(57)【要約】  本発明は、伝染性喉頭気管炎ウイルスタンパク質抗原および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスタンパク質抗原の両方をコードして発現する新規の組換え多価非病原性マレック病ウイルスコンストラクト、ならびに家禽ワクチンにおけるその使用の方法を開示する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え非病原性マレック病ウイルス（ｒＭＤＶｎｐ）であって、ｒＭＤＶｎｐゲノム内の第一の非必須部位の中に位置する第一の異種核酸およびｒＭＤＶｎｐゲノム内の第二の非必須部位の中に位置する第二の異種核酸を含み；
第一の異種核酸は、伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｄ（ＩＬＴＶ  ｇＤ）をコードするヌクレオチド配列および伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｉ（ＩＬＴＶ  ｇＩ）をコードするヌクレオチド配列の両方を含み；
第二の異種核酸は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのウイルスタンパク質２（ＩＢＤＶ  ＶＰ２）をコードするヌクレオチド配列を含み；
第一の非必須部位および第二の非必須部位は、同じであるかまたは異なるかのいずれかであり；そして、第一の非必須部位および第二の非必須部位が異なるときは、一方はＵＳ２部位であり他方はＵＬ５４．５部位である、前記組換え非病原性マレック病ウイルス。
【請求項２】
第一の非必須部位および第二の非必須部位がＵＳ２部位である、請求項１のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項３】
ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列が作動的に第一のプロモーターの制御下にあり、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列が作動的に第二のプロモーターの制御下にあり、そして、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列が作動的に第三のプロモーターの制御下にある、請求項１または２のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項４】
第一のプロモーター、第二のプロモーターおよび第三のプロモーターが全て異なるものである、請求項３のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項５】
第一のプロモーターが内在性ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターであり、第二のプロモーターが内在性ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターであり、そして、第三のプロモーターが、マウスサイトメガロウイルス最初期１遺伝子（ｍＣＭＶ−ＩＥ１）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス最初期１遺伝子（ｈＣＭＶ−ＩＥ１）プロモーターおよびニワトリβ−アクチンプロモーターよりなる群から選択される、請求項４のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項６】
ｒＭＤＶｎｐが組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ｒＨＶＴ）である、請求項１〜５のいずれかのｒＭＤＶｎｐ。
【請求項７】
ｒＭＤＶｎｐが組換えマレック病ウイルス血清型２型（ｒＭＤＶ２）である、請求項１、２、３、４または５のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項８】
５’から３’方向に次の順番で、
（ｉ）マウスサイトメガロウイルス最初期（ｍＣＭＶ  ＩＥ）プロモーター；
（ｉｉ）伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのウイルスタンパク質２（ＩＢＤＶ  ＶＰ２）のコーディング配列；
（ｉｉｉ）転写終結配列；
（ｉｖ）伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｄ（ＩＬＴＶ  ｇＤ）プロモーター；
（ｖ）ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコーディング配列；
（ｖｉ）伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｉ（ＩＬＴＶ  ｇＩ）プロモーター；および
（ｖｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコーディング配列、を含む、組換え核酸。
【請求項９】
配列番号：１５のヌクレオチド配列を含む、請求項８の組換え核酸。
【請求項１０】
非必須部位内に挿入された請求項８または９の組換え核酸を含む、組換え非病原性マレック病ウイルス（ｒＭＤＶｎｐ）。
【請求項１１】
非必須の挿入部位がＵＳ２およびＵＬ５４．５よりなる群から選択される、請求項１０のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項１２】
組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ｒＨＶＴ）である、請求項１０または１１のｒＭＤＶｎｐ。
【請求項１３】
請求項１、２、３、４、５、６、７、１０、１１または１２のｒＭＤＶｎｐを含む、免疫原性組成物。
【請求項１４】
ｒＭＤＶｎｐが組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ｒＨＶＴ）である、請求項１３の免疫原性組成物。
【請求項１５】
ｒＭＤＶｎｐが組換えマレック病ウイルス血清型２型（ｒＭＤＶ２）である、請求項１３の免疫原性組成物。
【請求項１６】
請求項１３、１４または１５の免疫原性組成物を含む、ワクチン。
【請求項１７】
請求項１６のワクチンを投与することを含む、ＩＬＴＶおよびＩＢＤＶに対するニワトリの防御を援助する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２０１６年６月１７日に出願された米国仮出願第６２／３５１，４７１号の利益を主張するものであり、その内容はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、伝染性喉頭気管炎ウイルスおよび伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのタンパク質抗原をコードして発現する新規の組換え多価非病原性マレック病ウイルスコンストラクト、ならびに家禽ワクチンにおけるその使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
病原性の家禽ウイルスは、ニワトリを衰弱させるだけではなく、ニワトリ飼育者にとって損失が大きいものでもあるが、その理由は結果となる疾患の大半が伝染しやすく、家禽産業は狭い大規模飼育施設に重度に依存しているためである。若いヒナへのワクチン接種は、これらのウイルスに対抗するための唯一の実行可能な手段であることが多い。弱毒化または死菌の家禽ウイルスワクチンは未だ市場において重要であるが、近年、病原性ウイルスタンパク質抗原を発現する組換えウイルスコンストラクトを含有するワクチンの開発に対して著しい資源が費やされている。さらには、安定で効果的な複数のウイルス病原体からの外来遺伝子を発現する多価組換え非病原性マレック病ウイルス（ｒＭＤＶｎｐと略す）ベクターを構築しようとする実質的な試みがなされている。かかる多価ワクチンは、ヒナに与えられる注射数を最少にし、それによって、ワクチン接種されたヒナへの不快感およびストレスを低減させ、並びに労力および材料のコストを顕著に低減させるのに役立つ。かかる単一の多価コンストラクトのワクチン接種はまた、複数の組換え一価ｒＭＤＶｎｐコンストラクトを含有する代替的な多価ｒＭＤＶｎｐワクチンより好ましいが、その理由は、これらの代替的ワクチンは少なくとも今までは単一のウイルス病原体に対する防御しかもたらさなかったためである。かかる代替的ワクチンの失敗は、おそらく、一価ｒＭＤＶｎｐコンストラクトのうちの１つが他の一価のｒＭＤＶｎｐコンストラクトよりも増えすぎて、それによってこれらの他の一価ｒＭＤＶｎｐコンストラクトが顕著な免疫応答を誘導するのを妨げることが原因である。いずれにせよ、安定で効果的な複数のウイルス病原体からの外来遺伝子を発現する多価ｒＭＤＶｎｐベクターを構築しようとする過去の実質的な試みにもかかわらず、実際にかかるワクチンは２０年超も前から提案されてきたものであるが［例えばＵ．Ｓ．５，９６５，１３８を参照されたい］、１を超える他の病原体からの抗原をコードする組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ｒＨＶＴと略す）を含む多価ワクチンが安定かつ効果的であることが示されたのは、ほんの近年である。
【０００４】
ワクチン接種を通じて制御することができる１つの家禽ウイルス疾患は、マレック病である。マレック病は、世界的にニワトリに悪影響を及ぼす病原性疾患である。マレック病は、２月齢から５月齢の間の若いニワトリにおいて主に起こる。臨床徴候としては：体肢のうちの１以上の進行性麻痺、肢の麻痺が原因の協調運動障害、翼の関与が原因の脚の垂れ下がり、首の筋肉の関与が原因の頭部位置の低下を含む。急性症例においては重篤な不振が生じ得る。嚢および胸腺の萎縮も発生し得る。
【０００５】
マレック病の病原因子は、マレック病ウイルス血清型１型（ＭＤＶ１と略す）という二本鎖ＤＮＡゲノムを持つ細胞随伴性ウイルスである。ＭＤＶ１は、（ｉ）Ｂ細胞に感染して細胞溶解をもたらすことができ、かつ（ｉｉ）Ｔ細胞に潜伏感染してＴ細胞リンパ腫を誘導することができる、リンパ指向性の鳥類アルファヘルペスウイルスである。病毒性ＭＤＶ１株の近縁であるマレック病ウイルス血清型２型（ＭＤＶ２と略す）は、以前はＧａｌｌｉｄヘルペスウイルス３型として知られており、ニワトリにおいて病原性をほとんどあるいは全く持たないことが示されている天然の弱毒化ＭＤＶ株である［Ｐｅｔｈｅｒｂｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５８：１１−１７（２００９）］。ＳＢ−１は、ＭＤＶ１に対するワクチンにおいて有用であることが示されている特定のＭＤＶ２株である［例えばＭｕｒｔｈｙ  ａｎｄ  Ｃａｌｎｅｋ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２６（２）  ５４７−５５３（１９７９）を参照されたい］。
【０００６】
別の近縁のアルファヘルペスウイルスであるマレック病ウイルス血清型３型（ＭＤＶ３と略す）は、シチメンチョウのヘルペスウイルス（ＨＶＴと略す）としてより広範に知られており、家禽シチメンチョウの非病原性ウイルスである［例えばＫｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８２：１１２３−１１３５（２００１）を参照されたい］。通常用いられる２つのＨＶＴ株は、ＰＢ１株およびＦＣ１２６株である。ＨＶＴもまたニワトリにおいて非病原性である一方、これは、ニワトリにおいてＭＤＶ１に対する長期持続性の防御免疫応答を誘導する。したがって、ＨＶＴは、長年にわたって病毒性ＭＤＶ１に対する家禽ワクチンにおいて、ＨＶＴよりもウイルス血性（ｖｉｒａｅｍｉｃ）であるが安全性がより低いと考えられるＳＢ−１と一般に組み合わせて用いられている。あるいは、群れを特に病毒性の高いＭＤＶ１株でチャレンジするとき、ＨＶＴはＲｉｓｐｅｎワクチンと組み合わせることができる。Ｒｉｓｐｅｎワクチンは、軽度に病毒性であるＭＤＶ１株を起源とし、その後に細胞継代によりさらに弱められた分離物である。しかしながら、Ｒｉｓｐｅｎ株は、高感受性のニワトリ系統に対し、いくらかの病毒性を保持している。
【０００７】
ＨＶＴの完全ゲノム配列は開示されており［Ａｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５（２）：９７１−９７８（２００１）］、大半のアルファヘルペスウイルスと同じように、ＨＶＴは著しい数の潜在的な非必須挿入部位を有する［例えばＵ．Ｓ．５，１８７，０８７；Ｕ．Ｓ．５，８３０，７４５；Ｕ．Ｓ．５，８３４，３０５；Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３；Ｕ．Ｓ．５，９２８，６４８；Ｕ．Ｓ．５，９６１，９８２；Ｕ．Ｓ．６，１２１，０４３；Ｕ．Ｓ．６，２９９，８８２  Ｂ１を参照されたい］。ＨＶＴはまた遺伝的改変を受け入れることができることが示されており、それゆえに長年にわたって組換えベクターとして用いられている［ＷＯ８７／０４４６３］。したがって、組換えＨＶＴベクターは、例えばニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）［Ｓｏｎｄｅｒｍｅｉｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１１：３４９−３５８（１９９３）；Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１４：４６９−４７７（１９９６）］、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）［Ｄａｒｔｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１１：４８１−４９０（１９９５）；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６（１１）：５６３７−５６４５（２００２）］および伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）［Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ，５４（４）：１２５１−１２５９（２０１０）；ＷＯ９２／０３５５４；Ｕ．Ｓ．６，８７５，８５６］からの抗原をコードする外来遺伝子を発現することが報告されている。ＭＤＶ２の全ゲノム配列もまた公知である［ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃ．ｎｒ：ＡＢ０４９７３５．１、および上のＰｅｔｈｅｒｂｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい］。ＭＤＶ２のゲノム構成はＨＶＴのそれと非常に類似しており、特にＵＳ領域はＨＶＴのそれと同一である［上のＫｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい］。
【０００８】
加えて、新規の鳥類ヘルペスウイルス（ＮＡＨＶ）として知られる、ＨＶＴゲノムの特定の領域がＭＤＶ１の対応するゲノム領域により置き換えられている組換えキメラウイルスが構築されている。ＮＡＨＶはまた、他の家禽ウイルスからの抗原をコードする外来遺伝子を発現させるために用いられている［Ｕ．Ｓ．５，９６５，１３８；Ｕ．Ｓ．６，９１３，７５１］。
【０００９】
ＭＤＶと同じく、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶまたはＩＬＴと略す）は、世界的にニワトリに悪影響を及ぼすアルファヘルペスウイルスである［Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３８：２６１−２７９（２００７）］。ＩＬＴＶは、ニワトリにおいて急性呼吸器疾患を引き起こし、これは、呼吸抑制、喘ぎおよび血の滲出物の喀痰を特徴とする。ウイルスの複製は気道の細胞に限定され、気管内で、感染は組織浸食および出血を起こさせる。
【００１０】
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶまたはＩＢＤと略す）は、ガンボロ病ウイルスとも呼ばれ、伝染性ファブリキウス嚢病の原因である。ＩＢＤＶは、急性で高度に伝染しやすいニワトリリンパ組織のウイルス感染を引き起こし、その最初の標的は鳥類の必須の免疫学的器官：ファブリキウス嚢である。感受性の群れにおける罹患率は高く、急激な体重減少および中程度から高い死亡率を有する。この疾患から回復したヒナは、ファブリキウス嚢（またはその一部）の破壊のために免疫不全を有し得る。このことは、それらを二次感染に対して特に脆弱にする。
【００１１】
ＩＢＤＶは、ビルナウイルス（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科のメンバーである。この科のウイルスは、二本鎖ＲＮＡの２つのセグメント（ＡおよびＢ）からなるゲノムを持つ。ＩＢＤＶには２つの血清型、血清型１型および２型が存在し、これらはウイルス中和（ＶＮ）試験により識別することができる。血清型１型ウイルスはニワトリに病原性であることが示されているが、血清型２型ウイルスはシチメンチョウにおいて亜急性の疾患のみ引き起こす。歴史的に、ＩＢＤＶ血清型１型ウイルスは、今は「古典的」ＩＢＤウイルスとして知られる１つの型のみからなる。より近年、いわゆる「バリアント」ＩＢＤＶ株が出現している。ＩＢＶＤの古典株およびバリアント株は、モノクローナル抗体のパネルを用いたウイルス中和試験により、またはＲＴ−ＰＣＲにより同定して識別することができる［Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，５１：５１５−５２６（２００７）］。周知の古典的ＩＢＤＶ株としては、Ｄ７８、Ｆａｒａｇｈｅｒ  ５２／７０およびＳＴＣを挙げることができ、一方、８９／０３は、周知のバリアント株である。多くの生きたまたは不活化されたＩＢＤＶワクチンが市販されており、例えば生ワクチン、例えばＮＯＢＩＬＩＳ（登録商標）Ｇｕｍｂｏｒｏ  Ｄ７８（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）がある。
【００１２】
上に示すように、ＨＶＴはマレック病に対する顕著な防御を提供する抗原および組換えベクターの両方として作用することができるため、現在、多価ワクチン、例えばＩＬＴＶから防御するＩｎｎｏｖａｘ（登録商標）−ＩＬＴ（Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈにより販売）；いずれもＮＤＶから防御するＩｎｎｏｖａｘ（登録商標）−ＮＤ−ＳＢ（Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈにより販売）およびＶｅｃｔｏｒｍｕｎｅ（登録商標）ＨＶＴ−ＮＤＶ（Ｃｅｖａにより販売）；ならびにいずれもＩＢＤＶから防御するＶａｘｘｉｔｅｋ（登録商標）ＨＶＴ＋ＩＢＤ（Ｍｅｒｉａｌ；旧名称：Ｇａｌｌｉｖａｃ（商標）ＨＶＴ−ＩＢＤ）およびＶｅｃｔｏｒｍｕｎｅ（商標）ＨＶＴ−ＩＢＤ（Ｃｅｖａ）などのためのプラットフォームベクターとして用いられる。注目すべきことに、Ｉｎｎｏｖａｘ（登録商標）−ＩＬＴは２つの外来遺伝子、すなわちＩＬＴＶ  ｇＤおよびＩＬＴＶ  ｇＩを含み、これは安全、有効で安定なことが証明されている。しかしながら、これらの２つの外来遺伝子は同じ病原体からのものであり、そのうえ、天然で重複していて、ＩＬＴＶに対して適当な免疫を与えるために共発現させる必要がある。より近年、組換え型の、安全、有効で安定な、ＨＶＴ−ＩＬＴＶ−ＮＤＶを含む多価ワクチンが開示されている［ＵＳ８，９３２，６０４  Ｂ２およびＵ．Ｓ．９，４０９，９５４  Ｂ２、これらの内容はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる］。初期のＨＶＴ−ＮＤＶ−ＩＢＤＶも開示されているが、対応する製品の開発の際に長期試験したところ、主要なコンストラクトのうちの１つであるＨＶＰ３０９は十分な遺伝的安定性も異種インサートの持続的発現も呈さないことが見出された［ＷＯ２０１３／０５７，２３５］。その後に続いて、より安定で効果的なコンストラクトが開発された［ＷＯ２０１６／１０２６４７］。
【００１３】
それゆえ、２以上の異なる病原体からの異種抗原を有効に発現することができる安定な多価の組換えＭＤＶｎｐコンストラクトの明確な利点、およびそれらを設計しようとする実質的な試みにもかかわらず、今までにほとんどが現れて来ておらず、またそれらのほとんどないもののうちの１つですら必要な要件の全てを達成することができないことが証明された。したがって、任意の所与の多価組換えＭＤＶｎｐのワクチンとしての適合性は、組換えＭＤＶｎｐが２以上の家禽ウイルスの固有のセットから得られる異種抗原の組み合わせを含むとき、予測不可能なままである。それゆえ、多価ワクチンにおいて２以上の異なる非ＭＤＶ１家禽ウイルス病原体から防御するための単一の活性成分として用いることができる新規の安定な組換えＭＤＶｎｐベクターを構築することによって、集団的な産業の不成功を克服することへの明確なニーズがある。
【００１４】
本明細書中でのあらゆる参考文献の引用は、かかる参考文献が本出願に対する「従来技術」として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】Ｕ．Ｓ．５，９６５，１３８
【特許文献２】Ｕ．Ｓ．５，１８７，０８７
【特許文献３】Ｕ．Ｓ．５，８３０，７４５
【特許文献４】Ｕ．Ｓ．５，８３４，３０５
【特許文献５】Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３
【特許文献６】Ｕ．Ｓ．５，９２８，６４８
【特許文献７】Ｕ．Ｓ．５，９６１，９８２
【特許文献８】Ｕ．Ｓ．６，１２１，０４３
【特許文献９】Ｕ．Ｓ．６，２９９，８８２  Ｂ１
【特許文献１０】ＷＯ８７／０４４６３
【特許文献１１】ＷＯ９２／０３５５４
【特許文献１２】Ｕ．Ｓ．６，８７５，８５６
【特許文献１３】Ｕ．Ｓ．６，９１３，７５１
【特許文献１４】ＵＳ８，９３２，６０４  Ｂ２
【特許文献１５】Ｕ．Ｓ．９，４０９，９５４  Ｂ２
【特許文献１６】ＷＯ２０１３／０５７，２３５
【特許文献１７】ＷＯ２０１６／１０２６４７
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｐｅｔｈｅｒｂｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５８：１１−１７（２００９）
【非特許文献２】Ｍｕｒｔｈｙ  ａｎｄ  Ｃａｌｎｅｋ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２６（２）  ５４７−５５３（１９７９）
【非特許文献３】Ｋｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８２：１１２３−１１３５（２００１）
【非特許文献４】Ａｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５（２）：９７１−９７８（２００１）
【非特許文献５】Ｓｏｎｄｅｒｍｅｉｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１１：３４９−３５８（１９９３）
【非特許文献６】Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１４：４６９−４７７（１９９６）
【非特許文献７】Ｄａｒｔｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１１：４８１−４９０（１９９５）
【非特許文献８】Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６（１１）：５６３７−５６４５（２００２）
【非特許文献９】Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ，５４（４）：１２５１−１２５９（２０１０）
【非特許文献１０】Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３８：２６１−２７９（２００７）
【非特許文献１１】Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，５１：５１５−５２６（２００７）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
したがって、本発明は、複数のウイルス病原体からの外来遺伝子を発現させるためのベクターとしての使用のための、新規の安定で効果的な多価組換え非病原性マレック病ウイルス（ｒＭＤＶｎｐ）を提供する。特定の実施形態において、ｒＭＤＶｎｐは組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ｒＨＶＴ）である。代替的実施形態において、ｒＭＤＶｎｐは組換えマレック病ウイルス血清型２型（ｒＭＤＶ２）である。ｒＭＤＶｎｐ、例えばｒＨＶＴまたはｒＭＤＶ２は、病原性の家禽（ｐｏｕｌｔｙ）ウイルスに対するワクチンにおいて用いることができる。
【００１８】
特定の実施形態において、ｒＭＤＶｎｐは、ｒＭＤＶｎｐゲノム中の第一の非必須部位内に位置する第一の異種核酸およびｒＭＤＶｎｐゲノム中の第二の非必須部位内に位置する第二の異種核酸を含む。第一の異種核酸は、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列および伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列の両方を含む。第二の異種核酸は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のウイルスタンパク質２（ＶＰ２）をコードするヌクレオチド配列を含む。このタイプの具体的な実施形態において、第一の異種核酸は配列番号：９のヌクレオチド配列を含み、そして、第二の異種核酸は、配列番号：５のヌクレオチド配列を含む。具体的な実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【００１９】
ある実施形態において、ｒＭＤＶｎｐの第一の非必須部位はＵＳ２部位である一方、第二の非必須部位はＵＳ２部位以外のｒＭＤＶｎｐの非必須部位である。関係する実施形態において、ｒＭＤＶｎｐの第一の非必須部位はＵＳ２部位であり、そして、ｒＭＤＶｎｐの第二の非必須部位はＵＬ７／８部位である。なお他の実施形態において、ｒＭＤＶｎｐの第一の非必須部位はＵＳ２部位であり、そして、ｒＭＤＶｎｐの第二の非必須部位はＵＳ１０部位である。さらに他の実施形態において、ｒＭＤＶｎｐの第一の非必須部位はＵＳ２部位であり、そしてｒＭＤＶｎｐの第二の非必須部位はＵＬ５４．５部位である。具体的な実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【００２０】
他の実施形態において、ｒＭＤＶｎｐの第二の非必須部位はＵＳ２部位である一方、第一の非必須部位はＵＳ２部位以外のｒＭＤＶｎｐの非必須部位である。関係する実施形態において、ｒＭＤＶｎｐの第二の非必須部位はＵＳ２部位であり、そして、ｒＭＤＶｎｐの第一の非必須部位はＵＬ７／８部位である。なお他の実施形態において、ｒＭＤＶｎｐの第二の非必須部位はＵＳ２部位であり、そして、ｒＭＤＶｎｐの第一の非必須部位はＵＳ１０部位である。さらに他の実施形態において、ＭＤＶｎｐの第二の非必須部位はＵＳ２部位であり、そして、ｒＭＤＶｎｐの第一の非必須部位はＵＬ５４．５部位である。具体的な実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【００２１】
他の実施形態において、ｒＭＤＶｎｐの第一の非必須部位および第二の非必須部位は同じである。このタイプの具体的な実施形態において、第一の異種核酸および第二の異種核酸は、実際には同じＤＮＡ分子の一部として構築され、これはｒＭＤＶｎｐの非必須部位内に挿入される。かかるＤＮＡ分子は、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ｇＤタンパク質、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ｇＩタンパク質および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２をコードする発現カセットであることができる。このタイプの特定の実施形態において、ＤＮＡ分子は、配列番号：１５のヌクレオチド配列を含む。このタイプの他の実施形態において、ＤＮＡ分子は、配列番号：１６のヌクレオチド配列を含む。このタイプのさらに他の実施形態において、ＤＮＡ分子は、配列番号：１７のヌクレオチド配列を含む。このタイプのなお他の実施形態において、ＤＮＡ分子は、配列番号：１８のヌクレオチド配列を含む。具体的な実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【００２２】
したがって、特定の実施形態において、ｒＭＤＶｎｐの第一の非必須部位および第二の非必須部位はＵＳ２部位である。他の実施形態において、ｒＭＤＶｎｐの第一の非必須部位および第二の非必須部位はＵＬ５４．５部位である。なお他の実施形態において、ｒＭＤＶｎｐの第一の非必須部位および第二の非必須部位はＵＬ７／８部位である。さらに他の実施形態において、ｒＭＤＶｎｐの第一の非必須部位および第二の非必須部位はＵＳ１０部位である。具体的な実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【００２３】
ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質およびＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、作動的に外来性プロモーター、すなわち天然にＭＤＶｎｐ中で見出されないプロモーターの制御下にあることができる。ある実施形態において、これらの３つのヌクレオチド配列は、作動的に異なるプロモーターの制御下にあること、すなわちＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列は作動的に第一のプロモーターの制御下にあり、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列は作動的に第二のプロモーターの制御下にあり、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列は作動的に第三のプロモーターの制御下にあり、この第一のプロモーター、第二のプロモーターおよび第三のプロモーターは全て異なるものである。特定の実施形態において、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは、内在性ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターである。ある実施形態において、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは、内在性ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターである。このタイプの特定の実施形態において、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは内在性ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターであり、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは内在性のＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターである。具体的な実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【００２４】
ある実施形態において、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質またはＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターのうちの少なくとも１つは、マウスサイトメガロウイルス最初期（ｍＣＭＶ  ＩＥ）プロモーターである。関係する実施形態において、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質またはＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターのうちの少なくとも１つは、ヒトサイトメガロウイルス最初期（ｈＣＭＶ  ＩＥ）プロモーターまたはその誘導体（例えばＡＤ１６９株からのもの）である。他の実施形態において、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質またはＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターのうちの少なくとも１つは、ニワトリβ−アクチンプロモーターである。さらに他の実施形態において、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質またはＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターのうちの少なくとも１つは、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇｐＸプロモーターである。
【００２５】
特定の実施形態において、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは、ｍＣＭＶ  ＩＥプロモーターである。関係する実施形態において、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス最初期（ｈＣＭＶ  ＩＥ）プロモーターまたはその誘導体（例えばＡＤ１６９株からのもの）である。他の実施形態において、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは、ニワトリβ−アクチン遺伝子プロモーターである。具体的な実施形態において、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターはｍＣＭＶ  ＩＥプロモーターであり、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは内在性ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターであり、そして、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは内在性ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターである。他の具体的な実施形態において、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターはｈＣＭＶ  ＩＥプロモーター（またはその誘導体）であり、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは内在性ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターであり、そして、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは内在性ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターである。なお他の具体的な実施形態において、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターはニワトリβ−アクチンプロモーターであり、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは内在性ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターであり、そして、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列のためのプロモーターは内在性ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターである。
【００２６】
ある実施形態において、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質およびＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列のインサートを包含する本発明のｒＭＤＶｎｐはまた、１以上の外来性転写終結配列を包含する。このタイプの具体的な実施形態において、転写終結配列は、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列から下流にある。特定の実施形態において、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質およびＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列は１つの転写終結配列を共有し、そして、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列は別のものを持つ。特定の実施形態において、転写終結配列のうちの少なくとも１つは、ネコヘルペスウイルスＵＳ−９（ＦＨＶ  ＵＳ−９）ポリアデニル化配列を含む。関係する実施形態において、転写終結配列のうちの少なくとも１つは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ  ＴＫ）ポリアデニル化配列を含む。具体的な実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【００２７】
本発明は、５’から３’方向に次の順番で、（ｉ）マウスサイトメガロウイルス最初期（ｍＣＭＶ  ＩＥ）プロモーター、（ｉｉ）ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質のコーディング配列、（ｉｉｉ）転写終結配列、（ｉｖ）ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター、（ｖ）ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコーディング配列、（ｖｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーターおよび（ｖｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコーディング配列を含む組換え核酸を提供する。このタイプの特定の実施形態において、組換え核酸は、配列番号：１５のヌクレオチド配列を含む。本発明はさらに、５’から３’方向に次の順番で、（ｉ）ヒトサイトメガロウイルス最初期（ｈＣＭＶ  ＩＥ）プロモーターまたはその誘導体、（ｉｉ）ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質のコーディング配列、（ｉｉｉ）転写終結配列、（ｉｖ）ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター、（ｖ）ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコーディング配列、（ｖｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター、および（ｖｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコーディング配列を含む組換え核酸を提供する。本発明はまた、５’から３’方向に次の順番で、（ｉ）ニワトリβ−アクチンプロモーター、（ｉｉ）ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質のコーディング配列、（ｉｉｉ）転写終結配列、（ｉｖ）ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター、（ｖ）ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコーディング配列、（ｖｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター、および（ｖｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコーディング配列を含む組換え核酸を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、５’から３’方向に次の順番で、（ｉ）伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ｇＤプロモーター、（ｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコーディング配列、（ｉｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター、（ｉｖ）ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコーディング配列、（ｖ）ヒトサイトメガロウイルス最初期（ｈＣＭＶ  ＩＥ）、その誘導体（例えばＡＤ１６９株からのもの）またはｍＣＭＶ  ＩＥプロモーター、（ｖｉ）ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質のコーディング配列、および（ｖｉｉ）転写終結配列を含む組換え核酸を提供する。このタイプの具体的な実施形態において、組換え核酸は、配列番号：１７のヌクレオチド配列を含む。
【００２９】
本発明はさらに、本発明の組換え核酸がｒＭＤＶｎｐの非必須の挿入部位内に挿入されているｒＭＤＶｎｐを提供する。このタイプのある実施形態において、ｒＭＤＶｎｐは、５’から３’方向に次の順番で（ｉ）マウスサイトメガロウイルス最初期（ｍＣＭＶ  ＩＥ）プロモーター、（ｉｉ）ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質のコーディング配列、（ｉｉｉ）転写終結配列、（ｉｖ）ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター、（ｖ）ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコーディング配列、（ｖｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター、および（ｖｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコーディング配列を含む組換え核酸を含む非必須部位内のインサートを包含する。具体的な実施形態において、介在性のヌクレオチド配列、例えばリンカー、スペーサー配列および／または外来性コーディング配列なども包含することができ、下の実施例１を参照されたい。特定の実施形態において、ｒＨＶＴは、非必須部位内に挿入された配列番号：１５のヌクレオチド配列を含む。このタイプの特定の実施形態において、非必須部位はＵＳ２部位である。他のかかる実施形態において、非必須部位はＵＬ５４．５部位である。さらに他のかかる実施形態において、非必須部位はＵＬ７／８部位である。なお他のかかる実施形態において、非必須部位はＵＳ１０部位である。具体的な実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【００３０】
本発明はまた、本発明のｒＭＤＶｎｐを作製する方法を提供する。ある実施形態において、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸が構築される。異種核酸は次いで本発明のｒＭＤＶｎｐの非必須部位内に挿入される。ある実施形態において、異種核酸は発現カセットである。このタイプの特定の実施形態において、発現カセットは、配列番号：１５のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第一の異種核酸が構築され；そして、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第二の異種核酸が構築される。第一の異種核酸はｒＭＤＶｎｐのＵＳ２部位内に挿入され、第二の異種核酸はｒＭＤＶｎｐの代替的な非必須部位内に挿入される。ある実施形態において、かかる異種核酸は発現カセットである。このタイプの特定の実施形態において、第一の異種核酸は配列番号：９のヌクレオチド配列を含み、そして、第二の異種核酸は配列番号：５のヌクレオチド配列を含む。このタイプの他の実施形態において、第一の異種核酸は配列番号：５のヌクレオチド配列を含み、そして、第二の異種核酸は配列番号：９のヌクレオチド配列を含む。具体的な実施形態において、ｒＭＤＶｎｐを作製する方法は、ｒＨＶＴを作製する方法である。代替的実施形態において、ｒＭＤＶｎｐを作製する方法は、ｒＭＤＶ２を作製する方法である。
【００３１】
本発明はさらに、本発明の任意のｒＭＤＶｎｐを含む免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。具体的な実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。加えて、本発明は、かかる本発明のワクチンおよび／または免疫原性組成物を投与することにより、ＩＬＴＶおよび／またはＩＢＤＶおよび／またはＭＤＶ１によって引き起こされる疾患に対する家禽の防御を援助する方法を提供する。具体的な実施形態において、かかる方法は、ニワトリの防御を援助する。このタイプの特定の実施形態において、本発明のワクチンは皮下投与される。他の実施形態において、本発明のワクチンは卵内投与される。
【００３２】
したがって、１つの態様において、本発明は、本発明のｒＭＤＶｎｐを含む免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。特定の実施形態において、これらの免疫原性組成物および／またはワクチンは、安定、安全であり、そして比較的強い抗原発現および／または有効性を持つ。あるいは、または加えて、本発明のｒＭＤＶｎｐを含む免疫原性組成物および／またはワクチンは、ニワトリへの免疫原性組成物および／またはワクチンの投与に続いて、ＩＬＴＶおよび／またはＩＢＤＶおよび／またはＭＤＶ１によって引き起こされる疾患に対するニワトリの防御を援助する。
【００３３】
本発明はまた、提供される免疫原性を改良して拡大するために、さらに付加的なＩＢＤＶ、ＩＬＴＶ、および／またはＭＤＶ抗原と組み合わされた本発明の任意のｒＭＤＶｎｐを含む免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。加えて、本発明はまた、さらにＭＤＶ、ＩＬＴＶまたはＮＤＶ以外の病原体についての抗原と組み合わされた本発明の任意のｒＭＤＶｎｐを含む免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。このタイプの特定の実施形態において、抗原は、弱毒化されたまたは軽度の生きたバリアントＩＢＤＶ（例えばＩＢＤＶ  ８９／０３）である。このタイプの別の特定の実施形態において、抗原は、弱毒化された（または軽度の生きた）ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、例えばＮＤＶ  Ｃ２である。本発明はまた、かかるワクチンおよび／または免疫原性組成物を家禽（例えばニワトリ）に投与することにより、ＩＬＴＶおよび／またはＩＢＤＶおよび／またはＭＤＶ１および／またはＮＤＶによって引き起こされる疾患に対する家禽の防御を援助する方法を提供する。このタイプの特定の実施形態において、本発明のワクチンは皮下投与される。他の実施形態において、本発明のワクチンは卵内投与される。
【００３４】
ある実施形態において、本発明の免疫原性組成物および／またはワクチンは、そのＵＳ２部位へのインサートとして、５’から３’に：（ｉ）伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ｇＤプロモーター；（ｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質のコーディング配列；（ｉｉｉ）ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター；（ｉｖ）ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質のコーディング配列；（ｖ）マウスサイトメガロウイルス最初期（ｍＣＭＶ  ＩＥ）プロモーター；（ｖｉ）伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＶＰ２タンパク質（ＩＢＤＶ  Ｖ２）のコーディング配列；および（ｖｉｉ）転写終結配列を含む組換え核酸を含むｒＨＶＴを含む。このタイプのさらにより特定の実施形態において、組換え核酸は配列番号：１７のヌクレオチド配列を持つ。このタイプの具体的な実施形態において、免疫原性組成物および／またはワクチンはさらに、弱毒化された（または軽度の生きた）バリアント伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）を含み、例えばＩＢＤＶは８９／０３である。
【００３５】
本発明はさらに、付加的なＩＢＤＶ、ＩＬＴＶおよび／またはＭＤＶ抗原、ならびにＭＤＶ、ＩＬＴＶまたはＩＢＤＶ以外の病原体と組み合わせされた本発明の任意のｒＭＤＶｎｐを含む免疫原性組成物および／またはワクチンを提供する。
【００３６】
本発明のこれらのおよび他の態様は、以下の図および詳細な説明への参照によって、より良く理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、ボックスとして表示されるリピート領域に隣接した、各々直線により表示されるユニークロング（ｕｎｉｑｕｅ  ｌｏｎｇ、ＵＬ）領域およびユニークショート（ｕｎｉｑｕｅ  ｓｈｏｒｔ、ＵＳ）領域からなるＨＶＴ（ＦＣ１２６）ゲノムの概略図である。ゲノム概略の下にあるのは、それらのゲノム位置に対するＢａｍＨＩ制限酵素消化断片の位置および各断片に関連した文字命名を指し示すバーである（最も大きい断片は文字「Ａ」を与えられ、次に大きいものは文字「Ｂ」を与えられる等である）。ＨＶＴ（ＦＣ１２６）またはｒＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶウイルスのいずれかを再構築するために用いられる各々のクローニングされたサブゲノム断片の位置（およびそれらの名称）は、ＢａｍＨＩ制限酵素地図の下に指し示される。アスタリスク（＊）は、挿入部位：４８４−１０５０−２６４１−１０８５９中のＵＬ５４．５；２２８５０９−ＩＬＴ−４３５Ｖｅｃ６、１３３３−８５．Ｂ６または１３８６−０４．４＃１中のＵＳ２の位置を指し示す。
【図２】図２は４つの異なる組換えＨＶＴの概略図であり、ＨＶＴ骨格内に挿入された遺伝子およびそれらの挿入部位を描写する。Ｉｎｎｏｖａｘ（登録商標）−ＩＬＴは、ｒＨＶＴのＵＬ５４．５部位内に挿入されたＩＬＴＶ  ｇＤおよびＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子をコードする発現カセットを包含するｒＨＶＴである。１３８６−４８は、ｒＨＶＴのＵＳ２部位内に挿入されたＩＬＴＶ  ｇＤ、ＩＬＴＶ  ｇＩおよびＩＢＤＶウイルスタンパク質２遺伝子をコードする発現カセットを包含するｒＨＶＴである。１３８６−１３４は、ＵＳ２部位内に挿入されたＩＬＴＶ  ｇＤおよびＩＬＴＶ  ｇＩ、ならびにＩＢＤＶウイルス（ｖｒｉａｌ）タンパク質２遺伝子をコードする発現カセットの両方をまた包含するが、カセットの順番が入れ替わった（すなわちＶＰ２、次いでＩＬＴ  ｇＤおよびｇＩである）ｒＨＶＴである。ＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  ４８４は、ｒＨＶＴのＵＬ５４．５部位内に挿入されたＩＢＤＶウイルスタンパク質２、ＩＬＴＶ  ｇＤおよびＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子をコードする発現カセットを包含するｒＨＶＴである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、先行する失敗を克服して、ＩＬＴＶおよびＩＢＤＶの両方からの抗原をコードして発現する単一のｒＭＤＶｎｐベクターを構築することを可能にする。特定の実施形態において、本発明のｒＭＤＶｎｐはＩＬＴＶおよびＩＢＤＶのみからの外来抗原をコードして発現し、そして、マレック病、伝染性ファブリキウス嚢病（ガンボロ病）および伝染性喉頭気管炎（Ｌａｒｙｎｇｏｔｒａｃｅｉｔｉｓ）ウイルスに対する防御を援助するように設計される。具体的な実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。完全に異なる態様において、ＩＬＴＶおよびＩＢＤＶからの外来抗原をコードして発現する組換えベクターはｒＭＤＶｎｐではなく、むしろＭＤＶ１からの指定されたゲノム配列を、ＨＶＴベクター、例えば新規鳥類ヘルペスウイルス（ＮＡＨＶ）中のそれらの対応する部分を置き換えて含有するキメラマレック病ウイルスである［例えばＵ．Ｓ．６，９１３，７５１を参照されたい］。
【００３９】
本発明に先行して、ＵＳ１０領域内に挿入されたＮＤＶ遺伝子を含有するＨＶＴベクターは既に構築されていた。このＨＶＴ−ＮＤＶベクターは、安定であること、および対応するＮＤＶ遺伝子産物であるＮＤＶ  Ｆタンパク質を十分なレベルで発現すること、ワクチン接種されたニワトリを病毒性ＮＤＶチャレンジに対して防御することが示された。加えて、ＨＶＴ  ＵＬ５４．５領域内に挿入されたＩＬＴＶ遺伝子のペアを含有するＨＶＴベクターは既に構築されていた。このＨＶＴ−ＩＬＴＶベクターは、安定であること、および対応するＩＬＴＶ遺伝子産物であるＩＬＴＶ  ｇＩおよびｇＤタンパク質を十分なレベルで発現すること、ワクチン接種されたニワトリを病毒性ＩＬＴＶチャレンジウイルスに対して防御することが示された。
【００４０】
以前、ＮＤＶおよびＩＬＴＶの両方に対して防御するための多価ＨＶＴコンストラクトは、上の成功したコンストラクト、すなわちＮＤＶ−Ｆ遺伝子をＵＳ１０部位内に挿入し、ＩＬＴＶ  ｇＤおよびｇＩ遺伝子をＵＬ５４．５部位内に挿入したものに基づいて設計された［ＵＳ８，９３２，６０４  Ｂ２を参照されたい］。しかしながら意外なことに、このコンストラクトを組織培養において継代した後、組換えウイルスは、ＩＬＴＶｇＤ、ＩＬＴＶｇＩおよびＮＤＶ  Ｆタンパク質を発現するその能力を失った。これは、多数の二重組換えＨＶＴコンストラクトに当てはまることが証明された。実際に、これらの組換えウイルスは不安定であり、ワクチンとしてのさらなる開発に不適であった。これらの知見は、ＮＤＶ  Ｆタンパク質ならびにＩＬＴＶｇＤおよびＩＬＴＶｇＩタンパク質の両方を安定的に発現することができる単一の多価ｒＨＶＴベクターの設計が存在する情報から外挿することができる単純なプロセスではなかったことを実証するものである。実際に、かかる安定で効果的な多価ｒＨＶＴベクターが仮に可能であったとしても、それらの設計は、用いられる挿入部位と挿入されることになる外来ヌクレオチド配列との間の関係に最小限に関与する、予測不可能な複雑な相互作用のセットを前提とする必要がある。したがって、ｒＨＶＴコンストラクトの設計は、公知技術から予測不可能なままである。
【００４１】
それゆえ、本発明は、ＩＬＴＶからの２つの遺伝子およびＩＢＤＶからの１つの遺伝子が挿入された組換えＭＤＶｎｐベクターを提供する。本発明の特定の実施形態において、３つの遺伝子は全てＨＶＴゲノムのＵＳ２領域内に挿入された。本発明の別の実施形態において、３つの遺伝子は全てＨＶＴゲノムのＵＬ５４．５部位内に挿入された。したがって、かかるｒＭＤＶｎｐベクターは、ＩＢＤＶおよびＩＬＴＶ両方の感染に対する防御を提供するために用いることが可能なものである。以前は、これら２つのウイルスに対する防御のためには、２つの別々の、すなわち一方がＩＬＴＶに対する防御のための、および他方がＩＢＤＶに対する防御のためのｒＨＶＴベクターが必要であった。
【００４２】
それゆえ、本発明は、家禽および／または家禽の卵に単一の組換えＭＤＶｎｐのみを接種することによってＩＬＴＶおよびＩＢＤＶに対する防御を同時に提供することが可能なものであるから、現行の方法よりも有利である。特に、卵内に注入することができる容量には制限があることから、これは卵内経路を介して付加的なワクチンが投与されることを可能にし、さらに、２つよりもむしろ１つだけのベクターを必要とすることから製造コストを節減する。そのうえ、これは、付加的な抗原、例えば弱毒化されたおよび／または軽度の生きたＮＤＶのようなワクチン、例えばＣ２株中に包含されることを可能にし得る。
【００４３】
さらには、本発明は、同じワクチンおよび／または免疫原性組成物中に、異なるｒＭＤＶｎｐコンストラクト含む実施形態を包含する。このタイプのある実施形態において、ワクチンおよび／または免疫原性組成物は、ｒＭＤＶ２およびｒＨＶＴの両方を含み、これらは各々１以上の外来抗原をコードする。実際に、２つのｒＨＶＴの組み合わせが一方コンストラクトの他方に対する顕著な過増殖を必然的に導くのとは異なり、ｒＨＶＴをｒＭＤＶ２と組み合わせることはかかる顕著な過増殖を導かない。それゆえ、具体的な実施形態において、本発明のワクチンは、ＩＬＴＶｇＤタンパク質、ＩＬＴＶｇＩタンパク質およびＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードするｒＨＶＴを、なお別の家禽ウイルス抗原、例えばＮＤＶ  Ｆタンパク質をコードするｒＭＤＶ２と共に含む。
【００４４】
本発明をより十分に理解するため、以下の定義が提供される。
【００４５】
記述における便宜上の単数形の使用は、そのように限定する意図は何らないものである。それゆえに、例えば「ポリペプチド（ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」を含む組成物への言及は、１以上のかかるポリペプチドへの言及を包含する。
【００４６】
本明細書中で用いられる「非病原性マレック病ウイルス」または「ＭＤＶｎｐ」または「ｎｐＭＤＶ」は、家禽において病原性をほとんどあるいは全く示さないＭＤＶファミリーのウイルスである。用語「ＭＤＶｎｐ」は、継代されているか、或いは同様に操作された天然起源のＭＤＶを包含するが、１つのＭＤＶ血清型のゲノムの特定の領域が異なるＭＤＶ血清型の対応する領域により置き換えられることでキメラウイルスが形成されるウイルスコンストラクト、例えば新規鳥類ヘルペスウイルス（ＮＡＨＶ）などを包含しない。ある実施形態において、ＭＤＶｎｐはＨＶＴである。他の実施形態において、ＭＤＶｎｐはＭＤＶ２である。このタイプの特定の実施形態において、ＭＤＶ２はＳＢ１である。
【００４７】
本明細書中で用いられる、異種ヌクレオチド配列（例えば外来遺伝子）をコードするように遺伝子改変されているＭＤＶｎｐは、「組換えＭＤＶｎｐ」または「ｒＭＤＶｎｐ」として定義される。用語「ｒＭＤＶｎｐ」は、異種ヌクレオチド配列をコードするように遺伝子改変されている天然起源のＭＤＶｎｐを包含するが、１つのＭＤＶ血清型のゲノムの特定の領域が異なるＭＤＶ血清型の対応する領域により置き換えられることでキメラウイルスが形成されるウイルスコンストラクト、例えば新規鳥類ヘルペスウイルス（ＮＡＨＶ）などを包含しない。
【００４８】
本明細書中で用いられる「新規鳥類ヘルペスウイルス」（「ＮＡＨＶ」）は、シチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）において天然に存在するユニークロングウイルスゲノム領域およびマレック病１（ＭＤＶ１）において天然に存在するユニークショートウイルスゲノム領域を含む組換えキメラウイルスである［Ｕ．Ｓ．５，９６５，１３８、Ｕ．Ｓ．６，１８３，７５３、Ｕ．Ｓ．６，９１３，７５１  Ｂ２を参照されたい］。好ましい実施形態（ｅｍｄｏｄｉｍｅｎｔ）において、ＮＡＨＶは、シチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）において天然に存在するユニークロングウイルスゲノム領域、マレック病１（ＭＤＶ１）において天然に存在するユニークショートウイルスゲノム領域およびＨＶＴの繰り返しウイルス領域を含む［Ｕ．Ｓ．６，９１３，７５１  Ｂ２を参照されたい］。
【００４９】
本明細書中で用いられる「非必須部位」は、ＭＤＶｎｐゲノム中の（あるいはＮＡＶＨゲノム中の）部位であって、その部位への異種ヌクレオチド配列の挿入が宿主細胞中でのＭＤＶｎｐ（またはＮＡＶＨ）の複製を妨げない部位である。非必須部位は、一般にそれらが存在する遺伝子によって、例えばＵＳ２部位のように同定され、または２つの遺伝子の間の領域によって、例えばＵＬ７／８部位のように同定される。用語「非必須部位」の使用は、ＭＤＶｎｐ（またはＮＡＶＨ）が宿主細胞中でのその複製能力を維持するために異種核酸の挿入がなされなければならない所与の遺伝子のヌクレオチド配列中に（または２つの遺伝子の間の領域中に）固有のヌクレオチド位置が１つだけであることを示唆することさえ、何ら意図されない。
【００５０】
本明細書中で用いられるように、ｒＭＤＶｎｐ（またはＮＡＨＶ）がｒＭＤＶｎｐゲノム（またはＮＡＨＶゲノム）中の非必須部位内に「挿入された」所与の核酸を含むと言われるとき、それは、所与の核酸がＭＤＶｎｐ（またはＮＡＨＶ）のその非必須部位内に位置する異種核酸であることを意味する。したがって、ｒＭＤＶｎｐゲノム中の第一の非必須部位内に挿入された第一の核酸およびｒＭＤＶｎｐゲノム中の第二の非必須部位内に挿入された第二の核酸を含むｒＭＤＶｎｐは、ｒＭＤＶｎｐゲノム中の第一の非必須部位内に位置する第一の異種核酸およびｒＭＤＶｎｐゲノム中の第二の非必須部位内に位置する第二の異種核酸を含むｒＭＤＶｎｐと等価であり、逆もまた同様である。
【００５１】
本明細書中で用いられる用語「家禽」は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジを包含し得る。
【００５２】
本明細書中で用いられる「ワクチン」は、１以上の抗原を典型的に薬学的に許容される担体、例えば水を含有する液体などと組み合わせて含む、動物（ある実施形態においてヒトを包含する一方、他の実施形態においてヒトに特異的ではない）への適用に適した組成物であり、動物に投与されると野生型微生物の感染から生じる臨床疾患からの防御を最小限に援助するのに十分な強さの、すなわち、臨床疾患の予防を援助するのにおよび／または臨床疾患を予防、寛解もしくは治療するのに十分な強さの免疫応答を誘導する。ＵＳＤＡにより制定され、連邦規則集タイトル９パート１１３（９ＣＦＲ  １１３）《Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ》中に成文化されるように、生きたウイルスワクチンは、承認を得るために、疾患に関連した臨床徴候または病変から、ＮＤＶ、ＩＢＤＶおよびＩＬＴＶの場合は少なくとも９０％の防御を、ＭＤＶの場合は少なくとも８０％の防御を提供しなければならない。
【００５３】
本明細書中で用いられる「多価ワクチン」は、２以上の異なる抗原を含むワクチンである。このタイプの特定の実施形態において、多価ワクチンは、２以上の異なる病原体に対するレシピエントの免疫系を刺激する。
【００５４】
本明細書中で用いられる用語「防御を援助する」は、感染のあらゆる兆候からの完全な防御を必要とするものではない。例えば、「防御を援助する」は、チャレンジ後に潜在する感染の症状が少なくとも低減されるように、および／または、症状を引き起こす潜在する細胞の生理的もしくは生化学的な原因もしくはメカニズムのうちの１もしくは複数が低減および／もしくは除去されるように、防御が十分であることを意味することができる。本発明との関連で用いられる「低減される」は、感染の生理的状態だけでなく感染の分子状態を包含する感染の状態に対する相対的なものを意味すると理解される。
【００５５】
本明細書中で用いられる「アジュバント」は、免疫学的イベントのカスケードを支持または増幅し、最終的により良好な免疫学的応答、すなわち、抗原に対する統合された身体的応答を導くことが可能な物質である。アジュバントは、一般的に免疫学的応答を起こさせるために必要とされないが、この応答を支持または増幅する。
【００５６】
本明細書中で用いられる用語「薬学的に許容される」は、修飾された名詞が医薬製品における使用のために適切であることを意味するように形容詞的に用いられる。例えば医薬ワクチンにおける添加剤を記述するために用いられるとき、この用語は、添加剤を、組成物中の他の成分と適合しており、対象のレシピエントに対して不利に有害でないものと特徴付ける。
【００５７】
本明細書中で用いられる「全身投与」は、体の循環系（心血管系およびリンパ系を含む）内への投与であり、それゆえに特定位置、例えば消化管（例えば経口または直腸投与を介するもの）および呼吸器系（例えば鼻腔内投与を介するもの）などよりもむしろ全身に影響を及ぼす。全身投与は、例えば、筋肉組織の中（筋肉内）、真皮の中（皮内または経皮的）、皮膚の下（皮下）、粘膜の下（粘膜下）、静脈の中（静脈内）などに投与することにより実施することができる。
【００５８】
本明細書中で用いられる用語「非経口投与」は、皮下注射、粘膜下注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射および点滴を包含する。
【００５９】
用語「およそ」は、用語「約」と交換可能に用いられ、値が指示された値の２５パーセント以内であることを表し、すなわち、「およそ」１００アミノ酸残基を含有するペプチドは７５から１２５の間のアミノ酸残基を含有することができる。
【００６０】
本明細書中で用いられるように、用語「ポリペプチド」は、用語「タンパク質」および「ペプチド」と交換可能に用いられ、ペプチド結合によりつながった２以上のアミノ酸を含むポリマーを意味する。本明細書中で用いられる用語「ポリペプチド」は、フラグメントまたはセグメントを包含し、少なくとも約８アミノ酸、一般に少なくとも約１２アミノ酸、典型的に少なくとも約１６アミノ酸、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、および特に好ましい実施形態において少なくとも約３０またはそれより多いアミノ酸、例えば３５、４０、４５、５０などの一続きのアミノ酸残基を包含する。かかる断片は、実質的に全ての位置において開始および／または終了する、全ての実際的な組み合わせにおいて、例えば残基１、２、３などにおいて開始し、例えば１５５、１５４、１５３などにおいて終了する末端を持ち得る。
【００６１】
場合により、ポリペプチドは、遺伝子によってまたはｍＲＮＡによってコードされる、あるアミノ酸残基を欠いてもよい。例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ分子は、最終タンパク質から切断され、それゆえ最終タンパク質の一部ではないものであり得る、ポリペプチドのＮ末端上のアミノ酸残基の配列（すなわちシグナル配列）をコードし得る。
【００６２】
本明細書中で用いられる、特定のタンパク質（例えばタンパク質抗原）に関する用語「抗原性断片」は、抗原性のある、すなわち免疫系の抗原認識分子、例えば免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体などと特異的に相互作用する能力のある、そのタンパク質の断片（完全長タンパク質から最少で１つのアミノ酸がなくなっている大きい断片を包含する）である。例えば、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質の抗原性断片は、抗原性のあるＶＰ２タンパク質断片である。好ましくは、本発明の抗原性断片は、抗体および／またはＴ細胞受容体認識について免疫優性である。
【００６３】
本明細書中で用いられるように、２つのアミノ酸配列が同一であるかおよび／または下に定義される中性もしくは保存的置換のみが異なる場合、アミノ酸配列は第二のアミノ酸配列と１００％「相同」である。したがって、２つのアミノ酸配列の約８０％が同一であるおよび／または下に定義される中性もしくは保存的置換のみが異なる場合、アミノ酸配列は第二のアミノ酸配列と約８０％「相同」である。
【００６４】
機能的に等価なアミノ酸残基は、しばしば配列内の残基と置換されることが可能であり、これは保存的アミノ酸置換をもたらす。かかる変化は、本明細書中で用いられる用語「保存的置換」を定義する。例えば、配列内の１以上のアミノ酸残基は、同様の極性を持つ別のアミノ酸により置換することができ、これは機能的等価物として作用して、サイレントな変化をもたらす。配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属する分類の他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）のアミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。芳香環構造を含有するアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンである。極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷（塩基性）のアミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷（酸性）のアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。かかる変化は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される見かけの分子量または等電点に影響しないと予想される。
【００６５】
特に好ましい保存的置換は：正電荷が維持され得るＬｙｓからＡｒｇ、逆もまた同様；負電荷が維持され得るＧｌｕからＡｓｐ、逆もまた同様；遊離の−−ＯＨが維持され得るＳｅｒからＴｈｒ；および遊離のＮＨ２が維持され得るＧｌｎからＡｓｎである。アミノ酸はまた、以下の類似群の中に置くこともできる：（１）プロリン、アラニン、グリシン、セリンおよびスレオニン；（２）グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸およびアスパラギン酸；（３）ヒスチジン、リジンおよびアルギニン；（４）システイン；（５）バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン；ならびに（６）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。
【００６６】
関連の実施形態において、２つの高度に相同なＤＮＡ配列は、それら自体の相同性によって、またはそれらがコードするアミノ酸の相同性によって同定することができる。かかる配列比較は、配列データバンクにおいて利用可能な標準的ソフトウェアを用いて実施することができる。特定の実施形態において、２つの高度に相同なＤＮＡ配列は、約８０％の同一性、より好ましくは約９０％の同一性、およびなおより好ましくは約９５％の同一性を持つアミノ酸配列をコードする。より詳細には、２つの高度に相同なアミノ酸配列は、約８０％の同一性、なおより好ましくは約９０％の同一性、およびなおより好ましくは約９５％の同一性を持つ。
【００６７】
本明細書中で用いられるタンパク質およびＤＮＡの配列パーセント同一性は、ソフトウェア、例えばＡｃｃｅｌｒｙｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から販売されているＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ｖ９、およびＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを用いて、アラインメントデフォルトパラメータおよびデフォルトの同一性パラメーターを使用して決定することができる。例えばＴｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ，．１９９４．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：４６７３−４６８０を参照されたい。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えばＥＭＢＬＩ、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から、Ｄｏｓ、ＭａｃｉｎｔｏｓｈおよびＵｎｉｘプラットフォーム用に無料でダウンロード可能である。現在のダウンロードリンクはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／において見出される。これらおよび他の利用可能なプログラムはまた、同じまたは類似したデフォルトパラメータを用いて配列類似性を決定するために用いることもできる。
【００６８】
本明細書中で用いられる用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」または「核酸分子」は、交換可能に用いられ、限定されるものではないが、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびさらには合成のＤＮＡ配列といったヌクレオチドを含む分子を意味する。この用語はまた、当該技術分野で公知のＤＮＡおよびＲＮＡの塩基アナログのいずれかを含む核酸分子を包含することが意図される。
【００６９】
核酸「コーディング配列」または特定のタンパク質またはペプチドを「コードする配列」は、適切な調節エレメントの制御下に置かれたときにインビトロまたはインビボで転写されてポリペプチドに翻訳されるヌクレオチド配列である。
【００７０】
コーディング配列の境界は、５’末端における開始コドンおよび３’末端における翻訳停止コドンにより決定される。コーディング配列としては、限定されるものではないが、原核生物の配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば鳥類）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、およびさらには合成のＤＮＡ配列を挙げることができる。転写終結配列は、コーディング配列から３’側に位置することができる。
【００７１】
「作動可能に連結される」とは、そのように記載された構成成分がそれらの通常の機能を果たすように設定されるエレメントの配置を指す。それゆえに、コーディング配列に作動可能に連結された制御エレメントは、コーディング配列の発現をもたらす能力がある。制御エレメントは、その発現を指示するように機能するかぎり、コーディング配列と近接する必要はない。それゆえに、例えば、翻訳されないが転写される介在性配列がプロモーターとコーディング配列との間に存在することができ、そのプロモーターはやはりコーディング配列に「作動可能に連結される」ものとみなされる。
【００７２】
本明細書中で用いられる用語「転写終結配列」は、用語「ポリアデニル化調節エレメント」と交換可能に用いられ、一般にＤＮＡコーディング領域から下流にあって、そのＤＮＡコーディング配列の転写の完全な終結に必要とされ得る配列である。転写終結因子は、コーディング領域のＲＮＡへの転写の終結に関与する調節性ＤＮＡエレメントである。一般に、かかるエレメントは、セクション、例えばヘアピン構造をコードし、これはＲＮＡポリメラーゼ複合体の転写停止を引き起こすことができる二次構造を持つ。それゆえ、転写終結因子は、常に翻訳されることになる領域から停止コドンの下流、３’非翻訳領域にある。
【００７３】
本明細書中で用いられる「発現カセット」は、プロモーターおよびそのプロモーターに作動可能に連結された異種コーディング配列を最小限含む組換え核酸である。多くのかかる実施形態において、発現カセットはさらに転写終結配列を含む。したがって、ｒＭＤＶｎｐゲノムの非必須部位への発現カセットの挿入は、ｒＭＤＶｎｐによる異種コーディング配列の発現を導くことができる。具体的な実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【００７４】
本明細書中で用いられる「異種ヌクレオチド配列」は、天然において自然に形成されない核酸を形成させるための組換え法によって本発明のヌクレオチド配列に加えられたヌクレオチド配列である。具体的な実施形態において、本発明の「異種ヌクレオチド配列」は、タンパク質抗原、例えばＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質および／またはＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードすることができる。異種ヌクレオチド配列はまた、融合（例えばキメラ）タンパク質をコードすることもできる。加えて、異種ヌクレオチド配列は、調節性および／または構造的な特性を含むペプチドおよび／またはタンパク質をコードすることができる。他のかかる実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、組換え核酸が発現した後に本発明のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質またはペプチドを検出する手段として機能するタンパク質またはペプチドをコードすることができる。さらに別の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列を検出する手段として機能することができる。異種ヌクレオチド配列は、制限部位、調節部位、プロモーターなどといった非翻訳領域配列を含むことができる。「異種核酸」は、異種ヌクレオチド配列を含む。
【００７５】
本発明の抗原をコードする核酸のｒＭＤＶｎｐベクターへの挿入は、核酸およびベクターの両方がその末端に互換性のある制限部位を含むとき容易に達成される。これがなされ得ない場合は、制限エンドヌクレアーゼ切断により生成される一本鎖核酸オーバーハング（例えばＤＮＡオーバーハング）を再消化することによってヌクレオチド配列および／もしくはベクターの末端を修飾することで平滑末端を生み出すこと、または一本鎖の末端を適切なポリメラーゼで埋めることによって同じ結果を達成することが必要であり得る。あるいは、所望の部位は、例えばその末端にヌクレオチド配列（リンカー）をライゲーションすることにより生み出され得る。かかるリンカーは、所望の制限部位を規定する特異的なオリゴヌクレオチド配列を含み得る。制限部位はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を通じて生成させることもできる［例えばＳａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７−４９１（１９８８）を参照されたい］。切断されたベクターおよびＤＮＡ断片はまた、必要な場合、ホモポリマーテーリングにより修飾され得る。
【００７６】
タンパク質抗原およびタンパク質抗原をコードする核酸
ＩＬＴＶ  ｇＤ遺伝子は、４８，４７７ダルトンの分子量を持つ長さ４３４アミノ酸の糖タンパク質をコードするように見えるが、他者は下流の開始コドンが３７７アミノ酸残基のみを含むＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質を導き、これが実際の開始コドンであることを示唆している［Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １２：１０４−１１６（１９９６）］。ＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子は、３９，７５３ダルトンの分子量を持つ長さ３６２アミノ酸の糖タンパク質をコードする［Ｕ．Ｓ．６，８７５，８５６、参照により本明細書中に組み込まれる］。ＩＬＴＶ  ｇＤおよびＩＬＴＶ  ｇＩの天然および／または実験室由来のバリアントをコードする核酸は、目下、例示されるものを置換し得る。
【００７７】
本発明の特定の実施形態において、ｒＭＤＶｎｐは、配列番号：２のアミノ酸配列を含むＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質またはその抗原性断片をコードする組換え核酸（例えば発現カセット）を含む。関係する実施形態において、ｒＭＤＶｎｐは、配列番号：２のアミノ酸配列に対して９０％より高い、および／または９５％より高い、および／または９８％より高い、および／または９９％より高い同一性を持つアミノ酸配列を含むＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質をコードする組換え核酸を含む。特定の実施形態において、ＩＬＴＶ  ｇＤタンパク質は、配列番号：１のヌクレオチド配列によりコードされる。具体的な実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【００７８】
本発明のある実施形態において、ｒＭＤＶｎｐは、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質またはその抗原性断片をコードする組換え核酸（例えば発現カセット）を含む。関係する実施形態において、ｒＭＤＶｎｐは、配列番号：４のアミノ酸配列に対して９０％より高い、および／または９５％より高い、および／または９８％より高い、および／または９９％より高い同一性を持つアミノ酸配列を含むＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質をコードする組換え核酸を含む。特定の実施形態において、ＩＬＴＶ  ｇＩタンパク質は、配列番号：３のヌクレオチド配列によりコードされる。具体的な実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【００７９】
前で言及されるように、ＩＢＤＶは、ビルナウイルス（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科のメンバーであり、二本鎖ＲＮＡの２つのセグメント（ＡおよびＢ）からなるゲノムを持つ。より大きいセグメントＡは１１０ｋＤａのポリタンパク質をコードし、これは続いて自己タンパク分解により切断されることで成熟ウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を形成する。これらのうち、ＶＰ２およびＶＰ３は、ビリオンの構造カプシドタンパク質であり、ＶＰ２タンパク質は主要な宿主防御性免疫原である。ＩＢＤＶの場合、２つの血清型、血清型１型および２型が存在し、これらはウイルス中和（ＶＮ）試験により識別することができる。血清型１型ウイルスはニワトリに病原性であることが示されているが、血清型２型ＩＢＤＶはシチメンチョウにおいて亜急性の疾患のみ引き起こす。歴史的に、ＩＢＤＶ血清型１型ウイルスは、「古典的」ＩＢＤウイルスとして知られる１つの型のみからなるが、その後にいわゆる「バリアント」ＩＢＤＶ株が出現している。本発明の特定の実施形態において、ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は、古典的な型であるＩＢＤＶからのＶＰ２タンパク質をコードする。かかる遺伝子は周知であり、それらの配列情報は容易に入手可能である［例えばＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃ．ｎｒ：Ｄ００８６９（Ｆ５２／７０）、Ｄ００４９９（ＳＴＣ）またはＡＦ４９９９２９（Ｄ７８）を参照されたい］。あるいは、この遺伝子は、天然から分離された古典的なＩＢＤＶのゲノムから、ビルナウイルスを操作するための通例の技術を用いて入手することができる。古典的な型のＩＢＤＶは、血清学または分子生物学を用いて容易に同定することができる。
【００８０】
本発明の特定の実施形態において、ｒＭＤＶｎｐは、配列番号：６のアミノ酸配列を含むＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質またはその抗原性断片をコードする組換え核酸（例えば発現カセット）を含む。関係する実施形態において、ｒＭＤＶｎｐは、配列番号：６のアミノ酸配列に対して９０％より高い、および／または９５％より高い、および／または９８％より高い、および／または９９％より高い同一性を持つアミノ酸配列を含むＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする組換え核酸を含む。具体的な実施形態において、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質は、配列番号：５のヌクレオチド配列によりコードされる。具体的な実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＨＶＴである。代替的実施形態において、ｒＭＤＶｎｐはｒＭＤＶ２である。
【００８１】
ＩＢＤＶに対する通例のワクチン接種は、弱毒化されたＩＢＤＶ株を用いて家禽の一生のなかで可能なかぎり早く実施されるが、これらはＩＢＤＶに対するＭＤＡのレベルが十分に低減したときにのみ適用することができ、これは通常は孵化後１５日から２０日までの間のどこかである。多くの「生きた」または不活化されたＩＢＤＶワクチンが市販されており、例えば「生きた」ワクチン、例えばＮｏｂｉｌｉｓ（商標）  Ｇｕｍｂｏｒｏ  Ｄ７８（Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）などがある。
【００８２】
ＮＤＶは、サイズが約１５ｋｂである非分節型の一本鎖マイナス鎖ＲＮＡゲノムを持ち、６個の遺伝子を含有するが、その中にいわゆる「融合」糖タンパク質（Ｆタンパク質）をコードするＮＤＶ  Ｆタンパク質遺伝子がある。Ｆタンパク質はＮＤＶの宿主細胞への付着および侵入に関与し、免疫優性タンパク質としてＮＤＶに対する有効な免疫応答の基礎となることができる。ＮＤＶ  Ｆタンパク質はネイティブなＦ０タンパク質として発現し、細胞外ペプチダーゼにより切断されて活性化される。
【００８３】
ＮＤＶ  Ｆタンパク質遺伝子は、例えば、通常の弱毒型（ｌｅｎｔｏｇｅｎｉｃ）ＮＤＶワクチン株であるＮＤＶクローン３０に由来するものであることができる。Ｆタンパク質遺伝子の天然および／または実験室由来のバリアントをコードする核酸は、弱毒型、中等毒型（ｍｅｓｏｇｅｎｉｃ）または強毒型（ｖｅｌｏｇｅｎｉｃ）ＮＤＶのいずれかから等しく適用可能であって、その理由は、Ｆタンパク質遺伝子配列自体はこれらの異なるＮＤＶ病原型において高度に保存されているためである。
【００８４】
プロモーターおよびポリアデニル化調節エレメント
プロモーターは、下流コーディング領域の転写を指示する生物のゲノム上の機能的領域である。それゆえ、プロモーターは、遺伝子コーディング領域の上流にある。プロモーターにより指示されるｍＲＮＡ合成は、「転写開始部位」（ＴＳＳ）から開始する。生産されたｍＲＮＡは、今度は、オープンリーディングフレーム中の第一のＡＴＧ配列（ｍＲＮＡ中の第一のＡＵＧ）である遺伝子の開始コドンから始まってタンパク質へと翻訳される。典型的に、ＴＳＳは、開始コドンの３０〜４０ヌクレオチド上流に位置する。ＴＳＳは、遺伝子ｍＲＮＡの５’末端を、例えばＲＡＣＥ技術によりシークエンスすることによって決定することができる。一般的に、プロモーターは、一般にＡ＋１と表示される開始コドンのＡの位置の約１０００ヌクレオチド上流の範囲内に含まれ、大半のプロモーターはヌクレオチド−５００からＡ＋１の間にある。
【００８５】
プロモーターの命名は、通常はそれが発現を制御する遺伝子の名称に基づく。例えば、マウスサイトメガロウイルス最初期１遺伝子（ｍＣＭＶ−ＩＥ１）プロモーター「ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーター」とは、ｍＣＭＶの初期１遺伝子（ＩＥ１遺伝子）の発現を天然で駆動するプロモーターを指し、したがって、その遺伝子のすぐ上流にある。ＩＥ１遺伝子は十分な裏付けがあって明確に認識可能である遺伝子であることから、およびいくつかのｍＣＭＶのゲノムは（全体がまたは部分的に）シークエンスされていることから、かかるプロモーターは通例の技術によって容易に同定することができる。例えば、基本的なプロトコールにおいて、プロモーターは、２つの連続した遺伝子の間の領域、例えば上流遺伝子のポリＡシグナルから下流遺伝子のＴＳＳまでの領域を概略的にサブクローニングすることによって入手することができる。プロモーターは次いで、標準的な試験によって、例えば徐々に小さくした予想プロモーターのセクションによるマーカー遺伝子の発現によって同定することができる。
【００８６】
一般に、プロモーターは多数の認識可能な調節領域、例えばエンハンサー領域などを含有し、これは転写の時期、期間、条件およびレベルに影響する調節因子の結合に関与する。エンハンサー領域は普通は上流にあるが、プロモーターは、転写因子の結合およびＲＮＡポリメラーゼ自体の指示に関与するより下流の領域も含有する。この下流領域は、一般に、多数の保存されたプロモーター配列エレメント、例えばＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックスおよびＧＣボックスを含有する。
【００８７】
エンハンサーおよび下流領域の両方を含むプロモーターは「完全」プロモーターと称され、一方で下流領域のみを含むプロモーターは「コア」プロモーターと称される。
【００８８】
（ウイルス）ベクターにおける（異種）遺伝子の発現のためのプロモーターは、その下流のコーディング配列の転写を効果的に駆動することが可能である必要がある。これは一般に、遺伝子がプロモーターの「制御下にある」またはプロモーターにより「駆動される」ように、プロモーターがコーディング配列に「作動的に連結される」といわれる。これは一般に、発現カセット中で遺伝子のプロモーターおよびコーディング配列が同じ核酸上に有効に近接して見出され、コーディング配列の有効な転写を干渉するシグナルまたは配列がそれらの間にないことを意味する。
【００８９】
ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは当該技術分野で周知であり、種々の商業的供給源から、例えばクローニングおよび発現のための商業的プラスミドの供給業者から容易に入手することができる。ＩＥ１遺伝子は、「主要ＩＥ遺伝子」とも呼ばれる。ｍＣＭＶ−ＩＥ１タンパク質は、ｐｐ８９ともいわれている。Ｄｏｒｓｃｈ−Ｈａｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２：８３２５−８３２９（１９８５）］は、１９８５年にｍＣＭＶ  ＩＥ１遺伝子プロモーターを記載しており、異種発現におけるこのプロモーターの使用は、ＷＯ８７／０３．９０５およびＥＰ７２８，８４２中にも記載されている。完全なｍＣＭＶ  ＩＥ遺伝子座のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋからａｃｃ．ｎｒ．Ｌ０６８１６．１（２００４年３月からのもの）の下で入手可能である。ｍＣＭＶ自体はＡＴＣＣから：最初はａｃｃ．ｎｒ．ＶＲ−１９４の下で入手可能であり、より近年、これはａｃｃ．ｎｒ．ＶＲ−１３９９の下で継続されている。
【００９０】
本発明の１つの実施形態において、ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは完全プロモーターであり、ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子のコアプロモーター領域、並びにエンハンサー領域の両方を含む。完全なｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターのサイズは約１．４ｋｂである。しかしながら、本発明はまた、ｍＣＭＶ  ＩＥ１遺伝子プロモーターのみならず、本発明において使用される組換えＤＮＡ発現カセットを構成する他のエレメントについても、その長さにいくらかのばらつきを許容する。これは、クローニングおよび構築のために用いられる厳密な条件の相違により生じることがある。例えば、このばらつきは、異なる制限酵素部位、ＰＣＲクローニングプライマーを用いることから、または用いられるクローニング分子の末端を適合させるための異なる条件を用いることから生じ得る。その結果として、構成エレメントの長さのいくらかのばらつき−より長いまたはより短い−が、発現カセット全体の安定性ならびに比較的強い抗原発現および／または有効性に影響を与えることなく起こり得る。その場合、これらの長さの相違は重要でなく、本発明の範囲内にある。それゆえ、「約１．４ｋｂ」のｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは：１．４ｋｂ±約２５％である。特定の実施形態において、プロモーターは１．４ｋｂ±約２０％である。さらに他の実施形態において、ばらつきは、１．４ｋｂ±約１５％、１．４ｋｂ±約１２％、１．４ｋｂ±約１０％、１．４ｋｂ±約８％、１．４ｋｂ±約６％、１．４ｋｂ±約５％、１．４ｋｂ±約４％、１．４ｋｂ±約３％、１．４ｋｂ±約２％またはさらに１．４ｋｂ±約１％であり得る。
【００９１】
同様に、等しく有効かつ安定であるプロモーターエレメントのホモログまたはバリアントが用いられ得る。それゆえ、ある実施形態において、本発明のｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは、配列番号：１０のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％またはさらには９９％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、約１．４ｋｂのＤＮＡ分子であり得る。特定の実施形態において、ｍＣＭＶ−ＩＥ１遺伝子プロモーターは、配列番号：１０のヌクレオチド配列からなる。
【００９２】
本発明のｒＭＤＶｎｐにおけるタンパク質抗原またはその抗原性断片をコードする異種遺伝子の発現を駆動するため、多くの代替的なプロモーターを用いることができる。例としては、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇｐＸプロモーター［ＷＯ８７／０４４６３を参照されたい］、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーター、配列番号：１１のヌクレオチド配列を含むニワトリベータ−アクチン遺伝子プロモーター、Ｔｏｗｎｅ株ｈＣＭＶ  ＩＥプロモーター、配列番号：１２のヌクレオチド配列を含むｈＣＭＶ  ＩＥプロモーター（ＡＤ１６９株からのもの）の誘導体、配列番号：７のヌクレオチド配列を含むＩＬＴＶ  ｇＤプロモーターおよび配列番号：８のヌクレオチド配列を含むＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター［例えばＵ．Ｓ．６，１８３，７５３  Ｂ１を参照されたい］、ヒトサイトメガロウイルス最初期１（ｈＣＭＶ  ＩＥ１）遺伝子プロモーター［Ｕ．Ｓ．５，８３０，７４５；Ｕ．Ｓ．５，９８０，９０６］、ならびにニワトリベータ−アクチン遺伝子プロモーター［ＥＰ１２９８１３９  Ｂ１］を含む。ＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子の特定の異種プロモーターは、マウス（ｍＣＭＶ  ＩＥ１）サイトメガロウイルスプロモーターである。このタイプの特定の実施形態において、ｍＣＭＶ  ＩＥ１は、配列番号：１０のヌクレオチド配列を含む［例えばＥＰ７２８，８４２；ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０８１１２１を参照されたい］。
【００９３】
ＤＮＡコーディング領域から下流にポリアデニル化調節エレメントを含むことは、コーディングＤＮＡ配列の転写を終結させるためにしばしば必要とされる。したがって、多くの遺伝子は、それらのコーディング配列末端の下流にポリアデニル化調節エレメントを含む。多くのかかる調節エレメントが同定されており、本発明のｒＭＤＶｎｐにおいて用いることができる。本明細書中に例示されるポリアデニル化調節エレメントの具体例としては、配列番号：１３のヌクレオチド配列を含むＦＨＶ  ＵＳ−９ポリアデニル化シグナルおよび配列番号：１４のヌクレオチド配列を含むＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナルを含む。
【００９４】
ワクチンおよび免疫原性組成物
本発明は、組換えＭＤＶｎｐの使用、ＭＤＶｎｐを構築するために用いられる核酸分子もしくはそれらを増殖させるための宿主細胞、または任意のそれらの組み合わせに関し、これらは全て、家禽のためのワクチンの製造のための本発明によるものである。したがって、本発明は、本発明の多価組換えＭＤＶｎｐを包含するワクチンおよび免疫原性組成物を提供する。かかるワクチンは、伝染性ファブリキウス嚢病（ガンボロ病）および／またはマレック病および／またはＩＬＴＶ感染に関連した病気の予防の援助および／または予防に用いることができる。本発明によるワクチンは、予防的処置のためおよび／または治療的処置のために用いることができ、それゆえに、疾患の感染および／またはその臨床症状の確立および／または進行を妨げることができる。
【００９５】
本発明の組換えＭＤＶｎｐは、当該技術分野において現在実行される任意の手段によって増殖させることができる。例えば、本発明の組換えＭＤＶｎｐは、初代ニワトリ細胞のインビトロ培養の使用を通じて増殖させることができ、例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を用いた下の実施例を参照されたい。ＣＥＦは、ニワトリ胚のトリプシン処理により調製することができる。ＣＥＦはまた、単層に播き、次いでＭＤＶｎｐを感染させることができる。この特定のプロセスは、工業的サイズの生産へと容易にスケールアップすることができる。
【００９６】
それゆえ、本発明のさらなる態様は、宿主細胞に本発明の組換えＭＤＶｎｐを感染させ、感染させた宿主細胞を回収しおよび回収された感染宿主細胞を薬学的に許容される担体と混合するステップを含む、本発明によるワクチンの調製のための方法に関する。感染、培養および回収に適した方法は当該技術分野で周知であり、本明細書中に記載され例示される。
【００９７】
典型的に、感染させた宿主細胞は、組換えＭＤＶｎｐをその細胞随伴性形態で得るためにインタクトなままで回収される。これらの細胞は、保存および凍結のために、安定化を提供するための適切な担体組成物中に取り入れることができる。感染細胞は、ガラスアンプル中に充填し、これを密封し、凍結して液体窒素中で保存することができる。したがって、本発明のある実施形態において、本発明のワクチンおよび免疫原性組成物は凍結保存され、したがって、凍結感染細胞を保存するために、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような凍結保存剤（ｃｒｙｒｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ）を含む。
【００９８】
あるいは、組換えＭＤＶｎｐが組換えＨＶＴであるとき、これをその宿主細胞から例えば培養終了時に超音波処理を通じて分離し、次いで安定剤中に取り入れ、安定保存のために凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ、ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）するか、または、或いは保存のために液量を低減させ、次いで投与の前または投与時に液体希釈剤中で再構成することができる。かかる再構成は、例えばワクチングレードの水を用いて達成し得る。ある実施形態において、多価ワクチンの凍結乾燥された部分は１以上の抗原を含むことができ、希釈剤は１以上の他の抗原を含むことができる。
【００９９】
特定の実施形態において、本発明のワクチン（またはその一部）は、凍結乾燥形態、例えばＷＯ２０１０／１２５０８４中に記載される方法により生産される錠剤および／またはスフェア剤（ｓｐｈｅｒｅ）であることができ、この文献はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。特に、ＷＯ２０１０／１２５０８４の第１５頁２８行目から第２７頁９行目までの例への参照がなされ、ここではかかる速崩壊性錠剤／スフェア剤を生産するための方法を記載している。かかる凍結乾燥形態は、希釈剤中に容易に溶解させることができ、ワクチンの全身投与を可能にする。
【０１００】
ワクチンおよび免疫原性組成物は、生理学的に適合性のあるバッファーおよび生理食塩水など、並びに薬学的に許容されるアジュバントを包含することができるが、必然的に包含するものではない。アジュバントは、免疫応答の改良および／またはワクチン製剤の安定性の増大のために有用であることができる。アジュバントは、免疫系の非特異的刺激物質として典型的に記載されるが、また免疫系の特異的な武器（ａｒｍ）を標的化するために有用であり得る。この活性を持つ１以上の化合物がワクチンに加えられ得る。それゆえ、本発明の特定のワクチンは、さらにアジュバントを含むことができる。アジュバントとして用いることができる化合物の例としては、限定されるものではないが、アルミニウム化合物（例えば水酸化アルミニウム）、代謝性および非代謝性の油、ミネラルオイル溶液中のオレイン酸マンニド（ｍａｎｎｉｄｅ  ｏｌｅａｔｅ）誘導体を含むミネラルオイル（例えばＳｅｐｐｉｃ  ＳＡ，ＦｒａｎｃｅからのＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ７０）、およびＤＲＡＫＥＯＬ  ６ＶＲのような軽油、ブロックポリマー、ＩＳＣＯＭ’ｓ（免疫刺激性複合体）、ビタミンおよびミネラル（限定されるものではないが：ビタミンＥ、ビタミンＡ、セレンおよびビタミンＢ１２）ならびにＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）を含む。
【０１０１】
他の好適なアジュバントは、時に免疫刺激物質といわれているものであり、これらとしては限定されるものではないが：サイトカイン、増殖因子、ケモカイン、リンパ球の細胞培養物からの上清、単球、リンパ器官からの細胞、植物、細菌もしくは寄生生物からの細胞調製物および／もしくは抽出物（スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）またはリポ多糖調製物）またはマイトジェンを含む。一般に、アジュバントは、本発明の抗原と同時に投与される。しかしながら、アジュバントはまた、あるいは代替的に、ワクチン接種の２週間前以内および／またはワクチン接種後の期間に、すなわち、抗原例えば本発明の組換えＭＤＶｎｐが組織中に残存するかぎり投与することができる。
【０１０２】
本発明のワクチンおよび免疫原性組成物は、任意の経路によって、例えば卵内に、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、皮内注射を含む非経口投与によって、乱刺によって、経口投与によって、またはそれらの任意の組み合わせによって投与され得る。
【０１０３】
さらには、本発明の多価組換えＭＤＶｎｐは、提供される免疫原性を改良して拡大するために付加的なＩＢＤＶ、ＩＬＴＶおよび／またはＭＤＶ抗原と、および／または他の病原体に対する免疫防御を提供するために他の病原体（例えばＮＤＶ）の抗原と共に用い、および／または組み合わせることができる。これらの付加的な抗原は、それらが本発明によるワクチンの安全性ならびに比較的強い抗原発現および／または有効性を伴った安定性をネガティブに妨げないかぎり、生きたまたは死滅させた微生物全体、他の組換えベクター、細胞ホモジネート、抽出物、タンパク質または任意の他のかかる派生物であり得る。
【０１０４】
本発明の多価組換えＭＤＶｎｐと付加的なＭＤＶ、ＩＢＤＶおよび／またはＩＬＴＶ抗原との組み合わせは、ＭＤＶ、ＩＢＤＶまたはＩＬＴＶの非常に病毒性の高い野外株が蔓延している場合、例えば特定の地域において有利であり得る。これに関して、本発明の多価組換えＭＤＶｎｐとＭＤＶ１、ＭＤＶ２またはＨＶＴとの組み合わせは、Ｒｉｓｐｅｎｓ（ＭＤＶ１）株、ＳＢ１（ＭＤＶ２）株、ＦＣ−１２６（ＨＶＴ）株および／またはＰＢ１（ＨＶＴ）株を包含する。ＩＢＤＶに対する応答を改良するため、多価組換えＭＤＶｎｐは、多価ワクチン中で、ＩＢＤＶワクチン株、例えば軽度の生きたＩＢＤＶワクチン株、例えばＤ７８（クローン化された中等度の株）、ＰＢＧ９８、Ｃｕ−１、ＳＴ−１２（中等度の株）または８９／０３（生きたＤｅｌａｗａｒｅバリアント株）と組み合わせ得る。
【０１０５】
本発明の多価組換えＭＤＶｎｐと一緒に抗原として用いることができる他の微生物の例としては：（ｉ）ウイルス、例えば伝染性気管支炎ウイルス、アデノウイルス、産卵低下症候群ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、鳥類脳−脊髄炎ウイルス、鶏痘ウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、アヒルペストウイルス（アヒルウイルス性腸炎）、ハトポックスウイルス、鳥類白血病ウイルス、鳥類ニューモウイルスおよびレオウイルスなど、（ｉｉ）細菌、例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、オルニトバクテリウム・ライノトラキアレ（Ｏｒｎｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ）、ヘモフィリス・パラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、エリシペロスリクス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、エリシペラス属種（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ  ｓｐｅｃ．）、マイコプラズマ属種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｅｃ．）およびクロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｅｃ．）など、（ｉｉｉ）寄生生物、例えばアイメリア属種（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｐｅｃ．）など、ならびに（ｉｖ）真菌、例えばアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃ．）などが挙げられる。本発明の特定の実施形態において、本発明の組換えＭＤＶｎｐは、軽度の生きたＮＤＶワクチン株、例えばワクチン株Ｃ２などと組み合わせることができる。かかる株の多くは商業的ワクチンにおいて用いられる。
【０１０６】
組み合わせワクチンは、本発明の組換えＭＤＶｎｐをウイルスもしくは細菌もしくは真菌もしくは寄生生物もしくは宿主細胞の調製物と、またはこれらのいずれかおよび／もしくは全ての混合物と組み合わせることによるものを包含する種々の方法で作製することができる。特定の実施形態において、かかる組み合わせワクチンの構成成分は、好都合には別々に生産され、次いで組み合わされて同じワクチン容器内に充填される。
【０１０７】
上記のように、本発明によるワクチンは、非常に若齢時のまたは卵内への単回接種によって、複数の疾患に対する家禽における安全で有効な免疫防御を提供するために好都合に用いることができる。あるいは、家禽ワクチンの技術分野における当業者に明らかであるように、上記の組み合わせはまた、本発明の多価組換えＭＤＶｎｐと付加的な抗原とが同時に適用されないワクチン接種スケジュールを包含することもでき；例えば組換えＭＤＶｎｐは卵内に適用され得て、ＮＤＶ  Ｃ２および／またはＩＢＤＶ株（例えば８９／０３）は同時／同日に適用することができる。
【０１０８】
したがって、本発明のワクチンは、単回用量でまたは複数回用量で鳥類対象に投与することができる。例えば、本発明のワクチンは、孵化日に、および／または１６〜１８日の胚形成日数（Ｅｍｂｒｙｏｎａｔｉｏｎ  Ｄａｙ）において卵内に適用され得る。複数回用量が投与されるとき、それらは同時または逐次的のいずれかで、ワクチン製剤に適合性のある方法および時間で、免疫学的に有効であるような量で与えられ得る。それゆえ、本発明のワクチンは、プライミングワクチン接種として効果的に働き得て、これはその後に同一のワクチンのブースターワクチン接種によって、または異なるワクチン製剤、例えば古典的な不活化されアジュバント化された全粒子ウイルスワクチンを使用して増幅することができる。
【０１０９】
本発明のワクチンの用量あたりの量は、意図される適用経路に応じて最適化することができ：卵内接種は通常０．０５から０．５ｍｌ／卵の間の量で適用され、非経口注射は通常０．１から１ｍｌ／トリの間の量で行われる。いずれの場合も、ワクチン用量の量の最適化は、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【０１１０】
配列表
【表１】
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【０１１１】
本発明は以下の限定されない例への参照によってより良く理解され得るものであり、これらは本発明の例示として提供されるものである。以下の例は本発明の実施形態をより十分に説明するために表されるものであり、決して本発明の幅広い範囲を限定するものとして解釈されるべきものではない。
【実施例】
【０１１２】
実施例１
組換えＨＶＴ／ＩＬＴＶ／ＩＢＤＶウイルスベクターの構築
伝染性喉頭気管炎ウイルスおよび伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス両方のタンパク質抗原をコードして発現する組換え多価非病原性マレック病ウイルスコンストラクトを調製した。本発明は、２つの組換えＨＶＴワクチン、例えばＩｎｎｏｖａｘ（登録商標）−ＩＬＴ（Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈにより販売）およびＶａｘｘｉｔｅｋ（登録商標）（Ｍｅｒｉａｌにより販売）が同じ動物に与えられたときに遭遇するワクチン干渉の問題を克服する。
【０１１３】
２つの家禽病原体、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）からの抗原性ドナー材料をシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）ベクター内に挿入した組換えウイルスコンストラクトを作った［ＵＳ８，９３２，６０４  Ｂ２、ＷＯ２０１３／０５７，２３５およびＷＯ２０１６／１０２６４７も参照されたい。これら全ての内容は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる］。ドナー材料は、ＩＬＴＶのＮＶＳＬ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ株Ｌｏｔ  ＃８３−２からの糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）および糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）の完全長遺伝子、これにプラスして糖タンパク質Ｅからの部分的コーディング領域（アミノ酸１〜１０１）およびＯＲＦ５（アミノ酸７３４〜９８５）をコードする３．５６３ｋｂのＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片［位置１０５３２〜１４０９４；Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １２：１０４−１１６（１９９６）：Ａｃｃ．＃Ｕ２８８３２］；ならびにＩＢＤＶ、Ｆａｒａｇｈｅｒ、Ｆ５２／７０型株のウイルスタンパク質２（ｖｐ２）遺伝子のコーディング領域からなる発現カセットを包含し、これらは真核生物またはウイルスのプロモーターにより駆動され、また後ろに転写終結配列を持つ。本実施形態において、ＶＰ２発現を駆動するプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ＡＤ１６９株の最初期（ＩＥ）遺伝子からの、ニワトリベータ−アクチン（ｃβ−ａｃｔ）遺伝子からの、またはマウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）株ＡＴＣＣ  ＶＲ−１９４のＩＥ遺伝子からのものであり得る。転写終結配列およびポリアデニル化配列は、ヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子からの、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）の糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）遺伝子からの、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ＡＤ１６９株の最初期（ＩＥ）遺伝子からの、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）からのものであり得る。ドナー材料は、ＨＶＴベクター中の２つの非必須部位であるＵＳ２部位［位置１４０５４０／１４０５４１、Ａｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５（２）：９７１−９７８（２００１）；Ａｃｃ．  ＃ＡＦ２９１８６６、アミノ酸残基１２４から１２５の間］もしくはＵＬ５４．５部位［位置１１１２４０／１１１２４１、上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．  ＃ＡＦ２９１８６６、アミノ酸残基２１から２２の間］のうちの１つに、または１つのインサートが各部位の中に挿入され得る。
【０１１４】
遺伝的および表現型の安定性は、任意の新たな組換えウイルスワクチン候補の安全性ならびに比較的強い抗原発現および／または有効性プロファイルの主要な要素である。ＨＶＴ骨格内に挿入されたＩＢＤＶおよびＩＬＴＶ発現カセットは、ウイルスの複製のために本来的に必要ではなく、それゆえ組織培養継代におけるウイルスストックの増幅の際の変異が原因で失われ得る。満足なワクチン候補は、外来遺伝子インサートの発現を失うように容易に変異してはならない。ワクチン候補は、組織培養における１０回以上の継代の後、少なくとも９０％のウイルスプラークが挿入された外来抗原性タンパク質を発現することを実証することができる場合には安定であると考えられる。
【０１１５】
実施例２
組換えＨＶＴ／ＩＬＴＶ／ＩＢＤＶウイルスベクターの構築
この方法によってヘルペスウイルスを作成することができることは、以前に仮性狂犬病ウイルスについて実証されている［ｖａｎ  Ｚｉｊｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６２：２１９１−２１９５（１９８８）］。その後に続いて、この手法を使って組換えＨＶＴベクターが構築され［Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３を参照されたい。この文献は、組換えＨＶＴベクターの構築に関して開示された方法論について、参照により本明細書中に組み込まれる］、これを用いて本発明の組換えＨＶＴ／ＩＬＴＶ／ＩＢＤＶベクターが構築された。この方法において、ＨＶＴの全ゲノムは、標準的な組換えＤＮＡ技術を利用して構築されたいくつかの大きなオーバーラップするサブゲノム断片として、細菌ベクター内にクローニングされる［Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）］。ＨＶＴ株ＦＣ１２６コスミドライブラリーは、コスミドベクターｐＷＥ１５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、現在はＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．）内にクローニングされた剪断ウイルスＤＮＡに由来するものであった。加えて、いくつかの大きなゲノムＤＮＡ断片を酵素ＢａｍＨＩでの制限消化により分離し、ｐＷＥ１５またはプラスミドベクターｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）のいずれかの中にクローニングした。Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３中に記載されるように、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）へのこれらの断片のコトランスフェクションは、オーバーラップする断片の領域を横断する相同的組換えにより媒介されるＨＶＴゲノムの再生をもたらす。コトランスフェクションの前に挿入物が１以上のサブゲノム断片の中に入るように直接操作される場合、この手法は挿入物を含有するウイルスを高頻度にもたらす。５個のオーバーラップするサブゲノムクローンがＨＶＴ／ＦＣ１２６ＨＶＴを作成するために必要であり、全てのＨＶＴ／ＩＬＴＶ／ＩＢＤＶ組換えウイルスを作るための基礎として働いた。
【０１１６】
ＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  １３８６−１３４．１−２の構築：［図２中に表現される１３８６−１３４を参照されたい］
ＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  １３８６−１３４．１−２のコスミド再建は、本質的にＵ．Ｓ．５，８５３，７３３［例えばＵ．Ｓ．５，８５３，７３３の図８；本明細書の図１中に少なくとも部分的に再描写］中に記載されるように実施した。ＦＣ１２６  ＨＶＴゲノムのＵＳ領域内への組込みを可能にするため、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３中でコスミドｎｒ．３７８−５０によりカバーされる領域を、ここでは３つのより小さいプラスミド：ｐＳＹ６４０および５５６−６０．６、ならびにこれら２つとオーバーラップしていて、ＵＳ２遺伝子座内にＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ発現カセットを含有する１つのトランスファープラスミド（２２８５０９−ＩＬＴ−４３５Ｖｅｃ６）から用意した。７個の直線化されたコンストラクトのセット：３個のコスミドおよび４個のプラスミドを全て一緒にＣＥＦ内に、標準的なＣａＣｌ２トランスフェクションプロトコールを用いてトランスフェクトし、得られたウイルスストックを２回プラーク精製した。
【０１１７】
ＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  １３８６−４８．１．１．１の構築：［図２中に表現される１３８６−４８を参照されたい］
ＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  １３８６−４８．１．１．１のコスミド再建は、本質的にＵ．Ｓ．５，８５３，７３３［例えばＵ．Ｓ．５，８５３，７３３の図８；本明細書の図１中に少なくとも部分的に再描写］中に記載されるように実施した。ＦＣ１２６  ＨＶＴゲノムのＵＳ領域内への組込みを可能にするため、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３中でコスミドｎｒ．３７８−５０によりカバーされる領域を、ここでは３つのより小さいプラスミド：ｐＳＹ６４０および５５６−６０．６、ならびにこれら２つとオーバーラップしていて、ＵＳ２遺伝子座内にＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ発現カセットを含有する１つのトランスファープラスミド（１３３３−８５．Ｂ６）から用意した。７個の直線化されたコンストラクトのセット：３個のコスミドおよび４個のプラスミドを全て一緒にＣＥＦ内に、標準的なＣａＣｌ２トランスフェクションプロトコールを用いてトランスフェクトし、得られたウイルスストックを２回プラーク精製した。
【０１１８】
ＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  １３８６−４８．３．１．７の構築：［図２中に表現される１３８６−４８を参照されたい］
ＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  １３８６−４８．３．１．７のコスミド再建は、本質的にＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８５３，７３３［例えばＵ．Ｓ．５，８５３，７３３の図８；本明細書の図１中に少なくとも部分的に再描写］中に記載されるように実施した。ＦＣ１２６  ＨＶＴゲノムのＵＳ領域内への組込みを可能にするため、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３中でコスミドｎｒ．３７８−５０によりカバーされる領域を、ここでは３つのより小さいプラスミド：ｐＳＹ６４０および５５６−６０．６、ならびにこれら２つとオーバーラップしていて、ＵＳ２遺伝子座内にＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ発現カセットを含有する１つのトランスファープラスミド（１３８６−０４．４＃１）から用意した。７個の直線化されたコンストラクトのセット：３個のコスミドおよび４個のプラスミドを全て一緒にＣＥＦ内に、標準的なＣａＣｌ２トランスフェクションプロトコールを用いてトランスフェクトし、得られたウイルスストックを２回プラーク精製した。
【０１１９】
ＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  ４８４の構築：［図２中に表現される１３８６−４８４を参照されたい］
ＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  ４８４のコスミド再建は、本質的にＵ．Ｓ．５，８５３，７３３［例えばＵ．Ｓ．５，８５３，７３３の図８；本明細書の図１中に少なくとも部分的に再描写］中に記載されるように実施した。ＦＣ１２６  ＨＶＴゲノムのＵＬ５４．５領域内への組込みを可能にするため、Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３中でコスミドｎｒ．４０７−３２．１Ｃ１によりカバーされる領域を、ここでは３つのより小さいプラスミド：６７２−０１．Ａ４０および６７２−０７．Ｃ４０、ならびにこれら２つとオーバーラップしていて、ＵＬ５４．５遺伝子座内にＩＢＤＶ／ＩＬＴＶ発現カセットを含有する１つのトランスファープラスミド（４８４−１０５０−２６４１−１０８５９）から用意した。７個の直線化されたコンストラクトのセット：４個のコスミドおよび３個のプラスミドを全て一緒にＣＥＦ内に、標準的なＣａＣｌ２トランスフェクションプロトコールを用いてトランスフェクトし、得られたウイルスストックを２回プラーク精製した。
【０１２０】
ＦＣ１２６  ＨＶＴを作成するためのサブゲノム断片の説明：
サブゲノムクローン４０７−３２．２Ｃ３
コスミド４０７−３２．２Ｃ３は、およそ４０，１７０塩基対のゲノムＨＶＴ  ＤＮＡ領域［左側の末端−位置３９，７５４；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。この領域は、ＨＶＴ  ＢａｍＨＩ断片Ｆ’、Ｌ、Ｐ、Ｎ１、Ｅ、Ｄ、および断片Ｂのうちの２，０９２塩基対を包含する。
【０１２１】
サブゲノムクローン１７２−０７．ＢＡ２
プラスミド１７２−０７．ＢＡ２は、２５，９３１塩基対のゲノムＨＶＴ  ＤＮＡ領域を含有する。これは、ＨＶＴ  ＢａｍＨＩ  Ｂ断片［位置３７，６６３から６３，５９３；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］をプラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）内にクローニングすることにより構築した。
【０１２２】
サブゲノムクローン４０７−３２．５Ｇ６
コスミド４０７−３２．５Ｇ６は、３９，４０４塩基対のゲノムＨＶＴ  ＤＮＡ領域［位置６１，８５２〜１０１，２５５；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。この領域は、ＨＶＴ  ＢａｍＨＩ断片Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｋ１、Ｍ、Ｋ２、これにプラスして断片Ｂのうちの１，７４２塩基対および断片Ｊのうちの３，８８０塩基対を包含する。
【０１２３】
サブゲノムクローン４０７−３１．１Ｃ１
コスミド４０７−３１．１Ｃ１は、３７，４４４塩基対のゲノムＨＶＴ  ＤＮＡ領域［位置９６，０９５〜１３３，５３８；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。この領域は、ＨＶＴ  ＢａｍＨＩ断片Ｊ、Ｇ、Ｉ、Ｆ、Ｏ、これにプラスして断片Ｋ２のうちの１，２８１塩基対および断片Ａのうちの６，６９１塩基対を包含する。
【０１２４】
サブゲノムクローン３７８−５０
コスミド３７８−５０は、２８，８９７塩基対のゲノムＨＶＴ  ＤＮＡ領域［Ｕ．Ｓ．５，８５３，７３３の図８を参照されたい；本明細書の図１中に少なくとも部分的に再描写］を含有する。この領域は、ＨＶＴ  ＢａｍＨＩ断片Ａを包含する。これは、ＨＶＴ  ＢａｍＨＩ  Ａ断片［位置１２６，８４８〜１５５，７４４；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］をコスミドｐＷＥ１５内にクローニングすることにより構築した。
【０１２５】
ＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  １３８６−１３４．１−２を作成するための付加的な挿入断片：
サブゲノムクローン２２８０５９−ＩＬＴ−４３５Ｖｅｃ６
挿入プラスミド２２８０５９−ＩＬＴ−４３５Ｖｅｃ６は、プラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ．）内にクローニングされた７３１１塩基対のＨＶＴユニークショート領域ＥｃｏＲＩ断片［位置１２６８８０−１４４１９０；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。ＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子内の固有のＳｔｕＩ部位［位置１４０５４０／１４０５４１；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６、アミノ酸残基１２４と１２５の間］に挿入されるのは、２つのエレメント：ｍＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＩＢＤＶの古典型Ｆ５２／７０、Ｆａｒａｇｈｅｒ株のウイルスタンパク質２遺伝子（ＶＰ２）およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルからなる発現カセット、その後に糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）および糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）の完全長遺伝子、これにプラスして糖タンパク質Ｅからの部分的コーディング領域（アミノ酸１〜１０１）およびＯＲＦ５（アミノ酸７３４〜９８５）をコードするＩＬＴＶのＮＶＳＬ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ株Ｌｏｔ  ＃８３−２からの３５６３塩基対のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片［位置１０５３２〜１４０９４；Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １２：１０４−１１６（１９９６）：Ａｃｃ．＃Ｕ２８８３２］である。ＩＢＤＶ  ＶＰ２、ＩＬＴＶ  ｇＤおよびＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子は、ＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子に対して逆向きに転写される。
【０１２６】
サブゲノムクローンｐＳＹ６４０
プラスミドｐＳＹ６４０は、ＢａｍＨＩ  断片Ａに由来するおよそ１３，６００塩基対のゲノムＨＶＴ  ＤＮＡ領域（位置１２６８４８〜１４０５４０；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。このプラスミドを作成するため、ＵＳ２遺伝子の上流に位置し、ＵＳ２遺伝子内に位置するＳｔｕＩ部位から始まってＢａｍＨＩ  Ａ断片の末端まで続くＤＮＡ領域を、プラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ．）内にクローニングした。
【０１２７】
サブゲノムクローン５５６−６０．６
プラスミド５５６−６０．６は、ＢａｍＨＩ  断片Ａに由来するおよそ１２，５００塩基対のゲノムＨＶＴ  ＤＮＡ領域（おおよその位置１４３３００〜１５５７４４；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。このプラスミドを作成するため、ＵＳ２遺伝子の下流に位置するＤＮＡ領域（ＵＳ２遺伝子内に位置するＳｔｕＩ部位から始まってＢａｍＨＩ  Ａ断片の末端まで続く）をｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ．）内にクローニングし、次いでエンドヌクレアーゼで処理することでＳｔｕＩ部位から約１５０ｂｐを「チューバック（ｃｈｅｗ  ｂａｃｋ）」し、ｐＢＲ３２２プラスミドベクター内に再クローニングした。
【０１２８】
ＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  １３８６−４８．１．１．１を作成するための付加的な挿入断片：
サブゲノムクローン１３３３−８５．Ｂ６
挿入プラスミド１３３３−８５．Ｂ６は、プラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ．）内にクローニングされた７３１１塩基対のＨＶＴユニークショート領域ＥｃｏＲＩ断片［位置１２６８８０〜１４４１９０；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。ＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子内の固有のＳｔｕＩ部位［位置１４０５４０／１４０５４１；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６、アミノ酸残基１２４と１２５の間］に挿入されるのは、２つのエレメント：糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）および糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）の完全長遺伝子、これにプラスして糖タンパク質Ｅからの部分的コーディング領域（アミノ酸１〜１０１）およびＯＲＦ５（アミノ酸７３４〜９８５）をコードするＩＬＴＶのＮＶＳＬ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ株Ｌｏｔ  ＃８３−２からの３５６３塩基対のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片［位置１０５３２〜１４０９４；Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １２：１０４−１１６（１９９６）；Ａｃｃ．＃Ｕ２８８３２］、ならびにニワトリβ−アクチンプロモーター、ＩＢＤＶの古典型Ｆ５２／７０、Ｆａｒａｇｈｅｒ株のウイルスタンパク質２遺伝子（ＶＰ２）およびネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）糖タンパク質Ｂ遺伝子からのポリアデニル化シグナルからなる発現カセットである。ＩＬＴＶ  ｇＤ、ＩＬＴＶ  ｇＩおよびＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は、ＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子に対して逆向きに転写される。
【０１２９】
サブゲノムクローンｐＳＹ６４０
プラスミドｐＳＹ６４０は、ＢａｍＨＩ  断片Ａに由来するおよそ１３，６００塩基対のゲノムＨＶＴ  ＤＮＡ領域（位置１２６８４８〜１４０５４０；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。このプラスミドを作成するため、ＵＳ２遺伝子の上流に位置し、ＵＳ２遺伝子内に位置するＳｔｕＩ部位から始まってＢａｍＨＩ  Ａ断片の末端まで続くＤＮＡ領域を、プラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ．）内にクローニングした。
【０１３０】
サブゲノムクローン５５６−６０．６
プラスミド５５６−６０．６は、ＢａｍＨＩ  断片Ａに由来するおよそ１２，５００塩基対のゲノムＨＶＴ  ＤＮＡ領域（おおよその位置１４３３００〜１５５７４４；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。このプラスミドを作成するため、ＵＳ２遺伝子の下流に位置するＤＮＡ領域（ＵＳ２遺伝子内に位置するＳｔｕＩ部位から始まってＢａｍＨＩ  Ａ断片の末端まで続く）をｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ．）内にクローニングし、次いでエンドヌクレアーゼで処理することでＳｔｕＩ部位から約１５０ｂｐを「チューバック（ｃｈｅｗ  ｂａｃｋ）」し、ｐＢＲ３２２プラスミドベクター内に再クローニングした。
【０１３１】
ＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  １３８６−４８．３．１．７を作成するための付加的な挿入断片：
サブゲノムクローン１３８６−０４．４＃１
挿入プラスミド１３８６−０４．４＃１は、プラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ．）内にクローニングされた７３１１塩基対のＨＶＴユニークショート領域ＥｃｏＲＩ断片［位置１２６８８０〜１４４１９０；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。ＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子内の固有のＳｔｕＩ部位［位置１４０５４０／１４０５４１；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６、アミノ酸残基１２４と１２５の間］に挿入されるのは、２つのエレメント：糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）および糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）の完全長遺伝子、これにプラスして糖タンパク質Ｅからの部分的コーディング領域（アミノ酸１〜１０１）およびＯＲＦ５（アミノ酸７３４〜９８５）をコードするＩＬＴＶのＮＶＳＬ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ株Ｌｏｔ  ＃８３−２からの３５６３塩基対のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片［位置１０５３２〜１４０９４；Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １２：１０４−１１６（１９９６）；Ａｃｃ．＃Ｕ２８８３２］、ならびに、ｈＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＩＢＤＶの古典型Ｆ５２／７０、Ｆａｒａｇｈｅｒ株のウイルスタンパク質２遺伝子（ＶＰ２）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ遺伝子からのポリアデニル化シグナルからなる発現カセットである。ＩＬＴＶ  ｇＤ、ＩＬＴＶ  ｇＩおよびＩＢＤＶ  ＶＰ２遺伝子は、ＨＶＴ  ＵＳ２遺伝子に対して逆向きに転写される。
【０１３２】
サブゲノムクローンｐＳＹ６４０
プラスミドｐＳＹ６４０は、ＢａｍＨＩ  断片Ａに由来するおよそ１３，６００塩基対のゲノムＨＶＴ  ＤＮＡ領域（位置１２６８４８〜１４０５４０；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。このプラスミドを作成するため、ＵＳ２遺伝子の上流に位置し、ＵＳ２遺伝子内に位置するＳｔｕＩ部位から始まってＢａｍＨＩ  Ａ断片の末端まで続くＤＮＡ領域を、プラスミドｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ．）内にクローニングした。
【０１３３】
サブゲノムクローン５５６−６０．６
プラスミド５５６−６０．６は、ＢａｍＨＩ  断片Ａに由来するおよそ１２，５００塩基対のゲノムＨＶＴ  ＤＮＡ領域（おおよその位置１４３３００〜１５５７４４；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。このプラスミドを作成するため、ＵＳ２遺伝子の下流に位置するＤＮＡ領域（ＵＳ２遺伝子内に位置するＳｔｕＩ部位から始まってＢａｍＨＩ  Ａ断片の末端まで続く）をｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ．）内にクローニングし、次いでエンドヌクレアーゼで処理することでＳｔｕＩ部位から約１５０ｂｐを「チューバック（ｃｈｅｗ  ｂａｃｋ）」し、ｐＢＲ３２２プラスミドベクター内に再クローニングした。
【０１３４】
ＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  ４８４を作成するための付加的な挿入断片：
サブゲノムクローン４８４−１０５０−２６４１−１０８５９
挿入プラスミド４８４−１０５０−２６４１−１０８５９は、プラスミドｐＮＥＢ１９３の誘導体（ＡａｔＩＩ−ＰｖｕＩＩを欠失）内にクローニングされた８６３６塩基対のゲノムＨＶＴユニークロング領域［位置１０９４８９〜１１８１２４；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。これはＡｓｃＩ部位に隣接しており、ＨＶＴ  ＢａｍＨＩ断片Ｉ、Ｓ、これにプラスして断片Ｇのうちの１３３７塩基対および断片Ｆのうちの１１７７塩基対を包含する。ＨＶＴ  ＵＬ５４．５オープンリーディングフレーム内のＸｈｏＩ部位［位置１１１２４０／１１１２４１；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６、アミノ酸残基２１と２２の間］に挿入されるのは、２つのエレメント：ｍＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＩＢＤＶの古典型Ｆ５２／７０、Ｆａｒａｇｈｅｒ株のウイルスタンパク質２遺伝子（ＶＰ２）およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルからなる発現カセット、その後に糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）および糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）の完全長遺伝子、これにプラスして糖タンパク質Ｅからの部分的コーディング領域（アミノ酸１〜１０１）およびＯＲＦ５（アミノ酸７３４〜９８５）をコードするＩＬＴＶのＮＶＳＬ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ株Ｌｏｔ  ＃８３−２からの３５６３塩基対のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片［位置１０５３２〜１４０９４；Ｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １２：１０４−１１６（１９９６）：Ａｃｃ．＃Ｕ２８８３２］である。ＩＢＤＶ  ＶＰ２、ＩＬＴＶ  ｇＤおよびＩＬＴＶ  ｇＩ遺伝子は、ＨＶＴ  ＵＬ５４．５遺伝子に対して逆向きに転写される。
【０１３５】
サブゲノムクローン６７２−０１．Ａ４０
プラスミド６７２−０１．Ａ４０は、プラスミドｐＮＥＢ１９３の誘導体内にクローニングされた、ユニークロング領域由来の１４，７３１塩基対のゲノムＨＶＴ  ＤＮＡ領域［位置９６０９５〜１１０８２５；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。この領域は、ＨＶＴ  ＢａｍＨＩ断片Ｇ、Ｊ、およびＫ２のうちの１２８１塩基対を包含する。
【０１３６】
サブゲノムクローン６７２−０７．Ｃ４０
プラスミド６７２−０７．Ｃ４０は、プラスミドｐＮＥＢ１９３の誘導体内にクローニングされた、ユニークロング領域由来の１２，５２０塩基対のゲノムＨＶＴ  ＤＮＡ領域［位置１１６９４８〜１２９４６７；上のＡｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｃｃ．＃ＡＦ２９１８６６］を含有する。この領域は、ＨＶＴ  ＢａｍＨＩ断片Ｆ、Ｏ、およびＡのうちの２６２０塩基対を包含する。
【０１３７】
標準的なＣａＣｌ２トランスフェクションプロトコール：
２代目のＣＥＦを６ウェル培養プレート上に播種し、３８℃、５％  ＣＯ２で２４時間インキュベートし、コンフルエントな単層を形成させる。各ウェルについて総量０．５μｇ  ＤＮＡのコスミドおよびプラスミドをＨｅｐｅｓバッファー中で混合し、沈殿が今にも生じそうになるまで１２５ｍＭ  ＣａＣｌ２を滴下して加えた。この混合物をＣＥＦ細胞単層に加え、２から３時間インキュベートした。上清を除去し、１５％グリセロールの上層を加え、細胞上で１分間維持した。次いでこれを除去し、ＰＢＳで洗浄し、新鮮な培地を加え、細胞を５日間インキュベートした。次に細胞をトリプシン処理により回収し、個々のプレートからの細胞を１０ｃｍプレート内のＣＥＦ細胞の新鮮な単層上に各々播種し、５０〜９０％  ＣＰＥを達成するまでインキュベートした。次に増幅されたトランスフェクト細胞をトリプシン処理により回収し、１０−２から１０−４の希釈物を、ＣＥＦ単層を有する１０ｃｍプレート上に播いてインキュベートした。翌日、プレートを寒天で覆い、ＨＶＴ／ＩＬＴＶ／ＩＢＤＶの多数の個々のプラークを分離してＣＥＦ上で増幅した。１０ｃｍプレート上のコンフルエントなＣＥＦ単層に１０−２から１０−４に希釈した１回目の精製ストックを感染させて細胞をインキュベートすることによって、各ウイルスストックの２回目のプラーク精製を行った。翌日、プレートを寒天で覆い、ＨＶＴ／ＩＬＴＶ／ＩＢＤＶの多数の個々のプラークを分離してＣＥＦ上で増幅した。
【０１３８】
実施例３
組換えＨＶＴ／ＩＬＴＶ／ＩＢＤＶウイルスストックは、組織培養における連続継代の後、ＩＬＴおよびＩＢＤＶタンパク質の発現について表現型的に安定である
３つのコンストラクト、ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴ  １３８６−１３４．１−２を含む１つ目のもの、ＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  １３８６−４８．１．１．１を含む第二のもの、およびＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  １３８６−４８．３．１．７を含む第三のものを２代目のＣＥＦ細胞上で１４回より多く連続継代し、挿入されたＩＬＴＶおよびＩＢＤＶ遺伝子の発現を免疫蛍光アッセイにおいて評価した。ＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  ４８４．１−１Ａ３Ａ３と称する第四のコンストラクトを２代目のＣＥＦ細胞上で１５回より多く連続継代し、挿入されたＩＬＴＶおよびＩＢＤＶ遺伝子の発現を免疫蛍光アッセイにおいて評価した［下の表１および２を参照されたい］。
【０１３９】
組織培養継代ストックの作成：
各組織培養継代のため、１０ｃｍディッシュ上に播種されたコンフルエントな２代目のＣＥＦ単層に５０〜１００μＬのウイルスストックを接種し、次いで３８℃、５％  ＣＯ２で２〜５日間、ＣＰＥが明らかになるまでインキュベートした。次に細胞をトリプシン処理により回収し、継代数１（Ｐ１）とした。このプロセスを繰り返してさらなる継代ストック（Ｐ２〜Ｐ１５）を調製した。
【０１４０】
表現型安定性の分析：
６ウェルプレートに２代目のＣＥＦ単層をまいた。この細胞に様々な継代レベル：Ｐ０〜Ｐ１５で回収したウイルスストックを、または希釈剤のみを接種した。カウント可能な数のプラーク／ウェルを達成するためにプレートに複数の希釈で接種し、３８℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。５日間のインキュベーション後、上清をデカントし、ＣＥＦ単層を１００％メタノールで１０〜１５分間、１５〜３０℃で固定した。メタノールをデカントし、細胞を風乾させた後、ＩＬＴＶ  ｇＤ（ＭＡＢ  ＃６）、ＩＬＴＶ  ｇＩ（ポリクローナルウサギ抗ｇＩ）およびＩＢＤＶ  ＶＰ２（ＭＣＡ  ＧＤＶ−Ｒ６３）一次抗体で染色した。２時間のブロッキングステップの後、（ＰＢＳ中５％の無脂肪乾燥乳）、２ｍＬ／ウェルをディッシュに加え、振動プラットフォーム上で１５〜３０℃でインキュベートし、一次抗体を適宜希釈し、２ｍＬ／ウェルで加え、次いで１５〜３０℃で３時間、振動プラットフォーム上でインキュベートした。抗体インキュベーション後、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。ＦＩＴＣ標識した二次抗体溶液（ウサギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ）を１：１００に調製し、各ウェルに２ｍＬを加えた。プレートを１時間、１５〜３０℃で、振動プラットフォーム上でインキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、蛍光視野下で調べた。ＩＬＴ抗体で染色されたプラークを蛍光陽性（＋）または陰性（−）について観察した。ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質に対する一次抗体で染色された蛍光プラークをカウントした。プレートを次いで光学顕微鏡下で調べ、プラークを再度カウントした。各継代レベルにおける蛍光プラークのパーセンテージは下の表１および２中に提供され、並びに、ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質発現およびベクター安定性の定性的な決定も提供する。
【０１４１】
表１
組織培養における継代後の発現の安定性
【表２】
2019517804.tif 000004
【０１４２】
表２
挿入プラスミドの説明／ベクター特性
【表３】
2019517804.tif 000005
【０１４３】
実施例４
組換えＨＶＴ／ＩＬＴＶ／ＩＢＤＶウイルスストックは、トリへのワクチン接種およびトリからの回収の後、ＩＬＴおよびＩＢＤＶタンパク質の発現について表現型的に安定である
３つのコンストラクト、ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴ  １３８６−１３４．１−２を含む１つ目のもの、ＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  １３８６−４８．３．１．７を含む別のもの、およびＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  ４８４．１−１Ａ３Ａ３を含む第三のものを用いて、３群の１５日齢のニワトリに皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｔｉｏｕｓ）経路により接種した。第４の群のトリに希釈剤のみをワクチン接種して、陰性対照群として機能させた。脾臓試料を接種７日後に採取し、ニワトリ胚線維芽細胞上でのウイルス分離のために処理した。接種細胞を２回継代して存在する何らかのウイルスを増やした。細胞変性効果がはっきりと視認できたとき、単層を回収してストックを凍結した。これらのストックを用いて２代目のＣＥＦに接種し、プラークをＩＬＴＶ  ｇＤ、ＩＬＴＶ  ｇＩおよびＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質の発現について、各タンパク質に特異的な抗体を使用した免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）により分析した。
【０１４４】
表現型安定性の分析：
６ウェルプレートに２代目のＣＥＦ単層をまいた。この細胞に、回収したウイルス分離ストックまたは希釈剤のみを接種した。カウント可能な数のプラーク／ウェルを達成するためにプレートに複数の希釈で接種し、３８℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。５日間のインキュベーション後、上清をデカントし、ＣＥＦ単層を１００％メタノールで１０〜１５分間、１５〜３０℃で固定した。メタノールをデカントし、細胞を風乾させた後、ＩＬＴＶ  ｇＤ（ＭＡＢ  ＃６）、ＩＬＴＶ  ｇＩ（ポリクローナルウサギ抗ｇＩ）およびＩＢＤＶ  ＶＰ２（ＭＣＡ  ＧＤＶ−Ｒ６３）一次抗体で染色した。２時間のブロッキングステップの後、（ＰＢＳ中５％の無脂肪乾燥乳）、２ｍＬ／ウェルをディッシュに加え、振動プラットフォーム上で１５〜３０℃でインキュベートし、一次抗体を適宜希釈し、２ｍＬ／ウェルで加え、次いで１５〜３０℃で３時間、振動プラットフォーム上でインキュベートした。抗体インキュベーション後、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。ＦＩＴＣ標識した二次抗体溶液（ウサギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ）を１：１００に調製し、各ウェルに２ｍＬを加えた。プレートを、１時間１５〜３０℃で、振動プラットフォーム上でインキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、蛍光視野下で調べた。ＩＬＴＶ抗体で染色されたプラークを蛍光陽性（＋）または陰性（−）について観察した。ＩＢＤＶ  ＶＰ２タンパク質に対する一次抗体で染色された蛍光プラークをカウントした。プレートを次いで光学顕微鏡下で調べ、プラークを再度カウントした。各継代レベルにおける蛍光プラークのパーセンテージは下の表３Ａ中に提供される。この試験を、ウイルスが接種２週後に回収された場合を除いて本質的に繰り返した（下の表３Ｂを参照されたい）。
【０１４５】
表３Ａ
トリにおける継代後の発現の安定性
【表４】
2019517804.tif 000006
【０１４６】
表３Ｂ
接種２週後に回収されたウイルス
【表５】
2019517804.tif 000007
【０１４７】
実施例５
不成功のコンストラクト
組換えベクターワクチンウイルスは、定義によると外来遺伝子を保有して発現するように操作される。これらの外来（ｆｏｒｅｇｉｎ）遺伝子の転写および発現が親ウイルスと比べて増殖の不都合を組換えウイルスに提供するならば、これらの遺伝子がワクチン生産の際に失われることがあり得る。この理由のため、ワクチン候補は、遺伝的および表現型的の両方の安定性について試験されなければならない。
【０１４８】
加えて、用いられる防御判断基準は、ＵＳＤＡにより制定され、連邦規則集タイトル９パート１１３（９ＣＦＲ  １１３）《Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ》中に成文化されているものである。生きたウイルスワクチンは承認を得るために、疾患に関連した臨床徴候または病変から、ＮＤＶ、ＩＢＤＶおよびＩＬＴＶの場合は少なくとも９０％の防御を、ＭＤＶの場合は少なくとも８０％の防御を提供しなければならない。
【０１４９】
ウイルスコンストラクトの遺伝的安定性は、組織培養における規定される継代回数後の最も高い予測ワクチン生産レベルをサザンブロット解析によって決定し、元の分離株からのＤＮＡと比較した。ウイルスストックから抽出されたＤＮＡを制限酵素で消化し、メンブレンにトランスファーし、挿入された外来（ｆｏｒｉｅｇｎ）遺伝子の存在を検出するように設計されたプローブとハイブリダイズする。遺伝的安定性はまた、ＰＣＲ解析によっても決定され得る。外来ＤＮＡの内部にあるまたはこれと隣接するＤＮＡにアニールするように設計されたＰＣＲプライマーを用いて、サイズが知られている断片を、組織培養における継代の前後両方のウイルスＤＮＡ鋳型から増幅することができる。
【０１５０】
ウイルスコンストラクトの表現型安定性は、これらの挿入された外来遺伝子のタンパク質産物に対する抗体を使用した個々のウイルスプラークの免疫染色によって決定した。これらの組換えワクチンにより提供される防御は、動物の免疫系を刺激するため、これらのタンパク質産物の発現に依拠する。大半の場合、外来タンパク質発現について陽性に染色されるウイルスのパーセントが９０％未満に低下したら、これは組織培養において増殖するウイルスの能力にとっておそらく有害であり、それゆえワクチン候補として不適であった。
【０１５１】
下の表４Ａおよび４Ｂから容易に明らかであるように、大半のｒＭＤＶｎｐコンストラクトはこれら２つの判断基準、すなわち比較的強い抗原発現および／または有効性を伴った安定性（ｓｔａｂｉｌｔｙ）を満たさない。表４Ａは、複数の異種インサートを有し、異種インサートのうちの１つがＩＢＤＶ抗原をコードする一連の組換えＨＶＴコンストラクトを提供する。結果が示すように、表４Ａ中のコンストラクトの全てが比較的強い抗原発現および／または有効性を伴った安定性の判断基準を満たすことができなかった。
【０１５２】
表４Ａ
二重の組換えＨＶＴおよびＩＢＤＶウイルスコンストラクト：
【表６】
2019517804.tif 000008
【０１５３】
下の表４Ｂは、各々複数の異種インサートを含み、異種インサートのうちの少なくとも１つがＮＤＶまたはＩＬＴＶのいずれかの抗原をコードする一連の１１個の組換えＨＶＴコンストラクトおよびただ１つのＮＡＨＶコンストラクトを提供する１。結果が示すように、表４Ｂ中のコンストラクトの全てが比較的強い抗原発現および／または有効性を伴った安定性の判断基準を満たすことができなかった。
【０１５４】
脚注
１  表４Ｂ中のデータは、Ｕ．Ｓ．８，９３２，６０４  Ｂ２の審査の際に本出願の共同発明者の１名により署名された宣誓書において米国特許庁に提出された。
【０１５５】
表４Ｂ
二重の組換えＨＶＴおよびＮＡＨＶウイルスコンストラクト：
【表７】
2019517804.tif 000009
【０１５６】
実施例６
配列
以下の配列が例示的なｒＨＶＴコンストラクトにおいて用いられている。下に提供されるコード配列は個々の終止コドンを包含し、これは、コーディング配列がコードしているタンパク質抗原の特性を改変することなく代わりの終止コドンで容易に置き換えることができる。
【０１５７】
配列番号１：ＩＬＴＶ  ｇＤ糖タンパク質（１１３４ｂｐ）
ａｔｇｇａｃｃｇｃｃａｔｔｔａｔｔｔｔｔｇａｇｇａａｔｇｃｔｔｔｔｔｇｇａｃｔａｔｃｇｔａｃｔｇｃｔｔｔｃｔｔｃｃｔｔｃｇｃｔａｇｃｃａｇａｇｃａｃｃｇｃｃｇｃｃｇｔｃａｃｇｔａｃｇａｃｔａｃａｔｔｔｔａｇｇｃｃｇｔｃｇｃｇｃｇｃｔｃｇａｃｇｃｇｃｔａａｃｃａｔａｃｃｇｇｃｇｇｔｔｇｇｃｃｃｇｔａｔａａｃａｇａｔａｃｃｔｃａｃｔａｇｇｇｔａｔｃａａｇａｇｇｃｔｇｃｇａｃｇｔｔｇｔｃｇａｇｃｔｃａａｃｃｃｇａｔｔｔｃｔａａｃｇｔｇｇａｃｇａｃａｔｇａｔａｔｃｇｇｃｇｇｃｃａａａｇａａａａａｇａｇａａｇｇｇｇｇｇｃｃｃｔｔｔｃｇａｇｇｃｃｔｃｃｇｔｃｇｔｃｔｇｇｔｔｃｔａｃｇｔｇａｔｔａａｇｇｇｃｇａｃｇａｃｇｇｃｇａｇｇａｃａａｇｔａｃｔｇｔｃｃａａｔｃｔａｔａｇａａａａｇａｇｔａｃａｇｇｇａａｔｇｔｇｇｃｇａｃｇｔａｃａａｃｔｇｃｔａｔｃｔｇａａｔｇｃｇｃｃｇｔｔｃａａｔｃｔｇｃａｃａｇａｔｇｔｇｇｇｃａｇｔｇｇａｃｔａｔｇｔｔｃｃｔａｇｃａｃｃｃｔｔｇｔａｔｃｇｃｇａａａｔｇｇｃｇｃｇｇｇａｃｔｇａｃｔａｔａｔｔｃｔｃｃｃｃｃａｃｔｇｃｔｇｃｇｃｔｃｔｃｔｇｇｃｃａａｔａｃｔｔｇｃｔｇａｃｃｃｔｇａａａａｔｃｇｇｇａｇａｔｔｔｇｃｇｃａａａｃａｇｃｔｃｔｃｇｔａａｃｔｃｔａｇａａｇｔｔａａｃｇａｔｃｇｃｔｇｔｔｔａａａｇａｔｃｇｇｇｔｃｇｃａｇｃｔｔａａｃｔｔｔｔｔａｃｃｇｔｃｇａａａｔｇｃｔｇｇａｃａａｃａｇａａｃａｇｔａｔｃａｇａｃｔｇｇａｔｔｔｃａａｇｇｃｇａａｃａｃｃｔｔｔａｔｃｃｇａｔｃｇｃａｇａｃａｃｃａａｔａｃａｃｇａｃａｃｇｃｇｇａｃｇａｃｇｔａｔａｔｃｇｇｇｇａｔａｃｇａａｇａｔａｔｔｃｔｇｃａｇｃｇｃｔｇｇａａｔａａｔｔｔｇｃｔｇａｇｇａａａａａｇａａｔｃｃｔａｇｃｇｃｇｃｃａｇａｃｃｃｔｃｇｔｃｃａｇａｔａｇｃｇｔｃｃｃｇｃａａｇａａａｔｔｃｃｃｇｃｔｇｔａａｃｃａａｇａａａｇｃｇｇａａｇｇｇｃｇｃａｃｃｃｃｇｇａｃｇｃａｇａａａｇｃａｇｃｇａａａａｇａａｇｇｃｃｃｃｔｃｃａｇａａｇａｃｔｃｇｇａｇｇａｃｇａｃａｔｇｃａｇｇｃａｇａｇｇｃｔｔｃｔｇｇａｇａａａａｔｃｃｔｇｃｃｇｃｃｃｔｃｃｃｃｇａａｇａｃｇａｃｇａａｇｔｃｃｃｃｇａｇｇａｃａｃｃｇａｇｃａｃｇａｔｇａｔｃｃａａａｃｔｃｇｇａｔｃｃｔｇａｃｔａｔｔａｃａａｔｇａｃａｔｇｃｃｃｇｃｃｇｔｇａｔｃｃｃｇｇｔｇｇａｇｇａｇａｃｔａｃｔａａａａｇｔｔｃｔａａｔｇｃｃｇｔｃｔｃｃａｔｇｃｃｃａｔａｔｔｃｇｃｇｇｃｇｔｔｃｇｔａｇｃｃｔｇｃｇｃｇｇｔｃｇｃｇｃｔｃｇｔｇｇｇｇｃｔａｃｔｇｇｔｔｔｇｇａｇｃａｔｃｇｔａａａａｔｇｃｇｃｇｃｇｔａｇｃｔａａ
配列番号２：ＩＬＴＶ  ｇＤ糖タンパク質（３７７アミノ酸）
ＭＤＲＨＬＦＬＲＮＡＦＷＴＩＶＬＬＳＳＦＡＳＱＳＴＡＡＶＴＹＤＹＩＬＧＲＲＡＬＤＡＬＴＩＰＡＶＧＰＹＮＲＹＬＴＲＶＳＲＧＣＤＶＶＥＬＮＰＩＳＮＶＤＤＭＩＳＡＡＫＥＫＥＫＧＧＰＦＥＡＳＶＶＷＦＹＶＩＫＧＤＤＧＥＤＫＹＣＰＩＹＲＫＥＹＲＥＣＧＤＶＱＬＬＳＥＣＡＶＱＳＡＱＭＷＡＶＤＹＶＰＳＴＬＶＳＲＮＧＡＧＬＴＩＦＳＰＴＡＡＬＳＧＱＹＬＬＴＬＫＩＧＲＦＡＱＴＡＬＶＴＬＥＶＮＤＲＣＬＫＩＧＳＱＬＮＦＬＰＳＫＣＷＴＴＥＱＹＱＴＧＦＱＧＥＨＬＹＰＩＡＤＴＮＴＲＨＡＤＤＶＹＲＧＹＥＤＩＬＱＲＷＮＮＬＬＲＫＫＮＰＳＡＰＤＰＲＰＤＳＶＰＱＥＩＰＡＶＴＫＫＡＥＧＲＴＰＤＡＥＳＳＥＫＫＡＰＰＥＤＳＥＤＤＭＱＡＥＡＳＧＥＮＰＡＡＬＰＥＤＤＥＶＰＥＤＴＥＨＤＤＰＮＳＤＰＤＹＹＮＤＭＰＡＶＩＰＶＥＥＴＴＫＳＳＮＡＶＳＭＰＩＦＡＡＦＶＡＣＡＶＡＬＶＧＬＬＶＷＳＩＶＫＣＡＲＳ
配列番号３：ＩＬＴＶ  ｇＩ糖タンパク質（１０８９ｂｐ）
Ａｔｇｇｃａｔｃｇｃｔａｃｔｔｇｇａａｃｔｃｔｇｇｃｔｃｔｃｃｔｔｇｃｃｇｃｇａｃｇｃｔｃｇｃａｃｃｃｔｔｃｇｇｃｇｃｇａｔｇｇｇａａｔｃｇｔｇａｔｃａｃｔｇｇａａａｔｃａｃｇｔｃｔｃｃｇｃｃａｇｇａｔｔｇａｃｇａｃｇａｔｃａｃａｔｃｇｔｇａｔｃｇｔｃｇｃｇｃｃｔｃｇｃｃｃｃｇａａｇｃｔａｃａａｔｔｃａａｃｔｇｃａｇｃｔａｔｔｔｔｔｃａｔｇｃｃｔｇｇｃｃａｇａｇａｃｃｃｃａｃａａａｃｃｃｔａｃｔｃａｇｇａａｃｃｇｔｃｃｇｃｇｔｃｇｃｇｔｔｔｃｇｇｔｃｔｇａｔａｔａａｃａａａｃｃａｇｔｇｃｔａｃｃａｇｇａａｃｔｔａｇｃｇａｇｇａｇｃｇｃｔｔｔｇａａａａｔｔｇｃａｃｔｃａｔｃｇａｔｃｇｔｃｔｔｃｔｇｔｔｔｔｔｇｔｃｇｇｃｔｇｔａａａｇｔｇａｃｃｇａｇｔａｃａｃｇｔｔｃｔｃｃｇｃｃｔｃｇａａｃａｇａｃｔａａｃｃｇｇａｃｃｔｃｃａｃａｃｃｃｇｔｔｔａａｇｃｔｃａｃｔａｔａｃｇａａａｔｃｃｔｃｇｔｃｃｇａａｃｇａｃａｇｃｇｇｇａｔｇｔｔｃｔａｃｇｔａａｔｔｇｔｔｃｇｇｃｔａｇａｃｇａｃａｃｃａａａｇａａｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃｔｔｃｇｃｇａｔｃｃａａｃｔａｔｃｇｇｔｇｔａｔｃａａｔｔｃｇｃｇａａｃａｃｃｇｃｃｇｃｇａｃｔｃｇｃｇｇａｃｔｃｔａｔｔｃｃａａｇｇｃｔｔｃｇｔｇｔｃｇｃａｃｃｔｔｃｇｇａｔｔａｃｃｔａｃｃｇｔｃｃａａｃｔｔｇａｇｇｃｃｔａｔｃｔｃａｇｇａｃｃｇａｇｇａａａｇｔｔｇｇｃｇｃａａｃｔｇｇｃａａｇｃｇｔａｃｇｔｔｇｃｃａｃｇｇａｇｇｃｃａｃｇａｃｇａｃｃａｇｃｇｃｃｇａｇｇｃｇａｃａａｃｃｃｃｇａｃｇｃｃｃｇｔｃａｃｔｇｃａａｃｃａｇｃｇｃｃｔｃｃｇａａｃｔｔｇａａｇｃｇｇａａｃａｃｔｔｔａｃｃｔｔｔｃｃｃｔｇｇｃｔａｇａａａａｔｇｇｃｇｔｇｇａｔｃａｔｔａｃｇａａｃｃｇａｃａｃｃｃｇｃａａａｃｇａａａａｔｔｃａａａｃｇｔｔａｃｔｇｔｃｃｇｔｃｔｃｇｇｇａｃａａｔｇａｇｃｃｃｔａｃｇｃｔａａｔｔｇｇｇｇｔａａｃｃｇｔｇｇｃｔｇｃｃｇｔｃｇｔｇａｇｃｇｃａａｃｇａｔｃｇｇｃｃｔｃｇｔｃａｔｔｇｔａａｔｔｔｃｃａｔｃｇｔｃａｃｃａｇａａａｃａｔｇｔｇｃａｃｃｃｃｇｃａｃｃｇａａａａｔｔａｇａｃａｃｇｇｔｃｔｃｇｃａａｇａｃｇａｃｇａａｇａａｃｇｔｔｃｃｃａａａｃｔａｇａａｇｇｇａａｔｃｇｃｇａａａａｔｔｔｇｇａｃｃｃａｔｇｇｔｔｇｃｇｔｇｃｇａａａｔａａａｃａａｇｇｇｇｇｃｔｇａｃｃａｇｇａｔａｇｔｇａａｃｔｔｇｔｇｇａａｃｔｇｇｔｔｇｃｇａｔｔｇｔｔａａｃｃｃｇｔｃｔｇｃｇｃｔａａｇｃｔｃｇｃｃｃｇａｃｔｃａａｔａａａａａｔｇｔｇａ
配列番号４：ＩＬＴＶ  ｇＩ糖タンパク質（３６２アミノ酸）
ＭＡＳＬＬＧＴＬＡＬＬＡＡＴＬＡＰＦＧＡＭＧＩＶＩＴＧＮＨＶＳＡＲＩＤＤＤＨＩＶＩＶＡＰＲＰＥＡＴＩＱＬＱＬＦＦＭＰＧＱＲＰＨＫＰＹＳＧＴＶＲＶＡＦＲＳＤＩＴＮＱＣＹＱＥＬＳＥＥＲＦＥＮＣＴＨＲＳＳＳＶＦＶＧＣＫＶＴＥＹＴＦＳＡＳＮＲＬＴＧＰＰＨＰＦＫＬＴＩＲＮＰＲＰＮＤＳＧＭＦＹＶＩＶＲＬＤＤＴＫＥＰＩＤＶＦＡＩＱＬＳＶＹＱＦＡＮＴＡＡＴＲＧＬＹＳＫＡＳＣＲＴＦＧＬＰＴＶＱＬＥＡＹＬＲＴＥＥＳＷＲＮＷＱＡＹＶＡＴＥＡＴＴＴＳＡＥＡＴＴＰＴＰＶＴＡＴＳＡＳＥＬＥＡＥＨＦＴＦＰＷＬＥＮＧＶＤＨＹＥＰＴＰＡＮＥＮＳＮＶＴＶＲＬＧＴＭＳＰＴＬＩＧＶＴＶＡＡＶＶＳＡＴＩＧＬＶＩＶＩＳＩＶＴＲＮＭＣＴＰＨＲＫＬＤＴＶＳＱＤＤＥＥＲＳＱＴＲＲＥＳＲＫＦＧＰＭＶＡＣＥＩＮＫＧＡＤＱＤＳＥＬＶＥＬＶＡＩＶＮＰＳＡＬＳＳＰＤＳＩＫＭ
配列番号５：ＩＢＤＶ  ＶＰ２（１３６２ｂｐ）
ａｔｇａｃａａａｃｃｔｇｃａａｇａｔｃａａａｃｃｃａａｃａｇａｔｔｇｔｔｃｃｇｔｔｃａｔａｃｇｇａｇｃｃｔｔｃｔｇａｔｇｃｃａａｃａａｃｃｇｇａｃｃｇｇｃｇｔｃｃａｔｔｃｃｇｇａｃｇａｃａｃｃｃｔｇｇａｇａａｇｃａｃａｃｔｃｔｃａｇｇｔｃａｇａｇａｃｃｔｃｇａｃｃｔａｃａａｔｔｔｇａｃｔｇｔｇｇｇｇｇａｃａｃａｇｇｇｔｃａｇｇｇｃｔａａｔｔｇｔｃｔｔｔｔｔｃｃｃｔｇｇａｔｔｃｃｃｔｇｇｃｔｃａａｔｔｇｔｇｇｇｔｇｃｔｃａｃｔａｃａｃａｃｔｇｃａｇａｇｃａａｔｇｇｇａａｃｔａｃａａｇｔｔｃｇａｔｃａｇａｔｇｃｔｃｃｔｇａｃｔｇｃｃｃａｇａａｃｃｔａｃｃｇｇｃｃａｇｃｔａｃａａｃｔａｃｔｇｃａｇａｃｔａｇｔｇａｇｔｃｇｇａｇｔｃｔｃａｃａｇｔｇａｇｇｔｃａａｇｃａｃａｃｔｃｃｃｔｇｇｔｇｇｃｇｔｔｔａｔｇｃａｃｔａａａｃｇｇｃａｃｃａｔａａａｃｇｃｃｇｔｇａｃｃｔｔｃｃａａｇｇａａｇｃｃｔｇａｇｔｇａａｃｔｇａｃａｇａｔｇｔｔａｇｃｔａｃａａｔｇｇｇｔｔｇａｔｇｔｃｔｇｃａａｃａｇｃｃａａｃａｔｃａａｃｇａｃａａａａｔｔｇｇｇａａｔｇｔｃｃｔｇｇｔａｇｇｇｇａａｇｇｇｇｔｃａｃｔｇｔｃｃｔｃａｇｃｃｔａｃｃｃａｃａｔｃａｔａｔｇａｔｃｔｔｇｇｇｔａｔｇｔｇａｇｇｃｔｔｇｇｔｇａｃｃｃｃａｔｔｃｃｃｇｃｔａｔａｇｇｇｃｔｔｇａｃｃｃａａａａａｔｇｇｔａｇｃｔａｃａｔｇｃｇａｃａｇｃａｇｔｇａｃａｇｇｃｃｃａｇａｇｔｃｔａｃａｃｃａｔａａｃｔｇｃａｇｃｃｇａｔｇａｔｔａｃｃａａｔｔｃｔｃａｔｃａｃａｇｔａｃｃａａｃｃａｇｇｔｇｇｇｇｔａａｃａａｔｃａｃａｃｔｇｔｔｃｔｃａｇｃｃａａｃａｔｔｇａｔｇｃｔａｔｃａｃａａｇｃｃｔｃａｇｃａｔｔｇｇｇｇｇａｇａｇｃｔｃｇｔｇｔｔｔｃａａａｃａａｇｃｇｔｃｃａａｇｇｃｃｔｔｇｔａｃｔｇｇｇｃｇｃｃａｃｃａｔｃｔａｃｃｔｔａｔａｇｇｃｔｔｔｇａｔｇｇｇａｃｔｇｃｇｇｔａａｔｃａｃｃａｇａｇｃｔｇｔｇｇｃｃｇｃａｇａｔａａｔｇｇｇｃｔｇａｃｇｇｃｃｇｇｃａｃｃｇａｃａａｔｃｔｔａｔｇｃｃａｔｔｃａａｔｃｔｔｇｔｃａｔｔｃｃａａｃｃａａｔｇａｇａｔａａｃｃｃａｇｃｃａａｔｃａｃａｔｃｃａｔｃａａａｃｔｇｇａｇａｔａｇｔｇａｃｃｔｃｃａａａａｇｔｇｇｔｇｇｔｃａｇｇｃａｇｇｇｇａｔｃａｇａｔｇｔｃａｔｇｇｔｃｇｇｃａａｇｔｇｇｇａｇｃｃｔａｇｃａｇｔｇａｃｇａｔｃｃａｔｇｇｔｇｇｃａａｃｔａｔｃｃａｇｇｇｇｃｃｃｔｃｃｇｔｃｃｃｇｔｃａｃａｃｔａｇｔａｇｃｃｔａｃｇａａａｇａｇｔｇｇｃａａｃａｇｇａｔｃｃｇｔｃｇｔｔａｃｇｇｔｃｇｃｔｇｇｇｇｔｇａｇｔａａｃｔｔｃｇａｇｃｔｇａｔｔｃｃａａａｔｃｃｔｇａａｃｔａｇｃａａａｇａａｃｃｔｇｇｔｔａｃａｇａａｔａｃｇｇｃｃｇａｔｔｔｇａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｔｇａａｃｔａｃａｃａａａａｔｔｇａｔａｃｔｇａｇｔｇａｇａｇｇｇａｃｃｇｔｃｔｔｇｇｃａｔｃａａｇａｃｃｇｔｃｔｇｇｃｃａａｃａａｇｇｇａｇｔａｃａｃｔｇａｔｔｔｔｃｇｔｇａｇｔａｃｔｔｃａｔｇｇａｇｇｔｇｇｃｃｇａｃｃｔｃａａｃｔｃｔｃｃｃｃｔｇａａｇａｔｔｇｃａｇｇａｇｃａｔｔｔｇｇｃｔｔｃａａａｇａｃａｔａａｔｃｃｇｇｇｃｔａｔａａｇｇａｇｇｔａａ
配列番号６：ＩＢＤＶ  ＶＰ２（４５３アミノ酸）
ＭＴＮＬＱＤＱＴＱＱＩＶＰＦＩＲＳＬＬＭＰＴＴＧＰＡＳＩＰＤＤＴＬＥＫＨＴＬＲＳＥＴＳＴＹＮＬＴＶＧＤＴＧＳＧＬＩＶＦＦＰＧＦＰＧＳＩＶＧＡＨＹＴＬＱＳＮＧＮＹＫＦＤＱＭＬＬＴＡＱＮＬＰＡＳＹＮＹＣＲＬＶＳＲＳＬＴＶＲＳＳＴＬＰＧＧＶＹＡＬＮＧＴＩＮＡＶＴＦＱＧＳＬＳＥＬＴＤＶＳＹＮＧＬＭＳＡＴＡＮＩＮＤＫＩＧＮＶＬＶＧＥＧＶＴＶＬＳＬＰＴＳＹＤＬＧＹＶＲＬＧＤＰＩＰＡＩＧＬＤＰＫＭＶＡＴＣＤＳＳＤＲＰＲＶＹＴＩＴＡＡＤＤＹＱＦＳＳＱＹＱＰＧＧＶＴＩＴＬＦＳＡＮＩＤＡＩＴＳＬＳＩＧＧＥＬＶＦＱＴＳＶＱＧＬＶＬＧＡＴＩＹＬＩＧＦＤＧＴＡＶＩＴＲＡＶＡＡＤＮＧＬＴＡＧＴＤＮＬＭＰＦＮＬＶＩＰＴＮＥＩＴＱＰＩＴＳＩＫＬＥＩＶＴＳＫＳＧＧＱＡＧＤＱＭＳＷＳＡＳＧＳＬＡＶＴＩＨＧＧＮＹＰＧＡＬＲＰＶＴＬＶＡＹＥＲＶＡＴＧＳＶＶＴＶＡＧＶＳＮＦＥＬＩＰＮＰＥＬＡＫＮＬＶＴＥＹＧＲＦＤＰＧＡＭＮＹＴＫＬＩＬＳＥＲＤＲＬＧＩＫＴＶＷＰＴＲＥＹＴＤＦＲＥＹＦＭＥＶＡＤＬＮＳＰＬＫＩＡＧＡＦＧＦＫＤＩＩＲＡＩＲＲ
配列番号７：ＩＬＴＶ  ｇＤプロモーター（５２７ｂｐ）
ａａａｃａｇｃｔｇｔａｃｔａｃａｇａｇｔａａｃｃｇａｔｇｇａａｇａａｃａｔｃｇｇｔｃｃａｇｃｔａａｔｇｔｇｃｃｔｇｔｃｇｔｇｃａｃｇａｇｃｃａｔｔｃｔｃｃｇｇａａｃｃｔｔａｃｔｇｔｃｔｔｔｔｃｇａｃａｃｇｔｃｔｃｔｔａｔａｇｃｇａｇｇｇａａａａａｇａｔａｔｃｇｃｇｃｃａｇａｇｔｔａｔａｃｔｔｔａｃｃｔｃｔｇａｔｃｃｇｃａａａｃｇｇｃａｔａｃｔｇｃａｃａａｔａａｃｔｃｔｇｃｃｇｔｃｃｇｇｃｇｔｔｇｔｔｃｃｇａｇａｔｔｃｇａａｔｇｇａｇｃｃｔｔａａｔａａｔｇｔｔｔｃａｃｔｇｃｃｇｇａａｔａｔｔｔｇａｃｇｇｃｃａｃｇａｃｃｇｔｔｇｔｔｔｃｇｃａｔａｃｃｇｃｔｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｔｇｇａａｇａｇｃａｇｃｇｃｇａｇａｇｃａｇｇｃｇａｇｇｃｇｔｇｇａｔｔｔｃｔｇｇｃｃｇｇｇｇａｇｇｃａａｔａｔａｔａｃｇａａｔｇｃａｃｃｇｔｃｃｔｃａｔｃｔｃａｇａｃｇｇｃａｃｔｃｇｃｇｔｔａｃｔａｃｇｃｇａａａｇｇａｇａｇｇｔｇｃｔｔａａｃａａａｃａｃａｔｇｇａｔｔｇｃｇｇｔｇｇａａａａｃｇｇｔｇｃｔｇｃｔｃａｇｇｃｇｃａｇｃｔｇｔａｔｔｃａｃｔｃｔｔｔｔｃｔｇｇａｃｔｔｇｔｇｔｃａｇｇａｔｔａｔｇｃｇｇｇａｇｃａｔａｔｃｔｇｃｔｔｔｇｔａｃｇｃａａｃｇｃｔ
配列番号８：ＩＬＴＶ  ｇＩプロモーター（２６４ｂｐ）
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配列番号９：ＩＬＴＶインサート（３５６３ｂｐ）
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配列番号１０：ｍＣＭＶ  ＩＥプロモーター（１３９１ｂｐ）
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配列番号１１：ニワトリβ−アクチンプロモーター（６９２ｂｐ）
（注：「ｎｎｎ」は高度にＧＣリッチな領域における不明瞭な配列を表す。３〜５個の「ｇ」であり得る）
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配列番号１２：ＡＤ１６９株からのｈＣＭＶ  ＩＥプロモーター（３０１ｂｐ）
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配列番号１３：ＦＨＶ  ＵＳ−９ポリアデニル化シグナル（５５ｂｐ）
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配列番号１４：ＨＳＶ  ＴＫポリアデニル化シグナル（３７０ｂｐ）
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配列番号１５：２２８５０９−ＩＬＴ−４３５Ｖｅｃ６（ｍＣＭＶ  ＩＥｐｒｏ−ＶＰ２−ＳＶ４０ｐＡ／ＩＬＴ／ＨＶＴ）（１４１１３ｂｐ）
（ＨＶＴ  ＥｃｏＲＩ＃７断片中のＩＢＤＶ＋ＩＬＴ遺伝子カセット。ウイルスｎｏ．ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴ  １３８６−１３４）
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配列番号１６：１３３３−８５．Ｂ６（ＩＬＴ／ニワトリβ−アクチン  ｐｒｏ−ＶＰ２−ＦＨＶ  ＵＳ９ｐＡ／ＨＶＴ）（１３０６４ｂｐ）
（ＨＶＴ  ＥｃｏＲＩ＃７断片中のＩＬＴ＋ＩＢＤＶ遺伝子カセット）
ウイルスｎｏ．ＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  １３８６−４８．１．１．１
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配列番号１７：１３８６−０４．４＃１（ＩＬＴ／ｈＣＭＶ  ＩＥｐｒｏ−ＶＰ２−ＨＳＶ  ＴＫｐＡ／ＨＶＴ）（１３０１７ｂｐ）
（ＨＶＴ  ＥｃｏＲＩ＃７断片中のＩＬＴ＋ＩＢＤＶ遺伝子カセット。
【０１５８】
ウイルスｎｏ．ＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶ  １３８６−４８．３．１．７）
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配列番号１８：４８４−１０５０−２６４１−１０８５９（ｍＣＭＶ  ＩＥｐｒｏ−ＶＰ２−ＳＶ４０ｐＡ／ＩＬＴ／ＨＶＴ）（１５２５２ｂｐ）
（ＨＶＴ  ＡｓｃＩ断片中のＩＢＤＶ＋ＩＬＴ遺伝子カセット）  ウイルスｎｏ．ＨＶＴ／ＩＢＤＶ／ＩＬＴ  ４８４
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配列番号１９：ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（１９９ｂｐ）
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【０１５９】
本発明は、本明細書中に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書中に記載されるものに加えて、本発明の様々な改変が前述の説明から当業者に明らかとなるであろう。かかる改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【０１６０】
さらに、核酸またはポリペプチドについて与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズならびに全ての分子量または分子質量の値はおおよそであり、説明のために提供されるものと理解されるものである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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