(57)【要約】静脈内投与に適した９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８製剤の調製に適した凍結乾燥ｒｈアネキシンＶ−１２８を含む組成物が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ５．０〜６．６の範囲で、抗酸化剤と組み合わせてｒｈアネキシンＶ−１２８を含む、静脈内投与に適した凍結乾燥組成物。
【請求項２】
前記抗酸化剤は、メタ重亜硫酸ナトリウム、ニコチンアミド、ピリドキシン塩酸塩、α−トコフェロールアセテート、モノチオグリセロールの中から選択される、請求項１に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項３】
乳酸塩緩衝液、琥珀酸塩緩衝液、グリコール緩衝液、ＴＲＩＳ、ヒスチジン緩衝液の中から選択される緩衝液を含んでいる、請求項１および２に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項４】
−抗酸化剤、
−ｐＨが５．０〜６．６の間である緩衝液
−還元剤；
−トランスキレート化剤；
−乾燥保護剤およびケーキ形成剤
並びに、可能なら、放射安定促進剤または可溶化剤
を含む、静脈内投与に適した、請求項１〜３に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項５】
前記成分は、以下の量、
−０．００５ｍｇ／バイアルを超える量の前記抗酸化剤
−１０ｍＭを超える濃度である、ｐＨが５．０〜６．６の間である緩衝液
−０．００５ｍｇ／バイアルを超える量の還元剤；
−０．０２ｍｇ／バイアルを超える量の乾燥保護剤およびケーキ形成剤；
−１０ｍｇ／バイアルを超える量の乾燥保護剤およびケーキ形成剤
前記放射安定促進剤または前記可溶化剤はそれぞれ、存在していれば、０．００５ｍｇ／バイアルを超える量および１ｍｇ／バイアルを超える量、
で存在している、請求項４に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項６】
以下のステップ、
−凍結したｒｈアネキシンＶ−１２８を解凍するステップ
−抗酸化剤／還元剤を添加するステップ
−タンジェンシャルフロー濾過により緩衝液を交換し、上記ｒｈアネキシンＶ−１２８が供給される緩衝液を、乳酸塩緩衝液、琥珀酸塩緩衝液、グリコール緩衝液、ＴＲＩＳ、ヒスチジン緩衝液の中から選択される緩衝液に置換するステップ
−トランスキレート化剤、放射安定促進剤、可溶化剤、抗酸化剤、乾燥保護剤およびケーキ形成剤を含む、賦形剤バルク溶液の調製ステップ
−前記賦形剤バルク溶液に必要量のｒｈアネキシンＶ−１２８の溶液を添加するステップ
−上記バルク溶液をバイアルに分配し、凍結乾燥するステップ
を含む、上記請求項の何れか１項に記載の単一バイアル凍結乾燥製剤の調製プロセス。
【請求項７】
請求項１〜５に記載の単一バイアル凍結乾燥製剤と市販の９９ｍＴｃＯ４−ジェネレータに由来する溶出液とを反応して得られた９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８を含む、静脈内投与に適した製剤。
【請求項８】
以下のステップ、
−上述の凍結乾燥製剤を含むバイアルに対して、７４０ＭＢｑ以下の放射能を有する市販の９９ｍＴｃＯ４−ジェネレータからの最適量の溶出液を添加するステップ；
−軽度の回転下で前記バイアルを９０分間室温で維持するステップ；
−反応を終了させ、得られた溶液を６時間安定化させるステップ；
を含む、請求項７に記載の９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８を得るプロセス。
【請求項９】
医療治療効果のモニタリングおよび診断用ツールとしての請求項７に記載の製剤の利用。
【請求項１０】
リウマチ、心循環器疾患、腫瘍学、移植の拒絶反応、自己免疫疾患、神経学、ならびに、アポトーシスプロセスを顕著な特徴として有する他の病状および／または処理誘導されたアポトーシスに対する処理応答のマーカーとしてアポトーシスプロセスを有する他の病状において使用する、請求項９に記載の利用。
【請求項１１】
前記心循環器疾患は、大動脈瘤、化学療法心毒性、およびアテローム性動脈硬化症である、請求項９および１０に記載の利用。
【請求項１２】
リウマチ関節炎、体軸性脊椎関節炎の検出および管理のための、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
心内膜炎および心筋炎の検出のための、請求項１０に記載の使用。
【請求項１４】
アテローム斑の検出およびステージ決定のための、請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、標識化合物、特にテクネチウムで標識された組換え型タンパク質アネキシンＶ−１２８に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
ｒｈアネキシンＶ−１２８は、下記配列（配列番号１）
ＡＧＧＣＧＨＡＱＶＬＲＧＴＶＴＤＦＰＧＦＤＥＲＡＤＡＥＴＬＲＫＡＭＫＧＬＧＴＤＥＥＳＩＬＴＬＬ
ＴＳＲＳＮＡＱＲＱＥＩＳＡＡＦＫＴＬＦＧＲＤＬＬＤＤＬＫＳＥＬＴＧＫＦＥＫＬＩＶＡＬＭＫ
ＰＳＲＬＹＤＡＹＥＬＫＨＡＬＫＧＡＧＴＮＥＫＶＬＴＥＩＩＡＳＲＴＰＥＥＬＲＡＩＫＱＶＹＥＥＥ
ＹＧＳＳＬＥＤＤＶＶＧＤＴＳＧＹＹＱＲＭＬＶＶＬＬＱＡＮＲＤＰＤＡＧＩＤＥＡＱＶＥ
ＱＤＡＱＡＬＦＱＡＧＥＬＫＷＧＴＤＥＥＫＦＩＴＩＦＧＴＲＳＶＳＨＬＲＫＶＦＤＫＹＭＴＩ
ＳＧＦＱＩＥＥＴＩＤＲＥＴＳＧＮＬＥＱＬＬＬＡＶＶＫＳＩＲＳＩＰＡＹＬＡＥＴＬＹＹＡＭＫＧＡ
ＧＴＤＤＨＴＬＩＲＶＭＶＳＲＳＥＩＤＬＦＮＩＲＫＥＦＲＫＮＦＡＴＳＬＹＳＭＩＫＧＤＴＳＧ
ＤＹＫＫＡＬＬＬＬＳＧＥＤＤ
を有する組換え型タンパク質として知られている。
【０００３】
この組換え型タンパク質は、Ｊｉｎ  Ｍ．ら著「Essential Role of B-helix Calcium Binding Sites in Annexin V-Membrane Binding」 The Journal of Biological Chemistry Vol. 279 No. 39 pp. 40351-40357 (2004)に記載されており、自然に分泌されるヒト血清タンパク質アネキシンＶの変異体である。当該変異体では、内因性の９９ｍＴｃ結合部位を形成するために、ｒｈアネキシンＶ（野生型ヒトアネキシンＶと同一）のＮ末端に、６つのアミノ酸（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ）が付加されている。
【０００４】
さらに、３１６番目のシステインは、セリンに変異している（上記配列の下線を付したＳを参照）。この変異により、ｒｈアネキシンＶ−１２８配列に残っている唯一システインは、Ｎ末端の９９ｍＴｃ結合部位内の４番目のシステインとなる。
【０００５】
ｒｈアネキシンＶ−１２８は、既知のEscherichia coliの組換え技術によりで産出され（例えば、Ｊｉｎ  Ｍ．ら著「Essential Role of B-helix Calcium Binding Sites in Annexin V-Membrane Binding」 The Journal of Biological Chemistry Vol. 279 No. 39  pp. 40351-40357 (2004)参照）、凍結保存される。
【０００６】
上述の記載のようなＮ末端に導入された改変により、上記タンパク質と９９ｍＴｃとの結合は、対応する標識タンパク質を形成する。このタンパク質は、その作用機構のおかげで、治療効果のモニタリングと同様に、診断ツールとしての広範な潜在的な用途があり、通常、静脈投与により使用される。
【０００７】
リウマチ、心循環器疾患、腫瘍学、移植による拒絶反応、自己免疫疾患、神経学の分野において、最も興味深い兆候がある。しかしながら、アポトーシスプロセスを顕著な特徴として有する病状に対しても余地がある。
【０００８】
心循環器疾患に関しては、大動脈瘤、化学療法心毒性、およびアテローム性動脈硬化症が判断され得る。
【０００９】
移植による拒絶反応、自己免疫疾患（リウマチ様関節炎以外の、例えば、炎症性腸疾患・・・）、または神経変性疾患といった、他の兆候も判断され得る。
【００１０】
しかしながら、前記９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８の前記調製は、様々な問題の理由からかなり複雑化する。
【００１１】
ｒｈアネキシンＶ−１２８に存在するシステインは、２つのシステイン間のジスルフィド架橋に起因して、二量化を引き起し、調製物の化学純度が減少する。また、タンパク質凝集、ミスフィールドタンパク質が凝集する自然現象を受ける。
【００１２】
注目すべき点は、ｒｈアネキシンＶ−１２８が、放射性９９ｍＴｃＯ４−溶液による長期保存および再構成とともに、いくつかのストレス性の処理ステップ（凍結融解、バルク製剤化、凍結乾燥）を受け、この間凝集が起きやすいことである。これらの理由から、化学純度はこの調製において慎重にモニタリングすべき分析パラメータである。
【００１３】
放射化学的純度もまた、放射性医薬品に対して重要なパラメータである。放射化学的純度は、安全性の理由および技術的性／診断上の性能の両方に対して必要不可欠である。９９ｍＴｃＯ４−の標識は、ＲＥＤＯＸ反応およびトランスキレート化を含む一連の反応／平衡を引き起こし、条件が最適でない場合には放射化学的不純物が形成されるかもしれない。
【００１４】
それゆえ、組換えタンパク質ｒｈアネキシンＶ−１２８は、細心の注意を払うべきものであり、凍結融解中に凝集し得、解凍プロセスおよび製造プロセスの間、さらに放射標識中にも、前記ＣｙｓのフリーＳＨ基を介して二量化し得る。
【００１５】
放射化学的純度および化学純度が高く、かつ安定性が高い９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８の最終調製のために、特定の製剤(formulation)が必要である。
【００１６】
Ｔａｉｔら著「Structural Requirements for In Vivo Detection of Cell Death with 99mTc-Annexin V」;The Journal of Nuclear Medicine Vol. 46 No. 5 pp. 807-815 (2005) には、ｒｈアネキシンＶ−１２８タンパク質の９９ｍＴｃ標識が記載されている。
【００１７】
しかしながら、Ｔａｉｔの研究には、２つのバイアルキットによる方法(approach)（溶液の形態でｒｈアネキシンＶ−１２８を有する）が記載されており、この方法は、９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８を得るための最終精製が必要である。これは、最適な製剤ではない。前記最終精製は、放射安全性および無菌の事項に関連する、かなり複雑な操作を必要とし製薬の品質基準に適合しないので、臨床治療のルーチンにおいて重大な欠点があるためである。
【００１８】
特許出願ＣＮ１０３１５９８４２、およびＬｕ Ｃ.ら著「Kit formulation for 99mTc-labeling of recombinant Annexin V molecule with a C-terminally engineered cysteine」; J Radioanal Nucl Chem Vol. 304 pp. 571-578 (2015) には、Ｃ末端が改変されたアネキシンＶの異なった形態の標識のための調製方法が記載されている。
【００１９】
前記の記載されている方法は、主に２つのステップ：１）前記タンパク質、グルコペプトン酸塩(glucoheptonate)、および転移配位子としてのＥＤＴＡを含むリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）、第一スズ塩、並びに希釈した塩酸を調製する；２）ステップ１）の溶液に９９ｍＴｃＯ４ナトリウムを添加し、３５〜３７℃の水槽内で得られた溶液を混合し、標識生成物９９ｍＴｃ−Ｃｙｓ−アネキシンＶを得る。
【００２０】
しかしながら、ＣＮ１０３１５９８４２に記載の前記アネキシンＶは、Ｔｃ−９９ｍと結合し得るＣ末端に単一のシステイン残基が存在するので、本アネキシンＶ−１２８と異なる。その上、ＣＮ１０３１５９８４２に記載の前記アネキシンＶは、６つのアミノ酸（６つのアミノ酸の中には１つのＣｙｓがある）が付加された、改変されたＮ末端が欠如しており、さらに、アネキシンＶ−１２８では、３１６番目に存在するＣｙｓは、セリンに置換されており、ジスルフィド結合を介した二量化に有利に働く残基を取り去っている。
【００２１】
上記特許および上記論文に記載されたプロセスは、ｐＨ＝７．４で行われる。このｐＨは二量体形成に有利に働くので、アネキシンＶ−１２８を含むプロセスに適用することができない。
【００２２】
その上、上記で報告した、特許出願ＣＮ１０３１５９８４２およびＬｕらによる発行物には、化学純度の特徴付けおよび二量化を抑制する抗酸化剤について言及されていない。これに対して、これらの事項は、本発明に基づくアネキシンＶ−１２８では重大である。
【００２３】
上述したことから、標識プロセスが容易であり、かつ放射化学的純度および化学純度が高く安定性が高い最終９９ｍＴｃ標識ｒｈアネキシン製剤へ導く、Ｖ−１２８アネキシンＶ−１２８を含む新たな組成物を開発する必要があることは明らかである。
【００２４】
この標識プロセスは、可能な限り、注入前にさらなる濾過ステップまたは精製ステップを必要とせず、製剤化前の単一バイアルの直接の再構成に基づくべきである。
【００２５】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、本発明に係る凍結乾燥されたｒｈアネキシン  Ｖ−１２８の調製プロセスの概略図を示す。
【００２６】
図２は、健康なマウス（ａ)、およびコラーゲン誘発関節炎のマウスモデル（ｂ)の前足内の９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８取り込みＳＰＥＣＴ画像である。図３ｃは、抗炎症薬による治療後の、前記コラーゲン誘発関節炎のマウス内での取り込みを示す（９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８の取り込みが全く検出され得ない）。
【００２７】
〔本発明の概要〕
静脈内投与のための９９ｍテクネチウム製剤の調製に適した、ｒｈアネキシンＶ−１２８を含む凍結乾燥組成物が記載されている。
【００２８】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、静脈内投与に適した、アネキシンＶ−１２８を含む凍結乾燥組成物と、特にｐＨが５．０〜６．６の範囲の抗酸化剤を含む適切な賦形剤との組み合わせにより、上述した問題を克服することができる。
【００２９】
また、本発明は、市販の９９ｍＴｃＯ４ジェネレータからの適切な量の溶出液を上述の組成物に添加して得られた製剤に関する。
【００３０】
好ましくは、上記で規定された前記凍結乾燥組成物は、特定の緩衝液を含む。
【００３１】
前記抗酸化剤は、前記凍結乾燥組成物の長期保存中および標識後の前記９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８の調製の両方における前記アネキシンＶ−１２８二量体の含有量を減少させる目的で含まれている。前記抗酸化剤がないと、二量体形成が制御されず、不適切な化学純度となる。
【００３２】
前記抗酸化剤の添加により、二量体の形成が制限され、前記凍結乾燥組成物の長期保存中および放射標識後少なくとも６時間において１０％未満の二量体含有量が保証される。
【００３３】
したがって、本発明によれば、抗酸化剤は、化学純度を良好なレベルに維持するという重要な役割があり、還元したテクネチウムのテクネチウム酸塩への再酸化を抑制する目的で添加されない。メタ重亜硫酸ナトリウム、ニコチンアミド、ピリドキシン塩酸塩、α−トコフェロールアセテート、モノチオグリセロールといった、異なる抗酸化剤は、評価された。
【００３４】
前記抗酸化剤の使用の他に、二量化およびさらに化学純度の制御は、ｐＨを５．０〜６．６の範囲に維持することにより達成される。より高いｐＨ値では二量体形成に有利に働く一方、より低いｐＨ値では、おそらくタンパク質の融解度の低下に起因して溶液の乳白光が観察された。
【００３５】
前記緩衝液の選択に関して、まず、クエン酸塩緩衝液の使用が計画された。クエン酸塩緩衝液は、アネキシンＶ−１２８が保存される、現状の緩衝液であるためである。しかし、約８５〜９０％の放射化学的純度が達成できただけであった。放射性医薬品の調製の共通に許容される下限である９０％超の値に放射化学的純度をシフトする目的で、乳酸塩、琥珀酸塩、グリコール、ＴＲＩＳおよびヒスチジンといった異なる緩衝液が評価された。乳酸塩緩衝液が選択された。乳酸塩緩衝液は、常に、放射化学的純度の値が約９４〜９６％に達し得たためである。
【００３６】
前記抗酸化剤および前記特定の緩衝液の使用によって、長期安定性が少なくとも１８カ月である、単一バイアルの凍結乾燥組成物を得ることができる。参考までに、先行技術（Ｌｕら著、２０１５）に記載の凍結乾燥組成物は、２１０日間安定であると示されている。
【００３７】
本発明によれば、上述した抗酸化剤および特定の緩衝液は、以下を含む凍結乾燥組成物に含まれる：
−還元剤
−トランスキレート化剤
−乾燥保護剤(lyoprotectant)およびケーキ形成剤
随意的に、前記組成物は、放射安定促進剤、および／または可溶化剤を含み得る。
【００３８】
本発明に係る凍結乾燥組成物には、上述した成分は、通常、以下の量で存在している。      
【００３９】
−抗酸化剤（高い化学純度の実現を目的とする）：０．００５ｍｇ／バイアル超、
−緩衝液：ｐＨが５．０〜６．６の範囲である、濃度が１０ｍＭ超、
−還元剤：０．００５ｍｇ／バイアル超
−トランスキレート化剤：０．０２ｍｇ／バイアル超
−乾燥保護剤およびケーキ形成剤：１０ｍｇ／バイアル超
随意的に、前記組成物は、放射安定剤を０．００５ｍｇ／バイアル超、および可溶化剤を１ｍｇ／バイアル超を含み得る。
【００４０】
上述した組成物を規定するために、開発中に、いくつかの試験が実施された。まず、クエン酸塩緩衝液の存在下で、以下の成分を含む、上記ｒｈアネキシンＶ−１２８の凍結乾燥組成物が調製された：
−ｒｈアネキシンＶ−１２８（活性薬剤成分）
−塩化第一スズ（還元剤）
−α−Ｄ―グルコヘプトン酸ナトリウム二水和物（トランスキレート化剤）
−ゲンチシン酸ナトリウム塩水和物（放射安定促進剤）
−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（可溶化剤）
−トレハロース二水和物（乾燥保護剤およびケーキ形成剤物）
−ｐＨ＝５．４
それぞれの成分量は、製剤を最適化するために、わずかに修正された。この凍結乾燥組成物の様々なバッチは、放射標識後、放射化学的純度が９０％（ＩＴＬＣおよびＨＰＬＣによって測定された）を超えることがなく、安定性が１．５時間よりも長くなかった。
【００４１】
第２のステップでは、上記ｒｈアネキシンＶ−１２８の凍結乾燥組成物は、クエン酸塩緩衝液に代えて乳酸塩緩衝液の存在下、異なるｐＨ値（６．４まで）、抗酸化剤非存在下で、調製された。このようにして得られた組成物は、放射標識後、放射化学的純度が改善した（ＩＴＬＣおよびＨＰＬＣの両方によって９０％を優に上回った）。しかし、これらの試験では、ｐＨの増加が二量体形成に有利に働き、放射標識後、より高いｐＨで二量体の割合が急速に増加したことが観測された。
【００４２】
第３のステップでは、抗酸化剤および乳酸塩緩衝液の存在下で試験した。以前のものと類似した凍結乾燥塩生物は、ｐＨ５．８で、抗酸化剤（メタ重亜硫酸塩ナトリウム）を含めて調製された。放射標識後、放射化学的純度は、９０％を優に超えることが確認され、化学純度は、放射標識後少なくとも６時間で約９７〜９８％の値になり（ＳＥＣ−ＨＰＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣによる）、顕著に改善されたことが確認された。
【００４３】
本発明に係る凍結乾燥組成物は、以下のステップ（図１参照）を含むプロセスに従って調製され得る：
−凍結したｒｈアネキシンＶ−１２８を制御温度下（５℃±３℃）で解凍するステップ、
−抗酸化剤／還元剤を添加することによって還元するステップ、
−タンジェンシャルフロー濾過により緩衝液を交換し、上記ｒｈアネキシンＶ−１２８が供給される緩衝液（通常、クエン酸塩緩衝液）を、上記にて規定した緩衝液に置換するステップ、
−賦形剤バルク溶液の調製ステップ（上記で規定した、抗酸化剤、トランスキレート化剤、放射安定促進剤、可溶化剤、乾燥保護剤およびケーキ形成剤からなる）
−前記賦形剤バルク溶液に必要量のｒｈアネキシンＶ−１２８の溶液を添加するステップ、
−上記バルク溶液をバイアルに分配し、凍結乾燥するステップ。
【００４４】
上述の組成物に対して、７４０ＭＢｑ以下の放射能を有する市販の９９ｍＴｃＯ４−ジェネレータからの最適量の溶出液を添加し、軽度の回転下でバイアルを９０分間室温で維持することにより、静脈内投与に適した最終的な９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８製剤が調製され得る。
【００４５】
注目される点は、このようにして得られた９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８製剤が、少なくとも６時間、ＩＴＬＣ、ＳＥＣ―ＨＰＬＣおよびＲＰ―ＨＰＬＣにより測定された放射化学的純度および化学純度を高く維持している点である。
【００４６】
本発明に係る組成物／製剤の必要不可欠な特徴は、これらの上述した調製プロセスと同様に、ｐＨが５．０〜６．６の範囲での、抗酸化剤および特定の緩衝液の使用である。  
【００４７】
これらの特徴により、放射化学的純度が高く（９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８モノマー≧９０％、ＳＥＣ−ＨＰＬＣとＩＴＬＣによる）、化学純度が高く（ｒｈアネキシン  Ｖ−１２８モノマー≧９０％、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣによる：二量体≦１０％）、当該放射化学的純度および化学純度が放射標識後少なくとも６時間維持される、投与可能な製剤を得ることができる。
【００４８】
本発明に係る組成物は、保存期間が２〜８℃で少なくとも１８か月であり、室温で放射標識され得、二量体の割合が制御されると共に、高い放射化学的純度および化学純度、並びに標識後少なくとも６時間の良好な安定性を付与する。
【００４９】
本発明に係る組成物により、上記ｒｈアネキシンＶ−１２８が凍結乾燥単一バイアル製造物として入手可能となる。当該バイアル製造物は、最終的な精製を全く必要とせずに、市販のジェネレータから溶出された９９ｍＴｃＯ４−溶液により再構成するのに必要である。
【００５０】
また、放射標識の手順が有効である事実のために、投与前の病院レベルでは、限られた品質管理チェック（ＩＴＬＣによる放射化学的純度の分析）のみが必要となる。
【００５１】
本発明に係る製剤は、診断上の性能のためにいくつかの動物モデル（肝臓アポトーシス、コラーゲン誘発関節炎のモデル、心内膜炎／心筋炎、炎症性腸疾患、その他）で試験される。
【００５２】
コラーゲン誘発関節炎のモデルのＳＰＥＣＴ画像の例は、図２に記載されている。  
【００５３】
アネキシンＶ−１２８は、完全な臨床前毒物検査パッケージ（関連するガイドラインおよび監督官庁から受領した情報(input)に従って設計された）で、その毒性が試験され、げっ歯類および非げっ歯類に１５日間の反復投与毒性試験をした。上記臨床前パッケージには、サイトカイン放出アッセイも含まれている。これらの試験の結果から、アネキシンＶ−１２８は、非常に有利な安全性の特徴を有することが示された（必要であればデータを提供可能）。
【００５４】
上記製剤は、その安全性および体内分布のために、フェーズ１試験で、ヒトのボランティアで試験され、最近、フェーズ２試験で、リューマチおよび心臓血管の兆候について試験されている。
【００５５】
〔実施例１〕
静脈内投与のための９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８形成の調製に適した、凍結乾燥ｒｈアネキシンＶ−１２８の合成物の調製
組成物：
ｒｈアネキシンＶ−１２８（０．４ｍｇ）；
塩化第一スズ（０．０１ｍｇ）；
α−Ｄ―グルコヘプトン酸ナトリウム二水和物（３ｍｇ）
ゲンチシン酸ナトリウム塩水和物（０．０２ｍｇ）
ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（５ｍｇ）
メタ重亜硫酸ナトリウム（０．０２ｍｇ）
トレハロース二水和物（５０ｍｇ）
乳酸塩緩衝液  １５０ｍＭ、ｐＨ５．８
調製：
ｒｈアネキシンＶ−１２８を解凍し、上記緩衝液の交換のためにタンジェンシャルフロー濾過システムに導入した。このステップでメタ重亜硫酸塩も導入した。この濾過手順を、製剤の緩衝液が少なくとも７回（diavolume）交換されるまで行った。上記二量体の含量は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（最大許容値＝５％）によって確認され、上記タンパク質の濃度も算定された（許容範囲１−２ｍｇ／ｍＬ）。濾過手順の最後に、溶液は、タンパク質の最終濃度１ｍｇ／ｍＬにした。
【００５６】
上記他の賦形剤は、適切な量で、注射のために水に溶解した：
−Ｄ（＋）−トレハロース二水和物（粉末）：最終バルク溶液にて５０ｍｇ／ｍｌの濃度を得るように、適当量秤量した；
−α−Ｄ―グルコヘプトン酸ナトリウム二水和物（６０ｍｇ／ｍｌのストック溶液）：最終バルク溶液にて３ｍｇ／ｍｌの濃度を得るように、適当量添加された；
−ゲンチシン酸ナトリウム塩水和物（０．１ｍｇ／ｍｌのストック溶液）：最終バルク溶液にて０．０２ｇ／ｍｌの濃度を得るように、適当量添加された；
−塩化第一スズ二水和物（１ｍｇ／ｍｌのストック溶液）：最終バルク溶液にて０．０１ｍｇ／ｍｌの濃度を得るように、適当量添加された。
【００５７】
適当量の賦形剤バルク溶液に、適当量のｒｈアネキシンＶ−１２８溶液を添加して、最終バルク溶液を調製した。
【００５８】
上記のバルク溶液は、濾過され（０．２２μｍフィルター）、自動的にバイアル内に充填され（１ｍＬ／バイアル）、凍結乾燥される。
【００５９】
〔実施例２〕
実施例１に記載された凍結乾燥組成物から開始した、９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８の調製
−上記バイアルの蓋をひっくり返し、上記バイアルを適切な放射シールド内に設置した；
−７４０ＭＢｑの放射能を含む、２ｍＬの過テクネチウム酸ナトリウムＴｃ−９９ｍ溶液を、無菌状態で、遮蔽板内のビンへ添加した；
−鉛製シールドから上記バイアルを取り出し、適切にシールドローラーに設置した。バイアルは、軽度の回転下で、９０分間室温で維持された；
−上記シールドローラーから上記バイアルを取り出し、再び鉛製シールド内に設置した；
そうして得られた溶液サンプルは、回収され、放射標識直後および６時間後に放射化学的純度および化学純度（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＩＴＬＣ）について分析され、以下の結果が得られた。これらのデータは３つの異なるバッチから得られた。
【００６０】
【表１】
2019533723.tif 000002
【００６１】
上述した製剤は、診断用ツールとして使用可能であり、リウマチ（例えば、リウマチ様関節炎，体軸性脊椎関節炎）、心循環器疾患（例えば、大動脈瘤、化学療法心毒性、心内膜炎および心筋炎）、アテローム性動脈硬化症（特に、アテローム斑の検出およびステージ決定(staging))）、腫瘍学、移植の拒絶反応、自己免疫疾患、神経学、および、アポトーシスプロセスを顕著な特徴として有する、および／または、処理誘導されたアポトーシスに対する処理応答のマーカーとして有する他の病状において、医療治療効果のモニタリングと同様に、最良の治療を選択するのに使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明に係る凍結乾燥されたｒｈアネキシン  Ｖ−１２８の調製プロセスの概略図を示す。
【図２】健康なマウス（ａ)、およびコラーゲン誘発関節炎のマウスモデル（ｂ)の前足内の９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８取り込みＳＰＥＣＴ画像である。（ｃ）は、抗炎症薬による治療後の、前記コラーゲン誘発関節炎のマウス内での取り込みを示す（９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８の取り込みが全く検出され得ない）。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月11日(2019.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ５．０〜６．６の範囲で、抗酸化剤と組み合わせてｒｈアネキシンＶ−１２８を含む、静脈内投与に適した凍結乾燥組成物。
【請求項２】
前記抗酸化剤は、メタ重亜硫酸ナトリウム、ニコチンアミド、ピリドキシン塩酸塩、α−トコフェロールアセテート、モノチオグリセロールの中から選択される、請求項１に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項３】
乳酸塩緩衝液、琥珀酸塩緩衝液、グリコール緩衝液、ＴＲＩＳ、およびヒスチジン緩衝液の中から選択される緩衝液を含んでいる、請求項１または２に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項４】
−抗酸化剤；
−ｐＨが５．０〜６．６の間である緩衝液；
−還元剤；
−トランスキレート化剤；
−乾燥保護剤およびケーキ形成剤；
並びに、随意的に、放射安定促進剤または可溶化剤
を含む、静脈内投与に適した、請求項１〜３の何れか１項に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項５】
前記成分は、以下の量、
−０．００５ｍｇ／バイアルを超える量の前記抗酸化剤；
−１０ｍＭを超える濃度である、ｐＨが５．０〜６．６の間である緩衝液；
−０．００５ｍｇ／バイアルを超える量の還元剤；
−０．０２ｍｇ／バイアルを超える量のトランスキレート化剤；
−１０ｍｇ／バイアルを超える量の乾燥保護剤およびケーキ形成剤；
前記放射安定促進剤または前記可溶化剤はそれぞれ、存在していれば、０．００５ｍｇ／バイアルを超える量および１ｍｇ／バイアルを超える量、
で存在している、請求項４に記載の凍結乾燥組成物。
【請求項６】
以下のステップ、
−凍結したｒｈアネキシンＶ−１２８を解凍するステップ
−抗酸化剤／還元剤を添加するステップ
−タンジェンシャルフロー濾過により緩衝液を交換し、上記ｒｈアネキシンＶ−１２８が供給される緩衝液を、乳酸塩緩衝液、琥珀酸塩緩衝液、グリコール緩衝液、ＴＲＩＳ、およびヒスチジン緩衝液の中から選択される緩衝液に置換するステップ
−トランスキレート化剤、放射安定促進剤、可溶化剤、抗酸化剤、乾燥保護剤およびケーキ形成剤を含む、賦形剤バルク溶液の調製ステップ
−前記賦形剤バルク溶液に必要量のｒｈアネキシンＶ−１２８の溶液を添加するステップ
−上記バルク溶液をバイアルに分配し、凍結乾燥するステップ
を含む、請求項１〜５の何れか１項に記載の凍結乾燥製剤の調製プロセス。
【請求項７】
請求項１〜５に記載の単一バイアル凍結乾燥製剤と市販の９９ｍＴｃＯ４−ジェネレータに由来する溶出液とを反応して得られた９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８を含む、静脈内投与に適した製剤。
【請求項８】
以下のステップ、
−請求項１〜５の何れか１項に記載の凍結乾燥製剤を含むバイアルに対して、７４０ＭＢｑ以下の放射能を有する市販の９９ｍＴｃＯ４−ジェネレータからの最適量の溶出液を添加するステップ；
−回転下で前記バイアルを９０分間室温で維持するステップ；
−反応を終了させ、これにより、６時間安定な９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８溶液を得るステップ；
を含む、請求項７に記載の９９ｍＴｃ−ｒｈアネキシンＶ−１２８を得るプロセス。
【請求項９】
リウマチ疾患、心循環器疾患、腫瘍学、移植の拒絶反応、自己免疫疾患、神経系疾患、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される疾患において、医療治療効果のモニタリングに利用するために、ｒｈアネキシンＶ−１２８を含み、上記治療は、細胞のアポトーシスを含む治療である、請求項１〜５に記載の凍結乾燥薬学的組成物。
【請求項１０】
リウマチ疾患、心循環器疾患、腫瘍学、移植の拒絶反応、自己免疫疾患、神経系疾患、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される疾患を診断するために、ｒｈアネキシンＶ−１２８を含む、請求項１〜５に記載の凍結乾燥薬学的組成物。
【請求項１１】
前記心循環器疾患は、大動脈瘤、化学療法心毒性、心内膜炎および心筋炎である、請求項９または１０に記載の凍結乾燥薬学的組成物。
【請求項１２】
前記リウマチ疾患は、リウマチ関節炎および体軸性脊椎関節炎である、請求項９または１０に記載の凍結乾燥薬学的組成物。
【請求項１３】
前記疾患はアテローム性動脈硬化症であり、前記診断によりアテローム斑を検出しステージ決定できる、請求項１０に記載の凍結乾燥薬学的組成物。
【国際調査報告】
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