(57)【要約】  本発明は、細胞および組織の生物活性および代謝活性によって分解可能ではない共有結合した酵素的に分解可能なペプチド配列を有するポリマーベース材料であって、ペプチド配列はそれぞれ２〜１５個のアミノ酸からなり、ポリマーベース材料中に組み込まれるか、またはポリマーベース材料にコンジュゲート化されるポリマーベース材料に関する。したがって、ペプチド配列は、ポリマーベース材料の三次元構造または二次元構造いずれかの一部であってよい。ペプチド配列の共有結合の酵素添加の制御された分解によって、三次元構造の生体直交分解、またはペプチド配列がポリマーベース材料にコンジュゲート化した場合には分子の少なくとも一部分の放出が実行される。本発明は、細胞培養または組織もしくは臓器のインビトロ生成のための、提供された細胞、組織もしくは臓器のインビボ安定化のための、ならびに生きている細胞、組織および臓器のインビボもしくはインビトロ処置のためのそのようなポリマーベース材料の使用にさらに関する。一方の材料と、他方のサンプル、すなわち細胞、組織または臓器との間の接着結合は、サンプルの完全性（細胞外マトリックスならびに細胞−細胞および細胞外マトリックス−細胞の接触）（生体直交性）を破壊することなく制御下で分解可能である。
2019513720.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼによって酵素的に切断可能な少なくとも１つの部位を有する、共有結合した酵素的に分解可能なペプチド配列を備えるポリマーベース材料であって、前記部位はタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼによって切断可能な部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼによって切断可能な部位、第Ｘａ因子プロテアーゼによって切断可能な部位、トロンビンプロテアーゼによって切断可能な部位、エンテロキナーゼによって切断可能な部位、ソルターゼＡプロテアーゼによって切断可能な部位、カスパーゼ−３プロテアーゼによって切断可能な部位、グランザイムＢセリンプロテアーゼによって切断可能な部位、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびヒトライノウイルス（ＨＲＶ）１４型由来３Ｃプロテアーゼの融合タンパク質によって切断可能な部位からなる切断可能な部位の群から選択され、前記ペプチド配列は、それぞれ２〜１５個のアミノ酸からなり、酵素添加によって制御される前記ペプチド配列の共有結合の分解を用いて、三次元構造の生体直交分解が発生するか、または前記ポリマーベース材料への前記ペプチド配列のコンジュゲート化のいずれかを用いると、前記ポリマーベース材料の二次元構造内もしくは前記三次元構造内いずれかのリンカー分子であるような方法で前記ポリマーベース材料に組み込まれるか、または前記ポリマーベース材料にコンジュゲート化され、前記分子の少なくとも一部分が放出されるポリマーベース材料。
【請求項２】
前記ポリマーベース材料は、頂点および辺を備える二次元もしくは三次元架橋構造であって、前記頂点および／または前記辺の少なくとも一部分は前記結合分子を含有することを特徴とする、請求項１に記載のポリマーベース材料。
【請求項３】
前記ポリマーベース材料は、ヒドロゲルまたは縮合ポリマーであることを特徴とする、請求項１または２に記載のポリマーベース材料。
【請求項４】
前記ポリマーベース材料は、酵素添加によって制御された前記ペプチド配列の前記共有結合の放出可能な分解であり、有効成分、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー）、タンパク質、ペプチドコンジュゲート、硫酸化および非硫酸化多糖およびそれらのコンジュゲートからなる一群の成分に属する少なくとも１つの生物活性成分を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリマーベース材料。
【請求項５】
前記少なくとも１つの放出可能な成分の前記分子は、それぞれが前記酵素的に分解可能なペプチド配列を含有するリンカーによって前記ポリマーベース材料にコンジュゲート化されることを特徴とする、請求項４に記載のポリマーベース材料。
【請求項６】
前記少なくとも１つの放出可能な成分の前記分子は、三次元ポリマーネットワークに物理的に封入および／または物理的に結合されることを特徴とする、請求項４に記載のポリマーベース材料。
【請求項７】
前記酵素的に分解可能なペプチド配列は、細胞および組織の前記生物活性および代謝活性によって分解可能ではないことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリマーベース材料。
【請求項８】
プロテアーゼによって切断可能な部位を有する前記切断可能なペプチド配列は、ＥＮＬＹＦＱ／Ｘ、ＥＴＶＬＦＱ／ＧＰ、ＥＶＬＦＱ／ＧＰ、ＩＥＧＲ／ＩＥＧＲＸ、ＤＤＤＤＫ／、ＬＶＰＲＧＳ／ＦＸＲＳ、ＤＸＸＤ／、ＬＰＥＴ／Ｇからなる一群から選択され、フォワードスラッシュ（／）は前記各切断可能な部位を示し、前記文字はタンパク質性アミノ酸の１文字コードを表し、Ｘは任意の天然型アミノ酸を表すことを特徴とする、請求項７に記載のポリマーベース材料。
【請求項９】
細胞および組織の前記生物活性および代謝活性によって分解可能なペプチド配列であって、それらが前記ポリマーベース材料の二次元構造もしくは三次元構造いずれか内でリンカー分子であるように前記ポリマーベース材料中に組み込まれるか、または前記ポリマーベース材料にコンジュゲート化されるペプチド配列をさらに含み、その結果細胞および組織の前記生物活性および代謝活性は前記三次元構造の生体直交分解、または前記ポリマーベース材料への前記ペプチド配列のコンジュゲート化の場合には、前記分子の少なくとも一部分の放出を生じさせる、請求項７または８に記載のポリマーベース材料。
【請求項１０】
前記プロテアーゼの添加によって制御される前記ペプチド配列の前記共有結合の分解を通して発生する、前記放出可能な成分の制御されたインビボまたはインビトロ放出に使用するための、請求項４〜９のいずれか一項に記載のポリマーベース材料。
【請求項１１】
必要であれば、前記上述の放出可能な生物活性成分の有効成分および／またはまた別の成分は、前記プロテアーゼの前記添加によって制御下で放出される、細胞、組織および臓器のインビボまたはインビトロ処置のための請求項１０に記載の使用のためのポリマーベース材料。
【請求項１２】
インビトロ細胞培養のため、または組織もしくは臓器のインビトロ生成のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリマーベース材料の使用。
【請求項１３】
提供された細胞、組織および臓器のインビトロ安定化のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリマーベース材料の使用。
【請求項１４】
必要であれば、前記プロテアーゼの添加によって制御される前記ペプチド配列の前記共有結合の分解、したがって前記放出可能な成分の放出が発生する、インビトロ法のための請求項〜９のいずれか一項に記載のポリマーベース材料の使用。
【請求項１５】
必要であれば、前記上述の放出可能な生物活性成分の有効成分および／またはまた別の成分は、前記プロテアーゼの添加によって制御下で放出される、生きている細胞、組織および臓器のインビトロ処置における、請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共有結合した酵素的に分解可能なペプチド配列を備えるポリマーベース材料に関する。本発明は、細胞培養または組織もしくは臓器のインビトロ生成のため、提供された細胞、組織もしくは臓器のインビボ安定化のため、ならびに生きている細胞、組織および臓器のインビボもしくはインビトロ処置のためのそのようなポリマーベース材料の使用にさらに関する。この場合には、一方の材料と他方の細胞、組織もしくは臓器を意味するサンプルとの接着結合は、サンプルの完全性（細胞外マトリックスならびに細胞−細胞および細胞外マトリックス−細胞の接触）を破壊することなく制御下で分解可能である（生体直交性）。
【背景技術】
【０００２】
細胞適合性材料の形成および様々な生物活性分子、例えば共有結合した細胞接着性のペプチド、タンパク質および時には成長因子およびサイトカインを用いたそれらの個々の機能化のためには数多くの技術が存在する。これらの方法と比較して、選択的材料分解反応を導入するための合成方法は、本質的にはまだ開拓されていない。このために使用される細胞分離／解離の酵素的方法、例えばトリプシン、ペプシンもしくはコラゲナーゼを使用する方法は、新規に生成もしくは提供された組織および臓器のいずれにも、これらの非選択的方法がそれらの細胞外マトリックスの秩序を損傷させるために、適用することができない。さらに、三次元材料中に細胞を放出させるためのそのような酵素の使用は、細胞表面タンパク質の望ましくない切断をもたらし得るより高い酵素濃度もしくはより長い処置時間を必要とするために、重度に制限される。所定のアミノ酸配列を切断する、より選択的なマトリックス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、三次元ヒドロゲル材料中での穏やかな細胞収集のために適切であることが証明されている。最も一般に使用されるＭＭＰは、細胞挙動にほとんど影響を及ぼさないことが証明されている。しかし、組織もしくは臓器適用のためのＭＭＰの使用は、それらが細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内でコラーゲンファミリータンパク質の切断を誘発し、組織および臓器の重要な構造単位の消失を生じさせ得るために、一般に限定されている。これらを要約すると、最新技術の状況は、二次元適用および三次元適用の両方における細胞回収のための実践的技術は提供するが、他方、担体材料から例えば組織および臓器などの複雑な細胞実体を穏やかに回収するために利用できる適切なバイオテクノロジーによる方法は、今のところ存在していない。
【０００３】
伝統的な酵素法に加えて、材料の物理化学的特性に及ぼす影響に基づく細胞除去のためのいくつかの未来の技術は前途有望である。例えば、温度変化に反応して機械的ストレスを誘導する熱応答性バイオハイブリッド材料の開発においては、多少の進展が見られる。そのようなストレス、例えばヒドロゲル構造の膨潤は、付着性細胞の分離（薄膜剥離）を誘導するので、このため細胞シートエンジニアリングとして公知である単層細胞層を調製するために使用されてきた。それでも、この方法は細胞接着と誘導脱離を平衡させること、および種々の細胞型にとって有用にさせるためにユーザー定義の担体特性を生成することを必要とする。そのような時間および資源集約的な生成／適応が行わなければ、材料誘導性ストレスは、材料に付着した細胞ＥＣＭを損傷させ得るので、これによりそのようなプロセスの再現性は限定される。
【０００４】
さらに、この先行技術は、単純な二次元適用に限定されており、多層組織もしくはより複雑な組織への感温性担体の適合性は疑わしい。そのような適用性の制限は、臓器が移植もしくは治療される場合はより厳密になる：その場合には、熱応答性担体は、十分に強力な接着を提供しない（ポリマー層の厚さは、数百ナノメートルに過ぎない）ので、もはや使用することができない。熱応答性担体のまた別の不利点は、層間剥離のために必要とされる温度変化である：極めて感受性であり、損傷することなく長期間の温度変化／温度低下を耐え抜けない細胞が存在する。
【０００５】
より近年は、材料化学における直交法への関心の高まりが光線および細胞によって直交的に切断され得るヒドロゲルの生成をもたらしてきた。二光子技術の使用は、ヒドロゲルフレームワークからの光線制御下での細胞移動／切断のためのそのような方法の使用を可能にする。ある程度調整すれば、そのようなシステムを細胞採取のために使用することができよう：しかし、現在の二光子器具の限界および対応する光子反応の低い生体適合性は、この前途有望な技術を単細胞適用のみに制限している。
【０００６】
要約すると、材料に影響を及ぼすために現在利用できる最先端の物理化学的方法は、例えば組織および臓器などの複雑な細胞集合体を担体材料から穏やかに細胞切断するために必要な器具類を有していない。
【０００７】
新規な組織生成、組織エンジニアリングまたは提供された組織もしくは臓器インプラントを安定させるために適合する材料の開発は、再生医学およびインプラント研究の分野における一般的アプローチである。これらの研究分野における進歩は、体外組織もしくは臓器をわずかな数の原細胞から再生できる自己再生法の重要性に関する現代の理解をもたらした。これらの方法は、組織および臓器インプラント製作のための材料開発に、それらの一部は自己排除問題である、複数の新しい問題を持ち込む。一方では、細胞培養には、三次元細胞外マトリックスに類似し、細胞の膨潤および細胞によるその後の組織生成のために分解され得る安定性の生体機能化表面もしくはスカフォールドを必要とする。そのような材料の強力な細胞接着特性は、細胞もしくは組織発達に成功するための重要な特徴である。他方、移植に成功するためには、形成された組織は、その細胞マトリックスおよび細胞外マトリックス構造を維持するために担体材料から穏やかに分離されなければならない。言い換えれば、組織と材料との接着は、細胞外マトリックスならびに組織内の細胞−細胞結合および細胞外マトリックス−細胞結合を破壊することなく減少させなければならない。しかし、これらの結合は同一もしくは類似の化学的性質の結合であるので、それらの選択的切断には、材料と組織との間の接着結合の選択的分解のための新規な自明ではない生体直交法が必要になる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このため、本発明の目的は、材料と細胞、組織もしくは臓器との接着結合を、組織内の細胞と細胞外マトリックスとの結合を破壊することなく、制御下で選択的に分解させることのできる材料を提供することである。
【０００９】
本発明の目的は、請求項１に記載の共有結合した酵素的に分解可能なペプチド配列を有するポリマーベース材料により達成される。分解可能な、好ましくは切断可能なペプチド配列は、これにより細胞および組織の一般的生物活性および代謝活性にとって不活性であるが、これはそれらが細胞および組織の生物活性および代謝活性によって分解され得ないことを意味する。ペプチド配列は、それぞれ２〜１５個のアミノ酸から構成されており、ポリマーベース材料に組み込まれ得るか、またはポリマーベース材料にコンジュゲート化され得る。したがって、ペプチド配列は、ポリマーベース材料の三次元構造もしくは二次元構造いずれかの一部であり得る。三次元構造の生体直交分解は、ペプチド配列の共有結合の酵素添加制御下での分解を通して発生するか、または分子の少なくとも一部分はペプチド配列がポリマーベース材料とコンジュゲート化すると放出されるかのいずれかである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
好ましくは、ペプチド分子１個当たりのアミノ酸残基の数は、５〜１０個である。ポリマーベース材料は、頂点および辺を備える二次元もしくは三次元ネットワーク構造を形成し得るが、このとき頂点および／または辺の少なくとも一部分は結合分子を有する。ポリマーベース材料は、例えば、ヒドロゲルもしくは好ましくは固体の縮合ポリマーであってよい。本発明の有益な実施形態によると、ポリマーベース材料は、担体基質（例えば、ガラス）のポリマーコーティングであってよい。
【００１１】
本発明の１つの特に好ましい実施形態によると、ポリマーベース材料には、酵素添加によって制御されたペプチド配列の共有結合の分解によって放出可能である少なくとも１つの好ましい生物活性成分が含まれる。この成分は、有効成分、核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡもしくはアプタマー、タンパク質、ペプチドコンジュゲート、硫酸化もしくは非硫酸化多糖類およびそれらのコンジュゲートからなる一群の成分に属する。タンパク質もしくはペプチドコンジュゲートは、有益にはサイトカイン、ケモカイン、成長因子、ホルモン、抗体または細胞外マトリックスの成分であってよい。
【００１２】
１つの改良実施形態によると、少なくとも１つの放出可能な成分の分子は、それぞれが酵素的に分解可能なペプチド配列を含有するリンカーによってポリマーベース材料にコンジュゲート化される。
【００１３】
または、少なくとも１つの放出可能な成分の分子は、三次元ポリマーネットワークに物理的に封入されて物理的に結合され得る。これらの成分はその後に、封入しているポリマーネットワークの生体直交分解によって放出されるであろう。
【００１４】
本発明によると、ペプチド配列は、プロテアーゼによって酵素的に切断可能である部位を有することによって酵素的に分解可能である。有効成分、核酸、タンパク質、ペプチドコンジュゲートもしくは多糖類の放出は、その後はプロテアーゼの添加によって制御することができる。
【００１５】
本発明によると、それにより切断可能なペプチド配列は、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼによって切断可能な部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼによって切断可能な部位、第Ｘａ因子プロテアーゼによって切断可能な部位、トロンビンプロテアーゼによって切断可能な部位、エンテロキナーゼによって切断可能な部位、ソルターゼ−Ａ−プロテアーゼによって切断可能な部位、カスパーゼ−３プロテアーゼによって切断可能な部位、グランザイムＢセリンプロテアーゼによって切断可能な部位ならびにPreScission（商標）によって切断可能な部位からなる一群の切断部位から選択される切断可能な部位を有する。PreScission（商標）は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびヒトライノウイルス（ＨＲＶ）１４型由来３Ｃプロテアーゼから構成される融合タンパク質である。
【００１６】
有益にも、これらのペプチド配列は、細胞および組織の生物活性および代謝活性によって分解され得ない、酵素的に分解可能なペプチド配列として選択される。ペプチド配列は、好ましくは、ＥＮＬＹＦＱ／Ｘ、ＥＴＶＬＦＱ／ＧＰ、ＥＶＬＦＱ／ＧＰ、ＩＥＧＲ／ＩＥＧＲＸ、ＤＤＤＤＫ／、ＬＶＰＲＧＳ／ＦＸＲＳ、ＤＸＸＤ／、ＬＰＥＴ／Ｇからなる一群から選択されるが、ここでフォワードスラッシュ（／）は各切断可能な部位を示し、文字はタンパク質性アミノ酸の１文字コードを表し、Ｘは任意の天然型アミノ酸を表す。
【００１７】
本発明のまた別の実施形態によると、本ポリマーベース材料には、細胞および組織の生物活性および代謝活性によって分解可能である、およびペプチド配列がポリマーベース材料の二次元構造もしくは三次元構造いずれかの一部であるように、ポリマーベース材料に組み込まれるか、またはポリマーベース材料にコンジュゲート化されるペプチド配列がさらに含まれる。細胞および組織の生物活性および代謝活性は、三次元構造の生体直交分解を生じさせるか、またはペプチド配列がポリマーベース材料にコンジュゲート化される場合には分子の少なくとも一部分の放出を誘発する。これらのペプチド配列は、好ましくは、細胞および組織の生物活性および代謝活性によって分解され得ないペプチド配列に連結される。酵素の制御された添加、すなわち必要に応じた酵素の添加は、材料の分解の加速もしくは成分の加速された放出を誘発する。
【００１８】
本発明は、ポリマーベース材料中の共有結合をオンデマンドで、すなわち時間制御下で切断するための方法とともに使用できるが、ここでこれらの方法は、生体直交法によりインビトロもしくはインビボで、生きている細胞、組織もしくは臓器の存在下で実施することができる。これらの適用／方法は、一般的ポリマーベース材料構造内への分子リンカーとしての短鎖の酵素的に分解可能／切断可能なペプチド配列の組込みに基づいている。共有結合の酵素的に制御された分解は、分解可能な共有結合が材料構造内に所在する場合は、材料の分解を生じさせる。共有結合の酵素的に制御された分解は、分解可能な結合がそれぞれの場合に材料にコンジュゲート化される分子の一部である場合は、分子が放出されることを誘発する。酵素的反応によって分解され得る材料の結合は、例えば細胞、組織もしくは臓器などの生きている物質の存在下、および／または細胞外マトリックスの分子の存在下では、酵素的反応の直交適用を可能にする。
【００１９】
分解可能なペプチド配列が用意されたポリマーベース材料は、上述した放出可能な生物活性成分の有効成分もしくはまた別の成分の制御されたインビボもしくはインビトロ放出のために使用できるが、このとき放出は酵素添加によってペプチド配列の共有結合の制御された分解を通して発生する。そのような適用は、特に細胞、組織および臓器のインビボもしくはインビトロ処置の状況において行われるが、ここで必要であれば、上述の放出可能な生物活性成分の有効成分および／またはまた別の成分は、酵素添加によって制御下で放出される。
【００２０】
さらに、本発明のポリマーベース材料は、インビトロ細胞培養および／または組織もしくは臓器のインビトロ生成のために好適である。材料の酵素的切断は、細胞外マトリックスもしくは細胞−細胞および細胞外マトリックス−細胞接触に影響を及ぼさない。したがって、材料の酵素的切断は、生きているサンプルの発達の任意の時点に必要に応じて材料を分解することによって、生きているサンプル、すなわち細胞、組織もしくは臓器およびその細胞外マトリックスの細胞層の担体材料からの非破壊的分離を可能にする。
【００２１】
分解可能なペプチド配列が提供されたポリマーベース材料は、さらにまた提供された細胞ならびに提供された組織もしくは臓器のインビトロ安定化のためにも使用され得る。さらにこの場合においても、材料の酵素的切断は、細胞外マトリックスもしくは細胞−細胞および細胞外マトリックス−細胞接触に影響を及ぼさない。ペプチド配列の制御された酵素的切断は、移植を成功させるための担体材料からの細胞／組織／臓器の穏やかな／非破壊的分離を許容する。
【００２２】
要約すると、材料分解のための生体直交法としての上述の酵素的分解の適用は、インビトロもしくはインビボでの生きている細胞、組織および臓器の生体材料適用にとっての完全に新規な展望を開く。
【００２３】
本発明の実施形態についてのさらなる詳細、特徴および利点は、下記の添付の図面を参照しながら典型的な実施形態の説明に従うことにより明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】分子リンカーとして組み込まれた短鎖の酵素的に切断可能なペプチド配列を備えるポリマーベース材料の構造を示す略図である。
【図２】分子リンカーとしての短鎖の酵素的に切断可能なペプチド配列を備える実行し得る機能的表面コーティングの例を示す図である。
【図３】同様にヒドロゲルもしくは縮合ポリマー材料の一部である酵素的に切断可能なペプチドリンカーの例を示す図である。
【図４】ペプチドリンカーを介して材料に結合させられ得る有効成分の使用を示す図である。
【図５】単層の細胞組織もしくは移植片を生成するための、生体直交法による材料分解の使用を示す略図である。
【図６】三次元適用における細胞および組織を生成するための生体直交法による材料分解の使用を示す略図である。
【図７Ａ】ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲート形成の反応スキームを示す図である。
【図７Ｂ】ＰＥＧ（マレイミド）４のＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図７Ｃ】ＰＥＧ（マレイミド）４と切断可能なペプチドとの反応混合物についてのＨＰＬＣ分析を示す図である。
【図８Ａ】マイケル付加によるヒドロゲルネットワーク形成を示す略図である。
【図８Ｂ】マイケル付加によるヒドロゲルネットワーク形成を示す略図である。
【図９】ＦＸａ分解可能ヒドロゲル上での長期培養の例を示す顕微鏡写真である。
【図１０】同時のヒドロゲル分解とともにヒト角膜内皮細胞（ＨＣＥＣ）の層の形成を示す光線顕微鏡写真である。
【図１１Ａ】同時のヒドロゲル分解とともにヒト角膜内皮細胞（ＨＣＥＣ）の層の形成を示す光線顕微鏡写真である。
【図１１Ｂ】形成されたＨＣＥＣ層の様々な例を示す光線顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、ポリマーベース材料中の共有結合のオンデマンドの、すなわち時間制御された切断の方法であって、図１において略図で示したように、インビトロもしくはインビボで生きている細胞、組織もしくは臓器の存在下で生体直交法により切断を実施できる方法に関する。本方法は、例えばヒドロゲルもしくは縮合ポリマーなどの一般に使用されるポリマーベース材料構造内への分子リンカー、すなわちリンカー分子としての短鎖の酵素的に切断可能なペプチド配列の組込みに基づく。
【００２６】
図１のダイアグラムＩは、一般構造ＲＣＢＡＲを有する多官能性ペプチド分子、一般構造ＲＢＡＲおよびＲＣＡＲを有する二官能性ペプチド分子および一般構造ＲＡＲを有する単官能性ペプチド分子を略図により示しており、ここでＲは材料のポリマー残基である。
【００２７】
Ａは、ここでは制御された酵素添加によって切断され得る酵素的に切断可能なペプチド配列である。好ましくは、これらの酵素は、表１に列挙したように、プロテアーゼである。同様に表１に示したように、切断部位（／）で対応するプロテアーゼによって切断され得る切断可能なペプチド配列は、それぞれが各プロテアーゼに指定されている。
【００２８】
列挙されたペプチドは、生きている組織の一般的生物活性および代謝活性にとって不活性であるが、特異的酵素による選択的酵素的切断を受けることができるペプチドの例である。表１に列挙した酵素は、極めて高い選択性でアミノ酸配列を切断することができるが、細胞および細胞外マトリックスタンパク質両方の消化に対して排他的に不活性である。
【００２９】
【表１】
2019513720.tif 000003
【００３０】
図１の構造に示した文字Ｂは、酵素的に切断可能なペプチド配列Ａ、例えば、細胞接着性ＲＧＤ配列とは異なる生物活性ペプチドモチーフを表す。
【００３１】
図１の構造に示した文字Ｃは、酵素的に切断可能なペプチド配列Ａ、例えば、細胞応答性ＭＭＰ配列、すなわちマトリックス・メタロプロテイナーゼによって切断可能なペプチド配列とは異なる生物活性ペプチドモチーフを表す。
【００３２】
図１のダイアグラムＩＩは、一方では相互に、他方ではそれぞれが２つの材料分子の１つと結び付けられているペプチド配列を備える、細胞応答性ＭＭＰ配列としてのタイプＣモジュールおよび酵素的に切断可能なタイプＡ直交モジュールを示している。図１のダイアグラムＩＩに示したように、細胞によって分泌されたＭＭＰ酵素は、モジュールＣの細胞応答性配列の切断を誘発し得る。生成物として、図１のダイアグラムＩＩの略図は、材料モジュールと一緒のＭＭＰ配列Ｃの切断産物、および一方ではＭＭＰ配列の第２切断産物と、他方では第２材料結合モジュールと接続されている切断されていないペプチド配列Ａを示している。
【００３３】
図１のダイアグラムＩＩの右側は、酵素的に切断可能なペプチド配列Ａの直交切断を示している。酵素の制御された添加、すなわち必要に応じた酵素の添加は、ここでは酵素的に切断可能なモジュールＡの直交切断、したがって材料の分解の加速を誘発する。生成された切断産物は、材料結合モジュールに接続されている酵素的に切断されたペプチド配列Ａのペプチドモチーフの１つの成分である。２番目に生成された切断産物は、順に材料モジュールに接続される配列Ｃに結合されている、酵素的に切断されたペプチド配列Ａのペプチドモチーフである。
【００３４】
本発明によって使用される酵素的に切断可能なペプチドＡは、生きている組織の一般的な生物活性および代謝活性に対して不活性であるが、表１に示したような特異的酵素による酵素的切断を受ける可能性がある。材料の酵素的切断は、細胞外マトリックスもしくは細胞−細胞および細胞外マトリックス−細胞の接触に影響を及ぼさない。したがって、材料の酵素的切断は、生きているサンプルの発達の任意の時点での必要に応じて、材料の分解によって、材料担体からの生きているサンプルおよびその細胞外マトリックスの分離を可能にする。さらに下記では、生物学的適用のための大多数の材料におけるそのような組込みを可能にする、一般的な軟質材料および縮合ポリマーベース材料に切断可能なペプチド配列を組み込むための様々な合成経路について説明する。
【００３５】
図２に示したように、酵素的に切断可能なペプチド配列を有するリンカーはコーティングの一部として含めることができ、切断可能なペプチド配列はリンカーを介してコーティングに付着させられた任意の物体の分離を許容する。
【００３６】
図２は、ダイアグラムＩでは、最初は共有結合もしくは接着結合（共有もしくは接着化学）による１つ以上の官能化ポリマーコーティングが行われ、その後にペプチドによるコーティングが行われる公知の方法でのＳｉＯ２ベース基質のコーティングを略図により示している。切断可能なペプチド配列を備えるペプチドは、分子リンカーとしてポリマー層の官能基を活性化合物と接続する。
【００３７】
図２の下方のダイアグラムＩＩに示したように、構造化生体応答性表面は第２の部分コーティング面によって生成され得るが、ここでコーティング内の表面上に活性化合物を備えるペプチドコーティングの一部だけはコーティングされていない。
【００３８】
図３は、例Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶによって、ヒドロゲルもしくは縮合ポリマー材料中への酵素的に切断可能なペプチドリンカーの組込みを略図により示している。図３の例において示したように、酵素的に切断可能なリンカーは、ヒドロゲルもしくは縮合ポリマー材料の一部であり、切断可能なリンカーは、所望であれば、ヒドロゲルもしくは縮合ポリマー材料の構造の制御された分解を許容する。分解の結果として、材料に結合しているか、または材料中に封入された物体が放出される。
【００３９】
図３における例Ｉは、バイオハイブリッドポリマーからのヒドロゲル／縮合ポリマーの形成について略図により示している。バイオハイブリッドポリマーは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリアクリルアミドなどの非生物学的ポリマーを例えば糖類、タンパク質モジュールおよび／またはＤＮＡエレメントなどの生物学的成分と結合させることによって調製できる。例Ｉは、各末端にペプチド配列を有する星形のポリマーを示している。共有結合した酵素的に分解可能なペプチド配列は、各生物学的成分を星形ポリマー分子の末端に位置する複数のペプチド配列に付着させることによって、バイオハイブリッドポリマーと相互連結する。したがって切断可能なペプチド配列は、ヒドロゲルの一部である。生物学的成分は、したがって材料に付着させられるか、または材料中に封入される。酵素を添加し、それによって生物学的材料からペプチド配列を切断することによって、ヒドロゲル材料は分解され、非生物学的分子上にペプチド配列を残して生物学的成分を放出する。
【００４０】
図３の例ＩＩは、星形ポリマー、例えばスターＰＥＧのヒドロゲルもしくは縮合ポリマー内でのポリマーベース材料の生成を略図により示しているが、ここで酵素的に切断可能なペプチド配列は、複数の星形ポリマー分子の末端を頂点および辺を形成するネットワーク構造に接続する。酵素添加および結果として生じるペプチド配列の切断の後には、個々の星形ポリマーへのネットワーク構造の制御された分解が続き、切断されたペプチド配列の残基は、末端のそれぞれに配列されたペプチドモチーフの形態にある。
【００４１】
図３の例ＩＩＩでは、酵素的に切断可能なペプチド配列は、短い側鎖を備える分枝状ポリマーを有するヒドロゲル／縮合ポリマーの一部であり、分枝状分子は切断可能なペプチド配列を介してそれらの側鎖の末端で一緒に連結されている。酵素添加および結果として生じるペプチド配列の切断に伴って、切断されたペプチド配列のペプチドモチーフを備える個々の分枝状ポリマー内へのネットワーク構造の制御された分解が側鎖の末端で発生し得る。
【００４２】
図３の例ＩＶでは、酵素的に切断可能なペプチド配列は直鎖状ポリマーを備えるヒドロゲル／縮合ポリマーの一部であり、ここでそれらの側鎖の末端にある直鎖状分子は切断可能なペプチド配列を介して一緒に連結され、球を形成する。酵素添加および結果として生じるペプチド配列の切断に伴って、末端に切断されたペプチド配列のペプチドモチーフを有する個々の直鎖状ポリマーへの球構造の制御された分解が発生し得る。
【００４３】
図４は、切断可能なペプチド配列を有する分子リンカーによって材料に結合された有効成分を放出させるための本発明の適用を略図により示している。これは、有効成分の需要に応じた、時間制御された放出を可能にするが、ここで有効成分は、三次元適用として材料の表面もしくは材料フレームワークに付着させられる。
【００４４】
図４のダイアグラムＩは、ヒドロゲルもしくは縮合ポリマーの形態にあるポリマーベース材料の生成を略図により示しているが、ここで星形ポリマー、例えばスターＰＥＧの分子はポリマー分子の末端で酵素切断可能なペプチド配列を含有するリンカー分子によって三次元ネットワーク構造に接続させられる。ネットワーク構造の生成中に有効成分を添加することにより、有効成分の分子はネットワーク構造内に物理的に封入される。酵素添加および結果として生じたペプチド配列の切断に伴って、個々の星形ポリマー内へのネットワーク構造の制御された分解が発生し得るが、切断されたペプチド配列の各残基は次にペプチドモチーフの形態にある星形ポリマーの末端に所在する。ネットワーク構造の分解の結果として、以前に物理的に封入された活性物質がネットワーク構造内に放出される。
【００４５】
図４のダイアグラムＩＩは、バイオハイブリッドポリマーの三次元ネットワーク化材料、好ましくはヒドロゲルもしくは縮合ポリマーの形成を略図で示しているが、ここで共有結合している有効成分を備える酵素的に切断可能なペプチド配列を有する分子は、ネットワーク化材料の表面上に付着させられる。酵素の添加は、共有結合の切断を誘発し、これは切断されたペプチド配列の共有結合したペプチドモチーフを含む有効成分の分子の放出を生じさせる。この方法で、酵素の添加によって制御される有効成分の放出が実行可能になり、これにより三次元ネットワーク（ヒドロゲルもしくは縮合ポリマー）が維持される。
【００４６】
生体直交法による材料分解の方法は、さらに単層の細胞ならびに組織および移植片を生成するために、または三次元適用において使用することができる（図５）。
【００４７】
図５は、その中で増殖させるべき材料がヒドロゲルである、細胞組織単層もしくは移植片を調製するための、生体直交法による材料分解法の適用を略図で示している。このヒドロゲルには、図５に示したように、星形ポリマー成分、糖もしくはグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の形態にある第２成分および切断可能な短鎖ペプチド配列を混合することによって生成されるポリマーネットワークが含まれる。これらの３種の成分は、一緒に星形ポリマーの各末端に１つのペプチド配列を備えるポリマーネットワークを形成する。同一ポリマー分子に連結されていない数個のペプチド配列は、糖もしくはＧＡＧ分子のそれぞれに接続されている。この方法で、ヒドロゲルのためのポリマーネットワークが形成されるが、それらの一部は切断可能なペプチド配列である。切断可能なペプチド配列は、ポリマーベース材料の三次元構造の一部としてこの構造が存在するために必須であるので、ペプチド配列の結合が切断もしくは分解された場合には構造の部分的から完全までの生体直交分解が発生する。細胞は、図５の上方部分に示したように、ヒドロゲル形成後にヒドロゲルに適用され、結果として細胞増殖が生じる。細胞もしくは組織層の形成後または移植片の調製後、ポリマーベース材料と細胞層／組織／移植片／インプラントとの間の接着結合は、制御された酵素添加によって分解され得る。酵素はペプチド配列の共有結合を切断／分解し、結果として三次元材料構造の生体直交分解を生じさせる。ポリマーネットワークは、以前に切断されたペプチド配列の末端ペプチドモチーフならびに糖もしくはＧＡＧ分子を備える、さらに切断されたペプチド配列の付着したペプチドモチーフを備える星形ポリマー分子に分解するので、これにより星形ポリマーおよび糖もしくはＧＡＧは、細胞もしくは組織層または移植片／インプラントから穏やかおよび選択的に脱離される。
【００４８】
図６は、三次元適用における細胞および組織生成のための生体直交法による材料分解の適用を略図で示している。この場合には、ポリマーネットワークは、その４つの末端にそれぞれ短鎖の切断可能なペプチド配列ならびに糖もしくはＧＡＧを有する星形ポリマー成分を混合することによって生成される。同一ポリマー分子に連結されていない数個のペプチド配列は、ネットワーク内でそれぞれ糖もしくはＧＡＧ分子に結合されている（ネットワークの形成）。ネットワーク構造の生成中に細胞を添加することにより、細胞はネットワーク構造内に物理的に組み込まれる。三次元ネットワーク構造は、三次元細胞外マトリックスに類似する、細胞のための安定性フレームワークを提供する。組織の生成に成功した後、組織は三次元担体材料からペプチド配列の制御された酵素的切断によって穏やかに、および選択的に分離することができ、ここで三次元ネットワークは、以前に切断されたペプチド配列および糖もしくはＧＡＧ分子の末端ペプチドモチーフを備える、さらに切断されたペプチド配列の付着したペプチドモチーフを備える星形ポリマー分子に分解する。
【００４９】
本発明は、他の方法では入手できない、生きている細胞、組織、臓器の収集、貯蔵および培養における研究者もしくは医療関係者のための新規なツールを提供する。
【００５０】
下記では、さらに典型的な実施形態について詳細に説明する：
ＰＥＧ−（ＦＸａ）４コンジュゲートの合成は、図７Ａに略図で示したように実施した。ＰＥＧ（ＦＸａ）４コンジュゲートの合成は、以前に刊行物Tsurkan M.V.et al.Defined polymer-peptide conjugates to form cell-instructive starPEG heparin matrices in situ.Adv.Mater.25,2606-2610(2013)に記載されたように実施した。ＦＸａペプチドは、第Ｘａ因子プロテアーゼによって切断可能である部位を有するペプチドであると理解すべきである。
【００５１】
４２７ｍｇのＰＥＧ−マレイミドを１０ｍｌの５０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／水中に短時間溶解させ、１５ｍｌの５０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／水中に溶解させた３００ｍｇのＦＸａペプチド（３０％過剰）と混合した。反応混合物のｐＨは、１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ７．５〜８へ調整した。この反応は窒素雰囲気下で５時間にわたり実施し、反応の完了は分析的ＨＰＬＣによって監視した。反応混合物は分取的ＨＰＬＣによって精製した。生成物をＨＰＬＣから収集し、２４時間超にわたり凍結乾燥させた。形成された白色粉末は、次に−２０℃で貯蔵した。合成スキームおよび反応のＨＰＬＣ監視は、図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃに例示した。
【００５２】
ヒドロゲル形成：
ヒドロゲル形成およびヒドロゲル架橋度の関数としての機械的特性についての略図は、図８Ａおよび８Ｂに示した。ヒドロゲルネットワークは、ペプチド架橋（頂点）の形成を通してマイケル付加反応によって形成される。全ゲル混合物の全固体含量は、架橋度（モル比ＰＥＧ／ＣＳＭａｌ６＝ｃに対応する）とは関係なく、常に５％（５０ｍｇ／ｍｌ）で維持した。一定の総体積を維持しながらＰＥＧ（ＦＸａ）４およびＣＳＭａｌ６の体積比を単純に調整すると、形成されるヒドロゲルの膨潤および剛性についての調整が可能になる。ここで、ＣＳはコンドロイチン硫酸塩の略称であり、Ｍａｌはマレイミドの略称である。
【００５３】
ヒドロゲル分解中のＨＣＥＣ層の形成：
（ＨＣＥＣ）系のＨＣＥＣ−Ｂ４Ｇ１２の不死化ヒト角膜内皮細胞は、公表された文献Valtink M. et al. Two clonal cell lines of immortalized human corneal endothelial cells show either differentiated or precursor cell characteristics. Cells. Tissues. Organs 187, 286-94(2008)に記載されたように、１０ｎｇ／ｍｌのヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を補給したヒト内皮ＳＦＭ（ＳＦＭ＝無血清角膜器官培養培地）中で培養した。ＨＣＥＣは、１ｃｍ２当たり１×１０５細胞の密度でＦＸａ分解性ヒドロゲル上に播種した。細胞は、５％のＣＯ２を含有する３７℃の加湿雰囲気下で保持した。培地は週３回取り替えた。ヒドロゲルの形成およびヒドロゲルの架橋度の機能としての機械的特性については、図９に示した。図９は、ＦＸａ分解性ヒドロゲル上での長期ＨＣＥＣ培養の顕微鏡写真を示している。架橋度がγ＝１．２５であるＦＸａ切断可能ヒドロゲルは、４８時間（２日間）後にほぼ融合した細胞層が形成されたので、ＨＣＥＣ培養手法のために適合することが見いだされた。
【００５４】
ＦＸａ−分解性ヒドロゲル上で７日間培養した後、９００ｎＭの第Ｘａ因子エンドプロテアーゼを含むヒト内皮ＳＦＭ内においてサンプルを３７℃で４５分間にわたりインキュベートした。この時間の経過後、細胞単層が完全に放出されたので、２０ゲージのカニューラ（HSW Fine Ject, Tuttlingen, Germany）を用いて注意深く取り扱うことができた。ヒドロゲル分解中のＨＣＥＣ層形成の光線顕微鏡写真は、追加の図１０および１１Ａに示した。
【００５５】
図１０は、光線顕微鏡写真によって、３７℃で４５０ｎＭの第Ｘａ因子エンドプロテアーゼを含むヒト内皮ＳＦＭ内でのヒドロゲル分解中のＨＣＥＣ層の形成を示している。完全な分解は、１２０分間後に観察することができた。
【００５６】
図１１Ａは、光学顕微鏡写真によって、３７℃で９００ｎＭの第Ｘａ因子エンドプロテアーゼを含むヒト内皮ＳＦＭ内でのヒドロゲル分解中のＨＣＥＣ層形成を光学顕微鏡写真によって示している。完全な分解は、４５分間後に発生した。
【００５７】
図１１Ｂは、形成されたＨＣＥＣ層の様々な例の様々な光線顕微鏡写真を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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