学的組成物は、少なくとも１つの第２のＨＰＶ抗原（例えば、少なくとも１つのＥ６抗原及び／または少なくとも１つのＥ７抗原）をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【００４４】
いくつかの態様では、本開示は、薬学的組成物を含む第３の脂質ナノ粒子担体を提供し、ここでこの薬学的組成物は、少なくとも１つの第３のＨＰＶ抗原（例えば、少なくとも１つのＥ６抗原及び／または少なくとも１つのＥ７抗原）をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【００４５】
いくつかの態様では、本開示は、薬学的組成物を含む第４の脂質ナノ粒子担体を提供し、ここでこの薬学的組成物は、少なくとも１つの第４のＨＰＶ抗原（例えば、少なくとも１つのＥ６抗原及び／または少なくとも１つのＥ７抗原）をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【００４６】
前述の医薬品またはワクチンのいくつかの態様では、第１、第２、第３及び第４の脂質ナノ粒子担体のそれぞれは、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長を含むペプチド抗原を含む。いくつかの態様では、各ペプチド抗原は、２５アミノ酸長を含む。
【００４７】
前述の第１、第２、第３及び第４の脂質ナノ粒子担体のいくつかの態様では、ＨＰＶ抗原（複数可）は、配列番号３６〜７２に示されるアミノ酸配列のうちの１つ以上を含む。いくつかの態様では、ＨＰＶ抗原（複数可）は、配列番号７３〜９４に記載のアミノ酸配列のうちの１つ以上を含む。
【００４８】
前述の第１、第２、第３及び第４の脂質ナノ粒子担体のいくつかの態様では、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドは、変異Ｖ１５５Ｍを含む。いくつかの態様では、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドは、少なくとも１つのｍｉＲ−１２２マイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲを含む。いくつかの態様では、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号１９９、１３１９または１３２０に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００４９】
いくつかの態様では、本開示は、予防的または治療的処置（例えば、がん療法）で使用するための前述または関連する脂質ナノ粒子担体のいずれかを含む、ワクチンなどの医薬品を、必要に応じて療法での使用説明書と共に提供する。いくつかの態様では、本開示は、がん治療に使用するための前述の第１、第２、第３及び第４の脂質ナノ粒子担体のいずれかを含む、ワクチンなどの医薬品を、必要に応じてがん治療に使用するための説明書と共に提供する。
【００５０】
いくつかの態様では、本開示は、予防的または治療的処置（例えば、がん療法）で使用するための第１、第２、第３及び第４脂質ナノ粒子担体を含む、ワクチンなどの医薬品を、必要に応じて療法で使用するための説明書と共に提供し、ここで：
（ｉ）第１の脂質ナノ粒子担体は、薬学的組成物を含み、この薬学的組成物は、少なくとも１つの目的の第１の抗原（例えば、少なくとも１つのがん抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、例えば、少なくとも１つのＥ６抗原及び／または少なくとも１つのＥ７抗原））をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含み；
（ｉｉ）第２の脂質ナノ粒子担体は、薬学的組成物を含み、この薬学的組成物は、少なくとも１つの目的の第２の抗原（例えば、がん抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、例えば、少なくとも１つのＥ６抗原及び／または少なくとも１つのＥ７抗原）をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む；
（ｉｉｉ）第３の脂質ナノ粒子担体は、薬学的組成物を含み、この薬学的組成物は、少なくとも１つの目的の第３の抗原（例えば、がん抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、例えば、少なくとも１つのＥ６抗原及び／または少なくとも１つのＥ７抗原）をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含み；そして
（ｉｖ）第４の脂質ナノ粒子担体は、薬学的組成物を含み、この薬学的組成物は、少なくとも１つの目的の第４の抗原（例えば、がん抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、例えば、少なくとも１つのＥ６抗原及び／または少なくとも１つのＥ７抗原）をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ；及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【００５１】
前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、対象を処置するための方法であって、それを必要とする対象に前述のもしくは関連する免疫調節治療組成物のいずれか、または前述のもしくは関連する脂質ナノ粒子担体のいずれかを投与することを包含する、方法を提供する。いくつかの態様では、免疫調節治療組成物または脂質ナノ粒子担体は、別の治療剤（例えば、がん治療剤）と組み合わせて投与される。いくつかの態様では、免疫調節治療組成物または脂質ナノ粒子担体は、阻害性チェックポイントポリペプチドと組み合わせて投与される。いくつかの態様では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ及びＬＡＧ３からなる群より選択される分子に特異的に結合する抗体またはその断片である。
【００５２】
いくつかの態様では、本開示は、目的の抗原をコードするｍＲＮＡ及び目的の抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチド（例えば、免疫増強剤、例えば、ＳＴＩＮＧポリペプチド）をコードするｍＲＮＡを含む組成物（例えば、ワクチン）を提供し、ここで、目的の抗原（Ａｇ）をコードするｍＲＮＡ及び目的の抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチド（例えば、免疫増強剤（ＩＰ）、例えば、ＳＴＩＮＧポリペプチド）をコードするｍＲＮＡは、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１または２０：１というＡｇ：ＩＰ質量比で処方される。あるいは、ＩＰ：Ａｇ質量比は、例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０または１：２０であってもよい。いくつかの態様では、組成物は、目的の抗原に対する免疫を増強するポリペプチド（例えば、免疫増強剤、例えば、ＳＴＩＮＧポリペプチド）をコードするｍＲＮＡに対して、目的の抗原をコードするｍＲＮＡの５：１という質量比で処方される（すなわち、５：１のＡｇ：ＩＰ比、あるいは１：５のＩＰ：Ａｇ比）。いくつかの態様では、組成物は、目的の抗原に対する免疫を増強するポリペプチド（例えば、免疫増強剤、例えば、ＳＴＩＮＧポリペプチド）をコードするｍＲＮＡに対して、目的の抗原をコードするｍＲＮＡの質量比１０：１で処方される（すなわち、Ａｇ：ＩＰ比が１０：１、あるいはＩＰ：Ａｇ比が１：１０である）。
【００５３】
別の態様では、本開示は、目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強する方法であって、目的の抗原に対する免疫応答が対象で増強されるように、目的の抗原（複数可）をコードする開示のｍｍＲＮＡ組成物及び目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するポリペプチド、もしくはその脂質ナノ粒子、またはそれらの薬学的組成物をそれを必要とする対象に投与することを包含する方法に関する。一態様では、対象における免疫応答を増強することは、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−α）産生を刺激することを包含する。別の態様では、対象における免疫応答を増強することは、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞活性、例えば、初回刺激、増殖及び／または生存を刺激すること（例えば、エフェクター／メモリーＴ細胞集団を増大させること）を包含する。一態様では、対象における免疫応答を増強することは、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞活性を刺激すること（例えば、ヘルパーＴ細胞活性を増大させること）を包含する。他の態様では、対象における免疫応答を増強することは、Ｂ細胞応答を刺激すること（例えば、抗体産生を増大させること）を包含する。
【００５４】
いくつかの態様では、対象における免疫応答の増強は、サイトカイン産生の刺激、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の刺激、抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパー細胞応答の刺激、エフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞集団の増大、Ｂ細胞活性の刺激または抗原特異的抗体産生の刺激、または前述の応答の任意の組み合わせを包含する。
【００５５】
いくつかの態様では、増強された免疫応答は、サイトカイン産生を刺激することを包含し、ここでこのサイトカインとはＩＦＮ−γもしくはＴＮＦ−α、またはその両方である。いくつかの態様では、増強された免疫応答は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激することを包含し、ここで抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖またはＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生またはその両方を含む。いくつかの態様では、ＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生は、少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％増大する。
【００５６】
いくつかの態様では、増強された免疫応答は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含み、ここでＣＤ８＋Ｔ細胞応答はＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を含み、そして総Ｔ細胞集団中のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％増大する。
【００５７】
いくつかの態様では、増強された免疫応答は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含み、ここでＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのエフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞の割合の増大を含む。
【００５８】
別の態様では、本開示は、目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するための方法に関し、この方法は、それを必要とする対象に目的の抗原（複数可）をコードする開示のｍＲＮＡ組成物及び目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するポリペプチド、もしくはその脂質ナノ粒子、またはそれらの薬学的組成物を投与することを包含し、その結果、目的の抗原に対する免疫応答が対象において増強され、目的の抗原に対する免疫応答が、１０日超、１５日超、２０日超、２５日超、３０日超、４０日超、５０日超、６０日超、７０日超、８０日超、９０日超、１００、１２０、１５０、２００、２５０、３００日を超えて、または１年以上維持される。
【００５９】
一態様では、本開示は、目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するための方法を提供し、ここでこの対象は、２つの異なる免疫増強剤ｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）構築物（一方または両方の構築物が、目的の抗原（複数可）をコードするｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）構築物もまたコードするか、または投与される）を、同時にまたは連続的に投与される。一態様では、Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達を刺激する免疫増強剤ｍｍＲＮＡ組成物を対象に投与する前に、樹状細胞の発達または活性を刺激する免疫増強剤ｍＲＮＡ組成物を対象に投与する。
【００６０】
他の態様では、本開示は、それを必要とする対象において腫瘍に対する免疫応答を刺激する方法を提供し、ここでこの方法は、腫瘍抗原（複数可）をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ構築物、及び腫瘍抗原（複数可）、もしくはその脂質ナノ粒子、またはその薬学的組成物に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ構築物を含む組成物の有効量を対象に投与することを包含し、その結果、腫瘍に対する免疫応答がその対象において刺激される。一態様では、腫瘍は、肝臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫癌、子宮頸癌、または頭頸部癌である。いくつかの態様では、対象はヒトである。
【００６１】
一実施形態では、本開示は、それを必要とする対象においてヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連がんを予防または治療する方法を提供し、この方法は、以下：（ｉ）少なくとも１つの目的のＨＰＶ抗原、及び（ｉｉ）少なくとも１つの目的のＨＰＶ抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチド、をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ構築物を含む組成物を対象に投与することを包含し、その結果、少なくとも１つの目的のＨＰＶ抗原に対する免疫応答が増強される。一実施形態では、少なくとも１つの目的のＨＰＶ抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するポリペプチドは、ＳＴＩＮＧポリペプチドである。一実施形態では、少なくとも１つのＨＰＶ抗原は、少なくとも１つのＥ６抗原、少なくとも１つのＥ７抗原、または少なくとも１つのＥ６抗原と少なくとも１つのＥ７抗原との組み合わせ（例えば、可溶性または細胞内型のＥ６及び／またはＥ７）である。一実施形態では、少なくとも１つのＨＰＶ抗原及びポリペプチドは、別々のｍＲＮＡ上にコードされており、そして対象への投与の前に脂質ナノ粒子中で共処方されている。あるいは、ＨＰＶ抗原（複数可）及びポリペプチドは、同じｍＲＮＡ上にコードされてもよい。一実施形態では、対象はＨＰＶへの曝露の危険性があり、この組成物はＨＰＶへの曝露の前に投与される。別の実施形態では、対象はＨＰＶに感染しているか、またはＨＰＶ関連がんを患っている。一実施形態では、ＨＰＶ関連がんは、子宮頸癌、陰茎癌、膣癌、外陰癌、肛門癌及び口腔咽頭癌からなる群より選択される。一実施形態では、がんを有する対象はまた、免疫チェックポイント阻害剤で処置される。
【００６２】
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象において病原体に対する免疫応答を刺激する方法を提供し、この方法は、病原体抗原（複数可）をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ構築物、及び病原体抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ構築物、もしくはその脂質ナノ粒子を含む有効量の組成物またはその薬学的組成物を対象に投与することを包含し、その結果、その病原体に対する免疫応答がその対象において刺激される。一態様では、この病原体は、ウイルス、細菌、原生動物、真菌及び寄生生物からなる群より選択される。一態様では、この病原体は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）などのウイルスである。一態様では、病原体は細菌である。一態様では、対象はヒトである。
【００６３】
任意の前述のまたは関連する態様では、本開示は、脂質ナノ粒子と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様では、薬学的組成物は、筋肉内送達用に処方されている。
【００６４】
任意の前述のまたは関連する態様では、本開示は、個体における免疫応答を増強する（例えば、個体におけるがんの進行を処置または遅延させる）際に使用するための脂質ナノ粒子、及び任意の薬学的に許容される担体、または薬学的組成物を提供し、ここで、この処置は、組成物を第２の組成物と組み合わせて投与することを包含し、ここでこの第２の組成物は、チェックポイント阻害剤ポリペプチド及び任意の薬学的に許容される担体を含む。
【００６５】
任意の前述のまたは関連する態様では、本開示は、個体における免疫応答を増強する（例えば、個体におけるがんの進行を処置または遅延する）ための医薬の製造における、脂質ナノ粒子及び任意の薬学的に許容される担体の使用を提供し、ここでこの医薬は脂質ナノ粒子及び任意の薬学的に許容される担体を含み、この処置は、必要に応じてチェックポイント阻害剤ポリペプチド及び任意の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせて、この医薬の投与を包含する。
【００６６】
任意の前述のまたは関連する態様では、本開示は、脂質ナノ粒子を含む容器、及び任意の薬学的に許容される担体、または薬学的組成物、ならびに個体における免疫応答を増強する（例えば、個体におけるがんの進行を治療または遅延させる）ための脂質ナノ粒子または薬学的組成物の投与の説明書を含む添付文書を備えるキットを提供する。いくつかの態様では、この添付文書は、脂質ナノ粒子または薬学的組成物を単独で、または個体における免疫応答を増強する（例えば、個体におけるがんの進行を処置または遅延させる）ためのチェックポイント阻害剤ポリペプチド及び任意の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせて投与するための説明書をさらに含む。
【００６７】
任意の前述のまたは関連する態様では、本開示は、脂質ナノ粒子、及び任意の薬学的に許容される担体、または薬学的組成物を含む医薬、ならびに単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチド及び個体における免疫応答を増強する（例えば、個体においてがんの進行を処置または遅延する）ための任意の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせた医薬の投与のための説明書を含む添付文書を備えるキットを提供する。いくつかの態様では、このキットは、個体における免疫応答を増強する（例えば、個体におけるがんの進行を処置または遅延させる）ための第２の医薬の投与の前、それと同時、またはその後の第１の医薬の投与の説明書を含む添付文書をさらに備える。
【００６８】
任意の前述のまたは関連する態様では、本開示は、本明細書に記載の脂質ナノ粒子、組成物、もしくはその使用、または脂質ナノ粒子もしくは組成物を含むキットを提供し、ここでチェックポイント阻害剤ポリペプチドがＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、またはそれらの組み合わせを阻害する。いくつかの態様では、このチェックポイント阻害剤ポリペプチドは、抗体である。いくつかの態様では、このチェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ１に特異的に結合する抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、及びそれらの組み合わせから選択される抗体である。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブから選択される抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、トレメリムマブまたはイピリムマブから選択される抗ＣＴＬＡ−４抗体である。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ニボルマブまたはペンブロリズマブから選択される抗ＰＤ１抗体である。
【００６９】
関連する態様では、本開示は、本開示の前述のもしくは関連する脂質ナノ粒子のいずれか、または本開示の前述のもしくは関連する組成物のいずれかを対象に投与することを包含する、それを必要とする対象において、腫瘍のサイズを減少もしくは縮小するか、または腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。
【００７０】
関連態様では、本開示は、本開示の前述もしくは関連脂質ナノ粒子のいずれか、または本開示の前述もしくは関連組成物のいずれかを対象に投与することを包含する、がんを有する対象において抗腫瘍応答を誘導する方法を提供する。いくつかの態様では、抗腫瘍反応はＴ細胞反応を含む。いくつかの態様では、Ｔ細胞応答はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
【００７１】
前述の方法のいくつかの態様では、この組成物は筋肉内注射によって投与される。
【００７２】
前述の方法のいくつかの態様では、この方法は、チェックポイント阻害剤ポリペプチド及び任意の薬学的に許容される担体を含む第２の組成物を投与することをさらに包含する。いくつかの態様では、このチェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、またはそれらの組み合わせを阻害する。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは抗体である。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ１に特異的に結合する抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、及びそれらの組み合わせから選択される抗体である。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブから選択される抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、トレメリムマブまたはイピリムマブから選択される抗ＣＴＬＡ−４抗体である。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ニボルマブまたはペンブロリズマブから選択される抗ＰＤ１抗体である。
【００７３】
任意の前述の方法または関連する方法のいくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物は静脈内注射によって投与される。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物は、２〜３週間に１回投与される。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物は、２週間に１回または３週間に１回投与される。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物は、脂質ナノ粒子またはその薬学的組成物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、構成的に活性なＳＴＩＮＧ  ｍＲＮＡ構築物でトランスフェクトされたＴＦ１ａ細胞におけるＩＦＮ−β産生の刺激を示す棒グラフである。
【図２】図２は、構成的に活性なＳＴＩＮＧ構築物によるインターフェロン感受性応答エレメント（ＩＳＲＥ）の活性化を示す棒グラフである。ＳＴＩＮＧバリアント２３ａ及び２３ｂは、配列番号１に相当し、ＳＴＩＮＧバリアント４２は、配列番号２に相当し、ＳＴＩＮＧバリアント１９、２１ａ及び２１ｂは、配列番号３に相当し、ＳＴＩＮＧバリアント４１は、配列番号４に相当し、ＳＴＩＮＧバリアント４３は、配列番号５に相当し、ＳＴＩＮＧバリアント４５は、配列番号６に相当し、ＳＴＩＮＧバリアント４６は、配列番号７に相当し、ＳＴＩＮＧバリアント４７は、配列番号８に相当し、ＳＴＩＮＧバリアント５６は、配列番号９に相当し、そしてＳＴＩＮＧバリアント５７は、配列番号１０に相当する。
【図３】図３Ａ〜図３Ｂは、構成的に活性なＩＲＦ３構築物（図３Ａ）または構成的に活性なＩＲＦ７構築物（図３Ｂ）によるインターフェロン感受性応答エレメント（ＩＳＲＥ）の活性化を示す棒グラフである。ＩＲＦ３バリアント１、３及び４は、配列番号１２に相当し、ＩＲＦ３バリアント２及び５は、配列番号１１に相当する（バリアントは異なるタグを有する）。ＩＲＦ７バリアント３６は、配列番号１８に相当し、バリアント３１は、配列番号１８のマウスバージョンである。ＩＲＦ７バリアント３２は、配列番号１７に相当し、ＩＲＦ７バリアント３３は、配列番号１４に相当する。
【図４】図４は、構成的に活性なｃＦＬＩＰ及びＩＫＫβｍＲＮＡ構築物によるＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化を示す棒グラフである。
【図５】図５は、構成的に活性なＲＩＰＫ１  ｍＲＮＡ構築物によるＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化を示すグラフである。
【図６】図６は、ＤＩＡＢＬＯ  ｍＲＮＡ構築物でトランスフェクトされたＳＫＯＶ３細胞におけるＴＮＦ−α誘導を示す棒グラフである。
【図７】図７は、ＤＩＡＢＬＯ  ｍＲＮＡ構築物でトランスフェクトされたＳＫＯＶ３細胞におけるインターロイキン６（ＩＬ−６）誘導を示す棒グラフである。
【図８】図８〜図８Ｂは、初回免疫後２１日目にＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３またはＩＲＦ７免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物のいずれかと共処方されたＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７ワクチン構築物で免疫したマウス由来のＣＤ８＋脾細胞の細胞内染色（ＩＣＳ）を示すグラフである。図８Ａは、ＩＦＮ−γＩＣＳに対するＥ７特異的応答を示す。図８Ｂは、ＴＮＦ−αＩＣＳに対するＥ７特異的応答を示す。
【図９】図９Ａ〜図９Ｂは、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３またはＩＲＦ７免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物のいずれかと共処方されたＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７ワクチン構築物で免疫したマウス由来のＣＤ８＋脾細胞の細胞内染色（ＩＣＳ）を示すグラフである。図９Ａは、ＩＦＮ−γＩＣＳに対するＥ６特異的応答を示す。図９Ｂは、ＴＮＦ−αＩＣＳに対する６７特異的応答を示す。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｂは、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３またはＩＲＦ７免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物のいずれかと共処方されたＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７ワクチン構築物で免疫されたマウス由来の２１日目（図１０Ａ）または５３日目（図１０Ｂ）のＣＤ８＋脾細胞のＩＦＮ−γ細胞内染色（ＩＣＳ）に対するＥ７特異的応答を示すグラフである。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｂは、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３またはＩＲＦ７免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物のいずれかと共処方されたＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７ワクチン構築物で免疫されたマウス由来の２１日目及び５３日目のＩＦＮ−γについてのＣＤ８＋脾細胞の細胞内染色（ＩＣＳ）を示すグラフである。図１１Ａは、細胞内Ｅ６／Ｅ７で免疫したマウス由来のＥ７特異的応答を示す。図１１Ｂは、可溶性Ｅ６／Ｅ７で免疫されたマウス由来のＥ７特異的応答を示す。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｂは、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３またはＩＲＦ７免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物のいずれかと共処方されたＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７ワクチン構築物で免疫されたマウス由来の２１日目（図１２Ａ）または５３日目（図１２Ｂ）の脾臓細胞についての生きたＣＤ４５＋細胞のうちのＣＤ８ｂ＋細胞の割合を示すグラフである。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｂは、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３またはＩＲＦ７免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物のいずれかと共処方されたＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７ワクチン構築物で免疫したマウス由来の２１日目（図１３Ａ）または５３日目（図１３Ｂ）のＣＤ８ｂ＋脾細胞のＥ７−ＭＨＣ１−四量体（エピトープＲＡＨＹＮＩＶＴＦに特異的）染色を示すグラフである。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｄは、２１日目対５３日目のＥ７四量体＋ＣＤ８細胞の比較において、Ｅ７四量体＋ＣＤ８＋細胞の大部分が「エフェクターメモリー」ＣＤ６２Ｌｌｏ表現型を有することを示すグラフであり、これによって、この研究全体を通じてこの「エフェクターメモリー」ＣＤ６２Ｌｌｏ表現型が維持されたことが示される。図１４Ａ（２１日目）及び図１４Ｂ（５３日目）は、エフェクターメモリーＣＤ６２Ｌｌｏ表現型を有するＣＤ８の増大％を示す。図１４Ｃ及び図１４Ｄは、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３またはＩＲＦ７免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物のいずれかと共処方されたＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７ワクチン構築物でマウスを免疫した場合、Ｅ７−四量体＋ＣＤ８の増大％がＣＤ６２Ｌｌｏであることを示す。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｂは、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３またはＩＲＦ７免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物のいずれかと共処方された、ＭＣ３８ネオ抗原ワクチン構築物（ＡＤＲｖａｘ）で免疫したマウス由来の２１日目（図１５Ａ）または３５日目（図１５Ｂ）のＣＤ８＋脾細胞のＩＦＮ−  細胞内染色（ＩＣＳ）によるＭＣ３８ネオ抗原特異的応答を示すグラフである。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｂは、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３またはＩＲＦ７免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物のいずれかと共処方されたＭＣ３８ネオ抗原ワクチン構築物（ＡＤＲｖａｘ）で免疫したマウス由来の、脾臓もしくはＰＢＭＣ中の生存ＣＤ４５＋細胞のうちのＣＤ８ｂ＋細胞の割合（図１６Ａ）、または脾臓もしくはＰＢＭＣ中のＣＤ８ｂ＋細胞のうちのＣＤ６２Ｌｌｏ細胞の割合（図１６Ｂ）を示すグラフである。
【図１７】図１７は、示された細菌抗原ｍＲＮＡ構築物単独（０．２μｇ）で処理されたマウス、またはＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物と共処方された細菌ペプチドｍＲＮＡ構築物で処理されたマウス由来の抗体価比較を示すグラフである。
【図１８】図１８は、ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌを使用して同定された結腸直腸癌におけるＮＲＡＳ及びＫＲＡＳの変異体頻度を示す。
【図１９】ＨＰＶ  Ｅ７を発現するＴＣ１腫瘍によるチャレンジの前またはチャレンジ時のいずれかにおいて、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７構築物と共にＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物を用いて示されるように予防的に処置された（単独で、または６、９及び１２日目に抗ＣＴＬＡ−４もしくは抗ＰＤ１処置と組み合わせて）マウス由来の腫瘍容積を示すグラフであり、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７＋ＳＴＩＮＧ処置による腫瘍増殖の阻害を示している。あるマウスを可溶性Ｅ６／Ｅ７＋ＳＴＩＮＧ（図１９Ａ）または細胞内Ｅ６／Ｅ７＋ＳＴＩＮＧ（図１９Ｂ）で−１４及び−７日目に処置し、１日目には腫瘍チャレンジを伴った。他のマウスは１日目に及び８日目に、可溶性Ｅ６／Ｅ７＋ＳＴＩＮＧ（図１９Ｃ）を用いて処置し、１日目には腫瘍チャレンジした。
【図２０Ａ−Ｃ】図２０Ａ〜２０Ｉは、ＨＰＶ  Ｅ７を発現するＴＣ１腫瘍でのチャレンジの後の、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７構築物と共にＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物を用いて（図２０Ａ）、単独で、または１３、１６及び１９日目の抗ＣＴＬＡ−４処置（図２０Ｂ）、または１３、１６及び１９日目の抗ＰＤ１処置（図２０Ｃ）と組み合わせて、示されるように治療的に処置されたマウス由来の腫瘍容積を示すグラフであり、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７＋ＳＴＩＮＧ処置による腫瘍増殖の阻害を示している。図２０Ｄ〜図２０Ｉは、マウスＳＴＩＮＧリガンドＤＭＸＡＡによる処置を示す。
【図２０Ｄ−Ｆ】図２０Ａ〜２０Ｉは、ＨＰＶ  Ｅ７を発現するＴＣ１腫瘍でのチャレンジの後の、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７構築物と共にＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物を用いて（図２０Ａ）、単独で、または１３、１６及び１９日目の抗ＣＴＬＡ−４処置（図２０Ｂ）、または１３、１６及び１９日目の抗ＰＤ１処置（図２０Ｃ）と組み合わせて、示されるように治療的に処置されたマウス由来の腫瘍容積を示すグラフであり、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７＋ＳＴＩＮＧ処置による腫瘍増殖の阻害を示している。図２０Ｄ〜図２０Ｉは、マウスＳＴＩＮＧリガンドＤＭＸＡＡによる処置を示す。
【図２０Ｇ−Ｉ】図２０Ａ〜２０Ｉは、ＨＰＶ  Ｅ７を発現するＴＣ１腫瘍でのチャレンジの後の、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７構築物と共にＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物を用いて（図２０Ａ）、単独で、または１３、１６及び１９日目の抗ＣＴＬＡ−４処置（図２０Ｂ）、または１３、１６及び１９日目の抗ＰＤ１処置（図２０Ｃ）と組み合わせて、示されるように治療的に処置されたマウス由来の腫瘍容積を示すグラフであり、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７＋ＳＴＩＮＧ処置による腫瘍増殖の阻害を示している。図２０Ｄ〜図２０Ｉは、マウスＳＴＩＮＧリガンドＤＭＸＡＡによる処置を示す。
【図２１】図２１は、２００ｍｍ３容積サイズ（上のグラフ）または３００ｍｍ３容積サイズ（下のグラフ）の腫瘍を有するマウスにおいてＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物と共にＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７構築物を用いて示されるように治療的に処置されたマウス由来の腫瘍容積を示すグラフを提供する。
【図２２】最初の免疫後２１日目に、示されたＡｇ：ＳＴＩＮＧ比でＳＴＩＮＧ免疫増強剤と共処方されたＡＤＲワクチン構築物で免疫されたマウス由来のＩＦＮ−γについてのＣＤ８＋脾細胞の細胞内染色（ＩＣＳ）を示すグラフである。ＣＤ８＋細胞を、変異体型ＡＤＲ抗原組成物（３つのペプチドを含む）または野生型ＡＤＲ組成物（対照として）のいずれかで再刺激した。
【図２３】最初の免疫後２１日目に、示されたＡｇ：ＳＴＩＮＧ比でＳＴＩＮＧ免疫増強剤と共処方されたＡＤＲワクチン構築物で免疫されたマウス由来のＴＮＦ−αについてのＣＤ８＋脾細胞の細胞内染色（ＩＣＳ）を示すグラフである。ＣＤ８＋細胞を、変異体ＡＤＲ抗原組成物（３つのペプチドを含む）または野生型ＡＤＲ組成物（対照として）のいずれかを用いて再刺激した。
【図２４Ａ−Ｂ】図２４Ａ〜２４Ｃは、最初の免疫後２１日目に、示されたＡｇ：ＳＴＩＮＧ比でＳＴＩＮＧ免疫増強剤と共処方されたＡＤＲワクチン構築物で免疫されたマウス由来のＩＦＮ−γについてのＣＤ８＋脾細胞の細胞内染色（ＩＣＳ）を示すグラフである。ＣＤ８＋細胞を、ＡＤＲ抗原組成物内に含まれる変異体または野生型（対照として）ペプチドのいずれかで再刺激した。図２４Ａは、ＡＤＲ組成物内のＡｄｐｋ１ペプチドに対する応答を示す。図２４Ｂは、ＡＤＲ組成物内のＲｅｐｓ１ペプチドに対する応答を示す。図２４Ｃは、ＡＤＲ組成物内のＤｐａｇｔ１ペプチドに対する応答を示す。
【図２４Ｃ】図２４Ａ〜２４Ｃは、最初の免疫後２１日目に、示されたＡｇ：ＳＴＩＮＧ比でＳＴＩＮＧ免疫増強剤と共処方されたＡＤＲワクチン構築物で免疫されたマウス由来のＩＦＮ−γについてのＣＤ８＋脾細胞の細胞内染色（ＩＣＳ）を示すグラフである。ＣＤ８＋細胞を、ＡＤＲ抗原組成物内に含まれる変異体または野生型（対照として）ペプチドのいずれかで再刺激した。図２４Ａは、ＡＤＲ組成物内のＡｄｐｋ１ペプチドに対する応答を示す。図２４Ｂは、ＡＤＲ組成物内のＲｅｐｓ１ペプチドに対する応答を示す。図２４Ｃは、ＡＤＲ組成物内のＤｐａｇｔ１ペプチドに対する応答を示す。
【図２５】図２５は、示した異なるＡｇ：ＳＴＩＮＧ比での、ＣＡ−１３２とＳＴＩＮＧ免疫増強剤の共処方で処置したマウス由来の、ＩＦＮ−γについてのＥＬＩＳｐｏｔ分析によって測定された、ＣＡ−１３２ワクチン内のＭＨＣクラスＩエピトープに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を示すグラフである。
【図２６】図２６は、示された異なるＡｇ：ＳＴＩＮＧ比でのＣＡ−１３２及びＳＴＩＮＧ免疫増強剤の共処方を用いて処置したマウス由来の、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔ分析によって測定された、ＣＡ−８７ペプチドでの再刺激後の、ＣＡ−１３２ワクチン内のＭＨＣクラスＩエピトープに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を示す棒グラフである。
【図２７】図２７は、最初の免疫後２１日目に、示されたＡｇ：ＳＴＩＮＧ比で、ＳＴＩＮＧ免疫増強剤と共処方されたＨＰＶ１６  Ｅ７ワクチン構築物を用いて免疫されたマウス由来のＩＦＮ−γについてのＣＤ８＋脾細胞の細胞内染色（ＩＣＳ）を示すグラフである。
【図２８】図２８Ａ〜図２８Ｃは、ＨＰＶワクチン＋ＳＴＩＮＧ構築物で処理し、続いてＨＰＶ１６  Ｅ６ペプチドプール（図２８Ａ）、ＨＰＶ１６  Ｅ７ペプチド（図２８Ｂ）または培地（陰性対照）（図２８Ｃ）のいずれかでエキソビボ刺激した、カニクイザル由来のＣＤ８＋Ｔ細胞についてのＴＮＦ  細胞内染色（ＩＣＳ）結果を示す棒グラフである。
【図２９】図２９Ａ〜図２９Ｃは、ＨＰＶワクチン＋ＳＴＩＮＧ構築物で処理し、続いてＨＰＶ１６  Ｅ６ペプチド（図２９Ａ）、ＨＰＶ１６  Ｅ７ペプチド（図２９Ｂ）または培地（陰性対照）（図２９Ｃ）のいずれかでエキソビボ刺激したカニクイザル由来のＣＤ８＋Ｔ細胞についてのＩＬ−２細胞内染色（ＩＣＳ）結果を示す棒グラフである。
【図３０】図３０は、ＨＰＶワクチン＋ＳＴＩＮＧ構築物で処置したカニクイザル由来の血清中の抗Ｅ６  ＩｇＧについてのＥＬＩＳＡ結果を示すグラフである。
【図３１】図３１は、ＨＰＶワクチン＋ＳＴＩＮＧ構築物で処置したカニクイザル由来の血清中の抗Ｅ７  ＩｇＧについてのＥＬＩＳＡ結果を示すグラフである。
【図３２】図３２は、変異体ＫＲＡＳワクチン＋ＳＴＩＮＧ構築物で免疫し、続いてＫＲＡＳ−Ｇ１２Ｖペプチドでエキソビボ刺激したマウス由来のＩＦＮ−γについてのＣＤ８＋脾細胞についての細胞内染色（ＩＣＳ）の結果を示すグラフである。
【図３３】図３３は、変異体ＫＲＡＳワクチン＋ＳＴＩＮＧ構築物で免疫し、続いてＫＲＡＳ−Ｇ１２Ｄペプチドでエキソビボ刺激したマウス由来のＩＦＮ−γについてのＣＤ８＋脾細胞についての細胞内染色（ＩＣＳ）の結果を示すグラフである。
【図３４】図３４は、変異体ＫＲＡＳワクチン＋ＳＴＩＮＧ構築物で免疫し、続いてＫＲＡＳ−Ｇ１２ＶでパルスしたＣｏｓ７−Ａ１１細胞とエキソビボで共培養したマウス由来のＩＦＮ−γについての細胞内染色（ＩＣＳ）結果またはＣＤ８＋脾細胞を示すグラフである。
【図３５】図３５は、変異体ＫＲＡＳワクチン＋ＳＴＩＮＧ構築物で免疫し、続いてＫＲＡＳ−Ｇ１２ＤでパルスしたＣｏｓ７−Ａ１１細胞とエキソビボで共培養したマウス由来のＩＦＮ−γについての細胞内染色（ＩＣＳ）結果またはＣＤ８＋脾細胞を示すグラフである。
【図３６】図３６は、ＳＴＩＮＧを含むＡ１１ウイルスエピトープコンカテマーまたは翻訳不能ｍＲＮＡ対照（ＮＴＦＩＸ）構築物で免疫し、続いて個々のウイルスエピトープでのエキソビボ刺激したマウス由来のＩＦＮ−γについての細胞内染色（ＩＣＳ）結果またはＣＤ８＋脾細胞を示すグラフである。
【図３７】図３７は、初回免疫後２１日目の、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３／ＩＲＦ７またはＩＲＦ３／ＩＲＦ７／ＩＫＫβ免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物のいずれかと共処方したＨＰＶワクチン構築物で免疫したマウス由来のＣＤ８＋脾細胞の細胞内染色（ＩＣＳ）を示すグラフである。図３７Ａは、ＩＦＮ−γＩＣＳに対するＥ７特異的応答を示す。図３７Ｂは、ＴＮＦ−αＩＣＳに対するＥ７特異的応答を示す。
【図３８】図３８Ａは、初回免疫後２５日目に、ＳＴＩＮＧ、ＴＡＫ１、ＴＲＡＭまたはＭｙＤ８８免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物のいずれかと共処方した、ＯＶＡ抗原で免疫したマウス由来のＣＤ８＋脾細胞の細胞内染色（ＩＣＳ）を示すグラフである。図３８Ａは、ＩＦＮ−γＩＣＳに対するＯＶＡ特異的応答を示す。図３８Ｂは、ＴＮＦ−αＩＣＳに対するＯＶＡ特異的応答を示す。図３８Ｃは、ＩＬ−２  ＩＣＳに対するＯＶＡ特異的応答を示す。
【図３９】図３９は、初回免疫後２１日目の、ＳＴＩＮＧ、ＭＡＶＳ、ＩＫＫβ、カスパーゼ１＋カスパーゼ４＋ＩＫＫβ、ＭＬＫＬまたはＭＬＫＬ＋ＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物のいずれかと共処方したＯＶＡ抗原で免疫したマウス由来のＩＦＮ−γについてのＣＤ８＋脾細胞の細胞内染色（ＩＣＳ）を示す棒グラフである。ＳＴＩＮＧの化学活性剤であるＤＭＸＡＡを比較因子として使用した。
【図４０】図４０は、初回免疫後５０日目の、ＳＴＩＮＧ、ＭＡＶＳ、ＩＫＫβ、カスパーゼ１＋カスパーゼ４＋ＩＫＫβ、ＭＬＫＬまたはＭＬＫＬ＋ＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物のいずれかと共処方したＯＶＡ抗原で免疫したマウス由来のＩＦＮ−γについてのＣＤ８＋脾細胞の細胞内染色（ＩＣＳ）を示す棒グラフである。ＳＴＩＮＧの化学活性剤であるＤＭＸＡＡを比較因子として使用した。
【図４１】図４１Ａ〜図４１Ｂは、示された構成的に活性なＳＴＩＮＧ変異体体構築物と共処方または同時投与されたＯＶＡ抗原で免疫されたマウス由来のＩＦＮ−γについてのＣＤ８＋脾細胞の細胞内染色（ＩＣＳ）を示す棒グラフである。図４１Ａは、免疫後２１日目を示す。図４１Ｂは、初回免疫後９０日目を示す。
【図４２】図４２は、ＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物と共処方されたＨＰＶワクチン構築物で免疫したＣＤ４枯渇マウス由来のＩＦＮ−γについてのＣＤ８＋脾細胞の細胞内染色（ＩＣＳ）を示す棒グラフである。図４２Ａは、初回免疫後２１日目を示す。図４２Ｂは、初回免疫後５０日目を示す。
【図４３】図４３は、ＨＰＶ−ＳＴＩＮＧワクチンを単独で、または抗ＣＤ４（ＣＤ４Ｔ細胞を枯渇させるため）または抗ＣＤ８（ＣＤ８Ｔ細胞を枯渇させるため）と組み合わせて用いて処置したＴＣ１  ＨＰＶ腫瘍を有するマウスの腫瘍容積を示すグラフを示す。
【図４４】図４４Ａ〜図４４Ｂは、示されたＡｇ及びＳＴＩＮＧ投与量でＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物と共処方されたＭＣ３８抗原ワクチン構築物で免疫されたマウスの脾臓由来のＣＤ４ｈｉＣＤ８＋細胞のうちのＣＤ６２Ｌｌｏ細胞の割合を示すグラフである。図４４Ａは、２１日目の脾臓細胞に対する結果を示す。図４４Ｂは、５４日目の脾臓細胞に対する結果を示す。
【図４５】図４５は、標準的アジュバント、または処方していない（ＬＮＰ中にカプセル化されていない）と比較した場合の、ＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡと組み合わせた、２０個のマウスエピトープ（ＣＡ−１３２）のコンカテマーをコードするｍＲＮＡで免疫したマウス由来の抗原特異的ＩＦＮ−γＴ細胞応答を示す棒グラフである。示されたデータは、コンカテマー内にコードされたクラスＩＩエピトープ（ＣＡ−８２及びＣＡ−８３）を用いたインビトロペプチド再刺激についてのものである。
【図４６】図４６は、標準的アジュバント、または処方していない（ＬＮＰ中にカプセル化されていない）と比較した場合の、ＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡと組み合わせた２０個のマウスエピトープ（ＣＡ−１３２）のコンカテマーをコードするｍＲＮＡで免疫した、マウス由来の抗原特異的ＩＦＮ−γＴ細胞応答を示す棒グラフである。示されたデータは、コンカテマー内にコードされたクラスＩエピトープ（ＣＡ−８７、ＣＡ−９０及びＣＡ−９３）を用いたインビトロペプチド再刺激についてのものである。
【図４７】図４７は、ＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡと組み合わせた２０個のマウスエピトープ（ＣＡ−１３２）のコンカテマーをコードするｍＲＮＡで免疫したマウス由来の抗原特異的ＩＦＮ−γＴ細胞応答を示す棒グラフであり、ここでＳＴＩＮＧ構築物は、２４時間後または４８時間後、ワクチンと同時に投与された。示されているデータは、コンカテマー内にコードされているクラスＩＩエピトープ（ＣＡ−８２及びＣＡ−８３）またはクラスＩエピトープ（ＣＡ−８７、ＣＡ−９０及びＣＡ−９３）のいずれかによるインビトロペプチド再刺激についてのものである。
【図４８】図４８は、様々なＡｇ及びＳＴＩＮＧ投与量ならびにＡｇ：ＳＴＩＮＧ比で、ＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡと組み合わせた５２個のマウスエピトープのコンカテマーをコードするｍＲＮＡで免疫されたマウス由来の抗原特異的応答を示す。示されたデータは、コンカテマー内にコードされたクラスＩＩエピトープＣＡ−８２に相当するペプチド配列を用いたインビトロ再刺激についてのものである。
【図４９】図４９は、様々なＡｇ及びＳＴＩＮＧ投与量ならびにＡｇ：ＳＴＩＮＧ比で、ＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡと組み合わせた５２個のマウスエピトープのコンカテマーをコードするｍＲＮＡで免疫されたマウス由来の抗原特異的応答を示す。示されたデータは、コンカテマー内にコードされたクラスＩＩエピトープＣＡ−８３に相当するペプチド配列を用いたインビトロ再刺激についてのものである。
【図５０】図５０は、様々なＡｇ及びＳＴＩＮＧ投与量ならびにＡｇ：ＳＴＩＮＧ比で、ＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡと組み合わせた５２個のマウスエピトープのコンカテマーをコードするｍＲＮＡで免疫したマウス由来の抗原特異的応答を示す。示されたデータは、コンカテマー内にコードされたクラスＩエピトープＣＡ−８７に相当するペプチド配列を用いたインビトロ再刺激についてのものである。
【図５１】図５１は、様々なＡｇ及びＳＴＩＮＧ投与量ならびにＡｇ：ＳＴＩＮＧ比で、ＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡと組み合わせた５２個のマウスエピトープのコンカテマーをコードするｍＲＮＡで免疫されたマウス由来の抗原特異的応答を示す。示されているデータは、コンカテマー内にコードされているクラスＩエピトープＣＡ−９３に相当するペプチド配列を用いたインビトロ再刺激についてのものである。
【図５２】図５２は、様々なＡｇ及びＳＴＩＮＧ投与量ならびにＡｇ：ＳＴＩＮＧ比で、ＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡと組み合わせた５２個のマウスエピトープのコンカテマーをコードするｍＲＮＡで免疫されたマウス由来の抗原特異的応答を示す。示されているデータは、コンカテマー内にコードされているクラスＩエピトープＣＡ−１１３に相当するペプチド配列を用いたインビトロ再刺激についてのものである。
【図５３】図５３は、様々なＡｇ及びＳＴＩＮＧ投与量ならびにＡｇ：ＳＴＩＮＧ比で、ＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡと組み合わせて５２個のマウスエピトープのコンカテマーをコードするｍＲＮＡで免疫されたマウス由来の抗原特異的応答を示す。示されたデータは、コンカテマー内にコードされたクラスＩＩエピトープＣＡ−９０に相当するペプチド配列を用いたインビトロ再刺激についてのものである。
【図５４】図５４は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ−Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いて測定した、ＭＬＫＬ１−１８０  ｍＲＮＡ構築物でトランスフェクトされたＨｅｐ３Ｂ細胞の細胞生存率を示す棒グラフである。
【図５５】図５５は、ＹＯＹＯ−３（登録商標）細胞生存率読み取り値を用いて測定した、ＭＬＫＬ１−１８０ｍＲＮＡ構築物でトランスフェクトされたＨｅｐ３Ｂ細胞の細胞生存率を示すグラフである。
【図５６】図５６は、ＭＬＫＬ１−１８０  ｍＲＮＡ構築物を用いてトランスフェクトされたＨｅｐ３Ｂ細胞からのＡＴＰ放出を示すグラフであり、ネクロトーシスを示している。
【図５７】図５７は、ＭＬＫＬ１−１８０  ｍＲＮＡ構築物を用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞からのＨＭＧＢ１放出を示すグラフであり、ネクロトーシスを示している。
【図５８】図５８は、ニセトランスフェクトされたか、アポトーシス誘導構築物（「ＰＵＭＡ」）を用いてトランスフェクトされたか、またはＭＬＫＬ構築物を用いてトランスフェクトされた細胞上のカルレティキュリンの細胞表面染色を示すグラフであり、ＭＬＫＬ構築物によるネクロトーシスを示している。
【図５９Ａ−Ｂ】図５９Ａ〜図５９Ｃは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ−Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いて測定した、ＭＬＫＬ、ＧＳＤＭＤまたはＲＩＰ３ＫのｍＲＮＡ構築物でトランスフェクトされた、ＨｅＬａ細胞（図５９Ａ）、Ｂ１６Ｆ１０細胞（図５９Ｂ）またはＭＣ３８細胞（図５９Ｃ）の細胞生存率を示す棒グラフである。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１対Ｌ２Ｋ  ＃＃ｐ＜０．０１対ＨｓＭＬＫＬ（１〜１８０）。
【図５９Ｃ】図５９Ａ〜図５９Ｃは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ−Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いて測定した、ＭＬＫＬ、ＧＳＤＭＤまたはＲＩＰ３ＫのｍＲＮＡ構築物でトランスフェクトされた、ＨｅＬａ細胞（図５９Ａ）、Ｂ１６Ｆ１０細胞（図５９Ｂ）またはＭＣ３８細胞（図５９Ｃ）の細胞生存率を示す棒グラフである。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１対Ｌ２Ｋ  ＃＃ｐ＜０．０１対ＨｓＭＬＫＬ（１〜１８０）。
【図６０】図６０は、多量体化ＲＩＰＫ３  ｍＲＮＡ構築物を用いてトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞における死の誘導を示す棒グラフである。
【図６１】図６１は、多量体化ＲＩＰＫ３構築物を用いてトランスフェクトされたＢ１６Ｆ１０細胞におけるＤＡＭＰ放出（ＨＭＧＢ１放出）の誘導を示す棒グラフであり、ネクロトーシスを示している。
【図６２】図６２は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ−Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いて測定した、ＤＩＡＢＬＯ  ｍＲＮＡ構築物を用いてトランスフェクトされたＳＫＯＶ３細胞の細胞生存率を示す棒グラフである。
【図６３】図６３は、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５またはカスパーゼ−１１のｍＲＮＡ構築物を用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における細胞死の誘導を示す棒グラフである。結果は、４回の独立した実験からの平均±ＳＥＭを示す。
【図６４】図６４は、ＮＬＲＰ３、ＰｙｒｉｎまたはＡＳＣ  ｍｍＲＮＡ構築物を用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における細胞死の誘導を示す棒グラフである。結果は、４回の独立した実験からの平均±ＳＥＭを示す。
【図６５】図６５Ａ〜図６５Ｂは、構成的に活性なＩＲＦ３構築物（図６５Ａ）またはＩＲＦ７構築物（図６５Ｂ）によるインターフェロン感受性応答エレメント（ＩＳＲＥ）の活性化を示す棒グラフである。
【図６６】図６６は、図６７に示す実験結果に対する研究デザインの概略図である。
【図６７】図６７は、図示されるように免疫増強剤で初回刺激され、示されるようにカスパーゼ−４、カスパーゼ−５またはカスパーゼ−１１構築物を用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞によるＩＬ−１８の放出を示す棒グラフである。
【図６８Ａ−Ｄ】図６８Ａ〜６８Ｋは、マウスにおけるＭＣ３８腫瘍の増殖に対する、単独でまたは示された免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて、示された実行型ｍＲＮＡ構築物を用いた処置の効果を示すグラフである。
【図６８Ｅ−Ｈ】図６８Ａ〜６８Ｋは、マウスにおけるＭＣ３８腫瘍の増殖に対する、単独でまたは示された免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて、示された実行型ｍＲＮＡ構築物を用いた処置の効果を示すグラフである。
【図６８Ｉ−Ｋ】図６８Ａ〜６８Ｋは、マウスにおけるＭＣ３８腫瘍の増殖に対する、単独でまたは示された免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて、示された実行型ｍＲＮＡ構築物を用いた処置の効果を示すグラフである。
【図６９】図６９Ａ〜６９Ｂは、マウスにおけるＭＣ３８腫瘍の増殖（図６９Ａ）及びマウスの生存率（図６９Ｂ）に対する、示された実行型ｍＲＮＡ構築物を用いて、単独でまたは示された免疫増強剤及び／または免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた処置の効果を示すグラフである。
【図７０】図７０Ａ〜図７０Ｂは、マウスにおけるＭＣ３８腫瘍の増殖に対する（図７０Ａ）及びマウスの生存率に対する（図７０Ｂ）、ビヒクル単独またはＮＴ対照＋抗ＰＤ−１と比較した、抗ＰＤ−１と組み合わせたＳＴＩＮＧ  ｍＲＮＡ構築物での処置の効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
詳細な説明
本開示は、本明細書で免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物または免疫増強剤ｍＲＮＡ、例としては、化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）と呼ばれる、目的の抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ構築物などの組成物を提供する。本開示の免疫増強剤ｍＲＮＡは、例えば、目的の抗原に対する抗原特異的応答が刺激されるように、Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達を活性化すること、ＮＦκＢ経路シグナル伝達を刺激すること、またはその両方によって免疫応答を増強する。本開示の免疫増強剤ｍＲＮＡは、免疫増強剤ｍＲＮＡが投与される対象において内因性抗原に対する免疫応答を増強するか、または免疫増強剤ｍＲＮＡと共に対象に投与される外因性抗原（例えば、免疫増強剤ｍＲＮＡまたは免疫増強剤ｍＲＮＡとは別に処方され投与される目的の抗原をコードするｍＲＮＡ構築物と共処方され同時投与される目的の抗原をコードするｍＲＮＡ構築物）に対する免疫応答を増強する。
【００７６】
驚くべきことに、本開示の免疫増強剤ｍＲＮＡ（例えば、構成的に活性なＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）または免疫増強剤ｍＲＮＡの組み合わせの対象への投与は、サイトカイン産生（例えば、炎症性サイトカイン産生）を刺激し、抗原特異的ＣＤ８＋エフェクター細胞応答を刺激し、抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパー細胞応答を刺激し、エフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞集団を増大させ、目的の抗原に対する抗原特異的抗体産生を刺激することが発見された。
【００７７】
実施例に詳細に記載されるように、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物（または免疫増強剤ｍＲＮＡの組み合わせ）の投与は、抗原に応答して、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα及び／またはＩＬ−２）についてＩＣＳによって陽性であるＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を増大させ、全Ｔ細胞集団のうちのＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を増大させることが見出された（例えば、実施例５及び図８〜１２）。注目すべきことに、これらの効果は、１つ以上のサイトカインについてＩＣＳによって陽性の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のさらに高い割合がインビボで最大７週間維持されたため、耐久性であった（図１１）。免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物（または免疫増強剤ｍＲＮＡの組み合わせ）の投与は、エフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞集団を増大させること（例えば、実施例５、６、及び実施例１９）、及びこの効果は経時的に維持されること（実施例１９及び図４４）も見出された。重要なことに、抗原特異的Ｔ細胞応答及びｍＲＮＡワクチンに対する抗体応答の増強もまた、非ヒト霊長類において実証された（例えば、実施例１２及び図２８〜３１）。
【００７８】
細菌ワクチンの状況では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物の投与は、インビボで抗原特異的抗体応答を増大させることによって細菌ワクチンに対する体液性応答を増強することが示されている（例えば、実施例７及び図１７）。
【００７９】
がんワクチンの状況では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物の投与は、がんのネオエピトープに対する頑強で耐久性のある免疫応答をもたらすことが示され（実施例６）、そして発がん性ウイルスワクチンによる予防的及び治療的ワクチン接種において腫瘍増殖を強力に阻害することが示された（実施例１０）。例えば、ＨＰＶワクチン接種と一緒の免疫増強剤ｍＲＮＡの投与は、インビボでのＨＰＶ発現腫瘍細胞の増殖の予防（図１９）において有効であり（単独でまたはチェックポイント阻害剤と組み合わせて）、及び免疫増強剤ｍＲＮＡと一緒に（単独でまたはチェックポイント阻害剤と組み合わせて）ＨＰＶワクチンを用いた治療的ワクチン接種（すなわち、腫瘍チャレンジの後）は、インビボでＨＰＶ発現腫瘍の退行を誘導するのに有効であった（図２０）。注目すべきことに、治療用ワクチンと共に免疫増強剤ｍＲＮＡを投与することはまた、インビボで大きな確立された腫瘍を阻害することにおいて有効性を示した（図２１）。
【００８０】
個別化がんワクチンの状況では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物の投与は、クラスＩ及びクラスＩＩ  ＭＣＨ応答の両方を誘導する個別化がんワクチン（コンカテマー）をコードするｍＲＮＡに対する抗原特異的Ｔ細胞応答及び抗体応答を増強することが示されている（例えば、実施例２０及び図４５〜５３）。免疫増強剤ｍＲＮＡの投与はまた、様々な形式（モノマー及びコンカテマー）のＫＲＡＳがん抗原をコードするｍＲＮＡに対する免疫応答を増強することも見出された（例えば、実施例１３及び図３２〜３６）。
【００８１】
Ｉ型インターフェロン誘導因子及びＮＦκＢ活性化因子をコードする免疫増強剤ｍＲＮＡ（例えば、実施例１４及び図３７）の組み合わせ、ならびにＴＬＲの下流で機能する細胞内シグナル伝達経路の構成要素をコードする免疫増強剤ｍＲＮＡの組み合わせ（例えば、実施例１５及び図３８）が抗原特異的Ｔ細胞応答を増強することもまた実証された。アダプタータンパク質（例えば、ＳＴＩＮＧまたはＭＡＶＳ）、ＮＦκＢ活性化剤（例：ＩＫＫβ）、インフラマソームの誘導因子（例えば、カスパーゼ１／４）及びネクロトソームの誘導因子（例えば、ＭＬＫＬ）をコードする免疫増強剤ｍＲＮＡの追加の組み合わせはまた、抗原特異的Ｔ細胞応答を増強することが示されている。驚くべきことに、アダプタータンパク質をコードするｍＲＮＡ（例えば、ＳＴＩＮＧ）とネクロトソームの誘導因子をコードするｍＲＮＡ（例えば、ＭＬＫＬ）との組み合わせは、ＭＬＫＬ単独をコードするｍＲＮＡと比較して高い活性を示した（例えば、実施例１６及び図３９〜４０）。９０日目の結果によって、免疫増強効果が持続的であったことが実証されている（例えば、実施例１８及び図４１）。
【００８２】
意外にも、免疫増強剤（Ａｇ：ＩＰ）比に対する抗原の大部分にわたる免疫増強剤（例えば、ＳＴＩＮＧ）をコードするｍＲＮＡの添加は、抗原単独と比較して抗原特異的Ｔ細胞応答を改善することが見出された（例えば、実施例２０）。応答性の幅は予想外であった。試験した６つの抗原（エピトープ）のうち４つについて、免疫増強剤をコードするｍＲＮＡの抗原への添加は、抗原単独よりも一貫してより高いＴ細胞応答を生じた。かくして、免疫原性を改善するために、抗原対免疫増強剤の比に広い釣鐘曲線があることが発見された。
【００８３】
試験した全ての抗原にわたって免疫増強剤（例えば、ＳＴＩＮＧ）をコードするｍＲＮＡを添加すると、抗原単独と比較して抗原に対する免疫応答が増強されることも発見された。ほとんどの場合、免疫増強の少なくとも２倍の増大が見られ、そして特定の抗原については、免疫増強のさらに一層の増強が生じた（例えば、５倍超、１０倍超、２０倍超、３０倍超、５０倍超、または７５倍超の増強）（例えば、実施例２１）。
【００８４】
したがって、本開示は、１つ以上のｍＲＮＡ構築物（例えば、１つ以上のｍｍＲＮＡ構築物）を含む組成物を提供し、ここで１つ以上のｍＲＮＡ構築物は、目的の抗原（複数可）をコードし、同じまたは別々のｍＲＮＡ構築物では、目的の抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、本開示は、単独でまたは目的の抗原をコードするｍＲＮＡと組み合わせて免疫応答を増強する、免疫増強剤ｍＲＮＡを含むナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子を提供する。本開示はまた、本明細書に記載の任意のｍＲＮＡまたはナノ粒子、例えば、本明細書に記載の任意のｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含む薬学的組成物も提供する。
【００８５】
別の態様では、本開示は、ネクロトーシスまたはパイロトーシスなどの免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードする１つ以上のｍＲＮＡ構築物（例えば、１つ以上のｍｍＲＮＡ構築物）を含む組成物を提供する。そのようなｍＲＮＡ構築物を、本開示の免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物と組み合わせて使用して、インビボでの内因性抗原の放出を増強し、それによって内因性抗原に対する免疫応答を刺激し得る。いくつかの態様では、本開示は、免疫原性細胞死誘導ｍＲＮＡを単独でまたは免疫増強剤ｍＲＮＡと組み合わせて含む、ナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子を提供する。本開示はまた、本明細書に記載の任意のｍＲＮＡまたはナノ粒子、例えば、本明細書に記載の任意のｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含む薬学的組成物を提供する。
【００８６】
他の態様では、本開示は、対象に免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物を単独で（内因性抗原のために）投与することによって、または目的の抗原（複数可）をコードする１つ以上のｍＲＮＡ、及び目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、またはそれらの脂質ナノ粒子、またはそれらの薬学的組成物を投与することによって、目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強して、その結果目的の抗原に対する免疫応答が、対象において増強される方法を提供する。免疫応答を増強する方法は、例えば、対象において腫瘍に対する免疫原性応答を刺激するため、対象において病原体に対する免疫原性応答を刺激するため、または対象においてワクチンに対する免疫応答を増強するために使用されてもよい。
【００８７】
免疫増強剤ｍＲＮＡ
本開示の一態様は、目的の１つ以上の抗原に対する免疫応答を刺激または増強するポリペプチドをコードするｍＲＮＡに関する。目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するそのようなｍＲＮＡは、本明細書において、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物または免疫増強剤ｍＲＮＡ、例としては、化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）と呼ばれる。本開示の免疫増強剤は、対象における目的の抗原に対する免疫応答を増強する。増強された免疫応答は、細胞性応答、体液性応答、またはその両方であり得る。本明細書中で使用される場合、「細胞性」免疫応答とは、Ｔ細胞を含むかまたはそれによって媒介される免疫応答を包含することを意図し、一方、「体液性」免疫応答とは、Ｂ細胞を含むかまたはそれによって媒介される免疫応答を包含することを意図する。免疫増強剤は、例えば、以下によって免疫応答を増強し得る、
（ｉ）Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉ）ＮＦκＢ経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉｉ）炎症反応を刺激すること；
（ｉｖ）サイトカイン産生を刺激すること；または
（ｖ）樹状細胞の発達、活性または動員を刺激すること；及び
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかの組み合わせ。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達を刺激すること」とは、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達経路の１つ以上の構成要素の活性化（例えば、そのような構成要素のリン酸化、二量体化などの改変であって、それによって経路を活性化するための改変）、インターフェロン感受性応答エレメント（ＩＳＲＥ）からの転写の刺激、及び／またはＩ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ及び／またはＩＦＮ−ω）の産生もしくは分泌の刺激を包含するものとする。本明細書中で使用される場合、「ＮＦκＢ経路シグナル伝達を刺激すること」とは、ＮＦκＢシグナル伝達経路の１つ以上の構成要素の活性化（例えば、そのような構成要素のリン酸化、二量体化などの改変であって、それによって経路を活性化するための改変）、ＮＦκＢ部位からの転写を刺激すること、及び／またはその発現がＮＦκＢによって調節される遺伝子産物の産生を刺激することを包含するものとする。本明細書中で使用される場合、「炎症反応を刺激すること」とは、炎症性サイトカイン（限定するものではないが、Ｉ型インターフェロン、ＩＬ−６及び／またはＴＮＦαを含む）の産生を刺激することを包含するものとする。本明細書中で使用される場合、「樹状細胞の発達、活性または動員を刺激すること」とは、樹状細胞の成熟、増殖及び／または機能的活性を直接的または間接的に刺激することを包含するものとする。
【００８９】
特定の実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、例えば、免疫増強剤の非存在下での抗原に対する免疫応答に比べて、または抗原に対する免疫応答を増強する低分子アゴニストに比べて、目的の抗原に対する免疫応答を何倍も増強する。例えば、様々な実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、目的の抗原に対する免疫応答を、例えば、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物の非存在下での抗原に対する免疫応答と比較して、または例えば、抗原に対する免疫応答の低分子アゴニストの存在下での抗原に対する免疫応答と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、７．５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、またはそれ以上増強する。いくつかの実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、目的の抗原に対する免疫応答を、例えば、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物の非存在下での抗原に対する免疫応答と比較して、または例えば、抗原に対する免疫応答の低分子アゴニストの存在下での抗原に対する免疫応答と比較して、０．３〜１０００倍、１〜７５０倍、５〜５００倍、７〜２５０倍、または１０〜１００倍増強する。免疫増強剤構築物の倍数増強は、当該技術分野において公知の標準的な方法を用いて（例えば、実施例に記載されるように）測定され得る。例えば、炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ及び／またはＴＮＦ−α）を発現する抗原特異的Ｔ細胞のレベルは、実施例に記載されるように、例えば、細胞内染色（ＩＣＳ）またはＥＬＩＳｐｏｔ分析によって評価され得る。
【００９０】
いくつかの態様では、本開示は、例えば、適応免疫を誘導すること（例えば、Ｉ型インターフェロン産生を刺激することにより）、炎症応答を刺激すること、ＮＦκＢシグナル伝達を刺激すること、及び／または対象における樹状細胞（ＤＣ）の発達、活性もしくは動員を刺激することによって、それを必要とする対象において免疫応答を刺激または増強する（例えば、その対象における免疫応答を増強する）ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを提供する。いくつかの態様では、それを必要とする対象への免疫増強剤ｍＲＮＡの投与は、対象において、細胞性免疫（例えば、Ｔ細胞媒介性免疫）、体液性免疫（例えば、Ｂ細胞媒介性免疫）、または細胞性免疫及び体液性免疫の両方を増強する。いくつかの態様では、免疫増強剤ｍＲＮＡの投与は、サイトカイン産生（例えば、炎症性サイトカイン産生）を刺激するか、抗原特異的ＣＤ８＋エフェクター細胞応答（細胞性免疫）を刺激するか、抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパー細胞応答を刺激するか、エフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞集団を増大するか、Ｂ細胞活性を刺激するか、または抗原特異的抗体産生を刺激し、これには前述の応答の組み合わせを包含する。いくつかの態様では、免疫増強剤ｍＲＮＡの投与は、サイトカイン産生（例えば、炎症性サイトカイン産生）を刺激し、抗原特異的ＣＤ８＋エフェクター細胞応答を刺激する。いくつかの態様では、免疫増強剤ｍＲＮＡの投与は、サイトカイン産生（例えば、炎症性サイトカイン産生）を刺激し、抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパー細胞応答を刺激する。いくつかの態様では、免疫増強剤ｍＲＮＡの投与は、サイトカイン産生（例えば、炎症性サイトカイン産生）を刺激し、エフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞集団を増大する。いくつかの態様では、免疫増強剤ｍＲＮＡの投与は、サイトカイン産生（例えば、炎症性サイトカイン産生）を刺激し、Ｂ細胞活性を刺激するか、または抗原特異的抗体産生を刺激する。
【００９１】
一実施形態では、免疫増強剤は、抗原特異的ＣＤ８＋エフェクター細胞応答（細胞性免疫）を増大させる。例えば、免疫増強剤は、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖及びＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生を含むがこれらに限定されない、抗原特異的ＣＤ８＋エフェクター細胞活性の１つ以上の指標を増大し得る。例えば、一実施形態では、免疫増強剤は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ、ＴＮＦα及び／またはＩＬ−２の産生を増大させる。様々な実施形態では、免疫増強剤は、抗原に応答してＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα及び／またはＩＬ−２産生）を（免疫増強剤の非存在下におけるＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生と比較して）少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％増大し得る。例えば、処置された対象から得られたＴ細胞を、目的の抗原を用いてインビトロで刺激してもよく、ＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生をインビトロで評価し得る。ＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生は、限定するものではないが、サイトカイン産生の分泌レベルの測定（例えば、ＥＬＩＳＡまたは上清中のサイトカイン量を決定するための当該技術分野で公知の他の適切な方法による）及び／またはサイトカインの細胞内染色（ＩＣＳ）について陽性であるＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の決定、を含む当該技術分野で公知の標準的な方法によって決定できる。例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα及び／またはＩＬ−２の発現のためのＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞内染色（ＩＣＳ）は、当該技術分野において公知の方法（例えば、実施例を参照のこと）によって実行され得る。一実施形態では、免疫増強剤は、抗原に応答して、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα及び／またはＩＬ−２）についてＩＣＳにより陽性であるＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を（免疫増強剤の非存在下でサイトカイン（複数可）に関してＩＣＳにより陽性であるＣＤ８＋Ｔ細胞の割合と比較して）、少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％増大する。
【００９２】
さらに別の実施形態では、免疫増強剤は、免疫増強剤の非存在下でのＣＤ８＋Ｔ細胞の割合と比較して、全Ｔ細胞集団（例えば、脾臓Ｔ細胞及び／またはＰＢＭＣ）のうちのＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を増大させる。例えば、免疫増強剤は、全Ｔ細胞集団のうちのＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を、免疫増強剤の非存在下でのＣＤ８＋Ｔ細胞の割合と比較して、少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％増大し得る。全Ｔ細胞集団のうちのＣＤ８Ｔ＋細胞の全割合は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を含むがこれらに限定されない当該技術分野において公知の標準的な方法によって決定され得る。
【００９３】
別の実施形態では、免疫増強剤は、免疫増強剤の非存在下における腫瘍容積と比較して、免疫増強剤の存在下におけるインビボでの腫瘍容積の減少によって決定されるように、腫瘍特異的免疫細胞応答を増大させる。例えば、免疫増強剤は、腫瘍容積を、免疫増強剤の非存在下での腫瘍容積と比較して、少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％低下し得る。腫瘍容積の測定は、当該技術分野において十分に確立されている方法によって決定され得る。
【００９４】
別の実施形態では、免疫増強剤は、例えば、免疫増強剤の非存在下での抗原特異的抗体産生と比較して、抗原特異的抗体産生量を増大させることによって、Ｂ細胞活性（体液性免疫応答）を増大させる。例えば、免疫増強剤は、抗原特異的抗体産生を、免疫増強剤の非存在下での抗原特異的抗体産生と比較して、少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％増大し得る。一実施形態では、抗原特異的ＩｇＧ産生が評価される。抗原特異的抗体産生は、試料（例えば、血清試料）中の抗原特異的抗体（例えば、ＩｇＧ）のレベルを測定する、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で十分確立された方法によって評価され得る。
【００９５】
別の実施形態では、免疫増強剤はエフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞集団を増大させる。例えば、免疫増強剤は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞の総％を増大し得る。他の機能のうちでも、エフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞集団は、リンパ球輸送において重要な機能を有することが示されている（例えば、Ｓｃｈｅｎｋｅｌ，Ｊ．Ｍ．及びＭａｓｏｐｕｓｔ，Ｄ．（２０１４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４１：８８６〜８９７を参照のこと）。様々な実施形態では、免疫増強剤は、抗原に応答してＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのエフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞の総割合を（免疫増強剤の非存在下でのＣＤ８＋Ｔ細胞集団のうちのＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞の総割合と比較して）少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％増大し得る。ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのエフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞の総割合は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の標準的な方法によって決定され得る。
【００９６】
目的の抗原に対する免疫応答を増強する免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物の能力は、長期間、例えば、９０日間もの期間にわたって増強された免疫原性が観察されることで、耐久性があることが示されている。したがって、様々な実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１１週間、少なくとも１２週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、または少なくとも３ヶ月、またはそれ以上の期間、抗原特異的免疫応答を増強し得る。
【００９７】
免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物が目的の抗原に対する免疫応答を増強する能力は、当該分野で公知のマウスモデル系において評価され得る。一実施形態では、イムノコンピテントなマウスモデル系が使用される。一実施形態では、マウスモデル系は、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスを含む（例えば、実施例に記載されるように、目的の抗原に対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を評価するため）。別の実施形態では、マウスモデル系は、ＢａｌｂＣマウスまたはＣＤ１マウスを含む（例えば、抗原特異的抗体応答などのＢ細胞応答を評価するために）。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本開示の免疫増強剤ポリペプチドは、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の下流で機能し、それによって免疫応答を増強する。したがって、一実施形態では、この免疫増強剤はＴＬＲではなく、受容体自体の下流のＴＬＲシグナル伝達経路内の分子である。
【００９９】
いくつかの実施形態では、このポリペプチドはＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を刺激する。免疫増強剤としての使用に適しているＩ型ＩＦＮ応答を刺激するポリペプチドの非限定的な例としては、ＳＴＩＮＧ、ＭＡＶＳ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＴＢＫ１、ＩＫＫα、ＩＫＫｉ、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＭ、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ４、ＴＲＩＦ、ＩＰＳ−１、ＲＩＧ−１、ＤＡＩ及びＩＦＩ１６が挙げられる。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を刺激するポリペプチドの具体例は、以下にさらに記載される。
【０１００】
別の実施形態では、ポリペプチドは、ＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激する。ＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激するポリペプチドの非限定的な例としては、ＳＴＩＮＧ、ｃ−ＦＬＩＰ、ＩＫＫβ、ＲＩＰＫ１、Ｂｔｋ、ＴＡＫ１、ＴＡＫ−ＴＡＢ１、ＴＢＫ１、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４、ＴＡＢ２、ＴＡＢ３、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＭ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６及びＭＫＫ７が挙げられる。ＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激するポリペプチドの具体例は以下にさらに記載される。
【０１０１】
別の実施形態では、ポリペプチドは細胞内アダプタータンパク質である。一実施形態では、細胞内アダプタータンパク質は、Ｉ型ＩＦＮ応答を刺激する。別の実施形態では、細胞内アダプタータンパク質は、ＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激する。細胞内アダプタータンパク質の非限定的な例としては、ＳＴＩＮＧ、ＭＡＶＳ及びＭｙＤ８８が挙げられる。細胞内アダプタータンパク質の具体例は以下にさらに記載される。
【０１０２】
別の実施形態では、ポリペプチドは、胞内シグナル伝達タンパク質である。一実施形態では、このペプチドは、ＴＬＲシグナル伝達経路の細胞内シグナル伝達タンパク質である。一実施形態では、この細胞内シグナル伝達タンパク質は、Ｉ型ＩＦＮ応答を刺激する。別の実施形態では、細胞内シグナル伝達タンパク質は、ＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激する。細胞内シグナル伝達タンパク質の非限定的な例としてはＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＴＡＫ１、ＴＡＢ２、ＴＡＢ３、ＴＡＫ−ＴＡＢ１、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＴＲＡＭ、ＴＲＩＦ、ＲＩＰＫ１、及びＴＢＫ１が挙げられる。細胞内シグナル伝達タンパク質の具体例は、以下にさらに記載される。
【０１０３】
別の実施形態では、ポリペプチドは転写因子である。一実施形態では、この転写因子はＩ型ＩＦＮ応答を刺激する。別の実施形態では、この転写因子はＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激する。転写因子の非限定的な例としては、ＩＲＦ３またはＩＲＦ７が挙げられる。転写因子の具体例は以下にさらに記載される。
【０１０４】
別の実施形態では、ポリペプチドはネクロトーシスまたはネクロトソーム形成に関与している。タンパク質がネクロトーシス自体を媒介するか、またはネクロトーシスの媒介及び／またはネクロトソーム形成においてさらなる分子と関与する場合、ポリペプチドは、ネクロトーシスまたはネクロトソーム形成に「関与している」。ネクロトーシスまたはネクロトソーム形成に関与するポリペプチドの非限定的な例としては、ＭＬＫＬ、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３、ＤＩＡＢＬＯ及びＦＡＤＤが挙げられる。ネクロトーシスまたはネクロトソーム形成に関与するポリペプチドの具体例は、以下にさらに記載される。
【０１０５】
別の実施形態では、ポリペプチドは、パイロトーシスまたはインフラマソーム形成に関与している。ポリペプチドは、タンパク質がそれ自体でパイロトーシスを媒介するか、またはパイロトーシスの媒介及び／またはインフラマソーム形成においてさらなる分子と関与する場合、パイロトーシスまたはインフラマソーム形成に「関与する」。パイロトーシスまたはインフラマソーム形成に関与するポリペプチドの非限定的な例としては、カスパーゼ１、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ１１、ＧＳＤＭＤ、ＮＬＲＰ３、Ｐｙｒｉｎドメイン及びＡＳＣ／ＰＹＣＡＲＤが挙げられる。パイロトーシスまたはインフラマソーム形成に関与するポリペプチドの具体例は、以下にさらに記載される。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、免疫増強剤をコードする本開示のｍＲＮＡは、１つ以上の修飾核酸塩基を含み得る。適切な修飾は、以下にさらに考察される。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、免疫増強剤をコードする本開示のｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子に処方される。一実施形態では、脂質ナノ粒子はさらに、目的の抗原をコードするｍＲＮＡを含む。一実施形態では、脂質ナノ粒子を対象に投与して、その対象における目的の抗原に対する免疫応答を増強する。適切なナノ粒子及び使用方法は、以下でさらに考察される。
【０１０８】
別の実施形態では、本開示は、２つ以上の免疫増強剤ｍＲＮＡの組み合わせを含む組成物を提供する。２つ以上の免疫増強剤ｍＲＮＡは、同じ種類の免疫増強剤（例えば、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を刺激する２つ以上の免疫増強剤）であってもよいし、または異なる種類の免疫増強剤であってもよい。したがって、一実施形態では、本開示は、対象における目的の抗原に対する免疫応答を増強する第１のポリペプチドをコードする第１のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、対象における目的の抗原に対する免疫応答を増強する第２のポリペプチドをコードする第２のｍＲＮＡ、及び、必要に応じて対象における目的の抗原に対する免疫応答を増強する第３のポリペプチドをコードする第３のｍＲＮＡ（及び必要に応じて、免疫増強剤をコードする第４、５、６またはそれ以上のｍＲＮＡ）を含む組成物を提供し、
ここでこの免疫応答は、以下：
（ｉ）Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉ）ＮＦκＢ経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉｉ）炎症反応を刺激すること；
（ｉｖ）サイトカイン産生を刺激すること；または
（ｖ）樹状細胞の発達、活性または動員を刺激すること；及び
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかの組み合わせ、
によって特徴付けられる細胞性免疫応答または体液性免疫応答を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、第１、第２及び／または必要に応じて第３のポリペプチド（及び必要に応じて第４、５、６またはそれ以上のポリペプチド）は、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の下流で機能し、それによって免疫応答を増強する。
【０１１０】
組み合わせ組成物の様々な実施形態では：
（ｉ）第１のポリペプチドは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を刺激し、そして第２のポリペプチドは、ＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激するか；
（ｉｉ）第１のポリペプチドは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を刺激し、そして第２のポリペプチドはネクロトーシスもしくはネクロトソーム形成に関与するか；
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を刺激し、そして第２のポリペプチドは、パイロトーシスもしくはインフラマソーム形成に関与するか；
（ｉｖ）第１のポリペプチドは、ＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激し、そして第２のポリペプチドは、ネクロトーシスもしくはネクロトソーム形成に関与するか；
（ｖ）第１のポリペプチドが、ＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激し、そして第２のポリペプチドが、パイロトーシスもしくはインフラマソーム形成に関与するか；
（ｖｉｉ）第１のポリペプチドがＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を刺激し、第２のポリペプチドがＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激し、そして第３のポリペプチドがネクロトーシスもしくはネクロトソーム形成に関与するか；または
（ｖｉｉｉ）第１のポリペプチドがＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を刺激し、第２のポリペプチドが、ＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激し、そして第３のポリペプチドが、パイロトーシスもしくはインフラマソーム形成に関与する。
【０１１１】
免疫増強剤のこれらのカテゴリーのそれぞれの適切な非限定的な例は、上に列挙されており、そして以下にさらに詳細に記載される。列挙された免疫増強剤の全ての組み合わせが企図される。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドはＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を刺激し、ＳＴＩＮＧ、ＭＡＶＳ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＴＢＫ１、ＩＫＫα、ＩＫＫｉ、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＭ、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ４、ＴＲＩＦ、ＩＰＳ−１、ＲＩＧ−１、ＤＡＩ及びＩＦＩ１６からなる群より選択され；第２のポリペプチドは、ＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激し、ＳＴＩＮＧ、ｃ−ＦＬＩＰ、ＩＫＫβ、ＲＩＰＫ１、Ｂｔｋ、ＴＡＫ１、ＴＡＫ−ＴＡＢ１、ＴＢＫ１、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４、ＴＡＢ２、ＴＡＢ３、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＭ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、及びＭＫＫ７からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、構成的に活性なＩＲＦ３であり、第２のポリペプチドは、構成的に活性なＩＫＫβである。いくつかの実施形態では、この組成物は構成的に活性なＩＲＦ７ポリペプチドをコードするｍＲＮＡをさらに含む（すなわち、この組成物は、構成的に活性なＩＲＦ３、構成的に活性なＩＲＦ７ポリペプチド及び構成的に活性なＩＫＫβをコードするｍＲＮＡを含む）。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を刺激し、ＳＴＩＮＧ、ＭＡＶＳ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＴＢＫ１、ＩＫＫα、ＩＫＫｉ、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＭ、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ４、ＴＲＩＦ、ＩＰＳ−１、ＲＩＧ−１、ＤＡＩ及びＩＦＩ１６からなる群より選択され；第２のポリペプチドは、ネクロトーシスまたはネクロトソーム形成に関与し、そしてＭＬＫＬ、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３、ＤＩＡＢＬＯ及びＦＡＤＤからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは構成的に活性なＳＴＩＮＧであり、第２のポリペプチドはＭＬＫＬポリペプチドである。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、ＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激し、ＳＴＩＮＧ、ｃ−ＦＬＩＰ、ＩＫＫβ、ＲＩＰＫ１、Ｂｔｋ、ＴＡＫ１、ＴＡＫ−ＴＡＢ１、ＴＢＫ１、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４、ＴＡＢ２、ＴＡＢ３、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＭ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、及びＭＫＫ７からなる群より選択され；そして、第２のポリペプチドは、パイロトーシスまたはインフラマソーム形成に関与し、そしてカスパーゼ１、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ１１、ＧＳＤＭＤ、ＮＬＲＰ３、Ｐｙｒｉｎドメイン及びＡＳＣ／ＰＹＣＡＲＤからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、構成的に活性なＩＫＫβであり、第２のポリペプチドはカスパーゼ−１ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この組成物はさらにカスパーゼ−４ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む（すなわち、この組成物は構成的に活性なＩＫＫβ、カスパーゼ−１ポリペプチド及びカスパーゼ−４ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む）。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、２つ以上の免疫増強剤をコードする本開示の組み合わせ組成物は、１つ以上の修飾核酸塩基を含む１つ以上のｍＲＮＡを含む。適切な修飾は、以下にさらに考察される。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、２つ以上の免疫増強剤をコードする本開示の組み合わせ組成物は、脂質ナノ粒子に処方される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、目的の抗原をコードするｍＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象に投与されて、対象における目的の抗原に対する免疫応答を増強する。適切なナノ粒子及び使用方法は、以下でさらに考察される。
【０１１７】
Ｉ型インターフェロンを刺激する免疫増強剤ｍＲＮＡ
いくつかの態様では、本開示は、Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達をシミュレートまたは増強し、それによってＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）産生を刺激または増強することによって、目的の抗原に対する免疫応答を刺激または増強するポリペプチドをコードする免疫増強剤ｍＲＮＡを提供する。抗腫瘍または抗微生物適応免疫の誘導を成功させるには、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達が必要であることが確認されている（例えば、Ｆｕｅｒｔｅｓ、Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：６７−７３を参照のこと）。Ｉ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ及びＩＦＮ−ωを含む）の産生は、ウイルス感染などの微生物感染の排除において、ある役割を果たす。宿主細胞ＤＮＡ（例えば、損傷を受けた細胞または死にかけている細胞に由来する）は、Ｉ型インターフェロン産生を誘導し得ること、及びＩ型ＩＦＮシグナル伝達経路は、適応抗腫瘍免疫の発生において、ある役割を果たすこともまた認識されている。しかし、多くの病原体及びがん細胞は、Ｉ型インターフェロン応答を減少または阻害するための機構を進化させてきた。したがって、それを必要とする対象におけるＩ型ＩＦＮシグナル伝達経路の活性化（刺激及び／または増強を含む）は、本開示の免疫増強剤ｍＲＮＡを対象に提供することによって、保護免疫を提供するためのワクチン反応の増強の場合と同様に、がん及び病原性感染症の処置を含む、広範な種々の臨床状況において対象における免疫応答を刺激または増強する。
【０１１８】
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）は、典型的にはウイルス感染の際に複数の異なる細胞型において急速に産生され、そして多種多様な効果を有することが知られている炎症誘発性サイトカインである。インビボでのＩ型ＩＦＮ産生の標準的な結果は、抗菌細胞プログラムの活性化、ならびに先天性免疫応答及び適応的免疫応答の発達である。Ｉ型ＩＦＮは、感染した細胞及び隣接する細胞において、感染性物質、特にウイルス性病原体の蔓延を制限する細胞固有の抗菌状態を誘導する。Ｉ型ＩＦＮはまた、抗原提示及びナチュラルキラー細胞機能を促進するために、先天性免疫細胞活性化（例えば、樹状細胞の成熟）を調節する。Ｉ型ＩＦＮはまた、高親和性抗原特異的Ｔ細胞及びＢ細胞応答、ならびに免疫学的記憶の発達を促進する（Ｉｖａｓｈｋｉｖ  ａｎｄ  Ｄｏｎｌｉｎ（２０１４）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１４（１）：３６−４９）。
【０１１９】
Ｉ型ＩＦＮは、樹状細胞（ＤＣ）を活性化し、そして自己分泌シグナル伝達を介してそれらのＴ細胞刺激能力を促進する（Ｍｏｎｔｏｙａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｂｌｏｏｄ  ９９：３２６３−３２７１）。Ｉ型ＩＦＮ曝露は、ケモカイン受容体及び接着分子（例えば、流入領域リンパ節へのＤＣ移動を促進するため）、共刺激分子、ならびにＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ抗原提示の発現を増大させることによってＤＣの成熟を促進する。Ｉ型ＩＦＮ曝露後に成熟するＤＣは、防御的Ｔ細胞応答を効果的に初回刺激し得る（Ｗｉｊｅｓｕｎｄａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９（４１２）及びその中の引用文献）。
【０１２０】
Ｉ型ＩＦＮは、Ｔ細胞受容体シグナル伝達と比較したＩ型ＩＦＮシグナル伝達のタイミングに大きく依存して、Ｔ細胞活性化、増殖、分化及び生存の促進または阻害のいずれかを行い得る（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１５：２３１−２４２）。初期の研究では、ＭＨＣ−Ｉ発現が、複数の細胞型においてＩ型ＩＦＮに応答してアップレギュレートされることが明らかになり（Ｌｉｎｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７６），Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １３３（Ｓｕｐｐｌ）：Ａ６６−Ａ６８；Ｌｉｎｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７６），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １７：１２８４−１２８７）、これは、最適なＴ細胞刺激、分化、増殖及び細胞溶解活性のための必要条件である。Ｉ型ＩＦＮは、ＣＤ８Ｔ細胞に対して強力な同時刺激効果を発揮し、ＣＤ８Ｔ細胞の増殖及び分化を増強し得る（Ｃｕｒｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１７４：４４６５−４４６９；Ｋｏｌｕｍａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０２：６３７−６５０）。
【０１２１】
Ｔ細胞に対する効果と同様に、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達は、曝露のタイミング及び状況に応じて、Ｂ細胞応答に対して正及び負の両方の効果を有する（Ｂｒａｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４（４）：４１１〜４１９；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）１８７（１）：７９−８７）。未成熟Ｂ細胞の生存及び成熟は、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達によって阻害され得る。未成熟Ｂ細胞とは対照的に、Ｉ型ＩＦＮ曝露は、ウイルス感染後または実験的免疫後のＢ細胞活性化、抗体産生及びアイソタイプスイッチを促進することが示されている（Ｌｅ  Ｂｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６：４：２０７４−２０７８；Ｓｗａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０７：１４８５−１５００）。
【０１２２】
ＳＴＩＮＧ、インターフェロン調節性因子、例えば、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、及びＩＲＦ９、ＴＢＫ１、ＩＫＫｉ、ＭｙＤ８８、ＭＡＶＳ及びＴＲＡＭを含む、Ｉ型ＩＦＮ経路シグナル伝達に関与する多数の構成要素が確認されている。Ｉ型ＩＦＮ経路シグナル伝達に関与するさらなる構成要素としては、ＩＫＫα、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＩＲＡＫ−１、ＩＲＡＫ−４、ＴＲＩＦ、ＩＰＳ−１、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＴＬＲ−９、ＲＩＧ−１、ＤＡＩ及びＩＦＩ１６が挙げられる。
【０１２３】
したがって、一実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡは、Ｉ型ＩＦＮ経路シグナル伝達に関与する前述の構成要素のいずれかをコードする。
【０１２４】
ＳＴＩＮＧをコードする免疫増強剤ｍＲＮＡ
本開示は、構成的に活性な形態のＳＴＩＮＧを免疫増強剤として含む、ＳＴＩＮＧをコードするｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡを含む）を包含する。ＳＴＩＮＧ（ＳＴｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ＩＮｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｇｅｎｅｓ；膜貫通タンパク質１７３（ＴＭＥＭ１７３）、ＩＲＦ３活性化のメディエータ（ＭＩＴＡ）、メチオニン−プロリン−チロシン−セリン（ＭＰＹＳ）、及びＥＲ  ＩＦＮ刺激剤（ＥＲＩＳ）としても公知）は、３７９アミノ酸であり、Ｉ型ＩＦＮ及び炎症誘発性サイトカインを含む免疫応答遺伝子の転写を制御するシグナル伝達分子として機能する小胞体（ＥＲ）内在性膜貫通タンパク質である（Ｉｓｈｉｋａｗａ＆Ｂａｒｂｅｒ、（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５５：６４７−６７８；Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４６１：７８８〜７９２；Ｂａｒｂｅｒ（２０１０）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１５（１２）：７６０〜７７０）。
【０１２５】
ＳＴＩＮＧは、ＤＮＡの細胞質ゾル検出を、ＴＢＫ１／ＩＲＦ３／Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達軸に連結するシグナル伝達アダプターとして機能する。ＳＴＩＮＧのシグナル伝達アダプター機能は、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）の直接感知を通して活性化される。ＣＤＮの例としては、環状ジ−ＧＭＰ（グアノシン５’−一リン酸）、環状ジ−ＡＭＰ（アデノシン５’−一リン酸）及び環状ＧＭＰ−ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）が挙げられる。当初偏在性の細菌性二次メッセンジャーとして特徴付けられたＣＤＮは、ＳＴＩＮＧとの直接相互作用を介してＴＢＫ１／ＩＲＦ３／Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達軸を活性化する、あるクラスの病原体関連分子パターン分子（ＰＡＭＰ）を構成することが現在知られている。ＳＴＩＮＧは、細菌由来のＣＤＮ及び／または宿主タンパク質環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）由来のＣＤＮを含む、細胞のサイトゾル中の異常なＤＮＡ種及び／またはＣＤＮを感知し得る。ｃＧＡＳタンパク質は、細胞質ゾル中のＤＮＡの検出に応答してｃＧＡＭＰを産生するＤＮＡセンサーである（Ｂｕｒｄｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ４７８：５１５−５１８；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：７８６〜７９１；Ｄｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ３：１３５５−１３６１；Ａｂｌａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  ４９８：３８０−３８４）。
【０１２６】
ＣＤＮに結合すると、ＳＴＩＮＧは、二量体化し、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）との複合体の形成を促進する立体構造変化を受ける（Ｏｕｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３６（６）：１０７３−１０８６）。この複合体は、核周囲ゴルジに転位し、それがエンドリソソーム区画へのＴＢＫ１の送達をもたらし、そこでそれはＩＲＦ３及びＮＦ−κＢ転写因子をリン酸化する（Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、（２００８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９：５３８−５５０）。最近の研究では、ＳＴＩＮＧが、ＴＢＫ１によるＩＲＦ３のリン酸化を特異的に促進するようにＴＢＫ１及びＩＲＦ３の両方に結合することによって足場として機能することが示された（Ｔａｎａｋａ＆Ｃｈｅｎ、（２０１２）Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ  ５（２１４）：ｒａ２０）。ＩＲＦ３依存性、ＩＲＦ７依存性及びＮＦ−κＢ依存性のシグナル伝達経路の活性化は、抗病原体及び／または抗腫瘍活性を促進する、サイトカイン及びＩ型ＩＦＮなどの他の免疫応答関連タンパク質の産生を誘導する。
【０１２７】
多くの研究が、体液性及び細胞性免疫応答を誘発するための潜在的なワクチンアジュバントまたは免疫調節剤としてのＳＴＩＮＧのＣＤＮアゴニストの使用を検討している（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｔｈｅｒ  Ａｄｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  １（４）：１３１−１４３、及びその中の引用文献）。初期の研究では、ＣＤＮ  ｃ−ｄｉ−ＧＭＰの投与が、インビボでＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染を減弱させ、マウス感染モデルにおいて回収された細菌細胞の数を減少させたがｃ−ｄｉ−ＧＭＰは、インビトロで細菌細胞に対して観察可能な阻害または殺菌効果を示さず、細菌細胞の減少が宿主の免疫系への影響によるものであることが示唆されている（Ｋａｒａｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ−Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４９：１０２９−１０３８；Ｋａｒａｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７５：４９４２−４９５０）。最近の研究は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）産生がんワクチン（ＳＴＩＮＧＶＡＸと呼ばれる）を用いて処方された合成ＣＤＮ誘導体分子が、ＧＭ−ＣＳＦワクチン単独による免疫と比較してがんの治療動物モデルにおいてインビボで抗腫瘍効果を高めることを示し（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７（２８３）：２８３ｒａ５２）、ＣＤＮが強力なワクチンアジュバントであることを示唆している。
【０１２８】
ヒトＴＭＥＭ１７３遺伝子にマッピングされた多型から生じる変異体ＳＴＩＮＧタンパク質は、機能獲得型または構成的に活性な表現型を示すことが記載されている。インビトロで発現させた場合、変異体ＳＴＩＮＧ対立遺伝子は、Ｉ型ＩＦＮの誘導を強力に刺激することが示された（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７１：５０７−５１８；Ｊｅｒｅｍｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２４：５５１６−５５２０；Ｄｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １８（２）：１５７−１６８；Ｔａｎｇ＆Ｗａｎｇ，（２０１５）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １０（３）：ｅ０１２００９０；Ｍｅｌｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１７）Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ；Ｋｏｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１７）Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ７６（２）：４６８−４７２；Ｂｕｒｄｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ４７８：５１５−５１８）。
【０１２９】
本明細書に記載の免疫増強剤として使用するための変異体ヒトＳＴＩＮＧアイソフォームを含む、構造的に活性な形態のＳＴＩＮＧをコードするｍＲＮＡ（化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を含む）が本明細書に提供される。変異体ヒトＳＴＩＮＧアイソフォームを含む、ＳＴＩＮＧの構成的に活性な形態をコードするｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）は、本明細書の配列表に記載されている。本明細書で使用される変異体ヒトＳＴＩＮＧポリペプチドのアミノ酸残基ナンバリングは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９３８０２３として当該技術分野で入手可能な３７９アミノ酸残基の野生型ヒトＳＴＩＮＧ（アイソフォーム１）に使用されるものに相当する。
【０１３０】
したがって、一態様では、本開示は、アミノ酸残基１５５位に変異、特にＶ１５５Ｍ変異体などのアミノ酸置換を有する変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）を提供する。一実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）は、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、ＳＴＩＮＧ  Ｖ１５５Ｍ変異体は、配列番号１９９、１３１９または１３２０に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。一実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ｍｍＲＮＡ）は、ｍｉＲ１２２結合部位を含む、配列番号２０９に示される３’ＵＴＲ配列を含む。
【０１３１】
他の態様では、本開示は、アミノ酸置換などの、アミノ酸残基２８４に変異を有する変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。残基２８４の置換の非限定的な例としては、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ２８４Ｍ及びＲ２８４Ｋが挙げられる。特定の実施形態では、変異ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、Ｒ２８４Ｔ変異として、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号２００もしくは配列番号１４４２に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。特定の実施形態では、変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、Ｒ２８４Ｍ変異を有し、例えば、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号２０１もしくは配列番号１４４３に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。特定の実施形態では、変異ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、Ｒ２８４Ｋ変異を有し、例えば、配列番号４もしくは２２４に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号２０２、２２５、１４４４もしくは１４６６に示すヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１３２】
他の態様では、本開示は、Ｎ１５４Ｓ変異のようなアミノ酸置換などの、アミノ酸残基１５４に変異を有する変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。特定の実施形態では、変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、Ｎ１５４Ｓ変異を有し、例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号２０３もしくは配列番号１４４５に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１３３】
さらに他の態様では、本開示は、アミノ酸残基１４７に変異、例えば、Ｖ１４７Ｌ変異などのアミノ酸置換を有する変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。特定の実施形態では、Ｖ１４７Ｌ変異を有する変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号２０４もしくは配列番号１４４６に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１３４】
他の態様では、本開示は、Ｅ３１５Ｑ変異のようなアミノ酸置換などの、アミノ酸残基３１５に変異を有する変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。特定の実施形態では、Ｅ３１５Ｑ変異を有する変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号２０５もしくは配列番号１４４７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１３５】
他の態様では、本開示は、Ｒ３７５Ａ変異のようなアミノ酸置換などの、アミノ酸残基３７５に変異を有する変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。特定の実施形態では、Ｒ３７５Ａ変異を有する変異ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号２０６もしくは配列番号１４４８に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１３６】
他の態様では、本開示は、前述の変異のうちの１つ以上または２つ、３つ、４つもしくはそれ以上の組合せを有する変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。したがって、一態様では、本開示は、Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｅ３１５Ｑ及びＲ３７５Ａ、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の変異を有する変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。他の態様では、本開示は、Ｖ１５５ＭとＲ２８４Ｔ；Ｖ１５５ＭとＲ２８４Ｍ；Ｖ１５５ＭとＲ２８４Ｋ；Ｖ１５５ＭとＶ１４７Ｌ；Ｖ１５５ＭとＮ１５４Ｓ；Ｖ１５５ＭとＥ３１５Ｑ；及びＶ１５５ＭとＲ３７５Ａからなる群より選択される変異の組合せを有する変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。
【０１３７】
他の態様では、本開示は、Ｖ１５５Ｍ、ならびに以下の変異：Ｒ２８４Ｔ；Ｒ２８４Ｍ；Ｒ２８４Ｋ；Ｖ１４７Ｌ；Ｎ１５４Ｓ；Ｅ３１５Ｑ；及びＲ３７５Ａのうちの１、２、３またはそれ以上を有する変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。他の態様では、本開示は、Ｖ１５５Ｍ、Ｖ１４７Ｌ及びＮ１５４Ｓ変異を有する変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。他の態様では、本開示は、Ｖ１５５Ｍ、Ｖ１４７Ｌ及びＮ１５４Ｓ変異、ならびに必要に応じてアミノ酸２８４で変異を有する、変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。さらに他の態様では、本開示は、Ｖ１５５Ｍ、Ｖ１４７Ｌ及びＮ１５４Ｓ変異、ならびにＲ２８４Ｔ、Ｒ２８４Ｍ及びＲ２８４Ｋから選択されるアミノ酸２８４で変異を有する、変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。他の態様では、本開示は、Ｖ１５５Ｍ、Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、及びＲ２８４Ｔ変異を有する変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。他の態様では、本開示は、Ｖ１５５Ｍ、Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、及びＲ２８４Ｍ変異を有する変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。他の態様では、本開示は、Ｖ１５５Ｍ、Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ及びＲ２８４Ｋ変異を有する変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。
【０１３８】
他の実施形態では、本開示は、アミノ酸残基１４７、１５４、１５５及び必要に応じて２８４で変異の組み合わせ、特にアミノ酸置換、例えば、Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ及び必要に応じてＲ２８４Ｍを有する変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。特定の実施形態では、この変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、Ｖ１４７Ｎ、Ｎ１５４Ｓ及びＶ１５５Ｍ変異、例えば、配列番号９に示されるか、または配列番号２０７もしくは配列番号１４４９に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、Ｒ２８４Ｍ、Ｖ１４７Ｎ、Ｎ１５４Ｓ及びＶ１５５Ｍの変異、例えば、配列番号１０に示されるか、または配列番号２０８もしくは配列番号１４５０に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有する。
【０１３９】
別の実施形態では、本開示は、アミノ酸１３７〜３７９からなる構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドなどの、全長３７９アミノ酸の野生型タンパク質の構成的に活性な短縮型である変異体ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。
【０１４０】
免疫調節因子（ＩＲＦ）をコードする免疫増強剤ｍＲＮＡ
本開示は、免疫増強剤としてのＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、及びＩＲＦ９などのインターフェロン調節因子（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒｓ）をコードするｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡを含む）を提供する。ＩＲＦ転写因子ファミリーは、先天性免疫応答の間にＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生をもたらす遺伝子発現の調節に関与している。今日までに９つのヒトＩＲＦが同定されており（ＩＲＦ−１〜ＩＲＦ−９）、各ファミリーメンバーはそれらのＮ末端結合ドメイン（ＤＢＤ）内で広範な配列相同性を共有している（Ｍａｍａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ  ２３７：１−１４；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：６２３−６５５）。ＩＲＦファミリー内で、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、及びＩＲＦ７は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子転写の正の調節因子として特に関与している（Ｈｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５（３）：３４９−３６０）。ＩＲＦ１は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子プロモーターを活性化することが発見された最初のファミリーメンバーであった（Ｍｉｙａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５４：９０３−９１３）。ＩＲＦ１は、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子発現に関与していることが研究により示されているが、ウイルス感染ＩＲＦ１−／−マウス線維芽細胞において、Ｉ型ＩＦＮの正常な誘導が観察され、分配性を示唆している（Ｍａｔｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５：８３−９７）。ＩＲＦ５はまた、ウイルスまたはＴＬＲアゴニストによるＩ型ＩＦＮ誘導には不必要であることが示された（Ｔａｋａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３４：２４３−２４９）。
【０１４１】
したがって、いくつかの態様では、本開示は、免疫増強剤としてのヒトＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、及びＩＲＦ９の構成的に活性な形態をコードするｍＲＮＡを提供する。いくつかの態様では、本開示は、構成的に活性な形態のヒトＩＲＦ３及び／またはＩＲＦ７をコードするｍＲＮＡを提供する。
【０１４２】
先天性免疫応答の間に、ＩＲＦ−３はＩ型ＩＦＮの早期誘導において重要な役割を果たす。ＩＲＦ３転写因子は、構成的に発現され、潜在的形態で細胞の核と細胞質の間を往復し、リン酸化の前に主に細胞質ゾルに局在する（Ｈｉｓｃｏｔｔ（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２（２１）：１５３２５−１５３２９；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０（１１）：４１５９−４１６８）。ＴＢＫ−１（ＴＡＮＫ結合キナーゼ１；Ｔ２Ｋ及びＮＡＫとしても公知である）及び／またはＩＫＫε（誘導性ＩκＢキナーゼ；ＩＫＫｉとしても知られる）によるＣ末端のセリン残基のリン酸化の際に、ＩＲＦ３は細胞質から核に転位する。（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏ  ４（５）：４９１−４９６；Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：１１４８−１１５１；Ｈｅｍｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１９９：１６４１−１６５０）。ＩＲＦ３の転写活性は、これらのリン酸化及び転座事象によって媒介される。ＩＲＦ３活性化のモデルは、Ｃ末端リン酸化が、ホモ及び／またはヘテロ二量体化を促進するＩＲＦ３のコンホメーション変化（例えば、ＩＲＦ７を有する；Ｈｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５（３）：３４６〜３６０を参照のこと）、核局在化、ならびに転写活性化補助因子ＣＢＰ及び／またはｐ３００との会合（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９（４）：２４６５−２４７４）を誘導することを提案する。不活性なＩＲＦ３は構成的に核内外を往復するが、リン酸化ＩＲＦ３タンパク質は、ＣＢＰ及び／またはｐ３００と会合したままであり、核内に保持され、ＩＦＮ及び他の遺伝子の転写を誘導する（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）。２０（１１）：４１５９−４１６８）。
【０１４３】
ＩＲＦ３とは対照的に、ＩＲＦ７は、ほとんどの細胞で低い発現レベルを示すが、Ｉ型ＩＦＮ媒介シグナル伝達によって強く誘導され、これによってＩＲＦ３は主にＩＦＮ遺伝子の早期誘導に関与すること、及び、ＩＲＦ７は後期に関与するという考えが支持される（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３（４）：５３９−５４８）。Ｉ型ＩＦＮ受容体へのリガンド結合は、ＩＲＦ９、ＳＴＡＴ１、及びＳＴＡＴ２からなり、ＩＲＦ７遺伝子の誘導に関与しているＩＦＮ刺激遺伝子因子３（ＩＳＧＦ３）と呼ばれるヘテロ三量体転写活性化因子の活性化をもたらす（Ｍａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ１７（２２）：６６６０−６６６９）。ＩＲＦ３と同様に、ＩＲＦ７は、そのＣ末端領域のセリンリン酸化後に細胞質と核との間で分配することができ、それによってその二量体化及び核移行が可能になる。ＩＲＦ７は、ＩＲＦ３とホモ二量体またはヘテロ二量体を形成し、そしてこれらの異なる二量体のそれぞれは、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子ファミリーメンバーに異なって作用する。ＩＲＦ３は、ＩＦＮ−α遺伝子よりもＩＦＮ−β遺伝子の活性化においてより強力であるが、ＩＲＦ７は、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−β遺伝子の両方を効率的に活性化する（Ｍａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ１７（２２）：６６６０−６６６９）。
【０１４４】
本明細書に記載の免疫増強剤として使用するための変異体ヒトＩＲＦ３及び変異体ヒトＩＲＦ７アイソフォームを含む、構成的に活性な形態のＩＲＦ３及びＩＲＦ７をコードするｍＲＮＡが、本明細書に提供される。変異体ヒトＩＲＦ３及びＩＲＦ７アイソフォームを含む、構成的に活性な形態のＩＲＦ３及びＩＲＦ７をコードするｍＲＮＡは、本明細書の配列表に記載されている。本明細書中で使用される変異体ヒトＩＲＦ３ポリペプチドのアミノ酸残基ナンバリングは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１５６２として当該技術分野で入手可能な４２７アミノ酸残基野生型ヒトＩＲＦ３（アイソフォーム１）に使用されるものに相当する。本明細書中で使用される変異体ヒトＩＲＦ７ポリペプチドのアミノ酸残基ナンバリングは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１５６３として当該分野で入手可能な５０３アミノ酸残基野生型ヒトＩＲＦ７（アイソフォームａ）に使用されるものに相当する。
【０１４５】
したがって、いくつかの態様では、本開示は、例えば、アミノ酸残基３９６に変異、例えば、Ｓ３９６Ｄ変異などのアミノ酸置換などを有する、例えば、配列番号１２のアミノ酸に示されるか、または配列番号２１１もしくは配列番号１４６３に示されるヌクレオチド配列によってコードされるような変異を有する、構成的に活性である、変異体ヒトＩＲＦ３タンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。他の態様では、ｍＲＮＡ構築物は、Ｓ３９６Ｄ変異、例えば、配列番号１１のアミノ酸配列に示されるか、または２１０もしくは配列番号１４５２に示されるヌクレオチド配列によりコードされるような変異を含む、構成的に活性なマウスＩＲＦ３ポリペプチドをコードする。
【０１４６】
他の態様では、本開示は、構成的に活性な変異体ヒトＩＲＦ７タンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。一態様では、本開示は、１つ以上の点突然変異（野生型と比較してアミノ酸置換）を含む構成的に活性なＩＲ７タンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。他の態様では、本開示は、タンパク質の短縮型（野生型と比較してアミノ酸欠失）を含む構成的に活性なＩＲ７タンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。さらに他の態様では、本開示は、１つ以上の点突然変異（野生型と比較したアミノ酸欠失及びアミノ酸置換の組み合わせ）も含む短縮型のタンパク質を含む構成的に活性なＩＲ７タンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。
【０１４７】
ヒトＩＲＦ７の野生型アミノ酸配列（アイソフォームａ）は、配列番号２１２または配列番号１４５４に示されるヌクレオチド配列によりコードされる配列番号１３に記載されている。野生型配列と比較して、点突然変異、欠失、またはその両方を含む一連の構成的に活性型のヒトＩＲＦ７を調製した。一態様では、本開示は、以下の変異：Ｓ４７５Ｄ、Ｓ４７６Ｄ、Ｓ４７７Ｄ、Ｓ４７９Ｄ、Ｌ４８０Ｄ、Ｓ４８３Ｄ及びＳ４８７Ｄ、ならびにそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む構成的に活性なＩＲＦ７ポリペプチドをコードしている免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物を提供する。他の態様では、本開示は、配列番号２１３または配列番号１４５５に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号１４のアミノ酸配列に示されるように、変異Ｓ４７７Ｄ及びＳ４７９Ｄを含む構成的に活性なＩＲＦ７ポリペプチドをコードするｍｍＲＮＡを提供する。別の態様では、本開示は、配列番号２１４または配列番号１４５６に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号１５のアミノ酸配列に示される、変異Ｓ４７５Ｄ、Ｓ４７７Ｄ及びＬ４８０Ｄを含む構成的に活性なＩＲＦ７ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを提供する。他の態様では、本開示は、配列番号２１５または配列番号１４５７に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、配列番号１６のアミノ酸配列に示される、変異Ｓ４７５Ｄ、Ｓ４７６Ｄ、Ｓ４７７Ｄ、Ｓ４７９Ｄ、Ｓ４８３Ｄ及びＳ４８７Ｄを含む構成的に活性なＩＲＦ７ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを提供する。別の態様では、本開示は、配列番号２１６または配列番号１４５８に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、配列番号１７のアミノ酸配列に示される、アミノ酸残基２４７〜４６７の欠失（すなわち、アミノ酸残基１〜２４６及び４６８〜５０３を含む）を含む構成的に活性なＩＲＦ７ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを提供する。さらに他の態様では、本開示は、アミノ酸残基２４７〜４６７の欠失を含み（すなわち、アミノ酸残基１〜２４６及び４６８〜５０３を含み）、配列番号２１７または配列番号１４５９に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、配列番号１８のアミノ酸配列に示される、変異Ｓ４７５Ｄ、Ｓ４７６Ｄ、Ｓ４７７Ｄ、Ｓ４７９Ｄ、Ｓ４８３Ｄ及びＳ４８７Ｄをさらに含む、構成的に活性なＩＲＦ７ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを提供する。
【０１４８】
他の態様では、本開示は、配列番号２１８または配列番号１４６０に示されるヌクレオチド配列によりコードされる配列番号１９のアミノ酸配列（例えば、制御の目的で使用される）に示されるように、残基１５２〜２４６の欠失を含む（すなわち、アミノ酸残基１〜１５１及び２４７〜５０３を含む）短縮型ＩＲＦ７不活性「ヌル」ポリペプチド構築物をコードするｍＲＮＡを提供する。他の態様では、本開示は、配列番号２１９または配列番号１４６１に示されるヌクレオチド配列によりコードされる（例えば、制御の目的で使用される）、配列番号２０のアミノ酸配列に示されるように、残基１〜１５１の欠失を含む（すなわち、アミノ酸残基１５２〜５０３を含む）短縮型ＩＲＦ７不活性「ヌル」ポリペプチド構築物をコードするｍＲＮＡを提供する。
【０１４９】
Ｉ型ＩＦＮを活性化する追加の免疫増強剤ｍＲＮＡ
上記のＳＴＩＮＧ及びＩＲＦ  ｍＲＮＡ構築物に加えて、本開示は、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達経路の活性化を通して免疫応答を増強するための免疫増強剤として使用され得るＩ型ＩＦＮシグナル伝達経路のさらなる構成要素をコードするｍＲＮＡ構築物を提供する。例えば、一実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、ＭｙＤ８８タンパク質をコードする。ＭｙＤ８８は、ＩＲＦ７の上流でシグナル伝達することが当該分野において公知である。一態様では、本開示は、１つ以上の点突然変異を有する変異型ＭｙＤ８８タンパク質などの構成的に活性なＭｙＤ８８タンパク質をコードするｍｍＲＮＡを提供する。一態様では、本開示は、それぞれ、配列番号１３４（配列番号１４０９または配列番号１４８０に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）及び１３５に記載のＬ２６５Ｐ置換を有する変異体ヒトまたはマウスＭｙＤ８８タンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。
【０１５０】
別の態様では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物はＭＡＶＳ（ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達）タンパク質をコードする。ＭＡＶＳは、ＩＲＦ３／ＩＲＦ７の上流でシグナル伝達することが当該分野において公知である。ＭＡＶＳは、二本鎖ＲＮＡウイルスに対する防御的インターフェロン応答において重要であることが実証されている。例えば、ＭＡＶＳを欠くロタウイルス感染マウスが産生するのは、ＭＡＶＳを有するマウスよりも有意に少ないＩＦＮ−β及び増大した量のウイルスである（Ｂｒｏｑｕｅｔ、Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８６：１６１８−１６２６）。さらに、ＭＡＶＳを通じたＲＩＧ−１またはＭＤＡ５シグナル伝達は、ロタウイルス感染細胞によるＩＦＮ−β産生の活性化に必要であることが示されている（Ｂｒｏｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，前出）。ＭＡＶＳはまた、ＭＤＡ５と共に媒介される、コクサッキーＢウイルスに対するＩ型インターフェロン応答に重要であることが示されている（Ｗａｎｇ、Ｊ．Ｐ．ら（２０１０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：２５４−２６０）。さらにまた、異なるクラスの受容体が細胞内のＲＮＡ及びＤＮＡセンシングに関与しているが、下流のシグナル伝達構成要素は、物理的及び機能的に相互接続されており、インターフェロン応答を含む効率的な抗ウイルス応答の増強において、ＲＩＧ−１／ＭＡＶＳ  ＲＮＡ感知とｃＧＡＳ−ＳＴＩＮＧ  ＤＮＡ感知経路との間にクロストークがあることが示されている（Ｚｅｖｉｎｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１９４−２０５）。一態様では、本開示は、１つ以上の点突然変異を有する変異ＭＡＶＳタンパク質などの構成的に活性なＭＡＶＳタンパク質をコードするｍＲＮＡを包含する。別の態様では、本開示は、過剰発現されている野生型ＭＡＶＳタンパク質を包含する。一態様では、本開示は、配列番号１３８７に示されるＭＡＶＳタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。配列番号１３８７のＭＡＶＳタンパク質をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１４１３及び配列番号１４８４に示される。
【０１５１】
別の態様では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、ＴＲＡＭ（ＴＩＣＡＭ２）タンパク質をコードする。ＴＲＡＭは、ＩＲＦ３の上流でシグナル伝達することが当該技術分野において公知である。一態様では、本開示は、１つ以上の点突然変異を有する変異体ＴＲＡＭタンパク質などの構成的に活性なＴＲＡＭタンパク質をコードするｍｍＲＮＡを包含する。別の態様では、本開示は、過剰発現されている野生型ＴＲＡＭタンパク質を包含する。一態様では、本開示は、配列番号１３６に示されるマウスＴＲＡＭタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する。配列番号１３６のＴＲＡＭタンパク質をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１４１０または配列番号１４８１に示される。
【０１５２】
さらに他の態様では、本開示は、構成的に活性な形態のＴＢＫ１またはＩＫＫｉを含む、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）または誘導性ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫεとしても公知のＩＫＫｉ）をコードする免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物を、免疫増強剤として提供する。ＴＢＫ１及びＩＫＫｉは、ＩＲＦ３及びＩＲＦ７をリン酸化し、それによってＩ型ＩＦＮシグナル伝達経路においてＩＲＦ３及びＩＲＦ７の上流で作用するウイルス活性化キナーゼの構成要素であることが実証されている（Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：１１４８−１１５１）。ＴＢＫ１及びＩＫＫｉは、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子ならびにＩＦＮ誘導性遺伝子の発現を誘導する転写因子（例えば、ＩＲＦ３／７及びＮＦ−κＢ）のリン酸化及び活性化に関与している（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４（５）：４９１〜４９６）。
【０１５３】
したがって、一態様では、本開示は、変異体ヒトＴＢＫ１アイソフォームを含む、構成的に活性な形態のＴＢＫ１を含む、ＴＢＫ１タンパク質をコードする免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物を提供する。さらに他の態様では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、変異体ヒトＩＫＫｉアイソフォームを含む、構成的に活性な形態のＩＫＫｉを含むＩＫＫｉタンパク質をコードする。
【０１５４】
炎症反応を刺激する免疫増強剤ｍＲＮＡ
他の態様では、本開示は、炎症反応を刺激することによって免疫反応を増強する免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物を提供する。炎症反応を刺激する因子の非限定的な例としては、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ４、及びＳＴＡＴ６が挙げられる。したがって、本開示は、構成的に活性な形態を含む、これらの炎症誘導タンパク質のうちの１つまたは組み合わせをコードする免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物を提供する。
【０１５５】
本明細書に記載の免疫増強剤として使用するための変異体ヒトＳＴＡＴ６アイソフォームを含む、構成的に活性な形態のＳＴＡＴ６をコードするｍＲＮＡが、本明細書に提供される。変異体ヒトＳＴＡＴ６アイソフォームを含む、ＳＴＡＴ６の構成的に活性な形態をコードするｍＲＮＡは、本明細書中の配列表に示される。本明細書中で使用される変異体ヒトＳＴＡＴ６ポリペプチドについてのアミノ酸残基ナンバリングは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１７１５５０．１として当該分野で入手可能な８４７アミノ酸残基野生型ヒトＳＴＡＴ６（アイソフォーム１）について使用されるナンバリングに相当する。
【０１５６】
一実施形態では、本開示は、Ｓ４０７Ｄ、Ｖ５４７Ａ、Ｔ５４８Ａ、Ｙ６４１Ｆ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上のアミノ酸変異を含む構成的に活性なヒトＳＴＡＴ６構築物をコードするｍＲＮＡ構築物を提供する。別の実施形態では、このｍＲＮＡ構築物は、配列番号１３７に示される配列などの、Ｖ５４７Ａ及びＴ５４８Ａ変異を含む構成的に活性なヒトＳＴＡＴ６構築物をコードする。別の実施形態では、このｍＲＮＡ構築物は、配列番号１３８に示される配列などの、Ｓ４０７Ｄ変異を含む構成的に活性なヒトＳＴＡＴ６構築物をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、配列番号１３９に示される配列などの、Ｓ４０７Ｄ、Ｖ５４７Ａ及びＴ５４８Ａ変異を含む構成的に活性なヒトＳＴＡＴ６構築物をコードする。別の実施形態では、このｍＲＮＡ構築物は、配列番号１４０に示される配列のような、Ｖ５４７Ａ、Ｔ５４８Ａ及びＹ６４１Ｆの変異を含む、構成的に活性なヒトＳＴＡＴ６構築物をコードする。
【０１５７】
ＮＦκＢシグナル伝達を刺激する免疫増強剤ｍＲＮＡ
他の態様では、本開示は、免疫応答の刺激に関与することが公知であるＮＦκＢシグナル伝達を刺激することによって免疫応答を増強する免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物を提供する。ＮＦκＢシグナル伝達を刺激するタンパク質の非限定的な例としては、ＳＴＩＮＧ、ｃ−ＦＬＩＰ、ＩＫＫβ、ＲＩＰＫ１、Ｂｔｋ、ＴＡＫ１、ＴＡＫ−ＴＡＢ１、ＴＢＫ１、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４、ＴＡＢ２、ＴＡＢ３、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＭ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、及びＭＫＫ７が挙げられる。したがって、本開示の免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、これらのＮＦκＢ経路誘導タンパク質のうちのいずれかを、例えば、構成的に活性な形態でコードし得る。
【０１５８】
ＮＦκＢシグナル伝達を刺激することによって免疫応答を増強する免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物として役立ち得る適切なＳＴＩＮＧ構築物は、Ｉ型ＩＦＮを活性化する免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物に関するサブセクションにおいて上記に記載されている。
【０１５９】
ＮＦκＢシグナル伝達を刺激することによって免疫応答を増強する免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物として役立ち得る、適切なＭｙＤ８８構築物は、Ｉ型ＩＦＮを活性化する免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物に関するサブセクションにおいて上記に記載されている。
【０１６０】
一実施形態では、本開示は、ｃ−ＦＬＩＰ（細胞カスパーゼ８（ＦＬＩＣＥ）様阻害タンパク質）タンパク質（ＣＡＳＰ８及びＦＡＤＤ様アポトーシス調節剤としても公知である）、例としては、構成的に活性なｃ−ＦＬＩＰをコードするＮＦκＢシグナル伝達を活性化する免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物を提供する。本明細書に記載の免疫増強剤として使用するための変異体ヒトｃ−ＦＬＩＰアイソフォームを含む、構成的に活性な形態のｃ−ＦＬＩＰをコードするｍｍＲＮＡが本明細書に提供される。変異体ヒトｃ−ＦＬＩＰアイソフォームを含む、構成的に活性な形態のｃ−ＦＬＩＰをコードするｍｍＲＮＡは、本明細書の配列表に記載されている。本明細書で使用される変異体ヒトｃ−ＦＬＩＰポリペプチドのアミノ酸残基ナンバリングは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００３８７０として当該技術分野で入手可能な４８０アミノ酸残基の野生型ヒトｃ−ＦＬＩＰ（アイソフォーム１）に使用されるナンバリングに相当する。
【０１６１】
一実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１４１に示される配列を有するものなど、２つのＤＥＤドメイン（ｐ２０ドメイン及びｐ１２ドメイン）を含むｃ−ＦＬＩＰ長（Ｌ）アイソフォームをコードする。別の実施形態では、このｍＲＮＡは、配列番号１４２に示される配列を有するような２つのＤＥＤドメインを含む、アミノ酸１〜２２７をコードするｃ−ＦＬＩＰ短（Ｓ）アイソフォームをコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１４３に示される配列を有するものなど、アミノ酸１〜１９８をコードするｃ−ＦＬＩＰ  ｐ２２切断産物をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１４４に示される配列を有するものなど、アミノ酸１〜３７６をコードするｃ−ＦＬＩＰ  ｐ４３切断産物をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１４５に示される配列を有するものなど、アミノ酸３７７〜４８０をコードするｃ−ＦＬＩＰ  ｐ１２切断産物をコードする。上記で考察されるｃ−ＦＬＩＰタンパク質をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１３９８〜１４０２及び１４６９〜１４７３に示される。
【０１６２】
別の実施形態では、ＮＦκＢシグナル伝達を活性化する免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、構成的に活性なＩＫＫα  ｍＲＮＡ構築物または構成的に活性なＩＫＫβ  ｍＲＮＡ構築物をコードする。一実施形態では、構成的に活性なヒトＩＫＫβポリペプチドは、配列番号１４６に示す配列などのＳ１７７Ｅ及びＳ１８１Ｅの変異を含む。別の実施形態では、構成的に活性なヒトＩＫＫβポリペプチドは、配列番号１４７に示される配列などの、Ｓ１７７Ａ及びＳ１８１Ａの変異を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、構成的に活性なマウスＩＫＫβポリペプチドをコードする。一実施形態では、構成的に活性なマウスＩＫＫβポリペプチドは、配列番号１４８に示す配列などのＳ１７７Ｅ及びＳ１８１Ｅの変異を含む。別の実施形態では、構成的に活性なマウスＩＫＫβポリペプチドは、配列番号１４９に示される配列などのＳ１７７Ａ及びＳ１８１Ａの変異を含む。配列番号１４６のタンパク質をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１４１４及び配列番号１４８５に示される。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、配列番号１５０（ヒト）（配列番号１５１または配列番号２８に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）または配列番号１５４（マウス）（配列番号１５５または配列番号１４２９に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）に示されるような配列を有するものなど、ＰＥＳＴ変異を含む構成的に活性なヒトまたはマウスＩＫＫαポリペプチドをコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、配列番号１５２（ヒト）（配列番号１５３または配列番号１３９７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）または配列番号１５６（マウス）（配列番号１５７または配列番号１４３０に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）に示されるような配列を有するものなど、ＰＥＳＴ変異を含む構成的に活性なヒトまたはマウスＩＫＫβポリペプチドをコードする。
【０１６３】
別の実施形態では、本開示は、受容体相互作用タンパク質キナーゼ１（ＲＩＰＫ１）タンパク質をコードするＮＦκＢシグナル伝達を活性化する免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物を提供する。免疫原性細胞死を誘導するＲＩＰＫ１構築物をコードするＤＮＡ構築物の構造は、当該分野で記載されており、例えば、Ｙａｔｉｍ、Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５０：３２８−３３４またはＯｒｏｚｃｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２１：１５１１−１５２１に記載されており、そして活性なＮＦκＢシグナル伝達もまた本明細書中に示される適切なＲＮＡ構築物の設計において使用され得る（実施例を参照のこと）。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、配列番号１５８（ヒト）または１６１（マウス）に示される配列を有するものなど、ヒトまたはマウスＲＩＰＫ１ポリペプチドのＲＩＰＫ１アミノ酸１〜５５５、ならびにＩＺドメインをコードする。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、配列番号１５９（ヒト）または配列番号１６２（マウス）に示される配列を有するものなど、ヒトまたはマウスのＲＩＰＫ１ポリペプチドのＲＩＰＫ１アミノ酸１〜５５５、ならびにＥＥ及びＤＭドメインをコードする。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、配列番号１６０（ヒト）または１６３（マウス）に示される配列を有するものなど、ヒトまたはマウスのＲＩＰＫ１ポリペプチドのＲＩＰＫ１アミノ酸１〜５５５、ならびにＲＲ及びＤＭドメインをコードする。上記のＲＩＰＫ１ポリペプチドをコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１４０３〜１４０８及び１４７４〜１４７９に示される。
【０１６４】
さらに別の実施形態では、ＮＦκＢシグナル伝達を活性化する免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、Ｂｔｋ（Ｅ４１Ｋ）ポリペプチド（例えば、配列番号１７３に示すＯＲＦアミノ酸配列をコードする）などの変異体ＢｔｋポリペプチドなどのＢｔｋポリペプチドをコードする。
【０１６５】
さらに別の実施形態では、ＮＦκＢシグナル伝達を活性化する免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、構成的に活性なＴＡＫ１などのＴＡＫ１タンパク質をコードする。
【０１６６】
さらに別の実施形態では、ＮＦκＢシグナル伝達を活性化する免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、構成的に活性なＴＡＫ−ＴＡＢ１などのＴＡＫ−ＴＡＢ１タンパク質をコードする。一実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、配列番号１６４に示される配列を有するような、ヒトＴＡＫ−ＴＡＢ１タンパク質をコードする。配列番号１６４のＴＡＫ−ＴＡＢ１タンパク質をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１４１１または配列番号１４８２に示される。
【０１６７】
細胞内アダプタータンパク質をコードする免疫増強剤ｍＲＮＡ
一実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物によってコードされるポリペプチドは、細胞内アダプタータンパク質である。細胞内アダプター（シグナル伝達アダプタータンパク質とも呼ばれる）は、シグナル伝達経路の主要タンパク質に付属するタンパク質である。アダプタータンパク質は、タンパク質結合パートナーを互いに連結し、そしてより大きなシグナル伝達複合体の作製を容易にする様々なタンパク質結合モジュールを含む。これらのタンパク質は、それ自体が固有の酵素活性を欠いている傾向があるが、代わりにタンパク質複合体の形成を促進する特定のタンパク質間相互作用を媒介する。
【０１６８】
一実施形態では、細胞内アダプタータンパク質は、Ｉ型ＩＦＮ応答を刺激する。別の実施形態では、細胞内アダプタータンパク質は、ＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激する。
【０１６９】
一実施形態では、細胞内アダプタータンパク質は、変異体ヒトＳＴＩＮＧアイソフォームを含む、ＳＴＩＮＧポリペプチドの構成的に活性な形態などのＳＴＩＮＧタンパク質である。ＳＴＩＮＧは、先天性免疫シグナル伝達を促進する小胞体アダプターとして当該分野で確立されており、そしてＮＦκＢ媒介性転写経路及びＩＲＦ３／ＩＲＦ７媒介性転写経路の両方を活性化して、Ｉ型ＩＦＮの発現を誘導することが示されている（例えば、Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．及びＢａｒｂｅｒ，Ｇ．Ｈ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５５：６７４−６７８を参照のこと）。例えば、ＳＴＩＮＧは、二本鎖ＤＮＡ（例えば、ウイルスＤＮＡ）によるｃＧＡＳ及びＩＦＩ１６の活性化に続く、ＴＢＫ１の活性化（ＮＦκＢ媒介及びＩＲＦ３／ＩＲＦ媒介転写の上流）においてアダプタータンパク質として作用する。ＳＴＩＮＧをコードする適切なｍＲＮＡ構築物は、Ｉ型インターフェロンを活性化する免疫増強剤のセクションにおいて、上記に詳細に記載されている。
【０１７０】
別の実施形態では、細胞内アダプタータンパク質は、変異体ヒトＭＡＶＳアイソフォームを含む、構成的に活性な形態のＭＡＶＳポリペプチドなどのＭＡＶＳタンパク質である。ＭＡＶＳはまた、当該技術分野においてＶＩＳＡ（ウイルス誘導シグナル伝達アダプター）、ＩＰＳ−１またはＣａｒｄｉｆとしても公知である。ＭＡＶＳは、二重鎖ＲＮＡ（例えば、二重鎖ＲＮＡウイルス）による細胞質ＲＮＡヘリカーゼＲＩＧ−１及びＭＤＡ５の活性化に続くＴＢＫ１の活性化（ＮＦκＢ媒介及びＩＲＦ３／ＩＲＦ媒介転写の上流）において細胞内アダプタータンパク質として作用することが当該技術分野において確立されている。ＭＡＶＳをコードする適切なｍＲＮＡ構築物は、Ｉ型インターフェロンを活性化する免疫増強剤のサブセクションにおいて上記に詳細に記載されている。
【０１７１】
別の実施形態では、細胞内アダプタータンパク質は、変異体ヒトＭｙＤ８８アイソフォームを含む、ＭｙＤ８８ポリペプチドの構成的に活性な形態などのＭｙＤ８８タンパク質である。ＭｙＤ８８は、Ｉ型ＩＦＮ応答及びＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を活性化するためにＴＬＲによって使用される細胞内アダプタータンパク質として当該分野で確立されている（例えば、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｓ．９：５５−５９を参照のこと）。ＭｙＤ８８をコードする適切なｍＲＮＡ構築物は、Ｉ型ＩＦＮ応答を活性化する免疫増強剤に関するサブセクションにおいて上記に詳細に記載されている。
【０１７２】
細胞内シグナル伝達タンパク質をコードする免疫増強剤ｍＲＮＡ
別の実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物によってコードされているポリペプチドは、細胞内シグナル伝達タンパク質である。本明細書中で使用される場合、「細胞内シグナル伝達タンパク質」とは、シグナル伝達経路に関与するタンパク質を指し、そして典型的には酵素活性（例えば、キナーゼ活性）を有する。一実施形態では、このポリペプチドは、ＴＬＲシグナル伝達経路の細胞内シグナル伝達タンパク質である（すなわち、このポリペプチドは、ＴＬＲ媒介シグナル伝達の伝達において機能するがＴＬＲ自体ではない細胞内分子である）。一実施形態では、細胞内シグナル伝達タンパク質は、Ｉ型ＩＦＮ応答を刺激する。別の実施形態では、細胞内シグナル伝達タンパク質は、ＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激する。細胞内シグナル伝達タンパク質の非限定的な例としては、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＴＡＫ１、ＴＡＢ２、ＴＡＢ３、ＴＡＫ−ＴＡＢ１、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＴＲＡＭ、ＴＲＩＦ、ＲＩＰＫ１、及びＴＢＫ１が挙げられる。細胞内シグナル伝達タンパク質の具体例は、Ｉ型インターフェロンを活性化するかまたはＮＦκＢシグナル伝達を活性化する免疫増強剤に関するサブセクションに記載されている。
【０１７３】
転写因子をコードする免疫増強剤ｍＲＮＡ
別の実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物によってコードされているポリペプチドは、転写因子である。転写因子は、少なくとも１つの配列特異的ＤＮＡ結合ドメインを含み、そしてｍＲＮＡへの遺伝子（複数可）の転写速度を調節するように機能する。一実施形態では、転写因子は、Ｉ型ＩＦＮ応答を刺激する。別の実施形態では、転写因子は、ＮＦκＢ媒介炎症誘発性応答を刺激する。転写因子の非限定的な例としては、ＩＲＦ３またはＩＲＦ７が挙げられる。ＩＲＦ３及びＩＲＦ７構築物の具体例は、Ｉ型インターフェロンを活性化する免疫増強剤についてのサブセクションに記載されている。
【０１７４】
ネクロトーシスまたはネクロトソーム形成に関与するポリペプチドをコードしている免疫増強剤ｍＲＮＡ
別の実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物によってコードされるポリペプチドは、ネクロトーシスまたはネクロトソーム形成に関与している。タンパク質がネクロトーシス自体を媒介するか、またはネクロトーシスの媒介及び／またはネクロトソーム形成におけるさらなる分子と関与する場合、ポリペプチドは、ネクロトーシスまたはネクロトソーム形成に「関与する」。ネクロトーシスまたはネクロトソーム形成に関与するポリペプチドの非限定的な例としては、ＭＬＫＬ、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３、ＤＩＡＢＬＯ及びＦＡＤＤが挙げられる。
【０１７５】
ＲＩＰＫ１をコードする適切なｍＲＮＡ構築物は、ＮＦκＢシグナル伝達を活性化する免疫増強剤のセクションにおいて上記に詳細に記載されている。
【０１７６】
一実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物によってコードされるポリペプチドは、混合系統キナーゼドメイン様タンパク質（ＭＬＫＬ）である。ＭＬＫＬ構築物は、ＤＡＭＰの放出を特徴とするネクロトーシスによる細胞死を誘導する。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ヒトまたはマウスＭＬＫＬのアミノ酸１〜１８０をコードする。ＭＬＫＬ、またはその免疫原性細胞死誘導断片をコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、それぞれ配列番号１３２７及び１３２８に示されるアミノ配列を含むヒトまたはマウスＭＬＫＬのアミノ酸１〜１８０をコードする。配列番号１３２７のＭＬＫＬタンパク質をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１４１２及び配列番号１４８３に示されている。
【０１７７】
別の実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物によってコードされるポリペプチドは、受容体相互作用タンパク質キナーゼ３（ＲＩＰＫ３）である。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、それ自体と多量体化する（ホモオリゴマー化）ＲＩＰＫ３ポリペプチドをコードする。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ＲＩＰＫ１と二量体化するＲＩＰＫ３ポリペプチドをコードする。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ＲＩＰＫ３のキナーゼドメイン及びＲＨＩＭドメインをコードする。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ＲＩＰＫ３のキナーゼドメイン、ＲＩＰＫ３のＲＨＩＭドメイン、及び２つのＦＫＢＰ（Ｆ＞Ｖ）ドメインをコードする。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ＲＩＰＫ３ポリペプチド（例えば、ＲＩＰＫ３のキナーゼドメイン及びＲＨＩＭドメインを含む）及びＩＺドメイン（例えば、ＩＺ三量体）をコードする。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ＲＩＰＫ３ポリペプチド（例えば、ＲＩＰＫ３のキナーゼドメイン及びＲＨＩＭドメインを含む）及び１つ以上のＥＥまたはＲＲドメイン（例えば、２×ＥＥドメインまたは２×ＲＲドメイン）をコードする。さらに、免疫原性細胞死を誘導するＲＩＰＫ３構築物をコードするＤＮＡ構築物の構造は、例えば、Ｙａｔｉｍ，Ｎ．（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５０：３２８−３３４またはＯｒｏｚｃｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２１：１５１１−１５２１にさらに記載されており、適切なＲＮＡ構築物の設計に使用され得る。ＲＩＰＫ３をコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１３２９〜１３４４及び１３７９に示される任意のアミノ酸配列を有するＯＲＦを含む。配列番号１３３９のＲＩＰＫ３ポリペプチドをコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１４１５及び配列番号１４８６に示される。
【０１７８】
別の実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、低いｐＩを有する直接ＩＡＰ結合タンパク質（ＤＩＡＢＬＯ）（ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯとしても公知である）をコードする。本明細書の実施例に記載されているように、ＤＩＡＢＬＯ構築物は、サイトカインの放出を誘導する。一実施形態では、本開示は、配列番号１６５に示される配列（当該技術分野でＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６３９４０．１として開示される２３９アミノ酸ヒトＤＩＡＢＬＯアイソフォーム１前駆体に相当する）を有するような野生型ヒトＤＩＡＢＬＯアイソフォーム１配列をコードするｍＲＮＡ構築物を提供する。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、配列番号１６６に示される配列を有するものなど、Ｓ１２６Ｌ突然変異を含むヒトＤＩＡＢＬＯアイソフォーム１配列をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、配列番号１６７に示される配列を有するような、ヒトＤＩＡＢＬＯアイソフォーム１のアミノ酸５６〜２３９をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ヒトＤＩＡＢＬＯアイソフォーム１のアミノ酸５６〜２３９をコードし、配列番号１６８に示される配列を有するようなＳ１２６Ｌ変異を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、配列番号１６９に示される配列（当該技術分野でＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｎｏ．ＮＰ＿００１２６５２７１．１として開示されている１９５アミノ酸のヒトＤＩＡＢＬＯアイソフォーム３に相当）を有するような、野生型ヒトＤＩＡＢＬＯアイソフォーム３配列をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、配列番号１７０に示される配列を有するような、Ｓ８２Ｌ突然変異を含むヒトＤＩＡＢＬＯアイソフォーム３配列をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、配列番号１７１に示される配列を有するような、ヒトＤＩＡＢＬＯアイソフォーム３のアミノ酸５６〜１９５をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、配列番号１７２に示される配列を有するような、ヒトＤＩＡＢＬＯアイソフォーム３のアミノ酸５６〜１９５をコードし、Ｓ８２Ｌ変異を含む。配列番号１６９のＤＩＡＢＬＯポリペプチドをコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１４１６及び配列番号１４８７に示されている。
【０１７９】
別の実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物によってコードされるポリペプチドは、ＦＡＤＤ（デスドメインを有するＦａｓ関連タンパク質）である。ＦＡＤＤをコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１３４５〜１３５１に示される任意のアミノ酸配列を有するＯＲＦを含む。ＦＡＤＤタンパク質をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１４１７〜１４２２及び１４８８〜１４９３に示される。
【０１８０】
パイロトーシスまたはインフラマソーム形成に関与するポリペプチドをコードしている免疫増強剤ｍＲＮＡ
別の実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物によってコードされているポリペプチドは、パイロトーシスまたはインフラマソーム形成に関与している。ポリペプチドは、タンパク質がそれ自体でパイロトーシスを媒介するか、またはパイロトーシスの媒介において、及び／またはインフラマソーム形成においてさらなる分子と関与する場合、パイロトーシスまたはインフラマソーム形成に「関与する」。パイロトーシスまたはインフラマソーム形成に関与するポリペプチドの非限定的な例としては、カスパーゼ１、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ１１、ＧＳＤＭＤ、ＮＬＲＰ３、Ｐｙｒｉｎドメイン及びＡＳＣ／ＰＹＣＡＲＤが挙げられる。
【０１８１】
一実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物によってコードされるポリペプチドは、カスパーゼ１である。一実施形態では、カスパーゼ１ポリペプチドは、自己活性化カスパーゼ−１ポリペプチド（例えば、配列番号１７５〜１７８に示される任意のＯＲＦアミノ酸配列をコードする）であり、これは、プロＩＬ１β及びプロＩＬ１８のそれぞれの成熟型への切断を促進し得る。
【０１８２】
別の実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物によってコードされているポリペプチドは、カスパーゼ−４またはカスパーゼ−５またはカスパーゼ−１１である。様々な実施形態では、カスパーゼ−４、−５、または−１１構築物は、（ｉ）全長の野生型カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、またはカスパーゼ−１１；（ｉｉ）全長カスパーゼ−４、−５または−１１に加えてＩＺドメイン；（ｉｉｉ）Ｎ末端が欠失したカスパーゼ−４、−５または−１１に加えてＩＺドメイン；（ｉｖ）全長カスパーゼ−４、−５または−１１に加えてＤＭドメイン；または（ｖ）Ｎ末端が欠失したカスパーゼ−４、−５または−１１に加えてＤＭドメインをコードし得る。Ｎ末端欠失型カスパーゼ−４及びカスパーゼ−１１の例は、アミノ酸残基８１〜３７７を含む。Ｎ末端欠失型カスパーゼ−５の例は、アミノ酸残基１３７〜４３４を含む。カスパーゼ−４をコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１３５２〜１３５６に示される任意のアミノ酸配列を有するＯＲＦを含む。カスパーゼ−５をコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１３５７〜１３６１に示される任意のアミノ酸配列を有するＯＲＦを含む。カスパーゼ１１をコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１３６２〜１３６６に示される任意のアミノ酸配列を有するＯＲＦを含む。
【０１８３】
一実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物によってコードされるポリペプチドは、ガスデルミンＤ（ＧＳＤＭＤ）である。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、野生型ヒトＧＳＤＭＤ配列をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ヒトＧＳＤＭＤのアミノ酸１〜２７５をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ヒトＧＳＤＭＤのアミノ酸２７６〜４８４をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、野生型マウスＧＳＤＭＤをコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、マウスＧＳＤＭＤのアミノ酸１〜２７６をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、マウスＧＳＤＭＤのアミノ酸２７７〜４８７をコードする。ＧＳＤＭＤをコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１３６７〜１３７２に示される任意のアミノ酸配列を有するＯＲＦを含む。
【０１８４】
別の実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物によってコードされているポリペプチドは、ＮＬＲＰ３である。ＮＬＲＰ３をコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１３７３または１３７４に示されるＯＲＦアミノ酸配列をコードする。
【０１８５】
別の実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物によってコードされるポリペプチドは、ＣＡＲＤ（ＡＳＣ／ＰＹＣＡＲＤ）を含むアポトーシス関連スペック様タンパク質、またはドメインなどのその断片である。一実施形態では、このポリペプチドは、Ｐｙｒｉｎ  Ｂ３０．２ドメインである。別の実施形態では、このポリペプチドは、Ｖ７２６Ａ変異を含むＰｙｒｉｎ  Ｂ３０．２ドメインである。Ｐｙｒｉｎ  Ｂ３０．２ドメインをコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１３７５または１３７６に示されるＯＲＦアミノ酸配列をコードする。ＡＳＣをコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１３７７または１３７８に示されるＯＲＦアミノ酸配列をコードする。
【０１８６】
追加の免疫増強剤ｍＲＮＡ
本開示は、追加の免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、ＳＯＣ３ポリペプチドをコードする（例えば、配列番号１７４に示されるＯＲＦアミノ酸配列をコードする）。
【０１８７】
さらに他の実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、ＤＣ産生、活性または動員の刺激など、樹状細胞（ＤＣ）活性を調節するタンパク質をコードする。ＤＣ動員を刺激するタンパク質の非限定的な例はＦＬＴ３である。したがって、一実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、ＦＬＴ３タンパク質をコードする。
【０１８８】
免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、典型的には、ポリペプチドコード配列に加えて、ｍＲＮＡ構築物について本明細書中に記載されるような他の構造特性（例えば、本明細書に記載の修飾核酸塩基、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ｍｉＲ結合部位（複数可）、ポリＡテール）を含む。適切なｍＲＮＡ構築物構成要素は、本明細書に記載のとおりである。
【０１８９】
ｍＲＮＡを含む目的の抗原
本開示の免疫増強剤ｍＲＮＡは、免疫応答の増強が望まれる任意の種類の抗原と組み合わせて有用であり、これには、腫瘍抗原または病原体抗原などの目的の抗原に対する免疫応答を増強するために、少なくとも１つの目的の抗原をコードするｍＲＮＡ配列（同一または別個のｍＲＮＡ構築物上）と組み合わせることが含まれる。したがって、本開示の免疫増強剤ｍＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡワクチン応答を増強し、それによって遺伝的アジュバントとして作用する。一実施形態では、目的の抗原（複数可）は腫瘍抗原である。別の実施形態では、目的の抗原（複数可）は病原体抗原である。様々な実施形態では、病原体抗原（複数可）は、ウイルス、細菌、原生動物、真菌及び寄生生物からなる群より選択される病原体由来であり得る。
【０１９０】
一実施形態では、抗原は、インサイチュで放出される腫瘍抗原または病原体抗原などの内因性抗原である。あるいは、抗原は外因性抗原である。外因性抗原は、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物と同時投与されてもよいし、あるいは、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物の前または後に投与されてもよい。外因性抗原は、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物と共処方されてもよいし、あるいは、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物とは別に処方されてもよい。一実施形態では、外因性抗原は、免疫増強剤をコードするものと同じまたは異なるｍＲＮＡ構築物のいずれかであるｍＲＮＡ構築物（例えば、ｍｍＲＮＡ構築物）によってコードされる。他の実施形態では、抗原は、例えば、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、多糖類または脂質であってもよい。
【０１９１】
一実施形態では、目的の抗原（複数可）は、腫瘍抗原である。一実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍ネオエピトープ、例えば、腫瘍抗原由来の変異体ペプチドを含む。一実施態様では、腫瘍抗原は、Ｒａｓ抗原である。がんにおけるＲａｓ変異の包括的な調査は、当該技術分野において記載されている（Ｐｒｉｏｒ，Ｉ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７２：２４５７−２４６７）。したがって、がんに関連する少なくとも１つの変異を含むＲａｓアミノ酸配列は、目的の抗原として使用され得る。一実施形態では、腫瘍抗原は、変異体ＫＲＡＳ抗原である。変異体ＫＲＡＳ抗原は、ある種の治療剤に対する獲得耐性に関与している（例えば、Ｍｉｓａｌｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  ４８６：５３２−５３６；Ｄｉａｚ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  ４８６：５３７−５４０を参照のこと）。さらに、少なくとも１つの変異型ＲＡＳペプチド及び代謝拮抗化学療法剤を含む抗腫瘍ワクチンが、当該技術分野において記載されている（その全体の内容が参照により本明細書に明白に組み込まれる、米国特許第９，７５７，４３９号）。したがって、米国特許第９，７５７，４３９号に記載されている任意の変異体ＲＡＳペプチドを、例えば、本開示の免疫増強剤と組み合わせて本開示の抗原として使用し、それによってＲａｓ腫瘍抗原に対する抗腫瘍免疫応答を増強し得る。
【０１９２】
一実施形態では、変異ＫＲＡＳ抗原は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ及びＧ１２Ｃ、ならびにそれらの組み合わせから選択される１つ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。変異体ＫＲＡＳ抗原の非限定的な例としては、配列番号９５〜１０６及び１３１〜１３２に示されるアミノ酸配列のうちの１つ以上を含む抗原が挙げられる。一実施形態では、変異体ＫＲＡＳ抗原は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、及びＧ１２Ｃから選択される変異を含む１つ以上の変異体ＫＲＡＳ１５量体ペプチドであり、それらの非限定的な例は、配列番号９５〜９７に示される。別の実施形態では、変異体ＫＲＡＳ抗原は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ及びＧ１２Ｃから選択される変異を含む１つ以上の変異体ＫＲＡＳ  ２５量体ペプチドであり、その非限定的な例は、配列番号９８〜１００及び１３１に示される。別の実施形態では、変異体ＫＲＡＳ抗原は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ及びＧ１２Ｃから選択される変異を含む１つ以上の変異体ＫＲＡＳ  ３×１５量体ペプチド（１５量体ペプチドの３コピー）であり、それらの非限定例は、配列番号１０１〜１０３に示される。別の実施形態では、変異体ＫＲＡＳ抗原は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ及びＧ１２Ｃから選択される変異を含む１つ以上の変異体ＫＲＡＳ  ３×２５量体ペプチド（２５量体ペプチドの３つのコピー）であり、その非限定的な例は、配列番号１０４〜１０６及び１３２に示される。別の実施形態では、変異体ＫＲＡＳ抗原は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ及びＧ１２Ｃの変異を含む２５量体のペプチドの１００量体のコンカテマーペプチド（すなわち、配列番号９８、９９、１００及び１３１の１００量体のコンカテマー）である。したがって、一実施形態では、変異体ＫＲＡＳ抗原は、配列番号９８、９９、１００、及び１３１をコードするｍＲＮＡ構築物を含む。変異体ＫＲＡＳ抗原、そのアミノ酸配列、及びそれをコードするｍＲＮＡ配列のさらなる説明は、その全体の内容が、参照により本明細書に明確に組み込まれている米国特許出願公開第６２／４５３，４６５号に開示される。いくつかの実施形態では、変異体ＫＲＡＳ抗原は、配列番号１３２１または１３２２に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＧ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ及びＧ１２Ｃの変異を含む２５量体のペプチドの１００量体のコンカテマーペプチドである。
【０１９３】
一実施形態では、腫瘍抗原は、免疫増強剤も含む（すなわち、腫瘍抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドもコードする）ｍＲＮＡ構築物によってコードされる。そのような構築物の非限定的な例としては、配列番号１０７〜１３０に示されるアミノ酸配列のうちの１つをコードするＫＲＡＳ−ＳＴＩＮＧ構築物が挙げられる。ＫＲＡＳ−ＳＴＩＮＧ構築物をコードするヌクレオチド配列の非限定的な例は、配列番号２２０〜２２３に示される。
【０１９４】
さらに別の実施形態では、腫瘍抗原は発がん性ウイルス抗原である。一実施形態では、発がん性ウイルスは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）であり、ＨＰＶ抗原（複数可）は、Ｅ６及び／またはＥ７抗原である。ＨＰＶ  Ｅ６抗原の非限定的な例としては、配列番号３６〜７２に示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。ＨＰＶ  Ｅ７抗原の非限定的な例としては、配列番号７３〜９４に示されるアミノ酸配列を含む抗原が挙げられる。他の実施形態では、ＨＰＶ抗原は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｌ１もしくはＬ２タンパク質、またはそれらの抗原性ペプチド配列である。適切なＨＰＶ抗原は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１４号にさらに記載されており、その全内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０１９５】
別の実施形態では、腫瘍抗原は、ｍＲＮＡがんワクチンによってコードされている。適切なｍＲＮＡがんワクチンは、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４９１８号に詳細に記載されており、その全内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０１９６】
さらに別の実施形態では、腫瘍抗原は、インサイチュでの腫瘍細胞の破壊時に放出される腫瘍抗原などの内因性腫瘍抗原である。免疫応答が細胞内構成要素に対して刺激され得るように、細胞内構成要素の放出をもたらすインビボでの細胞死をもたらす天然の機構が存在することが当該技術分野において確認されている。そのような機構は、本明細書において免疫原性細胞死と呼ばれ、そしてネクロトーシス及びパイロトーシスを含む。したがって、一実施形態では、本開示の免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、内因性免疫原性細胞死が生じて１つ以上の内因性腫瘍抗原が放出され、それによって腫瘍抗原に対する免疫応答を増強するような条件下で腫瘍を有する対象に投与される。一実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物は、対象における腫瘍細胞の免疫原性細胞死を刺激する「実行型ｍＲＮＡ構築物」をコードする第２のｍＲＮＡ構築物と共に腫瘍を有する対象に投与される。実行型ｍＲＮＡ構築物の例としては、ＭＬＫＬ、ＲＩＰＫ３、ＲＩＰＫ１、ＤＩＡＢＬＯ、ＦＡＤＤ、ＧＳＤＭＤ、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−１１、Ｐｙｒｉｎ、ＮＬＲＰ３及びＡＳＣ／ＰＹＣＡＲＤをコードする構築物が挙げられる。実行型ｍＲＮＡ構築物、及び免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物と組み合わせたそれらの使用は、その全内容が参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許出願第６２／４１２，９３３号にさらに詳細に記載されている。
【０１９７】
一実施形態では、目的の抗原（複数可）は、病原体抗原である。一実施形態では、病原体抗原は、ウイルス抗原を含む。一実施形態では、ウイルス抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原である。一実施形態では、ＨＰＶ抗原は、Ｅ６またはＥ７抗原である。ＨＰＶ  Ｅ６抗原の非限定的な例としては、配列番号３６〜７２に示されるアミノ酸配列を含む抗原が挙げられる。ＨＰＶ  Ｅ７抗原の非限定的な例としては、配列番号７３〜９４に示されるアミノ酸配列を含む抗原が挙げられる。他の実施形態では、ＨＰＶ抗原は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｌ１もしくはＬ２タンパク質、またはそれらの抗原性ペプチド配列である。適切なＨＰＶ抗原は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１４号にさらに記載されており、その全内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる。別の実施形態では、ウイルス抗原は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗原、例えば、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２抗原である。例えば、ウイルス抗原は、ＨＳＶ（ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２）糖タンパク質Ｂ、糖タンパク質Ｃ、糖タンパク質Ｄ、糖タンパク質Ｅ、糖タンパク質Ｉ、ＩＣＰ４またはＩＣＰ０抗原であり得る。適切なＨＳＶ抗原は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１４号にさらに記載されており、その全内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０１９８】
一実施形態では、病原体抗原は細菌性抗原である。一実施形態では、細菌抗原は多価抗原である（すなわち、抗原は、異なるエピトープを含む複数の抗原性ペプチドなどの複数の抗原性エピトープを含む）。一実施形態では、細菌抗原は、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）抗原、例えば、ＭＯＭＰ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＬ、ＯｍｐＦまたはＯｐｒＦ抗原である。適切なクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）抗原は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１４号にさらに記載されており、その全内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０１９９】
一実施形態では、病原体抗原は、免疫増強剤も含む（すなわち、腫瘍抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドもコードする）ｍＲＮＡ構築物によってコードされる。
【０２００】
目的の抗原（複数可）をコードするｍＲＮＡ構築物は、典型的には、抗原をコードする配列に加えて、ｍＲＮＡ構築物について本明細書に記載されるような他の構造特性（例えば、本明細書に記載の修飾核酸塩基、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ｍｉＲ結合部位（複数可）、ポリＡテール）を含む。適切なｍＲＮＡ構築物構成要素は、本明細書に記載のとおりである。
【０２０１】
オンコウイルス
一実施形態では、免疫増強剤構築物は、発がん性ウイルス（オンコウイルス）由来の１つ以上の抗原に対する免疫応答を増強するために使用される。ウイルス感染は、全てのヒトのがんのかなりの割合の原因である。世界中の全てのヒトのがんの約１２％がウイルスの病因を有すると推定されている（Ｐａｒｋｉｎ（２００６）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ１１８：３０３０−３０４４）。「オンコウイルス」という用語は、がんを引き起こし得るＤＮＡ及び／またはＲＮＡゲノムを有する任意のウイルスを指し、そして「腫瘍ウイルス」または「がんウイルス」という用語と同義的に使用され得る。世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）の国際癌研究機関（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＩＡＲＣ））は、７つのヒト癌ウイルスを、グループ１の生物学的発癌物質として認めており、これに関しては、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、高リスクヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びカポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）（Ｂｏｕｖａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １０：３２１−３２２）を含む「ヒトにおける十分な発現性の証拠」がある。メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）は、グループ２Ａの生物学的発癌物質としてＩＡＲＣによって分類されている最近発見された癌ウイルスである（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１９（５８６６）：１０９６−１１００）。
【０２０２】
病原性ウイルス（例えば、ポリオ、インフルエンザ）を標的とするワクチンの経済的に不利な集団に到達するための安全性、有効性、及び能力の優れた記録によって、オンコウイルスを標的とする予防及び治療ワクチン接種戦略の開発及び実施への努力が促された（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｗｙ（２０１０）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６４：２３−４１）。したがって、一態様では、免疫増強剤構築物を使用して、発がん性ウイルスの１つ以上の目的の抗原に対する免疫応答を増強し得る。例えば、発がん性ウイルス由来の目的の抗原（複数可）は、免疫増強剤構築物と同じｍｍＲＮＡ上に提供されるか、または免疫増強剤として異なる構築物ｍｍＲＮＡ構築物上に提供される、化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）によってコードされ得る。免疫増強剤及び抗原ｍｍＲＮＡを、それを必要とする対象に処方（または共処方）及び投与（同時または順次）して、その対象における発がん性ウイルス抗原（複数可）に対する免疫応答を刺激してもよい。発がん性ウイルス、及びそれによって発がん性ウイルスに対する免疫応答を増強するための免疫増強剤構築物と組み合わせて使用するためのその適切な抗原の非限定的な例は、以下にさらに記載される。
【０２０３】
Ａ．ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）
一実施形態では、癌ウイルス抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）由来である。子宮頸癌は、世界中で女性が罹患している４番目に最も一般的な悪性腫瘍である（Ｗａｋｅｈａｍ  ａｎｄ  Ｋａｖａｎａｇｈ（２０１４）Ｃｕｒｒ  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ１６（９）：４０２）。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による感染は、子宮頸癌のほぼ全ての症例に関連し、そして陰茎、膣、外陰、肛門及び口腔咽頭を含む他のいくつかの癌を引き起こす原因である（Ｆｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０  Ｓｕｐｐｌ  ５：Ｆ１２−２３；Ｍａｘｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  ６７：９１−１０１）。現在までに、３００以上のパピローマウイルスが同定され配列決定されており、その中には発がん性に応じて分類されている２００種類以上のＨＰＶが含まれている。子宮頸癌の発症と「高リスク」ＨＰＶタイプによる感染との間の関連は十分に確立されており、子宮頸部スクリーニング中のＨＰＶ  ＤＮＡ試験及び予防ワクチンの開発の理論的根拠を提供する（Ｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｖｉｒｕｓｅｓ  ７（７）：３８６３−３８９０）。高リスクＨＰＶ型のうち、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８は、子宮頸癌症例の約７０％に関与する主要なパピローマウイルス型である（Ｗａｌｂｏｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １８９（１）：１２〜１９；Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｂｒｉ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８８：６３−７３）。
【０２０４】
子宮頸癌及び他の泌尿生殖器悪性腫瘍の病因としてのＨＰＶの同定は、ワクチン接種及びＨＰＶ感染を標的とする他の治療戦略を通して、ＨＰＶ関連がんによって引き起こされる罹患率及び死亡率を軽減する機会を提供した（ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ（２００２）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ２（５）：３４２−３５０）。ＨＰＶウイルス粒子のメジャーキャプシドタンパク質Ｌ１を標的とする予防ＨＰＶワクチンが存在する（Ｈａｒｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｄｉｓｃｏｖ  Ｍｅｄ  １０（５０）：７−１７；Ｋａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  ４（４）：６１４−６３３）。これらのワクチンは、感染していない人々がＨＰＶ感染を獲得するのを防ぎ、さらに以前に感染した患者が再感染するのを防いだ。しかし、現在利用可能なＨＰＶワクチンは、確立されたＨＰＶ感染及びＨＰＶ関連病変を処置または解消することはできない（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｅｍｅｒｇ  Ｄｒｕｇｓ１７（４）：４６９−４９２）。治療用ＨＰＶワクチンは、既存のＨＰＶ感染及び関連疾患を解消するための潜在的な処置アプローチである。ウイルス粒子に対する中和抗体を生成し得る予防用ＨＰＶワクチンとは異なり、治療用ＨＰＶワクチンは、感染細胞を特異的に標的とし殺傷するように細胞媒介性免疫応答を刺激し得る。
【０２０５】
多くのＨＰＶ感染症は、無症候性のままであって免疫系によって解消されるが、持続性ＨＰＶ感染症が発症する可能性があり、この感染症はさらに低悪性度または高悪性度の子宮頸部上皮内腫瘍及び／または子宮頸癌に進展し得る（Ｏｓｔｏｒ（１９９３）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  ｐａｔｈｏｌ  １２（２）：１８６−１９２；Ｇｈｉｔｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｅｃｃａｎｃｅｒｍｅｄｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅ  ９：５２６）。ＨＰＶウイルスＤＮＡは、多くのＨＰＶ関連病変及びがんの宿主のゲノムに組み込まれている。この組み込みは、初期（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、及びＥ５）及び後期（Ｌ１及びＬ２）遺伝子の欠失をもたらし得る。組み込みプロセス中のＬ１及びＬ２の欠失は、ＨＰＶ関連がんに対する予防ワクチンの使用を妨げる。さらに、Ｅ２は、ＨＰＶがん遺伝子Ｅ６及びＥ７に対する負の調節因子である。組み込み中のＥ２の欠失は、Ｅ６及びＥ７の発現の増大をもたらし、そしてＨＰＶ関連発がん性に寄与すると考えられる。癌タンパク質Ｅ６及びＥ７は、ＨＰＶ関連悪性腫瘍の開始及び維持に必要であり、そして形質転換細胞において発現される。Ｅ６及びＥ７を標的とする治療用ＨＰＶワクチンは、自己抗原に対する免疫寛容の問題を回避し得る理由は、これらのウイルスコード化発癌タンパク質が、人体にとって外来タンパク質であるからである。これらの理由から、ＨＰＶ癌タンパク質Ｅ６及びＥ７は、治療用ＨＰＶワクチンの理想的な標的として働く。
【０２０６】
したがって、一態様では、免疫増強剤構築物を使用して、目的の１つ以上のＨＰＶ抗原に対する免疫応答を増強し得る。例えば、ＨＰＶ由来の目的の抗原（複数可）は、免疫増強剤構築物と同じｍｍＲＮＡ上に提供されるか、または免疫増強剤として異なる構築物ｍｍＲＮＡ構築物上に提供される化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）によってコードされ得る。免疫増強剤及びＨＰＶ抗原ｍｍＲＮＡを、それを必要とする対象に処方（または共処方）及び投与（同時または順次）して、その対象におけるＨＰＶ抗原に対する免疫応答を刺激し得る。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン（例えば、同一または異なるｍＲＮＡ上に免疫増強剤構築物及びＨＰＶ抗原構築物を含む）は、少なくとも１つのＨＰＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、ＨＰＶに対する免疫応答を誘導し得る免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＨＰＶ抗原性ポリペプチドは、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、及びＬ２、ならびにそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドは、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、及びＥ７から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドは、Ｅ６、Ｅ７、またはＥ６とＥ７の組み合わせである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドは、Ｌ１、Ｌ２、またはＬ１とＬ２の組み合わせである。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドはＬ１である。いくつかの実施形態では、Ｌ１タンパク質は、ＨＰＶ血清型６、１１、１６、１８、３１、３３、３５、３９、３０、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３または８２から得られる。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドは、Ｌ１、Ｌ２、またはＬ１とＬ２の組み合わせ、及びＥ６、Ｅ７、またはＥ６とＥ７の組み合わせである。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドは、ＨＰＶ株であるＨＰＶ１６型（ＨＰＶ１６）、ＨＰＶ１８型（ＨＰＶ１８）、ＨＰＶ２６型（ＨＰＶ２６）、ＨＰＶ３１型（ＨＰＶ３１）、ＨＰＶ３３型（ＨＰＶ３３）、ＨＰＶ３５型（ＨＰＶ３５）、ＨＰＶ４５型（ＨＰＶ４５）、ＨＰＶ５１型（ＨＰＶ５１）、ＨＰＶ５２型（ＨＰＶ５２）、ＨＰＶ５３型（ＨＰＶ５３）、ＨＰＶ５６型（ＨＰＶ５６）、ＨＰＶ５８型（ＨＰＶ５８）、ＨＰＶ５９型（ＨＰＶ５９）、ＨＰＶ６６型（ＨＰＶ６６）、ＨＰＶ６８型（ＨＰＶ６８）、ＨＰＶ８２型（ＨＰＶ８２）、またはそれらの組み合わせに由来する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドは、ＨＰＶ株ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、またはそれらの組み合わせに由来する。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原ポリペプチドは、ＨＰＶ株であるＨＰＶ６型（ＨＰＶ６）、ＨＰＶ１１型（ＨＰＶ１１）、ＨＰＶ１３型（ＨＰＶ１３）、ＨＰＶ４０型（ＨＰＶ４０）、ＨＰＶ４２型（ＨＰＶ４２）、ＨＰＶ４３型（ＨＰＶ４３）、ＨＰＶ４４型（ＨＰＶ４４）、ＨＰＶ５４型（ＨＰＶ５４）、ＨＰＶ６１型（ＨＰＶ６１）、ＨＰＶ７０型（ＨＰＶ７０）、ＨＰＶ７２型（ＨＰＶ７２）、ＨＰＶ８１型、（ＨＰＶ８１）、ＨＰＶ８９型（ＨＰＶ８９）、またはそれらの組み合わせに由来する。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原ポリペプチドは、ＨＰＶ株であるＨＰＶ３０型（ＨＰＶ３０）、ＨＰＶ３４型（ＨＰＶ３４）、ＨＰＶ５５型（ＨＰＶ５５）、ＨＰＶ６２型（ＨＰＶ６２）、ＨＰＶ６４型（ＨＰＶ６４）、ＨＰＶ６７型（ＨＰＶ６７）、ＨＰＶ６９型（ＨＰＶ６９）、ＨＰＶ７１型（ＨＰＶ７１）、ＨＰＶ７３型（ＨＰＶ７３）、ＨＰＶ７４型（ＨＰＶ７４）、ＨＰＶ８３型（ＨＰＶ８３）、ＨＰＶ８４型（ＨＰＶ８４）、ＨＰＶ８５型（ＨＰＶ８５）、またはそれらの組み合わせに由来する。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）のＨＰＶから得られたＥ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、及びＬ２タンパク質、またはそれらの組み合わせをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＨＰＶから得られたＥ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、及びＥ７タンパク質、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、または６）のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＨＰＶから得られたＥ６及びＥ７タンパク質から選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＨＰＶから得られたＬ１もしくはＬ２タンパク質、またはそれらの組み合わせから選択されるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、感染細胞を構造的に修飾する抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ＨＰＶウイルスキャプシドの一部または全部を形成する抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ウイルス様粒子に自己アセンブルし得る抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、感染している細胞へのＨＰＶの結合を担う抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２１８】
本開示のいくつかの実施形態は、ヒトにおけるＨＰＶ感染を処置及び／または予防する方法に関し、ここで免疫増強剤構築物及び少なくとも１つのＨＰＶポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする１つ以上の免疫調節治療用核酸を含む、本明細書に記載の１つ以上の組成物（免疫応答を生じることが当業者によって示されているか、または予測されている）が、それを必要とする対象（例えば、ＨＰＶに感染しているかまたは感染の危険がある人）に提供される。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＰＶ感染から生じるか及び／またはその原因として関連するがんを処置及び／または予防する方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染から生じる少なくとも１つの症状を軽減する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象における子宮頸癌、陰茎癌、膣癌、外陰癌、肛門癌または口腔咽頭癌のリスクを低減する方法を提供する。これらの方法のそれぞれにおいて、免疫増強剤構築物及び少なくとも１つのＨＰＶポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする１つ以上の免疫調節治療用核酸を含む、本明細書に記載の１つ以上の組成物（免疫応答を生じることが当業者によって示されるか、または推測されている）は、それを必要とする対象（例えば、ＨＰＶに感染しているかまたはＨＰＶによる感染の危険性がある人）に提供される。
【０２２０】
必要に応じて、ＨＰＶ感染を予防及び／または処置する医薬を必要とする対象は、ＨＰＶ及び／またはＨＰＶに感染している対象の細胞に対する免疫応答を生じるように、免疫増強剤構築物及び少なくとも１つのＨＰＶポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする１つ以上の免疫調節治療用核酸を含む医薬を提供される。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＨＰＶウイルス力価の低下をもたらす。いくつかの実施形態では、免疫応答は、中和抗ＨＰＶ抗体の産生をもたらす。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＨＰＶ感染細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答をもたらす。
【０２２１】
Ｂ．Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
別の実施形態では、オンコウイルス抗原は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来である。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科に属する二重鎖ＤＮＡウイルスである。ヒトに感染すると、ＨＢＶは、Ｂ型肝炎を引き起こす。肝炎を生じることに加えて、ＨＢＶの感染は、肝硬変及び肝細胞癌の発症をもたらし得る。したがって、別の態様では、免疫増強剤構築物を用いて、目的の１つ以上のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原に対する免疫応答を増強してもよい。例えば、ＨＢＶ由来の目的の抗原（複数可）は、免疫増強剤構築物と同じｍｍＲＮＡ上に提供されるか、または免疫増強剤として異なる構築物ｍｍＲＮＡ構築物上に提供される化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）によってコードされ得る。免疫増強剤及びＨＢＶ抗原ｍｍＲＮＡを、それを必要とする対象に処方（または共処方）及び投与（同時または順次）して、その対象のＨＢＶ抗原に対する免疫応答を刺激してもよい。
【０２２２】
ＨＢＶゲノムは、文字Ｓ、Ｃ、Ｐ、及びＸによって画定される４つの重複するオープンリーディングフレーム（すなわち遺伝子）をコードする（Ｇａｎｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４ｔｈｅｄ．；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４ｔｈｅｄ．）。Ｓ遺伝子は、ウイルス表面エンベロープタンパク質、ＨＢｓＡｇをコードし、そして構造的及び機能的にプレＳ１、プレＳ２、及びＳ領域に分けてもよい。ＨＢｓＡＧには、小（Ｓ）、中（Ｍ）、及び大（Ｌ）の３つの形態がある。コアまたはＣ遺伝子は、プレコア及びコア領域を有する。複数のインフレーム翻訳開始コドンは、Ｓ及びＣ遺伝子の特徴であり、これらは関連するが機能的に異なるタンパク質を生じる。Ｃ遺伝子は、翻訳がそれぞれコア領域またはプレコア領域のどちらから開始されるかに応じて、ウイルスヌクレオキャプシドＨＢｃＡｇまたはＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）のいずれかをコードする。コアタンパク質は、キャプシド様構造に自己アセンブルする。プレコアＯＲＦは、翻訳産物を感染細胞の小胞体に向かわせるシグナルペプチドをコードし、ここでタンパク質はさらにプロセシングされて分泌ＨＢｅＡｇを形成する。ＨＢｅＡｇの機能は、その機能が持続感染を促進することである免疫寛容に関与しているが、ほとんど特徴付けられていない（Ｍｉｌｉｃｈ及びＬｉａｎｇ（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３８：１０７５−１０８６。ポリメラーゼ（ｐｏｌ）は、約８００アミノ酸という大きなタンパク質であり、Ｐ  ＯＲＦによってコードされる。Ｐｏｌは、キャプシド形成及びマイナス鎖合成の開始に関与する、末端タンパク質ドメイン；ゲノム合成を触媒する逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン；及びプレゲノムＲＮＡを分解し、複製を促進する、リボヌクレアーゼＨドメインという３つのドメインに機能的に分けられる。ＨＢＶ  Ｘ  ＯＲＦは、シグナル伝達、転写活性化、ＤＮＡ修復、及びタンパク質分解の阻害など、複数の機能を有する１６．５−ｋｄタンパク質（ＨＢｘＡｇ）をコードする（Ｃｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：８０７８−８０８２；Ｂｏｕｃｈａｒｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（２００４）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７８：１２７２５−１２７３４）。ウイルスのライフサイクルにおけるこの活性の機構及びＨＢｘＡｇの生物学的機能は、ほとんど知られていない。しかし、ＨＢｘＡｇがインビボでの増殖性ＨＢＶ感染に必要であり、そしてＨＢＶの発がん性の可能性に寄与し得ることは十分に確立されている（Ｌｉａｎｇ（２００９）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４９（Ｓｕｐｐｌ  Ｓ５）：Ｓ１３−Ｓ２１）。
【０２２３】
効果的な予防ワクチンの入手可能性にもかかわらず、２億４千万人以上の人々が、ＨＢＶに慢性感染し続け、毎年５０万人超の人々が慢性感染症による肝疾患で死亡している（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（２０１５）Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｆａｃｔ  Ｓｈｅｅｔ  ＦＳ２０４）。ＨＢＶ感染に対する現在利用可能な治療選択肢としては、ヌクレオシド（ヌクレオチド）類似体及びアルファインターフェロン（ＩＦＮ−α）が挙げられる。しかし、これらの処置にはいくつかの制限がある。ヌクレオシド（ヌクレオチド）類似体は、ウイルス複製を効果的に抑制するが、感染を排除しない。ヌクレオシド（ヌクレオチド）類似体による処置が中止されると、ウイルスは、感染者では急速にリバウンドする。さらに、抗ウイルス薬による長期処置は、薬剤耐性変異ウイルスの生成をもたらし得る。ヌクレオシド（ヌクレオチド）類似体とは対照的に、抗ウイルス活性及び免疫調節活性の両方を有するＩＦＮ−αは、一部の患者においてより耐久性のある結果を生じ得る。しかし、ＩＦＮ−α処置は、しばしば高い発生率の副作用と関連しており、それによってそれは次善の治療選択肢となっている。したがって、ＨＢＶ関連感染症及び疾患に対する新たな有効な治療法の設計は不可欠である（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８９（２０）：１０４０７−１０４１５）。
【０２２４】
ＨＢＶ感染及びその処置は、典型的にはウイルス抗原及び／または抗原に対する抗体の検出によってモニターされる。ＨＢＶに感染すると、最初に検出可能な抗原は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）であり、続いてＢ型肝炎「ｅ」抗原（ＨＢｅＡｇ）である。ウイルスの除去は、ＨＢｓＡｇに対する、及び／またはコア抗原（ＨＢｃＡｇ）に対する血清中のＩｇＧ抗体の出現（セロコンバージョンとしても知られている）によって示される。多数の研究では、ウイルス複製、ウイルス血症のレベル、及びＨＢＶ感染個体における慢性状態への進行が、ＣＤ４＋ヘルパー（ＴＲ）及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって媒介されるＨＢＶ特異的細胞性免疫によって、直接的及び間接的に影響されることが示される。慢性疾患に進行している患者は、急性感染を解消する患者と比較して、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答がないか、弱いか、または焦点が絞られている傾向がある（例えば、Ｃｈｉｓａｒｉ，１９９７，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９９：１４７２−１４７７；Ｍａｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１７：１３８６−１３９６；Ｒｅｈｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５；５：２１５〜２２９；Ｔｈｉｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：３９８４−３９８７；Ｕｒｂａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：１２４２３−１２４３４；Ｗｉｅｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｉｓａｒｉ，２００５，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：９３６９−９３８０；Ｗｅｂｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３２：１１１７−１１２４；Ｐｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９８：１１８５−１１９４；Ｓｐｒｅｎｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２００６；４５：１８２−１８９を参照のこと）。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン（例えば、同一または異なるｍＲＮＡ上に免疫増強剤構築物及びＨＢＶ抗原構築物を含む）は、少なくとも１つのＨＢＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、ＨＢＶに対する免疫応答を誘導し得る免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する、少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＨＢＶ抗原ポリペプチドは、ＨＢｓＡｇ（Ｓ、ＭまたはＬ）、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｘＡｇ、Ｐｏｌ、及びそれらの組み合わせから選択される。
【０２２６】
配列決定されたゲノムにわたる群間の相違に基づいて、ＨＢＶは、系統発生学的に、単一の個体から単離された推定上の１０番目の遺伝子型Ｊを有する９つの遺伝子型Ａ−Ｉに分類されている。ＨＢＶ遺伝子型はさらに少なくとも３５のサブ遺伝子型に分類される。遺伝子型の違いは、疾患の重症度、疾患の経過及び合併症の可能性、処置に対する応答、及びおそらくワクチン接種に対する応答に影響を及ぼす（Ｋｒａｍｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３（１９）：２４０９−２４２３；Ｍａｇｎｉｕｓ  ａｎｄ  Ｎｏｒｄｅｒ，（１９９５），Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３８（１−２）：２４−３４）。
【０２２７】
ＨＢＶ遺伝子型Ａはさらに、サブ遺伝子型Ａ１、Ａ２、Ａ４、及び準サブ遺伝子型Ａ３に分類され、後者の群の配列は、サブ遺伝子型分類の基準を満たさない。ＨＢＶ遺伝子型Ｂはさらに、６つのサブ遺伝子型Ｂ１、Ｂ２、Ｂ４〜Ｂ６、及び準サブ遺伝子型Ｂ３に分類される。最も古いＨＢＶ遺伝子型であるＨＢＶ遺伝子型Ｃは、ヒト集団における長期の流行性を反映している、１６個のサブ遺伝子型Ｃ１〜Ｃ１６にさらに分類される。ＨＢＶ遺伝子型Ｄは、６つのサブ遺伝子型Ｄ１〜Ｄ６にさらに分類される。ＨＢＶ遺伝子型Ｆは、４つのサブ遺伝子型Ｆ１〜Ｆ４にさらに分類される。遺伝子型Ｉは、２つのサブ遺伝子型Ｉ１及びＩ２にさらに分類される。さらに、ＨＢＶは、血清学によってＨＢＶのエンベロープタンパク質上に存在する抗原性エピトープに基づいて、４つの主要な血清型ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ、及びａｙｗに分類されている（Ｋｒａｍｖｉｓ（２０１４）Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５７：１４１−１５０）。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＨＢＶ抗原ポリペプチドは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ（例えば、サブ遺伝子型Ａ１〜Ａ４のいずれか）、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ（例えば、サブ遺伝子型Ｂ１〜Ｂ６のいずれか）、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ（例えば、サブ遺伝子型Ｃ１〜Ｃ１６のいずれか）、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ（例えば、サブ遺伝子型Ｄ１〜Ｄ６のいずれか）、ＨＢＶ遺伝子型Ｅ、ＨＢＶ遺伝子型Ｆ（例えば、サブ遺伝子型Ｆ１〜Ｆ４のいずれか）、ＨＢＶ遺伝子型ＧまたはＨＢＶ遺伝子型Ｉ（例えば、サブ遺伝子型Ｉ１−Ｉ２のいずれか）に由来する。
【０２２９】
本開示のいくつかの実施形態は、ヒトにおけるＨＢＶ感染を処置及び／または予防する方法に関し、ここで、免疫増強剤構築物及び少なくとも１つのＨＢＶポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする１つ以上の免疫調節治療用核酸を含む、本明細書に記載の１つ以上の組成物（免疫応答を生じることが当業者によって示されているか、または予測されている）を、それを必要とする対象（例えば、ＨＢＶに感染しているかまたは感染の危険がある人）に提供する。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＢＶ感染に由来するか及び／または原因として関連するがんを処置及び／または予防する方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＢＶ感染、またはＨＢＶ感染から生じる少なくとも１つの症状を軽減する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象における肝臓の損傷を軽減するための方法を提供する。これらの方法のそれぞれにおいて、免疫増強剤構築物及び少なくとも１つのＨＢＶポリペプチドまたはその免疫原性断片（免疫応答を生じさせることが当業者によって示されるかまたは予測されている）をコードする１つ以上の免疫調節治療用核酸を含む、本明細書に記載の１つ以上の組成物が、それを必要とする対象（例えば、ＨＢＶに感染しているか、またはＨＢＶによる感染の危険性がある人）に提供される。
【０２３１】
必要に応じて、ＨＢＶ感染を予防及び／または処置する医薬を必要とする対象は、ＨＢＶ及び／またはＨＢＶに感染している対象の細胞に対する免疫応答を生じる、免疫増強剤構築物及び少なくとも１つのＨＢＶポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする１つ以上の免疫調節治療用核酸を含む医薬を提供される。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＨＢＶウイルス力価の低下をもたらす。いくつかの実施形態では、免疫応答は、中和抗ＨＢＶ抗体の産生をもたらす。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＨＢＶ感染細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答をもたらす。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、免疫調節治療用核酸（例えば、メッセンジャーＲＮＡ、ｍＲＮＡ）は、少なくとも１つのＨＢＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、ＨＢＶに対する免疫応答を誘導し得る免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片は、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｘＡｇ、またはＰｏｌから選択される。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片は、暫定的及び／または確認されたＨＢＶ遺伝子型及び／または亜遺伝子型から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片は、暫定的または未割り当てのＨＢＶ遺伝子型または亜遺伝子型から選択される。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、感染細胞を構造的に修飾する抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ＨＢＶウイルスキャプシドの一部または全部を形成する抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ウイルス様粒子に自己アセンブルし得る抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、感染している細胞へのＨＢＶウイルスの結合を担う抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２３８】
Ｃ．Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）
別の実施形態では、癌ウイルス抗原は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来である。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、主に肝臓に影響を与えるウイルス感染症である、Ｃ型肝炎を引き起こす、小さな、エンベロープが付いたプラス鎖の一本鎖ＲＮＡウイルスである。したがって、別の態様では、免疫増強剤構築物は、目的の１つ以上のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原に対する免疫応答を増強するために使用され得る。例えば、ＨＣＶ由来の目的の抗原（複数可）は、免疫増強剤構築物と同じｍｍＲＮＡ上に提供されるか、または免疫増強剤として異なる構築物ｍｍＲＮＡ構築物上に提供される化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）によってコードされ得る。免疫増強剤及びＨＣＶ抗原ｍｍＲＮＡを、それを必要とする対象に処方（または共処方）及び投与（同時または順次）して、対象のＨＣＶ抗原に対する免疫応答を刺激してもよい。
【０２３９】
ＨＣＶのＲＮＡゲノムは、成熟構造及び非構造（ＮＳ）タンパク質を産生するために、細胞及びウイルスでコードされたプロテアーゼ及びペプチダーゼによって同時翻訳的にプロセシングされ翻訳後プロセシングされる３０１０アミノ酸の大きなポリタンパク質をコードする。ＨＣＶ構造タンパク質には、コア（あるいはＣまたはｐ２２）、ならびに２つのエンベロープ糖タンパク質Ｅ１及びＥ２（あるいは、それぞれｇｐ３５及びｇｐ７０）が挙げられる。非構造（ＮＳ）タンパク質としては、ＮＳ１（あるいはｐ７）、ＮＳ２（あるいはｐ２３）、ＮＳ３（あるいはｐ７０）、ＮＳ４Ａ（あるいはｐ８）、ＮＳ４Ｂ（あるいはｐ２７）、ＮＳ５Ａ（あるいはｐ５６／５８）、及びＮＳ５Ｂ（あるいはｐ６８）（Ａｓｈｆａｑ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｖｉｒｏｌ  Ｊ  ８：１６１）が挙げられる。
【０２４０】
全ウイルスゲノムの系統発生分析及び配列分析に基づいて、ＨＣＶバリアントは、現在７つの別々の遺伝子型と８０を超える確認及び暫定サブタイプに分類されている（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５９（１）：３１８〜３２７）。国際ウイルス分類学会（Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ−Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ）（ＩＣＴＶ）は、参照分離株、確認済み及び暫定的なサブタイプ、未割り当てＨＣＶ分離株、アクセッション番号、及びアノテーションされたアラインメントの表を維持し定期的に更新している（ｈｔｔｐ：／／ｔａｌｋ．ｉｃｔｖｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｌｉｎｋｓ／ｈｃｖ／ｈｃｖ−ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｈｔｍ）。ＨＣＶサブタイプ１ａ、１ｂ、２ａ、及び３ａは「流行性サブタイプ」と考えられ、世界的に分布しており、そして高所得国におけるＨＣＶ感染の大部分を占める。これらのサブタイプは、感染血液、血液製剤、静脈内薬物使用、及び他の経路によるＨＣＶ感染の発見前の数年で急速に広まったと考えられている（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７８（Ｐｔ２）：３２１−３２８；Ｐｙｂｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｇｅｎｅｔ  Ｅｖｏｌ  ５：１３１−１３９；Ｍａｇｉｏｒｋｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ６：ｅ１０００１９８）。他のＨＣＶサブタイプは「流行」株と見なされ、比較的まれであり、より制限された地域で長期間循環している。遺伝子型１と２の風土病株は、主に西アフリカに、３は南アジアに局在し、４は中央アフリカ及び中東に、５は南アフリカに、及び６は東南アジアに局在している（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ（２００１）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８２：６９３：７１２；Ｐｙｂｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：１０７１〜１０８２）。今まで、１つのゲノムタイプ７の感染のみが、報告されている（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４５：１１０２−１１１２）。
【０２４１】
チンパンジーは実験的感染に感受性があることが示されているが、ＨＣＶは自然にはヒトにしか感染しない（Ｐｆａｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｅｍｅｒｇ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ３：ｅ２１）。ＨＣＶによる慢性ウイルス感染は、肝硬変、肝疾患、門脈圧亢進症、肝機能の悪化、及び癌（例えば、肝細胞癌、ＨＣＣ）の主な原因である（Ｗｅｂｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｌａｎｃｅｔ  ３８５（９９７３）：１１２４−１１３５）。世界中で１億６０００万から１億７０００万人を超える人々が、Ｃ型肝炎に罹患していると推定されており、最終的に年間約３５万人が死亡している（Ｚａｌｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）ＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １２（Ｓｕｐｐｌ  ２）：Ｓ２；Ｌａｖａｎｃｈｙ（２０１１）Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  １７：１０７−１１５）。世界的にみて、肝硬変及びＨＣＣの全症例の約４分の１が、ＨＣＶ感染に起因している。しかし、高い流行性の地域では、ＨＣＶは通常、ＨＣＣ及び肝硬変症例の５０％超を占める（Ｐｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ４５（４）：５２９−５３８）。慢性感染者は、一般集団と比較して生活の質が低下している（Ｂｅｚｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）ＢＭＣ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １２：１１）。
【０２４２】
血液及び血液製剤の輸血は、普遍的スクリーニングの実施に先立って、以前はＨＣＶ感染の主要な経路であった（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ５０（７）：１４９５−１５０４）。静脈内薬物使用による経皮伝達は現在、先進国における主要な伝達経路である（Ｃｏｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｔ  ３１（Ｓｕｐｐｌ  ２）：３０−６０；Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｌａｎｃｅｔ  ３７８（９７９１：５７１−５８３）。針と注射器交換のプログラム（ｎｅｅｄｌｅ  ａｎｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｓ）（ＮＳＰ）ならびに麻薬補充療法（ＯＳＴ）などの社会サービスは、薬物を注射する人々（ｐｅｏｐｌｅ  ｗｈｏ  ｉｎｊｅｃｔ  ｄｒｕｇｓ）（ＰＷＩＤ）の間でのＨＣＶ感染を効果的に減らし得るが、これらのアプローチは、ＨＣＶ有病率を低レベルまで低下するのには不十分である場合がある（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ａｄｄｉｔｉｏｎ  １０６（１１）１９７８−１９８８；Ｖｉｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ａｄｄｉｔｉｏｎ  １０７（１１）：１９８４−１９９５）。ごく最近では、非常に有効な直接作用型抗ウイルス療法（ＤＡＡ）が、ＨＣＶ感染症を処置するために開発され、使用されている（例えば、ボセプレビル、テラプレビル、シメプレビル、ソフォスブビル、リジパスビル、オムビタスビル、パリタプレビル、リトナビル、ダサブビル、ダクラタスビル、エルバスビル、グラゾプレビル、ベルパタスビル）。多くの患者では、ＤＡＡは、持続性ウイルス学的著効（ＳＶＲ、あるいは、「ウイルス治療」）に繋がり得るので、これらの薬物は、ＨＣＶの有病率を低下させるための予防としての処置アプローチの可能性を実証している（Ｓｍｉｔｈ−Ｐａｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）ＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １５：１９）。しかし、これらの処置に関する高い金銭的費用及び支払人払い戻し決定の課題によって、現在、それらの広範な使用が制限されている（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ５４（６）：１１３７−１１４４；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５５（１）：４９−５７；Ｂｒｅｎｎａｎ  ａｎｄ  Ｓｈｒａｎｋ（２０１４）ＪＡＭＡ  ３１２（６）：５９３−５９４）。
【０２４３】
ＨＣＶワクチン接種は、ＨＣＶ罹患率を低下させるための代替的な処置及び／または予防戦略である。実験的に感染したチンパンジーにおける初期のＨＣＶワクチン研究では、ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ１（ｇｐ３５）及びＥ２（ｇｐ７２）から構成されるサブユニットワクチンが、相同ＨＣＶ遺伝子型１ａウイルスの効果的に制御及び促進されたクリアランスを引き起こす高効率の体液性応答を惹起することが見出された（Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１（４）：１２９４−１２９８）。ヒトで行われた第Ｉ相試験では、糖タンパク質Ｅ１及びＥ２を含むワクチンが広範囲に反応性の中和抗体を惹起することが証明された（Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（３）：ｅ５９７７６）。ＨＣＶに対するＴ細胞応答を生じるように設計された代替のワクチン接種アプローチもまた、ヒト第１相試験において試験されており、そして高度に免疫原性であることが示された（Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ  ４（１１５）：１１５ｒａ１）。これらの研究によって、体液性の抗体媒介性免疫応答及び／または適応性Ｔ細胞媒介性応答の両方が予防的及び／または治療的ＨＣＶワクチンの開発のための有望なアプローチであることが実証された。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン（例えば、同一または異なるｍＲＮＡ上に免疫増強剤構築物及びＨＣＶ抗原構築物を含む）は、少なくとも１つのＨＣＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、ＨＣＶに対する免疫応答を誘導し得る免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＨＣＶ抗原ポリペプチドは、コア（Ｃ、ｐ２２）、Ｅ１（ｇｐ３５）、Ｅ２（ｇｐ７０）、ＮＳ１（ｐ７）、ＮＳ２（ｐ２３）、ＮＳ３（ｐ７０）、ＮＳ４Ａ（ｐ８）、ＮＳ４Ｂ（ｐ２７）、ＮＳ５Ａ（ｐ５６／５８）、ＮＳ５Ｂ（ｐ６８）、及びそれらの組み合わせから選択される。
【０２４５】
本開示のいくつかの実施形態は、ヒトにおけるＨＣＶ感染を処置及び／または予防する方法に関し、ここで、免疫増強剤構築物及び少なくとも１つのＨＣＶポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする１つ以上の免疫調節治療用核酸を含む、本明細書に記載の１つ以上の組成物（免疫応答を生じることが当業者によって示されているかまたは予測されている）が、それを必要とする対象（例えば、ＨＣＶに感染しているかまたは感染の危険がある人）に提供される。必要に応じて、ＨＣＶ感染を予防及び／または処置する医薬を必要とする対象は、免疫増強剤構築物及び少なくとも１つのＨＣＶポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする１つ以上の免疫調節治療用核酸を含む医薬を提供されて、ＨＣＶに対する及び／またはＨＣＶに感染している対象の細胞に対する免疫応答を生じる。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＨＣＶウイルス力価の低下及び／または持続的ウイルス学的応答の確立をもたらす。いくつかの実施形態では、免疫応答は、中和抗ＨＣＶ抗体の産生をもたらす。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＨＣＶ感染細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答をもたらす。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、免疫調節治療用核酸（例えば、メッセンジャーＲＮＡ、ｍＲＮＡ）は、少なくとも１つのＨＣＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、ＨＣＶに対する免疫応答を誘導し得る免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片は、コア（Ｃ、ｐ２２）、Ｅ１（ｇｐ３５）、Ｅ２（ｇｐ７０）、ＮＳ１（ｐ７）、ＮＳ２（ｐ２３）、ＮＳ３（ｐ７０）、ＮＳ４Ａ（ｐ８）、ＮＳ４Ｂ（ｐ２７）、ＮＳ５Ａ（ｐ５６／５８）、ＮＳ５Ｂ（ｐ６８）、及びそれらの組み合わせから選択される。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片は、確認されたＨＣＶ遺伝子型及び／またはサブタイプ１、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｇ、１ｈ、１ｉ、１ｊ、１ｋ、１ｌ、１ｍ、１ｎ、２、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｉ、２ｊ、２ｋ、２ｌ、２ｍ、２ｑ、２ｒ、２ｔ、２ｕ、３、３ａ、３ｂ、３ｄ、３ｅ、３ｇ、３ｈ、３ｉ、３ｋ、４、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｆ、４ｇ、４ｋ、４ｌ、４ｍ、４ｎ、４ｏ、４ｐ、４ｑ、４ｒ、４ｓ、４ｔ、４ｖ、４ｗ、５、５ａ、６、６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｄ、６ｅ、６ｆ、６ｇ、６ｈ、６ｉ、６ｊ、６ｋ、６ｌ、６ｍ、６ｎ、６ｏ、６ｐ、６ｑ、６ｒ、６ｓ、６ｔ、６ｕ、６ｖ、６ｗ、６ｘａ、６ｘｂ、６ｘｃ、６ｘｄ、６ｘｅ、７、または７ａから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片は、暫定ＨＣＶ遺伝子型及び／またはサブタイプ１ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｎ、２ｏ、２ｐ、２ｓ、３ｃ、３ｆ、４ｅ、４ｈ、４ｉ、または４ｊから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片は、暫定または未割り当てＨＣＶ単離体から選択される。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、感染細胞を構造的に修飾する抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ＨＣＶウイルスキャプシドの一部または全部を形成する抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ウイルス様粒子に自己アセンブルすることが可能である抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、感染している細胞へのＨＣＶの結合を担う抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２５２】
Ｄ．エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）
別の実施形態では、オンコウイルス抗原は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来である。エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、あるいはヒトヘルペスウイルス４（ＨＨＶ−４）は、感染性単核球症の病因であり、そしていくつかのヒト癌（例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、乳癌、肝細胞癌、胃／胃癌、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、中枢神経系リンパ腫（ＣＮＳ）、鼻咽頭癌、多発性硬化症、ＥＢＶ関連リンパ腫、口腔毛状白板症、びまん性白血病ラージＢ細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫）を含む多数の良性及び悪性の疾患と関連している（Ｊｈａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７（１６０２）及びその中の引用文献）。ＥＢＶは、世界の成人人口の９５％超に感染する極めて流行しているウイルスである（Ｃｏｈｅｎ（２０００）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４３：４８１−４９２）。したがって、別の態様では、免疫増強剤構築物は、目的の１つ以上のエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）抗原に対する免疫応答を増強するために使用され得る。例えば、ＥＢＶ由来の目的の抗原（複数可）は、免疫増強剤構築物と同じｍｍＲＮＡ上に提供されるか、または免疫増強剤として異なる構築物ｍｍＲＮＡ構築物上に提供される化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）によってコードされ得る。免疫増強剤及びＥＢＶ抗原ｍｍＲＮＡを、それを必要とする対象に処方（または共処方）及び投与（同時または順次）して、対象のＥＢＶ抗原に対する免疫応答を刺激してもよい。
【０２５３】
ＥＢＶゲノムは、長さ約１７２ｋｂの線状二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子である。ＥＢＶゲノムは、その多くは機能が特徴付けられていないままである、約８０のウイルスタンパク質をコードする可能性がある。それらの対応する遺伝子産物及び提案された機能を含む特徴付けられたＥＢＶ遺伝子としては、既知であれば、ＢＫＲＦ１（ＥＢＮＡ１）［プラスミド維持、ＤＮＡ複製、転写調節］、ＢＹＲＦ１（ＥＢＮＡ２）［トランス活性化］、ＢＬＲＦ３／ＢＥＲＦ１（ＥＢＮＡ３Ａ、あるいはＥＢＮＡ３）［転写調節］、ＢＥＲＦ２ａ／ｂ（ＥＢＮＡ３Ｂ、あるいはＥＢＮＡ４）、ＢＥＲＦ３／４（ＥＢＮＡ３Ｃ、あるいはＥＢＮＡ６）［転写調節］、ＢＷＲＦ１（ＥＢＮＡ−ＬＰ、あるいはＥＢＮＡ５）［トランス活性化］、ＢＮＬＦ１（ＬＭＰ１）［Ｂ細胞生存、抗アポトーシス］、ＢＮＲＦ１（ＬＭＰ２Ａ／Ｂ、あるいはＴＰ１／２）［潜伏期間の維持］、ＢＡＲＦ０（Ａ７３、ＲＰＭＳ１）、ＥＢＥＲ１／２（低分子ＲＮＡ）［自然免疫の調節］、ＢＺＬＦ１（ＺＥＢＲＡ／Ｚｔａ／ＥＢ１）［トランス活性化、溶解サイクルの開始］、ＢＲＬＦ１［トランス活性化、溶解サイクルの開始］、ＢＩＬＦ４［トランス活性化、溶解サイクルの開始］、ＢＭＲＦ１［トランス活性化］、ＢＡＬＦ２［ＤＮＡ結合］、ＢＡＬＦ５［ＤＮＡポリメラーゼ］、ＢＯＲＦ２［リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット］、ＢＡＲＦ１［リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット］、ＢＸＬＦ１［チミジンキナーゼ］、ＢＧＬＦ５［アルカリエキソヌクレアーゼ］、ＢＳＬＦ１［プライマーゼ］、ＢＢＬＦ４［ヘリカーゼ］、ＢＫＲＦ３［ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ］、ＢＬＬＦ１（ｇｐ３５０／２２０）［主要エンベロープ糖タンパク質］、ＢＸＬＦ２（ｇｐ８５、あるいはｇＨ）［ウイルス−宿主エンベロープ融合］、ＢＫＲＦ２（ｇｐ２５、あるいはｇＬ）［ウイルス−宿主エンベロープ融合］、ＢＺＬＦ２（ｇｐ４２）［ウイルス−宿主エンベロープ融合、ＭＨＣクラスＩＩと結合］、ＢＡＬＦ４（ｇｐ１１０、あるいはｇＢ）、ＢＤＬＦ３（ｇｐ１００−１５０）、ＢＩＬＦ２（ｇｐ５５−７８）、ＢＣＲＦ１［ウイルスインターロイキン−１０］、及びＢＨＲＦ１［ウイルスｂｃｌ−２類似体］（Ｌｉｅｂｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  Ｋｉｅｆｆ（１９９３）Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ．Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ．Ｒｏｉｚｍａｎ  Ｂ，Ｗｈｉｔｌｅｙ  ＲＪ，Ｌｏｐｅｚ−Ｃ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１０７−１７２；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６９：３９８７−３９９４；Ｎｏｌａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ（１９９５）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：１３８１−１３９２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｕｒｚｒｏｃｋ（２００４）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：８０３−８２１；Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｍｕｒｒａｙ（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：５１０８−５１２１）が挙げられる。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン（例えば、同一または異なるｍＲＮＡ上に免疫増強剤構築物及びＥＢＶ抗原構築物を含む）は、少なくとも１つのＥＢＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、ＥＢＶに対する免疫応答を誘導し得る免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。任意の前述のＥＢＶタンパク質を、抗原性ＥＢＶポリペプチドとして使用し得る。免疫原性ＥＢＶタンパク質及びそれらのエピトープは、当該技術分野において記載されている（例えば、Ｒａｊｃａｎｉ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ．Ａｎｔｉｉｎｆｅｃｔ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ．９：６２−７６）。特定の実施形態では、抗原性ＥＢＶポリペプチドは、ＢＬＬＦ１（ｇｐ３５０／２２０）、ＢＺＬＦ１／Ｚｔａ、ＥＢＮＡ２、ＥＢＮＡ３、ＥＢＮＡ６、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０２５５】
２つの主要なＥＢＶ型がヒトに感染することが知られている：ＥＢＶ−１及びＥＢＶ−２（あるいはそれぞれＡ型及びＢ型として、またはＢ９５−８株及びＡＧ８７６株としても公知である）。２つのＥＢＶ型は、ＥＢＶ核抗原であるＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３Ａ／３、ＥＢＮＡ−３Ｂ／４、及びＥＢＮＡ−３Ｃ／６をコードする遺伝子の配列が異なる（Ｓａｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６４：４０８４−４０９２；Ｄａｍｂｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：７６３２〜７６３６）。２つの主要なＥＢＶ型の中で、広範な株多様性が、臨床試料から単離されたＥＢＶにおいて観察され、それは疾患型及び重症度においてある役割を果たしている場合がある。最初の完全なＥＢＶゲノム配列であるＢ９５−８は、１９８４年に発表された（Ｂａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：２０７−２１１）。２２個の追加のＥＢＶのゲノム配列（ＡＧ８７６、ＧＤ１、ＧＤ２、ＨＫＮＰＣ１、Ａｋａｔａ、Ｍｕｔｕ、Ｃ６６６−１、Ｍ８１、Ｒａｊｉ、Ｋ４１２３−Ｍｉ、及びＫ４４１３−Ｍｉ）、ならびに鼻咽頭癌臨床試料由来の８個のＥＢＶ配列及び１０００Ｇｅｎｏｍｅｓプロジェクト由来の３つのＥＢＶゲノムが報告されている（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ５：４５８−４７０；Ｄｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３５０−１６４−１７０；Ｐａｌｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８９（１０）：５２２２−５２３７及びその中の引用文献）。最近の報告は、唾液から直接配列決定された最初のＥＢＶゲノムを含む、７１の新しいＥＢＶゲノムのゲノム配列を分析した。これらの新しいＥＢＶゲノム配列は、１２の以前に公表された株と組み合わせて分析された。この分析によって、ＥＢＶゲノムの確立された遺伝子地図（ＮＣ＿００７６０５）が、異なる地理的位置及び異なる種類の感染からのＥＢＶ分離株の代表であることが明らかになった。十分に確立されたＥＢＶ１型と２型の分類をこの研究で再検討し、主にＥＢＮＡ２ならびにＥＢＮＡ３Ａ、−Ｂ、及び−Ｃの変動によって説明される、主要な変動の形態のままであることがわかった（Ｐａｌｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８９（１０）：５２２２−５２３７）。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＥＢＶ抗原性ポリペプチドは、ＥＢＶ−１またはＥＢＶ−２に由来する。
【０２５７】
本開示のいくつかの実施形態は、ヒトにおけるＥＢＶ感染を治療及び／または予防する方法に関し、ここで、本明細書に記載の1つ以上の組成物であって、免疫増強剤構築物及び少なくとも１つのＥＢＶポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする１つ以上の免疫調節治療用核酸を含み、免疫応答を生じることが当業者によって示されているかまたは予測されている組成物が、それを必要とする対象（例えば、ＥＢＶに感染しているかまたは感染の危険がある人）に提供される。必要に応じて、ＥＢＶ感染を予防及び／または処置する医薬を必要とする対象は、免疫増強剤構築物及び少なくとも１つのＥＢＶポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする１つ以上の免疫調節治療用核酸を含む医薬を提供されて、ＥＢＶ及び／またはＥＢＶに感染している対象の細胞に対する免疫応答を生じる。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＥＢＶウイルス力価の低下及び／または持続的ウイルス学的応答の確立をもたらす。いくつかの実施形態では、免疫応答は、中和抗ＥＢＶ抗体の産生をもたらす。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＥＢＶ感染細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答をもたらす。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、感染細胞を構造的に修飾する抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ＥＢＶウイルスキャプシドの一部または全部を形成する抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ウイルス様粒子に自己アセンブルすることが可能である抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、感染している細胞へのＥＢＶの結合を担う抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２６２】
Ｅ．ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）
別の実施形態では、癌ウイルス抗原は、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）由来である。ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１、あるいはヒトＴリンパ好性ウイルスまたはヒトＴ細胞白血病リンパ腫ウイルス）は、ヒトにおいて持続感染を確立し得るレトロウイルスである。ＨＴＬＶ−１は、世界中で推定１０００万〜２０００万人の人々に感染し、そして感染は、ほとんどの人々において無症候性であるが、感染した個人の３％〜５％は非常に悪性かつ治療的に難治性の成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）を発症する（Ｇｅｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３：３８８；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４：６０４７−６０５７）。ＨＴＬＶ感染はまた、いくつかの炎症性障害及び免疫媒介性障害、最も顕著にはＨＴＬＶ関連骨髄腫／熱帯性痙性対麻痺（ＨＡＭ／ＴＳＰ）と原因として関連している。ＨＴＬＶ−１感染者の約０．２５％〜３．８％が、ＨＡＭ／ＴＳＰを発症する（Ｙａｍａｎｏ  ａｎｄ  Ｓａｔｏ（２０１２）Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３：３８９）。ＨＴＬＶ−１のヒトへの感染は、授乳、性交、細胞含有血液構成要素の輸血、ならびに針及び／または注射器の共有（例えば、静脈内薬物使用）によるウイルス感染細胞の移入を必要とする。したがって、別の態様では、免疫増強剤構築物は、目的の１つ以上のヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）抗原に対する免疫応答を増強するために使用してもよい。例えば、ＨＴＬＶ−１由来の目的の抗原（複数可）は、免疫増強剤構築物と同じｍｍＲＮＡ上に提供されるか、または免疫増強剤として異なる構築物ｍｍＲＮＡ構築物上に提供される化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）によってコードされ得る。免疫増強剤及びＨＴＬＶ−１抗原ｍｍＲＮＡを、それを必要とする対象に処方（または共処方）及び投与（同時または順次）して、対象のＨＴＬＶ−１抗原に対する免疫応答を刺激してもよい。
【０２６３】
ＨＴＬＶ−１は、複雑なレトロウイルスであり；全てのレトロウイルス（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｐｒｏ及びｅｎｖ）に共有される構造タンパク質及び酵素の標準レパートリーに加えて、ＨＴＬＶ−１ゲノムの３’領域（あるいはｐＸ領域と呼ばれる）は、アクセサリー遺伝子ｔａｘ、ｒｅｘ、ｐ１２、ｐ２１、ｐ１３、ｐ３０及びＨＢＺをコードする。ＡＴＬの発癌過程にはＴａｘ及びＨＢＺが不可欠である（Ｇｉａｍ  ａｎｄ  Ｓｅｍｍｅｓ（２０１６）Ｖｉｒｕｓｅｓ  ８（６）：１６１）。他のレトロウイルスと同様に、伝播後、ウイルス逆転写酵素は、ゲノムウイルスＲＮＡからプロウイルスＤＮＡを生成する。プロウイルスは、ウイルスインテグラーゼによって宿主ゲノムに組み込まれる。その後、ＨＴＬＶ−１感染は、分裂中の細胞を通してのみ広がると考えられ、粒子産生は最小限である。プロウイルスの定量は、プロウイルスの負荷を規定するＨＴＬＶ−１感染細胞の数を反映する（Ｃｏｎｃａｌｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２３（３）：５７７−５８９）。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン（例えば、同一または異なるｍＲＮＡ上に免疫増強剤構築物及びＨＴＬＶ−１抗原構築物を含む）は、少なくとも１つのＨＴＬＶ−１抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、ＨＴＬＶ−１に対する免疫応答を誘導し得る免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、抗原性ＨＴＬＶ−１ポリペプチドは、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｐｒｏ、ｅｎｖ、ｔａｘ、ｒｅｘ、ｐ１２、ｐ２１、ｐ１３、ｐ３０、ＨＢＺ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０２６５】
本開示のいくつかの実施形態は、ヒトにおけるＨＴＬＶ−１感染を処置及び／または予防する方法に関し、ここで、免疫増強剤構築物及び少なくとも１つのＨＴＬＶ−１ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする１つ以上の免疫調節治療用核酸を含み、免疫応答を生じることが当業者によって示されているかまたは予測されている、本明細書に記載の1つ以上の組成物が、それを必要とする対象（例えば、ＨＴＬＶ−１に感染しているまたは感染の危険がある人）に提供される。必要に応じて、ＨＴＬＶ−１感染を予防及び／または処置する医薬を必要とする対象は、免疫増強剤構築物及び少なくとも１つのＨＴＬＶ−１ポリペプチドまたは免疫原性断片をコードする１つ以上の免疫調節治療用核酸を含む医薬を提供されて、ＨＴＬＶ−１及び／またはＨＴＬＶ−１に感染している対象の細胞に対する免疫応答を生じる。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＨＴＬＶ−１ウイルス力価の低下及び／または持続的ウイルス学的応答の確立をもたらす。いくつかの実施形態では、免疫応答は、中和抗ＨＴＬＶ−１抗体の産生をもたらす。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＨＴＬＶ−１感染細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答をもたらす。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、感染細胞を構造的に修飾する抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ＨＴＬＶ−１ウイルスキャプシドの一部または全部を形成する抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ウイルス様粒子に自己アセンブルし得る抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、感染している細胞へのＨＴＬＶ−１の結合に関与する抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２７０】
Ｆ．カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）
別の実施形態では、上記がんウイルス抗原は、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）由来である。カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ、あるいはヒトヘルペスウイルス−８、ＨＨＶ−８）は、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科のＲｈａｄｉｎｏｖｉｒｕｓ属に属する二重鎖ＤＮＡγ−ヘルペスウイルスである。ＫＳＨＶは、ＡＩＤＳ患者に一般的に発生するがんであるカポジ肉腫の全ての形態の病因であり、原発性滲出性リンパ腫（ＰＥＬ；あるいは体腔ベースのリンパ腫、ＢＣＢＬ）、いくつかの種類の多中心性キャッスルマン病（ＭＣＤ；あるいは、多中心性キャッスルマン病（ＭＣＤ）関連形質芽球性リンパ腫）及びＫＳＨＶ炎症性サイトカイン症候群（ＫＩＣＳ）と原因として関連する（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１８６５−１８６９；Ｄｕｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：４５４６−４５５１；Ｂｏｓｈｏｆｆ＆Ｗｅｉｓｓ（２００２）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２（５）：３７３−３８２；Ｙａｒｃｈｏａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２（８）：４０６−４１５；Ｃｅｓａｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３２（１８）：１１８６−１１９１；Ｓｔａｕｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ６４（１４）：４７９０−４７９９；Ｓｏｕｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  ８６：１２７６−１２８０；Ｕｌｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ５１：３５０−３５８））。したがって、別の態様では、免疫増強剤構築物を使用して、目的の１つ以上のカポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）抗原に対する免疫応答を増強し得る。例えば、ＫＳＨＶ由来の目的の抗原（複数可）は、免疫増強剤構築物と同じｍｍＲＮＡ上に提供されるか、または免疫増強剤として異なる構築物ｍｍＲＮＡ構築物上に提供される化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）によってコードされ得る。免疫増強剤及びＫＳＨＶ抗原ｍｍＲＮＡを、それを必要とする対象に処方（または共処方）及び投与（同時にまたは順次）して、対象においてＫＳＨＶ抗原に対する免疫応答を刺激してもよい。
【０２７１】
ＫＳＨＶゲノムは、約１６５ｋｂのｄｓＤＮＡ分子を含み、そしてウイルス株及び単離株にまたがって高度の配列同一性を示す。２つの主要遺伝子領域、Ｋ１／ＶＩＰ（ＫＳＨＶゲノムの５’末端によってコードされる可変免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフタンパク質）及びＫ１５／ＬＡＭＰ（ＫＳＨＶゲノムの３’末端によってコードされる潜伏関連膜タンパク質）（ウイルスゲノムの末端に位置する）は、中央ゲノム領域と比較して非常に可変性である（Ｚｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：４１５６−４１７０；Ｐｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）７３：６６４６−６６６０）。
【０２７２】
Ｋ１遺伝子の配列可変性は、５つの主要なＫＳＨＶサブタイプ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ）の決定をもたらし、ウイルス株にわたってアミノ酸レベルで最大３５％の可変性を示した。Ｋ１５遺伝子の配列分析は、アミノ酸レベルで最大７０％異なる、Ｐ、Ｍ、またはＮ対立遺伝子と命名されるバリアントを有するＫＳＨＶ配列のさらなる分類をもたらした（Ｈａｙｗａｒｄ＆Ｚｏｎｇ（２００７）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１２：１−４２）。他の９つのウイルスゲノム遺伝子座（ゲノムの約５．６％）は、さらなる可変性（Ｔ０．７／Ｋ１２、Ｋ２、Ｋ３、ＯＲＦ１８／１９、ＯＲＦ２６、Ｋ８、ＯＲＦ７３）、ならびにＯＲＦ７５遺伝子領域内の２つの遺伝子座を、ＫＳＨＶゲノムの中央の、より保存された領域内に含む。Ｋ１／Ｋ１５の可変性、株の分類、及び９つのＯＲＦの変異性に基づいて、既知のＫＳＨＶゲノムは現在１２の主要な遺伝子型に分類されている（Ｓｔｒａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）Ｖｉｒｕｓｅｓ  ８（４）：９２）。
【０２７３】
カポジ肉腫のほぼ全ての症例にＫＳＨＶがあり、腫瘍形成にはＫＳＨＶの継続的な存在が必要である。ＫＳＨＶゲノムは、ウイルス複製、ウイルス−宿主相互作用、腫瘍形成、及び免疫抑制及び回避を仲介することが多く知られている約９０個のタンパク質をコードする可能性があり（Ｄｉｔｔｍｅｒ＆Ｄａｍａｎｉａ（２０１３）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｖｉｒｏｌ  ３：２３８−２４４）、潜在的な治療標的と見なされ得る。対応する遺伝子産物及び／または提案されている機能を含む特徴的なＫＳＨＶ遺伝子としては、既知であれば、ＯＲＦＫ１（糖タンパク質；ＫＳＨＶ  ＩＴＡＭシグナル伝達タンパク質、ＫＩＳ）、ＯＲＦ４（カポジ補体制御タンパク質、ＫＣＰ；カポシカ（ｋａｐｏｓｉｃａ））、ＯＲＦ６（ｓｓＤＮＡ結合タンパク質）、ＯＲＦ１１（ｄＵＴＰａｓｅ関連タンパク質、ＤＵＲＰ）、ＯＲＦＫ２（ウイルスインターロイキン６ホモログ、ｖＩＬ６）、ＯＲＦ７０（チミジレートシンターゼ）、ＯＲＦＫ４（ｖＣＣＬ−２、ｖＭＩＰ−ＩＩ、ＭＩＰ−１ｂ）、ＯＲＦＫ４．１（ｖＣＣＬ−３、ｖＭＩＰ−ＩＩＩ、ＢＣＫ）、ＯＲＦＫ５（免疫応答２のモジュレーター、ＭＩＲ−２；Ｅ３ユビキチンリガーゼ）、ＯＲＦＫ６（ｖＣＣＬ−１、ｖＭＩＰ−Ｉ、ＭＩＰ−１ａ）、ＰＡＮ（後期遺伝子発現）、ＯＲＦ１６（ｖＢＣＬ２、Ｂｃｌ２ホモログ）、ＯＲＦ１７．５（足場または集合タンパク質、ＳＣＡＦ）、ＯＲＦ１８（後期遺伝子制御）、ＯＲＦ３４（ＨＩＦ−１αに結合する）、ＯＲＦ３５（効率的な溶解性ウイルス再活性化に必要）、ＯＲＦ３６（ウイルスセリン／トレオニンプロテインキナーゼ）、ＯＲＦ３７（ｓｏｘ）、ＯＲＦ３８（テグメントタンパク質）、ＯＲＦ３９（糖タンパク質Ｍ、ｇＭ）、ＯＲＦ４５（テグメントタンパク質；ＲＳＫ活性化因子）、ＯＲＦ４６（ウラシルデグリコシラーゼ）、ＯＲＦ４７（糖タンパク質Ｌ、ｇＬ）、ＯＲＦ５０（ＲＴＡ）、ＯＲＦＫ８（ｋ−ｂＺＩＰ、複製関連タンパク質、ＲＡＰ）、ＯＲＦ５７（ｍＲＮＡ輸送／スプライシング）、ＯＲＦ５８、ＯＲＦ５９（進化性因子）、ＯＲＦ６０（リボヌクレオタンパク質レダクターゼ）、ＯＲＦ６１（リボヌクレオタンパク質レダクターゼ）、ＯＲＦＫ１２（カポシン）、ＯＲＦ７１（ｖＦＬＩＰ、ＯＲＦＫ１３）、ＯＲＦ７２（ｖＣｙｃｌｉｎ、ｖＣＹＣ）、ＯＲＦ７３（潜伏関連核抗原１、ＬＡＮＡ１）、ＯＲＦ８（糖タンパク質Ｂ、ｇＢ）、ＯＲＦ９（ＤＮＡポリメラーゼ）、ＯＲＦ１０（インターフェロン機能の調節因子）、ＯＲＦＫ３（免疫応答の調節因子１、ＭＩＲ−１；Ｅ３ユビキチンリガーゼ）、Ｋ５／６−ＡＳ、ＯＲＦ１７（プロテアーゼ）、ＯＲＦ２１（チミジンキナーゼ）、ＯＲＦ２２（糖タンパク質Ｈ、ｇＨ）、ＯＲＦ２３（予測糖タンパク質）、ＯＲＦ２４（複製に必須）、ＯＲＦ２５（メジャーキャプシドタンパク質、ＭＣＰ）、ＯＲＦ２６（マイナーキャプシドタンパク質；トリプレックス構成要素２、ＴＲＩ−２）、ＯＲＦ２７（糖タンパク質）、ＯＲＦ２８（ＢＤＬＦ３  ＥＢＶホモログ）、ＯＲＦ２９（パッケージングタンパク質）、ＯＲＦ３０（後期遺伝子調節）、ＯＲＦ３１（核及び細胞質）、ＯＲＦ３２（テグメントタンパク質）、ＯＲＦ３３（テグメントタンパク質）、ＯＲＦ４０／４１（ヘリカーゼ−プライマーゼ）、ＯＲＦ４２（テグメントタンパク質）、ＯＲＦ４３（ポータルキャプシドタンパク質）、ＯＲＦ４４（ヘリカーゼ）、ＯＲＦ４５．１、ＯＲＦＫ８．１Ａ（糖タンパク質、ｇｐ８．１Ａ）、ＯＲＦＫ８．１Ｂ（糖タンパク質ｇｐ８．１Ｂ、ＯＲＦ５２（テグメントタンパク質）、ＯＲＦ５３（糖タンパク質Ｎ、ｇＮ）、ＯＲＦ５４（ｄＵＴＰａｓｅ／免疫調節）、ＯＲＦ５５（テグメントタンパク質）、ＯＲＦ５６（ＤＮＡ複製）、ＯＲＦＫ９（ｖＩＲＦ１）、ＯＲＦＫ１０（ｖＩＲＦ４）、ＯＲＦＫ１０．５（ｖＩＲＦ３、ＬＡＮＡ２）、ＯＲＦＫ１１（ｖＩＲＦ２）、ＯＲＦ６２（トリプレックス構成要素１、ＴＲＩ−１）、ＯＲＦ６５（小型キャプシドタンパク質；小型キャプソマー相互作用タンパク質、ＳＣＩＰ）、ＯＲＦ６６（キャプシド）、ＯＲＦ６７（核放出複合体）、ＯＲＦ６７．５、ＯＲＦ６８（糖タンパク質）、ＯＲＦ６９（ＢＲＬＦ２核放出）、ＯＲＦＫ１４（ｖＯＸ２）、ＯＲＦ７４（ｖＧＰＣＲ）、ＯＲＦ７５（ＦＧＡＲＡＴ）、ＯＲＦ２（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、ＯＲＦ７（ビリオンタンパク質、ｖＧＰＣＲ）、ＯＲＦ４８、ＯＲＦ４９（ＪＮＫ／ｐ３８を活性化する）、ＯＲＦ６３（ＮＬＲホモログ）、ＯＲＦ６４（デユビキチナーゼ）、ＯＲＦＫ１５（ＬＭＰ１／２）、及びＯＲＦＫ７（アポトーシスのウイルス阻害剤、ｖＩＡＰ）が挙げられる。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン（例えば、同一または異なるｍＲＮＡ上に免疫増強剤構築物及びＫＳＨＶ抗原構築物を含む）は、少なくとも１つのＫＳＨＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、ＫＳＨＶに対する免疫応答を誘導し得る免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。前述の任意のＫＳＨＶタンパク質を抗原性ＫＳＨＶポリペプチドとして使用し得る。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＫＳＨＶ抗原性ポリペプチドは、ＫＳＨＶサブタイプＡ、ＫＳＨＶサブタイプＢ、ＫＳＨＶサブタイプＣ、ＫＳＨＶサブタイプＤまたはＫＳＨＶサブタイプＥに由来する。
【０２７６】
本開示のいくつかの実施形態は、ヒトにおけるＫＳＨＶ感染を処置及び／または予防する方法に関し、ここで、免疫増強剤構築物及び少なくとも１つのＫＳＨＶポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする１つ以上の免疫調節治療用核酸を含む本明細書に記載の１つ以上の組成物（免疫応答を生じることが当業者によって示されているかまたは予測されている）が、それを必要とする対象（例えば、ＫＳＨＶに感染しているかまたは感染の危険がある人）に提供される。必要に応じて、ＫＳＨＶ感染を予防及び／または処置する医薬を必要とする対象は、免疫増強剤構築物及び少なくとも１つのＫＳＨＶポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする１つ以上の免疫調節治療用核酸を含む医薬（ＫＳＨＶ及び／またはＫＳＨＶに感染している対象の細胞に対する免疫応答を生じる）を提供される。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＫＳＨＶウイルス力価の低下及び／または持続的ウイルス学的応答の確立をもたらす。いくつかの実施形態では、免疫応答は、中和抗ＫＳＨＶ抗体の産生をもたらす。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＫＳＨＶ感染細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答をもたらす。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、感染細胞を構造的に修飾する抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ＫＳＨＶウイルスキャプシドの一部または全部を形成する抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ウイルス様粒子に自己アセンブルし得る抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、感染している細胞へのＫＳＨＶの結合を担う抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２８１】
Ｇ．メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＰｙＶ）
別の実施形態では、オンコウイルス抗原は、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＰｙＶ）由来である。メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＰｙＶ）は、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ科の非エンベロープ二重鎖ＤＮＡウイルスであり、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）の病因学的因子である。ＭＣＣは、まれであるが、高齢、過度のＵＶ曝露、免疫不全、及びＭＣＰｙＶの存在に関連した、侵攻型の皮膚癌である。米国では、年間約１，５００例のＭＣＣが新たに診断されており、比較的まれながんに相当する；しかし、ＭＣＣの発生率は過去２０年間で３倍になり、年間診断数は５〜１０％増大し続けている。その希少性にもかかわらず、ＭＣＣは、死亡率が３０％を超える最も致命的かつ侵攻性の皮膚癌の１つである（Ａｇｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｃｌｅｇｇ（２００３）Ｊ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ４９：８３２−８４１；Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６６：１−８；Ｃａｌｄｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｏｌｌｅｒ（２０１０）Ａｄｖ  Ａｎａｔ  Ｐａｔｈｏｌ  １７：１５５−１６１；Ｈｏｄｇｓｏｎ，（２００５）Ｊ  Ｓｕｒ  Ｏｎｃｏｌ  ８９：１−４；Ｌｅｍｏｓ  ａｎｄ  Ｎｇｈｉｅｍ，（２００７）Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １２７：２１００−２１０３）。したがって、別の態様では、免疫増強剤構築物は、目的の１つ以上のメルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＰｙＶ）抗原に対する免疫応答を増強するために使用され得る。例えば、ＭＣＰｙＶ由来の目的の抗原（複数可）は、免疫増強剤構築物と同じｍｍＲＮＡ上に提供されるか、または免疫増強剤として異なる構築物ｍｍＲＮＡ構築物上に提供される化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）によってコードされ得る。免疫増強剤及びＭＣＰｙＶ抗原ｍｍＲＮＡを、それを必要とする対象に処方（または共処方）及び投与（同時または順次）して、対象におけるＭＣＰｙＶ抗原に対する免疫応答を刺激してもよい。
【０２８２】
ＭＣＣは、触覚及び／または触感に関与する機械受容細胞であるメルケル細胞（あるいはメルケル−ランヴィエ細胞または触覚上皮細胞）の悪性形質転換に由来する（Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２５（２）：７４−８１）。ＭＣＰｙＶは、臨床ＭＣＣ腫瘍標本の８０％〜８５％に存在する（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１９：１０９６−１１００；Ｄａｒｉａｎｉｓ  ａｎｄ  Ｈｉｒｓｃｈ（２０１３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４３７：６３−７２、及びその中の引用文献）。ＭＣＰｙＶは、今日まで、その天然宿主に腫瘍を引き起こす唯一のヒトポリオーマウイルスであると考えられている（Ａｒｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ  ２：４８９−４９８；Ｓｐｕｒｇｅｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｍｂｅｒｔ（２０１３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４３５：１１８−１３０）。
【０２８３】
ＭＣＰｙＶウイルスＤＮＡは、８０％〜８５％のＭＣＣ腫瘍にクローン的に組み込まれている。プロトタイプウイルス（ＭＣＶ３５０）ゲノムは、５３８７塩基対を含む環状の二重鎖ＤＮＡ分子である。全てのＭＣＰｙＶ株のゲノムは、平均約５．４キロベースを配列決定した。ＭＣＰｙＶゲノムは、双方向に発現され、ウイルス複製起点を含む非コード調節領域によって隔てられた初期コード領域及び後期コード領域を含む。ＭＣＰｙＶ初期領域（あるいは「Ｔ抗原遺伝子座」）は、サイズが約３ｋｂであり、感染時に最初に発現される遺伝子をコードする（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ６：ｅ２２４６８；Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１９：１０９６−１１００；Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ６：ｅ２９１１２）。ＭＣＰｙＶ初期領域は、３つのＴ抗原（タンパク質）を発現する：ラージＴ抗原（ＬＴ）、スモールＴ抗原（ｓＴ）、及び５７ｋＴ抗原（５７ｋＴ）（Ｓｈｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２５（６）：１２４３−９；Ｓｈｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５（４２）：１６２７２−７）。３つのＴ抗原に加えて、ＭＣＰｙＶ初期遺伝子座はまた、第４のタンパク質、代替Ｔ抗原オープンリーディングフレーム（ＡＬＴＯ）をコードする。ＡＬＴＯは、ＬＴの２００アミノ酸のＭＵＲ領域から転写され、そしてマウスポリオーマウイルスのミドルＴ抗原に進化的に関連しているようである（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１０：１２７４４−１２７４９）。
【０２８４】
ＭＣＰｙＶの後期領域は、メジャーキャプシドタンパク質ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）ならびにマイナーキャプシドタンパク質２及び３（ＶＰ２及びＶＰ３）のオープンリーディングフレームをコードする。ＭＣＰｙＶゲノムは、感染後期段階の間に初期のウイルス遺伝子発現を自己調節する可能性が最も高い、後期鎖由来の２２ヌクレオチドのウイルスｍｉＲＮＡ（ＭＣＶ−ｍｉＲ−Ｍ１−５ｐ）を発現する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｖｉｒｏｌ  ５２（３）：２７２−５；Ｓｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３８３（２）：１８３−７）。研究によって、ウイルスＴ抗原の構成的発現がウイルス誘導形質転換に必要であることが支持される（Ｓｐｕｒｇｅｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｍｂｅｒｔ（２０１３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４３５（１）：１１８−１３０及びその中の引用文献）。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン（例えば、同一または異なるｍＲＮＡ上に免疫増強剤構築物及びＭＣＰｙＶ抗原構築物を含む）は、少なくとも１つのＭＣＰｙＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、ＭＣＰｙＶに対する免疫応答を誘導し得る免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＭＣＰｙＶ抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片は、ラージＴ抗原（ＬＴ）、スモールＴ抗原（ｓＴ）、５７ｋＴ抗原（５７ｋＴ）、オルタナティブＴ抗原（ＡＬＴＯ）、メジャーキャプシドタンパク質ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）、マイナーキャプシドウイルスタンパク質２または３（ＶＰ２またはＶＰ３）、及びそれらの組み合わせから選択される。
【０２８６】
本開示のいくつかの実施形態は、ヒトにおけるＭＣＰｙＶ感染を処置及び／または予防する方法に関し、ここで、本明細書に記載される１つ以上の組成物であって、免疫増強剤構築物及び少なくとも１つのＭＣＰｙＶポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする１つ以上の免疫調節治療用核酸を含む組成物（免疫応答を生じることが当業者によって示されているかまたは予測されている）は、それを必要とする対象（例えば、ＭＣＰｙＶに感染しているかまたは感染の危険がある人）に提供される。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＭＣＰｙＶ感染に起因するか、及び／または原因として関連するがんを処置及び／または予防する方法に関し、ここで、免疫増強剤構築物及び少なくとも１つのＭＣＰｙＶポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする１つ以上の免疫調節治療用核酸を含む、本明細書に記載の１つ以上の組成物（免疫応答を生じることが当業者によって示されるかまたは予測されている）が、それを必要とする対象（例えば、ＭＣＰｙＶに感染しているかまたは感染の危険がある人）に提供される。
【０２８８】
必要に応じて、ＭＣＰｙＶ感染を予防及び／または処置する医薬を必要とする対象は、免疫増強剤構築物及び少なくとも１つのＭＣＰｙＶポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする１つ以上の免疫調節治療用核酸を含む医薬（ＭＣＰｙＶ及び／またはＭＣＰｙＶに感染している対象の細胞に対する免疫応答を生じる）を提供される。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＭＣＰｙＶウイルス力価の低下をもたらす。いくつかの実施形態では、免疫応答は、中和抗ＭＣＰｙＶ抗体の産生をもたらす。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＭＣＰｙＶ感染細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答をもたらす。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、免疫調節治療用核酸（例えば、メッセンジャーＲＮＡ、ｍＲＮＡ）は、少なくとも１つのＭＣＰｙＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、ＭＣＰｙＶに対する免疫応答を誘導し得る免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片は、ラージＴ抗原（ＬＴ）、スモールＴ抗原（ｓＴ）、５７ｋＴ抗原（５７ｋＴ）、オルタナティブＴ抗原（ＡＬＴＯ）、メジャーキャプシドタンパク質ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）、マイナーキャプシドウイルスタンパク質２または３（ＶＰ２またはＶＰ３）、及びそれらの組み合わせから選択される。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片は、暫定的及び／または確認されたＭＣＰｙＶ遺伝子型及び／またはサブタイプから選択される（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｔｅｌ−Ｊａｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５２（５）：１６８７−１６９０；Ｈａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９５：１３５−１４１；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ４８：２３３−２４２；Ｂａｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ２２１：１−７を参照のこと）。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片は、割り当てられていないＭＣＰｙＶ分離株から選択される。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、感染細胞を構造的に修飾する抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ＭＣＰｙＶウイルスキャプシドの一部または全部を形成する抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ウイルス様粒子に自己アセンブルし得る抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、感染している細胞へのＭＣＰｙＶウイルスの結合を担う抗原性ポリペプチドをコードする。
【０２９５】
個別化がんワクチン
いくつかの態様では、本開示は、目的のがん抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチド（すなわち免疫増強剤）をコードする、１つ以上のｍＲＮＡ構築物を含む個別化がんワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、目的のがん抗原は、同じまたは別々のｍＲＮＡ構築物のいずれかによってコードされる。いくつかの実施形態では、目的のがん抗原は、対象に特異的である。例えば、目的のがん抗原（例えば、下記のように選択及び／または設計された）は、免疫増強剤構築物と同じｍｍＲＮＡ上に提供されるか、または免疫増強剤として異なるｍｍＲＮＡ構築物上に提供される化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）によってコードされ得る。この免疫増強剤及びがん抗原ｍｍＲＮＡを、それを必要とする対象に処方（または共処方）及び投与（同時または順次）して、対象におけるがん抗原に対する免疫応答を刺激してもよい。免疫増強剤と共に使用するための、がんの対象に特異的な個別化抗原を含む適切ながん抗原が本明細書に記載されている。
【０２９６】
例えば、ワクチンは、ネオエピトープと呼ばれる、各対象に特異的な１つ以上のがん抗原をコードするｍＲＮＡを含んでもよい。腫瘍細胞内で、または腫瘍細胞によって発現される抗原は、「腫瘍関連抗原」と呼ばれる。特定の腫瘍関連抗原はまた、非癌性細胞において発現されてもよいし、されなくてもよい。多くの腫瘍変異が当該技術分野において周知である。非癌性細胞において発現されないかもしくはほとんど発現されないか、または非癌性細胞における発現が癌性細胞における発現と比較して十分に減少し、ワクチン接種時に誘導される免疫応答を誘導する、腫瘍関連抗原は、ネオエピトープと呼ばれる。ネオエピトープは、体に対して完全に外来性であり、したがって健康な組織に対して免疫応答を生じさせることもなく、免疫系の保護構成要素によって隠されることもないであろう。いくつかの実施形態では、ネオエピトープに基づく個別化ワクチンは、そのようなワクチン製剤が患者の特定の腫瘍に対する特異性を最大にするので望ましい。変異由来のネオエピトープは、点突然変異、タンパク質中の異なるアミノ酸をもたらす非同義的変異；終止コドンが修飾または欠失され、Ｃ末端に新規の腫瘍特異的配列を有する、さらに長いタンパク質の翻訳をもたらすリードスルー変異；成熟ｍＲＮＡにイントロンが含まれるようにするスプライス部位変異、したがってユニークな腫瘍特異的タンパク質配列；２つのタンパク質の接合部に腫瘍特異的配列を有するキメラタンパク質を生じさせる染色体再配列（すなわち、遺伝子融合）；新規の腫瘍特異的タンパク質配列を有する新しいオープンリーディングフレームをもたらすフレームシフト変異または欠失；ならびに転座から生じ得る。
【０２９７】
個別化されたがんワクチンを作製するための方法は、一般に、例えば、ディープ核酸またはタンパク質シーケンシング技術を用いた変異の同定、例えば、検証ペプチド−ＭＨＣ結合予測アルゴリズムの適用を用いたネオエピトープの同定、または患者のＨＬＡ対立遺伝子に結合し得る候補Ｔ細胞エピトープのセットを作製するための他の分析技術を含み、腫瘍に存在する変異、選択されたネオエピトープに対する抗原特異的Ｔ細胞の任意の証明、または腫瘍表面上のＨＬＡタンパク質に候補ネオエピトープが結合するという実証、及びワクチンの開発に基づく。
【０２９８】
変異を同定するための技術の例としては、限定するものではないが、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイ対角ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、パイロシーケンシング、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎシステム、ならびに様々なＤＮＡ「チップ」技術、すなわち、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰチップ、ならびに侵襲的開裂とそれに続く質量分析または固定化パドロックプローブ及びローリングサークル増幅による小シグナル分子の生成に基づく方法が挙げられる。
【０２９９】
ディープ核酸またはタンパク質シーケンシング技術は、当該技術分野において公知である。任意の種類の配列分析方法を使用してもよい。例えば、核酸配列決定は、全腫瘍ゲノム、腫瘍エキソーム（タンパク質をコードするＤＮＡ）または腫瘍トランスクリプトームに対して行われ得る。リアルタイム単一分子合成による配列決定技術は、それらが配列決定されている鋳型に相補的である新生ＤＮＡ鎖に組み込まれるので、蛍光ヌクレオチドの検出に依存する。他の迅速なハイスループット配列決定法もまた存在する。タンパク質配列決定を、腫瘍プロテオームに対して行ってもよい。さらに、タンパク質質量分析法を用いて、腫瘍細胞上のＭＨＣタンパク質に結合した変異ペプチドの存在を同定するか、または確認し得る。ペプチドは、腫瘍細胞から、または腫瘍から免疫沈降するＨＬＡ分子から酸溶出され得、次いで質量分析法を用いて同定され得る。配列決定の結果は、既知の対照セットと比較されてもよく、または患者の正常組織に対して行われた配列決定分析と比較されてもよい。
【０３００】
いくつかの実施形態では、これらのネオエピトープは、野生型ペプチドよりも高い親和性でクラスＩ  ＨＬＡタンパク質に結合するか、及び／または抗腫瘍ＣＤ８Ｔ細胞を活性化し得る。任意の特定の遺伝子における同一の変異は、腫瘍全体にまれに見出される。
【０３０１】
ＭＨＣクラスＩのタンパク質は、ほとんどの腫瘍細胞を含む身体のほとんど全ての細胞の表面に存在する。ＭＨＣクラスＩのタンパク質は、通常、内因性タンパク質または細胞内に存在する病原体に由来する抗原を負荷され、そして次に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に提示される。Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣクラスＩの分子と複合体を形成したペプチドを認識し、結合し得る。各細胞傷害性Ｔリンパ球は、特異的なＭＨＣ／ペプチド複合体を結合し得る固有のＴ細胞受容体を発現する。
【０３０２】
コンピュータアルゴリズムを使用して、ペプチド提示複合体の形態でクラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子によって結合され、次いでこの形態で、Ｔリンパ球のＴ細胞受容体によって認識される、Ｔ細胞エピトープ、すなわちペプチド配列などの潜在的ネオエピトープを予測し得る。ＭＨＣに結合するペプチドを同定するのに有用なプログラムの例としては、例えば、以下が挙げられる：Ｌｏｎｚａ  Ｅｐｉｂａｓｅ，ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，５０（１９９９），２１３〜２１９）及びＨＬＡ＿ＢＩＮＤ（Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２（１９９４）、１６３−１７５）。
【０３０３】
推定ネオエピトープが選択されると、それらはインビトロ及び／またはインビボアッセイを用いてさらに試験されてもよい。アルゴリズムの予測に基づいて選択されたネオエピトープのリストを改良するために、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイなどの従来のインビトロ実験室アッセイを、各患者からの単離物と共に使用ししてもよい。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡがんワクチン及びワクチン接種方法は、特定の変異（ネオエピトープ）及びがん生殖細胞系遺伝子によって発現されるもの（複数の患者に見られる腫瘍に共通の抗原、本明細書において「伝統的がん抗原」または「共有されたがん抗原」と呼ばれる）に基づくエピトープまたは抗原を包含する。いくつかの実施形態では、伝統的な抗原とは、一般にがんまたは腫瘍に、あるいは特定の種類のがんまたは腫瘍に見られることが公知である抗原である。いくつかの実施形態では、伝統的ながん抗原とは、変異していない腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、伝統的ながん抗原は、変異型腫瘍抗原である。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、１つ以上の非変異腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１つ以上の変異腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡをさらに含んでもよい。
【０３０６】
多くの腫瘍抗原が当該分野において公知である。いくつかの実施形態では、がんまたは腫瘍抗原は、以下の抗原のうちの１つである：ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ１３７、４−ＩＢＢ、５Ｔ４、ＡＧＳ−５、ＡＧＳ−１６、アンジオポイエチン２、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、ＢＴ−０６２、ＢＴＬＡ、ＣＡＩＸ、癌胎児性抗原、ＣＴＬＡ４、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ−Ｂ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＬ７、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＢ２、ＦＡＰ、フィブロネクチン、葉酸受容体、ガングリオシドＧＭ３、ＧＤ２、グルココルチコイド誘発腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、ｇｐ１００、ｇｐＡ３３、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＯＳ、ＩＧＦ１Ｒ、インテグリンａｖ、インテグリンαｖβ、ＬＡＧ−３、ルイスＹ、メソテリン、ｃ−ＭＥＴ、ＭＮカルボニックアンヒドラーゼＩＸ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ネクチン−４、ＮＫＧＤ２、ＮＯＴＣＨ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＳＬＣ４４Ａ４、シンデカン−１、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＩＭ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、及びそれらのバリアント。
【０３０７】
本明細書中で使用される場合、抗原決定基としても知られるエピトープは、適切な文脈において免疫系によって、具体的には抗体、Ｂ細胞、またはＴ細胞によって認識される抗原の一部である。エピトープとしては、Ｂ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープが挙げられる。Ｂ細胞エピトープは、特異的抗体産生Ｂ細胞による認識に必要とされるペプチド配列である。Ｂ細胞エピトープは、抗体によって認識される抗原の特定の領域を指す。エピトープに結合する抗体の部分は、パラトープと呼ばれる。エピトープは、構造及びパラトープとの相互作用に基づいて、立体配座エピトープであってもよいし、または線状エピトープであってもよい。直鎖状または連続的なエピトープは、タンパク質の特定の領域の一次アミノ酸配列によって定義される。抗体と相互作用する配列は、タンパク質上で連続して互いに隣接して位置しており、エピトープは、通常単一のペプチドによって模倣され得る。立体配座エピトープは、天然タンパク質の立体配座構造によって定義されるエピトープである。これらのエピトープは、連続的であってもまたは不連続的であってもよく、すなわちエピトープの構成要素は、折り畳まれた天然タンパク質構造において互いに接近しているタンパク質の異なる部分に位置されてもよい。
【０３０８】
Ｔ細胞エピトープは、ＡＰＣ上のタンパク質と関連して、特異的Ｔ細胞による認識に必要とされるペプチド配列である。Ｔ細胞エピトープは、細胞内でプロセシングされ、ＡＰＣの表面に提示され、そこでそれらは、ＭＨＣクラスＩＩ及びＭＨＣクラスＩを含むＭＨＣ分子に結合される。
【０３０９】
他の態様では、本発明のがんワクチンは、１つ以上の散在型ユニバーサルＩＩ型Ｔ細胞エピトープと共に配置された、複数のペプチドエピトープ抗原をコードするｍＲＮＡワクチンを含む。ユニバーサルＩＩ型Ｔ細胞エピトープとしては、限定するものではないが、ＩＬＭＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩ（破傷風毒素；配列番号２２６）、ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ、（破傷風毒素；配列番号２２７）、ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（破傷風毒素；配列番号２２８）ＱＳＩＡＬＳＳＬＭＶＡＱＡＩＰ（ジフテリア毒素；配列番号２２９）、及びＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（ｐａｎ−ＤＲエピトープ（ＰＡＤＲＥ）；配列番号２３０）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、同じユニバーサルＩＩ型Ｔ細胞エピトープを含む。他の実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０の異なるユニバーサルＩＩ型Ｔ細胞エピトープを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のユニバーサルＩＩ型Ｔ細胞エピトープ（複数可）はあらゆるがん抗原の間に散在している。他の実施形態では、１つ以上のユニバーサルＩＩ型Ｔ細胞エピトープ（複数可）は、あらゆる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または１００個のがん抗原の間に散在している。
【０３１０】
エピトープは、無料または市販のデータベース（Ｌｏｎｚａ  Ｅｐｉｂａｓｅ、例えばアンチトープ）を用いて同定され得る。そのようなツールは、標的抗原タンパク質内の最も免疫原性のエピトープを予測するのに有用である。次いで、選択されたペプチドを合成し、そしてヒトＨＬＡパネルにおいてスクリーニングしてもよく、そして最も免疫原性のある配列を用いて、抗原（複数可）をコードするｍＲＮＡを構築する。細胞傷害性Ｔ細胞のエピトープをマッピングするための１つの戦略は、タンパク質にわたる各々の公称１１量体について４つのＣ末端ペプチドの等モル混合物を生成することに基づいた。この戦略は全ての可能な活性ＣＴＬエピトープを含有するライブラリー抗原を生成するであろう。
【０３１１】
ペプチドエピトープは、エピトープにとって妥当な任意の長さであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、９〜３０アミノ酸である。他の実施形態では、長さは９〜２２、９〜２９、９〜２８、９〜２７、９〜２６、９〜２５、９〜２４、９〜２３、９〜２１、９〜２０、９〜１９、９〜１８、１０〜２２、１０〜２１、１０〜２０、１１〜２２、２２〜２１、１１〜２０、１２〜２２、１２〜２１、１２〜２０、１３〜２２、１３〜２１、１３〜２０、１４〜１９、１５〜１８、または１６〜１７アミノ酸である。
【０３１２】
個別化されたがんワクチンは、複数のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、個別化がんワクチンは、４８〜５４個の個別化がん抗原をコードする。一実施形態では、個別化がんワクチンは、５２個の個別化がん抗原をコードする。いくつかの実施形態では、個別化されたがん抗原の各々は、別々のオープンリーディングフレームによってコードされている。いくつかの実施形態では、個別化がんワクチンは、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、または５５以上の抗原から構成される。他の実施形態では、個別がんワクチンは、１０００以下、９００以下、５００以下、１００以下、７５以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、または１００以下のエピトープから構成される。さらに他の実施形態では、個別化がんワクチンは、３〜１００、５〜１００、１０〜１００、１５〜１００、２０〜１００、２５〜１００、３０〜１００、３５〜１００、４０〜１００、４５〜１００、５０〜１００、５５〜１００、６０〜１００、６５〜１００、７０〜１００、７５〜１００、８０〜１００、９０〜１００、５〜５０、１０〜５０、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、１００〜１５０、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜５００、５０〜５００、５０〜８００、５０〜１，０００、または１００〜１，０００のがん抗原を有する。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープの最適な長さは、以下の手順によって得てもよい：Ｖ５タグコンカテマー試験プロテアーゼ部位を合成すること、それをＤＣ細胞に導入すること（例えば、ＲＮＡスクイーズ手順を用いること）、細胞を溶解すること、その後、プロテアーゼ部位での切断を評価するために抗Ｖ５ウエスタンブロットを実行すること。
【０３１４】
ＲＮＡスクイーズ技術は、細胞内送達方法であり、それによって様々な材料が広範囲の生細胞に送達され得る。細胞は、急速な機械的変形を引き起こすマイクロ流体構築を受ける。変形は、一時的な膜の破壊及び新たに形成された一時的な孔をもたらす。その後、物質は一時的な孔を介して細胞サイトゾルに受動的に拡散される。この技術は、初代線維芽細胞、胚性幹細胞、及び免疫細胞の宿主など、様々な種類の細胞に使用され得、ほとんどの適用で比較的高い生存率を示し、量子ドットまたはタンパク質などの鋭敏な材料を、その作用を通して、損傷することはない。Ｓｈａｒｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（２０１３）；１１０（６）：２０８２−７。
【０３１５】
ネオエピトープは、強力な免疫応答を促進するために、ＭＨＣに最適に結合するように設計され得る。いくつかの実施形態では、各ペプチドエピトープは、抗原性領域及びＭＨＣ安定化領域を含む。ＭＨＣ安定化領域は、ＭＨＣ中のペプチドを安定化させる配列である。ＭＨＣ安定化領域は、５〜１０、５〜１５、８〜１０、１〜５、３〜７、または３〜８アミノ酸長であり得る。さらに他の実施形態では、抗原性領域は、５〜１００アミノ酸長である。ペプチドは、それらが細胞表面に提示される前に、小胞体内の競合的親和性結合によってＭＨＣクラスＩの分子と相互作用する。個々のペプチドの親和性は、そのアミノ酸配列及びアミノ酸配列内の定義された位置における特異的結合モチーフの存在に直接関連している。ＭＨＣに提示されているペプチドは、α１／α２ヘテロ二量体（２つの同一でないサブユニットから構成される分子）の中央領域において、ペプチド結合グルーブの底に保持されている。ペプチド結合グルーブの底の残基の配列は、それがどの特定のペプチド残基に結合するかを決定する。
【０３１６】
最適な結合領域は、全ての試験された抗原に対する理想的な結合剤を同定するために、標的エピトープの各々についての結合部位中の各アミノ酸における特定のアミノ酸に対する結合部位（ＭＨＣポケット）の親和性のコンピュータ支援比較により同定され得る。エピトープのＭＨＣ安定化領域は、結合部位についてのデータ点のアミノ酸予測マトリクスを使用して同定され得る。アミノ酸予測マトリクスは、データ点を定義する第１及び第２の軸を有する表である。予測マトリクスは、Ｓｉｎｇｈ，Ｈ．及びＲａｇｈａｖａ，Ｇ．Ｐ．Ｓ．（２００１），「ＰｒｏＰｒｅｄ：ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−ＤＲ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１７（１２），１２３６−３７）に示されているように生成され得る。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、ＭＨＣ安定化領域は、対象の特定のＭＨＣに基づいて設計されている。そのようにして、ＭＨＣ安定化領域は、各患者に対して最適化され得る。
【０３１８】
いくつかの場合には、抗原の各エピトープは、ＭＨＣ安定化領域を含んでもよい。エピトープ内の全てのＭＨＣ安定化領域は、同じであっても異なっていてもよい。ＭＨＣ安定化領域は、ペプチドのＮ末端部分にあっても、またはペプチドのＣ末端部分にあってもよい。あるいは、ＭＨＣ安定化領域は、ペプチドの中央領域にあってもよい。いくつかの実施形態におけるネオエピトープは、長さが１３残基以下であり、通常、約８〜約１１残基、特に９または１０残基からなる。他の実施形態では、ネオエピトープはより長くなるように設計されてもよい。例えば、ネオエピトープは、対応する各遺伝子産物のＮ末端及びＣ末端に向かって２〜５アミノ酸の伸長を有し得る。より長いペプチドの使用は、患者細胞による内因性プロセシングを可能にし得、そしてより効果的な抗原提示及びＴ細胞応答の誘導をもたらし得る。
【０３１９】
ワクチンに含めるために選択されたネオエピトープは、典型的には高親和性結合ペプチドであろう。いくつかの態様では、ネオエピトープは、野生型ペプチドよりも高い親和性でＨＬＡタンパク質に結合する。ネオエピトープは、いくつかの実施形態では、少なくとも５０００ｎＭ未満、少なくとも５００ｎＭ未満、少なくとも２５０ｎＭ未満、少なくとも２００ｎＭ未満、少なくとも１５０ｎＭ未満、少なくとも１００ｎＭ未満、少なくとも少なくとも５０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。典型的には、ＩＣ５０＜５０ｎＭと予測されるペプチドは、一般に中〜高親和性結合ペプチドと考えられ、ＨＬＡ結合の生化学的アッセイを用いて経験的にそれらの親和性を試験するために選択される。最後に、ヒトの免疫系がこれらの変異した腫瘍抗原に対して効果的な免疫応答を起こし得、それによって正常細胞ではなく腫瘍を効果的に殺傷し得るか否かが決定されるであろう。
【０３２０】
所望の活性を有するネオエピトープは、所望のＭＨＣ分子に結合して適切なＴ細胞またはＢ細胞を活性化するために未修飾ペプチドの生物学的活性の実質的に全部を増大させるかまたは少なくとも実質的に保持しながら、特定の所望の属性、例えば、薬理学的特徴の改善を提供するために必要に応じて修飾されてもよい。例えば、ネオエピトープは、保存的または非保存的のいずれかの置換などの様々な変化を受ける場合があり、そのような変化は、ＭＨＣ結合の改善など、それらの使用において特定の利点をもたらし得る。保存的置換とは、アミノ酸残基を生物学的及び／または化学的に類似している別のもの、例えば、別の疎水性残基、または別の極性残基と置換することを意味する。この置換は、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせを含む。単一アミノ酸置換の効果はまた、Ｄ−アミノ酸を用いて調べられ得る。そのような修飾は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−３４７（１９８６）、Ｂａｒａｎｙ＆Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ＆Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．（Ｎ．Ｙ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）．ｐｐ．１−２８４（１９７９）；及びＳｔｅｗａｒｔ＆Ｙｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｐｉｅｒｃｅ），２ｄ  Ｅｄ．（１９８４）に記載されるような、周知のペプチド合成手順を用いてなされ得る。
【０３２１】
ネオエピトープはまた、例えば、アミノ酸の付加または欠失によって、化合物のアミノ酸配列を伸長または減少させることによって修飾されてもよい。ペプチド、ポリペプチドまたは類似体は、特定の残基の順序または組成を変えることによっても修飾されてもよく、生物活性に必須の特定のアミノ酸残基、例えば、重要な接触部位または保存残基におけるアミノ酸残基は、生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく一般には変えられ得ないことが容易に予測される。
【０３２２】
典型的には、単一アミノ酸置換を有する一連のペプチドを使用して、結合に対する静電荷、疎水性などの効果を決定する。例えば、一連の正荷電（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）または負荷電（例えば、Ｇｌｕ）アミノ酸置換が、ペプチドの長さに沿ってなされ、様々なＭＨＣ分子及びＴ細胞またはＢ細胞受容体に対する異なるパターンの感受性が明らかになる。さらに、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、または類似の残基などの小さい比較的中性の部分を使用した複数の置換を使用してもよい。置換は、ホモオリゴマーであっても、またはヘテロオリゴマーであってもよい。置換または付加される残基の数及び種類は、本質的な接触点と求められる特定の機能的属性（例えば、疎水性対親水性）との間の必要な間隔に依存する。ＭＨＣ分子またはＴ細胞受容体に対する結合親和性の増大もまた、親ペプチドの親和性と比較して、そのような置換によって達成され得る。いずれにしても、そのような置換は、例えば、結合を妨害し得る立体的及び電荷的干渉を避けるために、選択されたアミノ酸残基または他の分子断片を使用するべきである。
【０３２３】
ネオエピトープはまた、ネオエピトープ中に２つ以上の残基のアイソスターを含んでもよい。本明細書で定義されるアイソスターは、第１の配列の立体配座が、第２の配列に特異的な結合部位に適合するので、第２の配列を置換し得る２個以上の残基の配列である。この用語は具体的には、当業者に周知のペプチド骨格修飾を包含する。そのような修飾としては、アミド窒素、α、−炭素、アミドカルボニルの修飾、アミド結合の完全な置換、伸長、欠失または骨格架橋が挙げられる。一般的には、Ｓｐａｔｏｌａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．ＶＩＩ（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｄ．，１９８３）を参照のこと。
【０３２４】
免疫原性を考慮することは、ワクチンに含めるための最適なネオエピトープの選択における重要な構成要素である。免疫原性は、例えば、ネオエピトープのＭＨＣ結合能、ＨＬＡ無差別性、突然変異位置、予測Ｔ細胞反応性、実際のＴ細胞反応性、特定の立体配座及びその結果としての溶媒曝露をもたらす構造、ならびに特定のアミノ酸の表示を分析することによって評価され得る。ＮｅｔＭＨＣ予測アルゴリズムなどの公知のアルゴリズムを使用して、一般的なＨＬＡ−Ａ及び−Ｂ対立遺伝子に結合するペプチドの能力を予測し得る。ＭＨＣ結合ペプチドの構造評価は、インシリコ三次元分析及び／またはタンパク質ドッキングプログラムによっても行われ得る。ロゼッタアルゴリズムから得られるような、ＭＨＣ分子に結合したときの予測エピトープ構造の使用は、エピトープがＭＨＣ分子に結合したときのエピトープのアミノ酸残基の溶媒曝露の程度を評価するために使用され得る。Ｔ細胞反応性は、インビトロでエピトープ及びＴ細胞を用いて実験的に評価され得る。あるいは、Ｔ細胞反応性は、Ｔ細胞応答／配列データセットを用いて評価され得る。
【０３２５】
ワクチンに含まれるネオエピトープの重要な要素は、自己反応性の欠如である。エピトープが腫瘍組織に限定されていること、例えば、悪性細胞内の遺伝的変化の結果として生じることを確認するために推定ネオエピトープをスクリーニングしてもよい。理想的には、エピトープは、患者の正常組織に存在すべきではなく、したがって自己に類似のエピトープはデータセットから除外される。
【０３２６】
他の態様では、本開示は、対象から試料を単離すること、試料中の複数のがん抗原を同定すること、複数のがん抗原からＴ細胞エピトープを決定すること、抗原及びこの抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有し、この抗原が少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むｍＲＮＡがんワクチンを調製することによる、ｍＲＮＡがんワクチンの調製方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、対象のＭＨＣに対するＴ細胞エピトープの結合強度を決定することを包含する。他の実施形態では、この方法は、各エピトープについてのＴ細胞受容体面（ＴＣＲ面）を決定すること、及び内因性タンパク質との類似性が低いＴＣＲ面を有するエピトープを選択することをさらに包含する。対象のＭＨＣへの結合強度について最適化され得るＴ細胞エピトープが提供される。いくつかの実施形態では、各エピトープに対するＴＣＲ面は、内因性タンパク質との類似性が低い。
【０３２７】
例えば、ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘ（Ｅｐｉｖａｘ）と呼ばれる、ラージゲノム配列データベースにわたる比較を可能にするためにＨＬＡ結合及びＴＣＲ対向側の両方からの交差反応性Ｔ細胞エピトープを調べる技術は、望ましいＴＣＲ面及びＭＨＣに対する結合強度を有するエピトープを同定するために使用され得る。一連のアルゴリズムを単独で、またはＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘと共に使用して、エピトープ選択を最適化し得る。例えば、ＥｐｉＭａｔｒｉｘは、保存された標的タンパク質配列に由来する重複する９量体フレームを取り、それらをクラスＩまたはクラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子のパネルに対する潜在的な結合親和性についてスコア付けする；高いスコアを示し、結合すると予測される各フレームごとの対立遺伝子評価は、推定上のＴ細胞エピトープである。ＣｌｕｓｔｉＭｅｒは、ＥｐｉＭａｔｒｉｘの出力を取り、多数の推定Ｔ細胞エピトープを含む９量体のクラスターを同定する。ＢｌａｓｔｉＭｅｒは、以前に同定された配列をＢＬＡＳＴに提出して、ヒトゲノムと類似性を共有するか否かを判断するプロセスを自動化する；任意のそのような類似の配列は、許容されるか、または望まれない自己免疫応答を誘発する可能性が高いであろう。ＥｐｉＡｓｓｅｍｂｌｅｒは、ＣｏｎｓｅｒｖａｔｒｉｘとＥｐｉＭａｔｒｉｘによって同定された保存された免疫原性配列を取り、それらを一緒に結び付けて免疫原性の高いコンセンサス配列を形成する。ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘは、ヒトゲノムによってコードされる配列との相同性に起因して、望ましくない自己免疫または調節性Ｔ細胞応答を潜在的に誘発する可能性がある配列をスクリーニングするために使用され得る。ＶａｃｃｉｎｅＣＡＤを使用して、候補エピトープを一連のビーズデザインにリンクしながら、リンクプロセスで作製される可能性がある非特異的接合エピトープを最小限に抑える。
【０３２８】
本開示による個別化されたがんワクチンを生成するための方法は、組織試料の本明細書に記載されているようなディープ核酸またはタンパク質シーケンシング法などの技術を用いた変異の同定を包含する。いくつかの実施形態では、患者のトランスクリプトームにおける変異の初期同定が行われる。患者のトランスクリプトームからのデータは、発現されている患者特異的及び腫瘍特異的な変異を同定するために、患者のエキソームからの配列情報と比較される。この比較により、ムタノームと呼ばれる推定ネオエピトープのデータセットが生じる。ムタノームは、１患者あたり約１００〜１０，０００の候補変異を含み得る。ムタノームは、ネオ抗原ワクチンの生成のための最適な変異セットを同定するための一連の問い合わせまたはアルゴリズムを用いたデータプロービング分析を受ける。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡネオ抗原ワクチンを設計及び製造する。次いで、患者をワクチンで処置する。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、変異同定プロセスの開始から患者処置の開始までの全方法は、２ヶ月未満で達成される。他の実施形態では、全プロセスは、７週間以内、６週間以内、５週間以内、４週間以内、３週間以内、２週間以内または１週間未満に達成される。いくつかの実施形態では、全方法は３０日未満で行われる。
【０３３０】
変異同定プロセスは、トランスクリプトーム分析とエキソーム分析の両方、またはトランスクリプトーム分析もしくはエキソーム分析のみを包含し得る。いくつかの実施形態では、トランスクリプトーム分析が、最初に行われ、エキソーム分析が次に行われる。分析は、生物学的試料または組織試料に対して行われる。いくつかの実施形態では、生物学的試料または組織試料は、血液試料または血清試料である。他の実施形態では、試料は組織バンク試料またはＢ細胞のＥＢＶ形質転換である。
【０３３１】
ｍＲＮＡワクチンが合成されると、それは患者に投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、最長２ヶ月、最長３ヶ月、最長４ヶ月、最長５ヶ月、最長６ヶ月、最長７ヶ月、最長８ヶ月、最長９ヶ月、最長１０か月、最長１１か月、最長１年、最長１年半、最長２年、最長３年、または最長４年のスケジュールで投与される。スケジュールは同じでも異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、スケジュールは、最初の３週間は毎週、その後は毎月である。
【０３３２】
処置の任意の時点で、ワクチン中の変異が依然として適切であるか否かを決定するために患者を検査する場合がある。その分析に基づいて、ワクチンは、１つ以上の異なる変異を含むように、または１つ以上の変異を除去するように調整しても、または再構成してもよい。
【０３３３】
がん関連変異の特定の特性を分析することによって、最適なネオエピトープがｍＲＮＡワクチンへの包含のために評価され得るか、及び／または選択され得ることが認識され理解されている。ネオエピトープまたはネオエピトープのセットの特性としては、例えば、患者のＲＮＡ−ｓｅｑまたは他の核酸分析における遺伝子または転写レベルの発現の評価、利用可能なデータベースにおける組織特異的な発現、既知のがん遺伝子／腫瘍抑制因子、バリアントコール信頼度スコア、ＲＮＡ−ｓｅｑ対立遺伝子特異的発現、保存的対非保存的ＡＡ置換、点突然変異の位置（ＴＣＲエンゲージメントの増大に関するセンタリングスコア）、点突然変異の位置（示差的ＨＬＡ結合に関するアンカースコア（Ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  Ｓｃｏｒｅ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ＨＬＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ））、自己性：患者ＷＥＳデータとの１００％未満のコアエピトープ相同性、８量体−１１量体のＨＬＡ−Ａ及び−Ｂ  ＩＣ５０、１５量体−２０量体のＨＬＡ−ＤＲＢ１  ＩＣ５０、非特異性スコア（すなわち、結合すると予測される患者ＨＬＡの数）、８量体−１１量体のＨＬＡ−Ｃ  ＩＣ５０、１５量体−２０量体のＨＬＡ−ＤＲＢ３−５  ＩＣ５０、１５量体−２０量体のＨＬＡ−ＤＱＢ１／Ａ１  ＩＣ５０、１５量体−２０量体のＨＬＡ−ＤＰＢ１／Ａ１  ＩＣ５０、クラスＩ対クラスＩＩの割合、患者の多様性ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ及びＤＲＢ１アロタイプカバー、点突然変異対複合体エピトープの割合（例えば、フレームシフト、及び／または疑似エピトープＨＬＡ結合スコアを挙げることができる。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、最適ネオエピトープを同定するために使用されるがん関連変異の特性とは、変異の種類、患者試料中の変異の存在量、免疫原性、自己反応性の欠如、及びペプチド組成の性質に関する特性である。
【０３３５】
変異の種類を決定し、推定上のエピトープをワクチンに含めるべきか否かを決定する際の要因として考慮する必要がある。変異の種類は変化し得る。いくつかの場合には、単一のワクチンに複数の異なる種類の変異を含めることが望ましい場合がある。他の場合には、単一の種類の変異がより望ましい場合がある。特定の変異についての値を、重み付けし、そして計算してもよい。
【０３３６】
患者試料中の変異の存在量もまたスコア付けされ、推定上のエピトープがワクチンに含まれるべきか否かの決定に織り込まれ得る。非常に豊富な変異はさらに強い免疫応答を促進する場合がある。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の個別化ｍＲＮＡがんワクチンは、がんの処置に使用され得る。
【０３３８】
ｍＲＮＡがんワクチンは、健康な個体またはがんの初期もしくは後期及び／または転移性癌への能動免疫スキームの一部として予防的または治療的に投与され得る。一実施形態では、細胞、組織または対象に提供されるｍＲＮＡがんワクチンの有効量は、免疫活性化のため、特に抗原特異的免疫活性化のために十分であり得る。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡがんワクチンは、限定するものではないが、伝統的ながんワクチンを含む抗がん治療剤と共に投与されてもよい。ｍＲＮＡがんワクチン及び抗がん治療薬を組み合わせて、免疫治療反応をさらに増強し得る。ｍＲＮＡがんワクチン及び他の治療剤は同時に投与されてもよいし、または順次投与されてもよい。他の治療薬が同時に投与される場合、それらは同じまたは別々の製剤で投与されてもよいが、同時に投与される。他の治療剤とｍＲＮＡがんワクチンの投与が時間的に離れている場合、他の治療剤は互いに、そしてｍＲＮＡがんワクチンと連続して投与される。これらの化合物の投与の間の時間的な隔たりは、およそ数分であってもよく、またはより長く、例えば、数時間、数日、数週、数か月であってもよい。他の治療剤としては、限定するものではないが、抗がん治療薬、アジュバント、サイトカイン、抗体、抗原などが挙げられる。
【０３４０】
別の実施形態では、ペプチドエピトープは、２〜１００個のペプチドエピトープから構成されるコンカテマーがん抗原の形態である。いくつかの実施形態では、コンカテマーがん抗原は、以下のうちの１つ以上を含む：ａ）２〜１００個のペプチドエピトープには切断感受性部位が点在されている；ｂ）各ペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡがリンカーなしで互いに直接結合されている；ｃ）各ペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡが、単一のヌクレオチドリンカーを用いて互いに連結されている；ｄ）各ペプチドエピトープは２５〜３５個のアミノ酸を含み、中央に位置するＳＮＰ変異を含む；ｅ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象由来のクラスＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有する；ｆ）少なくとも３０％のペプチドエピトープが、対象由来のクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有する；ｇ）ペプチドエピトープの少なくとも５０％が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及び／またはＤＲＢ１に対してＩＣ＞５００ｎＭという推定結合親和性を有する；ｈ）ｍＲＮＡは、４５〜５５ペプチドエピトープをコードする；ｉ）ｍＲＮＡは、５２個のペプチドエピトープをコードする；ｊ）５０％のペプチドエピトープが、クラスＩ  ＭＨＣに対する結合親和性を有し、５０％のペプチドエピトープが、クラスＩＩ  ＭＨＣに対する結合親和性を有する；ｋ）ペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡは、ペプチドエピトープが疑似エピトープを最小にするように配列されるように配置される、ｌ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、長さ１５アミノ酸のクラスＩ  ＭＨＣ結合ペプチドである；及び／またはｍ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％が２１アミノ酸長のクラスＩＩ  ＭＨＣ結合ペプチドである。
【０３４１】
バクテリアワクチン
いくつかの態様では、本開示は、目的の細菌抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチド（すなわち免疫増強剤）をコードする１つ以上のｍＲＮＡ構築物を含む細菌ワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、目的の細菌抗原は、同じまたは別々のｍＲＮＡ構築物によってコードされている。いくつかの実施形態では、細菌ワクチンは、免疫応答を増強するポリペプチドをコードする１つ以上のｍＲＮＡ構築物、及び少なくとも１つの目的の細菌抗原をコードする１つ以上のｍＲＮＡ構築物を含む。例えば、目的の細菌抗原は、免疫増強剤構築物と同じｍｍＲＮＡ上に提供されるか、または免疫増強剤として異なるｍｍＲＮＡ構築物上に提供される化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）によってコードされ得る。免疫増強剤及び細菌抗原ｍｍＲＮＡを、それを必要とする対象に処方（または共処方）及び投与（同時または順次）して、対象における細菌抗原に対する免疫応答を刺激してもよい。免疫増強剤と共に使用するのに適した細菌抗原は本明細書に記載されている。
【０３４２】
いくつかの実施形態では、細菌ワクチンは予防的である（すなわち、感染を予防する）。いくつかの実施形態では、細菌ワクチンは治療的である（すなわち、感染症を処置する）。いくつかの実施形態では、細菌ワクチンは、体液性免疫応答（すなわち、目的の細菌抗原に特異的な抗体の産生）を誘導する。いくつかの実施形態では、細菌ワクチンは、適応免疫応答を誘導する。適応免疫応答は、抗原または免疫原との対抗に応答して起こり、ここで免疫応答は、抗原／免疫原の抗原決定基に特異的である。適応免疫応答の例は、抗原特異的抗体産生の誘導またはＴヘルパーリンパ球もしくは細胞傷害性リンパ球の抗原特異的誘導／活性化である。
【０３４３】
いくつかの実施形態では、細菌ワクチンは、防御的、適応免疫応答を誘導し、抗原特異的免疫応答は、抗原による免疫（人工的または天然）に対する反応として対象に誘導され、ここでこの免疫応答は、抗原またはその抗原を含む病理学関連物質によるその後のチャレンジに対して対象を防御し得る。
【０３４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細菌ワクチンは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓによる感染症を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細菌ワクチンは、抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓによる感染症を処置するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細菌ワクチンは、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）による感染症を処置するために使用される。
【０３４５】
院内感染は、米国の医療システムにとって最も一般的でかつ費用のかかる問題の１つであり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓがそのような感染の第２の原因である。ＭＲＳＡは、院内感染した全てのＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症の４０〜５０％を占める。さらに、最近の研究では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓが補綴インプラント感染の主要な媒介因子でもあることが示されている。Ｓ．ａｕｒｅｕｓが宿主の免疫応答を妨げ、持続的感染に発展するのに利用される最も重要な機構の１つは、高度に発達したバイオフィルムの形成によるものである。バイオフィルムは、細菌細胞が水和表面に付着して、多糖類マトリックスに埋め込まれている、微生物由来の集団である。バイオフィルム中の細菌は、それらの増殖、遺伝子発現、及びタンパク質産生において表現型の変化を示す。
【０３４６】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細菌ワクチンは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓによるバイオフィルム媒介慢性感染の確立を予防する。いくつかの実施形態では、目的の抗原は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓによって産生されるバイオフィルム中に見出される。そのような抗原の例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，２６５，８２０号に記載されている。いくつかの実施形態では、細菌ワクチンは、浮遊型の細菌によって発現される少なくとも１つのポリペプチド、及びバイオフィルム型の細菌によって発現される少なくとも１つのポリペプチドを含む。
【０３４７】
いくつかの実施形態では、目的の細菌抗原はＳ．ａｕｒｅｕｓに由来する。薬剤耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、ワクチン標的としての候補である多数の表面露出タンパク質、ならびにＳ．ａｕｒｅｕｓを標的とする抗体を調製するための免疫剤としての候補を発現する。そのような抗原の例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／１３６６５３号及び同第ＷＯ２０１５／０８２５３６号、ならびにＲａｍｕｓｓｅｎ、Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３４：４６０２−４６０９（２０１６）に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３４８】
当業者は、本明細書中に記載される細菌ワクチンのためのｍＲＮＡによってコードされ得る異なるＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質の同一性、数及びサイズが変わり得ることを理解するであろう。例えば、ワクチンは全長ポリペプチドの一部のみをコードするｍＲＮＡを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ワクチンは、部分及び全長ポリペプチドの組み合わせをコードするｍＲＮＡを含んでもよい。
【０３４９】
本明細書に記載の細菌ワクチンに含まれるｍＲＮＡによってコードされる浮遊型発現及びバイオフィルム発現のポリペプチドの同一性は、特に限定されないが、それぞれＳ．ａｕｒｅｕｓ株由来のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドは細菌の表面に露出している。
【０３５０】
一実施形態では、細菌抗原は多価抗原である（すなわち、抗原は、コンカテマー抗原などの異なるエピトープを含む複数の抗原性ペプチドなどの複数の抗原性エピトープを含む）。
【０３５１】
別の実施形態では、細菌抗原は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ抗原、例えば、ＭＯＭＰ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＬ、ＯｍｐＦまたはＯｐｒＦ抗原である。適切なＣｈｌａｍｙｄｉａ抗原は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１４号にさらに記載されており、その全内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０３５２】
多価ワクチン
免疫増強剤構築物を多価抗原（すなわち、抗原は、コンカテマー抗原などの異なるエピトープを含む複数の抗原性ペプチドなどの複数の抗原性エピトープを含む）と組み合わせて使用して、それによって多価抗原に対する免疫応答を増強し得る。一実施形態では、多価抗原はがん抗原である。別の実施形態では、多価抗原は、細菌抗原である。例えば、目的の多価抗原（例えば、以下に記載されるように設計される）は、免疫増強剤構築物と同じｍｍＲＮＡ上に提供されるか、または免疫増強剤として異なるｍｍＲＮＡ構築物上に提供される化学修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）によってコードされ得る。免疫増強剤及び多価抗原ｍｍＲＮＡを、それを必要とする対象に処方（または共処方）及び投与（同時または順次）して、対象中の多価抗原に対する免疫応答を刺激してもよい。免疫増強剤と共に使用するための、がん抗原及び細菌抗原を含む適切な多価抗原が本明細書に記載されている。
【０３５３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡワクチンは、２〜１００個のペプチドエピトープから構成されるコンカテマー抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む。
【０３５４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコンカテマーワクチンは、単一のネオエピトープの複数コピー、単一のタイプの変異、すなわち点突然変異に基づく複数の異なるネオエピトープ、様々な変異型に基づく複数の異なるネオエピトープ、ネオエピトープ及び他の抗原、例えば、腫瘍関連抗原またはリコール抗原を含んでもよい。
【０３５５】
いくつかの実施形態では、コンカテマー抗原は、時には、記憶抗原とも呼ばれる、リコール抗原を含んでもよい。リコール抗原とは、以前に個人が遭遇したことがあり、そのために既存の記憶リンパ球がある抗原である。いくつかの実施形態では、リコール抗原は、個体が遭遇した可能性がある、インフルエンザ抗原などの感染性疾患抗原であってもよい。リコール抗原は、より強い免疫応答を促進することを助ける。
【０３５６】
ペプチドエピトープに加えて、コンカテマー抗原は１つ以上の標的化配列を有し得る。本明細書中で使用される場合、標的化配列とは、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ決定基内でのプロセシング及び／または提示のためにエンドソームなどの、細胞内区画へのペプチドの取り込みを容易にするペプチド配列を指す。
【０３５７】
標的化配列は、コンカテマー抗原のエピトープのＮ末端及び／またはＣ末端に、それらに直接隣接するか、または切断感受性部位のリンカーによって隔てられるかのいずれかで存在し得る。標的化配列は、様々な長さ、例えば、４〜５０アミノ酸長を有する。
【０３５８】
標的化配列は、例えば、エンドソーム標的化配列であってもよい。エンドソーム標的化配列は、インバリアント鎖、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ１，４ＬＡＭＰ２）、及び樹状細胞（ＤＣ）−ＬＡＭＰなどのＭＨＣクラスＩＩ  Ａｇプロセシング区画に存在することが知られているエンドソームもしくはリソソームタンパク質に由来する配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列である。さらに、ＭＨＣクラスＩシグナルペプチド断片（７８ｂｐ、分泌シグナル（ｓｅｃ））をコードする例示的な核酸ならびに終止コドン（ＭＨＣクラスＩ輸送シグナル（ＭＩＴＤ）、１６８ｂｐ）両方（ＰＢＭＣから増幅された）を含む膜貫通ドメイン及び細胞質ゾルドメインを使用してもよい（ｓｅｃセンス、５’−ａａｇ  ｃｔｔ  ａｇｃ  ｇｇｃ  ｃｇｃ  ａｃｃ  ａｔｇ  ｃｇｇ  ｇｔｃ  ａｃｇ  ｇｃｇ  ｃｃｃ  ｃｇａ  ａｃｃ−３’（配列番号１３１４）；ｓｅｃアンチセンス、５’−ｃｔｇ  ｃａｇ  ｇｇａ  ｇｃｃ  ｇｇｃ  ｃｃａ  ｇｇｔ  ｃｔｃ  ｇｇｔ  ｃａｇ−３’（配列番号１３１５）；ＭＩＴＤセンス、５’−ｇｇａ  ｔｃｃ  ａｔｃ  ｇｔｇ  ｇｇｃ  ａｔｔ  ｇｔｔ  ｇｃｔ  ｇｇｃ  ｃｔｇ  ｇｃｔ−３’（配列番号１３１６）；及びＭＩＴＤアンチセンス、５’−ｇａａ  ｔｔｃ  ａｇｔ  ｃｔｃ  ｇａｇ  ｔｃａ  ａｇｃ  ｔｇｔ  ｇａｇ  ａｇａ  ｃａｃ  ａｔｃ  ａｇａ  ｇｃｃ−３’（配列番号１３１７）。
【０３５９】
ＭＨＣクラスＩ提示は、典型的には非効率的なプロセスである（実際に提示されるのは、１０，０００の分解分子のうちの１つのペプチドのみである）。ＡＰＣによるＣＤ８Ｔ細胞の初回刺激は、不十分な密度の表面ペプチド／ＭＨＣ  Ｉ複合体を提供し、弱いレスポンダーが損なわれたサイトカイン分泌及び減少した記憶プールを示すことをもたらす。本明細書に記載の方法は、ＭＨＣクラスＩ提示の効率を増大し得る。ＭＨＣクラスＩ標的化配列としては、ＭＨＣクラスＩ輸送シグナル（ＭＩＴＤ）及びＰＥＳＴ配列（おそらく急速分解のためにタンパク質を標的化することによって抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を増大させる）が挙げられる。
【０３６０】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、例えば、非ＡＰＣを疑似ＡＰＣに変換することによって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の産生を促進するための因子と組み合わせてもよい。抗原提示は、免疫応答の開始、増幅及び持続期間における重要なステップである。この過程において、抗原の断片は、抗原特異的免疫応答を駆動するＴ細胞に対する、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を介して提示される。免疫予防及び治療に関して、この反応を増強することは、有効性を改善するために重要である。本発明のｍＲＮＡワクチンは、効率的な抗原提示を促進するように設計されても、または増強されてもよい。ＡＰＣプロセシング及び提示を増強するための１つの方法は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）へのｍＲＮＡワクチンのより良好な標的化を提供することである。別のアプローチは、免疫刺激製剤及び／または構成要素を用いてＡＰＣ細胞を活性化することを包含する。
【０３６１】
あるいは、非ＡＰＣをＡＰＣになるように再プログラミングするための方法は、本明細書中に記載されるｍＲＮＡワクチンと共に使用され得る。重要なことに、ｍＲＮＡ製剤を取り入れ、それらの治療作用の標的となるほとんどの細胞はＡＰＣではない。したがって、これらの細胞をＡＰＣに変換する方法を設計することは、有効性にとって有益であろう。ＲＮＡワクチン、例えば、ｍＲＮＡワクチンを細胞に送達し、一方で非ＡＰＣからＡＰＣへのシフトも促進するための方法及びアプローチが、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＡＰＣ再プログラミング分子をコードするｍＲＮＡは、ｍＲＮＡワクチンに含まれるか、またはｍＲＮＡワクチンと同時投与される。
【０３６２】
本明細書で使用されるＡＰＣ再プログラミング分子は、非ＡＰＣ細胞におけるＡＰＣ様表現型への移行を促進する分子である。ＡＰＣ様表現型は、ＭＨＣクラスＩＩプロセシングを可能にする特性である。したがって、ＡＰＣ様表現型を有するＡＰＣ細胞は、１つ以上の外因性分子を有さない同じ細胞と比較して、ＭＨＣクラスＩＩプロセシング能力が増強されている１つ以上の外因性分子（ＡＰＣ再プログラミング分子）を有する細胞である。いくつかの実施形態では、ＡＰＣ再プログラミング分子は、ＣＩＩＴＡ（ＭＨＣクラスＩＩ発現の中心的調節因子）；シャペロンタンパク質、例えば、ＣＬＩＰ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＭなど（ＭＨＣクラスＩＩへの抗原断片のローディングの促進剤）及び／またはＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６などのような共刺激分子（Ｔ細胞抗原認識及び／またはＴ細胞活性化の促進剤）である。
【０３６３】
ＣＩＩＴＡタンパク質は、クラスＩＩプロモーター領域と会合する、保存されたＤＮＡ結合タンパク質のセットと相互作用することにより、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の転写の活性化を増強するトランスアクチベーターである（Ｓｔｅｉｍｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｃｅｌｌ  ７５：１３５−１４６）。ＣＩＩＴＡの転写活性化機能は、アミノ末端酸性ドメイン（アミノ酸２６〜１３７）にマッピングされている。ＣＩＩＴＡと相互作用するタンパク質をコードする核酸分子は、ＣＩＩＴＡ相互作用タンパク質１０４（本明細書ではＣＩＰ１０４とも呼ばれる）と呼ばれる。ＣＩＴＴＡ及びＣＩＰ１０４は両方とも、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターからの転写を増強することが示されており、したがって本発明のＡＰＣ再プログラミング分子として有用である。いくつかの実施形態では、ＡＰＣ再プログラミング分子は、全長ＣＩＩＴＡ、ＣＩＰ１０４、または他の関連分子もしくはその活性な断片、例えば、ＣＩＩＴＡのアミノ酸２６〜１３７、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の転写の活性化を増強する能力を維持するアミノ酸である。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、ＡＰＣ再プログラミング分子は、ＡＰＣ再プログラミング分子をコードするｍＲＮＡの形態で対象に送達される。したがって、本明細書に記載のｍＲＮＡワクチンは、ＡＰＣ再プログラミング分子をコードするｍＲＮＡを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはモノシストロン性である。他の実施形態では、ｍＲＮＡはポリシストロン性である。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原をコードするｍＲＮＡは、ＡＰＣ再プログラミング分子をコードするｍＲＮＡとは別の製剤中にある。他の実施形態では、１つ以上の抗原をコードするｍＲＮＡは、ＡＰＣ再プログラミング分子をコードするｍＲＮＡと同じ製剤中にある。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原をコードするｍＲＮＡは、ＡＰＣ再プログラミング分子をコードするｍＲＮＡと同時に対象に投与される。他の実施形態では、１つ以上の抗原をコードするｍＲＮＡは、ＡＰＣ再プログラミング分子をコードするｍＲＮＡとは異なる時間に対象に投与される。例えば、ＡＰＣ再プログラミング分子をコードするｍＲＮＡは、１つ以上の抗原をコードするｍＲＮＡの前に投与され得る。ＡＰＣ再プログラミング分子をコードするｍＲＮＡは、抗原をコードするｍＲＮＡの直前、少なくとも１時間前、少なくとも１日前、少なくとも１週間前、または少なくとも１ヶ月前に投与されてもよい。あるいは、ＡＰＣ再プログラミング分子をコードするｍＲＮＡは、１つ以上の抗原をコードするｍＲＮＡの後に投与され得る。ＡＰＣ再プログラミング分子をコードするｍＲＮＡは、抗原をコードするｍＲＮＡの直後、少なくとも１時間後、少なくとも１日後、少なくとも１週間後、または少なくとも１ヶ月後に投与されてもよい。
【０３６５】
他の実施形態では、標的化配列は、コードされたペプチドの一方または両方の末端に付着しているユビキチン化シグナルである。他の実施形態では、標的化配列は、コードされたペプチドの内部部位及び／またはどちらかの末端に結合しているユビキチン化シグナルである。したがって、ｍＲＮＡは、コンカテマーペプチドをコードするヌクレオチドの一方または両方の末端にユビキチン化シグナルをコードする核酸配列を含んでもよい。翻訳後修飾であるユビキチン化は、ユビキチンを基質標的タンパク質に結合させるプロセスである。ユビキチン化シグナルは、ペプチドの１つ以上のプロテアソームへの標的化及びプロセシングを可能にするペプチド配列である。ユビキチン化シグナルの使用によりペプチドを標的化し処理することにより、ペプチドの細胞内プロセシングは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）における抗原プロセシングをより厳密に再現し得る。
【０３６６】
ユビキチンは、真核生物のほぼ全ての組織に見られる８．５ｋＤａの調節タンパク質である。ヒトゲノムには、ユビキチンを生産する４つの遺伝子がある：ＵＢＢ、ＵＢＣ、ＵＢＡ５２、及びＲＰＳ２７Ａ。ＵＢＡ５２及びＲＰＳ２７Ａは、それぞれリボソームタンパク質Ｌ４０及びＳ２７ａに融合したユビキチンの単一コピーをコードする。ＵＢＢ及びＵＢＣ遺伝子は、ポリユビキチン前駆体タンパク質をコードする。３つの酵素によって実行されるユビキチン化への３つのステップがある。Ｅ１酵素とも呼ばれるユビキチン活性化酵素は、ユビキチンを反応状態になるように修飾する。Ｅ１は、ＡＴＰとユビキチンの両方に結合し、ユビキチンのＣ末端のアシルアデニル化を触媒する。次に、ユビキチンは、活性部位のシステイン残基に転移されてＡＭＰを放出する。最終的に、チオエステル結合が、ユビキチンのＣ末端カルボキシル基とＥ１システインスルフヒドリル基の間に形成される。ヒトゲノムにおいて、ＵＢＡ１及びＵＢＡ６は、Ｅ１酵素をコードする２つの遺伝子である。
【０３６７】
次いで、活性化されたユビキチンは、トランス（チオ）エステル化反応を介してユビキチンをＥ１からＥ２の活性部位システインに転移させる、Ｅ２ユビキチン結合酵素にかけられる。Ｅ２は、活性化ユビキチンとＥ１酵素の両方に結合する。ヒトは、ユビキチン結合触媒（ＵＢＣ）フォールドとして知られている、それらの高度に保存された構造を特徴とする３５の異なるＥ２酵素を有する。Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ユビキチン化カスケードの最終段階を容易にする。一般に、それらは標的タンパク質のリジンとユビキチンのＣ末端グリシンとの間にイソペプチド結合を形成する。何百ものＥ３リガーゼがあり；いくつかはまたＥ２酵素を活性化する。Ｅ３酵素は、系の基質認識モジュールとして機能し、Ｅ２と基質の両方と相互作用する。この酵素は、２つのドメインのうちの１つを有する：Ｅ６−ＡＰカルボキシル末端（ＨＥＣＴ）ドメインに相同なドメイン、または非常に興味深い新遺伝子（ｒｅａｌｌｙ  ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅ）（ＲＩＮＧ）ドメイン（または密接に関連したＵボックスドメイン）。偏ったチオエステル中間体が、Ｅ３の活性部位システインと形成される場合、ＨＥＣＴドメインＥ３酵素は、ユビキチンに一時的に結合するが、ＲＩＮＧドメインＥ３酵素は、Ｅ２酵素から基質への直接移動を触媒する。
【０３６８】
抗原に添加されたユビキチンの数は、処理工程の有効性を向上し得る。例えば、ポリユビキチン化では、最初のユビキチン分子がペプチドに結合した後に追加のユビキチン分子が加えられる。得られたユビキチン鎖は、ユビキチン分子のグリシン残基の、ペプチドに結合したユビキチンのリジンへの連結によって作り出される。各ユビキチンは、７つのリジン残基及びＮ末端（ユビキチン化のための部位として役立ち得る）を含む。ペプチド抗原上のリジン残基に４つ以上のユビキチン分子が結合すると、２６Ｓプロテアソームは複合体を認識し、それを内在化し、そしてタンパク質を小さなペプチドに分解する。
【０３６９】
ユビキチン野生型は、以下の配列を有する（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）：
ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＧ（配列番号１３１８）
【０３７０】
エピトープは、いくつかの実施形態では切断感受性部位によって連結されている。切断感受性部位は、酵素またはプロテアーゼによる切断を受けやすいペプチドである。これらの部位は、プロテアーゼ切断部位とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは細胞内酵素である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に見られるプロテアーゼである。したがって、プロテアーゼ切断部位は、ＡＰＣにおける多量の（高度に発現された）プロテアーゼに相当する。ＡＰＣ酵素に対して感受性である切断感受性部位は、ＡＰＣ切断感受性部位と呼ばれる。ＡＰＣで発現されるプロテアーゼとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる：システインプロテアーゼ、例えば：カテプシンＢ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＦ、カテプシンＺ、カテプシンＶ、カテプシンＯ、カテプシンＣ、及びカテプシンＫ、ならびにアスパラギン酸プロテアーゼ、例えば、カテプシンＤ、カテプシンＥ、及びアスパラギニルエンドペプチダーゼ。
【０３７１】
以下は例示的なＡＰＣ切断感受性部位である：
カテプシンＢ：Ａｒｇ−Ａｒｇ結合のカルボキシル側の開裂
カテプシンＤは、以下の優先的切断配列を有する：
【表１Ａ】
2019532657.tif 000002
ここでXaa＝任意のアミノ酸残基、疎水性＝Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、またはTyr、及び↓＝切断部位
カテプシン  H：Arg−↓−NHMec；Bz−Arg−↓−NhNap；Bz−Arg−↓NHMec；Bz−Phe−Cal−Arg−↓−NHMec；Pro−Gly−↓−Phe
カテプシン  S  及び  F：Xaa−Xaa−Val−Val−Arg−Xaa−Xaa
式中Xaa＝任意のアミノ酸残基
カテプシン  V：Z−Phe−Arg−NHMec；Z−Leu−Arg−NHMec；Z−Val−Arg−NHMec
カテプシン  O：Z−Phe−Arg−NHMec  及び  Z−Arg−Arg−NHMec
カテプシン−Ｃ  は以下の優先的な切断配列を有する:
【表１Ｂ】
2019532657.tif 000003
ここで  Xaa＝任意のアミノ酸残基  及び  ↓＝切断部位
カテプシン  E：Arg−X、Glu−X、及びArg−Arg
アスパラギニル  エンドペプチダーゼ：アスパラギン残基の後
カテプシン  Lは、以下の優先的な切断配列を有する:
【表１Ｃ】
2019532657.tif 000004
ここでXaa＝任意のアミノ酸残基、疎水性＝Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、またはTyr、芳香族＝Phe、Trp、His、またはTyr、及び↓＝切断部位
【０３７２】
いくつかの実施形態では、切断感受性部位は、カテプシンＢまたはＳ感受性部位である。例示的なカテプシンＢ感受性部位としては、限定するものではないが、配列番号２２６〜６１５に記載のものが挙げられる。例示的なカテプシンＳ感受性部位としては、限定するものではないが、配列番号６１６〜１３１３に記載のものが挙げられる。
【０３７３】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡがんワクチン及びワクチン接種方法は、１つ以上のネオエピトープ及び１つ以上の伝統的ながん抗原から構成されるコンカテマーがん抗原をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、コードされたネオエピトープに加えて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の伝統的ながん抗原をコードする。
【０３７４】
いくつかの実施形態では、コンカテマー抗原は、５〜１０個のがんペプチドエピトープをコードする。さらに他の実施形態では、コンカテマー抗原は、２５〜１００個のがんペプチドエピトープをコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡがんワクチン及びワクチン接種方法は、特定の変異に基づくエピトープまたは抗原（ネオエピトープ）及びがん−生殖細胞系遺伝子によって発現されるもの（複数の患者に見られる腫瘍に共通の抗原）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡがんワクチン及びワクチン接種方法は、１つ以上の伝統的なエピトープまたは抗原、例えば、伝統的ながんワクチンに見られる１つ以上のエピトープまたは抗原を含む。
【０３７５】
コンカテマー抗原に含めるために選択されたネオエピトープは、典型的には高親和性結合ペプチドであろう。コンカテマー構築物中のネオエピトープは、同じでも異なっていてもよく、例えば、それらは長さ、アミノ酸配列またはその両方が変化する。
【０３７６】
いくつかの実施形態では、ネオエピトープには、リンカーが点在している。
【０３７７】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、複数のネオエピトープを含むポリシストロン性ワクチン、または１つ以上の単一ｍＲＮＡワクチン、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【０３７８】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ細菌ワクチン及びワクチン接種方法は、１つ以上の細菌抗原から構成されるコンカテマー細菌抗原をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の細菌抗原をコードする。
【０３７９】
免疫増強剤ｍＲＮＡ及び目的の抗原の組成
別の態様では、本開示は、以下をコードする少なくとも１つの化学修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を含む組成物を提供する：（ｉ）目的の少なくとも１つの抗原；及び（ｉｉ）少なくとも１つのｍｍＲＮＡが対象に投与されたとき、少なくとも１つの目的の抗原に対する免疫応答を増強する少なくとも１つのポリペプチドであって、ここで前記ｍｍＲＮＡは１つ以上の修飾核酸塩基を含むポリペプチド。したがって、本開示は、少なくとも１つの免疫増強剤ｍＲＮＡ及び目的の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含む組成物を提供し、ここで単一のｍＲＮＡ構築物が目的の抗原（複数可）及び抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するポリペプチドの両方をコードしてもよいし、あるいは、この組成物は、２つ以上の別々のｍＲＮＡ構築物、第１のｍＲＮＡ及び第２のｍＲＮＡを含んでもよく、ここで、第１のｍＲＮＡは、少なくとも１つの目的の抗原をコードし、第２のｍＲＮＡは、抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする（すなわち、第２のｍＲＮＡは免疫増強剤を含む）。
【０３８０】
目的の抗原（複数可）をコードする第１のｍＲＮＡ及び目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする第２のｍＲＮＡを含む実施形態では、第１のｍＲＮＡ及び第２のｍＲＮＡを一緒に（例えば、同時投与前）共処方してもよく、例えば、同じ脂質ナノ粒子中で共処方するなどしてもよい。
【０３８１】
目的の抗原（複数可）及び目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するポリペプチドの両方をコードする単一のｍＲＮＡを含む実施形態では、このポリペプチドをコードする配列は、目的の抗原をコードする配列の上流または下流のいずれかでｍＲＮＡ構築物上に位置し得る。例えば、抗原と免疫刺激ポリペプチドの両方をコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例としては、少なくとも１つの変異体ＫＲＡＳ抗原及び構成的に活性なＳＴＩＮＧポリペプチドをコードする、例えば、配列番号１０７〜１３０のいずれかに１つ示されるアミノ酸配列をコードする構築物が挙げられる。一実施形態では、構成的に活性なＳＴＩＮＧポリペプチドは、配列番号１０７〜１１８に示されるように、構築物のＮ末端（すなわち、抗原をコードする配列の上流）に位置する。別の実施形態では、構成的に活性なＳＴＩＮＧポリペプチドは、配列番号１１９〜１３０に示されるように、構築物のＣ末端（すなわち、抗原をコードする配列の下流）に位置する。
【０３８２】
本開示の免疫増強剤ｍＲＮＡと組み合わせて使用され得る目的の抗原をコードする様々なｍＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡワクチン）を以下にさらに詳細に記載する。
【０３８３】
免疫原性細胞死誘導ｍＲＮＡ構築物
別の態様では、本開示は、ネクロトーシスまたはパイロトーシスなどの免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ構築物（例えば、ｍｍＲＮＡ）を提供する。ｍＲＮＡによって誘導される免疫原性細胞死は、細胞に対する免疫応答がインビボで刺激されるように、細胞から細胞質ゾル成分の放出をもたらす。したがって、本発明のｍＲＮＡを使用して、がんの処置における腫瘍のような目的の細胞に対するインビボでの免疫応答を刺激してもよい。免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、単独で使用されてもよいし、あるいは、免疫応答性を刺激または増強する１つ以上のさらなる因子と組み合わせて使用されてもよい。そのような追加の因子としては、Ｉ型インターフェロン産生の刺激などの適応免疫を刺激する因子、Ｔ細胞活性化もしくは初回刺激を誘導する因子、及び／または１つ以上の免疫チェックポイントを調節する因子が挙げられる。そのような追加の因子はまた、ｍＲＮＡであってもよく、あるいは、タンパク質、抗体または低分子のような異なる種類の因子であってもよい。一実施形態では、追加の因子は、本開示の１つ以上の免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物である。
【０３８４】
免疫原性細胞死は、細胞から周囲の環境への細胞内構成要素の放出をもたらし、その結果、それらの構成要素が免疫応答の刺激に利用可能になるという点で、免疫原性細胞死は、非免疫原性細胞死と識別可能である。ＡＴＰ、ＨＭＧＢ１、ＩＬ−１ａ、尿酸、ＤＮＡ断片、ヒストン及びミトコンドリア含有量を含む、「損傷関連分子パターン」またはＤＡＭＰと呼ばれる、免疫原性細胞死の間に典型的に放出される多数の細胞内構成要素が同定されている。ＤＡＭＰは、細胞外に放出されてもよいし、または特定のＤＡＭＰは、細胞の内部から細胞表面に転位する（例えば、小胞体の内腔から細胞表面に転位するカルレティキュリン）。したがって、ＤＡＭＰの放出は、免疫原性細胞死の指標として役立つ。免疫原性細胞死は、炎症誘発性サイトカインの刺激によっても特徴付けられる。
【０３８５】
免疫原性細胞死の２つのタイプは、ネクロトーシス及びパイロトーシスである。これらの種類のプログラム細胞死のそれぞれは、それらをお互いから識別し、及びプログラムされた非免疫原性細胞死の一形態であるアポトーシスから識別する特徴的な特徴を有する。アポトーシスの際立った特徴は、それがカスパーゼ依存性（例えば、イニシエーターカスパーゼ、例えば、死受容体誘導性アポトーシスについてはカスパーゼ−８及び−１０、または本質的に誘発されたアポトーシスについてはカスパーゼ−９に依存する）であり、細胞質濃縮及び細胞収縮、すなわち、原形質膜ブレブ（原形質膜の完全性の喪失ではない）、細胞内カルシウム濃度の増大、及びミトコンドリア外膜透過処理（ＭＯＭＰ）をもたらす。重要なことに、アポトーシスは、細胞内構成要素の周囲環境への放出を引き起こさず、そして免疫学的に寛容原性であると考えられる。対照的に、ネクロトーシスは、カスパーゼ活性には依存しないが、受容体相互作用タンパク質キナーゼ１（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  １）（ＲＩＰＫ１）と呼ばれるキナーゼの活性には依存する。実際、カスパーゼの活性化は、例えば、活性化されたカスパーゼ−８及び−１０がＲＩＰＫ１を不活性化するので、ネクロトーシスを阻害する。ＲＩＰＫ１が活性化されると、それはＲＩＰＫ３と相互作用してネクロソーム複合体を形成する。ネクロトーシスによる細胞死はまた、混合系統キナーゼドメイン様タンパク質（Ｍｉｘｅｄ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｄｏｍａｉｎ−Ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＬＫＬ）にも依存する。ネクロトーシスは、細胞の崩壊及びＤＡＭＰの放出を含む、原形質膜の完全性の喪失を特徴とする。パイロトーシスはまた、ＤＡＭＰの放出によっても特徴付けられるが、それがガスデルミンＤ（ＧＳＤＭＤ）、ＮＬＲファミリーピリンドメイン含有−３（ＮＬＲＰ３；クリピリンをコードする）及びカスパーゼ１、ならびにヒトではカスパーゼ４及びカスパーゼ５、及びマウスではカスパーゼ−１１に依存しており、インフラマソームの誘導につながるという点でネクロトーシスとは異なる。原形質膜の破裂及び炎症をもたらすカスパーゼ非依存性免疫原性細胞死のさらなる形態としては、ミトコンドリア透過性遷移媒介調節壊死（ＭＰＴ−ＲＮ）、フェロプトーシス、パルタナトス及びＮＥＴｏｓｉｓが挙げられる（概説については、例えば、Ｌｉｎｋｅｒｍａｎｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：７５９−７６７を参照のこと）。
【０３８６】
一実施形態では、本発明は、ネクロトーシスを誘導するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを提供する。別の実施形態では、本発明は、パイロトーシスを誘導するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを提供する。さらに他の実施形態では、本発明は、ＭＰＴ−ＲＮ、フェロプトーシス、パルタナートまたはＮＥＴｏｓｉｓを誘導するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを提供する。
【０３８７】
一実施形態では、ネクロトーシスを誘導するポリペプチドは、混合系統キナーゼドメイン様タンパク質（ＭＬＫＬ）、またはその免疫原性細胞死誘導断片である。実施例２２〜２３にさらに記載されるように、ＭＬＫＬ構築物は、ＤＡＭＰの放出を特徴とするネクロトーシスによる細胞死を誘導する。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ヒトまたはマウスＭＬＫＬのアミノ酸１〜１８０をコードする。一実施形態では、ＭＬＫＬ構築物は１つ以上のｍｉＲ結合部位を含む。一実施形態では、ＭＬＫＬ構築物は、例えば、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲ内に、ｍｉＲ１２２結合部位、ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位またはその両方の結合部位を含む。ＭＬＫＬ、またはその免疫原性細胞死誘導断片をコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、それぞれ配列番号１３２７及び１３２８に示されるアミノ配列を含むヒトまたはマウスＭＬＫＬのアミノ酸１〜１８０をコードする。
【０３８８】
別の実施形態では、ポリペプチドは、受容体相互作用タンパク質キナーゼ３（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）（ＲＩＰＫ３）、またはその免疫原性細胞死誘導断片である。実施例２４にさらに記載されるように、ＲＩＰＫ３構築物は、ネクロトーシスによる細胞死を誘導する。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、それ自体と多量体化する（ホモオリゴマー化）ＲＩＰＫ３ポリペプチドをコードする。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ＲＩＰＫ１と二量体化するＲＩＰＫ３ポリペプチドをコードする。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ＲＩＰＫ３のキナーゼドメイン及びＲＨＩＭドメインをコードする。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ＲＩＰＫ３のキナーゼドメイン、ＲＩＰＫ３のＲＨＩＭドメイン、及び２つのＦＫＢＰ（Ｆ＞Ｖ）ドメインをコードする。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ＲＩＰＫ３ポリペプチド（例えば、ＲＩＰＫ３のキナーゼドメイン及びＲＨＩＭドメインを含む）及びＩＺドメイン（例えば、ＩＺ三量体）をコードする。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ＲＩＰＫ３ポリペプチド（例えば、ＲＩＰＫ３のキナーゼドメイン及びＲＨＩＭドメインを含む）及び１つ以上のＥＥまたはＲＲドメイン（例えば、２×ＥＥドメインまたは２×ＲＲドメイン）をコードする。さらに、免疫原性細胞死を誘導するＲＩＰＫ３構築物をコードするＤＮＡ構築物の構造は、例えば、Ｙａｔｉｍ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５０：３２８−３３４またはＯｒｏｚｃｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２１：１５１１−１５２１にさらに記載されており、適切なＲＮＡ構築物の設計に使用してもよい。一実施形態では、ＲＩＰＫ３構築物は、１つ以上のｍｉＲ結合部位を含む。一実施形態では、ＲＩＰＫ３構築物は、例えば、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲ内に、ｍｉＲ１２２結合部位、ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位またはその両方の結合部位を含む。ＲＩＰＫ３またはその免疫原性細胞死誘導断片をコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１３２９〜１３４４に示される任意のアミノ酸配列を有するＯＲＦを含む。
【０３８９】
別の実施形態では、ポリペプチドは、受容体相互作用タンパク質キナーゼ１（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  １）（ＲＩＰＫ１）、またはその免疫原性細胞死誘導断片である。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ヒトまたはマウスのＲＩＰＫ１ポリペプチドのアミノ酸１〜１５５をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ＲＩＰＫ１ポリペプチド及びＩＺドメインをコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ＲＩＰＫ１ポリペプチド及びＤＭドメインをコードする。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ＲＩＰＫ１ポリペプチド及び１つ以上のＥＥまたはＲＲドメインをコードする。さらに、免疫原性細胞死を誘導するＲＩＰＫ１構築物をコードするＤＮＡ構築物の構造は、例えば、Ｙａｔｉｍ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５０：３２８−３３４またはＯｒｏｚｃｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２１：１５１１−１５２１にさらに記載されており、適切なＲＮＡ構築物の設計に使用され得る。一実施形態では、ＲＩＰＫ１構築物は、１つ以上のｍｉＲ結合部位を含む。一実施形態では、ＲＩＰＫ１構築物は、例えば、３’ＵＴＲ内または５’ＵＴＲ内に、ｍｉＲ１２２結合部位、ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位またはその両方の結合部位を含む。ＲＩＰＫ１またはその免疫原性細胞死誘導断片をコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１５８〜１６３に示される任意のアミノ酸配列を有するＯＲＦを含む。
【０３９０】
別の実施形態では、ポリペプチドは、低ｐＩを有する直接ＩＡＰ結合タンパク質（ＤＩＡＢＬＯ）（ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯとしても知られる）、またはその免疫原性細胞死誘導断片である。実施例に記載されるように、ＤＩＡＢＬＯ構築物は、細胞死及びサイトカインの放出を誘導する。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、野生型ヒトＤＩＡＢＬＯアイソフォーム１配列をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、Ｓ１２６Ｌ変異を含むヒトＤＩＡＢＬＯアイソフォーム１配列をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ヒトＤＩＡＢＬＯアイソフォーム１のアミノ酸５６〜２３９をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ヒトＤＩＡＢＬＯアイソフォーム１のアミノ酸５６〜２３９をコードし、Ｓ１２６Ｌ変異を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、野生型ヒトＤＩＡＢＬＯアイソフォーム３配列をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、Ｓ２７Ｌ変異を含むヒトＤＩＡＢＬＯアイソフォーム３配列をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ヒトＤＩＡＢＬＯアイソフォーム３のアミノ酸５６〜２４０をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ヒトＤＩＡＢＬＯアイソフォーム３のアミノ酸５６〜２４０をコードし、Ｓ２７Ｌ変異を含む。一実施形態では、ＤＩＡＢＬＯ構築物は、１つ以上のｍｉＲ結合部位を含む。一実施形態では、ＤＩＡＢＬＯ構築物は、例えば、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲ中に、ｍｉＲ１２２結合部位、ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位またはその両方の結合部位を含む。ＤＩＡＢＬＯ、またはその免疫原性細胞死誘導断片をコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１６５〜１７２に示される任意のアミノ酸配列を有するＯＲＦを含む。
【０３９１】
別の実施形態では、ポリペプチドは、ＦＡＤＤ（デスドメインを有するＦａｓ関連タンパク質）、またはその免疫原性細胞死誘導断片である。一実施形態では、ＦＡＤＤ構築物は、１つ以上のｍｉＲ結合部位を含む。一実施形態では、ＦＡＤＤ構築物は、ｍｉＲ１２２結合部位、ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位、またはその両方の結合部位を、例えば、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲに含む。ＦＡＤＤまたはその免疫原性細胞死誘導断片をコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１３４５〜１３５１に示されるアミノ酸配列のいずれかを有するＯＲＦを含む。
【０３９２】
別の実施形態では、本発明は、パイロトーシスを誘発するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを提供する。一実施形態では、ポリペプチドは、ガスデルミンＤ（ＧＳＤＭＤ）、またはその免疫原性細胞死誘導断片である。一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、野生型ヒトＧＳＤＭＤ配列をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ヒトＧＳＤＭＤのアミノ酸１〜２７５をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、ヒトＧＳＤＭＤのアミノ酸２７６〜４８４をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、野生型マウスＧＳＤＭＤをコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、マウスＧＳＤＭＤのアミノ酸１〜２７６をコードする。別の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物は、マウスＧＳＤＭＤのアミノ酸２７７〜４８７をコードする。一実施形態では、ＧＳＤＭＤ構築物は、１つ以上のｍｉＲ結合部位を含む。一実施形態では、ＧＳＤＭＤ構築物は、ｍｉＲ１２２結合部位、ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位、またはその両方の結合部位を、例えば、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲに含む。ＧＳＤＭＤまたはその免疫原性細胞死誘導断片をコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１３６７〜１３７２に示される任意のアミノ酸配列をコードする。
【０３９３】
別の実施形態では、ポリペプチドは、カスパーゼ−４もしくはカスパーゼ−５もしくはカスパーゼ−１１、またはそれらの免疫原性細胞死誘導断片である。様々な実施形態では、カスパーゼ−４、−５、または−１１構築物は、（ｉ）全長の野生型カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、またはカスパーゼ−１１；（ｉｉ）全長カスパーゼ−４、−５または−１１に加えてＩＺドメイン；（ｉｉｉ）Ｎ末端が欠失したカスパーゼ−４、−５または−１１に加えてＩＺドメイン；（ｉｖ）全長カスパーゼ−４、−５または−１１に加えてＤＭドメイン；あるいは（ｖ）Ｎ末端が欠失したカスパーゼ−４、−５または−１１に加えてＤＭドメインをコードし得る。Ｎ末端欠失型のカスパーゼ−４及びカスパーゼ−１１の例は、アミノ酸残基８１〜３７７を含む。Ｎ末端欠失型カスパーゼ−５の例は、アミノ酸残基１３７〜４３４を含む。一実施形態では、カスパーゼ−４、−５、または−１１構築物は、１つ以上のｍｉＲ結合部位を含む。一実施形態では、カスパーゼ−４、−５、または−１１構築物は、ｍｉＲ１２２結合部位、ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位、またはその両方の結合部位を、例えば、３’ＵＴＲ内または５’ＵＴＲ内に含む。カスパーゼ−４またはその免疫原性細胞死誘導断片をコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１３５２〜１３５６に示される任意のアミノ酸配列を有するＯＲＦを含む。カスパーゼ−５またはその免疫原性細胞死誘導断片をコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１３５７〜１３６１に示される任意のアミノ酸配列を有するＯＲＦを含む。カスパーゼ１１、またはその免疫原性細胞死誘導断片をコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１３６２〜１３６６に示される任意のアミノ酸配列を有するＯＲＦを含む。
【０３９４】
別の実施形態では、ポリペプチドは、ＮＬＲＰ３、またはその免疫原性細胞死誘導断片である。一実施形態では、ＮＬＲＰ３構築物は、１つ以上のｍｉＲ結合部位を含む。一実施形態では、ＮＬＲＰ３構築物は、ｍｉＲ１２２結合部位、ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位またはその両方の結合部位を、例えば、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲ内に含む。ＮＬＲＰ３またはその免疫原性細胞死誘導断片をコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１３７３または１３７４に示されるＯＲＦアミノ酸配列をコードする。
【０３９５】
別の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＡＲＤ（ＡＳＣ／ＰＹＣＡＲＤ）、またはその免疫原性細胞死誘導断片、例えば、Ｐｙｒｉｎドメインを含むアポトーシス関連スペック様タンパク質である。一実施形態では、このペプチドはＰｙｒｉｎ  Ｂ３０．２ドメインである。別の実施形態では、ポリペプチドは、Ｖ７２６Ａ変異を含むＰｙｒｉｎ  Ｂ３０．２ドメインである。一実施形態では、ＡＳＣ／ＰＹＣＡＲＤまたはＰｙｒｉｎ構築物は、１つ以上のｍｉＲ結合部位を含む。一実施形態では、ＡＳＣ／ＰＹＣＡＲＤまたはＰｙｒｉｎ構築物は、ｍｉＲ１２２結合部位、ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位、またはその両方の結合部位を、例えば、３’ＵＴＲ内または５’ＵＴＲ内に含む。Ｐｙｒｉｎ  Ｂ３０．２ドメインをコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１３７５または１３７６に示されるＯＲＦアミノ酸配列をコードする。ＡＳＣをコードするｍＲＮＡ構築物の非限定的な例は、配列番号１３７７または１３７８に示されるＯＲＦアミノ酸配列をコードする。
【０３９６】
免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードする本発明のｍＲＮＡは、炎症性反応及び／または免疫反応を刺激し、及び／または免疫応答性を調節する他の因子と組み合わせて使用されてもよい。がん細胞に対する免疫応答ががん細胞の殺傷に効果的であるためには、段階的様式で起こりそして反復的に進行して拡大することを許容されなければならない、多数の事象が記載されている。このプロセスは、がん−免疫サイクルと呼ばれてきた（例えば、Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍｅｌｌｍａｎ，Ｉ．（２０１３）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３９：１−１０を参照のこと）。これらの連続した事象は以下を含む：（ｉ）がん細胞抗原の放出；（ｉｉ）がん抗原提示（例えば、樹状細胞または他の抗原提示細胞による）；（ｉｉｉ）Ｔ細胞の初回刺激及び活性化；（ｉｖ）Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬ）の腫瘍への輸送；（ｖ）腫瘍へのＴ細胞の浸潤；（ｖｉ）Ｔ細胞によるがん細胞の認識；及び（ｖｉｉ）がん細胞を殺傷すること。
【０３９７】
したがって、本発明の別の態様は、殺傷の標的となる細胞の細胞抗原に対する免疫応答を促進または増強するために、免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードする本発明のｍＲＮＡと組み合わせて使用され得る追加の因子に関する。そのような追加の因子は、炎症性及び／または免疫応答を刺激または促進し得る。追加的または代替的に、そのような追加の因子は、例えば、免疫チェックポイントモジュレーターとして作用することによって、免疫応答性を調節し得る。さらなる因子はまた、例えば、ｍＲＮＡ構築物について本明細書に記載されるような構造的性質を有するｍＲＮＡ（例えば、本明細書に記載されるような、修飾核酸塩基、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ｍｉＲ結合部位（複数可）、ポリＡテール）であってもよい。あるいは、追加の因子は、タンパク質、抗体または低分子などの非ｍＲＮＡ因子であってもよい。
【０３９８】
一実施形態では、追加の因子は、免疫応答を増強し、例えば、適応免疫を誘導する（例えば、Ｉ型インターフェロン産生を刺激することにより）、炎症応答を刺激する、ＮＦκＢシグナル伝達を刺激する、及び／または樹状細胞（ＤＣ）動員を刺激する。一実施形態では、適応免疫を誘導する因子は、Ｉ型インターフェロンである。例えば、Ｉ型インターフェロンを含む薬学的組成物を因子として使用してもよい。あるいは、別の実施形態では、適応免疫を誘導する追加の因子は、Ｉ型インターフェロン産生を刺激する因子である。Ｉ型インターフェロン産生を刺激する因子の非限定的な例としては、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ６、ＩＲＦ７及びＩＲＦ８が挙げられる。炎症反応を刺激する因子の非限定的な例としては、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ６、ＮＦＡＴ及びＣ／ＥＢＰｂが挙げられる。ＮＦκＢシグナル伝達を刺激する因子の非限定的な例としては、ＩＫＫβ、ｃ−ＦＬＩＰ、ＲＩＰＫ１、ＩＬ−２７、ＡｐｏＦ及びＰＬＰが挙げられる。ＤＣ動員を刺激する因子の非限定的な例は、ＦＬＴ３である。免疫応答を増強するさらに別の因子は、ＤＩＡＢＬＯ（ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ）である。
【０３９９】
一実施形態では、免疫応答を増強する因子は、本開示の免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物であり、その非限定的な例としては、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＳＴＡＴ６、Ｍｙｄ８８、Ｂｔｋ（Ｅ４１Ｋ）、ＴＡＫ−ＴＡＢ１、ＤＩＡＢＬＯ（ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ）、ＴＲＡＭ（ＴＩＣＡＭ２）ポリペプチドまたは自己活性化カスパーゼ−１ポリペプチド、構成的に活性なＩＫＫβ、構成的に活性なＩＫＫα、ｃ−ＦＬＩＰ及びＲＩＰＫ１のｍＲＮＡ構築物をコードする構築物が挙げられる。
【０４００】
別の実施形態では、追加の因子は、Ｔ細胞活性化または初回刺激を誘導する。例えば、Ｔ細胞活性化または初回刺激を誘導する追加の因子は、サイトカインであっても、またはケモカインであってもよい。Ｔ細胞活性化または初回刺激を誘導するサイトカインまたはケモカインの非限定的な例としては、ＩＬ−１２、ＩＬ３６ｇ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２０及びＣＣＬ２１が挙げられる。一実施形態では、この因子は、サイトカインまたはケモカインを含む薬学的組成物である。別の実施形態では、この因子はサイトカインまたはケモカインの産生を誘導する因子である。別の実施形態では、因子はサイトカインまたはケモカインをコードするｍＲＮＡ構築物である。別の実施形態では、この因子はケモカインまたはサイトカインを誘導するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ構築物である。
【０４０１】
別の実施形態では、追加の因子は、免疫チェックポイントを調節する。ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤及びＣＴＬＡ−４阻害剤を含む様々な免疫チェックポイント阻害剤が当該分野において記載されている。免疫チェックポイントの他の調節因子は、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０ＬまたはＩＣＯＳを標的とし得る。一実施形態では、免疫チェックポイントを調節する因子は、抗体である。別の実施形態では、免疫チェックポイントを調節する因子はタンパク質または低分子モジュレーターである。別の実施形態では、この因子（ｍＲＮＡなど）は、免疫チェックポイントの抗体モジュレーターをコードする。
【０４０２】
一実施形態では、免疫チェックポイントを調節する追加の因子は、ＰＤ−１を標的とする。ＰＤ−１を標的とする免疫療法剤の非限定的な例としては、ペムブロリズマブ、アレムツズマブ、アテゾリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブ、ピジリズマブ、オフマツマブ、リツキシマブ、ＭＥＤＩ０６８０及びＰＤＲ００１、ＡＭＰ−２２４、ＰＦ−０６１０１５９１、ＢＧＢ−Ａ３１７、ＲＥＧＮ２８１０、ＳＨＲ−１２１０、ＴＳＲ−０４２、アベルマブ、デュルバルマブ及びアフィマーが挙げられる。
【０４０３】
一実施形態では、免疫チェックポイントを調節する追加の因子は、ＰＤ−Ｌ１を標的とする。ＰＤ−Ｌ１を標的とする免疫療法剤の非限定的な例としては、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）及びＢＭＳ９３６５５９が挙げられる。
【０４０４】
一実施形態では、免疫チェックポイントを調節する追加の因子は、ＣＴＬＡ−４を標的とする。ＣＴＬＡ−４を標的とする免疫療法剤の非限定的な例としては、イピリムマブ、トレメリムマブ及びＡＧＥＮ１８８４が挙げられる。
【０４０５】
一実施形態では、免疫チェックポイントを調節する追加の因子は、ＯＸ−４０またはＯＸ−４０Ｌを標的とする。一実施形態では、ＯＸ−４０またはＯＸ−４０Ｌを標的とする因子は、Ｆｃ−ＯＸ−４０ＬポリペプチドをコードするｍＲＮＡ構築物である。さらに他の実施形態では、ＯＸ−４０またはＯＸ−４０Ｌを標的とする因子は、免疫刺激アゴニスト抗ＯＸ−４０またはＯＸ−４０Ｌ抗体であり、当該技術分野で知られているその例としては、ＭＥＤＩ６４６９（アゴニスト抗ＯＸ４０抗体）及びＭＯＸＲ０９１６（アゴニスト抗ＯＸ４０抗体）が挙げられる。
【０４０６】
さらに別の実施形態では、免疫チェックポイントを調節する追加の因子は、ＩＣＯＳ経路アゴニストである。
【０４０７】
ｍＲＮＡ構築物構成要素
ｍＲＮＡは、天然または非天然に存在するｍＲＮＡであってもよい。ｍＲＮＡは、以下に記載されるように、１つ以上の修飾核酸塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドを含んでもよく、その場合、それは、「修飾ｍＲＮＡ」または「ｍｍＲＮＡ」と称され得る。本明細書中に記載されるように、「ヌクレオシド」とは、有機塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）と組み合わせた、糖分子（例えば、ペントースまたはリボース）またはその誘導体を含む化合物として定義される。本明細書において記載される場合、「ヌクレオチド」とは、リン酸塩基を含むヌクレオシドとして定義される。
【０４０８】
ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）、及び／またはコード領域（例えば、オープンリーディングフレーム）を含んでもよい。構築物において使用するための例示的な５’ＵＴＲを、配列番号２１に示す。構築物において使用するための別の例示的５’ＵＴＲを、配列番号１３２３に示す。構築物において使用するための例示的３’ＵＴＲを、配列番号２２に示す。構築物において使用するためのｍｉＲ−１２２及びｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を含む例示的な３’ＵＴＲは、配列番号２３に示される。ｍＲＮＡは、任意の適切な数の塩基対を含んでもよく、これには、数十（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００）、数百（例えば、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００）または数千（例えば、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００）の塩基対を含む。任意の数（例えば、全部、いくつか、または全くない）の核酸塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドは、置換、修飾、またはそうでなければ天然に存在しない標準的な種の類似体であってもよい。特定の実施形態では、特定の核酸塩基型の全てを修飾してもよい。
【０４０９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡは、５’キャップ構造、鎖終結ヌクレオチド、必要に応じてＫｏｚａｋ配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列としても知られる）、ステムループ、ポリＡ配列、及び／またはポリアデニル化シグナルを含んでもよい。
【０４１０】
５’キャップ構造またはキャップ種は、リンカーによって結合された２つのヌクレオシド部分を含む化合物であり、天然に存在するキャップ、天然に存在しないキャップもしくはキャップ類似体、または抗逆キャップ類似体（ＡＲＣＡ）から選択されてもよい。キャップ種は、１つ以上の修飾ヌクレオシド及び／またはリンカー部分を含んでもよい。例えば、天然のｍＲＮＡキャップは、グアニンヌクレオチド及びその５’位において三リン酸結合によって結合された７位においてメチル化されたグアニン（Ｇ）ヌクレオチド、例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（通常はｍ７ＧｐｐｐＧと書かれている）を含んでもよい。キャップ種はまた、抗逆キャップ類似体であってもよい。可能性のあるキャップ種の非限定的なリストとしては、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ、ｍ７３’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ２７，Ｏ３’ＧｐｐｐＧ、ｍ２７，Ｏ３’ＧｐｐｐｐＧ、ｍ２７，Ｏ２’ＧｐｐｐｐＧ、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ、ｍ７３’ｄｐｐｐＧ、ｍ２７，Ｏ３’ＧｐｐｐＧ、ｍ２７，Ｏ３’ＧｐｐｐｐＧ、及びｍ２７，Ｏ２’ＧｐｐｐｐＧが挙げられる。
【０４１１】
ｍＲＮＡは、代わりにまたはそれに加えて、連鎖停止ヌクレオシドを含んでもよい。例えば、連鎖停止ヌクレオシドは、それらの糖基の２’及び／または３’位で脱酸素化されたヌクレオシドを含んでもよい。そのような種としては、３’デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−デオキシウリジン、３’−デオキシシトシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミン、及び２’、３’−ジデオキヌクレオシド、例えば、２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシウリジン、２’，３’−ジデオキシシトシン、２’，３’−ジデオキシグアノシン、及び２’，３’−ジデオキシチミンが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１０３６５９号に記載されているように、例えば、３’末端での鎖停止ヌクレオチドのｍＲＮＡへの組み込みは、ｍＲＮＡの安定化を生じ得る。
【０４１２】
ｍＲＮＡは、代わりにまたはそれに加えて、ヒストンステムループなどのステムループを含んでもよい。ステムループは、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のヌクレオチド塩基対を含んでもよい。例えば、ステムループは、４、５、６、７、または８ヌクレオチド塩基対を含んでもよい。ステムループは、ｍＲＮＡの任意の領域に位置し得る。例えば、ステムループは、非翻訳領域（５’非翻訳領域または３’非翻訳領域）、コード領域、またはポリＡ配列もしくはテールの中、前または後に位置し得る。いくつかの実施形態では、ステムループは、翻訳の開始、翻訳効率、及び／または転写終結などのｍＲＮＡの１つ以上の機能（複数可）に影響を及ぼし得る。
【０４１３】
ｍＲＮＡは、代わりにまたはそれに加えて、ポリＡ配列及び／またはポリアデニル化シグナルを含んでもよい。ポリＡ配列は、アデニンヌクレオチドまたはその類似体もしくは誘導体から完全に構成されてもよいし、またはほとんど構成されてもよい。ポリＡ配列は、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に隣接して位置するテールであってもよい。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、ｍＲＮＡの核外輸送、翻訳、及び／または安定性に影響を及ぼし得る。
【０４１４】
ｍＲＮＡは、代わりにまたはそれに加えて、マイクロＲＮＡ結合部位を含んでもよい。
【０４１５】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、第１のコード領域と第２のコード領域との間の内部翻訳開始を可能にする、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含む介在配列を有するかまたは２Ａペプチドなどの自己切断ペプチドをコードする介在配列を有する、第１のコード領域及び第２のコード領域を含むバイシストロン性ｍＲＮＡである。ＩＲＥＳ配列及び２Ａペプチドは、典型的には同じベクターからの複数のタンパク質の発現を増強するために使用される。例えば、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳを含む様々なＩＲＥＳ配列が当該分野で公知でありそして利用可能であり得、そして使用されてもよい。
【０４１６】
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、自己切断ペプチドをコードする配列を含んでもよい。自己切断ペプチドは、限定するものではないが、２Ａペプチドであってもよい。様々な２Ａペプチドが当該技術分野において公知であり入手可能であり、用いられてもよく、これには、例としては、例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａペプチド、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａペプチド、及びブタテスコウイルス−１２Ａペプチドが挙げられる。２Ａペプチドは、正常なペプチド結合が２Ａペプチド配列で損なわれ、１つの翻訳事象から２つの不連続タンパク質が生じるように、いくつかのウイルスによって使用され、リボソームスキッピングによって１つの転写物から２つのタンパク質を生成する。非限定的な例として、２Ａペプチドは、タンパク質配列：ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２４）、それらの断片またはバリアントを有し得る。一実施形態では、２Ａペプチドは、最後のグリシンと最後のプロリンとの間で切断する。別の非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、タンパク質配列ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２４）の断片またはそのバリアントを有する２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよい。２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の一例は以下である：ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴ（配列番号２５）。例示的な一実施形態では、２Ａペプチドは以下の配列によってコードされる：５’−
ＴＣＣＧＧＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＣＡＡＡＡＴＴＧＴＣＡＡＡＣＡＡＡＣＴＣＴＴＡＡＣＴＴＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＡＡＡＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＴＡＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＴＣ−３’（配列番号２６）。２Ａペプチドのポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載の方法によって修飾されてもよいし、またはコドン最適化されてもよいし、及び／または当該技術分野において公知である。
【０４１７】
一実施形態では、この配列を使用して、目的の２つ以上のポリペプチドのコード領域を分離し得る。非限定的な例として、Ｆ２Ａペプチドをコードする配列は、第１のコード領域Ａと第２のコード領域Ｂとの間にあってもよい（Ａ−Ｆ２Ａｐｅｐ−Ｂ）。Ｆ２Ａペプチドの存在は、Ｆ２Ａペプチド配列の末端でグリシンとプロリンとの間の１つの長いタンパク質の開裂をもたらし（ＮＰＧＰは、開裂されてＮＰＧ及びＰをもたらす）、したがって別個のプロテインＡ（ＮＰＧで終わる、結合されたＦ２Ａペプチドの２１アミノ酸を有する）及び分離したタンパク質Ｂ（結合したＦ２Ａペプチドの１個のアミノ酸、Ｐを有する）を作り出す。同様に、他の２Ａペプチド（Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ及びＥ２Ａ）については、長いタンパク質中のペプチドの存在は、２Ａペプチド配列の末端でグリシンとプロリンの間の切断をもたらす（ＮＰＧＰは、ＮＰＧ及びＰをもたらすために切断される）。プロテインＡ及びプロテインＢは、目的の同一または異なるペプチドまたはポリペプチドであってもよい。特定の実施形態では、プロテインＡは、免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドであり、プロテインＢは、炎症性及び／または免疫応答を刺激するか、及び／または免疫応答性を調節する別のポリペプチドである（以下にさらに記載）。
【０４１８】
修飾ｍＲＮＡ
特定の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、完全に非修飾核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むが、いくつかの実施形態では本開示のｍＲＮＡは、１つ以上の修飾核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む（「修飾ｍＲＮＡ」または「ｍｍＲＮＡ」と呼ばれる）。いくつかの実施形態では、修飾ｍＲＮＡは、参照未修飾ｍＲＮＡと比較して、安定性の向上、細胞内保持、翻訳の向上、及び／またはｍＲＮＡが導入される細胞の自然免疫応答の実質的な誘導の欠如などの有用な特性を有し得る。したがって、修飾ｍＲＮＡの使用は、タンパク質産生の効率、細胞内での核酸の保持を促進し得、同様に免疫原性の低下を保有し得る。
【０４１９】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは１つ以上（例えば、１、２、３または４）の異なる修飾核酸塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上の）異なる修飾核酸塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾ｍＲＮＡは、対応する未修飾ｍＲＮＡと比較して、ｍＲＮＡが導入された細胞内では分解が低下している場合がある。
【０４２０】
いくつかの実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたウラシルである。例示的な核酸塩基及びヌクレオシド（修飾されたウラシルを有する）としては、シュードウリジン（Ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有する）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−シュードウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン（ｍ３Ψ）、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２���）、α−チオ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル−シュードウリジン（Ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、及び５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、及び５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）］ウリジンが挙げられる。
【０４２１】
いくつかの実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたシトシンである。例示的な核酸塩基及びヌクレオシド（修飾されたシトシンを有する）としては、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α−チオ−シチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−アラ−シチジン、２’−Ｆ−シチジン、及び２’−ＯＨ−アラ−シチジンが挙げられる。
【０４２２】
いくつかの実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたアデニンである。例示的な核酸塩基及びヌクレオシド（修飾されたアデニンを有する）としては、α−チオ−アデノシン、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシニルカルバモイル−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、α−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸塩）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’−Ｆ−アラ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラ−アデノシン、及びＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル）−アデノシンが挙げられる。
【０４２３】
いくつかの実施形態では、修飾された核酸塩基とは、修飾されたグアニンである。例示的な核酸塩基及びヌクレオシド（修飾されたグアニンを有する）としては、α−チオ−グアノシン、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯｈｙＷ）、不完全修飾型ヒドロキシワイブトシン（ＯｈｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、キューオシン（Ｑ）、エポキシキューオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−キューオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−キューオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ），６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ１Ｉｍ）、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸塩）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオ−グアノシン、Ｏ６−メチル−グアノシン、２’−Ｆ−アラ−グアノシン、及び２’−Ｆ−グアノシンが挙げられる。
【０４２４】
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、１つ以上の前述の修飾核酸塩基の組み合わせ（例えば、２つ、３つまたは４つの前述の修飾核酸塩基の組み合わせ）を含む。
【０４２５】
いくつかの実施形態では、修飾された核酸塩基は、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、または２’−Ｏ−メチルウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、１つ以上の上述の修飾された核酸塩基の組み合わせ（例えば、上述の修飾された核酸塩基のうち２、３または４つの組み合わせ）を包含する。いくつかの実施形態では、修飾された核酸塩基は、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）であり、本開示のｍＲＮＡは、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）で完全に修飾される。いくつかの実施形態では、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）は、ｍＲＮＡ中の７５〜１００％のウラシルに相当する。いくつかの実施形態では、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）は、ｍＲＮＡ中の１００％のウラシルに相当する。
【０４２６】
いくつかの実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたシトシンである。例示的な核酸塩基及びヌクレオシド（修飾されたシトシンを有する）としては、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジンが挙げられる。いくつかの実施形態では、開示のｍＲＮＡとしては、上述の修飾された核酸塩基のうちの１つ以上の組み合わせ（例えば、上述の修飾された核酸塩基の２、３、または４つの組み合わせ）が挙げられる。
【０４２７】
いくつかの実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたアデニンである。例示的な核酸塩基及びヌクレオシド（修飾されたアデニンを有する）としては、７−デアザ−アデニン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、１つ以上の上述の修飾された核酸塩基の組み合わせ（例えば、上述の修飾された核酸塩基の２、３または４つの組み合わせ）が挙げられる。
【０４２８】
いくつかの実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたグアニンである。例示的な核酸塩基及びヌクレオシド（修飾されたグアニンを有する）としては、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７−デアザ−グアノシン、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシンが挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡとしては、上述の修飾された核酸塩基の１つ以上の組み合わせ（例えば、上述の修飾された核酸塩基の２、３または４つの組み合わせ）が挙げられる。
【０４２９】
いくつかの実施形態では、修飾された核酸塩基は、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（Ψ）、α−チオ−グアノシン、またはα−チオ−アデノシンである。いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡとしては、上述の修飾された核酸塩基の１つ以上の組み合わせ（例えば、上述の修飾された核酸塩基の２、３または４つの組み合わせ）が挙げられる。
【０４３０】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、シュードウリジン（Ψ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、シュードウリジン（Ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、２−チオウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
【０４３１】
特定の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、特定の修飾について均一に修飾されている（すなわち、完全に修飾された、配列全体にわたって修飾されている）。例えば、ｍＲＮＡは、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）で均一に修飾されてもよく、このことは、ｍＲＮＡ配列中の全てのシトシン残基が、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）で置き換えられていることを意味する。同様に、本開示のｍＲＮＡは、上記で示される残基のような修飾された残基との置換によって、配列中に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について均一に修飾され得る。
【０４３２】
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、コード領域（例えば、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム）において修飾され得る。他の実施形態では、ｍＲＮＡは、コード領域以外の領域で修飾されていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、５’−ＵＴＲ及び／または３’−ＵＴＲが提供され、ここで一方または両方は、独立して１つ以上の異なるヌクレオシド修飾を含んでもよい。そのような実施形態では、ヌクレオシド修飾はまたコード領域にも存在し得る。
【０４３３】
本開示のｍｍＲＮＡ中に存在し得る、ヌクレオシド修飾及びそれらの組み合わせの例としては、限定するものではないが、ＰＣＴ特許出願公開：ＷＯ２０１２０４５０７５、ＷＯ２０１４０８１５０７、ＷＯ２０１４０９３９２４、ＷＯ２０１４１６４２５３、及びＷＯ２０１４１５９８１３に記載されるものが挙げられる。
【０４３４】
本開示のｍｍＲＮＡは、糖、核酸塩基、及び／またはヌクレオシド間結合に対する修飾の組み合わせを含み得る。これらの組み合わせは、本明細書に記載の任意の１つ以上の改変を含み得る。
【０４３５】
修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオシドの組み合わせの例を、以下の表１及び表２に提供する。修飾ヌクレオチドのこれらの組み合わせを用いて、本開示のｍｍＲＮＡを形成し得る。特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、本開示のｍＲＮＡの天然ヌクレオチドと部分的にまたは完全に置換され得る。非限定的な例として、天然のヌクレオチドウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドで置換されていてもよい。別の非限定的な例では、天然ヌクレオシドウリジンは、本明細書に開示されている修飾ヌクレオシドの少なくとも１つによって部分的に置換されていてもよい（例えば、約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９．９％の天然ウリジン）。
【表１−１】
2019532657.tif 000005
【表１−２】
2019532657.tif 000006
【表１−３】
2019532657.tif 000007
【表２−１】
2019532657.tif 000008
【表２−２】
2019532657.tif 000009
【表２−３】
2019532657.tif 000010
【表２−４】
2019532657.tif 000011
【表２−５】
2019532657.tif 000012
【表２−６】
2019532657.tif 000013
【表２−７】
2019532657.tif 000014
【表２−８】
2019532657.tif 000015
【０４３６】
本開示に従って、本開示のポリヌクレオチドは、表１または表２の組み合わせまたは単一の修飾を含むように合成され得る。
【０４３７】
単一の修飾が列挙されている場合、列挙されているヌクレオシドまたはヌクレオチドは、修飾されているＡ、Ｕ、ＧまたはＣのヌクレオチドまたはヌクレオシドの１００パーセントに相当する。割合が列挙されている場合、これらは存在するＡ、Ｕ、ＧまたはＣ三リン酸の総量のうちのその特定のＡ、Ｕ、ＧまたはＣ核酸塩基三リン酸の割合を表す。例えば、２５％の５−アミノアリル−ＣＴＰ＋７５％のＣＴＰ／２５％の５−メトキシ−ＵＴＰ＋７５％のＵＴＰの組み合わせとは、２５％のシトシン三リン酸が、５−アミノアリル−ＣＴＰであり、一方で７５％のシトシンがＣＴＰであるポリヌクレオチドを指す；一方、ウラシルの２５％が５−メトキシＵＴＰであり、一方でウラシルの７５％はＵＴＰである。修飾されたＵＴＰが列挙されていない場合には、天然に存在するＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ及び／またはＣＴＰが、ポリヌクレオチド中に見出されるそれらのヌクレオチドの部位の１００％で使用される。この例では、全てのＧＴＰ及びＡＴＰヌクレオチドが未修飾のままである。
【０４３８】
本開示のｍＲＮＡ、またはその領域は、コドン最適化されていてもよい。コドン最適化法は、当該技術分野において公知であり、以下の種々の目的に有用であり得る：適切な折り畳みを保証するための宿主生物におけるコドン頻度の一致、ｍＲＮＡ安定性の向上または二次構造の低減のためのバイアスＧＣ含量、遺伝子構築または発現を障害し得る、タンデムリピートコドンまたはベースランを最小化する、転写及び翻訳制御領域をカスタマイズする、タンパク質輸送配列を挿入または除去する、コードされたタンパク質中の翻訳後修飾部位の除去／追加（例えば、グリコシル化部位）、タンパク質ドメインを追加、除去またはシャッフルする、制限部位の挿入または削除、リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾する、翻訳速度を調節してタンパク質の種々のドメインが適切に折り畳まれることを可能にするか、またはポリヌクレオチド内の問題の二次構造を減少もしくは排除する。コドン最適化ツール、アルゴリズム及びサービスは、当該技術分野において公知であり；非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）のサービス、及び／または独自の方法が挙げられる。一実施形態では、ｍＲＮＡ配列は、例えば、哺乳動物細胞における発現を最適化するため、またはｍＲＮＡの安定性を高めるために、最適化アルゴリズムを使用して最適化される。
【０４３９】
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の任意のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
【０４４０】
本開示のｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）及び合成方法を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において利用可能な手段によって産生され得る。酵素的（ＩＶＴ）、固相、液相、複合合成法、小領域合成、及び連結法を利用してもよい。一実施形態では、ｍＲＮＡは、ＩＶＴ酵素合成法を用いて作製される。ＩＶＴによるポリヌクレオチドの製造方法は当該技術分野において公知であり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／３００６２に記載されている。したがって、本開示はまた、本明細書に記載のｍＲＮＡをインビトロ転写するために使用され得るポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）、構築物（例えば、プラスミド）及びベクター（例えば、ウイルスベクター）を含む。
【０４４１】
合成中または合成後に、非天然修飾核酸塩基をポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡに導入してもよい。特定の実施形態では、修飾は、ヌクレオシド間結合、プリンもしくはピリミジン塩基、または糖にあってもよい。特定の実施形態では、修飾は、ポリヌクレオチド鎖の末端に導入しても、またはポリヌクレオチド鎖内の他のどこかに導入してもよい（化学合成によるかまたはポリメラーゼ酵素による）。修飾された核酸及びそれらの合成の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９号に開示されている。修飾ポリヌクレオチドの合成はまた、Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｅｒｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．７６，９９−１３４（１９９８）にも記載される。
【０４４２】
酵素的または化学的ライゲーション方法のいずれかを使用して、標的化剤または送達剤、蛍光標識、液体、ナノ粒子などのような、異なる機能部分とポリヌクレオチドまたはそれらの領域とをコンジュゲートさせてもよい。ポリヌクレオチド及び修飾ポリヌクレオチドのコンジュゲートは、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１（３），１６５〜１８７（１９９０）に概説されている。
【０４４３】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
本開示のポリヌクレオチドは、調節エレメント、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列及び／またはモチーフ、内因性核酸結合分子に対するシュード受容体として作用するように設計された人工結合部位、及びそれらの組み合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態では、そのような調節エレメントを含むポリヌクレオチドは、「センサー配列」を含むと称される。センサー配列の非限定的な例は、その内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０２００２６１号に記載されている。
【０４４４】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、さらに１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の包含もしくは組込みは、天然に存在するｍｉＲＮＡの組織特異的及び／または細胞型特異的な発現に基づいて、本開示のポリヌクレオチド、そして今度は、それからコードされるポリペプチドの調節を提供する。
【０４４５】
ｍｉＲＮＡ、例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡは、ポリヌクレオチドに結合し、安定性を低下させることによってまたはポリヌクレオチドの翻訳を阻害することによって、遺伝子発現を下方制御する１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち成熟ｍｉＲＮＡの２〜８位の領域内の配列を含む。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの２〜８位または２〜７位を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含んでもよく、ここで対応するｍｉＲＮＡ結合部位内のシード相補的部位には、ｍｉＲＮＡ位置１とは反対側のアデノシン（Ａ）が隣接している。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含んでもよく、ここで対応するｍｉＲＮＡ結合部位内のシード相補的部位には、ｍｉＲＮＡ位置１とは反対側のアデノシン（Ａ）が隣接している。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ  Ａ，Ｆａｒｈ  ＫＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ  Ｐ，Ｌｉｍ  ＬＰ，Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ；Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２００７  Ｊｕｌ  ６；２７（１）：９１−１０５を参照のこと。標的細胞または組織のｍｉＲＮＡプロファイリングは、細胞または組織中のｍｉＲＮＡの有無を決定するために行われ得る。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、１つ以上のマイクロＲＮＡ結合部位、マイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ相補的配列、またはマイクロＲＮＡシード相補的配列を含む。そのような配列は、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２００５／０２６１２１８号及び米国特許出願公開第２００５／００５９００５号に教示されているものなどの任意の既知のマイクロＲＮＡに相当し得、例えば、それに対する相補性を有し得る。
【０４４６】
本明細書中で使用される場合、「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」という用語は、ｍｉＲＮＡと相互作用、会合または結合するためにｍｉＲＮＡの全部または領域に対する十分な相補性を有する、ポリヌクレオチド内、例えば、ＤＮＡ内またはＲＮＡ転写物内の配列（５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ中を含む）を指す。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドをコードするＯＲＦを含む本開示のポリヌクレオチドは、さらに１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。例示的な実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。
【０４４７】
ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介調節、例えば、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介の翻訳抑制または分解を促進するのに十分な程度の相補性を指す。本開示の例示的な態様では、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介性分解、例えば、ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡ誘導型ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断を促進するのに十分な程度の相補性を指す。ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、１９〜２５ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列、１９〜２３ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列、または２２ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列に対して相補性を有し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部分のみに対して、例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列の全長の１、２、３、または４ヌクレオチド未満の部分に対して相補性であり得る。所望の調節がｍＲＮＡ分解である場合、全もしくは完全相補性（例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡの長さの全部もしくはかなりの部分にわたる全相補性、または完全相補性）が好ましい。
【０４４８】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列と相補性（例えば、部分的または完全相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と相補性（例えば、部分的または完全相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有するが、１、２、または３個のヌクレオチド置換、末端付加、及び／または切断がある。
【０４４９】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと同じ長さである。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端またはその両方において対応するｍｉＲＮＡよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチド（複数可）短い。さらに他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、またはその両方において、対応するマイクロＲＮＡよりも２ヌクレオチド短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位は依然として、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を組み込んでいるｍＲＮＡを分解するか、またはｍＲＮＡの翻訳を妨げ得る。
【０４５０】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、活性ＲＩＳＣ含有Ｄｉｃｅｒの一部である対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態では、ＲＩＳＣ中の対応するｍｉＲＮＡへのｍｉＲＮＡ結合部位の結合は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡを分解するか、またはｍＲＮＡが翻訳されるのを妨げる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有し、その結果、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドを切断する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、不完全な相補性を有し、その結果、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体がｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドの不安定性を誘発する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、不完全な相補性を有し、その結果、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体がｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドの転写を抑制する。
【０４５１】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のミスマッチ（複数可）を有する。
【０４５２】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡのそれぞれ、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の連続ヌクレオチドに対して相補的な、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の連続ヌクレオチドを有する。
【０４５３】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリヌクレオチドに操作することによって、問題のｍｉＲＮＡが利用可能であるという条件下で、ポリヌクレオチドを分解または翻訳の減少の標的とし得る。これは、ポリヌクレオチドの送達に対するオフターゲット効果を減少し得る。例えば、本開示のポリヌクレオチドが組織または細胞に送達されることを意図しないが、最終的に前記組織または細胞であるならば、ｍｉＲＮＡの１つまたは複数の結合部位が、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに操作される場合、組織または細胞に豊富に存在するｍｉＲＮＡは、目的の遺伝子の発現を阻害し得る。
【０４５４】
逆に、特定の組織におけるタンパク質発現を増大させるために、それらが天然に存在するポリヌクレオチド配列からｍｉＲＮＡ結合部位を除去し得る。例えば、特定のｍｉＲＮＡの結合部位をポリヌクレオチドから除去して、ｍｉＲＮＡを含む組織または細胞におけるタンパク質発現を改善し得る。
【０４５５】
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、細胞傷害性または細胞保護性ｍＲＮＡ治療薬を、限定するものではないが、正常細胞及び／または癌性細胞などの特定の細胞に調節するために、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、５’−ＵＴＲ及び／または３’−ＵＴＲ内に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含み、細胞傷害性または細胞保護性ｍＲＮＡ治療薬を、限定されるものではないが、正常細胞及び／または癌性細胞などの特定の細胞に調節してもよい。
【０４５６】
複数の組織における発現の調節は、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、１つ以上の異なるｍｉＲＮＡ結合部位の導入または除去によって達成され得る。ｍｉＲＮＡ結合部位を除去するかまたは挿入するかの決定は、ｍｉＲＮＡ発現パターン及び／または発生中の組織及び／または細胞及び／または疾患におけるそれらのプロファイリングに基づいて行ってもよい。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、ならびにそれらの発現パターン及び生物学における役割の同定が報告されている（例えば、Ｂｏｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２０１０  １１：９４３−９４９；Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ａｎｄ  Ｒａｏ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０１２  ２６：４０４−４１３（２０１１  Ｄｅｃ  ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；Ｂａｒｔｅｌ  Ｃｅｌｌ  ２００９  １３６：２１５−２３３；Ｌａｎｄｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００７  １２９：１４０１−１４１４；Ｇｅｎｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２  ８０：３９３−４０３及びその中の全ての引用文献；それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０４５７】
ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ結合部位は、その各々が、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０２００２６１号、同第２００５／０２６１２１８号、及び同第２００５／００５９００５号に記載されている非限定的な例を含む、任意の公知の配列に相当し得る。
【０４５８】
ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡを調節し、それによってタンパク質発現を調節することが公知である組織の例としては、限定するものではないが、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が挙げられる。
【０４５９】
具体的には、ｍｉＲＮＡは、免疫細胞（造血細胞とも呼ばれる）、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞及びマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞などにおいて示差的に発現されることが公知である。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子治療及び組織／臓器移植後の望ましくない免疫応答に関与している。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡはまた、造血細胞（免疫細胞）の発生、増殖、分化及びアポトーシスの多くの態様を調節する。例えば、ｍｉＲ−１４２及びｍｉＲ−１４６は、免疫細胞において排他的に発現され、特に骨髄性樹状細胞において豊富に発現される。ポリヌクレオチドに対する免疫応答は、ｍｉＲ−１４２結合部位をポリヌクレオチドの３’−ＵＴＲに付加することによって遮断され得、組織及び細胞におけるより安定な遺伝子導入を可能にすることが実証されている。ｍｉＲ−１４２は、抗原提示細胞中の外因性ポリヌクレオチドを効率的に分解し、そして形質導入細胞の細胞毒性除去を抑制する（例えば、各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｎｏｎｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，５１５２−５１６１；Ｂｒｏｗｎ  ＢＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  ｍｅｄ．２００６，１２（５），５８５〜５９１；Ｂｒｏｗｎ  ＢＤ，ｅｔ  ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０（１３）：４１４４〜４１５２を参照のこと）。
【０４６０】
抗原媒介免疫応答は、外来抗原によって引き起こされる免疫応答を指す場合があり、それは、生物に入ると、抗原提示細胞によって処理され、抗原提示細胞の表面に表示される。Ｔ細胞は、提示された抗原を認識し、そして抗原を発現する細胞の細胞傷害性除去を誘導し得る。
【０４６１】
本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲへのｍｉＲ−１４２結合部位の導入は、ｍｉＲ−１４２媒介分解を通して抗原提示細胞における遺伝子発現を選択的に抑制し、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）における抗原提示を制限し、それによって、ポリヌクレオチドの送達後、抗原媒介性免疫応答を妨げる。次いで、ポリヌクレオチドは、細胞傷害性排除を引き起こすことなく、標的組織または細胞において安定的に発現される。
【０４６２】
一実施形態では、免疫細胞、特に抗原提示細胞において発現されることが知られているｍｉＲＮＡの結合部位を、ｍｉＲＮＡ媒介ＲＮＡ分解を通じて抗原提示細胞におけるポリヌクレオチドの発現を抑制するために本開示のポリヌクレオチドに操作してもよく、抗原媒介性の免疫応答を抑制する。ポリヌクレオチドの発現は、免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡが発現されていない非免疫細胞において維持される。例えば、いくつかの実施形態では、肝臓特異的タンパク質に対する免疫原性反応を防ぐために、任意のｍｉＲ−１２２結合部位を除去してもよく、ｍｉＲ−１４２（及び／またはｍｉｒＲ−１４６）結合部位を、本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに操作してもよい。
【０４６３】
ＡＰＣ及びマクロファージにおける選択的分解及び抑制をさらに駆動するために、本開示のポリヌクレオチドは、単独で、またはｍｉＲ−１４２及び／またはｍｉＲ−１４６の結合部位と組み合わせて、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲにさらなる負の調節エレメントを含んでもよい。非限定的な例として、さらなる負の調節エレメントは、構成的減衰エレメント（Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ｄｅｃａｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＣＤＥ）である。
【０４６４】
免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡとしては、限定するものではないが、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｈｓａ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１１８４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−−１−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２−−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７９、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４７ａ、ｍｉＲ−１４７ｂ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ｂ、ｍｉＲ−１５５−３ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１６−１−３ｐ、ｍｉＲ−１６−２−３ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１９７−３ｐ、ｍｉＲ−１９７−５ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−２２３−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−１−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−２９０９、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３３１−５ｐ、ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｍｉＲ−３３９−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−３ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７７−３ｐ、ｍｉＲ−３７７−５ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、ｍｉＲ−５４２、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｊ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｍｉＲ−５９８、ｍｉＲ−７１８、ｍｉＲ−９３５、ｍｉＲ−９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが挙げられる。さらに、新規なｍｉＲＮＡは、マイクロアレイハイブリダイゼーション及びマイクロトーム分析を通じて免疫細胞において特定され得る（例えば、Ｊｉｍａ  ＤＤ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：ｅ１１８−ｅ１２７；Ｖａｚ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１，２８８，その各々の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０４６５】
肝臓で発現されることが知られているｍｉＲＮＡとしては、限定するものではないが、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｍｉＲ−１２２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２２８−５ｐ、ｍｉＲ−１２４９、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１３０３、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−５５７、ｍｉＲ−５８１、ｍｉＲ−９３９−３ｐ、及びｍｉＲ−９３９−５ｐが挙げられる。肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を調節するために、任意の肝臓特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本開示のポリヌクレオチドに導入してもよいし、またはそこから除去してもよい。肝臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドにおいて、単独で、またはさらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作され得る。
【０４６６】
肺で発現されることが知られているｍｉＲＮＡとしては、限定するものではないが、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３２−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−５ｐ、ｍｉＲ−３８１−３ｐ、及びｍｉＲ−３８１−５ｐが挙げられる。肺におけるポリヌクレオチドの発現を調節するために、任意の肺特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本開示のポリヌクレオチドに導入してもよいし、またはそこから除去してもよい。肺特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、またはさらに本開示のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作してもよい。
【０４６７】
心臓で発現されることが知られているｍｉＲＮＡとしては、限定するものではないが、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１８６−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７４４−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが挙げられる。心臓におけるポリヌクレオチドの発現を調節するために、任意の心臓特異的マイクロＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本開示のポリヌクレオチドに導入してもよいし、またはそこから除去してもよい。心臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドにおいて、単独で、またはさらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作してもよい。
【０４６８】
神経系で発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとしては、限定するものではないが、ｍｉＲ−１２４−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７１−３ｐ、ｍｉＲ−１２７１−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１８１ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ａ、ｍｉＲ−１９０ｂ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３６６６、ｍｉＲ−３８０−３ｐ、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４２５−３ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｍｉＲ−４５４−５ｐ、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−５１０、ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５７１、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−８０２、ｍｉＲ−９２２、ｍｉＲ−９−３ｐ、及びｍｉＲ−９−５ｐが挙げられる。神経系で豊富なｍｉＲＮＡとしてはさらに、限定するものではないが、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−３２０ｅ、ｍｉＲ−３２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−９２２を含むニューロンで特異的に発現されるｍｉＲＮＡ、ならびに限定するものではないが、ｍｉＲ−１２５０、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０６５−３ｐ、ｍｉＲ−３０６５−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−５ｐ、及びｍｉＲ−６５７を含むグリア細胞で特異的に発現されるｍｉＲＮＡが挙げられる。任意のＣＮＳ特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、神経系におけるポリヌクレオチドの発現を調節するための本開示のポリヌクレオチドに導入してもよいし、またはそこから除去してもよい。神経系特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で操作されてもよいし、またはさらに本開示のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作されてもよい。
【０４６９】
膵臓で発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとしては、限定するものではないが、ｍｉＲ−１０５−３ｐ、ｍｉＲ−１０５−５ｐ、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１９５−３ｐ、ｍｉＲ−１９５−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、及びｍｉＲ−９４４が挙げられる。任意の膵臓特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、膵臓におけるポリヌクレオチドの発現を調節するために、本開示のポリヌクレオチドに導入してもよいし、またはそこから除去してもよい。膵臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で操作されてもよいし、またはさらに本開示のポリヌクレオチドにおいて免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作されてもよい。
【０４７０】
腎臓で発現されることが知られているｍｉＲＮＡとしては、限定するものではないが、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、及びｍｉＲ−５６２が挙げられる。腎臓におけるポリヌクレオチドの発現を調節するために、任意の腎臓特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本開示のポリヌクレオチドに導入してもよいし、またはそこから除去してもよい。腎臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、またはさらに本開示のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作してもよい。
【０４７１】
筋肉内で発現されることが公知であるｍｉＲＮＡとしては、限定するものではないが、ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２８６、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、及びｍｉＲ−２５−５ｐが挙げられる。筋肉内のポリヌクレオチドの発現を調節するために、任意の筋肉特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本開示のポリヌクレオチドに導入してもよいし、またはそこから除去してもよい。筋肉特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で操作されてもよいし、またはさらに本開示のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作されてもよい。
【０４７２】
ｍｉＲＮＡはまた、限定するものではないが、内皮細胞、上皮細胞、及び脂肪細胞などの、異なる種類の細胞において示差的に発現される。
【０４７３】
内皮細胞において発現されることが知られているｍｉＲＮＡとしては、限定するものではないが、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１００−３ｐ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｍｉＲ−１０１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２３６−３ｐ、ｍｉＲ−１２３６−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−２２２−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３６１−３ｐ、ｍｉＲ−３６１−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２４−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−１−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−２−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが挙げられる。多くの新規なｍｉＲＮＡが、ディープシーケンシング分析から内皮細胞において発見されている（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｏｅｌｌｅｎｋｌｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，２０１２，１８、４７２−４８４）。任意の内皮細胞特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、内皮細胞におけるポリヌクレオチドの発現を調節するために、本開示のポリヌクレオチドに導入してもよいし、またはそこから除去してもよい。
【０４７４】
上皮細胞において発現されることが知られているｍｉＲＮＡとしては、限定するものではないが、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−８０２及びｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−４４９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４４９ｂ−５ｐ（呼吸器繊毛上皮細胞に特異的）、ｌｅｔ−７ファミリー、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１２６（肺上皮細胞に特異的）、ｍｉＲ−３８２−３ｐ、ｍｉＲ−３８２−５ｐ（腎臓上皮細胞に特異的）、及びｍｉＲ−７６２（角膜上皮細胞に特異的）が挙げられる。任意の上皮細胞特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、上皮細胞におけるポリヌクレオチドの発現を調節するために、本開示のポリヌクレオチドに導入してもよいし、またはそこから除去してもよい。
【０４７５】
さらに、ｍｉＲＮＡの大集団が胚性幹細胞に富んでおり、幹細胞の自己複製、ならびに神経細胞、心臓、造血細胞、皮膚細胞、骨形成原細胞及び筋肉細胞などの様々な細胞系列の発達及び／または分化を制御する（例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ  ＫＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１３，１３（５），７５７−７６４；Ｖｉｄｉｇａｌ  ＪＡ  ａｎｄ  Ｖｅｎｔｕｒａ  Ａ，Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．２０１２，２２（５−６），４２８−４３６；Ｇｏｆｆ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２；Ｍｏｒｉｎ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０−６２１；Ｙｏｏ  ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ−Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２０１２，２１（１１），２０４９−２０５７（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。胚性幹細胞で豊富なｍｉＲＮＡとしては限定するものではないが、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ７ｄ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−１３８−１−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−２−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−１５４−３ｐ、ｍｉＲ−１５４−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２９０、ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｅ、ｍｉＲ−３６７−３ｐ、ｍｉＲ−３６７−５ｐ、ｍｉＲ−３６９−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｅ、ｍｉＲ−５４８ｆ、ｍｉＲ−５４８ｇ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｋ、ｍｉＲ−５４８ｌ、ｍｉＲ−５４８ｍ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５４８ｏ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｏ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７６６−３ｐ、ｍｉＲ−７６６−５ｐ、ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｍｉＲ−９３−３ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−９６−３ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ及びｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが挙げられる。多くの予測される新規のｍｉＲＮＡが、ヒト胚性幹細胞におけるディープシーケンシングによって発見される（例えば、それぞれの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｉｎ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０−６２１；Ｇｏｆｆ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２；Ｂａｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，２００８，２６，２４９６−２５０５）。
【０４７６】
一実施形態では、胚性幹細胞特異的ｍｉＲＮＡの結合部位は、胚性幹細胞の発生及び／または分化を調節するために、変性条件（例えば、変性疾患）で幹細胞の老化を抑制するために、または疾患条件（例えば、がん幹細胞）において幹細胞の老化及びアポトーシスを刺激するために、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに含まれてもよいし、またはそこから除去されてもよい。
【０４７７】
様々ながん細胞／組織及び他の疾患におけるｍｉＲＮＡの示差的発現をプロファイルするために、多くのｍｉＲＮＡ発現研究が行われている。いくつかのｍｉＲＮＡは、特定のがん細胞で異常に過剰発現され、他のものは過小発現されている。例えば、ｍｉＲＮＡは、がん細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＵＳ２０１３／００５９０１５号、ＵＳ２０１３／００４２３３３号、ＷＯ２０１１／１５７２９４）；がん幹細胞（ＵＳ２０１２／００５３２２４号）；膵臓のがん及び疾患（ＵＳ２００９／０１３１３４８号、ＵＳ２０１１／０１７１６４６号、ＵＳ２０１０／０２８６２３２号、ＵＳ８３８９２１０号）；喘息及び炎症（ＵＳ８４１５０９６号）；膵臓癌（ＵＳ２０１３／００５３２６４号）；肝細胞癌（ＷＯ２０１２／１５１２１２、ＵＳ２０１２／０３２９６７２号、ＷＯ２００８／０５４８２８、ＵＳ８２５２５３８号）；肺癌細胞（ＷＯ２０１１／０７６１４３、ＷＯ２０１３／０３３６４０、ＷＯ２００９／０７０６５３、ＵＳ２０１０／０３２３３５７号）；癌性Ｔ細胞リンパ腫（ＷＯ２０１３／０１１３７８）；結腸直腸癌細胞（ＷＯ２０１１／０２８１７５６、ＷＯ２０１１／０７６１４２）；癌陽性リンパ節（ＷＯ２００９／１００４３０、ＵＳ２００９／０２６３８０３号）；鼻咽頭癌（ＥＰ２１１２２３５号）；慢性閉塞性肺疾患（ＵＳ２０１２／０２６４６２６号、ＵＳ２０１３／００５３２６３号）；甲状腺癌（ＷＯ２０１３／０６６６７８）；卵巣癌細胞（ＵＳ２０１２／０３０９６４５号、ＷＯ２０１１／０９５６２３）；乳癌細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＷＯ２００７／０８１７４０、ＵＳ２０１２／０２１４６９９号）、白血病及びリンパ腫（ＷＯ２００８／０７３９１５、ＵＳ２００９／００９２９７４号、ＵＳ２０１２／０３１６０８１号、ＵＳ２０１２／０２８３３１０号、ＷＯ２０１０／０１８５６３）において示差的に発現され、その各々の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０４７８】
非限定的な例として、特定のがん及び／または腫瘍細胞において過剰発現されるｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ結合部位を、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲから除去して、がん細胞において過剰発現されたｍｉＲＮＡによって抑制された発現を回復させ、これによって、対応する生物学的機能、例えば、転写刺激及び／または抑制、細胞周期停止、アポトーシス及び細胞死を改善する。ｍｉＲＮＡの発現がアップレギュレートされていない正常な細胞及び組織は、影響を受けないままである。
【０４７９】
ｍｉＲＮＡはまた、血管新生などの複雑な生物学的プロセス（例えば、ｍｉＲ−１３２）を調節し得る（Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６）。本開示のポリヌクレオチドにおいて、そのようなプロセスに関与するｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドの発現を生物学的に関連する細胞型または関連する生物学的プロセスに合わせるために除去されても、または導入されてもよい。これに関連して、本開示のポリヌクレオチドは、栄養要求性ポリヌクレオチドとして定義される。
【０４８０】
いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドの治療ウィンドウ及び／または示差的発現（例えば、組織特異的発現）は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡへのｍｉＲＮＡ結合部位の組み込みによって改変され得る。一例では、ｍＲＮＡは、１つの組織型において別の組織型と比較してより高い発現を有するｍｉＲＮＡによって結合される１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含んでもよい。別の例では、ｍＲＮＡは、同じ起源の組織の非癌性細胞と比較して、がん細胞においてより低い発現を有するｍｉＲＮＡによって結合される１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含んでもよい。低レベルのそのようなｍｉＲＮＡを発現するがん細胞中に存在する場合、ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、典型的には発現の増大を示すであろう。
【０４８１】
肝癌細胞（例えば、肝細胞癌細胞）は、通常、正常な肝細胞と比較して低レベルのｍｉＲ−１２２を発現する。したがって、少なくとも１つのｍｉＲ−１２２結合部位を含むポリペプチドをコードするｍＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ内）は、通常、正常な肝細胞において比較的低レベルのポリペプチドを発現し、比較的高レベルのポリペプチドを肝癌細胞中で発現する。ポリペプチドが免疫原性細胞死を誘導し得る場合、これは、正常な肝細胞と比較して、肝臓癌細胞（例えば、肝細胞癌細胞）の優先的免疫原性細胞死滅を引き起こし得る。
【０４８２】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのｍｉＲ−１２２結合部位、少なくとも２つのｍｉＲ−１２２結合部位、少なくとも３つのｍｉＲ−１２２結合部位、少なくとも４つのｍｉＲ−１２２結合部位、または少なくとも５つのｍｉＲ−１２２結合部位を含む。一態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２２に結合するか、またはｍｉＲ−１２２に相補的である。別の態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２２−３ｐまたはｍｉＲ−１２２−５ｐに結合する。特定の態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号１３２６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含み、ここでｍｉＲＮＡ結合部位はｍｉＲ−１２２に結合する。別の特定の態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号２６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含み、ここでｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２２に結合する。これらの配列を、下記表３に示す。
【０４８３】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含み、ｍｉＲＮＡ結合部位は、表３から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含み、任意の１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位配列の１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、表３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の同じまたは異なるｍｉＲＮＡ結合部位（任意の組み合わせを含む）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２に結合するか、またはｍｉＲ−１４２に相補的である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１４２は、配列番号２７を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２−３ｐまたはｍｉＲ−１４２−５ｐに結合する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位は、配列番号２９を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位は、配列番号３１を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号２９または配列番号３１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
【表３】
2019532657.tif 000016
【０４８４】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドの任意の位置（例えば、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ）で本開示のポリヌクレオチドに挿入される。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。ポリヌクレオチド中のｍｉＲＮＡ結合部位の挿入が、対応するｍｉＲＮＡの非存在下で機能的ポリペプチドの翻訳を妨害しない限り、ポリヌクレオチド中の挿入部位はポリヌクレオチド中のどこにあってもよい；そして、ｍｉＲＮＡの存在下で、ポリヌクレオチドへのｍｉＲＮＡ結合部位の挿入、及び対応するｍｉＲＮＡへのｍｉＲＮＡ結合部位の結合は、ポリヌクレオチドを分解し得るかまたはポリヌクレオチドの翻訳を妨げ得る。
【０４８５】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ＯＲＦを含む本開示のポリヌクレオチド中のＯＲＦの終止コドンから下流の少なくとも約３０ヌクレオチドに挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチド中のＯＲＦの終止コドンから、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチド下流に挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドにおいて、ＯＲＦの終止コドンから、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド〜約６５ヌクレオチド下流に挿入される。
【０４８６】
ｍｉＲＮＡ遺伝子調節は、ｍｉＲＮＡを取り巻く配列、例えば、限定するものではないが、周囲の配列の種類、配列の種類（例えば、異種、同種、外因性、内因性、または人工）、周囲の配列中の調節エレメント及び／または周囲の配列中の構造エレメントなどの影響を受ける場合がある。ｍｉＲＮＡは、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲによって影響を受ける場合がある。非限定的な例として、非ヒト３’ＵＴＲは、同じ配列型のヒト３’ＵＴＲと比較して、目的のポリペプチドの発現に対するｍｉＲＮＡ配列の調節効果を増大し得る。
【０４８７】
一実施形態では、５’ＵＴＲの他の調節エレメント及び／または構造エレメントは、ｍｉＲＮＡ媒介遺伝子調節に影響し得る。調節エレメント及び／または構造エレメントの一例は、５’ＵＴＲ中の構造化ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）であり、これは翻訳延長因子の結合がタンパク質翻訳を開始するのに必要である。５’−ＵＴＲにおけるこの二次構造化エレメントへのＥＩＦ４Ａ２の結合は、ｍｉＲＮＡ媒介遺伝子発現に必要である（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅｉｊｅｒ  ＨＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３年、３４０、８２−８５）。本開示のポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ媒介遺伝子調節を増強するために、この構造化５’ＵＴＲをさらに含んでもよい。
【０４８８】
少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作してもよい。これに関連して、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、またはそれ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作してもよい。例えば、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、２、または１つのｍｉＲＮＡ結合部位を、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作してもよい。一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれたｍｉＲＮＡ結合部位は、同じでもよいし、異なるｍｉＲＮＡ部位であってもよい。本開示のポリヌクレオチドに組み込まれた異なるｍｉＲＮＡ結合部位の組み合わせは、任意の異なるｍｉＲＮＡ部位の２つ以上のコピーが組み込まれている組み合わせを含み得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれたｍｉＲＮＡ結合部位は、体内の同じまたは異なる組織を標的とし得る。非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドの３’−ＵＴＲへの組織、細胞型、または疾患特異的ｍｉＲＮＡ結合部位の導入を通して、特定の細胞型における発現の程度（例えば、肝細胞、骨髄細胞、内皮細胞、がん細胞などを減らし得る。
【０４８９】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドにおける、３’ＵＴＲの５’末端付近、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間のほぼ中間、及び／または３’ＵＴＲの３’末端付近に操作され得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近及び３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間のほぼ中間の位置に操作され得る。別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの３’末端付近及び３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間のほぼ中間の位置に操作され得る。さらに別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端付近及び３’ＵＴＲの３’末端付近に操作され得る。
【０４９０】
別の実施形態では、３’ＵＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡシード配列、及び／またはこのシード配列に隣接するｍｉＲＮＡ配列に対して相補的であり得る。
【０４９１】
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、対象の異なる組織または異なる細胞型において発現される２つ以上のｍｉＲＮＡ部位を含むように操作され得る。非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、対象の肝臓及び腎臓におけるポリヌクレオチドの発現を調節するために、ｍｉＲ−１９２及びｍｉＲ−１２２を含むように操作され得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、同じ組織に対して２つ以上のｍｉＲＮＡ部位を含むように操作され得る。
【０４９２】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関連する治療ウィンドウ及びまたは示差的発現は、ｍｉＲＮＡ結合部位を用いて改変され得る。例えば、死のシグナルを提供するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、それらの細胞のｍｉＲＮＡサインによってがん細胞においてより高度に発現されるように設計され得る。がん細胞が低レベルの特定のｍｉＲＮＡを発現する場合、そのｍｉＲＮＡ（または複数のｍｉＲＮＡ）に対する結合部位をコードするポリヌクレオチドは、より高度に発現されるだろう。従って、死のシグナルを提供するポリペプチドは、がん細胞における細胞死を誘発または誘導する。同じｍｉＲＮＡのより高い発現を有する隣接する非癌性細胞は、結合部位へのｍｉＲＮＡの結合の効果、または３’ＵＴＲ中にコードされた「センサー」に起因して、このポリヌクレオチドが低レベルで発現されるので、コードされた死シグナルによる影響が少ない。逆に、細胞生存または細胞保護シグナルは、ｍｉＲＮＡが、がん細胞においてより高い発現を示す、がん及び非癌性細胞を含む組織に送達され得る−その結果、がん細胞に対するより低い生存シグナル及び正常細胞に対するより大きな生存シグナルが得られる。本明細書に記載のｍｉＲＮＡ結合部位の使用に基づいて、異なるシグナルを有する複数のポリヌクレオチドを設計して、投与してもよい。
【０４９３】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの発現は、少なくとも１つのセンサー配列をポリヌクレオチドに組み込むこと、及び、投与用のポリヌクレオチドを処方することによって制御され得る。非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むこと、及び本明細書に記載の任意の脂質を含むカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子中にこのポリヌクレオチドを処方することによって、組織または細胞に標的され得る。
【０４９４】
本開示のポリヌクレオチドは、異なる組織、細胞型、または生物学的条件におけるｍｉＲＮＡの発現パターンに基づいて、特定の組織、細胞型、または生物学的条件における、より標的化された発現のために操作され得る。組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位の導入を通じて、本開示のポリヌクレオチドは、組織もしくは細胞における、または生物学的条件の状況における最適なタンパク質発現のために設計され得る。
【０４９５】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、公知のｍｉＲＮＡシード配列に対して１００％の同一性を有するか、またはｍｉＲＮＡシード配列に対して１００％未満の同一性を有するｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むように設計され得る。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、公知のｍｉＲＮＡシード配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むように設計され得る。このｍｉＲＮＡシード配列は、ｍｉＲＮＡ結合親和性を減少させるために部分的に変異されてもよく、それ自体ポリヌクレオチドの下方調節を減少させる。本質的に、ｍｉＲＮＡ結合部位とｍｉＲＮＡシードとの間の一致または不一致の程度は、タンパク質発現を調節するｍｉＲＮＡの能力をさらに微調整するためのレオスタットとして作用し得る。さらに、ｍｉＲＮＡ結合部位の非シード領域における変異はまた、タンパク質発現を調節するｍｉＲＮＡの能力にも影響を及ぼし得る。
【０４９６】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列を、ステムループのループに組み込んでもよい。
【０４９７】
別の実施形態では、ｍｉＲＮＡシード配列を、ステムループのループに組み込んでもよく、ｍｉＲＮＡ結合部位をステムループの５’または３’ステムに組み込んでもよい。
【０４９８】
一実施形態では、翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）を、ステムループのステムの５’末端に組み込んでもよく、ｍｉＲＮＡシードを、ステムループのステムに組み込んでもよい。別の実施形態では、ＴＥＥをステムループのステムの５’末端に組み込んでもよく、ｍｉＲＮＡシードを、ステムループのステムに組み込んでもよく、ｍｉＲＮＡ結合部位をステムの３’末端に、またはステムループの後の配列に組み込んでもよい。ｍｉＲＮＡシード及びｍｉＲＮＡ結合部位は、同じ及び／または異なるｍｉＲＮＡ配列に対するものであり得る。
【０４９９】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列及び／またはＴＥＥ配列の組み込みは、翻訳を増大及び／または減少し得るステムループ領域の形状を変化させる。（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｅｄｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａ  Ｐｕｍｉｌｉｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  ｐ２７−３′ＵＴＲ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｍｉＲ−２２１  ａｎｄ  ｍｉＲ−２２  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  ２０１０を参照のこと）。
【０５００】
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’−ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含み得る。ｍｉＲＮＡ配列は、限定するものではないが、１９もしくは２２ヌクレオチド配列及び／またはシードを含まないｍｉＲＮＡ配列であり得る。
【０５０１】
一実施形態では、５’ＵＴＲ中のｍｉＲＮＡ配列を使用して、本明細書に記載の開示のポリヌクレオチドを安定化し得る。
【０５０２】
別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ中のｍｉＲＮＡ配列を使用して、限定するものではないが、開始コドンなどの翻訳開始部位のアクセス性を低下させ得る。例えば、Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１０  １１（５）：ｅ１５０５７（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと。これは、開始コドン（ＡＵＧコドンのＡが＋１である場合、−４〜＋３７）の周りにアンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド及びエキソン接合複合体（ＥＪＣ）を使用し、最初の開始コドン（ＡＵＧ）へのアクセス性を低下させる。Ｍａｔｓｕｄａは、ＬＮＡまたはＥＪＣを用いて開始コドン周辺の配列を変更することが、ポリヌクレオチドの効率、長さ及び構造安定性に影響を及ぼすことを示した。本開示のポリヌクレオチドは、翻訳開始部位へのアクセス性を減少させるために、翻訳開始部位の近くに、Ｍａｔｓｕｄａらによって記載されたＬＮＡまたはＥＪＣ配列の代わりに、ｍｉＲＮＡ配列を含んでもよい。翻訳開始部位は、ｍｉＲＮＡ配列の前であっても、後であっても、または内部であってもよい。非限定的な例として、翻訳開始部位は、シード配列または結合部位などのｍｉＲＮＡ配列内に位置してもよい。別の非限定的な例として、翻訳開始部位は、シード配列またはｍｉｒ−１２２結合部位などのｍｉＲ−１２２配列内に位置してもよい。
【０５０３】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、抗原提示細胞による抗原提示を抑制するために少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含んでもよい。ｍｉＲＮＡは、完全なｍｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡシード配列、シードなしのｍｉＲＮＡ配列、またはそれらの組み合わせであってもよい。非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれたｍｉＲＮＡは、造血系に特異的であり得る。別の非限定的な例として、抗原提示を抑えるために本開示のポリヌクレオチドに組み込まれたｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐである。
【０５０４】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、目的の組織または細胞におけるコードされたポリペプチドの発現を抑制するために少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、肝臓における目的のコードされたポリペプチドの発現を抑制するために、少なくとも１つのｍｉＲ−１２２結合部位を含み得る。別の非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−３ｐシード配列、シードなしのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐシード配列、シードなしのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４６結合部位、ｍｉＲ−１４６シード配列及び／またはシード配列なしのｍｉＲ−１４６結合部位を含み得る。
【０５０５】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、治療的送達によって引き起こされる望ましくない免疫原性反応を抑えるために免疫細胞中のｍＲＮＡ治療薬を選択的に分解するために、３’ＵＴＲ中に少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、抗原提示細胞において本開示のポリヌクレオチドをより不安定にする可能性がある。これらのｍｉＲＮＡの非限定的な例としては、ｍｉｒ−１４２−５ｐ、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉｒ−１４６ａ−５ｐ、及びｍｉｒ−１４６−３ｐが挙げられる。
【０５０６】
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用し得るポリヌクレオチドの領域内に、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含む。
【０５０７】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、（ｉ）配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）及び（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２と結合するｍｉＲＮＡ結合部位）を含む。
【０５０８】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示のポリペプチドをコードするウラシル修飾配列、及び本明細書に開示のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学修飾核酸塩基、例えば、５−メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中の少なくとも９５％の種類の核酸塩基（例えば、ウラシル）が修飾核酸塩基である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中の少なくとも９５％のウリシルは、５−メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドが、送達剤、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜１４７のいずれかと共に処方される。
【０５０９】
機能的ＲＮＡエレメントを含む修飾ポリヌクレオチド
本開示は、修飾（例えば、ＲＮＡエレメント）を含む合成ポリヌクレオチドを提供し、ここで修飾は所望の翻訳調節活性を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、開始コドン、ポリペプチドをコードする全オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、及び少なくとも１つの修飾を含むポリヌクレオチドを提供し、ここでこの少なくとも１つの修飾は、所望の翻訳調節活性、例えば、ｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実度を促進及び／または増強する修飾を提供する。いくつかの実施形態では、所望の翻訳調節活性は、シス作用調節活性である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳調節活性は、開始コドンにおける、またはその近くの４３Ｓ開始前複合体（ＰＩＣ）またはリボソームの滞留時間の増大である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳調節活性は、開始コドンにおける、または開始コドンからのポリペプチド合成の開始の増大である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳調節活性は、完全オープンリーディングフレームから翻訳されたポリペプチドの量の増大である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳調節活性は、ＰＩＣまたはリボソームによる開始コドンの解読の忠実度の増大である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳調節活性は、ＰＩＣまたはリボソームによるリーキースキャニングの阻害または低減である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳調節活性は、ＰＩＣまたはリボソームによる開始コドンの解読速度の低下である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳調節活性は、開始コドン以外のｍＲＮＡ内の任意のコドンにおけるポリペプチド合成の開始の阻害または減少である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳調節活性は、完全オープンリーディングフレーム以外のｍＲＮＡ内の任意のオープンリーディングフレームから翻訳されたポリペプチドの量の阻害または減少である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳調節活性は、異常な翻訳産物の産生の阻害または減少である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳調節活性は、前述の翻訳調節活性のうちの１つ以上の組み合わせである。
【０５１０】
したがって、本開示は、本明細書に記載の所望の翻訳調節活性を提供する、配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含むＲＮＡ要素を含むポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを提供する。いくつかの態様では、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実度を促進及び／または増強する、配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含むＲＮＡエレメントを含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡは、リーキースキャニングの阻害及び／または低減などの所望の翻訳調節活性を提供する、配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含むＲＮＡエレメントを含む。いくつかの態様では、本開示は、リーキースキャニングを阻害及び／または低減し、それによってｍＲＮＡの翻訳忠実度を促進する、配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含むＲＮＡエレメントを含むｍＲＮＡを提供する。
【０５１１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、天然及び／または修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、本明細書に記載されるように所望の翻訳調節活性を提供する、連結ヌクレオチドの配列、またはその誘導体もしくは類似体を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡエレメントは、安定なＲＮＡ二次構造を形成または折り畳む連結ヌクレオチドの配列、またはその誘導体もしくは類似体を含み、ここでＲＮＡ二次構造は、本明細書に記載の所望の翻訳調節活性を提供する。ＲＮＡエレメントは、そのエレメントの一次配列（例えば、ＧＣリッチエレメント）に基づいて、そのエレメントによって形成されるＲＮＡ二次構造（例えば、ステムループ）によって、ＲＮＡ分子内のエレメントの位置によって（例えば、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内に位置する）、エレメント（例えば、「翻訳エンハンサーエレメント」）の生物学的機能及び／または活性によって、ならびにそれらの任意の組み合わせによって、同定されてもよく、及び／または特徴付けされてもよい。
【０５１２】
いくつかの態様では、本開示は、リーキースキャニングを阻害するか、及び／またはｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実度を促進する１つ以上の構造修飾を有するｍＲＮＡを提供し、ここで構造修飾の少なくとも１つはＧＣリッチＲＮＡエレメントである。いくつかの態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、ここで、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のＫｏｚａｋコンセンサス配列に先行する、連結ヌクレオチドの配列、またはその誘導体もしくは類似体を含むＧＣリッチＲＮＡエレメントである。一実施形態では、ＧＣリッチのＲＮＡエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＫｏｚａｋコンセンサス配列の約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ヌクレオチド（複数可）上流に位置する。別の実施形態では、ＧＣリッチのＲＮＡエレメントは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の１５〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１０〜１５、または５〜１０ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、ＧＣリッチのＲＮＡエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内のＫｏｚａｋコンセンサス配列に直接隣接して位置する。
【０５１３】
前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、任意の順序で連結された、３〜３０、５〜２５、１０〜２０、１５〜２０、約２０、約１５、約１２、約１０、約７、約６または約３ヌクレオチドの配列、それらの誘導体または類似体を含むＧＣリッチのＲＮＡエレメントを提供し、ここで、この配列組成は、７０〜８０％シトシン、６０〜７０％シトシン、５０％〜６０％シトシン、４０〜５０％シトシン、３０〜４０％シトシン塩基である。前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、任意の順序で連結された、３〜３０、５〜２５、１０〜２０、１５〜２０、約２０、約１５、約１２、約１０、約７、約６または約３ヌクレオチドの配列、それらの誘導体または類似体を含むＧＣリッチのＲＮＡエレメントを提供し、ここで、この配列組成は、約８０％シトシン、約７０％シトシン、約６０％シトシン、約５０％シトシン、約４０％シトシン、または約３０％シトシンである。
【０５１４】
任意の前述のまたは関連の態様では、本開示は、任意の順序で連結された、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４もしくは３ヌクレオチドの配列、またはそれらの誘導体または類似体を含むＧＣリッチのＲＮＡエレメントを提供し、ここで、この配列組成は、７０〜８０％シトシン、６０〜７０％シトシン、５０％〜６０％シトシン、４０〜５０％シトシン、または３０〜４０％シトシンである。任意の前述のまたは関連の態様では、本開示は、任意の順序で連結された、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４もしくは３ヌクレオチドの配列、またはそれらの誘導体もしくは類似体を含むＧＣリッチのＲＮＡエレメントを提供し、ここで、この配列組成は、約８０％シトシン、約７０％シトシン、約６０％シトシン、約５０％シトシン、約４０％シトシン、または約３０％シトシンである。
【０５１５】
いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、ここで、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のＫｏｚａｋコンセンサス配列に先行する、連結ヌクレオチドの配列、またはその誘導体もしくは類似体を含むＧＣリッチＲＮＡエレメントであり、このＧＣリッチのＲＮＡエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のＫｏｚａｋコンセンサス配列の約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ヌクレオチド（複数可）上流に位置し、ここで、このＧＣリッチのＲＮＡエレメントは、任意の順序で連結された、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチドの配列、またはそれらの誘導体もしくは類似体を含み、ここでこの配列組成は＞５０％シトシンである。いくつかの実施形態では、配列組成は、＞５５％シトシン、＞６０％シトシン、＞６５％シトシン、＞７０％シトシン、＞７５％シトシン、＞８０％シトシン、＞８５％シトシン、または＞９０％シトシンである。
【０５１６】
他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、ここで、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＫｏｚａｋコンセンサス配列に先行する、連結ヌクレオチドの配列、またはその誘導体もしくは類似体を含むＧＣリッチＲＮＡエレメントであり、ここで、ＧＣリッチのＲＮＡエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のＫｏｚａｋコンセンサス配列の約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ヌクレオチド（複数可）上流に位置し、ここで、このＧＣリッチＲＮＡエレメントは、約３〜３０、５〜２５、１０〜２０、１５〜２０または約２０、約１５、約１２、約１０、約６もしくは約３ヌクレオチドの配列、またはその誘導体もしくは類似体を含み、ここで、この配列は反復ＧＣモチーフを含み、ここでこの反復ＧＣモチーフは［ＣＣＧ］ｎであり、ここでｎ＝１〜１０、ｎ＝２〜８、ｎ＝３〜６、またはｎ＝４〜５である。いくつかの実施形態では、配列は、反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここでｎ＝１、２、３、４または５である。いくつかの実施形態では、この配列は、反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここでｎ＝１、２または３である。いくつかの実施形態では、この配列は、反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここでｎ＝１である。いくつかの実施形態では、この配列は、反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここでｎ＝２である。いくつかの実施形態では、この配列は、反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここでｎ＝３である。いくつかの実施形態では、この配列は、反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここでｎ＝４（配列番号１３８４）である。いくつかの実施形態では、この配列は、反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ｎ＝５（配列番号１３８２）である。
【０５１７】
別の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、ここで少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＫｏｚａｋコンセンサス配列に先行する、連結ヌクレオチドの配列、またはその誘導体もしくは類似体を含むＧＣリッチＲＮＡエレメントであり、このＧＣリッチＲＮＡエレメントは、表４に記載の配列のいずれか１つを含む。一実施形態では、ＧＣリッチＲＮＡエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＫｏｚａｋコンセンサス配列の約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ヌクレオチド（複数可）上流に位置する。別の実施形態では、ＧＣリッチのＲＮＡエレメントは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の約１５〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１０〜１５、または５〜１０ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、ＧＣリッチのＲＮＡエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内のＫｏｚａｋコンセンサス配列に直接隣接して位置する。
【０５１８】
他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、ここで、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＫｏｚａｋコンセンサス配列に先行する、表４に記載の配列Ｖ１［ＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣ］（配列番号１３８３）、またはそれらの誘導体もしくは類似体を含むＧＣリッチＲＮＡエレメントである。いくつかの実施形態では、ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内のＫｏｚａｋコンセンサス配列の上流に直接隣接して位置する表４に記載の配列Ｖ１を含む。いくつかの実施形態では、ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのＫｏｚａｋコンセンサス配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基上流に位置する、表４に記載の配列Ｖ１を含む。他の実施形態では、ＧＣリッチのエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のＫｏｚａｋコンセンサス配列の１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１２、または１２〜１５塩基上流に位置する表４に記載の配列Ｖ１を含む。
【０５１９】
他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、ここで、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＫｏｚａｋコンセンサス配列に先行する、表４に記載の配列Ｖ２［ＣＣＣＣＧＧＣ］、またはその誘導体もしくは類似体を含むＧＣリッチＲＮＡエレメントである。いくつかの実施形態では、ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内のＫｏｚａｋコンセンサス配列の上流に直接隣接して位置する表４に記載の配列Ｖ２を含む。いくつかの実施形態では、ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のＫｏｚａｋコンセンサス配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基上流に位置する表４に記載の配列Ｖ２を含む。他の実施形態では、ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のＫｏｚａｋコンセンサス配列の１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１２、または１２〜１５塩基上流に位置する表４に記載の配列Ｖ２を含む。
【０５２０】
他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、ここで、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＫｏｚａｋコンセンサス配列に先行する、表４に記載の配列ＥＫ［ＧＣＣＧＣＣ］、またはその誘導体もしくは類似体を含むＧＣリッチＲＮＡエレメントである。いくつかの実施形態では、ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内のＫｏｚａｋコンセンサス配列の上流に直接隣接して位置する表４に記載の配列ＥＫを含む。いくつかの実施形態では、ＧＣリッチのエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＫｏｚａｋコンセンサス配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基上流に位置する表４に記載の配列ＥＫを含む。他の実施形態では、ＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のＫｏｚａｋコンセンサス配列の１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１２、または１２〜１５塩基上流に位置する表４に記載の配列ＥＫを含む。
【０５２１】
さらに他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、ここで少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＫｏｚａｋコンセンサス配列に先行する、表４に記載の配列Ｖ１［ＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣ］（配列番号１３８３）、またはその誘導体もしくは類似体を含むＧＣリッチＲＮＡエレメントであり、ここでこの５’ＵＴＲは、表４に示される以下の配列を含む：
ＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡ（配列番号１３８４）。
【０５２２】
いくつかの実施形態では、ＧＣリッチエレメントは、表４に示す５’ＵＴＲ配列内のＫｏｚａｋコンセンサス配列の上流に直接隣接して位置する表４に記載の配列Ｖ１を含む。いくつかの実施形態では、このＧＣリッチエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲにおけるＫｏｚａｋコンセンサス配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基上流に位置する表４に記載の配列Ｖ１を含み、ここでこの５’ＵＴＲは、表４に示す以下の配列を含む：
ＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡ（配列番号１３８４）。
【０５２３】
他の実施形態では、ＧＣリッチのエレメントは、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中にＫｏｚａｋコンセンサス配列の１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１２、または１２〜１５塩基上流に位置する表４に記載の配列Ｖ１を含み、ここで５’ＵＴＲは、表４に示す以下の配列を含む：
ＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡ（配列番号１３８４）。
【０５２４】
いくつかの実施形態では、この５’ＵＴＲは、表４に示される以下の配列を含む：
ＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号１３８５）
【０５２５】
いくつかの実施形態では、この５’ＵＴＲは、表４に示される以下の配列を含む：
ＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号１３８６）。
【表４】
2019532657.tif 000017
【０５２６】
別の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、ここで、少なくとも１つの修飾は、ヘアピンまたはステムループを形成する、ある順番で連結されたヌクレオチドの配列、またはその誘導体もしくは類似体を含む安定なＲＮＡ二次構造を含むＧＣリッチＲＮＡエレメントである。一実施形態では、安定なＲＮＡ二次構造は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の上流にある。別の実施形態では、安定なＲＮＡ二次構造は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、または約５ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、安定なＲＮＡ二次構造は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の約２０、約１５、約１０、または約５ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、安定なＲＮＡ二次構造は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の約５、約４、約３、約２、約１ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、安定なＲＮＡ二次構造は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の約１５〜３０、約１５〜２０、約１５〜２５、約１０〜１５、または約５〜１０ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、安定なＲＮＡ二次構造は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の１２〜１５ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、安定なＲＮＡ二次構造は、約−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−２０〜−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−１０〜−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−５〜−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌのデルタＧを有する。
【０５２７】
別の実施形態では、修飾はポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに機能的に連結されており、ここで修飾とオープンリーディングフレームとは異種である。
【０５２８】
別の実施形態では、ＧＣリッチのＲＮＡエレメントの配列は、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）核酸塩基のみから構成される。
【０５２９】
本明細書中に記載されるような所望の翻訳調節活性を提供するＲＮＡエレメントは、リボソームプロファイリングのような公知の技術を用いて同定されそして特徴付けられ得る。リボソームプロファイリングは、ｍＲＮＡに結合したＰＩＣ及び／またはリボソームの位置の決定を可能にする技術である（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＩｎｇｏｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４（５９２４）：２１８〜２３を参照のこと）。この技術は、ヌクレアーゼ消化から、ＰＩＣ及び／またはリボソームによって、ｍＲＮＡの領域またはセグメントを保護することに基づいている。保護により、「フットプリント」と呼ばれる３０ｂｐのＲＮＡ断片が生成される。ＲＮＡフットプリントの配列及び頻度は、当該分野で公知の方法（例えば、ＲＮＡ−ｓｅｑ）によって分析され得る。フットプリントは、リボソームのＡ部位にほぼ中心がある。ＰＩＣまたはリボソームが、ｍＲＮＡに沿った特定の場所または位置に滞留する場合、これらの位置に生じるフットプリントは比較的一般的であろう。ＰＩＣ及び／またはリボソームが加工性の低下を示す場所でより多くのフットプリントが生成し、ＰＩＣ及び／またはリボソームが加工性の増大を示す位置でより少ないフットプリントが生成されることが、研究により示されている（Ｇａｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）ｅＬｉｆｅ  ３：ｅ０３７３５）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡエレメントのうちの任意の１つ以上を含むポリヌクレオチドに沿った別々の場所または位置でのＰＩＣまたはリボソームの滞留時間または占有時間は、リボソームプロファイリングによって決定される。
【０５３０】
送達ビヒクル
概要
本開示のｍＲＮＡは、例えば、対象に送達されたときにそれらを分解から保護するために、ナノ粒子または他の送達ビヒクル中に処方され得る。例示的なナノ粒子は、Ｐａｎｙａｍ、Ｊ．＆Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ，Ｖ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５，３２９−３４７（２００３）及びＰｅｅｒ，Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ．２，７５１−７６０（２００７）に記載されている。特定の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、ナノ粒子内に封入されている。特定の実施形態では、ナノ粒子は、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、または１００ｎＭ以下の少なくとも１つの寸法（例えば、直径）を有する粒子である。特定の実施形態では、ナノ粒子は脂質を含む。脂質ナノ粒子としては、限定するものではないが、リポソーム及びミセルが挙げられる。カチオン性及び／またはイオン性脂質、アニオン性脂質、中性脂質、両親媒性脂質、ＰＥＧ化脂質、及び／または構造脂質を含む、任意の数の脂質が存在し得る。そのような脂質は、単独で使用されてもよいし、または組み合わせて使用されてもよい。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の１つ以上のｍＲＮＡを含む。
【０５３１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡの脂質ナノ粒子製剤は、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）のカチオン性及び／またはイオン性脂質を含み得る。そのようなカチオン性及び／またはイオン性脂質としては、限定するものではないが、３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１−［２−（ジドデシルアミノ）エチル］−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４−トリドデシル−１，４−ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５−ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（Ｏｃｔｙｌ−ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、（２Ｓ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（Ｏｃｔｙｌ−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロライド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロライド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（「ＤＯＴＡＰ」）；１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（「ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ」）；３−β−（Ｎ−−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アンモニウム  トリフルオロアセテート（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）、及びＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウム��ロミド（「ＤＭＲＩＥ」）が挙げられる。さらに、カチオン性脂質及び／またはイオン性脂質の多数の市販の調製物、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（例としては、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥ）、及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（例としては、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥ）などが用いられ得る。ＫＬ１０、ＫＬ２２、及びＫＬ２５は、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６９１，７５０号に記載される。特定の実施形態では、その脂質は、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡである。
【０５３２】
本開示の脂質ナノ粒子に使用するのに適したアニオン性脂質としては、限定するものではないが、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、及び中性脂質に結合された他のアニオン性飾基基が挙げられる。
【０５３３】
本開示の脂質ナノ粒子での使用に適した中性脂質としては、限定するものではないが、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、及びセレブロシドが挙げられる。様々な鎖長及び飽和度の様々なアシル鎖基を有する脂質が入手可能であるか、または周知の技術によって単離されても、もしくは合成されてもよい。さらに、飽和及び不飽和脂肪酸鎖の混合物を有する脂質を使用してもよい。いくつかの実施形態では、本開示において使用される中性脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、または任意の関連ホスファチジルコリンである。いくつかの実施形態では、中性脂質は、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、またはセリン及びイノシトールなどの他の頭部基を有するリン脂質から構成され得る。
【０５３４】
いくつかの実施形態では、両親媒性脂質は、本開示のナノ粒子に含まれる。本開示のナノ粒子における使用に適した例示的な両親媒性脂質としては、限定するものではないが、スフィンゴ脂質、リン脂質、及びアミノ脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、リン脂質は、以下からなる群より選択される：
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、
１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、
１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、
１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、
１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジアラクドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセリン−３−ホスホコリン、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６．０  ＰＥ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、及びスフィンゴミエリン。他のリン欠失化合物、例えば、スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、及びβ−アシルオキシ酸も使用されてもよい。さらに、そのような両親媒性脂質は、トリグリセリド及びステロールなどの他の脂質と容易に混合され得る。
【０５３５】
いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子の脂質構成要素は、１つ以上のＰＥＧ化脂質を含み得る。ＰＥＧ化脂質（ＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質とも呼ばれる）は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。脂質構成要素は、１つ以上のＰＥＧ化脂質を含んでもよい。ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、及びＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールからなる非限定的な群より選択され得る。例えば、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であってもよい。
【０５３６】
本開示の脂質ナノ粒子は、１つ以上の構造脂質を含んでもよい。本開示の脂質ナノ粒子中に存在し得る例示的で非限定的な構造脂質としては、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、またはα−トコフェロールが挙げられる。
【０５３７】
いくつかの実施形態では、本開示の１つ以上のｍＲＮＡは、約１ｎｍ〜約９００ｎｍ、例えば、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１ｎｍ〜約３００ｎｍ、約１ｎｍ〜約４００ｎｍ、約１ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１ｎｍ〜約６００ｎｍ、約１ｎｍ〜約７００ｎｍ、約１ｎｍ〜約８００ｎｍ、約１ｎｍ〜約９００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子に処方してもよい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約３０ｎｍ〜約１００ｎｍ、または約４０ｎｍ〜約８０ｎｍの直径を有し得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約３０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約７０〜約１１０ｎｍ、または約８０ｎｍ〜約１２０ｎｍの直径を有してもよい。一実施形態では、ｍＲＮＡは、限定するものではないが、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜約４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍ、及び／または約９０〜約１００ｎｍなどの間の範囲を含む約１０〜約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子に処方してもよい。一実施形態では、ｍＲＮＡは、約３０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、または約８０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、例としてはその間の範囲の直径を有する脂質ナノ粒子に処方されてもよい。
【０５３８】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、または９５０超の直径を有してもよい。
【０５３９】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の粒径は、増大しても、及び／または減少してもよい。粒径の変化は、それだけには限らないが炎症などの生物学的反応に対抗するのを助けることができ、または患者もしくは対象に送達されるｍＲＮＡの生物学的効果を増大し得る。
【０５４０】
特定の実施形態では、細胞型及び／または組織型に特異的な標的化部分を用いて、本開示のナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子を標的化することが望ましい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、標的化部分を用いて特定の細胞、組織、及び／または臓器に標的化されてもよい。特定の実施形態では、ナノ粒子は、本明細書に記載の１つ以上のｍＲＮＡ及び標的部分を含む。例示的な非限定的標的化部分は、リガンド、細胞表面受容体、糖タンパク質、ビタミン（例えば、リボフラビン）及び抗体（例えば、全長抗体、抗体断片（例えば、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）２断片）、単一ドメイン抗体、ラクダ抗体及びその断片、ヒト抗体及びその断片、モノクローナル抗体、及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体））を含む。いくつかの実施形態では、標的化部分はポリペプチドであってもよい。標的化部分は、ポリペプチド全体（例えば、ペプチドまたはタンパク質）またはそれらの断片を含んでもよい。標的化部分は、典型的には、標的化部分が標的、例えば、細胞表面受容体との相互作用に利用可能であるような方式で、ナノ粒子の外面に配置される。種々の異なる標的化部分及び方法は、例えば、Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４２（５）：４３９−６２，２００３及びＡｂｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２：１−３，２００２に記載のものを含み、当該分野で公知かつ利用可能である。
【０５４１】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子（例えば、リポソーム）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖などの親水性ポリマー鎖の表面コーティングを含んでもよい（例えば、Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １２３７：９９−１０８，１９９５；ＤｅＦｒｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １１８：６１０１−６１０４，１９９６；Ｂｌｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１４９：１８０−１８４，１９９３；Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２：３２１−３３４，１９９２；米国特許第５，０１３，５５６号；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４：２９６−２９９，１９９３；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５３：７１−７４，１９９４；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ｉｎ  Ｓｔｅａｌｔｈ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ９（Ｌａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｅｄｓ）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  Ｆｌａ．，１９９５を参照のこと）。１つのアプローチでは、脂質ナノ粒子を標的とするための標的部分を、ナノ粒子を形成する脂質の極性頭部基に結合させる。別のアプローチでは、標的化部分は、親水性ポリマーコーティングを形成するＰＥＧ鎖の遠位端に結合される（例えば、Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２：３２１−３３４，１９９２；Ｋｉｒｐｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３８８：１１５−１１８，１９９６を参照のこと）。
【０５４２】
標的化部分（複数可）を結合するための標準的な方法が使用され得る。例えば、標的化部分の結合のために活性化され得るホスファチジルエタノールアミン、または誘導体化親油性化合物、例えば、脂質誘導体化ブレオマイシンを使用してもよい。抗体標的化リポソームは、例えば、プロテインＡを組み込んだリポソームを用いて構築され得る（例えば、Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１６３３７−１６３４２，１９９０及びＬｅｏｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８７：２４４８−２４５１，１９９０を参照のこと）。抗体コンジュゲーションの他の例は、米国特許第６，０２７，７２６号に開示されている。標的化部分の例としてはまた、新生物または腫瘍に関連する抗原を含む、細胞構成要素に特異的な他のポリペプチドが挙げられる。標的化部分として使用されるポリペプチドは、共有結合を介してリポソームに結合してもよい（例えば、Ｈｅａｔｈ，Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，１４９  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１１−１１９（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）を参照のこと）。他の標的化方法としては、ビオチン−アビジン系が挙げられる。
【０５４３】
いくつかの実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子としては、限定するものではないが、肝細胞、結腸細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉系細胞、神経細胞、心臓細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、及び腫瘍細胞（原発性腫瘍細胞及び転移性腫瘍細胞を含む）を含む細胞に脂質ナノ粒子を標的化する標的化部分が挙げられる。特定の実施形態では、標的化部分は、脂質ナノ粒子を肝細胞に標的化する。他の実施形態では、標的化部分は脂質ナノ粒子を結腸細胞に標的化する。いくつかの実施形態では、標的化部分は、脂質ナノ粒子を肝臓がん細胞（例えば、肝細胞がん細胞）または結腸直腸がん細胞（例えば、原発腫瘍または転移）に標的化する。
【０５４４】
脂質ナノ粒子
一組の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が提供される。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン性脂質、構造脂質、リン脂質、及び１つ以上のｍＲＮＡを含む脂質を含む。本明細書に記載の各ＬＮＰは、本明細書に記載のｍＲＮＡの製剤として使用され得る。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン性脂質、構造脂質、リン脂質、ＰＥＧ修飾脂質、及び１つ以上のｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール及びリン脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約２０〜６０％のイオン性脂質：約５〜２５％のリン脂質：約２５〜５５％のステロール；及び約０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質というモル比を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約５０％のイオン性脂質、約１．５％のＰＥＧ修飾脂質、約３８．５％のコレステロール、及び約１０％のリン脂質というモル比を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約５５％のイオン性脂質、約２．５％のＰＥＧ脂質、約３２．５％のコレステロール、及び約１０％のリン脂質というモル比を含む。いくつかの実施形態では、イオン性脂質は、イオン性アミノまたはカチオン性脂質であり、中性脂質は、リン脂質であり、ステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、５０：３８．５：１０：１．５というイオン性脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ（１，２−ジオクタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）：ＰＥＧ−ＤＭＧのモル比を有する。
【０５４５】
ａ．イオン性脂質
本開示は、有利な性質を有する薬学的組成物を提供する。例えば、本明細書に記載の脂質（例えば、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）のいずれかを有する脂質）は、哺乳動物細胞または臓器への治療剤及び／または予防剤の送達のための脂質ナノ粒子組成物において有利には使用され得る。例えば、本明細書に記載の脂質は、免疫原性がほとんどないか、または全くない。例えば、本明細書に開示される脂質化合物は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）と比較して低い免疫原性を有する。例えば、本明細書に開示される脂質及び治療剤または予防剤を含む製剤は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）及び同じ治療剤または予防薬を含む、対応する製剤と比較して増大した治療インデックスを有する。特に、本出願は、以下を含む薬学的組成物を提供する：
（ａ）目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；及び
（ｂ）送達剤。
【０５４６】
いくつかの実施形態では、上記送達剤は、式（Ｉ）を有する脂質化合物であって、
【化１】
2019532657.tif 000018
式中
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群より選択され、ここでＱは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して１、２、３、４、及び５から選択され；
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ６は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より独立して選択され；
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され；
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群より選択され；
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群より選択され；
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及びＨからなる群より独立して選択され；
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群より選択され；
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群より選択され；
各Ｙは独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され；
ｍは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、脂質化合物、
またはそれらの塩もしくは立体異性体を含む。
【０５４７】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットとしては、
Ｒ１は、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５-２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群より選択され、ここでＱは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、そして各ｎは、独立して１、２、３、４及び５から選択され；
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され；
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群より選択され；
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群より選択され；
各Ｙは独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され；ｍは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物のサブセット、
またはその塩もしくは立体異性体が挙げられ、ここで、アルキル基及びアルケニル基は直鎖状でも分岐状でもよい。
【０５４８】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４もしくは５であるとき、ＱはＮ（Ｒ）２ではないか、または（ｉｉ）ｎが１もしくは２であるときは、Ｑは５、６または７員のヘテロシクロアルキルではないものを含む。
【０５４９】
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５-２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２及びＲ３が、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４が、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群より選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、ならびにオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１−３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換されている、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員〜１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎが、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され；
各Ｒ５が独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ６が独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
Ｍ及びＭ’が独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され；
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
Ｒ８が、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群より選択され；
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環、及び複素環からなる群より選択され；
各Ｒが独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ’が独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ”が独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群より選択され；
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群より選択され；
各Ｙが独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され；そして
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される化合物のサブセット、
またはそれらの塩もしくは立体異性体が挙げられる。
【０５５０】
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５-２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合する原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４が、−Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群より選択され、ここで、Ｑが、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ならびにオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１−３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換されている、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員ヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎは独立して１、２、３、４、及び５から選択され；
各Ｒ５が独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ６が独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、ヘテロアリール基から選択され；
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒが独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ’が独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ”が独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群より選択され；
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群より選択され；
各Ｙが独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され；そして
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される化合物のサブセット、
またはそれらの塩もしくは立体異性体が挙げられる。
【０５５１】
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５-２０アルキル、Ｃ５-２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４が、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群より選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員の複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各ｎは独立して１、２、３、４、及び５から選択され；かつＱが５〜１４員の複素環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱであり、ｎが１もしくは２であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ｎが１であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が−ＣＨＱＲ、及びＣＱ（Ｒ）２であるならば、Ｑは５〜１４員のヘテロアリールまたは８〜１４員のヘテロシクロアルキルであり；
各Ｒ５が独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ６が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より独立して選択され；
Ｍ及びＭ’が独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され；
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
Ｒ８が、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群より選択され；
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群より選択され；
各Ｒが独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ’が独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ”が独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群より選択され；
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群より選択され；
各Ｙが独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され；そして
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される化合物のサブセット、
またはそれらの塩もしくは立体異性体が挙げられる。
【０５５２】
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の他のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５-２０アルキル、Ｃ５-２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群より選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有する５〜１４員の複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され；及び各ｎが独立して１、２、３、４及び５から選択され；Ｑが５〜１４員の複素環であり、（ｉ）Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱであり、ｎが１もしくは２であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ｎが１であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２であるならば、Ｑは５〜１４員のヘテロアリールまたは８〜１４員のヘテロシクロアルキルであり；
各Ｒ５が独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ６が独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
Ｍ及びＭ’が独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基及びヘテロアリール基から選択され；
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒが独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ’が独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ”が独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群より選択され；
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群より選択され；
各Ｙが独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され；そして
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される化合物のサブセット、
またはそれらの塩もしくは立体異性体が挙げられる。
【０５５３】
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５-２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合する原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４が、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群より選択され、ここで、Ｑは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロアリール、−ＯＲ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４及び５から選択され；
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、ヘテロアリール基から選択され；
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群より選択され；
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群より選択され；
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ’’は独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群より選択され；
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群より選択され；
各Ｙは独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され；
そして
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物のサブセット、
またはそれらの塩もしくは立体異性体が挙げられる。
【０５５４】
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５-２０アルキル、Ｃ５-２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合する原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４が、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群より選択され、ここで、ＱがＣ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、及び各ｎは独立して１、２、３、４及び５から選択され；
各Ｒ５が独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ６が独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
Ｍ及びＭ’が独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され；
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒが独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ’が独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ’’が独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群より選択され；
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群より選択され；
各Ｙが独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｘが、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され；そして
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物のサブセット、
またはそれらの塩もしくは立体異性体が挙げられる。
【０５５５】
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５-２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ２−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合する原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱまたは−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここでＱはＮ（Ｒ）２であり、そしてｎは３、４及び５から選択され；
各Ｒ５が独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ６が独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
Ｍ及びＭ’が独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され；
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒが独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ’が独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ”が独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群より選択され；
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ１−１２アルケニルからなる群より選択され；
各Ｙが独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され；そして
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物のサブセット、
またはそれらの塩もしくは立体異性体が挙げられる。
【０５５６】
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５-２０アルキル、Ｃ５-２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ２−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択され、あるいはＲ２及びＲ３はそれらが結合する原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱまたは−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここでＱが−Ｎ（Ｒ）２であり、そしてｎは３、４及び５から選択され；
各Ｒ５が独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ６が独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
Ｍ及びＭ’が独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され；
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒが独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ’が独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ”が独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群より選択され；
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ１−１２アルケニルからなる群より選択され；
各Ｙが独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され；
そして
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物のサブセット、
またはそれらの塩もしくは立体異性体が挙げられる。
【０５５７】
さらに他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５-２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及びＣＱ（Ｒ）２からなる群より選択され、ここで、Ｑは−Ｎ（Ｒ）２であり；そしてｎは１、２、３、４、及び５から選択され；
各Ｒ５が独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ６が独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
Ｍ及びＭ’が独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され；
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒが独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ’が独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及びＨからなる群より独立して選択され；
各Ｒ”が独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群より選択され；
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ１−１２アルケニルからなる群より選択され；
各Ｙが独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され、そして
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物のサブセット、
またはそれらの塩もしくは立体異性体が挙げられる。
【０５５８】
さらに他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５-２０アルキル、Ｃ５-２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択され；
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合する原子と一緒になって複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群より選択され、ここで、Ｑが−Ｎ（Ｒ）２であり、そしてｎは１、２、３、４、及び５から選択され；
各Ｒ５が独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ６が独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
Ｍ及びＭ’が独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され；
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒが独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ’が独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及びＨからなる群より選択され；
各Ｒ”が独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群より選択され；
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ１−１２アルケニルからなる群より選択され；
各Ｙが独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群より選択され；そして
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物のサブセット、
またはそれらの塩もしくは立体異性体が挙げられる。
【０５５９】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＡ）の化合物：
【化２】
2019532657.tif 000019
またはその塩もしくは立体異性体を包含し、式中、ｌは１、２、３、４及び５から選択され；ｍは５、６、７、８、及び９から選択され；Ｍ１は結合またはＭ’であり；Ｒ４は、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり；Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され；そして
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群より選択される。
【０５６０】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＡ）の化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれ、
ここで
ｌは１、２、３、４及び５から選択され；ｍは５、６、７、８、及び９から選択され；
Ｍ１は結合またはＭ’であり；
Ｒ４は、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり；
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され；そして
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群より独立して選択される。
【０５６１】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩ）のもの
【化３】
2019532657.tif 000020
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、ｌは１、２、３、４及び５から選択され；Ｍ１は結合またはＭ’であり；Ｒ４は非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここでｎは２、３、または４であり、そしてＱは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり；Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され；そして
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群より選択される。
【０５６２】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩ）の化合物、またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中
ｌは１、２、３、４及び５から選択され；
Ｍ１は結合またはＭ’であり；
Ｒ４は非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここでｎは２、３または４であり、そしてＱはＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、またはＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり；
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され；そして
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群より選択される。
【０５６３】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は式（ＩＩａ）のもの、
【化４】
2019532657.tif 000021
またはその塩であり、式中Ｒ４は上記のとおりである。
【０５６４】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｂ）のもの、
【化５】
2019532657.tif 000022
またはその塩であり、式中Ｒ４は上記のとおりである。
【０５６５】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｃ）のもの、
【化６】
2019532657.tif 000023
またはその塩であり、式中Ｒ４は上記のとおりである。
【０５６６】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｅ）のもの：
【化７】
2019532657.tif 000024
またはその塩であり、式中Ｒ４は上記のとおりである。
【０５６７】
いくつかの実施形態では、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、または（ＩＩｅ）の化合物は、Ｒ４を含み、これは、−（ＣＨ２）ｎＱ及び−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択され、ここでＱ、Ｒ及びｎは、上記のとおりである。
【０５６８】
いくつかの実施形態では、Ｑは、−ＯＲ、−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、及び複素環からなる群より選択され、式中Ｒは上記のとおりである。いくつかの態様では、ｎは、１または２である。いくつかの実施形態では、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。
【０５６９】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｄ）のもの、
【化８】
2019532657.tif 000025
またはその塩であり、式中Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群より選択され、ｎは、２、３、及び４から選択され、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ５、Ｒ６及びｍは、上記のとおりである。
【０５７０】
式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、Ｒ２はＣ８アルキルである。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、Ｒ３はＣ５−Ｃ９アルキルである。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、ｍは５、７、または９である。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、各Ｒ５はＨである。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、各Ｒ６はＨである。
【０５７１】
別の態様では、本出願は、以下を含む脂質組成物（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））を提供する：（１）式（Ｉ）を有する化合物；（２）必要に応じてヘルパー脂質（例えば、リン脂質）；（３）必要に応じて構造脂質（例えば、ステロール）；及び（４）必要に応じて脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−脂質）。例示的な実施形態では、脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）はさらに、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、その中に封入されたポリヌクレオチドを含む。
【０５７２】
本明細書で使用される場合、「アルキル」または「アルキル基」という用語は、１個以上の炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の炭素原子）を含む直鎖状または分枝状の飽和炭化水素を意味する。
【０５７３】
表記「Ｃ１−１４アルキル」とは、１〜１４個の炭素原子を含む、直鎖状または分枝状の飽和炭化水素を意味する。アルキル基は必要に応じて置換されていてもよい。
【０５７４】
本明細書で使用されるとき、「アルケニル」または「アルケニル基」という用語は、２個以上の炭素原子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上の炭素原子）及び少なくとも１つの二重結合を含む、直鎖状または分岐状炭化水素を意味する。
【０５７５】
表記「Ｃ２−１４アルケニル」とは、２〜１４個の炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を含む、直鎖状または分岐状の炭化水素を意味する。アルケニル基は、１、２、３、４またはそれ以上の二重結合を含み得る。例えば、Ｃ１８アルケニルは、１つ以上の二重結合を含んでもよい。２つの二重結合を含むＣ１８アルケニル基は、リノレイル基であり得る。アルケニル基は、必要に応じて置換されていてもよい。
【０５７６】
本明細書で使用されるとき、「炭素環」または「炭素環式基」という用語は、炭素原子の１つ以上の環を含む単環式または多環式系を意味する。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５員環であってもよい。
【０５７７】
表記「Ｃ３−６炭素環」とは、３〜６個の炭素原子を有する単環を含む炭素環を意味する。炭素環は、１つ以上の二重結合を含んでもよく、そして芳香族（例えば、アリール基）であってもよい。炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ナフチル、及び１，２ジヒドロナフチル基が挙げられる。炭素環は必要に応じて置換されてもよい。
【０５７８】
本明細書で使用される場合、「複素環」または「複素環式基」という用語は、少なくとも１つの環が少なくとも１つのヘテロ原子を含む、１つ以上の環を含む単環式または多環式系を意味する。ヘテロ原子は、例えば、窒素原子、酸素原子、または硫黄原子であってもよい。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２員環であってもよい。複素環は、１つ以上の二重結合を含んでもよく、そして芳香族（例えば、ヘテロアリール基）であってもよい。複素環の例としては、イミダゾリル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、モルホリニル、ピロリル、ピロロリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チオフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、キノリル、及びイソキノリル基が挙げられる。複素環は必要に応じて置換されてもよい。
【０５７９】
本明細書中で使用される場合、「生分解性基」とは、対象における脂質のより速い代謝を促進し得る基である。生分解性基としては限定するものではないが、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基であり得る。
【０５８０】
本明細書で使用されるとき、「アリール基」とは、１つ以上の芳香環を含む炭素環式基である。アリール基の例としては、フェニル及びナフチル基が挙げられる。
【０５８１】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール基」とは、１つ以上の芳香環を含む複素環基である。ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、及びチアゾリルが挙げられる。アリール基及びヘテロアリール基の両方とも必要に応じて置換されていてもよい。例えば、Ｍ及びＭ’は、必要に応じて置換されているフェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる非限定的な群から選択され得る。本明細書中の式において、Ｍ及びＭ’は、上記生分解性基のリストから独立して選択され得る。
【０５８２】
アルキル、アルケニル、及びシクリル（例えば、カルボシクリル及びヘテロシクリル）基は、特に明記しない限り、必要に応じて置換されていてもよい。任意の置換基は、限定するものではないが、ハロゲン原子（例えば、塩化物、臭化物、フッ化物、またはヨウ化物基）、カルボン酸（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、アルコール（例えば、ヒドロキシル、−ＯＨ）、エステル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＲまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アルデヒド（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｈ）、カルボニル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ）、あるいは、Ｃ＝Ｏで表される）、ハロゲン化アシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、式中、Ｘは、臭化物、フッ化物、塩化物及びヨウ化物から選択されるハロゲン化物である）、炭酸塩（例えば、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ）、アルコキシ（例えば、−ＯＲ）、アセタール（例えば、−Ｃ（ＯＲ）２Ｒ”“、ここで各ＯＲは同一でも異なってもよいアルコキシ基であり、そしてＲ”“はアルキルまたはアルケニル基である）、ホスフェート（例えば、Ｐ（Ｏ）４３−）、チオール（例えば、−ＳＨ）、スルホキシド（例えば、−Ｓ（Ｏ）Ｒ）、スルフィン酸（例えば、−Ｓ（Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（例えば、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、チアール（例えば、−Ｃ（Ｓ）Ｈ）、硫酸塩（例えば、Ｓ（Ｏ）４２−）、スルホニル（例えば、Ｓ（Ｏ）２−）、アミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、または−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ）、アジド（例えば、−Ｎ３）、ニトロ（例えば、−ＮＯ２）、シアノ（例えば、−ＣＮ）、イソシアノ（例えば、−ＮＣ）、アシルオキシ（例えば、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アミノ（例えば、−ＮＲ２、−ＮＲＨ、または−ＮＨ２）、カルバモイル（例えば、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲＨ、または−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２）、スルホンアミド（例えば、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲＨ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ、または−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ）、アルキル基、アルケニル基、及びシクリル（例えば、カルボシクリルまたはヘテロシクリル）基からなる群より選択され得る。
【０５８３】
上記のいずれにおいても、Ｒは、本明細書に定義のアルキルまたはアルケニル基である。いくつかの実施形態では、置換基自体が、例えば、本明細書で定義の１、２、３、４、５、または６個の置換基でさらに置換されていてもよい。例えば、Ｃ１−６アルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、４、５、または６個の置換基でさらに置換されてもよい。
【０５８４】
式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、及び（ＩＩｅ）のうちいずれか１つの化合物は、該当する場合、以下の特徴の１つ以上を含む。
【０５８５】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群より選択され、式中、Ｑは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員の芳香族または非芳香族複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して１、２、３、４及び５から選択される。
【０５８６】
別の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群より選択され、ここでＱは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ならびに、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロシクロアルキル（オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１−３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される）から選択され、各ｎは独立して１、２、３、４、及び５から選択される。
【０５８７】
別の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群より選択され、ここでＱは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員の複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して１、２、３、４、及び５から選択され；Ｑが５〜１４員の複素環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱであり、ｎは１もしくは２であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ｎが１であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２であるならば、Ｑは５〜１４員のヘテロアリールまたは８〜１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかである。
【０５８８】
別の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群より選択され、ここでＱは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、及び各ｎは独立して１、２、３、４及び５から選択される。
【０５８９】
別の実施形態では、Ｒ４は非置換Ｃ１−４アルキル、例えば、非置換メチルである。
【０５９０】
特定の実施形態では、本開示は、Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱまたは−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、Ｑが−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎが３、４、及び５から選択される式（Ｉ）を有する化合物を提供する。
【０５９１】
特定の実施形態では、本開示は、Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群より選択され、ここでＱは−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは１、２、３、４及び５から選択される、式（Ｉ）を有する化合物を提供する。
【０５９２】
特定の実施形態では、本開示は、Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｃ２−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になって複素環または炭素環を形成し、そしてＲ４が−（ＣＨ２）ｎＱまたは−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここでＱが−Ｎ（Ｒ）２であり、そしてｎは３、４及び５から選択される、式（Ｉ）を有する化合物を提供する。
【０５９３】
特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｃ２−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になって複素環または炭素環を形成する。
【０５９４】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５-２０アルキル及びＣ５-２０アルケニルからなる群より選択される。
【０５９５】
他の実施形態では、Ｒ１は、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群より選択される。
【０５９６】
特定の実施形態では、Ｒ１は、−Ｒ＊ＹＲ”及び−ＹＲ”から選択される。いくつかの実施形態では、Ｙはシクロプロピル基である。いくつかの実施形態では、Ｒ＊は、Ｃ８アルキルまたはＣ８アルケニルである。特定の実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３−１２アルキルである。例えば、Ｒ’’はＣ３アルキルであってもよい。例えば、Ｒ”は、Ｃ４−８アルキル（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８アルキル）であってもよい。
【０５９７】
いくつかの実施形態では、Ｒ１はＣ５−２０アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１はＣ６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１はＣ８アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１はＣ９アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１−４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１はＣ１８アルキルである。
【０５９８】
いくつかの実施形態では、Ｒ１はＣ５-２０アルケニルである。特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１８アルケニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１はリノレイルである。
【０５９９】
特定の実施形態では、Ｒ１は分岐されている（例えば、デカン−２−イル、ウンデカン−３−イル、ドデカン−４−イル、トリデカン−５−イル、テトラデカン−６−イル、２−メチルウンデカン−３−イル、２−メチルデカン−２−イル、３−メチルウンデカン−３−イル、４−メチルドデカン−４−イル、またはヘプタデカ−９−イル）。特定の実施形態では、Ｒ１は、
【化９】
2019532657.tif 000026
である。
【０６００】
特定の実施形態では、Ｒ１は、非置換Ｃ５-２０アルキルまたはＣ５-２０アルケニルである。特定の実施形態では、Ｒ’は、置換Ｃ５-２０アルキルまたはＣ５-２０アルケニル（例えば、１−シクロプロピルノニルなどのＣ３−６炭素環で置換されている）である。
【０６０１】
他の実施形態では、Ｒ１は−Ｒ”Ｍ’Ｒ’である。
【０６０２】
いくつかの実施形態では、Ｒ’は、−Ｒ＊ＹＲ”及びＹＲ”から選択される。いくつかの実施形態では、ＹはＣ３−８シクロアルキルである。いくつかの実施形態では、ＹはＣ６−１０アリールである。いくつかの実施形態では、Ｙはシクロプロピル基である。いくつかの実施形態では、Ｙはシクロヘキシル基である。特定の実施形態では、Ｒ＊はＣ１アルキルである。
【０６０３】
いくつかの実施形態では、Ｒ’’は、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、Ｙに隣接するＲ”は、Ｃ１アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｙに隣接するＲ”は、Ｃ４−９アルキル（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８またはＣ９アルキル）である。
【０６０４】
いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ４アルキル及びＣ４アルケニルから選択される。特定の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ５アルキル及びＣ５アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ６アルキル及びＣ６アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ７アルキル及びＣ７アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ９アルキル及びＣ９アルケニルから選択される。
【０６０５】
他の実施形態では、Ｒ’はＣ１１アルキル及びＣ１１アルケニルから選択される。他の実施形態では、Ｒ’はＣ１２アルキル、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１３アルキル、Ｃ１３アルケニル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１５アルキル、Ｃ１５アルケニル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１６アルケニル、Ｃ１７アルキル、Ｃ１７アルケニル、Ｃ１８アルキル、及びＣ１８アルケニルから選択される。特定の実施形態では、Ｒ’は分岐されている（例えば、デカン−２−イル、ウンデカン−３−イル、ドデカン−４−イル、トリデカン−５−イル、テトラデカン−６−イル、２−メチルウンデカン−３−イル、２−メチルデカン−２−イル、３−メチルウンデカン−３−イル、４−メチルドデカン−４−イルまたはヘプタデカ−９−イル）。特定の実施形態では、Ｒ’は、
【化１０】
2019532657.tif 000027
である。
【０６０６】
特定の実施形態では、Ｒ’は、非置換Ｃ１−１８アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ’は、置換Ｃ１−１８アルキル（例えば、１−シクロプロピルノニルなどのＣ３−６炭素環で置換されているＣ１−１５アルキル）である。
【０６０７】
いくつかの実施形態では、Ｒ’’は、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ’’は、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、またはＣ８アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ’’は、Ｃ９アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１１アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１３アルキル、またはＣ１４アルキルである。
【０６０８】
いくつかの実施形態では、Ｍ’は−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、Ｍ’は−ＯＣ（Ｏ）−である。
【０６０９】
他の実施形態では、Ｍ’はアリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Ｍ’は、フェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる群より選択され得る。
【０６１０】
いくつかの実施形態では、Ｍは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、Ｍは、−ＯＣ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、Ｍは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−である。いくつかの実施形態では、Ｍは−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−である。
【０６１１】
他の実施形態では、Ｍは、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Ｍは、フェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる群より選択され得る。
【０６１２】
いくつかの実施形態では、Ｍは、Ｍ’と同じである。他の実施形態では、Ｍは、Ｍ’とは異なる。
【０６１３】
いくつかの実施形態では、各Ｒ５はＨである。このような特定の実施形態では、各Ｒ６もＨである。
【０６１４】
いくつかの実施形態では、Ｒ７はＨである。他の実施形態では、Ｒ７はＣ１−３アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、またはｉ−プロピル）である。
【０６１５】
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ５−１４アルキルまたはＣ５−１４アルケニルである。
【０６１６】
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３はＣ８アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３はＣ２アルキルである。他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３はＣ３アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３はＣ４アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ５アルキルである。他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３はＣ６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３はＣ７アルキルである。
【０６１７】
他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は異なる。特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、Ｃ１−７（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、またはＣ７アルキル）またはＣ９アルキルである。
【０６１８】
いくつかの実施形態では、Ｒ７及びＲ３はＨである。
【０６１９】
特定の実施形態では、Ｒ２はＨである。
【０６２０】
いくつかの実施形態では、ｍは５、７、または９である。
【０６２１】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は−（ＣＨ２）ｎＱ及び−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。
【０６２２】
いくつかの実施形態では、Ｑは、−ＯＲ、−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、炭素環、及び複素環からなる群より選択される。
【０６２３】
特定の実施形態では、Ｑは、−ＯＨである。
【０６２４】
特定の実施形態では、Ｑは、置換または非置換の５〜１０員ヘテロアリールであり、例えば、Ｑは、イミダゾール、ピリミジン、プリン、２−アミノ−１，９−ジヒドロ−６Ｈ−プリン−６−オン−９−イル（またはグアニン−９−イル）、アデニン−９−イル、シトシン−１−イル、またはウラシル−１−イルである。特定の実施形態では、Ｑは、例えば、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１−３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換されている、置換５〜１４員ヘテロシクロアルキルである。例えば、Ｑは、４−メチルピペラジニル、４−（４−メトキシベンジル）ピペラジニル、またはイソインドリン−２−イル−１，３−ジオンである。
【０６２５】
特定の実施形態では、Ｑは、非置換もしくは置換Ｃ６−１０アリール（例えば、フェニル）またはＣ３−６シクロアルキルである。
【０６２６】
いくつかの実施形態では、ｎは１である。他の実施形態では、ｎは２である。さらなる実施形態では、ｎは３である。特定の実施形態では、ｎは４である。例えば、Ｒ４は、−（ＣＨ２）２ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は−（ＣＨ２）３ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は−（ＣＨ２）４ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４はベンジルであり得る。例えば、Ｒ４は４−メトキシベンジルであり得る。
【０６２７】
いくつかの実施形態では、Ｒ４はＣ３−６炭素環である。いくつかの実施形態では、Ｒ４はＣ３−６シクロアルキルである。例えば、Ｒ４は、例えば、ＯＨ、ハロ、Ｃ１−６アルキルなどで必要に応じて置換されているシクロヘキシルであり得る。例えば、Ｒ４は、２−ヒドロキシシクロヘキシルであり得る。
【０６２８】
いくつかの実施形態では、ＲはＨである。
【０６２９】
いくつかの実施形態では、Ｒは、非置換Ｃ１−３アルキルまたは非置換Ｃ２−３アルケニルである。例えば、Ｒ４は、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＣＨ３であり得る。
【０６３０】
いくつかの実施形態では、Ｒは置換Ｃ１−３アルキル、例えば、ＣＨ２ＯＨである。例えば、Ｒ４は、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨであってもよい。
【０６３１】
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員の芳香族または非芳香族複素環を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、芳香族または非芳香族のいずれかで、必要に応じて置換されているＣ３−２０炭素環（例えば、Ｃ３−１８炭素環、Ｃ３−１５炭素環、Ｃ３−１２炭素環またはＣ３−１０炭素環）を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３−６炭素環を形成する。他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、シクロヘキシルまたはフェニル基などのＣ６炭素環を形成する。特定の実施形態では、複素環またはＣ３−６炭素環は、１つ以上のアルキル基で（例えば、同じ環原子または隣接もしくは非隣接環原子で）置換されている。例えば、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＣ５アルキル置換を保有するシクロヘキシルまたはフェニル基を形成し得る。特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３によって形成される複素環またはＣ３−６炭素環は、炭素環基で置換されている。例えば、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、シクロヘキシルまたはフェニル基を形成し得、これはシクロヘキシルで置換されている。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、シクロヘプチル、シクロペンタデカニル、またはナフチル基などのＣ７−１５炭素環を形成する。
【０６３２】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は−（ＣＨ２）ｎＱ及び−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。いくつかの実施形態では、Ｑは、−ＯＲ、−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、及び複素環からなる群より選択される。他の実施形態では、Ｑは、イミダゾール、ピリミジン、及びプリンからなる群より選択される。
【０６３３】
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、フェニル基などのＣ３−６炭素環を形成する。特定の実施形態では、複素環またはＣ３−６炭素環は、１つ以上のアルキル基で（例えば、同じ環原子または隣接もしくは非隣接環原子で）置換されている。例えば、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＣ５アルキル置換を保有するフェニル基を形成し得る。
【０６３４】
いくつかの実施形態では、本開示の薬学的組成物、式（Ｉ）の化合物は、以下からなる群より選択される：
【化１１】
2019532657.tif 000028
【化１２】
2019532657.tif 000029
【化１３】
2019532657.tif 000030
【化１４】
2019532657.tif 000031
【化１５】
2019532657.tif 000032
【化１６】
2019532657.tif 000033
【化１７】
2019532657.tif 000034
【化１８】
2019532657.tif 000035
【化１９】
2019532657.tif 000036
【化２０】
2019532657.tif 000037
【化２１】
2019532657.tif 000038
【化２２】
2019532657.tif 000039
【化２３】
2019532657.tif 000040
【化２４】
2019532657.tif 000041
【化２５】
2019532657.tif 000042
【化２６】
2019532657.tif 000043
【化２７】
2019532657.tif 000044
【化２８】
2019532657.tif 000045
【化２９】
2019532657.tif 000046
【化３０】
2019532657.tif 000047
【化３１】
2019532657.tif 000048
【化３２】
2019532657.tif 000049
【化３３】
2019532657.tif 000050
【化３４】
2019532657.tif 000051
【化３５】
2019532657.tif 000052
【化３６】
2019532657.tif 000053
【化３７】
2019532657.tif 000054
【化３８】
2019532657.tif 000055
【化３９】
2019532657.tif 000056
【化４０】
2019532657.tif 000057
ならびにその塩及び異性体。
【０６３５】
他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、化合物１〜化合物１４７、またはそれらの塩もしくは立体異性体からなる群より選択される。
【０６３６】
いくつかの実施形態では、中心ピペラジン部分を含むイオン性脂質が提供される。本明細書に記載の脂質は、哺乳動物細胞または臓器への治療剤及び／または予防剤の送達のための脂質ナノ粒子組成物において有利に使用され得る。例えば、本明細書に記載の脂質は、免疫原性がほとんどまたは全くない。例えば、本明細書に開示されている脂質化合物は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）と比較して低い免疫原性を有する。例えば、本明細書に開示される脂質と治療剤または予防剤とを含む製剤は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）及び同じ治療剤または予防剤を含む対応する製剤と比較して治療指数が大きい。
【０６３７】
いくつかの実施形態では、送達剤は式（ＩＩＩ）を有する脂質化合物
【化４１】
2019532657.tif 000058
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式
環Ａは
【化４２】
2019532657.tif 000059
であり；
ｔは１または２であり；
Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立してＣＨまたはＮから選択され；
ＺはＣＨ２であるかまたは存在せず、ここでＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）はそれぞれ単結合を表し；そして、Ｚが存在しないとき、破線（１）及び（２）は両方とも存在せず；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択され；
各Ｍは独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、ヘテロアリール基からなる群より選択され；
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は独立して、結合、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ−からなる群より選択され；
各Ｙは独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群より選択され；
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群より選択され；
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群より選択され；そして
各Ｒ’’は、独立して、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群より選択され、
式中、環Ａが
【化４３】
2019532657.tif 000060
であるならば、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうち少なくとも１つが−ＣＨ２−ではないか；及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４，及びＲ５のうちの少なくとも１つが−Ｒ”ＭＲ’である。
【０６３８】
いくつかの実施形態では、この化合物は、式（ＩＩＩａ１）−（ＩＩＩａ６）のうちいずれかである：
【化４４】
2019532657.tif 000061
【０６３９】
式（ＩＩＩ）の化合物または（ＩＩＩａ１）−（ＩＩＩａ６）のうちのいずれかとしては、適用可能な場合以下の特徴のうちの１つ以上が挙げられる。
【０６４０】
いくつかの実施形態では、環Ａは
【化４５】
2019532657.tif 000062
である。
【０６４１】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化４６】
2019532657.tif 000063
または
【化４７】
2019532657.tif 000064
である。
【０６４２】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化４８】
2019532657.tif 000065
である。
【０６４３】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化４９】
2019532657.tif 000066
である。
【０６４４】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化５０】
2019532657.tif 000067
である。
【０６４５】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化５１】
2019532657.tif 000068
であり、
式中環には、Ｎ原子にＸ２が接続されている。
【０６４６】
いくつかの実施形態では、ＺはＣＨ２である。
【０６４７】
いくつかの実施形態では、Ｚは存在しない。
【０６４８】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２の少なくとも１つはＮである。
【０６４９】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のそれぞれがＮである。
【０６５０】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のそれぞれがＣＨである。
【０６５１】
いくつかの実施形態では、Ａ１はＮであり、Ａ２はＣＨである。
【０６５２】
いくつかの実施形態では、Ａ１はＣＨであり、Ａ２はＮである。
【０６５３】
いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３の少なくとも１つは−ＣＨ２−ではない。例えば、特定の実施形態では、Ｘ１は−ＣＨ２−ではない。いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは−Ｃ（Ｏ）−である。
【０６５４】
いくつかの実施形態では、Ｘ２は−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−である。
【０６５５】
いくつかの実施形態では、Ｘ３は−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−である。他の実施形態では、Ｘ３は−ＣＨ２−である。
【０６５６】
いくつかの実施形態では、Ｘ３は結合または−（ＣＨ２）２−である。
【０６５７】
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は同じである。特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ４及びＲ５は同じである。特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は同じである。
【０６５８】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは−Ｒ”ＭＲ’である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの最大１つが−Ｒ”ＭＲ’である。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’であってもよく及び／またはＲ４及びＲ５のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’である。特定の実施形態では、少なくとも１個のＭは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、各Ｍは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＭは、−ＯＣ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、各Ｍは−ＯＣ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＭは−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、各Ｍは−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＲ”は、Ｃ３アルキルである。特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＲ’’はＣ５アルキルである。特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ５アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＲ’’はＣ６アルキルである。特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＲ’’はＣ７アルキルである。特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ７アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のＲ’は、Ｃ５アルキルである。特定の実施形態では、各Ｒ’は、Ｃ５アルキルである。他の実施形態では、少なくとも１個のＲ’はＣ１アルキルである。特定の実施形態では、各Ｒ’はＣ１アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ２アルキルである。特定の実施形態では、各Ｒ’は、Ｃ２アルキルである。
【０６５９】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の少なくとも１つはＣ１２アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のそれぞれは、Ｃ１２アルキルである。
【０６６０】
特定の実施形態では、化合物は、以下からなる群より選択される：
【化５２】
2019532657.tif 000069
【化５３】
2019532657.tif 000070
【化５４】
2019532657.tif 000071
【化５５】
2019532657.tif 000072
【化５６】
2019532657.tif 000073
【化５７】
2019532657.tif 000074
【化５８】
2019532657.tif 000075
【化５９】
2019532657.tif 000076
【化６０】
2019532657.tif 000077
【化６１】
2019532657.tif 000078
【化６２】
2019532657.tif 000079
【０６６１】
いくつかの実施形態では、上記送達剤は、化合物２３６を含む。
【０６６２】
いくつかの実施形態では、上記送達剤は、式（ＩＶ）を有する化合物
【化６３】
2019532657.tif 000080
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中
Ａ１及びＡ２はそれぞれ独立してＣＨまたはＮから選択され、Ａ１及びＡ２の少なくとも一方はＮであり；
ＺはＣＨ２であるかまたは存在せず、ここでＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）はそれぞれ単結合を表し；そして、Ｚが存在しないとき、破線（１）及び（２）は両方とも存在せず；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、Ｃ６−２０アルキル及びＣ６−２０アルケニルからなる群より選択され；
式中、環Ａが、
【化６４】
2019532657.tif 000081
であるならば、
ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は同じであり、ここでＲ１はＣ１２アルキルでも、Ｃ１８アルキルでも、またはＣ１８アルケニルでもないか；
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの１つのみがＣ６−２０アルケニルから選択されるか；
ｉｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つが、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の少なくとも１つの他のものとは異なる数の炭素原子を有するか；
ｉｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３がＣ６−２０アルケニルから選択され、ならびにＲ４及びＲ５がＣ６−２０アルキルから選択されるか；または
ｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３がＣ６−２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５がＣ６−２０アルケニルから選択される。
【０６６３】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＶａ）の化合物：
【化６５】
2019532657.tif 000082
のものである。
【０６６４】
適用可能であれば、式（ＩＶ）または（ＩＶａ）の化合物は、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
【０６６５】
いくつかの実施形態では、ＺはＣＨ２である。
【０６６６】
いくつかの実施形態では、Ｚは存在しない。
【０６６７】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２の少なくとも一方はＮである。
【０６６８】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のそれぞれはＮである。
【０６６９】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のそれぞれはＣＨである。
【０６７０】
いくつかの実施形態では、Ａ１はＮであり、Ａ２はＣＨである。
【０６７１】
いくつかの実施形態では、Ａ１はＣＨであり、Ａ２はＮである。
【０６７２】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は同じであり、かつＣ１２アルキルでも、Ｃ１８アルキルでも、またはＣ１８アルケニルでもない。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は同じであり、Ｃ９アルキルまたはＣ１４アルキルである。
【０６７３】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの１つのみが、Ｃ６−２０アルケニルから選択される。特定のこのような実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が同数の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、Ｒ４はＣ５−２０アルケニルから選択される。例えば、Ｒ４は、Ｃ１２アルケニルであっても、またはＣ１８アルケニルであってもよい。
【０６７４】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの他の少なくとも１つとは異なる数の炭素原子を有する。
【０６７５】
特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６−２０アルケニルから選択され、そしてＲ４及びＲ５は、Ｃ６−２０アルキルから選択される。他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６−２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６−２０アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同数の炭素原子を有する、及び／またはＲ４及びＲ５は同数の炭素原子を有する。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、６、８、９、１２、１４、または１８個の炭素原子を有してもよい。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、Ｃ１８アルケニル（例えば、リノレイル）である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、６、８、９、１２、または１４個の炭素原子を含むアルキル基である。
【０６７６】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。他の実施形態では、Ｒ３は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。さらなる実施形態では、Ｒ４は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。
【０６７７】
いくつかの実施形態では、上記化合物は、以下からなる群より選択される：
【化６６】
2019532657.tif 000083
【化６７】
2019532657.tif 000084
【化６８】
2019532657.tif 000085
【０６７８】
他の実施形態では、送達剤は式（Ｖ）を有する化合物
【化６９】
2019532657.tif 000086
またはその塩もしくは立体異性体を含み、ここで
Ａ３はＣＨまたはＮであり；
Ａ４はＣＨ２またはＮＨであり；ならびにＡ３及びＡ４の少なくとも一方はＮまたはＮＨであり；
ＺはＣＨ２であるかまたは存在せず、ここでＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）はそれぞれ単結合を表し；そして、Ｚが存在しないとき、破線（１）及び（２）は両方とも存在せず；
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、独立して、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択され；
各Ｍは独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され；
Ｘ１及びＸ２は独立して、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群より選択され；
各Ｙは独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群より選択され；
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群より選択され；
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群より選択され；そして
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群より選択される。
【０６７９】
いくつかの実施形態では、化合物は式（Ｖａ）の化合物：
【化７０】
2019532657.tif 000087
のものである。
【０６８０】
適用可能であれば、式（Ｖ）または（Ｖａ）の化合物は、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
【０６８１】
いくつかの実施形態では、ＺはＣＨ２である。
【０６８２】
いくつかの実施形態では、Ｚは存在しない。
【０６８３】
いくつかの実施形態では、Ａ３及びＡ４の少なくとも一方はＮまたはＮＨである。
【０６８４】
いくつかの実施形態では、Ａ３はＮであり、Ａ４はＮＨである。
【０６８５】
いくつかの実施形態では、Ａ３はＮであり、Ａ４はＣＨ２である。
【０６８６】
いくつかの実施形態では、Ａ３はＣＨであり、Ａ４はＮＨである。
【０６８７】
いくつかの実施形態では、Ｘ１及びＸ２の少なくとも一方は−ＣＨ２−ではない。例えば、特定の実施形態では、Ｘ１は−ＣＨ２−ではない。いくつかの実施形態では、Ｘ１及びＸ２の少なくとも一方は−Ｃ（Ｏ）−である。
【０６８８】
いくつかの実施形態では、Ｘ２は−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−である。
【０６８９】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、独立して、Ｃ５−２０アルキル及びＣ５−２０アルケニルからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は同じである。特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、またはＣ１４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３がＣ１８アルケニルである。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、リノレイルであってもよい。
【０６９０】
いくつかの実施形態では、化合物は、以下からなる群より選択される：
【化７１】
2019532657.tif 000088
【０６９１】
他の実施形態では、送達剤は、式（ＶＩ）：
【化７２】
2019532657.tif 000089
を有する化合物、またはその塩もしくは立体異性体を含み、ここで
Ａ６及びＡ７はそれぞれ独立してＣＨまたはＮから選択され、ここでＡ６及びＡ７の少なくとも１つはＮであり；
ＺはＣＨ２であるかまたは存在せず、ここでＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）はそれぞれ単結合を表し；Ｚが存在しないとき、破線（１）及び（２）は両方とも存在しない；
Ｘ４及びＸ５は独立して、−ＣＨ２−、−ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群より選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ独立して、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群より選択され；
各Ｍは独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群より選択され；
各Ｙは独立してＣ３−６炭素環であり；
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群より選択され；
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群より選択され；
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群より選択され；そして
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群より選択される。
【０６９２】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ独立して、Ｃ６−２０アルキル及びＣ６−２０アルケニルからなる群より選択される。
【０６９３】
いくつかの実施形態では、Ｒ１とＲ２とは同じである。特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ４とＲ５とは同じである。特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は同じである。
【０６９４】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つはＣ９−１２アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のそれぞれは、独立して、Ｃ９、Ｃ１２またはＣ１４アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のそれぞれは、Ｃ９アルキルである。
【０６９５】
いくつかの実施形態では、Ａ６はＮであり、かつＡ７はＮである。いくつかの実施形態では、Ａ６はＣＨでありかつＡ７はＮである。
【０６９６】
いくつかの実施形態では、Ｘ４は−ＣＨ２−であり、かつＸ５は−Ｃ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、Ｘ４及びＸ５は−Ｃ（Ｏ）−である。
【０６９７】
いくつかの実施形態では、Ａ６がＮでありかつＡ７がＮである場合、Ｘ４及びＸ５の少なくとも一方は−ＣＨ２−ではなく、例えば、Ｘ４及びＸ５の少なくとも一方は−Ｃ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、Ａ６がＮであり、かつＡ７がＮである場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の少なくとも１つは−Ｒ”ＭＲ’である。
【０６９８】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは−Ｒ”ＭＲ’ではない。
【０６９９】
いくつかの実施形態では、上記化合物は
【化７３】
2019532657.tif 000090
である。
【０７００】
他の実施形態では、上記送達剤は、以下の式：
【化７４】
2019532657.tif 000091
を有する化合物を含む。
【０７０１】
本明細書に開示されている脂質化合物のアミン部分は、特定の条件下でプロトン化され得る。例えば、式（Ｉ）による脂質の中心アミン部分は、典型的には、アミノ部分のｐＫａ未満のｐＨでプロトン化（すなわち、正に荷電）されており、ｐＫａを超えるｐＨでは実質的に荷電されていない。そのような脂質は、イオン性アミノ脂質と呼んでもよい。
【０７０２】
特定の一実施形態では、イオン性アミノ脂質は化合物１８である。別の実施形態では、イオン性アミノ脂質は化合物２３６である。
【０７０３】
いくつかの実施形態では、イオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中で、約１モル％〜９９モル％の範囲である。
【０７０４】
一実施形態では、イオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中で、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９モル％である。
【０７０５】
一実施形態では、イオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中で、約３０モル％〜約７０モル％、約３５モル％〜約６５モル％、約４０モル％〜約６０モル％、及び約４５モル％〜約５５モル％の範囲である。
【０７０６】
１つの特定の実施形態では、イオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中で、約５０モル％である。
【０７０７】
本明細書に開示されるイオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物に加えて、本明細書に開示される薬学的組成物の脂質組成物は、リン脂質、構造脂質、ＰＥＧ−脂質、及びそれらの任意の組み合わせなどの追加の構成要素を含んでもよい。
【０７０８】
ｂ．リン脂質
本明細書に開示される薬学的組成物の脂質組成物は、１つ以上のリン脂質、例えば、１つ以上の飽和もしくは（多価）不飽和リン脂質、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つ以上の脂肪酸部分を含む。
【０７０９】
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２−リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。
【０７１０】
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ−リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。
【０７１１】
特定のリン脂質は膜への融合を促進し得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つ以上の負荷電リン脂質と相互作用し得る。リン脂質の膜への融合は、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つ以上の要素（例えば、治療剤）が膜を通過すること、例えば、１つ以上の要素の標的組織への送達を可能にし得る。
【０７１２】
分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換を有する天然種を含む非天然リン脂質種もまた企図される。例えば、リン脂質は、１つ以上のアルキン（例えば、１つ以上の二重結合が三重結合で置き換えられているアルケニル基）で官能化されても、または架橋されてもよい。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドへの曝露時に銅触媒付加環化を受け得る。そのような反応は、膜透過もしくは細胞認識を容易にするためにナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化することにおいて、または標的化もしくは画像化部分（例えば、染料）などの有用な構成要素にナノ粒子組成物を結合することにおいて有用であり得る。
【０７１３】
リン脂質としては、限定するものではないが、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸などが挙げられる。リン脂質としてはまた、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴ糖脂質も挙げられる。
【０７１４】
リン脂質の例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：
【化７５】
2019532657.tif 000092
【化７６】
2019532657.tif 000093
【化７７】
2019532657.tif 000094
【０７１５】
特定の実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、ＤＳＰＣ（１，２−ジオクタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）の類似体またはバリアントである。特定の実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、式（ＩＸ）の化合物：
【化７８】
2019532657.tif 000095
（またはその塩であり、式中：
各Ｒ１は独立して必要に応じて置換されているアルキルであるか；あるいは必要に応じて２つのＲ１が介在原子と一緒になって連結され、必要に応じて置換されている単環式カルボシクリルまたは必要に応じて置換されている単環式ヘテロシクリルを形成するか；あるいは必要に応じて３つのＲ１が介在原子と一緒になって連結され、必要に応じて置換されている二環式カルボシクリルを形成するかまたは必要に応じて置換二環式ヘテロシクリルを形成し；
ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
ｍは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
Ａは、以下の式：
【化７９】
2019532657.tif 000096
のものであり；
Ｌ２の各例は独立して、結合または必要に応じて置換されているＣ１−６アルキレンであり、ここで必要に応じて置換されているＣ１−６アルキレンの１つのメチレン単位は、必要に応じて−Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、または−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−で置換されており；
Ｒ２の各実例は、独立して、必要に応じて置換されているＣ１−３０アルキル、必要に応じて置換されているＣ１−３０アルケニル、または必要に応じて置換されているＣ１−３０アルキニルであり；必要に応じて、ここで、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は独立して、必要に応じて置換されているカルボシクリレン、必要に応じて置換されているヘテロシクリレン、必要に応じて置換されているアリーレン、必要に応じて置換されているヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−で置き換えられ；
ＲＮの各実例は、独立して、水素、必要に応じて置換されているアルキル、または窒素保護基であり；
環Ｂは、必要に応じて置換されているカルボシクリル、必要に応じて置換されているヘテロシクリル、必要に応じて置換されているアリール、または必要に応じて置換されているヘテロアリールであり；そして
ｐは１または２であり；
ただし、上記化合物は式：
【化８０】
2019532657.tif 000097
のものではなく、式中、Ｒ２の各実例は、独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである。
【０７１６】
ｉ）リン脂質ヘッドの修飾
特定の実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、修飾リン脂質ヘッド（例えば、修飾コリン基）を含む。特定の実施形態では、修飾頭部を有するリン脂質は、修飾四級アミンを有するＤＳＰＣ、またはその類似体である。例えば、式（ＩＸ）の実施形態では、少なくとも１つのＲ１はメチルではない。特定の実施形態では、Ｒ１の少なくとも１つは、水素でもまたはメチルでもない。特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下の式；
【化８１】
2019532657.tif 000098
のうちの１つのもの、
またはその塩であり、式中：
各ｔは独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
各ｕは独立して０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；かつ
各ｖは独立して１、２、または３である。
【０７１７】
特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下の式：
【化８２】
2019532657.tif 000099
のうちの１つのもの、
またはその塩である。
【０７１８】
特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下：
【化８３】
2019532657.tif 000100
【化８４】
2019532657.tif 000101
のうちの１つ、
またはその塩である。
【０７１９】
特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ−ａ）：
【化８５】
2019532657.tif 000102
のもの、
またはその塩である。
【０７２０】
特定の実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、修飾コアを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の修飾コアを有するリン脂質は、修飾コア構造を有する、ＤＳＰＣまたはその類似体である。例えば、式（ＩＸ−ａ）の特定の実施態様では、基Ａは、以下の式：
【化８６】
2019532657.tif 000103
のものではない。
【０７２１】
特定の実施形態では、式（ＩＸ−ａ）の化合物は、以下の式のうちの１つ：
【化８７】
2019532657.tif 000104
のもの、
またはその塩である。
【０７２２】
特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下：  
【化８８】
2019532657.tif 000105
のうち１つ、
またはその塩である。
【０７２３】
特定の実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を含む。特定の実施形態では、本発明において有用なリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環式部分を有する、ＤＳＰＣ（１，２−ジオクタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、またはその類似体である。特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ−ｂ）のもの：
【化８９】
2019532657.tif 000106
またはその塩である。
【０７２４】
特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｂ）の化合物は、式（ＩＸ−ｂ−１）のもの：
【化９０】
2019532657.tif 000107
またはその塩であり、式中：
ｗは、０、１、２、または３である。
【０７２５】
特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｂ）の化合物は、式（ＩＸ−ｂ−２）のもの：
【化９１】
2019532657.tif 000108
またはその塩である。
【０７２６】
特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｂ）の化合物は、式（ＩＸ−ｂ−３）のもの：
【化９２】
2019532657.tif 000109
またはその塩である。
【０７２７】
特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｂ）の化合物は、式（ＩＸ−ｂ−４）のもの：
【化９３】
2019532657.tif 000110
またはその塩である。
【０７２８】
特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｂ）の化合物は、以下：
【化９４】
2019532657.tif 000111
のうちの１つのものまたはその塩である。
【０７２９】
（ｉｉ）リン脂質テール修飾
特定の実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、修飾テールを含む。特定の実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、修飾テールを有するＤＳＰＣ（１，２−ジオクタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、またはその類似体である。本明細書に記載される場合、「修飾テール」とは、より短いまたはより長い脂肪鎖、分岐が導入された脂肪鎖、置換が導入された脂肪鎖、１つ以上のメチレンが環状基またはヘテロ原子基によって置き換えられる脂肪鎖、またはそれらの任意の組み合わせを有するテールであり得る。例えば、特定の実施形態では、（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ−ａ）のものまたはその塩であり、式中、Ｒ２の少なくとも１つの事例は、必要に応じて、Ｃ１−３０アルキルで置換されているＲ２のそれぞれの事例であり、ここでＲ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、必要に応じて置換されているカルボシクリレン、必要に応じて置換されているヘテロシクリレン、必要に応じて置換されているアリーレン、必要に応じて置換されているヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−で置き換えられる。
【０７３０】
特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ−ｃ）のもの：
【化９５】
2019532657.tif 000112
またはその塩であり、式中：
各ｘは独立して、０〜３０の整数（包括的）であり；そして
各々の事例は、Ｇであり、独立して、必要に応じて置換されているカルボシクリレン、必要に応じて置換されているヘテロシクリレン、必要に応じて置換されているアリーレン、必要に応じて置換されているヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−からなる群より選択される。各々の可能性は、本発明の別の実施形態に相当する。
【０７３１】
特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、式（ＩＸ−ｃ−１）のもの：
【化９６】
2019532657.tif 000113
またはその塩であり、式中：
ｖの各々の事例は、独立して１、２、または３である。
【０７３２】
特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、式（ＩＸ−ｃ−２）のもの：
【化９７】
2019532657.tif 000114
またはその塩である。
【０７３３】
特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、以下の式のもの：
【化９８】
2019532657.tif 000115
またはその塩である。
【０７３４】
特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、以下：
【化９９】
2019532657.tif 000116
またはその塩である。
【０７３５】
特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、式（ＩＸ−ｃ−３）のもの：
【化１００】
2019532657.tif 000117
またはその塩である。
【０７３６】
特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、以下の式のもの：
【化１０１】
2019532657.tif 000118
またはその塩である。
【０７３７】
特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、以下：
【化１０２】
2019532657.tif 000119
またはその塩である。
【０７３８】
特定の実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、第四級アミンをホスホリル基に連結するアルキル鎖がエチレンではない（例えば、ｎが２ではない）修飾ホスホコリン部分を含む。したがって、特定の実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、式（ＩＸ）の化合物であり、式中、ｎは、１、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。例えば、特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの：
【化１０３】
2019532657.tif 000120
またはその塩である。
【０７３９】
特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下：
【化１０４】
2019532657.tif 000121
【化１０５】
2019532657.tif 000122
のうちの１つ、またはその塩である。
【０７４０】
ｃ．代替の脂質
特定の実施形態では、本発明のリン脂質の代わりに代替の脂質が使用される。そのような代替脂質の非限定的な例としては以下が挙げられる：
【化１０６】
2019532657.tif 000123
【０７４１】
ｄ．構造脂質
本明細書に開示される薬学的組成物の脂質組成物は、１つ以上の構造脂質を含んでもよい。本明細書中で使用される場合、「構造脂質」という用語は、ステロール及びステロール部分を含有する脂質を指す。
【０７４２】
脂質ナノ粒子への構造脂質の組み込みは、粒子中の他の脂質の凝集を軽減することを補助し得る。構造脂質は、限定するものではないが、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ−トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド、及びそれらの混合物を含む群から選択され得る。いくつかの実施形態では、構造脂質はステロールである。本明細書で定義される場合、「ステロール」とは、ステロイドアルコールからなるステロイドのサブグループである。特定の実施形態では、構造脂質はステロイドである。特定の実施形態では、構造脂質はコレステロールである。特定の実施形態では、構造脂質はコレステロールの類似体である。特定の実施形態では、構造脂質はアルファ−トコフェロールである。構造脂質の例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：
【化１０７】
2019532657.tif 000124
【０７４３】
一実施形態では、本明細書に開示される薬学的組成物の脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロールなどのステロール）の量は、約２０モル％〜約６０モル％、約２５モル％〜約５５モル％、約３０モル％〜約５０モル％、または約３５モル％〜約４５モル％の範囲である。
【０７４４】
一実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロールなどのステロール）の量は、約２５モル％〜約３０モル％、約３０モル％〜約３５モル％、または約３５〜約４０モル％の範囲である。
【０７４５】
一実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロールなどのステロール）の量は、約２４モル％、約２９モル％、約３４モル％、または約３９モル％である。
【０７４６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロールなどのステロール）の量は、少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０モル％である。
【０７４７】
ｅ．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質
本明細書中に開示される薬学的組成物の脂質組成物は、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含み得る。
【０７４８】
本明細書で使用される場合、「ＰＥＧ脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を指す。ＰＥＧ脂質の非限定的な例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧセラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−Ｃｅｒ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが挙げられる。そのような脂質はまた、ＰＥＧ化脂質とも呼ばれる。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であってもよい。
【０７４９】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質としては、限定するものではないが、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ−ジステアリルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）、ＰＥＧ−ジパルメトレイル、ＰＥＧ−ジオレイル、ＰＥＧ−ジステアリル、ＰＥＧ−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）が挙げられる。
【０７５０】
一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群より選択される。
【０７５１】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質の脂質部分としては、約Ｃ１４〜約Ｃ２２、好ましくは約Ｃ１４〜約Ｃ１６の長さを有するものを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分、例えば、ｍＰＥＧ−ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００または２０，０００ダルトンのサイズを有する。一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。
【０７５２】
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含み得る。非拡散性ＰＥＧの非限定的な例としては、ＰＥＧ−ＤＳＧ及びＰＥＧ−ＤＳＰＥが挙げられる。
【０７５３】
ＰＥＧ−脂質は、米国特許第８１５８６０１号及び国際公開第ＷＯ２０１５／１３０５８４Ａ２号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものなど、当該技術分野において公知である。
【０７５４】
一般に、本明細書に記載されている様々な式の他の脂質構成要素（例えば、ＰＥＧ脂質）のいくつかは、その全体が参考として組み込まれる、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ」と題される、２０１６年１２月１０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９号に記載のとおり合成され得る。
【０７５５】
脂質ナノ粒子組成物の脂質構成要素は、ポリエチレングリコールを含む１つ以上の分子、例えば、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含んでもよい。そのような種は、代わりにＰＥＧ化脂質も呼ばれてもよい。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む非限定的な群から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であってもよい。
【０７５６】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ  ＤＭＧの修飾型である。ＰＥＧ−ＤＭＧは以下の構造を有する：
【化１０８】
2019532657.tif 000125
【０７５７】
一実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０９９７５５号に記載されているＰＥＧ化脂質であってもよい。本明細書に記載の任意のこれらの例示的なＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ鎖上にヒドロキシル基を含むように修飾され得る。特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ＯＨ脂質である。本明細書で一般的に定義されるように、「ＰＥＧ−ＯＨ脂質」（本明細書では「ヒドロキシ−ＰＥＧ化脂質」とも呼ばれる）は、脂質上に１つ以上のヒドロキシル（−ＯＨ）基を有するＰＥＧ化脂質である。特定の実施形態では、ＰＥＧ−ＯＨ脂質は、ＰＥＧ鎖上に１つ以上のヒドロキシル基を含む。特定の実施形態では、ＰＥＧ−ＯＨまたはヒドロキシ−ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ鎖の末端に−ＯＨ基を含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
【０７５８】
特定の実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩＩ）の化合物である。本明細書で提供されるのは、式（ＶＩＩ）の化合物
【化１０９】
2019532657.tif 000126
またはその塩であり、式中：
Ｒ３は、−ＯＲＯであり；
ＲＯは、水素、必要に応じて置換されているアルキル、または酸素保護基であり；
ｒは１〜１００の整数（包括的）であり；
Ｌ１は、必要に応じて置換されているＣ１−１０アルキレンであり、ここで、必要に応じて置換されているＣ１−１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンは独立して、必要に応じて置換されているカルボシクリレン、必要に応じて置換されているヘテロシクリレン、必要に応じて置換されているアリーレン、必要に応じて置換されているヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ）、−ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ）、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置換されており；
Ｄは、クリックケミストリーまたは生理学的条件下で切断可能な部分によって得られる部分であり；
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
Ａは、式：
【化１１０】
2019532657.tif 000127
のものであり；
Ｌ２の各事例は独立して結合または必要に応じて置換されているＣ１−６アルキレンであり、ここで必要に応じて置換されているＣ１−６アルキレンの１つのメチレン単位は必要に応じて、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置換されており；
Ｒ２の各事例は、独立して、必要に応じて置換されているＣ１−３０アルキル、必要に応じて置換されているＣ１−３０アルケニル、または必要に応じて置換されているＣ１−３０アルキニルであり；必要に応じてここで、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は独立して、必要に応じて置換されているカルボシクリレン、必要に応じて置換されているヘテロシクリレン、必要に応じて置換されているアリーレン、必要に応じて置換されているヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、−Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置換されており；
ＲＮの各事例は独立して、水素、必要に応じて置換されているアルキル、または窒素保護基であり；
環Ｂは必要に応じて置換されているカルボシクリル、必要に応じて置換されているヘテロシクリル、必要に応じて置換されているアリール、または必要に応じて置換されているヘテロアリールであり；そして
ｐは１または２である。
【０７５９】
特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、ＰＥＧ−ＯＨ脂質である（すなわち、Ｒ３は−ＯＲＯであり、ＲＯは水素である）。特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ−ＯＨ）のもの：
【化１１１】
2019532657.tif 000128
またはその塩である。
【０７６０】
特定の実施形態では、Ｄは、クリックケミストリー（例えば、トリアゾール）によって得られる部分である。特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ−ａ−１）もしくは（ＶＩＩ−ａ−２）のもの：
【化１１２】
2019532657.tif 000129
またはその塩である。
【０７６１】
特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式の１つのもの：
【化１１３】
2019532657.tif 000130
またはその塩であり、式中
ｓは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。
【０７６２】
特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式の１つのもの：
【化１１４】
2019532657.tif 000131
またはその塩である。
【０７６３】
特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式の１つのもの：
【化１１５】
2019532657.tif 000132
【化１１６】
2019532657.tif 000133
またはその塩である。
【０７６４】
特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式の１つのもの：
【化１１７】
2019532657.tif 000134
またはその塩である。
【０７６５】
特定の実施形態では、Ｄは、生理学的条件下で切断可能な部分（例えば、エステル、アミド、カーボネート、カルバメート、尿素）である。特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ−ｂ−１）または（ＶＩＩ−ｂ−２）のもの：
【化１１８】
2019532657.tif 000135
またはその塩である。
【０７６６】
特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ−ｂ−１−ＯＨ）または（ＶＩＩ−ｂ−２−ＯＨ）のもの：
【化１１９】
2019532657.tif 000136
またはその塩である。
【０７６７】
特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式の１つのもの：
【化１２０】
2019532657.tif 000137
またはその塩である。
【０７６８】
特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式の１つのもの：
【化１２１】
2019532657.tif 000138
またはその塩である。
【０７６９】
特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式の１つのもの：
【化１２２】
2019532657.tif 000139
またはその塩である。
【０７７０】
特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式の１つのもの：
【化１２３】
2019532657.tif 000140
またはその塩である。
【０７７１】
特定の実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ化脂肪酸である。特定の実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩＩＩ）の化合物である。本明細書で提供されるのは、式（ＶＩＩＩ）の化合物：
【化１２４】
2019532657.tif 000141
またはその塩であり、式中：
Ｒ３は−ＯＲＯであり；
ＲＯは水素、必要に応じて置換されているアルキルまたは酸素保護基であり；
ｒは１〜１００の整数（包括的）であり；
Ｒ５は、必要に応じて置換されているＣ１０−４０アルキル、必要に応じて置換されているＣ１０−４０アルケニル、または必要に応じて置換されているＣ１０−４０アルキニルであり；かつ必要に応じてＲ５の１つ以上のメチレン基は、必要に応じて置換されていているカルボシクリレン、必要に応じて置換されているヘテロシクリレン、必要に応じて置換されているアリーレン、必要に応じて置換されているヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、−Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、−Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、−Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置換され；そして
ＲＮの各例は独立して、水素、必要に応じて置換されているアルキル、または窒素保護基である。
【０７７２】
特定の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩＩ−ＯＨ）のもの：
【化１２５】
2019532657.tif 000142
またはその塩である。いくつかの実施形態では、ｒは、４５である。
【０７７３】
特定の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの：
【化１２６】
2019532657.tif 000143
またはその塩である。いくつかの実施形態では、ｒは４５である。
【０７７４】
さらに他の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は以下：
【化１２７】
2019532657.tif 000144
またはその塩である。
【０７７５】
一実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、
【化１２８】
2019532657.tif 000145
である。
【０７７６】
一実施形態では、本明細書に開示される薬学的組成物の脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、約０．１モル％〜約５モル％、約０．５モル％〜約５モル％、約１モル％〜約５モル％、約１．５モル％〜約５モル％、約２モル％〜約５モル％、約０．１モル％〜約４モル％、約０．５モル％〜約４モル％、約１モル％〜約４モル％、約１．５モル％〜約４モル％、約２モル％〜約４モル％、約０．１モル％〜約３モル％、約０．５モル％〜約３モル％、約１モル％〜約３モル％、約１．５モル％〜約３モル％、約２モル％〜約３モル％、約０．１モル％〜約２モル％、約０．５モル％〜約２モル％、約１モル％〜約２モル％、約１．５モル％〜約２モル％、約０．１モル％〜約１．５モル％、約０．５モル％〜約１．５モル％、または約１モル％〜約１．５モル％の範囲である。
【０７７７】
一実施形態では、本明細書に開示されている脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、約２モル％である。一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中のＰＥＧ−脂質の量は、約１．５モル％である。
【０７７８】
一の実施形態では、本明細書に開示されている脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５モル％である。
【０７７９】
いくつかの態様では、本明細書に開示されている薬学的組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ−脂質を含まない。
【０７８０】
ｆ．他のイオン性アミノ脂質
本明細書に開示される薬学的組成物の脂質組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）による脂質に加えてまたはその代わりに、１つ以上のイオン性アミノ脂質を含み得る。
【０７８１】
イオン性脂質は、３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１−［２−（ジドデシルアミノ）エチル］−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４−トリドデシル−１，４−ピペラジンジエタノールアミン（ＫＬ２２）、１４，２５ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、（１３Ｚ，１６５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニドコサ−１３−１６−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）、２（｛８［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣｌｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）−２−（｛８［（３β）］−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、及び（２Ｓ）−２−（｛８［（３β）コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣｌｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる非限定的な群から選択される。これらに加えて、イオン性アミノ脂質はまた、環状アミン基を含む脂質であってもよい。
【０７８２】
イオン性脂質はまた、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１７／０７５５３１Ａ１号に開示されている化合物であってもよい。例えば、イオン性アミノ脂質としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：
【化１２９】
2019532657.tif 000146
及びそれらの任意の組み合わせ。
【０７８３】
イオン性脂質はまた、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１５／１９９９５２Ａ１号に開示されている化合物であってもよい。例えば、イオン性アミノ脂質としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：
【化１３０】
2019532657.tif 000147
【化１３１】
2019532657.tif 000148
【化１３２】
2019532657.tif 000149
及びそれらの任意の組み合わせ。
【０７８４】
ｇ．ナノ粒子組成物
本明細書に開示される薬学的組成物の脂質組成物は、上記のものに加えて１つ以上の構成要素を含み得る。例えば、脂質組成物は、１つ以上の透過性増強剤分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤（例えば、界面活性剤）、または他の構成要素を含んでもよい。例えば、透過性増強剤分子は、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載されている分子であってもよい。炭水化物は、単糖（例えば、グルコース）及び多糖（例えば、グリコーゲンならびにそれらの誘導体及び類似体）を含んでもよい。
【０７８５】
ポリマーは、本明細書に開示されている薬学的組成物（例えば、脂質ナノ粒子形態の薬学的組成物）を封入するかまたは部分的に封入するために含まれてもよく、及び／または使用されてもよい。ポリマーは生分解性であっても、及び／または生体適合性であってもよい。ポリマーは、限定するものではないが、ポリアミン類、ポリエーテル類、ポリアミド類、ポリエステル類、ポリカルバメート類、ポリウレア類、ポリカーボネート類、ポリスチレン類、ポリイミド類、ポリスルホン類、ポリウレタン類、ポリアセチレン類、ポリエチレン類、ポリエチレンイミン類、ポリイソシアネート類、ポリアクリレート類、ポリメタクリレート類、ポリアクリロニトリル類、及びポリアリレート類から選択され得る。
【０７８６】
脂質組成物とポリヌクレオチド範囲との間の比率は、約１０：１〜約６０：１（ｗｔ／ｗｔ）であってもよい。
【０７８７】
いくつかの実施形態では、脂質組成物とポリヌクレオチドとの間の比率は、約１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１または６０：１（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。いくつかの実施形態では、治療剤をコードするポリヌクレオチドに対する脂質組成物のｗｔ／ｗｔ比は、約２０：１または約１５：１である。
【０７８８】
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、脂質：ポリヌクレオチド重量比５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１もしくは７０：１で、またはある範囲またはこれらの任意の比率、例えば、限定するものではないが、５：１〜約１０：１、約５：１〜約１５：１、約５：１〜約２０：１、約５：１〜約２５：１、約５：１〜約３０：１、約５：１〜約３５：１、約５：１〜約４０：１、約５：１〜約４５：１、約５：１〜約５０：１、約５：１〜約５５：１、約５：１〜約６０：１、約５：１〜約７０：１、約１０：１〜約１５：１、約１０：１〜約２０：１、約１０：１〜約２５：１、約１０：１〜約３０：１、約１０：１〜約３５：１、約１０：１〜約４０：１、約１０：１〜約４５：１、約１０：１〜約５０：１、約１０：１〜約５５：１、約１０：１〜約６０：１、約１０：１〜約７０：１、約１５：１〜約２０：１、約１５：１〜約２５：１、約１５：１〜約３０：１、約１５：１〜約３５：１、約１５：１〜約４０：１、約１５：１〜約４５：１、約１５：１〜約５０：１、約１５：１〜約５５：１、約１５：１〜約６０：１もしくは約１５：１〜約７０：１で含んでもよい。
【０７８９】
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチドを、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ、例えば、限定するものではないが、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、１．９ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌまたは２．０ｍｇ／ｍｌ超などの濃度で含んでもよい。
【０７９０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される薬学的組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として処方される。したがって、本開示はまた、（ｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物などの送達剤を含む脂質組成物、及び（ｉｉ）目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物を提供する。そのようなナノ粒子組成物において、本明細書に開示される脂質組成物は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをカプセル化し得る。
【０７９１】
ナノ粒子組成物は、典型的にはマイクロメートル以下程度の大きさであり、脂質二重層を含んでもよい。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質小胞）、及びリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、５００ｎｍ以下の直径を有する脂質二重層を有するリポソームであってもよい。
【０７９２】
ナノ粒子組成物は、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム、及びリポプレックスを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、１つ以上の脂質二重層を含む小胞である。特定の実施形態では、ナノ粒子組成物は、水性区画によって分離された２つ以上の同心二重層を含む。脂質二重層は、官能化されてもよいし、及び／または互いに架橋されてもよい。脂質二重層は、１つ以上のリガンド、タンパク質、またはチャネルを含んでもよい。
【０７９３】
いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）による少なくとも１つの化合物を含む。例えば、ナノ粒子組成物は、１つ以上の化合物１〜１４７、または１つ以上の化合物１〜３４２を含んでもよい。ナノ粒子組成物はまた、様々な他の構成要素を含んでもよい。例えば、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）による脂質に加えて、以下のような１つ以上の他の脂質を含んでもよい。（ｉ）少なくとも１つのリン脂質、（ｉｉ）少なくとも１つの構造脂質、（ｉｉｉ）少なくとも１つのＰＥＧ脂質、または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせ。例えば、式ＩＩＩによる脂質が本発明の脂質ナノ粒子複合体に使用される場合、構造脂質の包含は任意であり得る。
【０７９４】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）及びリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含む。
【０７９５】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）及びリン脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）を含む。
【０７９６】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）からなるかまたは本質的になる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）及びリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）からなるかまたは本質的になる脂質組成物を含む。
【０７９７】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）からなるか、または本質的にそれからなる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）及びリン脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）からなるかまたは本質的になる脂質組成物を含む。
【０７９８】
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン性脂質、構造脂質、リン脂質、ＰＥＧ修飾脂質、及びｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール及びリン脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約２０〜６０％のイオン性脂質：約５〜２５％のリン脂質：約２５〜５５％のステロール；及び約０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質というモル比を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約５０％のイオン性脂質、約１．５％のＰＥＧ修飾脂質、約３８．５％のコレステロール、及び約１０％のリン脂質というモル比を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約５５％のイオン性脂質、約２．５％のＰＥＧ脂質、約３２．５％のコレステロール、及び約１０％のリン脂質というモル比を含む。いくつかの実施形態では、イオン性脂質は、イオン性アミノ脂質であり、中性脂質はリン脂質であり、ステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、５０：３８．５：１０：１．５のイオン性脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ脂質というモル比を有する。いくつかの実施形態では、イオン性脂質は化合物１８または化合物２３６であり、ＰＥＧ脂質は化合物４２８またはＰＥＧ−ＤＭＧである。
【０７９９】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、５０：３８．５：１０：１．５の化合物１８：コレステロール：リン脂質：化合物４２８というモル比を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、５０：３８．５：１０：１．５の化合物１８：コレステロール：ＤＳＰＣ：化合物４２８というモル比を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、５０：３８．５：１０：１．５の化合物１８：コレステロール：リン脂質：ＰＥＧ−ＤＭＧというモル比を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、５０：３８．５：１０：１．５の化合物１８：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ−ＤＭＧというモル比を有する。
【０８００】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、５０：３８．５：１０：１．５の化合物２３６：コレステロール：リン脂質：化合物４２８というモル比を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは５０：３８．５：１０：１．５の化合物２３６：コレステロール：ＤＳＰＣ：化合物４２８というモル比を有する。
【０８０１】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、４０：３８．５：２０：１．５の化合物１８：コレステロール：リン脂質：化合物４２８というモル比を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、４０：３８．５：２０：１．５の化合物１８：コレステロール：ＤＳＰＣ：化合物４２８というモル比を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、４０：３８．５：２０：１．５の化合物１８：コレステロール：リン脂質：ＰＥＧ−ＤＭＧというモル比を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、４０：３８．５：２０：１．５の化合物１８：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ−ＤＭＧというモル比を有する。
【０８０２】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、化合物１８：リン脂質：コレステロール：化合物４２８が５０：１０：３８．５：１．５というモル比である製剤を有し得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、化合物１８：ＤＳＰＣ：コレステロール：化合物４２８が５０：１０：３８．５：１．５というモル比である製剤を有し得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、化合物１８：リン脂質：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧが５０：１０：３８．５：１．５というモル比である製剤を有し得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、化合物１８：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧが５０：１０：３８．５：１．５というモル比である製剤を有し得る。
【０８０３】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、０．４未満の多分散度値を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、中性ｐＨで正味の中性電荷を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、５０〜１５０ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、８０〜１００ｎｍの平均直径を有する。
【０８０４】
本明細書で一般的に定義されるように、「脂質」という用語は、疎水性または両親媒性の性質を有する低分子を指す。脂質は天然のものでも合成のものでもよい。脂質の種類の例としては、限定するものではないが、脂肪類、ワックス類、ステロール含有代謝産物類、ビタミン類、脂肪酸類、グリセロ脂質類、グリセロリン脂質類、スフィンゴ脂質類、糖脂質類、及びポリケチド類、ならびにプレノール脂質類が挙げられる。いくつかの例では、いくつかの脂質の両親媒性によって、それらは水性媒体中でリポソーム、小胞または膜を形成することになる。
【０８０５】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、イオン性脂質を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「イオン性脂質」という用語は、当該技術分野におけるその通常の意味を有し、そして１つ以上の荷電部分を含む脂質を指し得る。いくつかの実施形態では、イオン性脂質は、正電荷または負電荷を帯びていてもよい。イオン性脂質は正に帯電していてもよく、その場合それは「カチオン性脂質」と呼ばれる場合がある。特定の実施形態では、イオン性脂質分子は、アミン基を含んでもよく、そしてイオン性アミノ脂質と称されてもよい。本明細書中で使用される場合、「荷電部分」は、形式的な電荷を帯びた化学部分、例えば、一価（＋１、または−１）、二価（＋２、または−２）、三価（＋３、または−３）などである。荷電部分は、アニオン性（すなわち、負に荷電）またはカチオン性（すなわち、正に荷電）であってもよい。正電荷部分の例としては、アミン基（例えば、一級、二級、及び／または三級アミン）、アンモニウム基、ピリジニウム基、グアニジン基、及びイミジゾリウム基が挙げられる。特定の実施形態では、荷電部分は、アミン基を含む。負に帯電した基またはその前駆体の例としては、カルボキシレート基、スルホネート基、スルフェート基、ホスホネート基、ホスフェート基、ヒドロキシル基などが挙げられる。荷電部分の電荷は、ある場合には、環境条件によって変化し得、例えば、ｐＨの変化は、その部分の電荷を変化させ得、及び／またはその部分を荷電または非荷電にし得る。一般に、分子の電荷密度は、所望のとおりに選択されてもよい。
【０８０６】
「荷電」または「荷電部分」という用語は、分子上の「部分的負電荷」または「部分的正電荷」を指すものではないことを理解されたい。「部分的負電荷」及び「部分的正電荷」という用語は、当該技術分野におけるその通常の意味を与えられる。「部分的負電荷」とは、官能基が、電子密度が結合の１つの原子に向かって引き寄せられ、原子上に部分的負電荷を生成するように分極される結合を含む場合に生じ得る。当業者は、一般的には、このように分極化し得る結合を認識する。
【０８０７】
いくつかの実施形態では、イオン性脂質はイオン性アミノ脂質であり、当該技術分野において「イオン性カチオン性脂質」と呼ばれることもある。一実施形態では、イオン性アミノ脂質は、リンカー構造を介して結合している正電荷を帯びた親水性頭部及び疎水性テールを有し得る。
【０８０８】
これらに加えて、イオン性脂質はまた、環状アミン基を含む脂質であってもよい。
【０８０９】
一実施形態では、イオン性脂質は、限定するものではないが、国際公開第ＷＯ２０１３０８６３５４号及び同第ＷＯ２０１３１１６１２６号に記載されているイオン性脂質から選択され得て；それぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０８１０】
さらに別の実施形態では、イオン性脂質は、限定するものではないが、米国特許第７，４０４，９６９号（これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＸＸＩＩから選択され得る。
【０８１１】
一実施形態では、脂質は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２１７０８８９号に記載されているものなどの切断可能な脂質であってもよい。一実施形態では、脂質は、当該技術分野で公知の方法によって、及び／または国際公開第ＷＯ２０１３０８６３５４号（それぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように合成され得る。
【０８１２】
ナノ粒子組成物は様々な方法によって特徴付けることができる。例えば、顕微鏡法（例えば、透過型電子顕微鏡法または走査型電子顕微鏡法）を使用して、ナノ粒子組成物の形態及びサイズ分布を調べてもよい。動的光散乱法または電位差測定法（例えば、電位差滴定）を用いて、ゼータ電位を測定してもよい。動的光散乱もまた粒径を決定するために利用してもよい。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）などの機器を使用して、粒径、多分散指数、及びゼータ電位などのナノ粒子組成物の複数の特性を測定してもよい。
【０８１３】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）からなるかまたは本質的になる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）及びリン脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ）からなるか、または本質的にそれからなる脂質組成物を含む。
【０８１４】
ナノ粒子組成物は様々な方法によって特徴付けられ得る。例えば、顕微鏡法（例えば、透過型電子顕微鏡法または走査型電子顕微鏡法）を使用して、ナノ粒子組成物の形態及びサイズ分布を調べてもよい。動的光散乱法または電位差測定法（例えば、電位差滴定）を用いて、ゼータ電位を測定してもよい。動的光散乱もまた粒径を決定するために利用してもよい。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）などの機器を使用して、粒径、多分散指数、及びゼータ電位などのナノ粒子組成物の複数の特性を測定してもよい。
【０８１５】
ナノ粒子のサイズは、限定するものではないが、炎症などの生物学的反応に対抗するのに役立ち得るか、またはポリヌクレオチドの生物学的効果を増大し得る。
【０８１６】
本明細書で使用される場合、ナノ粒子組成物の文脈における「サイズ」または「平均サイズ」とは、ナノ粒子組成物の平均直径を指す。
【０８１７】
一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、約１０〜約１００ｎｍ、例えば、限定するものではないが、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜約４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍ及び／または約９０〜約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子に処方される。
【０８１８】
一実施形態では、ナノ粒子は、約１０〜５００ｎｍの直径を有する。一実施形態では、ナノ粒子は、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超、または１０００ｎｍ超の直径を有する。
【０８１９】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物の最大寸法は、１μｍ以下（例えば、１μｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、またはそれ以下）である。
【０８２０】
ナノ粒子組成物は比較的均質であり得る。多分散指数は、ナノ粒子組成物の均一性、例えば、ナノ粒子組成物の粒径分布を示すために使用され得る。小さい（例えば、０．３未満の）多分散性指数は一般に、狭い粒径分布を示す。ナノ粒子組成物は、約０〜約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、または０．２５という多分散指数を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のナノ粒子組成物の多分散指数は、約０．１０〜約０．２０であってもよい。
【０８２１】
ナノ粒子組成物のゼータ電位は、組成物の界面動電位を示すために使用してもよい。例えば、ゼータ電位は、ナノ粒子組成物の表面電荷を表す場合がある。より高い電荷を有する種は、細胞、組織、及び体内の他の要素と望ましくなく相互作用する可能性があるので、正または負の比較的低い電荷を有するナノ粒子組成物が一般に望ましい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノ粒子組成物のゼータ電位は、約−１０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約１０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約−５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、または約＋５ｍＶ〜約＋１０ｍＶであってもよい。
【０８２２】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約０ｍＶ〜約２０ｍＶ、約０ｍＶ〜約１０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約１０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約２０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約２０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約３０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約４０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約６０ｍＶ、及び約４０ｍＶ〜約５０ｍＶであってもよい。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約１５ｍＶ〜約４５ｍＶ、約２０ｍＶ〜約４０ｍＶ、及び約２５ｍＶ〜約３５ｍＶであってもよい。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ、約２０ｍＶ、約３０ｍＶ、約４０ｍＶ、約５０ｍＶ、約６０ｍＶ、約７０ｍＶ、約８０ｍＶ、約９０ｍＶ、及び約１００ｍＶであってもよい。
【０８２３】
ポリヌクレオチドの「カプセル化効率」という用語は、提供された初期量に対する、調製後にナノ粒子組成物によってカプセル化されるか、そうでなければナノ粒子組成物と会合するポリヌクレオチドの量を表す。本明細書で使用される場合、「カプセル化」とは、完全な、実質的な、または部分的な囲い込み、閉じ込め、包含、または内包を指し得る。
【０８２４】
カプセル化効率は、高いことが望ましい（例えば、１００％に近い）。カプセル化効率は、例えば、ナノ粒子組成物を１つ以上の有機溶媒または界面活性剤で粉砕する前後の、ナノ粒子組成物を含有する溶液中のポリヌクレオチドの量を比較することによって測定され得る。
【０８２５】
蛍光は、溶液中の遊離ポリヌクレオチドの量を測定するために使用され得る。本明細書に記載のナノ粒子組成物では、ポリヌクレオチドのカプセル化効率は、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、カプセル化効率は少なくとも８０％であってもよい。特定の実施形態では、カプセル化効率は少なくとも９０％であってもよい。
【０８２６】
本明細書に開示される薬学的組成物中に存在するポリヌクレオチドの量は、ポリヌクレオチドのサイズ、所望の標的及び／または用途、あるいはナノ粒子組成物の他の特性、ならびにポリヌクレオチドの特性などの複数の要因に依存し得る。
【０８２７】
例えば、ナノ粒子組成物に有用なｍＲＮＡの量は、ｍＲＮＡのサイズ（長さ、または分子量として表される）、配列、及び他の特徴に依存し得る。ナノ粒子組成物中のポリヌクレオチドの相対量もまた変動し得る。
【０８２８】
本開示の脂質ナノ粒子組成物中に存在する脂質組成物及びポリヌクレオチドの相対量は、有効性及び耐容性を考慮して最適化され得る。ポリヌクレオチドとしてｍＲＮＡを含む組成物の場合、Ｎ：Ｐ比は有用な測定基準として役立ち得る。
【０８２９】
ナノ粒子組成物のＮ：Ｐ比が、発現及び忍容性の両方を制御するので、低いＮ：Ｐ比及び強い発現を有するナノ粒子組成物が望ましい。Ｎ：Ｐ比は、ナノ粒子組成物中の脂質対ＲＮＡの比に従って変わる。
【０８３０】
一般に、より低いＮ：Ｐ比が好ましい。１つ以上のＲＮＡ、脂質、及びそれらの量は、約２：１〜約３０：１、例えば、２：１、３：１、４：１、５：１，６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２２：１、２４：１、２６：１、２８：１、または３０：１などのＮ：Ｐ比を提供するように選択され得る。特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約２：１〜約８：１であり得る。他の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は約５：１〜約８：１である。特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は５：１から６：１の間である。特定の一態様では、Ｎ：Ｐ比は約５．６７：１である。
【０８３１】
ナノ粒子組成物を提供することに加えて、本開示はまた、ポリヌクレオチドを封入することを含む脂質ナノ粒子を製造する方法も提供する。そのような方法は、本明細書に開示されている薬学的組成物のいずれかを使用すること、及び当該分野で公知の脂質ナノ粒子の製造方法に従って脂質ナノ粒子を製造することを包含する。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．８７：６８〜８０；Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」．Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９４０−９５４；Ｎａｓｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）「Ｓｏｌｉｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５：３０５−１３；Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）「Ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２９１−３０２、及びその中で引用されている引用文献を参照のこと。
【０８３２】
薬学的組成物
本開示は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤と組み合わせて、本明細書に記載のｍＲＮＡまたはナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を含む薬学的組成物を包含する。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、ナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子中に存在する。特定の実施形態では、ｍＲＮＡまたはナノ粒子は薬学的組成物中に存在する。様々な実施形態では、この薬学的組成物中に存在する１つ以上のｍＲＮＡは、ナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子中にカプセル化されている。特定の実施形態では、第１のｍＲＮＡ対第２のｍＲＮＡのモル比は、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、または約５：１、約１０：１、約２５：１または約５０：１である。特定の実施形態では、第１のｍＲＮＡ対第２のｍＲＮＡのモル比は１：１より大きい。
【０８３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、目的の抗原（Ａｇ）をコードするｍＲＮＡ、及び目的の抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチド（例えば、免疫増強剤（ＩＰ）、例えば、ＳＴＩＮＧポリペプチド）をコードするｍＲＮＡを含み、ここで目的の抗原（Ａｇ）をコードするｍＲＮＡ及び目的の抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチド（例えば、免疫増強剤、例えば、ＳＴＩＮＧポリペプチド）（ＩＰ）をコードするｍＲＮＡは、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１または２０：１というＡｇ：ＩＰ質量比で処方される。あるいは、ＩＰ：Ａｇ質量比は、例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、または１：２０であり得る。いくつかの実施形態では、組成物は、１：１、１．２５：１、１．５０：１、１．７５：１、２．０：１、２．２５：１、２．５０：１、２．７５：１、３．０：１、３．２５：１、３．５０：１、３．７５：１、４．０：１、４．２５：１、４．５０：１、４．７５：１または５：１という目的の抗原をコードするｍＲＮＡ対、目的の抗原に対する免疫を増強するポリペプチド（例えば、免疫増強剤、例えば、ＳＴＩＮＧポリペプチド）をコードするｍＲＮＡのＡｇ：ＩＰ質量比で処方される。いくつかの実施形態では、この組成物は、目的の抗原をコードするｍＲＮＡ対、目的の抗原に対する免疫を増強するポリペプチド（例えば、免疫増強剤、例えば、ＳＴＩＮＧポリペプチド）をコードするｍＲＮＡの５：１という質量比で処方される（５：１というＡｇ：ＩＰ；または、１：５というＩＰ：Ａｇ比）。いくつかの実施形態では、この組成物は、目的の抗原をコードするｍＲＮＡ対、目的の抗原に対する免疫を増強するポリペプチド（例えば、免疫増強剤、例えば、ＳＴＩＮＧポリペプチド）をコードするｍＲＮＡの１０：１という質量比で処方される（１０：１というＡｇ：ＩＰ；または、１：１０というＩＰ：Ａｇ比）。
【０８３４】
免疫増強剤をコードするｍＲＮＡ構築物及び目的の抗原をコードするｍＲＮＡ構築物の両方を含む共処方物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の初回刺激及び抗原特異的免疫応答（例えば、抗腫瘍免疫）の誘導に特に有益であり得る。その技術において、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）による抗原提示細胞（ＡＰＣ）の直接活性化は、ＣＤ８＋Ｔ細胞初回刺激に必要であるが、炎症性メディエータにより間接的に活性化されるＡＰＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の初回刺激には効果的でないと報告されている（Ｋｒａｔｋｙ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０８：１７４１４−１７４１９）。従って、免疫増強剤及び目的の抗原をコードするｍＲＮＡ構築物の共処方は、ＡＰＣを直接活性化しそしてＣＤ８＋Ｔ細胞を初回刺激するために特に有益であり得る。
【０８３５】
薬学的組成物は、１つ以上の追加の活性物質、例えば、治療的及び／または予防的活性物質を必要に応じて含み得る。本開示の薬学的組成物は、無菌であるか及び／または発熱物質を含まないものであり得る。薬剤の処方及び／または製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出され得る。特定の実施形態では、薬学的組成物は、ｍＲＮＡ及び脂質ナノ粒子、またはそれらの複合体を含む。
【０８３６】
本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬理学の分野において公知であるかまたは今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤及び／または１つ以上の他の副成分と会合させ、次いで必要に応じて及び／または望ましい場合には、製品を、望ましい単回または複数回投与単位に分割、成形及び／または包装するステップを包含する。
【０８３７】
本開示による薬学的組成物中の、活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意のさらなる成分の相対量は、処置される対象の同一性、大きさ、及び／または状態に応じて、さらにその組成物が投与される経路に依存して変化する。例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば、０．５％〜７０％、１％〜３０％、５％〜８０％、または少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでもよい。
【０８３８】
本開示のｍＲＮＡは、１つ以上の賦形剤を用いて以下を行うように処方され得る：（１）安定性を増大する；（２）細胞トランスフェクションを増大させる；（３）持続放出または遅延放出（例えば、ｍＲＮＡのデポー製剤からの）を可能にする；（４）生体内分布を変える（例えば、ｍＲＮＡを特定の組織または細胞型に標的化する）；（５）インビボでｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの翻訳を増大させる；及び／または（６）インビボでｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの放出プロファイルを変える。任意のかつ全ての溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤などの従来の賦形剤に加えて、本開示の賦形剤は、限定するものではないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子（例えば、リポソーム及びミセル）、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植用）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、及びそれらの組み合わせが含まれてもよい。したがって、本開示の製剤は、一緒になってｍＲＮＡの安定性を高める、ｍＲＮＡによる細胞トランスフェクションを高める、ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現を高める、及び／またはｍＲＮＡコードポリペプチドの放出プロファイルを変化させる各々の量の１種以上の賦形剤を含んでもよい。さらに、本開示のｍＲＮＡは、自己アセンブル核酸ナノ粒子を使用して処方され得る。
【０８３９】
薬学的組成物を配合するための様々な賦形剤及び組成物を調製するための技術は、当該技術分野において公知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６（全体として参照によって本明細書に組み込まれている）を参照のこと）。通常の賦形剤媒体の使用は、任意の通常の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と不適合であり得る場合を除いて（例えば、何らかの望ましくない生物学的効果を生じさせることによって、またはそうでなければ薬学的組成物の任意の他の構成要素（複数可）と有害な方法で相互作用することによって）、本開示の範囲内で企図され得る。賦形剤としては、例えば、粘着防止剤、酸化防止剤、結合剤、コーティング、圧縮助剤、崩壊剤、色素（着色剤）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、フィルム形成剤またはコーティング、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（流動促進剤（ｆｌｏｗ  ｅｎｈａｎｃｅｒ））、滑剤、防腐剤、印刷インキ、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味料、及び水和水が挙げられ得る。例示的な賦形剤としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、レチニルパルミテート、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、ナトリウムグリコール酸デンプン、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトール。
【０８４０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤は、少なくとも１つの薬学的に許容される塩を含み得る。本開示の製剤に含まれ得る薬学的に許容される塩の例としては、限定するものではないが、酸付加塩、アルカリまたはアルカリ土類金属塩、アミンなどの塩基性残基の無機または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩；などが挙げられる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシルスルホン酸塩、エプタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに非毒性のアンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンカチオンが挙げられ、これには、限定するものではないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられる。
【０８４１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤は、少なくとも１種類のポリヌクレオチドを含有してもよい。非限定的な例として、この製剤は、本明細書に記載の１、２、３、４、５または５を超えるｍＲＮＡを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤は、ポリペプチドをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ、ならびに少なくとも１つの核酸配列、例えば、限定するものではないが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡを含んでもよい。
【０８４２】
例えば、非経口投与用の液体剤形としては、限定するものではないが、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤、及び／またはエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加えて、液体剤形は、当該技術分野で通常使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に綿実油、落花生油、とうもろこし油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含んでもよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤及び／または懸濁剤を含んでもよい。非経口投与のための特定の実施形態では、組成物は、可溶性剤、例えば、ＣＲＥＭＡＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、改質油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、及び／またはそれらの組み合わせと混合される。
【０８４３】
注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液は、適切な分散剤、湿潤剤、及び／または懸濁剤を使用して公知の技術に従って処方されてもよい。無菌注射用製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、無毒性の非経口的に許容される希釈剤及び／または溶媒中の無菌注射用溶液、懸濁液、及び／またはエマルジョンであり得る。許容されるビヒクル及び溶媒の中では、水、リンゲル液（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）、及び等張塩化ナトリウム溶液が使用されてもよい。無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来から使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性不揮発性油を使用してもよい。オレイン酸などの脂肪酸を、注射剤の調製に使用してもよい。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターによる濾過によって、及び／または使用前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体に溶解または分散され得る滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌され得る。
【０８４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのｍＲＮＡを含む薬学的組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される。本明細書で提供される薬学的組成物の説明は主に、ヒトへの投与に適した薬学的組成物を対象としているが、そのような組成物は一般に任意の他の動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に適していることが当業者には理解されよう。組成物を様々な動物への投与に適したものにするためのヒトへの投与に適した薬学的組成物の改変は十分に理解されており、当業者の獣医薬理学者は、あるとしても単に通常の実験によって、そのような改変を設計及び／または実施し得る。薬学的組成物の投与が企図される対象としては、限定するものではないが、ヒト及び／または他の霊長類；哺乳動物、例としては商業的に関連する哺乳動物、例えば、牛、豚、馬、羊、猫、犬、マウス、及び／またはラット；及び／または、鳥類、例としては、商業的に関連する鳥類、例えば、家禽、鶏、アヒル、ガチョウ、及び／または七面鳥が挙げられる。特定の実施形態では、対象は本明細書に記載の２つ以上のｍＲＮＡが提供される。特定の実施形態では、第１及び第２のｍＲＮＡは、同時にまたは異なる時間に、例えば、順次に対象に提供される。特定の実施形態では、例えば、同じ細胞による両方のｍＲＮＡの取り込みを容易にするために、第１及び第２のｍＲＮＡが、同じ薬学的組成物または製剤で対象に提供される。
【０８４５】
本開示はまた、免疫応答を増強するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む容器を備えるキットを包含する。別の実施形態では、このキットは、免疫応答を増強するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ならびに１つ以上の目的の抗原をコードする１つ以上の追加のｍＲＮＡを含む容器を備える。他の実施形態では、このキットは、免疫応答を増強するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む第１の容器と、目的の１つ以上の抗原をコードする１つ以上のｍＲＮＡを含む第２の容器とを備える。特定の実施形態では、免疫応答を増強するためのｍＲＮＡ、及び抗原（複数可）をコードするｍＲＮＡ（複数可）は、同じまたは異なるナノ粒子及び／または薬学的組成物中に存在する。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、凍結乾燥、乾燥、またはフリーズドライされている。
【０８４６】
免疫応答を増強する方法
本開示は、対象、例えば、ヒト対象における目的の抗原に対する免疫応答を増強するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、目的の抗原（複数可）に対する免疫応答が増強されるように、以下をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ構築物を含む本開示の組成物（またはその脂質ナノ粒子、またはその薬学的組成物）を対象に投与することを包含する：（ｉ）目的の少なくとも１つの抗原、及び（ｉｉ）目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するポリペプチド。一実施形態では、免疫応答を増強することは、サイトカイン産生を刺激することを包含する。別の実施形態では、免疫応答を増強することは、細胞性免疫（Ｔ細胞応答）を増強すること、例えば、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞活性を刺激すること、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞活性を刺激すること、または「エフェクターメモリー」ＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞の割合を増大させることを包含する。別の実施形態では、免疫応答を増強することは、抗原特異的抗体産生を刺激することなどの体液性免疫（Ｂ細胞応答）を増強することを包含する。
【０８４７】
この方法の一実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡは、Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達を刺激するポリペプチドをコードする（例えば、免疫増強剤は、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７または本明細書に記載の任意のさらなる免疫増強剤などのポリペプチドをコードする）。この方法の他の様々な実施形態では、免疫増強剤は、ＮＦκＢ経路シグナル伝達を刺激するか、炎症反応を刺激するか、または樹状細胞の発達、活性もしくは動員を刺激するポリペプチドをコードする。一実施形態では、この方法は、Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達を刺激するｍＲＮＡ組成物を対象に投与する前に、樹状細胞の発達、活性または動員を刺激するｍＲＮＡ組成物を対象に投与することを包含する。例えば、樹状細胞の発達または活性を刺激するｍＲＮＡ組成物は、Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達を刺激するｍＲＮＡ組成物を投与する１〜３０日前、例えば、３日、５日、７日、１０日、１４日、２１日、２８日に投与され得る。
【０８４８】
本開示の免疫増強剤による、目的の抗原（複数可）に対する対象における免疫応答の増強は、限定するものではないが、実施例に記載の方法を含む、免疫応答を評価するために当該分野で確立されている様々な方法によって評価され得る。例えば、種々の実施形態では、増強は、ＩＦＮ−γもしくはＴＮＦ−αについてのＣＤ８＋細胞の細胞内染色（ＩＣＳ）のレベル、脾臓もしくは末梢のＣＤ８ｂ＋細胞の割合、または脾臓もしくは末梢の「エフェクターメモリー」ＣＤ６２Ｌｌｏ細胞の割合によって評価される。
【０８４９】
ＳＴＩＮＧ媒介シグナル伝達の結果は、異なる細胞型の間で異なり得、特にＴ細胞は、他の細胞型（例えば、マクロファージ及び樹状細胞）と比較してより強いＳＴＩＮＧ応答を示し、Ｔ細胞はＳＴＩＮＧの発現レベル増大を示すことが報告されている（Ｇｕｌｅｎ，Ｍ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍ．８（１）：４２７）。したがって、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の大きさは、異なるエフェクター応答をもたらし得、それにより、用量、細胞型発現及び／または目的の抗原との共処方（例えば、Ａｇ：ＳＴＩＮＧ比）に応じてＳＴＩＮＧ媒介応答の調整及び微調整を可能にし得る。実施例に記載されているデータでは、ＳＴＩＮＧが抗原特異的免疫応答の増強において有効性を示す広い治療ウィンドウがあることが示されている。
【０８５０】
本開示の組成物は、有効量で対象に投与される。一般に、有効量の組成物は、細胞内でのコードされたポリペプチドの効率的な産生を可能にするであろう。効率のための測定基準としては、ポリペプチド翻訳（ポリペプチド発現によって示される）、ｍＲＮＡ分解のレベル、及び免疫応答指標が挙げられ得る。
【０８５１】
免疫原性細胞死を誘導する方法
本発明は、細胞、例えば、哺乳動物細胞において免疫原性細胞死を誘導する方法を提供する。一実施形態では、この細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞内で免疫原性細胞死を誘導する方法は、細胞を本明細書に記載のｍＲＮＡ、例えば、ネクロトーシスまたはパイロトーシスなどの免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードするｍＲＮＡと接触させることを包含する。特定の実施形態では、そのような方法は、免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードする単離されたｍＲＮＡと細胞とを接触させることを包含する。特定の実施形態では、細胞を、免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物と接触させる。細胞を脂質ナノ粒子組成物または単離されたｍＲＮＡと接触させると、ｍＲＮＡは細胞内に取り込まれて翻訳され、免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドを産生し得る。一実施形態では、免疫原性細胞死は、細胞の膨潤、原形質膜の破裂、及び細胞の細胞質ゾル内容物の放出によって特徴付けられる。一実施形態では、免疫原性細胞死は、細胞からのＡＴＰ及びＨＭＧＢ１の放出を特徴とする。
【０８５２】
本発明はさらに、正常細胞と比較してがん細胞において免疫原性細胞死を選択的に誘導する方法を提供する。いくつかの実施形態では、がん細胞において免疫原性細胞死を選択的に誘導する方法は、細胞を本明細書に記載のｍＲＮＡ、例えば、免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ（ここでこのｍＲＮＡはさらに、がん細胞と比較した正常細胞中のポリペプチドの発現を低下する調節性エレメントを含む）と接触させることを包含する。特定の実施形態では、調節性エレメントは、がん細胞よりも正常細胞中で発現が大きいマイクロＲＮＡの結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）であり、ここでマイクロＲＮＡの結合部位への結合は、ポリペプチドの発現を阻害する。特定の実施形態では、細胞を、ポリペプチドをコードする領域を含むｍＲＮＡとマイクロＲＮＡ結合部位とを含むナノ粒子組成物と接触させる。その細胞をナノ粒子組成物または単離されたｍＲＮＡと接触させると、ｍＲＮＡは細胞内に取り込まれ、翻訳されてポリペプチドを産生する。ポリペプチドの発現は、正常細胞よりもがん細胞において大きく、その結果、正常細胞よりもがん細胞の免疫原性細胞死の誘導が大きい。
【０８５３】
一般に、哺乳動物細胞を組成物（例えば、本発明の単離されたｍＲＮＡ、ナノ粒子、または薬学的組成物）と接触させるステップは、インビボ、エキソビボ、培養中、またはインビトロで行われてもよい。本発明の例示的実施形態では、哺乳動物細胞を組成物（例えば、本発明の単離されたｍＲＮＡ、ナノ粒子、または薬学的組成物）と接触させるステップは、インビボまたはエキソビボで行われる。細胞と接触させる組成物の量、及び／またはその中のｍＲＮＡの量は、接触させる細胞または組織の種類、投与手段、組成物及びその中のｍＲＮＡの生理化学的特徴（例えば、サイズ、電荷、及び化学組成）、ならびに他の要因に依存し得る。一般に、有効量の組成物は、細胞内でのコードされたポリペプチドの効率的な産生を可能にする。効率のための測定基準は、ポリペプチド翻訳（ポリペプチド発現によって示される）、ｍＲＮＡ分解のレベル、及び免疫応答指標を含み得る。
【０８５４】
ｍＲＮＡまたは単離されたｍＲＮＡを含む組成物を細胞と接触させる工程は、トランスフェクションを伴うことも、または引き起こすこともある。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子に含まれるリン脂質は、例えば、細胞膜または細胞内膜と相互作用及び／または融合することによって、トランスフェクションを容易にし、かつ／またはトランスフェクション効率を高め得る。トランスフェクションは、細胞内でのｍＲＮＡの翻訳を可能にし得る。本発明の組成物（例えば、脂質ナノ粒子または単離されたｍＲＮＡ）が免疫原性細胞死を誘導する能力は、例えば、限定するものではないが、ＴＮＦＲ、ＴＬＲもしくはＴＣＲ受容体の関与、ＤＮＡ損傷またはウイルス感染を含む、免疫原性細胞死を誘導し得る公知の薬剤またはその操作と比較して、免疫原性細胞死を誘導する組成物の能力を比較することによって容易に決定され得る。薬剤が免疫原性細胞死を誘導し得るか否かを決定する様々な方法、例えば、染色剤及び染料（例えば、ＣＥＬＬＴＯＸ（商標）、ＭＩＴＯＴＲＡＣＫＥＲ（登録商標）Ｒｅｄ、ヨウ化プロピジウム、及びＹＯＹＯ３）、細胞生存率アッセイ、及びＤＡＭＰ（「損傷関連分子パターン（ｄａｍａｇｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎｓ）」）の放出、例としては、ＡＴＰ、ＨＭＧＢ１、ＩＬ−１ａ、尿酸、ＤＮＡ断片及び／またはミトコンドリア含有量の放出を検出するアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ））は当該分野で公知である。
【０８５５】
予防及び治療方法
対象において目的の抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するための本開示の方法は、様々な臨床的、予防的または治療的用途に使用され得る。例えば、この本方法は、腫瘍を有する対象または腫瘍の危険性がある対象（例えば、ＨＰＶなどの発がん性ウイルスに潜在的にさらされる）において抗腫瘍免疫を刺激するために使用してもよい。さらに、本方法は、病原性感染症に罹患している対象を処置するため、または病原体に対する曝露前に病原体に対して対象に防御免疫を提供するため（例えば、病原体に対する予防接種）などのために、対象における抗病原体免疫を刺激するために使用されてもよい。
【０８５６】
したがって、一態様では、本開示は、それを必要とする対象において腫瘍または腫瘍抗原に対する免疫原性応答を刺激する方法であって、目的の腫瘍抗原（複数可）に対する免疫応答が増強されるように：（ｉ）少なくとも１つの目的の腫瘍抗原、及び（ｉｉ）目的の腫瘍抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ構築物を含む、本開示の組成物（またはその脂質ナノ粒子、またはその医薬品）を対象に投与することを包含する方法に関与する。目的の適切な腫瘍抗原としては、本明細書に記載されているもの（例えば、変異ＫＲＡＳ抗原を含む腫瘍新生抗原；ＨＰＶ抗原を含む発がん性ウイルス抗原）が挙げられる。この方法の一実施形態では、対象に、配列番号１０７〜１３０のいずれかに示される配列をコードする変異体ＫＲＡＳ抗原−ＳＴＩＮＧ  ｍＲＮＡ構築物を投与する。
【０８５７】
本開示はまた、それを必要とする対象においてがんを治療または予防する方法であって、対象に対して、本明細書に記載の少なくとも１つのｍＲＮＡ組成物（すなわち、同一または別々のｍＲＮＡ構築物中の、免疫増強剤ｍＲＮＡ及び抗原コードｍＲＮＡ）を提供または投与することを含む方法を提供する。関連の実施形態では、対象は、ｍＲＮＡ（複数可）を含むナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を提供されるかまたは投与される。さらなる関連の実施形態では、対象は、本開示の薬学的組成物をその対象に提供されるかまたは投与される。特定の実施形態では、薬学的組成物は、抗原をコードするｍＲＮＡ（複数可）及び本明細書に記載の免疫刺激ポリペプチドを含むか、またはｍＲＮＡ（複数可）を含むナノ粒子を含む。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ（複数可）はナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子中に存在する。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ（複数可）またはナノ粒子は薬学的組成物中に存在する。
【０８５８】
特定の実施形態では、それを必要とする対象は癌と診断されたか、またはがんを発症する危険性があるとみなされる。いくつかの実施形態では、癌は、肝臓癌、結腸直腸癌、黒色腫癌、膵臓癌、ＮＳＣＬＣ、子宮頸癌、または頭頸部癌である。特定の実施形態では、肝臓癌は、肝細胞癌腫である。いくつかの実施形態では、結腸直腸癌は、原発腫瘍または転移である。いくつかの実施形態では、癌は造血器癌である。いくつかの実施形態では、癌は急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、骨髄ジストロフィー症候群（難治性貧血及び難治性血球減少症を含む）または骨髄増殖性新生物もしくは疾患（真性多血症、本態性血小板増多症及び原発性骨髄線維症を含む）である。他の実施形態では、癌は、血液系癌または造血系癌である。さらに他の実施形態では、癌は、子宮頸癌、陰茎癌、膣癌、外陰癌、肛門癌及び／または口腔咽頭癌などのＨＰＶ関連癌である。
【０８５９】
特定のがん型に対する選択性は、ｍＲＮＡ構築物に操作された適切な調節部位（複数可）（例えば、マイクロＲＮＡ）と組み合わせた、適切なＬＮＰ製剤（例えば、特定の細胞型を標的とする）の使用の組み合わせによって達成され得る。
【０８６０】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（複数可）、ナノ粒子、または薬学的組成物は、非経口的に患者に投与される。特定の実施形態では、対象は哺乳動物、例えば、ヒトである。様々な実施形態では、対象は有効量のｍＲＮＡ（複数可）を提供される。
【０８６１】
がんを治療する方法は、対象における抗腫瘍応答を増強するか、及び／または腫瘍に対して細胞傷害性である追加の薬剤（例えば、化学療法剤）による対象の処置をさらに包含し得る。併用療法に使用するのに適した治療剤としては、プロテインチロシンキナーゼ阻害剤を含む低分子化学療法剤、ならびに以下にさらに論じるものを含むがこれらに限定されない抗がん抗体などの生物学的抗がん剤が挙げられる。併用療法は、抗腫瘍免疫を増強するための免疫チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤及びＣＴＬＡ−４阻害剤を対象に投与することを包含し得る。免疫チェックポイントの他の調節因子は、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０ＬまたはＩＣＯＳを標的とし得る。一実施形態では、免疫チェックポイントを調節する薬剤は抗体である。別の実施形態では、免疫チェックポイントを調節する薬剤は、タンパク質または低分子モジュレーターである。別の実施形態では、因子（ｍＲＮＡなど）は、免疫チェックポイントの抗体モジュレーターをコードする。併用療法に使用され得る免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例としては、ペムブロリズマブ、アレムツズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ＭＥＤＩ０６８０及びＰＤＲ００１、ＡＭＰ−２２４、ＰＦ−０６８０１５９１、ＢＧＢ−Ａ３１７、ＲＥＧＮ２８１０、ＳＨＲ−１２１０、ＴＳＲ−０４２、アフィマー、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、ＢＭＳ９３６５５９、イピリムマブ、トレメリムマブ、ＡＧＥＮ１８８４、ＭＥＤＩ６４６９及びＭＯＸＲ０９１６が挙げられる。
【０８６２】
一実施形態では、本発明は、それを必要とする対象においてＨＰＶ関連がんを予防または処置する方法であって、目的のＨＰＶ抗原（複数可）に対する免疫応答が増強されるように、以下：（ｉ）少なくとも１つの目的のＨＰＶ抗原、及び（ｉｉ）目的のＨＰＶ抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ構築物を含む開示の組成物（またはその脂質ナノ粒子、またはその薬学的組成物）を対象に投与することを包含する方法を提供する。様々な実施形態では、ＨＰＶ関連癌は子宮頸癌、陰茎癌、膣癌、外陰癌、肛門癌及び／または口腔咽頭癌である。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ構築物（複数可）によってコードされるＨＰＶ抗原（複数可）は、少なくとも１つのＥ６抗原、少なくとも１つのＥ７抗原、または少なくとも１つのＥ６抗原と少なくとも１つのＥ７抗原の両方である。一実施形態では、Ｅ６抗原（複数可）及び／またはＥ７抗原（複数可）は可溶性である。別の実施形態では、Ｅ６抗原（複数可）及び／またはＥ７抗原（複数可）は細胞内にある。一実施形態では、目的のＨＰＶ抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するポリペプチドは、ＳＴＩＮＧポリペプチド（例えば、構成的に活性なＳＴＩＮＧポリペプチド）である。一実施形態では、ＨＰＶ抗原（複数可）及びＳＴＩＮＧポリペプチドは、異なるｍＲＮＡ上にコードされており、対象への同時投与の前に脂質ナノ粒子中に共処方されている。別の実施形態では、ＨＰＶ抗原（複数可）及びＳＴＩＮＧポリペプチドは、同じｍＲＮＡ上にコードされている。一実施形態では、ＨＰＶ抗原（複数可）及び免疫増強剤をコードする組成物は、ＨＰＶへの曝露の危険性がある対象に投与され、それによってＨＰＶ感染及びＨＰＶ関連がん（複数可）の発症に対する予防的防御が提供される。別の実施形態では、ＨＰＶ抗原（複数可）及び免疫増強剤をコードする組成物は、ＨＰＶに感染しているか、及び／またはＨＰＶ関連がんを有する対象に投与され、それによって対象におけるＨＰＶに対する免疫応答を増強することによって、ＨＰＶに対する治療活性が提供される。特定の実施形態では、ＨＰＶ関連がんを有する対象はまた、ＨＰＶ＋免疫増強ワクチンを用いた処置と組み合わせて、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１など）でも処置される。
【０８６３】
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象において病原体に対する免疫原性応答を刺激する方法に関し、この方法は、目的の病原体抗原（複数可）に対する免疫応答が増強されるように、以下：（ｉ）少なくとも１つの目的の病原体抗原、及び（ｉｉ）目的の病原体抗原（複数可）に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ構築物を含む本開示の組成物（またはその脂質ナノ粒子、またはその薬学的組成物）を対象に投与することを包含する。一実施形態では、少なくとも１つの病原体抗原は、ウイルス、細菌、原生動物、真菌及び寄生生物からなる群より選択される病原体に由来する。
【０８６４】
目的の適切な病原体抗原としては、本明細書に記載のものが挙げられる。一実施形態では、病原体抗原（複数可）はウイルス抗原（複数可）である。一実施形態では、病原体抗原（複数可）は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、例えば、Ｅ６抗原（例えば、配列番号３６〜７２のいずれかに示すアミノ酸配列を含む）またはＥ７抗原（例えば、配列番号７３〜９４のいずれかに示すアミノ酸配列を含む）である。一実施形態では、この病原体抗原（複数可）は、多価細菌抗原などの細菌抗原（複数可）である。
【０８６５】
それを必要とする対象において病原体抗原（複数可）に対する免疫原性応答を刺激する方法の一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物（複数可）、脂質ナノ粒子または薬学的組成物が、非経口的に対象に投与される。一実施形態では、ｍＲＮＡ（複数可）、脂質ナノ粒子または薬学的組成物は、週に１回の注入によって投与される。
【０８６６】
本開示の１つ以上のｍＲＮＡを含む薬学的組成物は、任意の適切な経路によって対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、非経口（例えば、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液内、胸骨内、髄腔内、病巣内または頭蓋内注射ならびに任意の適切な注入技術）、経口、経皮または皮内、皮内、直腸内、膣内、局所（例えば、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、及び／またはドロップによる）、粘膜、経鼻、口腔内、経腸、硝子体、腫瘍内、舌下、鼻腔内；気管内注入、気管支注入、及び／または吸入による；経口スプレー及び／または粉末、鼻腔スプレー、及び／またはエアロゾルとして、及び／または門脈カテーテルを含む種々の経路のうち１つ以上によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内、筋肉内、皮内、動脈内、腫瘍内、皮下または吸入によって投与してもよい。いくつかの実施形態では、組成物は筋肉内投与される。しかし、本開示は、薬物送達の科学における可能性のある進歩を考慮に入れた任意の適切な経路による本開示の組成物の送達を包含する。一般に、最も適切な投与経路は、１つ以上のｍＲＮＡを含む薬学的組成物の性質（例えば、血流及び胃腸管などの様々な身体環境におけるその安定性）、及び患者の状態（例えば、患者が特定の投与経路に耐えることができるか否か）を含む様々な要因に依存する。
【０８６７】
特定の実施形態では、本開示の組成物は、所定の用量中で、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投薬レベルで投与されてもよいが、１ｍｇ／ｋｇの用量では、対象の体重１ｋｇあたり１ｍｇのｍＲＮＡまたはナノ粒子が得られる。特定の実施形態では、本開示のｍＲＮＡまたはナノ粒子の約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの用量が投与され得る。
【０８６８】
いくつかの実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物（例えば、ＳＴＩＮＧ構築物）及び抗原構築物（例えば、ワクチン構築物）の両方を含む本開示の組成物は、それが免疫増強剤構築物の固定用量の関数として最適化されるように処方される。免疫増強構築物の固定用量の非限定的な例としては、所定の用量中で０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇが挙げられ、ここで１ｍｇ／ｋｇの用量によって、対象の体重１ｋｇあたり１ｍｇのｍＲＮＡが得られる。
【０８６９】
別の実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物（例えば、ＳＴＩＮＧ構築物）及び抗原構築物（例えば、ワクチン構築物）の両方を含む本開示の組成物は、抗原構築物の固定用量の関数として最適化されるように処方される。抗原構築物の固定用量の非限定的な例としては、所定の用量中で０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇが挙げられ、ここで１ｍｇ／ｋｇの用量によって、対象の体重１ｋｇあたり１ｍｇのｍＲＮＡが得られる。
【０８７０】
いくつかの実施形態では、免疫調節治療組成物中のＲＮＡポリヌクレオチド（免疫増強剤ＲＮＡポリヌクレオチド、抗原コードＲＮＡポリヌクレオチド、または両方）の投与量は、１用量あたり１〜５μｇ、５〜１０μｇ、１０〜１５μｇ、１５〜２０μｇ、１０〜２５μｇ、２０〜２５μｇ、２０〜５０μｇ、３０〜５０μｇ、４０〜５０μｇ、４０〜６０μｇ、６０〜８０μｇ、６０〜１００μｇ、５０〜１００μｇ、８０〜１２０μｇ、４０〜１２０μｇ、４０〜１５０μｇ、５０〜１５０μｇ、５０〜２００μｇ、８０〜２００μｇ、１００〜２００μｇ、１００〜３００μｇ、１２０〜２５０μｇ、１５０〜２５０μｇ、１８０〜２８０μｇ、２００〜３００μｇ、３０〜３００μｇ、５０〜３００μｇ、８０〜３００μｇ、１００〜３００μｇ、４０〜３００μｇ、５０〜３５０μｇ、１００〜３５０μｇ、２００〜３５０μｇ、３００〜３５０μｇ、３２０〜４００μｇ、４０〜３８０μｇ、４０〜１００μｇ、１００〜４００μｇ、２００〜４００μｇ、または３００〜４００μｇである。いくつかの実施形態では、免疫調節治療組成物は、皮内注射または筋肉内注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫調節治療組成物は、０日に対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫調節治療組成物の第２の用量は、７日目、または１４日目または２１日目に対象に投与される。
【０８７１】
いくつかの実施形態では、２５マイクログラムの用量のＲＮＡポリヌクレオチドが、対象に投与される免疫調節治療組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、１０マイクログラムの用量のＲＮＡポリヌクレオチドが、対象に投与される免疫調節治療組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、３０マイクログラムの用量のＲＮＡポリヌクレオチドが、対象に投与される免疫調節治療組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、１００マイクログラムの用量のＲＮＡポリヌクレオチドが、対象に投与される免疫調節治療組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、５０マイクログラムの用量のＲＮＡポリヌクレオチドが、対象に投与される免疫調節治療組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、７５マイクログラムの用量のＲＮＡポリヌクレオチドが、対象に投与される免疫調節治療組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、１５０マイクログラムの用量のＲＮＡポリヌクレオチドが、対象に投与される免疫調節治療組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、４００マイクログラムの用量のＲＮＡポリヌクレオチドが、対象に投与される免疫調節治療組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、３００マイクログラムの用量のＲＮＡポリヌクレオチドが、対象に投与される免疫調節治療組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、２００マイクログラムの用量のＲＮＡポリヌクレオチドが、対象に投与される免疫調節治療組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、遠位リンパ節と比較して局所リンパ節において１００倍高いレベルで蓄積する。他の実施形態では、免疫調節治療組成物は、化学的に修飾されており、他の実施形態では免疫調節治療組成物は、化学的に修飾されていない。
【０８７２】
いくつかの実施形態では、有効量は１〜１００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は１００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計１回または２回投与される２５μｇの用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計２回投与される１００μｇの用量である。いくつかの実施形態では、この有効量は、１μｇ〜１０μｇ、１μｇ〜２０μｇ、１μｇ〜３０μｇ、５μｇ〜１０μｇ、５μｇ〜２０μｇ、５μｇ〜３０μｇ、５μｇ〜４０μｇ、５μｇ〜５０μｇ、１０μｇ〜１５μｇ、１０μｇ〜２０μｇ、１０μｇ〜２５μｇ、１０μｇ〜３０μｇ、１０μｇ〜４０μｇ、１０μｇ〜５０μｇ、１０μｇ〜６０μｇ、１５μｇ〜２０μｇ、１５μｇ〜２５μｇ、１５μｇ〜３０μｇ、１５μｇ〜４０μｇ、１５μｇ〜５０μｇ、２０μｇ〜２５μｇ、２０μｇ〜３０μｇ、２０μｇ〜４０μｇ、２０μｇ〜５０μｇ、２０μｇ〜６０μｇ、２０μｇ〜７０μｇ、２０μｇ〜７５μｇ、３０μｇ〜３５μｇ、３０μｇ〜４０μｇ、３０μｇ〜４５μｇ、３０μｇ〜５０μｇ、３０μｇ〜６０μｇ、３０μｇ〜７０μｇ、３０μｇ〜７５μｇの用量であり、対象に合計１回または２回投与され得る。
【０８７３】
用量は、所望のレベルのｍＲＮＡ発現及び／または効果（例えば、治療効果）を得るために、１日に１回以上同じ量または異なる量で投与されてもよい。所望の投与量は、例えば、１日３回、１日２回、１日１回、隔日、３日ごと、毎週、２週間ごと、３週間ごと、または４週間ごとに送達されてもよい。特定の実施形態では、所望の投与量は、複数回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４またはそれ以上の投与）を用いて送達され得る。例えば、特定の実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物（例えば、ＳＴＩＮＧ構築物）及び抗原構築物（例えば、ワクチン構築物）の両方を含む本開示の組成物は少なくとも２回投与され、ここで第２の用量は、第１の用量が投与された後、少なくとも１日、または少なくとも３日、または少なくとも７日、または少なくとも１０日、または少なくとも１４日、または少なくとも２１日、または少なくとも２８日、または少なくとも３５日、または少なくとも４２日、または少なくとも４８日に投与される。特定の実施形態では、第１及び第２の用量は、それぞれ０日目及び２日目に、またはそれぞれ０日目及び７日目に、またはそれぞれ０日目及び１４日目に、またはそれぞれ０日目及び２１日目に、またはそれぞれ０日目及び４８日目に投与される。追加の投与量（すなわち、３回目の投与量、４回目の投与量など）は、最初の２回投与量が投与されたのと同じスケジュールで投与されてもまたは異なるスケジュールで投与されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、第１及び第２の投与量は、７日間隔で投与され、次いで１回以上の追加投与量がその後毎週投与される。別の実施形態では、第１及び第２の投与量は７日間隔で投与され、次いで、２週間ごとに１回以上のさらなる投与量がその後に投与される。
【０８７４】
いくつかの実施形態では、単回用量は、例えば、外科的手順の前もしくは後に、または急性の疾患、障害もしくは病態の場合に投与され得る。任意の特定の患者に対する具体的な治療上有効、予防上有効、またはそうでなければ適切な用量レベルは、もしあれば、治療される障害の重症度及び同定；使用された１つ以上のｍＲＮＡ；採用した特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事；使用した特定の薬学的組成物の投与時間、投与経路、及び排泄速度；処置期間；使用される特定の薬学的組成物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；そして医学の分野で周知の同様の要因を含む様々な要因に依存する。
【０８７５】
いくつかの実施形態では、本開示の薬学的組成物は、別の薬剤、例えば、別の治療剤、予防剤、及び／または診断剤と組み合わせて投与されてもよい。「と組み合わせて」とは、薬剤を同時に投与しなければならない、及び／または一緒に送達するために処方しなければならないことを意味することを意図するものではないが、これらの送達方法は、本開示の範囲内である。例えば、１つ以上の異なるｍＲＮＡを含む１つ以上の組成物を組み合わせて投与してもよい。組成物は、１つ以上の他の所望の治療薬または医療手順と同時に、その前に、またはその後に投与されてもよい。一般に、各薬剤はその薬剤について決定された用量及び／またはタイムスケジュールで投与されるであろう。いくつかの実施形態では、本開示は、それらのバイオアベイラビリティーを改善し、それらの代謝を低減及び／または改変し、それらの排泄を阻害し、及び／または体内でのそれらの分布を改変する薬剤と組み合わせた、本開示の組成物の送達、またはそのイメージング、診断もしくは予防組成物を包含する。
【０８７６】
本開示の組成物と組み合わせて投与され得る例示的な治療剤としては、限定するものではないが、細胞傷害性剤、化学療法剤、及び他の治療剤が挙げられる。細胞傷害剤としては、例えば、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシネジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｉｎｅｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メイタンシノイド、ラシェルマイシン、及びそれらの類似体が挙げられ得る。放射性イオンも治療剤として使用されてもよく、例えば、放射性ヨウ素、ストロンチウム、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、コバルト、イットリウム、サマリウム、及びプラセオジムが挙げられ得る。他の治療剤としては、例えば、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、及び５−フルオロウラシル、及びデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、ラシェルマイシン、メルファラン、カルムスチン、ロムスチン、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、及びシスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン及びドキソルビシン）、抗生物質（例、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン及びアントラマイシン）、及び抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、及びメイタンシノイド）が挙げられ得る。
【０８７７】
併用レジメンで使用する療法（治療薬または手順）の特定の組み合わせは、所望の治療薬及び／または手順の適合性、ならびに達成されるべき所望の治療効果を考慮に入れる。使用される療法が同じ障害に対して所望の効果を達成し得る（例えば、がんを処置するのに有用な組成物は、化学療法剤と同時に投与され得る）、またはそれらは異なる効果を達成し得る（例えば、有害効果の制御）ことも理解される。
【０８７８】
プログラム死受容体１／プログラム死リガンド１（ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１）とＰＤ−Ｌ２との間の相互作用を標的とするペムブロリズマブまたはニボルマブなどの免疫チェックポイント阻害剤は、最近、様々な悪性腫瘍の処置に承認されており、現在メラノーマ、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む様々ながんの臨床試験で調査中である。
【０８７９】
したがって、本開示の一態様は、本開示の脂質ナノ粒子または組成物の投与の前に、対象が以前にＰＤ−１アンタゴニストで治療されている併用療法に関する。別の態様では、対象は、本開示の脂質ナノ粒子または組成物を投与する前に、ＰＤ−１に結合するモノクローナル抗体で処置されている。別の態様では、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体療法による処置の前に、対象に本開示の脂質ナノ粒子または組成物を投与した。いくつかの態様では、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体療法は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０８８０】
別の態様では、対象は、本開示の脂質ナノ粒子または組成物を投与する前に、ＰＤ−Ｌ１に結合するモノクローナル抗体で処置されている。別の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体療法による処置の前に、対象に脂質ナノ粒子または組成物を投与する。いくつかの態様では、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体療法は、デュルバルマブ、アベルマブ、ＭＥＤＩ４７３、ＢＭＳ−９３６５５９、エゾリズマブ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０８８１】
いくつかの態様では、対象は、本開示の組成物による処置の前にＣＴＬＡ−４アンタゴニストで処置されている。別の態様では、対象は、本開示の脂質ナノ粒子または組成物の投与前に、ＣＴＬＡ−４に結合するモノクローナル抗体で以前に処置されている。いくつかの態様では、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体による処置の前に、対象に脂質ナノ粒子または組成物が投与されている。いくつかの態様では、抗ＣＴＬＡ−４抗体療法は、イピリムマブまたはトレメリムマブを含む。
【０８８２】
前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、個体におけるがんの処置または進行の遅延に使用するための脂質ナノ粒子、及び任意の薬学的に許容される担体、または薬学的組成物を提供し、ここでこの処置は、第２の組成物と組み合わせたこの組成物の投与を包含し、この第２の組成物は、チェックポイント阻害剤ポリペプチド及び任意の薬学的に許容される担体を含む。
【０８８３】
前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、個体におけるがんの処置または進行を遅延させるための医薬の製造における脂質ナノ粒子及び任意の薬学的に許容される担体の使用を提供し、ここでこの医薬は、脂質ナノ粒子及び任意の薬学的に許容される担体を含み、ここでこの処置は、チェックポイント阻害剤ポリペプチド及び任意の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせたこの医薬の投与を包含する。
【０８８４】
任意の前述のまたは関連する態様では、本開示は、個体におけるがんの処置または進行を遅延させるための、脂質ナノ粒子、及び任意の薬学的に許容される担体、または薬学的組成物、ならびに脂質ナノ粒子または薬学的組成物の投与の説明書を含む添付文書を備える容器を備えるキットを提供する。いくつかの態様では、この添付文書は、個体におけるがんの処置または進行を遅延させるための、チェックポイント阻害剤ポリペプチド及び任意の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせた、脂質ナノ粒子または薬学的組成物の投与の説明書をさらに含む。
【０８８５】
任意の前述のまたは関連する態様では、本開示は、脂質ナノ粒子、及び任意の薬学的に許容される担体、または薬学的組成物を含む医薬、ならびに単独でまたは個体におけるがんの処置または進行を遅延させるためのチェックポイント阻害剤ポリペプチドと任意の薬学的に許容される担体とを含む組成物と組み合わせたこの医薬の投与の説明書を含む添付文書を備えるキットを提供する。いくつかの態様では、このキットは、個体におけるがんの処置または進行を遅延させるための第２の医薬の投与の前、それと同時、またはその後の第１の医薬の投与のための説明書を含む添付文書をさらに備える。
【０８８６】
任意の前述のまたは関連する態様では、本開示は、脂質ナノ粒子、組成物もしくはそれらの使用、または本明細書に記載の脂質ナノ粒子もしくは組成物を備えるキットを提供し、ここでこのチェックポイント阻害剤ポリペプチドがＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、またはそれらの組み合わせを阻害する。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、抗体である。いくつかの態様では、そのチェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ１に特異的に結合する抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、及びそれらの組み合わせから選択される抗体である。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブから選択される抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、トレメリムマブまたはイピリムマブから選択される抗ＣＴＬＡ−４抗体である。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ニボルマブまたはペンブロリズマブから選択される抗ＰＤ１抗体である。
【０８８７】
関連する態様では、本開示は、本開示の任意の前述のもしくは関連する脂質ナノ粒子、または本開示の任意の前述のまたは関連する組成物を対象に投与することを包含する、それを必要とする対象における腫瘍のサイズを低減もしくは縮小するか、または腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。
【０８８８】
関連する態様では、本開示は、本開示の任意の前述もしくは関連脂質ナノ粒子、または本開示の任意の前述もしくは関連組成物を対象に投与することを包含する、がんを有する対象において抗腫瘍応答を誘導する方法を提供する。いくつかの態様では、抗腫瘍反応は、Ｔ細胞反応を含む。いくつかの態様では、Ｔ細胞応答はＣＤ８＋Ｔ細胞を包含する。
【０８８９】
前述の方法のいくつかの態様では、上記方法はさらに、チェックポイント阻害剤ポリペプチド及び任意の薬学的に許容される担体を含む第２の組成物を投与することを包含する。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、またはそれらの組み合わせを阻害する。いくつかの態様では、このチェックポイント阻害剤ポリペプチドは抗体である。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ１に特異的に結合する抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、及びそれらの組み合わせから選択される抗体である。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブから選択される抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、トレメリムマブまたはイピリムマブから選択される抗ＣＴＬＡ−４抗体である。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ニボルマブまたはペンブロリズマブから選択される抗ＰＤ１抗体である。
【０８９０】
任意の前述の方法または関連する方法のいくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物は、静脈内注射によって投与される。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物は、２〜３週間に１回投与される。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物は、２週間に１回または３週間に１回投与される。いくつかの態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物は、脂質ナノ粒子またはその薬学的組成物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与される。
【０８９１】
前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、脂質ナノ粒子と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様では、薬学的組成物は、筋肉内送達用に処方されている。
【０８９２】
免疫原性細胞死を誘導するための治療方法
本発明は、それを必要とする対象、例えば、ヒト対象において腫瘍に対する免疫原性応答を刺激する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、腫瘍に対する免疫原性応答が対象において刺激されるように、免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードする本発明のｍＲＮＡの有効量を対象に投与することを包含する。別の実施形態では、この方法は、腫瘍に対する免疫原性応答が対象において刺激されるように、免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む有効量の本発明の脂質ナノ粒子を対象に投与することを包含する。さらに別の実施形態では、この方法は、腫瘍に対する免疫原性応答が対象において刺激されるように、対象に本発明の薬学的組成物（例えば、本発明のｍＲＮＡまたは脂質ナノ粒子を含む）を投与することを包含する。
【０８９３】
様々な実施形態では、この方法は、炎症性及び／または免疫反応を刺激する、及び／または免疫応答性を調節し、それによって対象における腫瘍に対する免疫原性応答をさらに促進もしくは増強する１つ以上のさらなる因子を対象に投与することを包含し得る。追加の因子として使用するための適切な種類の因子は上記されている。一実施形態では、対象に１つの追加の因子が投与される。別の実施形態では、対象に２つの追加の因子が投与され、それら追加の因子は互いに異なる。さらに別の実施形態では、対象に３つの追加の因子が投与され、それらの追加の因子は互いに異なる。
【０８９４】
一実施形態では、方法は、免疫応答を増強する、例えば、適応免疫を誘導する（例えば、Ｉ型インターフェロン産生を刺激することによって）、炎症性応答を刺激する、ＮＦκＢシグナル伝達を刺激する、及び／または樹状細胞（ＤＣ）動員を刺激する、少なくとも１つの因子を対象に投与することをさらに包含する。一実施形態では、この方法は、適応免疫を誘導する少なくとも１つの因子を対象に投与することをさらに包含する。一実施形態では、適応免疫を誘導する因子は、Ｉ型インターフェロン（例えば、Ｉ型インターフェロンを含む薬学的組成物）である。別の実施形態では、適応免疫を誘導する因子は、Ｉ型インターフェロンを刺激する。適応免疫を刺激する因子（例えば、ｍＲＮＡ構築物）の非限定的な例としては、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ６、ＩＲＦ７及びＩＲＦ８が挙げられる。別の実施形態では、この因子は炎症反応を刺激する。炎症反応を刺激する因子（例えば、ｍＲＮＡ構築物）の非限定的な例としては、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ６、ＮＦＡＴ及びＣ／ＥＢＰｂが挙げられる。別の実施形態では、この因子は、ＮＦκＢシグナル伝達を刺激する。ＮＦκＢシグナル伝達を刺激する因子（例えば、ｍＲＮＡ構築物）の非限定的な例としては、ＩＫＫβ、ｃ−ＦＬＩＰ、ＲＩＰＫ１、ＩＬ−２７、ＡｐｏＦ及びＰＬＰが挙げられる。別の実施形態では、この因子はＤＣ動員を刺激する。ＤＣ動員を刺激する因子の非限定的な例は、ＦＬＴ３である。さらに別の実施形態では、免疫応答を増強する因子は、ＤＩＡＢＬＯ（ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ）（例えば、ＤＩＡＢＬＯ  ｍＲＮＡ構築物）である。
【０８９５】
別の実施形態では、上記方法は、Ｔ細胞活性化または初回刺激を誘導する少なくとも１つの因子を対象に投与することをさらに包含する。一実施形態では、Ｔ細胞活性化または初回刺激を誘導する因子はサイトカインまたはケモカインである。Ｔ細胞活性化または初回刺激を誘導するサイトカインまたはケモカインの非限定的な例としては、ＩＬ−１２、ＩＬ３６ｇ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２０及びＣＣＬ２１が挙げられる。一実施形態では、Ｔ細胞活性化または初回刺激を誘導する因子は、ＩＬ−１２、ＩＬ３６ｇ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２０またはＣＣＬ２１を含む薬学的組成物である。別の実施形態では、Ｔ細胞活性化または初回刺激を誘導する因子は、ＩＬ−１２、ＩＬ３６ｇ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２０またはＣＣＬ２１をコードする因子（例えば、ｍＲＮＡ構築物）である。さらに別の実施形態では、この因子は、ケモカインまたはサイトカインを誘導する（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ３６ｇ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２０またはＣＣＬ２１を誘導する）ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ構築物である。
【０８９６】
別の実施形態では、上記方法は、免疫チェックポイントを調節する少なくとも１つの因子を対象に投与することをさらに包含する。一実施形態では、免疫チェックポイントを調節する因子は抗体である。別の実施形態では、免疫チェックポイントを調節する因子は、抗体をコードする因子（例えば、ｍＲＮＡ構築物）である。一実施形態では、免疫チェックポイントを調節する因子は、ＣＴＬＡ−４阻害剤であり、その非限定的な例としてはイピリムマブ、トレメリムマブ及びＡＧＥＮ１８８４が挙げられる。別の実施形態では、免疫チェックポイントを調節する因子は、ＰＤ−１阻害剤であり、その非限定的な例としては、ペムブロリズマブ、アレムツズマブ、アテゾリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブ、ピジリズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ＭＥＤＩ０６８０及びＰＤＲ００１、ＡＭＰ−２２４、ＰＦ−０６８０１５９１、ＢＧＢ−Ａ３１７、ＲＥＧＮ２８１０、ＳＨＲ−１２１０、ＴＳＲ−０４２、アベルマブ、デュルバルマブ及びアフィマーが挙げられる。別の実施形態では、免疫チェックポイントを調節する因子は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤であり、その非限定的な例としては、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ及びＢＭＳ９３６５５９が挙げられる。さらに別の実施形態では、免疫チェックポイントを調節する因子は、ＯＸ−４０またはＯＸ−４０Ｌの活性を調節し、その非限定的な例としては、Ｆｃ−ＯＸ−４０Ｌ、ＭＥＤＩ６４６９（アゴニスト抗ＯＸ４０抗体）及びＭＯＸＲ０９１６（アゴニスト抗ＯＸ４０抗体）が挙げられる。さらに別の実施形態では、免疫チェックポイントを調節する因子は、ＩＣＯＳの活性を調節する（例えば、ＩＣＯＳ経路アゴニスト）。
【０８９７】
一実施形態では、免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを投与することに加えて、この方法はさらに：（ｉ）免疫応答を増強する（例えば、適応免疫を誘導する、Ｉ型インターフェロンを刺激する、炎症反応を刺激する、ＮＦκＢシグナル伝達を刺激する、及び／またはＤＣ動員を刺激する）少なくとも１つの因子；ならびに（ｉｉ）Ｔ細胞活性化または初回刺激を誘導する少なくとも１つの因子を投与することを包含する。別の実施形態では、この方法はさらに：（ｉ）免疫応答を増強する（例えば、適応免疫を誘導する、Ｉ型インターフェロンを刺激する、炎症応答を刺激する、ＮＦκＢシグナル伝達を刺激する、及び／またはＤＣ動員を刺激する）少なくとも１つの因子；ならびに（ｉｉ）免疫チェックポイントを調節する少なくとも１つの因子を投与することを包含する。別の実施形態では、この方法はさらに以下を投与することを包含する：（ｉ）Ｔ細胞活性化または初回刺激を誘導する少なくとも１つの因子；ならびに（ｉｉ）免疫チェックポイントを調節する少なくとも１つの因子。さらに別の実施形態では、この方法はさらに、対象に対して以下を投与することを包含する：（ｉ）免疫応答を増強する（例えば、適応免疫を誘導する、Ｉ型インターフェロンを刺激する、炎症応答を刺激する、ＮＦκＢシグナル伝達を刺激する、及び／またはＤＣ動員を刺激する）少なくとも１つの因子；（ｉｉ）Ｔ細胞活性化または初回刺激を誘導する少なくとも１つの因子；ならびに（ｉｉｉ）免疫チェックポイントを調節する少なくとも１つの因子。
【０８９８】
それを必要とする対象において腫瘍に対する免疫原性応答を刺激する方法の一実施形態では、ｍＲＮＡ構築物、脂質ナノ粒子または薬学的組成物は、非経口的に対象に投与される。一実施形態では、ｍＲＮＡ、脂質ナノ粒子または薬学的組成物は、週に１回の注入によって投与される。一実施形態では、腫瘍は、肝臓癌、結腸直腸癌または黒色腫癌細胞である。
【０８９９】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象において腫瘍に対する免疫原性応答を刺激するための方法を提供し、この方法は対象に有効量の以下：
（ｉ）免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードする第１の化学修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）（ここで、上記第１のｍｍＲＮＡは１つ以上の修飾核酸塩基を含む）；
及び以下のうち少なくとも１つ：
（ｉｉ）免疫応答を増強する（例えば、適応免疫を誘導する、Ｉ型インターフェロンを刺激する、炎症応答を刺激する、ＮＦκＢシグナル伝達を刺激する、及び／またはＤＣ動員を刺激する）ポリペプチドをコードする第２のｍｍＲＮＡ（ここで上記第２のｍｍＲＮＡは、１つ以上の修飾核酸塩基を含む）；
（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化または初回刺激を誘導するポリペプチドをコードする第３のｍｍＲＮＡ（ここで、前記第３のｍｍＲＮＡは、１つ以上の修飾核酸塩基を含む）；及び／または
（ｉｖ）免疫チェックポイントを調節するポリペプチドをコードする第４のｍｍＲＮＡ（ここで前記第４のｍｍＲＮＡは１つ以上の修飾核酸塩基を含む）、
を投与することを包含し、
その結果、腫瘍に対する免疫原性応答が対象において生じる。
【０９００】
第１のｍｍＲＮＡ、第２のｍｍＲＮＡ、第３のｍｍＲＮＡ及び／または第４のｍｍＲＮＡは、対象に投与されるのと同じ薬学的組成物または脂質ナノ粒子中に存在してもよい。あるいは、第１のｍｍＲＮＡ、第２のｍｍＲＮＡ、第３のｍｍＲＮＡ及び／または第４のｍｍＲＮＡは、対象に投与される異なる薬学的組成物または脂質ナノ粒子中に存在してもよい。
【０９０１】
一実施形態では、第１のｍｍＲＮＡ及び第２のｍｍＲＮＡが対象に投与される。別の実施形態では、第１のｍｍＲＮＡ及び第３のｍｍＲＮＡが対象に投与される。別の実施形態では、第１のｍｍＲＮＡ及び第４のｍｍＲＮＡが対象に投与される。別の実施形態では、第１のｍｍＲＮＡ、第２のｍｍＲＮＡ及び第３のｍｍＲＮＡが対象に投与される。別の実施形態では、第１のｍｍＲＮＡ、第２のｍｍＲＮＡ及び第４のｍｍＲＮＡが対象に投与される。別の実施形態では、第１のｍｍＲＮＡ、第３のｍｍＲＮＡ及び第４のｍｍＲＮＡが対象に投与される。別の実施形態では、第１のｍｍＲＮＡ、第２、第３のｍｍＲＮＡ及び第４のｍｍＲＮＡが対象に投与される。
【０９０２】
一実施形態では、第１のｍｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、ＭＬＫＬ、ＲＩＰＫ３、ＲＩＰＫ１、ＤＩＡＢＬＯ、ＦＡＤＤ、ＧＳＤＭＤ、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−１１、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣ／ＣＡＲＤ及びＰｙｒｉｎからなる群より選択される。一実施形態では、第２のｍｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、ＤＩＡＢＬＯ、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ６、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ６、ＮＦＡＴ、Ｃ／ＥＢＰｂ、ＩＫＫβ、ｃ−ＦＬＩＰ、ＲＩＰＫ１、ＩＬ−２７、ＡｐｏＦ、ＰＬＰ及びＦＬＴ３からなる群より選択される。一実施形態では、第２のｍｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、ＤＩＡＢＬＯ、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＳＴＡＴ６、ＩＫＫβ、ｃ−ＦＬＩＰ及びＲＩＰＫ１からなる群より選択される。一実施形態では、第３のｍｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、ＩＬ−１２、ＩＬ３６ｇ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２０及びＣＣＬ２１からなる群より選択される。一実施形態では、第４のｍｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＯＸ−４０アゴニスト、ＯＸ−４０Ｌ及びＩＣＯＳ経路アゴニストからなる群より選択される。
【０９０３】
本発明はまた、本明細書に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを対象に提供または投与することを包含する、それを必要とする対象においてがんを処置または予防する方法を提供する。関連の実施形態では、対象は、ｍＲＮＡを含むナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を提供されるかまたは投与される。さらなる関連の実施形態では、対象は、本発明の薬学的組成物を対象に提供または投与される。特定の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むか、またはそのｍＲＮＡを含むナノ粒子を含む。特定の実施形態では、ｍＲＮＡはナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子中に存在する。特定の実施形態では、ｍＲＮＡまたはナノ粒子は薬学的組成物中に存在する。特定の実施形態では、それを必要とする対象は癌と診断されたか、またはがんを発症する危険性があるとみなされる。いくつかの実施形態では、癌は肝臓癌、結腸直腸癌または黒色腫癌である。特定の実施形態では、肝臓癌は肝細胞癌腫である。いくつかの実施形態では、結腸直腸癌は、原発腫瘍または転移である。いくつかの実施形態では、癌は造血器癌である。いくつかの実施形態では、癌は急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、骨髄ジストロフィー症候群（難治性貧血及び難治性血球減少症を含む）または骨髄増殖性新生物または疾患（真性多血症、本態性血小板増多症及び原発性骨髄線維症を含む）である。他の実施形態では、癌は血液系癌または造血系癌である。特定のがん型に対する選択性は、ｍＲＮＡ構築物に操作された適切な調節部位（複数可）（例えば、マイクロＲＮＡ）と組み合わせた適切なＬＮＰ製剤（例えば、特定の細胞型を標的とする）の使用の組み合わせによって達成され得る。
【０９０４】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ、ナノ粒子、または薬学的組成物は、患者に非経口的に投与される。特定の実施形態では、対象は哺乳動物、例えば、ヒトである。様々な実施形態では、対象は有効量のｍＲＮＡを提供される。
【０９０５】
本発明はさらに、それを必要とする対象においてがんを治療または予防する方法であって、有効量の本明細書に記載のｍＲＮＡ、例えば、免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを対象に提供することを包含する方法を提供し、ここでｍＲＮＡがさらに正常細胞と比較してがん細胞におけるポリペプチドの発現を増強する調節エレメントをさらに包含する。特定の実施形態では、調節エレメントは、がん細胞よりも正常細胞中で発現が大きいマイクロＲＮＡの結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位）であり、ここでマイクロＲＮＡの結合部位への結合はポリペプチドの発現を阻害する。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、ナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子中に存在する。特定の実施形態では、ｍＲＮＡまたはナノ粒子は薬学的組成物中に存在する。免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドを産生するために、ナノ粒子または単離されたｍＲＮＡを対象の細胞に取り込んで翻訳してもよい。特定の実施形態では、ポリペプチドの発現は、正常細胞よりもがん細胞において大きく、その結果、正常細胞よりもがん細胞の免疫原性細胞死が大きくなる。
【０９０６】
特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の第１のｍＲＮＡ、例えば、免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを、化学療法薬または他の抗がん剤などの治療剤と組み合わせて、対象に提供することを包含する、それを必要とする対象におけるがんの処置または予防の方法を包含する。併用療法に使用するのに適した治療剤としては、低分子化学療法剤、例としては、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤、ならびに生物学的抗がん剤、例えば、抗がん抗体が挙げられる。併用療法における使用のための他の適切な治療剤は、以下にさらに記載される。
【０９０７】
本発明の１つ以上のｍＲＮＡを含む薬学的組成物は、任意の適切な経路によって対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、１つ以上の様々な経路、例としては、非経口（例えば、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液内、胸骨内、くも膜下腔内、病巣内または頭蓋内注射、ならびに任意の適切な注入技術）、経口、経皮または皮内、皮内、直腸内、膣内、局所（例えば、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、及び／またはドロップによる）、粘膜、経鼻、口腔内、経腸、硝子体、腫瘍内、舌下、鼻腔内によって；気管内注入、気管支注入、及び／または吸入によって；経口スプレー及び／または粉末、鼻腔スプレー、及び／またはエアロゾルとして、及び／または門脈カテーテルを通して投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内、筋肉内、皮内、動脈内、腫瘍内、皮下または吸入によって投与され得る。しかし、本開示は、薬物送達の科学における可能性のある進歩を考慮に入れて、任意の適切な経路による本発明の組成物の送達を包含する。一般に、最も適切な投与経路は、１つ以上のｍＲＮＡを含む薬学的組成物の性質（例えば、血流及び胃腸管などの様々な身体環境におけるその安定性）、及び患者の状態（例えば、患者が特定の投与経路に耐えることができるか否か）を含む様々な要因に依存する。
【０９０８】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、所定の用量中で約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ送達するのに十分な投薬レベルで投与され得、ここで、１ｍｇ／ｋｇの用量によって、対象の体重１ｋｇあたり１ｍｇのｍＲＮＡまたはナノ粒子が提供される。特定の実施形態では、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇという本発明のｍＲＮＡまたはナノ粒子の投与量が投与され得る。
【０９０９】
用量は、所望のレベルのｍＲＮＡ発現及び／または効果（例えば、治療効果）を得るために、１日に１回以上、同じ量または異なる量で投与されてもよい。所望の投与量は、例えば、１日３回、１日２回、１日１回、隔日、３日ごと、毎週、２週間ごと、３週間ごと、または４週間ごとに送達してもよい。特定の実施形態では、所望の投与量は、複数回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４またはそれ以上の投与）を用いて送達され得る。いくつかの実施形態では、単回用量は、例えば、外科的処置の前もしくは後に投与されても、または急性の疾患、障害もしくは病態の場合に投与されてもよい。任意の特定の患者に対する具体的な治療上有効、予防上有効、またはそうでなければ適切な用量レベルは、もしあれば、処置される障害の重症度及び同定；使用された１つ以上のｍＲＮＡ；使用された特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事；使用した特定の薬学的組成物の投与時間、投与経路、及び排泄速度；処置の期間；使用される特定の薬学的組成物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；そして医学の分野で周知の同様の要因を含む様々な要因に依存するであろう。
【０９１０】
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、別の薬剤、例えば、別の治療剤、予防剤、及び／または診断剤と組み合わせて投与され得る。「と組み合わせて」とは、薬剤を同時に投与しなければならないか、及び／または一緒に送達するために処方されなければならないことを意味することを意図しないが、これらの送達方法は、本開示の範囲内である。例えば、１つ以上の異なるｍＲＮＡを含む１つ以上の組成物は組み合わせて投与されてもよい。組成物は、１つ以上の他の所望の処置法または医療処置と同時に、その前に、またはその後に投与されてもよい。一般に、各因子はその因子について決定された用量及び／またはタイムスケジュールで投与される。いくつかの実施形態では、本開示は、それらのバイオアベイラビリティーを改善する、それらの代謝を低減及び／または改変する、それらの排泄を阻害する、及び／または体内でのそれらの分布を改変する因子と組み合わせた、本発明の組成物、またはその画像化、診断もしくは予防用の組成物の送達を包含する。
【０９１１】
本発明の組成物と組み合わせて投与され得る例示的な治療剤としては、限定するものではないが、細胞傷害性剤、化学療法剤、及び他の治療剤が挙げられる。細胞傷害剤としては、例えば、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシネジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｉｎｅｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メイタンシノイド、ラシェルマイシン、及びそれらの類似体が挙げられ得る。放射性イオンも治療剤として使用されてもよく、例えば、放射性ヨウ素、ストロンチウム、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、コバルト、イットリウム、サマリウム、及びプラセオジムが挙げられ得る。他の治療剤としては、例えば、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、及び５−フルオロウラシル、及びデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、ラシェルマイシン、メルファラン、カルムスチン、ロムスチン、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、及びシスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン及びアントラマイシン）、及び抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、及びメイタンシノイド）が挙げられ得る。
【０９１２】
併用レジメンで使用する療法（治療薬または手順）の特定の組み合わせは、所望の治療薬及び／または手順の適合性、ならびに達成されるべき所望の治療効果を考慮に入れる。使用される療法が同じ障害に対して所望の効果を達成し得ること（例えば、がんを処置するのに有用な組成物は、化学療法剤と同時に投与されてもよい）、またはそれらは異なる効果を達成する場合もある（例えば、有害効果の制御）ことも理解される。
【０９１３】
本開示の他の実施形態
Ｅ１．免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードする化学修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、上記ｍｍＲＮＡは１つ以上の修飾核酸塩基を含む、化学修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）。
【０９１４】
Ｅ２．上記ポリペプチドがネクロトーシスを誘発する、実施形態１に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９１５】
Ｅ３．上記ポリペプチドが混合系列キナーゼドメイン様タンパク質（ＭＬＫＬ）、またはその免疫原性細胞死誘導断片である、実施形態２に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９１６】
Ｅ４．上記ＭＬＫＬポリペプチドが、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態３に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９１７】
Ｅ５．上記ポリペプチドが受容体相互作用タンパク質キナーゼ３（ＲＩＰＫ３）、またはその免疫原性細胞死誘導断片である、実施形態２に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９１８】
Ｅ６．上記ＲＩＰＫ３ポリペプチドが配列番号３〜１９に示されるアミノ酸配列のいずれかを含む、実施形態５に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９１９】
Ｅ７．上記ポリペプチドが受容体相互作用タンパク質キナーゼ１（ＲＩＰＫ１）、またはその免疫原性細胞死誘導断片である、実施形態２に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９２０】
Ｅ８．上記ＲＩＰＫ１ポリペプチドが配列番号６２〜６７に示されるアミノ酸配列のいずれかを含む、実施形態７に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９２１】
Ｅ９．上記ポリペプチドが、低ｐＩの直接ＩＡＰ結合タンパク質（ＤＩＡＢＬＯ）、またはその免疫原性細胞死誘導断片である、実施形態２に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９２２】
Ｅ１０．上記ＤＩＡＢＬＯポリペプチドが配列番号２６〜３３に示されるアミノ酸配列のいずれかを含む、実施形態９に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９２３】
Ｅ１１．上記ポリペプチドが、デスドメインを有するＦａｓ関連タンパク質（ＦＡＤＤ）、またはその免疫原性細胞死誘導断片である、実施形態２に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９２４】
Ｅ１２．上記ＦＡＤＤポリペプチドが配列番号５６〜６１に示されるアミノ酸配列のいずれかを含む、実施形態１１に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９２５】
Ｅ１３．上記ポリペプチドがパイロトーシスを誘発する、実施形態１に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９２６】
Ｅ１４．上記ポリペプチドがガスデルミンＤ（ＧＳＤＭＤ）、またはその免疫原性細胞死誘導断片である、実施形態１３に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９２７】
Ｅ１５．上記ＧＳＤＭＤポリペプチドが配列番号２０〜２５に示されるアミノ酸配列のいずれかを含む、実施形態１４に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９２８】
Ｅ１６．上記ポリペプチドがカスパーゼ−４、その免疫原性細胞死誘導断片である、実施形態１３に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９２９】
Ｅ１７．上記カスパーゼ−４ポリペプチドが配列番号３４〜３８に示されるアミノ酸配列のいずれかを含む、実施形態１６に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９３０】
Ｅ１８．上記ポリペプチドがカスパーゼ−５、その免疫原性細胞死誘導断片である、実施形態１３に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９３１】
Ｅ１９．上記カスパーゼ−５ポリペプチドが配列番号３９〜４３に示されるアミノ酸配列のいずれかを含む、実施形態１８に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９３２】
Ｅ２０．上記ポリペプチドがカスパーゼ−１１、その免疫原性細胞死誘導断片である、実施形態１３に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９３３】
Ｅ２１．上記カスパーゼ−１１ポリペプチドが、配列番号４４〜４８に示されるアミノ酸配列のいずれかを含む、実施形態２０に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９３４】
Ｅ２２．上記ポリペプチドがＮＬＲＰ３、その免疫原性細胞死誘導断片である、実施形態１３に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９３５】
Ｅ２３．上記ＮＬＲＰ３ポリペプチドが配列番号５１〜５２に示されるアミノ酸配列のいずれかを含む、実施形態２２に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９３６】
Ｅ２４．上記ポリペプチドが、Ｐｙｒｉｎドメイン、その免疫原性細胞死誘導断片である、実施形態１３に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９３７】
Ｅ２５．上記Ｐｙｒｉｎドメインポリペプチドが配列番号４９〜５０に示されるアミノ酸配列のいずれかを含む、実施形態２４に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９３８】
Ｅ２６．上記ポリペプチドがＡＳＣ／ＰＹＣＡＲＤ、その免疫原性細胞死誘導断片である、実施形態１３に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９３９】
Ｅ２７．上記ＡＳＣ／ＰＹＣＡＲＤポリペプチドが、配列番号５３〜５４に示されるアミノ酸配列のいずれかを含む、実施形態２６に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９４０】
Ｅ２８．上記ｍｍＲＮＡが、５’ＵＴＲ、上記ポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ及び連結ヌクレオシドの３’テーリング領域を含む、先行する実施形態のうちのいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡ。
【０９４１】
Ｅ２９．上記ｍｍＲＮＡが、１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位をさらに含む、実施形態２８に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９４２】
Ｅ３０．上記ｍｍＲＮＡが完全に修飾されている、上記実施形態のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡ。
【０９４３】
Ｅ３１．上記ｍｍＲＮＡが、シュードウリジン（Ψ）、シュードウリジン（Ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２−チオウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）またはＮ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む、先行する実施形態のうちいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡ。
【０９４４】
Ｅ３２．上記ｍｍＲＮＡが、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、または２’−Ｏ−メチルウリジン、またはそれらの組み合わせを含む、先行する実施形態のうちいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡ。
【０９４５】
Ｅ３３．上記ｍｍＲＮＡが、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（Ψ）、α−チオ−グアノシンまたはα−チオ−アデノシン、またはそれらの組み合わせを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡ。
【０９４６】
Ｅ３４．実施形態１〜３３のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子。
【０９４７】
Ｅ３５．リポソームである、実施形態３４に記載の脂質ナノ粒子。
【０９４８】
Ｅ３６．カチオン性脂質及び／またはイオン性脂質を含む、実施形態３４に記載の脂質ナノ粒子。
【０９４９】
Ｅ３７．上記カチオン性脂質及び／またはイオン性脂質が、２，２−ジリノレイル−４−メチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）またはジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）である、実施形態３６に記載の脂質ナノ粒子。
【０９５０】
Ｅ３８．上記脂質ナノ粒子が、上記脂質ナノ粒子の外面にコンジュゲートされている標的化部分をさらに含む、実施形態３４〜３７のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
【０９５１】
Ｅ３９．実施形態１〜３３のいずれかに記載のｍｍＲＮＡまたは実施形態３４〜３８のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子、及び薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物。
【０９５２】
Ｅ４０．細胞の免疫原性細胞死を誘導するための方法であって、上記細胞を、実施形態１〜３３のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡ、実施形態３４〜３８のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子、または実施形態３９に記載の薬学的組成物と接触させることを包含し、その結果上記細胞の免疫原性細胞死が起こる方法。
【０９５３】
Ｅ４１．免疫原性細胞死が、原形質膜の破裂及び上記細胞のサイトゾル内容物の放出によって特徴付けられる、実施形態４０に記載の方法。
【０９５４】
Ｅ４２．ＡＴＰ及びＨＭＧＢ１が細胞から放出される、実施形態４１に記載の方法。
【０９５５】
Ｅ４３．上記接触がインビトロまたはインビボで起こる、実施形態４０〜４２のいずれか１つに記載の方法。
【０９５６】
Ｅ４４．上記細胞ががん細胞である、実施形態４０〜４３のいずれか１つに記載の方法。
【０９５７】
Ｅ４５．上記がん細胞が肝臓癌細胞、結腸直腸癌細胞または黒色腫癌細胞である、実施形態４４に記載の方法。
【０９５８】
Ｅ４６．上記細胞がヒト細胞である、実施形態４０〜４５のいずれか１つに記載の方法。
【０９５９】
Ｅ４７．それを必要とする対象において腫瘍に対する免疫原性応答を刺激する方法であって、上記対象に対して有効量の実施形態１〜３３のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡ、実施形態３４〜３８のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子、または実施形態３９に記載の薬学的組成物を投与することを包含し、その結果上記腫瘍に対する免疫原性応答が上記対象において刺激される方法。
【０９６０】
Ｅ４８．実施形態４７に記載の方法であって、上記対象に対して、免疫応答を増強する少なくとも１つの因子を投与し、免疫応答を増強する上記少なくとも１つの因子が適応免疫を誘導するか、１型インターフェロンを刺激するか、炎症応答を刺激するか、ＮＦκＢシグナル伝達を刺激するか、または樹状細胞動員を刺激することをさらに包含する、方法。
【０９６１】
Ｅ４９．上記少なくとも１つの因子が１型インターフェロンを刺激することによって適応免疫を誘導する、実施形態４８に記載の方法。
【０９６２】
Ｅ５０．Ｔ細胞活性化または初回刺激を誘導する少なくとも１つの因子を上記対象に投与することをさらに包含する、実施形態４７に記載の方法。
【０９６３】
Ｅ５１．Ｔ細胞活性化または初回刺激を誘導する上記少なくとも１つの因子がサイトカインまたはケモカインである、実施形態５０に記載の方法。
【０９６４】
Ｅ５２．免疫チェックポイントを調節する少なくとも１つの因子を上記対象に投与することをさらに包含する、実施形態４７に記載の方法。
【０９６５】
Ｅ５３．実施形態４７に記載の方法であって、上記対象に以下：（ｉ）免疫応答を増強する少なくとも１つの因子；（ｉｉ）Ｔ細胞活性化または初回刺激を誘導する少なくとも１つの因子；及び（ｉｉｉ）免疫チェックポイントを調節する少なくとも１つの因子、を投与することをさらに包含する、方法。
【０９６６】
Ｅ５４．上記ｍｍＲＮＡ、脂質ナノ粒子または薬学的組成物が上記対象に非経口投与される、実施形態４７〜５３のいずれか１つに記載の方法。
【０９６７】
Ｅ５５．上記ｍｍＲＮＡ、脂質ナノ粒子または薬学的組成物が週１回の注入によって投与される、実施形態５４に記載の方法。
【０９６８】
Ｅ５６．上記対象がヒトである、実施形態４７〜５５のいずれか１つに記載の方法。
【０９６９】
Ｅ５７．上記腫瘍が肝臓癌または結腸直腸癌である、実施形態４７〜５６のいずれか１つに記載の方法。
【０９７０】
Ｅ５８．それを必要とする対象において腫瘍に対する免疫原性応答を刺激する方法であって、上記対象に有効量の：
（ｉ）免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードする第１の化学修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、上記第１のｍｍＲＮＡが１つ以上の修飾核酸塩基を包含する、メッセンジャーＲＮＡ；
ならびに以下のうち少なくとも次の１つ：
（ｉｉ）免疫応答を増強するポリペプチドをコードする第２のｍｍＲＮＡであって、１つ以上の修飾核酸塩基を含む、第２のｍｍＲＮＡ；
（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化または初回刺激を誘導するポリペプチドをコードする第３のｍｍＲＮＡであって、１つ以上の修飾核酸塩基を含む第３のｍｍＲＮＡ、及び／または
（ｉｖ）免疫チェックポイントを調節するポリペプチドをコードする第４のｍｍＲＮＡであって、１つ以上の修飾核酸塩基を含む第４のｍｍＲＮＡ、
を投与することを包含し、
その結果、上記腫瘍に対する免疫原性応答が上記対象において生じる、方法。
【０９７１】
Ｅ５９．上記第２のｍｍＲＮＡが、適応免疫を誘導するか、１型インターフェロンを刺激するか、炎症応答を刺激するか、ＮＦκＢシグナル伝達を刺激するか、または樹状細胞動員を刺激する、ポリペプチドをコードする、実施形態５８に記載の方法。
【０９７２】
Ｅ６０．上記第１のｍｍＲＮＡ及び第２のｍｍＲＮＡが上記対象に投与される、実施形態５８に記載の方法。
【０９７３】
Ｅ６１．上記第１のｍｍＲＮＡ、上記第２のｍｍＲＮＡ及び上記第３のｍｍＲＮＡが上記対象に投与される、実施形態５８に記載の方法。
【０９７４】
Ｅ６２．上記第１のｍｍＲＮＡ、上記第２のｍｍＲＮＡ、上記第３のｍｍＲＮＡ及び上記第４のｍｍＲＮＡが上記対象に投与される、実施形態５８に記載の方法。
【０９７５】
Ｅ６３．上記第１のｍｍＲＮＡ、第２のｍｍＲＮＡ、第３のｍｍＲＮＡ及び／または第４のｍｍＲＮＡが、上記対象に投与されるのと同じ薬学的組成物または脂質ナノ粒子中に存在する、実施形態５８〜６２のいずれか１つに記載の方法。
【０９７６】
Ｅ６４．上記第１のｍｍＲＮＡによってコードされる上記ポリペプチドが、ＭＬＫＬ、ＲＩＰＫ３、ＲＩＰＫ１、ＤＩＡＢＬＯ、ＦＡＤＤ、ＧＳＤＭＤ、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−１１、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣ／ＰＹＣＡＲＤ及びＰｙｒｉｎからなる群より選択される、実施形態５８〜６３のいずれか１つに記載の方法。。
【０９７７】
Ｅ６５．上記第２のｍｍＲＮＡによってコードされる上記ポリペプチドが、ＤＩＡＢＬＯ、ＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ６、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ６、ＮＦＡＴ、Ｃ／ＥＢＰｂ、ＩＫＫβ、ｃ−ＦＬＩＰ、ＲＩＰＫ１、ＩＬ−２７、ＡｐｏＦ、ＰＬＰ及びＦＬＴ３からなる群より選択される、実施形態５８〜６４のいずれか１つに記載の方法。
【０９７８】
Ｅ６６．上記第３のｍｍＲＮＡによってコードされる上記ポリペプチドがＩＬ−１２、ＩＬ３６ｇ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２０及びＣＣＬ２１からなる群より選択される、実施形態５８及び６０〜６４のいずれか１つに記載の方法。
【０９７９】
Ｅ６７．上記第４のｍｍＲＮＡによってコードされる上記ポリペプチドが、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＯＸ−４０アゴニスト、ＯＸ−４０Ｌ及びＩＣＯＳ経路アゴニストからなる群より選択される、実施形態５８及び６１〜６５のいずれか１つに記載の方法。
【０９８０】
Ｅ６８．それを必要とする対象において腫瘍に対する免疫原性応答を刺激する方法であって、上記対象に有効量の：
（ｉ）免疫原性細胞死を誘導するポリペプチドをコードする少なくとも１つの第１の化学修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、１つ以上の修飾核酸塩基を含む、第１のｍｍＲＮＡ；
ならびに以下のうちの少なくとも１つ：
（ｉｉ）免疫応答を増強するポリペプチドをコードする少なくとも１つの第２のｍｍＲＮＡであって、１つ以上の修飾核酸塩基を含む第２のｍｍＲＮＡ、及び／または
（ｉｉｉ）免疫チェックポイント阻害剤、
を投与することを包含し、
その結果、上記腫瘍に対する免疫原性応答が上記対象において生じる、方法。
【０９８１】
Ｅ６９．上記少なくとも１つの第１のｍｍＲＮＡが、ＭＬＫＬ、Ｄｉａｂｌｏ、ＲＩＰＫ３、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるポリペプチドをコードする、実施形態６８に記載の方法。
【０９８２】
Ｅ７０．上記第１のｍｍＲＮＡがＭＬＫＬをコードする、実施形態６９に記載の方法。
【０９８３】
Ｅ７１．上記第１のｍｍＲＮＡがＤｉａｂｌｏをコードする、実施形態６９に記載の方法。
【０９８４】
Ｅ７２．上記第１のｍｍＲＮＡがＲＩＰＫ３をコードする、実施形態６９に記載の方法。
【０９８５】
Ｅ７３．上記第１のｍｍＲＮＡが、一方がＭＬＫＬをコードし、他方がＤｉａｂｌｏをコードする２つのｍｍＲＮＡを含む、実施形態６９に記載の方法。
【０９８６】
Ｅ７４．上記第１のｍｍＲＮＡが、一方がＭＬＫＬをコードし、他方がＲＩＰＫ３をコードする２つのｍｍＲＮＡを含む、実施形態６９に記載の方法。
【０９８７】
Ｅ７５．上記第１のｍｍＲＮＡが、一方がＲＩＰＫ３をコードし、他方がＤｉａｂｌｏをコードする２つのｍｍＲＮＡを含む、実施形態６９に記載の方法。
【０９８８】
Ｅ７６．上記第２のｍｍＲＮＡがＳＴＩＮＧをコードする、実施形態６８〜７５のいずれか１つに記載の方法。
【０９８９】
Ｅ７７．上記免疫チェックポイント阻害剤が抗ＣＴＬＡ−４抗体である、実施形態６８〜７６のいずれか１つに記載の方法。
【０９９０】
Ｅ７８．上記免疫チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ−１抗体である、実施形態６８〜７６のいずれか１つに記載の方法。
【０９９１】
Ｅ７９．対象における目的の抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする化学修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であって、上記ｍｍＲＮＡが、１つ以上の修飾核酸塩基を含み、上記免疫応答は、以下：
（ｉ）Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉ）ＮＦκＢ経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉｉ）炎症反応を刺激すること；
（ｉｖ）サイトカイン産生を刺激すること；または
（ｖ）樹状細胞の発達、活性もしくは動員を刺激すること；及び
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかの組み合わせ、
によって特徴付けられる、
細胞性免疫応答または体液性免疫応答を含む、ｍｍＲＮＡ。
【０９９２】
Ｅ８０．上記目的の抗原が上記対象における内因性抗原である、実施形態７９に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９９３】
Ｅ８１．上記目的の抗原が、ｍｍＲＮＡと一緒に上記対象に同時投与される外因性抗原である、実施形態７９に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９９４】
Ｅ８２．上記目的の抗原がｍｍＲＮＡによってコードされている実施形態８１に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９９５】
Ｅ８３．構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードする、実施形態７９〜８２のいずれかに記載のｍｍＲＮＡ。
【０９９６】
Ｅ８４．上記構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドが、Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｅ３１５Ｑ、Ｒ３７５Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の変異を含む、実施形態８３に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９９７】
Ｅ８５．上記構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドがＶ１５５Ｍ変異を含む、実施形態８４に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９９８】
Ｅ８６．上記構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドが変異Ｒ２８４Ｍ／Ｖ１４７Ｌ／Ｎ１５４Ｓ／Ｖ１５５Ｍを含む実施形態８４に記載のｍｍＲＮＡ。
【０９９９】
Ｅ８７．上記構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドが、配列番号１〜１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１９９〜２０８、２２５、１３１９もしくは１３２０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態８４に記載のｍｍＲＮＡ。
【１０００】
Ｅ８８．上記ｍｍＲＮＡが構成的に活性なＩＲＦ３ポリペプチドをコードする、実施形態７９〜８２のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡ。
【１００１】
Ｅ８９．上記構成的に活性なＩＲＦ３ポリペプチドがＳ３９６Ｄ変異を含む、実施形態８８に記載のｍｍＲＮＡ。
【１００２】
Ｅ９０．上記構成的に活性なＩＲＦ３ポリペプチドが、配列番号１１〜１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、実施形態８９に記載のｍｍＲＮＡ。
【１００３】
Ｅ９１．上記ｍｍＲＮＡが構成的に活性なヒトＩＲＦ７ポリペプチドをコードする、実施形態７９〜８２のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡ。
【１００４】
Ｅ９２．上記構成的に活性なヒトＩＲＦ７ポリペプチドが、Ｓ４７５Ｄ、Ｓ４７６Ｄ、Ｓ４７７Ｄ、Ｓ４７９Ｄ、Ｌ４８０Ｄ、Ｓ４８３Ｄ、Ｓ４８７Ｄ、アミノ酸２４７〜４６７の欠失、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の変異を含む、実施形態９１に記載のｍｍＲＮＡ。
【１００５】
Ｅ９３．上記構成的に活性なヒトＩＲＦ７ポリペプチドが配列番号１４〜１８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、実施形態９１に記載のｍｍＲＮＡ。
【１００６】
Ｅ９４．上記ポリペプチドが、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＭ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＴＢＫ１、ＩＫＫｉ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ６、ｃ−ＦＬＩＰ、ＩＫＫβ、ＲＩＰＫ１、ＴＡＫ−ＴＡＢ１、ＤＩＡＢＬＯ、Ｂｔｋ、自己活性化カスパーゼ−１及びＦｌｔ３からなる群より選択される、実施形態７９〜８２のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡ。
【１００７】
Ｅ９５．上記ポリペプチドがＩ型インターフェロン経路シグナル伝達を刺激する、実施形態７９〜８２のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡ。
【１００８】
Ｅ９６．上記ポリペプチドがＮＦκＢシグナル伝達を刺激する、実施形態７９〜８２のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡ。
【１００９】
Ｅ９７．上記ポリペプチドがサイトカイン産生を刺激する、実施形態７９〜８２のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡ。
【１０１０】
Ｅ９８．上記ポリペプチドによって増強される免疫応答が細胞性免疫応答である、実施形態７９〜８２のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡ。
【１０１１】
Ｅ９９．上記ポリペプチドによって増強される免疫応答が体液性免疫応答である、実施形態７９〜８２のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡ。
【１０１２】
Ｅ１００．実施形態７９、８１〜９９のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡ及び少なくとも１つの目的の抗原をコードする第２のｍｍＲＮＡを含む組成物であって、上記第２のｍｍＲＮＡが１つ以上の修飾核酸塩基を含み、上記組成物が対象に投与されるとき、上記ポリペプチドが上記少なくとも１つの目的の抗原に対する免疫応答を増強する組成物。
【１０１３】
Ｅ１０１．上記少なくとも１つの目的の抗原及び上記少なくとも１つの目的の抗原に対する免疫応答を増強する上記ポリペプチドの両方をコードする単一のｍｍＲＮＡ構築物を含む、実施形態１００に記載の組成物。
【１０１４】
Ｅ１０２．一方は目的の少なくとも１つの上記抗原をコードし、もう一方は目的の少なくとも１つの上記抗原に対する免疫応答を増強する上記ポリペプチドをコードする、２つのｍｍＲＮＡ構築物を含む、実施形態１００記載の組成物。
【１０１５】
Ｅ１０３．上記２つのｍｍＲＮＡ構築物が脂質ナノ粒子中に共処方されている、実施形態１０２に記載の組成物。
【１０１６】
Ｅ１０４．上記少なくとも１つの目的の抗原が少なくとも１つの腫瘍抗原である、実施形態１００〜１０３のいずれか１つに記載の組成物。
【１０１７】
Ｅ１０５．上記少なくとも１つの腫瘍抗原が少なくとも１つの変異体ＫＲＡＳ抗原である、実施形態１０４に記載の組成物。
【１０１８】
Ｅ１０６．上記少なくとも１つの変異体ＫＲＡＳ抗原がＧ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｃ及びそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む、実施形態１０５に記載の組成物。
【１０１９】
Ｅ１０７．上記少なくとも１つの変異体ＫＲＡＳ抗原が、配列番号９５〜１０６及び１３１〜１３２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１３２１または１３２２に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態１０５に記載の組成物。
【１０２０】
Ｅ１０８．実施形態１０５の組成物であって、少なくとも１つの変異体ＫＲＡＳ抗原及び構成的に活性なＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするｍｍＲＮＡを含み、上記ｍｍＲＮＡが配列番号１０７〜１３０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードする、組成物。
【１０２１】
Ｅ１０９．上記少なくとも１つの目的の抗原が少なくとも１つの病原体抗原である、実施形態１００〜１０３のいずれか１つに記載の組成物。
【１０２２】
Ｅ１１０．上記少なくとも１つの病原体抗原が、ウイルス、細菌、原生動物、真菌及び寄生生物からなる群より選択される病原体に由来する、実施形態１０９に記載の組成物。
【１０２３】
Ｅ１１１．上記少なくとも１つの病原体抗原が少なくとも１つのウイルス抗原である、実施形態１１０に記載の組成物。
【１０２４】
Ｅ１１２．上記少なくとも１つのウイルス抗原が少なくとも１つのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原である、実施形態１１１に記載の組成物。
【１０２５】
Ｅ１１３．上記ＨＰＶ抗原がＨＰＶ１６  Ｅ６もしくはＨＰＶ  Ｅ７抗原、またはそれらの組み合わせである、実施形態１１２に記載の組成物。
【１０２６】
Ｅ１１４．上記ＨＰＶ抗原が、配列番号３６〜９４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１１３に記載の組成物。
【１０２７】
Ｅ１１５．上記少なくとも１つの病原体抗原が少なくとも１つの細菌性抗原である、実施形態１１０に記載の組成物。
【１０２８】
Ｅ１１６．上記ｍｍＲＮＡ（複数可）が、５’ＵＴＲ、上記ポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ及び連結ヌクレオシドの３’テーリング領域を含む、実施形態７９〜１１５のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡまたは組成物。
【１０２９】
Ｅ１１７．上記ｍｍＲＮＡ（複数可）が、１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位をさらに含む、実施形態１１６に記載のｍｍＲＮＡまたは組成物。
【１０３０】
Ｅ１１８．上記ｍｍＲＮＡ（複数可）が完全に修飾されている、実施形態７９〜１１７のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡまたは組成物。
【１０３１】
Ｅ１１９．上記ｍｍＲＮＡ（複数可）が、シュードウリジン（Ψ）、シュードウリジン（Ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２−チオウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）またはＮ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む、実施形態７９〜１１８のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡまたは組成物。
【１０３２】
Ｅ１２０．上記ｍｍＲＮＡ（複数可）が、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、または２’−Ｏ−メチルウリジン、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態７９〜１１９のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡまたは組成物。
【１０３３】
Ｅ１２１．上記ｍｍＲＮＡ（複数可）が、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１Ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（Ψ）、α−チオ−グアノシン、もしくはα−チオ−アデノシン、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態７９〜１２０のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡまたは組成物。
【１０３４】
Ｅ１２２．実施形態７９〜１２１のいずれかに記載のｍｍＲＮＡまたは組成物を含む脂質ナノ粒子。
【１０３５】
Ｅ１２３．リポソームである、実施形態１２２の脂質ナノ粒子。
【１０３６】
Ｅ１２４．カチオン性及び／またはイオン性アミノ脂質を含む、実施形態１２２に記載の脂質ナノ粒子。
【１０３７】
Ｅ１２５．上記カチオン性及び／またはイオン性アミノ脂質が、２，２−ジリノレイル−４−メチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）またはジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノ酪酸エステル（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）である、実施形態１２４に記載の脂質ナノ粒子。
【１０３８】
Ｅ１２６．上記脂質ナノ粒子が、上記脂質ナノ粒子の外面にコンジュゲートした標的化部分をさらに含む、実施形態１２２〜１２５のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
【１０３９】
Ｅ１２７．実施形態７９〜１２１のいずれかに記載のｍｍＲＮＡもしくは組成物または実施形態１２２〜１２６のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子、及び薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物。
【１０４０】
Ｅ１２８．目的の抗原に対する免疫応答を増強するための方法であって、実施形態７９〜１２１のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡもしくは組成物、実施形態１２２〜１２６のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子、または実施形態１２７に記載の薬学的組成物を対象に投与することを包含し、その結果、上記目的の抗原に対する免疫応答が上記対象において増強される、方法。
【１０４１】
Ｅ１２９．免疫応答を増強することがサイトカイン産生を刺激することを包含する、実施形態１２８に記載の方法。
【１０４２】
Ｅ１３０．免疫応答を増強することが、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞活性を刺激することを包含する、実施形態１２８に記載の方法。
【１０４３】
Ｅ１３１．免疫応答を増強することが、抗原特異的抗体産生を刺激することを包含する、実施形態１２８に記載の方法。
【１０４４】
Ｅ１３２．Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達を刺激するｍＲＮＡ組成物を上記対象に投与する前に、樹状細胞の発達または活性を刺激するｍＲＮＡ組成物を上記対象に投与することを包含する、実施形態１２８に記載の方法。
【１０４５】
Ｅ１３３．それを必要とする対象において腫瘍に対する免疫原性応答を刺激する方法であって、上記対象に対して、有効量の実施形態７９〜１２１のいずれか１つに記載のｍｍＲＮＡもしくは組成物、またはそれらの脂質ナノ粒子、またはその薬学的組成物を投与することを包含し、その結果、上記腫瘍に対する免疫原性応答が上記対象において刺激される、方法。
【１０４６】
Ｅ１３４．上記腫瘍が、肝臓癌、結腸直腸癌、黒色腫癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、子宮頸癌、または頭頸部癌である、実施形態１３３に記載の方法。
【１０４７】
Ｅ１３５．上記対象がヒトである、実施形態１３３に記載の方法。
【１０４８】
Ｅ１３６．それを必要とする対象において病原体に対する免疫原性応答を刺激する方法であって、上記対象に対して、実施形態７９〜９９及び１１６〜１２１のいずれか１つに記載の有効量のｍｍＲＮＡ、または実施形態１００〜１１５のいずれか１つに記載の組成物、またはその脂質ナノ粒子、またはその薬学的組成物を投与することを包含し、その結果、上記病原体に対する免疫原性応答が上記対象において刺激される、方法。
【１０４９】
Ｅ１３７．上記病原体が、ウイルス、細菌、原生動物、真菌及び寄生生物からなる群より選択される、実施形態１３６に記載の方法。
【１０５０】
Ｅ１３８．上記病原体がウイルスである、実施形態１３７に記載の方法。
【１０５１】
Ｅ１３９．上記病原体がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）である、実施形態１３８に記載の方法。
【１０５２】
Ｅ１４０．上記病原体が細菌である、実施形態１３７に記載の方法。
【１０５３】
Ｅ１４１．上記対象がヒトである、実施形態１３６に記載の方法。
【１０５４】
Ｅ１４２．それを必要とする対象においてヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連がんを予防または処置する方法であって、以下：（ｉ）少なくとも１つの目的のＨＰＶ抗原、及び（ｉｉ）少なくとも１つの上記目的のＨＰＶ抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチド、をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ構築物を含む組成物を上記対象に投与することを包含し、その結果、上記目的の少なくとも１つのＨＰＶ抗原に対する免疫応答が増強される、方法。
【１０５５】
Ｅ１４３．上記目的の少なくとも１つのＨＰＶ抗原（複数可）に対する免疫応答を増強する上記ポリペプチドがＳＴＩＮＧポリペプチドである、実施形態１４２に記載の方法。
【１０５６】
Ｅ１４４．上記少なくとも１つのＨＰＶ抗原が、少なくとも１つのＥ６抗原、少なくとも１つのＥ７抗原、または少なくとも１つのＥ６抗原と少なくとも１つのＥ７抗原との組合せである、実施形態１４２に記載の方法。
【１０５７】
Ｅ１４５．上記少なくとも１つのＨＰＶ抗原及び上記ポリペプチドが別々のｍＲＮＡ上にコードされており、そして上記対象への投与の前に脂質ナノ粒子中に共処方されている、実施形態１４２に記載の方法。
【１０５８】
Ｅ１４６．上記対象がＨＰＶへの曝露の危険性があり、上記組成物がＨＰＶへの曝露の前に投与される、実施形態１４２に記載の方法。
【１０５９】
Ｅ１４７．上記対象がＨＰＶに感染しているか、またはＨＰＶ関連がんを患っている、実施形態１４２に記載の方法。
【１０６０】
Ｅ１４８．上記がんが、子宮頸癌、陰茎癌、膣癌、外陰癌、肛門癌、及び口腔咽頭癌からなる群より選択される、実施形態１４７に記載の方法。
【１０６１】
Ｅ１４９．上記対象が免疫チェックポイント阻害剤を用いても処置されている、実施形態１４８に記載の方法。
【１０６２】
Ｅ１５０．対象における少なくとも１つの目的の発がん性ウイルス抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする第１の化学修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）、及び少なくとも１つの目的の発がん性ウイルス抗原をコードする第２のｍｍＲＮＡを含む組成物であって、各ｍｍＲＮＡは、１つ以上の修飾核酸塩基を含み、上記免疫応答は、以下：
（ｉ）Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉ）ＮＦκＢ経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉｉ）炎症反応を刺激すること；
（ｉｖ）サイトカイン産生を刺激すること；または
（ｖ）樹状細胞の発達、活性または動員を刺激すること；及び
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかの組み合わせ、
によって特徴付けられる細胞性免疫応答または体液性免疫応答を含む、組成物。
【１０６３】
Ｅ１５１．上記少なくとも１つの目的の発がん性ウイルス抗原及び上記少なくとも１つの目的の発がん性ウイルス抗原に対する免疫応答を増強する上記ポリペプチドの両方をコードする単一のｍｍＲＮＡ構築物を含む、実施形態１５０の組成物。
【１０６４】
Ｅ１５２．上記少なくとも１つの目的の発がん性ウイルス抗原が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）及びメルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＰｙＶ）からなる群より選択される発がん性ウイルスに由来する、実施形態１５０または１５１の組成物。
【１０６５】
Ｅ１５３．上記少なくとも１つの目的の発がん性ウイルス抗原が：Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２及びそれらの組み合わせからなるＨＰＶ抗原の群から選択される、実施形態１５０または１５１に記載の組成物。
【１０６６】
Ｅ１５４．上記少なくとも１つの目的の発がん性ウイルス抗原が：ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｘＡｇ、Ｐｏｌ、及びそれらの組み合わせからなるＨＢＶ抗原の群から選択される、実施形態１５０または１５１に記載の組成物。
【１０６７】
Ｅ１５５．上記少なくとも１つの目的の発がん性ウイルス抗原が：コア（Ｃ、ｐ２２）、Ｅ１（ｇｐ３５）、Ｅ２（ｇｐ７０）、ＮＳ１（ｐ７）、ＮＳ２（ｐ２３）、ＮＳ３（ｐ７０）、ＮＳ４Ａ（ｐ８）、ＮＳ４Ｂ（ｐ２７）、ＮＳ５Ａ（ｐ５６／５８）、ＮＳ５Ｂ（ｐ６８）、及びそれらの組み合わせからなるＨＣＶ抗原の群から選択される、実施形態１５０または１５１に記載の組成物。
【１０６８】
Ｅ１５６．上記少なくとも１つの目的の発がん性ウイルス抗原が、ＥＢＶ−１またはＥＢＶ−２由来の抗原性ポリペプチドである、実施形態１５０または１５１に記載の組成物。
【１０６９】
Ｅ１５７．上記少なくとも１つの目的の発がん性ウイルス抗原が：ｇａｇ、ｐｏｌ、ｐｒｏ、ｅｎｖ、ｔａｘ、ｒｅｘ、ｐ１２、ｐ２１、ｐ１３、ｐ３０、ＨＢＺ、及びそれらの組み合わせからなるＨＴＬＶ−１抗原の群から選択される、実施形態１５０または１５１に記載の組成物。
【１０７０】
Ｅ１５８．少なくとも１つの発がん性ウイルス抗原が、ＫＳＨＶサブタイプＡ、ＫＳＨＶサブタイプＢ、ＫＳＨＶサブタイプＣ、ＫＳＨＶサブタイプＤ、ＫＳＨＶサブタイプＥ、またはそれらの組み合わせ由来の抗原性ポリペプチドである、実施形態１５０または１５１に記載の組成物。
【１０７１】
Ｅ１５９．上記少なくとも１つの目的の発がん性ウイルス抗原が：ラージＴ抗原（ＬＴ）、スモールＴ抗原（ｓＴ）、５７ｋＴ抗原（５７ｋＴ）、選択的Ｔ抗原（ＡＬＴＯ）、メジャーキャプシドタンパク質ウイルスタンパク質１（ＶＰ１）、マイナーキャプシドウイルスタンパク質２または３（ＶＰ２またはＶＰ３）、及びそれらの組み合わせからなるＭＣＰｙＶ抗原の群から選択される、実施形態１５０または１５１に記載の組成物。
【１０７２】
Ｅ１６０．上記少なくとも１つの発がん性ウイルス抗原が、２〜２０の発がん性ウイルス抗原から構成されるコンカテマー発がん性ウイルス抗原である、実施形態１５０〜１５９のいずれか１つの実施形態に記載の組成物。
【１０７３】
Ｅ１６１．上記コンカテマー発がん性ウイルス抗原が、以下：
ａ）２２〜２０個の上記発がん性ウイルス抗原に切断感受性部位が散在している；
ｂ）各発がん性ウイルス抗原をコードするｍｍＲＮＡがリンカーなしで互いに直接結合している、及び／または
ｃ）各発がん性ウイルスをコードするｍｍＲＮＡが単一のヌクレオチドリンカーで互いに連結されている、
のうちの１つ以上を含む、実施形態１６０に記載の組成物。
【１０７４】
Ｅ１６２．ユビキチン化シグナルをさらに含む、実施形態１５０〜１６１のいずれか１つに記載の組成物。
【１０７５】
Ｅ１６３．上記ユビキチン化シグナルが上記ｍｍＲＮＡのＣ末端に位置する、実施形態１６２に記載の組成物。
【１０７６】
Ｅ１６４．上記切断部位の少なくとも１つがＡＰＣ切断部位である、実施形態１６１〜１６３のいずれか１つに記載の組成物。
【１０７７】
Ｅ１６５．上記切断部位がセリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、またはメタロプロテアーゼの切断部位である、実施形態１６４に記載の組成物。
【１０７８】
Ｅ１６６．上記切断部位がシステインプロテアーゼに対するものである、実施形態１６５に記載の組成物。
【１０７９】
Ｅ１６７．上記システインプロテアーゼがカテプシンＢである、実施形態１６６に記載の組成物。
【１０８０】
Ｅ１６８．上記切断部位がアミノ酸配列ＧＦＬＧ、Ａｒｇ−↓−ＮＨＭｅｃ；Ｂｚ−Ａｒｇ−↓−ＮｈＮａｐ；Ｂｚ−Ａｒｇ−↓ＮＨＭｅｃ；Ｂｚ−Ｐｈｅ−Ｃａｌ−Ａｒｇ−↓−ＮＨＭｅｃ；Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−↓−Ｐｈｅ；Ｘａａ−Ｘａａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｘａａ−ＸまたはＡｒｇ−Ａｒｇを含み、、ここでＸａａが任意のアミノ酸残基である、実施形態１６４に記載の組成物。
【１０８１】
Ｅ１６９．さらにリコール抗原を含む、実施形態１５０〜１６８のいずれか１つに記載の組成物。
【１０８２】
Ｅ１７０．上記リコール抗原が、上記リコール抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡである、実施形態１６９に記載の組成物。
【１０８３】
Ｅ１７１．上記リコール抗原が上記コンカテマー抗原に含まれる、実施形態１６９または１７０に記載の組成物。
【１０８４】
Ｅ１７２．エンドソーム標的化配列をさらに含む、実施形態１５０〜１７１のいずれか１つに記載の組成物。
【１０８５】
Ｅ１７３．上記エンドソーム標的化配列が、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ−１）の膜貫通ドメインの少なくとも一部分を含む、実施形態１７２に記載の組成物。
【１０８６】
Ｅ１７４．上記エンドソーム標的化配列が、不変鎖の膜貫通ドメイン（Ｉｉ）の少なくとも一部を含む、実施形態１７２に記載の組成物。
【１０８７】
Ｅ１７５．ＨＰＶ由来の少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする第１の化学修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）、及びＨＰＶ由来の上記少なくとも１つの抗原をコードする第２のｍｍＲＮＡを含む組成物であって、各ｍｍＲＮＡが１つ以上の修飾核酸塩基を含む、組成物。
【１０８８】
Ｅ１７６．上記第２のｍｍＲＮＡがＨＰＶ抗原Ｅ６及び／またはＨＰＶ抗原Ｅ７をコードする、実施形態１７５に記載の組成物。
【１０８９】
Ｅ１７７．上記第１のｍｍＲＮＡが構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードする、実施形態１７５または１７６に記載の組成物。
【１０９０】
Ｅ１７８．各ｍｍＲＮＡが同じまたは異なる脂質ナノ粒子に処方されている、実施形態１５０〜１７７のいずれか１つに記載の組成物。
【１０９１】
Ｅ１７９．発がん性ウイルス抗原をコードする各ｍｍＲＮＡが、同一または異なる脂質ナノ粒子に処方されている、実施形態１７８に記載の組成物。
【１０９２】
Ｅ１８０．上記発がん性ウイルス抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする各ｍｍＲＮＡが、同一または異なる脂質ナノ粒子に処方されている、実施形態１７９の組成物。
【１０９３】
Ｅ１８１．発がん性ウイルス抗原をコードする各ｍｍＲＮＡが同じ脂質ナノ粒子に処方され、上記発がん性ウイルス抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする各ｍｍＲＮＡが異なる脂質ナノ粒子に処方される、実施形態１７８〜１８０のいずれか１つに記載の組成物。
【１０９４】
Ｅ１８２．発がん性ウイルス抗原をコードする各ｍｍＲＮＡが同じ脂質ナノ粒子に処方され、上記発がん性ウイルス抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする各ｍｍＲＮＡが、発がん性ウイルス抗原をコードする各ｍｍＲＮＡと同じ脂質ナノ粒子に処方される、実施形態１７８〜１８０のいずれか１つに記載の組成物。
【１０９５】
Ｅ１８３．発がん性ウイルス抗原をコードする各ｍｍＲＮＡが異なる脂質ナノ粒子に処方され、上記発がん性ウイルス抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする各ｍｍＲＮＡが各発がん性ウイルス抗原をコードする各ｍｍＲＮＡと同じ脂質ナノ粒子に処方される、実施形態１７８〜１８０のいずれか１つに記載の組成物。
【１０９６】
Ｅ１８４．薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子担体であって、上記薬学的組成物が：
発がん性ウイルス抗原のコンカテマーをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ；
発がん性ウイルス抗原のコンカテマーに対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ；及び
薬学的に許容される担体または賦形剤、
を含む、脂質ナノ粒子担体。
【１０９７】
Ｅ１８５．薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子担体であって、上記薬学的組成物が：
発がん性ウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのｍｍＲＮＡ；
上記発がん性ウイルス抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ；及び
薬学的に許容される担体または賦形剤、
を含む、脂質ナノ粒子担体。
【１０９８】
Ｅ１８６．薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子担体であって、上記薬学的組成物が：
ＨＰＶ抗原のコンカテマーをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ；
構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ；及び
薬学的に許容される担体または賦形剤、
を含む、脂質ナノ粒子担体。
【１０９９】
Ｅ１８７．ＨＰＶ抗原のコンカテマーがＨＰＶ抗原Ｅ６及びＥ７を含む、実施形態１８６に記載の脂質ナノ粒子担体。
【１１００】
Ｅ１８８．薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子担体であって、上記薬学的組成物が：
ＨＰＶウイルス抗原Ｅ６をコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ；
ＨＰＶウイルス抗原Ｅ７をコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ；
構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ；及び
薬学的に許容される担体または賦形剤、
を含む、脂質ナノ粒子担体。
【１１０１】
Ｅ１８９．ワクチンであって：
薬学的組成物を含む第１のナノ粒子であって、上記薬学的組成物が、目的の第１の発がん性ウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡと、上記目的の第１の発がん性ウイルス抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、第１のナノ粒子；
薬学的組成物を含む第２のナノ粒子であって、上記薬学的組成物が、目的の第２の発がん性ウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡと、上記目的の第２の発がん性ウイルス抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、第２のナノ粒子；
薬学的組成物を含む第３のナノ粒子であって、上記薬学的組成物が、目的の第３の発がん性ウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡと、上記目的の第３の発がん性ウイルス抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、第３のナノ粒子；
薬学的組成物を含む第４のナノ粒子であって、上記薬学的組成物が、目的の第４の発がん性ウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡと、上記目的の第４の発がん性ウイルス抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、第４のナノ粒子；または
それらの組み合わせ、
を含む、ワクチン。
【１１０２】
Ｅ１９０．ワクチンであって：
薬学的組成物を含むナノ粒子であって、上記薬学的組成物が、目的のコンカテマー発がん性ウイルス抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡと、上記目的のコンカテマー発がん性ウイルス抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含むナノ粒子、を含むワクチン。
【１１０３】
Ｅ１９１．ワクチンであって：
薬学的組成物を含む第１のナノ粒子であって、上記薬学的組成物が、ＨＰＶ抗原Ｅ６をコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、第１のナノ粒子；ならびに
薬学的組成物を含む第２のナノ粒子であって、上記薬学的組成物が、ＨＰＶ抗原Ｅ７をコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡと、構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、第２のナノ粒子、
を含む、ワクチン。
【１１０４】
Ｅ１９２．発がん性ウイルスに感染した対象における腫瘍増殖を予防する方法であって、実施形態１５０〜１９１のいずれか１つに記載の組成物、脂質ナノ粒子担体、またはワクチンを上記対象に投与することを包含し、その結果腫瘍増殖が上記対象において予防される、方法。
【１１０５】
Ｅ１９３．上記対象が投与前に検出可能な腫瘍を有していない、実施形態１９２に記載の方法。
【１１０６】
Ｅ１９４．発がん性ウイルスに感染した対象において腫瘍増殖を阻害する方法であって、上記対象に対して実施形態１５０〜１９１のいずれか１つの組成物、脂質ナノ粒子担体、またはワクチンを投与することを包含し、その結果、腫瘍増殖が上記対象において阻害される、方法。
【１１０７】
Ｅ１９５．投与前の腫瘍形成が上記発がん性ウイルスの感染の結果である、実施形態１９４に記載の方法。
【１１０８】
Ｅ１９６．癌性ウイルスに感染した癌対象においてがんを処置する方法であって、上記対象に対して、実施形態１５０〜１９１のいずれか１つに記載の組成物、脂質ナノ粒子担体、またはワクチンを投与することを包含し、その結果癌が上記対象において処置される、方法。
【１１０９】
Ｅ１９７．上記癌が上記発がん性ウイルスの感染の結果である、実施形態１９６に記載の方法。
【１１１０】
Ｅ１９８．対象において少なくとも１つの目的のがん抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする第１の化学修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）、及び上記少なくとも１つの目的のがん抗原をコードする第２のｍｍＲＮＡを含む、個別化がんワクチンであって、各ｍｍＲＮＡが、１つ以上の修飾核酸塩基を含み、免疫応答が、以下：
（ｉ）Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉ）ＮＦκＢ経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉｉ）炎症反応を刺激すること；
（ｉｖ）サイトカイン産生を刺激すること；または
（ｖ）樹状細胞の発達、活性または動員を刺激すること；及び
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかの組み合わせ
によって特徴付けられる細胞性免疫応答または体液性免疫応答を含む、個別化がんワクチン。
【１１１１】
Ｅ１９９．上記少なくとも１つの目的のがん抗原と、少なくとも１つの目的のがん抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドとの両方をコードする単一のｍｍＲＮＡ構築物を含む、実施形態１９８に記載の個別化されたがんワクチン。
【１１１２】
Ｅ２００．上記少なくとも１つの目的のがん抗原が、２〜１００個のペプチドエピトープから構成されるコンカテマーがん抗原である、実施形態１９８または１９９に記載の個別化されたがんワクチン。
【１１１３】
Ｅ２０１．上記コンカテマーがん抗原が、以下：
ａ）上記２〜１００個のペプチドエピトープに切断感受性部位が点在している；
ｂ）各ペプチドエピトープをコードする上記ｍＲＮＡが、リンカーなしで互いに直接結合されている；
ｃ）各ペプチドエピトープをコードする上記ｍＲＮＡが、単一のヌクレオチドリンカーを用いて互いに連結されている；
ｄ）各ペプチドエピトープが２５〜３５個のアミノ酸を含み、中央に位置するＳＮＰ変異を含む；
ｅ）上記ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象由来のクラスＩＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有する；
ｆ）少なくとも３０％の上記ペプチドエピトープが、対象由来のクラスＩＩＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有する；
ｇ）上記ペプチドエピトープの少なくとも５０％が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及び／またはＤＲＢ１に対してＩＣ＞５００ｎＭという推定結合親和性を有する；
ｈ）上記ｍＲＮＡが２０個のペプチドエピトープをコードする；
ｉ）５０％の上記ペプチドエピトープがクラスＩＭＨＣに対する結合親和性を有し、５０％の上記ペプチドエピトープがクラスＩＩＭＨＣに対する結合親和性を有する；及び／または
ｊ）ペプチドエピトープをコードする上記ｍＲＮＡは、上記ペプチドエピトープが疑似エピトープを最小にするように順序付けられるように配置される、
のうちの１つ以上を含む、実施形態２００に記載の個別化されたがんワクチン。
【１１１４】
Ｅ２０２．各ペプチドエピトープが３１個のアミノ酸を含み、中央に位置するＳＮＰ変異を含み、ＳＮＰ変異の両側に１５個の隣接アミノ酸を有する、実施形態２０１に記載の個別化されたがんワクチン。
【１１１５】
Ｅ２０３．上記ペプチドエピトープがＴ細胞エピトープ及び／またはＢ細胞エピトープである、実施形態２００〜２０２のいずれか１つに記載の個別化されたがんワクチン。
【１１１６】
Ｅ２０４．上記ペプチドエピトープがＴ細胞エピトープ及びＢ細胞エピトープの組み合わせを含む、実施形態２００〜２０３のいずれか１つに記載の個別化されたがんワクチン。
【１１１７】
Ｅ２０５．上記少なくとも１つのペプチドエピトープがＴ細胞エピトープである、実施形態２００〜２０４のいずれか１つに記載の個別化されたがんワクチン。
【１１１８】
Ｅ２０６．上記少なくとも１つのペプチドエピトープがＢ細胞エピトープである、実施形態２００〜２０５のいずれか１つに記載の個別化されたがんワクチン。
【１１１９】
Ｅ２０７．上記Ｔ細胞エピトープが８〜１１個のアミノ酸を含む、実施形態２００〜２０６のいずれか１つに記載の個別化されたがんワクチン。
【１１２０】
Ｅ２０８．上記Ｂ細胞エピトープが１３〜１７個のアミノ酸を含む、実施形態２００〜２０７のいずれか１つに記載の個別化されたがんワクチン。
【１１２１】
Ｅ２０９．ユビキチン化シグナルをさらに含む、実施形態１９８〜２０８のいずれか１つに記載の個別化されたがんワクチン。
【１１２２】
Ｅ２１０．上記ユビキチン化シグナルが上記ｍｍＲＮＡのＣ末端に位置する、実施形態２０９に記載の個別化されたがんワクチン。
【１１２３】
Ｅ２１１．上記切断感受性部位の少なくとも１つがＡＰＣ切断部位である、実施形態２０１〜２１０のいずれか１つに記載の個別化されたがんワクチン。
【１１２４】
Ｅ２１２．上記切断部位がセリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、またはメタロプロテアーゼの切断部位である、実施形態２１１に記載の個別化がんワクチン。
【１１２５】
Ｅ２１３．上記切断部位がシステインプロテアーゼのためのものである、実施形態２１２の個別化されたがんワクチン。
【１１２６】
Ｅ２１４．上記システインプロテアーゼがカテプシンＢである、実施形態２１３に記載の個別化されたがんワクチン。
【１１２７】
Ｅ２１５．上記切断部位がアミノ酸配列ＧＦＬＧ、Ａｒｇ−↓−ＮＨＭｅｃ；Ｂｚ−Ａｒｇ−↓−ＮｈＮａｐ；Ｂｚ−Ａｒｇ−↓ＮＨＭｅｃ；Ｂｚ−Ｐｈｅ−Ｃａｌ−Ａｒｇ−↓−ＮＨＭｅｃ；Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−↓−Ｐｈｅ；Ｘａａ−Ｘａａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｘａａ−ＸまたはＡｒｇ−Ａｒｇを含み、ここでＸａａは任意のアミノ酸残基である、実施形態２１４の個別化されたがんワクチン。
【１１２８】
Ｅ２１６．各ペプチドエピトープが抗原性領域及びＭＨＣ安定化領域を含む、実施形態２００〜２１５のいずれか１つに記載の個別化されたがんワクチン。
【１１２９】
Ｅ２１７．上記ＭＨＣ安定化領域が５〜１０アミノ酸長である、実施形態２１６に記載の個別化されたがんワクチン。
【１１３０】
Ｅ２１８．上記抗原性領域が５〜１００アミノ酸長である、実施形態２１６または２１７の個別化されたがんワクチン。
【１１３１】
Ｅ２１９．上記ペプチドエピトープが、上記対象のＭＨＣに対する結合強度について最適化されている、実施形態２００〜２１８のいずれか１つに記載の個別化されたがんワクチン。
【１１３２】
Ｅ２２０．各エピトープに対するＴＣＲ面が内因性タンパク質との類似性が低い、実施形態２１９の個別化されたがんワクチン。
【１１３３】
Ｅ２２１．さらにリコール抗原を含む、実施形態１９８〜２２０のいずれか１つの個別化されたがんワクチン。
【１１３４】
Ｅ２２２．上記リコール抗原が感染性疾患抗原である、実施形態２２１に記載の個別化されたがんワクチン。
【１１３５】
Ｅ２２３．上記リコール抗原が、上記リコール抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡである、実施形態２２１または２２２の個別化されたがんワクチン。
【１１３６】
Ｅ２２４．上記リコール抗原が上記コンカテマー抗原中のペプチドエピトープである、実施形態２２１〜２２３のいずれか１つに記載の個別化されたがんワクチン。
【１１３７】
Ｅ２２５．上記リコール抗原がインフルエンザ抗原である、実施形態２２１及び２２３〜２２４のいずれか１つの個別化されたがんワクチン。
【１１３８】
Ｅ２２６．エンドソーム標的化配列をさらに含む、実施形態１９８〜２２５のいずれか１つに記載の個別化されたがんワクチン。
【１１３９】
Ｅ２２７．上記エンドソーム標的化配列が、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ−１）の膜貫通ドメインの少なくとも一部を含む、実施形態２２６に記載の個別化されたがんワクチン。
【１１４０】
Ｅ２２８．上記エンドソーム標的化配列が、不変鎖の膜貫通ドメイン（Ｉｉ）の少なくとも一部を含む、実施形態２２６に記載の個別化されたがんワクチン。
【１１４１】
Ｅ２２９．上記ペプチドエピトープが少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ及び少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む、実施形態２００の個別化されたがんワクチン。
【１１４２】
Ｅ２３０．上記エピトープの少なくとも３０％がＭＨＣクラスＩエピトープである、実施形態２２９の個別化されたがんワクチン。
【１１４３】
Ｅ２３１．上記エピトープの少なくとも３０％がＭＨＣクラスＩＩエピトープである、実施形態２２９の個別化されたがんワクチン。
【１１４４】
Ｅ２３２．１つ以上の伝統的ながん抗原をコードするＯＲＦをさらに含む、実施形態１９８〜２３１のいずれか１つに記載の個別化されたがんワクチン。
【１１４５】
Ｅ２３３．１つ以上の伝統的ながん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡをさらに含む、実施形態１９８〜２３２のいずれか１つに記載の個別化されたがんワクチン。
【１１４６】
Ｅ２３４．対象において少なくとも１つの目的のがん抗原に対する免疫応答を増強する上記ポリペプチドが構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドである、実施形態１９８〜２３３のいずれか１つに記載の個別化されたがんワクチン。
【１１４７】
Ｅ２３５．上記構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドが、Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｅ３１５Ｑ、Ｒ３７５Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の変異を含む、実施形態２３４に記載の個別化されたがんワクチン。
【１１４８】
Ｅ２３６．上記構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドがＶ１５５Ｍ変異を含む、実施形態２３５に記載の個別化されたがんワクチン。
【１１４９】
Ｅ２３７．上記構成的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドが、変異Ｒ２８４Ｍ／Ｖ１４７Ｌ／Ｎ１５４Ｓ／Ｖ１５５Ｍを含む、実施形態２３５に記載の個別化されたがんワクチン。
【１１５０】
Ｅ２３８．実施形態１９８〜２３８のいずれか１つに記載の個別化されたがんワクチンを含む組成物。
【１１５１】
Ｅ２３９．各ｍｍＲＮＡが同一または異なる脂質ナノ粒子に処方されている、実施形態２３８に記載の組成物。
【１１５２】
Ｅ２４０．目的のがん抗原をコードする各ｍｍＲＮＡが、同一または異なる脂質ナノ粒子に処方されている、実施形態２３９に記載の組成物。
【１１５３】
Ｅ２４１．目的のがん抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする各ｍｍＲＮＡが、同じまたは異なる脂質ナノ粒子に処方されている、実施形態２４０に記載の組成物。
【１１５４】
Ｅ２４２．目的のがん抗原をコードする各ｍｍＲＮＡが同じ脂質ナノ粒子に処方され、上記目的のがん抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする各ｍｍＲＮＡが異なる抗原に処方される、実施形態２３９〜２４１のいずれか１つに記載の組成物。
【１１５５】
Ｅ２４３．目的のがん抗原をコードする各ｍｍＲＮＡが同じ脂質ナノ粒子に処方され、上記目的のがん抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする各ｍｍＲＮＡが、目的のがん抗原をコードする各ｍｍＲＮＡと同じ脂質ナノ粒子に処方される、実施形態２３９〜２４１のいずれか１つに記載の組成物。
【１１５６】
Ｅ２４４．目的のがん抗原をコードする各ｍｍＲＮＡが異なる脂質ナノ粒子に処方され、上記目的のがん抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする各ｍｍＲＮＡが目的の各がん抗原をコードする各ｍｍＲＮＡと同じ脂質ナノ粒子に処方される、実施形態２３９〜２４１のいずれか１つに記載の組成物。
【１１５７】
Ｅ２４５．薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子担体であって、上記薬学的組成物が以下：
目的のコンカテマーがん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ；
上記目的のコンカテマーがん抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ；
薬学的に許容される担体または賦形剤、
を含む、脂質ナノ粒子担体。
【１１５８】
Ｅ２４６．薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子担体であって、上記薬学的組成物が以下：
目的のがん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのｍｍＲＮＡ；
上記目的のがん抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ；及び
薬学的に許容される担体または賦形剤、
を含む、脂質ナノ粒子担体。
【１１５９】
Ｅ２４７．個別化されたがんワクチンであって、以下：
薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子であって、上記薬学的組成物が、対象において目的のがん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのｍｍＲＮＡ、上記目的のがん抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、脂質ナノ粒子、
を含む、個別化されたがんワクチン。
【１１６０】
Ｅ２４８．個別化されたがんワクチンであって、以下：
薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子であって、上記薬学的組成物が、目的のコンカテマーがん抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのｍｍＲＮＡ、上記目的のがん抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、脂質ナノ粒子、
を含む、個別化されたがんワクチン。
【１１６１】
Ｅ２４９．対象にワクチン接種するための方法であって、以下：
がんを有する対象に、個別化されたがんワクチンまたは実施形態１９８〜２４８のいずれか１つに記載の組成物を、上記対象にワクチン接種するために投与すること、
を包含する、方法。
【１１６２】
Ｅ２５０．個別化されたがんワクチンを用いて対象を処置する方法であって、上記対象から試料を単離すること、上記試料由来の患者のトランスクリプトーム及び／または患者のエキソームを分析することによって一組のネオエピトープを同定して、患者特異的ムタノームを生成すること、ＭＨＣ結合強度、ＭＨＣ結合多様性、予測される免疫原性の程度、低い自己反応性、及び／またはＴ細胞反応性に基づいて上記ムタノーム由来ワクチンのネオエピトープのセットを選択すること、上記ネオエピトープのセットをコードするｍＲＮＡ及び上記ネオエピトープに対する免疫応答を増強するポリペプチドを調製すること、ならびに上記対象から上記試料を単離した後２ヶ月以内に、上記対象に対して上記個別化されたがんワクチンを投与することを包含する、方法。
【１１６３】
Ｅ２５１．上記個別化されたがんワクチンが、上記対象から上記試料を単離した後１ヶ月以内に上記対象に投与される、実施形態２５０に記載の方法。
【１１６４】
Ｅ２５２．上記個別化されたがんワクチンが１つ以上の伝統的ながん抗原をさらにコードする、実施形態２５０または２５１に記載の方法。
【１１６５】
Ｅ２５３．上記１つ以上の伝統的ながん抗原が上記ネオエピトープのセットをコードする同じｍＲＮＡによってコードされる、実施形態２５２に記載の方法。
【１１６６】
Ｅ２５４．上記１つ以上の伝統的ながん抗原が、上記ネオエピトープのセットをコードするｍＲＮＡとは異なるｍＲＮＡによってコードされる、実施形態２５２に記載の方法。
【１１６７】
Ｅ２５５．上記個別化されたがんワクチンががん治療剤と組み合わせて投与される、実施形態２５０〜２５４のいずれか１つに記載の方法。
【１１６８】
Ｅ２５６．上記がん治療薬が伝統的ながんワクチンである、実施形態２５５の方法。
【１１６９】
Ｅ２５７．少なくとも１つの目的の細菌抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする第１の化学修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）、及び少なくとも１つの目的の細菌抗原をコードする第２のｍｍＲＮＡを含む細菌ワクチンであって、各ｍｍＲＮＡは、１つ以上の修飾核酸塩基を含み、上記免疫応答は、以下：
（ｉ）Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉ）ＮＦκＢ経路シグナル伝達を刺激すること；
（ｉｉｉ）炎症反応を刺激すること；
（ｉｖ）サイトカイン産生を刺激すること；または
（ｖ）樹状細胞の発達、活性または動員を刺激すること；及び
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかの組み合わせ、
によって特徴付けられる細胞性免疫応答または体液性免疫応答を含む、細菌ワクチン。
【１１７０】
Ｅ２５８．上記少なくとも１つの目的の細菌抗原及び上記少なくとも１つの目的の細菌抗原に対する免疫応答を増強する上記ポリペプチドの両方をコードする単一のｍｍＲＮＡ構築物を含む、実施形態２５７に記載の細菌ワクチン。
【１１７１】
Ｅ２５９．上記目的の少なくとも１つの細菌抗原が、２〜１０個の細菌抗原から構成されるコンカテマー細菌抗原である、実施形態２５７または２５８に記載の細菌ワクチン。
【１１７２】
Ｅ２６０．上記コンカテマー細菌抗原が、以下：
ａ）上記２〜１０個の細菌抗原に切断感受性部位が分散されている；
ｂ）各細菌抗原をコードする上記ｍｍＲＮＡがリンカーなしで互いに直接結合されている；及び／または
ｃ）各細菌抗原をコードする上記ｍｍＲＮＡが単一のヌクレオチドリンカーを用いて互いに連結されている、
のうちの１つ以上を含む、実施形態２５９に記載の細菌ワクチン。
【１１７３】
Ｅ２６１．ユビキチン化シグナルをさらに含む、実施形態２５７〜２６０のいずれか１つに記載の細菌ワクチン。
【１１７４】
Ｅ２６２．上記ユビキチン化シグナルが上記ｍｍＲＮＡのＣ末端に位置する、実施形態２６１に記載の細菌ワクチン。
【１１７５】
Ｅ２６３．上記切断部位のうち少なくとも１つがＡＰＣ切断部位である、実施形態２６０〜２６２のいずれか１つに記載の細菌ワクチン。
【１１７６】
Ｅ２６４．上記切断部位がセリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、またはメタロプロテアーゼの切断部位である、実施形態２６３に記載の細菌ワクチン。
【１１７７】
Ｅ２６５．上記切断部位がシステインプロテアーゼのためのものである、実施形態２６４の細菌ワクチン。
【１１７８】
Ｅ２６６．上記システインプロテアーゼがカテプシンＢである、実施形態２６５の細菌ワクチン。
【１１７９】
Ｅ２６７．上記切断部位がアミノ酸配列ＧＦＬＧ、Ａｒｇ−↓−ＮＨＭｅｃ；Ｂｚ−Ａｒｇ−↓−ＮｈＮａｐ；Ｂｚ−Ａｒｇ−↓ＮＨＭｅｃ；Ｂｚ−Ｐｈｅ−Ｃａｌ−Ａｒｇ−↓−ＮＨＭｅｃ；Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−↓−Ｐｈｅ；Ｘａａ−Ｘａａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｘａａ−ＸまたはＡｒｇ−Ａｒｇを含み、ここでＸａａは任意のアミノ酸残基である、実施形態２６３の細菌ワクチン。
【１１８０】
Ｅ２６８．さらにリコール抗原を含む、実施形態２５７〜２６７のいずれか１つに記載の細菌ワクチン。
【１１８１】
Ｅ２６９．上記リコール抗原が感染性疾患抗原である、実施形態２６８に記載の細菌ワクチン。
【１１８２】
Ｅ２７０．上記リコール抗原が、上記リコール抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡである、実施形態２６８または２６９の細菌ワクチン。
【１１８３】
Ｅ２７１．上記リコール抗原が上記コンカテマー抗原に含まれる、実施形態２６８〜２７０のいずれか１つに記載の細菌ワクチン。
【１１８４】
Ｅ２７２．上記リコール抗原がインフルエンザ抗原である、実施形態２６８〜２７１のいずれか１つに記載の細菌ワクチン。
【１１８５】
Ｅ２７３．エンドソーム標的化配列をさらに含む、実施形態２５７〜２７２のいずれか１つに記載の細菌ワクチン。
【１１８６】
Ｅ２７４．上記エンドソーム標的化配列が、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ−１）の膜貫通ドメインの少なくとも一部を含む、実施形態２７３に記載の細菌ワクチン。
【１１８７】
Ｅ２７５．上記エンドソーム標的化配列が、不変鎖の膜貫通ドメイン（Ｉｉ）の少なくとも一部を含む実施形態２７３に記載の細菌ワクチン。
【１１８８】
Ｅ２７６．上記ワクチンが体液性免疫応答を誘導する、実施形態２５７〜２７５のいずれか１つに記載の細菌ワクチン。
【１１８９】
Ｅ２７７．上記ワクチンが適応免疫応答を誘導する、実施形態２５７〜２７５のいずれか１つに記載の細菌ワクチン。
【１１９０】
Ｅ２７８．上記適応免疫応答が、抗原特異的抗体産生の誘導またはＴヘルパーリンパ球もしくは細胞傷害性リンパ球の抗原特異的誘導／活性化を含む、実施形態２７７に記載の細菌ワクチン。
【１１９１】
Ｅ２７９．上記目的の細菌抗原がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに由来する、実施形態２５７〜２７８のいずれか１つに記載の細菌ワクチン。
【１１９２】
Ｅ２８０．実施形態２５７〜２７９のいずれか１つに記載の細菌ワクチンを含む組成物。
【１１９３】
Ｅ２８１．各ｍｍＲＮＡが同じまたは異なる脂質ナノ粒子に処方されている、実施形態２８０に記載の組成物。
【１１９４】
Ｅ２８２．目的の細菌抗原をコードする各ｍｍＲＮＡが、同一または異なる脂質ナノ粒子に処方されている、実施形態２８１に記載の組成物。
【１１９５】
Ｅ２８３．上記目的の細菌抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする各ｍｍＲＮＡが、同じまたは異なる脂質ナノ粒子に処方されている、実施形態２８２に記載の組成物。
【１１９６】
Ｅ２８４．目的の細菌抗原をコードする各ｍｍＲＮＡが同じ脂質ナノ粒子に処方され、上記細菌抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする各ｍｍＲＮＡが異なる脂質ナノ粒子に処方される、実施形態２８１〜２８３のいずれか１つに記載の組成物。
【１１９７】
Ｅ２８５．目的の細菌抗原をコードする各ｍｍＲＮＡが同じ脂質ナノ粒子に処方され、上記細菌抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする各ｍｍＲＮＡが細菌性抗原をコードする各ｍｍＲＮＡと同じ脂質ナノ粒子に処方される、実施形態２８１〜２８３のいずれか１つに記載の組成物。
【１１９８】
Ｅ２８６．細菌抗原をコードする各ｍｍＲＮＡが異なる脂質ナノ粒子中に処方され、上記細菌抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードする各ｍｍＲＮＡが各細菌抗原をコードする各ｍｍＲＮＡと同じ脂質ナノ粒子中に処方される、実施形態２８１〜２８３のいずれか１つに記載の組成物。
【１１９９】
Ｅ２８７．薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子担体であって、上記薬学的組成物が：
細菌抗原のコンカテマーをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ；
上記細菌抗原のコンカテマーに対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ；及び
薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、
脂質ナノ粒子担体。
【１２００】
Ｅ２８８．薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子担体であって、上記薬学的組成物が：
細菌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのｍｍＲＮＡ；
上記細菌抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ；及び
薬学的に許容される担体または賦形剤、を含む、
脂質ナノ粒子担体。
【１２０１】
Ｅ２８９．細菌ワクチンであって以下：
薬学的組成物を含むナノ粒子であって、上記薬学的組成物が目的の細菌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ、上記目的の細菌抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体または賦形剤、を含む、ナノ粒子、を含む、細菌ワクチン。
【１２０２】
Ｅ２９０．細菌ワクチンであって、以下：
薬学的組成物を含むナノ粒子であって、上記薬学的組成物が目的のコンカテマー細菌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ、上記目的のコンカテマー細菌抗原に対する免疫応答を増強するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍｍＲＮＡ、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、ナノ粒子、
を含む細菌ワクチン。
【１２０３】
Ｅ２９１．目的の細菌による感染に対して対象にワクチン接種するための方法であって：
実施形態２５７〜２９０のいずれか１つの細菌ワクチン、組成物、または脂質ナノ粒子担体を上記対象に投与して、上記対象にワクチン接種することを包含する、方法。
【１２０４】
Ｅ２９２．上記目的の細菌がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓである、実施形態２９１に記載の方法。
【１２０５】
Ｅ２９３．上記目的の細菌がメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）である、実施形態２９１に記載の方法。
【１２０６】
Ｅ２９４．細菌感染症を有する対象を処置するための方法であって：
上記対象に実施形態２５７〜２９０のいずれか１つに記載の細菌ワクチン、組成物、または脂質ナノ粒子担体を投与して、上記対象を処置することを包含する、方法。
【１２０７】
Ｅ２９５．上記細菌性感染がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓによって引き起こされる、実施形態２９４に記載の方法。
【１２０８】
Ｅ２９６．上記細菌感染がメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）によって引き起こされる、実施形態２９４に記載の方法。
【１２０９】
定義
投与：本明細書中で使用される場合、「投与する」とは、組成物を対象または患者に送達する方法を指す。投与方法は、身体の特定の領域または系への送達を標的する（例えば、特異的に送達する）ために選択され得る。例えば、投与は、非経口（例えば、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液内、胸骨内、髄腔内、病巣内、または頭蓋内注射、ならびに任意の適切な注入技術）、経口、経皮、もしくは皮内、皮内、直腸内、膣内、局所用（例えば、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、及び／またはドロップによる）、粘膜、鼻腔、口腔内、経腸、硝子体、腫瘍内、舌下、鼻腔内；気管内注入、気管支注入、及び／または吸入による；経口スプレー及び／または粉末、鼻腔スプレー、及び／またはエアロゾルとして、及び／または門脈カテーテルを通してであってもよい。
【１２１０】
おおよそ、約：本明細書で使用される場合、「ほぼ、おおよそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約、ほぼ（ａｂｏｕｔ）」とは、１つ以上の目的の値に適用される場合、述べられた参照値と同様の値を指す。特定の実施形態では、「ほぼ」または「約」という用語は、特に明記しない限り、または文脈から明らかな場合を除き、いずれかの方向（超えるかまたは下回る）で、言及した参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内におさまる値の範囲を指す（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
【１２１１】
がん：本明細書中で使用される場合、「がん」とは、異常な及び／または未制御の細胞増殖を含む状態である。癌という用語は良性及び悪性のがんを包含する。例示的な非限定的な癌としては、副腎皮質癌、進行癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨転移、脳腫瘍、脳癌、乳癌、小児癌、原発不明癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質性腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭癌及び下咽頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、骨髄異形成症候群（難治性貧血及び難治性血球減少症を含む）、骨髄増殖性新生物または疾患（真性多血症、本態性血小板増多症及び原発性骨髄線維症を含む）、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟部肉腫、基底及び扁平上皮癌、黒色腫、小腸癌、胃癌、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、及びがん処置による二次がんが挙げられる。特定の実施形態では、がんは肝臓癌（例えば、肝細胞癌）または結腸直腸癌である。他の実施形態では、癌は、血液系癌または造血系癌である。
【１２１２】
切断可能なリンカー：本明細書で使用される場合、「切断可能なリンカー」という用語は、等モルレベルの複数の遺伝子が同じｍＲＮＡから産生され得るように、マルチシストロンｍＲＮＡ構築物に組み込むことができるリンカー、典型的にはペプチドリンカー（例えば、約５〜３０アミノ酸長、典型的には約１０〜２０アミノ酸長）を指す。切断可能なリンカーの非限定的な例としては、ピコルナウイルスにおいて最初に発見された、Ｆ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ及びＥ２Ａを含む２Ａファミリーのペプチドが挙げられ、これは、ｍＲＮＡ構築物に組み込まれると（例えば、２つのポリペプチドドメイン間）、２ＡエレメントのＣ末端でのペプチド結合の合成をリボソームにスキップさせることによって機能し、それによって２Ａ配列の末端と下流の次のペプチドとの間の分離をもたらす。
【１２１３】
コンジュゲートされた：本明細書で使用される「コンジュゲートされた」という用語は、２つ以上の部分に関して使用される場合、その部分が直接または連結剤として働く１つ以上の追加の部分を介して物理的に会合または互いに結合して、構造が使用される条件下、例えば、生理学的条件下で部分が物理的に会合したままであるように十分に安定な構造を形成することを意味する。いくつかの実施形態では、２つ以上の部分が直接共有化学結合によってコンジュゲートされてもよい。他の実施形態では、２つ以上の部分がイオン結合または水素結合によってコンジュゲートされてもよい。
【１２１４】
接触：本明細書で使用される場合、「接触する」という用語は、２つ以上の実体の間の物理的接続を確立することを意味する。例えば、細胞をｍＲＮＡまたは脂質ナノ粒子組成物と接触させることは、その細胞及びｍＲＮＡまたは脂質ナノ粒子が物理的結合を共有するように作られることを意味する。インビボ、インビトロで、及びエキソビボの両方で細胞を外部実体と接触させる方法は、生物学的分野において周知である。本開示の例示的な実施形態では、哺乳動物細胞を組成物（例えば、本開示の単離されたｍＲＮＡ、ナノ粒子、または薬学的組成物）と接触させるステップはインビボで行われる。例えば、脂質ナノ粒子組成物と生物（例えば、哺乳動物）内に配置され得る細胞（例えば、哺乳動物細胞）とを接触させることは、任意の適切な投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内及び皮下投与を含む、生物への非経口投与）によって行われ得る。インビトロで存在する細胞の場合、例えば、組成物を細胞の培地に添加することによって組成物（例えば、脂質ナノ粒子または単離されたｍＲＮＡ）と細胞とを接触させてもよく、トランスフェクションを伴う場合もあるし、生じる場合もある。さらに、２つ以上の細胞がナノ粒子組成物によって接触されてもよい。
【１２１５】
封入する：本明細書で使用される場合、「封入する（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）」という用語は、包み込む、囲む、または封入することを意味する。いくつかの実施形態では、化合物、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、または他の組成物は、完全に封入されていても、部分的に封入されていても、または実質的に封入されていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子、例えば、リポソーム中にカプセル化されてもよい。
【１２１６】
有効量：本明細書で使用される場合、ある因子の「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」とは、それが関係する文脈次第である。例えば、がんを処置するある因子を投与するという文脈において、ある因子の有効量とは、例えば、その因子を投与しないで得られた応答と比較して、本明細書に定義のがんの処置を達成するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、治療有効量とは、感染、疾患、障害、及び／または病態に罹患しているかまたは感染しやすい対象に投与した場合に、その感染、疾患、障害及び／または病態を処置、その症状を改善、その発現を診断、予防及び／または遅延させるために十分である、送達される因子（例えば、核酸、薬物、治療剤、診断剤または予防薬剤）の量である。
【１２１７】
発現：本明細書中で使用される場合、核酸配列の「発現」とは、以下の事象のうちの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からの（例えば、転写による）ＲＮＡテンプレートの生成；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端プロセシングによる）；（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳；ならびに（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
【１２１８】
同一性：本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子間（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子間）及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的のために２つの配列を整列させることによって実施され得る（例えば、最適整列のために第１及び第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入してもよく、及び非同一配列は比較目的で無視してもよい）。特定の実施形態では、比較目的で整列された配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドで占められているならば、その分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数、及び２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要がある各ギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一位置の数の関数である。２つの配列間の配列の比較及び同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１（各々が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載の方法などの方法を用いて決定され得る。例えば、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１−１７）を用いて決定され得る。２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、あるいは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して決定され得る。配列間の同一性パーセントを決定するために一般に使用される方法としては、��定するものではないが、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）（参照により本明細書に組み込まれる）に開示される方法が挙げられる。同一性を決定するための技術は、公的に利用可能なコンピュータープログラムに体系化されている。２つの配列間の相同性を決定するための例示的なコンピューターソフトウェアとしては、限定するものではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１）：３８７，１９８４，ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３，１９９０が挙げられる。
【１２１９】
断片：「断片」とは、本明細書において用いる場合、ある部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された全長タンパク質を消化することによって得られるか、または組換えＤＮＡ技術によって得られるポリペプチドを含んでもよい。
【１２２０】
ＧＣリッチ：本明細書で使用される場合、「ＧＣリッチ」という用語は、グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）核酸塩基を含む、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、またはその任意の部分（例えば、ＲＮＡエレメント）の核酸塩基組成、またはその誘導体もしくは類似体（ここで、ＧＣ含有量は、約５０％を超える）を指す。「ＧＣリッチ」という用語は、限定するものではないが、遺伝子、非コード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、ＲＮＡエレメント、配列モチーフ、またはそれらの任意の個別の配列、断片、もしくはセグメント（約５０％のＧＣ含有量を含む）を含む、ポリヌクレオチドの全部または一部を指す。本開示のいくつかの実施形態では、ＧＣリッチのポリヌクレオチド、またはその任意の部分は、グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）核酸塩基のみから構成される。
【１２２１】
ＧＣ含量：本明細書で使用される場合、「ＧＣ含有量」という用語は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）またはその一部（例えば、ＲＮＡエレメント）の中の核酸塩基（グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）核酸塩基、またはその誘導体もしくは類似体のいずれかである）の割合を指す（ＤＮＡ中及びＲＮＡ中の、アデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ）ならびにそれらの誘導体もしくは類似体を含む可能性のある核酸塩基の総数から）。「ＧＣ含量」という用語は、限定するものではないが、遺伝子、非コード領域、５’または３’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、ＲＮＡエレメント、配列モチーフ、またはそれらの任意の別個の配列、断片、もしくはセグメントを含むポリヌクレオチドの全部または一部を指す。
【１２２２】
遺伝子アジュバント：本明細書で使用される「遺伝子アジュバント」とは、例えば、サイトカイン産生を刺激することによって、及び／または抗原特異的なエフェクター細胞（例えば、ＣＤ８Ｔ細胞）の産生を刺激することによって、ワクチンに対する免疫応答を増強するｍＲＮＡ構築物（例えば、ｍｍＲＮＡ構築物）を指す。遺伝子アジュバントｍＲＮＡ構築物は、例えば、Ｉ型インターフェロンを刺激する（例えば、Ｉ型インターフェロン経路シグナル伝達を活性化する）か、または樹状細胞の発達もしくは活性を促進するポリペプチドをコードし得る。
【１２２３】
異種：本明細書で使用される場合「異種」とは、配列（例えば、アミノ酸配列またはアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）が通常、所与のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに存在しないことを示す。例えば、あるタンパク質のドメインまたはモチーフに相当するアミノ酸配列は、第２のタンパク質に対して異種であってもよい。
【１２２４】
疎水性アミノ酸：本明細書で使用される場合、「疎水性アミノ酸」とは、非荷電の非極性側鎖を有するアミノ酸である。天然に存在する疎水性アミノ酸の例は、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、及びトリプトファン（Ｔｒｐ）である。
【１２２５】
免疫増強剤：本明細書で使用される「免疫増強剤」とは、例えば、限定するものではないが、サイトカイン産生、抗体産生の刺激、または抗原特異的免疫細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞）の産生の刺激を含む、Ｔ細胞、Ｂ細胞または樹状細胞応答の刺激によって、例えば、目的の抗原に対する（免疫増強剤を投与される対象における内因性抗原または免疫増強剤と同時投与される外因性抗原のいずれか）免疫応答を増強するｍＲＮＡ構築物（例えば、ｍｍＲＮＡ構築物）を指す。
【１２２６】
開始コドン：本明細書で使用される場合、「開始コドン（ｓｔａｒｔ  ｃｏｄｏｎ）」という用語と交換可能に使用される「開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎ）」という用語は、リボソームによって翻訳され、そして連結されたアデニン−ウラシル−グアニン核酸塩基のトリプレットから構成されるオープンリーディングフレームの最初のコドンを指す。開始コドンは、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、及びグアニン（Ｇ）の最初の文字コードによって表され、そしてしばしば単に「ＡＵＧ」と書かれる。天然のｍＲＮＡは、開始コドンとしてＡＵＧ以外のコドン（本明細書では「代替開始コドン」と呼ばれる）を使用し得るが、本明細書に記載のポリヌクレオチドの開始コドンはＡＵＧコドンを使用する。翻訳開始の過程の間、開始コドンを含む配列は、リボソームによって結合された開始ｔＲＮＡ（Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔ）のアン菣뎂菣뎃臣뺯臣讂鯧鲣髧ꦡ鿥뺯郥銂믤鞁臣趪귨閁苣讂胣ꪂ菣鞃菣ꪃ菣螃苣뎃苣閃菣벃菣꾁胣겜飦내鯦궸臣貀믤뾛雩讧苣覃菣趀臣벑臣貂苣膀볯ꒁ믤誸臣ꆼ볯Ꞽ雩讧苣覃菣銂郥鎂臣节苣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†雩讧苣覃菣꾁胣뮿꣨讖꟥ꮁ臣蒁臣趇ꛨꪁ뷥늉苣鲞臣馁胣讖꟥뎂菣뎃臣膀菣鲃苣벃菣ꮁ苣ꎁ臣뮿꣨閁苣讂苣벃菣뎃菣벃菣ꎂ菣낂菣것菣ꂃ臣肜裥꺁苣覃菣ꞁ臣讂胣뢅黥蒚臣꾁胣讖꟥뎂菣뎃臣膀菣꾂菣ꪂ菣覃菣ꪃ菣것菣袃볯떼볯銂郥肂臣膀臣讂ꃥ袐臣꾁胣뮿꣨讖꟥꾁闧ꪁ苣貃苣것苣膃菣讁苣讧裦閁苣讂믤꺁苣覃菣ꞁ뗨鎁苣뒠郥节臣讂胣龜ꃦ龔觧ꮁ臣醁苣뮿꣨꺁雩讧臣膀菣莃苣뎃苣ꎃ菣늼볯ꆼ裥邭볯趽볯꺼볯覼胣钼볯뎼菣鲃苣벃菣떂菣ꚃ菣莃菣膀뿧뎨ꧦ讧臣隻臣讧裦膦듧袼뻤袁臣膀鳧뢠铧ꦉ雩讧鯥邭볯薽볯ꚼ볯覼臣鎖臣骤闦꺁苣뎃菣꾂돨銈苣뎃菣꾂돨膀苣뎃菣꾂돨銈볯꺼볯膀迥뎁볯꺼볯銈볯꺼볯꺁鯧銺뷤ꢔ苣ꮐ苣膀ꓥ떮髩龔賥ꚭ菣궃苣릂臣芁苣芀뷯늼볯ꆼ뿧뎨雩讧臣뺏鳥꺁菣螃菣꾁胣릉껥꺁뿧뎨뿤늀菣꾂菣ꪂ菣覃郥覜觧袼볯辽뷯膽뷯超裥覼蛥ꮁ귥ꢜ臣讂鳦鶈臣ꆼ볯Ꞽ苣覃菣ꮁ臩螁臣讂臣ꞁ볯馀臣覂볯馀雦醐臣貃苣것苣膃菣銂苣궂菣뎃臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ胣讖꟥趉ꓨ袐뷤袼臣讂臣꾁胣钼볯뎼雩讧觥螤郥鎽胣鮼胣낼볯ꎼ胣ꢁ闧閁苣讂볯貁뷯늼볯ꆼ룤꺁该ꆓ菩趽볯뢅黥蒚臣꾁볯馀苣ꎃ菣鞃볯讁苣讖꟥뎂菣뎃臣ꊻ뷤馁苣ꢁ믤骮臣讂볯ꮼ뷯骽뷯讽볯醼볯颼볯覼볯ꎼ뷯貽뷯₌ꊼ뷯辽뷯醼볯颼볯銼볯馼裢銼볯醼볯芀볯ꦼ볯ꮁ苣讂苣궂菣뎃菣뎃苣꾁胣讖꟥궼뷯钽裢钽볯꺼볯㲡畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲉猯扵㰾畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯薽뷯㲔猯灵ꊻ꟧늼볯ꆼ臣ꊂ菣膃��覃菣銂郥肂菣꾂菣ꪂ菣覃臣趽볯꺼볯꺁雩讧苣覃菣銂郥肂菣꾂菣ꪂ菣覃臣꺁雩꺁鯧鲣髧ꦡ鿥뺯郥ꮁ苣ꎁ臣芵뫤馁苣芀볯떼볯뎂菣뎃臣궼뷯钽裢钽볯꺼볯㲡畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲉猯扵㰾畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯薽뷯㲔猯灵ꊂ菣膃苣覃菣ꢁ臣鎖臣龔铧蒚臣ꦡ鿥뺯郥꾁胣낼볯ꎼ臣꺁ꓥ趁臣隼볯뎼菣鲃苣벃菣떂菣ꚃ菣莃菣꺁胩邵臣誁臣ꚁ볯ꦼ볯ꮁ臩馁苣肸胩꺁꟦ꂀ髧誏臣龔賥ꚭ髧论뇨銂ꫨ몙臣ꚁ胣뮿꣨뢼闩ꮁ臩베臣뮴胦ꪃ菣붂菣ꂃ苣ꊽ裦馁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 뾌藥骼鳦躘듧뢛룤ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀胣뾌藥趀臣龁臣貀믤ꂊ胣ꢁ臣膀迥ꞅ藩鞈胣设臣낁胣ꦤ蓧ꮁ귥ꢜ臣讂裥邭臣讦苣貂苣超裥ꢁ꿦莼臣ꚁ胣鶁苣麁苣膀裥邭臣꺁볯ꒁ믤誸臣ꊂ菣躃藩议鿥뺁臣꾁菣꾂菣ꪂ菣覃臣颻諥銂苣龁苣馁胣ꊂ菣躃藩뺁臣꾁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣覤賥銂賦馁胣设臣낁胣낕꣧鶃菣骃菣膃菣袼뻤袁臣膀볯ꢼ볯覃菣ꒂ菣覼臣ꊂ菣躃藩超裥꾁胣뾌藥ꮁ臩鞁臣ꢃ뷤ꞁ뛨뒠菣ꪃ菣鞃菣覃볯设臣낁胣뎼뷯薽볯뎶ꃥ鶃菣骃菣膃菣覼臣뾌藥閁苣ꚁ苣袂臣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀뻤袁臣膀뛨뒠菣ꪃ菣鞃菣覃臣ꮃ菣鞃苣ꊽ裦馁苣ꊂ菣躃藩超裥袼뻤袁臣膀볯钽뷯ꆼ臣龁臣뎼뷯薽볯颪냥鎽臣ꮃ菣鞃볯뺁臣꾁菣벃菣銼볯貁闧꺨菣ꪃ菣鞃菣覃臣ꊂ菣躃藩超裥ꞁ뷧鮏臣貂苣뒠郥膀賦ꖅ臣꺽迦ꞁ臣ꎁ臣节苣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†賦ꖅ菩趽볯겜飦내鯦ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀胣뾌藥ꢃ뷤趀臣膀闧꺨菣ꪃ菣鞃菣覃臣ꊂ菣躃藩超裥꺁賦ꖅ臣ꦁ臣ꚁ臣讂뛨뒠菣ꪃ菣鞃菣覃臣趽뷧뺁臣꾁ꃩ龟臣芁苣芀賦ꖅ菩趽臣뺁臣膀菣ꪃ菣鞃菣覃苣뎂菣覃臣讂菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣趽뷧뺁臣꾁ꃩ龟볯设臣낁胣뎶ꃥ鶃菣骃菣膃菣궸臣肉룤꺁苣龃菣뢅苣뎂菣覃臣讂菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣뎂菣뎃볯銂賦馁ꃥ袐苣芁苣鎁臣銂郧ꎧ臣릁臣ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣뎶ꃥ鶃菣骃菣膃菣뢁臣낕꣧鶃菣骃菣膃菣꺁苣龃菣뢅藩鞈臣뾌藥꾁胣뎶ꃥ鶃菣骃菣膃菣꺁껥骮胦袼뻤袁臣膀ꯧ鎽꟦ꂀ껥骮胦覼胣몙迧것菣ꮃ胣뺁臣꾁藥鎽髧ꪁ뫤ꆬ꟦ꂀ臣뮁臣鎂臣뺁臣꾁藥辁뷥뾟苣誏臣閁臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†跥ꊛ臣貂臣骼鳦躘듧뢛臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣貀跥ꊛ臣貂臣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣鶁苣貁雩ꎀ臣龁볯ꪇ蓧貕臣节껥鎨鋧莢臣节볯讧裦膦듧꺁냥ꪁ臣ꢁ苣蒁臣ꒁ臣讁苣蚈鯩閁苣ꚁ臣讂觧ꪳ臣龁臣龮뷤銂賦馁胣��鯩閁苣龁觧ꪳ臣膀臣貂苣貁雩ꎀ臣ꚁ臣讂觧ꪳ臣ꊖ胩鞁臣颧胣ꪁ菣馃菣꺁듧ꚺ苣覜臣鞾苣芀跥ꊛ臣貂臣ꦉ돨誏臣込臣龁臣龮뷤꾁胣鶁苣覂臣肜裥ꮁ雩ꎀ臣ꚁ臣龁믤꺁꟦邈ꛨꂴ臣醰臣辁臣节듧醼볯薼胣蒴볯邼볯膀듧鎼볯薼胣蒴볯邼볯膀듧閼볯薼胣蒴볯邼볯膀듧鞼볯薼胣蒴볯邼볯膀듧馼볯薼胣뺁臣꾁臣貂믤誸臣覂裥ꊛ臣貂뻥讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣颍鯩閁苣龁鯥邭臣膀듧颼볯薼胣蒴볯閼볯膀듧馼볯薼胣蒴볯醼볯膀듧馼볯薼胣蒴볯鎼볯膀듧馼볯薼胣蒴볯閼볯膀듧馼볯薼胣蒴볯鞼볯膀듧馼볯薼胣蒴볯馼볯膀臣龁臣蒴볯馼볯薶듧讲臣芁苣芀鳦躘듧뢛臣誁臣ꚁ铧蒁苣뒠郥膀믤꺁꟦邈ꛨꂴ苣龮돨蒚臣ꮐ臣ꪁ臣ꪁ苣낁胣鶁臣ꦉ돨꾁胣钴닧趀臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꮼ뷯骽뷯讽藩鞈볯貀볯辽뷯膽뷯超裥趀볯貀볯辽뷯膽뷯뎂菣뮂菣떂苣超裥趀臣节釥낁苣讂볯ꢁ臣蚁铧麪臣膀臩鶼귥뺁臣꾁苣벃菣뎃菣벃菣ꎂ菣낂菣것菣ꂃ臣몙迧銂ꋥ랼臣讂臣膂臣뮿꣨讖꟥ꢂ菣较菣떂菣ꢂ菣ꆃ菣袃苣螌臣膀臣貂臣膀鳧뢠铧ꦉ臣誁臣ꚁ臣閼胢떼볯늼臣趽뷧馁苣芀菣것菣궃苣뎃苣ꪃ菣몁볤邭臣뮿꣨ꮁ꿥馁苣讖꟥뎂菣뎃볯ꆼ볯Ꞽ볯銂鯥肂跥肸臣覤闧꺁뷥뾟臣蚈黦ꮁ뛧蒁臣膀볯辽뷯膽뷯뎂菣뮂菣떂苣超裥꾁苣ꢁ苣ꢁ藩鞈甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯㲣甯袼볯鶼菣ꪃ菣覼臣鞁臣骮뻧閁苣龁볯ꮼ뷯骽뷯讽볯醼볯颼볯覼볯薽뷯貽†볯钼볯銼볯鎼裢銼볯銼볯芀鳦躘듧뢛臣讖ꓧ閁苣讂菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣膀볯辽뷯膽뷯뎂菣뮂菣떂苣超裥膀臣龁臣鶁臣颪냥鎽苣鞁臣꾁铦覤뷤銂郥肂胣袼뿧뎨苣뎃菣뎃苣벃뗧邈觧誏臣鶁臣뾽铧릖돦꺁뻤膀臣꺁藥鎽臣芏藧ꮁ苣誂鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣ꆼ뷯蒽뷯薽뷯鎽苣꺁뇧붛觧놨곧閼볯颼볯鞼볯鞼볯鞼迥鮼臣꺁藥鎽臣芏藧ꮁ苣誂鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣ꎼ뷯薽뷯躽뷯誽뷯隽뷯讽뷯꺁뇧붛觧놨곧閼볯鞼볯鎼볯鎼볯銼迥鮼臣꺁藥鎽臣芏藧ꮁ苣誂鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣膀볯覽뷯鎽뷯躽臣뎱鯥릉꣨견볯貼볯馼볯貼볯隼볯랏苣芏藧꺁臣ꢁ볯芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꪃ菣궂菣릂苣ꎃ菣뎃苣骼胣ꪃ菣궂菣릂苣ꎃ菣뎃苣趀臣鞁臣ꖟ苣貂苣뺏뇨貁뗨鎁苣鞾胣鶁苣ꮁ苣ꎁ臣낼볯ꎼ臣讖꟥뎂菣뎃苣芿鯥鞁胣ꎻ苣誂臣膀믤뾛臣뺁臣꾁믤辂苣꺁雩讧苣覃菣貁ꫨ颭臣貂苣뺁臣许뗦뢁臣릂苣ꎃ菣뎃苣銂뛧醁苣芀駧龔ꃩꚺ臣鲿臣ꚁ胣낼볯ꎼ臣袂苣讖꟥뎂菣��뎃臣芿鯥꾁뿧뎨諥螎臣躽룤銂苣龁苣鞁뻥讂胣閁苣ꮁ胣鎁臣许뗦꺁볯떼볯뎂菣뎃臣覂臣뮿꣨貁뗨鎁苣鞾苣貁胣鶁苣꾁触鮜臣ꚇ뷧趏뿥銂볥趁蟥馁臣ꢁ臣ꞁ臣ꪁ臣讁苣鞁苣ꪁ臣膀触鮜臣貂臣蒁胣낕룥ꪁ뿧뎨铧ꦉ臣ꎔ铧銂苣龁苣馁臣芁苣蚁胣芁苣뒠郥ꮁ臣膀闧뢸臣뮿꣨ꎔ觧貁껥鮚臣覜껥ꪁ迥鲿苣龔臣鞾苣袼볯銽뷯莽뷯钽†뷯钽†뷯貽볯貼볯銼볯醼볯覼볯膽뷯ₔ궼뷯蒽†볯鎼볯钼볯骼볯邼볯銈볯邼볯覼胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†菣鶃苣벃菣骼鳦躘듧뢛臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣貀菣鶃苣벃菣趀臣꾁胣뒰胦薆菩銂鯥肂蓨ꪳ郥覜蛨銂郥肂꟦ꂀ苣辄釥馁苣芀菣鶃苣벃菣꾁胣醼臣ꖻ룤꺁蓨ꪳ蛨銂鳦鞁臣节苣蒁胣ꪃ菣붂菣ꂃ臣鞁臣꾁胣颍뇥ꪃ菣붂菣ꂃ볯鎽뷯躽뷯貽뷯銈뷯膽뷯薽뷯薽뷯₄貽뷯邽뷯鎽뷯趽뷯鎽볯袼뷥늩諦鎡裥躇臣誁臣ꚁ跥꒱菣鶃苣벃菣袼뷯躽뷯貽뷯趽뷯貽뷯膽뷯ₒ貽뷯邽뷯鎽뷯趽뷯鎽볯ꢁ臣ꚁ苣ꖟ苣貂臣蒁苣覼迥뎁ꓥ꒱菣鶃苣벃菣袼뷯閽뷯钽뷯銈뷯膽뷯薽뷯薽뷯₄貽뷯邽뷯鎽뷯趽뷯鎽볯袼뷥늩諦鎡裥躇臣誁臣ꚁꓥ꒱菣鶃苣벃菣袼뷯閽뷯钽뷯貽뷯趽뷯貽뷯膽뷯ₒ貽뷯邽뷯鎽뷯趽뷯鎽볯ꢁ臣ꚁ苣ꖟ苣貂臣蒁苣覼臣馌臣覂苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†믨뮧볯겜飦내鯦궸臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣貀믨뮧胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀臣鎂臣肜裥ꮁ駧龔臣龁ꃥ肉臣覂軥몙藨趘臣鞁臣ꮺ뷤薆臣ꊛ苣龁ꃥ肉臣ꆋ臣讂臩讨苣辄釥馁苣芀臣꺁菣궃苣릂臣邵黦ꢁ臣ꚁ铧颁臣貺곦ꮅ飧꾁胣貀믨뮧胣ꢁ釥낁苣讂ꃥ袐苣芁苣芀뷯늼볯ꆼ볯겜飦내鯦ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀胣趽볯꺼볯趀臣꾁菣莃苣뎃苣ꎃ菣ꪃ菣뢠藩銂賦馁胣趽볯꺼볯꾁ꓥ뚄臣节臣ꞁ臣ꎁ臣节胣ꦤ蓧꺁苣꺁臣ꪁ臣ꚁ苣袂臣芀뻤袁臣膀뷯늼볯ꆼ臣膀볯ꒁ믤誸臣뢠藩ꦡ鿥膀菣꾂菣ꪂ苣覃胣貃苣것苣膃菣膀臣龁臣ꪃ菣ꮂ菣ꪁ臣꺁뿤뺣臣貂臣讧裦膦듧銂郥鎂臣节胣誏臣込臣龁臣ꦤ蓧ꮁ귥ꢜ臣ꪁ臣讧裦膦듧銂郥鎂臣节苣蒁胣趽볯꺼볯꾁胣궂菣莃菣讧胩膀軩芵뗧貃苣것苣랂菣膀苣蚃菣ꮃ菣鞃胣鶃菣ꆼ藩鞈胣誏臣込臣龁臣鶃菣ꊂ菣讃菣隌苣낂菣ꮃ苣ꮐ苣ꞁ苣袂臣芀뷯늼볯ꆼ臣膀菣ꪃ菣鞃菣覃苣뎂菣覃臣讂菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈苣覜臣鞾苣芀뷯늼볯ꆼ臣뮿꣨膀뻤袁臣膀鏥뎹该ꦉ듧麃蛥ꞁ臣趽볯꺼볯꺁苣뎃菣鲃뿧뎨臣膀菣ꪃ菣鞃菣覃苣ꎔ铧鞁뻥讂胣鶼뗧蒚臣膀뷯늼볯ꆼ裥邭臣몟鳦蒚臣讧裦膦듧ꢁ臣ꚁ臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣뎂菣覃ꃩ龟胣閼胢銈鷩��꣨颠鿥袼볯馀裢떼볯늼볯膀볯馀볯뒼볯膀볯馀苣ꎃ菣鞃迥뎁菣ꪃ볯超裥貁賦銁苣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 麃苣꾂菣늼볯ꆼ볯趽뷯늼볯ꆼ볯骼鳦躘듧뢛룤ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀胣麃苣꾂菣늼볯ꆼ볯趽뷯늼볯ꆼ볯趀臣꾁胣袼뻤袁臣膀볯꺼볯떂苣것菣랂菣낂臣袂苣膀뻤袁臣膀뷯늼볯ꆼ臣螈雦ꮁ苣讂胣鶁臣鶃菣ꆼ菣벃菣銂鿧辁臣讂臣ꢁ臣袂苣膀迥뎁볯뺁臣꾁菣鲃苣벃菣ꮁ苣讂뷯늼볯ꆼ臣鶃菣骃菣膃菣뢁臣뮿꣨릊軧銂ꛥ銁苣鎁臣ꮁ苣讂뷯늼볯ꆼ臣趸껥骮賥ꮁ苣讂볯몁볤邭駧뺏臣ꊻ蛥貾ꫨ肯臣誁臣ꚁꧦ붃臣鞾苣辰臣ꪁ鷩뎂菣覃볯꺼볯蚈귥ꞁ臣讂胣邈蛧趽뷯늼볯ꆼ臣뢅黥蒚臣꾁듧銼볯貃苣것苣膃菣랕臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 麃苣꾂菣늼볯ꆼ裢醼볯銼볯趽뷯늼裢醼볯銼볯骼鳦躘듧뢛臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣貀菣ꒂ苣궃볯꺼볯銈볯銼볯袼뷯覽볯銈볯銼볯覼胣꾁胣릉臣몤臣ꪁ臣邙苣膀뻤袁臣膀菣袃苣ꮐ苣膀믤辄臣誄ꓦ開觧략뫦놔鷦꺁믤辄臣ꦤ蓧趽뷯늼裢醼볯銼苣螌臣芀뷯覽볯銈볯銼볯꾁胩뢸苨鎇臣颫臣몙迧鞁臣誁苣膀臣鎁臣芄苨뢅믤鶬苣뾪꿧鞁뻥讂胣鶂蟨貙胣设臣낁胣鶂듧麃駧ꞁ臣膀뷯覽볯銈볯銼볯것菣ꮃ臣躽룤馁苣芀뷯覽볯銈볯銼볯꾁胣鶂蟨ꞁ鳦节ꯩ辁駧뺏臣ꚁ臣讂뷯覽볯꺼볯꺁볯ꒁ臣芁苣膀臣貂臣邙껥馁苣节臣ꞁ臣ꪁ臣貁胣ꎼ볯뒼裢醼胣ꎼ볯鎼볯邼胣ꆼ뷯蒽뷯ꆼ胣ꢼ뷯隽胣ꢼ뷯薽胣ꆼ볯ꆼ볯醼볯膀볯Ꞽ볯늼볯膀볯ꎼ볯Ꞽ볯膀迥뎁볯꒼볯궼볯鞼苣ꮐ苣馨髧銂ꫨ肯臣讂胣邈蛧銃菣趽뷯늼裢醼볯銼臣膀볯ꆼ볯Ꞽ볯ꎼ볯떼볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯袽뷯膽裢趽뷯늼裢醼볯銼裢鎼뷯ꮁ鯧鎽臣讂藩鞈闧랏볯銼볯뺁臣꾁볯Ꞽ볯ꆼ볯떼볯떼볯ꆼ볯ꆼ볯떼볯Ꞽ볯Ꞽ볯떼볯Ꞽ볯袽뷯膽裢趽뷯늼裢醼볯銼裢閼뷯ꮁ鯧鎽臣讂藩鞈闧랏볯鎼볯꺁藩鞈苣覜臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 麃苣꾂菣늼볯ꆼ裢銼볯袼뷯覽볯銈볯醼볯骼鳦躘듧뢛臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣貀菣ꒂ苣궃볯꺼볯銈볯醼볯趽뷯늼裢銼볯覼胣꾁胣隻臣몤臣貂臣蒁駩誂胣设臣낁胣銃菣銂郥肂믤辄臣誄ꓦ開觧략뫦놔鷦꺁믤辄臣ꦤ蓧꺁뷯覽볯銈볯醼苣螌臣芀뷯覽볯銈볯醼菣馃菣꾁胣ꎭ룥ꪁ苨鎇臣钯볨鞁臣膀苨鎇駧膀뻤袁臣膀苨내菨貙臣誁臣ꚁꋥꞤ臣ꚁ臣讂胣邈蛧銃菣趽뷯늼裢銼볯꾁胣떼볯Ꞽ볯떼볯ꆼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯떼볯떼볯Ꞽ볯袼뷯膽뷯銈뷯覽볯銈볯醼裢閼뷯ꮁ鯧鎽臣讂藩��闧랏볯钼볯뺁臣꾁볯馀裢ꎼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯떼볯떼볯鎼胢袼뷯膽뷯銈뷯覽볯銈볯醼裢鎼뷯ꮁ鯧鎽臣讂藩鞈闧랏볯閼볯꺁藩鞈苣覜臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 麃苣꾂菣늼볯ꆼ裢醼볯銼볯趽뷯늼裢醼볯銼볯骼鳦躘듧뢛臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣貀菣ꒂ苣궃볯꺼볯銈볯钼볯袼뷯覽볯銈볯钼볯覼胣꾁胣隻臣몤臣ꪁ臣邙苣膀뻤袁臣膀菣袃苣ꮐ苣뮻蓦꺁蓨躤该ꦉ뗨邺铧ꖝ臣뮻蓦꺁ꓥ뚄臣趽뷯늼裢醼볯銼苣螌臣芀뷯覽볯銈볯钼볯꾁胣뢅黥蒚臣꾁ꫩ蒫듧麃臣誁臣ꚁꯩꚺ臣몙迧閁苣讂胣邈蛧銃菣趽뷯늼裢醼볯銼臣膀볯Ꞽ볯ꆼ볯떼볯떼볯떼볯ꎼ볯ꆼ볯떼볯떼볯떼볯Ꞽ볯袼뷯鎽뷯銈뷯覽볯銈볯钼볯銈볯邽臣뢛뷥馁苣超裥ꪕ迥銼볯覼臣龁臣ꎼ볯떼볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ볯ꆼ볯떼볯袽뷯膽裢趽뷯늼裢醼볯銼裢閼뷯ꮁ鯧鎽臣讂藩鞈闧랏볯邼볯꺁藩鞈苣覜臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 麃苣꾂菣늼볯ꆼ볯趽뷯늼볯ꆼ볯邵郥ꢃ뷤骼鳦躘듧뢛룤ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀胣麃苣꾂菣늼볯ꆼ볯趽뷯늼볯ꆼ볯邵郥ꢃ뷤趀臣꾁胣趽뷯늼볯ꆼ꣦蒚菩趽苣鞁臣꾁뷯覽볯꺼볯趪귨ꢃ뷤膀臣龁臣趽뷯늼볯ꆼ臣邵郥节臣辁臣骼郥馁苣뮻蓦꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈苣螌臣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀뷯覽볯꺼볯邵郥ꢃ뷤꾁胣趽뷯늼볯ꆼ臣醰臣辁臣节胣랂菣覃胣颠鿥貁뗧袐臣讂菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃볯设臣낁胣趽볯꺼볯覼臣貃苣것苣膃菣趽뷧뺁臣꾁ꃩ龟苣ꢡ臣芀胣邵郥趀臣膀볤놵髧ꪁ菣袃苣뎃裢꾂菣莃苣较苣隃菣肃苣벂菣랂菣뎃돦螉臣鎾臣뒠郥节臣誂胣뺁臣꾁菣ꒂ苣궃볯꺼볯ꢃ뷤ꮁ胣뺁臣꾁臣貂臣ꎚ軦鞁臣趽뷯늼볯ꆼ臣馨髧超裥ꢁ臣뮻蓦꺁껥骮臣骼郥銂迥ꂘ臣讂ꃥ袐苣芁苣鎁臣貁郧ꎧ臣貂苣릁臣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†뷯覽볯꺼볯랂菣覃볯겜飦내鯦궸臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣趽뷯늼볯ꆼ臣貀苣벃菣趀ꃩ龟臣膀裦龆뷯覽볯꺼볯꺁볯鲀볯趽臣颠鿥薆臣超裥ꞁ臣ꎁ臣膀藥讞髧ꮁ臣趽뷯늼볯ꆼ뗧袐菩趽臣뺯臣ꚁ껥ꢅ臣꾃菣붂菣銈苣ꪃ菣꾂鯧鲣胦銂鳦馁苣超裥銂賦馁胣趽뷯늼볯ꆼ苣벃菣꾁胣邈蛧趽뷯늼볯ꆼ臣銼胣颼뷤뺁臣꾁볯鲀볯趽苣ꮐ苣ꞁ苣袂臣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀뷯覽볯꺼볯랂菣覃臣膀볯貃苣것苣膃菣袼뻤袁臣膀裦龆뷯覽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃볯鲀볯覼苣ꮐ苣ꞁ苣袂臣膀臣鎁臣膀꿥鲿臣讂뷯覽볯꺼볯邵郥ꢃ뷤ꮁ臣醁苣랂菣覃鯧鲣髧ꢃ뷤��臣膀뷯覽볯꺼볯趽뷧醼臣꾁迥뺯臥꺁苣螃菣뎃볯ꆼ볯貁髩ꖎ臣ꚁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣趽뷯늼볯ꆼ苣벃菣꾁胣隼菣꾂菣ꪂ菣覃볯设臣낁胣邈蛧趽뷯늼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣銼胣鞼볯銂郥鎂臣节苣辁胣뺯뿥馁苣趽뷯늼볯ꆼ뗧袐菩趽蛥꺁苣벃菣뢛ꏨ蒚菩趽臣꾁胣趽뷯늼볯ꆼ뷤꺽볯ꢁ臣趏꿥뒁臣ꊂ菣讃菣袼볯覼臣ꎚ軦鞁臣蒁苣芀뷯覽볯꺼볯邵郥ꢃ뷤ꮁ꣨誏臣讂臣趁胣趽뷯늼볯ꆼ苣벃菣超裥꾁胣趽뷯늼볯ꆼ뗧袐菩趽臣邵郥馁苣趽뷯늼볯ꆼ臣랂菣覃藩鞈臣뢛ꏨꞀ볯设臣낁胣ꢃ裥蒚胣龮돨蒚臣龁臣貮藥ꪁ鯧鲣胦覼苣覜臣讂臣蚐꟨閁苣讂臣趁臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 꺿ꏩ骼鳦躘듧뢛臣뾽铧閁苣讂胣꺿ꏩ閁苣龁胣뺁臣꾁胣꺿ꏩ趀臣꾁胣겜飦내鯦ꞁ迦鮾臣貂苣鶃菣貃苣것苣膃菣袼뻤袁臣膀뷯늼볯ꆼ볯뺁臣꾁裥邭臣覤賥鞁臣뚊藦뺁臣꾁뗧邈苣鞁臣꾁꟦ꂀ臣覤賥銂賦馁胣鶃菣貃苣것苣膃菣誏臣蚈귥꾁胣颧胣ꪁ雦閳臣膀뻤袁臣膀賥ꚭ髧ꮁ胣讧胩蒚臣膀迥뎁볯뺁臣꾁ꧦ붃髧ꮁ뿤뺣臣貂뻥讂胣设臣낁胣鶃菣貃苣것苣膃菣꾁胣醼臣ꖻ룤꺁ꧦ붃볯设臣낁胣뮿꣨뾪꿧뮴胦覼苣邏뻤馁苣超裥誏臣込臣龁臣늼볯ꆼ뫤ꆬ꟦ꂀ볯螤闦꾏볯銂郥肂胣醼臣ꖻ룤꺁볯꺼볯ꢂ菣ꆃ菣袃臣蒵臣벾臣ꮁ苣ꎁ臣讧胩蒚臣꺿ꏩ閁苣ꚁ苣袂臣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣膀뻤袁臣膀ꓥ뚄臣ꪃ菣貃苣것苣膃菣ꆼ胣떼胣Ꞽ迥뎁볯ꮁ雩馁苣뒠郥膀鷩ꦤ蓧꺁菣꾂菣ꪂ苣覃迥뎁볯뺁臣꾁菣꾂菣ꪂ菣覃臣躰藥ꮁ苣ꎁ臣꺿ꏩ閁苣讂胣궂菣莃菣讧胩ꪁ臣꺁鷩馨뫦貃苣것苣膃菣꾁胣貀뿤뺣胣ꢁ臣ꪁ臣貂臣蒁臣膀볯膀볯膀볯膀볯ꪃ菣貃苣것苣膃菣꺁賥ꚭ꟦ꂀ臣꾁闧ꪁ苣芀臣龁臣ꎁ臣膀鳦讖ꓧ꺁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃迥뎁裥邭臣膀볯ꒁ믤誸臣꺿ꏩ袼뻤袁臣膀볯ꒁ믤誸臣隌귥蒚뿤뺣胣讧胩蒚뿤뺣胣뺁臣꾁ꧦ붃髧꺿ꏩ袼臣貂苣꺁믤辄臣蒵臣袐苣鮁苣ꮐ苣覼苣ꮐ臣鞾苣覼臣覂꟦邈臣貂臣节苣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†菣躃닧邭볯겜飦내鯦ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀胣誃菣銲귥趀臣꾁胣貐臣邝雦꺁菣ꮃ苣ꚩ雦ꢁ꿦莼臣ꚁ雦辦臣릉胦銂ꓧ馁胣蒴볯邼볯邼뷯趽鳦肺臣릂苣벃菣꺁臣骁苣讁볯ꒁ臣讧胩蒚觧뒾苣覜臣讂닧邭苣螌臣芀胩뢸胣誃菣銲귥꾁胣蒴볯邼볯躽뷯ꪜ뫦膀듧銼볯邼뷯趽鳦肺胣뺁臣꾁듧醼볯邼뷯趽臣릂苣벃菣ꞁ臣骁苣讁볯ꒁ臣讧胩蒚觧뒾苣覜臣讂胣뺁臣膀胩뢸胣誃菣銲귥꾁胣��볯邼뷯趽胣蒴볯邼볯躽뷯膀듧閼볯躽뷯鲀듧銼볯邼뷯趽胣뺁臣꾁듧鞼볯鲀듧醼볯邼뷯趽臣릂苣벃菣꺁臣骁苣讁볯ꒁ臣讧胩蒚觧뒾苣覜臣讂胣设ꓧ蒚껥붖뷥讅臣꾁胣誃菣銲귥꾁胣蒴볯鲀볯邼볯邼뷯趽꣧ꚺ臣醼臣ꖻ룤꺁꿥閳苣覜臣讂닧邭臣芁苣芀믤꺁뻤몤髧龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀菣躃닧邭臣膀듧醼볯鲀볯邼볯躽뷯讨뫥꺁볯ꒁ믤誸臣뢯돦銂鳦馁苣銲귥ꞁ臣讂胣隻臣设ꓧ蒚臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀菣躃닧邭臣膀듧閼볯鲀볯邼볯躽뷯讨뫥꺁볯ꒁ믤誸臣뢯돦銂鳦馁苣銲귥ꞁ臣讂胣莐諧誃菣銲귥꾁胣设臣낁胣蒴볯邼胣醼볯邼臣龁臣鞼볯鲀볯銼볯誃菣ꆃ菣袃菣꺁鯧蒾苣覜臣讂臣芁苣蚁胣誃菣銲귥꾁胣뮁臣鎂臣꺁ꃥ袐胣鶁臣뢼胩ꢁ觧Ꞁ臣뎦苧讁苣醼臣꺁跥趽臣鞁臣馌该銂ꓧ馁胣誃菣銲귥銂꿥鲿臣讂菣ꮃ苣邝雦ꢁ賥ꖈ臣讂雦辦臣릉胦꾁胣뢅黥蒚臣꾁볯邼볯邼뷯趽鳦肺臣떂苣몂苣놂菣ꮃ胣뺁臣꾁듧醼볯邼뷯趽臣떂苣몂臣몙臩馁苣貁胣誃菣銲귥꾁胣设臣낁胣랕ꗦ蚆뷥膀껧뚊臣ꦁ臣銲귥꺁ꃥ袐胣袂苣Ꞥ臣ꪁ苣ꒂ苣ꞁ臣誂뻥讂臣ꢁ臣馕蓦閁苣龁臣芀ꓥꢃ裥꺁裥邭臣떂苣몂臣誸꣨꺁ꛦ膦臣ꦁ郥馁苣貁胣讀胣꺁裥邭臣骀룥誃菣銲귥ꢁ臣벑臣貂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†ꃦ뢅볯겜飦내鯦ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀胣뢠藩趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁臣꺁鳦节뫥蒁蓦뎑臣뾽铧閁苣膀臣鞁臣貃苣것苣膃菣꺁菣ꪃ菣벃苣ꮐ苣뮻蓦꺁賥袐觧誏臣込臣龁臣ꦉ돨銂賥ꮐ臣讂胣鎁苣覂臣鶃菣麃菣꾁臣낁臣낁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣벑臣貂苣芀鳦讖ꓧ꺁뻤몤髧ꪁꃦ뢅臣龁臣鶃菣貃苣것苣膃菣ꢁ臣ꚁ臣膀駩骮臣讂苣꺁臣꾁臣蒁臣膀菣鲃ꃦ뢅볯늼볯ꆼ볯膀菣ꪂ苣랂菣鲃ꃦ뢅볯꒼볯ꆼ볯膀볯꺼볯銈볯꺼볯较苣隃菣莃菣膀볯꺼볯覽ꫨ躰觥膀볯꺼볯覽觥膀뷯覽볯꺼볯膀뷯袽볯꺼볯膀뷯覽볯꺼볯膀苣뎃菣뮂菣릂볯꺼볯膀菣鲃苣ꒂ菣膀꟨銪胦꒼볯ꆼ胣覸蟩覂臣鎂뷥邈苣颪냥馁苣늼볯ꆼ胣袃菣ꪂ菣릂ꃦ뢅볯뒼볯ꆼ볯膀苣ꪃ苣벃菣뢠藩袼볯꺼볯覼胣骃菣膃菣뢠藩袼볯꺼볯覼胣궃菣꾂菣뢠藩袼볯꺼볯膀뻤ꢁ臣ꚁ臣膀닎裢꒼裢ꪃ菣讫뷤超뷧銂鳦馁苣겼볯ꆼ胣캁銈볯銈菣鲃ꯧ鎽藩꺽苣覜臣讂뇎裢겼볯ꆼ볯겼볯ꆼ臣뢂苣릂菣것苣麃菣覼胣銼胢銈苣龃菣颮菨隌苣覜臣讂볯馀裢ꊂ菣躃裢겼볯ꆼ胣誏臣銼胢銈苣龃菣颮菨隌苣覜臣讂볯馀裢ꊂ菣躃裢캒銈볯꺼볯覼臣龁臣鶁苣覂臣较苣隃菣莃菣貁賦銁苣貂苣芀臣覂臣膀ꃦ뢅臣膀菣ꦃ苣龃菣뺁臣꾁菣꾂苣��벃볯设臣낁胣Ꚃ苣ꮃ苣馃苣뾂菣膀駧뺏菣꾂苣벃볯ꪁ臣꺁ꃦ뢅꟦覯觧꺁뷥讅臣芁臣ꚁ苣袂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 뢠藩ꦡ鿥骼鳦躘듧뢛臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣貀ꃦ뢅ꇥ몟胣ꢁ臣蚁铧麪볯芁苣蒁臣貀菣꾂菣ꪂ菣覃ꇥ몟胣뺁臣꾁胣銪듧ꮐ鳦ꦡ鿥趀볯ꢁ臣膀ꃦ뢅臣龁臣鶁臣肸菩节臣辁臣뮂苣ꆃ菣袃臣뺯臣讂铦蒖臣貂臣릉胦袼뻤袁臣膀뗧袐ꛨ貒胦膀菣꾂菣ꊂ菣벂胨Ꞁ胣隌귥蒚껥骮胦覼苣颻룤馁苣膀ꓥ뚄臣颭鳥馁苣鞃菣뎃迥뎁菣ꪃ菣뢂菣꺁믤辄臣颪냥鎽臣龁臣麡볤鎽苣ꮐ苣膀ꃦ뢅룤ꮁꛨ覂苣讂菣ꪃ菣뺁臣꾁菣ꪃ菣뢂菣螤듧낒볥隌郥ꦉ苣螌臣芀苣螃菣뎃胣랂菣랂菣膀苣ꊂ菣뎃胣膃菣뎃胣誏臣Ꚃ菣랂菣꾁胣뮸臣ꦤ蓧뢠藩ꮁꛨ覂苣讂ꃦ뢅ꇥ몟臣芁苣芀뷥늩諦鎡裥躇臣誁臣ꚁ藥ꖟ臣芁苣讁胣誏臣込臣龁臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣貂苣袂臣ꪁ믤꺁ꓥ뚄胣麝ꓥ뚄迥뎁볯뺁臣꾁郥邈ꃦ뢅ꇥ몟苣뢠藩ꮁ뗧뾁뻨鎂臣节苣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†菣꾂菣ꪂ苣覃볯貃苣것苣膃菣骼鳦躘듧뢛臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣貀菣꾂菣ꪂ苣覃胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀ꃦ뢅ꇥ몟볯设臣낁胣鞃菣뎃臣龁臣钃菣龃苣뎃볯뺁臣꾁臣貂苣꺁ꫨ躰뷤节臣辁臣麡볤鎽볯겜飦내鯦ꞁ臣貀ꃦ뢅ꇥ몟胣ꢁ苣벑臣貂苣覼臣놅鳦邵郥鞁臣隳裥邭볯设臣낁胣늼볯ꆼ룤꺁菣鲃菣릂臣龁臣꒼볯ꆼ룤꺁菣ꪂ苣랂菣鲃菣릂볯膀臣龁臣鶁苣覂臣颪냥鎽苣鞁臣꾁ꇩ벼뷤銂郥肂臣膀菣꾂菣ꪂ苣覃雩ꎀ뗧몟볯设臣낁胣ꪃ菣뢅鿥覼苣ꂬ臣隌郥ꦉ苣螌臣芀鳦躘듧뢛룤ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀胣貃苣것苣膃菣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣뢠藩뺁臣꾁臣꺁룤ꢃ苣鞁臣꾁苣낂菣뎃菣ꮁ꿥馁苣膀賥ꚭ髧誏臣込臣龁臣龩菨蒚觧Ꞁ볯设臣낁胣邵郥ꪦ鋥Ꞁ胣貃苣것苣벃苣邀胦膀賥ꚭ髧覮껥Ꞁ볯꺁铦蒖苣颻룤馁苣膀菣꾂菣ꪂ苣覃雩ꎀ뗧몟볯设臣낁胣ꪃ菣뢅鿥覼臣놅鳦邵郥鞁臣貃苣것苣랂菣膀臣龁臣鶁臣뮻蓦꺁ꫨ躰뷤膀ꇩ벼뷤节臣辁臣꺿ꏩ銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†苣벃菣뎃菣벃菣ꎂ菣낂菣것菣ꂃ볯겜飦내鯦궸臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣貀苣벃菣뎃菣벃菣ꎂ菣낂菣것菣ꂃ胣ꢁ臣蚁铧麪볯貀볯늼볯趀臣ꖕ臣貂苣覼臣膀菣ꪃ菣鞃菣覃苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ裥邭臣뮂苣ꆃ菣袃臣龁臣颠鿥銂賦馁胣꾼볯ꚼ臣膀雩讧苣覃菣ꞁ꟥뺁苣芵귦뎂菣뎃臣芵苣讂胩骶臣龁룤骶臣꺁蟩ꪁ苣ꪁ臣ꒂ菣閃菣벃菣뎂菣뎃苣ꮐ臣膀臣鞁臣ꪃ菣붂菣ꂃ臣袂臣ꚁ뿧뎨臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾��㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 ꎂ胨骼鳦躘듧뢛룤ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀胣ꎂ胨趀臣꾁胣ꚇ뷧銂뇦膂臣蒁苣讁苣鞁臣꾁蟥꺽苣薿ꛨꢁ臣讂臣膀蟥꺽臣薿ꛨꞁ臣讂臣膀蟥꺽苣鞏臣ꚁ臣讂臣膀蟥꺽苣鞏臣讂꿥ꆱ胣뺁臣꾁觧骮臣뺖苦节臣辁臣뚊藦ꮁ雩鞁臣鎨럧銂迥醁臣芰雩뚮臣袂苣뮲駧궸臣뺯뇨銂賦馁胣릉껥꺁껥붖뷥讅臣꾁胣ꎂ胨꾁菣袃苦薀臣芁苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀苦薀臣貁苣袼뻤袁臣膀苨鎇駧뺁臣꾁뗧뢅鯧뢅駧覼臣립苦鞁臣蒁苣ꎂ胨ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†雨ꚭ髧ꮁ꣨릮臣貂苣骼胣겖귥蒚臣놨껥閁苣讂胣ꢁ臣蚁ꫨꖏ臣膀臥ꢅ臣뮌귥蒚裥궖臣蒯鯥薆臣膀郥蚐髧ꪁ裥誛볯농駩螎臣讦郥ꎁ臣膀臩ꚺ臣銯胦膀裥肿胣ꊂ菣ꮃ苣벃迥鲿胣뺁臣꾁믤꺁闥財苣鞁臣꾁郥떽韧貁臣辁胣銃菣誏臣開觧꺁뗧钹臣ꖎ꟨鞁臣뾽铧馁苣꺁臣ꦁ臣ꚁ臣讂賥袐觧膀鷦首胣蒵裦ꦉ迥뎁볯뺁臣꾁觥ꊽ苣螌臣袂臣ꮁ鳦躘듧뢛臣뾽铧閁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†雨ꚭ髧ꮁ꣨릮臣貂苣ꚳ뷥ꒉ볯겜飦내鯦ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥貀雨ꚭ髧ꮁ꣨릮臣貂苣ꚳ뷥ꒉ胣ꢁ臣蚁迥꾁胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣隌郥ꦉ믤隤臣뮻蓦꺁꟦邈ꛨꂴ볯设臣낁胣뮴胦隌郥ꦉ苣뢇뿦뺁臣꾁뫦ꎧ臣鞾苣鎃菣꾂菣覼臣芁臣ꚁ胣ꎂ胨ꮁ臣蒁臣膀껥ꪳ髧ꮁ蓧銯臣ꒁ鷩躂韧Ꞁ臣芁苣ꢁ臣蚁觧Ꞁ苣覜臣讂꟦邈ꛨꂴ苣螌臣芀돨ꊽ觥ꢁ臣ꚁ臣膀뻤袁臣骼믤肝飩ꊭ觥膀藩隌飩ꊭ觥膀뗧袐觥膀苣벃菣ꎂ菣낂觥膀鳥꺸諥ꒉ胣ꦴꏥꒉ胣늉듧袼鷧늉觥覼胣꺚蛨龻賥ꒉ胣뎹賥ꒉ胣薅ꇥꒉ볯貸蟩ꒉ볯膀菣ꎂ菣ꂃ뷥邈觥뺁臣꾁苣벃菣ꎂ菣낂觥膀ꛩ首胣뎊ꛩꒉ胣膵该莿胩ꒉ볯膵该鞢볥ꒉ볯膀뷦醻觥膀飩邅觥膀跥랈苣뎃苣膀郥躏觥膀蟦膿觥뺁臣꾁裥ꎕ觥膀铧뎑雦膀迥뎁냦貒냦貁賦銁苣貂뻥讂胣设ꓧ蒚臣ꚳ뷥ꒉ臣鞁臣꾁胣邙껥馁苣节臣ꞁ臣ꪁ臣貁胣ꖻ룤貁賦銁苣貂苣骼菣膃菣隌菣覃菣궂苣袃菣ꢂ菣袼볯ꢼ볯覼胣궂藩ꮂ菣랂苣ꂃ胣ꪃ菣뢅苣ꮃ苣Ꚃ菣袼뫤ꦡ鿥Ꞁ볯膀苣蚃苣ꪃ菣뢅苣ꮃ苣Ꚃ菣膀苣궃苣ꮂ菣ꆃ菣벃苣膀黦让菣ꪃ菣讃菣钃菣ꪃ菣뎃胣꾂苣뎃藩膀苣궃苣鶃菣覃菣膀苣릂菣ꒂ菣膀苣膃菣뮂菣궃菣릂胣벂菣膃菣膀菣覃菣궂苣鞃菣钃菣뮂菣궃菣릂胣銃菣궃苣랂菣궃菣ꮃ菣膃菣뮂菣궃菣릂胣ꦃ苣袃菣릂胣릂菣ꊂ菣뎃藩麃苣趃苣Ꚃ菣膀菣ꮃ菣袃菣ꮃ胣麃菣讃菣벃菣膀菣膃苣讃菣膀菣膃菣뮂菣궃菣릂胣ꆃ菣ꮃ菣ꦃ菣뎃胣꺾뗧뚙胦뮂菣궃菣릂胣��鶃菣ꢂ菣것菣낂菣뎂菣ꮃ胣鶃菣鎃菣ꮃ菣궃菣覃菣膀菣鎃菣뎃胣ꊂ菣閃苣隌菣뎃菣뎃胣鞃菣钃菣醃菣馃菣膀菣膃菣ꮃ菣ꮃ菣蚃菣袃胣랂苣ꦃ菣꾂胣貺藩隌苣ꒂ듧膀苣ꮃ菣궂苣ꆃ菣ꮃ苣ꮃ菣벃苣誃菣ꪃ苣ꂃ胣꾂苣뎃藩誃菣ꪃ苣ꂃ胣誃菣ꪃ苣ꂃ苣ꪃ苣벃菣뢅菣뎃菣뎃胣붂菣鎃菣벃菣膀菣뎃菣뎃볯袃苣ꊃ菣뎂苣覼胣릂菣ꊂ菣뎃藩膀苣꾂菣벃苣膀苣ꮃ苣膀뫤뢅賥膃苣뎃胣鎃苣龃菣ꆼ胣鎃苣龃菣ꖼ胣鎃苣龃菣ꎼ胣誏臣궂苣ꪃ菣벃菣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 겖귥蒚臣놨껥閁苣讂ꇥ骼鳦躘듧뢛臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣貀雨ꚭ髧ꮁ꣨릮臣貂苣ꦡ胣ꢁ臣膀韦颭臣뢅臣龁臣ꦡ鿥ꢃ裥銂臣꺁ꇥꊽ藦ꮁꓥ鮏臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ볯设臣낁胣誁鯩꺁ꇥ몟鿥ꢁ臩螈臣覜ꧦ뢅臣銂迥鲿臣鮁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣覼ꛨ隌郥ꦉ臣꺿ꏩ閁苣讂雩몤臣貂臣隌郥ꦉ臣颪냥鎽苣螌臣芀雨ꚭ髧ꮁ꣨릮臣貂苣ꦡ臣设臣鞁臣꾁胣邙껥馁苣节臣ꞁ臣ꪁ臣貁胣ꊂ菣뎃臣ꦁ臣ꦡ鿥Ꞁ껦몟臣ꆄꧦ뢅ꇥ뺁臣꾁鳦龩藩ꦡ볯ꮂ菣鲃菣뢅臣ꦁ臣뢅胦议鿥꺁苣ꮃ苣ꪃ臣龁臣覜ꧦꦡ볯ꪁ臣貁賦銁苣貂苣芀믤ꢡ髧ꪁ藩颻諥ꦡ臣鞁臣꾁胣ꊅ藩ꦡ胣ꊅ藩膀苣뢂菣뎃藩ꦡ胣ꊂ菣꺂菣뢅ꇥ膀苣릂苣ꮃ菣뎃藩ꦡ胣ꊂ苣醃菣꺂菣뢅ꇥ膀菣뎃苣뎃苣ꮃ菣뎃藩ꦡ胣馃菣벂菣릂菣鮃菣뢅胣覮臦馦藩ꦡ胣趇ꇧ뢅ꇥ膀菣Ꚃ藩ꦡ胣ꪅ藩ꦡ胣랂菣Ꚃ菣Ꚃ藩ꦡ胣ꮂ菣閃苣벃苣ꮃ菣뎃藩ꦡ胣꾂苣뎃藩ꦡ胣랂苣궃菣뎃苣뎃菣궃菣ꪂ菣뢅ꇥ膀苣낂菣뎂菣뢅ꇥ膀菣螃苣ꮃ苣ꮃ菣뎃藩ꦡ胣ꢂ苣뎃苣ꮃ菣뎃藩ꦡ胣閃菣ꮃ藩ꦡ胣낂菣뎂菣鞃菣뎃藩ꦡ胣낂菣뮂菣ꪃ菣뢅ꇥ膀菣龃ꇧ뢅ꇥ膀菣鞃菣뎃藩ꦡ胣颃苣떂菣뢅ꇥ膀蟨隌냦ꂴ藩ꦡ胣ꦡ藩ꦡ胣ꢃ苣隌냦ꂴ藩ꦡ胣銼裢銃菣궃苣랂裢ꢂ苣뎃苣ꮃ菣뎃藩ꦡ胣ꦃ苣袃菣ꪂ菣뢅ꇥ膀매뢅ꇥ膀菣Ꚃ菣뎃藩ꦡ胣ꦃ苣ꪃ菣ꮡ藩ꦡ胣ꪃ菣뒂藩ꦡ胣麃菣ꒂ菣뢅ꇥ膀菣궃菣뢅ꇥ膀菣뾂菣릂菣鮃菣뢅ꇥ膀볯銈菣閃苣것菣릂菣鮃菣뢅ꇥ膀菣뎂菣뎃藩ꦡ胣鶡藩ꦡ胣ꪂ菣ꒂ菣뢅ꇥ膀苣ꖃ苣뢅ꇥ膀菣ꮃ菣膃菣뢅ꇥ膀菣ꊃ藩ꦡ胣骃苣膃菣뢅ꇥ膀臩ꮡ藩ꦡ胣鎼裢閃苣讃菣鞃菣钃苣뎃藩ꦡ胣ꪃ菣뢅ꇥ膀菣꾂菣뎃藩ꦡ胣钃菣ꮃ藩ꦡ胣鞃菣钃苣뎃藩ꦡ胣릂菣ꊂ菣뎃藩ꦡ胣뎂菣꾂藩ꦡ胣ꮡ藩ꦡ胣銅鿧뢅ꇥ膀菣ꪂ苣ꊂ菣뢅ꇥ膀菣ꮃ苣뎃苣ꮃ菣뎃藩ꦡ胣Ꚃ菣螃苣뎃藩ꦡ胣覐跨뢅ꇥꪁ臣貁賦銁苣貂苣芀믤ꢡ髧ꪁ苣ꮃ苣ꪃ蟩麱ꇥ뺁臣꾁苣ꮃ苣ꪃ鳥麡蟩麱ꇥꢁ臣ꚁ臣膀菣��袃菣Ꚃ菣ꦡ胣ꪃ菣Ꚃ菣ꦡ胣ꮂ菣Ꚃ菣ꦡ胣ꮂ菣랂苣ꂃꇥ膀菣낂菣랂苣ꂃꇥꪁ臣膀臣覂臣ꮁ蓧銯胦ꊂ菣ꊃ菣Ꚃ菣ꦡ胣견鯥骴苣뎃菣讃苣ꂃꇥ誏臣ꊂ菣뎃苣膃苣뎃臣ꦡ臣馌臣覂苣膀臣貂苣ꮁ臣膀駩骮臣讂苣꺁臣꾁臣蒁臣膀苣뎃菣讃苣ꂃ胣蚃菣ꦃ菣膃菣ꊂ菣ꊃ菣Ꚃ菣膀菣袃菣ꢂ菣ꮃ苣뎃菣讃苣ꂃ胣ꆃ菣ꮃ苣龃菣膀苣ꆃ菣ꮃ苣龃菣膀菣ꪃ菣膃菣ꊂ菣뎃胣袃菣ꢂ菣ꮃ苣龃菣膀苣膃菣ꊂ菣뎃臣ꦁ臣ꦡ苣ꮐ苣芀鳦讖ꓧ꺁雨ꚭ髧ꮁ꣨릮臣貂苣ꦡ臣鞁臣꾁胣设臣낁胣ꆄ꿦Ꞁ臣ꆄꧦ뺁臣꾁鳦龩臣뢅臣覂뷥邈臣貂臣ꪦ賥袐觧꺁뻥ꖝ臣ꆄ꿦Ꞁ臣ꦡ臣馌臣覂苣讂胣겜雩몤臣겖귥蒚臣놨껥閁苣讂ꇥ꾁胣ꦡ鿥Ꞁ菩蚈臣龁臣뢅胦ꢃ裥銂郥肂ꛨ隌郥ꦉ臣覂胣鎾鷦꺁賥ꚭ髧릖돦ꮁ苣ꎁ臣袐裦閁苣鞾苣芀룤겈臣膀臣꺁苣蚁臣ꦡ臣膀臣貂苣꺁賥袐觧꺁臩ꊛ藩뺁臣꾁ꇥ몟뷥讅苣隌귥辇ꯨ蒚蟩꺁臩鎽臣ꦡ鿥뺁臣꾁藩ꢁ胣뒰룤节臣辁臣覜ꧦ뚺ꫥ궸胣뺁臣꾁臣꺁볯ꒁ臣랷郥ꦉ룤ꞁ迥鲿臣鮁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣뾪ꏨ閁苣鞾苣袼룤겈臣膀苣벃菣ꮃ胣ꊅ藩ꢂ菣ꮃ胣ꢂ苣躃菣ꮃ胣ꒂ苣鞃菣醃菣벃菣膀臣龁臣ꊂ苣袃菣袃菣ꮃ臣袂臣ꪁ鷩뒰胦銪뷤貁ꗥ뺁臣蒁볯芀臩螈臣ꦡ臣鞈賦꾁胣늼뷯趽뷯躽뷯钽뷯躽胢鎽†볯袽뷯銽뷯膽뷯薽뷯钽뷯莽뷯貽†볯莽뷯薽뷯莽뷯鎽볯醼볯钽뷯₈薽뷯躼볯궼뷯莽뷯₋낼뷯芽뷯覽뷯袽뷯躽뷯₇ꎼ뷯趽뷯膽뷯馽볯ꖼ뷯鎽뷯辽뷯貼볯膽볯貼볯馼볯閼볯邽볯醼볯醼볯貼볯袽뷯銽뷯膽뷯薽뷯钽뷯莽뷯貽†볯膽뷯钽뷯骼볯銽뷯邽뷯銽뷯覽뷯鎽볯뎼뷯貽뷯莽뷯覽뷯躽볯膽뷯蒽†볯鎽뷯貼볯躼볯躼볯钽뷯袽뷯₌膽뷯蒽†볯躼볯躼볯薽뷯趽뷯钽뷯袼뷯蒽뷯躼볯貼볯覽뷯薽뷯銈볯ꎼ볯貼볯邼볯颼胣誏臣ꊼ뷯銽뷯薽†뷯钽†뷯貽볯貼볯辽뷯銽뷯膽뷯₌辽뷯₆낼뷯膽뷯趽뷯莽뷯閽뷯覽뷯膽뷯₌뎼뷯覽뷯躽뷯薽볯隼볯貼볯銈볯馼볯醼볯鞼볯覼볯鶁臣蒐胣貁臣꺁藥鎽臣芏藧ꮁ苣ꎁ臣겜飦내鯦ꮁ뗧뾁뻨뺁苣讂볯ꮁꛨ몇臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 鶃菣骃菣膃菣骼鳦躘듧뢛룤ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀胣鶃菣骃菣膃菣趀臣龁臣貀鯧蒚臣鶃菣骃菣膃菣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣ꦤ蓧ꮁ볯设臣낁胣颍鯩뺁臣꾁닧붣臣貂볯뺁臣꾁郥邈臣袂臣ꚁ铧龔臣貂뻥讂菣鞃菣覃뗧袐臣袂臣ꚁ藥讞髧ꮁ胩邵臣貂苣ꊂ菣躃藩议鿥꺁菣ꪃ菣벃苣螌臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 讖꟥趉ꓨ袐뷤袼볯ꦼ볯覼볯겜飦내鯦궸臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣貀雩��觥螤郥鎽胣ꢁ臣蚁铧麪볯芁苣蒁臣貀볯鎼볯讖꟥趉ꓨ袐뷤趀볯貀볯ꦼ볯趀臣ꖕ臣貂苣覼臣膀볯邼볯ꪃ菣붂菣ꂃ苣隃菣讃菣袃胣龜ꃦ龔觧讖꟥ꂛ귥袼뷯ꦼ볯醼胣薽볯ꚼ볯ꆼ胣薽볯ꚼ볯膀뷯ꦼ볯閼볯膀迥뎁뷯ꦼ볯銼裢Ꞽ볯낼裢궼뷯钽裢钽볯꺼볯㲡畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲉猯扵㰾畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯薽뷯㲔猯灵覸藥螤郥鎽볯鎁苣꾁鳦ꪳ髧ꮁ뷯늼볯ꆼ裥邭臣閼胢궂菣莃菣ꮁ뗧袐臣鞾胣鶁臣ꚁ뗧袐뻥ꮁ볯馀볯뒼볯꺁菣鲃苣벃菣릂苣ꎃ菣뎃苣銂ꇨ蒁뻥讂볯銂郥肂菣鲃ꃦ뾂菣醃苣ꪳꓨ袐뷤銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†볯꺼볯ꢂ菣ꆃ菣袃볯겜飦내鯦궸臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣貀볯꺼볯ꢂ菣ꆃ菣袃胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀铧ꦉ귥蒚ꧦ붃苣邏뻤馁苣讁胣誏臣込臣龁臣龔觧ꚭ髧뮴胦袼뻤袁臣膀뿧뎨ꫨ肯듦Ꞁ볯銂鳦馁苣늼볯ꆼ裥邭臣ꢃ裥膀雦螉胣뺁臣꾁苣낂菣뎃菣銂賦馁胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣节臣ꪁ臣꺁볯ꒁ믤誸臣늼볯ꆼ苣것菣뎃菣꺁뗧뾁뻨뾁臣袂苣鶃菣貃苣것苣膃菣꺁뿤뺣臣膀뿤뺣臣貂臣鶃菣貃苣것苣膃菣ꮁ볯ꒁ믤誸臣鮜臣鞁臣龩菨蒚觧Ꞁ苣邏뻤馁苣芀鳦躘듧뢛臣風볨꺁볯꺼볯ꢂ菣ꆃ菣袃臣膀ꓥ뚄臣颭鳥馁苣节臣ꞁ臣ꎁ臣节胣ꦤ蓧ꮁ귥ꢜ臣ꪁ臣节臣ꞁ臣ꎁ臣节胣袐裦ꞁ臣ꎁ臣节胣몁볤邭鏦鲽臣芁臣ꚁ苣膀臣龁臣鶁苣覂臣뮻蓦꺁뗧뾁郥辂臣ꞁ臣ꎁ臣节苣蒁胣设臣낁胣뾪꿧뮴胦銂迦鮾臣讂ꓥ뚄臣颭鳥馁苣늼볯ꆼ苣것菣뎃菣ꢁ臣ꚁ臣膀苣ꒂ菣릂胣龎ꃦ龔觧誏臣龜ꃦ龔觧袼뻤袁臣膀菣袃볯꺁菣ꦃ菣릂苣ꪃ菣袃菣ꂃ藥鎽臣讦苣貂苣ꢂ菣ꆃ菣袃臣馌臣覂苣讂胣늼볯ꆼ苣것菣뎃菣膀觧ꮁ鳧뢠铧ꦉ뷯늼볯ꆼ迥뎁뿧뎨臣貂臣Ꚃ苣ꮃ苣늼볯ꆼ臣膀듧麃蛥꺁ꓥ辁臣龩菨銂ꫥ讻臣讂臣ꢁ臣ꊖ룤鞁臣蒁苣鎁臣貁ꓧ閁苣ꚁ臣讂胣设ꓧ蒚臣ꦤ蓧꺁볯꺼볯ꢂ菣ꆃ菣袃臣鞁臣꾁胣邙껥馁苣节臣ꞁ臣ꪁ臣貁胣뮿꣨讖꟥ꢂ菣ꆃ菣袃볯设臣낁胣薆菩ꪃ菣붂菣ꂃ胩ꖅ菩趽볯ꦼ볯ꖼ볯覼胣ꮼ뷯薽뷯钽†뷯钽†뷯貽볯貼볯銼볯邼볯覼볯꺼볯鞼볯銼볯骼볯馼볯鲀볯邼볯銂迥ꞅ볯膀뿧뎨苣뎃菣뎃苣벃苣것菣뎃菣袼뻤袁臣膀볯낼볯₰趽볯꺼볯뮿꣨ꢂ菣较菣떂菣ꢂ菣ꆃ菣袃胣늼뷯螽뷯銽뷯ₓ薽뷯ₔ膽뷯躼볯袼볯馼볯馼볯ꪼ†볯覽뷯貽†볯袽뷯趽†볯鞼볯袼볯邼볯骼볯钼볯醼裢隼볯鎼볯銂迥ꞅ臣鎁臣覼胣趽볯꺼볯覮껥Ꞁ苣것菣뎃菣袼뻤袁臣膀볯떼菣莃菣ꢂ菣ꆃ菣袃볯ꆼ볯ꖼ볯膀볯膽뷯躽뷯膽뷯ₕ薽뷯ₔ膽뷯躼볯袼��邼볯鞼볯꺼뷯钽†볯薽뷯ₖ궼뷯貽†볯薽뷯貽†볯覽뷯貽†볯袼볯覼볯醼볯鎼裢醼볯隼苣芏藧꺁臣ꢁ볯膀뿧뎨諦뚈苣것菣뎃菣袼뻤袁臣膀볯貽뷯趽뷯銽†뷯钽†뷯貽볯貼볯銼볯邼볯覼볯薽뷯袽†볯薽뷯醼볯邼볯醼裢銼볯骼볯鞼裢醼볯銼苣芏藧꺁臣ꢁ볯膀苣뎃菣꾂돨邵郥늼볯ꆼ苣것菣뎃菣袼뻤袁臣膀觩鲿귧ꢂ菣ꆃ菣袃胣뎼뷯貽뷯骽뷯薽뷯膽†뷯钽†뷯貽볯貼볯銼볯醼볯覼볯₪궼뷯貽†볯覽뷯貽†볯銼볯袼볯颼볯骼볯鎼볯醼裢鎼볯醼볯銂迥ꞅ臣鎁臣覼胣내菨ꪳ菣ꪃ苣螃菣ꮃ賥ꢂ菣ꆃ菣袃볯뚼뷯貽뷯膽뷯芽뷯₁薽뷯ₔ膽뷯躼볯袼볯邼볯醼볯ꎼ뷯銽뷯ₒ꾼뷯覽뷯₎Ꞽ뷯躽뷯钽†볯薽뷯ₖ銼볯袼볯覼볯钼볯銼裢钼볯鞼볯膀迥뎁꟨銪胦늼볯ꆼ苣것菣뎃菣袼뻤袁臣膀菣鲃苣ꒂ菣膀볯莽뷯钽뷯ₔ薽뷯ₔ膽뷯躼볯袼볯邼볯馼볯ꊼ뷯辽뷯袽뷯趽†볯覽뷯邽뷯馽뷯ₓꆼ뷯钽뷯₁醼볯颼볯袼볯銈볯邼볯骼볯鎼볯銈볯钼볯銂迥ꞅ臣鎁臣覼臣馌臣覂苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†믦馕駦鎖볯겜飦내鯦ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀胣麻闧芙雩趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣趽볯꺼볯蚈귥ꮁ닦ꎁ臣ꖈ胣꺁뷤꺽臣龁臣뒠触ꞁ臣讖꟥趉ꓨ袐뷤袼볯ꦼ볯覼臣龁臣ꪃ菣붂菣ꂃ臣ꂍ鳦芙雩銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†꿥ꆱ볯겜飦내鯦궸臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣貀꿥ꆱ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀뻤袁臣膀껥鎨髧膀꣨궖髧膀뫤늘髧誏臣込臣龁臣뮲駧蒚鯧蒚臣龁苣ꮁ胣겜雩몤臣袂苣蒵裦ꦉ臣閊룤閁苣鞾苣뮻蓦꺁铧ꦉ苣螌臣芀藥讞髧ꪁ꿥ꆱ臣開觧袼뻤袁臣膀菣Ꚃ苣膀菣莃菣膀苣떂苣膀鷩銃菣誜闩麡胣誏臣銃菣ꪁ臣꺁鏥뎹该ꦉ볯誏臣込臣龁臣趤觧銂郥肂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣뺯뇨꾁苦薀臣芁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 龮돨蒚臣骼鳦躘듧뢛臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣貀껥ꪳ髧ꮁ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀鯧蒚臣芁苣릉뻥뺁臣꾁觧Ꞁ臣ꢅ뷤蒚臣龁臣뮁臣ꢅ뷤蒚臣ꚺ郥节臣辁臣讨뫥銂ꓧ馁껥Ꞁ髧뚊藦銂賦馁胣龔觧ꚭ髧蚈蟩꺁뷥궥胨꾁胣龔觧ꚭ髧誏臣隌귥蒚迧ꆱ臣膀껥邈臣讂臣ꞁ胩財臣讂臣膀迥뎁볯뺁臣꾁껥ꢅ臣ꪁ苣讁胣뺁臣꾁뗧뺯髧ꪁ뗧鲞苣钁裦节臣辁臣麛臩馁苣뒠郥貁臣ꎁ臣节胣膂臣龁臣ꪁ臣鎁臣銂郧ꎧ臣讂臣芁苣蚁胣鞁臣貁臣ꚁ胣貀껥ꪳ髧ꮁ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀ꓥ辁臣龔觧ꚭ髧誏臣隌귥蒚迧ꆱ臣몛鳦꺁껥ꢅ胦꺁뷦ꢜ髧ꪁ곦芦苣覍臣讂臣膂臣겜飦내鯦ꞁ뷤ꢔ臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 립苦鞁臣蒁苣骼��ꎂ胣鲚껥膀迥뎁볯뺁臣꾁韧讅臣貀뷧ꎂ臣ꚁ臣讂胣讀뷤꾁胣뺖苦膀髩뎮胣誏臣込臣龁臣薗藦꺁볯ꒁ믤誸臣螗諧ꢁ꣨궖臣貂臣蒁苣讁胣뺁臣꾁臣貂苣꺁韧뚊苣몤臣ꚁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†꣦蒚賥ꢃ裥骼鳦躘듧뢛臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣貀꣦蒚賥ꢃ裥趀臣꾁胣誃菣銲귥銂觧骮臣내菨膀뗧钹胣誏臣込臣龁臣ꢙ껥讞臣馨髧隌臣鞾苣隌郥ꦉ臣龁臣겖觥ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†닦芙觥骼胣뮲駧ꒉ胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀꿥ꆱ臣閊룤鞁臣ꢁ臣ꮁ胣뮲駧蒚胣모雦蒚胣誏臣込苣鞁臣꾁뫤늘髧릊黦銂鳦馁苣讁胣ꪁ苣뎁臣込臣龁臣肉鳦꺁铧ꦉ귥蒚諥鲞迥뎁볯节臣辁臣겖郧ꚭ髧릊黦銂볥趁蟥馁믤辄臣겖觥銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃볯겜飦내鯦궸臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣貀菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀꣧袼뻤袁臣膀뷯늼볯ꆼ臣ꦁ臣鶃菣貃苣것苣膃菣覼苣내菨ꮁ냥ꖅ臣讂臣膂臣릖돦銂臣蚁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†뿧뎨ꫨ肯듦Ꞁ볯겜飦내鯦궸臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣貀뿧뎨ꫨ肯듦Ꞁ胣ꢁ臣蚁铧麪볯貀뿧뎨ꫨ肯ꧦ붃胣ꢁ뫤鮏迥붃臣뾽铧閁苣讂볯꾁胣낼볯ꎼ迥뎁볯뺁臣꾁菣鲃苣벃菣꺁듦Ꞁ苣ꮐ苣뮿꣨薣뷧꺁듦Ꞁ苣뾪꿧馁苣袼뻤袁臣膀ꫨ肯臣讂胣놽鿩馁苣膀裥ꆾ臣讂胣覤賥閁臣讂볯龔觧ꚭ髧ꪁꧦ붃胣龩꟦膀臣龁臣鞃菣뮂苣銂賦馁胣蒁臣ꒁ臣꺁藦颧臣꾁胣肉鳦꺁뿧뎨ꫨ肯듦Ꞁ臣膀뷯늼볯ꆼ뿧뎨臣뮿꣨ꂿ껥ꚺ苣莿胩誏臣込臣龁臣鞢볥馁苣芀臣辁臣讁臣讅꟦ꞁ臣膀触鮜臣뮿꣨뾪꿧뮴胦꾁胣ꪃ菣궂菣릂苣ꎃ菣뎃苣銂뷤鮸迥뎁볯뺁臣꾁飩뎮臣讂胣뺯뇨骼鳦躘듧뢛룤ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀胣뺯뇨趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣设臣낁胣龮꣩蒚胣모雦蒚胣袺飩蒚迥뎁볯뺁臣꾁닦芙髧ꪁ鯧蒚臣龁苣ꮁ胣겜雩몤臣袂苣蒵裦ꦉ臣閊룤閁苣鞾苣뮻蓦꺁铧ꦉ苣螌臣芀藥讞髧ꪁ꿥ꆱ臣鞁臣꾁该ꦉ볯设臣낁胣麃苣릂胣ꦃ菣袃胣Ꚃ苣꺂胣麝菣袃鳩랕ꇩ膀迥뎁菣袃臣ꦁ臣몓매開觧覼迥뎁볯뺁臣꾁ꓦꦉ臣馌臣覂苣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣뺯뇨꾁苦薀臣芁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 뮲駧骼鳦躘듧뢛臣뾽铧閁苣讂ꃥ袐胣貀蟥꺽臣讂胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀觧骮臣龄鿦膀雧ꎂ胣鲚껥膀迥뎁볯뺁臣꾁韧讅臣醼臣ꖻ룤꺁韧뚊臣龁臣릉뻥銂胣ꢃ裥蒚臣龁臣貮藥ꮁ럧貒胣붻룦膀铦蒖胣醕룦膀駧螗臣薁믥膀胩財臣醊裥膀蟩螗뫥꺁뷤许胣誏臣込臣龁��鶁臣뮠뫥꺁뷤鮸苣螌臣芀뻤袁臣膀臣鎂苣貀蟥꺽臣讂胣ꢁ臣膀藨趘臣龔귥膀裦랕胣誏臣込臣龁臣ꆋꓥ銂飩뎮臣讂臣ꢁ苣螌臣뒠郥貁臣讂胣뺖苦膀髩뎮胣誏臣込臣龁臣薗藦ꮁ雩ꎀ臣讂韧蚐臣몙韧꺁跥몙胦銂룦醰臣鮁苣꺛髧ꞁ胣뺖苦膀髩뎮胣誏臣込臣龁臣薗藦꺁뻥馀苣몤臣ꪁ臣뺯뇨ꮁ꿥鞁臣膀迥뎁볯뺁臣꾁雧ꎂ胣鲚껥膀迥뎁볯뺁臣꾁韧讅臣鶈鳦蚅胥꺁臣銂ꓧ馁꿥ꆱ臣뺯臣ꚁ胣ꚇ뷧銂雦鞁臣节苣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†뫤늘볯겜飦내鯦ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀胣袺飩馁苣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣릉껥꺁蓦鎟胣뺖苦膀髩뎮胣誏臣込臣龁臣薗藦꺁볯ꒁ믤誸臣螗諧뺁臣꾁觧뒾臣몙韧銂菩蚈髧뺁臣꾁껥ꢅ臣뮘껥馁苣鎁臣銂賦馁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†藨趘볯겜飦내鯦ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀胣ꮅ飧趀臣꾁胣꾉胦뺁臣꾁苦Ꞁ臣讁臣辂苣骁胣蒵맧꺁闧뢸臣鞢껦ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†鳦꺿ꏩ骼鳦躘듧뢛룤ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀胣ꪜ뿤뺣胣ꢁ臣膀뷤覂臣꺁뷥ꞁꓥ뒛臣貂苣趉臣뮻蓦꺁觧ꪳ胣隌郥ꦉ臣龁臣蚈귥銂賦馁胣ꪜ뿤뺣臣꾁胣薿臣鞁苣鶁臣ꢁ臣邙苣ꪁ臣貁胣躇铧讞臣龁臣ꦤ蓧讞臣龔뷤蚈귥銂賦馁臣ꢁ臣芁苣芀裥邭臣肸胩꺁뿤뺣苣鞏臣ꚁ苣袂臣膀臣貂臣袂苣蒐뿤뺣裥邭臣膀臣꺁뻥꺁뿤뺣臣龁苣꺁胣ꪜ뿤뺣胣몇駧蚈귥ꢁ臣ꚁ뷥讫臣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 Ꚃ菣뢂菣ꮐ鳦辇볯貀苣ꪃ苣뎃郥覜蟩趀臣龁臣貀苣ꦃ苣ꮃ郥覜蟩趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁뫤鮏髧ꞁ臣誂胣릉껥꺁ꃦ뢅藩鞈룤ꮁ귥ꢜ臣讂苣ꦃ苣ꮃ臣龁臣Ꚃ菣뢂菣꺁蟩銂賦馁胣Ꚃ菣뢂菣ꮐ鳦辇臣龁臣Ꚃ菣랂菣ꮐ鳦辇臣膀뗧뺯胥袼藩鞈룤꺁苣ꪃ苣뎃臣龁臣Ꚃ菣랂菣꺁럧낕볯뺁臣꾁鯧뺯胥袼ꃦ뢅藩鞈룤꺁ꃦ뢅ꇥ몟臣辷闦ꮁ꿥馁苣Ꚃ菣뢂菣뺁臣꾁苣ꦃ苣ꮃ臣늉郥覼臣鞁臣ꢡ臣貂뻥讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†苣ꪃ苣뎃뿤뺣藩鞈볯貀苣ꪃ苣뎃뿤뺣藩鞈胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀胥鲣ꃦ뢅藩鞈臣Ꚃ菣뢂菣ꮐ鳦辇迥뎁볯뺁臣꾁苣ꪃ苣뎃菣뾂菣뎃臣ꊖ臣ꚁ胣낕臣讂藥鎽苣鞁臣꾁뇥肉苣ꪃ苣뎃郥覜蟩袼苣誂ꯩ蒁臣龁臣袂苣躽臣Ꚃ菣뢂菣ꮐ鳦辇볯銂鳦馁苣讁胣뺁臣꾁闧ꪁ苣Ꚃ菣뢂菣醃苣벃菣袼뻤袁臣膀该超裥莸臣龁臣꾂菣릂苣ꪃ菣낂볯銂鳦馁苣超裥肜臩隌ꃦ뢅볯设臣낁胣袐裦趽볯꺼볯超裥覼苣螌臣芀鳦讖ꓧ꺁蛥릮臣誁臣ꚁ胣貀苣ꪃ苣뎃뿤뺣藩鞈胣誏臣貀苣ꦃ苣ꮃ뿤뺣藩鞈胣ꢁ臣蚁铧麪臣膀郥覭��芁苣銺迦蒚臣芁苣ꢁꛨꪁ臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 貀ꯩꚂ菣뢂菣뎂菣뎃胣ꢁ臣膀볯ꒁ臣龁臣鎼臣꺁苣ꪃ苣뎃苣ꮐ苣뎂菣뎃臣鞁臣骮뻧閁苣膀胣躽苣ꪃ苣뎃苣覃菣趀臣꾁胣醼臣꺁苣ꪃ苣뎃苣ꮐ苣뎂菣뎃臣鞁臣骮뻧閁苣膀胣ꆄ苣ꪃ苣뎃苣覃菣趀臣꾁胣Ꚃ菣뢂菣銂郥뺁臣蒁苣覃菣ꞁ臣讂胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣Ꚃ菣뢂菣꺿ꏩ超裥꾁胣躽苣ꪃ苣뎃苣覃菣ꮁ苣讂ꯩꚂ菣뢂菣뎂菣뎃臣꺽迦膀蓧Ꚃ菣뢂菣뎂菣뎃臣袂苣颫苣ꪃ苣뎃苣覃菣꺁뷧鮏胣颫苣ꪃ苣뎃苣覃菣ꮁ苣讂뷤Ꚃ菣뢂菣뎂菣뎃臣꺽迦膀蓧Ꚃ菣뢂菣뎂菣뎃臣袂苣躽苣ꪃ苣뎃苣覃菣꺁뷧鮏胣躽苣ꪃ苣뎃苣覃菣ꮁ苣讂蓧Ꚃ菣뢂菣뎂菣뎃臣꺽迦膀ꯩꚂ菣뢂菣뎂菣뎃臣袂苣ꆄ苣ꪃ苣뎃苣覃菣꺁뷧鮏胣誏臣鶁苣覂臣蒵臣袐苣鮁苣ꮐ苣芀臣辁臣讁臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀ꯩꚂ菣뢂菣뎂菣뎃臣ꖈ臣颫苣ꪃ苣뎃苣覃菣ꞁ뷧趁迦袁臣节苣蒁胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣躽苣ꪃ苣뎃苣覃菣꾁胣ꖈ臣躽苣ꪃ苣뎃苣覃菣ꞁ뷧趁迦袁臣节苣蒁胣蒁臣ꒁ臣꺁껥붖뷥讅臣꾁胣ꆄ苣ꪃ苣뎃苣覃菣꾁裥꺁蓧Ꚃ菣뢂菣뎂菣뎃臣꺽臣鮏臣覂苣ꚁ苣袂臣芀苣ꪃ苣뎃뿤뺣藩鞈臣膀苣ꪃ苣뎃꿥隌臣貂臣节胣뺁臣꾁苣ꪃ苣뎃룥蒖賥閁苣ꚁ苣袂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 Ꚃ菣뢂菣貯賥骼鳦躘듧뢛룤ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀胣Ꚃ菣뢂菣貯賥趀臣蒁臣ꢔꫨ誏臣螖돦蒚ꓥꊽ臣膀꿥鲿臣讂胥鲣ꃦ뢅藩鞈臣Ꚃ菣뢂菣ꮐ蟩ꮁ雩鞁臣膀藩鞈鳦ꦁ賥뢠藩袼뻤袁臣膀郥邈뷯늼볯ꆼ藩鞈볯궸臣Ꚃ菣뢂菣ꮐ鳦辇臣鞢ꓥ袼뗧뺯胥뺁臣꾁觥袐胥ꢁ臣ꚁꇨ閁苣讂볯銂賦馁胣Ꚃ菣뢂菣貯賥꾁胣馀ꏨ뢠藩超裥궸臣뎂菣뎃苣膀郥鎂臣蒁苣Ꚃ菣뢂菣뢠藩ꦡ鿥貁냥ꪁ臣貐뻧뎂菣뎃臣꺽迦馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣龮雦閁苣鞾苣芀苣ꪃ苣뎃꿥隌臣膀藥鎽髧袼臣ꪁ苣ꆁ胣馀ꏨ뢠藩超裥꺁藥랕臣뺯臣ꚁ볯ꞁ臣ꎁ臣节胣뺁臣꾁뇥肉髧袼臣ꪁ苣ꆁ胣馀ꏨ뢠藩超裥꺁菩蚈藩鞈臣龁臣颠鿥ꮁ꿥鞁臣覼臣芁臣ꚁ苣袂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 Ꚃ菣뢂菣貸雨隌볯겜飦내鯦ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀胣Ꚃ菣뢂菣貸雨隌胣ꢁ臣蚁铧麪迥뎁雦閳룤꺁ꓥꊽ臣膀꿥鲿臣讂胥鲣ꃦ뢅藩鞈臣Ꚃ菣뢂菣ꮐ蟩ꮁ雩鞁臣膀藩鞈鳦ꦁ賥뢠藩袼뻤袁臣膀郥邈뷯늼볯ꆼ藩鞈볯궸臣Ꚃ菣뢂菣ꮐ鳦辇臣鮸냥袼뗧뺯胥뺁臣꾁觥袐胥ꢁ臣ꚁꇨ閁苣讂볯銂賦馁胣Ꚃ菣뢂菣貸雨隌臣膀胥鲣ꃦ뢅藩鞈룤꺁苣覃菣銂胣ꮐ苣ꞁ臣讂��ꪃ苣뎃ꃦ뢅ꇥ몟臣醰臣蒁郥ꦾ苣覃菣ꞁ뷧鮏臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ껥붖臣貂뻥讂胣Ꚃ菣뢂菣貸雨隌臣膀藥鎽髧袼臣ꪁ苣ꆁ胣馀ꏨ뢠藩超裥꺁藥랕臣뺯臣ꚁ볯ꞁ臣ꎁ臣节胣뺁臣꾁뇥肉髧袼臣ꪁ苣ꆁ胣馀ꏨ뢠藩超裥꺁菩蚈藩鞈臣龁臣颠鿥ꮁ꿥鞁臣覼臣芁臣ꚁ苣袂臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 覭뻤ꦉ迥뎁꿧늛戼㹲 鎽ꗦ薀臣芁苣낁胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣讖ꓧꮁ苣讂藥鎽髧ꪁ껥붖뷥讅臣뺯臣讂ꓥ辁臣覭뻤ꦉ苣趪귨馁苣讁胣뺁臣꾁胩뢸臣龮꣩꺁臣銂铧蒁臣몢ꫨ鞁뻥讂臣芁苣蚁胣겜雩몤臣蒯鯥꾁胣ꖻ룤꺁ꫨ躘臣邙껥閁苣讂臣ꢁ苣辄鯥馁苣节臣ꞁ臣ꪁ臣膀苣鞁苣뮷믤꺁觧놨ꯨ花臣蒯鯥ꮁ꣨覼臣ꢁ臣誂臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 릉꣨讫뇦꺁꿧늛臣誁臣ꚁ胣貀볯ꒁ臣膀臣讂볯膽胣膽뷯覼胣膀迥뎁胣鎁臣膀臣꺁볯钽뷯薽볯趀臣ꦁ臣ꂆꧨ꾁胣趏꿥꺁賦몤臣ꪁ臣邙苣膀臣龁臣螖蓨讁苣躘苣讁臣ꪁ臣邙苣膀볯ꒁ臣龁臣銼臣ꖻ룤銂蓦뎑臣鞾苣芀볯ꒁ胣銼臣ꖻ룤膀臣龁臣ꢅ臣꺁苣ꮃ菣鞃菣뎃菣벃臣膀迥뺯臣螌ꓧ貁臣蒁駩誂胣鶁臣ꞁ臣醁苣낁臣꺁雦袄臣覂飦覂臣ꞁ臣蒁駩誂胣肉껥꺁铧邈觧뺁臣꾁菣궃苣릂臣颭鳥馁苣讁胣뾽铧閁苣讂臣膀臣龁臣鶁臣ꞁ臣醁苣낁雩ꎀ臣芁苣뒠郥膀苣ꮃ菣鞃臣醼臣ꖻ룤꺁菣뎃菣벃雩ꮁ胣뺁臣꾁胣銂郥肂ꯨ花ꃩ뺁臣꾁ꫨ躘臣膀뫦龁臣貂苣ꢁꛨꪁ臣貂苣芀鳦讖ꓧ꾁胣鶁臣꒾臣ꎭꋧꮁ볯ꒁ臣ꆃ菣邃菣貁触骮臣龔裦ꦉ臣龁臣鞃菣뮂苣궸臣颭鳥馁苣讁胣뾽铧閁苣讂臣膀臣龁臣鶁臣ꞁ臣醁苣낁雩ꎀ臣讂껥붖뷥讅苣薌郥馁苣芀鳦讖ꓧ꾁胣醼臣袂苣骤臣膀臣龁臣ꢅ臣꺁苣ꮃ菣鞃菣뎃菣벃臣肉껥꺁铧邈觧뺁臣꾁菣궃苣릂룤ꮁ귥ꢜ臣讂臣膀뷤ꢔ臣貂苣讁胣뺁臣꾁臣蚁臣ꪁ臣貂臣ꊖ胩馁苣龮雦ꊽ藦銂賥ꮐ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†胣ꮐ苣趀臣蒁臣ꢔꫨ꾁胣讖铦蒚臣놨껥閁苣讂臣ꢁ苣辄鯥鞁臣蒁苣貁胣붿諥꺁ꛨꂴ臣龁臣릂菣莃菣銂郥膂苣鎁臣銂뿥膦臣鞁臣蒁臣ꢁ臣节闧辄臣貂臣蒁胣貀郥肂胣ꢁ臣蚁铧麪臣겜飦내鯦ꞁ뷤ꢔ臣貂苣뒠郥膀臣龁臣ꎁ臣膀胣讁苣ꪁ苣趀臣蒁臣ꢔꫨ节賥ꮐ臣貂雩몤臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 蒯鯥貁賦骮臣貂臣蒁苣뒠郥꾁胣ꢂ菣覃菣ꒂ菣袃臣ꮐ臣貂苣芀臣覂臣膀뷥궥胨꺁雦袄迥뎁郧ꎧ臣覂믤ꮁꓧ閁苣ꚁ臣ꪁ臣讁臣龁臣閁苣ꪁ臣貂臣躘駧ꞁ臣蒁駩誂胣蒯鯥ꢁ臣ꚁꇨ閁苣讂胥꾁胣겜雩몤臣낕臣讂껥붖뷥��讅臣誁臣ꚁ뿨릁苣貂臣蒯鯥薆臣뮻蓦꺁觧骮臣ꒀ臣龁臣ꢃ裥蒯鯥讁苣膀雦袄룤躘苣讁臣鶁臣ꞁ臣蒁臣몤臣貂臣蒁駩誂胣鶁臣蒯鯥꺁룤邙臣颍뷤꺁볯邼裥꺁볯뺁臣銂믤骮臣鞾苣鎁臣貁郧ꎧ臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 ꢅ臣꺁볥ꢔ臣貂臣몇藥膀뻤袁臣膀鳦躘듧뢛臣閼铧閁苣龁볥ꢔ雦꺌胣몇觧ꦉ胣螃菣뾂菣벃苣膀菣벃苣馃菣릂苣뎃菣ꪃ胣誏臣肊ꇨ꾁胣鶁臣閼铧螖賧궸臣躘ꓧ蒚臣ꢡ迧閁苣ꪁ臣뒠郥ꞁ臣袁胣芏藧ꮁ苣誂鳦몇ꇩꮁ뗧뾁뻨뺁苣讂胣閼铧閁苣龁蟥뢅臣風볨ꢁ鳦몇ꇩ꺁꣨覼臣貁鿧뺛臣讂ꃥ袐胣겜蟥颡臣誁臣讂꣨覼臣ꪄ藥馁苣节臣ꢁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀껥붖뻤醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 겜雩몤臣膀믤许臣龮雦设苣芏藧馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣袂苣貮藥ꮁ郧ꎧ臣貂苣ꞁ臣趂臣芀臣讁臣膀臣貂苣꾁鳦讖ꓧ꺁꿧늛苣邙껥馁苣节臣ꢁ꟨袇臣貂苣릁臣ꞁ臣ꪁ臣芀鳦躘듧뢛臣風볨閁苣讂껥붖뻤誏臣龮雦ꊽ藦꾁胣设ꓧ꺛髧꺁臣ꮁ臩躁臣膀臣貂苣莀藦鞁臣颧胣ꪁ뿤ꎭ臣龁臣覤鯦貁뷥궥胨ꮁꓧ蚔臣貂胣鶁臣ꚁ鳦몇ꇩ誏臣뮷믤꺁觧놨ꯨ花臣蒯鯥꺁뛨ꢗ迥뎁꿧늛蛥ꮁ郥뺁苣讂臣趁臣芁苣鎁臣貁郧ꎧ臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯骼볯뒼볯꺼볯超雧鞢볥ꒉ뷯늼볯ꆼ꟦覯觧㲩牢ਾ†臣꺁껥붖뻤ꞁ臣膀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ賥閁苣龁뷥讅臣銃菣뎼볯ꦼ볯Ꞽ苣뎂菣覃臣讂룤ꎀ臣趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂뷤붣臣膀臣貂苣貁苣뎃苣벃菣Ꞃ菣뎃裢캒袼볯ꚼ볯銈닎볯ꎔ铧銂裥肿臣讂菨鮊臣ꒁ臣ꚁꧨ鎨臣龁胣讧꿧ꦉ臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂菣袃볯뒼볯꺼볯뾂菣醃苣ꪳ臣膀볯ꒁ믤誸臣릂ꫧ뚄ꓥ낕臣躰藥銂胩鞁臣讧裦蒚臣뮴胦隌臣貂臣芀믤许臣颍룤뺁臣꾁뗧뾁郥辂臣릂ꫧ뚄ꓥ낕苣ꚩ꣩鞁臣骼볯覽볯뚼볯閼볯궼볯袼뷯覽볯늼볯颼볯뒼볯袼뷯覽뷯覼볯醼볯鞼볯込볯醼볯钼볯込볯醼볯閼볯鮼迥뎁볯覽뷯覼볯銼볯钼볯込볯醼볯鞼볯込볯醼볯钼볯込볯醼볯閼볯芀臣貂苣꺁꟦覯觧꾁藥讞髧ꮁ臣鲤蟥銂껥鎘臣馁苣龁苣ꮁ볯ꮜꯧ뺁臣꾁볯ꮜꯧ꺁臣骁苣讁臣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣뎂菣覃臣龁胣낕臣讂苣钃菣벃菣뾂苣銂ꧨ鎨臣龁볯ꚼ볯ꆼ볯膀볯馽뷯膀볯뒼胣ꢼ볯膀볯閼볯芀臣覂臣膀藥ꚁ臣讧꿧ꦉ臣膀苣ꎃ菣鞃볯ₑ閼胢궂菣莃菣袼볯趽볯袼볯馀볯邽뷯邽볯閼胢覼볯貽뷯邽볯邽볯膀볯馀볯뒼볯膀볯馀볯뒼볯膀볯邼볯貃苣것苣膃菣꺁菣ꪃ볯蚃菣ꮃ苣ꮐ臣膀臣鞁臣醼裢ꆃ菣ꮃ裢랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣袼뷯醼꣎볯ꞁ껥ꢅ臣��꺿ꏩ閁苣龁胣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣覜臣ꪁ臣膀믤ꢡ髧ꪁ꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣銃菣뎼볯ꦼ볯Ꞽ꟦覯觧꺁볯늼볯ꊂ菣躃藩超裥銂藩鞈闧랏볯鲀볯邼臣몤臣芀臣貂苣꺁苣龃菣뢅藩鞈苣뎂菣覃臣讂뻤몤髧ꪁ菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈苣膀藩鞈闧랏볯馼볯鲀볯邼볯誏臣醼볯钼볯鲀볯钼볯邼臣몤臣芀꟦覯觧ꮁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣设ꓧ蒚臣閼胢떼볯늼苣超裥ꪕ迥銼볯誏臣醼볯銼볯ꮁꓧ馁胣讧꿧ꦉ臣뾽铧馁苣龁苣꺁뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯銂藩鞈闧랏볯銼臣몤臣芀꟦覯觧ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣龁苣꺁뷯覽볯銈볯銼볯誏臣趽뷯늼裢醼볯銼裢鎼뷯邵郥ꢃ뷤銂郥肂뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯꾁胣超裥ꪕ迥銼볯ꮁꓧ閁苣讂胣ં䐼噉邀볯銼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ꟦覯觧貁볯ꚼ볯銈닎铧龔苣몈뿦鞁뻥讂臣Ꚑ臣銂뇦骮臣讂臣膂臣膀臣꺁꟦覯觧銂菣袃볯ꚼ볯膽듧麃臣袃菣뎃苣閃苣꾂菣鞁臣芀蟩龔黥袼鷩讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯銃菣誏臣麃苣릂볯뒼볯꺼볯讧꿧ꦉ苣낙胦뺯藧ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣龁胣銼볯貼볯邼볯내菨込苣Ꞃ菣銂胣馼볯Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃臣鞃菣벃菣鞁胣鶁臣ꚁ뷯趽볯꺼볯讧꿧ꦉ볯銼볯邼뷯螽볯銂볯覽뷯辽뷯薽뷯钽뷯趽뷯躽뷯₅銼볯邼볯銂铧蒁臣鶁苣覂臣袃菣뎃苣閃苣꾂菣鞁臣芀볯钼迥뎁볯颼駦鎖뻥膀룤薸苣麛迥鞁胣鶁臣ꚁ볯ꚼ볯銈닎菣馃菣銂꣦隺髧ꪁ볯겼볯뎼볯ꮁ苣ꎁ臣몱껥鞁臣芀臣꺁뗧鲞苣뎛볯ꮁꓧ鞁臣誁苣膀臣貂臣袂臣ꚁ胣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯뒼볯꺼볯讧꿧ꦉ臣膀蟩龔黥袼鷩讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯銃菣誏臣麃苣릂볯뒼볯꺼볯뺯藧ꢁ꿦莼臣ꚁ胣ꦼ볯꺼裢캒ꎔ铧銂裥肿臣龁臣ꢁ臣龮꣨閁苣ꚁ臣讂胣钼臣ꢅ臣꺁ꓥ낕볯뒼볯꺼볯讧꿧ꦉ臣ꦼ볯꺼裢캒ꎔ铧銂裥肿臣龁臣膀볯醼볯閼볯覤闧誏臣늼볯颼볯뒼ꓥ낕臣肜苣颫臣뮴胦銂ꓧ鞁臣芀臣貂苣꺁뗧鲞臣覂胣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯뒼볯꺼볯₧趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣膀볯ꚼ볯銈닎铧龔臣몈뿦銂胩鞁臣超雧鲿귧銂ꋥ랼臣讂菨鮊臣龮꣨閁苣讂胣ં䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†곧銼臣뮂菣袃臣龮꣩ꞁ臣膀믨馆臣ꒂ菣뾂菣閃苣궃菣龄迥Ꞁ뿥钭苣것菣뎃菣袼볯뎼볯ꖼ볯ꮁ苣ꎁ臣蚧该閁苣讂菣鶃菣뾂菣몁볤邭苣ꢔ臣ꚁ胣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯뒼볯꺼볯₧趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣醃菣ꮃ臣膀볯醼볯ꆃ菣讃菣ꊽ裦내菨놔鷦꺁볯뒼볯꺼볯₧ꮼ볯것菣벃苣벃菣Ꚃ苣내菨ꪠ臣誁臣ꚁ볯뎼볯ꖼ苣뮴胦隌臣讂菨鮊苣ꚩ꣩鞁臣芀臣꺁뗧鲞苣뎛볯ꮁꓧ鞁臣誁苣膀臣貂臣膀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ꟦覯觧貁菣鶃菣뾂菣몁볤邭駧��뺏苣몈뿦鞁臣鎁臣銂ꓧ鞁胣鶁苣ꮁ苣ꎁ臣鶁臣讧꿧ꦉ臣ꒂ菣뾂菣閃苣궃菣龄迥Ꞁ뿥钭苣것菣뎃菣袼볯뎼볯ꖼ볯銂듦Ꞁ賥ꞁ臣龁臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤銼볯ꦼ볯ꚼ볯誏臣ꦼ볯ꚼ볯超雧鞢볥ꒉ뷯늼볯ꆼ꟦覯觧㲩牢ਾ†臣꺁껥붖뻤ꞁ臣膀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ賥閁苣龁뷥讅臣ꦼ볯ꚼ볯뺁臣꾁볯늼볯鞼苣뎂菣覃臣讂룤ꎀ臣趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂뷤붣臣膀臣貂苣貁苣뎃苣벃菣Ꞃ菣뎃蓦鞏胦鲿귧ꢂ菣ꆃ菣袃볯ꦼ볯늼볯覼苣뮴胦隌臣讂菨鮊臣ꒁ臣ꚁꧨ鎨臣龁胣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣覜臣ꪁ臣膀볯鎼볯隼볯릂ꫧ뚄ꓥ낕苣ꮐ苣膀믤ꢡ髧ꪁ꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣麃苣릂迥뎁菣袃臣ꦼ볯ꚼ볯讧꿧ꦉ臣꾼볯ꚼ苣龃菣뢅藩鞈苣膀藩鞈闧랏볯醼胣醼볯ꮁꓧ馁胣鎁苣覂臣ꊂ菣躃藩超裥銂苣벃菣馁苣设ꓧ蒚臣貃苣것苣膃菣超裥꾁胣超裥ꪕ迥銼볯邼胣銼볯醼臣몤臣貂苣芀苣钃菣벃菣뾂苣銂鳦閁臣蒁胣躇铧讞菣袃볯늼볯鞼꟦覯觧꺁볯늼볯ꊂ菣躃藩超裥銂胣超裥ꪕ迥醼볯ꮁꓧ馁볯超裥ꪕ迥銼볯銼臣몤臣貃苣것苣膃菣超裥ꮁ苣誂苣벃菣閁苣讂볯芀苣钃菣벃菣뾂苣銂鳦閁臣蒁胣ꎻꇨ蒚臣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ菣袃볯늼볯鞼꟦覯觧꺁볯늼볯ꊂ菣躃藩超裥銂胣超裥ꪕ迥醼볯鲀볯颼臣몤臣芀臣貂苣꺁苣龃菣뢅藩鞈苣뎂菣覃臣讂뻤몤髧ꪁ菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈苣膀藩鞈闧랏볯醼볯鲀볯醼볯誏臣醼볯銼胣醼볯閼볯ꮁꓧ馁胣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣覜臣ꪁ臣膀믤ꢡ髧ꪁ鿧꺸黥銃菣ꦼ볯ꚼ볯讧꿧ꦉ볯趸듦Ꞁ胣貃菣趀ꓥ낕볯꺁볯늼볯ꊂ菣躃藩超裥銂胣超裥ꪕ迥醼볯鲀볯邼臣몤臣芀臣貂苣꺁苣龃菣뢅藩鞈苣뎂菣覃臣讂뻤몤髧ꪁ菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣膀藩鞈闧랏볯醼볯鲀볯醼볯ꮁꓧ閁苣讂胣鎁苣覂臣讧꿧ꦉ臣뢅黥蒚臣꾁胣鲤蟥銂껥鎘臣馁苣龁苣ꮁ볯ꮜꯧ뺁臣꾁볯ꮜꯧ꺁臣骁苣讁臣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣뎂菣覃臣龁胣낕臣讂苣钃菣벃菣뾂苣銂ꧨ鎨臣龁볯ꚼ볯ꆼ볯膀볯馽뷯膀볯뒼胣ꢼ볯膀볯閼볯芀臣覂臣膀藥ꚁ臣讧꿧ꦉ臣膀苣ꎃ菣鞃볯ₑ閼胢궂菣莃菣袼볯趽볯袼볯馀볯邽뷯邽볯閼胢覼볯貽뷯邽볯邽볯膀볯馀볯뒼볯膀볯馀볯뒼볯膀볯邼볯貃苣것苣膃菣꺁菣ꪃ볯蚃菣ꮃ苣ꮐ臣膀臣鞁臣醼裢ꆃ菣ꮃ裢랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣袼뷯醼꣎볯ꞁ껥ꢅ臣꺿ꏩ閁苣龁胣讧꿧ꦉ臣뾽铧馁苣龁苣꺁뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯銂胣超裥ꪕ迥銼볯誏臣醼볯銼볯ꮁꓧ馁胣讧꿧ꦉ臣뾽铧馁苣龁苣꺁뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯銂胣超裥ꪕ迥銼볯ꮁꓧ馁胣讧꿧ꦉ臣誁臣ꚁ뷤ꢔ臣讂��膂臣趽뷯늼裢醼볯銼迥뎁뷯覽볯銈볯钼볯銈볯邽뗧袐菩趽苣ꮐ苣设ꓧ蒚臣鎼胢떼볯늼苣膀藩鞈闧랏볯鎼臣몤臣芀㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 ꊻ蛥貁苣뎃苣벃菣Ꞃ菣뎃蓦鞏胦鲿귧ꢂ菣ꆃ菣袃볯ꦼ볯늼볯覼臣袂臣ꚁ꟩開臣貂苣膀껥붖뻤醼臣뾽铧閁苣龁菣鶃菣뾂菣내菨ꪠ苣뾽铧鞁臣膀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣ꦼ볯ꚼ볯誏臣ꦼ볯ꚼ볯꺁뷯늼볯ꆼ꟦覯觧貁볯뎼볯ꖼ苣뮴胦隌臣讂菨鮊苣ꚩ꣩鞁臣芀臣꺁뗧鲞苣뎛볯ꆼ胣鎼볯ꮁꓧ鞁臣誁苣膀臣貂臣膀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣ꦼ볯ꚼ볯讧꿧ꦉ볯뎛볯ꆼ볯誏臣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯늼볯鞼꟦覯觧袼鯥鎼볯覼臣것菣벃苣벃臩鶼귥몙迧銂裥肿臣讂臣ꢁ苣龮꣨鞁臣誁苣膀臣貂臣袂臣ꚁ臣꺁꟦覯觧貁苣뎃苣벃菣Ꞃ菣뎃蓦鞏胦鲿귧ꢂ菣ꆃ菣袃볯ꦼ볯늼볯覼苣뮴胦隌臣趁臣鎁臣貁ꓧ閁苣讂胣ં䐼噉邀볯銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤鎼볯ꦼ볯ꮼ닎胣莽볯겼볯낼迥뎁볯ꦼ볯ꮼ볯超雧鞢볥ꒉ뷯늼볯ꆼ꟦覯觧㲩牢ਾ†臣꺁껥붖뻤ꞁ臣膀믨馆臣꺼볯캦ꊼ苣낂菣ꮃ볤钁뗧꾷臣袂臣ꚁ꟩開臣貂苣ꮃ苣閃苣ꦃ菣벂菣鶃菣뾂菣몁볤邭苣뾽铧鞁臣膀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣ꦼ볯ꮼ胣莽볯겼볯낼迥뎁볯ꦼ볯ꮼ볯ₑ趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣꺼볯캦ꊼ苣낂菣ꮃ볤钁苣뮴胦隌臣讂菨鮊苣ꚩ꣩鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯ꮼ볯캫讧꿧ꦉ臣膀믤许臣銼臣꺁苧膪蓧覤闧銂郥鎂臣蒁臣骼볯醼볯鞼볯込볯醼볯醼볯芀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣ꦼ볯ꮼ뇎臣龁臣ꦼ볯ꮼ닎꟦覯觧꾁胣낼볯뎼볯覤闧銂郥鎂臣蒁臣芀苣钃菣벃菣뾂苣銂鳦閁臣蒁胣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯ꮼ볯캫讧꿧ꦉ臣꾼볯ꚼ苣龃菣뢅藩鞈苣膀藩鞈闧랏볯钼볯鲀볯钼볯ꮁꓧ馁胣超裥ꪕ迥醼볯隼臣뾂菣醃苣ꪳ苣뎂菣覃臣讂뻤몤髧ꪁ菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈苣膀藩鞈闧랏볯钼볯钼迥뎁볯钼볯閼臣몤臣芀苣钃菣벃菣뾂苣ꪁ臣ꞁ胣낼볯뎼볯覤闧銂郥肂胣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯ꮼ볯캫뺁臣꾁볯ꮼ볯캫讧꿧ꦉ臣꾼볯ꚼ苣龃菣뢅藩鞈臣膀藩鞈闧랏볯閼볯膀볯閼볯膀볯閼볯膀迥뎁볯閼볯ꮁꓧ閁苣讂볯鶁苣麁苣膀藩鞈闧랏볯閼볯膀볯閼볯膀볯閼볯膀迥뎁볯閼볯膀臣龁臣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯銼볯膀볯鎼볯鞼胣醼볯銼볯膀迥뎁볯钼볯邼臣몤臣貂苣貃苣것苣膃菣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣覼胣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ뷯ꚼ볯ꦼ볯讧꿧ꦉ臣膀뷯ꚼ볯ꦼ볯銈볯膀뷯ꚼ볯ꦼ볯銈볯袼뷯膽볯銈볯銼볯覼胣莽볯겼볯낼†뷯銼볯袼뷯膽볯銈볯馼볯覼胣莽볯겼볯낼†뷯钼볯袼뷯膽볯銈볯鞼볯覼臣龁臣莽볯겼볯낼†뷯醼��袼뷯膽†볯鞼볯銈볯颼볯覼苣ꮐ苣ꞁ臣龁胣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣覜臣ꪁ臣膀뷯ꚼ볯ꦼ볯讧꿧ꦉ臣꾼볯ꚼ苣龃菣뢅藩鞈臣膀藩鞈闧랏볯钼볯鲀볯钼볯ꮁꓧ閁苣讂胣鎁苣覂臣莽볯겼볯낼苣뎃菣꾂돨銂苣벃菣馁苣设ꓧ蒚臣貃苣것苣膃菣超裥꾁胣超裥ꪕ迥醼볯馼볯鲀볯钼볯銼迥뎁볯钼볯馼胣醼볯鞼볯ꮁꓧ閁苣讂胣꺨胣꺁꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣늼볯낼볯醼꟦覯觧꺁꟦ꂀ臣膀뻤袁臣膀볯膽뷯覽뷯貼볯躼뷯钽†뷯貽볯袼볯邼볯閼볯뎼뷯覽뷯躽뷯薽†볯閼볯骼볯銼볯銈볯鎼볯뺁臣꾁볯銽뷯骽뷯辽볯뎼볯薽뷯ₔ膽뷯躼볯銼볯醼볯覼볯薽뷯貽†볯薽뷯钽뷯₈꒼뷯蚽뷯薽뷯躼볯醼볯醼볯醼볯鲀볯閼볯醼臣閁苣ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣芀苣钃菣벃菣뾂苣銂鳦閁臣蒁胣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯ꦼ볯ꮼ볯讧꿧ꦉ臣꾼볯ꚼ苣龃菣뢅藩鞈臣膀藩鞈闧랏볯閼볯鲀볯隼볯ꮁꓧ閁苣讂胣鎁苣覂臣늼볯낼볯醼苣뎃菣꾂돨銂苣벃菣馁苣设ꓧ蒚臣貃苣것苣膃菣超裥꾁胣超裥ꪕ迥醼볯邼볯鲀볯钼볯颼迥뎁볯钼볯钼胣醼볯鞼볯ꮁꓧ閁苣讂胣ꪂ菣鞃菣ꪃ菣螃苣뎃苣閃菣벃菣ꮁ諥袁臣膀藥ꚁ臣讧꿧ꦉ臣膀볯膽뷯醼†볯馀볯膽뷯袼볯趽볯袼볯馀볯邽뷯邽볯閼胢覼볯貽뷯邽볯邽볯膀볯馀볯뒼볯膀볯馀볯뒼볯膀볯邼볯貃苣것苣膃菣꺁菣ꪃ볯蚃菣ꮃ苣ꮐ臣膀臣鞁臣醼裢ꆃ菣ꮃ裢랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣袼뷯醼꣎볯銂铧蒁臣貮藥ꮁ뿤뺣臣貂臣芀꟦覯觧ꮁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣设ꓧ蒚臣閼胢떼볯늼苣膀藩鞈闧랏볯醼迥뎁볯鎼볯鎼臣몤臣芀꟦覯觧ꮁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣设ꓧ蒚臣鎼胢떼볯늼苣膀藩鞈闧랏볯銼臣몤臣芀꟦覯觧ꮁ臣醁苣뾽铧꺁臣膂臣趽뷯늼裢醼볯銼迥뎁뷯覽볯銈볯钼볯銈볯邽뗧袐菩趽苣ꮐ苣设ꓧ蒚臣鎼胢떼볯늼苣超裥ꪕ迥銼볯ꮁꓧ馁胣ં䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†鳦鶈臣肸胩꺁껥鎨臣꾁胣莽볯겼볯낼臣龁臣ꦼ볯ꮼ닎꟦覯觧꺁臣骁苣讁볯醼볯躼볯躽뷯늼볯ꆼ볯銂胣꺼볯캦ꊼ裢貽뷯莽菣鶃菣뾂菣몁볤邭臣놅臣膀볯醼볯ꚼ볯邼胣궼볯鎼볯뺁臣꾁볯ꖼ볯銼볯鎼듧麃臣袃菣뎃苣閃苣꾂菣鞁胣貺蟩겼뷯莽苣莃苣ꒂ苣膀볯ꚼ뫎볯랂苣誃菣鶼臩꺁듦Ꞁ賥꺁賦馨臣鞁臣袃菣뎃苣閃苣꾂苣ꞃ菣銼볯芙雩貾臣財臣龁胣鶁臣邵黦銂鯥钼臣몤臣ꚁ臣誂胣鎁苣꾁胣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ뷯ꚼ볯ꦼ볯誏臣ꦼ볯ꮼ닎꟦覯觧貁菣鶃菣뾂菣몁볤邭駧뺏苣몈뿦鞁臣鎁臣銂껥벨臣ꚁ臣誂胣鶁苣ꮁ苣ꎁ臣讧꿧ꦉ臣꺼볯캦ꊼ苣낂菣ꮃ볤钁뗧꾷苣뮴胦隌臣趁臣鎁臣貁ꓧ閁苣ꚁ臣讂胣견볯꺁룤ꎀ臣龮꣩��臣膀볯ꦼ볯ꮼ볯讧꿧ꦉ苣膀볯ꚼ뫎볯銈뷯閽뷯것菣벃苣벃臩鶼귥ꢁ藥ꮁ胣ꊼ볯隼볯醼볯내菨ꮁ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣膀菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃臣銼볯芙雩貾臣꺼볯캦ꊼ苣낂菣ꮃ볤钁臣뮴胦隌臣螌꣦ꢁ臣ꚁ뫤趇볯閽뷯ꊂ菣뮂苣銂ꇨꎁ臣芀臣꺁뗧鲞苣뎛볯ꮁꓧ鞁臣誁苣膀臣貂臣膀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣늼볯낼볯醼꟦覯觧貁菣鶃菣뾂菣몁볤邭駧뺏苣몈뿦鞁臣鎁臣銂껥벨臣ꚁ臣誂胣鶁苣ꮁ苣ꎁ臣讧꿧ꦉ臣꺼볯캦ꊼ苣낂菣ꮃ볤钁뗧꾷苣뮴胦隌臣趁臣鎁臣銂ꓧ鞁臣蒁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯骼볯ꦼ볯ꊼ볯꾼藥ꮖꋥ랼觥趽볯꺼볯讧꿧ꦉ戼㹲 鎁臣龮雦设臣꾁胣꒼볯ꆼ볯겼볯銂苣벃菣馁苣肸胩꺁뷯趽볯꺼볯讧꿧ꦉ苣鲽ꏨ鞁胣鶁苣覂臣떂苣袃苣ꒂ菣ꎔ铧銂ꫨ躰臣讂菨鮊臣ꒁ臣ꚁꧨ鎨臣龁胣鎁苣覂臣讧꿧ꦉ臣膀藥讞髧ꮁ臣鲤蟥銂껥鎘臣馁苣龁苣ꮁ볯ꮜꯧ뺁臣꾁볯ꮜꯧ꺁臣骁苣讁臣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣뎂菣覃臣ꚁ臣龁胣낕臣讂苣钃菣벃菣뾂苣銂ꧨ鎨臣龁볯ꚼ볯ꆼ볯膀볯馽뷯膀볯뒼胣ꢼ볯膀볯閼볯芀臣覂臣膀藥ꚁ臣讧꿧ꦉ臣膀苣ꎃ菣鞃볯ₑ閼胢궂菣莃菣袼볯趽볯袼볯馀볯邽뷯邽볯閼胢覼볯貽뷯邽볯邽볯膀볯馀볯뒼볯膀볯馀볯뒼볯膀볯邼볯貃苣것苣膃菣꺁菣ꪃ볯蚃菣ꮃ苣ꮐ臣膀臣鞁臣醼裢ꆃ菣ꮃ裢랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣袼뷯醼꣎볯ꞁ껥ꢅ臣꺿ꏩ閁苣龁胣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣覜臣ꪁ臣꒼볯ꆼ볯겼볯讧꿧ꦉ臣꾼볯ꚼ苣龃菣뢅藩鞈臣膀藩鞈闧랏볯隼볯鲀볯鞼볯ꮁꓧ閁苣讂胣超裥ꪕ迥醼볯馼臣꒼볯ꆼ볯겼볯뾂菣醃苣ꪳ苣뎂菣覃臣讂뻤몤髧貃苣것苣膃菣超裥꾁胣超裥ꪕ迥醼볯醼볯誏臣醼볯颼볯ꮁꓧ閁苣讂胣讧꿧ꦉ臣뾽铧馁苣龁苣꺁뻤몤髧閼胢떼볯늼臣膀藩鞈闧랏볯醼迥뎁볯鎼볯鎼臣몤臣貂苣芀꟦覯觧ꮁ臣醁苣뾽铧꺁臣膂臣设ꓧ蒚臣鎼胢떼볯늼苣超裥ꪕ迥銼볯ꮁꓧ馁胣讧꿧ꦉ룤꺁뷤ꢔ臣龁苣꺁뷯覽볯銈볯銼볯誏臣趽뷯늼裢醼볯銼裢鎼뷯邵郥ꢃ뷤銂郥肂뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯銂胣超裥ꪕ迥銼볯ꮁꓧ馁胣ં䐼噉邀볯銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†볯ꦼ볯ꊼ볯꾼꟦覯觧貁苣ꒂ菣ꮂ苣뎃铧龔苣颪냥ꞁ臣讂臣Ꚑ臣銂뇦骮臣讂臣膂臣膀꟦覯觧銂볯ꮼ볯뚼볯내菨ꮁ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣龁胣醼룤讀臣내菨込苣Ꞃ菣銂볯隼苣Ꞃ菣鞃菣벃菣ꮁ菣것菣袃臣膀臣鞁臣趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂胣겼뷯邽뷯蚽뷯莽뷯膽뷯覽뷯薽†볯邼볯邼苣ꢔ臣ꚁ臣貂苣ꮁ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣龁胣뎼볯꾼볯鎼듧麃臣誁臣讂볯ꦼ볯ꊼ볯꾼†뷯趽볯꺼볯讧꿧��臣袂苣떂苣袃苣ꒂ菣ꎔ铧꺁裥肿苣겸껥鞁臣芀臣꺁뗧鲞苣膀볯꺼볯銈뇎臣ꒁ臣ꚁ臣뎛볯ꮁ胣ꒂ菣뾂菣궃苣궂菣隼볯ꦼ볯銈볯覼臣ꒁ臣ꚁ臣뎛볯ꮁꓧ鞁臣誁苣膀ꓥ낕臣꒼볯ꆼ볯겼볯₯趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧貁볯ꮼ볯뚼볯내菨ꮁ苣讂苣ꒂ菣ꮂ苣뎃臣ꎔ铧銂裥肿臣讂臣ꢁ臣龮꣨閁苣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯銼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤閼볯超雧鞢볥ꒉ뷯늼볯ꆼ臣膀볯낼볯꾃苣膃菣鲿귧銂ꋥ랼臣讂戼㹲 鎁臣龮雦设臣꾁胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ胣ꦼ볯ꚼ볯뺁臣꾁볯늼볯鞼藥ꮖꋥ랼觥ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣銃菣醃菣궃菣麃苣ꒂ菣릂볯ꢼ볯뚼볯ꖼ볯込볯鞼†뷯늼볯ꆼ菣벃苣꺁菣꾂菣뎃臣뺯臣讂뿥钭臣릊諥誏臣邀매Ꞁ苣뾪臣龁胣邭껥뢠菩꺁뻥辰鋧莢臣誁臣讂菣袃菣钃菣벃菣Ꚃ苣ꮃ苣袼볯낼볯覼臣뺯臣讂觧낕髧超雧趏뿥꾁胣龄鿦銂ꃦ뚵臣膀ꓥ낕듧麃苣銎駩馁苣꺁臣趇ꛨꪁ뷥늉苣鲞臣馁臣ꢁ臣겅鿧ꞁ臣讂胣鞁臣鞁胣颫菣릂苣ꢼ볯뚼臣膀藥ꮖ듧麃苣뾪꿧鞁臣超雧醊裥꺾냥낒ꋥ銂뷤誂蟥馁臣ꢁ臣ꖟ苣貂臣蒁苣袼뻤袁臣膀볯銽뷯钽뷯膀볯躼볯躼뷯钽†뷯貽볯袼볯邼볯閼볯ꦼ뷯趽뷯躽뷯貽뷯螽뷯ₙ醼볯隼볯醼볯鎼裢醼볯醼苣芏藧꺁臣ꢁ볯芀臣龁臣ꎁ臣膀ꃩ랼臣讁臣邀매Ꞁ臣芁苣超雧鲿귧銂苣龁苣馁볯낼볯꾃苣膃菣ꖎ꣧ꊂ菣궃菣膃臣麝룥ꮁ鳦뺁臣蒁胣ં䐼噉邀볯銼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁껥붖뻤ꞁ뷤ꢔ臣龁볯낼볯꾃苣膃菣꾁胣겜飦내鯦ꞁ臣貂臣貂뷯ꖼ볯込볯鞼迥뎁뷯ꖼ볯込볯鞼臣벑臣貂苣膀듧麃蛥뺁臣꾁迥뚺胦ꊽ藦꺁볯낼볯醼볯鞊軥ꖼ볯誏臣ꖼ볯꺁臣骁苣讁苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ꟦覯觧ꞁ臣ꎁ臣芀迥뚺胦閃苣벃菣莃菣銂뷤붣臣讂臣膂臣膀裥貳臣薿ꛨꪁ苣낂菣ꮃ菣鞃菣覃苣膀諦龎臣꺼鳦꾫臣趞郥鞁臣芀苣낂菣ꮃ菣鞃菣覃臣超裥꾁胣ꦼ뷯ꮂ菣醃軩뚼裢ꦼ볯ꦼꃩ龟볯ꆼ볯ꮁ铧ꖝ臣龁胣邼韦꺛迥뎁볯钼韦꺛臣膀뷯ꖼ볯込볯鞼臣龁臣鎽볯隼볯ꖼ볯ₗ趽볯꺼볯꾃苣膃菣袼볯躼볯閼뷯螽볯讽뷯꺁铧辇볯꺁臣骁苣讁苣膀꿥ꞅ뷯늼볯ꆼ꟦覯觧袼볯뒼볯ꦼ볯覼胣뺁臣꾁볯뒼볯꺼볯膀볯늼볯鎼苣鞁臣ꦼ볯ꚼ볯超雧鞢볥ꒉ뷯늼볯ꆼ꟦覯觧袼볯躼볯閼뷯螽볯讽뷯꺁铧辇臣覼臣蒁臣貂臣ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ菣Ꚃ苣ꮁ귧覂蛥超雧鞁臣芀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥꾁胣뚼볯閼볯궼ꓥ낕볯超裥ꪕ迥醼臣뢛뷥馁苣麃苣릂臣邃菣뢂菣뎃볯銂郥鎂臣蒁臣芀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣ꦼ볯ꚼ볯超雧鞢볥ꒉ臣膀볯鎼볯隼볯膪蓧覤闧袼藩鞈闧랏볯銼臣뢛��馁苣覼苣ꮐ苣ꞁ臣龁胣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯늼볯鞼藥ꮖꋥ랼觥꾁胣薆菩ꂬꓥ誏臣隼臣꺁苧膪蓧覤闧袼藩鞈闧랏볯颼臣뢛뷥馁苣麃苣릂臣邃菣뢂菣뎃볯銂郥鎂臣蒁臣芀볯낼볯꾃苣膃菣讧꿧ꦉ迥뎁藥ꮖꋥ랼觥讧꿧ꦉ苣膀볯ꎼ볯芄돨誃菣銲귥궸臣놅蟥릖臣龁胣ં䐼噉邀볯銼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†볯醼韦꺛迥뎁볯鎼韦꺛臣膀郥ꚩ꣩꒾臣麃苣릂铧ꖝ臣뺄蟨내菨誏臣ꮜꋦ股跥뢠郧袼볯ꊼ볯ꎼ볯銂胣Ꞽ뷯貽뷯覽볯貽뷯螽볯蚕꣦覼볯ꊼ뷯薽뷯薽뷯蒽뷯躽†볯鮼볯꒼†볯覽뷯鎽뷯覽뷯躽뷯薽뷯覼苣ꮐ苣覼臣颭鳥许臣膀볯鞼蓢ꞁ볯芙雩膀苣궂苣鎃菣ꞁ胣ꖼ볯骃菣膃菣鞃菣ꮃ볯鎼볯ꖼ볯骃菣膃菣銂郥뾁胣鶁臣超裥꾁藩鞈闧랏볯隼胣鞼볯ꮁꓧ閁苣讂볯膀볯鞼菣鞃菣覃菣벃菣袼볯銼†볯鞼菣鞃菣覃苣ꮐ臣膀臣꺁藩鞈臣超裥ꪕ迥鞼볯鲀볯钼臣몤臣貂苣覼胣ꖼ볯颍룤骃菣膃菣袼볯讀臣讀胣꺁菣鞃菣覃볯膀볯鞼跥肸菣鞃菣覃볯鞼胥꺁胥薀臣骃菣膃菣覼臣龁臣骃菣膃菣ꪁ臣袼꿥ꞅ볯꺁臣骁苣讁苣ꢔ臣ꚁ胣趆裥肿臣龁胣蒐菣鞃菣覃臣邼볯銼볎뷯込뷯貽臣ꢔ蟩ꞁ迦鮾臣貂臣芀볯꒼볯꾃苣膃菣鲿귧꾁胣ꦼ볯꺼裢캒뺁臣꾁볯꺼볯銈뇎臣ꒁ臣ꚁ臣내菨薆鿦늉볯ꦼ볯뎼볯ꮁ苣ꎁ臣閩뻤鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ꦼ볯꺼裢캒誏臣뒼볯ꚼ裢캒ꮁ臣蒁臣꺁볯醼韦꺛臣뺄蟨내菨ꮁ苣讂볯鞼觧낕髧鲿귧ꮁ臣蒁臣꺁믤ꢡ髧ꪁ볯ꎼ볯邵黦銂胣뎛볯ꆼ볯ꦼ볯꺼裢캒覼迥뎁鯥颼볯袼볯꺼볯銈뇎볯ꮁꓧ馁胣ꦼ볯꺼裢캒誏臣뒼볯ꚼ裢캒ꮁ臣蒁臣銼볯ꖗ鯧꺁蓨鎇듧麃臣袂苣ꖼ볯릉闧蒚뿥钭臣ꒁ臣ꚁ臣ꎻꇨ蒚臣ꦼ볯뎼臣邵黦銂鯥馼볯袼볯ꚼ볯銈돎볯誏臣뎛볯ꊼ볯뒼볯ꚼ裢캒覼臣몤臣芀鯥颼볯鲀볯ꊼ迥뎁鯥馼볯鲀볯ꊼ臣邵黦ꮁ苣ꎁ臣膀볯뒼볯꺼볯膀볯늼볯鎼臣龁臣ꦼ볯ꚼ볯超雧鞢볥ꒉ苣꾃苣膃菣ꢁ藥ꚇ雦鞁臣뒠郥膀볯꒼볯꾃苣膃菣鲿귧袼듧麃蛥誏臣꾏뫦Ꞁ諦龎菣ꦂ菣麃菣袃臣ꆸ雦ꮁ꿥馁苣覼臣麝룥ꮁꋥ랼臣貂臣鎁臣貁껥벨臣貂胣鎁臣ꞁ臣ꖼ볯ꢂ菣袃菣鞃臣ꖼ볯ꢂ菣袃菣鞃苣誂苣랼臣讁臣覤该貁냥ꪁ臣膀迥뚺黥꺁諦龎臣膀듧麃蛥ꊽ藦꺁諦龎苣誂苣랼臣芀藥ꮖꋥ랼觥ꮁ苣讂臣꺁ꋥ랼臣貂臣ꎼ볯颼菣꾂菣뎃뿥钭臣膀臣貂臣貂鯥醼볯ꆼ迥뎁鯥醼볯ꊼ臣몤臣貂苣膀믤ꢡ髧ꪁ볯醼韦꺛臣閼볯ꖗ鯧꺁볯鞼觧낕髧뺄蟨내菨ꦼ볯꺼裢캒ꦼ볯뎼菣벃苣ꞁ飦覂臣ꪁ苣蚁臣膀胨薹胦貁臣讂臣ꢁ臣몤臣貂臣芀蓨鎇듧麃菣벃苣ꢁ郥颧臣邵黦貁胣낼볯궼볯龮꣩ꮁ��蒁臣뎦꿥閁苣龁볯螃菣뾂臣몤臣骁볯芀諦龎觧낕髧ꎼ볯颼뿥钭臣邀매Ꞁ苣릔雥馁苣뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣붃諥꾁胣뎛볯醼볯袼듧麃蛥ꖼ볯込볯鞼臣超雧鞁臣麃苣릂铧ꖝ臣ꖼ볯릉闧蒚뿥钭볯誏臣뎛볯醼볯袼迥뚺胦ꖼ볯込볯鞼臣超雧閁苣龁菣Ꚃ苣놔鷦꺁볯鞼觧낕髧鲿귧覼臣몤臣貂苣ꦼ볯꺼裢캒ꦼ볯뎼菣벃苣ꮁ苣ꎁ臣閁苣ꮁ껥벨臣貂胣鎁臣ꞁ胣鞼胩鎖臣龮꣩꺁臩讨臣辂臣ꎁ臣膀볯뒼볯꺼볯ꚇ뷧麃苣릂臣誁臣ꚁ苣誂ꯩ蒁觥袐臣鞊軥릉闧蒚볯꒼볯뒼듧麃臣궶賦閁苣龁臣ꢁ臣龮꣨閁苣龁胣ં䐼噉邀볯銼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†铧ꎼ볯钼볯㲕畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲋猯灵내菨꺁臣ꆁ臣ꎼ볯颼뷯㲂畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲋猯灵내菨꺁觥袐苣뾪臣龁胣銼볯ꖗ鯧뺯볯鎼韦꺛臣뺄蟨내菨꺁뗧鲞苣膀臣貂臣貂鯥醼볯ꆼ迥뎁볯銼볯ꮁꓧ馁胣鶁臣邵黦讁苣膀藥ꮖꋥ랼觥袼觧ꮁ볯뒼볯꺼볯讧꿧ꦉ볯貁볯醼韦꺛臣辷볯꒼볯芽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰讼⼼畳㹰鯩ꎛ苣ꆋꓥ馁苣貁胣閼볯ꖗ鯧ꮁ臣ꆋꓥ鞁臣蒁臣ꢁ臣龮꣨閁苣讂胣ં䐼噉邀볯銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†藥ꮖꋥ랼觥讧꿧ꦉ臣ꎼ볯颼菣꾂菣뎃뿥钭苣鞢볥馁苣붃諥꾁胣ꖼ볯銈볯ꢼ볯醼裢鮛蟩鎽鿦늉臣袂臣ꚁ臣覂臣몢ꫨ閁苣龁胣銼볯ꖗ鯧뺯볯鎼韦꺛臣뺄蟨내菨꺁믤ꢡ髧ꪁ뗧鲞苣膀臣貂臣貂鯥醼볯ꆼ迥뎁볯鎼볯ꮁꓧ馁胣ꖼ볯銈볯ꢼ볯銈볯銈鯥辇뷤鎟觨꺁뗧鲞臣膀룤ꞁ胨龯臣龁볯ꎼ볯꺁뗧鲞臣肸蟨鞁臣貁胣鶁苣覂臣閁苣ꮁꓥ開胦ꞁ臣ꎁ臣芀鯥醼볯ꆼ胣뎛볯钼볯ꮁꓧ馁苣蚁臣膀ꓥꢃ裥꺁鯥辇뷤붙胦ꎼ볯颼듧麃臣膀胣ꢂ菣Ꞃ苣뾂菣ꆃ菣ꪃ菣趀볯ꎼ볯隼볯겼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰貽뷯㲏猯灵ꢡ迧讞苣覜臣讂臣ꢁ臣讦蟥閁苣龁胣銼볯ꖗ鯧ꢁ볯鎼韦꺛臣ꖼ볯鮛蟩鎽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰讼⼼畳㹰볯꒼볯내菨꺁꿦莼臣袂臣ꚁ胣鎁臣貀苣閃苣꾂苣벃꣨뚆胣ꎼ볯隼볯겼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰貽뷯㲏猯灵ꢡ迧讞臣钠ꧧ銂胩鞁臣궶賦閁苣龁臣ꢁ臣龮꣨閁苣龁胣閁苣ꪁ苣鎟觨龮꣩ꮁ苣ꎁ臣膀藥ꮖꋥ랼觥貁藥ꚼ뷯颽뷯鎼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰讼⼼畳㹰볯銽뷯螽裢ꎼ볯钼볯내菨꺁볯銂苣骁臣ꮁ룦醰臣鮁볯螃菣뾂ꓧ閁臣覼胣鶁臣ꚁ볯꒼볯鎼볯㲘畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲋猯灵ꊽ돨붊듧麃臣薼苣覤臣ꪁ臣鎁臣袼菣벃苣꾁ꓧ閁臣覼臣龮꣨閁苣龁胣ં䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤隼볯超雧鞢볥ꒉ뷯늼볯ꆼ臣膀볯ꎼ볯颼臣鎂菣꾂菣뎃뿥钭苣鞢볥馁苣㲋牢ਾ†臣꺁껥붖뻤ꞁ臣膀볯��볯꺼볯膀볯늼볯鎼臣龁臣ꦼ볯ꚼ볯超雧鞢볥ꒉ뷯늼볯ꆼ꟦覯觧ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣궼볯鎼볯趽볯꺼볯馃菣릂臣貁苣꾃苣膃菣ꮁ꿥馁苣鲿귧꺁諥鮊迥뎁胨薹胦銂ꫨ릁臣芀볯ꎼ볯颼菣Ꚃ苣ꮅ飧ꊃ菣ꮃ臣膀諦ꮅ飧뒼듧麃뿥钭苣몈뿦鞁뻥讂菣ꪂ苣钃菣벃菣銂郥覜臣讂藥ꮖ軥Ꞁꓥ낕菣鞃菣覃苣貐껥馁苣龁苣ꮁ뷤ꢔ臣貂臣趁臣袼뻤袁臣膀볯膽뷯膽뷯貼볯躼뷯钽†뷯貽볯袼볯邼볯钼볯꺼뷯钽뷯銽뷯₅閼볯閼볯閼볯銼裢閼볯隼苣芏藧꺁臣ꢁ볯芀臣龁臣ꎁ臣膀藨趘菣ꪂ苣钃菣벃菣ꮁ꿥馁苣醠볥ꞁ胨薹胦꺁臣讂藥ꮖ뿥钭苣节臣覂臣貁苣꾃苣膃菣ꖎ꣧ꊂ菣궃菣膃臣麝룥ꮁ鳦뺁臣蒁胣ં䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁껥붖뻤ꞁ뷤ꢔ臣龁볯ꎼ볯颼菣꾂菣뎃臣膀볯蒽뷯螽뷯膀볯邽뷯螽뷯醼胣誏臣늼뷯邽뷯醼臣놔鷦馁苣ꮅ飧趃苣ꢂ菣袃菣鞃苣ꮐ鳦馁苣鎼臣꺁볯閼蟩鎽臣覤闧鎽菣鞃菣覃臣ꆼ볯늼苣뎃苣蚃菣벃苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ꟦覯觧ꞁ臣ꎁ臣袼臣꺁菣꾂菣뎃臣膀鳦躘듧뢛臣꾁볯꒼볯隽뷯颽臣节釥낁苣讂볯芀뷯늼볯ꆼ꟦覯觧꾁胣릮飦ꮁꓦ몇臣讂臣膂臣꺼鳦꾫볯覽뷯뾂苣节郥肂胣超裥ꪕ迥醼볯馼臣몤臣貂苣ꪂ菣鞃菣ꪃ菣螃苣뎃苣閃菣벃菣銂苣벃菣馁苣芀볯ꖗ鯧誏臣醼볯ꖗ鯧ꮁ胣뺯藧꺁뷯늼볯ꆼ꟦覯觧袼볯뒼볯ꦼ볯覼胣뺁臣꾁볯뒼볯꺼볯膀볯늼볯鎼苣鞁臣꾁볯늼볯鞼藥ꮖꋥ랼觥趽볯꺼볯讧꿧ꦉ볯邼볯銼볯趽뷯込뷯螽臣ꢔ蟩覼臣蒁臣貂臣ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ胣麃苣릂苣ꆼ볯늼뷯膽뷯ₘ趽볯꺼볯꾃苣膃菣袼볯躼볯閼뷯螽볯讽뷯꺁铧辇볯ꞁ귧覂蛥超雧鞁臣芀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥꾁胣뚼볯閼볯궼ꓥ낕볯超裥ꪕ迥醼臣뢛뷥馁苣麃苣릂臣邃菣뢂菣뎃볯銂郥鎂臣蒁臣芀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣ꦼ볯ꚼ볯超雧鞢볥ꒉ臣膀볯鎼볯隼볯覤闧袼藩鞈闧랏볯銼臣뢛뷥馁苣覼苣ꮐ苣ꞁ臣龁胣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯늼볯鞼藥ꮖꋥ랼觥꾁胣薆菩ꂬꓥ誏臣隼臣꺁苧膪蓧覤闧袼藩鞈闧랏볯颼臣뢛뷥馁苣麃苣릂菣벃苣ꞃ菣覼苣ꮐ苣ꞁ臣龁胣궼볯鎼볯꾃苣膃菣讧꿧ꦉ迥뎁藥ꮖꋥ랼觥讧꿧ꦉ苣膀볯ꎼ볯芄돨誃菣銲귥궸臣놅蟥릖臣龁胣ં䐼噉邀볯銼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†볯醼韦꺛迥뎁볯閼韦꺛臣膀郥ꚩ꣩꒾臣麃苣릂铧ꖝ臣ꎼ볯颼볯뺄蟨내菨銂胣Ꞽ뷯貽뷯覽볯貽뷯螽볯蚕꣦覼볯ꊼ뷯薽뷯薽뷯蒽뷯躽볯鮼볯꒼†볯覽뷯鎽뷯覽뷯躽뷯薽뷯銂郥肂볯꺁귥ꢜ룤膀蟩龔黥뺁臣꾁ꓥ낕뷤궼볯鎼볯ₘꆼ볯늼菣鞃菣覃볯骃菣膃菣芁臣誂볯캑螽볯��뷯覼臣놅臣鎼볯莄臣膀볯芙雩ꢂ苣붂菣鲃臣趆裥肿臣膀볯꒼볯꾃苣膃菣鲿귧銂胣ꦼ볯꺼裢캒ꮁ臣蒁臣내菨薆鿦늉볯ꦼ볯뎼볯ꮁ苣ꎁ臣閩뻤鞁臣芀볯ꚼ볯銈돎臣ꒁ臣ꚁ臣銼볯ꖗ鯧誏臣鎼볯ꖗ鯧꺁볯꒼볯讼蓨鎇듧麃臣袂苣궼볯鎼볯ₘꆼ볯늼觧낕髧鲿귧ꮁ臣蒁臣꺁믤ꢡ髧ꪁ볯ꎼ볯邵黦銂胣뎛볯閼볯袼볯醼韦꺛볯誏臣뎛볯閼볯袼볯閼韦꺛볯ꮁꓧ馁胣뒼볯ꚼ裢캒誏臣ꎼ볯颼볯낼볯궼볯꺁볯ꎼ볯ꮁ臣蒁臣节郥颧臣邵黦貁ꛨ龯臣貂臣芀臣꺁뗧鲞臣覂胣ꎼ볯颼菣꾂菣뎃뿥钭臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥讧꿧ꦉ臣袂臣ꚁ鷩뢸臣鞢볥閁苣膀臣鞁臣ꦼ볯ꚼ볯誏臣ꦼ볯ꚼ볯超雧鞢볥ꒉ꟦覯觧ꮁ苣ꎁ臣궸꣧ꚺ臣鞢볥閁苣龁臣ꢁ臣龮꣨閁苣讂胣超雧鞢볥ꒉ臣ꚇ뷧鞁臣麃苣릂臣ꒁ臣ꚁ臣鞊軥릉闧蒚볯꒼볯鲿귧꺁鳦鶈臣릔雥貁胣銼볯ꖗ鯧ꮁꛨ龯臣貂볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ蟥꺽꿥뺯藧ꮁ臣蒁臣膀듧閼볯뺯볯薼볯膀臣貂臣鎼볯ꖗ鯧뺁臣ꮁ铦蒖臣骶臣袼꿥ꞅ臣钯볨鞁臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ蟥꺽臣뺯臣ꚁ鳦Ꞥ볯閼볯覼胣鶁苣ꮁ苣ꎁ臣鲿귧꺁胨薹胦貁껥벨臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 龔귥ꎼ볯钼볯㲕畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲋猯灵내菨꺁臣ꆁ臣ꎼ볯颼뷯㲂畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲋猯灵내菨꺁觥袐苣뾪臣龁胣鎼볯ꖗ鯧꺁蓨鎇듧麃迥뎁볯ꊼ볯ꎼ臣ꒁ臣ꚁ臣邵黦銂胣뎛볯隼볯ꮁꓧ鞁臣誁苣膀臣貂臣袂臣ꚁ胣超雧鞢볥ꒉ꟦覯觧貁藥ꎼ볯颼뷯㲂畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲋猯灵蚛鯥銂详Ꞥ臣讂臣ꢁ臣龮꣨閁苣讂胣뎛볯隼볯ꮁꓧ馁苣蚁臣膀ꓥꢃ裥꺁볯꒼볯讼蓨鎇듧麃迥뎁볯ꊼ볯ꎼ臣膀胣ꢂ菣Ꞃ苣뾂菣ꆃ菣ꪃ菣趀볯꒼볯銼볯㲬畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯辽⼼畳㹰ꇨ뺏黥銂鳦馁苣鎁臣貁ꛨ몇臣貂臣芀臣覂臣讂鿦늉껥鎨臣袂臣ꚁ胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ迥뎁볯늼볯鞼藥ꮖꋥ랼觥讧꿧ꦉ臣ꢅ볯辽뷯邽볯㲓畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲋猯灵뒼뷯薽뷯ꎼ볯钼볯내菨꺁볯銂苣骁臣ꮁ룦醰臣鮁苣鎁臣貁껥벨臣貂臣袼菣벃苣꾁ꓧ閁臣覼胣붿諥꺁鿦늉껥鎨臣袂臣ꚁ胣超雧鞢볥ꒉ臣ꎼ볯醼볯颼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰讼⼼畳㹰뷥ꪳ諨내菨꺁볯銂ꓥ隌臣鮁臣蒁臣ꢁ臣龮꣨閁苣龁볯螃菣뾂ꓧ閁臣覼胣ં䐼噉邀볯銼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤鞼볯超雧鞢볥ꒉ뷯늼볯ꆼ臣내迨꾃苣膃菣鲿귧銂ꋥ랼臣讂戼㹲 鎁臣龮雦设臣꾁胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ뷤ꢔ臣貂苣내迨Ꞁ뷯늼볯ꆼ菣벃苣꺁菣꾂菣뎃臣뺯臣讂뿥钭臣릊諥膀觧ꮁ듧貏胦鞊軥ꮁ꿥馁苣鎽뛦Ꞁ藥��뿥钭臣뺯臣讂藥ꮖꋥ랼觥꺁諥鲞볯鞊뷤ꎔ铧覼苣뾪臣龁胣ં䐼噉邀볯銼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁껥붖뻤ꞁ뷤ꢔ臣龁듧貏菣꾂菣뎃臣膀듧貏蓦鎟臣뺯臣讂飩ꆾ藥ꮖ苣邏뻤馁苣龁苣ꮁ뷥늩諦鎡裥躇臣몢ꯧ閁苣ꚁ臣讂듧貏諦龎菣鞃菣覃臣醃菣ꮃ苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ꟦覯觧꺁菣벃菣ꞁ臣ꎁ臣芀臣龁臣ꎁ臣膀臣꺁껥붖뻤ꞁ뷤ꢔ臣貂臣꾃苣膃菣꾁胣骤뻤趽볯꺼볯馃菣릂臣내迨꾃苣膃菣ꞁ臣ꎁ臣芀듧貏菣鞃菣覃諦龎뷯늼볯ꆼ꟦覯觧꾁胣骃菣膃菣鞊軥ꮁ꿥馁苣꾼볯ꚼ苣뎂菣覃臣膀臣鞁臣뺁臣膀苣ꎃ菣鞃볯ₑ閼胢궂菣莃菣袼볯趽볯袼볯馀볯邽뷯邽볯閼胢覼볯貽뷯邽볯邽볯膀볯馀볯뒼볯膀볯馀볯뒼볯膀볯邼볯貃苣것苣膃菣꺁菣ꪃ볯蚃菣ꮃ苣ꮐ鳦鞁胣醼裢ꆃ菣ꮃ裢랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣袼뷯醼꣎볯ꞁ껥ꢅ臣꺿ꏩ閁苣ꚁ臣龁胣讧꿧ꦉ臣뾽铧馁苣龁苣꺁뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯銂胣超裥ꪕ迥銼볯誏臣醼볯銼볯ꮁꓧ馁胣讧꿧ꦉ臣뾽铧馁苣龁苣꺁뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯銂藩鞈闧랏볯銼臣몤臣芀꟦覯觧ꞁ臣뾽铧꺁臣膂臣趽뷯늼裢醼볯銼迥뎁뷯覽볯銈볯钼볯銈볯邽뗧袐菩趽苣ꮐ苣设ꓧ蒚臣鎼胢떼볯늼臣膀藩鞈闧랏볯鎼臣몤臣芀臣貂苣꺁꟦覯觧꾁臣龁胣薿ꛨꮁ뿥颁臣膀ꓦ몇苣릮飦ꮁ臣讂臣膂臣꺼鳦꾫臣龁臣ꎼ鳦꾫臣蒁臣貂臣ꮁ苣钃菣벃菣뾂苣銂苣벃菣鞁뻥讂胣낕臣讂苣钃菣벃菣뾂苣銂ꧨ鎨臣龁볯ꚼ볯ꆼ볯膀볯馽뷯膀볯뒼胣ꢼ볯膀볯閼볯芀㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 내迨骃菣膃菣鞊軥趽볯꺼볯讧꿧ꦉ苣膀볯膀볯钼迥뎁볯颼韦꺛臣膀跥겋臣뺁臣꾁볯뒼볯꺼볯超雧鞢볥ꒉ뷯늼볯ꆼ꟦覯觧ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ胣鞊軥芁臣誂볯躼볯캒螽臣龁臣邼볯颼볎뷯꺁铧辇臣麃苣릂臣閊룤鞁臣芀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥꾁胣뚼볯閼볯궼ꓥ낕볯超裥ꪕ迥醼臣뢛뷥馁苣麃苣릂臣邃菣뢂菣뎃볯銂郥鎂臣蒁臣芀ꇨ薸苣膀蟥꺽觥ꪁ苣뎁臣醼볯膀볯颼迥뎁볯閼韦꺛臣ꆎ迥鞁臣芀듧貏菣鞃菣覃諦龎뷯늼볯ꆼ꟦覯觧颍诧ꞁ蟥蚐臣龁菣Ꚃ苣ꢁ胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ†뷯늼볯ꆼ꟦覯觧ꢁ뗧뾁郥辂臣龁듧貏菣鞃菣覃諦龎뷯늼볯ꆼ꟦覯觧ꞁ蟥蚐臣龁菣Ꚃ苣ꢁ臣鎖臣膀諦鎽뻤銂꿦莼臣龁胣袂苣颫铧辇볯邼볯颼볎뷯覼臣내迨Ꞁ諦龎菣鞃菣覃뷯늼볯ꆼ꟦覯觧ꞁ蟥꺽臣龁菣Ꚃ苣꾁胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ꟦覯觧ꢁ臣貐駦ꚇ뷧ꮁ苣ꎁ臣鞊軥릉闧蒚諦鎽뻤ꮁ꿥鞁臣궸꣧ꚺ臣릊黦銂ꓧ鞁臣袼菣벃苣꾁ꓧ閁臣覼胣鞁臣鞁胣뎛볯鞼臣몤臣袂臣ꮁ胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ꟦覯觧ꢁ臣貐駦��뷧꾁胣躽铧辇볯邼볯銼볎뷯覼臣내迨骃菣膃菣鞊軥趽볯꺼볯讧꿧ꦉ볯뎛볯鞼臣늼볯ꆼ†볯銼볯颼胣銼볯閼볯膀볯鞼볯鎼胣銼볯鎼볯膀볯閼볯鞼胣邼볯馼볯誏臣邼볯鎼볯ꢁ釥낁苣讂볯ꞁ蟥蚐臣貂臣麃苣릂臣誁臣ꚁ諦龎觧낕髧鞊뷤ꆾ臣뺯臣ꚁ鳦辄臣릊黦銂ꓧ鞁臣芀臣貂苣꺁뗧鲞臣覂胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥貁胣릉臣내迨趽볯꺼볯꾃苣膃菣讧꿧ꦉ臣袂苣躽铧辇臣뾽铧閁苣龁ꃥ袐臣膀듧貏뷯늼볯ꆼ菣꾂菣뎃꟦覯觧ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂臣내迨骃菣膃菣鞊軥ꮁ꿥馁苣鎽뛦Ꞁ藥ꮖ뿥钭苣鞢볥鞁臣鎁臣貁껥벨臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯骼볯늼볯뎼裢뎼볯ꦼ볯Ꞽ†뷯늼볯ꆼ꟦覯觧㲩牢ਾ†꟦薀臣꺨ꇩ꺁臣鎂臣誁臣讂볯膽뷯覤闧꺁賥겋髧ꪁꫨ뮟臣놠釥閁苣ꚁ臣讂볯낼뷯覽뷯銽胣ꦼ볯ꆼ볯薽뷯ₔ膽뷯躼볯銼볯醼볯覼볯膽뷯莽뷯銽†볯薽뷯躼볯銼볯銼볯閼볯銈볯钼볯鞼볯芀臣꺁ꫨ뮟臣袂臣ꚁ胣邵藨뒛藨貙臣誁臣讂볯늼볯뎼臣誸뷤鎼臣꺁鳦节ꃩ膹臣覤闧貁볯醼볯꒼胣Ꞽ볯銼볯誏臣Ꞽ볯鎼볯ꞁ臣讂臣ꢁ臣벨飦閁苣龁胣ꮼ볯ꆼ볯鞊藨趘뷯늼볯ꆼ菣벃苣꺁菣꾂菣뎃臣鞁臣뾽铧馁苣龁苣ꮁ胣鎁苣覂볯ꒁ臣覤闧꺁臣ꆁ臣醼臣銂郥肂볯ꒁ믤誸臣ꮼ볯ꆼ볯骃菣膃菣銂苣벃菣馁苣膀룤ꎀ臣覤闧鎽볯늼볯뎼†뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂ꫨ붣臣龁胣閁苣ꮁ胣ꮼ볯ꆼ볯꾃苣膃菣鲿귧ꮁ꿥馁苣趽볯꺼볯馃菣릂臣超雧鞢볥ꒉ臣릊黦銂ꫨ릁苣龁苣ꮁ胣超雧鞢볥ꒉ臣鞁臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ苣뎂菣覃臣讂藩鞈臣꺼鳦꾫臣龁臣ꎼ鳦꾫臣ꎀ뗧閁苣龁볯ꒁ믤誸臣覤闧鎽볯늼볯뎼菣鞃菣覃苣뎂菣覃臣讂룤ꎀ臣趽볯꺼볯讧꿧ꦉ苣뾪ꏨ鞁臣芀臣龁臣ꎁ臣膀臣貂苣꺁볯늼볯뎼裢뎼볯ꦼ볯Ꞽ†뷯늼볯ꆼ꟦覯觧ꮁ臣蒁臣膀菣꾂菣뎃諦龎볯螤闦꾏볯誏臣超雧鞢볥ꒉ臣膀郥颁뷯늼볯ꆼ꟦覯觧ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂臣蒁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 ꖻ룤꺁苣꺁苣뎂菣覃臣讂ꓥ낕뷤ꮼ볯ꆼ볯骃菣膃菣趽볯꺼볯讧꿧ꦉ苣뾪ꏨ鞁臣骼볯醼볯꒼胣Ꞽ볯銼볯뺁臣꾁볯醼볯꒼臣覤闧銂鳦馁苣醼볯辇뷤꺁菣鞃菣覃볯鶁臣ꊂ菣躃藩超裥꾁臣貂臣貂藩鞈闧랏볯閼胣馼볯ꮁꓧ馁볯鮼볯醼볯꒼胣Ꞽ볯銼볯뺁臣꾁볯醼볯꒼臣覤闧銂鳦馁苣銼볯辇뷤骃菣膃菣袼臣貂臣貂藩鞈闧랏볯颼胣醼볯邼볯鮼볯醼볯꒼胣Ꞽ볯銼볯뺁臣꾁볯醼볯꒼ꓥ낕苣覜臣讂볯閼蟩鎽菣鞃菣覃臣鎼臣꺁苣钃菣袼臣貂臣貂藩鞈闧랏볯邼볯鲀볯邼볯覼볯뺁臣꾁볯醼볯꒼胣Ꞽ볯銼볯뺁臣꾁볯醼볯��ꓥ낕苣覜臣讂볯閼蟩鎽菣鞃菣覃臣鎼臣꺁苣钃菣袼臣貂臣貂胣超裥ꪕ迥醼볯钼胣醼볯隼볯芀臣覂臣讂꟦覯觧꾁胣Ꞽ볯銼볯覤闧銂鳦馁苣銼볯辇뷤꺁菣鞃菣覃볯鶁苣麁苣膀藩鞈闧랏볯鎼볯鲀볯鎼볯覼臣龁臣躇铧讞볯閼蟩鎽菣鞃菣覃볯超裥ꪕ迥醼볯鎼볯꺁볯뎂菣벃臣龁臣鎼苣钃菣銂苣벃菣鞁臣芀觧骮臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀볯醼볯ꎼ臣ꮼ볯ꆼ볯覤闧꾁胣Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯뚼苣鞁臣꾁볯醼볯꒼臣覤闧膀臣龁臣鶁苣覂臣蒵臣袐苣鮁臣蒵臣袐苣鮁臣뾽铧閁苣鞾苣芀臣貂苣꺁ꓥ낕뷤ꮼ볯ꆼ볯骃菣膃菣銂苣벃菣馁苣貃苣것苣膃菣超裥꾁胣龮雦设볯ꮁ迦鮾臣貂臣蒁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 꺼鳦꾫臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ苣벃菣超裥銂鳦馁苣膀믤许臣节臣銂苣벃菣馁苣覤闧鎽볯늼볯뎼菣鞃菣覃裢뎼볯ꦼ볯Ꞽ†뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂ꫨ붣臣龁볯Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯뚼臣龁臣Ꞽ볯鎼볯覤闧銂鳦馁苣醼볯辇뷤骃菣膃菣袼臣꺁苣龃菣뢅藩鞈臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯邼볯鲀볯邼볯ꮁꓧ馁볯鮼볯醼볯꒼胣Ꞽ볯銼볯뺁臣꾁볯醼볯꒼臣覤闧銂鳦馁苣銼볯辇뷤骃菣膃菣袼臣貂臣貂藩鞈闧랏볯醼볯鲀볯醼볯覼볯Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯뚼臣龁臣Ꞽ볯鎼볯覤闧銂鳦馁苣醼볯辇뷤骃菣膃菣꺁볯ꒁ臣뎂菣벃볯鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯鎼胣醼볯閼볯鮼臣讂臣꾁볯醼볯꒼胣Ꞽ볯銼볯뺁臣꾁볯醼볯꒼ꓥ낕苣覜臣讂볯閼蟩鎽菣鞃菣覃臣鎼臣꺁苣钃菣袼臣貂臣貂胣超裥ꪕ迥醼볯隼胣醼볯颼볯芀觧骮臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀볯醼볯ꎼ臣ꮼ볯ꆼ볯覤闧꾁胣Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯뚼苣鞁臣꾁볯醼볯꒼臣覤闧膀臣龁臣鶁苣覂臣蒵臣袐苣鮁臣蒵臣袐苣鮁臣뾽铧閁苣鞾苣芀볯ꮜꯧꮁ볯뒼볯꺼볯뎂菣覃藩鞈苣覜臣讂臣貂苣꺁볯늼볯뎼菣鞃菣覃볯뒼볯꺼볯讧꿧ꦉ苣뎂菣覃臣讂믤ꢡ髧ꪁ菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣膀藩鞈闧랏볯銼볯誏臣銼볯銼臣몤臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 ꎼ鳦꾫臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ苣벃菣超裥銂鳦馁苣ꖻ룤銂苣벃菣鞁臣覤闧鎽볯늼볯뎼菣鞃菣覃裢뎼볯ꦼ볯Ꞽ†뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂ꫨ붣臣龁볯Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯뚼臣龁臣Ꞽ볯鎼볯覤闧銂鳦馁苣醼볯辇뷤骃菣膃菣袼臣꺁苣龃菣뢅藩鞈臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯醼볯鲀볯銼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂볯鮼볯醼볯꒼胣Ꞽ볯銼볯뺁臣꾁볯醼볯꒼臣覤闧銂鳦馁苣銼볯辇뷤骃菣膃菣袼臣貂臣貂藩鞈闧랏볯銼볯鲀볯銼볯覼볯Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯뚼臣龁臣Ꞽ볯鎼볯覤闧銂鳦馁苣醼볯辇뷤骃菣膃菣꺁볯ꒁ臣뎂菣벃볯鶁苣麁苣超��ꪕ迥醼볯閼胣醼볯鞼볯鮼臣龁臣Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯뚼苣鞁臣꾁볯醼볯꒼ꓥ낕苣覜臣讂볯閼蟩鎽菣鞃菣覃臣鎼臣꺁苣钃菣袼臣貂臣貂胣超裥ꪕ迥醼볯颼胣醼볯邼볯芀觧骮臣龮雦ꊽ藦ꞁ臣膀볯醼볯ꎼ臣ꮼ볯ꆼ볯覤闧꾁胣Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯뚼苣鞁臣꾁볯醼볯꒼臣覤闧膀臣龁臣鶁苣覂臣蒵臣袐苣鮁臣蒵臣袐苣鮁臣뾽铧閁苣鞾苣芀볯ꮜꯧꮁ볯뒼볯꺼볯뎂菣覃藩鞈苣覜臣讂臣貂苣꺁볯늼볯뎼菣鞃菣覃볯뒼볯꺼볯讧꿧ꦉ苣뎂菣覃臣讂믤ꢡ髧ꪁ菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣膀藩鞈闧랏볯銼볯誏臣銼볯鎼臣몤臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 鎁苣覂臣讧꿧ꦉ臣뺁臣膀ꓦ몇苣릮飦ꮁ臣讂臣膂臣꺼鳦꾫臣龁臣ꎼ鳦꾫臣蒁臣貂臣ꞁ苣钃菣벃菣뾂苣銂苣벃菣鞁뻥讂胣낕臣讂苣钃菣벃菣뾂苣銂뷤ꢔ臣ꚁ苣袂臣袼뻤袁臣膀볯겼볯Ꞽ胣궼뷯莽胣ꎼ볯膀볯ꆼ胣뚼볯覼胣閁苣ꮁ胣ꢅ臣꺁꟦覯觧꾁胣궂菣莃菣醼†볯馀苣ꎃ菣鞃볯鞼뷯Ꞽ볯閼胢覼뷯邽뷯袼볯馀볯꺼뷯趽뷯꺼뷯覼胣閼胢떼볯늼胣鎼胢떼볯늼胣鶃菣ꆼ菣벃菣銂郥뾁胣鶁臣ꚁ볯銈菣膃菣銈苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃볯趽볯캑覼臣貮藥ꮁ뿤뺣臣貂臣芀꟦覯觧ꮁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣设ꓧ蒚臣閼胢떼볯늼苣膀藩鞈闧랏볯醼迥뎁볯鎼볯鎼臣몤臣芀꟦覯觧ꮁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣设ꓧ蒚臣鎼胢떼볯늼苣膀藩鞈闧랏볯銼臣몤臣芀꟦覯觧ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣龁苣꺁뷯覽볯銈볯銼볯誏臣趽뷯늼裢醼볯銼裢鎼뷯邵郥ꢃ뷤銂郥肂뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯꾁胣超裥ꪕ迥銼볯ꮁꓧ馁胣ં䐼噉邀볯鎼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†볯늼볯뎼ꓥ낕뷤骃菣膃菣袼ꓨ낕迥覼뷯늼볯ꆼ菣꾂菣뎃꟦覯觧뺁臣꾁볯늼볯뎼ꓥ낕뷤骃菣膃菣袼ꓨ낕迥覼菣꾂菣뎃裢뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣蒁臣貂臣ꞁ蟥꺽臣龁菣Ꚃ苣ꮁ臣醁苣꾃苣膃菣鲿귧銂ꧨ鎨臣讂臣膂臣膀菣Ꚃ苣袼볯겼볯銈볯誼볯醼볯邼볯뺁臣꾁볯겼볯銈볯誼볯骼볯醼볯뒼뷯莽뷯躽뷯莽볯銂胣ꮼ볯ꆼ볯覤闧鎽菣鞃菣覃菣꾂菣뎃뷯늼볯ꆼ꟦覯觧袼뻤袁臣膀藩鞈闧랏볯閼胣醼볯隼臣蚁臣꺁볯ꒁ苣뎂菣覃臣讂볯뺁臣꾁볯늼볯뎼ꓥ낕뷤骃菣膃菣꾃苣膃菣銈볯뒼볯꺼볯超雧鞢볥ꒉ뷯늼볯ꆼ꟦覯觧袼뻤袁臣膀藩鞈闧랏볯邼볯銈볯鎼볯꺁臣ꆁ臣醼臣銂苣벃菣馁苣覼苣ꢔ臣ꚁ蟥꺽臣讂胣麃苣릂苣醼韦꺛迥뎁볯閼韦꺛臣训苨薆臣超雧鞁볯邼볯閼뷯螽볯讽뷯覼胣鶁臣ꚁ볯銼韦꺛臣ꂱ껦馁苣芀볯꒼볯꾃苣膃菣鲿귧銂ꧨ鎨臣讂臣膂臣膀볯꒼볯讼蓨鎇듧麃迥뎁볯ꊼ볯ꎼ苣膀볯辽뷯��螽뷯낼뷯閽뷯袼闥馨볯袼볯銽뷯蚽뷯貽뷯覽뷯ꆼ볯ꊼ볯₤ꊼ뷯辽뷯莽뷯薽뷯莽뷯鎽볯銂郥肂볯꺁귥ꢜ룤ꞁ胣覤闧鎽볯늼볯뎼菣鞃菣覃볯Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯뚼臣龁臣Ꞽ볯鎼볯覼臣龁臣躇铧讞볯늼볯뎼菣鞃菣覃볯骃菣膃菣芁臣誂볯캑螽볯趽뷯覼臣蒁臣貂臣銂铧蒁臣膀苣辰볯鞼뫥ꞁ볯芙雩ꢂ苣붂菣鲃臣趆裥肿臣龁胣ꆬ臣ꞁ胣ꎼ볯颼菣꾂菣뎃뿥钭苣膀볯ꚼ볯銈돎迥뎁볯뺁臣꾁볯꺼볯銈뇎臣ꒁ臣ꚁ臣내菨薆鿦늉볯ꦼ볯뎼볯ꮁ苣ꎁ臣閩뻤鞁뻥讂胣ꮼ볯ꆼ볯覤闧鎽菣鞃菣覃菣꾂菣뎃裢뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣ꚇ뷧鞁臣麃苣릂臣誁臣讂볯ꚼ볯銈돎迥뎁볯뺁臣꾁볯꺼볯銈뇎臣ꦼ볯뎼뿥钭臣鞢볥꾁胣ꮼ볯ꆼ볯覤闧鎽菣鞃菣覃菣꾂菣뎃뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂铧蒁臣ꚇ뷧ꢁ꿦莼臣ꚁ胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥貁胣ꮼ볯ꆼ볯릉闧蒚볯꒼볯꾃苣膃菣鲿귧銂ꋥ랼臣讂臣ꢁ苣몤臣芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯骼듦Ꞁ賥貁苣몁볤邭볯늼볯뎼ꓥ낕뷤骃菣膃菣趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣蒵臣袐苣鮁臣超雧鞢볥ꒉ뷯늼볯ꆼ꟦覯觧꺁뷤ꢔ戼㹲 鎁臣龮雦设臣꾁胣覤闧鎽볯늼볯뎼菣鞃菣覃뷯늼볯ꆼ꟦覯觧꾁胣覤闧鎽볯늼볯뎼菣鞃菣覃臣뺯臣讂藥ꮖ뿥钭苣鞢볥馁苣龁苣ꮁ胣ꖈ胥꺁꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣蒵臣袐苣鮁臣뾽铧閁苣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†볯늼볯뎼臣膀菣袃臣貁苣ꮁ臣蒁臣肜苣뮠맧ꮁꓥ낕臣讂臣鎂臩鶼귥ꞁ臣讂볯蒴볯閼볯覼胣ꮼ볯ꆼ볯覤闧꾁胣뮸臣蒁臣ꒁ臣꺁胣鮃菣袃苣鶃菣袃胣ꞁ駧龔臣膀臣鎂臩鶼귥銂듦Ꞁ賥馁苣芀믤趉臣钠ꧧ꾁胣몙臣鎂胦膪蓧覤闧ꮁ觧낕髧ꪁ볯내菨銂菦략臣讂菨鮊臣邙苣貂臣蒁苣鎁臣銂ꓧ鞁臣蒁臣芀臣讁臣膀臣貂臣Ꞥ菩蚈臣肜苣肸裨蒚臣ꢼ볯ꆼ꿥讫臩鶼귥袼볯銼胣붙뫤꺁듧閼볯薼臣龔臣讂볯꺁諧膳臣財苣貂臣芀臣辁鳦醿臣ꪁ臣ꚁ胣袼뷯覼觧낕胦뒼듧麃臣膀臣뺁苣肸裨蒚臣ꪁ臣ꢼ볯ꆼ꿥讫臩鶼귥袼볯醼볯膀볯颼볯꺁諧膳臣릂ꫧ뚄ꓥ낕臣뺯臣ꚁ铧邈臣貂뻥膀臣鞁臣袼뷯覼苣궂苣鎃菣ꞁ臣貂苣꺁듧麃苣鞢껦閁臣膀臣貂苣銂苦薀臣뮧藥鞁臣뮈臣鎁臣꾁胣몂駧ꎂ胨ꮁ臣蒁臣螊髧ꪁ藨趘迥鲿苣銪믤鞁臣鎁臣貁껥벨臣貂臣芀볯꺼†볯躽뷯貽†볯궼뷯蒽†볯邼볯隼볯鎼볯閼볯銼볯閼볯銈볯銼볯銼†볯薽뷯薽뷯芽뷯銽†볯貼볯邼볯隼볯꾼볯骼볯邼볯醼볯閼볯込볯ꖼ볯궼뷯膽볯隼볯馼볯鞼볯覼胣ં䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†룤風臣ꢡ볯ꮁꓧ馁��蚁臣膀볯늼볯袼뗧뢅鯧뢅駧覼臣꾁胣鎼臣꺁ꓥ낕볯Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯꒼胣誏臣Ꞽ볯鎼볯覼臣뾁臣膀臣꺁苦Ꞁ藨趘臣誁臣讂볯늼볯뎼ꓥ낕臣馼볯薼苣ꂍ苣讂胣閁苣ꮁ胣ꢅ臣꺁볯늼볯ꎂ胨銂꣦隺닦芙臣鞁臣ꮼ볯ꆼ볯覤闧ꮁ臣蒁臣몁볤邭黥몱껥鞁臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㔱㰰愯㰾䐯噉ਾਊ䐼噉邀볯鎼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†裥꺁볯꾼볯궼볯ꎼ菣벃苣뮂菣袃臣꾁胣邵藨뒛藨貙臣誁臣讂볯늼볯뎼ꓥ낕臣蚁臣鞼볯躼볯颼볯貁胣鎁苣覂臣鎼臣꺁ꓥ낕볯Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯꒼胣誏臣Ꞽ볯鎼볯覼臣袂臣ꚁ跥膂苣貂臣蒁苣袼ꇨ隼볯芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㔱㰱愯㰾䐯噉ਾਊ䐼噉邀볯鎼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†볯銽뷯辽뷯覂臣膀臣貂臣貂볯늼볯뎼胣ꮼ볯ꆼ볯膀迥뎁볯늼볯뎼臣ꒁ臣ꚁ胣ꊂ苣붂菣ꦂ菣ꂃ觧낕髧ꪁ苧膪蓧覤闧릉闧Ꞁ苣鲤꣨鞁臣膦듧鞁臣袼볯銽뷯辽뷯ₒ薽뷯ₔ膽뷯躼볯膽뷯莽뷯銽†볯薽뷯躼볯邼볯銼†볯膽뷯ₙ醼볯鮼볯銼볯醼볯覼볯銼볯閼볯銈볯钼볯鞼볯芀郥릂ꫧ뚄ꓥ낕苣覜臣讂藨趘臣辷闦銂ꇨ馁菣벃苣銂胣ꎼ볯뎼볯ꦼ볯隽볯銼臣뺔蟥讁苣ꞅ郥鞁臣芀郥貁苣讞臣蒐苣ꒂ苣閃苣벃菣ꮁ臣蒁臣肜苣뮠뫥꺁ꯩ蒁ꓥ낕臣놠釥閁苣ꚁ臣讂볯낼뷯覽뷯銽苣꺁臣ꢡ볯銂迥ꞅ臣鎁臣覼胣ં䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†臣覂臣膀뫤ꆬ볯늼볯뎼ꓥ낕臣膀볯Ꞽ볯늼臩궖胨Ꞁ苦薀臣誁臣ꚁ郥骮臣貂臣蒁苣芀볯ꆼ볯꾁胣ꖼ볯ꚼ볯꺁룤膵臣芁苣膀臣貂臣ꖼ볯ꚼ볯꺁雦芙돦ꮁ꿥馁苣邀胦꺁ꧦ讧苣讧裦馁苣鎁臣貁ꛨ몇臣貂臣芀볯Ꞽ볯늼臩궖胨Ꞁ볯늼볯뎼ꓥ낕藨趘臣膀鳦躘듧뢛臣讖ꓧ閁苣讂뗧邈觧誏臣릖돦銂铧蒁臣馨髧隌臣貂뻥讂胣醰闦꺁苣벃苣ꞁ臣膀郥颁苦薀臣螤闦꺁볯늼볯뎼ꓥ낕臣貐껥閁苣龁볯肜ꓥ钼臣꺁闧ꪁ苣覤闧貁郥芙臣몙铧馁苣覼胣꒼뷯膽뷯覂臣膀볯Ꞽ볯늼臩궖臣늍뻥貾臣鎁苣覂臣貺곦ꮼ볯ꆼ볯覤闧銂ꃥ誑臣ꚁ臣誂볯鲣臩꺁ꇨ銼苣芏藧꺁臣ꢁ볯膀迥뎁볯覽뷯膽뷯薽苣꾁胣ꖼ볯ꚼ볯꺁雦貾臣貺곦ꮼ볯ꆼ볯覤闧銂ꃥ誑臣ꚁ臣讂볯뎛볯芽迥ꞅ苣芏藧꺁臣ꢁ볯袼볯覽뷯骽†뷯钽†뷯貽볯貼볯袽뷯₅趽뷯貽뷯莽뷯貽뷯銽†뷯隽뷯貽뷯钽뷯辽뷯₎辽뷯₆膽뷯閽뷯閽뷯銽뷯蒽†뷯薽뷯覽뷯钽뷯躽뷯薽†뷯辽†뷯膽뷯螽뷯钽뷯蒽†볯Ꞽ볯늼†뷯貽뷯莽뷯膽뷯薽†뷯躽†뷯辽뷯辽뷯薽뷯钽뷯貽†뷯膽뷯莽뷯銽뷯貼볯膽뷯閽뷯薽†볯颼볯骼볯鎼볯袼볯邼볯銼볯鮼볯覽뷯膽뷯薽†��钽†뷯貽볯ꖼ뷯薽뷯螽뷯躽뷯薽†뷯蚽†볯늼볯뎼†뷯閽뷯膽뷯覽뷯躽뷯ₓ膽뷯蒽†뷯莽뷯閽뷯銽뷯蒽†뷯薽뷯覽뷯钽뷯躽뷯薽†뷯辽†뷯躽뷯覽裢ꖼ볯ꚼ볯₲钽뷯薽뷯膽뷯馽†뷯躽†뷯辽뷯辽뷯薽뷯钽뷯貽†뷯膽뷯莽뷯銽볯꺼뷯钽뷯銽뷯₅钼볯隼볯閼볯銼볯銼볯醼볯覼볯芀臣꺁ꓥ낕苣骃苣袃菣꾁胣邵藨뒛藨貙臣誁臣讂軥몙胦ꮅ飧龃苣뮂菣릂ꓥ낕뷤ꢁ냥ꪁ臣ꢁ苣芁苣讨뫥꾁闧ꪁ苣袂臣ꮁ胦辂苣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†鯥醼볯ꮁꓧ馁苣蚁臣膀볯늼볯뎼臣邵藨뒛藨貙臣誁臣ꚁ苣覤闧鞁臣蒁苣貁胣莽볯覽뷯낼뷯銽뷯膽뷯ꞁ裥ꢔ迥붃臣螃菣뾂臣蚈黦ꮁ鿥ꖁ臣ꚁ胣ꮼ볯ꆼ볯袂苣节뷤蒁ꃩꚺ臣芁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 겜껥붖뻤ꞁ臣膀该ꦉ臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣醼臣꺁듦Ꞁ賥貁苣몁볤邭ꫧ뚄ꓥ낕菣鞃菣覃胣设臣낁胣醰臣辁臣节볯ꒁ臣뮴胦隌볯늼볯뎼ꓥ낕苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ苣颍诧ꞁ胣뺁臣꾁藥ꮖꋥ랼觥趽볯꺼볯讧꿧ꦉ胣设臣낁胣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯뒼볯꺼볯₧趽볯꺼볯讧꿧ꦉ胣设臣낁胣超裥ꪕ迥醼胣醼볯꺁臣骁苣讁臣몤臣貂苣超裥銂苣벃菣馁苣膀뻤袁臣膀藩鞈闧랏볯ꮁꓧ閁苣誏臣超裥ꪕ迥醼볯馼臣몤臣貂苣貃苣것苣膃菣超裥銂苣벃菣鞁臣ꊂ菣躃藩超裥銂鳦馁苣膀볯醼볯閼볯覤闧銂郥肂꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣銃菣뎼볯ꦼ볯Ꞽ苣뎃菣꾂돨銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣ꦁ臣蒵臣袐苣鮁臣ꮐ苣超雧뾪꿧뮲駧蒵裦ꦉ苣閊룤馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 设ꓧ蒚臣ꮼ볯ꆼ볯覤闧鎽菣鞃菣覃藩鞈迥뎁뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂ꇨ鞼胣馼臣몤臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㔱㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀ꇨ颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㌵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㔱㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ賥ꚭ볯Ꚃ菣뢂菣꺿ꏩ閁苣龁볯醼裢ꆃ菣ꮃ苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃볯趽볯캑覼戼㹲ꎼ뷯邽볯ꎼ볯㲑牢ਾ볯膽뷯貽볯뒼볯邼볯㲐牢ਾ볯馀볯뒼볯超裥袼꣦隺볯馀볯貽뷯躽뷯袼铧邈볯낼볯뒼볯ꢃ뷤讼볯馀볯뒼볯覼苣ꮐ苣覼볯뒼볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯뒼볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯袼藩鞈闧랏볯醼볯㲉牢ਾ볯馀볯뒼볯超裥袼菣궃菣벃苣벃臣鞁볯骼볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ��Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯㲣牢ਾ볯超裥ꪕ迥醼볯钼볯㲉牢ਾ볯馀볯뒼볯超裥袼菣袃볯馀볯뒼볯₲뢼뷯膽볯ꪁ臣覼볯뒼볯ꆼ볯ꆼ볯뒼볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯Ꞽ볯뒼볯Ꞽ볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯뒼볯뒼볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯Ꞽ볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯뒼볯뒼볯뒼볯ꆼ볯뒼볯ꆼ볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯超裥ꪕ迥銼볯覼㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꒂ菣鎃菣ꞁ臣ꮼ볯ꆼ볯鞊軥鲿귧ꮁ꿥馁苣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣릊黦銂ꫨ릁苣龁苣꺁鳦鶈臣钠ꧧꮁ臣蒁臣膀볯겼볯銈볯誼볯骼볯醼†볯螽菣Ꚃ苣袼볯膽뷯辽뷯覽뷯膀돧놵볯隼볯馼볯膀뷯鶼볯覼臣膀믤许臣袂臣ꮁ胣覤闧鞁臣ꮼ볯ꆼ볯銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯銂諦躸臣讂볯覤闧鞁臣ꮼ볯ꆼ볯銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯袼跥겋臣뺁臣꾁볯뒼볯꺼볯ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ볯銂볯ꖗ鯧ꮁ諦躸臣膀볯ꖗ鯧ꮁ軦股臣膀ꓥ낕臣龁볯늼볯뎼苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ볯颍诧ꞁ臣龁臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣蒵臣袐苣鮁臣覼苣醼볯ꖗ鯧ꮁ諦躸臣膀该ꦉ苣銼볯ꖗ鯧ꮁ뇥몮臣龁胣ꚩ꣩꒾苣膀곦꺁苣蚁臣ꢡ볯邼臣몤臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㔵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 趽볯꺼볯銂볯躼볯趽뷯込뷯螽볯開觧銼볯螽臣龁苣醼볯閽뷯覼臣ꢔ蟩ꞁ该ꦉ臣閊룤馁苣芀볯늼볯뎼迥뎁볯뒼볯꺼볯讧꿧ꦉ臣醼볯醼臣钯軧ꞁ諦躸臣貂苣芀苣궂苣鎃菣趆裥肿볯骃菣膃菣芁臣誂볯캑螽볯趽뷯覼苣膀볯辽뷯螽뷯낼뷯閽뷯袼볯銽뷯蚽뷯貽뷯覽뷯₎ꆼ볯꺁귥ꢜ룤膀苣辰볯鞼뫥ꞁ볯芙雩ꚩ꣩馁苣芀듧麃蛥떂苣袃苣ꒂ菣鎟觨袼볯ꎼ볯覼苣膀볯늼볯뎼†볯醼볯꒼胣ꮼ볯ꆼ볯₳Ꞽ볯銼볯膀볯늼볯뎼†볯醼볯꒼胣ꮼ볯ꆼ볯₳Ꞽ볯銼볯뒼胣ꮼ볯ꆼ볯₳Ꞽ볯鎼볯뒼胣誏臣骃菣膃菣ꪁ臣ꮁ臣蒁臣ꚩ꣩馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꮼ볯ꆼ볯覤闧銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯銂胣颍诧ꞁ臣龁臣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯뒼볯꺼볯銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ胣뒼듧麃苣龔裦馁苣붃諥ꮁ臣蒁臣ꚩ꣩馁苣芀볯늼볯뎼ꓥ낕苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ臣覜諥Ꞁ臣膀뻤袁臣膀菣鞃菣覃菣꾂菣뎃軦꺨臣钯볨閁苣讂胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥꺁諥鲞臣膀볯늼볯뎼ꓥ낕菣鞃菣覃跥겋臣袂苣ꚇ뷧ꢁ볯뒼볯꺼볯超雧鞢볥ꒉ臣꺁뗧뾁郥辂臣ꮁ苣讂蟥꺽臣銂꿦莼臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ뇦骮臣��貂苣芀뻤袁臣膀볯꒼볯꾃苣膃菣鲿귧꾁胣겜飦내鯦궸臣風볨閁苣讂苣蚁臣膀볯ꚼ볯銈돎迥뎁볯뺁臣꾁볯꺼볯銈뇎臣ꒁ臣ꚁ臣내菨薆鿦늉볯ꦼ볯뎼볯ꮁ苣ꎁ臣閩뻤閁苣鞾苣芀볯늼볯뎼ꓥ낕뷤骃菣膃菣꾃苣膃菣趽볯꺼볯讧꿧ꦉ跥겋臣꺁蟥꺽臣钯볨鞁臣膀볯뒼볯꺼볯超雧鞢볥ꒉ뷯늼볯ꆼ꟦覯觧ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ볯늼볯뎼ꓥ낕뷤骃菣膃菣꾃苣膃菣ꞁ蟥꺽臣龁菣Ꚃ苣ꮁ臣醁苣ꦼ볯꺼裢캒誏臣込臣龁臣뒼볯ꚼ裢캒ꮁ꿥馁苣ꦼ볯뎼뿥钭臣鞢볥ꮁ苣ꎁ臣膀볯뒼볯꺼볯超雧鞢볥ꒉ臣膀볯늼볯뎼觧낕髧ꎼ볯颼菣꾂菣뎃뿥钭苣鞢볥馁苣鎁臣貁ꓧ閁苣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†볯뒼볯꺼볯超雧鞢볥ꒉ뷯늼볯ꆼ꟦覯觧貁ꓥ낕뷤ꮼ볯ꆼ볯骃菣膃菣鞊軥趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣颧胣ꪁ闧ꪁ苣ꊽ藦ꮁ꿥馁苣超雧鲿귧ꮁ迥벁臣놽鿩銂ꫨ릁苣龁苣꺁곧銼臣钠ꧧꮁ臣蒁臣膀볯겼볯誼볯誼볯醼볯邼볯ₑ뒼뷯麃苣릂볯뒼뷯莽뷯躽뷯莽胣ꪠ볯隼볯邼볯膀뷯鶼볯覼臣膀믤许臣ꢁ臣誂볯뒼볯꺼볯超雧鞢볥ꒉ뷯늼볯ꆼ꟦覯觧ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ胣꺨胣꺁闧ꪁ苣ꊽ藦꺁ꓥ낕臣龁볯늼볯뎼菣鞃菣覃諦龎뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯銂諦躸臣讂볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣蒵臣袐苣鮁臣覤闧ꮼ볯ꆼ볯銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯銂볯ꖗ鯧ꮁ諦躸臣膀볯ꖗ鯧ꮁ軦股臣膀볯뒼볯꺼볯ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁꓥ낕臣龁볯늼볯뎼苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ苣醼볯ꖗ鯧ꮁ諦躸臣膀볯銼韦꺛臣開觧銂뇥몮臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ鎨臣龁ꓥ낕뷤ꮼ볯ꆼ볯讧꿧ꦉ臣꺨ꇩ꾁믤许臣ꢁ臣誂臣芁臣龁볯袼뷯覼볯醼볯꒼胣Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯꒼臣龁臣Ꞽ볯銼볯覤闧袼胣肸蟩薠胣覼臣蒁臣貂臣銂郥肂跥肸ꓥ낕뷤ꮼ볯ꆼ볯₳銼볯辇뷤骃菣膃菣鞊軥銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯鮼볯覽뷯覼볯ꒁ臣銼볯辇뷤骃菣膃菣鞊軥꺁苣뎃苣蚃菣벃苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ볯鞁臣貁臣ꚁ볯閼蟩鎽苣鲽ꏨ馁苣覼胣鶁苣麁苣醼臣꾁볯醼볯꒼胣Ꞽ볯銼볯誏臣Ꞽ볯鎼볯覤闧銂郥肂볯貀볯늼볯뎼裢鎼볯떼볯趀볯鮼볯覽뷯覽볯鶁苣麁苣꺁볯ꒁ臣Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯뚼胣Ꞽ볯鎼볯誏臣Ꞽ볯銼볯覤闧銂郥覜臣讂胣钼臣꺁볯閼蟩鎽菣鞃菣覃諦龎臣뎂菣ꮂ菣麃菣袼臣龁臣ꎁ臣醼볯邼蟩鎽苣鲽ꏨ馁苣覼苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ볯貀볯늼볯뎼裢钼볯떼볯趀볯鮼臣龁臣袼뷯隽볯肸럧ꮁ郥芙諦躸臣貂臣钼臣꺁裥薀臣趽볯꺼볯膀臣貂臣貂볯醼볯꒼胣Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯꒼臣龁臣Ꞽ볯銼볯覤闧꺁臣骁苣讁苣ꮐ苣颍룤覤闧鎽볯��늼볯뎼†볯閼蟩鎽菣鞃菣覃諦龎苣뎂菣覃臣讂볯貀跥肸韃볯趀볯芀㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 Ꞽ볯銼볯₤銼볯辇뷤꺁苣龃菣뢅藩鞈迥뎁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈苣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯颼迥뎁볯颼볯ꮁꓧ馁胣Ꞽ볯銼볯₶銼볯辇뷤꺁苣龃菣뢅藩鞈迥뎁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈苣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯馼迥뎁볯颼볯ꮁꓧ馁胣Ꞽ볯鎼볯₤銼볯辇뷤꺁苣龃菣뢅藩鞈迥뎁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈苣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯邼볯誏臣醼볯鞼臣몤臣芀볯醼볯ꎼ볯閼蟩鎽臣ꊂ菣躃藩超裥誏臣貃苣것苣膃菣超裥銂胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯醼迥뎁볯馼볯ꮁꓧ馁胣ꮼ볯ꆼ볯銈볯궼볯뒼†볯閼蟩鎽臣ꊂ菣躃藩超裥誏臣貃苣것苣膃菣超裥銂胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯閼迥뎁볯馼볯ꮁꓧ馁胣ꮼ볯ꆼ볯銈볯궼볯뒼†볯邼볯辇뷤꺁苣龃菣뢅藩鞈迥뎁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈苣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯馼볯誏臣醼볯颼臣몤臣芀볯늼볯뎼裢钼볯떼볯₴醼볯邼蟩鎽臣閁苣ꪁ苣貃苣것苣膃菣超裥銂胣超裥ꪕ迥醼볯銼볯誏臣醼볯銼볯ꮁꓧ馁胣ં䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ鎨뻧銂믤许臣ꢁ臣誂ꇨ醼볯ꮁꓧ馁胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㔱㰶愯㰾䐯噉ਾਊ䐼噉邀볯鎼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†뷯늼볯ꆼ苣膀볯躼볯趽뷯込뷯螽볯開觧銼볯螽臣龁苣醼볯캐螽볯꺁铧辇臣開觧ꮁ諦躸臣讂胣ꮼ볯ꆼ볯誏臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ꟦覯觧꾁胣醼볯醼臣钯軧ꞁ諦躸臣讂胣ꢂ苣붂菣鲃蛥몈뿦袼菣鞃菣覃臣龁苣醼볎뷯込뷯貽볯銂胣Ꞽ뷯貽뷯覽볯貽뷯螽볯ꊼ뷯薽뷯薽뷯蒽뷯躽†볯覼臣颭鳥许胣뮂냦鎼볯ꚺ臣钼駦鎖ꧨ鎨臣讂胣내菨薆苣ꒂ菣ꮂ苣뎃鿦늉볯ꦼ볯뎼볯銂胣ꮼ볯ꆼ볯₳Ꞽ볯銼볯膀볯늼볯뎼†볯醼볯뚼胣ꮼ볯ꆼ볯₳Ꞽ볯鎼볯膀볯醼볯ꎼ胣ꮼ볯ꆼ볯₳Ꞽ볯銼볯뒼胣ꮼ볯ꆼ볯₳Ꞽ볯鎼볯뒼胣誏臣骃菣膃菣ꪁ臣ꮁ臣蒁臣ꚩ꣩馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯뒼볯꺼볯銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ볯늼볯뎼ꓥ낕苣뎂菣覃臣讂꣧薀臣趽볯꺼볯貁볯내菨鲿귧銂铧邈臣讂菨鮊苣ꚩ꣩鞁臣膀꣧薀臣낕臣讂볯늼볯뎼꟦覯觧ꮁ꿥馁苣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥꺁諥鲞臣钯볨銂迥붃臣馁苣芀뻤袁臣膀볯꒼볯꾃苣膃菣鲿귧꾁胣겜飦내鯦궸臣風볨閁苣讂苣蚁臣膀볯ꚼ볯銈돎迥뎁볯뺁臣꾁볯꺼볯銈뇎臣ꒁ臣ꚁ臣내菨薆鿦늉볯ꦼ볯뎼볯ꮁ苣ꎁ臣閩뻤閁苣鞾苣芀㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯邼볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥ꢁ뗧뾁郥辂臣龁볯낼볯꾃苣膃菣ꮁ苣讂뫤��늘髧뺁臣꾁닦芙髧ꪁ菣꾂菣뎃軦꺨臣膀藨趘ꋥ隮苣뮘껥馁苣㲋牢ਾ†鳦龮雦设臣꾁胣뒼볯醼藨趘듧麃臣膃菣것菣뢂臣讂觥膀臣貂臣貐駦ꮁ胣뺁臣꾁臣꺁뻥ꞁ胣麃苣릂苣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ볯낼볯꾃苣膃菣ꞁ蟥꺽臣龁胣뒼볯銈볯꾁胣鎽ꧨ肊ꇨ蚈蟩ꮁ臣蒁臣겅鿧꺁볯낼볯醼볯ₖꖼ볯몙迧麃苣릂藨趘菣螃菣ꞁ臣讂볯设臣낁胣ꊼ뷯銽뷯讽뷯鞽뷯膽뷯₋薽뷯ₔ膽뷯躼볯銼볯醼볯覼볯銽뷯莽볯꺼뷯钽뷯躼볯莽뷯蒽볯뎼뷯覽볯떼볯ꆼ†볯醼볯骼볯閼볯馼볯銈볯銼볯馼苣芏藧꺁臣ꢁ볯芀臣꺁껥붖뻤ꞁ뷤ꢔ臣龁볯낼볯꾃苣膃菣꾁胣龮雦设볯ꮁ꣨覼臣龁苣蚁臣膀鳦躘듧뢛臣鶁苣麁苣覽볯隼볯ꖼ볯誏臣鎽볯隼볯ꖼ볯ꢁ釥낁苣讂胣내菨薆臣龁臣꾏뫦Ꞁ뷥讅臣ꢼ볯뚼볯隼諦龎볯隼迥뎁볯鞼臣蒁臣貂臣銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣芁臣龁胣鎁臣龮雦设臣뾽铧鞁臣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯뒼볯꺼볯超雧鞢볥ꒉ臣膀껥붖뻤閼臣風볨鞁臣袂臣ꮁ胣뚼볯閼볯궼ꓥ낕苣ꮐ苣ꞁ臣龁胣ꢼ볯뚼菣꾂菣뎃꟦覯觧誏臣超雧鞢볥ꒉ꟦覯觧銂胣궼볯鎼蓨ꪳ菣躃닧邭룤ꮁ藥ꚇ雦鞁臣芀觧骮臣麃苣릂苣뺁臣膀藥ꮖ菣Ꞃ菣꾂菣ꒂ菣袃飩뎮觥袼諦ꎼ볯겼볯銈볯뺁臣꾁諦낼볯銈볯꺁臣骁苣讁볯ꞁ苣ꚇ뷧鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 ꢼ볯뚼볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ菣꾂菣뎃軦꺨臣袺飩뮴胦銂ꫨ릁苣견볯뮂菣袃臣龮꣩ꞁ臣膀볯閼볯込볯隼菣Ꚃ苣銂胣袼뷯覼裢鞼韦꺛迥뎁裢醼볯ꖗ鯧膀臣龁臣袼뷯覽볯醼韦꺛迥뎁볯ꖗ鯧꺁臣骁苣讁臣膀볯躼볯趽뷯込뷯螽臣ꢼ볯뚼볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ菣꾂菣뎃볯鎽볯隼볯ꖼ볯뺁臣꾁뷯ꖼ볯込볯鞼臣蒁臣貂臣銂苣벃菣馁苣覼臣训苨薆돦蒰臣袂苣膀臣꺁뻥醼韦꺛臣銼韃볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰閼⼼畳㹰胥꺁볯ꎼ볯내菨꺁髧许돦蒰臣袂臣ꚁ胣ꚇ뷧鞁臣芀觧骮臣麃苣릂苣뺁臣膀볯膀볯誏臣醼볯ꖗ鯧ꮁ諦ꎼ볯겼볯銈볯袼苣궃菣뎃볯ꢼ볯邼볯뺁臣꾁諦낼볯銈볯袼볯궼볯醼裢醼볯覼臣蒁臣貂臣銂铧蒁臣ꚇ뷧鞁臣芀뗧芙髧ꪁ藨趘껥趩臣鞁臣놠釥閁苣讂믤ꢡ髧ꪁ뗧鲞臣膀鯥醼볯ꆼ胣뎛볯馼볯꺁苣ꦃ菣ꮁꓧ閁苣膀臣鎁臣뎛볯馼볯誏臣뎛볯馼볯꾁胣鎽볯隼볯ꖼ볯袼鯥醼볯ꆼ볯뺁臣꾁뷯ꖼ볯込볯鞼볯뎛볯馼볯覼臣蒁臣貂臣ꞁ裢醼볯誏臣銈볯ꖗ鯧ꮁ蟥꺽臣龁菣Ꚃ苣ꮁ臣蒁臣꺁菣벃苣銂ꓧ鞁胣뎛볯馼볯꾁胣醼迥뎁볯ꖗ鯧ꮁ뷯ꖼ볯込볯鞼臣ꚇ뷧鞁臣麃苣릂臣ꒁ臣ꚁ臣螃菣뾂苣몤臣芀臣꺁뗧鲞臣覂胣ꢼ볯뚼볯뎼볯��ꦼ볯Ꞽ菣꾂菣뎃볯颍诧ꞁ臣龁臣超雧膃苣莃苣鶃苣뎃菣뮘껥ꒉ臣蒵臣袐苣鮁臣覼臣ꚇ뷧鞁臣麃苣릂臣ꢅ臣貁胣뺯藧麃苣릂볯뺯藧趽볯꺼볯讧꿧ꦉ볯뒼볯ꦼ볯銂铧蒁臣膀跥겋臣뺁臣꾁藥ꮖ菣Ꞃ菣꾂菣ꒂ菣袃飩뎮觥ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ蟥꺽臣龁볯ꢁ꿦莼臣ꚁ胣낕胩鎖臣辂臣ꎁ臣ꮅ飧鞢껦꺁껥ꢅ臣뮘껥銂ꓧ鞁臣鎁臣貁껥벨臣貂苣芀臣龁臣ꎁ臣膀臣貂苣꺁껥鎨臣袂臣ꚁ胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥ꢁ룤銷臣ꢼ볯뚼菣꾂菣뎃臣袂苣袺飩蒚菣꾂菣뎃軦꺨볯馁臣辂臣膀藨趘菣ꎃ菣뎃苣꺁觥뺁臣꾁郥芙臣覼臣膀苣뎃菣鲃臣꺁볯낼볯몙迧ꮅ飧내菨꺁ꋥ隮臣늘귦ꮁ鳦릊臣芁苣鎁臣貁껥벨臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 ꢼ볯뚼볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ菣꾂菣뎃軦꺨臣뮲駧뮴胦銂ꫨ릁苣견볯꺁苣莃菣꺁껥鎨臣꾁胣ꎼ볯鞼볯ꊼ볯麃苣릂臣醼韦꺛臣銼韃볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰閼⼼畳㹰볯ꎼ볯내菨銂髧许諦躸臣膀뛧蒁臣邼볯閼뷯螽볯讽뷯꺁볯낼볯讼볯뒼볯꺼볯꾃苣膃菣袼뷯ꖼ볯込볯鞼苣뎂菣覃臣讂볯銂볯ꖗ迥뎁볯閼韦ꮁ귧覂蛥ꢳ냥馁苣鎁臣ꮁ苣誂蟥꺽臣龁胣릉껥꺁菣Ꚃ苣꾁臣龁胣醼볯膀볯隼迥뎁볯馼韦꺛臣鞊볯뒼볯ꆼ裢钼볯꾂菣벃菣馼볯醼볯覼臣龁臣鞊볯꒼裢醼볯늼볯낼볯銈볯钼볯꺁臣骁苣讁臣ꚇ뷧鞁臣芀뗧芙髧ꪁ藨趘껥趩臣鞁臣놠釥閁苣ꚁ臣讂믤ꢡ髧ꪁ뗧鲞臣膀鯥銼볯ꆼ胣銼볯ꦼ臣낂菣閃臣몤臣貂臣蒁苣芀臣꺁뗧鲞臣覂胣뺯藧趽볯꺼볯讧꿧ꦉ볯뒼볯ꦼ볯銂跥겋臣节臣辁臣超雧膃苣莃苣鶃苣뎃菣뮘껥ꒉ볯뎛볯邼볯鲀볯邼볯覼臣蒵臣袐苣鮁臣ꚇ뷧鞁臣뺯藧麃苣릂胣뺁臣꾁꿥ꞅ볯궼볯ꆼ볯隌郥ꦉ볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣隌귥뮴胦隌觥覼臣蒵臣袐苣鮁臣鎽볯隼볯ꖼ볯讧꿧ꦉ苣ꢔ臣ꚁ跥겋臣节臣辁臣超雧膃苣莃苣鶃苣뎃菣뮘껥ꒉ볯뎛볯邼볯鲀鯥銼볯ꦼ볯ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ蟥꺽臣龁꿥ꞅ菣Ꚃ苣ꢁ꿦莼臣ꚁ胣ꢼ볯뚼볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ菣꾂菣뎃臣袼跥겋臣뺁臣꾁藥ꮖ菣Ꞃ菣꾂菣ꒂ菣袃飩뎮觥ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ볯ꚇ뷧鞁臣麃苣릂臣ꮅ飧肀룧銂ꓧ鞁臣袼鯥銼볯ꆼ胣뎛볯邼볯覼臣ꢁ臣몤臣貂苣芀臣龁臣ꎁ臣膀臣貂苣꺁껥鎨臣袂臣ꚁ胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥ꢁ藥ꮁ볯낼볯꾃苣膃菣銂铧蒁臣뮲駧蒚菣꾂菣뎃軦꺨볯馁臣辂臣膀藨趘菣ꎃ菣뎃苣貾볯貁苣뎃菣鲃臣ꢼ볯뚼駧뺏藨趘臣肀룧銂ꫨ躰臣讂臣ꮁ鳦릊臣芁苣鎁臣貁껥벨臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯銼볯醀⼼䥄㹖 견볯꺁룤ꎀ臣龮꣩ꞁ臣膀苣誂ꓥ趁臣뒼볯醼藨趘臣誁臣讂볯낼볯銈볯��뒼볯꺼볯뮲駧꾃苣膃菣꺁鳦릊胦銂ꫨ릁苣龁苣ꮁ胣ꎼ볯鞼볯ꊼ볯麃苣릂臣銼韃볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰閼⼼畳㹰볯ꎼ볯내菨銂髧许諦躸臣膀藨趘苣銼볯邼뷯趽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼⼼畳㹰臣龁臣鎼볯邼뷯趽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼⼼畳㹰臣릮ꧧ뺁臣鞢껦閁臣膀곦蒁臣膀臣貂苣醼韦꺛臣鞁臣芀곦蒁臣膀菣Ꚃ苣銂볯ꖗ鯧誏臣颼韦꺛臣ꢼ볯뚼볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ菣꾂菣뎃볯鎽볯隼볯ꖼ볯銂苣벃菣馁苣覼苣训苨薆돦蒰臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ蟥꺽臣龁胣ꚇ뷧꒾迥뎁꿥鲿臣讂諦躸蟩銂ꇨ醼볯ꮁꓧ馁胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㔱㰷愯㰾䐯噉ਾਊ䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁뗧鲞苣뎛볯醼臣몤臣ꚁ臣誂胣鎁苣꾁볯銼韦鎖臣貵臩ꮁ苣龁苣ꮅ飧릮ꧧ銂ꓧ馁볯誸臣낂菣閃臣銼볯邼뷯趽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼⼼畳㹰臣ꮅ飧ꮁ臣蒁臣꺁苣꺁臣芁苣膀룤꺁苣ꦃ菣꾁볯邼볯趽뷯㲍畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲓猯灵꺁藨趘臣ꒁ臣ꚁ臣节臣ꞁ臣讂볯芀臣꺁뗧鲞臣覂胣ꢼ볯뚼裢뎼볯ꦼ볯Ꞽ닦芙铧꾃苣膃菣貁苣뎃菣鲃臣袂苣Ꞥ臣ꪁ볯낼볯몙迧ꮅ飧銂飩뎮臣讂臣ꮁ鳦릊胦銂ꓧ馁臣ꢁ臣龮꣨閁苣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤醼볯骼뷯늼볯ꆼ菣꾂菣뎃꣨袨臣誁臣讂鳦ꦁ諦龎볯超雧鞢볥ꒉ臣ꪳ蟩钯臣몱껥㲚牢ਾ†臣꺁껥붖뻤ꞁ臣膀闧ꪁ苣ꆼ뷯骼藥ꮖꋥ랼觥钯臣超雧鞢볥ꒉ臣蒵臣袐苣鮁臣꺛髧꺁諦龎볯ꆼ뷯覼臣ꚇ郧鞁臣開觧ꞁꧨ鎨苣財臣膀뛧蒁臣鞊軥ꮁ꿥馁苣뒼듧麃뿥钭苣뾪臣ꚁ胣꺛髧꺁臣꺁諦龎臣뺯臣讂藥ꮖ뿥钭苣鞢볥馁苣꺁臣肜臩ꪁ볯螽볯超雧鞢볥ꒉ臣钯軧銂ꋧ趪臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†곧醼苣莃菣꺁껥鎨臣꾁胣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯뒼볯꺼볯超雧鞢볥ꒉ꟦覯觧ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ胣龮雦设볯ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣袂臣ꮁ胣ꆼ뷯邽뷯讽胣꒼뷯膽뷯钽볯膀迥뎁볯薽뷯鎽볯놔鷦꺁藨趘菣ꪂ苣钃菣벃菣銂郥肂볯ꒁ臣銼볯辇뷤膪蓧覤闧骃菣膃菣꺁볯꒼볯뎂菣ꮂ菣麃菣銂苣벃菣馁苣궼볯鎼볯꾃苣膃菣袼臣꺁菣꾂菣뎃臣겜飦내鯦ꮁ臣蒁臣ꆼ볯늼뷯膽뷯ꢁ苣벑臣貂苣覼苣ꢔ臣ꚁ菣Ꚃ苣銂蟥꺽臣龁胣鎁臣龮雦设臣뾽铧鞁臣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯뒼볯꺼볯超雧鞢볥ꒉ臣膀껥붖뻤閼臣風볨鞁臣袂臣ꮁ胣뚼볯閼볯궼ꓥ낕苣ꮐ苣ꞁ臣龁胣许臣ꢡ볯鎼臣뺁臣膂臣钠ꧧ螃苣ꒂ菣ꮁ苣誂胣ꆼ볯늼뷯膽뷯誏臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ꟦覯觧銂胣颧胣ꪁ볯螽볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ꿦ꞁ볯궼볯邼볯ꮂ菣ꪂ菣Ꞁ蓨ꪳ��躃닧邭볯隌郥ꦉ볯閼苣ꮐ苣覼룤ꮁ藥ꚇ雦鞁臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㠵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 麃苣릂臣醼韦꺛迥뎁볯閼韦꺛臣训苨薆諦躸臣龁胣銼볯ꖗ鯧ꮁ胣蒐ꧨ鎨뻧꺁菣Ꚃ苣놔鷦꺁볯꒼볯讼蓨鎇듧麃苣膀볯辽뷯螽뷯낼뷯閽뷯袼闥馨볯袼볯銽뷯蚽뷯貽뷯覽뷯₎ꆼ볯ꊼ볯₤ꊼ뷯辽뷯莽뷯薽뷯莽뷯鎽볯銂郥肂볯꺁귥ꢜ룤ꞁ胣뮂냦鎼볯莄臣钼駦鎖苣궂苣鎃菣ꞁ胣躇铧讞臣龁臣覤闧鎽볯ꎼ볯颼†볯꒼볯骃菣膃菣袼菣鞃菣覃臣龁苣醼볎뷯込뷯貽胣鞃菣ꮃ볯銂铧蒁臣趆裥肿臣膀볯꒼볯꾃苣膃菣鲿귧銂胣ꦼ볯꺼裢캒뺁臣꾁볯꺼볯銈뇎臣ꒁ臣ꚁ듧麃蛥鎟觨袼볯ꎼ볯覼臣袂臣ꚁꧨꆾ臣龁胣ꦼ볯꺼裢캒ꮁ臣蒁臣꺁볯醼韦꺛臣ꎼ볯颼볯뺄蟨내菨ꮁ苣讂볯ꎼ볯颼†볯꒼볯릉闧蒚뿥钭臣ꒁ臣ꚁ臣ꎻꇨ蒚臣ꦼ볯뎼臣邵黦銂胣뎛볯銼臣膀臣鞁臣뒼볯ꚼ裢캒ꮁ臣蒁臣꾁鯥銼볯ꮁꓧ馁胣銼볯ꖗ鯧꺁볯ꊼ볯ꎼ臣貐귧꺁뗧鲞臣뎦꿥閁苣龁胣閁苣ꮁ胣龮꣩꾁볯钼韦銂胩鞁臣財臣膀볯钼韦꺛臣뺄蟨내菨꺁뗧鲞臣銼볯ꖗ鯧꺁蓨鎇듧麃臣ꒁ臣ꚁꛨ龯臣貂臣邵黦ꢁ郥覭臣芁臣龁胣閁苣ꮁ胣ꆼ볯늼뷯膽뷯薆臣鎼臣꺁胥薀臣ꢂ菣袃菣鞃볯馁臣辂臣膀菣鞃菣覃볯蒽뷯讽볯膀볯薽뷯鎽볯誏臣꒼뷯膽뷯钽볯覼臣鶁苣麁苣ꮁ꿥馁苣ꎼ볯颼菣꾂菣뎃뿥钭苣膀胥薀臣ꢂ菣袃菣鞃臣몈뿦鞁臣貾臣ꦼ볯꺼裢캒ꮁ臣蒁臣ꦼ볯뎼臣袂臣ꚁꧨꆾ臣龁胣鶁臣邵黦銂鯥銼볯ꆼ볯骃菣膃菣ꆼ뷯邽뷯醼臣ꒁ臣ꚁ볯膀鯥銼볯ꊼ볯骃菣膃菣늼뷯邽뷯醼臣ꒁ臣ꚁ볯誏臣뎛볯钼볯袼菣鞃菣覃볯邽뷯螽뷯醼臣ꒁ臣ꚁ볯몤臣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 鶁臣邵黦讁苣膀ꧨ鎨臣龁藥ꚁ臣ꆼ뷯骼볯뒼볯꺼볯钯볯醼볯醼胣銼볯骼볯꺁꿧늛볯貁胣뺯藧ꢁ꿦莼臣ꚁ볯뒼볯꺼볯꺁苣뢂菣邃菣袃諥鲞苣몤臣龁臣ꢁ臣龮꣨閁苣讂胣ꢅ뷤ꢁ臣ꚁ볯꒼볯隽뷯颽諦龎臣ꒁ臣ꚁ胣肜臩ꪁ볯螽볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ꿦꾁胣閼볯醼臣芁苣鎁臣貁ꛨ몇臣貂臣芀볯꒼볯隽뷯颽蛥꺁胥薀臣骃菣膃菣ꢂ菣袃菣鞃臣ꒁ臣ꚁ胣ꆼ뷯邽뷯讽볯骃菣膃菣ꮁ臣蒁臣꺁鳦ꦁ볯螽볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ꿦꾁胣閼볯醼臣芁臣龁臣膀볯薽뷯鎽볯骃菣膃菣ꮁ臣蒁臣꺁鳦ꦁ볯螽볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ꿦꾁胣醼볯骼볯ꞁ臣ꎁ臣袼곧鎼菣鞃菣覃胣꒼뷯膽뷯钽볯ꮁ꿥馁苣鲿귧꾁胣鎽ꧨ肊ꇨ蚈蟩ꞁ鿧覂苣ꚁ臣讂苣蚁臣鶁苣貁鷩ꪄ胦ꢂ菣袃菣鞃臣芁苣鎁臣ꢁ룤뒇臣ꚁ胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣覜蓧ꮁ臣��苣覂臣떥苣ꚁ뷤讁臣龁볯芀볯뒼볯꺼볯꾁臣龁胣ꢔ蟩趏뿥貁ꛨ龯臣貂苣ꢁ볯螃菣뾂臣몤臣骁볯膀볯꒼볯閼볯뒼듧麃臣蚁臣꺁볯꒼볯讼듧麃臣辷觥袐苣鞢ꓥ閁臣讂臣ꢁ臣讦蟥閁苣膀臣鞁臣ꢔ蟩趏뿥貁ꛨ龯臣貂苣ꢁ볯螃菣뾂ꓧ閁臣覼胣ꎼ볯钼볯袽뷯銈볯꒼볯讼듧麃볯ꢂ菣Ꞃ苣뾂菣込꣨뚆苣隃苣莃菣覼臣蚁臣꺁볯꒼볯銼볯내菨꺁럧늉郥銂ꋥꞤ臣鮁苣鎁臣貁ꛨ몇臣貂臣芀臣覂臣膀볯ꊼ볯ꎼ듧麃臣覂뻥覂苣龁뗧鲞臣膀蓨鎇듧麃臣邵黦ꢁ룤뒇臣龁볯螃菣뾂臣몤臣骁볯芀臣龁臣ꎁ臣膀臣貂苣꺁껥鎨臣袂臣ꚁ胣뎼볯늼볯꺼볯貁볯꒼볯隽뷯颽諦龎臣뺯臣讂藥ꮖ뿥钭苣鞢볥馁苣鮚臣超雧鞢볥ꒉ臣鞁臣鲽铧馁苣붃諥貁ꋧ趪臣貂胣鶁臣ꚁ臣覂臣膀蟥꺽臣ꢁ臣ꚁ鳦ꦁ臣ꆼ뷯骼藥ꮖꋥ랼觥钯軧꺁뇦骮臣龮꣨閁苣膀볯骼볯ꖻꓥ꺁꿦螎臣肜臩ꞁ臣讂볯设臣낁胣閼볯醼臣龁臣醼볯骼볯꺁꿦貁볯骼볯袂苣节諥鲞髧ꞁ臣讂볯鎁臣貁ꛨ蒁臣閁苣龁胣鶁臣邵黦讁苣閁苣ꮁ胣肜臩ꪁ볯螽볯超雧鞢볥ꒉ臣钯軧貁胣뾽铧閁苣讂鯧蒚臣릉껥꺁諦龎臣鲿臣ꚁ闧ꪁ苣뒠郥貁臣讂臣ꢁ臣몤臣貂臣蒁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 견볯꺁苣莃菣꺁껥鎨臣꾁胣麝菣袃鳩랕ꇩ銂胣许꣨꺁ꇨ醼볯ꮁ臣ꢁ苣覂苣龁ꃧ뚩菣뚂苣뎃臣鎾臣ꚁ胣꺨胣꺁볯螽볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ꿦ꞁ꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥讧꿧ꦉ臣蒵臣袐苣鮁臣袼볯궼볯邼볯ꮂ菣ꪂ菣Ꞁ蓨ꪳ菣躃닧邭룤ꮁ藥ꚇ雦閁苣龁볯膀껥붖뻤閼臣風볨鞁臣袂臣ꮁ胣내菨薆볯隼볯ꖼ볯銂苣벃菣馁苣ꢼ볯뚼菣꾂菣뎃볯覽볯隼볯ꖼ볯覼臣ꚇ뷧鞁臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㤵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 肜裥꺁諦躸볯训苨薆諦躸볯꺁볯钼駦鎖뻥ꮁ蟨誺触讦臣뎦꿥閁苣骁胣ꢳ냥ꢃ뷤꺁迥鲿臣ꪁ臣膀裥龜臣ꚇ뷧꾁껥ꢅ臣鞏臣覂苣龁臣ꢁ臣몤臣貂臣蒁苣芀볯ꖗ鯧꺁裥麛諦躸뻥膀该ꦉ臣銼胩鎖臣麛뻥龜雩銂鳦鞁胣ꆬ臣ꞁ볯钼韦꺛臣銼鯥꺛臣閊룤銂迥醁胣骶臣ꚁ臣覂臣銼胩鎖臣麛뻥龜雩銂룤袁苣貂苣芀臣覂臣讂껥ꢅ胦蚈黦꾁胣銼胣醼볯誏臣鎼볯ꖗ鯧ꮁ蟨誺韧蚐귥袼蟨誺賥ꚭ胣股뛦ꚭ迥뎁蟥몛볯ꮁ苣誂뇦骮臣貂苣芀볯꒼볯誏臣ꎼ볯颼듧麃臣뺯臣讂볯ꚼ볯銈돎臣뺯臣讂諦鞊뷤誏臣ꖼ볯ꦼ볯邽뷯钽裥邞臣龁臣ꦼ볯뎼苣財臣ꚁ胣ꚩ꣩閁苣龁꟦薀臣钯軧ꞁ볯뒼볯꺼볯ꮁ苣讂볯낼볯꾃苣膃菣ꮁ꿥馁苣超雧鲿귧꺁ꋥ랼苣閩뻤馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯��醀⼼䥄㹖 견볯꺁苣莃菣꺁껥鎨臣꾁胣ꊗ鿧꺁菣Ꚃ苣ꢂ菣袃菣鞃苣ꢔ臣龁菣螃菣뎂菣ꮂ菣麃菣鞊軥銂胣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯뒼볯꺼볯超雧鞢볥ꒉ臣颧胣ꪁ꿦螎臣蒵臣袐苣鮁臣麃苣릂臣ꚩ꣩鞁臣芀鳦躘듧뢛臣ꎼ볯銈볯鎼볯ꢁ釥뚁苣뎃苣蚃菣벃諦龎臣膀볯ꊼ볯麃苣릂臣궼볯ꎼ苣ꦃ苣ꦼ迥뎁苣ꦃ苣ꦼ볯鞊軥誸臣邏ꓧ閁苣讂臣莀臣覂苣讂볯邼臣ꊗ鿧꺁菣Ꚃ苣ꢂ菣袃菣鞃苣ꮐ苣芀臣貂苣꺁苣钃菣벃菣꾁胣螖賧ꮁ铧ꖝ臣讂苣钃菣벃菣꺁藥놅菣벃苣馃菣릂臣芁苣ꦼ볯꒼볯躼뷯銽뷯Ꚃ苣隃苣ꒂ菣讁苣ꖅ触鞁臣芀苣ꦃ苣ꦼ苣钃菣벃菣꾁胣궼볯ꎼ苣ꦃ苣ꦼ裥邭룤ꮁ迦몤臣貂臣ꎼ볯颼볯鲿귧銂ꫨ몙臣讂臣袺菦閁苣讂臣膀苣ꦃ苣ꦼ볯ꢂ菣袃菣鞃臣膀볯ꢼ볯꾂菣릂볯ꦼ裥邭룤ꮁ迦몤臣貂臣ꎼ볯钼볯뒼듧麃뿥钭苣颪駧馁苣ꢁ뫤뎃臣貂苣芀볯ꆼ裢醼볯銼諦龎꟦覯觧꾁胣꾂菣릂볯誏臣꾂菣릂볯ꦼ苣钃菣벃菣꺁룤릖苣뎂菣覃臣膀볯꒼볯誏臣ꎼ볯颼臣뒼듧麃뿥钭臣ꆸ雦꺁ꧨꆾ苣꾏菨ꮁ臣讂胣閁苣ꮁ胣뎂菣ꮂ菣麃菣鞊軥ꮁ苣ꦃ苣ꦼ볯ꢂ菣袃菣鞃苣ꮐ苣讂臣ꢁ볯鞁臣貁臣ꚁ볯꒼볯鲿귧銂볥趁뗨鎁臣鎁臣覼臣膀苣誂볥蒁볯꒼볯뒼듧麃뿥钭苣颪냥馁苣꺁臣립ꯧꒁ臣莀臣覂苣ꚁ臣讂胣鞁臣貁臣ꚁ胣ꎼ볯銈볯鎼볯鞊軥꺁꣨袨臣꺁苣鞃菣벃菣꾁胣隻臣뎂菣ꮂ菣麃菣鞊軥讧꿧ꦉ臣궨꣨ꮁ臣蒁臣节뷤ꢔ臣貂뻥讂볯设臣낁胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣貂苣袂臣ꮁ胣讀裥隌臣貂臣貁苣꾃苣膃菣뺁臣꾁듧貏菣꾂菣뎃臣龁苣ꮁ볯芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꎼ볯銈볯鎼볯鞊軥讧꿧ꦉ迥뎁볯뒼볯꺼볯超雧鞢볥ꒉ꟦覯觧銂胣뎼볯醼볯銼苣膃苣뎃胦芄돨誃菣銲귥궸臣놅蟥릖臣膀臣鞁臣ꖻ룤꺁諦躸蟩ꞁ볯ꊼ볯麃苣릂臣训苨薆諦躸臣龁볯ꎼ볯銈볯鎼볯颍诧銂볯캑螽胣鎼볎뷯뺁臣꾁볯邼볎뷯ꞁ胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ跥겋苣鎼볎뷯ꞁ胣ꎼ볯銈볯鎼볯讼볯뒼볯꺼볯銂臣貂臣貂볯캓螽臣龁臣鶁苣麁苣醼볎뷯袼볯骼볯꺁꿦螎볯膀볯ꆼ裢醼볯銼苣鎼볎뷯誏臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ苣醼볎뷯袼볯螽볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣钯軧貁볯骼볯覼臣龁臣ꎼ볯銈볯鎼볯銂볯캑螽迥뎁볯뒼볯꺼볯銂볯캓螽볯ꆼ뷯骼볯뒼볯꺼볯꺁꿦貁볯骼볯覼胣ꎼ볯銈볯鎼볯鞊軥讧꿧ꦉ蛥꺁苣ꦃ苣ꦼ苣钃菣벃菣ꮁ꿥馁苣鞊軥릉闧蒚볯내菨鲿귧銂胣ꦼ볯꺼裢캒ꮁ臣蒁臣꺁볯겼볯뎼뷯辽뷯蚈黦ꮁ苣ꎁ臣뾪臣膀臣꺁뗧鲞苣뎛볯閼臣몤臣芀臣꺁뗧鲞臣覂胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ苣ꢔ臣ꚁ蟥릖臣龁ꃥ袐胣꾂菣릂볯ꢂ菣袃菣鞃臣뺯臣��볯ꚼ볯銈돎뿥钭臣鞢ꓥ貁껥벨臣貂臣芀臣貂苣꺁뗧鲞臣膀볯ꆼ裢醼볯銼諦龎蛥꺁苣ꦃ苣ꦼ苣钃菣벃菣꺁볯ꒁ볯ꢂ菣袃菣鞃볯ꆼ裢颼볯覼苣ꢔ臣龁볯꒼볯讼볯내菨꺁蛥몈뿦ꢁ臣貂臣骶臣ꦼ볯꺼裢캒꺁볯겼볯뎼뷯辽뷯蚈黦ꮁ苣ꎁ臣몢ꫨ閁苣膀臣꺁뗧鲞苣뎛볯隼臣몤臣芀臣貂苣꺁뗧鲞臣袂臣ꚁ胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣膀볯骼볯膀볯骼볯誏臣醼볯鎼臣ꆼ뷯骼볯뒼볯꺼볯钯臣膀諦龎觧낕髧ꎼ볯颼볯뒼듧麃뿥钭苣超雧鞢볥馁苣붃諥貁껥벨臣貂臣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 견볯꺁苣莃菣꺁껥鎨臣꾁胣ꎼ볯鞼볯ꊼ뷯隼菣Ꚃ苣銂胣颧胣ꪁ볯螽볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ꿦ꞁ胣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯뒼볯꺼볯超雧鞢볥ꒉ꟦覯觧ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ胣ꢼ볯뚼볯隼†볯鞼菣꾂菣뎃볯龮雦设볯ꮁ꣨覼볯銂铧蒁臣醼韦꺛迥뎁볯钼韦꺛臣ꚇ뷧鞁臣芀믤许臣ꢡ볯閼臣膦듧閁苣讂ꃧ뚩菣뚂苣뎃臣鎾臣ꚁ胣趽볯꺼볯銂胣隌郥ꦉ볯閼볯뎂菣릂菣궃菣ꮃ볯꒼볯낼볯骼볯ꖼ볯銈볯궼볯袼臣貂臣貂볯邼볯鎼볯躼볯骼볯邼볯醼볯閼臣钯軧ꞁ볯銂郥肂蓨ꪳ菣躃닧邭룤ꮁ藥ꚇ雦鞁臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰〶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲銼볯ꖗ鯧ꮁ胣麃苣릂苣ꂱ껦鞁胣ꎼ볯颼볯뒼듧麃臣袂苣ꦼ볯꺼裢캒몙迧銂胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣袂臣ꮁ볯ꎼ볯ꮁ苣誂ꧨꆾ臣龁胣鶁臣邵黦銂鯥銼볯ꮁꓧ鞁臣誁苣膀臣貂臣袂臣ꚁ볯骼볯膀볯骼볯誏臣醼볯骼볯ꢁ臣蚁볯螽볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ꿦ꞁ臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ†뷯늼볯ꆼ꟦覯觧꺁볥鮊臣超雧鞢볥릊黦貁ꓧ閁苣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†ꛨ蒴臣讂臣膀臣貂苣꺁ꃧ뚩臣膀볯뒼볯꺼볯超雧鞢볥ꒉ꟦覯觧貁鯧蒚臣鞊軥ꮁ꿥馁苣超雧鲿귧銂ꋥ랼臣讂菨鮊苣몢ꫨ鞁胣鶁臣ꚁ蟥꺽臣龁苣꺁鳦ꦁ臣ꆼ뷯骼볯뒼볯꺼볯钯臣몱껥銂껥벨臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤醼볯骼鷩銃菣誜闩麡臣誁臣讂볯뒼볯꺼볯ꮁ苣讂藥ꮖꋥ랼戼㹲 鎁臣龮雦设臣꾁胣麝菣袃鳩랕ꇩ袼苣讃苣ꒂ苣ꮃ볯銂胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ볯낼볯꾃苣膃菣銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯ꞁ蟥꺽臣膀뛧蒁臣鞊軥릉闧蒚볯내菨誏臣鞊뷤鲿귧銂ꧨꆾ臣龁胣鎁臣龮雦设臣뾽铧鞁臣ꢼ볯뚼菣꾂菣뎃꟦覯觧꾁胣龮雦设볯ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣芀臣꺁껥붖뻤ꞁ뷤ꢔ臣龁꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥讧꿧ꦉ臣膀껥붖뻤閼臣風볨鞁臣袂臣ꮁ볯醼볯閼볯覤闧銂郥鎂臣蒁臣芀볯낼볯꾃苣膃꟦覯觧誏臣超雧鞢볥ꒉ뷯늼볯ꆼ꟦覯觧꾁胣隌郥ꦉ볯閼��뎂菣릂菣궃菣ꮃ볯꒼볯낼볯骼볯ꖼ볯銈볯궼볯銂臣貂臣貂볯邼볯鎼볯躼볯骼볯邼볯醼볯閼臣钯臣ꮐ苣芄돨誃菣銲귥ꮁ藥ꚇ雦鞁臣芀闧ꪁ苣钯軧꺁볯뒼볯꺼볯骼볯螽苣ꚩ꣩鞁臣芀꿥ꞅ该ꦉ臣膀볯낼볯鞊軥颍诧뺁臣꾁볯뒼볯꺼볯超雧鞢볥ꒉ跥겋臣蒁臣貂臣銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯ꞁ蟥꺽臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†볯鲀볯뎭臣鎽蟩銼胣閼뷯螽臣醼볯릌臣ꪂ苣꺁苣讃苣ꒂ苣ꮃ苣膀믤许臣ꢡ볯隼臣몤臣钠ꧧ螃苣ꒂ菣ꮁ뻥ꎁ臣ꚇ뷧鞁臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰ㄶ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 閊룤趉ꧨ首臣낼볯궼볯銂胣銈볯ꖗ鯧ꮁ迥蚛臣膀뛧蒁臣醼韦꺛迥뎁볯閼韦꺛臣開觧銂뷯늼볯ꆼ†볯꺼볯銂铧蒁臣训苨薆臣ꚇ뷧鞁臣芀諦躸뻥ꚩ雦꺁볯ꊼ볯ꎼ苣膀볯馼韦꺛臣躏鯩鞁臣芀ꃧ뚩룤ꮁ臣銯胦节믤꺁룤ꪁ蟨誺ꛨ龯苣ꢳ鯧閁苣骁胣趽볯꺼볯₡겼볯낼臣趿껥Ꞁ臣꾉ꗥꞁ臣讂臣ꢁ臣몤臣貂臣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥貁諦龎觧낕髧ꎼ볯颼볯뒼듧麃뿥钭苣鞢볥馁苣붃諥銂ꫨ릁苣龁苣ꮁ胣뒼볯ꚼ뇎迥뎁볯겼裢銼臣ꒁ臣ꚁ臣내菨薆苣ꒂ菣ꮂ苣뎃鿦늉볯ꦼ볯뎼볯銂껥붖臣龁胣낼볯궼볯銂胣ꢼ볯뚼볯隼†볯隼菣鞃菣覃菣벃菣뺁臣꾁볯낼볯醼볯ₖꖼ볯骃菣膃菣鞃菣ꮃ苣ꢔ臣ꚁ胣鎼볯莄臣膀볯芙雩ꢂ苣붂菣鲃臣몈뿦鞁臣芀볯궼볯込苣ꪂ菣麃苣랂菣ꞁ臣몈뿦銂駩Ꞁ꿥ꞅ臣鞁臣뾽铧鞁胣릟鳥颍诧ꞁ臣몈뿦銂駩Ꞁ꿥ꞅ臣鞁臣뾽铧鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 뒼볯ꚼ뇎臣ꦼ볯뎼臣ꎻꇨ蒚臣邵黦銂鯥銼볯ꆼ胣뎛볯颼볯ꮁꓧ鞁臣誁苣膀臣鎁臣뎛볯颼볯꾁胣ꖼ볯骃菣膃菣鞃菣ꮃ臣袂苣ꢂ苣붂菣鲃裥肿臣邵黦銂ꓧ鞁胣뎛볯颼볯꾁胣ꖼ볯骃菣膃菣鞃菣ꮃ臣袂苣ꢂ苣붂菣鲃裥肿臣邵黦銂ꓧ鞁臣誁苣膀鯥銼볯ꎼ臣膀鿥난꿥ꞅ臣袂苣ꢂ苣붂菣鲃裥肿臣邵黦銂ꓧ馁胣鞊軥颍诧ꞁ藥ꮖ臣龁諦躸觥꒾臣閊룤貾뻧ꢁ臣鎖臣꾁胣뒼볯ꚼ뇎볯ꎼ볯颼볯내菨뮠뫥꺁ꋥꞤ臣뎦꿥閁苣ꪁ臣ꎁ臣袼뻧醼볯芀볯뒼볯꺼볯ꚇ뷧꺁臣ꮁ苣讂藥ꮖ볯꒾볯覼臣膀볯꺼볯캦讼볯꒼볯뒼듧麃ꃩꚺ臣뺯臣ꚁ苣骁臣ꪁ諥鲞苣誏臣鞁臣芀꿥ꞅ髧ꮁ胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯ꆼ뷯ꞁ藥ꮖ臣龁뻧袼뻧鎼胣钼胣閼볯꾁胣鞊軥릉闧蒚볯꺼볯캦讼볯꒼볯뒼듧麃臣覜蓦ꪁꋥꞤ苣몤臣龁胣閁苣ꮁ胣貀菣莃菣뎃苣趀諦龎铧辇臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯ꆼ뷯袼볯骼볯邼臣钯볯ꞁ藥ꮖ臣龁곧閼뻧꾁胣꒾볯誏臣꒾볯꺁꿥ꞅ臣钯��鞁臣뒠郥膀諦龎觧낕髧뒼볯ꚼ뇎볯ꎼ볯颼볯내菨꺁鳦辄臣鞢ꓥ銂ꓧ鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 ꦼ볯銈볯꺁볯ꎼ볯ꮁ臣蒁臣꺁믤ꢡ髧ꪁ뗧鲞苣뎛볯馼볯鲀鯥銼볯ꎼ臣몤臣ꚁ臣誂胣鎁臣ꞁ鯥銼볯ꆼ臣膀볯隼菣鞃菣覃菣벃菣ꮁ苣讂苣궂苣鎃菣몈뿦꺁뗧鲞苣몤臣膀鯥銼볯ꊼ臣膀볯鞼菣鞃菣覃菣벃菣ꮁ苣讂苣궂苣鎃菣몈뿦꺁뗧鲞苣몤臣膀鯥銼볯ꎼ臣膀鿥난꿥ꞅ苣ꢔ臣龁苣궂苣鎃菣몈뿦꺁뗧鲞苣몤臣芀諦躸觥ꢁ諦躸뻥ꢁ臣鎖臣ꦼ볯銈볯讼볯꒼볯뒼듧麃ꃩꚺ臣辩苣讁臣鞢ꓥ貁胣ꢅ臣꺁藥ꮖ该ꦉ臣誁臣ꚁꛨ龯臣貂臣袼곧醼胣閼뻧覼胣鞁臣鞁胣ꦼ볯銈볯讼볯꒼볯뒼듧麃臣鞢ꓥ꾁胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯ꆼ뷯銂볯骼볯ꢁ볯骼볯꺁꿦ꞁ蟥꺽臣龁뻧袼곧鎼뻧誏臣钼뻧覼臣誁臣ꚁ鳦节ꓦ몇迥붃臣芁苣膀룤릖臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯ꆼ뷯銂볯骼볯邼臣钯臣ꚇ뷧鞁臣開觧ꞁ臣膀꿥ꞅ臣钯볨鞁臣鞢ꓥ鞁臣ꦼ볯銈볯讼볯꒼볯뒼듧麃臣鞢ꓥ銂ꓧ閁臣讁臣龁胣ꦼ볯銈볯꺁ꋥꞤ臣膀듦Ꞁ볯내菨鲿귧궸臣뒼듧麃臣떂菣뮂菣袃臣ꦼ볯銈볯銂裥貳臣讂臣蒁臣겅鿧꺁菨鮊臣肸蟨馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 鞊軥릉闧蒚諦鎽뿥钭臣뺯臣讂볯ꢼ볯궸臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯ꆼ뷯ꚇ뷧꺁諥鲞苣뾪臣讂臣膂臣膀볯隼觧낕髧ꖼ볯ꦼ볯ꆼ迥뎁볯鞼觧낕髧ꖼ볯ꦼ볯ꆼ苣龮雦鞁臣芀菣것菣袃苣膀뗧鮏臣ꖼ볯袼볯銽뷯鎽뷯薽뷯鮼볯ꢼ볯뚼裢邼볯閼†볯覽뷯ₓꢼ볯뚼볯隼†볯隼볯뺁臣꾁뗧鮏臣ꖼ볯袼볯銽뷯钽뷯覽뷯뢼볯莼볯邼볯鎼볯邼볯ₗꢼ뷯鎽†볯낼볯醼볯ₖꖼ볯覼臣蒁臣貂臣ꞁ苣벃菣ꎂ菣낂臣龁胣ꆼ뷯邽뷯膽†볯覽뷯螽뷯辽뷯钽뷯莽뷯ₓꦼ뷯钽뷯銽뷯膽뷯覽뷯躽뷯貽臣覂臣麃苣릂諦ꖼ볯ꊃ菣꾂菣벃菣ꮃ諦鎽볯莼볯낼볯醼볯ꖼ볯醼裢궼볯銂駩Ꞁ꿥ꞅ臣鞁臣뾽铧鞁臣芀볯覽뷯袽뷯銽볯겼뷯蚽뷯₅뒼뷯莽뷯躽뷯貽뷯螽뷯薽뷯꺁菣Ꚃ苣鞊볯鞼菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤袼볯銼볯邼볯邼볯銈볯ꆼ볯銂駩Ꞁ꿥ꞅ臣鞁臣뾽铧鞁臣芀볯膽뷯讽뷯辽뷯₎ꦼ뷯趽뷯躽뷯늼뷯鎽뷯膽뷯莽뷯꺁諦麃苣릂볯螽볯銈볯늼볯鞊뷤袼볯鞼볯閼裢邼볯閼裢醼볯邼볯銂胣붙胦뺯藧꺁뫤ꆬ諦鎽臣鞁臣뾽铧鞁臣芀볯芽뷯膽뷯꺁諦떂菣ꦼ뷯Ꞽ裢ꢼ볯낼볯莼뷯芽볯醼볯鞼볯鞼볯銂胣꺼볯낼ꇨ薸臣뺯臣讂뫤ꆬ諦鎽臣鞁臣뾽铧鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 鞃菣벃菣銂胣蒵迦袁볯隼臣龁臣ꖼ볯袼볯邼볯躽뷯込苣Ꞃ菣鮼볯邼볯캐貽볯Ꚃ苣ꮃ볯銂铧蒁臣膀볯莄臣肸駦뎂菣蚃苣뎃苣鞁胣ꆬ臣ꞁ��ꊼ볯₳뎼뷯邽뷯銽볯貽뷯莽뷯銂铧蒁臣꒮룦ꞁ볯芙雩隃菣莃苣鞁臣芀룤ꆬ諦鎽苣ꂊ臣袼볯邼볯캐貽볯Ꚃ苣ꮃ볯膀臣鞁臣꒮룦ꞁ볯芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣붙胦뺯藧鞊뷤銂껦躚룥袇臣龁胣꺼볯낼ꇨ薸苣醼볯閼볯邼볯ꮁ룥袇臣龁胣鞴뗦貾胣貺곦鞊뷤銂럦ꂊ臣袼볯邼볯캐貽볯Ꚃ苣ꮃ볯膀臣鞁臣꒮룦ꞁ볯芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣붙胦뺯藧鞊菣Ꚃ苣ꦼ뷯Ꞽ裢ꢼ볯낼苣膀볯骼볯邼볯邼臣貸蟩鞁臣芀볯ꢼ볯股룦ꮁ臣蒁臣꾁胣鞊苣ꮃ볯螽볯銈볯늼볯銂볯骼볯邼볯邼볯邼臣貸蟩鞁臣芀觨銂볯蚈雩袼諦ꖼ볯覼臣龁臣醼볯蚈雩袼諦ꖼ볯覼駧늉臣鮁胣ꆬ臣ꞁ臥ꊭ臣鮁臣钼볯邼뷯趽臣궪臣随臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†諦ꢼ볯뚼볯隼†볯隼†볯螽볯ꮁ雩馁苣ꎻꇨ蒚臣邵黦銂鯥鎼볯ꮁꓧ馁胣鞊볯낼볯醼볯ₖꖼ볯ₗꦼ뷯Ꞽ臣ꒁ臣ꚁ臣ꎻꇨ蒚臣邵黦銂胣뎛볯醼臣몤臣芀諦ꖼ볯誏臣鞊볯鞼臣ꆸ雦ꮁ臣蒁臣꺁뗧鲞臣袂臣ꚁ胣릉臣醼볯閼迥뎁볯骼볯邼臣钯臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯ꆼ뷯ꞁ该ꦉ苣ꚇ뷧馁苣ꢁ胣鞊軥릉闧蒚諦鎽뿥钭臣鞢ꓥ馁苣鎁臣貁ꓧ閁苣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†臣龁臣ꎁ臣膀鷩銃菣誜闩麡ꃧ뚩臣ꊖ臣ꚁ鳦躘듧뢛臣風볨閁苣讂뗧鲞臣袂臣ꚁ胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣ꒂ菣鎃菣ꞁ뷯늼볯ꆼ菣꾂菣뎃諦龎臣뺯臣讂諦龎觧낕髧뒼듧麃迥뎁諦鎽뿥钭苣超雧鞢볥馁苣鎁臣貁ꋧ趪臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯鎼볯ꢼ볯ꆼ볯ꆼ볯醼菣ꦃ菣릂苣Ꞃ菣莃苣麃苣릂臣誁臣讂꣧薀臣ꮼ볯ꆼ볯銈볯뒼볯꺼볯꾃苣膃菣閃苣벃菣莃菣꺁藥ꮖ軥Ꞁ戼㹲 鎁臣龮雦设臣꾁胣覤闧鎽볯늼볯뎼菣鞃菣覃諦龎뷯늼볯ꆼ꟦覯觧꺁꟦薀臣낕臣讂뷥讅臣뺯臣讂藥ꮖ뿥钭臣뺯臣讂볯뒼볯꺼볯超雧鞢볥ꒉ뷯늼볯ꆼ꟦覯觧꺁諥鲞苣뾪臣讂臣膂臣膀볯겼볯誼볯誼볯醼볯邼볯ₑ뒼뷯麃苣릂볯뒼뷯莽뷯躽뷯莽胣ꪠ볯隼볯邼볯膀뷯鶼볯覼苣膀믤许臣袂臣ꮁ胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣蒵臣袐苣鮁臣膀꣧薀臣낕臣讂뷥讅臣覤闧閁苣龁볯늼볯뎼菣鞃菣覃諦龎뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯銂諦躸臣龁볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣蒵臣袐苣鮁臣膀ꓥ낕臣龁볯늼볯뎼苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ苣膀볯ꖗ鯧誏臣醼볯ꖗ鯧ꮁ諦躸臣膀볯醼韦꺛臣開觧銂뇥몮臣龁胣麃苣릂臣膀볯ꖗ鯧ꮁ볯鲀볯놀뷩ꞁ臣ꎁ臣芀뷯늼볯ꆼ苣邼볯閼뷯螽볯讽뷯꺁铧辇臣開觧ꮁ諦躸臣龁볯開觧銼볯螽臣龁苣醼볯캐螽볯芀볯늼볯뎼迥뎁볯뒼볯꺼볯讧꿧ꦉ苣膀볯骼볯��꺁꿦螎볯ꆼ뷯骼볯뒼볯꺼볯覼臣閊룤馁苣芀뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂胣뎼볯醼볯銼苣膃苣뎃胦芄돨誃菣銲귥袼賥袐觧銼볯銂郥肂볯궸臣놅蟥릖臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ鎨臣龁ꓥ낕臣龁볯늼볯뎼꟦覯觧꺁꣧麡臣ꖻ룤꺁臣誁苣ꞁ臣ꎁ臣骼볯覽볯Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯뚼胣Ꞽ볯鎼볯뺁臣꾁볯醼볯ꎼꓥ낕臣蒁臣貂臣銂郥覜臣讂跥肸ꓥ낕뷤ꮼ볯ꆼ볯₳銼볯辇뷤骃菣膃菣鞊軥銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯袼胣颍蟩鎽胣覼볯袼뷯覽볯鎼臣꺁볯閼蟩鎽菣鞃菣覃諦龎臣뎂菣ꮂ菣麃菣銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯袼臣龁臣ꎁ臣鞼볯辇뷤銂뷤붣臣讂볯膀臣貂臣貂볯ꒁ臣Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯뚼迥뎁볯醼볯꒼ꓥ낕苣ꮐ苣袼胣ꮼ볯ꆼ볯銈볯궼볯뒼苣뎃苣蚃菣벃胣覼볯袼뷯覽뷯覼볯ꒁ臣銼볯辇뷤骃菣膃菣鞊軥꺁苣뎃苣蚃菣벃苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ볯鞁臣貁臣ꚁ볯邼볯辇뷤銂뷤붣臣讂볯膀臣貂臣貂볯ꒁ臣Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯뚼胣Ꞽ볯鎼볯誏臣Ꞽ볯銼볯覤闧銂郥肂볯貀볯늼볯뎼裢钼볯떼볯뎂菣ꮂ菣麃菣趀볯鮼臣龁臣袼뷯隽볯肸럧ꮁ郥芙諦躸臣貂臣钼臣꺁裥薀臣趽볯꺼볯膀臣貂臣貂臣Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯뚼胣Ꞽ볯鎼볯뺁臣꾁볯醼볯ꎼꓥ낕臣蒁臣貂臣銂郥肂跥肸臣覤闧鎽볯늼볯뎼†볯閼蟩鎽菣鞃菣覃諦龎볯貀菣벃菣閁苣龁跥辇뷤趀볯銂苣벃菣馁苣芀꟦覯觧꺁苣龃菣뢅迥뎁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣膀껥붖뻤馼臣風볨꺁臣誁苣ꞁ臣讂胣ꆼ볯醼苣ꒂ菣릂苣钃菣벃菣뎂菣ꮂ菣麃菣鞊軥节臣龁볯뒼볯꺼볯뺁臣꾁꿥ꞅ뷯늼볯ꆼ볯꺼볯ꚼ볯뢼볯袼胣覜諥ꪁ볯醼볯ₑꆼ뷯趀볯ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁꧨ鎨臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†ꧨ鎨뻧銂믤许臣ꢁ臣誂ꇨ醼볯ꮁꓧ馁볯㲚牢ਾ䐼噉邀ꇨ醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㘱㰲愯㰾䐯噉ਾਊ䐼噉邀볯鎼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†볯늼볯뎼諦龎臣뺯臣讂諦龎觧낕髧ꎼ볯颼볯뒼듧麃뿥钭苣閩뻤馁苣龁苣꺁곧醼苣莃菣꺁껥鎨臣꾁胣麃苣릂铧ꖝ臣銼볯ꖗ鯧꺁蓨鎇듧麃苣膀볯辽뷯螽뷯낼뷯閽뷯袼볯銽뷯蚽뷯貽뷯覽뷯₎ꆼ볯꺁귥ꢜ룤ꞁ胣뮂냦鎼볯莄臣閼駦鎖胣ꮼ볯ꆼ볯颍蟩鎽菣鞃菣覃볯骃菣膃菣芁臣誂볯캒螽볯趽뷯覼臣膀苣궂苣鎃菣ꞁ蛥몈뿦鞁臣芀듧麃蛥떂苣袃苣ꒂ菣鎟觨袼볯ꎼ볯覼볯ꦼ볯꺼裢캒覼苣膀볯늼볯뎼†볯醼볯꒼볯膽뷯誼볯込볯銈볯隼볯膀볯늼볯뎼†볯醼볯뚼볯膽뷯誼볯込볯銈볯隼볯膀볯늼볯뎼†볯醼볯꒼볯膽뷯誼볯込볯銈볯隼볯膀볯醼볯ꎼ볯膽뷯誼볯込볯銈볯隼볯膀볯늼볯뎼†볯뒼볯膽뷯誼��込볯鲀볯隼볯誏臣骃菣膃菣ꪁ臣ꮁ臣蒁臣財臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†볯늼볯뎼裢Ꞽ볯銼볯릉闧蒚뿥钭臣ꒁ臣ꚁ臣ꦼ볯뎼臣邵黦銂鯥鎼볯ꮁꓧ馁胣ꮼ볯ꆼ볯銈볯醼볯꒼觧낕髧鲿귧ꮁ臣蒁臣꺁볯ꎼ볯꺁뗧鲞苣뎛볯鎼臣몤臣芀臣貂苣꺁뗧鲞臣袂苣膀諦ꮼ볯ꆼ볯銈볯醼볯뚼迥뎁諦ꮼ볯ꆼ볯銈볯醼볯꒼觧낕髧ꎼ볯颼볯뒼듧麃臣膀꿥鲿臣讂볯늼볯뎼裢뎼볯ꦼ볯Ꞽ菣꾂菣뎃볯颍蟩鎽臣龁臣뎂菣ꮂ菣麃菣覼臣超雧閁苣鶁臣ꚁ郥辗菣鞃菣覃臣趆裥肿臣貂臣麃苣릂臣誁臣ꚁꓦ몇臣貂臣鎁臣貁껥벨臣貂苣芀볯늼볯뎼ꓥ낕苣颍蟩鎽臣龁臣뎂菣ꮂ菣麃菣ꢁ臣ꚁ菣Ꚃ苣ꮁ諦躸臣龁ꃥ袐胣릌闦馁苣薼臣ꦼ볯꺼裢겂菣麃駩Ꞁ볯꒼볯讼볯내菨貁ꛨ覂苣龁胣Ꞽ볯銼볯ꞁꛨ龯臣貂臣鲿귧꾁胣Ꞽ볯銼볯ꞁꛨ龯臣貂臣趏뿥袂苣节볥讁臣龁胣鎁臣龮꣩ꞁ臣膀諦ꮼ볯ꆼ볯₳Ꞽ볯銼볯誏臣鞊볯늼볯뎼†볯醼볯꒼뿥钭臣뎦꿥閁苣ꪁ臣ꎁ臣袼菣벃苣몤臣骁볯芀㰊䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 ꮼ볯ꆼ볯鞊軥ꮁ꿥馁苣鞊軥릉闧蒚볯꒼볯讼볯내菨鲿귧銂ꧨꆾ臣讂臣膂臣견볯꺁苣莃菣꺁껥鎨臣꾁胣麃苣릂铧ꖝ臣銼볯ꖗ鯧꺁蓨鎇듧麃苣膀꿥鲿臣讂볯늼볯뎼菣鞃菣覃볯Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯꒼臣龁臣랼볯뺯藧覼胣骶臣ꚁ볯ꎼ볯袼볯ꚼ볯銈돎볯銂铧蒁臣醃菣릂臣龁볯겼볯誼볯醼볯몙迧馨髧내菨袼볯辽뷯鞼裢ꆼ볯醼듧麃볯ꢁ藥릟ꓩ鞁臣芀볯늼볯뎼裢Ꞽ볯銼볯릉闧蒚뿥钭臣ꒁ臣ꚁ臣ꎼ뷯鎽볯銈볯醼볯놅鿥誤臣邵黦銂鯥鎼볯ꮁꓧ馁胣ꮼ볯ꆼ볯銈볯醼볯꒼觧낕髧鲿귧ꮁ臣蒁臣꺁볯辽뷯鞼裢ꆼ볯醼藥릟ꓩ꺁뗧鲞苣뎛볯閼臣몤臣芀臣貂苣꺁뗧鲞臣覂胣鞊볯늼볯뎼裢Ꞽ볯銼볯誏臣鞊볯늼볯뎼裢Ꞽ볯銼볯릉闧蒚볯꒼볯讼볯내菨鲿귧貁胣뺯뿥馁苣ꮼ볯ꆼ볯銈볯뒼볯꺼볯꾃苣膃菣袼跥辇뷤뺁臣꾁苣뎃苣蚃菣벃볯ꞁ藥ꮖ臣貂胣Ꞽ볯銼볯뺁臣꾁볯醼볯꒼臣醃菣릂臣貂臣ꆼ볯醼볯몙迧내菨ꪠ臣趆裥肿臣貂臣麃苣릂臣誁臣ꚁꓦ몇臣貂臣鎁臣貁껥벨臣貂苣芀臣龁臣ꎁ臣膀볯늼볯뎼諦龎臣뺯臣讂諦龎觧낕髧ꎼ볯颼볯뒼듧麃뿥钭臣鲤蟥ꮁ雩馁苣鎁臣견볯뮂菣袃臣龮꣩ꮁ臣醁苣邵黦꾁胣貐韦骃菣膃菣ꮁ苣讂蛥몈뿦銂铧蒁臣견볯뮂菣袃臣龮꣩讁苣꺁뗧鲞臣麝룥ꮁꇩ벼臣ꚁ臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†鳦貾臣膀韦ꖟ臣ꆼ볯醼볯颋鷦Ꞁ苣ꒂ菣릂苣钃菣벃菣ꮁ꿥馁苣鞊軥릉闧蒚뿥钭苣鞢볥馁苣뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣붃諥銂胣ꆼ볯醼苣ꒂ菣릂苣钃菣벃菣뎂菣ꮂ菣麃��ꞁ藥ꮖ臣龁菣Ꚃ苣놔鷦꺁볯醼韦꺛臣뺄蟨내菨銂铧蒁臣閩뻤鞁臣芀볯醼볯銈菣ꦃ菣릂苣Ꞃ菣莃苣麃苣릂볯ꢡ볯鞼臣ꚇ뷧꒾볯覼臣誁臣ꚁ볯뒼볯꺼볯ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ諦龎臣鞁臣뾽铧馁苣龁苣ꮁ胣颼臣꺁苣ꒂ菣릂苣钃菣벃菣袼볯ꊼ볯₶ꊼ볯겼볯醼胣ꚼ볯떼胣ꢼ볯뚼†볯ꖼ볯膀볯ꊼ볯膀볯ꊼ볯뎂苣鞊軥膀볯ꎼ볯膀볯궼볯誏臣ꊼ볯겼裢銼볯醼볯袼郥銼볯ꊂ菣躃藩覼苣뎂菣ꮂ菣麃菣隌臣ꚁ胣趽볯꺼볯ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣龁胣ꆼ볯醼苣ꒂ菣릂苣钃菣벃菣뎂菣ꮂ菣麃菣节胣꺼볯ꚼ볯뢼꿥ꞅ뷯늼볯ꆼ臣貐駦閊룤鞁臣袼ꇨ醼볯꺁蟥꺽뻧醼볯覼胣颼臣꺁苣钃菣벃菣꺁臣ꆁ볯ꒁ볯ꖼ볯뚼†볯늼볯ꚼ볯膀볯겼볯膀볯ꦼ볯₶꺼볯ꚼ胣ꖼ볯뚼胣ꢼ볯뚼苣ꊂ諦龎볯銂胣钯볨蒚뷤蒁뫤겸볯ꎼ볯邼苣覜臣讂볯醼볯邵郥ꒉ臣鞁臣鲤꣨鞁臣鮼믤꺁볯ꒁ臣ꢂ菣袃菣鞃볯ꢼ볯뚼胣ꎼ볯뚼迥뎁볯ꎼ볯銈볯겼볯覼臣膀볯醼볯ꮁ꿥鞁臣袂苣궸꣧ꚺ臣袺룦閁苣讂ꛨ貒胦銂鳦鞁臣蒁臣貁胣龮꣩蒚臣꾁ꓦ벨臣貂臣蒁臣蒁胣Ꚃ苣ꮃ苣ꢂ菣袃菣鞃臣ꒁ臣ꚁ臣ꊂ菣躃藩超裥膀臣覂臣ꮁ臣貂苣꺁볯ꎼ볯邼苣膀믤许臣ꢡ볯颼臣몤臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㌶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ㰊䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 銼볯ꖗ鯧꺁蓨鎇듧麃苣膀胥薀臣ꆼ볯醼볯Ꚃ苣ꮃ苣ꢂ菣袃菣鞃苣ꢔ臣膀뛧蒁臣ꦼ볯뎼볯ꦼ볯꺼裢캒誏臣뒼볯ꚼ裢캒覼苣ꢔ臣ꚁ苣궂苣鎃菣ꞁ蛥몈뿦鞁臣膀諦龎觧낕髧ꎼ볯颼볯뒼듧麃뿥钭苣鲤蟥鞁臣芀諦龎觧낕髧ꎼ볯颼볯뒼듧麃뿥钭臣膀볯ꒁ臣Ꚃ苣ꮃ苣ꢂ菣袃菣鞃臣蚁臣꺁볯ꒁ볯ꖼ볯뚼胣ꖼ볯뚼†볯늼볯ꚼ볯膀볯겼볯誏臣ꢼ볯뚼†볯ꖼ볯覼臣ꒁ臣ꚁꛨ龯臣貂胣뎛볯隼臣몤臣貂苣袂臣ꮁ胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣鎁苣覂臣Ꚃ苣ꮃ苣ꢂ菣袃菣鞃臣蚁臣鎼臣袼볯ꊼ볯膀볯ꊼ볯₶ꊼ볯겼볯醼迥뎁볯겼볯覼臣ꒁ臣ꚁ볯내菨鲿귧銂ꋥ랼臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†臣龁臣ꎁ臣膀볯겼볯誼볯醼볯袃菣뎃苣뢂苣讃菣꾂菣Ꚃ苣ꮁ臣蒁臣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣貂苣邵黦ꮁ苣ꎁ臣膀볯뒼볯꺼볯貁胣鞊軥릉闧蒚볯내菨鞊볯늼볯뎼뿥钭胣ꪁ苣뎁臣隻臣ꆼ볯醼详龝胦Ꚃ苣ꮃ苣鞊軥ꮁ꿥馁苣鞊苣ꒂ菣릂뿥钭苣超雧鞢볥鞁胣꾃苣膃菣鞊軥ꮁ꿥馁苣鲿귧銂꣧薀臣ꊽ볥袼跥辇뷤誏臣뎂菣ꮂ菣麃菣覼臣超雧鞢볥鞁뻥讂臣ꢁ臣龮꣨閁苣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤醼볯骼볯뒼볯꺼볯꺁藥ꮖꋥ랼臣膀볯讞苣뎃苣벃菣Ꞃ菣뎃迥뎁볯ꚼ뫎볯꺁듦��賥ꮁ苣ꎁ臣趆꟦邈臣貂苣㲋牢ਾ†臣꺁껥붖뻤ꞁ臣膀볯낼볯꾃苣膃菣麃苣릂菣螃菣뮳苣ꢔ臣ꚁ胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣超雧鞢볥鲽铧銂胣醼黥ꒂ菣뾂菣閃苣궃菣銂듦Ꞁ賥馁苣袼꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣ꦼ볯ꚼ볯誏臣ꦼ볯ꚼ볯覼臣膀臣龁臣꺼볯캦ꊼ苣뮴胦隌臣讂볯讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯ꮼ볯캫覼臣꺁臣骁苣讁臣芁苣膀藥ꮖꋥ랼觥꺁藥ꮖꋥ랼뷤ꢔ臣钯볨鞁臣芀볯뒼볯꺼볯₧趽볯꺼볯讧꿧ꦉ볯뚼볯閼볯궼ꓥ낕볯꾁껥붖뻤醼臣風볨閁苣ꚁ臣讂胣讧裦蒚臣뮴胦ꦼ볯ꚼ볯誏臣ꦼ볯ꚼ볯꺁뷯늼볯ꆼ꟦覯觧꾁胣龮雦设볯ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣芀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ볯ꮼ볯캫讧꿧ꦉ臣膀껥붖뻤鎼臣風볨閁苣ꚁ臣讂胣ꢼ볯뚼菣꾂菣뎃菣Ꚃ苣ꊃ菣ꮃ돧꾁胣龮雦设볯ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣芀菣Ꚃ苣銂胣ꢼ볯뚼菣꾂菣뎃苣骼볯覽볯뺯藧讧꿧ꦉ볯꺼볯ꚼ볯뢼볯膀볯覽뷯覼볯뒼볯꺼볯讧꿧ꦉ胣袼뷯覽뷯覼볯늼볯鎼볯ꦼ볯ꚼ볯讧꿧ꦉ胣뺁臣꾁볯覽뷯覼볯늼볯鎼볯ꦼ볯ꚼ볯込볯ꮼ볯캫讧꿧ꦉ臣蒁臣貂臣ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ铧蒁臣超雧鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯閼볯醀⼼䥄㹖 蒐ꧨ鎨뻧꺁菣Ꚃ苣놔鷦꺁볯醼韦꺛臣뺄蟨내菨銂胣龮雦设볯ꮁ꣨覼臣袂臣ꮁ胣ꖼ볯颍룤骃菣膃菣袼볯讀臣讀胣꺁菣鞃菣覃볯뺁臣꾁볯鞼菣鞃菣覃菣벃菣꺁臣骁苣讁苣ꢔ臣ꚁ胣Ꞽ뷯貽뷯覽볯貽뷯螽볯蚕꣦覼볯ꊼ뷯薽뷯薽뷯蒽뷯躽†볯鮼볯꒼†볯覽뷯鎽뷯覽뷯躽뷯薽뷯銂郥肂볯꺁귥ꢜ룤ꞁ胣鎼볯莄臣钼駦鎖苣궂苣鎃菣ꞁ蛥몈뿦鞁臣芀볯꒼볯꾃苣膃菣鲿귧꾁胣ꦼ볯꺼裢캒뺁臣꾁볯꺼볯銈뇎臣ꒁ臣ꚁ臣내菨薆鿦늉볯ꦼ볯뎼볯ꮁ苣ꎁ臣閩뻤鞁臣芀볯ꚼ볯銈돎迥뎁볯꺼볯銈뇎臣ꒁ臣ꚁ臣銼볯ꖗ鯧꺁蓨鎇듧麃臣袂苣ꖼ볯릉闧蒚뿥钭臣ꒁ臣ꚁ臣ꎻꇨ蒚臣ꦼ볯뎼뗧鲞苣뎛볯鞼볯袼볯ꚼ볯銈돎볯誏臣뎛볯鞼볯袼볯꺼볯銈뇎볯ꮁꓧ馁胣龮꣩꾁볯邼韦銂胩鞁臣財臣膀볯邼韦꺛臣뺄蟨내菨꺁뗧鲞臣銼볯ꖗ鯧ꮁꛨ龯臣貂臣邵黦ꢁ郥覭臣芁臣龁胣鶁臣邵黦讁苣膀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣ꦼ볯ꚼ볯讼꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣ꦼ볯ꚼ볯讼꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣ꦼ볯ꮼ닎臣蒵臣袐苣鮁臣膀볯뒼볯꺼볯銪믤ꊂ苣ꖃ菣뎃菣ꢡ迧讞苣趏뻥鞁臣鎁臣貁ꓧ閁苣讂胣鞁臣貁臣ꚁ胣鎁苣覂臣邵黦讁苣膀볯뒼볯꺼볯꺁藥ꮖꋥ랼諥鮊臣膀볯讞苣뎃苣벃菣Ꞃ菣뎃迥뎁볯ꚼ뫎볯銂듦Ꞁ賥馁苣讧꿧ꦉ臣뾽铧ꮁ苣ꎁ臣趆꟦邈臣貂뻥讂臣ꢁ臣龮꣨閁苣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤醼볯骼듧麃蛥貵럨꺁ꫨ肯臣袂苣超雧鞢볥㲷牢ਾ†臣꺁껥붖뻤ꞁ臣膀볯뒼볯꺼볯��꺁藥ꮖꋥ랼諥鲞苣膀듧麃蛥貵럨銂ꫨ肯臣讂藥ꮖꋥ랼觥꺁ꋥ랼諥鲞臣钯볨鞁臣芀臣貂臣貂볯겼볯꺁룤膵臣龩菨馁苣내菨薆苣낂菣ꮃ볤钁苣뎃菣꾂돨ꞁ臣讂胣뒼볯ꮼ볯膀볯늼볯궼臣龁臣궼뷯꒼볯颼苣뎂菣覃臣讂藥ꮖꋥ랼觥趽볯꺼볯讧꿧ꦉ苣ꚩ꣩鞁臣芀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ꟦覯觧袼볯醼볯閼볯覼臣膀껥붖뻤醼臣風볨閁苣ꚁ臣讂胣뒼볯ꮼ볯讧꿧ꦉ臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂믤ꢡ髧ꪁ苣龃菣뢅藩鞈臣膀藩鞈闧랏볯隼볯ꮁꓧ閁苣讂볯超裥ꪕ迥醼볯醼볯誏臣醼볯颼볯ꮁꓧ閁苣讂뻤몤髧貃苣것苣膃菣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣覼胣뒼볯ꆼ볯讧꿧ꦉ臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂믤ꢡ髧ꪁ苣龃菣뢅藩鞈臣膀藩鞈闧랏볯鎼볯ꮁꓧ閁苣讂볯超裥ꪕ迥醼볯醼볯誏臣醼볯颼볯ꮁꓧ閁苣讂뻤몤髧ꪁ菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂볯芀볯馽볯颼볯讧꿧ꦉ臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂믤ꢡ髧ꪁ苣龃菣뢅藩鞈臣膀藩鞈闧랏볯鎼볯袼藩鞈闧랏볯钼볯馼迥뎁볯钼볯邼臣몤臣貂苣设ꓧ蒚臣貃苣것苣膃菣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣覼迥뎁藩鞈闧랏볯鎼볯ꮁꓧ閁苣讂胣麃苣릂苣骼볯覽볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ胣袼뷯覽볯뒼볯ꮼ볯膀볯覽뷯覽볯뒼볯ꆼ볯膀臣龁臣袼뷯隽볯궼뷯꒼볯颼臣蚁臣꺁臣骁苣讁苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ꟦覯觧ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ胣ꚩ꣩鞊軥ꢁ臣ꚁ苣鲃苣ꮃ菣龃菣銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯銂铧蒁臣超雧鞁臣芀볯뚼볯鞊軥趽볯꺼볯讧꿧ꦉ迥뎁藥ꮖꋥ랼觥趽볯꺼볯讧꿧ꦉ苣膀臣貂臣貂볯邼볯鎼볯躼볯骼볯邼볯醼볯閼臣钯臣膀賥袐觧銼볯骼苣것苣蚃菣벃菣骼볯뎼볯ꎼ볯낼볯Ꞽ裢꒼볯Ꞽ苣ꮐ苣芄돨誃菣銲귥궸臣놅蟥릖臣龁胣麃苣릂苣膀볯誏臣醼볯ꖗ鯧ꮁ볯躼볯趽뷯込뷯螽臣训苨薆臣超雧鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 蒐ꧨ鎨뻧꺁菣Ꚃ苣놔鷦꺁볯閼韦꺛臣뺄蟨내菨銂胣Ꞽ뷯貽뷯覽볯貽뷯螽볯蚕꣦覼볯ꊼ뷯薽뷯薽뷯蒽뷯躽†볯鮼볯꒼†볯覽뷯鎽뷯覽뷯躽뷯薽뷯銂郥肂볯꺁귥ꢜ룤ꞁ胣鎼볯莄臣钼駦鎖胣꾼볯ꆼ菣鞃菣覃볯궼볯ꎼ苣ꦃ苣ꦼ볯銂铧蒁臣ꢂ苣붂菣鲃臣趆裥肿臣龁胣ꎼ볯颼菣꾂菣뎃뿥钭臣膀볯ꚼ볯銈돎胣뒼볯ꚼ裢캒뺁臣꾁볯겼裢銼臣ꒁ臣ꚁ臣내菨薆鿦늉볯ꦼ볯뎼볯ꮁ苣ꎁ臣閩뻤鞁臣芀볯ꚼ볯銈돎胣뒼볯ꚼ裢캒誏臣ꦼ볯銈볯ꮁ臣蒁臣꺁볯閼韦꺛臣뺄蟨내菨ꮁ苣讂볯뚼볯릉闧蒚뿥钭臣ꒁ臣ꚁ臣ꎻꇨ蒚臣ꦼ볯뎼뗧鲞苣뎛볯颼볯袼볯ꚼ볯銈돎볯膀鯥鎼볯ꊼ볯뒼볯ꚼ裢캒覼迥뎁鯥鎼볯ꎼ볯ꦼ볯銈볯覼臣몤臣��臣꺁껥鎨臣閼볯ꖗ臣辂臣ꎁ臣財臣膀볯邼韦꺛臣뺄蟨내菨꺁뗧鲞臣銼볯ꖗ鯧ꮁꛨ龯臣貂臣邵黦ꢁ賥떕臣ꚁ臣龁胣鶁臣邵黦讁苣膀볯ꆼ볯醼胣뒼볯ꆼ볯誏臣궼뷯꒼볯颼꟦覯觧貁볯뒼볯꺼볯ꢁ郥颧臣超雧鞢볥뮴胦銂ꓧ鞁臣鎁臣貁껥벨臣貂苣芀臣龁臣ꎁ臣膀臣貂苣꺁뗧鲞臣覂胣鶁臣袂臣ꪁ듧麃蛥貵럨꺁꟦邈ꛨꂴ胣릉臣뒼볯늼臣许뗦ꞁꧦ붃臣讂꟦邈ꛨꂴ苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂铧蒁臣내菨薆뗧꾷苣뾪꿧馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣超雧鲿귧貁ꋥ랼臣貂뻥讂臣ꢁ臣龮꣨閁苣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤醼볯骼苣肃菣뾂菣뾂菣醃苣ꪳ臣袂苣誏臣ꒂ菣閃菣麃苣벃菣ꮁ苣讂藥ꮖꋥ랼臣龁臣趃苣궃菣붂菣ꂃ臣颪냥㲎牢ਾ†臣꺁껥붖뻤ꞁ臣膀뷯늼볯ꆼ꟦覯觧꺁菣趃菣꺁藥ꮖꋥ랼菨銂胣ꚩ꣩鞊軥ꢁ臣ꚁ苣鲃苣ꮃ菣龃菣銂铧蒁臣麃苣릂臣钯볨鞁臣袼껥붖뻤醼볯ꮁ꣨覼臣ꢁ臣誂볯芀뷯늼볯ꆼ꟦覯觧꺁菣趃菣꾁胣ꊂ菣鞃苣벃苣뎃菣꾂돨뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣龁臣궼볯뚼볯袼菣袃苣뎃菣ꪃ苣鞊苣ꒂ菣릂苣낂菣ꮃ볤钁苣뎃菣꾂돨覼胣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯ꮼ볯캫袼볯ꚼ뫎볯銂듦Ꞁ賥馁苣覼胣ꮂ苣醃菣벂볯込볯袼苣뎃菣ꦃ菣붂菣ꂃꫨ躰臣ꊖ룤覼臣龁臣궼볯ꮼ볯袼菣꾂菣袃苣벃菣颪냥ꮁ雩躸볯꺁臣骁苣讁苣뎂菣覃臣龁胣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯뒼볯꺼볯讧꿧ꦉ볯뚼볯閼볯궼볯꾁胣龮雦设볯ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣芀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣ꦼ볯ꮼ닎꟦覯觧꾁胣龮雦设볯ꮁ꣨覼臣貂臣誁苣膀臣鞁臣超裥ꪕ迥醼볯銼臣몤臣貂苣ꊂ菣躃藩超裥銂苣벃菣馁苣袼藩鞈闧랏볯閼볯誏臣醼볯馼볯ꮁꓧ閁苣讂뻤몤髧ꪁ菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂볯芀볯ꆼ볯뎼꟦覯觧ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣ꎻꇨ蒚臣ꊂ菣躃藩超裥꾁胣超裥ꪕ迥醼볯颼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂볯超裥ꪕ迥醼볯醼볯誏臣醼볯颼볯ꮁꓧ閁苣讂뻤몤髧ꪁ菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂볯芀볯겼볯겼꟦覯觧ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣ꎻꇨ蒚臣ꊂ菣躃藩超裥꾁胣超裥ꪕ迥醼볯銼볯袼藩鞈闧랏볯钼볯銼迥뎁볯钼볯鎼臣몤臣设ꓧ蒚臣貃苣것苣膃菣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣覼迥뎁볯鎼볯颼臣몤臣貂苣芀苣릂菣벃苣銈볯讧꿧ꦉ臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂믤ꢡ髧ꪁ苣龃菣뢅藩鞈臣膀藩鞈闧랏볯鞼볯鲀볯鞼볯袼藩鞈闧랏볯鎼볯閼迥뎁볯钼볯鞼臣몤臣貂苣设ꓧ蒚臣貃苣것苣膃菣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣覼臣몤臣貂苣芀苣릂菣벃苣銈볯讧꿧ꦉ臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂믤ꢡ髧ꪁ苣龃菣뢅��鞈臣膀藩鞈闧랏볯鎼볯銼胣醼볯閼볯袼藩鞈闧랏볯鎼볯隼迥뎁볯钼볯颼臣몤臣貂苣设ꓧ蒚臣貃苣것苣膃菣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣覼臣몤臣貂苣芀믤许臣蒁臣貂臣銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣蒵臣袐苣鮁臣膀ꧨ鎨諦龎臣鞁臣꺁苣鲃苣ꮃ菣龃菣銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯ꞁ菣Ꚃ苣銂藥ꮖ臣龁볯袼뷯覼볯뒼볯꺼볯鮼볯覽뷯覼볯ꆼ볯뎼볯袼뷯覽뷯覼볯ꮼ볯캫鮼볯覽뷯覼苣릂菣벃苣醼볯钼볯ꦼ볯ꮼ닎볯袼뷯覼볯겼볯겼볯뺁臣꾁볯隽뷯覼볯겼볯겼볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ胣꺼볯ꚼ볯뢼꟦覯觧誏臣꒼볯뢼볯ꆼ볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ뻤颭胦ꪇ蓧超雧貵럨꺁賥ꚭ髧뮴胦隌觥覼苣뺯藧ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣龁胣꾼볯ꆼ諦龎뷯늼볯ꆼ꟦覯觧誏臣超雧鞢볥ꒉ뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂胣鶁苣麁苣閼볯骼볯颼볯閼볯醼볯骼볯躼볯꺁꿦ꞁ胣隌郥ꦉ볯閼볯뎂菣릂菣궃菣ꮃ볯꒼볯낼볯骼볯ꖼ볯銈볯궼볯銂郥肂蓨ꪳ菣躃닧邭룤ꮁ藥ꚇ雦鞁臣芀菣Ꚃ苣銂볯誏臣醼볯ꖗ鯧ꮁ볯躼볯趽뷯込뷯螽臣训苨薆臣超雧鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 蒐ꧨ鎨뻧꺁菣Ꚃ苣놔鷦꺁蓨鎇듧麃苣膀볯辽뷯螽뷯낼뷯閽뷯袼闥馨볯袼볯銽뷯蚽뷯貽뷯覽뷯₎ꆼ볯ꊼ볯₤ꊼ뷯辽뷯莽뷯薽뷯莽뷯鎽苣ꮐ苣覼臣颭鳥许臣膀볯뚼볯骃菣膃菣袼볯ꢼ볯꾂菣릂볯覼苣ꢔ臣ꚁ볯鞼蓢ꞁ볯芙雩膀苣궂苣鎃菣ꞁ蛥몈뿦鞁臣芀諦龎觧낕髧ꎼ볯颼뿥钭臣膀볯ꚼ볯銈돎臣ꒁ臣ꚁ듧麃蛥鎟觨袼볯ꎼ볯覼臣袂臣ꚁꧨꆾ臣貂臣芀볯ꚼ볯銈돎臣ꒁ臣ꚁ臣銼볯ꖗ鯧꺁蓨鎇듧麃臣袂苣꾼볯ꆼ觧낕髧鲿귧ꮁ臣蒁臣꺁믤ꢡ髧ꪁ볯ꎼ볯邵黦銂鯥鎼볯ꮁꓧ馁胣ꦼ볯꺼裢캒ꮁ臣蒁臣꺁볯邼韦꺛臣뺄蟨내菨ꮁ苣讂볯뚼볯릉闧蒚뿥钭臣ꒁ臣ꚁ臣ꎻꇨ蒚臣ꦼ볯뎼뗧鲞苣膀鯥钼볯ꮁꓧ馁胣鶁臣邵黦ꮁ苣ꎁ臣膀苣肃菣뾂菣隌郥ꦉ볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ迥뎁볯ꆼ볯뎼볯膀苣뎃菣ꦃ菣붂菣ꂃ臣颪냥袼苣릂菣벃苣醼볯钼볯ꦼ볯ꮼ닎臣袂苣覼臣龁臣趃苣궃菣붂菣ꂃ臣颪냥袼볯겼볯겼臣袂苣覼臣ꢅ臣膀諦龎觧낕髧ꎼ볯颼뿥钭臣超雧鞢볥銂苣龁苣鞁臣鎁臣貁껥벨臣貂苣芀臣覂臣膀볯겼볯겼臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣蒵臣袐苣鮁臣膀볯겼볯겼跥겋臣钯볨鞁臣鞢볥閁苣龁듦Ꞁ苣몤臣龁胣閁苣ꮁ胣閼볯ꖗ鯧꺁뗧鲞臣袂臣ꚁ胣超雧鞢볥릊黦貁賦骶髧ꞁ臣讂臣ꢁ臣龮꣨閁苣ꚁ臣讂胣鎁苣覂臣邵黦讁苣膀藥ꮖ뿥钭臣ꊂ菣鞃苣벃苣뎃菣꾂돨ꮁ苣ꎁ臣膀苣뎃菣ꦃ菣붂菣ꂃ臣颪냥ꮁ苣ꎁ臣膀臣龁臣趃苣궃菣붂菣ꂃ臣颪냥ꮁ苣ꎁ臣鞢볥閁苣鞾苣鎁臣貁껥벨臣��貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯鞼볯讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯뒼볯꺼볯讧꿧ꦉ臣钯볨㲃牢ਾ†臣꺁껥붖뻤ꞁ臣膀볯閼볯込볯貽볯麃苣릂苣膀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣낕臣讂볯뒼볯꺼볯覤闧鎽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧ꢁ藥ꚇ雦뺁臣꾁郥芙諦躸臣龁胣꾼볯ꆼ諦龎苣벃菣趽볯꺼볯讧꿧ꦉ苣ꢔ臣ꚁ藥ꮖ臣龁胣ꚩ꣩鞁臣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯뒼볯꺼볯讧꿧ꦉ臣ꖻ룤꺁臣誁苣ꞁ臣ꎁ臣骼볯覽볯邽볯鎼볯뚼볯閼볯궼볯鮼볯覽뷯覼뷯閼볯袼볯銼볯钼볯込볯醼볯鞼볯込볯醼볯钼볯込볯醼볯閼볯覼볯袼뷯覽뷯覼뷯閼볯袼볯醼볯鞼볯込볯醼볯钼볯込볯醼볯閼볯覼볯誏臣袼뷯隽볯邽볯馼볯늼볯颼볯궼볯芀藥ꚁ臣讧꿧ꦉ苣膀볯뚼볯鞊軥讧꿧ꦉ臣놅蟥릖臣ꚁꧨ鎨臣龁胣邽볯鎼꟦覯觧节臣龁胣꾼볯ꆼ諦龎꟦覯觧ꢁ郥芙諦躸臣ꚁ胣龁臣鞁裥薀臣ꚇ雦鞁臣ꚩ꣩鞁臣芀菣Ꚃ苣銂볯ꖗ鯧誏臣醼볯ꖗ鯧ꮁ藥ꮖ臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†볯醼韦꺛臣膀菣Ꚃ苣銂뇥몮臣膀볯꒼볯讼볯내菨ꮁ苣讂볯ꚼ볯銈돎駧뺏苣膀鳦躘듧뢛臣風볨꺁苣蚁臣ꦼ볯뎼臣袂苣閩뻤鞁臣芀臣꺁뗧鲞苣뎛볯醼볯ꮁꓧ鞁臣誁苣膀臣貂臣袂苣膀ꧨ鎨臣龁藥ꚁ臣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯뒼볯꺼볯覤闧鎽꟦覯觧貁胣ꒂ菣鎃菣ꞁ볯꺼볯ꚼ볯뢼꿥ꞅ臣钯볨鞁臣覼볯뚼볯鞊軥ꮁ꿥馁苣鞊軥릉闧蒚볯꒼볯讼볯내菨鲿귧銂藥ꮖꋥ랼臣讂菨鮊苣몤臣龁臣ꢁ臣龮꣨閁苣讂胣閁苣ꮁ胣邽볯鎼꟦覯觧꾁胣鶁苣貁볯뚼볯鞊軥讧꿧ꦉ臣놅蟥릖臣貂臣ꢁ臣膀迥뎁臣貂臣꾼볯ꆼ諦龎꟦覯觧ꢁ郥芙諦躸臣貂臣貁胣龁臣鞁裥薀臣ꚇ雦閁苣龁臣趁臣ꆸ雦ꢁ苣膀諦龎觧낕髧ꎼ볯颼볯뒼듧麃뿥钭苣超雧鞢볥鞁臣芀臣覂臣膀볯邼韦꺛臣膀菣Ꚃ苣銂뇥몮臣膀볯꒼볯讼볯내菨ꮁ苣讂볯ꚼ볯銈돎駧뺏苣膀鳦躘듧뢛臣風볨꺁苣蚁臣ꦼ볯뎼臣袂苣閩뻤鞁臣芀臣꺁뗧鲞苣뎛볯醼볯ꮁꓧ鞁臣誁苣膀臣貂臣袂臣ꚁ胣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯뒼볯꺼볯覤闧鎽꟦覯觧꺁藥ꮖꋥ랼諥鲞臣膌뛧蒚臣芁苣鎁臣貁껥벨臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯颼볯뎼볯ꦼ볯Ꞽꫥ讻藥ꮖꋥ랼臣誁臣讂볯꒼볯誏臣ꎼ볯颼볯내菨꺁뷥늉戼㹲 鎁臣龮雦设臣꾁胣ꎼ볯钼黦螸菣Ꚃ苣뺁臣꾁볯꒼볯꾞룦麃苣릂苣ꢔ臣ꚁ胣뎼볯ꦼ볯Ꞽꫥ讻藥ꮖꋥ랼臣誁臣讂볯꒼볯讼臣龁臣ꎼ볯颼볯뒼듧麃臣립觥銂ꧨꆾ臣龁胣견볯꺁룤ꎀ臣龮꣩ꞁ臣膀볯꒼볯내菨銂黦螸臣鮁苣龁苣ꮁ胣龮꣩꺁裢鎼胣銈볯膀볯醼迥뎁볯鎼韦꺛臣膀菣Ꚃ苣ꮁ諦ꎼ볯钼†뷯ꆼ뷯₂Ꞽ볯��볯閼苣릅藨薆돦蒰臣龁胣꾞룦릊軧꾁胣閃菣벃苣ꒂ菣ꆃ菣ꪃ菣ꮁ苣ꎁ臣몢ꫨ鞁臣芀菣Ꚃ苣ꮁ胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ꟦覯觧袼볯醼볯閼볯覼臣놅蟥릖臣貂臣ꢼ볯뚼볯隼†볯隼볯ꖼ볯鞊軥꾃苣膃菣銂铧蒁臣膀볯躼볯趽뷯込뷯螽臣ꢔ蟩ꞁ귧覂蛥ꮁ胣醼韦꺛臣醼볯ꖗ鯧ꮁ菣꾂菣뎃軦꺨臣龁胣鎁臣꾃苣膃菣誏臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ†뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂胣醼볯醼臣钯臣膀賥袐觧銼볯骼苣것苣蚃菣벃菣骼볯뎼볯ꎼ볯낼볯Ꞽ裢꒼볯Ꞽ苣膀臣貂臣貂볯邼볯鎼볯躼볯骼볯邼볯醼볯閼臣钯臣ꮐ苣芄돨誃菣銲귥궸臣놅蟥릖臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†볯醼韦꺛迥뎁볯邼韦꺛臣膀菣Ꚃ苣銂뇥몮臣膀볯꒼볯讼볯내菨ꮁ苣讂볯ꚼ볯銈돎駧뺏苣膀鳦躘듧뢛臣風볨꺁苣蚁臣ꦼ볯뎼臣袂臣ꚁꧨꆾ臣龁胣鶁臣邵黦銂鯥钼볯ꆼ볯銼볯ꖗ鯧覼迥뎁鯥钼볯ꊼ볯閼볯ꖗ鯧覼臣몤臣芀볯ꎼ볯ꮁ苣誂ꧨꆾ臣龁臣鎁苣袼菣벃苣꾁ꓧ閁臣覼胣ꎼ볯颼볯뒼듧麃臣袂苣뒼볯ꚼ裢캒몙迧ꮁ臣蒁臣貐꟦꺁뗧鲞臣뎦꿥閁苣龁胣鶁臣邵黦ꮁ苣誂胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣袂臣ꚁꫥ讻臣貂苣ꊂ苣ꖃ菣뎃菣릊黦貁볯꒼볯讼볯내菨꺁諥醁臣꾁臣ꢁ苣ꦁ蓧ꊖ뿤ꞁ臣讂臣ꢁ臣龮꣨閁苣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†곧銼臣肸胩꺁껥鎨臣꾁胣ꮅ飧내菨鞢껦ꮁ꿥馁苣ꢼ볯뚼裢뎼볯ꦼ볯Ꞽ菣꾂菣뎃臣릊黦ꮁ臣醁苣ꎼ볯钼迥뎁볯꒼볯뒼듧麃臣립觥銂胣龮雦设볯邼臣風볨꺁볯ꎼ볯ꊃ菣ꮃ苣ꢔ臣ꚁꫨ릁臣芀볯ꎼ볯ₑꢼ볯뚼듧麃볯銼韃볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰閼⼼畳㹰듧麃볯銂胣ꎼ볯鞼볯ꊼ볯麃苣릂臣꺚룤뮧ꓦ鞁胣ꮅ飧銂볯邼볯趽뷯㲍畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲓猯灵꺁껥趩臣Ꞥ臣閁臣ꞁꋥ隮臣鮁臣膀臣貂苣醼韦꺛臣鞁臣芀볯ꖗ鯧誏臣颼韦꺛臣膀菣Ꚃ苣ꮁ볯뒼볯꺼볯讧꿧ꦉ볯뚼볯閼볯궼볯ꢁ藥ꚇ雦閁苣龁볯낼볯醼볯ₖꖼ볯込볯鞼迥뚺胦鞊軥꾃苣膃菣袼볯骼볯꺁꿦螎臣鎽볯隼볯ꖼ볯誏臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯銂볯邼볎뷯꺁諦躸蟩ꞁ귧覂蛥ꮁ諦躸臣龁胣뺯藧麃苣릂臣낼볯뎼臣뾁臣ꚇ뷧鞁臣芀臣覂臣膀볯膀볯膀볯膀볯邼韦꺛臣膀臣鞁臣鶁臣貾ꃧ뚩臣芵苣誂臣ꞁ胩ꮁ볯麛胣麃苣릂苣鞊볯꒼볯袼볯ꮼ볯躼볯趽볯芽볯뺁臣꾁諦ꎼ볯颼볯銼볯钼볯趽볯芽볯꺁臣骁苣讁苣ꢔ臣ꚁ蟥꺽臣ꚁ胣鶁苣麁苣ꎼ볯钼볯내菨뺁臣꾁볯꒼볯내菨銂黦螸臣鮁臣芀꿥ꞅ菣Ꚃ苣꾁黦螸諦鎽臣ꚇ뷧鞁臣讁臣龁胣ꚇ뷧꒾迥뎁꿥鲿臣讂諦躸蟩꾁ꇨ醼볯ꮁꓧ鞁臣蒁苣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮��㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㐶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ㰊䥄㹖胣醼볯隼볯醀⼼䥄㹖 邵黦銂鯥钼볯ꮁꓧ鞁胣鎁苣꾁볯銼韦꺁뗧躁臣辂臣讂藨趘껥趩苣몤臣芀臣꺁뗧鲞臣覂胣ꎼ볯钼볯뒼듧麃臣꾞룦꾁볯낼볯銈볯뒼볯꺼볯꾃苣膃菣꺁諦ꮅ飧릊黦ꮁ鳦辄臣놽鿩銂迥벁臣ꪁ臣ꎁ臣貁胣ꎼ볯颼볯뒼듧麃臣꾞룦꾁볯낼볯銈볯뒼볯꺼볯꾃苣膃菣꺁諦ꮅ飧릊黦ꮁ뷥뾟苣誏臣鞁臣鎁臣貁껥벨臣貂胣鶁苣ꮁ苣ꎁ臣꾃苣膃菣꺁鳦릊胦꾁볯꒼볯讼볯내菨ꮁ臣鶾귥馁苣貁胣ꎼ볯钼볯뒼듧麃臣꾁뻤颭臣ꪁ臣鎁臣貁껥벨臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯馼볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣膀볯꒼볯내菨銂苣閃苣꾂苣벃꣨뚆ꇨ뺏黥뢁귦뺁臣讂戼㹲 鎁臣龮雦设臣꾁胣ꎼ볯隼볯겼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰貽뷯㲏猯灵ꢂ菣Ꞃ苣뾂菣ꆃ菣ꪃ菣내菨ꮁ雩鞁臣龮雦设볯誏臣隼臣놠釥閁苣龁뗧鲞苣閁苣ꮁꋧ趪臣讂臣膂臣膀볯閼볯込볯貽볯麃苣릂苣颧胣ꪁ뿦ꚺ臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣놅蟥릖臣龁꟦薀臣莿뫥꺁볯ꎼ볯颼菣꾂菣뎃臣超雧鞁臣붿諥龮꣩銂ꇨꎁ臣芀뷤ꢔ臣龁볯螽迥뎁볯뒼볯꺼볯꺁蟩込꿦螎臣膀껥붖뻤醼볯꺁ꇨ醼볯ꮁ꣨覼臣节臣ꢁ郥颁臣芁臣龁胣麃苣릂苣醼韦꺛迥뎁볯钼韦꺛臣超雧鞁臣芀볯醼韦꺛迥뎁볯钼韦꺛臣膀볯꒼볯钼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰袽뷯㲉猯灵ꎼ볯颼볯내菨꺁臣ꆁ臣ꎼ볯隼볯겼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰貽뷯㲏猯灵ꢂ菣Ꞃ苣뾂菣ꆃ菣ꪃ菣내菨꺁觥袐苣뾪臣龁胣鶁臣邵黦銂鯥钼볯ꆼ볯銼볯ꖗ鯧覼迥뎁鯥钼볯ꊼ볯閼볯ꖗ鯧覼臣몤臣芀臣꺁뗧鲞臣覂胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ藥ꮖꋥ랼觥趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣膀볯꒼볯내菨蚛鯥銂苣閃苣꾂苣벃꣨뚆ꇨ뺏黥袼볯꒼볯銼볯㲬畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯辽⼼畳㹰듧麃볯뢁귦뺁臣讂臣ꢁ臣龮꣨閁苣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤銼볯骼볯뒼볯꺼볯꾁胣뎂菣ꮂ菣麃菣꾃苣膃菣ꮁ꿥馁苣鲿귧銂胣颧胣ꪁ諦龎볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ꿦螎臣超雧鞢볥馁苣㲋牢ਾ†臣꺁껥붖뻤ꞁ臣膀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣ꦁ臣超雧鞢볥ꒉ臣膀苣뎃苣蚃菣벃菣꾂菣뎃臣뺯臣讂볯내菨鲿귧銂ꋥ랼臣鞾苣讁郥讁苣鲤꣨鞁臣芀苣ꦃ苣ꦼ迥뎁苣ꦃ苣ꦼ볯ꢂ菣袃菣鞃苣뎂菣覃臣讂볯ꆼ裢醼볯銼苣뎃苣蚃菣벃볯龮雦设볯醼臣風볨覼苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂菣꾂菣뎃臣鞁臣뾽铧鞁胣鶁臣ꚁ苣ꦃ苣ꦼ迥뎁苣ꦃ苣ꦼ볯ꢂ菣袃菣鞃臣뺯臣讂볯내菨鲿귧ꮁ꿥馁苣趽볯꺼볯₡뎼볯ꦼ볯Ꞽ꟦覯觧꺁諥鲞苣鲤꣨鞁臣芀볯ꆼ裢��醼볯銼迥뎁볯뒼볯꺼볯₧趽볯꺼볯꾁胣놅蟥릖臣貂郥芙臣膀臩閁苣讂臣膀臣龁臣놅蟥릖臣貂臣ꮁ胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ†뷯늼볯ꆼ臣薁믥膀臩閁苣龁胣開觧ꮁ胣醼韦꺛臣鞃菣ꒂ菣뎃苣ꢔ蟩銂胣誏臣醼볯ꖗ鯧ꮁ뿨ꂊ藥ꮖ苣躸臣龁胣뺄듧麃苣銼볯ꖗ鯧ꮁ軦随臣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†볯뒼볯꺼볯銂꟦薀臣钯軧ꞁ苣뎃苣蚃菣벃菣꾂菣뎃臣뮷諥馁苣ꢁ臣꺁藥ꮖ軥Ꞁ苣몱껥馁苣龁苣膀볯뒼볯꺼볯銂룥ꦲ臣肸뗦ꊂ苣ꖃ菣뎃菣ꢁ꿦莼臣讂臣膂胣超雧龎胦貁볯뒼볯꺼볯閊룤꺁苣ꒂ菣뎃苣ꮁ뻤颭臣讂臣Ꚑ臣銂뇦骮臣讂臣膂胣誏臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ諦躸駦꺁鳦ꚇ雦趽볯꺼볯꺁藥ꮖ軥Ꞁ苣鲤鿦馁苣龁苣ꮁ胣꺨胣꺁鷦首苣ꚩ꣩鞁臣芀믤许臣邝雦込鷦뚻苣ꚩ꣩鞁臣骼볯ꆼ裢醼볯銼볯鎼볎뷯覼胣鶃菣ꦼ볯ꎼ볯醼볯캐螽볯銂鳦馁苣ꎼ볯銈볯鎼볯袼볯캓螽볯膀볯낼볯ꆼ볯閼볎뷯覼苣覜臣讂볯ꆼ裢醼볯銼볯鎼볎뷯覼胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯醼볎뷯覼볯ꎼ볯銈볯鎼볯袼볯캓螽볯膀볯뒼볯꺼볯袼볯躼볯캖螽볯込볯ꆼ裢醼볯銼볯鎼볎뷯覼胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯邼볯隼볎뷯覼볯ꎼ볯銈볯鞼볯鎼볎뷯覼胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯邼볯隼볎뷯覼볯ꎼ볯銈볯鎼볯袼볯캓螽볯袼볯钼駦鎖뻥覼胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯邼볯隼볎뷯覼볯ꎼ볯銈볯鎼볯袼볯캓螽볯袼볯颼駦鎖뻥覼胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯邼볯隼볎뷯覼볯ꎼ볯銈볯鎼볯袼볯캓螽볯袼鳦ꚇ雦覼胣誏臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯隼볎뷯覼볯ꎼ볯銈볯鎼볯袼볯邼볎뷯覼볯ꪜ蟥릖볯芀볯ꆼ裢閼볯꾁胣閼臣꺁苣ꦃ苣ꦼ볯ꢂ菣袃菣鞃臣뎂菣ꮂ菣麃菣ꞁ臣讂볯鶁苣覂臣ꢅ臣ꎼ볯銈볯鎼볯ꮁ郥뺁苣ꚁ臣讂볯芀㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 邵黦銂鯥钼볯鲀볯鞼臣몤臣芀諦龎觧낕髧ꦼ볯꺼裢캒鲿귧貁苣ꦃ苣ꦼ볯ꢂ菣袃菣鞃臣뾪臣覂苣龁臣趁胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣膀뷯늼볯ꆼ臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣龁볯ꢼ볯꾂菣릂볯ꦼ苣钃菣벃菣ꮁ꿥馁苣超雧鲿귧銂ꋥ랼臣讂臣ꢁ臣讦蟥閁苣龁胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣膀룥ꦲ臣ꊂ苣ꖃ菣뎃菣ꢁ郥覭臣馌该銂ꓧ鞁臣袼铧辇臣閼胣醼볯趀臣꺷볯芀ꧨ鎨臣龁룤릖臣钯軧꾁ꧦ붃臣龁臣膀볯骼볯꺁볯뒼볯꺼볯骼諦龎臣钯軧꾁볯骼볯꺁뗧뾁郥辂臣袂苣节觨붥臣龩菨鞁臣袼鯥钼볯覼胣誸꣨꺁臣誁苣膀臣龁鯥钼볯ꮁꓧ馁苣蚁臣膀苣ꦃ苣ꦼ苣钃菣벃菣銂뷤ꢔ臣ꚁ郥颧臣邵黦貁뻥覂苣龁胣貐꟦ꮁ胣醼볯閼臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯鞊軥钯臣膀苣ꦃ苣ꦼ苣钃菣벃菣ꮁ臣蒁臣꺁볯骼볯꺁뗧뾁郥辂臣袂苣节觨붥臣龩菨馁苣鎁臣貁ꛨ몇臣貂臣芀㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 閁��ꮁ胣薁臣芙苧袼볯钼駦鎖볯ꞁ볯뒼볯꺼볯銂諦躸臣讂臣膀藥膀臩ꢁ郥颧臣超雧龎胦貁ꋥꞤ臣讂臣ꢁ臣讦蟥閁苣龁볯뎛볯鞼볯芀㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 閁苣ꪁ苣龮꣩ꞁ臣膀볯銼胥꺁菣Ꚃ苣ꢂ菣袃菣鞃苣뾽铧鞁臣膀闧ꪁ苣뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯鞊軥钯臣릊黦銂ꫨ릁臣芀菣Ꚃ苣ꮁ볯ꖗ鯧ꮁ菣ꦃ苣龃菣낂铧辇胣颼韦꺛臣붿諥超雧ꢔ蟩銂諦躸臣膀볯閼韦꺛臣뺄듧麃苣ꆎ迥鞁臣芀蛥몈뿦ꮁ꿥馁苣뒼듧麃뿥钭苣膀볯겼볯뎼뷯辽뷯誏臣ꚼ볯ꎼ볯銂뷤ꢔ臣ꚁꧨꆾ臣龁胣ꒂ菣鎃菣궃臣꺁볯내菨꺁蛥몈뿦꾁胣뎂菣ꮂ菣麃菣薆臣뎂菣覃臣貂臣蒁苣ꢂ菣袃菣鞃臣뢛뷥馁苣骃菣膃菣超裥銂铧蒁臣芀볯ꒁ臣꾂菣릂볯ꦼ苣钃菣벃菣骃菣膃菣袼볯ꆼ裢颼볯誏臣ꎼ볯銈볯鎼볯誏臣钼臣꺁苣ꦃ苣ꦼ苣钃菣벃菣骃菣膃菣袼볯ꆼ裢颼볯膀볯ꆼ裢馼볯膀볯ꆼ裢醼볯鎼迥뎁볯ꆼ裢馼볯覼臣뺯臣讂볯내菨鲿귧銂ꫨ릁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 麝룥ꮁꧩ辁臣趁臣ꢁ臣膀ꧨ鎨臣龁ꓥꢃ裥꺁꿦螎臣辂臣ꎁ臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ苣뮷諥馁苣ꢁ胣鞊軥颍诧ꢁ꿦莼臣ꚁ볯내菨鲿귧貁铦蒖臣貂胣鞊軥颍诧袂苣节뇦鞁臣ꪂ臣龮ꇨ閁苣ꪁ臣鎁臣貁ꛨ몇臣貂臣芀뿥钭胦꺁맥꾁뫤뎃ꓥꞁ臣ꎁ臣芀ꧨ鎨臣龁볯ꒁ臣鞊軥袼苣钃菣벃菣覼臣蚁臣꺁볯ꒁ臣ꒁ臣ꚁ胣醼볯鲀볯邼볎뷯꺁藥ꢔ蟩ꞁ볯뒼볯꺼볯銂諦龎臣뮷諥馁苣ꢁ胣閼볯캐螽铧辇臣鞊軥颍诧꺁ꃥ袐苣誂苣肸단鞁臣袂苣颫臣뒼듧麃뿥钭臣龔臣龁胣鞁臣貁臣ꚁ胣超雧龎胦銂铦蒖臣讂臣膂臣膀볯뒼볯꺼볯骼諦龎臣钯軧ꮁ뫥蒁郩讞鯦骷臣芁苣芀戼㹲ꚩ꣩꒾臣ꖻ룤꺁ꇨ銼볯ꮁꓧ馁臣誁苣ꞁ臣ꎁ臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㔶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 꾂菣릂볯ꦼ苣钃菣벃菣꺁臣ꆁ胣ꎼ볯銈볯銼볯뎛볯颼臣몤臣邵黦覼迥뎁볯ꆼ裢颼볯袼鯥钼볯ꮁꓧ馁뗧鲞볯꾁胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ苣뮷諥馁苣ꢁ胣鞊軥꺁臣꺁뻧袼鳦Ꞥ볯邼볎뷯뺁臣꺁铧辇臣鞊軥颍诧銂郥肂볯ꮁ꿥鞁臣醼볯醼볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯鞊軥覼鳦肺臣钯臣뒼듧麃뿥钭臣鞢ꓥ馁苣鎁臣貁ꓧ閁苣龁胣뎛볯馼臣ꚷ菣趃菣꾁胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ苣뮷諥馁苣ꢁ胣鞊軥꺁臣꺁뻧ꢁ꿦莼臣ꚁ藥ꚁ臣钯軧ꞁ볯내菨鲿귧貁ꋥꞤ臣龁臣ꢁ臣몤臣芀㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 貐꟦꺁뗧鲞臣꾂菣릂볯ꢂ菣袃菣鞃臣节ꛨ覂苣龁胣ꎼ볯銈볯鞼볯뎛볯邼臣몤臣邵黦覼胣ꎼ볯銈볯鎼볯뎛볯醼臣몤臣邵黦覼胣ꎼ볯銈볯醼볯袼鯥閼볯ꮁꓧ馁뗧鲞볯膀迥��볯ꆼ裢馼볯袼鯥閼볯ꮁꓧ馁뗧鲞볯꺁藥ꚁ臣袂臣ꚁ胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯鞊軥꺁꿦螎臣膀藥趽볯꺼볯ꢔ蟩ꢁ꿦莼臣龁ꃥ袐胣鞊軥꺁臣꺁뻧ꢁ꿦莼臣ꚁ苣誂ꯩ蒁볯내菨鲿귧銂铧颁臣鎁臣貁ꓧ閁苣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤銼볯骼볯뒼볯꺼볯銪믤超雧鞢볥꺁胥鞢戼㹲 鎁臣龮雦设臣꾁胣颧胣ꪁ諦龎臣ꒁ臣ꚁ볯뒼볯꺼볯ꮁ苣ꎁ臣銪믤閁苣讂藥ꮖꋥ랼臣Ꞥ臣閁苣뾪臣讂臣膂臣膀菣Ꚃ苣銂꟦薀臣鞊軥ꢁ뗧뾁郥辂臣ꚁ볯뒼볯꺼볯ꞁ蟥꺽臣龁胣肜裥꺁룤ꎀ臣龮꣩ꞁ臣膀菣Ꚃ苣銂믤许臣趉뿨꺁諦龎臣蚁臣꺁볯ꒁ臣蒵臣袐苣鮁臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣ꚇ뷧鞁臣骼볯覽볯ꢼ볯뚼볯隼†볯鞼볯내菨薆볯鮼볯覽뷯覼볯낼볯醼볯ₖꖼ볯袼迥뚺胦覼볯袼뷯覽뷯覼볯ꎼ볯颼†볯꒼볯趃苣鞊軥袼듧麃蛥覼볯뺁臣꾁볯覽뷯覼볯뚼볯袼迥뚺胦覼胣銼볯閼볎뷯꺁볯낼볯醼볯ₖꖼ볯鞊軥뺁臣꾁볯캕螽臣궼볯鎼볯ₘꆼ볯늼菣ꪂ諦龎苣膀볯캕螽臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣肸럧ꮁ諦躸臣龁胣ꢼ볯뚼볯隼†볯鞼苣膀볯隼臣놅蟥릖臣龁臣鎁苣膀볯낼볯鞊軥ꢁ볯꒼볯鞊軥꺁룤릖臣ꒁ臣ꚁ볯骼볯ꢁ臣蚁諦龎볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ꿦貁뻥覂苣龁胣銼볯ꖗ鯧誏臣閼볯讼韦꺛臣膀蓨내菨銂軦随臣膀볯ꚼ볯銈돎苣몙迧馁苣뒼듧麃苣膀鳦躘듧뢛臣風볨꺁苣蚁臣내菨薆鿦늉볯ꦼ볯뎼볯ꮁ苣ꎁ臣閩뻤鞁臣芀臣꺁뗧鲞臣超雧鲿귧꺁ꋥꞤ胥낕臣鞁臣袨껧鞁臣膀믤许臣ꢡ볯醼볯銼볯ꖗ鯧꺁뗧鲞볯誏臣ꢡ볯銼볯閼볯讼韦꺁뗧鲞볯ꮁ臣ꢁ苣ꚁ臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㘱㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀ꇨ銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㘱㰷愯㰾䐯噉ਾਊ䐼噉邀볯鎼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†곧銼臣肸胩꺁껥鎨臣꾁胣麃苣릂苣龮雦设볯邼臣風볨꺁볯ꆼ裢醼볯銼苣뎃苣蚃菣벃菣꾂菣뎃臣蒵臣袐苣鮁臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣ꚇ뷧鞁胣뎂菣ꮂ菣麃菣꾃苣膃菣薆臣颧胣ꪁ苣钃菣벃菣ꮁ꿥馁苣鞊軥릉闧蒚볯내菨鲿귧銂볯ꚼ볯銈돎駧뺏臣ꒁ臣ꚁ臣ꖼ볯ꦼ볯邽뷯钽裥邞臣袂臣ꚁꧨꆾ臣龁胣鶁臣邵黦꾁胣超雧鲿귧꺁ꋥꞤ胥낕臣鞁臣鞮蟥鞁胣ꖻ룤꺁ꇨ銼볯ꮁ臣ꢁ苣ꚁ臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㘱㰸愯㰾䐯噉ਾਊ䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁뗧鲞臣覂胣뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣袂臣ꚁꫥ讻臣貂苣超雧鲿귧Ꞁ臣趀闦鞢ꓥ꾁諦龎臣몟臣蒁臣覤该鞁臣貁胣ꚩ꣩閁苣龁臣ꢁ苣ꦁ臣鞊軥ꮁ臣蒁臣뎼볯ꦼ볯Ꞽ臣醰臣辁臣节볯趀臣超雧鲿귧Ꞁ臣鞢ꓥ銂ꫨ��躰臣膀觧骮臣鞊軥ꮁ雩鞁臣꾁胣鞊軥颍诧袼臣ꪁ苣ꆁ胣鞊軥讼볯뒼볯ꦼ볯趽볯꺼볯覼臣钯볨鞁臣超雧鲿귧꺁臣覂臣鶁苣袂苣Ꞥ臣蒁ꋥ랼볯设臣낁胣閼胥薶胣醼볯趀뛨膀볯邼胥薶胣鎼볯趀뛨膀볯邼胥薶臣龁臣鞼볯趀뛨꺁ꋥ랼볯銂ꓧ鞁臣鎁臣貁껥벨臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯銼볯궼볯ꮼ볯€趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧꾁胣내菨뮭苣颪냥馁苣㲋牢ਾ†臣꺁껥붖뻤ꞁ臣膀菣袃臣龁臣麃苣릂볯겼볯겼臣ꊂ菣躃藩议鿥醼胣醼볯邼苣뎂菣覃臣讂룤ꎀ臣趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂뷤붣臣膀臣貂苣貁듧麃귦銂ꫨ躰臣讂菨鮊臣ꒁ臣ꚁꧨ鎨臣龁胣鎁苣覂臣讧꿧ꦉ臣뢅黥蒚臣꾁胣鲤蟥銂껥鎘臣馁苣龁苣ꮁ볯ꮜꯧ뺁臣꾁볯ꮜꯧ꺁臣骁苣讁臣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣뎂菣覃臣龁胣낕臣讂苣钃菣벃菣뾂苣銂ꧨ鎨臣龁볯ꚼ볯ꆼ볯膀볯馽뷯膀볯뒼胣ꢼ볯膀볯閼볯芀臣覂臣膀藥ꚁ臣讧꿧ꦉ臣膀苣ꎃ菣鞃볯ₑ閼胢궂菣莃菣袼볯趽볯袼볯馀볯邽뷯邽볯閼胢覼볯貽뷯邽볯邽볯膀볯馀볯뒼볯膀볯馀볯뒼볯膀볯邼볯貃苣것苣膃菣꺁菣ꪃ볯蚃菣ꮃ苣ꮐ臣膀臣鞁臣醼裢ꆃ菣ꮃ裢랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣袼뷯醼꣎볯ꞁ껥ꢅ臣꺿ꏩ閁苣ꚁ臣龁胣릉껥꺁꟦覯觧ꞁ臣膀볯馀볯뒼볯꾁胣趽뷯늼裢醼볯銼迥뎁뷯覽볯銈볯钼볯銈볯邽뗧袐菩趽苣ꮐ苣ꞁ臣龁胣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣覜臣ꪁ臣膀菣袃迥뎁菣Ꚃ苣꺁볯겼볯겼볯銈볯颼볯讧꿧ꦉ臣ꪂ菣鞃菣ꪃ菣螃苣뎃苣閃菣벃菣袼볯늼볯覼臣ꊂ菣躃藩超裥銂胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯銼볯誏臣醼볯銼볯ꮁꓧ馁胣超裥ꪕ迥醼볯銼볯꺁볯겼볯겼苣뎃菣꾂돨銂苣벃菣馁苣设ꓧ蒚菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈苣膀藩鞈闧랏볯钼볯銼迥뎁볯钼볯鎼臣몤臣芀꟦覯觧ꮁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣设ꓧ蒚볯馀볯뒼볯꾁胣超裥ꪕ迥銼볯誏臣醼볯銼볯ꮁꓧ閁苣讂胣讧꿧ꦉ臣誁臣讂뷤ꢔ臣龁苣꺁뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯銂胣超裥ꪕ迥銼볯ꮁꓧ馁胣讧꿧ꦉ룤ꞁ臣뾽铧꺁臣膂臣趽뷯늼裢醼볯銼迥뎁뷯覽볯銈볯钼볯銈볯邽뗧袐菩趽苣ꮐ苣设ꓧ蒚臣鎼胢떼볯늼苣膀藩鞈闧랏볯鎼臣몤臣芀㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 궼볯ꮼ볯醼裢醼볯邼꟦覯觧貁듧麃귦銂ꫨ躰臣鞾苣讁郥讁苣몱껥馁苣龁苣ꮁ胣讧꿧ꦉ苣ꢼ뷯邽볯ꊼ菣袃苨貙듧麃臣袃菣뎃苣閃苣꾂菣鞁臣芀볯Ꚃ苣ꮃ臣龁苣銼볯貼볯邼볯讀臣ꢼ뷯겼뷯내菨銂胣馼볯Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃臣鞃菣벃菣鞁胣겼뷯邽뷯蚽뷯莽뷯膽뷯覽뷯薽†볯邼볯邼苣뾽铧鞁臣趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂臣貂苣ꮁ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣龁胣銼볯芙雩��貾胣내菨뮭苣膀볯薽뷯貽볯覽뷯薽뷯銈볯貽뷯袼駧늌闥馨볯몙藥뮂菣龔귥螎苣莃苣ꒂ볯낼뷯辽뷯薽뷯膽볯銂뷤ꢔ臣ꚁ룦骮臣龁胣鶁臣邵黦銂鯥閼볯ꮁꓧ鞁臣誁苣膀臣貂臣袂臣ꚁ胣궼볯ꮼ볯醼裢醼볯邼뷯趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣ꢼ뷯겼뷯내菨꺁듧麃귦銂ꫨ躰臣趁臣鎁臣貁껥벨臣貂臣蒁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 鎁苣覂臣邵黦꾁胣내菨뮭臣讨뫥銂룦骮臣讂臣膂臣뾽铧閁苣讂귦薻듧麃臣袂臣ꚁ蓥袅髧ꮁ郥躏臣貂苣꒼볯ꆼ觨ꂴ臣芁苣膀볯꾼볯꾼裢鎼볯뮙賩蚕꣦覼볯겼뷯蚽뷯₅뒼뷯莽뷯躽뷯貽뷯螽뷯薽뷯覼臣颭鳥许臣膀볯겼볯겼볯銈볯颼볯趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧誏臣ꢼ뷯邽볯ꊼ듧麃苣ꢔ臣ꚁ郥颧臣龮꣩銂ꇨ蚁臣ꢁ臣袂臣ꚁꋧ趪臣貂臣芀듧麃铧颭軧ꮁ臣蒁臣림볯림볯銈볯袼駧늌闥馨볯ꪃ菣覃苣Ꚃ菣랂苣蚃菣銂铧蒁臣龮꣩銂ꇨ蒁胣鶁臣邵黦銂鯥閼볯ꮁꓧ鞁臣誁苣膀臣貂臣袂臣ꚁ胣궼볯ꮼ볯醼裢醼볯邼†뷯趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣ꢼ뷯邽볯ꊼ苨貙듧麃臣내菨뮭苣颪냥ꞁ臣龁臣ꢁ臣몢ꫨ閁苣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤銼볯骼볯겼볯겼†뷯趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣膀菣꾂菣袃菣랂苣銂볥趁뗨鎁臣㲙牢ਾ†臣꺁껥붖뻤ꞁ臣膀볯겼볯겼볯銈볯颼볯ₐ趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧貁菣꾂菣袃菣랂苣銂볥趁뗨鎁臣붃諥銂ꫨ릁臣芀菣꾂菣袃菣랂苣꾁胣龎뷥ꪳ蛨꺁ꃧ芣迥뎁苣ꒂ菣뺂菣薆껥ꦉ臣ꢑ뻨颠鿥뢁臣込蟥銂觧뒾臣馁苣芀臣貂臣袂臣ꚁ胣릟ꓩ릟鳥ꮁ볦몇臣讂郦랂雩ꎀ裥邭菣뾂菣뎃볯꒼볯궼볯覼臣鲤蟥ꮁ苣讂苣뎃菣袃菣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣ꚩ꣩鞁臣节苣蒁胣ં䐼噉邀볯鎼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†鳦鶈臣肸胩꺁껥鎨臣꾁胣궼볯ꮼ볯醼裢醼볯邼†뷯趽볯꺼볯讧꿧ꦉ苣膀볯薽볯膽듧麃臣袃菣뎃苣閃苣꾂菣鞁볯龮雦设볯銼臣風볨꺁臣誁苣覼胣誣귦꺁賦馨臣鞁臣꒼볯궼볯ꞁ臣讂볯뒼볯꺁铦몇苣겸껥鞁臣芀볯뒼볯꺁铦몇臣膀볯꺼볯ꦼ볯ꖼ볯袼駧늌闥馨볯ꆼ볯낼苣莃苣ꒂ볯낼뷯辽뷯薽뷯膽볯銂铧蒁臣鲤蟥鞁臣芀臣꺁뗧鲞苣뎛볯隼臣몤臣ꚁ臣誂胣鎁苣ꮁ苣ꎁ臣膀볯겼볯겼볯銈볯颼볯趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧貁듧麃臣覂臣ꆼ볯낼臣뺔蟥銂ꫨ躰臣讂臣ꢁ臣龮꣨閁苣膀臣貂臣袂臣ꚁ臣꺁꟦覯觧貁菣꾂菣袃菣랂苣銂볥趁뗨鎁臣ꚁ臣讂臣ꢁ臣몤臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 趃苣袃菣벃苣릂臣략臣ꎁ臣蒁苣鎁臣銂ꋧ趪臣讂臣膂臣膀볯겼볯겼볯銈볯颼볯ₐ趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂볯薽볯膽듧麃臣袃菣뎃苣閃苣꾂菣鞁胣ꖈ臣꒼볯궼볯ꞁ臣讂볯궼볯ꊼ볯��铦몇苣趃苣궃菣벃苣릂臣螌꣦ꢁ臣ꚁ룦骮臣讂곧銼臣肸胩꺁껥鎨苣財臣龁胣ꢼ볯Ꞽ볯醼臣뺔蟥꾁胣ꢼ볯Ꞽ볯醼†볯겼볯뎼볯ꊂ菣뮂苣銂铧蒁臣鲤蟥鞁臣芀臣꺁껥鎨臣뮂菣袃臣꾁胣ꢼ뷯겼뷯내菨袼볯쎒醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲔猯灵내菨込볯邼볯캐貽볯Ꚃ苣ꮃ볯銂胣趽볯꺼볯讧꿧ꦉ볯銼볯邼뷯螽볯Ꚃ苣ꮃ볯醼볎뷯릮ꧧ覼胣겼뷯邽뷯蚽뷯莽뷯膽뷯覽뷯薽볯邼볯銼볎뷯込苣Ꞃ菣릮ꧧ覼迥뎁볯邽뷯覽裢궼볯궼볯醼볯躼볯캘겼볯Ꚃ苣ꮃ껥趩볯銂郥肂菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃럦袐觧袼볯邼볎뷯覼苣ꢔ臣ꚁ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣龁胣내菨꺁菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃臣趉臣膀菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃럦袐觧銂胣꒮룦ꞁ볯邼裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁胣ꆬ臣ꞁ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃럦袐觧銂胣내菨꺁룤ꮁ諥袁臣芀鿥誤菣것菣袃苣붻臣龁臣趁胣ꆬ臣ꞁ볯鞼蓢膀볯薼볯꾼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢臣邼胣醼胣鎼迥뎁볯芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣鎁苣覂臣蒐駦릂臣膀볯醼볯캐貽臣誸룦銂迥誂蟥鞁胣鞃菣ꮃ臣ꚁ볯邼볯邼뷯邽뷯ꞁ苣钃菣肃苣뎃臣龁胣袃菣뎃苣閃苣꾂苣ꞃ菣芁臣誂볯邼볎뷯꺁룤薸苣膀꣦隺볯궼볯ꊼ볯ₑꖼ볯ꦼ볯ꆼ臣뾽铧鞁臣芀臣꺁뗧鲞苣뎛볯鞼臣몤臣ꚁ臣誂胣鎁苣꾁胣궼볯ꮼ볯醼裢醼볯邼†뷯趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣내菨讁苣꺁볯궼볯ꊼ볯꺁铦몇苣颪냥馁苣鎁臣銂껥벨臣ꚁ臣誂胣鶁苣ꮁ苣ꎁ臣鎁臣讧꿧ꦉ臣趃苣궃菣벃苣릂苣閼臣략臣鞁臣蒁苣鎁臣貁ꓧ閁苣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†곧鎼臣肸胩꺁껥鎨臣膀胩뢸臣辰菨鎽臣薆藨ꮁ귥ꢜ臣讂臣膀菣꾂菣袃菣랂苣꺁ꫨ躰볯麃苣궃菣ꆂ菣뢂迥뎁꣦뚊듧麃臣袂苣龣뷤ꢔ苣銪믤馁苣覼뻥膀귦ꮁ苣辁듧麃臣ꢡ鷩ꮁ믨趽臣讂볯ꆼ볯낼裥邭臣芁苣ꮂ菣것菣ꎂ苣ꖃ菣뎃볯ꎼ볯뒼볯꺁듧麃ꇨꊝ駧뺏臣뺯臣讂볯겼볯겼볯銈볯颼볯趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧ꮁ苣讂蟥蚐臣릊黦銂ꫨ릁臣芀듧麃苣膀菣뮂菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣膀苣鶃菣벃苣릂ꫨ躰꟦覯觧袼胣낼볯궼볯趀볯銂铧蒁臣袃菣뎃苣閃苣꾂菣馁苣讁胣뺁臣꾁볯겼볯겼볯銈볯颼볯趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧袼뷯閽볯겼볯겼†볯ꢼ볯袼볯銈볯颼볯覼볯莽볯ꆼ†뷯覽볯醼볯銼볯醼볯銼裢鎼뷯覼苣ꢔ臣ꚁ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣膀듧麃ꇨꊝ苣膀苣ꮃ菣蚃苣궂菣ꪃ菣꺁駧뺏臣龁苣꺁꣦隺髧ꪁ雦閳臣袂臣ꚁ鿦늉臣龁胣鶁臣邵黦銂鯥閼볯ꮁꓧ鞁臣誁苣膀臣貂臣膀苣鶃菣벃苣릂ꫨ躰胦讧꿧ꦉ臣꾁臣辁胣궼볯ꮼ볯讧꿧ꦉ臣내��ꢡ鷩뢁臣ꎼ볯뒼臣ꊻ뫥銂ꫨ躰臣龁臣ꢁ苣龮꣨鞁臣誁苣膀臣貂臣袂臣ꚁ볯겼볯겼꟦覯觧貁菣꾂菣袃菣랂苣銂볥趁뗨鎁臣龁臣ꢁ臣閁苣ꮁꋧ趪臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯颼볯醀⼼䥄㹖 견볯꺁룤ꎀ臣龮꣩ꞁ臣膀볯겼볯겼ꫨ躰胦내菨뮭臣뺯臣讂飩뎮觥趃苣궃苣ꮃ菣뎃苣龃菣袼볯뎼볯覼臣릊黦銂ꫨ릁臣芀볯뎼볯꾁胣궼볯ꮼ볯銂觧낕髧ꮁ꣦蒚臣馁苣뮘껥ꒉ臣芁苣芀볯뎼볯꾁胣궼볯ꮼ볯讧꿧ꦉ臣袂臣ꚁꫨ躰臣貂苣莿뫥鶾귥릖볥ꞁ듧麃귦銂飩뎮臣讂臣ꢁ臣몤臣貂볯ꪃ菣覃苣Ꚃ菣ꢁ臣ꚁ볯꾼볯꾼裢鎼볯뮙賩蚕꣦覼苣ꢔ臣ꚁ룦骮볯螃菣뾂ꓧ閁臣覼胣鶁苣ꮁ苣ꎁ臣뎦꿥閁苣龁듧麃귦꾁볯겼볯겼臣袂臣ꚁꫨ躰臣貂苣趃苣궃菣벃苣릂臣袂苣내菨뮭臣芁苣鎁臣貁ꋧ趪臣貂臣芀㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯钼볯늼볯낼볯鎼迥뎁볯뎼볯궼볯₤趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧꾁듧麃귦銂ꫨ躰臣讂戼㹲 겜껥붖뻤ꞁ臣膀볯ꦼ볯鎼볯뺁臣꾁볯뎼볯궼볯銂苣벃菣馁苣肸胩꺁뷯趽볯꺼볯讧꿧ꦉ苣鲽ꏨ鞁胣鶁苣覂臣내菨뮭苣颪냥馁苣붃諥ꮁ臣蒁臣ꚩ꣩鞁臣芀臣貂苣꺁꟦覯觧꾁藥讞髧ꮁ臣膀ꓦ몇苣릮飦ꮁ臣讂臣膂臣꺼鳦꾫臣龁臣ꎼ鳦꾫臣蒁臣貂臣ꮁ苣钃菣벃菣뾂苣节苣벃菣鞁臣芀闧ꪁ苣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣ꚩ꣩鞁臣袼볯겼볯Ꞽ胣궼뷯莽胣ꎼ볯膀볯ꆼ胣뚼볯覼胣閁苣ꮁ胣ꢅ臣꺁꟦覯觧꾁胣궂菣莃菣醼†볯馀苣ꎃ菣鞃볯鞼뷯Ꞽ볯閼胢覼뷯邽뷯袼볯馀볯꺼뷯趽뷯꺼뷯覼胣閼胢떼볯늼胣鎼胢떼볯늼胣醼볯邼菣꾂菣ꪂ菣覃臣鶃菣ꆼ菣벃菣銂郥뾁胣鶁臣ꚁ볯銈菣膃菣銈苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃볯趽볯캑覼臣貮藥ꮁ뿤뺣臣貂臣蒁臣芀苣钃菣벃菣뾂苣銂鳦閁臣蒁胣늼볯낼볯ꮼ꟦覯觧꺁볯늼볯ꊂ菣躃藩超裥銂胣超裥ꪕ迥醼볯銼볯鲀볯鎼볯钼臣몤臣ꚁ臣讂胣超裥ꪕ迥醼볯鎼볯꺁볯ꦼ볯ꮼ볯뾂菣醃苣ꪳ苣뎂菣覃臣讂뻤몤髧ꪁ菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣膀藩鞈闧랏볯钼볯閼迥뎁볯钼볯隼臣몤臣貂臣蒁苣芀苣钃菣벃菣뾂苣銂鳦閁臣蒁胣Ꞽ볯꒼볯꒼꟦覯觧꺁볯늼볯ꊂ菣躃藩超裥꾁胣超裥ꪕ迥醼볯隼볯鲀볯鎼볯銼臣몤臣貂臣蒁苣芀꟦覯觧ꮁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣设ꓧ蒚臣閼胢떼볯늼苣膀藩鞈闧랏볯醼迥뎁볯鎼볯鎼臣몤臣芀꟦覯觧ꮁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣设ꓧ蒚臣鎼胢떼볯늼苣膀藩鞈闧랏볯銼臣몤臣芀꟦覯觧ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣龁苣꺁뷯覽볯銈볯銼볯誏臣趽뷯늼裢醼볯銼裢鎼뷯邵郥ꢃ뷤銂郥肂뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯銂胣超裥ꪕ迥銼볯ꮁꓧ馁胣ં䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉��†볯ꦼ볯ꮼ볯뺁臣꾁볯뎼볯궼볯讧꿧ꦉ臣내菨뮭苣颪냥鞁뻥讂臣Ꚑ臣銂뇦骮臣讂臣膂臣膀꟦覯觧銂볯ꒁ臣낕臣讂듧麃黥骼볯薽볯膽듧麃胣ꊼ볯隼볯醼볯내菨誏臣궼볯鎼볯내菨ꮁ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣龁胣醼苣Ꞃ菣芁臣誂볯邼볯邼胥꺁듧麃苣馼볯Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃臣鞃菣벃菣鞁胣趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂胣겼뷯邽뷯蚽뷯莽뷯膽뷯覽뷯薽†볯邼볯邼苣ꢔ臣ꚁ臣貂苣ꮁ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣龁胣銼볯芙雩貾胣ꎼ뷯貽뷯뒼뷯钽뷯銽裢Ꞽ뷯辽볯뮙賩蚕꣦覼볯閽뷯覽뷯薽뷯莽뷯躽뷯銈볯薽뷯貽†볯覽뷯芽뷯貽뷯钽뷯ₙꆼ뷯鎽뷯馽볯낼뷯辽뷯薽뷯膽볯銂铧蒁臣내菨뮭苣겸껥鞁臣芀臣꺁뗧鲞苣뎛볯馼볯袼볯薽볯膽듧麃볯膀鯥閼볯ꊼ볯ꊼ볯隼볯醼볯내菨覼迥뎁鯥閼볯ꎼ볯궼볯鎼볯내菨覼臣몤臣膀볯겼볯겼볯醼裢醼볯邼볯讧꿧ꦉ臣ꒁ臣ꚁ臣螃菣뾂苣뺁臣钯볨꺁鯧蒚臣龁苣ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂胣鎁臣邵黦ꮁ苣ꎁ臣膀볯ꦼ볯ꮼ볯ₓ趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧貁胣궼볯ꮼ볯袼볯銈볯颼볯覼꟦覯觧ꮁ臣蒁臣뎦꿥閁苣龁苣꺁臣릌闦馁苣릊諥ꞁ볯ꒁ藥ꚁ臣내菨讞臣誁臣ꚁ듧麃귦銂ꫨ躰臣趁臣鎁臣貁껥벨臣貂苣芀臣꺁뗧鲞臣覂臣覂臣膀볯뎼볯궼볯讧꿧ꦉ臣膀볯겼볯겼볯醼裢醼볯邼볯讧꿧ꦉ臣ꒁ臣ꚁꛨ龯臣貂臣节臣袂苣节뷤蒁諥鮊臣꾁臣讂臣膀볯ꒁ藥ꚁ臣내菨讞臣誁臣ꚁ듧麃귦銂ꫨ躰臣趁臣鎁臣貁껥벨臣貂苣芀볯꾼볯꾼裢鎼볯뮙賩蚕꣦覼菣벃菣ꊂ苣袃苣릂菣ꂃ苣ꢔ臣ꚁ껥붖臣龁껥鎨臣ꒁ臣ꚁ苣貐꟦꺁뗧鲞臣뎦꿥閁苣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†苣ꪃ苣麃菣隌臣讂苣蚁臣궨꣨閁苣龁룤ꎀ臣붿諥꺁볯ꦼ볯ꮼ볯讧꿧ꦉ苣鲽ꏨ鞁臣芀臣貂苣꺁꟦覯觧꾁胣뾂菣醃苣ꪳ臣覸蟩鎽賥誏臣ꪂ菣뒂菣벃賥銂苣龁苣馁苣뎃菣꾂돨覃菣ꒂ菣袼볯몼룤辇뷤膀臣龁臣궃苣랂菣뢂菣醃菣궂菣ꮃ菣ꆃ苣뎃볯ꖼ볯誏臣늼볯覼볯銂郥肂胣늼볯낼볯鎼臣颪냥閁苣龁뫤辇뷤뺁臣꾁룤辇뷤ꊽ裦꾁胣袂苣颫裥邭蟩꺁苣ꪃ苣麃菣誏臣趃苣궃菣벃苣릂臣颪냥銂苣龁苣馁볯芏胨ꢁ臣ꚁ볯膽뷯覽뷯₍薽뷯ₔ膽뷯躼볯뎼뷯覽뷯躽뷯薽볯銼볯醼볯誏臣꾼뷯辽뷯莽뷯₏薽뷯ₔ膽뷯躼볯ꎼ뷯貽뷯₌꒼뷯膽뷯袽†볯覽뷯蚽뷯銽볯銼볯醼볯銂迥ꞅ臣鎁臣覼胣鎁苣覂臣讧꿧ꦉ苣膀볯ꦼ볯鎼볯鎼듧麃臣꺁菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃臣袂臣ꚁ듧麃귦銂ꫨ躰臣讂臣貂苣꺁菨鮊臣ꒁ臣ꚁꧨ鎨臣龁胣袃菣뎃苣閃苣꾂苣ꞃ菣꺁볯閼駦鎖뻥ꮁ胣림볯림볯銈볯袼駧늌闥馨볯ꪃ菣覃苣Ꚃ菣랂苣蚃��銂铧蒁臣내菨뮭苣겸껥鞁臣芀臣꺁뗧鲞苣뎛볯邼迥뎁ꇨ銼볯ꮁꓧ鞁臣誁苣膀臣貂臣袂臣ꚁ胣骤蟩鎽賥늼볯낼볯鎼꟦覯觧貁볯ꦼ볯鎼볯鎼듧麃臣뮭苣颪냥馁苣鎁臣貁껥벨臣貂臣蒁苣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㤶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 骤蟩鎽賥늼볯낼볯鎼꟦覯觧貁볯ꆼ볯낼铦몇苣颪냥馁苣붃諥銂胣讧꿧ꦉ臣袂苣趃苣궃菣벃苣릂臣颪냥꺁賦馨臣鞁臣ꚩ꣩鞁臣芀볯醼볯ꚼ볯邼듧麃苣膀껥붖뻤銼볯ꮁꓧ閁苣讂ꓥ辇뷤隌볯ꦼ볯ꮼ볯讧꿧ꦉ볯늼볯낼볯鎼裢ꦼ볯覸蟩鎽볯膀苣鶃菣벃苣릂ꫨ躰꟦覯觧袼볯떼볯ꆼ볯膀볯겼볯겼볯銈볯颼볯讧꿧ꦉ볯袽뷯궼볯ꮼ볯躼볯ꢼ볯袼볯銈볯颼볯覼볯莽볯ꆼ†뷯覽볯醼볯銼볯醼볯銼裢鎼뷯覼臣蒁臣貂臣ꞁ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣ꚁ胣꒼볯궼볯뺔蟥뺁臣꾁볯ꚼ볯뚈뻥讧꿧ꦉ苣颪냥鞁臣芀볯궼볯ꊼ볯꺁铦몇臣膀볯궼볯ꊼ볯ₑꖼ볯ꦼ볯ꆼ苣莃苣ꒂ苣ꢔ臣ꚁꓦ몇臣龁胣鶁臣邵黦銂鯥隼볯ꮁꓧ鞁臣誁苣膀臣貂臣袂苣膀ꓥ辇뷤隌볯ꦼ볯ꮼ볯讧꿧ꦉ臣궼볯ꮼ볯讧꿧ꦉ臣貐꟦꺁菣馃菣ꞁ볯궼볯ꊼ볯꺁铦몇苣颪냥鞁臣鎁臣貁껥벨臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ꖈ臣肸胩꺁껥鎨臣꾁胣뮘껥ꒉ볯뎼볯馀볯鞼볯貁볯ꦼ볯ꮼ볯颪냥Ꞁ臣내菨뮭臣誏臣馁뷥뾟苣뾪臣龁胣Ꞽ볯ꮼ胢颼볯銼臣膀볯ꦼ볯ꮼ볯銂觧낕髧ꮁ꣦蒚臣馁苣뮘껥ꒉ臣芁苣芀볯뎼볯馀볯鞼볯꾁胣늼볯낼볯鎼꟦覯觧ꮁ苣ꎁ臣颪냥閁苣讂뿦ꚺ뻤颭髧릖볥ꞁ듧麃귦銂飩뎮臣讂臣ꢁ臣몤臣貂볯ꪃ菣覃苣Ꚃ菣ꢁ臣ꚁ胣림볯림볯銈볯袼駧늌闥馨볯銂铧蒁臣겸껥骼菣벃苣몤臣骁볯膀臣貂臣袂臣ꚁꛨ龯臣貂臣내菨뮭臣늼볯낼볯鎼臣袂臣ꚁꫨ躰臣貂苣趃苣궃菣벃苣릂듧麃귦ꞁ臣讂臣ꢁ臣몢ꫨ閁苣龁胣ં䐼噉邀볯鎼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤銼볯骼볯ꦼ볯ꊼ볯꾼†뷯趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣내菨뮭苣颪냥馁苣㲋牢ਾ†臣꺁껥붖뻤ꞁ臣膀볯ꦼ볯ꊼ볯꾼苣뎂菣覃臣讂룤ꎀ臣趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂뷤붣臣膀臣貂苣貁듧麃귦銂ꫨ躰臣讂菨鮊臣ꒁ臣ꚁꧨ鎨臣龁胣鎁苣覂臣讧꿧ꦉ臣뢅黥蒚臣꾁ꓦ몇苣릮飦ꮁ臣讂臣膂臣꺼鳦꾫臣龁臣ꎼ鳦꾫臣蒁臣貂臣ꮁ苣钃菣벃菣뾂苣节苣벃菣鞁臣芀闧ꪁ苣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣ꚩ꣩鞁臣袼볯겼볯Ꞽ胣궼뷯莽胣ꎼ볯膀볯ꆼ胣뚼볯覼胣閁苣ꮁ胣ꢅ臣꺁꟦覯觧貁胣궂菣莃菣醼†볯馀苣ꎃ菣鞃볯鞼뷯Ꞽ볯閼胢覼뷯邽뷯袼볯馀볯꺼뷯趽뷯꺼뷯覼胣閼胢떼볯늼胣鎼胢떼볯늼胣醼볯邼��꾂菣ꪂ菣覃臣鶃菣ꆼ菣벃菣銂郥뾁胣鶁臣ꚁ볯銈菣膃菣銈苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃볯趽볯캑覼臣貮藥ꮁ뿤뺣臣貂臣芀苣钃菣벃菣뾂苣銂鳦閁臣蒁볯ꦼ볯ꊼ볯꾼꟦覯觧꺁볯늼볯ꊂ菣躃藩超裥꾁胣超裥ꪕ迥醼볯閼胣醼볯銼臣몤臣貂苣芀藩鞈闧랏볯隼볯꺁볯ꦼ볯ꊼ볯꾼苣뎃菣꾂돨銂苣벃菣馁苣设ꓧ蒚菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣膀藩鞈闧랏볯钼볯隼迥뎁볯钼볯鞼臣몤臣貂苣芀꟦覯觧ꮁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣设ꓧ蒚볯馀볯뒼볯꾁胣超裥ꪕ迥銼볯誏臣醼볯銼볯ꮁꓧ閁苣讂胣讧꿧ꦉ臣誁臣讂뷤ꢔ臣龁苣꺁뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯꾁胣超裥ꪕ迥銼볯ꮁꓧ閁苣讂胣讧꿧ꦉ룤꺁뷤ꢔ臣龁苣꺁뷯覽볯銈볯銼볯誏臣趽뷯늼裢醼볯銼裢鎼뷯邵郥ꢃ뷤銂郥肂뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯銂藩鞈闧랏볯鎼臣몤臣芀㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ꒼볯ꆼ볯겼볯讧꿧ꦉ臣내菨뮭苣颪냥鞁뻥讂臣Ꚑ臣銂뇦骮臣讂臣膂臣膀臣꺁꟦覯觧銂볯ꮼ볯뚼볯내菨ꮁ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣龁胣馼볯Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃臣醼룤내菨込苣Ꞃ菣銂菣것菣袃臣膀볯覽뷯辽뷯薽뷯钽뷯趽뷯躽뷯₅銼볯邼볯銂铧蒁臣趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂臣貂苣ꮁ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣龁胣钼볯芙雩貾胣ꎼ뷯貽뷯뒼뷯钽뷯銽裢Ꞽ뷯辽볯뮙賩蚕꣦覼볯閽뷯覽뷯薽뷯莽뷯躽뷯銈볯薽뷯貽†볯覽뷯芽뷯貽뷯钽뷯ₙꆼ뷯鎽뷯馽볯낼뷯辽뷯薽뷯膽볯銂铧蒁臣내菨뮭苣겸껥鞁臣芀臣꺁뗧鲞苣뎛볯銼臣몤臣ꚁ臣誂胣鎁苣ꮁ苣ꎁ臣膀ꓥ낕臣꒼볯ꆼ볯겼볯₯趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧貁듧麃귦銂ꫨ躰臣趁臣鎁臣貁껥벨臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯隼볯ꮂ苣醃菣벂볯膀苣릂菣벃苣銈볯膀苣릂菣벃苣銈볯醼胣낼뷯銽뷯躽胣꺼볯늼볯鎼迥뎁볯뎼볯₣趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧꾁胣내菨뮭苣颪냥馁苣㲋牢ਾ†臣꺁껥붖뻤ꞁ臣膀꟦薀臣ꊽ藦꺁苣릂菣벃苣銈볯膀苣릂菣벃苣銈볯膀苣릂菣벃苣銈볯醼胣낼뷯銽뷯躽胣꺼볯늼볯鎼臣龁臣ꆼ볯ꎼ苣뎂菣覃臣讂뷯趽볯꺼볯讧꿧ꦉ苣뾪ꏨ鞁胣내菨ꮁ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣ꚁ볯꾼볯꾼裢鎼볯뮙賩蚕꣦覼볯꺼볯늉듧袼볯覽뷯薽†볯薽뷯袽뷯辽뷯辽뷯覽뷯鎽볯銂铧蒁臣내菨뮭苣颪냥馁苣붃諥銂ꫨ릁臣膀듧麃귦꺁꣧ꚺ苣겸껥鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 肜裥꺁룤ꎀ臣龮꣩ꞁ臣膀꟦薀臣ꮂ苣醃菣벂裢钼胣銈볯뺁臣꾁裢醼볯뾂菣醃苣ꪳ苣뎂菣覃臣讂胣芁苣醃菣ꮃ臣趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂뷤붣臣膀臣貂苣貁듧麃귦銂ꫨ躰臣讂菨鮊臣ꒁ臣ꚁꧨ鎨臣龁胣ꚩ꣩鞁臣讧꿧ꦉ臣膀볯覽볯ꢅ闩꺁蟩龔黥ꮂ��醃菣벂裢钼胣ꮂ苣醃菣벂裢閼臣龁臣ꮂ苣醃菣벂裢醼볯鮼볯覽뷯覼藥랕苣릂菣벃苣銈볯膀裢閼臣龁臣銈볯醼臣ꂊ臣ꚁ볯몼菣ꆃ苣뎃볯袼뷯覽뷯覼볯ꮜꯧ貁곦놤臣龁苣릂菣벃苣銈볯膀裢閼臣龁臣銈볯醼臣ꂊ臣ꚁ볯몼菣ꆃ苣뎃볯袼뷯隽볯ꢅ闩ꮂ苣醃菣벂裢钼胣銈볯뺁臣꾁裢醼볯ꮁ諥袁臣꒼볯覃菣ꒂ菣鮼臣讂臣꾁볯隽볯꺼鳦꾫臣ꂬꓥ鞁臣ꮂ苣醃菣벂裢钼胣銈볯뺁臣꾁裢醼볯ꮁ諥袁臣꒼볯覃菣ꒂ菣膀臣蒁臣貂臣銂苣벃菣鞁臣芀볯ꮜꯧꂬꓥ讞臣ꮂ苣醃菣벂裢钼迥뎁苣릂菣벃苣銈볯醼臣膀苣龃菣뢅껦몟볯醼胣鎼볯鞼苣ꮐ臣膀룤릖볯ꮜꯧꂬꓥ讞臣ꮂ苣醃菣벂裢閼臣膀苣龃菣뢅껦몟볯鎼볯鲀볯鎼볯銂郥鎂臣蒁臣芀臣貂苣꺁꟦覯觧꾁胩뢸胣鲤蟥銂껥鎘臣馁苣龁苣ꮁ볯ꮜꯧ뺁臣꾁볯ꮜꯧ꺁臣骁苣讁臣ꢂ菣袃菣鞃苣낂볯设臣낁胣ꚼ볯ꆼ볯膀볯馽뷯膀볯뒼胣ꢼ볯膀볯閼볯节苣벃菣鞁臣芀臣覂臣膀藥ꚁ臣讧꿧ꦉ臣膀苣ꎃ菣鞃볯ₑ閼胢궂菣莃菣袼볯趽볯袼볯馀볯邽뷯邽볯閼胢覼볯貽뷯邽볯邽볯膀볯馀볯뒼볯膀볯馀볯뒼볯膀볯邼볯貃苣것苣膃菣꺁菣ꪃ볯蚃菣ꮃ苣ꮐ臣膀臣鞁臣醼裢ꆃ菣ꮃ裢랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣袼뷯醼꣎볯ꞁ껥ꢅ臣꺿ꏩ閁苣ꚁ臣龁胣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣覜臣ꪁ臣膀苣릂菣벃苣銈볯讧꿧ꦉ臣꾼볯ꚼ苣龃菣뢅藩鞈臣膀藩鞈闧랏볯鎼볯銼胣醼볯閼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂胣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣覜臣ꪁ臣膀苣릂菣벃苣銈볯讧꿧ꦉ臣꾼볯ꚼ苣龃菣뢅藩鞈臣膀藩鞈闧랏볯鎼볯鞼胣醼볯隼볯ꮁꓧ閁苣讂胣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣覜臣ꪁ臣膀苣릂菣벃苣醼볯讧꿧ꦉ臣꾼볯ꚼ苣龃菣뢅藩鞈臣膀藩鞈闧랏볯鎼볯銼胣醼볯隼볯ꮁꓧ閁苣讂胣讧꿧ꦉ臣뾽铧馁苣龁苣꺁뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯銂胣超裥ꪕ迥銼볯誏臣醼볯銼볯ꮁꓧ馁胣讧꿧ꦉ臣뾽铧馁苣龁苣꺁뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯銂藩鞈闧랏볯銼臣몤臣芀꟦覯觧ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣龁苣꺁뷯覽볯銈볯銼볯誏臣趽뷯늼裢醼볯銼裢鎼뷯邵郥ꢃ뷤銂郥肂뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯꾁藩鞈闧랏볯鎼臣몤臣芀㰊䥄㹖胣醼볯馼볯醀⼼䥄㹖 ꮂ苣醃菣벂裢钼胣銈볯誏臣銈볯醼꟦覯觧貁듧麃귦銂ꫨ躰臣鞾苣讁郥讁苣몱껥馁苣龁苣ꮁ胣겼뷯邽뷯蚽뷯莽뷯膽뷯覽뷯薽†볯邼볯邼苣ꢔ臣ꚁ꟦覯觧銂볯薽볯膽듧麃臣袃菣뎃苣閃苣꾂菣鞁臣芀볯钼駦鎖뻥膀볯꾼볯꾼裢鎼볯뮙賩蚕꣦覼볯꺼볯늉듧銂铧蒁臣내菨뮭苣겸껥鞁臣芀臣꺁뗧鲞苣뎛볯鎼臣몤臣ꚁ臣誂胣鎁苣ꮁ苣ꎁ臣膀볯ꒁ臣ꊽ藦꺁苣릂菣벃苣銈��膀苣릂菣벃苣銈볯誏臣ꮂ苣醃菣벂裢醼볯꺁뷯趽볯꺼볯讧꿧ꦉ藥ꚁ臣膀볯薽볯膽듧麃臣내菨뮭苣颪냥ꞁ臣龁臣ꢁ臣龮꣨閁苣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯钼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†곧銼臣肸胩꺁껥鎨臣꾁胣颧胣ꪁ볯馽뷯覽뷯膀볯겼볯낼볯뺁臣꾁볯뎼볯뾂菣醃苣ꪳ苣뎂菣覃臣讂뷯趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣醃菣ꮃ苣鲽ꏨ鞁胣鶁苣覂臣내菨뮭苣颪냥馁苣붃諥ꮁ臣蒁臣ꚩ꣩鞁臣芀臣貂苣꺁꟦覯觧꾁胩뢸胣鲤蟥銂껥鎘臣馁苣龁苣ꮁ볯ꮜꯧ뺁臣꾁볯ꮜꯧ꺁臣骁苣讁臣ꢂ菣袃菣鞃苣낂볯设臣낁胣ꚼ볯ꆼ볯膀볯馽뷯膀볯뒼胣ꢼ볯膀볯閼볯节苣벃菣鞁臣芀臣覂臣膀藥ꚁ臣讧꿧ꦉ臣膀苣ꎃ菣鞃볯ₑ閼胢궂菣莃菣袼볯趽볯袼볯馀볯邽뷯邽볯閼胢覼볯貽뷯邽볯邽볯膀볯馀볯뒼볯膀볯馀볯뒼볯膀볯邼볯貃苣것苣膃菣꺁菣ꪃ볯蚃菣ꮃ苣ꮐ臣膀臣鞁臣醼裢ꆃ菣ꮃ裢랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣袼뷯醼꣎볯ꞁ껥ꢅ臣꺿ꏩ閁苣ꚁ臣龁胣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣覜臣ꪁ臣낼뷯銽뷯躽꟦覯觧꺁볯늼볯ꊂ菣躃藩超裥꾁胣超裥ꪕ迥醼볯鞼볯誏臣醼볯鞼볯ꮁꓧ閁苣讂胣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣覜臣ꪁ臣꺼볯늼볯鎼꟦覯觧꺁볯늼볯ꊂ菣躃藩超裥꾁胣超裥ꪕ迥醼볯鞼볯誏臣醼볯鞼볯ꮁꓧ閁苣讂胣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣覜臣ꪁ臣膀볯뎼볯讧꿧ꦉ臣꾼볯ꚼ苣龃菣뢅藩鞈苣膀藩鞈闧랏볯鎼볯鞼迥뎁볯鎼볯颼臣몤臣芀꟦覯觧ꮁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣设ꓧ蒚볯馀볯뒼볯銂藩鞈闧랏볯醼迥뎁볯鎼볯鎼臣몤臣芀꟦覯觧ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣龁苣꺁뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯銂藩鞈闧랏볯銼臣몤臣芀꟦覯觧ꮁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣趽뷯늼裢醼볯銼迥뎁뷯覽볯銈볯钼볯銈볯邽뗧袐菩趽苣ꮐ苣设ꓧ蒚臣鎼胢떼볯늼苣超裥ꪕ迥銼볯ꮁꓧ馁胣ં䐼噉邀볯钼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†볯馽뷯覽뷯膀볯겼볯낼볯誏臣ꆼ볯ꎼ꟦覯觧貁듧麃귦銂ꫨ躰臣趁苣讁郥讁苣몱껥馁苣龁苣ꮁ胣겼뷯邽뷯蚽뷯莽뷯膽뷯覽뷯薽†볯邼볯邼苣ꢔ臣ꚁ꟦覯觧銂볯薽볯膽듧麃臣袃菣뎃苣閃苣꾂菣鞁臣芀볯钼駦鎖뻥膀볯꾼볯꾼裢鎼볯뮙賩蚕꣦覼볯꺼볯늉듧銂铧蒁臣내菨뮭苣겸껥鞁臣芀臣꺁뗧鲞苣뎛볯钼臣몤臣ꚁ臣誂胣鎁苣꾁胣낼뷯銽뷯躽뷯膀볯겼볯낼볯誏臣ꆼ볯ꎼ†뷯趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣ꢼ뷯겼뷯내菨꺁듧麃귦銂ꫨ躰臣趁臣鎁臣銂껥벨臣ꚁ臣讂胣ં䐼噉邀볯钼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤銼볯骼꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣ꦼ볯ꚼ볯誏臣ꦼ볯ꚼ볯ₗ趽뷯늼볯ꆼ꟦覯觧꾁胣ꒂ菣뾂菣閃苣궃菣龄迥Ꞁ뿥钭苣것菣뎃菣袼볯뎼볯ꖼ볯뮴胦隌臣讂戼㹲 겜껥붖뻤ꞁ臣膀믨馆臣ꒂ菣��菣閃苣궃菣龄迥Ꞁ뿥钭苣것菣뎃菣袼볯뎼볯ꖼ볯ꮁ苣ꎁ臣蚧该閁苣讂菣鶃菣뾂菣몁볤邭苣뾽铧鞁臣膀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣ꦼ볯ꚼ볯誏臣ꦼ볯ꚼ볯ₗ趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣ꦼ볯늼볯銂듦Ꞁ賥馁苣붃諥銂ꧨ鎨臣龁胣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯늼볯鎼迥뎁볯늼볯鞼꟦覯觧銂ꫨ붣臣膀臣鞁臣ꖻ룤ꮁ꣨覼臣讂胣鎁苣覂臣讧꿧ꦉ臣뢅黥蒚臣꾁臣龁胣鲤蟥銂껥鎘臣馁苣龁苣ꮁ볯ꮜꯧ뺁臣꾁볯ꮜꯧ꺁臣骁苣讁臣ꢂ菣袃菣鞃苣낂苣뎂菣覃臣龁胣낕臣讂苣钃菣벃菣뾂苣銂ꧨ鎨臣龁볯ꚼ볯ꆼ볯膀볯馽뷯膀볯뒼胣ꢼ볯膀볯閼볯芀臣覂臣膀藥ꚁ臣讧꿧ꦉ臣膀苣ꎃ菣鞃볯ₑ閼胢궂菣莃菣袼볯趽볯袼볯馀볯邽뷯邽볯閼胢覼볯貽뷯邽볯邽볯膀볯馀볯뒼볯膀볯馀볯뒼볯膀볯邼볯貃苣것苣膃菣꺁菣ꪃ볯蚃菣ꮃ苣ꮐ臣膀臣鞁臣醼裢ꆃ菣ꮃ裢랂菣벃菣Ꚃ菣뢂菣袼뷯醼꣎볯ꞁ껥ꢅ臣꺿ꏩ閁苣龁胣ꢂ菣袃菣鞃苣낂臣鞁臣膀볯鎼볯隼볯릂ꫧ뚄ꓥ낕苣ꮐ苣膀믤ꢡ髧ꪁ꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣麃苣릂迥뎁菣袃臣ꦼ볯ꚼ볯讧꿧ꦉ臣꾼볯ꚼ苣龃菣뢅藩鞈苣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯醼迥뎁볯銼臣몤臣芀臣貂苣꺁볯늼볯鎼苣뎃菣꾂돨銂苣벃菣馁苣设ꓧ蒚臣貃苣것苣膃菣超裥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥銼볯邼迥뎁볯醼볯膀臣覂臣ꮁ臣貂臣貂藩鞈闧랏볯钼볯銼迥뎁볯钼볯鎼臣몤臣芀苣钃菣벃菣뾂苣銂鳦閁臣蒁胣ꎻꇨ蒚臣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ菣袃볯늼볯鞼꟦覯觧꺁볯늼볯ꊂ菣躃藩超裥銂胣超裥ꪕ迥醼볯鲀볯邼臣몤臣芀臣貂苣꺁볯늼볯鞼苣뎃菣꾂돨銂苣벃菣馁苣设ꓧ蒚臣貃苣것苣膃菣超裥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥銼볯銼胣銼볯馼迥뎁藩鞈闧랏볯钼볯钼胣醼볯隼볯ꮁꓧ馁胣讧꿧ꦉ臣뾽铧馁苣龁苣꺁뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯銂胣超裥ꪕ迥銼볯誏臣醼볯銼볯ꮁꓧ馁胣讧꿧ꦉ臣뾽铧馁苣龁苣꺁뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯銂藩鞈闧랏볯銼臣몤臣芀꟦覯觧ꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣龁苣꺁뷯覽볯銈볯銼볯誏臣趽뷯늼裢醼볯銼裢鎼뷯邵郥ꢃ뷤銂郥肂뻤몤髧ꪁ볯馀볯뒼볯銂藩鞈闧랏볯鎼臣몤臣芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 鶁臣邵黦銂鯥隼볯ꆼ胣뎛볯閼볯ꮁꓧ鞁胣鎁苣ꮁ苣ꎁ臣膀꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣ꦼ볯ꚼ볯讧꿧ꦉ볯뎛볯閼볯覼迥뎁꟦邈髧ꮁ듦Ꞁ臣ꦼ볯ꚼ볯讧꿧ꦉ볯뎛볯閼볯覼臣ꆸ雦貁菣鶃菣뾂菣몁볤邭駧뺏苣몈뿦馁苣鎁臣貁껥벨臣貂胣鶁苣ꮁ苣ꎁ臣鎁臣讧꿧ꦉ臣ꒂ菣뾂菣閃苣궃菣龄迥Ꞁ뿥钭苣것菣뎃菣袼볯뎼볯ꖼ볯銂듦Ꞁ賥鞁뻥龁臣ꢁ臣몤臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯颼볯��苣궃菣벃苣릂꟦覯觧ꞁ蟥蚐臣龁듧麃臣袂苣躂韧Ꞁ苣ꒂ菣ꮂ苣뎃臣뺔蟥ꮁ꿥馁苣鶈鯥몈뿦꺁諥鲞戼㹲 겜껥붖뻤ꞁ臣膀듧麃臣袂苣躂韧颪駧Ꞁ苣ꒂ菣ꮂ苣뎃臣뺔蟥ꮁ꿥馁苣膀菣ꒂ菣袃菣랂苣趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣꺁菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣랂菣뎃臣趉臣超雧鞢볥ꒉ臣내菨銂裥麛裥肿臣讂臣ꢁ臣릊黦銂ꫨ릁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 钠ꧧ꺁菣뚂苣뎃臣뎛볯隼臣몤臣貂臣蒁苣芀볯ꖗ鯧ꮁ胣馼볯Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃臣醼苣Ꞃ菣芁臣誂볯邼볯邼볯邼胥꺁볯薽볯膽듧麃苣鞃菣벃菣鞁臣芀볯ꖗ鯧ꮁ胣내菨銂鯥隼볯ꮁꓧ馁藥ꮖꋥ랼觥꺁臣ꆁ臣醼臣ꞁ蟥蚐臣龁볯讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯ꮼ볯캫讧꿧ꦉ臣龮雦设볯ꮁ臣覂臣風볨閁苣ꚁ臣讂볯芀볯ꖗ鯧ꮁ胣내菨ꮁ胣뎛볯隼臣몤臣ꮂ苣醃菣벂裢钼胣ꮂ苣醃菣벂裢閼臣龁臣ꮂ苣醃菣벂裢醼볯꺁뷯늼볯ꆼ꟦覯觧꺁臣ꆁ臣醼臣銂菣ꦃ菣릂菣Ꞃ苣袃臣龁볯ꮂ苣醃菣벂裢钼胣銈볯誏臣銈볯醼꟦覯觧꾁胣龮雦设볯隼臣閁苣ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣覼胣钼韦꺛臣膀룤薸苣躏鯩鞁胣鶁臣ꚁ꣦隺髧ꪁ볯겼볯뎼볯ꮁ苣ꎁ臣躂韧Ꞁ苣ꒂ菣ꮂ苣뎃볯겼裢醼볯꺁菣馃菣ꮁ臣蒁臣ꊂ菣뮂苣鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 鶁臣邵黦銂鯥隼볯ꮁꓧ鞁臣誁苣膀臣貂臣袂臣ꚁ胣릉臣낼볯뎼볯覤闧銂鳦馁苣超雧鞢볥ꒉ볯겼裢醼뇎臣龁臣讧裦蒚臣뮴胦ꪁ볯ꮼ볯캫讧꿧ꦉ臣꺁듧麃臣鶈鯥몈뿦貁胣ꢼ뷯겼뷯내菨膀觧ꮁ苣릂菣벃苣銈볯뺁臣꾁苣릂菣벃苣銈볯讧꿧ꦉ臣ꚇ郧閁苣龁苣꺁臣袂苣躂韧颪駧Ꞁ苣ꒂ菣ꮂ苣뎃臣뺔蟥銂裥肿臣龁臣ꢁ臣龮꣨閁苣讂胣鎁苣覂臣邵黦讁苣膀苧螗ꫨ몙胦鲿귧銂ꋥ랼臣讂臣膂臣膀藥ꮖ軥Ꞁ듧麃귦銂裥肿臣讂菣ꪃ菣鞃菣覃苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ꟦覯觧ꢁ藥ꮖꋥ랼觥ꢁ苣蒵臣袐苣鮁苣鎁臣꺁裥릂臣龮꣨閁苣讂胣ં䐼噉邀볯钼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤銼볯骼跥겋臣膀臣龁臣超雧鞢볥ꒉ迥뎁볯节臣辁臣超雧膃苣莃苣鶃苣뎃菣뮘껥ꒉ臣蒵臣袐苣鮁臣膀껥財黥趽볯꺼볯꺁諦ꮅ飧릊黦㲜牢ਾ†臣꺁껥붖뻤ꞁ臣膀菣Ꚃ苣꺁苣뎃菣鲃臣꺁藨趘ꋥ隮臣뺯臣讂껥財黥趽볯꺼볯꺁諥鲞苣뾪臣龁胣궼볯ꮼ볯膀볯ꦼ볯ꮼ볯뺁臣꾁볯ꦼ볯ꊼ볯꾼苣뎂菣覃臣讂껥財黥趽볯꺼볯讧꿧ꦉ苣膀跥겋臣뺁臣꾁藥ꮖꋥ랼觥袼볯뒼볯꺼볯₧趽볯꺼볯讧꿧ꦉ볯誏臣込苣鞁臣꾁藥ꮖ菣Ꞃ菣꾂菣ꒂ菣袃飩뎮觥袼諦ꎼ볯겼볯钼諦鎽苣鞁臣꾁諦낼볯銈볯鞊뷤覼臣蒵臣袐苣鮁臣ꢔ臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†곧醼苣莃菣꺁껥鎨臣꾁��궼볯鎼볯邵藨貙藨趘볯꺚룤뮧ꓦ閁苣龁볯쎕醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲕猯灵내菨鮼蟥꺽駦꺁ꓥ趁臣貁듧醼볯邼胣醼볯邼뷯趽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼⼼畳㹰臣ꮅ飧覼苣覜臣讂菣Ꚃ苣銂胣醼볯꺁蟥꺽뻧ꮁ裥醁胣鶁臣ꚁ胣钼胩鎖臣辂臣ꎁ臣놀臣銼鯥袼볯膀볯膀볯膀볯醼胣醼볯膀볯邼胣銼볯誏臣銼볯ꖗ볯ꖻ룤꺁뷯늼볯ꆼ꟦覯觧銂铧蒁臣릅藨薆蟥꺽臣膀觧骮臣꒾臣꾁胣ꖻ룤ꮁꓧ閁苣讂苣蚁臣超雧膃苣莃苣鶃苣뎃菣뮘껥ꒉ볯螤闦꾏볯ꞁ苣ꚇ뷧閁苣ꚁ臣讂볯袼뷯覼駩Ꞁ꿥ꞅ臣鞁臣꺁볯뒼裢궼볯꒼볯袼뷯覽볯袽뷯궼볯ꮼ볯躼볯ꢼ볯袼볯銈볯颼볯覼볯莽볯ꆼ†뷯覽볯醼볯銼볯醼볯銼裢鎼뷯袼볯銼볯閼볎뷯込该ꦉ볯鮼볯覽뷯覽볯꒼볯ꆼ볯겼볯袼볯銼볯閼볎뷯込该ꦉ볯鮼볯覽뷯覼뷯閽볯ꦼ볯ꮼ볯銈볯몼룤辇뷤袼볯銼볯閼볎뷯込该ꦉ볯鮼볯隽볯袽뷯궼볯ꮼ볯躼볯ꢼ볯袼볯銈볯颼볯覼볯莽볯ꆼ†뷯覽볯醼볯銼볯醼볯銼裢鎼뷯袼볯銼볯閼볎뷯込该ꦉ볯讼諦ꎼ볯겼볯钼†볯ꢼ볯邼볯閼뷯螽볯讽뷯膀볯ꖗ鯧ꮁ藨钅蛥膀볯躼볯趽뷯込뷯螽胣钼韦꺛迥뎁볯ꖗ鯧ꮁ藨钅蛥覼臣覂臣ꮁ볯覼볯袼뷯覽볯꒼볯ꆼ볯겼볯袼볯銼볯閼볎뷯込该ꦉ볯讼諦ꎼ볯겼볯钼†볯ꢼ볯邼볯閼뷯螽볯讽뷯膀볯ꖗ鯧ꮁ藨钅蛥膀볯躼볯趽뷯込뷯螽胣钼韦꺛迥뎁볯ꖗ鯧ꮁ藨钅蛥覼볯袼뷯覽뷯覼뷯閽볯ꦼ볯ꮼ볯銈볯몼볯覸蟩鎽볯醼볯躼볯캕螽볯開觧覼볯鞊볯뒼볯ꆼ볯ₔ馼볯醼볯袼볯趽뷯込뷯螽胣醼韦꺛臣릅藨薆胣銼볯閼뷯螽볯讽뷯銂볯ꖗ鯧誏臣鞼韦꺛臣릅藨薆볯鮼볯隽뷯覽뷯覼볯뒼裢궼볯꒼볯鞊볯뒼볯ꆼ볯ₔ馼볯醼볯袼볯趽뷯込뷯螽胣醼韦꺛臣릅藨薆胣銼볯閼뷯螽볯讽뷯銂볯ꖗ鯧誏臣鞼韦꺛臣릅藨薆볯鮼볯覽뷯覼뷯閽볯겼볯겼볯钼볯ꊼ볯醼裢醼볯邼볯躼뷯ꢼ볯₡趽뷯늼볯銼볯込볯钼볯銈볯邽볯醼볯躼볯캕螽볯開觧覼볯꒼볯ꆼ볯겼볯袼볯銼볯閼볎뷯込该ꦉ볯鮼볯颽볯袽뷯궼볯ꮼ볯躼볯ꢼ볯袼볯銈볯颼볯覼볯莽볯ꆼ†뷯覽볯醼볯銼볯醼볯銼裢鎼뷯袼볯銼볯閼볎뷯込该ꦉ볯讼볯ꦼ볯ꊼ볯꾼볯醼볯躼볯캕螽볯開觧覼볯鞊볯뒼볯ꆼ볯ₔ馼볯醼볯袼볯趽뷯込뷯螽胣醼韦꺛臣릅藨薆胣銼볯閼뷯螽볯讽뷯銂볯ꖗ鯧誏臣鞼韦꺛臣릅藨薆볯鮼臣覂臣ꮁ볯颽뷯覼諦ꎼ볯겼볯钼†볯ꢼ볯邼볯閼뷯螽볯讽뷯膀볯ꖗ鯧ꮁ藨钅蛥膀볯躼볯趽뷯込뷯螽苣钼韦꺛迥뎁볯ꖗ鯧ꮁ藨钅蛥覼볯鞊볯꒼裢醼볯궼볯醼裢醼볯袼볯놀雩ꮁ苣龁臣ꚁ胩ꮁ볯麛볯��뷯込뷯螽藨钅蛥覼볯붙胦뺯藧ꢁ臣ꚁ볯芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 鶁臣邵黦銂鯥隼볯ꆼ胣뎛볯颼볯ꮁꓧ鞁臣誁苣膀臣貂臣膀룤風臣醼볯꺁蟥꺽뻧ꮁ鯧鎽臣ꚁ臣誂胣鎁臣龮꣩꺁駦鎖뗧躁臣辂臣讂菣Ꚃ苣꺁藨趘껥趩볯趽뷯㲍畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲓猯灵覼苣몤臣芀臣覂臣膀鳦鶈臣ꮅ飧薆돦蒰臣醼볯芙雩貾迥뎁볯钼駦鎖뻥ꮁꇨ薸苣躏鯩鞁胣낼뷯辽뷯膽뷯膽볯貽뷯颽볯ꆼ뷯蚽뷯趽뷯钽뷯覽뷯覼苣ꢔ臣ꚁ苧螗胦떂苣袃苣ꒂ菣꺁駧뺏臣ꒁ臣ꚁ裥邞臣龁胣떂苣袃苣ꒂ菣蚈黦ꮁ苣誂胣ꦼ볯꺼裢캒膀볯겼裢隼胣뒼볯ꚼ裢캒膀볯늼볯₯츠袼볯뢼볯겼볯覼胣궼볯낼裢醼†뇎볯ꎼ볯겼볯覼胣궼볯낼裢醼닎볯ꎼ볯겼볯覼胣誏臣늼볯꺼볯ꖼ볯袼볯ꎼ볯閼볯꺁菣馃菣貁꿥ꞅ臣钯볨鞁臣ꚇ뷧꒾臣誁臣ꚁ룤螘臣龁臣ꢁ臣躘苣讁臣ꪁ臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†곧銼臣뮂菣袃臣龮꣩ꞁ臣膀볯ꎼ볯颼뗧뢅駧ꮅ飧袼髧许臣뮧ꓦ閁苣龁볯쎕醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲕猯灵내菨鮼蟥꺽駦꺁ꓥ趁臣貁듧醼볯邼胣醼볯邼뷯趽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼⼼畳㹰臣ꮅ飧覼苣覜臣讂菣Ꚃ苣銂胣鞼臣꺁蟥꺽뻧ꮁ裥醁胣鶁臣ꚁ볯놀雩ꮁ苣龁臣ꚁ꿦놀믤许臣趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣ꮅ飧薆蟥꺽臣龁볯醼胣颼胣醼볯膀볯銼韦꺛볯骼볯覽볯낙胦뺯藧ꢁ臣ꚁ臣꺼볯銈볯꾼볯鮼볯覽뷯覼볯뒼裢궼볯꒼볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯袼뷯覽뷯覼볯겼볯겼볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯袼뷯隽볯꒼뷯膽뷯貽뷯讼볯뒼볯꺼볯鮼볯隽볯늼볯낼볯鎼볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯袼뷯覽볯궼볯ꮼ볯讼볯覽뷯芽뷯辽볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ볯誏臣袼뷯覽뷯覼볯ꦼ볯ꮼ볯讼볯覽뷯芽뷯辽볯뎼볯ꦼ볯Ꞽ胣ꢅ臣꺁뻧銂胣醼韦꺛臣閼뷯螽볯讽뷯膀臣鞁臣钼韦꺛迥뎁볯ꖗ鯧ꮁ볯躼볯趽뷯込뷯螽臣膀諦ꎼ볯겼볯钼苣ꢔ臣ꚁ볯릅藨薆臣覼蟥꺽臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁뗧鲞苣뎛볯馼볯ꮁꓧ鞁臣誁苣膀臣貂臣膀룤風臣鞼臣꺁蟥꺽뻧ꮁ鯧鎽臣ꚁ臣誂胣龮꣩꺁駦鎖뗧躁臣辂臣讂菣Ꚃ苣꺁藨趘껥趩볯趽뷯㲍畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲓猯灵覼苣몤臣膀鯥隼볯ꊼ臣꾁胣龮꣩꺁臩讨臣辂臣讂ꓧ閁苣龁닦芙뻧꺁铧颭軧銂ꓧ鞁臣蒁苣芀臣覂臣膀鳦鶈臣ꮅ飧薆돦蒰臣醼볯芙雩貾迥뎁볯钼駦鎖뻥ꮁꇨ薸苣躏鯩鞁胣낼뷯辽뷯膽뷯膽볯貽뷯颽볯ꆼ뷯蚽뷯趽뷯钽뷯覽뷯覼苣ꢔ臣ꚁ苧螗胦떂苣袃苣ꒂ菣꺁駧뺏臣ꒁ臣ꚁ裥邞臣龁胣떂苣袃苣ꒂ菣蚈黦ꮁ苣誂胣ꦼ볯꺼裢캒膀볯겼裢隼胣뒼볯ꚼ裢캒膀볯늼볯₯츠袼볯뢼볯겼��覼胣궼볯낼裢醼†뇎볯ꎼ볯겼볯覼胣궼볯낼裢醼닎볯ꎼ볯겼볯覼胣誏臣늼볯꺼볯ꖼ볯袼볯ꎼ볯閼볯꺁菣馃菣貁꿥ꞅ臣钯볨鞁臣ꚇ뷧꒾臣誁臣ꚁ룤螘臣龁臣ꢁ臣躘苣讁臣ꪁ臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†곧鎼臣뮂菣袃臣龮꣩ꞁ臣膀볯ꎼ볯颼뗧뢅駧ꮅ飧袼髧许臣뮧ꓦ閁苣龁볯쎕醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲕猯灵내菨覼苣覜臣讂菣Ꚃ苣銂胣鎼臣꺁蟥꺽뻧ꮁ裥醁胣鶁臣ꚁ볯놀雩ꮁ苣龁苣躯胩膀믤许臣趽볯꺼볯讧꿧ꦉ苣ꢔ臣ꚁ藨趘蛥ꞁ蟥꺽臣龁볯醼胣颼胣醼볯膀볯銼韦꺛볯骼볯覽볯鎃菣꾂菣뺯藧鮼볯覽뷯覼볯뒼裢궼볯꒼볯鞊볯꒼裢醼볯袼뷯覽뷯覼볯뒼볯꺼볯讼諦낼볯銈볯芀諦낼볯醼苣膀볯놀雩ꮁ苣龁臣ꚁ胩ꮁ볯麛胣閼뷯螽볯讽뷯ꞁ藨钅蛥閊룤鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 鶁臣邵黦銂鯥鞼볯ꆼ臣몤臣ꚁ臣誂胣鎁苣꾁胣誸꣨꺁볯ꒁ臣ꚇ뷧꒾臣뢛뷥鞁胣龮꣩꺁駦鎖뗧躁臣辂臣讂菣Ꚃ苣ꮁ臣醁苣ꮅ飧릮ꧧ袼뷯趽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼⼼畳㹰볯銂ꓧ鞁臣誁苣膀鯥鞼볯ꊼ臣꾁胣龮꣩꺁臩讨臣辂臣讂蟥꺽뻧꺁铧颭軧銂ꓧ馁胣ં䐼噉邀볯钼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†믤꺁껥붖뷥讅戼㹲 겜雩몤苣鶁臣뎩듧ꪁꫨ躘臣떽臣ꚁ雩몤臣ꚁ臣龁臣膀觥낿臣겪飦꾁뻤몤苣辄鯥鞁臣节臣ꞁ臣誂胣뮷믤꺁觧놨ꯨ花臣蒯鯥ꮁ苣ꎁ臣骮뻧閁苣讂鳦讖ꓧ꺁꿧늛苣邙껥馁苣节臣ꞁ臣ꪁ臣鎁臣貁郧ꎧ臣貂苣릁臣ꞁ臣讂胣隻臣讅꟦膀裥릂胣誏臣覤鯦꾁胣ꖻ룤꺁觧놨ꯨ花臣蒯鯥薆臣芁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣ꢅ臣꺁볥ꢔ雦꺌臣膀臣꺁藥鎽臣芏藧ꮁ苣誂鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂苣芀戼㹲超裥ꢡ臣뺁臣膂戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㜱㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰ㄷ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㜱㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㌷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㜱㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㔷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㜱㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㜷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㜱㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯��胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㤷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㠱㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰ㄸ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㠱㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㌸⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㠱㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㔸⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㠱㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㜸⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㠱㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㤸⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㤱㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰ㄹ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㤱㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㌹⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㤱㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㔹⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㤱㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㜹⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㤱㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㄰㤹⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰〲㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㄰⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰〲㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㌰⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰〲㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㔰⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦��〰〲㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㜰⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰〲㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㤰⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰ㄲ㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰ㄱ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰ㄲ㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㌱⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰ㄲ㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㔱⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰ㄲ㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㜱⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰ㄲ㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㤱⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㈲㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰ㄲ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㈲㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㌲⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㈲㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㔲⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㈲㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㜲⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㈲㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㤲⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㌲㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰ㄳ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㌲㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㌳⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄��愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㌲㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㔳⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㌲㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㜳⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯邼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㌲㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㤳⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯邼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㐲㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰ㄴ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯邼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㐲㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㌴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯邼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㐲㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥銼볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㔴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯邼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㐲㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㜴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㐲㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㤴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㔲㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰ㄵ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㔲㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㌵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㔲㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥銼볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㔵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㔲㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㜵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㔲㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㤵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㘲㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰ㄶ⼼㹡⼼䥄��ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㘲㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㌶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㘲㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥銼볯颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㔶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㘲㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㜶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㘲㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㤶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㜲㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊牢ਾ䐼噉邀賥銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰ㄷ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ戼㹲㰊䥄㹖胣隌볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㜲㰲愯㰾䐯噉ਾਊ⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㜲㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㐷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㜲㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㘷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㜲㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㠷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㜲㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰〸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㠲㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㠲㰲愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㠲㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㠲㰴愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㠲㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㠲㰶愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㠲㰷愯㰾䐯噉ਾ†��††䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㠲㰸愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㠲㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㤲㰰愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㤲㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯ꆼ裢ꎼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㈹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㤲㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯Ꞽ裢ꦼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㐹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㔹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㘹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㜹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㤲㰸愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯ꎼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㈰㤹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰〰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㄰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㈰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㌰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㐰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㔰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㘰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㜰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㠰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㤰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰〱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰ㄱ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾��牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㈱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㌱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㐱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㔱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㘱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㜱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㠱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㤱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰〲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰ㄲ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㈲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㌲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㐲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㔲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㘲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㜲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㠲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㤲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰〳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰ㄳ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㈳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㌳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㌳㰴愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼볯ꎼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㔳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㘳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯��醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㜳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㠳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㤳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰〴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰ㄴ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㈴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㌴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㐳㰴愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥隼볯ꖼ裢ꢼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㔴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼볯銈볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㐳㰶愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㐳㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㐳㰸愯㰾䐯噉ਾ††††⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀藩鞈ꇨ醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦⸢㈯㄰㔹㈳㔶⼷⸲㄰㔹㈳㔶䔷〫㔱㈯㄰㔹㈳㔶〷〰〰⸱灡≰㈾㄰㔹㈳㔶〷〰〰⸱灡㱰愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣붛髩뾪鿦놠釥醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㐳㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰〵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㔳㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㈵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㔳㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㐵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㔳㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㘵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㔳㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㤱㌵㘲㜵琮晩㸢〲㤱㌵㘲㜵琮晩ꃂ〰㌰㠵⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰㔹㈳㔶⸷楴≦㈾㄰㔹㈳㔶⸷楴쉦゠〰㔳㰹愯㰾䐯噉ਾ⼼潢祤ਾ⼼瑨汭ਾ