(57)【要約】  本発明は、スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）又はスモールＲＮＡに関連するタンパク質を検出する方法に関する。より具体的には、本発明は、Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有し、検出しようとするスモールＲＮＡの塩基配列の全部又は一部と相補的結合が可能な塩基配列で構成された一本鎖核酸を使用した、スモールＲＮＡ又はスモールＲＮＡに関連するタンパク質を検出する方法に関する。本発明によれば、スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）又は前記スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質を迅速かつ正確に検出することができるので、本発明は、様々な疾患の診断や予後診断に有用に利用できる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）生物学的試料から検出しようとするスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を含むＲＮＡを得る工程と、ｂ）前記ａ）工程で得られたＲＮＡから検出しようとするスモールＲＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列が含まれたＸ−Ｙ−Ｚ構造の一本鎖核酸を用いてｃＤＮＡを合成する工程と、ｃ）前記ｂ）工程のｃＤＮＡを増幅する工程と、ｄ）前記ｂ）工程の前記一本鎖核酸のＹ部位を切断可能な酵素により切断された一本鎖核酸断片の量を測定する工程と、を含み、
又は、ａ−１）生物学的試料から検出しようとするスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を含むＲＮＡを得る工程と、ｂ−１）前記ａ−１）工程で得られたＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程と、ｃ−１）前記ｂ−１）工程のｃＤＮＡに前記ｃＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列を含み、（i）フォワードプライマー及びプローブ、（ii）リバースプライマー及びプローブ、又は（iii）フォワードプライマーとリバースプライマーとプローブとして使用可能な一本鎖核酸を混合して、前記ｃＤＮＡを増幅する工程と、ｄ−１）前記ｃ−１）工程の前記一本鎖核酸のＹ部位を切断可能な酵素により切断された一本鎖核酸断片の量を測定する工程と、を含むスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を検出する方法であって、
前記一本鎖核酸はＸ−Ｙ−Ｚの構造を有し、前記一本鎖核酸の両末端又は内部に１つ又はそれ以上の検出可能なマーカーが付されており、リアルタイム検出を目的とする標的核酸又は標的タンパク質の特定の部位に結合して複合体を形成し、特定の酵素によりＹ部位の切断時に、Ｘ部位は、標的核酸又は標的タンパク質と複合体を維持しながらプライマーとして作用し、Ｙ及びＺは、前記標的核酸又は標的タンパク質の特定の部位から分離されることを特徴とし、
前記Ｘ、Ｙ、及びＺは、塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、
前記Ｘ、Ｙ、及びＺのいずれか１つがＤＮＡであるとき、他の２つの１つ以上は、ＲＮＡであることを特徴とする、スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を検出する方法。
【請求項２】
前記Ｘは、１〜６０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡ、
前記Ｙは、１〜１０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡ、及び
前記Ｚは、０〜１０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、
前記Ｚが０であるとき、Ｙは、３〜１０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、
前記Ｚが１であるとき、Ｙは、２〜１０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡで構成されたことを特徴とする、請求項１に記載のスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を検出する方法。
【請求項３】
前記検出可能なマーカーは、前記一本鎖核酸に共有結合又は非共有結合により結合する蛍光物質、又は蛍光物質と消光物質で構成された蛍光ペアであることを特徴とする、請求項１に記載のスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を検出する方法。
【請求項４】
前記一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）のＸ、Ｙ、及びＺは、非特異的な切断を防ぐために全体的にメチル化されるか、又は部分的にメチル化されるように合成されたことを特徴とする、請求項１に記載のスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を検出する方法。
【請求項５】
前記一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）のＸは、１０〜３０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、Ｙは、１〜１０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、前記Ｚは、２〜１０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載のスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を検出する方法。
【請求項６】
前記酵素は、Ｙ部位がＤＮＡであるとき、ＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮＡ  ｎｕｃｌｅａ
ｓｅ、ＤＮａｓｅ）、具体的には、ＤＮａｓｅII、ＤＮａｓｅII、Ｓ１ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＰ１、ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＵｖｒＡＢＣヌクレアーゼを用い、Ｘ部位がＲＮＡであるとき、ＲＮＡ加水分解酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＲＮａｓｅ）、具体的には、ＲＮａｓｅII、ＲＮａｓｅIII、ＲＮａｓｅIV、ＲＮａｓｅＨ、又はＲＮａｓｅ  Ｔ２を用いることを特徴とする、請求項１に記載のスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を検出する方法。
【請求項７】
前記ｃ）工程又はｃ−１）工程は、前記ｂ）工程又はｂ−１）工程で合成されたｃＤＮＡと結合した前記一本鎖核酸が、前記一本鎖核酸のＹ部位を切断する酵素により前記一本鎖核酸のＹ部位が切断され、Ｙ及びＺ部位が分離され、Ｘ部位がプライマーとして機能して増幅されることを特徴する、請求項１に記載のスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を検出する方法。
【請求項８】
前記ｃ−１）工程は、（i）前記一本鎖核酸がフォワードプライマー及びプローブとして使用される場合、ｃＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列で構成されたリバースプライマーがさらに含まれ、（ii）前記一本鎖核酸がリバースプライマー及びプローブとして使用される場合、ｃＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列で構成されたフォワードプライマーがさらに含まれることを特徴とする、請求項１に記載のスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を検出する方法。
【請求項９】
ａ）Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有する前記一本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する核酸が付着している抗体を調製する工程と、ｂ）生物学的試料から得られたスモールＲＮＡに関連するタンパク質と、前記ａ）工程で調製した抗体とを結合させて、タンパク質−抗体複合体を形成させる工程と、ｃ）前記複合体にＸ−Ｙ−Ｚの構造を有する前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせ、タンパク質−抗体−一本鎖核酸複合体を形成させる工程と、ｄ）前記タンパク質−抗体−一本鎖核酸複合体を切断試薬で処理して、一本鎖核酸断片を抗体から分離させた後に、分離された前記一本鎖核酸断片の量を測定して、スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質を検出する工程と、を含むスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質分子を検出する方法であって、
前記一本鎖核酸は、Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有し、前記一本鎖核酸の両末端又は内部に１つ又はそれ以上の検出可能なマーカーが付されており、リアルタイム検出を目的とする標的核酸又は標的タンパク質の特定部位に結合して複合体を形成し、特定の酵素によりＹ部位の切断時、Ｘ部位は、標的核酸又は標的タンパク質と複合体を維持しながらプライマーとして作用し、Ｙ及びＺは、前記標的核酸又は標的タンパク質の特定の部位から分離されることを特徴とし、
前記Ｘ、Ｙ、及びＺは、塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、
前記Ｘ、Ｙ、及びＺのいずれか１つがＤＮＡであるとき、他の２つの１つ以上は、ＲＮＡであることを特徴とする、スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質分子を検出する方法。
【請求項１０】
前記ｄ）工程は、前記ａ）工程で調製した抗体と結合した前記一本鎖核酸が、Ｙ部位を切断する酵素により前記一本鎖核酸のＹ部位が切断され、Ｙ及びＺ部位が分離され、Ｘ部位がプライマーとして機能して増幅されることを特徴とする、請求項９に記載のスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質分子を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）又はスモールＲＮＡに関連するタンパク質を検出する方法に関し、さらに詳しくは、Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有し、検出しようとするスモールＲＮＡの塩基配列の全部又は一部と相補的結合が可能な塩基配列で構成された一本鎖核酸を使用した、スモールＲＮＡ又はスモールＲＮＡに関連するタンパク質を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）は、細胞に存在するスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）の１つであって、細胞の発生と分化及びプログラム細胞死のような生物学的過程で極めて重要な役割をするものと知られており、細胞における特定のｍｉＲＮＡの発現レベルの差は、癌を含めた様々な疾患に関連しているものと知られている。このため、特定のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を検出することは、最近の科学研究分野において重要な部分として注目されている。具体的に、特定のｍｉＲＮＡやこれに関連するタンパク質を検出して同定することにより、遺伝的、生物学的マーカーとして活用され、ヒトの健康状態を示す指標として活用することができる。前記検出と同定によって、簡単に末梢血、ホルモン、脊髄液を活用したキットと、体外で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）使用できる診断キットの開発が可能となった。これらのキットは、認知症疾患（アルツハイマー、パーキンソン等）と糖尿病、癌等の検査に適用できる。しかし、ｍｉＲＮＡは、約２２個のヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）で極めて短いので、検出及び探知が難しく、有効なバイオマーカーとして使用するには限界がある。
【０００３】
一般に、ｍｉＲＮＡの検出は核酸増幅方法に基づいており、このような方法の例としては、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等がある。このような核酸増幅反応を用いた従来の検出方法は、本発明の属する技術分野における通常の技術者には公知のものである。これらの検出方法は、通常、核酸増幅後、増幅された核酸を検出可能な電気泳動又はプローブ又はブロット技術の利用のような労働集約的な処理が必要である。
【０００４】
最も広く公知されたｍｉＲＮＡ検出のためのリアルタイム検出は、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ等によって行われる。これらの方法は、標的物質とハイブリダイズしなければ、蛍光が消失する二次構造を形成する蛍光ハイブリダイゼーションプローブ（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ）、ハイブリダイゼーション後に、Ｔａｑポリメラーゼにより切断されて蛍光が増加するハイブリダイゼーションプローブ、ｄｓＤＮＡ−結合剤等に基づく。各測定時点において、それぞれの増幅産物にプローブ（ｐｒｏｂｅ）がハイブリダイズしながら開き又は切断されて蛍光光度が増加する。この場合、１つのプローブに対して１つの増幅の比率で増幅が検出される。与えられたサイクルにおいて、１つの増幅は、プローブのハイブリダイゼーション又は切断により検出される１つのプローブ（例えば、分子ビーコン、Ｔａｑｍａｎ  プローブ、ＭＧＢ  プローブ等）を示す。また、リアルタイム検出方法のうち、分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）を用いて増幅と同時にＮＡＳＢＡ産物を検出する方法も知られている。
【０００５】
このようなｍｉＲＮＡを検出する具体的な例としては、図１のように、ＴａｑＭａｎ  プローブとステムループプライマーを利用する方法と、ポリＡテールを利用してオリゴ−ｄＴアダプタープライマーを利用する方法が広く利用されている。
【０００６】
しかしながら、上述した技術は、いくつかの欠点がある。
【０００７】
第１に、上記の技術は、ｍｉＲＮＡの分析のためのプローブ（ｐｒｏｂｅ）とプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）が標的ｍｉＲＮＡに位置せず、追加のオリゴの伸長を要求する。図１の場合、表記されているステムループプライマー、オリゴ−ｄＴアダプタープライマー等が伸長されたオリゴである。このとき、重大な問題は、増幅されたｍｉＲＮＡ標的に全的に依存する蛍光の増加ではなく、伸長されたオリゴの増幅による蛍光の増加を測定するようになり、これは、非特異的な増幅及び結合により不正確な結果をもたらす。
【０００８】
第２に、プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）とプローブ（ｐｒｏｂｅ）との間に一定の離隔距離を必要とする。例えば、Ｔａｑｍａｎ  プローブとＭＧＢ  プローブの場合、５’末端に供与体発色団が標識され、ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）がプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を伸長させる過程においてプローブと衝突したら、ポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）のエキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性が５’末端から開始し、順次プローブ（ｐｒｏｂｅ）を分解するようになる。このとき、プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）とプローブとの間隔は、少なくとも７〜１０個のヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）である状況で開裂（ｃｌｅａｖａｇｅ）が可能である。また、プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）と３’末端の消光体との間隔は、少なくとも２〜４個のヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を要求する。このような制限的事項は、短いＲＮＡ又はＤＮＡの分析に限定要素として作用する。
【０００９】
第３に、ＮＡＳＢＡを利用した方法は、プローブ（ｐｒｏｂｅ）がドナーの蛍光光度を消失させる二次構造を形成する必要があるので、ビーコン（ｂｅａｃｏｎ）の融解温度が精巧に調節されなければならない。このような調節は、ＮＡＳＢＡやＲＣＡのように一定の温度で反応させる場合は、適用し難い。また、前記ビーコン（ｂｅａｃｏｎ）は標的と結合しないときはヘアピン構造を維持し、標的と結合する反応温度では、開くように設計しなければならない。これは、プローブの設計を極めて難しくし、また反応温度でビーコン（ｂｅａｃｏｎ）が開くときに、プローブがしばしば蛍光を放出するので、ノイズの信号に関連する問題を引き起こす。
【００１０】
第４に、ｍｉＲＮＡ等のスモールＲＮＡのイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）の区別が困難である。ｍｉＲＮＡの場合、短い長さにより、１〜３個だけ異なる多数のイソフォームが存在する。一例として、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−３０等のｍｉＲＮＡは、類似するイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）の区分が難解なことが知られている。
【００１１】
ここに、本発明者等は、上記した欠点を克服するとともに、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡのようなスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を迅速かつ正確に検出する方法を開発するために研究する中で、韓国特許出願第１０−２０１６−００１７３５９号を優先権基礎として特許文献１に記述した一本鎖核酸で核酸又はタンパク質を正確かつ迅速にリアルタイム検出できる一本鎖核酸を、スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）またスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）のｃＤＮＡとハイブリダイズさせた後に、核酸の内部を切断試薬で切断させ、分離された蛍光断片の量を測定することにより、微量の試料からスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を迅速かつ正確に検出することができることを確認し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】韓国特許出願第１０−２０１７−００２０２３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の１つの目的は、スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を検出する方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の１つの目的は、リアルタイム増幅反応と連携して、スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質を検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
１つの態様として、本発明は、スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）又はスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質のリアルタイム検出のためにプライマー及びプローブとして使用される一本鎖核酸を提供する。
【００１６】
前記一本鎖核酸は、韓国特許出願第１０−２０１６−００１７３５９号を優先権の基礎として特許文献１に記述された一本鎖核酸に由来するものであって、本発明において、上記した韓国特許出願等は、本明細書の一部として含まれる。
【００１７】
具体的には、本発明において、前記一本鎖核酸は、Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有し、一本鎖核酸の両末端又は内部に１つ又はそれ以上の検出可能なマーカーが付されていることを特徴とする。このとき、付される検出可能なマーカーの位置は、特定の部位に限定されず、特定の酵素によるＹ部位の切断時に検出可能なマーカーが分離される位置であればどこでも可能である。
【００１８】
また、前記一本鎖核酸は、リアルタイム検出を目的とする標的スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）又は標的スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連する標的タンパク質の特定の部位に結合して複合体を形成し、特定の酵素によるＹ部位の切断時に、ＹおよびＺ部位は、標的スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）又は標的スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連する標的タンパク質の特定の部位から分離されるが、Ｘ部位は分離されず、複合体を維持し、増幅するためのプライマーとして使用されることを特徴とする。
【００１９】
本発明において、前記一本鎖核酸は「プロマー（ｐｒｏｍｅｒ）」と称され、以下では、特に言及のない限り、一本鎖核酸と言えばプロマー（ｐｒｏｍｅｒ）として、プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）およびプローブ（ｐｒｏｂｅ）として同時に使用可能な一本鎖核酸を指すものとする。
【００２０】
本発明の一本鎖核酸は、Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有し、Ｘ、ＹおよびＺの各々は、様々な数のヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を有することができる。
【００２１】
例えば、ここで、前記Ｘは、１〜６０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは２〜３０個、さらにより好ましくは３〜３０個、さらにより好ましくは４〜３０個、さらにより好ましくは５〜３０個、さらにより好ましくは６〜３０個、さらにより好ましくは７〜３０個、さらにより好ましくは８〜３０個、さらにより好ましくは１０〜３０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡである。Ｘが６０個を超えた塩基配列を有する場合、核酸又はタンパク質のリアルタイム検出時に非特異的反応が生じる可能性がある。
【００２２】
例えば、前記Ｙは、１〜１０個、好ましくは１〜９個、より好ましくは１〜８個、さらにより好ましくは１〜７個、さらにより好ましくは１〜６個、さらにより好ましくは１〜５個、さらにより好ましくは１〜４個、さらにより好ましくは１〜３個、さらにより好ましくは１〜２個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡである。また、前記Ｙは、Ｚが
０個の塩基で構成されたとき、少なくとも３個以上、好ましくは３〜１０個、より好ましくは３〜９個、さらにより好ましくは３〜８個、さらにより好ましくは３〜７個、さらにより好ましくは３〜６個、さらにより好ましくは３〜５個、さらにより好ましくは３〜４個の塩基配列で構成される。また、前記Ｙは、Ｚが１個の塩基で構成されたとき、少なくとも２個以上、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜９個、さらにより好ましくは２〜８個、さらにより好ましくは２〜７個、さらにより好ましくは２〜６個、さらにより好ましくは２〜５個、さらにより好ましくは２〜４個、さらにより好ましくは２〜３個の塩基配列で構成された。Ｙを構成する塩基配列が前記範囲を外れた場合には、核酸又はタンパク質のリアルタイム検出時に、非特異的反応が発生して感度が低下する可能性がある。
【００２３】
例えば、前記Ｚは、０〜１０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは２〜１０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡである。Ｚを構成する塩基配列が前記範囲を外れた場合には、Ｙが切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）された後、標的核酸又はタンパク質に結合されたＺが標的核酸又は標的タンパク質から離脱せずにそのまま結合されているため、核酸又はタンパク質を検出することができないという問題がある。
【００２４】
この際、前記Ｘ、ＹおよびＺのうちいずれか１つがＤＮＡであるとき、他の２つのうちの１つ以上はＲＮＡである。好ましくは、前記Ｘ、ＹおよびＺは、順番にＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ、又はＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡである。
【００２５】
一具体例によれば、ＸがＤＮＡであるとき、ＹおよびＺのいずれか一方はＲＮＡ、例えば、ＹはＲＮＡであり、ＺはＤＮＡであるか、又は、ＹはＤＮＡであり、ＺはＲＮＡである。ここで、前記ＤＮＡおよびＲＮＡは、０個以上であってもよく、前記Ｘ、ＹおよびＺで定義される個数のＤＮＡおよびＲＮＡを有する。
【００２６】
他の具体例によれば、ＸがＲＮＡであるとき、ＹおよびＺのいずれか一方はＲＮＡ、例えば、ＹはＲＮＡであり、ＺはＤＮＡであるか、又は、ＹはＤＮＡであり、ＺはＲＮＡである。ここで、前記ＤＮＡおよびＲＮＡは、０個以上であってもよく、前記Ｘ、ＹおよびＺで定義される個数のＤＮＡおよびＲＮＡを有する。
【００２７】
また他の具体例によれば、Ｚが０であるとき、ＸおよびＹのいずれか一方はＤＮＡであり、他方はＲＮＡである。ここで、前記ＤＮＡおよびＲＮＡは１個以上であり、前記ＸおよびＹで定義される個数のＤＮＡおよびＲＮＡを有する。
【００２８】
また、前記Ｘ、ＹおよびＺは、非特異的な切断を防ぐために、全体的にメチル化されるか、又は部分的にメチル化されるように合成されたものであってもよい。
【００２９】
本発明において、前記核酸は、試料からリアルタイムで検出しようとするＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
【００３０】
本発明において、前記検出可能なマーカーとしては、一本鎖核酸に共有結合又は非共有結合によって結合する蛍光物質、又は蛍光物質および消光物質で構成された蛍光ペアを用いることができる。
【００３１】
前記蛍光物質は、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｂｏｄｉｐｙ、Ａｌｅｘａ  ４８８、Ａｌｅｘａ  ５３２、Ａｌｅｘａ  ５４６、Ａｌｅｘａ  ５６８、Ａｌｅｘａ  ５９４、Ａｌｅｘａ  ６６０、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＴＡＭＲＡ、  ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏｒ  Ｘ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ＯＲＮＡｇｅ  ｇｒｅｅｎ  ４８８Ｘ、ＯＲＮＡｇｅ  ｇｒｅｅｎ  ５１４Ｘ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｏｙｓ
ｔｅｒ  ５５６、Ｏｙｓｔｅｒ  ６４５、Ｂｏｄｉｐｙ  ６３０／６５０、Ｂｏｄｉｐｙ
６５０／６６５、Ｃａｌｆｌｕｏｒ  ＯＲＮＡｇｅ  ５４６、Ｃａｌｆｌｕｏｒ  ｒｅｄ  ６１０、  Ｑｕａｓａｒ  ６７０およびビオチンからなる群より選ばれるいずれか１つであることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。また、前記消光物質は、例えば、ＤＤＱ−１、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｃｌｉｐａｓｅ、６−ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３、ｌｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ−Ｓｐ、ＱＳＹ−７、ＱＳＹ−２およびＭＧＢＮＦＱからなる群より選ばれるいずれか１つであることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明で検出可能なマーカーとして蛍光ペアを用いる場合、蛍光物質および消光物質の位置は、Ｘ又はＺであってもよく、Ｙ部位であってもよく、これらのうちいずれか１箇所に限定されるものではない。例えば、蛍光物質はＸに位置し、消光物質はＹ又はＺに位置してもよい。
【００３３】
本発明の一本鎖核酸は、スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）又はスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質を検出するにあたってｉ）スモールＲＮＡからｃＤＮＡを合成するためのＲＴプライマー、ｉｉ）スモールＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを増幅するためのフォワードプライマー、ｉｉｉ）スモールＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを増幅するためのリバースプライマー、ｉｖ）スモールＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマー、又はｖ）検出しようとするスモールＲＮＡ又はこれに関連するタンパク質をリアルタイムで確認するためのプローブとして使用できる。
【００３４】
このような一連の具体的な態様において、本発明の一本鎖核酸は、一本鎖核酸のＹ部位を切断する酵素により一本鎖核酸のＹ部位が切断された後、Ｙ及びＺ部位は分離され、Ｘ部位は、標的スモールＲＮＡ又はこれに関連する標的タンパク質と複合体を維持してプライマーとして用いられ、スモールＲＮＡを合成及び増幅することができ、一本鎖核酸のＹ部位を切断する酵素により一本鎖核酸のＹ部分だけ切断されるので、従来のＤＮＡポリメラーゼにより分解されるプローブに比べて、検出しようとするスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）又はスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質をさらに正確に検出することができる。
【００３５】
特に、本発明の一本鎖核酸において、Ｙ又はＺの３’末端に蛍光物質又は消光物質が結合されている場合、一本鎖核酸のＹ部位が切断されない限り、標的核酸又は標的タンパク質の特定の核酸がポリメラーゼにより増幅されることを遮断することができるので、非特異的な増幅によるエラーを減らすことができる。
【００３６】
したがって、本発明の一本鎖核酸を、スモールＲＮＡ又はスモールＲＮＡに関連するタンパク質の検出に使用する場合、従来技術に比べて、追加の別の過程（例えば、ＲＴプライマーをループ状に形成、ポリＡを形成するなど）、および分析時間およびコストを削減することができ、従来の方法に比べて、検出しようとするスモールＲＮＡ又はスモールＲＮＡに関連するタンパク質をより正確に特異的に検出することができるので、スモールＲＮＡ又はスモールＲＮＡに関連するタンパク質をリアルタイムで検出するためのキットとして有効に利用することができる。
【００３７】
本発明の一本鎖核酸を、スモールＲＮＡ又はスモールＲＮＡに関連するタンパク質の検出のためのキットとして用いる場合、前記キットは、本発明の一本鎖核酸の他に、一本鎖核酸のＹ部位を切断できる酵素をさらに含むことが望ましい。
【００３８】
本発明において、前記一本鎖核酸のＹ部位を切断できる酵素は、一本鎖核酸のＹ部位を
特異的に切断できるものであればいかなるものであってもよい。例えば、Ｙ部位がＤＮＡである場合は、ＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮＡ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＤＮａｓｅ）、具体的には、ＤＮａｓｅ  I、ＤＮａｓｅ  II、Ｓ１核酸加水分解酵素、核酸加水分解酵素Ｐ１、ＡＰエンドヌクレアーゼ、又はＵｖｒＡＢＳＣ核酸加水分解酵素などを使用することが好ましく、Ｙ部位がＲＮＡである場合は、ＲＮＡ加水分解酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＲＮａｓｅ）、具体的には、ＲＮａｓｅ  II、ＲＮａｓｅ  III、ＲＮａｓｅ  IV、ＲＮａｓｅ  Ｈ、又はＲＮａｓｅ  Ｔ２等を使用することが好ましい。
【００３９】
本発明の一本鎖核酸を、核酸又はタンパク質をリアルタイムで検出するためのキットとして用いることができる検出のためのキットとして使用する場合、前記キットは、本発明の一本鎖核酸と一本鎖核酸のＹ部位を切断できる酵素との他に、ＤＮＡの増幅反応に必要な試薬をさらに含むことができる。
【００４０】
前記増幅反応に必要な試薬としては、例えば、適量のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、テルムス・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｕｃｕｓ）（Ｔａｑ）、サーマス・サーモフィルス （Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）、サーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、サーマス・フラブス（Ｔｈｅｒｍｉｓ  ｆｌａｖｕｓ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）またはピュロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｉｓ（Ｐｆｕ）から得られた熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼ助因子（Ｍｇ２＋）、緩衝液、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）および水（Ｈ２Ｏ）を挙げられる。また、前記緩衝液としては、適量のトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）、Ｔｗｅｅｎ２０、ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、ＰＥＧ  ６０００、ホルムアミドおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
他の１つの態様として、本発明は、スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を検出する方法を提供する。
【００４２】
以下、本発明に係るスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を検出する方法を各工程に応じて具体的に説明する。
【００４３】
ａ）生物学的試料から鋳型核酸を得る工程である。
【００４４】
本発明において、前記鋳型核酸は、生物学的試料から検出しようとするスモール（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）ＲＮＡを含むＲＮＡを言う。前記スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）は、生体の生命現象を維持又は調整が必要な状況で、このためのタンパク質を作るために又はタンパク質の生成を調節するために発現するものである。
【００４５】
前記生物学的試料は、個体から得られた各種類型の試料、具体的に固体組織試料、液体組織試料、生物学的液体、気管支吸引液、細胞及び細胞断片を用いてもよい。生物学的試料の具体的な例としては、手術過程で個体から除去した固体組織試料、病理学的標本、保存された試料又は生検標本、組織培養液又はこれらに由来した細胞及びこれらの子孫から調製された切片等があるが、これに限定されるものではない。
【００４６】
前記保存された生物学的試料は、当業界に公知の通常の保存方法に基づいて１週間以上、１年以上、例えば、１年乃至１０年間保存、冷凍保存、又はホルマリンで固定された組織を常温で保存した組織から由来したものであり得る。
【００４７】
本発明において、試料からのＲＮＡの抽出には、当業界に公知の様々な方法を用いることができ、例えば、トリゾール（ｔｒｉｚｏｌ）又はトリトンＸ−１００等を用いて行うことができる。
【００４８】
ｂ）スモールＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程である。
【００４９】
具体的には、本発明のｂ）工程は、前記ａ）工程で抽出したスモールＲＮＡに別のＲＴプライマーを混合してｃＤＮＡを合成する工程である。
【００５０】
本発明において、前記ＲＴプライマーは、検出しようとするＲＮＡの一部塩基配列と相補的結合が可能な核酸である。このとき、ＲＴプライマーは、当業界に公知のＲＴプライマー又は本発明の一本鎖核酸であることができる。
【００５１】
本発明において、ＲＴプライマーとして本発明の一本鎖核酸を用いる場合、前記一本鎖核酸は、検出しようとするスモールＲＮＡの一部塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列で構成されたことを特徴とする。
【００５２】
本発明において、前記ｃＤＮＡの合成は、当業界に公知の様々な方法を用いて行うことができ、例えば、試料から得られたＲＮＡを鋳型として逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼによって行われてもよい。また、上記したＲＴプライマーは、ポリＡ後に追加の核酸で伸長されたオリゴｄＴプライマー又はルーフ形態のＲＴプライマーであってもよい。
【００５３】
ｃ）ｃＤＮＡを増幅する工程である。
【００５４】
具体的には、本発明のｃ）工程は、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡに、本発明の一本鎖核酸を含むキット、および／又は前記ｃＤＮＡと相補的な塩基配列を有するフォワードプライマー又はリバースプライマーを混合して、伸長反応によりｃＤＮＡを増幅させる工程である。
【００５５】
前記一本鎖核酸を含むキットは、本発明の一本鎖核酸と、前記一本鎖核酸のＹ部位を切断できる酵素とからなることをいう。
【００５６】
前記一本鎖核酸のＹ部位を切断できる酵素は、一本鎖核酸のＸ部位を特異的に切断できるものであればいかなるものであってもよい。例えば、Ｘ部位がＤＮＡである場合は、ＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮＡ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＤＮａｓｅ）、具体的には、ＤＮａｓｅ
I、ＤＮａｓｅ  II、Ｓ１核酸加水分解酵素、核酸加水分解酵素Ｐ１、ＡＰエンドヌクレアーゼ、又はＵｖｒＡＢＳＣ核酸加水分解酵素などを使用することが好ましく、Ｘ部位がＲＮＡである場合は、ＲＮＡ加水分解酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＲＮａｓｅ）、具体的には、ＲＮａｓｅ  II、ＲＮａｓｅ  III、ＲＮａｓｅ  IV、ＲＮａｓｅ  Ｈ、又はＲＮａｓｅ  Ｔ２などを使用することが好ましい。
【００５７】
本発明において、前記一本鎖核酸は、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡの一部塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列からなるものであり、ｃＤＮＡを増幅するための、ｉ）フォワードプライマーおよびプローブ、ｉｉ）リバースプライマーおよびプローブ、又はｉｉｉ）フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブとして使用されることを特徴とする。また、本発明の前記一本鎖核酸は、Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有し、一本鎖核酸の両末端又は内部に１つ又はそれ以上の検出可能なマーカーが付されており、特定の酵素によるＹ部位の切断時に、ＹおよびＺが分離され、Ｘがプライマーとして機能する。
【００５８】
前記検出可能なマーカーとしては、一本鎖核酸に共有結合又は非共有結合によって結合
する蛍光物質、又は蛍光物質および消光物質からなる蛍光ペアを用いることができる。
【００５９】
前記蛍光物質は、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｂｏｄｉｐｙ、Ａｌｅｘａ  ４８８、Ａｌｅｘａ  ５３２、Ａｌｅｘａ  ５４６、Ａｌｅｘａ  ５６８、Ａｌｅｘａ  ５９４、Ａｌｅｘａ  ６６０、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＴＡＭＲＡ、  ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏｒ  Ｘ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ＯＲＮＡｇｅ  ｇｒｅｅｎ  ４８８Ｘ、ＯＲＮＡｇｅ  ｇｒｅｅｎ  ５１４Ｘ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｏｙｓｔｅｒ  ５５６、Ｏｙｓｔｅｒ  ６４５、Ｂｏｄｉｐｙ  ６３０／６５０、Ｂｏｄｉｐｙ
６５０／６６５、Ｃａｌｆｌｕｏｒ  ＯＲＮＡｇｅ  ５４６、Ｃａｌｆｌｕｏｒ  ｒｅｄ  ６１０、  Ｑｕａｓａｒ  ６７０およいビオチンからなる群より選ばれるいずれか１つであり得るが、 必ずしもこれらに限定されるものではない。また、前記消光物質は、例えば、ＤＤＱ−１、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｃｌｉｐａｓｅ、６−ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３、ｌｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ−Ｓｐ、ＱＳＹ−７、ＱＳＹ−２およびＭＧＢＮＦＱからなる群より選ばれるいずれか１つであってもよく、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００６０】
一具体例によれば、本発明の一本鎖核酸を、フォワードプライマーおよびプローブ、又はリバースプライマーおよびプローブとして用いる場合、前記一本鎖核酸は、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡの一部塩基配列と相補的結合が可能な塩基序列からなることを特徴とする。
【００６１】
他の具体例によれば、本発明の一本鎖核酸を、フォワードプライマーおよびプローブ、又はリバースプライマーおよびプローブとして使用する場合、前記一本鎖核酸の他に、別のリバースプライマー又はフォワードプライマーが使用できる。この時、前記別のリバースプライマー又はフォワードプライマーは、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡと相補的結合が可能であり、５〜３０個、好ましくは１０〜３０個の塩基配列で構成されたＤＮＡである。ここで、前記リバースプライマーは、前記ｂ）工程のＲＴプライマーと同じものであってもよい。
【００６２】
また他の具体例によれば、本発明の一本鎖核酸を、フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブとして使用する場合、前記リバースプライマーとして使用される一本鎖核酸は、前記ｂ）工程の一本鎖核酸と同じものであってもよく、一本鎖核酸の両末端又は内部に付された検出可能なマーカーは、前記ｂ）工程の一本鎖核酸と同一又は異なるものであってもよい。
【００６３】
本発明において、ｃＤＮＡの増幅は、Ａ）フォワードプライマーおよびプローブ、又はリバースプライマーおよびプローブとして使用される本発明の一本鎖核酸と、当業界で汎用されるフォワードプライマー又はリバースプライマーとによりアニーリングされるか、Ｂ）フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブとして使用される本発明の一本鎖核酸によりアニーリングされ、使用される酵素の活性を実質的に抑制しない等温温度で行われることが望ましい。ここで、前記等温とは、熱循環（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ）がないことを意味するものであり、必ずしも物理的に同じ温度を意味するものではない。
【００６４】
一具体例によれば、本発明において増幅反応が行われる等温温度は、４０〜８０℃、好ましくは５５〜７５℃、より好ましくは６０〜７５℃であることができる。
【００６５】
本発明において、前記ｃＤＮＡの増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌ
ａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）および核酸配列ベースの増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）からなる群より選ばれるいずれか１つの方法により行われるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００６６】
本発明において、前記ｃＤＮＡの増幅反応は、本発明の一本鎖核酸を含むキットの他に、増幅に必要な試薬、例えば、適量のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｕｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｉｓ（Ｐｆｕ）から得られた熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼ助因子（Ｍｇ２＋）、緩衝液、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）および水（ｄＨ２Ｏ）を含むことができる。前記緩衝液としては、適量のトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）、Ｔｗｅｅｎ２０、ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、ＰＥＧ  ６０００、ホルムアミドおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などがさらに使用できるが、これらに限定されない。
【００６７】
ｄ）一本鎖核酸のＹ部位を切断できる酵素によって切断された一本鎖核酸断片の量を測定する工程である。
【００６８】
本発明において、一本鎖核酸断片の量の測定は、様々な検出方法を用いて行うことができる。具体的には、本発明により分離された一本鎖核酸断片の量の測定は、リアルタイム又は反応が終了した後に行うことが好ましく、蛍光光度の変化又は化学発光の測定により行うことができる。
【００６９】
前記蛍光光度の変化又は化学発光の測定装置としては、当業界に公知の蛍光マーカーの検出が可能な装置であればいかなる装置でも使用可能であり、例えば、リアルタイムＰＣＲ装置、ＴＲＩＡＤマルチモード検出器（ＴＲＩＡＤ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ蛍光（Ｗａｌｌａｃ／Ｖｉｃｔｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）又はパーキンエルマー社のＬＢ５０Ｂルミネセンス分光計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＢ５０Ｂ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）、Ｌｉｇｈｔサイクルｒ  ９６、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｕｓ  ７５００、又はＢｏｐｒａｄ  ＣＦＸ９６  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｔｅｒｍｏサイクルｒ等が使用できるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明により切断された一本鎖核酸断片の量の測定および検出方法は、一本鎖核酸又は反応液に流入した標識又は検出可能なマーカーの種類に応じて変わることができる。
【００７１】
例えば、Ｘ末端に蛍光供与体が付着し、Ｚ末端にクエンチャーが付着した一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）が標的スモールＲＮＡ又はｃＤＮＡとハイブリダイズし、Ｙ部位を切断できる酵素によってＹおよびＺ部位が分離される前には、Ｘ末端に付着した蛍光供与体の蛍光が、Ｚ末端に付着したクエンチャーによって大幅に減少した状態を維持する。しかし、Ｙ部位を切断できる酵素によってＸ部位は分離されず、ＹおよびＺ部位のみが標的スモールＲＮＡ又はｃＤＮＡから分離されて反応溶液中に分散されると、Ｘ末端に付着した蛍光供与体の蛍光が、Ｚ末端に付着したクエンチャーの影響を受けなくなるため増加することになる。このとき、Ｘ末端に付着した蛍光供与体の蛍光放出が増加し、これにより前述した機器を用いて標的スモールＲＮＡ又はｃＤＮＡをリアルタイムで検出することができる。
【００７２】
一具体例によれば、スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）と相補的な結合を示すＲＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した後、本発明に基づき、ｃＤＮＡと相補的な結合を示し、ＦＡＭが付着した一本鎖核酸をフォワードプライマー又はリバースプライマーとして用いてｃＤＮＡを増幅した結果、従来の、検出可能なマーカーが付されていないフォワードプライマーを用いて増幅されたｃＤＮＡとは異なり、ｃＤＮＡが増幅される過程中に増幅曲線が示されたことを確認した。
【００７３】
本発明に係るスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）の検出方法は、Ｔａｑｍａｎプローブ、ＭＧＢプローブ又はサイバーグリーン(Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ)のようなインターカレータタイプの二本鎖ＤＮＡ結合剤等を使用する従来方法とは異なり、Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有する核酸をプローブとプライマーとして同時に用いるので、検出しようとするスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を正確に増幅することができる。また、鋳型核酸を増幅すると同時にＤＮＡポリメラーゼにより分解されたプローブの量を測定する従来技術に比べて、微量の試料からスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を正確に検出することができるという利点がある。
【００７４】
１つの具体的実施として、本発明に係るスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）の検出方法を用いてヒト由来ｍｉＲＮＡを分析した結果、ｍｉＲＮＡの濃度が１／１００００倍に希釈された場合でも、正確な分析が可能であった（実施例１及び２参照）。
【００７５】
他の１つの具体的実施として、本発明に係るスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）の検出方法を用いてリアルタイムｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡを分析した結果、ｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡが微量存在する場合、例えば、１ａＭの濃度でも安定的に迅速かつ正確なｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡの分析が可能であった（実施例３及び４参照）。
【００７６】
また他の一態様として、本発明は、前記核酸を用いてスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質分子を検出する方法を提供する。
【００７７】
具体的には、本発明は、ａ）Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有する一本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する核酸が付着している抗体を調製する工程と、ｂ）生物学的試料から得られたスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質と、前記ａ）工程で調製した抗体とを結合させて、タンパク質−抗体複合体を形成させる工程と、ｃ）前記複合体にＸ−Ｙ−Ｚの構造を有する一本鎖核酸をハイブリダイズさせて、タンパク質−抗体−一本鎖核酸複合体を形成させる工程と、ｄ）前記タンパク質−抗体−一本鎖核酸複合体を切断試薬で処理して、一本鎖核酸断片を抗体から分離させてから、分離された一本鎖核酸断片の量を測定して、スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質を検出する工程と、を含むスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質分子を検出する方法を提供する。
【００７８】
以下、本発明に係るスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質分子を検出する方法を、各工程により具体的に説明する。
【００７９】
ａ）Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有する一本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する核酸が付着している抗体を調製する工程である。
【００８０】
本発明において、前記Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有する一本鎖核酸の構造、特徴等は、上述した通りであるので、以下では省略する。
【００８１】
本発明において、前記Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有する一本鎖核酸と相補的な配列を有する核酸は、Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有する核酸の塩基配列を鋳型として、当業界で通常使用される
増幅反応により合成されたものである。
【００８２】
本発明において、前記Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有する一本鎖核酸と相補的な配列を有する核酸が付着している抗体は、Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有する一本鎖核酸と相補的な配列を有する核酸が抗体のＦｃ領域にリンカーで連結されてなる構造を有する。前記リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）は、典型的には１〜１０個の塩基配列で構成されたＤＮＡである。
【００８３】
前記Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有する一本鎖核酸と相補的な配列を有する核酸と抗体を連結させる方法としては、通常、２つの方法が使用される。第１の方法によれば、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ；ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｌ）Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ；Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）、ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−Ｐｙｒｉｄｙｌｔｈｉｏ）Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ；ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−［３’−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ；ＮＨＳ−Ｉｃ−ＳＰＤＰ）、又はスルホスクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏ  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−［３’−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ；Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｉｃ−ＳＰＤＰ）などからなる群より選ばれるいずれか１つの試薬を使用して、５’末端がチオール（ｔｈｉｏｌ）化されたＤＮＡを抗体の遊離アミノ基に連結する。前記試薬は、それらの間隔を隔てるスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）の長さおよび水への溶解度程度が異なる。もし必要であれば、追加の操作のためにＤＮＡを放出させるチオール化（ｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ）試薬により連結部位を切断することができる。
【００８４】
第２の方法によれば、４量体（ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ）のタンパク質であるストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）によって抗体−ＤＮＡ間の連結部位を提供することにより、前記タンパク質は、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）とほぼ不可逆的な結合を形成する。抗体の遊離アミノ基は、ビオチン−ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｂｉｏｔｉｎ−ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）と反応してビオチン標識化される。ＤＮＡのビオチン化は、５’−ビオチンホスホロアミダイト（５’−ｂｉｏｔｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）の使用、又は５’末端のアミノ基標識化の後に、ビオチン−ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて行われてもよい。ＤＮＡ、ストレプトアビジンおよび抗体の複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、１モル当量の抗体をＤＮＡ−ストレプトアビジン複合体に添加して調製することができる。
【００８５】
前述した方法に基づいて、核酸が結合された抗体を、４℃で１時間反応させた後、抗体−核酸複合体をスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ゲル濾過カラムで精製し、抗体−核酸複合体を得ることができる。
【００８６】
本発明に基づいて調製された抗体は、検出しようとするタンパク質のみを特異的に認識するとともに、本発明の一本鎖核酸がハイブリダイズする可能性があるので、所望のタンパク質をリアルタイムで検出するのに容易に使用することができる。
【００８７】
ｂ）スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質と、前記ａ）工程で調製した抗体とを結合させ、タンパク質−抗体複合体を形成させる工程である。
【００８８】
本発明において、前記スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質は、抗体、リガンド、天然化合物、抽出物、合成ペプチド、及び新薬候補物質等からなる群より選ばれたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００８９】
本発明において、スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質と抗体との結合は、標的タンパク質と、前記ａ）工程で調製した抗体とを混合して行われてもよい。
【００９０】
ｃ）タンパク質−抗体複合体にＸ−Ｙ−Ｚの構造を有する一本鎖核酸をハイブリダイズさせ、タンパク質−抗体−一本鎖核酸複合体を形成させる工程である。
【００９１】
本発明において、タンパク質−抗体複合体と一本鎖核酸のハイブリダイゼーションは、タンパク質−抗体複合体に一本鎖核酸を添加して行われてもよい。
【００９２】
ｄ）タンパク質−抗体−一本鎖核酸複合体を切断試薬で処理して、一本鎖核酸断片を抗体から分離させてから、分離された一本鎖核酸断片の量を測定し、標的タンパク質分子を検出する工程である。
【００９３】
本発明において、前記切断試薬は、酵素を媒介して前記一本鎖核酸のＹ部位のみを特異的に切断できるものであれば、いずれも使用可能である。例えば、デオキシリボ核酸加水分解酵素（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＤＮａｓｅ）、リボ核酸加水分解酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＲＮａｓｅ）、ヘリカーゼ（ｈｅｌｉｃａｓｅ）、エキソヌクレアーゼ、及びエンドヌクレアーゼ等で構成された群より選ばれた１つ、好ましくは、リボ核酸加水分解酵素を用いてもよい。
【００９４】
本発明において、一本鎖核酸の量の測定は、多様な検出方法を用いて行ってもよい。具体的に、本発明により分離された一本鎖核酸断片は、リアルタイム又は反応の終了後に測定されることが好ましく、蛍光光度の変化又は化学発光の測定で行われてもよい。
【００９５】
前記蛍光光度の変化又は化学発光の測定は、当業者に公知された蛍光マーカーの検出が可能な装置であればいかなる装置でも使用可能であり、例えば、ＴＲＩＡＤマルチモード検出器（ＴＲＩＡＤ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）、ウォラックビクター蛍光（Ｗａｌｌａｃ／Ｖｉｃｔｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、及びパーキンエルマー社のＬＢ５０Ｂルミネセンス分光計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＢ５０Ｂ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）等を用いて行われてもよく、これに限定されない。
【００９６】
上記のような分離された一本鎖核酸の量の測定と検出方法は、一本鎖核酸又は反応液に流入した標識又は検出マーカーの形態により異なることができる。
【００９７】
本発明に係る標的タンパク質を検出する方法は、Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有する一本鎖核酸と相補的な配列を有する核酸が結合された抗体と、Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有する核酸とを用いることにより、検出しようとするスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質を検出する速度と精度を向上させる利点がある。
【発明の効果】
【００９８】
従来のスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を分析するためには、任意に伸長されたオリゴを用いてｃＤＮＡを合成し、伸長されたオリゴに依存して検出が行われた。しかし、本発明に係るＸ−Ｙ−Ｚの構造を有する一本鎖核酸は、任意に延長されたオリゴシーケンス（ｏｌｉｇｏ  ｓｅｗｕｅｎｃｅ）に依存せず、純粋にスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）の配列で増幅及び検出が可能である。これは、任意に延長された配列に依存して検出する方法による誤った増幅又は検出を防止することができる。また、前記一本鎖核酸は、切断試薬によってのみ切断されるので、従来のＤＮＡポリメラーゼにより分解されるプローブに比べて、検出しようとする一本鎖核酸の量をさらに正確に測定することができる利点がある。
【００９９】
したがって、本発明のＸ−Ｙ−Ｚの構造を有する核酸を用いてスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）又は前記スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質を検出する方法は、スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）又は前記スモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）に関連するタンパク質を迅速かつ正確に検出することができるので、様々な疾患の診断及び予後診断に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】従来のスモールＲＮＡを検出するために用いる方法のうち、ＴａｑＭａｎ  プローブとステムループプライマーを用いる方法と、ポリＡテールを用いてオリゴ−ｄＴアダプタープライマーを用いる方法を示す模式図である。
【図２】ｍｉＲＮＡをポリ（Ａ）テール後に伸長されたオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成し、本発明に係る一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を用いてスモールＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）を検出する方法を示す模式図である。
【図３】ｍｉＲＮＡをポリ（Ａ）テールせずに、ＲＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した後、本発明に係る一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を用いてｍｉＲＮＡを検出する方法を示す模式図である。
【図４】本発明に係る一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を用いてｍｉＲＮＡ−２１の遺伝子発現を観察したグラフである。
【図５】本発明に係る一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を用いてｍｉＲＮＡ−１５５の遺伝子発現を観察したグラフである。
【図６】本発明に係る一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を用いてｍｉＲＮＡ−２１のｃＤＮＡを様々な濃度別に希釈してからの発現を観察した図である。
【図７】本発明に係る一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を用いてｍｉＲＮＡ−１５５のｃＤＮＡを様々な濃度別に希釈してからの発現を観察した図である。
【図８】本発明に係る一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を用いてｌｅｔ−７ａ  ｍｉＲＮＡの遺伝子発現を観察した図である。
【図９】本発明に係る一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を用いてｌｅｔ−７ｄ  ｍｉＲＮＡの遺伝子発現を観察した図である。
【図１０】本発明に係る一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を用いて、ｌｅｔ−７ａ  ｌｐＭの存在下で、ｌｅｔ−７ａ  ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを様々な濃度で希釈した後の発現を観察した図である。
【発明を実施するための形態】
【０１０１】
以下、実施例等を用いて本発明についてさらに詳述する。これらの実施例は、単に本発明をさらに具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨に応じて、本発明の範囲がこれらの実施例等により制限されないというのは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明なものであろう。
【０１０２】
実施例１：本発明に係る一本鎖核酸を用いたリアルタイムヒト由来ｍｉＲＮＡの分析
【０１０３】
ｍｉＲＮＡ−２１（５’−ｕａｇ  ｃｕｕ  ａｕｃ  ａｇａ  ｃｕｇ  ａｕｇ  ｕｕｇ
ａ）、ｍｉＲＮＡ−１５５（５’−ｕｕａ  ａｕｇ  ｃｕａ  ａｕｃ  ｇｕｇ  ａｕａ
ｇｇｇ  ｇｕ）の遺伝子発現を測定するために、本発明に係る一本鎖核酸（ｐｒｏｍｏ
ｒ）とプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）、ＲＴプライマーを、下記表１に示すように、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）に依頼して調製した（表１参照）。ここで、本発明に係る一本鎖核酸（ｐｒｏｍｏｒ）の場合、５’末端には、ＦＡＭ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）を、３’末端には３ＩＡＢｋＦＧを付着しており、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）との区別のために、配列の前に添え字「ｒ」で示した。
【０１０４】
【表１】
2019536435.tif 000003
【０１０５】
ゼノルーション（Ｇｅｎｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）のＥｘｏｓｏｍａｌ  ｍｉＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて正常血液の血清２００μｌから１１．９ｎｇ／μｌ濃度のｍｉＲＮＡを抽出した。抽出したｍｉＲＮＡの１μｌ、０．１μｌ、及び０．０１μｌのそれぞれをＡｍｂｉｏｎ社のｐｏｌｙ−（Ａ）Ｔａｉｌｉｎｇ  ｋｉｔとＲｏｃｈｅ社のＮｘｔｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｋｉｔ（合計２０μｌ）を用いて、４５℃で、上記表１のそれぞれのＲＴプライマー１０μＭ濃度の１μｌ存在下で、３０分間反応してｃＤＮＡを合成した。
【０１０６】
上記表１の一本鎖核酸及びプライマーのそれぞれが、１０μＭ濃度の０．５μｌ存在下で、前記合成したそれぞれのｃＤＮＡ１μｌ、１０ｍユニットの耐熱性のＲＮａｓｅ  Ｈ、ＡｐｔａＴａｑ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ調製）４μｌを入れて、３次蒸留水で全容積（ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ）が２０μｌとなるように調整した後、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行った。このとき、ＰＣＲ反応条件は、９５℃で５分、６３〜６４℃で６０秒、９５℃で１０秒であり、４５サイクルを行った。これについての結果を図４及び図５に示した。
【０１０７】
その結果、ｔｏｔａｌ  ｍｉＲＮＡ  １１９ｐｇのみを用いて合成したｃＤＮＡの１／２０のみを用いた５．９５ｐｇの微量のｔｏｔａｌ  ｍｉＲＮＡのみで、信頼性の高い分析が可能であることが確認された。
【０１０８】
実施例２：本発明に係る一本鎖核酸を用いたリアルタイムヒト由来ｍｉＲＮＡの分析
【０１０９】
前記実施例１における１１．９ｎｇ／μｌ濃度のｍｉＲＮＡの１μｌから合成されたｃＤＮＡを、１／１０、１／１００、１／１０００、１／１００００、１／１０００００倍
に希釈した。
【０１１０】
上記表１の一本鎖核酸及びプライマーのそれぞれが、１０μＭ濃度の０．５μｌ存在下で、前記希釈した各ｃＤＮＡ１μｌ、１０ｍユニットの耐熱性のＲＮａｓｅ  Ｈ、ＡｐｔａＴａｑ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ調製）４μｌを入れて、３回蒸留水で全容積（ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ）が２０μｌとなるように調整してから、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行った。このとき、ＰＣＲ反応条件は、９５℃で５分、６３〜６４℃で６０秒、９５℃で１０秒であり、５５サイクルを行った。これについての結果を図６及び図７に示した。
【０１１１】
その結果、１／１０００まで希釈したｃＤＮＡまで増幅曲線を描き、それ以降の希釈されたｃＤＮＡでは、増幅曲線が示されなかった。これは、微量のターゲット（ｔａｒｇｅｔ）まで非特異的な増幅がないことが確認され、これにより、微量のｍｉＲＮＡのみを用いて１０コピー未満の特定ｍｉＲＮＡの分析が可能であることが確認された。
【０１１２】
実施例３：本発明に係る一本鎖核酸を用いたリアルタイムｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡの分析
【０１１３】
ｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡのうち、最も多くのイソフォームが存在することが知られている。このようなｌｅｔ−７のイソフォームを区別することは非常に難しいことが知られており、通常１％未満の特異度の区別は、特に難しいことが知られている。本実施例では、中でも最も困難であるｌｅｔ−７ａ（５’−ｕｇａ  ｇｇｕ  ａｇｕ  ａｇｇ  ｕｕｇ  ｕａｕ  ａｇｕ  ｕ）とｌｅｔ−７ｄ（５’−ａｇａ  ｇｇｕ  ａｇｕ  ａｇｇ  ｕｕｇ  ｃａｕ  ａｇｕ  ｕ）の遺伝子発現を測定するために、本発明に係る一本鎖核酸とプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）、ＲＴプライマーを、下記表２に示すように、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）に依頼して調製した（表２参照）。また、正確な定量のために、前記ｌｅｔ−７のｍｉＲＮＡをＩＤＴに依頼して調製した。ここで、一本鎖核酸の場合、５’末端には、ＦＡＭ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）を、３’末端には３ＩＡＢｋＦＧを付し、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）との区別のために、配列の前に添え字「ｒ」で示した。
【０１１４】
【表２】
2019536435.tif 000004
【０１１５】
合成した各２０ｐＭ濃度のｍｉＲＮＡ１μｌと、Ａｍｂｉｏｎ社のｐｏｌｙ−（Ａ）Ｔａｉｌｉｎｇ  ｋｉｔと、Ｒｏｃｈｅ社のＮｘｔｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｋｉｔ（合計２０μｌ）を用いて、４５℃で、上記表２のそれぞれのＲＴプライマー１０μＭ濃度の１μｌ存在下で、３０分間反応してｃＤＮＡを合成した。
【０１１６】
合成したｃＤＮＡを１００ｆＭから１ａＭの濃度まで希釈した。
【０１１７】
上記表２の一本鎖核酸及びプライマーが、それぞれ１０μＭ濃度の０．５μｌ存在下で、前記合成を行った後、希釈した各ｃＤＮＡ２μｌ、１０ｍユニットの耐熱性のＲＮａｓｅ  Ｈ、ＡｐｔａＴａｑ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ調製）４μｌを入れて、３次蒸留水で全容積が２０μｌとなるように調整してから、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行った。このとき、ＰＣＲ反応条件は、９５℃で５分、６３〜６４℃で６０秒、９５℃で１０秒であり、４５サイクルを行った。これについての結果を図８及び図９に示した。
【０１１８】
その結果、ｍｉＲＮＡ１ａＭ濃度の希釈したｃＤＮＡ２μｌ（約１コピー）のみを用いて、それぞれのｍｉＲＮＡ分析が可能であることが確認された。
【０１１９】
実施例４：本発明に係る一本鎖核酸を用いたリアルタイムｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡの特異度の検出
【０１２０】
上記表２の一本鎖核酸及びプライマーが、それぞれ１０μＭ濃度の０．５μｌ存在下で、前記実施例３で作製した１ｐＭ濃度のｌｅｔ−７ｄ  ｃＤＮＡ２μｌに、１／１０ずつ１００ｆＭから１ａＭの濃度まで希釈したｌｅｔ−７ａ  ｃＤＮＡ２μｌずつ添加し、１０ｍユニットの耐熱性のＲＮａｓｅ  Ｈ、ＡｐｔａＴａｑ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ調製）４μｌを入れて、３回蒸留水で全容積が２０μｌとなるように調整してから、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行った。このとき、ＰＣＲ反応条件は、９５℃で５分、６３〜６４℃で６０秒、９５℃で１０秒であり、４５サイクルを行った。これについての結果を図１０に示した。
【０１２１】
その結果、１ｐＭ濃度のｌｅｔ−７ｄ  ｃＤＮＡ２μｌに、１／１０ずつ１００ｆＭから１ａＭの濃度まで希釈したｌｅｔ−７ａ  ｃＤＮＡ２μｌずつを添加した実験群において、１００ｆＭから１ｆＭの濃度までは安定的に分析が可能であるが、１００ａＭにおいてグラフが崩れることが確認された。これにより、イソフォームのｍｉＲＮＡを０．１％まで特異度を維持しながら分析が可能であることが確認された。
【図１】
2019536435.tif 000005
【図２】
2019536435.tif 000006
【図３】
2019536435.tif 000007
【図４】
2019536435.tif 000008
【図５】
2019536435.tif 000009
【図６】
2019536435.tif 000010
【図７】
2019536435.tif 000011
【図８】
2019536435.tif 000012
【図９】
2019536435.tif 000013
【図１０】
2019536435.tif 000014
【配列表】
2019536435000001.app
【国際調査報告】
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