(57)【要約】本発明は、ワクチンとして使用するための、そのＣ末端で抗原と融合したエキソソームアンカータンパク質を含むかもしくはそれからなる融合タンパク質を発現するヌクレオチド配列、または上記ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ発現ベクターに関する。一局面において、上記ヌクレオチド配列または上記ＤＮＡ発現ベクターは、筋肉内投与によって投与される。別の局面において、上記抗原は、Ｅ６およびＥ７などのヒトパピローマウイルス抗原などからなる群より選択される。
2019536473.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＴＬ免疫応答を誘導することによるワクチンによる予防および療法において使用するための、そのＣ末端で免疫原性抗原と融合した配列番号１の配列のエキソソームアンカータンパク質を含むかもしくはそれからなる融合タンパク質を発現するヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ発現ベクターであって、配列番号１が以下の配列：
【化７】
2019536473.tif 000017
である、ヌクレオチド配列またはＤＮＡ発現ベクター。
【請求項２】
筋肉内投与によって投与される、請求項１に従って使用するための、請求項１に記載のヌクレオチド配列またはＤＮＡ発現ベクター。
【請求項３】
前記抗原が、Ｅ６およびＥ７などのヒトパピローマウイルス抗原、ＧａｇおよびＴａｔなどのＨＩＶ抗原、ＶＰ２４、ＶＰ４０、ＮＰ、およびＧＰなどのエボラウイルス抗原、ＮＳ３などのウエストナイルウイルス抗原、ＣｏｒｅなどのＨＢＶ抗原、Ｃｏｒｅ、ＮＳ３、Ｅ１およびＥ２などのＨＣＶ抗原、ＧＰおよびＮＰなどのクリミアコンゴウイルス抗原、ＮＰおよびＭ１などのインフルエンザＡウイルス抗原、ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＡＲＴ−１などのヒトメラノーマ抗原、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、Ｈｏｘ  Ｂ７などのヒト腫瘍関連抗原からなる群より選択される、請求項１から２のいずれか一項に従って使用するための、請求項１から２のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列またはＤＮＡ発現ベクター。
【請求項４】
配列番号１の配列のエキソソームアンカータンパク質を発現するヌクレオチド配列が、以下の配列番号２のヌクレオチド配列：
【化８】
2019536473.tif 000018
である、請求項１から３のいずれか一項に従って使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列またはＤＮＡ発現ベクター。
【請求項５】
ＨＢＶ、ＨＣＶおよびＨＩＶなどの慢性感染疾患、結核およびマラリア、インフルエンザ、ウエストナイル、クリミアコンゴ出血熱およびエボラ疾患などの急性感染疾患、乳房、肺、前立腺または膀胱腫瘍などの腫瘍からなる群より選択される疾患の予防および処置のために、請求項１から４のいずれか一項に従って使用するための、請求項１から４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列またはＤＮＡ発現ベクター。
【請求項６】
そのＣ末端で抗原と融合した配列番号１の配列のエキソソームアンカータンパク質を含むかもしくはそれからなる融合タンパク質を発現するヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ発現ベクターを、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤および／またはアジュバントと共に含むかまたはそれらからなる、免疫原性である医薬組成物であって、配列番号１が以下の配列：
【化９】
2019536473.tif 000019
である医薬組成物。
【請求項７】
前記抗原が、Ｅ６およびＥ７などのヒトパピローマウイルス抗原、ＧａｇおよびＴａｔなどのＨＩＶ抗原、ＶＰ２４、ＶＰ４０、ＮＰ、およびＧＰなどのエボラウイルス抗原、ＮＳ３などのウエストナイルウイルス抗原、ＣｏｒｅなどのＨＢＶ抗原、Ｃｏｒｅ、ＮＳ３、Ｅ１およびＥ２などのＨＣＶ抗原、ＮＰおよびＧＰなどのクリミアコンゴウイルス抗原、ＮＰおよびＭ１などのインフルエンザＡウイルス抗原、ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＡＲＴ−１などのヒトメラノーマ抗原、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、Ｈｏｘ  Ｂ７などのヒト腫瘍関連抗原からなる群より選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
配列番号１の配列のエキソソームアンカータンパク質を発現するヌクレオチド配列が、以下の配列番号２の配列：
【化１０】
2019536473.tif 000020
である、請求項６から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
筋肉内投与経路に適切な形態である、請求項６から８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記アジュバントが、ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答のアジュバントである、請求項６から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ワクチンによる予防および療法において使用するための、請求項６から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ＨＢＶ、ＨＣＶおよびＨＩＶなどの慢性感染疾患、結核およびマラリア、インフルエンザ、ウエストナイル、クリミアコンゴ出血熱およびエボラ疾患などの急性感染疾患、乳房、肺、前立腺または膀胱腫瘍などの腫瘍からなる群より選択される疾患の予防および処置のために、請求項１１に従って使用するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチンとして使用するためのエキソソームアンカータンパク質を発現するヌクレオチド配列に関する。特に、本発明は、ワクチンとして使用するための、そのＣ末端で抗原と融合したエキソソームアンカータンパク質を含むかもしくはそれからなる融合タンパク質を発現するヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫応答により、外部と内部の両方の健康上の脅威から保護されることが公知である。多くの場合、自然免疫が病理の進展を抑え込むことができない場合、免疫原の接種によって誘発される免疫応答が、病理プロセスを遮断することができ、これは例えば、いくつかの感染性病原体に対する中和抗体の誘導によって起こる。
【０００３】
それとは別に、ＣＴＬ系ワクチンの同定、生産、およびマーケティングは、慢性感染および腫瘍疾患の進展に対する潜在的有用性について幅広い意見の一致があるにもかかわらず、さらに限定的である。
【０００４】
強力かつ幅広いＣＴＬ免疫応答を誘発することは、いくつかの病理の処置に対して治療として妥当であることが期待される。例として、いくつかの系列のエビデンスにより、ＨＰＶ感染、およびその結果、ウイルス関連新生物を制御する際に細胞媒介免疫応答が重要であることが示唆される。実際に、一般的な免疫抑制、または抗ＨＰＶ  ＣＴＬ応答が乏しいことのいずれかが、ウイルス持続性および疾患進行に関連する。
【０００５】
抗原に特異的なＣＴＬ免疫の誘導に対して最も一般的に使用される実験技法は、ウイルスベクター、ペプチドおよび不活性化病原体の使用に基づく。しかしながら、今日まで、ＣＴＬ免疫原性薬物は市販されていない。
【０００６】
免疫原性タンパク質の生成のためのＤＮＡワクチン接種は成功が認められた。例として、日本脳炎に対するＤＮＡワクチンが２０１０年にヒトへの使用に対してリリースされた（１）。さらに、ウエストナイルウイルスからウマを保護するために、獣医医学のＤＮＡワクチンが承認された（２、３）。また、多発性硬化症に対するＤＮＡワクチン接種の予備研究では、有効であることが報告された（４）。全体的に、これらのエビデンスにより、原則として、ＤＮＡワクチン接種には、ヒトにおける適用可能性の見通しがあり得るという見解が支持される。ＤＮＡワクチン接種の利点の中で、開発および生産の容易性、貯蔵安定性、費用対効果、ならびに免疫原の持続性について言及されるべきである。理論上の短所は、抗ＤＮＡ抗体産生の可能性、および細胞成長の遺伝子制御機序に対する妨害によって表されることとなる。しかしながら、より重要な限界は、惹起された免疫応答の不充分な効力によって表される。このような理由で、免疫応答を予備刺激するためのＤＮＡの使用を含む多くのワクチン接種プロトコールの後に、免疫を追加刺激する（boost）ために代替製剤のもとで免疫原の接種がなされる。
【０００７】
エキソソームは、全細胞型によって構成的に放出される５０〜１００ナノメートルの小胞である。これらは、エンドソーム膜の内部への陥入によって生じる。これらの腔内小胞は、原形質膜へと輸送されることが可能である多小胞体（ＭＶＢ）を形成し、多小胞体（ＭＶＢ）は原形質膜に融合し、それによって、その小胞内容物を細胞外環境に放出する。エキソソームに似た物理的かつ生化学的特徴を示すが原形質膜の直接的押出しによって生じたナノ小胞について、筋肉細胞において記載されている（５、６）。エキソソームは、以前には、細胞老廃物の分泌に排他的に寄与すると考えられていたが、現在では、エキソソームが細胞間伝達ネットワークの一部であることが受け入れられている。これらは、標的細胞において機能的となり得るメッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡ、およびタンパク質を取り込む。
【０００８】
これらの免疫原性は、基本的に、これらが取り込む抗原の量と質の結果である。エキソソームについては、抗腫瘍免疫刺激剤に関して調査され、一部の場合には、これらは臨床試験での承認に達する（７〜９）。自発的に、腫瘍抗原、主に、ｇｐ１００、ＴＲＰ−１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、およびＣＥＡのような膜貫通型タンパク質をアップローディングするエキソソームは、特異的抗腫瘍Ｔ細胞免疫の活性化を誘導することが見出された（１０、１１）。臨床試験は、腫瘍患者の無細胞ワクチンとしてのエキソソームの実施可能性と良好な忍容性の両方を実証した。しかしながら、それらの治療有効性は非常に限定されていると考えられ、それらの免疫原性を増加させる新たな方法の必要性を提起する。この問題には、エキソソーム膜における外来抗原提示を増加させるためにそれらを操作する際に直面してきた。この点について、これまでに２つの戦略について記載されてきた。第１の戦略は、異種抗原のエキソソーム膜の外側との会合をもたらす、ラクトアドへリンのＣ１Ｃ２ドメインのエキソソーム脂質への結合を活用する。他の戦略は、疎水性の高い膜貫通型ドメインを末端に付加したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのエンテロトキシンＡでエキソソームをコーティングすることに依拠する。
【０００９】
ＨＩＶの出芽には、エキソソーム生合成にも関与するいくつかの細胞因子、すなわち、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、および輸送に必要なエンドソーム選別複合体（ＥＳＣＲＴ）のいくつかの他の成分との相互作用が必要とされる。また、ＨＩＶのエンベロープ膜とエキソソームは、脂質ラフト、すなわち、コレステロール、飽和側鎖を有するリン脂質、およびスフィンゴ脂質に富む細胞膜マイクロドメインを含む多くの成分を共有する。エキソソームとＨＩＶの生合成の収斂は、ウイルス生成物がエキソソームに取り込まれる可能性を意味する。そのＮ末端のミリストイル化を、ＭＶＢの境界膜における脂質ラフトマイクロドメインにアンカーすることにより会合するＨＩＶ−１  Ｎｅｆの場合がそうである。Ｎｅｆは、２７キロダルトン（ｋＤａ）の酵素活性を欠くタンパク質であるが、ほとんどの場合に、脂質ラフトマイクロドメインと会合して、シグナル伝達分子の活性化を誘発することにおいてスキャホールド／アダプターエレメントとして作用する。
【００１０】
ＨＩＶ−１粒子、ＨＩＶ−１系ウイルス様粒子（ＶＬＰ）（１２）、およびエキソソーム（１３）に非常に高いレベルで取り込まれるＶ１５３Ｌ Ｅ１７７Ｇ  Ｎｅｆ変異体が以前に特定されている。この変異体が、Ｇ３Ｃ変異によるＮ末端パルミトイル化により操作された場合には、エキソソーム取り込みの効率はさらに増加し、これは、脂質ラフトとの会合の改善から予期される結果である。このＮｅｆ変異体（Ｎｅｆｍｕｔとも称される）は、基本的にすべてのＮｅｆ機能について欠陥があり、そのＣ末端において外来タンパク質と融合した場合にも、ナノ小胞におけるその取り込みの効率は有意に変化しない。Ｎｅｆｍｕｔに操作を加えることにより、選択した抗原を多量にエキソソームに取り込むことが可能となり、したがって、エキソソームは外部からの中和／分解因子から保護されたままになる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたＮｅｆｍｕｔにより操作されたエキソソームは、有効な抗原特異的ＣＴＬ応答を誘導することが最近報告された（１４）。特に、免疫原としてＨＰＶ−Ｅ７タンパク質を有するｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたエキソソームを使用して、非常に有望な結果（１４）が既に得られている。
【００１１】
しかしながら、これらの知見の可能な臨床適用の点から、この戦略は、工業的製造の標準化、費用対効果の高さ、および免疫原の貯蔵を含む可能性のある技術的困難に直面することになる。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたエキソソームは、注入の際の半減期が限定されることが予測され、また、エキソソーム膜に会合した「非自己」分子の認識により宿主の細網内皮系から排除される傾向にある。この課題に関して、ｅｘ  ｖｉｖｏで単離されたかまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたエキソソームのいずれかの半減期は、注入後およそ２分間継続し、肝臓および脾臓における迅速な蓄積を示し、ほんの少量のエキソソームだけが４時間後に検出可能であることが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｐｅｒｅｔｔｉ  Ｓ．ら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．（２００５）１２：１１８５〜９６
【非特許文献２】Ｌａｔｔａｎｚｉ  Ｌ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１２）３０：７２２９〜３７
【非特許文献３】Ｄｉ  Ｂｏｎｉｔｏ  Ｐ．ら、Ｖｉｒｕｓｅｓ（２０１５）７：１０７９〜９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、上記観点から、公知の療法の短所を克服することができる新たな免疫療法を提供することが必要であるのは明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この技術的背景に関して、本発明は、感染および腫瘍疾患の処置に対するＣＴＬ免疫応答を含む公知の治療戦略の短所を克服することができる内因性の操作されたエキソソームの生成に基づく新たなワクチン戦略を提供する。
【００１５】
本発明によれば、Ｎｅｆｍｕｔ系融合タンパク質を発現するＤＮＡベクターの、筋肉内（ｉ．ｍ．）接種による宿主動物への投与は、既に移植された腫瘍細胞の成長を強力に阻害する有効なＣＴＬ免疫応答を誘発することが見出された。いくつかの系列のエビデンスにより、内因性の操作されたエキソソームの生成が、観察された抗腫瘍作用の根底にあったことが示される。
【００１６】
特に、本発明による結果は、ｉ）ＤＮＡトランスフェクション後に操作されたエキソソームを生成する筋肉細胞の能力；ｉｉ）治療状況において強力な抗腫瘍作用を示すＮｅｆｍｕｔ／Ｅ７を発現するベクターの接種後の抗原特異的ＣＴＬ免疫の再現性のある誘導；およびｉｉｉ）レシピエントマウスに再注入されたＤＮＡ接種マウスの血漿から単離されたエキソソームの免疫原性を示す。
【００１７】
さらに、Ｎｅｆｍｕｔの異所発現が操作されたエキソソームの放出を導くかどうか、およびどの程度の効率でＮｅｆｍｕｔの異所発現が操作されたエキソソームの放出を導くかが調査された。Ｃ２Ｃ１２細胞で得られたデータにより、Ｎｅｆｍｕｔが、ヒト細胞で検出可能なものと同様のレベルで、マウス筋肉細胞によって放出されたエキソソーム様ナノ小胞中に蓄積するという見解が支持された。調査には、最終的に分化した筋肉細胞、すなわち、マウスにおけるｉ．ｍ．接種によって最も標的とされる可能性が高い細胞型が含まれなかった。これらの細胞では、小胞の細胞内輸送の根底にある機序が、少なくとも定性的に変化しないと仮定される。
【００１８】
この課題に関して、Ｎｅｆｍｕｔ系ＤＮＡベクターをｉ．ｍ．接種したマウス由来の血漿中の操作されたエキソソームの検出により、Ｎｅｆｍｕｔが分化した筋肉細胞によって放出されたエキソソーム中にも蓄積することができるという見解が支持された。理論的には、例えば、樹状細胞（ＤＣ）によって捕捉され、内部移行され得る流入領域リンパ節におけるＤＮＡの拡散によって、注入されたＤＮＡの少なくとも一部が他の細胞型を標的とする可能性を除外することはできない。しかしながら、優先的にＤＣを標的とすることが期待されるＮｅｆｍｕｔ／Ｅ７を発現するＤＮＡのサブキュート（ｓｕｂ−ｃｕｔｅ）接種により、有意に弱いＥ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答が生じた（図示せず）ことを考慮すると、ＤＣによるＤＮＡ取り込みは、本明細書に記載したＣＤ８＋  Ｔ細胞活性化事象の機序にとって重要な部分ではなかったと考えるのが妥当である。
【００１９】
ＤＮＡを接種したマウスで検出されたＣＤ８＋  Ｔ細胞活性化の程度は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した操作されたエキソソームを注入したマウスで観察されたものよりもはるかに強力であるようであった（１４）。２つの異なる免疫原の量を比較するのが不可能である点から、直接比較実験を実行することはできないが、ＤＮＡ接種により、マウスがヒト細胞によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたエキソソームを接種された場合に必要とされる脾臓細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激／増殖なしで、はっきりと検出されるのに十分強力なＥ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化が誘発された（１４）。ＤＮＡ注入により得られた明らかに優れた結果は、おそらく、接種されたＤＮＡを発現する細胞が、局所と遠位の両方のＡＰＣによって容易に内部移行される免疫原性エキソソームの連続供給源を確立することができるという事実の結果であった。
【００２０】
本発明によれば、いくつかの実験のエビデンスが、ＤＮＡ注入後に観察されたＣＴＬ免疫応答の根底にある機序に関して提供された。特に、Ｎｅｆｍｕｔと融合したＧＦＰを発現するベクターを接種したマウスの血漿における蛍光エキソソームの検出により、操作されたエキソソームが、実際に、ＤＮＡベクターの注入の際に生成されたことが判明した。さらに、エキソソームにおける蓄積以外のＮｅｆｍｕｔ活性は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化にとって重要でないようである。なぜなら、Ｎｅｆｍｕｔ活性が、Ｎｅｆｍｕｔを発現するベクターを注入されたマウスで検出されたが、野生型Ｎｅｆでは検出されなかったためである。これと一致して、抗Ｅ７抗体応答がＥ７細胞外排出の証拠となった、Ｅ７発現ベクターを注入されたマウスにおけるＥ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の欠如によって示されるように、ＣＴＬ応答がＤＮＡ標的化細胞由来の遊離抗原の放出に依拠しなかったことが観察された。さらに、Ｅ７単独ではなく、Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７を発現するベクターを注入されたマウスの血漿から単離されたエキソソームが、ナイーブなレシピエントマウスに注入された場合に免疫原性であったことが判明した。
【００２１】
まとめると、これらの実験のエビデンスは、免疫原性の内因性の操作されたエキソソームの生成が、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化の根底にあるという見解と一致するものであった。とりわけ、この免疫応答は、免疫化の前に移植された同系腫瘍細胞の成長を効率的に妨害するのに十分迅速かつ強力であるようであった。
【００２２】
本明細書に提示した実験のエビデンスに基づいて、Ｎｅｆｍｕｔ系ベクターを発現するＤＮＡベクターの接種によって誘導されるＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化の根底にある最も可能性の高い機序は、図１に報告したようにまとめることができる。注入されたＤＮＡベクターを発現する筋肉細胞は、ＡＰＣによって内部移行される操作されたエキソソームを放出する。以前に実証されたように、Ｎｅｆｍｕｔ系エキソソームの内部移行は、関連する抗原の交差提示を導き、結果として、抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を予備刺激する。第２のＤＮＡ注入によって確保される免疫応答の追加刺激は、接種されたＤＮＡによって標的とされる細胞由来のエキソソームの連続生成によって強化されることとなる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたエキソソームを接種したマウスでの以前の観察によれば（１４）、抗Ｅ７抗体も抗Ｎｅｆ抗体も接種したマウス由来の血漿において検出されず、エキソソームによりアップローディングされた抗原は、基本的に、ＴＨ−１に偏った免疫応答を誘発することが強く示唆される。
【００２３】
最後に、ヒトの乳がんに対するこの知見の可能な適用の点から、以下の態様についても調査した：ｉ）操作されたエキソソームによって誘導される免疫原刺激が免疫寛容を破壊することができるかどうか、およびｉｉ）ヒトの系に適用した場合のこれらの有効性。特に、ｉｎ  ｖｉｖｏで操作されたエキソソームによって誘導される免疫活性化が、寛容を破壊するのに十分強力であり得るかどうかを試験するために、ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスの広範に調査されたモデルが考慮されてきた（１５）。ここで、ｒＨＥＲ２／ｎｅｕ導入遺伝子は胸腺で発現され、寛容を逃避するＣＤ８＋  Ｔリンパ球が非常に少数であるという事実によって判明したように、ＣＤ８＋  Ｔブランチをひどく損なう寛容を導く（１６）。ＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより、本発明者らは、ＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＨＥＲ２−ＥＣＤ）と融合したＮｅｆｍｕｔを発現するＤＮＡベクターの２回の注入が、ＨＥＲ２／ｎｅｕに対するＣＤ８＋  Ｔ寛容を破壊するのに十分であることを再現可能に評価した。これらの結果は、著しいＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的ＣＴＬ応答が、ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現ＤＮＡベクターを注入した際にこれらのトランスジェニックマウスにおいて見出されなかったため、妥当であった（１７〜１９）。
【００２４】
興味深いことに、この免疫活性化は、腫瘍発生の遅延と相関することが見出された。これは、腫瘍発生のＣＴＬに関連するが抗体に依存しない阻害が、ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスで観察された最初の事例である。一方、ＨＥＲ２−ＥＣＤ特異的ＣＴＬ免疫応答によって生じた免疫学的圧力が腫瘍疾患を治癒させるのに十分ではなかったという事実は、少なくとも２つの理由で驚くべきものではなかった。第１に、ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスでは、すべての哺乳動物の上皮細胞が癌遺伝子を同時に発現し、多数の腫瘍性病変の同期的発生を生じる。それゆえに、抗腫瘍免疫は、多重の形質転換事象によって圧倒され得る。さらに、腫瘍細胞の固有の遺伝的不安定性により、３つの「Ｅ」、すなわち、排除（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）、平衡（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）、および逃避（ｅｓｃａｐｅ）（２０）によってまとめられるいわゆる免疫編集の機序によって免疫圧からの逃避が導かれ得る。このようにして、がん細胞の変化に対する抗腫瘍免疫応答の選択により、免疫制御を回避することができる。もちろん、このような機序の有効性は、同時発生の腫瘍病変の数と共に増加することが予測される。
【００２５】
診療所において本発明のツールを活用する可能性を開くために、ヒトの系におけるその有効性も実証された。この目標を達成するために、マウスで以前に記載された（２１）抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔリンパ球免疫応答の誘導の根底にある機序を再現する条件を使用して、実験を設定した。共焦点顕微鏡分析からの結果は、ヒト初代筋肉細胞にトランスフェクトされたＤＮＡベクターの生成物が、操作されたエキソソームの形成によりＤＣによって内部移行され得るという見解と一致した。さらに、クロスプライミングアッセイからのデータは、トランスフェクトされた筋肉細胞による、Ｎｅｆｍｕｔまたはその誘導体の取り込みのために操作されたエキソソームの生成が、十分に検出可能な抗原特異的ＣＴＬ活性を生じるのに十分であることを示す。抗原特異的クロスプライミングがエキソソーム生合成の阻害剤が使用された場合に著しく損なわれたという事実は、操作されたエキソソームのＤＣへの送達が抗原特異的ＣＴＬ活性化の発生に対する重要なステップであるという見解と一致した。全体として、ｅｘ  ｖｉｖｏの細胞に関して得られた結果は、ヒトにおけるＮｅｆｍｕｔ系ＣＴＬワクチンプラットフォームの使用において明らかな制限がないことを示す。
【００２６】
上記に基づいて、本発明によるＣＴＬワクチンプラットフォームは、固形腫瘍に対する新規療法を表す。腫瘍関連自己抗原に対する寛容を破壊することおよび腫瘍関連抗原に対する応答を改良することは、抗腫瘍免疫療法に関して次の新天地を表す（２２）。本発明による内因性エキソソームを操作することに基づくＣＴＬワクチンプラットフォームは、両方のエンドポイントを満たす可能性を有し、それゆえに、ＣＴＬ免疫化に関して真に新規な概念を表す。
【００２７】
操作された内因性エキソソームに基づいてＣＴＬ免疫を誘導する本明細書で提案される戦略は、Ｎｅｆｍｕｔと融合した際にエキソソームにアップローディングされる抗原の有効な免疫原性と組み合わせた、ＤＮＡワクチンに特有の生産、貯蔵、および送達の容易性、ならびに免疫原の選択に関するその固有の高い柔軟性を活用する。
【００２８】
本発明によれば、選択した抗原の配列を容易に挿入し発現させると考えられる「Ｎｅｆｍｕｔシャトル」と呼ばれるＤＮＡベクターが提供されている。
【００２９】
構造的観点から、本発明によるＤＮＡベクターは、例えば、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターをさらにより強力な他のプロモーターと置き換えること、および／または転写物の安定化配列を挿入すること（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後エレメント（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）、ＷＰＲＥ）、および最小サイズまで「エキソソームアンカータンパク質」を低減させ、したがって、それに融合した抗原の取り込みを支持することによって、転写効率に関して両方の改良を受けることができる。
【００３０】
本発明によれば、エキソソーム／ナノ小胞は、多量の任意の抗原を取り込むために「ｉｎ  ｖｉｖｏで」操作され得るため、本発明のバイオテクノロジープラットフォームは、特異的ＣＴＬの攻撃に対して感受性の任意の疾患に対して治療上有益となる可能性がある。
【００３１】
本発明による「エキソソームアンカータンパク質」Ｎｅｆｍｕｔとの融合生成物を発現するＤＮＡベクターに基づくワクチン接種の治療目的での使用は、有効なＣＴＬ免疫応答から利益を得る可能性のあるすべての病理に適用可能である。明らかに、操作することができる抗原の数および起源は、扱われる治療戦略に関連して拡大され得る。
したがって、本発明の具体的な目的は、ワクチンによる予防および療法において使用するための、そのＣ末端で抗原と融合した配列番号１の配列のエキソソームアンカータンパク質を含むかもしくはそれからなる融合タンパク質を発現するヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ発現ベクターであって、配列番号１が以下の配列：
【化１】
2019536473.tif 000003
であるヌクレオチド配列またはＤＮＡ発現ベクターである。
【００３２】
本発明によるヌクレオチド配列またはＤＮＡ発現ベクターは、好ましくは筋肉内に投与することができ、他の投与経路は、エアロゾル投与（すなわち、上気道への投与）、皮内、粘膜、サブキュート投与であってもよい。
【００３３】
抗原は、Ｅ６およびＥ７などのヒトパピローマウイルス抗原、ＧａｇおよびＴａｔなどのＨＩＶ抗原、ＶＰ２４、ＶＰ４０、ＮＰ、およびＧＰなどのエボラウイルス抗原、ＮＳ３などのウエストナイルウイルス抗原、ＣｏｒｅなどのＨＢＶ抗原、Ｃｏｒｅ、ＮＳ３、Ｅ１およびＥ２などのＨＣＶ抗原、ＧＰおよびＮＰなどのクリミアコンゴウイルス抗原、ＮＰおよびＭ１などのインフルエンザＡウイルス抗原、ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＡＲＴ−１などのヒトメラノーマ抗原、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、Ｈｏｘ  Ｂ７などのヒト腫瘍関連抗原からなる群より選択することができる。
上述のように、配列番号１の配列のエキソソームアンカータンパク質を発現するヌクレオチド配列は、以下の配列番号２のヌクレオチド配列（Ｎｅｆｍｕｔのヌクレオチド配列）：
【化２】
2019536473.tif 000004
であってもよい。
【００３４】
本発明によるヌクレオチド配列またはＤＮＡ発現ベクターは、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびＨＩＶなどの慢性感染疾患、結核およびマラリア、インフルエンザ、ウエストナイル、クリミアコンゴ出血熱およびエボラ疾患などの急性感染疾患、乳房、肺、前立腺または膀胱腫瘍などの腫瘍からなる群より選択される疾患の予防および処置のために使用することができる。
【００３５】
本発明はまた、そのＣ末端で抗原と融合した配列番号１の配列のエキソソームアンカータンパク質を含むかもしくはそれからなる融合タンパク質を発現するヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ発現ベクターを、１つもしくは複数の薬学的に許容される賦形剤および／またはアジュバント、例えば、ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答のアジュバント（例として、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ（商標）アジュバント）と共に含むかまたはそれらからなる医薬組成物であって、配列番号１が以下の配列：
【化３】
2019536473.tif 000005
である医薬組成物に関する。
【００３６】
上述のように、抗原は、Ｅ６およびＥ７などのヒトパピローマウイルス抗原、ＧａｇおよびＴａｔなどのＨＩＶ抗原、ＶＰ２４、ＶＰ４０、ＮＰ、およびＧＰなどのエボラウイルス抗原、ＮＳ３などのウエストナイルウイルス抗原、ＣｏｒｅなどのＨＢＶ抗原、Ｃｏｒｅ、ＮＳ３、Ｅ１およびＥ２などのＨＣＶ抗原、ＮＰおよびＧＰなどのクリミアコンゴウイルス抗原、ＮＰおよびＭ１などのインフルエンザＡウイルス抗原、ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＡＲＴ−１などのヒトメラノーマ抗原、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、Ｈｏｘ  Ｂ７などのヒト腫瘍関連抗原からなる群より選択することができる。
【００３７】
本発明の実施形態によれば、配列番号１の配列のエキソソームアンカータンパク質を発現するヌクレオチド配列は、以下の配列番号２の配列：
【化４】
2019536473.tif 000006
であってもよい。
【００３８】
医薬組成物は、好ましくは、筋肉内投与によって投与することができ、他の投与経路は、エアロゾル投与（すなわち、上気道への投与）、皮内、粘膜、サブキュート投与であってもよい。
【００３９】
さらに、本発明は、例として、ＨＣＶおよびＨＩＶなどの慢性感染疾患、結核およびマラリア、インフルエンザ、ウエストナイル、クリミアコンゴ出血熱およびエボラ疾患などの急性感染疾患、乳房、肺、前立腺または膀胱腫瘍などの腫瘍からなる群より選択される疾患の予防および処置において、ワクチンによる予防および療法において使用するための上述の医薬組成物に関する。
【００４０】
本発明にしたがう、ヌクレオチド配列、それを含むＤＮＡ発現ベクターまたは医薬組成物は、医学分野および獣医医学分野において使用することができる。
【００４１】
ここで、本発明は、同封した図面を特に参照して、その好ましい実施形態に従って、例証であるが非限定的方法で説明されることとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、Ｎｅｆｍｕｔ系ＤＮＡベクターの接種によって誘導されたＣＴＬ活性化の根底にある機序のスキームを示す。Ｎｅｆｍｕｔに融合した抗原を発現するＤＮＡベクターを注入した後、トランスフェクトされた筋肉細胞は、改変されていないエキソソームと操作されたエキソソームの両方を放出する。これらの後者の内容物は、ＡＰＣによって一旦内部移行され、交差提示されると、内因性の操作されたエキソソームにアップローディングされた抗原に特異的なＣＤ８＋  Ｔリンパ球の予備刺激／活性化を誘導する。
【図２ＡＢ】図２は、トランスフェクトされたマウスの筋肉細胞の上清中の操作されたエキソソームの検出を示す。Ａ．Ｎｅｆｍｕｔ／ＧＦＰまたはＮｅｆＧ２Ａ／ＧＦＰ発現ベクターのいずれかによるトランスフェクションの２日後の、ヒト２９３Ｔ細胞とマウスＣ２Ｃ１２筋肉細胞の両方のＦＡＣＳ分析。Ｍ１は、模擬トランスフェクト細胞の分析によって確立された陽性の範囲を示す。陽性細胞のパーセンテージが報告されている。Ｂ．同数（すなわち、５×１０６個）の２９３ＴとＣ２Ｃ１２のトランスフェクトされた細胞の両方から上清の分画遠心分離によって回収されたエキソソームのＡｃｈＥ活性に関する定量化。Ｃ．２９３ＴとＣ２Ｃ１２のトランスフェクトされた細胞の両方に由来するエキソソームのウエスタンブロット分析。Ｎｅｆ系生成物が細胞溶解物とエキソソームの両方で検出され、一方、β−アクチンとＡｌｉｘは、それぞれ、細胞溶解物とエキソソームに対するマーカーとして作用した。矢印は、関連するタンパク質生成物を示す。分子マーカーはｋＤａで与えられる。Ｄ．Ｃ２Ｃ１２のトランスフェクトされた細胞由来のエキソソームのＦＡＣＳ分析。Ｎｅｆｍｕｔ−ＧＦＰ発現ベクターまたはＮｅｆＧ２Ａ−ＧＦＰ発現ベクターのいずれかをトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞由来の１０ｍＵのエキソソームを、前方／側方散乱（上のパネル）とＧＦＰ蛍光（下のパネル）の両方に関して、ＦＡＣＳによって分析した。象限（ｑｕａｄｒａｎｔ）は、検出された粒子の寸法（上のパネル）、または模擬トランスフェクト細胞由来のエキソソームの分析によって計算された陽性の範囲のいずれかを示す。結果は、２つの独立した実験の代表例である。
【図２ＣＤ】同上
【図３Ａ】図３は、Ｎｅｆｍｕｔ−ＧＦＰ発現ＤＮＡベクターを接種したマウス由来の血漿における蛍光ナノ小胞の検出を示す。Ａ．指定のＤＮＡベクターを接種したマウス由来の筋肉組織におけるＧＦＰ関連生成物の発現の分析。倍率：４０倍。Ｂ．Ｃ５７  ＢＩ／６マウスを、指定の生成物を発現するＤＮＡベクターと共にｉ．ｍ．接種して、３および９日後に、エキソソームを分画遠心分離によって血漿から単離した。次いで、等量（すなわち、１ｍＵ）のエキソソームを、界面活性剤を含まない白色のアルデヒド／サルフェートラテックスビーズに結合させ、最終的に、それらの蛍光をアッセイした。対照として、Ｎｅｆｍｕｔ−ＧＦＰベクターを一過的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上清から単離した１０μＵのエキソソームを使用した（Ｃｔｒｌ＋）。象限は、未処理ビーズの蛍光に基づいて設定した。陽性事象のパーセンテージを示す。結果は、２つのアッセイの代表例である。
【図３Ｂ】図３は、Ｎｅｆｍｕｔ−ＧＦＰ発現ＤＮＡベクターを接種したマウス由来の血漿における蛍光ナノ小胞の検出を示す。Ａ．指定のＤＮＡベクターを接種したマウス由来の筋肉組織におけるＧＦＰ関連生成物の発現の分析。倍率：４０倍。Ｂ．Ｃ５７  ＢＩ／６マウスを、指定の生成物を発現するＤＮＡベクターと共にｉ．ｍ．接種して、３および９日後に、エキソソームを分画遠心分離によって血漿から単離した。次いで、等量（すなわち、１ｍＵ）のエキソソームを、界面活性剤を含まない白色のアルデヒド／サルフェートラテックスビーズに結合させ、最終的に、それらの蛍光をアッセイした。対照として、Ｎｅｆｍｕｔ−ＧＦＰベクターを一過的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上清から単離した１０μＵのエキソソームを使用した（Ｃｔｒｌ＋）。象限は、未処理ビーズの蛍光に基づいて設定した。陽性事象のパーセンテージを示す。結果は、２つのアッセイの代表例である。
【図４Ａ】図４は、抗体産生がない場合のＥ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答を誘導するＮｅｆｍｕｔ／Ｅ７ＤＮＡベクターの接種を示す。Ｅ７もしくはＮｅｆｍｕｔ／Ｅ７のいずれかを発現するＤＮＡベクター、または空ベクターを接種したマウスにおけるＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答。Ｃ５７  ＢＩ／６マウス（１群当たり６頭）に、異なるＤＮＡベクターを２回接種した。マウスから回収した脾臓細胞を、無関連（図示せず）、Ｅ７、またはＮｅｆ特異的９量体のいずれかを５μｇ／ｍｌを用いてまたは用いずに接種した。１ウェル当たり１０５個の細胞を用いてＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを三連で行うことによって細胞活性化の程度を評価した。対照として、未処理細胞も５ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシンと共にインキュベートした。各接種したマウス由来の脾臓細胞を播種した三連のウェルから、１０５個の細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＵ）の数が示される。ＳＦＵの群間平均＋ＳＤも報告した。結果は、３つの独立した実験の代表である。＊ｐ＜０．０５。Ｂ．指定のベクターを接種したマウス由来のＣＤ８＋  Ｔ細胞を用いて行ったＣＴＬアッセイ。異なる接種したマウス由来の脾臓細胞から単離されたＣＤ８＋  Ｔ細胞をプールして、ＣＦＳＥで以前に標識したＥＬ−４細胞を用いて、異なる細胞比（すなわち、２０：１から５：１まで）で６時間培養し、無関連またはＥ７ペプチドのいずれかを用いて１６時間前処理した。６時間後、ＥＬ−４細胞の死亡率レベルを、７−ＡＡＤ標識に関するＦＡＣＳ分析によってスコア化した。４つの独立した実験を代表する結果を示す。Ｃ．指定のＤＮＡベクターを接種したマウス由来の血漿における抗Ｅ７抗体の検出。内部の陽性対照標準（Ｃｔｒｌ＋）として、１０μｇの組換えＥ７またはＮｅｆタンパク質のいずれかとアジュバントを注入したマウス由来の血漿の１：１０，０００希釈物を使用した。１群当たり６頭のマウスからプールした三連の血漿の平均吸光度値＋ＳＤを示す。
【図４ＢＣ】同上
【図５】図５は、ｗｔＮｅｆ発現ＤＮＡベクターの注入によっては、マウスにおけるＮｅｆ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答を誘発できないことを示す。ｗｔＮｅｆ、Ｎｅｆｍｕｔを発現するＤＮＡベクター、または空ベクターを接種したマウスにおけるＮｅｆ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答。Ｃ５７  ＢＩ／６マウス（１群当たり４頭）にＤＮＡベクターを２回、ｉ．ｍ．接種し、最後の免疫化の１０日後に、マウスを屠殺し、脾臓細胞を、無関連またはＮｅｆ特異的９量体のいずれかの非存在下または存在下で、ＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔマイクロウェル中で１６時間培養した。対照として、５ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシンと共に未処理の細胞もインキュベートした。１０５個の細胞当たりのＳＦＵの平均＋ＳＤ数を示す。結果は、２つの独立した実験の代表例である。＊ｐ＜０．０５。
【図６】図６は、Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７ＤＮＡベクターを接種したマウス由来のエキソソームを注入したマウスにおいて誘導されたＥ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫を示す。Ｅ７、Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７を発現するベクター、または空ベクターを以前に注入した同系マウスの血漿から単離したエキソソームを接種したマウスにおけるＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答。Ｃ５７  ＢＩ／６マウス（１群に対して８頭、ドナーマウス）に指定のＤＮＡベクターを２回接種し、最後の接種の１０日後に、後眼窩採血（ｒｅｔｒｏ  ｏｒｂｉｔａｌ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ）からＰＢＭＣを回収し、Ｅ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の存在に対して、ＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて試験した（上のパネル）。２日後に、マウスを屠殺して、分画遠心分離によって血漿からエキソソームを単離した。次いで、これらのエキソソームを等量使用して、同系のマウス（１群当たり３頭）に３回接種した。最後の接種の１０日後に、脾臓細胞を回収し、ＣＤ８＋  Ｔ細胞活性化の程度を三連で行ったＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって評価した（下のパネル）。  すべてのＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて、５ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシンと共に細胞もインキュベートした。１０５個の細胞当たりのＳＦＵの平均＋ＳＤ数を示す。結果は、２つの独立した実験の代表例である。＊ｐ＜０．０５。
【図７Ａ】図７は、Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７ＤＮＡベクターのｉ．ｍ．接種によって誘導された治療上の抗腫瘍作用を示す。Ｃ５７  ＢＩ／６マウスに２×１０５個のＴＣ−１細胞をチャレンジし、４日後に、腫瘍塊が触診によって検出可能である場合、Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７を発現するＤＮＡベクター（７頭のマウス）、または対照として、Ｎｅｆｍｕｔを発現するＤＮＡベクター、空ベクター、またはビヒクル（１群当たり４頭のマウス）を接種した。ＤＮＡ接種は、腫瘍細胞移植の１１日後に繰り返し、腫瘍塊の成長を時間をわたり追跡した。Ａ．最後の免疫化の７日後に後眼窩採血から回収し、無関連またはＥ７ペプチドのいずれかの存在下で１６時間培養したＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−γ  ＥｌｉｓｐｏｔアッセイによるＥ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答。対照として、５ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシンと共にＰＢＭＣもインキュベートした。各接種したマウス由来の脾臓細胞を播種した三連のウェルからの１０５個の細胞当たりのＳＦＵ数を示す。Ｂ．３０日の観察時間における腫瘍サイズの決定。Ｃ．屠殺時におけるＮｅｆｍｕｔまたはＮｅｆｍｕｔ／Ｅ７ＤＮＡベクターのいずれかを注入したマウス由来の腫瘍の重量測定。  各接種したマウスについて検出された値を示す。結果は、２つの独立した実験の代表例である。
【図７Ｂ】同上
【図７Ｃ】同上
【図８】図８は、トランスフェクトされた細胞の上清中でＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＥＣＤを用いて操作されたエキソソームの検出を示す。Ｎｅｆｍｕｔ、Ｎｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２  ＥＣＤのいずれかを発現するベクター、またはボイドベクターをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の培養物由来の細胞およびエキソソーム両方の溶解物のウエスタンブロット分析。Ｎｅｆ系生成物は、細胞とエキソソームの両方で検出され、一方、β−アクチンとＡｌｉｘは、それぞれ、細胞溶解物とエキソソームに対するマーカーとして作用した。矢印は、関連するタンパク質生成物を示す。分子マーカーはｋＤａで与えられる。結果は、５つの独立した実験の代表例である。
【図９】図９は、接種したマウス由来の血漿における抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体の検出を示す。ＮｅｆｍｕｔまたはＮｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤのいずれかを発現するベクターを注入したマウスに関する血漿を、ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現ベクターを注入する２日前に、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞と共にインキュベートした。二次Ａｂとのインキュベーション後に、細胞を固定し、ＦＡＣＳ分析を行った。陽性対照として、ＨＥＲ２／ｎｅｕを構成的に過剰発現する６７６−１−２５腫瘍細胞（ＨＥＲ２／ｎｅｕ細胞）の溶解物を注入したマウス由来の血漿と、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｍＡｂ（Ｃｔｒｌ＋）との両方を使用した。結果は、各注入されたマウス由来の血漿を使用して、ＦＡＣＳによって検出された平均蛍光強度（ＭＦＩ）の平均値＋ＳＤとして表され、２つのアッセイの代表例である。
【図１０】図１０は、Ｎｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤを発現するＤＮＡベクターの注入の際にマウスに誘導されるＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫の検出を示す。ＮｅｆｍｕｔもしくはＮｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤのいずれかを発現するＤＮＡベクター、または空ベクター（ボイド）を接種したマウスにおけるＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答。１２９Ｓｖ−ＮｅｕＴマウス（１群当たり５頭）に、異なるＤＮＡベクターを２回、ｉ．ｍ．接種した。屠殺時に、１０５個の脾臓細胞を、二連または三連のいずれかのＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔマイクロウェル中で、無関連、Ｎｅｆ−、またはＨＥＲ２−ＥＣＤ特異的９量体のいずれかを５μｇ／ｍｌ用いてまたは用いないで、ｏ．ｎ．でインキュベートした。対照として、ペプチド（Ｎｉｌ）の非存在下でも細胞をインキュベートした。１０５個の細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成単位（ＳＦＵ）の平均数＋ＳＤを示す。結果は、３つの独立した実験の代表例である。＊ｐ＜０．０５。下に、代表的アッセイから発色させたＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔプレートを示す。
【図１１Ａ】図１１は、抗原特異的ＣＴＬ活性を有するＤＮＡを注入したマウスのカップルにおいて誘導されたＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫の検出を示す。ＣＴＬアッセイを、指定のベクターを接種したマウス由来のＣＤ８＋  Ｔ細胞を用いて行った。ＣＤ８＋  Ｔ細胞をプールした脾臓細胞から単離し、ＣＦＳＥで以前に標識したＴＣ−１細胞と１０：１の細胞比で６時間、二連で培養し、無関連、Ｎｅｆ−、またはＨＥＲ２−ＥＣＤ特異的ペプチドのいずれかを用いて１６時間処理した。６時間後、ＴＣ−１細胞の死亡率を、７−ＡＡＤ標識に関するＦＡＣＳ分析によってスコア化した。３つの独立した実験から計算された平均値＋ＳＤを示す。＊ｐ＜０．０５。バックグラウンド条件（すなわち、ナイーブマウス由来のＣＤ８＋  Ｔリンパ球の未処理ＴＣ−１細胞との共培養物）の平均値：８．１±３．５。下に、共培養物のＦＡＣＳ分析由来の代表的ドットプロットを示す。ＣＦＳＥ陽性細胞の合計に対する二重蛍光のパーセンテージを示す。
【図１１Ｂ】同上
【図１２Ａ】図１２は、Ｎｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤ  ＤＮＡベクターの接種により誘導された抗腫瘍作用を示す。１２９Ｓｖ−ＮｅｕＴマウス（１群当たり５頭）に、１５週齢と１７週齢の両方で、指定のＤＮＡベクターまたはビヒクル（Ｎｉｌ）のいずれかを２回、接種した。Ａ．少なくとも１つの腫瘍の直径が１ｍｍを超えるマウスの数として表される腫瘍発生率。Ｂ．腫瘍の累積数／マウスの総数＋ＳＤとして計算された腫瘍の多重度。データは、３つの独立した実験の代表例である。
【図１２Ｂ】同上
【図１３Ａ】図１３は、ヒト初代骨格筋細胞によって放出されたエキソソームのｉＤＣにおける内部移行を示す。Ａ．ＧＦＰ、Ｎｅｆｍｕｔ／ＧＦＰを発現するベクター、または空ベクターでのトランスフェクションの２日後のＳＫＭＣのＦＡＣＳ分析。５つの独立した実験の代表例において検出されたＧＦＰ蛍光レベルを示す。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを示す。Ｍ１：陽性の範囲。Ｂ．ＧＦＰまたはＮｅｆｍｕｔ／ＧＦＰのいずれかを発現するＤＮＡベクターをトランスフェクトされたｉＤＣとＳＫＭＣとを含む共培養物の共焦点顕微鏡分析であり、後者は、ＧＷ４８６９とスピロエポキシドの両方の存在下またはそれら両方の不在下で行った。スライドを分析前にＤＡＰＩ（青色蛍光）と抗ＣＤ４５  ｍＡｂ（赤色蛍光）の両方で染色した。Ｎｅｆｍｕｔ／ＧＦＰをトランスフェクトされたＳＫＭＣを含む共培養物に対して、同じ視野の２つのセクションが報告され、第１のものはＣＤ４５陽性細胞を強調し（上のパネル、黒の矢印）、一方、下の画像では、Ｎｅｆｍｕｔ／ＧＦＰを発現するＳＫＭＣ（グリーンブラックの矢印）とｉＤＣへの蛍光蓄積の領域（白色の矢印）の両方が示される。
【図１３Ｂ】同上
【図１４Ａ】図１４は、Ｎｅｆｍｕｔ系ＤＮＡベクターを発現する筋肉細胞と共培養したヒトＤＣによって誘発されたＮｅｆ特異的ＣＴＬ活性を示す。Ａ．クロスプライミングアッセイのスキーム。ＳＫＭＣをトランスフェクトし、４８時間後に、ｉＤＣと共培養させ、さらに２４時間後、単離して成熟させた。次いで、自己ＰＢＬをｍＤＣに添加し、共培養を７日間行った。その後、ＰＢＬ刺激を繰り返し、さらに７日後、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球を単離して、同系標的細胞との共培養によりＣＴＬアッセイで試験した。Ｂ．親またはＮｅｆｍｕｔを安定にトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞のいずれかに由来する細胞溶解物のウエスタンブロット分析。フィルターを抗Ｎｅｆまたは抗β−アクチンＡｂのいずれかとインキュベートした。矢印は、関連するタンパク質生成物を示す。分子マーカーはｋＤａで与える。Ｃ．予備刺激したＣＤ８＋  Ｔリンパ球を、Ｎｅｆｍｕｔを発現するかまたは発現しないＭＣＦ−７細胞と、１０：１の細胞比で共培養することによって行ったＣＴＬアッセイ。結果は、３つの独立した実験の三連の条件から計算した平均値＋ＳＤとして表した。＊ｐ＜０．０５。バックグラウンド条件（すなわち、ナイーブなＣＤ８＋  Ｔリンパ球のＭＣＦ−７との共培養物）の平均値：１１．９±５。
【図１４ＢＣ】同上
【図１５】図１５は、エキソソーム合成の阻害剤による処置が、トランスフェクトされたＳＫＭＣとの共培養物から単離したＤＣによって誘導されたクロスプライミングを遮断することを示す。ＳＫＭＣに、Ｎｅｆｍｕｔ／ＭＡＲＴ−１融合生成物を発現するＤＮＡベクターをトランスフェクトし、２日後に、ＧＷ４８６９とスピロエポキシドの両方の存在下またはそれら両方の不在下でｉＤＣと共培養させた。１６時間後、ｉＤＣを単離し、成熟させ、自己ＰＢＬと共培養させた。２サイクルの刺激後、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球を単離し、無関連またはＭＡＲＴ−１特異的ペプチドのいずれかで以前に処理した、ＣＦＳＥで標識した同系のＢ−ＬＣＬとの１０：１の共培養によってＣＴＬアッセイにおいてチャレンジした。３つの独立した実験の三連の条件から計算した標的細胞の死亡率の平均パーセンテージ＋ＳＤを示す。バックグラウンド条件（すなわち、ナイーブなＣＤ８＋  Ｔリンパ球の未処理の同系のＢ−ＬＣＬとの共培養物）の平均値：７．３±２．１。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
（実施例１：ＤＮＡ接種により生成されたｉｎ  ｖｉｖｏで操作されたエキソソームにより誘発された抗腫瘍ＨＰＶ  Ｅ７特異的ＣＴＬ活性の研究）
【００４４】
材料および方法
分子構築物および細胞培養物
すべての分子構築物は、ＩＥ−ＣＭＶにプロモートされたベクターに基づく。Ｎｅｆｍｕｔ（１３）、Ｎｅｆｍｕｔ−ＧＦＰ（１３）、ＮｅｆＧ２Ａ−ＧＦＰ（２３）、ｗｔＮｅｆ（２４）、およびＨＰＶ−Ｅ７（２５）を発現するベクターの構築物については、既に記載されている。２９３Ｔ細胞、マウスのＣ２Ｃ１２筋肉細胞、およびＨＰＶ−Ｅ７発現ＴＣ−１腫瘍細胞は、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を加えたダルベッコ改変イーグル培地中で成長させた。トランスフェクションアッセイは、リポフェクタミン２０００に基づく方法を使用して行い、Ｃ２Ｃ１２細胞の場合には、新たにトリプシン処理した細胞にリポソームを添加することによって改変した。マウスの脾臓細胞とＥＬ−４細胞、すなわち、９，１０−ジメチル−１，２−ベンズアントラセンで処理した際にＣ５７  ＢＩ／６マウスから最初に得たマウスの胸腺リンパ腫ＣＤ４＋  Ｔ細胞の両方を、１０％のＦＣＳを補充したＲＰＭＩ培地中で培養した。
【００４５】
エキソソームの単離、検出、および特徴付け
エキソソームを、分画遠心分離によって、細胞上清から単離した。詳細には、上清を５００×ｇで１０分間、遠心分離した。次いで、上清を、１０，０００×ｇで３０分間の第１の超遠心分離からなる分画遠心分離にかけた。次いで、上清を採取し、０．２２μＭ孔径で濾過し、７０，０００×ｇで１時間、超遠心分離した。ペレット化した小胞を１×ＰＢＳ中に再懸濁し、７０，０００×ｇで１時間、再度超遠心分離した。その後、ペレットを、１×ＰＢＳの最初の体積の１：１００で再懸濁した。接種したマウスの血漿からのエキソソームの回収を、その実行時間が２倍である遠心分離を開始する前に試料を５倍希釈したことを除いて同様の方法で行った。回収したエキソソームの量を、製造業者の推奨に従ってＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）によって、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）、すなわち、古典的なエキソソームマーカーの活性を測定することによって評価した。ＡｃｈＥ活性をｍＵ／ｍＬとして測定し、ここで、１ｍＵは、１ピコモルのアセチルコリンを、ｐＨ８．０で３７℃にて、１分当たりコリンとアセテートに加水分解する酵素の量として定義される。
トランスフェクトされた細胞培養物由来の蛍光エキソソームは、ＦＡＣＳ（Ｇａｌｌｉｏｓ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって直接検出されるか、または、血漿から単離したエキソソームの場合には、アルデヒド／サルフェートラテックスビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に結合した際に分析されるかのいずれかであった。この目標を達成するために、試料を、回転プレート上で、室温にて終夜、５μｌのビーズと共にインキュベートし、次いで、洗浄し、１×ＰＢＳ−２％ｖ／ｖのホルムアルデヒド中に再懸濁し、ＦＡＣＳ分析した。
【００４６】
エキソソームのウエスタンブロット分析のために、等量のナノ小胞を、抗タンパク質分解剤の存在下で、ＰＢＳ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に溶解し、次いで、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。一方、細胞を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、これらを、氷上で、抗タンパク質分解剤を補充した溶解緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＥＧＴＡ、０．５％の非イオン性洗剤ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０）で２０分間溶解させることによって、ウエスタンブロット分析をトランスフェクトされた細胞の溶解物に関しても行った。全細胞溶解物を、４℃にて、６，０００×ｇで１０分間遠心分離した。細胞抽出物のタンパク質濃度をＬｏｗｒｙのタンパク質定量アッセイによって決定した。全タンパク質のうち３０から５０μｇのアリコートを、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔを使用して、０．４５μｍ孔径のニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に終夜エレクトロブロッティングすることによって、タンパク質を移行させた。フィルターを、１：１０００に希釈したヒツジの抗Ｎｅｆ抗血清ＡＲＰ４４４（Ｍ．  Ｈａｒｒｉｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｅｅｄｓ、Ｌｅｅｄｓ、ＵＫから寄贈されたもの）、および１：２５０に希釈したＳｉｇｍａからの抗β−アクチンＡＣ−７４  ｍＡｂと、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚからの抗Ａｌｉｘ  Ｈ−２７０ポリクローナルＡｂの両方を使用して明らかにした。
【００４７】
マウスの免疫化とＣＤ８＋  Ｔリンパ球を生成するＩＦＮ−γの検出
本明細書に記載した動物を用いるすべての研究は、実験動物保護に関するイタリアのＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ８６／６０９／ＥＥＣで実施されてきたＬｅｇｉｓｌａｔｉｖｅ  Ｄｅｃｒｅｅ  １１６／９２に従ったＥｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｓｕｐｅｒｉｏｒｅ  ｄｉ  Ｓａｎｉｔａ、Ｒｏｍｅ、Ｉｔａｌｙ（プロトコール番号５５５／ＳＡ／２０１２）によって承認されている。研究において使用される動物は、本明細書で上述したＬｅｇｉｓｌａｔｉｖｅ  Ｄｅｃｒｅｅに挿入されたガイドラインに従って収容され処理された。Ｃ５７  ＢＩ／６マウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、エンドトキシンを含まないＱｉａｇｅｎ  ｋｉｔで精製したプラスミドＤＮＡをそれぞれの後ろ肢に５０μｇ、１０日間隔で２回、ｉ．ｍ．接種した。マウスには、１０日間隔で３回、ＤＮＡベクターを注入したマウスの血漿から精製した、６ｍＵ等量のＡｃｈＥ活性のエキソソームを皮下（ｓ．ｃ．）にも接種し、最後の免疫化の１０日後に屠殺した。Ｅ７−およびＮｅｆ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答を検出するために、脾臓細胞を、Ｃ５７  ＢＩ／６マウスのＨ−２Ｋｂ複合体に効率的に結合させるために既に特定されたＨＰＶ−Ｅ７またはＨＩＶ−１  Ｎｅｆ８もしくは９量体ペプチド、すなわち、Ｅ７（ＨＰＶ−１６  Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ受託番号ＡＡＤ３３２５２．１）に対するＤＬＹＣＹＥＱＬ（アミノ酸２１〜２８）（配列番号３）およびＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（アミノ酸４９〜５７）（配列番号４）、ならびにＮｅｆ（ＨＩＶ−１、Ｆ１２株、受託番号ＥＭＢＬ  Ｚ１１５３０）に対するＴＡＡＴＮＡＤＣＡ（アミノ酸４８〜５６）（配列番号５）のいずれか５μｇ／ｍｌの存在下で、ＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔマイクロウェル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中の培養に供した。ＨＰＶ  Ｅ６特異的ＫＬＰＱＬＣＴＥＬ（アミノ酸１８〜２６）（配列番号６）およびＹＤＦＡＦＲＤＬ（アミノ酸５０〜５７）（配列番号７）ペプチドに結合するＨ−２  Ｋｂ（ＨＰＶ−１６  Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ受託番号ＡＡＤ３３２５３．１）を無関連ペプチドとして使用した。ｏ．ｎ．インキュベーションの後、ＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔプレートを発色させ（Ｍａｂｔｅｃｈ  ＡＢ）、スポット形成細胞を分析し、Ｅｌｉｓｐｏｔリーダー（Ａ．ＥＬ．ＶＩＳ．  Ｅｌｉｓｐｏｔ  ｒｅａｄｅｒ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＧｍｂＨ）を使用して計数した。
【００４８】
蛍光顕微鏡分析
蛍光顕微鏡による分析のために、接種したマウスの四頭筋由来の７μＭの切片をクリオスタット（Ｌｅｉｋａ  ＣＭ  ３０５０）切片作製によって調製し、スライドに配置した。次いで、切片を、褪色防止用封入剤と一緒に、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とインキュベートした。最終的に、スライドにカバーガラスを載せ、次いで、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ２  Ｐｌｕｓ蛍光顕微鏡で観察した。
【００４９】
ＣＴＬアッセイ
ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、正の免疫磁気選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって、接種したマウスの脾臓細胞から単離した。これらを、ＲＰＭＩ  １０％のＦＣＳ中で６時間、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で以前に標識したＥＬ−４細胞との共培養に供し、Ｅ７または無関連ペプチドのいずれかで終夜処理した。共培養は、Ｕ底９６ウェルプレートにおける２００μｌのＲＰＭＩ  ２０％中で、異なる細胞比（すなわち、２０：１から５：１までのエフェクター／標的細胞）で実行した。その後、最終濃度１μｇ／ｍｌでの７−ＡＡＤの添加後間もなく、ＥＬ−４細胞の死亡率をＦＡＣＳ分析によってスコア化した。
【００５０】
血漿中の抗Ｅ７および抗Ｎｅｆ抗体の検出
接種したマウス由来の血漿をプールし、１：１０から開始する２倍連続希釈物を、抗Ｅ７  Ａｂの存在についてアッセイした。エンドポイント希釈は、４５０ｎｍにおける吸光度がＯＤ０．１未満に相当した。各血漿を三連でアッセイし、吸光度値の平均を最終読み出しとして得た。組換えＥ７とＮｅｆの両方をアッセイのために使用した。タンパク質を、炭酸緩衝液（ｐＨ９．４）中４℃で、１ウェル当たり０．２５μｇの濃度で、Ｍａｘｉｓｏｒｐのマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）中に終夜吸着させた。３％のノンファットドライミルク（ＮＦＤＭ）を含有するＰＢＳ中、３７℃で２時間のブロッキングステップの後、プレートを、３７℃で１時間、１％のＮＦＤＭ−ＰＢＳ中で連続希釈した血漿１００μＬと共にインキュベートした。特異的抗原−抗体複合体を、基質としてテトラメチルベンジジンを使用して、ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｔｄ）によって検出した。室温で３０分後、１ウェル当たり１Ｍの硫酸５０μｌを添加することによって、酵素反応を停止させた。洗浄ステップは、自動洗浄機中で、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳを１ウェル当たり２００μｌ用いて行った。
【００５１】
Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７エキソソームの抗腫瘍作用
Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７発現ベクターの接種によって誘導された抗腫瘍活性を、２×１０５個のＴＣ−１細胞を以前にチャレンジしたマウスにおいて評価した。ＤＮＡ接種は、腫瘍細胞のチャレンジの４および１１日後に、上記報告したプロトコールに従って、かつ触診できる腫瘍を発生したマウスにおいてのみ実施した。腫瘍成長は、目視検査、触診、および（長さ×幅２）／２として計算した腫瘍小結節の直径の測定によってモニタリングした。観察時間の終了時に、腫瘍を外植し、秤量した。
【００５２】
統計分析
適当な場合に、データは、平均＋標準偏差（ＳＤ）として表す。一部の例では、対応のあるＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用し、ノンパラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して確認した。ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【００５３】
結果
ＤＮＡをトランスフェクトされたマウス筋肉細胞により放出された操作されたエキソソームの検出
筋肉細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与の際の異所性ＤＮＡの効率的かつ安定な発現に対する理想的な標的を表す。目的は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＮｅｆｍｕｔ系ＤＮＡベクターを発現させ、接種したＤＮＡを発現する細胞によって構成的に放出されるエキソソームを操作することであった。これらの内因性エキソソームは、抗原特異的ＣＴＬ免疫応答の誘導に関して、組織培養で生成されるものと少なくとも類似する特徴を示すことが期待される。
【００５４】
異なる起源のヒト細胞型で既に評価されたように、マウスの筋肉細胞におけるＮｅｆｍｕｔ発現ＤＮＡベクターの内部移行が、操作されたエキソソームの生成に十分であるかどうかが、予備的に調査された。とりわけ、マウスの筋肉細胞は、エキソソーム様の特徴を有するナノ小胞を放出するが、その生合成は、ＭＶＢにより生じたエキソソームのものと異なる。明確化のために、マウスの筋肉細胞によって放出されたエキソソーム様ナノ小胞を、本明細書でエキソソームと定義する。
【００５５】
マウスのＣ２Ｃ１２筋肉細胞と、対照として、ヒト２９３Ｔ細胞に、エキソソームと会合することのその非効率性について既に特徴付けられているＮｅｆｍｕｔまたはＮｅｆアイソタイプ（すなわち、ＮｅｆＧ２Ａ）のいずれかのＣ末端で融合したＧＦＰを発現するベクターをトランスフェクトした（２６）。トランスフェクトされた細胞培養物を、筋肉細胞において、２９３Ｔ細胞において検出されたものの５０％を超えるようであった、それぞれのトランスフェクション効率（図２Ａ）についてモニタリングした。上清を収集し、分画遠心分離によりエキソソームを単離した。次いで、エキソソーム調製物を、ＡｃｈＥ活性に関して滴定した（図２Ｂ）。２つの細胞型は、どんなトランスフェクション条件でも、明らかに類似するレベルのＡｃｈＥ陽性ナノ小胞を生成した。等しい量のエキソソームのウエスタンブロット分析は、Ｎｅｆｍｕｔ−ＧＦＰベクターをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞とＣ２Ｃ１２細胞の両方に由来するエキソソームにおいてＮｅｆ由来分子の存在を示したが、ＮｅｆＧ２Ａ−ＧＦＰベクターでは存在を示さなかった（図２Ｃ）。エキソソーム調製物のＦＡＣＳ分析により、Ｎｅｆｍｕｔ−ＧＦＰをトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞から回収されたナノ小胞に蛍光が伴うが、ＮｅｆＧ２Ａ−ＧＦＰでは蛍光がともなわなかったことを確認した（図２Ｄ）。
【００５６】
まとめると、マウスの筋肉細胞によって放出されたエキソソーム様ナノ小胞は、上皮様の、形質転換ヒト２９３Ｔ細胞で以前に判明したように、Ｎｅｆｍｕｔ誘導体によって操作することができることが判明した。
【００５７】
Ｎｅｆｍｕｔ由来生成物は、ＤＮＡを接種したマウスの血漿由来のエキソソーム中で検出され得る
【００５８】
マウスの筋肉細胞に関して得られたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果に基づき、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮｅｆｍｕｔ系ベクターの発現が試みられた。この目的のために、Ｎｅｆｍｕｔ−ＧＦＰ、ＮｅｆＧ２Ａ−ＧＦＰ、または空ベクターのいずれか５０μｇを、Ｃ５７  ＢＩ／６マウスの各四頭筋に接種した。３日後、何頭かの接種したマウスを屠殺し、それらの肢を凍結保存した。次いで、接種のゾーンから得た切片を、ＧＦＰ関連生成物の発現について分析した。Ｎｅｆおよびその変異体／誘導体の既に記載した特徴と一致して、Ｎｅｆｍｕｔは、原形質膜に明らかに蓄積する一方で、細胞内の点状パターンにも配置される。それとは別に、ＮｅｆＧ２Ａ変異体は、Ｎ末端のミリストイル化の欠如の結果として、より拡散した細胞質内分布で配置された（図３Ａ）。接種の３日後および９日後に、血漿を残りの接種したマウスから回収し、分画遠心分離によりエキソソームを単離した。次いで、エキソソーム調製物を、ＡｃｈＥ活性に関して滴定し、同量のエキソソームを、白色のアルデヒド／サルフェートラテックスビーズに結合させた。この方法により、さらに稀な蛍光ナノ小胞が、ＦＡＣＳ分析によって検出可能となることが期待された。Ｎｅｆｍｕｔ−ＧＦＰベクターを注入した３日後と９日後の両方で、マウスの血漿から単離したエキソソームを含む試料において、正のシグナルをスコア化したが、ＮｅｆＧ２Ａ−ＧＦＰベクターではそうならなかった（図３Ｂ）。これらの結果は、Ｎｅｆｍｕｔ−誘導体を発現するベクターのマウスにおける接種によって、操作されたエキソソームの発生を導くことができることを示唆した。
【００５９】
Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７発現ＤＮＡベクターのｉ．ｍ．接種の際のＨＰＶ−Ｅ７特異的ＣＴＬ応答
次に、Ｎｅｆｍｕｔ−誘導体を発現するＤＮＡベクターの接種によって生じた操作されたエキソソームにアップローディングされた抗原の免疫原性を評価した。この目的のために、Ｃ５７  ＢＩ／６マウス（１群当たり６頭）に、Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７もしくはＥ７単独のいずれかを発現するベクター５０μｇ、または空ベクターを、各後ろ肢に、ｉ．ｍ．接種した。とりわけ、Ｅ７単独を発現するベクターの注入後の免疫応答の分析は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の免疫原性に関して、Ｎｅｆｍｕｔ融合の利益を評価する助けとなった。１０日後に、接種を繰り返し、さらに１０日後、マウスを屠殺し、無関連、ＮｅｆまたはＥ７特異的Ｈ−２  Ｋｂ９量体の存在下で、ＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔマイクロウェル中で、脾臓細胞をｏ．ｎ．培養した。無関連ペプチドとの培養で観察されたＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化レベルは、バックグラウンドレベルのままであり、ペプチドの非存在下で培養した脾臓細胞で検出されたものと同様であった（図示せず）。一方、細胞活性化は、Ｅ７またはＮｅｆ９量体を接種した後に、Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７発現ベクターを接種したマウス由来の脾臓細胞中で、はっきりと検出可能であった（図４Ａ）。逆に、ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答は、いかなるペプチドが使用されても、Ｅ７発現ベクター、空ベクターのどちらを受けるマウス由来の脾臓細胞の培養においても検出されなかった。
【００６０】
ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答が測定可能なＣＴＬ活性と関連するかどうかを評価するために、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を脾臓細胞のプールから単離し、次いで、異なる細胞比（すなわち、２０：１から５：１）で６時間、無関連またはＥ７  ９量体のいずれかで、ｏ．ｎ．で前処理したＣＦＳＥ標識ＥＬ−４細胞との共培養に供した。その後、共培養物を７−ＡＡＤで標識し、標的細胞の死亡率レベルをＦＡＣＳ分析によってスコア化した。図４Ｂにおいて報告した結果は、Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７発現ベクターを接種したマウスのみに由来するＣＤ８＋  Ｔリンパ球を、Ｅ７特異的９量体で前処理したＥＬ−４と共に含む、２０：１と１０：１の両方の共培養物における標的細胞の死亡率の明らかな増加を示す。この結果は、ＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって、Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７発現ベクターを接種したマウスにおいて検出された活性化ＣＤ８＋  Ｔリンパ球が、Ｅ７特異的細胞傷害活性を有することを実証した。とりわけ、抗Ｅ７抗体は、Ｅ７を単独で発現するベクターを接種したマウス由来の血漿においてのみ検出された（図４Ｃ）。
【００６１】
まとめると、これらのデータは、Ｎｅｆｍｕｔと融合した異種抗原を発現するベクターのｉ．ｍ．接種により、抗体産生の非存在下で、強力な抗原特異的ＣＴＬ応答の誘導が導かれることを示した。
【００６２】
野生型Ｎｅｆアイソフォームを発現するＤＮＡベクターの接種は、Ｎｅｆ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化を誘発しない
【００６３】
結果は、Ｎｅｆｍｕｔ誘導体を発現するＤＮＡベクターのｉ．ｍ．注入により、エキソソームに取り込まれた外来抗原に対するＣＴＬ応答の誘導と相関する、Ｎｅｆｍｕｔ生成物をアップローディングするエキソソームの生成が導かれるというエビデンスを提供する。しかしながら、エキソソームにおける高レベルのＮｅｆｍｕｔ取り込みが抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘発するのに必須であるという見解を支持するために、Ｎｅｆｍｕｔと比較してかなり低い程度でエキソソームに取り込まれる野生型アイソフォームのＮｅｆを発現するベクターをマウスに接種することによって、免疫原性実験が再現された（１３）。この目標を達成するために、Ｃ５７  ＢＩ／６マウス（１群当たり４頭）に、ｗｔＮｅｆもしくはＮｅｆｍｕｔのいずれかを発現するベクター５０μｇ、または空ベクターを、各後ろ肢に、ｉ．ｍ．注入した。１０日後に接種を繰り返し、さらに１０日後、マウスを屠殺した。次いで、脾臓細胞を単離し、無関連またはＮｅｆ特異的９量体のいずれかの存在下で、ＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔマイクロウェル中でｏ．ｎ．培養した。図５に示すように、ｗｔＮｅｆを発現するベクターを接種したマウスは、Ｎｅｆｍｕｔベクターを受けたものと異なって、検出可能なＣＤ８＋  Ｔ  Ｎｅｆ特異的応答を開始することができなかった。
【００６４】
これらの結果は、エキソソームにおける抗原アップローディングの効率が免疫応答の誘導に重要であることを示し、また、ｗｔＮｅｆの機能は、それ自体は、本発明者らが観察したＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化に関与しなかったことを示唆する。
【００６５】
Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７を発現するＤＮＡベクターで免疫化したマウスの血漿から単離したエキソソームは、同系マウスにおいて、Ｅ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘導する。
【００６６】
Ｎｅｆｍｕｔ発現ベクターの接種の際に検出されたＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答が操作されたエキソソームのｉｎ  ｖｉｖｏでの生成に依拠するという仮定を主張するために、接種したマウスの血漿から精製されたエキソソームがレシピエントのナイーブマウスにおいて免疫原性であるかどうかを評価した。この目的のために、本明細書の上記で詳述したスケジュールに従い、８頭のマウスに、Ｅ７、Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７を発現するベクターまたは空ベクターを接種した。最後の免疫化の８日後に、ＰＢＭＣを後眼窩採血により回収し、Ｅ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答をチェックするために、ＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔマイクロウェルに置いた。既に観察したように、Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７発現ベクターの注入により、十分に検出可能なＥ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答が生じたが、Ｅ７を単独で発現するベクターではそうならなかった（図６Ａ）。均一な群由来の血漿をプールし、分画遠心分離によってエキソソームを単離した。その後、エキソソームを、ＡｃｈＥ活性に関して滴定し、等量の６ｍＵのＡｃｈＥ活性のエキソソームを、１０日間隔で、３回、同系マウスにｓ．ｃ．注入した。最後に、マウスを屠殺し、Ｅ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答について脾臓細胞を試験した。興味深いことに、ＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔマイクロウェルにおけるｏ．ｎ．培養によって、本発明者らは、Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７発現ベクターを注入したマウスから精製したエキソソームを接種したマウス由来の脾臓細胞培養においてのみＥ７特異的細胞の活性化を認めた（図６Ｂ）。
【００６７】
これらの結果は、Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７を発現するＤＮＡのｉ．ｍ．注入によって、免疫原性エキソソームの生成が導かれることを示し、それゆえに、内因性の操作されたエキソソームのＤＮＡ誘導性生成が観察された強力なＥ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答の根底にあるという見解をさらに支持する。
【００６８】
Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７発現ＤＮＡベクターのｉ．ｍ．接種によって誘導されたＨＰＶ−Ｅ７特異的ＣＴＬ応答の治療上の抗腫瘍作用
最後に、抗腫瘍作用に関してＮｅｆｍｕｔ／Ｅ７発現ベクターの注入によって惹起されるＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答の効力を評価した。この目標を達成するために、２×１０５個のＴＣ−１細胞をｓ．ｃ．接種したＣ５７  ＢＩ／６マウスに関する治療的免疫化アッセイを設定した。次いで、触診によって検出可能な、すなわち、約２ｍｍの直径の腫瘍塊を発生するマウスに、細胞移植の４日後と１１日後の両方に、後ろ肢当たり５０μｇの、空ベクター、Ｎｅｆｍｕｔ（各群当たり４頭のマウス）またはＮｅｆｍｕｔ／Ｅ７（６頭のマウス）のいずれかを発現するベクターを接種した。対照として、４頭の腫瘍を移植したマウスに、ビヒクルのみを注入した。２１日目に、Ｅ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答の誘導を評価するために供したＮｅｆｍｕｔまたはＮｅｆｍｕｔ／Ｅ７発現ベクターを注入したマウスに関して、後眼窩採血を行った（図７Ａ）。腫瘍の成長を３０日にわたってモニタリングし、その後、マウスを屠殺し、腫瘍を外植し、秤量した。図７Ｂは、腫瘍重量の評価によって確認されるように、対照ＤＮＡベクターの注入は移植された腫瘍細胞の成長に影響を及ぼさなかったが、Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７ベクターを接種したマウスでは、これらの増殖が著しく損なわれ、腫瘍細胞は、３頭のマウスにおいてさらに明らかに取り除かれたことをはっきりと示す（図７Ｃ）。
【００６９】
これらのデータから、Ｎｅｆｍｕｔ／Ｅ７発現ＤＮＡベクターの接種により、腫瘍細胞の存在下でも、ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答が誘発されると結論付けることができる。最も重要なのは、この免疫応答が、前もって移植された同系の腫瘍細胞の成長を強力に阻害するのに十分強力かつ迅速であることであった。
【００７０】
まとめると、これらの結果は、Ｎｅｆｍｕｔ系の内因性エキソソームに基づく免疫化戦略の可能な治療適用に対する妥当なマイルストーンを表す。
【００７１】
（実施例２：Ｎｅｆｍｕｔと融合した抗原を発現するベクターのｉｎ  ｖｉｖｏでの接種によって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫に関する研究）
ＮｅｆｍｕｔのＣ末端に融合した抗原を発現するＤＮＡベクターの接種に基づく免疫化戦略は、様々なさらなるウイルス抗原に対しても首尾よく適用された（表１を参照のこと）。詳細には、Ｎｅｆｍｕｔと融合したこのような抗原を発現するベクターを、本明細書の上記のスケジュールに従い、Ｃ５７  ＢＩ／６マウスまたはＢａｌｂ／ｃマウスのいずれかに注入した。最後の接種の１０から１５日後に、表１に列挙したペプチドを使用して、注入したマウス由来の脾臓細胞を用いて、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。
【表１】
2019536473.tif 000007
ａそれぞれ三連のウェルで試験した４頭の接種したマウス由来の脾臓細胞を用いて得られたデータから計算したバックグラウンド値を減算した平均値±ＳＤを示す。
【００７２】
結果は、Ｎｅｆｍｕｔに融合した抗原を発現するＤＮＡの注入は、幅広い範囲の全長抗原に対して、ＣＴＬ免疫を誘導する助けとなるという見解を支持する。
【００７３】
（実施例３：乳がんにおいて本発明に従ってｉｎ  ｖｉｖｏで操作したエキソソームによって誘発されるＣＴＬ活性の研究）
材料および方法
分子構築物
活性化ｒＨＥＲ２／ｎｅｕの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするＤＮＡを、Ｎ２０２．１Ａ細胞、すなわち、ｒＨＥＲ−２／ｎｅｕにトランスジェニックであるＦＶＢマウスに由来する細胞株から抽出した全ＲＮＡに関して行ったＲＴ−ＰＣＲによって回収した（２７）。それぞれの５’末端にＮｈｅ  ＩおよびＥｃｏ  ＲＩ制限部位を含む以下のプライマーを使用した：フォワード（シグナルペプチドに対してすぐ下流）
【化５】
2019536473.tif 000008
（配列番号１８）；リバース：
【化６】
2019536473.tif 000009
（配列番号１９）。Ｎｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤ融合生成物を発現するベクターを得るために、ＰＣＲ生成物をＮｈｅ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩで切断し、Ｎｅｆｍｕｔを発現するＮｈｅ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩによって消化されるｐｃＤＮＡ３系ベクターの３’末端にインフレームで挿入された。この戦略を通して、ラットとマウスの両方のＨＥＲ２−ＥＣＤ配列が、得られた分子構築物においてＮｅｆｍｕｔと融合することが期待される。選択は、ｒＨＥＲ２／ｎｅｕ配列の存在に基づいてなされた。Ｎｅｆｍｕｔ、Ｎｅｆｍｕｔ／ＧＦＰ、およびＮｅｆｍｕｔ／ＭＡＲＴ−１を発現するベクターは、既に記載されている（１３）。ｒＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するＩＥ−ＣＭＶにプロモートされたベクターが、Ａ．  Ａｍｉｃｉ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｒｂｉｎｏ、Ｉｔａｌｙから厚意により提供された。
【００７４】
細胞の培養とトランスフェクション
２９３Ｔ細胞、ＭＣＦ−７細胞、マウスのＣ２Ｃ１２筋肉細胞（すべて、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した）、およびＴＣ−１細胞（２８）は、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を加えたダルベッコ改変イーグル培地中で成長させた。トランスフェクションアッセイは、リポフェクタミン２０００に基づく方法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって行い、Ｃ２Ｃ１２細胞の場合には、新たにトリプシン処理した細胞にリポソームを添加することによって改変した。ＨＬＡ−Ａ．０２  Ｂ−ＬＣＬ（２９）、マウスの脾臓細胞、およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球を、１０％のＦＣＳを加えたＲＰＭＩ培地中で培養した。ヒトの初代骨格筋細胞（ＳＫＭＣ）はＬｏｎｚａから入手し、推奨される培地で培養した。
【００７５】
ヒトのＰＢＭＣを、Ｆｙｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅの密度勾配によって、健康なドナーから単離した。単球を、免疫磁気単球選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、ＰＢＭＣから単離した。回収した細胞集団の純度を、ＰＥがコンジュゲートした抗ＣＤ１４  ｍＡｂ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、ＦＡＣＳ分析によってアッセイした。単球は、２０％のＦＣＳ、３０ｎｇ／ｍＬの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Ｓｅｒｏｔｅｃ  Ｌｔｄ）、および５００ユニット／ｍＬのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＲＰＭＩ培地中で４〜５日培養して、ｉＤＣへと分化させた。ＤＣの成熟は、１０ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）によるｏ．ｎ．処理により得られた。
【００７６】
エキソソームの調製および精製
エキソソームを、トランスフェクションの４８から７２時間後に、２９３Ｔ細胞の上清から出発して、以前に記載されたように（３０）、分画遠心分離によって単離した。回収されたエキソソームの量は、製造業者の推奨に従ってＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）によって、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ、すなわち、古典的なエキソソームマーカー）（３１）の活性を測定することによって評価した。
【００７７】
ウエスタンブロット
細胞溶解物とエキソソームの両方のウエスタンブロット分析は、記載されているように（１３）行った。フィルターを、１：１０００に希釈したヒツジの抗Ｎｅｆ抗血清ＡＲＰ４４４（ＭＲＣ）、１：２５０に希釈したＳｉｇｍａからの抗β−アクチンＡＣ−７４  ｍＡｂ、および１：１００に希釈したＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚからの抗Ａｌｉｘ  Ｈ−２７０ポリクローナルＡｂを使用して明らかにした。
【００７８】
マウスモデル
本明細書に記載した動物を用いるすべての研究は、実験動物保護に関するイタリアのＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ８６／６０９／ＥＥＣで実施されてきたＬｅｇｉｓｌａｔｉｖｅ  Ｄｅｃｒｅｅ  １１６／９２に従ったＥｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＳＳ（プロトコール番号１０７／２０１６−ＰＲ）によって承認されている。本発明者らの研究において使用される動物は、本明細書で上述したＬｅｇｉｓｌａｔｉｖｅ  Ｄｅｃｒｅｅに挿入されたガイドラインに従って収容され処理された。ＩＳＳの動物施設（３２）で産まれて飼育された１２９Ｓｖ−ＮｅｕＴトランスジェニックマウスのコロニーを使用した。これらのマウスでは、活性化したｒＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子が、ＭＭＬＶ  ＬＴＲによってプロモートされ、処女雌は、１５〜２０週齢で、触診可能となる乳癌を自発的に発生させる。ｒＨＥＲ２／ｎｅｕ導入遺伝子の存在は、通常、記載されているように（３２）、ＰＣＲによってチェックされた。マウスに、エンドトキシンを含まないＱｉａｇｅｎのキットを用いて精製したプラスミドＤＮＡを各四頭筋当たり５０μｇ、１５週齢と１７週齢において、２回、ｉ．ｍ．接種した。乳腺を、腫瘍モニタリングの間、１週間に一度、検査した。直径３０ｍｍを超える腫瘍を保有するマウスを安楽死させた。
【００７９】
抗体の検出
接種したマウス由来の血漿を、１：２０に希釈し、ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現ベクターを２日前にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞における抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体の存在について試験した。４℃での２時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣにコンジュゲートした抗マウスＩｇＧと共にインキュベートし、１時間後にＦＡＣＳ分析を行った。陽性対照として、１：２０に希釈した抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｍＡｂクローン７．１６．４（Ｓｉｇｍａ）を使用した。
【００８０】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答とＮｅｆ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答の両方を検出するために、脾臓細胞を、１２９ＳｖトランスジェニックマウスのＨ−２Ｋｂ複合体に結合するＨＥＲ２／ｎｅｕまたはＨＩＶ−１  Ｎｅｆ９量体ペプチド、すなわち、それぞれ、ＩＬＨＤＧＡＹＳＬ（アミノ酸４３６〜４４４）（３３）およびＴＡＡＴＮＡＤＣＡ（アミノ酸４８〜５６）（３４）のいずれか５μｇ／ｍｌの存在下で、ＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔマイクロウェル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中に置いた。Ｈ−２Ｋｂに結合する異種ペプチド（３５）を対照として使用した。ｏ．ｎ．接種後に、ＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔプレートを発色し（Ｍａｂｔｅｃｈ）、スポット形成単位（ＳＦＵ）を計数した。
【００８１】
クロスプライミングアッセイ
合計１０６個のＳＫＭＣに、Ｎｅｆｍｕｔ系ベクターまたは対照ベクターのいずれか１０μｇをトランスフェクトした。４８時間後、細胞を、１：５の細胞比で、ｉＤＣとの共培養に供し、一部の例では、エキソソーム生合成の阻害剤ＧＷ４８６９とスピロエポキシド２μＭの存在下で行った（３６〜４１）。終夜のインキュベーション後、ｉＤＣを単離し、２４時間のＬＰＳ処理によって成熟させた。その後、ｉＤＣを洗浄し、１：１０の細胞比で、自己末梢血リンパ球（ＰＢＬ）との共培養に供した。１週間後、刺激手順を繰り返し、さらに１週間後、ＣＴＬアッセイのためにＣＤ８＋  Ｔ細胞を回収した。
【００８２】
ＣＴＬアッセイ
マウス細胞を用いたＣＴＬアッセイは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を正の免疫磁気選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によって脾臓細胞から単離することによって実施した。これらを、ＲＰＭＩ  １０％のＦＣＳ中で６時間、製造業者の推奨に従って、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で以前に標識したＴＣ−１細胞との共培養に供し、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ｎｅｆ、または無関連ペプチドのいずれかで終夜処理した。共培養は、Ｕ底９６ウェルプレートにおける２００μＬのＲＰＭＩ  ２０％中で、１０：１のエフェクター／標的細胞比で実行した。その後、最終濃度１μｇ／ｍｌでの７−ＡＡＤの添加後間もなく、ＴＣ−１細胞の死亡率をＦＡＣＳ分析によってスコア化した。ヒト細胞におけるＣＴＬアッセイを、標的細胞としてＭＣＦ−７またはＢ−ＬＣＬを使用したことを除いて、同様の方法で行った。
【００８３】
共焦点顕微鏡分析
ＧＦＰまたはＮｅｆｍｕｔ／ＧＦＰのいずれかを発現するベクターを用いて２日前にトランスフェクトされたｉＤＣとＳＫＭＣとを含む終夜にわたる共培養を、ＧＷ４８６９とスピロエポキシドの存在下またはそれら両方の不在下で、１：５の細胞比で行った。その後、細胞を、最初に、４℃で１時間、抗ＣＤ４５（すなわち、ｉＤＣのマーカー）で染色し、次いで、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ６１０にコンジュゲートした二次Ａｂで染色した。最後に、共培養物を４’，６’ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で標識し、緩衝したホルムアルデヒド（２％ｖ／ｖ）中で固定した。位相差と蛍光画像をＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−８１デバイスで記録した。
【００８４】
統計分析
適当な場合に、データは、平均＋標準偏差（ＳＤ）として表す。一部の例では、対応のあるＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用し、ノンパラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して確認した。ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【００８５】
結果
ｒＨＥＲ２／ｎｅｕの細胞外ドメインは、Ｎｅｆｍｕｔと融合した際にエキソソームに効率的にアップローディングされる
【００８６】
シグナルペプチドの欠乏したｒＨＥＲ２／ｎｅｕのＥＣＤを、ＩＥ−ＣＭＶにプロモートされた真核生物のベクターに関連して、ＮｅｆｍｕｔのＣ末端に融合させた。融合生成物の安定性とエキソソーム取り込みの両方をチェックするために、２９３Ｔ細胞に、ＮｅｆｍｕｔもしくはＮｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤを発現するベクター、またはボイドベクターを一過的にトランスフェクトした。４８時間後、細胞を溶解させ、上清を分画遠心分離にかけ、エキソソームを単離した。細胞とエキソソームの両方の溶解物をウエスタンブロットによって分析した（図８）。融合生成物は、エキソソーム中で安定であり、有用な程度にアップローディングされているようであった。同様の結果を、マウスのＣ２Ｃ１２筋肉細胞にトランスフェクトすることによって得た（図示せず）。
【００８７】
Ｎｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤを発現するＤＮＡベクターのｒＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにおける注入は、抗体応答の非存在下で、特異的ＣＤ８＋  Ｔリンパ球の活性化を誘導する
【００８８】
他のＮｅｆｍｕｔ系融合生成物について既に判明したように（２１）、Ｎｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤを発現するベクターのマウスにおけるｉ．ｍ．注入により、Ｎｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤ融合生成物を取り込む免疫原性の内因性の操作されたエキソソームの生成が導かれると仮定される。問題は、これらのエキソソームについて期待されるＣＤ８＋  Ｔリンパ球の免疫原性が、ＨＥＲ２／ｎｅｕに対する寛容を破壊するのに十分強力であるかどうかということであった。
【００８９】
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体の誘導、すなわち、ｒＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＤＮＡベクターを注入したマウスにおいて既に記載された作用（４２、４３）を最初に試験した（）。この目標を達成するために、ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスに、ＮｅｆｍｕｔまたはＮｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤのいずれかを発現するＤＮＡベクターを注入した（１群当たり３頭）。２回目の注入の１５日後、血漿を回収し、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するＤＮＡベクターを一過的にトランスフェクトされた２９３Ｔを指標細胞として使用して抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  Ａｂの存在について試験した。図９に報告したように、ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的抗体は、Ｎｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤを発現するＤＮＡベクターを注入したマウス由来の血漿において検出不能であった。それとは別に、以前に記載されたように（３２）、Ａｂは、ｒＨＥＲ２／ｎｅｕ発現細胞の溶解物を注入したマウス由来の血漿において検出可能であった。これらの結果は、操作されたエキソソームに取り込まれた生成物に対する抗体応答の欠如について、本発明者らが以前に報告したこと（１４、２１）と十分に一致するようであった。
【００９０】
次に、Ｈ２ｂ制限ＮｅｆおよびＨＥＲ２−ＥＣＤ９量体による刺激の際に行われたＩＦＮ−γ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを介して、注入したマウス由来の脾臓細胞を試験する抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔリンパ球応答を分析した。図１０に示すように、Ｎｅｆｍｕｔ発現ＤＮＡを注入したマウス由来の脾臓細胞がＮｅｆペプチドによって刺激された場合に、リンパ球の活性化が検出されたが、ＨＥＲ２−ＥＣＤペプチドによっては刺激されなかった。一方、ＮｅｆペプチドとＨＥＲ２−ＥＣＤペプチドの両方は、Ｎｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤを注入したマウス由来の脾臓細胞培養においてリンパ球の活性化を誘導した。後眼窩採血によって回収したＰＢＭＣを試験して同様の結果が得られた（図示せず）。
【００９１】
これらのデータは、Ｎｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤ  ＤＮＡベクターを注入したマウスにおける、Ｎｅｆ特異的ＣＤ８＋  Ｔリンパ球応答とＨＥＲ／ｎｅｕ特異的ＣＤ８＋  Ｔリンパ球応答の両方の誘導を実証する。
【００９２】
Ｎｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤ発現ＤＮＡベクターを注入したｒＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにおける抗原特異的ＣＴＬ活性の誘導。
【００９３】
次に、研究の目的は、Ｎｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤ発現ＤＮＡベクターの注入がＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的ＣＴＬ活性を誘導できるかどうかを評価することであった。この目標を達成するために、ボイドベクターまたはＮｅｆｍｕｔもしくはＮｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤのいずれかを発現するベクターを接種したＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスの脾臓細胞から、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球を単離した。次いで、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球を、適当なペプチドで前処理した、同系の、ＣＦＳＥ標識したＴＣ−１細胞との共培養に供した。５時間後、共培養を停止させ、７−ＡＡＤで標識し、ＦＡＣＳによって分析して、死滅したＴＣ−１標的細胞のパーセンテージを評価した。図１１に示すように、ＮｅｆｍｕｔＤＮＡベクターを注入したマウス由来のＣＤ８＋  Ｔリンパ球を、Ｎｅｆペプチドで前処理したＴＣ−１と共培養した場合、標的細胞の死亡率の増加が検出可能であった。より重要なことに、Ｎｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤ  ＤＮＡベクターを注入したマウス由来のＣＤ８＋  Ｔリンパ球を、Ｎｅｆに特異的なＨ２ｂ制限ペプチドまたはＨＥＲ２に特異的なＨ２ｂ制限ペプチドのいずれかで前処理したＴＣ−１と共培養した場合にも、ＣＴＬ活性は明らかであった。
【００９４】
これらの結果は、Ｎｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤ  ＤＮＡベクターのｉ．ｍ．送達とＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的ＣＴＬ活性の誘導の間のリンクを確立した。
【００９５】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ寛容の破壊は抗腫瘍活性と関連する
次に、研究の目的は、ＨＥＲ２−ＥＣＤ特異的ＣＴＬ活性が検出可能な抗腫瘍活性と結び付くかどうかを評価することであった。未だ触診可能な病変を有さない１５週齢の１２９Ｓｖ−Ｎｅｕ  Ｔトランスジェニックマウスに、ビヒクルまたはＮｅｆｍｕｔおよびＮｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤを発現するＤＮＡベクターのいずれかを注入した。注入を２週間後に繰り返し、触診可能な腫瘍の外観を毎週モニタリングした。図１２に報告したように、Ｎｅｆｍｕｔ／ＨＥＲ２−ＥＣＤを発現するＤＮＡの注入は、腫瘍発生の著しい遅延と関連した。モニタリングは、倫理的理由で必要な最初の屠殺時に停止した。
【００９６】
これらのデータは、ＤＮＡのｉ．ｍ．注入によって誘導されたＨＥＲ２−ＥＣＤに特異的なＣＴＬ活性と抗腫瘍活性の間の直接的関係を強調する。
【００９７】
ＣＴＬワクチンプラットフォームをヒトに移行させること：操作されたエキソソームによる抗原特異的ＣＴＬ活性の誘導
【００９８】
診療所において本発明者らのＣＴＬワクチンプラットフォームを活用する可能性を開くために、ヒトの系におけるその有効性を実証することが必須である。この目標を達成するために、Ｎｅｆｍｕｔ発現ＤＮＡベクターを注入したマウスで以前に記載された抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔリンパ球免疫応答の誘導の根底にある機序を少なくとも部分的に再現する条件を使用する実験を設定した（１）。トランスフェクトされた筋肉細胞由来のエキソソームのｉＤＣへの移入が最初に報告された。ＳＫＭＣは、ＧＦＰまたはＮｅｆｍｕｔ／ＧＦＰ  ＤＮＡベクターのいずれかをトランスフェクトされ、トランスフェクション効率はＦＡＣＳ分析によってチェックした（図１３Ａ）。この課題に関して、Ｎｅｆｍｕｔ／ＧＦＰの発現が蛍光エキソソームの生成を導くことが以前に報告されている（１３）。トランスフェクトされたＳＫＭＣのｉＤＣとの共培養後に、ｉＤＣへの蛍光凝集物の存在が、抗ＣＤ４５  ｍＡｂによりレシピエントｉＤＣを標識する際の共焦点顕微鏡分析によって報告された（図１３Ｂ、中央のパネル）。一方、ＧＦＰをトランスフェクトされたＳＫＭＣを使用した場合、および共培養物をエキソソーム生合成の阻害剤ＧＷ４８６９とスピロエポキシドで処理した場合のＣＤ４５＋細胞集団内では、ＧＦＰ蛍光は検出されなかった（図１３Ｂ、それぞれ、左のパネルと右のパネル）。この結果は、ｉＤＣにおけるＮｅｆｍｕｔ／ＧＦＰ分子の侵入が、エキソソームの細胞間伝達によって媒介されたという見解を支持する。
【００９９】
次に、抗原特異的ＣＴＬ活性の誘導を評価することを目的としたクロスプライミングアッセイを、図１４Ａにまとめたように実施した。詳細には、ＳＫＭＣに、Ｎｅｆｍｕｔ誘導体を発現するＤＮＡベクターをトランスフェクトし、次いで、ＨＬＡ−Ａ．０２  ｉＤＣと共培養した。２４時間後、ｉＤＣを単離し、ＬＰＳで成熟させ、次いで、自己ＰＢＬとの共培養に供した。成熟した（ｍ）ＤＣ−ＰＢＬの共培養を７日間行い、その後、リンパ球を単離し、トランスフェクトされたＳＫＭＣと以前に共培養した新鮮なｍＤＣを添加することによって第２の刺激サイクルに供した。さらに７日後、共培養からリンパ球を回収し、ＣＤ８＋  Ｔ画分を単離し、親またはＮｅｆｍｕｔの安定な発現のために操作したＨＬＡ−Ａ．０２  ＭＣＦ−７細胞によるＣＴＬアッセイに関する共培養に供した（図１４Ｂ）。ＣＴＬアッセイからの結果（図１４Ｃ）は、ＭＣＦ−７／Ｎｅｆｍｕｔ標的細胞の死亡率が、対照ベクターをトランスフェクトされたＳＫＭＣとの共培養由来のＤＣによって刺激されたＣＤ８＋  Ｔ細胞との共培養において検出されたものと比較して、Ｎｅｆｍｕｔを発現するＳＫＭＣと共培養したＤＣによって刺激されたＣＤ８＋  Ｔ細胞によってそれらがチャレンジされた場合に、より高いようであることを示した。一方、抗原特異的ＣＴＬ活性は、標的細胞として親ＭＣＦ−７を使用することに関して一貫して検出不能であった。
【０１００】
次に、これらの調査を、Ｎｅｆｍｕｔと融合した抗原に対して拡大した。さらに、操作したエキソソームの生成が、実際に、抗原特異的ＣＴＬ活性の誘導の根底にあるかどうかを確かめた。この目的のために、ＭＡＲＴ−１、すなわち、ヒトメラノーマ関連抗原（４４）と融合したＮｅｆｍｕｔを発現するＤＮＡベクターを使用し、ＳＫＭＣ−ｉＤＣ共培養をエキソソーム生合成の阻害剤ＧＷ４８６９とスピロエポキシドの存在下でまたはそれらの不在下で行ったことを除いて、図１４Ａに示した手順に従って、クロスプライミングアッセイを再現した。最終的に、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球を、ＨＬＡ−Ａ．０２制限ＭＡＲＴ−１（すなわち、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号２０）、アミノ酸２７〜３５）（４５）または無関連ペプチドのいずれかで以前に処理したＨＬＡ−Ａ．０２  Ｂ−ＬＣＬと共培養することによって、ＣＴＬアッセイを実施した。図１５に報告したように、刺激したＣＤ８＋  Ｔリンパ球は、ＭＡＲＴ−１特異的ＣＴＬ活性を示した。しかしながら、エキソソーム阻害剤の存在下で行われたＳＫＭＣとの共培養由来のＤＣによって刺激されたＣＤ８＋  Ｔリンパ球が使用された場合には、もはや検出不能であった。
【０１０１】
これらのデータは、Ｎｅｆｍｕｔまたはその誘導体の取り込みのために操作されたエキソソームの、トランスフェクトされた筋肉細胞による生成が、本発明者らがヒト細胞で観察した抗原特異的ＣＴＬ活性の誘導の根底にある機序の一部であることを示す。それゆえに、これらの知見は、ＣＴＬワクチンプラットフォームは、腫瘍抗原に対してヒトで適用される可能性を有するという見解を支持する。
（参照文献）
【表２−１】
2019536473.tif 000010
【表２−２】
2019536473.tif 000011
【表２−３】
2019536473.tif 000012
【表２−４】
2019536473.tif 000013
【表２−５】
2019536473.tif 000014
【表２−６】
2019536473.tif 000015
【表２−７】
2019536473.tif 000016
【図１】
2019536473.tif 000021
【図２ＡＢ】
2019536473.tif 000022
【図２ＣＤ】
2019536473.tif 000023
【図３Ａ】
2019536473.tif 000024
【図３Ｂ】
2019536473.tif 000025
【図４Ａ】
2019536473.tif 000026
【図４ＢＣ】
2019536473.tif 000027
【図５】
2019536473.tif 000028
【図６】
2019536473.tif 000029
【図７Ａ】
2019536473.tif 000030
【図７Ｂ】
2019536473.tif 000031
【図７Ｃ】
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【図８】
2019536473.tif 000033
【図９】
2019536473.tif 000034
【図１０】
2019536473.tif 000035
【図１１Ａ】
2019536473.tif 000036
【図１１Ｂ】
2019536473.tif 000037
【図１２Ａ】
2019536473.tif 000038
【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４ＢＣ】
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【図１５】
2019536473.tif 000044
【配列表】
2019536473000001.app
【国際調査報告】
2019536473.tif 000045
2019536473.tif 000046