(57)【要約】微生物、例えば、細菌および他の感染因子のような病原性微生物に結合する抗体を同定するためのアッセイまたは方法を提供する。一部の態様では、標的微生物と結合する抗体を同定するための提供される方法は、抗体産生細胞を標的微生物と共にゲル微小滴中にゲル封入する段階を含む。該方法によって産生される抗体も提供する。アシネトバクターの変異体または種にわたり保存された領域またはエピトープと結合する抗体も提供する。2019503203.tif 000008
2019503203.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的微生物と結合する抗体を同定するための方法であって、
(a)複数の候補抗体産生細胞を得る段階；
(b)複数の候補抗体産生細胞を標的微生物と共にゲル微小滴中に封入する段階；および
(c)ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、前記標的微生物と結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階であって、それにより、前記標的微生物に特異的に結合する抗体を同定する、段階
を含む前記方法。
【請求項２】
段階(b)が、前記標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体を微小滴中に封入することをさらに含み；
段階(c)が、前記標的微生物と結合すると同定された抗体が、同じゲル微小滴内のそのエピトープ含有フラグメントとも結合するかどうかを判定することを含む、
請求項1に記載の方法。
【請求項３】
標的微生物と結合する抗体を同定するための方法であって、
(a)複数の候補抗体産生細胞を得る段階；
(b)複数の候補抗体産生細胞を標的微生物および該標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体と共にゲル微小滴中に封入する段階；および
(c)ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する前記標的微生物および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階であって、それにより、前記標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントに特異的に結合する抗体を同定する、段階
を含む前記方法。
【請求項４】
エピトープ含有フラグメントが、固体支持体に結合している、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
固体支持体が、ビーズである、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記標的微生物が、細菌、真菌、寄生虫またはウイルスである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記標的微生物が、細菌または真菌である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物が、多剤耐性微生物である、請求項6または請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物が、グラム陰性菌である細菌である、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
グラム陰性菌が、プロテオバクテリアである、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物が、アシネトバクター属（Acinetobacter）、デロビブリオ属（Bdellovibrio）、バークホルデリア属（Burkholderia）、クラミジア属（Chlamydia）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、フランシセラ属（Francisella）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、クレブシエラ属（Klebsiella）、レジオネラ属（Legionella）、モラクセラ属（Moraxella）、ナイセリア属（Neisseria）、パンテア属（Pantoea）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、ステノトロホモナス属（Stenotrophomonas）、ビブリオ属（Vibrio）およびエルシニア属（Yersinia）の種の中より選択される細菌である、請求項6〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物が、アシネトバクター・アピス（Acinetobacter apis）、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）、アシネトバクター・バイリイ（Acinetobacter baylyi）、アシネトバクター・ベイジェリンキイ（Acinetobacter beijerinckii）、アシネトバクター・ベレジニエ（Acinetobacter bereziniae）、アシネトバクター・ボヘミカス（Acinetobacter bohemicus）、アシネトバクター・ボイシエリ（Acinetobacter boissieri）、アシネトバクター・ボウベティイ（Acinetobacter bouvetii）、アシネトバクター・ブリソウィイ（Acinetobacter brisouii）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）、アシネトバクター・ガンデンシス（Acinetobacter gandensis）、アシネトバクター・ゲルネリ（Acinetobacter gerneri）、アシネトバクター・ガンドンジェンシス（Acinetobacter guangdongensis）、アシネトバクター・ギロウイエ（Acinetobacter guillouiae）、アシネトバクター・ジレンベルジイ（Acinetobacter gyllenbergii）、アシネトバクター・ヘモリティカス（Acinetobacter haemolyticus）、アシネトバクター・ハービネンシス（Acinetobacter harbinensis）、アシネトバクター・インディカス（Acinetobacter indicus）、アシネトバクター・ジョンソニイ（Acinetobacter johnsonii）、アシネトバクター・ジュニイ（Acinetobacter junii）、アシネトバクター・クーキイ（Acinetobacter kookii）、アシネトバクター・ルヴォフィイ（Acinetobacter lwoffii）、アシネトバクター・ネクタリス（Acinetobacter nectaris）、アシネトバクター・ノソコミアリス（Acinetobacter nosocomialis）、アシネトバクター・パキスタネンシス（Acinetobacter pakistanensis）、アシネトバクター・パルブス（Acinetobacter parvus）、アシネトバクター・ピティイ（Acinetobacter pitii）、アシネトバクター・ピッティイ（Acinetobacter pittii）、アシネトバクター・プヤンジェンシス（Acinetobacter puyangensis）、アシネトバクター・キンフェンジェンシス（Acinetobacter qingfengensis）、アシネトバクター・ラジオレジスタンス（Acinetobacter radioresistans）、アシネトバクター・ラジオレジステンス（Acinetobacter radioresistens）、アシネトバクター・ルディス（Acinetobacter rudis）、アシネトバクター・シンドレリ（Acinetobacter schindleri）、アシネトバクター・セイフェルティイ（Acinetobacter seifertii）、アシネトバクター・ソリ（Acinetobacter soli）、アシネトバクター・タンドイイ（Acinetobacter tandoii）、アシネトバクター・チェルンベルギエ（Acinetobacter tjernbergiae）、アシネトバクター・タウネリ（Acinetobacter towneri）、アシネトバクター・ウルシンギイ（Acinetobacter ursingii）、アシネトバクター・バリアビリス（Acinetobacter variabilis）、アシネトバクター・ベネチアヌス（Acinetobacter venetianus）、大腸菌（Escherichia coli）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ボイド赤痢菌（Shigella boydii）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）、ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）、コレラ菌（Vibrio cholera）およびペスト菌（Yersinia pestis）の中より選択される、請求項6〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物が、アシネトバクター・バウマニである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物が、グラム陽性菌である細菌である、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記微生物が、ブドウ球菌属（Staphylococcus）および連鎖球菌属（Streptococcus）の種の中より選択される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物が、アスペルギルス属（Aspergillus）またはカンジダ属（Candida）の種である真菌である、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記微生物が、コクシジウム亜綱（Coccidia）またはプラスモジウム属（Plasmodium）の種である寄生虫である、請求項6または請求項8に記載の方法。
【請求項１８】
複数の候補抗体産生細胞が、前記標的微生物もしくは前記標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体に曝露されたことのあるドナーから得られる、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
複数の候補抗体産生細胞が、
(i)前記標的微生物もしくは前記標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体に曝露されたことのあるドナーから得られた抗体産生細胞を、該抗体産生細胞を含む細胞組成物を免疫無防備状態の動物に導入することによって増殖させる段階；および
(ii)増殖した抗体産生細胞を回収する段階であって、それにより、複数の候補抗体産生細胞を得る、段階
を含む方法によって得られる、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体産生細胞を含む細胞組成物が、ドナーの脾臓および／またはリンパ節から得られた細胞を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞組成物が、T細胞を含む、請求項19または請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞組成物が、抗体産生細胞を含む末梢血単核細胞（PBMC）を含む、請求項19〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
免疫無防備状態の動物が、SCIDマウスである、請求項19〜22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体産生細胞を含む細胞組成物が、免疫無防備状態の動物の静脈内に導入される、または該免疫無防備状態の動物の脾臓への移植により導入される、請求項19〜23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
抗体産生細胞が、前記標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントの第1の変異体に曝露されたドナーからのものであり、かつ
抗体産生細胞を含む細胞組成物を免疫無防備状態の動物に導入する前に、前記方法が、抗体産生細胞を前記標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントの第2の変異体と共に混合またはインキュベートする段階を含み、該導入される細胞組成物が、前記標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントの第2の変異体と複合体を形成した抗体産生細胞を含む、
請求項19〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
エピトープ含有フラグメントが、前記標的微生物の必須タンパク質または必須タンパク質のフラグメントを含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
エピトープ含有フラグメントが、前記標的微生物に由来する細菌外膜（OM）タンパク質、膜タンパク質、エンベロープタンパク質、細胞壁タンパク質、細胞壁成分、表面脂質、糖脂質、リポ多糖、糖タンパク質、表面多糖、莢膜、表面付属器、鞭毛、線毛、単分子表面層、もしくはS層またはそのフラグメントを含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
エピトープ含有フラグメントが、前記標的微生物の表面からの脂質を含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
エピトープ含有フラグメントが、リポ多糖（LPS）またはリポタンパク質を含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
エピトープ含有フラグメントが、外膜（OM）タンパク質を含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
OMタンパク質が、BamA、LptD、AdeC、AdeK、BtuB、FadL、FecA、FepA、FhaC、FhuA、LamB、MepC、MexA、NalP、NmpC、NspA、NupA、Omp117、Omp121、Omp200、Omp71、OmpA、OmpC、OmpF、OmpG、OmpT、OmpW、OpcA、OprA、OprB、OprF、OprJ、OprM、OprN、OstA、PagL、PagP、PhoE、PldA、PorA、PorB、PorD、PorP、SmeC、SmeF、SrpC、SucY、TolC、TtgCおよびTtgFの中より選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
OMタンパク質が、BamAまたはLptDである、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
エピトープ含有フラグメントが、OMタンパク質またはそのフラグメントの可溶化によって調製される、請求項25〜27および30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
可溶化が、1種類または複数種類の洗剤または界面活性剤の添加によって実施される、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
抗体産生細胞と共に混合またはインキュベートする段階の前に、エピトープ含有フラグメントをリフォールディングする段階をさらに含む、請求項33または請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
リフォールディングが、1種類または複数種類の洗剤または界面活性剤の存在下で実施される、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
洗剤または界面活性剤が、ラウリルジメチルアミンオキシド（LDAO）、2-メチル-2,4-ペンタンジオール（MPD）、アンフィポール（amphipol）、アンフィポールA8-35、C8E4、トリトン（Triton）X-100、オクチルグルコシド、DM（n-デシル-β-D-マルトピラノシド）、DDM（n-ドデシル-β-D-マルトピラノシド、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート（CHAPS）および3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート（CHAPSO）の中より選択される、請求項34〜36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
調製物中の洗剤および／または界面活性剤の一部または全部を両親媒性ポリマーまたは界面活性剤により置き換える段階をさらに含む、請求項34〜37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
抗体産生細胞と共に混合またはインキュベートする段階の前に、エピトープ含有フラグメントの調製物から、過剰の洗剤または界面活性剤が、抗体産生細胞に有毒でないおよび／または抗体産生細胞の溶解を誘導しないレベルまたは量に除去または低減される、請求項34〜38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
第1および第2の変異体が、前記標的微生物のエピトープ含有フラグメントをそれぞれ独立して含む、請求項25〜39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
第1および第2の変異体が、少なくとも1つの保存された領域またはドメインを共有する、請求項25〜40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
第1および第2の変異体が、互いに異なる少なくとも1つの領域またはドメインをそれぞれ含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
第1および第2の変異体が、同じ微生物の2つの異なる臨床単離株に由来するOMタンパク質またはそのフラグメントを含む、請求項25〜42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
第1の変異体および／または第2の変異体が、完全長OMタンパク質であり、かつ該第1および／または第2の変異体の他方が、OMタンパク質の免疫優性エピトープまたはループの欠失を含むOMタンパク質のフラグメントである、請求項25〜43のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
同定された抗体が、前記標的微生物の少なくとも1つの保存された領域またはドメインに結合する、請求項41〜44のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ドナーが、前記標的微生物もしくは前記標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体で免疫されたまたはそれに感染したことがある、請求項18〜45のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ドナーが、免疫された動物または感染した動物である、請求項18〜46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ドナーが、哺乳動物または鳥類である、請求項18〜47のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
ドナーが、ヒト、マウスまたはニワトリである、請求項18〜48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
ドナーが、前記微生物に感染したヒトドナーである、請求項18〜49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
ドナーが、部分ヒト抗体または完全ヒト抗体を産生する遺伝子改変非ヒト動物である、請求項18〜50のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
抗体産生細胞が、末梢血単核細胞（PBMC）、B細胞、形質芽細胞または形質細胞を含む、請求項1〜51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
抗体産生細胞が、B細胞、形質芽細胞または形質細胞を含む、請求項1〜52のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
B細胞を単離または濃縮するために、複数の候補抗体産生細胞が、正または負の選択によってドナーより選択される、請求項18〜53のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
B細胞が、形質芽細胞または形質細胞である、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
前記選択が、CD2、CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD34、CD56、CD61、CD138、CD235a（グリコホリンA）およびFceRIaのうちの1つまたは複数の中より選択される細胞表面マーカーの発現に基づく正の選択である、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
抗体産生細胞がCD138+細胞を含む、請求項52〜56のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、またはそれ以上または少なくとも約50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、もしくはそれ以上が、形質細胞もしくは形質芽細胞であり、かつ／またはCD138+細胞である、請求項52〜57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗体が、抗体またはその抗原結合性フラグメントである、請求項1〜58のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
ゲル微小滴が、マイクロフルイディクスに基づく方法によって生成される、請求項1〜59のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
ゲル微小滴が、アガロース、カラゲナン、アルジネート、アルジネート-ポリリジン、コラーゲン、セルロース、メチルセルロース、ゼラチン、キトサン、細胞外マトリックス、デキストラン、デンプン、イヌリン、ヘパリン、ヒアルロナン、フィブリン、ポリビニルアルコール、ポリ(N-ビニル-2-ピロリドン)、ポリエチレングリコール、ポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート)、アクリレートポリマーおよびポリアクリル酸ナトリウム、ポリジメチルシロキサン、シスポリイソプレン、Puramatrix（商標）、ポリジベニル（divenyl）ベンゼン、ポリウレタン、もしくはポリアクリルアミドまたはそれらの組み合わせの中より選択される材料を含む、請求項1〜60のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
ゲル微小滴が、アガロースを含む、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
アガロースが、低ゲル化温度アガロースである、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
アガロースが、約35℃未満、約30℃未満、約25℃未満、約20℃未満、約15℃未満、約10℃未満または約5℃未満のゲル化温度を有する、請求項62または請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
アガロースが、約5℃〜約30℃、約5℃〜約20℃、約5℃〜約15℃、約8℃〜約17℃または約5℃〜約10℃のゲル化温度を有する、請求項62または請求項63に記載の方法。
【請求項６６】
段階(b)が、封入に続いてゲル微小滴を約0℃〜約5℃の温度で約1分間〜約10分間インキュベートすることをさらに含む、請求項1〜65のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
ビーズが、約100nm〜約100μm、または約3μm〜約5μmの平均直径を有する、請求項5〜66のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
ゲル微小滴1個あたりの候補抗体産生細胞の平均比が、1未満または約1未満である、請求項1〜67のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
ゲル微小滴1個あたりの候補抗体産生細胞の平均比が、それぞれ両端の値を含む約0.05〜約1.0、約0.05〜約0.5、約0.05〜約0.25、約0.05〜約0.1、約0.1〜約1.0、約0.1〜約0.5、約0.1〜約0.25、約0.25〜約1.0、約0.25〜約0.5または0.5〜約1.0である、請求項1〜68のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
微小滴1個あたりの候補抗体産生細胞の平均比が、0.1または約0.1である、請求項69に記載の方法。
【請求項７１】
ゲル微小滴1個あたりの前記微生物の平均比が、約50〜約150または約50〜約100である、請求項1〜70のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
ゲル微小滴1個あたりのビーズの平均比が、約2〜約10または約3〜約5である、請求項5〜71のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
候補細胞 対 微生物 対 ビーズの平均比が、約0.1:100:10である、請求項5〜72のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
ゲル微小滴が、成長培地を含み、かつ非水環境によって囲まれている、請求項1〜73のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
非水環境が、油を含む、請求項74に記載の方法。
【請求項７６】
油が、ガス透過性である、請求項75に記載の方法。
【請求項７７】
段階(c)の前に、ゲル微小滴を37℃または約37℃の温度でインキュベートする段階をさらに含む、請求項1〜76のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
ゲル微小滴が、成長培地中でインキュベートされる、請求項77に記載の方法。
【請求項７９】
段階(c)の前に、抗体に結合する試薬をゲル微小滴中に導入し、該試薬が検出可能な部分を含む、請求項1〜78のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記試薬が、封入された抗体産生細胞によって産生される抗体に特異的な二次抗体を含む、請求項79に記載の方法。
【請求項８１】
ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する前記標的微生物および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階が、
(i)前記標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメント；
(ii)抗体産生細胞によって産生された抗体；および
(iii)結合した検出可能な部分を含む試薬
を含む複合体
の存在を検出することを含み、該複合体の存在が、該抗体が前記標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合することを示す、請求項79または請求項80に記載の方法。
【請求項８２】
ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する前記標的微生物および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階が、該抗体の存在が同じゲル微小滴中の前記標的微生物の表現型の特徴を改変するかどうかを判定することを含み、改変された表現型の特徴の存在が、該抗体が前記標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合することを示す、請求項1〜78のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
改変された表現型の特徴が、細胞成長、細胞死、挙動の変化、結合性、転写、翻訳、発現、タンパク質輸送、細胞もしくは膜構築、接着、運動性、細胞ストレス、細胞分裂および／または細胞生存度の中より選択される、請求項82に記載の方法。
【請求項８４】
ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する前記標的微生物および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階が、レポーター分子によって生成されるシグナルを検出することを含み、該シグナルが、改変された表現型の特徴の存在下で生成される、請求項82または請求項83に記載の方法。
【請求項８５】
前記微生物が、レポーター分子をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項84に記載の方法。
【請求項８６】
ポリヌクレオチドが、レポーター分子をコードする配列に機能的に連結された調節領域を含み、該調節領域が、改変された表現型の特徴に応答性である、請求項85に記載の方法。
【請求項８７】
調節領域がプロモーターを含む、請求項86に記載の方法。
【請求項８８】
改変された表現型の特徴が細胞ストレスを含み、かつシグナルが該細胞ストレスの存在下で生成される、請求項82〜87のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
細胞ストレスが細菌の外膜（OM）に対するストレスを含む、請求項83〜88のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
レポーター分子によって生成されるシグナルが、検出可能な部分で検出される、請求項84〜89のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
レポーター分子によって生成されるシグナルが、蛍光シグナル、発光シグナル、比色シグナル、化学発光シグナルまたは放射性シグナルを含む、請求項84〜90のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
レポーター分子が、蛍光タンパク質、発光タンパク質、色素タンパク質または酵素である、請求項84〜91のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する前記標的微生物および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階が、該抗体の存在が同じゲル微小滴中の前記標的微生物を殺傷するかどうかを判定することを含み、前記標的微生物の殺傷が、該抗体が前記標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合することを示す、請求項1〜78のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
ゲル微小滴が、細胞死を示す検出可能な部分を含む、請求項93に記載の方法。
【請求項９５】
前記検出可能な部分が、発色団部分、蛍光部分、リン光部分、発光部分、光吸収部分、放射性部分、および遷移金属同位体質量タグ部分の中より選択される1つまたは複数の検出可能な標識を含む、請求項79〜81、90〜92および94のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
(d)前記標的微生物もしくはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合すると同定された抗体を産生する細胞を含む微小滴を単離する段階または該同定された抗体をコードするポリヌクレオチドを単離する段階
をさらに含む、請求項1〜95のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
単離が、マイクロマニピュレーターまたは自動ソーターを用いて実施される、請求項96に記載の方法。
【請求項９８】
(e)同定された抗体をコードする核酸の配列を決定する段階
をさらに含む、請求項1〜97のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
核酸の配列を決定する段階が、核酸増幅および／または配列決定を用いて実施される、請求項98に記載の方法。
【請求項１００】
核酸の配列を決定する段階が、単一細胞PCRおよび核酸配列決定を用いて実施される、請求項98または請求項99に記載の方法。
【請求項１０１】
(f)同定された抗体またはそのフラグメントをコードする核酸の配列を含むポリヌクレオチドを細胞内に導入する段階
をさらに含む、請求項98〜100のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
段階(a)の完了から約60日、50日、40日、30日、20日、19日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日、3日、2日または1日以内に完了する、請求項1〜101のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
段階(a)の完了から約30日、20日、19日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日、3日、2日または1日以内に完了する、請求項102に記載の方法。
【請求項１０４】
請求項1〜103のいずれか一項に記載の方法によって同定された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１０５】
グラム陰性菌のBamA（β-バレルアセンブリー機構）の少なくとも1つの保存された領域またはドメインに存在するエピトープに結合する、請求項104に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１０６】
グラム陰性菌のBamA（β-バレルアセンブリー機構）の少なくとも1つの保存された領域またはドメインに存在するエピトープに結合する、抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１０７】
グラム陰性菌が、アシネトバクター属の種である、請求項105または請求項106に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１０８】
グラム陰性菌が、アシネトバクター・バウマニである、請求項105〜107のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１０９】
保存された領域またはドメインが、A.バウマニ ATCC19606からのBamAとA.バウマニ ATCC17978からのBamAとの間で共有される保存された領域またはドメインである、請求項105〜108のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１０】
保存された領域またはドメインが、SEQ ID NO:11に示されるA.バウマニのBamA配列の423〜438、440〜460、462〜502、504〜533、537〜544、547〜555、557〜561、599〜604、606〜644、646〜652、659〜700、702〜707、718〜723、735〜747、749〜760、784〜794、798〜804、806〜815および817〜841位のアミノ酸残基を含む、請求項109に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１１】
保存された領域またはドメインが、SEQ ID NO:12〜20に示される配列を含む、請求項110に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１２】
エピトープが、保存された領域またはドメインの連続配列または不連続配列である、請求項105〜111のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１３】
ヒト型である、請求項104〜112のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１４】
ヒト化抗体である、請求項104〜112のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１５】
ヒト化抗体を産生するように操作されたトランスジェニック動物からの抗体産生細胞によって産生される、請求項114に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１６】
組換え型である、請求項104〜115のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１７】
モノクローナルである、請求項104〜116のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１８】
抗原結合性フラグメントである、請求項104〜117のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１１９】
アフィニティータグ、検出可能なタンパク質、プロテアーゼ切断配列、リンカーまたは非タンパク質性部分をさらに含む、請求項104〜118のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１２０】
A.バウマニのBamAに対して400nM、300nM、200nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、もしくは1nMの、または400nM未満、300nM未満、200nM未満、100nM未満、50nM未満、40nM未満、30nM未満、25nM未満、20nM未満、19nM未満、18nM未満、17nM未満、16nM未満、15nM未満、14nM未満、13nM未満、12nM未満、11nM未満、10nM未満、9nM未満、8nM未満、7nM未満、6nM未満、5nM未満、4nM未満、3nM未満、2nM未満、もしくは1nM未満の、または約400nM未満、約300nM未満、約200nM未満、約100nM未満、約50nM未満、約40nM未満、約30nM未満、約25nM未満、約20nM未満、約19nM未満、約18nM未満、約17nM未満、約16nM未満、約15nM未満、約14nM未満、約13nM未満、約12nM未満、約11nM未満、約10nM未満、約9nM未満、約8nM未満、約7nM未満、約6nM未満、約5nM未満、約4nM未満、約3nM未満、約2nM未満、もしくは約1nM未満の平衡解離定数（KD）を有する、請求項104〜119のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１２１】
請求項104〜120のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１２２】
請求項104〜120のいずれか一項に記載の抗体を含む、組成物。
【請求項１２３】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項122に記載の組成物。
【請求項１２４】
候補抗体産生細胞；および
標的微生物
を各々含む複数の微小滴
を含む、組成物。
【請求項１２５】
各微小滴が、固体支持体に結合している前記標的微生物もしくはそのエピトープ含有フラグメントまたはその変異体をさらに含む、請求項124に記載の組成物。
【請求項１２６】
前記標的微生物が、レポーター分子をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項124または請求項125に記載の組成物。
【請求項１２７】
候補抗体産生細胞；および
標的微生物
を各々含む、微小滴のライブラリー。
【請求項１２８】
各微小滴が、固体支持体に結合している前記標的微生物もしくはそのエピトープ含有フラグメントまたはその変異体をさらに含む、請求項127に記載のライブラリー。
【請求項１２９】
前記標的微生物が、レポーター分子をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項127または請求項128に記載のライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその内容がその全体として組み入れられる、2016年1月29日に出願された「Screening Methods for Identifying Antibodies that Bind Cell Surface Epitopes」という名称の米国仮特許出願第62/288,729号の優先権を主張するものである。
【０００２】
配列表の参照による組み入れ
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に出願される。配列表は、2017年1月27日に作成された、サイズが53,519バイトの757832000140SeqList.TXTという名称のファイルとして提供される。配列表の電子フォーマット中の情報は、参照によりその全体として組み入れられる。
【０００３】
分野
本開示は、微生物、例えば細菌および他の感染因子のような病原性微生物に結合する抗体を同定するためのアッセイまたは方法を提供する。一部の態様では、標的微生物と結合する抗体を同定するための方法は、抗体産生細胞を標的微生物と共にゲル微小滴中にゲル封入することを含む。本開示は、該方法によって産生される抗体も提供する。本開示は、アシネトバクター（Acinetobacter）の変異体または種にわたり保存された領域またはエピトープと結合する抗体も提供する。
【背景技術】
【０００４】
背景
多剤耐性細菌は、世界中に出現しており、広まり続けており、公衆衛生上の懸念が大きくなっている。疾病予防管理センター（Centers for Disease Control and Prevention）は、米国における毎年少なくとも23,000人の死亡の原因が抗生物質耐性感染であり、一部の感染の種類は、50％に達する死亡率と関連するとした。アシネトバクター菌種および緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のような治療が困難なグラム陰性病原体では、米国における多剤耐性率は、それぞれ63％および13％と報告されている。これらの多剤耐性単離株の蔓延の継続は、生死に関わる感染を有する患者のための処置の選択肢を医師にほとんど残さなかった。多剤耐性グラム陰性菌感染を処置する新しい抗生物質のこの緊急の必要性に対処することは、重大である。当技術分野において、既存の治療薬の多くに耐性である病原性微生物、例えば細菌に特異的な治療薬、例えば抗体を同定する方法の必要性がある。当技術分野において、広い範囲の微生物、例えば病原体に対して有効な治療薬を同定する方法の必要性もある。そのような必要性に応じる方法および製品が、提供される。
【発明の概要】
【０００５】
概要
標的微生物と結合する抗体を同定するための方法であって、(a)複数の候補抗体産生細胞を得る段階；(b)複数の候補抗体産生細胞を標的微生物と共にゲル微小滴中に封入する段階；および(c)ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、標的微生物と結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階であって、それにより、標的微生物に特異的に結合する抗体を同定する、段階を含む方法が、本明細書に提供される。一部の態様では、段階(b)は、標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体を微小滴中に封入することをさらに含み；段階(c)は、標的微生物と結合すると同定された抗体が、同じゲル微小滴内のそのエピトープ含有フラグメントとも結合するかどうかを判定することを含む。
【０００６】
標的微生物と結合する抗体を同定するための方法であって、(a)複数の候補抗体産生細胞を得る段階；(b)複数の候補抗体産生細胞を標的微生物および標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体と共にゲル微小滴中に封入する段階；および(c)ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する標的微生物および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階であって、それにより、標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントに特異的に結合する抗体を同定する、段階を含む方法が、本明細書に提供される。
【０００７】
一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、固体支持体に結合している。一部の態様では、固体支持体はビーズである。
【０００８】
一部の態様では、標的微生物は、細菌、真菌、寄生虫またはウイルスである。一部の態様では、標的微生物は、細菌または真菌である。一部の態様では、微生物は、多剤耐性微生物である。
【０００９】
一部の態様では、微生物は、グラム陰性菌である細菌である。一部の態様では、グラム陰性菌は、プロテオバクテリアである。一部の態様では、微生物は、アシネトバクター属（Acinetobacter）、デロビブリオ属（Bdellovibrio）、バークホルデリア属（Burkholderia）、クラミジア属（Chlamydia）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、フランシセラ属（Francisella）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、クレブシエラ属（Klebsiella）、レジオネラ属（Legionella）、モラクセラ属（Moraxella）、ナイセリア属（Neisseria）、パンテア属（Pantoea）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、ステノトロホモナス属（Stenotrophomonas）、ビブリオ属（Vibrio）およびエルシニア属（Yersinia）の種の中より選択される細菌である。
【００１０】
一部の態様では、微生物は、アシネトバクター・アピス（Acinetobacter apis）、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）、アシネトバクター・バイリイ（Acinetobacter baylyi）、アシネトバクター・ベイジェリンキイ（Acinetobacter beijerinckii）、アシネトバクター・ベレジニエ（Acinetobacter bereziniae）、アシネトバクター・ボヘミカス（Acinetobacter bohemicus）、アシネトバクター・ボイシエリ（Acinetobacter boissieri）、アシネトバクター・ボウベティイ（Acinetobacter bouvetii）、アシネトバクター・ブリソウィイ（Acinetobacter brisouii）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）、アシネトバクター・ガンデンシス（Acinetobacter gandensis）、アシネトバクター・ゲルネリ（Acinetobacter gerneri）、アシネトバクター・ガンドンジェンシス（Acinetobacter guangdongensis）、アシネトバクター・ギロウイエ（Acinetobacter guillouiae）、アシネトバクター・ジレンベルジイ（Acinetobacter gyllenbergii）、アシネトバクター・ヘモリティカス（Acinetobacter haemolyticus）、アシネトバクター・ハービネンシス（Acinetobacter harbinensis）、アシネトバクター・インディカス（Acinetobacter indicus）、アシネトバクター・ジョンソニイ（Acinetobacter johnsonii）、アシネトバクター・ジュニイ（Acinetobacter junii）、アシネトバクター・クーキイ（Acinetobacter kookii）、アシネトバクター・ルヴォフィイ（Acinetobacter lwoffii）、アシネトバクター・ネクタリス（Acinetobacter nectaris）、アシネトバクター・ノソコミアリス（Acinetobacter nosocomialis）、アシネトバクター・パキスタネンシス（Acinetobacter pakistanensis）、アシネトバクター・パルブス（Acinetobacter parvus）、アシネトバクター・ピティイ（Acinetobacter pitii）、アシネトバクター・ピッティイ（Acinetobacter pittii）、アシネトバクター・プヤンジェンシス（Acinetobacter puyangensis）、アシネトバクター・キンフェンジェンシス（Acinetobacter qingfengensis）、アシネトバクター・ラジオレジスタンス（Acinetobacter radioresistans）、アシネトバクター・ラジオレジステンス（Acinetobacter radioresistens）、アシネトバクター・ルディス（Acinetobacter rudis）、アシネトバクター・シンドレリ（Acinetobacter schindleri）、アシネトバクター・セイフェルティイ（Acinetobacter seifertii）、アシネトバクター・ソリ（Acinetobacter soli）、アシネトバクター・タンドイイ（Acinetobacter tandoii）、アシネトバクター・チェルンベルギエ（Acinetobacter tjernbergiae）、アシネトバクター・タウネリ（Acinetobacter towneri）、アシネトバクター・ウルシンギイ（Acinetobacter ursingii）、アシネトバクター・バリアビリス（Acinetobacter variabilis）、アシネトバクター・ベネチアヌス（Acinetobacter venetianus）、大腸菌（Escherichia coli）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、緑膿菌、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ボイド赤痢菌（Shigella boydii）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）、ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）、コレラ菌（Vibrio cholera）およびペスト菌（Yersinia pestis）の中より選択される。一部の態様では、微生物は、アシネトバクター・バウマニである。
【００１１】
一部の態様では、微生物は、グラム陽性菌である細菌である。一部の態様では、微生物は、ブドウ球菌属（Staphylococcus）および連鎖球菌属（Streptococcus）の種の中より選択される。
【００１２】
一部の態様では、微生物は、アスペルギルス属（Aspergillus）種またはカンジダ属（Candida）の種である真菌である。
【００１３】
一部の態様では、微生物は、コクシジウム亜綱（Coccidia）またはプラスモジウム属（Plasmodium）の種である寄生虫である。
【００１４】
一部の態様では、複数の候補抗体産生細胞は、標的微生物もしくは標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体に曝露されたことのあるドナーから得られる。
【００１５】
本明細書に提供される方法の一部の態様では、複数の候補抗体産生細胞は、(i)標的微生物もしくは標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体に曝露されたことのあるドナーから得られた抗体産生細胞を、該抗体産生細胞を含有する細胞組成物を免疫無防備状態の動物に導入することによって増殖させる段階；および(ii)増殖した抗体産生細胞を回収する段階であって、それにより複数の候補抗体産生細胞を得る、段階を含む方法によって得られる。
【００１６】
一部の態様では、抗体産生細胞を含有する細胞組成物は、ドナーの脾臓および／またはリンパ節から得られた細胞を含む。一部の態様では、細胞組成物は、T細胞を含む。一部の態様では、細胞組成物は、抗体産生細胞を含む末梢血単核細胞（PBMC）を含む。
【００１７】
一部の態様では、免疫無防備状態の動物は、SCIDマウスである。
【００１８】
一部の態様では、抗体産生細胞を含有する細胞組成物は、免疫無防備状態の動物の静脈内に導入されるか、または免疫無防備状態の動物の脾臓への移植により導入される。
【００１９】
本明細書に提供される方法の一部の態様では、抗体産生細胞は、標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントの第1の変異体に曝露されたドナー由来であり、抗体産生細胞を含有する細胞組成物を免疫無防備状態の動物に導入する前に、該方法は、抗体産生細胞を標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントの第2の変異体と共に混合またはインキュベートする段階を含み、その際、導入される細胞組成物は、標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントの第2の変異体と複合体を形成した抗体産生細胞を含む。
【００２０】
一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、標的微生物の必須タンパク質または必須タンパク質のフラグメントを含む。
【００２１】
一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、標的微生物に由来する細菌外膜（OM）タンパク質、膜タンパク質、エンベロープタンパク質、細胞壁タンパク質、細胞壁成分、表面脂質、糖脂質、リポ多糖、糖タンパク質、表面多糖、莢膜、表面付属器、鞭毛、線毛、単分子表面層、もしくはS層またはそのフラグメントを含む。
【００２２】
一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、標的微生物の表面からの脂質を含む。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、リポ多糖（LPS）またはリポタンパク質を含む。
【００２３】
一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、外膜（OM）タンパク質を含む。一部の態様では、OMタンパク質は、BamA、LptD、AdeC、AdeK、BtuB、FadL、FecA、FepA、FhaC、FhuA、LamB、MepC、MexA、NalP、NmpC、NspA、NupA、Omp117、Omp121、Omp200、Omp71、OmpA、OmpC、OmpF、OmpG、OmpT、OmpW、OpcA、OprA、OprB、OprF、OprJ、OprM、OprN、OstA、PagL、PagP、PhoE、PldA、PorA、PorB、PorD、PorP、SmeC、SmeF、SrpC、SucY、TolC、TtgCおよびTtgFの中より選択される。一部の態様では、OMタンパク質は、BamAまたはLptDである。
【００２４】
一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、OMタンパク質またはそのフラグメントの可溶化によって調製される。一部の態様では、可溶化は、1種類または複数種類の洗剤または界面活性剤の添加によって実施される。
【００２５】
本明細書に提供される方法の一部の態様では、方法は、抗体産生細胞と共に混合またはインキュベートする段階の前にエピトープ含有フラグメントをリフォールディングする段階も含む。一部の態様では、リフォールディングは、1種類または複数種類の洗剤または界面活性剤の存在下で実施される。
【００２６】
一部の態様では、洗剤または界面活性剤は、ラウリルジメチルアミンオキシド（LDAO）、2-メチル-2,4-ペンタンジオール（MPD）、アンフィポール（amphipol）、アンフィポールA8-35、C8E4、トリトン（Triton）X-100、オクチルグルコシド、DM（n-デシル-β-D-マルトピラノシド）、DDM（n-ドデシル-β-D-マルトピラノシド、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート（CHAPS）および3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート（CHAPSO）の中より選択される。
【００２７】
本明細書に提供される方法の一部の態様では、方法は、調製物中の洗剤および／または界面活性剤の一部または全てを両親媒性ポリマーまたは界面活性剤により置き換える段階も含む。
【００２８】
一部の態様では、抗体産生細胞と共に混合またはインキュベートする段階の前に、エピトープ含有フラグメントの調製物から、過剰の洗剤または界面活性剤が、抗体産生細胞に有毒でないおよび／または抗体産生細胞の溶解を誘導しないレベルまたは量に除去または低減される。
【００２９】
一部の態様では、第1および第2の変異体は、標的微生物のエピトープ含有フラグメントをそれぞれ独立して含む。一部の態様では、第1および第2の変異体は、少なくとも1つの保存された領域またはドメインを共有する。一部の態様では、第1および第2の変異体は、互いに異なる少なくとも1つの領域またはドメインをそれぞれ含む。
【００３０】
一部の態様では、第1および第2の変異体は、同じ微生物の2つの異なる臨床単離株に由来するOMタンパク質またはそのフラグメントを含む。
【００３１】
一部の態様では、第1の変異体および／または第2の変異体は、完全長OMタンパク質であり、第1および／または第2の変異体の他方は、OMタンパク質の免疫優性エピトープまたはループの欠失を含むOMタンパク質のフラグメントである。
【００３２】
一部の態様では、同定された抗体は、標的微生物の少なくとも1つの保存された領域またはドメインに結合する。
【００３３】
本明細書に提供される方法の一部の態様では、ドナーは、標的微生物もしくは標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体で免疫されたまたはそれに感染したことがある。一部の態様では、ドナーは、免疫された動物または感染した動物である。一部の態様では、ドナーは、哺乳動物または鳥類である。一部の態様では、ドナーは、ヒト、マウスまたはニワトリである。一部の態様では、ドナーは、微生物に感染したヒトドナーである。一部の態様では、ドナーは、部分ヒト抗体または完全ヒト抗体を産生する遺伝子改変非ヒト動物である。
【００３４】
本明細書に提供される方法の一部の態様では、抗体産生細胞は、末梢血単核細胞（PBMC）、B細胞、形質芽細胞または形質細胞を含む。一部の態様では、抗体産生細胞は、B細胞、形質芽細胞または形質細胞を含む。
【００３５】
一部の態様では、複数の候補抗体産生細胞は、B細胞を単離または濃縮するための正の選択または負の選択によってドナーより選択される。一部の態様では、B細胞は、形質芽細胞または形質細胞である。一部の態様では、選択は、CD2、CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD34、CD56、CD61、CD138、CD235a（グリコホリンA）およびFceRIaのうちの1つまたは複数の中より選択される細胞表面マーカーの発現に基づく正の選択である。一部の態様では、抗体産生細胞は、CD138+細胞を含む。一部の態様では、細胞の少なくとも、または少なくとも約50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、もしくはそれ以上は、形質細胞もしくは形質芽細胞である、および／またはCD138+細胞である。
【００３６】
一部の態様では、抗体は、抗体またはその抗原結合性フラグメントである。
【００３７】
一部の態様では、ゲル微小滴は、マイクロフルイディクスに基づく方法によって生成される。一部の態様では、ゲル微小滴は、アガロース、カラゲナン、アルジネート、アルジネート-ポリリジン、コラーゲン、セルロース、メチルセルロース、ゼラチン、キトサン、細胞外マトリックス、デキストラン、デンプン、イヌリン、ヘパリン、ヒアルロナン、フィブリン、ポリビニルアルコール、ポリ(N-ビニル-2-ピロリドン)、ポリエチレングリコール、ポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート)、アクリレートポリマーおよびポリアクリル酸ナトリウム、ポリジメチルシロキサン、シスポリイソプレン、Puramatrix（商標）、ポリジベニル（divenyl）ベンゼン、ポリウレタン、もしくはポリアクリルアミドまたはそれらの組み合わせの中より選択される材料を含む。
【００３８】
一部の態様では、ゲル微小滴は、アガロースを含む。一部の態様では、アガロースは、低ゲル化温度アガロースである。一部の態様では、アガロースは、約35℃未満、約30℃未満、約25℃未満、約20℃未満、約15℃未満、約10℃未満または約5℃未満のゲル化温度を有する。一部の態様では、アガロースは、約5℃〜約30℃、約5℃〜約20℃、約5℃〜約15℃、約8℃〜約17℃または約5℃〜約10℃のゲル化温度を有する。
【００３９】
本明細書に提供される方法の一部の態様では、段階(b)は、封入に続いてゲル微小滴を約0℃〜約5℃の温度で約1分間〜約10分間インキュベートすることも含む。
【００４０】
一部の態様では、そのエピトープ含有フラグメントと結合したビーズなどのビーズは、約100nm〜約100μm、または約3μm〜約5μmの平均直径を有する。
【００４１】
一部の態様では、ゲル微小滴1個あたりの候補抗体産生細胞の平均比は、1未満または約1未満である。一部の態様では、ゲル微小滴1個あたりの候補抗体産生細胞の平均比は、約0.05〜約1.0、約0.05〜約0.5、約0.05〜約0.25、約0.05〜約0.1、約0.1〜約1.0、約0.1〜約0.5、約0.1〜約0.25、約0.25〜約1.0、約0.25〜約0.5または0.5〜約1.0（それぞれ両端の値を含む）である。一部の態様では、微小滴1個あたりの候補抗体産生細胞の平均比は、0.1または約0.1である。
【００４２】
一部の態様では、ゲル微小滴1個あたりの微生物の平均比は、約50〜約150または約50〜約100である。
【００４３】
一部の態様では、ゲル微小滴1個あたりのビーズの平均比は、約2〜約10または約3〜約5である。
【００４４】
一部の態様では、候補細胞 対 微生物 対 ビーズの平均比は、約0.1:100:10である。
【００４５】
一部の態様では、ゲル微小滴は、成長培地を含み、かつ非水環境によって囲まれている。一部の態様では、非水環境は、油を含む。一部の態様では、油は、ガス透過性である。
【００４６】
本明細書に提供される方法の一部の態様では、方法は、段階(c)の前にゲル微小滴を37℃または約37℃の温度でインキュベートする段階も含む。一部の態様では、ゲル微小滴は、成長培地中でインキュベートされる。
【００４７】
本明細書に提供される方法の一部の態様では、方法は、抗体に結合する試薬であって、検出可能な部分を含む試薬を、段階(c)の前にゲル微小滴内に導入する段階も含む。一部の態様では、試薬は、封入された抗体産生細胞によって産生される抗体に特異的な二次抗体を含む。
【００４８】
一部の態様では、ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する標的微生物および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階は、複合体の存在を検出する段階を含み、該複合体は、(i)標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメント；(ii)抗体産生細胞によって産生される抗体；および(iii)結合した検出可能な部分を含む試薬を含み、該複合体の存在は、抗体が標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合することを示す。
【００４９】
一部の態様では、ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する標的微生物および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階は、抗体の存在が、同じゲル微小滴中の標的微生物の表現型の特徴を改変するかどうかを判定する段階を含み、改変された表現型の特徴の存在は、抗体が標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合することを示す。
【００５０】
一部の態様では、改変された表現型の特徴は、細胞成長、細胞死、挙動の変化、結合性、転写、翻訳、発現、タンパク質輸送、細胞もしくは膜構築、接着、運動性、細胞ストレス、細胞分裂および／または細胞生存度の中より選択される。
【００５１】
一部の態様では、ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する標的微生物および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階は、レポーター分子によって生成されるシグナルを検出する段階を含み、該シグナルは、改変された表現型の特徴の存在下で生成される。一部の態様では、微生物は、レポーター分子をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、レポーター分子をコードする配列に機能的に連結された調節領域を含み、該調節領域は、改変された表現型の特徴に応答性である。一部の態様では、調節領域は、プロモーターを含む。
【００５２】
一部の態様では、改変された表現型の特徴は細胞ストレスを含み、かつシグナルは細胞ストレスの存在下で生成される。一部の態様では、細胞ストレスは、細菌の外膜（OM）に対するストレスを含む。一部の態様では、レポーター分子によって生成されるシグナルは、検出可能な部分で検出される。
【００５３】
一部の態様では、レポーター分子によって生成されるシグナルは、蛍光シグナル、発光シグナル、比色シグナル、化学発光シグナルまたは放射性シグナルを含む。一部の態様では、レポーター分子は、蛍光タンパク質、発光タンパク質、色素タンパク質または酵素である。
【００５４】
一部の態様では、ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する標的微生物および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階は、抗体の存在が、同じゲル微小滴中の標的微生物を殺傷するかどうかを判定する段階を含み、該標的微生物の殺傷は、抗体が標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合することを示す。一部の態様では、ゲル微小滴は、細胞死を示す検出可能な部分を含む。
【００５５】
一部の態様では、検出可能な部分は、発色団部分、蛍光部分、リン光部分、発光部分、光吸収部分、放射性部分、および遷移金属同位体質量タグ部分の中より選択される1つまたは複数の検出可能な標識を含む。
【００５６】
本明細書に提供される方法の一部の態様では、該方法は、(d)標的微生物もしくはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合すると同定された抗体を産生する細胞を含む微小滴を単離する段階、または同定された抗体をコードするポリヌクレオチドを単離する段階も含む。一部の態様では、単離は、マイクロマニピュレーターまたは自動ソーターを用いて実施される。
【００５７】
本明細書に提供される方法の一部の態様では、該方法は、(e)同定された抗体をコードする核酸の配列を決定する段階も含む。一部の態様では、核酸の配列を決定する段階は、核酸の増幅および／または配列決定を用いて実施される。一部の態様では、核酸の配列を決定する段階は、単一細胞PCRおよび核酸配列決定を用いて実施される。
【００５８】
本明細書に提供される方法の一部の態様では、該方法は、(f)同定された抗体またはそのフラグメントをコードする核酸の配列を含むポリヌクレオチドを細胞内に導入する段階も含む。
【００５９】
一部の態様では、提供される方法は、段階(a)の完了から約60日、50日、40日、30日、20日、19日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日、3日、2日または1日以内に完了する。
【００６０】
一部の態様では、提供される方法は、段階(a)の完了から約30日、20日、19日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日、3日、2日または1日以内に完了する。
【００６１】
本明細書に提供される方法を用いて同定された抗体、または該抗体の任意の抗原結合性フラグメントも、本明細書に提供される。一部の態様では、提供される抗体は、グラム陰性菌のBamA（β-バレルアセンブリー機構）の少なくとも1つの保存された領域またはドメインに存在するエピトープに結合する。
【００６２】
抗体またはその抗原結合性フラグメントも本明細書に提供され、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、グラム陰性菌のBamA（β-バレルアセンブリー機構）の少なくとも1つの保存された領域またはドメインに存在するエピトープに結合する。
【００６３】
提供される抗体またはその抗原結合性フラグメントの一部の態様では、グラム陰性菌は、アシネトバクター属の種である。一部の態様では、グラム陰性菌は、アシネトバクター・バウマニである。一部の態様では、保存された領域またはドメインは、A.バウマニATCC19606のBamAとA.バウマニ ATCC17978のBamAと間で共有される保存された領域またはドメインである。一部の態様では、保存された領域またはドメインは、SEQ ID NO:11に示されるA.バウマニのBamA配列の423〜438、440〜460、462〜502、504〜533、537〜544、547〜555、557〜561、599〜604、606〜644、646〜652、659〜700、702〜707、718〜723、735〜747、749〜760、784〜794、798〜804、806〜815および817〜841位のアミノ酸残基を含む。一部の態様では、保存された領域またはドメインは、SEQ ID NO:12〜20に示される配列を含む。
【００６４】
一部の態様では、エピトープは、保存された領域またはドメインの連続配列または不連続配列である。
【００６５】
一部の態様では、抗体または抗原結合性フラグメントは、ヒト型である。
【００６６】
一部の態様では、抗体または抗原結合性フラグメントは、ヒト化抗体である。一部の態様では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒト化抗体を産生するように操作されたトランスジェニック動物からの抗体産生細胞によって産生される。一部の態様では、抗体または抗原結合性フラグメントは、組換え型である。一部の態様では、抗体または抗原結合性フラグメントは、モノクローナルである。
【００６７】
一部の態様では、提供される抗体またはその抗原結合性フラグメントは、抗原結合性フラグメントである。
【００６８】
一部の態様では、提供される抗体またはその抗原結合性フラグメントは、アフィニティータグ、検出可能なタンパク質、プロテアーゼ切断配列、リンカーまたは非タンパク質性部分も含む。
【００６９】
一部の態様では、提供される抗体または抗原結合性フラグメントは、A.バウマニのBamAに対して400nM、300nM、200nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、もしくは1nMの、または400nM未満、300nM未満、200nM未満、100nM未満、50nM未満、40nM未満、30nM未満、25nM未満、20nM未満、19nM未満、18nM未満、17nM未満、16nM未満、15nM未満、14nM未満、13nM未満、12nM未満、11nM未満、10nM未満、9nM未満、8nM未満、7nM未満、6nM未満、5nM未満、4nM未満、3nM未満、2nM未満、もしくは1nM未満の、または約400nM未満、約300nM未満、約200nM未満、約100nM未満、約50nM未満、約40nM未満、約30nM未満、約25nM未満、約20nM未満、約19nM未満、約18nM未満、約17nM未満、約16nM未満、約15nM未満、約14nM未満、約13nM未満、約12nM未満、約11nM未満、約10nM未満、約9nM未満、約8nM未満、約7nM未満、約6nM未満、約5nM未満、約4nM未満、約3nM未満、約2nM未満、もしくは約1nM未満の平衡解離定数（KD）を有する。
【００７０】
本明細書に提供される抗体またはその抗原結合性フラグメントのいずれかをコードするポリヌクレオチドも、本明細書に提供される。
【００７１】
本明細書に提供される抗体またはその抗原結合性フラグメントのいずれかを含有する組成物も、本明細書に提供される。一部の態様では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤も含有する。
【００７２】
候補抗体産生細胞および標的微生物を各々含有する複数の微小滴を含有する組成物も、本明細書に提供される。一部の態様では、各微小滴は、固体支持体に結合している標的微生物もしくはそのエピトープ含有フラグメントまたはその変異体も含有する。一部の態様では、標的微生物は、レポーター分子をコードするポリヌクレオチドを含有する。
【００７３】
候補抗体産生細胞および標的微生物を各々含有するゲル微小滴のライブラリーも、本明細書に提供される。一部の態様では、各微小滴は、固体支持体に結合している標的微生物もしくはそのエピトープ含有フラグメントまたはその変異体も含有する。一部の態様では、標的微生物は、レポーター分子をコードするポリヌクレオチドを含有する。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】一部の局面において、抗体発現B細胞の供給源からのB細胞の濃縮、機能性抗体の選択および単一細胞クローニングを含む、提供される方法の態様の略図を提供する。一部の場合では、提供される方法は、迅速抗体発見（RAD）プラットフォームと名付けることができる。
【図２】RADプラットフォームにおける稀少なB細胞の濃縮の一態様の模式図を提供する。本方法では、1つの変異体で免疫し、保存されたエピトープだけを共通に有する第2の変異体を用いて濃縮することによって、関心対象の標的抗原上に高度に保存されたエピトープに対する抗体の濃縮が可能になる。例示的な標的をアミノ酸保存に従って網がけ表示する。薄い網がけ表示は可変領域に対応し、濃い網がけ表示は保存された領域に対応する。
【図３】機能性抗体の選択の態様を示す。病原体抗体Trap（PAT: Pathogen Antibody Trap）技法のこの態様では、稀少な抗体を産生している抗体分泌細胞の検出が可能になる。緑色蛍光シグナル（矢印が付いた薄い灰色の点）は、陽性のPAT内のビーズおよび細菌上に抗体の結合を見ることができることを指し示している。
【図４】BamAの相同性モデルを提供する。左欄はA.バウマニのBamAのリボン構造を示すのに対し、右欄は空間充填モデルを示す。アミノ酸は、A.バウマニ臨床単離株のパネルの中の保存に従って標識する。ループ4は、実質的に多様であるが、高度に保存されたエピトープが細胞外表面に見られる。薄い網がけ表示は可変領域に対応し、濃い網がけ表示は保存された領域に対応する。
【図５】BamA変異体を用いて例証する稀少なB細胞の増殖段階の態様の模式図を示す。B細胞のIgG特異分析における濃い点は、それぞれ抗体を分泌するB細胞を表す。BamA変異体2の特異分析における濃い点は、それぞれ保存されたエピトープに対する抗体を産生しているB細胞を表す。
【図６】図6A〜6Bは、機能性抗体の選択の免疫蛍光を示す。緑色蛍光（薄い灰色の点および矢印で指し示す）は、ヤギ抗マウス-AlexaFluor488からのシグナルを示し；矢印は、抗体と結合した細菌からのシグナルを示し；矢尻印は、抗体と結合したBamA被覆ビーズからのシグナルを示し；白枠の矢印は、未標識細菌からのシグナルを示し；白枠の矢尻印は、未標識抗原被覆ビーズからのシグナルを示す；スケールバー=25μm；図6Aに、細菌およびビーズの両方からの蛍光シグナルによって同定された、保存された表面露出BamAエピトープに対する抗体を分泌しているB細胞を含有する中心粒子を示す。図6Bに、ピペットチップ中の選択された単一粒子を示す。
【図７】BamAの高度に保存されたエピトープに対する組換え型抗体の結合性を示す。代表的なELISA曲線（2つ組の試料）。粒子のスクリーニングにおいて同定された組換え抗体が、陰性対照タンパク質（BSA）ではなく、3つのBamA変異体（変異体1、3および4）に特異的に結合することが示され、これは、エピトープがBamAの高度に保存された領域中にあることを指し示している。
【図８】提供される方法のある特定の態様に採用されたゲル封入スクリーニング方法論の様々な態様を示す略図である。
【図９】提供される方法のある特定の態様に採用されたゲル封入スクリーニング方法論の様々な態様を示す略図である。
【図１０】提供される方法のある特定の態様に採用されたゲル封入スクリーニング方法論の様々な態様を示す略図である。
【図１１】図11A〜11Cは、外膜（OM）ストレスに応答性のレポーターを用いた、細菌細胞と共に抗体産生細胞を含有する微小滴の検出を示す。蛍光シグナルは、OMの破壊および／またはOMストレスの存在を指し示す。
【図１２】LptD/LptEを標的とする9つのハイブリドーマ生成抗体のELISA結合アッセイからの光学密度（OD）測定値のヒストグラムを示す。ELISAを行って、1:50および1:250希釈のLptD/LptEに対する、ならびに1:50の陰性対照抗原（BamA）に対する結合性を評価した。
【図１３】図13Aおよび13Bは、BamA変異体5を差次的に発現しているA.バウマニ株に対する、BamA変異体1で免疫されたマウスから生成されたポリクローナル血清の細胞結合応答の蛍光シグナルのヒストグラムの重ね合わせを示す。図13Aに、表面にBamAを発現していないA.バウマニとの結合性を示す。図13Bに、BamA変異体5を発現しているA.バウマニとの結合性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
詳細な説明
微生物、例えば、細菌および他の感染因子のような病原性微生物に結合する抗体を同定するためのアッセイまたは方法が、本明細書に提供される。本明細書に提供される方法の一部の態様では、該方法は、標的微生物と結合する抗体を同定する段階を含む。一部の態様では、該方法は、(a)複数の候補抗体産生細胞を得る段階；(b)複数の候補抗体産生細胞を標的微生物と共にゲル微小滴中に封入する段階；および(c)ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、標的微生物と結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階であって、それにより、標的微生物に特異的に結合する抗体を同定する、段階を含む。特定の態様では、抗体は、標的細胞、細菌および他の感染因子の成長または増殖を阻害することが可能である。特定の態様では、抗体は、標的細胞、細菌および他の感染因子を殺傷する。
【００７６】
治療用抗体は、伝統的な小分子薬と比べて多くの利点を有し、治療用抗体を新興感染症の処置にとって魅力的な選択肢にする。抗体は、標的抗原に対して精巧な特異性を有し、そのことは、オフターゲット毒性のリスクを大きく減らす。この有益な安全性プロファイルは、新興感染症の大発生の間にしばしばリスクが最も高い小児集団および高齢集団に対し適切な予防的および治療的処置の選択肢ならびに安全域を可能にする。追加的に、大部分のヒト抗体は、予測可能なヒトクリアランスで長い半減期（約21日）を有し、そのことは、感染した個体における単回処置の選択肢も可能にし、さらに高リスク個体における予防的処置も可能にする。これらの好都合な抗体の性質は、感染症の大発生の間の速い応答に必須の、迅速な臨床開発経路も支援する。臨床開発が促進されるだけでなく、新しい抗体発見技法は、治療用抗体の同定を伝統的な小分子の発見よりも速くする。最後に、薬物の組み合わせが耐性を制限するが、潜在的薬物相互作用および予期しないオフターゲット毒性のせいで、小分子薬の組み合わせを迅速に開発することは困難であることが十分に立証されている。抗体は、耐性を制限しかつ効力の幅を広げる抗体カクテルをすぐに製剤化する可能性を与える。上記の理由で、ヒトまたはヒト化抗体は、感染症の処置に有用である。
【００７７】
伝統的に、所与の病原体の全ての臨床単離株を広く中和することができる単一の抗体を同定することは困難であった。これは、病原体が宿主免疫応答と「軍備競争」をしているからである。例えば、宿主免疫応答が機能性中和抗体によって支配される場合、病原体は、成功した病原体のままでいるために宿主防御を回避しなければならない。
【００７８】
病原体は、免疫優性抗体応答によって広く中和されることを回避するために2つの基本的な方法を利用する。第1に、病原体は、必須タンパク質上に高度に可変で免疫優性のエピトープを産生し、高度に可変のエピトープに対する多数の非機能性抗体を産生するよう宿主をだます。これらのエピトープは、宿主免疫応答の焦点を、より大きく保存された重要なエピトープから離すデコイとして作用する。第2に、病原体は、保存された機能性エピトープを容易にはアクセスできないようにすることによって保護するので、これらの重要なエピトープに結合する抗体の数が大きく減少する。これは、広域中和性抗体の頻度を極めて低くし、ハイブリドーマのような伝統的な抗体発見法を用いたときに、ほとんど発見不可能にする。このパラダイムの最近の例は、広域中和性A型インフルエンザ抗体の発見に関する文献に見出すことができる。免疫後または活動性インフルエンザ感染の途中に産出される抗体の大部分は、A型インフルエンザ表面の高度可変エピトープに結合する。したがって、抗体応答は、次の季節になると防御性でなく、個体はその生涯にわたり何回もインフルエンザに感染する。インフルエンザ表面の高度に保存されたエピトープは、数十年前に同定されたが、このエピトープと結合し、全てのA型インフルエンザを広く中和することができる抗体の発見を可能にした免疫学および分子生物学における最近の進歩まで、抗体は同定されなかった。
【００７９】
提供される方法は、変異体および標的微生物の種にわたり保存されたエピトープのような、関心対象のエピトープ含有フラグメントに特異的に結合する、関心対象の候補抗体産生細胞を迅速に生成、スクリーニングかつ同定するための効率的で効果的な方法を提供する。
【００８０】
I.  定義
特に定義しないかぎり、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、請求される主題が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一部の場合では、通常理解される意味を有する用語は、明確さおよび／または容易な言及のために本明細書において定義されるのであって、本明細書におけるそのような定義の包含は、当技術分野において一般的に理解されるものと比べた実質的な差を表すと必ずしも解釈すべきではない。
【００８１】
本明細書に使用される用語「有効量」は、所望の結果、例えば、抗原に対する増強した免疫応答、腫瘍の成長もしくは転移の減少、または腫瘍サイズの縮小を達成するために必要な投薬量および時間で有効な量を少なくとも表す。有効量は、1回または複数回の投与で提供することができる。
【００８２】
本明細書に使用される単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、特に示さないかぎり、複数の言及を含む。
【００８３】
本明細書における「約」が付いた値またはパラメーターへの言及は、本技術分野の当業者に容易に知られているそれぞれの値についての通常の誤差範囲を表す。特定の態様では、約への言及は、値またはパラメーターから上または下に10％以内の範囲を表し、一方で他の態様では、約への言及は、値またはパラメーターから上または下に5％または20％以内の範囲を表す。本明細書における「約」値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体に向けられた局面を含む（そして説明する）ものである。例えば、「約X」を言及する説明は、「X」の説明を含む。
【００８４】
本明細書に使用される用語「モジュレートすること」は、変化させることを意味し、典型的には対照と比較して統計的に有意または生理学的に有意な量の「増加させること」、「増強すること」、「誘導すること」または「刺激すること」のような正のモジュレートを行うこと、および「減少させること」、「阻害すること」または「縮小すること」のような負のモジュレートを行うことを含む。「増加した」、「刺激された」または「増強した」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、本明細書記載のような処置がないことにより、または対照処置により産生される量の1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍またはそれ以上（例えば500、1000倍）（1を超えるその間の全ての整数および小数点、例えば、1.5、1.6、1.7. 1.8などを含める）である増加を、その間の全ての整数を含めて含み得る。「減少した」、「阻害された」または「縮小した」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、本明細書記載のような処置がないことにより、または対照処置により産生される量における1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％）、80％）、85％、90％）、95％、または100％の減少を、その間の全ての整数を含めて含み得る。
【００８５】
「統計的に有意な」は、その結果が偶然起こる可能性が低かったことを意味する。統計的有意性は、当技術分野において公知の任意の方法によって決定することができる。
【００８６】
通常使用される有意性の尺度は、帰無仮説が真であった場合に、観察される事象が起こる頻度または確率であるp値を含む。得られたp値が有意水準よりも小さいならば、帰無仮説は棄却される。簡単な場合には、有意水準は、0.05以下のp値で定義される。
【００８７】
本明細書記載の発明の局面および態様は、局面および態様を「含むこと」、それらから「なること」および「本質的になること」を含むと理解される。
【００８８】
用語「抗体」および「免疫グロブリン」には、任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、Fab、Fv、scFv、およびFdフラグメントを非限定的に含めて、抗原への特異結合性を保持する抗体のフラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、ならびに抗体の抗原結合部分および非抗体タンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。抗体は、例えば放射性同位体、検出可能な産物を生成する酵素、蛍光タンパク質などで検出可能に標識され得る。抗体は、特異結合ペアのメンバー、例えばビオチン（ビオチン-アビジン特異結合ペアのメンバー）などの他の部分にさらにコンジュゲートされ得る。抗体はまた、ポリスチレンプレートまたはビーズなどを非限定的に含む固体支持体に結合し得る。該用語によって、Fab'、Fv、F(ab')2、および／または抗原への特異結合性を保持する他の抗体フラグメント、ならびにモノクローナル抗体も包含される。抗体は、例えばFv、Fab、および(Fab')2、ならびに二機能性(すなわち二重特異性）ハイブリッド抗体（例えばLanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)）および一本鎖(例えばHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988)およびBird et al., Science, 242, 423-426 (1988))を含む多様な他の形態で存在し得る。（一般的にHood et al., "Immunology", Benjamin, N.Y., 2nd ed. (1984)およびHunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986)を参照されたい）。無傷の抗体を含めたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびにフラグメント性抗原結合（Fab)フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント、組換え型IgG（rIgG)フラグメント、抗原と特異的に結合することが可能な重鎖可変（VH)領域、単鎖可変フラグメント（scFv)を含めた単鎖抗体フラグメント、ならびに単一ドメイン抗体（例えば、sdAb、sdFv、ナノボディー）フラグメントを含めた機能性（抗原結合性）抗体フラグメントも包含される。該用語は、細胞内抗体（intrabody）、ペプチボディー（peptibody）、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性、例えば二重特異性抗体、ダイアボディー（diabody）、トリアボディー（triabody）、およびテトラボディー（tetrabody）、タンデム型ジ-scFv、タンデム型トリ-scFvのような免疫グロブリンの遺伝子操作された形態および／またはその他の方法で改変された形態を包含する。特に述べないかぎり、用語「抗体」は、本明細書において「抗原結合性フラグメント」とも呼ばれるその機能性抗体フラグメントを包含すると理解すべきである。該用語は、IgGおよびそのサブクラス、IgM、IgE、IgA、ならびにIgDを含めた任意のクラスまたはサブクラスの抗体を含めた、無傷または完全長抗体も包含する。
【００８９】
本明細書に使用されるベクター（またはプラスミド）は、核酸の発現またはその複製のいずれかのために異種核酸を細胞内に導入するために使用される別個のエレメントを含む核酸構築物、典型的には環状DNAベクターを表す。ベクターは、典型的にはエピソーム性のままであるが、ゲノムの染色体への遺伝子またはその部分の安定組み込みを引き起こすように設計することができる。一部の場合では、ベクターは、宿主細胞DNAへのプラスミドの組み込みなしにプラスミドの多数のコピーを細菌細胞または真核細胞において産生させる複製起点を含む。そのようなベクターの選択および使用は、当業者に周知である。
【００９０】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）のような1本鎖および／または2本鎖ポリヌクレオチド、ならびにRNAまたはDNAのいずれかの類似体または誘導体を表すために互換的に使用される。ポリヌクレオチド分子の長さは、ヌクレオチド（「nt」と省略）または塩基対（「bp」と省略）を単位として本明細書に示される。ペプチド核酸（PNA）、ホスホロチオエートDNAのような核酸類似体、ならびに他のそのような類似体および誘導体も、用語「核酸」に含まれる。核酸は、例えばポリペプチド、調節性RNA、マイクロRNA、siRNAおよび機能性RNAのような遺伝子産物をコードすることができる。したがって、核酸分子は、cDNA、プラスミドまたはベクターならびに改変ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含めたDNAを含む全ての種類およびサイズのDNA分子を含むことが意味される。
【００９１】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを表すために互換的に使用され、最小長に限定されない。ポリペプチドは、天然および／または非天然アミノ酸残基を含めたアミノ酸残基を含み得る。該用語は、ポリペプチドの発現後改変、例えばグリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化なども含む。一部の局面では、タンパク質が所望の活性を維持するかぎり、ポリペプチドは、ネイティブな配列または天然配列に関する改変を含み得る。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるような意図的な場合があり、またはタンパク質を産生する宿主の変異もしくはPCR増幅が原因の誤りのように偶発的な場合がある。
【００９２】
本明細書に使用される、特異遺伝子への言及に使用される「調節配列」または「調節領域」は、遺伝子のコード領域の調節された発現を提供するために必要または十分なその遺伝子内のコードまたは非コード核酸制御配列を表す。したがって、該用語は、プロモーター配列、調節性タンパク質結合部位、上流の活性化因子配列などを包含する。調節領域内の特異ヌクレオチドは、複数の機能を果たし得る。例えば、特異ヌクレオチドは、プロモーターの部分であり、かつ転写活性化因子タンパク質の結合に関与し得る。
【００９３】
「機能的に連結される」は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター）と第2の核酸配列との間の機能連結を意味し、該発現制御配列が、第2の配列に対応する核酸の転写を指示する。
【００９４】
2種以上の核酸またはポリペプチド配列に関連する「同一な」率または「同一」率は、最大の類似性のために比較および整列されたときに、配列比較アルゴリズムを用いてまたは目視検査により決定された、それぞれ同じである、または同じ核酸残基もしくはアミノ酸残基の特定パーセンテージを有する2つ以上の配列を表す。参照アミノ酸配列に対する対象アミノ酸配列の「配列同一率」または「同一％」または「配列同一％」または「アミノ酸配列同一％」は、配列が最適に整列された場合に比較長にわたり対象アミノ酸配列が参照アミノ酸配列と特定パーセンテージだけ（すなわちアミノ酸-アミノ酸ベースで）同一であることを意味する。したがって、2つのアミノ酸配列に関して80％のアミノ酸配列同一性または80％の同一性は、2つの最適に整列されたアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の80％が同一であることを意味する。
【００９５】
本明細書に使用される用語「操作された」および「組換え型」の細胞または「組換え型」核酸分子は、少なくとも1つの融合タンパク質をコードするcDNAもしくは遺伝子のような外因性DNAセグメントもしくは遺伝子が導入された細胞、または外因性DNAセグメントもしくは遺伝子を含むそのような核酸分子を表すことが意図される。したがって、操作された細胞は、組換え導入された外因性DNAセグメントまたは遺伝子を含まない天然の細胞と識別可能である。したがって、操作された細胞は、ヒトの介入を経て導入された1つまたは複数の遺伝子を有する細胞である。組換え型細胞は、導入されたcDNAまたはゲノム遺伝子を有する細胞を含み、特定の導入遺伝子と天然では関連しないプロモーターに隣接して位置する遺伝子も含む。
【００９６】
本明細書に使用される「レポーター分子」は、直接もしくは間接的に検出可能な分子、またはその存在をその他の方法で測定することができる分子を表す。一部の局面では、レセプター分子は、蛍光シグナルのような検出可能なシグナルを発生することができるタンパク質、および検出可能な反応を触媒することができるまたは検出可能な産物の形成を触媒することができる酵素を含む。レポーター分子は、検出可能な核酸も含むことができる。一部の態様では、レポーター分子は、細胞で発現された場合に検出することができるポリペプチドである。一部の場合では、検出可能なレポーターの発現は、日常的な技法を用いて検出することができるシグナル、例えば蛍光シグナル、生物発光シグナルまたは比色シグナルの生成を導き得る。シグナルは、発現後にレポーターから直接、または標識抗体のような二次分子により間接的に生成され得る。
【００９７】
用語「レポーター細胞」および「レポーター微生物」は、レポーター分子をコードするcDNAまたは遺伝子のような外因性または異種ポリヌクレオチドが導入された操作された微生物を表すために互換的に使用される。したがって、レポーター細胞は、組換え導入された外因性ポリヌクレオチドを含まない天然の微生物と識別可能である。したがって、レポーター細胞は、ヒトの介入を介して導入された1つまたは複数の遺伝子を有する、かつ外因性レポーター分子を発現する細胞である。
【００９８】
本明細書に使用される、ポリヌクレオチドまたは遺伝子に関して異種（外因性または外来とも呼ばれる）は、該生物もしくはその中に含まれる遺伝子に本来存在しないヌクレオチド配列、または発現される元となる細菌のような生物によって通常はインビボ産生されないヌクレオチド配列を表す。
【００９９】
本明細書に使用されるキットは、追加的な試薬および組み合わせまたはその要素の使用のための説明書のような他の要素を任意で含む、パッケージされた組み合わせである。キットは、使用説明書を任意で含む。
【０１００】
本開示の実施は、特に示さないかぎり、当業者の技能の範囲内の細胞培養、分子生物学（組換え技法を含める）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技法を採用する。そのような技法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook et al., 2001) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (P. Herdewijn, ed., 2004); Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir & C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Manual of Clinical Laboratory Immunology (B. Detrick, N. R. Rose, and J. D. Folds eds., 2006); Immunochemical Protocols (J. Pound, ed., 2003); Lab Manual in Biochemistry: Immunology and Biotechnology (A. Nigam and A. Ayyagari, eds. 2007); Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques (Ivan Lefkovits, ed., 1996); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, eds., 1988);および他のような文献に十分に説明されている。
【０１０１】
本出願において参照された特許文書、科学論文およびデータベースを含めた全ての刊行物は、各個別の刊行物が個別に参照により組み入れられる場合と同じ程度に全ての目的のためにその全体として参照により組み入れられる。本明細書に示される定義が、参照により本明細書に組み入れられる特許、出願、公開された出願および他の刊行物に示される定義と正反対である、または他の点で矛盾するならば、本明細書に示される定義が、参照により本明細書に組み入れられる定義よりも優先される。
【０１０２】
本明細書において使用される節の見出しは、単に構成目的であり、説明される主題を限定するものと見なすべきではない。
【０１０３】
II.  病原体抗体トラップ技法（PAT）を用いた抗体スクリーニング方法
標的微生物と結合する抗体を同定するために抗体産生細胞を迅速および効果的にスクリーニングする方法が、本明細書に提供される。提供される方法は、抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞と、標的微生物および／または抗原とのゲル封入（例えば、ゲル微小環境における）を利用して、抗体産生B細胞および／または形質芽細胞が標的微生物、例えば、細菌もしくは真菌細胞の結合活性、挙動改変活性、または殺滅活性を有する抗体を産生する能力について該細胞を迅速にスクリーニングする。提供される方法は、所与の病原性微生物の全てまたは大部分の臨床単離株を広く中和することができる単一の抗体を同定するために、および従来の治療薬で処置することが困難な感染、例えば多剤耐性微生物を処置するのに有効な抗体を同定するために、特に有用である。
【０１０４】
本開示は、部分的に、細胞、細菌および他の感染因子、例えば微生物の表面に結合する抗体を同定するための方法および／またはアッセイに関する。特定の態様では、抗体は、標的細胞、細菌および他の感染因子の成長または増殖を阻害することが可能である。特定の態様では、抗体は、標的細胞、細菌および他の感染因子を殺傷する。
【０１０５】
一部の態様では、提供される方法は、従来方法を用いて同定することが困難な抗体を同定することができ、および／またはそれに対する抗体を産出することが困難なエピトープを標的とする抗体を同定することができる。例えば、一部の態様では、提供される方法は、必須でありかつ標的微生物の多くの変異体および／または種にわたり保存されているが、その抗体の同定または入手は困難である標的に対する抗体を同定することができる。一部の場合では、同定が困難であるのは、抗体もしくは抗体産生細胞を産生する従来の方法における、保存されたおよび必須のエピトープの妨害性、または抗体もしくは抗体産生細胞を産生する従来方法における、標的微生物の可変の免疫優性エピトープに対する抗体の優勢性に起因する。一部の態様では、提供される方法は、所望の標的微生物および／またはそのエピトープ含有フラグメントに対する抗体を産生する候補抗体産生細胞の効率的な生成および／またはスクリーニングを可能にし、それにより、関心対象の特異抗体の同定に必要な時間を短縮する。
【０１０６】
同定技法のための既存の方法は、数多くの制約を有する。現在のところB細胞は、B細胞によって産生される抗体に関する任意の結合データまたは機能データが得られる前にハイブリドーマ融合技法に供される。ハイブリドーマ融合技法は、途方もなく非効率であり、融合割合は、B細胞5000個あたり約1回である。したがって、免疫応答によって産生される抗体レパートリーの大部分は、抗体の結合性または機能について問い合わせまたは試験されていない。追加的に、B細胞ハイブリドーマの融合パートナーは、マウス以外の種について容易に入手することができず、そのことが、細菌または真菌細胞結合性で稀少な機能性抗体の単一ドナー動物種への探索を制限している。
【０１０７】
提供される方法は、ハイブリドーマ技法に頼らず、したがって、微生物、例えば細菌または真菌細胞と結合するまたはそれに対して表現型の改変を引き起こす抗体について全免疫レパートリーを検討することができる。これは、非常に稀少な抗体の発見を可能にし、ハイブリドーマ技法を用いてこれを実現することは不可能である。加えて、提供される方法は、ヒト、ラット、ニワトリ、ラマ、またはラクダを非限定的に含めた所望の任意の動物起源からB細胞および／または形質芽細胞をスクリーニング可能にする。
【０１０８】
提供される方法の特定の態様では、抗体選択段階は、濃縮された単一B細胞を含む単一の抗体分泌B細胞および／または形質芽細胞によって産生される抗体をスクリーニングするために、ゲル封入に基づく病原体抗体トラップ（PAT）技法と呼ばれるアプローチを用いる。特定の態様では、提供される方法は、抗体のクローニング、産生、および特徴付けという、より労働集約的な段階を行う前に、機能性抗体を産生する可能性が最も高いB細胞だけを選択できるようにする。
【０１０９】
ある特定の態様では、抗体産生細胞、例えばB細胞は、ゲル封入、例えばPAT技法を用いてスクリーニングされる。一部の態様では、PAT技法は、小さいアガロース微小滴内に単一の抗体分泌B細胞および／または形質芽細胞を封入することを特徴として備える。ある特定の態様では、PAT微小滴は、サイズが均一である。
【０１１０】
標的微生物と結合する抗体を同定するための提供される方法は、複数の候補産生細胞と、特定の標的微生物、例えば病原性微生物、またはそのエピトープ含有フラグメント、例えば抗原とのゲル微小封入を使用する段階を含む。一部の態様では、該方法は、複数の候補抗体産生細胞を得る段階；複数の候補抗体産生細胞を標的微生物と共にゲル微小滴中に封入する段階；およびゲル微小滴内の抗体産生細胞が、標的微生物と結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階であって、それにより、標的微生物に特異的に結合する抗体を同定する、段階を含む。
【０１１１】
任意の微生物、例えば病原体、例えば任意の細菌または真菌種をゲル微小環境内に封入し、提供される方法によりスクリーニングプロトコールに供することができる。例示的な病原体を本明細書に記載する。
【０１１２】
特定の態様では、細胞表面に露出したタンパク質、炭水化物、脂質部分、またはその任意の組み合わせに結合する抗体を同定するために、本発明の技法が用いられ得る。
【０１１３】
一部の場合では、関心対象の免疫防御タンパク質、例えば標的微生物からのエピトープ含有フラグメントとコンジュゲートしたビーズをアガロース微小滴内に同時封入することができる。提供される方法は、同じアガロース微小滴内に同時封入してPAT封入をもたらすことができる微生物、例えば細菌細胞のような病原体を用いて実施することができることが、本明細書において見出されている。図3に示すように、抗体産生細胞、例えばハイブリドーマ細胞と、抗原コンジュゲート型ビーズ（例えば、標的微生物のエピトープ含有フラグメントとコンジュゲートしたビーズ）および微生物（例えば細菌細胞）の一方または両方のいずれかとを封入して、ビーズ上または細菌表面の抗原（例えばBamA）に結合する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を同定することが可能である。提供される方法を用いて、抗原と結合しない抗体を産生しているハイブリドーマ細胞と非常に低い細胞数（frequency）で混合した後であっても、抗原結合性クローンを容易に検出することができる。
【０１１４】
したがって、一部の態様では、該方法は、標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体を微小滴中に封入する段階；および標的微生物と結合すると同定された抗体産生細胞が、同じゲル微小滴内のそのエピトープ含有フラグメントとも結合するかどうかを判定する段階をさらに含む。
【０１１５】
ある特定の態様では、所望の抗体の存在は、視覚的に、例えば蛍光顕微鏡法によって判定される。一部の態様では、PATは、一次抗体が標的タンパク質に対して特異性を有して結合するかどうかを視覚化および判定するために蛍光二次抗体で染色される。低倍率蛍光顕微鏡法を用いると、分泌された抗体が認識される抗原に結合するかどうかの点状蛍光スポットをPAT内に見ることができる。一部の態様では、分泌された抗体の結合性は、ビーズにコンジュゲートした免疫防御タンパク質および病原体表面の標的タンパク質に対して検出される。一部のそのような場合に、抗原とコンジュゲートしたビーズ（例えば、標的微生物のエピトープ含有フラグメントとコンジュゲートしたビーズ）および病原体表面に抗体が結合することは、抗体が標的特異的であり、かつ病原体の表面の天然免疫防御タンパク質を認識することができるという非常に高い信頼を与える。
【０１１６】
特定の態様では、抗体を機能的にスクリーニングして、標的を阻害する、例えば標的微生物の成長または増殖を阻害する抗体を直接同定するために、PAT技法が使用される。
【０１１７】
一部の局面では、発見プラットフォームの次の相におけるクローニングのために、関心対象の陽性B細胞を含有するPATを簡単に選択することができる。ヒトの眼は、陰性のPATにおけるシグナルの欠如から陽性のPAT内の蛍光シグナルを非常に迅速に見分けることができるので、PAT技法を用いて1人の科学者が数十万個のB細胞を素早くスクリーニングすることができる。興味深いことに、PAT法は、FACSのような液体分離システムよりもずっと高い効率であり、その結果、関心対象の稀少な抗体を見出すために有意に多数のB細胞をスクリーニングすることができる。
【０１１８】
一部の態様では、提供される方法は、数千〜数百万個またはそれ以上のゲルに封入された抗体産生細胞のハイスループットスクリーニングを用いて実施され得る。一部の態様では、数百万個のB細胞をPAT封入し、提供される方法を用いて1回の発見実験の間にスクリーニングすることができる。ある特定の態様では、封入後、抗体がスクリーニングおよび選択される前に、B細胞に、抗体をアガロース小滴内に数時間分泌させる。本明細書記載の方法の態様を用いて、病原体の、例えば細菌または真菌の細胞の結合性または機能性抗体について数百万個の抗体分泌B細胞を迅速にスクリーニングすることができる。
【０１１９】
一部の態様では、1日あたり少なくとも100万個のB細胞がスクリーニングされ得る。ある特定の態様では、該方法は、PATスクリーニング1回あたり約100種の抗体のクローニングを可能にする。ある特定の態様では、該方法は、PATスクリーニング1回あたり約100種の抗体のトランスフェクション、精製、インビトロ効力分析を可能にする。
【０１２０】
本開示の特定の態様は、稀少なB細胞の濃縮、機能性抗体の選択に続いて、単一B細胞クローニングを統合する現状技術の抗体発見プラットフォームに向けられており、該プラットフォームは、迅速抗体発見（RAD: Rapid Antibody Discovery）プラットフォームと名付けることができる。このプラットフォームは、最も高度に保存された重要な標的タンパク質エピトープに結合する機能性ヒト抗体の大型パネルの迅速な増大、選択、および発見を可能にする。
【０１２１】
ある特定の態様では、本開示は、標的微生物、例えば病原体またはそのエピトープ含有フラグメントに特異的に結合する抗体を同定するための方法であって、(a)標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメントに感染したまたはそれで免疫された動物から得られた抗体産生細胞を、該抗体産生細胞を免疫無防備状態の動物に導入することによって増殖させる段階；(b)段階(a)に続いて免疫無防備状態の動物から得られた抗体産生細胞を、標的病原体および／またはそのエピトープ含有フラグメントと一緒にゲル微小滴中に封入する段階であって、複数のゲル微小滴が、1つの抗体産生細胞だけを含む段階；および(c)ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する標的病原体および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階であって、それにより、標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメントに特異的に結合する抗体を同定する、段階を含む、方法を含む。
【０１２２】
本明細書に提供される方法の一部の態様では、該方法は、特異的な標的微生物または標的微生物の抗原もしくはエピトープに対する抗体を産生する稀少な抗体産生細胞のインビボ濃縮または増殖のための段階を含む。例えば、一部の態様では、複数の候補抗体産生細胞は、(i)標的微生物もしくは標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体に曝露されたことのあるドナーから得られた抗体産生細胞を、該抗体産生細胞を免疫無防備状態の動物に導入することによって増殖させる段階；および(ii)増殖した抗体産生細胞を回収する段階であって、それにより、複数の候補抗体産生細胞を得る、段階を含む、方法によって得られる。一部の態様では、そのような段階は、関心対象の稀少な抗体産生細胞を濃縮するまたは増殖させるために使用することができる。
【０１２３】
ある特定の態様では、提供される方法の特定の態様、例えば抗体産生細胞をスクリーニングするための方法は、以下の段階の1つまたは複数を含む：関心対象の標的に対するヒト化抗体またはヒト抗体を産生するB細胞および／または形質芽細胞の生成；2)望ましい抗体が濃縮された細胞を得るための、例えばインビボ濃縮、例えばSCID増殖を用いたB細胞および／または形質芽細胞、例えば稀少なB細胞の増殖；3)単一のB細胞を関心対象の抗原および病原体と共に封入して、最も高い能力のB細胞を選択するためのゲル封入方法論；および単一B細胞クローニング。ある特定の態様では、ヒトの眼は、抗体産生細胞をスクリーニングするための提供される方法におけるシグナルの同定に、FACSのような自動化システムよりも巧妙であり得る。したがって、ある特定の態様では、関心対象の細胞、例えば標的微生物に特異的に結合する抗体を産生する細胞を含有するゲル微小滴を迅速に同定および選択するために蛍光顕微鏡法が採用される。
【０１２４】
本方法は、より労働集約的な、抗体発見の下流の段階に従事する前に最も高い治療能力の抗体の濃縮を可能にするプラットフォームを提供する。したがって、特定の態様では、稀少なB細胞の濃縮相は、所望の機能性活性を有する抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞の大型パネルを素早く生成させることを可能にし、かつ治療用抗体候補および有効な治療用抗体を成功裏に生成させる機会を大きく向上させる。
【０１２５】
特定の態様では、抗体産生細胞をスクリーニングするための提供される方法、例えば迅速抗体発見(RAD）プラットフォームは、感染症を処置するための治療用抗体の発見のために使用される。緑膿菌およびアシネトバクター・バウマニによって引き起こされる、最も処置が困難な感染症を標的とする殺菌抗体は、提供される方法に従って生成され得る。提供される方法を用いて、従来の治療法によって処置が困難な感染に関与する微生物に対して有効な抗体を迅速に生成および同定することができる。
【０１２６】
ある特定の態様では、必須の外膜タンパク質BamAおよびLptDの高度に保存されたエピトープに結合することによって細菌を直接殺傷する高親和性ヒト抗体を生成させるために、提供される方法が使用される。本明細書記載の最初の実験は、抗体の結合性に利用可能であり、細菌の健康（fitness）および生存に必須であるとして、これらの例示的な標的抗原の実験的証拠および検証を示した。
【０１２７】
プラットフォームは、任意の標的に対する抗体の発見に適するものの、それは、ヒトの健康に重大な脅威を生み出す感染症に迅速に応答するために特によく適している。一部の態様では、提供される方法は、抗体を同定する従来方法よりも実質的に短い時間で特定の抗体を同定するすることができる。例えば一部の態様では、該方法は、候補抗体産生細胞を得る段階から約60日、50日、40日、30日、20日、19日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日、3日、2日または1日以内に完了する。一部の態様では、該方法は、候補抗体産生細胞を得る段階から約30日、20日、19日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日、3日、2日または1日以内に完了する。具体的には、提供される方法、例えば抗体発見プラットフォーム技法の特定の態様を、3つの期、すなわち稀少なB細胞の濃縮（例えば約10日）、機能性抗体の選択（例えば約1日）、および単一B細胞クローニング（例えば約7日）に分割することができ、これらより、B細胞抽出から治療用抗体候補の同定まで合計で約18日かかると考えられる（例えば図1参照）。
【０１２８】
一部の態様では、提供される方法は、標的微生物に特異的に結合する抗体を同定する段階を含む。一部の態様では、該方法は、同定された抗体を産生する細胞を含む微小滴を単離する段階または標的微生物もしくはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合すると同定された抗体をコードするポリヌクレオチドを単離する段階をさらに含む。一部の態様では、該方法は、同定された抗体をコードする核酸の配列を決定する段階をさらに含む。一部の態様では、関心対象の抗体を産生する抗体産生細胞の単離および関心対象の抗体をコードする配列の決定は、核酸増幅方法および／または配列決定方法を用いて行うことができる。例えば、一部の態様では、単離および配列決定のために単一細胞PCRおよびクローニングが使用される。ある特定の態様では、抗体産生細胞をスクリーニングするための方法の単一B細胞クローニング相は、提供される方法の、選択されたゲル微小滴内に産生される抗体をコードする重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を効率的にPCR増幅する能力を利用する。特定の態様では、PCRは、PCRの前に7日のB細胞を増やす段階の必要性を回避して単一細胞レベルで行われる。追加的に、単一細胞PCRは、ハイブリドーマ融合パートナーの必要を取り除き、そのことは、ヒトを含めた任意の動物B細胞起源からの抗体の発見を可能にする。提供される方法は、濃縮されたB細胞および／または形質芽細胞のプールから、最大潜在性のB細胞および／または形質芽細胞を選択すること、ならびにそれらの抗体をコードする核酸のPCR増幅を開始することへの進展をわずか数時間で可能にする。
【０１２９】
抗体産生細胞をスクリーニングするための提供される方法は、伝統的な抗体発見プラットフォームと比べて多くの利点を与える。第1に該方法は、天然の完全ヒト抗体の発見を可能にし、したがって一部の場合ではヒト化の必要を取り除き、最終的に開発スケジュールの迅速化を可能にする。第2にこれらの方法は、微生物の最も重要なエピトープ、例えば関心対象の免疫防御タンパク質、例えば関心対象の抗原またはエピトープに対する抗体を産生するB細胞および／または形質芽細胞の増殖および濃縮を可能にする。第3に、ゲル封入技法は、抗体をコードする遺伝子をクローニングすることに貴重な時間および資源を投じる前に、抗原特異性および結合性について試験することを可能にする。加えて、直鎖DNAトランスフェクション技法と連結した単一B細胞クローニング技法は、伝統的な抗体発見方法と比較して必要な時間を有意に短縮する。したがって、抗体産生細胞をスクリーニングするための提供される方法は、微生物の最も高度に保存された重要なエピトープ、例えば免疫防御タンパク質標的、例えば関心対象の抗原またはエピトープと結合すると検証された完全ヒト抗体のパネルを約18日で作ることができる。これは、抗体のパネルが標的抗原またはエピトープと結合することが検証される前に、典型的には少なくとも2ヶ月かかる伝統的なマウスハイブリドーマ技法よりもずっと速い。提供される方法によって同定された抗体は、最も優位なB細胞クローンだけからの、したがって非機能性である可能性があるハイブリドーマ抗体のパネルよりも顕著な利点を有する。追加的に、ハイブリドーマ抗体は、発見後になお長期にわたるヒト化工程を受ける必要がある。このことは、抗体産生細胞をスクリーニングするための提供される方法が、新興感染症の脅威に対処する場合にかなりの時間（約4ヶ月）をいかに節約するかを例証している。
【０１３０】
抗体産生細胞をスクリーニングするための提供される方法は、新興感染に応答する能力におけるギャップを埋めることができる。抗体治療薬は、広い臨床適用性を提供し、小児集団および他の特別な集団の要求を満たすことができる安全性プロファイルを与える。他の抗体生成技法とは異なり、抗体産生細胞をスクリーニングするための提供される方法は、B細胞からクローニング済み抗体に至る非常に短い生産サイクルを有する。このことは、利用可能な分子ツールがほとんどない、以前は知られていなかった病因の疾患に対処するために、該方法を適切なものにする。特に関連性があるのは、感染した新興疾患の犠牲者または回復した犠牲者が、提供される方法を用いてスクリーニングするための抗体産生細胞、例えばB細胞を提供することができるという事実である。さらに、提供される方法の並外れた選択能力は、治療可能性を欠いている抗体であふれていることが原因で他の方法では見逃してしまう稀少な抗体を同定することができる。
【０１３１】
一局面では、提供される方法は、治療候補の迅速生成が多数の感染症の脅威と立ち向かえるようにする抗体発見プラットフォームを含む。上記のように、提供される方法により関心対象の抗体を同定するために必要な時間は、関心対象の抗体を同定するために既存の方法を用いた場合よりも実質的に短い。さらに、提供される方法は、関心対象の保存されたエピトープに結合する稀少な抗体の同定を可能にするが、これは、微生物に免疫優性の超可変エピトープが存在するせいで、既存の方法を用いては困難である。またこの技法を用いて、細菌または真菌細胞を標的とするそのような抗体を同定し得る。特定の態様では、プラットフォームは、多剤耐性グラム陰性菌に対して内因性殺菌活性を有する抗体を生成させるために使用される。特定の態様では、本発明の方法は、BamAまたはLptDに特異的に結合する抗体を同定および入手するために使用される。
【０１３２】
抗体産生細胞をスクリーニングするための提供される方法の利点は、以下を非限定的に含む：
・治療用抗体の安全性、特異性、および薬物動態特性が、感染症対策の迅速開発に適している
・高い特異性および低いオフターゲット毒性ポテンシャルが、抗体を小児および高齢者のような高リスク患者集団に理想的な治療にする
・抗体産生細胞をスクリーニングするための提供される方法が、重要なエピトープに対する治療用抗体の生成を可能にするが、これは、伝統的なハイブリドーマまたはファージ抗体アプローチでは不可能である
・稀少な細胞のインビボ濃縮、例えば、稀少な機能性抗体のSCIDマウス増殖が、免疫レパートリー全体の多様性を解除する（unlock）
・抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞を含むゲル微小滴のスクリーニングが、多数の単一細胞を問い合わせる流体システムよりも速い
・単一B細胞クローニングが、融合パートナーの必要を取り除き、任意の細胞源からのヒト抗体の発見を可能にし；単一B細胞クローニングが、適正な重鎖と軽鎖との対形成を確実にし、これは、ファージディスプレイでは不可能である。
【０１３３】
A.  候補抗体産生細胞
本明細書に提供される方法の態様のいずれにおいても、スクリーニングおよび同定されるべき複数の候補抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞は、ドナー動物および／または改変された細胞のような多様な起源からのものであることができる。一部の態様では、候補抗体産生細胞は、標的微生物もしくはそのエピトープ含有フラグメントもしくはその変異体および／またはその任意の組み合わせに曝露されたことのあるドナー、例えば動物から得られる。例えば一部の態様では、抗体産生細胞は、標的抗原もしくはそのエピトープもしくは変異体、標的抗原もしくはそのエピトープもしくは変異体を発現する関心対象の微生物、および／またはその任意の組み合わせもしくは混合物で免疫されたことのある、またはそれに感染したことのあるドナー、例えば動物から得られる。
【０１３４】
ある特定の態様では、標的微生物、例えば病原体、またはそのエピトープ含有フラグメントに感染したまたはそれで免疫された動物から得られ、かつ増殖された抗体産生細胞は、末梢血単核細胞（PBMC）またはB細胞または形質芽細胞である。
【０１３５】
ある特定の態様では、抗体産生細胞は、病原体に感染したまたは病原体もしくはそのエピトープ含有フラグメントで免疫されたヒトまたは他の動物ドナーから得られる。一部の態様では、ドナーは、哺乳動物または鳥類である。一部の態様では、ドナーは、ヒト、マウスまたはニワトリである。
【０１３６】
特定の態様では、ヒト抗体を産生するB細胞は、標的病原体で免疫された、または標的病原体に感染したヒトまたはヒト化動物、例えばマウスまたはニワトリから得られる。特定の態様では、病原体は、細菌、ウイルスまたは他の微生物である。一部の態様では、ドナーは、微生物に感染したヒトドナーである。
【０１３７】
ある特定の態様では、標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメントに感染した、またはそれで免疫された動物は、部分ヒト抗体または完全ヒト抗体を産生する遺伝子改変非ヒト動物である。そのような動物は、当技術分野において公知および利用可能であり、例えば、染色体導入（transchromosomic）ウシおよびTrianniトランスジェニックマウスなどのトランスジェニックげっ歯動物、およびCrystal Biosciences製のHuMabニワトリのようなトランスジェニックニワトリを非限定的に含む。
【０１３８】
一部の態様では、抗体産生細胞は、改変された、例えば遺伝的または物理的に改変された細胞であった細胞である。一部の態様では、抗体産生細胞は融合細胞、例えばハイブリドーマである。一部の態様では、抗体産生細胞は改変されていない。
【０１３９】
一部の態様では、抗体産生細胞の濃縮が採用される。一部の態様では、抗原（例えば標的微生物のエピトープ含有フラグメント）と複合体形成した抗体産生細胞をSCIDマウスのような免疫無防備状態の動物に導入することによって濃縮を実施することができる。ある特定の態様では、標的病原体と結合する抗体を産生するB細胞および／または形質芽細胞は、SCID動物のような免疫無防備状態の動物、例えばマウスに標的抗原を導入することによって産生される。特定の態様では、抗原は、脾臓注射または尾静脈注射によってSCID動物に導入される。B細胞の濃縮および増殖方法を含む例示的な方法を下の第III節にさらに説明する。
【０１４０】
ある特定の態様では、免疫無防備状態の動物は、重症複合免疫不全症（SCID）を有するげっ歯動物、例えばSCIDマウスである。本発明により使用され得る免疫無防備状態の動物の例には、米国特許出願公開第2014/0134638号、Depraeter et al. (2001) J. Immunology 166:2929-2936、PCT特許出願公開WO1999/60846、および米国特許第5,663,481号に記載されているものが非限定的に含まれる。
【０１４１】
ある特定の態様では、稀少な抗体を、例えば稀少細胞のインビボ濃縮段階によって同定するために、該方法を用いて、抗原特異的形質芽細胞またはB細胞が濃縮される。特定の態様では、抗体産生細胞を含めたドナー動物からの細胞、例えば、末梢血白血球またはPBMCが、抗原（例えば標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメント）と一緒に動物の脾臓に移植されることによって免疫無防備状態の動物に導入される。他の態様では、それらは、単独または標的病原体もしくはそのエピトープ含有フラグメントと組み合わせてのいずれかで免疫無防備状態の動物に非経口的に、例えば尾静脈注射によるなどの静脈内に導入される。ある特定の態様では、抗体産生細胞は、免疫無防備状態の動物に導入する前に標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメントと共にインキュベートされる。
【０１４２】
一部の態様では、複数の候補抗体産生細胞は、抗体産生細胞のライブラリー、例えばB細胞ライブラリーまたは組換え抗体産生細胞ライブラリーから得られる。
【０１４３】
B.  標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメント
提供される方法を用いて、標的微生物と結合する抗体を迅速および特異的に同定することができる。特に、提供される方法は、関心対象の微生物、抗原またはエピトープを特異的に標的とする抗体を産生する稀少な抗体産生細胞を見い出す困難さが原因で、抗体の同定ために用いられる既存の方法が無効、非効率および／または非特異的であった、標的微生物および／もしくはそのエピトープ含有フラグメントまたはその抗原にとって有用である。
【０１４４】
一部の態様では、該方法は、複数の候補抗体産生細胞を標的微生物と共にゲル微小滴中に封入する段階を含む。
【０１４５】
提供される方法を用いて、関心対象の任意の微生物を標的とする抗体を同定することができる。例えば、標的微生物は、病原性微生物、例えば病原体であることができる。標的微生物は、原核生物、真核生物またはウイルスであることができる。標的微生物は、単細胞性または多細胞性であることができる。本発明の方法の様々な態様では、病原体は、本明細書に記載された微生物のいずれかを非限定的に含めた微生物である。特定の態様では、微生物は、細菌または真菌である。一部の態様では、病原体は、細菌、真菌、寄生虫またはウイルスである。
【０１４６】
本発明の対象となる細胞の例には、エシェリキア属、クレブシエラ属、アセニトバクター属（Acenitobacter）、エンテロバクター属、シュードモナス属、フランシセラ属、バークホルデリア属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、アスペルギルス属、およびコクシジウム亜綱の種が非限定的に含まれる。
【０１４７】
一部の態様では、標的微生物は細菌、例えばグラム陰性菌である。一部の態様では、細菌は、プロテオバクテリアである。例えば一部の態様では、標的微生物は、アシネトバクター属、デロビブリオ属、バークホルデリア属、クラミジア属、エンテロバクター属、エシェリキア属、フランシセラ属、ヘモフィルス属、ヘリコバクター属、クレブシエラ属、レジオネラ属、モラクセラ属、ナイセリア属、パンテア属、シュードモナス属、サルモネラ属、シゲラ属、ステノトロホモナス属、ビブリオ属およびエルシニア属の種の中より選択される。
【０１４８】
一部の態様では、微生物は、アシネトバクター・アピス、アシネトバクター・バウマニ、アシネトバクター・バイリイ、アシネトバクター・ベイジェリンキイ、アシネトバクター・ベレジニエ、アシネトバクター・ボヘミカス、アシネトバクター・ボイシエリ、アシネトバクター・ボウベティイ、アシネトバクター・ブリソウィイ、アシネトバクター・カルコアセティカス、アシネトバクター・ガンデンシス、アシネトバクター・ゲルネリ、アシネトバクター・ガンドンジェンシス、アシネトバクター・ギロウイエ、アシネトバクター・ジレンベルジイ、アシネトバクター・ヘモリティカス、アシネトバクター・ハービネンシス、アシネトバクター・インディカス、アシネトバクター・ジョンソニイ、アシネトバクター・ジュニイ、アシネトバクター・クーキイ、アシネトバクター・ルヴォフィイ、アシネトバクター・ネクタリス、アシネトバクター・ノソコミアリス、アシネトバクター・パキスタネンシス、アシネトバクター・パルブス、アシネトバクター・ピティイ、アシネトバクター・ピッティイ、アシネトバクター・プヤンジェンシス、アシネトバクター・キンフェンジェンシス、アシネトバクター・ラジオレジスタンス、アシネトバクター・ラジオレジステンス、アシネトバクター・ルディス、アシネトバクター・シンドレリ、アシネトバクター・セイフェルティイ、アシネトバクター・ソリ、アシネトバクター・タンドイイ、アシネトバクター・チェルンベルギエ、アシネトバクター・タウネリ、アシネトバクター・ウルシンギイ、アシネトバクター・バリアビリス、アシネトバクター・ベネチアヌス、大腸菌、インフルエンザ菌、肺炎桿菌、緑膿菌、ネズミチフス菌、ボイド赤痢菌、志賀赤痢菌、フレクスナー赤痢菌、ソンネ赤痢菌、コレラ菌およびペスト菌の中より選択される。一部の態様では、病原体は、アシネトバクター・バウマニである。
【０１４９】
一部の態様では、標的微生物は多剤耐性微生物である。本明細書に提供される方法の態様のいずれかを用いて、標的微生物を標的とする抗体を迅速および効果的に同定し、それにより、多剤耐性標的微生物が感受性である新しい治療剤の同定を可能にすることができる。一部の態様では、標的微生物は、多剤耐性グラム陰性菌である。
【０１５０】
本明細書に提供される方法のいずれかでは、同定されるべき抗体は、標的微生物、特に標的微生物のエピトープ含有フラグメントと結合する。例えば一部の態様では、抗体は、標的微生物または特に標的微生物表面のエピトープに発現される抗原に結合する。
【０１５１】
一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、免疫分子、例えば抗体または免疫レセプターによって認識される抗原決定基を含むエピトープを含む細胞の任意のフラグメントまたは細胞の部分であることができる。例えば一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは抗原である。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、エピトープ、または抗原のフラグメントもしくは部分である。
【０１５２】
一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、タンパク質もしくはポリペプチドまたはそのフラグメントである。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リン脂質、糖脂質、リポ多糖、核酸、多糖および／またはそれらの組み合わせのうちの1種類または複数種類の中より選択される。
【０１５３】
一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、微生物の表面に存在する。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、同定された抗体によって生きた微生物上で到達可能であり、例えば微生物表面の抗原またはエピトープに結合する。例えば、一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、細菌外膜（OM）タンパク質、膜タンパク質、エンベロープタンパク質、細胞壁タンパク質、表面脂質、糖脂質（例えばリポ多糖）、糖タンパク質、表面多糖（例えば莢膜）、表面付属器（例えば鞭毛または線毛）、単分子表面層（例えばS層）、またはその任意のエピトープ、部分もしくはフラグメント、またはそれらの組み合わせの中より選択される。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、標的微生物の外膜（OM）、細胞壁またはエンベロープと関連する。一部の態様では、標的微生物はグラム陰性菌であり、エピトープ含有フラグメントは、OMタンパク質である。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、OMの細胞外側と関連する。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、ウイルスのエンベロープ、または細菌もしくは真菌の細胞壁と関連する。
【０１５４】
一部の態様では、微生物のエピトープ含有フラグメント、例えば抗原は、標的微生物の必須の成分である。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントを含む抗原は、標的微生物における必須タンパク質である。一部の態様では、抗原またはエピトープ含有フラグメントに対する、本明細書に提供される方法を用いて同定された抗体の結合性は、微生物の必須の成分であるエピトープ含有フラグメントの機能の遮断、低下、阻止、変更および／または阻害を招き、それにより、標的微生物における必須の機能を妨害し、標的微生物を、該抗体を用いた治療的介入に感受性にすることができる。
【０１５５】
一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、グラム陰性菌のOMタンパク質を含む。OMタンパク質は、栄養素の取り込み、細胞接着、細胞シグナル伝達および老廃物の搬出を含めた、標的微生物に必須の機能に役立つ、完全内在性膜タンパク質である。一部の標的微生物では、OMタンパク質は、栄養素の捕捉および宿主防御メカニズムの回避のための病原性因子としても役立つ。一部の場合では、例えば抗体の結合により、グラム陰性菌における必須のOMタンパク質の機能を妨害することは、細菌を殺傷するまたはその成長を激しく阻害することができる。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、BamA、LptD、AdeC、AdeK、BtuB、FadL、FecA、FepA、FhaC、FhuA、LamB、MepC、MexA、NalP、NmpC、NspA、NupA、Omp117、Omp121、Omp200、Omp71、OmpA、OmpC、OmpF、OmpG、OmpT、OmpW、OpcA、OprA、OprB、OprF、OprJ、OprM、OprN、OstA、PagL、PagP、PhoE、PldA、PorA、PorB、PorD、PorP、SmeC、SmeF、SrpC、SucY、TolC、TtgCおよびTtgFの中より選択されるOMタンパク質を含む。
【０１５６】
抗体発見のための標的微生物、抗原および／またはエピトープを選択するために、新しい標的感染症に焦点を合わせた新しい治療用抗体の発見の努力を開始するときに、典型的には4つの主要な考慮事項がある。第1に、関心対象の微生物、例えば病原体内の選択された標的抗原またはエピトープは、病原体の健康または生存に必須でなければならない。第2に、標的が抗体治療薬に到達可能であることが必要である。第3に、抗体の結合の対象となるエピトープは、病原体の最も蔓延している臨床単離株にわたり高度に保存されていなければならない。最後に、保存されたエピトープへの抗体の結合が必須標的の阻害にどのように変わるかについて強い根拠が開発されるべきである。一部の態様では、上記の4つの基準を満たす標的微生物のエピトープ結合性フラグメント、例えばA.バウマニにおける抗体発見プロジェクトのためのエピトープ結合性フラグメントは、BamAである。
【０１５７】
特定の態様では、提供される方法を用いて、多剤耐性グラム陰性菌に対して内因性殺菌活性を有する抗体を生成させることができる。一部の態様では、そのような抗体は、抗体の会合に到達可能な標的であって、それに対する阻害が細胞に致命的な標的を必要とする。グラム陰性菌表面に必須タンパク質をコードすることが公知の2つの遺伝子、すなわちBamA（β-バレルアセンブリー機構）およびLptD（リポ多糖輸送）の最近の特徴付けは、殺菌性抗体の発見のためのそのような機会を生み出す。一部の態様では、標的微生物のエピトープ結合性フラグメントは、BamAもしくはLptDである、またはBamAもしくはLptDを含む。
【０１５８】
大腸菌におけるLptDまたはBamAのいずれかの枯渇は、グラム陰性菌における必須オルガネラである外膜の集合を止め、それにより、細胞死を引き起こす。LptDおよびBamAは、両方とも外膜新生に重大な役割を果たす内在性外膜（OM）βバレルタンパク質である。BamAは、周辺質にある5つのポリペプチド輸送関連（POTRA）ドメインを有する16本鎖βバレルである。LptDは、細胞表面へのリポ多糖の搬出における最終段階を触媒する一方で、BamAは、LptDを含めた全ての外膜タンパク質をフォールディングするために必要である。LptDは、リポタンパク質LptEと複合体を形成してOMにおいて複合体を形成する。LptDの抗体阻害は、外膜におけるLPSレベルを減少させ、これが伝統的な抗生物質または細胞死に対する劇的な感作を引き起こす。BamAの抗体阻害は、外膜タンパク質のフォールディングを遮断し、それにより、外膜の必須の機能を劇的に損なう。LptDおよびBamAは、グラム陰性菌種の間で広範に分布し、そのことが、これらの標的を阻害する抗体が広範囲のグラム陰性病原体に関連することもできる可能性を高め、グラム陰性菌感染が処置される方法におけるパラダイムシフトに繋がっている。
【０１５９】
一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、A.バウマニのBamAを含む。ある特定の態様では、エピトープ含有フラグメントは、SEQ ID NO:1、2、5、6もしくは31に示されるアミノ酸配列またはそのフラグメント、領域もしくはドメインを含む。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、SEQ ID NO:1、2、5、6もしくは31に示されるアミノ酸配列またはそのフラグメント、領域もしくはドメインと少なくとも90％の配列同一性、例えばそれと少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。一部の態様では、本明細書に提供される方法に用いられるエピトープ含有フラグメントは、精製用のアフィニティータグおよび／またはそれに続くタグの除去のための切断配列と任意で連結されている。
【０１６０】
一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、A.バウマニのLptDを含む。
【０１６１】
一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、タンパク質またはポリペプチドの部分またはフラグメントである。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、ポリペプチドフラグメントまたはアミノ酸残基の連続ストレッチであり、かつアミノ酸残基約5個〜約25個、例えばアミノ酸残基約7〜約22、約9〜約22、約10〜約20、約12〜約20、約13〜約19、約14〜約19、約13〜約17個の長さを有する。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、タンパク質配列中に遠く離れており、タンパク質の三次元フォールディングによって近接されるポリペプチドセグメントを含む不連続（コンフォメーション）エピトープを含む。一部の態様では、コンフォメーションエピトープは、アミノ酸残基約5個〜約25個、例えばアミノ酸残基約7〜約22、約9〜約22、約10〜約20、約12〜約20、約13〜約19、約14〜約19、約13〜約17個の組み合わせ長さまたは長さを有する。
【０１６２】
一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、標的微生物の多数の変異体または微生物の異なる種にわたり保存されたエピトープを含む。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、微生物またはその変異体の表面に発現されるタンパク質の多数の変異体にわたり保存されたエピトープを含む。A.バウマニの例示的な変異体には、A.バウマニ ATCC19606、A.バウマニ ATCC17978、A.バウマニ 1440422株、A.バウマニ MSP4-16株およびA.バウマニ1202252株が非限定的に含まれる。
【０１６３】
一部の態様では、変異体は、同じ微生物の異なる臨床単離株に由来する。一部の態様では、2つ以上の変異体、例えば変異型タンパク質は、標的微生物のエピトープ含有フラグメントをそれぞれ独立して含む。一部の態様では、2つ以上の変異体、例えば変異型タンパク質は、少なくとも1つの保存された領域またはドメインを共有する。一部の態様では、2つ以上の変異体は、互いに異なる少なくとも1つの領域またはドメインをそれぞれ含む。一部の態様では、2つ以上の変異体、例えばタンパク質変異体は、長さが異なり、例えば変異体の1つは、タンパク質の特定領域またはドメインの欠失を有する。本明細書に提供される方法の一部の態様に使用されるエピトープ含有フラグメントは、天然変異体に由来することができ、および／または遺伝子操作もしくは遺伝子組換えされることができる。例えば一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、第1の変異型タンパク質および第2の変異型タンパク質を含み、第1および／または第2の変異体は、完全長であり、第1および／または第2の変異体の他方は、タンパク質の免疫優性エピトープまたはループの欠失を含む、タンパク質のフラグメントである。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントを操作して、膜タンパク質の周辺質部分または細胞内部分の保存されたエピトープへの抗体結合を妨げることができる。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントのドメインまたは領域を異なる変異体の間で交換して、標的微生物の一方の変異体からのある特定のドメインまたは領域および別の変異体からの他のドメインまたは領域を含む新しい変異体を生じさせることができる。例えば一部の態様では、エピトープを含む可変ループを異なる変異体の間で交換することができる。例えばBamA変異体5（SEQ ID NO:31に示される）は、BamAの異なる単離物および変異体の間で高度に可変のループである細胞外ループ4がBamA変異体2の細胞外ループ4配列によって置き換えられている、BamA変異体1の改変版である。
【０１６４】
一部の態様では、保存されたエピトープは、A.バウマニの少なくとも2つの異なる変異体の間で保存されたエピトープである。一部の態様では、保存されたエピトープは、BamAの少なくとも2つの異なる変異体の間で保存されたエピトープである。例えば、一部の態様では、標的微生物はA.バウマニであり、BamAの第1および第2の変異体は、A.バウマニの第1および第2の変異体に発現されている。一部の態様では、A.バウマニの第1および第2の変異体は、異なる臨床単離株に由来する。BamAは、異なる変異体の間で、特に細胞外ループ、例えばループ4に、顕著なアミノ酸多様性を示す領域またはドメインを含む（例えば図4参照）。一部の態様では、顕著なアミノ酸多様性を示す領域またはドメインは、超可変および／または免疫優性の領域またはドメインである。BamAは、異なる変異体にわたり保存されている、保存されたドメインまたは領域も含む。一部の態様では、そのように高度に保存されたドメインまたは領域は、タンパク質の機能に必須または重大である。
【０１６５】
一部の態様では、保存されたエピトープは、アミノ酸の連続配列である、またはそれを含む。一部の態様では、保存されたエピトープは、アミノ酸の非連続配列である、またはそれを含む。例えば、BamAは膜貫通タンパク質であり、周辺質ドメイン、膜貫通βバレルならびに細胞外および周辺質ループを含む。標的微生物の表面のエピトープ含有フラグメント、例えばOMタンパク質に結合する抗体について、細胞外ループは、標的微生物の表面に露出している。したがって、そのような抗体は、露出した細胞外ループ内のエピトープに結合する。BamAのような膜貫通タンパク質であるOMタンパク質について、抗体が1つまたは複数の別個の細胞外ループまたはその部分もしくはそれらの組み合わせを含むエピトープと結合することができるとき、エピトープは、非連続配列を含むことができる。
【０１６６】
様々なA.バウマニにおいて保存されている例示的な領域は、SEQ ID NO:11に示されるA.バウマニATCC19606のBamA配列の423〜438、440〜460、462〜502、504〜533、537〜544、547〜555、557〜561、599〜604、606〜644、646〜652、659〜700、702〜707、718〜723、735〜747、749〜760、784〜794、798〜804、806〜815および817〜841位のアミノ酸残基を含むことができる。一部の態様では、様々なA.バウマニにおいて保存されている例示的な保存された領域は、SEQ ID NO:12〜30に示されるアミノ酸配列またはその任意のフラグメントのうちの任意の1つまたは複数を含む。
【０１６７】
一部の態様では、本明細書に提供される方法を用いて同定された抗体によって結合されるエピトープは、微生物の異なる変異体の間で保存されたエピトープ、例えば微生物の表面に発現したタンパク質の異なる変異体上に保存されたエピトープである。一部の態様では、同定された抗体は、標的微生物の少なくとも1つの保存された領域またはドメインに結合する。保存されたエピトープに結合するそのような同定された抗体は、広範囲の微生物変異体、例えば異なる血清型の病原体、または病原体種の変種に有効であることができる。
【０１６８】
一部の態様では、そのエピトープ含有フラグメントは、細胞系における発現によって生成される、またはタンパク質産生を増強する培地中で成長され得る。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントの全部または部分を、組換え技法を用いて産生させることができる。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、組換え細菌または真菌タンパク質発現系で産生させることができる。一部の態様では、組換え発現のために使用することができる例示的な細菌細胞は、大腸菌MC4100、B1LK0、RR1、大腸菌LE392、大腸菌B、大腸菌X1776（ATCC No.31537）、大腸菌BL21-DE3、および大腸菌W3110株（F-、λ-、原栄養性、ATCC No.273325）を含む。
【０１６９】
一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、組換え産生され、精製に供される。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドは、精製を促進するためにアフィニティータグまたは精製タグをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結される。例示的なアフィニティータグには、ポリヒスチジンタグ（例えば、SEQ ID NO:10に示される）、Strepタグ、FLAGタグ、AviTag（商標）、HAタグ、mycタグおよびGSTタグが含まれる。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、エピトープ含有フラグメントとアフィニティータグとの融合タンパク質をコードする。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントを組換え発現系からの生物物質の残りから単離または精製するために、精製カラムが使用される。一部の態様では、本明細書に提供される方法に使用されるエピトープ含有フラグメントは、プロテアーゼ切断部位のような切断配列と任意で連結されている。一部の態様では、プロテアーゼ切断部位をアフィニティータグの後続の除去のために使用することができる。例示的な切断配列には、タバコエッチ病ウイルス（TEV）切断部位が含まれる。一部の態様では、本明細書に提供される方法に用いられるエピトープ含有フラグメントは、1つもしくは複数のタグおよび／または1つもしくは複数の切断配列と任意で連結されている。そのようなタグの例には、AviTag-10×His-TEV（SEQ ID NO:9に示される）が含まれる。
【０１７０】
一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、OMタンパク質のような膜タンパク質であり、提供される方法は、膜関連ポリペプチドまたはフラグメントの可溶化、変性および／またはリフォールディングを含むエピトープ含有フラグメントの調製物を生成させる段階を含む。一部の態様では、可溶化および／またはリフォールディングは、エピトープ含有フラグメントとの複合体を形成する別のタンパク質を必要とする。例えば、LptDは、OMにおいてリポタンパク質LptEと複合体を形成し、LptEの調製物がLptDの適正なリフォールディングのために必要である。エピトープ結合性フラグメントの調製物は、標準的な組換えDNA技法により生成させることができ、必要ならば、例えば、当技術分野において公知または本明細書記載の方法のいずれかを用いて、エピトープ結合性フラグメントを可溶化することができる。膜タンパク質の可溶化のための例示的な段階には、国際公開公報第2015/097154号に記載された段階が含まれる。
【０１７１】
一部の態様では、提供される方法は、抗体産生細胞と共に混合またはインキュベートする段階の前にエピトープ含有フラグメントをリフォールディングする段階も含む。一部の態様では、リフォールディングは、1種類または複数種類の洗剤または界面活性剤の存在下で実施される。一部の態様では、調製物中に洗剤または界面活性剤を用いて、エピトープ含有フラグメントを可溶化、変性および／またはリフォールディングすることができる。一部の態様では、可溶化および／または変性された調製物を、例えば洗剤または界面活性剤の存在下でリフォールディングまたは復元することができる。一部の態様では、洗剤または界面活性剤は、ラウリルジメチルアミンオキシド（LDAO）、2-メチル-2,4-ペンタンジオール（MPD）、アンフィポール、アンフィポールA8-35、C8E4、トリトンX-100、オクチルグルコシド、DM（n-デシル-β-D-マルトピラノシド)、DDM（n-ドデシル-β-D-マルトピラノシド、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート（CHAPS）および3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート（CHAPSO）の中より選択される。一部の態様では、抗体産生細胞を免疫するまたはそれと接触またはそれと共にインキュベートする前に、調製物中の過剰な洗剤を除去することができる。
【０１７２】
ある特定の態様では、そのエピトープ含有フラグメントは、ビーズのような固体支持体に結合している。ある特定の態様では、抗原含有フラグメントまたは病原体抗原は、以下の特徴:基材に連結するためのタグ、スペーサー部分、リンカー、例えば切断可能なリンカー、および反応基のうちの1つまたは複数を有する適切な連結剤（例えば、適切なオルト-ニトロベンジル系連結剤）を用いて基材に繋ぎ止められる。ある特定の態様では、タグは、アフィニティータグ、例えばビオチン基など、または基材表面の適切な部位（例えばアルコール、アミノ求核試薬、チオール求核試薬またはシラン基）と反応して基材とリンカーまたは抗原含有フラグメントとの間に共有結合を形成することができる反応性部分（例えばカルボキシ基、アミノ基、ハロ基、トシレート基、メシレート基、反応性ヒドロキシル基または金属オキシド）であり得る。ある特定の態様では、スペーサーは、例えば炭素原子3〜12個を含む非反応性アルキル鎖（例えば5-アミノカプロン酸）を含み得、切断可能なリンカーが、適切な化学的性質を含むとして選ばれ得る（上記参照）。反応基は、一般的にエフェクター分子と反応し、それと共有結合を形成する。適切な反応基は、ハロゲン（スルフヒドリル反応性である）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）カルボネート（アミン反応性である）およびN,N-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホラミダイト（ヒドロキシル反応性である）、ならびに当技術分野において公知のいくつかの他の反応基を含み、本方法に容易に採用され得る。
【０１７３】
ある特定の非限定的な態様では、ビーズは、20nm〜200μmまたはそれ以上のサイズ範囲であることができる。一部の態様では、ビーズは、約100nm〜約100μm、約250nm〜約75μm、約500nm〜約50μm、約750nm〜約25μm、約1μm〜約10μm、約2μm〜約8μm、約3μm〜約7μmもしくは約3μm〜約5μmの平均直径；または平均直径約1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μmもしくは10μmを有する。
【０１７４】
一部の態様では、ビーズは、例えばポリスチレンからできている場合があるが、他の材料、例えば、ポリメチルメタクリレート（PMMA）、ポリビニルトルエン（PVT）、スチレン／ブタジエン（S/B）コポリマー、スチレン／ビニルトルエン（S/VT）も使用される。本発明に有用なビーズは、Molecular Probes （Invitrogen）、Bangs Labs、およびPolymicrospheres, Inc.を含めた数多くの入手源から商業的に得ることができる。
【０１７５】
ビーズは、その表面に多様な化学官能基をディスプレイするように作ることができる。通常使用される反応性基には、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドロキシル、エポキシ、およびクロロメチルが含まれる（例えば米国特許第4,217,338号、同第5,326,692号、同第5,786,219号、同第4,717,655号、同第7,445,844号、同第5,573,909号および同第6,023,540号参照）。ある特定の態様では、リンカーがこれらの反応基に付加される場合があり、標的抗原含有フラグメントがリンカーを介して直接または間接的にコンジュゲートされる場合がある。
【０１７６】
C.  ゲル封入
提供される方法は、複数の候補抗体産生細胞を標的微生物と共に微小滴、例えばゲル微小滴中に封入する段階を含む。一部の態様では、微小滴は、(i)候補抗体産生細胞および(ii)標的微生物を含む。一部の態様では、該方法は、標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体、例えば標的微生物の抗原もしくはエピトープまたはその変異体を微小滴中に封入する段階をさらに含む。特定の態様では、微小滴は、(i)1つまたは複数の抗体産生細胞；および(ii)標的微生物、例えば病原体および／またはそのエピトープ含有フラグメントを含む。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、ビーズのような固体支持体に結合している。微小滴、例えばゲル微小滴は、標的微生物、例えば病原体および／またはそのエピトープ含有フラグメントの複数のコピーを含み得る。微小滴、例えばゲル微小滴は、標的抗原と結合する抗体をスクリーニングする迅速および効果的な方法を提供し、かつ、任意の従来方法と比較して、特異標的に対して所望の結合特異性を有する抗体を同定するために必要な時間を実質的に短縮することができる。
【０１７７】
一部の態様では、抗体産生細胞、例えば、B細胞、形質芽細胞および／または形質細胞を単離または濃縮するために、複数の候補抗体産生細胞は、正の選択または負の選択によって選択または精製される。一部の態様では、抗体産生細胞は、形質芽細胞または形質細胞である。一部の態様では、抗体産生細胞は、封入の前にドナーまたは免疫無防備状態の動物からの器官または組織試料から選択または精製される。一部の態様では、器官または組織試料は、脾臓またはリンパ節である。一部の態様では、器官または組織試料は、末梢血である。一部の態様では、ドナーまたは免疫無防備状態の動物から得られる細胞は、末梢血単核細胞（PBMC)、B細胞、形質細胞および／または形質芽細胞である。
【０１７８】
一部の態様では、複数の候補抗体産生細胞などの器官または組織試料からの細胞は、細胞表面マーカーの発現に基づき1つまたは複数の正の選択または負の選択に供される。一部の態様では、候補抗体産生細胞を得る段階は、細胞における表面マーカー、例えば、表面タンパク質、細胞内マーカー、または核酸などの1種類または複数種類の特異分子の発現または存在に基づく細胞型の選択を含む。一部の態様では、そのようなマーカーに基づく選択のための任意の公知の方法を用いて候補抗体産生細胞を得てもよい。一部の態様では、選択は、親和性または免疫親和性に基づく選択である。例えば一部の局面における単離は、1つまたは複数のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの細胞の発現または発現レベルに基づく細胞および細胞集団の選択を含み、該選択は、例えば、そのようなマーカーに特異的に結合する抗体または結合剤と共にインキュベーションすることにより、続いて一般的に、抗体または結合剤に結合しなかった細胞から抗体または結合剤と結合した細胞の洗浄段階および選択により行う。
【０１７９】
そのような選択段階は、試薬と結合した細胞がさらなる使用のために保持される正の選択および／または抗体もしくは結合剤に結合しなかった細胞が保持される負の選択に基づくことができる。
【０１８０】
選択は、結果として、特定のマーカーを発現している特定の細胞集団または細胞の100％濃縮または除去を招く必要はない。例えば、マーカーを発現している細胞のような特定の型の細胞の正の選択または濃縮は、そのような細胞の数または率を増加させることを表すが、マーカーを発現していない細胞の完全な非存在を招く必要はない。同様に、マーカーを発現している細胞のような特定の種類の細胞の負の選択、除去、または枯渇は、そのような細胞の数または率を減少させることを表すが、全てのそのような細胞の完全な除去を招く必要はない。
【０１８１】
一部の例では、1つの段階から正または負の選択が行われた画分が、後続する正または負の選択のような別の選択段階に供される、複数ラウンドの選択段階が実施される。一部の例では、単一の選択段階は、例えば、負の選択のために標的とされたマーカーにそれぞれ特異的な複数の抗体または結合剤と共に細胞をインキュベートすることによって、複数のマーカーを同時に発現している細胞を枯渇させることができる。同様に、細胞を、様々な種類の細胞上に発現される複数の抗体または結合剤と共にインキュベートすることによって、複数の種類の細胞に同時に正の選択を行うことができる。
【０１８２】
一部の態様では、選択は、正の選択であり、細胞表面マーカーは、CD2、CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD34、CD56、CD61、CD138、CD235a（グリコホリンA）およびFceRIaのうちの1つまたは複数の中より選択される。一部の態様では、封入およびスクリーニング用の候補抗体産生細胞を得るために、1つまたは複数の別々の選択段階のような1つまたは複数の選択段階が使用される。一部の態様では、Miltenyi Biotechから入手可能なB細胞単離キット、Stemcell Technologies製のEasySep（商標）B細胞単離キット、Stemcell Technologies製のCD138+細胞単離キットまたはDynabeads B細胞キットなどの市販の細胞選択キットを用いて、候補抗体産生細胞を得ることができる。他の公知マーカーおよび／または方法を用いて所望の候補抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞を単離することができる。一部の態様では、封入用の複数の候補抗体産生細胞は、CD138+細胞を含む。一部の態様では、細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、またはそれ以上または少なくとも約50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、またはそれ以上は、形質細胞もしくは形質芽細胞であり、かつ／またはCD138+細胞である。
【０１８３】
一部の態様では、候補抗体産生細胞は、ゲル封入のために最適化された培地と混合される。一部の態様では、ゲル封入培地は、抗体産生細胞の生存能を促進する細胞培養培地、および封入効率を高めるために封入の間に抗体産生細胞の沈降を防止する密度勾配培地を含む。使用することができる例示的な密度勾配培地には、OptiPrep（商標）、Lymphoprep（商標）、Polymorphprep（商標）、Nycodenz（登録商標）、Nycoprep 1.077（商標）、Polysucrose（商標）400、Ficoll（登録商標）、Histodenz（商標）、またはHistopaque（登録商標）のような市販の密度勾配培地が含まれる。
【０１８４】
一部の態様では、ゲル微小滴は、ポリマーマトリックスおよび／またはゲルマトリックスを含む。ある特定の態様では、ゲル微小滴は、アガロース、カラゲナン、アルジネート、アルジネート-ポリリジン、コラーゲン、セルロース、メチルセルロース、ゼラチン、キトサン、細胞外マトリックス、デキストラン、デンプン、イヌリン、ヘパリン、ヒアルロナン、フィブリン、ポリビニルアルコール、ポリ(N-ビニル-2-ピロリドン)、ポリエチレングリコール、ポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート)、アクリレートポリマーおよびポリアクリル酸ナトリウム、ポリジメチルシロキサン、シスポリイソプレン、Puramatrix（商標）、ポリジベニルベンゼン、ポリウレタン、またはポリアクリルアミドを含む。特定の態様では、ゲル微小滴は、例えばアガロース、カラゲナン、アルジネート、アルジネート-ポリリジン、コラーゲン、植物由来ゴム、セルロースもしくはその誘導体（例えばメチルセルロース）、ゼラチン、キトサンもしくはKleinman（米国特許第4,829,000号）に記載されているような細胞外マトリックス（ECM）、またはそれらの組み合わせであり得るポリマーマトリックスを含む。ゲル微小滴に使用され得る合成ヒドロゲルには、ポリビニルアルコール、エチレン-ビニルアルコールブロックコポリマー、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、ビニル-メチル-トリベンジル塩化アンモニウムおよびポリホスファゼンが非限定的に含まれる。
【０１８５】
本発明により使用され得るゲル微小滴およびスクリーニング方法論は、当技術分野において公知および利用可能な任意のものを含む。使用され得るゲル微小滴およびスクリーニング方法論の例には、米国特許第8,415,173号、同第8,030,095号、同第7,939,344号、同第7413868号、および同第8445193号、米国特許出願公開第20080038755号および同第20060073095号、ならびにPCT特許出願公開WO2015/038817に記載されているものが非限定的に含まれる。
【０１８６】
一部の態様では、微小滴は、マイクロフルイディクスに基づく方法によって生成される。微小滴を生成させるために使用できる例示的なマイクロフルイディクスに基づく装置には、μEncapsulator System（Dolomite Microfluidics）およびCellena（登録商標）Microencapsulator（Biomedal Lifescience）が含まれる。
【０１８７】
一部の態様では、ゲル微小滴は、アガロースを含む。一部の態様では、アガロースは、超低ゲル化温度アガロースのような低ゲル化温度アガロースである。一部の態様では、低ゲル化温度アガロースは、より低い温度、例えば抗体産生細胞および標的微生物、例えば病原体の生存を許す温度でアガロースを液体のままにさせ、それにより、生きた細胞および標的微生物、例えば病原体の封入を可能にする。一部の態様では、封入に使用されるアガロースのゲル化温度は、液体アガロースの温度が抗体産生細胞および／または標的微生物、例えば病原体の生存能に不利に影響せず、かつゲル封入を液体状態で実施することができる温度である。一部の態様では、アガロースは、約35℃未満、例えば約30℃、約25℃、約20℃、約15℃、約10℃または約5℃のゲル化温度を有する。一部の態様では、アガロースは、ゲル化温度が約20℃、約15℃、約10℃または約5℃未満のアガロースのようなの超低ゲル化温度アガロースである。一部の態様では、アガロースは、約5℃〜約30℃、約5℃〜約20℃、約5℃〜約15℃、約8℃〜約17℃または約5℃〜約10℃、例えば約8℃〜約17℃のゲル化温度を有する。
【０１８８】
一部の態様では、ゲル封入は、抗体産生細胞および標的微生物、例えば病原体を生存させる温度、例えば約37℃、約35℃、約30℃、約25℃または約20℃で実施される。
【０１８９】
本明細書に提供される方法の一部の態様では、該方法は、微小滴をポリマーマトリックスおよび／またはゲルマトリックスのゲル化温度未満の温度、例えば約0℃〜約5℃、例えば約0℃、約1℃、約2℃、約3℃、約4℃、または約5℃の温度でインキュベートする段階を含む。一部の態様では、インキュベーションは、約1分間〜約10分間、例えば約1分間、約2分間、約3分間、約4分間、約5分間、約6分間、約7分間、約8分間、約9分間、または約10分間である。
【０１９０】
一部の態様では、提供される方法は、結合性の決定前にゲル微小滴を37℃または約37℃の温度でインキュベートする段階をさらに含む。この段階は、抗体産生細胞、例えばB細胞または形質芽細胞による生存および抗体分泌を促進する。一部の態様では、ゲル微小滴は、成長培地中でインキュベートされる。培地中でのインキュベーション時間は、抗体産生細胞による最適な生存および抗体分泌に基づき決定することができる。一部の態様では、インキュベーションは、約45分〜2時間、例えば約1時間である。
【０１９１】
一部の態様では、ゲル微小滴は、封入段階の間または後に非水環境に囲まれている。一部の態様では、ゲル微小滴は、成長培地を含み、非水環境に囲まれている。一部の態様では、非水環境は、油を含む。一部の態様では、油はガス透過性である。ガス透過性油の存在は、微小滴の物理的分離を可能にし、かつ分泌された抗体が非水環境から漏れないことを確実にすることができ、その結果として、スクリーニングの効率増加のために微小滴中に十分に高い濃度の抗体が生じる。使用できる例示的なガス透過性油には、3M（商標）Novec（商標）7500およびFluorinert FC40（Sigma Aldrich）を非限定的に含めたフッ素化油が含まれる。一部の態様では、ゲル微小滴は、封入後に非水環境中でインキュベートされる。一部の態様では、ゲル微小滴は、結合性の決定前に37℃または約37℃の温度の非水環境中でインキュベートされる。一部の態様では、非水環境は、3M（商標）Novec（商標）7500またはFluorinert FC40のようなガス透過性油を含む。
【０１９２】
一部の態様では、微小滴は、1つまたは複数の標的微生物、例えば病原体または標的微生物の1つもしくは複数のエピトープ含有フラグメント、例えば病原体またはその変異体を含む。一部の態様では、微小滴は、1つまたは複数の標的微生物、例えば病原体および標的微生物の1つまたは複数のエピトープ含有フラグメント、例えば病原体またはその変異体を含む。一部の態様では、標的微生物、例えば微小滴中の病原体は、標的微生物、例えば病原体の表面にエピトープまたはその変異体を発現する。一部の態様では、そのエピトープ含有変異体は、ビーズのような固体支持体に結合している。例えば、一部の態様では、微小滴は、エピトープ含有フラグメントで被覆されている1つまたは複数のビーズを含む。
【０１９３】
一部の態様では、微小滴は、抗体産生細胞を含む。一部の態様では、微小滴は、平均して1つまたはより少数の抗体産生細胞を含む。一部の態様では、ゲル微小滴1個あたりの候補抗体産生細胞の平均比は、1未満または約1未満である。一部の態様では、ゲル微小滴1個あたりの候補抗体産生細胞の平均比は、約0.05〜約1.0、約0.05〜約0.5、約0.05〜約0.25、約0.05〜約0.1、約0.1〜約1.0、約0.1〜約0.5、約0.1〜約0.25、約0.25〜約1.0、約0.25〜約0.5または0.5〜約1.0である（それぞれ両端の値を含む）。一部の態様では、微小滴1個あたりの候補抗体産生細胞の平均比は、0.1または約0.1である。
【０１９４】
一部の態様では、微小滴は、単一の抗体産生細胞および複数の標的微生物、例えば病原体を含有し得る。一部の態様では、微小滴は、単一の抗体産生細胞および標的微生物の複数のエピトープ含有フラグメント、例えば固体支持体、例えばビーズに結合しているエピトープ含有フラグメントを含有し得る。
【０１９５】
抗体産生細胞ならびに標的微生物、例えば病原体および／またはエピトープ含有フラグメントの数は、例えばPowell（Biotechnology 1990 8: 333-7）；Weaverら（Biotechnology 1991 9: 873-877）に記載されているようにポアソン統計によって制御され得る。封入工程の間に、粒子の成分（例えば、抗体産生細胞、標的微生物、例えば病原体、エピトープ含有フラグメント、例えば固体支持体に結合しているもの）は、新生微小滴中にランダムに分布される。事実上全ての粒子が微小滴中に包埋されるようになるので、粒子の数が微小滴の数を超えるならば、各微小滴は、平均して＞1つの粒子を含有し得る。同様に、微小滴の数が粒子の数を超えるならば、各微小滴は、平均して＜1つの粒子を含有し得る。
【０１９６】
一般に本明細書記載の方法の一部について、微小滴1個あたり1つまたはより少数の抗体産生細胞を有することが望ましい場合がある。理由は、これにより標的微生物、例えば病原体および／またはエピトープ含有フラグメントに作用し得る単一種類の抗体産生細胞の封入が確実になることで、複数の型の抗体産生細胞が微小滴中に存在した場合よりも明白に解釈可能な結果を生じるからである。ある場合には、微小滴は、時間をかけて成長させる抗体産生細胞を含有し、その結果、微小滴1個あたり複数の抗体産生細胞が生じ得る。この場合、1つの微小滴中の細胞は、クローン起源であり、したがって、1種類の抗体だけを産生する。
【０１９７】
一部の態様では、候補細胞と標的微生物と、例えば病原体とエピトープ含有フラグメントとの比、および微小滴中の各々の平均数を、スクリーニング、検出および同定の所望の方法ならびにゲル封入のパラメーターに基づき最適化することができる。そのような最適化のために考慮するための例示的な変数には、例えば標的微生物のサイズ、微小滴のサイズ、微小滴中の他の粒子の数、検出シグナルの強度、抗体産生細胞の抗体産出量および抗体の親和性が非限定的に含まれる。標的微生物、例えば病原体および／またはエピトープ含有フラグメントに関して、各微小滴内に各種類の複数のメンバーを含有させることが理想的であり得る。一部の態様では、候補細胞 対 微生物 対 ビーズの平均比は、約0.1:100:10である。一部の態様では、候補細胞 対 微生物 対 ビーズの平均比は、約0.1:200:5または約0.1:50:20である。
【０１９８】
微小滴1個あたりの標的微生物、例えば病原体の数は、抗体産生細胞のスクリーニングおよび同定の間のシグナルの視感度を確実にするために微小滴のサイズに関して最適化することができる。細菌である標的微生物の場合、微小滴1個あたりの標的微生物の平均数は、約5〜約500、例えば約10〜約250、約50〜約200、約50〜約150、約50〜約100、または約80〜約120、例えば約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190または200であることができる。細胞のサイズがより大きい微生物、例えば真菌または寄生虫について、微小滴1個あたりの標的微生物の数は、平均してより小さい場合がある。
【０１９９】
微小滴1個あたりのエピトープ含有フラグメント、例えば固体支持体に結合しているフラグメントの数は、蛍光シグナルの感度および特異性について最適化することができる。考慮するための例示的な変数には、例えばビーズのサイズ、微小滴中の他の粒子の数、微小滴のサイズ、検出シグナルの強度、抗体産生細胞の抗体産出量および抗体の親和性が非限定的に含まれる。例えば、ビーズに被覆されているエピトープ含有フラグメントについて、ゲル微小滴1個あたりのビーズの平均比は、約2〜約25、約3〜約8、約3〜約7、約3〜約5、約5〜約20、約5〜約15、約7〜約15、約8〜約12、約9〜約11、または約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20であることができる。
【０２００】
D.  抗体産生細胞の検出または同定
本明細書に提供される方法の一部の態様では、該方法は、ゲル微小滴内の抗体産生細胞が標的微生物と結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階を含む。そのような段階は、標的微生物に特異的に結合する抗体の同定を可能にすることができる。特に、一部の態様では、本明細書に提供される方法は、従来方法を用いて同定することが困難な抗体を同定することができる。一部の態様では、提供される方法を用いて、従来方法を用いて同定することが困難な標的エピトープに対する抗体を同定することができる。
【０２０１】
一部の態様では、結合性を判定するためのそのような段階は、標的微生物と結合性であると同定された抗体が同じゲル微小滴内のそのエピトープ含有フラグメントとも結合するかどうかを判定する段階を含む。一部の態様では、結合性の判定のための段階は、分子の結合性、例えば標的微生物のエピトープ含有フラグメントに対する抗体の結合性の存在を検出する方法および／またはアッセイを含む。一部の態様では、提供される方法は、結合性、標的微生物の表現型の特徴の改変および／または標的微生物の死滅もしくは生存能を検出する方法および／またはアッセイを含む。一部の態様では、結合性および／またはその下流の効果、例えば標的微生物の表現型の特徴の改変および／もしくは死滅もしくは生存能の判定は、ゲル微小滴内でおよび／またはレポーター分子を用いて実施される。
【０２０２】
一部の態様では、提供される方法は、ゲル微小滴内の抗体産生細胞が標的微生物と結合する抗体を産生するかどうかを判定する前に、抗体に結合する試薬をゲル微小滴に導入する段階を含み、該試薬は、検出可能な部分を含む。例えば試薬は、封入された抗体産生細胞によって産生される抗体に特異的な二次抗体を含む。
【０２０３】
特定の態様では、ゲル微小滴は、標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体の検出を促進する検出可能な部分を含む。ある特定の態様では、検出可能な部分は、封入された抗体産生細胞によって産生される抗体に特異的に結合する。ある特定の態様では、検出可能な部分は、封入された抗体産生細胞によって産生される抗体に特異的な標識二次抗体である。B細胞によって産生される一次抗体に特異的なように、蛍光二次抗体を単に変動させることによって、任意の種からの抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞をこの技法に使用することができる。
【０２０４】
特定の態様では、ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する標的微生物、例えば病原体および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階は、複合体の存在を検出することを含み、該複合体は、(i)標的微生物、例えば病原体、またはそのエピトープ含有フラグメント；(ii)抗体産生細胞によって産生される抗体；および(iii)検出可能な部分を含み、該複合体の存在が、抗体が標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合することを示す。一部の態様では、結合性を判定する段階は、標識二次抗体、例えば候補抗体産生細胞によって産生される一次抗体に結合することができる抗体の添加によって実施することができる。例えば一部の態様では、二次抗体は、特異エピトープ、例えば保存されたエピトープに対する一次抗体の存在および／または結合性を検出することができ、二次抗体の存在は、一次抗体の存在ならびに／または標的とされた微生物および／もしくはそのエピトープ含有フラグメントに対する一次抗体の結合を示す。一部の態様では、二次抗体は、検出可能な標識を含む。
【０２０５】
例えば、図8に示される例示的な一態様では、任意の供給源からの単一の抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞を個別にゲル微小環境内に封入することができる。抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞は、ゲル封入された微小環境内に蓄積する一次抗体を分泌する。関心対象の任意の標的微生物、例えば細菌または真菌細胞を同じゲル微小環境内に封入することができる。追加的に、抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞によって産生される一次抗体アイソタイプに特異的な二次蛍光性抗体もゲル微小環境内に封入することができる。一次抗体は、二次抗体によって会合されて蛍光性抗体複合体を形成する。一次抗体が細菌または真菌細胞に対して結合特異性を有さないならば、蛍光性抗体複合体は拡散性のままであり、それは、個別のゲル微小環境を分析するために蛍光顕微鏡を使用することによって、例えば検出可能な標識からのスポットおよび／または別個の点状シグナルを欠如するとして、検出されることができる。図8に示すように、一次抗体が標的微生物、例えば細菌または真菌細胞の表面に結合するならば、蛍光性抗体複合体は、ゲル微小環境内で別個の点状蛍光スポットを形成し、それを蛍光顕微鏡を用いて検出することができ、このB細胞は、下流のプロセシングおよび抗体発見のために選択される。
【０２０６】
ある特定の態様では、ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する標的微生物、例えば病原体および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階は、抗体の存在が同じゲル微小滴中の標的病原体の表現型の特徴を改変するかどうかを判定することを含み、改変された表現型の特徴の存在が、抗体が標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合することを示す。特定の態様では、改変された表現型の特徴は、細胞成長または細胞死である。
【０２０７】
本明細書に提供される方法の一部の態様では、改変された表現型の特徴は、細胞成長、細胞死、挙動の変化、結合性、転写、翻訳、発現、タンパク質輸送、細胞もしくは膜構築、接着、運動性、細胞ストレス、細胞分裂および／または細胞生存度の中より選択される。
【０２０８】
例えば、図9に示される態様では、単一の抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞は、関心対象の細胞状態に関して報告するよう操作された標的微生物、例えば細菌または真菌細胞と共に微小環境内に封入される。例えば、細胞ストレスを引き起こす抗体を得るために、細菌または真菌細胞は、ストレス誘発時に蛍光特性を変化させるように操作される。これらの操作されたレポーター株は、ストレス誘発時に蛍光化合物を産生することもでき、またはその代わりに蛍光顕微鏡方によって検出することができる蛍光発生変化をストレス下で引き起こす所与の化学物質に対して不安定になることもできる。抗体が標的微生物、例えば細菌または真菌細胞と会合しないならば、細菌細胞内に観察可能な表現型変化は起こらず、それらのB細胞は関心対象ではない。抗体が、標的微生物、例えば細菌または真菌細胞と特異接触を行うこともできるが、所望の細菌または真菌表現型を誘起しない場合も関心対象ではない。しかし、図9に示すように、抗体が標的微生物、例えば細菌または真菌細胞と特異的に結合し、所望の挙動をモジュレートするならば、その抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞は、下流の処理および抗体発見のために選択される。上記のように、抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞によって産生される一次アイソタイプに特異的な蛍光二次抗体を添加して、標的微生物、例えば細菌または真菌細胞への結合性、および標的微生物、例えば細菌または真菌における挙動改変を同時に検出することもできる。
【０２０９】
一部の態様では、本明細書に提供される方法は、ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する標的微生物および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかを判定する段階を含み、これは、レポーター分子によって生成されるシグナルを検出する段階を含み、該シグナルが、改変された表現型の特徴の存在下で生成される。
【０２１０】
一部の態様では、本明細書に提供される方法に使用される微生物は、レポーター分子をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば一部の態様では、抗体産生細胞と共にゲル微小滴中に封入される微生物は、特定の生理刺激に応答してまたは特定の細胞状態でレポーター分子、例えば検出可能なレポーター分子を産生するポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変されている。関心対象の細胞状態に関して報告するために微生物、例えば細菌または真菌細胞を遺伝子改変することによって、挙動を改変する抗体の迅速同定も容易に検出され得る。
【０２１１】
一部の態様では、ポリヌクレオチドは、レポーター分子をコードする配列に機能的に連結された調節領域を含み、該調節領域が、改変された表現型の特徴に応答性である。一部の態様では、調節領域は、プロモーターを含む。例えば、一部の態様では、調節領域は、特定の改変された表現型の特徴に応答性である。一部の態様では、調節領域は、例えば標的微生物の、改変された表現型の特徴の存在下でそれに機能的に連結されるレポーター分子に応答性であり、例えばその発現の改変を指示する。
【０２１２】
一部の態様では、改変された表現型の特徴は、細胞ストレスを含み、シグナルが細胞ストレスの存在下で生成される。一部の態様では、細胞ストレスは、細菌の外膜（OM）に対するストレスを含む。
【０２１３】
当業者は、遺伝子の発現が改変された表現型の変化の存在下でモジュレートされるかどうかを容易に判定することができる。例えば、改変された表現型の特徴に曝露されてきた微生物の遺伝子の転写レベルを比較することができる。一部の態様では、発現レベルは、熟練の技術者に公知の任意の方法を用いて、例えば定量PCR、マイクロアレイ、RNA-Seq、ノーザンブロッティング、またはSAGEを使用することによって、評価または判定することができる。一部の態様では、配列、または配列の部分もしくは配列のフラグメントが、モジュレートされた（例えば増加または減少した）と同定された遺伝子を、微生物ゲノムの参照配列を用いて同定することができる。微生物の例示的なゲノム配列は、公知であり、ワールドワイドウェブのtigr.org、kegg.jp、またはncbi.nlm.nih.gov/genbankからオンラインで容易に入手可能である。
【０２１４】
一部の態様では、調節領域またはその部分は、改変された表現型変化に応答して発現がモジュレートされる（例えば増加する）遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）の上流または5'の配列を含む。一部の態様では、調節領域またはその部分の配列は、例えば改変された表現型の変化が誘導された際にまたはその存在下で、それに機能的に連結されるレポーター分子のコード領域の調節された発現を提供するために十分である。異なる条件下でレポーター分子の発現を誘導するために十分な調節領域配列またはその部分を判定または同定するための欠失分析を含めた組換えDNA技法を実施することは、熟練の技術者の水準の範囲内である。一部の態様では、調節領域は、ネイティブなプロモーターである、またはそれを含む。
【０２１５】
当業者は、標準的な技法により調節領域を同定することができる。例えば、推定上の調節領域または配列を、レポーター分子をコードする配列と融合すること、標準技法を用いて構築物を微生物に導入すること、改変された表現型の変化を引き起こすことによって推定上の調節領域または上流の配列を誘導すること、およびレポーター分子が誘導されたかどうかを判定することによって、調節領域を同定することもできる。推定上の調節領域は、多くの場合に、活性または誘導性に影響せずに短縮または延長することができる。当業者は、推定上の調節領域配列からヌクレオチドを除去する効果を系統的に試験して、どの推定上の調節エレメントが改変された表現型の挙動に必要であるかまたは十分であるかを判定することができる。
【０２１６】
一部の態様では、検出可能な標識は、発色団部分、蛍光部分、リン光部分、比色部分、発光部分、化学発光部分、光吸収部分、放射性部分、および遷移金属同位体質量タグ部分の中より選択される。例えば一部の態様では、蛍光顕微鏡方によって検出可能な任意の蛍光団、例えば蛍光部分を、細菌または真菌細胞の挙動の改変または細胞死のための読取りとして使用することができる。
【０２１７】
一部の態様では、検出は、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、分光光度計、蛍光標示式細胞分取器、蛍光試料リーダー、3D断層撮影機またはカメラの中より選択される器具を用いて実施される。
【０２１８】
一部の態様では、レポーター分子によって産生されるシグナルは、検出可能な部分で検出される。一部の態様では、レポーター分子によって生成されるシグナルは、蛍光シグナル、発光シグナル、比色シグナル、化学発光シグナルまたは放射性シグナルを含む。一部の態様では、レポーター分子は、蛍光タンパク質、発光タンパク質、色素タンパク質または酵素である。
【０２１９】
本明細書に提供される方法の一部の態様では、ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する標的微生物および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階は、抗体の存在が同じゲル微小滴中の標的微生物を殺傷するかどうかを判定することを含み、該標的微生物の殺傷が、抗体が標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合することを示す。一部の態様では、ゲル微小滴は、細胞死を示す検出可能な部分を含む。
【０２２０】
ある特定の態様では、ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する標的微生物、例えば病原体および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階は、抗体の存在が同じゲル微小滴中の標的病原体を殺傷するかどうかを判定することを含み、該標的病原体の殺傷が、抗体が標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合することを示す。一部の態様では、ゲル微小滴は、細胞死を示す検出可能な部分を含む。ある特定の態様では、検出可能な部分は、生存細胞と死滅細胞との間を識別することができる、例えば生体染色色素である。特定の態様では、ゲル微小滴は、細胞死を示す検出可能な部分を含む。生存細菌または真菌細胞を死滅細菌または真菌細胞から識別する蛍光色素を使用することによって、殺細菌抗体または殺真菌抗体の迅速同定を同定することもできる。
【０２２１】
一部の態様では、検出可能な部分は、細胞の生存能に応じてシグナルを発し、例えば、細胞生存度および／または細胞死を示す色素を含めた色素またはキットである。細胞死を示す例示的な検出可能な部分には、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、5-カルボキシフルオレセイン二酢酸、5-シアノ-2,3-ジトリルテトラゾリウムクロリド（CTC）、7-AAD、アセトキシメチルエステル（CFDA AM）、膜完全性の指示薬、水-蛍光反応性色素、BacLight細菌膜電位キット、BacLightマウンティングオイル、BacLight RedoxSensor CTCバイタリティーキット、BacLight RedoxSensorグリーンバイタリティーキット、細菌計数キット（細胞計数用アッセイ、C12-レサズリン、カルセインAM、カルセインAMエチジウムホモダイマー-1、カルセインブルーAM、カルセインバイオレットAM、カルコフロール（Calcofluor）ホワイトM2R、カルボニルシアニド3-クロロフェニルヒドラゾン（CCCP）、DMSO中のCCCP、細胞増殖および細胞周期 - 15.4節）、CellTraceカルセインバイオレットAM、DAPI、DEAD Red核酸染色、詳細なプロトコール（製品情報シート）、ジヒドロクロリド（DAPI）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、DiOC18、、DMSO中のDiOC2、DMSO、ドデシルレサズリン（C12-レサズリン）、エチジウムホモダイマー-1、F34953、固定可能な生存能色素eFluor（登録商標）450、固定可能な生存能色素eFluor（登録商標）455UV、固定可能な生存能色素eFluor（登録商標）506、固定可能な生存能色素eFluor（登録商標） 520、固定可能な生存能色素eFluor（登録商標）660、固定可能な生存能色素eFluor（登録商標）780、蛍光反応色素、FUN1細胞染色、フローサイトメトリー用FungaLight CFDA AM/ヨウ化プロピジウム酵母バイタリティーキット、ヨウ化ヘキシジウム、LIVE BacLight細菌グラム染色キット、LIVE/DEAD細胞バイタリティーアッセイキット、LIVE/DEAD細胞介在性細胞傷害性キット、LIVE/DEAD固定可能な死細胞染色キット、LIVE/DEADバイオハザード軽減細胞生存能キット#1、LIVE/DEAD精子生存能キット、LIVE/DEAD生存能/細胞傷害性キット、LIVE/DEAD酵母生存能キット、LIVE/DEAD BacLight細菌生存能および計数キット、LIVE/DEAD BacLight細菌生存能キット、フローサイトメトリー用LIVE/DEAD FungaLight酵母生存能キット、LIVE/DEAD（登録商標）固定可能なアクアステイン、LIVE/DEAD（登録商標）固定可能な青色素、LIVE/DEAD（登録商標）固定可能な紫色素、LIVE/DEAD（登録商標）固定可能な黄色素、反応緩衝液、反応混合物、RedoxSensor緑試薬、レサズリン、レゾルフィン、アジ化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、懸濁ミクロスフェア標準、SYBR14核酸染色、SYBR（商標）14色素、SYTO10核酸染色、SYTO24緑色蛍光核酸染色、SYTO9核酸染色、SYTO BC細菌染色、SYTOX緑色核酸染色、SYTOX（商標）緑色色素、コムギ胚芽アグルチニン（WGA）のTexas Red-Xコンジュゲート、ViaGram Red+細菌グラム染色および生存能キット、Vybrant細胞代謝アッセイキットおよびVybrant細胞傷害性アッセイキットが非限定的に含まれる。
【０２２２】
図10に示される例示的な態様では、単一抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞が、標的微生物、例えば細菌または真菌細胞と共に微小環境内に封入される。しかし、生存している細胞に対して死滅した細胞内に特異的に進入して濃縮する色素もこの微小環境内である。したがって、死滅した標的微生物、例えば細菌または真菌細胞を、顕微鏡法を用いて検出することができる。次に、抗体が関心対象の標的微生物、例えば細菌または真菌細胞に対して殺滅表現型を引き起こす能力について、該抗体を迅速にスクリーニングすることができる。抗体が、標的微生物、例えば細菌または真菌細胞と会合しないならば、細菌細胞内で観察可能な表現型の変化が起こりそうもなく、それらのB細胞は、関心対象ではない。特定の態様では、抗体は、標的微生物、例えば細菌または真菌細胞と特異接触も行うことができるが、殺滅応答を誘起しない。しかし、抗体が標的微生物、例えば細菌または真菌細胞と特異的に結合し、細胞死を引き起こすならば、その抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞は、下流の処理および抗体発見のために選択され得る。細菌または真菌細胞の結合性および細菌または真菌細胞死を同時に検出するために、抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞によって産生される一次アイソタイプに特異的な蛍光二次抗体を添加することもできる。提供される方法は、細胞死を検出するための色素分子に限定されない。理由は、殺滅抗体、例えば標的微生物の死滅を引き起こすことができる抗体を産生する抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞を特異的に同定するために任意のレポーター系を使用することもできるからである。一部の態様では、抗体は、殺菌抗体である。
【０２２３】
本開示は、抗体をクローニング、一過性発現、精製、および機能について試験するために必要な時間および資源を費やす前に、機能性産出量を決定できるようにもする。したがって、関心対象の機能性抗体を製造していると以前に判定されたそれらの抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞からの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子だけが、クローニング相に進む。一部の場合では、これは、稀少な機能性抗体の追求においてかなりの時間および金銭を節約することができ、抗体産生細胞の効率的なスクリーニングを促進して、関心対象の抗体を迅速および効果的に同定することができる。
【０２２４】
E.  抗体の単離および同定
一部の態様では、提供される方法は、同定された抗体を産生する細胞を含む微小滴を単離する段階または標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合すると同定された抗体をコードするポリヌクレオチドを単離する段階を含む。一部の態様では、提供される方法は、同定された抗体をコードする核酸の配列を決定する段階も含む。
【０２２５】
一部の態様では、同定された抗体、例えば、標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントに結合する関心対象の抗体を産生する細胞を含有するゲル微小滴が、複数の微小滴から分離される。一部の態様では、単離は、マイクロマニピュレーターまたは自動ソーターを用いて実施される。例えば、一部の態様では、ゲル微小滴は、顕微鏡下で、例えば蛍光顕微鏡下で視覚的にスクリーニングされ、同定された抗体、例えば本明細書記載の所望の特性を表す抗体を産生する細胞を含有する微小滴がスクリーニング工程の間に同定されるときに、それらを他の微小滴から物理的に分離することができる。一部の態様では、微小滴は、マイクロマニピュレーターを用いて分離される。一部の態様では、自動ソーターを用いて、判断基準、例えば、微小滴中の検出可能なシグナルのレベルに基づき特定の小滴を分別することができる。
【０２２６】
FACSのような他の技法は、単一のB細胞操作を可能にする。しかし、FACSは、抗原の結合を問い合わせるために抗体が発現され、B細胞表面に付加したままであることを必要とする。FACSの際の高い物理的剪断力のせいで、細菌または真菌細胞の表面に結合する抗体を製造するB細胞を単離するためにFACSを使用することは不可能である。したがって、本明細書記載の本発明は、微生物、例えば細菌または真菌の表面に結合し、細胞応答を誘起する抗体を使用者が不可知論的に同定できるようにする。B細胞によって産生されている抗体に関するそのような知識の深さは、FACSだけでは不可能である。
【０２２７】
一部の態様では、提供される方法は、同定された抗体をコードする核酸の配列を決定する段階も含む。一部の態様では、核酸の配列を決定する段階は、核酸増幅および／または配列決定を用いて実施される。核酸の配列を決定するための当技術分野において公知の任意の方法を当技術分野において使用することができる。特に、少量の出発物質から核酸配列の決定を可能にする技法、例えば単一細胞PCRを用いて、ゲル微小滴中に含有される細胞によって産生される抗体の配列を決定することができる。特定の態様では、関心対象の、微小環境内のB細胞からの抗体を逆転写（RT）-PCR、プロテオミクス、または抗体の分子シグネチャーを得るために使用される任意の他の下流の方法によって同定することができる。一部の態様では、核酸の配列を決定する段階は、単一細胞PCRおよび核酸配列決定を用いて実施される。特定の態様では、提供される方法は、標的微生物、例えば病原体、またはそのエピトープ含有フラグメント（もしくはそのフラグメント）と特異的に結合するとして同定された抗体をコードするポリヌクレオチドを単離する段階、ポリヌクレオチドを発現ベクター中にサブクローニングする段階、および標的病原体と特異的に結合する組換え抗体を産生させる段階をさらに含む。
【０２２８】
上記のような関心対象の抗体を産生する細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞を内部に有すると同定された任意のゲル微小環境、例えばゲル微小滴を検索することができ、かつ抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子をコードする抗体を、確立されたプロトコールによりPCR増幅、クローニング、配列決定、および発現させることができる。例えば一部の態様では、本明細書に提供される方法は、同定された抗体またはそのフラグメントをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを細胞内に導入する段階も含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入することができる。一部の態様では、ポリヌクレオチドを組換え発現のために細胞内に導入することができる。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、コードする配列を含む。
【０２２９】
ある特定の態様では、本発明は、抗体をコードする直鎖PCR DNA産物を哺乳動物細胞にトランスフェクトすることによって組換え抗体を産生する迅速法を提供する。これは、抗体産生前のプラスミドクローニングという、時間を浪費する段階を取り除く。哺乳動物細胞のトランスフェクションが関心対象の抗体タンパク質を製造し始めることができる前に、プラスミドのクローニングおよび検証のために典型的には10日かかる。哺乳動物細胞に直鎖PCR産物をトランスフェクトできることによって、本発明を用いてPCR産物が生成されるのと同じ日のうちに抗体の産生が始まる場合がある。単一の抗体産生細胞、例えばB細胞から抗体遺伝子をPCR増幅し、それらの遺伝子を直鎖DNA産物としてトランスフェクトすることもできることは、B細胞生成から治療用抗体の生成の間の時間を少なくとも17日間だけ短縮する。
【０２３０】
次に、これらの抗体を用いて、検出のために使用される特異微生物、例えば細菌または真菌細胞に対するインビトロおよびインビボ活性および効力を試験することができる。一部の態様では、そのような抗体のインビトロおよびインビボ活性および効力を、同じ微生物の他の変異体または微生物の他の種に対して試験することもできる。
【０２３１】
同定された抗体をその活性についてさらに試験および評価することができる。一部の態様では、同定された抗体は、広範囲の標的への結合性、例えば微生物もしくはそのエピトープ含有フラグメントの多数の変異体への結合性、および／または保存されたエピトープ、例えば微生物もしくはそのエピトープ含有フラグメントの多数の変異体の間で保存されたエピトープへの結合性について試験される。一部の態様では、抗体は、その機能活性、例えば標的微生物に対する殺傷活性、および／または標的微生物の表現型の特徴を改変する能力について試験される。一部の態様では、抗体は、抗微生物活性、殺細菌活性および／または殺真菌活性について試験される。一部の態様では、抗体は、それが補体結合を誘導する能力について試験される。一部の態様では、抗体は、広範囲の標的、例えば微生物もしくはそのエピトープ含有フラグメントの多数の変異体および／または広範囲の微生物変異体、例えば異なる血清型の病原体、もしくは多様な病原体種に対するその機能活性について試験される。一部の態様では、抗体は、広域中和活性について試験される。
【０２３２】
III.  稀少な細胞のインビボ濃縮
本明細書に提供される方法の一部の態様は、稀少な抗体産生細胞の優先的刺激および増殖をインビボで可能にするための稀少な細胞のインビボ濃縮段階を含むことができる。一部の態様では、稀少な細胞のインビボ濃縮段階を用いて、稀少な抗体を同定するために抗原特異的形質芽細胞またはB細胞を濃縮することができる。特に本方法を用いて、標的微生物の表面の保存されたエピトープ、例えば、非免疫優性の保存されたエピトープに結合する抗体を産生する稀少な細胞を優先的に刺激し、該方法を用いてそのような稀少な細胞を同定する確率を大きく増加させることができる。
【０２３３】
ある特定の態様では、稀少な細胞のインビボ濃縮段階、例えば稀少なB細胞の濃縮相は、細胞が関心対象の免疫防御タンパク質、例えば標的微生物のエピトープ含有フラグメントに対する抗体を製造する能力が高度に強化された候補抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞のプールを生成させることを含む。この技法は、伝統的なハイブリドーマまたはファージディスプレイ技法に依存しないので、濃縮のために使用される候補抗体産生細胞、例えばB細胞のプールは、任意の供給源からのものであることができる。例えば、この相の間に利用されるB細胞を、感染の餌食になったヒト対象、細菌感染から回復したヒト対象、または標的抗原、例えば標的微生物のエピトープ含有フラグメントで免疫されたことのあるヒト化動物、例えばヒト化抗体を産生するように遺伝子改変された動物から検索することもできる。供給源にかかわらず、候補抗体産生細胞、例えばB細胞を、照射された免疫無防備状態の動物、例えばSCIDマウスの脾臓内で抗原特異的に増殖および濃縮することができる（例えば、図2参照）。
【０２３４】
ある特定の態様では、本発明の方法は、標的微生物、例えば病原体の免疫防御標的タンパク質、抗原またはエピトープの最も高度に保存されたエピトープに対する抗体を製造する候補抗体産生細胞、例えばB細胞の増殖を優先的に可能にする。したがって、該技法は、病原体表面の重要な、決定的なまたは必須のエピトープと結合する最も高い能力を有する抗体、および病原体を広く中和する最も高い見込みを有する抗体を濃縮する。この局面は、このプラットフォームを、大部分が関心対象の標的抗原に対して特異性を有さないまたは標的抗原の高度に可変の非機能性エピトープに結合する抗体パネルを問い合わせる、より伝統的な技法と引き離している。この伝統的なアプローチが有効な可能性があるものの、該アプローチは非常に労働集約的であり、遅く、そのことが、新興感染症脅威に対応する場合のその有用性を制限している。
【０２３５】
該方法の一部の態様では、複数の候補抗体産生細胞は、(i)標的微生物もしくは標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体に曝露されたことのあるドナーから得られた抗体産生細胞を、該抗体産生細胞を含む細胞組成物を免疫無防備状態の動物に導入することによって増殖させる段階；および(ii)増殖した抗体産生細胞を回収する段階であって、それにより、複数の候補抗体産生細胞を得る、段階を含む、方法によって得られる。
【０２３６】
一部の態様では、抗体産生細胞を含む細胞組成物は、標的微生物に感染したまたはそれで免疫された動物のようなドナー動物の脾臓および／またはリンパ節から得られた細胞を含む。一部の態様では、脾臓および／またはリンパ節から得られた細胞は、抗体産生細胞、例えばB細胞または形質芽細胞、T細胞、およびNK細胞、樹状細胞、ならびに他の免疫細胞を含む末梢血単核細胞（PBMC）を含む。一部の態様では、細胞組成物は、T細胞を含む。抗体産生細胞を含むそのような細胞組成物は、重症複合免疫不全症（SCID）マウスのような免疫無防備状態の動物に導入することができる。一部の態様では、細胞組成物は、非経口的に、例えば尾静脈注射によるなどの静脈内に、または免疫無防備状態の動物の脾臓への移植により導入される。
【０２３７】
一部の態様では、稀少な細胞のインビボ濃縮は、免疫無防備状態の動物に細胞組成物を導入する前に、標的微生物またはその特異エピトープ含有フラグメント、抗原もしくはエピトープまたは任意のその変異体を用いてドナー動物からの細胞組成物を刺激する段階も含む。一部の態様では、候補抗体産生細胞は、標的微生物、標的抗原もしくはそのエピトープおよび／または標的抗原の変異体もしくはそのエピトープと接触されるまたはそれと共にインキュベートされる。一部の態様では、候補抗体産生細胞は、異なる抗原変異体の混合物のような1つまたは複数の標的微生物および／または変異型抗原および／またはエピトープの混合物と接触される。一部の態様では、候補抗体産生細胞は、ドナー動物が曝露されたことのあった標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントの変異体と比較してエピトープ含有フラグメントの異なる変異体を発現する標的微生物変異体と接触される。
【０２３８】
一部の態様では、抗体産生細胞は、免疫無防備状態の動物に導入される前に、標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントと共にインキュベートされるまたはそれと接触される。一部の態様では、インキュベーションは、抗体産生細胞から産生される特異抗体による標的エピトープの認識のおかげで、抗体産生細胞と、標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントとの間の複合体の形成を可能にする、またはそれを招く。一部の態様では、このインキュベーションは、関心対象の抗体、例えば標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメント、特に標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメント上の保存されたエピトープに結合する抗体を産生する候補細胞に特異刺激を提供する。したがって、これは、関心対象の稀少な抗体産生細胞を優先的に刺激することができ、関心対象の稀少な細胞の増殖および濃縮を招く。
【０２３９】
一部の態様では、抗体産生細胞および／または抗原および／または標的微生物は、免疫無防備状態の動物の脾臓に導入される、または静脈内に導入される。
【０２４０】
一部の態様では、抗体産生細胞は、標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントの第1の変異体に曝露されたドナーであって、免疫無防備状態の動物に抗体産生細胞を含む細胞組成物を導入する前のドナーからのものであり、該方法は、抗体産生細胞を標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントの第2の変異体と共に混合またはインキュベートする段階を含み、該導入される細胞組成物が、標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントの第2の変異体と複合体を形成した抗体産生細胞を含む。
【０２４１】
一部の態様では、第1および第2の変異体は、標的微生物のエピトープ含有フラグメントをそれぞれ独立して含む。一部の態様では、第1および第2の変異体は、少なくとも1つの保存された領域またはドメインを共有する。一部の態様では、第1および第2の変異体は、可変または超可変であるドメインまたは領域のような、互いに異なる少なくとも1つの領域またはドメインをそれぞれ含む。
【０２４２】
一部の態様では、第1および第2の変異体は、同じ微生物の2つの異なる臨床単離に由来するOMタンパク質またはそのフラグメントを含む。一部の態様では、第1または第2の変異体を、既存の変異体、例えば臨床単離株からさらに改変することができる。例えば一部の態様では、第1の変異体および／または第2の変異体は、完全長OMタンパク質であり、第1および／または第2の変異体の他方は、OMタンパク質の免疫優性エピトープまたはループの欠失を含む、OMタンパク質のフラグメントである。
【０２４３】
一部の態様では、例えば免疫または感染によって、ドナー動物が曝露されたことがあった標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントの変異体は、免疫無防備状態の動物への導入前に刺激に使用される標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントの変異体と異なる。例えば一部の態様では、ドナー動物は、標的微生物からのエピトープ含有フラグメントの1つの変異体、例えばBamA変異体1（SEQ ID NO:1に示される）で免疫され、ドナー動物から得られた細胞組成物は、インビボ濃縮のために免疫無防備状態の動物に導入する前に、標的微生物からのエピトープ含有フラグメントの異なる変異体、例えばBamA変異体2（SEQ ID NO:2に示される）と接触される。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントの1つの変異体、例えばBamA変異体1（SEQ ID NO:1に示される）を発現している標的微生物に感染したことのあるドナー動物、および該ドナー動物から得られた細胞組成物は、インビボ濃縮のために免疫無防備状態の動物に導入する前に、標的微生物からのエピトープ含有フラグメントの異なる変異体、例えばBamA変異体2（SEQ ID NO:2に示される）と接触される。一部の態様では、BamA変異体3（SEQ ID NO:5に示される）および／またはBamA変異体4（SEQ ID NO:6に示される）は、いずれかの段階で使用され得る。一部の態様では、BamAの任意の公知の変異体または臨床単離株を免疫および／またはインビボ濃縮のために使用することができる。
【０２４４】
一部の態様では、任意の1つまたは複数の他の変異体、標的微生物の他の変異体、例えば異なる臨床単離株もしくは異なる血清型からの対応するエピトープ結合性フラグメントの任意の他の変異体、または関連するが異なる微生物からの対応するエピトープ結合性フラグメントを、ドナー動物における曝露およびインビボ濃縮の前の抗体産生細胞の刺激のために、任意の順序および／または任意の組み合わせで使用することができる。例えば一部の態様では、変異型エピトープ含有フラグメントは、SEQ ID NO:1、2、5、6もしくは31に示されるアミノ酸配列を有するBamA変異体またはそのフラグメント、領域もしくはドメインを含む。一部の態様では、変異型エピトープ含有フラグメントは、SEQ ID NO:1、2、5、6もしくは31に示されるアミノ酸配列またはそのフラグメント、領域もしくはドメインと少なくとも90％の配列同一性、例えばそれと少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。
【０２４５】
ドナー曝露およびインビボ濃縮のためにエピトープ含有フラグメントの異なる変異体を利用することは、使用される異なる変異体に共有されるエピトープを標的とする抗体を産生する細胞の特異刺激を可能にする。したがって、この結果として、広範囲の標的微生物変異体、例えば、異なる血清型または標的微生物種の標的微生物に対して有効であることができる、保存されたエピトープを標的とする抗体の同定ができる。
【０２４６】
一部の態様では、エピトープ含有フラグメントは、稀少な細胞のインビボ濃縮段階において候補抗体産生細胞と共に接触および／またはインキュベーションするために生成および調製される。一部の態様では、タンパク質の可溶化および／またはリフォールディングのためにエピトープ含有フラグメントを調製するために、1種類または複数種類の洗剤または界面活性剤が使用される。特に膜タンパク質について、可溶化および／またはリフォールディング段階が必要とされる可能性がある。一部の態様では、調製物中に洗剤または界面活性剤を用いて、エピトープ含有フラグメントを可溶化、変性および／またはリフォールディングすることができる。一部の態様では、可溶化および／または変性された調製物を、例えば洗剤または界面活性剤の存在下でリフォールディングまたは復元することができる。一部の態様では、洗剤または界面活性剤は、ラウリルジメチルアミンオキシド（LDAO）、2-メチル-2,4-ペンタンジオール（MPD）、アンフィポール、アンフィポールA8-35、C8E4、トリトンX-100、オクチルグルコシド、DM（n-デシル-β-D-マルトピラノシド)、DDM（n-ドデシル-β-D-マルトピラノシド、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート（CHAPS）および3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート（CHAPSO）の中より選択される。
【０２４７】
一部の態様では、調製物は、調製物中の洗剤および／または界面活性剤の一部または全てをアンフィポール、例えばアンフィポールA8-35のような両親媒性ポリマーまたは界面活性剤により置き換える洗剤交換に供される。一部の態様では、エピトープ含有フラグメントの調製物を抗体産生細胞と接触させる前に、エピトープ含有フラグメントの調製物から、過剰の洗剤または界面活性剤が、抗体産生細胞に有毒でないおよび／またはその溶解を誘導しないレベルまたは量に除去または低減される。一部の態様では、洗剤の除去はゲル濾過カラムを用いて実施される。
【０２４８】
一部の態様では、該方法は、免疫無防備状態の動物の脾臓から候補抗体産生細胞、例えばB細胞および／または形質芽細胞を単離し、それにより、微生物におけるエピトープ含有フラグメントに対する特異性を有する形質芽細胞が濃縮された形質芽細胞集団を得る段階を含むことができる。一部の態様では、そのような候補細胞は、本明細書に提供される方法のいずれかを用いて封入および同定に供することができる。
【０２４９】
IV.  抗体
標的微生物のエピトープ含有フラグメント、例えば抗原またはエピトープと結合する抗体が提供される。一部の態様では、細菌外膜（OM）タンパク質と結合する抗体が提供される。一部の態様では、アシネトバクター・バウマニBamAと結合する抗体が提供される。一部の態様では、提供される抗体は、標的微生物におけるエピトープに結合する。一部の態様では、標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントの少なくとも1つの保存された領域、すなわち該微生物またはそのエピトープ含有フラグメントの異なる変異体の間で保存された領域に存在するエピトープ、例えば抗原またはエピトープ、に結合する抗体が提供される。一部の態様では、抗体は、本明細書に提供される方法を用いて同定された抗体である。
【０２５０】
一部の態様では、グラム陰性菌のOMタンパク質の少なくとも1つの保存された領域に存在するエピトープに結合する抗体が提供される。グラム陰性菌の少なくとも1つの保存された領域またはドメインに存在するエピトープに結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントが提供される。一部の態様では、アシネトバクター属の種におけるBamAの少なくとも1つの保存された領域に存在するエピトープに結合する抗体が提供される。一部の態様では、少なくとも1つの保存された領域に存在するエピトープ、例えばアシネトバクター・バウマニBamAの1つまたは複数の変異体または単離株において保存されている1つまたは複数の保存されたアミノ酸に結合する抗体が提供される。一部の態様では、A.バウマニ ATCC19606からのBamAとA.バウマニ ATCC17978からのBamAとの間で保存された領域に結合する抗体が提供される。一部の態様では、抗体は、A.バウマニ 1440422株からのBamA、A.バウマニ MSP4-16株からのBamAおよび／またはA.バウマニ 1202252株からのBamAの間で保存された領域に結合する。
【０２５１】
一部の態様では、エピトープは、アミノ酸の連続配列である、またはそれを含む。一部の態様では、エピトープは、アミノ酸の非連続配列である、またはそれを含む。様々なA.バウマニにおいて保存されている例示的な領域は、SEQ ID NO:11に示されるA.バウマニATCC19606のBamA配列の423〜438、440〜460、462〜502、504〜533、537〜544、547〜555、557〜561、599〜604、606〜644、646〜652、659〜700、702〜707、718〜723、735〜747、749〜760、784〜794、798〜804、806〜815および817〜841位のアミノ酸残基を含むことができる。一部の態様では、様々なA.バウマニにおいて保存されている、保存された領域は、SEQ ID NO:12〜30に示されるアミノ酸配列またはその任意のフラグメントのうちの任意の1つまたは複数を含む。一部の態様では、提供される抗体は、保存された領域内に部分的または完全に含まれるエピトープに結合する。
【０２５２】
抗体は、単離された抗体を含む。一部の態様では、提供される抗体は、ヒト抗体である。一部の態様では、提供される抗体は、全てまたは実質的に全ての相補性決定領域（CDR）のアミノ酸残基が、非ヒトCDRに由来し、全てまたは実質的全てのフレームワーク領域（FR）のアミノ酸残基が、ヒトFRに由来する抗体のような、ヒト化抗体である。一部の態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の態様では、抗体は、ヒト化動物、例えばヒト化抗体を産生するように遺伝子改変された動物の細胞によって産生される。一部の態様では、抗体は、Trianniトランスジェニックマウス、およびCrystal Biosciences製のHuMabニワトリのようなトランスジェニックニワトリのように、ヒト化または部分ヒト化抗体を産生するように操作されたトランスジェニックマウスまたはトランスジェニックニワトリからの細胞によって産生される。
【０２５３】
一部の態様では、提供される抗体は、任意のいくつかの公知の方法によって測定されるとき、標的微生物のエピトープ含有フラグメントと少なくともある特定の親和性で結合することができる。一部の態様では、親和性は、平衡解離定数（KD）によって表される。一部の態様では、提供される抗体は、標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその中のエピトープに、105M-1以上の親和性またはKA（すなわち、特定の結合相互作用の平衡結合定数（単位1/M）であって、2分子相互作用を仮定して、この結合反応に関する解離速度（off-rate）[koffまたはkd]に対する結合速度（on-rate）[konまたはka]の比と等しい）で結合する、例えば特異的に結合する。一部の態様では、提供される抗体は、標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその中のエピトープに、10-5M以下のKD（すなわち、特定の結合相互作用の平衡解離定数（単位M）であって、2分子相互作用を仮定して、この結合反応に関する結合速度[konまたはka]に対する解離速度[koffまたはkd]の比と等しい）で結合する、例えば特異的に結合する。例えば、平衡解離定数KDは、10-5M〜10-13Mの範囲、例えば10-7M〜10-11M、10-8M〜10-10M、または10-9M〜10-10Mである。ある特定の態様では、標的微生物のエピトープ含有フラグメントに対する抗体のKDは、400nM、300nM、200nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、もしくは1nMもしくはそれ以下、または、400nM、300nM、200nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、もしくは1nM未満もしくはそれ以下、または約400nM、300nM、200nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、もしくは1nMもしくはそれ以下である。
【０２５４】
一部の態様では、提供される抗体は、組換え産生される。一部の態様では、同定された抗体またはそのフラグメントをコードする核酸配列を細胞内に含むポリヌクレオチド。一部の態様では、抗体は、哺乳動物細胞、または例えば細菌細胞もしくは酵母細胞への組換え発現用細胞において産生される。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、別の部分、例えばアフィニティータグ、検出可能な標識、プロテアーゼ切断配列および／または可動性リンカーをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結される配列を含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドは、提供される抗体またはそのフラグメントと、別の部分、例えばアフィニティータグ、検出可能な標識および／またはプロテアーゼ切断配列との融合タンパク質をコードする。一部の態様では、検出可能な標識は、蛍光タンパク質、発光タンパク質、色素タンパク質または酵素である。
【０２５５】
一部の態様では、提供される抗体は、機能性抗原結合性フラグメントである。一部の態様では、抗体は、軽鎖抗原結合部位（例えば軽鎖可変（VL）領域）と対形成していない、および／または任意の追加的な抗体ドメインもしくは結合部位を有さない重鎖可変（VH）領域を含む単一ドメイン抗体であって、標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその中のエピトープに特異的に結合することができる単一ドメイン抗体である抗体を含む。抗体の中には、単一ドメイン抗体のVHドメインまたはその抗原結合部位から構成されるVHドメインおよびVLドメインを含む多ドメイン抗体のような多ドメイン抗体も含まれる。一部の態様では、抗体は、scFvのように重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。抗体は、標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその中のエピトープに特異的に結合する抗体を含む。
【０２５６】
ある特定の態様では、抗体は、例えばアミノ酸配列を変更することおよび／または例えばある特定の細胞株を用いてグリコシル化部位に付加したオリゴ糖を改変することによって1つまたは複数のグリコシル化部位を除去または挿入することによって、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように変更される。一部の態様では、共通配列-Asn-Xaa-Ser/Thrにおけるアスパラギンに存在するグリコシル化部位であるN結合型グリコシル化が、除去または挿入される。
【０２５７】
例えば、一部の態様では、提供される抗体は、1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば置換）を含む、定常領域のヒトFc領域の配列または他の部分（例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4のFc領域）を有する抗体のように、Fc領域に1つまたは複数のアミノ酸改変を有する。そのような改変は、例えば半減期を改善するため、1つもしくは複数の種類のFcレセプターへの結合性を変更するため、および／またはエフェクター機能を変更するために行うことができる。他の改変は、例えば薬剤とリンカー剤とのコンジュゲーション用に、到達可能な部位に反応性チオール基を形成させるために抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基により置換されてイムノコンジュゲートを産生させるシステイン操作を含む。システイン操作抗体は、例えば米国特許第7,855,275号および同第7,521,541号に記載されている。
【０２５８】
一部の態様では、抗体（例えば、抗原結合性フラグメント）は、ポリエチレングリコール（PEG）のような水溶性ポリマーを含めた、追加的な非タンパク質性部分を含有するように改変される。ポリマーは、任意の分子量であり得、分岐または非分岐であり得る。抗体に付加させるポリマーの数は変動する場合があり、1つまたは複数の異なるポリマーを付加させることができる。
【０２５９】
V.  例示的な態様
本発明のこれらの局面および他の局面の例証的な態様を下により詳細に説明する。しかし、本発明は、これらの特定の態様に限定されない。
1.  標的微生物と結合する抗体を同定するための方法であって、
(a)複数の候補抗体産生細胞を得る段階；
(b)複数の候補抗体産生細胞を標的微生物と共にゲル微小滴中に封入する段階；および
(c)ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、前記標的微生物と結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階であって、それにより、前記標的微生物に特異的に結合する抗体を同定する、段階
を含む前記方法。
2.  段階(b)が、前記標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体を微小滴中に封入することをさらに含み；
段階(c)が、前記標的微生物と結合すると同定された抗体が、同じゲル微小滴内のそのエピトープ含有フラグメントとも結合するかどうかを判定することを含む、
態様1の方法。
3.  標的微生物と結合する抗体を同定するための方法であって、
(a)複数の候補抗体産生細胞を得る段階；
(b)複数の候補抗体産生細胞を標的微生物および該標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体と共にゲル微小滴中に封入する段階；および
(c)ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する前記標的微生物および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階であって、それにより、前記標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントに特異的に結合する抗体を同定する、段階
を含む前記方法。
4.  エピトープ含有フラグメントが、固体支持体に結合している、態様1〜3のいずれか一つの方法。
5.  固体支持体が、ビーズである、態様4の方法。
6.  前記標的微生物が、細菌、真菌、寄生虫またはウイルスである、態様1〜5のいずれか一つの方法。
7.  前記標的微生物が、細菌または真菌である、態様6の方法。
8.  前記微生物が、多剤耐性微生物である、態様6または態様7の方法。
9.  前記微生物が、グラム陰性菌である細菌である、態様6〜8のいずれか一つの方法。
10.  グラム陰性菌が、プロテオバクテリアである、態様9の方法。
11.  前記微生物が、アシネトバクター属（Acinetobacter）、デロビブリオ属（Bdellovibrio）、バークホルデリア属（Burkholderia）、クラミジア属（Chlamydia）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、フランシセラ属（Francisella）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、クレブシエラ属（Klebsiella）、レジオネラ属（Legionella）、モラクセラ属（Moraxella）、ナイセリア属（Neisseria）、パンテア属（Pantoea）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、ステノトロホモナス属（Stenotrophomonas）、ビブリオ属（Vibrio）およびエルシニア属（Yersinia）の種の中より選択される細菌である、態様6〜10のいずれか一つの方法。
12.  前記微生物が、アシネトバクター・アピス（Acinetobacter apis）、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）、アシネトバクター・バイリイ（Acinetobacter baylyi）、アシネトバクター・ベイジェリンキイ（Acinetobacter beijerinckii）、アシネトバクター・ベレジニエ（Acinetobacter bereziniae）、アシネトバクター・ボヘミカス（Acinetobacter bohemicus）、アシネトバクター・ボイシエリ（Acinetobacter boissieri）、アシネトバクター・ボウベティイ（Acinetobacter bouvetii）、アシネトバクター・ブリソウィイ（Acinetobacter brisouii）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）、アシネトバクター・ガンデンシス（Acinetobacter gandensis）、アシネトバクター・ゲルネリ（Acinetobacter gerneri）、アシネトバクター・ガンドンジェンシス（Acinetobacter guangdongensis）、アシネトバクター・ギロウイエ（Acinetobacter guillouiae）、アシネトバクター・ジレンベルジイ（Acinetobacter gyllenbergii）、アシネトバクター・ヘモリティカス（Acinetobacter haemolyticus）、アシネトバクター・ハービネンシス（Acinetobacter harbinensis）、アシネトバクター・インディカス（Acinetobacter indicus）、アシネトバクター・ジョンソニイ（Acinetobacter johnsonii）、アシネトバクター・ジュニイ（Acinetobacter junii）、アシネトバクター・クーキイ（Acinetobacter kookii）、アシネトバクター・ルヴォフィイ（Acinetobacter lwoffii）、アシネトバクター・ネクタリス（Acinetobacter nectaris）、アシネトバクター・ノソコミアリス（Acinetobacter nosocomialis）、アシネトバクター・パキスタネンシス（Acinetobacter pakistanensis）、アシネトバクター・パルブス（Acinetobacter parvus）、アシネトバクター・ピティイ（Acinetobacter pitii）、アシネトバクター・ピッティイ（Acinetobacter pittii）、アシネトバクター・プヤンジェンシス（Acinetobacter puyangensis）、アシネトバクター・キンフェンジェンシス（Acinetobacter qingfengensis）、アシネトバクター・ラジオレジスタンス（Acinetobacter radioresistans）、アシネトバクター・ラジオレジステンス（Acinetobacter radioresistens）、アシネトバクター・ルディス（Acinetobacter rudis）、アシネトバクター・シンドレリ（Acinetobacter schindleri）、アシネトバクター・セイフェルティイ（Acinetobacter seifertii）、アシネトバクター・ソリ（Acinetobacter soli）、アシネトバクター・タンドイイ（Acinetobacter tandoii）、アシネトバクター・チェルンベルギエ（Acinetobacter tjernbergiae）、アシネトバクター・タウネリ（Acinetobacter towneri）、アシネトバクター・ウルシンギイ（Acinetobacter ursingii）、アシネトバクター・バリアビリス（Acinetobacter variabilis）、アシネトバクター・ベネチアヌス（Acinetobacter venetianus）、大腸菌（Escherichia coli）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ボイド赤痢菌（Shigella boydii）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）、ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）、コレラ菌（Vibrio cholera）およびペスト菌（Yersinia pestis）の中より選択される、態様6〜11のいずれか一つの方法。
13.  前記微生物が、アシネトバクター・バウマニである、態様12の方法。
14.  前記微生物が、グラム陽性菌である細菌である、態様6〜8のいずれか一つの方法。
15.  前記微生物が、ブドウ球菌属（Staphylococcus）および連鎖球菌属（Streptococcus）の種の中より選択される、態様14の方法。
16.  前記微生物が、アスペルギルス属（Aspergillus）またはカンジダ属（Candida）の種である真菌である、態様6〜8のいずれか一つの方法。
17.  前記微生物が、コクシジウム亜綱（Coccidia）またはプラスモジウム属（Plasmodium）の種である寄生虫である、態様6または態様8の方法。
18.  複数の候補抗体産生細胞が、前記標的微生物もしくは前記標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体に曝露されたことのあるドナーから得られる、態様1〜17のいずれか一つの方法。
19.  複数の候補抗体産生細胞が、
(i)前記標的微生物もしくは前記標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体に曝露されたことのあるドナーから得られた抗体産生細胞を、該抗体産生細胞を含む細胞組成物を免疫無防備状態の動物に導入することによって増殖させる段階；および
(ii)増殖した抗体産生細胞を回収する段階であって、それにより、複数の候補抗体産生細胞を得る、段階
を含む方法によって得られる、態様1〜18のいずれか一つの方法。
20.  前記抗体産生細胞を含む細胞組成物が、ドナーの脾臓および／またはリンパ節から得られた細胞を含む、態様19の方法。
21.  前記細胞組成物が、T細胞を含む、態様19または態様20の方法。
22.  前記細胞組成物が、抗体産生細胞を含む末梢血単核細胞（PBMC）を含む、態様19〜21のいずれか一つの方法。
23.  免疫無防備状態の動物が、SCIDマウスである、態様19〜22のいずれか一つの方法。
24.  前記抗体産生細胞を含む細胞組成物が、免疫無防備状態の動物の静脈内に導入される、または該免疫無防備状態の動物の脾臓への移植により導入される、態様19〜23のいずれか一つの方法。
25.  抗体産生細胞が、前記標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントの第1の変異体に曝露されたドナーからのものであり、かつ
抗体産生細胞を含む細胞組成物を免疫無防備状態の動物に導入する前に、前記方法が、抗体産生細胞を前記標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントの第2の変異体と共に混合またはインキュベートする段階を含み、該導入される細胞組成物が、前記標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントの第2の変異体と複合体を形成した抗体産生細胞を含む、
態様19〜24のいずれか一つの方法。
26.  エピトープ含有フラグメントが、前記標的微生物の必須タンパク質または必須タンパク質のフラグメントを含む、態様1〜25のいずれか一つの方法。
27.  エピトープ含有フラグメントが、前記標的微生物に由来する細菌外膜（OM）タンパク質、膜タンパク質、エンベロープタンパク質、細胞壁タンパク質、細胞壁成分、表面脂質、糖脂質、リポ多糖、糖タンパク質、表面多糖、莢膜、表面付属器、鞭毛、線毛、単分子表面層、もしくはS層またはそのフラグメントを含む、態様1〜26のいずれか一つの方法。
28.  エピトープ含有フラグメントが、前記標的微生物の表面からの脂質を含む、態様1〜27のいずれか一つの方法。
29.  エピトープ含有フラグメントが、リポ多糖（LPS）またはリポタンパク質を含む、態様28の方法。
30.  エピトープ含有フラグメントが、外膜（OM）タンパク質を含む、態様1〜27のいずれか一つの方法。
31.  OMタンパク質が、BamA、LptD、AdeC、AdeK、BtuB、FadL、FecA、FepA、FhaC、FhuA、LamB、MepC、MexA、NalP、NmpC、NspA、NupA、Omp117、Omp121、Omp200、Omp71、OmpA、OmpC、OmpF、OmpG、OmpT、OmpW、OpcA、OprA、OprB、OprF、OprJ、OprM、OprN、OstA、PagL、PagP、PhoE、PldA、PorA、PorB、PorD、PorP、SmeC、SmeF、SrpC、SucY、TolC、TtgCおよびTtgFの中より選択される、態様30の方法。
32.  OMタンパク質が、BamAまたはLptDである、態様31の方法。
33.  エピトープ含有フラグメントが、OMタンパク質またはそのフラグメントの可溶化によって調製される、態様25〜27および30〜32のいずれか一つの方法。
34.  可溶化が、1種類または複数種類の洗剤または界面活性剤の添加によって実施される、態様33の方法。
35.  抗体産生細胞と共に混合またはインキュベートする段階の前に、エピトープ含有フラグメントをリフォールディングする段階をさらに含む、態様33または態様34の方法。
36.  リフォールディングが、1種類または複数種類の洗剤または界面活性剤の存在下で実施される、態様35の方法。
37.  洗剤または界面活性剤が、ラウリルジメチルアミンオキシド（LDAO）、2-メチル-2,4-ペンタンジオール（MPD）、アンフィポール（amphipol）、アンフィポールA8-35、C8E4、トリトン（Triton）X-100、オクチルグルコシド、DM（n-デシル-β-D-マルトピラノシド）、DDM（n-ドデシル-β-D-マルトピラノシド、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート（CHAPS）および3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート（CHAPSO）の中より選択される、態様34〜36のいずれか一つの方法。
38.  調製物中の洗剤および／または界面活性剤の一部または全部を両親媒性ポリマーまたは界面活性剤により置き換える段階をさらに含む、態様34〜37のいずれか一つの方法。
39.  抗体産生細胞と共に混合またはインキュベートする段階の前に、エピトープ含有フラグメントの調製物から、過剰の洗剤または界面活性剤が、抗体産生細胞に有毒でないおよび／または抗体産生細胞の溶解を誘導しないレベルまたは量に除去または低減される、態様34〜38のいずれか一つの方法。
40.  第1および第2の変異体が、前記標的微生物のエピトープ含有フラグメントをそれぞれ独立して含む、態様25〜39のいずれか一つの方法。
41.  第1および第2の変異体が、少なくとも1つの保存された領域またはドメインを共有する、態様25〜40のいずれか一つの方法。
42.  第1および第2の変異体が、互いに異なる少なくとも1つの領域またはドメインをそれぞれ含む、態様41の方法。
43.  第1および第2の変異体が、同じ微生物の2つの異なる臨床単離株に由来するOMタンパク質またはそのフラグメントを含む、態様25〜42のいずれか一つの方法。
44.  第1の変異体および／または第2の変異体が、完全長OMタンパク質であり、かつ該第1および／または第2の変異体の他方が、OMタンパク質の免疫優性エピトープまたはループの欠失を含むOMタンパク質のフラグメントである、態様25〜43のいずれか一つの方法。
45.  同定された抗体が、前記標的微生物の少なくとも1つの保存された領域またはドメインに結合する、態様41〜44のいずれか一つの方法。
46.  ドナーが、前記標的微生物もしくは前記標的微生物のエピトープ含有フラグメントまたはその変異体で免疫されたまたはそれに感染したことがある、態様18〜45のいずれか一つの方法。
47.  ドナーが、免疫された動物または感染した動物である、態様18〜46のいずれか一つの方法。
48.  ドナーが、哺乳動物または鳥類である、態様18〜47のいずれか一つの方法。
49.  ドナーが、ヒト、マウスまたはニワトリである、態様18〜48のいずれか一つの方法。
50.  ドナーが、前記微生物に感染したヒトドナーである、態様18〜49のいずれか一つの方法。
51.  ドナーが、部分ヒト抗体または完全ヒト抗体を産生する遺伝子改変非ヒト動物である、態様18〜50のいずれか一つの方法。
52.  抗体産生細胞が、末梢血単核細胞（PBMC）、B細胞、形質芽細胞または形質細胞を含む、態様1〜51のいずれか一つの方法。
53.  抗体産生細胞が、B細胞、形質芽細胞または形質細胞を含む、態様1〜52のいずれか一つの方法。
54.  B細胞を単離または濃縮するために、複数の候補抗体産生細胞が、正または負の選択によってドナーより選択される、態様18〜53のいずれか一つの方法。
55.  B細胞が、形質芽細胞または形質細胞である、態様54の方法。
56.  前記選択が、CD2、CD3、CD4、CD14、CD15、CD16、CD34、CD56、CD61、CD138、CD235a（グリコホリンA）およびFceRIaのうちの1つまたは複数の中より選択される細胞表面マーカーの発現に基づく正の選択である、態様55の方法。
57.  抗体産生細胞がCD138+細胞を含む、態様52〜56のいずれか一つの方法。
58.  前記細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、またはそれ以上または少なくとも約50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、もしくはそれ以上が、形質細胞もしくは形質芽細胞であり、かつ／またはCD138+細胞である、態様52〜57のいずれか一つの方法。
59.  前記抗体が、抗体またはその抗原結合性フラグメントである、態様1〜58のいずれか一つの方法。
60.  ゲル微小滴が、マイクロフルイディクスに基づく方法によって生成される、態様1〜59のいずれか一つの方法。
61.  ゲル微小滴が、アガロース、カラゲナン、アルジネート、アルジネート-ポリリジン、コラーゲン、セルロース、メチルセルロース、ゼラチン、キトサン、細胞外マトリックス、デキストラン、デンプン、イヌリン、ヘパリン、ヒアルロナン、フィブリン、ポリビニルアルコール、ポリ(N-ビニル-2-ピロリドン)、ポリエチレングリコール、ポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート)、アクリレートポリマーおよびポリアクリル酸ナトリウム、ポリジメチルシロキサン、シスポリイソプレン、Puramatrix（商標）、ポリジベニル（divenyl）ベンゼン、ポリウレタン、もしくはポリアクリルアミドまたはそれらの組み合わせの中より選択される材料を含む、態様1〜60のいずれか一つの方法。
62.  ゲル微小滴が、アガロースを含む、態様61の方法。
63.  アガロースが、低ゲル化温度アガロースである、態様62の方法。
64.  アガロースが、約35℃未満、約30℃未満、約25℃未満、約20℃未満、約15℃未満、約10℃未満または約5℃未満のゲル化温度を有する、態様62または態様63の方法。
65.  アガロースが、約5℃〜約30℃、約5℃〜約20℃、約5℃〜約15℃、約8℃〜約17℃または約5℃〜約10℃のゲル化温度を有する、態様62または態様63の方法。
66.  段階(b)が、封入に続いてゲル微小滴を約0℃〜約5℃の温度で約1分間〜約10分間インキュベートすることをさらに含む、態様1〜65のいずれか一つの方法。
67.  ビーズが、約100nm〜約100μm、または約3μm〜約5μmの平均直径を有する、態様5〜66のいずれか一つの方法。
68.  ゲル微小滴1個あたりの候補抗体産生細胞の平均比が、1未満または約1未満である、態様1〜67のいずれか一つの方法。
69.  ゲル微小滴1個あたりの候補抗体産生細胞の平均比が、それぞれ両端の値を含む約0.05〜約1.0、約0.05〜約0.5、約0.05〜約0.25、約0.05〜約0.1、約0.1〜約1.0、約0.1〜約0.5、約0.1〜約0.25、約0.25〜約1.0、約0.25〜約0.5または0.5〜約1.0である、態様1〜68のいずれか一つの方法。
70.  微小滴1個あたりの候補抗体産生細胞の平均比が、0.1または約0.1である、態様69の方法。
71.  ゲル微小滴1個あたりの前記微生物の平均比が、約50〜約150または約50〜約100である、態様1〜70のいずれか一つの方法。
72.  ゲル微小滴1個あたりのビーズの平均比が、約2〜約10または約3〜約5である、態様5〜71のいずれか一つの方法。
73.  候補細胞 対 微生物 対 ビーズの平均比が、約0.1:100:10である、態様5〜72のいずれか一つの方法。
74.  ゲル微小滴が、成長培地を含み、かつ非水環境によって囲まれている、態様1〜73のいずれか一つの方法。
75.  非水環境が、油を含む、態様74の方法。
76.  油が、ガス透過性である、態様75の方法。
77.  段階(c)の前に、ゲル微小滴を37℃または約37℃の温度でインキュベートする段階をさらに含む、態様1〜76のいずれか一つの方法。
78.  ゲル微小滴が、成長培地中でインキュベートされる、態様77の方法。
79.  段階(c)の前に、抗体に結合する試薬をゲル微小滴中に導入し、該試薬が検出可能な部分を含む、態様1〜78のいずれか一つの方法。
80.  前記試薬が、封入された抗体産生細胞によって産生される抗体に特異的な二次抗体を含む、態様79の方法。
81.  ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する前記標的微生物および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階が、
(i)前記標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメント；
(ii)抗体産生細胞によって産生された抗体；および
(iii)結合した検出可能な部分を含む試薬
を含む複合体
の存在を検出することを含み、該複合体の存在が、該抗体が前記標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合することを示す、態様79または態様80の方法。
82.  ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する前記標的微生物および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階が、該抗体の存在が同じゲル微小滴中の前記標的微生物の表現型の特徴を改変するかどうかを判定することを含み、改変された表現型の特徴の存在が、該抗体が前記標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合することを示す、態様1〜78のいずれか一つの方法。
83.  改変された表現型の特徴が、細胞成長、細胞死、挙動の変化、結合性、転写、翻訳、発現、タンパク質輸送、細胞もしくは膜構築、接着、運動性、細胞ストレス、細胞分裂および／または細胞生存度の中より選択される、態様82の方法。
84.  ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する前記標的微生物および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階が、レポーター分子によって生成されるシグナルを検出することを含み、該シグナルが、改変された表現型の特徴の存在下で生成される、態様82または態様83の方法。
85.  前記微生物が、レポーター分子をコードするポリヌクレオチドを含む、態様84の方法。
86.  ポリヌクレオチドが、レポーター分子をコードする配列に機能的に連結された調節領域を含み、該調節領域が、改変された表現型の特徴に応答性である、態様85の方法。
87.  調節領域がプロモーターを含む、態様86の方法。
88.  改変された表現型の特徴が細胞ストレスを含み、かつシグナルが該細胞ストレスの存在下で生成される、態様82〜87のいずれか一つの方法。
89.  細胞ストレスが細菌の外膜（OM）に対するストレスを含む、態様83〜88のいずれか一つの方法。
90.  レポーター分子によって生成されるシグナルが、検出可能な部分で検出される、態様84〜89のいずれか一つの方法。
91.  レポーター分子によって生成されるシグナルが、蛍光シグナル、発光シグナル、比色シグナル、化学発光シグナルまたは放射性シグナルを含む、態様84〜90のいずれか一つの方法。
92.  レポーター分子が、蛍光タンパク質、発光タンパク質、色素タンパク質または酵素である、態様84〜91のいずれか一つの方法。
93.  ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する前記標的微生物および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階が、該抗体の存在が同じゲル微小滴中の前記標的微生物を殺傷するかどうかを判定することを含み、前記標的微生物の殺傷が、該抗体が前記標的微生物またはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合することを示す、態様1〜78のいずれか一つの方法。
94.  ゲル微小滴が、細胞死を示す検出可能な部分を含む、態様93の方法。
95.  前記検出可能な部分が、発色団部分、蛍光部分、リン光部分、発光部分、光吸収部分、放射性部分、および遷移金属同位体質量タグ部分の中より選択される1つまたは複数の検出可能な標識を含む、態様79〜81、90〜92および94のいずれか一つの方法。
96.  (d)前記標的微生物もしくはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合すると同定された抗体を産生する細胞を含む微小滴を単離する段階または該同定された抗体をコードするポリヌクレオチドを単離する段階
をさらに含む、態様1〜95のいずれか一つの方法。
97.  単離が、マイクロマニピュレーターまたは自動ソーターを用いて実施される、態様96の方法。
98.  (e)同定された抗体をコードする核酸の配列を決定する段階
をさらに含む、態様1〜97のいずれか一つの方法。
99.  核酸の配列を決定する段階が、核酸増幅および／または配列決定を用いて実施される、態様98の方法。
100.  核酸の配列を決定する段階が、単一細胞PCRおよび核酸配列決定を用いて実施される、態様98または態様99の方法。
101.  (f)同定された抗体またはそのフラグメントをコードする核酸の配列を含むポリヌクレオチドを細胞内に導入する段階
をさらに含む、態様98〜100のいずれか一つの方法。
102.  段階(a)の完了から約60日、50日、40日、30日、20日、19日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日、3日、2日または1日以内に完了する、態様1〜101のいずれか一つの方法。
103.  段階(a)の完了から約30日、20日、19日、18日、17日、16日、15日、14日、13日、12日、11日、10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日、3日、2日または1日以内に完了する、態様102の方法。
104.  態様1〜103のいずれか一つの方法によって同定された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
105.  グラム陰性菌のBamA（β-バレルアセンブリー機構）の少なくとも1つの保存された領域またはドメインに存在するエピトープに結合する、態様104の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
106.  グラム陰性菌のBamA（β-バレルアセンブリー機構）の少なくとも1つの保存された領域またはドメインに存在するエピトープに結合する、抗体またはその抗原結合性フラグメント。
107.  グラム陰性菌が、アシネトバクター属の種である、態様105または態様106の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
108.  グラム陰性菌が、アシネトバクター・バウマニである、態様105〜107のいずれか一つの抗体またはその抗原結合性フラグメント。
109.  保存された領域またはドメインが、A.バウマニ ATCC19606からのBamAとA.バウマニ ATCC17978からのBamAとの間で共有される保存された領域またはドメインである、態様105〜108のいずれか一つの抗体またはその抗原結合性フラグメント。
110.  保存された領域またはドメインが、SEQ ID NO:11に示されるA.バウマニのBamA配列の423〜438、440〜460、462〜502、504〜533、537〜544、547〜555、557〜561、599〜604、606〜644、646〜652、659〜700、702〜707、718〜723、735〜747、749〜760、784〜794、798〜804、806〜815および817〜841位のアミノ酸残基を含む、態様109の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
111.  保存された領域またはドメインが、SEQ ID NO:12〜20に示される配列を含む、態様110の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
112.  エピトープが、保存された領域またはドメインの連続配列または不連続配列である、態様105〜111のいずれか一つの抗体またはその抗原結合性フラグメント。
113.  ヒト型である、態様104〜112のいずれか一つの抗体またはその抗原結合性フラグメント。
114.  ヒト化抗体である、態様104〜112のいずれか一つの抗体またはその抗原結合性フラグメント。
115.  ヒト化抗体を産生するように操作されたトランスジェニック動物からの抗体産生細胞によって産生される、態様114の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
116.  組換え型である、態様104〜115のいずれか一つの抗体またはその抗原結合性フラグメント。
117.  モノクローナルである、態様104〜116のいずれか一つの抗体またはその抗原結合性フラグメント。
118.  抗原結合性フラグメントである、態様104〜117のいずれか一つの抗体または抗原結合性フラグメント。
119.  アフィニティータグ、検出可能なタンパク質、プロテアーゼ切断配列、リンカーまたは非タンパク質性部分をさらに含む、態様104〜118のいずれか一つの抗体または抗原結合性フラグメント。
120.  A.バウマニのBamAに対して400nM、300nM、200nM、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、もしくは1nMの、または400nM未満、300nM未満、200nM未満、100nM未満、50nM未満、40nM未満、30nM未満、25nM未満、20nM未満、19nM未満、18nM未満、17nM未満、16nM未満、15nM未満、14nM未満、13nM未満、12nM未満、11nM未満、10nM未満、9nM未満、8nM未満、7nM未満、6nM未満、5nM未満、4nM未満、3nM未満、2nM未満、もしくは1nM未満の、または約400nM未満、約300nM未満、約200nM未満、約100nM未満、約50nM未満、約40nM未満、約30nM未満、約25nM未満、約20nM未満、約19nM未満、約18nM未満、約17nM未満、約16nM未満、約15nM未満、約14nM未満、約13nM未満、約12nM未満、約11nM未満、約10nM未満、約9nM未満、約8nM未満、約7nM未満、約6nM未満、約5nM未満、約4nM未満、約3nM未満、約2nM未満、もしくは約1nM未満の平衡解離定数（KD）を有する、態様104〜119のいずれか一つの抗体または抗原結合性フラグメント。
121.  態様104〜120のいずれか一つの抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
122.  態様104〜120のいずれか一つの抗体を含む、組成物。
123.  薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、態様122の組成物。
124.  候補抗体産生細胞；および
標的微生物
を各々含む複数の微小滴
を含む、組成物。
125.  各微小滴が、固体支持体に結合している前記標的微生物もしくはそのエピトープ含有フラグメントまたはその変異体をさらに含む、態様124の組成物。
126.  前記標的微生物が、レポーター分子をコードするポリヌクレオチドを含む、態様124または態様125の組成物。
127.  候補抗体産生細胞；および
標的微生物
を各々含む、微小滴のライブラリー。
128.  各微小滴が、固体支持体に結合している前記標的微生物もしくはそのエピトープ含有フラグメントまたはその変異体をさらに含む、態様127のライブラリー。
129.  前記標的微生物が、レポーター分子をコードするポリヌクレオチドを含む、態様127または態様128のライブラリー。
130.  標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメントに特異的に結合する抗体を同定するための方法であって、
(a)標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメントに感染したまたはそれで免疫された動物から得られた抗体産生細胞を免疫無防備状態の動物に導入することによって、該抗体産生細胞を増殖させる段階；
(b)段階(a)に続いて、免疫無防備状態の動物から得られた抗体産生細胞を標的病原体および／またはそのエピトープ含有フラグメントと一緒にゲル微小滴中に封入する段階であって、複数のゲル微小滴が、抗体産生細胞を1つだけ含む段階；および
(c)ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する標的病原体および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階であって、それにより、標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメントに特異的に結合する抗体を同定する、段階
を含む前記方法。
131.  標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合すると同定された抗体をコードするポリヌクレオチドを単離する段階をさらに含む、態様130の方法。
132.  標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメントに感染したまたはそれで免疫された動物が、病原体に感染したヒトドナーである、態様130または態様131の方法。
133.  標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメントに感染したまたはそれで免疫された動物が、部分ヒトまたは完全ヒト抗体を産生する遺伝子改変非ヒト動物である、態様130または態様131の方法。
134.  病原体が微生物である、態様130〜133のいずれか一つの方法。
135.  微生物が、細菌または真菌である、態様134の方法。
136.  免疫無防備状態の動物が、SCIDマウスである、態様130〜135のいずれか一つの方法。
137.  抗体産生細胞を含むPBMCが、免疫無防備状態の動物に導入される、態様130〜136のいずれか一つの方法。
138.  抗体産生細胞が、免疫無防備状態の動物の静脈内に導入される、または免疫無防備状態の動物の脾臓への移植により導入される、態様130〜137のいずれか一つの方法。
139.  ゲル微小滴が、抗体に結合する検出可能な部分を含む、態様130〜138のいずれか一つの方法。
140.  前記検出可能な部分が、封入された抗体産生細胞によって産生される抗体に特異的な標識二次抗体である、態様139の方法。
141.  ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する標的病原体および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階が、
(i)標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメント；
抗体産生細胞によって産生された抗体；および
(iii)検出可能な部分
を含む複合体
の存在を検出することを含み、該複合体の存在が、抗体が標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合することを示す、態様139または態様140の方法。
142.  ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する標的病原体および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階が、抗体の存在が同じゲル微小滴中の標的病原体の表現型の特徴を改変するかどうかを判定することを含み、改変された表現型の特徴の存在が、抗体が標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合することを示す、態様130〜138のいずれか一つの方法。
143.  改変された表現型の特徴が、細胞成長または細胞死である、態様142の方法。
144.  ゲル微小滴内の抗体産生細胞が、同じゲル微小滴中に存在する標的病原体および／またはそのエピトープ含有フラグメントと結合する抗体を産生するかどうかを判定する段階が、抗体の存在が同じゲル微小滴中の標的病原体を殺傷するかどうかを判定することを含み、該標的病原体の殺傷が、抗体が標的病原体またはそのエピトープ含有フラグメントと特異的に結合することを示す、態様130〜138のいずれか一つの方法。
145.  ゲル微小滴が、細胞死を示す検出可能な部分を含む、態様144の方法。
【実施例】
【０２６０】
VI.  実施例
以下の実施例は、例証的な目的のためだけに含まれるものであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０２６１】
実施例1：ゲル封入およびスクリーニングのための例証的な方法
本実施例は、提供される方法によるゲル封入およびスクリーニングの例証的な方法を記載する。
【０２６２】
生きた哺乳動物抗体産生細胞（この場合ハイブリドーマ細胞であるが形質細胞を使用することもできる）を、関心対象の抗原BamAを発現している細菌細胞および関心対象の例示的なタンパク質（抗原）BamAとコンジュゲートしたビーズと共に、アガロース粒子（直径約100um）中に封入した。関心対象の抗原に結合する抗体を産生する細胞と産生しない細胞とを速やかに区別するために封入スクリーニングを使用できるかどうかを試験するために、ハイブリドーマ細胞は、生きた細菌細胞の表面のBamAに結合することが公知の抗体または対照抗体のいずれかを分泌した細胞であった。
【０２６３】
アガロース粒子を生成させるために、アガロース（4℃で保存）を水浴中で70℃に加熱し、次に37℃に冷却した。B細胞、関心対象の細菌病原体および例示的なBamAタンパク質とコンジュゲートしたビーズを含有する試料を、体積300μL（培地）中に調製し、37℃に5分間加温した。4％アガロース約300μLを試料に添加し、十分に混合した。分散相600μLを200センチストーク（cSt）のジメチルポリシロキサン（DMPS）油16mLに37℃でゆっくりと加え、次に2分間急速撹拌した。これを氷浴に移し、5分間ゆっくりと撹拌して凝固させ、それに培地約15mLを上から注いだ。2600rpm（約1800×g）で9分間遠心分離することによってアガロース粒子をペレットにした。アガロース粒子をハイブリドーマ培地15mL中で洗浄し、各試料を成長培地30mL中に再懸濁し、T75フラスコに移し、CO2中にて37℃で3時間撹拌しながらインキュベートした。アガロース粒子を成長培地中でインキュベートして、哺乳動物細胞に抗体を分泌させた。
【０２６４】
アガロース粒子を洗浄し、蛍光検出剤（すなわち二次抗体、生／死染色）で染色した。具体的には、アガロース粒子をペレットにし、冷PBS中で1回洗浄し、20μg/ml ヤギ抗マウス（GAM）(H+L)-AF488標識二次抗体および2uM Syto（登録商標）64赤色蛍光核酸染色を含有するPBS+10％ FBS 2mL中に各試料を再懸濁し、氷上で45分間インキュベートした。インキュベート後の溶液を冷PBS中で2回洗浄し、ペレットを冷PBS 1mL中に再懸濁し、画像化まで氷上で保存した。
【０２６５】
同じチャネルで蛍光性（すなわち緑色蛍光）であった細菌またはビーズのいずれかについて倒立蛍光顕微鏡検索を用いてアガロース粒子をスクリーニングした。封入からの例示的な画像を図3に示す。図3に示すように、蛍光シグナルについて陽性であった、「病原体抗体トラップ（PAT）」と称されるハイブリドーマ細胞と共に封入された細菌病原体細胞を含有するアガロース粒子は、封入されたハイブリドーマ細胞がビーズおよび細菌表面のBamAに結合される抗体を分泌したことを示した。図3に、抗原陽性アガロース粒子を容易に検出することができることをより大きな倍率の画像にも示す。
【０２６６】
「ヒットした」粒子を釣り上げ、単一細胞クローニングのためにPCRチューブ中に入れた。単一細胞RT-PCRの結果として得られたDNAを、TBD一過性トランスフェクション発現系において発現させる。
【０２６７】
実施例2：稀少なB細胞の濃縮のための方法
本実施例に、高度に保存されたエピトープに対する抗体を産生する稀少なB細胞を濃縮するための方法を説明する。該方法は、必須のグラム陰性タンパク質、例えばアシネトバクター・バウマニのBamAおよびLptD上の高度に保存されたエピトープに対する稀少な抗体を見出すために使用され得る。加えて、提供される方法に濃縮されたB細胞を用いて、任意の感染症標的上の重要で保存されたエピトープに対する抗体を迅速に発見することができる。
【０２６８】
A.  標的としてのアシネトバクター・バウマニBamA
BamAが、抗体に基づく発見方法による標的化のためのA.バウマニ内の関心対象の選ばれた標的であるかどうかを評価するための実験を行った。BamAタンパク質枯渇分析を用いて、BamAがA.バウマニの生存に必須であることが示された。BamAタンパク質は、外膜内に位置し、したがって、抗体に到達可能である。到達可能性を確認するために、A.バウマニの臨床単離株表面の標的に結合することができるBamA特異抗体のパネルを生成させた。
【０２６９】
最も高い保存性のBamAエピトープを理解するために、100個を超えるA.バウマニ臨床単離株にタンパク質配列解析を行った。共通配列を評価し、BamAの構造モデル上にマッピングして、保存性の高い領域を図示した。興味深いことに、膜に包埋したベータ鎖および周辺質のループは、全ての単離株にわたり高度に保存されていたものの、細胞外抗体に到達可能なループのうちの少数は、有意な多様性を示した（図4）。具体的には、ループ4は、高度に可変に見える。興味深いことに、BamAの到達可能性を検証するための上記抗体パネルは、可変ループ4に結合することが示された。伝統的なハイブリドーマ技法を用いてこの抗体パネルを生成させ、ループ4に向けられた抗体がBamAに対する宿主免疫応答を支配することが示された。ループ4は、タンパク質から欠失された場合に機能に影響しなかったが、これは、保存性の低いタンパク質領域が典型的には機能に重要ではないという一般的な概念と矛盾しない。それが機能に及ぼす効果をさらに確認するために、この可変ループに結合した抗体がBamAの機能を阻害しないことを示した。低い保存、機能重要性の欠如、および宿主免疫優性は、ループ4を古典免疫系のデコイにする。
【０２７０】
しかし、抗体の結合の対象となるBamAの抗体到達可能表面の高度に保存されたエピトープを同定した（図4、例えば円内の領域）。保存されたエピトープの存在は、病原体が多くの場合に高度に可変のデコイエピトープを産生し、最も重要な高度に保存されたエピトープを保護する能力があることと一致する。BamAはコンフォメーションを変化させて必須の機能を果たすので、この高度に保存されたエピトープに結合する抗体は、機能を遮断し、細菌の細胞死に導くこともできる。
【０２７１】
B.  第1相：稀少なB細胞の濃縮
上記研究は、BamAが高度に保存されたエピトープと結合する稀少な抗体を濃縮するための優れた標的であったことを実証した。ループ4内においてアミノ酸レベルで劇的に異なるA.バウマニBamAタンパク質の2つの異なる変異体を産生させた。N末端のAvi-10His-TEVタグを有するようにも変異体を操作した。N末端のAvi-10His-TEVタグを有し、5つの球形POTRAサブドメインをタンデムで含むN末端周辺質ドメインを欠失させるようにBamA変異体1を操作した。配列をSEQ ID NO:3に示す。N末端欠失は、細菌表面の保存されたエピトープに対する抗体を製造したB細胞に向けてB細胞の濃縮を偏らせることを助けることを意図したものである。N末端の6×Hisタグを有するようにBamA変異体2を操作し、配列をSEQ ID NO:4に示す。操作されたBamA変異体2は、N末端周辺質ドメインを保持していた。
【０２７２】
抗体産生細胞の出発プールを生成させるために、BALB/cマウスをBamA変異体1で免疫した。産生された圧倒的多数の抗体が、ループ4と結合したことが示された。次に、それらのB細胞を稀少なB細胞の濃縮相に供した。免疫したマウスのリンパ節からB細胞を採集し、BamA変異体2と混合して、保存されたBamAエピトープを認識する表面抗体を有するB細胞だけに生存シグナルを提供した。したがって、ループ4は、本来の免疫原（BamA変異体1）と増殖用抗原（BamA変異体2）との間で保存されていないので、ループ4抗体を製造する全てのB細胞が集団から枯渇されるべきである。組換え発現された場合に膜からBamAを精製するために可溶化の必要があり、洗剤の存在がB細胞の生存能に影響を及ぼすので、BamAをB細胞と混合する前に洗剤を除去するための実験も行った。下記実施例6は、洗剤を除去するための例示的な方法を説明するものである。
【０２７３】
BamA変異体2の刺激後、最近照射されたSCID/ベージュマウスの脾臓にB細胞を注射し、そこでB細胞を10日間増やした。対照として、BamA変異体2を用いて刺激されなかった出発B細胞集団の半分も、抗原刺激なしにSCID脾臓に注射した。SCIDマウスにおける10日間の抗原特異増殖の後に、B細胞を採集し、ELISpot分析に供して、BamA変異体2刺激を受けたB細胞が保存されたエピトープに対する抗体をより高い頻度で有したかを判定した。BamA変異体2の刺激は、保存されたエピトープに対する抗体を製造している顕著な数のB細胞を生成し、一方で模擬処理された細胞は、ELISpotによりBamA変異体2と交差反応性を示さなかった（図5）。
【０２７４】
実施例3：抗体をスクリーニングするための病原体抗体トラップ（PAT）
本実施例は、関心対象の標的への結合について多数のB細胞をスクリーニングするための提供される方法の実施ならびに単一B細胞クローニングおよびトランスフェクションプロトコールによる抗体の単離を実証するものである。本方法を用いて、大発生の間に細菌または他の微生物に対する抗体を迅速同定することができる。
【０２７５】
A.  機能性抗体の選択
BamA変異体1（SEQ ID NO:3に示される）で免疫されたBALB/cマウスからの抗体分泌B細胞をスクリーニングした。単一のB細胞を、BamA変異体1を発現している細菌細胞およびBamA変異体2（SEQ ID NO:4に示される）で被覆されているビーズと共に同時封入した。一部の実験では、抗体分泌細胞、ビーズおよび細胞を一般的に下の実施例4に記載されているように封入した。次にこれらのB細胞に、一次抗体を粒子中に分泌させた。
【０２７６】
細菌またはビーズに結合性の一次抗体を視覚化するために、蛍光二次抗体を粒子中に浸漬した。様々な結合パターンが観察された。図6に代表的な研究を示す。図6に示すように、BamAの保存された表面露出エピトープに対する抗体を産生したB細胞を、蛍光ビーズおよび蛍光細菌の存在により同定した。他の粒子は、細菌またはビーズのみに蛍光シグナルを表し、それぞれBamAの表面露出可変領域または非表面露出保存領域と結合する抗体を同定した。これらの異なる結合パターンにより、封入された粒子において観察される結合パターンと最終的な組換え抗体の抗体結合性のパターンとの間の相関の検討が可能になった。
【０２７７】
最初のスクリーニングでは、20,000個の抗体分泌B細胞を1日でスクリーニングし、BamA変異体2被覆ビーズ上に蛍光シグナルを有する粒子10個を同定した。2日目に、50,000個の抗体分泌B細胞をスクリーニングし、蛍光性の細菌およびビーズを有する粒子2つ（図6）および細菌性蛍光シグナルを有する粒子14個を選択した。これらの選択された粒子を単一B細胞クローニングのために選択した。
【０２７８】
B.  単一B細胞クローニング
次に、抗体をコードする重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の単一細胞逆転写（RT）およびPCRのために、上記で選択された粒子を処理した。BamAの保存された領域のエピトープに対する抗体を発現しているB細胞10個のうち、B細胞6個からの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方についてのPCR産物を生成させた。
【０２７９】
抗体をコードする直鎖PCR産物を哺乳動物細胞中にトランスフェクトして、組換え抗体を産生させ、それを、ELISAによるBamA結合性、BamA変異体1（SEQ ID NO:3に示される）、BamA変異体3（SEQ ID NO:7に示される）およびBamA変異体4（SEQ ID NO:8に示される）の調製物への結合性について試験した。これらの組換え抗体の5種は、BamA上の高度に保存されたエピトープと結合した（図7）。図7に示すように、ループ4および他の可変細胞外ループの配列が全て劇的に異なった3つの異なるBamA変異体（BamA変異体1、3および4）に関するELISAにより、これらの抗体について抗体結合性を確認した。
【０２８０】
実施例4：微生物の封入および粒子のスクリーニング
本実施例は、抗体産生細胞試料を調製する、抗体産生細胞を微生物および／またはビーズと共に封入する、ならびにBamAまたは他の細菌外膜タンパク質または免疫原のような関心対象の免疫原に対する抗体を産生する細胞を迅速および効率的に同定するために粒子をスクリーニングするための、例示的な方法を記載する。
【０２８１】
A.  抗体産生細胞の調製
マウス、例えばbalb/Cマウスを、A.バウマニ細菌細胞もしくは精製BamAタンパク質またはその変異体のような関心対象の免疫原で免疫した。数週間後に、免疫されたマウスからの脾臓および／またはリンパ節を取り出した。汎B細胞単離キット（Miltenyi Biotec、カタログ番号130-095-813）を用いて抗体産生細胞を単離し、続いてEasySep（商標）CD138+細胞単離キット（Stemcell Technologies）を用いてCD138+細胞を単離した。汎B細胞調製物は、抗体産生細胞を約10％含有し、結果として、組織破片および未知の雑多物（junk）を欠如する細胞調製物も生じた。さらなるCD138+細胞単離により、抗体産生細胞がさらに3倍超濃縮された。この段階の間の抗体産生細胞の高い濃縮は、関心対象の粒子（ヒット）を見出すためにスクリーニングされる合計粒子数を減少させることによってスクリーニングの効率を上げることができる。このことは、場合によりスクリーニングの間にスクリーニング時間を増加させると細胞生存度が減少する可能性があるので有利である。
【０２８２】
B.  封入
関心対象の免疫原または標的（例えばBamAまたは実施例4記載の他の外膜タンパク質）で被覆されているビーズ（平均直径：3〜5μm）およびスクリーニングされるべき微生物（例えばA.バウマニ細菌細胞）（平均サイズ:0.5〜1μm）と共に、抗体産生細胞を含有する単離された細胞を封入した。
【０２８３】
封入の前に、リン酸緩衝食塩水（PBS）中4％超低ゲル化温度アガロース（Sigma-Aldrich、カタログ番号A5030）の調製物を70℃で15分間融解させ、次に、生きた抗体産生細胞の封入のために37℃に冷却した。超低ゲル化温度アガロースは、アガロースをずっと低い温度で液体状態のまま保つことを可能にし、それにより生きた細胞を封入できるようにする。
【０２８４】
封入されるべき個々の成分を遠心沈殿し、封入のために所望の濃度に再懸濁した。抗体産生細胞を含有する単離された細胞を遠心分離し、封入培地（イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）とOptiPrep（商標）密度勾配培地（Sigma-Aldrich、カタログ番号D1556）との組み合わせ）中に再懸濁した。封入の間に抗体産生細胞の沈降を防止するために密度勾配培地を含めたが、これにより、粒子中への単一細胞の封入効率を高めることができる。抗原で被覆されているビーズおよび細菌細胞を遠心分離し、2×OptiPrep（商標）密度勾配培地中に再懸濁した。アガロースゲル粒子1個あたり抗体産生細胞、ビーズおよび細菌細胞を約0.1:5:100の比で組み合わせた。細胞生存度およびアガロースゲル粒子1個あたりの各成分についての潜在的蛍光シグナルの最適化に基づきこの比を決定した。一部の場合では、粒子1個あたり多すぎるビーズは、凝集したビーズを招き、凝集したビーズは蛍光性抗体をトラップし、非特異蛍光シグナルを発したことが見出された。さらに一部の局面では、粒子1個あたり3つ未満のビーズは、蛍光シグナルを減少させることが見出され、そのことは、一部の場合では、スクリーニングの間にビーズの視覚化をより困難にした。細菌（または他の微生物）の場合、多すぎるまたは少なすぎる細菌の存在は、一部の場合では、細胞を視覚化することをより困難にする可能性があった。多すぎる細菌は、一部の局面では、全ての細菌を被覆するためにまたは全ての細菌と結合するために十分な抗体が分泌されないことも意味する。
【０２８５】
全ての成分を含有する組み合わせ試料を37℃に5分間加温した。融解したアガロース溶液約125μLを、成分を含有する培地に添加し、封入混合物約100μLを製造業者の説明書に従ってμEncapsulator（Dolomite Microfluidics）チップ上に負荷して、非水環境において封入粒子を生成させた。封入粒子を収集し、氷上で5〜10分間インキュベートして、アガロースをゲル化した。ゲル化した封入粒子を非水性ガス透過性油としての3M（商標）Novec（商標）7500 1mLを含有する6ウェルのディッシュに移し、撹拌しながら37℃で1時間インキュベートして、B細胞による抗体分泌を可能にした。ガス透過性油の存在は、小滴の物理的分離を可能にし、分泌された抗体が非水環境から漏れないことを確実にし、その結果として、スクリーニング方法の効率増加のために微小滴中に十分に高い濃度の抗体が生じた。次に、試料をチューブに移し、Pico-Break（Dolomite Microfluidics）を用いてエマルションを破壊し、PBS中の2％ウシ胎児血清（FBS）で洗浄した。
【０２８６】
産生した抗体の視覚化のために、粒子試料を、20μg/mL IgG（サブクラス1+2a+2b+3）のFcγフラグメント特異二次抗体が緑色蛍光団（ヤギ抗マウスFc-AF488; Jackson Immunoresearch カタログ番号102646-750、10％ FBS/PBSに希釈）とコンジュゲートしたものと共に暗条件で氷上にて30分間インキュベートした。次に、試料を2％ FBS/PBS中で洗浄し、スクリーニングの用意ができるまで氷上で保存した。体積約300〜500μL（または密度に応じて最大1mL）の粒子を丸形カバーグラス底スクリーニングディッシュ（Fisher Scientific、カタログ番号14035-20）上に置いた。カバーグラス底スクリーニングディッシュは、より厚いイメージング表面よりも明るい高解像度イメージングおよび蛍光シグナルの視覚化を可能にした。2mLを超えないように濾過後のPBSを合計体積に加え、粒子をディッシュの底に沈降させた。蛍光顕微鏡を使用する蛍光シグナルの視覚化により、粒子をイメージングし、抗体結合性についてスクリーニングした。蛍光ビーズおよび／または蛍光細菌ならびに抗体産生細胞と共に同時封入された粒子を検出した。シグナル陽性であった粒子からの抗体産生細胞を、マイクロマニピュレーター針（Origio、カタログ番号C140819）を用いて選択した。
【０２８７】
実施例5：グラム陰性細胞エンベロープを撹乱させる抗体についての微粒子ベースのスクリーニングにおけるA.バウマニレポーター細胞の使用
細菌に表現型変化を誘導した抗体を分泌した抗体産生細胞を含有する粒子が、外膜への細胞ストレスを含む改変された表現型変化に応答性の調節領域の機能的制御下で細菌細胞における蛍光レポーター分子の誘導によって同定されたことを除き、外膜（OM）ストレス転写レポーターであるA.バウマニ細胞を、実施例4に実質的に記載された方法を用いて抗体産生細胞と共に封入した。
【０２８８】
外膜ストレスに応答性の調節領域を同定するために、BamAの枯渇、必須のOM新生因子、またはグラム陰性菌の外膜を破壊もしくは透過化することが公知の薬剤であるポリミキシンBノナペプチド（PMBN）の存在下での成長のいずれかによって、A.バウマニに外膜ストレスを誘導した。RNA-Seqを用いて遺伝子発現における変化を評価した。遺伝子約790個の発現は、改変された表現型変化を引き起こす薬剤の一方または両方に応答して2倍以上よりも大きくアップレギュレーションされた。遺伝子約640個の発現は、改変された表現型変化を引き起こす薬剤の一方または両方に応答して2倍以上よりも大きくダウンレギュレーションされた。
【０２８９】
10倍よりも大きくアップレギュレーションされると同定された例示的な遺伝子の上流に転写調節領域を含む例示的なレポーター構築物を生成させた。各遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）の上流のDNA配列を蛍光レポーター分子と連結した。発現ベクター内への集合によって融合ポリペプチドを組み入れ、A.バウマニに導入してレポーター細菌細胞を生成させた。
【０２９０】
A.バウマニ Ab307-0294でBalb/Cマウスを免疫することによって抗体産生細胞プールを生成させた。実施例4に実質的に記載された2段階細胞精製工程において、免疫されたBalb/C動物の脾臓およびリンパ節細胞から抗体産生B細胞を単離した。最初に、脾臓およびリンパ節細胞を採集し、汎B細胞単離キット（Miltenyi Biotec、カタログ番号130-095-813）を用いて精製して、組織破片および他の物質を除去した。次に、EasySep（商標）CD138+細胞単離キット（Stemcell Technologies）を用いて細胞調製物をさらに精製して、B細胞調製物を得た。
【０２９１】
この例示的な実験で抗原被覆ビーズを同時封入しなかったことを除き、実施例4に記載されているように単一のB細胞をレポーター細菌細胞と共に同時封入した。また、細菌細胞がレポーター分子を発現するので、分泌された抗体を検出するための二次抗体と共のインキュベーションを省略した。
【０２９２】
粒子をイメージングし、蛍光顕微鏡を使用する蛍光シグナルの視覚化により抗体結合性についてスクリーニングした。蛍光細菌および抗体産生細胞を同時封入した粒子を検出した。図11A〜11Cに示されたように、外膜を破壊するおよび／または外膜ストレスを誘導する方法で、細胞に結合した分子を分泌した抗体分泌B細胞の存在を示す、蛍光細菌を含有する粒子を観察した。次に、単一細胞抗体クローニングのためにマイクロマニピュレーター針（Origio、カタログ番号C140819）を用いてこのB細胞を選択する。
【０２９３】
実施例6：免疫用抗原の精製および調製
本実施例は、免疫用抗原として例示的な外膜タンパク質を生成、精製、および調製して、免疫されたタンパク質に対する抗体産生細胞を得るための方法を記載する。
【０２９４】
A.  抗原：BamAの精製
A.バウマニBamAのバレル部分を生成および精製するために、N末端のAvi-10His-TEVタグを含むA.バウマニBamAのバレル部分をコードする（例えば、SEQ ID NO:3に示されるBamA変異体をコードする）プラスミドを用いて大腸菌BL21-DE3細胞を形質転換した。大腸菌細胞を培養し、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）の添加によってタンパク質の発現を誘導した。細胞を採集し、細胞ペレットを溶解緩衝液（50mlあたり50mMトリス（pH8）、150mM NaCl、DNAseI 20μl（25μg/μl）、1mM PMSF、1のRoche Completeプロテアーゼ阻害剤）およびリゾチームに再懸濁し、LM-10 Microfluidizer（登録商標）（Microfluidics, Westwood, MA）を用いて細胞を追加的に18,000psiで3回均質化することによって溶解させた。
【０２９５】
均質化した試料を遠心分離し、洗浄緩衝液（50mMトリス（pH8）、150mM NaCl、0.1mM PMSF、1mM DTT、0.5％トリトンX100、Roche Completeプロテアーゼ阻害剤）中で数回洗浄し、可溶化のために8M尿素、50mMトリス（pH8）、150mM NaCl中にて室温で一晩インキュベートした。次に試料を遠心分離し、充填済み3ml Co2+カラム（ThermoScientific, Prod# 89969）を通過させ、UniA緩衝液（8M尿素、50mMトリス（pH7.4）、150mM NaCl）中で数回洗浄し、続いてUniB緩衝液（150mMイミダゾール、8M尿素、50mMトリス（pH7.4）、150mM NaCl）で溶出させた。8M尿素、50mMトリス（pH7.4）、150mM NaCl、1mM DTTおよび10kDaの分子量カットオフのAmicon Ultra-15装置（Millipore）を用いて、緩衝液交換および試料の濃縮を行った。
【０２９６】
タンパク質試料1部を1.1×リフォールディング緩衝液（55mMトリス（pH8）、165mM NaCl、66mM SDS、1.65 MPD）9部に添加し、混合し、室温で3日間インキュベートすることによって、調製後のタンパク質試料をリフォールディングした。10kDa分子量カットオフを備えるAmicon Ultra-15装置（Millipore）を用いて、リフォールディング後のタンパク質試料を濃縮し、流動緩衝液（10mMヘペス（pH8.0）、150mM NaCl、0.8％ C8E4）を用いてAKTA Pure（GE healthcare）に装着したSuperdex 200 Increase 10/30サイズ排除カラム（GE healthcare, Pittsburgh, PA）を通過させた。試料をSDS-PAGEゲルで検証し、プールし、さらに濃縮した。
【０２９７】
B.  免疫用調製物
上記のように生成した膜タンパク質調製物中の洗剤または界面活性剤を両親媒性界面活性剤アンフィポールにより置き換えて、免疫の準備をした。アンフィポールA8-35の蒸留水溶液を、タンパク質:アンフィポールの濃度比1:4（例えば、タンパク質1mgあたりアンフィポール4mg）で調製した。各抗原を2mg/mlタンパク質濃度でアンフィポール溶液に溶解し、静かに撹拌しながら4℃で4時間インキュベートした。タンパク質／アンフィポール混合物を、ゲル濾過緩衝液（20mM Hepes（pH8.0）、150mM NaCl）で平衡化したHiPrep 16/60 S-300ゲル濾過カラムに負荷し、タンパク質をゲル濾過緩衝液で溶出して、過剰の未結合のアンフィポールまたは残留している任意の残留未結合洗剤もしくは残留界面活性剤を除去した。試料をSDS-PAGEゲルで検証し、タンパク質／アンフィポール複合体をプールし、10kDa分子量カットオフを備えるAmicon Ultra-15装置（Millipore）を用いてさらに濃縮した。
【０２９８】
実施例7：LptDに結合性の抗体を同定するための例証的な方法
LptDで免疫されたマウスからA.バウマニLptDに対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を生成させた。BALB/cマウスを精製LptD/LptE複合体で免疫した。LptDの適正なリフォールディングのためにLptEが必要である。精製LptD/LptEに対するポリクローナル血清応答を示しているマウスの脾臓から抗体産生細胞を採集した。別個の抗体産生細胞からハイブリドーマを生成させるために電気融合を行った。ハイブリドーマによって分泌された抗体を細胞培養上清として収集した。
【０２９９】
精製LptD/LptEおよび陰性対照抗原BamAに対する結合性について、ハイブリドーマ細胞から得られた抗体の結合性をELISAによって試験した。LptD/LptEを1:50および1:250のmAb希釈で試験し、陰性対照BamAを1:50のmAb希釈で試験した。図12に、9つの独立したハイブリドーマ株からの結果を示す。結果は、結合活性が、添加したmAbの量に基づきタイトレーション可能であったことを示している。結果は、全部で9種のモノクローナル抗体が、陰性対照抗原BamAではなくLptD/LptEに対して結合性を表すことを示しており、抗原特異結合活性を示している。
【０３００】
全般的に上記実施例4により記載されているように、LptDに対する抗体を産生しているハイブリドーマ細胞を、LptDを発現している細菌細胞およびLptDの変異体とコンジュゲートしたビーズと共にアガロース微小滴中に封入する。
【０３０１】
実施例8：BamAの保存された領域に対するヒト化抗体
ヒト化抗体を産生するように遺伝子改変されたトランスジェニックマウスをA.バウマニのBamAで免疫した。上記実施例6に記載されているように生成されたSEQ ID NO:3に示されるBamA変異体1のバレル部分の精製調製物10μgでヒト化抗体産生Trianniマウス（TRIANNI, Inc）8匹を免疫した。環状ジヌクレオチドをアジュバントとして使用し、抗原調製物を足底に注射した。足底および皮下注射により高度免疫を行った。
【０３０２】
免疫の21日後および終末時（終末時血液）に各マウスからポリクローナル抗体を含有する血清を得た。TrianniドナーマウスがBamAの保存された領域に対する抗体を産生するかどうかを試験するために、D21血清および／または終末時血液を、BamAの異なる変異体に結合性の抗体の存在について試験した。表面にBamA変異体5（SEQ ID NO:31に示される）を条件付き発現するA.バウマニ試験株を生成させた。BamA変異体5は、BamAの異なる単離株と変異体との間で高度に可変のループである細胞外ループ4が、BamA変異体2の細胞外ループ4によって置き換えられているBamA変異体1の改変バージョンである。BamA変異体1を用いた免疫から得られた抗体がBamA変異体5にも結合するならば、抗体によって認識されるエピトープから非保存的超可変ループ4を排除することができる。
【０３０３】
免疫されたマウス8匹からのD21血および／または終末時血液からのポリクローナル血清の40倍希釈物を、BamAを発現していないA.バウマニ対照（低）またはBamA変異体5を発現しているA.バウマニ試験株（高）と共にインキュベートした。結合した抗体を、蛍光標識二次抗体を用いて検出した。図13Aに、BamAを発現しなかった対照A.バウマニに結合性のマウス8匹のそれぞれについてのD21血および終末時血液のポリクローナル血清と共にインキュベーション後の、蛍光シグナルのヒストグラムの重ね合わせを示す。図13Bに、BamA変異体5を発現しているA.バウマニ試験株（高）に対する、マウス8匹の各々についての終末時血液ポリクローナル血清と共にインキュベーション後の、蛍光シグナルのヒストグラム重ね合わせを示す。表1に、BamA変異体5に結合性の細胞についての各マウス由来の終末時血清からの平均蛍光強度シグナルを対照からバックグラウンド蛍光シグナルによって割った値を示す。示すように、終末時血液応答は、BamAの非ループ4領域に対する結合シグナルの強化を示したが、これは、細胞外部分の保存された領域への結合性を示している。
【０３０４】
（表１）BamA変異体5に対する細胞結合応答
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【０３０５】
本発明は、例えば本発明の様々な局面を例証するために提供された、特定の開示された態様に範囲が限定されることを意図しない。記載された組成物および方法に対する様々な改変は、本明細書における記載および教示から明白になる。そのような変形は、本開示の真の範囲および精神から逸脱することなく実施され得、本開示の範囲内に入ることが意図される。
【０３０６】
配列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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