(57)【要約】  本出願において記載される化合物は、糖尿病および／または高血糖症の治療に関する。より具体的には、記載される化合物は、血糖を低下させるアシル化インスリン化合物、そのような化合物を含有する薬学的組成物、そのような化合物の治療的使用、およびそのアシル化インスリン化合物を作製するために使用される中間体化合物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
2019536758.tif 000014
（式中、Ｘａａは、アミノ酸のグリシンまたはアスパラギンである）の化合物。
【請求項２】
Ｘａａが、アミノ酸のグリシンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘａａが、アミノ酸のアスパラギンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１〜３に記載の化合物と１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項５】
患者における糖尿病を治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の、請求項１〜３に記載の化合物または請求項４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項６】
患者における高血糖症を治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の、請求項１〜３に記載の化合物または請求項４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項７】
治療に使用するための、請求項１〜３に記載の化合物。
【請求項８】
糖尿病の治療に使用するための、請求項１〜３に記載の化合物。
【請求項９】
高血糖症の治療に使用するための、請求項１〜３に記載の化合物。
【請求項１０】
下記式を有する化合物。
【化２】
2019536758.tif 000015
【請求項１１】
糖尿病の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜３に記載の化合物の使用。
【請求項１２】
高血糖症の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜３に記載の化合物の使用。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物の調製または製造における、請求項１０に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病および／または高血糖症の治療分野にある。本発明は、血糖を低下させる化合物、そのような化合物を含有する薬学的組成物、およびそのような化合物の治療的使用に関する。
【発明の概要】
【０００２】
糖尿病患者へのインスリン補充療法は、健常者の内因性インスリンの分泌パターンに可能な限り類似させることが理想的である。インスリンに対する生理学的要求は、２つの段階：（ａ）食事に関連した血糖の急上昇に対処するための、「プランジアル」インスリンとしても知られているインスリンのパルスを必要とする栄養吸収段階、および（ｂ）最適な空腹時血糖を維持するための、肝臓グルコース生産を制御する、「基礎」インスリンとしても知られているインスリンの持続的な送達を必要とする吸収後の段階に分けることができる。
【０００３】
糖尿病を患う人々に対する効果的なインスリン療法には、一般に、２つのタイプの外因性インスリン製剤：即効作用型の食事時のプランジアルインスリン、および食間の血糖値を調節するために１日に１回または２回投与される長時間作用型の基礎インスリンの併用が含まれ得る。模倣することが望ましい内因性インスリンの１つ以上の特徴としては、ヒトインスリン受容体に対する結合親和性、ヒトＩＧＦ−１受容体を超えるヒトインスリン受容体への優先的結合、ヒトインスリン受容体のリン酸化、および血中のグルコース低下が挙げられる。
【０００４】
また、望ましい外因性基礎インスリンは、延長された作用時間を提供するべきであり、すなわち、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間以上、高血糖症の重大なリスクを伴うことなく血糖値を制御するであろう。いくつかの基礎インスリンは２４時間以上の作用時間を有する。延長された作用時間プロファイルを有する化合物は、その間に有効性に大きな変動はなく、夜間低血糖のリスクを低減させ得、患者の高血糖症のリスクを上昇させることなく、日々の投与時刻により多くの可変性をもたらし得る。望ましい外因性基礎インスリンの特徴には、血流からの減少したクリアランス速度および複数の濃度での化学的安定性が含まれ、これは長期保存安定性に寄与し得る。
【０００５】
それを必要とする患者における糖尿病および／または高血糖症の代替治療に対する必要性が存在する。いくつかのアシル化インスリン化合物が知られており、例えば、米国特許第６，４４４，６４１号および米国特許第７，６１５，５３２号を参照されたいが、追加の代替治療が必要とされている。本発明は、それを必要とする患者における、糖尿病の治療、ヘモグロビンＡ１ｃの減少、および血糖値の減少に有用な化合物を提供する。本化合物はまた、下記の新規の化合物を使用して作製される。
【０００６】
本発明は、式（式Ｉ）の化合物であって、
【化１】
2019536758.tif 000002
式中、Ｘａａは、アミノ酸のグリシンまたはアスパラギンである、化合物を含む。
【０００７】
式Ｉの化合物は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＡ鎖および配列番号４のアミノ酸配列を有するＢ鎖からなるインスリン化合物であり、ここで、配列番号１の６位のシステインと配列番号１の１１位のシステインとの間にジスルフィド結合が存在し、配列番号１の７位のシステインと配列番号４の７位のシステインとの間にジスルフィド結合が存在し、配列番号１の２０位のシステインと配列番号４の１９位のシステインとの間にジスルフィド結合が存在し、Ｂ鎖（配列番号４）の２９位のリジンは、リジン側鎖のイプシロンアミノ基とＯＨ−Ｃ１８−γＧｌｕ−γＧｌｕ−Ｌｙｓ−（ＡＥＥＡ）のＡＥＥＡの遊離カルボキシレートとの間のアミド結合の形成によって化学的に修飾されており、ここで、ＯＨ−Ｃ１８はオクタデカン二酸であり、γＧｌｕは側鎖のガンマカルボキシル基を介して結合されたＬ−グルタミン酸であり、ＡＥＥＡは２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］酢酸である。上記構造、式Ｉは、リジンである、Ｂ鎖の残基２９（そのアミノ酸残基の構造が拡大されている）を除いて、インスリンＡ鎖およびＢ鎖のアミノ酸残基をコードする標準的な一文字のアミノ酸を含有する。
【０００８】
本化合物は、式Ｉの構造を有し、Ｘａａがアミノ酸のグリシンである、化合物１２をさらに含む。本化合物は、式Ｉの構造を有し、Ｘａａがアミノ酸のアスパラギンである、化合物１９をさらに含む。
【０００９】
本出願はまた、式Ｉの化合物、化合物１２、または化合物１９、および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。本出願はさらに、患者における糖尿病を治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の、式Ｉの化合物、化合物１２、もしくは化合物１９、または式Ｉの化合物、化合物１２、もしくは化合物１９を含む薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【００１０】
本出願は、患者における高血糖症を治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の、式Ｉの化合物、化合物１２、もしくは化合物１９、または式Ｉの化合物、化合物１２、もしくは化合物１９を含む薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。本出願はまた、治療に使用するための、式Ｉの化合物、化合物１２、または化合物１９を提供する。本出願はさらに、糖尿病の治療または高血糖症の治療に使用するための、式Ｉの化合物、化合物１２、または化合物１９を提供する。
【００１１】
本出願は、以下の式を有する化合物Ａを提供する。
【化２】
2019536758.tif 000003
【００１２】
本出願はまた、糖尿病および／または高血糖症の治療のための薬剤の製造における化合物Ａの使用を提供する。本出願はさらに、式Ｉの化合物、化合物１２、または化合物１９の調製または製造における化合物Ａの使用を提供する。
【００１３】
本発明の化合物は、インスリンデグルデックなどの既知のアシル化インスリンよりもクリアランス速度が遅く、これは、バイオアベイラビリティを改善し、経時的にヒトにおいてより安定した薬物動態プロファイルを達成し、かつ／またはインビボでの化合物の作用時間を増加させることができる。また、本発明の化合物は、低い化学的分解速度を示し、これは、それらが化学的安定性を増加させ、インスリンデグルデックなどの既知のアシル化インスリンよりも長い有効期間を達成できることを示す。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、糖尿病もしくは高血糖症、または他の状態を有する患者の管理およびケアを指し、他の状態とは、それら状態の症状および合併症に拮抗させることまたはそれらを緩和させることを目的としてインスリンの投与が指示されるものである。治療される患者は、動物であり、好ましくはヒトである。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、患者もしくは対象への単回投与または反復投与で、研究者、獣医師、医師、または他の臨床医の目的である組織、システム、動物、哺乳動物、またはヒトに対して、生物学的反応もしくは医学的反応または所望される治療効果を惹起する、本発明の化合物、または本発明の化合物を含有する薬学的組成物の量または用量を指す。用量は、より高い初期負荷用量、その後でより少ない用量を含むことができる。
【００１６】
本明細書において互換的に使用される、「患者」、「対象」、および「個体」という用語は、動物を指し、好ましくは、この用語はヒトを指す。特定の実施形態において、患者、好ましくは、ヒトはさらに、血糖値を低下させることで利益を得る疾患、または障害、または状態を有することを特徴とする。
【００１７】
本発明の化合物を含む薬学的組成物は、そのような治療を必要とする患者に非経口的に投与されてもよい。非経口投与は、シリンジ、任意選択的にペン型シリンジ、または機械操作型注射器の手段によって、皮下注射、筋肉内注射、または静脈内注射で行ってもよい。あるいは、非経口投与は、点滴ポンプの手段によって行うことができる。
【００１８】
本発明の実施形態は、本発明の化合物の治療有効量および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者への投与に適した薬学的組成物を提供する。そのような薬学的組成物は、当該技術分野において周知の、医薬品に従来の賦形剤を使用して、任意の様々な技術によって調製されてもよい。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  ＵＳＡ（２００６））。
【００１９】
特許請求された化合物は、糖尿病および／または糖尿病に関連した状態を治療するのに有用な１つ以上の追加の治療薬と同時、別々、または連続的に組み合わせて使用してもよい。特許請求された化合物と組み合わせることができる追加の治療薬の非限定的な例としては、インスリンもしくはインスリン類似体、ビグアニド、スルホニル尿素、チアゾリジンジオン、ジペプチジルペプチダーゼ−４（「ＤＰＰ−４」）阻害剤、ナトリウム依存性グルコーストランスポーター（ＳＧＬＴ２）阻害剤、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）もしくはＧＬＰ−１類似体、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）もしくはＧＩＰ類似体、オキシントモジュリンもしくはオキシントモジュリン類似体などのインクレチン化合物、または前述の物質のいずれかの組み合わせが挙げられる。特許請求された化合物および追加の治療薬（複数可）は、単一の丸薬、カプセル、錠剤、または注射用製剤などの同じ送達経路および装置を介して一緒に投与するか、別々の送達装置もしくは経路で同時に、または連続的に投与して別々に投与することができる。
【００２０】
特許請求されたアシル化インスリン化合物の１つ、化合物１２は、Ａ２１Ｇインスリン（インスリンＡ鎖の２１番目のアミノ酸がグリシンで置換されたヒトインスリン、Ａ２１Ｇインスリン）のＬｙｓＢ２９のイプシロンアミノ基を、リンカー脂肪酸中間体：Ｃ１８−ＯｔＢｕ−γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）−γＧｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＡＥＥＡ−ＯＨ（ここで、Ｃ１８−ＯｔＢｕは１８−ｔｅｒｔ−ブトキシ−１８−オキソ−オクタデカン二酸であり、γＧｌｕは側鎖のガンマカルボキシル基を介して結合されたＬ−グルタミン酸であり、ＡＥＥＡは２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］酢酸である）を用いて選択的アシル化することによって生成された。
【００２１】
分子の生成は、３つの主な段階：１）Ａ２１Ｇインスリンの生成、２）リンカー脂肪酸中間体の合成、ならびに３）化合物１２を単離するための、アシル化、脱保護、精製および塩交換で行われた。
【００２２】
本化合物のインスリン部分は、組換えＤＮＡ技術を使用した前駆体タンパク質分子の生成を介するなどの、当業者に知られている様々な技術によって調製されてもよい。ｃＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含むＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であってもよい。本明細書に記載の前駆体タンパク質分子をコードするコード配列は、遺伝子コードの冗長性または縮重の結果として変化してもよい。本発明の前駆体タンパク質を生成するために、ＤＮＡを宿主細胞に導入してもよい。適切な宿主細胞は、前駆体タンパク質を生成するための発現系を用いて、一過性か安定的のいずれかでトランスフェクトまたは形質転換される。宿主細胞は、大腸菌のＫ１２もしくはＢ株などの細菌細胞、酵母細胞などの真菌細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞などの哺乳動物細胞であってもよい。
【００２３】
発現ベクターは、典型的には、エピソーム、または宿主染色体ＤＮＡの一体化した部分のいずれかとして、宿主生物中で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、およびジヒドロ葉酸レダクターゼを含有する。
【００２４】
本化合物は、当技術分野において既知の様々な手順、ならびに以下に記載される方法によって調製されてもよい。記載される各経路の具体的な合成工程は、本明細書に記載の化合物を調製するための異なる方法と組み合わせてもよい。化合物１９は、化合物１２と同様の方法で調製された。
【００２５】
以下に示す式を有する、化合物１２および１９のリンカー脂肪酸分子部分、化合物Ａは、図２に示す通り、固相合成を使用して生成される。
【化３】
2019536758.tif 000004
【００２６】
液相法のみを使用して、またはよりスケーラブルであり得る固相法と組み合わせて化合物Ａを生成する可能性がある。リンカー脂肪酸分子のＡ２１Ｇインスリンへの結合は、アミノ酸ベースのリンカー脂肪酸を保護した、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル「Ｂｏｃ」／ｔｅｒｔ−ブチルエステル「ｔＢｕ」の溶解性のために有機溶媒（Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）／ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））中で行われる。しかしながら、リンカー脂肪酸を水溶液に可溶にして有機溶媒の使用を最小限にするために、代替の保護／脱保護スキームを考案することができる。
【００２７】
同様に、最後の化学変換は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用して、Ｂｏｃ／ｔＢｕ保護基を除去する。より穏やかな切断条件のために、代替の保護／脱保護戦略を考案することができる。
【００２８】
化合物Ａは、固相ペプチド合成によって生成される。フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１４３０ｍｇ、３ｍｍｏｌ、樹脂に対して２当量；Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍカタログ番号８５２０１２）を１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（１１５０ｍｇ、３ｍｍｏｌ、樹脂に対して２当量；Ｏａｋｗｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌカタログ＃０２３９２６）およびＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（１３３３μｌ、７．６ｍｍｏｌ、５当量）、１０ｍＬのＤＭＦ中で２分間混合した後、Ｈ−ＡＥＥＡ−２−クロロトリチル−クロリド樹脂（２．１１ｇ、０．７２ｍｍｏｌ／ｇ、１．５２ｍｍｏｌ；Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌカタログ番号ＲＨＸ−１１０７４−ＰＩ）を入れた容器に移し、これをジクロロメタン（ＤＣＭ）に予備膨潤させ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で予備洗浄する。
【００２９】
スラリーを１．５時間混合し、ろ過し、樹脂をＤＭＦでよく洗浄する（カイザーテストは陰性である）。Ｆｍｏｃ保護基を、２０％ピペリジン／ＤＭＦで樹脂を処理する（１０ｍＬ、３０分）ことにより除去する。樹脂のＤＭＦ洗浄（４０ｍＬ）後、カイザーテストは陽性であり、Ｈ２Ｎ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＡＥＥＡ−２−クロロトリチル−クロリド樹脂（理論値１．５２ｍｍｏｌ）が得られる。
【００３０】
１０ｍＬのＤＭＦにおいて塩基としてＤＩＥＡ（１３３３μＬ、７．７ｍｍｏｌ、５．０当量）を使用してＨＡＴＵ（１１５３ｍｇ、３ｍｍｏｌ、２当量）でＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（１２９７ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ、２．０当量、Ａｒｋ  Ｐｈａｒｍａカタログ番号ＡＫ−４８５３２）をあらかじめ活性化し（２分）、次いで樹脂に移した。スラリーを３時間混合し、ろ過し、樹脂をＤＭＦでよく洗浄する（カイザーテストは陰性である）。
【００３１】
Ｆｍｏｃ保護基を、２０％ピペリジン／ＤＭＦで樹脂を処理する（１０ｍＬ、３０分）ことにより除去し、続いて樹脂をＤＭＦ洗浄した（４０ｍＬ、カイザーテストは陽性である）。１．５時間のカップリング時間を使用して、上記の条件を繰り返すことにより、第２のＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕを樹脂にカップリングさせる。
【００３２】
最後のＦｍｏｃ保護基を除去した後、１８−ｔｅｒｔ−ブトキシ−１８−オキソ−オクタデカン二酸（１．１３ｇ、３．０ｍｍｏｌ、２．０当量）を、１０ｍＬのＤＭＦにおいて塩基としてＤＩＥＡ（１３３３μＬ、７．７ｍｍｏｌ、５．０当量）を使用してＨＡＴＵ（１．１５ｇ、３．０ｍｍｏｌ、２．０当量）であらかじめ活性化し（２分）、次いで樹脂に移した。スラリーを３時間混合し、ろ過し、樹脂を最初にＤＭＦで、次にＤＣＭでよく洗浄した（カイザーテストは陰性である）。保護されたリンカー脂肪酸を、３０％ＨＦＩＰ／ＤＣＭ（２０ｍＬ）と１時間混合することにより樹脂から切断する。樹脂をろ別し、ＤＣＭでよくすすいだ。合わせたろ液を真空中で蒸発させて油状物にする。残った油状物をアセトニトリル（１５〜２０ｍＬ）で希釈し、再度真空中で蒸発させて油状物にする。
【００３３】
試料をアセトニトリル（１５〜２０ｍＬ）で再度溶解し、真空中で蒸発させて油状物を形成する。窒素の穏やかな流れにより、残留アセトニトリルを蒸発させて、２．６グラムの粗非晶質固体を得る（理論値＝１．７グラム）。
【００３４】
精製は、粗試料を５ｍＬのＤＭＦおよび２０ｍＬのアセトニトリルに溶解することから始まる（フラスコの洗浄を含む）。次いで、水を加えて４０ｍＬの濁った溶液を得る。５ｍＬの追加のアセトニトリルにより、透明な溶液が得られる（総容量は４５ｍＬに等しい（３３％水溶液））。精製は、試料をセミ分取シアノ逆相ＨＰＬＣカラム（ＳｉｌａＣｈｒｏｍ  ＸＤＢ１−ＣＮ；１０μｍ、１００Å；２．１×２５ｃｍ）に充填することによって行われる。
【００３５】
次いで、試料を、４０〜６０％のＢ勾配を使用して、６０℃で、１５ｍＬ／分、７２分かけて溶出する（緩衝液Ａ＝水中０．１％ＴＦＡおよび緩衝液Ｂ＝アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより所望の生成物を含有すると決定された画分をプールし、凍結乾燥して１．２２グラムの生成物（化合物Ａ）を白色無定形固体として得る（理論値の７２％；ＲＰ−ＨＰＬＣにより９１％純度；実測値ＭＷ＝１１１４．６ダルトン（Ｄａ）；理論値ＭＷ＝１１１４．４５Ｄａ）。
【００３６】
アシル化は、４０４．９ｍｇ、０．３６３ｍｍｏｌ、１．３２当量の化合物Ａ、上記の合成、およびＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）（９１．５ｍｇ、０．３０３９ｍｍｏｌ、１．１当量）で開始し、これは２．５ｍＬのＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）に溶解する。この溶液にジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１９２μＬ、１．１０２ｍｍｏｌ、４当量）を加え、得られた混合物を室温で３０分間インキュベートして、ＮＭＰ中の化合物Ａ−ＯＳｕエステルを生成し、直接使用する。
【００３７】
化合物１２を作製する際、Ａ２１Ｇインスリンを１５ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した溶液（または化合物１９の場合にはヒトインスリンの溶液）（ＴＦＡ塩、１．５８４ｇ、０．２７６ｍｍｏｌ）に、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ、４９５μＬ、３．３１ｍｍｏｌ、１２当量、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号：３３４８２）を添加する。次いで、直ちに、ＮＭＰ中の上記化合物Ａ−ＯＳｕエステルを添加する。
【００３８】
反応混合物を周囲温度で１２分間撹拌した後、それを、ジエチルエーテル／ＤＣＭ／ＴＦＡ（３０：１０：０．２ｖ／ｖ、２００ｍＬ容量）の混合物に添加する。得られた白色沈殿物を遠心分離により単離し、次いでジエチルエーテルで１回粉砕する。
【００３９】
脱保護（ＢｏｃおよびＯｔＢｕ基の除去）は、上記エーテル湿潤白色沈殿物を、ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ；Ａｌｄｒｉｃｈ）／水（９２．５：５．０：２．５ｖ／ｖ、５０ｍＬ）の混合物で２０分間処理することで開始する。混合物にジエチルエーテル（２００ｍＬ）を添加し、得られた沈殿物を遠心分離により収集する。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、脱保護工程が完了したことを示す（１２．４％の未反応Ａ２１Ｇインスリン、５６．７％のＢ２９アシル化生成物、１３％のビスアシル化生成物）。
【００４０】
精製は、上記の粗生成物を、水／アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ、２０ｍＬ）に溶解することで開始する。体積が約２０ｍＬになるまで混合物の表面に穏やかな流れの窒素を適用することによって残留エーテルを除去する。得られた溶液を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（２００ｍＬ）で希釈し、Ｚｅｏｓｐｈｅｒｅ１２０ＤＲＰ、Ａ１０、Ｃ８分取ＨＰＬＣカラム（５ｘ２５ｃｍ）に充填する。
【００４１】
試料を、２２５ｎｍおよび２８０ｎｍでＵＶモニターしながら、水中（０．１％ｖ／ｖのＴＦＡを含有する）のアセトニトリル（２０〜３５％）の勾配で２８ｍＬ／分で１４４分かけてカラムから溶出する。所望の生成物を含有する画分を、ＲＰ−ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＸＳｅｌｅｃｔ  ＣＳＨ  Ｃ１８、４．６×５０ｍｍ）により同定し、プールする（１００ｍＬ；ＲＰ−ＨＰＬＣにより９９．８％）。ＥＳＭＳ：デコンボリューションスペクトル：実測値：６，５７７．１Ｄａ、計算値：６，５７８．５Ｄａ。
【００４２】
ＨＣｌ塩交換への変換（カラム法）では、上記のプールした画分を水で２００ｍＬに希釈し、Ｚｅｏｓｐｈｅｒｅ分取ＨＰＬＣカラムに再充填する。次いで、溶出緩衝液を交換する。Ａ緩衝液は水中０．０１％ＨＣｌを含有し、Ｂ緩衝液はアセトニトリルである。
【００４３】
次いで、カラムを３カラム容量の５％緩衝液Ｂで洗浄し、次いで、試料を、２２５ｎｍおよび２８０ｎｍでモニターしながら７０％緩衝液Ｂを使用して溶出する。試料をきれいな凍結乾燥ジャーに収集し、凍結し、凍結乾燥して、化合物１２を白色粉末として得る（６２０．５ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ；全体の収率３４％）。純度は、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより確認され、９９．９％であることが分かる。ＥＳＭＳ：デコンボリューションスペクトル：実測値：６，５７７．３Ｄａ、計算値：６，５７８．５Ｄａ。
【００４４】
ＨＣｌ塩交換への変換（樹脂法）では、化合物１２（ＴＦＡ塩；１０２．９ｍｇ）を、水／アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ；２０ｍＬ）に溶解し、塩化物イオン交換樹脂（４．０５ｇ；２４８ｍｍｏｌの樹脂／インスリン１ｍｍｏｌ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ１−ｘ８（カタログ番号１４０−１４３１）；５０〜１００メッシュ；塩化物形態；２．０８ミリ当量／乾燥グラム；４６％水分；四級アンモニウム；対照番号２１０００１１７４２）に添加し、これをメタノール、アセトニトリル、および水／アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）各２０ｍＬで予備洗浄する。
【００４５】
樹脂およびインスリンを室温で１時間混合し、その時点で樹脂をろ別し、水／アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ、２０ｍＬ）で洗浄する。ろ液および洗浄液を合わせ、凍結し、凍結乾燥して、化合物１２を白色粉末として得る（８９．９ｍｇ；８７％の工程回収率）。純度は、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより確認され、９９．９％であることが分かる。ＥＳＭＳ：デコンボリューションスペクトル：実測値：６，５７６．７Ｄａ、計算値：６５７８．５Ｄａ。透析などの追加の塩交換方法もまた使用され得る。
【００４６】
本化合物のＬｙｓＢ２９のアシル化は、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃによる消化によって確認される。約３００μｇの化合物１２または１９を、５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８に溶解し（１ｍｇ／ｍｌ）、次いで、２０μｇのエンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌカタログ番号ＬＳ００３６０５）で処理する。室温で１７．５時間インキュベートした後、反応混合物のアリコート（２００μＬ）を、０．１ＮのＨＣｌ（３００μＬ）でクエンチする。
【００４７】
得られた混合物（８０μＬ）を、ＬＣ／ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ８カラム、４．６ｘ１５０ｍｍ、５μｍ、１３０Å）で分析する。診断断片、Ｂ２２〜３０＋化合物Ａは、１９４４．４Ｄａであることが分かった（対計算値＝１９４４．３Ｄａ）。化合物１２または１９の得られた他の全てのＧｌｕ−Ｃ消化断片は、アシル化を含まなかった。
【００４８】
インビトロ受容体親和性
化合物１２および１９ならびに対照化合物（生合成ヒトインスリン、およびインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１））を、ヒトインスリン受容体（ｈＩＲ）およびヒトＩＧＦ−１受容体（ｈＩＧＦ−１Ｒ）シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）組換えｈＩＲ−Ａ、ｈＩＲ−ＢまたはｈＩＧＦ−１Ｒを過剰発現させて安定にトランスフェクトした２９３ＨＥＫ細胞からの分画遠心分離工程を使用して調製された膜を使用した競合放射性リガンド結合アッセイで試験する。
【００４９】
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００３％（ｗ／ｖ）ＮＰ−４０からなり、ヒト組換え（３−［１２５Ｉ］−ヨードチロシル−Ａ１４）−インスリンまたはヒト組換え［１２５Ｉ］−ＩＧＦ−１のいずれかを含有するアッセイ緩衝液条件を使用する。１分あたりのカウント数（ＣＰＭ）データを、未標識のヒトインスリンまたはＩＧＦ−１対照に対して正規化し、ｘ軸上のｌｏｇ化合物濃度に対するｙ軸上のパーセント阻害としてプロットする。ＩＣ５０値は、４パラメータロジスティック非線形回帰分析（ＧｅｎｅＤａｔａ、バージョン１２）から決定され、特異的結合が５０％阻害される濃度を表す。必要に応じて、曲線の頂部または底部のパラメータを、それぞれ１００パーセントまたは０パーセントに固定して、完全な曲線を生成する。
【００５０】
親和性定数（Ｋｉ）を、方程式Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋Ｌ＊／Ｋｄ）に基づいてＩＣ５０値から計算し、式中、Ｌ＊は、実験に使用される放射性リガンドの濃度と等しく、Ｋｄは、飽和結合分析から決定されたその同起源受容体に対する放射性リガンドの平衡結合親和性定数と等しい。
【００５１】
化合物１２の計算されたＫｉ値は、ｈＩＲ−ＡについてはＫｉ＝７．１１ｎＭ、ｈＩＲ−ＢについてはＫｉ＝７．５６ｎＭである（表１）。化合物１２およびヒトインスリンは、両方とも１０ｎＭ未満のｈＩＲ−ＡおよびｈＩＲ−Ｂに対する結合親和性を有し、化合物１２は、ｈＩＧＦ−１Ｒと比較して、ｈＩＲ−ＡおよびｈＩＲ−Ｂに対してかなり選択的（両方に対して５００倍以上選択的）であり、これは、同じアッセイにおけるヒトインスリンの選択比と類似している。
【００５２】
化合物１９の計算されたＫｉ値は、ｈＩＲ−ＡについてはＫｉ＝３．４０ｎＭ、ｈＩＲ−ＢについてはＫｉ＝３．４５ｎＭである（表１）。化合物１９およびヒトインスリンは、両方とも４ｎＭ未満のｈＩＲ−ＡおよびｈＩＲ−Ｂに対する結合親和性を有し、化合物１９は、ｈＩＧＦ−１Ｒと比較して、ｈＩＲ−ＡおよびｈＩＲ−Ｂに対してかなり選択的（両方に対して７００倍以上選択的）であり、これは、同じアッセイにおけるヒトインスリンの選択比よりも選択的である。
【表１】
2019536758.tif 000005
【００５３】
受容体の機能的活性化
インスリン受容体は、リガンド結合時にそれ自体のチロシン残基を自己リン酸化して、インスリンシグナル伝達経路を誘導するように作用するアダプタータンパク質の動員を可能にする細胞内チロシンキナーゼドメインを含有する。受容体の刺激チロシン残基上の自己リン酸化についての機能的細胞活性は、それぞれがＣ末端Ｃ９エピトープ（ＴＥＴＳＱＶＡＰＡ、配列番号５）を有する、ｈＩＲ−Ａ、ｈＩＲ−Ｂ、またはｈＩＧＦ−１Ｒを過剰発現する２９３ＨＥＫ細胞のリガンド処理後に測定される。
【００５４】
アルブミンを含まない培地中、３７℃で、６０分間（ｈＩＲ−ＡおよびｈＩＲ−Ｂアッセイ）または３０分間（ｈＩＧＦ−１Ｒアッセイ）、様々な濃度のリガンドで細胞を刺激した後、各受容体のキナーゼドメインによるチロシン自己リン酸化の程度は、ＥＬＩＳＡによって測定され、ここで、活性化受容体は、Ｃ９エピトープタグに対する抗体（ＲＨＯ１Ｄ４）によって捕捉され、続いて汎抗ホスホチロシン西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体、４Ｇ１０（商標）−ＨＲＰ抗体を用いてチロシンリン酸化の程度が検出される。
【００５５】
機能的効力は、最大有効濃度（１００ｎＭ）のポジティブコントロール、ヒトインスリン（ｈＩＲ−ＡおよびｈＩＲ−Ｂリン酸化アッセイ）または１０ｎＭのポジティブコントロール、ｈＩＧＦ−１（ｈＩＧＦ−１Ｒリン酸化アッセイ）に対して、半最大応答を誘発する濃度（ＥＣ５０）として報告される。ＥＣ５０値は、４パラメータロジスティック非線形回帰分析（ＮＧＲ  Ｓｃｒｅｅｎｅｒ１３）から測定される。必要であれば、曲線上部または底部パラメータを、それぞれ１００または０に設定する。
【００５６】
ＥＣ５０について報告された値は、幾何平均および平均の幾何標準誤差（ｇｅｏＳＥＭ）として示され、独立した測定の数は「ｎ」で示される（表２）。
【００５７】
化合物１２は、ヒトＩＲ−ＡおよびＩＲ−Ｂアイソフォームの活性化を実証する。ＩＲ−ＡおよびＩＲ−Ｂアイソフォームに対する化合物１２およびヒトインスリンの効力は、４０ｎＭ未満である。化合物１２は、ｈＩＲ−ＡおよびｈＩＲ−Ｂにおいて、ＩＧＦ−１Ｒよりも約１３００倍強力であり、これは、同じアッセイにおけるヒトインスリンの選択比よりも大きい。
【００５８】
化合物１９は、ヒトＩＲ−ＡおよびＩＲ−Ｂアイソフォームの活性化を実証する。ＩＲ−ＡおよびＩＲ−Ｂアイソフォームに対する化合物１９およびヒトインスリンの効力は、２５ｎＭ未満である。化合物１９は、ｈＩＲ−ＡおよびｈＩＲ−Ｂにおいて、ＩＧＦ−１Ｒよりも約４００倍強力であり、これは、同じアッセイにおけるヒトインスリンの選択比よりも大きい。比較すると、ＩＧＦ−１Ｒと比較してＩＲ−ＡおよびＩＲ−Ｂに対するヒトインスリンの選択性は、約２００倍である。
【表２】
2019536758.tif 000006
【００５９】
１型糖尿病のラットモデルにおける、インビボ効力の評価
化合物１２および１９の効果を、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で処理されたラット糖尿病モデルにおいて検証する。４００〜４２５グラムの体重の雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａから入手する。約１週間、馴化させた後、ラットをイソフルランで麻酔し、Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標）（商品番号８９２５６、Ｔｅｖａ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ、４０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）を１回注射する。Ｚａｎｏｓａｒの注射から３日後に、ラットを試験に使用し、非空腹時の血糖値が４００〜５５０ｍｇ／ｄｌである動物のみ、これらの試験に使用する。
【００６０】
ラットを群に分配し、血糖値および体重に関して同等の分散として、ラットを無作為化する。血糖値を、Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ  Ａｖｉｖａ血糖値測定器（Ｒｏｃｈｅ）を使用して測定する。
【００６１】
ＳＴＺで処理されたラットに、単回皮下（ＳＣ）用量の試験物またはビヒクル（滅菌通常生理食塩水、０．９％ｗ／ｖの塩化ナトリウム溶液）を投与する。グルコース測定のための血液試料を、尾の断切りによって収集する。試験期間を通じて、動物は食物および水を自由に摂取する。これらの試験からの血漿試料を、化合物レベルの分析のために送る。表３に示す通り、化合物１２は、１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、少なくとも２４時間有効なグルコース低下を示した。表３は、評価中の様々な時点での、化合物１９についての値を示す。化合物１９もまた、１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、少なくとも２４時間有効なグルコース低下を示した。
【表３】
2019536758.tif 000007
【表４】
2019536758.tif 000008
【００６２】
１型糖尿病のブタモデルにおける薬物クリアランスの評価
糖尿病（アロキサン誘発）の、去勢された、事前に血管アクセスを装着した雄のユカタンミニブタを拘束のためにスリングに入れ、アクセスし（血液採取のために備え）、かつ開通性をチェックしたそれらの血管アクセスポートを有する。動物を無作為に処置群に入れ、それらのペンに戻す。２つのベースライン血液試料を採取した後（−３０分および０分）、動物は、試験物を１．８ｎｍｏｌ／ｋｇで、インシュリン注射器（０．３ｍｌ５／１６インチの針）を用いて側腹部に皮下注射される（０分）。全ての試験動物は、残りの採血期間を通して、清潔で新鮮な水を自由に摂取する。
【００６３】
連続血液試料（それぞれ２．０ｍＬ）を、以下の時点：−３０、０（投与直前）、皮下投与後の、１．５、３、６、１２、１８、２４、３６、４２、４８、５４、６０および７２時間で各動物から採取する。次いで、全ての試験動物を一晩絶食させ、２４時間後に試料を採取するまで再度給餌しない。その時点で、動物に３００グラムのＳ−９食餌を与え、０．２Ｕ／ｋｇのＨｕｍａｌｏｇを投与する。それらは、６０時間の試料を採取するまで再度絶食させられ、次いでそれらは、３００グラムのＳ−９食餌および０．２Ｕ／ｋｇのＨｕｍａｌｏｇを摂取する。７２時間の試料採取後、それらは、通常の給餌および維持インスリン療法に戻る。
【００６４】
凝固を可能にするために、血液試料（抗凝固剤：なし［血清］）を、周囲温度で少なくとも３０分間、しかし２時間以下維持する。血清グルコース濃度は、自動のＡＵ４８０Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して測定される。ＰＫのアリコートは、分析のために出荷される。
【００６５】
特に明記しない限り、データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。ベースラインからのグルコースの変化は、各時点でのグルコース値をベースラインのグルコース値から差し引くことによって計算される。ベースライン値は、−０．５および０分のグルコース値の平均から計算される。ＰＫ／ＰＤのための試料を、投与後７２時間までに採取する。
【００６６】
化合物１２のブタ血漿（Ｋ３ＥＤＴＡ）濃度は、Ｑ２Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ）でＬＣ／ＭＳにより測定される。抗インスリンビオチンモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ＃１０Ｒ−Ｉ１３４Ｅ）およびストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍ−２８０）を使用して、１００μＬの血漿／血清アリコートから化合物１２を免疫沈降（ＩＰ）させる。洗浄工程の後、インスリン変異体は、酸性アセトニトリル（５：２０：８０ギ酸／アセトニトリル／水）を用いてＩＰ複合体から溶出される。
【００６７】
溶出後、１０μＬの溶出液を、ＬＣ／ＭＳ分析のために質量分析計に注入する。ＬＣ／ＭＳシステムは、Ｄｉｏｎｅｘ２Ｄ−ｎａｎｏＵＰＬＣ液体クロマトグラフ（ＮＣＳ−３５００ＲＳ）およびＴｈｅｒｍｏ  Ｑ／Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ質量分析計で構成されている。どちらも６０℃で操作される、Ｔｈｅｒｍｏマイクロプレカラム（１６０４５４）およびＡｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ−１００Ｃ１８カラム（０．３ｘ５ｍｍ、５μｍ  ｄｐ）からなるシリアルトラップカラムと、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅａｓｙ  Ｓｐｒａｙ  ＰｅｐＭａｐ  Ｃ１８分析カラム（７５μｍｘ１５ｃｍ、５μｍ  ｄｐ）を使用した二次元クロマトグラフィーにより分離が達成される。
【００６８】
質量分析計は、陽イオン、ｎａｎｏＥＳＩ（Ｅａｓｙ  Ｓｐｒａｙ）モードで操作され、化合物１２について以下の前駆体／生成物イオン遷移をモニターする：１３１６．６００→５８６．８５４。アッセイは、０．２５〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲にわたってインスリン変異体濃度を測定することが確認される。
【００６９】
化合物１２の薬物動態（ＰＫ）を、化合物１２を１．８ｎｍｏｌ／ｋｇで単回皮下（ＳＣ）投与した後の糖尿病を誘発した雄のユカタンブタにおいて評価する。インスリンデグルデックの試料は、化合物１２と同様の方法で調製され、この試験において比較剤として使用される。
【００７０】
化合物１２およびインスリンデグルデックのいくつかのＰＫパラメータを表５に示す。化合物１２のクリアランス速度は、インスリンデグルデックのクリアランス速度よりも２〜３倍遅く、これは、ヒトにおけるインビボでの化合物１２の、より平坦なＰＫプロファイルおよび増加した作用時間をもたらし得る。
【表５】
2019536758.tif 000009
【００７１】
化学的安定性の評価
試料は、化合物１２および１９の凍結乾燥粉末を２０ｍＭ  ＮａＯＨに目標濃度約６ｍＭで溶解することによって調製される。次いで、この溶液を１０ｍＭトリスに対して透析し、５．６ｍＭの原液濃度を得る。次いで、この原液を使用して、ｐＨ７．５で、１０ｍＭのトリス、１９ｍｇ／ｍＬのグリセロール、３．１５ｍｇ／ｍＬのｍ−クレゾール、および４つの亜鉛／インスリン六量体（モル基準）を含有する目標濃度の溶液を調製する。目標濃度は、Ｕ２００（２００単位／ｍＬ、これは１．２ｍＭに相当する）、Ｕ４００（２．４ｍＭ）、Ｕ６００（３．６ｍＭ）およびＵ８００（４．８ｍＭ）であった。溶液の実際の濃度は、目標濃度レベルの０．１ｍＭ以内であった。安定性試験のための化合物１２および１９の試料と同じ方法で、比較剤であるインスリンデグルデックの試料を調製する。
【００７２】
使用時の安定性試験のために、試料を、約１．５ｍＬの充填容量で３ｍＬのシリコン処理カートリッジに充填する。カートリッジプランジャーは、カートリッジ内のヘッドスペースを排除するように配置されている。次いで、カートリッジを３０℃に置く。試料を、針を取り付け、およそ２日ごとに５〜１０μＬを放出することによって「使用時」条件に供する。以下の表に詳述される通り、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による分析を、最初の時点および様々な追加の貯蔵日数の後の試料に対して実施する。
【００７３】
静的貯蔵安定性試験のために、試料を、１．５ｍＬの充填容量で３ｍＬのカートリッジまたは約０．２ｍＬの充填容量で０．３ｍＬのガラスバイアルに充填する。次いで、カートリッジまたはバイアルを３０℃に置く。以下の表に詳述される通り、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による分析を、最初の時点および様々な追加の貯蔵日数の後の試料に対して実施する。
【００７４】
ＲＰ−ＨＰＬＣパラメータは以下の通りであり：（１）機器：ＵＶ検出器およびカラムオーブンを有するＬＣ、（２）カラム：ＳｙｍｍｅｔｒｙＳｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８  ３．５ｕｍ  ＰＮ１８６０００１７９ＳＮ０１５９３５３２０１４０２８、（３）カラム温度：６０℃、（４）移動相：Ａ＝水中０．０８５％ＴＦＡ、Ｂ＝アセトニトリル中０．０８５％ＴＦＡ、（５）０．９ｍＬ／分の流速での勾配は以下の通りである。
【表６】
2019536758.tif 000010
【００７５】
Ｕ２００からＵ８００までの化合物１２の濃度は、ＲＰ−ＨＰＬＣまたはＳＥＣによって測定された通り、安定性に対して明らかな影響を及ぼさなかった。３０℃での使用時の安定性試験における化合物１２の化学的安定性（１１０日までのデータ）を表６に示す。静的安定性試験における、全てＵ２００濃度での、化合物１２、化合物１９および比較剤インスリンデグルデックの化学的安定性を表７に示す。３０℃での静的安定性試験におけるインスリンデグルデックの化学的安定性を表８に示す。
【００７６】
表６に示す通り、４つの異なる濃度における化合物１２の主ピークの平均分解率は、１週間当たり０．０６４％である。この割合は、表８に示す通り、０．４９％であるインスリンデグルデックの主ピークの分解率よりも７〜８倍低い。表７は、同じ時点での、化合物１２、化合物１９およびインスリンデグルデックのＵ２００調製物の直接比較を示す。表７に示す直接比較において、化合物１２の分解率は、インスリンデグルデックよりも４倍以上低く、化合物１９の分解率は、インスリンデグルデックよりも２倍以上低い。化合物１２および１９によって示されるより低い化学的分解率は、本発明の化合物の増加した有効期間をもたらし得る。
【表７】
2019536758.tif 000011
【表８】
2019536758.tif 000012
【表９】
2019536758.tif 000013
【００７７】
配列表
Ａ鎖の一般構造（配列番号１）
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＸａａ
ここで、配列番号１の２１位のＸａａは、ＧまたはＮである。
【００７８】
化合物１２のＡ鎖（配列番号２）
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧ
【００７９】
化合物１９のＡ鎖（配列番号３）
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
【００８０】
化合物１２および化合物１９のＢ鎖（配列番号４）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ
【００８１】
Ｃ末端Ｃ９エピトープ（配列番号５）
ＴＥＴＳＱＶＡＰＡ
【配列表】
2019536758000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月20日(2019.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
2019536758.tif 000016
（式中、Ｘａａは、アミノ酸のグリシンまたはアスパラギンである）の化合物。
【請求項２】
Ｘａａが、アミノ酸のグリシンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘａａが、アミノ酸のアスパラギンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１〜３に記載の化合物と１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項５】
請求項１〜３に記載の化合物を含む糖尿病の治療剤。
【請求項６】
請求項４に記載の組成物を含む糖尿病の治療剤。
【請求項７】
請求項１〜３に記載の化合物を含む高血糖症の治療剤。
【請求項８】
請求項４に記載の組成物を含む高血糖症の治療剤。  
【国際調査報告】
2019536758.tif 000017
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