(57)【要約】本発明は、ＲＮＡ分子、特にｍｉＲＮＡのような小さなサイズを有するＲＮＡ分子検出用キット及び方法に関する。本発明は、逆転写過程で短い逆転写用プライマーを使用することにより、逆転写反応溶液におけるプライマー拡散が速くなり、これにより逆転写反応時間が短くなり、全体ＰＣＲ反応速度を向上させ、安定的で迅速にＲＮＡを検出することができるＲＮＡ検出用キット及び方法を提供する。また、本発明は、逆転写過程後に一本鎖ｃＤＮＡに対して逆転写用プライマーよりもはるかに長い延長用プライマーを使用して延長反応を行うことにより、ＰＣＲ増幅反応のための十分な鋳型の長さを確保することができるＲＮＡ検出用キット及び方法を提供する。【選択図】図２
2019524103.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増幅対象ＲＮＡ分子のポリＡ（ｐｏｌｙ  Ａ）鎖と混成化するオリゴｄＴから構成される第１混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第１混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記増幅対象ＲＮＡ分子と混成化しない任意の核酸配列である第１アダプターオリゴヌクレオチドから構成された短い逆転写用プライマー；
前記増幅対象ＲＮＡ分子から逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのうち前記オリゴｄＴ部分を除く３’末端部分と特異的に混成化可能な第２混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第２混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記一本鎖ｃＤＮＡと混成化されない任意の核酸配列から構成された第２アダプターオリゴヌクレオチドから構成され、前記逆転写用プライマーよりも長さが長い延長用プライマー；及び
前記第２アダプターオリゴヌクレオチド内から選択されるフォワードプライマーを含むＲＮＡ分子検出用キット。
【請求項２】
前記増幅対象ＲＮＡ分子は、長さ１８〜１８０ｎｔから構成された小さなサイズのＲＮＡ分子である、請求項１に記載のＲＮＡ分子検出用キット。
【請求項３】
前記小さなサイズのＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである、請求項２に記載のＲＮＡ分子検出用キット。
【請求項４】
前記第２アダプターオリゴヌクレオチドは、増幅対象ＲＮＡ分子の種類に応じた増幅対象ＲＮＡ標識（ｔａｇｇｉｎｇ）オリゴヌクレオチド、又は前記増幅対象ＲＮＡ標識オリゴヌクレオチド及び増幅対象ＲＮＡの種類と無関係な共通の核酸配列から構成される共通オリゴヌクレオチドから構成される、請求項１に記載のＲＮＡ分子検出用キット。
【請求項５】
前記短い逆転写用プライマーは２９〜３４ｎｔから構成される、請求項１に記載のＲＮＡ分子検出用キット。
【請求項６】
前記第１アダプターオリゴヌクレオチドは１７〜２２ｎｔから構成される、請求項１に記載のＲＮＡ分子検出用キット。
【請求項７】
増幅対象ＲＮＡ分子の３’末端の５〜９ｎｔの核酸から構成された３’末端部分と混成化する核酸配列から構成された第１混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第１混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記増幅対象ＲＮＡ分子と混成化しない任意の核酸配列である第１アダプターオリゴヌクレオチドから構成された短い逆転写用リバースプライマー；
前記増幅対象ＲＮＡ分子から逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのうち前記第１混成化オリゴヌクレオチドと混成化される前記増幅対象ＲＮＡ分子の３’末端部分に相応する部分を除く部分と特異的に混成化可能な第２混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第２混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記一本鎖ｃＤＮＡと混成化されない任意の核酸配列から構成された第２アダプターオリゴヌクレオチドから構成され、前記短い逆転写用リバースプライマーよりも長さが長い延長用プライマー；及び
前記第２アダプターオリゴヌクレオチド内から選択されるフォワードプライマーを含むＲＮＡ分子検出用キット。
【請求項８】
前記増幅対象ＲＮＡ分子は、長さ１８〜１８０ｎｔから構成された小さなサイズのＲＮＡ分子である、請求項７に記載のＲＮＡ分子検出用キット。
【請求項９】
前記小さなサイズのＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである、請求項８に記載のＲＮＡ分子検出用キット。
【請求項１０】
前記第２アダプターオリゴヌクレオチドは、増幅対象ＲＮＡ分子の種類に応じた増幅対象ＲＮＡ標識（ｔａｇｇｉｎｇ）オリゴヌクレオチド、又は前記増幅対象ＲＮＡ標識オリゴヌクレオチド及び増幅対象ＲＮＡの種類と無関係な共通の核酸配列から構成される共通オリゴヌクレオチドから構成される、請求項７に記載のＲＮＡ分子検出用キット。
【請求項１１】
前記短い逆転写用リバースプライマーは２６〜２８ｎｔ、２３〜２８ｎｔ、又は１８〜２８ｎｔの長さを有する、請求項７に記載のＲＮＡ分子検出用キット。
【請求項１２】
前記第１アダプターオリゴヌクレオチドは２０〜２２ｎｔ、１７〜２２ｎｔ、又は１２〜２２ｎｔの長さを有する、請求項７に記載のＲＮＡ分子検出用キット。
【請求項１３】
ポリＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ分子にポリＡ鎖を連結するポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子の製造段階；
ポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子を、前記ポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子のポリＡ（ｐｏｌｙ  Ａ）鎖と混成化するオリゴｄＴから構成される第１混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第１混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記ポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子と混成化しない任意の核酸配列である第１アダプターオリゴヌクレオチドから構成された短い逆転写用プライマーと、逆転写酵素により、逆転写する逆転写反応段階；
前記逆転写酵素を不活性化させ、前記逆転写によって生成されたＤＮＡを溶かし、前記ポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子から逆転写された一本鎖ｃＤＮＡを準備する段階；及び
前記逆転写反応産物の全部又は一部を、前記逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのうち前記オリゴｄＴ部分を除く３’末端部分と特異的に混成化可能な第２混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第２混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記一本鎖ｃＤＮＡと混成化されない任意の核酸配列から構成された第２アダプターオリゴヌクレオチドから構成され、前記逆転写用プライマーよりも長さが長い延長用プライマー、前記第２アダプターオリゴヌクレオチド内から選択されるフォワードプライマー及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含むプライマー延長及びＰＣＲ反応用容器に移した後、プライマー延長及びＰＣＲ反応を単一段階で行うＰＣＲ反応段階を含む、増幅対象ＲＮＡ分子の検出方法。
【請求項１４】
増幅対象ＲＮＡ分子を、前記増幅対象ＲＮＡ分子の３’末端の５〜９ｎｔの核酸から構成された３’末端部分と混成化する核酸配列から構成された第１混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第１混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記増幅対象ＲＮＡ分子と混成化しない任意の核酸配列である第１アダプターオリゴヌクレオチドから構成された短い逆転写用リバースプライマーと、逆転写酵素を用いて逆転写する逆転写反応段階；
前記逆転写酵素を不活性化させ、前記逆転写によって生成されたＤＮＡを溶かし、前記増幅対象ＲＮＡ分子から逆転写された一本鎖ｃＤＮＡを準備する段階；及び
前記逆転写反応産物の全部又は一部を、前記逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのうち前記第１混成化オリゴヌクレオチドと混成化される前記増幅対象ＲＮＡ分子の３’末端部分に相応する部分を除く部分と特異的に混成化可能な第２混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第２混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記一本鎖ｃＤＮＡと混成化されない任意の核酸配列から構成された第２アダプターオリゴヌクレオチドから構成され、前記短い逆転写用リバースプライマーよりも長さが長い延長用プライマー、前記第２アダプターオリゴヌクレオチド内から選択されるフォワードプライマー及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含むプライマー延長及びＰＣＲ反応用容器に移した後、プライマー延長反応及びＰＣＲ反応を単一段階で行うＰＣＲ反応段階を含む、増幅対象ＲＮＡ分子の検出方法。
【請求項１５】
前記増幅対象ＲＮＡ分子は、長さ１８〜１８０ｎｔから構成される小さいサイズのＲＮＡ分子である、請求項１３又は１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
前記小さなサイズのＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである、請求項１５に記載の検出方法。
【請求項１７】
前記第２アダプターオリゴヌクレオチドは、増幅対象ＲＮＡ分子の種類に応じた増幅対象ＲＮＡ標識（ｔａｇｇｉｎｇ）オリゴヌクレオチド、又は前記増幅対象ＲＮＡ標識オリゴヌクレオチド及び増幅対象ＲＮＡの種類と無関係な共通の核酸配列から構成される共通オリゴヌクレオチドから構成される、請求項１３又は１４に記載の検出方法。
【請求項１８】
前記短い逆転写用プライマーは２９〜３４ｎｔから構成される、請求項１３に記載の検出方法。
【請求項１９】
前記第１アダプターオリゴヌクレオチドは１７〜２２ｎｔから構成される、請求項１３に記載の検出方法。
【請求項２０】
前記短い逆転写用リバースプライマーは、２６〜２８ｎｔ、２３〜２８ｎｔ、又は１８〜２８ｎｔの長さを有する、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項２１】
前記第１アダプターオリゴヌクレオチドは、２０〜２２ｎｔ、１７〜２２ｎｔ、又は１２〜２２ｎｔの長さを有する、請求項１４に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検出用キット及び方法に関し、より詳細には、ＲＮＡ検出用キット及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ、以下「ｍｉＲＮＡ」と略称する）は、２２個程度のリボヌクレオチドから構成された非翻訳ＲＮＡであり、転写段階でＲＮＡサイレンシング（ＲＮＡ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）そして転写後の段階で遺伝子の発現を調節する機能をし、このようなｍｉＲＮＡの機能は、ｍＲＮＡ内の相補配列との塩基対の形成により行われることが知られている。最初にカエノラブディティス・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）で発見されて以来、動物、植物及びウイルスに遺伝子発現の調節機構として活用されていることが知られ、様々な種類のｍｉＲＮＡが続々と報告されているのが実情である。それだけでなく、ｍｉＲＮＡ遺伝子の突然変異等に起因する機能の不調和により癌などの特定の疾病が発生しうることが知られており、その重要性がさらに強調されている。
【０００３】
ｍｉＲＮＡは、その大きさが非常に小さく（〜２２ｎｔ）ｍＲＮＡよりも容易に分解されることが知られているので、これを分離したり検出するのに大きな困難がある。これを検出するための通常の方法としては、ノーザンブロット分析とマイクロアレイを用いた交雑に基づく検出、特定のｍｉＲＮＡと特異的に相補結合をするステムループ構造のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲとそれに伴う定量的ＰＣＲの二段階にわたる工程で検出及び定量する方法と、ポリＡポリメラーゼでｍｉＲＮＡの３’末端にポリＡ鎖を連結し、ポリ（Ｔ）アダプターをプライマーとして使用してｃＤＮＡを合成した後、ｍｉＲＮＡ特異的フォワードプライマーとポリ（Ｔ）アダプターに基づくリバースプライマーを用いてｍｉＲＮＡを増幅する方法などが知られている。
【０００４】
しかし、前記の方法は、限定された相補配列を用いるため、非特異的増幅となることがあり、通常、リアルタイムＰＣＲ技術に基づいているため、高価なリアルタイムＰＣＲ装置が必要であり、生成されたＰＣＲ産物のサイズが類似するため、様々なｍｉＲＮＡを同時に検出するマルチプレックス分析が制限的であるという欠点を有している。
【０００５】
また、従来のｍｉＲＮＡ検出方法は、ｍｉＲＮＡの長さが短いため、ＰＣＲ増幅のための鋳型の長さを確保するために逆転写用プライマーを略７０〜８０ｍｅｒ程度に長くする方式を採用している。しかし、このような従来の検出方法の場合、逆転写用プライマーが長いため、反応溶液における拡散が遅くなり、これにより逆転写反応時間が長くなって、全体の反応時間が長くなる。したがって、従来の検出方法は、リアルタイムＰＣＲでＣｔ値が大きくなり、反応性が低下する問題がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記のような問題点を含め複数の問題点を解決するためのものであり、より効率的で経済的なｍｉＲＮＡを含む小さなサイズのＲＮＡ分子検出用キット及び方法を提供することを目的とする。しかし、このような課題は例示的なものであり、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一観点によると、増幅対象ＲＮＡ分子のポリＡ（ｐｏｌｙ  Ａ）鎖と混成化するオリゴｄＴから構成される第１混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第１混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記増幅対象ＲＮＡ分子と混成化しない任意の核酸配列である第１アダプターオリゴヌクレオチドから構成された短い逆転写用プライマー；前記増幅対象ＲＮＡ分子から逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのうち前記オリゴｄＴ部分を除く３’末端部分と特異的に混成化可能な第２混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第２混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記一本鎖ｃＤＮＡと混成化されない任意の核酸配列から構成された第２アダプターオリゴヌクレオチドから構成され、前記逆転写用プライマーよりも長さが長い延長用プライマー；及び前記第２アダプターオリゴヌクレオチド内から選択されるフォワードプライマーを含む増幅対象ＲＮＡ分子検出用キットが提供される。
【０００８】
本発明の他の一観点によると、増幅対象ＲＮＡ分子の３’末端の５〜９ｎｔの核酸から構成された３’末端部分と混成化する核酸配列から構成された第１混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第１混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記増幅対象ＲＮＡ分子と混成化しない任意の核酸配列である第１アダプターオリゴヌクレオチドから構成された短い逆転写用リバースプライマー；前記増幅対象ＲＮＡ分子から逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのうち前記第１混成化オリゴヌクレオチドと混成化される前記増幅対象ＲＮＡ分子の３’末端部分に相応する部分を除く部分と特異的に混成化可能な第２混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第２混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記一本鎖ｃＤＮＡと混成化されない任意の核酸配列から構成された第２アダプターオリゴヌクレオチドから構成され、前記短い逆転写用リバースプライマーよりも長さが長い延長用プライマー；及び前記第２アダプターオリゴヌクレオチド内から選択されるフォワードプライマーを含む増幅対象ＲＮＡ検出用キットが提供される。
【０００９】
本発明の他の一観点によると、ポリＡポリメラーゼを用いて検出対象から分離された試料内のＲＮＡ分子にポリＡ鎖を連結するポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子の製造段階；
ポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子を、前記ポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子のポリＡ（ｐｏｌｙ  Ａ）鎖と混成化するオリゴｄＴから構成される第１混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第１混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記ポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子と混成化しない任意の核酸配列である第１アダプターオリゴヌクレオチドから構成された短い逆転写用プライマーと、逆転写酵素により、逆転写する逆転写反応段階；前記逆転写酵素を不活性化させ、前記逆転写により生成されたＤＮＡを溶かし、前記ポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子から逆転写された一本鎖ｃＤＮＡを準備する段階；及び
前記逆転写反応産物の全部又は一部を、前記逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのうち前記オリゴｄＴ部分を除く３’末端部分と特異的に混成化可能な第２混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第２混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記一本鎖ｃＤＮＡと混成化されない任意の核酸配列から構成された第２アダプターオリゴヌクレオチドから構成され、前記逆転写用プライマーよりも長さが長い延長用プライマー、前記第２アダプターオリゴヌクレオチド内から選択されるフォワードプライマー及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含むプライマー延長及びＰＣＲ反応用容器に移した後、プライマー延長及びＰＣＲ反応を単一段階で行うＰＣＲ反応段階を含む増幅対象ＲＮＡ分子の検出方法が提供される。
【００１０】
本発明の他の一観点によると、増幅対象ＲＮＡ分子を、前記増幅対象ＲＮＡ分子の３’末端の５〜９ｎｔの核酸から構成された３’末端部分と混成化する核酸配列から構成された第１混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第１混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記増幅対象ＲＮＡ分子と混成化しない任意の核酸配列である第１アダプターオリゴヌクレオチドから構成された短い逆転写用リバースプライマーと、逆転写酵素を用いて逆転写する逆転写反応段階；前記逆転写酵素を不活性化させ、前記逆転写により生成されたＤＮＡを溶かし、前記増幅対象ＲＮＡ分子から逆転写された一本鎖ｃＤＮＡを準備する段階；及び
前記逆転写反応産物の全部又は一部を、前記逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのうち前記第１混成化オリゴヌクレオチドと混成化される前記増幅対象ＲＮＡ分子の３’末端部分に相応する部分を除く部分と特異的に混成化可能な第２混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第２混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記一本鎖ｃＤＮＡと混成化されない任意の核酸配列から構成された第２アダプターオリゴヌクレオチドから構成され、前記短い逆転写用リバースプライマーより長さが長い延長用プライマー、前記第２アダプターオリゴヌクレオチド内から選択されるフォワードプライマー及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含むプライマー延長及びＰＣＲ反応用容器に移した後、プライマー延長反応及びＰＣＲ反応を単一段階で行うＰＣＲ反応段階を含む、増幅対象ＲＮＡ分子の検出方法が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の一実施例によるＲＮＡ検出用キット及び方法は、短い逆転写用プライマーの使用により逆転写反応時間が短くなり、全体ＰＣＲ反応速度を向上させることができ、迅速にＲＮＡを検出することができ、延長反応段階では逆転写用プライマーよりもはるかに長い延長用プライマーを使用することにより、ＰＣＲ増幅反応のために十分な長さの鋳型を作ることができる。具体的には、本発明の一実施例によるＲＮＡ検出用キット及び方法は、逆転写過程で短い逆転写用プライマーを使用することにより、逆転写反応溶液におけるプライマー拡散が速くなり、これにより逆転写反応時間が短くなり、全体ＰＣＲ反応速度を速め、Ｃｔ値を下げることができ、安定的で迅速にＲＮＡを検出することができる。また、本発明のキット及び方法は、逆転写過程後に一本鎖ｃＤＮＡに対して逆転写用プライマーよりもはるかに長い延長用プライマーを使用して延長反応を行うことにより、ＰＣＲ増幅反応のための十分な鋳型の長さを確保することができる。
【００１２】
それだけでなく、本発明のキット及び方法は、逆転写段階で生成されたｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ段階で再び検証して最終増幅産物を合成することにより、高精度を示し、長い延長用プライマーの長さ調節により各標的ＲＮＡ別にラベルが可能であり、複数ＲＮＡの同時多重分析（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）が可能な臨床診断製品として高い競争力を有する。したがって、本発明のキット及び方法は、特定のＲＮＡを高価な装置がなくても正確かつ迅速に検出することが可能であり、複数のＲＮＡを同時に検出することができるマルチプレックス分析も可能である。例えば、本発明のキット及び方法は、癌をはじめとする様々な疾病の診断及び予後判定などに非常に有用に用いることができる。
【００１３】
もちろん、前述のような効果によって、本発明の範囲が限定されるものではない。
【００１４】
本発明の前記及び他の技術的課題と特徴は、次のような図面を参照して行われる本発明の実施例に対する説明を通じて当業者に明確になるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施例によるポリＡポリメラーゼを用いたｍｉＲＮＡの検出方法を概略的に示す概要図である。
【図２】本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ特異的逆転写用プライマーを用いたｍｉＲＮＡ検出方法を概略的に示す概要図である。
【図３】本発明の一実施例によるポリＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙ  Ａ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）及びオリゴｄＴ（ｏｌｉｇｏ  ｄＴ）プライマーを用いたｍｉＲＮＡ検出キット及び方法によりｍｉＲ−５３２を増幅した結果を示す。図において、上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、中段は温度による蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、下段の左の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、下段の右側は、１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図４】本発明の一実施例によるポリＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙ  Ａ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）及びオリゴｄＴ（ｏｌｉｇｏ  ｄＴ）プライマーを用いたｍｉＲＮＡ検出キット及び方法によりｍｉＲ−１９６ｂを増幅した結果を示す。図において、上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、中段は温度による蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、下段の左の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、下段の右側は、１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図５】本発明の一実施例によるポリＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙ  Ａ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）及びオリゴｄＴ（ｏｌｉｇｏ  ｄＴ）プライマーを用いたｍｉＲＮＡ検出キット及び方法によりｍｉＲ−３６２を増幅した結果を示す。図において、上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、中段は温度による蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、下段の左の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、下段の右側は、１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図６】本発明の一実施例によるポリＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙ  Ａ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）及びオリゴｄＴ（ｏｌｉｇｏ  ｄＴ）プライマーを用いたｍｉＲＮＡ検出キット及び方法によりｍｉＲ−２９ｃを増幅した結果を示す。図において、上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、中段は温度による蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、下段の左の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、下段の右側は、１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図７】本発明の一実施例によるポリＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙ  Ａ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）及びオリゴｄＴ（ｏｌｉｇｏ  ｄＴ）プライマーを用いたｍｉＲＮＡ検出キット及び方法によりｍｉＲ−１０６ｂを増幅した結果を示す。図において、上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、中段は温度による蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、下段の左の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、下段の右側は、１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図８】本発明の一実施例によるポリＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙ  Ａ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）及びオリゴｄＴ（ｏｌｉｇｏ  ｄＴ）プライマーを用いたｍｉＲＮＡ検出キット及び方法によりｍｉＲ−２００ｃを増幅した結果を示す。図において、上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、中段は温度による蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、下段の左の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、下段の右側は、１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図９】本発明の一実施例によるポリＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙ  Ａ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）及びオリゴｄＴ（ｏｌｉｇｏ  ｄＴ）プライマーを用いたｍｉＲＮＡ検出キット及び方法によりｍｉＲ−１２７を増幅した結果を示す。図において、上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、中段は温度による蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、下段の左の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、下段の右側は、１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図１０】本発明の一実施例によるポリＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙ  Ａ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）及びオリゴｄＴ（ｏｌｉｇｏ  ｄＴ）プライマーを用いたｍｉＲＮＡ検出キット及び方法によりｍｉＲ−１４５を増幅した結果を示す。図において、上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、中段は温度による蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、下段の左の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、下段の右側は、１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図１１】本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ特異的逆転写用プライマーを用いたｍｉＲＮＡ検出キット及び方法によりｍｉＲ−５３２を増幅した結果を示す。図において、左上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、左中段は温度に応じた蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、左下段の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、右は１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図１２】本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ特異的逆転写用プライマーを用いたｍｉＲＮＡ検出キット及び方法によりｍｉＲ−１９６ｂを増幅した結果を示す。図において、左上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、左中段は温度に応じた蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、左下段の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、右は１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図１３】本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ特異的逆転写用プライマーを用いたｍｉＲＮＡ検出キット及び方法によりｍｉＲ−３６２を増幅した結果を示す。図において、左上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、左中段は温度に応じた蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、左下段の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、右は１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図１４】本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ特異的逆転写用プライマーを用いたｍｉＲＮＡ検出キット及び方法によりｍｉＲ−２９ｃを増幅した結果を示す。図において、左上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、左中段は温度に応じた蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、左下段の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、右は１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図１５】本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ特異的逆転写用プライマーを用いたｍｉＲＮＡ検出キット及び方法によりｍｉＲ−１０６ｂを増幅した結果を示す。図において、左上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、左中段は温度に応じた蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、左下段の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、右は１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図１６】本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ特異的逆転写用プライマーを用いたｍｉＲＮＡ検出キット及び方法によりｍｉＲ−２００ｃを増幅した結果を示す。図において、左上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、左中段は温度に応じた蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、左下段の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、右は１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図１７】本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ特異的逆転写用プライマーを用いたｍｉＲＮＡ検出キット及び方法によりｍｉＲ−１２７を増幅した結果を示す。図において、左上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、左中段は温度に応じた蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、左下段の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、右は１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図１８】本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ特異的逆転写用プライマーを用いたｍｉＲＮＡ検出キット及び方法によりｍｉＲ−１４５を増幅した結果を示す。図において、左上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、左中段は温度に応じた蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、左下段の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、右は１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図１９】比較例として、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮＡ検出キットを用いて、ｍｉＲ−５３２を増幅した結果を示す。図において、上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、中段は温度による蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、下段の左の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、下段の右側は、１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図２０】比較例として、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮＡ検出キットを用いて、ｍｉＲ−１９６ｂを増幅した結果を示す。図において、上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、中段は温度による蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、下段の左の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、下段の右側は、１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図２１】比較例として、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮＡ検出キットを用いて、ｍｉＲ−３６２を増幅した結果を示す。図において、上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、中段は温度による蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、下段の左の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、下段の右側は、１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図２２】比較例として、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮＡ検出キットを用いて、ｍｉＲ−２９ｃを増幅した結果を示す。図において、上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、中段は温度による蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、下段の左の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、下段の右側は、１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図２３】比較例として、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮＡ検出キットを用いて、ｍｉＲ−１０６ｂを増幅した結果を示す。図において、上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、中段は温度による蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、下段の左の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、下段の右側は、１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図２４】比較例として、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮＡ検出キットを用いて、ｍｉＲ−２００ｃを増幅した結果を示す。図において、上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、中段は温度による蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、下段の左の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、下段の右側は、１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図２５】比較例として、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮＡ検出キットを用いて、ｍｉＲ−１２７を増幅した結果を示す。図において、上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、中段は温度による蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、下段の左の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、下段の右側は、１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図２６】比較例として、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮＡ検出キットを用いて、ｍｉＲ−１４５を増幅した結果を示す。図において、上段は増幅サイクル数に応じた蛍光値の変化を示し、中段は温度による蛍光発光速度の変化を示すグラフであり、下段の左の表は、サンプルの種類、蛍光検出基準値及び融点を示し、下段の右側は、１．５％アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図２７】本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ検出キットと市販されているｍｉＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ社製品）を用いたｍｉＲＮＡ  ｌｅｔ−７ｅのリアルタイムＰＣＲ増幅結果を示すグラフである。
【図２８】本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ検出キットと市販されているｍｉＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ社製品）を用いたｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅのリアルタイムＰＣＲ増幅結果物に対するシークエンシングの結果を示す図である。
【図２９】順次希釈されたｍｉＲＮＡを鋳型とし、本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ検出キットでリアルタイムＰＣＲを行った結果、鋳型のコピー（ｃｏｐｙ）の数と検出限界（Ｃｑ）サイクルの間の相関関係を示すグラフである。
【図３０】本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ検出キットでＣＡＬ２７細胞及びＨＳＣ３細胞におけるｍｉＲ−２００の三サブタイプであるｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ及びｍｉＲ−２００ｃの発現程度を定量的に測定した結果を示すグラフである。
【図３１】本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ検出キットで逆転写用プライマーを第２段階の反応であるプライマー延長及びリアルタイムＰＣＲ反応時に添加するか否か、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図３２】一実施例によるｍｉＲＮＡ検出キットを使用して得られたＣｔ値とＱｉａｇｅｎ社の商用ｍｉＲＮＡ検出キットを使用して得られたＣｔ値を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
用語の定義
本文書で使用される用語「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、前記ヌクレオチド単量体分子の重合体であり、一般的に１３〜２５個までのヌクレオチドから構成された、短い一本鎖核酸鎖を意味するが、場合によっては６−ｍｅｒ、７−ｍｅｒ、８−ｍｅｒ、９−ｍｅｒ、１０−ｍｅｒ、１１−ｍｅｒ及び１２−ｍｅｒなど１３個未満のヌクレオチドから構成されたり、２５個を超えるヌクレオチドから構成された核酸鎖を指すこともある。本文書で使用される用語「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、通常、前記オリゴヌクレオチドよりもさらに長いヌクレオチド単量体の重合体鎖を意味するが、前記オリゴヌクレオチドと混用されて使用もされる。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖核酸鎖の両方を含む。
【００１７】
本文書で使用される用語「ＲＮＡ分子」は、遺伝子の暗号化、脱暗号化、調節及び発現において様々な役割を果たす多量体性分子であり、一本鎖を形成して構成単位である核酸の構成成分のうち５炭糖であるリボースの２’炭素にヒドロキシ基が付いており、塩基にチミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）の代わりにウラシル（ｕｒａｃｉｌ）が含まれるという点で、一般的に二本鎖から構成されるＤＮＡと区別される。ＲＮＡ分子には、タンパク質を暗号化するｍＲＮＡ、リボソームの構成成分であるｒＲＮＡ、たんぱく質の翻訳に関与するｔＲＮＡ、真核細胞の細胞核のスプライシングスペックル（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｓｐｅｃｋｌｅ）及びカハール体（Ｃａｊａｌ  ｂｏｄｉｅｓ）内で発見される小さなＲＮＡ分子で主にヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）を加工する役割をするｓｎＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、前記ｓｎＲＮＡのような他のＲＮＡの修飾をガイドする役割をするｓｎｏＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ＲＮＡ）、特定の遺伝子の発現を抑制するために合成された人工ＲＮＡ分子であるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、細胞外に分泌されるエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）内に存在するｅｘＲＮＡ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ又はｅｘｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ）、レトロトランスポゾン（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）及び生殖系列細胞における他の遺伝学的因子のエピジェネティック（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ）及び転写後遺伝子サイレンシングと関連するｐｉｗｉタンパク質と相互作用してＲＮＡタンパク質複合体を形成するｐｉＲＮＡ、及び特定の遺伝子の発現を調節する機能を担当する約２２ｎｔで構成された小さなＲＮＡ分子であるｍｉｃｒｏＲＮＡ（又はｍｉＲＮＡ）を含む。
【００１８】
本文書で使用される「増幅対象ＲＮＡ分子」は、検出対象から得られた試料内に存在する様々なＲＮＡ分子のうちＰＣＲ反応により増幅しようとする検出対象となるＲＮＡ分子を意味する。このような増幅対象ＲＮＡ分子は、その増幅及び検出により、特定の疾患の有無及び程度、特定の治療剤に対する感受性又は耐性の有無を判定する標識因子として使用することができる。本文書で使用される用語「センス鎖」は、二本鎖ＤＮＡ分子中の遺伝子のコードの進行方向と同じ方向の一本鎖核酸分子を意味し、「アンチセンス鎖」は、前記センス鎖と相補結合をする他の一本鎖核酸分子を意味するが、遺伝子のコード進行方向とは無関係に、最初に核酸配列が究明された鎖を「センス鎖」と定義し、その相補鎖を「アンチセンス鎖」と定義してもよい。
【００１９】
本文書で使用される用語「ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）」又は「核酸増幅反応」は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、特定の標的核酸分子を増幅する反応を意味する。  ＰＣＲには、ＤＮＡポリメラーゼ以外に標的核酸に特異的に混成化することができるオリゴヌクレオチドであるプライマー（フォワードプライマー、リバースプライマー）、デオキシヌクレオチド混合物（ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ）、Ｍｇ２＋などの２価イオンを含む反応緩衝液などが使用される。前記ＰＣＲ反応によって生成されたＤＮＡ分子を、本文書では「増幅産物」と呼ぶ。本文書で使用される用語「プライマー延長反応（ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）」は、ＤＮＡポリメラーゼが、限られた長さの鋳型核酸に相補的に混成化されたプライマーを延長させて前記鋳型核酸の５’末端で終了する非連鎖反応を意味する。前記プライマー延長反応によって生成されたＤＮＡ分子を、本文書では「延長産物」と呼ぶ。本文書で使用される用語「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」は、ＰＣＲ反応又はプライマー延長反応（ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）の開始のために使用される、鋳型核酸分子に相補的に混成化するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを意味する。ＰＣＲ反応のためのプライマーは、増幅される核酸分子の遺伝子コード進行方向と同じセンス鎖から選択されるフォワードプライマー（又はセンスプライマー）及び前記センス鎖に相補的なアンチセンス鎖から選択されるリバースプライマー（又はアンチセンスプライマー）の対が使用され、プライマー延長反応の場合、通常、単一の延長用プライマーが使用される。
【００２０】
本文書で使用される用語「アダプター（ａｄａｐｔｏｒ）」は、特定のＲＮＡを特異的に区分するためにＲＮＡに相応するセンスＤＮＡの５’末端に付加されるオリゴヌクレオチド又はＲＮＡの逆転写のための逆転写用プライマーの５’末端に付加されるオリゴヌクレオチドを意味する。この場合、これらアダプターは、延長されたｃＤＮＡを増幅するのに使用されるプライマー配列で使用することができ、後者の場合、ＲＮＡと混成化可能な核酸配列でのみプライマーを構成する場合に現れる、低いＴｍ値を補正する目的で使用することができる。前記アダプターは、増幅対象の鋳型核酸と、延長用オリゴヌクレオチドを除く他のプライマーと相同性が存在せず、非特異的増幅反応を最小限にするように考案されてもよい。本文書で使用される用語「混成化オリゴヌクレオチド」は、増幅対象ＲＮＡ分子又は前記増幅対象ＲＮＡ分子から逆転写されたｃＤＮＡと相補結合によって混成化可能な核酸分子を意味する。本文書で使用される用語「ユニバーサルプライマー」は、増幅しようとする対象核酸分子の種類に無関係に増幅が可能なプライマーであり、逆転写及びプライマー延長反応によって追加されたアダプターオリゴヌクレオチドの核酸配列を用いて製造が可能である。この場合、単一のプライマーセットを活用することによりキットの製造原価を下げることができる利点がある。本文書で使用される用語「フォワードプライマー」は、当該プライマーの方向（５’→３’）が遺伝子の方向と一致する場合のプライマーを意味する。逆に「リバースプライマー」は、当該プライマーの方向が遺伝子の方向と逆になるプライマーを意味する。
【００２１】
本文書で使用される用語「Ｃｔ値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）」は、指数増殖期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ）の範囲内でリアルタイムに増幅産物を測定するリアルタイムＰＣＲにおいて測定された蛍光の強度がベースライン値（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｌｅｖｅｌ）を超えて感知される程度に著しく増加する時点のサイクル数であり、これは標的ＲＮＡの初期鋳型量を反映する。  
【００２２】
本発明は、逆転写過程で短い逆転写用プライマーを使用することにより、逆転写反応溶液におけるプライマー拡散が速くなり、これにより逆転写反応時間が短くなり、全体ＰＣＲ反応速度を向上させ、安定的で迅速にＲＮＡを検出することができるＲＮＡ検出用キット及び方法を提供する。また、本発明は、逆転写過程後に一本鎖ｃＤＮＡに対して逆転写用プライマーよりもはるかに長い延長用プライマーを使用して延長反応を行うことにより、ＰＣＲ増幅反応のための十分な鋳型の長さを確保することができるＲＮＡ検出用キット及び方法を提供する。
【００２３】
本発明の一観点によると、試料内の増幅対象ＲＮＡ分子のポリＡ（ｐｏｌｙ  Ａ）鎖と混成化するオリゴｄＴから構成される第１混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第１混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記増幅対象ＲＮＡ分子と混成化しない任意の核酸配列である第１アダプターオリゴヌクレオチドから構成された短い逆転写用プライマー；前記増幅対象ＲＮＡ分子から逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのうち前記オリゴｄＴ部分を除く３’末端部分と特異的に混成化可能な第２混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第２混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記一本鎖ｃＤＮＡと混成化されない任意の核酸配列から構成された第２アダプターオリゴヌクレオチドから構成され、前記逆転写用プライマーよりも長さが長い延長用プライマー；及び前記第２アダプターオリゴヌクレオチド内から選択されるフォワードプライマーを含む増幅対象ＲＮＡ分子検出用キットが提供される。
【００２４】
前記キットにおいて、前記増幅対象ＲＮＡ分子は、長さ１８〜１８０ｎｔ、２０〜９０ｎｔ、２０〜７０ｎｔ、２０〜５０ｎｔ、又は２０〜３０ｎｔから構成された小さなサイズのＲＮＡ分子であってもよく、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ又はｍｉＲＮＡであってもよい。前記キットにおいて、前記試料は、上皮、毛髪、生検（ｂｉｏｐｓｙ）、剖検（ａｕｔｏｐｓｙ）、血液、血漿、血清、唾液、尿、便、汗、痰、鼻水、又は涙であってもよい。
【００２５】
前記キットは、前記第１アダプターオリゴヌクレオチド内から選択される核酸配列から構成されるリバースプライマーをさらに含むことができ、前記リバースプライマーは増幅対象ＲＮＡ分子の種類に無関係に同じ核酸配列から構成されるユニバーサルリバースプライマーであってもよい。しかし、好ましい実施態様では、前記追加のリバースプライマーが含まれず、この場合、逆転写反応に使用された逆転写用プライマーがＰＣＲ反応におけるリバースプライマーの役割まで兼ねるようになり、ＰＣＲ反応時、前記リバースプライマーを追加しなくても逆転写反応物内に含まれていた前記逆転写用プライマーがＰＣＲ反応にもそのまま使用されてもよい。
【００２６】
前記キットにおいて、前記第２アダプターオリゴヌクレオチドは、増幅対象ＲＮＡ分子の種類に応じた増幅対象ＲＮＡ標識（ｔａｇｇｉｎｇ）オリゴヌクレオチド、又は前記増幅対象ＲＮＡ標識オリゴヌクレオチド及び増幅対象ＲＮＡの種類と無関係な共通の核酸配列から構成される共通オリゴヌクレオチドから構成されてもよく、前記フォワードプライマーは、前記共通オリゴヌクレオチドから選択されるユニバーサルフォワードプライマーであってもよい。
【００２７】
前記キットにおいて、前記短い逆転写用プライマーは略２９〜３４ｎｔの長さを有してもよく、第１アダプターオリゴヌクレオチドは略１７〜２２ｎｔの長さを有してもよい。前記キットにおいて、前記第２アダプターオリゴヌクレオチドは、略３２〜６１ｎｔ又は略５６〜６３ｎｔの長さを有してもよく、増幅対象ＲＮＡの種類によって長さを異にすることができる。この場合、２以上の増幅対象ＲＮＡを一つの反応によって多重に（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）検出することが可能である。前記キットにおいて、前記第２混成化オリゴヌクレオチドは、１２〜２２ｎｔ、１３〜２２ｎｔ、又は１４〜２２ｎｔから構成されてもよく、前記短い逆転写用プライマーと混成化しない。
【００２８】
本発明の他の一観点によると、増幅対象ＲＮＡ分子の３’末端の５〜９ｎｔの核酸から構成された３’末端部分と混成化する核酸配列から構成された第１混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第１混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記増幅対象ＲＮＡ分子と混成化しない任意の核酸配列である第１アダプターオリゴヌクレオチドから構成された短い逆転写用リバースプライマー；前記増幅対象ＲＮＡ分子から逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのうち前記第１混成化オリゴヌクレオチドと混成化される前記増幅対象ＲＮＡ分子の３’末端部分に相応する部分を除く部分と特異的に混成化可能な第２混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第２混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記一本鎖ｃＤＮＡと混成化されない任意の核酸配列から構成された第２アダプターオリゴヌクレオチドから構成され、前記短い逆転写用リバースプライマーよりも長さが長い延長用プライマー；前記第２アダプターオリゴヌクレオチド内から選択されるフォワードプライマーを含む増幅対象ＲＮＡ検出用キットが提供される。
【００２９】
前記キットにおいて、前記増幅対象ＲＮＡ分子は、長さ１８〜１８０ｎｔ、２０〜９０ｎｔ、２０〜７０ｎｔ、２０〜５０ｎｔ、又は２０〜３０ｎｔから構成された小さなサイズのＲＮＡ分子であってもよく、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ又はｍｉＲＮＡであってもよい。
【００３０】
前記キットは、前記第１アダプターオリゴヌクレオチド内から選択される核酸配列から構成されるリバースプライマーをさらに含むことができ、前記リバースプライマーは、増幅対象ＲＮＡ分子の種類に無関係に同じ核酸配列から構成されるユニバーサルリバースプライマーであってもよい。しかし、好ましい実施態様では、前記追加のリバースプライマーが含まれず、この場合、逆転写反応に使用された短い逆転写用リバースプライマーがＰＣＲ反応におけるリバースプライマーの役割まで兼ねるようになり、ＰＣＲ反応時に前記リバースプライマーを追加しなくても、逆転写反応物内に含まれていた前記短い逆転写用リバースプライマーがＰＣＲ反応にもそのまま使用されてもよい。
【００３１】
前記キットにおいて、前記第２アダプターオリゴヌクレオチドは、増幅対象ＲＮＡ分子の種類に応じた増幅対象ＲＮＡ標識（ｔａｇｇｉｎｇ）オリゴヌクレオチド、又は前記増幅対象ＲＮＡ標識オリゴヌクレオチド及び増幅対象ＲＮＡの種類と無関係な共通の核酸配列から構成される共通オリゴヌクレオチドから構成されてもよく、前記フォワードプライマーは、前記共通オリゴヌクレオチドから選択されるユニバーサルフォワードプライマーであってもよい。
【００３２】
前記キットにおいて、前記短い逆転写用リバースプライマーは、略２６〜２８ｎｔ、２３〜２８ｎｔ、又は１８〜２８ｎｔの長さを有してもよく、第１アダプターオリゴヌクレオチドは、略２０〜２２ｎｔ、１７〜２２ｎｔ、又は１２〜２２ｎｔの長さを有してもよい。前記キットにおいて、前記第２アダプターオリゴヌクレオチドは、略３２〜６１ｎｔ又は略５６〜６３ｎｔの長さを有してもよく、増幅対象ＲＮＡの種類にによって長さを異にすることができる。この場合、２以上の増幅対象ＲＮＡを一つの反応によって多重に（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）検出することが可能である。
【００３３】
前記キットにおいて、前記第１混成化オリゴヌクレオチドは、６〜８  ｎｔから構成されてもよく、より好ましくは６〜７ｎｔから構成されてもよく、最も好ましくは６ｎｔから構成されてもよい。前記第２混成化オリゴヌクレオチドは、１２〜１６ｎｔ、１３〜１６ｎｔ、又は１４〜１６ｎｔから構成されてもよく、前記短い逆転写用リバースプライマーと混成化しない。
【００３４】
本発明の他の一観点によると、ポリＡポリメラーゼを用いて、検出対象から分離された試料内のＲＮＡ分子にポリＡ鎖を連結するポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子の製造段階；
ポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子を、前記ポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子のポリＡ（ｐｏｌｙ  Ａ）鎖と混成化するオリゴｄＴから構成される第１混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第１混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記ポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子と混成化しない任意の核酸配列である第１アダプターオリゴヌクレオチドから構成された短い逆転写用プライマーと、逆転写酵素により、逆転写する逆転写反応段階；前記逆転写酵素を不活性化させ、前記逆転写によって生成されたＤＮＡを溶かし、前記ポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子から逆転写された一本鎖ｃＤＮＡを準備する段階；及び
前記逆転写反応産物の全部又は一部を、前記逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのうち前記オリゴｄＴ部分を除く３’末端部分と特異的に混成化可能な第２混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第２混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記一本鎖ｃＤＮＡと混成化されない任意の核酸配列から構成された第２アダプターオリゴヌクレオチドから構成され、前記逆転写用プライマーよりも長さが長い延長用プライマー、前記第２アダプターオリゴヌクレオチド内から選択されるフォワードプライマー及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含むプライマー延長及びＰＣＲ反応用容器に移した後、プライマー延長及びＰＣＲ反応を単一段階で行うＰＣＲ反応段階を含む増幅対象ＲＮＡ分子の検出方法が提供される。  
【００３５】
前記検出方法において、前記増幅対象ＲＮＡ分子は、長さ１８〜１８０ｎｔ、２０〜９０ｎｔ、２０〜７０ｎｔ、２０〜５０ｎｔ、又は２０〜３０ｎｔから構成された小さなサイズのＲＮＡ分子であってもよく、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ又はｍｉＲＮＡであってもよい。前記検出方法において、前記試料は、上皮、毛髪、生検（ｂｉｏｐｓｙ）、剖検（ａｕｔｏｐｓｙ）、血液、血漿、血清、唾液、尿、便、汗、痰、鼻水、又は涙であってもよい。
【００３６】
前記検出方法において、前記ＰＣＲ反応段階において、前記第１アダプターオリゴヌクレオチド内から選択される核酸配列から構成されるリバースプライマーがさらに使用されてもよく、前記リバースプライマーは、前記増幅対象ＲＮＡ分子の種類に無関係に同じ核酸配列から構成されるユニバーサルリバースプライマーであってもよい。しかし、好ましい実施態様では、前記追加のリバースプライマーが含まれず、この場合、逆転写反応に使用された逆転写用プライマーがＰＣＲ反応におけるリバースプライマーの役割まで兼ねるようになり、前記ＰＣＲ反応段階で、前記リバースプライマーを追加しなくても、逆転写反応物内に含まれていた前記逆転写用プライマーが前記ＰＣＲ反応段階でもそのまま使用されてもよい。本発明者は、前記ＰＣＲ反応段階で、前記リバースプライマーをさらに添加する場合、非特異的なバンドが現れるなど、好ましくない結果が導き出され、むしろ前記リバースプライマーを追加しない場合、より好ましい結果が導き出されることを確認した。
【００３７】
前記検出方法において、前記第２アダプターオリゴヌクレオチドは、増幅対象ＲＮＡ分子の種類に応じた増幅対象ＲＮＡ標識（ｔａｇｇｉｎｇ）オリゴヌクレオチド、又は前記増幅対象ＲＮＡ標識オリゴヌクレオチド及び増幅対象ＲＮＡの種類と無関係な共通の核酸配列から構成される共通オリゴヌクレオチドから構成されてもよく、前記フォワードプライマーは、前記共通オリゴヌクレオチドから選択されるユニバーサルフォワードプライマーであってもよい。
【００３８】
前記検出方法において、前記短い逆転写用プライマーは略２９〜３４ｎｔの長さを有してもよく、第１アダプターオリゴヌクレオチドは略１７〜２２ｎｔの長さを有してもよい。前記検出方法において、前記第２アダプターオリゴヌクレオチドは、略３２〜６１ｎｔ又は略５６〜６３ｎｔの長さを有してもよく、増幅対象ＲＮＡの種類によって長さを異にすることができる。この場合、２以上の増幅対象ＲＮＡを一つの反応によって多重に（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）検出することが可能である。前記検出方法において、前記第２混成化オリゴヌクレオチドは、１２〜２２ｎｔ、１３〜２２ｎｔ、又は１４〜２２ｎｔから構成されてもよく、前記短い逆転写用プライマーと混成化しない。
【００３９】
本発明の他の一観点によると、試料内の増幅対象ＲＮＡ分子を、前記増幅対象ＲＮＡ分子の３’末端の５〜９ｎｔの核酸から構成された３’末端部分と混成化する核酸配列から構成された第１混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第１混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記増幅対象ＲＮＡ分子と混成化しない任意の核酸配列である第１アダプターオリゴヌクレオチドから構成された短い逆転写用リバースプライマーと、逆転写酵素を用いて逆転写する逆転写反応段階；前記逆転写酵素を不活性化させ、前記逆転写によって生成されたＤＮＡを溶かし、前記増幅対象ＲＮＡ分子から逆転写された一本鎖ｃＤＮＡを準備する段階；及び
前記逆転写反応産物の全部又は一部を、前記逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのうち前記第１混成化オリゴヌクレオチドと混成化される前記増幅対象ＲＮＡ分子の３’末端部分に相応する部分を除く部分と特異的に混成化可能な第２混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第２混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記一本鎖ｃＤＮＡと混成化されない任意の核酸配列から構成された第２アダプターオリゴヌクレオチドから構成され、前記短い逆転写用リバースプライマーよりも長さが長い延長用プライマー、前記第２アダプターオリゴヌクレオチド内から選択されるフォワードプライマー及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含むプライマー延長及びＰＣＲ反応用容器に移した後、プライマー延長反応及びＰＣＲ反応を単一段階で行うＰＣＲ反応段階を含む、増幅対象ＲＮＡ分子の検出方法が提供される。
【００４０】
前記検出方法において、前記増幅対象ＲＮＡ分子は、長さ１８〜１８０ｎｔ、２０〜９０ｎｔ、２０〜７０ｎｔ、２０〜５０ｎｔ、又は２０〜３０ｎｔから構成された小さなサイズのＲＮＡ分子であってもよく、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ又はｍｉＲＮＡであってもよい。前記検出方法において、前記試料は、上皮、毛髪、生検（ｂｉｏｐｓｙ）、剖検（ａｕｔｏｐｓｙ）、血液、血漿、血清、唾液、尿、便、汗、痰、鼻水、又は涙であってもよい。
【００４１】
前記検出方法において、前記ＰＣＲ反応段階で、前記第１アダプターオリゴヌクレオチド内から選択される核酸配列から構成されるリバースプライマーがさらに使用されてもよく、前記リバースプライマーは、前記増幅対象ＲＮＡ分子の種類に無関係に同じ核酸配列から構成されるユニバーサルリバースプライマーであってもよい。しかし、好ましい実施態様では、前記追加のリバースプライマーが含まれず、この場合、逆転写反応に使用された短い逆転写用リバースプライマーがＰＣＲ反応におけるリバースプライマーの役割まで兼ねるようになり、前記ＰＣＲ反応段階で、前記リバースプライマーを追加しなくても逆転写反応物内に含まれていた前記短い逆転写用リバースプライマーが前記ＰＣＲ反応段階でもそのまま使用されてもよい。本発明者は、前記ＰＣＲ反応段階で、前記リバースプライマーをさらに添加する場合、非特異的なバンドが現れるなど、好ましくない結果が導き出され、むしろ前記リバースプライマーを追加しない場合、より好ましい結果が導き出されることを確認した。
【００４２】
前記検出方法において、前記第２アダプターオリゴヌクレオチドは、増幅対象ＲＮＡ分子の種類に応じた増幅対象ＲＮＡ標識（ｔａｇｇｉｎｇ）オリゴヌクレオチド、又は前記増幅対象ＲＮＡ標識オリゴヌクレオチド及び増幅対象ＲＮＡの種類と無関係な共通の核酸配列から構成される共通オリゴヌクレオチドから構成されてもよく、前記フォワードプライマーは、前記共通オリゴヌクレオチドから選択されるユニバーサルフォワードプライマーであってもよい。
【００４３】
前記検出方法において、前記短い逆転写用リバースプライマーは、略２６〜２８ｎｔ、２３〜２８ｎｔ、又は１８〜２８ｎｔの長さを有してもよく、第１アダプターオリゴヌクレオチドは、略２０〜２２ｎｔ、１７〜２２ｎｔ、又は１２〜２２ｎｔの長さを有してもよい。前記検出方法において、前記第２アダプターオリゴヌクレオチドは、略３２〜６１ｎｔ又は約５６〜６３ｎｔの長さを有してもよく、増幅対象ＲＮＡの種類によって長さを異にすることができる。この場合、２以上の増幅対象ＲＮＡを一つの反応によって多重に（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）検出することが可能である。
【００４４】
前記検出方法において、前記第１混成化オリゴヌクレオチドは、好ましくは６〜８ｎｔから構成されてもよく、より好ましくは６〜７ｎｔから構成されてもよく、最も好ましくは６ｎｔから構成されてもよい。前記第２混成化オリゴヌクレオチドは、１２〜１６ｎｔ、１３〜１６ｎｔ、又は１４〜１６ｎｔから構成されてもよく、前記短い逆転写用リバースプライマーと混成化しない。
【００４５】
本発明で特に言及されない限り、複数のオリゴヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチドから構成された核酸分子は、５’末端から３’末端の順で説明される。
【００４６】
以下、本発明の一実施例によるキット及び方法を添付された図面によって、より詳細に説明する。  
【００４７】
図１は、本発明の一実施例によるポリＡポリメラーゼを用いた小さなサイズのＲＮＡ検出方法を概略的に示す概要図である。図１に示すように、ＲＮＡ分子１０１は、ｍｉＲＮＡと同様に２０〜３０ｎｔ程度の非常に短い核酸分子を例示的に示した。ｍｉＲＮＡ１０１は、ｍＲＮＡとは異なり、ポリＡ鎖がないので、ｍｉＲＮＡ１０１が含まれた試料にポリＡポリメラーゼとＡＴＰを混合して反応させると、ｍｉＲＮＡ１０１にポリＡ鎖１０２が付いてポリＡ鎖化ｍｉＲＮＡが生成される（第１反応）。ここで増幅対象ＲＮＡ分子と混成化されない核酸配列から構成された第１アダプターオリゴヌクレオチド１０４及び第１混成化オリゴヌクレオチド１０３であるポリｄＴから構成された逆転写用プライマー１０５を混合するとポリＡ鎖１０２と、第１混成化オリゴヌクレオチド１０３が相補結合をするようになり、ここで逆転写酵素とｄＮＴＰ混合物を添加して逆転写反応を行うと、第１アダプターオリゴヌクレオチド１０４−第１混成化オリゴヌクレオチド１０３−アンチセンス鎖ｃＤＮＡ１１１から構成された標的ｍｉＲＮＡの逆転写産物１１０が生成される（第２反応）。
【００４８】
そして逆転写酵素を不活性化させ、ＤＮＡを溶かし、逆転写過程を確実に終了した後、一本鎖ｃＤＮＡを準備する。ＰＣＲ増幅反応のための十分な鋳型の長さを確保するために逆転写用プライマーよりもはるかに長い延長用プライマーを使用して延長反応を行うが、反応性が低下することを防止するために、ヘテロデュプレックスではなく、一本鎖ｃＤＮＡに対して逆転写用プライマーよりはるかに長い延長用プライマーを使用して延長反応を行う。
【００４９】
前記逆転写産物１１０の全部又は一部を第２反応容器に移した後、ここにアンチセンス鎖ｃＤＮＡに相補的な配列を有する第２混成化オリゴヌクレオチド１２２を３’末端に有し、ｍｉＲＮＡ１０１及びアンチセンスｃＤＮＡ１１１と混成化しない任意の核酸配列である第２アダプターオリゴヌクレオチド１２１を５’末端に有する延長用プライマー１２０（逆転写用プライマーよりも長い延長用プライマー）と混成化させた後、ＤＮＡポリメラーゼでプライマー延長反応を行うと、延長された二本鎖ｃＤＮＡ１４０が生成される（第３反応）。このとき、第２アダプターオリゴヌクレオチド１２１の長さを調節すれば、各標的ＲＮＡ別にラベルが可能であり、複数のＲＮＡの同時多重分析（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）が可能である。
【００５０】
延長された二本鎖ｃＤＮＡ１４０を鋳型として、第１アダプターオリゴヌクレオチドと同じ核酸配列を有するリバースプライマー１３１と第２アダプターオリゴヌクレオチドの５’末端の核酸配列を有するフォワードプライマー１３２によりＰＣＲ反応を行うと、延長された二本鎖ｃＤＮＡ１４０が指数的に増幅されるようになる（第４反応）。前記プライマー延長反応（第３反応）とＰＣＲ反応（第４反応）は順次に行わず、一つの反応で行われることがある。さらに、この場合、リバースプライマー１３１の代わりに前記第２反応に使用された逆転写用プライマー１０５がリバースプライマーとして使用されてもよく、この場合、第４反応で別途に逆転写用プライマー１０５を追加するよりも、第２反応産物の一部又は全部をプライマー延長及びＰＣＲ反応用容器に移す過程で第２反応産物に含まれていた逆転写用プライマー１０５が第４反応で再活用されてもよい。
【００５１】
図２は、本発明の一実施例によるＲＮＡ特異的プライマー（逆転写用プライマー）を用いた短いサイズのＲＮＡ検出方法を概略的に示す概要図である。図２に示すように、ＲＮＡ１０１の３’末端の５〜７ｎｔ、好ましくは６ｎｔの部分と特異的に相補結合することができる第１混成化オリゴヌクレオチド１３４を３’末端にして、これと連結されており、標的ＲＮＡと混成化しない任意の核酸配列から構成された第１アダプターオリゴヌクレオチド１３５を５’末端にすることにより、構成されたＲＮＡ特異的リバースプライマー１３６（短い逆転写用プライマー）が混成化された後、逆転写酵素によって逆転写反応が起きればアンチセンス鎖ｃＤＮＡ１３７が生成される（第１段階反応）。
【００５２】
そして逆転写酵素を不活性化させ、ＤＮＡを溶かし、逆転写過程を確実に終了した後、一本鎖ｃＤＮＡを準備する。ＰＣＲ増幅反応のための十分な鋳型の長さを確保するために逆転写用プライマーよりもはるかに長い延長用プライマーを使用して延長反応を行うが、反応性が低下することを防止するためにヘテロデュプレックスではなく、一本鎖ｃＤＮＡに対して逆転写用プライマーよりはるかに長い延長用プライマーを使用して延長反応を行う。
【００５３】
アンチセンス鎖ｃＤＮＡ１３７に、前述した６ｎｔを除くＲＮＡの部分（つまり１６ｎｔ程度）と特異的に相補結合することができる第２混成化オリゴヌクレオチド１３８を３’末端にして、それに関連する任意のオリゴヌクレオチドとしてアンチセンス鎖ｃＤＮＡ１３７やＲＮＡ１０１の両方に対して相補結合しない第２アダプターオリゴヌクレオチド１４２を５’末端に含む延長用プライマー１４３により延長反応を行うと、双方向に延長が行われ、ＲＮＡ特異的プライマー１３６の部分及び第２アダプターオリゴヌクレオチド１４２部分の相補的な鎖を含む延長産物が生成される。このとき、第２アダプターオリゴヌクレオチド１４２は、すべてのＲＮＡ検出キットで共通に使用されるユニバーサルフォワードプライマー部分である５’領域１４１を５’末端に含んでおり、その他の部分である３’領域１３９は、ＲＮＡの種類によって、配列及び／又は長さを異にすることにより、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）分析時に同時に、様々なＲＮＡを検出することができるようにする。延長反応が完了すると、同じチューブでＲＮＡ特異的プライマー１３６と５’領域１４１に相応するフォワードプライマー１４４を用いたＰＣＲによりＰＣＲ産物１４５が生成される（第２段階反応）。
【００５４】
前記フォワードプライマー１４４の場合、第２アダプターオリゴヌクレオチドの５’末端の核酸配列から選択されるが、前記第２アダプターオリゴヌクレオチドの５’末端配列をＲＮＡの種類と無関係に同じ配列に考案する場合、ユニバーサルフォワードプライマーとなる。前記ＲＮＡ特異的プライマー１３６は、逆転写反応で使用された逆転写用プライマーがそのまま使用されてもよく、この場合、第２段階反応でさらに前記逆転写用プライマーを添加してもよく、さらに添加することなく第１段階反応物に含まれていた逆転写用プライマーを第２段階反応でそのまま活用してもよい。ＰＣＲ産物１４５は、リアルタイムＰＣＲにより反応過程で検出されることが可能であり、反応が完結した後、アガロースゲル電気泳動等により確認が可能である。
【００５５】
以下、実施例及び実験例を通じて本発明を詳細に説明する。しかし、本発明は、以下で開示される実施例及び実験例に限定されるものではなく、異なる多様な形態で具現することができるものであり、以下の実施例は本発明の開示が完全になるようにし、当該技術分野における通常の知識を持つ者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものである。したがって、本発明の下記実施例及び実験例は、あくまで本発明を具体化するためのものであり、本発明の権利範囲を制限したり、限定するものでないことはもちろんである。本発明の詳細な説明、実施例及び実験例から、本発明が属する技術分野の専門家が容易に類推することができるものは、本発明の権利範囲に属するものと解釈される。本発明に引用された参考文献は、本発明に参考として統合される。
【実施例】
【００５６】
本発明のキットによるＲＮＡの検出
本発明者は、本発明の一実施例により、ｍｉＲＮＡのポリＡを連結した後、オリゴｄＴ（ｏｌｉｇｏ  ｄＴ）プライマーを用いた逆転写を行い、逆転写されたｃＤＮＡを含む逆転写産物に対してｍｉＲＮＡ特異的配列を含む延長用プライマーを用いた双方向の延長反応とリアルタイムＰＣＲを単一段階で行うことにより、様々なｍｉＲＮＡを検出した。さらに、本発明者は、本発明の一実施例により、オリゴｄＴプライマーを使用せずに、ｍｉＲＮＡの３’末端の特異的な６ｎｔの核酸配列を有するｍｉＲＮＡ特異的プライマー（短い逆転写用プライマー）と、前記６ｎｔの核酸配列以外のｍｉＲＮＡ特異的配列を有する延長用プライマー（逆転写用プライマーよりも長い延長用プライマー）を用いて、様々なｍｉＲＮＡを検出した。検出しようとしたｍｉＲＮＡは、下記の表１の通りである。
【００５７】
ポリＡポリメラーゼを使用した方法の場合、４２℃で６０分間、ポリＡ鎖連結及び逆転写反応を行った後、７０℃で１０分間加熱して逆転写酵素を不活性化させ、プライマー延長反応及びＰＣＲは、９５℃で１５分間ＤＮＡを溶かした後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７０℃で３０秒の４０サイクルを繰り返して行った。融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）は９５℃で１０秒加熱した後、６５℃から９５℃まで５秒ごとに０．５℃ずつ上昇するようにして測定した。
【００５８】
ｍｉＲＮＡ特異的プライマーを使用した方法の場合、４２℃で６０分間逆転写反応を行った後、７０℃で１０分間加熱して逆転写酵素を不活性化させ、プライマー延長反応及びＰＣＲは、９５℃で１５分間ＤＮＡを溶かした後、９５℃で１０秒、６０℃で４０秒の４０サイクルを繰り返して行った。融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）は、９５℃で１０秒加熱した後、６５℃から９５℃まで５秒ごとに０．５℃ずつ上昇するようにして測定した。
【００５９】
併せて、逆転写反応とリアルタイムＰＣＲ反応に、それぞれ使用した試薬の使用量は、表２及び表３に示す。
【００６０】
ＰＣＲ反応は、ＢＩＯ−ＲＡＤ社のリアルタイムＰＣＲ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム）を用いて行い、実際のＰＣＲ反応が正常に行われたことを確認するために、１．５％アガロースゲル電気泳動によりバンドパターンを確認した。  
【００６１】
【表１】
2019524103.tif 000003
【００６２】
【表２】
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【００６３】
【表３】
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【００６４】
比較例：
本発明者は、比較例としてＱｉａｇｅｎ社販売のｍｉＲＮＡ検出キットを用いて、本発明の一実施例によるＲＮＡ検出キットと性能を比較した。
【００６５】
【表４】
2019524103.tif 000006
【００６６】
前述した分析の結果、図３〜図２６に示すように、本発明の一実施例によるＲＮＡ検出キット及び方法によれば（図３〜図１８）、Ｑｉａｇｅｎ社の商用ｍｉＲＮＡの検出キット（図１９〜図２６）よりもさらに鮮明で正確なｍｉＲＮＡ検出が可能であることを確認できた。
【００６７】
実験例１：増幅されたＰＣＲ産物の塩基配列の決定
本発明者は、前記実施例の方法のうちポリＡポリメラーゼを使用しない方法及び比較例としてＱｉａｇｅｎ社から販売されているｍｉＲＮＡ検出キットを使用して、Ａ５４９細胞に対してｍｉＲＮＡ  ｈｓａ  ｌｅｔ−７ｅを増幅し、増幅されたＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。
【００６８】
具体的には、配列番号２０で記載される核酸配列から構成される逆転写用プライマー、配列番号２１で記載される核酸配列から構成される延長用プライマー及び配列番号２２で記載されるフォワードプライマーを使用し、逆転写条件及びリアルタイムＰＣＲ条件は前記実施例と同様に設定した。
【００６９】
その結果、図２７に示すように、比較例であるＱｉａｇｅｎ社のキットを用いたリアルタイムＰＣＲキットの使用には陰性対照群で非特異的な増幅産物が観察されたのに対し、本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ検出キットの場合、非特異的な増幅がまったく示されなかった。併せて、増幅されたＰＣＲ産物に対してシークエンシングを行った結果、図２８に示すように、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＲＮＡの検出キットで増幅された増幅産物は塩基配列を正確に確認することができず、標的ｍｉＲＮＡを正しく増幅したか否か確認が困難であったが、本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ検出キットの場合、塩基配列を正確に決定することができた。
【００７０】
実験例２：増幅されたＰＣＲ産物の検量曲線の確認
続いて、本発明者は、本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ検出キットを用いて、試料中に含まれるｍｉＲＮＡのレベルを正確に定量することができるかを確認するために、順次希釈した所定の濃度のｍｉＲＮＡサンプルを対象にリアルタイムＰＣＲ反応を行った後、検出限界サイクル（Ｃｑ）を測定した。
【００７１】
具体的には、標的ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１４５を使用し、逆転写及びＰＣＲ条件は、前記実施例に記載された条件をそのまま使用した。
【００７２】
その結果、図２９に示すように、非常に低濃度からＣｑ値が正確な指数関係を示すことが確認され、ｍｉＲＮＡのコピー数のログ値とＣｑとの相関関係は、Ｒ２値が０．９９７９に至るほどに非常に高く示された。したがって、前記結果から本願発明のキット及び方法は、ｍｉＲＮＡの検出はもちろん、正確な定量のためにも使用が可能であることが確認できた。
【００７３】
また、本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ検出キットによるＣｔ値とＱｉａｇｅｎ社の商用ｍｉＲＮＡ検出キットによるＣｔ値を比較すると、図３２のグラフの通りである（ヒトのＡ５４９肺癌腫細胞株に対するリアルタイムＰＣＲの結果）。図３２のグラフから確認されるように、Ｑｉａｇｅｎ社の商用ｍｉＲＮＡ検出キットのＣｔ値は、早い時間内に安定せず変化しており、リアルタイムＰＣＲ反応時間が長くなって反応性が低下する一方で（図３２の（ａ）参照）、本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ検出キットのＣｔ値は、１０分以降安定してリアルタイムＰＣＲ反応時間が短くなって反応性が向上することがわかる（図３２の（ｂ）参照）。
【００７４】
したがって、本発明の一実施例によるＲＮＡ検出キット及び方法によると、短い逆転写用プライマーの使用により逆転写反応時間が短くなり、全体ＰＣＲ反応速度を向上させることができ、迅速にＲＮＡを検出することができ、延長反応段階で逆転写用プライマーよりもはるかに長い延長用プライマーを用いてＰＣＲ反応のために十分な長さの鋳型を作ることができる。
【００７５】
実験例３：ｍｉＲＮＡのサブタイプ区分
ｍｉＲＮＡの場合、個体又は細胞により、同じｍｉＲＮＡでも少し配列が異なるサブタイプの違いが見られる。そこで、本発明者は、本発明の一実施例によるｍｉＲＮＡ検出キットがｍｉＲＮＡのサブタイプを区分することができるか調査した。
【００７６】
具体的には、ＣＡＬ２７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０９５）及びＨＳＣ−３細胞から総ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬で分離した後、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ及びｍｉＲ−２００ｃの３’末端６ｎｔとそれぞれ相補結合する３’末端の第１混成化オリゴヌクレオチド及び５’末端の第１アダプターオリゴヌクレオチドから構成された逆転写用プライマー（配列番号２３〜２５）を用いて４２℃で６０分間、逆転写反応を行った。次に、前記逆転写反応産物１μＬを前記表３に記載されたリアルタイムＰＣＲ反応液の入った容器に移した後、７０℃で１０分間加熱して酵素を不活性化させた。ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ機器を用いたプライマー延長反応及びＰＣＲは、９５℃で１５分間ＤＮＡを溶かした後、９５℃で１０秒、６０℃で４０秒の４０サイクルを繰り返して行った。融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）は、９５℃で１０秒加熱した後、６５℃から９５℃まで５秒ごとに０．５℃ずつ上昇するようにして測定した。前記リアルタイムＰＣＲ反応では、それぞれのｍｉＲＮＡに特異的な延長用プライマー（配列番号２６〜２８）及び前記延長用プライマーの５’末端の共通の配列に該当するユニバーサルフォワードプライマー（配列番号２２）を使用した。その結果、図３０に示すように、ＣＡＬ２７細胞及びＨＳＣ３細胞の両方がｍｉＲ−２００ａ及びｍｉＲ−２００ｂは発現されることを確認したが、ｍｉＲ−２００ｃは両細胞ともに検出されなかった。前記結果は、ＡＢＩＴａｑＭａｎRＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙキットを用いた結果と非常に類似したものであり、本願発明の一実施例によるキットが信頼性のある結果を導出できることがわかる。
【００７７】
実験例４：リアルタイムＰＣＲ反応時の逆転写プライマーの追加の有無による結果
また、本発明者は、プライマー延長及びリアルタイムＰＣＲ反応を区分して行わず、単一段階で行った。リアルタイムＰＣＲ反応のためのプライマー対としては、延長用プライマーの５’末端の固有の核酸配列を用いたフォワードプライマーと逆転写反応時に使用された逆転写用プライマーをリバースプライマーとして使用した。ところが、前記リバースプライマーは、既に第１段階の逆転写反応に使用され、２段階のプライマー延長及びリアルタイムＰＣＲ反応に添加された第１段階の逆転写反応物内に含まれているので、２段階のプライマー延長及びリアルタイムＰＣＲ反応にリバースプライマーを別途に追加しなくても２段階反応が正常に行われると判断した。そこで、逆転写用プライマーを追加しない場合と、２段階反応で逆転写用プライマーをさらに添加する場合の両方の条件がリアルタイムＰＣＲ反応に及ぼす影響を調査した。
【００７８】
具体的には、増幅対象ＲＮＡはｍｉＲ−１６を使用し、細胞はＡ５４９肺癌腫細胞株を使用し、逆転写用プライマーをさらに添加しない場合には、前記表２及び３に記載された条件を使用して逆転写反応と、プライマー延長及びリアルタイムＰＣＲ反応を行い、逆転写用プライマーをさらに添加する場合には、逆転写用プライマー（２μＭ）１μＬをさらに添加して、その体積だけ蒸留水を少なく添加する条件で、第２段階反応を行った。逆転写用プライマーには、配列番号２９で記載される核酸配列から構成されたオリゴヌクレオチドを使用し、プライマー延長及びリアルタイムＰＣＲ反応のためのｍｉＲ−１６特異的延長プライマーとしては、配列番号３０で記載される核酸配列から構成されたオリゴヌクレオチド、そしてフォワードプライマーとしては、配列番号２２で記載される核酸配列から構成されたユニバーサルフォワードプライマーを使用した。逆転写反応段階と、プライマー延長及びリアルタイムＰＣＲ反応段階の条件は、前記実験例２と同様であった。
【００７９】
その結果、図３１に示すように、第２段階反応で逆転写用プライマーを追加した場合には、陰性対照群でも非特異的な反応産物が産出されることが示されたのに対し、逆転写用プライマーを追加しない場合には、そのような非特異的反応産物が全く検出されなかった。したがって、むしろ第２段階反応時に逆転写用プライマーをさらに入れないほうがより好ましい結果を導出できることがわかった。
【００８０】
以上、本発明を前記実施例を挙げて説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者であれば、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく修正、変更することができ、このような修正と変更も本発明に属するものであることがわかるだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年6月14日(2018.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ポリＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ分子にポリＡ鎖を連結するポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子の製造段階；
（ｂ）ポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子を、前記ポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子のポリＡ（ｐｏｌｙ  Ａ）鎖と混成化するオリゴｄＴから構成される第１混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第１混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記ポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子と混成化しない任意の核酸配列である第１アダプターオリゴヌクレオチドから構成された短い逆転写用プライマーと、逆転写酵素により、逆転写する逆転写反応段階；
（ｃ）前記逆転写酵素を不活性化させ、前記逆転写によって生成されたＤＮＡを溶かし、前記ポリＡ鎖連結ＲＮＡ分子から逆転写された一本鎖ｃＤＮＡを準備する段階；及び
（ｄ）前記逆転写反応産物の全部又は一部を、前記逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのうち前記オリゴｄＴ部分を除く３’末端部分と特異的に混成化可能な第２混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第２混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記一本鎖ｃＤＮＡと混成化されない任意の核酸配列から構成された第２アダプターオリゴヌクレオチドから構成され、前記逆転写用プライマーよりも長さが長い延長用プライマー、前記第２アダプターオリゴヌクレオチド内から選択されるフォワードプライマー及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含むプライマー延長及びＰＣＲ反応用容器に移した後、プライマー延長及びＰＣＲ反応を単一段階で行うＰＣＲ反応段階を含み、
前記（ｄ）段階では、リバースプライマーが別途に追加されず、前記（ｂ）段階の逆転写反応に使用された短い逆転写用プライマーが前記ＰＣＲ反応におけるリバースプライマーの役割まで兼ねるようになり、前記逆転写反応産物内に含まれていた短い逆転写用プライマーを前記ＰＣＲ反応段階でリバースプライマーとして使用することを特徴とする、増幅対象ＲＮＡ分子の検出方法。
【請求項２】
（ａ）増幅対象ＲＮＡ分子を、前記増幅対象ＲＮＡ分子の３’末端の５〜９ｎｔの核酸から構成された３’末端部分と混成化する核酸配列から構成された第１混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第１混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記増幅対象ＲＮＡ分子と混成化しない任意の核酸配列である第１アダプターオリゴヌクレオチドから構成された短い逆転写用リバースプライマーと、逆転写酵素を用いて逆転写する逆転写反応段階；
（ｂ）前記逆転写酵素を不活性化させ、前記逆転写によって生成されたＤＮＡを溶かし、前記増幅対象ＲＮＡ分子から逆転写された一本鎖ｃＤＮＡを準備する段階；及び
（ｃ）前記逆転写反応産物の全部又は一部を、前記逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのうち前記第１混成化オリゴヌクレオチドと混成化される前記増幅対象ＲＮＡ分子の３’末端部分に相応する部分を除く部分と特異的に混成化可能な第２混成化オリゴヌクレオチド、及び前記第２混成化オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され、前記一本鎖ｃＤＮＡと混成化されない任意の核酸配列から構成された第２アダプターオリゴヌクレオチドから構成され、前記短い逆転写用リバースプライマーよりも長さが長い延長用プライマー、前記第２アダプターオリゴヌクレオチド内から選択されるフォワードプライマー及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含むプライマー延長及びＰＣＲ反応用容器に移した後、プライマー延長反応及びＰＣＲ反応を単一段階で行うＰＣＲ反応段階を含み、
前記（ｃ）段階では、リバースプライマーが別途に追加されず、前記（ａ）段階の逆転写反応に使用された短い逆転写用リバースプライマーが前記ＰＣＲ反応におけるリバースプライマーの役割まで兼ねるようになり、前記逆転写反応産物内に含まれていた短い逆転写用リバースプライマーを前記ＰＣＲ反応段階でリバースプライマーとして使用することを特徴とする、増幅対象ＲＮＡ分子の検出方法。
【請求項３】
前記増幅対象ＲＮＡ分子は、長さ１８〜１８０ｎｔから構成される小さいサイズのＲＮＡ分子である、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記小さなサイズのＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである、請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
前記第２アダプターオリゴヌクレオチドは、増幅対象ＲＮＡ分子の種類に応じた増幅対象ＲＮＡ標識（ｔａｇｇｉｎｇ）オリゴヌクレオチド、又は前記増幅対象ＲＮＡ標識オリゴヌクレオチド及び増幅対象ＲＮＡの種類と無関係な共通の核酸配列から構成される共通オリゴヌクレオチドから構成される、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項６】
前記短い逆転写用プライマーは２９〜３４ｎｔから構成される、請求項１に記載の検出方法。
【請求項７】
前記第１アダプターオリゴヌクレオチドは１７〜２２ｎｔから構成される、請求項１に記載の検出方法。
【請求項８】
前記短い逆転写用リバースプライマーは、２６〜２８ｎｔ、２３〜２８ｎｔ、又は１８〜２８ｎｔの長さを有する、請求項２に記載の検出方法。
【請求項９】
前記第１アダプターオリゴヌクレオチドは、２０〜２２ｎｔ、１７〜２２ｎｔ、又は１２〜２２ｎｔの長さを有する、請求項２に記載の検出方法。
【国際調査報告】
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