(57)【要約】  １種以上のネオエピトープ及び／又は腫瘍関連抗原を樹状細胞において生成するか又は樹状細胞に伝達し、こうして改変した樹状細胞を、好ましくは刺激性シグナルの存在下で患者の免疫細胞と共培養する免疫療法方法及び組成物が企図される。次に細胞を、好ましくは免疫チェックポイント阻害治療を受けた患者に輸注する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有する患者を治療する方法であって、
トランスフェクトされた抗原提示細胞に予めエクスビボで曝露された複数の免疫細胞を患者に投与する段階を含む方法を含み、
抗原提示細胞が、少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープ、又は少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープをコードする核酸配列を含むＲＮＡ若しくは発現ベクターをトランスフェクトされており、及び
免疫細胞が腫瘍を有する患者から得られる
方法。
【請求項２】
複数の免疫細胞が、患者の全血の白血球画分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複数の免疫細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球及びＢ細胞のうちの少なくとも１種に関して富む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗原提示細胞が患者由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗原提示細胞が、少なくとも１患者特異的腫瘍ネオエピトープをトランスフェクトされている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗原提示細胞が、少なくとも１種の腫瘍関連エピトープをコードする核酸を含む発現ベクターをトランスフェクトされている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープが、ＨＬＡ適合の患者特異的腫瘍ネオエピトープである、請求項６又は請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも患者特異的腫瘍ネオエピトープが、患者特異的ネオエピトープをＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩ提示へと標的化する標的配列を更に含む、請求項６又は請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
抗原提示細胞が、少なくとも２種の異なる患者特異的腫瘍ネオエピトープをトランスフェクトされたか、又は核酸が、少なくとも２種の異なる患者特異的腫瘍ネオエピトープをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
抗原提示細胞が、少なくとも免疫刺激分子を更にトランスフェクトされたか若しくはその免疫刺激分子に曝露され、又は核酸が少なくとも１種の免疫刺激分子を更にコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも免疫刺激分子が共刺激分子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
共刺激分子が、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ又はＴＬ１Ａである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
抗原提示細胞が、少なくとも１種のチェックポイント阻害剤を更にトランスフェクトされたか若しくはそのチェックポイント阻害剤に曝露され、又は核酸が、少なくとも１種のチェックポイント阻害剤を更にコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）又はＰＤ−１（ＣＤ２７９）に結合するポリペプチドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
発現ベクターがウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ウイルスベクターが、必要に応じてＥ２ｂ遺伝子を欠失又は非機能化しているアデノウイルスベクターである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ウイルスベクターが、対応する野生型ウイルスベクターと比較して免疫原性が低下している、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
複数の免疫細胞が、サイトカインの存在下、トランスフェクトされた抗原提示細胞に曝露された、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５スーパーアゴニストである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
複数の免疫細胞を投与する段階の前に免疫チェックポイント阻害剤を患者に投与する段階を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
複数の免疫細胞を、トランスフェクトされた抗原提示細胞と共に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
複数の免疫細胞を輸注によって投与し、患者の腫瘍の少なくとも１種の腫瘍関連エピトープをコードする核酸を含むウイルスベクターを患者に投与する段階を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
腫瘍を有する患者由来の免疫細胞をエクスビボで活性化する方法であって、
患者から複数の免疫細胞を得る段階と、
複数の抗原提示細胞に、少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープ、又は少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープをコードする核酸を含む発現ベクターをエクスビボでトランスフェクトする段階と、
複数の免疫細胞を、複数のトランスフェクトされた抗原提示細胞と、免疫細胞を活性化するのに十分な時間に亘って共培養する段階を含む方法。
【請求項２５】
複数の免疫細胞が患者の全血の白血球画分である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
複数の免疫細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球及びＢ細胞のうちの少なくとも１種に関して富む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
抗原提示細胞が患者由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
抗原提示細胞が、少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープをトランスフェクトされる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
抗原提示細胞が、少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープをコードする核酸を含む発現ベクターをトランスフェクトされている、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープが、ＨＬＡ適合の患者特異的腫瘍ネオエピトープである、請求項２９又は請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープが、腫瘍関連エピトープをＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩ提示へと標的化する標的配列を更に含む、請求項２９又は請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
抗原提示細胞が、少なくとも２種の異なる患者特異的腫瘍ネオエピトープをトランスフェクトされたか、又は核酸が少なくとも２種の異なる患者特異的腫瘍ネオエピトープをコードする、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
抗原提示細胞が、少なくとも免疫刺激分子を更にトランスフェクトされたか若しくはその免疫刺激分子に曝露され、又は核酸が少なくとも１種の免疫刺激分子を更にコードする、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも免疫刺激分子が共刺激分子である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
共刺激分子が、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ又はＴＬ１Ａである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抗原提示細胞が、少なくとも１種のチェックポイント阻害剤を更にトランスフェクトされたか若しくはそのチェックポイント阻害剤に曝露され、又は核酸が少なくとも１種のチェックポイント阻害剤を更にコードする、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）又はＰＤ−１（ＣＤ２７９）に結合するポリペプチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
発現ベクターがウイルスベクターである、請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
ウイルスベクターが、必要に応じてＥ２ｂ遺伝子を欠失又は非機能化しているアデノウイルスベクターである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ウイルスベクターが、対応する野生型ウイルスベクターと比較して免疫原性が低下している、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
共培養する段階をサイトカインの存在下で行う、請求項２４に記載の方法。
【請求項４３】
サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５スーパーアゴニストである、請求項２４に記載の方法。
【請求項４４】
免疫細胞を活性化するのに十分な時間が２時間〜２４時間である、請求項２４に記載の方法。
【請求項４５】
複数の免疫細胞及び複数のトランスフェクトされた抗原提示細胞と組み合わせて輸注用の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、
抗原提示細胞が、少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープ、又は少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープをコードする核酸を含む発現ベクターをトランスフェクトされた細胞であり、
免疫細胞が腫瘍を有する患者から得られる
医薬組成物。
【請求項４６】
複数の免疫細胞が、患者の全血の白血球画分である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
複数の免疫細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球及びＢ細胞のうちの少なくとも１種が豊富である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４８】
抗原提示細胞が患者由来である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４９】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５０】
抗原提示細胞が、少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープをトランスフェクトされている、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５１】
抗原提示細胞が、少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープをコードする核酸を含む発現ベクターをトランスフェクトされている、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５２】
少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープが、ＨＬＡ適合の腫瘍関連エピトープである、請求項５０又は請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープが、腫瘍関連エピトープをＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩ提示へと標的化する標的配列を更に含む、請求項５０又は請求項５１に記載の組成物。
【請求項５４】
抗原提示細胞が、少なくとも２種の異なる患者特異的腫瘍ネオエピトープをトランスフェクトされたか、又は核酸が少なくとも２種の異なる患者特異的腫瘍ネオエピトープをコードする、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５５】
抗原提示細胞が、少なくとも免疫刺激分子を更にトランスフェクトされたか又はその免疫刺激分子に曝露され、又は核酸が少なくとも１種の免疫刺激分子を更にコードする、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５６】
少なくとも免疫刺激分子が共刺激分子である、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
共刺激分子が、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ又はＴＬ１Ａである、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
抗原提示細胞が、少なくとも１種のチェックポイント阻害剤を更にトランスフェクトされたか又はそのチェックポイント阻害剤に曝露され、又は核酸が少なくとも１種のチェックポイント阻害剤を更にコードする、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５９】
チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）又はＰＤ−１（ＣＤ２７９）に結合するポリペプチドである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項６０】
発現ベクターがウイルスベクターである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項６１】
ウイルスベクターが、必要に応じてＥ２ｂ遺伝子を欠失又は非機能化しているアデノウイルスベクターである、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
ウイルスベクターが、対応する野生型ウイルスベクターと比較して免疫原性が低下している、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６３】
サイトカインを更に含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項６４】
サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５スーパーアゴニストである、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
免疫チェックポイント阻害剤を更に含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項６６】
患者の腫瘍の治療用の医薬組成物を処方するための複数の免疫細胞及びトランスフェクトされた抗原提示細胞の使用であって、
複数の免疫細胞が、トランスフェクトされた抗原提示細胞にエクスビボで曝露され、
抗原提示細胞が、少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープ、又は少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープをコードする核酸配列を含むＲＮＡ又は発現ベクターをトランスフェクトされており、及び
免疫細胞が腫瘍を有する患者由来である
使用。
【請求項６７】
複数の免疫細胞が、患者の全血の白血球画分である、請求項６６に記載の使用。
【請求項６８】
複数の免疫細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球及びＢ細胞のうちの少なくとも１種に富む、請求項６６に記載の使用。
【請求項６９】
抗原提示細胞が患者由来である、請求項６６に記載の使用。
【請求項７０】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項６６に記載の使用。
【請求項７１】
抗原提示細胞が、患者の腫瘍の少なくとも１種の腫瘍関連エピトープをトランスフェクトされている、請求項６６に記載の使用。
【請求項７２】
抗原提示細胞が、少なくとも１種の腫瘍関連エピトープをコードする核酸を含む発現ベクターをトランスフェクトされている、請求項６６に記載の使用。
【請求項７３】
少なくとも１種の腫瘍関連エピトープが、ＨＬＡ適合の腫瘍関連エピトープである、請求項７１又は請求項７２に記載の使用。
【請求項７４】
少なくとも患者特異的腫瘍ネオエピトープが、腫瘍関連エピトープをＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩ提示へと標的化する標的配列を更に含む、請求項７１又は請求項７２に記載の使用。
【請求項７５】
抗原提示細胞が、少なくとも２種の異なる患者特異的腫瘍ネオエピトープをトランスフェクトされたか、又は核酸が少なくとも２種の異なる患者特異的腫瘍ネオエピトープをコードする、請求項６６に記載の使用。
【請求項７６】
抗原提示細胞が、少なくとも免疫刺激分子を更にトランスフェクトされたか又はその免疫刺激分子に曝露され、又は核酸が少なくとも１種の免疫刺激分子を更にコードする、請求項６６に記載の使用。
【請求項７７】
少なくとも免疫刺激分子が共刺激分子である、請求項７６に記載の使用。
【請求項７８】
共刺激分子が、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ又はＴＬ１Ａである、請求項７７に記載の使用。
【請求項７９】
抗原提示細胞が、少なくとも１種のチェックポイント阻害剤を更にトランスフェクトされたか又はそのチェックポイント阻害剤に曝露され、又は核酸が少なくとも１種のチェックポイント阻害剤を更にコードする、請求項６６に記載の使用。
【請求項８０】
チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）又はＰＤ−１（ＣＤ２７９）に結合するポリペプチドである、請求項７９に記載の使用。
【請求項８１】
発現ベクターがウイルスベクターである、請求項６６に記載の使用。
【請求項８２】
ウイルスベクターが、必要に応じてＥ２ｂ遺伝子を欠失又は非機能化しているアデノウイルスベクターである、請求項８１に記載の使用。
【請求項８３】
ウイルスベクターが対応する野生型ウイルスベクターと比較して免疫原性が低下している、請求項８２に記載の使用。
【請求項８４】
複数の免疫細胞が、サイトカインの存在下、トランスフェクトされた抗原提示細胞に曝露された、請求項６６に記載の使用。
【請求項８５】
サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５スーパーアゴニストである、請求項８４に記載の使用。
【請求項８６】
複数の免疫細胞を投与する段階の前に免疫チェックポイント阻害剤を患者に投与する段階を更に含む、請求項６６に記載の使用。
【請求項８７】
複数の免疫細胞を、トランスフェクトされた抗原提示細胞と共に投与する、請求項６６に記載の使用。
【請求項８８】
複数の免疫細胞を輸注によって投与し、患者の腫瘍の少なくとも１種の腫瘍関連エピトープをコードする核酸を含むウイルスベクターを提供する段階を更に含む、請求項８７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１６年８月２日出願の米国特許仮出願第６２／３７０２０８号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明の分野は免疫療法組成物及び方法であり、特にエクスビボ成分を有する癌ワクチン調製物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
以下の説明には本発明を理解するのに有用となり得る情報が含まれる。本明細書に記載の情報がいずれも本願で特許請求される発明の先行技術であるか又はこれに関連するものであること、或いは具体的又は黙示的に参照される任意の刊行物が先行技術であることを認めるものではない。
【０００４】
本明細書で特定された特許出願及び刊行物はいずれも、各々の刊行物又は特許出願が具体的且つ個別的に参照によって組み込まれることが示された場合と同程度に、参照によって組み込まれる。組み込まれる参考文献における用語の定義及び使用法が、本明細書に記載の用語の定義と一致しないか、これに反する場合、本明細書に記載のその用語の定義が適用され、参考文献中でのその用語の定義は適用されない。
【０００５】
癌ワクチンは近年非常に有望であることが示されているが、様々な要因、例えば、ウイルス媒体の免疫原性及び組換え抗原の不十分な提示に起因して制限されることが多い。更に、多くの場合にはウイルス媒体の全身送達のために、免疫系における様々な成分（例えば、樹状細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、Ｂ細胞）の広範な訓練がなされないことが多く、なされても不十分に過ぎない。また、抗原提示が少なくともある程度なされる場合でも、免疫チェックポイント阻害が、有効な治療への更なるハードルとなることが多い。
【０００６】
腫瘍抗原の全身送達に関連する幾つかの困難を克服するため、癌特異的抗原を用いて特定の抗原提示細胞のインビトロ刺激を誘発するための様々な努力がなされてきた。こうしてパルスされた抗原提示細胞は、次に治療用組成物として患者に輸注される（例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２  Ｖｏｌ．１２  ｐ．２６５−２７７を参照）。他のアプローチでは、樹状細胞をＮＫ細胞と共にインキュベートして、ＴＬＲアゴニストの存在下で成熟樹状細胞を生成した（例えば、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１０），４２（６），ｐ４０７−４１９を参照）。少なくとも概念的には魅力的であるが、それでも様々な欠点が残る。特に、パルスした樹状細胞は多くの場合、自己免疫を生成するという固有のリスクを有する腫瘍細胞に曝露されるか、又は持続免疫の誘発能を欠くことの多いＮＫ細胞と組み合わされる。
【０００７】
このように、免疫応答を発生させる多くの方法と組成物が当技術分野で知られているが、それらの全て又はほぼ全てが様々な欠点を有する。したがって、免疫療法のための改良組成物と改良方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の主題は患者の免疫学的腫瘍治療の組成物及び方法に関し、ここでは、患者の免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞等）を、患者の腫瘍の１種以上の腫瘍関連エピトープを予めトランスフェクトしたか、又は患者の腫瘍の１種以上の腫瘍関連エピトープをコードする核酸を含む発現ベクターを予めトランスフェクトした様々な抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）と共培養する。こうして生成した細胞集団は、患者の腫瘍の腫瘍関連エピトープに対して特異的な免疫反応性を有し、治療法として適している。
【０００９】
本発明の主題の一態様では、本発明者らは、腫瘍を有する患者を治療する方法であって、トランスフェクトされた抗原提示細胞に予め曝露した複数の免疫細胞を患者に投与する段階を含む方法を企図する。
【００１０】
最も好ましくは、抗原提示細胞は、患者の腫瘍の少なくとも１種の腫瘍関連エピトープ、又は患者の腫瘍の少なくとも１種の腫瘍関連エピトープをコードする核酸を含む発現ベクターをトランスフェクトされ、免疫細胞は腫瘍を有する患者から得た。
【００１１】
したがって、本発明者らは、腫瘍を有する患者由来の免疫細胞をエクスビボで活性化する方法も企図する。このような方法は、典型的には、患者から複数の免疫細胞を得る段階と、患者の腫瘍の少なくとも１種の腫瘍関連エピトープ、又は患者の腫瘍の少なくとも１種の腫瘍関連エピトープをコードする核酸を含む発現ベクターを複数の抗原提示細胞にエクスビボでトランスフェクトする更なる段階を含む。更に他の段階では、複数の免疫細胞を、複数のトランスフェクトされた抗原提示細胞と、免疫細胞を活性化するのに十分な時間に亘って共培養する。
【００１２】
したがって、及び本発明の主題の更に他の態様では、本発明者らは、複数の免疫細胞及び複数のトランスフェクトされた抗原提示細胞と組み合わせて輸注用の薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物も企図する。したがって、異なる観点から見ると、本発明者らは、患者の腫瘍の治療用の医薬組成物を処方するための複数の免疫細胞及びトランスフェクトされた抗原提示細胞の使用も企図する。抗原提示細胞は、典型的には、患者の腫瘍の少なくとも１種の腫瘍関連エピトープ、又は患者の腫瘍の少なくとも１種の腫瘍関連エピトープをコードする核酸を含むウイルスベクターを予めトランスフェクトされた細胞であり、免疫細胞は腫瘍を有する患者から予め得た。
【００１３】
本発明の主題を限定するわけではないが、免疫細胞は患者の全血の白血球画分であるか又はそれを含むことが一般に好ましい。例えば、適切な免疫細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球及びＢ細胞のうちの少なくとも１種が豊富な白血球の集合体であり得る。同様に、抗原提示細胞は患者由来であり、最も好ましくは樹状細胞由来であることが企図される。
【００１４】
ある実施形態では、患者の腫瘍の少なくとも１種の腫瘍関連エピトープを抗原提示細胞にトランスフェクトし、他の実施形態では、少なくとも１種の腫瘍関連エピトープをコードする核酸を含む発現ベクターを抗原提示細胞にトランスフェクトする。好ましくは、腫瘍関連エピトープは、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的抗原及び／又は腫瘍関連抗原を含み、必要に応じてＨＬＡ適合の腫瘍関連エピトープである。また、腫瘍関連エピトープは、ＭＨＣ−Ｉ及び／又はＭＨＣ−ＩＩを提示するために腫瘍関連エピトープを標的とする標的配列を更に含むことができる。当然のことながら、患者の腫瘍の少なくとも２種の異なる腫瘍関連エピトープを抗原提示細胞にトランスフェクトすることができること、又は核酸は患者の腫瘍の少なくとも２種の異なる腫瘍関連エピトープをコードすることが理解されるべきである。
【００１５】
免疫応答を増強するため、抗原提示細胞は、１種以上の免疫刺激分子を更にトランスフェクトされるか若しくはその免疫刺激分子に曝露されてもよく、又は核酸は少なくとも１種の免疫刺激分子、及び特に共刺激分子（例えば、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ又はＴＬ１Ａ）を更にコードすることができる。同様に、抗原提示細胞は、１種以上のチェックポイント阻害剤をトランスフェクトされるか又はそのチェックポイント阻害剤に曝露されてもよく、又は核酸は１種以上のチェックポイント阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）又はＰＤ−１（ＣＤ２７９）に結合するポリペプチド）を更にコードすることができる。
【００１６】
更に企図される態様では、発現ベクターはウイルスベクター、好ましくは必要に応じてＥ２ｂ遺伝子が欠失又は非機能的であるアデノウイルスベクターであり得る。他の観点から見ると、ウイルスベクターは対応する野生型ウイルスベクターと比較して免疫原性が低下していてもよい。
【００１７】
必要に応じて、免疫細胞をサイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５スーパーアゴニストの存在下、トランスフェクトされた抗原提示細胞に曝露することもできる。更に、複数の免疫細胞を投与する段階の前に免疫チェックポイント阻害剤を患者に投与できること、及び／又は免疫細胞をトランスフェクトされた抗原提示細胞と共に投与することが企図される。必要に応じて、患者の腫瘍の１種以上の腫瘍関連エピトープをコードする核酸を含むウイルスベクターを患者に投与することができる。
【００１８】
以下の好ましい実施形態の詳細な説明から本発明の主題の様々な目的、特徴、態様及び利点が更に明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の主題は、免疫療法のための様々な組成物、方法及び使用、特に細胞ベースの組成物、方法及び使用に関し、そこでは、腫瘍を有する患者の１種以上の免疫細胞を、患者の腫瘍の１種以上の腫瘍関連エピトープを予めトランスフェクトされたか若しくはそのエピトープに予め曝露された樹状細胞にエクスビボで曝露するか、又は患者の腫瘍の１種以上の腫瘍関連又は腫瘍特異的エピトープをコードする核酸を含む発現ベクターを予めトランスフェクトした樹状細胞にエクスビボで曝露する。こうして、免疫応答を特定の腫瘍に（及び更には腫瘍亜集団にも）特異的に向けることができ、患者の免疫細胞は拒絶反応を受けないであろう。その上、樹状細胞の活性化及び樹状細胞による免疫細胞の指示は、細胞混合物を免疫刺激性組成物、特にＩＬ−１５（又はＩＬ−１５スーパーアゴニスト）に曝露することによって更に高めることができる。
【００２０】
例えば、本発明の主題の企図される一態様では、大腸癌と診断された患者の免疫細胞を、典型的には全血の白血球画分の形態で単離する（例えば、バフィーコートとして単離する）。この画分又は患者の他の試料から（例えば、皮膚又は脾臓から）樹状細胞を単離する。或いは、樹状細胞は特定の増殖因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）に反応する前駆細胞に由来してもよい。単離の種類に関わらず、患者の腫瘍の１種以上の腫瘍関連エピトープ又は患者の腫瘍の１種以上の腫瘍関連エピトープをコードする核酸を含む発現ベクター（好ましくはウイルスベクター）を樹状細胞にトランスフェクトすることが企図される。トランスフェクションは、既知のトランスフェクション剤又は機械的に誘導されるトランスフェクションを用いて行うことが好ましい。最も好ましくは、以下で更により詳細に説明するように、腫瘍関連エピトープは患者の腫瘍に特異的なネオエピトープを含むか又はそのネオエピトープである。結果として、こうしてトランスフェクトされた樹状細胞は、ＭＨＣ−Ｉ／ＭＨＣ−ＩＩ系を介して腫瘍エピトープを提示するであろう。
【００２１】
好都合なことには、腫瘍エピトープを提示する樹状細胞を、好ましくは免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５スーパーアゴニスト）の存在下、予め単離した免疫細胞（又は白血球画分）とエクスビボで接触させる。樹状細胞による腫瘍関連エピトープの提示の結果として免疫細胞が活性化し、次にこうして活性化した免疫細胞を典型的には樹状細胞と共に患者に輸注することができる。しかし、活性化した免疫細胞から他の成分を除去するのは不要と考えられること、及び共培養細胞を患者に直接投与できることに留意すべきである。更に、こうして得た免疫治療用組成物は患者に由来するため、拒絶反応が全く見られないことが理解されるべきである。更に、免疫刺激性サイトカインによる刺激はエクスビボ段階に限定されるため、他の全身投与の望ましくない副作用には至らないはずである。患者における免疫応答を更に増強するため、活性化した免疫細胞の投与前及び／又は投与中に、患者が１種以上の免疫チェックポイント阻害剤（例えば、イピリムマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ）による治療を受けることができることも企図される。
【００２２】
当然のことながら、本明細書に示す組成物と方法は大腸癌と診断された患者に限定されるものではなく、実際には他の適切な抗原に対する免疫応答が不完全、抑制、又は欠如していることに伴う全ての病態が企図されることが理解されるべきである。したがって、企図される別の疾患としては、他の様々な固形癌及び血液由来の癌、例えば、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、肺癌膠芽腫、黒色腫、リンパ腫等が挙げられる。
【００２３】
同様に、癌と診断された患者の企図される免疫細胞は、患者の全血の白血球画分／バフィーコートに限定される必要はなく、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ及びＢ細胞のうちの１種以上が豊富な画分を挙げることができる。当然のことながら、このような細胞は比較的高い純度（例えば、少なくとも８０％、より典型的には少なくとも９０％、最も典型的には少なくとも９５％）まで単離できることに留意すべきである。しかし、次に好ましい態様では、免疫細胞を全血試料として提供することもできる。更に、免疫細胞は、ＨＬＡ適合の非患者ドナーから提供され得ることも理解されるべきであり、この場合、ＨＬＡ適合は、マイクロビーズアレイ上でのＰＣＲ−ＳＳＯアッセイ等の標準的方法によって、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲＢ１／Ｂ３／Ｂ４及びＤＱＢ１遺伝子座のうちの１種以上（典型的には全て）について少なくとも４桁適合している。同様に、免疫細胞は、低下した抗原性を有するように、同種異系であってもよく、遺伝子改変されて（例えば、患者特異的ＨＬＡを発現して）いてもよい。
【００２４】
最も典型的には、免疫細胞の数は約１０６〜１０１０個の範囲、又は１０６〜１０８個の範囲、又は１０７〜１０９個の範囲、又は１０８〜１０１０個の範囲、又はそれより多い。免疫細胞の種類に応じて、免疫細胞を培養して数を増やし、特定の比率（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞のＮＫ細胞に対する比率が約１０：１）を達成するように組み合わせてもよく、又は特定の種類の免疫細胞を特定の抗原提示方法に適合させるように濃縮してもよい（例えば、ＭＨＣ−Ｉに対する抗原提示の場合にはＣＤ８＋を濃縮し、ＭＨＣ−ＩＩに対する抗原提示の場合にはＣＤ４＋を濃縮する）ことが理解されるべきである。したがって、患者の免疫細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ及びＢ細胞のうちの１種、又は２種、又は３種、又は４種、又は５種、又は全てを含み得ることが理解されるべきである。
【００２５】
選択された免疫細胞、特に疲弊Ｔ細胞を、最も典型的にはＴ細胞疲弊の表面マーカーに基づく磁気ビーズ分離又はＦＡＣＳ分離を使用して、免疫細胞から除去してもよいことが更に企図される。例えば、適切な疲弊マーカーとしては、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＬＡＧ３、ＰＤ１、ＴＩＭ３等が挙げられる。このような枯渇によって、樹状細胞が提示する抗原に対して活性化Ｔ細胞の全集団を有利に増加させることができる。一方、疲弊Ｔ細胞を、樹状細胞又は他の抗原提示細胞と接触させる前に、例えば、ＩＬ２１等の種々の化合物又はＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３若しくはＣＴＬＡ４に対する抗体を用いて再活性化することもできる。
【００２６】
同様に、免疫細胞を樹状細胞又は他の抗原提示細胞と接触させる前に、１種以上の免疫刺激性化合物又は組成物に曝露できることが理解されるべきであり、適切な免疫刺激性化合物又は組成物としては、種々のサイトカイン及びケモカイン、特にＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１が挙げられる。例えば、免疫細胞をＩＬ−２又はＩＬ−１５に曝露（例えば、Ｔ細胞が免疫細胞の一部である場合）、又はＴＮＦ−αに曝露（例えば、マクロファージが免疫細胞の一部である場合）、又はインターフェロン−γに曝露（例えば、ＮＫ細胞が免疫細胞の一部である場合）して免疫細胞の活性を更に刺激することができる。注目すべきことに、このようなインビトロ免疫刺激はインビボでは少なくとも問題となり得る（例えば、ＩＬ−２が使用される血管漏出症候群のため）条件で実施することができる。必要に応じて、免疫細胞を樹状細胞又は他の抗原提示細胞と接触させる前に、免疫刺激性化合物又は組成物を除去することができる。
【００２７】
同様に、適切な抗原提示細胞は樹状細胞に限定される必要はなく、他の多くの専門的及び非専門的抗原提示細胞（及びその全ての適切な混合物）も適切であると見なされることが理解されるべきである。したがって、適切な抗原提示細胞としては、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞等が挙げられる。しかし、樹状細胞が一般に好ましいことに留意されたい。最も典型的には、樹状細胞は同じ患者から、例えば、血液、脾臓又は皮膚から単離する（例えば、Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ｍａｙ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ７：Ｕｎｉｔ  ７．３２又はＪ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００１  Ｊｕｎ  １；２５２（１−２）：９３−１０４を参照）。しかし、他の態様では、当技術分野で周知のように（例えば、Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１３；４：２９２を参照）、適切な因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、αＴＮＦ、又は他の様々なサイトカイン）を用いて患者の前駆細胞から樹状細胞を誘導することもできる。
【００２８】
抗原提示細胞を得る方法に関わらず、このような抗原提示細胞は、免疫細胞と接触させる（免疫刺激性化合物又は組成物に曝露されていてもされていなくてもよい）前に活性化又は刺激できることが企図される。このような刺激又は活性化は、抗原提示細胞において１種以上の共刺激分子の発現が増加している（未刺激細胞又は非活性化細胞と比較して）ことが望ましい場合に特に有利である。例えば、パターン認識受容体の１種以上のリガンド、例えば、ＴＬＲリガンド（例えば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７／８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１３等）、ＮＬＲリガンド（例えば、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２等）、ＲＬＲリガンド（例えば、５’ｐｐｐ−ｄｓＲＮＡ、ポリ（ｄＡ：ｄＴ、等）、ＣＬＲリガンド（例えば、ＨＫＣＡ、リケナン、βグルカンペプチド等）、及び／又はＳＴＩＮＧリガンド（例えば、２’２’−ｃＧＡＭＰ、２’３’−ｃＧＡＭＰ、ｃ−ジ−ＡＭＰ等の環状ジヌクレオチド）に抗原提示細胞を曝露してもよいことが企図される。このような抗原提示細胞のインビトロ刺激は、通常ならば有害反応若しくは自己免疫反応を誘発するか又は患者に対して毒性となるような条件下で刺激を行うことができるので、特に有益であることが特に理解されるべきである。
【００２９】
最も典型的には、抗原提示細胞の数は約１０６〜１０１０個の範囲、又は１０６〜１０８個の範囲、又は１０７〜１０９個の範囲、又は１０８〜１０１０個の範囲、又はそれより多い。その上、抗原提示細胞の種類に応じて、抗原提示細胞を培養して数を増やし、特定の比率（例えば、樹状細胞のマクロファージに対する比率が約１０：１）を達成するように組み合わせてもよく、又は特定の種類の抗原提示細胞を、特定のトランスフェクション方法若しくは腫瘍関連エピトープ（例えば、患者及び腫瘍特異的ネオエピトープ、癌関連抗原、又は癌特異的抗原）への曝露に適合するように濃縮してもよいことが理解されるべきである。したがって、患者の抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージ及びＢ細胞のうちの１種、又は２種、又は全てを含み得ることが理解されるべきである。当然のことながら、樹状細胞は特定の起源（例えば、皮膚、末梢血、脾臓等）のものであり得ることも理解されるべきである。
【００３０】
抗原提示細胞（腫瘍関連抗原をコードする核酸が予めトランスフェクトされたか又は腫瘍関連抗原に予め曝露された）の免疫細胞に対する適切な比率に関して、適切な比率は典型的には１０４：１（抗原提示細胞：免疫細胞）〜１：１０４（抗原提示細胞：免疫細胞）、又は１０３：１〜１：１０３、又は１０２：１〜１：１０２、又は１０：１〜１：１０であることが企図される。混合後、以下で更により詳細に説明するように、細胞を免疫刺激性化合物及び組成物に更に曝露してもよいことが認識されるべきである。
【００３１】
企図される腫瘍関連エピトープに関して、腫瘍関連エピトープは、以下で更により詳細に説明するように、腫瘍及び患者特異的ネオエピトープ、癌関連抗原（例えば、ＣＥＡ、ＭＵＣ１等）、及び／又は癌特異的抗原（例えば、ＨＥＲ２、ＰＳＭＡ等）であり得ることに留意すべきである。したがって、免疫細胞の特異性は、ネオエピトープを用いて特定の腫瘍又は腫瘍のサブクローン集団に向けて微調整できること、又は免疫細胞をより広範の腫瘍細胞集団に向けて訓練できることに留意すべきである。腫瘍関連エピトープは、典型的にはより大きなポリペプチドの一部であるか、又はおそらく適切な非免疫原性散在スペーサーと連結した７〜５０アミノ酸の長さを有するエピトープであり得る。例えば、エピトープがＭＨＣ−Ｉを介した提示を意図する場合、エピトープの典型的な長さは７〜１５アミノ酸であり得る。一方、エピトープがＭＨＣ−ＩＩを介した提示を意図する場合、エピトープの典型的な長さは１５〜５０アミノ酸であり得る。
【００３２】
最も好ましくは、腫瘍関連エピトープは、抗原提示細胞にトランスフェクトされた発現ベクター又はＲＮＡ上にコードされる。特に好ましい態様では、発現ベクターはウイルスベクター、最も好ましくはアデノウイルスベクターである。ＲＮＡを用いて細胞をトランスフェクトする場合、ＲＮＡはモノシストロン性、バイシストロン性、又はポリシストロン性であり得る。このような場合、既知のトランスフェクション方法を用いて発現ベクター又はＲＮＡを細菌又は酵母に送達することができる。しかし、適切な腫瘍関連エピトープも、組換えタンパク質として、或いは細菌ワクチン又は酵母ワクチン調製物として抗原提示細胞に添加できることが理解されるべきである。したがって、腫瘍関連エピトープは、細胞表面との接触を介して、又は腫瘍関連エピトープを細胞質の中に強制的に挿入するトランスフェクションを介して（例えば、ソノポレーション、リポフェクション、弾道導入等を介して）抗原提示細胞と直接接触させることができる。したがって、抗原提示細胞及び腫瘍関連エピトープと共に使用される「トランスフェクトする」という用語は、腫瘍関連エピトープを抗原提示細胞へ取り込ませる条件下で抗原提示細胞を腫瘍関連エピトープに曝露すること、及び腫瘍関連エピトープを抗原提示細胞へと強制的に通過させる又は通過させるための抗原提示細胞の処置（例えば、ソノポレーション、押圧トランスフェクション、化学的トランスフェクション等）を包含することを意図する。
【００３３】
腫瘍関連エピトープの特定の配列に関して、癌に関連するエピトープ（例えば、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１等）、癌の種類に特異的なエピトープ（例えば、ＰＳＡ、ＨＥＲ２等）、並びに／又は患者及び腫瘍特異的であるエピトープはいずれも本明細書での使用に適していることが理解されるべきであり、特に好ましい配列は患者及び腫瘍特異的ネオエピトープを含む。エピトープが健常対照（例えば、同じ患者の非罹患組織由来）より多く発現すること、並びにエピトープは、患者のＭＨＣ−Ｉ及び／又はＭＨＣ−ＩＩ複合体のそれぞれの結合モチーフに結合すると予測されるエピトープを含むことが更に好ましい。
【００３４】
例えば、第一段階で腫瘍生検（又はリンパ生検又は転移部位の生検）及びマッチさせた正常組織（即ち、同じ患者由来の非罹患組織）の全ゲノム解析によって患者の腫瘍からネオエピトープを特定することができ、好ましくは、同じ患者の腫瘍組織及びマッチさせた正常組織から得たオミクス情報の位置誘導型同期アライメントによって行う。次に、こうして特定したネオエピトープを患者のＨＬＡ型とのマッチに関して更にフィルタリングし、ネオエピトープの抗原提示の可能性を高めることができる。最も好ましくは、以下で更に説明するように、このようなマッチングはインシリコで行うことができる。最も典型的には、患者特異的エピトープは患者に特有であるが、少なくとも幾つかの場合では、腫瘍型特異的ネオエピトープ（例えば、Ｈｅｒ−２、ＰＳＡ、ブラキウリ）又は癌関連ネオエピトープ（例えば、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＣＹＰＢ１）を含み得る。したがって、アデノウイルス核酸構築物（又は他の送達用の核酸構築物）は、少なくとも１種の患者特異的ネオエピトープをコードする、より典型的には、少なくとも２種又は３種以上のネオエピトープ及び／又は腫瘍型特異的ネオエピトープ及び／又は癌関連ネオエピトープをコードする組換えセグメントを含むことが理解されるべきである。選択したネオエピトープの数がウイルスの組換え核酸容量よりも大きいか又はＲＮＡの実際的な限界を超える場合、複数の異なるネオエピトープを複数の異なるＲＮＡ又は組換えウイルスを介して送達することができる。
【００３５】
患者からオミクス情報を得て１種以上のネオエピトープを同定する段階に関して、標準的な組織処理プロトコル及び配列決定プロトコルの後に患者の生検試料からオミクスデータが得られることが企図される。本発明の主題を限定するわけではないが、データは患者のマッチさせた腫瘍データ（例えば、腫瘍データと同じ患者の正常データとの比較）であること、及びデータフォーマットはＳＡＭ、ＢＡＭ、ＧＡＲ又はＶＣＦフォーマットであることが典型的には好ましい。しかし、他の参照データ（例えば、同じ患者の以前の正常データ又は同じ患者の以前の腫瘍データ、又はベースラインデータ（ｈｏｍｏ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｕｓ））と比較した非マッチ又はマッチデータも本明細書での使用に適していると考えられる。したがって、オミクスデータは、「新しい」オミクスデータであってもよく、以前の処置で得た（又は異なる患者から得た）オミクスデータであってもよい。
【００３６】
参照配列の性質（例えば、対応する正常配列）に関わらず、参照配列を使用して複数のエピトープを計算することが一般に好ましい。最も典型的には、エピトープは２〜５０アミノ酸の長さ、より典型的には５〜３０アミノ酸の長さ、最も典型的には９〜１５アミノ酸の長さを有するものとして計算され、変化したアミノ酸は好ましくは中央に位置するか、又はＭＨＣに対する結合を改善するように存在する。例えば、エピトープがＭＨＣ−Ｉ複合体によって提示される場合、典型的なエピトープの長さは約８〜１１アミノ酸であるが、ＭＨＣ−ＩＩ複合体によって提示される場合の典型的なエピトープの長さは、約１３〜１７アミノ酸の長さである。以下で更に詳細に説明するように、こうして計算したエピトープ及びネオエピトープを、次にその患者特異的ＨＬＡ型（ＭＨＣ−ＩとＭＨＣ−ＩＩ）に対する親和性に関してインシリコで解析することが更に好ましい。このようなネオエピトープに対するＨＬＡ親和性を知ることによって少なくとも２種の有益な情報、即ち、（ａ）それ以外は免疫療法に適したエピトープの欠失を認識でき、それに応じてその欠失エピトープを標的にしないように免疫療法を調整できるという情報、及び（ｂ）免疫療法に適したネオエピトープの生成を認識でき、それに応じてそのネオエピトープを標的にするように免疫療法を調整できるという情報がもたらされることが理解されるべきである。
【００３７】
一般にネオエピトープに関して、ネオエピトープは、腫瘍細胞において独自の腫瘍特異的な抗原を生成するランダム変異として特徴付けられ得ることが理解されるべきである。したがって、解析が同じ患者のマッチさせた正常組織も考慮する場合、ハイスループットのゲノム配列決定によって、患者特異的ネオエピトープの迅速且つ特異的な同定が可能となるはずである。注目すべきことに、本発明者らの同時係属中の国際出願国際公開第２０１６／１６４８３３号にも開示されているように、免疫応答を誘発するために必要であり、その結果、癌免疫療法の製造に独自の機会を表すネオエピトープは非常に少数であると思われる。その上、以下で更に説明するように、ネオエピトープの選択も、ネオエピトープの発現レベル及び細胞内位置を調べることによって更に誘導されることが理解されるべきである。例えば、ネオエピトープがマッチさせた正常と比較して発現していないか又は発現がごくわずかな場合（例えば、マッチさせた正常な発現の２０％以下の場合）、そのネオエピトープを適切なネオエピトープの選択から除外することができる。同様に、ネオエピトープが核タンパク質として特定される場合、そのネオエピトープを適切なネオエピトープの選択から除外することができる。一方、ネオエピトープに関する正の選択には、ネオエピトープが部分的に細胞外又は膜貫通部分に存在することが必要であり、及び／又はマッチさせた正常と比較して少なくとも５０％の発現レベルが必要であり得る。発現レベルは当技術分野で公知の多数の方法で測定することができ、適切な方法としては、ｑＰＣＲ、ｑＬＣＲ、及び他の定量的ハイブリダイゼーション技法が挙げられる。
【００３８】
ゲノム解析は様々な解析方法によって実施可能であることが一般に企図されるが、特に好ましい解析方法としては、腫瘍試料及びマッチさせた正常試料の両方のＷＧＳ（全ゲノム配列決定）及びエクソーム配列決定が挙げられる。同様に、配列データの計算解析を多くの方法で行うことができる。しかし、最も好ましい方法では、ＢＡＭファイル及びＢＡＭサーバを使用し、例えば、米国特許出願公開第２０１２／００５９６７０号Ａ１及び米国特許出願公開第２０１２／００６６００１号Ａ１に開示されているように、腫瘍試料及び正常試料の位置誘導型同期アライメントによってインシリコで解析を行う。
【００３９】
コンピュータに関する言葉はいずれも、サーバ、インターフェース、システム、データベース、エージェント、ピア、エンジン、コントローラ、又は他の個別に若しくは共同で作動する種類の計算装置を含む、計算装置の任意の適切な組合せを包含することに留意すべきである。計算装置は、有形の非一時的なコンピュータ可読記憶媒体（例えば、ハードドライブ、ソリッドステートドライブ、ＲＡＭ、フラッシュ、ＲＯＭ等）に格納されているソフトウェア命令を実行するよう設定されたプロセッサを含むことが理解されるべきである。ソフトウェア命令は、後に本開示の装置に関して説明するように、計算装置が役割、責任、又は他の機能を提供するよう設定するのが好ましい。更に、開示された技術は、コンピュータベースのアルゴリズム、プロセス、方法又は他の命令の実行に関連した開示段階をプロセッサに実行させるソフトウェア命令を格納した非一時的なコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品として具体化することができる。特に好ましい実施形態では、様々なサーバ、システム、データベース又はインターフェースは、ＨＴＴＰ、ＨＴＴＰＳ、ＡＥＳ、官民キー交換、ウェブサービスＡＰＩ、公知の金融取引プロトコル、又は他の電子情報交換法に基づく可能性のある標準化プロトコル又はアルゴリズムを用いてデータを交換する。装置間でのデータ交換は、パケット交換網、インターネット、ＬＡＮ、ＷＡＮ、ＶＰＮ、又は他のタイプのパケット交換網、回路交換網、セル交換網、又は他の種類のネットワークを通じて実施することができる。
【００４０】
発現レベルの同定は、当技術分野で知られている全ての方法で行うことができ、好ましい方法としては、定量的ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ又はｍＲＮＡ）解析及び／又は定量的プロテオミクス解析が挙げられる。最も典型的には、エピトープ及びネオエピトープを含めるための閾値レベルは、発現レベルがマッチさせた正常レベルに比べて少なくとも２０％、より典型的には少なくとも５０％であり、このように（ネオ）エピトープが免疫系に対して少なくとも潜在的に確実に「可視化される」ようにする。したがって、オミクス解析は、変異を有する遺伝子の発現レベルを同定するために役立つように遺伝子発現解析（トランスクリプトーム解析）も含むことが一般に好ましい。他の観点から見ると、トランスクリプトーム解析は（単独で行うにしても、ゲノム解析と併用するにしても）、癌及び患者特異的な変異を有する遺伝子を同定及び定量するのに適切となり得る。当技術分野では多くのトランスクリプトーム解析方法が知られており、全ての公知の方法が本明細書での使用に適していると考えられる。したがって、上述のことを考慮すると、腫瘍組織及びマッチさせた正常組織由来のＤＮＡ及びＲＮＡを含む患者試料を使用して特定の変異を同定し、その変異を定量化できることが理解されるべきである。本明細書に示される教示と併せて使用するのに適した更なるエピトープ、ネオエピトープ、方法及びシステムは、国際出願国際公開第２０１６／１７２７２２号に開示されている。
【００４１】
したがって、患者及び癌特異的なネオエピトープは、患者及び腫瘍の種類に特有の潜在的エピトープを最終的に予測する専用のインシリコ環境で同定できることが認識されるべきである。次に、こうして同定及び選択したネオエピトープを、同定された患者のＨＬＡ型に対してインシリコで更にフィルタリングすることができる。このようなＨＬＡマッチングによって、有核細胞のＭＨＣ−Ｉ複合体及び特異的抗原提示細胞のＭＨＣ−ＩＩ複合体に対するネオエピトープの強い結合を確実にすると考えられる。両方の抗原提示系を標的化することによって、免疫系の細胞性部分と液性部分の両方を伴う治療上有効で持続的な免疫応答を生じると特に考えられる。
【００４２】
ＭＨＣ−Ｉ及びＭＨＣ−ＩＩの両方に対するＨＬＡの決定は、当技術分野で周知の様々な湿式化学方法を用いて行うことができ、これらの方法は全て本明細書での使用に適していると考えられる。しかし、特に好ましい方法では、以下により詳細に示すように、公知のＨＬＡ型及び／又は通常のＨＬＡ型の大部分又は全てを含む参照配列を用い、インシリコでオミクスデータからＨＬＡ型を予測することもできる。即ち、患者のＨＬＡ型を（湿式化学的な又はインシリコでの確認によって）確認し、ＨＬＡ型の構造解を計算又はデータベースから得た後、それをインシリコでドッキングモデルとして用いて、ＨＬＡ構造解に対するネオエピトープの結合親和性を求める。結合親和性を求めるのに適したシステムとしては、ＮｅｔＭＨＣプラットフォーム（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００８  Ｊｕｌ  １；３６（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５０９−Ｗ５１２を参照）、ＨＬＡＭａｔｃｈｍａｋｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｉｔｏｐｅｓ．ｎｅｔ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ．ｈｔｍｌ）、及びＩＥＤＢ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ｍｈｃｉｉ／）が挙げられる。次に、予め決定したＨＬＡ型に対して高親和性（例えば、ＭＨＣ−Ｉに対して１００ｎＭ未満、又は７５ｎＭ未満、又は５０ｎＭ未満、ＭＨＣ−Ｉに対して５００ｎＭ未満、又は３００ｎＭ未満、又は１００ｎＭ未満）を有するネオエピトープを選択する。最も高い親和性を計算する上で、Ｎ末端及び／又はＣ末端の改変をエピトープに追加してネオエピトープに対する改変を行って、ウイルスが発現するネオエピトープのＨＬＡ型への結合を更に高めることができる。したがって、ネオエピトープは同定されたままの天然型であってもよく、特定のＨＬＡ型により良くマッチするように更に改変してもよい。
【００４３】
患者のＨＬＡ型のインシリコでの予測のために、カラーのＤｅ  Ｂｒｕｉｊｎグラフを使用してオミクスデータを分析することができ、このグラフではエッジが、どの入力ソース（例えば、参照試料、正常試料、及び／又は腫瘍試料、異なる時間又は年齢で採取した試料、異なる患者又は対象群由来の試料等）にｋ−ｍｅｒが存在するかを同定する「色」を有するｋ−ｍｅｒ（ｋ＝１５）であり、各エッジは隣接するエッジに接続されている。例示的なシステムと方法は国際出願国際公開第２０１７／０３５３９２号に記載されている。
【００４４】
したがって、ネオエピトープをＨＬＡにドッキングさせ、最良の結合体（例えば、最低ＫＤ、例えば、５０ｎＭ未満）を決定することによって、コンピュータ解析を実施できることが理解されるべきである。このようなアプローチによって患者及び腫瘍に対して真正である特定のネオエピトープが同定されるだけでなく、細胞上に提示される可能性が最も高く、よって、治療効果を伴う免疫応答を引き起こす可能性が最も高いそれらのネオエピトープも同定されることも認識されるべきである。当然のことながら、エピトープをコードする核酸をペイロードとしてウイルスに封入するか又はネオエピトープをコードするＲＮＡを生成する前に、こうして特定されたＨＬＡ適合のネオエピトープをインビトロで生化学的に検証できることも理解されるべきである。
【００４５】
最も好ましくは、組換え核酸は、エピトープがＭＨＣ−Ｉ及び／又はＭＨＣ−ＩＩ提示経路に向けられるような構成で癌関連又は癌特異的エピトープ、又は患者特異的ネオエピトープをコードする。こうして同定及び発現したネオエピトープの所望のＭＨＣ系への経路決定に関して、ＭＨＣ−Ｉ提示ペプチドは典型的には、プロテアソームプロセシングを介して細胞質から生じ、小胞体を通して送達されることが理解されるべきである。したがって、以下で更により詳細に説明するように、ＭＨＣ−Ｉ提示が意図されるエピトープの発現は一般に細胞質に向けられる。一方、ＭＨＣ−ＩＩ提示ペプチドは典型的には、分解を介してエンドソーム及びリソソーム区画から生じ、細胞膜への送達前に酸性プロテアーゼ（例えば、レグマイン、カテプシンＬ及びカテプシンＳ）によってプロセシングされる。したがって、以下でより詳細に説明するように、ＭＨＣ−ＩＩ提示が意図されるエピトープの発現は一般にエンドソーム区画及びリソソーム区画に向けられる。
【００４６】
最も好ましい態様では、エンドソーム区画及びリソソーム区画への輸送又は細胞質空間内での保持のためにシグナルペプチドを用いることができる。例えば、ペプチドがエンドソーム区画及びリソソーム区画に搬出される場合には、標的化プレ配列及び内部標的化ペプチドを用いることができる。標的化ペプチドのプレ配列は好ましくはＮ末端に付加され、６〜１３６個の塩基性及び疎水性アミノ酸を含む。ペルオキシソーム標的化の場合、標的化配列はＣ末端に存在することができる。他のシグナル（例えば、シグナルパッチ）を用いることができ、このシグナルには、ペプチド配列では離れているが、適切なペプチドフォールディングの際に機能的になる配列要素を含むことができる。更に、グリコシル化のようなタンパク質改変によって標的化を誘発することができる。他の適切な標的化シグナルのうち、本発明者らは、ペルオキシソーム標的化シグナル１（ＰＴＳ１）、Ｃ末端トリペプチド、及びＮ末端付近に位置するノナペプチドであるペルオキシソーム標的シグナル２（ＰＴＳ２）を企図する。更に、エンドソーム及びリソソームへのタンパク質の選別は、典型的には短い直鎖状配列を含むタンパク質の細胞質ドメイン内のシグナルによって媒介することもできる。一部のシグナルはチロシンベースの選別シグナルと称され、ＮＰＸＹ又はＹＸＸΦコンセンサスモチーフと一致する。ジロイシンベースのシグナルとして知られる他のシグナルは、［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］又はＤＸＸＬＬコンセンサスモチーフに適合する。これらのシグナルは全て、膜の細胞質表面の周囲に結合したタンパク質コートの成分によって認識される。ＹＸＸΦシグナル及び［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］シグナルは、アダプタータンパク質（ＡＰ）複合体ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−３及びＡＰ−４によって特徴的な微細な特異性で認識され、ＤＸＸＬＬシグナルはＧＧＡとして知られる別のアダプターファミリーによって認識される。液胞タンパク質選別及びエンドソーム機能に関連しているＦＹＶＥドメインも付加することができる。更なる態様では、ヒトＣＤ１尾部配列を用いてエンドソーム区画を標的化することもできる（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２２，５２２−５３１を参照）。
【００４７】
細胞質区画への輸送又は細胞質区画内での保持に１種以上の特定の配列要素が必ずしも必要というわけではない。しかし、少なくとも一部の態様では、膜アンカータンパク質又は膜アンカータンパク質の膜アンカードメインを含むＮ末端又はＣ末端細胞質保持シグナルを付加することができる。例えば、膜アンカータンパク質としては、ＳＮＡＰ−２５、シンタキシン、シナプトプレビン、シナプトタグミン、小胞結合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）、シナプス小胞糖タンパク質（ＳＶ２）、高親和性コリン輸送体、ニューレキシン、電位開口型カルシウムチャネル、アセチルコリンエステラーゼ及びＮＯＴＣＨが挙げられる。
【００４８】
更に企図される態様では、組換え抗原又はネオエピトープのＮ末端アミノ酸の適切な選択によってタンパク質代謝回転を更に促進することができ、Ｎ末端アミノ酸が不安定化アミノ酸であることが特に好ましい。したがって、適切なＮ末端アミノ酸としては特にＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ及びＴｙｒが挙げられ、ある程度にはＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ及びＧｌｕも挙げられる。ＭＨＣ−Ｉ及びＭＨＣ−ＩＩ提示経路を標的とするペプチドにこのようなアミノ酸を付加することができる。したがって、適切なシグナル配列によってペプチドを適切な区画へ向かわせ、必要に応じて不安定化Ｎ末端アミノ酸によってペプチドを改変することは、抗原カスケーディング及びエピトープ伝播を高めるのに役立つ。
【００４９】
更に企図される態様では、様々なネオエピトープを多くの方法で配置することができ、転写又は翻訳ユニットは、典型的には短いリンカー（例えば、４〜２０個のアミノ酸を有する可動性リンカー）で隔てられ、プロテアーゼ切断部位を更に含むことができる複数のエピトープのコンカテマー配置を有することができることに留意すべきである。このようなコンカテマーは、１〜２０個のネオエピトープ（典型的には、ウイルスを介して送達することができる組換え核酸のサイズによって制限される）を有することができ、コンカテマーは、ＭＨＣ−Ｉ及びＭＨＣ−ＩＩ複合体への送達に関して同一であってもよく、異なっていてもよいことに留意すべきである。
【００５０】
したがって、様々なペプチドを特定の細胞区画に経路決定し、ＭＨＣ−Ｉ及び／又はＭＨＣ−ＩＩを介した優先的又は特異的な提示を得ることができることが理解されるべきである。他の観点から見ると、腫瘍関連抗原及びネオエピトープは、両方の提示経路を介して又はいずれかの経路に対して選択的に、同時に又は以降の複数回の治療で提示され得ることが認識されるべきである。
【００５１】
その結果、（ネオ）抗原は樹状細胞（及び他の抗原提示細胞）のＭＨＣ−Ｉ及び／又はＭＨＣ−ＩＩ経路を介して提示されるので、活性化した免疫細胞を患者に投与した後の免疫系によるプロセシングによって、患者におけるＣＤ８＋細胞及びＣＤ４＋細胞の両方の継続的な刺激がもたらされ、その結果、ＩｇＧ１を形成するように訓練されたＢ細胞が形成されると共に訓練されたＮＫ細胞及び対応する記憶細胞が形成されることが認識されるべきである。更に、ＩｇＧ１分子によってＮＫ細胞による腫瘍特異的作用が可能になることに留意すべきである。
【００５２】
本発明の主題を限定するわけではないが、ネオエピトープ配列は、タンデム型ミニ遺伝子（例えば、ａａ１２−ネオエピトープ１２−ａａ１２）として、又は単一の転写単位として構成されることが一般に好ましく、これはキメラタンパク質に翻訳されてもされなくてもよい。したがって、既に上述したように、エピトープは、モノマー、マルチマーとして個別に若しくはコンカテマーとして、又はＮ及び／若しくはＣ末端ペプチドを有するハイブリッド配列として提示され得ることが理解されるべきである。最も典型的には、ウイルス及び／又は宿主のコドン選択に適合するように適切なコドン使用を用いて核酸配列を逆翻訳することが好ましい。しかし、他のコドン使用法又は非適合コドン使用法も適切であると考えられる。
【００５３】
更に、ウイルス送達媒体（又は他の発現構築物）は、感染した樹状細胞（又は他の抗原提示細胞）と免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞等）との相互作用を高めるために、少なくとも１種、より典型的には少なくとも２種、更に典型的には少なくとも３種、最も典型的には少なくとも４種の共刺激分子もコードすることが好ましい。例えば、適切な共刺激分子としては、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＩＣＯＳ−Ｌ及びＬＦＡ−３（ＣＤ５８）が挙げられ、特にＢ７．１（ＣＤ８０）及び／又はＢ７．２（ＣＤ８６）との組み合わせが挙げられる。更に企図される共刺激分子としては、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ及びＴＬ１Ａが挙げられる。更に、共刺激分子の発現を、抗原及び／又はネオエピトープが１種以上の共刺激分子と共に提示されるように協調させるのが好ましいことが理解されるべきである。このようにして、配列内リボソーム進入部位又は２Ａ配列を用いて単一の転写物から共刺激分子を産生するか、又は複数の転写物から共刺激分子を産生することが典型的には企図される。或いは、別々のＲＮＡ構築物を介して共刺激分子を送達することもできる。
【００５４】
更に、しかし必ずというわけではないが、ウイルスベクター（又は他の発現構築物、好ましくはＲＮＡ）はチェックポイント受容体に結合する１種以上のポリペプチドリガンドをコードする配列部分も含み得ることが企図される。最も典型的には、受容体を介したシグナル伝達が結合によって阻害又は少なくとも抑制され、特に企図される受容体としては、ＣＴＬＡ−４（特にＣＤ８＋細胞に対する）、ＰＤ−１（特にＣＤ４＋細胞に対する）が挙げられる。例えば、ポリペプチド結合体は抗体断片（特にｓｃＦｖ）を含むことができるが、受容体に特異的に結合する小分子ペプチドリガンドを含むこともできる。この場合も、（ポリ）ペプチド分子の発現を、抗原及び／又はネオエピトープが１種以上の（ポリ）ペプチド分子と共に提示されるように協調させるのが好ましいことが理解されるべきである。このようにして、配列内リボソーム進入部位又は２Ａ配列を用いて単一の転写物から（ポリ）ペプチド分子を産生するか、又は複数の転写物から（ポリ）ペプチド分子を産生することが典型的には企図される。或いは、既に上述したように、活性化した免疫細胞の投与前又は投与中に免疫チェックポイント阻害剤を患者に投与することができる。
【００５５】
更に企図される態様では、発現ベクター又はＲＮＡは、相互作用して免疫応答を増強することが知られている機能的に関連するタンパク質をコードし、含むこともできる。例えば、発現ベクター又はＲＮＡは、ＣＤ２７とＣＤ７０、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０、ＧＩＴＲＬとＧＩＴＲ、ＩＬ−２とＣＤ１２２、ＣＤ１３７とＴＲＡＦ２、及び／又はＩＣＯＳＬとＩＣＯＳをコードするセグメントを含むことができる。同様に、適切な発現ベクター及びＲＮＡは、阻害系と相互作用して免疫応答を更に増強するリガンドをコードし、含むこともできる。例えば、適切な（天然由来又は改変）リガンドとしては、Ｔ細胞活性化のＣＤ２７６／Ｂ７−Ｈ３阻害を阻害するリガンド、Ｔ細胞活性化のＢ７−Ｈ４／ＶＴＣＮ１阻害を阻害するリガンド、Ｔ細胞活性化のＣＤ２７２／ＨＶＥＭ阻害を阻害するリガンド、Ｔ細胞活性化のＬＡＧ３阻害を阻害するリガンド（例えば、ＭＨＣ−ＩＩ等）、Ｔ細胞活性化のＰＤ−１阻害を阻害するリガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１）、Ｔ細胞活性化のＣＴＬＡ−４阻害を阻害するリガンド（例えば、生体内因子、可溶ＣＤ２８等）、Ｔ細胞活性化のＴＩＭ−３阻害を阻害するリガンド（例えば、ガレクチン−９、生体内因子、抗体等）、Ｔ細胞活性化のＶＩＳＴＡ阻害を阻害するリガンド（例えば、抗体等）、及び／又はＮＫ細胞のＭＩＣ阻害を阻害するリガンド（例えば、抗体、生体内因子等）が挙げられる。
【００５６】
最も典型的には、組換え遺伝子の発現は構成的に活性な調節配列によって促進される。しかし、本発明の主題の他の態様では、調節配列は誘導型であり、好ましくは癌組織に対して内因性の１種以上の調節シグナル又は合成誘導因子を用いて選択的に誘導可能である。殆どの場合、転写物がＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）又は２Ａ配列（切断可能な２Ａ様ペプチド配列）を含み、サイトカイン及び共刺激分子の協調的発現を再び可能にすることが更に好ましい。
【００５７】
樹状細胞又は他の抗原提示細胞のトランスフェクションに関して、組換え核酸を裸のＤＮＡ又は複合体ＤＮＡとして（例えば、リポフェクションを用いて）投与できることに留意すべきであるが、組換え核酸はウイルスゲノム又は組換えＲＮＡの一部であることが一般に好ましい。次にこうして遺伝子改変したウイルスを用いてインビトロで樹状細胞に感染させることができ、これによってウイルス媒体の免疫原性に関する潜在的な問題を有意に減少させる。組換えウイルスに関しては、組換えウイルスを産生する公知の方法は全て本明細書での使用に適していると考えられるが、特に好ましいウイルスは既に療法において確立されているものであり、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス等であることが企図される。他の適切な選択肢のうち、アデノウイルスが特に好ましい。その上、ウイルスが複製欠損性の非免疫原性ウイルスであることが更に一般に好ましいが、これは典型的には、選択したウイルスタンパク質（例えば、Ｅ１タンパク質、Ｅ３タンパク質）の標的化欠失によって得られる。このような望ましい特性はＥ２ｂ遺伝子機能を欠失させることにより更に向上させることができ、既に報告されているように（例えば、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９８  Ｆｅｂ；７２（２）：９２６−９３３）、遺伝子改変ヒト２９３細胞を用いて組換えウイルスの高い力価を得ることができる。最も典型的には、所望の核酸配列（ウイルス感染細胞からの発現用）は当技術分野で周知の適切な調節要素の制御下にある。
【００５８】
したがって、上述に鑑みて、本明細書に記載の組成物及び方法が、ウイルス発現抗原をＭＨＣ系の１つまたは他方（又は両方）に特異的に向かわせるのに適しているだけではなく、様々な共刺激分子（例えば、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）、並びにＢ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）の少なくとも１種）を含めることを介して、及びチェックポイント阻害剤の分泌又は膜結合提示を介して、ＣＤ８＋細胞及び／又はＣＤ４＋細胞に及ぼす刺激作用の増大をもたらすことも理解されるべきである。
【００５９】
その上、企図されるネオエピトープに関して、ネオエピトープは必ずしも抗原提示細胞によって発現される必要はないが、ネオエピトープの少なくとも一部（又は全て）も個別のペプチド又はポリペプチドとして抗原提示細胞内に送達され得ることが理解されるべきである。容易に理解されるように、このようなポリペプチドは、合成ペプチド、又は組換え発現系（例えば、細菌及び／又は酵母の発現系）で産生されたペプチドであり得る。したがって、適切なペプチドは「最小の」ペプチド（即ち、ＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩによる結合及び提示に必要な残基の数を超えない長さを有する）であってもよく、Ｎ末端及び／又はＣ末端に追加の配列部分を有していてもよい。例えば、プロテアソーム若しくはＴＡＰ系におけるプロセシング若しくは経路決定を促進若しくは誘発するため、又はＭＨＣ−Ｉ若しくはＭＨＣ−ＩＩに対する親和性を増大させるために、追加のアミノ酸が存在してもよい。或いは又は更には、追加の配列部分は、好ましくは免疫原性が低いか全くなく、堅固な二次構造を有するスペーサー要素であってもよい。例えば、企図されるスペーサー部分は、少なくとも２種の共有結合したネオエピトープ間で有用であり得る。一方、追加の配列部分も機能的役割を有することができ、特に企図される機能的役割としては、検出能（例えば、ＧＦＰ部分を介する）、精製能（例えば、アビジン部分を介する）、又はシグナル伝達機能が挙げられる。
【００６０】
樹状細胞又は他の抗原提示細胞を遺伝子改変して抗原ペプチドを発現させるか、又はこのような細胞を抗原ペプチドに曝露させる場合、遺伝子改変又は抗原ペプチドへの曝露は、樹状細胞又は他の抗原提示細胞を免疫細胞と接触させる前に行うことができることに留意すべきである。或いは、樹状細胞又は他の抗原提示細胞が免疫細胞と接触している間に遺伝子改変又は曝露を行うこともできる。
【００６１】
更に企図される態様では、曝露又はトランスフェクトされた抗原提示細胞（例えば、患者由来）を、患者の免疫細胞と共に、抗原提示細胞による免疫細胞の指示又は活性化を可能にするために十分な時間、典型的には少なくとも２時間、より典型的には少なくとも４時間、最も典型的には少なくとも８時間、インビトロでインキュベートする。本明細書で使用される「共培養する」及び「インキュベートする」という用語は同義的に使用され、細胞が、細胞分裂も含み得る生存可能な状態に維持されるプロセスを意味する。最も典型的には、抗原提示細胞（例えば、腫瘍関連抗原をコードする核酸を予めトランスフェクトされた又は腫瘍関連抗原に予め曝露された）の免疫細胞に対する適切な比率は、典型的には１０４：１（抗原提示細胞：免疫細胞）〜１：１０４（抗原提示細胞：免疫細胞）、又は１０３：１〜１：１０３、又は１０２：１〜１：１０２、又は１０：１〜１：１０である。しかし、次に好ましい態様では、曝露又はトランスフェクトされた抗原提示細胞（例えば、患者由来）を患者の免疫細胞と共にインビボでインキュベートすることもできる。
【００６２】
更に企図される態様では、単離した樹状細胞（他の単離した抗原提示細胞）を使用する代わりに、患者の大量の白血球（ＷＢＣ）をネオエピトープと共に培養するか、又は発現のためにネオエピトープをコードする核酸をトランスフェクトすることができる。このようなアプローチは、大量のＷＢＣ中で抗原提示細胞による所望のＭＨＣ／ネオエピトープ複合体の産生を引き起こすことが予想される。このようにして、患者のマクロファージ、樹状細胞及びＢ細胞は、ＮＫ細胞及びＴ細胞に、それらが疾患組織を標的とするのに望ましい特性を有するように指示を与える。
【００６３】
更に、トランスフェクトされた抗原提示細胞と免疫細胞との混合は、１種以上の免疫刺激性サイトカインの存在下で実施できることが理解されるべきである。例えば、適切なサイトカインとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、及び特に修飾ＩＬ−１５（例えば、Ａｌｔｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＩＬ−１５スーパーアゴニスト）が挙げられる。更に又は或いは、トランスフェクトされた抗原提示細胞と免疫細胞との混合は、パターン認識受容体の１種以上のリガンド、例えば、ＴＬＲリガンド（例えば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７／８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１３等）、ＮＬＲリガンド（例えば、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２等）、ＲＬＲリガンド（例えば、５’ｐｐｐ−ｄｓＲＮＡ、ポリ（ｄＡ：ｄＴ等）、ＣＬＲリガンド（例えば、ＨＫＣＡ、リケナン、βグルカンペプチド等）、及び／又はＳＴＩＮＧリガンド（例えば、２’２’−ｃＧＡＭＰ、２’３’−ｃＧＡＭＰ、ｃ−ジ−ＡＭＰ等の環状ジヌクレオチド）の存在下で行うことができる。
【００６４】
トランスフェクトされた抗原提示細胞と免疫細胞との混合物を処理して１種以上の成分を除去した後に患者に投与できることが更に企図される。例えば、混合物を処理して、１種以上の免疫刺激性サイトカイン、パターン認識リガンド、及び／又は樹状細胞又は他の抗原提示細胞を除去することができる。したがって、細胞含有輸注組成物は、典型的には、おそらく１種以上のネオエピトープをコードする配列を含む組換え核酸を含む発現ベクター又はウイルス送達媒体（例えば、アデノウイルス）と更に組み合わせた、患者由来のトランスフェクトされた抗原提示細胞及び／若しくは免疫細胞、並びに／又は１種以上のネオエピトープペプチドを含むことに留意すべきである。更に、輸注組成物は免疫刺激性サイトカイン及び／又はチェックポイント阻害剤を含むこともできる。更に、トランスフェクトされた抗原提示細胞と免疫細胞との混合物の処理は、疲弊Ｔ細胞を除去する段階又は疲弊Ｔ細胞を活性化する段階を含むこともできる。例えば、混合物を、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４若しくはＣＤ２４４に対する抗体の有効量、又はＩＬ２１と接触させることができる。
【００６５】
必要に応じて、輸注組成物は異種ＮＫ細胞、特に、より弱い阻害を示すように遺伝子改変されたＮＫ細胞を含むこともできる。当然のことながら、企図されるＮＫ細胞を、輸注組成物の投与前又は投与後に患者に投与することもできる。
【００６６】
例えば、遺伝子改変ＮＫ細胞は、少なくとも１種のキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の発現が低下又は消失するように改変されたＮＫ−９２誘導体であり得て、これによってこのような細胞が構成的に活性化される。当然のことながら、１種以上のＫＩＲ、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３及びＫＩＲ３ＤＳ１を欠失させることができ、又はその発現を抑制することができる（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等を介して）ことに留意すべきである。このような改変細胞は当技術分野で周知のプロトコルを用いて調製することができる。或いは、このような細胞はＮａｎｔＫｗｅｓｔからａＮＫ細胞（活性化ナチュラルキラー細胞）として商業的に入手することもできる。
【００６７】
本発明の主題の他の好ましい態様では、遺伝子改変ＮＫ細胞は高親和性Ｆｃγ受容体（ＣＤ１６）を発現するように改変されたＮＫ−９２誘導体でもあり得る。Ｆｃγ受容体の高親和性変異体の配列は当技術分野で周知であり、生成及び発現の方法は全て本明細書での使用に適していると考えられる。上述の受容体の発現は、本明細書で企図される治療に反応して患者が産生する抗体、又は患者の腫瘍細胞（例えば、ネオエピトープ）、特定の腫瘍型（例えば、ｈｅｒ２ｎｅｕ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ等）に特異的な抗体、若しくは癌に関連する（例えば、ＣＥＡ−ＣＡＭ）抗体を用いて、腫瘍細胞の特異的な標的化を可能にすると考えられる。好都合なことに、このような細胞はＮａｎｔＫｗｅｓｔからｈａＮＫ細胞（高親和性ナチュラルキラー細胞）として購入することができる。
【００６８】
或いは、遺伝子改変ＮＫ細胞はキメラＴ細胞受容体を発現させるように遺伝子改変することもできる。特に好ましい態様では、キメラＴ細胞受容体は、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原及び／又は癌ネオエピトープに対して結合特異性を有するｓｃＦｖ部分又は他のエクトドメインを有する。上述のように、このような細胞はＮａｎｔＫｗｅｓｔからｔａＮＫ細胞（標的活性化ナチュラルキラー細胞）として購入することができ、必要に応じて更に改変することができる。このような細胞が癌関連抗原又はネオエピトープに対して親和性を有するように改変されたキメラＴ細胞受容体を有する場合には、既知の癌関連抗原及びネオエピトープの全てが使用に適すると考えられることが企図される。例えば、腫瘍関連抗原としては、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＣＹＰＢ１、ＰＳＡ、Ｈｅｒ−２、ＰＳＡ、ブラキウリ等が挙げられる。
【００６９】
更に、上述のように、特に組換えウイルス又はＲＮＡがチェックポイント受容体を標的とするポリペプチドをコードする核酸配列を含まない場合には、細胞含有輸注組成物の予防的又は治療的投与は、１種以上の免疫チェックポイント阻害剤の同時投与を伴うことができることが企図される。例えば、特に好ましいチェックポイント阻害剤としては、現在利用可能な阻害剤（例えば、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブ）が挙げられる。
【００７０】
当然のことながら、企図される組成物及び方法は単一の治療事象で用いることができるだけでなく、組成物を経時的に患者に繰り返し投与できることが認識されるべきである。このような反復投与は、予測され得る新たに生じたネオエピトープについて患者を調査する場合には特に有利である。このような新たに同定されたネオエピトープを次に、患者の疾患により適合するように、又は腫瘍が免疫系による攻撃を回避する試みに適応させるように、企図される治療組成物の改変に集中させることができる。
【００７１】
本明細書の説明、及び以下の特許請求の範囲全体を通して使用される「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」の意味は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数の指示対象を包含する。また、本明細書の説明で使用される「ｉｎ」の意味は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、「ｉｎ」および「ｏｎ」を包含する。更に本明細書では、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、用語「ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ」は、直接結合（互いに結合される２個の要素が互いに接触する）と間接結合（少なくとも１個の追加的要素がその２個の要素の間に位置している）の両方を包含することを意図する。したがって、用語「ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ」と「ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ」は同意語として使用される。最後に、文脈が反対であることを示さない限り、本明細書中に記載の範囲は全て、その範囲の端点を含んでいると解釈されるべきであり、またオープンエンドの範囲は商業上実用的な値を含むように解釈されるべきである。同様に、値の一覧は全て、文脈が反対であることを示さない限り、中間の値を含んでいると見なされるべきである。
【００７２】
既に記載されたもの以外の多くの更なる変更が本明細書中の発明概念から逸脱することなく可能であることは、当業者には明白なはずである。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることを除いて制限されるべきではない。更に、明細書及び特許請求の範囲の両方を解釈する上で、全ての用語は文脈と矛盾せず可能な限りその最も広い意味で解釈されるべきである。特に用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、要素、成分又は段階に対して非排他的に言及していると解釈されるべきであり、このことは、参照された要素、成分又は段階が、明確には参照されていない他の要素、成分又は段階と共に存在しても、利用されても、又は組み合わされてもよいことを示している。本明細書の特許請求の範囲で、Ａ、Ｂ、Ｃ・・・・及びＮから成る群から選択されるものの少なくとも１個に言及される場合、その文章は、Ａに加えてＮ、又はＢに加えてＮ等ではなく、その群から１個の要素のみが必要とされていると解釈されるべきである。
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月20日(2019.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有する患者由来の免疫細胞をエクスビボで活性化する方法であって、
患者から複数の免疫細胞を得る段階と、
複数の抗原提示細胞に、少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープ、又は少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープをコードする核酸を含む発現ベクターをエクスビボでトランスフェクトする段階と、
複数の免疫細胞を、複数のトランスフェクトされた抗原提示細胞と、免疫細胞を活性化するのに十分な時間に亘って共培養する段階を含む方法。
【請求項２】
複数の免疫細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球及びＢ細胞のうちの少なくとも１種に関して富む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗原提示細胞が、少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープをトランスフェクトされる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープが、ＨＬＡ適合の患者特異的腫瘍ネオエピトープである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープが、腫瘍関連エピトープをＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩ提示へと標的化する標的配列を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも免疫刺激分子、少なくとも１種の免疫刺激分子をコードする核酸、チェックポイント阻害剤、若しくは少なくとも１種のチェックポイント阻害剤をコードする核酸を含む抗原提示細胞が、更にトランスフェクトされるか、又は曝露される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
共培養する段階をサイトカインの存在下で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５スーパーアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
複数の免疫細胞及び複数のトランスフェクトされた抗原提示細胞と組み合わせて輸注用の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、
抗原提示細胞が、少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープ、又は少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープをコードする核酸を含む発現ベクターをトランスフェクトされた細胞であり、
免疫細胞が腫瘍を有する患者から得られる
医薬組成物。
【請求項１１】
複数の免疫細胞が、患者の全血の白血球画分である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
複数の免疫細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球及びＢ細胞のうちの少なくとも１種が豊富である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
抗原提示細胞が、少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープをトランスフェクトされている、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープが、ＨＬＡ適合の腫瘍関連エピトープである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
少なくとも１種の患者特異的腫瘍ネオエピトープが、腫瘍関連エピトープをＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩ提示へと標的化する標的配列を更に含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
少なくとも免疫刺激分子、少なくとも１種の免疫刺激分子をコードする核酸、チェックポイント阻害剤、若しくは少なくとも１種のチェックポイント阻害剤をコードする核酸を含む抗原提示細胞が、更にトランスフェクトされるか、又は曝露される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
発現ベクターがウイルスベクターである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１９】
サイトカインを更に含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項２０】
免疫チェックポイント阻害剤を更に含む、請求項１０に記載の組成物。
【国際調査報告】
2019524773.tif 000002
2019524773.tif 000003
2019524773.tif 000004