(57)【要約】  本発明は、ペプチドが細胞内分解可能な連結を通して光増感剤と結合された光力学診断または治療用結合体及びそれを含む光力学診断または治療用組成物に関する。本発明の結合体は、光増感剤の蛍光信号と反応性酸素生成能力が消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）されることで、正常組織でまたは血液を循環する間には蛍光信号及び反応性酸素を発生させず、標的細胞内に選択的に摂取された後、細胞内で連結子が分解されてペプチド内に含まれていたトリプトファンと光増感剤との間の距離が離れるようになり、消光作用が消えて強い蛍光信号発生と反応性酸素生成が活発に起こる。従って、本発明に係る結合体は、組織透過性が高く、正常細胞では安全であるのに対し、標的細胞でのみ高い光力学治療効果を示し、背景対比標的信号率の高い良い診断映像を得ることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光増感剤；
トリプトファンを含むペプチド；及び
前記光増感剤及び前記ペプチドを共有結合で連結させる連結子（ｌｉｎｋｅｒ）を含む、結合体。
【請求項２】
前記トリプトファンを含むペプチドは、上皮成長因子受容体１（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ１）、上皮成長因子受容体２（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）、上皮成長因子受容体３（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ３）及び上皮成長因子受容体４（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ４）から選択された１種以上の上皮成長因子受容体と特異的に結合できるものである、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
前記トリプトファンを含むペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載の結合体。
【請求項４】
前記連結子は、線形ジスルフィド結合または環状ジスルフィド結合のものである、請求項１に記載の結合体。
【請求項５】
前記連結子はペプチドであって、アルギニン、リシンまたはその組み合わせであり、前記連結子は、三つ以下のアミノ酸配列で構成されたものである、請求項１に記載の結合体。
【請求項６】
前記トリプトファンを含むペプチドは、トリプトファンがペプチド内に一つ以上三つ以下で連続して存在するものである、請求項１に記載の結合体。
【請求項７】
前記連結子は、ジスルフィド結合及びジアルギニン（ｄｉ−ａｒｇｉｎｉｎｅ）；またはジスルフィド結合及びジリシン（ｄｉ−ｌｙｓｉｎｅ）が環状の形態で光増感剤とペプチドとの間に位置するものである、請求項１に記載の結合体。
【請求項８】
前記結合体は、化１で表示されるものである、請求項１に記載の結合体。
【化１】
2019531258.tif 000017
【請求項９】
前記結合体は、化２で表示されるものである、請求項１に記載の結合体。
【化２】
2019531258.tif 000018
【請求項１０】
前記結合体は、化３で表示されるものである、請求項１に記載の結合体。
【化３】
2019531258.tif 000019
【請求項１１】
前記結合体は、化４で表示されるものである、請求項１に記載の結合体。
【化４】
2019531258.tif 000020
【請求項１２】
前記結合体は、化５で表示されるものである、請求項１に記載の結合体。
【化５】
2019531258.tif 000021
【請求項１３】
前記結合体は、化６で表示されるものである、請求項１に記載の結合体。
【化６】
2019531258.tif 000022
【請求項１４】
前記結合体は、化７で表示されるものである、請求項１に記載の結合体。
【化７】
2019531258.tif 000023
【請求項１５】
請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の結合体を有効成分として含む、光力学診断または治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドが細胞内分解可能な連結を通して光増感剤が結合された光力学診断または治療用結合体及びそれを含む光力学診断または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
光力学治療法（ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ：ＰＤＴ）は、光敏感性物質（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ、以下、光増感剤と称する）を利用して、手術することなく、がん等の難病を治療したり、ニキビ等の病気を治療したりする技術である。このようなＰＤＴは、２０世紀初頭から活発な研究が進行し、現在に至っては、がんの診断と治療、自家骨髄移植、抗菌薬、ＡＩＤＳ治療、皮膚移植手術や関節炎等の治療に免疫性を高めるために使用されており、その応用範囲は、次第に拡大されている。
【０００３】
特に、がんの治療に使用されるＰＤＴは、光に鋭敏な反応を示す物質である光増感剤を体内に投与すると、外部から光を照射した場合、体内の豊富な酸素と外部の光による化学反応で一重項酸素（ｓｉｎｇｌｅｔ  ｏｘｙｇｅｎ）またはフリーラジカル（ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ）が生成し、このような一重項酸素またはフリーラジカルが各種の病変部位やがん細胞の細胞死を誘導して破壊する原理を利用した治療法である。
【０００４】
現在、ＰＤＴ療法に使用されている光増感剤としては、ポルフィリン（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）誘導体、クロリン（ｃｈｌｏｒｉｎ）、バクテリオクロリン（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎ）、フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、５−アミノレブリン酸（５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体等が知られており、光増感剤としてサイクリックテトラピロール誘導体は、がん細胞に選択的に蓄積されるだけではなく、化合物の特徴上、蛍光や燐光を示すので、腫瘍の早期診断試薬にも活用できる特徴がある。また、サイクリックテトラピロール内部に金属が結合されているメタロポルフィリン（ｍｅｔａｌｌｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）の場合には、結合された金属の種類によって様々な特性を示すため、メタロポルフィリンをＭＲＩ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ）時の造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）として利用して、がん細胞のような腫瘍細胞の早期診断に応用されることもあり、最も広く知られた光増感剤である５−アミノレブリン酸誘導体は、使用方法が単純で分子量が小さく、比較的に皮膚浸透が容易であり、副作用が少なくて安全であるという長所がある。
【０００５】
しかし、このような従来に使用されていた光力学診断または治療用光増感剤の場合、がん細胞の蓄積率と標的率が低く、蛍光干渉を起こすことができないため、光を照射するようになると、体内で一般細胞、即ち、正常細胞にも細胞毒性を示すので、治療効果が低く、様々な副作用を誘発する問題点があった。即ち、従来の光力学治療に使用される光増感剤は、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）を帯びており、静脈注射された後にがん組織の他にも皮膚を含む正常組織にも非特異的に蓄積される。これは、腫瘍−対比−背景雑信号比率を悪くして腫瘍部位の映像診断を困難にするだけではなく、光力学治療時、周辺の重要な正常組織にも損傷を与え得る危険性がある。それだけではなく、光力学治療を受けた患者が日光等の明るい光に晒されると、皮膚に蓄積されていた光増感剤からまた反応性酸素が生成して皮膚光敏感性（ｓｋｉｎ  ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）副作用を起こすこととなる。このような理由から、光力学治療後に患者は皮膚等の正常組織に蓄積された光増感剤がなくなるまで暗い室内に最小６週間留まるように勧告されており、これは、患者に不便を引き起こす。光増感剤の親水性を増加させることで皮膚光敏感性の問題を解決しようとする試みがあるが、この場合は、静脈投与された光増感剤の多くの量が小便を通して排出されるため、治療に十分な量の光増感剤が腫瘍組織に蓄積されるためには、遥かに高い容量の光増感剤を投与しなければならない。
【０００６】
このような問題点を解決し、腫瘍選択性を高めるための手段として、がん細胞の表面に過発現されている受容体等と特異的に結合できるペプチドを光増感剤と結合させたペプチド−光増感剤結合体を開発することで、標的とするがん細胞にのみ特異的に光増感剤が入られるようにしようとした。しかし、既存に開発されてきたペプチド−光増感剤結合体は、標的とする細胞の外にある時や細胞の中に入った時のいずれにも蛍光信号を発生し、光毒性を示す短所を依然として有しており、正常細胞に非特異的に吸着された場合にも光を当てると正常細胞に対する光毒性を示す。従って、血液内循環中であるか正常細胞に非特異的に蓄積されたペプチド−蛍光染料またはペプチド光増感剤結合体が小便排出または代謝によって除去されるまで待ってから蛍光映像を得るか光力学治療を施行しなければならない限界があった。しかし、患者によって薬動学的特性が異なるので、最適な映像または光力学治療のための時間を知るのが大変であるという問題があり、腫瘍選択的光力学治療効果を得るのに限界がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明は、従来の蛍光染料及び光増感剤が一般的な細胞透過性に依存してがん細胞の蓄積率と標的率が低く、自家蛍光による腫瘍−対−背景信号比が低下し、個体間の互いに異なる薬動学的特性に影響を受けて滞留時間が顕著に変わり、蛍光活性映像に雑音が生じる点等を解決しようとする。このために、平常時は信号を出せず、標的細胞（例えば、がん細胞）に入った時にのみ選択的に強い蛍光信号を生成する光増感剤−ペプチド結合体を開発し、標的とするがん細胞だけを時間の制限なく高い腫瘍−対−背景信号比で映像検出が可能となるようにしようとする。
【０００８】
また、本発明の分解可能な光増感剤−ペプチド結合体の場合は、標的とする細胞外に存在する時は、反応性酸素を生成できず、標的とする細胞内に摂取されて入った場合にのみ反応性酸素生成が活性化され、標的細胞特異的光力学治療効果を得ることができるようにすることで、正常組織に対する非特異的な損傷を抑制しようとする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記の目的を達成するために、本発明は、光増感剤；トリプトファンを含むペプチド；及び、前記光増感剤及び前記ペプチドを共有結合で連結させる連結子（ｌｉｎｋｅｒ）を含む結合体を提供する。
【００１０】
本発明の一実施例によれば、前記光増感剤と前記ペプチドのトリプトファンの距離は、２ｎｍ以内のものであってよい。前記トリプトファンが光増感剤と２ｎｍ以内に近く位置している時は、トリプトファンと光増感剤との間で光電子伝達（ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）現象が発生するようになり、この時は、光増感剤が消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）されて蛍光信号を発生できず、反応性酸素も生成できないように誘導できる。
【００１１】
本発明の一実施例によれば、トリプトファンと光増感剤との間の距離を２ｎｍ以内となるようにするために使用される連結子は、細胞内で分解が可能な連結子であって、細胞内の還元剤によって分解されるか、細胞内の酵素によって分解されるか、細胞内のｐＨ４〜５．５環境で分解される連結の中から選択されたいずれか一つ以上であってよい。
【００１２】
本発明の一実施例によれば、分解可能連結子；トリプトファンを含むペプチド及び光増感剤の結合体は、特定細胞を標的できる抗体、アプタマー、及びペプチドリガンドにさらに結合させることができ、これは、標的とする細胞に対する特異的摂取能力をさらに向上させることができる。
【００１３】
本発明の一実施例によれば、特定細胞の表面に特異的に結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）できるペプチドリガンド内にトリプトファンが既に含まれている場合は、ペプチドリガンドと光増感剤を分解可能連結子で連結させることができる。
【００１４】
本発明の一実施例によれば、トリプトファンを含むペプチドは、上皮成長因子受容体１（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ１）、上皮成長因子受容体２（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）、上皮成長因子受容体３（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ３）及び上皮成長因子受容体４（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ４）から選択された１種以上の上皮成長因子受容体と特異的に結合できる。
【００１５】
本発明の一実施例によれば、トリプトファンを含むペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するものであってよく、トリプトファンがペプチド内に一つ以上三つ以下で連続して存在するものであってよい。
【００１６】
本発明の一実施例によれば、前記連結子は、線形ジスルフィド結合または環状ジスルフィド結合のものである、結合体であってよい。
【００１７】
本発明の一実施例によれば、前記連結子はペプチドであって、アルギニン、リシンまたはその組み合わせであり、前記ペプチドは、三つ以下のアミノ酸配列で構成されたものであってよく、前記連結子は、ジスルフィド結合及びジアルギニン（ｄｉ−ａｒｇｉｎｉｎｅ）；またはジスルフィド結合及びジリシン（ｄｉ−ｌｙｓｉｎｅ）が環状の形態で光増感剤とペプチドとの間に位置するものであってよく、前記環状の形態は、ジアルギニンまたはジリシンの両末端にシステインを結合させることで、形成させることができる。
【００１８】
本願発明の一実施例によれば、化１〜７で表示される結合体であってよい。
【化１】
2019531258.tif 000003
【化２】
2019531258.tif 000004
【化３】
2019531258.tif 000005
【化４】
2019531258.tif 000006
【化５】
2019531258.tif 000007
【化６】
2019531258.tif 000008
【化７】
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【発明の効果】
【００１９】
本発明の光増感剤−ペプチド結合体で光増感剤とトリプトファンが分解可能な連結を通して２ｎｍ以内の距離を維持している場合は、光増感剤の蛍光信号と反応性酸素生成能力が消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）されることで、正常組織でまたは血液を循環する間には蛍光信号を発生しないだけではなく、反応性酸素を生成することもない。本発明の結合体が標的とする細胞の表面に過発現された抗原と相互作用によって細胞内に選択的に摂取された後には、細胞内で連結子が分解されてペプチド内に含まれていたトリプトファンと光増感剤との間の距離が２ｎｍよりもさらに離れるようになり、消光作用が消えて強い蛍光信号発生と反応性酸素生成が活発に起こる。従って、本発明に係るペプチドを含む光力学診断または治療用結合体は、組織透過性が高く、正常細胞では安全であるのに対し、標的細胞（例えば、がん細胞）でのみ高い光力学治療効果を示し、背景対比標的信号率の高い良い診断映像を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１ａ】分解可能な連結子を含む光増感剤−ペプチド結合体の構造及び特徴を概略的に示す模式図である。
【図１ｂ】分解可能な環状連結子を含む光増感剤−ペプチド結合体の効能を示す模式図である。
【図１ｃ】分解可能な線形連結子を含む光増感剤−ペプチド結合体の効能を示す模式図である。
【図２】本発明の光増感剤に対するトリプトファンの消光効果を示す実験結果である（図２Ａ：Ｃｈｌｏｒｉｎ  ｅ４（Ｃｅ４）の濃度を濃度５μＭに固定させ、トリプトファンの濃度を増加させながらトリプトファンが添加されなかった時の蛍光信号（Ｆ0）に対するトリプトファンが添加された時の蛍光信号（Ｆ）の比率を求めたものである（λEx.４００ｎｍ、λEm.６６５ｎｍ）；図２Ｂ：Ａｌ（III）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＡｌＰｃＳ４）の濃度を濃度５μＭに固定させ、トリプトファンの濃度を増加させながらトリプトファンが添加されなかった時の蛍光信号（Ｆ0）に対するトリプトファンが添加された時の蛍光信号（Ｆ）の比率を求めたものである（濃度５μＭ、λEx.６６０ｎｍ、λEm.６９０ｎｍ））。
【図３】本発明の実施例２において合成された環状ジスルフィド結合連結子を含む光増感剤−ペプチド結合体であるＣ−ＥＧＦＲの質量分析資料である。
【図４Ａ】本発明の実施例２において合成された環状ジスルフィド結合連結子を含む光増感剤−ペプチド結合体であるＣ−ＥＧＦＲと自由染料のＵＶ／ｖｉｓ吸収スペクトルを比較したものである。
【図４Ｂ】本発明の実施例２のＣ−ＥＧＦＲをＰＢＳ水溶液で処理した場合、還元剤であるｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）２μＭの濃度で４時間処理した場合、ＤＴＴ５ｍＭの濃度で４時間処理した場合の蛍光スペクトル変化をそれぞれ観察したものである（λEx.４００ｎｍ）。
【図４Ｃ】実施例２のＣ−ＥＧＦＲをＰＢＳ水溶液、還元剤であるｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）で２μＭ及び５ｍＭの濃度で処理し、時間による蛍光スペクトル変化を（λEx.４００ｎｍ、λEm.６６５ｎｍ）それぞれ観察したものである。
【図４Ｄ】実施例２のＣ−ＥＧＦＲをＰＢＳ水溶液、ＤＴＴ２μＭ及び５ｍＭでそれぞれ処理し、６７０ｎｍのレーザを照射しながら一重項酸素生成を分析したグラフである。
【図５】実施例２において使用されたヒト正常細胞株（ＰＣＡ−ＳＭＣ）及びヒト乳がん細胞株（ＨＣＣ７０）での上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の発現量をフローサイトメトリーで分析した結果である（ＰＣＡ−ＳＭＣ細胞は、ＥＧＦＲ陰性細胞株であり、ＨＣＣ７０細胞は、ＥＧＦＲ陽性細胞株であることを確認する）。
【図６】本発明の実施例２のＣ−ＥＧＦＲ及び自由染料Ｃｅ４をＨＣＣ７０細胞に処理した後、洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）過程なしに時間帯別に近赤外線蛍光映像を撮った写真である（λEx.６４０±１５ｎｍ、λEm.６９０±２５ｎｍ）。
【図７】本発明の実施例２のＣ−ＥＧＦＲを正常細胞株であるＰＣＡ−ＳＭＣとヒト乳がん細胞株であるＨＣＣ７０にそれぞれ４時間の間処理した後、リソソームを染色するＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒをさらに処理し、共焦点レーザ顕微鏡（ＣＬＳＭ）で撮影した蛍光写真である（λEx.４０５ｎｍ、λEm.６２５〜７５４ｎｍ）。
【図８Ａ】実施例２のＣ−ＥＧＦＲに対する細胞毒性を分析するために、ヒト乳がん細胞株であるＨＣＣ７０にＣ−ＥＧＦＲを様々な濃度で処理し、細胞生存率を求めた資料である。
【図８Ｂ】実施例２のＣ−ＥＧＦＲに対する標的細胞特異的光力学治療効果を検証するために、ＰＣＡ−ＳＭＣ細胞とＨＣＣ７０細胞に様々な濃度で４時間の間処理して洗浄した後、６７０ｎｍのレーザを照射して光力学治療を施行し、細胞生存率を分析した資料である。
【図９】本発明の実施例３において合成された線形ジスルフィド結合連結子を含む光増感剤−ペプチド結合体であるＬ−ＥＧＦＲの質量分析資料である。
【図１０Ａ】実施例３において合成された線形ジスルフィド結合連結子を含む光増感剤−ペプチド結合体であるＬ−ＥＧＦＲと自由染料Ｃｅ４のＵＶ／ｖｉｓ吸光スペクトルを示す資料である。
【図１０Ｂ】実施例３のＬ−ＥＧＦＲ結合体をリン酸緩衝（ＰＢＳ）水溶液、ＤＴＴに２μＭ及び５ｍＭで４時間の間処理した後に得た蛍光スペクトルである（λEx.４００ｎｍ；比較のために同じ濃度の自律染料Ｃｅ４に対する蛍光スペクトルを示している）。
【図１０Ｃ】実施例３のＬ−ＥＧＦＲ結合体をＰＢＳ水溶液、ＤＴＴに２μＭ及び５ｍＭで処理した後、蛍光強度の変化を時間によって測定した資料である（λEx.４００ｎｍ、λEm.６６５ｎｍ）。
【図１０Ｄ】実施例３のＬ−ＥＧＦＲ結合体をＰＢＳ水溶液、ＤＴＴに２μＭ及び５ｍＭで４時間の間それぞれ処理し、６７０ｎｍのレーザを照射しながら一重項酸素生成を分析したグラフである。
【図１１】実施例３のＬ−ＥＧＦＲ結合体が血清が存在する条件で蛍光消光効果が安定的に維持されるかを観察するために、ＲｅｄｏｘＴを血清が含まれたリン酸緩衝水溶液に溶かし、時間帯別に蛍光変化を測定した結果である。
【図１２Ａ】ヒト正常細胞株ＰＣＡ−ＳＭＣ、ヒト乳がん細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８での上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の発現を免疫細胞染色を通して分析した資料である（核は、青色に染色され、細胞表面のＥＧＦＲは、緑色に染色されている）。
【図１２Ｂ】実施例３のＬ−ＥＧＦＲ結合体をＰＣＡ−ＳＭＣ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞株にそれぞれ時間別に処理して得た共焦点レーザ顕微鏡写真である（λEx.４０５ｎｍ、λEm.６２５〜７５４ｎｍ）。
【図１３】実施例３のＬ−ＥＧＦＲ結合体をＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒと共にＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に処理した共焦点レーザ顕微鏡写真である。
【図１４Ａ】実施例３のＬ−ＥＧＦＲ結合体に対する細胞毒性を分析するために、ヒト乳がん細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−４６８にＲｅｄｏｘＴを様々な濃度で処理し、細胞生存率を求めた資料である。
【図１４Ｂ】実施例３のＬ−ＥＧＦＲ結合体に対する標的細胞特異的光力学治療効果を検証するために、ＰＣＡ−ＳＭＣ細胞とＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞にＲｅｄｏｘＴを様々な濃度で４時間の間処理して洗浄した後、６７０ｎｍのレーザを照射して光力学治療を施行し、細胞生存率を分析した資料である。
【図１５Ａ】本発明の実施例４の光増感剤−ペプチド結合体であるＣｅ４−ＲＲＷに対する質量分析資料である。
【図１５Ｂ】本発明の実施例４の光増感剤−ペプチド結合体であるＣｅ４−ＲＲＷＷに対する質量分析資料である。
【図１５Ｃ】本発明の実施例４の光増感剤−ペプチド結合体であるＣｅ４−ＲＲＷＷＷに対する質量分析資料である。
【図１５Ｄ】本発明の実施例４の光増感剤−ペプチド結合体であるＣｅ４−ＲＷＲに対する質量分析資料である。
【図１６Ａ】本発明の実施例４のＣｅ４−ＲＲＷ、Ｃｅ４−ＲＲＷＷ、Ｃｅ４−ＲＲＷＷＷ、Ｃｅ４−ＲＷＲ及び自由染料であるＣｅ４のＵＶ／ｖｉｓ吸収スペクトル資料である。
【図１６Ｂ】本発明の実施例４のＣｅ４−ＲＲＷ、Ｃｅ４−ＲＲＷＷ、Ｃｅ４−ＲＲＷＷＷ、Ｃｅ４−ＲＷＲ及び自由染料であるＣｅ４の蛍光スペクトル（λEx.４００ｎｍ）資料である。
【図１７】本発明の実施例４のＣｅ４−ＲＲＷＷとＣｅ４−ＲＲＷＷＷにトリプシン酵素をそれぞれ処理した後、時間による蛍光増加を６６５ｎｍで観察したグラフ（λEx.４００ｎｍ）である。
【図１８】本発明の実施例４の光増感剤−ペプチド結合体であるＣｅ４−ＲＲＷを血清が含まれたリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶かした後、時間帯別に蛍光変化を測定して血清内の安定性を測定したグラフである。
【図１９】本発明の実施例４の光増感剤−ペプチド結合体であるＣｅ４−ＲＲＷががん細胞内で蛍光活性化を示すかを分析するために、結合体をＫＢがん細胞株に３０分、１時間、２時間及び４時間処理して得た共焦点レーザ顕微鏡写真である。
【図２０】本発明の実施例４の光増感剤−ペプチド結合体であるＣｅ４−ＲＲＷをＫＢがん細胞株に処理し、細胞内のリソソームを染色できるＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒをさらに蛍光染色した後に得た共焦点レーザ顕微鏡写真である（還元剤の濃度が高く存在するリソソームと光増感剤の蛍光が重なることを確認しており、それは結合体がリソソーム内の還元剤によって分解されて蛍光活性化が起こったことを示す）。
【図２１】本発明の実施例５の光増感剤−ペプチド結合体であるＣｅ４−ＣＲＲＣＷの質量分析資料である。
【図２２Ａ】本発明の実施例５の光増感剤−ペプチド結合体であるＣｅ４−ＣＲＲＣＷと自由染料Ｃｅ４のＵＶ／ｖｉｓ吸光スペクトル資料である。
【図２２Ｂ】本発明の実施例５の光増感剤−ペプチド結合体であるＣｅ４−ＣＲＲＣＷと自由染料Ｃｅ４の蛍光スペクトル（λEx．４００ｎｍ）である。
【図２３】本発明の実施例５の光増感剤−ペプチド結合体であるＣｅ４−ＣＲＲＣＷを還元剤であるＤＴＴ及びカテプシン酵素単独及び複合処理して得た蛍光スペクトル資料である（λEx.４００ｎｍ；カテプシン酵素（カテプシンＢ、Ｓ、Ｌ及び抑制剤であるＥ６４が先処理されたカテプシンＢ）は、Ｃｅ４−ＣＲＲＣＷに６時間の間それぞれ処理し、還元剤であるＤＴＴは、２μＭ及び５ｍＭの濃度でＣｅ４−ＣＲＲＣＷに単独で処理するか、またはＤＴＴ５ｍＭ及びカテプシンＢをＣｅ４−ＣＲＲＣＷに共に処理して蛍光スペクトルを分析する）。
【図２４】本発明の実施例５の光増感剤−ペプチド結合体であるＣｅ４−ＣＲＲＣＷをＳＣＣ７がん細胞株に２時間、４時間、６時間の間処理してそれぞれ得た共焦点レーザ顕微鏡写真である。
【図２５】本発明の実施例５の光増感剤−ペプチド結合体であるＣｅ４−ＣＲＲＣＷをＳＣＣ７細胞に処理し、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒを使用してリソソームをさらに染色した後に得た共焦点レーザ顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
上述の目的を達成するための本発明は、トリプトファン、またはトリプトファンを含んでいるペプチドが細胞内分解可能な連結を通して光増感剤と結合された光力学診断または治療用結合体及びそれを含む光力学診断または治療用組成物を提供する。
【００２２】
前記「治療」とは、特に断らない限り、前記用語が適用される疾患または疾病、または前記疾患または疾病の一つ以上の症状を逆転させるか、緩和させるか、その進行を抑制するか、または予防することを意味し、本願において使用された前記「治療」という用語は、「治療する」が前記のように定義されるとき、治療する行為をいう。
【００２３】
本発明において、トリプトファンの主要機能は、結合された光増感剤との３次元上での距離が２ｎｍ以内にある時には消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）剤として作用することで結合体から蛍光信号を発生できないようにするだけではなく、治療用反応性酸素も発生できないように抑制させる。結合体が標的とする細胞内に摂取された後には、結合体内の連結子が細胞内で分解されてトリプトファンと光増感剤との間の距離が２ｎｍ以上に離れるようになり、トリプトファンによる消光作用がなくなる。この時からは強い蛍光信号を発生して標的細胞特異的蛍光映像診断を可能とし、反応性酸素の生成も活発に起こることで選択的光力学治療を可能とする。特に、分解可能連結子で結合されたトリプトファンと光増感剤結合体を特定細胞に結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）できる抗体、ＲＮＡまたはＤＮＡアプタマー、ペプチドリガンド、ナノ粒子等にさらに結合させた場合は、標的とする細胞に対する特異性をさらに向上させることができる。
【００２４】
特定細胞と特異的結合が可能なペプチド自体がトリプトファンを含んでいる場合は、このようなペプチドと光増感剤を分解可能連結子で結合させることで、トリプトファンと光増感剤との間の距離を２ｎｍ以内となるように誘導でき、この時にも光増感剤の消光現象を得ることができる。このように消光された蛍光染料（または光増感剤）とペプチド結合体は、標的とするがん細胞及び炎症細胞の表面にペプチドが特異的に結合することで、ペプチド−光増感剤結合体が標的とする細胞内にのみ摂取され、標的とする細胞内に入った後には連結子が分解されてトリプトファンと蛍光染料（または光増感剤）との間の距離が２ｎｍ以上に離れるようになり、トリプトファンによる消光作用がなくなる。この時からは強い蛍光信号を発生して標的細胞特異的蛍光映像診断を可能とし、反応性酸素の生成も活発に起こることで選択的光力学治療を可能とする。
【００２５】
前記細胞内分解可能な連結とは、細胞内環境、例えば、酵素、信号因子、還元剤、ｐＨ等によって分解され得ることを意味し、より具体的には、リソソーム内で分解されるものであってよい。従って、前記細胞内分解可能な連結は、細胞内の酵素により分解される連結、細胞内の還元剤により分解される連結、または細胞内の低いｐＨにより分解される結合の中から選択されたいずれか一つ以上であってよい。
【００２６】
本発明の光力学診断または治療用結合体に含まれた連結子を分解する酵素は、カテプシン（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ）及びエステラーゼ（ｅｓｔｅｒａｓｅｓ）の中から選択されたいずれか一つまたは複合であってよく、前記カテプシンは、カテプシンＢ、カテプシンＬ及びカテプシンＳの中から選択されたいずれか一つ以上の酵素であってよい。例えば、リソソーム内に存在するカテプシンＢ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂ）により分解されるアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）またはリシン（ｌｙｓｉｎｅ）からなる結合であるか、またはエステラーゼにより分解されるエステル（ｅｓｔｅｒ、−ＣＯＯ−）結合またはチオエステル（ｔｈｉｏｅｓｔｅｒ、−ＣＯＳ−）結合であってよい。
【００２７】
本発明の光力学診断または治療用結合体に含まれた連結子を分解可能な細胞内の還元剤は、グルタチオン、スルフヒドリル及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の中から選択された一つ以上であってよく、例えば、リソソーム内のグルタチオンによって分解され得るジスルフィド（ｄｉ−ｓｕｌｆｉｄｅ）結合であってよい。グルタチオンの場合、血液を含む細胞外の領域では約２μＭの濃度であり、がん細胞内では１０ｍＭの高い濃度で存在すると知られている。
【００２８】
本発明の作用についての模式図は、図１に示している。図１Ａは、分解可能な連結子を含む光増感剤−ペプチド結合体の構造及び特性を概略的に示す模式図である。光増感剤とトリプトファンまたは光増感剤とトリプトファンを含有するペプチドは、細胞内分解可能な連結子を通して結合されており、トリプトファンによる光増感剤の消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）効果を極大化するために、トリプトファンと光増感剤との間の距離は、２ｎｍ以内であることを特徴とする。より好ましくは、３次元立体上での距離は、２ｎｍ以内であってよい。前記細胞内分解可能な連結子が標的とする細胞内で切断されてトリプトファンと光増感剤の距離が２ｎｍよりもさらに離れた場合は、トリプトファンによる消光効果が消えて光増感剤から強い蛍光信号が発生し、光力学治療効果を示すことができるようになる（図１Ｂ及び図１Ｃ）。連結子は、細胞内の酵素または還元剤の単独または複合作用によって分解され得る。
【００２９】
本発明に係る光力学診断または治療用結合に使用される光増感剤は、当該分野で通常の技術者が適用できる光増感剤が適用され得る。例えば、ポルフィリン類（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ）、クロリン類（ｃｈｌｏｒｉｎｓ）、フェオホルビド類（ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅｓ）、バクテリオクロリン類（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎｓ）、ポルフィセン類（ｐｏｒｐｈｙｃｅｎｅｓ）、フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ）からなる群から選択されたポルフィリン系化合物；またはヒペリシン（ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ローズベンガル（ｒｏｓｅ  ｂｅｎｇａｌ）、プソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）、フェノチアジニウム（ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｕｍ）系染料及びメロシアニン（ｍｅｒｏｃｙａｎｉｎｅ）からなる群から選択された非ポルフィリン系化合物からなる群の中から使用され得、これに制限されることはない。より具体的には、遊離塩基または金属錯体形態のヘマトポルフィリン（ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ）、ポルフィセン（ｐｏｒｐｈｙｃｅｎｅｓ）、フェオホルビド（ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅｓ）、プルプリン（ｐｕｒｐｕｒｉｎｓ）、クロリン（ｃｈｌｏｒｉｎｓ）、プロトポルフィリン（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ）、フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ）からなる群から選択されたポルフィリン系化合物；またはヒペリシン（ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、アトー（ＡＴＴＯ）、ローズベンガル（ｒｏｓｅ  Ｂｅｎｇａｌ）、プソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）、フェノチアジニウム（ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｉｕｍ）系染料及びメロシアニン（ｍｅｒｏｃｙａｎｉｎｅ）からなる群から選択された非ポルフィリン系化合物からなる群から選択されるものを単独または複合的に使用できる。
【００３０】
本発明は、本発明の結合体ががん組織に選択的に蓄積される場合、がん細胞内の還元剤または酵素作用等により蛍光干渉が解け、レーザ照射によりがん細胞でのみ光増感剤が蛍光発色を示すことができるため、このような蛍光の有無を通してがんを診断できる。また、抑制されていた反応性酸素生成がまた活性化されて標的細胞特異的光力学治療効果を得ることができるようになる。
【００３１】
本発明は、上述の光力学診断または治療用結合体を含む光力学診断または治療用組成物を提供する。
【００３２】
本発明に係る前記光力学治療用組成物は、薬学的に有効な量の本発明の光力学診断または治療用結合体を単独で含むか、または一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含むことができる。前記にて薬学的に有効な量とは、病気の症状を予防、改善及び治療するに十分な量をいう。
【００３３】
本発明に係る光力学診断または治療用結合体の薬学的に有効な量は、０．５〜１００ｍｇ／ｄａｙ／体重ｋｇ、好ましくは、０．５〜５ｍｇ／ｄａｙ／体重ｋｇである。しかし、前記薬学的に有効な量は、疾患症状の程度、患者の年齢、体重、健康状態、性別、投与経路及び治療期間等によって適宜変化し得る。
【００３４】
前記にて薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とは、生理学的に許容され、ヒトに投与されるとき、通常、胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはそれと類似した反応を起こさない組成物をいう。前記担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤等をさらに含むことができる。
【００３５】
また、本発明の組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延された放出を提供できるように当業界に公知になった方法を使用して剤形化され得る。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアゾール、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末の形態であってよい。
【００３６】
本発明に係る光力学治療用組成物は、経口、経皮、皮下、静脈または筋肉を含む様々な経路を通して投与され得、活性成分の投与量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重及び患者の重症度等の様々な因子によって適宜選択され得る。
【００３７】
また、本発明に係る結合体または前記結合体を含む組成物を利用して疾病を治療または診断する場合、使用できる光源としては、これに制限されることはないが、超音波照射放出器、光放出ダイオード、レーザダイオード、染料レーザ、ハロゲン化金属ランプ、フラッシュランプ、機械的にフィルタリングされた蛍光光源、機械的にフィルタリングされた白熱、及びフィラメント光源からなる群の中から選択された生体外光照射のための光源；及び光力学治療用レーザファイバー等の生体内光照射のための光源からなる群の中から選択された一つ以上のものを使用することができ、本発明において、前記光増感剤は、６００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の近赤外線光線で活性を示すことができる。
【実施例】
【００３８】
以下においては、実施例を通して本発明をさらに詳細に説明する。ただし、これらの実施例は、専ら本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されることはないといえる。
【００３９】
［実施例１］トリプトファンによる光増感剤の消光効果分析
【００４０】
光増感剤に対するトリプトファンの消光効果を確認する実験を遂行した。
【００４１】
より具体的には、光増感剤とトリプトファンとの間の距離が近くなるにつれて消光作用が起こることを確認するために、代表的なクロリン及びシアニン系の光増感剤であるＣｈｌｏｒｉｎ  ｅ４（Ｃｅ４）とＡＩＰｃＳ４Ａｌ（III）（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）を使用して分析を進行した。Ｃｅ４とＡｌＰｃＳ４の濃度を濃度５μＭに固定し、トリプトファンの濃度を増加させながらトリプトファンが添加されなかった時の蛍光信号（Ｆ0）に対するトリプトファンが添加された時の蛍光信号（Ｆ）の比率を求めた（Ｃｅ４：λEx.４００ｎｍ、λEm.６６５ｎｍ；ＡｌＰｃＳ４：λEx  ６６０ｎｍ、λEm.６９０ｎｍ）。その結果を図２に示した。
【００４２】
図２ａ及び図２ｂによれば、トリプトファンの濃度が増加されるにつれて光増感剤の蛍光発生が顕著に抑制されることが分かり、これは、光増感剤とトリプトファンの距離が十分に近くなる場合は、光増感剤がトリプトファンによって消光されることを意味する。
【００４３】
［実施例２］環状二硫化結合連結子を含む光増感剤−ペプチド結合体（Ｃ−ＥＧＦＲ）の製造及び特性分析
【００４４】
実施例２においては、ペプチドリガンド内に含有されたトリプトファンと光増感剤との間の距離を調節することで、光増感剤の消光効果を調節できるかを分析する実験を実施した。トリプトファンを含有するペプチドリガンドの例として、がん細胞の表面で過発現された上皮成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＥＧＦＲ）と特異的に結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）できるものと知られたＧＥ１１ペプチド（ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ；配列番号１）を選択し、光増感剤としては、ｃｈｌｏｒｉｎ  ｅ４（Ｃｅ４）を使用した。分解可能連結子としては、細胞内で高い濃度で存在する還元剤によって分解可能な二硫化結合が環状に挿入されたものを選択した。
【００４５】
２．１．環状二硫化結合連結子を含む光増感剤−ペプチド結合体（Ｃ−ＥＧＦＲ）の合成
【００４６】
Ｃ−ＥＧＦＲの合成のために、ＡＳＰ４８Ｓ（Ｐｅｐｔｒｏｎ  Ｉｎｃ、米国）を用いたＦｍｏｃ固相ペプチド合成法（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＳＰＰＳ）を通してペプチドを製造し、製造過程は、次のとおりである。
【００４７】
Ｈ−Ｉｌｅ−２−ｃｈｌｏｒｏ−Ｔｒｉｔｙｌレジン（Ａｎａｓｐｅｃ、米国）に保護基（Ｆｍｏｃ）が結合されたアミノ酸８当量及び２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール（Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ）−１−ｙｌ）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート［２−（１Ｈ−Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＨＢＴＵ］８当量／Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ、ＨＯＢｔ）８当量／４−メチルモルホリン（Ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ、ＮＭＭ）１６当量をジメチルホルムアミド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｎｄｅ、ＤＭＦ）に溶かして添加して２時間の間室温で反応した後、ＤＭＦ、メタノール及びＤＭＦの順に洗浄した。
【００４８】
アミノ酸に付いている保護基Ｆｍｏｃを分離するために、前記反応液に２０％のピペリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）を含有するＤＭＦを加えて室温で５分間２回反応させた後、ＤＭＦ、メタノール及びＤＭＦの順に洗浄した。前記過程を繰り返してペプチド基本骨格にレジンが結合された［Ｈ−ｍｉｎｉＰＥＧ２−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−２−ｃｈｌｏｒｏ−Ｔｒｉｔｙｌ  Ｒｅｓｉｎ］構造体を合成した。
【００４９】
前記レジン−ペプチド基本骨格結合体にＣｅ４４当量及びＨＢＴＵ４当量／ＨＯＢｔ４当量／ＮＭＭ８当量をジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）に溶かして添加した後、前記混合液を１２時間の間反応させてサクションした後、ＤＭＦ、メタノール及びＤＭＦの順に洗浄した。
【００５０】
前記過程を通して合成しようとするペプチド骨格が形成されると、トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、ＴＦＡ）／１，２−エタンジチオール（１，２−ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ、ＥＤＴ）／チオアニソール（ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）／トリイソプロピルシラン（ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ、ＴＩＳ）／水を９０／２．５／２．５／２．５／２．５に希釈した溶液を処理して前記にて生成されたペプチド残基の保護基を除去し、ペプチドをレジンから分離して［Ｃｅ４−ｍｉｎｉＰＥＧ２−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｉｌｅ］を生成する。
【００５１】
その後、反応液に１０倍の冷たいジエチルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ）を加えてペプチドを沈殿させ、１０分間３０００ｒｐｍで遠心分離する。ろ液を捨てて２回繰り返す。前記にて得た結合体は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）を遂行して精製した。
【００５２】
ペプチド内の環状ジスルフィド結合のために精製されたペプチドを０．１％の酢酸アンモニウム溶液に溶かして２４時間の間強く撹拌した。反応の進行状況をＨＰＬＣとＬＣ／ＭＳを使用して確認した。反応が完了したことを確認した後、Ｖｙｄａｃ  Ｃ４、５ｕ、３００  Ａカラム（４．６×５０ｍｍ）を使用した逆相ＨＰＬＣを遂行して精製した。ＴＦＡ０．１％を含有する３０〜６０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル溶液を利用する水−アセトニトリル線形グラディエントを使用して溶出した。
【００５３】
前記によって製造されたＣ−ＥＧＦＲ結合体の化学構造は、下記化１のとおりである。即ち、光増感剤とＥＧＦＲ標的ペプチドであるＧＥ１１が環状ジスルフィド結合を通して結合されており、環状構造形態によって光増感剤であるＣｅ４がトリプトファンと近い所に位置するようになるだけではなく、環状結合による移動性（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）の制限によってＣｅ４がトリプトファンと近い所に位置し続けているように誘導される。
【化１】
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【００５４】
２．２．環状Ｃ−ＥＧＦＲ結合体の特性
【００５５】
１）分子量測定及び蛍光放出特性分析
【００５６】
合成及び精製されたＣ−ＥＧＦＲの分子量は、ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  １１００シリーズ、米国）を使用して測定し、吸光度は、ＵＶ／Ｖｉｓ吸光スペクトロメータ（ＤＵ３７０、米国）を使用して測定した。
【００５７】
評価の結果、前記得た精製された本発明の結合体、即ち、Ｃ−ＥＧＦＲ結合体の分子量は、２，４２３ｇ／ｍｏｌであり（図３）、最高吸光ピークは、２８２，４０２及び６６５ｎｍで現れた（図４Ａ）。４０２ｎｍで励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）時に６６１ｎｍで最大発光ピークを示した（図４Ｂ参照）。
【００５８】
２）還元剤処理による蛍光信号及び反応性酸素発生回復分析
【００５９】
還元剤処理によって蛍光及び反応性酸素発生が増加するかを分析した。前記にて得たＣ−ＥＧＦＲ結合体をリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ、６．７ｍＭ、ｐＨ７．４、１５４ｍＭ  ＮａＣｌ）に２μＭとなるように溶かした後、多機能マイクロプレートリーダー（Ｓａｆｉｒｅ  ２、Ｔｅｃａｎ社、スイス）に入れて蛍光スペクトル（λEx.４００ｎｍ、λEm.６５０〜８５０ｎｍ）結果を得た。還元剤であるＤｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）処理試料には、２μＭの結合体にＤＴＴ２μＭと５ｍＭを混合し、緩衝液処理群には、同量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を混合した。前記混合液（２００μｌ）の蛍光強度を３０分間隔で４時間の間測定した（λEx.４００ｎｍ、λEm.６６５ｎｍ）。
【００６０】
一重項酸素生成（ｓｉｎｇｌｅｔ  ｏｘｙｇｅｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＳＯＧ）は、下記のような方法で測定した。前記にて得たＣ−ＥＧＦＲ結合体をＰＢＳに２μＭとなるように溶かした後、ＤＴＴ処理試料には、２μＭと５ｍＭのＤＴＴをそれぞれ混合し、緩衝液処理群には、同量のＰＢＳを混合した。前記混合液（２００μｌ）を４時間の間３７℃で培養した。以後、濃縮されたＳｉｎｇｌｅｔ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｇｒｅｅｎ（ＳＯＳＧ）を含有する酸素飽和ＰＢＳを混合した後、最終ＳＯＳＧの濃度を５μＭに調整した。前記試料の光照射（光照射量５０ｍＷ／ｃｍ2）の間、ＳＯＳＧの蛍光強度変化を６７０ｎｍ連続波長レーザ装置を使用して周期的に測定した。
【００６１】
図４によれば、Ｃ−ＥＧＦＲ結合体だけが存在する時は蛍光が出ないが（ＯＦＦ状態）、５ｍＭのＤＴＴ処理時には二硫化結合が分解されて光増感剤固有の蛍光を示すこと（ＯＮ状態）を確認した（図４Ｂ）。５ｍＭの濃度のＤＴＴ処理によって蛍光強度は何と３．４倍に非常に増加し、特に反応が始まって３０分ぶりに蛍光が速く回復し、２時間以後には安定状態を維持した（図４Ｃ）。また、ＤＴＴを処理しないか細胞外還元剤濃度である２μＭのＤＴＴを処理した時には一重項酸素の生成が抑制されていたが、５ｍＭのＤＴＴを処理時には二硫化結合が分解されて消光が解消され、一重項酸素生成が５倍増加した（図４Ｄ）。従って、本発明のＣ−ＥＧＦＲ結合体は、標的細胞内に摂取されたとき、環状二硫化結合が切れて蛍光と一重項酸素の生成が活性化されることが分かる。
【００６２】
３）細胞培養
【００６３】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を過発現するヒト乳がん細胞株ＨＣＣ７０とＥＧＦＲを発現しないヒト正常細胞株ＰＣＡ−ＳＭＣ（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｏｒｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌｓ）はいずれもＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、米国）から得た。
【００６４】
前記ＨＣＣ７０細胞は、ウシ胎児血清１０％及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１％を含むＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０培地で３７℃、５％の二酸化炭素及び標準湿度条件下で培養した。ＰＣＡ−ＳＭＣ細胞は、組換えヒトインスリン、アスコルビン酸、グルタミン、組換えヒト上皮成長因子、ウシ胎児血清１０％を含む血管細胞基底培地で３７℃、５％の二酸化炭素及び標準湿度条件下で培養した。
【００６５】
４）フローサイトメトリーを用いたＥＧＦＲ発現量測定
【００６６】
標的タンパク質であるＥＧＦＲの各細胞別の発現量をフローサイトメトリーを通して測定した。ＰＣＡ−ＳＭＣとＨＣＣ７０細胞を３×１０5個ずつ入れて４％のパラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を含有するリン酸緩衝液で固定し、３回洗浄する。固定された細胞は、ＥＧＦＲ抗体（４μｇ／１ｍＬ  ｉｎ  １％  ＢＳＡ／０．２５％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）と３０分間反応し、冷たいリン酸緩衝液で洗浄する。その後、蛍光染料であるＦＩＴＣが結合された２次抗体（１：１００希釈）と３０分間反応した後、冷たいリン酸緩衝液でもう一回洗浄してフローサイトメトリーで分析することで、細胞表面に発現されているＥＧＦＲの程度を検証した（図５）。
【００６７】
５）蛍光消光及び蛍光回復のリアルタイム観察
標的細胞外では蛍光信号発生が消光されている本発明のＣ−ＥＧＦＲ結合体が標的細胞の中に摂取された後には強い蛍光を発生することを検証しようとした。ＥＧＦＲ過発現ＨＣＣ７０細胞に前記Ｃ−ＥＧＦＲ結合体及び自由光増感剤（Ｃｅ４）を処理した後、洗浄することなく一定の時間の間隔で蛍光写真を得た。具体的な方法は、次のとおりである。
【００６８】
１２−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）に各ｗｅｌｌ毎にＨＣＣ７０細胞を１×１０6個ずつ入れて細胞がよく吸着するように２４時間の間培養した後、Ｃ−ＥＧＦＲ結合体及び自由光増感剤を混合して希釈した。以後、既存の培地を結合体及び自由光増感剤を含む新鮮な培地０．５ｍｌに取り替えた。以後、細胞を洗浄せずに、Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社、ドイツ）を使用して４時間の間１５分の間隔でそれぞれの近赤外光蛍光映像（λEx.６４０±１５ｎｍ、λEm.６９０±２５ｎｍ）を得た。
【００６９】
図６によれば、Ｃ−ＥＧＦＲ結合体を処理した時は、細胞外では蛍光信号発生が抑制されていたが、細胞表面に存在するＥＧＦＲに結合体が結合して細胞内に摂取された後には、強い蛍光信号を発生して各細胞の位置を蛍光映像から確認できることが分かった。これは、細胞外では消光されていた結合体が細胞の中ではジスルフィド結合が分解されて消光効果が消えるようになり、この時からは明るい蛍光信号を発生するということを示す。これに対して、自由光増感剤を処理した場合、蛍光信号発生が常に活性化されているので、細胞外で発生する強い蛍光信号による高い背景信号のため、がん細胞の位置を蛍光映像から区分できないことが分かる。
【００７０】
６）結合体の特異的細胞摂取及びそれによる蛍光活性
【００７１】
ＰＣＡ−ＳＭＣ細胞及びＨＣＣ７０細胞を８−ｗｅｌｌ  Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバに各ｗｅｌｌ毎にＰＣＡ−ＳＭＣ細胞は５×１０3個、ＨＣＣ７０細胞は５×１０4個ずつ入れて細胞がよく吸着するように２４時間の間培養した。以後、既存の培地をＣ−ＥＧＦＲ結合体（２μＭ）を溶かした新鮮な培地２００μｌに取り替えた後、前記細胞を４時間の間培養した。
【００７２】
最終的に、培養培地で細胞を３回洗浄した後、共焦点レーザ顕微鏡（ＣＬＳＭ．ＺＥＩＳＳ  ＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ、ドイツ）を使用して近赤外光蛍光イメージ（λEx.４０５ｎｍ、λEm.６２５〜７５４ｎｍ）を得た。
【００７３】
本発明のＣ−ＥＧＦＲ結合体の細胞内位置を把握するための実験を遂行した。８−ｗｅｌｌ  Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバに各ｗｅｌｌ毎にＰＣＡ−ＳＭＣ細胞は５×１０3個、ＨＣＣ７０細胞は５×１０4個ずつ入れて細胞がよく吸着するように２４時間の間培養した後、Ｃ−ＥＧＦＲを２μＭ添加して４時間培養した後、３回洗浄した。以後、既存の培地をＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−２２染料１００ｎＭを含む新鮮な培地に取り替えた後、前記細胞を４５分間培養した。前記試料に対して共焦点顕微鏡を使用してＣ−ＥＧＦＲ結合体（λEx.４０５ｎｍ、λEm.６２５〜７５４ｎｍ）及びＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（λEx.４０５ｎｍ、λEm.４１１〜４９７ｎｍ）に対する蛍光映像を得た。
【００７４】
図７によれば、Ｃ−ＥＧＦＲ結合体をＨＣＣ７０細胞に処理した場合には細胞の中に摂取された後に強い蛍光信号を示し、結合体をＰＣＡ−ＳＭＣ細胞に処理した場合には蛍光信号がほとんど示されないことを確認した。この結果は、Ｃ−ＥＧＦＲ結合体がＥＧＦＲ過発現細胞であるＨＣＣ７０細胞表面のＥＧＦＲと特異的な相互作用をすることで細胞内に摂取されたことを裏付ける。また、細胞内のリソソームを特異的に染色するＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒと結合体を共に処理したとき、共同で染色される部位が存在することを確認し、蛍光写真を重ねて見た時もその位置が正確に重なることから、Ｃ−ＥＧＦＲ結合体が細胞内部のグルタチオン濃度の高いリソソームの中に移動し、そこで蛍光活性化が起こったことを確認した。
【００７５】
７）細胞毒性及び光力学治療効能実験
【００７６】
光のない暗い状態で本発明のＣ−ＥＧＦＲ結合体をＨＣＣ７０細胞に０〜１０μＭの濃度で処理し、細胞毒性を評価した。その結果、図８Ａに示されているように、光が照射しない場合には、該当濃度の範囲で細胞毒性を示さないことを確認した。
【００７７】
標的光力学治療効果を評価するために、ＰＣＡ−ＳＭＣ細胞は１×１０3個／ｗｅｌｌ、ＨＣＣ７０細胞は１×１０4個／ｗｅｌｌだけ９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに入れ、細胞がよく付着するように２４時間の間培養した。Ｃ−ＥＧＦＲ結合体をそれぞれ０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭの濃度で準備して細胞に処理した後、４時間の間培養した。その後、細胞に引き込まれなかったＣ−ＥＧＦＲ結合体を洗浄して除去した後に６７０ｎｍのレーザを利用して照射線量密度５０ｍＷ／ｃｍ2で６分４０秒間照射した。その後、安定化のためにｏｖｅｒｎｉｇｈｔの間インキュベーターで培養した後、ＣＣＫ−８  ａｓｓａｙで細胞毒性有無を判断した。
【００７８】
その結果、図８Ｂによれば、ＨＣＣ７０細胞でＣ−ＥＧＦＲ結合体のＩＣ50値は０．２８μＭと計算され、ＰＣＡ−ＳＭＣ細胞では１０μＭの高い濃度でも７０％以上の細胞が生きていることを確認した。これから、Ｃ−ＥＧＦＲ結合体がＥＧＦＲを媒介としてがん細胞の中に摂取され、蛍光及び光力学治療効果が活性化され、特に低い濃度でも高いがん治療効果を誘導することが分かる。
【００７９】
［実施例３］線形二硫化結合連結子を含む光増感剤−ペプチド結合体（Ｌ−ＥＧＦＲ）の製造及び特性分析
【００８０】
実施例３においては、光増感剤とトリプトファンとの間の連結子が線形になされており、かつ細胞内で線形連結子が分解される時には消光されていた蛍光及び反応性酸素生成が活性化されるかを検証した。このために、光増感剤としてＣｅ４を選択し、トリプトファンを含有するＧＥ１１ペプチド（ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ）と光増感剤を線形ジスルフィド結合で連結された結合体を合成し、効能を分析した。
【００８１】
３．１．線形二硫化結合連結子を含む光増感剤−ペプチド結合体（Ｌ−ＥＧＦＲ）の合成
【００８２】
ＡＳＰ４８Ｓを用いたＦｍｏｃ固相ペプチド合成法を通してペプチドを製造し、製造過程は、次のとおりである。
【００８３】
Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−２−ｃｈｌｏｒｏ−Ｔｒｉｔｙｌレジン（Ａｎａｓｐｅｃ、米国）にＦｍｏｃ−ｍｉｎｉＰＥＧ２−ＯＨ８当量及びＨＢＴＵ８当量／ＨＯＢｔ８当量／ＮＭＭ１６当量をＤＭＦに溶かして添加して２時間の間室温で反応した後、ＤＭＦ、メタノール及びＤＭＦの順に洗浄した。
【００８４】
アミノ酸に付いている保護基Ｆｍｏｃを分離するために、前記反応液に２０％のピペリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）を含有するＤＭＦを加えて室温で５分間２回反応させた後、ＤＭＦ、メタノール及びＤＭＦの順に洗浄した。
【００８５】
ペプチドレジンにｃｈｌｏｒｉｎ  ｅ４（Ｃｅ４）４当量とＨＢＴＵ４当量／ＨＯＢｔ４当量／ＮＭＭ８当量をＤＭＳＯに溶かして添加した後、１２時間の間反応してサクションする。生成されたＣｅ４−ｍｉｎｉＰＥＧ２−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−２−ｃｈｌｏｒｏ−Ｔｒｉｔｙｌレジンを、メタノール及びＤＭＦの順に洗浄した。
【００８６】
生成されたペプチドレジンにＴＦＡ／ＥＤＴ／ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ／ＴＩＳ／水を９０／２．５／２．５／２．５／２．５に希釈した溶液を処理してペプチド残基の保護基を除去し、ペプチドをレジンから分離してＣｅ４−ｍｉｎｉＰＥＧ２−Ｃｙｓを得る。
【００８７】
その後、反応液に１０倍の冷たいジエチルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ）を加えてペプチドを沈殿させ、１０分間３０００ｒｐｍで遠心分離する。ろ液を捨てて２回繰り返す。前記にて得た結合体は、逆相ＨＰＬＣを遂行して精製する。
【００８８】
上記で得たＣｅ４−ｍｉｎｉＰＥＧ２−ＣｙｓとＡｌｄｒｉｔｈｉｏｌ−２を酢酸に溶かした後、室温で４時間の間反応する。反応進行状況をＨＰＬＣとＬＣ／ＭＳを使用して確認する。反応が完了すると、遠心分離して精製した後、凍結乾燥してＣｅ４−ｍｉｎｉＰＥＧ−Ｃｙｓ（Ｐｙｓ）を得る。
【００８９】
一方、ペプチド骨格合成のためにＨ−Ｉｌｅ−２−ｃｈｌｏｒｏ−Ｔｒｉｔｙｌレジン（Ａｎａｓｐｅｃ、米国）にＦｍｏｃ−アミノ酸８当量及びＨＢＴＵ８当量／ＨＯＢｔ８当量／ＮＭＭ１６当量をＤＭＦに溶かして添加して２時間の間室温で反応した後、ＤＭＦ、メタノール及びＤＭＦの順に洗浄した。
【００９０】
アミノ酸に付いている保護基Ｆｍｏｃを分離するために、前記反応液に２０％のピペリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）を含有するＤＭＦを加えて室温で５分間２回反応させた後、ＤＭＦ、メタノール及びＤＭＦの順に洗浄した。
【００９１】
前記過程を繰り返してペプチド基本骨格にレジンが結合された［Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−２−ｃｈｌｏｒｏ−Ｔｒｉｔｙｌ  Ｒｅｓｉｎ］構造体を合成した。
【００９２】
生成されたペプチドレジンにＴＦＡ／ＥＤＴ／ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ／ＴＩＳ／水を９０／２．５／２．５／２．５／２．５に希釈した溶液を処理してペプチド残基の保護基を除去し、ペプチドをレジンから分離する。
【００９３】
その後、反応液に１０倍の冷たいジエチルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ）を加えてペプチドを沈殿させ、１０分間３０００ｒｐｍで遠心分離する。ろ液を捨てて２回繰り返す。前記にて得た結合体は、逆相ＨＰＬＣを遂行して精製する。
【００９４】
精製されたペプチド骨格とＣｅ４−ｍｉｎｉＰＥＧ２−Ｃｙｓ（Ｐｙｓ）を水とアセトニトリルの１：１溶液に溶かして１２時間の間室温で反応させる。反応の進行状況をＨＰＬＣとＬＣ／ＭＳを使用して確認する。反応が完了したことを確認した後、逆相ＨＰＬＣを遂行して精製する。ＴＦＡ０．１％を含有する４０〜７０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル溶液を利用する水−アセトニトリル線形グラディエントを使用して溶出した。
【００９５】
前記によって製造されたＬ−ＥＧＦＲ結合体の化学構造は、下記化２のとおりである。即ち、光増感剤とＥＧＦＲ標的ペプチドが線形二硫化結合を通して結合されている。
【化２】
2019531258.tif 000011
【００９６】
３．２．線形Ｌ−ＥＧＦＲ結合体の特性
【００９７】
１）分子量及び吸光スペクトル
【００９８】
分子量は、ＬＣ／ＭＳＤを使用して測定し、吸光度は、ＵＶ／Ｖｉｓスペクトロメータを使用して測定した。
【００９９】
評価の結果、前記得た精製された本発明の結合体、化学式２の分子量は２，４４１ｇ／ｍｏｌであり（図９）、吸光スペクトル上、それぞれ２８２、４０４、５０５、６６０ｎｍで最大吸収ピークを示した（図１０Ａ参照）。
【０１００】
２）還元剤作用による蛍光及び反応性酸素発生回復分析
【０１０１】
がん細胞内に高い濃度で存在する還元剤に反応して前記にて得た結合体の蛍光回復を前記実施例２において遂行した方法と同じ方法で、遂行して分析した。一方、希釈して準備した試料を多機能マイクロプレートリーダーに入れて蛍光スペクトル（λEx.４００ｎｍ、λEm.６２０〜８５０ｎｍ）結果を得た。
【０１０２】
また、一重項酸素生成（ＳＯＧ）を確認するために、実施例２において遂行した方法と同じ方法を遂行して分析した。
【０１０３】
図１０によれば、Ｌ−ＥＧＦＲ結合体だけが存在する時は蛍光が出ないが（ＯＦＦ状態）、５ｍＭのＤＴＴ処理時には線形二硫化連結子が分解されて光増感剤固有の蛍光を示すこと（ＯＮ状態）を確認した（図１０Ｂ）。蛍光発現状態（ＯＮ）の蛍光強度は、消光（ＯＦＦ）状態に比べて２．５倍に増加し、自由光増感剤の蛍光をほとんど回復するものと確認された。特に反応が始まって５分ぶりに９０％以上の蛍光が速く回復することが分かる（図１０Ｃ）。
【０１０４】
また、消光状態では一重項酸素の生成が抑制されていたが、５ｍＭのＤＴＴ処理時には消光状態が解消されて一重項酸素生成が２倍に増加した。従って、本発明の実施例３のＬ−ＥＧＦＲは、標的細胞内に摂取されたとき、線形二硫化結合が切れて蛍光と一重項酸素の生成が活性化されることが分かる。
【０１０５】
３）血清内安定性
【０１０６】
本発明のＬ−ＥＧＦＲ結合体をＰＢＳ、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、米国）１０％を含有したＰＢＳにそれぞれ混合して培養し、血清内安定性を評価した。溶液内の前記結合体の最終濃度は、２μＭに調整した。前記溶液を室温で４時間の間反応させた後、多機能マイクロプレートリーダー（Ｓａｆｉｒｅ  ２、Ｔｅｃａｎ社、スイス）に入れて蛍光スペクトル（λEx.４００ｎｍ）の蛍光スペクトル結果を得た。
【０１０７】
図１１によれば、血清タンパク質は、結合体の蛍光強度に影響を及ぼさないことを確認した。
【０１０８】
４）細胞培養
【０１０９】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を過発現するヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、中等程度発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１、そしてＥＧＦＲを発現しないヒト正常細胞株ＰＣＡ−ＳＭＣはいずれもＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、米国）から得た。
【０１１０】
前記ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＦＢＳ１０％及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１％を含むＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０培地で３７℃、５％の二酸化炭素及び標準湿度条件下で培養した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は、ＦＢＳ１０％及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１％を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）培地で３７℃、５％の二酸化炭素及び標準湿度条件下で培養した。ＰＣＡ−ＳＭＣ細胞は、組換えヒトインスリン、アスコルビン酸、グルタミン、組換えヒト上皮成長因子、ＦＢＳ１０％を含む血管細胞基底培地で３７℃、５％の二酸化炭素及び標準湿度条件下で培養した。
【０１１１】
５）免疫細胞化学分析
【０１１２】
標的タンパク質であるＥＧＦＲの各細胞別の発現量を免疫細胞化学分析法を通して測定した。ＰＣＡ−ＳＭＣとＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞をｃｏｖｅｒ  ｇｌａｓｓに付着させた後、４％のｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅを含有するＰＢＳで１５分間常温で固定し、２回洗浄した。固定された細胞は、０．２５％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と１０分間反応させ、ＰＢＳで５分間３回洗浄した。その後、１％のＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を含有したＰＢＳＴ緩衝液を３０分間細胞に処理した後、ＥＧＦＲ抗体（１：５００希釈）と１時間の間反応させ、ＰＢＳで５分間３回洗浄した。その後、２次抗体（１：５００希釈）と１時間の間暗所で反応した後、ＰＢＳでさらに５分間３回洗浄する。ＤＡＰＩで１分間細胞核を染色した後、ＰＢＳで洗浄した後、ｍｏｕｎｔｉｎｇした。
【０１１３】
図１２Ａによれば、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞株はＥＧＦＲ発現が高く、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株はＥＧＦＲ発現が中等程度であり、ＰＣＡ−ＳＭＣはＥＧＦＲ発現が非常に低いことを確認した。
【０１１４】
６）結合体の細胞内摂取及びそれによる蛍光活性
【０１１５】
ＰＣＡ−ＳＭＣ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を８−ｗｅｌｌ  Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバに各ｗｅｌｌ毎にＰＣＡ−ＳＭＣ細胞は５×１０3個、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は５×１０4個ずつ入れて細胞がよく付着するように２４時間の間培養した。以後、既存の培地を結合体が２μＭで溶けている新鮮な培地２００μｌに取り替え、前記細胞をそれぞれ３０分、１時間、４時間の間培養した。
【０１１６】
最終的に、新鮮な培養培地で細胞を３回洗浄して細胞外に存在する結合体を除去した後、共焦点レーザ顕微鏡を使用して近赤外光蛍光イメージ（λEx.４０５ｎｍ、λEm.６２５〜７５４ｎｍ）を得た。
【０１１７】
本発明のＬ−ＥＧＦＲ結合体の細胞内位置を把握するための実験を遂行した。８−ｗｅｌｌ  Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバに各ｗｅｌｌ毎に細胞１×１０5個ずつ入れて細胞がよく吸着するように２４時間の間培養した。Ｌ−ＥＧＦＲ結合体を２μＭの濃度で処理した後、４時間培養し、以後に３回洗浄した。リソソームを染色するために、既存の培地をＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−２２染料１００ｎＭを含む新鮮な培地に取り替えた後、前記細胞を４５分間培養した。前記試料に対して共焦点顕微鏡を使用して結合体（λEx．４０５ｎｍ、λEm．６２５〜７５４ｎｍ）及びＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（λEx．４０５ｎｍ、λEm．４１１〜４９７ｎｍ）に対する蛍光映像を得た。
【０１１８】
図１２Ｂによれば、Ｌ−ＥＧＦＲ結合体をＰＣＡ−ＳＭＣ細胞に処理した場合には、４時間の間培養したにもかかわらず、細胞の中に入らなかったものと示され、がん細胞表面にＥＧＦＲの発現量が高ければ細胞摂取が増加することを確認した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞では、最初３０分間培養した時は蛍光がほとんど示されないが、培養時間が増えるほど蛍光強度も増加することが分かる。これに対して、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞では、３０分間短く培養しても細胞表面で強い蛍光信号を示し、培養時間が増加するほど細胞内部に入るものと示された。この結果は、実施例３のＬ−ＥＧＦＲ結合体が細胞表面のＥＧＦＲとの特異的相互作用を通して細胞内に摂取されたことを裏付ける。
【０１１９】
図１３によれば、細胞内のリソソームを特異的に染色するＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒと結合体を共に染色したとき、共同で染色される部位が存在することを確認し、蛍光写真を重ねて見た時もその位置が正確に重なることから、Ｌ−ＥＧＦＲ結合体は、還元剤であるグルタチオンの濃度の高い細胞内のリソソームの中に位置し、前記リソソーム内で活性化されることを確認した。
【０１２０】
７）細胞毒性及び光力学治療効能実験
【０１２１】
光のない暗い状態で本発明のＬ−ＥＧＦＲ結合体を０〜１０μＭの濃度でＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に添加して細胞毒性を評価した。その結果、図１４Ａに示されているように、光を照射しない場合には該当濃度の範囲で細胞毒性を示さないことを確認した。
【０１２２】
光力学治療効能を評価するために、ＰＣＡ−ＳＭＣ細胞は１×１０3個／ｗｅｌｌ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞はそれぞれ１×１０4個／ｗｅｌｌだけ９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに入れ、細胞がよく付着するように２４時間の間培養した。Ｌ−ＥＧＦＲ結合体をそれぞれ０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭの濃度で準備して細胞に処理した後、４時間の間培養した。その後、細胞に摂取されなかった結合体を洗浄を通して除去した後に、６７０ｎｍのレーザを利用して照射線量密度５０ｍＷ／ｃｍ2で６分４０秒間照射した。翌日までインキュベーターでさらに培養した後、ＣＣＫ−８ａｓｓａｙで細胞毒性有無を判断した。
【０１２３】
その結果、図１４Ｂによれば、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞で結合体のＩＣ50値は０．６６μＭと計算され、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞では１．８１μＭと得られた。ＰＣＡ−ＳＭＣ細胞では、１０μＭの高い濃度でも７０％以上の細胞が生きていることを確認した。これから、Ｌ−ＥＧＦＲ結合体がＥＧＦＲを媒介としてがん細胞の中に摂取され、そのように摂取された結合体は、低い濃度でも高いがん治療効果を誘導することが分かる。
【０１２４】
［実施例４］光増感剤−アルギニン及びトリプトファンを含むペプチド結合体の製造及び特性分析
【０１２５】
４．１．光増感剤、アルギニン、トリプトファンを含む結合体の作製
【０１２６】
ＡＳＰ４８Ｓを用いたＦｍｏｃ固相ペプチド合成法（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＳＰＰＳ）を通してペプチドを製造し、製造過程は、次のとおりである。
【０１２７】
Ｔｒｔ−Ｃｌレジン（ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、中国）に保護基（Ｆｍｏｃ）が結合されたアミノ酸を２０％のピペリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）を含有するＤＭＦに強く混ぜて室温で１０分間２回反応させた後、ＤＭＦとメタノールで２回洗浄した。その後、アミノ酸８当量及びＨＢＴＵ８当量／ＨＯＢｔ８当量／ジイソプロピルエチルアミン（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、ＤＩＰＥＡ）１６当量をＤＭＦに溶かして添加して２時間の間室温で反応した後、ＤＭＦ及びメタノールで２回洗浄した。前記の過程を繰り返して、それぞれＲＲＷ−レジン、ＲＲＷＷ−レジン、ＲＲＷＷＷ−レジン及びＲＷＲ−レジンを製造した。
【０１２８】
前記レジン−ペプチド基本骨格結合体に光増感剤Ｃｅ４及びＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡをＤＭＦに溶かして添加した後、前記混合液を１２時間の間反応させてサクションした後、ＤＭＦ、メタノール及びＤＭＦの順に洗浄した。
【０１２９】
前記過程を通して合成しようとするペプチド骨格が形成されると、ＴＦＡ／ＥＤＴ／チオアニソール（ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）／ＴＩＳ／水を９０／２．５／２．５／２．５／２．５に希釈した溶液を２時間の間処理して前記にて生成されたペプチド残基の保護基を除去し、ペプチドをレジンから分離した。その後、反応液に冷たいジエチルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ）を加えてペプチドを沈殿させて遠心分離し、得られた生成物を乾燥させた。
【０１３０】
最終的に得られた生成物をＤＭＳＯに溶かしてＶｙｄａｃ  Ｅｖｅｒｅｓｔ  Ｃ１８カラム（２５０ｍｍ×２２ｍｍ×１０μｍ、米国）を使用した逆相ＨＰＬＣを遂行して精製した。ＴＦＡ０．１％を含有する１０〜７５％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル溶液を利用する水−アセトニトリル線形グラディエントを使用して溶出し、精製された生成物を凍結乾燥した。
【０１３１】
前記によって製造された結合体（実施例４）の化学構造は、下記化３〜６のとおりであり、光増感剤とトリプトファンがアルギニンを通して連結されている。
【化３】
2019531258.tif 000012
【化４】
2019531258.tif 000013
【化５】
2019531258.tif 000014
【化６】
2019531258.tif 000015
【０１３２】
４．２．光増感剤、アルギニン、トリプトファンを含む結合体の特性
【０１３３】
１）分子量及び蛍光放出
【０１３４】
分子量は、ＬＣ／ＭＳＤを使用して測定し、吸光度は、ＵＶ／Ｖｉｓスペクトロメータを使用して測定した。
【０１３５】
評価の結果、前記得た精製された本発明の結合体の分子量は、Ｃｅ４−ＲＲＷが１，０５１ｇ／ｍｏｌ、Ｃｅ４−ＲＲＷＷが１，２３７ｇ／ｍｏｌ、Ｃｅ４−ＲＲＷＷＷが１，４２３ｇ／ｍｏｌ、Ｃｅ４−ＲＷＲが１，０５１ｇ／ｍｏｌとそれぞれ測定され（図１５参照）、それぞれ４０３〜４０４ｎｍ、６６６〜６６８ｎｍで最大吸収と最大発光を示した（図１６Ａ及び図１６Ｂ参照）。
【０１３６】
２）酵素活性による蛍光信号の増加
【０１３７】
前記にて得たＣｅ４−ＲＲＷＷ、Ｃｅ４−ＲＲＷＷＷをそれぞれ１ｎｍｏｌずつ準備してＰＢＳ溶液に溶かす。トリプシン酵素を５０ｎｍｏｌずつ各結合体に混合し、３７℃で時間が経つにつれて蛍光変化を観察した。
【０１３８】
図１７によれば、トリプシン酵素を処理した後、両結合体のいずれにおいても蛍光が回復することを観察でき、４時間が経った後には、初期蛍光よりＣｅ４−ＲＲＷＷは約１．６倍、Ｃｅ４−ＲＲＷＷＷは４．３倍の蛍光増加を示した。
【０１３９】
前記にて得たＣｅ４−ＲＲＷを酢酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ５．０）９３．５μｌに希釈した後、酵素処理試料には、カテプシンＢ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国）９７ｐｍｏｌを混合し、緩衝液処理群には、同量の酢酸ナトリウム緩衝液を混合した。前記混合液（１００μｌ）を２時間の間３７℃で培養した。
【０１４０】
３）血清内安定性
【０１４１】
本発明の結合体Ｃｅ４−ＲＲＷをＦＢＳ１０％を含有するＰＢＳに混合して培養し、血清内安定性を評価した。溶液内の前記結合体の最終濃度は、２μＭに調整した。前記溶液を室温で４時間まで反応させた後、多機能マイクロプレートリーダーに入れて蛍光スペクトル（λEx.６１０ｎｍ、λEm.６２０〜８５０ｎｍ）結果を得た。
【０１４２】
図１８によれば、血清タンパク質は、Ｃｅ４−ＲＲＷの蛍光に影響を及ぼさないことを確認した。
【０１４３】
４）細胞培養
【０１４４】
ヒトがんＫＢ細胞株は、ＡＴＣＣから得た。前記ＫＢ細胞をＦＢＳ１０％及びペニシリン／ストレプトマイシン１％を含むＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉａ）培地（Ｇｉｂｃｏ）で３７℃、５％の二酸化炭素の条件下で培養した。
【０１４５】
５）結合体の特異的細胞摂取及びそれによる蛍光活性
【０１４６】
ＫＢ細胞を４−ｗｅｌｌ  Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバに各ｗｅｌｌ毎に２×１０5個ずつ入れて細胞がよく吸着するように２４時間の間培養した後、既存の培地をＣｅ４−ＲＲＷ結合体（２μＭ）が溶けている新鮮な培地５００μｌに取り替えた後、前記細胞を４時間の間培養した。
【０１４７】
最終的に、培養培地で細胞を３回洗浄した後、共焦点レーザ顕微鏡を使用して近赤外光蛍光イメージ（λEx.４０５ｎｍ、λEm.６２５〜７５４ｎｍ）を得た。
【０１４８】
本発明のＣｅ４−ＲＲＷの細胞内位置を把握するための実験を遂行した。８−ｗｅｌｌ  Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバに各ｗｅｌｌ毎にＫＢ細胞を５×１０4個ずつ入れて細胞がよく吸着するように２４時間の間培養した後、Ｃｅ４−ＲＲＷを２μＭ添加して４時間培養した後、３回洗浄した。以後、既存の培地をＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−２２染料１００ｎＭを含む新鮮な培地に取り替えた後、前記細胞を４５分間培養した。前記試料に対して共焦点顕微鏡を使用してＣｅ４−ＲＲＷ（λEx.４０５ｎｍ、λEm.６２５〜７５４ｎｍ）及びＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（λEx.４０５ｎｍ、λEm.４１１〜４９７ｎｍ）で蛍光映像を得た。
【０１４９】
図１９によれば、Ｃｅ４−ＲＲＷをＫＢ細胞に処理した場合には、細胞の中に引き込まれて強い蛍光信号を示し、特に本発明のＣｅ４−ＲＲＷを処理した場合には、培養時間が経過するほど細胞内の蛍光強度がさらに増加し、標的細胞の中で蛍光発生が活性化されたことが分かる。
【０１５０】
図２０によれば、細胞内のリソソームを特異的に染色するＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒとＣｅ４−ＲＲＷを共に培養したとき、共同で染色される部位が存在することを確認し、蛍光写真を重ねて見た時もその位置が正確に重なることから、Ｃｅ４−ＲＲＷは、細胞内部に摂取された後にリソソームに位置し、酵素によって活性化されることを確認した。
【０１５１】
［実施例５］二硫化結合とアルギニンを含む光増感剤−ペプチド結合体の製造
【０１５２】
実施例５においては、トリプトファンによって消光されていた光増感剤が細胞内の還元剤と酵素の複合的作用によって分解される時に、消光効果が解消されて強い蛍光信号を発生できるようになり、同時に光力学治療効能も回復する結合体を製造した。
【０１５３】
５．１．還元剤／酵素複合反応型結合体の合成
【０１５４】
結合体は、還元剤により分解される二硫化結合と、酵素によって分解されるアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）が含有された結合を同時に有する結合体のモデルとして、Ｃｅ４−ＣＲＲＣＷ結合体を合成した。
【０１５５】
ＡＳＰ４８Ｓを用いたＦｍｏｃ固相ペプチド合成法（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＳＰＰＳ）を通してペプチドを製造し、製造過程は、次のとおりである。
【０１５６】
Ｔｒｔ−Ｃｌレジン（ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、中国）に保護基（Ｆｍｏｃ）が結合されたアミノ酸を２０％のピペリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）を含有するＤＭＦに強く混ぜて室温で１０分間２回反応させた後、ＤＭＦとメタノールで２回洗浄した。その後、アミノ酸８当量及びＨＢＴＵ８当量／ＨＯＢｔ８当量／ジイソプロピルエチルアミン（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、ＤＩＰＥＡ）１６当量をＤＭＦに溶かして添加して２時間の間室温で反応した後、ＤＭＦ及びメタノールで２回洗浄した。前記の過程を繰り返してＣＲＲＣＷ−レジンを製造した。
【０１５７】
前記レジン−ペプチド基本骨格結合体に光増感剤Ｃｅ４及びＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡをＤＭＦに溶かして添加した後、前記混合液を１２時間の間反応させてサクションした後、ＤＭＦ、メタノール及びＤＭＦの順に洗浄した。
【０１５８】
前記過程を通して合成しようとするペプチド骨格が形成されると、ＴＦＡ／ＥＤＴ／チオアニソール（ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）／ＴＩＳ／水を９０／２．５／２．５／２．５／２．５に希釈した溶液を２時間の間処理して前記にて生成されたペプチド残基の保護基を除去し、ペプチドをレジンから分離した。その後、反応液に冷たいジエチルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ）を加えてペプチドを沈殿させて遠心分離し、得られた生成物を乾燥させた。
【０１５９】
環状ジスルフィド結合生成のために、得られた生成物を水／アセトニトリル（９：１、ｖ／ｖ）混合液に０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かした後、酢酸アンモニウム溶液（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）を入れて撹拌する（ペプチド溶液：酢酸アンモニウム＝９：１、ｖ／ｖ）。反応の進行程度は、Ｅｌｍａｎ試薬で確認した。
【０１６０】
最終的に得られた生成物をＤＭＳＯに溶かしてＶｙｄａｃ  Ｅｖｅｒｅｓｔ  Ｃ１８カラム（２５０ｍｍ×２２ｍｍ×１０μｍ、米国）を使用した逆相ＨＰＬＣを遂行して精製した。ＴＦＡ０．１％を含有する１０〜７５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液を利用する水−アセトニトリル線形グラディエントを使用して溶出した。精製された生成物は、凍結乾燥した。
【０１６１】
前記によって製造された結合体Ｃｅ４−ＣＲＲＣＷの化学構造は、下記化７のとおりである。
【化７】
2019531258.tif 000016
【０１６２】
５．２．還元剤／酵素複合反応型結合体の特性分析
【０１６３】
１）分子量及び蛍光放出
【０１６４】
合成されたＣｅ４−ＣＲＲＣＷの分子量は、ＬＣ／ＭＳＤを使用して測定し、吸光度は、ＵＶ／Ｖｉｓスペクトロメータを使用して測定した。最高吸光ピークは、４０２、５０８及び６６５ｎｍで測定された。
【０１６５】
評価の結果、前記得た精製された本発明の結合体の分子量は、１，２５５ｇ／ｍｏｌであり（図２１参照）、それぞれ４０２ｎｍ、６６５ｎｍで最大吸収と最大発光を示した（図２２参照）。
【０１６６】
２）還元剤及び酵素作用による蛍光信号の増加
【０１６７】
一方、還元剤／酵素複合反応型Ｃｅ４−ＣＲＲＣＷ結合体の還元剤に対する反応性を分析するために、結合体を還元剤であるＤＴＴ２μＭ及び５ｍＭで６時間の間処理し、多機能マイクロプレートリーダーに入れて蛍光スペクトル（λEx.４００ｎｍ、λEm.６２０〜８５０ｎｍ）結果を得た。酵素に対する反応性を分析するためには、結合体をカテプシンＢ、Ｓ、Ｌ、Ｓで処理するか、またはカテプシン抑制剤であるＥ６４を前処理したカテプシンＢを６時間の間処理し、多機能マイクロプレートリーダーに入れて蛍光スペクトル（λEx．４００ｎｍ、λEm．６２０〜８５０ｎｍ）結果を得た。還元剤／酵素複合反応を分析するためには、５ｍＭのＤＴＴとカテプシンＢ酵素を共に６時間の間処理し、多機能マイクロプレートリーダーに入れて蛍光スペクトル（λEx.４００ｎｍ、λEm.６２０〜８５０ｎｍ）結果を得た。
【０１６８】
図２３によれば、結合体を５ｍＭのＤＴＴまたはカテプシンＢ単独で処理した時にそれぞれ蛍光発生が増加することを観察でき、５ｍＭのＤＴＴとカテプシンＢを同時に処理した場合には、対照群より蛍光強度が何と２６倍高く示されることを確認した。５ｍＭのＤＴＴだけを処理した時には、１０．６倍の蛍光強度の増加を示した。細胞外の還元剤濃度である２μＭのＤＴＴを処理した時は蛍光強度が全く増加せず、それは、結合体が細胞内に入った時には、細胞内の還元剤及び酵素の単独または複合作用によって結合体の蛍光及び反応性酸素生成特性が活性化されることを示す。
【０１６９】
３）細胞培養
【０１７０】
ＳＣＣ７がん細胞株をＦＢＳ１０％及びペニシリン／ストレプトマイシン１％を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）培地（Ｇｉｂｃｏ）で３７℃、５％の二酸化炭素の条件下で培養した。
【０１７１】
４）結合体のがん細胞内摂取及びそれによる蛍光活性分析
【０１７２】
ＳＣＣ７がん細胞を４−ｗｅｌｌ  Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバに各ｗｅｌｌ毎に２×１０5個ずつ入れて細胞がよく吸着するように２４時間の間培養した後、既存の培地をＣｅ４−ＣＲＲＣＷ結合体２μＭが含まれた新鮮な培地５００μｌに取り替えた後、前記細胞を２時間乃至６時間の間培養した。最終的に、培養培地で細胞を３回洗浄した後、共焦点レーザ顕微鏡を使用して近赤外光蛍光イメージ（λEx.６３３ｎｍ、λEm.６４６〜７５３ｎｍ）を得た。
【０１７３】
また、結合体が細胞内の還元剤の濃度の高いリソソームに移動するかを分析するための実験を遂行した。８−ｗｅｌｌ  Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバに各ｗｅｌｌ毎にＳＣＣ７細胞を５×１０4個ずつ入れて細胞がよく吸着するように２４時間の間培養した後、結合体を２μＭ添加して６時間培養した後、３回洗浄した。以後、既存の培地をＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−２２染料１００ｎＭを含む新鮮な培地に取り替えた後、前記細胞を４５分間培養した。前記試料に対して共焦点顕微鏡分析を使用して結合体（λEx.４０５ｎｍ、λEm.６２５〜７５４ｎｍ）及びＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（λEx.４０５ｎｍ、λEm.４１１〜４９７ｎｍ）に対する蛍光映像を得た。
【０１７４】
図２４によれば、結合体であるＣｅ４−ＣＲＲＣＷをＳＣＣ７細胞に処理した場合には、細胞の中に摂取された後に強い蛍光信号を示し、特に培養時間が経過するほど細胞内の蛍光強度がさらに増加し、それを通してがん細胞の中で蛍光発生が活性化されたことが分かる。
【０１７５】
図２５によれば、細胞内のリソソームを特異的に染色するＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒと結合体の蛍光を共に観察したとき、共同で染色される部位が存在することを確認し、蛍光写真を重ねて見た時もその位置が正確に重なることから、結合体が細胞内のリソソームの中に位置し、その中で活性化されることを確認した。
【０１７６】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は、単に好ましい実施様態であるだけで、それによって本発明の範囲が制限されるものではないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。
【図１ａ】
2019531258.tif 000024
【図１ｂ】
2019531258.tif 000025
【図１ｃ】
2019531258.tif 000026
【図２】
2019531258.tif 000027
【図３】
2019531258.tif 000028
【図４】
2019531258.tif 000029
【図５】
2019531258.tif 000030
【図６】
2019531258.tif 000031
【図７】
2019531258.tif 000032
【図８】
2019531258.tif 000033
【図９】
2019531258.tif 000034
【図１０】
2019531258.tif 000035
【図１１】
2019531258.tif 000036
【図１２】
2019531258.tif 000037
【図１３】
2019531258.tif 000038
【図１４】
2019531258.tif 000039
【図１５】
2019531258.tif 000040
【図１６】
2019531258.tif 000041
【図１７】
2019531258.tif 000042
【図１８】
2019531258.tif 000043
【図１９】
2019531258.tif 000044
【図２０】
2019531258.tif 000045
【図２１】
2019531258.tif 000046
【図２２】
2019531258.tif 000047
【図２３】
2019531258.tif 000048
【図２４】
2019531258.tif 000049
【図２５】
2019531258.tif 000050
【配列表】
2019531258000001.app
【国際調査報告】
2019531258.tif 000051
2019531258.tif 000052
2019531258.tif 000053
2019531258.tif 000054
2019531258.tif 000055
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