(57)【要約】ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）または破傷風神経毒素などの神経毒素を検出及び特徴付けるための手段が本明細書に開示される。本開示は、インビトロ及びインビボで神経毒素の効力及び活性を決定するための方法を提供する。レポータータンパク質のＮ末端断片とＣ末端断片とが神経毒素切断部位を含むリンカーによって分断されたものを含むポリペプチドも開示される。神経毒素によってリンカーが切断されると、レポータータンパク質活性が減少し、それによって神経毒素の活性が示される。開示のポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及びそのようなポリペプチドを発現する細胞、を含む組成物及びキットも開示される。【選択図】図１
2019532651.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．レポータータンパク質のＮ末端断片と、
ｂ．神経毒素切断部位を含むリンカーと、
ｃ．前記レポータータンパク質のＣ末端断片と、
をＮ末端からＣ末端の順序で含む単鎖ポリペプチドであって、
前記Ｎ末端断片及び前記Ｃ末端断片が、機能性レポータータンパク質配列をまとめて含み、前記リンカーによって前記Ｎ末端断片と前記Ｃ末端断片とが機能的に連結されることで機能性レポーター融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
【請求項２】
前記レポータータンパク質が、ルシフェラーゼタンパク質である、請求項１に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項３】
ａ．配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＮ末端ドメイン（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、
ｂ．前記Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置し、神経毒素切断部位を含むリンカーと、
ｃ．前記リンカーのＣ末端に位置し、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有するＣ末端ドメイン（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９と前記Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
【請求項４】
ａ．配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９に対する置換、欠失、または付加が１０アミノ酸残基未満である配列を含むＮ末端ドメイン（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、
ｂ．前記Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置し、神経毒素切断部位を含むリンカーと、
ｃ．前記リンカーのＣ末端に位置し、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０に対する置換、欠失、または付加が３アミノ酸残基未満である配列を有するＣ末端ドメイン（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９と前記Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
【請求項５】
前記Ｎ末端ドメインが、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９の配列（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）を有し、前記Ｃ末端ドメインが、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０の配列（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）を有する、請求項３〜４のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項６】
前記神経毒素切断部位が、Ｃ．ボツリヌム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素（ＢｏＮＴ）切断部位及び／または破傷風神経毒素切断部位である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項７】
前記リンカーが、前記ＢｏＮＴ切断部位と前記Ｎ末端断片もしくはＮ末端ドメインとの間、前記神経毒素切断部位と前記Ｃ末端断片もしくはＣ末端ドメインとの間、またはそれらの両方に位置する１つまたは複数のスペーサーをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項８】
前記リンカーが、前記ＢｏＮＴ及び／または破傷風神経毒素に対する受容体の結合断片をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項９】
前記結合断片が、前記Ｎ末端断片またはＮ末端ドメインと前記ＢｏＮＴ切断部位との間に位置する、請求項８に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１０】
前記リンカーが、前記結合断片と前記ＢｏＮＴ切断部位との間に位置するスペーサーをさらに含む、請求項８〜９のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１１】
少なくとも１つのスペーサーが、グリシン及びセリンから構成される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１２】
少なくとも１つのスペーサーが、５〜１５アミノ酸である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１３】
少なくとも１つのスペーサーが、配列番号４〜９から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１４】
前記ＢｏＮＴが、Ａ、Ｅ、Ｃ、Ｂ、Ｄ、Ｆ、またはＧである、請求項６〜１３のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１５】
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ＳＮＡＲＥタンパク質に由来する、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１６】
前記ＳＮＡＲＥタンパク質が、ＳＮＡＰ−２５、シナプトブレビン（ＶＡＭＰ）、またはシンタキシンである、請求項１５に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１７】
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ヒトＳＮＡＰ−２５ｂのアミノ酸１４１〜２０６である、請求項６〜１６のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１８】
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸３５〜９６である、請求項６〜１６のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項１９】
前記受容体が、ヒトＳＶ２Ｃである、請求項８〜１７のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２０】
前記結合断片が、ヒトＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６であるか、またはヒトＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６との同一性が少なくとも９０％である配列であるか、またはヒトＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６に対する置換、欠失、もしくは付加が１０アミノ酸残基以下である配列である、請求項１９に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２１】
ポリヒスチジン親和性タグをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２２】
前記ポリヒスチジン親和性タグが、前記ポリペプチドのＣ末端に位置する、請求項２１に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２３】
前記リンカーが、前記Ｎ末端断片またはＮ末端ドメインと前記ＢｏＮＴ切断部位との間に位置するインタクトな第２のルシフェラーゼポリペプチドをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２４】
前記第２のルシフェラーゼポリペプチドが、ホタルルシフェラーゼ（例えば、フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ））、細菌ルシフェラーゼ（例えば、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ））、ウミシイタケルシフェラーゼ（ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、またはカイアシルシフェラーゼである、請求項２３に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２５】
前記リンカーが、前記第２のルシフェラーゼポリペプチドと前記ＢｏＮＴ切断部位との間に位置するスペーサーをさらに含む、請求項２３または請求項２４に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２６】
前記スペーサーが、５〜１５アミノ酸である、請求項２５に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２７】
前記スペーサーが、
2019532651.tif 000024
である、請求項２５または請求項２６に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項２８】
ａ．配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、
ｂ．ｉ．５〜１５アミノ酸の第１のスペーサー、
ｉｉ．前記第１のスペーサーのＣ末端に位置し、ＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６から構成される結合断片、
ｉｉｉ．前記結合断片のＣ末端に位置する第２のスペーサー、
ｉｖ．前記第２のスペーサーのＣ末端に位置し、ヒトＳＮＡＰ２５ｂのアミノ酸１４１〜２０６を含むＢｏＮＴ切断部位、
ｖ．前記ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第３のスペーサー
を含む、前記Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置するリンカーと、
ｃ．前記リンカーのＣ末端に位置する、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９と前記Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
【請求項２９】
ａ．配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、
ｂ．ｉ．５〜１５アミノ酸の第１のスペーサー、
ｉｉ．前記第１のスペーサーのＣ末端に位置し、ヒトＳＮＡＰ２５ｂのアミノ酸１４１〜２０６を含むＢｏＮＴ切断部位、
ｉｉｉ．前記ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサー、
を含む、前記Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置するリンカーと、
ｃ．前記リンカーのＣ末端に位置する、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９と前記Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
【請求項３０】
ａ．配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、
ｂ．ｉ．５〜１５アミノ酸の第１のスペーサー、
ｉｉ．前記第１のスペーサーのＣ末端に位置し、ヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸３５〜９６を含むＢｏＮＴ切断部位、
ｉｉｉ．前記ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサー、
を含む、前記Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置するリンカーと、
ｃ．前記リンカーのＣ末端に位置する、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９と前記Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
【請求項３１】
ａ．配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、
ｂ．ｉ．第２の機能性ルシフェラーゼポリペプチド、
ｉｉ．前記第２のルシフェラーゼポリペプチドのＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第１のスペーサー、
ｉｉｉ．前記第１のスペーサーのＣ末端に位置し、ヒトＳＮＡＰ２５ｂのアミノ酸１〜２０６を含むＢｏＮＴ切断部位、
ｉｖ．前記ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサー、
を含む、前記Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置するリンカーと、
ｃ．前記リンカーのＣ末端に位置する、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、
を含む単鎖ポリペプチドであって、
前記リンカーによって前記Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９と前記Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する、前記単鎖ポリペプチド。
【請求項３２】
１つまたは複数のスペーサーが、
2019532651.tif 000025
である、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項３３】
前記Ｃ末端に位置するＨｉｓ６配列（配列番号１２）をさらに含む、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチド。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項３５】
請求項３４に記載の核酸を含む、核酸ベクター。
【請求項３６】
発現ベクターであり、発現可能な形態の前記核酸配列を含む、請求項３５に記載の核酸ベクター。
【請求項３７】
ウイルス発現ベクター、原核生物発現ベクター、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクター、または哺乳類発現ベクターからなる群から選択される、請求項３６に記載の核酸ベクター。
【請求項３８】
請求項３４に記載の核酸または請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の核酸ベクターを含む、細胞。
【請求項３９】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチドを発現する、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４０】
原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または動物細胞である、請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
ボツリヌス神経毒素の効力を決定するための方法であって、
（ａ）ＢｏＮＴ活性に適した条件下で請求項１〜３３のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチドに前記神経毒素を接触させること、及び
（ｂ）参照基準と比較して前記ポリペプチドのルシフェラーゼ活性を決定し、それによって前記効力を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項４２】
試料におけるＣ．ボツリヌム神経毒素（ＢｏＮＴ）活性を検出するための方法であって、
（ａ）ＢｏＮＴ活性に適した条件下で請求項１〜３３のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチドに前記試料を接触させること、及び
（ｂ）前記試料の非存在下での前記ポリペプチドのルシフェラーゼ活性と比較して前記ポリペプチドのルシフェラーゼ活性を決定すること、
を含み、ルシフェラーゼ活性の減少によって前記試料におけるＢｏＮＴ活性が示される、前記方法。
【請求項４３】
インビトロで実施される、請求項４１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記接触が、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０μＭのＺｎＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む緩衝液（ｐＨ７．１）において実施される、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記試料と接触する前記単鎖ポリペプチドの濃度が、約３０ｎＭ〜３００ｎＭである、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料と接触する単鎖ポリペプチドの濃度が、約３０ｎＭである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ルシフェラーゼ活性が、ルシフェラーゼ基質を前記単鎖ポリペプチドに添加し、生成する発光シグナルを定量的に測定することによって決定される、請求項４１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記条件が、約３７℃で約１時間〜約３６時間の期間インキュベートすることを含む、請求項４１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記条件が、約３７℃で約１時間〜約２４時間の期間インキュベートすることを含む、請求項４１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記条件が、約３７℃で約４時間〜約２４時間の期間インキュベートすることを含む、請求項４１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記リンカーが、
５〜１５アミノ酸の第１のスペーサーと、
前記第１のスペーサーのＣ末端かつ前記ＢｏＮＴ切断部位のＮ末端に位置する、ヒトＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６の結合断片と、
前記ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサーと、
を含み、
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ヒトＳＮＡＰ２５のアミノ酸１４１〜２０６を含む、請求項４１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記リンカーが、
前記ＢｏＮＴ切断部位のＮ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第１のスペーサーと、
前記ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサーと、
を含み、
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ヒトＳＮＡＰ２５のアミノ酸１４１〜２０６を含む、請求項４１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記リンカーが、
前記ＢｏＮＴ切断部位のＮ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第１のスペーサーと、
前記ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサーと、
を含み、
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸３５〜９６を含む、請求項４１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記単鎖ポリペプチドが、神経細胞によって発現され、前記方法が、前記接触段階の後に、
前記神経細胞を約１２時間〜約６０時間の期間インキュベートすること、及び
前記神経細胞から溶解液を回収すること、
をさらに含む、請求項４１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
試料におけるＣ．ボツリヌム神経毒素（ＢｏＮＴ）活性を検出するための方法であって、
（ａ）配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）とが、前記Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端かつ前記Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０のＮ末端に位置する、ＢｏＮＴ切断部位を含むリンカーによって分断かつ機能的に連結されたものを含む単鎖ポリペプチドを発現する神経細胞に前記試料を接触させること、
（ｂ）前記神経細胞を約１２時間〜約６０時間の期間インキュベートすること、
（ｃ）前記神経細胞から溶解液を回収すること、
（ｄ）前記試料の非存在下で同一の処理を実施した神経細胞におけるルシフェラーゼ活性と比較して前記溶解液におけるルシフェラーゼ活性を測定すること、
を含み、
前記ルシフェラーゼ活性の減少によって前記試料におけるＢｏＮＴ活性が示される、前記方法。
【請求項５６】
前記リンカーが、前記Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９と前記切断部位との間に位置するインタクトな第２のルシフェラーゼポリペプチドをさらに含む、請求項４１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
第２のルシフェラーゼポリペプチドが、ホタルルシフェラーゼ（フォティヌス・ピラリス）、細菌ルシフェラーゼ（ビブリオ・フィシェリ、ビブリオ・ハーベイ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（ウミシイタケ）、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、またはカイアシルシフェラーゼである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記試料における前記第２のルシフェラーゼポリペプチドの前記ルシフェラーゼ活性が決定され、前記回収された溶解液に存在する総単鎖ポリペプチドの指標として使用される、請求項５６〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記神経細胞が、ウイルス発現ベクターから前記単鎖ポリペプチドを発現する、請求項５４〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記単鎖ポリペプチドが、段階（ａ）の前の６日間発現する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ウイルス発現系が、レンチウイルス発現系である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記インキュベート段階が、約４８時間実施される、請求項５４〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記回収段階が、溶解緩衝液を添加することによって実施される、請求項５４〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ＳＮＡＰ−２５、シナプトブレビン（ＶＡＭＰ）、またはシンタキシンに由来するものである、請求項４１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ＢｏＮＴ  Ａ、ＢｏＮＴ  Ｅ、及びＢｏＮＴ  Ｃによって特異的に認識されるか、またはＢｏＮＴ  Ｂ、ＢｏＮＴ  Ｄ、ＢｏＮＴ  Ｆ、及びＢｏＮＴ  Ｇによって特異的に認識される、請求項４１〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
異なるＢｏＮＴ切断部位を有する単鎖ポリペプチドの組み合わせが使用される、請求項４１〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ヒトＳＮＡＰ−２５のアミノ酸１４１〜２０６、またはヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸３５〜９６、ヒトＳＮＡＰ３５のアミノ酸１〜２０６、またはＶＡＭＰ１のアミノ酸１〜９６である、請求項４１〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記リンカーが、ＢｏＮＴ受容体の結合断片をさらに含む、請求項４１〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記受容体が、ＳＶ２Ｃである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記結合断片が、ヒトＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６を含む、請求項６８〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記リンカーが、
第２のルシフェラーゼポリペプチドと、
前記第２のルシフェラーゼポリペプチドのＣ末端かつ前記ＢｏＮＴ切断部位のＮ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第１のスペーサーと、
前記ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサーと、
を含み、
前記ＢｏＮＴ切断部位が、ヒトＳＮＡＰ２５のアミノ酸１〜２０６を含み、前記第１のスペーサーのＣ末端に位置する、請求項４１〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
ルシフェラーゼ活性の測定が、前記ルシフェラーゼに特異的な基質を添加し、得られる発光シグナルを定量的に検出することによって実施される、請求項４１〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
配列番号１のルシフェラーゼの前記基質が、フリマジン（２−フラニルメチル−デオキシ−セレンテラジン）である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
以下を含む、キット：
（ａ）１つもしくは複数の、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の単鎖ポリペプチドであって、前記単鎖ポリペプチドのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記単鎖ポリペプチド、
（ｂ）１つもしくは複数の、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の核酸もしくは核酸ベクターであって、前記核酸もしくは核酸ベクターのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記核酸もしくは核酸ベクター、及び／または
（ｃ）１つもしくは複数の、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の細胞であって、前記細胞のそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容されている、前記細胞。
【請求項７５】
独立した容器に収容されたルシフェラーゼ基質をさらに含む、請求項７４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１０月２０日出願の米国仮出願第６２／４１０５５８号の利益を主張し、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本明細書は、配列表（「０３４２９４１＿０６３０＿ＳＬ．ＴＸＴ」という名称の．ｔｘｔファイルとして電子的に提出される）を参照するものである。この．ｔｘｔファイルは、２０１７年１０月１３に作成されたものであり、そのサイズは、３４，３０５バイトである。配列表の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本明細書に記載の技術は、神経毒素（例えば、ボツリヌス毒素）の活性を決定するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）は、バイオテロの懸念でも治療への応用でも関心を集める物質である。伝統的に、ＢｏＮＴの検出及び特徴付けは、試料をマウスに投与し、かなりの用量でマウスを死に至らしめることによって実施されている。細胞またはインビトロで実施することができるアッセイが探求されているものの、こうしたアッセイは、感度または特異性が伴わないという問題を抱えており、臨床試料に共通する成分との反応が生じる結果として陽性シグナルを生じさせてしまうことが多い。
【発明の概要】
【０００５】
概要
インビトロとインビボとの両方においてＢｏＮＴの活性を検出及び測定するために開発された新たなアッセイが本明細書に記載される。このアッセイでは、例えばＢｏＮＴ活性のセンサーとして働くように操作されたＢｏＮＴ基質を介して分断型ルシフェラーゼが連結されることによって特徴付けられる特有の単鎖ポリペプチドが使用される。ＢｏＮＴが存在すると、当該毒素によってリンカー領域が切断される結果、ルシフェラーゼ活性が減少し、この活性減少は、容易に検出される。
【０００６】
実施形態のいずれかの１つの態様では、ａ）レポータータンパク質のＮ末端断片と、ｂ）神経毒素切断部位を含むリンカーと、ｃ）レポータータンパク質のＣ末端断片と、をＮ末端からＣ末端の順序で含む単鎖ポリペプチドが本明細書に記載され、Ｎ末端断片及びＣ末端断片は、機能性レポータータンパク質配列をまとめて含み、リンカーによってＮ末端断片とＣ末端断片とが機能的に連結されることで機能性レポーター融合タンパク質が生成する。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、レポータータンパク質は、ルシフェラーゼタンパク質である。
【０００７】
実施形態のいずれかの１つの態様では、ａ）配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＮ末端ドメイン（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、ｂ）Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置し、神経毒素切断部位を含むリンカーと、ｃ）リンカーのＣ末端に位置し、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有するＣ末端ドメイン（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、を含む単鎖ポリペプチドが本明細書に記載され、リンカーによってＮ−ｎａｎｏ１〜１５９とＣ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する。
【０００８】
実施形態のいずれかの１つの態様では、ａ）配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９に対する置換、欠失、または付加が１０アミノ酸残基未満である配列を含むＮ末端ドメイン（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、ｂ）Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置し、神経毒素切断部位を含むリンカーと、ｃ）リンカーのＣ末端に位置し、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０に対する置換、欠失、または付加が３アミノ酸残基未満である配列を有するＣ末端ドメイン（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、を含む単鎖ポリペプチドが本明細書に記載され、リンカーによってＮ−ｎａｎｏ１〜１５９とＣ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する。
【０００９】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、Ｎ末端ドメインは、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９の配列（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）を有し、Ｃ末端ドメインは、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０の配列（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）を有する。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、神経毒素切断部位は、Ｃ．ボツリヌム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素（ＢｏＮＴ）切断部位及び／または破傷風神経毒素切断部位である。
【００１０】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、ＢｏＮＴ切断部位とＮ末端断片もしくはＮ末端ドメインとの間、神経毒素切断部位とＣ末端断片もしくはＣ末端ドメインとの間、またはそれらの両方に位置する１つまたは複数のスペーサーをさらに含む。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、ＢｏＮＴ及び／または破傷風神経毒素に対する受容体の結合断片をさらに含む。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、結合断片は、Ｎ末端断片またはＮ末端ドメインとＢｏＮＴ切断部位との間に位置する。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、結合断片とＢｏＮＴ切断部位との間に位置するスペーサーをさらに含む。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも１つのスペーサーは、グリシン及びセリンから構成される。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも１つのスペーサーは、５〜１５アミノ酸である。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、少なくとも１つのスペーサーは、配列番号４〜９から選択される。
【００１１】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴは、Ａ、Ｅ、Ｃ、Ｂ、Ｄ、Ｆ、またはＧである。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ切断部位は、ＳＮＡＲＥタンパク質に由来するものである。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＳＮＡＲＥタンパク質は、ＳＮＡＰ−２５、シナプトブレビン（ＶＡＭＰ）、またはシンタキシンである。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ切断部位は、ヒトＳＮＡＰ−２５ｂのアミノ酸１４１〜２０６である。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ切断部位は、ヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸３５〜９６である。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、受容体は、ヒトＳＶ２Ｃである。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、結合断片は、ヒトＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６であるか、またはヒトＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６との同一性が少なくとも９０％である配列であるか、またはヒトＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６に対する置換、欠失、もしくは付加が１０アミノ酸残基以下である配列である。
【００１２】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ポリヒスチジン親和性タグをさらに含む。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリヒスチジン親和性タグは、ポリペプチドのＣ末端に位置する。
【００１３】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、Ｎ末端断片またはＮ末端ドメインとＢｏＮＴ切断部位との間に位置するインタクトな第２のルシフェラーゼポリペプチドをさらに含む。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、第２のルシフェラーゼポリペプチドは、ホタルルシフェラーゼ（例えば、フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ））、細菌ルシフェラーゼ（例えば、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ））、ウミシイタケルシフェラーゼ（ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼ、またはカイアシ（ｃｏｐｅｐｏｄ）ルシフェラーゼである。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、第２のルシフェラーゼポリペプチドとＢｏＮＴ切断部位との間に位置するスペーサーをさらに含む。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサーは、５〜１５アミノ酸である。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサーは、
2019532651.tif 000003
である。
【００１４】
実施形態のいずれかの１つの態様では、ａ）配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、ｂ）ｉ）５〜１５アミノ酸の第１のスペーサー、ｉｉ）第１のスペーサーのＣ末端に位置し、ＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６から構成される結合断片、ｉｉｉ）結合断片のＣ末端に位置する第２のスペーサー、ｉｖ）第２のスペーサーのＣ末端に位置し、ヒトＳＮＡＰ２５ｂのアミノ酸１４１〜２０６を含むＢｏＮＴ切断部位、ｖ）ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第３のスペーサー、を含む、Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置するリンカーと、ｃ）リンカーのＣ末端に位置する、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、を含む単鎖ポリペプチドが本明細書に記載され、リンカーによってＮ−ｎａｎｏ１〜１５９とＣ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する。
【００１５】
実施形態のいずれかの１つの態様では、ａ）配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、ｂ）ｉ）５〜１５アミノ酸の第１のスペーサー、ｉｉ）第１のスペーサーのＣ末端に位置し、ヒトＳＮＡＰ２５ｂのアミノ酸１４１〜２０６を含むＢｏＮＴ切断部位、ｉｉｉ）ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサー、を含む、Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置するリンカーと、ｃ）リンカーのＣ末端に位置する、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、を含む単鎖ポリペプチドが本明細書に記載され、リンカーによってＮ−ｎａｎｏ１〜１５９とＣ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する。
【００１６】
実施形態のいずれかの１つの態様では、ａ）配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、ｂ）ｉ）５〜１５アミノ酸の第１のスペーサー、ｉｉ）第１のスペーサーのＣ末端に位置し、ヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸３５〜９６を含むＢｏＮＴ切断部位、ｉｉｉ）ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサー、を含む、Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置するリンカーと、ｃ）リンカーのＣ末端に位置する、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、を含む単鎖ポリペプチドが本明細書に記載され、リンカーによってＮ−ｎａｎｏ１〜１５９とＣ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する。
【００１７】
実施形態のいずれかの１つの態様では、ａ）配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、ｂ）ｉ）第２の機能性ルシフェラーゼポリペプチド、ｉｉ）第２のルシフェラーゼポリペプチドのＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第１のスペーサー、ｉｉｉ）第１のスペーサーのＣ末端に位置し、ヒトＳＮＡＰ２５ｂのアミノ酸１〜２０６を含むＢｏＮＴ切断部位、ｉｖ）ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサー、を含む、Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置するリンカーと、ｃ）リンカーのＣ末端に位置する、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、を含む単鎖ポリペプチドが本明細書に記載され、リンカーによってＮ−ｎａｎｏ１〜１５９とＣ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する。
【００１８】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、１つまたは複数のスペーサーは、
2019532651.tif 000004
である。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｃ末端に位置するＨｉｓ６配列（配列番号１２）をさらに含む。
【００１９】
実施形態のいずれかの１つの態様では、本明細書に記載の単鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が本明細書に記載される。実施形態のいずれかの１つの態様では、本明細書に記載の単鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む核酸ベクターが本明細書に記載される。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターであり、発現可能な形態の核酸配列を含む。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルス発現ベクター、原核生物発現ベクター、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクター、または哺乳類発現ベクターからなる群から選択される。
【００２０】
実施形態のいずれかの１つの態様では、上述のパラグラフの核酸またはベクターを含む細胞が本明細書に記載される。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載の単鎖ポリペプチドを発現する。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または動物細胞である。
【００２１】
実施形態のいずれかの１つの態様では、ボツリヌス神経毒素の効力の決定方法が本明細書に記載され、この方法は、ＢｏＮＴ活性に適した条件下で本明細書に記載の単鎖ポリペプチドに神経毒素を接触させること、及び参照基準と比較してポリペプチドのルシフェラーゼ活性を決定し、それによって効力を決定すること、を含む。
【００２２】
実施形態のいずれかの１つの態様では、試料におけるＣ．ボツリヌム神経毒素（ＢｏＮＴ）活性の検出方法が本明細書に記載され、この方法は、ＢｏＮＴ活性に適した条件下で本明細書に記載の単鎖ポリペプチドに試料を接触させること、及び試料の非存在下でのポリペプチドのルシフェラーゼ活性と比較してポリペプチドのルシフェラーゼ活性を決定すること、を含み、ルシフェラーゼ活性の減少によって試料におけるＢｏＮＴ活性が示される。
【００２３】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、インビトロで実施される。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、接触は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０μＭのＺｎＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む緩衝液（ｐＨ７．１）において実施される。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、試料と接触する単鎖ポリペプチドの濃度は、約３０ｎＭ〜３００ｎＭである。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、試料と接触する単鎖ポリペプチドの濃度は、約３０ｎＭである。
【００２４】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼ基質を単鎖ポリペプチドに添加し、生成する発光シグナルを定量的に測定することによって決定される。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、条件は、約３７℃で約１時間〜約３６時間インキュベートすることを含む。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、条件は、約３７℃で約１時間〜約２４時間インキュベートすることを含む。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、条件は、約３７℃で約４時間〜約２４時間インキュベートすることを含む。
【００２５】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、５〜１５アミノ酸の第１のスペーサーと、第１のスペーサーのＣ末端かつＢｏＮＴ切断部位のＮ末端に位置する、ヒトＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６の結合断片と、ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサーと、を含み、ＢｏＮＴ切断部位は、ヒトＳＮＡＰ２５のアミノ酸１４１〜２０６を含む。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、ＢｏＮＴ切断部位のＮ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第１のスペーサーと、ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサーと、を含み、ＢｏＮＴ切断部位は、ヒトＳＮＡＰ２５のアミノ酸１４１〜２０６を含む。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、ＢｏＮＴ切断部位のＮ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第１のスペーサーと、ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサーと、を含み、ＢｏＮＴ切断部位は、ヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸３５〜９６を含む。
【００２６】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖ポリペプチドは、神経細胞によって発現するものであり、方法は、接触段階の後に、神経細胞を約１２時間〜約６０時間インキュベートすること、及び神経細胞から溶解液を回収すること、をさらに含む。
【００２７】
実施形態のいずれかの１つの態様では、試料におけるＣ．ボツリヌム神経毒素（ＢｏＮＴ）活性の検出方法が本明細書に記載され、この方法は、ａ）配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）とが、Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端かつＣ−ｎａｎｏ１６０〜１７０のＮ末端に位置する、ＢｏＮＴ切断部位を含むリンカーによって分断かつ機能的に連結されたものを含む単鎖ポリペプチドを発現する神経細胞に試料を接触させること、ｂ）神経細胞を約１２時間〜約６０時間インキュベートすること、ｃ）神経細胞から溶解液を回収すること、ならびにｄ）試料の非存在下で同一の処理を実施した神経細胞におけるルシフェラーゼ活性と比較して溶解液におけるルシフェラーゼ活性を測定すること、を含み、ルシフェラーゼ活性の減少によって試料におけるＢｏＮＴ活性が示される。
【００２８】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９と切断部位との間に位置するインタクトな第２のルシフェラーゼポリペプチドをさらに含む。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、第２のルシフェラーゼポリペプチドは、ホタルルシフェラーゼ（フォティヌス・ピラリス）、細菌ルシフェラーゼ（ビブリオ・フィシェリ、ビブリオ・ハーベイ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（ウミシイタケ）、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、またはカイアシルシフェラーゼである。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、試料における第２のルシフェラーゼポリペプチドのルシフェラーゼ活性が決定され、回収された溶解液に存在する総単鎖ポリペプチドの指標として使用される。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、神経細胞は、ウイルス発現ベクターから単鎖ポリペプチドを発現する。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖ポリペプチドは、段階ａ）の前の６日間発現する。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルス発現系は、レンチウイルス発現系である。
【００２９】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、インキュベート段階は、約４８時間実施される。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、回収段階は、溶解緩衝液を添加することによって実施される。
【００３０】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ切断部位は、ＳＮＡＰ−２５、シナプトブレビン（ＶＡＭＰ）、またはシンタキシンに由来するものである。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ切断部位は、ＢｏＮＴ  Ａ、ＢｏＮＴ  Ｅ、及びＢｏＮＴ  Ｃによって特異的に認識されるか、またはＢｏＮＴ  Ｂ、ＢｏＮＴ  Ｄ、ＢｏＮＴ  Ｆ、及びＢｏＮＴ  Ｇによって特異的に認識される。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異なるＢｏＮＴ切断部位を有する単鎖ポリペプチドの組み合わせが使用される。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ切断部位は、ヒトＳＮＡＰ−２５のアミノ酸１４１〜２０６、またはヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸３５〜９６、ヒトＳＮＡＰ３５のアミノ酸１〜２０６、またはＶＡＭＰ１のアミノ酸１〜９６である。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、ＢｏＮＴ受容体の結合断片をさらに含む。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、受容体は、ＳＶ２Ｃである。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、結合断片は、ヒトＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６を含む。
【００３１】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、第２のルシフェラーゼポリペプチドと、第２のルシフェラーゼポリペプチドのＣ末端かつＢｏＮＴ切断部位のＮ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第１のスペーサーと、ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサーと、を含み、ＢｏＮＴ切断部位は、ヒトＳＮＡＰ２５のアミノ酸１〜２０６を含み、第１のスペーサーのＣ末端に位置する。
【００３２】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ルシフェラーゼ活性の測定は、ルシフェラーゼに特異的な基質を添加し、得られる発光シグナルを定量的に検出することによって達成される。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、配列番号１のルシフェラーゼの基質は、フリマジン（２−フラニルメチル−デオキシ−セレンテラジン）である。
【００３３】
１つの態様では、ａ）１つもしくは複数の本明細書に記載の単鎖ポリペプチドであって、単鎖ポリペプチドのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容される単鎖ポリペプチド、ｂ）１つもしくは複数の本明細書に記載の核酸もしくは核酸ベクターであって、核酸もしくは核酸ベクターのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容される核酸もしくは核酸ベクター、及び／またはｃ）１つもしくは複数の本明細書に記載細胞であって、細胞のそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容される細胞、を含むキットが本明細書に記載される。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、独立した容器に収容されたルシフェラーゼ基質をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】毒素センサーに基づく分断型ルシフェラーゼの模式図を示す。左パネル：ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼは、２つの相補断片であるＮ−ｎａｎｏとＣ−ｎａｎｏとに分離されている。これらの２つの断片は、毒素基質（ＳＮＡＰ−２５（ｐ２５としても知られる）またはＶＡＭＰ１／２／３（例えば、シナプトブレビン））に基づくリンカーで共に連結されている。右パネル：ＢｏＮＴによってリンカー領域が切断されることで、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼの２つの部分が分離され、発光シグナルが消失する。
【図２】図２Ａ〜図２Ｂは、ＢｏＮＴ／Ａのインビトロ検出アッセイを示す。ＢｏＮＴ／Ａ毒素を検出するために２つのセンサータンパク質を設計し、検討した。１つは、ＮＮａｎｏ−ＳＶ２Ｃ−Ｌ４−ｐ２５−ＣＮａｎｏであり、もう１つは、ＮＮａｎｏ−ｐ２５−ＣＮａｎｏである。これらのセンサータンパク質は、体積を３０ｕｌとして３０ｎＭで調製し、ＢｏＮＴ／Ａは、１ｎＭ〜１ｆＭとなるように１０倍希釈系列を調製した。センサータンパク質溶液にＢｏＮＴ／Ｂを添加したものを負の対照とした。ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼの発光率に基づいて曲線（図２Ａ）をプロットした。ＢｏＮＴ／Ａについては、ＮＮａｎｏ−ＳＶ２Ｃ−ｐ２５−ＣＮａｎｏを使用すると、４時間後のＥＣ５０は９．７３ｐＭであり、２４時間後のＥＣ５０は７．８６ｐＭであり、一方、ＮＮａｎｏ−ｐ２５−ＣＮａｎｏを使用すると、４時間後のＥＣ５０は４８．２６ｐＭであり、２４時間後のＥＣ５０は３５．８７ｐＭである（３７℃で実施）。ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインであるＳＶ２Ｃ−Ｌ４を含むセンサータンパク質では、ＥＣ５０が約５倍向上した（図２Ｂ）。
【図３】図３Ａ〜図３Ｂは、４時間後及び２４時間後のＢｏＮＴ／Ｂのインビトロ検出アッセイを示す。センサータンパク質であるＮＮａｎｏ−ＶＡＭＰ１−ＣＮａｎｏは、体積を３０ｕｌとして３０ｎＭで調製し、ＢｏＮＴ／Ｂは、１０ｎＭ〜１ｆＭとなるように１０倍希釈系列を調製した。センサータンパク質溶液にＢｏＮＴ／Ａを添加したものを負の対照とした。ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼの発光率に基づいて曲線（図３Ａ）をプロットした。ＢｏＮＴ／Ｂについては、４時間後のＥＣ５０は７５．７ｐＭであり、２４時間後のＥＣ５０は３．９ｐＭである（３７℃で実施）（図３Ｂ）。
【図４】ウイルス感染させた神経細胞を使用するＢｏＮＴ／Ａのインビボ検出アッセイを示す。それぞれの神経細胞溶解液試料について、ホタルルシフェラーゼのシグナルとＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのシグナルとの両方を測定し、比（ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）／ホタル）を計算した。その後、毒素への曝露がないものを参照対照として使用してそれぞれの試料の比の割合を得た。毒素タンパク質を４８時間負荷した後のＥＣ５０は２．９ｐＭであり、この値は、ＬＤ５０の３０倍に等しい。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
詳細な説明
酵素活性の測定及び／または検出に関する組成物及び方法が本明細書に記載される。具体的には、組成物及び方法は、神経毒素の検出及び／または測定に関し、こうした神経毒素は、例えば、Ｃ．ボツリヌム神経毒素（ＢｏＮＴ）である。
【００３６】
本明細書で使用される「Ｃ．ボツリヌム神経毒素」または「ＢｏＮＴ」は、Ｃ．ボツリヌム毒素が神経細胞に侵入し、神経伝達物質の放出を阻害し、低親和性または高親和性の受容体複合体へのＣ．ボツリヌム毒素の結合、毒素の内部移行、細胞質への毒素軽鎖の転位、及びＣ．ボツリヌム毒素基質の酵素的な改変を含む細胞機構全体を実行することができる任意のポリペプチドを指す。
【００３７】
クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）の株からは、７つの抗原的に異なる型のボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）が産生し、これらのＢｏＮＴは、ヒト（ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｅ、及びＢｏＮＴ／Ｆ）、動物（ＢｏＮＴ／Ｃ１及びＢｏＮＴ／Ｄ）におけるボツリヌス中毒の大流行の調査、または土壌（ＢｏＮＴ／Ｇ）からの単離によって同定されている。ＢｏＮＴセロタイプは、７つすべてが同様の構造及び薬理学的特性を有する一方で、それぞれが示す細菌学的特性は不均一でもある。Ｃ．ボツリヌム株の遺伝的多様性については、Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８９，Ｎｏ．３，ｐ．８１８−８３２（２００７））に詳細に記載されており、当該文献の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴは、Ａ株、Ｅ株、Ｃ株、Ｂ株、Ｄ株、Ｆ株、またはＧ株のものである。非天然起源のＣ．ボツリヌム神経毒素についても、さまざまなものが当該技術分野において知られており、例えば、国際特許公開ＷＯ９５／３２７３８、ＷＯ９６／３３２７３、ＷＯ９８／０７８６４、及びＷＯ９９／１７８０６に記載されており、当該文献はそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３８】
同一の機能性ドメイン機構及び全構造様式が、さまざまなＣ．ボツリヌム株に由来する毒素によって共有されている。Ｃ．ボツリヌム毒素は、それぞれが約１５０ｋＤａの単鎖ポリペプチドとして翻訳され、この単鎖ポリペプチドは、次に、天然起源のプロテアーゼ（例えば、内在性のＣ．ボツリヌム毒素プロテアーゼなど）、または環境中で産生する天然起源のプロテアーゼによって、ジスルフィドループ内がタンパク質分解性の切断によって切断される。この翻訳後プロセシングによって、約５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）と約１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）とが単一のジスルフィド結合及び非共有結合性相互作用によって共に保持されたものを含む二鎖分子が生成する。成熟二鎖分子はそれぞれ、１）神経伝達物質放出装置のコア構成要素を特異的に標的とする亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性を含むメタロプロテアーゼ領域を含む、ＬＣに位置するタンパク質分解ドメイン、２）細胞内小胞から標的細胞の細胞質にＬＣを放出することを促進する、ＨＣのアミノ末端側半分（ＨＮ）に含まれる転位ドメイン、ならびに３）標的細胞の表面に位置する受容体複合体への毒素の結合活性及び結合特異性を決定する、ＨＣのカルボキシル末端側半分に見られる結合ドメイン、という機能的に異なる３つのドメインを含む。
【００３９】
これら３つの機能性ドメインの結合活性、転位活性、及びプロテアーゼ活性はすべて、毒性に必要なものである。Ｃ．ボツリヌム毒素が神経細胞に侵入し、神経伝達物質の放出を阻害する細胞中毒機構全体は、セロタイプまたはサブタイプを問わず、類似している。理論によって拘束されることを望むものではないが、中毒機構は、１）受容体への結合、２）複合体の内部移行、３）軽鎖の転位、及び４）プロテアーゼによる標的の改変、という少なくとも４つの段階を必要とするものである。このプロセスは、標的細胞の細胞膜表面に位置する毒素特異的受容体にＣ．ボツリヌム毒素のＨＣドメインが結合すると開始される。受容体複合体の結合特異性は、部分的には、ガングリオシドとタンパク質受容体との特定の組み合わせによって達成されると考えられる。結合が生じると、毒素／受容体複合体は、エンドサイトーシスによって内部移行し、内部移行した小胞は、特定の細胞内経路へと振り分けられる。転位段階は、小胞コンパートメントの酸性化によって引き起こされる。転位が生じると、毒素の軽鎖エンドペプチダーゼが細胞内小胞からサイトゾルに放出され、サイトゾルでは、神経伝達物質放出装置のコア構成要素として知られる３つのタンパク質（小胞結合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）／シナプトブレビン、２５ｋＤａのシナプトソーム関連タンパク質（ＳＮＡＰ−２５）、及びシンタキシン）のうちの１つが軽鎖エンドペプチダーゼによって特異的に標的とされる。
【００４０】
これらのコア構成要素は、神経終末におけるシナプス小胞のドッキング及び融合に必要なものであり、可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（ＳＮＡＲＥ）ファミリーのメンバーを構成している。ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｅは、カルボキシル末端領域でＳＮＡＰ−２５を切断することで、それぞれ９つのアミノ酸のセグメントまたは２６のアミノ酸のセグメントを放出し、ＢｏＮＴ／Ｃ１もまた、カルボキシル末端付近でＳＮＡＰ−２５を切断する。ボツリヌスセロタイプであるＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ、及びＢｏＮＴ／Ｇ、ならびに破傷風毒素は、ＶＡＭＰの保存された中心部分に作用し、ＶＡＭＰのアミノ末端部分をサイトゾルに放出する。ＢｏＮＴ／Ｃ１は、サイトゾル側の細胞膜表面付近の単一部位でシンタキシンを切断する。シナプスＳＮＡＲＥが選択的にタンパク質分解を受けることが、インビボでＣ．ボツリヌム毒素によって神経伝達物質の放出が遮断されることの原因である。Ｃ．ボツリヌム毒素のＳＮＡＲＥタンパク質標的は、さまざまな非神経細胞型におけるエキソサイトーシスに共通して見られるものであり、こうした細胞では、神経細胞において見られるように、軽鎖ペプチダーゼ活性によってエキソサイトーシスが阻害される。例えば、Ｙａｎｎ  Ｈｕｍｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｏｗ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  Ｂｌｏｃｋ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  Ｒｅｌｅａｓｅ，８２（５）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．４２７−４４６（２０００）、Ｋａｔｈｒｙｎ  Ｔｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｔｉｌｉｔｙ，２７（１１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．５５２−５５８．（２００２）、Ｇｉｏｖａｎｎａ  Ｌａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎｅｙ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｎｓ，１１（９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３１−４３７，（２００３）を参照のこと。
【００４１】
レポータータンパク質の配列がリンカーセグメントによって分断または分割された単鎖ポリペプチドが本明細書に記載される。この分断型レポータータンパク質は、機能性である。
【００４２】
本明細書で使用される「単鎖」という用語は、ポリペプチドに関するとき、隣接残基のアルファ−アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに連結された一連のアミノ酸残基を有する単一のポリペプチド分子を指す。すなわち、単鎖ポリペプチドの記載要素はそれぞれ、ペプチド結合によってその他の要素（複数可）に連結される。このことは、例えば水素結合またはジスルフィド結合を介して互いに結合することでポリペプチド複合体を形成することができる複数の単鎖ポリペプチドを含む多鎖ポリペプチドとは対照的である。
【００４３】
本明細書に記載の単鎖ポリペプチドは、ルシフェラーゼ及び／またはその部分を含み得、例えば、レポータータンパク質は、ルシフェラーゼであり得る。本明細書で使用される「ルシフェラーゼ」は、例えばルシフェリンの酸化、発光、オキシルシフェリンの放出を触媒することによって生物発光反応を触媒する酵素を指す。ルシフェラーゼは、天然起源のものであるか、または操作されたものであり得る。本明細書で使用される「機能性」ルシフェラーゼは、適切な基質の存在下で反応を触媒する能力を有するルシフェラーゼである。ルシフェラーゼの変形形態及び実施形態は多くのものが利用可能であり、こうしたものには、例えば、ホタルルシフェラーゼ（フォティヌス・ピラリス）（例えば、配列番号１３を参照のこと）、細菌ルシフェラーゼ（ビブリオ・フィシェリ、ビブリオ・ハーベイ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（ウミシイタケ）、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼ、甲虫目ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ（例えば、Ｈｅｉｓｅ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ，“Ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｇａｕｓｓｉａ  ａｎｄ  ＮＡＮＯＬＵＣ”Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１３）を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）、カイアシルシフェラーゼ（例えば、Ｔａｋｅｎａｋａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ，“Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ｃｏｐｅｐｏｄ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ”Ｇｅｎｅ（２０１３）を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）、及びＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼが含まれる。
【００４４】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼであり得る。本明細書で使用される「ＮＡＮＯＬＵＣルシフェラーゼ」は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓルシフェラーゼに由来し、フリマジンまたはセレンテラジンを基質として利用することができ、配列番号１の配列を有する１９．１ｋＤａのルシフェラーゼを指す。ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼの変異体もまた、本明細書の方法及び組成物の態様及び実施形態のいずれにおいても使用することができ、こうした変異体は、例えば、米国特許第８，５５７，９７０号に記載されており、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４５】
実施形態のいずれかの１つの態様では、レポータータンパク質のＮ末端断片と、神経毒素切断部位を含むリンカーと、レポータータンパク質のＣ末端断片とを、Ｎ末端からＣ末端の順序で含む単鎖ポリペプチドが本明細書に記載される。本明細書で使用される「断片」は、分子の一部または一部分（例えば、ポリペプチドの一部または一部分）を指す。本明細書に記載の単鎖ポリペプチドでは、レポータータンパク質のＮ末端断片及びＣ末端断片は、機能性レポータータンパク質配列をまとめて含むが、機能性レポータータンパク質配列を個別には含まない。レポータータンパク質のＮ末端断片及びＣ末端断片が、例えばリンカー配列によって機能的に連結されて同一の単鎖ポリペプチドに存在するとき、当該Ｎ末端断片及びＣ末端断片によって、機能性レポーター融合タンパク質が生成する。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、レポータータンパク質は、ルシフェラーゼタンパク質である。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、断片は、天然起源の配列、本明細書に記載のレポータータンパク質配列、及び／または当該技術分野において知られるレポータータンパク質配列の変異体または誘導体であり得、例えば、こうした断片は、レポータータンパク質配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するか、またはレポータータンパク質配列に対する置換、欠失、もしくは付加が１０アミノ酸残基以下であり得る。
【００４６】
実施形態のいずれかの１つの態様では、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＮ末端ドメイン（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置し、神経毒素切断部位を含むリンカーと、リンカーのＣ末端に位置し、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有するＣ末端ドメイン（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、を含む単鎖ポリペプチドが本明細書に記載され、リンカーによってＮ−ｎａｎｏ１〜１５９とＣ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する。
【００４７】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、レポータータンパク質のドメインまたは断片は、レポータータンパク質配列（例えば、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）または配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）との配列同一性が少なくとも少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％であり得る。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、変異アミノ酸は、保存的置換バリエーションであり得る。
【００４８】
実施形態のいずれかの１つの態様では、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９に対する置換、欠失、または付加が１０アミノ酸残基未満である配列を含むＮ末端ドメイン（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置し、神経毒素切断部位を含むリンカーと、リンカーのＣ末端に位置し、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０に対する置換、欠失、または付加が３アミノ酸残基未満である配列を有するＣ末端ドメイン（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、を含む単鎖ポリペプチドが本明細書に記載され、リンカーによってＮ−ｎａｎｏ１〜１５９とＣ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する。
【００４９】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、レポータータンパク質のドメインまたは断片は、レポータータンパク質配列（例えば、配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）または配列番号１のルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０））に対する欠失、挿入、または置換の数が１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１の配列であり得る。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、置換アミノ酸は、保存的置換バリエーションであり得る。実施形態のいずれかの１つの態様では、ａ）ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、ｂ）Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置し、神経毒素切断部位を含むリンカーと、ｃ）リンカーのＣ末端に位置する、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、を含む単鎖ポリペプチドが本明細書に記載され、リンカーによってＮ−ｎａｎｏ１〜１５９とＣ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する。
【００５０】
本明細書に示されるように、ルシフェラーゼタンパク質は、リンカー配列によって分割され得るが、依然として機能性ルシフェラーゼを与えるものである。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、配列番号１の残基１５９及び残基１６０に対応する残基の間にリンカーが提供される。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、配列番号１の残基１５９と残基１６０との間にリンカーが提供される。
【００５１】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載の単鎖ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１５９に対応する配列を含むＮ末端ドメインと、配列番号１の残基１６０〜１７０に対応する配列を含むＣ末端ドメインと、を含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載の単鎖ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１５９に対応する配列から本質的になるＮ末端ドメインと、配列番号１の残基１６０〜１７０に対応する配列から本質的になるＣ末端ドメインと、を含み得る。
【００５２】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載の単鎖ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１５９を含むＮ末端ドメインと、配列番号１の残基１６０〜１７０を含むＣ末端ドメインと、を含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載の単鎖ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１５９から本質的になるＮ末端ドメインと、配列番号１の残基１６０〜１７０から本質的になるＣ末端ドメインと、を含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載の単鎖ポリペプチドは、配列番号１の残基１〜１５９からなるＮ末端ドメインと、配列番号１の残基１６０〜１７０からなるＣ末端ドメインと、を含み得る。
【００５３】
本明細書に記載の単鎖ポリペプチドでは、Ｎ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間にリンカードメインが見られる。本明細書で使用される「リンカー」は、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ酵素）に対して外来性であり、レポータータンパク質のＮ末端ドメインとＣ末端ドメインとを機能的に連結するように操作された配列を指す。リンカーは、例えば、１つまたは複数の切断部位、１つまたは複数のスペーサー、１つまたは複数の結合断片、及び１つまたは複数の追加のルシフェラーゼ酵素を含み得る。
【００５４】
本明細書で使用される「機能的に連結する」は、２つの断片が活性かつ機能性の三次構造を形成することを介在配列が妨げないような様式でレポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）の２つの断片を連結することを指す。機能的に連結された２つの断片は、リンカー配列が存在しないタンパク質を特徴付ける活性を示すことになる。
【００５５】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、１つまたは複数の切断部位を含み得、こうした切断部位は、例えば、１つまたは複数の酵素の作用によって特異的に切断されるアミノ酸配列である。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、切断部位は、神経毒素切断部位であり得る。したがって、神経毒素切断部位は、少なくとも１つの神経毒素によって特異的に切断される配列を含む。神経毒素は、神経組織の機能を阻害し、及び／または神経組織を死滅させる化合物である。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、神経毒素は、シナプス小胞放出の阻害剤であり得る。神経毒素切断部位の例には、限定はされないが、Ｃ．ボツリヌム神経毒素（ＢｏＮＴ）切断部位及び／または破傷風神経毒素切断部位が含まれ得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、複数の神経毒素切断部位を含み得、例えば、リンカーは、複数の神経毒素によって切断され、それによって複数の神経毒素の検出及び／または測定が可能となり得る。
【００５６】
ＢｏＮＴは、ＳＮＡＲＥタンパク質を切断することによって作用する。したがって、ＢｏＮＴ切断部位は、ＳＮＡＲＥタンパク質に由来するものであり得る。本明細書で使用される「ＳＮＡＲＥタンパク質」は、神経細胞におけるシナプス前膜のシナプス小胞融合を含めて、小胞融合を媒介するタンパク質のスーパーファミリーを指す。ＳＮＡＲＥタンパク質には、非限定的な例として、ＳＮＡＰ−２５（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子識別：６６１６であり、ヒトＳＮＡＰ２５ｂについてはＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿５７０８２４．１、及びラットＳＮＡＰ２５ｂについてはＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿１１２２５３．１も併せて参照のこと）、シナプトブレビン（ＶＡＭＰ）（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子識別番号：６８４３、６８４４、６８４５、８６７３、８６７４、９３４１、９５５４、１０６５２、１０７９１、及び２６９８４）、ならびにシンタキシン（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子識別番号：２０５４、６８０４、６８０９、６８１０、６８１１、８４１７、８６７５、８６７６、８６７７、９４８２、１０２２８、２３６７３、５３４０７、５５０１４、１１２７５５、及び４１５１７７）が含まれる。クロストリジウム神経毒素によって切断されるＳＮＡＲＥの切断可能な結合は、例えば、Ｂｉｎｚ，Ｔｈ．ｅｔ  ａｌ．“Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ＳＮＡＲＥ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ｏｕｔｌｏｏｋ  ｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．”Ｔｏｘｉｎｓ  ２．４（２０１０）：６６５−６８２に記載されている。好ましくは、ＢｏＮＴ切断部位は、ヒトＳＮＡＲＥタンパク質に由来するものである。ヒトＳＮＡＲＥの切断可能な結合の例は、表１に示される。
【００５７】
（表１）クロストリジウム神経毒素によって切断されるヒトＳＮＡＲＥの切断可能な結合
2019532651.tif 000005
【００５８】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのクロストリジウム神経毒素切断部位（好ましくは、ヒト神経毒素切断部位）を含む。クロストリジウム神経毒素切断部位は、ＳＮＡＲＥ（好ましくは、ヒトＳＮＡＲＥ）のアミノ酸残基Ｐ３Ｐ２Ｐ１Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３’を少なくとも含む配列として定義され得るものであり、Ｐ１及びＰ１’は、クロストリジウム神経毒素によって切断される切断可能なペプチド結合の両側に位置する残基であり、例えば、ＢｏＮＴ／Ａについては、ヒトＳＮＡＰ２５のＧｌｎ１９７及びＡｒｇ１９８である。
【００５９】
好ましい実施形態では、クロストリジウム神経毒素切断部位は、ＳＮＡＲＥのアミノ酸残基Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３’Ｐ４’を少なくとも含む。より好ましい実施形態では、クロストリジウム神経毒素切断部位は、ＳＮＡＲＥのアミノ酸残基Ｐ５Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３’Ｐ４’Ｐ５’を少なくとも含み、より好ましくは、アミノ酸残基Ｐ６Ｐ５Ｐ４Ｐ３Ｐ２Ｐ１Ｐ１’Ｐ２’Ｐ３’Ｐ４’Ｐ５’Ｐ６’を少なくとも含む。
【００６０】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ａ切断部位を含み、当該ＢｏＮＴ／Ａ切断部位は、ヒトＳＮＡＰ２５（配列番号２３）の残基１９５〜２００を含み、好ましくは、ヒトＳＮＡＰ２５（配列番号２３）の残基１９４〜２０１、残基１９３〜２０２、または残基１９２〜２０３を含む。
【００６１】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ｂ切断部位を含み、当該ＢｏＮＴ／Ｂ切断部位は、ヒトＶＡＭＰ−１（配列番号２４）の残基７６〜８１を含み、好ましくは、ヒトＶＡＭＰ−１（配列番号２４）の残基７５〜８２、残基７４〜８３、または残基７３〜８４を含む。
【００６２】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ｂ切断部位を含み、当該ＢｏＮＴ／Ｂ切断部位は、ヒトＶＡＭＰ−２（配列番号２５）の残基７４〜７９を含み、好ましくは、ヒトＶＡＭＰ−２（配列番号２５）の残基７３〜８０、残基７２〜８１、または残基７１〜８２を含む。
【００６３】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ｂ切断部位を含み、当該ＢｏＮＴ／Ｂ切断部位は、ヒトＶＡＭＰ−３（配列番号２６）の残基５７〜６２を含み、好ましくは、ヒトＶＡＭＰ−３（配列番号２６）の残基５６〜６３、残基５５〜６４、または残基５４〜６５を含む。
【００６４】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ｃ１切断部位を含み、当該ＢｏＮＴ／Ｃ１切断部位は、ヒトＳＮＡＰ２５（配列番号２３）の残基１９６〜２０１を含み、好ましくは、ヒトＳＮＡＰ２５（配列番号２３）の残基１９５〜２０２、残基１９４〜２０３、または残基１９３〜２０４を含む。
【００６５】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ｃ１切断部位を含み、当該ＢｏＮＴ／Ｃ１切断部位は、ヒトシンタキシン１Ａ（配列番号２７）の残基２５１〜２５６を含み、好ましくは、ヒトシンタキシン１Ａ（配列番号２７）の残基２５０〜２５７、残基２４９〜２５８、または残基１４８〜２５９を含む。
【００６６】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ｃ１切断部位を含み、当該ＢｏＮＴ／Ｃ１切断部位は、ヒトシンタキシン１Ｂ（配列番号２８）の残基２５２〜２５７を含み、好ましくは、ヒトシンタキシン１Ｂ（配列番号２８）の残基２５１〜２５８、残基２４９〜２５９、または残基１４９〜２６０を含む。
【００６７】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ｄ切断部位を含み、当該ＢｏＮＴ／Ｄ切断部位は、ヒトＶＡＭＰ−１（配列番号２４）の残基５９〜６４を含み、好ましくは、ヒトＶＡＭＰ−１（配列番号２４）の残基５８〜６５、残基５７〜６６、または残基５６〜６７を含む。
【００６８】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ｄ切断部位を含み、当該ＢｏＮＴ／Ｄ切断部位は、ヒトＶＡＭＰ−２（配列番号２５）の残基５７〜６２を含み、好ましくは、ヒトＶＡＭＰ−２（配列番号２５）の残基５６〜６３、残基５５〜６４、または残基５４〜６５を含む。
【００６９】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ｄ切断部位を含み、当該ＢｏＮＴ／Ｄ切断部位は、ヒトＶＡＭＰ−３（配列番号２６）の残基４０〜４５を含み、好ましくは、ヒトＶＡＭＰ−３（配列番号２６）の残基３９〜４６、残基３８〜４７、または残基３７〜４８を含む。
【００７０】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ｅ切断部位を含み、当該ＢｏＮＴ／Ｅ切断部位は、ヒトＳＮＡＰ２５（配列番号２３）の残基１７８〜１８３を含み、好ましくは、ヒトＳＮＡＰ２５（配列番号２３）の残基１７７〜１８４、残基１７６〜１８５、または残基１７５〜１８６を含む。
【００７１】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ｆ切断部位を含み、当該ＢｏＮＴ／Ｆ切断部位は、ヒトＶＡＭＰ−１（配列番号２４）の残基５８〜６３を含み、好ましくは、ヒトＶＡＭＰ−１（配列番号２４）の残基５７〜６４、残基５６〜６５、または残基５５〜６６を含む。
【００７２】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ｆ切断部位を含み、当該ＢｏＮＴ／Ｆ切断部位は、ヒトＶＡＭＰ−２（配列番号２５）の残基５６〜６１を含み、好ましくは、ヒトＶＡＭＰ−２（配列番号２５）の残基５５〜６２、残基５４〜６３、または残基５３〜６４を含む。
【００７３】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ｆ切断部位を含み、当該ＢｏＮＴ／Ｆ切断部位は、ヒトＶＡＭＰ−３（配列番号２６）の残基３９〜４４を含み、好ましくは、ヒトＶＡＭＰ−３（配列番号２６）の残基３８〜４５、残基３７〜４６、または残基３６〜４７を含む。
【００７４】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ｇ切断部位を含み、当該ＢｏＮＴ／Ｇ切断部位は、ヒトＶＡＭＰ−１（配列番号２４）の残基８１〜８６を含み、好ましくは、ヒトＶＡＭＰ−１（配列番号２４）の残基８０〜８７、残基７９〜８８、または残基７８〜８９を含む。
【００７５】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ｇ切断部位を含み、当該ＢｏＮＴ／Ｇ切断部位は、ヒトＶＡＭＰ−２（配列番号２５）の残基７９〜８４を含み、好ましくは、ヒトＶＡＭＰ−２（配列番号２５）の残基７８〜８５、残基７７〜８６、または残基７６〜８７を含む。
【００７６】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ｇ切断部位を含み、当該ＢｏＮＴ／Ｇ切断部位は、ヒトＶＡＭＰ−３（配列番号２６）の残基６２〜６７を含み、好ましくは、ヒトＶＡＭＰ−３（配列番号２６）の残基６１〜６８、残基６０〜６９、または残基５９〜７０を含む。
【００７７】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＢｏＮＴ／Ｂ切断部位を含み、当該ＴｅＮＴ切断部位は、ヒトＶＡＭＰ−１（配列番号２４）の残基７６〜８１を含み、好ましくは、ヒトＶＡＭＰ−１（配列番号２４）の残基７５〜８２、残基７４〜８３、または残基７３〜８４を含む。
【００７８】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＴｅＮＴ切断部位を含み、当該ＴｅＮＴ切断部位は、ヒトＶＡＭＰ−２（配列番号２５）の残基７４〜７９を含み、好ましくは、ヒトＶＡＭＰ−２（配列番号２５）の残基７３〜８０、残基７２〜８１、または残基７１〜８２を含む。
【００７９】
１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＴｅＮＴ切断部位を含み、当該ＢｏＮＴ／Ｂ切断部位は、ヒトＶＡＭＰ−３（配列番号２６）の残基５７〜６２を含み、好ましくは、ヒトＶＡＭＰ−３（配列番号２６）の残基５６〜６３、残基５５〜６４、または残基５４〜６５を含む。
【００８０】
ＳＮＡＲＥタンパク質における適切なＢｏＮＴ切断部位の例には、非限定的な例として、ヒトＳＮＡＰ−２５ｂのアミノ酸１４１〜２０６（例えば、配列番号１０）、及びヒトＶＡＭＰ１（例えば、ＮＣＢＩ遺伝子識別：６８４３）のアミノ酸３５〜９６が含まれる。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸３５〜９６は、配列番号１６のアミノ酸３５〜９６であり得る。ＳＮＡＲＥタンパク質におけるＢｏＮＴ切断部位の別の例には、限定はされないが、ヒトＶＡＭＰ２のアミノ酸６０〜８７、ヒトＶＡＭＰ３のアミノ酸４３〜７０、及びヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸６２〜８９が含まれる。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ヒトＶＡＭＰ２のアミノ酸６０〜８７は、配列番号１９の配列であり得る。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ヒトＶＡＭＰ３のアミノ酸４３〜７０は、配列番号２０の配列であり得る。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸６２〜８９は、配列番号２１の配列であり得る。
【００８１】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ切断部位は、本明細書に記載の特定の配列のいずれかの変異体であり得、例えば、ＳＮＡＲＥタンパク質に見られる天然のＢｏＮＴ切断部位の変異体である。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ切断部位は、配列番号１０のアミノ酸１４１〜２０６の変異体であるか、または配列番号１６のアミノ酸３５〜９６の変異体であり得る。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ切断部位は、ＳＮＡＲＥタンパク質に見られる天然のＢｏＮＴ切断部位との配列同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％であり得る。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ切断部位は、配列番号１０のアミノ酸１４１〜２０６または配列番号１６のアミノ酸３５〜９６との配列同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％であり得る。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、変異体は、保存的置換変異体であり得る。
【００８２】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ切断部位は、ＳＮＡＲＥタンパク質に見られる天然のＢｏＮＴ切断部位に対する欠失、挿入、または置換の数が１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１の配列であり得る。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ切断部位は、ＳＮＡＲＥタンパク質に見られる天然のＢｏＮＴ切断部位と異なる残基の数が１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１の配列であり得る。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ切断部位は、配列番号１０のアミノ酸１４１〜２０６または配列番号１６のアミノ酸３５〜９６に対する欠失、挿入、または置換の数が１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１の配列であり得る。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ切断部位は、配列番号１０のアミノ酸１４１〜２０６または配列番号１６のアミノ酸３５〜９６と異なる残基の数が１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１の配列であり得る。
【００８３】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ切断部位は、ヒトＳＮＡＰ−２５ｂのアミノ酸１４１〜２０６（例えば、配列番号１０）、ヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸３５〜９６、ＶＡＭＰ１のアミノ酸１〜９６、ヒトＳＮＡＰ２５、及び／またはヒトＳＮＡＰ２５ｂ（配列番号１４）のアミノ酸１〜２０６を含み得る。
【００８４】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ切断部位は、ＢｏＮＴ  Ａ、ＢｏＮＴ  Ｂ、ＢｏＮＴ  Ｃ、ＢｏＮＴ  Ｄ、ＢｏＮＴ  Ｅ、ＢｏＮＴ  Ｆ、及び／またはＢｏＮＴ  Ｇによって特異的に認識（例えば、切断）され得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ切断部位は、ＢｏＮＴ  Ａ、ＢｏＮＴ  Ｅ、及びＢｏＮＴ  Ｃによって特異的に認識（例えば、切断）され得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ切断部位は、ＢｏＮＴ  Ｂ、ＢｏＮＴ  Ｄ、ＢｏＮＴ  Ｆ、及びＢｏＮＴ  Ｇによって特異的に認識（例えば、切断）され得る。
【００８５】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のスペーサーを含み得る。本明細書で使用される「スペーサー」は、同一のペプチド鎖における２つの他の配列を分離するという構造的な目的を果たすアミノ酸配列を指す。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサー配列は、可動性ペプチド配列であり得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシン残基及びセリン残基を含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシン残基及びセリン残基から本質的になり得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシン残基及びセリン残基からなり得る。
【００８６】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサーは、約２〜約３０のアミノ酸の長さを有し得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサーは、２〜３０のアミノ酸の長さを有し得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサーは、約３〜約２０のアミノ酸の長さを有し得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサーは、３〜２０のアミノ酸の長さを有し得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサーは、約５〜約１５のアミノ酸の長さを有し得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサーは、５〜１５アミノ酸の長さを有し得る。
【００８７】
スペーサーの例には、限定はされないが、
2019532651.tif 000006
が含まれ得る。リンカーの設計、選択、及び別のリンカーの例は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、Ｃｈｅｎ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ，“Ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｎｋｅｒｓ：ｐｒｏｔｅｒｔｙ，ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ”Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．（２０１３）に記載されており、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００８８】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、神経毒素結合断片を含み得、例えば、神経毒素が結合する配列及び／または神経毒素に結合する配列であって、神経毒素によって切断されない配列を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、神経毒素結合断片は、神経毒素受容体（例えば、ＢｏＮＴ及び／または破傷風神経毒素の受容体）の断片であり得る。
【００８９】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、神経毒素受容体は、ヒト、マウス、ラット、または霊長類の神経毒素受容体であり得る。好ましい実施形態では、神経毒素受容体は、ヒトの神経毒素受容体である。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、神経毒素受容体は、ＳＶ２Ｃであり得、例えば、ヒトＳＶ２Ｃ（ＮＣＢＩ遺伝子識別：２２９８７、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＩ００８２８．１）である。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、受容体の神経毒素結合断片は、ヒトＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６（ＳＶ２Ｃ−Ｌ４、例えば、配列番号１１）に対応する配列を含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、神経毒素結合断片は、ヒトＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６（ＳＶ２Ｃ−Ｌ４、例えば、配列番号１１）を含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、神経毒素受容体は、ＳＹＴＩ（ＮＣＢＩ遺伝子識別：６８５７）またはＳＹＴ２（ＮＣＢＩ遺伝子識別：１２７８３３）であり得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、受容体の神経毒素結合断片は、ＳＹＴＩのアミノ酸３２〜５２（例えば、配列番号１７）またはＳＹＴ２のアミノ酸４０〜６０（配列番号１８）に対応する配列を含み得る。
【００９０】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、インタクトな第２のルシフェラーゼポリペプチドを含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、第２のルシフェラーゼは、単鎖ポリペプチドの切断（例えば、神経毒素によるもの）の前及び／または後に活性である。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、第２のルシフェラーゼは、第１のルシフェラーゼと区別可能であり、例えば、第２のルシフェラーゼは、異なる基質に作用し、及び／または異なる光波長を生成する。例えば、第１のルシフェラーゼがＮＡＮＯＬＵＣであるならば、第２のルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ（例えば、フォティヌス・ピラリス）、細菌ルシフェラーゼ（例えば、ビブリオ・フィシェリ、ビブリオ・ハーベイ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケ）、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、またはガウシアルシフェラーゼであり得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、第２のルシフェラーゼは、配列番号１３に対応する配列を含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、第２のルシフェラーゼは、配列番号１３を含み得る。
【００９１】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、Ｎ末端レポータータンパク質ドメインと、少なくとも１つの切断部位と、の間に位置するインタクトな第２のルシフェラーゼポリペプチドを含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９とＢｏＮＴ切断部位との間に位置するインタクトな第２のルシフェラーゼポリペプチドを含み得る。
【００９２】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、結合断片は、少なくとも１つの切断部位のＮ末端に位置し得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、結合断片は、Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９とＢｏＮＴ切断部位との間に位置し得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの結合断片と、少なくとも１つのスペーサーと、少なくとも１つの切断部位と、をＮ末端からＣ末端の順序で含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの結合断片と、少なくとも１つのスペーサーと、少なくとも１つのＢｏＮＴ切断部位と、をＮ末端からＣ末端の順序で含み得る。
【００９３】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のスペーサーと、少なくとも１つの切断部位と、をＮ末端からＣ末端の順序で含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のスペーサーと、少なくとも１つの切断部位と、１つまたは複数のスペーサーと、をＮ末端からＣ末端の順序で含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの切断部位と、１つまたは複数のスペーサーと、をＮ末端からＣ末端の順序で含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、ＢｏＮＴ切断部位とＮ−ｎａｎｏ１〜１５９との間、神経毒素切断部位とＣ−ｎａｎｏ１６０〜１７０との間、またはそれらの両方に位置する１つまたは複数のスペーサーを含み得る。
【００９４】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、第２のルシフェラーゼポリペプチドと切断部位との間に位置するスペーサーを含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、第２のルシフェラーゼポリペプチドと、少なくとも１つのスペーサーと、少なくとも１つの切断部位と、をＮ末端からＣ末端の順序で含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、第２のルシフェラーゼポリペプチドとＢｏＮＴ切断部位との間に位置するスペーサーを含み得る。
【００９５】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖ポリペプチドは、ポリヒスチジン親和性タグ（例えば、Ｈｉｓ６（配列番号１２））をさらに含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリヒスチジン親和性タグは、ポリペプチドのＣ末端に位置し、例えば、レポータータンパク質Ｃ末端ドメインのＣ末端に位置する。
【００９６】
実施形態のいずれかの１つの態様では、ａ）ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、ｂ）ｉ）５〜１５アミノ酸の第１のスペーサー、ｉｉ）第１のスペーサーのＣ末端に位置し、ＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６から構成される結合断片、ｉｉｉ）結合断片のＣ末端に位置する第２のスペーサー、ｉｖ）第２のスペーサーのＣ末端に位置し、ヒトＳＮＡＰ２５ｂのアミノ酸１４１〜２０６を含むＢｏＮＴ切断部位、ｉｖ）ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第３のスペーサー、を含む、Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置するリンカーと、ｃ）リンカーのＣ末端に位置する、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、を含む単鎖ポリペプチドが本明細書に記載され、リンカーによってＮ−ｎａｎｏ１〜１５９とＣ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）のＣ末端にポリヒスチジン親和性タグをさらに含む。
【００９７】
実施形態のいずれかの１つの態様では、ａ）ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、ｂ）ｉ）５〜１５アミノ酸の第１のスペーサー、ｉｉ）第１のスペーサーのＣ末端に位置し、ヒトＳＮＡＰ２５ｂのアミノ酸１４１〜２０６を含むＢｏＮＴ切断部位、ｉｉｉ）ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサー、を含む、Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置するリンカーと、ｃ）リンカーのＣ末端に位置する、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、を含む単鎖ポリペプチドが本明細書に記載され、リンカーによってＮ−ｎａｎｏ１〜１５９とＣ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）のＣ末端にポリヒスチジン親和性タグをさらに含む。
【００９８】
実施形態のいずれかの１つの態様では、ａ）ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、ｂ）ｉ）５〜１５アミノ酸の第１のスペーサー、ｉｉ）第１のスペーサーのＣ末端に位置し、ヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸３５〜９６を含むＢｏＮＴ切断部位、ｉｉｉ）ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサー、を含む、Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置するリンカーと、ｃ）リンカーのＣ末端に位置する、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、を含む単鎖ポリペプチドが本明細書に記載され、リンカーによってＮ−ｎａｎｏ１〜１５９とＣ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）のＣ末端にポリヒスチジン親和性タグをさらに含む。
【００９９】
実施形態のいずれかの１つの態様では、ａ）ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、ｂ）ｉ）第２の機能性ルシフェラーゼポリペプチド、ｉｉ）第２のルシフェラーゼポリペプチドのＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第１のスペーサー、ｉｉｉ）第１のスペーサーのＣ末端に位置する、ヒトＳＮＡＰ２５ｂ（例えば、配列番号１４）のアミノ酸１〜２０６を含むＢｏＮＴ切断部位、ｉｖ）ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサー、を含む、Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端に位置するリンカーと、ｃ）リンカーのＣ末端に位置する、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）と、を含む単鎖ポリペプチドが本明細書に記載され、リンカーによってＮ−ｎａｎｏ１〜１５９とＣ−ｎａｎｏ１６０〜１７０とが機能的に連結されることで機能性ルシフェラーゼ融合タンパク質が生成する。
【０１００】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）のＣ末端にポリヒスチジン親和性タグをさらに含む。
【０１０１】
（表２）
2019532651.tif 000007
2019532651.tif 000008
2019532651.tif 000009
2019532651.tif 000010
2019532651.tif 000011
【０１０２】
実施形態のいずれかの１つの態様では、本明細書に記載の単鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が本明細書に記載される。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１５、配列番号２９、配列番号３０、または配列番号３１を含み得る。
【０１０３】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の核酸分子を含む核酸ベクターに関する。１つの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。そのような発現ベクターは、本明細書では発現コンストラクトと称され、当該発現ベクターに機能可能なように連結された本明細書に開示の核酸分子を含み、当該発現ベクターは、細胞または無細胞抽出物における当該核酸分子の発現に有用なものである。本発明の単鎖ポリペプチドをコードする核酸分子の発現には多種多様な発現ベクターを利用することができ、こうした発現ベクターには、限定はされないが、ウイルス発現ベクター、原核生物発現ベクター、真核生物発現ベクター（例えば、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクター、及び哺乳類発現ベクターなど）、ならびに無細胞抽出物発現ベクターが含まれる。こうした方法の態様の実施に有用な発現ベクターには、構成的、組織特異的、細胞特異的、または誘導性のプロモーター要素、エンハンサー要素、または両方の制御下で単鎖ポリペプチドを発現するものが含まれ得るとさらに理解される。発現ベクターの比限定的な例、ならびにそのような発現ベクターから発現コンストラクトを調製及び使用するための、よく確立された試薬及び条件は、商業的な供給業者から容易に入手可能なものであり、こうした供給業者には、限定はされないが、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆが含まれる。適切な発現ベクターの選択、調製、及び使用は、当業者の技能範囲に十分含まれる日常的な手順であると共に、本明細書の教示内容に示される。
【０１０４】
実施形態のいずれかの１つの態様では、本明細書に記載の単鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む核酸ベクターが本明細書に記載される。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１５を含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターあり、発現可能な形態の核酸配列を含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルス発現ベクター、原核生物発現ベクター、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクター、または哺乳類発現ベクターであり得る。
【０１０５】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、細胞への送達または異なる細胞間の移行のために設計される核酸コンストラクトを指す。標的細胞への外来遺伝子の移入に有用なベクターは、多くのものが利用可能であり、例えば、ベクターは、エピソーム（例えば、プラスミド、ウイルス由来のベクター）であり得るか、または相同組換えもしくは無作為組み込みを介して標的細胞ゲノムに組み込まれ得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターであり得る。本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、異種核酸断片を細胞に取り込ませ、その細胞においてその異種核酸断片を発現する能力を有するベクターを指す。発現ベクターは、追加の要素を含み得る。ベクターに組み込まれる核酸は、そのポリヌクレオチド配列の転写及び翻訳を発現制御配列が制御及び調節するとき、その発現制御配列に機能可能なように連結することができる。
【０１０６】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の核酸分子または発現コンストラクトを含む細胞に関する。細胞は、核酸増幅、核酸発現、または両方のためのものであり得る。実施形態のいずれかの１つの態様では、本明細書に記載の核酸及び／またはベクターを含む細胞が本明細書に記載される。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載の単鎖ポリペプチドを発現する。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、マウス細胞、霊長類細胞、及び／または神経細胞であり得る。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、神経細胞であり、具体的には、ＢｏＮＴに対して高い感受性を有する細胞である。
【０１０７】
ＢｏＮＴに対して高い感受性を有する細胞は、ＢｏＮＴ中毒が生じやすい細胞である。いくつかの実施形態では、ＢｏＮＴに対して高い感受性を有する細胞は、例えば、約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、約９０ｐＭ以下、約８０ｐＭ以下、約７０ｐＭ以下、約６０ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約４０ｐＭ以下、約３０ｐＭ以下、約２０ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、約９ｐＭ以下、約８ｐＭ以下、約７ｐＭ以下、約６ｐＭ以下、約５ｐＭ以下、約４ｐＭ以下、約３ｐＭ以下、約２ｐＭ以下、約１ｐＭ以下、約０．９ｐＭ以下、約０．８ｐＭ以下、約０．７ｐＭ以下、約０．６ｐＭ以下、約０．５ｐＭ以下、約０．４ｐＭ以下、約０．３ｐＭ以下、約０．２ｐＭ、約０．１ｐＭ以下のＢｏＮＴ、約９０ｆＭ以下のＢｏＮＴ、約８０ｆＭ以下のＢｏＮＴ、約７０ｆＭ以下のＢｏＮＴ、約６０ｆＭ以下のＢｏＮＴ、約５０ｆＭ以下のＢｏＮＴ、約４０ｆＭ以下のＢｏＮＴ、約３０ｆＭ以下のＢｏＮＴ、約２０ｆＭ以下のＢｏＮＴ、または約１０ｆＭ以下のＢｏＮＴによってＢｏＮＴ中毒が生じやすい細胞である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、細胞は、ＢｏＮＴに対して高い感受性を有する初代神経細胞であり、例えば、皮質神経細胞、海馬神経細胞、及び／または脊髄神経細胞である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、細胞は、ＢｏＮＴに対して高い感受性を有する神経細胞株に由来するものであり、例えば、ＢＥ（２）−Ｍ１７、Ｋｅｌｌｙ、ＬＡ１−５５ｎ、Ｎ１Ｅ−１１５、Ｎ４ＴＧ３、Ｎ１８、Ｎｅｕｒｏ−２ａ、ＮＧ１０８−１５、ＰＣ１２、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＳｉＭａ、及び／またはＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）−Ｃである。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞由来の神経細胞（具体的には、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に由来する神経細胞（例えば、ｉ−Ｃｅｌｌ（登録商標）神経細胞、ｉ−Ｃｅｌｌ（登録商標）ドーパ神経細胞、ｉＣｅｌｌグルタミン酸作動性神経細胞、ｉＣｅｌｌ運動神経細胞（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｃ）））、大脳皮質神経細胞、神経幹細胞（Ａｘｏｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｐｅｒｉ．４Ｕ神経細胞、ＣＮＳ．４Ｕ神経細胞、Ｄｏｐａ．４Ｕ神経細胞（Ａｘｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＭＮＰ細胞（Ｌｏｎｚａ）、皮質神経細胞、運動神経細胞（ｉＳｔｅｍ）、及び／またはｉＰＳＣ由来の神経系細胞（ＭＴＩ−ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）である。
【０１１１】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞（限定はされないが、好気性、微好気性、炭酸ガス嗜好性（ｃａｐｎｏｐｈｉｌｉｃ）、通性、嫌気性、グラム陰性、及びグラム陽性の細菌細胞の株（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ナイセリア・メニンジルス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｒｕｌｌｓ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、及びサルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）に由来するものなど）が含まれる）、ならびに真核細胞（限定はされないが、酵母株（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及びヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に由来するものなど）、昆虫細胞もしくは昆虫に由来する細胞株（例えば、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、及びタバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）に由来するものなど）、または哺乳類細胞もしくは哺乳類細胞に由来する細胞株（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類、及びヒトに由来するものなど）が含まれる）であり得る。細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、及びＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓから入手され得る。適切な細胞株を選択、調製、及び使用するための特定のプロトコールの例は、限定はされないが、例えば、ＩＮＳＥＣＴ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（Ｍａｔｔｈｅｕｓ  Ｆ．Ａ．Ｇｏｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，１９９３）、ＩＮＳＥＣＴ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥＳ：ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＡＮ���  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＡＳＰＥＣＴＳ（Ｊ．Ｍ．Ｖｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９６）、Ｍａｕｒｅｅｎ  Ａ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＆  Ｉａｎ  Ｆ．Ｒａｅ，ＧＥＮＥＲＡＬ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  ＯＦ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）、ＣＥＬＬ  ＡＮＤ  ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ：ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ（Ａｌａｎ  Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ  ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９８）、Ｒ．Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＦ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬＳ：Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，４．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄ．２０００）、ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｊｏｈｎ  Ｒ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓ  ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，３．ｓｕｐ．ｒｄ  ｅｄ．２０００）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，前出，（２００１）、ＢＡＳＩＣ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｊｏｈｎ  Ｍ．Ｄａｖｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ，２．ｓｕｐ．ｎｄ  ｅｄ．２００２）、及びＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，前出，（２００４）に記載されている。こうしたプロトコールは、当業者の技能範囲に含まれる日常的な手順であると共に、本明細書の教示内容に示される。
【０１１２】
本明細書に記載の組成物は、例えば神経毒素（例えば、ＢｏＮＴ）の存在、効力、及び／または活性の検出方法及び／または測定方法において使用することができる。ＢｏＮＴが存在すると、ＢｏＮＴ切断部位を有する単鎖ポリペプチドは、リンカー配列が切断され、分断型レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）の活性が破壊されることになる。したがって、レポータータンパク質の活性の減少によってＢｏＮＴの存在が示される。実施形態のいずれかの１つの態様では、試料におけるＣ．ボツリヌム神経毒素（ＢｏＮＴ）活性の検出方法が本明細書に記載され、この方法は、ａ）ＢｏＮＴ活性に適した条件下で本明細書に記載の単鎖ポリペプチドに試料を接触させること、及び試料の非存在下でのポリペプチドのルシフェラーゼ活性と比較してポリペプチドのルシフェラーゼ活性を決定すること、を含み、ルシフェラーゼ活性の減少によって試料におけるＢｏＮＴ活性が示される。実施形態のいずれかの１つの態様では、ボツリヌス神経毒素の効力の決定方法が本明細書に記載され、この方法は、ａ）ＢｏＮＴ活性に適した条件下で本明細書に記載の単鎖ポリペプチドに神経毒素を接触させること、及びｂ）参照基準と比較してポリペプチドのルシフェラーゼ活性を決定し、それによって効力を決定すること、を含む。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、バッチ出荷に適しており、例えば、バッチ出荷試験及び／またはロット出荷試験に適している。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、インビトロで実施することができる。
【０１１３】
実施形態のいずれかの１つの態様では、試料におけるＣ．ボツリヌム神経毒素（ＢｏＮＴ）活性の検出方法が本明細書に記載され、この方法は、ａ）ＢｏＮＴ活性に適した条件下で本明細書に記載の単鎖ポリペプチドに試料を接触させること、及びｂ）試料の非存在下でのポリペプチドのルシフェラーゼ活性と比較してポリペプチドのルシフェラーゼ活性を決定すること、を含み、ルシフェラーゼ活性の減少によって試料におけるＢｏＮＴ活性が示される。実施形態のいずれかの１つの態様では、試料におけるＣ．ボツリヌム神経毒素（ＢｏＮＴ）活性の検出方法が本明細書に記載され、この方法は、ａ）ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）とが、Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端かつＣ−ｎａｎｏ１６０〜１７０のＮ末端に位置する、ＢｏＮＴ切断部位を含むリンカーによって分断かつ機能的に連結されたものを含む単鎖ポリペプチドに対してＢｏＮＴ活性に適した条件下で試料を接触させること、ならびにｂ）試料の非存在下でのポリペプチドのルシフェラーゼ活性と比較してポリペプチドのルシフェラーゼ活性を決定すること、を含み、ルシフェラーゼ活性の減少によって試料におけるＢｏＮＴ活性が示される。
【０１１４】
実施形態のいずれかの１つの態様では、試料におけるＣ．ボツリヌム神経毒素（ＢｏＮＴ）活性の検出方法が本明細書に記載され、この方法は、ａ）ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）とが、Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端かつＣ−ｎａｎｏ１６０〜１７０のＮ末端に位置する、ＢｏＮＴ切断部位を含むリンカーによって分断かつ機能的に連結されたものを含む単鎖ポリペプチドに対してＢｏＮＴ活性に適した条件下で試料を接触させること、ならびにｂ）試料の非存在下でのポリペプチドの活性と比較してポリペプチドのルシフェラーゼ活性を決定すること、を含み、ルシフェラーゼ活性が減少することが試料におけるＢｏＮＴ活性の指標である。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、５〜１５アミノ酸の第１のスペーサーと、第１のスペーサーのＣ末端かつＢｏＮＴ切断部位のＮ末端に位置する、ヒトＳＶ２Ｃのアミノ酸５２９〜５６６の結合断片と、ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサーと、を含み、ＢｏＮＴ切断部位は、ヒトＳＮＡＰ２５のアミノ酸１４１〜２０６を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、ＢｏＮＴ切断部位のＮ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第１のスペーサーと、ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサーと、を含み、ＢｏＮＴ切断部位は、ヒトＳＮＡＰ２５のアミノ酸１４１〜２０６を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、ＢｏＮＴ切断部位のＮ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第１のスペーサーと、ＢｏＮＴ切断部位のＣ末端に位置する５〜１５アミノ酸の第２のスペーサーと、を含み、ＢｏＮＴ切断部位は、ヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸３５〜９６を含む。
【０１１５】
実施形態のいずれかの１つの態様では、ＢｏＮＴのＥＣ５０の決定方法が本明細書に記載され、この方法は、ａ）ＢｏＮＴ活性に適した条件下で本明細書に記載の単鎖ポリペプチドを第１の濃度のＢｏＮＴと接触させ、試料の非存在下でのポリペプチドのルシフェラーゼ活性と比較してポリペプチドのルシフェラーゼ活性を決定すること、ｂ）異なる濃度のＢｏＮＴで段階ａ）を、ＥＣ５０を決定できるまで反復実施すること、を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異なる濃度のＢｏＮＴは、少なくとも１桁の差異を含む。
【０１１６】
当該技術分野では知られていることであるが、「半数効果濃度（ＥＣ５０）」は、何らかの特定の曝露時間後にベースラインと最大値との間の中間の応答を誘導する薬物濃度、抗体濃度、または毒物濃度を指す。ＥＣ５０は、一般に、薬物の効力の尺度として使用される。したがって、連続的用量反応曲線のＥＣ５０は、その最大作用の５０％が観測される化合物濃度に相当する。量子的用量反応曲線のＥＣ５０は、特定の曝露期間後に集団の５０％が応答を示す化合物濃度に相当する。
【０１１７】
本明細書で使用される「ＢｏＮＴ活性に適した条件」は、ＢｏＮＴがＢｏＮＴ切断部位を特異的に切断することができる条件（例えば、温度、ｐＨ、補因子など）を指す。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ活性に適した条件は、２０μＭのＺｎＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ活性に適した条件は、１０〜３０μＭのＺｎＣｌ２、１〜３ｍＭのＤＴＴ、０．５〜２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）を含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＢｏＮＴ活性に適した条件は、５〜５０μＭのＺｎＣｌ２、０．１〜１０ｍＭのＤＴＴ、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）を含み得る。
【０１１８】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、条件は、約３７℃で約１時間〜約３６時間インキュベートすることを含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、条件は、約３７℃で１時間〜３６時間インキュベートすることを含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、条件は、約３７℃で約１時間〜約２４時間インキュベートすることを含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、条件は、約３７℃で１時間〜２４時間インキュベートすることを含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、条件は、約３７℃で約４時間〜約２４時間インキュベートすることを含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、条件は、約３７℃で４時間〜２４時間インキュベートすることを含み得る。
【０１１９】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖ポリペプチドの存在濃度は、約３ｎＭ〜約３００ｎＭである。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖ポリペプチドの存在濃度は、３ｎＭ〜３００ｎＭである。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖ポリペプチドの存在濃度は、約３０ｎＭ〜約３００ｎＭである。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖ポリペプチドの存在濃度は、３０ｎＭ〜３００ｎＭである。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖ポリペプチドの存在濃度は、約３０ｎＭである。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖ポリペプチドの存在濃度は、３０ｎＭである。
【０１２０】
ＢｏＮＴ活性は、細胞（例えば、神経細胞）においても検出することができる。実施形態のいずれかの１つの態様では、試料におけるＣ．ボツリヌム神経毒素（ＢｏＮＴ）活性の検出方法が本明細書に記載され、この方法は、ａ）本明細書に記載の単鎖ポリペプチドを発現する神経細胞に試料を接触させること、ｂ）神経細胞を約１２時間〜約６０時間インキュベートすること、ｃ）神経細胞から溶解液を回収すること、及びｄ）試料の非存在下で同一の処理を実施した神経細胞におけるＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼ活性と比較して溶解液におけるＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼ活性を測定すること、を含み、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼ活性の減少によって試料におけるＢｏＮＴ活性が示される。実施形態のいずれかの１つの態様では、試料におけるＣ．ボツリヌム神経毒素（ＢｏＮＴ）活性の検出方法が本明細書に記載され、この方法は、ａ）ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１〜１５９（Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９）と、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのアミノ酸１６０〜１７０（Ｃ−ｎａｎｏ１６０〜１７０）とが、Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９のＣ末端かつＣ−ｎａｎｏ１６０〜１７０のＮ末端に位置する、ＢｏＮＴ切断部位を含むリンカーによって分断かつ機能的に連結されたものを含む単鎖ポリペプチドを発現する神経細胞に試料を接触させること、ｂ）神経細胞を約１２時間〜約６０時間インキュベートすること、ｃ）神経細胞から溶解液を回収すること、ならびにｄ）試料の非存在下で同一の処理を実施した神経細胞におけるＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼ活性と比較して溶解液におけるＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼ活性を測定すること、を含み、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼ活性の減少によって試料におけるＢｏＮＴ活性が示される。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、Ｎ−ｎａｎｏ１〜１５９と切断部位との間に位置するインタクトな第２のルシフェラーゼポリペプチドをさらに含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、神経細胞は、ウイルス発現ベクターから単鎖ポリペプチドを発現する。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、神経細胞は、接触段階の前の少なくとも３日間、ウイルス発現ベクターから単鎖ポリペプチドを発現する。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、神経細胞は、接触段階の前の少なくとも４日間、ウイルス発現ベクターから単鎖ポリペプチドを発現する。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、神経細胞は、接触段階の前の少なくとも６日間、ウイルス発現ベクターから単鎖ポリペプチドを発現する。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、神経細胞は、接触段階の前の６日間、ウイルス発現ベクターから単鎖ポリペプチドを発現する。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルス発現系は、レンチウイルス発現系である。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、インキュベート段階ｂ）は、約１２時間〜約７２時間実施される。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、インキュベート段階ｂ）は、約４８時間実施される。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、インキュベート段階ｂ）は、４８時間実施される。
【０１２１】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、溶解液の回収段階は、溶解緩衝液の添加を含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、溶解液の回収段階は、遠心分離及び／または沈降を含み得る。
【０１２２】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、単鎖ポリペプチドの組み合わせの使用を含み得、それぞれのポリペプチドは、異なるＢｏＮＴ切断部位及び／またはＢｏＮＴ切断部位の組み合わせを有する。
【０１２３】
本明細書で使用される「ルシフェラーゼ活性の決定」は、ルシフェラーゼ基質の存在下でルシフェラーゼ（または機能性ルシフェラーゼを含み得る試料）によって生成する光のレベルを定量的または定性的に検出することを指す。発光は、当該技術分野において知られる任意の手段によって検出することができ、例えば、発光顕微鏡、光度計、発光プレートリーダー、光電子増倍管検出器、及び同様のものによって検出することができる。
【０１２４】
ルシフェラーゼ基質には、天然起源のルシフェリンならびに操作された基質が含まれ得る。ルシフェリンには、例えば、ホタルルシフェリン、ウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）［ウミホタル（Ｖａｒｇｕｌａ）としても知られる］ルシフェリン［セレンテラジン］、細菌ルシフェリン、ならびにこうした基質の合成アナログが含まれる。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ルシフェリンは、セレンテラジン及びそのアナログであり、こうしたものには、米国特許第６，４３６，６８２号に記載の分子が含まれ、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ，（２００４），Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ，３；４３−５４を参照のこと。追加の基質は、例えば、米国特許第５，３７４，５３４号、第５，０９８，８２８号、第６，４３６，６８２号、第５，００４，５６５号、第５，４５５，３５７号、及び第４，９５０，５８８号に記載されており、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１２５】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ルシフェラーゼ活性は、単鎖ポリペプチドにルシフェラーゼ基質を添加し、生成する発光シグナルを定量的に測定することによって決定できる。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼの基質は、フリマジン（２−フラニルメチル−デオキシ−セレンテラジン）であり得る。
【０１２６】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、単鎖ポリペプチドを構成する第２のルシフェラーゼの活性を測定することをさらに含み得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、第２のルシフェラーゼの活性は、細胞溶解液において測定することができる。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、第２のルシフェラーゼの活性によって、試料、細胞、細胞集団、及び／またはウェルにまたがって単鎖ポリペプチドの発現を正規化することが可能になり得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、試料における第２のルシフェラーゼポリペプチドのルシフェラーゼ活性が決定され、回収された溶解液に存在する総単鎖ポリペプチドの指標として使用される。
【０１２７】
実施形態のいずれかの１つの態様では、ａ）１つもしくは複数の本明細書に記載の単鎖ポリペプチドであって、単鎖ポリペプチドのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容される単鎖ポリペプチド、１つもしくは複数の本明細書に記載の核酸もしくは核酸ベクターであって、核酸もしくは核酸ベクターのそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容される核酸もしくは核酸ベクター、及び／または１つもしくは複数の本明細書に記載細胞であって、細胞のそれぞれもしくは組み合わせが、独立した容器に収容される細胞、を含むキットが本明細書に記載される。
【０１２８】
キットは、少なくとも１つの試薬を含む任意の製造物（例えば、パッケージまたは容器）であり、こうした試薬は、例えば、単鎖ポリペプチド、単鎖ポリペプチドをコードする核酸、または本明細書に記載の単鎖ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞であり、製造物は、本明細書に記載の方法またはアッセイを実施するための単位として、宣伝、配布、または販売される。
【０１２９】
本明細書に記載のキットは、レポーター（例えば、１つまたは複数の型のルシフェラーゼ）の活性レベルのアッセイを可能にする試薬及び／または要素を含む。そのような試薬は、単鎖ポリペプチドに加えて、例えば、緩衝液、基質、または洗浄液などを含む。さらに、キットは、キットの較正に使用するか、または内部標準として使用することができる量の神経毒素（例えば、ＢｏＮＴ）またはルシフェラーゼを含み得る。さらに、キットは、使用説明書を含み得、及び／または得られる結果と関連する情報を提供し得る。
【０１３０】
便宜上、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲において使用されるいくつかの用語及び語句の意味が以下に提供される。別段の記載がない限り、または文脈上暗黙的に示されない限り、下記の用語及び語句は、以下に提供される意味を含む。定義は、特定の実施形態の説明に役立つように提供されるものであり、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定されるため、請求発明の限定は意図されない。別段の定義がない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。当該技術分野における用語の用法と本明細書で提供されるその定義との間に明らかな相違が存在するのであれば、本明細書中で提供される定義が優先されるものとする。
【０１３１】
便宜上、この説明部、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲で用いられるある特定の用語がここにまとめられている。
【０１３２】
「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、「減少した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、または「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」という用語はすべて、統計学的に有意な量の減少を意味するために本明細書で使用される。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、「減少する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、もしくは「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、または「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」は、典型的には、参照レベル（例えば、所与の処理または物質が存在しない場合のもの）と比較したときの、少なくとも１０％の減少を意味し、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれを超える割合の減少を含み得る。
【０１３３】
「増加した」、「増加する」、「増進する」、または「活性化する」という用語はすべて、統計学的に有意な量の増加を意味するために本明細書で使用される。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、「増加した」、「増加する」、「増進する」、または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較したときの、少なくとも１０％の増加を意味し得、例えば、参照レベルと比較したときの、少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の増加、もしくは１００％までの増加（１００％を含む）、もしくは１０〜１００％の任意の増加を意味するか、または参照レベルと比較したときの、少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍の増加、もしくは２倍〜１０倍以上の任意の増加を意味する。マーカーの文脈では、「増加する」は、そのようなマーカーのレベルが統計学的に有意に増加することである。
【０１３４】
本明細書で使用される「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、飼育動物、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク（例えば、アカゲザル）が含まれる。げっ歯類には、マウス、ラット、マーモット、フェレット、ウサギ、及びハムスターが含まれる。飼育動物または狩猟動物には、雌ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種（例えば、イエネコ）、イヌ種（例えば、イヌ、キツネ、オオカミ）、トリ種（例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ）、及びサカナ（例えば、マス、ナマズ、及びサケ）が含まれる。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、哺乳類（例えば、霊長類（例えば、ヒト））である。「個体」、「患者」、及び「対象」という用語は、本明細書で互換的に使用される。
【０１３５】
好ましくは、対象は、哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、または雌ウシであり得るが、これらの例に限定はされない。ボツリヌス活性の動物モデルとなる対象としてヒト以外の哺乳類を有利に使用することができる。対象は、雄性または雌性であり得る。
【０１３６】
本明細書で使用される「結合活性」という用語は、少なくとも１つの分子間力または分子内力を介して１つの分子が別の分子と接触することを意味し、こうした分子間力または分子内力には、限定はされないが、共有結合、イオン結合、金属結合、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、及び同様のもの、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。「結合した」または「結合する」は、結合が考慮された用語である。
【０１３７】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖ポリペプチドを単離または精製することができる。「単離された」は、その天然の状態で見られると通常はそれに伴う成分が程度の差はあれ除去された材料を意味する。「単離する」は、元の供給源または環境（例えば、細胞または細胞溶解液）からある一定程度分離されていることを示す。
【０１３８】
「精製された」という用語は、調製物の他の成分（例えば、他のポリペプチド）に対して「実質的に純粋」な物質（ポリペプチドなど）を指すために使用される。この用語は、他の成分に対して、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、または約７５％、好ましくは、少なくとも約８５％、より好ましくは、少なくとも約９０％、最も好ましくは、少なくとも約９５％の純度を有するポリペプチドを指し得る。換言すれば、ポリペプチドに対する「実質的に純粋」または「本質的に精製された」という用語は、１つまたは複数の他の成分（例えば、他のポリペプチドまたは細胞成分）の含有率が約２０％未満、より好ましくは、約１５％未満、約１０％未満、約８％未満、約７％未満、最も好ましくは、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または１％未満である調製物を指す。
【０１３９】
本明細書で使用される「接触」は、本明細書に記載の単鎖ポリペプチド（または当該ポリペプチドを含む細胞）に対して試料または物質を送達または曝露するための任意の適切な手段を指す。送達方法の例には、限定はされないが、試料または細胞培地への直接的な送達、灌流、注射、または当業者によく知られる他の送達方法が含まれる。
【０１４０】
本明細書で使用される「試料」または「試験試料」という用語は、任意の供給源から取得または単離された試料を示し、こうした供給源は、例えば、生物学的なもの、環境的なもの、産業的なもの、またはその他の形態のものである。この用語は、上述の試料の混合物も含む。「試験試料」という用語は、未処理の試料または前処理（もしくは予備処理）を行った試料も含む。試験試料は、供給源から試料を取り出すことによって得ることができるだけなく、以前に単離された試料（例えば、事前に単離されたもの及び同一の者または別の者によって単離されたもの）を使用することによっても得ることができる。
【０１４１】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、試験試料は、未処理の試験試料であり得る。本明細書で使用される「未処理の試験試料」という語句は、溶液における希釈及び／または懸濁を除き、任意の試料前処理に事前に供されていない試験試料を指す。試験試料の処理方法の例には、限定はされないが、遠心分離、濾過、超音波処理、均質化、加熱、凍結、及び解凍、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、試験試料は、凍結試験試料であり得、例えば、凍結環境試料、凍結産業試料、または凍結組織である。凍結試料は、本明細書に記載の方法、アッセイ、及び系を利用する前に解凍することができる。解凍後、凍結試料は、本明細書に記載の方法、アッセイ、及び系に供す前に遠心分離することができる。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、試験試料は、調製された清澄化試験試料であり、こうした清澄化試験試料は、例えば、遠心分離を実施し、上清を回収することによって調製される。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、試験試料は、予備処理された試験試料であり得、例えば、遠心分離、濾過、解凍、精製、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される処理から得られる上清または濾液である。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、試験試料は、化学的及び／または生物学的な試薬で処理することができる。化学的及び／または生物学的な試薬は、処理の間に試料（そこに存在する生体分子（例えば、タンパク質）を含む）の安定性を保護及び／または維持するために利用することができる。本明細書に記載の発現産物のレベルを決定するために必要な生物学的試料の予備処理に適した方法及び処理は、当業者なら十分に認識している。
【０１４２】
本明細書で使用される「神経細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ）」または「神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）」という用語は、神経シグナルとしての情報を受容、処理、及び伝達することに特化した、神経系に見られる細胞を指す。神経細胞は、中心の細胞体または神経細胞体を含むと共に、一般に、神経シグナルの大部分を細胞体に伝達する樹状突起、及び一般に、神経シグナルの大部分を細胞体からエフェクター細胞（標的神経細胞または筋肉など）に伝達する軸索、という２つ型の突起を含み得る。神経細胞は、組織及び臓器からの情報を中枢神経系（求心性神経または感覚神経）に送達すると共に、中枢神経系からエフェクター細胞（遠心性神経または運動神経）にシグナルを伝達することができる。他の神経細胞は、介在神経細胞と呼ばれており、神経系内の神経細胞を結び付けるものである。
【０１４３】
本明細書で使用される「特異的」という用語は、２つの分子の間の特定の相互作用（例えば、結合及び／または切断）を指し、こうした相互作用では、第１の実体が非標的である第３の実体と相互作用する場合と比較して高い特異性及び親和性を伴って第１の実体が第２の標的実体と相互作用する。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、特異的は、第１の実体と第３の非標的実体との相互作用と比較して第１の実体と第２の標的実体との相互作用が少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、またはそれを超える倍数であることを指し得る。所与の標的に特異的な試薬は、例えば、利用されるアッセイの条件下でその標的に対して特異的に結合するものであるか、または利用されるアッセイの条件下で標的配列を特異的に切断するものである。
【０１４４】
本明細書で使用される「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、隣接残基のアルファ−アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに連結された一連のアミノ酸残基を指すために本明細書で互換的に使用される。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能を問わず、修飾されたアミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化されたものなど）及びアミノ酸アナログを含めて、アミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、比較的大きなポリペプチドに関して使用されることが多い一方で、「ペプチド」という用語は、小さなポリペプチドに関して使用されることが多いが、当該技術分野におけるこれらの用語の用法には重複が存在する。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、遺伝子産物及びその断片を指すとき、本明細書で互換的に使用される。したがって、ポリペプチドまたはタンパク質の例には、遺伝子産物、天然起源のタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片及び他の同等形態、変異体、断片、ならびにこうしたもののアナログが含まれる。
【０１４５】
本明細書に記載のさまざまな実施形態では、記載の特定のポリペプチドのいずれかの変異体（天然起源のものもしくはその他の起源のもの）、対立遺伝子、ホモログ、保存的に改変された変異体、及び／または保存的置換変異体を包含することがさらに企図される。アミノ酸配列に関しては、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失、または付加によって、コード配列中の単一のアミノ酸または少ない割合のアミノ酸が変更されたものが「保存的に改変された変異体」であり、当該変異体では、こうした変更によって、化学的に類似したアミノ酸でアミノ酸が置換され、ポリペプチドの所望の活性が保持されることを当業者なら認識するであろう。そのような保存的に改変された変異体は、本開示と整合する多型変異体、種間ホモログ、及び対立遺伝子に加わるものであり、これらを除外するものではない。
【０１４６】
同様の生理化学的特性を有する残基によって所与のアミノ酸を交換することができ、例えば、ある脂肪族残基で別の脂肪族残基が置換されるか（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＡｌａが互いに置換されるなど）、またはある極性残基が別の極性残基で置換される（ＬｙｓとＡｒｇとの置換、ＧｌｕとＡｓｐとの置換、もしくはＧｌｎとＡｓｎとの置換など）。そのような保存的置換は他にもよく知られており、例えば、同様の疎水特性を有する領域全体が置換される。天然のポリペプチドまたは参照ポリペプチドの所望の活性（例えば、ポリペプチド結合活性）及び特異性が保持されるかを確認するために、本明細書に記載のアッセイのいずれか１つにおいて、保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドを試験することができる。
【０１４７】
アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性に応じて群分けすることができる（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ．７３−７５，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５））：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、（２）無電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。あるいは、天然起源の残基は、共通の側鎖特性に基づく群に分けることができる：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。非保存的置換では、これらのクラスのうちの１つのメンバーが別のクラスのものと交換されることになる。特定の保存的置換には、例えば、ＡｌａからＧｌｙもしくはＳｅｒへのもの、ＡｒｇからＬｙｓへのもの、ＡｓｎからＧｌｎもしくはＨｉｓへのもの、ＡｓｐからＧｌｕへのもの、ＣｙｓからＳｅｒへのもの、ＧｌｎからＡｓｎへのもの、ＧｌｕからＡｓｐへのもの、ＧｌｙからＡｌａもしくはＰｒｏへのもの、ＨｉｓからＡｓｎもしくはＧｌｎへのもの、ＩｌｅからＬｅｕもしくはＶａｌへのもの、ＬｅｕからＩｌｅもしくはＶａｌへのもの、ＬｙｓからＡｒｇ、Ｇｌｎ、もしくはＧｌｕへのもの、ＭｅｔからＬｅｕ、Ｔｙｒ、もしくはＩｌｅへのもの、ＰｈｅからＭｅｔ、Ｌｅｕ、もしくはＴｙｒへのもの、ＳｅｒからＴｈｒへのもの、ＴｈｒからＳｅｒへのもの、ＴｒｐからＴｙｒへのもの、ＴｙｒからＴｒｐへのもの、及び／またはＰｈｅからＶａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＬｅｕへのものが含まれる。
【０１４８】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（またはそのようなポリペプチドをコードする核酸）は、本明細書に記載のアミノ酸配列のうちの１つの機能性断片であり得る。本明細書で使用される「機能性断片」は、本明細書で後述されるアッセイによる野生型参照ポリペプチドの活性の少なくとも５０％を保持する、ペプチドの断片またはセグメントである。機能性断片は、本明細書に開示の配列の保存的置換を含み得る。
【０１４９】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、本明細書に記載の配列の変異体であり得る。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、変異体は、保存的に改変された変異体である。保存的置換変異体は、例えば天然のヌクレオチド配列に変異を導入することによって得ることができる。本明細書で称される「変異体」は、天然のポリペプチドまたは参照ポリペプチドと実質的に相同的であるが、１つまたは複数の欠失、挿入、または置換を有することに起因して天然のポリペプチドまたは参照ポリペプチドのものとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変異ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然のＤＮＡ配列または参照ＤＮＡ配列と比較するとヌクレオチドの１つまたは複数の付加、欠失、または置換を含むが、活性を保持する変異タンパク質またはその断片をコードする配列を含む。ＰＣＲに基づく部位特異的変異導入手法は、多種多様なものが当該技術分野において知られており、当業者は、こうした手法を適用することができる。
【０１５０】
変異アミノ酸配列または変異ＤＮＡ配列は、天然の配列または参照配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれを超える割合の同一性を有し得る。天然の配列と変異配列との相同性の度合（同一性パーセント）は、例えば、ワールドワイドウェブでこの目的に一般に用いられる自由に利用可能なコンピュータープログラムを使用（例えば、ＢＬＡＳＴｐまたはＢＬＡＳＴｎをデフォルト設定で使用）して２つの配列を比較することによって決定できる。
【０１５１】
天然のアミノ酸配列の改変は、当業者に知られる多くの手法のいずれによっても達成することができる。例えば、天然の配列の断片へのライゲーションを可能にする制限酵素認識部位が隣接する変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって特定の遺伝子座に変異を導入することができる。ライゲーションの後、得られる再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、アミノ酸置換、またはアミノ酸欠失を有するアナログをコードする。あるいは、オリゴヌクレオチド介在性部位特異的変異導入手順を利用することで、必要な置換、欠失、または挿入に沿って改変された特定のコドンを有する改変ヌクレオチド配列を得ることができる。そのような改変を施すための手法は非常によく確立されており、こうした手法には、例えば、Ｗａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  ４２：１３３，１９８６）、Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  ３７：７３，１９８５）、Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ  １９８５，１２−１９）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９８１）、ならびに米国特許第４，５１８，５８４号及び第４，７３７，４６２号によって開示されるものが含まれ、これらの文献は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ポリペプチドの適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基もまた、一般にはセリンで置換することで、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を阻止することができる。逆に、システイン結合（複数可）をポリペプチドに付加することで、その安定性の改善またはオリゴマー化の促進を行うことができる。
【０１５２】
本明細書で使用される「核酸」または「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはそのアナログの単位が組み込まれた任意の分子、好ましくは、ポリマー分子を指す。核酸は、１本鎖または２本鎖のいずれかであり得る。１本鎖核酸は、変性した２本鎖ＤＮＡの核酸鎖の１つであり得る。あるいは、１本鎖核酸は、いずれの２本鎖ＤＮＡにも由来しない１本鎖核酸であり得る。１つの態様では、核酸は、ＤＮＡであり得る。別の態様では、核酸は、ＲＮＡであり得る。適切なＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡが含まれ得る。適切なＲＮＡには、例えば、ｍＲＮＡが含まれ得る。
【０１５３】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、または細胞を操作することができる。本明細書で使用される「操作された」は、人為的に操作されているという性状を指す。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドの少なくとも１つの性状（例えば、その配列）が人為的に操作されていることで、それが天然に存在するときの性状と異なるとき、「操作された」と考えられる。一般的なことであり、当業者なら理解していることであるが、操作された細胞の子孫は、実際の操作は前の実体に対して実施されたものであるものの、典型的には、依然として「操作された」と称される。
【０１５４】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、宿主細胞への送達または異なる宿主細胞間の移行のために設計される核酸コンストラクトを指す。本明細書で使用されるベクターは、ウイルス性または非ウイルス性のものであり得る。「ベクター」という用語は、適切な制御要素と関連付けられると複製能力を有し、遺伝子配列を細胞に導入することができる任意の遺伝要素を包含する。ベクターには、限定はされないが、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどが含まれ得る。
【０１５５】
本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、ベクターに存在する転写制御配列に連結された配列からのＲＮＡまたはポリペプチドの発現を誘導するベクターを指す。発現する配列は、必ずしもそうなるわけではないが、細胞に対して異種のものとなることが多い。発現ベクターは、追加の要素を含み得、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有し、それによって２つの生物において維持されることが可能であり得、例えば、発現についてはヒト細胞で維持され、クローニング及び増幅については原核生物宿主において維持される。「発現」という用語は、ＲＮＡ及びタンパク質の生成、ならびに必要に応じてタンパク質の分泌に関与する細胞プロセスを指し、こうした細胞プロセスには、限定はされないが、例えば、転写、転写物のプロセシング、翻訳、ならびにタンパク質のフォールディング、修飾、及びプロセシングが必要に応じて含まれる。「発現産物」は、遺伝子から転写されるＲＮＡと、遺伝子から転写されるｍＲＮＡが翻訳されることによって得られるポリペプチドと、を含む。「遺伝子」という用語は、適切な制御配列に機能可能なように連結されると、インビトロまたはインビボでＲＮＡへと転写される核酸配列（ＤＮＡ）を意味する。遺伝子は、コード領域の上流に位置する領域及び下流に位置する領域を含む場合も含まない場合もあり得、こうした領域は、例えば、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列、及び３’ＵＴＲまたは「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）である。
【０１５６】
本明細書で使用される「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の要素を少なくとも１つ含み、ウイルスベクター粒子へとパッケージングされる能力を有する核酸ベクターコンストラクトを指す。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の代わりに、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸を含み得る。ベクター及び／または粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで任意の核酸を細胞に導入する目的で利用され得る。当該技術分野では多くの形態のウイルスベクターが知られている。
【０１５７】
「組換えベクター」は、インビボで発現する能力を有する異種核酸配列または「導入遺伝子」を含むベクターを意味する。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載のベクターは、他の適切な組成物及び治療と併用できることを理解されたい。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ベクターは、エピソームである。適切なエピソームベクターを使用することによって、対象または細胞において目的ヌクレオチドを染色体ＤＮＡ外に高コピー数で維持する手段が得られ、それによって、染色体への組み込み作用が生じる可能性が除去される。
【０１５８】
「統計学的に有意な」または「有意に」という用語は、統計学的有意性を指し、一般に、２標準偏差（２ＳＤ）以上の差異を意味する。
【０１５９】
操作実施例または別段の記載がある場合を除き、本明細書で使用される成分の量または反応条件を示す数はすべて、「約」という用語によっていかなる場合も修飾されると理解されたい。「約」という用語は、割合との関連で使用されるとき、±１％を意味し得る。
【０１６０】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、組成物、方法、及び方法または組成物に必要不可欠なそのそれぞれの構成要素（複数可）に関して使用され、必要不可欠であるか否かを問わず、不特定の要素を含むことを依然として許容する。
【０１６１】
「からなる」という用語は、本明細書に記載の組成物、方法、及びそのそれぞれの構成要素を指し、実施形態のその説明に記載されない要素はいずれも、こうしたものには含まれない。
【０１６２】
本明細書で使用される「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、その実施形態の基本的かつ新規または機能的な特性（複数可）に実質的に影響を与えない要素の存在を許容する。
【０１６３】
本明細書で使用される「に対応する」という用語は、第１のポリペプチドもしくは核酸において列挙される位置に存在するアミノ酸もしくはヌクレオチドを指すか、または第２のポリペプチドもしくは核酸において列挙されるアミノ酸もしくはヌクレオチドに相当するアミノ酸もしくはヌクレオチドを指す。列挙されるアミノ酸またはヌクレオチドに相当するものは、当該技術分野において知られる相同性度プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）を使用して候補配列のアライメントをとることによって決定できる。
【０１６４】
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」という単数形の用語は、文脈上明確に別に示されない限り、複数の参照対象を含む。同様に、「または」という言葉は、文脈上明確に別に示されない限り、「及び」を含むことが意図される。本開示の実施または試験においては、本明細書に記載のものと同様または同等の方法及び材料を使用することができるが、以下には適切な方法及び材料が記載される。「例えば（ｅ．ｇ．）」という略語は、例えば（ｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａ）というラテン語に由来しており、非限定的な例を示すために本明細書で使用される。したがって、「例えば（ｅ．ｇ．）」という略語は、「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」という用語と同義である。
【０１６５】
本明細書に別段の定義がない限り、本出願と関連して使用される科学用語及び専門用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、及び試薬などに限定されず、したがって、こうしたものは異なり得ると理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態のみの説明を目的とし、本発明の範囲の限定は意図されておらず、本発明は、特許請求の範囲によってのみ定義される。免疫学及び分子生物学の一般用語の定義は、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ  ＆  Ｄｏｈｍｅ  Ｃｏｒｐ．により刊行，２０１１（ＩＳＢＮ９７８−０−９１１９１０−１９−３）、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．により刊行，１９９９−２０１２（ＩＳＢＮ９７８３５２７６００９０８）、及びＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により刊行，１９９５（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｂｙ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｌｕｔｔｍａｎｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒにより刊行，２００６、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ  Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ  Ｗｅａｖｅｒ（ｅｄｓ．），Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ０８１５３４５３０５、９７８０８１５３４５３０５）、Ｌｅｗｉｎ’ｓ  Ｇｅｎｅｓ  ＸＩ，Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓにより刊行，２０１４（ＩＳＢＮ−１４４９６５９０５５）、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ１９３６１１３４１４）、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ０４４４６０１４９Ｘ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ  Ｌｏｒｓｃｈ（ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ０１２４１９９５４２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ０４７１５０３３８Ｘ、９７８０４７１５０３３��５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５、ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ  Ｍ  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ  Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅ，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ０４７１１４２７３５、９７８０４７１１４２７３７）において見つけることができ、これらの文献の内容はすべて、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
他の用語は、本発明のさまざまな態様の説明に含めて本明細書に定義される。
【０１６７】
参考文献、交付済特許、刊行済特許出願、及び同時係属中の特許出願を含めて、本出願を通じて引用される特許及び他の刊行物はすべて、例えば本明細書に記載の技術と関連して使用され得るそのような刊行物に記載の方法論を説明及び開示することを目的として、参照によって本明細書に明確に組み込まれる。こうした刊行物は、単に、本出願の出願日より前のその開示内容が提供されているにすぎない。この点に関して、先行発明であるという理由または任意の他の理由によってそのような開示に先行する権利が本発明者らに付与されないことを承認するものとして決して解釈されるべきではない。日付に関する記載またはこうした文書の内容に関する表現はすべて、本出願人らが利用可能な情報に基づいており、こうした文書の日付または内容の正確性に関するいかなる承認にもならない。
【０１６８】
本開示の実施形態の説明は、完全に網羅されたものであることも、開示される正確な形態に本開示を限定することも意図されない。本開示の特定の実施形態及び本開示の実施例は、例示を目的として本明細書に記載されており、当業者なら認識するであろうが、本開示の範囲内でさまざまな同等の改変形態が可能である。例えば、方法段階または機能は、所与の順序で示されるが、代替の実施形態では、異なる順序で機能が発揮され得るか、または機能は、実質的に同時に発揮され得る。本明細書で提供される本開示の教示内容は、必要に応じて他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載のさまざまな実施形態を組み合わせることで別の実施形態を得ることができる。本開示の態様は、必要であれば改変して上記の参考文献及び出願の組成物、機能、及び概念を利用することで、本開示の別の実施形態をさらに得ることができる。さらに、生物学的機能的同等性を考慮すると、生物学的または化学的な作用に本質的または全体的に影響を与えることなく、タンパク質構造に何らかの変更を施すことができる。説明が詳細であることを踏まえると、本開示に対してこうした変更及び他の変更を施すことができる。そのような改変はすべて、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０１６９】
前述の実施形態のいずれかの特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わせるか、または他の実施形態の要素の代わりに使用することができる。さらに、本開示のある特定の実施形態と関連する利点は、こうした実施形態と関連して説明されている一方で、他の実施形態もまた、そのような利点を示し得るが、本開示の範囲に含まれるために必ずしもすべての実施形態がそのような利点を示す必要があるわけではない。
【０１７０】
本明細書に記載の技術は、下記の実施例によってさらに例示されるが、こうした実施例は、いかなる様式においても限定の追加であると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１７１】
実施例１：ボツリヌス神経毒素の活性を測定するための、新規のインビトロアッセイ及び細胞ベースのアッセイ
【０１７２】
ボツリヌス神経毒素は、７つの細菌毒素（ＢｏＮＴ／Ａ〜Ｇ）のファミリーである。ボツリヌス神経毒素は、カテゴリーＡの６つある潜在的バイオテロ物質のうちの１つである。こうした毒素は、医学的状態の治療にも広く使用されていると共に、こうした毒素で治療される医学的状態は増加中であり、その市場規模は、２０億ドルを超えている。ＢｏＮＴの検出及び特徴付けは、古典的なマウス致死量（ＬＤ５０）アッセイに依存している。バイオテロ防御の目的からも、医薬品を開発するためにも、より簡便、高感度、かつ正確なインビトロアッセイ及び細胞ベースのアッセイで動物アッセイを置き換える必要性が高まっている。
【０１７３】
毒素活性を検出及び特徴付けるためのインビトロアッセイが開発されているが、現在利用可能なものの感度はさまざまである。商業化された主なアッセイは２つ存在しており、それらは両方共、毒素の酵素ドメインによって基質が切断されたことを蛍光で検出することに基づくものである。これらのアッセイの１つ目は、ＳＮＡＰｔｉｄｅ（商標）（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）であり、このアッセイでは、ＢｏＮＴの天然の切断部位を含み、２つの蛍光色素で標識された合成ペプチドが使用される。蛍光シグナルは２つの色素間で通常は消光しており、ＢｏＮＴによってペプチドが切断されるとシグナルが上昇する。２つ目のアッセイは、ＢｏＴｅｓｔ（商標）（ＢｉｏＳｅｎｔｉｎｅｌ  ＬＬＣ）である。ペプチド配列を介してシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）が黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）に連結されたものである。ＣＦＰとＹＦＰとの間で生じる検出可能な蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が、ＢｏＮＴによってリンカーが切断されると消失する。
【０１７４】
毒素を検出し、毒素活性を特徴付けるための高感度かつ簡便な方法を両方のアッセイが提供しており、これらのアッセイは、現在、研究室において広く使用されている。これらアッセイの重大な欠点は、毒素の医薬品及び臨床試料に高レベルで存在する血清アルブミンタンパク質による干渉をこれら蛍光アッセイが受けやすいことである。これらの蛍光アッセイを行う前に特異的な毒素抗体でこうした試料から毒素を除去して精製することが現在の解決策であるが、この解決策では、アッセイコストが著しくかさみ、入手困難な特殊な物質（毒素抗体）が必要となる。
【０１７５】
現在のところ、毒素活性を定量化するために毎年多くのマウスが製薬会社によって利用されている。ＢｏＮＴの生産における動物の使用を低減するために、細胞ベースのアッセイを開発してマウスバイオアッセイを置き換える必要性が高まっている。細胞ベースのアッセイによって、受容体への結合、膜転位、及び酵素活性を含めて、毒素活性のすべての性状を調べる能力が得られる。こうした性状は、いずれのインビトロアッセイによってもとらえられないものである。現在のところ、細胞ベースのアッセイは、主要な製薬会社（Ａｌｌｅｒｇａｎ）によってよく確立されたものが１つ存在するのみである。このアッセイは、ＢｏＮＴ／Ａによって切断されたＳＮＡＰ−２５タンパク質を認識するモノクローナル抗体を使用することに基づくＥＬＩＳＡ型のアッセイである。簡潔に記載すると、ＢｏＮＴ／Ａに細胞が曝露された後、切断ＳＮＡＰ−２５のみを認識するが、全長タンパク質は認識しない特殊な抗体によって切断ＳＮＡＰ−２５がプルダウンされ、固定化される。その後、第２のＳＮＡＰ−２５抗体によって固定化ＳＮＡＰ−２５が検出される。このアッセイからは、良好な感度が得られており、このアッセイは、マウスアッセイを置き換え得る可能性を有している。このアッセイは、毒素製品の定量化を目的としてＦＤＡによって認可されている。Ａｌｌｅｒｇａｎによって生成される特殊な抗体に依存することがこのアッセイの主な欠点である。
【０１７６】
開発中の代替アッセイには、細胞においてＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰを基質として使用するもの（ＢｉｏＳｅｎｔｉｎｅｌ  ＬＬＣ）が含まれる。細胞においてこの融合タンパク質が切断されると、ＣＦＰとＹＦＰとの間で生じるＦＲＥＴシグナルが消失する。このアッセイにおいても、蛍光顕微鏡などの複雑な機器が必要になることが主な欠点である。
【０１７７】
インビトロ及びインビボでＢｏＮＴの活性を検出及び測定するために開発された新たなアッセイについて本明細書に記載される。このアッセイは、分断形態のルシフェラーゼの開発に基づいている。ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼは、優れたタンパク質安定性を有し、発光シグナルが大幅に増加（古典的なホタルルシフェラーゼと比較して＞１００倍の上昇）した新世代のルシフェラーゼである。このルシフェラーゼは、２つの断片に分断することができる。これら２つの断片は、互いに接近すると、発光シグナルを生成する完全な活性形態へと戻ることができる。これら２つの断片が互いに分離されると発光シグナルが消失する。図１に示される例示の実施形態では、毒素基質（ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ、及びＢｏＮＴ／ＣについてはＳＮＡＰ−２５、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇについてはシナプトブレビン）に由来するリンカー領域がＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼの２つの断片の間に挿入されている。ＢｏＮＴによってこのリンカー領域が切断されると、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼの２つの断片が分離され、その活性が消失する結果、発光シグナルが減少する。この手法の実現可能性を示すために、下記の毒素センサーを設計し、試験した。
【０１７８】
インビトロ毒素センサー：
異なるインビトロプロトタイプ毒素センサーを３つ創出し、試験した（図２Ａ〜図２Ｂ、図３Ａ〜図３Ｂ）。第１のセンサーは、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｅ、及びＢｏＮＴ／Ｃが切断できるＳＮＡＰ−２５断片を２つの分断型ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）断片（それぞれＮ−ｎａｎｏ及びＣ−ｎａｎｏ、図２Ａ〜図２Ｂ）の間に含む。第２のセンサーは、毒素受容体として働くＳＶ２Ｃの断片を追加で含んでおり、この断片を含むことで、毒素とセンサーとの間の相互作用が増進することによって切断効率が高まり得る。第３のバージョンは、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ、及びＢｏＮＴ／Ｇが切断できるシナプトブレビン断片を含む（図３Ａ〜図３Ｂ）。
【０１７９】
これらのセンサータンパク質は、組換えタンパク質として精製した。ＢｏＮＴ／Ａの濃度勾配系列と共に２つのバージョンのＳＮＡＰ−２５含有センサーを４時間または２４時間インキュベートした。残存ルシフェラーゼ活性を測定し、図２Ａに示されるようにプロットした。対照として、ＢｏＮＴ／Ｂがこれら２つのセンサーのルシフェラーゼ活性に影響を与えなかったことが明らかとなり、このことは、これら２つのセンサーがＢｏＮＴ／Ａに特異性を有することを示している。図２Ｂに示されるように、ＳＶ２Ｃ断片を含むセンサーは、４時間のインキュベートの後に９．７ｐＭのＥＣ５０を有している。このセンサーは、ＳＶ２Ｃを含まないセンサーと比較して約５倍高感度であり、このことは、毒素受容体の断片を含めることで毒素センサーの感度が向上し得ることを示している。
【０１８０】
ＢｏＮＴ／Ｂの濃度勾配系列と共に第３のセンサータンパク質をインキュベートした。残存ルシフェラーゼ活性を測定し、図３Ａに示されるようにプロットした。ＥＣ５０は、図３Ｂに示されており、４時間のインキュベート後では約７５．７ｐＭである。センサーと共に毒素を２４時間インキュベートすると、ＥＣ５０は３．９ｐＭへと顕著に改善した。
【０１８１】
利用可能なインビトロセンサーと比較したときの利点：
ルシフェラーゼに基づくこうした毒素センサーからは、蛍光に基づくセンサーと同様の感度が得られる。分断型ルシフェラーゼに基づくこうしたセンサーの主な利点は、血清アルブミンタンパク質の存在によってこうしたセンサーが影響を受けないことである。
【０１８２】
細胞ベースのアッセイ：
細胞ベースのアッセイのためのセンサーの例示の実施形態は、図４に示される。この実施形態は、分断型ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼ断片の間に全長ＳＮＡＰ−２５を含む。さらに、この実施形態は、Ｎ−ｎａｎｏとＳＮＡＰ−２５との間にホタルルシフェラーゼも含んでおり、このホタルルシフェラーゼは、細胞におけるセンサータンパク質の発現レベルに対する内部標準となる。このセンサータンパク質は、レンチウイルス介在性の感染を介して神経細胞において発現する。その後、さまざまな濃度のＢｏＮＴ／Ａに神経細胞を曝露した。４８時間後に細胞溶解液を収集し、ホタルルシフェラーゼとＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼとの両方のルシフェラーゼ活性を測定した。ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのレベルは、ホタルルシフェラーゼシグナルを使用して正規化され、次に、いずれの毒素にも曝露されなかった対照神経細胞に正規化される（図４）。毒素と共に神経細胞をインキュベートすると、ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼのシグナルは減少し（図４）、ＥＣ５０は、２．９ｐＭであった。
【０１８３】
利用可能な細胞ベースのアッセイと比較したときの利点：
本明細書に記載のアッセイからは、Ａｌｌｅｒｇａｎによって確立されたＥＬＩＳＡベースのアッセイと同様の感度が得られる。本アッセイの主な利点は、本アッセイではいずれの特殊な抗体も必要ないことである。本アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイと比較して、より簡単、安価、かつ迅速でもある。
【０１８４】
本明細書に記載の毒素センサー及び細胞ベースのアッセイは、製薬会社がＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂの活性を測定及び定量化する、より迅速、安価、かつ簡便な方法を提供することで、マウスバイオアッセイを置き換える可能性があることが本明細書で特に企図される。
【０１８５】
ＢｏＮＴを検出するためのインビトロコンストラクト及びインビボコンストラクト：
ＢｏＮＴ／Ａの検出については、ＮｏｃＩ／ＮｏｔＩを有するｐＥＴ２８ａベクターにコンストラクトをクローニングし、Ｎｎａｎｏ−ＳＶ２Ｃ（５２９−５６６）−Ｇ４Ｓ−ＳＮＡＰ２５（１４１−２０６）−Ｃｎａｎｏ及びＮｎａｎｏ−ＳＮＡＰ２５（１４１−２０６）−Ｃｎａｎｏ（「Ｇ４Ｓ」は、配列番号６として開示のものである）を挿入断片とした。分断型ＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼ配列は、Ｐｒｏｍｅｇａから利用可能である。全挿入断片を得るためにオーバーラップＰＣＲを使用した後、挿入断片を切断ベクターにライゲーションした。ＢｏＮＴ／Ｂの検出については、Ｎｎａｎｏ−ＶＡＭＰ（３５−９６）−Ｃｎａｎｏをコンストラクトとした。
【０１８６】
ＢｏＮＴ／Ａのインビボでの検出については、分断型ホタルまたは分断型ＮＡＮＯＬＵＣのいずれかを使用してコンストラクトを設計した後、内部標準としてウミシイタケ及びホタルを別に適用した。内部標準は、ＳＮＡＰ２５（全長）のすぐ上流に位置する。ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１及びｓｙｎ−ｌｏｘレンチウイルスベクターに基づくものを使用した。
【０１８７】
インビトロアッセイコンストラクトのクローニング
センサー１：ＮＮａｎｏ−ＳＶ２Ｃ−ｐ２５−ＣＮａｎｏ
2019532651.tif 000012
2019532651.tif 000013
は、配列番号４として開示のものであり、
“ＧＧＧＧＳ”は、配列番号６として開示のものであり、
2019532651.tif 000014
は、配列番号５として開示のものであり、
“Ｈｉｓ６”は、配列番号１２として開示のものである。）
【０１８８】
センサー２：ＮＮａｎｏ−ｐ２５−ＣＮａｎｏ
2019532651.tif 000015
2019532651.tif 000016
は、配列番号４として開示のものであり、
2019532651.tif 000017
は、配列番号５として開示のものであり、
“Ｈｉｓ６”は、配列番号１２として開示のものである。）
【０１８９】
センサー３：ＮＮａｎｏ−ｈＶＡＭＰ１−ＣＮａｎｏ
2019532651.tif 000018
2019532651.tif 000019
は、配列番号４として開示のものであり、
2019532651.tif 000020
は、配列番号５として開示のものであり、
“Ｈｉｓ６”は、配列番号１２として開示のものである。）
【０１９０】
インビボアッセイコンストラクトのクローニング
2019532651.tif 000021
（“ＧＧＧＧＳ”は、配列番号６として開示のものであり、
2019532651.tif 000022
は、配列番号５として開示のものである。）
【０１９１】
インビトロアッセイのためのセンサータンパク質のＩＭＡＣ精製
固定化金属親和性カラム（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｏｌｕｍｎ）（ＩＭＡＣ）を使用してセンサータンパク質の異なるコンストラクトを精製した。Ｃ末端に配置されるようにＨｉｓ６タグ（配列番号１２）をｐＥＴ２８ａベクターにクローニングした。インビトロコンストラクトの正しいプラスミドを含むＢＬ２１を植菌して一晩保持し、光学濃度（Ｏ．Ｄ．）がおよそ０．６〜０．８となるまで３７℃で培養した後、２０℃で一晩、０．２５ｍＭ（最終濃度）のＩＰＴＧで誘導をかけた。４５００ｇで１０分間遠心分離することによって細胞を収集した。その後、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．４）に細胞のペレットを溶解した後、超音波で３分間処理した。細胞溶解液の上清を回収し、４℃で回転させながらＮｉ２＋ビーズと共に１時間混合した。その後、混合物をカラムに負荷し、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．４）に含めた２０ｍＭのイミジゾール（Ｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）を使用し、カラム総容量の１０倍量で樹脂を洗浄した。最終的に、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．４）に含めた５００ｍＭのイミジゾール（Ｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）を使用し、カラム総容量の４倍量でタンパク質を溶出した。アッセイの即時実施のために、精製センサータンパク質を透析して５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む緩衝液（ｐＨ７．１）に含めた。
【０１９２】
毒素を検出するインビトロアッセイ
標準ＢＳＡを参照として使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってセンサータンパク質の濃度を推定した。５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０μＭのＺｎＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む緩衝液（ｐＨ７．１）において３０ｎＭのセンサータンパク質を調製した。ボツリヌス毒素Ａを希釈し、１ｎＭ〜１ｆＭの１０倍希釈濃度系列としてセンサータンパク質溶液に添加した。３７℃で４時間及び２４時間インキュベートした後、それぞれの試料に対して等量のＮａｎｏ−Ｇｌｏ（商標）基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。発光シグナルは、プレートリーダーで測定した。アッセイは、２連で実施した。負の対照も設計して実施した。ＢｏＮＴ／Ａは、Ｎｎａｎｏ−ＶＡＭＰ−Ｃｎａｎｏセンサータンパク質と混合し、ＢｏＮＴ／Ｂは、Ｎｎａｎｏ−ＳＶ２Ｃ−ｐ２５−Ｃｎａｎｏセンサータンパク質と混合した。
【０１９３】
毒素を検出するインビボアッセイ（細胞ベースのアッセイ）
二重ルシフェラーゼコンストラクト（内部標準としてのホタル及び切断を検出するための分断型ＮＡＮＯＬＵＣ（商標））のウイルスを７日目の神経細胞に添加した後、３００ｐＭ〜１ｐＭの濃度系列のボツリヌス毒素Ａを１３日目の神経細胞に３連で添加した。毒素を４８時間負荷した後、２００μｌの受動溶解緩衝液（ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加することによって神経細胞を溶解し、室温で２０分間インキュベートした。５０μｌのホタルルシフェラーゼ基質（ＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ＥＸ試薬）と５０μｌの細胞溶解液を混合し、光の放出を測定した。その後、５０μｌのＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼ基質（ＮａｎｏＤＬＲ（商標）Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ（登録商標）試薬）を添加し、光の放出を測定した。
【０１９４】
2019532651.tif 000023
【図１】
2019532651.tif 000026
【図２】
2019532651.tif 000027
【図３】
2019532651.tif 000028
【図４】
2019532651.tif 000029
【配列表】
2019532651000001.app
【国際調査報告】
2019532651.tif 000030
2019532651.tif 000031
2019532651.tif 000032
2019532651.tif 000033
2019532651.tif 000034