(57)【要約】【構成】本発明の哺乳動物の精液サンプルの特性を改善する方法では、毀損された精子膜完全性および／または毀損された精子自動性の指示薬に結合する少なくとも一つの配位子を担持した不溶性担体、またはこの少なくとも一つの配位子に結合できる少なくとも一つの分子を担持した不溶性担体を準備し、そして上記精液サンプルと上記不溶性担体とを接触させて、結合精子細胞集団および結合していない精子細胞集団を形成する。上記不溶性担体は複数のビーズであればよく、各ビーズが上記の少なくとも一つの配位子あるいは上記の少なくとも一つの分子を有する。上記指示薬は、毀損精子先体および毀損精子原形質膜完全性の一方か両方に対応するものであればよい。上記配位子は抗体であればよい。上記分子はストレプトアビジン、プロテインＡおよび抗配位子抗体のうちの一つであればよい。また、本発明は上記方法を実施するためのキットにも関する。【選択図】図１
2019503169.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の精液サンプルの特性を改善する方法であって、
毀損された精子膜完全性および／または毀損された精子自動性の指示薬に結合する少なくとも一つの配位子を担持した不溶性担体、またはこの少なくとも一つの配位子に結合できる少なくとも一つの分子を担持した不溶性担体を準備し、
前記精液サンプルと前記不溶性担体とを接触させて、結合精子細胞集団および結合していない精子細胞集団を形成し、そして
前記の結合していない精子細胞集団から前記の結合精子細胞集団を分離することを特徴とする改善方法。
【請求項２】
前記不溶性担体が複数のビーズを有し、各ビーズが前記の少なくとも一つの配位子あるいは前記の少なくとも一つの分子を有する請求項１に記載の改善方法。
【請求項３】
前記精液サンプルと前記不溶性担体とを混合によって接触させる請求項２に記載の改善方法。
【請求項４】
サイズ排除ろ過によって前記の結合精子細胞集団を分離するステップを有する請求項３に記載の改善方法。
【請求項５】
前記複数のビーズが磁気ビーズであり、そして磁気分離によって前記の結合精子細胞集団を分離するステップを有する請求項３に記載の改善方法。
【請求項６】
前記指示薬が、毀損された精子先体および毀損された精子原形質膜完全性の一方か両方に対応する請求項１に記載の改善方法。
【請求項７】
前記配位子が抗体である請求項１に記載の改善方法。
【請求項８】
前記配位子が抗ウサギＩｇＧである請求項７に記載の改善方法。
【請求項９】
ストレプトアビジン、プロテインＡおよび抗配位子抗体からなる群から前記分子を選択する請求項１に記載の改善方法。
【請求項１０】
精液原形質および／またはエクステンダーが存在する場合、準備ステップ、混合ステップおよび分離ステップの前にこれらを取り除くステップを有する請求項１に記載の改善方法。
【請求項１１】
ヒト、ウマ、ウシ、ヒツジ、およびブタからなる群から前記哺乳動物を選択する請求項１に記載の改善方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物がウシである請求項１１に記載の改善方法。
【請求項１３】
新たに回収した精液サンプル、冷却精液サンプル、凍結‐解凍精液サンプル、ニートな精液サンプル、および希釈精液サンプルの一つかそれ以上として前記精液サンプルを準備する請求項１に記載の改善方法。
【請求項１４】
哺乳動物の精液サンプルの特性を改善する試剤を含有するキットであって、
ｉ）毀損された精子膜完全性および／または毀損された精子自動性の指示薬に結合する少なくとも一つの配位子を担持した不溶性担体、または
ｉｉ）少なくとも一つの配位子およびこの少なくとも一つの配位子に結合できる少なくとも一つの分子を担持した不溶性担体のうち一種から選択する結合試剤を有し、そして適宜、他の試剤、ガラス容器および／またはプラスチック容器、および前記の少なくとも一つの配位子を担持した前記不溶性担体、あるいは前記の少なくとも一つの配位子、および前記の少なくとも一つの配位子に結合でき、毀損された膜完全性および／または毀損された自動性をもつ精子に結合し、かつ分離する少なくとも一つの分子を担持した不溶性担体に関する使用説明書を有することを特徴とするキット。
【請求項１５】
前記不溶性担体が複数のビーズを有し、各ビーズが前記の少なくとも一つの配位子あるいは前記の少なくとも一つの分子を有する請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
さらにサイズ排除フィルターを有する請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記複数のビーズが磁気ビーズである請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
さらに磁気分離装置を有する請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記配位子が抗体である請求項１４に記載のキット。
【請求項２０】
前記配位子が抗ウサギＩｇＧである請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
ストレプトアビジン、プロテインＡおよび抗配位子抗体からなる群から前記分子を選択する請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年１月４日を出願日とする米国特許出願第６２／２７４，４６６号の優先権を主張する出願であり、この米国特許出願明細書の全体を援用する出願である。
本発明は、精液サンプルから有害な精子を取り除くことによって精液特性を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
牛の人工授精によって、米国の畜牛業および酪農業では世界中の遺伝学的にすぐれた雄親から多数の子孫を得ることが可能になってきたが、高い遺伝的メリットをもつ一部の雄牛の場合、人工受精後雌牛が受胎しないことがある。雄牛の精液の受精能力は、この精液に含まれる健全な精子の個数に依存し、劣弱な自動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ、運動性）および／または易感染性膜を有する精子数が増えるに従って受精能力が低下する（Ｐａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８１；Ｊａｎｕｓｋａｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００３；Ｄｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。これは、セルトリ細胞が射精前の精子形成中に退化精子を取り除けなかったためであり、あるいは射精精液の凍結保存に対する敏感性が強くなる結果、解凍後の精子の自動性および／または膜完全性が低下するためと考えられる。この結果、受胎率および出産率が低下し、また離乳時の体重減少および牛乳産生量の低下が生じる。
【０００３】
この問題やその他の問題を解決するために、本明細書には、精液の凍結保存前後において有害な精子を取り除き、選択的に健全な精子を増やすことによって精液特性を改善する方法を開示する。本発明方法によると、健全な精子の個数が増加し、受精能力が高くなり、人工授精や体外受精などの処置後の生殖結果（体外胚生産、受精、妊娠、子牛の誕生など）に改善が見られる。もう一つの非限定的な例として、選別によって雌雄を決定した哺乳動物精液の場合、未選別精液よりも特性が低くなることも知られている。本発明方法は、同時係属出願である米国公開特許出願第２０１５/０２３３９２０号およびＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ/ＵＳ２０１５/１６５８９号に開示されている方法などの任意の適当な方法によって雌雄を決定した精液特性を改善するために有効である。なお、これら両出願明細書はここに全体を援用し、発明の名称が“雌雄比のスキューイング用抗体およびその使用方法”であり、また出願日はいずれも２０１５年２月１４日である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国公開特許出願第２０１５/０２３３９２０号
【特許文献２】ＰＣＴ/ＵＳ２０１５/１６５８９
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄｏｇａｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ  ５９：  １８−２６
【非特許文献２】Ｊａｎｕｓｋａｕｓｋａｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ６０：  ７４３−５８
【非特許文献３】Ｎａｇｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ａｎｉｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｓｃｉ  ８０：  ２２５−３５
【非特許文献４】Ｐａｃｅ，Ｍ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８１）．Ｊ  Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ  ５３：  ６９３−７０１
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的および作用効果に従って、本発明の一つの態様は、毀損された精子膜完全性を示す指示薬に結合する少なくとも一つの配位子か、あるいはこの少なくとも一つの配位子に結合できる少なくとも一つの分子を有する不溶性担体を使用して、有害な精子を取り除くことによって精液特性を改善する方法を提供するものである。指示薬は、毀損された精子先体完全性（ｓｐｅｒｍ  ａｃｒｏｓｏｍｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）および毀損された精子原形質膜完全性（ｓｐｅｒｍ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）の一方か、あるいは両方に対応するものであればよい。実施態様においては、上記分子はストレプトアビジン、プロテインＡおよび抗体からなる群から選択する。実施態様においては、指示薬はビオチンであればよく、また配位子は抗体であればよい。実施態様においては、抗体は抗ウサギＩｇＧか、あるいはその結合フラグメントであればよい。抗体はポリクロナール抗体か、あるいはモノクロナール抗体であればよい。
【０００７】
本発明の方法は、さらに配位子の自動性および／または膜完全性が毀損された精子への結合に好ましい条件下で精液サンプルと不溶性担体とを接触させ、不溶性担体結合精子細胞集団および結合していない精子細胞集団を準備するステップを有する。さらに、本発明の方法は結合していない精子細胞集団から結合した精子細胞集団を分離するステップを有する。実施態様においては、不溶性担体は少なくとも一つの配位子または少なくとも一つの分子で被覆された複数のビーズを有し、この場合本発明方法は精液サンプルとこの複数の被覆ビーズとを混合するステップを有する。実施態様においては、本発明の方法はサイズ排除ろ過によってビーズが結合している精子細胞集団を分離するステップを有する。他の実施態様においては、本発明の方法は磁気ビーズである不溶性担体を供給するステップ、および、磁気分離によってビーズ結合精子細胞集団を分離するステップを有する。
【０００８】
本発明のもう一つの態様は、本発明は試剤を有し、また適宜ガラス容器および／またはプラスチック容器を有し、そして上記方法の使用説明書を含むキットを提供するものである。
【０００９】
以下、精液特性の改善方法の実施態様を説明する。なお、本発明の方法は他の異なる態様でも実施可能であり、その細部については、特許請求の範囲に記載した方法から逸脱せずに、各種の自明な態様で変更可能であることが理解されるべきである。即ち、添付図面および説明は本質的に例示を目的とし、制限を加えるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
明細書の一部を構成する添付図面は精液特性を改善する方法のいくつかの態様を図示するもので、明細書の説明と相俟って本発明のいくつかの原理の説明に資するものである。
【図１】各種の被覆された不溶性担体での培養後の自動性精子のパーセント（％）を示す図である。
【図２】各種の被覆された不溶性担体での培養後の無毀損先体および原形質膜をもつ精子のパーセントを示す図である。
【００１１】
以下、本発明の精液特性改善方法の実施態様を詳しく説明する。なお、実施例を添付図面に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
実施例１：エクステンダー除去後の被覆ビーズによる凍結-解凍雄牛精液の特性改善
異なるタイプの被覆ビーズ（表１）に個別に雄牛精子をインキュベートした。被覆ビーズによるインキュベーションに先立って、ＨＥＰＥＳ/ＴＡＬＰクエン酸緩衝液（予め２５〜３０℃に加温された緩衝液で、１１４ｍＭのＮａＣｌ、３．２ｍＭのＫＣｌ、０．３ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭの乳酸、２ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＮａＨＣＯ３、０．２ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．５％のＢＳＡ、０．６％のクエン酸ナトリウムを有する緩衝液）で希釈後に、２頭の雄牛（ホルスタイン）から採取した凍結-解凍精液を遠心分離し、エクステンダーを除去した。ＨＥＰＥＳ/ＴＡＬＰクエン酸緩衝液を使用して、得られた精子ペレットを２０×１０６細胞/ｍＬの濃度に再懸濁した。精子懸濁液を０．５ｍＬの容量で２ｍＬの丸底管に移した。（表１に示す容量の）被覆ビーズをＨＥＰＥＳ/ＴＡＬＰクエン酸緩衝液とともに精子を含有する各管に個別に加え、１ｍＬの最終容量に調整した。ビーズ保存緩衝液を（表１に示す）細胞に加える前に除去することがメーカーによって勧められている場合には、メーカーの勧めに従ってビーズをＨＥＰＥＳ/ＴＡＬＰクエン酸緩衝液で洗浄した。対照サンプル（ビーズなし）はＨＥＰＥＳ/ＴＡＬＰクエン酸緩衝液のみを加えた精子からなる。室温において３０分間丸底管を緩やかに混合した。
【００１３】
表１：有害な精子を取り除くことによって評価される被覆ビーズの説明
2019503169.tif 000003
【００１４】
適正な装置を使用して、結合していない細胞をビーズおよびビーズ結合精子から分離した。Ｓ−ｐｌｕｒｉｂｅａｄｓ（登録商標）およびＭ−ｐｌｕｒｉｂｅａｄｓ（登録商標）については、それぞれ、サイズが３０μｍおよび６０μｍの排除篩（ｐｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ（登録商標））を使用して非磁気分離を行った。即ち、結合していない細胞は篩のメッシュを通過し、下の別な新しい管に集まり、ビーズ結合精子はメッシュ上に残った。ＦｌｏｗＣｏｍｐ（登録商標）ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）およびＢｉｏＭａｇ（登録商標）粒子については、６本の管からなる磁気分離ラックを使用して、ビーズおよびビーズ結合精子を管の側部に押し付け、上澄み液に懸濁している結合していない細胞を別な新しい管に移した。ＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓについては、ＭＡＣＳ（登録商標）マルチスタンド（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に取り付けたＭｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）分離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）の磁気ＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、磁気分離を行った。即ち、ビーズおよびビーズ結合精子はカラムの磁場内に残り、結合していない細胞はカラムを通過して、別な新しい管に集まった。
【００１５】
対照精子に対して結合していない精子の健全性を比較評価するために、自動性および膜状態を評価した。コンピュータ補助式精子分析装置（ＣＡＳＡ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｔｈｏｒｎｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、精子の自動性を求めた。精子の先体および原形質膜（ａｃｒｏｓｏｍａｌ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）の状態を評価するために、Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ（２００４）に記載されている手順を一部変更して、結合していない細胞の一部をＳＹＢＲ−１４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で同時染色し、サンプル中の非精子物から精子を識別し、またフィコエリスリン結合ピーナッツアグルチニン（ＰＥ−ＰＮＡ；ＧｅｎｅＴｅｘ  Ｉｎｃ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で同時染色し、精子を非完全な先体で標識化し、そしてＤＲＡＱ７（Ａｂｃａｍ（登録商標）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）で同時染色し、易感染性の原形質膜で精子を標識化した。具体的には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＤＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ（登録商標）  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で希釈した精子を１０ｎＭのＳＹＢＲ−１４、２．５μｇ/ｍＬのＰＥ−ＰＮＡおよび３μＭのＤＲＡＱ７で１０分間３５℃において染色してから、ＢＤ  ＡｃｃｕｒｉＣ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で評価した。各サンプルにつき、最小で５０，０００個の細胞を評価した。
【００１６】
ビーズ試験の結果が示唆するところによれば、使用するビーズのタイプに応じて（自動性および膜状態に基づいて）健全な精子を強化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）することは実行可能であった。図１を参照すると、ビーズ処置後の結合していない精子の自動性と（ビーズに全く暴露していない）対照精子の自動性との比較から、ＦｌｏｗＣｏｍｐ（登録商標）ビーズ、ＢｉｏＭａｇ（登録商標）粒子またはＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓのいずれかに暴露したサンプルでは自動性精子のパーセントは２０％以上も増加したが、Ｓ−ｐｌｕｒｉｂｅａｄｓ（登録商標）、Ｍ−ｐｌｕｒｉｂｅａｄｓ（登録商標）またはＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）とともに同時インキュベートした精子の場合、結合していない精子集団における自動性に対してはほとんど効果がないことがわかった。結合していない精子の膜状態の評価結果（表２を参照）からは、精子がＳ−ｐｌｕｒｉｂｅａｄｓ（登録商標）、ＦｌｏｗＣｏｍｐ（登録商標）ビーズ、ＢｉｏＭａｇ（登録商標）粒子またはＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓのいずれかに暴露した後、無傷の先体および原形質膜をもつ精子のパーセントは１４％以上高くなったが、Ｍ−ｐｌｕｒｉｂｅａｄｓ（登録商標）またはＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の場合、ほとんど効果がなかったことがわかった。
【００１７】
実施例２：エクステンダーの存在下でＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを使用した場合における凍結‐解凍精液の特性改善
ＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを使用して有害な精子を除去できる効能をさらに試験するために、二種類の被膜、アネキシンＶまたは抗ウサギＩｇＧを４頭の異なる雄牛の精子に使用して試験を行った。ＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを使用するインキュベーションを行う前に、個別の雄牛（ホルスタインまたはセネポル）から採取した凍結‐解凍精液を等容量のＨＥＰＥＳ/ＴＡＬＰクエン酸緩衝液と混合した。精子懸濁液を１ｍＬ容量で２ｍＬの丸底管に移した。ＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを各精子管に４通りの異なる組み合わせで加えた。即ち、１）ビーズなし、２）１００μＬのアネキシンＶ被覆ビーズ、３）１００μＬの抗ウサギＩｇＧ被覆ビーズ、および４）１００μＬのアネキシンＶ被覆ビーズ＋１００μＬの抗ウサギＩｇＧ被覆ビーズである。サンプルに緩衝液を加え、処理間における最終容量が確実に同じになるようにした。管を室温において３０分間緩やかに混合した。
【００１８】
ＭＡＣＳ（登録商標）マルチスタンド（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に取り付けたＭｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）分離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）の磁気ＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に精子‐ビーズ懸濁液を装填した。結合していない細胞はカラムを通過し、別な新しい管に集まった。分離装置からカラムを取り外し、磁場からビーズおよびビーズ結合精子を放出した。１．２ｍＬのＨＥＰＥＳ−ＴＡＬＰ緩衝液を使用してカラムを洗浄し、ビーズ結合精子を回収した。処理後、および結合していないフラクションおよび結合したフラクションに分離後精子の健全性を評価するために、上記のＣＡＳＡ装置を使用して、ＶＩＡＤＥＮＴ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｔｈｏｒｎｅ；易感染性の原形質膜をもつラベル精子）で染色した精子細胞の自動性および原形質膜状態を評価した。それぞれ異なる雄牛を使用して、実験を異なる時間で４回繰り返した。二項分布と一般化線形混合モデル（ＰＲＯＣ  ＧＬＩＭＭＩＸ：ＳＡＳ９．４、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔ．，Ｉｎｃ、Ｃａｒｙ、ＮＣ、ＵＳＡ）を使用して、データを乱塊法（ランダム化ブロックデザイン）として分析した。プロテクト付き最小有意差法（ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｌｅａｓｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）を使用して処理差を求め、逆リンクオプション（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｌｉｎｋ  ｏｐｔｉｏｎ）を使用して最小二乗平均±ＳＥＭとして示す。
【００１９】
それぞれ異なる雄牛の精子を使用して４回再現したＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ実験の結果から、自動性が劣弱か、あるいは易感染性の原形質膜をもつ精子を取り除く効力は使用したビーズの被覆に依存することがわかった。抗ウサギＩｇＧ被覆ビーズに暴露後の精子の結合していないフラクションの場合、対照（表２）よりも無傷の原形質膜（Ｐ＜０．０００１）をもつ自動性精子が多かった（Ｐ＜０．０００１）が、アネキシンＶ被覆ビーズとともに同時インキュベートした精子は、対照と比較して、結合していないフラクションにおける自動性または原形質膜状態に改善は認められなかった。２種類の被覆ビーズを併用した場合、結合していないフラクションにおける健全な精子強化に対する相乗効果は認められなかった（表２に示す通り、自動性および原形質膜状態：アネキシンＶ≦対照＜抗ウサギＩｇＧ＝両方）。ビーズ種間差については、劣弱な自動性または易感染性の原形質膜をもつ精子のビーズへの結合によって取り除かれる程度に反映されていた（結合フラクション；表２を参照）。ビーズに結合した精子の場合、自動性は結合していないフラクションや対照と比べて小さく、この効果は抗ウサギＩｇＧ被覆ビーズに暴露された精子においてより明らかであった（対照＞アネキシンＶ＞抗ウサギＩｇＧ；表２を参照）。膜状態については、（アネキシンＶ被覆ビーズを併用した、あるいは併用しない）抗ウサギＩｇＧ被覆ビーズに暴露された精子の結合フラクションは、対照と比較した場合、無傷の原形質膜をもつ精子が少なかった（表２）。
【００２０】
表２：結合していない精子およびビーズ結合精子の分離されていないフラクションおよびＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ分離フラクションにおける精子自動性および原形質膜状態の結果
2019503169.tif 000004
【００２１】
実施例３：エクステンダーの存在下でＢｉｏＭａｇ（登録商標）粒子を使用した場合における凍結‐解凍精液の特性改善
ＢｉｏＭａｇ（登録商標）粒子を使用するインキュベーションを行う前に、個別の雄牛（ホルスタインまたはセネポル）から採取した凍結‐解凍精液を等容量のＨＥＰＥＳ/ＴＡＬＰクエン酸緩衝液と混合した。精子懸濁液を１ｍＬ容量で２ｍＬの丸底管に移した。精子に加える前に、抗ウサギＩｇＧを被覆したＢｉｏＭａｇ（登録商標）粒子（１５０μＬ）をＨＥＰＥＳ−ＴＡＬＰ/クエン酸緩衝液で洗浄した。対照サンプルに緩衝液を加え、処理間における最終容量が確実に同じになるようにした。室温において３０分間穏やかに混合した後、丸底管を７分間６本の管からなる磁気分離ラックに載置した。上澄み液に懸濁した結合していないフラクションを別な新しい管に移した。次に、ＨＥＰＥＳ/ＴＡＬＰクエン酸緩衝液を管に加え、ラックから管を取り外した。ビーズおよびビーズ結合精子（結合フラクション）を穏やかにピペットで取り上げ、均質な懸濁液を得た。処理後および結合していないフラクションおよび結合したフラクションの分離後、精子の健全性を評価するために、ＣＡＳＡ装置を使用して、ＶＩＡＤＥＮＴ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｔｈｏｒｎｅ）で染色した精子細胞中で自動性および原形質膜状態を評価した。それぞれ異なる雄牛を使用して、実験を異なる時間で４回繰り返した。二項分布と一般化線形混合モデル（ＰＲＯＣ  ＧＬＩＭＭＩＸ：ＳＡＳ９．４、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔ．，Ｉｎｃ、Ｃａｒｙ、ＮＣ、ＵＳＡ）を使用して、データを乱塊法として分析した。プロテクト付き最小有意差法を使用して処理差を求め、逆リンクオプションを使用して最小二乗平均±ＳＥＭとして示す。
【００２２】
それぞれ異なる雄牛に対してＢｉｏＭａｇ（登録商標）粒子を使用して行った４回の再現試験の結果から、劣弱な自動性をもつ精子を取り除いても、結合していないフラクションの特性に格別な改善が見られなかったことがわかった。抗ウサギＩｇＧビーズに暴露後の精子の結合していないフラクションの自動性および無傷の原形質膜の程度は対照と同様であった（表３を参照）。ビーズに結合した精子の自動性は結合していないフラクションおよび対照よりも低い（Ｐ＜０．０００１）が、グループ間には無傷の原形質膜をもつ精子のパーセントに相違は認められなかった（Ｐ＝０．４５６３；表３）。
【００２３】
表３：結合していない精子およびビーズ結合精子の分離されていないフラクションおよびＢｉｏＭａｇ（登録商標）粒子分離フラクションにおける精子自動性および原形質膜状態の結果
2019503169.tif 000005
【００２４】
特に断らない限り、本明細書で使用した技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味をもつ。本明細書に記載したのと同様な、あるいは等価な方法、装置および物質はいずれも本明細書に開示した要旨の実施または試験に使用できるが、代表的な方法、装置および物質を記載した。
【００２５】
長年の特許法実施慣習に従って、特許請求の範囲を含む本願において使用される場合、単数表現は“一つかそれ以上”を意味するものとする。従って、例えば“細胞”と表現する場合、このような細胞などを複数含意するものとする。
【００２６】
特に断らない限り、本明細書および特許請求の範囲に使用する成分量を表すすべての数値、反応条件などの特性については、いずれもその前に“約”が付くものとする。従って、逆の趣旨を述べない限り、本明細書および特許請求の範囲に記載する数値パラメーターは近似値であり、本発明要旨の目的である所望特性に応じて変わるものである。
【００２７】
また、組成物量、投与量、配列同一性の値や量値に言及する場合（例えば２つかそれ以上のヌクレオチドやアミノ酸配列を比較する場合）、その前につけた“約”は、質量、重量、温度、時間、容量、濃度、パーセントなどが具体的に記載した量から一部の実施態様では±２０％、一部の実施態様では±１０％、一部の実施態様では±５％、一部の実施態様では±１％、一部の実施態様では±０．５％、そして一部の実施態様では±０．１％の幅があることを意味する。このような幅において本発明の方法を実施でき、あるいは本発明組成物を使用できる。
【００２８】
“含む”、“含有する”、あるいは“特徴とする”と同義な用語“有する”は包括的な、換言すると“制限のない”用語であり、付加的な、言及していない要素または方法ステップを排除するものではない。“有する”は特許請求の範囲を記載するさいに使用される用語であり、記載した要素が絶対に必要な要素ではあるが、他の要素も付加でき、特許請求の範囲内に含まれる構成を提供できることを意味する用語である。
【００２９】
一方、用語“からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）”は特許請求の範囲に記載されていない要素、ステップまたは成分のいずれをも排除する用語である。この用語“からなる”がある請求項のプリアンブル（ｐｒｅａｍｂｌｅ）直後ではなく、本文（ｂｏｄｙ）の一節に出てくる場合、この一節に記載されている要素のみを制限するものであり、全体として当該請求項から他の要素を排除するものではない。
【００３０】
また、用語“本質的にからなる”は具体的に記載された物質またはステップにある請求項の範囲を制限するだけでなく、特許請求の範囲に記載された要旨の基本的かつ新規な特徴に重要な影響を与えない物質またはステップに制限するものである。用語“有する”、“からなる”および“本質的にからなる”に関して、これら３つの用語の一つが使用されている場合、本明細書に開示し、かつ特許請求の範囲に記載した要旨は、他の２つの用語の何れかの使用も包摂できる。
【００３１】
また、用語“および／または”は、実在物をリストする文脈で使用される場合、単独で存在する実在物または組み合わせた状態で存在する実在物を指すものである。即ち、例えば“Ａ、Ｓ、Ｃ、および／またはＯ”はＡ、Ｓ、Ｃ、およびＯが単独で存在する場合を包含するだけでなく、Ａ、Ｓ、Ｃ、およびＯが任意の組み合わせ、すべての組み合わせおよびいくつかの組み合わせで存在する場合も包含するものである。
【００３２】
本明細書で使用する用語“抗体”（Ａｂ）は、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、多特異性抗体および抗体フラグメントを意味するが、これらが目的の生物学的活性および結合特性を示す限りにおいてである。本明細書で使用する用語“ポリクロナール抗体”は異種抗体の集団から得られた抗体を指す。即ち、これらは体内の異なるＢ細胞系列（Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ）によって分泌されるものである。また、用語“モノクロナール抗体”は実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指す。即ち、集団を構成する個々の抗体が、自然に発生する考えられる突然変異を除いて、同一である。モノクロナール抗体は特異性が高く、単一の抗原部位（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｓｉｔｅ）のみに結合する抗体である。
【００３３】
また、本明細書で使用する用語“抗体”（Ａｂ）は、抗体フラグメントも含む用語である。“抗体フラグメント”は無傷の抗体の一部であり、好ましくはこの無傷の抗体の抗原結合領域または抗原可変領域である。制限するわけではないが、抗原フラグメントの実例を挙げると、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ´フラグメント、Ｆ（ａｂ´）２フラグメント、およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；線形抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；単鎖抗体（一本鎖抗体、ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）分子；および抗体フラグメントから形成された多特異性抗体がある。
【００３４】
本明細書で使用する用語“精液”は、哺乳動物の精子細胞を含有する流体を指す。本明細書で使用する“精液”はニート（希釈していない、ｎｅａｔ）な精液および希釈精液を含む。本発明方法は、新鮮な精液、凍結（凍結保存）精液、および冷却精液の特性を改善するのに有効である。
【００３５】
本発明の好適な実施態様に関する上記説明は、例示を目的とするものである。徹底的な説明を意図せず、また本発明を正確な開示形態に限定することも意図していない。上記の説明に照らせば、一部変更や変型などは容易に実施することができる。実施態様については、本発明の原理およびその実際上の応用の最善の説明を与え、当業者が本発明を各種実施態様において利用できるように、また各種変更を利用できるように選択し、かつ記述した。また、これら実施態様および変更は意図する具体的な用途に適用することができる。これら一部変更および変型の全ては、公正、合法的かつ公平の範囲に従って解釈した場合に、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲内に包摂されるものである。本明細書において言及した参考文献などはその全体を援用するものとする。
【図１】
2019503169.tif 000006
【図２】
2019503169.tif 000007
【国際調査報告】
2019503169.tif 000008