(57)【要約】  抗ＰＶＲＩＧおよび抗ＴＩＧＩＴ抗体が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴＩＧＩＴ（配列番号９７）に結合する抗原結合ドメインを含む組成物であって、
ａ）配列番号１６０を含む可変重鎖ドメインと、
ｂ）配列番号１６５を含む可変軽鎖ドメインと、を含む、組成物。
【請求項２】
前記組成物が、
ａ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖であって、前記ＶＨが配列番号１６０を含む、重鎖と、
ｂ）ＶＬ−ＶＣを含む軽鎖であって、前記ＶＬが配列番号１６５を含み、ＶＣがカッパまたはラムダのいずれかである、軽鎖と、を含む抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
配列前記ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４、ならびにそのバリアントから選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記重鎖が配列番号１６４を有し、前記軽鎖が配列番号１６９を有する、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
ヒトチェックポイント受容体タンパク質に結合する第２の抗体をさらに含む、請求項２〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記第２の抗体がヒトＰＤ−１に結合する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記第２の抗体がヒトＰＶＲＩＧ（配列番号２）に結合する、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記第２の抗体が、配列番号５を含む可変重鎖ドメインと、配列番号１０を含む可変軽鎖ドメインと、を含む、抗原結合ドメインを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記第２の抗体の前記重鎖が配列番号９を有し、前記第２の抗体の前記軽鎖が配列番号１４を有する、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
ａ）配列番号１６０を含む可変重鎖ドメインをコードする第１の核酸と、
ｂ）配列番号１６５を含む可変軽鎖ドメインをコードする第２の核酸と、を含む、核酸組成物。
【請求項１１】
前記第１の核酸が、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖をコードし、前記ＶＨが配列番号１６０を含み、前記第２の核酸が、ＶＬ−ＶＣを含む軽鎖をコードし、前記ＶＬが配列番号１６５を含み、ＶＣがラムダドメインである、請求項１０に記載の核酸組成物。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、請求項１０または１１に記載の前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターとをそれぞれ含む、発現ベクター組成物。
【請求項１３】
請求項１０または１１に記載の前記第１の核酸と、請求項１０または１１に記載の前記第２の核酸と、をそれぞれ含む発現ベクターを含む、発現ベクター組成物。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の前記発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
【請求項１５】
抗ＴＩＧＩＴ抗体の作製方法であって、
ａ）請求項１４に記載の前記宿主細胞を、前記抗体が発現される条件下で培養することと、
ｂ）前記抗体を回収することと、を含む、方法。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、Ｔ細胞を活性化させることによる癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｉ．関連出願
本出願は、２０１６年８月１７日に出願された米国出願第６２／３７６，３３４号、２０１７年６月１日に出願された米国出願第６２／５１３，７７１号、２００６年８月１７日に出願された米国出願第６２／３７６，３３５号、２０１６年１１月３日に出願された米国出願第６２／４１７，２１７号、２０１７年６月１日に出願された米国出願第６２／５１３，７７５号、２０１７年３月２８日に出願された米国出願第６２／４７７，９７４号、２０１７年６月１日に出願された米国出願第６２／５１３，９１６号、および２０１７年７月２８日に出願された米国出願第６２／５３８，５６１号の優先権を主張するものであり、これらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。該ＡＳＣＩＩコピーは、２０１７年８月１７日に作成され、１１４３８６−５００８−ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で５９０，４３６バイトのサイズである。
【０００３】
ＩＩ．発明の背景
ナイーブＴ細胞は、生産的に活性化されるには抗原提示細胞（ＡＰＣ）から２つの独立したシグナルを受け取らなければならない。第１のシグナル１は、抗原特異的であり、Ｔ細胞抗原受容体がＡＰＣ上の適切な抗原−ＭＨＣ複合体に出会うと生じる。免疫応答の運命は、そのＡＰＣで発現されるリガンドに結合するＴ細胞共刺激分子を介して送達される、第２の抗原非依存性シグナル（シグナル２）によって決定付けられる。この第２のシグナルは、刺激性（正の共刺激）または抑制性（負の共刺激または共抑制）のいずれかであり得る。共刺激シグナルの不在下、または共抑制シグナルの存在下では、Ｔ細胞活性化は損なわれるかまたは中断され、これが抗原特異的不応答性（Ｔ細胞アネルギーとして知られる）状態につながり得るか、またはＴ細胞アポトーシス死をもたらし得る。
【０００４】
共刺激分子対は通常、ＡＰＣ上で発現されるリガンドおよびＴ細胞上で発現されるそれらの同種の受容体からなる。共刺激分子のリガンド／受容体対の原型は、Ｂ７／ＣＤ２８およびＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌである。Ｂ７ファミリーは、免疫応答への刺激性または抑制性入力を提供し得る、構造的に関連する細胞表面タンパク質リガンドからなる。Ｂ７ファミリーのメンバーは、構造的に関連しており、このうち細胞外ドメインが、少なくとも１つの可変または定常免疫グロブリンドメインを含有する。
【０００５】
正および負の共刺激シグナルは両方とも、細胞媒介性免疫応答の調節において必要不可欠な役割を果たし、これらのシグナルを媒介する分子は、免疫調節の有効な標的であることが判明している。この知識に基づいて、共刺激分子を標的とすることを伴ういくつかの治療的アプローチが開発されてきており、がんの予防および治療において、がん患者における免疫応答をオンにすること、または免疫応答がオフになるのを予防することによって有用であること、また、自己免疫疾患および炎症性疾患の予防および治療、ならびに同種移植拒絶に対しても、それぞれ、これらの病的状態を有する対象における無制御な免疫応答をオフにすることによって、または負の共刺激（または共抑制）による「オフシグナル」の誘導によって、有用であることが示される。
【０００６】
Ｂ７リガンドによって送達されるシグナルの操作は、自己免疫疾患、炎症性疾患、および移植片拒絶の治療において有望性を示してきた。治療的戦略には、共刺激対のリガンドもしくは受容体に対するモノクローナル抗体を用いた、またはその適切なリガンドに結合しそれを遮断し得る共刺激受容体から構成される可溶性融合タンパク質を用いた、共刺激の遮断が含まれる。別のアプローチは、阻害リガンドの可溶性融合タンパク質を用いた共阻害の誘導である。これらのアプローチは、共刺激（これは細胞生存遺伝子を誘導する）の不在下でＴ細胞がアポトーシス誘導の影響を高度に受けやすくなることを恐らくは理由とする、自己反応性または同種反応性Ｔ細胞（これは、それぞれ自己免疫疾患または移植における病的過程に関与する）の最終的な除去に少なくとも部分的に依存する。故に、病原体から防御する免疫系の能力を損なうことなく共刺激シグナルを調節することが可能である新規の薬剤が、かかる病的状態の治療および予防に大いに有利である。
【０００７】
共刺激経路は、腫瘍発達において重要な役割を果たす。興味深いことに、腫瘍は、Ｂ７−ＣＤ２８およびＴＮＦファミリーにおける共刺激因子の抑制を通してＴ細胞活性化を妨げることによって、ならびに調節Ｔ細胞を誘引することで抗腫瘍Ｔ細胞応答を抑制することによって、免疫による破壊を回避することが示されてきた（Ｗａｎｇ（２００６），“Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｔｕｍｏｒ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ４＋Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ”，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｂｉｏｌ．１６：７３−７９、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００５），“Ｔｈｅ  Ｂ７  Ｆａｍｉｌｙ  Ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ”，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：５１５−４８、Ｗａｔｔｓ（２００５），“ＴＮＦ／ＴＮＦＲ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒｓ  ｉｎ  Ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ”，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２３−６８、Ｓａｄｕｍ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）“Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒｓ  Ｒｅｖｅａｌ  Ｕｎｉｑｕｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｅｓｃａｐｅ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．１３（１３）：４０１６−４０２５）。かかる腫瘍で発現される共刺激分子は、魅力的な癌バイオマーカーとなってきており、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）としての役目を果たし得る。さらに、共刺激経路が、Ｔ細胞依存性免疫応答を腫瘍転移内での開始およびエフェクター機能の両方のレベルで減弱する免疫チェックポイントとして特定されてきた。操作されたがんワクチンが改善され続けるにつれて、かかる免疫チェックポイントが、治療的な抗腫瘍応答を誘導するワクチンの能力に対する主要な障壁であることが明白になりつつある。この点において、共刺激分子は、免疫寛容を阻止し、免疫系を刺激するための戦略を提供する、能動的（ワクチン接種）および受動的（抗体媒介性）がん免疫療法のための免疫賦活剤としての役目を果たすことができる。
【０００８】
過去１０年間にわたって、種々の共刺激タンパク質に対する作用物質および／または拮抗物質が、自己免疫疾患、移植片拒絶、アレルギー、およびがんの治療のために開発されてきた。例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ａｂａｔａｃｅｐｔ、Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））はＲＡの治療のために、突然変異ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ｂｅｌａｔａｃｅｐｔ、Ｎｕｌｏｊｉｘ（登録商標））は急性腎臓移植拒絶の予防のために承認され、抗ＣＴＬＡ４抗体（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））においては、黒色腫の治療のために最近承認されている。Ｍｅｒｃｋ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））およびＢＭＳ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））の抗ＰＤ−１抗体等の、他の共刺激調節因子が承認されてきており、がん治療のために承認されてきており、またウイルス感染に対しても試験段階にある。
【０００９】
しかしながら、抗チェックポイント阻害剤抗体を用いた単剤療法が有望となってきた一方で、いくつかの研究（Ａｈｍａｄｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１４：１５３７（２００９）、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０７（１７）：７８７５−７８８０（２０１０）、Ｆｏｕｒｃａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７２（４）：８８７−８９６（２０１２）およびＧｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔ．１２４（５）：２２４６（２０１４））は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が一般に複数のチェックポイント受容体を発現することを示している。さらに、複数のチェックポイントを発現するＴＩＬが、実際には腫瘍反応性が最も高い可能性がある。対照的に、末梢における非腫瘍反応性Ｔ細胞は、単一のチェックポイントを発現する可能性がより高い。単一特異性の完全長抗体によるチェックポイントの遮断は、自己免疫毒性に寄与すると想定される自己抗原反応性の単一発現Ｔ細胞と比較して、腫瘍反応性ＴＩＬの脱抑制に関して非差別的である可能性が高い。
【００１０】
関心対象の１つはＰＶＲＩＧである。ＰＶＲＩＧは、ポリオウイルス受容体関連免疫グロブリンドメイン含有タンパク質（Ｑ６ＤＫＩ７またはＣ７ｏｒｆ１５）とも称され、シグナルペプチド（アミノ酸１〜４０に及ぶ）、細胞外ドメイン（アミノ酸４１〜１７１に及ぶ）、膜貫通ドメイン（アミノ酸１７２〜１９０に及ぶ）および細胞質ドメイン（アミノ酸１９１〜３２６に及ぶ）を含む、３２６アミノ酸長の膜貫通ドメインタンパク質である。ＰＶＲＩＧは、ＰＶＲＩＧの結合パートナーである、ポリオウイルス受容体関連２タンパク質（ＰＶＬＲ２、別名ネクチン−２、ＣＤ１１２またはヘルペスウイルス侵入メディエーターＢ、（ＨＶＥＢ））に結合する。
【００１１】
別の関心対象はＴＩＧＩＴである。ＴＩＧＩＴは、エフェクター＆調節（Ｔｒｅｇ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞上で高度に発現される共阻害受容体である。ＴＩＧＩＴは、（１）直接シグナル伝達、（２）リガンドシグナル伝達の誘導、ならびに（３）共刺激受容体ＣＤ２２６（別名ＤＮＡＭ−１）によるシグナル伝達との競合およびその妨害によって免疫応答を減弱させることが示されている。ＴＩＧＩＴシグナル伝達は、ＮＫ細胞において最もよく研究されており、その同族リガンドであるポリオウイルス受容体（ＰＶＲ、別名ＣＤ１５５）との結合が細胞質ＩＴＩＭドメインを介してＮＫ細胞の細胞傷害性を直接抑制することが実証されている。ＴＩＧＩＴ遺伝子のノックアウトまたはＴＩＧＩＴ／ＰＶＲ相互作用の抗体遮断は、インビトロでのＮＫ細胞殺傷を増強すると共に、インビボでの自己免疫疾患を悪化させることが示されている。Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対するその直接的な影響に加えて、ＴＩＧＩＴは、樹状細胞または腫瘍細胞におけるＰＶＲ媒介性シグナル伝達を誘導し得、これがＩＬ１０等の抗炎症性サイトカインの産生の増加につながる。Ｔ細胞において、ＴＩＧＩＴはまた、共刺激受容体ＣＤ２２６のホモ二量体化を妨害することによって、およびＰＶＲへの結合についてそれと競合することによって、リンパ球応答を阻害し得る。
【００１２】
ＴＩＧＩＴは、様々な種類の腫瘍に浸潤する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）およびＴｒｅｇを含むリンパ球で高度に発現される。ＰＶＲもまた、腫瘍において広く発現され、ＴＩＧＩＴ−ＰＶＲシグナル伝達軸ががんの優勢的な免疫逃避機構であり得ることを示唆している。注目すべきことに、ＴＩＧＩＴ発現は、別の重要な共阻害性受容体ＰＤ１の発現と密接に相関している。ＴＩＧＩＴおよびＰＤ１は、多数のヒトおよびマウスの腫瘍のＴＩＬ上で共発現される。ＴＩＧＩＴおよびＣＴＬＡ４とは異なり、Ｔ細胞応答のＰＤ１阻害は、共刺激受容体とのリガンド結合の競合を伴わない。
【００１３】
したがって、ＴＩＧＩＴは、モノクローナル抗体療法のための、さらには抗ＰＶＲＩＧ抗体を含む追加の抗体との組み合せにおいて魅力的な標的である。
【００１４】
ＩＩＩ．発明の概要
したがって、一態様において、本発明は、配列番号１６０を含む可変重鎖ドメインと、配列番号１６５を含む可変軽鎖ドメインとを含む、ヒトＴＩＧＩＴ（配列番号９７）に結合する抗原結合ドメインを含む組成物を提供する。さらに、抗原結合ドメインは、配列番号１５０を含む可変重鎖ドメインと、配列番号１５５を含む可変軽鎖ドメインとを含む。さらに、抗原結合ドメインは、配列番号５６０を含む可変重鎖ドメインと、配列番号５６５を含む可変軽鎖ドメインとを含む。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖であって、該ＶＨが配列番号１６０を含む、重鎖と、ＶＬ−ＶＣを含む軽鎖であって、該ＶＬが配列番号１６５を含み、ＶＣがカッパまたはラムダのいずれかである、軽鎖とを含む抗体を含む組成物を提供する。さらに、抗体は、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖であって、このＶＨが配列番号１５０を含む、重鎖と、ＶＬ−ＶＣを含む軽鎖であって、該ＶＬが配列番号１５９を含み、ＶＣがカッパまたはラムダのいずれかである、軽鎖とを含み得る。さらに、抗体は、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖であって、このＶＨが配列番号５６０を含む、重鎖と、ＶＬ−ＶＣを含む軽鎖であって、該ＶＬが配列番号５６５を含み、ＶＣがカッパまたはラムダのいずれかである、軽鎖とを含み得る。
【００１６】
いくつかの態様において、配列ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４、ならびにそのバリアントから選択される。いくつかの態様において、重鎖は配列番号１６４を有し、軽鎖は配列番号１６９を有する。
【００１７】
さらなる態様において、組成物は、ヒトＰＤ−１またはヒトＰＶＲＩＧであり得るヒトチェックポイント受容体タンパク質に結合する第２の抗体をさらに含み得る。第２の抗体は、配列番号５を含む可変重鎖ドメインと配列番号１０を含む可変軽鎖ドメイン、または配列番号９を含む重鎖と配列番号１４を含む軽鎖とを含む、抗原結合ドメインを含み得る。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、配列番号１６０を含む可変重鎖ドメインをコードする第１の核酸と、配列番号１６５を含む可変軽鎖ドメインをコードする第２の核酸とを含む、核酸組成物を提供する。代替的に、核酸組成物は、配列番号１５０を含む可変重鎖ドメインをコードする第１の核酸と、配列番号１５５を含む可変軽鎖ドメインをコードする第２の核酸とを含む。代替的に、核酸組成物は、配列番号５６０を含む可変重鎖ドメインをコードする第１の核酸と、配列番号５６５を含む可変軽鎖ドメインをコードする第２の核酸とを含む。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、これらの核酸組成物を含む発現ベクター組成物、例えば、第１の核酸を含む第１の発現ベクターおよび第２の核酸を含む第２の発現ベクター、または代替的に、第１の核酸および第２の核酸の両方を含む発現ベクターもまた提供される。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、発現ベクター組成物を含む宿主細胞、および抗体が産生される条件下で宿主細胞を培養することと、抗体を回収することとを含む、抗体の作製方法を提供する。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は、配列番号９を有する重鎖と、配列番号１４を有する軽鎖とを含む抗ＰＶＲＩＧ抗体を提供する。本発明は、配列番号１９を有する重鎖と、配列番号２４を有する軽鎖とを有する抗体をさらに提供する。
【００２２】
さらなる態様において、抗ＰＶＲＩＧ抗体（ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）またはＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐのいずれか）が、ヒトチェックポイント受容体タンパク質に結合する第２の抗体、例えば、ＰＤ−１に結合する抗体と共投与される。
【００２３】
さらなる態様において、抗ＰＶＲＩＧ抗体（ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）またはＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）のいずれかが、ヒトチェックポイント受容体タンパク質に結合する第２の抗体、例えば、ヒトＴＩＧＩＴに結合する抗体、例えば、ＣＰＡ．９．０８６またはＣＰＡ．９．０８３またはＣＨＡ．９．５４７．１３と共投与される。
【００２４】
さらなる態様において、本発明は、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）またはＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ））のいずれかの重鎖をコードする第１の核酸と、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）またはＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）のいずれかの軽鎖ドメインをコードする第２の核酸とを含む、核酸組成物を提供する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、これらの核酸組成物を含む発現ベクター組成物、例えば、第１の核酸を含む第１の発現ベクターおよび第２の核酸を含む第２の発現ベクター、または代替的に、第１の核酸および第２の核酸の両方を含む発現ベクターもまた提供される。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、発現ベクター組成物を含む宿主細胞、および抗体が産生される条件下で宿主細胞を培養することと、抗体を回収することとを含む、抗体の作製方法を提供する。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、ａ）患者からの腫瘍試料由来の細胞集団を提供することと、ｂ）該集団を、ｉ）ＴＩＧＩＴタンパク質、ｉｉ）ＰＶＲタンパク質、ｉｉｉ）ＰＤ−１タンパク質、ｉｖ）ＰＤ−Ｌ１タンパク質、およびｖ）アイソタイプ対照に結合する標識されたタンパク質で染色することと、ｃ）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を実行することと、ｄ）ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の各々について、該アイソタイプ対照抗体と比較してのこれらのタンパク質を発現する該集団における細胞のパーセンテージを決定することと、陽性細胞のパーセンテージが４つ全ての受容体について＞１％である場合、ｅ）ＴＩＧＩＴおよびＰＤ−１に対する抗体を該患者に投与することとを含む、方法を提供する。
【００２８】
さらなる態様において、本発明は、ａ）患者からの腫瘍試料由来の細胞集団を提供することと、ｂ）該集団を、ｉ）ＴＩＧＩＴタンパク質、ｉｉ）ＰＶＲＩＧタンパク質、ｉｉｉ）ＰＶＲＬ２タンパク質、ｉｖ）ＰＤ−Ｌ１タンパク質、およびｖ）アイソタイプ対照に結合する標識されたタンパク質で染色することと、ｃ）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を実行することと、ｄ）ＰＶＲＩＧ、ＰＶＲＬ２、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の各々について、該アイソタイプ対照抗体と比較してのこれらのタンパク質を発現する該集団における細胞のパーセンテージを決定することと、陽性細胞のパーセンテージが４つ全ての受容体について＞１％である場合、ｅ）ＰＶＲＩＧおよびＰＤ−１に対する抗体を該患者に投与することとを含む、方法を提供する。
【００２９】
さらなる態様において、本発明は、ａ）患者からの腫瘍試料由来の細胞集団を提供することと、ｂ）該集団を、ｉ）ＴＩＧＩＴタンパク質、ｉｉ）ＰＶＲＩＧタンパク質、ｉｉｉ）ＴＩＧＩＴタンパク質、ｉｖ）ＰＶＲタンパク質、およびｖ）アイソタイプ対照に結合する標識されたタンパク質で染色することと、ｃ）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を実行することと、ｄ）ＰＶＲＩＧ、ＰＶＲＬ２、ＴＩＧＩＴおよびＰＶＲの各々について、該アイソタイプ対照抗体と比較してのこれらのタンパク質を発現する該集団における細胞のパーセンテージを決定することと、陽性細胞のパーセンテージが４つ全ての受容体について＞１％である場合、ｅ）ＰＶＲＩＧおよびＴＩＧＩＴに対する抗体を該患者に投与することとを含む、方法を提供する。
ＩＶ．
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ヒトＰＶＲＩＧの完全長配列（２つの異なるメチオニン開始点を示す）を図示する。シグナルペプチドは下線が引かれ、ＥＣＤは二重下線が引かれている。
【図２】ＰＶＲＩＧの結合パートナーである、ヒトポリオウイルス受容体関連２タンパク質（ＰＶＬＲ２、別名ネクチン−２、ＣＤ１１２またはヘルペスウイルス侵入メディエーターＢ、（ＨＶＥＢ））の配列を図示する。ＰＶＬＲ２は、ヒト形質膜糖タンパク質である。
【図３】図３ＡおよびＢは、列挙される本発明のＣＨＡ抗体ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の各々の可変重鎖および軽鎖、ならびにｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３の配列を図示する。
【図４−Ｂ】ＰＶＲＩＧ抗体は、ＭＬＲにおけるＴ細胞増殖を増加させる。表示されるＰＶＲＩＧ抗体で処理したＭＬＲアッセイからのＣＦＳＥが低い細胞のパーセンテージが示される。各グラフは、１つの個々のＣＤ３Ｔ細胞ドナーを表す。実験は、参照により本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１５／０４８，９６７の実施例２３に記載されている。
【図５】図５ＡおよびＢ：ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧで操作された細胞株、ＨＥＫ親細胞、およびＪｕｒｋａｔ細胞に対するＰＶＲＩＧハイブリドーマ抗体結合特性。ＨＥＫ  ＯＥはＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞を表し、ＨＥＫ  ｐａｒはＨＥＫ親細胞を表す。Ｊｕｒｋａｔデータに関しては、ｇＭＦＩｒは、それらの対照と比較したＰＶＲＩＧ抗体染色の幾何ＭＦＩにおける倍率差異を示す。濃度は、ｇＭＦＩｒが算出された濃度を示す。結合なしとは、抗体が試験した細胞株に結合しないことを示す。ハイライトした抗体は、目的とする抗体の「上位４つ」である。
【図６】図６ＡおよびＢ：初代ヒトＰＢＭＣ、カニクイザル過剰発現細胞、およびカニクイザル初代ＰＢＭＣに対するＰＶＲＩＧハイブリドーマ抗体結合特性。ＥｘｐｉカニクイザルＯＥは、ｃＰＶＲＩＧで一過性でトランスフェクトされたｅｘｐｉ細胞を表し、ｅｘｐｉ  ｐａｒは、ｅｘｐｉ親細胞を表す。ｇＭＦＩｒは、それらの対照と比較したＰＶＲＩＧ抗体染色の幾何ＭＦＩにおける倍率差異を示す。濃度は、ｇＭＦＩｒが算出された濃度を示す。試験せずは、ヒトＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ、ｅｘｐｉ  ｃＰＶＲＩＧ細胞に対する結合の不在に起因して試験されなかったか、あるいはＰＢＭＣサブセットに対する結合要件を満たさなかった抗体を示す。ハイライトした抗体は、目的とする抗体の「上位４つ」である。実験は、参照により本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１５／０４８，９６７の実施例２１に記載されている。
【図７Ａ−Ｂ】ＦＡＣＳ系競合アッセイにおけるＰＶＲＩＧ抗体の遮断能力の概要。阻害のＩＣ５０が示される。ＩＣ５０なしとは、これらの抗体が遮断剤でないことを示す。ハイライトした抗体は、目的とする抗体の「上位４つ」である。実験は、参照により本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１５／０４８，９６７の実施例２１に記載されている。
【図８】図８Ａ〜Ｂ：ＴＩＬを、抗ＰＶＲＩＧ抗体（ＣＰＡ．７．０２１、１０ｕｇ／ｍｌ）、抗ＴＩＧＩＴ（１０Ａ７クローン、１０ｕｇ／ｍｌ）、または組み合わせの存在下で、黒色腫細胞６２４と共に１：１のエフェクター：標的で１８時間共培養した。上清を収集し、Ｔｈ１  Ｔｈ２  Ｔｈ１７サイトメトリービーズアレイアッセイにおいて試験して、分泌されたサイトカインを検出した。ＩＦＮγ（Ａ）およびＴＮＦ（Ｂ）レベルを検出した。処理を、３連試料のスチューデントｔ−検定（＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１）によって比較した。
【図９】図９Ａ〜Ｆ：ＭＡＲＴ−１または２０９  ＴＩＬを、抗ＰＶＲＩＧ抗体（ＣＰＡ．７．０２１、１０ｕｇ／ｍｌ）、抗ＤＮＡＭ１（ＤＸ１１クローン、１０ｕｇ／ｍｌ）、または組み合わせの存在下で、黒色腫細胞６２４と共に１：１のエフェクター：標的で１８時間共培養した。上清を収集し、Ｔｈ１  Ｔｈ２  Ｔｈ１７サイトメトリービーズアレイアッセイにおいて試験して、分泌されたサイトカインを検出した。ＩＦＮγ（Ａ、Ｄ）およびＴＮＦ（Ｂ、Ｅ）レベルを検出した。ＴＩＬをＣＤ１３７（Ｃ、Ｆ）の表面発現について染色した。
【図１０】図１０ＡおよびＢ：ＴＩＬ（Ｆ４）を、抗ＰＶＲＩＧ抗体（ＣＰＡ．７．０２１、１０ｕｇ／ｍｌ）、抗ＴＩＧＩＴ（１０Ａ７クローン、１０ｕｇ／ｍｌ）、抗ＰＤ１（ｍＡｂ  １Ｂ８、Ｍｅｒｃｋ、１０ｕｇ／ｍｌ）、または組み合わせの存在下で、黒色腫細胞６２４と共に１：３のエフェクター：標的で１８時間共培養した。上清を収集し、Ｔｈ１  Ｔｈ２  Ｔｈ１７サイトメトリービーズアレイアッセイにおいて試験して、分泌されたサイトカインを検出した。ＩＦＮγ（Ａ）およびＴＮＦ（Ｂ）レベルを検出した。
【図１１】図１１Ａ〜Ｅは、ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３８＿１、およびＣＨＡ．７．５３８＿２の各々についての４つのヒト化配列を図示する。全てのヒト化抗体が、Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）置換を含む。ＣＨＡ．７．５３８＿２の軽鎖はＣＨＡ．７．５３８＿１のものと同じであることに留意されたい。各々の「Ｈ１」は、ヒトフレームワークには変化がない「ＣＤＲスワップ」である。続くフレームワークは、より大きい太字で示すフレームワーク変化を改変する。ＣＤＲ配列は太字で記されている。ＣＤＲ定義は、ウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／からのＡｂＭである。ＩＭＧＴ（登録商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（登録商標）情報系ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ（設立者およびディレクター：Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）からのヒト生殖細胞系列および接合配列。残基付番は、順次（ｓｅｑ）で示すか、またはウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／からのＣｈｏｔｈｉａ（ＡｂＭ）に従う。「ｂ」は埋まった側鎖を記し、「ｐ」は部分的に埋まっていることを記し、「ｉ」はＶＨドメインとＶＬドメインとの間の界面にある側鎖を記す。ヒト生殖細胞系列とマウス生殖細胞系列との間の配列差異はアスタリスク（＊）で記す。フレームワークにおける可能性のある追加の突然変異は、配列の下に記す。ＣＤＲ配列における可能性のある変化は、図に記すように、各ＣＤＲ配列の下に記す（＃脱アミド化置換：Ｑ／Ｓ／Ａ、これらはアスパラギン（Ｎ）脱アミド化を防止し得る。＠トリプトファン酸化置換：Ｙ／Ｆ／Ｈ、これらはトリプトファン酸化を防止し得る。＠メチオニン酸化置換：Ｌ／Ｆ／Ａ）。
【図１２】図１２Ａ〜Ｅは、５つのＣＨＡ抗体のヒト化配列の照合を図示する。
【図１３】ヒト化ＶＨおよびＶＬ  ＣＨＡ抗体を組み合わせるためのスキームを図示する。「ｃｈｉｍＶＨ」および「ｃｈｉｍＶＬ」は、ヒトＩｇＧ定常ドメインに結合したマウス可変重鎖および軽鎖配列である。
【図１４】初代ヒトＰＢＭＣ、カニクイザル過剰発現細胞、およびカニクイザル初代ＰＢＭＣに対するＰＶＲＩＧハイブリドーマ抗体結合特性。ＥｘｐｉカニクイザルＯＥは、ｃＰＶＲＩＧで一過性でトランスフェクトされたｅｘｐｉ細胞を表し、ｅｘｐｉ  ｐａｒは、ｅｘｐｉ親細胞を表す。ｇＭＦＩｒは、それらの対照と比較したＰＶＲＩＧ抗体染色の幾何ＭＦＩにおける倍率差異を示す。濃度は、ｇＭＦＩｒが算出された濃度を示す。試験せずは、ヒトＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ、ｅｘｐｉ  ｃＰＶＲＩＧ細胞への結合の不在に起因して試験されなかったか、あるいはＰＢＭＣサブセットに対する結合要件を満たさなかった抗体を示す。ハイライトした抗体は、ヒト化を行った４つの抗体である（図２４参照）。実験は、参照により本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１５／０４８，９６７の実施例２１に記載されている。
【図１５】ＦＡＣＳ系競合アッセイにおけるＰＶＲＩＧ抗体の遮断能力の概要。阻害のＩＣ５０が示される。ＩＣ５０なしとは、これらの抗体が遮断剤でないことを示す。ハイライトした抗体は、ヒト化を行った４つの抗体である（図２４参照）。
【図１６】ＲｅｈおよびＭＯＬＭ−１３細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害アッセイにおける選定したＰＶＲＩＧ抗体の活性の概要。対照に対する細胞傷害性における倍率変化は、ＰＶＲＩＧ抗体を用いた条件における殺傷の絶対レベル（％）を、対照抗体による殺傷の絶対レベル（％）で割ることによって算出した。倍率変化は、５：１のエフェクター対標的の比から算出される。
【図１７】ＰＶＲＩＧオルソログの配列アラインメント。ヒト、カニクイザル、マーモセット、およびアカゲザルＰＶＲＩＧ細胞外ドメインのアラインメントした配列。ヒトとカニクイザルとの間の差異は黄色でハイライトされる。
【図１８】抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体の、カニクイザル、ヒト、カニクイザル／ヒトハイブリッドＰＶＲＩＧバリアントへの結合。抗体の、野生型カニクイザルＰＶＲＩＧ（●）、Ｈ６１ＲカニクイザルＰＶＲＩＧ（■）、Ｐ６７ＳカニクイザルＰＶＲＩＧ（▲）、Ｌ９５Ｒ／Ｔ９７ＩカニクイザルＰＶＲＩＧ（▼）、および野生型ヒトＰＶＲＩＧ（◆）への結合を示す。ＥＬＩＳＡシグナルを抗体濃度の関数としてプロットする。
【図１９】抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体のエピトープ群およびカニクイザル交差反応性の相関。
【図２０Ａ−Ｂ】（Ａ）ＰＶＲＩＧおよびＨＥＫ親細胞を過剰発現するように操作されたＨＥＫ細胞に向けたＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の特異性。データは、増加する抗体濃度の関数としての絶対幾何ＭＦＩ（ｇＭＦＩ）測定値を示す。（Ｂ）ＰＶＲＩＧおよびＨＥＫ親細胞を過剰発現するように操作されたＨＥＫ細胞に向けたＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の特異性。データは、増加する抗体濃度の関数としての絶対幾何ＭＦＩ（ｇＭＦＩ）測定値を示す。
【図２１Ａ−Ｂ】ＲＮＡ発現によって確認されたＰＶＲＩＧを内因性で発現するＪｕｒｋａｔ細胞に結合する、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）（Ａ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）（Ｂ）の能力を示す。（Ａ）Ｊｕｒｋａｔ細胞へのＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の結合。データは、増加する抗体濃度の関数としての絶対幾何ＭＦＩ（ｇＭＦＩ）測定値を示す。アイソタイプ染色が陰性対照として示される。（Ｂ）Ｊｕｒｋａｔ細胞へのＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の結合。データは、増加する抗体濃度の関数としての絶対幾何ＭＦＩ（ｇＭＦＩ）測定値を示す。アイソタイプ染色が陰性対照として示される。両方の抗体が、ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞と同等の親和性でＪｕｒｋａｔ細胞に結合することができる。
【図２２】ＣＭＶペプチド（４９４〜５０３、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）への曝露によって増殖した、ＲＮＡ発現によって確認されたＰＶＲＩＧを内因性で発現するＣＤ８Ｔ細胞に結合する、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の能力を示す。ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の、ＣＭＶペプチドで増殖されたＣＤ８Ｔ細胞への結合。データは、増加する抗体濃度の関数としての絶対幾何ＭＦＩ（ｇＭＦＩ）測定値を示す。アイソタイプ染色が陰性対照として示される。
【図２３Ａ−Ｂ】（Ａ）カニクイザルＰＶＲＩＧおよびｅｘｐｉ親細胞を過剰発現するように操作されたｅｘｐｉ細胞に向けたＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の特異性。データは、増加する抗体濃度の関数としての絶対幾何ＭＦＩ（ｇＭＦＩ）測定値を示す。カニクイザルＰＶＲＩＧおよびｅｘｐｉ親細胞を過剰発現するように操作されたｅｘｐｉ細胞に向けたＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の特異性。データは、増加する抗体濃度の関数としての絶対幾何ＭＦＩ（ｇＭＦＩ）測定値を示す。
【図２４Ａ−Ｂ】（Ａ）ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）によるＨＥＫ細胞に対するＰＶＲＩＧ  Ｆｃの遮断。データは、最大ＰＶＲＩＧ  Ｆｃ誘導性シグナルおよび二次抗体のみのバックグラウンドと比較した増加する抗体濃度の関数として、ＨＥＫ細胞に対するＰＶＲＩＧ  Ｆｃ結合のパーセンテージを示す。（Ｂ）ＨＥＫ細胞に対するＰＶＲＩＧ  Ｆｃの結合に対するＣＨＡ．７．５４４の効果。データは、漸増濃度のＣＨＡ．７．５４４の存在下でのＨＥＫ細胞へのＰＶＲＩＧ  Ｆｃ結合から導出された絶対ｇＭＦＩを示す。ＰＶＲＩＧ  Ｆｃ結合の量は、抗マウスＦｃをＡｌｅｘａ  ６４７に二次コンジュゲートすることによって検出した。
【図２５】図２５Ａ〜Ｂ：（Ａ）ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３０．３によるＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞に対するＰＶＲＬ２  Ｆｃの遮断。データは、最大ＰＶＲＬ２  Ｆｃ誘発シグナルおよび二次抗体のみのバックグラウンドと比較して増加する抗体濃度の関数として、ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞に対するＰＶＲＬ２  Ｆｃ結合のパーセンテージを示す。（Ｂ）ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞へのＰＶＲＬ２  Ｆｃ結合に対するＣＨＡ．７．５４４の効果。データは、最大ＰＶＲＬ２  Ｆｃ誘発シグナルおよび二次抗体のみのバックグラウンドと比較して増加する抗体濃度の関数として、ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞に対するＰＶＲＬ２  Ｆｃ結合のパーセンテージを示す。
【図２６】非コンジュゲートＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびアイソタイプ対照とのＪｕｒｋａｔ細胞のプレインキュベーション後のそれらの最大シグナルと比較した、Ａｌｅｘａ  ６４７コンジュゲートＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の結合のパーセンテージを示す。
【図２７】図２７Ａ〜Ｂ：Ａ）ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を増加させる。代表的なデータ（ｎ≧２）は、抗ＤＮＡＭ−１抗体もしくは異なる抗ＰＶＲＩＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ対照の存在下でＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２細胞と共培養したときの、単一のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞ドナーからのＣＦＳＥ低、増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージ（平均＋標準偏差）を示す。破線は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体で処理した後に増殖するＣＦＳＥ低、ＣＤ４＋Ｔ細胞のベースラインパーセンテージを示す。数字は、関連するアイソタイプ対照抗体（Ｂ）ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と比較した、それぞれ抗ＰＶＲＩＧまたは抗ＤＮＡＭ−１抗体処理の増殖におけるパーセント増加または減少を指し、ｈＰＶＲＬ２依存的様態でＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を増加させる。代表的なデータ（ｎ≧２）は、抗ＤＮＡＭ−１抗体もしくは異なる抗ＰＶＲＩＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ対照の存在下でのＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３親、またはＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２細胞との共培養に応答した、単一のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞ドナーからのＣＦＳＥ低、増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージ（平均＋標準偏差）を示す。破線は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ抗体またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ抗体のいずれかで処理した後に増殖するＣＦＳＥ低ＣＤ４＋Ｔ細胞のベースラインパーセンテージを示す。数字は、関連するアイソタイプ対照抗体と比較した、それぞれ抗ＰＶＲＩＧまたは抗ＤＮＡＭ−１抗体処理の増殖におけるパーセント増加または減少を指す。
【図２８】図２８Ａ〜Ｃ：（Ａ）ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を増加させる。代表的なデータ（ｎ≧２）は、抗ＤＮＡＭ−１抗体もしくは異なる抗ＰＶＲＩＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ対照の存在下でＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２細胞と共培養したときの、単一のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞ドナー（ドナー２３２）からのＣＦＳＥ低、増殖ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ（平均＋標準偏差）を示す。破線は、マウスＩｇＧ４またはヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体で処理した後に増殖するＣＦＳＥ低、ＣＤ８＋Ｔ細胞のベースラインパーセンテージを示す。数字は、関連するアイソタイプ対照抗体と比較した、それぞれ抗ＰＶＲＩＧまたは抗ＤＮＡＭ−１抗体処理の増殖におけるパーセント増加または減少を指す。（Ｂ）ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を増加させる。代表的なデータ（ｎ≧２）は、抗ＤＮＡＭ−１抗体もしくは異なる抗ＰＶＲＩＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ対照の存在下でＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２細胞と共培養したときの、単一のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞ドナー（ドナー２３４）からのＣＦＳＥ低、増殖ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ（平均＋標準偏差）を示す。破線は、マウスＩｇＧ４またはヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体で処理した後に増殖するＣＦＳＥ低、ＣＤ８＋Ｔ細胞のベースラインパーセンテージを示す。数字は、関連するアイソタイプ対照抗体と比較した、それぞれ抗ＰＶＲＩＧまたは抗ＤＮＡＭ−１抗体処理の増殖におけるパーセント増加または減少を指す。（Ｃ）ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌を増加させる。代表的なデータ（ｎ≧２）は、抗ＤＮＡＭ−１抗体もしくは異なる抗ＰＶＲＩＧ抗体またはＩｇＧアイソタイプ対照の存在下でＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２細胞と共培養したときの、３つの異なるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞ドナー（ドナー２３１、２３２、および２３４）により産生されたＩＦＮγのｐｇ／ｍｌ（平均＋標準偏差）を示す。破線は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ抗体で処理した後のベースラインＩＦＮγ産生を示す。数字は、ＩｇＧ４アイソタイプ対照と比較した、抗ＰＶＲＩＧ抗体処理のＩＦＮγ分泌のパーセント増加を指す。
【図２９】ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、複数のドナーにわたってＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を一貫して増加させるが、ＣＨＡ．７．５３０．３およびＣＨＡ．７．５４４は増加させない。アイソタイプ対照と比較した増殖パーセントは、ＰＶＲＩＧ抗体処理後のＣＦＳＥ低、ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを各ドナーのアイソタイプ抗体処理に対して割ることによって算出した。アイソタイプ抗体処理の増殖パーセントをゼロに設定した。グラフにおける各記号は、異なるドナーを表す。
【図３０】図３０Ａ〜Ｄ：（Ａ）ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖に対する用量依存的効果。２つの異なるヒトドナーでの代表的なデータ（ｎ≧２）は、ヒトＩｇＧアイソタイプ、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、またはＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）抗体のいずれかによる６６ｎＭ〜０．７２６ｎＭの用量滴定後の、増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞の平均パーセンテージを示す。推定ＥＣ５０は、１桁のｎＭの範囲内にある。（Ｂ）ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖に対する用量依存的効果。２つの異なるヒトドナーでの代表的なデータ（ｎ≧２）は、ヒトＩｇＧアイソタイプ、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．７．３８．１．２、またはＣＨＡ．７．５４４抗体のいずれかによる６６ｎＭ〜０．２６４ｎＭの用量滴定後の、増殖ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均パーセンテージを示す。推定ＥＣ５０は、１桁のｎＭの範囲内にある。
【図３１】図３１Ａ〜Ｃ：（Ａ）ＴＩＬ上でのＴＩＧＩＴおよびＰＶＲＩＧ発現、ならびに６２４黒色腫細胞株上でのＰＶＲ、ＰＶＲＬ２発現のフローサイトメトリー分析。値は、アイソタイプ対照と対比した平均蛍光強度（ＭＦＩ）比率を表す。（Ｂ〜Ｃ）単剤処理（青色ヒストグラム）としての、または抗ＴＩＧＩＴ（緑色ヒストグラム）と組み合わせたアイソタイプ対照、抗ＴＩＧＩＴ（３０μｇ／ｍｌ）または抗ＰＶＲＩＧ抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、黒色腫細胞６２４と共に１：３のエフェクター：標的で１８時間共培養したときの、ＴＩＬによるＩＦＮγ（Ｂ）およびＴＮＦ（Ｃ）分泌を示す代表的実験。抗体単剤処理効果のパーセンテージをアイソタイプ対照処理ｍＩｇＧ１と比較し、抗体併用処理効果のパーセンテージを抗ＴＩＧＩＴ単剤処理と比較した。
【図３２Ａ−Ｈ】ＴＩＬ（２０９−ｇｐ１００／４６３−Ｆ４−ｇｐ１００）を、抗ＴＩＧＩＴ（ａＴＩＧＩＴ）併用を含めてまたは含めずに抗ＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）またはＣＨＡ．７．５３８の存在下で、黒色腫細胞６２４と共に１：３のエフェクター：標的で１８時間共培養し、サイトカイン分泌について試験した。抗体処理効果のパーセンテージをアイソタイプ対照処理と比較し、５回の実験（Ｆ４）または６回の実験（２０９）の平均値をプロットした。対応のある両側ｔ検定を、アイソタイプと比較した各処理について、または抗ＴＩＧＩＴ単独と比較した併用において算出した。ｐ値が示される。
【図３３】図３３Ａ〜Ｂ：（Ａ）ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、単一抗体処理と比較してＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を増加させる。代表的なデータ（ｎ≧２）は、ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２細胞と共培養したときの、単一のヒトＣＤ３＋Ｔ細胞ドナー（ドナー１４３）からのＣＦＳＥ低、増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージ（平均＋標準偏差）を示す。破線は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体で処理した後に増殖するＣＦＳＥ低、ＣＤ４＋Ｔ細胞のベースラインパーセンテージを示す。（Ｂ）ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、単一抗体処理と比較してＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を増加させる。代表的なデータ（ｎ≧２）は、ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２細胞と共培養したときの、単一のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞ドナー（ドナー２０１）からのＣＦＳＥ低、増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージ（平均＋標準偏差）を示す。破線は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体で処理した後に増殖するＣＦＳＥ低、ＣＤ４＋Ｔ細胞のベースラインパーセンテージを示す。数字は、関連するアイソタイプ対照抗体と比較した、それぞれ抗ＰＶＲＩＧまたは抗ＤＮＡＭ−１抗体処理の増殖におけるパーセント増加または減少を指す。
【図３４】図３４Ａ〜Ｂ：（Ａ）ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、抗ＴＩＧＩＴ抗体の組み合わせは、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を増加させる。代表的なデータ（ｎ≧２）は、ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２細胞と共培養したときの、代表的なヒトＣＤ８＋Ｔ細胞ドナー（ドナー２３２）からのＣＦＳＥ低、増殖ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ（平均＋標準偏差）を示す。破線は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体で処理した後に増殖するＣＦＳＥ低、ＣＤ８＋Ｔ細胞のベースラインパーセンテージを示す。数字は、関連するアイソタイプ対照抗体と比較した、それぞれ抗ＰＶＲＩＧまたは抗ＤＮＡＭ−１抗体処理の増殖におけるパーセント増加または減少を指す。（Ｂ）ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、抗ＴＩＧＩＴ抗体の組み合わせは、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌を増加させる。代表的なデータ（ｎ≧２）は、ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２細胞と共培養したときの、代表的なヒトＣＤ８＋Ｔ細胞ドナー（ドナー２３２）により産生されたＩＦＮγのｐｇ／ｍｌ（平均＋標準偏差）を示す。破線は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ抗体で処理した後のベースラインＩＦＮγ産生を示す。数字は、関連するアイソタイプ対照抗体と比較した、それぞれ抗ＰＶＲＩＧまたは抗ＤＮＡＭ−１抗体処理のＩＦＮγ分泌における増加または減少を指す。
【図３５】実施例２（３）の実験系の設計を図示する。
【図３６】図３６Ａ〜Ｃは、ＰＶＲＩＧ（抗ヒトＰＶＲＩＧ  ＣＨＡ．７．５３８．ＡＦ６４７を使用）、ＴＩＧＩＴ（抗ヒトＴＩＧＩＴ、カタログ１７−９５００−４１  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅを使用）およびＤＮＡＭ−１（抗ヒトＣＤ２２６−ＡＰＣカタログ３３８３１２  ｂｉｏｌｅｇｅｎｄを使用）の、ＴＩＬにおける発現のレベルを図示するヒストグラムを示す。発現の倍率をアイソタイプ（アイソ）対照と比較する。
【図３７】ＴＩＬからのＩＦＮγの分泌に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果を要約したプロット。ＴＩＬを、抗ＰＶＲＩＧ抗体（ｃ５１８、ｃ５３８および５４４）の存在下で、または抗ＴＩＧＩＴ抗体を含めて、ＰＶＲＬ２を過剰発現するＣＨＯ−ＳＨＬＡ−Ａ２／Ｂ２Ｍ細胞と共に１：３のエフェクター：標的比で１８時間共培養した。各ドットは、異なる実験からの同じＴＩＬによるＩＦＮγ分泌のデータの平均を表す。示されるパーセンテージは、アイソタイプ対照と比較した各抗体処理間の差異である。対応のある両側ｔ検定を、５４４と比較した各処理について、または抗ＴＩＧＩＴ単独と比較した併用において算出した。ｐ値が示される。各ＴＩＬごとに実行された実験の数、２０９（Ｎ＝３）、Ｆ４（Ｎ＝２）、Ｆ５（Ｎ＝３）、およびＭＡＲＴ１（Ｎ＝２）。
【図３８】ＴＩＬからのＴＮＦ−αの分泌に対するｃ５１８およびｃ５３８用量反応での効果を要約したプロット。ＴＩＬを、実施例２（３）に記載されるように抗ＰＶＲＩＧ抗体（ｃ５１８、ｃ５３８またはアイソタイプ対照）の存在下で、ＰＶＲＬ２を過剰発現するＣＨＯ−ＳＨＬＡ−Ａ２／Ｂ２Ｍ細胞と共に１：３のエフェクター対標的比で１８時間共培養した。
【図３９】図３９Ａ〜Ｃ：ＴＩＬを、抗ＰＶＲＩＧ抗体（ｃ５１８、ｃ５３８および５４４）の存在下で、または抗ＴＩＧＩＴ抗体を含めて、ＰＶＲＬ２を過剰発現するＣＨＯ−ＳＨＬＡ−Ａ２／Ｂ２Ｍ標的細胞と共に１：３のエフェクター：標的比で１８時間共培養した。上の表に示されるパーセンテージは、アイソタイプ対照と比較した各抗体処理間の、ＴＩＬからのサイトカイン分泌の効果における差異である。第１の実験は図ＡおよびＢに表し、第２の実験は図Ｃに表す。
【図４０】ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３共培養アッセイ設計。ＣＦＳＥ標識ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＣＨＯ−Ｓ−ＯＫＴ３−ＰＶＲＬ２または擬トランスフェクト細胞と共に５日間共培養した。Ｔ細胞増殖およびサイトカイン分泌に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果を分析した。
【図４１】レスポンダー対非レスポンダードナーにおけるＣＨＯ−ＯＫＴ３  ＰＶＲＬ２細胞に対するＩＦＮγ分泌に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果。２つの異なるドナーからのＣＤ３＋細胞を、抗ＰＶＲＩＧ抗体の存在下で、ＣＨＯ−Ｓ−ＰＶＲＬ２細胞と共に５：１のエフェクター：標的で５日間共培養し、サイトカイン分泌およびＴ細胞増殖について試験した。（Ａ）抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果が観察された「レスポンダードナー」。（Ｂ）抗体処理の効果が観察されない「非レスポンダードナー」。
【図４２】レスポンダードナーからのＣＤ４およびＣＤ８増殖に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果。ＣＦＳＥ標識ＣＤ３＋Ｔ細胞を、抗ＰＶＲＩＧ抗体または抗ＴＩＧＩＴ抗体の存在下で、ＣＨＯ−Ｓ−ＰＶＲＬ２細胞と共に５：１のエフェクター：標的で５日間共培養した。ＣＤ４またはＣＤ８上のＴ細胞増殖ゲーティングに対する効果を、フローサイトメトリーによって評価した。ＣＤ４＋ＣＦＳＥ低またはＣＤ８＋ＣＦＳＥ低の増殖細胞（ＣＦＳＥ低）（Ａ）または全細胞数（Ｂ）のパーセンテージを提示する。
【図４３】レスポンダードナーからのＩＦＮγ分泌またはＣＤ８増殖に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果を示す。ＣＤ３＋細胞を、抗ＰＶＲＩＧ抗体の存在下で、ＣＨＯ−Ｓ−ＰＶＲＬ２細胞と共に５：１のエフェクター：標的で５日間共培養し、（Ａ）サイトカイン分泌および（Ｂ）Ｔ細胞増殖について試験した。抗体処理効果のパーセンテージをアイソタイプ対照処理と比較した。５回の「レスポンダー」ドナー（レスポンダー）の平均値を提示する。（Ｃ）アイソタイプ対抗ＰＶＲＩＧ抗体による処理後の、節ＡおよびＢに記載されるようにＣＨＯＳ−ＯＫＴ３  ＰＶＲＬ２と共に共培養した際の同じ５つのドナーからのＩＦＮγ分泌レベル。ｐ値は比率対応のあるｔ検定を表す。
【図４４】試験したドナー（ｎ＝１０）にわたる抗体処理効果の要約表である。示されるパーセンテージは、関連するアイソタイプ対照と比較した、特定の読み取り値（列タイトルで示される）に対する抗体処理の効果を表す。いくつかの抗ＰＶＲＩＧ抗体（主にＣＨＡ．７．５１８）がＩＦＮγまたは増殖対アイソタイプ対照を増強した「レスポンダー」ドナー（ドナー番号３、７２、２２６、３４５およびＥＳ＿００１）が「レスポンダー」と見なされた。
【図４５Ａ−Ｂ】いくつかの抗体を用いた実験の結果を図示する。親和性（ｎＭ）がＡに示され、このうちＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞は、本明細書で考察されるようにｈＰＶＲＩＧで形質転換されたＨＥＫ細胞であり、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、内因性ｈＰＶＲＩＧを発現する。（Ｂ）は、ドナー１の初代ＣＤ８Ｔ細胞に対して４つの異なる抗体を用いたｇＭＦＩを図示し、（Ｃ）はドナー２の初代ＣＤ８Ｔ細胞である。
【図４６Ａ−Ｂ】ＴＩＧＩＴのＣＨＯ細胞との相互作用を図示する。（Ａ）ヒトＴＩＧＩＴ  Ｆｃタンパク質はＣＨＯ細胞に結合する。ヒトＴＩＧＩＴ  Ｆｃおよびｓｙｎａｇｉｓ  ＩｇＧ１対照の段階的濃度を、ＦＡＣＳに基づく結合アッセイにおいてＣＨＯ細胞に結合するそれらの能力について評価した。（Ｂ）ヒトＰＶＲは、活性化ＣＤ４Ｔ細胞上で発現される。ＣＤ４Ｔ細胞を、ＯＫＴ３抗体のｓｃＦｖを発現するＣＨＯ細胞と共培養し、５日間活性化させた。５日目に、ＣＤ４Ｔ細胞をＰＶＲの発現およびＣＦＳＥの希釈について分析した。
【図４７Ａ−Ｃ】ＣＴ２６腫瘍モデルにおける抗ｍＰＶＲＩｇおよび抗ＰＤＬ−１抗体の抗腫瘍応答を図示する。Ａ〜Ｂ．１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群に、５×１０５のＣＴ２６細胞を皮下注射した。腫瘍を４日目に測定した後、マウスを無作為化し（４０ｍｍ３の平均腫瘍体積／群）、次いで指定のｍＡｂ（１００または２００μｇ／用量、腹腔内）で処置し、続いて７、１１、１４、１８および２１日目に追加の用量を与えた。Ａ．群を単剤の６回用量で処置した。抗ＰＤＬ−１対対照＊＊＊ｐ＜０．０００１。腫瘍体積は、平均体積＋ＳＥＭとして表される。Ｂ．腫瘍体積を週２回測定した。群あたりの無腫瘍（ＴＦ）マウスの数が示される。Ｃ．割り付けされた群の生存割合。抗ＰＤＬ−１対対照＊＊ｐ＝０．００５。
【図４８Ａ−Ｃ】ＣＴ２６腫瘍モデルにおける抗ＰＶＲＩＧおよび抗ＰＤＬ−１抗体の組み合わせの抗腫瘍応答を図示する。Ａ〜Ｂ．１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群に、５×１０５のＣＴ２６細胞を皮下注射した。腫瘍を７日目に測定した後、マウスを無作為化し（７５ｍｍ３の平均腫瘍体積／群）、次いで指定のｍＡｂ（３００μｇ／用量、腹腔内）で処置し、続いて１１、１４、１８、２１、および２５日目に追加の用量を与えた。Ａ．群を組み合わせた薬剤の６回用量で処置した。抗ＰＤＬ−１＋ｍＡｂ４０７対対照ｐ＝０．０００５；抗ＰＤＬ−１およびｍＡｂ４０６対対照ｐ＝０．０５６。Ｂ．腫瘍体積を週３回測定した。群あたりの無腫瘍（ＴＦ）マウスの数が示される。Ｃ．割り付けされた群の生存割合。抗ＰＤＬ−１＋ｍＡｂ４０７対対照＊ｐ＝０．００８８。
【図４９】図４９Ａ〜Ｄは、ＡＢ−４０７（ＢＯＪ−５Ｇ４−Ｆ４）についての可変重鎖（それぞれＡおよびＢ）のアミノ酸配列および核酸配列ならびに可変軽鎖（それぞれＣおよびＤ）のアミノ酸配列および核酸配列を図示する。
【図５０】ヒトＩｇＧ１（いくつかの有用なアミノ酸置換を有する）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、本発明で特に有用であるヒンジバリアントを有するＩｇＧ４の定常ドメイン、ならびにカッパおよびラムダ軽鎖の定常ドメインのアミノ酸配列を図示する。
【図５１】ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）（カニクイザル（ｃｙｎｏ）と称される）ＴＩＧＩＴ  ＥＣＤの配列ならびにヒトＰＶＲ  ＥＣＤタンパク質の配列を図示する。
【図５２】抗ＴＩＧＩＴ  ｆａｂのフローサイトメトリー結合の要約を示す。全ての固有のＥＬＩＳＡ陽性ｆａｂをフローサイトメトリーにより分析した。ヒトまたはカニクイザルＴＩＧＩＴを過剰発現するＥｘｐｉ２９３細胞ならびに親Ｅｘｐｉ２９３細胞について、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。標的特異的結合対オフターゲット結合のＭＦＩ比を算出した。選択したクローンのデータが示される。
【図５３Ａ−Ｂ】抗ＴＩＧＩＴ抗体の配列を図示する。特に明記しない限り、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ付番を利用する（配列表の抗体を含む。
【図５４】実施例１２に記載のＥｘｐｉ２９３ヒトＴＩＧＩＴ過剰発現細胞への抗ＴＩＧＩＴ  ｍＡｂ結合のＦＡＣＳ  ＫＤ結果を示す。
【図５５】Ｅｘｐｉ２９３カニクイザルＴＩＧＩＴ過剰発現細胞へのｍＡｂ結合のＦＡＣＳ  ＫＤ結果を示す。
【図５６】データの信頼性が結合定数を推定するのに十分であった、結果として生じる反応速度定数および平衡解離定数を示す実施例１４からの結果を示す。
【図５７Ａ−Ｂ】実施例４に記載のＥｘｐｉ２９３ヒトＴＩＧＩＴ過剰発現細胞へのヒトＰＶＲ−Ｆｃバリアント結合の結果を示す。図Ａ（左）：Ｅｘｐｉ２９３ヒトＴＩＧＴ過剰発現細胞で滴定したヒトＰＶＲ−ｍ２ａＦｃ構築物について生成した結合曲線。ＫＤおよび９５％信頼区間が示される。図Ｂ（右）：Ｅｘｐｉ２９３ヒトＴＩＧＴ過剰発現細胞で滴定したヒトＰＶＲ−ｈ１Ｆｃ構築物について生成した結合曲線。ＫＤおよび９５％信頼区間が示される。
【図５８】ヒトＴＩＧＩＴを過剰発現するＥｘｐｉ２９３細胞へのヒトＰＶＲ−ｍ２ａＦｃの結合を阻害するファージ抗体の表を示す。ｍＡｂを、既知の遮断（ＢＭ２６）ベンチマーク抗体およびヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照（Ｓｙｎａｇｉｓ）抗体と対比して試験した。「はい」は、ｍＡｂがＢＭ２６に類似してｈＰＶＲを阻害したことを示す。
【図５９】Ｅｘｐｉ２９３細胞上で過剰発現されたヒトＴＩＧＩＴへのヒトＰＶＲ−ｈ１Ｆｃの結合を阻害する抗ＴＩＧＩＴハイブリドーマ抗体のＩＣ５０値の表を示す。値は、２つの独立した実験のうちの１つを表す。２つの独立して実施された実験のＩＣ５０結果は、わずか１．２倍から２倍までの範囲の差を示した。
【図６０】ファージ由来抗体およびＢＭ抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体、ＣＰＡ．９．０２７、ＣＰＡ．９．０４９、ＣＰＡ．９．０５９、ＢＭ２６、およびＢＭ２９がＩＬ−２シグナル伝達を増加させるという、実施例６の結果を示す。ＢＭ２６およびＢＭ２９は両方とも、ヒトＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐバリアントを有するｈＩｇＧ４）アイソタイプである。代表的なデータ（ｎ≧２）は、Ｊｕｒｋａｔ  ＩＬ−２−ＲＥルシフェラーゼヒトＴＩＧＩＴ細胞およびａＡＰＣ  ＣＨＯ−Ｋ１ヒトＰＶＲ細胞の６時間の共培養からのルシフェラーゼシグナルのＲＬＵ（平均＋／−標準偏差）を示す。各抗体の濃度は１０μｇ／ｍｌであった。
【図６１】ファージ由来抗体およびＢＭ  ｈＩｇＧ４抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体、ＣＰＡ．９．０２７、ＣＰＡ．９．０４９、ＣＰＡ．９．０５９、ＢＭ２６、およびＢＭ２９が用量依存的様態でＩＬ−２シグナル伝達を増加させるという、実施例６の追加の結果を示す。ＢＭ２６およびＢＭ２９は両方ともｈＩｇＧ４アイソタイプである。代表的なデータ（ｎ≧２）は、Ｊｕｒｋａｔ  ＩＬ−２−ＲＥルシフェラーゼヒトＴＩＧＩＴ細胞およびａＡＰＣ  ＣＨＯ−Ｋ１ヒトＰＶＲ細胞の６時間の共培養からのルシフェラーゼシグナルのＲＬＵ（平均＋／−標準偏差）を示す。各抗体について、２０μｇ／ｍｌで開始する１０点、２倍希釈系列を使用した。
【図６２】ハイブリドーマ由来抗体およびＢＭ抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体、ＣＨＡ．９．５３６、ＣＨＡ．９．５４１、ＣＨＡ．９．５４６、ＣＨＡ．９．５４７、ＣＨＡ．９．５６０、ＢＭ２６、およびＢＭ２９がＩＬ−２シグナル伝達を増加させるという、実施例６の結果を示す。ＢＭ２６およびＢＭ２９は両方ともｍＩｇＧ１アイソタイプである。非遮断抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体、ＣＨＡ．９．５４３は、ＩＬ−２シグナル伝達を増強しない。代表的なデータ（ｎ≧２）は、Ｊｕｒｋａｔ  ＩＬ−２−ＲＥルシフェラーゼヒトＴＩＧＩＴ細胞およびａＡＰＣ  ＣＨＯ−Ｋ１ヒトＰＶＲ細胞の６時間の共培養からのルシフェラーゼシグナルのＲＬＵ（平均＋／−標準偏差）を示す。各抗体の濃度は１０μｇ／ｍｌであった。
【図６３】ハイブリドーマ由来抗体およびベンチマークｍＩｇＧ１抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体、ＣＨＡ．９．５３６、ＣＨＡ．９．５４１、ＣＨＡ．９．５４６、ＣＨＡ．９．５４７、ＣＨＡ．９．５６０、およびＢＭ２６が用量依存的様態でＩＬ−２シグナル伝達を増加させるという、実施例６の結果を示す。ＢＭ２６はｍＩｇＧ１アイソタイプである。代表的なデータ（ｎ≧２）は、Ｊｕｒｋａｔ  ＩＬ−２−ＲＥルシフェラーゼヒトＴＩＧＩＴ細胞およびａＡＰＣ  ＣＨＯ−Ｋ１ヒトＰＶＲ細胞の６時間の共培養からのルシフェラーゼシグナルのＲＬＵ（平均＋／−標準偏差）を示す。各抗体について、２０μｇ／ｍｌで開始する１０点、２倍希釈系列を使用した。
【図６２】ファージ抗体、ハイブリドーマ抗体およびＢＭ抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体、ＣＰＡ．９．０２７、ＣＰＡ．９．０４９、ＣＰＡ．９．０５９、ＣＨＡ．９．５３６、ＣＨＡ．９．５４１、ＣＨＡ．９．５４６、ＣＨＡ．９．５４７、ＣＨＡ．９．５６０、ＢＭ２６、およびＢＭ２９が抗原特異的ＩＦＮγシグナル伝達を増加させることを示す。ＢＭ２６は、ｈＩｇＧ４アイソタイプおよびｍＩｇＧ１アイソタイプの両方として試験されるが、ＢＭ２９は、ｈＩｇＧ４アイソタイプとしてのみ試験される。代表的なデータ（ｎ＝２）は、ＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をＭｅｌ６２４ヒトＰＶＲ細胞と２４時間共培養した後の培養上清中のＩＦＮγ（平均＋／−標準偏差）の量を示す。各抗体の濃度は１０μｇ／ｍｌであった。アッセイに使用したＭｅｌ６２４ヒトＰＶＲを、０．００３３μｇ／ｍｌまたは０．００１μｇ／ｍｌのペプチドでパルスした。
【図６５】ファージ抗体、ハイブリドーマ抗体およびＢＭ抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体、ＣＰＡ．９．０２７、ＣＰＡ．９．０４９、ＣＰＡ．９．０５９、ＣＨＡ．９．５３６、ＣＨＡ．９．５４１、ＣＨＡ．９．５４６、ＣＨＡ．９．５４７、およびＣＨＡ．９．５６０、ならびにＢＭ２６が、抗原特異的ＩＦＮγシグナル伝達を単独で（中空バー）または抗ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と組み合わせて（斜線付きバー）のいずれかで増加させることを示す。ＢＭ２６はｍＩｇＧ１アイソタイプである。アイソタイプ抗体対照処理については、中空バーは、アイソタイプ抗体単独を指し、斜線付きバーは、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と組み合わせたアイソタイプ抗体を指す。代表的なデータ（ｎ＝２）は、ＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ヒトＰＶＲおよびヒトＰＶＲＬ２を過剰発現するＭｅｌ６２４細胞と２４時間共培養した後の培養上清中のＩＦＮγ（平均＋／−標準偏差）の量を示す。各抗体の濃度は１０μｇ／ｍｌであった。アッセイに使用したＭｅｌ６２４ヒトＰＶＲ／ヒトＰＶＲＬ２細胞を、０．００３３μｇ／ｍｌまたは０．００１μｇ／ｍｌのペプチドでパルスした。
【図６６】抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、および抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体とＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）との組み合わせによる、それぞれのアイソタイプ対照抗体に対するＩＦＮγ分泌の増加パーセントを示す。
【図６７】実施例７のエピトープビニング実験のための樹形図である。
【図６８】実施例７のエピトープビニング実験からの抗体の群分けである。
【図６９】実施例３の実験に記載される、ヒトＴＩＧＩＴを過剰発現するＥｘｐｉ２９３細胞上での親和性成熟ファージ抗体（ＣＰＡ．９．０８３、ＣＰＡ．９．０８６）、ヒト化ハイブリドーマ抗体（ＣＨＡ．９．５４７．７、ＣＨＡ．９．５４７．１３）、ベンチマーク抗体（ＢＭ２６、ＢＭ２９）、およびｈＩｇＧ４アイソタイプ対照（抗Ｓｙｎａｇｉｓ）の用量滴定におけるヒトＴＩＧＩＴ過剰発現細胞への高親和性結合を示す。全ての抗体を、１０μｇ／ｍｌ（１３３．３３ｎＭ￥［結合部位］）で開始する１１点にわたる段階２倍希釈を用いて滴定した。抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合を検出するために、ＡＦ６４７標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を細胞に加えた。ヒトＴＩＧＩＴを過剰発現するＥｘｐｉ２９３細胞（黒線）および親Ｅｘｐｉ２９３細胞（灰色線）に結合した抗ＴＩＧＩＴ抗体のｇＭＦＩを示す。ＫＤ値＋／−９５％ＣＩ、および曲線適合が各グラフの下に示される。
【図７０】抗ＴＩＧＩＴ抗体が、実施例３の実験に記載される、カニクイザルＴＩＧＩＴを過剰発現するＥｘｐｉ２９３細胞上での親和性成熟ファージ抗体（ＣＰＡ．９．０８３、ＣＰＡ．９．０８６）、ヒト化ハイブリドーマ抗体（ＣＨＡ．９．５４７．７、ＣＨＡ．９．５４７．１３）、ベンチマーク抗体（ＢＭ２６、ＢＭ２９）、およびｈＩｇＧ４アイソタイプ対照（抗Ｓｙｎａｇｉｓ）の用量滴定においてカニクイザルＴＩＧＩＴに対して交差反応性であることを示す。全ての抗体を、１０μｇ／ｍｌ（１３３．３３ｎＭ￥［結合部位］）で開始する１１点にわたる段階２倍希釈を用いて滴定した。抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合を検出するために、ＡＦ６４７標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を細胞に加えた。カニクイザルＴＩＧＩＴを過剰発現するＥｘｐｉ２９３細胞（黒線）および親Ｅｘｐｉ２９３細胞（灰色線）に結合した抗ＴＩＧＩＴ抗体のｇＭＦＩを示す。ＫＤ値＋／−９５％ＣＩ、および曲線適合が各グラフの下に示される。
【図７１】親和性成熟ファージ抗体が、実施例３の実験に記載される、カニクイザルＴＩＧＩＴを過剰発現するＥｘｐｉ２９３細胞上でのマウスＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１）として再フォーマットした親和性成熟ファージ抗体（ＣＰＡ．９．０８３、ＣＰＡ．９．０８６）、ベンチマーク抗マウスＴＩＧＩＴ抗体（ＢＭ２７  ｍＩｇＧ１、ＢＭ３０  ｍＩｇＧ１）、およびｍＩｇＧ１アイソタイプ対照（抗Ｓｙｎａｇｉｓ）が示され、用量滴定においてマウスＴＩＧＩＴに対して交差反応性であることを示す。Ａ）マウスＴＩＧＩＴを過剰発現するＨＥＫ細胞（黒線）および親ＨＥＫ細胞（灰色線）に結合した抗ＴＩＧＩＴ抗体のｇＭＦＩ。Ｂ）Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下移植されたＲｅｎｃａ腫瘍から単離された調節性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞に結合した抗ＴＩＧＩＴ抗体（黒線）またはＳｙｎａｇｉｓ  ｍＩｇＧ１（灰色線）のｇＭＦＩ。抗ＴＩＧＩＴ抗体を、１５μｇ／ｍｌ（２００ｎＭ［結合部位］）、または１０μｇ／ｍｌ（１３２ｎＭ［結合部位］）でそれぞれ開始する段階２倍または３倍希釈系列のいずれかを用いて滴定した。マウスＴＩＧＩＴ過剰発現細胞上の抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合を検出するために、ＡＦ６４７標識ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を細胞に加えた。抗ＴＩＧＩＴ抗体を、マウスＴｒｅｇ結合についてＡＦ６４７に直接コンジュゲートした。各抗ＴＩＧＩＴ抗体のＫＤ値を示す。
【図７２】実施例３の実験に記載される、３つの健常なドナーＰＢＭＣ由来のヒトエフェクターメモリーＣＤ９５＋ＣＤ２８−ＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞上での親和性成熟ファージ抗体（ＣＰＡ．９．０８３、ＣＰＡ．９．０８６）、ヒト化ハイブリドーマ抗体（ＣＨＡ．９．５４７．７、ＣＨＡ．９．５４７．１３）、およびベンチマーク抗体（ＢＭ２６、ＢＭ２９）の用量滴定を示す。ＰＢＭＣは、以下の系列マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ５６、およびＣＤ９５に対する抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ならびにＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅアクア色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で表面染色した。次いで、ＡＦ６４７標識抗ＴＩＧＩＴ抗体およびｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体（抗Ｓｙｎａｇｉｓ）を、３０μｇ／ｍｌ（３９６ｎＭ￥［結合部位］）で開始する１２点にわたる段階３倍希釈を用いて滴定した。エフェクターメモリーＴ細胞に結合した抗ＴＩＧＩＴ抗体のｇＭＦＩを示す。３つの異なるドナーにわたる各抗体のＫＤ値を表に報告する。親和性成熟ファージ抗体（ＣＰＡ．９．０８３およびＣＰＡ．９．０８６）が、ヒトエフェクターメモリーＴ細胞に対して最も高い結合親和性を有した。
【図７３】実施例３の実験に記載される、２匹のカニクイザルから単離したＰＢＭＣ（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ）由来のカニクイザルエフェクターメモリーＣＤ９５＋ＣＤ２８−ＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞上での親和性成熟ファージ抗体（ＣＰＡ．９．０８３、ＣＰＡ．９．０８６、ＣＰＡ．９．１０３）、ヒト化ハイブリドーマ抗体（ＣＨＡ．９．５４７．１）、およびベンチマーク抗体（ＢＭ２６）の用量滴定を示す。ＰＢＭＣは、以下の系列マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ５６、およびＣＤ９５に対する抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ならびにＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅアクア色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で表面染色した。次いで、ＡＦ６４７標識抗ＴＩＧＩＴ抗体およびｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体（抗Ｓｙｎａｇｉｓ）を、３０μｇ／ｍｌ（３９６ｎＭ￥［結合部位］）で開始する１２点にわたる段階３倍希釈を用いて滴定した。エフェクターメモリーＴ細胞に結合した抗ＴＩＧＩＴ抗体のｇＭＦＩを、抗Ｓｙｎａｇｉｓ  ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体のｇＭＦＩを差し引いて示す。２つのドナーにわたる各抗体のＫＤ値を表に報告する。親和性成熟ファージ抗体（ＣＰＡ．９．０８３およびＣＰＡ．９．０８６）が、カニクイザルエフェクターメモリーＴ細胞に対して最も高い結合親和性を有した。
【図７４】実施例５の実験に記載される、ヒト、カニクイザルおよびマウスＴＩＧＩＴへの抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合のＳＰＲ速度測定値を示す。親和性成熟ファージ抗体（ＣＰＡ．９．０８３、ＣＰＡ．９．０８６、ＣＰＡ．９．１０３）、ヒト化ハイブリドーマ抗体（ＣＨＡ．９．５４７．１およびＣＨＡ．９．５４７．７）、およびベンチマーク抗体（ＢＭ２６、ＢＭ２９）の反応速度定数および平衡解離定数を、ＰｒｏｔｅＯｎ機器でのＳＰＲによって決定した。
【図７５】実施例４の実験に記載されるように、抗ＴＩＧＩＴ抗体がＰＶＲ／ＴＩＧＩＴ相互作用を遮断することを示す。ヒトＴＩＧＩＴを過剰発現するＥｘｐｉ２９３細胞を、親和性成熟ファージ抗体（ＣＰＡ．９．０８３、ＣＰＡ．９．０８６）、ヒト化ハイブリドーマ抗体（ＣＨＡ．９．５４７．７、ＣＨＡ．９．５４７．１３）、ベンチマーク抗体（ＢＭ２６、ＢＭ２９）、またはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照（抗Ｓｙｎａｇｉｓ）のいずれかでプレインキュベートした。全ての抗体を、１０μｇ／ｍｌ（１３３．３３ｎＭ￥［結合部位］）で開始する１１点にわたる段階２．５倍希釈を用いて滴定した。抗体プレインキュベーションの後、ヒトＰＶＲ−ｍ２ａＦｃを１５８ｎＭ［結合部位］またはＥＣ９０で細胞に加えた。抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合を検出するために、ＡＦ６４７標識ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を次いで細胞に加えた。ヒトＴＩＧＩＴを過剰発現するＥｘｐｉ２９３細胞へのＰＶＲ−ｍ２ａＦｃ結合の阻害パーセントを各抗体について示す。各抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体のＩＣ５０値を表に報告する（ｎ＝２回の実験）。
【図７６】親和性成熟ファージ抗体（ＣＰＡ．９．０８３、ＣＰＡ．９．０８６）、ヒト化ハイブリドーマ抗体（ＣＨＡ．９．５４７．７、ＣＨＡ．９．５４７．１３）、およびベンチマーク抗体（ＢＭ２６）が、ＩＬ−２シグナル伝達を用量依存的様態で増加させるという、実施例６の結果を示す。Ｓｙｎａｇｉｓ  ｈＩｇＧ４はアイソタイプ対照抗体である。代表的なデータ（ｎ≧２）は、Ｊｕｒｋａｔ  ＩＬ−２−ＲＥルシフェラーゼヒトＴＩＧＩＴ細胞とＣＨＯ−Ｋ１ヒトＰＶＲ細胞の６時間の共培養からのルシフェラーゼシグナルのＲＬＵ（平均＋／−標準偏差）を示す。各抗体について、２０μｇ／ｍｌで開始する１９点、１．５倍希釈系列を使用した。
【図７７】抗ＴＩＧＩＴ抗体がＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＩＦＮγを誘導することを示す。ヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞でのインビトロ共培養アッセイを利用して、実施例６の実験に記載される、抗原特異的サイトカイン分泌に対する親和性成熟ファージ抗体（ＣＰＡ．９．０８３、ＣＰＡ．９．０８６）、ヒト化ハイブリドーマ抗体（ＣＨＡ．９．５４７．７、ＣＨＡ．９．５４７．１３）、およびベンチマーク抗体（ＢＭ２６、ＢＭ２９）の効果を評価した。アッセイに用いた標的細胞株は、ヒトＰＶＲおよびＰＶＲＬ２を内因性で発現するＨＬＡ−Ａ２＋膵臓腺癌細胞Ｐａｎｃ．０５．０４であった。Ｐａｎｃ．０５．０４細胞に、０．０３μｇ／ｍｌまたは０．０１μｇ／ｍｌのＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチドを３７℃で１時間パルスした。次いで、細胞を洗浄し、９６ウェル丸底組織培養処理プレートに５０，０００細胞／ウェルでプレートした。抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体またはアイソタイプ対照ｈＩｇＧ４抗体（抗Ｓｙｎａｇｉｓ）を０．１μｇ／ｍｌの濃度で添加した。単一のドナー由来のヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を上記のプロトコルに従って増殖させた。５０，０００個のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を各ウェルに添加した。共培養物を３７℃で、５％ＣＯ２と共に２４時間インキュベートした。共培養上清中のヒトインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の量を、フローサイトメトリーにより、サイトメトリービーズアッセイ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。ｈＩｇＧ４アイソタイプと比べた各抗体のＩＦＮγ分泌の増加パーセントを表に要約する（ｎ＝２回の実験）。
【図７８】抗ＴＩＧＩＴ抗体が、ＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と組み合わせたときにＩＦＮγを増強することを示す。ヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞でのインビトロ共培養アッセイを利用して、抗ＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ．７．５１８．１と組み合わせて、抗原特異的サイトカイン分泌に対する親和性成熟ファージ抗体（ＣＰＡ．９．０８３、ＣＰＡ．９．０８６）、ヒト化ハイブリドーマ抗体（ＣＨＡ．９．５４７．７、ＣＨＡ．９．５４７．１３）、およびベンチマーク抗体（ＢＭ２６、ＢＭ２９）の効果を評価した。アッセイに用いた標的細胞株は、ヒトＰＶＲおよびＰＶＲＬ２を内因性で発現するＨＬＡ−Ａ２＋膵臓腺癌細胞Ｐａｎｃ．０５．０４であった。Ｐａｎｃ．０５．０４細胞に、０．０３μｇ／ｍｌまたは０．０１μｇ／ｍｌのＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチドを３７℃で１時間パルスした。次いで、細胞を洗浄し、９６ウェル丸底組織培養処理プレートに５０，０００細胞／ウェルでプレートした。抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体またはアイソタイプ対照ｈＩｇＧ４抗体（抗Ｓｙｎａｇｉｓ）を、ＣＨＡ．７．５１８．１（斜線付きバー）または１０μｇ／ｍｌの対照ｈＩｇＧ４アイソタイプ抗体（塗りつぶされたバー）と組み合わせて、０．１μｇ／ｍｌの濃度で添加した。単一のドナー由来のヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を上記のプロトコルに従って増殖させた。５０，０００個のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を各ウェルに添加した。共培養物を３７℃で、５％ＣＯ２と共に２４時間インキュベートした。共培養上清中のヒトＩＦＮγの量を、フローサイトメトリーにより、サイトメトリービーズアッセイ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。ｈＩｇＧ４アイソタイプと比べた各抗体のＩＦＮγ分泌の増加パーセントを表に要約する（ｎ＝２回の実験）。
【図７９】解離した腫瘍からのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＰＶＲＩＧおよびＴＩＧＩＴ発現の相関分析を示す。各腫瘍試料について、平均蛍光強度比（ＭＦＩｒ）を算出し、スピアマン相関分析を行い、ｒ２およびｐ値を報告した。
【図８０】抗マウスＰＶＲＩＧ抗体で処置したＴＩＧＩＴ  ＫＯマウスにおける腫瘍増殖阻害および生存の結果を示す。７〜１０匹のＴＩＧＩＴ  ＫＯおよびＣ５７ＢＬ／６ＷＴマウスの群に、１×１０５個のＢ１６／Ｄｂ−ｈｍｇｐ１００細胞を皮下注射した。マウスを、接種日（０日目）から開始して週２回、３週間にわたって、示される抗体で処置した。Ａ）平均腫瘍体積＋／−平均値の標準誤差（±ＳＥＭ）が上のグラフに示され、このうち＊＊＊は、ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体で処置したＣ５７ＢＬ／６ＷＴと比較した、抗マウスＰＶＲＩＧ抗体（クローン４０７）で処置したＴＩＧＩＴ  ＫＯについてのｐ値＜０．００１を示す。各抗体処置群内の個々のマウスの腫瘍体積が、下のグラフにスパイダープロットとして示される。Ｂ）ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照で処置した対照Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴマウスと比較した、示される日に測定したＴＧＩを要約した表。Ｃ）Ｂ１６／Ｄｂ−ｈｍｇｐ１００細胞の皮下注射後のマウスの生存。
【図８１】図８１Ａ〜Ｃは、Ｍｅｌ−６２４、Ｃｏｌｏ２０５、およびＰａｎｃ．０５．０４細胞における、対照と比較した、示される抗体との併用処置を図示する。ｇｐ１００またはＣＭＶ  ｐｐ６５特異的Ｔ細胞を、Ｍｅｌ−６２４、Ｃｏｌｏ２０５、およびＰａｎｃ．０５．０４細胞、ｇｐ１００またはＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチド、ならびに１０ｍｇ／ｍｌの示される抗体と共培養した。馴化培地中のＩＦＮ−γ濃度を２４時間時点で決定した。３連実験の平均＋標準偏差が示される。ｈＩｇＧ４に対する各条件のＩＦＮ−γの変化％が示される。
【図８２】図８２Ａ〜Ｃは、ＣＤ８Ｔ細胞上でのＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ／ＰＶＲＩＧの発現およびＣｏｌｏ２０５、Ｐａｎｃ．０５．０４細胞上でのＰＤ−Ｌ１、ＰＶＲ、ＰＶＲＬ２の発現を図示する。Ａ）ＩＬ−２およびＩＬ−７と共にｐｐ６５ペプチドで１０日間増殖させたＣＭＶ  ｐｐ６５反応性Ｔ細胞上でのＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、およびＰＤ−１の発現。ＣＭＶ  ｐｐ６５反応性Ｔ細胞上でのＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、およびＰＤ−１の発現が示される。Ｂ）Ｃｏｌｏ２０５およびＰａｎｃ．０５．０４細胞上でのＰＤ−Ｌ１、ＰＶＲ、およびＰＶＲＬ２の発現が示される。Ｃ）ＣＭＶ  ｐｐ６５特異的Ｔ細胞を、Ｃｏｌｏ２０５およびＰａｎｃ．０５．０４細胞、ＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチド、および１０ｍｇ／ｍｌの示される抗体と共培養した。馴化培地中のＩＦＮ−γ濃度を２４時間時点で決定した。３連実験の平均＋標準偏差が示される。ｈＩｇＧ４に対する各条件のＩＦＮ−γの変化％を示す。
【図８３】ＰＶＲＩＧは、ヒト癌からの細胞傷害性リンパ球サブセット上で最も高度に発現される。Ａ）５−８つの健康なドナーＰＢＭＣからの白血球細胞サブセット上でのＰＶＲＩＧの発現が示される。ＰＶＲＩＧ発現は、アイソタイプ対照ＭＦＩに対するＰＶＲＩＧ  ＭＦＩの比率として定義される。Ｂ）５つの健康なドナーＰＢＭＣからのＣＤ８Ｔ細胞サブセットと比較した末梢血Ｔｒｅｇ上でのＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、およびＰＤ−１の発現が示される。Ｃ）３つの健康なドナーからのＣＭＶ  ｐｐ６５特異的Ｔ細胞を、ｐｐ６５（４９５〜５０３）ペプチド、ＩＬ−２およびＩＬ−７で最大７日間、インビトロで増殖させた。ＨＬＡ−Ａ２／ｐｐ６５（４９５〜５０３）四量体陽性細胞上でのＴＩＧＩＴ（青色）およびＰＶＲＩＧ（黒色）の発現が示される。Ｄ）ヒトＴ細胞を同種ＤＣと共に培養し、ＴＩＧＩＴおよびＰＶＲＩＧの発現が、活性化後０、１、２、および７日目にＣＤ４＋Ｔ細胞上に示される。Ｅ）代表的な肺および腎臓癌由来のＴＩＬ（ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、およびＮＫ細胞）上のアイソタイプ対照（赤色）と比較したＰＶＲＩＧ（青色）の発現を示す代表的なＦＡＣＳプロット。Ｆ）肺癌試料由来のＣＤ４およびＣＤ８ＴＩＬ上でのＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、およびＰＤ−１の共発現が示される。Ｇ）様々な癌の種類の解離したヒト腫瘍由来のＣＤ８＋およびＣＤ４＋ＴＩＬ上でのＰＶＲＩＧの発現が示される。各ドットは、個々の患者からの別々の腫瘍を表す。Ｈ）子宮内膜癌、腎臓癌、および肺腫瘍由来のＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、およびＰＤ−１上でのＣＤ８ＴＩＬ対Ｔｒｅｇ  ＴＩＬの相対的発現を評価した。各腫瘍について、ＣＤ８ＴＩＬ上での発現倍率をＴｒｅｇ  ＴＩＬ上での発現倍率に対して正規化し、プロットした。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｇ、およびＨについて、平均＋ＳＥＭが誤差バーで示される。
【図８４】ＰＶＲＬ２発現は腫瘍微小環境において増強される。Ａ）肺癌、卵巣癌／子宮内膜癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、および黒色腫腫瘍に関するＩＨＣによりＰＶＲＬ２発現を評価した。バーは平均＋ＳＥＭを示す。各腫瘍について、２つのコアを病理学者が評価し、補足的方法に記載されるように、腫瘍細胞上の膜染色の蔓延率および強度に基づいてスコアを付けた。各腫瘍について、２つのコアの平均スコアが示される。Ｂ）間質における腫瘍細胞（矢印）および免疫細胞（＊）上でのＰＶＲＬ２発現を示す代表的な黒色腫腫瘍を示す。Ｃ）ＣＤ４５−、ＣＤ１４＋ＴＡＭ、およびＬｉｎ−ＣＤ１４−ＣＤ３３ｈｉｍＤＣ細胞サブセット上での、ＦＡＣＳによって決定した解離腫瘍由来のｌｏｇ２スケールでのＰＶＲＬ２発現が示される。平均＋ＳＥＭが各癌の種類について示される。点線は染色が観察されなかったことを表す。各細胞型について、分析するために少なくとも１００の事象が必要であった。Ｄ）ＩｇＧ（赤色）と比較したＰＶＲＬ２発現（青色）の代表的なＦＡＣＳプロットが、肺癌について示される。Ｅ）ＰＶＲＩＧおよびＰＶＲＬ２発現の両方を評価することができた腫瘍試料について、ＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＰＶＲＩＧ発現を、各腫瘍についてのＣＤ１４＋ＴＡＭＳおよびＣＤ４５−細胞上でのＰＶＲＬ２発現に対してプロットした。各ドットは、個々の腫瘍試料を表す。赤色の線は、ＩｇＧと比較したＰＶＲＩＧまたはＰＶＲＬ２の２倍の発現を表す。図８４Ｆの表は、様々な腫瘍試料におけるＰＶＲＬ２の蔓延率を示す。
【図８５】腫瘍細胞上でのＰＶＲＬ２およびＰＤ−Ｌ１の別々の調節。Ａ）ＰＤ−Ｌ１およびＰＶＲＬ２の発現を、連続切片に対するＩＨＣにより評価した。図８４Ａからの腫瘍試料を組織型に基づいて群分けし、ＰＤ−Ｌ１陰性およびＰＤ−Ｌ１陽性におけるＰＶＲＬ２の発現を示す。ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍は、所与の腫瘍の２連コアのいずれからの腫瘍細胞または免疫細胞でも膜染色がないと定義された。ＰＤ−Ｌ１陽性染色は、腫瘍の少なくとも１つのコアでの膜染色として定義された。バーは各群の平均＋ＳＥＭを図示する。Ｂ、Ｃ）ＰＶＲＬ２＋ＰＤ−Ｌ１−子宮内膜（Ｂ）腫瘍およびＰＶＲＬ２＋ＰＤ−Ｌ１−肺（Ｃ）腫瘍の代表的な発現Ｄ）未成熟ＢＭ−ＤＣを示される刺激物質と共に培養し、培養２日目にＰＶＲ、ＰＶＲＬ２、およびＰＤ−Ｌ１の発現をＦＡＣＳによって評価した。各条件について、発現を培地のみの対照条件に対して正規化した。Ｅ）ＩＦＮ−γまたは培地単独で処理したＨＴ−２９細胞上でのＰＶＲ、ＰＶＲＬ２、およびＰＤ−Ｌ１の発現を示す。ＰＤ−Ｌ１またはＰＶＲＬ２は青色で示され、ＩｇＧアイソタイプ対照染色は赤色で示される。
【図８６】ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、Ｔ細胞活性化を増強する高親和性抗体である。Ａ）ＦＡＣＳによるＨＥＫ２９３  ＰＶＲＩＧまたはＨＥＫ２９３親細胞へのＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）またはＩｇＧアイソタイプ対照の結合が示される。ＨＥＫ２９３  ｈＰＶＲＩＧ、ＨＥＫ２９３  ｃＰＶＲＩＧ、およびＪｕｒｋａｔ細胞へのＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の結合についてのＦＡＣＳ  ＫＤ値が示される。Ｂ）ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、ＰＶＲＩＧを異所的に発現するＨＥＫ２９３細胞へのＰＶＲＬ２  Ｆｃの結合を妨害する。３連値の平均＋標準偏差が示される。Ｃ）ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、ＰＶＲＬ２を内因性で発現するＨＥＫ２９３細胞へのＰＶＲＩＧ  Ｆｃの結合を遮断する。Ｄ）ヒトＣＤ４  Ｔ細胞を、１０μｇ／ｍｌの抗ＰＶＲＩＧ抗体およびヒトＩｇＧアイソタイプ対照抗体の存在下で、細胞表面結合抗ＣＤ３抗体およびｈＰＶＲＬ２を発現するａＡＰＣ  ＣＨＯ細胞と共培養した。１１の異なるドナーから単離されたＣＤ４  Ｔ細胞の増殖に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果が示される。バーは平均＋ＳＥＭを図示する。Ｅ）ｇｐ１００特異的Ｔ細胞株（ＴＩＬ−２０９、ＴＩＬ−４６３）を、１０μｇ／ｍｌの抗ＰＶＲＩＧまたはＩｇＧアイソタイプ対照抗体と共に、ＨＬＡ−Ａ２およびＰＶＲＬ２を発現するように操作したＣＨＯ細胞と共培養した。ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α産生は、共培養の２４時間後に試験した。３連値の平均＋標準偏差が示される。アイソタイプ対照と比較した各条件のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのパーセント変化を、各バーの上の数字で示す。Ｆ）ＭＥＬ６２４、Ｃｏｌｏ２０５、およびＰａｎｃ．０５．０４細胞上での、ＩｇＧ（青色）と比較したＰＶＲ、ＰＶＲＬ２、およびＰＤ−Ｌ１（赤色）の発現が示される。Ｔ細胞については、ＴＩＬ−２０９およびＴＩＬ−４６３  ｇｐ１００特異的Ｔ細胞上での、ならびにＣＭＶ  ｐｐ６５特異的Ｔ細胞上での、ＩｇＧ（青色）と比較したＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、およびＰＤ−１（赤色）の発現が示される。ＣＭＶｐｐ６５反応性Ｔ細胞を増殖させるために、ＰＢＭＣをｐｐ６５（４９５〜５０３）ペプチド、ＩＬ−２、およびＩＬ−７と共に１０日間培養した。ＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ−１の発現は、ＨＬＡ−Ａ２／ｐｐ６５四量体陽性細胞上で示される。Ｇ）黒色腫腫瘍に由来するＴＩＬから増殖させたｇｐ１００特異的Ｔ細胞（ＴＩＬ−２０９、ＴＩＬ−４６３）を、１０μｇ／ｍｌの示される抗体の存在下でＭＥＬ６２４細胞と共培養した。馴化培地中のＩＦＮ−γ濃度を２４時間時点で決定した。Ｈ、Ｉ）増殖させたＣＭＶ  ｐｐ６５特異的Ｔ細胞を、Ｃｏｌｏ２０５およびＰａｎｃ．０５．０４細胞、ＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチド、および１０μｇ／ｍｌの示された抗体と共培養した。馴化培地中のＩＦＮ−γ濃度を２４時間時点で決定した。Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉについて、３連実験の平均＋標準偏差が示される。アイソタイプ対照と比較した各条件のＩＦＮ−γのパーセント変化を、各バーの上の数字で示す。
【図８７】ＰＶＲＩＧ欠損マウスはＴ細胞機能を増加させた。Ａ）精製したマウス免疫細胞サブセットからのｑＲＴ−ＰＣＲによって測定したＰＶＲＩＧのＲＮＡ発現を評価した。ハウスキーピングに対する相対的発現は、ΔＣｔ法によって決定した。Ｂ）ｐｍｅｌ  ＣＤ８＋ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞をｇｐ１００（２５〜３３）で活性化し、ＰＶＲＩＧおよびＴＩＧＩＴ  ＲＮＡ転写物レベルを、示される時点でｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した。グラフは、５つの異なる実験からの結果の平均＋ＳＥＭを示す。Ｃ）脾臓をＰＶＲＩＧ−／−およびＷＴ同腹仔から採取し、ＮＫ、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（「休止」細胞）上でのＰＶＲＩＧの発現についてフローサイトメトリーによって分析した。さらに、ＣＤ３＋Ｔ細胞を脾細胞から単離し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで１１日間活性化した。活性化後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（「活性化」細胞）上でのＰＶＲＩＧ発現をフローサイトメトリーによって分析した。各ドットは、個々のマウス由来の細胞を表す。Ｄ）ＷＴおよびＰＶＲＩＧ−／由来の脾細胞をＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ４５０で標識し、対照−Ｆｃ（マウスＩｇＧ２ａ）の存在下でまたはマウスＰＶＲＬ２  Ｆｃと共に培養した。４日間の培養後、細胞分裂をフローサイトメトリーによって分析した。ある実験からの代表的なＦＡＣＳプロット（左）および３つの独立した実験のＰＶＲＬ２  Ｆｃによる阻害パーセンテージ（ＰＶＲＬ２  Ｆｃ増殖％から対照−Ｆｃ増殖％を減算したものと定義する）の要約（右）が提示される。＊は、ＷＴ対ＰＶＲＩＧ−／−Ｔ細胞における、タンパク質対照の存在下での増殖と比較したＰＶＲ２−ＦＣの存在下での増殖の変化についての対応のあるスチューデントｔ検定、ｐ値＜０．０５を示す。Ｅ）ｐｍｅｌ  ＰＶＲＩＧ−／−またはｐｍｅｌ  ＰＶＲＩＧ  ＷＴマウス由来のｐｍｅｌ  ＣＤ８＋Ｔ細胞を同族のペプチドおよびＩＬ２で１１日間活性化した。次いで、活性化したｐｍｅｌ  ＣＤ８＋細胞をＢ１６−Ｄｂ／ｇｐ１００細胞と共に１８時間共培養し、共培養後、ＣＤ１０７発現およびサイトカイン産生について評価した。各対合ドットによって示されるように４つの独立した実験が提示される。＊は、ＰＶＲＩＧ−／−対ＷＴを比較するスチューデントｔ検定、ｐ値＜０．０５を示す。
【図８８】ＰＶＲＩＧ欠損は、腫瘍増殖の低減およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞機構の増加をもたらす。Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６  ＷＴまたはＰＶＲＩＧ−／−マウスに、５×１０５個のＭＣ３８細胞を皮下注射した。腫瘍体積を週２回測定した。ｎ＝１群当たり１０匹のマウス、平均＋ＳＥＭが示され、＊は、ＷＴマウス対ＰＶＲＩＧ−／−マウスについての対応のないスチューデントｔ検定（ＡＮＯＶＡ）によるｐ値＜０．０５を示す。Ｂ）個々の腫瘍増殖曲線を示す。ｎ＝１群当たり１０匹のマウス、１つの代表的な実験が示されている（ｎ＝２）。Ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴまたはＰＶＲＩＧ−／−マウスに、５×１０５個のＭＣ３８細胞を皮下注射した。接種後１４日目に、マウスを抗ＰＤ−Ｌ１で、週２回、２週間にわたって処置した。腫瘍体積を週２回測定した。ｎ＝１群当たり１０匹のマウス、平均＋ＳＥＭが示され、ＷＴマウス対ＰＶＲＩＧ−／−マウス（両方とも抗ＰＤ−Ｌ１で処置した）についての対応のないスチューデントｔ検定によるｐ値＝＜０．０５２である。Ｄ）個々の腫瘍増殖曲線を示す。１つの代表的な実験が示されている（ｎ＝２）。Ｅ〜Ｈ）別個の２連実験において、マウスに２用量の抗ＰＤ−Ｌ１または関連するアイソタイプ対照を投与した後１８日目に腫瘍を採取した。解離した腫瘍をＣＤ４５＋細胞について濃縮してから、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａの存在下でＰＭＡおよびイオノマイシンで４時間刺激した。グラフは、アイソタイプで処置した野生型マウスおよびＰＶＲＩＧ−／−マウス（Ｅ）から、ならびに抗ＰＤーＬ１で処置した野生型マウスおよびＰＶＲＩＧ−／−マウス（Ｆ）からの、腫瘍組織１ｍｇあたりのＣＤ４５＋免疫細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびインターフェロン−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の総数を示す。Ｇ〜Ｈ）対応する野生型コホートと比較した、アイソタイプ処置および抗ＰＤ−Ｌ１処置ＰＶＲＩＧ−／−マウス由来の腫瘍流入領域リンパ節におけるＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋エフェクター細胞の頻度を示す。Ｅ〜Ｈについて、平均＋ＳＥＭが示され、対応のないスチューデントｔ検定からのｐ値が示される。
【図８９】アンタゴニスト抗ＰＶＲＩＧ抗体は、ＰＤ−１阻害剤またはＴＩＧＩＴ遺伝子欠損の組み合わせにおいて腫瘍増殖を相乗的に阻害する。Ａ）抗ｍＰＶＲＩＧ  ｍＡｂまたはＩｇＧアイソタイプ対照抗体の段階希釈液でプレインキュベートしたｍＰＶＲＩＧ  ＨＥＫ２９３操作細胞へのｍＰＶＲＬ２  Ｆｃ融合タンパク質の結合が示される。Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０５個のＣＴ２６細胞を皮下注射した。接種後１４日目にマウスを屠殺し、脾臓、流入領域リンパ節および腫瘍を採取した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ３−ＣＤ４９ｂ＋ＮＫ細胞、Ｄ１１ｂ＋ＧＲ−１＋骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）およびＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋マクロファージ上でのＰＶＲＩＧの発現について、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。Ｃ、Ｄ）ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０５個のＣＴ２６細胞を皮下注射した。接種後７日目に、マウスを抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＰＶＲＩＧ抗体で週２回、３週間にわたって処置した（矢印は抗体処置を示す）。Ｃ）腫瘍体積が示される。＊＊＊は、αＰＤ−Ｌ１＋ａＰＶＲＩＧ処置群と比較した、ａＰＤ−Ｌ１＋ラットＩｇＧ２ｂについてのｐ値＜０．００１（ＡＮＯＶＡ）を示す。矢印は、抗体が投与された時期を示す。Ｄ．完全レスポンダーのマウスの生存分析。＊は、αＰＤ−Ｌ１＋αＰＶＲＩＧ処置群と比較した、αＰＤ−Ｌ１＋ラットＩｇＧ２ｂについてのｐ値＜０．０５（ログランク検定）を示す。３つの研究のうちの１つの代表的な研究が示される。Ｅ．Ｃ５７ＢＬ／６またはＴＩＧＩＴ−／−マウスに、１×１０５個のＢ１６／Ｄｂ−ｈｍｇｐ１００細胞を皮下注射した。接種当日（０日目）から開始して、マウスを指定のｍＡｂで週２回、３週間にわたって処置した。Ｅ．腫瘍体積を週２回測定し、平均±ＳＥＭを示す（ｓｈｏｗｎ  ｓｈｏｗｎ）。対照ＷＴ＋ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した、示される日に測定した腫瘍増殖阻害。＊＊＊は、ＷＴ＋ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した、ＴＩＧＩＴ−／−＋ａＰＶＲＩＧについてのｐ値＜０．００１を示す。矢印は、抗体が投与された時期を示す。Ｆ．各マウスの個々の腫瘍増殖曲線を示す。実施した２つの実験のうちの代表的な１つを示す。
【図９０】ＰＶＲＩＧが、ヒト癌におけるＴＩＬのＴ細胞およびＮＫ細胞上で発現される。Ａ）健康なドナーＰＢＭＣからのＣＤ４  Ｔ細胞サブセット上でのＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、およびＰＤ−１の発現が示される。平均＋ＳＥＭが示される。Ｂ）ヒトＴ細胞を同種異系ＰＢＭＣと共培養し、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞上でのＰＶＲＩＧタンパク質の発現を示す（上図）。Ｃ）腫瘍を解離させ、単一細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で活性化した。ＩｇＧアイソタイプ対照（赤色）と比較したＰＶＲＩＧ（青色）の発現を活性化後０日目（エクスビボで直接）および５日目に評価した。Ｄ）解離したヒト腫瘍由来のＮＫ細胞上でのＰＶＲＩＧの発現が示される。各ドットは、個々の患者からの別々の腫瘍を表す。平均＋９５％信頼区間が示される。Ｄ）解離した腫瘍細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ビーズで５日間活性化した。活性化後０日目にエクスビボで直接、および５日目の、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞上でのＩｇＧ対照（赤色）と比較したＰＶＲＩＧ（青色）の発現を、２つの解離した腫瘍試料について示す。Ｅ）ＰＶＲＩＧの発現を、解離した腫瘍由来、および解離したドナーに一致する正常な隣接組織由来のＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞について評価した。各線は、個々の患者から得られた一致した組織を表す。対応のあるスチューデントｔ検定を実施した。Ｆ）腫瘍由来のＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞上での、ＩｇＧアイソタイプ対照と比較したＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、およびＰＤ−１の発現倍率の規模の相関分析を示す。各ドットは、個々の腫瘍試料を表す。スピアマンの相関係数およびｐ値が示される。
【図９１】ＰＶＲＬ２の発現は大腸癌、皮膚癌、乳癌において増強される。Ａ）ｐＨ９での抗原回収後の、陰性細胞ＣＨＯ−Ｓ（左）と比較した陽性細胞ＣＨＯ−ＳヒトＰＶＲＬ２（右）のＦＦＰＥ切片へのＳｉｇｍａ抗ヒトＰＶＲＬ２抗体の結合を示す顕微鏡写真。る。Ｂ）抗ＰＶＲＬ２抗体をＰＶＲＬ２＋（ＨＴ２９、ＭＣＦ７、ＰＣ３、ＰＡＮＣ１、ＲＴ４、ＮＣＩ−Ｈ１５７３）およびＰＶＲＬ２−（Ｊｕｒｋａｔ、ＯＰＭ２、Ｄａｕｄｉ、ＣＡ４６）細胞株のパネルに対して試験した。Ｃ〜Ｆ）肺の正常組織および癌組織におけるＰＶＲＬ２の発現例。Ｃ）染色のない正常組織。Ｄ）部分陽性染色を示す肺腺癌。Ｅ）陽性染色を示す肺腺癌。Ｆ）強い陽性染色を示す肺腺癌。
【図９２】ＰＶＲＬ２は、正常な隣接組織と比較して、腫瘍におけるＴＡＭおよびＣＤ４５−細胞上で上方制御される。ドナーに一致する腫瘍および正常な隣接組織由来のＣＤ４５−細胞およびＴＡＭ上でのＰＶＲＬ２の発現が示される。対応のあるスチューデントｔ検定によるｐ値を示す。
【図９３】ＰＶＲＩＧおよびＰＶＲＬ２が同じ腫瘍試料中で共発現される。ＣＤ４Ｔ細胞（Ａ）およびＮＫ細胞（Ｂ）上でのＰＶＲＩＧ発現を、個々の腫瘍についてのＴＡＭ上でのＰＶＲＬ２発現に対してプロットする。
【図９４】ヒトＴ細胞に対するＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の活性。Ａ）細胞表面結合した抗ＣＤ３およびＰＶＲＬ２を発現するＣＨＯ細胞で活性化されたＣＤ４Ｔ細胞上でのＰＶＲＩＧの発現。Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２、Ｂ−２ｍ、およびＰＶＲＬ２の発現が、ＣＨＯ−Ｓ親細胞株および操作されたＣＨＯ−Ｓ細胞株上で示される。アイソタイプと比較した発現倍率が、数字によって示される。Ｃ）細胞表面に結合した抗ＣＤ３およびＰＶＲＬ２を異所的に発現するＣＨＯ細胞を、様々な濃度の抗ＰＶＲＩＧ抗体または関連ＩｇＧ対照の存在下で精製ＣＤ８Ｔ細胞と共培養した。増殖％が示される。各ドットは、３連実験値の平均を表す。Ｄ）ＨＬＡ−Ａ２／Ｂ２ｍ異所的発現ＣＨＯ細胞を、１ｕｇ／ｍｌのｇｐ１００および様々な濃度の抗ＰＶＲＩＧ抗体または関連ＩｇＧ対照の存在下で、２つのｇｐ１００特異的Ｔ細胞株（ＴＩＬ  Ｆ４、ＴＩＬ  ２０９）と共培養した。共培養３日目のＴＮＦ−α濃度は低下している。各値は、３連実験の平均を表す。
【図９５】ｍＰＶＲＩＧ結合相互作用および代理抗ｍＰＶＲＩＧ抗体の特徴付け。Ａ、Ｂ）ｍＰＶＲＬ２へのｍＰＶＲＩＧの結合を、表面プラズモン共鳴によって評価した。Ｃ）可溶性受容体Ｆｃまたは対照タンパク質を、ＥＬＩＳＡフォーマットで固定化したｍＰＶＲＬ２  ＨＩＳとの用量反応においてインキュベートした。結合した受容体Ｆｃが示される。Ｄ）可溶性ＰＶＲＬ２  ＨＩＳタンパク質を、ＰＶＲＩＧ  ＦｃまたはＤＮＡＭ  Ｆｃコーティングプレートとの用量反応においてインキュベートした。Ｅ）ｍＰＶＲＬ２  ｓｉＲＮＡ、ｍＰＶＲｓＲＮＡ、またはスクランブルｓｉＲＮＡトランスフェクションでトランスフェクトされたＢ１６−Ｆ１０細胞系へのｍＰＶＲＩＧ  Ｆｃまたは対照Ｆｃ融合タンパク質の結合が示される。Ｆ）ｍＰＶＲＩＧを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への抗ｍＰＶＲＩＧの結合を検査することにより、ラット抗マウスＰＶＲＩＧ  ｍＡｂの親和性の特徴付けを行った。Ｇ）アイソタイプ対照ラットＩｇＧと対比した、ｍＰＶＲＩＧを内因性で発現するＤ１０．Ｇ４．１細胞株への抗ｍＰＶＲＩＧの結合を検査することにより、ラット抗マウスＰＶＲＩＧ  ｍＡｂの親和性の特徴付けを行った。Ｈ）ｓｃｒ  ｓｉＲＮＡ（オレンジ色のヒストグラム）と対比した、マウスＰＶＲＩＧ−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＤ１０．Ｇ４．１細胞（緑色ヒストグラム）への抗ｍＰＶＲＩＧの結合。Ｉ）ＰＶＲＬ２を内因性で発現するＢ１６−Ｆ１０細胞への、抗ｍＰＶＲＩＧ抗体でプレインキュベートしたｍＰＶＲＩＧ  Ｆｃの結合
【図９６】トランスジェニックＰＶＲＩＧおよびＴＩＧＩＴノックアウトマウスの作製。ＰＶＲＩＧ条件付きノックアウトマウスおよびＴｉｇｉｔノックアウトマウス株は、Ｏｚｇｅｎｅ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ（Ｂｅｎｔｌｅｙ  ＷＡ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって作製された。Ａ）ＰＶＲＩＧエクソン１〜４にｌｏｘＰ導入した標的化構築物をＣ５７ＢＬ／６ＥＳ細胞株、Ｂｒｕｃｅ４（Ｋｏｅｎｔｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５：９５７−９６４，１９９３）にエレクトロポレーションした。Ｂ）Ｔｉｇｉｔエクソン１（ＡＴＧを含む）ならびにエクソン２および３のコード領域がＦＲＴ隣接ネオカセットで置換された標的化構築物をＣ５７ＢＬ／６ＥＳ細胞株、Ｂｒｕｃｅ４にエレクトロポレーションした。相同組換えＥＳ細胞クローンをサザンハイブリダイゼーションにより特定し、ｇｏＧｅｒｍｌｉｎｅ胚盤胞に注入した（Ｋｏｅｎｔｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｇｅｎｅｓｉｓ  ５４：３２６−３３３，２０１６）。雄のキメラマウスを得、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌に交配させて、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド上にヘテロ接合生殖細胞系列子孫を樹立させた。生殖細胞系列マウスをユビキタスＦＬＰ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス株に交配させて、ＦＲＴ隣接選択可能マーカーカセットを除去し、条件付きまたはノックアウト対立遺伝子（それぞれＰＶＲＩＧおよびＴｉｇｉｔについて）を生成した。ＰＶＲＩＧノックアウトについては、マウスをユビキタスＣｒｅ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス株にさらに交配させて、ｌｏｘＰ隣接エキソンを除去し、ノックアウト対立遺伝子を生成した。
【図９７】ＰＶＲＩＧノックアウトマウスは、野生型マウスと免疫表現型的に同様である。マウス（野生型コホートおよびＰＶＲＩＧノックアウトコホートにつきｎ＝５）を安楽死させてから、静脈血を抗凝固剤コーティングチューブに収集し、臓器を採取した。新しく採取した骨髄、胸腺、脾臓、皮膚および腸間膜リンパ節から単細胞を回収した。細胞を蛍光色素結合表面マーカー抗体で染色し、ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで取得した。パネルは、リンパ組織型にわたる骨髄細胞（Ａ）、樹状細胞（Ｂ）、Ｂ細胞（Ｃ）、Ｔ細胞（Ｄ）、ＣＤ４Ｔ細胞（Ｅ）、ＣＤ８Ｔ細胞（Ｆ）、およびＮＫ細胞（Ｇ）の同等の頻度を示す。（Ｈ〜Ｉ）全静脈血をＨｅｍａｖｅｔ９５０獣医血液学システムで流して、野生型およびＰＶＲＩＧ欠損マウス由来の血液細胞サブセットの示差的数および頻度を比較した。
【図９８】抗ＰＤ−Ｌ１を用いたＷＴと比較して増加した、抗ＰＤＬ１で処置したＰＶＲＩＧ−／−マウスのＴ細胞エフェクター機能。ＭＣ３８腫瘍をＷＴまたはＰＶＲＩＧ−／−マウスに接種し、その後抗ＰＤ−Ｌ１またはラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照で処置した。１８日目に、ＣＤ４５＋腫瘍浸潤リンパ球を腫瘍から精製し、ＲＮＡを抽出し、転写物プロファイリングを行った。いくつかのＴ細胞関連遺伝子が示され、各ドットは個々のマウスを表す。スチューデントｔ検定によるｐ値が示される。
【図９９】抗ＴＩＧＩＴおよび抗ＰＶＲＩＧ抗体は、腫瘍細胞の殺傷を誘導する。ヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させたインビトロ共培養アッセイを利用して、抗原特異的腫瘍細胞殺傷に対するベンチマーク抗ＴＩＧＩＴ抗体およびＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の効果を評価した。アッセイに用いたＨＬＡ−Ａ２＋標的細胞株は、Ｍｅｌ６２４（Ａ）およびＰａｎｃ０５．０４（Ｂ）であった。Ｓｙｎａｇｉｓ  ｈＩｇＧ４はアイソタイプ対照抗体である。標的細胞におけるルシフェラーゼ活性を、Ｂｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼ基質を用いて測定した。代表的なデータ（ｎ≧２）は、３つの異なるドナーからのヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞との１６時間の共培養後の、Ｍｅｌ６２４またはＰａｎｃ０５．０４細胞の特異的殺傷パーセント（平均＋／−標準偏差）を示す。
【図１００】ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と共にした抗ＴＩＧＩＴ抗体の用量依存的腫瘍細胞殺傷。ヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させたインビトロ共培養アッセイを利用して、抗原特異的Ｍｅｌ６２４細胞殺傷に対する、２つの異なる抗ＴＩＧＩＴ抗体、ＢＭ２６およびＣＰＡ．９．０８６の、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と組み合わせたときの効果を評価した。標的細胞におけるルシフェラーゼ活性を、Ｂｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼ基質を用いて測定した。代表的なデータ（ｎ≧２）は、１つのドナーからのヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞との１６時間の共培養後の、Ｍｅｌ６２４細胞の特異的殺傷パーセント（平均＋／−標準偏差）を示す。
【図１０１】ＣＰＡ．９．０８６のＣＤＲ配列、ＩＭＧＴおよびＫａｂａｔ付番。
【図１０２】抗ＴＩＧＩＴ  ｈＩｇＧ４＋ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の組み合わせは、腫瘍細胞の殺傷を誘導する。ＣＭＶ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞と、Ｍｅｌ６２４ＰＶＲ、ＰＶＲＬ２およびルシフェラーゼＯＥとの共培養、ＣＭＶ反応性ドナー４では、１０μｇ／ｍｌのａＴＩＧＩＴ抗体および１０μｇ／ｍｌのＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の単回投与、一方でＣＭＶ反応性ドナー１５６では、用量滴定は、０．５μｇ／ｍｌのａＴＩＧＩＴ抗体および１０μｇ／ｍｌのＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）から開始。
【００３１】
Ｖ．発明を実施するための形態
Ａ．概要
本発明は、がんの治療のために、単独使用でまたは併用で有用ないくつかの抗体を提供する。癌は、患者が癌性細胞を認識し排除する能力を持たないものと見なすことができる。多くの場合、これらの形質転換した（例えば、がん性）細胞は、免疫監視に反作用する。体内でのＴ細胞活性化を制限して無制限なＴ細胞活性を予防する天然の制御機序が存在し、これを、がん性細胞が免疫応答を回避または抑制するために利用し得る。免疫エフェクター細胞、特にＴ細胞が癌を認識し排除する能力を回復させることが、免疫療法の目的である。「免疫療法」と称されることがある免疫腫瘍学の分野は、急速に進化しており、Ｙｅｒｖｏｙ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ、およびＯｐｄｉｖｏ等のＴ細胞チェックポイント阻害抗体が、いくつかの最近承認されたものである。これらの抗体は、それらがＴ細胞性免疫の通常は負の調節因子を遮断するため、一般に「チェックポイント阻害剤」と称される。共刺激性および共抑制性両方の種々の免疫調節シグナルを使用して、最適な抗原特異的免疫応答を統合することができると一般に理解されている。一般的に、これらの抗体は、通常の状況下では細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化を予防または抑制する、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１等のチェックポイント阻害剤タンパク質に結合する。チェックポイントタンパク質を阻害することにより、例えば、これらのタンパク質を結合する抗体の使用を介して、腫瘍に対する増加したＴ細胞応答を達成することができる。つまり、これらのがんチェックポイントタンパク質は免疫応答を抑制し、このタンパク質が、例えばチェックポイントタンパク質に対する抗体を使用して遮断されるとき、免疫系が活性化されることで免疫刺激につながり、その結果、がんおよび感染性疾患等の状態の治療をもたらす。
【００３２】
本発明は、追加のチェックポイントタンパク質、ＰＶＲＩＧおよびＴＩＧＩＴに対する抗体の使用に関する。ＰＶＲＩＧは、ＮＫおよびＴ細胞の細胞表面上で発現され、他の既知の免疫チェックポイントといくつかの類似点を共有する。ＰＶＲＩＧがチェックポイント受容体であることを示すために使用される識別および方法は、参照により本明細書に明示的に組み込まれるＷＯ２０１６／１３４３３３で考察される。ＰＶＬＲ２の相互作用および／または結合を遮断するヒトＰＶＲＩＧに対する抗体が本明細書で提供される。ＰＶＲＩＧにそのリガンド（ＰＶＲＬ２）が結合すると、ＮＫおよびＴ細胞の標的細胞に対する免疫応答を減弱させるように作用する（即ち、ＰＤ−１／ＰＤＬ１に類似した）抑制シグナルが励起される。ＰＶＲＬ２のＰＶＲＩＧへの結合の遮断により、ＰＶＲＩＧのこの抑制シグナルが断たれ、その結果、ＮＫおよびＴ細胞の免疫応答が調節される。ＰＶＲＬ２への結合を遮断する、ＰＶＲＩＧに対する抗体の利用は、ＮＫおよびＴ細胞による癌細胞の殺傷を増強する治療的アプローチである。ＰＶＲＩＧに結合し、そのリガンドであるＰＶＲＬ２の結合を遮断する遮断抗体が生成されてきた。ＰＤ−１等の他のチェックポイント阻害剤抗体と組み合わせた抗ＰＶＲＩＧ抗体が提供される。
【００３３】
同様に、ＴＩＧＩＴは、チェックポイント受容体の属性も有することが示されており、本発明は、ＴＩＧＩＴのＰＶＲへの相互作用および／または結合を遮断する抗ＴＩＧＩＴ抗体を提供する。ＴＩＧＩＴにそのリガンド（ＰＶＲ）が結合すると、ＮＫおよびＴ細胞の標的細胞に対する免疫応答を減弱させるように作用する（即ち、ＰＤ−１／ＰＤＬ１に類似した）抑制シグナルが励起される。ＰＶＲのＴＩＧＩＴへの結合の遮断により、ＴＩＧＩＴのこの抑制シグナルが断たれ、その結果、ＮＫおよびＴ細胞の免疫応答が調節される。ＰＶＲへの結合を遮断する、ＴＩＧＩＴに対する抗体の利用は、ＮＫおよびＴ細胞による癌細胞の殺傷を増強する治療的アプローチである。ＴＩＧＩＴに結合し、そのリガンドであるＰＶＲの結合を遮断する遮断抗体が生成されてきた。ＰＤ−１等の他のチェックポイント阻害剤抗体と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴ抗体が提供される。
【００３４】
さらに、本発明は、がんの治療に用いるための抗ＰＶＲＩＧおよび抗ＴＩＧＩＴ抗体の組み合わせを提供する。
【００３５】
Ｂ．定義
本発明をより完全に理解できるようにするため、いくつかの定義を以下に示す。かかる定義は、文法的同等物を包含することを意図する。
【００３６】
本明細書において「切除」とは、活性の低下または除去を意味する。いくつかの実施形態では、抗体の定常ドメインから活性を除去することが有用である。したがって、例えば、「ＦｃγＲ結合を切除する」とは、Ｆｃ領域アミノ酸バリアントが、その特定のバリアントを含まないＦｃ領域と比較して５０％未満の開始結合を有することを意味し、７０−８０−９０−９５−９８％未満の活性喪失が好ましく、一般に、活性はＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいて検出可能な活性のレベル未満である。図５０に示すように、ＩｇＧ１定常領域における１つの切除バリアントはＮ２９７Ａバリアントであり、これは天然グリコシル化部位を除去し、ＦｃγＲＩＩＩａ結合を大幅に低減し、故に抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を低減する。
【００３７】
本明細書において「抗原結合ドメイン」または「ＡＢＤ」とは、ポリペプチド配列の一部として存在する場合、本明細書で考察されるような標的抗原に特異的に結合する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の組を意味する。したがって、「ＴＩＧＩＴ抗原結合ドメイン」は、本明細書に概説されるＴＩＧＩＴ抗原（その配列は図５１に示される）に結合する。同様に、「ＰＶＲＩＧ抗体結合ドメイン」は、本明細書に概説されるＰＶＲＩＧ抗原（その配列は図１に示される）に結合する。当該技術分野で知られているように、これらのＣＤＲは、可変重鎖ＣＤＲ（ｖｈＣＤＲまたはＶＨＣＤＲ）の第１の組および可変軽鎖ＣＤＲの第２の組（ｖｌＣＤＲまたはＶＬＣＤＲ）として一般に存在し、各々が３つのＣＤＲ、即ち重鎖についてｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、軽鎖についてｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２およびｖｌＣＤＲ３を含む。ＣＤＲは、可変重鎖および可変軽鎖ドメインにそれぞれ存在し、一緒になってＦｖ領域を形成する。したがって、場合によっては、抗原結合ドメインの６つのＣＤＲには、可変重鎖および可変軽鎖が寄与する。「Ｆａｂ」フォーマットにおいて、６つのＣＤＲの組には、２つの異なるポリペプチド配列、即ち可変重鎖ドメイン（ｖｈまたはＶＨ；ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２およびｖｈＣＤＲ３を含む）および可変軽鎖ドメイン（ｖｌまたはＶＬ；ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２およびｖｌＣＤＲ３を含む）が寄与し、このうちｖｈドメインのＣ末端が重鎖のＣＨ１ドメインのＮ末端に結合し、ｖｌドメインのＣ末端が定常軽鎖ドメインのＮ末端に結合している（したがって、軽鎖を形成する）。
【００３８】
本明細書における「修飾」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、および／もしくは欠失、またはタンパク質に化学的に連結された部分への改変を意味する。例えば、改変は、タンパク質に結合した改変された炭水化物またはＰＥＧ構造であってもよい。本明細書における「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を意味する。明確にするために、別段の記載がない限り、アミノ酸修飾は、常に、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡにコドンを有する２０個のアミノ酸に対するものである。
【００３９】
本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することを意味する。特に、いくつかの実施形態では、置換は、特定の位置で天然に存在しない（生物内で天然に存在しないか、またはいずれの生物中にも存在しない）アミノ酸に対するものである。例えば、置換Ｎ２９７Ａは、２９７位のアスバラギンがアラニンで置換されているバリアントポリペプチド（この場合はＦｃバリアント）を指す。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、出発アミノ酸を変化させない（例えば、宿主生物発現レベルを上昇させるためにＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（アルギニンをなおコードする）に交換する）ように操作されたタンパク質は、「アミノ酸置換」ではない。即ち、同じタンパク質をコードする新たな遺伝子の創出にもかかわらず、タンパク質は、それが開始する特定の位置に同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。
【００４０】
「アミノ酸挿入」または「挿入」は、本明細書で使用されるとき、親ポリペプチド配列の特定の位置にアミノ酸配列を付加することを意味する。例えば、−２３３Ｅまたは２３３Ｅは、２３３位の後、かつ２３４位の前のグルタミン酸の挿入を示す。さらに、−２３３ＡＤＥまたはＡ２３３ＡＤＥは、２３３位の後、かつ２３４位の前のＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を示す。
【００４１】
「アミノ酸欠失」または「欠失」は、本明細書で使用されるとき、親ポリペプチド配列中の特定の位置でアミノ酸配列を除去することを意味する。例えば、Ｅ２３３−またはＥ２３３＃、Ｅ２３３（）またはＥ２３３ｄｅｌは、２３３位のグルタミン酸の欠失を示す。さらに、ＥＤＡ２３３−またはＥＤＡ２３３＃は、２３３位で始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を示す。
【００４２】
本明細書で使用される「バリアントタンパク質」または「タンパク質バリアント」または「バリアント」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親タンパク質のそれとは異なるタンパク質を意味する。タンパク質バリアントは、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物、またはそれをコードするアミノ配列を指し得る。好ましくは、タンパク質バリアントは、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して約１〜約７０個のアミノ酸修飾、好ましくは約１〜約５個のアミノ酸修飾を有する。以下に記載するように、いくつかの実施形態では、親ポリペプチド、例えばＦｃ親ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のＦｃ領域等のヒト野生型配列であるが、バリアントを有するヒト配列もまた、「親ポリペプチド」としての役割を果たすことができる。本明細書のタンパク質バリアント配列は、好ましくは、親タンパク質配列と少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９５−９８−９９％の同一性を有する。バリアントタンパク質は、バリアントタンパク質それ自体、タンパク質バリアントを含む組成物、またはそれをコードするＤＮＡ配列を指すことができる。したがって、本明細書で使用される「抗体バリアント」または「バリアント抗体」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親抗体とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される「ＩｇＧバリアント」または「バリアントＩｇＧ」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親ＩｇＧ（ここでも、多くの場合はヒトＩｇＧに由来）とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される「免疫グロブリンバリアント」または「バリアント免疫グロブリン」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親免疫グロブリン配列のそれとは異なる免疫グロブリン配列を意味する。本明細書で使用される「Ｆｃ変異体」または「変異体Ｆｃ」は、Ｆｃドメインにアミノ酸修飾を含むタンパク質を意味する。本発明のＦｃバリアントは、それらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。このため、例えば、Ｓ２４１ＰまたはＳ２２８Ｐは、親ＩｇＧ４ヒンジポリペプチドと比較して２２８位に置換プロリンを有するヒンジバリアントであり、ここでの付番Ｓ２２８ＰはＥＵインデックスに従い、Ｓ２４１ＰはＫａｂａｔ付番である。ＥＵインデックス、またはＫａｂａｔもしくはＥＵ付番スキームにあるようなＥＵインデックスは、ＥＵ抗体の付番を指す（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ６３：７８−８５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。修飾は、付加、欠失、または置換であり得る。置換には、天然に存在するアミノ酸および場合によっては合成アミノ酸が含まれ得る。例としては、米国特許第６，５８６，２０７号、ＷＯ９８／４８０３２、ＷＯ０３／０７３２３８、ＵＳ２００４−０２１４９８８Ａ１、ＷＯ０５／３５７２７Ａ２、ＷＯ０５／７４５２４Ａ２、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉ��，＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２），ＰＩＣＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４、およびＬ．Ｗａｎｇ，＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．１−１０が挙げられ、全て参照によりその全体が組み込まれる。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、本明細書における「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味する。ペプチジル基は、天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造、即ち、ペプトイド（全体が参照により組み込まれるＳｉｍｏｎｅｔａｌ．，ＰＮＡＳＵＳＡ８９（２０）：９３６７（１９９２）を参照されたい）等の「類似体」を含んでもよい。アミノ酸は、当業者には理解されようが、天然に存在するものでも合成物（例えば、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸ではないもの）でもよい。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、オルニチン、およびノルロイシン（ｎｏｒｅｌｅｕｃｉｎｅ）は、本発明の目的では合成アミノ酸と見なされ、Ｄ−およびＬ−（ＲまたはＳ）立体配置のアミノ酸の両方を利用することができる。本発明のバリアントは、Ｃｒｏｐｐ＆Ｓｈｕｌｔｚ，２００４，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．２０（１２）：６２５−３０、Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ．，２００４，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０１（２）：７５６６−７１、Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２００３，３０３（５６５６）：３７１−３、およびＣｈｉｎｅｔａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ３０１（５６３５）：９６４−７によって説明されている方法が挙げられるがこれらに限定されない、Ｓｃｈｕｌｔｚおよび共同研究者らによって開発された技術を使用して組み込まれた合成アミノ酸の使用を含む修飾を含み得る。さらに、ポリペプチドには、１つ以上の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ＰＥＧ化、円順列、環化、他の分子へのリンカー、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、およびペプチドタグまたは標識の付加が含まれ得る。
【００４４】
「残基」とは、本明細書で使用されるとき、タンパク質における位置およびその関連するアミノ酸素性を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７またはＮ２９７とも称される）は、ヒト抗体ＩｇＧ１中の２９７位の残基である。
【００４５】
本明細書で使用される「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」とは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、単離したこの領域、または完全長抗体もしくは抗体断片との関連でのこの領域を指し得る。
【００４６】
「Ｆｖ」または「Ｆｖ断片」または「Ｆｖ領域」は、本明細書で使用されるとき、単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。当業者には理解されようが、それらは一般に、２本の鎖で構成されている。
【００４７】
本明細書における「単一鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、一般に本明細書で考察されるようなｓｃＦｖリンカーを使用して可変軽鎖ドメインに共有結合し、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖドメインを形成する、可変重鎖ドメインを意味する。ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端（ｖｈ−リンカー−ｖｌまたはｖｌ−リンカー−ｖｈ）のいずれの配向にもあり得る。一般に、リンカーは、当該技術分野で一般に既知のｓｃＦｖリンカーであり、このうちリンカーペプチドには主として以下のアミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒが含まれる。リンカーペプチドは、それらが所望の活性を保持するように互いに対して正しい立体配座をとるような様態で２つの分子を連結するのに十分な長さを有するべきである。一実施形態では、リンカーは、約１〜５０アミノ酸長、好ましくは約１〜３０アミノ酸長である。一実施形態では、１〜２０アミノ酸長のリンカーが使用されてもよく、いくつかの実施形態では、約５〜約１０アミノ酸が有用である。有用なリンカーには、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎ（ｎは少なくとも１（および一般に３〜４）の整数である）を含むグリシン−セリンポリマー、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、ならびに他の可動性リンカーが含まれる。代替的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むがこれらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーが、リンカーとして有用であり得、すわなちリンカーとして有用であり得る。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、「ＩｇＧサブクラス修飾」または「アイソタイプ修飾」とは、１つのＩｇＧアイソタイプの１つのアミノ酸を、異なる、整合したＩｇＧアイソタイプの対応するアミノ酸に変換するアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＥＵ位置２９６においてＩｇＧ１はチロシンを含み、ＩｇＧ２はフェニルアラニンを含むので、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙ置換は、ＩｇＧサブクラス修飾であると考えられる。同様に、ＩｇＧ１は２４１位にプロリンを有し、ＩｇＧ４はそこでセリンを有するので、Ｓ２４１Ｐを有するＩｇＧ４分子は、ＩｇＧサブクラス修飾と見なされる。サブクラス修飾は、本明細書のアミノ酸置換と見なされることに留意されたい。
【００４９】
本明細書で使用される「天然に存在しない修飾」とは、アイソタイプ性ではないアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＩｇＧのうちのいずれも２９７位にＡＮアスパラギンを含まないので、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４（またはそれらのハイブリッド）における置換Ｎ２９７Ａは、天然に存在しない修飾であると見なされる。
【００５０】
本明細書で使用される「アミノ酸」および「アミノ酸同一性」は、ＤＮＡおよびＲＮＡによってコードされている２０種の天然に存在するアミノ酸のうちの１つを意味する。
【００５１】
本明細書で使用される「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用から生じる生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣが含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
本明細書で使用される「ＩｇＧ  Ｆｃリガンド」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌプロテインＡ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌプロテインＧ、およびウイルスＦｃγＲが含まれるが、これらに限定されない。Ｆｃリガンドにはまた、ＦｃγＲと同種であるＦｃ受容体のファミリーである、Ｆｃ受容体ホモログ（ＦｃＲＨ）が含まれる（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９０：１２３−１３６、参照により全体が組み込まれる）。Ｆｃリガンドは、Ｆｃに結合する未発見の分子を含み得る。特定のＩｇＧ  Ｆｃリガンドは、ＦｃＲｎおよびＦｃガンマ受容体である。本明細書で使用される「Ｆｃリガンド」とは、抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。
【００５３】
本明細書で使用される「親ポリペプチド」とは、バリアントを生成するようにその後修飾される出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドのバリアントもしくは操作されたバージョンであってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指してもよい。したがって、本明細書で使用される「親Ｆｃポリペプチド」は、バリアントを生成するように修飾される非修飾免疫グロブリンポリペプチドを意味し、本明細書で使用される「親抗体」は、バリアント抗体を生成するように修飾される非修飾抗体を意味する。「親抗体」には、以下に概説されるように、既知の市販の組換え産生抗体が含まれることに留意すべきである。
【００５４】
本明細書で使用される「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域、および場合によってはヒンジの一部を含む、ポリペプチドを意味する。このため、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、およびこれらのドメインに対する可動性ヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡおよびＩｇＭの場合、ＦｃはＪ鎖を含んでもよい。ＩｇＧの場合、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびにＣγ１（Ｃγ１）とＣγ２（Ｃγ２）との間の下部ヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシ末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むものと定義され、ここでの付番はＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、以下でより詳細に説明されるように、例えば、１つ以上のＦｃγＲ受容体またはＦｃＲｎ受容体への結合を変化させるために、Ｆｃ領域に対してアミノ酸修飾が行われる。
【００５５】
本明細書における「重鎖定常領域」とは、抗体のＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分を意味する。
【００５６】
本明細書で使用される「位置」は、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順次に、または確立されているフォーマット、例えば、抗体付番のためのＥＵインデックスに従って、付番されてもよい。
【００５７】
「標的抗原」は、本明細書で使用されるとき、所与の抗体の可変領域が特異的に結合する分子を意味する。本発明の場合、本明細書で目的とする１つの標的抗原は、以下に定義されるように、ＴＩＧＩＴ、通常はヒトＴＩＧＩＴおよび任意にカニクイザルＴＩＧＩＴである。目的とする別の標的抗原は、以下に定義されるように、ＰＶＲＩＧ、通常はヒトＰＶＲＩＧおよび任意にカニクイザルＰＶＲＩＧである。
【００５８】
「標的細胞」は、本明細書で使用されるとき、標的抗原を発現する細胞を意味する。
【００５９】
「可変領域」は、本明細書で使用される場合、実質的にＶκ（Ｖ．カッパ）またはＶλ（Ｖ．ラムダ）のいずれかでコードされる１つ以上のＩｇドメイン、ならびに／または、それぞれ、カッパ、ラムダ、および重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成するＶＨ遺伝子を含む、免疫グロブリンの領域を意味する。
【００６０】
本明細書における「野生型またはＷＴ」は、対立遺伝子変異を含む、自然界に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【００６１】
本発明の抗体は一般に、単離されているか、または組換え体である。本明細書に開示される様々なポリペプチドを説明するために使用される場合、「単離された」とは、それが発現された細胞または細胞培養物から特定および分離および／または回収されたポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。「組換え体」は、外来性宿主細胞において組換え核酸技術を用いて抗体が生成されることを意味する。
【００６２】
特定の抗原またはエピトープへの「特異的結合」もしくは「〜に特異的に結合する」または特定の抗原またはエピトープ「〜に対して特異的である」とは、非特異的相互作用とは測定できるほどに異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を有しない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって、測定することができる。例えば、特異的結合は、標的と同様である対照分子との競合によって決定することができる。
【００６３】
特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対して少なくとも約１０−９Ｍ、少なくとも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ、少なくとも約１０−１３Ｍ、少なくとも約１０−１４Ｍ、少なくとも約１０−１５ＭのＫＤを有する抗体によって示され得、ＫＤとは特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープと比べて、対照分子に対して２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きいＫＤを有することになる。
【００６４】
また、特定の抗原またはエピトープへの特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対するＫＡまたはＫａが、対照と比べて、そのエピトープに対して少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きい抗体によって示され得、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す。結合親和性は、一般に、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ）および抗原発現細胞によるフローサイトメトリーを用いて測定される。
【００６５】
Ｃ．配列
配列表は、図５３のフォーマットに基づいていくつかの配列を提供する。配列の標示のためのガイドとして、ＵＳＳＮ６２／５１３，９１６の図４（参照により本明細書に明示的に組み込まれる）が参照される。可変重鎖ドメインは、識別子（例えば、「ＣＰＡ．０．８６」）で標示され、このうち次の配列識別子がｖｈＣＤＲ１へ、次がｖｈＣＤＲ２へのものであり、ｖｈＣＤＲ３、完全長重鎖、可変軽鎖ドメイン、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３および完全長軽鎖であるという点で、次の配列は本明細書の図５３のフォーマット（上記で参照される図４のフォーマットと同一）に従う。したがって、個々の抗体は、１０個の関連する配列識別子を有する。）。配列表には、ＢＭ２６マウスＩｇＧ１（ＢＭ２６−Ｍ１）（ＷＯ２０１６／０２８６５６Ａ１、クローン３１Ｃ６）およびＢＭ２９マウスＩｇＧ１（ＢＭ２９−Ｍ１）（ＵＳ２０１６／０１７６９６３Ａ１、クローン２２Ｇ２）の配列が含まれる。注記しない限り、ＴＩＧＩＴ抗体の完全長ＨＣ配列はＨ４（Ｓ２４１Ｐ）フォーマットにある。
【００６６】
Ｄ．ＰＶＲＩＧタンパク質
本発明は、ＰＶＲＩＧタンパク質に特異的に結合し、そのリガンドタンパク質、ＰＶＲＬ２（ヒト原形質膜糖タンパク質）による活性化を防止する抗体を提供する。ポリオウイルス受容体関連免疫グロブリンドメイン含有タンパク質、Ｑ６ＤＫＩ７またはＣ７ｏｒｆ１５とも称されるＰＶＲＩＧは、図１に示すＲｅｆＳｅｑ受託識別子ＮＰ＿０７６９７５に示されるアミノ酸および核酸配列に関する。（米国公開第２０１６／０２４４５２１号の実施例５に示される）ＰＶＲＩＧの結合パートナーである、ヒトポリオウイルス受容体関連２タンパク質（ＰＶＬＲ２、別名ネクチン−２、ＣＤ１１２またはヘルペスウイルス侵入メディエーターＢ、（ＨＶＥＢ））の配列は、図２に示される。本発明の抗体は、ＰＶＲＩＧおよびＰＶＬＲ２の結合が遮断されるように、ＰＶＲＩＧ細胞外ドメインに特異的である。
【００６７】
ＰＶＲＩＧは、シグナルペプチド（アミノ酸１から４０に及ぶ）、細胞外ドメイン（アミノ酸４１から１７１に及ぶ）、膜貫通ドメイン（アミノ酸１７２から１９０に及ぶ）、および細胞質ドメイン（アミノ酸１９１から３２６に及ぶ）を有する３２６アミノ酸長の膜貫通ドメインタンパク質である。開始コドンであり得るメチオニンが２つあるが、成熟タンパク質は同一である。
【００６８】
したがって、本明細書で使用する場合、「ＰＶＲＩＧ」または「ＰＶＲＩＧタンパク質」または「ＰＶＲＩＧポリペプチド」という用語は、本明細書に記載の既知のまたは野生型ＰＶＲＩＧを非限定的に含む、任意のかかるタンパク質、またはその変異体、コンジュゲート、または断片、ならびに任意の天然に存在するスプライス変異体、アミノ酸変異体またはアイソフォーム、および特にＰＶＲＩＧのＥＣＤ断片を任意選択で含んでもよい。
【００６９】
本明細書に注記され、以下でより十分に記載されるように、ＰＶＲＩＧへの結合と、ＰＶＲＬ２による活性化の防止（例えば、最も一般的には、ＰＶＲＩＧとＰＶＬＲ２との相互作用を遮断することによって）との両方を行う抗ＰＶＲＩＧ抗体（抗原結合断片を含む）は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞活性化を増強するために使用され、またがんおよび病原体感染等の疾患の治療に使用される。
【００７０】
Ｅ．ＴＩＧＩＴタンパク質
本発明は、ＴＩＧＩＴタンパク質に特異的に結合し、そのリガンドタンパク質、ＰＶＲ（ポリオウイルス受容体（別名ＣＤ１５５）ヒト原形質膜糖タンパク質）による活性化を防止する抗体を提供する。ＴＩＧＩＴ、またはＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体は、共阻害性受容体タンパク質、別名ＷＵＣＡＭ、Ｖｓｔｍ３またはＶｓｉｇ９である。ＴＩＧＩＴは、免疫グロブリン可変ドメイン、膜貫通ドメイン、および免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、ＰＶＲタンパク質ファミリーのシグネチャ配列要素を含む。ＴＩＧＩＴおよびＰＶＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列を図５１に示す。本発明の抗体は、ＴＩＧＩＴおよびＰＶＲの結合が遮断されるように、ＴＩＧＩＴ  ＥＣＤに特異的である
【００７１】
したがって、本明細書で使用する場合、「ＴＩＧＩＴ」または「ＴＩＧＩＴタンパク質」または「ＴＩＧＩＴポリペプチド」という用語は、本明細書に記載の既知のまたは野生型ＴＩＧＩＴを非限定的に含む、任意のかかるタンパク質、またはその変異体、コンジュゲート、または断片、ならびに任意の天然に存在するスプライス変異体、アミノ酸変異体またはアイソフォーム、および特にＴＩＧＩＴのＥＣＤ断片を任意選択で含んでもよい。
【００７２】
本明細書に注記され、以下でより十分に記載されるように、ＴＩＧＩＴへの結合と、ＰＶＲによる活性化の防止（例えば、最も一般的には、ＴＩＧＩＴとＰＶＲとの相互作用を遮断することによって）との両方を行う抗ＴＩＧＩＴ抗体（抗原結合断片を含む）は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞活性化を増強するために使用され、またがんおよび病原体感染等の疾患の治療に使用される。
【００７３】
ＶＩ．抗体
以下で考察するように、「抗体」という用語は全般的に使用される。伝統的な抗体構造単位は、典型的には四量体を含む。各四量体は、典型的には、２本の同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は、１本の「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量）と、１本の「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量）とを有する。ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖としてクラス分けされる。本発明は、一般にＩｇＧクラスに基づくモノクローナル抗体を対象とし、これは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。一般に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４が、ＩｇＧ３よりも頻繁に使用される。ＩｇＧ１は、３５６（ＤまたはＥ）および３５８（ＬまたはＭ）で多型を有する異なるアロタイプを有することに留意すべきである。本明細書に図示される配列は３５６Ｄ／３５８Ｍアロタイプを使用するが、他のアロタイプが本明細書に含まれる。即ち、本明細書に含まれるＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む任意の配列は、３５６Ｄ／３５８Ｍアロタイプの代わりに３５６Ｅ／３５８Ｌを有することができる。
【００７４】
各鎖のアミノ末端部分は、「Ｆｖドメイン」または「Ｆｖ領域」として当該技術分野および本明細書では一般に称される、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。可変領域において、重鎖および軽鎖のＶドメインの各々について３つのループが集約されて、抗原結合部位を形成する。ループの各々は、相補性決定領域（これ以降「ＣＤＲ」と称される）と称され、ここではアミノ酸配列における変形が最も顕著である。「可変」は、可変領域のある特定のセグメントが抗体間で配列において大きく異なるという事実を指す。可変領域内の可変性は均一に分布していない。その代わり、Ｖ領域は、「超可変領域」と称される極可変性のより短い領域によって隔てられた１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と称される比較的不変の区間からなる。
【００７５】
各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へとＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順序で配列された３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）および４つのＦＲで構成される。
【００７６】
超可変領域は、一般に、軽鎖可変領域においておよそアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１；「Ｌ」は軽鎖を表す）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域においてはおよそ約３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１；「Ｈ」は重鎖を表す）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）からのアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））ならびに／または超可変ループを形成する残基（例えば、軽鎖可変領域における残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域における２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）、および９６−１０１（ＨＣＤＲ３）を包含する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）。本発明の特定のＣＤＲを以下に記載する。
【００７７】
当業者には理解されようが、ＣＤＲの正確な付番および配置は、異なる付番系間で異なり得る。しかしながら、可変重鎖および／または可変軽鎖の開示は、関連する（固有の）ＣＤＲの開示を含むことが理解されるべきである。したがって、各可変重鎖領域の開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２およびｖｈＣＤＲ３）の開示であり、各可変軽鎖領域の開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２およびｖｌＣＤＲ３）の開示である。ＣＤＲ付番の有用な比較は以下の通りである（Ｌａｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５−７７（２００３）を参照されたい）。
【表１】
2019533984.tif 000003
【００７８】
本明細書全体を通して、Ｋａｂａｔ付番系は一般に、可変ドメイン内の残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７および重鎖可変領域の残基１〜１１３）およびヒンジを参照する場合に使用され、ＥＵ付番系は、Ｆｃ領域に対するものである（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）（１９９１））。
【００７９】
本発明は、多数の異なるＣＤＲセットを提供する。この場合、「完全ＣＤＲセット」は、３つの可変軽鎖および３つの可変重鎖ＣＤＲ、例えばｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２およびｖｈＣＤＲ３を含む。これらは、それぞれより大きな可変軽または可変重鎖ドメインの一部であり得る。さらに、本明細書により完全に概説されているように、可変重および可変軽鎖ドメインは、重鎖および軽鎖が使用される場合には別個のポリペプチド鎖上に、またはｓｃＦｖ配列の場合には単一ポリペプチド鎖上にあり得る。
【００８０】
ＣＤＲは、抗原結合の形成、またはより具体的には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域内の特異的抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖等の分子の群分けであり、通常、特異的構造特性、ならびに特異的電荷特性を有する。単一抗原が、２つ以上のエピトープを有してもよい。
【００８１】
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性成分とも称される）および結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的抗原結合ペプチドによって効果的に遮断されるアミノ酸残基（言い換えれば、このアミノ酸残基は、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にある）を含み得る。
【００８２】
エピトープは、立体配座または直線状のいずれであってもよい。立体配座エピトープは、直線状のポリペプチド鎖の異なるセグメントからのアミノ酸の空間的な並置によって作り出される。直線状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基によって作り出されるものである。立体配座エピトープおよび非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないという点で区別され得る。
【００８３】
エピトープは、典型的には、固有の空間立体配座内に、少なくとも３個、より一般的には、少なくとも５個、または８〜１０個のアミノ酸を含む。同じエピトープを認識する抗体は、ある抗体の別の抗体の標的抗原への結合を遮断する能力、例えば、「ビニング」を示す単純な免疫アッセイにおいて検証され得る。以下に概説するように、本発明は、列挙された抗原結合ドメインおよび本明細書の抗体を含むだけでなく、列挙された抗原結合ドメインによって結合されるエピトープとの結合について競合するものも含む。
【００８４】
各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を定める。Ｋａｂａｔらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存の程度に基づき、Ｋａｂａｔらは、個々の一次配列をＣＤＲおよびフレームワークに分類し、そのリストを作成した（参照により全体が組み込まれるＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）。
【００８５】
免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスには、重鎖においていくつかの免疫グロブリンドメインがある。本明細書の「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、明確に異なる三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。定常重（ＣＨ）ドメインおよびヒンジドメインを含む重鎖ドメインが本発明における関心対象である。ＩｇＧ抗体の関連において、ＩｇＧアイソタイプは、各々、３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧの関連における「ＣＨ」ドメインは以下の通りである。「ＣＨ１」は、ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスに従う１１８〜２２０位を指す。「ＣＨ２」は、ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスに従う２３７〜３４０位を指し、「ＣＨ３」は、ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスに従う３４１〜４４７位を指す。
【００８６】
重鎖のＩｇドメインの別の種類は、ヒンジ領域である。本明細書において、「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「免疫グロブリンヒンジ領域」とは、抗体の第１および第２の定常ドメイン間のアミノ酸を含む可動性ポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインはＥＵ位置２２０で終わり、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインは残基ＥＵ位置２３７で始まる。したがって、ＩｇＧについては、抗体ヒンジは、本明細書において、２２１位（ＩｇＧ１中のＤ２２１）〜２３６位（ＩｇＧ１中のＧ２３６）を含むように定義され、付番はＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスに従う。
【００８７】
軽鎖は、一般に、可変軽鎖ドメイン（軽鎖ＣＤＲを含み、可変重鎖ドメインと一緒にＦｖ領域を形成する）、および定常軽鎖領域（しばしばＣＬまたはＣκと称される）の２つのドメインを含む。一般に、定常ラムダまたは定常カッパドメインのいずれかを用いることができ、このうちラムダが一般に本発明で有用である。
【００８８】
以下に概説される追加の置換のための別の目的とする領域は、Ｆｃ領域である。
【００８９】
Ａ．キメラおよびヒト化抗体
いくつかの実施形態では、本明細書の抗体は、異なる種由来の混合物、例えばキメラ抗体および／またはヒト化抗体に由来し得る。一般に、「キメラ抗体」および「ヒト化抗体」の両方は、２つ以上の種由来の領域を組み合わせる抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は伝統的に、マウス（または場合によってはラット）由来の可変領域（複数可）およびヒト由来の定常領域（複数可）を含む。「ヒト化抗体」は一般に、可変ドメインフレームワーク領域がヒト抗体に見出される配列でスワップされた、非ヒト抗体を指す。一般に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体全体は、ヒト起源のポリヌクレオチドによってコードされるか、またはそのＣＤＲ内を除いてかかる抗体と同一である。非ヒト生物を起源とする核酸によって一部または全てがコードされるＣＤＲを、ヒト抗体可変領域のベータシートフレームワークにグラフティングして、その特異性がグラフティングされたＣＤＲによって決定される抗体を作製する。かかる抗体の作製は、例えば、ＷＯ９２／１１０１８、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６に記載され、全て参照により全体が組み込まれる。選択されたアクセプターフレームワーク残基の、対応するドナー残基への「逆突然変異」が、最初のグラフト構築物において失われた親和性を回復するためにしばしば必要とされる（ＵＳ５５３０１０１、ＵＳ５５８５０８９、ＵＳ５６９３７６１、ＵＳ５６９３７６２、ＵＳ６１８０３７０、ＵＳ５８５９２０５、ＵＳ５８２１３３７、ＵＳ６０５４２９７、ＵＳ６４０７２１３（全て参照により全体が組み込まれる））。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分、通常は全部を含み、したがって典型的にはヒトＦｃ領域を含むであろう。ヒト化抗体はまた、遺伝子操作された免疫系を有するマウスを用いて生成され得る。Ｒｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４（参照により全体が組み込まれる）。非ヒト抗体をヒト化および再形成するための様々な技法および方法は、当該技術分野で周知である（Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ＆Ｖａｓｑｕｅｚ，２００４，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ，５３３−５４５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）、およびそこで引用される参考文献を参照されたく、全て参照により全体が組み込まれる）。ヒト化方法には、限定されないが、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ８６：１００２９−３３、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９−１０３５、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９��２，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５−９，Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７（２０）：４５９３−９、Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：４１８１−４１８５、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １１：３２１−８に記載される方法が含まれ、全て参照により全体が組み込まれる。ヒト化、または非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低下させる他の方法には、例えば、参照により全体が組み込まれるＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９６９−９７３に記載されているような表面再構成法が含まれ得る。
【００９０】
したがって、本明細書における列挙された抗体のいずれか由来のｖｈＣＤＲおよびｖｌＣＤＲは、ヒト化され（またはすでにヒト化されているものに対して「再ヒト化」され）てもよい。
【００９１】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、特定の生殖細胞系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。例えば、かかる抗体は、特定の生殖細胞系列配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含むヒト抗体を含み得るかまたはそれからなり得る。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較することと、ヒト抗体の配列に最も近い配列である（即ち、最も高い同一性％）ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンを選択することとによって、そのようなものとして特定され得る。特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に生じる体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的導入に起因して、生殖細胞系列配列と比較してアミノ酸の相違を含み得る。しかしながら、ヒト化抗体は、典型的には、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較したときに、抗体をヒト配列に由来するものとして特定するアミノ酸残基を含む。ある特定の場合には、ヒト化抗体は、ＣＤＲを除いて生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９５、９６、９７、９８もしくは９９％、またはさらには少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。即ち、ＣＤＲはマウスであってもよいが、可変領域（重鎖または軽鎖のいずれか）のフレームワーク領域は、１つのヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるフレームワークアミノ酸と、アミノ酸配列において少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。
【００９２】
典型的には、特定のヒト生殖細胞系列配列に由来するヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０〜２０アミノ酸以下の相違しか示さない。ある特定の場合には、ヒト化抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは５アミノ酸以下、またはさらには４、３、２、もしくは１アミノ酸以下の相違しか示さない場合がある（ここでも、本明細書における任意のバリアントの導入前、即ち、バリアントの数は一般的に低い）。
【００９３】
一実施形態では、親抗体は、当該技術分野で知られているように、親和性成熟されたものである。構造ベースの方法が、例えば、ＵＳＳＮ１１／００４，５９０に記載されているように、ヒト化および親和性成熟のために用いられ得る。選択ベースの方法が、抗体可変領域をヒト化および／または親和性成熟させるために用いられ得、これには、限定されるものではないが、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８−１０６８４、Ｒｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３７）：２２６１１−２２６１８、Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：８９１０−８９１５、Ｋｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６（１０）：７５３−７５９に記載される方法が含まれ、全て参照によりその全体が組み込まれる。他のヒト化方法は、ＣＤＲの部分のみをグラフティングすることを含み得、これには、限定されるものではないが、ＵＳＳＮ０９／８１０，５１０、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−１１２５、Ｄｅ  Ｐａｓｃａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６−３０８４に記載される方法が含まれ，全て参照によりその全体が組み込まれる。
【００９４】
Ｂ．任意選択の抗体操作
本発明の抗体は、アミノ酸置換によってアミノ酸配列を改変するように修飾または操作され得る。本明細書で考察されるように、アミノ酸置換は、タンパク質に対するＣＤＲの親和性を改変するため（例えば、ＴＩＧＩＴまたはＰＶＲＩＧ、結合の増加および減少の両方を含む）、ならびに抗体の追加の機能特性を改変するために行われ得る。例えば、抗体は、Ｆｃ領域内に修飾を含むように、典型的には、抗体の１つ以上の機能特性、例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞傷害性を改変するように操作され得る。さらに、本発明の少なくともいくつかの実施形態に従う抗体は、同じく抗体の１つ以上の機能特性を改変するために、化学修飾され得る（例えば、１つ以上の化学的部分が抗体に結合し得る）か、またはそのグリコシル化を改変するように修飾され得る。かかる実施形態については、以下にさらに記載される。Ｆｃ領域内の残基の付番は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの付番である。
【００９５】
一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が改変される、例えば、増加または減少するように修飾される。このアプローチについては、米国特許第５，６７７，４２５号（Ｂｏｄｍｅｒら）にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリを容易にするように、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるように改変される。
【００９６】
さらに別の実施形態では、抗体は、特にＩｇＧ４定常ドメインが使用される場合、インビボでのＦａｂアーム交換を抑止するように修飾され得る。具体的には、このプロセスは、機能的に一価である二重特異性抗体を効果的にもたらす他のＩｇＧ４抗体間でのＩｇＧ４半分子（重鎖１本＋軽鎖１本）の交換を伴う。重鎖のヒンジ領域および定常ドメインに対する突然変異がこの交換を抑止する（Ａａｌｂｅｒｓｅ，ＲＣ，Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ  Ｊ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０５：９−１９を参照されたい）。本明細書に概説されるように、本発明において特に有用である突然変異は、ＩｇＧ４定常ドメインの関連におけるＳ２４１Ｐである。ＩｇＧ４は、顕著なエフェクター機能を有しないため本発明で有用であり、したがって、細胞の枯渇なしにそのリガンドへの（例えばＰＶＲＩＧのＰＶＲＬ２への、またはＴＩＧＩＴのＰＶＲへの）受容体結合を遮断するために使用される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、一般にＦｃγＲ受容体への結合を改変するために、Ｆｃ領域内で行われ得る。本明細書で使用される「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」、または「ＦｃガンマＲ」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、かつＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトにおいて、このファミリーには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）（アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含む）；ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）（アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、およびＦｃγＲＩＩｃ；ならびにＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（アイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５（参照により全体が組み込まれる））、ならびに任意の発見されていないヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、これらに限定されない任意の生物由来であり得る。マウスＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ−１（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに任意の発見されていないマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
ＦｃγＲ受容体のうちの１つ以上への結合を改変するために行われ得るいくつかの有用なＦｃ置換が存在する。結合の増加ならびに結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加は、一般に、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性、即ち、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応の増加をもたらすことが知られている。同様に、いくつかの状況下では、ＦｃγＲＩＩｂ（抑制性受容体）への結合の減少も有益であり得る。本発明で有用なアミノ酸置換には、米国特許出願第１１／１２４，６２０号（特に図４１）および米国特許第６，７３７，０５６号に記載されているものが含まれ、これらの両方は、参照によりそれらの全体、特にその中に開示されるバリアントが本明細書に明示的に組み込まれる。
【００９９】
なおも別の例では、Ｆｃ領域は、以下の位置：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８、もしくは４３９の１つ以上のアミノ酸を修飾することによって、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させ、かつ／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させ、かつ／またはＦｃＲｎ結合を増加させるように修飾される。このアプローチについては、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／４２０７２号（Ｐｒｅｓｔａ）にさらに記載される。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、結合が改善されたバリアントが記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４を参照されたい）。２５６、２９０、２９８、３３３、３３４、および３３９位での特異的突然変異が、ＦｃｙＲＩＩＩへの結合を改善することが示されている。加えて、以下の変異体組み合わせ：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４Ａ、およびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａが、ＦｃγＲＩＩＩ結合を改善することが示されている。さらに、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６ＥまたはＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ等の突然変異が、ＦｃＲｎへの結合を改善し、抗体の循環半減期を増加させる（Ｃｈａｎ  ＣＡ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｅｒ  ＰＪ（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：３０１−３１６を参照されたい）。
【０１００】
加えて、本発明の抗体は、その生物学的半減期を増加させるように修飾される。種々のアプローチが可能である。例えば、米国特許第６，２７７，３７５号（Ｗａｒｄ）に記載されるように、以下の突然変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆのうちの１つ以上が導入され得る。あるいは、生物学的半減期を増加するために、抗体は、米国特許第５，８６９，０４６号および同第６，１２１，０２２号（Ｐｒｅｓｔａら）に記載されるように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ受容体結合エピトープを含むようにＣＨ１またはＣＬ領域内で改変され得る。血清半減期を増加させるためのさらなる突然変異は、米国特許第８，８８３，９７３号、同第６，７３７，０５６号、および同第７，３７１，８２６号に開示され、これには４２８Ｌ、４３４Ａ、４３４Ｓ、および４２８Ｌ／４３４Ｓが含まれる。
【０１０１】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、アグリコシル化抗体が作製され得る（すわなち、抗体はグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるか、またはＡＤＣＣ等のエフェクター機能を低減するように改変され得る。かかる炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位、例えば、Ｎ２９７を改変することによって達成され得る。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化領域の排除をもたらす、１つ以上のアミノ酸置換を行ない、それによってその部位でのグリコシル化を排除することができ、いくつかの実施形態ではアラニン置換が有用である。
【０１０２】
加えてまたは代替的に、改変した種類のグリコシル化を有する抗体、例えば、フコシル残基の量が低減した低フコシル化抗体または二分ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体が作製され得る。かかるグリコシル化パターンの改変は、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。かかる炭水化物修飾は、例えば、抗体をグリコシル化機構が改変された宿主細胞で発現させることによって達成され得る。グリコシル化機構が改変された細胞については、当該技術分野で説明されており、本発明の少なくともいくつかの実施形態に従う組換え抗体を発現させ、それによりグリコシル化が改変された抗体を産生する宿主細胞として使用され得る。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号およびＷＯ２００３／０３５８３５を参照されたい。
【０１０３】
本発明によって企図される本明細書における抗体の別の修飾は、例えば、半減期を高めるための、ペグ化、即ち他の水溶性部分（典型的にはポリマー）の付加である。抗体は、当該技術分野で知られているように、例えば、抗体の生物学的（例えば血清）半減期を増加させるためにＰＥＧ化することができる。
【０１０４】
ＦｃγＲおよび／もしくはＦｃＲｎに対する結合親和性を改変し、かつ／またはインビボ血清半減期を増加させるために行われる置換に加えて、以下にさらに詳細に記載されるように、追加の抗体修飾が行われ得る。
【０１０５】
場合によっては、親和性成熟が行われる。ＣＤＲにおけるアミノ酸修飾は、「親和性成熟」と称されることがある。「親和性成熟」抗体は、１つ以上のＣＤＲにおいて１つ以上の改変（複数可）を有するものであり、この改変は、それらの改変（複数可）を有しない親抗体と比較して抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。場合によっては、抗体のその抗原に対する親和性を低下させることが望ましい場合がある。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾が、本発明の抗体（ＰＶＲＩＧまたはＴＩＧＩＴ抗体）のＣＤＲのうちの１つ以上において行われる。一般に、任意の単一のＣＤＲにおいて１または２または３アミノ酸のみが置換され、一般に、１、２、３．４、５、６、７、８、９、または１０個を超える変化が、６つ一組のＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１〜３およびｖｌＣＤＲ１〜３）内で行われることはない。しかしながら、任意のＣＤＲにおける無置換、１つの置換、２つの置換、または３つの置換の任意の組み合わせが、独立してかつ任意選択で、任意の他の置換と組み合わされ得ることを理解されたい。
【０１０７】
親和性成熟は、「親」抗体と比較して抗原に対する抗体の結合親和性を少なくとも約１０％〜５０−１００−１５０％以上、または１〜５倍増加させるために行われ得る。好ましい親和性成熟抗体は、抗原に対してナノモル親和性またはさらにはピコモル親和性を有する。親和性成熟抗体は、既知の手順によって作り出される。親和性と有効性との相関関係については後述する。
【０１０８】
代替的に、例えば、抗原に対する抗体の親和性を著しく改変しない「サイレント」なアミノ酸修飾が、本発明の抗体のＣＤＲのうちの１つ以上で行われ得る。これらは、（本発明の抗体をコードする核酸に対して行われ得るような）発現の最適化を含むいくつかの理由で行われ得る。
【０１０９】
したがって、バリアントＣＤＲおよび抗体が本発明のＣＤＲおよび抗体の定義に含まれ、つまり、本発明の抗体は、本発明の列挙される抗体のＣＤＲのうちの１つ以上にアミノ酸修飾を含み得る。加えて、以下に概説されるように、アミノ酸修飾は、独立してかつ任意選択で、フレームワークおよび定常領域を含む、ＣＤＲ外の任意の領域でも行われ得る。
【０１１０】
ａ．追加の抗体の生成
ヒトＰＶＲＩＧに対する追加の抗体は、実施例において概説するもの等の周知の方法を使用して、当該技術分野で周知の通りになすことができる。このため、追加の抗ＰＶＲＩＧ抗体は、マウスの免疫付与（例えば、Ａｌｄｅｖｒｏｎによって使用されるもの等のＤＮＡ免疫付与を使用する場合がある）、その後の、抗体精製および回収を伴うヒトＰＶＲＩＧタンパク質に対するスクリーニングおよびハイブリドーマ生成等の従来の方法によって生成することができる。
【０１１１】
ＶＩＩ．本発明のＴＩＧＩＴ抗体
本発明は、抗ＴＩＧＩＴ抗体を提供する。（便宜上、「抗ＴＩＧＩＴ抗体」および「ＴＩＧＩＴ抗体」は交換可能に使用される）。本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ヒトＴＩＧＩＴ、好ましくはヒトＴＩＧＩＴのＥＣＤに特異的に結合する。本発明は、ＴＩＧＩＴに結合する、いくつかの特異的な列挙される６つ一組のＣＤＲを含む完全長抗体を含む、抗原結合ドメインをさらに提供する。
【０１１２】
ＴＩＧＩＴまたはＴＩＧＩＴのエピトープに対する特異的結合は、少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、代替的には少なくとも１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ、少なくとも約１０−１３Ｍ、少なくとも約１０−１４Ｍ、少なくとも約１０−１５Ｍ、またはそれを超えるＫＤを有する抗体によって示され得、ここでＫＤは、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、ＴＩＧＩＴ抗原またはエピトープと比べて、対照分子に対して２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きいＫＤを有することになる。
【０１１３】
しかしながら、ＮＫおよびＴ細胞の表面上で発現されるＴＩＧＩＴへの最適な結合のためには、抗体は、好ましくは５０ｎＭ未満、最も好ましくは１ｎＭ未満のＫＤを有し、０．１ｎＭ未満および１ｐＭ未満が本発明の方法に有用である。
【０１１４】
また、特定の抗原またはエピトープへの特異的結合は、例えば、ＴＩＧＩＴ抗原またはエピトープに対するｋａ（会合速度定数を指す）が、対照と比べて、そのエピトープに対して少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きい抗体によって示され得、ｋａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度定数を指す。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、もしくは１ｎＭ以下のＫＤ（つまり、より高い結合親和性）、または１ｐＭ以下のＫＤでヒトＴＩＧＩＴに結合し、ＫＤは、既知の方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ）、ＥＬＩＳＡ、ＫＩＮＥＸＡ、最も典型的にはＳＰＲによって２５℃または３７℃で決定される。
【０１１６】
本明細書に記載されるＴＩＧＩＴ抗体は、以下のように標示される。これらの抗体は参照番号、例えば「ＣＰＡ．９．０８６」を有する。これは、これらの抗体が２本の重鎖および２本の軽鎖を含むと理解しつつ、例えば図５３に図示されるように、可変重鎖および可変軽鎖の組み合わせを表す。「ＣＰＡ．９．０８６．ＶＨ」は、ＣＰＡ．９．０８６の可変重鎖部分を指し、一方で「ＣＰＡ．９．０８６．ＶＬ」は可変軽鎖である。「ＣＰＡ．９．０８６．ｖｈＣＤＲ１」、「ＣＰＡ．９．０８６．ｖｈＣＤＲ２」、「ＣＰＡ．９．０８６．ｖｈＣＤＲ３」、「ＣＰＡ．９．０８６．ｖｌＣＤＲ１」、「ＣＰＡ．９．０８６．ｖｌＣＤＲ２」、および「ＣＰＡ．９．０８６．ｖｌＣＤＲ３」は、示されるＣＤＲを指す。「ＣＰＡ．９．０８６．ＨＣ」は、この分子の重鎖全体（例えば、可変および定常ドメイン）を指し、「ＣＰＡ．９．０８６．ＬＣ」は、同じ分子の軽鎖全体（例えば、可変および定常ドメイン）を指す。一般に、ヒトカッパ軽鎖は、本明細書における各ファージ（またはヒト化ハイブリドーマ）抗体の定常ドメインに使用されるが、いくつかの実施形態では、ラムダ軽鎖定常ドメインが使用される。「ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ１」は、ヒトＩｇＧ１の定常ドメインを含む可変重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインを含む完全長抗体を指す（よってＨ１；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４配列は図５０に示す）。したがって、「ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ２」であれば、ヒトＩｇＧ２に連結されたＣＰＡ．９．０８６可変ドメインとなる。「ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ３」であれば、ヒトＩｇＧ３に連結されたＣＰＡ．９．０８６可変ドメインとなり、「ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４」であれば、ヒトＩｇＧ４に連結されたＣＰＡ．９．０８６可変ドメインとなる。場合によっては、ヒトＩｇＧは、追加の突然変異を有してもよく、そのようなものは以下に記載され、これには注釈を付けられ得ることに留意されたい。例えば、多くの実施形態では、ヒトＩｇＧ４にＳ２４１Ｐ突然変異が存在し得、これは、例えば、「ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）」と注釈を付けられ得る。このＳ２４１Ｐヒンジバリアントを有するヒトＩｇＧ４配列を図５０に示す。他の可能性のあるバリアントは、ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）（またはこの部位でグリコシル化を切除し、したがってＦｃγＲＩＩＩａ結合に関連するエフェクター機能の多くを切除した他のバリアント）、およびＦｃγＲ受容体への結合を低下させるＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）である。
【０１１７】
本発明は、可変重鎖ドメインおよび軽鎖ドメイン、ならびに完全長重鎖および軽鎖をさらに提供する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、上で概説したｓｃＦｖリンカーによって連結された可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含むＴＩＧＩＴに結合するｓｃＦｖを提供する。ＶＬおよびＶＨドメインは、いずれかの配向、例えばＮ末端からＣ末端まで「ＶＨ−リンカー−ＶＬ」または「ＶＬ−リンカー」ＶＨ」にあり得る。これらは、その構成要素部分によって命名され、例えば、「ｓｃＦｖ−ＣＰＡ．９．０８６．ＶＨ−リンカー−ＶＬ」または「ｓｃＦｖ−ＣＰＡ．９．０８６．ＶＬ−リンカー−ＶＨ」等である。したがって、「ｓｃＦｖ−ＣＰＡ．９．０８６」はいずれの配向にあってもよい。
【０１１９】
多くの実施形態では、本発明の抗体は、ヒト（ファージに由来する）であり、ＴＩＧＩＴおよびＰＶＲの結合を遮断する。図５８および７５に示すように、受容体−リガンド相互作用の結合と遮断との両方を行うＣＰＡ抗体は以下の通りであり、これらの構成要素も概説される（「配列」節で考察されるように、ｓｃＦｖ構築物を除く全ての配列が配列表内にある）：
【０１２０】
ＣＰＡ．９．０１８、ＣＰＡ．９．０１８．ＶＨ、ＣＰＡ．９．０１８．ＶＬ、ＣＰＡ．９．０１８．ＨＣ、ＣＰＡ．９．０１８．ＬＣ、ＣＰＡ．９．０１８．Ｈ１、ＣＰＡ．９．０１８．Ｈ２、ＣＰＡ．９．０１８．Ｈ３、ＣＰＡ．９．０１８．Ｈ４；ＣＰＡ．９．０１８．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）；ＣＰＡ．９．０１８．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．０１８．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．０１８．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．９．０１８．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．０１８．ｖｌＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．０１８．ｖｌＣＤＲ３およびｓｃＦｖ−ＣＰＡ．９．０１８；
【０１２１】
ＣＰＡ．９．０２７、ＣＰＡ．９．０２７．ＶＨ、ＣＰＡ．９．０２７．ＶＬ、ＣＰＡ．９．０２７．ＨＣ、ＣＰＡ．９．０２７．ＬＣ、ＣＰＡ．９．０２７．Ｈ１、ＣＰＡ．９．０２７．Ｈ２、ＣＰＡ．９．０２７．Ｈ３、ＣＰＡ．９．０２７．Ｈ４；ＣＰＡ．９．０１８．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）；ＣＰＡ．９．０２７．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．０２７．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．０２７．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．９．０２７．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．０２７．ｖｌＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．０２７．ｖｌＣＤＲ３およびｓｃＦｖ−ＣＰＡ．９．０２７；
【０１２２】
ＣＰＡ．９．０４９、ＣＰＡ．９．０４９．ＶＨ、ＣＰＡ．９．０４９．ＶＬ、ＣＰＡ．９．０４９．ＨＣ、ＣＰＡ．９．０４９．ＬＣ、ＣＰＡ．９．０４９．Ｈ１、ＣＰＡ．９．０４９．Ｈ２、ＣＰＡ．９．０４９．Ｈ３；ＣＰＡ．９．０４９．Ｈ４；ＣＰＡ．９．０４９．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）；ＣＰＡ．９．０４９．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．０４９．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．０４９．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．９．０４９．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．０４９．ｖｌＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．０４９．ｖｌＣＤＲ３およびｓｃＦｖ−ＣＰＡ．９．０４９；
【０１２３】
ＣＰＡ．９．０５７、ＣＰＡ．９．０５７．ＶＨ、ＣＰＡ．９．０５７．ＶＬ、ＣＰＡ．９．０５７．ＨＣ、ＣＰＡ．９．０５７．ＬＣ、ＣＰＡ．９．０５７．Ｈ１、ＣＰＡ．９．０５７．Ｈ２、ＣＰＡ．９．０５７．Ｈ３；ＣＰＡ．９．０５７．Ｈ４；ＣＰＡ．９．０５７．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）；ＣＰＡ．９．０５７．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．０５７．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．０５７．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．９．０５７．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．０５７．ｖｌＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．０５７．ｖｌＣＤＲ３およびｓｃＦｖ−ＣＰＡ．９．０５７；
【０１２４】
ＣＰＡ．９．０５９、ＣＰＡ．９．０５９．ＶＨ、ＣＰＡ．９．０５９．ＶＬ、ＣＰＡ．９．０５９．ＨＣ、ＣＰＡ．９．０５９．ＬＣ、ＣＰＡ．９．０５９．Ｈ１、ＣＰＡ．９．０５９．Ｈ２、ＣＰＡ．９．０５９．Ｈ３；ＣＰＡ．９．０５９．Ｈ４；ＣＰＡ．９．０５９．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）；ＣＰＡ．９．０５９．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．０５９．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．０５９．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．９．０５９．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．０５９．ｖｌＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．０５９．ｖｌＣＤＲ３およびｓｃＦｖ−ＣＰＡ．９．０５９；
【０１２５】
ＣＰＡ．９．０８３、ＣＰＡ．９．０８３．ＶＨ、ＣＰＡ．９．０８３．ＶＬ、ＣＰＡ．９．０８３．ＨＣ、ＣＰＡ．９．０８３．ＬＣ、ＣＰＡ．９．０８３．Ｈ１、ＣＰＡ．９．０８３．Ｈ２、ＣＰＡ．９．０８３．Ｈ３；ＣＰＡ．９．０８３．Ｈ４；ＣＰＡ．９．０８３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）；ＣＰＡ．９．０８３．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．０８３．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．０８３．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．９．０８３．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．０８３．ｖｌＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．０８３．ｖｌＣＤＲ３およびｓｃＦｖ−ＣＰＡ．９．０８３；
【０１２６】
ＣＰＡ．９．０８６、ＣＰＡ．９．０８６．ＶＨ、ＣＰＡ．９．０８６．ＶＬ、ＣＰＡ．９．０８６．ＨＣ、ＣＰＡ．９．０８６．ＬＣ、ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ１、ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ２、ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ３；ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４；ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）；ＣＰＡ．９．０８６．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．０８６．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．０８６．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．９．０８６．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．０８６．ｖｌＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．０８６．ｖｌＣＤＲ３およびｓｃＦｖ−ＣＰＡ．９．０８６；
【０１２７】
ＣＰＡ．９．０８９、ＣＰＡ．９．０８９．ＶＨ、ＣＰＡ．９．０８９．ＶＬ、ＣＰＡ．９．０８９．ＨＣ、ＣＰＡ．９．０８９．ＬＣ、ＣＰＡ．９．０８９．Ｈ１、ＣＰＡ．９．０８９．Ｈ２、ＣＰＡ．９．０８９．Ｈ３；ＣＰＡ．９．０８９．Ｈ４；ＣＰＡ．９．０８９．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）；ＣＰＡ．９．０８９．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．０８９．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．０８９．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．９．０８９．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．０８９．ｖｌＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．０８９．ｖｌＣＤＲ３およびｓｃＦｖ−ＣＰＡ．９．０８９；
【０１２８】
ＣＰＡ．９．０９３、ＣＰＡ．９．０９３．ＶＨ、ＣＰＡ．９．０９３．ＶＬ、ＣＰＡ．９．０９３．ＨＣ、ＣＰＡ．９．０９３．ＬＣ、ＣＰＡ．９．０９３．Ｈ１、ＣＰＡ．９．０９３．Ｈ２、ＣＰＡ．９．０９３．Ｈ３；ＣＰＡ．９．０９３．Ｈ４；ＣＰＡ．９．０９３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）；ＣＰＡ．９．０９３．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．０９３．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．０９３．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．９．０９３．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．０９３．ｖｌＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．０９３．ｖｌＣＤＲ３およびｓｃＦｖ−ＣＰＡ．９．０９３；
【０１２９】
ＣＰＡ．９．１０１、ＣＰＡ．９．１０１．ＶＨ、ＣＰＡ．９．１０１．ＶＬ、ＣＰＡ．９．１０１．ＨＣ、ＣＰＡ．９．１０１．ＬＣ、ＣＰＡ．９．１０１．Ｈ１、ＣＰＡ．９．１０１．Ｈ２、ＣＰＡ．９．１０１．Ｈ３；ＣＰＡ．９．１０１．Ｈ４；ＣＰＡ．９．１０１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）；ＣＰＡ．９．１０１．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．１０１．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．１０１．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．９．１０１．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．１０１．ｖｌＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．１０１．ｖｌＣＤＲ３およびｓｃＦｖ−ＣＰＡ．９．１０１；ならびに
【０１３０】
ＣＰＡ．９．１０３、ＣＰＡ．９．１０３．ＶＨ、ＣＰＡ．９．１０３．ＶＬ、ＣＰＡ．９．１０３．ＨＣ、ＣＰＡ．９．１０３．ＬＣ、ＣＰＡ．９．１０３．Ｈ１、ＣＰＡ．９．１０３．Ｈ２、ＣＰＡ．９．１０３．Ｈ３；ＣＰＡ．９．１０３．Ｈ４；ＣＰＡ．９．１０３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）；ＣＰＡ．９．１０３．ｖｈＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．１０３．ｖｈＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．１０３．ｖｈＣＤＲ３、ＣＰＡ．９．１０３．ｖｌＣＤＲ１、ＣＰＡ．９．１０３．ｖｌＣＤＲ２、ＣＰＡ．９．１０３．ｖｌＣＤＲ３およびｓｃＦｖ−ＣＰＡ．９．１０３．
【０１３１】
さらに、本発明は、ハイブリドーマから生成されたマウス抗体であるいくつかのＣＨＡ抗体を提供する。当該技術分野で周知のように、これらの６つのＣＤＲは、ヒトフレームワーク可変重および可変軽鎖領域に入れられる場合、または可変重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインがヒト化される場合に有用である。
【０１３２】
したがって、本発明は、以下のＣＤＲの組を含む抗体、通常は完全長またはｓｃＦｖドメインを提供し、その配列は図５３および／または配列表に示される：
【０１３３】
ＣＨＡ．９．５３６．１、ＣＨＡ．９．５３６．１．ＶＨ、ＣＨＡ．９．５３６．１．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５３６．１．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５３６．１．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５３６．１．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５３６．１．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５３６．１．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５３６．１．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５３６．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５３６．１．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５３６．１．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５３６．１．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５３６．１．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５３６．１．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５３６．１．ｖｈＣＤＲ３；
【０１３４】
ＣＨＡ．９．５３６．３、ＣＨＡ．９．５３６．３．ＶＨ、ＣＨＡ．９．５３６．３．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５３６．３．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５３６．３．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５３６．３．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５３６．３．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５３６．３．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５３６．３．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５３６．３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）；ＣＨＡ．９．５３６．３．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５３６．３．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５３６．３．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５３６．３．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５３６．３．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５３６．３．ｖｈＣＤＲ３；
【０１３５】
ＣＨＡ．９．５３６．４、ＣＨＡ．９．５３６．４．ＶＨ、ＣＨＡ．９．５３６．４．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５３６．４．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５３６．４．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５３６．４．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５３６．４．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５３６．４．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５３６．４．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５３６．４．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５３６．４．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５３６．４．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５３６．４．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５３６．４．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５３６．４．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５３６．４．ｖｈＣＤＲ３；
【０１３６】
ＣＨＡ．９．５３６．５、ＣＨＡ．９．５３６．５．ＶＨ、ＣＨＡ．９．５３６．５．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５３６．５．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５３６．５．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５３６．５．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５３６．５．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５３６．５．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５３６．５．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５３６．５．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５３６．５．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５３６．５．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５３６．５．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５３６．５．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５３６．５．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５３６．５．ｖｈＣＤＲ３；
【０１３７】
ＣＨＡ．９．５３６．６、ＣＨＡ．９．５３６．６．ＶＨ、ＣＨＡ．９．５３６．６．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５３６．６．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５３６．６．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５３６．６．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５３６．６．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５３６．６．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５３６．６．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５３６．６．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５３６．６．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５３６．６．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５３６．６．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５３６．６．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５３６．６．ｖｈＣＤＲ３；
【０１３８】
ＣＨＡ．９．５３６．７、ＣＨＡ．９．５３６．７．ＶＨ、ＣＨＡ．９．５３６．７．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５３６．７．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５３６．７．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５３６．７．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５３６．７．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５３６．７．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５３６．７．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５３６．５．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）；ＣＨＡ．９．５３６．７．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５３６．７．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５３６．７．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５３６．７．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５３６．７．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５３６．７．ｖｈＣＤＲ３；
【０１３９】
ＣＨＡ．９．５３６．８、ＣＨＡ．９．５３６．８．ＶＨ、ＣＨＡ．９．５３６．８．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５３６．８．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５３６．８．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５３６．８．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５３６．８．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５３６．８．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５３６．８．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５３６．８．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５３６．８．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５３６．８．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５３６．８．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５３６．８．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５３６．８．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５３６．８．ｖｈＣＤＲ３；
【０１４０】
ＣＨＡ．９．５６０．１、ＣＨＡ．９．５６０．１ＶＨ、ＣＨＡ．９．５６０．１．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５６０．１．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５６０．１．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５６０．１．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５６０．１．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５６０．１．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５６０．１．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５６０．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５６０．１．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５６０．１．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５６０．１．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５６０．１．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５６０．１．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５６０．１．ｖｈＣＤＲ３；
【０１４１】
ＣＨＡ．９．５６０．３、ＣＨＡ．９．５６０．３ＶＨ、ＣＨＡ．９．５６０．３．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５６０．３．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５６０．３．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５６０．３．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５６０．３．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５６０．３．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５６０．３．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５６０．３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）；ＣＨＡ．９．５６０．３．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５６０．３．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５６０．３．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５６０．３．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５６０．３．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５６０．３．ｖｈＣＤＲ３；
【０１４２】
ＣＨＡ．９．５６０．４、ＣＨＡ．９．５６０．４ＶＨ、ＣＨＡ．９．５６０．４．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５６０．４．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５６０．４．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５６０．４．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５６０．４．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５６０．４．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５６０．４．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５６０．４．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５６０．４．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５６０．４．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５６０．４．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５６０．４．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５６０．４．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５６０．４．ｖｈＣＤＲ３；
【０１４３】
ＣＨＡ．９．５６０．５、ＣＨＡ．９．５６０．５ＶＨ、ＣＨＡ．９．５６０．５．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５６０．５．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５６０．５．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５６０．５．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５６０．５．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５６０．５．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５６０．５．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５６０．５．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５６０．５．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５６０．５．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５６０．５．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５６０．５．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５６０．５．ｖｈＣＤＲ３；
【０１４４】
ＣＨＡ．９．５６０．６、ＣＨＡ．９．５６０．６ＶＨ、ＣＨＡ．９．５６０．６．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５６０．６．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５６０．６．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５６０．６．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５６０．６．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５６０．６．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５６０．６．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５６０．６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５６０．６．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５６０．６．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５６０．６．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５６０．６．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５６０．６．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５６０．６．ｖｈＣＤＲ３；
【０１４５】
ＣＨＡ．９．５６０．７、ＣＨＡ．９．５６０．７ＶＨ、ＣＨＡ．９．５６０．７．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５６０．７．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５６０．７．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５６０．７．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５６０．７．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５６０．７．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５６０．７．Ｈ４；ＣＨＡ．９．５６０．７．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）；ＣＨＡ．９．５６０．７．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５６０．７．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５６０．７．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５６０．７．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５６０．７．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５６０．７．ｖｈＣＤＲ３；
【０１４６】
ＣＨＡ．９．５６０．８、ＣＨＡ．９．５６０．８ＶＨ、ＣＨＡ．９．５６０．８．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５６０．８．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５６０．８．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５６０．８．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５６０．８．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５６０．８．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５６０．８．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５６０．８．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）；ＣＨＡ．９．５６０．８．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５６０．８．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５６０．８．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５６０．８．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５６０．８．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５６０．８．ｖｈＣＤＲ３；
【０１４７】
ＣＨＡ．９．５４６．１、ＣＨＡ．９．５４６．１ＶＨ、ＣＨＡ．９．５４６．１．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５４６．１．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５４６．１．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５４６．１．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５４６．１．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５４６．１．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５４６．１．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４６．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４６．１．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４６．１．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５４６．１．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５４６．１．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４６．１．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５４６．１．ｖｈＣＤＲ３；
【０１４８】
ＣＨＡ．９．５４７．１、ＣＨＡ．９．５４７．１ＶＨ、ＣＨＡ．９．５４７．１．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５４７．１．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５４７．１．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５４７．１．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５４７．１．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５４７．１．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５４７．１．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４７．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４７．１．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４７．１．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５４７．１．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５４７．１．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４７．１．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５４７．１．ｖｈＣＤＲ３；
【０１４９】
ＣＨＡ．９．５４７．２、ＣＨＡ．９．５４７．２ＶＨ、ＣＨＡ．９．５４７．２．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５４７．２．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５４７．２．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５４７．２．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５４７．２．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５４７．２．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５４７．２．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４７．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４７．２．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４７．２．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５４７．２．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５４７．２．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４７．２．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５４７．２．ｖｈＣＤＲ３；
【０１５０】
ＣＨＡ．９．５４７．３、ＣＨＡ．９．５４７．３ＶＨ、ＣＨＡ．９．５４７．３．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５４７．３．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５４７．３．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５４７．３．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５４７．３．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５４７．３．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５４７．３．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４７．３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４７．３．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４７．３．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５４７．３．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５４７．３．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４７．３．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５４７．３．ｖｈＣＤＲ３；
【０１５１】
ＣＨＡ．９．５４７．４、ＣＨＡ．９．５４７．４ＶＨ、ＣＨＡ．９．５４７．４．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５４７．４．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５４７．４．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５４７．４．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５４７．４．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５４７．４．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５４７．４．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４７．４．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４７．４．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４７．４．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５４７．４．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５４７．４．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４７．４．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５４７．４．ｖｈＣＤＲ３；
【０１５２】
ＣＨＡ．９．５４７．６、ＣＨＡ．９．５４７．６ＶＨ、ＣＨＡ．９．５４７．６．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５４７．６．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５４７．６．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５４７．６．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５４７．６．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５４７．６．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５４７．６．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４７．６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４７．６．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４７．６．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５４７．６．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５４７．６．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４７．６．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５４７．６．ｖｈＣＤＲ３；
【０１５３】
ＣＨＡ．９．５４７．７、ＣＨＡ．９．５４７．７ＶＨ、ＣＨＡ．９．５４７．７．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５４７．７．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５４７．７．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５４７．７．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５４７．７．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５４７．７．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５４７．７．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４７．７．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４７．７．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４７．７．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５４７．７．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５４７．７．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４７．７．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５４７．７．ｖｈＣＤＲ３；
【０１５４】
ＣＨＡ．９．５４７．８、ＣＨＡ．９．５４７．８ＶＨ、ＣＨＡ．９．５４７．８．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５４７．８．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５４７．８．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５４７．８．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５４７．８．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５４７．８．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５４７．８．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４７．８．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４７．８．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４７．８．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５４７．８．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５４７．８．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４７．８．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５４７．８．ｖｈＣＤＲ３；
【０１５５】
ＣＨＡ．９．５４７．９、ＣＨＡ．９．５４７．９、ＣＨＡ．９．５４７．９ＶＨ、ＣＨＡ．９．５４７．９．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５４７．９．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５４７．９．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５４７．９．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５４７．９．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５４７．９．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５４７．９．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４７．９．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４７．９．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４７．９．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４７．９．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４７．９．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５４７．９．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５４７．９．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４７．９．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５４７．９．ｖｈＣＤＲ３；
【０１５６】
ＣＨＡ．９．５４７．１３、ＣＨＡ．９．５４７．１３、ＣＨＡ．９．５４７．１３ＶＨ、ＣＨＡ．９．５４７．１３．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５４７．１３．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５４７．１３．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４７．１３．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４７．１３．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５４７．１３．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５４７．１３．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４７．１３．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５４７．１３．ｖｈＣＤＲ３；
【０１５７】
ＣＨＡ．９．５４１．１、ＣＨＡ．９．５４１．１．ＶＨ、ＣＨＡ．９．５４１．１．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５４１．１．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５４１．１．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５４１．１．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５４１．１．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５４１．１．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５４１．１．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４１．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４１．１．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４１．１．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５４１．１．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５４１．１．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４１．１．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５４１．１．ｖｈＣＤＲ３；
【０１５８】
ＣＨＡ．９．５４１．３、ＣＨＡ．９．５４１．３．ＶＨ、ＣＨＡ．９．５４１．３．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５４１．３．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５４１．３．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５４１．３．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５４１．３．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５４１．３．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５４１．３．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４１．３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４１．３．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４１．３．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５４１．３．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５４１．３．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４１．３．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５４１．３．ｖｈＣＤＲ３；
【０１５９】
ＣＨＡ．９．５４１．４、ＣＨＡ．９．５４１．４．ＶＨ、ＣＨＡ．９．５４１．４．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５４１．４．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５４１．４．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５４１．４．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５４１．４．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５４１．４．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５４１．４．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４１．４．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４１．４．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４１．４．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５４１．４．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５４１．４．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４１．４．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５４１．４．ｖｈＣＤＲ３；
【０１６０】
ＣＨＡ．９．５４１．５、ＣＨＡ．９．５４１．５．ＶＨ、ＣＨＡ．９．５４１．５．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５４１．５．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５４１．５．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５４１．５．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５４１．５．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５４１．５．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５４１．５．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４１．５．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４１．５．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４１．５．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５４１．５．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５４１．５．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４１．５．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５４１．５．ｖｈＣＤＲ３；
【０１６１】
ＣＨＡ．９．５４１．６、ＣＨＡ．９．５４１．６．ＶＨ、ＣＨＡ．９．５４１．６．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５４１．６．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５４１．６．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５４１．６．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５４１．６．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５４１．６．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５４１．６．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４１．６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４１．６．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４１．６．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５４１．６．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５４１．６．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４１．６．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５４１．６．ｖｈＣＤＲ３；
【０１６２】
ＣＨＡ．９．５４１．７、ＣＨＡ．９．５４１．７．ＶＨ、ＣＨＡ．９．５４１．７．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５４１．７．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５４１．７．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５４１．７．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５４１．７．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５４１．７．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５４１．７．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４１．７．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４１．７．ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４１．７．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５４１．７．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５４１．７．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４１．７．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５４１．７．ｖｈＣＤＲ３；ならびに
【０１６３】
ＣＨＡ．９．５４１．８、ＣＨＡ．９．５４１．８．ＶＨ、ＣＨＡ．９．５４１．８．ＶＬ、ＣＨＡ．９．５４１．８．ＨＣ、ＣＨＡ．９．５４１．８．ＬＣ、ＣＨＡ．９．５４１．８．Ｈ１、ＣＨＡ．９．５４１．８．Ｈ２、ＣＨＡ．９．５４１．８．Ｈ３；ＣＨＡ．９．５４１．８．Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４１．８．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）；ＣＨＡ．９．５４１．８ｖｈＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４１．８．ｖｈＣＤＲ２、ＣＨＡ．９．５４１．８．ｖｈＣＤＲ３、ＣＨＡ．９．５４１．８．ｖｌＣＤＲ１、ＣＨＡ．９．５４１．８．ｖｌＣＤＲ２およびＣＨＡ．９．５４１．８．ｖｈＣＤＲ３。
【０１６４】
上記の抗体のＣＤＲを含むｓｃＦｖの場合、これらは、ｓｃＦｖと標示され、ｓｃＦｖは、上記のように再びいずれかの配向で、ｖｈＣＤＲを有する可変重鎖ドメイン、リンカー、およびｖｌＣＤＲを有する可変軽鎖ドメインを含む。したがって、本発明は、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５３６．３．１、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５３６．３、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５３６．４、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５３６．５、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５３６．７、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５３６．８、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５６０．１、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５６０．３、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５６０．４、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５６０．５、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５６０．６、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５６０．７、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５６０．８、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５４６．１、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５４７．１、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５４７．２、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５４７．３、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５４７．４、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５４７．６、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５４７．７、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５４７．８、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５４７．９、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５４７．１３、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５４１．１、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５４１．３、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５４１．４、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５４１．５、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５４１．６、ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５４１．７およびｓｃＦｖ−ＣＨＡ．９．５４１．８を含む。
【０１６５】
さらに、ＣＨＡ．９．５４３は、ＴＩＧＩＴに結合するが、ＴＩＧＩＴ−ＰＶＲ相互作用を遮断しない。
【０１６６】
本明細書で考察されるように、本発明は、上で概説されるＣＤＲにおけるバリアントを含む、上記の構成要素（ＣＰＡおよびＣＨＡ）のバリアントをさらに提供する。したがって、本発明は、抗体が依然としてＴＩＧＩＴに結合する限り、一組のＣＤＲに１つ、２つまたは３つのアミノ酸の相違を含み得る、本明細書に概説される６つ一組のＣＤＲを含む抗体を提供する。Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ等の、本明細書に概説されるＣＤＲ配列と比較して突然変異を含む抗ＴＩＧＩＴ抗体かどうかを試験するための好適なアッセイが、当該技術分野で知られている。
【０１６７】
さらに、本発明は、上記の可変重鎖および軽鎖のバリアントをさらに提供する。この場合、可変重鎖は、本明細書の「ＶＨ」配列と、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であり得、かつ／あるいは、Ｆｃ変異体を使用する場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多くのアミノ酸変化を含み得る。本明細書の「ＶＬ」配列（および特にＣＰＡ．９．０８６）と、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であり得、かつ／あるいは、Ｆｃ変異体を使用する場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多くのアミノ酸変化を含み得る、可変軽鎖が提供される。これらの実施形態では、本発明は、抗体が依然としてＴＩＧＩＴに結合する限り、これらのバリアントを含む。Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ等の、本明細書に概説されるＣＤＲ配列と比較して突然変異を含む抗ＴＩＧＩＴ抗体かどうかを試験するための好適なアッセイが、当該技術分野で知られている。
【０１６８】
同様に、本明細書の完全長「ＨＣ」および「ＶＬ」配列（および特にＣＰＡ．９．０８６）と、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であり、かつ／あるいは、Ｆｃ変異体を使用する場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多くのアミノ酸変化を含む、重鎖および軽鎖が提供される。これらの実施形態では、本発明は、抗体が依然としてＴＩＧＩＴに結合する限り、これらのバリアントを含む。Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ等の、本明細書に概説されるＣＤＲ配列と比較して突然変異を含む抗ＴＩＧＩＴ抗体かどうかを試験するための好適なアッセイが、当該技術分野で知られている。
【０１６９】
加えて、本明細書のＣＰＡまたはＣＨＡ抗体のいずれかの可変重鎖および可変軽鎖のフレームワーク領域は、当該技術分野で知られているようにヒト化（あるいは、ＣＨＡ抗体の場合、代替のヒト化方法が行われ得る範囲で「再ヒト化」）することができ（時折、バリアントが必要に応じてＣＤＲにおいて生成される）、このようにして、図５３のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のヒト化バリアント（および特にＣＰＡ．９．０８６）を生成することができる。さらに、続いてヒト化可変重および軽鎖ドメインを、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４（ＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）を含む）由来の定常領域等のヒト定常領域と融合させることができる。
【０１７０】
特に、当該技術分野で知られているように、マウスＶＨおよびＶＬ鎖は、例えば、ヒト化方法について参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＹｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１：Ｗ３４−Ｗ４０（２０１３）に概説されるように、ＮＣＢＩウェブサイトのＩｇＢＬＡＳＴプログラムを用いて、当該技術分野で知られているようにヒト化することができる。ＩｇＢＬＡＳＴは、マウスＶＨおよび／またはＶＬ配列を採取し、それを既知のヒト生殖細胞系列配列のライブラリと比較する。本明細書に示されるように、本明細書で生成されるヒト化配列について、使用したデータベースは、ＩＭＧＴヒトＶＨ遺伝子（Ｆ＋ＯＲＦ、２７３生殖細胞系列配列）およびＩＭＧＴヒトＶＬカッパ遺伝子（Ｆ＋ＯＲＦ、７４生殖細胞系列配列）であった。例となる５つのＣＨＡ配列を選択した：ＣＨＡ．９．５３６、ＣＨＡ９．５６０、ＣＨＡ．９．５４６、ＣＨＡ．９．５４７およびＣＨＡ．９．５４１（図５３参照）。このヒト化の実施形態のために、ヒト生殖細胞系列ＩＧＨＶ１−４６（対立遺伝子１）を、アクセプター配列およびヒト重鎖ＩＧＨＪ４（対立遺伝子１）接合領域（Ｊ遺伝子）として５つ全てについて選択した。４つ（ＣＨＡ．７．５１８、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３８＿１、およびＣＨＡ．７．５３８＿２）のうちの３つについては、ヒト生殖細胞系列ＩＧＫＶ１−３９（対立遺伝子１）をアクセプター配列として選択し、ヒト軽鎖ＩＧＫＪ２（対立遺伝子１）（Ｊ遺伝子）を選択した。Ｊ遺伝子は、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇのｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム、ＩＭＧＴ（登録商標）にてコンパイルされたヒト接合領域配列から選択した。ＣＤＲは、ＡｂＭ定義（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照）に従って定義した。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、異なる抗ＴＩＧＩＴ抗体のＶＨおよびＶＬ配列が「ミックスアンドマッチ」（ｍｉｘｅｄ  ａｎｄ  ｍａｔｃｈｅｄ）されて他の抗ＴＩＧＩＴ抗体を創出することができる抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む。かかる「ミックスアンドマッチ」抗体のＴＩＧＩＴ結合は、上記の結合アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅアッセイ）を使用して試験することができる。いくつかの実施形態では、ＶＨおよびＶＬ鎖がミックスアンドマッチされるとき、特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＨ配列が構造的に同様のＶＨ配列と置き換えられる。同様に、いくつかの実施形態では、特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＬ配列が構造的同様のＶＬ配列と置き換えられる。例えば、同種抗体のＶＨおよびＶＬ配列は、ミックスアンドマッチに特に適している。
【０１７２】
したがって、本発明のＴＩＧＩＴ抗体は、（ａ）本明細書に列挙される配列、（ｂ）（ａ）で指定したＣＤＲアミノ酸配列とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多くのアミノ酸置換だけ異なる配列；（ｃ）（ａ）または（ｂ）で指定した配列との９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；（ｄ）本明細書に列挙されるアミノ酸をコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群から選択される、ＣＤＲアミノ酸配列を含む。特に、ＣＰＡ．９．０８６抗体は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）から選択される配列を有することができる。
【０１７３】
加えて、本明細書に列挙するＴＩＧＩＴ抗体との同一性を共有する抗体がＴＩＧＩＴ抗体の定義に含まれる。つまり、ある特定の実施形態では、本発明に従う抗ＴＩＧＩＴ抗体は、好ましい抗ＴＩＧＩＴ抗体の抗ＴＩＧＩＴアミノ酸配列の全てまたは一部とそれぞれ同一であるアミノ酸配列を含む、重鎖および軽鎖可変領域を含み、この抗体は、親抗ＴＩＧＩＴ抗体の所望の機能特性を保持する。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列を最適にアラインメントするために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列が共有する同一位置の数の関数である（即ち、相同性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、以下の非限定的な実施例において記載するように、数学アルゴリズムを使用して達成することができる。
【０１７４】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み残差テーブル（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを使用して決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（市販されている）中のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して決定することができる。
【０１７５】
加えてまたは代替的に、本発明のタンパク質配列をさらに「クエリ配列」として使用して、例えば関連配列を特定するために、公的なデータベースに対して検索を行うことができる。かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行って、本発明の少なくともいくつかの実施形態に従う抗体分子と相同であるアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップのあるアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されるように利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムの利用時には、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用することができる。
【０１７６】
一般に、ＴＩＧＩＴ抗体間の比較のための同一性パーセンテージは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％であり、少なくとも約９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性パーセントが好ましい。同一性パーセンテージは、全アミノ酸配列、例えば重鎖もしくは軽鎖全体にかかるか、または鎖の一部にかかるものであり得る。例えば、可変領域全体にかけて（例えば、同一性が可変領域にかけて９５または９８％同一である場合）、または定常領域全体にかけて、またはＦｃドメインのみにかけて同一性を共有するものが、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体の定義に含まれる。特に、本発明は、ＣＰＡ．９．０８６に関して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を有するＴＩＧＩＴ抗体を提供し、少なくとも約９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性パーセントが好ましい。
【０１７７】
加えて、ＣＤＲは同一であるが、可変ドメイン（または重鎖もしくは軽鎖全体）のフレームワーク部分において変化を有し得る配列もまた含まれる。例えば、ＴＩＧＩＴ抗体には、ＣＤＲは図５３に示すものと同一であるが、可変領域にかけての同一性がより低い、例えば、９５または９８％の同一性パーセントであり得るものが含まれる。特に、本発明は、ＣＰＡ．９．０８６と同一のＣＤＲを有するが、フレームワーク領域がＣＰＡ．９．０８６と９５または９８％同一である、ＴＩＧＩＴ抗体を提供する。
【０１７８】
Ａ．結合について競合するＴＩＧＩＴ抗体
本発明は、列挙される抗体だけでなく、ＴＩＧＩＴ分子と特異的に結合するために列挙される抗体（ＴＩＧＩＴと特異的に結合する本明細書に列挙されるＣＰＡ数）と競合する追加の抗体も提供する。実施例１６に示すように、本発明のＴＩＧＩＴ抗体は、異なるエピトープビンに「ビニング」される。エピトープビニング研究における４４個のＴＩＧＩＴ抗体の中には、それぞれが関連する対合遮断パターンを有する４つのコミュニティがあり、これらは、本明細書に概説され、図６７および６８に示される総計１２個の個別ビンに分離する。本明細書では１２個の個別のビンが概説される。１）ＢＭ９−Ｈ４、ＣＨＡ．９．５２５、ＣＰＡ．９．０８１−Ｈ４、ＣＨＡ．９．５３８、ＣＨＡ．９．５５３、ＣＰＡ．９．０６９−Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４３、ＣＨＡ．９．５５６、ＣＰＡ．９．０７７−Ｈ４およびＣＨＡ．９．５６１；２）ＣＨＡ．９．５６０およびＣＨＡ．９．５２８；３）ＣＨＡ．９．５５２、ＣＨＡ．９．５２１、ＣＨＡ．９．５４１、ＣＨＡ．９．５２９、ＣＨＡ．９．５１９、ＣＨＡ．９．５２７およびＣＨＡ．９．５４９；４）ＣＰＡ．９．０５７−Ｈ４およびＣＨＡ．９．５５４；ＣＨＡ．９．５４６、ＣＰＡ．９．０１２−Ｈ４、ＣＨＡ．９．５４７、ＣＰＡ．９．０１３−Ｈ４、ＣＰＡ．９．０１８−Ｈ４、ＭＢＳＡ４３−Ｍ１、ＳｉｎｏＰＶＲ−Ｆｃ（リガンド）、ＣＨＡ．９．５５５、ＰＶＲ−ＦｃＭ２Ａ（リガンド）、ＢＭ２９−Ｈ４、ＣＰＡ．９．０２７−Ｈ４、ＣＰＡ．９．０４９−Ｈ４およびＣＰＡ．９．０５３−Ｈ４；６）ＣＰＡ．９．０６４−Ｈ４；７）ＢＭ２６−Ｈ４；８）ＣＰＡ．９．０５９−Ｈ４；９）ＣＨＡ．９．５３５およびＣＰＡ．９．００９−Ｈ４；１０）ＣＨＡ．９．５３６、ＣＨＡ．９．５２２およびＣＰＡ．９．０１５−Ｈ４；１１）ＣＰＡ．９．０１１−Ｈ４およびＢＭ８−Ｈ４ならびに１２）ＣＰＡ．９．０７１−Ｈ４。
【０１７９】
したがって、本発明は、個別のエピトープビン１〜１２にある抗体との結合について競合する抗ＴＩＧＩＴ抗体を提供する。特定の実施形態では、本発明は、ＣＰＡ．９．０８６との結合について競合し、ＣＰＡ．９．０８６と少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％同一である、抗ＴＩＧＩＴ抗体を提供する。
【０１８０】
列挙される抗体と競合する追加の抗体は、当該技術分野で知られているように、また以下で一般に概説するように、生成される。競合的結合研究は、一般に、ＳＰＲ／Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）結合アッセイ、ならびにＥＬＩＳＡおよび細胞系アッセイを使用して、当該技術分野で知られているように行うことができる。
【０１８１】
ＶＩＩＩ．ＰＶＲＩＧ抗体
本発明は、抗ＰＶＲＩＧ抗体を提供する。（便宜上、「抗ＰＶＲＩＧ抗体」および「ＴＩＧＩＴ抗体」は交換可能に使用される）。本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体は、ヒトＰＶＲＩＧ、好ましくはヒトＰＶＲＩＧのＥＣＤと特異的に結合する。
【０１８２】
ＰＶＲＩＧまたはＰＶＲＩＧのエピトープに対する特異的結合は、少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、代替的には少なくとも１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれを超えるＫＤを有する抗体によって示され得、ここでＫＤは、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、ＰＶＲＩＧ抗原またはエピトープと比べて、対照分子に対して２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きいＫＤを有することになる。
【０１８３】
しかしながら、ＷＯ２０１６／１３４３３３の実施例に示されるように、ＮＫおよびＴ細胞の表面上で発現されるＰＶＲＩＧへの最適な結合のためには、抗体は、好ましくは５０ｎＭ未満、最も好ましくは１ｎＭ未満のＫＤを有し、０．１ｎＭ未満ならびに１ｐＭおよび０．１ｐＭ未満が本発明の方法において有用である。
【０１８４】
また、特定の抗原またはエピトープへの特異的結合は、例えば、ＰＶＲＩＧ抗原またはエピトープについてのＫＡまたはＫａが、対照と比べて、そのエピトープに対して少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きい抗体によって示され得、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体は、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、もしくは１ｎＭ以下のＫＤ（つまり、より高い結合親和性）、または１ｐＭ以下のＫＤでヒトＰＶＲＩＧに結合し、ＫＤは、既知の方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ）、ＥＬＩＳＡ、ＫＩＮＥＸＡ、最も典型的にはＳＰＲによって２５℃または３７℃で決定される。
【０１８６】
抗ＰＶＲＩＧ抗体に対する結合親和性は活性と驚くほどに相関することに留意することが重要である。スクリーニングデータの累積分析は、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体の親和性が、初代ヒトＴ細胞に結合するそれらの能力と高度に相関することを示す。より具体的には、Ｔ細胞上で最も高い最大シグナルを生じた抗体は、ピコモル範囲の親和性を有する抗体であった。低ナノモル範囲以上の親和性を有する抗体は、Ｔ細胞上で比較的弱い最大シグナルを生じた。したがって、このデータは、Ｔ細胞ベースの免疫療法に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の有用性が、その親和性に部分的に基づいて定義される可能性があり得ることを示している。ＷＯ２０１６／１３４３３３からの抗体配列に参照がなされ、これは参照により、特に図３８（ＰＶＲＩＧに結合し、ＰＶＲＩＧとＰＶＲＬ２との相互作用を遮断する配列を図示する）、図３９（ＰＶＲＩＧに結合しＰＶＲＩＧとＰＶＲＬ２との相互作用を遮断しない配列を図示る）、図４０（これらの抗体からのＣＤＲおよびデータを図示する）、および図４１（結合および遮断するハイブリドーマからのＣＤＲを図示する）に概説される抗ＰＶＲＩＧ抗原結合ドメインについて本明細書に組み込まれる。即ち、ＷＯ２０１６／１３４３３３による図および凡例、ならびに全てのＣＰＡ．７およびＣＨＡ．７抗体（ＣＤＲ、ＶＨおよびＶＬならびに完全長配列を含む）からの特定の配列および配列番号が、本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１８７】
図４５は、異なる親和性の２つの抗ＰＶＲＩＧ抗体が初代ＣＤ８Ｔ細胞に結合する能力を例示する。図４５に示されるように、ＣＨＡ．７．５１８は、ＰＶＲＩＧ（ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ）を過剰発現するように操作されたＨＥＫ細胞への結合によって測定するときＣＰＡ．７．０２１（ＷＯ２０１６／１３４３３の配列）よりも約８倍高い親和性を有する。これと一致して、ＣＨＡ．７．５１８は、Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合によって測定するときＣＰＡ．７．０２１よりも約１３倍高い親和性を有する。ＣＨＡ．７．５１８のより高い親和性は、ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞からのより大きな最大結合シグナルには一致したが、Ｊｕｒｋａｔ細胞ではその限りでなかった。
【０１８８】
対照的に、ＣＨＡ．７．５１８は、一貫して、ＣＰＡ．７．０２１と比較して、初代ＣＤ８Ｔ細胞からのより高い最大結合シグナルを生じた。これは、様々な濃度のアイソタイプまたは抗ＰＶＲＩＧ抗体を初代ＣＤ８Ｔ細胞に加え、得られた最大結合シグナルを測定する結合滴定実験において例示される。例示される２つのドナー（図４５）において、ＣＨＡ．７．５１８は、一貫して、滴定依存的様態でＣＰＡ．７．０２１よりも高い最大シグナル（幾何平均蛍光強度、ｇＭＦＩ）を生じた。ｇＭＦＩｒ＝目的とする抗体の幾何学的蛍光強度／対照抗体の幾何学的蛍光強度。ｇＭＦＩｒは、目的とする抗体が両方の固定濃度でアイソタイプ抗体と比べて生じるシグナルを測定する。
【０１８９】
したがって、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体は、ピコモル範囲、例えば、０．１〜９ｐＭ（約０．２〜約２が好ましく、約０．２〜約０．５が特に有用である）の（本明細書に概説される技法を用いて測定される）結合親和性を有する。
【０１９０】
ＴＩＧＩＴ抗体の場合のように、ＰＶＲＩＧ抗体は同様に以下のように標示される。これらの抗体は参照番号、例えば「ＣＨＡ．７．５１８．１」を有する。これは、これらの抗体が２本の重鎖および２本の軽鎖を含むと理解しつつ、例えば図３に図示されるように、可変重鎖および可変軽鎖の組み合わせを表す。「ＣＰＡ．「７．５１８．１．ＶＨ」は、ＣＰＡ．７．５１８．１の可変重鎖部分を指し、一方で「ＣＰＡ．７．５１８．１．ＶＬ」は、可変軽鎖である。「ＣＰＡ．７．５１８．１．ｖｈＣＤＲ１」、「ＣＰＡ．７．５１８．１．ｖｈＣＤＲ２」、「ＣＰＡ．７．５１８．１．ｖｈＣＤＲ３」、「ＣＰＡ．７．５１８．１．ｖｌＣＤＲ１」、「ＣＰＡ．７．５１８．１．ｖｌＣＤＲ２」、および「ＣＰＡ．７．５１８．１．ｖｌＣＤＲ３」は、示されるＣＤＲを指す。「ＣＰＡ．７．５１８．１．ＨＣ」は、この分子の重鎖全体（例えば、可変および定常ドメイン）を指し、「ＣＰＡ．７．５１８．１．ＬＣ」は、同じ分子の軽鎖全体（例えば、可変および定常ドメイン）を指す。一般に、ヒトカッパ軽鎖は、本明細書における各ファージ（またはヒト化ハイブリドーマ）抗体の定常ドメインに使用されるが、いくつかの実施形態では、ラムダ軽鎖定常ドメインが使用される。「ＣＰＡ．７．５１８．１．Ｈ１」は、ヒトＩｇＧ１の定常ドメインを含む可変重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインを含む完全長抗体を指す（よってＨ１；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４配列は図５０に示す）。したがって、「ＣＰＡ．７．５１８．１．Ｈ２」であれば、ヒトＩｇＧ２に連結されたＣＰＡ．７．５１８．１可変ドメインとなる。「ＣＰＡ．７．５１８．１．Ｈ３」であれば、ヒトＩｇＧ３に連結されたＣＰＡ．７．５１８．１可変ドメインとなり、「ＣＰＡ．７．５１８．１．Ｈ４」であれば、ヒトＩｇＧ４に連結されたＣＰＡ．７．５１８．１可変ドメインとなる。場合によっては、ヒトＩｇＧは、追加の突然変異を有してもよく、そのようなものは以下に記載され、これには注釈を付けられ得ることに留意されたい。例えば、多くの実施形態では、ヒトＩｇＧ４にＳ２４１Ｐ突然変異が存在し得、これは、例えば、「ＣＰＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）」と注釈を付けられ得る。このＳ２４１Ｐヒンジバリアントを有するヒトＩｇＧ４配列を図５０に示す。他の可能性のあるバリアントは、ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）（またはこの部位でグリコシル化を切除し、したがってＦｃγＲＩＩＩａ結合に関連するエフェクター機能の多くを切除した他のバリアント）、およびＦｃγＲ受容体への結合を低下させるＩｇＧ１（Ｄ２６５Ａ）である。
【０１９１】
本発明は、可変重鎖ドメインおよび軽鎖ドメイン、ならびに完全長重鎖および軽鎖をさらに提供する。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、本発明は、上で概説したｓｃＦｖリンカーによって連結された可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含むＰＶＲＩＧに結合するｓｃＦｖを提供する。ＶＬおよびＶＨドメインは、いずれかの配向、例えばＮ末端からＣ末端まで「ＶＨ−リンカー−ＶＬ」または「ＶＬ−リンカー」ＶＨ」にあり得る。これらは、その構成要素部分によって命名され、例えば、「ｓｃＦｖ−ＣＨＡ．７．５１８．１ＶＨ−リンカー−ＶＬ」または「ｓｃＦｖ−ＣＰＡ．７．５１８．１．ＶＬ−リンカー−ＶＨ」等である。したがって、「ｓｃＦｖ−ＣＰＡ．７．５１８．１」はいずれの配向にあってもよい。
【０１９３】
ＩＸ．抗体をコードする核酸
本発明の抗体をコードする核酸組成物、ならびに核酸および核酸でトランスフェクトした宿主細胞を含む発現ベクター、および／または発現ベクター組成物も提供される。当業者には理解されようが、本明細書に図示されるタンパク質配列は、遺伝コードの縮重に起因して、任意の数の可能性のある核酸配列によってコードされ得る。
【０１９４】
抗体をコードする核酸組成物は、抗体の形式に依存することになる。２本の重鎖および２本の軽鎖を含む従来の四量体抗体は、重鎖をコードする核酸および軽鎖をコードする核酸という２つの異なる核酸によってコードされる。これらは、当該技術分野で知られているように、単一の発現ベクターまたは２つの発現ベクターの中に入れ、宿主細胞に形質転換することができ、そこでそれらが発現されて本発明の抗体を形成する。いくつかの実施形態では、例えばｓｃＦｖ構築物を使用する場合、可変重鎖−リンカー−可変軽鎖をコードする単一の核酸が通常使用され、これを宿主細胞への形質転換のために発現ベクターの中に挿入し得る。核酸は、シグナルおよび分泌配列、調節配列、プロモーター、複製起点、選択遺伝子等が挙げられるがこれらに限定されない、適切な転写および翻訳制御配列を含む発現ベクターの中に入れることができる。
【０１９５】
本発明の少なくともいくつかの実施形態に従う組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＥＫ２９３、および当該技術分野で既知の他の細胞が含まれる。
【０１９６】
核酸は、全細胞において、細胞溶解物において、または部分的に精製されているかもしくは実質的に純粋な形態において存在してもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当該技術分野で周知の他のものを含む標準的な技法によって、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質から精製されるときに、「単離される」または「実質的に純粋にされる」。
【０１９７】
ｓｃＦｖ遺伝子を創出するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片を、可動性リンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３および本明細書で考察されるその他をコードする別の断片に動作可能に連結させて、その結果、ＶＨおよびＶＬ配列が連続した１本鎖タンパク質として、ＶＬおよびＶＨ領域が可動性リンカーによって接合された状態で発現され得るようにする。
【０１９８】
Ｘ．製剤
前述の方法の実施に使用される治療用組成物（特に、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＰＡ．９．０８６）は、所望の送達方法に好適な担体を含む薬学的組成物に製剤化することができる。好適な担体には、治療用組成物と組み合わせたときに、その治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、かつ一般に患者の免疫系と反応性ではない任意の物質が含まれる。例としては、いくつかの標準的な薬学的担体、例えば、無菌リン酸緩衝生理食塩水、静菌水等のうちの任意のものが挙げられるが、これらに限定されない（一般には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｏｓａｌ．，Ｅｄ．，１９８０を参照されたい）。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対し無毒である。
【０１９９】
好ましい実施形態では、本発明の抗体を含む薬学的組成物は、酸付加塩および塩基付加塩の両方を含むことを意図する、薬学的に許容される塩として存在する等、水溶性形態であってもよい。「薬学的に許容される酸付加塩」は、無機酸等によって形成された、遊離塩基の生物学的有効性を保持し、かつ生物学的に、ないしは別様に不適切でない塩を指す。「薬学的に許容される塩基付加塩」には、無機塩基等から誘導されるものが含まれる。
【０２００】
好ましくは無菌水溶液の形態である本発明の抗体を含む薬学的組成物の投与は、皮下および静脈内を含むがこれらに限定されない様々な方法で行われ得る。
【０２０１】
投薬量および投薬頻度は、好ましい実施形態では、治療的または予防的に有効であるように選択される。当該技術分野で知られているように、タンパク質分解、全身対局所送達、および新たなプロテアーゼ合成の速度、ならびに年齢、体重、全般的な健康、性別、食生活、投与時間、薬物相互作用、および状態の重症度に対する調整が必要であり得、これは、当業者によって慣習的な実験を用いて確認可能であろう。
【０２０２】
患者を治療するために、治療有効量の本発明のＦｃバリアントが投与され得る。本明細書における「治療有効量」は、それを投与した目的である効果を生む用量を意味する。正確な用量は治療の目的によることになり、既知の技法を使用して当業者によって確認可能であろう。
【０２０３】
ＸＩ．抗体を使用する方法
ＰＶＲＩＧおよびＴＩＧＩＴ抗体の両方を含む本発明の抗体は、いくつかの診断および治療用途に使用することができる。場合によっては、患者にどの抗体を投与するかの決定は、試料がＴＩＧＩＴもしくはＰＶＲＩＧのいずれか、または両方を過剰発現しているかどうかを決定するための試料腫瘍生検の発現レベル（遺伝子発現レベルまたはタンパク質発現レベルのいずれかであるが、後者が好ましい）の評価を使用して行われ、どのような治療抗体を投与するかを決定する。
【０２０４】
Ａ．診断的使用
したがって、本発明の抗体はまた、ＰＶＲＩＧまたはＴＩＧＩＴのいずれかをそれぞれ過剰発現する腫瘍のインビトロまたはインビボ診断（画像診断を含む）においても有用である。しかしながら、本明細書で考察するように、免疫腫瘍学的標的タンパク質としてのＴＩＧＩＴおよびＰＶＲＩＧの両方は、必ずしもがん細胞上ではなく、むしろがんにおける免疫浸潤物内で過剰発現されることに留意されたい。故に、がん診断をもたらすのは、作用機序、例えば、Ｔ細胞およびＮＫ細胞等の免疫細胞の活性化である。したがって、これらの抗体を使用して、がんを診断することができる。ＰＶＲＩＧ抗体を用いた診断はまた、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１３４３３３、［０４３４〜０４５９］に概説される。
【０２０５】
一般に、診断はいくつかの方法で行うことができる。一実施形態では、生検試料等の患者からの組織を、一般的には標識されているＴＩＧＩＴ抗体と接触させ、それにより抗体が内因性ＴＩＧＩＴと結合するようにする。シグナルのレベルを、同じ患者または参照試料のいずれかに由来する正常な非がん性組織のレベルと比較して、がんの存否を決定する。生検試料は、固形腫瘍、血液試料（リンパ腫および白血病、例えば、ＡＬＬ、Ｔ細胞リンパ腫等に由来する）に由来し得る。
【０２０６】
一般に、本実施形態では、抗ＴＩＧＩＴは、例えば、当該技術分野で周知であるように、蛍光光度計または他の光学検出系を使用して検出されるフルオロフォアまたは他の光標識で標識する。代替的な実施形態では、二次標識抗体を、当該技術分野で既知であるように、例えば、異なる哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等）由来の抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して試料と接触させ、サンドイッチアッセイを形成する。代替的に、抗ＰＶＲＩＧ  ｍＡｂを直接標識し（即ち、ビオチン）、当該技術分野の標識剤に向けられた二次抗体によって検出を行うことができる。
【０２０７】
ＴＩＧＩＴの過剰発現が見られたら、本明細書で概説する本発明に従う抗ＴＩＧＩＴ抗体の投与により治療を進め得る。
【０２０８】
他の実施形態においては、インビボ診断を行う。一般に、本実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体（抗体断片を含む）を患者に注射し、画像診断を行う。この実施形態では、例えば、抗体は一般に、光標識、またはｍＡｂ（断片を含む）の放射性標識であるガドリニウムキレート剤等のＭＲＩ標識で標識される。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、診断と治療との両方、または診断のみに使用される。抗ＴＩＧＩＴ抗体が診断と治療との両方に使用される場合、いくつかの実施形態は、診断用抗体が治療用抗体と結合について競合しないように２つの異なるエピトープに対して２つの異なる抗ＴＩＧＩＴ抗体に頼るが、場合によっては、同じ抗体を両方に対して使用できる。例えば、これは、本明細書で概説するもの等の、異なるビンにある、例えば、ＴＩＧＩＴ上で異なるエピトープと結合する抗体を使用して行うことができる。このため、診断用抗体および治療用抗体を含む組成物が本明細書に含まれ、いくつかの実施形態では、診断用抗体は本明細書に記載のように標識される。加えて、治療用および診断用抗体の組成物は、本明細書に概説する他の薬物と共投与することもできる。
【０２１０】
診断における使用に特に有用な抗体には、これらの列挙する抗体、またはバリアント配列を有するＣＤＲを利用する抗体、図５３の抗体のうちのいずれかと結合について競合するものが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１１】
多くの実施形態では、診断用抗体は標識される。本明細書における「標識される」とは、本明細書に開示の抗体に、スクリーンまたは診断手順における検出を可能にするために１つ以上の元素、同位体、または化学的化合物を結合させることを意味する。一般に、標識は、いくつかのクラスに分けられる：ａ）抗体によって認識される融合パートナーとして組み込まれるエピトープであり得る、免疫標識、ｂ）放射性または重同位体であり得る、同位体標識、ｃ）蛍光および比色色素、または他の標識方法を可能にするビオチン等の分子を含み得る、小分子標識、ならびにｄ）粒子（超音波標識用のバブルを含む）または身体撮像を可能にする常磁性標識等の標識。標識は、当該技術分野で既知であるように、いずれの位置で抗体に組み込んでもよく、またタンパク質発現中にインビトロまたはインビボで組み込んでもよい。
【０２１２】
診断は、以下に記載のように全身画像診断を可能にする診断用抗体の投与によってインビボで、あるいは患者から取り出した試料においてインビトロで行うことができる。本文脈における「試料」は、体液（血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門および膣分泌物、汗、ならびに精液を含むがこれらに限定されない）、ならびに関連組織の生検から得られるもの等の組織試料を含むがこれらに限定されない、任意の数のものを含む。
【０２１３】
加えて、以下ならびに実施例および図に概説されるように、ＰＶＲＩＧもしくはＴＩＧＩＴのいずれか、またはその両方、またはＰＶＲＩＧおよびＰＤ−１、またはＴＩＧＩＴおよびＰＤ−１のタンパク質発現レベルに関する情報を使用して、どの抗体が患者に投与されるべきかを決定することができる。
【０２１４】
Ｂ．癌治療
本発明の抗体は、癌の治療に特に有用である。一般に、本発明の抗体は、がん性細胞を直接攻撃するというよりは、本発明の抗体が概してチェックポイント受容体（例えば、ＰＶＲＩＧまたはＴＩＧＩＴ）の作用を阻害することによって免疫系を刺激するという点において、免疫調節性である。このため、腫瘍成長および発達に必須である分子経路を阻害すること、ならびに／または腫瘍細胞を枯渇させることを目的とする腫瘍標的化療法とは異なり、がん免疫療法は、患者自身の免疫系を刺激してがん細胞を排除し、息の長い腫瘍破壊を提供することを目的とする。種々のアプローチをがん免疫療法において使用することができ、腫瘍特異的Ｔ細胞応答を誘導するための治療用がんワクチン、および免疫抑制経路を除去するための免疫刺激抗体（即ち、抑制性受容体の拮抗物質＝免疫チェックポイント）がその一部である。
【０２１５】
標的化療法または従来の抗がん療法による臨床応答は、がん細胞が耐性を発達し、腫瘍の再発が起きるため、一過性である傾向にある。しかしながら、過去数年のがん免疫療法の臨床使用により、この種の療法が永続的な臨床応答を有し得、長期的な生存率に対する劇的な影響を示すことが示されている。しかしながら、応答は長期的ではあるが、少数の患者しか応答しない（多数の患者が応答するが応答は一過性である従来のまたは標的化療法とは対照的）。
【０２１６】
腫瘍が臨床で検出されるまでに、腫瘍は、免疫耐性および免疫抑制特性を獲得すること、ならびに種々の機序および種々の免疫細胞を通して免疫抑制腫瘍微小環境を創出することによって、既に免疫防御系をかいくぐっている。
【０２１７】
したがって、本発明の抗体は、がんの治療において有用である。免疫腫瘍学的作用機序の性質に起因して、チェックポイント受容体（ＴＩＧＩＴまたはＰＶＲＩＧ）は、必ずしも特定のがんの種類上で過剰発現されるか、またはそれと相関する必要はなく、これはつまり、目標は、抗体にＴ細胞およびＮＫ細胞活性化の抑制を解除させて、免疫系ががんを狙うようにすることである。
【０２１８】
本明細書で使用される「がん」は、悪性増殖または腫瘍（例えば、無調節の細胞増殖）を引き起こす異常かつ無制御の細胞分裂を特徴とする任意の腫瘍性疾患（浸潤性であろうと転移性であろうと）を広く指す。本明細書で使用される用語「がん」または「がん性」は、悪性増殖または腫瘍を引き起こす異常かつ無制御の細胞分裂を特徴とする任意の腫瘍性疾患（浸潤性であろうと転移性であろうと）を包含するものと理解すべきであり、これらの非限定的例が本明細書に記載されている。これは、無調節の細胞増殖を典型的に特徴とする哺乳動物におけるいずれの生理学的状態も含む。癌の例は、実施例において例示されており、また、明細書内にも記載されている。
【０２１９】
本発明の抗体を用いて治療することができるがんの非限定的な例としては、がん腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。かかる癌のより具体的な例には、扁平細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（消化管癌を含む）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、黒色腫，非黒色腫皮膚癌（扁平上皮および基底細胞癌）、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、および種々の型の頭頚部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；多発性骨髄腫、ならびに移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）が含まれる。
【０２２０】
ＷＯ２０１６／１３４３３３の実施例に示されるように、ＰＶＲＩＧは、種々の起源のいくつかの異なる腫瘍において、過剰発現し、かつ／または腫瘍リンパ球浸潤と相関する（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＰＤ−１発現との相関によって示される）ため、任意のがんの治療に有用であり、これらのがんには、前立腺癌、肝臓癌（ＨＣＣ）、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮頚癌、頭頚部癌、甲状腺癌、精巣癌、尿路上皮癌、肺癌、黒色腫、非黒色腫皮膚癌（扁平および基底細胞癌）、神経膠腫、腎臓癌（ＲＣＣ）、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）およびホジキンリンパ腫（ＨＤ））、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、精巣胚細胞腫瘍、中皮腫、および食道癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２１】
特に、ＣＨＡ．７．５１８．１Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、前立腺癌、肝臓癌（ＨＣＣ）、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮頚癌、頭頚部癌、甲状腺癌、精巣癌、尿路上皮癌、肺癌、黒色腫、非黒色腫皮膚癌（扁平上皮および基底細胞癌）、神経膠腫、腎臓癌（ＲＣＣ）、リンパ腫（ＮＨＬまたはＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、精巣胚細胞腫瘍、中皮腫、膀胱癌および食道癌の治療に有用である。
【０２２２】
特に、ＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、前立腺癌、肝臓癌（ＨＣＣ）、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮頚癌、頭頚部癌、甲状腺癌、精巣癌、尿路上皮癌、肺癌、黒色腫、非黒色腫皮膚癌（扁平上皮および基底細胞癌）、神経膠腫、腎臓癌（ＲＣＣ）、リンパ腫（ＮＨＬまたはＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、精巣胚細胞腫瘍、中皮腫、膀胱癌および食道癌の治療に有用である。
【０２２３】
特に、ＣＰＡ．９．０８６Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、前立腺癌、肝臓癌（ＨＣＣ）、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮頚癌、頭頚部癌、甲状腺癌、精巣癌、尿路上皮癌、肺癌、黒色腫、非黒色腫皮膚癌（扁平上皮および基底細胞癌）、神経膠腫、腎臓癌（ＲＣＣ）、リンパ腫（ＮＨＬまたはＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、精巣胚細胞腫瘍、中皮腫、膀胱癌および食道癌の治療に有用である。
【０２２４】
特に、ＣＰＡ．９．０８３Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、前立腺癌、肝臓癌（ＨＣＣ）、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮頚癌、頭頚部癌、甲状腺癌、精巣癌、尿路上皮癌、肺癌、黒色腫、非黒色腫皮膚癌（扁平上皮および基底細胞癌）、神経膠腫、腎臓癌（ＲＣＣ）、リンパ腫（ＮＨＬまたはＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、精巣胚細胞腫瘍、中皮腫、膀胱癌および食道癌の治療に有用である。
【０２２５】
特に、ＣＨＡ．９．５４７．７．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、前立腺癌、肝臓癌（ＨＣＣ）、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮頚癌、頭頚部癌、甲状腺癌、精巣癌、尿路上皮癌、肺癌、黒色腫、非黒色腫皮膚癌（扁平上皮および基底細胞癌）、神経膠腫、腎臓癌（ＲＣＣ）、リンパ腫（ＮＨＬまたはＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、精巣胚細胞腫瘍、中皮腫、膀胱癌および食道癌の治療に有用である。
【０２２６】
特に、ＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、前立腺癌、肝臓癌（ＨＣＣ）、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮頚癌、頭頚部癌、甲状腺癌、精巣癌、尿路上皮癌、肺癌、黒色腫、非黒色腫皮膚癌（扁平上皮および基底細胞癌）、神経膠腫、腎臓癌（ＲＣＣ）、リンパ腫（ＮＨＬまたはＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、精巣胚細胞腫瘍、中皮腫、膀胱癌および食道癌の治療に有用である。
【０２２７】
Ｃ．ＴＩＧＩＴ抗体単剤療法
本発明のＴＩＧＩＴ抗体は、単剤療法として癌の治療に特に有用である。免疫腫瘍学的作用機序の性質に起因して、ＴＩＧＩＴは、必ずしも特定のがんの種類上で過剰発現されるか、またはそれと相関する必要はなく、これはつまり、目標は、抗ＴＩＧＩＴ抗体にＴ細胞およびＮＫ細胞活性化の抑制を解除させて、免疫系ががんを狙うようにすることである。
【０２２８】
図５３のいずれの抗ＴＩＧＩＴ抗体も、がんの治療において我々を見出すが（ｆｉｎｄ  ｕｓ）（以下に概説するＴ細胞の活性化を含む）、ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＰＡ．９．０８３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４７、およびＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）が、いくつかの実施形態で特に有用である。
【０２２９】
Ｄ．ＰＶＲＩＧ抗体単剤療法
本発明のＰＶＲＩＧ抗体は、単剤療法として癌の治療に特に有用である。免疫腫瘍学的作用機序の性質に起因して、ＴＩＧＩＴは、必ずしも特定のがんの種類上で過剰発現されるか、またはそれと相関する必要はなく、これはつまり、目標は、抗ＴＩＧＩＴ抗体にＴ細胞およびＮＫ細胞活性化の抑制を解除させて、免疫系ががんを狙うようにすることである。
【０２３０】
特に、ＣＨＡ．７．５１８．１Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、単剤療法として有用である。
【０２３１】
同様に、特に、ＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、前立腺癌、肝臓癌（ＨＣＣ）、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮頚癌、頭頚部癌、甲状腺癌、精巣癌、尿路上皮癌、肺癌、黒色腫、非黒色腫皮膚癌（扁平上皮および基底細胞癌）、神経膠腫、腎臓癌（ＲＣＣ）、リンパ腫（ＮＨＬまたはＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、精巣胚細胞腫瘍、中皮腫、膀胱癌および食道癌の治療に、単剤療法として有用である。
【０２３２】
Ｅ．併用療法
当該技術分野で知られているように、疾患状態に特異的な、免疫療法標的を標的化する治療用抗体および追加の治療薬を含む併用療法は、極めて有望である。例えば、免疫療法の分野では、化学療法剤（小分子薬または抗腫瘍抗体のいずれか）を使用する、または免疫腫瘍学的抗体と共にした、いくつかの有望な併用療法が存在する。
【０２３３】
「と組み合わせて」および「共投与」という用語は、厳密に同じ時間での該予防剤または治療剤の投与に限定されない。その代わり、これらの用語は、抗体および他の薬剤（単数または複数）が、それらが共に作用して、本発明の抗体または他の薬剤（単数または複数）のいずれかのみによる治療と比較して増加した利益を提供するように、順次にかつある時間間隔内で投与されることを意味する。抗体および他の薬剤（単数または複数）は相加的に作用することが好ましく、またそれらは相乗的に作用することが特に好ましい。かかる分子は、意図する目的に有効な量で組み合わせて存在するのが好適である。熟練した医師であれば、経験的に、または薬剤の薬物動態および作用様式を考慮することによって、各治療剤の適切な用量（単数または複数）、ならびに投与の適切なタイミングおよび方法を決定することができる。
【０２３４】
したがって、本発明の抗体は、１つ以上の他の治療レジメンまたは薬剤と同時に投与することができる。追加の治療レジメンまたは薬剤を使用して、抗体の効能または安全性を改善し得る。また、追加の治療レジメンまたは薬剤を使用して、抗体の作用を改変するのではなく、その疾患または併存疾患を治療してもよい。例えば、本発明の抗体は、化学療法、放射線療法、または化学療法と放射線療法の両方と共に患者に投与してもよい。
【０２３５】
１．化学療法小分子と共にしたＴＩＧＩＴ抗体
【０２３６】
本発明のＴＩＧＩＴ抗体は、細胞傷害剤、化学療法剤、サイトカイン、成長抑制剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、抗血管新生剤、心臓保護剤、免疫刺激剤、免疫抑制剤、血液細胞の増殖を促進する薬剤、血管新生抑制剤、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）抑制剤、または他の治療薬を含むがこれらに限定されない、１つ以上の他の予防または治療薬と組み合わせて投与してもよい。
【０２３７】
この関連において、「化学療法剤」は、がんの治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパおよびシクロホスファミド等のアルキル化剤、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン等のアルキルスルホネート、ベンゾドパ、カルボコン、メトレドパ、およびウレドパ等のアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロールメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ’）；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルチカイン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリースタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード等の窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン等のニトロソ尿素；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマＩおよびカリケアマイシンオメガＩ（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照されたい）；ジネミシンＡを含むジネミシン；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−リボフラノシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣ等のマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン等の抗生物質；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル���５−ＦＵ）等の代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート等の葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン等のプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン等のピリミジン類似体；カロ試験ロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、試験ラクトン等のアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン等の抗副腎剤；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）等の葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキサート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン；エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシンおよびアンサマイトシン等のマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ．ＲＴＭ．多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクノン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、（ＴＡＸＯＬ（登録商標）；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）、パクリタキセルのクレモフォールフリーアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌ．）、およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）；Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲＭ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチン等のプラチナ類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸等のレチ���イド；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ならびに上記の２つ以上の組み合わせ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の略語であるＣＨＯＰ；シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の略語であるＣＶＰ、；オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））と５−ＦＵおよびロイコボリンを併用した治療レジメンの略語であるＦＯＬＦＯＸが挙げられる。
【０２３８】
少なくともいくつかの実施形態によれば、抗ＴＩＧＩＴ免疫分子は、当該技術分野で既知の標準治療としてのがん治療のいずれかと併用され得る（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃａｎｃｅｒｔｏｐｉｃｓに見出すことができる通り）。
【０２３９】
したがって、場合によっては、本明細書に概説される抗ＰＶＲＩＧ抗体（特にＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）またはＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）を含む）を化学療法剤と組み合わせることができる。同様に、本明細書に概説される抗ＴＩＧＩＴ抗体（特にＰＡ．９．０８６Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＰＡ．９．０８３Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）を含む）を化学療法剤と組み合わせることができる。
【０２４０】
さらに、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体および抗ＴＩＧＩＴ抗体は、他のチェックポイント阻害剤または活性化剤と共に投与することもできる。
【０２４１】
２．ＴＩＧＩＴおよびチェックポイント抗体の併用療法
本明細書に示すように、本発明のＴＩＧＩＴ抗体は、いくつかのチェックポイント受容体抗体のうちの１つと組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、患者の腫瘍が受容体の発現について評価され、次いで結果が、ＰＶＲＩＧおよびＰＤ−１、ＴＩＧＩＴおよびＰＤ−１またはＴＩＧＩＴおよびＰＶＲＩＧのうちのどの抗体を投与するかについて臨床医に知らせるために使用され得る。これらのアッセイを以下に記載する。
【０２４２】
ａ．抗ＰＤ−１抗体と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴ抗体
一実施形態では、本発明は、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＰＤ−１抗体との組み合わせを提供する。
【０２４３】
一実施形態では、がんを有する患者からの腫瘍から生検を採取し、ＦＡＣＳ分析のために当該技術分野で知られているように解離させる。細胞は、（１）ＴＩＧＩＴ（例えば、本明細書に記載される任意のもの、またはＭＢＳＡ４３等の当該技術分野における他のものを使用して）、（２）ＰＤ−１（例えば、ＥＨ１２．２Ｈ７、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）等を含む当該技術分野で既知のものを使用して）、（３）ＰＤ−Ｌ１（例えば、本明細書に概説されるＢＭ−１等の当該技術分野で既知のものを使用して）および（４）ＰＶＲ（例えば、ＳＫＩＩ．４等の当該技術分野で既知のものを使用して）に対する標識抗体、ならびに（５）アイソタイプ対照抗体で染色される。ＦＡＣＳが行われ、各受容体について、対照抗体と比べた受容体を発現する細胞のパーセンテージが算出される。ＴＩＧＩＴ、ＰＤ−１、ＰＤ−１およびＰＶＲについての陽性細胞のパーセンテージが全ての４つの受容体について＞１％である場合、患者は本明細書に概説されるようにＴＩＧＩＴおよびＰＤ−１に対する抗体で治療される。
【０２４４】
したがって、本発明は、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＰＤ−１抗体との組み合わせを提供する。２つの承認された抗ＰＤ−１抗体、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））およびニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））ならびに開発中のさらに多くのものがあり、これらは本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体と併用され得る。
【０２４５】
したがって、本発明は、以下の特定の組み合わせを提供する：ＣＰＡ．９．０８３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）（図５３Ｂに示される）とペンブロリズマブ、図５３Ｂに示されるＣＰＡ．９．０８３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とニボルマブ、図５３Ａに示されるＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とペンブロリズマブ、図５３Ａに示されるＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とニボルマブ、ＣＨＡ．９．５４７．７Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とペンブロリズマブ、ＣＨＡ．９．５４７．７Ｈ４（Ｓ２４１Ｐとニボルマブ、ＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とペンブロリズマブ、およびＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とニボルマブ。（配列表を参照する）。
【０２４６】
ｂ．抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴ抗体
別の実施形態では、本発明は、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体との組み合わせを提供する。２つの承認された抗ＣＴＬＡ−４抗体、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））、およびトレメリムマブ、ならびに開発中の他のものがあり、これらは本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体と併用され得る。
【０２４７】
したがって、本発明は、以下の特定の組み合わせを提供する：ＣＰＡ．９．０８３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とイピリムマブ、ＣＰＡ．９．０８３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とトレメリムマブ、ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とイピリムマブ、ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とトレメリムマブ、ＣＨＡ．９．５４７．７Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とイピリムマブ、ＣＨＡ．９．５４７．７Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とトレメリムマブ、ＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とイピリムマブ、およびＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とトレメリムマブ。
【０２４８】
ｃ．抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴ抗体
別の実施形態では、本発明は、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせを提供する。３つの承認された抗ＰＤ−Ｌ１抗体、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標））、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標）、およびデュルバルマブ（ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標）、ならびに開発中の他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体があり、これらは本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体と併用され得る。
【０２４９】
したがって、本発明は、以下の特定の組み合わせを提供する：ＣＰＡ．９．０８３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とアテゾリズマブ、ＣＰＡ．９．０８３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とアベルマブ、ＣＰＡ．９．０８３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とデュルバルマブ、ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とアテゾリズマブ、ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とアベルマブ、ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とデュルバルマブ、ＣＨＡ．９．５４７．７Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とアテゾリズマブ、ＣＨＡ．９．５４７．７Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とアベルマブ、ＣＨＡ．９．５４７．７Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とデュルバルマブ、ＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とアテゾリズマブ、ＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とアベルマブ、ＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とデュルバルマブ。
【０２５０】
ｄ．抗ＬＡＧ−３抗体と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴ抗体
別の実施形態では、本発明は、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＬＡＧ−３抗体との組み合わせを提供する。いくつかの抗ＬＡＧ−３抗体が開発中であり、これにはＢＭＳ−９８６０１６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＷＯ２００１０／０１９５７０Ａ２号を参照されたい）、ＧＳＫ２８３１７８１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１６／００１７０３７Ａ号）、およびＭｅｒｃｋクローン２２Ｄ２、１１Ｃ９、４Ａ１０、および／または１９Ｅ８（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０２８６７２Ａ１を参照されたい）およびＧＳＫ２８３１７８１、ならびに開発中の他のものがあり、これらは本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体と併用され得る。
【０２５１】
したがって、本発明は、以下の特定の組み合わせを提供する：ＣＰＡ．９．０８３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＢＭＳ−９８６０１６、ＣＰＡ．９．０８３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＧＳＫ２８３１７８１、ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＢＭＳ−９８６０１６、ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＧＳＫ２８３１７８１、ＣＨＡ．９．５４７．７Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＢＭＳ−９８６０１６、ＣＨＡ．９．５４７．７Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＧＳＫ２８３１７８１、ＣＨＳ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＢＭＳ−９８６０１６、およびＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＧＳＫ２８３１７８１。
【０２５２】
したがって、本発明は、以下の特定の組み合わせを提供する：ＣＰＡ．９．０８３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＭｅｒｃｋクローン２２Ｄ２、１１Ｃ９、および／または４Ａ１０、ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＭｅｒｃｋクローン２２Ｄ２、１１Ｃ９、および／または４Ａ１０、ＣＨＡ．９．５４７．７Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＭｅｒｃｋクローン２２Ｄ２、１１Ｃ９、および／または４Ａ１０、ＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＭｅｒｃｋクローン２２Ｄ２、１１Ｃ９、および／または４Ａ１０。
【０２５３】
ｅ．抗ＴＩＭ−３抗体と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴ抗体
別の実施形態では、本発明は、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＬＡＧ−３抗体との組み合わせを提供する。少なくとも１つの抗ＴＩＭ−３抗体、ＴＳＲ−０２２、ならびに開発中の他のものがあり、これらは本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体と併用され得る。
【０２５４】
したがって、本発明は、以下の特定の組み合わせを提供する：ＣＰＡ．９．０８３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＴＳＲ−０２２、ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１ＰとＴＳＲ−０２２６、ＣＨＡ．９．５４７．７Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＴＳＲ−０２２、およびＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＴＳＲ−０２２。
【０２５５】
ｆ．抗ＢＴＬＡ抗体と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴ抗体
別の実施形態では、本発明は、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＢＴＬＡ抗体との組み合わせを提供し、参照によりその全体が、特にその中に開示される抗ＢＴＬＡ抗体のＣＤＲおよび全長配列に関して本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／０１４４３８を参照されたい。したがって、本発明は、以下の特定の組み合わせを提供する：ＣＰＡ．９．０８３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と抗ＢＴＬＡ抗体、ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と抗ＢＴＬＡ抗体、ＣＨＡ．９．５４７．７Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と抗ＢＴＬＡ抗体、およびＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐと抗ＢＴＬＡ抗体。
【０２５６】
ｇ．抗腫瘍抗体とのＴＩＧＩＴ抗体
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、一般に免疫系に作用して患者の自然免疫応答を増加させる免疫腫瘍／チェックポイント阻害剤とは異なり、代わりに特異的な腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に指向される抗体と共投与される。本発明のＴＩＧＩＴ抗体と組み合わせることができる、承認されたまたは開発中のいずれかの多数の抗ＴＴＡ抗体が存在する。現在承認されている抗体には、セツキシマブ、パニツムマブ、ニノツズマブ（全てＥＧＦＲに対する）、リツキシマブ（ＣＤ２０）、トラスツズマブおよびペルツズマブ（ＨＥＲ２）、アレムツズマブ（ＣＤ５２）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ）、オファツムマブ（ＣＤ２０）、デノスマブ（ＲＡＮＫリガンド）、ブレンツキシマブ（ＣＤ３０）、ダラツムマブ（ＣＤ３８）、イブリツモマブ（ＣＤ２０）およびイピリムマブ（ＣＴＬＡ−４）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書の抗ＴＩＧＩＴ抗体と組み合わせることができる、臨床試験における特異的な標的腫瘍抗体には、イピリムマブ、トレメリムマブ等の抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ；ニボルマブＢＭＳ−９３６５５８／ＭＤＸ−１１０６／ＯＮＯ−４５３８、ＡＭＰ２２４、ＣＴ−０１１、ＭＫ−３４７５等の抗ＰＤ−１、ＢＭＳ−９３６５５９／ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６、ＲＧ−７４４６／ＭＰＤＬ３２８０Ａ等の抗ＰＤＬ−１アンタゴニスト；ＩＭＰ−３２１等の抗ＬＡＧ−３）、抗ＴＩＭ−３、抗ＢＴＬＡ、抗Ｂ７−Ｈ４、抗Ｂ７−Ｈ３、抗ＶＩＳＴＡ；ＣＰ−８７０、８９３、ルカツムマブ、ダセツズマブ等の抗ＣＤ４０  ｍＡｂを含む、免疫刺激タンパク質を標的とするアゴニスト抗体；ＢＭＳ−６６３５１３ウレルマブ（抗４−１ＢＢ、例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２８８，６３８号および同第８，９６２，８０４号を参照されたい）等の抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ；ＰＦ−０５０８２５６６ウトミルマブ（例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，８２１，８６７号、同第８，３３７，８５０号、および同第９，４６８，６７８号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２００２／３２４３３号を参照されたい）；抗ＯＸ４０等の抗ＯＸ４０  ｍＡｂ（例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００６／０２９８７９またはＷＯ２０１００９６４１８を参照されたい）；ＴＲＸ５１８（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，８１２，１３５号を参照されたい）等の抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ；バルリルマブＣＤＸ−１１２７（例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／１４５０８５および米国特許公開第ＵＳ２０１１／０２７４６８５号および同第ＵＳ２０１２／０２１３７７１号を参照されたい）等の抗ＣＤ２７  ｍＡｂ、抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂ（例えば、ＭＥＤＩ−５７０、ＪＴＸ−２０１１、および抗ＴＩＭ３抗体（例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／００６４９０または米国特許出願公開第ＵＳ２００６／２５５７７５８号を参照されたい）、ならびに前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、黒色腫、リンパ腫、小細胞肺癌を含む肺癌、腎臓癌、結���直腸癌、膵臓癌、胃癌、脳癌に対するモノクローナル抗体（一般にｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖを参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５７】
３．ＰＶＲＩＧおよびＰＤ−１併用療法
本明細書に示すように、本発明のＰＶＲＩＧ抗体は、いくつかのチェックポイント受容体抗体のうちの１つと組み合わせることができる。
【０２５８】
ａ．抗ＰＤ−１抗体と組み合わせた抗ＰＶＲＩＧ抗体
別の実施形態では、本発明は、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体と抗ＰＤ−１抗体との組み合わせを提供する。
【０２５９】
一実施形態では、がんを有する患者からの腫瘍から生検を採取し、ＦＡＣＳ分析のための当該技術分野で知られているように解離させる。細胞は、（１）ＰＶＲＩＧ（一般にＣＨＡ．７．５１８．１Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）を使用するが、例えば、ＷＯ２０１６／１３４３３３（遮断しないとしても、結合する任意のものを具体的に含む）またはＷＯ２０１７／０４１００４に概説される任意のものが使用され得る）、（２）ＰＤ−１（例えば、ＥＨ１２．２Ｈ７、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）等を含む当該技術分野で既知のものを使用して）、（３）ＰＤ−Ｌ１（例えば、本明細書に概説されるＢＭ−１等の当該技術分野で既知のものを使用して）および（４）ＰＶＲＬ２（例えば、ＴＸ１１等の当該技術分野で既知のものを使用して）に対する標識抗体、ならびに（５）アイソタイプ対照抗体で染色される。ＦＡＣＳが行われ、各受容体について、対照抗体と比べた受容体を発現する細胞のパーセンテージが算出される。ＰＶＲＩＧ、ＰＤ−１、ＰＤ−１およびＰＶＲＬ２についての陽性細胞のパーセンテージが全ての４つの受容体について＞１％である場合、患者は本明細書に概説されるようにＰＶＲＩＧおよびＰＤ−１に対する抗体で治療される。
【０２６０】
２つの承認された抗ＰＤ−１抗体、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））およびニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））ならびに開発中のさらに多くのものがあり、これらは本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体と併用され得る。
【０２６１】
したがって、本発明は、以下の特定の組み合わせを提供する：ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）（図３に示される）とペンブロリズマブ、図３に示されるＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とニボルマブ、図３に示されるＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とペンブロリズマブ、およびに示されるＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とニボルマブ。
【０２６２】
ｂ．抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせた抗ＰＶＲＩＧ抗体
別の実施形態では、本発明は、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体との組み合わせを提供する。２つの承認された抗ＣＴＬＡ−４抗体、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））、およびトレメリムマブ、ならびに開発中の他のものがあり、これらは本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体と併用され得る。
【０２６３】
したがって、本発明は、以下の特定の組み合わせを提供する：ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とイピリムマブ、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とトレメリムマブ、ＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とイピリムマブおよびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とトレメリムマブ。
【０２６４】
ｃ．抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせた抗ＰＶＲＩＧ抗体
別の実施形態では、本発明は、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体と抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせを提供する。アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標））、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標））、およびデュルバルマブ、ならびに開発中の他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体があり、これらは本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体と併用され得る。
【０２６５】
したがって、本発明は、以下の特定の組み合わせを提供する：ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とアテゾリズマブ、ＣＰＡ．７５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とアベルマブ、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とデュルバルマブ、ＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とアテゾリズマブ、ＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とアベルマブ、およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とデュルバルマブ。
【０２６６】
ｄ．抗ＬＡＧ−３抗体と組み合わせた抗ＰＶＲＩＧ抗体
別の実施形態では、本発明は、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体と抗ＬＡＧ−３抗体との組み合わせを提供する。いくつかの抗ＬＡＧ−３抗体が開発中であり、これにはＢＭＳ−９８６０１６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＷＯ２００１０／０１９５７０Ａ２号を参照されたい）、ＧＳＫ２８３１７８１（米国特許出願第２０１６／００１７０３７Ａ号）、およびＭｅｒｃｋクローン２２Ｄ２、１１Ｃ９、４Ａ１０、および／または１９Ｅ８（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０２８６７２Ａ１を参照されたい）およびＧＳＫ２８３１７８１、ならびに開発中の他のものがあり、これらは本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体と併用され得る。
【０２６７】
したがって、本発明は、以下の特定の組み合わせを提供する：ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＢＭＳ−９８６０１６、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＧＳＫ２８３１７８１、ＣＨＳ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＢＭＳ−９８６０１６およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＧＳＫ２８３１７８１。
【０２６８】
したがって、本発明はまた、以下の特定の組み合わせを提供する：ＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＭｅｒｃｋクローン２２Ｄ２、１１Ｃ９、および／または４Ａ１０、ならびにＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＭｅｒｃｋクローン２２Ｄ２、１１Ｃ９、および／または４Ａ１０。
【０２６９】
ｅ．抗ＴＩＭ−３抗体と組み合わせた抗ＰＶＲＩＧ抗体
別の実施形態では、本発明は、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体と抗ＴＩＭ−３抗体との組み合わせを提供する。少なくとも１つの抗ＴＩＭ−３抗体、ＴＳＲ−０２２、ならびに開発中の他のものがあり、これらは本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体と併用され得る。
【０２７０】
したがって、本発明は、以下の特定の組み合わせを提供する：ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＴＳＲ−０２２およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）とＴＳＲ−０２２６。
【０２７１】
ｆ．抗ＢＴＬＡ抗体と組み合わせた抗ＰＶＲＩＧ抗体
別の実施形態では、本発明は、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体と抗ＢＴＬＡ抗体との組み合わせを提供し、参照によりその全体が、特にその中に開示される抗ＢＴＬＡ抗体のＣＤＲおよび全長配列に関して本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／０１４４３８を参照されたい。したがって、本発明は、以下の特定の組み合わせを提供する：ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と抗ＢＴＬＡ抗体およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と抗ＢＴＬＡ抗体。
【０２７２】
ｇ．抗腫瘍抗体とのＰＶＲＩＧ抗体
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体は、一般に免疫系に作用して患者の自然免疫応答を増加させる免疫腫瘍／チェックポイント阻害剤とは異なり、代わりに特異的な腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に指向される抗体と共投与される。ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）を含む本発明のＰＶＲＩＧ抗体と組み合わせることができる、承認されたまたは開発中のいずれかの多数の抗ＴＴＡ抗体が存在する。現在承認されている抗体には、セツキシマブ、パニツムマブ、ニノツズマブ（全てＥＧＦＲに対する）、リツキシマブ（ＣＤ２０）、トラスツズマブおよびペルツズマブ（ＨＥＲ２）、アレムツズマブ（ＣＤ５２）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ）、オファツムマブ（ＣＤ２０）、デノスマブ（ＲＡＮＫリガンド）、ブレンツキシマブ（ＣＤ３０）、ダラツムマブ（ＣＤ３８）、イブリツモマブ（ＣＤ２０）およびイピリムマブ（ＣＴＬＡ−４）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書の抗ＰＶＲＩＧ抗体と組み合わせることができる、臨床試験における特異的な標的腫瘍抗体には、イピリムマブ、トレメリムマブ等の抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ；ニボルマブＢＭＳ−９３６５５８／ＭＤＸ−１１０６／ＯＮＯ−４５３８、ＡＭＰ２２４、ＣＴ−０１１、ＭＫ−３４７５等の抗ＰＤ−１、ＢＭＳ−９３６５５９／ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６、ＲＧ−７４４６／ＭＰＤＬ３２８０Ａ等の抗ＰＤＬ−１アンタゴニスト；ＩＭＰ−３２１等の抗ＬＡＧ−３）、抗ＴＩＭ−３、抗ＢＴＬＡ、抗Ｂ７−Ｈ４、抗Ｂ７−Ｈ３、抗ＶＩＳＴＡ；ＣＰ−８７０、８９３、ルカツムマブ、ダセツズマブ等の抗ＣＤ４０  ｍＡｂを含む、免疫刺激タンパク質を標的とするアゴニスト抗体；ＢＭＳ−６６３５１３ウレルマブ（抗４−１ＢＢ、例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２８８，６３８号および同第８，９６２，８０４号を参照されたい）等の抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ；ＰＦ−０５０８２５６６ウトミルマブ（例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，８２１，８６７号、同第８，３３７，８５０号、および同第９，４６８，６７８号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２００２／３２４３３号を参照されたい）；抗ＯＸ４０等の抗ＯＸ４０  ｍＡｂ（例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００６／０２９８７９またはＷＯ２０１００９６４１８を参照されたい）；ＴＲＸ５１８（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，８１２，１３５号を参照されたい）等の抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ；バルリルマブＣＤＸ−１１２７（例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／１４５０８５および米国特許公開第ＵＳ２０１１／０２７４６８５号および同第ＵＳ２０１２／０２１３７７１号を参照されたい）等の抗ＣＤ２７  ｍＡｂ、抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂ（例えば、ＭＥＤＩ−５７０、ＪＴＸ−２０１１、および抗ＴＩＭ３抗体（例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／００６４９０または米国特許出願公開第ＵＳ２００６／２５５７７５８号を参照されたい）、ならびに���立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、黒色腫、リンパ腫、小細胞肺癌を含む肺癌、腎臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、脳癌に対するモノクローナル抗体（一般にｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖを参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７３】
４．ＰＶＲＩＧおよびＴＩＧＩＴの併用療法
特定の実施形態で有用な抗ＴＩＧＩＴ抗体および抗ＰＶＲＩＧ抗体の特定の組み合わせが存在する。
【０２７４】
一実施形態では、がんを有する患者からの腫瘍から生検を採取し、ＦＡＣＳ分析のための当該技術分野で知られているように解離させる。細胞は、（１）ＰＶＲＩＧ（一般にＣＨＡ．７．５１８．１Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）を使用するが、例えば、ＷＯ２０１６／１３４３３３（遮断しないとしても、結合する任意のものを具体的に含む）またはＷＯ２０１７／０４１００４に概説される任意のものが使用され得る）、（２）ＴＩＧＩＴ（例えば、本明細書に記載の任意のもの、またはＭＢＳＡ４３等の当該技術分野における他のもの）、（３）ＰＶＲ（例えば、ＳＫＩＩ．４等の当該技術分野で既知のものを使用して）および（４）ＰＶＲＬ２（例えば、ＴＸ１１等の当該技術分野で既知のものを使用して）に対する標識抗体、ならびに（５）アイソタイプ対照抗体で染色される。ＦＡＣＳが行われ、各受容体について、対照抗体と比べた受容体を発現する細胞のパーセンテージが算出される。ＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲおよびＰＶＲＬ２についての陽性細胞のパーセンテージが全ての４つの受容体について＞１％である場合、患者は本明細書に概説されるようにＰＶＲＩＧおよびＴＩＧＩＴに対する抗体で治療される。この点に関し好ましい組み合わせは、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＰＡ．９．０８６である。
【０２７５】
一実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＣＰＡ．９．０８６由来のＣＤＲ組を含む抗体が、抗ＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ．７．５１８．１由来のＣＤＲ組を含む抗体と組み合わされる。特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＣＰＡ．９．０８６由来のＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体が、抗ＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ．７．５１８．１由来のＶＨおよびＶＬを含む抗体と組み合わされる。一実施形態では、図５３に示されるＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）が、図３に示されるＣＨＡ．７．５１８．１Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と組み合わされる。
【０２７６】
一実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＣＰＡ．９．０８３由来のＣＤＲ組を含む抗体が、抗ＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ．７．５１８．１由来のＣＤＲ組を含む抗体と組み合わされる。特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＣＰＡ．９．０８３由来のＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体が、抗ＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ．７．５１８．１由来のＶＨおよびＶＬを含む抗体と組み合わされる。一実施形態では、ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）がＣＨＡ．７．５１８．１Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と組み合わされる。
【０２７７】
一実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＣＰＡ．９．０８６由来のＣＤＲ組を含む抗体が、抗ＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）由来のＣＤＲ組を含む抗体と組み合わされる。特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＣＰＡ．９．０８６由来のＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体が、抗ＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）由来のＶＨおよびＶＬを含む抗体と組み合わされる。一実施形態では、ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）がＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と組み合わされる。
【０２７８】
一実施形態では、ＣＨＡ．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）が、（ＵＳＳＮ６２／５１３，９１６の図４に列挙された全ての抗体を参照して）配列表に列挙される抗ＴＩＧＩＴ抗体、具体的にはＣＰＡ．９．０１８、ＣＰＡ９．０２７、ＣＰＡ．９．０４９、ＣＰＡ．９．０５７、ＣＰＡ．９．０５９、ＣＰＡ．９．０８３、ＣＰＡ．９．０８６、ＣＰＡ．９．０８９、ＣＰＡ．９．０９３、ＣＰＡ．９．１０１、ＣＰＡ．９．１０３、ＣＨＡ．９．５３６．１、ＣＨＡ．９．５３６．３、ＣＨＡ．９．５３６．４、ＣＨＡ．９．５３６．５、ＣＨＡ．９．５３６．６、ＣＨＡ．９．５３６．７、ＣＨＡ．９．５３６．８、ＣＨＡ．９．５６０．１、ＣＨＡ．９．５６０．３、ＣＨＡ．９．５６０．４、ＣＨＡ９．５６０．５、ＣＨＡ．９．５６０．６、ＣＨＡ．９．５６０．７、ＣＨＡ．９．５６０．８、ＣＨＡ．９．５４６．１、ＣＨＡ．９．５４６．１、ＣＨＡ．９．５４７．２、ＣＨＡ．９．５４７．３、ＣＨＡ．９．５４７．４、ＣＨＡ．９．５４７．６、ＣＨＡ．９．５４７．７、ＣＨＡ．９．５４７．８、ＣＨＡ．９．５４７．９、ＣＨＡ．９．５４７．１３、ＣＨＡ．９．５４１．１、ＣＨＡ．９．５４１．３．ＣＨＡ．９．５４１．４．ＣＨＡ．９．５４１．５、ＣＨＡ．９．５４１．６．ＣＨＡ．９．５４１．７およびＣＨＡ．９．５４１．８と組み合わされる。
【０２７９】
一実施形態では、ＣＰＡ．９．０８６は、ＷＯ２０１７／０４１００４に概説される抗ＰＶＲＩＧ抗体を組み合わされ、これには、ａ）ＨＣ配列（配列番号５）およびＬＣ配列（配列番号３）（またはその中に含まれるＣＤＲ組）、ｂ）ＨＣ配列（配列番号３２）およびＬＣ配列（配列番号３３）（またはその中に含まれるＣＤＲ組）、ならびにｃ）ＨＣ配列（配列番号３２）およびＬＣ配列（配列番号４０）（またはその中に含まれるＣＤＲ組）を有するものが含まれるが、これらに限定されない。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、この組み合わせは、ＣＰＡ．９．０８６、ＣＰＡ．９．０８３、ＣＨＡ．９．５４７．７、およびＣＨＡ．９．５４７．１３からなる群から選択される抗ＴＩＧＩＴ抗体を含み、ＰＶＲＩＧ抗体は、ＣＨＡ７．５１８．１およびＣＨＡ．７．５３８．１．２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、この組み合わせは、ＣＰＡ．９．０８６、ＣＰＡ．９．０８３、ＣＨＡ．９．５４７．７およびＣＨＡ．９．５４７．１３からなる群から選択される抗ＴＩＧＩＴ抗体を含み、ＰＶＲＩＧ抗体はＣＨＡ７．５１８．１である。いくつかの実施形態では、この組み合わせは、ＣＰＡ．９．０８６、ＣＰＡ．９．０８３、ＣＨＡ．９．５４７．７、およびＣＨＡ．９．５４７．１３からなる群から選択される抗ＴＩＧＩＴ抗体を含み、ＰＶＲＩＧ抗体はＣＨＡ７．５３８．１．２である。いくつかの実施形態では、この組み合わせは、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＣＰＡ．９．０８６およびＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ７．５１８．１を含む。いくつかの実施形態では、この組み合わせは、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＣＰＡ．９．０８３およびＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ７．５１８．１を含む。いくつかの実施形態では、この組み合わせは、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＣＨＡ．９．５４７．７およびＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ７．５１８を含む。いくつかの実施形態では、この組み合わせは、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＣＨＡ．９．５４７．１３およびＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ７．５１８．１を含む。いくつかの実施形態では、この組み合わせは、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＣＰＡ．９．０８６およびＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ７．５３８．１．２を含む。いくつかの実施形態では、この組み合わせは、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＣＰＡ．９．０８３およびＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ７．５３８．１．２を含む。いくつかの実施形態では、この組み合わせは、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＣＨＡ．９．５４７．７およびＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ７．５３８．１．２を含む。いくつかの実施形態では、この組み合わせは、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＣＨＡ．９．５４７．１３およびＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ７．５３８．１．２を含む。
【０２８１】
図２０〜２４は、２０１６年９月２７日に出願された米国特許出願第１５／２７７，９７８号に開示されるＰＶＲＩＧ抗体を提供する。本発明のＴＩＧＩＴ抗体は、これらの図に開示されているＰＶＲＩＧ抗体ならびに本出願全体を通して開示されているものと併用することができる。
【０２８２】
５．治療の評価
一般に、本発明の抗体は、単独でまたは組み合せて（ＰＶＲＩＧとＰＤ−１、ＴＩＧＩＴとＰＤ−１またはＴＩＧＩＴとＰＶＲＩＧ）、がんを有する患者に投与され、有効性が、本明細書に記載のいくつかの方法で評価される。このため、がん量、腫瘍のサイズ、転移の存在または程度の評価等の、有効性の標準的なアッセイを実行し得るが、免疫腫瘍学的治療もまた免疫状態評価に基づいて評価され得る。これは、インビトロアッセイおよびインビボアッセイの両方を含むいくつかの方法で行うことができる。例えば、腫瘍量、サイズ、侵襲性、ＬＮ関与、転移等といった「古典的な」測定と併せて、免疫状態（例えば、ｉｐｉ治療後のＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在）の変化の評価を行うことができる。このため、以下のいずれかまたは全てを評価することができる：ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化もしくは増殖、ＣＤ８＋Ｔ（ＣＴＬ）細胞活性化もしくは増殖、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性細胞傷害性活性および／もしくはＣＴＬ媒介性細胞枯渇、ＮＫ細胞活性およびＮＫ媒介性細胞枯渇に対するＰＶＲＩＧまたはＴＩＧＩＴの抑制効果、Ｔｒｅｇ細胞分化および増殖ならびにＴｒｅｇ細胞もしくは骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）媒介性免疫抑制もしくは免疫耐性に対するＰＶＲＩＧまたはＴＩＧＩＴの増強効果、ならびに／または免疫細胞による炎症性サイトカイン産生、例えば、Ｔ細胞もしくは他の免疫細胞によるＩＬ−２、ＩＦＮ−γもしくはＴＮＦ−α産生に対するＰＶＲＩＧまたはＴＩＧＩＴの影響。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、例えば、ＣＦＳＥ希釈法、免疫エフェクター細胞のＫｉ６７細胞内染色、および３Ｈ−チミジン組み込み法を使用して、免疫細胞増殖を評価することによって行われる。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＰＤ１、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、およびＣＤ１０７Ａの表面発現によって測定される細胞脱顆粒のうちの１つ以上を含む、遺伝子発現の増加または活性化関連マーカーの増加したタンパク質レベルを評価することによって行われる。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、治療の不在下で、例えば、本発明の抗体の投与前に、Ｔ細胞増殖の量を評価することによって行われる。投与後、患者がＴ細胞増殖の増加を有する場合、例えば、患者のＴ細胞のサブセットが増殖している場合、これはＴ細胞が活性化されたことの指標である。
【０２８６】
同様に、本発明の抗体を用いた治療の評価は、治療の有効性を評価するために、投与前および投与後に患者のＩＦＮγレベルを測定することによって行うことができる。これは、数時間または数日以内に行われ得る。
【０２８７】
一般に、遺伝子発現アッセイは、当該技術分野で知られているように行われる。例えば、Ｇｏｏｄｋｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄＣｈｅｍ．Ｅｎｇ．２９（３）：５８９（２００５），Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  １１／１５／１５  ９（Ｓｕｐｐｌ．１）：２９−４６，Ｃａｍｐｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．２０１３  Ｊａｎ；２６  ｓｕｐｐｌ．１：Ｓ９７−Ｓ１１０を参照されたく、その遺伝子発現測定技法は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０２８８】
一般に、タンパク質発現測定もまた同様に、当該技術分野で知られているように行われ、例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ−Ｂａｓｅｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１３：９８４：１−１２、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ，  ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１４，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ３６１５９０，８  ｐａｇｅｓ，Ｂｅｃｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ  ２０１１  Ｊｕｎｅ  １７：７２２（２）：１７１−１８２を参照されたく、その測定技法は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる
【０２８９】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、酵素活性（プロテアーゼ活性を含む）、細胞膜透過性、細胞接着、ＡＴＰ産生、補酵素産生、およびヌクレオチド取り込み活性等の多数の細胞パラメータを推測することを通した標的細胞生存検出によって測定される細胞傷害性活性を評価することによって行われる。これらのアッセイの具体的な例としては、トリパンブルーまたはＰＩ染色、５１Ｃｒまたは３５Ｓ放出法、ＬＤＨ活性、ＭＴＴおよび／またはＷＳＴアッセイ、カルセイン−ＡＭアッセイ、発光系アッセイ、ならびに他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、サイトカイン産生によって測定されるＴ細胞活性を評価することによって行われ、周知の技法を使用して、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１０、ＩＬ１３を含むがこれらに限定されないサイトカインを使用して、培養上清液中で細胞内のいずれかで測定する。
【０２９１】
したがって、治療の評価は、以下のうちの１つ以上を評価するアッセイを使用して行うことができる：（ｉ）免疫応答を増加させる、（ｉｉ）αβおよび／またはγδ  Ｔ細胞の活性化を増加させる、（ｉｉｉ）細胞傷害性Ｔ細胞活性を増加させる、（ｉｖ）ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞活性を増加させる、（ｖ）αβおよび／またはγδ  Ｔ細胞抑制を軽減させる、（ｖｉ）炎症促進性サイトカイン分泌を増加させる、（ｖｉｉ）ＩＬ−２分泌を増加させる；（ｖｉｉｉ）インターフェロン−γ産生を増加させる、（ｉｘ）Ｔｈ１応答を増加させる、（ｘ）Ｔｈ２応答を減少させる、（ｘｉ）調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の少なくとも１つの細胞数および／または活性化を減少させるかまたは排除する。
【０２９２】
有効性を測定するためのアッセイ
【０２９３】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化は、実施例に記載のように、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを使用して評価される。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０２９４】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、異なる因子のリン酸化または脱リン酸化によって、または他の翻訳後修飾を測定することによって測定される免疫応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０２９５】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδ  Ｔ細胞の活性化の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０２９６】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばがん細胞のような標的細胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、細胞傷害性Ｔ細胞活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０２９７】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばがん細胞のような標的細胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または例えば、ＣＤ１０７ａ等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０２９８】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδ  Ｔ細胞抑制の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０２９９】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、またはＬｕｍｉｎｅｘによって、またはＭｕｌｔｉｐｌｅｘビーズ系方法によって、または細胞内染色およびＦＡＣＳ解析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔ等によって測定される炎症促進性サイトカイン分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３００】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、またはＬｕｍｉｎｅｘによって、またはＭｕｌｔｉｐｌｅｘビーズ系方法によって、または細胞内染色およびＦＡＣＳ解析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔ等によって測定されるＩＬ−２分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３０１】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、またはＬｕｍｉｎｅｘによって、またはＭｕｌｔｉｐｌｅｘビーズ系方法によって、または細胞内染色およびＦＡＣＳ解析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔ等によって測定されるインターフェロン−γ産生の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３０２】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＴｈ１応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３０３】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＴｈ２応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３０４】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定される調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の少なくとも１つの細胞数および／または活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。
【０３０５】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定されるＭ２マクロファージ細胞数の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。
【０３０６】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＭ２マクロファージ腫瘍形成促進活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。
【０３０７】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定されるＮ２好中球増加の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。
【０３０８】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＮ２好中球腫瘍形成促進活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。
【０３０９】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｔ細胞活性化の抑制の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３１０】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばがん細胞のような標的細胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、ＣＴＬ活性化の阻害の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３１１】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例として活性化マーカーの発現の変化によって測定されるαβおよび／またはγδ  Ｔ細胞枯渇の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。
【０３１２】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδ  Ｔ細胞応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３１３】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、抗原特異的メモリー応答の刺激の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３１４】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルサインＡＭ等の細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、がん細胞のアポトーシスまたは溶解の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３１５】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルサインＡＭ等の細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、がん細胞に対する細胞傷害性または細胞増殖抑制性の刺激の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３１６】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルサインＡＭ等の細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、がん細胞の直接殺傷の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３１７】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイ測定は、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＴｈ１７活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３１８】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルサインＡＭ等の細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、補体依存性細胞傷害性および／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性の誘導の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０３１９】
一実施形態では、Ｔ細胞活性化は、例えば、例えばがん細胞のような標的細胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される。Ｔ細胞については、増殖、活性化の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＰＤ１）、細胞傷害性（標的細胞を殺傷する能力）、およびサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ）の増加が、がん細胞の強化された殺傷と一貫する免疫調節を示し得る。
【０３２０】
一実施形態では、ＮＫ細胞活性化は、例えば、例えばがん細胞のような標的細胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または例えばＣＤ１０７ａ等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される。ＮＫ細胞については、増殖、細胞傷害性（標的細胞を殺傷し、ＣＤ１０７ａ、グランザイム、およびパーフォリン発現を増加させる能力）、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮγおよびＴＮＦ）、および細胞表面受容体発現（例えば、ＣＤ２５）の増加が、がん細胞の強化された殺傷と一貫する免疫調節を示し得る。
【０３２１】
一実施形態では、γδ  Ｔ細胞活性化は、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される。
【０３２２】
一実施形態では、Ｔｈ１細胞活性化は、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される。
【０３２３】
活性または応答の適切な増加（または減少、上で概説したように適切なもの）は、参照試料または対照試料のいずれか、例えば、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体を含まない試験試料におけるシグナルと比べた、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８〜９９％パーセントの増加である。活性の具体的な増加が図２７〜３４に図示される。例えば、Ｔ細胞増殖の増加に関して、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は約６０％の増加を示し、ＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は４７％の増加を示す。Ｔ細胞増殖またはＩＦＮ−γのいずれかにおいて約１０〜７０％の関連性のある増加が示され、約２０〜６０％もまた有用である。
【０３２４】
同様に、参照対象または対照試料と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍または５倍の増加が有効性を示す。
ＸＩＩ．実施形態の一覧
１．ヒトＴＩＧＩＴ（配列番号９７）に結合する抗原結合ドメインを含む組成物であって、
ａ）配列番号１６０を含む可変重鎖ドメインと、
ｂ）配列番号１６５を含む可変軽鎖ドメインと、を含む、組成物。
２．該組成物が、
ａ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖であって、前記ＶＨが配列番号１６０を含む、重鎖と、
ｂ）ＶＬ−ＶＣを含む軽鎖であって、前記ＶＬが配列番号１６５を含み、前記ＶＣがカッパまたはラムダのいずれかである、軽鎖と、を含む抗体である、請求項１に記載の組成物。
３．配列前記ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４、ならびにそのバリアントから選択される、請求項２に記載の組成物。
４．該重鎖が配列番号１６４を有し、該軽鎖が配列番号１６９を有する、請求項２または３に記載の組成物。
５．ヒトチェックポイント受容体タンパク質に結合する第２の抗体をさらに含む、請求項２〜４のいずれかに記載の組成物。
６．該第２の抗体がヒトＰＤ−１に結合する、請求項５に記載の組成物。
７．該第２の抗体がヒトＰＶＲＩＧ（配列番号２）に結合する、請求項５に記載の組成物。
８．該第２の抗体が、配列番号５を含む可変重鎖ドメインと配列番号１０を含む可変軽鎖ドメインとを含む抗原結合ドメインを含む、請求項７に記載の組成物。
９．該第２の抗体の重鎖が配列番号９を有し、該第２の抗体の軽鎖が配列番号１４を有する、請求項７に記載の組成物。
１０．
ａ）配列番号１６０を含む可変重鎖ドメインをコードする第１の核酸と、
ｂ）配列番号１６５を含む可変軽鎖ドメインをコードする第２の核酸と、を含む、核酸組成物。
１１．前記第１の核酸が、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖をコードし、前記ＶＨが配列番号１６０を含み、前記第２の核酸が、ＶＬ−ＶＣを含む軽鎖をコードし、前記ＶＬが配列番号１６５を含み、ＶＣがラムダドメインである、請求項１０に記載の核酸組成物。
１２．請求項１０または１１に記載の前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、請求項１０または１１に記載の前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターとをそれぞれ含む、発現ベクター組成物。
１３．請求項１０または１１に記載の前記第１の核酸と、請求項１０または１１に記載の前記第２の核酸とをそれぞれ含む発現ベクターを含む、発現ベクター組成物。
１４．請求項１２または１３に記載の該発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
１５．抗ＴＩＧＩＴ抗体の作製方法であって、
ａ）請求項１４に記載の前記宿主細胞を、前記抗体が発現される条件下で培養することと、
ｂ）該抗体を回収することと、を含む、方法。
１６．請求項１〜９のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、Ｔ細胞を活性化させることによる癌の治療方法。
１７．ヒトＴＩＧＩＴ（配列番号９７）に結合する抗原結合ドメインを含む組成物であって、
ａ）配列番号１５０を含む可変重鎖ドメインと、
ｂ）配列番号１５５を含む可変軽鎖ドメインと、を含む、組成物。
１８該組成物が、
ａ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖であって、前記ＶＨが配列番号１５０を含む、重鎖と、
ｂ）ＶＬ−ＶＣを含む軽鎖であって、前記ＶＬが配列番号１５９を含み、ＶＣがカッパまたはラムダのいずれかである、軽鎖と、を含む抗体である、請求項１７に記載の組成物。
１９．配列前記ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４、ならびにそのバリアントから選択される、請求項１８に記載の組成物。
２０．該重鎖が配列番号１５４を有し、該軽鎖が配列番号１５９を有する、請求項１７または１８に記載の組成物。
２１．ヒトチェックポイント受容体タンパク質に結合する第２の抗体をさらに含む、請求項１７〜２０のいずれかに記載の組成物。
２２．該第２の抗体がヒトＰＤ−１に結合する、請求項２１に記載の組成物。
２３．該第２の抗体がヒトＰＶＲＩＧ（配列番号２）に結合する、請求項２１に記載の組成物。
２４．該第２の抗体が、配列番号５を含む可変重鎖ドメインと配列番号１０を含む可変軽鎖ドメインとを含む抗原結合ドメインを含む、請求項２３に記載の組成物。
２５．該第２の抗体の重鎖が配列番号９を有し、該第２の抗体の軽鎖が配列番号１４を有する、請求項２３に記載の組成物。
２６．
ａ）配列番号１５０を含む可変重鎖ドメインをコードする第１の核酸と、
ｂ）配列番号１５５を含む可変軽鎖ドメインをコードする第２の核酸と、を含む、核酸組成物。
２７．前記第１の核酸が、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖をコードし、前記ＶＨが配列番号１５０を含み、前記第２の核酸が、ＶＬ−ＶＣを含む軽鎖をコードし、前記ＶＬが配列番号１５５を含み、ＶＣがラムダドメインである、請求項２６に記載の核酸組成物。
２８．請求項２６または２７に記載の前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、請求項２６または２７に記載の前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターとをそれぞれ含む、発現ベクター組成物。
２９．請求項２６または２７に記載の前記第１の核酸と、請求項２６または２７に記載の前記第２の核酸とをそれぞれ含む発現ベクターを含む、発現ベクター組成物。
３０．請求項２７または２８に記載の該発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
３１．抗ＴＩＧＩＴ抗体の作製方法であって、
ａ）請求項３０に記載の前記宿主細胞を、前記抗体が発現される条件下で培養することと、
ｂ）該抗体を回収することと、を含む、方法。
３２．請求項１７〜２５のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、Ｔ細胞を活性化させることによる癌の治療方法。
３３．
ａ）配列番号９を有する重鎖と、
ｂ）配列番号１４を有する軽鎖と、を含む、抗体。
３４．ヒトチェックポイント受容体タンパク質に結合する第２の抗体をさらに含む、請求項３３に記載の抗体。
３５．該第２の抗体がヒトＰＤ−１に結合する、請求項３４に記載の組成物。
３６．該第２の抗体がヒトＴＩＧＩＴ（配列番号９７）に結合する、請求項３４に記載の組成物。
３７．該第２の抗体が、配列番号１６０を含む可変重鎖ドメインと配列番号１６５を含む可変軽鎖ドメインとを含む抗原結合ドメインを含む、請求項３６に記載の組成物。
３８．該第２の抗体の重鎖が配列番号１６４を有し、該第２の抗体の軽鎖が配列番号１６９を有する、請求項３６に記載の組成物。
３９．
ａ）配列番号９をコードする第１の核酸と、
ｂ）配列番号１４をコードする第２の核酸と、を含む、核酸組成物。
４０．請求項３９に記載の該第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、請求項３９に記載の該第２の核酸を含む第２の発現ベクターとを含む、発現ベクター組成物。
４１．請求項３９に記載の該第１の核酸と、請求項３９に記載の該第２の核酸とを含む発現ベクターを含む、発現ベクター組成物。
４２．請求項４１に記載の該発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
４３．抗ＰＶＲＩＧ抗体の作製方法であって、
ａ）請求項４２に記載の前記宿主細胞を、前記抗体が発現される条件下で培養することと、
ｂ）該抗体を回収することと、を含む、方法。
４４．請求項３３に記載の抗体を投与することを含む、Ｔ細胞を活性化させることによる癌の治療方法。
４５．
ａ）配列番号１９を有する重鎖と、
ｂ）配列番号２４を有する軽鎖と、を含む、抗体。
４６．ヒトチェックポイント受容体タンパク質に結合する第２の抗体をさらに含む、請求項４５に記載の抗体。
４７．該第２の抗体がヒトＰＤ−１に結合する、請求項４６に記載の組成物。
４８．該第２の抗体がヒトＴＩＧＩＴ（配列番号９７）に結合する、請求項４６に記載の組成物。
４９．該第２の抗体が、配列番号１６０を含む可変重鎖ドメインと配列番号１６５を含む可変軽鎖ドメインとを含む抗原結合ドメインを含む、請求項４８に記載の組成物。
５０．該第２の抗体の重鎖が配列番号１６４を有し、該第２の抗体の軽鎖が配列番号１６９を有する、請求項４９に記載の組成物。
５１．
ａ）配列番号１９をコードする第１の核酸と、
ｂ）配列番号２４をコードする第２の核酸と、を含む、核酸組成物。
５２．請求項５１に記載の該第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、請求項５１に記載の該第２の核酸を含む第２の発現ベクターとを含む、発現ベクター組成物。
５３．請求項５１に記載の該第１の核酸と、請求項５１に記載の該第２の核酸とを含む発現ベクターを含む、発現ベクター組成物。
５４．請求項５３に記載の該発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
５５．抗ＴＩＧＩＴ抗体の作製方法であって、
ａ）請求項５４に記載の前記宿主細胞を、前記抗体が発現される条件下で培養することと、
ｂ）該抗体を回収することと、を含む、方法。
５６．請求項４５に記載の抗体を投与することを含む、Ｔ細胞を活性化させることによる癌の治療方法。
５７．
ａ）患者由来の腫瘍試料から細胞集団を用意することと、
ｂ）該集団を、
ｉ）ＴＩＧＩＴタンパク質、
ｉｉ）ＰＶＲタンパク質、
ｉｉｉ）ＰＤ−１タンパク質、
ｉｖ）ＰＤ−Ｌ１タンパク質、および
ｖ）ｉ）〜ｉｖ）の抗体に対して関連するアイソタイプ対照、に結合する標識抗体で染色することと、
ｃ）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を実行することと、
ｄ）ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の各々について、前記アイソタイプ対照抗体と比較した、前記タンパク質を発現する前記集団における細胞のパーセンテージを決定することと、
陽性細胞のパーセンテージが全ての４つの受容体について＞１％である場合、
ｅ）ＴＩＧＩＴおよびＰＤ−１に対する抗体を該患者に投与することと、を含む、方法。
５８．前記ＴＩＧＩＴ抗体がＣＰＡ．９．０８６である、請求項５７に記載の方法。
５９．前記ＰＤ−１抗体が、ペンブロリズマブおよびニボルマブから選択される、請求項５７または５８に記載の方法。
６０．
ａ）患者由来の腫瘍試料から細胞集団を用意することと、
ｂ）該集団を、
ｉ）ＰＶＲＩＧタンパク質、
ｉｉ）ＰＶＲＬ２タンパク質、
ｉｉｉ）ＰＤ−１タンパク質、
ｉｖ）ＰＤ−Ｌ１タンパク質、および
ｖ）ｉ）〜ｉｖ）の抗体に対して関連するアイソタイプ対照、に結合する標識抗体で染色することと、
ｃ）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を実行することと、
ｄ）ＰＶＲＩＧ、ＰＶＲＬ２、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の各々について、前記アイソタイプ対照抗体と比較した、前記タンパク質を発現する前記集団における細胞のパーセンテージを決定することと、
陽性細胞のパーセンテージが全ての４つの受容体について＞１％である場合、
ｅ）ＰＶＲＩＧおよびＰＤ−１に対する抗体を該患者に投与することと、を含む、方法。
６１．前記ＰＶＲＩＧ抗体がＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）である、請求項６０に記載の方法。
６２．前記ＰＤ−１抗体が、ペンブロリズマブおよびニボルマブから選択される、請求項６０または６１に記載の方法。
６３．
ａ）患者由来の腫瘍試料から細胞集団を用意することと、
ｂ）該集団を、
ｉ）ＰＶＲＩＧタンパク質、
ｉｉ）ＰＶＲＬ２タンパク質、
ｉｉｉ）ＴＩＧＩＴタンパク質、
ｉｖ）ＰＶＲタンパク質、および
ｖ）アイソタイプ対照、に結合する標識抗体で染色することと、
ｃ）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を実行することと、
ｄ）ＰＶＲＩＧ、ＰＶＲＬ２、ＴＩＧＩＴおよびＰＶＲの各々について、前記アイソタイプ対照抗体と比較した、前記タンパク質を発現する前記集団における細胞のパーセンテージを決定することと、
陽性細胞のパーセンテージが全ての４つの受容体について＞１％である場合、
ｅ）ＰＶＲＩＧおよびＴＩＧＩＴに対する抗体を該患者に投与することと、を含む、方法。
６４．前記ＰＶＲＩＧ抗体がＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）である、請求項６３に記載の方法。
６５．前記ＴＩＧＩＴ抗体がＣＰＡ９．０８６である、請求項６３または６４に記載の方法。
６６．ヒトＴＩＧＩＴ（配列番号９７）に結合する抗原結合ドメインを含む組成物であって、
ａ）配列番号５６０を含む可変重鎖ドメインと、
ｂ）配列番号５６５を含む可変軽鎖ドメインと、を含む、組成物。
６７．該組成物が、
ａ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖であって、前記ＶＨが配列番号５６０を含む、重鎖と、
ｂ）ＶＬ−ＶＣを含む軽鎖であって、前記ＶＬが配列番号５６５を含み、前記ＶＣがカッパまたはラムダのいずれかである、軽鎖と、を含む抗体である、請求項６６に記載の組成物。
６８．配列前記ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４、ならびにそのバリアントから選択される、請求項６７に記載の組成物。
６９．該重鎖が配列番号５６４を有し、該軽鎖が配列番号５６９を有する、請求項６７または６８に記載の組成物。
７０．ヒトチェックポイント受容体タンパク質に結合する第２の抗体をさらに含む、請求項６７〜６９のいずれかに記載の組成物。
７１．＿該第２の抗体がヒトＰＤ−１に結合する、請求項７０に記載の組成物。
７２．該第２の抗体がヒトＰＶＲＩＧ（配列番号２）に結合する、請求項７０に記載の組成物。
７３．該第２の抗体が、配列番号５を含む可変重鎖ドメインと配列番号１０を含む可変軽鎖ドメインとを含む抗原結合ドメインを含む、請求項７２に記載の組成物。
７４．該第２の抗体の重鎖が配列番号９を有し、該第２の抗体の軽鎖が配列番号１４を有する、請求項７２に記載の組成物。
７５．
ａ）配列番号５６０を含む可変重鎖ドメインをコードする第１の核酸と、
ｂ）配列番号５６５を含む可変軽鎖ドメインをコードする第２の核酸と、を含む、核酸組成物。
７６．前記第１の核酸が、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖をコードし、前記ＶＨが配列番号５６０を含み、前記第２の核酸が、ＶＬ−ＶＣを含む軽鎖をコードし、前記ＶＬが配列番号５６５を含み、ＶＣがラムダドメインである、請求項７５に記載の核酸組成物。
７７．請求項７５または７６に記載の前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、請求項７５または７６に記載の前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターとをそれぞれ含む、発現ベクター組成物。
７８．請求項７５または７６に記載の前記第１の核酸と、請求項７５または７６に記載の前記第２の核酸とをそれぞれ含む発現ベクターを含む、発現ベクター組成物。
７９．請求項７７または７８に記載の該発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
８０．抗ＴＩＧＩＴ抗体の作製方法であって、
ａ）請求項７９に記載の前記宿主細胞を、前記抗体が発現される条件下で培養することと、
ｂ）該抗体を回収することと、を含む、方法。
８１．請求項６６〜７４のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、Ｔ細胞を活性化させることによる癌の治療方法。
ＸＩＩＩ．
【実施例】
【０３２５】
参照によりその全体が、特に実施例１〜５、７〜８、１１〜１３、１６〜２０および２６〜２８、ならびに添付の図に関して本明細書に明示的に組み込まれる、「ＰＶＲＩＧ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ」と題される２０１６年２月１９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／１８８０９が参照される。
【０３２６】
Ａ．実施例１：ＰＶＲＩＧ、ＤＮＡＭ、およびＴＩＧＩＴへのＰＶＲ、ＰＶＲＬ２、およびＰＶＲＬ３結合の表面プラズモン共鳴研究
材料および方法
全ての実験は、２２℃でＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ  ３６機器を使用して行った。
【０３２７】
工程１：高密度ヤギ抗ヒトｆｃポリクローナル抗体表面（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｈ１０５００）を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ  ３６バイオセンサーを使用してＧＬＣチップの６つ全てのレーンにわたって調製した。抗ヒトｆｃ表面に対する活性化工程は水平流向で行い、一方で高密度ｐＡｂに対する固定化工程は垂直流向で行った。遮断工程は、垂直位置および水平位置の両方で行うことで、水平「インタースポット」を参照表面として使用できるようにした。平均約４４００ＲＵのヤギ抗ヒトｐＡｂを各レーンに固定化した。
【０３２８】
工程２：各サイクルについて、ヒトＰＶＲＩＧ融合タンパク質の３つの異なるロット（ヒトｆｃ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔロット４５１、４４８、１２５）、ヒトＤＮＡＭ−１融合タンパク質（ヒトｆｃ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトＴＩＧＩＴ融合タンパク質（ヒトｆｃ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、および対照ヒトＩｇＧ（Ｓｙｎａｇｉｓ）を、各々、２μｇ／ｍＬの濃度で２分間、異なる垂直レーンにわたって捕捉した。ＰＶＲ、２つのロットのＰＶＲＬ２、およびＰＶＲＬ３を各々、異なるリガンド捕捉サイクルで捕捉された６つ全てのリガンドにわたって、６つの異なる濃度で水平流向に注入した。注入を２分間行い、続いて５０μＬ／分の流速で１０分間解離させた。ＰＶＲ濃度範囲は３倍希釈系列で１．４ｎＭ〜３３２ｎＭであり、ＰＶＲＬ２の両ロットは３倍希釈系列で１．３ｎＭ〜３２２ｎＭの濃度範囲で注射し、ＰＶＲＬ３は３倍希釈系列で１．４ｎＭ〜３３４ｎＭの濃度範囲で注射した。全てのタンパク質試薬を泳動緩衝液中で調製し、この緩衝液は、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０および０．０１％のＢＳＡを添加した脱気ＰＢＳ緩衝液であった。抗ヒトｆｃ捕捉表面を、各サイクル後の１４６ｍＭのリン酸の３０秒パルス２回によって再生成した。
【０３２９】
工程３：捕捉した各リガンドへの分析物結合のセンサーグラムデータを処理し、インタースポット参照、および分析物注射と同一のプレブランク注射を利用したＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒバージョン３．１．０．６を利用して二重参照（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）した。
【０３３０】
結果
ａ）ＰＶＲ：捕捉したＤＮＡＭ−１およびＴＩＧＩＴに弱く結合し、ＰＶＲＩＧの３つ全てのロットおよび対照ＩｇＧへの結合を示さない。ＤＮＡＭ−１およびＴＩＧＩＴとのＰＶＲ相互作用のＫＤを推定するのに十分な情報は生成されなかった（データ図示せず）。
【０３３１】
ｂ）ＰＶＲＬ２：ＰＶＲＬ２の両ロットは、ＰＶＲＩＧの３つ全てのロットおよびＤＮＡＭ−１への結合を示したが、ＴＩＧＩＴへの結合は最低限であったかまたは皆無であり、対照ＩｇＧへの結合は示さなかった。センサーグラムは複合の動態を示したため、結合定数を推定することはできなかった（データ図示せず）。
【０３３２】
ｃ）ＰＶＲＬ３：ＴＩＧＩＴへの最低限の結合しか示さず、他のタンパク質には結合しなかった（データ図示せず）。
【０３３３】
Ｂ．実施例２：ＰＶＲＩＧノックダウン（ＫＤ）および抗ＰＶＲＩＧ抗体がヒト黒色腫特異的ＴＩＬ機能に与える効果
これらのアッセイの目的は、黒色腫標的細胞との共培養時の活性化マーカーおよびサイトカイン分泌によって測定した、ヒト由来ＴＩＬにおけるＰＶＲＩＧの機能的能力を評価することである。
【０３３４】
１．実施例２（１）：
単独でまたは他の抗体（例えば、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＤＮＡＭ１）と組み合わせて、ＰＶＲＩＧおよびＰＶＲＬ２間の相互作用を遮断することが示されている抗ＰＶＲＩＧ抗体（ＣＰＡ．７．０２１）の効果を評価した。ＰＤ１を、ノックダウン（ｓｉＲＮＡ）研究のためのベンチマーク免疫チェックポイントとして使用した。
【０３３５】
３人の黒色腫患者由来の腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、１）ＴＩＬ−４１２−ＨＬＡ−Ａ２−Ｍａｒｔ１特異的、２）ＴＩＬ−Ｆ４−ＨＬＡ−Ａ２−ｇｐ１００特異的、および３）ＴＩＬ−２０９−ＨＬＡ−Ａ２−ｇｐ１００特異的を使用した。ＴＩＬを、１０％のヒト血清（Ｓｉｇｍａ、Ｈ３６６７）＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３５０５０−０３８）＋１％のピルビン酸ナトリウム（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０４２−１Ｂ）＋１％の非必須アミノ酸（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０１−３４０−１Ｂ）＋１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０３１−１Ｂ）＋３００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、５０９１２９）を補充したＩＭＤＭ（ＢＩ、０１−０５８−１Ａ）完全培地内で解凍した。
【０３３６】
腫瘍細胞株：ヒト黒色腫細胞Ｍｅｌ−６２４は、ＭＨＣ−ＩハプロタイプＨＬＡ−Ａ２との関連でＭＡＲＴ−１およびｇｐ−１００抗原を発現する。細胞を、１０％、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１％、および１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを補充した完全ＤＭＥＭ培地で培養した。
【０３３７】
ＴＩＬにおけるノックダウン：ＴＩＬにおけるヒトＰＶＲＩＧおよびヒトＰＤ１のノックダウン（ＫＤ）を、１００ｐｍｏｌのＤｈａｒｍａｃｏｎ  ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓヒトＰＶＲＩＧ  ｓｉＲＮＡ−ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（Ｌ−０３２７０３−０２）またはヒトＰＤ１  ｓｉＲＮＡ−ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（Ｌ−００４４３５）または非標的化ｓｉＲＮＡ（Ｄ−００１８１０−０１−０５）を使用して行った。ｓｉＲＮＡをＴＩＬにエレクトロポレーションした（ＡＭＡＸＡ、プログラムＸ−００５）。解凍から２４時間後にＩＬ−２を補充した完全ＩＭＤＭ中で培養した休止ＴＩＬに対してエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、ＴＩＬを９６ウェルＴＣプレートに播種して、２４時間回復させた。２４時間後、細胞を採取し、生死判定色素（ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ、カタログ番号５６２２４７、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、ＰＢＳで洗浄し、３０分間室温で抗ヒトＰＶＲＩＧ−ＣＰＡ．７．０２１（ＣＰＡ．７．０２１  ＩｇＧ２  Ａ６４７、７．５ｕｇ／ｍｌ）または抗ヒトＰＤ−１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、番号３２９９１０  ＡＦ６４７、５ｕｇ／ｍｌ）で染色した。使用したアイソタイプ対照は、それぞれ、Ｓｙｎａｇｉｓ（ＩｇＧ２  Ａ６４７、７．５ｕｇ／ｍｌ）およびマウスＩｇＧ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ番号４００１３０  Ａ６４７、５ｕｇ／ｍｌ）であった。全ての試料をＭＡＣＳＱｕａｎｔ解析器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に流し、デＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ｖ１０．０．８）を使用して解析した。
【０３３８】
６２４黒色腫細胞とのＴＩＬの共培養：ｓｉＲＮＡエレクトロポレーションしたＴＩＬを採取し、９６  ＴＣプレートに５×１０４／ウェルで播種した。Ｍｅｌ−６２４細胞も採取し、共培養中に１：１／１：３のエフェクター：標的比で播種した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩（１８時間）インキュベートした。
【０３３９】
黒色腫特異的ＴＩＬ活性に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体（ＣＰＡ．７．０２１、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ米国特許出願第２００９／０２５８０１３号より）、および抗ＤＮＡＭ１（クローンＤＸ１１、Ｓｈｉｂｕｙａ  ｅｔ  ａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｖｏｌｕｍｅ４，Ｉｓｓｕｅ  ６，１  Ｊｕｎｅ  １９９６，Ｐａｇｅｓ  ５７３−５８１において最初に記載、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マウス抗ヒトＤＮＡＭ−１クローンＤＸ１１、カタログ番号５５９７８７）の効果を評価するために、ＴＩＬ（１×１０５細胞／ウェル）を、単剤処理（１０μｇ／ｍＬ）または併用処理（各々につき最終１０μｇ／ｍＬ）で、試験抗体または関連アイソタイプ対照と共にプレインキュベートした後、６２４黒色腫標的細胞を１：３のエフェクター：標的比で添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩（１８時間）インキュベートした。
【０３４０】
ＴＩＬ活性化の評価：共培養から１６時間後、細胞を生死判定色素（ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ、カタログ番号５６２２４７、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、ＰＢＳで洗浄し、Ｆｃブロッキング溶液（カタログ番号３０９８０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に曝露した後、３０分間４℃で抗ＣＤ８ａ（カタログ番号３０１０４８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および抗ＣＤ１３７（カタログ番号３０９８０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。全ての試料をＭＡＣＳＱｕａｎｔ解析器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に流し、データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ｖ１０．０．８）を使用して解析した。培養上清を収集し、ＣＢＡキット（カタログ番号５６０４８４、ＢＤ）を用いてサイトカイン分泌について分析した。
【０３４１】
結果
ＴＩＬにおけるＰＶＲＩＧノックダウン：ＴＩＬ  ＭＡＲＴ−１およびＴＩＬ  Ｆ４をＩＬ−２と共に２４時間培養した。１００ｐｍｏｌのＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓヒトＰＶＲＩＧ  ｓｉＲＮＡ−ＳＭＡＲＴ  ｐｏｏｌ（Ｌ−０３２７０３−０２）またはヒトＰＤ１  ｓｉＲＮＡ−ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（Ｌ−００４４３５）または非標的化ｓｉＲＮＡ（Ｄ−００１８１０−０１−０５）を、ＴＩＬにエレクトロポレーションした（ＡＭＡＸＡ、プログラムＸ−００５）。ＰＶＲＩＧまたはＰＤ−１の検出を、エレクトロポレーションから２４時間後（および共培養前）に行った。細胞を生死判定色素について染色し、続いて抗ＰＶＲＩＧまたは抗ＰＤ−１との３０分の室温でのインキュベーションを行った。ＫＤ集団のパーセンテージは、参照により本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１５／０４８，９６７の図８２に示される。
【０３４２】
ノックダウンしたＴＩＬを使用する機能アッセイ：ＩＬ２と共に２４時間培養したヒトＴＩＬを、ヒトＰＶＲＩＧもしくはＰＤ−１をコードするｓｉＲＮＡまたは対照としてスクランブル配列を用いてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションから２４時間後にＴＩＬをＰＶＲＩＧおよびＰＤ−１発現について試験した。参照により本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１５／０４８，９６７の図８２で実証されるように、スクランブルエレクトロポレーションＴＩＬと比較してＰＶＲＩＧの約８０％ノックダウンおよびＰＤ−１の約５０％ノックダウンが観察された。
【０３４３】
ＫＤ  ＴＩＬを、Ｍｅｌ−６２４細胞と共に１：１または１：３のエフェクター：標的比で１８時間培養し、ＣＤ１３７の発現について染色した。対照のスクランブルｓｉＲＮＡと比較して、ＰＤ−１  ｓｉＲＮＡを用いてエレクトロポレーションしたＴＩＬと同様に、上昇したレベルの活性化マーカーＣＤ１３７が、ＰＶＲＩＧ  ｓｉＲＮＡを用いてエレクトロポレーションしたＴＩＬ  ＭＡＲＴ−１において示された（参照により本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ  １５／０４８，９６７の図８３Ａに実証されるように）。共培養上清を収集し、分泌サイトカインの存在について試験した。ＰＶＲＩＧ  ｓｉＲＮＡを用いてエレクトロポレーションしたＴＩＬは、対照のＳＣＲ  ｓｉＲＮＡと比較して、ＩＦＮγおよびＴＮＦレベルの顕著な増加を示す。同様の効果が、ＰＤ−１  ｓｉＲＮＡを用いてエレクトロポレーションしたＴＩＬにおいて示された（参照により本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ  １５／０４８，９６７の図８３Ｂ〜Ｃに実証されるように）。
【０３４４】
活性化レベルの同じ増加傾向がＴＩＬ  Ｆ４において観察された。ＰＶＲＩＧ  ｓｉＲＮＡでエレクトロポレーションしたＴＩＬ  Ｆ４をＭｅｌ−６２４と共に１：３のエフェクター：標的比で共培養することによって、参照により本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ  １５／０４８，９６７の図８４Ａおよび８４Ｂに示されるように、ＣＤ１３７表面発現のレベルの増加および共培養上清中のＩＦＮγの分泌の増加がもたらされた。同様の傾向が、ＰＤ−１  ｓｉＲＮＡを用いてエレクトロポレーションしたＴＩＬにおいて観察された。
【０３４５】
遮断抗体を使用する機能アッセイ：
【０３４６】
抗ＰＶＲＩＧおよび抗ＴＩＧＩＴのインビトロ単剤療法および併用療法：２０９のＴＩＬをＭｅｌ−６２４細胞と共に１：１のエフェクター：標的比で１８時間培養した。共培養上清を収集し、分泌サイトカインの存在について試験した。抗ＴＩＧＩＴによる処理は、ＩＦＮγ分泌レベルにもＴＮＦ分泌レベルにも影響を及ぼさなかった。しかしながら、抗ＴＩＧＩＴおよび抗ＰＶＲＩＧを組み合わせて共培養に添加したときに、ＩＦＮγレベルおよびＴＮＦレベルの増加が観察された（図８Ａ〜Ｂ）。
【０３４７】
抗ＰＶＲＩＧおよび抗ＴＩＧＩＴのインビトロ単剤療法および併用療法：２０９のＴＩＬをＭｅｌ−６２４細胞と共に１：１のエフェクター：標的比で１８時間培養した。ＴＩＬを活性化マーカーＣＤ１３７の表面発現について染色すると、抗ＤＮＡＭ−１による処理後の発現レベルの低減を示した。共培養上清を収集し、分泌サイトカインの存在について試験した。抗ＤＮＡＭ−１の処理は、分泌されたサイトカインであるＩＦＮγおよびＴＮＦを増加させる傾向を媒介した。抗ＤＮＡＭ−１および抗ＰＶＲＩＧの組み合わせによる処理は、ＣＤ１３７発現（図９Ｃ）に対する影響を部分的に逆転させ、サイトカイン分泌ＩＦＮγおよびＴＮＦに対する影響を増強した（図９Ａ〜Ｂ）。ＭＡＲＴ−１  ＴＩＬを、Ｍｅｌ−６２４細胞と共に１：１のエフェクター：標的比で１８時間培養した。共培養上清を収集し、分泌サイトカインの存在について試験した。抗ＤＮＡＭ−１での処理により、ＴＩＬ上のＣＤ１３７表面発現、ならびに分泌されたサイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦも低減した。抗ＤＮＡＭ−１および抗ＰＶＲＩＧの組み合わせによる処理は、これらの効果を部分的に逆転させた（図９Ｄ〜Ｆ）。
【０３４８】
要約および結論：ＰＤ１のＫＤは、ＩＦＮγならびにＦ４およびＭＡＲＴ−１  ＴＩＬにおける分泌によって測定したときに、ＴＩＬ活性を改善した。対照ｓｉＲＮＡと比較して、ＩＦＮγおよびＴＮＦ分泌の増加（約２０％）がＭＡＲＴ−１  ＴＩＬにおけるＰＶＲＩＧ  ＫＤの際に観察された。同じ傾向が、Ｆ４  ＴＩＬ上の６２４黒色腫細胞との共培養時にＣＤ１３７発現において観察された。
【０３４９】
抗ＴＩＧＩＴの処理は、６２４  Ｍｅｌと共培養したＴＩＬからのＩＦＮγ分泌レベルにもＴＮＦ分泌レベルにも影響を及ぼさなかったが、抗ＴＩＧＩＴおよび抗ＰＶＲＩＧ（ＣＰＡ．７．０２１）を併用して共培養に添加したときに、ＩＦＮγおよびＴＮＦレベルの増加が観察された。
【０３５０】
抗ＤＮＡＭ−１処理により、低減したＣＤ１３７およびサイトカイン分泌によって表されるＴＩＬ−ＭＡＲＴ−１活性化の低減がもたらされ、抗ＰＶＲＩＧ（ＣＰＡ．７．０２１）は、ＤＮＡＭ−１  Ａｂとの併用療法においてこの影響を部分的に逆転することができた。ＴＩＬ  ２０９においては、ＩＦＮγおよびＴＮＦ分泌レベルは、抗ＤＮＡＭ−１によってわずかに上昇（約１０％）し、抗ＤＮＡＭ１および抗ＰＶＲＩＧ（ＣＰＡ．７．０２１）を併用して共培養に添加したときに、ＩＦＮγおよびＴＮＦレベルの増加（それぞれ、約４０％および３０％）が観察された。まとめると、発明者らの結果は、ＰＶＲＩＧが、ＰＶＲＬ２に対する新たな共抑制性受容体であることを示した。
【０３５１】
２．実施例２（２）：
単独でまたは他の抗体（例えば、抗ＴＩＧＩＴ、ＰＤ１）と組み合わせてＰＶＲＩＧおよびＰＶＲＬ２間の相互作用を遮断することが示されている、追加の抗ＰＶＲＩＧ抗体（ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３８）の、６２４黒色腫細胞株と共培養したときのＴＩＬ−２０９、ＴＩＬ−４１２およびＴＩＬ−４６３−Ｆ４活性に対する効果を評価した。
【０３５２】
このアッセイで使用した機能的抗体は、抗ｈＰＶＲＩＧハイブリドーマ抗体（ｍＩｇＧ１骨格）−ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３８（Ｍ１ロット番号３０８１６）、抗ｈＴＩＧＩＴ（ｍＩｇＧ１骨格）−クローン１０Ａ７（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）、抗ＴＩＧＩＴクローンＭＢＳＡ４３（ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびｍＩｇＧ１（カタログ番号４００１６６、ＭＯＰＣ−２１クローン、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）であった。
【０３５３】
ＴＩＬおよび６２４  ｍｅｌの共培養：共培養に先立って、ＴＩＬを解凍し、２．１に記載されるように２４時間培養した。試験した抗体を、単剤処理（１０μｇ／ｍＬ）または抗ＴＩＧＩＴと組み合わせて（２０μｇ／ｍＬ）、播種したＴＩＬに添加し、３７℃、５％ＣＯ２中で１時間インキュベートした（総計１００μＬ）。Ｍｅｌ−６２４細胞を採取し、ＴＩＬとの共培養において１：３のエフェクター：標的比で播種した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２中で一晩（１８時間）インキュベートした。
【０３５４】
ＴＩＬの機能的能力の評価：Ｔ細胞活性を、共培養上清中のＩＦＮγの検出に基づいて評価した。培養上清を回収し、ＣＢＡキット（カタログ番号５６０４８４、ＢＤ）またはＭＡＧＰＩＸヒトＩＦＮγ／ＴＮＦαキットによりサイトカインについて試験した。対応のない両側Ｔ検定を算出した。Ｐ＜０．０５は統計的に有意と称される。
【０３５５】
結果
抗ＰＶＲＩＧハイブリドーマ抗体の存在下でのＴＩＬおよび黒色腫細胞を用いた機能アッセイ：ＩＬ２と共に２４時間培養したヒトＴＩＬを１：３のエフェクター：標的でＭｅｌ−６２４細胞と１８時間共培養し、サイトカイン分泌について試験した。図３１は、５〜６回実施したうちの代表的な実験を記載している。抗ＴＩＧＩＴもしくは抗ＰＶＲＩＧ抗体の存在下（青色）または抗ＴＩＧＩＴおよび抗ＰＶＲＩＧの組み合わせ（緑色）で、ＴＩＬを黒色腫細胞６２４と共培養し、ＩＦＮγ／ＴＮＦ分泌について試験した。この実験では、試験した３つのＴＩＬのうち２つ（ＴＩＬ−２０９およびＴＩＬ４６３−Ｆ４）において、４つの抗ＰＶＲＩＧ抗体単剤処理全てがＩＦＮγ分泌を増加させたが（２０〜３０％）、抗ＴＩＧＩＴとの組み合わせでは、抗ＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３８全てが、抗ＴＩＧＩＴ処理単独と比較してＩＦＮγ分泌を増加させた。
【０３５６】
抗体ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の効果は、ＴＩＬ４６３−Ｆ４−ｇｐ１００における実験にわたって、単剤としておよび抗ＴＩＧＩＴと組み合わせた５回の実験を通して統計学的に有意であることが見出された（図９Ｅ、Ｇ）。抗ＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の併用処理の効果も、ＴＩＬ２０９において統計的に有意であった（図９Ｃ）。抗ＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ．７．５３８の併用処理効果は、ＴＩＬ４６３−Ｆ４−ｇｐ１００において統計的に有意であることが見出された（図９Ｆ）。
【０３５７】
要約および結論：本明細書に記載の実験系では、ＩＦＮγ分泌の変化によって見たときに、標的黒色腫細胞に応答するＴＩＬに対する抗ＰＶＲＩＧの効果が観察された。試験した抗ＰＶＲＩＧハイブリドーマ抗体は、関連するアイソタイプ対照と比較して、ＩＦＮγ分泌の増加を媒介した。抗体ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、単剤処理としてＩＦＮγ分泌の増加を媒介する際に利点を有すると思われるが、試験した他のａＰＶＲＩＧ抗体と比較するとこの影響の規模は異なるＴＩＬ間で様々である。この効果は、抗ＴＩＧＩＴ治療と組み合わせて強化される。
【０３５８】
３．実施例２（３）：
目的は、ＨＬＡ−Ａ２、ｂ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）およびＰＶＲＬ２を安定に共発現するペプチドパルスＣＨＯ−Ｓ細胞と共培養した際のヒトＴＩＬ活性に対する抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体（ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．７．５４４、またはＣＨＡ．７．５３８）の機能活性を評価することである。
【０３５９】
以下の３名の黒色腫患者の切除された転移由来のＴＩＬを使用した：ＴＩＬ−４１２−ＨＬＡ−Ａ２−Ｍａｒｔ１（２６〜３５）特異的、ＴＩＬ−４６３−Ｆ４−ＨＬＡ−Ａ２−ｇｐ１００（２０９〜２１７）特異的、ＴＩＬ−４６３−Ｆ５−ＨＬＡ−Ａ２−ｇｐ１００（２０９〜２１７）特異的、およびＴＩＬ−２０９−ＨＬＡ−Ａ２−ｇｐ１００（２０９〜２１７）特異的。
【０３６０】
ＴＩＬを、１０％のヒト血清＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ＋１％のピルビン酸ナトリウム＋１％の非必須アミノ酸＋１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ＋３００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、５８９１０６）を補充したＩＭＤＭ完全培地中で解凍した。
【０３６１】
ＣＨＯ−Ｓ細胞（標的細胞）に、ＨＬＡ−Ａ２／Ｂ２Ｍを発現するレンチウイルス（レンチウイルスベクターカタログ番号ＣＤ５１５Ｂ−１−ＳＢＩ、ｓｙｓｔｅｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を安定的に形質導入し、８ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ１％および１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＣＤ  ＣＨＯ培地（カタログ番号１０７４３−０１１）中、６００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ選択下で増殖させた。次いで、ＨＬＡ−Ａ２／Ｂ２Ｍ発現細胞を限界希釈によってクローニングした。次いで、高ＨＬＡ−Ａ２およびＢ２Ｍ発現を有する３Ｅ８クローンに、ヒトＰＶＲＬ２を発現するレンチウイルス（レンチウイルスベクターカタログ番号ＣＤ５１０Ｂ−１−ＳＢＩ、ｓｙｓｔｅｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を形質導入し、６ｕｇ／ｍｌのピューロマイシン選択下で増殖させた。
【０３６２】
本明細書に記載の実験系（図３５に図示される）では、ＴＩＧＩＴ、ＤＮＡＭ−１およびＰＶＲＩＧ  図３７を内因性で発現するｇｐ１００またはＭＡＲＴ−１反応性ＴＩＬを、ペプチドパルスしたＣＨＯ−Ｓ  ＨＬＡ−Ａ２／Ｂ２Ｍ／ＰＶＲＬ２細胞と共培養した。
【０３６３】
このアッセイで使用した機能性抗体は、抗ヒトＰＶＲＩＧ、抗体４６１（Ａｌｄｅｖｅｒｏｎ）（この実施例では５４４と称される）、抗ヒトＰＶＲＩＧキメラ抗体（ｈＩｇＧ４骨格）−ＣＨＡ．７．５３８、ＣＨＡ．７．５１８（この実施例ではｃ５３８およびｃ５１８と称され、つまり７．５３８および７．５１８の可変重鎖および軽鎖領域がヒトＩｇＧ４定常領域に融合されている抗ヒトＴＩＧＩＴ（ｍＩｇＧ１骨格）クローンＭＢＳＡ４３（ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｍＩｇＧ１（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびｈＩｇＧ４（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）であった。
【０３６４】
標的細胞との共培養に先立って、ＴＩＬを解凍し、本明細書に記載のように２４時間培養した。試験した抗体を、単剤処理（１０μｇ／ｍＬ）または抗ＴＩＧＩＴと組み合わせて（総計２０μｇ／ｍＬ）、播種したＴＩＬに添加し、３７℃、５％ＣＯ２中で３０分間インキュベートした（総計１００μＬ）。ＣＨＯ−Ｓ細胞を採取し、０．１または０．５μｇ／ｍｌのｇｐ−１００（ｇｐ１００２０９−２１７）または２０μｇ／ｍｌのＭＡＲＴ−１２６−３５ペプチドで３７℃で１時間、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）血清低減培地中でパルスした。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）血清低減培地で木（ｔｒｅｅ）洗浄した後、ペプチドパルスした標的細胞を１：３（３３ｋ：１００ｋ）のエフェクター：標的比でＴＩＬと一晩（１８時間）共培養した。
【０３６５】
ＴＩＬの機能的能力の評価：ＴＩＬ活性に対する、単剤処理または抗ＴＩＧＩＴとの併用処理としての抗ＰＶＲＩＧ抗体（１０μｇ／ｍｌ）の効果を、Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）キット（カタログ番号５６０４８４、ＢＤ）を用いた、一晩の共培養上清からのサイトカイン分泌の測定を用いて評価した。全ての試料をＭＡＣＳＱｕａｎｔ解析器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で取得し、データを、Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ｖ１０．０．８）を使用して解析した。
【０３６６】
抗ＰＶＲＩＧ抗体の用量反応：抗ＰＶＲＩＧ抗体ｃ５１８、ｃ５３８（またはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照）用量反応の効果を、記載されたアッセイにおいて３０、１０、３、１、０．３、０．１および０．０３μｇ／ｍｌの抗体濃度で試験した。対応のない両側Ｔ検定を算出した。Ｐ＜０．０５は統計的に有意と称される。
【０３６７】
結果
ＰＶＲＬ２を発現するＣＨＯ−ＳＨＬＡ−Ａ２／Ｂ２Ｍ細胞と共培養した際のＴＩＬ活性に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果：２つの異なる実験からの４つの異なるＴＩＬ（４１２，４６３、４６２および２０９）の活性に対する３つの抗ＰＶＲＩＧ抗体（５４４、ｃ５３８およびｃ５１８）の効果を、図３７に要約する。抗体は非遮断剤抗体対照として機能した。実験の詳細な結果を図３９に提示する。５４４、ｃ５３８およびｃ５１８抗体での処理は、アイソタイプ抗体での処理と比較して、ＴＩＬからのＩＦＮ分泌のレベルを（平均してそれぞれ６％、２８％および２３％）増加させた。増加したＩＦＮ分泌は、非遮断剤対照である５４４と比較してｃ５３８またはｃ５１８で処理したＴＩＬにおいて検出された。ｃ５３８対ｃ５１８抗体での処理間に有意差は見られなかった。抗ＴＩＧＩＴでの処理は、アイソタイプと比較して、ＴＩＬからのＩＦＮ分泌を（平均４９％）増加させた。抗ＴＩＧＩＴとのｃ５１８およびｃ５３８の併用処理は、ＴＩＬからのＩＦＮ分泌における相加効果を誘導したが、この併用効果は、ＴＩＧＩＴの単剤処理での処理と比較して統計学的に有意ではなかった。
【０３６８】
ＴＩＬの機能的能力に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の用量反応の効果：ＴＩＬ  Ｆ４および２０９の活性に対する、抗ＰＶＲＩＧ抗体（ｃ５３８およびｃ５１８）の添加の用量反応における効果を評価した（図８０）。ｃ５１８およびｃ５３８抗体のＥＣ５０は、ＴＩＬからのＴＮＦα分泌の効果によって測定するとき、アイソタイプ対照と比較して１桁のｎＭにある。
【０３６９】
要約および結論：本明細書に記載の実験系では、ＰＶＲＬ２を過剰発現するペプチドパルスしたＣＨＯ−Ｓ  ＨＬＡ−Ａ２／Ｂ２Ｍ標的細胞との共培養に応答する、ＴＩＬに対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果が観察された。試験した抗ＰＶＲＩＧ抗体は、関連するアイソタイプ対照と比較して、ＴＩＬからのＩＦＮおよびＴＮＦの分泌増加を媒介した。抗体ｃ５１８およびｃ５３８は、ＰＶＲＩＧの非遮断剤抗体である５４４と比較して（ＰＶＲＩＧ発現細胞で行った競合実験に基づいて）、ＩＦＮ分泌によって表されるＴＩＬ活性に対して統計的に有意な利点（それぞれｐ−０．００６３およびｐ−０．００３４）発現細胞）を有する。ｃ５１８およびｃ５３８抗体の両方が、抗ＴＩＧＩＴ抗体との相加的効果を有した（統計的に有意ではない）。
【０３７０】
４．実施例２（４）
この実施例の目的は、黒色腫標的細胞との共培養時のサイトカイン分泌によって測定した、ヒト由来ＴＩＬにおけるＰＶＲＩＧの機能的能力を評価することである。単独でまたは他の抗体（例えば、抗ＴＩＧＩＴ、ＰＤ１）と組み合わせてＰＶＲＩＧおよびＰＶＲＬ２間の相互作用を遮断することが示されている、抗ＰＶＲＩＧ抗体（ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３８）の効果を評価した。
【０３７１】
バフィーコート血液試料上でＲｏｓｓｅｔｅｓｅｐヒトＴ細胞濃縮カクテルキット（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）を用いて精製したＣＤ３＋Ｔ細胞を得た。細胞を解凍し、共培養における増殖を追跡することができるように、ＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅプローブ）で標識した。
【０３７２】
ＣＨＯ−Ｓ細胞に、ＣＨＯ−Ｓ−ＯＫＴ３細胞：ＣＤ７１０Ｂ−１（ＳＢＩ、カタログ番号ＣＳ９６５Ａ−１、ロット番号１５１０１４−００５、１．４０×１０８／ｍｌ）中のＣＤ５Ｌ−ＯＫＴ３−ｓｃＦｖ−ＣＤ１４を形質導入した。細胞を、８ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘおよび６μｇ／ｍｌピューロマイシンを添加したＣＤ  ＣＨＯ（Ｇｉｂｃｏ、ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０７４３−０１１）の存在下で培養した。表面ＯＫＴ３レベルを、１：２００希釈でＰＥ−ヤギ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ）’２（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−１１６−１４６）を用いてフローサイトメトリーによって評価した。次いで、ＣＨＯ−Ｓ−ＯＫＴ３細胞を、製造業者の指示に従ってＡｍａｘａエレクトロポレーションシステム（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用してヒトＰＶＲＬ２（デルタアイソフォーム）または空ベクターで一過性でトランスフェクトした。Ｉｎｇｅｎｉｏ（商標）エレクトロポレーション溶液（Ｍｉｒｕｓ、カタログ番号ＭＣ−ＭＩＲ−５０１１５）中の２×１０６細胞あたり５ｕｇのｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（空ベクターまたはｈＰＶＲＬ２）、およびパルスプログラムＵ−０２４を使用した。トランスフェクトしたＣＨＯＳ−Ｓ−ＯＫＴ３細胞上でのＰＶＲＬ２の発現を、抗ＰＶＲＬ２抗体（カタログ番号３３７４１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いてフローサイトメトリーにより評価した。
【０３７３】
このアッセイで使用した機能的抗体は、抗ｈＰＶＲＩＧハイブリドーマ抗体（ｍＩｇＧ１骨格）−ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．７．５２４、ＣＨＡ．７．５３０、ＣＨＡ．７．５３８、抗ＴＩＧＩＴクローンＭＢＳＡ４３（ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびｍＩｇＧ１（カタログ番号４００１６６、ＭＯＰＣ−２１クローン、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）であった。
【０３７４】
ＣＤ３  Ｔ細胞およびＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞の共培養：ＣＤ３＋Ｔ細胞を解凍し、即座にＣＦＳＥで標識した。並行して、ＣＨＯ−Ｓ−ＯＫＴ３−ＰＶＲＬ２細胞を採取し、マイトマイシンＣで３７℃で１時間処理し、洗浄し、Ｔ細胞と共に１：５のエフェクター：標的（１×１０５個のＴ細胞および２×１０４個のＣＨＯ−ＯＫＴ３−ＰＶＲＬ２または擬）で共培養した。抗体を、単剤処理（１０μｇ／ｍＬ）または抗ＴＩＧＩＴ（１０μｇ／ｍＬ）と組み合わせて添加し、共培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。５日後、細胞を採取し、Ｔ細胞増殖を、ＣＤ４およびＣＤ８亜集団上のＦＡＣＳゲーティングによって分析した。
【０３７５】
ＣＨＯＳ−ＯＫＴ３共培養アッセイにおける抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果：ＣＦＳＥ標識したＴ細胞を刺激細胞（膜結合抗ＣＤ３ｍＡｂ断片を発現するＣＨＯ細胞）で刺激した。ヒトＰＶＲＬ２を発現するＣＨＯＳ刺激細胞および対照刺激細胞（空ベクター）をマイトマイシンＣ（５０μｇ／ｍｌ、１時間）で処理してから、ＣＦＳＥ標識ヒトＴ細胞と共に１：５の比で共培養した。３７℃および５．０％ＣＯ２で５日後、培養上清中のＴ細胞増殖（ＣＦＳＥ希釈）およびサイトカイン分泌（ＥＬＩＳＡまたはＴＨ１／２／１７ＣＢＡキット）に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体（１０ｕｇ／ｍｌ）の効果を評価した。全ての試料をＭＡＣＳＱｕａｎｔ解析器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で取得し、データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ｖ１０．０．８）を使用して解析した。培養上清を収集し、ＣＢＡキット（カタログ番号５６０４８４、ＢＤ）を用いてサイトカイン分泌について分析した。
【０３７６】
結果
ＣＨＯＳ−ＯＫＴ３アッセイにおけるＰＶＲＬ２過剰発現に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果：ＰＶＲＬ２を過剰発現するＣＨＯＳ−ＯＫＴ３または擬（空ベクター）細胞をＣＤ３＋細胞と共培養し、単剤処理としてまたは抗ＴＩＧＩＴと組み合わせた抗ＰＶＲＩＧ抗体の、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン分泌に対する効果を試験した（図４０）。５日後、細胞を採取し、ＣＦＳＥ希釈について分析した。並行して、共培養上清を収集し、サイトカイン分泌について試験した。図４１は、レスポンダー対非レスポンダードナーにおける抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果を示す。抗ＴＩＧＩＴと組み合わせた単剤処理としてのＴ細胞増殖に対する種々の抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果を評価した。いくつかの抗ＰＶＲＩＧ抗体はＴ細胞増殖を増強するが、抗ＴＩＧＩＴ抗体との相加効果はこの系で観察されなかった（図４２）。これらの効果は、ＣＤ３＋細胞と擬（空ベクタートランスフェクション）ＣＨＯ−Ｓ細胞との共培養において抗体を試験した場合には見られなかった（データ図示せず）。
【０３７７】
合計１０個のドナーを試験し、１０中５つのドナーが抗ＰＶＲＩＧ抗体に応答した。抗体ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の処理は、試験した５つのレスポンダードナーにわたって２０〜５０％の範囲のＩＦＮγ分泌増強を一貫してもたらし、一方、他の抗体での処理は明確な傾向を示さなかった（図４３）。ＣＤ８＋細胞の増殖においても同様の効果が観察された。抗体処理の効果を図４４に要約する。
【０３７８】
Ｃ．実施例３：抗ＴＩＧＩＴおよび抗ＰＤ１抗体と組み合わせたヒト黒色腫特異的ＴＩＬ機能に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の効果
１．実施例３（１）：
材料および方法
ＴＩＬ：以下の３人の黒色腫患者由来の腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を使用した：（１）ＴＩＬ−４１２−ＨＬＡ−Ａ２−Ｍａｒｔ１特異的、（２）ＴＩＬ−Ｆ４−ＨＬＡ−Ａ２−ｇｐ１００特異的、および（３）ＴＩＬ−２０９−ＨＬＡ−Ａ２−ｇｐ１００特異的。
【０３７９】
ＴＩＬを、１０％のヒト血清（Ｓｉｇｍａ、Ｈ３６６７）＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３５０５０−０３８）＋１％のピルビン酸ナトリウム（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０４２−１Ｂ）＋１％の非必須アミノ酸（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０１−３４０−１Ｂ）＋１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０３１−１Ｂ）＋３００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、５０９１２９）を補充したＩＭＤＭ（ＢＩ、０１−０５８−１Ａ）完全培地内で解凍した。
【０３８０】
腫瘍細胞株：ヒト黒色腫細胞Ｍｅｌ−６２４は、ＭＨＣ−ＩハプロタイプＨＬＡ−Ａ２との関連でＭＡＲＴ−１およびｇｐ−１００抗原を発現する。細胞を、１０％ＦＢＳ（ＢＩ、０４−１２７−１Ａ）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ＢＩ、０３−０２５−１Ｂ）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３５０５０−０３８）、および１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０３１−１Ｂ）を補充した完全ＤＭＥＭ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０１−０５５−１Ａ）中で培養した。
【０３８１】
抗ＰＶＲＩＧ、抗ＴＩＧＩＴ、およびＰＤ１遮断抗体の存在下でのＴＩＬと６２４黒色腫細胞との共培養：黒色腫特異的ＴＩＬ活性に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体（ＣＰＡ．７．０２１）、抗ＴＩＧＩＴ（クローン１０Ａ７）、および抗ＰＤ１（ｍＡｂ１Ｂ８、Ｍｅｒｃｋ）の効果を評価するために、ＴＩＬ（３×１０４細胞／ウェル）を、単剤処理（１０μｇ／ｍＬ）または併用処理（各々最終１０μｇ／ｍＬ）で、試験抗体または関連アイソタイプ対照と共にプレインキュベートした後、６２４黒色腫標的細胞を１：３のエフェクター：標的比で添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２中で一晩（１８時間）インキュベートした。
【０３８２】
ＴＩＬ活性化の評価：培養上清を収集し、ＣＢＡキット（カタログ番号５６０４８４、ＢＤ）を用いてサイトカイン分泌について分析した。
【０３８３】
インビトロ抗ＰＶＲＩＧ単剤療法、ならびに抗ＴＩＧＩＴおよびＰＤ１遮断抗体との併用療法：Ｆ４ＴＩＬ（ｇｐ１００特異的）をＭｅｌ−６２４細胞と１：３のエフェクター：標的比で１８時間培養した。共培養上清を収集し、分泌サイトカインの存在について試験した。抗ＴＩＧＩＴまたは抗ＰＤ１の処置は、ＩＦＮγ分泌レベルにもＴＮＦ分泌レベルにも影響を及ぼさなかった。しかしながら、抗ＰＶＲＩＧと組み合せた抗ＴＩＧＩＴまたは抗ＰＤ１を共培養に組み合せて添加したときに、ＩＦＮγレベルおよびＴＮＦレベルの増加が観察された（図１０Ａ〜Ｂ）。
【０３８４】
抗ＰＶＲＩＧ、抗ＴＩＧＩＴ、およびＰＤ１単独での処理は、６２４Ｍｅｌと共培養したＴＩＬからのＩＦＮγレベルにもＴＮＦ分泌レベルにも影響を及ぼさなかったが、抗ＴＩＧＩＴまたは抗ＰＤ１抗体を抗ＰＶＲＩＧ（ＣＰＡ．７．０２１）と組み合せて添加したときに、ＩＦＮγおよびＴＮＦレベルの増加が観察された。提示したデータは、抗ＴＩＧＩＴまたは抗ＰＤ１抗体との併用療法に相乗効果があることを示唆する。
【０３８５】
２．実施例３（２）：
ここでもまた、抗ＴＩＧＩＴ抗体と組み合わせてＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞機能を増強する抗ＰＶＲＩＧ抗体の能力を初代インビトロ細胞ベースのアッセイにおいて評価した。
【０３８６】
ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３アッセイ：ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３アッセイを利用して、ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、および市販の抗ＴＩＧＩＴ抗体の組み合わせが、Ｔ細胞増殖、およびサイトカイン分泌を単一の抗ＰＶＲＩＧまたは抗ＴＩＧＩＴ抗体処理よりも大きく増加させ得るかどうかを決定した。共培養アッセイに使用した標的細胞は、抗ヒトＣＤ３抗体クローンＯＫＴ３（ＯＫＴ３と略記）の１本鎖可変断片、およびヒトＰＶＲＬ２（ｈＰＶＲＬ２と略記）を安定に過剰発現する、チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ−Ｓ（ＡＴＣＣ）であった。ＣＨＯ−ＯＫＴ３親細胞を、４０ｍＭのグルタマックス、ペニシリン／ストレプトマイシン、および６μｇ／ｍｌのピューロマイシンを補充した無血清ＣＤ−ＣＨＯ培地中で増殖させた。ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２細胞を、４０ｍＭのグルタマックス、ペニシリン／ストレプトマイシン、６μｇ／ｍｌのピューロマイシン、および６００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを補充した無血清ＣＤ−ＣＨＯ培地中で増殖させた。
【０３８７】
ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびヒトＣＤ８＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）をそれぞれ用いて、健康なヒトドナーから初代ＣＤ３＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離し、液体窒素中で凍結した。共培養アッセイの当日、ＣＤ３＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を解凍し、計数し、１μのＭＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３７℃で１０分間標識した。このインキュベーション後、Ｔ細胞を洗浄し、１０％熱失活ＦＢＳ、グルタマックス、ペニシリン／ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および５０μＭのβ−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩを含有する完全培地に再懸濁させた。ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２細胞を培養物から採取し、マイトマイシンＣで３７℃で１時間、周期的に混合しながら処理した。インキュベーション後、標的細胞を完全に洗浄し、計数し、完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁させた。アッセイは、Ｔ細胞（１００，０００）対標的細胞（２０，０００）の比が５：１であるように設定した。標的細胞、Ｔ細胞、および１０μｇ／ｍｌの各抗体処理剤を９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に一緒に添加し、３７℃で３日間（ＣＤ８＋Ｔ細胞）、または５日間（ＣＤ４＋Ｔ細胞）のいずれかにわたってインキュベートした。抗体処理剤には、ヒトＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）ＩｇＧ４単独、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照とマウス抗ヒトＴＩＧＩＴの組み合わせ（クローンＭＢＳＡ４３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ならびにＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）および抗ＴＩＧＩＴ（クローンＭＢＳＡ４３）の組み合わせが含まれた。さらに、マウス抗ヒトＤＮＡＭ−１  ＩｇＧ１（クローンＤＸ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（クローンＭＯＰＣ２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、およびヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照の活性も評価した。
【０３８８】
３または５日間のインキュベーション期間の後、共培養上清を、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＴＮＦα、およびＩＦＮγを含む分泌されたサイトカインについて、サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）ヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標）ヒトＴｈサイトカインキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて分析した。Ｔ細胞増殖を、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ固定可能アクア死細胞染色キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、抗ＣＤ４抗体（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、および抗ＣＤ８抗体（クローンＨＩＴ８ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色することによって測定し、生存、ＣＦＳＥ低増殖ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージにゲートをかけた。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）およびＰｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）ソフトウェアを使用して解析した。
【０３８９】
結果：ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）および抗ＴＩＧＩＴ抗体の組み合わせは、単一抗体処理と比較してＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を増強する：ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）ヒト化ハイブリドーマ由来ＰＶＲＩＧ抗体が、抗ＴＩＧＩＴ抗体と組み合わせた場合にインビトロで初代ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を増強する能力を、ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３アッセイで評価した。
【０３９０】
図３３ＡおよびＢは、ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２標的細胞との共培養、ならびに抗ＰＶＲＩＧおよび抗ＴＩＧＩＴ抗体での単独または組み合わせた処理に応答して増殖する、２つの異なるドナー由来のＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。これらの２つの代表的なヒトＣＤ３＋Ｔ細胞ドナーにおいて、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）および抗ＴＩＧＩＴ抗体との組み合わせは、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）単独、またはＩｇＧ４アイソタイプおよび抗ＴＩＧＩＴ抗体の組み合わせと比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を増加させる。抗ＤＮＡＭ−１抗体は、両方のドナーにおいてＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較してＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を低減する。
【０３９１】
ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）および抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖およびＩＦＮ−ｇ分泌を増強する図３４Ａは、ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３アッセイにおいて、ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）が抗ＴＩＧＩＴ抗体と組み合わせてＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増加させる能力を示す。代表的なヒトＣＤ８＋Ｔ細胞ドナーにおいて、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）および抗ＴＩＧＩＴ抗体の組み合わせは、Ｔ細胞がＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２細胞と共培養されたときに、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増加させる。抗ＰＶＲＩＧおよび抗ＴＩＧＩＴ抗体の組み合わせは、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）単独、またはｈＩｇＧ４アイソタイプに抗ＴＩＧＩＴ抗体を加えた処理よりも大きく増殖を増加させる。図３４Ｂは、上述の同じ代表的なヒトＣＤ８＋Ｔ細胞ドナーにおいて、抗ＴＩＧＩＴ抗体と組み合わせたヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）もまた、ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３アッセイにおいてＩＦＮγ分泌を増強することを示す。抗ＰＶＲＩＧおよび抗ＴＩＧＩＴ抗体の組み合わせは、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）単独、またはｈＩｇＧ４アイソタイプに抗ＴＩＧＩＴ抗体を加えた処理よりも大きくＩＦＮγ分泌を増加させる。抗ＤＮＡＭ−１抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞増殖およびＩＦＮγ産生の両方を低減する。
【０３９２】
要約および結論
まとめると、ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）および抗ＴＩＧＩＴ抗体は、初代細胞ベースのＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３アッセイにおいてインビトロでの機能活性を有していた。ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）および抗ＴＩＧＩＴ抗体の組み合わせは、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）または抗ＴＩＧＩＴ抗体のいずれか単独での処理と比較して、ＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌の増加をもたらした。まとめると、これらのデータは、２つのチェックポイント受容体、ＰＶＲＩＧおよびＴＩＧＩＴの共遮断が、単一の受容体遮断と比較してＴ細胞機能を増加させたことを実証する。
【０３９３】
ＴＩＧＩＴはＣＤ１１２とは相互作用せず（ＰＶＲＬ２、Ｚｈｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２０１６）：１−１０の図４Ｅおよび４Ｆを参照されたい）、むしろ、異なるリガンドであるＰＶＲと相互作用することに留意されたい。ＰＶＲは、ＺｈｕらのＣＨＯ／ＣＤ１１２系で発現される。したがって、ａＣＤ１１２Ｒ（抗ＰＶＲＩＧ抗体）および抗ＴＩＧＩＴの併用効果についての発明者らの解釈では、ａＣＤ１１２Ｒ／ａＰＶＲＩＧは、ヒトＣＤ１１２ＲのヒトＣＤ１１２との相互作用を遮断しているが、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ヒトＴＩＧＩＴの、（Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞上の）ヒトまたはハムスターＰＶＲとの相互作用を遮断しており、Ｚｈｕらは、ＣＨＯ  ＣＤ１１２アッセイにおいて抗ＣＤ１１２Ｒ／抗ＴＩＧＩＴ併用効果が生じている理由についての仮説を実際には提供していない。即ち、併用効果はＰＶＲＬ２／ＣＤ１１２リガンド単独によるものではない。
【０３９４】
Ｄ．実施例４：カニクイザル交差反応性に基づく抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体のエピトープマッピング
論理的根拠および目的
この研究の目的は、カニクイザル（ｃｙｎｏ）オルソログに対する抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体の交差反応性を決定するＰＶＲＩＧタンパク質上のエピトープを特定することである。ヒトＰＶＲＩＧ標的に対する抗体の多くは、これらの抗体の多くが同じエピトープビンに属するという事実にもかかわらず、多様な程度のカニクイザル交差反応性を示す。ヒト／カニクイザル交差反応性（またはその欠如）の分子的根拠を明らかにするために、ＰＶＲＩＧ組み換えタンパク質においていくつかのカニクイザルからヒトへの変異を設計し、発現させて精製し、ＥＬＩＳＡにおいて抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体のパネルへの結合について試験した。
【０３９５】
方法
カニクイザルからヒトへのＰＶＲＩＧバリアントの設計：ヒトおよびＰＶＲＩＧ  ＥＣＤの配列アライメントは、ヒトオルソログとカニクイザルオルソログとの間の９０％の配列同一性および９３％の配列相同性を示す。変異領域の変異の性質（保存対非保存）および二次構造予測（コイル対伸展）に基づいて、カニクイザルＰＶＲＩＧの３つの部位指向性変異を設計して、カニクイザル交差反応性に焦点を当てたエピトープマッピングを探った。これらの変異体には、Ｈ６１Ｒ、Ｐ６７Ｓ、およびＬ９５Ｒ／Ｔ９７ＩカニクイザルＰＶＲＩＧが含まれる。野生型カニクイザルおよびヒトＰＶＲＩＧも生成した。
【０３９６】
カニクイザル、ヒト、およびハイブリッドＰＶＲＩＧバリアントの発現および精製：全てのＰＶＲＩＧバリアントを、哺乳類細胞中でＣ末端６ＸＨｉｓタグとのＥＣＤ融合物として発現させた。タンパク質を、親和性精製、イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。精製したタンパク質をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に緩衝液交換し、４℃で保管した。
【０３９７】
ＰＶＲＩＧ−抗体相互作用を決定するためのＥＬＩＳＡ：機能的ＥＬＩＳＡを以下のように行った：カニクイザル、ヒト、およびカニクイザル／ヒトハイブリッドＰＶＲＩＧ（Ｈｉｓタグ融合）組換えタンパク質を４℃で一晩ＩＡプレートに吸着させた。コーティングしたプレートウェルをＰＢＳで２回すすぎ、３００μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中５％の脱脂粉乳、ｐＨ７．４）と共に室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去し、プレートをＰＢＳでさらに２回すすいだ。プレートに結合したＰＶＲＩＧバリアントを、溶液（５０μＬ／ウェルの体積で０．１μｇ／ｍＬ〜８μｇ／ｍＬの線形範囲）中の抗ヒトＰＶＲＩＧ  ｍＡｂ（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）と共に室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、次いでＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識二次抗体を添加した（ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメイン特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）。これを１時間室温でインキュベートし、プレートを再度洗浄した。５０μＬのＳｕｒｅｂｌｕｅ  ＴＭＢ基質（ＫＰＬ  Ｉｎｃ）を添加し、５〜２０分間インキュベートすることによって、全てのウェルにおいてＥＬＩＳＡシグナルを発現させた。５０μＬの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（ＶＷＲ）を添加することによってＨＲＰ反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光シグナルをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）またはＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）分光光度計で読み取った。データをＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）にエクスポートし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）においてプロットした。
【０３９８】
結果
カニクイザル交差反応性の決定基としてのＳ６７、Ｒ９５、およびＩ９７残基：図１８に示す結合データは、Ｓ６７、Ｒ９５、およびＩ９７残基が種々の抗体のカニクイザル交差反応性に影響を及ぼすことを明確に示す。Ｐ６７Ｓのカニクイザルからヒトへの変異がＣＰＡ．７．００２およびＣＰＡ．７．０４１の結合に負の影響を及ぼす一方、Ｌ９５Ｒ／Ｔ９７Ｉのカニクイザルからヒトへの変異は、ＣＰＡ．７．００２、ＣＰＡ．７．０２１、ＣＰＡ．７．０２８、およびＣＰＡ．７．０４１の結合を顕著に改善する。他方では、Ｈ６１Ｒのカニクイザルからヒトへの変異は、試験した抗体のいずれの結合にも影響しない。
【０３９９】
カニクイザルからヒトへのバリアントへの相対的結合は、以下の３つのエピトープ群を示唆する：カニクイザル、ヒト、およびハイブリッドＰＶＲＩＧバリアントへの抗体の相対的結合は、以下の３つの明確に異なるエピトープ群を示唆する。群１はＲ９５／Ｉ９７残基（ＣＰＡ．７．０２１およびＣＰＡ．７．０２８）に結合する。群２は、Ｓ６７およびＲ９５／Ｉ９７残基（ＣＰＡ．７．００２およびＣＰＡ．７．０４１）に結合する。群３は、Ｓ６７にもＲ９５／Ｉ９７残基（ＣＰＡ．７．０２４およびＣＰＡ．７．０５０）にも結合しない。エピトープ群は、これらの抗体のカニクイザル交差反応性の程度との強い相関を示す（図１９）。
【０４００】
要約および結論：ＰＶＲＩＧ  ＥＣＤにおけるカニクイザルからヒトへの多様性に基づく制限されたエピトープマッピングにより、Ｓ６７、Ｒ９５、およびＩ９７残基を、抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体のカニクイザル交差反応性の決定基として特定した。ＣＰＡ．７．０２１およびＣＰＡ．７．０２８抗体についてのＬ９５Ｒ／Ｔ９７ＩカニクイザルＰＶＲＩＧへの結合の完全回復、ならびにこの変異体へのＣＰＡ．７．００２の改善した結合は、Ｒ９５およびＩ９７残基がこれらの抗体に不可欠なヒトＰＶＲＩＧエピトープであることを強く示唆する。これらの知見はまた、非ヒト霊長類ＰＶＲＩＧオルソログに対する交差反応性を、それらの一次アミノ酸配列に基づいて予測する可能性のある方法も示唆する。
【０４０１】
Ｅ．実施例５：ヒト化抗体：ヒト化抗ＰＶＲＩＧハイブリドーマ由来抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の結合および受容体−リガンド遮断分析
この実験は、Ｊｕｒｋａｔ細胞上で発現されたＰＶＲＩＧ抗原への結合に対する競合を評価することによって、細胞株および主要白血球上のヒトおよびカニクイザルＰＶＲＩＧタンパク質へのＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の結合を特徴付けるため、ＰＶＲＩＧおよびＰＶＲＬ２間の相互作用を遮断するＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の能力を特徴付けるため、ならびにＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２の互いに対するエピトープ空間を特徴付けるために行った。
【０４０２】
ｈＰＶＲＩＧ過剰発現細胞のＦＡＣＳ解析：以下の細胞株を使用して、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の特異性を評価した：ＨＥＫ親およびＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ過剰発現細胞。これらの細胞を、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）＋グルタマックス（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ過剰発現細胞については、陽性選択のために０．５ｕｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ）も培地に添加した。ＦＡＣＳ解析のため、全ての細胞株を対数増殖期に採取し、ウェル当たり５０，０００〜１００，０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種した。非コンジュゲートＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）（ｈＩｇＧ４）ならびにそれらのそれぞれの対照の結合を、氷上で１０ｕｇ／ｍｌで開始する８点滴定系列で３０分間〜１時間評価した。滴定系列は３倍段階希釈として実施した。非コンジュゲート一次抗体を、抗ヒトＦｃ  Ａｌｅｘａ  ６４７コンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で検出した。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）およびＰｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）ソフトウェアを使用して解析した。
【０４０３】
ｈＰＶＲＩＧに対するヒト細胞株のＦＡＣＳ解析：以下の細胞株を使用して、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の発現および特異性を評価した：ＪｕｒｋａｔおよびＨｅｐＧ２。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＲＰＭＩ培地＋１０％のウシ胎仔血清、グルタマックス、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＨｅｐＧ２細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清＋グルタマックス中で培養した。ＦＡＣＳ解析のため、全ての細胞株を対数増殖期に採取し、ウェル当たり５０，０００〜１００，０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種した。非コンジュゲートＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）（ｈＩｇＧ４）ならびにそれらのそれぞれの対照の結合を、氷上で１０ｕｇ／ｍｌで開始する８点滴定系列で３０分間〜１時間評価した。非コンジュゲート一次抗体を、抗ヒトＦｃ  Ａｌｅｘａ  ６４７コンジュゲート抗体で検出した。滴定系列は３倍段階希釈として実施した。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩまたはＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔｅを使用してデータを得て、ＦｌｏｗＪｏおよびＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析した。
【０４０４】
ＣＭＶで増殖させたＣＤ８  Ｔ細胞上のＰＶＲＩＧのＦＡＣＳ分析：ＣＭＶ反応性ドナーをＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＣＴＬ）から購入した。供給されたＰＢＭＣを、１０μＭのＣＭＶペプチド４９４〜５０３（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ、Ａｎａｓｐｅｃ）で２時間パルスした。続いてＰＢＭＣを３回洗浄した後、それらをＲＰＭＩ＋１０％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）、グルタマックス、ペニシリン／ストレプトマイシン、ならびに２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）からなるサイトカイン増殖カクテル中、２４ウェルプレートに９日間プレートした。９日後、非接着性細胞を採取し、ＣＤ８  Ｔ細胞濃縮について表現型を決定し、液体窒素中で貯蔵した。
【０４０５】
ＣＭＶで増殖させたＣＤ８  Ｔ細胞上での発現を評価するために、非コンジュゲートＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）（ｈＩｇＧ４）ならびにそれらのそれぞれの対照の結合を、氷上で６６６ｎＭで開始する８点滴定系列で３０分間〜１時間評価した。滴定系列は４倍段階希釈系列として実施した。非コンジュゲート一次抗体を、抗ヒトＦｃ  Ａｌｅｘａ  ６４７コンジュゲート抗体で検出した。ＦｌｏｗＪｏおよびＰｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを解析し、ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０で収集した。
【０４０６】
カニクイザルＰＶＲＩＧ操作された過剰発現細胞のＦＡＣＳ解析：以下の細胞株を使用して、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）のカニクイザルＰＶＲＩＧ（ｃＰＶＲＩＧ）との交差反応性を評価した：ｅｘｐｉ親およびｅｘｐｉ  ｃＰＶＲＩＧ過剰発現細胞。これらの細胞をＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清＋グルタマックス中で培養した。ｅｘｐｉ  ｃＰＶＲＩＧ一過性過剰発現細胞を、Ｎｅｏｎトランスフェクション系を使用して、ｃＰＶＲＩＧ  ＤＮＡの親ｅｘｐｉ細胞へのエレクトロポレーションによって生成した。ＦＡＣＳ解析のために、ｅｘｐｉ  ｃＰＶＲＩＧ細胞をトランスフェクションから１〜３日後に使用した。親ｅｘｐｉ細胞を対数増殖期から採取した。各種類、ウェル当たり５０，０００〜１００，０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種した。非コンジュゲートＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）（ｈＩｇＧ４）ならびにそれらのそれぞれの対照の結合を、氷上で１０ｕｇ／ｍｌで開始する８点滴定系列で３０分間〜１時間評価した。滴定系列は３倍段階希釈として実施した。非コンジュゲート一次抗体を、抗ヒトＦｃ  Ａｌｅｘａ  ６４７コンジュゲート抗体で検出した。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩまたはＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔｅを使用してデータを得て、ＦｌｏｗＪｏおよびＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析した。
【０４０７】
細胞ベースの受容体−リガンド遮断アッセイ：ＰＶＲＩＧとそのリガンドＰＶＲＬ２との相互作用を阻害するＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の能力を、２つの配向において細胞競合アッセイで評価した。
【０４０８】
第１の配向では、ＰＶＲＬ２を、操作されていないＨＥＫ細胞上で内因性で発現させ、ＨＥＫ細胞への可溶性ビオチン化ＰＶＲＩＧ  Ｆｃ結合を遮断するＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の能力を測定した。より具体的には、ビオチン化ＰＶＲＩＧ  Ｆｃタンパク質（３３ｎＭ）ならびにＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）（１．０３〜１９８ｎＭ、ｈＩｇＧ４）を１００，０００個のＨＥＫ細胞に同時に添加し、氷上で１時間インキュベートした。その後、ビオチン化ＰＶＲＩＧ  Ｆｃ結合の程度を、氷上で２０〜３０分間、ストレプトアビジンＡｌｅｘａ  ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加することによって検出した。細胞を、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩを使用した取得のために、ＰＢＳ中で２回洗浄した。データを、ＦｌｏｗＪｏ、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）、およびＰｒｉｓｍを使用して解析した。
【０４０９】
第２の配向では、ＨＥＫ細胞を、ヒトＰＶＲＩＧ（ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ）を発現するように操作し、可溶性ヒトＰＶＲＬ２  Ｆｃを阻害するＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）（ｈＩｇＧ４）の能力を評価した。より具体的には、ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞を、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）（０．６６〜６６ｎＭ）と共に氷上で３０分間プレインキュベートした後、ＰＶＲＬ２  ｍＦｃ（マウスＦｃを有するヒトＰＶＲＬ２）を添加し（氷上で１時間）、ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧに結合するその能力を測定した。ＰＶＲＬ２  ｍＦｃ結合の程度を、その後、氷上で２０〜３０分間、ヤギ抗マウスＡ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加することによって検出した。細胞を、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩを使用した取得のために、ＰＢＳ中で２回洗浄した。データを、ＦｌｏｗＪｏ、Ｅｘｃｅｌ、およびＰｒｉｓｍを使用して解析した。
【０４１０】
細胞ベースのエピトープ空間分析：ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）のエピトープ空間を、Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合について他方と競合するそれらの能力の基づいて評価した。簡潔に述べると、Ｊｕｒｋａｔ細胞を対数増殖期に採取し、氷上で３０分間、５０μｇ／ｍｌの非標識ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）で染色した。その後、Ｊｕｒｋａｔ細胞をスピンダウンし、洗浄し、氷上で３０分間、５μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ  ６４７標識ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）で対比染色した。Ｊｕｒｋａｔ細胞上での、非標識抗体とのＰＶＲＩＧ結合に対する標識抗体の競合を、フローサイトメトリーによるＡｌｅｘａ  ６４７シグナルの規模によって評価した。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩを使用してデータを得て、ＦｌｏｗＪｏ、Ｅｘｃｅｌ、およびＰｒｉｓｍを使用して解析した。
【０４１１】
結果
ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、過剰発現細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、およびヒトＴ細胞上でＰＶＲＩＧを認識する：ヒトＰＶＲＩＧに結合するＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）ヒト化ハイブリドーマ由来ＰＶＲＩＧ抗体の能力を、ヒトＰＶＲＩＧを過剰発現するＨＥＫ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、および初代Ｔ細胞を用いて評価した。図２０は、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）（Ａ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）（Ｂ）の両方の特異性を示す。両抗体が、ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞に高度に特異的に結合し、ＨＥＫ親細胞には結合しない。
【０４１２】
結合親和性：また、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は両方とも、高い親和性でＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞への結合を示し、それらの関連するＫｄ値は、ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞への結合に関してＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）が０．２９ｎＭ、ＣＨＡ７．５３８．１．２が０．８６ｎＭである。
【０４１３】
図２１は、ＰＶＲＩＧを内因性で発現するＪｕｒｋａｔ細胞に結合するＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）（Ａ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）（Ｂ）の能力を例示する。両方とも、ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞に対するのと同等の親和性でＪｕｒｋａｔ細胞に結合することができる。
【０４１４】
Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するこれらの抗体の親和性は、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）が０．１５ｎＭ、ＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）が０．５９ｎＭである。
【０４１５】
図２２は、ＣＭＶペプチド（４９４〜５０３、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）への曝露によって増殖した、ＰＶＲＩＧを内因性で発現するＣＤ８Ｔ細胞に結合する、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の能力を例示する。
【０４１６】
ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、ｅｘｐｉ細胞上で発現されるカニクイザルＰＶＲＩＧ（ｃＰＶＲＩＧ）を検知する：ｃＰＶＲＩＧに結合するＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の能力を、ｃＰＶＲＩＧを過剰発現するｅｘｐｉ細胞を用いて評価した。図２３は、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）（Ａ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）（Ｂ）の両方の特異性を例示する。両抗体が、ｅｘｐｉ  ｃＰＶＲＩＧ細胞に高度に特異的に結合し、ｅｘｐｉ親細胞には結合しない。また、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は両方とも、高い親和性でｅｘｐｉ  ｃＰＶＲＩＧ細胞への結合を示し、それらの関連するＫｄ値は、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）が０．２４ｎＭ、ＣＨＡ７．５３８．１．２が０．５８ｎＭである。
【０４１７】
細胞ベースの受容体−リガンド遮断アッセイ：ＰＶＲＩＧとＰＶＲＬ２との相互作用を阻害するＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の能力を、プロトコルの節に概説されるように、２つの配向において評価した。第１の順列では、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の両方が、ＰＶＲＩＧ  ＦｃのＨＥＫ細胞への結合を完全に阻害することができた（図２４Ａ）。この遮断能力に関連するＩＣ５０値は、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）が１５ｎＭ、ＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）が１６．１ｎＭである。重要なことに、ＰＶＲＩＧに結合することが確認されたハイブリドーマ計画に由来する抗体の全てが、ＰＶＲＩＧ  ＦｃのＨＥＫ細胞への結合を遮断できたわけではなかった。図２４Ｂに示すように、ＣＨＡ．７．５４４と表記される抗体クローンは、ＰＶＲＩＧ  ＦｃのＨＥＫ細胞への結合を遮断することができない。
【０４１８】
第２の順列では、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の両方がまた、ＰＶＲＩＧ  ＦｃのＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞への結合を完全に阻害することができた（図２５Ａ）。この阻害に関連するＩＣ５０値は、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）が１．８ｎＭ、ＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）が２．５３ｎＭである。ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の能力は、第１の順列におけるＰＶＲＩＧ  Ｆｃ結合を阻害するそれらの能力と一致して、この順列においてＰＶＲＬ２  Ｆｃ結合を完全に阻害することができたが、他の抗体はこの同じ傾向を示さなかった。より具体的には、ＰＶＲＩＧ  ＦｃのＨＥＫ細胞への結合を完全に阻害することができた（第１の順列、データ図示せず）別のヒト化ハイブリドーマ由来抗体ＣＨＡ．７．５３０．３は、ＰＶＲＬ２  Ｆｃ結合のＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞への結合を完全に阻害することができなかった（図２５Ａ）。まとめると、このデータは、細胞ベースの受容体リガンド遮断アッセイの第２の順列が、第１の順列と比較して受容体−リガンド遮断抗体の効力をより高い感度で区別できることを示している。重要なことに、ＣＨＡ．７．５４４は、ＨＥＫ細胞へのＰＶＲＩＧ  Ｆｃ結合を遮断する能力の欠如と一致して、ＨＥＫ  ｈＰＶＲＩＧ細胞へのＰＶＲＬ２  Ｆｃの結合を遮断することができないことが示された（図２５Ｂ）。
【０４１９】
細胞ベースのエピトープ空間分析：プロトコルの節に概説されるように、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）のエピトープ空間の分析を、ＰＶＲＩＧ結合に対して競合するそれらの能力を評価することによって実施した。図２６は、抗体の非コンジュゲート型が同じ抗体のＡｌｅｘａ  ６４７（Ａ６４７）コンジュゲート型の結合を阻害する能力を示す。図２６のデータは、Ａ６４７コンジュゲート抗体の、競合がない場合にそれらが生み出す最大シグナルに対するパーセンテージ結合を図示する。ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）Ａ６４７およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）Ａ６４７から得られたシグナルは、Ｊｕｒｋａｔ細胞のアイソタイプ対照（データ図示せず）とのプレインキュベーションの影響を受けなかった。予想通り、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）Ａ６４７およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）Ａ６４７から得られたシグナルは、それら自体の非コンジュゲート型と競合した場合に有意に低下した（データ図示せず）。興味深いことに、反対の抗体の非コンジュゲート型とのプレインキュベーションの関連でＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）からのＡ６４７シグナルを分析してもまた、有意な低下があった。これは、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）が、内因性で発現されたＰＶＲＩＧ上で同様のエピトープ空間を共有し得ることを示す。
【０４２０】
要約および結論：ＣＨＡ．７．５１８およびＣＨＡ．７．５３８と表記される抗ＰＶＲＩＧ抗体のマウス型は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ（ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ））に首尾よくヒト化され、ヒトＰＶＲＩＧ抗原に対する結合特性を保持した。操作された過剰発現細胞、Ｊｕｒｋａｔ、およびＣＭＶ増殖初代ＣＤ８Ｔ細胞を用いて、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、内因性ヒトＰＶＲＩＧに高度に特異的であり、かつ高い親和性で結合することが示された。さらに、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）はまた、カニクイザルＰＶＲＩＧ抗原に対する反応性も示し、過剰発現細胞に高い親和性で結合した。機能的には、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）はまた、ＦＡＣＳベースのアッセイにおいてＰＶＲＩＧとＰＶＲＬ２との相互作用を阻害することもできた。最後に、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合に対して互いに競合する能力から、内因性ヒトＰＶＲＩＧ上でエピトープ空間を共有する可能性があることが示された。
【０４２１】
Ｆ．実施例６：ヒト化抗体：ヒト化抗体の機能解析
本発明のいくつかのヒト化抗体の機能活性を検証した。
【０４２２】
ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３アッセイ：ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３アッセイを利用して、ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、ならびにサイトカイン分泌を増強し得るかどうかを決定した。共培養アッセイに使用した標的細胞は、抗ヒトＣＤ３抗体クローンＯＫＴ３（ＯＫＴ３と略記）の１本鎖可変断片を安定に過剰発現するか、またはＯＫＴ３およびヒトＰＶＲＬ２（ｈＰＶＲＬ２と略記）の両方を安定に過剰発現するかのいずれかである、チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ−Ｓ（ＡＴＣＣ）であった。ＣＨＯ−ＯＫＴ３親細胞を、４０ｍＭのグルタマックス（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、および６μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充した無血清ＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２細胞を、親細胞と同じＣＤ−ＣＨＯ培地中で増殖させたが、６００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Ｇｉｂｃｏ）も補充した。
【０４２３】
ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびヒトＣＤ８＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）をそれぞれ用いて、健康なヒトドナーから初代ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離し、液体窒素中で凍結した。共培養アッセイの当日、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を解凍し、計数し、１μのＭＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３７℃で１０分間標識した。このインキュベーション後、Ｔ細胞を洗浄し、１０％熱失活ＦＢＳ、グルタマックス、ペニシリン／ストレプトマイシン、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、および５０μＭのβ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）を含有する完全培地に再懸濁させた。ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３およびＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２細胞を培養物から採取し、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で３７℃で１時間、周期的に混合しながら処理した。インキュベーション後、標的細胞を完全に洗浄し、計数し、完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁させた。アッセイは、Ｔ細胞（１００，０００）対標的細胞（２０，０００）の比が５：１であるように設定した。標的細胞、Ｔ細胞、および１０μｇ／ｍｌの各抗体処理剤を９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に一緒に添加し、３７℃で３日間（ＣＤ８＋Ｔ細胞）、または５日間（ＣＤ４＋Ｔ細胞）のいずれかにわたってインキュベートした。ＰＶＲＩＧ抗体処理剤には、ヒトＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）ＩｇＧ４、ヒトＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）ＩｇＧ４、ヒトＣＨＡ．７．５３０．３ＩｇＧ４（部分受容体／リガンド遮断抗体）、およびマウスＣＨＡ．７．５４４  ＩｇＧ１（非受容体／リガンド遮断抗体）が含まれた。ＰＶＲＩＧ抗体に加えて、マウス抗ヒトＤＮＡＭ−１  ＩｇＧ１（クローンＤＸ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（クローンＭＯＰＣ２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、およびヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照活性も評価した。抗体用量滴定のために、６６ｎＭ〜０．２６４ｎＭのＰＶＲＩＧ抗体の３倍希釈液、およびそれぞれのアイソタイプ対照抗体を利用した。
【０４２４】
３または５日間のインキュベーション期間の後、共培養上清を、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＴＮＦα、およびＩＦＮγを含む分泌されたサイトカインについて、サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）ヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標）ヒトＴｈサイトカインキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて分析した。Ｔ細胞増殖を、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ固定可能アクア死細胞染色キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、抗ＣＤ４抗体（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、および抗ＣＤ８抗体（クローンＨＩＴ８ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色することによって測定し、生存、ＣＦＳＥ低増殖ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージにゲートをかけた。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）およびＰｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）ソフトウェアを使用して解析した。
【０４２５】
結果
ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、ｈＰＶＲＬ２依存的様態でＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を増強する：ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）ヒト化ハイブリドーマ由来ＰＶＲＩＧ抗体が、インビトロで初代ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を増強する能力を、ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３アッセイで評価した。図２７Ａは、ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２標的細胞および異なるＰＶＲＩＧ抗体との共培養に応答して増殖する、代表的なドナー由来のＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。このドナーにおいて、ヒト化ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照（破線）と比較してＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を増加させる。部分受容体／リガンド遮断抗体、ヒトＣＨＡ．７．５３０．３ＩｇＧ４はＴ細胞増殖をわずかにしか増強しないが、非受容体／リガンド遮断抗体であるマウスＣＨＡ．７．５４４ＩｇＧ１は、アイソタイプ対照抗体と比較して効果がない。抗ＤＮＡＭ−１抗体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を低減する。図２７Ｂは、ヒト化ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）ＰＶＲＩＧ抗体、ならびに抗ＤＮＡＭ−１抗体の効果が標的細胞上でのｈＰＶＲＬ２過剰発現に依存することを実証する。ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．１抗体処理の後、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２細胞と共培養したときに、ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３親細胞との共培養と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖のより大きな増加が観察される。同様に、抗ＤＮＡＭ−１抗体は、Ｔ細胞をｈＰＶＲＬ２発現ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３細胞と共培養したときにのみ、ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖を減少させる。
【０４２６】
ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖およびＩＦＮ−ｇ分泌を増強する：図２８Ａ〜Ｂは、ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３アッセイにおいて、ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）がＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増加させる能力を例示する。２つの異なるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞ドナーにおいて、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）抗体は、Ｔ細胞をＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２細胞と共培養したときに、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を増加させる。しかしながら、マウスＣＨＡ．７．５４４ＩｇＧ１はほとんどから全く効果がない。ＣＤ４＋Ｔ細胞で観察されるように、抗ＤＮＡＭ−１抗体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を低減する。図２８Ｃは、ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）がまた、ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３アッセイにおいてＩＦＮγ分泌を増強することを示す。３つの異なるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞ドナーにおいて、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照（破線）と比較してＩＦＮγ産生を増加させる。ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）抗体処理後に、ＩＬ−１０、ＩＬ２２およびＴＮＦαの増加も観察された（データ図示せず）。
【０４２７】
ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、複数のヒトドナーにわたってＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を一貫して増強する：次に、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）ａｎｄ  ＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）抗体がＴ細胞機能を再現可能に増強し得ることを実証するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖に対するヒト化ＰＶＲＩＧ抗体の効果を、ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３アッセイにおいて１１の異なるドナーにわたって試験した。図２９は、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の両方が、Ｔ細胞をＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２細胞と共培養したときに、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体と比較して、試験されたドナーの大部分においてＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を一貫して増加させたことを実証する。さらに、部分受容体／リガンド遮断抗体ＣＨＡ．７．５３０．３、および非受容体／リガンド遮断抗体ＣＨＡ．７．５４４は、同じドナーにわたってＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を一貫しては増強しない。
【０４２８】
ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖に用量依存的効果を有する：最後に、ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の用量依存的効果をＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３アッセイにおいて測定した。ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）抗体の用量を減少させると、Ｔ細胞をＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３  ｈＰＶＲＬ２細胞と共培養したときのＣＤ４＋Ｔ細胞（図３０Ａ）、およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図３０Ｂ）の増殖パーセントが低下する。このＴ細胞増殖に対する用量依存的効果は、ＣＨＡ．７．５４４抗体またはＩｇＧ４アイソタイプ対照では観察されない。さらに、用量滴定による二相性効果は観察されなかったことから、ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体のアゴニスト活性の欠如が示唆される。
【０４２９】
要約および結論
ヒト化ＰＶＲＩＧ抗体、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、初代細胞ベースのＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３アッセイにおいてインビトロ機能活性を有していた。ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）はいずれも用量依存的様態でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を増加させた。ＣＨＯ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）はまた、ＣＨＯ−Ｓ  ＯＫＴ３アッセイにおいてＩＦＮγ分泌を増強することができた。ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）抗体の活性は、標的細胞上のｈＰＶＲＬ２の過剰発現に依存することが示された。ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）およびＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、複数のヒトドナーにわたってＴ細胞活性を一貫して増強したが、非遮断ＣＨＡ．７．５４４抗体はほとんどかた全く効果がなかった。
【０４３０】
Ｇ．実施例７：マウスＰＶＲＩＧに対するラットモノクローナル抗体の開発
ラットモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の開発はＡｌｄｅｖｒｏｎ  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ（ドイツ）で行われた。マウスＰＶＲＩＧタンパク質に対する抗体は、ＤＮＡ免疫技術を用いて産生された。宿主生物（ラット）に導入されたマウスＰＶＲＩＧを発現する免疫化ベクター。マウスＰＶＲＩＧを発現させ、免疫反応を生じさせた。マウスＰＶＲＩＧを一過性で発現する細胞に対して陽性抗血清同定およびハイブリドーマスクリーニングを分析した。
【０４３１】
ラット抗マウスＰＶＲＩＧ  ｐＡｂ生成
マウスＰＶＲＩＧタンパク質に対するラットポリクローナル抗体の開発には、マウスＰＶＲＩＧ細胞外ドメインのＡｌｄｅｖｒｏｎ専有免疫化ベクターへのクローニング、ならびに全長および細胞外ドメインのＡｌｄｅｖｒｏｎ専有スクリーニングベクターへのクローニングが含まれた。免疫化およびスクリーニングに使用した種々の発現ベクターを、マウスＰＶＲＩＧを一過性で発現する細胞におけるＦＡＣＳによって確認した。次いで、３匹のラットを免疫化ベクターで免疫化した。免疫血清を採取し、希釈した血清を、スクリーニングベクターで一過性でトランスフェクトした細胞を用いてＦＡＣＳにより試験した。各ラットからの産生血液を採取し、プロテインＡを用いた精製を行った。
【０４３２】
ラット抗マウスＰＶＲＩＧ  ｍＡｂ生成
ラットリンパ球の融合およびＡｌｄｅｖｒｏｎの試験系を用いた選択を行った。これには、２０×９６ウェルプレートの融合、続いて、マウスＰＶＲＩＧ  ＥＣＤ（細胞外ドメイン）またはＦＬ（全長）により一過性でトランスフェクトした細胞における、細胞ベースのＥＬＩＳＡ（ｃＥＬＩＳＡ）による初期スクリーニングが含まれた。１０８個の陽性クローン（マウスＰＶＲＩＧ  ＥＣＤ￥ＦＬを発現する細胞に結合した）をさらに増殖させ、再試験した。３０個の陽性クローンをＴ−２５フラスコ中に増殖させ、上清を細胞ベースのＥＬＩＳＡにおいて試験した。２３個のハイブリドーマクローンをさらなるサブクローニングのために選択した。血清を含まない上清をｃＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳにより試験した。合計２１個のクローンが生成され、マウスＰＶＲＩＧタンパク質を過剰発現する細胞において結合が確認された。
【０４３３】
抗体の特徴付け
ラット抗マウスＰＶＲＩＧ試験採取血液、精製ｐＡｂ、プレクローンおよびクローン上清ならびに精製ｍＡｂの結合を、フローサイトメトリーによって、マウスＰＶＲＩＧを過剰発現する安定ＨＥＫ２９３細胞を用いて分析した。マウスＰＶＲＩＧを内因性で発現するＤ１０．Ｇ４．１細胞への抗体の結合も試験した。マウスＰＶＲＩＧの特異的細胞表面発現が確認された。細胞（１〜２×１０５）をＰＢＳ中で１：１０００に希釈した固定可能生存率染料で、室温で１０分間染色し、続いてＰＢＳで細胞を洗浄した。その後、抗体を細胞に加え（ＦＡＣＳ緩衝液中で希釈）、続いてヤギ抗ラット−ＰＥ（ＦＡＣＳ緩衝液中で１：１００に希釈）で染色した。
【０４３４】
ｍＡｂ特異性を、マウスＰＶＲＩＧを内因性で発現するＤ１０．Ｇ４．１細胞系のＰＶＲＩＧトランスフェクションについてｓｉＲＮＡによって試験した。マウスＰＶＲＩＧノックダウン後に細胞表面の減少が観察された。
【０４３５】
ＮＫ細胞へのｍＡｂ結合もＦＡＣＳにより試験した。
ビンニングアッセイを実施して、ｍＡｂの多様性を実証した。
精製ｍＡｂの親和性（Ｋｄ）を、マウスＰＶＲＩＧを過剰発現する安定細胞対空ベクター形質導入細胞、およびＤ１０．Ｇ４．１細胞株に対するＦＡＣＳ滴定によって決定した。細胞（１×１０５）をＰＢＳ中で１：１０００に希釈した固定可能生存率染料で、室温で１０分間染色し、続いてＰＢＳで細胞を洗浄した。その後、抗体を細胞に加え（８つの濃度、１：３段階希釈、１０〜０．０１μｇ／ｍｌをＦＡＣＳ緩衝液中に希釈）、続いてヤギ抗ラット−ＰＥ（ＦＡＣＳ緩衝液中で１：１００に希釈）で染色した。
【０４３６】
ｍＡｂの特徴付け−要約表
表７（列１〜１０）は、抗マウスＰＶＲＩＧ抗体の特徴付けのために生成されたデータを要約する。
●列１は抗体コードＩＤを表す
●列２は、Ａｌｄｅｖｒｏｎによって提供された抗体名を表す
●列３は、１０μｌ／ｍｌのｍＡｂ濃度での、空ベクター形質導入細胞に対する、安定した過剰発現細胞上のＭＦＩ比率としてのＦＡＣＳデータを表す
●列４は、過剰発現ＨＥＫ細胞上の親和性（ｎＭ）を表す
●列５は、１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ濃度でのＮＫ細胞への結合を表す
●列６は、アイソタイプ対照に対する、Ｄ１０．Ｇ４．１細胞株の結合のＭＦＩ比率を表す
●列７は、Ｄ１０．Ｇ４．１細胞株に対する親和性（ｎＭ）を表す
●列８は、エピトープビニングアッセイにおける種々のビンを表す
●列９は、受容体−リガンド遮断％アッセイ（マウスＰＶＲＬ２過剰発現細胞へのマウスＰＶＲＩＧ−Ｆｃ融合タンパク結合）およびＩＣ５０（ｎＭ）を表す
●列１０は、受容体−リガンド遮断％アッセイ（マウスＰＶＲＩＧ過剰発現細胞へのマウスＰＶＲＬ２−Ｆｃ融合タンパク結合）およびＩＣ５０（ｎＭ）を表す
【０４３７】
ＡＢ−４０６およびＡＢ−４０７は、両方の受容体−リガンド結合アッセイにおいて遮断活性を実証し、相対的に高い親和性を有し、ＮＫおよびＤ１０．Ｇ４．１細胞に結合する。
【０４３８】
これらの抗体を、ＴＭＥ発現およびインビボ研究のために選択した。
【０４３９】
表７．抗マウスＰＶＲＩＧモノクローナル抗体の特徴付け。
【表２】
2019533984.tif 000004
【０４４０】
Ｈ．実施例８：追加の免疫チェックポイント阻害剤との併用試験
背景
ＣＴＬＡ４およびＰＤ１経路の抗体遮断が、がんの有効な治療法として浮上しているが、患者の大部分は長期的な利益を得ておらず、追加の免疫チェックポイントの標的化の必要性が示唆される。独自の計算アルゴリズムを用いてＢ７／ＣＤ２８ファミリーの新たな成員を定義することにより、発明者らはＴ細胞およびＮＫ細胞の複数のサブセットによって発現されるＰＶＲＩＧを同定した。ここでは、この分子を標的とする遮断抗体の発現パターン、機能的特徴付け、および抗腫瘍活性を報告する。
【０４４１】
方法
Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォームを利用して、ＰＶＲＩＧを潜在的な新規免疫チェックポイントとして同定した後、レトロウイルス細胞スクリーニングライブラリーを使用して同族の結合相手を同定した。Ｔ細胞調節に対する標的効果を、標的過剰発現、ノックダウン、およびアンタゴニスト抗体アプローチを利用して、初代および腫瘍由来のＴ細胞アッセイで評価した。ヒトタンパク質に対する抗体をインビトロでのＴ細胞活性化を増強する能力についてスクリーニングし、一方でマウスのオルソログを標的とする抗体を、同系モデルにおける腫瘍増殖阻害に対する効果についてインビボで評価した
【０４４２】
結果
ＰＶＲＩＧ−Ｆｃ融合タンパク質がＰＶＲＬ２に結合することが見出され、その結合特異性はＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリー分析の両方によって確認された。ＰＶＲＩＧは、メモリーＴ細胞、ならびにＮＫ細胞およびγδ  Ｔ細胞上の標的の検出を伴って、Ｔ細胞活性化時に固有の発現動態を実証した。ＰＶＲＩＧとＰＶＲＬ２との相互作用を遮断する能力を有する高親和性ヒト抗体のパネルを生成し、それはインビトロで試験したときに、ＰＶＲＬ２依存性機構による初代ＣＤ４＋および腫瘍由来ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を増強することが示された。
【０４４３】
ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）はマウス交差反応性ではないため、インビボ研究は代理遮断抗マウスＰＶＲＩＧ抗体を用いて行った。抗ＰＤＬ−１遮断と組み合わせた場合、抗マウスＰＶＲＩＧは、ＣＴ２６結腸直腸癌モデルおよびＭＣ３８結腸直腸癌モデルの両方において定着した腫瘍の増殖を阻害する。追加の免疫チェックポイント阻害剤との、ならびにＰＶＲＩＧノックアウトマウスにおける併用試験は進行中である。
【０４４４】
結論
高親和性アンタゴニスト抗体は、ヒトＴ細胞活性化を増強することができ、同様の特性を有する代理抗体は、複数の同系モデルにおいてインビボでＰＤ−Ｌ１との相乗作用を示す。全体として、本発明者らのデータは、がん治療のための他のＢ７ファミリーチェックポイントに加えてＰＶＲＩＧを標的とする有用性を実証している
【０４４５】
Ｉ．実施例９：インビボＰＯＣ研究：ＣＴ２６腫瘍モデルにおける抗ＭＰＶＲＩＧ  ＭＡＢの有効性
この実施例は、単剤療法としてまたは抗ＰＤＬ−１治療と組み合わせたＣＴ２６マウス結腸癌モデルにおける抗ｍＰＶＲＩｇ  ｍＡｂ治療の有効性を記載する。
【０４４６】
材料および方法
腫瘍刺激実験：
ＣＴ２６結腸癌は、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−２６３８）から購入した。細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０４−１２７−１Ａ）、および１００μｇ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３−０３１−１Ｂ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０１−１００−１Ａ）中で培養した。腫瘍移植のために、細胞を採取し、洗浄し、計数し、冷ＲＰＭＩ  １６４０中で１０７個の細胞／ｍｌに懸濁させ、氷中に置いた。ＢＡＬＢ／ｃマウス（（雌、８週齢）Ｅｎｖｉｇｏ）に１０％ケタミン（Ｃｌｏｒｋｅｔａｍ、ＳＡＧＡＲＰＡＱ−７０９０−０５３）および１０％キシラジン（Ｓｅｄａｘｙｌａｎ、ＢＥ−Ｖ２５４８３４）混合物を腹腔内注射して麻酔した。次に、マウスの背部を剃毛し、７０％エタノール溶液で消毒した。腫瘍細胞を５×１０５個のＣＴ２６細胞５０μｌとして、マウスの背部右脇腹に皮下注射した。腫瘍接種後４日目（単剤処理）または７日目（併用処理）、腫瘍が３０〜５０ｍｍ３の体積であったとき（単剤処置）または６０〜９０ｍｍ３の体積（併用処置）の体積に達したときにｍＡｂ投与を開始し、３週間にわたって総計６回の投与で２００ｕｌの最終体積／注射を腹腔内（ｉ．ｐ．）与えた。腫瘍増殖は、２〜３日毎に電子キャリパーで測定し、０．５×Ｗ２×Ｌｍｍ３と報告された。マウスは、研究終了時、または次の臨床的エンドポイントのいずれかが生じたときにＣＯ２を用いて屠殺した：腫瘍体積２２５０ｍｍ３以上の腫瘍体積、腫瘍の潰瘍形成、体重減少２０％以上の体重減少、または瀕死の外観。
【０４４７】
抗体：
ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプモノクローナル抗体（ｍＡｂ）として設計された、この研究で使用したキメラ抗マウスＰＶＲＩｇ抗体（ｍＡｂ  ４０６およびｍＡｂ  ４０７）は、ｍＰＶＲＩｇを発現する２９３ＨＥＫトランスフェクタントに結合し、ｍＰＶＲＬ２のこれらの細胞への結合を遮断することが示された。この研究で使用したｍＩｇＧ１抗マウスＰＤＬ−１阻害剤は、ｍＡｂ  ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０であった。ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０抗体は、ＷＯ２０１０／０７７６３４（ＷＯ２０１０／０７７６３４の配列番号２０および２１にそれぞれ示される重鎖および軽鎖可変領域配列）に記載され、その中に開示される配列を有する、抗ＰＤ−Ｌ１である。
【０４４８】
全てのｍＡｂは滅菌ＰＢＳ中で製剤化し、内毒素が低かった（＜０．０５ＥＵ／ｍｇ）。
【０４４９】
表８．試験したｍＡｂ。
【表３】
2019533984.tif 000005
【０４５０】
研究設計
単剤処置
８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスをＥｎｖｉｇｏから購入し、実験開始前に１週間ＳＰＦ動物施設で維持した。マウスを麻酔し、剃毛し、５×１０５個のＣＴ２６腫瘍細胞５０μｌを皮下接種した。腫瘍接種後４日目で、マウスをｎ＝１０の処置群に無作為割付した（以下に記載する）。接種後４、７、１１、１４、１８および２１日目にｍＡｂ（以下に詳述する）注射してマウスを処置した。腫瘍増殖を２〜３日ごとにキャリパーで測定した。
【０４５１】
表９．処置群。
【表４】
2019533984.tif 000006
【０４５２】
併用処置
抗ｍＰＶＲＩｇおよび抗ｍＰＤＬ−１ｍＡｂ処置の併用に関して。マウスを単剤処置に記載したように処置した。腫瘍接種後７日目で、マウスをｎ＝１０の処置群に無作為割付した（以下に記載する）。接種後７、１１、１４、１８、２１および２５日目にｍＡｂ（以下に詳述する）を注射してマウスを処置した。
【０４５３】
表１０．処置投薬量。
【表５】
2019533984.tif 000007
【０４５４】
統計解析：
ＪＵＭＰ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ  ＴＭ）ソフトウェアを使用して、反復測定による二元ＡＮＯＶＡ、続いて選択された群の対についての反復測定による二元ＡＮＯＶＡを行った。全ての研究動物が生存していた最後の日に測定した腫瘍体積を比較することによって、腫瘍増殖の測定の分析を行った。腫瘍のないマウスのパーセンテージの統計的有意差を、Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ  Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定によって決定した。Ｐ＜０．０５の値を有意とみなした。
【０４５５】
＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。各実験について、実施した反復実験の数および群当たりの動物の数が、対応する図の凡例（複数可）に記載される（図４７〜４８）。
【０４５６】
結果
同系ＣＴ２６腫瘍モデルにおける抗ｍＰＶＲＩｇおよび抗ｍＰＤＬ−１の単剤療法活性
マウス同系ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて、抗ｍＰＶＲＩｇおよび抗ｍＰＤＬ−１単剤療法の前臨床評価を開始した。マウスをｍＩｇＧ１アイソタイプ抗ＰＤＬ−１抗体（ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０）またはｒＩｇＧ２ｂアイソタイプ抗ｍＰＶＲＩｇ（ｍＡｂ  ４０６および４０７）で処置した。
【０４５７】
ＣＴ２６結腸癌の半治療的処置モデルにおいて、抗ＰＤＬ−１を用いた単剤療法は、ほとんどのマウスにおいて有意に効果的であり（Ｐ＜０．０００１）、対照ｍＩｇＧ１アイソタイプと比較して７０％のＴＧＩを引き出し、迅速な腫瘍拒絶と共に腫瘍拒絶の率がより大きく、持続的な抗腫瘍免疫が観察された（図６３Ａ＋Ｂ）。
【０４５８】
抗ｍＰＶＲＩｇ  ｍＡｂ  ４０６および抗ｍＰＶＲＩｇ  ｍＡｂ  ４０７のいずれかで処置した群は、ｒＩｇＧ２ｂアイソタイプと比べてＴＧＩがなく同様の腫瘍増殖率を示した（図６３Ａ＋Ｂ）。したがって、抗ＰＤＬ−１  ｍＩｇＧ１処置は、１０個体のうちの５個体でマウスの生存を延長させ（Ｐ＜０．０１、図６３Ｃ）、完全な腫瘍排除を実証した（図６３Ｂ）。生存率に対する抗ｍＰＶＲＩｇ  ｍＡｂの効果は観察されなかった。
【０４５９】
同系マウス腫瘍モデルにおける抗ＰＶＲＩｇおよび抗ＰＤＬ−１併用の活性
次に、マウス同系腫瘍モデルにおける抗ＰＶＲＩｇおよび抗ＰＤＬ−１併用療法の活性を評価した。
【０４６０】
ＣＴ２６結腸癌の治療的処置モデルにおいて、接種後７日目に開始した、対照ｒＩｇＧ２ｂアイソタイプ処置と共にした抗ＰＤＬ−１投与は効果的でなかった一方で、抗ＰＶＲＩｇ  ｍＡｂ  ４０７と抗ＰＤＬ−１との組み合わせは、有意なＴＧＩ（５６％、Ｐ＝０．０００５）を引き出し、１０個体のうちの４個体で完全な腫瘍排除を実証して（図６４Ａ＋Ｂ）腫瘍拒絶率がより高く、持続的な抗腫瘍免疫が検出されて（Ｐ＜０．０１、図６４）より良好な抗腫瘍活性を促進した。抗ＰＶＲＩｇ  ｍＡｂ  ４０６と抗ＰＤＬ−１との組み合わせは部分的に効果的であり、３３％のＴＧＩをもたらしたが、記録された抗腫瘍応答は一過性であり、生存率への効果は観察されなかった。
【０４６１】
結論
ｍＰＶＲＩｇは新規のＢ７様分子として、したがって抗体ベースの癌免疫療法の潜在的標的としての役割を果たすことが予測された。いくつかのヒトインビトロ実験系では、ｍＰＶＲＩｇに対する免疫調節効果を実証されている。この報告書で提示される研究では、発明者らは、ｍＰＶＲＩｇに対するｍＡｂのインビボ抗癌作用を評価した。この研究では、最小の疾患設定、即ち４日目の治療開始（腫瘍平均４０ｍｍ３）における単剤療法としての１０ｍｇ／ｋｇ（２００ｕｇ／マウス）の抗ｍＰＶＲＩｇによる処置は、ＴＧＩも生存に関する利点ももたらさなかったが、陽性対照抗ＰＤＬ−１  ｍＡｂは有意なＴＧＩを示し、生存期間延長をもたらした。
【０４６２】
抗ｍＰＶＲＩｇ  ｍＡｂはまた、抗ＰＤＬ−１処置と組み合わせても試験した。腫瘍が７５ｍｍ３の平均サイズに達する７日目に１０ｍｇ／ｋｇ（２００μｇ／マウス）での処置を開始した。治療的ＣＴ２６モデルにおける抗ｍＰＶＲＩｇ  ｍＡｂ  ４０７と抗ＰＤＬ−１との併用療法は、処置マウスの腫瘍増殖阻害および生存期間延長を示した。腫瘍増殖に対する効果は個々のマウス間で異なり、完全な腫瘍排除を実証した個体もあれば、部分応答（一過性ＴＧＩ）を示した個体もあり、いくつかの個体は応答しなかった。抗ｍＰＶＲＩｇおよび抗ｍＰＤＬ−１併用処置のインビボ効果もまた、ＭＣ３８およびＢ１６−Ｄｂ／ｇｐ１００腫瘍モデルにおいて示された（データ図示せず）。
【０４６３】
追加の同系モデルにおける、または追加の治療化合物もしくはレジメンと組み合わせた用量依存性および有効性を評価するために、さらなるインビボ研究が計画されている。
【０４６４】
Ｊ．実施例１０：ファージディスプレイによるＴＩＧＩＴ治療用抗体の発見
１．序論
組換えヒトＴＩＧＩＴ細胞外ドメインを標的抗原として用いて、ナイーブヒトｆａｂライブラリからヒトＴＩＧＩＴ結合因子を単離するためにファージディスプレイ抗体発見計画を行った。４５個の新規ヒトＴＩＧＩＴ特異的抗体を単離し、本明細書で考察されるようにヒンジ領域に任意のＳ２４１Ｐを含めて、ヒトＩｇＧ４として生成した。得られた抗体を、ＴＩＧＩＴ−ＰＶＲ相互作用を遮断する能力および細胞により発現されたカニクイザルＴＩＧＩＴとの交差反応性について、フローサイトメトリーによってスクリーニングした。これらの抗体のうちの２つは、より高いヒトおよびカニクイザルＴＩＧＩＴ結合親和性のためにさらに最適化した。
【０４６５】
２．プロトコル
ファージディスプレイによる抗体発見のための抗原：ファージディスプレイにおいてヒトＴＩＧＩＴタンパク質の２つの型を抗原として使用した。第１のものは、Ｃ末端ポリヒスチジンタグに融合したヒトＴＩＧＩＴ  ＥＣＤ（Ｍｅｔ２２−Ｐｒｏ１４１）（ｈＴＩＧＩＴ−ＨＩＳ）で構成され、これは研究室内で生成したか、またはＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から商業的に入手した。第２の抗原型は、Ｃ末端でヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインに融合したヒトＴＩＧＩＴ  ＥＣＤ（ｈＴＩＧＩＴ−ｈＦｃ）で構成され、これは研究室内で生成したか、またはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから商業的に入手した。
【０４６６】
抗原の機能的ＱＣ：バイオパンニングに使用した組換えＴＩＧＩＴ抗原は、ヒトＴＩＧＩＴのリガンドであるヒトＰＶＲに結合する能力により機能的に有効性が確認された。ビオチン化抗原を、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーのいずれかによってＰＶＲ結合について試験した。ビオチン化ｈＴＩＧＩＴ−ＨＩＳは、ＥＬＩＳＡによってｈＰＶＲ−ｈＦｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）に結合する能力により有効性が確認された。ビオチン化ｈＴＩＧＩＴ−ｈＦｃは、Ｅｘｐｉ２９３細胞上での内因性で表面発現されたＰＶＲに結合する能力について、フローサイトメトリーによって有効性が確認された。
【０４６７】
ヒト抗体ライブラリーのファージパンニング：ヒトＴＩＧＩＴ−ＨＩＳ（計画１）またはヒトＴＩＧＩＴ−ｈＦｃ（計画２）のいずれかを抗原として利用する２つのファージ計画を実行した。パンニング反応を、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用して溶液中で実行し、ビオチン化ＴＩＧＩＴ抗原を提示させた。両計画とも、最初の発見のためにヒトｆａｂ抗体ファージディスプレイライブラリを使用した。それぞれのヒトＴＩＧＩＴ抗原を使用し、各々後続するパンニング回毎により高い洗浄ストリンジェンシーおよびより低い抗原濃度を用いて、３回のパンニングを実施した。計画１で生成した抗体ＣＰＡ．９．００２を、Ｌ−ＣＤＲ３の飽和突然変異誘発によりファージライブラリーを生成し、得られたライブラリーをヒトＴＩＧＩＴ−ＨＩＳに対してパンニングすることによって、改善されたヒトＴＩＧＩＴ結合のために最適化した（計画３）。計画２および３でそれぞれ生成した２つの抗体ＣＰＡ．９．０５９およびＣＰＡ．９．０２７もまた、改善されたヒトＴＩＧＩＴ親和性およびカニクイザルＴＩＧＩＴ交差反応性のために最適化した（計画４）。各抗体について、ファージライブラリーを２つのＣＤＲ（Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、またはＬ−ＣＤＲ３の任意の組み合わせ）の飽和突然変異誘発によって生成した。得られたファージライブラリを、ヒトＴＩＧＩＴ−ＨＩＳおよびＣ末端ＨＩＳタグ融合カニクイザルＴＩＧＩＴ  ＥＣＤ組換えタンパク質に対して各回交互にパンニングして、４回にわたってパンニングした。使用したパンニング抗原は以下の通りであった：第１回目は１ｎＭのヒトＴＩＧＩＴ−ＨＩＳ、第２回目は１ｎＭのカニクイザルＴＩＧＩＴ−ＨＩＳ、第３回目は０．１ｎＭのヒトＴＩＧＩＴ−ＨＩＳ、第４回目は０．１ｎＭのカニクイザルＴＩＧＩＴ−ＨＩＳ。
【０４６８】
ｆａｂ断片として発現される抗体を用いた結合スクリーニング：ファージミド構築物は、それがＦａｂ発現ベクターとして機能することを可能にするアンバー停止コドンを含む。これらのベクターのＥ．ｃｏｌｉへの形質転換およびイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による誘導は、可溶性ｆａｂ分子のペリプラズム発現をもたらす。大腸菌ペリプラズムに分泌されたＦａｂタンパク質を、結合スクリーニングのために浸透圧ショックによって抽出した。
【０４６９】
ＥＬＩＳＡによる一次スクリーニング：ｆａｂのＰＰＥ抽出物を、ＥＬＩＳＡによってパンニング抗原ｈＴＩＧＩＴ−ＨＩＳまたはｈＴＩＧＩＴ−ｈＦｃへの結合について試験した。ＥＬＩＳＡスクリーニングからの陽性ヒットを、重鎖および軽鎖特異的プライマーを用いて配列決定した。配列を組み立て、解析した。クローンは、重鎖ＣＤＲ３に非保存的差異が２つ以上あった場合に配列固有性と見なした。
【０４７０】
フローサイトメトリーによる二次スクリーニング：配列固有性ＥＬＩＳＡ陽性ｆａｂクローンを選択し、フローサイトメトリーによってヒトＴＩＧＩＴ過剰発現Ｅｘｐｉ２９３細胞に結合する能力について分析した。親Ｅｘｐｉ２９３細胞を各ｆａｂ試料の陰性対照として用いた。
【０４７１】
ｆａｂヒットの再フォーマットおよびヒトＩｇＧ４分子としての産生：考えられるヒトＴＩＧＩＴ結合ｆａｂを、さらなる特徴付けのために完全長ヒトＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐヒンジ変異体を含む（参照によりその全体が、特にＳ２４１Ｐの考察に関して本明細書に組み込まれるＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０２  １０５：９−１９、およびその中で引用される参考文献１、２および３を参照されたい））に変換した。タンパク質発現構築物を、ｐＵＮＯ３ベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）にサブクローニングした可変重鎖および軽鎖配列のＰＣＲ増幅によって得た。
【０４７２】
３．結果
ヒトＴＩＧＩＴ組換えタンパク質の機能的ＱＣ：研究室内で生成したか、または商業的に入手した、ｈＴＩＧＩＴ−ＨＩＳおよびｈＴＩＧＩＴ−ｈＦｃ組換えタンパク質は、ヒトＰＶＲに結合する能力により機能的に有効性が確認された。ヒトＰＶＲ（Ｆｃコンジュゲート）は、ＥＬＩＳＡにおいてビオチン化ｈＴＩＧＩＴ−ＨＩＳへの用量依存的結合を示した（データ図示せず）。ＰＶＲをＥＬＩＳＡプレート上に固定化し、ｈＴＩＧＩＴ−ＨＩＳが溶液中にあった逆配向で、同様の結合が観察された（データ図示せず）。
【０４７３】
ｈＴＩＧＩＴ−ｈＦｃタンパク質は、フローサイトメトリーアッセイにおいてＰＶＲに結合することにより機能的に有効性が確認された。このアッセイでは、ヒトＰＶＲを内因性で発現するＥｘｐｉ２９３細胞に対してｈＴＩＧＩＴ−ｈＦｃタンパク質を滴定した。ＡＦ６４７蛍光標識にコンジュゲートした抗ｈＦｃ二次抗体を用いて相互作用を検出した。無関係なＦｃタンパク質を対照として使用した（データ図示せず）。
【０４７４】
機能アッセイは、以下の実施例に記載されるように、いくつかの候補に対して行った。
【０４７５】
Ｆａｂ断片として発現された抗体を用いた親和性成熟結合スクリーニング：ペリプラズム抽出したｆａｂクローンの８つの９６ウェルプレートを、デノボ計画（１および２）について分析した。計画１では標的抗原としてｈＴＩＧＩＴ−ＨＩＳタンパク質を用いて７３個の固有のクローンを同定した。フローサイトメトリーによる７３個のＥＬＩＳＡ陽性クローンの二次スクリーニングにより、ヒトＴＩＧＩＴ過剰発現Ｅｘｐｉ２９３細胞への結合について２１個を陽性と特定した。計画２（標的抗原としてのｈＴＩＧＩＴ−ｈＦｃ）に関する同様のスクリーニングで、３７個のＥＬＩＳＡ陽性クローンが得られ、そのうちの２４個はまた、フローサイトメトリーによりヒトＴＩＧＩＴ過剰発現Ｅｘｐｉ２９３細胞への結合についても陽性であった（図５２）。
【０４７６】
Ｆａｂクローン（ＰＰＥとして）の２つの９６ウェルプレートを、最適化／親和性成熟化計画（３および４）のためにスクリーニングした。ＥＬＩＳＡ陽性の固有のバリアントを、フローサイトメトリーでヒトおよび／またはカニクイザルＴＩＧＩＴ過剰発現Ｅｘｐｉ２９３細胞への結合についてスクリーニングした。ｈＴＩＧＩＴ−ＨＩＳタンパク質に対する上位クローンの結合親和性をまた、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。ＣＰＡ．９．００２抗体の親和性成熟の第１のサイクルは、Ｌ−ＣＤＲ３における変異、および組換えヒトＴＩＧＩＴに対する結合親和性の少なくとも３倍の改善を有する、５つの新たな抗体、ＣＰＡ．９．０２１、ＣＰＡ．９．０２７、ＣＰＡ．９．０４４、ＣＰＡ．９．０４８、およびＣＰＡ．９．０４９を生み出した。ＣＰＡ．９．０２７抗体の最適化の第２のサイクルは、組換えヒトＴＩＧＩＴへの結合の少なくとも２５倍の改善を有する４つの新たな抗体を生み出した。新たなバリアントは、Ｈ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３（ＣＰＡ．９．０８３およびＣＰＡ．９．０８６）に、追加的にＣＰＡ．９．０８９およびＣＰＡ．９．０９３に関してはＬ−ＦＲ４に変異を示した。ＣＰＡ．９．０５９の最適化は、カニクイザルＴＩＧＩＴへの有意に改善された結合、ならびにＣＰＡ．９．１０３に関してはヒトＴＩＧＩＴ結合の有意な改善を有する、２つの新たな抗体、ＣＰＡ．９．１０１およびＣＰＡ．９．１０３をもたらした。両方の新たなバリアントについて、Ｈ−ＣＤＲ３およびＬ−ＣＤＲ１に変異が観察された。さらに、ＣＰＡ．９．１０１についてはＬ−ＦＲ１の軽微な変化が観察された。
【０４７７】
ｈＩｇＧ４へのＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ陽性ｆａｂの再フォーマット：ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーにおいてヒトＴＩＧＩＴ結合に陽性の４５個の固有のｆａｂを、本明細書で考察される任意選択のＳ２４１Ｐヒンジバリアントを含めた、ヒトＩｇＧ４分子として発現するように再フォーマットした。さらに、１１個の親和性最適化バリアントもＩｇＧ４として再フォーマットした。選択されたファージ由来抗体の配列を図５３に示す。２つのベンチマーク抗体であるＢＭ２６（ＷＯ２０１６／０２８６５６、クローン３１Ｃ６）およびＢＭ２９（ＵＳ２０１６／０１７６９６３、クローン２２Ｇ２）の配列も比較のために図５３に示す。再フォーマットした抗体を、ヒトＴＩＧＩＴ過剰発現Ｅｘｐｉ２９３細胞への結合について評価し、結合曲線を生成して平衡結合定数（ＫＤ）を算出した。これらの抗体をまた、細胞ベースのアッセイにおいて、カニクイザルＴＩＧＩＴ過剰発現Ｅｘｐｉ２９３細胞への結合、ならびにヒトＴＩＧＩＴとヒトＰＶＲとの間の相互作用を遮断するそれらの能力について評価した。これらの特徴付けに基づいて、これらの抗体のサブセットを、以下により詳細に記載されるインビトロ機能アッセイのために選択した。
【０４７８】
Ｋ．実施例１１：ハイブリドーマによるＴＩＧＩＴ治療用抗体の発見
１．論理的根拠および目的
当該技術分野で既知の標準的な方法を用いたハイブリドーマ技術を用いて、ヒトＴＩＧＩＴに高親和性で結合し、非ヒト霊長類（カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、カニクイザル（ｃｙｎｏ）と称される）ＴＩＧＩＴと交差反応性であり、かつＴＩＧＩＴとそのリガンドであるＰＶＲ（ＣＤ１５５）との相互作用を遮断する、マウス抗体を生成した。
【０４７９】
２．概要
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ヒトおよびカニクイザルＴＩＧＩＴ細胞外ドメインタンパク質の組換え型で免疫化した。免疫化マウスの脾臓およびリンパ節から単離した細胞をＳｐ２／０骨髄腫細胞株と融合させて、マウス抗体を分泌するハイブリドーマを生成した。ポリクローナルおよびサブクローニングされたモノクローナルハイブリドーマからの上清を、標準的なＳＰＲ法を用いて、ヒトおよびカニクイザルＴＩＧＩＴ過剰発現Ｅｘｐｉ２９３細胞への結合、ならびにヒトおよびカニクイザルＴＩＧＩＴ組換えタンパク質に対する結合親和性についてスクリーニングした。選択されたハイブリドーマ由来のマウス抗体を精製し、結合アッセイおよび機能アッセイで広範に特徴付けた。５つの機能性およびカニクイザル交差反応性マウス抗体を、ｈＩｇＧ４フレームワーク（本明細書に概説された任意選択のヒンジバリアントを含めた）およびアイソタイプを含むようにヒト化した。配列を図５３に示す。
【０４８０】
Ｌ．実施例１２：ヒトおよびカニクイザルＴＩＧＩＴを過剰発現するの細胞に結合する、ファージおよびハイブリドーマに由来する抗体のＦＡＣＳ  ＫＤ測定
１．プロトコル
以下の細胞株を調製して、ヒトファージ抗体およびマウス抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合親和性を推定した：Ｅｘｐｉ２９３親、Ｅｘｐｉ２９３ヒトＴＩＧＩＴ過剰発現、およびＥｘｐｉ２９３カニクイザルＴＩＧＩＴ過剰発現。以下のハイブリドーマおよびファージ抗体を各々、１９５ｐＭ〜２００ｎＭの結合部位濃度範囲で１１点２倍段階希釈系列において調製した：
【０４８１】
ファージにより生成された抗体：ＣＰＡ．９．０２７、ＣＰＡ．９．０４９、ＣＰＡ．９．０５９。
【０４８２】
ハイブリドーマにより生成された抗体（ヒト化前）：ＣＨＡ．９．５３６、ＣＨＡ．９．５４１、ＣＨＡ．９．５４３、ＣＨＡ．９．５４６、ＣＨＡ．９．５４７およびＣＨＡ．９．５６０。ＢＭ２６（ＷＯ２０１６／０２８６５６Ａ１、マウスＩｇＧ１としてのクローン３１Ｃ６）およびＢＭ２９（ＵＳ２０１６／０１７６９６３Ａ１、マウスＩｇＧ１としてのクローン２２Ｇ２）の２つの異なるベンチマーク抗体を含めた。
【０４８３】
各滴定の１２番目のウェルは、バックグラウンドとしての役割を果たす緩衝液のみを含有した。各細胞型を抗ヒトＴＩＧＩＴ  ｍＡｂと共に４℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、ＡＦ６４７標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）およびＡＦ６４７標識ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ番号１０３０−３０）を、ヒトｍＡｂおよびマウスｍＡｂと共にインキュベートした細胞にそれぞれ添加した。次いで、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ  ＨＴＳ機器で、各ウェルにつき５０００〜１０，０００事象の幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を記録した。ヒトＰＶＲ分子濃度の関数としてのｇＭＦＩのプロットを、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍの「１部位、特異的結合」モデルを用いて適合させて、ＫＤおよび各非線形適合の９５％信頼区間を推定した。
【０４８４】
２．結果
各ｍＡｂについて測定された２つの独立したＦＡＣＳ  ＫＤは、平均して２倍以下しか異なっていなかった。結合等温適合の９５％信頼区間と共にＫＤの単一の代表的測定値を、それぞれ図５４および図５５のヒトおよびカニクイサル過剰発現細胞の各ｍＡｂについて列挙する。ＣＰＡ．９．０５９は、カニクイザル過剰発現細胞への結合を示さなかった。全てのｍＡｂについての結合部位濃度（分子濃度の２倍）が非線形曲線適合に使用されることに留意すべきであり、つまり、このＦＡＣＳ  ＫＤ法は、分子または化学量論的結合定数ではなく結合部位定数（ｋＤ）を測定していると想定する。
【０４８５】
Ｍ．実施例１３：ＴＩＧＩＴへのＰＶＲ−ＦＣ結合を阻害する、ファージおよびハイブリドーマに由来する抗ヒトＴＩＧＩＴ  ＭＡＢのＦＡＣＳ遮断アッセイ
１．序論
このアッセイの目的は、細胞表面上で過剰発現されるヒトＴＩＧＩＴへのヒトＰＶＲの結合を阻害する、ファージおよびハイブリドーマ由来の抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体の能力を特徴付けることである。まず、ヒトＴＩＧＩＴ−ヒトＰＶＲ結合親和性を、ＦＡＣＳによって決定する。結合等温線は、遮断アッセイに用いたヒトＰＶＲの飽和濃度を示した。次に、ヒトＴＩＧＩＴ細胞を過剰発現する細胞を、ファージおよびハイブリドーマで産生された抗ＴＩＧＩＴ  ｍＡｂで滴定し、続いて飽和濃度のヒトＰＶＲを添加した。次いで、過剰発現細胞上での抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体結合を、ＦＡＣＳを用いて測定した。
【０４８６】
２．プロトコル
ＦＡＣＳ  ＫＤアッセイ：種々のヒトＰＶＲ−Ｆｃアイソタイプを、ＦＡＣＳを介して最適結合について試験し、ヒトＰＶＲ−ｈ１Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ番号１０１０９−Ｈ２０Ｈ）およびヒトＰＶＲ−ｍ２ａＦｃ（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ）がヒトＴＩＧＩＴ過剰発現細胞に対して最も高い結合レベルを示すことが決定された。２つのＰＶＲアイソタイプを各々、９８ｐＭ〜１００ｎＭの最終分子濃度範囲で、１１点滴定系列にわたって２倍段階希釈した。各滴定の１２番目のウェルは、バックグラウンドとしての役割を果たす緩衝液のみを含有した。各細胞型をｍＡｂと共に間４℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、ＡＦ６４７標識Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ番号１０９−６０６−０９８）およびＡＦ６４７標識ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ番号１０３３−３１）を、ヒトおよびマウス抗ＴＩＧＩＴ  ｍＡｂでそれぞれ滴定したウェルに添加した。次いで、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ  ＨＴＳ機器で、各ウェルにつき５０００〜１０，０００事象の幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を記録した。ヒトＰＶＲ分子濃度の関数としてのｇＭＦＩのプロットを、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍの「１部位、特異的結合」モデルを用いて適合させて、ＫＤおよび各非線形適合の９５％信頼区間を推定した。ヒトＰＶＲ−ｍ２ａＦｃおよびヒトＰＶＲ−ｈ１Ｆｃの結果をそれぞれ図５７ＡおよびＢに示す。
【０４８７】
ファージＭＡｂ遮断アッセイ：以下のファージ由来ｈＩｇＧ４抗体およびベンチマークｍＡｂを各々、２６７ｐＭ〜６．７ｎＭの結合部位濃度範囲で３点５倍段階希釈系列において調製した：ＣＰＡ．９．０２７、ＣＰＡ．９．０４９およびＣＰＡ．９．０５９、ならびにＢＭ２６（ＷＯ２０１６／０２８６５６Ａ１、ｈＩｇＧ４としてのクローン３１Ｃ６）およびＳｙｎａｇｉｓ  ｈＩｇＧ４（陰性アイソタイプ対照）。
【０４８８】
各滴定の４番目のウェルは、バックグラウンドとしての役割を果たす緩衝液のみを含有した。細胞をｍＡｂと共に４℃で１５分間インキュベートした。次いで、ヒトＰＶＲ−ｍ２ａＦｃ（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ）を４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ＡＦ６４７標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ番号１０３３−３１）を添加した。次いで、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ  ＨＴＳ機器で、各ウェルにつき５０００〜１０，０００事象の幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を記録した。ｍＡｂでプレインキュベートした細胞ついての結合ヒトＰＶＲのｇＭＦＩ値を、遮断ベンチマークｍＡｂおよび非遮断対照ｍＡｂでプレインキュベートした細胞のｇＭＦＩ値と比較した。ファージ抗体が、既知の非遮断ｍＡｂによる滴定からのシグナルと比較して、ヒトＰＶＲ−ｍ２ａＦｃ結合シグナルを低減した場合、その抗体は、その濃度のファージｍＡｂでＰＶＲ結合を遮断すると特徴付けられた。ファージｍＡｂの遮断傾向は、ＢＭ２６ベンチマークによるＰＶＲ遮断と同様であった（図５８）。
【０４８９】
ハイブリドーマＭＡｂ遮断アッセイ：以下のハイブリドーマ抗体を各々、１４ｐＭ〜１３３ｎＭの結合部位濃度範囲で１１点２．５倍希釈系列において調製した：ＣＨＡ．９．５３６、ＣＨＡ．９．５４１、ＣＨＡ．９．５４６、ＣＨＡ．９．５４７、ＣＨＡ．９．５６０、ＢＭ２６（ＷＯ２０１６／０２８６５６Ａ１、マウスＩｇＧ１としてのクローン３１Ｃ６）およびＢＭ２９（ＵＳ２０１６／０１７６９６３Ａ１、マウスＩｇＧ１としてのクローン２２Ｇ２）。
【０４９０】
各滴定の１２番目のウェルはバックグラウンドとしての役割を果たす緩衝液のみを含んでいた。細胞をｍＡｂと共に４℃で１５分間インキュベートした。次いで、ヒトＰＶＲ−ｈ１Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ番号１０１０９−Ｈ２０Ｈ）を添加し、次いで細胞を４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ＡＦ６４７標識Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を添加した。次いで、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ  ＨＴＳ機器で、各ウェルにつき５０００〜１０，０００事象の幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を記録した。ｍＡｂ結合部位濃度の関数としてのｇＭＦＩのプロットを、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍの「ｌｏｇ（阻害剤）対応答−変数傾き（４パラメーター）」モデルを用いて非線形に適合させ、各非線形適合のＩＣ５０を推定した。この実験を２日間にわたって２回繰り返した。
【０４９１】
３．結果
図５８および５９は、ファージおよびハイブリドーマ抗体の両方が、Ｅｘｐｉ２９３細胞の細胞表面上で過剰発現されるヒトＴＩＧＩＴへのヒトＰＶＲ−Ｆｃの結合を強力に遮断することを実証する。ファージおよびハイブリドーマ抗体の遮断活性は、試験した２つのベンチマーク抗体であるＢＭ２６およびＢＭ２９に匹敵する。
【０４９２】
Ｎ．実施例１４：ヒト、カニクイザル、およびマウスＴＩＧＩＴへの９つのファージ由来およびハイブリドーマ由来Ｍａｂの結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）動態研究
１．プロトコル
全ての実験は、２２℃でＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ  ３６機器を使用して行った。まず、標準的なアミンカップリングを用いて別個のＧＬＣチップ上の全ての垂直捕捉レーンおよび水平インタースポットにわたって固定化した、ヤギ抗ヒトＦｃポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ番号Ｈ１０５００）およびウサギ抗マウス抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ番号ＢＲ１００８３８）をそれぞれ用いて、高密度捕捉表面を調製した。各ＧＬＣチップにつき抗ヒト捕捉ｐ抗体および抗マウス捕捉抗体の典型的な固定化レベルは、約５０００ＲＵであった。ヒトＴＩＧＩＴはＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから入手し、一方でマウスＴＩＧＩＴモノマーおよびカニクイザルＴＩＧＩＴモノマーは研究室内で調製した。ヒト、マウス、およびカニクイザルへの結合について研究した精製ｍＡｂを以下に列挙する：
【０４９３】
ファージ抗体：ＣＰＡ．９．０２７、ＣＰＡ．９．０４９およびＣＰＡ．９．０５９
【０４９４】
ハイブリドーマ抗体：ＣＨＡ．９．５３６、ＣＨＡ．９．５４１、ＣＨＡ．９．５４３、ＣＨＡ．９．５４６、ＣＨＡ．９．５４７およびＣＨＡ．９．５６０
【０４９５】
ベンチマーク比較対象：ＢＭ２６（ＷＯ２０１６／０２８６５６Ａ１、ｈＩｇＧ４としてのクローン３１Ｃ６）およびＢＭ２９（ＵＳ２０１６／０１７６９６３Ａ１、ｈＩｇＧ４としてのクローン２２Ｇ２）。
【０４９６】
各ｍＡｂを、濾過したＢＳＡを添加して１００μｇ／ｍＬの最終濃度にした１×ＰＢＳＴである泳動緩衝液中で約０．５μｇ／ｍＬに希釈した。ＰｒｏｔｅＯｎ機器の各「シングルショット動態」サイクルにつき、異なるｍＡｂを６つの固有の垂直捕捉レーンのうちの１つの上に約１．５〜２．５分間捕捉した。ＰｒｏｔｅＯｎの緩衝液流を水平方向に切り替えた後、捕捉表面を約１５〜２０分間安定化させた。ヒトＴＩＧＩＴ（３４６ｐＭ〜８４．１ｎＭ）、カニクイザルＴＩＧＩＴ（３７１ｐＭ〜９０．２ｎＭ）、またはマウスＴＩＧＩＴ（３８２ｐＭ〜９２．９ｎＭ）の３倍希釈系列の６つの濃度を２分間注入し、続いて５０μＬ／分の流速で２０分間解離させた。二重参照のために、それぞれの一連の抗原注入の前に同一の緩衝液を注入した。抗ヒト抗体表面を１４６ｍＭのリン酸の３０秒パルス２回によって再生し、抗マウス抗体表面を１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．７）の３０秒パルス２回によって再生した。捕捉されたｍＡｂ上に注入されたＴＩＧＩＴ抗原のセンサーグラムを、ＰｒｏｔｅＯｎバージョンのスクラバーを使用して処理し、質量輸送の項を含む１：１速度論的結合モデルに適合させた。
【０４９７】
図５６は、データの信頼性が結合定数を推定するのに十分であった、得られた反応速度定数および平衡解離定数を示す（センソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）データは図示せず）。アスタリスクは、１．００×１０−５／秒で一定に保たれる必要があったｋｄ値を示す。ヒトＴＩＧＩＴに結合するクローンＣＨＡ．９．５６０等の場合、速度論的モデルはＫｄを推定することができたが、機器の感度を考慮すると、解離データのわずか２０分間後に１×１０−６／秒の桁でＫｄを正確に推定することは事実上不可能である。
【０４９８】
Ｏ．実施例１５：抗ＴＩＧＩＴ抗体の機能分析
１．原理および目的
ＴＩＧＩＴとそのリガンドＰＶＲとの相互作用を阻害し、結果として、単剤療法として、または抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と組み合わせてヒトＴ細胞活性化を増強する抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体の機能を特徴付けること。
【０４９９】
２．プロトコル
ヒトＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５  Ｊｕｒｋａｔ  ＩＬ−２ルシフェラーゼレポーターアッセイ：ヒトＴＩＧＩＴ／ＰＶＲ  Ｊｕｒｋａｔ  ＩＬ−２ルシフェラーゼレポーターバイオアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、Ｔ細胞活性化に対する抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体処理の効果を評価した。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を、組換えヒトＴＩＧＩＴおよびＩＬ−２応答要素（ＩＬ−２−ＲＥ）によって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子で安定にトランスフェクトした。刺激細胞は、組換えヒトＰＶＲを発現する人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびＴＣＲ媒介性シグナル伝達を抗原非依存的に活性化するように設計された操作された細胞表面タンパク質であった。これらの細胞を共培養した後、ヒトＴＩＧＩＴ／ヒトＰＶＲ相互作用により、ＴＣＲシグナル伝達およびＩＬ−２−ＲＥ媒介性の発光が阻害される。ヒトＴＩＧＩＴ／ヒトＰＶＲ相互作用を遮断する抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体を添加すると、阻害シグナルが放出され、Ｔ細胞活性化およびＩＬ−２−ＲＥ媒介性の発光が生じる。アッセイは製造者の指示に従って行った。簡潔には、ａＡＰＣ  ＣＨＯ−Ｋ１ヒトＰＶＲ細胞を３７℃の水浴中で解凍し、１０％ＦＢＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を補充したＦ−１２培地で希釈した。２５，０００細胞／ウェルを白色平底組織培養処理９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）上にプレートした。次いで、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ハイブリドーマおよびファージ由来の抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体、マウスＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１）、およびｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体、またはベンチマーク（ＢＭ）抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体を、１０μｇ／ｍｌの単回用量として、または２０μｇ／ｍｌで開始する１０点、２倍希釈系列で添加した。Ｊｕｒｋａｔ  ＩＬ−２−ＲＥルシフェラーゼヒトＴＩＧＩＴ細胞を３７℃の水浴中で解凍し、１０％ＦＢＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を補充したＲＰＭＩ培地で希釈した。１２５，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞を各ウェルに添加した。次いで、プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出し、３０分間室温に平衡化させた。８０μｌのＢｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加え、混合物を遮光しながら室温で１０分間平衡化させた。超高感度発光検出器を備えたＥｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、発光を定量化した。発光シグナルは相対光単位（ＲＬＵ）で報告した。
【０５００】
ヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖：ヒトＣＭＶ反応性末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（ＣＴＬ）を解凍し、２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、２ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）および１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した３７℃の完全ＲＰＭＩ培地中で１μｇ／ｍｌのＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ）によって刺激した。９日後、細胞を１：２に分割し、低用量ヒトＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ）と共に静置した。ＣＭＶ  ｐ６５／ＨＬＡ−Ａ２四量体（ＭＢＬ）を用いて、ＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を決定した。６５〜９８％四量体陽性であったＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＭＶペプチド刺激後１２日目〜１６日目の間のアッセイに利用した。
【０５０１】
ヒトＰＶＲ発現黒色腫細胞株を用いたヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞共培養アッセイ：ヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞とのインビトロ共培養アッセイを利用して、抗原特異的サイトカイン分泌に対する抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体の効果を評価した。アッセイに使用した標的細胞株は、ＨＬＡ−Ａ２＋黒色腫細胞株、ヒトＰＶＲ  ＤＮＡを含むレンチウイルスで安定に形質導入されたＭｅｌ６２４（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であった。Ｍｅｌ６２４ヒトＰＶＲ過剰発現細胞の安定なプールに、０．００３３μｇ／ｍｌまたは０．００１μｇ／ｍｌのＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチドを３７℃で１時間パルスした。次いで、細胞を洗浄し、５０，０００細胞／ウェルでプレートした。ハイブリドーマおよびファージ由来の抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体、対照ｍＩｇＧ１またはｈＩｇＧ４アイソタイプ抗体、またはＢＭ抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で加えた。ドナー２、ドナー４、およびドナー２１０として示される３種の異なるドナー由来のヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を上記プロトコルに従って増殖させた。５０，０００個のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を各ウェルに添加した。共培養物を、５％ＣＯ２と共に２４時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、プレートを１２００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を回収した。共培養上清中のヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の量を、サイトメトリービーズアッセイ（ＢＤ）を使用するフローサイトメトリーによって測定した。
【０５０２】
ヒトＰＶＲおよびヒトＰＶＲＬ２（ＣＤ１１２）発現黒色腫細胞株によるヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞共培養アッセイ：抗原特異的サイトカイン分泌に対する抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体および抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の併用効果を、上記のアッセイと同様に、ヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いたインビトロ共培養アッセイによって評価した。アッセイに使用した標的細胞株は、レンチウイルス形質導入（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を介して、それぞれＴＩＧＩＴおよびＰＶＲＩＧのリガンドであるヒトＰＶＲおよびヒトＰＶＲＬ２を安定して発現した、ＨＬＡ−Ａ２＋黒色腫細胞株Ｍｅｌ６２４であった。ヒトＰＶＲおよびヒトＰＶＲＬ２を過剰発現するＭｅｌ６２４細胞に、０．００３３μｇ／ｍｌまたは０．００１μｇ／ｍｌのＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチドを３７℃で１時間パルスした。次いで、細胞を洗浄し、５０，０００細胞／ウェルでプレートした。ハイブリドーマおよびファージ由来の抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体、またはＢＭ抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体を、１０μｇ／ｍｌのＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）または対照ｈＩｇＧ４アイソタイプ抗体と組み合わせて培養物に添加した。ドナー４、ドナー２５、およびドナー２１０として示される３種の異なるドナー由来のヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を上記プロトコルに従って増殖させた。５０，０００個のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を各ウェルに添加した。共培養物を３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを１２００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を回収した。共培養上清中のヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の量を、サイトメトリービーズアッセイ（ＢＤ）を使用するフローサイトメトリーによって測定した。
【０５０３】
３．結果
ＩＬ−２シグナル伝達を増強する抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体：ＩＬ−２シグナル伝達を増強するハイブリドーマおよびファージ由来抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体の能力を、ヒトＴＩＧＩＴ／ヒトＰＶＲ  Ｊｕｒｋａｔルシフェラーゼレポーターアッセイによって評価した。図６０および図６２は、それぞれ、ＩＬ−２シグナル伝達に対する１０μｇ／ｍｌのファージまたはハイブリドーマ由来抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体の効果を示す。３つのファージ由来抗体、ＣＰＡ．９．０２７、ＣＰＡ．９．０４９、およびＣＰＡ．９．０５９は、ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照と比較して強力にＩＬ−２シグナル伝達を増強した。加えて、３つのファージ抗体は全て、ＢＭ抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体、ＢＭ２６、およびＢＭ２９と比較して、より多くのＩＬ−２シグナル伝達を誘導した。５つのハイブリドーマ由来抗体、ＣＨＡ．９．５３６、ＣＨＡ．９．５４１、ＣＨＡ．９．５４６、ＣＨＡ．９．５４７、およびＣＨＡ．９．５６０も、ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較してＩＬ−２シグナル伝達を誘導した。注目すべきことに、５つのハイブリドーマ抗体は、ＢＭ２６およびＢＭ２９と比較して同様のＩＬ−２シグナル伝達を誘導した。抗ヒトＴＩＧＩＴ非遮断抗体であるＣＨＡ．９．５４３は、ＩＬ−２シグナル伝達を有意には増加させなかった。抗ＴＩＧＩＴ抗体の効果が用量依存的であるかどうかを決定するために、２０μｇ／ｍｌで開始する各抗体についての１０点、２倍希釈系列を用いてアッセイを実行した（図６１および６３）。ＩＬ−２シグナル伝達は、８つ全ての抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体、ならびにＢＭ２６およびＢＭ２９では用量依存的に減少した。
【０５０４】
抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体はヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌を増加させる：ＩＦＮγ分泌を調節するハイブリドーマおよびファージ由来抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体の能力を、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞／Ｍｅｌ６２４共培養アッセイによって評価した。図６４は、ＩＦＮγ分泌に対する抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体の効果を示す。３つのファージ由来抗体、ＣＰＡ．９．０２７、ＣＰＡ．９．０４９、およびＣＰＡ．９．０５９は、培地単独およびｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体と比較してＩＦＮγ分泌を増強した。加えて、５つのハイブリドーマ由来抗体、ＣＨＡ．９．５３６、ＣＨＡ．９．５４１、ＣＨＡ．９．５４６、ＣＨＡ．９．５４７、およびＣＨＡ．９．５６０も、ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較してＩＦＮγ産生を増加させた。ファージおよびハイブリドーマ由来ＴＩＧＩＴ抗体は、ＢＭ２６およびＢＭ２９と同様にＩＦＮγを誘導した。予想通り、抗ヒトＴＩＧＩＴ非遮断抗体であるＣＨＡ．９．５４３は、ＩＦＮγ分泌に有意には影響しなかった。
【０５０５】
図６５は、ＩＦＮγ分泌に対する抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体およびＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の併用効果を示す。３つのファージ由来抗体、ＣＰＡ．９．０２７、ＣＰＡ．９．０４９、およびＣＰＡ．９．０５９、ならびに５つのハイブリドーマ由来抗体、ＣＨＡ．９．５３６、ＣＨＡ．９．５４１、ＣＨＡ．９．５４６、ＣＨＡ．９．５４７、およびＣＨＡ．９．５６０（ＢＭ２６を含む）は全て、単独で、またはＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と組み合わせて処理した場合に、それぞれのアイソタイプ対照抗体と比較してＩＦＮγ分泌を増強した。抗ヒトＴＩＧＩＴ非遮断抗体であるＣＨＡ．９．５４３は、他の抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体と比較してより少ないＩＦＮγ分泌をもたらした。それぞれのアイソタイプ対照抗体に対する各抗体のＩＦＮγ分泌の増加率を図６６に要約する。抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体とＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）との併用処理において、相乗効果が観察される。
【０５０６】
４．要約および結論
ヒトＴＩＧＩＴ／ヒトＰＶＲ  Ｊｕｒｋａｔレポーターアッセイへの抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体の添加により、ＩＬ−２シグナル伝達において強力で用量依存的な増加が誘導された。加えて、抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体は、Ｍｅｌ６２４ヒトＰＶＲ細胞と共培養すると、ヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌を増加させた。ＩＦＮγの分泌は、抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体と組み合わせた抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体によってさらに増加した。まとめると、これらのデータにより、抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体がＴＩＧＩＴ媒介性のヒトＴ細胞活性化の抑制を遮断することができ、Ｔ細胞活性化がＴＩＧＩＴおよびＰＶＲＩＧの共遮断によって増強されることが示される。
【０５０７】
Ｐ．実施例１６：抗ＴＩＧＩＴ抗体のビニング分析
１．プロトコル
実験は、Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｆｌｏｗ  Ｍｉｃｒｏｓｐｏｔｔｅｒ（ＣＦＭ）およびＩＢＩＳ  ＭＸ９６  ＳＰＲ  Ｉｍａｇｅｒ（ＭＸ９６ＳＰＲｉ）を使用して、Ｗａｓａｔｃｈ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｉｎｃ．（Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ＵＴ）によって行われた。以下の抗ヒトＴＩＧＩＴ  ｍＡｂおよびヒトＰＶＲ−Ｆｃバリアントを、それぞれ、ｐＨ５．０の１０ｍＭの酢酸ナトリウム中約１０μｇ／ｍＬに希釈し、Ｘａｎｔｅｃ  ２００Ｍバイオセンサープリズムチップの独立したスポットに、ＣＦＭを使用する７分間のサイクルで標準的なアミンカップリングを使用して共有結合により固定化した。
【表６】
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【０５０８】
ＢＭ８−Ｈ４およびＢＭ９−Ｈ４は、（ＵＳ２０１５／０２１６９７０Ａ１、ｈＩｇＧ４として再フォーマットされたクローン１０Ａ７および１Ｆ４）をそれぞれ指す。ＭＢＳＡ４３−Ｍ１は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのマウス抗ヒトＴＩＧＩＴ  ＩｇＧ１である。次いで、プリズムチップを１倍のＰＢＳＴで３分間すすいだ後、ＭＸ９６  ＳＰＲｉイメージャに直接ロードし、過剰のＮＨＳエステルを１Ｍエタノールアミンの５分間の注入でクエンチした。予備実験には、抗体の結合活性を試験するため、またＴＩＧＩＴ結合の再現性の評価によって再生状態を最も良く決定するために、１００ｎＭ単量体ヒトＴＩＧＩＴ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号１０９１７−Ｈ０８Ｈ）を全ての固定化ｍＡｂに４分間注入した後、再生を行うという数回のサイクルを含んだ。これらの予備実験により、ほとんどの固定化ｍＡｂを再現可能に再生するための最良の試薬が１／５００リン酸の３０秒パルスであることが示された。しかしながら、固定化ＰＶＲは活性を保持しなかったので、それらの遮断パターンを生成し、溶液中の分析物としてのみ「ビニング」した。以下に記載するこれらの予備実験およびビニング実験では、全てのタンパク質試料を、脱気したＨＢＳＴである泳動緩衝液中で調製した。固定化ｍＡｂによって溶液中のｍＡｂのＴＩＧＩＴへの結合が遮断されるか否かを決定するために、各固定化ｍＡｂに予め複合体化したＴＩＧＩＴ上に各ｍＡｂおよびＰＶＲを注入する「サンドイッチ」エピトープビニングプロトコルを行った。各サイクルについて、最初に１００ｎＭのＴＩＧＩＴを全ての固定化ｍＡｂ上に４分間注入し、その後直ちに２７４ｎＭ（結合部位濃度）で競合ｍＡｂまたはリガンドを４分間注入した。これを競合分析物として作用する各ｍＡｂおよびＰＶＲで繰り返した。競合タンパク質の代わりに泳動緩衝液を用いた対照サイクルを、二重参照のために１２サイクルごとに行った。１／５００リン酸の３０秒パルスを用いて各サイクル後に全ての表面を再生した。センサーグラムデータを、Ｗａｓａｔｃｈ独自のソフトウェアを使用して処理および参照した。固定化ｍＡｂに予め複合体化したＴＩＧＩＴ上の競合物の注入から結合が観察されなかった場合、抗体対を、共有されたＴＩＧＩＴ結合エピトープを有するものとして分類した。競合ｍＡｂの注入により予め複合体化したＴＩＧＩＴへの結合が示された場合、抗体対を、ＴＩＧＩＴ上の異なるエピトープに結合するもの、または「サンドイッチ」であるものとして分類した。競合物の低いまたは最小の結合は、「中間」遮断剤として分類した。各ｍＡｂおよびリガンドについての一対ＴＩＧＩＴ遮断パターンの階層的クラスタリングを、Ｗａｓａｔｃｈ独自のソフトウェアを使用して行った。
【０５０９】
２．結果
ＰＶＲ−Ｆｃタンパク質と１３のｍＡｂとの両方は、活性を失ったかまたはリガンドとして再生できなかったので、それらの遮断パターンを溶液中の分析物としてのみ決定した。ＭＡｂであるＣＰＡ．９．０１４−Ｈ４は、ＴＩＧＩＴへの結合を示さなかったため、ビニングしなかった。図６７は、各ｍＡｂおよび２つのＰＶＲタンパク質についての一対遮断パターンに基づく樹形図クラスタリングを示す。縦軸は、遮断パターンにおける統計的類似度を表す。Ｗａｓａｔｃｈ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓにより、カットオフ因子５を適用して、図６７の線で示されるｍＡｂをクラスター化した。同一の遮断パターンを示すｍＡｂ（およびＰＶＲ）のみが一緒にビニングされるエピトープ「ビン」の厳密な定義のために、合計１２個の別個のビンが存在する。最小限の相違しか示さない遮断パターンが一緒にクラスター化される場合、ｍＡｂおよびＰＶＲの４つの密接に関連した「コミュニティ」が存在する。これらの「コミュニティ」は、図６７の下部に異なる斜線のブロックで示される。図６８は、ブラックボックスによって示される各ビンを有する各々個別の固有のビンを埋めるｍＡｂおよびＰＶＲを一緒に群化する。関連する遮断パターンの各「コミュニティ」を構成する全ての固有のビンを灰色のボックスで囲む。図６８のｍＡｂおよびＰＶＲは、図６７の樹形図における各タンパク質を表す数字キーと共に列記されている。
【０５１０】
Ｑ．実施例１７：ＴＩＧＩＴノックアウトマウスへの抗ＰＶＲＩＧ抗体の投与
原理および目的
マウスＰＶＲＩＧ遮断と組み合わせたＴＩＧＩＴ欠失が、同系マウス腫瘍モデルにおける腫瘍増殖阻害および生存を増強し得るかどうかを調査すること。
【０５１１】
プロトコル
動物
ＴＩＧＩＴノックアウト（ＫＯ）マウスは、Ｏｚｇｅｎｅ  Ｐｔｙ  ＬＴＤ（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で作製された。Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）マウス（Ｏｚｇｅｎｅ）を対照として用いた。８〜１１週齢のメスのＴＩＧＩＴ  ＫＯおよびＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。全ての研究は、Ｔｅｌ−Ａｖｉｖ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｔｅｌ−Ａｖｉｖ，Ｉｓｒａｅｌ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたものであった。
【０５１２】
インビボ腫瘍モデル
１×１０５個のＢ１６／Ｄｂ−ｈｍｇｐ１００黒色腫細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴまたはＴＩＧＩＴ  ＫＯマウスの右脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）接種した。抗体処理は腫瘍接種と同じ日に開始し（０日目）、処置群当たり７〜１０匹のマウスを用いた。使用した抗体は、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（クローンＭＯＰＣ−２１、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）およびマウスＩｇＧ１抗マウスＰＶＲＩＧ（クローン４０７、Ｃｏｍｐｕｇｅｎ  ＬＴＤ）であった。抗体を、週２回、３週間にわたって、腹腔内注射によって１０ｍｇ／ｋｇで投与した。腫瘍増殖は、２〜３日毎に電子キャリパーで測定し、０．５×Ｗ２×Ｌ３ｍｍ３（Ｌは長さ、Ｗは腫瘍の幅）と報告された。２２５０ｍｍ３の腫瘍サイズに到達した動物を麻酔した。
【０５１３】
統計分析
反復測定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡ、続いて選択された対の群についての反復測定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを、ＪＵＭＰソフトウェア（ＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌＤｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ  ＴＭ）を使用して行った。全ての研究動物が生存していた最後の日に測定した腫瘍体積を比較することによって、腫瘍増殖測定値の分析を行った。腫瘍のないマウスのパーセンテージの統計的差異を、Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ  Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ試験によって決定した。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
結果
ＴＩＧＩＴ  ＫＯマウスにおける抗マウスＰＶＲＩＧ遮断抗体による処置後のインビボ腫瘍増殖阻害
同系マウスＢ１６／Ｄｂ−ｈｍｇｐ１００皮下黒色腫腫瘍モデルにおけるマウスＰＶＲＩＧ遮断と組み合わせたＴＩＧＩＴ欠失のインビボの影響を試験した。腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６ＷＴマウスの抗マウスＰＶＲＩＧ遮断抗体による処置は、アイソタイプ処置（１１日目に１７％のＴＧＩおよび１８日目に８％のＴＧＩ）と比較して、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）に対して軽微な効果しか示さなかった。腫瘍増殖に対するＴＩＧＩＴ欠失の影響は、Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴ対照群（１１日目に１７％のＴＧＩおよびエンドポイントで１３％のＴＧＩ）と比較して軽微であった。しかし、ＴＩＧＩＴ欠失を抗マウスＰＶＲＩＧ抗体（クローン４０７）処置と組み合わせた場合、有意なＴＧＩが明らかであった（１１日目で６３％、エンドポイントで４９％のＴＧＩ）（図８０Ａおよび８０Ｂ）。ＴＧＩにしたがうと、抗マウスＰＶＲＩＧ抗体（クローン４０７）で処置したＴＩＧＩＴ  ＫＯマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴ対照群と比較して生存率が増加したが、統計学的有意性は達成されなかった（図８０Ｃ）。
【０５１４】
要約および結論
ＴＩＧＩＴ欠失およびＰＶＲＩＧ遮断の組合せは、インビボでの腫瘍増殖を有意に減少させ、ＴＩＧＩＴおよびＰＶＲＩＧの両方が、この黒色腫腫瘍モデルにおいて阻害的役割を果たすことを示す。これらのデータにより、ＴＩＧＩＴおよびＰＶＲＩＧを同時標的とすることが、抗腫瘍応答を有意に増強する別の併用療法であり得ることが示唆される。
【０５１５】
Ｒ．実施例１８：ＰＶＲＩＧアンタゴニスによりＴ細エフェクター機能が増強され、腫瘍増殖が低下する。
摘要
最近の進歩にもかかわらず、大多数の患者は、チェックポイント阻害剤から長期的な利益を得ていない。ＰＶＲＩＧは、ＤＮＡＭ／ＴＩＧＩＴファミリーの新規免疫抑制性受容体であり、ここでは、抗腫瘍応答の調節におけるＰＶＲＩＧの役割を実証する。ＰＶＲＩＧはＰＶＲＬ２に結合し、正常組織由来のリンパ球と比較して、腫瘍浸潤リンパ球上で発現が著しく増強される。ＰＶＲＩＧ拮抗作用がヒトＴ細胞活性化を増強し、ＰＶＲＩＧとＰＤ−１阻害剤またはＴＩＧＩＴ阻害剤との併用により、相乗的にリンパ球機能が増加した。次に、前臨床腫瘍モデルにおけるＰＶＲＩＧの役割について検討した。ＰＶＲＩＧ−／−マウスは、インビトロで有意にＴ細胞活性化の増加を示し、ＣＤ８エフェクター機能の増加によって媒介されるＭＣ３８腫瘍増殖を低下させた。アンタゴニスト抗ＰＶＲＩＧ抗体は、抗ＰＤ−Ｌ１と組み合わせて、またはＴＩＧＩＴ−／−マウスで試験した場合、腫瘍増殖を有意に低下させた。要約すると、ＰＶＲＩＧ−ＰＶＲＬ２経路がヒトがんにおいて誘導され、ＰＶＲＩＧ−ＰＶＲＬ２相互作用に拮抗することによりＴ細胞機能の増加および腫瘍増殖の低下が生じることを実証する。
【０５１６】
重要度
これらのデータにより、ＰＶＲＩＧががん治療のための有望な標的であることが実証され、単剤療法として、またはＴＩＧＩＴもしくはＰＤ１のいずれかと組み合わせて新規ながん免疫療法剤としてＰＶＲＩＧ阻害剤ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）を試験するための論理的根拠が提供される。
【０５１７】
導入
ますます多くの証拠により、内因性免疫応答ががんの開始、進行、および抑制を形作る際に重要であることが示されている（１）（２）。患者の免疫状態および腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内の腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）の内容は、がん生存率だけでなく、患者が療法にどのように応答するかの主要な予後指標でもある（３）（４）。Ｔ細胞は、抗腫瘍応答を引き起こすことができるＴＩＬの重要な構成要素であり、ほとんどの抗腫瘍免疫応答は、最終的に、エフェクターリンパ球細胞の機能性に依存する。患者の腫瘍のＴＭＥにおけるＣＤ８Ｔ細胞のエンリッチメント、ならびに突然変異荷重およびＴｈ１極性化ＴＭＥ等の有効なＣＤ８Ｔ細胞応答に対する免疫応答を偏らせる他の因子は全て、好都合な抗腫瘍免疫応答に関する重要な予後指標である（５）（６）。
【０５１８】
多くの固形腫瘍にわたる重要な所見は、エフェクターＴ細胞がＴＭＥ内で活性化されたまたは「枯渇」した発現型を有することである（７）。これにより、ＴＭＥ内のＴ細胞は最初に同種抗原を認識し、活性化され、腫瘍に輸送されたが、その後、有効な抗腫瘍応答を引き起こすことができないことが示される。予め活性化または枯渇したＴ細胞は、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４（８）等の共抑制性受容体の表面発現の増加によって定義される。これらの共抑制性受容体をそれらの同族リガンドとの相互作用を阻害する抗体で治療的に標的とすることにより、複数の進行した癌を有する患者において顕著な臨床的有効性が示された（９）。機構的には、これらの共抑制性受容体を標的とすると、ＴＭＥ中に既存の既に腫瘍反応性であるＴ細胞の拡大、およびＴ細胞受容体の多様性が広がったＴ細胞プールの産生につながることが示されている（１０））（１２）。現在クリニックにあるチェックポイント阻害剤はがん治療に革命をもたらし、がんとの戦いにおける免疫系の力を実証したが、多くの患者は依然として再発し、かつ／または治療に応答しない。結果として、がんにおける免疫応答およびさらなる免疫に基づく経路の標的化の理解を増すことは、さらなる治療処置につながるであろう。
【０５１９】
これらの新規の経路のなかで、可能性のある新規のがん免疫療法として、ネクチンおよびネクチン様のファミリー内の受容体およびリガンドの群が現在研究されている。このファミリーの受容体には、ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＴＩＧＩＴ、および最近ではＰＶＲＩＧ（ＣＤ１１２Ｒ）が含まれる（１３）（１４）（１５）。これらの分子のうち、ＤＮＡＭは、活性化シグナルをリンパ球に送達するために、２つのリガンド、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）およびＰＶＲＬ２（ＣＤ１１２）に結合する、このサブファミリー内の活性化受容体である（１６）。このファミリーの２つの受容体は、ヒトリンパ球機能、ＴＩＧＩＴ、およびより最近ではＰＶＲＩＧを阻害することが示される（１７）（１８）。ＴＩＧＩＴは、ＰＶＲと高い親和性で相互作用し、ＰＶＲＬ２とは親和性がはるかに弱いことが報告されており、ＩＴＳＭモチーフを介してリンパ球に阻害シグナルを送達することによってＴ細胞応答およびＮＫ細胞応答の両方を阻害することが示される（１９）（２０）。より最近では、ＰＶＲＩＧはＰＶＲＬ２に高親和性で結合し、そのＩＴＩＭモチーフを介して阻害シグナルを伝達することが示された（１５）。どちらの場合も、ＴＩＧＩＴのＰＶＲとの親和性およびＰＶＲＩＧのＰＶＲＬ２との親和性がＤＮＡＭのＰＶＲまたはＰＶＲＬ２との親和性よりも高いことから、ＴＩＧＩＴおよびＰＶＲＩＧにはＤＮＡＭからＰＶＲおよびＰＶＲＬ２を打ち負かす能力があり、ＴＩＧＩＴおよびＰＶＲＩＧがＴ細胞機能を低下させ得る間接的な機序をもたらすことが示唆される。このファミリー内では、ＰＶＲもＣＤ９６のリガンドである。ＣＤ９６の機能は、マウスリンパ球（２１）では阻害的であるが、ヒトリンパ球では活性化させるものであることが報告されている（２２）。これらのデータに基づき、ヒトリンパ球について、２つの受容体、ＴＩＧＩＴおよびＰＶＲＩＧが、それぞれＰＶＲおよびＰＶＲＬ２に高い親和性で結合して、Ｔ細胞機能を抑えるための阻害シグナルを送達することを仮定する。
【０５２０】
ヒトＰＶＲＩＧはある最近の報告でＴ細胞応答を阻害することが示されているが、がん免疫監視におけるＰＶＲＩＧおよびＰＶＲＬ２の役割は十分に理解されていない。特に、がんにおけるこの経路の発現プロファイルおよびＣＤ８Ｔ細胞抗腫瘍応答の調節におけるＰＶＲＩＧの役割は報告されていない。さらに、マウスＰＶＲＩＧ遺伝子の機能的特徴付けおよび前臨床腫瘍モデルにおけるインビボでのＰＶＲＩＧ−ＰＶＲＬ２相互作用の妨害の効果は報告されていない。本明細書では、がんにおけるＰＶＲＩＧおよびＰＶＲＬ２発現プロファイルならびに腫瘍細胞共培養アッセイおよび前臨床腫瘍モデルにおけるＰＶＲＩＧ拮抗作用の効果を報告することによって、がんの設定におけるＰＶＲＩＧの役割を解明した。ＰＶＲＩＧがＴＩＧＩＴまたはＣＤ９６と比較してＴ細胞サブセット上の区別された発現プロファイルを有し、ＰＶＲＩＧおよびＰＶＲＬ２発現が正常な隣接組織と比較して癌において誘導されたことが示される。複数のヒトインビトロアッセイ系において、高親和性ＰＶＲＩＧ拮抗性モノクローナル抗体（ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ））は、特に抗ＴＩＧＩＴまたは抗ＰＤ１抗体と組み合わせた場合に、Ｔ細胞機能を増強した。加えて、アンタゴニスト抗体またはＰＶＲＩＧ欠損マウスを用いたマウスＰＶＲＩＧの新規の特徴付けが報告され、ＰＶＲＩＧ−ＰＶＲＬ２相互作用の阻害により腫瘍増殖が低下し、ＰＤ−１阻害またはＴＩＧＩＴ遺伝子欠損と組み合わせると効果が最も強力であったことが示される。総括的に、このデータにより、ＰＶＲＩＧが、Ｔ細胞の抗腫瘍応答を調節する上で重要な阻害性受容体であり、がん患者の臨床試験のためのＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の開発を支援するものであることが示される。
【０５２１】
材料および方法
ヒト末梢血および腫瘍発現研究
健康なドナーのヒトＰＢＭＣは、ヘルシンキ宣言に従ってＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手した。ヒト組織は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ支援リソースであるＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋによって提供された。ヒト癌組織および適合した正常隣接組織を、製造業者のプロトコル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に従って単一細胞に解離させた。解離させた細胞を、異なる細胞サブセット上の様々な標的の発現についてフローサイトメトリーによって分析した。個々の細胞サブセット上の各標的発現について、アイソタイプ対照のＭＦＩ値で割った標的のＭＦＩ値をとることによって発現倍率値を算出した。他の研究者がこれらの同じ組織標本から試料を受け取った可能性がある。腫瘍の種類を、各試料の病理学的報告の検討に基づいて決定した。ＩＨＣ試験では、補足的方法に記載の条件を用いて、抗ＰＶＲＬ２抗体（ＨＰＡ−０１２７５９、Ｓｉｇｍａ）およびＰＤ−Ｌ１（Ｓｐ１４２、ＳｐｒｉｎｇＢｉｏ）を用いて腫瘍マイクロアレイ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を染色した。スコアリングは、同じ腫瘍の２連したコアについて２人の独立した評者によって行われた。
【０５２２】
ＰＶＲＩＧ抗体の作製および特徴付け
抗ヒトＰＶＲＩＧおよび抗マウスＰＶＲＩＧ抗体を、補足的方法で詳述したように作製した。簡潔には、抗体結合特異性および親和性を、遺伝子を発現しない細胞への検出可能な結合がないＰＶＲＩＧ操作細胞への選択的結合によって評価した。これらの抗ＰＶＲＩＧ抗体の拮抗活性を、ＰＶＲＩＧとＰＶＲＬ２との相互作用が妨害されたＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳに基づくアッセイを用いて決定した。細胞に基づくアッセイにおける特徴付けのために、抗体を、ＰＢＭＣまたは腫瘍由来Ｔ細胞との培養中でＰＶＲＬ２を発現する標的細胞からなるいくつかのＴ細胞標的化細胞共培養アッセイ系において試験した。ｇｐ１００特異的Ｔ細胞株は、既に記載したように黒色腫腫瘍から増殖させた（２３）。ＣＭＶｐｐ６５反応性Ｔ細胞を、ＣＭＶｐｐ６５（４９５〜５０３）、ＩＬ−２、およびＩＬ−７を用いて、健康なドナーのＰＢＭＣ（ＣＴＬ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）から１０日間増殖させた。併用試験のために、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、およびＰＶＲＩＧに対する抗体を１０μｇ／ｍｌで使用した。馴化培地中のサイトカイン濃度を、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）を用いて決定し、補足的方法に記載されているようにＦＡＣＳ染色を行った。
【０５２３】
マウスＰＶＲＩＧの発現および機能の特徴付け
マウスＰＶＲＩＧとｍＰＶＲＬ２およびｍＰＶＲとの結合相互作用を、組換えＰＶＲＩＧ、ＰＶＲＬ２、およびＰＶＲタンパク質を用いたＳＰＲおよびＥＬＩＳＡ、ならびに異所的に操作したＰＶＲＩＧおよびＰＶＲＬ２過剰発現細胞株またはＰＶＲもしくはＰＶＲＬ２  ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞株を用いたＦＡＣＳによって評価した。ＰＶＲＩＧおよびＴＩＧＩＴ欠損マウスを、補足的方法に記載されているように作製した。発現分析を行って、様々な細胞サブセットにおける脾臓、リンパ節、および腫瘍中のＰＶＲＩＧの発現を調べた。マウスＰＶＲＩＧのＴ細胞調節活性を実証する細胞機能アッセイを、補足的材料および方法に詳述されるように、ＷＴおよびＰＶＲＩＧ−／−Ｔ細胞、ならびにＰＶＲＬ２  ＦｃまたはＰＶＲＬ２を異所的に発現した標的細胞を使用して確立した。ＣＴ２６、ＭＣ３８、およびＢ１６／Ｄｂ−ｈｍｇｐ１００腫瘍モデルを、補足的方法に記載されるように行った。全ての試験は、Ｔｅｌ−Ａｖｉｖ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｔｅｌ−ａｖｉｖ，Ｉｓｒａｅｌ）またはＪｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＵＳＡ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【０５２４】
結果
ＰＶＲＩＧ発現は、末梢血および腫瘍のエフェクターＴ細胞で最も高い。
Ｉｇスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）は何百ものタンパク質からなるが、それらのうちのほんの少数のみがＴ細胞阻害性受容体である。ＩｇＳＦのタンパク質は迅速に進化する傾向があり（２４）、したがって、これらのタンパク質間の配列類似性は一般に低く、新規の免疫受容体の特定には最適ではない。新規の免疫チェックポイントを特定するために、遺伝子構造、タンパク質ドメイン、予測された細胞局在、および発現パターン等の既知の免疫チェックポイントの間で共有されたゲノムおよびプロテオーム特性に基づいたバイオインフォマティクスアルゴリズムを開発した。これらのアルゴリズムを用いて、ＰＶＲＩＧを新規の免疫受容体であると特定した。最近、ヒトＰＶＲＩＧ（ＣＤ１１２Ｒ）がＰＶＲＬ２に結合し、Ｔ細胞機能を阻害することも報告されている（１５）。しかしながら、腫瘍免疫監視の調節におけるこの経路の関連性は報告されていない。ここでは、ヒトがんおよび前臨床腫瘍モデルにおけるＰＶＲＩＧおよびＰＶＲＬ２の発現および機能を解明した。健康なドナー由来の末梢血において、ＰＶＲＩＧは、リンパ球でのみ発現され、この発現は、ＣＤ８Ｔ細胞およびＮＫ細胞で最も高かった。（図８３Ａ）。Ｔ細胞のさらなるサブセット分析により、Ｔｒｅｇサブセットと比較してＣＤ８またはＣＤ４メモリー／エフェクターＴ細胞サブセットでＰＶＲＩＧ発現が最も高かったことが示された（図８３Ｂ、図９０Ａ）。主にメモリーＴ細胞発現パターンにより、ＰＶＲＩＧは、メモリー／エフェクターＴ細胞と比較してＴｒｅｇ上で同等以上の発現を示す傾向のあるファミリー（ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６）の他の受容体と区別される。さらに、２つのアッセイ系（図８３ＣのＣＭＶリコール応答、図８３Ｄ、図９０ＢのＤＣ−ＭＬＲ）におけるＴ細胞活性化後のＰＶＲＩＧおよびＴＩＧＩＴの発現動態を比較し、ＰＶＲＩＧが、ＴＩＧＩＴと比較して、遅延した誘導速度論、および後期の時点でのより持続した発現を有することを示す。ＴＩＧＩＴと比較したメモリー／エフェクター細胞上のＰＶＲＩＧの優先的発現により、Ｔ細胞応答の調節におけるＰＶＲＩＧの固有の役割が示唆される。
【０５２５】
活性化後のＴ細胞上でのＰＶＲＩＧ発現の遅延および持続的誘導により、これが腫瘍微小環境において発現され得ることが示唆された。次に、ＦＡＣＳによりエクスビボで直接、解離させたヒト腫瘍由来の白血球上のＰＶＲＩＧの発現を分析した。ＰＶＲＩＧの発現は、複数の腫瘍型由来のＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、およびＮＫ細胞で検出された（図８３Ｅ〜Ｇ、図９０Ｃ）。ＰＶＲＩＧを、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞上でＰＤ−１およびＴＩＧＩＴと共発現させた（図８３Ｆ）。平均して、膀胱、結腸直腸、および前立腺と比較して、乳房、子宮内膜、頭頸部、肺、腎臓、および卵巣腫瘍由来のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＴＩＬにおいてより高い発現が検出された。ＰＶＲＩＧ発現がエクスビボで低い／存在しない腫瘍試料において、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８による活性化により、ＰＶＲＩＧの発現が増強され、ＰＶＲＩＧのＴＩＬ発現が再活性化の際にさらに誘導され得ることが示唆される（図９０Ｄ）。結腸、肺、腎臓、子宮内膜、および卵巣腫瘍について、同じ患者由来の正常な隣接組織を得て、腫瘍から単離したリンパ球対正常組織から単離したリンパ球に対するＰＶＲＩＧ発現の比較を行うことができた。ＴＩＬにより、適合する正常な隣接組織（ＮＡＴ）から単離された細胞と比較して、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞上のＰＶＲＩＧの有意な誘導が示された（図９０Ｅ）。ＰＢＭＣと同様に、さらに、肺、子宮内膜、および腎臓腫瘍由来のＴｒｅｇ対ＣＤ８Ｔ細胞上のＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、およびＰＤ１発現を比較した。ＴＩＬでは、ＴＩＧＩＴの発現はＣＤ８Ｔ細胞と比較してＴｒｅｇでより高かったが、ＰＶＲＩＧおよびＰＤ１ではＴｒｅｇと比較してＣＤ８Ｔ細胞で同様のまたはより高い発現が観察された（図８３Ｈ）。次に、ＴＩＬのエクスビボでの発現の大きさまたは腫瘍とＮＡＴとの間の発現における倍率変化の大きさの相関分析によって、Ｔ細胞集団に対するＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、およびＰＤ−１の共調節を試験した。両方の分析において、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞は、ＰＶＲＩＧとＰＤ１またはＴＩＧＩＴとの間に有意な正相関を示した（図９０Ｆ）。まとめると、これらのデータにより、ＰＶＲＩＧは、複数のヒトがん由来のＴ細胞およびＮＫ細胞上で発現されるため、腫瘍におけるＴ細胞機能を調節するのに重要であり得る新規の阻害性受容体標的とされることが実証される。
ＰＶＲＬ２発現は正常な隣接組織と比較して腫瘍組織において増強される。
【０５２６】
ＰＤ−１発現がＰＤ−１阻害剤に対する応答を予測するのに役立つことが示されたので、ＰＶＲＬ２の発現がヒトがん組織におけるその同族受容体ＰＶＲＩＧの発現と同時であるかどうかを調べた。ＦＦＰＥ試料を染色することを立証した抗ＰＶＲＬ２抗体（図９１Ａ）を用いて、肺、結腸、皮膚、乳房、卵巣／子宮内膜、および腎臓癌組織からなる腫瘍マイクロアレイ（ＴＭＡ）を染色し、核コアをＰＶＲＬ２発現の分布率および強度に基づいてスコアリングした。ＰＶＲＬ２発現は、これらの器官からの正常組織試料の大部分において存在しないか、または最小限に発現された。腫瘍組織において、腫瘍細胞上のＰＶＲＬ２発現は、肺、結腸、乳房、および卵巣／子宮内膜癌の約５０〜７０％で検出された（図８４Ａ、８４Ｆ）。腎臓癌試料における発現は２０〜４０％の範囲であったのに対して、黒色腫における発現は最低（約１０％）であった（図８４Ａ、８４Ｆ）。ＰＶＲＬ２発現は、腫瘍細胞および侵襲前線の免疫細胞で検出された（図８４Ｂ）。ＰＶＲＬ２を発現する特定の免疫細胞サブセットを決定するために、新たに解離した腫瘍に対してフローサイトメトリーを行った。ＣＤ４５＋免疫細胞、特に骨髄細胞（例えば、ＣＤ１４＋腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）および骨髄ＤＣ）上、ならびに複数の腫瘍型由来のＣＤ４５−非免疫細胞上でＰＶＲＬ２の発現が検出された（図８４Ｃ、Ｄ）。リンパ球ではＰＶＲＬ２の発現は検出されなかった（データは図示せず）。結腸、肺、腎臓、子宮内膜、および卵巣腫瘍から単離されたＣＤ４５−細胞およびＴＡＭ上のＰＶＲＬ２発現の比較により、同じドナーの一致するＮＡＴから単離された細胞と比較して、腫瘍から単離された細胞においてＰＶＲＬ２の有意な誘導が示された。ＰＶＲＩＧおよびＰＶＲＬ２発現が得られた試料について、リンパ球上のＰＶＲＩＧの発現を骨髄上および複数の腫瘍型由来のＣＤ４５−細胞上のＰＶＲＬ２と比較して調べた。調べた癌の型の中で、子宮内膜、肺、および腎臓癌が、ＰＶＲＩＧｈｉリンパ球およびＰＶＲＬ２ｈｉＴＡＭまたはＣＤ４５−非免疫細胞の最も高い分布率を有した。ＴＭＡと解離した腫瘍研究とのデータを統合することにより、乳房、子宮内膜、肺、頭頸部、腎臓、および卵巣腫瘍が、ＰＶＲＩＧ拮抗作用の反応性腫瘍型であり得ることが示される。
ＰＤ−Ｌ１と比較して、ＰＶＲＬ２発現は、ＰＤ−Ｌ１−腫瘍中で異なって調節され、存在する。
【０５２７】
ＰＶＲＩＧおよびＰＤ−１は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）上で共発現させることができるため、同じＴＭＡの連続切片を染色することによって同じ腫瘍上のＰＶＲＬ２およびＰＤ−Ｌ１の共発現も調べた。腫瘍細胞上のＰＶＲＬ２発現は、ＰＤ−Ｌ１＋試料と比較して同様の頻度および平均スコアでＰＤ−Ｌ１−腫瘍試料において明確に検出された（腫瘍細胞または免疫細胞にはＰＤ−Ｌ１膜染色がないことによって定義する）。（図８５Ａ、図８４Ｆ）。免疫細胞では、ＰＶＲＬ２発現が免疫細胞上で検出された５つの腫瘍のうち３つはＰＤ−Ｌ１も発現した（データは図示せず）が、試料が少数であったため、ＰＤ−Ｌ１とＰＶＲＬ２との免疫細胞上の共発現を結論付けることは困難である。ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍における腫瘍細胞上のＰＶＲＬ２の発現により、ＰＶＲＬ２発現がいくつかの腫瘍型においてＰＤ−Ｌ１よりも優勢であること、およびこの経路の標的化がＰＤ−Ｌ１−腫瘍において特に有効であり得ることが示唆された。ＰＤ−Ｌ１は、主にＩＦＮ−γによって適応耐性の機序として誘導され（２８）、一方でＰＶＲＬ２は、ゲノムストレス、ＤＮＡ損傷、および腫瘍抑制遺伝子によって調節される（２９、３０）。ＰＤ−Ｌ１およびＰＶＲ／ＰＶＲＬ２の独特の調節をさらに理解するために、次に、様々な炎症性刺激への曝露による腫瘍細胞系および単球由来ＤＣにおけるＰＶＲ、ＰＶＲＬ２、およびＰＤ−Ｌ１発現の調節を評価した（図８５Ｄ）。炎症性シグナルによるＤＣの処理により、概して、ＰＶＲ、ＰＶＲＬ２、およびＰＤ−Ｌ１発現の増加が生じ、これにより、ＰＶＲ、ＰＶＲＬ２、およびＰＤ−Ｌ１発現がＤＣ成熟時に増加することが示される。対照的に、ＩＦＮ−γによる上皮細胞の処理では、ＰＤ−Ｌ１の発現は増加したが、ＰＶＲＬ２の高いベースライン発現は影響を受けなかったため（図８５Ｅ）、ＩＦＮ−γによるＰＤ−Ｌ１と比較したＰＶＲＬ２発現の差異的な調節が裏付けられた。要約すると、これらの所見により、ＰＤ−Ｌ１およびＰＶＲＬ２が、ＤＣ等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で同時調節され得るが、上皮細胞上では差異的に調節され得ることが示される。ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍におけるＰＶＲＬ２の存在により、この経路を標的とすることが、ＰＤ−１阻害剤に対して非応答性または進行性の患者において有益な可能性があり得ることが示唆される。
【０５２８】
ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、ＰＶＲＩＧとＰＶＲＬ２との相互作用を妨害する、ＰＶＲＩＧに対する高親和性ヒト化モノクローナル抗体である
ヒトＰＶＲＩＧ−ＰＶＲＬ２相互作用に拮抗する機能的結果を調べるために、ＰＶＲＩＧとＰＶＲＬ２との相互作用を遮断する高親和性のアンタゴニスト抗ＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）を作製した。この抗体は、ヒトＰＶＲＩＧまたはカニクイザルＰＶＲＩＧを異所的に発現するＨＥＫ２９３細胞に選択的に結合し、ナノモル以下の親和性でＰＶＲＩＧを内因性発現するＪｕｒｋａｔ細胞にも結合した（図８６Ａ）。生化学的アッセイにおいて、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、ＰＶＲＩＧ  ＦｃとＰＶＲＬ２＋ＨＥＫ２９３細胞との相互作用を遮断し（図８６Ｂ）、またＰＶＲＬ２  ＦｃのＰＶＲＩＧ＋ＨＥＫ２９３細胞への結合を遮断した（図８６Ｃ）。この抗体を用いて、いくつかのＴ細胞アッセイにおいてアンタゴニスト抗ＰＶＲＩＧの機能的効果を観察した。細胞表面抗ＣＤ３抗体およびヒトＰＶＲＬ２を異所的に発現する人工の抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を作製し、抗ＰＶＲＩＧ（ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ））またはアイソタイプ対照の存在下で初代ヒトＣＤ４Ｔ細胞と共培養した。ＣＨＯ抗ＣＤ３  ａＡＰＣとの共培養の際に増殖しているＣＤ４Ｔ細胞上でＰＶＲＩＧ発現を誘導した（図９４Ａ）。ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）によるＰＶＲＩＧの拮抗作用により、複数のドナー由来のＣＤ４Ｔ細胞の増殖が増強された（図８６Ｄ）。また、黒色腫腫瘍に由来した２つのヒトｇｐ１００反応性ＣＤ８Ｔ細胞株に対する抗ＰＶＲＩＧの効果を試験した。これらのＴ細胞系を、アイソタイプ対照ＩｇＧまたは抗ＰＶＲＩＧ抗体の存在下で、ＨＬＡ−Ａ２およびＰＶＲＬ２を発現するａＡＰＣと共に個々に共培養した（図９４Ｂ）。両方の株において観察されるように、抗ＰＶＲＩＧは、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α産生を約２０〜５０％増加させた。用量反応評価において、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）は、複数のアッセイにおいて１桁のナノモルＥＣ５０値を示した（図９４Ｃ、Ｄ）。これらのデータをまとめると、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）によってＰＶＲＩＧ−ＰＶＲＬ２相互作用に拮抗することで、Ｔ細胞活性化の増加が生じることが示される。
【０５２９】
ＴＩＧＩＴまたはＰＤ−１阻害剤と組み合わせたＣＨ７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）により、Ｔ細胞機能の相乗的な増強が生じた。
ＰＶＲＩＧおよびＴＩＧＩＴ遮断の組み合わせにより、Ｔ細胞−樹状細胞共培養アッセイ（１５）において相乗的にＣＤ４Ｔ細胞機能が増加し、Ｔ細胞−ＡＰＣ相互作用の調節におけるこの経路の役割が示唆される。腫瘍細胞共培養の背景でのＣＤ８Ｔ細胞に対するＰＶＲＩＧおよびＴＩＧＩＴ遮断の効果は報告されていない。発明者らの腫瘍発現プロファイリングによりＣＤ４５−免疫細胞上のＰＶＲＬ２の発現を実証したため、さらに、２Ｔ細胞アッセイ系を用いたＴ細胞−腫瘍細胞共培養におけるこの経路の標的化の効果を調べた。まず、抗ＰＶＲＩＧ、抗ＴＩＧＩＴ、またはアイソタイプ対照抗体の存在下で、単独または組み合わせのいずれかで、２つのｇｐ１００腫瘍抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞株と黒色腫細胞株ＭＥＬ６２４との共培養を行った。ＭＥＬ６２４細胞はＰＶＲおよびＰＶＬＲ２の両方を発現し、ＴＩＬ−２０９およびＴＩＬ−４６３は両方とも、ＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、およびＰＤ−１を発現した（図８６Ｆ）。ＴＩＬ−２０９では、抗ＰＶＲＩＧまたは抗ＴＩＧＩＴ単独ではＩＦＮ−γが増加せず、抗ＰＶＲＩＧと抗ＴＩＧＩＴの組み合わせでは相乗的にＩＦＮ−γ産生が増加したことが観察された（図８６Ｇ）。ＴＩＬ−４６３では、抗ＰＶＲＩＧまたは抗ＴＩＧＩＴではＩＦＮ−γ産生が適度に増加し、抗ＰＶＲＩＧおよび抗ＴＩＧＩＴの組合せでは相加的にＩＦＮ−γが増加したことを観察した（図８６Ｇ）。追加のアッセイ系において、ヒトＴ細胞応答を研究するためのモデル系として、ＣＭＶ  ｐｐ６５反応性ＣＤ８Ｔ細胞を利用した。ＨＬＡ−Ａ２＋ＣＭＶ  ｐｐ６５ＣＤ８Ｔ細胞をＣＭＶ  ｐｐ６５（４９５〜５０３）の存在下で増殖させ、ＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、およびＰＤ−１の発現を１０日目に観察した（図８６Ｆ）。ＰＶＲＩＧは、ＣＭＶ  ｐｐ６５特異的ＣＤ８Ｔ細胞上で、ヒト癌試料で観察されたものと同様の大きさで発現された（図８３）。標的細胞として、同様の量のＰＶＲおよびＰＶＲＬ２を発現するＰＤ−Ｌ１ｈｉ（Ｐａｎｃ０５．０４）およびＰＤ−Ｌ１ｌｏ（Ｃｏｌｏ２０５）ＨＬＡ−Ａ２＋がん細胞株を特定した（図８６Ｆ）。次に、ＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、および／またはＰＤ−１に対する遮断抗体の存在下で、ＣＭＶ  ｐｐ６５反応性Ｔ細胞とｐｐ６５（４９５〜５０３）ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞株との共培養を行った。抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂにより、Ｐａｎｃ０５．０４細胞との共培養ではＩＦＮ−γが約５０％増加し、Ｃｏｌｏ２０５との共培養では最小限にＩＦＮ−γが増加したことを観察した（図８６Ｉ）。抗ＴＩＧＩＴと抗ＰＶＲＩＧ  Ａｂの組み合わせにより、両方の標的細胞株で相乗的にＩＦＮ−γ産生が増加し、ＰＤ−１抗体のみと比較してより高いＩＦＮ−γの増加が生じた（図８６Ｈ）。また、抗ＰＶＲＩＧと抗ＰＤ−１との組み合わせにより、個々の抗体と比較した場合に、ＩＦＮ−γ産生が相乗的に増加した（図８６Ｉ）。まとめると、これらのデータにより、腫瘍細胞と相互作用する時のヒトＣＤ８Ｔ細胞の活性化の増加における組み合わせたＰＶＲＩＧおよびＴＩＧＩＴまたはＰＶＲＩＧおよびＰＤ１遮断の強力な相乗作用が示唆される。
【０５３０】
ＰＶＲＩＧの欠損により、Ｔ細胞増殖の増加および腫瘍成長の減少が生じた。
マウスＰＶＲＩＧの配列およびそのマウスＰＶＲＬ２との相互作用が報告されているが、マウスＰＶＲＩＧの発現プロファイルおよび免疫調節活性は十分に理解されていない。まず、ＮＫ、ＮＫＴ、およびＴ細胞におけるｍＰＶＲＩＧ  ＲＮＡ発現および転写物を分析した（図８７Ａ）。活性化されたマウスＣＤ８Ｔ細胞は、ＴＩＧＩＴと比較して、誘導速度論が遅延したＰＶＲＩＧ転写産物の上昇を有した（図８７Ｂ）。組換えｍＰＶＲＩＧが、いくつかのアッセイ配向で行われた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）およびＥＬＩＳＡによってｍＰＶＲＬ２タンパク質に結合することを確認した（図９５Ａ〜Ｄ）。親和性はｍＰＶＲＬ２との相互作用より約１０倍小さかったが、ｍＰＶＲＩＧとｍＰＶＲとの間の相互作用も観察された（図９５Ｅ）。ＰＶＲまたはＰＶＲＬ２がｍＰＶＲＩＧの主要なリガンドであるかどうかを決定するために、ＰＶＲおよびＰＶＲＬ２を発現するＢ１６Ｆ１０細胞へのマウスＰＶＲＩＧ  Ｆｃの結合を試験した（データは図示せず）。ＰＶＲＩＧ  Ｆｃは、Ｂ１６Ｆ１０細胞への用量依存的結合を示し、この結合はＢ１６Ｆ１０細胞におけるＰＶＲＬ２  ｓｉＲＮＡノックダウン時に完全に消滅した（図９５Ｆ）。これと比較して、ＰＶＲＩＧ  Ｆｃ融合タンパク質の結合は、ＰＶＲノックダウン後にわずかに、しかし一貫して減少し（図９５Ｆ）、ｍＰＶＲＩＧとｍＰＶＲとの間に非常に弱い相互作用が生じることが示唆された。まとめると、これらの結果により、マウスにおいてＰＶＲＬ２がヒトにおける場合のようにＰＶＲＩＧの主要なリガンドであることが実証される。
免疫応答におけるＰＶＲＩＧの役割を描写するために、ＰＶＲＩＧ欠損（−／−）マウスを作製した（図９６）。ＰＶＲＩＧ−／−マウスは予想されるメンデル比で生まれ、１０カ月齢まで顕著な発現型を示さず、８週齢で野生型マウスと比較して同様の白血球細胞性（末梢およびリンパ組織）を有した（図９７）。野生型（ＷＴ）ＣＤ８Ｔ細胞およびＮＫ細胞はＰＶＲＩＧを発現し、ＰＶＲＩＧ−／−細胞ではＰＶＲＩＧの発現は検出されなかった（図８７Ｃ）。マウスＴ細胞応答の調節におけるＰＶＲＩＧの役割を調べるために、２つのアッセイ系においてＷＴおよびＰＶＲＩＧ−／−Ｔ細胞の増殖を調べた。ＷＴまたはＰＶＲＩＧ−／−Ｔ細胞を、可溶性ＰＶＲＬ２  Ｆｃまたは対照Ｆｃタンパク質の存在下で固定化抗ＣＤ３で活性化した。可溶性ＰＶＲＬ２  Ｆｃは、ＷＴＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を有意に阻害したが、ＰＶＲＩＧ−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を阻害せず（図８７Ｄ）、これは、ＰＶＲＩＧ−／−細胞が阻害シグナルを欠いていることを示唆する。腫瘍細胞とのＣＤ８＋Ｔ細胞の相互作用におけるマウスＰＶＲＩＧの役割を評価するために、ＰＶＲＩＧ−／−マウスを、ｇｐ１００２５−３３に特異的なトランスジェニックＴＣＲを発現するｐｍｅｌ  ＴＣＲトランスジェニックマウスに交配した（２８）。活性化したＰＶＲＩＧ−／−またはＷＴ  Ｐｍｅｌ  ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＰＶＲＬ２を内因性発現するＢ１６−Ｄｂ／ｇｐ１００黒色腫腫瘍と共培養し（データは図示せず）、活性化およびエフェクター機能を評価した。ＰＶＲＩＧ−／−ｐｍｅｌ  ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＷＴ細胞と比較してエフェクターサイトカイン（ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）の脱顆粒および産生の増強を示した（図８７Ｅ）。これらのデータにより、マウスＰＶＲＩＧがＰＶＲＬ２＋腫瘍標的細胞との共培養の際に腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化およびエフェクター機能を阻害することが示される。
【０５３１】
次に、ＭＣ３８同系モデルにおける腫瘍増殖に対するＰＶＲＩＧ欠損の効果を研究した。ＰＶＲＩＧ−／−マウスは、ＷＴマウスと比較して有意に減少した腫瘍増殖を示した（ｐ＜０．０５、図８８Ａ〜Ｂ）。さらに、１４日目に開始したＰＤ−Ｌ１遮断により、抗ＰＤ−Ｌ１処置ＷＴマウス（ｐ＝０．０５２）と比較して、ＰＶＲＩＧ−／−マウスにおける抗腫瘍応答がさらに増幅し、腫瘍増殖が減少した（図８８Ｃ〜Ｄ）。ＰＶＲＩＧ−／−およびＷＴ腫瘍微小環境におけるＰＤ−Ｌ１遮断の機能的効果を評価するために、１８日目に４つの実験コホートの各々から腫瘍および腫瘍流入領域リンパ節を採取し（この１８日目に、これらの群はアイソタイプまたは抗ＰＤ−Ｌ１の２用量を受けたが、腫瘍体積の差は観察されなかった）、免疫サブセット組成物および細胞内サイトカインについてフローサイトメトリーを実施した。ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＷＴ腫瘍と比較して９２％）およびＩＦＮ−γ産生性ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＷＴ腫瘍よりも１１０％増加、図８８Ｅ）と同様に、ＰＶＲＩＧ−／−腫瘍への免疫細胞（ＣＤ４５＋）の輸送は適度に増強された（ＷＴ腫瘍に対して８８％）。ＰＤ−Ｌ１遮断と組み合わせて、ＣＤ４５＋細胞の浸潤は、ＰＶＲＩＧ−／−腫瘍において有意に増加した（抗ＰＤ−Ｌ１処置ＷＴマウス由来の腫瘍に対して１６０％、ｐ＝０．０３２、図８８Ｆ）。抗ＰＤ−Ｌ１処置ＰＶＲＩＧ−／−腫瘍は、処置した抗ＰＤ−Ｌ１処置したＷＴ腫瘍と比較して、腫瘍重量当たりの総ＣＤ８＋Ｔ細胞（２５２％の増加）およびＩＦＮ−γ産生性ＣＤ８＋Ｔ細胞（２９７％の増加）の数がより大きかった（図８８Ｆ）。ＰＶＲＩＧ−／−マウスが、ＰＤ−Ｌ１遮断に関係なく、未変化のエフェクター腫瘍浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞数およびＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ数を有したことも観察した（データは図示せず）。特にＰＤ−Ｌ１遮断後のＰＶＲＩＧ−／−腫瘍における免疫機能不全の救済は、ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が抗ＰＤ−Ｌ１処置ＷＴマウスに対して高かった腫瘍流入領域リンパ節に反映された（図８８Ｇ〜Ｈ）。まとめると、これらのデータにより、ＰＶＲＩＧ切除が、特に抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置と組み合わせた場合、抗腫瘍免疫応答の増加に関連する腫瘍増殖の減少をもたらすことが実証される。
【０５３２】
ＰＤ−１抗体またはＴＩＧＩＴ欠損と組み合わせた抗ｍＰＶＲＩＧ抗体は、腫瘍増殖を阻害した。
ＰＶＲＩＧの遺伝的欠損により腫瘍増殖が減少することを実証した後、続いて、ヒトインビトロデータによって実証されたように、ＰＶＲＩＧ−ＰＶＲＬ２相互作用の抗体媒介性阻害により、特にＰＤ１またはＴＩＧＩＴ阻害剤と組み合わせた場合に、抗腫瘍免疫が改善し得ることの実証を目標に定めた。これを評価するために、高親和性のアンタゴニスト抗ｍＰＶＲＩＧ抗体を作製した。ＦＡＣＳによって決定した抗ｍＰＶＲＩＧ  ｍＡｂの親和性評価により、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と同様に、ナノモル以下のＫｄ（ＨＥＫ２９３  ｍＰＶＲＩＧでは０．３３ｎＭ、Ｄ１０．Ｇ４．１細胞では０．３９ｎＭ）が示された（図９５Ｇ〜Ｈ）。この抗体の特異性は、ｍＰＶＲＩＧノックダウン時にＤ１０．Ｇ４．１細胞への結合の大部分が抑止された際に、さらに確認された（図９５Ｉ）。ｍＰＶＲＩＧ  ＦｃとＢ１６Ｆ１０との結合およびｍＰＶＲＬ２  ＦｃとｍＰＶＲＩＧを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞との結合を阻害することによるｍＰＶＲＩＧ−ｍＰＶＲＬ２相互作用の妨害について、抗ｍＰＶＲＩＧを試験した（図８９Ａ）。抗ｍＰＶＲＩＧ抗体によるＰＶＲＩＧ−ＰＶＲＬ２相互作用の完全な遮断が、両方のアッセイフォーマット（図８９Ａ、図９５Ｊ）で観察され、アンタゴニスト抗ｍＰＶＲＩＧ抗体を実証した。次に、同系のＣＴ２６皮下結腸腫瘍モデルにおけるｍＰＶＲＩＧ遮断のインビボ有効性を試験した。ＰＶＲＩＧ発現は、対応する脾臓または流入領域リンパ節サブセットと比較して、腫瘍微小環境におけるＮＫおよびＴ細胞上で上昇した（図８９Ｂ）。単剤療法として腫瘍保持マウスを抗ｍＰＶＲＩＧ遮断ｍＡｂで処置することでは、腫瘍増殖を減少させることはできなかった（データは図示せず）。しかし、抗ＰＶＲＩＧおよび抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの組合せは、ＣＴ２６腫瘍増殖を効果的に遅延させ（図８９Ｃ）、完全寛解マウスの率が４０％で、処置マウスの生存期間を有意に増加させた（図８９Ｄ）。ヒトＴ細胞アッセイデータと一致して、これらのデータにより、ＰＤ−１およびＰＶＲＩＧ阻害剤の組合せが腫瘍増殖を減少させ得ることが実証される。
【０５３３】
また、抗腫瘍応答の調節におけるＰＶＲＩＧおよびＴＩＧＩＴ両方のシグナル伝達の切除効果を試験した。これらの研究のために、Ｂ１６Ｆ１０／Ｄｂ−ｈｍｇｐ１００黒色腫細胞を接種したＷＴマウスまたはＴＩＧＩＴ−／−マウスのいずれかにおける抗ｍＰＶＲＩＧ抗体の有効性を試験した。抗ｍＰＶＲＩＧ遮断ｍＡｂを用いた腫瘍保有ＷＴマウスの処置は、アイソタイプ処置（１１日目で１７％のＴＧＩおよび１８日目のエンドポイントで８％のＴＧＩ）と比較してわずかな効果しかなかった。腫瘍増殖に対するＴＩＧＩＴ欠失の影響も、ＷＴ対照群（１１日目で１７％のＴＧＩおよびエンドポイントで１３％のＴＧＩ）と比較してわずかであった。しかし、ＴＩＧＩＴ欠失を抗ＰＶＲＩＧ  ｍＡｂ処置と組み合わせた場合、有意な腫瘍増殖阻害が観察された（１１日目で６３％、エンドポイントで４９％のＴＧＩ（図８９Ｅ、Ｆ）。腫瘍増殖阻害に従って、抗ＰＶＲＩＧ  ｍＡｂ  ４０７で処置したＴＩＧＩＴ−／−マウスは、ＷＴ対照群と比較して生存率が高かったが、侵攻性で急速に増殖する腫瘍モデルでは統計的有意性は達成されなかった（データは図示せず）。まとめると、これらのデータは、ＰＤ１またはＴＩＧＩＴ阻害剤とのＰＶＲＩＧ阻害剤の相乗的活性を実証し、またＰＤ１またはＴＩＧＩＴ阻害剤によるＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の臨床試験の論理的根拠を提供する発明者らのヒト機能データと一致する。
【０５３４】
考察
ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１等の免疫Ｔ細胞チェックポイントを標的とする抗体はがん患者の生存を増加させてきたが、がん患者の大部分は依然として臨床的利益を示さない。この可能性のある理由の１つは、Ｔ細胞の抗腫瘍免疫を阻害する追加のＴ細胞調節因子の存在である。ここでは、エフェクターＴ細胞機能の調節におけるＰＶＲＩＧの役割を解明し、ＰＶＲＩＧ拮抗作用がＴ細胞の抗腫瘍応答を高め、腫瘍増殖を減少させることを実証する。
【０５３５】
ＰＶＲＩＧは、ネクチンおよびネクチン様ファミリーの新規のメンバーであり、ファミリー内のいくつかの既知の免疫調節性受容体の中の１つとされる。このファミリー内の受容体の相互作用を理解することは、ＰＶＲＩＧの関連性および作用機序を理解する上で非常に重要である。これらの受容体のうち、ＤＮＡＭ、ＴＩＧＩＴ、およびＣＤ９６は、同じリガンドＰＶＲおよびＰＶＲＬ２を共有する点で、ＰＶＲＩＧと最も密接に関連している。ＤＮＡＭは、ＰＶＲおよびＰＶＲＬ２の両方に結合し、リンパ球に共刺激シグナルを送達する。ＴＩＧＩＴは、ＰＶＲに結合し、ＰＶＲＬ２に弱く結合することが報告されている。ＥＬＩＳＡまたはＳＰＲを用いてＴＩＧＩＴとＰＶＲＬ２との間の相互作用を検出することはできず（データは図示せず）、ＰＶＲがＴＩＧＩＴの主要リガンドであることが示唆された。同様の方法を用いて、本発明者らおよび最近の報告により、ＰＶＲＬ２とＰＶＲＩＧとの間の高い親和性の相互作用が検出され、ＰＶＲＩＧがＰＶＲＬ２に対する優勢な阻害性受容体であることが示唆された。これらのデータにより、ＴＩＧＩＴおよびＰＶＲＩＧがこの軸に二重シグナル伝達ノードを含み、このファミリー内のＴ細胞活性化を最大限に増加させるためには、これらの両方を遮断することが必要であることが示唆される。異なるリガンドとの相互作用に加えて、ＰＤＲＩＧはＰＤ−１と同様にエフェクターＴ細胞またはメモリーＴ細胞で最も発現が高いが、ＴＩＧＩＴは調節性Ｔ細胞で最も発現が高いことが観察された。さらに、ＰＶＲＩＧが、ＴＩＧＩＴと比較して、Ｔ細胞活性化後に遅れた誘導を示したことが観察された。これらのデータにより、ＰＶＲＩＧが、ＰＶＲＬ２に対する高い親和性で相互作用し、メモリー細胞上での異なった発現およびＴＩＧＩＴに対する遅れた誘導プロファイルを有するという、このファミリー内で固有の役割を有することが示唆される。
【０５３６】
ここでは、ＰＶＲＩＧ欠損マウスおよびアンタゴニスト抗ＰＶＲＩＧ抗体を用いた抗腫瘍Ｔ細胞応答の調節におけるＰＶＲＩＧの新規の役割が報告される。マウスＰＶＲＩＧは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞上で発現され、リンパ球活性化時に誘導され、末梢と比較してＴＭＥにおいて最高であることがここで実証された。さらに、ＰＶＲＩＧ欠損により、Ｔ細胞機能のインビトロの増加、腫瘍増殖のインビボの減少が生じることが示される。ＰＶＲＩＧに対するアンタゴニスト抗体は、抗ＰＤ−Ｌ１またはＴＩＧＩＴの遺伝子的欠損と組み合わせたときに腫瘍増殖を減少させ、Ｔ細胞応答の調節におけるＰＶＲＩＧの不可欠な役割を実証した。これらの新規のデータにより、ＰＤ１またはＴＩＧＩＴ拮抗作用と組み合わせてＰＶＲＩＧを標的し、癌の治療のための可能性のある新規療法である前臨床腫瘍モデルを用いたインビボでの概念実証が提供される。
【０５３７】
臨床試験における試験が続行されているＰＶＲＩＧとＰＶＲＬ２との相互作用を妨害する高親和性の抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体について、ここで報告する。臨床試験における患者の選択に関する情報を提供し得る可能性のあるがんの兆候を決定するために、ＦＡＣＳおよびＩＨＣによってヒトがんにおけるこの軸の発現プロファイルを調べた。ＰＶＲＩＧについて、ＦＡＣＳによるＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞上のＰＶＲＩＧの平均発現は、子宮内膜、肺、腎臓、および卵巣癌において最も高いことが観察されたが、この差異は、現在数の試料によるテューキーの多重比較検定を用いたＡＮＯＶＡによって決定して、他のがん種との統計学的差異を達成しなかった。ＰＶＲＩＧがＴ細胞活性化時に誘導され、腫瘍浸潤Ｔ細胞の大部分が抗原を経験していることからすれば、ＰＶＲＩＧ発現の中央値が腫瘍試料およびがんの種類にわたって類似していたことは、おそらく驚くにはあたらない。ＰＶＲＩＧ発現がＰＤ−１およびＴＩＧＩＴ発現と相関することが観察され、これらの３つの阻害性受容体の相互作用が抗腫瘍応答を調節する上で重要となることが示唆された。この報告では、ＰＤＲＩＧ抗体をＣＤ８Ｔ細胞腫瘍細胞共培養においてＴＩＧＩＴ抗体と組み合わせた場合、ＰＶＲＩＧまたはＴＩＧＩＴ阻害剤と組み合わせたＰＤ−１よりも良好にＴ細胞機能の相乗的増加が観察された。ＤＣ−Ｔ細胞相互作用の調節におけるＰＶＲＩＧおよびＴＩＧＩＴの役割を実証する以前の研究と共に、これらのデータにより、この経路がＴ細胞−ＡＰＣおよびＴ細胞−腫瘍細胞相互作用の調節に関与し、ＰＶＲＩＧを標的とすることにより抗腫瘍免疫応答を増加させる複数の機序を提供することが示される。
【０５３８】
また、ＰＤ−Ｌ１の発現とＰＤ−１阻害剤に対する臨床的応答とが相互に関関連付けられたため、ある特定のがんの種類がより高い発現を有するかどうかを評価するために、ＦＡＣＳおよびＩＨＣによって腫瘍におけるＰＶＲＬ２発現を分析した。解離した腫瘍細胞を評価すると、子宮内膜、頭頸部、腎臓、肺、および卵巣試料由来のマクロファージにおける平均ＰＶＲＬ２発現が、他の腫瘍型と比較して高かったことが観察された。ＣＤ４５−非免疫細胞上の平均ＰＶＲＬ２発現は、他のがんと比較して、乳癌、大腸癌、子宮内膜癌、肺癌、卵巣癌、および前立腺癌で高かった。ＰＶＲＩＧおよびＰＶＲＬ２発現に基づいて、子宮内膜癌、頭頸部癌、肺癌、腎臓癌、および卵巣癌の腫瘍発生率が高く、高いＰＶＲＩＧおよびＰＶＲＬ２発現を伴うこと、またこれらのがんがこの経路の阻害剤に応答し得る可能性のあるがんであることが決定された。
【０５３９】
ここでは、ＰＶＲＬ２発現は、炎症性メディエーターによってインビトロで抗原産生細胞上で調節され得るが、癌細胞上のＰＶＲＬ２発現は変化しないことが観察された。これらのデータにより、抗原提示細胞上のＰＶＲＬ２発現が、炎症によって調節され得、炎症性腫瘍の指標であり得ることが示唆される。実際に、ＰＤ−Ｌ１＋腫瘍は全て、腫瘍細胞および免疫コンパートメントの両方においてＰＶＲＬ２も発現することが観察された。骨髄細胞でのＰＶＲＬ２の発現は、抗腫瘍効果をさらに増強するためにＰＤ−１またはＴＩＧＩＴによる併用設定においてＰＶＲＩＧ阻害剤に対する応答を予測するのに役立ち得る。興味深いことに、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍の一部は、主に腫瘍細胞上でもＰＶＲＬ２を発現し、免疫細胞上では発現しなかった。上皮細胞でのＰＶＲおよびＰＶＲＬ２発現は、腫瘍形成中に、ならびにストレスおよびＤＮＡ損傷に応答して誘導されることが報告されている。これらのデータは、腫瘍細胞におけるＰＶＲＬ２発現の調節がＩＦＮ−ｇに依存しないというインビトロの所見と一致する。ＰＤ−Ｌ１は、ＩＦＮ−ｇに応答して適応耐性設定で誘導され、炎症性応答に関連するため、ＰＤ−Ｌ１の非存在下でのＰＶＲＬ２の発現は、ＰＶＲＬ２発現がＰＤ−Ｌ１よりも一般的であり、ＰＶＲＬ２が非炎症性腫瘍において発現されることを示唆する。上記に基づいて、ＰＶＲおよびＰＶＲＬ２の存在がＰＤ−Ｌ１とは無関係に免疫応答の抑制に寄与し、ＰＶＲＩＧおよびＴＩＧＩＴの阻害剤が、ＰＤ−Ｌ１陰性であるか、またはＰＤ−１阻害剤に対して応答性／促進性ではない患者において特に重要である可能性がある。
【０５４０】
要約すると、この報告は、ヒトがんにおけるこの軸の発現を特徴付けること、ＣＤ８−腫瘍細胞相互作用の調節におけるＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴの卓越した役割を実証すること、およびＰＤ−１阻害またはＴＩＧＩＴ欠損と組み合わせたＰＤＲＩＧ拮抗作用により、腫瘍増殖における相乗的な減少が生じることを示すことを含む、ＰＶＲＩＧ生物学に対するいくつかの新規の洞察を提供する。これらのデータにより、ＰＶＲＩＧ生物学の現在の理解が広がり、がん患者における高親和性抗ＰＶＲＩＧ抗体であるＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の臨床試験の論理的根拠が提供される。
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１５．Ｚｈｕ  Ｙ，Ｐａｎｉｃｃｉａ  Ａ，Ｓｃｈｕｌｉｃｋ  ＡＣ，Ｃｈｅｎ  Ｗ，Ｋｏｅｎｉｇ  ＭＲ，Ｂｙｅｒｓ  ＪＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ１１２Ｒ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０１６；２１３（２）：１６７−７６ｄｏｉ  １０．１０８４／ｊｅｍ．２０１５０７８５．
１６．Ｂｏｔｔｉｎｏ  Ｃ，Ｃａｓｔｒｉｃｏｎｉ  Ｒ，Ｐｅｎｄｅ  Ｄ，Ｒｉｖｅｒａ  Ｐ，Ｎａｎｎｉ  Ｍ，Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＶＲ（ＣＤ１５５）ａｎｄ  Ｎｅｃｔｉｎ−２（ＣＤ１１２）ａｓ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００３；１９８（４）：５５７−６７  ｄｏｉ  １０．１０８４／ｊｅｍ．２００３０７８８．
１７．Ｙｕ  Ｘ，Ｈａｒｄｅｎ  Ｋ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ＬＣ，Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  Ｍ，Ｃｈｉａｎｇ  Ｅ，Ｉｒｖｉｎｇ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＴＩＧＩＴ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９；１０（１）：４８−５７  ｄｏｉ  １０．１０３８／ｎｉ．１６７４．
１８．Ｓｔａｎｉｅｔｓｋｙ  Ｎ，Ｓｉｍｉｃ  Ｈ，Ａｒａｐｏｖｉｃ  Ｊ，Ｔｏｐｏｒｉｋ  Ａ，Ｌｅｖｙ  Ｏ，Ｎｏｖｉｋ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＩＧＩＴ  ｗｉｔｈ  ＰＶＲ  ａｎｄ  ＰＶＲＬ２  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｈｕｍａｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００９；１０６（４２）：１７８５８−６３  ｄｏｉ  １０．１０７３／ｐｎａｓ．０９０３４７４１０６．
１９．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＲＪ，Ｃｏｍｐｓ−Ａｇｒａｒ  Ｌ，Ｈａｃｋｎｅｙ  Ｊ，Ｙｕ  Ｘ，Ｈｕｓｅｎｉ  Ｍ，Ｙａｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴＩＧＩＴ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｎｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ＣＤ８（＋）Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０１４；２６（６）：９２３−３７  ｄｏｉ  １０．１０１６／ｊ．ｃｃｅｌｌ．２０１４．１０．０１８．
２０．Ｚｈａｎｇ  Ｂ，Ｚｈａｏ  Ｗ，Ｌｉ  Ｈ，Ｃｈｅｎ  Ｙ，Ｔｉａｎ  Ｈ，Ｌｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴＩＧＩＴ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＣＤ１５５．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０１６；６５（３）：３０５−１４  ｄｏｉ  １０．１００７／ｓ００２６２−０１６−１７９９−４．
２１．Ｃｈａｎ  ＣＪ，Ｍａｒｔｉｎｅｔ  Ｌ，Ｇｉｌｆｉｌｌａｎ  Ｓ，Ｓｏｕｚａ−Ｆｏｎｓｅｃａ−Ｇｕｉｍａｒａｅｓ  Ｆ，Ｃｈｏｗ  ＭＴ，Ｔｏｗｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＣＤ９６  ａｎｄ  ＣＤ２２６  ｏｐｐｏｓｅ  ｅａｃｈ  ｏｔｈｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１４；１５（５）：４３１−８  ｄｏｉ  １０．１０３８／ｎｉ．２８５０．
２２．Ｆｕｃｈｓ  Ａ，Ｃｅｌｌａ  Ｍ，Ｇｉｕｒｉｓａｔｏ  Ｅ，Ｓｈａｗ  ＡＳ，Ｃｏｌｏｎｎａ  Ｍ．Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ＣＤ９６（ｔａｃｔｉｌｅ）ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ＮＫ  ｃｅｌｌ−ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＤ１５５）．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；１７２（７）：３９９４−８．
２３．Ｍａｃｈｌｅｎｋｉｎ  Ａ，Ｕｚａｎａ  Ｒ，Ｆｒａｎｋｅｎｂｕｒｇ  Ｓ，Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  Ｇ，Ｅｉｓｅｎｂａｃｈ  Ｌ，Ｐｉｔｃｏｖｓｋｉ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｐｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｂｙ  ｔｒｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＣＴＬｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８；６８（６）：２００６−１３  ｄｏｉ  １０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−０７−３１１９．
２４．Ｏｈｔａｎｉ  Ｈ，Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｔ，Ａｋａｒｉ  Ｈ，Ｉｓｈｉｄａ  Ｔ，Ｋｉｍｕｒａ  Ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０１１；６３（７）：４１７−２８  ｄｏｉ  １０．１００７／ｓ００２５１−０１１−０５１９−７．
２５．Ｔａｕｂｅ  ＪＭ，Ａｎｄｅｒｓ  ＲＡ，Ｙｏｕｎｇ  ＧＤ，Ｘｕ  Ｈ，Ｓｈａｒｍａ  Ｒ，ＭｃＭｉｌｌｅｒ  ＴＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｂ７−ｈ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ａｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｓｃａｐｅ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１２；４（１２７）：１２７ｒａ３７  ｄｏｉ  １０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００３６８９．
２６．Ｃｅｒｂｏｎｉ  Ｃ，Ｆｉｏｎｄａ  Ｃ，Ｓｏｒｉａｎｉ  Ａ，Ｚｉｎｇｏｎｉ  Ａ，Ｄｏｒｉａ  Ｍ，Ｃｉｐｐｉｔｅｌｌｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ：Ａ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＫＧ２Ｄ  ａｎｄ  ＤＮＡＭ−１  Ｌｉｇａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｏｒｍａｌ，Ｉｎｆｅｃｔｅｄ，ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１４；４：５０８  ｄｏｉ  １０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１３．００５０８．
２７．ｄｅ  Ａｎｄｒａｄｅ  ＬＦ，Ｓｍｙｔｈ  ＭＪ，Ｍａｒｔｉｎｅｔ  Ｌ．ＤＮＡＭ−１  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｎｅｃｔｉｎ  ａｎｄ  ｎｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１４；９２（３）：２３７−４４  ｄｏｉ  １０．１０３８／ｉｃｂ．２０１３．９５．
２８．Ｏｖｅｒｗｉｊｋ  ＷＷ，Ｔｓｕｎｇ  Ａ，Ｉｒｖｉｎｅ  ＫＲ，Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ  ＭＲ，Ｇｏｌｅｔｚ  ＴＪ，Ｔｓｕｎｇ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．ｇｐ１００／ｐｍｅｌ  １７  ｉｓ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ”ｓｅｌｆ”−ｒｅａｃｔｉｖｅ，ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ，ａｌｔｅｒｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９８；１８８（２）：２７７−８６．
【０５４１】
Ｓ．実施例１９：腫瘍細胞殺傷アッセイ
腫瘍細胞殺傷に対する抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体およびＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の単独または組み合わせの効果を、ヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いたインビトロ共培養アッセイによって評価した。アッセイに用いたＨＬＡ−Ａ２＋標的細胞株は、ヒトＰＶＲおよびＰＶＲＬ２を安定に発現する黒色腫細胞株Ｍｅｌ６２４、ならびにヒトＰＶＲおよびＰＶＲＬ２の内因性レベルを発現する膵臓腺癌細胞株Ｐａｎｃ０５．０４であった。両方の腫瘍細胞株を、レンチウイルス形質導入（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を介してルシフェラーゼレポーター遺伝子で安定に形質導入した。Ｍｅｌ６２４およびＰａｎｃ０５．０４細胞に、それぞれ、０．００３３μｇ／ｍｌまたは０．０１μｇ／ｍｌのＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチドを３７℃で１時間パルスした。次いで、細胞を洗浄し、２０，０００細胞／ウェルでプレートした。ベンチマーク抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体およびＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）を、組み合わせて、または１０μｇ／ｍｌの対照ｈＩｇＧ４アイソタイプ抗体と共に培養物に添加した。ドナー４、ドナー７２、およびドナー２３４として示される３種の異なるドナー由来のヒトＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を１００，０００細胞／ウェルで添加した。共培養物を３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出し、３０分間室温に平衡化させた。Ｂｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加え、混合物を遮光しながら室温で１０分間平衡化させた。超高感度発光検出器を備えたＥｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、発光または相対光単位（ＲＬＵ）を定量化した。殺傷率を、［（処理抗体のＲＬＵ−培地のみのＲＬＵ）／培地のみのＲＬＵ］×１００によって算出した。
【０５４２】
結果
図９９ＡおよびＢは、Ｍｅｌ６２４およびＰａｎｃ０５．０４細胞の殺傷に対する抗ＴＩＧＩＴ抗体およびＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）処理の効果をそれぞれ示す。単独で共培養物に添加すると、抗ＴＩＧＩＴ抗体およびＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の両方が、アイソタイプ対照抗体と比較して腫瘍細胞株の顕著なＴ細胞殺傷を誘導した。抗ＴＩＧＩＴ抗体について、特異的殺傷率は、Ｍｅｌ６２４細胞については１９〜４１％、試験した３種の異なるＣＭＶ反応性ドナーにわたるＰａｎｃ０５．０４細胞については３〜４４％の範囲であった。ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）については、特異的殺傷率は、Ｍｅｌ６２４細胞については１６〜２０％、Ｐａｎｃ０５．０４細胞については０．２１〜２９％の範囲であった。いくつかの場合では、抗ＴＩＧＩＴ抗体およびＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の併用処理において、腫瘍細胞殺傷に対する相加効果が観察された。
【０５４３】
腫瘍細胞殺傷に対する抗ＴＩＧＩＴ抗体およびＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の効果が用量依存的であるかどうかを決定するために、各抗体について１０点、２倍希釈系列を用いてアッセイを実行し、抗ＴＩＧＩＴ抗体については０．５μｇ／ｍｌ、ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）については１０μｇ／ｍｌで開始した（図１００）。抗ＴＩＧＩＴ抗体、ＢＭ２６、またはＣＰＡ．９．０８６のいずれかをＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と組み合わせると、Ｍｅｌ６２４殺傷は用量依存的に減少した。ＥＣ５０が２．６±１．７ｎＭであったＢＭ２６とＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）との組み合わせと比較して、ＥＣ５０が０．４０±０．４９ｎＭであったＣＰＡ．９．０８６とＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）との組み合わせについて、より強力な殺傷が観察された。
【０５４４】
Ｔ．実施例２０：ＫＤ生物学的測定
ＫｉｎＥｘＡ平衡実験を、２２℃でのＫｉｎＥｘＡ  ３２００機器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ，ＵＳＡ）を使用して行った。組換えＨｉｓタグ化ヒトＴＩＧＩＴは、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）から入手し、１倍のＰＢＳ中に再構成した。ＫｉｎＥｘＡ分析のための抗原および抗体試料は全て、１００μｇ／ｍＬの濾過したＢＳＡおよび０．０２％のアジ化ナトリウムを含む脱気ＰＢＳＴ緩衝液（０．０５％のｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）中で調製した。使用した二次検出抗体は、ｐＨ７．４の１倍ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌの原液から上記のＰＢＳＴ緩衝液（ＢＳＡおよびアジドを含む）中で４００〜７００倍に希釈した、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ６４７で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）であった。各ＫｉｎＥｘＡ実験について、約２０μｇのヒトＴＩＧＩＴを、５０ｍＭの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．２の１ｍＬ中に希釈し、これを５０ｍｇのアズラクトンビーズ（Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ  Ｓｕｐｐｏｒｔ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）に直接添加し、一晩４℃で揺動させた。揺動後、ビーズを１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するｐＨ８．５の１Ｍトリス緩衝液で１回すすぎ、同じ緩衝液中で室温で１時間揺動させる。結合したビーズをＫｉｎＥｘＡ機器のビーズリザーバーに加え、ＫｉｎＥｘＡ機器用の泳動緩衝液でもある０．０２％のアジ化ナトリウムを含有する１倍のＨＢＳ−Ｎ（０．０１ＭのＨｅｐｅｓ、０．１５ＭのＮａＣｌ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて約３０ｍＬに希釈した。全ての抗原結合ビーズは、調製直後に使用した。
【０５４５】
ＣＰＡ．９．０８６（表１）に関するＫＤの２回の反復測定のために、９５７ａＭ〜２１２ｐＭの範囲の１４濃度のＴＩＧＩＴを、２．５ｐＭのＣＰＡ．９．０８６結合部位および１．８ｐＭのＣＰＡ．９．０８６結合部位を用いて室温で約７２時間平衡化した。ＣＰＡ．９．０８３について、４７８ａＭ〜１９６ｐＭの範囲の１４濃度のＴＩＧＩＴを、１．８ｐＭのＣＰＡ．９．０８３結合部位を用いて約７２時間平衡化した。ベンチマーク抗体の２連測定のために、ＢＭ２６  ｈＩｇＧ４、９．６ｆＭ〜３．５３ｎＭの範囲の１４濃度のＴＩＧＩＴを、２０ｐＭのＢＭ２６結合部位および８．０ｐＭのＢＭ２６結合部位を用いて約７２時間平衡化した。ＣＨＡ．９．５４７．１３について、１０．５ｆＭ〜２．２ｎＭの範囲の１４濃度のＴＩＧＩＴを、８ｐＭのｍＡｂ  ＣＨＡ．９．５４７．１３結合部位を用いて約７２時間平衡化した。全ての実験について平衡化した各試料のビーズパックを通って流入した体積は、流量０．２５ｍＬ／分で４ｍＬ〜１１ｍＬの範囲であった。ＫＤを推定し、曲線適合の９５％信頼区間（ＣＩ）を生成するために、ＫｉｎＥｘＡ  Ｐｒｏソフトウェア（バージョン４．２．１０；Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて１：１の「標準平衡」結合モデルでデータを適合させた。
【０５４６】
結果
ＣＰＡ．９．０８３およびＣＰＡ．９．０８６は共に、フェムトモル結合親和性でヒトＴＩＧＩＴに結合したのに対し、ＣＨＡ．９．５４７．１３およびＢＭ２６はピコモル親和性で結合した。したがって、ＣＰＡ．９．０８３およびＣＰＡ．９．０８６は、試験した４つの異なる抗体の中で最も高い親和性でヒトＴＩＧＩＴに結合した。
【０５４７】
表１：ＫｉｎＥｘＡによって決定した抗ヒトＴＩＧＩＴ  ｈＩｇＧ４抗体のＫＤ測定値
【表７】
2019533984.tif 000009
【０５４８】
Ｕ．実施例２１：免疫チェックポイントＴＩＧＩＴを標的とする新規の治療用抗体ＣＰＡ．９．０８６の開発および機能的特徴付け
背景：ＴＩＧＩＴは、異なる腫瘍型に浸潤するエフェクターおよび調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を含むリンパ球で高度に発現される、共阻害性受容体である。報告されているリガンド、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）、およびＰＶＲ様タンパク質（ＰＶＲＬ２およびＰＶＲＬ３）とのＴＩＧＩＴのエンゲージメントにより、リンパ球活性化が直接的に抑制される。ＰＶＲはまた、腫瘍中で広く発現され、これは、ＴＩＧＩＴ−ＰＶＲシグナル伝達軸ががんの主要な免疫逃避機構であり得ることを示唆している。ここでは、ＴＩＧＩＴを標的とする治療用抗体であるＣＰＡ．９．０８６の生物物理学的および機能的特徴付けを報告する。また、ＴＩＧＩＴと新たなチェックポイント阻害剤ＰＶＲＩＧとの共遮断により、Ｔ細胞応答が増大することを実証する。
【０５４９】
材料および方法：ヒトファージディスプレイおよびマウスハイブリドーマ抗体発見計画を実施して、治療用抗ＴＩＧＩＴ抗体を作製した。得られた抗体を、高い親和性で組換えおよび細胞表面発現ヒトＴＩＧＩＴに結合する能力について評価した。カニクイザルおよびマウスＴＩＧＩＴに対する抗体の交差反応性も調べた。ヒトＴＩＧＩＴに高親和性で結合し、カニクイザルＴＩＧＩＴと交差反応する抗体のサブセットを、ＴＩＧＩＴとＰＶＲとの間の相互作用を遮断する能力についてさらに特徴付けた。遮断抗体を、単独で、または抗ＰＶＲＩＧ抗体ＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）と組み合わせてインビトロで抗原特異的Ｔ細胞活性化を増強する能力についてスクリーニングした。
【０５５０】
結果：ヒトＴＩＧＩＴに高いフェムトモル親和性で結合する鉛抗体ＣＰＡ．９．０８６を特定した。この抗体は、試験したベンチマーク抗体よりも高い親和性でヒトＣＤ８＋Ｔ細胞で内因性発現されるＴＩＧＩＴに結合し、またカニクイザルＴＩＧＩＴおよびマウスＴＩＧＩＴの両方に対して交差反応性であった。インビトロ活性について試験すると、ＣＰＡ．９．０８６は、試験したベンチマーク抗体と同等またはそれ以上の効力でＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン分泌および腫瘍細胞殺傷を増大させた。ＣＰＡ．９．０８６と抗ＰＤ１抗体またはＣＨＡ．７．５１８．１．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）との組み合わせにより、ＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞活性の増強が生じた。さらに、ＴＩＧＩＴは、末梢血と比較して固形腫瘍由来のＴｒｅｇおよびエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞で主に発現され、これらの集団がＣＰＡ．９．０８６によって優先的に標的化される可能性が高いことを示した。
【０５５１】
結論：現在、前臨床開発中である非常に高い親和性のアンタゴニストＴＩＧＩＴ抗体ＣＰＡ．９．０８６の開発を説明する。ＣＰＡ．９．０８６のフェムトモル親和性により、患者における投薬量を低下させ、投薬頻度を減少させることができると仮定する。ＣＰＡ．９．０８６は、単独で、または他のチェックポイント抗体と組み合わせて、ヒトＴ細胞活性化を増強することができる。したがって、このデータにより、がんの治療のためのＴＩＧＩＴ、ＰＤ１、およびＰＶＲＩＧの標的化の有用性が実証される。
【図１】
2019533984.tif 000010
【図２】
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【図３Ａ】
2019533984.tif 000012
【図３Ｂ】
2019533984.tif 000013
【図４Ａ】
2019533984.tif 000014
【図４Ｂ】
2019533984.tif 000015
【図５Ａ】
2019533984.tif 000016
【図５Ｂ】
2019533984.tif 000017
【図６Ａ】
2019533984.tif 000018
【図６Ｂ】
2019533984.tif 000019
【図７Ａ】
2019533984.tif 000020
【図７Ｂ】
2019533984.tif 000021
【図８Ａ】
2019533984.tif 000022
【図８Ｂ】
2019533984.tif 000023
【図９】
2019533984.tif 000024
【図１０Ａ】
2019533984.tif 000025
【図１０Ｂ】
2019533984.tif 000026
【図１１Ａ】
2019533984.tif 000027
【図１１Ｂ】
2019533984.tif 000028
【図１１Ｃ】
2019533984.tif 000029
【図１１Ｄ】
2019533984.tif 000030
【図１１Ｅ】
2019533984.tif 000031
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４８Ｃ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図４９Ｄ】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５３Ｃ】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０Ａ】
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【図８０Ｂ】
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【図８０Ｃ】
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【図８１】
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【図８２Ａ−Ｂ】
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【図８２Ｃ】
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【図８３】
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【図８４Ａ】
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【図８４Ｆ】
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【図８５】
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【図８６Ａ】
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【図８６Ｂ】
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【図８６Ｃ】
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【図８６Ｄ】
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【図８６Ｅ】
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【図８６Ｆ】
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【図８６Ｇ】
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【図８６Ｈ】
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【図８６Ｉ】
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【図８７Ａ】
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【図８７Ｂ】
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【図８７Ｃ】
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【図８７Ｄ】
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【図８７Ｅ】
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【図８８Ａ】
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【図８８Ｂ】
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【図８８Ｃ】
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【図８８Ｄ】
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【図８８Ｅ】
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【図８８Ｆ】
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【図８８Ｇ】
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【図８８Ｈ】
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【図８９Ａ】
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【図８９Ｂ】
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【図８９Ｃ】
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【図８９Ｄ】
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【図８９Ｅ】
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【図８９Ｆ】
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【図９０Ａ】
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【図９０Ｂ】
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【図９０Ｃ】
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【図９０Ｄ】
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【図９０Ｅ】
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【図９０Ｆ】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３Ａ】
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【図９３Ｂ】
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【図９４Ａ】
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【図９４Ｂ】
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【図９４Ｃ】
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【図９４Ｄ】
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【図９５】
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【図９６Ａ】
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【図９６Ｂ】
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【図９７】
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【図９７Ｈ】
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【図９７Ｉ】
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【図９８】
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【図９９Ａ】
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【図９９Ｂ】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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