(57)【要約】本発明は、環状ペプチドを含むワクチン組成物、環状ペプチドに対する抗体又はそれを含む抗癌組成物に関し、本発明のワクチン組成物は、癌転移に対する阻害活性を示し、本発明の抗体は、腫瘍特異抗原ＴＭ４ＳＦ５に高い親和力で結合し、これを発現する癌細胞の成長、転移及び浸潤を著しく抑制するので、ＴＭ４ＳＦ５を発現する様々な癌の診断、予防又は治療に用いることができる。
2019532015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の第１配列及び配列表の第２配列で構成される群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド、
又は配列表の第１配列及び配列表の第２配列中の、３番目のシステインと２６番目のシステインアミノ酸との間にジスルフィド結合で連結された環状ペプチドで構成される群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、ワクチン組成物。
【請求項２】
前記ペプチドワクチン組成物は、免疫刺激オリゴヌクレオチド及びリポソームに捕集されたことを特徴とする、請求項１に記載のペプチドワクチン組成物。
【請求項３】
配列表の第１配列及び配列表の第２配列で構成される群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド、
又は配列表の第１配列及び配列表の第２配列中の、３番目のシステインと２６番目のシステインアミノ酸との間にジスルフィド結合で連結された環状ペプチドで構成される群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体は、配列表の第３配列又は第４配列からなるＣＤＲＨ１、配列表の第５配列又は第６配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列表の第７配列又は第８配列からなるＣＤＲＨ３の重鎖ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）アミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
配列表の第９配列又は第１０配列からなるＣＤＲＬ１、配列表の第１１配列又は第１２配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列表の第１３配列又は第１４配列からなるＣＤＲＬ３の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
前記重鎖可変領域は、配列表の第１５配列又は第１６配列のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項４に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
前記軽鎖可変領域は、配列表の第１７配列又は第１８配列のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項４に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
請求項４に記載の抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードする核酸分子。
【請求項８】
前記核酸分子は、配列表の第１９配列又は第２０配列のヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
請求項４に記載の抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードする核酸分子。
【請求項１０】
前記核酸分子は、配列表の第２１配列又は第２２配列のヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
（ａ）請求項３乃至４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片の薬学的有効量と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む、癌の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項１２】
前記癌は、肝癌、大腸癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、直腸癌、軟部組織肉腫（ｓｏｆｔ−ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｒｃｏｍａ）、結腸癌、十二指腸乳頭部上皮癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｐｉｌｌａ  ｖａｔｅｒｉ）、非内分泌肺腫瘍（ｎｏｎｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｌｕｎｇ  ｔｕｍｏｒ）及び気管支類癌腫（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ）で構成される群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、癌細胞の転移又は癌細胞の浸潤を抑制することを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項３乃至４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む癌診断用キット。
【請求項１５】
前記癌は、肝癌、大腸癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、直腸癌、軟部組織肉腫（ｓｏｆｔ−ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｒｃｏｍａ）、結腸癌、十二指腸乳頭部上皮癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｐｉｌｌａ  ｖａｔｅｒｉ）、非内分泌肺腫瘍（ｎｏｎｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｌｕｎｇ  ｔｕｍｏｒ）及び気管支類癌腫（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ）で構成される群から選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状ペプチドを含むワクチン組成物、環状ペプチドに対する抗体又はそれを含む抗癌組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト癌においてＴＭ４ＳＦ５（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ４  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ５  ｐｒｏｔｅｉｎ）のｍＲＮＡの発現は、膵臓癌、軟部組織肉腫（ｓｏｆｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｒｃｏｍａ）、胃癌、十二指腸乳頭部上皮癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｐｉｌｌａ  ｖａｔｅｒｉ）及び大腸癌で観察されている。ＴＭ４ＳＦ５は、誘導された形態学的伸長及び上皮細胞の間葉細胞への転換（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）により肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＨＣＣ）の形成に重要な役割を果たし、インビトロで異常な細胞成長及びインビボで腫瘍形成を引き起こす。ＴＭ４ＳＦ５とインテグリンα２との間の細胞外相互作用によるコラーゲンタイプＩ環境でインテグリンα２の機能を抑制する場合、ＴＭ４ＳＦ５発現−誘導された調節されていない細胞増殖及び新生血管形成が起こるという事実が報告された。ＴＭ４ＳＦ５をターゲッティングする合成抑制剤であるＴＳＡＨＣ（４’−（ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ−ａｍｉｄｏ）−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｈａｌｃｏｎｅ）は、インビトロ及びインビボでＨＣＣの成長及び転移を抑制した。これらの事実は、ＨＣＣの形成におけるＴＭ４ＳＦ５の役割が、ＨＣＣの治療薬物の開発のための新規な分子ターゲットであることを示す。
【０００３】
ＨＣＣは、全世界的に最もよく見られる癌の一つであり、特に、アジアとサハラ砂漠以南のアフリカ（ｓｕｂ−Ｓａｈａｒａｎ  Ａｆｒｉｃａ）で広く発症している。ほとんどのＨＣＣの発達は、異形成結節（ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｎｏｄｕｌｅ）、初期ＨＣＣ、高分化度ＨＣＣ、並びに中分化度及び低ＨＣＣを含む多段階の過程であることが知られている。
【０００４】
大腸癌は、全世界で３番目によく見られる癌であり、開発途上国よりも先進国でさらによく見られる癌である。大腸癌において最もよく見られる突然変異遺伝子は、Ｗｎｔ−ＡＰＣ−β−カテニン信号伝達経路と関連するＡＰＣ、β−カテニン、ＡＸＩＮ１、ＡＸＩＮ２、ＴＣＦ７Ｌ２又はＮＫＤ１である。
【０００５】
一方、生体による腫瘍細胞とウイルス感染細胞などの排除は、細胞性免疫、特に細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬと称する）が重要な役割を果たしている。腫瘍細胞の排除の場合、ＣＴＬは、腫瘍細胞上の抗原ペプチド（腫瘍抗原ペプチド）とＭＨＣ（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）クラスＩ抗原（ヒトの場合はＨＬＡクラスＩ抗原と称する）の複合体を認識し、腫瘍細胞を攻撃及び破壊する。すなわち、腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍に特有のタンパク質、すなわち腫瘍抗原タンパク質が細胞内で合成された後、プロテアーゼにより細胞内で分解されることによって生成される。生成された腫瘍抗原ペプチドは、小胞体内でＭＨＣクラスＩ抗原（ＨＬＡクラスＩ抗原）と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。この抗原提示に係る複合体を腫瘍特異的なＣＴＬが認識し、細胞毒性作用とリンフォカイン（ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ）の産生を介して抗腫瘍効果を示す。このような一連の作用の解明に伴い、腫瘍抗原タンパク質又は腫瘍抗原ペプチドを、いわゆる癌免疫療法剤（癌ワクチン）として利用することによって、癌患者の体内の癌特異的ＣＴＬを増強させる治療法が開発されている。
【０００６】
本明細書全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として組み込まれ、本発明の属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】大韓民国特許公開第１０−２０１５−０１２２１５９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、癌を診断、予防及び治療できるワクチン及び抗体を開発するために鋭意研究した。その結果、腫瘍特異抗原であるＴＭ４ＳＦ５のペプチドに対して高い親和力で結合する新規な抗体及びその抗原結合断片を製造し、癌細胞の成長、転移及び浸潤に対する前記抗体の優れた抑制活性を確認することによって、本発明を完成した。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、環状ペプチドワクチン組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、その環状ペプチドに対する抗体又はその抗原結合断片を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードする核酸分子を提供することにある。
【００１２】
本発明の更に他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードする核酸分子を提供することにある。
【００１３】
本発明の更に他の目的は、癌の予防又は治療用薬学的組成物を提供することにある。
【００１４】
本発明の更に他の目的は、癌診断用キットを提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の目的を達成するために、本発明は、配列表の第１配列及び配列表の第２配列で構成される群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド；又は配列表の第１配列及び配列表の第２配列中の、３番目のシステインと２６番目のシステインアミノ酸との間にジスルフィド結合で連結された環状ペプチドで構成される群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含むワクチン組成物を提供する。
【００１７】
本発明の一具現例において、前記ペプチドワクチン組成物は、免疫刺激オリゴヌクレオチド及びリポソームに捕集されることが好ましいが、これに限定されない。
【００１８】
本明細書において、「リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）」という用語は、脂質二重膜を形成することによって製造される脂質運搬体を意味する。一般に、リポソームは、生体親和的であり、両親媒性を有しているので、内部の親水性物質を含んだまま、疎水性膜を通過することができる。リポソームの直径は、一般的に２０〜２，０００ｎｍであるが、これに制限されず、製造方法及び運搬されるヌクレオチドの長さによって様々な大きさであってもよい。
【００１９】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明のリポソームは、ＣＨＥＭＳ及びＤＯＰＥの混合物である。本発明で使用するリポソーム内でのＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳのモル比は、好ましくは７：３〜３：７であり、より好ましくは４．５：５．５〜５．５：４．５であり、最も好ましくは５．０：５．０である。
【００２０】
本発明のリポソームの製造は、当業界で公知の様々な方法により行うことができるが、好ましくは、有機溶媒−混合方法又は界面剤−混合方法を用いる（米国特許登録第５，７０５，３８５号；米国特許出願第０８／６６０，０２５号）。より好ましくは、リポソームは、ＤＯＰＥ及びＣＨＥＭＳを混合し、これを窒素ガスと共に蒸発させて無溶媒（ｓｏｌｖｅｎｔｆｒｅｅ）脂質フィルムを作った後、アルコール溶液中で溶解させ、最終的に水溶性ヌクレオチド混合物と混合する過程により製造する。
【００２１】
本発明のリポソームの製造を有機溶媒の混合により行う場合、これに用いられる有機溶媒は、クロロホルム、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール又はブタノールを含む。好ましくは、前記有機溶媒はエタノールである。
【００２２】
本明細書において、「捕集（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）」という用語は、効率的なインビボ運搬のために、運搬される物質を相対的に安定したシェル内に封入する（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）ことを意味する。
【００２３】
本明細書において、「免疫刺激（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）」という用語は、初期免疫反応を誘導するか、又は抗原に対する既存の免疫反応を測定可能レベルに増加させることを意味する。
【００２４】
本発明で利用できる免疫刺激オリゴヌクレオチドは、当業界で公知のいかなる免疫刺激オリゴヌクレオチドも含む。例えば、前記免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ヘアピン二次構造を形成するパリンドローム、ＣｐＧモチーフ、ＣｐＴモチーフ又は多重Ｇドメインを含むオリゴヌクレオチド、又は他の公知のＩＳＳ（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であってもよい。例えば、本発明で利用される免疫刺激オリゴヌクレオチドは、米国特許出願公開第２００８００４５４７３号、ＷＯ２００６／０６３１５２又はＷＯ１９９８／１８８１０に開示された免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む。前記ＣｐＧモチーフを含む免疫刺激オリゴヌクレオチドの具体的な例は、ＷＯ２００６／０８０５９６に開示の本発明者らによって開発されたＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。
【００２５】
本発明で有効成分として用いられる免疫刺激オリゴヌクレオチドは、天然（ｎａｔｕｒａｌ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ヌクレオチド、骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）変形されたヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６−５６８（１９９３））、ホスホロチオエートＤＮＡ、ホスホロジチオエートＤＮＡ、ホスホロアミデートＤＮＡ、アミド連結されたＤＮＡ、ＭＭＩ連結されたＤＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、α−ＤＮＡ及びメチルホスホネートＤＮＡ、糖変形されたヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、２’−フルオロＲＮＡ、２’−アミノＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＤＮＡ、２’−Ｏ−アリルＤＮＡ、２’−Ｏ−アルキニルＤＮＡ、ヘキソースＤＮＡ、ピラノシルＲＮＡ及びアンヒドロヘキシトールＤＮＡ）、及び塩基変形されたヌクレオチド（例えば、Ｃ−５置
【００２６】
換されたピリミジン（置換基は、フルオロ−、ブロモ−、クロロ−、ヨード−、メチル−、エチル−、ビニル−、ホルミル−、エチニル−、プロピニル−、アルキニル−、チアゾリル−、イミダゾリル−及びピリジル−を含む）、Ｃ−７置換基を有する７−デアザプリン（置換基は、フルオロ−、ブロモ−、クロロ−、ヨード−、メチル−、エチル−、ビニル−、ホルミル−、アルキニル−、アルケニル−、チアゾリル−、イミダゾリル−、ピリジル−を含む）、イノシン及びジアミノプリン）を含む。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは天然ヌクレオチドである。
【００２７】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ホスホロジエステル骨格又はホスホロチオエート骨格を有する。
【００２８】
本発明で用いられる免疫刺激オリゴヌクレオチドの長さは、特に制限されないが、好ましくは、８〜１００ヌクレオチド長であり、より好ましくは１５〜５０ヌクレオチド長であり、最も好ましくは、約１３〜２５ヌクレオチド長である。好ましくは、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドは、配列表の第２３配列のオリゴヌクレオチドである。
【００２９】
本明細書において、「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」という用語は、抗体と相互作用する抗原の部位を意味する。より詳しくは、エピトープは、免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）又はＴ細胞受容体に特異的に結合できるタンパク質決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を意味する。また、本発明のエピトープは、免疫反応を増加させることができる分子又は物質を含む。例えば、本発明のエピトープは、ペプチド、これらのペプチドをエンコードする核酸及び糖タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
本明細書において、「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、アミノ酸残基間のペプチド結合によって形成された線形の分子を意味し、本明細書において、「ペプチドエピトープ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ）」という用語は、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞の特異的反応を誘導できるエピトープを含むペプチドを意味する。
【００３１】
本発明の組成物には、その他の薬物又は他の免疫補助剤が含まれて追加的な免疫刺激効果を提供することができる。免疫補強剤の種類は、当分野に公知である（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ−Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１９９５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ６，Ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ，ＩＳＢＮ  ０−３０６−４４８６７−Ｘ）。好ましくは、本発明の組成物に含まれる免疫補強剤は、アルミニウム塩又はカルシウム塩（例えば、ヒドロキシド又はホスフェート）を含む。
【００３２】
好ましい免疫補強剤の具体例は、次の通りである：アルミニウム塩又はカルシウム塩（ヒドロキシド又はホスフェート）、水中油（ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）エマルション（ＷＯ９５／１７２１０、ＥＰ０  ３９９  ８４３）又はリポソームのような微粒性キャリア（ＷＯ９６／３３７３９）、南アメリカの樹木であるキラヤ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）由来の免疫学的に抗原補強剤活性を有するサポニン画分（例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ）、３  Ｄｅ−Ｏ−アシル化されたモノホスホリル脂質Ａ、ムラミルジペプチド、３ＤＭＰＬ（３−Ｏ−デアシル化されたモノホスホリル脂質Ａ）を含むが、これに限定されるものではない。
【００３３】
本発明のワクチン組成物は、様々な状態又は疾患の治療に適用することができ、前記状態又は疾患の例は、大腸癌、肝癌、胃癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、前立腺癌、骨癌、皮膚癌、甲状腺癌、副甲状腺癌及び尿管癌のような癌に適用することができる。
【００３４】
本発明の薬学的組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に一般的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬学的組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適した薬学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【００３５】
本発明の薬学的組成物は、経口又は非経口で投与することができるが、好ましくは非経口投与であり、非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができる。
【００３６】
本発明の薬学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方することができる。一方、本発明の薬学的組成物の経口投与量は、好ましくは、１日当たり０．００１〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。
【００３７】
本発明の薬学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位用量形態で製造されるか、又は多用量容器内に入れて製造されてもよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、又はエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
【００３８】
また、本発明は、配列表の第１配列及び配列表の第２配列で構成される群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド；又は配列表の第１配列及び配列表の第２配列中の、３番目のシステインと２６番目のシステインアミノ酸との間にジスルフィド結合で連結された環状ペプチドで構成される群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３９】
本発明の一具現例において、前記抗体は、配列表の第３配列又は第４配列からなるＣＤＲＨ１、配列表の第５配列又は第６配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列表の第７配列又は第８配列からなるＣＤＲＨ３の重鎖ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）アミノ酸配列を有する重鎖可変領域；及び配列表の第９配列又は第１０配列からなるＣＤＲＬ１、配列表の第１１配列又は第１２配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列表の第１３配列又は第１４配列からなるＣＤＲＬ３の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００４０】
本発明において、本発明者らは、ＴＭ４ＳＦ５のＥＣ２（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ２）に該当する環状ペプチドを考案し、環状ｈＴＭ４ＳＦ５ペプチド及びＭＢ−ＯＤＮ  ４５３１（Ｏ）をｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−β−ｏｌｅｏｙｌ−γ−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ  ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＯＰＥ）：ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ（ＣＨＥＭＳ）複合体にカプセル化し、免疫化後、マウスから環状ペプチド−特異的な抗体を産生した。転移モデルとして、マウスにマウス大腸癌細胞株ＣＴ−２６の静脈内注射により肺で腫瘍を誘導した。ペプチドワクチンで免疫化されたマウスにおいて生存率は増加し、転移された肺結節の数及び肺腫瘍の成長は減少した。これは、そのペプチドワクチンの抗転移効果を示唆した。本発明者らは、抗原として、ＴＭ４ＳＦ５の環状ペプチド類似構造モチーフを使用し、低いオフレート（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）を有するＴＭ４ＳＦ５タンパク質を認知するモノクローナル抗体を成功裏に分離した。また、本発明者らは、ヒト化された抗体を製造し、インビトロ及びインビボでその反応性を評価した。重要なことに、本発明者らは、本発明のヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体の肝癌及び大腸癌の形成及び成長に対する阻害効果を見出した。また、静脈内注射されたそのヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体は、マウス転移モデルに大腸癌細胞の静脈内注射によって確立された肺転移を阻害した。
【００４１】
したがって、本発明の主な内容は、
ｉ）ＴＭ４ＳＦ５が肝癌及び大腸癌などに発現されて癌の成長に影響を与え、
ｉｉ）ＴＭ４ＳＦ５のｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ２（ＥＣ２）に該当する環状ペプチドを合成して環状ペプチド−ＣｐＧ−ＤＮＡ−リポソーム複合体を製造してマウスに免疫すると、環状ペプチドに対する抗体が生成され、
ｉｉｉ）環状ペプチド−ＣｐＧ−ＤＮＡ−リポソーム複合体をワクチンとして用い、大腸癌（ＣＴ−２６細胞を利用）の転移に対するワクチン効能を検証し、
ｉｖ）環状ペプチド−ＣｐＧ−ＤＮＡ−リポソーム複合体を免疫したマウスの脾臓細胞を融合したモノクローナル抗体を製造し、
ｖ）マウスａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体に基づいてヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体を製造し、
ｖｉ）ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体の肝癌、大腸癌の抑制効能及び大腸癌の転移抑制効能を評価することに関する。
【００４２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４３】
抗ＴＭ４ＳＦ５ヒト化された抗体及びその抗原結合断片
【００４４】
本発明の抗体は、ＴＭ４ＳＦ５に対して特異的結合能を有する。
【００４５】
本明細書において、ＴＭ４ＳＦ５に言及しながら使用される「抗体」という用語は、ＴＭ４ＳＦ５に対する特異抗体であって、ＴＭ４ＳＦ５の特定のエピトープに対して特異的に結合するものを指し、完全な抗体の形態だけでなく、抗体分子の抗原結合断片（抗体断片）を含む。
【００４６】
「ヒト化」という用語は、抗体が全体的又は部分的に非ヒト起源のもの、例えば、関心のある抗原でマウスを免疫化させて取得されたマウス抗体、又はそのようなマウス抗体に基づくキメラ抗体である場合、特に、重鎖及び軽鎖のフレームワーク領域及び不変ドメインにある特定のアミノ酸を置換させることで、ヒトにおいて免疫反応を回避又は最小化できるという事実を指す。すべての抗体は、論議されている抗体の「ヒト化（ｈｕｍａｎｎｅｓｓ）」のレベルとある程度関連するヒト抗−抗体反応を誘導する可能性を有するものと知られている。たとえ、免疫原性、そして、これによって特定の抗体のヒト抗−抗体反応を精密に予測することはできないが、非ヒト抗体は、ヒト抗体よりも免疫原性が高い傾向がある。外来（一般的にげっ歯類）不変領域がヒト起源の配列で置換されたキメラ抗体は、完全な外来起源の抗体よりも一般的に免疫原性が低いことが示されており、治療用抗体での趨勢は、ヒト化又は完全なヒト抗体を目指している。キメラ抗体又は非ヒト起源のその他の抗体の場合、その結果として、これらをヒト化させてヒト抗−抗体反応の危険性を減少させることが好ましい。
【００４７】
抗体配列をヒト化する多くの方法は当分野で公知である；参照：例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ＆  Ｆｒａｎｓｓｏｎ（２００８）  Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３によって概観される。通常使用される一つの方法は、例えば、マウス由来のキメラ抗体の場合、マウス可変領域遺伝子に対するヒト生殖細胞遺伝子対応部を同定し、マウスＣＤＲ配列をこのようなフレームワークにグラフトすることを含むＣＤＲグラフティングである。ＣＤＲグラフティングは、カバットＣＤＲの定義に基づき得るが、より最近の刊行物（Ｍａｇｄｅｌａｉｎｅ−Ｂｅｕｚｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ．６４：２１０−２２５）は、ＩＭＧＴ(登録商標)の定義（ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ(登録商標)，ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）がヒト化の結果を向上させ得ることを提案している（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｖ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７，５５−７７参照）。ＣＤＲグラフティングは、ＣＤＲグラフトされた非ヒト抗体の結合特異性及び親和性、並びにこれによって生物学的活性を減少させることができるので、復帰突然変異（しばしば「フレームワーク復旧」と呼ばれる）を、典型的にフレームワーク領域でＣＤＲグラフトされた抗体の選択された位置に導入させて、親抗体の結合特異性及び親和性を再確立させることができる。可能な復帰突然変異のための位置の確認は、文献及び抗体データベースで利用可能な情報を用いて行うことができる。復帰突然変異の候補であるアミノ酸残基は、典型的に抗体分子の表面に位置したものである反面、埋もれている又は低いレベルの表面露出を有する残基は、一般的に変更されないはずである。ＣＤＲグラフティング及び復帰突然変異に代わるヒト化技法は、非ヒト起源の表面露出されていない残基を維持する一方、表面残基をヒト残基に変更させるリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）である。
【００４８】
特定の場合に、標的エピトープに対する結合親和性を向上させるために、１つ以上のＣＤＲアミノ酸残基を変更させることがまた好ましいことがある。これは、「親和性成熟化」として知られており、例えば、抗体のヒト化が減少された結合特異性又は親和性をもたらし、復帰突然変異単独で結合特異性又は親和性を十分に向上させることができない状況で、任意にヒト化と共に行われ得る。様々な親和性成熟化方法、例えば、文献［Ｂｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，ｖｏｌ．９４，ｐｐ．４１２−４１７］に記載された試験管内スキャニング飽和突然変異発生方法、及び文献［Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，ｖｏｌ．９５，ｐｐ．６０３７−６０４２］の段階式試験管内親和性成熟化方法が当分野で公知である。
【００４９】
完全な抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。
【００５０】
抗体分子の抗原結合断片又は抗体断片とは、抗原結合機能を保持している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうちＦａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の不変領域、及び重鎖の１番目の不変領域（ＣＨ１）を有する構造で、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合して生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有している最小の抗体片であって、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は、ＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ８８／１０６４９、ＷＯ８８／１０６６３０、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６及びＷＯ８８／０９３４４に開示されている。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、一般的にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域とが共有結合で連結されるか、又はＣ末端で直接連結されているので、二重鎖Ｆｖと同様にダイマーのような構造をなすことができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すると、Ｆａｂが得られ、ペブシンで切断すると、Ｆ（ａｂ’）２断片が得られる）、遺伝子組換え技術により作製することもできる。
【００５１】
本発明の一具現例によれば、本発明において抗体は、Ｆａｂの形態であるか、又は完全な抗体の形態である。また、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）又はイプシロン（ε）のいずれか一つのアイソタイプから選択され得る。一つの特定例において、不変領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ２（ＩｇＧ２）、ガンマ３（ＩｇＧ３）又はガンマ４（ＩｇＧ４）であり、他の特定例において、不変領域はＩｇＧ２ａアイソタイプである。軽鎖不変領域は、カッパ又はラムダタイプであってもよい。一つの特定例において、前記軽鎖不変領域はカッパタイプである。
【００５２】
本明細書で使用される用語、「重鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びその断片をいずれも意味する。また、本明細書で使用される用語、「軽鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びその断片をいずれも意味する。
【００５３】
本明細書において、用語「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）」は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））。重鎖（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び軽鎖（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）には、それぞれ３個のＣＤＲｓが含まれている。ＣＤＲは、抗体が抗原又はエピトープに結合する場合に主要な接触残基を提供する。
【００５４】
本発明の抗体又は抗体断片は、ＴＭ４ＳＦ５を特異的に認識できる範囲内で、添付の配列表に記載されたアミノ酸配列の変異体を含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他の生物学的特性をさらに改善するために、抗体のアミノ酸配列に追加的な変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいてなされる。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形状及び種類に対する分析によって、アルギニン、リジン及びヒスチジンは、いずれも正電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシン及びセリンは、類似の大きさを有し；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、類似の形状を有するということが分かる。したがって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リジン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；そして、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、生物学的に機能均等物であると言える。
【００５５】
変異を導入する場合、アミノ酸の疎水性インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。それぞれのアミノ酸は、疎水性及び電荷によって疎水性インデックスが付与されている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。
【００５６】
タンパク質の相互的な生物学的機能（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を付与するに当たり、疎水性アミノ酸インデックスは非常に重要である。類似の生物学的活性を保持するためには、類似の疎水性インデックスを有するアミノ酸で置換しなければならないということは公知の事実である。疎水性インデックスを参照して変異を導入させる場合、一つの特定例では±２以内、他の特定例では±１以内、更に他の特定例では±０．５以内の疎水性インデックスの差を示すアミノ酸間で置換を行う。
【００５７】
一方、類似の親水性値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）を有するアミノ酸間の置換が、均等な生物学的活性を有するタンパク質をもたらすということもよく知られている。米国特許第４，５５４，１０１号に開示されたように、次の親水性値がそれぞれのアミノ酸残基に付与されている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。親水性値を参照して変異を導入させる場合、一つの特定例では±２以内、他の特定例では±１以内、更に他の特定例では±０．５以内の親水性値の差を示すアミノ酸間で置換を行う。
【００５８】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質におけるアミノ酸交換は、当該分野で公知である（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も一般的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。
【００５９】
上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すれば、本発明の抗体又はそれをコードする核酸分子は、配列表に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、前記の本発明の配列と任意の他の配列とを最大限対応するようにアラインし、当業界で通常用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも６１％の相同性、一つの特定例によれば、７０％の相同性、他の特定例によれば、８０％の相同性、更に他の特定例によれば、９０％の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は当業界で公知である。アラインメントに対する様々な方法及びアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９８１）２：４８２  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．（１９７０）４８：４４３；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）２４：３０７−３１；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ（１９８８）７３：２３７−４４；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）５：１５１−３；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８８）１６：１０８８１−９０；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＳｃｉ．（１９９２）８：１５５−６５及びＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９４）２４：３０７−３１に開示されている。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３−１０）は、ＮＢＣＩなどでアクセス可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して利用することができる。ＢＬＳＡＴは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／でアクセス可能である。このプログラムを用いた配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認することができる。
【００６０】
本発明の一具現例によれば、本発明の抗体は、配列表の第１５配列又は第１６配列のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
【００６１】
本発明の一具現例によれば、本発明の抗体は、配列表の第１７配列又は第１８配列のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００６２】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、そして、前記抗体のエピトープ結合断片などを含むが、これらに限定されるものではない。
【００６３】
本発明によれば、本発明の抗体は、様々な形態の抗体として製造され得る。例えば、下記の実施例に記載されるように、本発明の抗体は、Ｆａｂ抗体として製造され得、また、Ｆａｂ抗体に得た軽鎖及び重鎖可変領域を用いてヒト由来の不変領域と組み換えることによって完全な（ｗｈｏｌｅ）形態の抗体を提供することもできる。
【００６４】
本発明の一具現例によれば、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同じ抗体集団から取得した単一分子組成の抗体分子を意味し、モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対して単一結合特異性及び親和度を示す。
【００６５】
本発明の抗体は、腫瘍特異抗原として知られたＴＭ４ＳＦ５タンパク質に結合してその活性を減少／抑制／除去させることによって癌を治療することができる。
【００６６】
核酸分子及び組換えベクター
【００６７】
本発明の他の態様によれば、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードする核酸分子を提供する。
【００６８】
本発明の更に他の態様によれば、本発明は、前記ＴＭ４ＳＦ５に対する抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードする核酸分子を提供する。
【００６９】
本明細書で使用される用語、「核酸分子」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）、そして、ＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，（１９９０）９０：５４３−５８４）。本発明の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸分子の配列は変形可能である。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。
【００７０】
本発明の一具現例によれば、前記重鎖可変領域をコードする核酸分子は、配列表の第１９配列又は第２０配列のヌクレオチドを含み、前記軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、配列表の第２１配列又は第２２配列のヌクレオチドを含む。
【００７１】
本発明の核酸分子は、前記のヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、前記の本発明のヌクレオチド配列と任意の他の配列とを最大限対応するようにアラインし、当業界で通常用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも８０％の相同性、一つの特定例では、少なくとも９０％の相同性、他の特定例では、少なくとも９５％の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。
【００７２】
本発明の更に他の態様によれば、本発明は、（ａ）本発明の重鎖可変領域をコードする核酸分子；及び（ｂ）本発明の軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含む組換えベクターを提供する。
【００７３】
本明細書で使用される用語、「ベクター」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であって、プラスミドベクター；コスミドベクター；そして、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びアデノ関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどを含む。
【００７４】
本発明の一具現例によれば、本発明のベクターにおいて軽鎖可変領域をコードする核酸分子及び重鎖可変領域をコードする核酸分子は、プロモーターと作動的に結合（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）されている。
【００７５】
本明細書で使用される用語、「作動的に結合された」は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節するようになる。
【００７６】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の組換えベクターは、（ａ）配列表の第２５配列の重鎖可変領域をコードする核酸分子；及び（ｂ）配列表の第２６配列の軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含む。
【００７７】
本発明の組換えベクターシステムは、当業界で公知の様々な方法により構築することができ、これについての具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）に開示されており、この文献は、本明細書に参照として組み込まれる。
【００７８】
本発明のベクターは、典型的にクローニングのためのベクター又は発現のためのベクターとして構築され得る。また、本発明のベクターは、原核細胞又は真核細胞を宿主として構築され得る。例えば、本発明のベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合部位及び転写／解読終結配列を含むことが一般的である。宿主細胞として、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＢＬ２１、ＤＨ５αなど）が用いられる場合、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーター及びオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１０１８−１０２４（１９８４））、そして、ファージλの左向きプロモーター（ｐＬλプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ．ａｎｄ  Ｈａｇｅｎ，Ｄ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１４：３９９−４４５（１９８０））が調節部位として用いられ得る。宿主細胞としてバチルス菌が用いられる場合、バチルス・チューリンゲンシスの毒素タンパク質遺伝子のプロモーター（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：３９３２−３９３８（１９９８）；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５０：７３４−７４１（１９９６））、又はバチルス菌で発現可能ないかなるプロモーターでも調節部位として用いられ得る。
【００７９】
一方、本発明の組換えベクターは、当業界でたびたび使用されるプラスミド（例：ｐＣＬ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ及びｐＵＣ１９など）、ファージ（例：λｇｔ４・λＢ、λ−Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１及びＭ１３など）又はウイルス（例：ＳＶ４０など）を操作して作製することができる。
【００８０】
一方、本発明のベクターが発現ベクターであり、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が用いられ得、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
【００８１】
本発明の組換えベクターは、それから発現される抗体の精製を容易にするために、他の配列と融合されてもよい。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）；マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）；ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）；６ｘ  Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）、Ｐｒｅ−Ｓ１、ｃ−Ｍｙｃのようなタグ配列；ＯｍｐＡ、ＰｅｌＢのような先導配列などがある。また、本発明のベクターによって発現されるタンパク質が抗体であるため、精製のための追加的な配列がなくても、発現された抗体はタンパク質Ａカラムなどにより容易に精製することができる。
【００８２】
一方、本発明の組換えベクターは、選択標識として、当業界で通常用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネテシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
【００８３】
本発明の抗体を発現するベクターは、軽鎖と重鎖が一つのベクターで同時に発現されるベクターシステム、又は軽鎖と重鎖をそれぞれ別途のベクターで発現させるシステムがいずれも可能である。後者の場合、２つのベクターは、同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ）及び標的形質転換（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により宿主細胞に導入される。同時形質転換は、軽鎖及び重鎖をコードするそれぞれのベクターＤＮＡを同時に宿主細胞に導入した後、軽鎖及び重鎖の両方を発現する細胞を選別する方法である。標的形質転換は、軽鎖（又は重鎖）を含むベクターで形質転換された細胞を選別し、軽鎖を発現する選別された細胞を重鎖（又は軽鎖）を含むベクターで再び形質転換して、軽鎖及び重鎖の両方を発現する細胞を最終的に選別する方法である。下記の実施例では、軽鎖（ＶＬ及びＣＬ）と重鎖（ＶＨ及びＣＨ１）が１つのベクターで同時に発現されるベクターシステムを用いて抗体を製造した。
【００８４】
形質転換体
【００８５】
本発明の更に他の態様によれば、本発明は、本発明の組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００８６】
本発明のベクターを安定かつ連続してクローニング及び発現させることができる宿主細胞は、当業界で公知のいかなる宿主細胞も利用可能であり、例えば、エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・スブチリス及びバチルス・チューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ））、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）又はスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を含むが、これに制限されるものではない。
【００８７】
前記ベクターの適した真核細胞宿主細胞は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）のような真菌、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）のような酵母、その他の下等真核細胞、昆虫由来の細胞のような高等真核生物の細胞、そして、植物又は哺乳動由来の細胞を用いることができる。
【００８８】
本明細書において、宿主細胞への「形質転換」及び／又は「形質感染」は、核酸を有機体、細胞、組織又は器官に導入するいかなる方法も含まれ、当分野で公知なように、宿主細胞に応じて適した標準技術を選択して行うことができる。このような方法には、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、シリコンカーバイド繊維を用いた撹拌、アグロバクテリア媒介された形質転換、ＰＥＧ、デキストランサルフェート、リポフェクタミン、及び乾燥／抑制媒介された形質転換方法などが含まれるが、これに制限されない。
【００８９】
抗ＴＭ４ＳＦ５抗体の変異体又はその抗原結合断片の製造方法
【００９０】
本発明の更に他の態様によれば、本発明は、（ａ）本発明の組換えベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップ；及び（ｂ）前記宿主細胞で抗ＴＭ４ＳＦ５抗体又はその抗原結合断片を発現させるステップを含む抗ＴＭ４ＳＦ５抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する。
【００９１】
前記抗体の製造において、形質転換された宿主細胞の培養は、当業界において周知の適当な培地及び培養条件によって行われ得る。このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。このような様々な培養方法は、様々な文献（例えば、Ｊａｍｅｓ  Ｍ．Ｌｅｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，１３８−１７６）に開示されている。細胞の培養は、細胞の成長方式によって懸濁培養と付着培養、培養方法によって回分式、流加式及び連続培養式の方法に区分される。培養に使用される培地は、特定の菌株の要求条件を適切に満足させなければならない。
【００９２】
動物細胞の培養において、前記培地は、様々な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。使用可能な炭素源の例は、ブドウ糖、蔗糖、乳糖、果糖、マルトース、澱粉及びセルロースのような炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油及びココナッツ油のような脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸のような脂肪酸、グリセロール及びエタノールのようなアルコール、そして、酢酸のような有機酸を含む。これらの炭素源は、単独又は組み合わせて使用することができる。使用可能な窒素源の例は、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液（ＣＳＬ）及び大豆麦のような有機窒素源、及びヨウ素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源を含む。これらの窒素源は、単独又は組み合わせて使用することができる。前記培地には、リン源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び対応するナトリウム含有塩が含まれ得る。また、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄のような金属塩を含むことができる。その他に、アミノ酸、ビタミン、及び適切な前駆体などが含まれ得る。
【００９３】
培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を培養物に適切な方式で添加して、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡の生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素又は酸素含有気体（例えば、空気）を注入する。培養物の温度は、通常、２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃である。
【００９４】
形質転換された宿主細胞を培養して取得した抗体は、精製していない状態で使用することができ、追加で様々な通常の方法、例えば、透析、塩沈澱及びクロマトグラフィーなどを用いて高純度に精製して使用することができる。その中でも、クロマトグラフィーを用いる方法が最も多く使用され、カラムの種類及び順序は、抗体の特性、培養方法などに応じて、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどから選択することができる。
【００９５】
癌の予防又は治療用薬学的組成物
【００９６】
本発明の更に他の態様によれば、本発明は、（ａ）本発明のＴＭ４ＳＦ５に対する抗体又はその抗原結合断片の薬学的有効量；及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む癌の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【００９７】
前記抗体は、ＴＭ４ＳＦ５に高い親和度で結合して、ＴＭ４ＳＦ５を発現する癌の成長、浸潤及び転移を抑制することができるので、抗体単独又は通常の薬学的に許容される担体と共に癌の予防及び治療に使用可能である。
【００９８】
本明細書で使用される用語、「予防」は、本発明の組成物の投与で癌を抑制させたり、進行を遅延させたりするあらゆる行為を意味し、「治療」は、癌の増殖の抑制、癌の軽減又は癌の除去を意味する。
【００９９】
本発明の一具現例によれば、本発明の組成物に適用される疾患である癌は、ＴＭ４ＳＦ５を発現する癌であり、このような癌の例としては、肝癌、大腸癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、直腸癌、軟部組織肉腫（ｓｏｆｔ−ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｒｃｏｍａ）、結腸癌、十二指腸乳頭部上皮癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｐｉｌｌａ  ｖａｔｅｒｉ）、非内分泌肺腫瘍（ｎｏｎｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｌｕｎｇ  ｔｕｍｏｒ）及び気管支類癌腫（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ）などを挙げることができる。
【０１００】
本発明の薬学的組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬学的組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適した薬学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【０１０１】
本発明の薬学的組成物は、経口又は非経口で投与することができ、非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与することができる。経口投与時に、タンパク質又はペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃での分解から保護されるように剤形化したりしなければならない。また、薬学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与され得る。
【０１０２】
本発明の薬学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様であり、通常の熟練した医師は、所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の一具現例によれば、本発明の薬学的組成物の１日投与量は、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇである。本明細書において用語、「薬学的有効量」は、癌を予防又は治療するのに十分な量を意味する。
【０１０３】
本発明の薬学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位用量形態で製造されるか、又は多用量容器内に入れて製造されてもよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、又はエキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
【０１０４】
本発明の組成物は、個別治療剤として投与するか、又は他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次又は同時に投与することができる。
【０１０５】
抗体は、抗体−治療剤結合体の形態で生体内に投入して癌の治療に用いることができる。治療剤は、化学治療剤、放射性核種、免疫治療剤、サイトカイン、ケモカイン、毒素、生物作用剤及び酵素阻害物質などを含む。本発明の抗体又はその断片とカップリングさせるのに好ましい機能性分子は、化学物質、サイトカイン又はケモカインである。前記化学物質は抗癌剤であり、例えば、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロナイシン、アドゼレシン、アラノシン、アルデスロイキン、アロプリノールナトリウム、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アモナファイド、アンプリジェン、アムサクリン、アンドロゲン、アングイジン、アフィジコリングリシネート、アサレイ、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、バチルス・カルメット−ゲラン（ＢＣＧ）、ベーカーズアンチフォール、β−２−デオキシチオグアノシン、ビスアントレンＨＣｌ、ブレオマイシンサルフェート、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、ＢＷＡ７７３Ｕ８２、ＢＷ  ５０２Ｕ８３／ＨＣｌ、ＢＷ  ７Ｕ８５メシレート、セラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、クロロキノキサリンスルホンアミド、クロロゾトシン、クロモマイシンＡ３、シスプラチン、クラドリビン、コルチコステロイド、コリネバクテリウムパルブム、ＣＰＴ−１１、クリスナトール、シクロシチジン、シクロホスファミド、シタラビン、シテムベナ、ダビスマレアート、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、デアザウリジン、デクスラゾキサン、ジアンヒドロガラクチトール、ジアジクオン、ジブロモズルシトール、ジデムニンＢ、ジエチルジチオカルバメート、ジグリコアルデヒド、ジヒドロ−５−アザシチジン、ドキソルビシン、エチノマイシン、エダトレキセート、エデルフォシン、エフロルニチン、エリオット溶液、エルサミトルシン、エピルビシン、エソルビシン、リン酸エストラムスチン、エストロゲン、エタニダゾール、エチオホス、エトポシド、ファドラゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボン酢酸、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、５’−フルオロウラシル、ＦｌｕｏｓｏｌＴＭ、フルタミド、硝酸ガリウム、ゲムシタビン、酢酸ゴセレリン、ヘプスルファム、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ホモハリントニン、硫酸ヒドラジン、４−ヒドロキシアンドロステンジオン、ヒドロキシウレア、イダルビシンＨＣｌ、イホスファミド、４−イポメアノール、イプロプラチン、イソトレチノイン、ロイコボリンカルシウム、酢酸リュープロリド、レバミソール、リポソームダウノルビシン、リポソーム捕集ドキソルビシン、ロムスチン、ロニダミン、メイタンシン、塩酸メクロレタミン、メルファラン、メノガリル、メルバロン、６−メルカプトプリン、メスナ、バチルス・カルメット−ゲランのメタノール抽出物、メトトレキサート、Ｎ−メチルホルムアミド、ミフェプリストン、ミトグアゾン、マイトマイシンＣ、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、モノサイト／マクロファージコロニー刺激因子、ナビロン、ナフォキシジン、ネオカルチノスタチン、酢酸オクトレオチド、オルマプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パラ、ペントスタチン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ピラルビシン、ピリトレキシム、塩酸ピロキサントロン、ＰＩＸＹ−３２１、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プレドニムスチン、プロカルバジン、プロゲスチン、ピラゾフリン、ラゾキサン、サルグラモスチム、セムスチン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌール、スラミンナトリウム、タモキシフェン、タキソテール、テガフール、テニポシド、テレフタルアミジン、テロキシロン、チオグアニン、チオテパ、チミジンインジェクション、チアゾフリン、トポテカン、トレミフェン、トレチノイン、塩酸トリフルオペラジン、トリフルリジン、トリメトレキサート、ＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）、ウラシルマスタード、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンゾリジン、Ｙｏｓｈｉ  ８６４、ゾルビシン、シトシンアラビノシド、エトポシド、メルファラン、タキソテール、タキソール、及びこれらの混合物であるが、これに限定されない。
【０１０６】
癌診断用組成物
【０１０７】
本発明の更に他の態様によれば、本発明は、前記本発明の抗体又はその抗原結合断片を含む癌診断用キットを提供する。
【０１０８】
本発明の抗体は、生物学的試料に適用されて癌の発症の有無を診断することができる。
【０１０９】
本明細書で使用される用語、「生物学的試料」とは、組織、細胞、全血、血清、血漿、組織剖検試料（脳、皮膚、リンパ節、脊髄など）、細胞培養上澄液、破裂した真核細胞及び細菌発現系などを挙げることができるが、これに制限されるものではない。これらの生物学的試料を操作した、又は操作していない状態で、本発明の抗体と反応させて癌の発症の有無を確認することができる。
【０１１０】
前記の抗原−抗体複合体の形成は、比色法（ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）、電気化学法（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ）、蛍光法（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）、発光法（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）、粒子計数法（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）、肉眼測定法（ｖｉｓｕａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）又は閃光計数法（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）により検出することができる。本明細書上の「検出」は、抗原−抗体複合体を検出するためのものであって、様々な標識体を使用して行うことができる。標識体の具体例としては、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子又は放射性同位元素を含む。
【０１１１】
検出標識体として使用される酵素としては、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びβ−ラクタマーゼなどを含み、蛍光物としては、フルオレセイン、Ｅｕ３＋、Ｅｕ３＋キレート又はクリプタートなどを含み、リガンドとしては、ビオチン誘導体などを含み、発光物としては、アクリジニウムエステル及びイソルミノール誘導体などを含み、微小粒子としては、金コロイド及び着色されたラテックスなどを含み、放射性同位元素としては、５７Ｃｏ、３Ｈ、１２５Ｉ及び１２５Ｉ−ボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）試薬などを含む。
【０１１２】
本発明の一具現例によれば、抗原−抗体複合体を酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて検出することができる。酵素免疫吸着法には、固体支持体に付着した抗原を認知する標識された抗体を用いる直接ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗原を認知する抗体の複合体において捕獲抗体を認知する標識された２次抗体を用いる間接ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体において抗原を認知する標識された別の抗体を用いる直接的サンドイッチＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体において抗原を認知する別の抗体と反応させた後、この抗体を認知する標識された２次抗体を用いる間接的サンドイッチＥＬＩＳＡなどの様々なＥＬＩＳＡ方法を含む。本発明の抗体は、検出標識を有することができ、検出標識を有さない場合は、本発明の抗体を捕獲し得、検出標識を有する他の抗体を処理して確認することができる。
【発明の効果】
【０１１３】
本発明を通じて分かるように、環状ペプチドワクチンの免疫化及びＴＭ４ＳＦ５−特異的な抗体で注射は、マウスモデルにおいて大腸癌に対する抗転移効果を有し、また、そのヒト化された抗体は、患者の治療のための適用のための開始プラットホームとして使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】ＴＭ４ＳＦ５環状ペプチドワクチンで免疫化されたマウスから抗体の誘導を示す。（Ａ）ＴＭ４ＳＦ５ターゲット部位の配列。（Ｂ）本発明に使用されたペプチドの配列。ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃ及びｍＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃは、ジスルフィド結合で連結されたｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２及びｍＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２の環状ペプチドを示す。（Ｃ）ＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回、ＰＢＳ又はｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃペプチド及びＬｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）複合体を注射した（ｎ＝５／グループ）。血清内の抗体のタイター及び反応性は、記載されたペプチドを使用してＥＬＩＳＡで測定した。（Ｄ）ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃペプチドに対して反応する抗体のアイソタイプをアイソタイピングのためにＥＬＩＳＡで究明した。
【図２】異型移植の大腸癌モデルにおけるＴＭ４ＳＦ５環状ペプチドワクチンで免疫化による肺転移の阻害を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回、ＰＢＳ、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）、ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃペプチド及びＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ内のカプセル化されたＣｐＧ−ＤＮＡ（Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ））複合体を注射した（（ＰＢＳ対照群ｎ＝８、大腸癌細胞群ｎ＝１５）。転移モデルは、処理されたＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ−２６細胞を移植して確立し、マウスの体重及び生存率を調査した。（Ａ）実験スケジュール。（Ｂ）体重は、ＣＴ−２６細胞の移植後、２０日間、２日ごとに測定した。（Ｃ）ＣＴ−２６細胞の移植後、免疫化されたマウスの生存を示す。（Ｄ）５２日に調査された肺の巨視的外観を示す。（Ｅ）５２日にマウスの肺重量を示す。＊Ｐ＜０．０５であった。（Ｆ）肺組織の組織学的調査を示す。スケールバー、１００μｍ。
【図３】異型移植の大腸癌モデルにおけるＴＭ４ＳＦ５環状ペプチドワクチンで免疫化による肺結節の数の減少を示す：ＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回、ＰＢＳ又はｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃペプチド及びＬｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）複合体を注射した（ｎ＝８／グループ）。転移モデルは、処理されたＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ−２６細胞を移植して確立し、腫瘍の成長を４６又は５０日間モニタリングした。（Ａ）実験スケジュールを示す。（Ｂ）４６日（ＣＴ−２６群）及び５０日（ＰＢＳ対照群、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）＋ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃペプチド／ＣＴ−２６群（ｎ＝４／各群）に調査された肺の巨視的外観及び肺重量を示す。（Ｃ）４６日（ＣＴ−２６群）及び５０日（ＰＢＳ対照群、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）＋ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃペプチド／ＣＴ−２６群（ｎ＝４／各群）に肺結節の数を示す。＊＊Ｐ＜０．０１であった。
【図４】ＴＭ４ＳＦ５環状ペプチドを認知するａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体を産生するＨＡＴ培地でハイブリドーマクローンのスクリーニングを示す。（Ａ）３つのＢＡＬＢ／ｃマウスを１０日間隔で４回、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体に同時にカプセル化されたｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃペプチド及びＭＢ−ＯＤＮ  ４５３１（Ｏ）でｉ．ｐ．（腹腔に）免疫化し、その血清を集めて全体ＩｇＧをＥＬＩＳＡキットを使用してアッセイした。（Ｂ、Ｃ）ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃペプチドで免疫化されたマウスの脾臓細胞を使用したＨＡＴ培地で細胞−融合実験の初期スクリーニング由来のＥＬＩＳＡ結果を示す。（Ｄ）ＨＥＫ  ２９３Ｆ−ＥＶ（ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ）及びＨＥＫ  ２９３Ｆ−ＴＭ４ＳＦ５細胞のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ハイブリドーマクローン（Ｂの１Ｈ１クローン）培養上澄液、ａｎｔｉ−Ｍｙｃ抗体を使用したウエスタンブロットで分析した。
【図５】ＴＭ４ＳＦ５環状ペプチドを認知するａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体を産生するＨＴ培地でハイブリドーマクローンのスクリーニングを示す。（Ａ、Ｂ）図５由来のハイブリドーマクローンをモノクローナル抗体の産生のために選択し、リミッティング希釈方法を用いてサブクローニングを行った。（Ｃ）環状ペプチドｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃに対するハイブリドーマクローン培養上澄液をＥＬＩＳＡを使用して分析した。（Ｄ）ＨＥＫ  ２９３Ｆ−ＥＶ（ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ）及びＨＥＫ  ２９３Ｆ−ＴＭ４ＳＦ５細胞のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ハイブリドーマクローン培養上澄液を使用したウエスタンブロットで分析した。
【図６】ＴＭ４ＳＦ５環状ペプチドを認知するマウスａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体の精製及び特性を示す。（Ａ）図５由来のハイブリドーマクローン（２Ａ１０  ｃｌｏｎｅ）をｉ．ｐ．腔に注射してＢＡＬＢ／ｃマウスで腹水を産生した。Ａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体をｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  ａｇａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィーを使用して精製し、その精製された抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）染色で同定した。（Ｂ）適正曲線を精製されたモノクローナル抗体を使用して得てアイソタイプを決定した。（Ｃ）ＥＬＩＳＡを使用した環状ペプチドｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃに対するモノクローナル抗体の結合親和度の決定を示す。（Ｄ）Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＳＰＲ  ７５００ＤＣ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ）を使用した環状ペプチドｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃに対するモノクローナル抗体の結合親和度の決定を示す。ビオチン化されたペプチドをストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）チップに固定化し、抗体の量を増加させた。結合反応のキネティック（Ｋｉｎｅｔｉｃ）パラメータをセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ）下で示す。（Ｅ）ＨＥＫ  ２９３Ｆ−ＥＶ（ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ）及びＨＥＫ  ２９３Ｆ−ＴＭ４ＳＦ５細胞のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体（ｍＥＣ２−Ｃ）、ａｎｔｉ−Ｍｙｃ抗体又はａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ抗体を使用したウエスタンブロットで分析した。ＨＥＫ  ２９３Ｆ−ＥＶ及びＨＥＫ  ２９３Ｆ−ＴＭ４ＳＦ５細胞のタンパク質をｍＥＣ２−Ｃで免疫沈殿し、ａｎｔｉ−Ｍｙｃ抗体を使用したウエスタンブロットで分析した。これらの結果は、少なくとも３回の独立した実験の代表値である。
【図７】異種移植マウスモデルにおける大腸癌の成長に対するａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体の治療効果を示す。マウス腫瘍モデルを、ＨＴ−２９細胞をＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｉ−ｎｕ／ｎｕマウスに移植して確立した。ＰＢＳ又はａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体を、腫瘍サイズが直径５ｍｍに到達するときにマウスに注射し、その腫瘍の成長を３１日間モニタリングした（各ｎ＝６）。（Ａ）は実験スケジュールである。（Ｂ）は大腸癌組織の巨視的外観である。（Ｃ）は腫瘍体積（ｗｉｄｔｈ２×ｌｅｎｇｔｈ／２）である。（Ｄ）は腫瘍重量である。（Ｅ）は体重である。
【図８】ハイブリドーマ細胞クローンから分離された重鎖及び軽鎖の可変領域のｃＤＮＡ配列を示す。（Ａ）は重鎖可変ドメインの配列である。（Ｂ）は軽鎖可変ドメインの配列である。予測されたアミノ酸配列をｃＤＮＡ配列の下段に表示する。
【図９】ヒト化抗体の構築のための配列分析及び本発明のヒト化抗体であるｈＥＣ２−Ｃ−１、ｈＥＣ２−Ｃ−２、野生型マウス由来の抗体であるｍＥＣ２−Ｃ、ヒト化抗体の構築に使用されたヒトＶＨ３−Ｖｋ１  ｓｕｂｔｙｐｅ骨格を有するハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）抗体のアミノ酸配列を可変重鎖と可変軽鎖とに分けて一直線に整列した図である。大括弧（［］）は、それぞれのＣＤＲ区域を示し、下線は、バーニヤゾーンに該当するアミノ酸を示し、アスタリスク（＊）は、親和度の維持のためにマウスｍＥＣ２−Ｃ野生型抗体由来のアミノ酸に逆置換した部分を示す。このとき、ＣＤＲ区域は、Ｋａｂａｔナンバリングに従って定義した。
【図１０】ＣＤＲ移植後、構造の変化を見るために、図９に示したｍＥＣ２−Ｃ、ｈＥＣ２−Ｃ−１、ｈＥＣ２−Ｃ−２抗体の可変部位（Ｆｖ）をそれぞれコンピュータモデリングしてＰｙｍｏｌソフトウェア内で重ね合わせた結果を正面から見た構造及び上から見た構造で示した図である。骨格部位（ＦＲ）は白黒で、各抗体のＣＤＲは、図面内に表示された色と同じ色で表し、重鎖の各ＣＤＲはＨＣＤＲ１／２／３で、軽鎖の各ＣＤＲはＬＣＤＲ１／２／３で表した。
【図１１】ＴＭ４ＳＦ５環状ペプチドを認知するヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体の精製及び特性を示す。（Ａ）ヒト化されたＡｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体をｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  ａｇａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィーを使用して精製し、その精製された抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）染色で同定した。（Ｂ）ＥＬＩＳＡを使用して環状ペプチドｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃに対するヒト化された抗体の結合親和度を分析した。（Ｃ）Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＳＰＲ  ７５００ＤＣ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ）を使用して環状ペプチドｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃに対するヒト化抗体の結合親和度を分析した。（Ｄ）ＨＥＫ  ２９３Ｆ−ＥＶ及びＨＥＫ  ２９３Ｆ−ＴＭ４ＳＦ５細胞のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体（ｈＥＣ２−Ｃ−２）又はａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ抗体を使用したウエスタンブロットで分析した。ＨＥＫ  ２９３Ｆ−ＥＶ及びＨＥＫ  ２９３Ｆ−ＴＭ４ＳＦ５細胞のタンパク質破砕液をｈＥＣ２−Ｃ−２で免疫沈殿し、ａｎｔｉ−Ｍｙｃ抗体を使用したウエスタンブロットで分析した。
【図１２】大腸癌細胞の移動に対するヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体の効果を示す。（Ａ）移動アッセイ。スケールバー、１００μｍ。（Ｂ）創傷治癒アッセイ。スケールバー、３００μｍ。ＣＴ−２６及びＨＣＴ−１１６細胞の移動特性をＰＢＳ、正常ヒトＩｇＧ、又はｈＥＣ２−Ｃ−２抗体で処理した後、比較した。これらの結果は、少なくとも３回の独立した実験の代表値である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１であった。
【図１３】吸着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）分子の発現に対するヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体の効果を示す。（Ａ）ＣＴ−２６及びＨＣＴ−１１６細胞をＰＢＳ、正常ヒトＩｇＧ、又はｈＥＣ２−Ｃ−２抗体で処理し、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びβ−ｃａｔｅｎｉｎの発現をａｎｔｉ−Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びａｎｔｉ−β−ｃａｔｅｎｉｎ抗体を使用して共焦点顕微鏡法で分析した。スケールバー、２０μｍ。（Ｂ）ウエスタンブロットで分析した。β−ａｃｔｉｎ発現レベルをローディング対照群として使用した。Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びβ−ｃａｔｅｎｉｎの発現をａｎｔｉ−Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びａｎｔｉ−β−ｃａｔｅｎｉｎ抗体を使用して決定。バンド強度を測定し、定量的変化をグラフで示す。これらの結果は、少なくとも３回の独立した実験の代表値である。
【図１４】異種移植マウスモデルにおいて、ＨＣＣ腫瘍の成長に対する注射されたヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体の治療効果を示す。マウス腫瘍モデルを、Ｈｕｈ−７細胞をＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｉ−ｎｕ／ｎｕマウスに移植して確立した。ＰＢＳ又はヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体を、腫瘍サイズが直径５ｍｍに到達するときにマウスに注射し、その腫瘍の成長を４４日間モニタリングした（各ｎ＝６）。（Ａ）は実験スケジュールである。（Ｂ）はＨＣＣ腫瘍組織の巨視的外観である。（Ｃ）は腫瘍体積（ｗｉｄｔｈ２×ｌｅｎｇｔｈ／２）である。（Ｄ）は腫瘍重量である。（Ｅ）は体重である。
【図１５】異種移植マウスモデルにおいて、大腸癌の成長に対するヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体の治療効果を示す。マウス腫瘍モデルを、ＨＴ−２９細胞をＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｉ−ｎｕ／ｎｕマウスに移植して確立した。ＰＢＳ又はヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体を腫瘍サイズが直径５ｍｍに到達するときにマウスに注射し、その腫瘍の成長を２８日間モニタリングした（各ｎ＝６）。（Ａ）は実験スケジュールである。（Ｂ）は大腸癌組織の巨視的外観である。（Ｃ）は腫瘍体積（ｗｉｄｔｈ２×ｌｅｎｇｔｈ／２）である。（Ｄ）は腫瘍重量である。（Ｅ）は体重である。
【図１６】同種移植の大腸癌モデルにおいて、ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体による肺転移の生存率を示す。ＣＴ−２６細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内移植して注射。ＰＢＳ、ヒトＩｇＧ又はｈＥＣ２−Ｃ−２をマウスに静脈内注射し、腫瘍の成長を２２日間モニタリングした（ＰＢＳ対照群ｎ＝８、癌細胞群の各ｎ＝１２）。（Ａ）は実験スケジュールである。（Ｂ）体重は、２日間隔で２０日間測定した。（Ｃ）ＣＴ−２６細胞の移植後、ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体−注射されたマウスの生存を示す。
【図１７】同種移植の大腸癌モデルにおいて、ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体による肺転移の阻害を示す。ＣＴ−２６細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内移植して注射。ＰＢＳ、ヒトＩｇＧ又はｈＥＣ２−Ｃ−２をマウスに静脈内注射し、腫瘍の成長を１９日後にモニタリングした（ＰＢＳ対照群ｎ＝８、癌細胞群の各ｎ＝１２）。（Ａ）は実験スケジュールである。（Ｂ）１９日に肺の形状を調査した。（Ｃ）１９日目のマウスの肺重量である。＊＊Ｐ＜０．０１であった。（Ｄ）肺組織の組織学的調査を示す。スケールバー：１００Ｘ、１００μｍ；４００Ｘ、２５μｍ。
【発明を実施するための形態】
【０１１５】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の趣旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明である。
【０１１６】
実施例１：ＣｐＧ−ＤＮＡ及びｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２の環状ペプチドの合成
【０１１７】
３つのＣｐＧモチーフを有する２０塩基で構成される天然ＣｐＧ−ＤＮＡ、ＭＢ−ＯＤＮ  ４５３１（Ｏ）（Ｋｗｏｎ  Ｓ，Ｋｉｍ  Ｄ，Ｐａｒｋ  ＢＫ，Ｃｈｏ  Ｓ，Ｋｉｍ  ＫＤ，Ｋｉｍ  ＹＥ，Ｐａｒｋ  ＣＳ，Ａｈｎ  ＨＪ，Ｓｅｏ  ＪＮ，Ｃｈｏｉ  ＫＣ，Ｋｉｍ  ＤＳ，Ｌｅｅ  Ｙ，Ｋｗｏｎ  ＨＪ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２；７（３）：ｅ３３１２１４）は三千里製薬から提供される。ＭＢ−ＯＤＮ  ４５３１は、３つのＣｐＧモチーフを有する２０塩基で構成される：ＡＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧＴＧＴＣＧＧＣＣＴ（配列番号２３）。本発明者らは、ヒトＴＭ４ＳＦ５の細胞外ドメイン２をミミックした環状ペプチド（ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃ、図１Ｂ）を考案して、ペプトロンから化学的に合成された環状ペプチド及び対照群ペプチドを購入した。
【０１１８】
実施例２：ＴＭ４ＳＦ５ターゲッティングペプチドワクチンで環状ペプチドｅｐｉｔｏｐｅ及びＣｐＧ−ＤＮＡを同時にカプセル化したリポソーム複合体の製造
【０１１９】
リポソーム複合体は、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ））と同時にカプセル化されたＴＭ４ＳＦ５環状ペプチド（ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃ）及びＣｐＧ−ＤＮＡで構成され、Ｋｗｏｎ  Ｓ、Ｋｉｍ  Ｄ、Ｐａｒｋ  ＢＫ、Ｃｈｏ  Ｓ、Ｋｉｍ  ＫＤ、Ｋｉｍ  ＹＥ、Ｐａｒｋ  ＣＳ、Ａｈｎ  ＨＪ、Ｓｅｏ  ＪＮ、Ｃｈｏｉ  ＫＣ、Ｋｉｍ  ＤＳ、Ｌｅｅ  Ｙ、Ｋｗｏｎ  ＨＪ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２；７（３）：ｅ３３１２１４に報告された通りに製造した。
【０１２０】
実施例３：動物
【０１２１】
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｉ−ｎｕ／ｎｕマウス（４週齢）をＮａｒａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃから購入し、そのマウスを、無特異病原の条件下で２０〜２５℃、３２〜３７％の湿度で維持した。全ての動物実験の過程は、国立獣医科学検疫院の実験動物使用管理ガイドに従い、翰林大学校の動物実験管理委員会の承認を受けて行った。本発明者らは、イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）吸入下でマウスを犠牲にし、苦しみを最小化するためのあらゆる努力を行った。
【０１２２】
実施例４：抗原−特異的Ｉｇ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙｓ（ＥＬＩＳＡ）
【０１２３】
各投与前及び最終投与１０日後にマウスを犠牲にして血清を得た。全体ＩｇＧのタイター及び量を確認するために、９６ウェル免疫プレート（Ｎａｌｇｅｎ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を５μｇ／ｍｌのｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃ環状ペプチドでコーティングし、１％ＢＳＡを含有する０．０５％ＰＢＳＴで２時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去した後、培養上清液１００μlを添加し、常温で２時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）−結合された抗−ＩｇＧ抗体のような検出抗体と共に２時間インキュベートした。ＴＭＢ基質溶液で比色分析法を開発し、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ２５０マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１２４】
ＩｇＧアイソタイプを測定するために、９６ウェル免疫プレートをｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃペプチドでコーティングし、血清と反応させた後、ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（各アイソタイプ）抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で培養した。
【０１２５】
実施例５：大腸癌の肺転移モデルにおける抗転移剤としてのＴＭ４ＳＦ５ペプチドワクチンの評価
【０１２６】
ＣｐＧ−ＤＮＡを含むＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ（Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ））と同時にカプセル化されたＴＭ４ＳＦ５環状ペプチド（ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃ）で構成されるリポソーム複合体を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で３回免疫化した。対照群マウスをＰＢＳ又はＬｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）で注射した。転移性癌の動物実験のために、マウスを１×１０５細胞のＣＴ−２６マウス大腸癌細胞株（ＰＢＳ対照群ｎ＝８、大腸癌細胞群ｎ＝１５）を３０日目に静脈内注射した。体重を２日間隔で測定した。ＣＴ−２６細胞の注射後、２２日目に、マウスを犠牲にし、肺重量を測定した。
【０１２７】
実施例６：肺結節の調査
【０１２８】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを前記のように免疫化し、ＣＴ−２６細胞に注射した。ＣＴ−２６細胞の注射後、２０日目に、マウスを犠牲にし、気管に２０−ｇａｕｇｅケータラー（ｃａｔｅｒｅｒ）でカニューレを挿入し、１ｍｌのＩｎｄｉａ  ｉｎｋ（Ｐａｒｋｅｒ、ＰＢＳで１：１６希釈）を肺に注射した。肺を抽出し、Ｆｅｋｅｔｅ’ｓ溶液に浸して脱色した後、転移性結節をカウントした（Ｌａｒｉｖｅ  ＲＭ，Ｍｏｒｉｇｇｉ  Ｇ，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４；５：３８８１）。
【０１２９】
実施例７：ＴＭ４ＳＦ５に特異的なマウスモノクローナル抗体の産生
【０１３０】
ヒトＴＭ４ＳＦ５（ｈＴＭ４ＳＦ５）タンパク質のｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃ環状ペプチド（１３１ＴＡＣＡＹＬＬＮＲＴＬＷＤＲＣＥＡＰＰＲＶＶＰＷＮＣＴ１５７）は、ペプトロンで自動化されたペプチドシンセサイザー（Ｐｅｐｔｒｏｎ  ＩＩＩ−Ｒ２４、Ｐｅｐｔｒｏｎ）により製造した。
【０１３１】
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに１０日間隔で４回、ＣｐＧ−ＤＮＡを含むＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳ複合体と同時にカプセル化されたｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃ環状ペプチドを腹腔内投与した。免疫化された脾臓から脾臓細胞（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）を得た後、標準ハイブリドーマ技術（Ｙｏｋｏｙａｍａ  ＷＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ｕｎｉｔ  ２．５（２００６））に従って４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールの存在下で、ＨＡＴ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ＳＰ２／０マウス骨髄種細胞と融合した。ハイブリドーマ細胞の培養上清液を、ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃ環状ペプチドに対する結合を確認するためにＥＬＩＳＡでテストし、陽性ハイブリドーマ細胞をスクリーニングした。ＥＬＩＳＡ−陽性ハイブリドーマ細胞群をサブクローニングした後、腹水を生成させるためにＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に注射した。タンパク質Ａカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体（ｍＥＣ２−Ｃ）を腹水液から精製した。
【０１３２】
実施例８：ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分析
【０１３３】
ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃ環状ペプチドに結合するａｎｔｉ−ｈＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体（ｍＥＣ２−Ｃ）及びヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体（ｈＥＣ２−Ｃ−２）の親和度を、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ＳＰＲシステムを使用して２５℃で測定した。ストレプトアビジンがコーティングされたセンサチップの各フローセルの表面でビオチン化ペプチドを捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）した。ビオチンを陰性対照群として使用した。ａｎｔｉ−ｈＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体（ｍＥＣ２−Ｃ）及びヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体を、３０ｍｌ／分の流動速度で注入した。データは、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ＳＰＲ評価ソフトウェアを使用して評価した。
【０１３４】
実施例９：細胞培養
【０１３５】
Ｈｕｈ７のようなヒトＨＣＣ細胞株、及びＨＴ−２９、及びＨＣＴ１１６のようなヒト大腸癌細胞株、及びマウス大腸癌細胞株ＣＴ−２６は、韓国細胞株銀行から得た。ＣＴ−２６細胞を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが含有されたＤＭＥＭで管理した。他の細胞株は、１０％ＦＢＳ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが含有されたＲＰＭＩ  １６４０培地で管理した。全ての細胞を９５％空気及び５％ＣＯ２で３７℃の温度で培養した。
【０１３６】
実施例１０：組換えヒトＴＭ４ＳＦ５の発現
【０１３７】
ヒトＴＭ４ＳＦ５ｃ  ＤＮＡをＨｕｈ−７  ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲを下記のプライマーセットを使用して増幅した：ｈＴＭ４ＳＦ５  ５’  ｐｒｉｍｅｒ、５’−ＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＣＧＧＧＡＡＡＡＴＧＴＧＣＣ−３’；ｈＴＭ４ＳＦ５  ３’  ｐｒｉｍｅｒ、５’−ＡＡＧＣＴＴＴＴＧＴＧＡＧＧＴＧＴＧＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＴ−３’。そのｃＤＮＡ切片を、発現ベクターｐｃＤＮＡ−３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ｈＴＭ４ＳＦ５を発現する安定した細胞株の生成のために、ＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を、２．５μｇ／ｍｌのｈＴＭ４ＳＦ５／ｐｃＤＮＡ及び７．５μｇ／ｍｌのポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）でトランスフェクションさせ、そのトランスフェクションされた細胞を１４日間、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して収集した。Ｍｙｃ−ｔａｇｇｅｄ  ｈＴＭ４ＳＦ５の発現を、ａｎｔｉ−Ｍｙｃ−ｔａｇ抗体を使用したウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）分析により確認した。
【０１３８】
実施例１１：ウエスタンブロット及び免疫沈殿法分析
【０１３９】
ａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体及びヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体の特異性を分析するために、ＴＭ４ＳＦ５−過剰発現細胞破砕液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ウエスタンブロット及び免疫沈殿アッセイを、Ｋｗｏｎ  Ｓ、Ｋｉｍ  Ｄ、Ｒｈｅｅ  ＪＷ、Ｐａｒｋ  ＪＡ、Ｋｉｍ  ＤＷ、Ｋｉｍ  ＤＳ、Ｌｅｅ  Ｙ、Ｋｗｏｎ  ＨＪ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｌ．２０１０；８：２３に記載された通りに行った。Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びβ−ｃａｔｅｎｉｎの発現を、ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体−処理された細胞で同定するために、細胞破砕液を、Ｋｗｏｎ  Ｓ、Ｃｈｏｉ  ＫＣ、Ｋｉｍ  ＹＥ、Ｈａ  ＹＷ、Ｋｉｍ  Ｄ、Ｐａｒｋ  ＢＫ、Ｗｕ  Ｇ、Ｋｉｍ  ＤＳ、Ｌｅｅ  Ｙ、Ｋｗｏｎ  ＨＪ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１４；７４（１４）：３８４４−３８５６に記載された通りにＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより分析した。
【０１４０】
実施例１２：マウスａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体に対する大腸癌マウス（異種移植）モデル
【０１４１】
１２匹のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｉ−ｎｕ／ｎｕマウスの背中の右側面に、５０％マトリゲル（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する５×１０６のＨＴ−２９細胞を皮下注射した。腫瘍の直径が５ｍｍに到達したとき、マウスをＰＢＳ、及びａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体（ｍＥＣ２−Ｃ）の２つの処理グループ（６匹のマウス／各グループ）に任意に分類した。抗体（２５ｍｇ／ｋｇ）を週ごとに２回ずつ尾静脈に注射した。癌細胞の注入後、３０日間、３日又は４日間隔で腫瘍の直径を測定し、腫瘍の体積を幅２×長さ／２の式によって計算した。腫瘍サイズが±６００ｍｍ３に到達したとき、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｉ−ｎｕ／ｎｕマウスを犠牲にし、腫瘍の重量を測定した。
【０１４２】
実施例１３：ａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体の可変重鎖及び軽鎖（Ｆａｂ）のクローニング
【０１４３】
ａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体（ｍＥＣ２−Ｃ）を産生するハイブリドーマ細胞を培養し、全体ＲＮＡをハイブリドーマ細胞から抽出し、ｃＤＮＡを逆転写で合成した。ａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体のＦａｂ配列をクローニングするために、生成されたｃＤＮＡをＶｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）、及び次のプライマーを使用して増幅した。：重鎖ｐｒｉｍｅｒｓ、ＩＧＧ３：ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧ、５’ＭＨ２：ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＳＡＲＧＴＮＭＡＧＣＴＧＳＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ；Ｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ  ｐｒｉｍｅｒｓ、３’Ｋｃ：ＧＧＴＧＣＡＴＧＣＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣ、５’Ｍｋ：ＧＧＧＡＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＳＡＣＭＣＡＲＷＣＴＭＣＡ。標準ＰＣＲ反応を２５サイクル行った。ＰＣＲ生産物を、ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に直接ライゲーションした。クローニングされたマウスＩｇ挿入物をＤＮＡ塩基配列分析法で分析した。
【０１４４】
実施例１４：可変切片（Ｆｖ）の配列分析及び分子モデリング
【０１４５】
ｍＥＣ２−Ｃの免疫グロブリン可変ドメイン配列は、ＩｇＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）で分析した（Ｙｅ  Ｊ，Ｍａ  Ｎ，Ｍａｄｄｅｎ  ＴＬ，Ｏｓｔｅｌｌ  ＪＭ．ＩｇＢＬＡＳＴ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３；４１（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ３４−４０２７）。６つのＣＤＲｓ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ）を、Ｋａｂａｔナンバリング（Ｋａｂａｔ  ＥＡ，Ｗｕ  ＴＴ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１；１４７（５）：１７０９−１７１９２８）によって決定し、ｍＥＣ２−Ｃ  ｍＡｂの一部の骨格（ＦＲ）残基をヒトＶＨ３−Ｖｋ１サブファミリーに接ぎ木した。この場合には、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）骨格である。マウス及びヒト化されたＥＣ２−Ｃ  Ｆｖアミノ酸配列の３次元構造をｗｅｂモデリングプログラム、ＲＯＳＩＥを使用してシミュレーションした（Ｌｙｓｋｏｖ  Ｓ，Ｃｈｏｕ  ＦＣ，Ｃｏｎｃｈｕｉｒ  ＳＯ，Ｄｅｒ  ＢＳ，Ｄｒｅｗ  Ｋ，Ｋｕｒｏｄａ  Ｄ，Ｘｕ  Ｊ，Ｗｅｉｔｚｎｅｒ  ＢＤ，Ｒｅｎｆｒｅｗ  ＰＤ，Ｓｒｉｐａｋｄｅｅｖｏｎｇ  Ｐ，Ｂｏｒｇｏ  Ｂ，Ｈａｖｒａｎｅｋ  ＪＪ，Ｋｕｈｌｍａｎ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３；８（５）：ｅ６３９０６２９）。このプログラムは、重鎖及び軽鎖のＦＲｓ及びＣＤＲｓに対するほとんどのホモロゴステンプレートを同定し、このテンプレート構造を最適化されたモデルとして組み合わせる。その結果、モデルの構造は、リボンモデルによってＰｙｍｏｌソフトウェア（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＬＣ）を使用してスーパーインポーズされた。
【０１４６】
実施例１５：ＥＣ２−Ｃペプチド抗原に対するヒト化抗体の構築
【０１４７】
非ヒト（マウス）由来の抗体のＣＤＲｓ決定
【０１４８】
ヒト化を行うためには、一番最初に抗体のＣＤＲｓを決定することが必要である。ＣＤＲｓを決定する方法には、アミノ酸配列の多様性を基準とするＫａｂａｔナンバリング、ループ地域の構造を基準とするＣｈｏｔｈｉａナンバリング（Ｊａｍｅｓなど、Ｊａｎ；４２：Ｄ１１４０−６，２０１４）、可変部位構造の高い保存レベルを基準とするＩＭＧＴナンバリング（Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰなど、Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５；５：２２，２００１）などがあるが、最も広く使用されるものがＫａｂａｔナンバリングである。Ｋａｂａｔナンバリングによって、ＥＣ２−Ｃペプチド抗原に対するマウス由来の抗体のＣＤＲｓを決定した（図８及び図９参照）。
【０１４９】
ヒト化抗体の構築に適したヒト抗体骨格の選定及び野生型抗体のＣＤＲ部位移植
【０１５０】
ヒト抗体の可変部位は、アミノ酸配列によって、大きく、重鎖は７種のｓｕｂｔｙｐｅ（ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７）、軽鎖は１７種のｓｕｂｔｙｐｅ（κ１、κ２、κ３、κ４、κ５、κ６、λ１、λ２、λ３、λ４、λ５、λ６、λ７、λ８、λ９、λ１０、λ１１）に分かれる。それぞれのｓｕｂｔｙｐｅは、アミノ酸配列が互いに異なるため、生物理学的構造が異なり、それによって安定性も互いに異なり、これによって天然のヒト抗体レパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）で使用される頻度数も異なる（Ｔｉｌｌｅｒ  Ｔなど、ＭＡｂｓ，５（３）：４４５−７０，２０１３）。一般的にＣＤＲ移植法を用いてヒト化抗体を作製するときには、できる限りＣＤＲの構造を維持させるために、野生型非ヒト由来の抗体と配列相同性が非常に高いヒト骨格に移すようになり、この場合に、移されるヒト化抗体のｓｕｂｔｙｐｅが自然的に安定性や頻度数が低いｓｕｂｔｙｐｅである場合、ヒト化後に安定性の低い抗体が得られる可能性がある。
【０１５１】
ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃペプチド抗原に対するマウス由来の抗体のヒト化に適したヒト骨格を決定するために、Ｉｇｂｌａｓｔ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）により、既存の野生型抗体と最も配列相同性が高いヒト抗体可変部位のｓｕｂｔｙｐｅを検索した。その結果、ヒト抗体のＶＨ４、Ｖｋ４  ｓｕｂｔｙｐｅと最も相同性が高いことを確認した。しかし、参考文献によれば、前記の２つのｓｕｂｔｙｐｅはそれぞれ、自然に発生するヒト抗体レパートリーで発見される頻度数及び安定性が非常に低い。したがって、本発明では、抗原に対する親和度及びその機能は維持しながら、安定性が高いヒト化抗体を構築するために、ＶＨ３−Ｖｋ１  ｓｕｂｔｙｐｅのヒト抗体骨格に抗原結合部位を移植した。ＶＨ３−Ｖｋ１  ｓｕｂｔｙｐｅは、商業化された治療用抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の骨格であって、その熱力学的安定性及び発現収率が既存の研究結果によって十分に証明されており、特に、様々なマウス抗体のヒト化に成功裏に使用されてきた（Ｃａｒｔｅｒなど、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８９：４２８５−４２８９  １９９２；Ｐｒｅｓｔａなど、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５７：４５９３−４５９９  １９９７；）。
【０１５２】
野生型マウス抗体のＣＤＲ部位移植及び親和度の維持のための追加的な保存アミノ酸の選定
【０１５３】
先に言及したように、単純なＣＤＲ移植法により構築されたヒト化抗体が、野生型非ヒト由来の抗体と比較したときにその機能が減少する場合がたびたび発生するため、ＥＣ２−Ｃペプチド抗原に対するヒト化は、免疫原性の問題を減らすために単にＣＤＲのみを移植したクローン（ｈＥＣ２−Ｃ−１）と、機能の喪失を懸念して、ＣＤＲ移植と同時に、抗体骨格に位置しながらＣＤＲループ構造に影響を与えられるバーニヤゾーンに位置するアミノ酸を追加的に逆置換したクローン（ｈＥＣ２−Ｃ−２）との２個で進行した。バーニヤゾーンに位置するアミノ酸は、可変部位内の総３０個で、可変重鎖部位に１６個、可変軽鎖部位に１４個が存在し、野生型マウス抗体と選定されたＶＨ３−Ｖｋ１ヒト抗体骨格ｓｕｂｔｙｐｅとの間の配列分析により、計３０個のバーニヤゾーンのアミノ酸のうち、可変重鎖部位に９個（２８、２９、３０、４８、４９、６７、７１、７３、９３）、可変軽鎖部位に２個（４９、６６）のアミノ酸の配列が異なることを確認した（図９参照）。特に、可変重鎖部位内の２６−３０番の４個のアミノ酸は、文献上でＣＤＲ１とＣＤＲ２内の相互作用によるカノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）構造の維持に重要な役割を果たす（Ｆｏｏｔｅ  Ｊなど、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２２４（２）：４８７−９９，１９９２）。したがって、移植された野生型抗体のＣＤＲの構造を安定化させると予想されるので、既存のマウス抗体の配列を用いることが好ましい。重鎖可変部位内の７１番のアミノ酸もまた同様に、ＣＤＲ１と２の配置を決定するのに重要な役割を果たし、この位置に、体積が大きい残基を有するアミノ酸（リシンあるいはアルギニン）あるいは小さい残基を有するアミノ酸（バリン、アラニン）のどちらが位置するかによって、ＣＤＲの特性が決定される。野生型マウス抗体は、重鎖内の７１番にアルギニンを有しているが、これは、ヒトＶＨ３  ｓｕｂｔｙｐｅ骨格内の７１番のアラニンと反対の特性を有しているので、逆置換した。
【０１５４】
配列分析のためのヒトＶＨ３−Ｖｋ１  ｓｕｂｔｙｐｅの塩基及びアミノ酸配列は、前記のｓｕｂｔｙｐｅの骨格を有していると共に、免疫原性や発現量に大きな問題なく商業化された抗体、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）のものを使用した。
【０１５５】
バーニヤゾーン以外にも、安定性に影響を与えるＶＨ／ＶＬインターフェースアミノ酸は、その残基が抗体の表面ではなく内部に向かっているので、可変重鎖部位及び軽鎖部位の結合を安定化させて抗体全体の安定性に影響を与える地域であり、このような理由から、ほとんどの抗体が同じアミノ酸残基からなっている。前記の抗体の場合にも、既存のマウス抗体とヒト抗体のアミノ酸残基が同一であることを確認し、ヒト化時に大きな影響を及ぼさないと思われ、変形を与えなかった。
【０１５６】
構築された抗ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃヒト化抗体の重鎖可変領域の塩基配列とアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２０及び１６で示し、軽鎖可変領域の塩基配列とアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２及び１８で示した。前記のヒト化抗体の構築のためのクローンは、アミノ酸配列だけでなく、コンピュータモデリングによる構造データの分析も共に併行した。まず、アミノ酸配列の分析により１次的に得られた候補クローン及び野生型マウス抗体の可変部位配列をモデリングオンラインサーバー（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｒｏｓｉｅ．ｒｏｓｅｔｔａｃｏｍｍｏｎｓ．ｏｒｇ／；Ｌｙｓｋｏｖ  Ｓなど、ＰＬｏｓＯｎｅ，（５）：ｅ６３９０６，２０１３）内の抗体モデリングパートにそれぞれ入力して予測された構造を得た。得られたそれぞれの構造は、ＣＤＲループの構造的変化を観察するために、タンパク質の構造が見られるＰｙｍｏｌソフトウェアを用いて重畳させた。図１０にその構造を示した。重畳構造上で、移植された６個のＣＤＲｓが、野生型マウス抗体のＣＤＲｓと比較したときに大きく外れない構造を有することを確認し、特に、抗原結合に影響を与えられるＣＤＲループ内のアミノ酸残基の方向が大部分一致することを確認した。
【０１５７】
実施例１６：ヒト化されたｈＥＣ２−Ｃ抗体の構築及び発現
【０１５８】
ｉｎｔａｃｔ  ＩｇＧフォーマットを有するヒト化されたＩｇＧ１  Ａｂを得るために、ＶＨ及びＶｋコーディング遺伝子を５’及び３’末端の両方に制限酵素部位を含むように合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）。これらの遺伝子を、ＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞から哺乳類細胞発現のために、ヒトＩｇＧ１固定部位（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）又はヒトカッパ鎖固定部位（ＣＬ）を運搬する変形されたｐｃＤＮＡ  ３．４発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。そのヒト化されたＥＣ２−Ｃ  ｍＡｂをＣｈｏｉ  ＨＪ、Ｋｉｍ  ＹＪ、Ｌｅｅ  Ｓ、Ｋｉｍ  ＹＳ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２０１３；１２（１２）：２７４８−２７５９及びＣｈｏｉ  ＤＫ、Ｂａｅ  Ｊ、Ｓｈｉｎ  ＳＭ、Ｓｈｉｎ  ＪＹ、Ｋｉｍ  Ｓ、Ｋｉｍ  ＹＳ．ＭＡｂｓ．２０１４；６（６）：１４０２−１４１４に記載された通りにＨＥＫ  ２９３Ｆ発現システムを用いて産生し、５〜７日間培養後、製造業者のプロトコルに従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。マウスペアレント及びヒト化された抗体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によってその純度を評価した。
【０１５９】
実施例１７：ＩｇＧ形態のヒト化抗体遺伝子の作製
【０１６０】
設計されたヒト化抗体の塩基配列は、基本的に、商業化された高収率の治療用抗体ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の塩基配列に従うものの、それと異なる部分は、コドンの使用頻度を考慮（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）して塩基配列に変換し、ヒト化抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を暗号化する塩基配列を設計する。設計した塩基配列は、５’と３’の両方の末端に動物細胞発現ベクターへのクローニングのための制限酵素の認識配列を導入して合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）。合成された遺伝子は、Ｂｉｏｎｅｅｒ社で提供する基本ベクターであるｐＢＨＡベクターにクローニングされた状態で受けることができ、完全なＩｇＧ形態への発現のために、重鎖不変領域、軽鎖不変領域がそれぞれ入っている動物発現ベクターに合成時に導入していた制限酵素認識配列を用いてクローニングした。このとき、重鎖及び軽鎖の不変領域のアミノ酸及び塩基配列は、同様に、治療用抗体ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の塩基配列に従う。
【０１６１】
実施例１８：抗体の発現及び精製
【０１６２】
構築された抗ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃヒト化抗体の発現は、軽鎖、重鎖発現ベクターとポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）の混合物をＨＥＫ２９３−Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞に一時的にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が入っている振盪フラスコで培養することによってなされる。詳細な方法は、次の通りである。
【０１６３】
振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２００ｍＬトランスフェクション時に、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を２．０×１０６細胞／ｍｌの密度で培地１００ｍｌに播種して、１５０ｒｐｍ、８％ＣＯ２で培養した。それぞれのヒト化抗体を産生するために、それによる重鎖及び軽鎖プラスミドを１０ｍｌ  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に重鎖１２５μｇ、軽鎖１２５μｇの計２５０μｇ（２．５μｇ／ｍｌ）で希釈し、ＰＥＩ７５０μｇ（７．５μｇ／ｍｌ）を希釈した１０ｍｌの培地と混合して、室温で１０分間反応させた。その後、反応させた混合培地を、先の１００ｍｌで播種した細胞に入れ、１５０ｒｐｍ、８％ＣＯ２で４時間培養した後、残りの１００ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地を追加して、短くは５日、長くは７日間培養する場合、細胞が産生したタンパク質、すなわち、ＩｇＧ形態のヒト化抗体は、細胞によって細胞外に分泌されて培地に蓄積される。そのため、ヒト化抗体は、細胞培養後、２５００ｒｐｍで２０分間遠心分離して採取した細胞培養上澄液からタンパク質Ａセファロースカラム（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｃｏｌｕｍｎ，ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。このとき、精製方法は、タンパク質Ａカラム会社で提供する標準プロトコルを参照し、精製されたタンパク質は、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）内の溶液を用いて５６２ｎｍの波長で吸光度を測定し、描かれた標準曲線に従ってその量を定量した。精製された抗体の大きさ及び純度は、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図１１に示したように、本発明の抗ｍＥＣ２−Ｃヒト化抗体であるｈＥＣ２−Ｃ−２  ＩｇＧは、約１５０ｋＤａの分子量を有し、９９％以上の純度に精製されることを確認した。
【０１６４】
実施例１９：共焦点イメージ
【０１６５】
Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びβ−ｃａｔｅｎｉｎの発現に対するヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体の効果を同定するために、ＣＴ−２６細胞及びＨＣＴ−１１６細胞を培養し、対照群ＩｇＧ又はヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体（１０ｕｇ／ｍｌ）で処理した。３日後、細胞でＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びβ−ｃａｔｅｎｉｎの発現を、Ｋｉｍ  ＹＥ、Ｋｗｏｎ  Ｓ、Ｗｕ  Ｇ、Ｋｉｍ  Ｄ、Ｐａｒｋ  ＢＫ、Ｐａｒｋ  ＪＡ、Ｃｈｏｉ  ＫＣ、Ｋｉｍ  ＤＳ、Ｋｗｏｎ  ＨＪ、Ｌｅｅ  Ｙ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１４；５（１８）：８４０２−８４１５によって分析した。
【０１６６】
実施例２０：インビトロ細胞移動分析
【０１６７】
８μｍの空隙を有するトランスウェルチャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）を分析に使用した。移動分析のために、トランスウェルチャンバー膜の下面を１０μｇ／ｍｌのゼラチンでコーティングした。大腸細胞を、ヒトＩｇＧ対照群又はヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体（ｈＥＣ２−Ｃ−２  Ａｂ）が含まれた無血清培地で懸濁し（１×１０５細胞／ｍｌ）、トランスウェルの最上部に分注した。１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地を下部チャンバーに置いた。空隙を介して移動する細胞がフィルターの低い表面に位置し、２４時間後、固定し、クリスタルバイオレットで３０分間染色した後、顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ−２００，Ｎｉｋｏｎ）で細胞数をカウントした。
【０１６８】
実施例２１：インビトロ創傷治療（Ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ）分析
【０１６９】
創傷治療の分析のために、１×１０６細胞（Ｈｕｈ−７、及びＣＴ−２６）を６ウェルプレートに分注し、血清を含む培地で一晩培養した後、ピペットチップを用いて単一層に創傷を誘発した。ＰＢＳ、ヒトＩｇＧ対照群、又はヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体（ｈＥＣ２−Ｃ−２  Ａｂ）（１０ｕｇ／ｍｌ）をその培地に添加した。指示された時点で細胞を４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、ギームザ液で３０分間染色した。創傷部位に移動した細胞数を、実験処理当たり３つのウェル及び各ウェル当たり３つの創傷でカウントした。
【０１７０】
実施例２２：肝癌マウスモデル
【０１７１】
１２匹のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｉ−ｎｕ／ｎｕマウスの背中の右側面（ｄｏｒｓａｌ  ｒｉｇｈｔ  ｆｌａｎｋ）に、５０％マトリゲル（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む５×１０６Ｈｕｈ−７細胞を皮下注射した。腫瘍の直径が５ｍｍに到達したとき、マウスをＰＢＳ、及びヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体（ｈＥＣ２−Ｃ−２  Ａｂ）の２つの処理グループ（６匹のマウス／各グループ）に任意に分類した。抗体（２５ｍｇ／ｋｇ）を週ごとに２回ずつ尾静脈に注射した。癌細胞の注入後、４４日間、４日間隔で腫瘍の直径を測定し、腫瘍の体積を幅２×長さ／２の式によって計算した。腫瘍サイズが２０００ｍｍ３に到達したとき、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｉ−ｎｕ／ｎｕマウスを犠牲にし、腫瘍の重量を測定した。
【０１７２】
実施例２３：ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体に対する大腸癌マウスモデル（異種移植）
【０１７３】
１２匹のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｉ−ｎｕ／ｎｕマウスの背中の右側面に、５０％マトリゲル（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する５×１０６のＨＴ−２９細胞を皮下注射した。腫瘍の直径が５ｍｍに到達したとき、マウスをＰＢＳ、及びａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体（ｍＥＣ２−Ｃ）の２つの処理グループ（６匹のマウス／各グループ）に任意に分類した。抗体（２５ｍｇ／ｋｇ）を週ごとに２回ずつ尾静脈に注射した。癌細胞の注入後、３０日間、３日又は４日間隔で腫瘍の直径を測定し、腫瘍の体積を幅２×長さ／２の式によって計算した。腫瘍サイズが８００ｍｍ３に到達したとき、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｉ−ｎｕ／ｎｕマウスを犠牲にし、腫瘍の重量を測定した。
【０１７４】
実施例２４：大腸癌の肺転移モデルにおける抗転移剤としてヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体の評価
【０１７５】
ＢＡＬＢ／ｃマウスに１×１０５細胞のマウスＣＴ−２６大腸癌細胞株（ＰＢＳ対照群ｎ＝８、大腸癌細胞ｎ＝３６）を尾静脈に注射した。１日目に、癌細胞が注射されたマウスをＰＢＳ、ヒトＩｇＧ対照群、及びヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体（ｈＥＣ２−Ｃ−２  Ａｂ）のような３つの処理群に分けた（ｎ＝１２／各群）。抗体（２５ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈に週２回注射し、体重を２日間隔で測定した。マウスの生存を２２日までモニタリングした（図１６）。
【０１７６】
同じセッティングを有する他の実験を、肺の状態を調べるために準備した（ｎ＝１２／各群）。１９日目に、マウスを犠牲にし、肺重量を測定した（図１７）。
【０１７７】
実施例２５：組織学（Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ）
【０１７８】
組織病理学的検査のために腫瘍及び肺を除去し、４％ホルマリン溶液で一晩固定し、パラフィンに包埋した後、５μｍの厚さのセクションに切断した。脱パラフィン化セクションをＨ＆Ｅ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎ）で染色した。その後、サンプルをヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）でカウンター染色し、全てのイメージをＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ−２００顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を使用して調査した。
【０１７９】
前記の実施例の結果は、下記の通りである。
【０１８０】
ＴＭ４ＳＦ５ペプチドワクチンで免疫化及びＴＭ４ＳＦ５の環状ペプチドに特異的な抗体の産生（図１）
【０１８１】
タイトな結合を維持しながら、構造的エピトープを認知する抗体を得るために、本発明者らは、ＴＭ４ＳＦ５  ＥＣ２（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ２）をミミックした環状ペプチドの構造的モチーフを考案した。図１Ａ及び図１Ｂに示したように、本発明者らは、グリシン１３３及びバリン１５６をシステインで代替して突然変異ペプチドｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２を作った。ペプチドの化学的変形により、本発明者らは、システイン残基の間にジスルフィド結合を有する環状ペプチドｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃを産生した。本発明者らは、ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃペプチド及びＣｐＧ−ＤＮＡを同時にカプセル化したｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−β−ｏｌｅｏｙｌ−γ−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ  ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＯＰＥ）：ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ（ＣＨＥＭＳ）を含むリポソーム複合体（Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ））でマウスを免疫化し、３番目のブースティング後、ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃ環状ペプチドを認知する抗体の産生を確認した（図１Ｃ）。抗体は、該当するマウス環状（ｃｙｃｌｉｃ）ペプチド（ｍＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃ）と交差反応し、ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２及びｍＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２のような線状ペプチドに対する活性は、環状ペプチドよりも低かった。その抗体は、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３又はマウス該当エピトープｍＴＭ４ＳＦ５２−３を認知できなかった。これは、その産生された抗体が構造的エピトープを認知するということを示唆する。図１Ｄに示したように、その産生された抗体は、主にＩｇＧ２ａであった。
【０１８２】
マウス肺転移モデルにおけるＭ４ＳＦ５ペプチドワクチンによる免疫化で大腸腫瘍の成長阻害（図２及び図３）
【０１８３】
マウスにおいて大腸癌の転移を調節するターゲットとしてＴＭ４ＳＦ５の重要性を評価するために、本発明者らは、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、環状ＴＭ４ＳＦ５ペプチド（ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃ）及びＬｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）で構成されるＴＭ４ＳＦ５ペプチドワクチンで免疫化した。その後、ＴＭ４ＳＦ５ペプチドワクチンの効果を、ＣＴ−２６細胞の注射によって誘導された肺腫瘍の成長に対して決定した（図２Ａ）。ＣＴ−２６細胞が注射されたマウスは、細胞注射１２日後、体重が減量した。しかし、ＴＭ４ＳＦ５ペプチドワクチンで免疫化されたマウスは、非処理された対照群マウスと類似のパターンを示した（図２Ｂ）。マウスの生存は、図２Ｃに示したように、ＰＢＳ対照群と比較して、ペプチドワクチンによって大きく増加した（５２日に８０％対０％）。ペプチドのないＣｐＧ−ＤＮＡ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ複合体（Ｌｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ））による免疫化は、非特異的免疫促進効果により部分的な保護効果を誘導した（５２日に２７％）。腫瘍の体積及び重量を使用して、本発明者らは、ペプチドワクチンによる免疫化は、ＰＢＳ又はＬｉｐｏｐｌｅｘ（Ｏ）対照群と比較して、肺転移腫瘍の進行を減少させたということを観察した（図２Ｄ〜図２Ｅ）。組織学的調査は、適切にワクチン化されたマウスの肺組織は、正常マウスのものと類似の形態を示した（図２Ｆ）。ペプチドワクチンの抗転移効果を確認するために、本発明者らは、類似の実験を繰り返し、肺において転移性結節をチェックした。ペプチドワクチンによる免疫化は、ＰＢＳ対照群と比較して肺結節の数を著しく減少させた（図３）。これらの結果は、ＴＭ４ＳＦ５ペプチドワクチンによる免疫化は、マウスｓｙｎｇｅｎｅｉｃモデルにおいて大腸腫瘍の肺転移を減少させることができることを示唆する。
【０１８４】
ＴＭ４ＳＦ５環状ペプチドに特異的なモノクローナル抗体の生成
【０１８５】
ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃペプチド及びＣｐＧ−ＤＮＡを同時にカプセル化したＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳを含むリポソーム複合体で４回免疫化した後、マウス血清から環状ＴＭ４ＳＦ５ペプチド（ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃ）に対する抗体の適正曲線をＥＬＩＳＡで得た（図４Ａ）。最終ブースターの３日後、最も高い抗体タイター（ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃ）を有する脾臓を得、その脾臓細胞をＳＰ２／０ｍｙｅｌｏｍａ細胞と通常のハイブリドーマ技術により融合した。１４日後、上澄液をＥＬＩＳＡ方法で分析して、ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃペプチドに対する特定の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞をスクリーニングした。スクリーニング過程により、本発明者らは、ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃペプチドと反応する一つのハイブリドーマ細胞（１Ｈ１）を分離した（図４Ｂ及び図４Ｃ）。本発明者らは、ＴＭ４ＳＦ５を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｆ−ＴＭ４ＳＦ４細胞を使用してウエスタンブロット分析を行い、その抗体が組換えＴＭ４ＳＦ５タンパク質を認知することを証明した（図４Ｄ）。
【０１８６】
その一つのハイブリドーマ細胞をリミッティング希釈方法によるサブクローニング後、モノクローナル抗体の生成を分析した（図５Ａ及び図５Ｂ）。４つのハイブリドーマクローン（４つの１Ｈ１誘導体）を選択し、ＴＭ４ＳＦ５を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｆ−ＴＭ４ＳＦ４細胞を使用してウエスタンブロット分析を行い、その抗体が組換えＴＭ４ＳＦ５タンパク質を認知するということを証明した（図５Ｄ）。結論的に、一つのハイブリドーマクローン（２Ａ１０）をモノクローナル抗体（ｍＥＣ２−Ｃ）の生成のために選択した（図５Ｄ）。
【０１８７】
ＴＭ４ＳＦ５環状ペプチドに特異的なモノクローナル抗体の特性
【０１８８】
本発明者らは、ハイブリドーマ細胞株（２Ａ１０）をスクリーニングし、ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃペプチドを認知するモノクローナル抗体を成功裏に分離した。ａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体（ｍＥＣ２−Ｃ）をプロテインＡカラムクロマトグラフィーで腹水液から精製し、その純度が９９％以上と測定された（図６Ａ）。本発明者らは、生成されたモノクローナル抗体はＩｇＧ３であることを見出した（図６Ｂ）。本発明者らは、そのモノクローナル抗体をｍＥＣ２−Ｃと命名し、環状ペプチドｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃに対するその特異的な結合をＥＬＩＳＡで確認した（図６Ｃ）。図６Ｄに示したように、ｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃペプチドに対する抗体の結合親和度をＳＰＲ（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分析によって測定した。その抗体の平衡解離定数（Ｋｄ）は、〜０．４８ｎＭであった。その抗体のオフレート（ｋｄ）は、１０−５／ｓｅｃであった。したがって、本発明者らは、この抗体が臨床的適用にさらに有用であり得ると結論を下した。本発明者らは、ＴＭ４ＳＦ５を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｆ−ＴＭ４ＳＦ４細胞及びＨＥＫ２９３Ｆ対照群細胞を使用して免疫沈殿及びウエスタンブロットを行い、その抗体がＭｙｃ−タグされた組換えＴＭ４ＳＦ５タンパク質を認知するということを証明した（図６Ｅ）。
【０１８９】
Ａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体（ｍＥＣ２−Ｃ）は、異種移植マウスモデルにおいて大腸癌の成長を阻害する
【０１９０】
本発明者らは、異種移植マウスモデルを使用したインビボ大腸癌細胞の成長に対するＴＭ４ＳＦ５−ターゲットされたモノクローナル抗体の効果を観察した。まず、本発明者らは、ＨＴ−２９細胞をヌードマウスの背中に皮下注射して腫瘍を成長させた。腫瘍サイズが直径５ｍｍに到達したとき、本発明者らは、週に２回、ａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体（ｍＥＣ２−Ｃ）を尾静脈に注射した。腫瘍の体積及び重量に基づいて、ａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体（ｍＥＣ２−Ｃ）は、ＰＢＳ対照群と比較して大腸癌の進行を弱化させた（図７Ｂ〜図７Ｄ）。その抗体処理は、実験の間、体重に影響がなかった（図７Ｅ）。異種移植実験の分析は、大腸腫瘍細胞をターゲットとするａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体が、インビボで腫瘍の成長を減少させることができるということを示した。
【０１９１】
ａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体の可変ドメインのクローニング
【０１９２】
重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）をコードするｃＤＮＡ配列を、通常の重鎖及び軽鎖プライマーを使用してａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞（ｍＥＣ２−Ｃ）からクローニングした。ＤＮＡシークエンシングによって確認された配列を図８に示した。その配列を、ＩｇＢＬＡＳＴプログラムを使用して、公知の配列とのホモロジーを分析した（Ｙｅ  Ｊ，Ｍａ  Ｎ，Ｍａｄｄｅｎ  ＴＬ，Ｏｓｔｅｌｌ  ＪＭ．ＩｇＢＬＡＳＴ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３；４１（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ３４−４０）。
【０１９３】
ヒト化されたモノクローナル抗体の産生及び特性
【０１９４】
臨床にモノクローナル抗体の適用のために、その抗体をヒトでの免疫原性を減少させるヒト化作業を行わなければならない。したがって、本発明者らは、得られたモノクローナル抗体ｍＥＣ２−Ｃの免疫グロブリン可変ドメイン配列をＩｇＢＬＡＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｙｅ  Ｊ，Ｍａ  Ｎ，Ｍａｄｄｅｎ  ＴＬ，Ｏｓｔｅｌｌ  ＪＭ．ＩｇＢＬＡＳＴ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３；４１（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ３４−４０）を使用して分析し、その可変ドメインサブタイプがマウスＶＨ２−Ｖｋ８に属するということを見出した。ｍＥＣ２−Ｃ  ｍＡｂのヒト化のために、本発明者らは、ＶＨ３−Ｖｋ１骨格を、この骨格が最も共通的にヒト生殖系列（ｇｅｒｍ  ｌｉｎｅ）レパートリーで観察されるという事実（Ｃａｒａｖｅｌｌａ  ＪＡ，Ｗａｎｇ  Ｄ，Ｇｌａｓｅｒ  ＳＭ，Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ  Ａ．Ｃｕｒｒ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｉｄｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．２０１０；６（２）：１２８−１３８）を参考にして選択した。本発明者らは、ヒトＶＨ３−Ｖｋ１骨格に一部の骨格配列、この場合にはハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）骨格とＣＤＲ部位を一般に確立された方法で接ぎ木した（Ｋａｂａｔ  ＥＡ，Ｗｕ  ＴＴ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１；１４７（５）：１７０９−１７１９）。ｍＥＣ２−２及びヒト化されたモノクローナル抗体（ｈＥＣ２−Ｃ−２）由来の構造をモデル化して比較し、それらは互いに同一ではないが、類似するということを示した（図９及び図１０）。
【０１９５】
本発明者らは、組換えヒト化されたモノクローナル抗体（ｈＥＣ２−Ｃ−２）をＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞を使用して産生し（図１１Ａ）、その反応性を評価した（図１１Ｂ〜図１１Ｄ）。そのヒト化された抗体は、ＥＬＩＳＡに基づいて環状ペプチドｈＴＭ４ＳＦ５ＥＣ２−Ｃに対しては特異的に反応するが、ｈＴＭ４ＳＦ５Ｒ２−３にはそうではなかった（図１１Ｂ）。その抗体の平衡解離定数（Ｋｄ）は、〜２２．７ｐＭであり、それは、元のマウスモノクローナル抗体ｍＥＣ２−Ｃに比べて約２０倍さらに低かった（図１１Ｃ）。そのヒト化された抗体は、ウエスタンブロット及び免疫沈殿分析に基づいて、ＴＭ４ＳＦ５タンパク質をＴＭ４ＳＦ５を過剰発現するＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞から検出することができた（図１１Ｄ）。
【０１９６】
したがって、本発明者らは、そのヒト化された抗体がＴＭ４ＳＦ５タンパク質に完全に反応し、元のモノクローナル抗体と比較してさらに高い親和度を有するという結論を得ることができる。
【０１９７】
ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体の大腸癌細胞のβ−ｃａｔｅｎｉｎ発現及び移動に対する効果
【０１９８】
ＴＭ４ＳＦ５は、腫瘍細胞の転移及び細胞の移動／侵襲に重要なインテグリン媒介信号経路を活性化する（Ｌｅｅ  ＳＡ，Ｋｉｍ  ＴＹ，Ｋｗａｋ  ＴＫ，Ｋｉｍ  Ｈ，Ｋｉｍ  Ｓ，Ｌｅｅ  ＨＪ，Ｋｉｍ  ＳＨ，Ｐａｒｋ  ＫＨ，Ｋｉｍ  ＨＪ，Ｃｈｏ  Ｍ，Ｌｅｅ  ＪＷ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１０；１１１（１）：５９−６６；Ｊｕｎｇ  Ｏ，Ｃｈｏｉ  Ｓ，Ｊａｎｇ  ＳＢ，Ｌｅｅ  ＳＡ，Ｌｉｍ  ＳＴ，Ｃｈｏｉ  ＹＪ，Ｋｉｍ  ＨＪ，Ｋｉｍ  ＤＨ，Ｋｗａｋ  ＴＫ，Ｋｉｍ  Ｈ，Ｋａｎｇ  Ｍ，Ｌｅｅ  ＭＳ，Ｐａｒｋ  ＳＹ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．２０１２；１２５（Ｐｔ２４）：５９６０−５９７３）。したがって、本発明者らは、ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体のＣＴ−２６細胞及びＨＣＴ−１１６細胞を使用した細胞の移動に対するインビトロ効果を評価した。図１２Ａに示したように、本発明者らは、ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体の添加は、ＣＴ−２６細胞の移動を阻害したが、ＰＢＳ又はヒトＩｇＧはそうではなかった。対照的に、その抗体は、ＴＭ４ＳＦ５を発現しないＨＣＴ−１１６細胞の移動には効果がなかった。また、本発明者らは、インビトロで創傷治癒アッセイを行った。図１２Ｂに示したように、創傷部位へＣＴ−２６細胞の移動は、ＰＢＳ又はヒトＩｇＧ対照群と比較して大きく阻害されたが、ＨＣＴ−１１６細胞において創傷治癒能力には、ＰＢＳ、ヒトＩｇＧ対照群、又はａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５の間に差がなかった。
【０１９９】
ａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体の細胞相互作用の特性に対する効果を究明するために、本発明者らは、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びβ−ｃａｔｅｎｉｎの発現をＣＴ−２６細胞及びＨＣＴ−１１６細胞でチェックした（図１３）。共焦点イメージデータは、β−ｃａｔｅｎｉｎの発現が、ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体に対してＣＴ−２６細胞で大きく増加した（図１３Ａ）。Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎの発現は、処理にもかかわらず、ＣＴ−２６細胞で観察されず、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎの基本発現がＣＴ−２６細胞で非常に低いということを示唆する。対照的に、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びβ−ｃａｔｅｎｉｎの発現は、ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体で処理した後、ＨＣＴ−１１６細胞で変化がなかった。ウエスタンブロット分析は、同じ結果を示した（図１３Ｂ）。したがって、ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体は、ＴＭ４ＳＦ５を発現する細胞において移動能力を減少させ、細胞−細胞の相互作用を増加させる。
【０２００】
ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体は、異種移植マウスモデルにおいてＨＣＣ腫瘍の成長を阻害する
【０２０１】
本発明者らは、異種移植マウスモデルを使用して、ＴＭ４ＳＦ５−ターゲットされたヒト化された抗体のＨＣＣ細胞の成長に対する効果を調べた。まず、本発明者らは、Ｈｕｈ−７細胞をマウスの背中に皮下注射して腫瘍を成長させた。腫瘍サイズが直径５ｍｍに到達するとき、本発明者らは、ＰＢＳ又はヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体を、週に２回、尾静脈に投与した。腫瘍の体積及び重量によれば、ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体は、ＨＣＣ腫瘍の進行を、ＰＢＳ対照群と比較して弱化させた（図１４Ｂ〜図１４Ｅ）。異種移植実験の分析は、ＨＣＣ腫瘍細胞をターゲットとするヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体が、インビボで腫瘍の成長を減少させるのに十分であることを示した。
【０２０２】
ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体は、異種移植マウスモデルにおいて大腸癌の成長を阻害する
【０２０３】
本発明者らは、異種移植マウスモデルを使用したインビボ大腸癌細胞の成長に対するＴＭ４ＳＦ５−ターゲットされたヒト化された抗体の効果を観察した。まず、本発明者らは、ＨＴ−２９細胞をヌードマウスの背中に皮下注射して腫瘍を成長させた。腫瘍サイズが直径５ｍｍに到達するとき、本発明者らは、週に２回、ＰＢＳ又はヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体を尾静脈に投与した。腫瘍の体積及び重量によれば、ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体は、大腸腫瘍の進行を、ＰＢＳ対照群と比較して弱化させた（図１５Ｂ〜図１５Ｄ）。その抗体処理は、実験の間、体重に影響がなかった（図１５Ｅ）。異種移植実験の分析は、大腸癌をターゲットとするヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体が、インビボで腫瘍の成長を減少させることができるということを示した。
【０２０４】
ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体は、マウス肺転移モデルにおいて大腸腫瘍の成長を阻害する
【０２０５】
ＴＭ４ＳＦ５ペプチドワクチンによるマウスの免疫化は、ＣＴ−２６細胞の注射による肺腫瘍組織の成長を阻害するため、免疫化によって誘導されたＴＭ４ＳＦ５−特異的な抗体が抗転移効果に直接的に寄与すると仮説化することができる。
【０２０６】
したがって、次に、本発明者らは、図１６Ａに示したような実験スケジュールに従って、肺転移に対するヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体の効果を調べた。ＣＴ−２６細胞の注射１日後、本発明者らは、正常ＩｇＧ又はヒト化された抗体ｈＥＣ２−Ｃ−２を尾静脈に注射し、マウスからその抗体の効果をチェックした。対照群マウスは、ＣＴ−２６細胞の注射から約１６日後、体重が減量した。しかし、ヒト化された抗体ｈＥＣ２−Ｃ−２で注射されたマウスは、非処理された対照群マウスと類似の体重を示した（図１６Ｂ）。マウスの生存は、図１６Ｃに示したように、ヒトＩｇＧ対照群と比較して、ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体によって大きく増加した（７５％対０％）。
【０２０７】
ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体の抗転移効果を確認するために、本発明者らは、類似の実験を繰り返して肺転移をチェックした。ヒト化された抗体ｈＥＣ２−Ｃ−２で注射されたマウスは、ＰＢＳ対照群と比較して、肺転移された腫瘍の形成及び成長を著しく減少させた（図１７）。腫瘍の体積及び重量の変化を考慮すると、ａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５抗体は、ヒトＩｇＧと比較して肺転移腫瘍の成長を減少させた（図１７Ｂ〜図１７Ｄ）。したがって、本発明者らは、ヒト化されたａｎｔｉ−ＴＭ４ＳＦ５モノクローナル抗体がマウスシンジェネイックモデルにおいて大腸腫瘍の肺転移を緩和させることができるという結論を得ることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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