(57)【要約】本発明は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む構築物を提供する。これらの構築物を作製し、使用する方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、前記単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項２】
前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、請求項１に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項３】
前記ｓｄＡｂ部分が、以下：
（１）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（９）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１０）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１１）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１２）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１３）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１４）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１５）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１６）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１７）配列番号２１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１８）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１９）配列番号２１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２０）配列番号２１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２１）配列番号２１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２２）配列番号２１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２３）配列番号２１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２４）配列番号２２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２５）配列番号２２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２６）配列番号２２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；または
（２７）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体
のいずれか１つを含む、請求項１または２に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項４】
前記ｓｄＡｂ部分が、以下：
（１）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（９）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１０）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１１）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１２）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１３）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１４）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１５）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１６）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１７）配列番号２１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１８）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１９）配列番号２１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２０）配列番号２１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２１）配列番号２１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２２）配列番号２１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２３）配列番号２１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２４）配列番号２２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２５）配列番号２２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２６）配列番号２２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；または
（２７）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体
のいずれか１つを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項５】
前記ｓｄＡｂ部分が、以下：
ａ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｉ、Ｗ、Ｃ、Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｔ、及びＰからなる群から選択され；
ａ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｒ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｖ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｗ、Ｍ、及びＩからなる群から選択され；
ａ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｌ、Ｒ、Ｐ、Ｈ、Ｆ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、Ｅ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、Ｉ、Ｄ、及びＶからなる群から選択され；
ａ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｗ、Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｍ、Ｙ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ｑ、Ｐ、Ｅ、及びＣからなる群から選択され；及び
ａ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑ、Ｌ、Ｒ、Ｐ、Ｅ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ａ、及びＨからなる群から選択され；または
ｂ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶからなる群から選択され；
ｂ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ｅ及びＱからなる群から選択され；
ｂ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｒ及びＬからなる群から選択され；
ｂ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｗ、Ｒ、Ｇ、及びＳからなる群から選択され；及び
ｂ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑ及びＬからなる群から選択され；または
ｃ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶからなる群から選択され；
ｃ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＬからなる群から選択され；
ｃ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｌ、Ｒ、及びＣからなる群から選択され；
ｃ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｐ、Ｒ、及びＳからなる群から選択され；及び
ｃ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑ及びＬからなる群から選択される；
のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み、
前記アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔ番号付けに従っており、１０８位がＱである場合、１０８位が、Ｌに適宜ヒト化することができる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項６】
前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項７】
前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または前記ＶＨＨドメインにおいて最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、請求項６に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項８】
前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号１１４、１２９、２０１、２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む、請求項７に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項９】
前記ｓｄＡｂ部分と前記ＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄが、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項１０】
前記ｓｄＡｂ部分と前記ＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄが、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍである、請求項９に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項１１】
ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分が、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項１２】
前記単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が、重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項１３】
前記ＨＣＡｂが、単量体または二量体である、請求項１２に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項１４】
前記ＨＣＡｂが、配列番号１３０〜１３３、２８３〜２９１、及び３６６〜３７１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１２または１３に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項１５】
前記単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が、第２のエピトープを特異的に認識する第２の抗体部分をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項１６】
前記第２の抗体部分が、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、またはｓｄＡｂである、請求項１５に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項１７】
前記抗ＣＴＬＡ−４構築物が、多重特異性である、請求項１５または１６に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項１８】
ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分、及び前記第２の抗体部分が、ペプチドリンカーによって適宜連結される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項１９】
前記ペプチドリンカーが、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項２０】
前記第２の抗体部分が、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体である、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項２１】
ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分のＮ末端が、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される、請求項２０に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項２２】
ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分のＣ末端が、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される、請求項２０に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項２３】
ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分のＮ末端が、前記完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される、請求項２０に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項２４】
ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分のＮ末端が、前記完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される、請求項２０に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項２５】
前記抗ＣＴＬＡ−４構築物が、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する４つのｓｄＡｂ部分を含み、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する各ｓｄＡｂ部分のＣ末端が、前記完全長抗体の各鎖のＮ末端に融合される、請求項２０に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項２６】
前記完全長抗体が、ＰＤ−１を特異的に認識する、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項２７】
前記完全長抗体が、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項２６に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項２８】
前記完全長抗体が、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項２６に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項２９】
前記完全長抗体が、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項２６に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項３０】
前記完全長抗体が、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つが、前記抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号１３４〜１４５、２９２〜２９６、及び３１９〜３２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項３１】
前記完全長抗体が、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つが、前記抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号１４６〜１５７、２９７〜３０１、及び３２４〜３２８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項３２】
前記完全長抗体が、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つが、前記抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号３１０〜３１８及び３２９〜３３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項３３】
前記完全長抗体が、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つが、前記抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、前記軽鎖融合ポリペプチドが、配列番号３５４及び３５５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項３４】
前記完全長抗体が、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂが、前記完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合され、前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号３５６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖融合ポリペプチドが、配列番号３５７のアミノ酸配列を含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項３５】
前記抗ＣＴＬＡ−４構築物が、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する４つの同一なｓｄＡｂを含み、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する２つのｓｄＡｂが一緒に融合し、前記完全長抗体の各重鎖のＮ末端にさらに融合される、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項３６】
前記完全長抗体が、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項３７】
前記完全長抗体が、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項３８】
前記完全長抗体が、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項３７に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項３９】
前記完全長抗体が、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項３７に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項４０】
前記完全長抗体が、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つが、前記抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号１７１〜１８２、３０２〜３０６、及び３４５〜３４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項４１】
前記完全長抗体が、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つが、前記抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号１８３〜１９４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項４２】
ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、前記単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項４３】
請求項１〜４２のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物と競合的にＣＴＬＡ−４に特異的に結合する、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物、及び医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項４５】
ＣＴＬＡ−４関連疾患を有する個体の治療方法であって、前記個体に有効量の請求項４４に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項４６】
前記ＣＴＬＡ−４関連疾患が、がんである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記がんが、固形腫瘍である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記がんが、大腸癌である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記個体に追加のがん療法を投与することをさらに含む、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記医薬組成物が、全身投与される、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記医薬組成物が、局所投与される、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本発明は、２０１６年１０月１１日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／１０１７７７号、及び２０１７年７月２０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９３６４４号の利益を主張し、これらの出願は、それらの全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルによる配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイル上の以下の提出物の内容、すなわち、コンピューターで読取り可能な形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：７６１４２２０００３４１ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、記録日：２０１７年１０月９日、サイズ：６９９ＫＢ）は、その全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
［技術分野］
【０００３】
本発明は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む構築物、及びこれらを作製し、使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した刺激だけでなく、Ｔ細胞表面上で構成的に発現される共刺激表面分子（例えば、ＣＤ２８）を介した追加のシグナリングもまた必要とする。ＣＤ２８のリガンドは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、活性化Ｂ細胞、または単球）上に存在するＢ７−１（ＣＤ８０）及びＢ７−２（ＣＤ８６）である。Ｂ７とＣＤ２８の間の相互作用は、抗原特異的Ｔ細胞の成熟及び増殖をトリガーするのに十分であると見なされるいくつかの共刺激シグナリング経路の１つである。共刺激の欠如により付随するＩＬ−２産生の不備は、その後のＴ細胞増殖を妨げ、「アネルギー」と呼ばれる非反応性の状態を誘導する。
【０００５】
細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４、またはＣＤ１５２）は、ＣＤ２８のホモログであり、活性化Ｔ細胞上で上方調節される阻害性免疫チェックポイント分子として知られる。ＣＴＬＡ−４は、Ｂ７−１及びＢ７−２にも結合するが、ＣＤ２８よりも親和性が大きい。Ｂ７とＣＴＬＡ−４の間の相互作用は、Ｔ細胞活性化を弱め、これは、腫瘍免疫逃避の重要な機序を構成する。抗ＣＴＬＡ−４抗体療法は、黒色腫などの多くのがんに有望であることが示された。
【０００６】
一本鎖抗体（ｓｄＡｂ）は、単一の単量体抗体可変ドメインを有することで従来の４鎖抗体とは異なる。例えば、ラクダ及びサメは、軽鎖が自然に欠如している重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）という名の単一ドメイン抗体を産生する。ラクダ科動物のＨＣＡｂの各アームの抗原結合断片は、単一重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）を有し、これは、軽鎖の助けを借りることなく抗原に対して高親和性を示すことができる。ラクダ科動物のＶＨＨは、おおよそ１５ｋＤの分子量を有する最小の機能的抗原結合断片として知られる。
【０００７】
本明細書に参照される全ての刊行物、特許、特許出願、及び公開特許出願の開示は、それらの全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む構築物、及びこれらを作製し、使用する方法に関する。
【０００９】
本発明の一態様は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。
【００１０】
上述の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。
【００１１】
上述の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、以下のいずれか１つを含む：
（１）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（９）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１０）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１１）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１２）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１３）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１４）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１５）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１６）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１７）配列番号２１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１８）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１９）配列番号２１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２０）配列番号２１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２１）配列番号２１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２２）配列番号２１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２３）配列番号２１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２４）配列番号２２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２５）配列番号２２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２６）配列番号２２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；または
（２７）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。
【００１２】
上述の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、以下のいずれか１つを含む：
（１）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（９）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１０）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１１）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１２）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１３）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１４）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１５）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１６）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１７）配列番号２１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１８）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１９）配列番号２１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２０）配列番号２１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２１）配列番号２１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２２）配列番号２１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２３）配列番号２１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２４）配列番号２２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２５）配列番号２２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２６）配列番号２２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；または
（２７）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。
【００１３】
上述の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、以下のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む：ａ−１）３７位のアミノ酸残基は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｉ、Ｗ、Ｃ、Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｔ、及びＰ（例えば、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、またはＶ、例えば、ＦまたはＹ、または例えば、Ｆ）からなる群から選択され；ａ−２）４４位のアミノ酸残基は、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｒ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｖ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｗ、Ｍ、及びＩ（例えば、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、またはＬ、または例えば、Ｇ、Ｅ、またはＱ）からなる群から選択され；ａ−３）４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ、Ｐ、Ｈ、Ｆ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、Ｅ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、Ｉ、Ｄ、及びＶ（例えば、Ｌ、Ｃ、またはＲ、または例えば、ＬまたはＲ）からなる群から選択され；ａ−４）１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｍ、Ｙ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ｑ、Ｐ、Ｅ、及びＣ（例えば、Ｗ、Ｇ、またはＲ、または例えば、Ｗ）からなる群から選択され；及びａ−５）１０８位のアミノ酸残基は、Ｑ、Ｌ、Ｒ、Ｐ、Ｅ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ａ、及びＨ（例えば、Ｑ）からなる群から選択され；またはｂ−１）３７位のアミノ酸残基は、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶ（例えば、ＦまたはＹ、または例えば、Ｆ）からなる群から選択され；ｂ−２）４４位のアミノ酸残基は、Ｅ及びＱからなる群から選択され；ｂ−３）４５位のアミノ酸残基は、Ｌ及びＲ（例えば、Ｒ）からなる群から選択され；ｂ−４）１０３位のアミノ酸残基は、Ｇ、Ｗ、Ｒ及びＳ（例えば、Ｗ）からなる群から選択され；及びｂ−５）１０８位のアミノ酸残基は、Ｑ及びＬ（例えば、Ｑ）からなる群から選択され；またはｃ−１）３７位のアミノ酸残基は、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶ（例えば、ＦまたはＹ、または例えば、Ｆ）からなる群から選択され；ｃ−２）４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＬ（例えば、Ｇ、Ｅ、またはＱ）からなる群から選択され；ｃ−３）４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ、及びＣ（例えば、ＬまたはＲ）からなる群から選択され；ｃ−４）１０３位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ｒ、及びＳ（例えば、ＲまたはＳ）からなる群から選択され；及びｃ−５）１０８位のアミノ酸残基は、Ｑ及びＬ（例えば、Ｑ）からなる群から選択され；アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ番号付けに従っている。いくつかの実施形態では、１０８位は、１０８位がＱである場合、Ｌに適宜ヒト化することができる。
【００１４】
上述の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）の配列同一性を有するその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメインにおいて最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、配列番号１１４、１２９、２０１、２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。
【００１５】
上述の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。
【００１６】
上述の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【００１７】
上述の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物は、重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃに融合される。いくつかの実施形態では、ＨＣＡｂは、単量体または二量体である。いくつかの実施形態では、ＨＣＡｂは、配列番号１３０〜１３３、２８３〜２９１、及び３６６〜３７１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００１８】
上述の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物は、第２の抗原（またはエピトープ）を特異的に認識する第２の抗体部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、またはｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、第２の抗体部分のＮ末端及び／またはＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び第２の抗体部分が、ペプチドリンカー（例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５）によって適宜連結される。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、ｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは、ＣＴＬＡ−４由来である。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは、ＣＴＬＡ−４由来でない。いくつかの実施形態では、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する２つ以上のｓｄＡｂ（例えば、ＣＴＬＡ−４の同じまたは異なるエピトープ）を含む。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）由来でない。
【００１９】
上述の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物は、第２の抗原を特異的に認識する第２の抗体部分をさらに含み、第２の抗体部分は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、第２の抗体部分のＮ末端及び／またはＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び第２の抗体部分が、ペプチドリンカー（例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５）によって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、ＰＤ−１を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号１３４〜１４５、２９２〜２９６、及び３１９〜３２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号１４６〜１５７、２９７〜３０１、及び３２４〜３２８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３１０〜３１８及び３２９〜３３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、軽鎖融合ポリペプチドは、配列番号３５４及び３５５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３５６のアミノ酸配列を含み、軽鎖融合ポリペプチドは、配列番号３５７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する４つの同一なｓｄＡｂを含み、完全長抗体の各重鎖のＮ末端は、２つの同一なｓｄＡｂであり、２つの同一なｓｄＡｂは、適宜ペプチドリンカーを介して互いに融合され、２つの同一なｓｄＡｂは、適宜ペプチドリンカーを介して完全長抗体の各重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号１７１〜１８２、３０２〜３０６、及び３４５〜３４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号１８３〜１９４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。抗ＣＴＬＡ−４構築物は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する４つの同一なｓｄＡｂを含み、完全長抗体の各重鎖のＮ末端は、２つの同一なｓｄＡｂであり、２つの同一なｓｄＡｂは、適宜ペプチドリンカーを介して互いに融合され、２つの同一なｓｄＡｂは、適宜ペプチドリンカーを介して完全長抗体の各重鎖のＮ末端に融合される。
【００２０】
上述の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、（ａ）上述のＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のいずれかを含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第２の抗原結合部分を含み、ＶＨ及びＶＬは一緒に、第２のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合される。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは、ＣＴＬＡ−４由来である。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは、ＣＴＬＡ−４由来でない。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、二重特異性である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む抗体断片（例えば、Ｆａｂ）である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む単一ポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、適宜ペプチドリンカーを介して一緒に融合したＣＴＬＡ−４を特異的に認識する２つの同一なｓｄＡｂ部分を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分のＣ末端は、第２の抗原結合部分の少なくとも１つの重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分のＣ末端は、第２の抗原結合部分の少なくとも１つの軽鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分のＮ末端は、第２の抗原結合部分の少なくとも１つの重鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分のＮ末端は、第２の抗原結合部分の少なくとも１つの軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分のＣ末端は、第２の抗原結合部分の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分のＣ末端は、第２の抗原結合部分のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分のＮ末端は、第２の抗原結合部分のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＣＨ１ドメインに融合したＣＴＬＡ−４を特異的に認識する第１のｓｄＡｂ部分を含む第１のポリペプチド鎖、及びＣＬドメインに融合したＣＴＬＡ−４を特異的に認識する第２のｓｄＡｂ部分を含む第２のポリペプチド鎖を含むＦａｂ様ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の抗原結合部分は、ヒト、ヒト化、ヒト、またはキメラ抗体、またはその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの実施形態���は、Ｆｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を有するＩｇＧ４  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、適宜ペプチドリンカー（例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含むペプチドリンカー）を介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは、免疫チェックポイント分子、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１由来である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−１抗体、またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、配列番号１３４〜１４５、２９２〜２９６、３１９〜３２３、３５８、及び３５９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つのコピー、ならびに配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖の２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖の２つのコピー、及び配列番号３５４または３５５のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドの２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、配列番号３５６のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つのコピー、及び配列番号３５７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドの２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、配列番号３６１のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つのコピー、及び配列番号３６２のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドの２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、配列番号３６３のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つのコピー、及び配列番号３６４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドの２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、配列番号３６０のアミノ酸配列を含むポリペプチドの２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、配列番号１４６〜１５７、２９７〜３０１、及び３２４〜３２８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つのコピー、ならびに配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖の２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、配列番号３１０〜３１８及び３２９〜３３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つのコピー、ならびに配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖の２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。い��つかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、配列番号１７１〜１８２、３０２〜３０６、及び３４５〜３４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つのコピー、ならびに配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖の２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、配列番号１８３〜１９４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つのコピー、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖の２つのコピーを含む。
【００２１】
上述の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物は、生物学的に活性なタンパク質またはその断片をさらに含む。
【００２２】
ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物をさらに提供する。
【００２３】
上述の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つと競合的にＣＴＬＡ−４に特異的に結合する単離抗ＣＴＬＡ−４構築物をさらに提供する。
【００２４】
上述の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つ、及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物をさらに提供する。
【００２５】
本発明の別の態様は、個体に有効量の上述の医薬組成物のいずれか１つを投与することを含む、ＣＴＬＡ−４関連疾患を有する個体の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４関連疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍、例えば、大腸癌である。いくつかの実施形態では、方法は、個体に追加のがん療法、例えば、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４関連疾患は、病原性感染である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身に、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）または腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所的に、例えば、腫瘍内に投与される。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。
【００２６】
上述の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つをコードする単離核酸をさらに提供する。いくつかの実施形態では、単離核酸は、配列番号９７〜１１２及び２６４〜２７３のいずれか１つの核酸配列を含む。
【００２７】
上述の単離核酸のいずれか１つを含むベクターをさらに提供する。
【００２８】
上述の単離核酸またはベクターのいずれか１つを含む単離宿主細胞をさらに提供する。
【００２９】
上述の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物、単離核酸、ベクター、または単離宿主細胞のいずれか１つを含むキットをさらに提供する。
【００３０】
本発明の別の態様は、上述の単離核酸もしくはベクターのいずれか１つを含む宿主細胞を培養すること、またはコードされた抗ＣＴＬＡ−４構築物の産生に効果的な条件下で上述の単離宿主細胞のいずれか１つを培養すること；及び発現された抗ＣＴＬＡ−４構築物を前記宿主細胞から得ることを含む、上述の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つの産生方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、上述の単離核酸またはベクターのいずれか１つを含む宿主細胞を産生することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】免疫前血清、及び４番目、５番目、及び６番目の免疫後の免疫血清の免疫応答評価を示す。
【図２】６番目の免疫後の重鎖抗体（ＩｇＧ２及びＩｇＧ３）の免疫応答評価を示す（末梢採血）。免疫前血清から分画した重鎖抗体は、陰性対照として使用した。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、Ｂ７−１を発現する安定細胞株及びビオチン標識ｈＣＴＬＡ−４／Ｆｃタンパク質を用いた、ＦＡＣＳに基づくリガンド競合アッセイによるｓｄＡｂ（図３Ａ）及びそれらの重鎖抗体（図３Ｂ）の機能的活性評価を示す。ヤーボイ（登録商標）は、陽性抗ＣＴＬＡ−４抗体対照として使用した。
【図４】ＣＴＬＡ−４に基づく封鎖アッセイによる精製ｓｄＡｂの機能的活性評価を示す。ヤーボイ（登録商標）は、陽性抗ＣＴＬＡ−４抗体対照として使用した。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｆは、ＣＴＬＡ−４に基づく封鎖アッセイによる精製トップＨＣＡｂ（図５Ｂ〜５Ｅ）の機能的活性評価を示す。ヤーボイ（登録商標）は、陽性抗ＣＴＬＡ−４抗体対照として機能した（図５Ａ）。全てのアッセイからのＥＣ５０を図５Ｆにまとめた。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【図６】ヒト化後のＡ３４３１１（ＷＴ）及びトップ３クローンのｓｄＡｂ配列アライメントを示す。ヒトアクセプター（ｓｄＡｂ  Ａ３４３１１と最も高い相同性を共有する最良のヒト生殖細胞系列配列）と比較したフレームワーク領域におけるアミノ酸差異は、濃い灰色で網掛けする。
【図７】Ｂ７−１を発現する安定細胞株及びビオチン標識ｈＣＴＬＡ−４  Ｆｃタンパク質を用いた、ＦＡＣＳに基づくリガンド競合アッセイによるＡ３４３１１  ｓｄＡｂ及びヒト化ｓｄＡｂ  ＡＳ０２６４０の機能的活性評価を示す。
【図８】ＣＴＬＡ−４に基づく封鎖アッセイによるＡ３４３１１  ｓｄＡｂ及びＡＳ０２６４０  ｓｄＡｂの機能的活性評価を示す。
【図９】例示のｓｄＡｂ  Ａ３４３１１及びそのヒト化バージョン（ＡＳ０２６４０）の親和性決定を示す。ＣＴＬＡ−４  Ｆｃタンパク質をチップ上に固定化し、２つのｓｄＡｂは、１、３、９、２７、及び８１ｎＭの濃度で分析物として流した。
【図１０】ＣＴＬＡ−４に基づく封鎖アッセイによるＡ３４３１１  ＨＣＡｂ及びＡＳ０２６４０  ＨＣＡｂの機能的活性評価を示す。ヤーボイ（登録商標）は、陽性抗ＣＴＬＡ−４抗体対照として機能した。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＭＣ３８同系マウスモデルを用いた、Ａ３４３１１  ＨＣＡｂ及びＡＳ０２６４０  ＨＣＡｂのインビボでの有効性研究を示す。図１１Ａは、実験的なタイムラインを示す。図１１Ｂは、インビボで腫瘍増殖を阻害するＡ３４３１１  ＨＣＡｂ及びＡＳ０２６４０  ＨＣＡｂの能力を示し、社内製ヤーボイ（イピリムマブ）バイオシミラー抗体（ヤーボイ（登録商標）と実質的に同じアミノ酸配列を有する４鎖抗体）と同等の有効性を有する。図１１Ｃは、ＭＣ３８移植したマウスの体重が治療の影響を受けなかったことを示す。
【図１２−１】図１２Ａ〜１２Ｄは、ＰＤ−１結合に対する例示の２つの二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体の親和性決定を示す。キイトルーダ（登録商標）は、抗ＰＤ−１抗体の陽性対照として使用した。抗体をチップ上に固定化し、ＰＤ−１−Ｈｉｓタンパク質は、０．７８、１．５６、３．１５、６．２５、１２．５、２５、５０、及び１００ｎＭの濃度で分析物として流した。
【図１２−２】同上。
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｅは、ＣＴＬＡ−４結合に対する例示の２つの二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体の親和性決定を示す。Ａ３４３１１  ＨＣＡｂ及びヤーボイ（登録商標）は、抗ＣＴＬＡ−４陽性対照として機能した。抗体をチップ上に固定化し、ＣＴＬＡ−４−Ｈｉｓタンパク質は、０．７８、１．５６、３．１５、６．２５、１２．５、２５、５０、及び１００ｎＭの濃度で分析物として流した。
【図１３−２】同上。
【図１３−３】同上。
【図１４】ＰＤ−１を発現する安定細胞株及びビオチン標識ｈＰＤ−Ｌ１  Ｆｃタンパク質を用いた、ＦＡＣＳに基づくリガンド競合アッセイにより標的化されるＰＤ−１に対する設計された二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体の機能的活性評価を示す。
【図１５】Ｂ７−１を発現する安定細胞株及びビオチン標識ｈＣＴＬＡ−４  Ｆｃタンパク質を用いた、ＦＡＣＳに基づくリガンド競合アッセイにより標的化されるＣＴＬＡ−４に対する設計された二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体の機能的活性評価を示す。
【図１６−１】図１６Ａ〜１６Ｆは、ＣＴＬＡ−４に基づく封鎖アッセイにより標的化されるＣＴＬＡ−４に対する設計された二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体の機能的活性評価を示す。社内発現されたヤーボイバイオシミラー、ヤーボイ（登録商標）抗体、及びＡ３４３１１  ＨＣＡｂは、陽性抗ＣＴＬＡ−４抗体対照として使用した。
【図１６−２】同上。
【図１６−３】同上。
【図１７−１】図１７Ａ〜１７Ｄは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにより標的化されるＰＤ−１に対する設計された二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体の機能的活性評価を示す。キイトルーダ（登録商標）は、陽性抗ＰＤ−１抗体対照として使用した。
【図１７−２】同上。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｊは、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂのＦＡＣＳに基づくリガンド競合評価を示す。ヤーボイ（登録商標）は、陽性抗ＣＴＬＡ−４抗体対照として機能した。全てのアッセイからのＩＣ５０を図１８Ｊにまとめた。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｌは、ＣＴＬＡ−４に結合するための例示の二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１抗体のＦＡＣＳに基づくリガンド競合評価を示す。ヤーボイ（登録商標）は、陽性抗ＣＴＬＡ−４抗体対照として機能した。ヒトＩｇＧは、陰性対照として機能した。全てのアッセイからのＩＣ５０を図１９Ｌにまとめた。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｊは、ＰＤ−１に結合するための例示の二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体のＦＡＣＳに基づくリガンド競合評価を示す。キイトルーダ（登録商標）及びオプジーボ（登録商標）は、陽性抗ＰＤ−１抗体対照として機能した。全てのアッセイからのＩＣ５０を図２０Ｊにまとめた。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｇは、ＰＤ−Ｌ１に結合するための例示の二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１抗体のＦＡＣＳに基づくリガンド競合評価を示す。テセントリク（登録商標）は、陽性抗ＰＤ−Ｌ１抗体対照として機能した。キイトルーダ（登録商標）は、抗ＰＤ−１抗体対照として機能した。ヒトＩｇＧは、陰性対照として使用した。全てのアッセイからのＩＣ５０を図２１Ｇにまとめた。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｂは、ＡＳ０７０１４  ｓｄＡｂ及びＡＳ０７０８９  ｓｄＡｂの親和性決定を示す。ＣＴＬＡ−４−Ｈｉｓタンパク質をチップ上に固定化し、２つのｓｄＡｂは、５、１０、２０、４０、８０、及び１６０ｎＭの濃度で分析物として流した。動態データを図２２Ｂにまとめた。
【図２３Ａ】図２３Ａ〜２３Ｂは、例示の抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ及びそれらのヒト化ＨＣＡｂの親和性決定を示す。ＣＴＬＡ−４−Ｈｉｓタンパク質をチップ上に固定化し、ＨＣＡｂは、５、１０、２０、４０、８０、及び１６０ｎＭの濃度で分析物として流した。動態データを図２３Ｂにまとめた。
【図２３Ｂ】同上。
【図２４Ａ】図２４Ａ〜２４Ｂは、ＣＴＬＡ−４に結合するための例示の二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１抗体の親和性決定を示す。ヤーボイ（登録商標）は、抗ＣＴＬＡ−４抗体に対する陽性対照として使用した。抗体をチップ上に固定化し、ＣＴＬＡ−４−Ｈｉｓタンパク質は、１２．５、２５、５０、１００、及び２００ｎＭの濃度で分析物として流した。動態データを図２４Ｂにまとめた。
【図２４Ｂ】同上。
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｂは、ＰＤ−１に結合するための例示の二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体の親和性決定を示す。オプジーボ（登録商標）は、抗ＰＤ−１抗体に対する陽性対照として使用した。抗体をチップ上に固定化し、ＰＤ−１−Ｈｉｓタンパク質は、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、及び１００ｎＭの濃度で分析物として流した。動態データを図２５Ｂにまとめた。
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｂは、ＰＤ−Ｌ１に結合するための例示の二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１抗体の親和性決定を示す。テセントリク（登録商標）は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対する陽性対照として使用した。抗体をチップ上に固定化し、ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓタンパク質は、１．５６、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、及び５０ｎＭの濃度で分析物として流した。動態データを図２６Ｂにまとめた。
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｃは、ＣＴＬＡ−４に基づく封鎖アッセイによる精製ｓｄＡｂの機能的活性評価を示す（図２７Ａ）。ヤーボイ（登録商標）は、陽性抗ＣＴＬＡ−４抗体対照として機能した（図２７Ｂ）。全てのアッセイからのＥＣ５０を図２７Ｃにまとめた。
【図２８Ａ】図２８Ａ〜２８Ｂは、ＣＴＬＡ−４に基づく封鎖アッセイによる（ヒト化ＨＣＡｂを含む）精製ＨＣＡｂの機能的活性評価を示す。ヤーボイ（登録商標）は、陽性抗ＣＴＬＡ−４抗体対照として機能した一方、ヒトＩｇＧは、陰性対照として機能した（図２８Ａ）。全てのアッセイからのＥＣ５０を図２８Ｂにまとめた。
【図２８Ｂ】同上。
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｂは、ＣＴＬＡ−４に基づく封鎖アッセイによる例示の二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１抗体の機能的活性評価を示す。ヤーボイ（登録商標）は、陽性抗ＣＴＬＡ−４抗体対照として機能した（図２９Ａ）。全てのアッセイからのＥＣ５０を図２８Ｂにまとめた。
【図３０】図３０Ａ〜３０Ｂは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１に基づく封鎖アッセイによる例示の二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１抗体の機能的活性評価を示す。キイトルーダ（登録商標）及びオプジーボ（登録商標）は、陽性抗ＰＤ−１抗体対照として機能した。テセントリク（登録商標）は、陽性抗ＰＤ−Ｌ１抗体対照として機能した（図３０Ａ）。全てのアッセイからのＥＣ５０を図３０Ｂにまとめた。
【図３１Ａ】図３１Ａ〜３１Ｃは、選択されたラクダ科動物のｓｄＡｂ配列（Ａ３４３１１、ＡＳ０７０１４及びＡＳ０７１８９）、及びそれらの対応するヒト化ｓｄＡｂならびにヒトアクセプターを示す。
【図３１Ｂ】同上。
【図３１Ｃ】同上。
【図３２Ａ】図３２Ａ〜３２Ｂは、ＣＴＬＡ−４を発現するＣＨＯ細胞に対するヒト化抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂのＦＡＣＳに基づく細胞結合評価を示す。ヤーボイ（登録商標）は、陽性抗ＣＴＬＡ−４抗体対照として機能した。全てのアッセイからのＥＣ５０を図３２Ｂにまとめた。
【図３２Ｂ】同上。
【図３３】図３３Ａ〜３３Ｂは、ヒトＣＴＬＡ−４を発現するＣＨＯ細胞に対する例示の二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１抗体のＦＡＣＳに基づく細胞結合評価を示す。ヤーボイ（登録商標）は、陽性抗ＣＴＬＡ−４抗体対照として機能した。全てのアッセイからのＥＣ５０を図３３Ｂにまとめた。
【図３４】図３４Ａ〜３４Ｂは、ヒトＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞に対する例示の二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体のＦＡＣＳに基づく細胞結合評価を示す。キイトルーダ（登録商標）及びオプジーボ（登録商標）は、陽性抗ＰＤ−１抗体対照として機能した。全てのアッセイからのＥＣ５０を図３４Ｂにまとめた。
【図３５】図３５Ａ〜３５Ｂは、ＰＤ−Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞に対する例示の二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１抗体のＦＡＣＳに基づく細胞結合評価を示す。テセントリク（登録商標）は、陽性抗ＰＤ−Ｌ１抗体対照として機能した。全てのアッセイからのＥＣ５０を図３５Ｂにまとめた。
【図３６】図３６Ａ〜３６Ｃは、ＣＴＬＡ−４  ＫＩマウスにおけるＭＣ３８同系マウスモデルを用いた、Ａ３４３１１  ＨＣＡｂ、ヒト化ＡＳ０７０１４ＶＨ１１  ＨＣＡｂ、及びヒト化ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１  ＨＣＡｂのインビボでの有効性研究を示す。ヤーボイバイオシミラーは、陽性抗ＣＴＬＡ−４抗体対照として使用した。図３６Ａは、実験的なタイムラインを示す。図３６Ｂは、インビボで腫瘍増殖を阻害するＡ３４３１１  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１  ＨＣＡｂ、及びＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１  ＨＣＡｂの能力を示し、ヤーボイバイオシミラーと同等の有効性を有する。図３６Ｃは、ＭＣ３８移植したマウスの体重が治療の影響を受けなかったことを示す。
【図３７Ａ】図３７Ａ〜３７Ｂは、ＰＤ−１  ＫＩマウスにおけるＭＣ３８同系マウスモデルを用いた、例示のＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体ＢＣＰ−７５、ＢＣＰ−７９、及びＢＣＰ−８０のインビボでの有効性研究を示す。図３７Ａは、インビボで腫瘍増殖を阻害するＢＣＰ−７５、ＢＣＰ−７９、及びＢＣＰ−８０二重特異性抗体の能力を示し、社内発現されたキイトルーダ（ペムブロリズマブ）バイオシミラー及びオプジーボ（ニボルマブ）バイオシミラー（４鎖抗体）と同等の有効性を有する。図３７Ｂは、ＭＣ３８移植したマウスの体重が治療の影響を受けなかったことを示す。
【図３７Ｂ】同上。
【図３８Ａ】図３８Ａ〜３８Ｂは、ＣＴＬＡ−４  ＫＩマウスにおけるＭＣ３８同系マウスモデルを用いた、例示のＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体ＢＣＰ−７５、ＢＣＰ−７９、及びＢＣＰ−８０のインビボでの有効性研究を示す。図３８Ａは、インビボで腫瘍増殖を阻害するＢＣＰ−７５及びＢＣＰ−７９二重特異性抗体の能力を示す。キイトルーダ（登録商標）と同じＦｃ領域を有するＡＳ０７０１４ＶＨ１１  ＨＣＡｂ及びＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１  ＨＣＡｂは、２つの二重特異性抗体の対照として機能した。ヤーボイバイオシミラーは、このアッセイの陽性対照として機能した。図３８Ｂは、ＭＣ３８移植したマウスの体重が治療の影響を受けなかったことを示す。
【図３８Ｂ】同上。
【図３９Ａ】図３９Ａ〜３９Ｂは、ＣＴＬＡ−４  ＫＩマウスにおけるヒトＰＤ−Ｌ１  ＫＩＭＣ３８同系マウスモデルを用いた、例示のＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体ＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５のインビボでの有効性研究を示す。社内発現されたテセントリクバイオシミラー４鎖抗体は、抗ＰＤ−Ｌ１の陽性対照として機能した。図３７Ａは、インビボで腫瘍増殖を阻害するＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５二重特異性抗体の能力を示し、併用療法群であるテセントリクバイオシミラー＋ＡＳ０７０１４ＶＨ１１  ＨＣＡｂ及びテセントリクバイオシミラー＋ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１  ＨＣＡｂと同等の有効性を有する。図３９Ｂは、ＭＣ３８移植したマウスの体重が治療の影響を受けなかったことを示す。
【図３９Ｂ】同上。
【図４０】２つの同一な重鎖及び２つの同一な軽鎖、及び２つの同一なｓｄＡｂを有する単一特異性完全長抗体を含み、各ｓｄＡｂのＣ末端が、１つの重鎖のＮ末端に融合される、例示のＢＡＢＰの概略構造を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。２つのｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは、以下のようにＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＬ−ＣＬ、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、各ＶＨＨは、第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、各ｓｄＡｂは省略してもよく、または互いに融合した２つの同一もしくは異なるｓｄＡｂと置換してもよい。単一特異性完全長抗体は、二重特異性完全長抗体と置換して、結合特異性をさらに拡張してもよい。
【図４１】２つの同一な重鎖及び２つの同一な軽鎖、及び２つの同一なｓｄＡｂを有する単一特異性完全長抗体を含み、各ｓｄＡｂのＮ末端が、適宜ペプチドリンカーを介して、１つの重鎖のＣ末端に融合される、例示のＢＡＢＰの概略構造を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。２つのｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは、以下のようにＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ；及び（４）ＶＬ−ＣＬ、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、各ＶＨＨは、第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、各ｓｄＡｂは省略してもよく、または互いに融合したｓｄＡｂの２つのコピーと置換してもよい。単一特異性完全長抗体は、二重特異性完全長抗体と置換して、結合特異性をさらに拡張してもよい。
【図４２】２つの同一な重鎖及び２つの同一な軽鎖、及び２つの同一なｓｄＡｂを有する単一特異性完全長抗体を含み、各ｓｄＡｂのＣ末端が、適宜ペプチドリンカーを介して、１つの軽鎖のＮ末端に融合される、例示のＢＡＢＰの概略構造を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。２つのｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは、以下のようにＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＨＨ−ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＨＨ−ＶＬ−ＣＬ、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、各ＶＨＨは、第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、各ｓｄＡｂは省略してもよく、または互いに融合した２つの同一もしくは異なるｓｄＡｂと置換してもよい。単一特異性完全長抗体は、二重特異性完全長抗体と置換して、結合特異性をさらに拡張してもよい。
【図４３】２つの同一な重鎖及び２つの同一な軽鎖、及び２つの同一なｓｄＡｂを有する単一特異性完全長抗体を含み、各ｓｄＡｂのＮ末端が、適宜ペプチドリンカーを介して、１つの軽鎖のＣ末端に融合される、例示のＢＡＢＰの概略構造を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。２つのｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは、以下のようにＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、各ＶＨＨは、第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、各ｓｄＡｂは省略してもよく、または互いに融合した２つの同一もしくは異なるｓｄＡｂと置換してもよい。単一特異性完全長抗体は、二重特異性完全長抗体と置換して、結合特異性をさらに拡張してもよい。
【図４４】２つの同一な重鎖及び２つの同一な軽鎖、及び４つの同一なｓｄＡｂを有する単一特異性完全長抗体を含み、各ｓｄＡｂのＣ末端が、適宜ペプチドリンカーを介して、単一特異性完全長抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端に融合される、例示のＢＡＢＰの概略構造を示す。完全長抗体は、各々が第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。各ｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは、以下のようにＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＨＨ−ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＨＨ−ＶＬ−ＣＬ、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、各ＶＨＨは、第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、各ｓｄＡｂは省略してもよく、または互いに融合した２つの同一もしくは異なるｓｄＡｂと置換してもよい。単一特異性完全長抗体は、二重特異性完全長抗体と置換して、結合特異性をさらに拡張してもよい。
【図４５】２つの同一な重鎖及び２つの同一な軽鎖、及び４つの同一なｓｄＡｂを有する単一特異性完全長抗体を含み、各重鎖のＮ末端が、２つの同一なｓｄＡｂに融合され、２つのｓｄＡｂが、適宜ペプチドリンカーを介して互いに融合され、２つのｓｄＡｂが、適宜ペプチドリンカーを介して各重鎖のＮ末端に融合される、例示のＢＡＢＰの概略構造を示す。完全長抗体は、各々が第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。各ｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは、以下のようにＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨＨ−ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨＨ−ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＬ−ＣＬ、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、各ＶＨＨは、第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、各ｓｄＡｂは省略してもよく、または互いに融合した２つの同一もしくは異なるｓｄＡｂと置換してもよい。単一特異性完全長抗体は、二重特異性完全長抗体と置換して、結合特異性をさらに拡張してもよい。
【図４６】２つの同一な抗原結合（Ｆａｂ）断片、２つの同一なｓｄＡｂ、及びＦｃ領域を含み、各ｓｄＡｂのＮ末端が、適宜ペプチドリンカーを介してＣＨ１領域のＣ末端に融合され、各ｓｄＡｂのＣ末端が、Ｆｃ領域のＣＨ２領域のＮ末端に融合される、例示のＢＡＢＰの概略構造を示す。完全長抗体は、各々が第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。各ｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは、以下のようにＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＬ−ＣＬ、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、各ＶＨＨは、第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、各ｓｄＡｂは省略してもよく、または互いに融合した２つの同一もしくは異なるｓｄＡｂと置換してもよい。単一特異性完全長抗体は、二重特異性完全長抗体と置換して、結合特異性をさらに拡張してもよい。代替フォーマットでは、特異性を拡張するため、２つのＦａｂ断片は、異なるエピトープに特異的に結合することができ、及び／またはＶＨＨ断片は、異なるエピトープに特異的に結合することができる。
【図４７】２つの同一な一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、２つの同一なｓｄＡｂ及び断片結晶化可能（Ｆｃ）領域を含み、各ｓｄＡｂのＮ末端が、適宜ペプチドリンカーを介してｓｃＦｖのＣ末端に融合され、各ｓｄＡｂのＣ末端が、Ｆｃ領域のＮ末端に融合される、例示のＢＡＢＰの概略構造を示す。各ｓｃＦｖは、第１のエピトープに特異的に結合する。各ｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは、各々が以下のようにＮ末端からＣ末端の構造を有する２つのポリペプチド鎖からなり得る：ＶＬ−ＶＨ−ＶＨＨ−ＣＨ２−ＣＨ３、各ポリペプチド鎖のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープのコピーに特異的に結合するｓｃＦｖドメインを形成し、各ＶＨＨは、第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、ｓｃＦｖドメインは、ＶＨ−ＶＬのＮ末端からＣ末端を含み得る。さらに、特異性を拡張するため、２つのｓｃＦｖは、異なるエピトープに特異的に結合することができ、及び／またはＶＨＨ断片は、異なるエピトープに特異的に結合することができる。
【図４８】２つの同一な抗原結合（Ｆａｂ）断片、各々が２つのＶＨＨ断片を含む２つの同一なＦａｂ様断片、及びＦｃ領域を含む、例示のＢＡＢＰの概略構造を示す。各Ｆａｂ様ドメインでは、ＶＨ及びＶＬ領域は、各々、ｓｄＡｂによって置換される。各Ｆａｂ断片は、第１のエピトープに特異的に結合し、各Ｆａｂ様断片は、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは、以下のようにＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ−ＣＬ；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ−ＣＬ、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、各ＶＨＨは、第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、特異性を拡張するため、２つのＦａｂ断片は、異なるエピトープに特異的に結合することができ、及び／またはＦａｂ様断片は、異なるエピトープに特異的に結合することができる。
【図４９】２つの同一なｓｃＦｖ、各々が２つのＶＨＨ断片を含む２つの同一なＦａｂ様断片、及びＦｃ領域を含む、例示のＢＡＢＰの概略構造を示す。各Ｆａｂ様ドメインでは、ＶＨ及びＶＬ領域は、各々、ｓｄＡｂによって置換される。例えば、ＢＡＢＰは、以下のようにＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得る：（１）ＶＨＨ−ＣＬ；（２）ＶＬ−ＶＨ−ＶＨＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＬ−ＶＨ−ＶＨＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＨＨ−ＣＬ、ポリペプチド鎖（２）及び（３）のＶＨ及びＶＬは、各々、第１のエピトープのコピーに特異的に結合するｓｃＦｖを形成し、各ＶＨＨは、第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、ｓｃＦｖのＣ末端は、ＶＨＨ−ＣＬを含むＦａｂ様断片における鎖のＮ末端に融合され得；及び／またはｓｃＦｖドメインは、ＶＨ−ＶＬのＮ末端からＣ末端を含み得る。さらに、特異性を拡張するため、２つのｓｃＦｖは、異なるエピトープに特異的に結合することができ、及び／またはＶＨＨ断片は、異なるエピトープに特異的に結合することができる。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する新規の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（以下、「抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ」とも呼ばれる）、及びその抗体変異体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、例えば、重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）、完全長抗体に融合した抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖを含む、より大きなタンパク質もしくはポリペプチド、または抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む多重特異性抗原結合タンパク質（ＭＡＢＰ））、及びＣＴＬＡ−４関連疾患、例えば、がんを治療するためのそれらの使用を提供する。
【００３３】
一本鎖抗体（ｓｄＡｂ）は、単一単量体抗体可変ドメイン、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）を有する従来の４鎖抗体と異なり、これは、軽鎖の助けを借りることなく抗原に対して高親和性を示すことができる。ラクダ科動物のＶＨＨは、おおよそ１５ｋＤの分子量を有する最小の機能的抗原結合断片として知られる。
【００３４】
従って、本発明の一態様は、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物を提供する。単離抗ＣＴＬＡ−４構築物は、例えば、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（例えば、天然またはヒト化）、一緒に融合した本明細書に記載の複数の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含むポリペプチド、Ｆｃ断片（例えば、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ）に融合した本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含むＨＣＡｂ、または完全長抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体）もしくは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗原結合断片に融合した本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含むＭＡＢＰであり得る。抗ＣＴＬＡ−４構築物は、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）、一価または多価（例えば、二価）であり得る。
【００３５】
組成物（例えば、医薬組成物）、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含む構築物を含むキット及び製造品、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含む構築物の作製方法、ならびに抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含む構築物を用いたＣＴＬＡ−４関連疾患（例えば、がん）の治療方法も提供される。
【００３６】
Ｉ．定義
「細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４」、「ＣＴＬＡ−４」、「ＣＴＬＡ４」、「ＣＴＬＡ−４抗原」、及び「ＣＤ１５２」（例えば、Ｍｕｒａｔａ（１９９９）ＡＭ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５：４５３−４６０を参照されたい）という用語は、交換可能に使用され、ヒトＣＴＬＡ−４の変異体、アイソフォーム、種ホモログ、及びＣＴＬＡ−４との少なくとも１つの共通エピトープを有するアナログを含む（例えば、Ｂａｌｚａｎｏ（１９９２）ＩｎＪ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．７：２８−３２を参照されたい）。従って、本発明の抗ＣＴＬＡ−４構築物は、ある特定の場合には、ヒト以外の種に由来するＣＴＬＡ−４、またはヒトＣＴＬＡ−４に構造的に関連する他のタンパク質（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４ホモログ）と交差反応し得る。他の場合には、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、ヒトＣＴＬＡ−４に対して完全に特異的であり得、種または他の種類の交差反応性を示さない場合がある。
【００３７】
「ヒトＣＴＬＡ−４」という用語は、ヒト配列ＣＴＬＡ−４、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５２０５を有するヒトＣＴＬＡ−４の完全アミノ酸配列を指す。ヒトＣＴＬＡ−４配列は、例えば、保存された突然変異または非保存領域中の突然変異を有することによってＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５２０５のヒトＣＴＬＡ−４と異なる場合があり、ＣＴＬＡ−４は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５２０５のヒトＣＴＬＡ−４と実質的に同じ生物学的機能を有する。例えば、ヒトＣＴＬＡ−４の生物学的機能は、本開示の抗ＣＴＬＡ−４構築物によって特異的に結合されるＣＴＬＡ−４の細胞外ドメイン中にエピトープを有することであり、またはヒトＣＴＬＡ−４の生物学的機能は、Ｔ細胞活性の調節である。
【００３８】
「エピトープ」という用語は、抗体へ特異的に結合できるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸や糖側鎖といった分子の化学的活性表面群から構成され、かつ通常は特異的な電荷特性だけでなく、特異的な三次元構造特性を有する。立体配座及び非立体配座エピトープは、変性溶媒存在下で後者ではなく前者への結合が失われることで区別される。
【００３９】
「Ｂ７リガンド」という用語は、本明細書で使用する場合、ＣＴＬＡ−４に対するリガンドである分子のＢ７ファミリーのメンバー（すなわち、ＣＴＬＡ−４に結合することができる分子のＢ７ファミリーのメンバー）を指すことを意図する。Ｂ７リガンドの例は、Ｂ７−１及びＢ７−２である。ヒトＢ７−１（ＣＤ８０）のアミノ酸及びＤＮＡ配列は、それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５１８２及びＮＭ＿００５１９１で開示される。ヒトＢ７−２（ＣＤ８６）（アイソフォーム１）のアミノ酸及びＤＮＡ配列は、それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿７８７０５８及びＮＭ＿１７５８６２で開示され；ヒトＢ７−２（ＣＤ８６）（アイソフォーム２）のアミノ酸及びＤＮＡ配列は、それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００８８２０及びＮＭ＿００６８８９で開示される。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「治療」または「治療すること」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的では、有益なまたは所望の結果としては、以下：疾患から生じる１つ以上の症状を緩和すること、疾患範囲を縮小すること、疾患を安定化すること（例えば、疾患の悪化の予防または遅らせること）、疾患の拡散（例えば、転移）を予防または遅らせること、疾患の再発を予防または遅らせること、疾患の進行を遅延または遅らせること、疾患状態を改善すること、疾患の寛解（部分的なまたは完全な）を提供すること、疾患を治療するために必要な１つ以上の他の薬物適用の用量を低下させること、疾患の進行を遅らせること、生活の質を向上させること、及び／または生存を延長することの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、「治療」によって包含されるのは、がんの病理学的結果の縮小である。本発明の方法は、治療のこれらの態様のいずれか１つ以上を企図する。
【００４１】
「予防する」という用語、及び「予防した」、「予防すること」などの同様の言葉は、疾患または状態、例えば、がんの再発の可能性を予防、阻害、または低減するためのアプローチを示す。それは、疾患もしくは状態の再発を遅らせること、または疾患もしくは状態の症状の再発を遅らせることも指す。本明細書で使用する場合、「予防」及び同様の言葉は、疾患または状態の再発の前に、疾患または状態の強度、効果、症状、及び／または負担を軽減することも含む。
【００４２】
本明細書で使用する場合、がんの発症を「遅らせること」とは、疾患の発症を引き延ばす、妨害する、遅らせる、妨げる、安定化する、及び／または延期することを意味する。この遅延は、治療する疾患及び／または個体の病歴に応じて時間の長さを変化させることであると言える。がんの発症を「遅延する」方法は、方法を用いない場合と比較して、所定の時間枠で疾患発症の可能性を低下させる及び／または所定の時間枠で疾患の程度を軽減する方法である。そのような比較は、典型的には、統計的に有意な数の個体を用いた臨床研究に基づいている。がんの発症は、コンピューター断層撮影（ＣＡＴスキャン）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、腹部超音波検査、凝固試験、動脈造影、または生検を含むが、これらに限定されない標準方法を用いて検出可能であり得る。また、発症とは、最初は検出不可能であり得るがんの進行のことであってもよく、発生、再発、及び開始が含まれる。
【００４３】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、特定の疾病、状態または疾患を治療する、例えば、その症状の１つ以上を改善、緩和、軽快、及び／または遅延させるのに十分な薬剤または薬剤の組み合わせの量を指す。がんを引き合いに出す場合、有効量は、腫瘍が退縮するか、及び／または腫瘍の増殖速度が低下するか（腫瘍増殖の抑制等）、または他の望ましくない細胞増殖が予防もしくは遅延されるのに十分な量を含む。いくつかの実施形態では、有効量は、発症を遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、再発を予防するかまたは遅延させるのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与によって投与することができる。薬物または組成物の有効量は、（ｉ）がん細胞の数を減少させる、（ｉｉ）腫瘍のサイズを低減させる、（ｉｉｉ）がん細胞が末梢器管に浸潤するのを阻害、遅延、ある程度まで緩徐化及び好ましくは停止させる、（ｉｖ）腫瘍の転移を阻害する（すなわち、ある程度まで緩徐化し、好ましくは停止させる）、（ｖ）腫瘍の成長を阻害する、（ｖｉ）腫瘍の発現及び／または再発を予防または遅延させる、及び／または（ｖｉｉ）がんに伴う症状の１つ以上をある程度まで緩和することができる。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「個体」または「対象」は、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類または霊長類を含むが、これらに限定されない哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。
【００４５】
「抗体」、「抗原結合部分」、または「抗体部分」という用語は、それらの最も広い意味で用いられ、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、完全長抗体及びその抗原結合断片を含むが、これらに限定されない種々の抗体構造を包含する。
【００４６】
基本的な４鎖抗体単位は、２つの同一な軽（Ｌ）鎖及び２つの同一な重（Ｈ）鎖で構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる付加的ポリペプチドを伴った５つの基本へテロ四量体単位からなり、１０の抗原結合部位を含有するが、一方、ＩｇＡ抗体は、２〜５つの基本的な４鎖単位からなり、これは重合して、Ｊ鎖と組み合わせて多価集合体を形成し得る。ＩｇＧの場合、４鎖単位は、一般的に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によりＨ鎖と連結されるが、一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに依存して、１つ以上のジスルフィド結合により互いに連結される。Ｈ及びＬ鎖は、各々、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）と、その後にα及びγ鎖の各々では３つの定常ドメイン（ＣＨ）ならびにμ及びεアイソタイプでは４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）と、その後にその他端に定常ドメインを有する。ＶＬは、ＶＨと共に整列され、ＣＬは、重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列される。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる。ＶＨ及びＶＬの対合は一緒になって、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性に関しては、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｏｌｗ  （ｅｄｓ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ，１９９４，ｐａｇｅ  ７１ａｎｄ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。任意の脊椎動物種からのＬ鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明白に異なる型のうちの１つに割り当てられ得る。それらの重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てられ得る。それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる重鎖を有する５つのクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがある。γ及びαクラスは、ＣＨ配列及び機能の相対的に小さな差に基づいてさらにサブクラスに分けられ、例えば、ヒトは、以下のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２。
【００４７】
「重鎖のみ抗体」または「ＨＣＡｂ」という用語は、重鎖を含むが、４鎖抗体で通常見られる軽鎖が欠けている機能的抗体を指す。ラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ、またはアルカパ）は、ＨＣＡｂを産生することが知られている。
【００４８】
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」という用語は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する単一抗原結合ポリペプチドを指す。ｓｄＡｂのみは、対応するＣＤＲ含有ポリペプチドと対合せずに抗原に結合することができる。場合によっては、単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物のＨＣＡｂから操作されており、それらの重鎖可変ドメインは、「ＶＨＨ」（重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン）とも本明細書で呼ばれる。ラクダ科動物のｓｄＡｂは、公知の最小抗原結合抗体断片の１つである（例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：１６８−７３（１９９５）；Ｈａｓｓａｎｚａｄｅｈ−Ｇｈａｓｓａｂｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ），８：１０１３−２６（２０１３）を参照されたい）。基本的なＶＨＨは、Ｎ末端からＣ末端までの以下の構造：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有し、ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４は、フレームワーク領域１〜４をそれぞれ指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は、相補性決定領域１〜３を指す。
【００４９】
「単離された」抗体（または構築物）は、その作製（例えば、天然または組み換え）環境の構成成分から特定、単離、及び／または回収されたものである。単離されたポリペプチドは、その作製環境からの他の全ての構成成分と関連しないのが好ましい。その作製環境の混入汚染構成成分、例えば、組み換えトランスフェクト細胞から生じるものは、典型的には、抗体の研究、診断、または治療への使用を妨げる物質であり、それらには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、（１）例えば、Ｌｏｗｒｙ法で測定した場合に、抗体の９５重量％を超えるまで、いくつかの実施形態では、９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用して、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いた非還元条件または還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。単離された抗体（または構築物）には、抗体の天然の環境の少なくとも１つの構成成分は存在しないことになるため、組み換え細胞内にインサイチュ抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチド、抗体、または構築物は、少なくとも１つの精製ステップにより調製されることになる。
【００５０】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、「ＶＨ」及び「ＶＬ」と呼ばれ得る。これらのドメインは、一般的に、（同じクラスの他の抗体に対して）抗体の最も可変な部分であり、抗原結合部位を含有している。ラクダ科の種に由来する重鎖のみ抗体は、「ＶＨＨ」と呼ばれる単一重鎖可変領域を有する。従って、ＶＨＨは、特殊型のＶＨである。
【００５１】
「可変」という用語は、可変ドメインのあるセグメントが抗体の間の配列で広範囲に異なる、という事実を指す。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、特定抗体の、その特定抗原に関する特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの全スパンを通して均一に分布しない。代わりに、可変性は、軽鎖及び重鎖の両可変ドメイン内の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインの、より高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。自然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、４つのＦＲ（大部分はβシート立体配置をとり、３つのＣＤＲにより連結される）を含み、これは、βシート構造を連結し、いくつかの場合には、その一部を構成するループを形成する。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域により密に接近して一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ    Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、抗体依存的細胞性細胞傷害性の関与といったような種々のエフェクター機能を示す。
【００５２】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然に生じる突然変異及び／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に向けられる。典型的に異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対して向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが、他の免疫グロブリンによって夾雑されないハイブリドーマ培養により合成されるという点で有益である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を指し、任意の特定の方法による抗体作製が必要であると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用するモノクローナル抗体は、種々の技術で作製されてよく、例えば、ハイブリドーマ方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７（１９７５）；Ｈｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組み換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）、ファージ提示技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）、ならびに、ヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリンの座位または遺伝子の一部または全部を有する、ヒトまたはヒト様抗体を動物に産生させる技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３；ＷＯ１９９６／３４０９６；ＷＯ１９９６／３３７３５；ＷＯ１９９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８��５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；及び同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）；及びＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照されたい）が挙げられる。
【００５３】
「ネイキッド抗体」という用語は、細胞傷害部分または放射標識に抱合されていない抗体を指す。
【００５４】
「完全長抗体」、「無傷抗体」、または「全抗体」という用語は、交換可能に使用され、抗体断片とは対照的に、その実質的に無傷な形態の抗体を指す。具体的には、完全長４鎖抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を伴うものを含む。完全長重鎖のみ抗体は、重鎖（例えば、ＶＨＨ）及びＦｃ領域を含む。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であり得る。場合によっては、無傷抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有し得る。
【００５５】
「抗体断片」または「抗原結合断片」は、無傷抗体の一部、好ましくは、無傷抗体の抗原結合及び／または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）を参照されたい）；一本鎖抗体分子；単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一な抗原結合断片、及び残余「Ｆｃ」断片（この名称は容易に結晶化する能力を反映している）を産生した。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）及び１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を伴う完全Ｌ鎖からなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価であり、すなわち、それは単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、単一大型Ｆ（ａｂ’）２断片を生じるが、これは、異なる抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片におおよそ対応し、依然として抗原に架橋し得る。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含めてＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に２〜３の付加的残基を有することでＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’に関する本明細書中での呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも既知である。
【００５６】
Ｆｃ断片は、ジスルフィドにより一緒にまとめられた両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域（特定の細胞型で見い出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によっても認識される領域）中の配列により決定される。
【００５７】
「定常ドメイン」という用語は、抗原結合部位を含む、免疫グロブリンの他の部分である可変ドメインと比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメイン（総称して、ＣＨ）、及び軽鎖のＣＨＬ（またはＣＬ）ドメインを含む。
【００５８】
いかなる哺乳類に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて明確に区別される、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２タイプの１つに割り当てられ得る。
【００５９】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含有する最小の抗体断片である。この断片は、堅く、非共有的に会合した１つの重鎖及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これら２つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（各々Ｈ及びＬ鎖からの３つのループ）を生じる。しかしながら、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、完全結合部位より低い親和性ではあるが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
【００６０】
「一本鎖Ｆｖ」（「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される）は、単一ポリペプチド鎖に連結されるＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはさらに、ＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを含み、これは、抗原結合のために望ましい構造をｓＦｖに形成させる。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００６１】
本明細書に記載の抗体の「機能的断片」は、無傷抗体の部分を含み、一般的に、無傷抗体の抗原結合領域もしくは可変領域、または改変されたＦｃＲ結合能を保持するもしくは有する抗体のＦｃ領域を含む。抗体断片の例としては、線状抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００６２】
「ダイアボディ」という用語は、Ｖドメインの鎖内対合ではなく鎖間対合が達成され、それにより二価断片、すなわち２つの抗原結合部位を有する断片を生じるよう、ＶＨ及びＶＬドメイン間に短いリンカー（約５〜１０残基）を有するｓＦｖ断片（前段落を参照）を構築することにより調製される小抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）により詳細に記載されている。
【００６３】
本明細書のモノクローナル抗体としては具体的には「キメラ」抗体（免疫グロブリン）が挙げられ、これにおいて、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における、対応する配列と同一または相同であり、一方、当該鎖（複数可）の残りの部分は、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における、対応する配列と同一または相同であり、そのような抗体の断片についても、それらが所望の生物学的活性を示す限り、抗体の場合と同様である（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５（１９８４））。「ヒト化抗体」は、「キメラ抗体」のサブセットとして使用される。
【００６４】
非ヒト（例えば、ラマまたはラクダ）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここで、レシピエントのＣＤＲ（以下に定義される）に由来する残基は、所望の特異性、親和性、及び／または能力を有するマウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ラマ、アルカパ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基で置換される。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（「ＦＲ」）残基は、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含んでよい。これらの改変を、抗体性能（例えば、結合親和性）をさらに洗練させるために作製してもよい。一般的に、ヒト化抗体は、実質的に全てまたは少なくとも１つ、及び典型的に２つの可変ドメインを含み、それにおいて超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリン配列のものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものであるが、ＦＲ領域は、抗体性能（例えば、結合親和性、異性化、免疫原性など）を改善する１つ以上の個々のＦＲ残基の置換を含み得る。ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換の数は、典型的には、Ｈ鎖におけるわずか６つ、及びＬ鎖におけるわずか３つである。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも部分、典型的にヒト免疫グロブリンのものも含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。また、例えば、Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）；ならびに米国特許第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号を参照されたい。
【００６５】
「ヒト抗体」は、ヒトにより産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有し、及び／または、本明細書で開示するヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製された抗体である。ヒト抗体のこの定義では、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体が除外される。ヒト抗体を、当該技術分野において公知の種々の技術（ファージ提示ライブラリーを含む）を使用して産生することができる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。また、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能な方法が、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載される。また、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：３６８−７４（２００１）を参照されたい。ヒト抗体は、抗原攻撃に応答してそのような抗体を産生するように改変されているが、しかしながら、その内因性遺伝子座が無能になっているトランスジェニック動物（例えば、免疫化ゼノマウス）に対して抗原を投与することにより調製することができる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照されたい）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体に関しては、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）を参照されたい。
【００６６】
「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、本明細書で使用する場合、配列が超可変である、及び／または構造的に定義されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、単一ドメイン抗体は、３つのＨＶＲ（またはＣＤＲ）：ＨＶＲ１（またはＣＤＲ１）、ＨＶＲ２（またはＣＤＲ２）、及びＨＶＲ３（またはＣＤＲ３）を含む。ＨＶＲ３（またはＣＤＲ３）は、３つのＨＶＲのうち最も高い多様性を示し、抗体に優れた特異性を付与するうえで特異な役割を果たすと考えられている。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）；Ｓｈｅｒｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３−７３６（１９９６）を参照されたい。
【００６７】
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、Ｋａｂａｔシステムで定義されるように、超可変領域を指すように使用される。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  ＳｅｒＶｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい。
【００６８】
多くのＨＶＲ描写が本明細書において使用され、包含される。Ｋａｂａｔの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づき、最も共通して使用される（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造的ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭ  ＨＶＲは、ＫａｂａｔのＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａの構造的ループの間での妥協を表わし、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲの各々からの残基を以下の表１に指摘する。
【表１−１】
2019533719.tif 000002
【表１−２】
2019533719.tif 000003
【００６９】
ＨＶＲは以下の通りの「伸長ＨＶＲ」：ＶＬ内に、２４〜３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７または８９〜９６（Ｌ３）、ならびに、ＶＨ内に、２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５または４９〜６５（Ｈ２）、及び９３〜１０２、９４〜１０２、または９５〜１０２（Ｈ３）を含み得る。可変ドメイン残基を、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａに従って、これらの定義の各々について番号付けする。
【００７０】
単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）のアミノ酸残基は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０００  Ｊｕｎ  ２３；２４０（１−２）：１８５−１９５の論文においてラクダ科動物に由来するＶＨＨドメインに適用されるように、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，ＵＳ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１）によって与えられたＶＨドメインに関する一般的な番号付けに従って番号付けされる。この番号付けに従うと、ＶＨＨのＦＲ１は、１位〜３０位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ１は、３１位〜３５位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ２は、３６位〜４９位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ２は、５０位〜６５位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ３は、６６位〜９４位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ３は、９５位〜１０２位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ４は、１０３位〜１１３位のアミノ酸残基を含む。これに関して、ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインに関して当該技術分野で既知のように、ＣＤＲそれぞれにおけるアミノ酸残基の総数は変わる可能性があり、Ｋａｂａｔ番号付けで示されるアミノ酸残基の総数に対応していなくてもよい（すなわち、Ｋａｂａｔ番号付けによる１つ以上の位置が実際の配列で占められていなくてもよく、または実際の配列が、Ｋａｂａｔ番号付けで可能な数より多くのアミノ酸残基を含有していてもよい）ことに留意すべきである。
【００７１】
「Ｋａｂａｔにおける可変ドメイン残基番号付け」または「Ｋａｂａｔにおけるアミノ酸位置番号付け」という表現、及びそのバリエーションは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａにおいて抗体の編集での重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについて使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用し、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＨＶＲの短縮、またはその中への挿入に対応するより少ないまたは追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後の単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従った残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔに従った残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列を伴う抗体の配列の相同性の領域でのアライメントにより所与の抗体について決定することができる。
【００７２】
本明細書で別段の指定がない限り、免疫グロブリン重鎖における残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａと同様のＥＵインデックスのものである。「Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
【００７３】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００７４】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」または「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も共通して生じるアミノ酸残基を表わすフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般的に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）におけるサブグループである。例は、ＶＬについて、サブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａにおけるサブグループカッパＩ、カッパＩＩ、カッパＩＩＩ、またはカッパＩＶであり得る。さらに、ＶＨについて、サブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．におけるサブグループＩ、サブグループＩＩ、サブグループＩＩＩであり得る。あるいは、ヒトコンセンサスフレームワークは、上に由来し得るが、それにおいて特定の残基、例えば、ヒトフレームワーク残基が、ドナーフレームワーク配列を種々のヒトフレームワーク配列のコレクションと整列することにより、ドナーフレームワークとのその相同性に基づいて選択される場合などである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得る、またはそれは、既存のアミノ酸配列変化を含み得る。いくつかの実施形態では、既存のアミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。
【００７５】
「親和性成熟した」抗体は、その１つ以上のＣＤＲにおいて１つ以上の変化を有する抗体であり、それらの変化（複数可）を持たない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善がもたらされる抗体である。いくつかの実施形態では、親和性成熟した抗体は、標的抗原に対してナノモル、さらにはピコモルの親和性を有する。親和性成熟した抗体は、当該技術分野で公知の手順により作製される。例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９−７８３（１９９２）には、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャッフリングによる親和性成熟が記載されている。ＣＤＲ及び／またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発は、例えば：Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）；及びＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）に記載されている。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」、または「特異的である」という用語は、測定可能で再現性のある相互作用、例えば、標的と抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）の間での結合を指し、それは、生物学的分子を含む分子の異種集団の存在において標的の存在を決定可能である。例えば、標的（エピトープであり得る）に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）は、より大きな親和性、アビディティを伴い、より容易に、及び／またはそれが他の標的に結合するよりも大きな持続時間を伴いこの標的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態では、無関係な標的への抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定される通り、標的への抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）の結合の約１０％未満である。いくつかの実施形態では、標的に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）は、≦１０−５Ｍ、≦１０−６Ｍ、≦１０−７Ｍ、≦１０−８Ｍ、≦１０−９Ｍ、≦１０−１０Ｍ、≦１０−１１Ｍ、または≦１０−１２Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、異なる種からのタンパク質間で保存されているタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、特異的結合は、排他的な結合を含み得るが、それを要求しない。
【００７７】
「特異性」という用語は、抗原の特定のエピトープに対する抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）の選択的認識を指す。天然抗体は、例えば、単一特異性である。「多重特異性」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原結合タンパク質が、ポリエピトープ特異性を有する（すなわち、１つの生物学的分子上の２つ、３つ、もしくはそれ以上の異なるエピトープに特異的に結合することができる、または２つ、３つ、もしくはそれ以上の異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる）ことを指す。「二重特異性」は、本明細書で使用する場合、抗原結合タンパク質が２つの異なる抗原結合特異性を有することを指す。別段の指定がない限り、二重特異性抗体によって結合した抗原を表記した順番は任意である。すなわち、例えば、「抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１」、「抗ＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４」、「ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１」、「ＰＤ−１×ＣＴＬＡ−４」、「ＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４」、「ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１」、「ＰＤ−１−ＣＴＬＡ−４」、及び「ＣＴＬＡ−４−ＰＤ−１」という用語は、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１の両方を特異的に認識する二重特異性抗体を指すように交換可能に使用され得る。「単一特異性」という用語は、本明細書で使用する場合、各々が同じ抗原の同じエピトープに結合する１つ以上の結合部位を有する抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）を指す。
【００７８】
「価」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原結合タンパク質における特定の数の結合部位の存在を指す。例えば、天然抗体または完全長抗体は、２つの結合部位を有し、二価である。このように、「三価」、「四価」、「五価」、及び「六価」という用語は、抗原結合タンパク質における２つの結合部位、３つの結合部位、４つの結合部位、５つの結合部位、及び６つの結合部位の存在をそれぞれ指す。
【００７９】
「抗体エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因するそれらの生物学的活性を指し、抗体アイソタイプに伴い変動する。抗体エフェクター機能の例としては、以下：Ｃ１ｑ結合及び補体依存的細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存的細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が挙げられる。「低下または最小化」抗体エフェクター機能は、野生型または非改変抗体から少なくとも５０％（あるいは、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）だけ低下されるものを意味する。抗体エフェクター機能の決定は、当業者により容易に決定可能かつ測定可能である。好ましい実施形態では、補体結合の抗体エフェクター機能、補体依存的細胞傷害、及び抗体依存的細胞傷害が影響を受ける。いくつかの実施形態では、エフェクター機能は、グルコシル化を除去する定常領域中の突然変異（例えば、「エフェクターなし突然変異」）を通じて除去される。一態様では、エフェクターなし突然変異は、ＣＨ２領域中のＮ２９７ＡまたはＤＡＮＡ突然変異（Ｄ２６５Ａ＋Ｎ２９７Ａ）である。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１）。あるいは、低下または除去されたエフェクター機能をもたらす追加の突然変異は、Ｋ３２２Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）を含む。あるいは、エフェクター機能は、産生技術、例えば、グリコシル化しない宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）またはそれにおいてエフェクター機能を促進する際に無効もしくは効果が低い変化したグリコシル化パターンをもたらす宿主細胞における発現などを通じて低下または除去することができる（例えば、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６−３４７３（２００３））。
【００８０】
「抗体依存的細胞媒介性細胞傷害」またはＡＤＣＣは、細胞傷害の形態を指し、それにおいて特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合した分泌Ｉｇによって、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を持つ標的に特異的に結合し、続いて細胞毒素を用いて標的細胞を殺すことが可能になる。抗体は細胞傷害性細胞を「武装」し、この機構による標的細胞の死滅のために必要とされる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介するための一次細胞は、ＦｃγＲＩＩＩだけを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃ発現が、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイ（例えば、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されるものなど）を実施してもよい。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、または加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、インビボで（例えば、動物モデル、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるものなど）評価してもよい。
【００８１】
本明細書において「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域（天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む）を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシ末端まで伸展すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４７）を、抗体の産生もしくは精製の間に、または抗体の重鎖をコードする核酸の組み換え操作により除去してもよい。従って、無傷抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、及びＫ４４７残基を伴う及び伴わない抗体の混合物を有する抗体集団を含み得る。本明細書に記載の使用のための適当な天然配列Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。
【００８２】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。好ましいＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラス（これらの受容体の対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング形態を含む）を含み、ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、それらは、主に細胞質ドメインにおいて異なる、類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフを含む（Ｍ．Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）を参照されたい）。ＦｃＲｓは、以下において概説される：Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；及びｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）。他のＦｃＲ（今後、同定されるであろうものを含む）が、本明細書中の「ＦｃＲ」という用語により包含される。
【００８３】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、また、新生児受容体ＦｃＲｎを含み、それは、胎児への母親のＩｇＧの転移に関与する。Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４）。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法が公知である（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：（１２）：５９２−８（１９９７）；Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５（７）：６３７−４０（１９９７）；Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３−６（２００４）；ＷＯ２００４／９２２１９（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）を参照されたい）。インビボでのＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清中半減期を、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクションされたヒト細胞株において、または変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長類において評価することができる。ＷＯ２００４／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）には、ＦｃＲへの結合を改善または減弱させた抗体変異体が記載される。また、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい。
【００８４】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在における標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、その同種抗原に結合した（適切なサブクラスの）抗体への補体系（Ｃ１ｑ）の第１成分の結合により開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載される）を実施してもよい。変化したＦｃ領域アミノ酸配列及び増加または減少したＣ１ｑ結合能を伴う抗体変異体が、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号及びＷＯ９９／５１６４２に記載されている。それらの特許公報の内容は、具体的に、参照することによって本明細書に組み込まれる。また、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）を参照されたい。
【００８５】
「結合親和性」は、一般的に、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間での非共有結合的な相互作用の合計の強度を指す。別段の指定がない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合対のメンバーの間での１：１の相互作用を反映する内因性の結合親和性を指す。結合親和性は、Ｋｄ、Ｋｏｆｆ、Ｋｏｎ、またはＫａによって示すことができる。「Ｋｏｆｆ」という用語は、本明細書で使用する場合、動態選択の機構から決定される、抗体／抗原複合体からの抗体（または抗原結合ドメイン）の解離についてのｏｆｆ速度定数を指すことを意図し、ｓ−１の単位で表される。「Ｋｏｎ」という用語は、本明細書で使用する場合、抗体（または抗原結合ドメイン）が抗原に会合して、抗体／抗原複合体を形成するｏｎ速度定数を指すことを意図し、Ｍ−１ｓ−１の単位で表される。平衡解離定数「ＫＤ」または「Ｋｄ」という用語は、本明細書で使用する場合、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指し、平衡状態にある抗体分子の溶液中に存在する全ての抗体結合ドメインの半分を占めるのに必要な抗原の濃度を示し、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎに等しく、Ｍの単位で表される。Ｋｄの測定から、全ての結合剤が溶液中にあることが想定される。例えば、酵母発現系で、抗体が細胞壁に繋がっている場合、対応する平衡速度定数は、ＥＣ５０として表され、それからＫｄの良好な近似値が得られる。親和性定数Ｋａは、解離定数Ｋｄの逆数であり、Ｍ−１の単位で表される。
【００８６】
解離定数（ＫＤまたはＫｄ）は、抗体の抗原に対する親和性を示す指標として使用される。例えば、各種標識剤で標識した抗体を用いたスキャチャード方法、ならびに市販の測定キットであるＢｉａｃｏｒｅＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）または類似のキットを用いて、当該キットに添付された取扱い説明書及び実験操作方法に従って容易に分析することができる。これらの方法を用いて求められるＫＤ値は、Ｍ（モル）の単位で表される。標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、例えば、≦１０−５Ｍ、≦１０−６Ｍ、≦１０−７Ｍ、≦１０−８Ｍ、≦１０−９Ｍ、≦１０−１０Ｍ、≦１０−１１Ｍ、または≦１０−１２Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有し得る。
【００８７】
抗体または抗原結合ドメインの結合特異性は、当該技術分野で公知の方法によって実験的に決定することができる。そのような方法は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＥＩＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ試験、及びペプチドスキャンを含むが、これらに限定されるものではない。
【００８８】
半分の最大阻害濃度（ＩＣ５０）は、特定の生物学的または生化学的機能を阻害する際の物質（例えば、抗体）の有効性の尺度である。それは、どの程度の量の特定の薬物または他の物質（阻害剤、例えば、抗体）が、所与の生物学的過程（例えば、ＣＴＬＡ−４及びＢ７−１の間の結合、または過程の成分、すなわち、酵素、細胞、細胞受容体、もしくは微生物）を半分まで阻害するのに必要とされるかということを示す。値は、典型的には、モル濃度として表される。ＩＣ５０は、作動薬または他の物質（例えば、抗体）に対するＥＣ５０に匹敵する。ＥＣ５０は、最大効果の５０％をインビボで得るために必要な血漿濃度も表す。本明細書で使用する場合、「ＩＣ５０」は、抗原の生物学的活性（例えば、ＣＴＬＡ−４の生物学的活性）の５０％をインビトロで中和するために必要な抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ）の有効な濃度を示すように使用される。ＩＣ５０またはＥＣ５０は、バイオアッセイ、例えば、ＦＡＣＳ分析によるリガンド結合の阻害（競合結合アッセイ）、細胞ベースサイトカイン放出アッセイ、または増幅発光近接均質アッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）によって測定することができる。
【００８９】
ペプチド、ポリペプチド、または抗体配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」及び「相同性」は、配列を整列させ、ギャップを導入し（必要な場合）、最高パーセント配列同一性を達成した後（任意の保存的置換を配列同一性の部分として考えず）、特定のペプチドまたはポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、当該技術分野内にある種々の方法で、例えば、公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどを使用して達成することができる。当業者は、アライメントを測定するための適切なパラメーター（比較されている配列の全長にわたる最高アライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む）を決定することができる。
【００９０】
本明細書に記載の構築物、抗体、またはその抗原結合断片をコードする「単離」核酸分子は、それが産生された環境において通常会合している少なくとも１つの混入核酸分子から同定及び分離される核酸分子である。好ましくは、単離核酸は、産生環境に関連する全ての成分との会合がない。本明細書に記載のポリペプチド及び抗体をコードする単離核酸分子は、それが天然で見出される形態または設定以外の形態である。単離核酸分子は、従って、細胞中に天然に生じる本明細書に記載のポリペプチド及び抗体をコードする核酸から区別される。単離核酸は、核酸分子を通常含有する細胞中に含有される核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外に、またはその天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【００９１】
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物のために適した制御配列は、例えば、プロモーター、場合により、オペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが公知である。
【００９２】
核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係におかれた場合に「作動可能に連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダー用のＤＮＡを、それが、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチド用のＤＮＡに作動可能に連結し；プロモーターまたはエンハンサーを、それが配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結し；または、リボソーム結合部位を、それが翻訳を促進するように位置付けられる場合、コード配列に作動可能に連結する。一般的に、「作動可能に連結された」は、連結されたＤＮＡ配列が近接しており、及び、分泌リーダーの場合では、近接し、リーディング段階にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、近接する必要はない。連結は、便利な制限部位での連結により達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の実行に従って使用する。
【００９３】
「ベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、それが連結される別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結される核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、「発現ベクター」と本明細書中で呼ばれる。
【００９４】
本明細書で使用する場合、「自己の」という用語は、それが個体に後に再導入されることになる個体と同一の個体に由来する任意の材料を指すことを意味する。
【００９５】
「同種の」とは、同じ種の異なる個体に由来する移植片を指す。
【００９６】
「トランスフェクションされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、それによって外来性の核酸が宿主細胞に導入（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）されるか、または導入（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）されるプロセスを指す。「トランスフェクションされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外来性の核酸を用いてトランスフェクション、形質転換、または形質導入された細胞である。細胞には、初代対象細胞及びその子孫が含まれる。
【００９７】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」という用語は、交換可能に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は、親細胞と核酸含量が完全に同一ではない場合があるが、突然変異を含み得る。最初に形質転換細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が本明細書に含まれる。
【００９８】
「アジュバント設定」とは、ある個体が、がんの既往歴を持ち、全般的に（必ずしもそうとは限らない）、外科手術（例えば、外科切除）、放射線治療、及び化学療法などを含むが、これらに限定されない治療に応答的である場合の臨床設定である。しかしながら、がんの既往歴のため、そのような個体は、該疾患の発症のリスクがあると考えられる。「アジュバント設定」における治療または投与とは、事後の治療方式を指す。リスクの程度（例えば、アジュバント設定における個体が、「高リスク」または「低リスク」と考えられる場合）は、いくつかの要因に依存するが、もっとも多くの場合、最初に治療されたときの疾患の程度に依存する。
【００９９】
「ネオアジュバント設定」は、方法が、一次／根治治療の前に実施される臨床的設定を指す。
【０１００】
「医薬組成物」の「医薬製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効となるような形態であり、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加成分を含有しない調製物を指す。そのような製剤は、滅菌性である。「滅菌」製剤は、無菌であるか、または全ての生きている微生物及びそれらの胞子を含まない。
【０１０１】
本明細書に記載の本発明の実施形態は、実施形態「からなる」こと、及び／または実施形態「から本質的になる」を含むことを理解されたい。
【０１０２】
「約」に関して、本明細書における値またはパラメーターは、その値またはパラメーターそれ自体を対象とする変化量を含む（記載する）。例えば、「約Ｘ」という記述は、「Ｘ」の記述を含む。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、ある値またはパラメーター「ではない」という言及は、一般にある値またはパラメーター「以外」を意味し、記載する。例えば、方法は、タイプＸのがんを治療するために使用されないということは、この方法は、Ｘ以外のタイプのがんを治療するために使用されることを意味する。
【０１０４】
本明細書で使用される「約Ｘ〜Ｙ」という用語は、「約Ｘ〜約Ｙ」と同じ意味を有する。
【０１０５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる単数形の「ａ」、「または」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別段に決定することが明らかでない限り、複数の指示を包含する。
【０１０６】
ＩＩ．抗ＣＴＬＡ−４構築物
（Ｉ）抗ＣＴＬＡ−４単一ドメイン抗体部分
本明細書に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物は、ＣＴＬＡ−４（または「抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ」）を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む。いくつかの実施形態では、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物は、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂである。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。
【０１０９】
従って、いくつかの実施形態では、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分であって、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１１３】
本明細書に記載したＣＤＲの配列を以下の表２及び表６に提供する。
【表２−１】
2019533719.tif 000004
【表２−２】
2019533719.tif 000005
【表２−３】
2019533719.tif 000006
【表６−１】
2019533719.tif 000007
【表６−２】
2019533719.tif 000008
【表６−３】
2019533719.tif 000009
【０１１４】
ＣＤＲは、種々のペアワイズ組み合わせで組み合わせて、多くの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を生成することができる。
【０１１５】
例えば、いくつかの実施形態では、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、配列番号２１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、配列番号２１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、配列番号２１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、配列番号２１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、配列番号２１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、配列番号２１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、配列番号２２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、配列番号２２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、配列番号２２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１４２】
抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、１つ以上のＦＲ配列中に１つ以上の「ホールマーク残基」を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、以下のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み得る：ａ−１）３７位のアミノ酸残基は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｉ、Ｗ、Ｃ、Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｔ、及びＰ（例えば、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、またはＶ、例えば、ＦまたはＹ、または例えば、Ｆ）からなる群から選択され；ａ−２）４４位のアミノ酸残基は、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｒ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｖ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｗ、Ｍ、及びＩ（例えば、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、またはＬ、または例えば、Ｇ、Ｅ、またはＱ）からなる群から選択され；ａ−３）４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ、Ｐ、Ｈ、Ｆ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、Ｅ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、Ｉ、Ｄ、及びＶ（例えば、Ｌ、Ｃ、またはＲ、または例えば、ＬまたはＲ）からなる群から選択され；ａ−４）１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｍ、Ｙ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ｑ、Ｐ、Ｅ、及びＣ（例えば、Ｗ、Ｇ、またはＲ、または例えば、Ｗ）からなる群から選択され；及びａ−５）１０８位のアミノ酸残基は、Ｑ、Ｌ、Ｒ、Ｐ、Ｅ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ａ、及びＨ（例えば、Ｑ）からなる群から選択され；またはｂ−１）３７位のアミノ酸残基は、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶ（例えば、ＦまたはＹ、または例えば、Ｆ）からなる群から選択され；ｂ−２）４４位のアミノ酸残基は、Ｅ及びＱからなる群から選択され；ｂ−３）４５位のアミノ酸残基は、Ｌ及びＲ（例えば、Ｒ）からなる群から選択され；ｂ−４）１０３位のアミノ酸残基は、Ｇ、Ｗ、Ｒ、及びＳ（例えば、Ｗ）からなる群から選択され；及びｂ−５）１０８位のアミノ酸残基は、Ｑ及びＬ（例えば、Ｑ）からなる群から選択され；またはｃ−１）３７位のアミノ酸残基は、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶ（例えば、ＦまたはＹ、または例えば、Ｆ）からなる群から選択され；ｃ−２）４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＬ（例えば、Ｇ、Ｅ、またはＱ）からなる群から選択され；ｃ−３）４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ、及びＣ（例えば、ＬまたはＲ）からなる群から選択され；ｃ−４）１０３位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ｒ、及びＳ（例えば、ＲまたはＳ）からなる群から選択され；及びｃ−５）１０８位のアミノ酸残基は、Ｑ及びＬ（例えば、Ｑ）からなる群から選択され；アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ番号付けに従う。Ｋａｂａｔ番号付けによるアミノ酸位置３７、４４、４５、１０３及び１０８でのこれらの「ホールマーク残基」は、天然ＶＨＨ配列の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分に適用し、及びヒト化中に置換することができることに留意すべきである。例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによるアミノ酸位置１０８でのＱは、Ｌに適宜ヒト化することができる。他のヒト化置換は、当業者には明らかであろう。例えば、潜在的に有用なヒト化置換は、天然に生じるＶＨＨのＦＲ配列を、１つ以上の密接に関連するヒトＶＨの対応するＦＲ配列と比較した後、当該技術分野で公知の（本明細書にも記載される）方法を用いて、１つ以上のそのような潜在的に有用なヒト化置換を前記ＶＨＨに導入することで決定することができる。得られるヒト化ＶＨＨ配列は、ＣＴＬＡ−４結合親和性、安定性、発現のしやすさ及びレベル、及び／または他の所望の特性について試験することができる。可能な残基置換は、抗体ＶＨドメインから来てもよく、ＶＨ／ＶＬ界面は、１つ以上の高電荷アミノ酸残基を含む。本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、部分的または完全にヒト化することができる。好ましくは、得られるヒト化抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、本明細書に記載のＫｄ、Ｋｏｎ、ＫｏｆｆでＣＴＬＡ−４に結合する。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）の配列同一性を有するその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメインにおいて最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、及び／またはＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、アミノ酸置換は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＦＲ、例えば、ＦＲ１、及び／またはＦＲ２、及び／またはＦＲ３、及び／またはＦＲ４内である。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ＣＤＲ及びＦＲの両方においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分に基づいてヒト化される。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１２９、２０１、２０２、２７４、及び３４２〜３４４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分に基づいてヒト化される。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２７５〜２７９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１２２のアミノ酸配列を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分に基づいてヒト化される。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２８０〜２８２及び３４１のアミノ酸配列を含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分のいずれか１つと競合的にＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分（以下、「競合抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分」または「競合抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ」と呼ばれる）または抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含む、抗ＣＴＬＡ−４構築物（以下、「競合抗ＣＴＬＡ−４構築物」と呼ばれる）が提供される。いくつかの実施形態では、競合的結合は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分と競合的にＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分（または抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＣＴＬＡ−４構築物）が提供される。別の例では、いくつかの実施形態では、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分と競合的にＣＴＬＡ−４に特異的に結合する、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分（または抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＣＴＬＡ−４構築物）が提供される。いくつかの実施形態では、競合抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、競合抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１４６】
単一ドメイン抗体
例示のｓｄＡｂとしては、重鎖のみ抗体に由来する重鎖可変ドメイン（例えば、ラクダ科におけるＶＨＨ（重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン）または軟骨魚類におけるＶＮＡＲ（サメ新抗原受容体の可変ドメイン））、軽鎖を天然に欠く結合分子、慣用の４鎖抗体に由来する単一ドメイン（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、ヒト化重鎖のみ抗体、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウスまたはラットにより産生されたヒト単一ドメイン抗体、ならびに抗体に由来するもの以外の操作されたドメイン及び単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ｓｄＡｂは、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、サカナ、サメ、ヤギ、ウサギ、及びウシを含むが、これらに限定されない任意の種由来であってもよい。本明細書で検討される単一ドメイン抗体は、ラクダ科及びサメ以外の種に由来する天然に生じる単一ドメイン抗体分子も含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、軽鎖を欠く重鎖として知られる天然に生じる単一ドメイン抗原結合分子（「重鎖のみ抗体」、または「ＨＣＡｂ」とも本明細書中で呼ばれる）由来である。そのような単一ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４／０４６７８号及びＨａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８に開示されている。明確化するために、天然に軽鎖を欠く重鎖分子に由来する可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの慣用のＶＨと区別するために、ＶＨＨとして本明細書で知られる。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えば、ラクダ、ラマ、ビクーニャ、ヒトコブラクダ、アルカパ、及びグアナコで育った抗体由来であり得る。ラクダ科以外の他の種は、天然に軽鎖を欠く重鎖分子を産生し得、そのようなＶＨＨは、本発明の範囲内である。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、軟骨魚類で見られる免疫グロブリンの可変領域由来である。例えば、ｓｄＡｂは、サメの血清に見られる新規抗原受容体（ＮＡＲ）として知られる免疫グロブリンアイソタイプ由来であり得る。ＮＡＲ（「ＩｇＮＡＲ」）の可変領域に由来する単一ドメイン分子を生成する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１及びＳｔｒｅｌｔｓｏｖ（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１４：２９０１−２９０９に記載されている。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、組み換え、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、及び／またはインビトロで生成される（例えば、ファージ提示により選択される）。いくつかの実施形態では、フレームワーク領域のアミノ酸配列は、フレームワーク領域における特定のアミノ酸残基の「ラクダ化」によって変更され得る。ラクダ化とは、従来の４鎖抗体からの（天然に生じる）ＶＨドメインのアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶＨＨドメインにおける対応する位置（複数可）で生じる１つ以上のアミノ酸残基と置き換えるまたは置換することを指す。これは、それ自体が知られた方法で行うことができ、例えば、本明細書中のさらなる説明に基づいて、当業者には明白であろう。そのような「ラクダ化」置換は、本明細書で定義するように、ＶＨ−ＶＬ界面及び／またはいわゆるラクダ科動物のホールマーク残基を形成する、及び／またはに存在するアミノ酸位置に挿入するのが好ましい（例えば、ＷＯ９４／０４６７８、Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３３９：２８５−２９０，１９９４；Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（６）：５３１−５３７，１９９６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５９：９５７−９６９，１９９６；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：２５−３８，１９９９を参照されたい）。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウスまたはラットが産生するヒトｓｄＡｂである。例えば、ＵＳ２００９０３０７７８７Ａ１、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９Ａ１、ＵＳ２０１００１２２３５８Ａ１、及びＷＯ２００４０４９７９４を参照されたい。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、親和性成熟される。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、特定の抗原または標的に対する天然に生じるＶＨＨドメインは、ラクダ科動物のＶＨＨ配列の（ナイーブまたは免疫）ライブラリーから得ることができる。そのような方法は、１つ以上のそれ自体が知られたスクリーニング技術を使用して、前記抗原もしくは標的、またはその少なくとも一部、断片、抗原決定基もしくはエピトープを用いてそのようなライブラリーをスクリーニングすることを伴ってもよいし、伴わなくてもよい。そのようなライブラリー及び技術は、例えば、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ０１／９０１９０、ＷＯ０３／０２５０２０、及びＷＯ０３／０３５６９４に記載されている。あるいは、（ナイーブまたは免疫）ＶＨＨライブラリーに由来する改良した合成または半合成ライブラリー、例えば、ＷＯ００／４３５０７に記載されるように、無作為突然変異誘発及び／またはＣＤＲシャッフリングなどの技術によって（ナイーブまたは免疫）ＶＨＨライブラリーから得られたＶＨＨライブラリーを使用してもよい。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、従来の４鎖抗体から生成される。例えば、ＥＰ０３６８６８４、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  １９８９  Ｏｃｔ．１２；３４１（６２４２）：５４４−６）、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３，２１（１１）：４８４−４９０；ＷＯ０６／０３０２２０；及びＷＯ０６／００３３８８を参照されたい。
【０１５３】
ｓｄＡｂの特有な特性により、ＶＨＨドメインを単一抗原結合タンパク質または抗原結合ドメイン（すなわち、より大きいタンパク質またはポリペプチドの一部として）として使用することは、従来のＶＨ及びＶＬ、ｓｃＦｖ及び従来の抗体断片（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ’）２）を上回る多くの有意な優位性を提供する：１）たった１つのドメインしか抗原が高い親和性で結合するのに必要でないので、第２のドメインを有する必要も、これら２つのドメインが正しい空間的な構造及び立体配置に存在することを確かめる必要もない（例えば、折り畳み中に重鎖と軽鎖を対合する必要がない、特別に設計されたリンカー（例えば、ｓｃＦｖに対して）を使用する必要がない）；２）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、１つの遺伝子から発現することができ、転写後の折り畳みまたは改変の必要がない；３）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、簡単に多価及び／または多重特異的な形態（本明細書にさらに記載するようなもの）に操作することができる；４）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、高い可溶性を示し、凝集しやすい傾向（マウス由来「ｄＡｂｓ」に見られるような、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９８９  Ｏｃｔ  １２；３４１（６２４２）：５４４−６に記載されている）が見られない；５）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、熱、ｐＨ、プロテアーゼ、及び他の変性剤または変性条件に対して高い安定性を示す；６）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、例えば、微生物発酵を用いて、（大規模な生産規模であっても）容易かつ比較的安価に調製でき、（例えば、従来の抗体断片の生産に必要な）哺乳類の発現系を必要としない；７）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、従来の４鎖抗体及びそれらの抗原結合断片と比較して比較的小さい（従来のＩｇＧよりもおおよそ１５ｋＤａまたは１０倍小さい）ため、例えば、固形腫瘍及び他の密集組織への（より）高い組織浸透能力を有する；８）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、（従来のＶＨドメインのものと比較して拡張されたＣＤＲ３ループにより）いわゆる「空洞結合特性」を示すため、従来の４鎖抗体及びその抗原結合断片が接近できなかった標的及びエピトープに接近することができる。例えば、ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、酵素を阻害することができることが示されている（例えば、ＷＯ１９９７０４９８０５；Ｔｒａｎｓｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．１９９８  Ｓｅｐ  １；３２（４）：５１５−２２；Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９８  Ｊｕｌ  １；１７（１３）：３５１２−２０を参照されたい）。
【０１５４】
ＣＴＬＡ−４
ＣＴＬＡ−４は、細胞外Ｖドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質尾部を含む。選択的スプライス変異体によってコードされるいくつかのアイソフォームが特徴付けられている。膜結合アイソフォームは、ジスルフィド結合によって相互連結されるホモ二量体として機能する一方、可溶性アイソフォームは、モノマーとして機能する。ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８のものと同様の細胞内ドメインを有し、これは、固有の触媒活性が欠如し、ＰＩ３Ｋ、ＰＰ２Ａ、及びＳＨＰ−２に結合することができる１つのＹＶＫＭモチーフ、ならびにＳＨ３含有タンパク質に結合することができる１つのプロリンリッチモチーフを含む。
【０１５５】
ヒトＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５２０５で開示される。アミノ酸１〜３７の領域は、リーダーペプチドであり；３８〜１６１は、細胞外Ｖ様ドメインであり；１６２〜１８７は、膜貫通ドメインであり；及び１８８〜２２３は、細胞質ドメインである。ヒトＣＴＬＡ−４  ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＮＭ＿００５２１４で開示される。４９位でのＧからＡへの転位、２７２位でのＣからＴへの転位、及び４３９位でのＡからＧへの転位を含む、ヌクレオチド配列の変異体が報告されている。
【０１５６】
特定のヒトＣＴＬＡ−４配列は、一般的に、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５２０５のヒトＣＴＬＡ−４に対するアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、他の種（例えば、ネズミ）のＣＴＬＡ−４アミノ酸配列と比較した場合にアミノ酸配列をヒトとして同定するアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣＴＬＡ−４は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５２０５のＣＴＬＡ−４に対してアミノ酸配列が少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。いくつかの実施形態では、ヒトＣＴＬＡ−４配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５２０５のＣＴＬＡ−４から１０以下のアミノ酸差異を示す。いくつかの実施形態では、ヒトＣＴＬＡ−４は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５２０５のＣＴＬＡ−４から５、４、３、２、または１以下のアミノ酸差異を示し得る。同一性パーセントは、本明細書に記載されるように決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５２０５のＣＴＬＡ−４に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有するＣＴＬＡ−４ポリペプチドを特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＣＴＬＡ−４ポリペプチドを特異的に認識する。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ヒト以外の種、またはヒトＣＴＬＡ−４に構造的に関連する他のタンパク質（例えば、ヒトＣＴＬＡ−４ホモログ）に由来するＣＴＬＡ−４と交差反応し得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ヒトＣＴＬＡ−４に対して完全に特異的であり、種または他の種類の交差反応性を示さない。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ヒトＣＴＬＡ−４の可溶性アイソフォームを特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ヒトＣＴＬＡ−４の膜結合アイソフォームを特異的に認識する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ＣＴＬＡ−４細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のＮ末端部分を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ＣＴＬＡ−４細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のＣ末端部分を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ＣＴＬＡ−４細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の中央部分を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分によって特異的に認識されるＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５２０５のＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインに対してアミノ酸配列が少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分によって特異的に認識されるＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５２０５のＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインに対してアミノ酸配列が１００％同一である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１６４のアミノ酸配列を含むＣＴＬＡ−４ポリペプチドを特異的に認識する。
【０１５９】
抗体親和性
抗体または抗原結合ドメインの結合特異性は、当該技術分野で公知の方法によって実験的に決定することができる。そのような方法は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ−、ＲＩＡ−、ＥＣＬ−、ＩＲＭＡ−、ＥＩＡ−、ＢＩＡｃｏｒｅ試験及びペプチドスキャンを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−８Ｍ、または約１０−６Ｍ〜約１０−８Ｍである。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｏｎは、約１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０４Ｍ−１ｓ−１、約１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０６Ｍ−１ｓ−１、約１０６Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、約１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、約１０３Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、約１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、約１０５Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、約１０３Ｍ−１ｓ−１〜約１０６Ｍ−１ｓ−１、または約１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０６Ｍ−１ｓ−１である。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｏｆｆは、約１ｓ−１〜約１０−２ｓ−１、約１０−２ｓ−１〜約１０−４ｓ−１、約１０−４ｓ−１〜約１０−５ｓ−１、約１０−５ｓ−１〜約１０−６ｓ−１、約１ｓ−１〜約１０−６ｓ−１、約１０−２ｓ−１〜約１０−６ｓ−１、約１０−３ｓ−１〜約１０−６ｓ−１、約１０−４ｓ−１〜約１０−６ｓ−１、約１０−２ｓ−１〜約１０−５ｓ−１、または約１０−３ｓ−１〜約１０−５ｓ−１である。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分のＩＣ５０は、０．１２ｎＭ  Ｂ７−１及び０．２ｎＭ  ＣＴＬＡ−４による増幅発光近接均質アッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）で１０ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分のＩＣ５０は、ＦＡＣＳ分析（競合結合アッセイ）または細胞ベースサイトカイン放出アッセイによるリガンド結合の阻害において５００ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分のＩＣ５０は、１ｎＭ未満、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約５０ｎＭ、約５０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約２００ｎＭ、約２００ｎＭ〜約３００ｎＭ、約３００ｎＭ〜約４００ｎＭ、または約４００ｎＭ〜約５００ｎＭである。
【０１６４】
キメラまたはヒト化抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、ラクダ科の種、例えば、ラマに由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般的に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合により、ヒト定常領域の少なくとも部分も含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）に由来する対応する残基で置換されている。
【０１６６】
ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に総説され、さらに、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェシング」を記述）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
【０１６７】
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）；軽鎖または重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照されたい）；及びＦＲライブラリースクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）、及びＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照されたい）を含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、異種の種に対するその免疫原性を減少させながら、抗原に対するドメインの天然の親和性を減少させることなく改変される、例えば、ヒト化される。例えば、ラマ抗体の抗体可変ドメイン（ＶＨＨ）のアミノ酸残基は、決定することができ、例えば、フレームワーク領域におけるラクダ科動物のアミノ酸の１つ以上は、ヒトコンセンサス配列で見られるようにそれらのヒト対応物によって置換され、そのポリペプチドはその典型的な特性を失うことはない、すなわち、ヒト化は、得られるポリペプチドの抗原結合能力に有意な影響を与えない。ラクダ科動物の単一ドメイン抗体のヒト化には、単一ポリペプチド鎖における限られた量のアミノ酸の導入及び突然変異誘発が必要である。これは、２本の鎖、軽鎖及び重鎖におけるアミノ酸変化の導入、ならびに両鎖のアセンブリの保存が必要なｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、及びＩｇＧのヒト化と対照的である。
【０１６９】
ＶＨＨドメインを含む単一ドメイン抗体は、ヒト様配列を有するようにヒト化することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＶＨＨドメインのＦＲ領域は、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のいずれか１つのアミノ酸配列相同性を含む。ヒト化ＶＨＨドメインの１つの例示のクラスは、そのＶＨＨが、Ｋａｂａｔ番号付けに従って、位置４５にグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、アスパラギン、またはグルタミンからなる群より選ばれるアミノ酸（例えば、Ｌ４５など）を持ち、位置１０３にトリプトファンを持つことを特徴とする。従って、このクラスに属するポリペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して高いアミノ酸配列相同性を示し、前記ポリペプチドは、望ましくない免疫応答を引き起こす可能性を伴わず、かつさらなるヒト化の負担も伴わずに、ヒトに直接投与され得る。
【０１７０】
ヒト化ラクダ科単一ドメイン抗体の別の例示のクラスは、ＷＯ０３／０３５６９４に記載されており、ヒト起源のまたは他の種由来の従来型抗体に典型的に見られる疎水性ＦＲ２残基を含有するが、この親水性の喪失を、二本鎖抗体由来のＶＨに存在する保存されたトリプトファン残基に代わる１０３位の荷電アルギニン残基によって補償している。従って、これら２つのクラスに属するペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して高いアミノ酸配列相同性ーを示し、前記ペプチドは、望ましくない免疫応答を引き起こす可能性を伴わず、かつさらなるヒト化の負担も伴わずに、ヒトに直接投与され得る。
【０１７１】
ヒト抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は、一般的に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。完全ヒト単一ドメイン抗体を産生することができるトランスジェニックマウスまたはラットは、当該技術分野で公知である。例えば、ＵＳ２００９０３０７７８７Ａ１、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９Ａ１、ＵＳ２０１００１２２３５８Ａ１、及びＷＯ２００４０４９７９４を参照されたい。
【０１７２】
ヒト抗体は、抗原攻撃に応答して、無傷ヒト抗体またはヒト可変領域を持つ無傷抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。そのような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含む。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載している、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号、及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号を参照されたい。そのような動物で生成された無傷抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに改変される可能性がある。
【０１７３】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種細胞株が記載されている（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載される。
【０１７４】
ヒト抗体は、ヒトに由来するファージ提示ライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。そのような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に説明される。
【０１７５】
特定の抗原または標的に対するＶＨＨ配列を得る１つの技術は、重鎖抗体を発現することができるトランスジェニック哺乳動物を適当に免疫化すること（すなわち、免疫応答及び／または前記抗原または標的に対する重鎖抗体をもたらすために）、前記ＶＨＨ配列（をコードする核酸配列）を含有する前記トランスジェニック哺乳動物から適当な生物学的試料（例えば、血液試料、血清試料またはＢ細胞の試料）を得ること、及び次に、それ自体公知である任意の適当な技術（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかまたはハイブリドーマ技術）を用いて、前記試料から出発して、前記抗原または標的に対するＶＨＨ配列を生成することを伴う。例えば、この目的のために、重鎖抗体を発現するマウス、及びＷＯ０２／０８５９４５、ＷＯ０４／０４９７９４及びＷＯ０６／００８５４８及びＪａｎｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００６  Ｏｃｔ．１０；１０３（４１）：１５１３０−５に記載されるさらなる方法及び技術を用いることができる。例えば、そのような重鎖抗体を発現するマウスは、任意の適当な（単一）可変ドメイン、例えば、天然の供給源からの（単一）可変ドメイン（例えば、ヒトの（単一）可変ドメイン、ラクダ科動物の（単一）可変ドメインまたはサメの（単一）可変ドメイン）、ならびに、例えば、合成または半合成の（単一）可変ドメインを有する重鎖抗体を発現することができる。
【０１７６】
ライブラリーに由来する抗体
本発明の抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、種々の方法が、ファージ提示ライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に総説され、さらに、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）；Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）に記載されている。単一ドメイン抗体ライブラリーを構築する方法は、例えば、米国特許第７３７１８４９号に記載されている。
【０１７７】
ある特定のファージ提示法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいてランダムに組み換えられ、これをその後、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ＶＨＨ遺伝子のレパートリーは、ＰＣＲにより同様にクローニングされ、ファージライブラリーにおいてランダムに組み換えられ、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、抗体断片を、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された供給源由来のライブラリーは、ハイブリドーマを構築することを必要とせずに、免疫原に対して親和性の高い抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）に記載されるようにして、ナイーブレパートリーを（例えば、ヒトから）クローニングし、いかなる免疫付与も無しに、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対する、単一供給源の抗体を提供できる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞由来の再構成されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングして、高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再構成を達成するランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することによって、ナイーブライブラリーを合成的に製造することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許公報には、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国公開公報第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び第２００９／０００２３６０号が含まれる。
【０１７８】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書でヒト抗体またはヒト抗体断片とみなされる。
【０１７９】
生物学的活性
本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分の生物学的活性は、その５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を測定することで決定することができ、これは、特異的な生物学的または生化学的機能を阻害する（例えば、ＣＴＬＡ−４及びそのリガンドＢ７−１及び／またはＢ７−２の間の結合を阻害する）抗体の有効性の尺度である。例えば、ここで、ＩＣ５０は、ＣＴＬＡ−４生物活性の５０％をインビトロで中和するのに必要な抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂの有効濃度を示すために使用することができる。ＩＣ５０は、作動薬または他の物質（例えば、抗体）のＥＣ５０に匹敵する。ＥＣ５０は、最大効果の５０％をインビボで得るために必要な血漿濃度も表す。ＩＣ５０またはＥＣ５０は、当該技術分野で公知のアッセイ、例えば、ＦＡＣＳ分析（競合結合アッセイ）によるリガンド結合の阻害などのバイオアッセイ、細胞ベースサイトカイン放出アッセイ、または増幅発光近接均質アッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）によって測定することができる。
【０１８０】
例えば、リガンド結合の遮断は、フローサイトメトリーを用いて試験することができる（実施例１も参照されたい）。ヒトＢ７−１を発現するＣＨＯ細胞を接着培養フラスコから解離して、種々の濃度の試験用の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、及び一定濃度の標識ＣＴＬＡ−４タンパク質（例えば、ビオチン標識ｈＣＴＬＡ−４／Ｆｃタンパク質）と混合することができる。抗ＣＴＬＡ−４抗体陽性対照、例えば、ヤーボイ（登録商標）を使用することができる。混合物を室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。その後、一定濃度の標識ＣＴＬＡ−４タンパク質を特異的に認識する抗体（例えば、ＰＥ／Ｃｙ５ストレプトアビジン二次抗体）を添加し、室温で１５分間インキュベートする。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーで分析する。非線形回帰を用いて、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でデータを分析し、ＩＣ５０を算出することができる。競合アッセイからの結果は、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂが標識ＣＴＬＡ４とＢ７−１の間の相互作用を阻害する能力を示すことができる。
【０１８１】
抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分の生物学的活性は、サイトカイン放出に対するＣＴＬＡ−４に基づく封鎖アッセイによって試験することもできる（実施例１も参照されたい）。ＣＴＬＡ−４シグナリングは、細胞生存率またはＩＬ−２に対する応答性を調節しないが、ＣＤ２８依存的ＩＬ−２産生を阻害する（Ｗａｌｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３：２５４１−５０（１９９６））。実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、ミエリン抗原に対するＴｈ１細胞により誘導される自己免疫疾患であり、これは、病理学的な免疫応答の誘導におけるＢ７仲介共刺激の役割を研究するためのインビボモデルを提供する。抗ＣＴＬＡ−４抗体は、脳炎誘発性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−２の産生を強化して、ＥＡＥ疾患状態を悪化させることがわかった（Ｐｅｒｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７：１３３３−６（１９９６））。従って、抗ＣＴＬＡ−４抗体によるＣＴＬＡ−４経路の遮断は、Ｔ細胞増殖、ＩＦＮ−γ放出、またはＩＬ−２分泌をモニターする種々のバイオアッセイを用いて試験することができる。
【０１８２】
例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞（単離キットによってＰＢＭＣから精製することができる）及びＣＨＯ−Ｋ１／ヒトＣＤ８０（ヒトＣＤ８０を安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１）をウェル中で混合する。試験抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを各ウェルに異なる濃度で添加する。バックグラウンド対照として使用できる抗体はない。陰性対照（例えば、ヒトＩｇＧ４）及び陽性対照（例えば、ヤーボイ（登録商標））を使用することができる。ＣＴＬＡ−４タンパク質をシステムに添加して、反応を開始させる。３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベーションの２４時間後、培地を各試験ウェルから取り出し、ＩＬ−２分泌測定（Ｃｉｓｂｉｏ）した。試験抗体ごとのＥＣ５０値を測定し、これは試験抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂが、Ｔ細胞上のＣＤ８０とＣＴＬＡ−４の間の相互作用を遮断することで、Ｔ細胞ＩＬ−２産生を阻害する能力を反映している。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ＣＴＬＡ−４受容体により形質導入されたシグナルを遮断または拮抗する。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、Ｂ７リガンド（例えば、Ｂ７−１及び／またはＢ７−２）との相互作用からＣＴＬＡ−４を阻害するように、ＣＴＬＡ−４上のエピトープに結合することができる。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、抗体結合部位対ＣＴＬＡ−４リガンド結合部位の比が１：１より大きく、かつ、抗体の濃度が１０−８Ｍより大きい条件下で、ＣＴＬＡ−４のＢ７リガンド（例えば、Ｂ７−１及び／またはＢ７−２）への結合を少なくとも約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％のいずれかだけ減少させることができる。
【０１８４】
（ＩＩ）抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含む構築物
抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＣＴＬＡ−４構築物は、任意の可能な形式のものであり得る。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＣＴＬＡ−４構築物は、追加のポリペプチド配列、例えば、１つ以上の抗体部分、または免疫グロブリンのＦｃ断片をさらに含み得る。そのような追加のポリペプチド配列は、ｓｄＡｂの（生物学的）特性に変化あるいはそれに影響を及ぼしても及ぼさなくてもよく、本明細書に記載のｓｄＡｂにさらなる機能性を追加しても追加しなくてもよい。いくつかの実施形態では、追加のポリペプチド配列は、本発明のｓｄＡｂに１つ以上の所望の特性または機能性を与える。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の１つ以上の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含む細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、追加のポリペプチド配列は、第２の抗原または第２のエピトープを特異的に認識する第２の抗体部分（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、完全長抗体）であってもよい。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＣＴＬＡ−４ではない。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは、ＣＴＬＡ−４由来である。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは、ＣＴＬＡ−４由来でない。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂとして、ＣＴＬＡ−４上の同じエピトープを特異的に認識する。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂとして、ＣＴＬＡ−４上の異なるエピトープを特異的に認識する。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、追加のポリペプチド配列は、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂそれ自体と比較して、本発明の抗ＣＴＬＡ−４構築物の抗体構築物半減期、溶解性または吸収を増加させ、免疫原性または毒性を低減し、望ましくない副作用を排除または軽減し、及び／または他の有利な特性をそれに付与し、及び／またはその望ましくない特性を低減してもよい。そのような追加のポリペプチド配列のいくつかの非限定例は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（例えば、ＷＯ００／２７４３５を参照されたい）またはハプテン分子（例えば、循環抗体によって認識されるハプテン、例えば、ＷＯ９８／２２１４１を参照されたい）である。免疫グロブリンの断片（例えば、ＶＨドメイン）を血清アルブミンまたはその断片に連結することが、抗体半減期を増加させ得ることを示した（例えば、ＷＯ００／２７４３５及びＷＯ０１／０７７１３７を参照されたい）。従って、いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＴＬＡ−４構築物は、適当なリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を適宜介して、血清アルブミン（またはその適当な断片）に連結した本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、血清アルブミンドメインＩＩＩを少なくとも含む血清アルブミンの断片に連結することができる（ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００２８１７を参照されたい）。
【０１８８】
重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、リンカー配列を適宜介して、１つ以上の（好ましくは、ヒト）ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメイン、例えば、Ｆｃ断片に連結して、その半減期をインビボで増加させることができる。
【０１８９】
従って、いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭのＦｃ断片に融合した本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含むＨＣＡｂ（以下、「抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ」と呼ばれる）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂは、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のいずれかのＦｃ配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、ヒトＦｃである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂは、単量体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂは、二量体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分及びＦｃ断片は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ（配列番号１６３）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、変異ヒトＩｇＧ１ヒンジ（配列番号３０７）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２のアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ）または配列番号３６５（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）である。
【０１９０】
従って、いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂであって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、ｓｄＡｂ部分は、免疫グロブリンのＦｃ断片に融合される、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂであって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、ｓｄＡｂ部分は、免疫グロブリンのＦｃ断片に融合される、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂであって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、ｓｄＡｂ部分は、免疫グロブリンのＦｃ断片に融合される、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、以下のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む：ａ−１）３７位のアミノ酸残基は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｉ、Ｗ、Ｃ、Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｔ、及びＰ（例えば、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、またはＶ、例えば、ＦまたはＹ、または例えば、Ｆ）からなる群から選択され；ａ−２）４４位のアミノ酸残基は、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｒ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｖ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｗ、Ｍ、及びＩ（例えば、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、またはＬ、または例えば、Ｇ、Ｅ、またはＱ）からなる群から選択され；ａ−３）４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ、Ｐ、Ｈ、Ｆ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、Ｅ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、Ｉ、Ｄ、及びＶ（例えば、Ｌ、Ｃ、またはＲ、または例えば、ＬまたはＲ）からなる群から選択され；ａ−４）１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｍ、Ｙ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ｑ、Ｐ、Ｅ、及びＣ（例えば、Ｗ、Ｇ、またはＲ、または例えば、Ｗ）からなる群か���選択され；及びａ−５）１０８位のアミノ酸残基は、Ｑ、Ｌ、Ｒ、Ｐ、Ｅ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ａ、及びＨ（例えば、Ｑ）からなる群から選択され；またはｂ−１）３７位のアミノ酸残基は、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶ（例えば、ＦまたはＹ、または例えば、Ｆ）からなる群から選択され；ｂ−２）４４位のアミノ酸残基は、Ｅ及びＱからなる群から選択され；ｂ−３）４５位のアミノ酸残基は、Ｌ及びＲ（例えば、Ｒ）からなる群から選択され；ｂ−４）１０３位のアミノ酸残基は、Ｇ、Ｗ、Ｒ、及びＳ（例えば、Ｗ）からなる群から選択され；及びｂ−５）１０８位のアミノ酸残基は、Ｑ及びＬ（例えば、Ｑ）からなる群から選択され；またはｃ−１）３７位のアミノ酸残基は、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶ（例えば、ＦまたはＹ、または例えば、Ｆ）からなる群から選択され；ｃ−２）４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＬ（例えば、Ｇ、Ｅ、またはＱ）からなる群から選択され；ｃ−３）４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ、及びＣ（例えば、ＬまたはＲ）からなる群から選択され；ｃ−４）１０３位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ｒ、及びＳ（例えば、ＲまたはＳ）からなる群から選択され；及びｃ−５）１０８位のアミノ酸残基は、Ｑ及びＬ（例えば、Ｑ）からなる群から選択され；アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ番号付けに従っており、１０８位は、１０８位がＱである場合、Ｌに適宜ヒト化することができる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂは、単量体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂは、二量体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分及びＦｃ断片は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂであって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）の配列同一性を有するその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂであって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメインにおいて最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、及び／またはＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、アミノ酸置換は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＦＲ、例えば、ＦＲ１、及び／またはＦＲ２、及び／またはＦＲ３、及び／またはＦＲ４内である。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ＣＤＲ及びＦＲの両方においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂであって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂであって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号���１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂは、単量体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂは、二量体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分及びＦｃ断片は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、配列番号１３０〜１３３、２８３〜２９１、及び３６６〜３７１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂが提供される。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、または本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つと競合的にＣＴＬＡ−４に特異的に結合する、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ（以下、「競合抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ」と呼ばれる）も提供される。競合的結合は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、配列番号１３０〜１３３、２８３〜２９１、及び３６６〜３７１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂと競合的にＣＴＬＡ−４に特異的に結合する、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂが提供される。別の例では、いくつかの実施形態では、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂと競合的にＣＴＬＡ−４に特異的に結合する、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（または抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む抗ＣＴＬＡ−４構築物）と競合的にＣＴＬＡ−４に特異的に結合する、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、競合抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂとＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、競合抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂは、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１９４】
多価及び／または多重特異性抗体
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、１つ以上の他の抗体部分（例えば、別の抗原または別のエピトープを特異的に認識する抗体部分）に融合した本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含む。１つ以上の他の抗体部分は、任意の抗体または抗体断片形式、例えば、多重特異性ｓｄＡｂ（例えば、二重特異性ｓｄＡｂ）、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、またはｓｄＡｂであり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗体部分は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の抗体断片の総説については、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい；ＷＯ９３／１６１８５；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。多重特異性抗体の概説については、Ｗｅｉｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１０（１）：１−１８，２０１３；Ｇｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３（２）：６５−７９，２０１５；Ｓｔａｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１（２）：１７２−１９８，２０１２を参照されたい。ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディもまた、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。抗体断片は、種々の技術で作製することができ、限定されないが、本明細書に記載されるように、無傷抗体の分解、ならびに組み換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生を含む。
【０１９５】
多重特異性抗体を製造するための技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組み換え同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３）、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）を参照されたい）、及び「ノブ−イン−ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）などが含まれるが、それらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製するために静電的ステアリング効果を操作すること（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）；２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）を参照されたい）；ロイシンジッパーを使って二重特異性抗体を製造すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい）；二重特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい）；及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）；及び、例えば、Ｔｕｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されているようにして、三重特異性抗体を調製すること；及びタンデム単一ドメイン抗体を含むポリペプチドを生成すること（例えば、米国特許出願第２０１１００２８６９５号；及びＣｏｎｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１；２７６（１０）：７３４６−５０を参照されたい）によって製造することもできる。「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する改変抗体も、これに含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい）。
【０１９６】
ペプチドリンカー
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物内の２つ以上の抗体部分（例えば、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、ＶＨ及びＶＬを含む完全長抗体または抗原結合部分）は、場合により、ペプチドリンカーによって連結することができる。抗ＣＴＬＡ−４構築物で使用されるペプチドリンカー（複数可）の長さ、柔軟性の程度、及び／または他の特性は、１つ以上の特定の抗原またはエピトープに対する親和性、特異性、またはアビディティを含むが、これらに限定されない特性にいくらかの影響を与え得る。例えば、２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないことを確実にするために、より長いペプチドリンカーが選択され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、隣接するドメインが互いに自由に動くように、フレキシブル残基（例えば、グリシン及びセリン）を含む。例えば、グリシン−セリンダブレットは、適当なペプチドリンカーであり得る。
【０１９７】
ペプチドリンカーは、任意の適当な長さであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００以上のアミノ酸長のいずれかである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約１００、７５、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５以下のアミノ酸長のいずれかである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーの長さは、約１アミノ酸〜約１０アミノ酸、約１アミノ酸〜約２０アミノ酸、約１アミノ酸〜約３０アミノ酸、約５アミノ酸〜約１５アミノ酸、約１０アミノ酸〜約２５アミノ酸、約５アミノ酸〜約３０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約３０アミノ酸長、約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１００アミノ酸、または約１アミノ酸〜約１００アミノ酸のいずれかである。
【０１９８】
ペプチドリンカーは、天然に生じる配列または非天然に生じる配列を有し得る。例えば、重鎖のみ抗体のヒンジ領域に由来する配列は、リンカーとして使用され得る。例えば、ＷＯ１９９６／３４１０３を参照されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ（配列番号１６３）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、変異ヒトＩｇＧ１ヒンジ（配列番号３０７）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、フレキシブルリンカーである。例示のフレキシブルリンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ（配列番号３７５）、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ（配列番号３７６）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３７７）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３７８）、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３７９）、ｎは、少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、及び当該技術分野で公知の他のフレキシブルリンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１６２）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３６５（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を含む。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分及び１つ以上の他の抗体部分（例えば、ＶＨ及びＶＬを含む完全長抗体または抗原結合部分）を含む抗ＣＴＬＡ−４構築物は、単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分、及び１つ以上の他の抗体部分（例えば、ＶＨ及びＶＬを含む完全長抗体または抗原結合部分）を含む抗ＣＴＬＡ−４構築物は、多重特異性（例えば、二重特異性）である。多重特異性分子は、少なくとも２つの異なる抗原またはエピトープに対して結合特異性を有する分子である（例えば、二重特異性抗体は、２つの抗原またはエピトープに対して結合特異性を有する）。３つ以上の価数及び／または特異性を有する多重特異性分子も考慮される。例えば、三重特異性抗体は、調製することができる。Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。当業者であれば、本明細書に記載の個々の多重特異性分子の適切な機能を選択して、互いに組み合わせて、本発明の多重特異性の抗ＣＴＬＡ−４分子を形成できることが理解されるはずである。
【０２００】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、多価であるが、単一特異性である、すなわち、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分と同じＣＴＬＡ−４エピトープを特異的に認識する、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分、及び少なくとも第２の抗体部分（例えば、ＶＨ及びＶＬを含む完全長抗体または抗原結合部分）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分と同じＣＴＬＡ−４エピトープを特異的に認識する１つ以上の抗体部分は、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分と同じＣＤＲ及び／または同じＶＨＨアミノ酸配列を含み得る。例えば、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、２つ以上の本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含み得、２つ以上の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、同じである。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ペプチドリンカー（複数可）によって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、多価及び多重特異性である、すなわち、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分、及びＣＴＬＡ−４以外の第２の抗原を特異的に認識する少なくとも第２の抗体部分（例えば、ＶＨ及びＶＬを含む完全長抗体または抗原結合部分）、または本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分により認識される異なるＣＴＬＡ−４エピトープを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、ｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、第２の抗体部分のＮ末端及び／またはＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、三価及び二重特異性である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、及び第２の抗体部分（例えば、抗ＨＳＡ  ｓｄＡｂ）を含み、第２の抗体部分は、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂの間にある。いくつかの実施形態では、抗体部分は、ペプチドリンカー（複数可）によって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。
【０２０２】
ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する２つ以上のｓｄＡｂ部分を含む単一特異性または多重特異性の抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の単一抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分のものと比較して、アビディティの増加を有し得る。
【０２０３】
完全長抗体に融合したｓｄＡｂを含む二重特異性抗体
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、第２の抗体部分に融合した本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含み、第２の抗体部分は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体（例えば、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体）である。ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１に対する二重特異性を含む構築物は、「抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１抗体」、「抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１構築物」、または「ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体」と以下で呼ばれる。ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−Ｌ１に対する二重特異性を含む構築物は、「抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−Ｌ１抗体」、「抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−Ｌ１構築物」、または「ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１抗体」と以下で呼ばれる。
【０２０４】
ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１は、ＣＴＬＡ−４と同様に、阻害性免疫チェックポイント分子である。
【０２０５】
ＰＤ−１は、Ｔ細胞活性化及び耐性を調節する共刺激分子のＢ７／ＣＤ２８ファミリーの一部であるため、アンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体は、耐性を克服するために有用であり得る。ＰＤ−１は、Ｂ７−４の受容体として定義されている。Ｂ７−４は、免疫細胞上の阻害性受容体に結合する際に免疫細胞活性化を阻害することができる。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の関与は、Ｔ細胞エフェクター機能、サイトカイン分泌及び増殖の阻害をもたらす（Ｔｕｒｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（７）：１１７２−１１７４，２０１２）。高レベルのＰＤ−１は、疲弊したＴ細胞または慢性的に刺激されたＴ細胞と関連する。さらに、ＰＤ−１発現の増加は、がん患者の生存率の低下と相関している。ＰＤ−１、Ｂ７−４、ならびに免疫細胞中のＢ７−４及びＰＤ−１阻害シグナル間の相互作用を下方調節する薬剤は、免疫応答の増強をもたらし得る。本発明に適用することができる例示の抗ＰＤ−１抗体としては、ペムブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））及びニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２０６】
ＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死リガンド１）は、分化クラスター２７４（ＣＤ２７４）またはＢ７ホモログ１（Ｂ７−Ｈ１）としても知られる。ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−１のリガンドとして機能し、特定の事象、例えば、妊娠、組織同種移植片、自己免疫疾患及び他の疾患状態、例えば、肝炎及びがんの最中の免疫系の抑制に主要な役割を果たす。ＰＤ−１受容体／ＰＤ−Ｌ１リガンド複合体の形成により、リンパ節でＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を低下させる阻害シグナルを伝える。本発明に適用することができる例示の抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録商標））及びデュルバルマブ（例えば、ＭＥＤＩ４７３６、ＩＭＦＩＮＺＩ（商標））が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第１の適宜リンカーを介して一緒に融合し���他方の２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第２の適宜リンカーを介して一緒に融合し、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ融合体の各セットのＣ末端は、完全長抗体の重鎖のＮ末端に融合される（図４５に例示される）。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号１３４〜１４５、２９２〜２９６、及び３１９〜３２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号１４６〜１５７、２９７〜３０１、及び３２４〜３２８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３１０〜３１８及び３２９〜３３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、軽鎖融合ポリペプチドは、配列番号３５４または３５５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、配列番号３５６のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つのコピー、及び配列番号３５７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドの２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプ���ドの２つのコピー、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖の２つのコピーを含む。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）の配列同一性を有するその変異体を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメインにおいて最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、及び／またはＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、アミノ酸置換は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＦＲ、例えば、ＦＲ１、及び／またはＦＲ２、及び／またはＦＲ３、及び／またはＦＲ４内である。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ＣＤＲ及びＦＲの両方においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第１の適宜リンカーを介して一緒に融合し、他方の２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第２の適宜リンカーを介して一緒に融合し、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ融合体の各セットのＣ末端は、完全長抗体の重鎖のＮ末端に融合される（図４５に例示される）。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第１の適宜リンカーを介して一緒に融合し、他方の２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第２の適宜リンカーを介して一緒に融合し、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ融合体の各セットのＣ末端は、完全長抗体の重鎖のＮ末端に融合される（図４５に例示される）。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）の配列同一性を有するその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメインにおいて最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、及び／またはＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、アミノ酸置換は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＦＲ、例えば、ＦＲ１、及び／またはＦＲ２、及び／またはＦＲ３、及び／またはＦＲ４内である。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ＣＤＲ及びＦＲの両方においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第１の適宜リンカーを介して一緒に融合し、他方の２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第２の適宜リンカーを介して一緒に融合し、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ融合体の各セットのＣ末端は、完全長抗体の重鎖のＮ末端に融合される（図４５に例示される）。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第１の適宜リンカーを介して一緒に融合し、他方の２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第２の適宜リンカーを介して一緒に融合し、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ融合体の各セットのＣ末端は、完全長抗体の重鎖のＮ末端に融合される（図４５に例示される）。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）の配列同一性を有するその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメインにおいて最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、及び／またはＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、アミノ酸置換は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＦＲ、例えば、ＦＲ１、及び／またはＦＲ２、及び／またはＦＲ３、及び／またはＦＲ４内である。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ＣＤＲ及びＦＲの両方においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第１の適宜リンカーを介して一緒に融合し、他方の２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第２の適宜リンカーを介して一緒に融合し、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ融合体の各セットのＣ末端は、完全長抗体の重鎖のＮ末端に融合される（図４５に例示される）。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第１の適宜リンカーを介して一緒に融合し、他方の２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第２の適宜リンカーを介して一緒に融合し、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ融合体の各セットのＣ末端は、完全長抗体の重鎖のＮ末端に融合される（図４５に例示される）。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）の配列同一性を有するその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメインにおいて最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、及び／またはＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、アミノ酸置換は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＦＲ、例えば、ＦＲ１、及び／またはＦＲ２、及び／またはＦＲ３、及び／またはＦＲ４内である。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ＣＤＲ及びＦＲの両方においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第１の適宜リンカーを介して一緒に融合し、他方の２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第２の適宜リンカーを介して一緒に融合し、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ融合体の各セットのＣ末端は、完全長抗体の重鎖のＮ末端に融合される（図４５に例示される）。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号１３４〜１４５、２９２〜２９６、及び３１９〜３２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する２つのｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の各重鎖は、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号１３４〜１４５、２９２〜２９６、及び３１９〜３２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１３４〜１４５、２９２〜２９６、及び３１９〜３２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つの同一なコピー、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖の２つの同一なコピーを含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、図４０及び図４１に示す構造を有する。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号１４６〜１５７、２９７〜３０１、及び３２４〜３２８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する２つのｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の各重鎖は、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号１４６〜１５７、２９７〜３０１、及び３２４〜３２８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１４６〜１５７、２９７〜３０１、及び３２４〜３２８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つの同一なコピー、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖の２つの同一なコピーを含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、図４０及び図４１に示す構造を有する。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３１０〜３１８及び３２９〜３３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する２つのｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の各重鎖は、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３１０〜３１８及び３２９〜３３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３１０〜３１８及び３２９〜３３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つの同一なコピー、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖の２つの同一なコピーを含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、図４０及び図４１に示す構造を有する。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、軽鎖融合ポリペプチドは、配列番号３５４及び３５５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する２つのｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の各軽鎖は、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、軽鎖融合ポリペプチドは、配列番号３５４及び３５５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖の２つの同一なコピー、及び配列番号３５４及び３５５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドの２つの同一なコピーを含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、図４２及び図４３に示す構造を有する。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＴＬＡ−４を特異的に認識する４つのｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、各抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、完全長抗体の各鎖のＮ末端に融合される、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、配列番号３５６のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つの同一なコピー、及び、配列番号３５７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドの２つの同一なコピーを含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、図４４に示す構造を有する。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＴＬＡ−４を特異的に認識する４つのｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは一緒に融合され、他方の２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは一緒に融合され、完全長抗体の各重鎖のＮ末端は、各抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ融合体のＣ末端に融合される、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する２つのｓｄＡｂ部分は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つの同一なコピー、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖の２つの同一なコピーを含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、図４５に示す構造を有する。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第１の適宜リンカーを介して一緒に���合し、他方の２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第２の適宜リンカーを介して一緒に融合し、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ融合体の各セットのＣ末端は、完全長抗体の重鎖のＮ末端に融合される（図４５に例示される）。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号１７１〜１８２、３０２〜３０６、及び３４５〜３４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号１８３〜１９４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）の配列同一性を有するその変異体を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメインにおいて最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、及び／またはＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、アミノ酸置換は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＦＲ、例えば、ＦＲ１、及び／またはＦＲ２、及び／またはＦＲ３、及び／またはＦＲ４内である。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ＣＤＲ及びＦＲの両方においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第１の適宜リンカーを介して一緒に融合し、他方の２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第２の適宜リンカーを介して一緒に融合し、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ融合体の各セットのＣ末端は、完全長抗体の重鎖のＮ末端に融合される（図４５に例示される）。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第１の適宜リンカーを介して一緒に融合し、他方の２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第２の適宜リンカーを介して一緒に融合し、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ融合体の各セットのＣ末端は、完全長抗体の重鎖のＮ末端に融合される（図４５に例示される）。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）の配列同一性を有するその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメインにおいて最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、及び／またはＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、アミノ酸置換は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＦＲ、例えば、ＦＲ１、及び／またはＦＲ２、及び／またはＦＲ３、及び／またはＦＲ４内である。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ＣＤＲ及びＦＲの両方においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第１の適宜リンカーを介して一緒に融合し、他方の２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第２の適宜リンカーを介して一緒に融合し、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ融合体の各セットのＣ末端は、完全長抗体の重鎖のＮ末端に融合される（図４５に例示される）。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第１の適宜リンカーを介して一緒に融合し、他方の２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、第２の適宜リンカーを介して一緒に融合し、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ融合体の各セットのＣ末端は、完全長抗体の重鎖のＮ末端に融合される（図４５に例示される）。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）の配列同一性を有するその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメインにおいて最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、及び／またはＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、アミノ酸置換は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＦＲ、例えば、ＦＲ１、及び／またはＦＲ２、及び／またはＦＲ３、及び／またはＦＲ４内である。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ＣＤＲ及びＦＲの両方においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号１７１〜１８２、３０２〜３０６、及び３４５〜３４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する２つのｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の各重鎖は、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号１７１〜１８２、３０２〜３０６、及び３４５〜３４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１７１〜１８２、３０２〜３０６、及び３４５〜３４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つの同一なコピー、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖の２つの同一なコピーを含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、図４０及び図４１に示す構造を有する。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号１８３〜１９４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する２つのｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の各重鎖は、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号１８３〜１９４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１８３〜１９４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つの同一なコピー、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖の２つの同一なコピーを含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、図４０及び図４１に示す構造を有する。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合される、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＴＬＡ−４を特異的に認識する２つのｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、完全長抗体の各軽鎖は、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合される、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物は、完全長抗体重鎖の２つの同一なコピー、ならびに完全長抗体軽鎖及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む軽鎖融合ポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、図４２及び図４３に示す構造を有する。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＴＬＡ−４を特異的に認識する４つのｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、各抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、完全長抗体の各鎖のＮ末端に融合される、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物は、完全長抗体重鎖及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む重鎖融合ポリペプチドの２つの同一なコピー、ならびに完全長抗体軽鎖及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む軽鎖融合ポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、図４４に示す構造を有する。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＴＬＡ−４を特異的に認識する４つのｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは一緒に融合され、他方の２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは一緒に融合され、完全長抗体の各重鎖のＮ末端は、各抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ融合体のＣ末端に融合される、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する２つのｓｄＡｂ部分が、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物は、完全長抗体重鎖及び２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂの融合体を含む重鎖融合ポリペプチドの２つの同一なコピー、ならびに完全長抗体軽鎖の２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、図４５に示す構造を有する。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つ（例えば、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む多重特異性または単一特異性の抗ＣＴＬＡ−４構築物、例えば、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１構築物または抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−Ｌ１構築物）と競合的にＣＴＬＡ−４に特異的に結合するＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＣＴＬＡ−４構築物（以下、「競合抗ＣＴＬＡ−４構築物」と呼ばれる）も提供される。
【０２３３】
抗ＣＴＬＡ−４多重特異性抗原結合タンパク質（ＭＡＢＰ）
いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む完全長抗体または抗原結合断片に融合した本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、多重特異性である（「多重特異性抗ＣＴＬＡ−４構築物」または「抗ＣＴＬＡ−４多重特異性抗原結合タンパク質（ＭＡＢＰ）」と以下で呼ばれる）、抗ＣＴＬＡ−４構築物が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、二重特異性（「二重特異性抗ＣＴＬＡ−４構築物」または「抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質（ＢＡＢＰ）」と以下で呼ばれる）である。抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、完全長抗体または抗原結合断片により認識される標的（複数可）とは異なるＣＴＬＡ−４に特異的に結合することで、より広範な標的化能力を与える。ｓｄＡｂの小さいサイズのため、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、完全長抗体または抗原結合断片成分のものと比較して、同様の分子量及び薬物動態特性を有し得る。例えば、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、臨床効果及び安全性が証明されたモノクローナル抗体に１つ以上のｓｄＡｂを融合させることで設計し、多重特異性構築物の発現性を妨げることなく臨床的有用性の増加及び望ましい薬物動態特性を提供することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、適宜ペプチドリンカーによって完全長抗体または抗原結合断片に融合される。本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、ＣＴＬＡ−４を加えた種々の疾患関連エピトープまたは抗原の組み合わせ、例えば、免疫チェックポイント分子、細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原）、またはプロ炎症性分子との組み合わせによるＣＴＬＡ−４を標的にするように使用し、種々の疾患及び条件、例えば、がん、炎症、及び自己免疫疾患の治療に有用な薬剤を提供することができる。
【０２３４】
従って、いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第２の抗原結合部分を含み、ＶＨ及びＶＬは一緒に、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合される、抗ＣＴＬＡ−４構築物（例えば、ＭＡＢＰまたはＢＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）の配列同一性を有するその変異体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメインにおいて最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列��含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、及び／またはＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、アミノ酸置換は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＦＲ、例えば、ＦＲ１、及び／またはＦＲ２、及び／またはＦＲ３、及び／またはＦＲ４内である。いくつかの実施形態では、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ＣＤＲ及びＦＲの両方においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第２の抗原結合部分を含み、ＶＨ及びＶＬは一緒に、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合される、抗ＣＴＬＡ−４構築物（例えば、ＭＡＢＰまたはＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは、免疫チェックポイント分子（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）である。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは、プロ炎症性分子である。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは、細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原、または免疫エフェクター細胞上の細胞表面抗原）である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、または軽鎖のＣ末端で第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、完全長４鎖抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−１完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分に化学的に融合される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０以下（例えば、約２５、２０、または１５のいずれか１つ以下）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合断片は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  ＦｃまたはＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物（例えば、ＭＡＢＰまたはＢＡＢＰ）は、少なくとも２つの異なるエピトープに特異的に結合することができる少なくとも２つの抗原結合部分を含む。少なくとも２つの抗原結合部分のいくつかは、ＭＡＢＰが２つの異なるエピトープに対する結合部位を有する限り、同一であってもよい。抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、対称または非対称であり得る。例えば、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分の１〜８つのコピー、及び第２の抗原結合部分の１または２つのコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、２つの異なる抗原結合部分を含み、各々は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、異なる抗原結合部位を一緒に形成する。例えば、第２の抗原結合部分は、二重特異性抗体であり得る。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、単一特異性完全長抗体、またはその抗原結合断片、例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖである。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、１、２、３、４、５、６、７、８以上の異なる抗原結合部分のいずれか１つを含み、各々は、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、２つの同一な抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、互いに融合され、第２の抗原結合部分にさらに融合される。いくつかの実施形態では、２つの異なる抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、互いに融合され、第２の抗原結合部分にさらに融合される。
【０２３７】
抗ＣＴＬＡ−４構築物（例えば、ＭＡＢＰ）は、ＣＴＬＡ−４及び／または第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）の任意の適当な数の価数、及び任意の適当な数の特異性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、二価、三価、四価、五価、六価、またはそれよりも高い価数のＣＴＬＡ−４である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、二価、三価、四価、五価、六価、またはそれよりも高い価数の第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、二重特異性（例えば、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰ、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰ）である。例示のＢＡＢＰを図４０〜４９に示す。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、三重特異性である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、四重特異性である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、５つ以上の特異性である。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分の１つ以上のコピー（例えば、２）、及び（ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第２の抗原結合部分の単一コピーを含み、ＶＨ及びＶＬは一緒に、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部分の各コピーは、第２の抗原結合部分に融合される、抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質（「ＢＡＢＰ」）が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂの１つ以上は各々、別の同一または異なる抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂにさらに融合される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−１完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合断片は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  ＦｃまたはＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上）の同一または異なる抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、及び（ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む複数（例えば、２、３、４、５、６、またはそれ以上）の第２の抗原結合部分を含み、ＶＨ及びＶＬは一緒に、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、互いに融合される、及び／または第２の抗原結合部分に融合される、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰが提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−１完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、ペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫ���は、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合断片は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  ＦｃまたはＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分の単一コピー、及び（ｂ）第２の抗原結合部分の２つのコピーを含み、各々は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬは一緒に、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分の２つのコピーの１つに融合される、抗ＣＴＬＡ−４多重特異性（例えば、二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−１完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態���は、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合断片は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  ＦｃまたはＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む複数（例えば、２、３、または４）の同一または異なる抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、及び（ｂ）第２の抗原結合部分の２つのコピーを含み、各々は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬは一緒に、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、互いに融合される、及び／または第２の抗原結合部分に融合される、抗ＣＴＬＡ−４多重特異性（例えば、二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−１完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、ペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合断片は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  ＦｃまたはＩｇＧ４  Ｆｃを含む。例を図４４、４５、４８、及び４９に示す。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、（ａ）第１の抗原結合部分の２つのコピー、各々は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、及び（ｂ）第２の抗原結合部分の２つのコピーを含み、各々は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬは一緒に、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部分の１つのコピーは、第２の抗原結合部分の各コピーに融合される、抗ＣＴＬＡ−４多重特異性（例えば、二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂの１つ以上は各々、別の同一または異なる抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂにさらに融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−１完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合断片は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  ＦｃまたはＩｇＧ４  Ｆｃを含む。例を図４０〜４３、４６、及び４７に示す。
【０２４３】
ａ）融合ポリペプチド
抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰの第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合される（すなわち、共有結合される）。従って、本発明の抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、１つ以上の融合ポリペプチドを含む。各融合ポリペプチドは、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分、及び第２の抗原結合部分に由来するポリペプチドを含み得る。
【０２４４】
抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分、及び第２の抗原結合部分は、単一の化学結合（例えば、ペプチド結合）によって、またはペプチドリンカーを介して直接結合され得る。抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分のいずれか１つ（各々を含む）のポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかで融合され得る、または第２の抗原結合部分のいずれか１つ（各々を含む）のポリペプチドの内部位置で、例えば、第２の抗原結合部分の重鎖中のＦｃ領域のＮ末端で融合され得る。融合ポリペプチドは、組み換え的または化学的のいずれかで得られ得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分のＣ末端は、化学結合（例えば、ペプチド結合）またはペプチドリンカーを介して第２の抗原結合部分の任意（各々を含む）のポリペプチドのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分のＮ末端は、化学結合（例えば、ペプチド結合）またはペプチドリンカーを介して第２の抗原結合部分の任意（各々を含む）のポリペプチドのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分は、アミノ酸の主鎖化学基を伴うペプチド結合ではない化学結合を介して第２の抗原結合部分に融合される。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ＶＨ及びＶＬを含む一本鎖抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端の方向において、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、適宜ペプチドリンカー、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む第１の抗原結合部分を含む融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端の方向において、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、適宜ペプチドリンカー、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む第１の抗原結合部分を含む融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端の方向において、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、適宜ペプチドリンカー、及び本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分を含む融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端の方向において、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、適宜ペプチドリンカー、及び本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分を含む融合ポリペプチドを含む。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖ドメイン、及びＶＬを含む軽鎖ドメインを含む。いくつかの実施形態では、重鎖は、１つ以上の重鎖定常ドメイン、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４、及び／または抗体ヒンジ領域（ＨＲ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、例えば、ラムダＣＬドメインまたはカッパＣＬドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分のＮ末端は、重鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分のＣ末端は、重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分のＮ末端は、軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分のＣ末端は、軽鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、重鎖、適宜ペプチドリンカー、及び本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分のＮ末端からＣ末端を含む第１のポリペプチド；及び軽鎖を含む第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分、適宜ペプチドリンカー、及び重鎖のＮ末端からＣ末端を含む第１のポリペプチド；及び軽鎖を含む第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、軽鎖、適宜ペプチドリンカー、及び本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分のＮ末端からＣ末端を含む第１のポリペプチド；及び重鎖を含む第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分、適宜ペプチドリンカー、及び軽鎖のＮ末端からＣ末端を含む第１のポリペプチド；及び重鎖を含む第２のポリペプチドを含む。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体（例えば、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体）を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、２つの同一な重鎖及び２つの同一な軽鎖からなる完全長モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、重鎖、適宜ペプチドリンカー、及び本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分のＮ末端からＣ末端を各々が含む２つの同一な第１のポリペプチド；及び軽鎖を各々が含む２つの同一な第２のポリペプチドを含む（例えば、図４１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分、適宜ペプチドリンカー、及び重鎖のＮ末端からＣ末端を各々が含む２つの同一な第１のポリペプチド；及び軽鎖を各々が含む２つの同一な第２のポリペプチドを含む（例えば、図４０を参照されたい）。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、軽鎖、適宜ペプチドリンカー、及び本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分のＮ末端からＣ末端を各々が含む２つの同一な第１のポリペプチド；及び重鎖を各々が含む２つの同一な第２のポリペプチドを含む（例えば、図４３を参照されたい）。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分、適宜ペプチドリンカー、及び軽鎖のＮ末端からＣ末端を各々が含む２つの同一な第１のポリペプチド；及び重鎖を含む２つの同一な第２のポリペプチドを含む（例えば、図４２を参照されたい）。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、（ａ）第１及び第２の重鎖ならびに第１及び第２の軽鎖からなる完全長抗体、完全長抗体は、第１のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）を特異的に認識し；（ｂ）第２のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第１の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ；（ｃ）第３のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第２の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ；（ｄ）第４のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第３の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ；及び（ｅ）第５のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第４の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み；第１の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、第１の軽鎖のＮ末端に融合され、第２の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、第２の軽鎖のＮ末端に融合され、第３の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、第１の重鎖のＮ末端に融合され、及び第４の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、第２の重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、異なる。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、第３または第４の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、適宜ペプチドリンカー、及び重鎖のＮ末端からＣ末端を各々が含む２つの同一な第１のポリペプチド；及び第１または第２の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、適宜ペプチドリンカー、及び軽鎖を各々が含む２つの同一な第２のポリペプチドを含む。例えば、図４４を参照されたい。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、（ａ）２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体、完全長抗体は、第１のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）を特異的に認識し；（ｂ）第２のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第１の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ；（ｃ）第３のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第２の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ；（ｄ）第４のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第３の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ；及び（ｅ）第５のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第４の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み；第１の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、第２の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＮ末端に融合され、及び第２の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、一方の重鎖のＮ末端に融合され、及び第３の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、第４の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＮ末端に融合され、及び第４の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、他方の重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、異なる。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、第１または第３の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、適宜ペプチドリンカー、第２または第４の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、適宜ペプチドリンカー、及び重鎖のＮ末端からＣ末端を各々が含む２つの同一な第１のポリペプチド；及び軽鎖を各々が含む２つの同一な第２のポリペプチドを含む。例えば、図４５を参照されたい。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、（ａ）２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体、完全長抗体は、第１のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）を特異的に認識し；（ｂ）第２のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第１の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ；及び（ｃ）第３のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第２の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、第１または第２の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＮ末端は、重鎖のＣＨ１領域のＣ末端に融合され、及び第１または第２の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、重鎖のＣＨ２領域のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、異なる。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、ＶＨ−ＣＨ１−適宜ペプチドリンカー−抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−ＣＨ２−ＣＨ３のＮ末端からＣ末端を各々が含む２つの同一な第１のポリペプチド；及び軽鎖を各々が含む２つの同一な第２のポリペプチドを含む。例えば、図４６を参照されたい。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、（ａ）第１のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）を特異的に認識する第１のｓｃＦｖ；（ｂ）第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）を特異的に認識する第２のｓｃＦｖ；（ｃ）Ｆｃ領域；（ｄ）第３のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第１の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ；及び（ｄ）第４のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第２の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、各抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＮ末端は、ｓｃＦｖのＣ末端に融合され、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、Ｆｃ領域のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、異なる。いくつかの実施形態では、２つのｓｃＦｖは、同一である。いくつかの実施形態では、２つのｓｃＦｖは、異なる。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、ｓｃＦｖ−適宜ペプチドリンカー−抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−ＣＨ２−ＣＨ３のＮ末端からＣ末端を各々が含む２つの同一なポリペプチドを含む。例えば、図４７を参照されたい。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、（ａ）第１のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）を特異的に認識する第１のＦａｂ；（ｂ）第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）を特異的に認識する第２のＦａｂ；（ｃ）Ｆｃ領域；（ｄ）第３のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第１の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、及び第４のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第２の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１のＦａｂ様ドメイン；（ｅ）第５のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第３の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ及び第６のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第４の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第２のＦａｂ様ドメインを含み、各Ｆａｂ様ドメインのＮ末端は、ＦａｂのＣ末端に融合され、Ｆａｂ様ドメインの２つのＣ末端の１つは、Ｆｃ領域のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、異なる。いくつかの実施形態では、２つのＦａｂは、同一である。いくつかの実施形態では、２つのＦａｂは、異なる。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、ＶＨ−ＣＨ１−適宜ペプチドリンカー−抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３のＮ末端からＣ末端を各々が含む２つの同一な第１のポリペプチド；及びＶＬ−ＣＬ−適宜ペプチドリンカー−抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−ＣＬのＮ末端からＣ末端を各々が含む２つの同一な第２のポリペプチドを含む。例えば、図４８を参照されたい。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、（ａ）第１のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）を特異的に認識する第１のｓｃＦｖ；（ｂ）第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）を特異的に認識する第２のｓｃＦｖ；（ｃ）Ｆｃ領域；（ｄ）第３のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第１の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、及び第４のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第２の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第１のＦａｂ様ドメイン；（ｅ）第５のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第３の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、及び第６のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第４の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第２のＦａｂ様ドメインを含み、各Ｆａｂ様ドメインの２つのＮ末端の１つは、ｓｃＦｖのＣ末端に融合され、Ｆａｂ様ドメインの２つのＣ末端の１つは、Ｆｃ領域のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、異なる。いくつかの実施形態では、２つのｓｃＦｖは、同一である。いくつかの実施形態では、２つのｓｃＦｖは、異なる。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、ｓｃＦｖ−適宜ペプチドリンカー−抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３のＮ末端からＣ末端を各々が含む２つの同一な第１のポリペプチド；及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−ＣＬのＮ末端からＣ末端を各々が含む２つの同一な第２のポリペプチドを含む。例えば、図４９を参照されたい。
【０２５４】
本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰは、第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分の間に位置する１つ以上のペプチドリンカーを含み得る。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分の重鎖ポリペプチドと第１の抗原結合部分の間のペプチドリンカーは、第２の抗原結合部分の軽鎖ポリペプチドと第１の抗原結合部分の間のペプチドリンカーと同じである。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分の重鎖ポリペプチドと第１の抗原結合部分の間のペプチドリンカーは、第２の抗原結合部分の軽鎖ポリペプチドと第１の抗原結合部分の間のペプチドリンカーと異なる。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分は、その間に配置されるペプチドリンカー無しで互いに直接融合される。２つ以上の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂの間のペプチドリンカーは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂと第２の抗原結合部分の間のものと同じかまたは異なっていてもよい。「ペプチドリンカー」セクションにおいて上述されたペプチドリンカーのいずれかを本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰのいずれかで使用することができる。
【０２５５】
ｂ）ＶＨ及びＶＬを含む第２の抗原結合部分
抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む少なくとも１つの抗原結合部分を含む。そのような抗原結合部分は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長の従来抗体、またはそれらに由来する抗原結合断片であり得る。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ＶＨドメインを含む重鎖及びＶＬドメインを含む軽鎖を含む抗原結合断片である。本明細書で検討される例示の抗原結合断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ヒトＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ分子、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスのいずれか１つに由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体エフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞障害性）及び／またはＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）を媒介することができる。例えば、野生型Ｆｃ配列を有するサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３の抗体は、通常、Ｃ１ｑ及びＣ３結合を含む補体活性化を示し、一方、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及び／またはＣ３に結合しない。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域のＦｃ受容体への結合親和性を減少させる改変を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃは、２３３〜２３６位に１つ以上の突然変異、例えば、Ｌ２３４Ａ及び／またはＬ２３５Ａを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４  Ｆｃは、３２７、３３０及び／または３３１位に突然変異を含む。例えば、Ａｒｍｏｕｒ  ＫＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；２９：２６１３；及びＳｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：６５９１を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｐ３２９Ｇ突然変異を含む。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、２つの同一でない重鎖のヘテロ二量体化を促進する改変を含む。そのような改変Ｆｃ領域は、非対称設計を有する本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰに対して特に興味深いものであり得る。いくつかの実施形態では、前記改変は、重鎖または重鎖融合ポリペプチドの一方にノブ改変、及び２つの重鎖または重鎖融合ポリペプチドの他方にホール改変を含むノブ−インテゥー−ホール改変である。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＨ３ドメインにおける２つの重鎖の間の界面内に改変を含み、ｉ）１つの重鎖のＣＨ３ドメインでは、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それにより他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおける界面内の空洞（「ホール」）で配置可能である１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおける界面内の隆起（「ノブ」）を生成し、ｉｉ）他方の重鎖のＣＨ３ドメインでは、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それにより第１のＣＨ３ドメインにおける界面内の隆起（「ノブ」）が配置可能である第２のＣＨ３ドメインにおける界面内の空洞（「ホール」）を生成する。ノブ−インテゥー−ホール改変の例は、例えば、ＵＳ２０１１／０２８７００９、ＵＳ２００７／０１７８５５２、ＷＯ９６／０２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、及びＺｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：７８１−７８８に記載されている。ヘテロ二量体化を促進するＦｃ領域に対する他の改変も、本明細書で検討される。例えば、静電ステアリング効果をＦｃ領域中に操作して、Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を提供することができる（例えば、ＵＳ４６７６９８０、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆａｂアーム交換を阻害する改変を含む。例えば、ＩｇＧ４  ＦｃにおけるＳ２２８Ｐ突然変異は、Ｆａｂアーム交換を阻害する。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、カッパ軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ラムダ軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖定常領域を含む。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなるモノクローナル抗体を含む（「４鎖抗体」とも本明細書中で呼ばれる）。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる多重特異性（例えば、二重特異性）完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ１サブクラスの完全長抗体、または突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラスの完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ２サブクラスの完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ３サブクラスの完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ４サブクラスの完全長抗体、またはさらなる突然変異Ｓ２２８Ｐを有するヒトＩｇＧ４サブクラスの完全長抗体を含む。
【０２６２】
当該技術分野で公知の任意の完全長４鎖抗体、またはそれに由来する抗原結合断片は、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰにおける第２の抗原結合部分として使用することができる。臨床効果、安全性、及び薬物動態プロファイルが証明された抗体または抗体断片が、特に注目されるものである。いくつかの実施形態では、当該技術分野で公知の抗体または抗体断片は、さらに操作され、例えば、ヒト化または突然変異誘発され、第１の抗原結合部分と融合する前に適当な親和性を有する変異体を選択し、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、当該技術分野で公知のモノクローナル抗体または抗体断片のＶＨ及びＶＬドメイン、ならびに改変された重鎖定常領域及び／または軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、当該技術分野で公知のモノクローナル抗体、及び改変Ｆｃ領域、例えば、Ｓ２２８Ｐ突然変異を有するＩｇＧ４  Ｆｃを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ヒト、ヒト化、またはキメラ完全長抗体、または抗体断片を含む。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−１抗体、またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ペムブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））またはニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録商標））またはデュルバルマブ（例えば、ＩＭＦＩＮＺＩ（商標））である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０２６４】
ｃ）例示の抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰ及びＢＡＢＰ
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、（ａ）本明細書に記載のＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第２の抗原結合部分を含み、ＶＨ及びＶＬは一緒に、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合され、「ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰ」または「ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰ」と以下で呼ばれる。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、（ａ）本明細書に記載のＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第２の抗原結合部分を含み、ＶＨ及びＶＬは一緒に、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合され、「ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰ」または「ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰ」と以下で呼ばれる。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含むＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体（例えば、ペムブロリズマブまたはニボルマブ）を含む第２の抗原結合部分を含み、完全長抗体は、ＰＤ−１に特異的に結合し；第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合される、抗ＣＴＬＡ−４多重特異性（例えば、二重特異性）抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、２つの重鎖の１つもしくは各々のＮ末端、２つの軽鎖の１つもしくは各々のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２つの重鎖の１つもしくは各々のＣ末端、または２つの軽鎖の１つもしくは各々のＣ末端で第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分に化学的に融合される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ペプチド結合またはペプチドリンカーを介して第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０未満（例えば、約２５、２０、または１５のいずれか１つ以下）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合断片は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ４  Ｆｃを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約���０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＮ末端からＣ末端を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）ＶＬ−ＣＬのＮ末端からＣ末端を含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質（ＢＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペムブロリズマブまたはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ３及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、ペプチドリンカー、例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、及び３１９〜３２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、及び３２４〜３２８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号１６１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号３２９〜３３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰは、図４１に示す構造を有する。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＮ末端からＣ末端を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）ＶＬ−ＣＬのＮ末端からＣ末端を含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質（ＢＡＢＰ）が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、アテゾリズマブまたはデュルバルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ３及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、ペプチドリンカー、例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、及び３４５〜３４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、及び１９３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号１９８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰは、図４１に示す構造を有する。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、（ａ）抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３のＮ末端からＣ末端を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）ＶＬ−ＣＬのＮ末端からＣ末端を含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰが提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペムブロリズマブまたはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、ペプチドリンカー、例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、及び２９２〜２９６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、及び２９７〜３０１のいずれか１つのアミノ���配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号１６１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号３１０〜３１８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰは、図４０に示す構造を有する。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、（ａ）抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３のＮ末端からＣ末端を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）ＶＬ−ＣＬのＮ末端からＣ末端を含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰが提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、アテゾリズマブまたはデュルバルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、ペプチドリンカー、例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、及び３０２〜３０６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、及び１９４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号１９８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴ���Ａ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰは、図４０に示す構造を有する。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３のＮ末端からＣ末端を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）ＶＬ−ＣＬ−抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＮ末端からＣ末端を含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰが提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペムブロリズマブまたはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＣＬ及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、ペプチドリンカー、例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号３５５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰは、図４３に示す構造を有する。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３のＮ末端からＣ末端を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−ＶＬ−ＣＬのＮ末端からＣ末端を含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペムブロリズマブまたはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＬ及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、ペプチドリンカー、例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号３５４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰは、図４２に示す構造を有する。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、（ａ）抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３のＮ末端からＣ末端を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−ＶＬ−ＣＬのＮ末端からＣ末端を含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペムブロリズマブまたはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＬ及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、及び／またはＶＬ及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、ペプチドリンカー、例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号３５６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号３５７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰは、図４４に示す構造を有する。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、（ａ）抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ１−抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ２−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３のＮ末端からＣ末端を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）ＶＬ−ＣＬのＮ末端からＣ末端を含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ１及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ２は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ１及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ２は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ１及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ２は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペムブロリズマブまたはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ１及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ２、及び／またはＶＨ及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ２は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号３５８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施��態では、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰは、図４５に示す構造を有する。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨ−ＣＨ１−抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−ＣＨ２−ＣＨ３のＮ末端からＣ末端を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）ＶＬ−ＣＬのＮ末端からＣ末端を含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペムブロリズマブまたはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ１及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、ペプチドリンカー、例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号３５９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰは、図４６に示す構造を有する。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ−抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−ＣＨ２−ＣＨ３のＮ末端からＣ末端を含むポリペプチドを含み、ｓｃＦｖは、ＰＤ−１に特異的に結合し、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ペムブロリズマブまたはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、ペプチドリンカー、例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰは、配列番号３６０のアミノ酸配列を含むポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰは、図４７に示す構造を有する。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、（ａ）ＶＨ−ＣＨ１−抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３のＮ末端からＣ末端を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）ＶＬ−ＣＬ−抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−ＣＬのＮ末端からＣ末端を含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペムブロリズマブまたはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ１及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、及び／またはＣＬ及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、ペプチドリンカー、例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号３６１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号３６２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰは、図４８に示す構造を有する。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、（ａ）ｓｃＦｖ−抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−ＣＨ２−ＣＨ３のＮ末端からＣ末端を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−ＣＬのＮ末端からＣ末端を含む第２のポリペプチドを含み、ｓｃＦｖは、ＰＤ−１に特異的に結合し、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ペムブロリズマブまたはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、ペプチドリンカー、例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号３６３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号３６４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰは、図４９に示す構造を有する。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つ（例えば、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む  多重特異性または単一特異性の抗ＣＴＬＡ−４構築物、例えば、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１構築物（例えば、ＢＡＢＰ）または抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−Ｌ１構築物（例えば、ＢＡＢＰ））と競合的にＣＴＬＡ−４に特異的に結合するＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）（以下、「競合抗ＣＴＬＡ−４構築物」と呼ばれる）も提供される。
【０２７９】
（ＩＩＩ）抗ＣＴＬＡ−４抗体変異体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードする核酸配列に適切な改変を導入するか、またはペプチド合成によって調製し得る。そのような改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内における残基の欠失、及び／または挿入、及び／または置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴（例えば、抗原結合）を有する限り、最終構築物に到達するために、欠失、挿入及び置換のいかなる組み合わせをも行うことができる。
【０２８０】
ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体を提供する。置換突然変異誘発のための目的の部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換は、「好ましい置換」という見出しの下で表３に示す。より実質的な変化は、「例示的な置換」という見出しの下で表３に提供し、これは、アミノ酸側鎖クラスに関連して以下にさらに記載する通りである。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、生成物を所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、低減した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについて、スクリーニングすることができる。
【表３】
2019533719.tif 000010
【０２８１】
アミノ酸は、側鎖の共通する特性に従って分類することができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２８２】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【０２８３】
置換変異体の１つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般的に、さらなる研究のために選択される得られる変異体（複数可）は、ある特定の生物学的特性（例えば、増加した親和性、低減した免疫原性）において、親抗体に比して改変（例えば、改善）されているか、及び／または、親抗体のある特定の生物学的特性が実質的に保持されている。例示的な置換変異体は、例えば、本明細書に記載するようなファージ提示に基づく親和性成熟技術を用いて簡便に生成され得る親和性成熟抗体である。簡単に言うと、１つ以上のＨＶＲ残基を突然変異させ、ファージ上で変異体抗体を提示させ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【０２８４】
変化（例えば、置換）を、例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいて起こさせてもよい。そのような変化を、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程の間に高頻度に突然変異を起こすコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照されたい）、及び／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）によってコードされる残基において起こさせてもよく、得られた変異体ＶＨまたはＶＬを結合親和性について試験する。二次ライブラリーを構築し、そこから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリングまたはオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子に多様性を導入する。次いで、二次ライブラリーを作製する。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有するあらゆる抗体変異体を同定する。多様性を導入するための別の方法は、数個のＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６残基）をランダム化するＨＶＲ特異的なアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発またはモデル化を用いて具体的に同定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３は標的とされることが多い。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失は、そのような変更が、抗体が抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で生じてもよい。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的変化（例えば、本明細書で提供される保存的置換）を、ＨＶＲ内で起こさせてもよい。そのような変化は、例えば、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＣＤＲの外であってもよい。上で提供された変異体ＶＨＨ配列のいくつかの実施形態では、各ＨＶＲは変化していないか、１、２、または３以下のアミノ酸置換しか含まない。
【０２８６】
突然変異誘発のための標的とし得る抗体の残基または領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５に記載されるように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基または一群の標的残基（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕのような荷電残基）を同定し、それを中性または負電荷を持つアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）で置換して、抗体の、抗原との相互作用が影響を受けるか否かを決定する。最初の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に、さらなる置換を導入してもよい。あるいは、またはさらに、抗体と抗原の間の接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を用いることができる。このような接触残基及びその隣接残基を、置換の候補として標的にしても、排除してもよい。変異体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含むか否かを決定してもよい。
【０２８７】
アミノ酸配列挿入には、１残基から、１００残基またはそれ以上を含有するポリペプチドまでに及ぶ長さのアミノ末端及び／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入も含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体のＮ末端またはＣ末端への、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）、または抗体の血清中半減期を増加させるポリペプチドの融合が含まれる。
【０２８８】
ｂ）グリコシル化変異体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＴＬＡ−４構築物を変化させて、構築物がグリコシル化される程度を増加または減少させる。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作出または除去されるようにアミノ酸配列を変化させることによって、簡便に達成することができる。
【０２８９】
抗ＣＴＬＡ−４構築物がＦｃ領域を含む場合、そこに結合する糖質を変化させてもよい。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、分岐した二分岐オリゴ糖を含み、これは一般的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ連結によって結合される。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、種々の炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、ならびにフコースを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＴＬＡ−４構築物におけるオリゴ糖の改変は、一定の改善された特性を有する抗体変異型を作製するために行われ得る。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）結合したフコースを欠く糖質構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％または２０％〜４０％であってもよい。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合型、混成型、及び高マンノース型構造）の合計に比しての、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を算出することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指す；しかしながら、抗体における軽微な配列変異のため、Ａｓｎ２９７は、２９７位の上流側または下流側約±３アミノ酸、すなわち２９４位と３００位の間に位置する場合もあり得る。そのようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；ＵＳ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化欠損性のＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）；米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及びＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．、特に実施例１１）、及びα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞のようなノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４（４）：６８０−６８８（２００６）；及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照されたい）が挙げられる。
【０２９１】
抗ＣＴＬＡ−４構築物変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖と共にさらに与えられる。そのような抗体変異体は、フコシル化を減少させ、及び／またはＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）；及びＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、ＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。そのような抗体変異体は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）；ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０２９２】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＴＬＡ−４構築物のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸改変を導入することにより、Ｆｃ領域変異体を生成させてもよい。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、本発明は、インビボにおける抗ＣＴＬＡ−４構築物の半減期が重要であるが、ある特定のエフェクター機能（例えば、補体及びＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗ＣＴＬＡ−４構築物変異体を意図している。インビトロ及び／またはインビボでの細胞傷害性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／またはＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照されたい）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２（１９８５）；同第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照されたい）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるように、インビボで、例えば、動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体がＣ１ｑに結合することができないこと、従って、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３（２００���）を参照されたい）。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定ではまた、当該技術分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照されたい）。
【０２９４】
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の１つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２つ以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０２９５】
ＦｃＲへの改善されたまたは減少した結合を持つある特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい）。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／または３３４における置換（残基のＥＵ番号付け）を含む。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、改変された（すなわち、改善されたか減少したのいずれか）Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載される。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、半減期を増加し、及び／または新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を改善する１つ以上のアミノ酸置換を含む変異体Ｆｃ領域を含む抗ＣＴＬＡ−４構築物（例えば、ＨＣＡｂ）変異体が提供される。増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））が、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基の１つ以上の置換を有するものが含まれる：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０２９９】
Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び、Ｆｃ領域の変異体の他の例に関してはＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。
【０３００】
本明細書に記載のＦｃ変異体のいずれかまたはそれらの組み合わせを含む抗ＣＴＬＡ−４構築物（例えば、本明細書に記載の、ＨＣＡｂ、完全長抗体に融合した抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、または抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰ／ＢＡＢＰ）が企図される。
【０３０１】
ｄ）システイン改変抗体変異体
いくつかの実施形態では、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン改変抗ＣＴＬＡ−４構築物、例えば、「チオＭＡｂ」を作製することが望まれ得る。特定の実施形態では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で起きる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲートを作製するために、例えば、薬物部分またはリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。いくつかの実施形態では、以下の残基のいずれか１つ以上がシステインで置換され得る：軽鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗ＣＴＬＡ−４構築物は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成され得る。
【０３０２】
ｅ）抗体誘導体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＴＬＡ−４構築物は、当該技術分野で知られ、容易に入手されている追加の非タンパク質部分を含むようにさらに改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体またはランダム共重合体のいずれか）及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは、いずれかの分子量のものであり得、分枝鎖または未分枝鎖であり得る。抗体に結合するポリマーの数は、変動し得、１つ以上の重合体が結合する場合、それらは同じかまたは異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／または種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が特定の条件下で治療に使用されるのかなどを考慮しながら決定することができる。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい抗ＣＴＬＡ−４構築物と非タンパク質部分とのコンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態では、非タンパク質部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長であってよいが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＴＬＡ−４構築物（例えば、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ、抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１二重特異性抗体、抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体、または抗ＣＴＬＡ−４  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ））は、１つ以上の生物学的に活性なタンパク質、ポリペプチドまたはその断片を含むようにさらに改変されてもよい。「生物活性」または「生物学的に活性な」は、本明細書で交換可能に使用する場合、具体的な機能を実行するために体内で生物学的活性を示すことを意味する。例えば、それは、特定の生体分子、例えば、タンパク質、ＤＮＡなどとの組み合わせ、次いで、そのような生体分子の活性の促進または阻害を意味し得る。いくつかの実施形態では、生物活性タンパク質またはその断片には、疾患または状態の予防または治療のための活性薬物として患者に投与されるタンパク質及びポリペプチド、ならびに診断目的に使用されるタンパク質及びポリペプチド、例えば、診断検査またはインビトロアッセイで使用される酵素、ならびに疾患を予防するために患者に投与されるタンパク質及びポリペプチド、例えば、ワクチンが含まれる。いくつかの実施形態では、生物活性タンパク質またはその断片は、免疫刺激／免疫調節、膜輸送、または酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、生物学的に活性なタンパク質、ポリペプチドまたはその断片は、酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイン、またはこれらの混合物である。いくつかの実施形態では、生物学的に活性なタンパク質、ポリペプチドまたは断片は、標的ペプチド（例えば、抗原または他のタンパク質）を特異的に認識することができる。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４構築物内に含まれ得る生物活性タンパク質またはその断片は、タンパク質結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４構築物内に含まれ得る生物活性タンパク質またはその断片は、抗体によく似ている、抗原結合ドメインを含む小さな操作されたタンパク質である抗体模倣物である（Ｇｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３（２）：６５−７９，２０１５）。これらの分子は、既存のヒト足場タンパク質に由来し、単一ポリペプチドを含む。本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４構築物内に含まれ得る例示の抗体模倣物は、限定されないが、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ；Ｎ末端及びＣ末端Ｃａｐドメインが隣接する３〜５の完全合成アンキリンリピートを含む）、アビディティマルチマー（アビマー；複数のＡドメインを含む高親和性タンパク質、各ドメインは、標的に対する親和性が低い）、またはアンチカリン（４つのアクセス可能なループを有するリポカリンの足場に基づき、各々の配列は、無作為化され得る）であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４構築物内に含まれ得る生物活性タンパク質またはその断片は、アルマジロリピート単位（約４０残基長の特徴的な繰返しアミノ酸配列）を含むアルマジロリピートタンパク質（例えば、β−カテニン、α−インポーチン、プラコグロビン、大腸腺腫様性ポリポーシス（ＡＰＣ））である。各アルマジロリピートは、ヘアピン構造を形成する一対のアルファヘリックスからなる。リピート形態の複数コピーは、アルファソレノイド構造として知られるものである。アルマジロリピートタンパク質は、特定の保存された側鎖を必要とせずに、またはペプチドの遊離Ｎ末端もしくはＣ末端と相互作用せずに、ペプチド骨格の結合の一定の方法に依存して、異なるタイプのペプチドに結合することができる。リピートタンパク質の固有のモジュール性と組み合わせた、残基によるペプチド残基の認識の可能性により、アルマジロリピートタンパク質は、ペプチド結合に対する一般的な足場の設計の有望な候補になる。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４構築物内に含まれ得る生物学的に活性なタンパク質またはその断片は、リガンド、例えば、特定の細胞受容体と相互作用するリンホカイン及び細胞因子である。リンホカインは、抗原またはレクチンがＴ細胞の増殖を刺激する場合にＴ細胞により分泌される低分子タンパク質である。
【０３０７】
ＩＩＩ．医薬組成物
本明細書に記載されるようにＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂを含む抗ＣＴＬＡ−４構築物のいずれか１つ（例えば、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ、抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１二重特異性抗体（例えば、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰ）、または抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（例えば、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰ））、及び適宜、医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物が本発明でさらに提供される。医薬組成物は、所望の純度を有する本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４構築物を、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤と適宜混合することにより（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製することができる。
【０３０８】
医薬組成物は、安定的であることが好ましく、その中で、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む抗ＣＴＬＡ−４構築物は、その物理的及び化学的安定性ならびに保管時の完全性を本質的に保持する。タンパク質安定性を測定するための種々の分析的技術は、当該技術分野において利用可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）に総説されている。安定性は、選択された温度で選択された期間、測定することができる。迅速スクリーニングの場合、製剤を２週間から１ヵ月間４０℃で保持し、その間安定性を測定する。製剤が２〜８℃で保管される場合、一般的には、製剤は３０℃または４０℃で少なくとも１ヵ月間安定的であるべきであり、及び／または２〜８℃では少なくとも２年間安定的であるべきである。製剤が３０℃で保管される場合、一般的には、製剤は３０℃で少なくとも２年間安定的であるべきであり、及び／または４０℃では少なくとも６ヵ月間安定的であるべきである。例えば、保管中の凝集の程度は、タンパク質安定性の指標として使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４構築物の安定製剤は、製剤中に凝集体として存在する約１０％未満（好ましくは、約５％未満）の抗ＣＴＬＡ−４構築物を含み得る。
【０３０９】
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、緩衝液、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、異性重亜硫酸ナトリウムを含む抗酸化剤；防腐剤、等張剤（例えば、塩化ナトリウム）、安定剤、金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ＥＤＴＡなどのキレート剤、及び／または非イオン性界面活性剤を含む。
【０３１０】
生理学的に許容可能な担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例として、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤が挙げられる。
【０３１１】
治療効果を最適化する範囲にｐＨを制御するために緩衝剤が使用され、特に安定性がｐＨ依存である場合に使用される。緩衝剤は、好ましくは、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本発明で使用するための適当な緩衝剤は、有機酸及び無機酸の両方ならびにその塩を含む。例えば、クエン酸、リン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、グルコン酸、シュウ酸、乳酸、酢酸である。さらに、緩衝剤は、ヒスチジン及びトリメチルアミン塩を含み得、例えば、Ｔｒｉｓである。
【０３１２】
防腐剤は微生物の増殖を遅らせるために添加され、典型的には、０．２％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。防腐剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回投与）製剤の生産を容易にし得る。本発明での使用に適当な防腐剤には、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；ベンザルコニウムハロゲン化合物（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ベンゼトニウム；チメロサール、フェノール、ブチル及びベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが含まれる。
【０３１３】
しばしば「安定剤」としても知られる緊張剤は、組成物中の液体の緊張性を調節または維持するために存在する。タンパク質や抗体などの大きな荷電生体分子と共に用いる場合、それらは、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用して分子内及び分子間相互作用の潜在性を減少させることができるため、しばしば「安定剤」と称される。緊張剤は、他の成分との相対的な量を考慮して、０．１重量％〜２５重量％、好ましくは１％〜５％の間の任意の量で存在し得る。好ましい緊張剤には、多価糖アルコール、好ましくは、三水素またはより高い糖アルコール、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールが含まれる。
【０３１４】
さらなる賦形剤には、以下のものの１つ以上として機能し得る薬剤が含まれる：（１）充填剤、（２）溶解亢進剤、（３）安定剤、及び（４）変性や容器壁への付着を防止する作用剤。そのような賦形剤は、多価糖アルコール（上に列挙）；アミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど；有機糖または糖アルコール、例えば、スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイノシトース、ミオイノシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；硫黄含有還元剤、例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、ナトリウムチオグリコール酸塩、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びナトリウムチオ硫酸塩；低分子量タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは他の免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；単糖類（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、ブドウ糖）；二糖類（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）；三糖類、例えば、ラフィノース；及び多糖類、例えば、デキストリンまたはデキストランが含まれる。
【０３１５】
非イオン性界面活性剤または洗剤（「湿潤剤」としても公知）が存在し、治療用薬剤を安定化させ、ならびに、撹拌誘導性の凝集に対して治療用タンパク質を保護することを助け、それは、また、活性な治療用タンパク質または抗体の変性を引き起こすことなく、製剤が剪断表面ストレスに対して暴露されることを許す。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在する。
【０３１６】
適当な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポロキサマー（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素化カスター油１０、５０、及び６０、グリセロールモノステアレート、スクロース脂肪性酸エステル、メチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロースが含まれる。使用することができる陰イオン性洗剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルソジウムスルホサクシネート、及びジオクチルソジウムスルホネートを含む。陽イオン性洗剤は、ベンザルコニウムクロリドまたはベンゼトニウムクロリドを含む。
【０３１７】
医薬組成物をインビボでの投与のために使用するために、それらは無菌でなければならない。医薬組成物を、無菌ろ過膜を通じたろ過により無菌にしてもよい。本明細書における医薬組成物は、一般的に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により穴を開けることができるストッパーを有する静脈用溶液のバッグまたはバイアル中に置く。
【０３１８】
投与経路は、公知の受け入れられた方法に従って、例えば、適した様式での長期間にわたる単回または複数回のボーラスまたは注入、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内、もしくは関節内経路による注射もしくは注入、局所投与、吸入または持続放出もしくは延長放出の手段による。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与、例えば、腫瘍内に投与される。
【０３１９】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適当な例としては、アンタゴニストを含む固体疎水性重合体の半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、フィルムまたはマイクロカプセルなどの成形品の形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０３２０】
ここで、医薬組成物は、治療される特定の効能に必要な２つ以上の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。あるいは、またはさらに、組成物は、細胞毒性剤、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、または成長阻害剤を含み得る。そのような分子は、好適には、意図した目的に有効な量で組み合わせて存在する。
【０３２１】
また、活性成分は、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）またはマクロエマルションに捕捉することができる。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎに開示されている。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回使用のバイアル、例えば、単回使用の密封バイアル中に含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数回使用のバイアル中に含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、容器中に大量に含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、凍結保存される。
【０３２３】
ＩＶ．ＣＴＬＡ−４関連疾患の治療方法
本明細書に記載されるようにＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂを含む抗ＣＴＬＡ−４構築物（例えば、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ、抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１二重特異性抗体（例えば、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰ）、または抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（例えば、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰ））、及びその組成物（例えば、医薬組成物）は、種々の用途、例えば、診断、分子アッセイ、及び治療において有用である。
【０３２４】
本発明の一態様は、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４構築物を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、それを必要とする個体におけるＣＴＬＡ−４関連疾患または状態の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４関連疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４関連疾患は、病原性感染、例えば、ウイルス感染である。
【０３２５】
本発明は、一部、少なくともいくつかの態様では、医薬的に許容可能な担体または賦形剤と一緒に、単体または別の治療法と任意の組み合わせのいずれかで投与することができる、タンパク質構築物（例えば、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ、抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１二重特異性抗体（例えば、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰ）、または抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（例えば、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰ））、核酸分子及び／またはそれをコードするベクター、核酸分子及び／またはそれをコードするベクターを含む宿主細胞を企図している。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物の投与前に、それらは、当該技術分野で周知の適当な医薬担体及び賦形剤と組み合わせてもよい。本開示に従って調製された組成物は、がんの治療またはがんの悪化の遅延に使用することができる。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物（例えば、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ、抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１二重特異性抗体（例えば、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰ）、または抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（例えば、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰ））を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、がんの治療方法であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び適宜医薬的に許容可能な担体を含む、がんの治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍（例えば、大腸癌）である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身投与される（例えば、静脈内または腹腔内）。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与される（例えば、腫瘍内）。いくつかの実施形態では、方法は、追加のがん療法（例えば、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせ）を個体に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、がんの治療方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞の死滅（バイスタンダー死滅を含む）；（２）がん細胞の増殖の阻害；（３）腫瘍における免疫応答の誘導；（４）腫瘍サイズの減少；（５）がんを有する個体における１つ以上の症状の軽減；（６）腫瘍転移の阻害；（７）生存の延長；（８）がんの進行までの時間の延長；及び（９）がんの再発の可能性の予防、阻害、または低減の１つ以上を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介されるがん細胞の死滅方法は、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のいずれかの腫瘍細胞死率を達成することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介されるがん細胞の死滅方法は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のいずれかの（腫瘍溶解性ＶＶによって非感染な）バイスタンダー腫瘍細胞死率を達成することができる。いくつかの実施形態では、本明���書に記載の医薬組成物によって仲介される腫瘍サイズの減少方法は、腫瘍サイズの少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか）を減らすことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介される腫瘍転移の阻害方法は、転移の少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか）を阻害することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介される個体（例えば、ヒト）の生存の延長方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、または２４ヵ月のいずれかだけ個体の生存を延ばすことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介されるがんの進行までの時間の延長方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間のいずれかだけがんの進行までの時間を延ばすことができる。
【０３２７】
本明細書に記載の方法は、固形がん及び液体がんの両方を含む、種々のがんの治療に適当である。方法は、早期がん、非転移性がん、原発性がん、進行がん、局所進行がん、転移性がん、または寛解のがんを含む、全てのステージのがんに適用可能である。本明細書に記載の方法は、アジュバント設定またはネオアジュバント設定において、第１の療法、第２の療法、第３の療法、または当該技術分野で公知の他の種類のがん治療、例えば、化学療法、外科手術、ホルモン療法、放射線、遺伝子療法、免疫療法（例えば、Ｔ細胞療法）、骨髄移植、幹細胞移植、標的治療、凍結療法、超音波療法、光線力学療法、ラジオ波焼灼療法などとの併用療法として使用され得る（すなわち、方法は、一次／根治治療の前に実施してもよい）。いくつかの実施形態では、方法を用いて、以前に治療されている個体を治療する。いくつかの実施形態では、がんは、前治療に無効であった。いくつかの実施形態では、方法を用いて、以前に治療されていない個体を治療する。
【０３２８】
いくつかの実施形態では、方法は、異常なＣＴＬＡ−４発現、活性、及び／またはシグナリングを有するがん（非限定的な例としては、黒色腫、前立腺癌、肺癌、大腸癌、胃癌、卵巣癌、乳癌、及び膠芽腫が挙げられる）の治療に適当である。
【０３２９】
従って、いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物（例えば、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ、抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１二重特異性抗体（例えば、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰ）、または抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（例えば、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰ））を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、免疫療法応答性固形腫瘍（例えば、がん腫または腺癌、例えば、異常なＣＴＬＡ−４発現、活性、及び／またはシグナリングを有するがん）の治療方法であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び適宜医薬的に許容可能な担体を含む、治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍（例えば、大腸癌）である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身投与される（例えば、静脈内または腹腔内）。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与される（例えば、腫瘍内）。いくつかの実施形態では、方法は、追加のがん療法（例えば、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせ）を個体に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、がんの治療方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞の死滅（バイスタンダー死滅を含む）；（２）がん細胞の増殖の阻害；（３）腫瘍における免疫応答の誘導；（４）腫瘍サイズの減少；（５）がんを有する個体における１つ以上の症状の軽減；（６）腫瘍転移の阻害；（７）生存の延長；（８）がんの進行までの時間の延長；及び（９）がんの再発の可能性の予防、阻害、または低減の１つ以上を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介されるがん細胞の死滅方法は、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のいずれかの腫瘍細胞死率を達成することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介されるがん細胞の死滅方法は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のいずれかの（腫瘍溶���性ＶＶによって非感染な）バイスタンダー腫瘍細胞死率を達成することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介される腫瘍サイズの減少方法は、腫瘍サイズの少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか）を減らすことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介される腫瘍転移の阻害方法は、転移の少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか）を阻害することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介される個体（例えば、ヒト）の生存の延長方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、または２４ヵ月のいずれかだけ個体の生存を延ばすことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介されるがんの進行までの時間の延長方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間のいずれかだけがんの進行までの時間を延ばすことができる。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、方法は、異常なＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２発現、活性、及び／またはシグナリングを有するがん（非限定的な例としては、血液癌及び／または固形腫瘍が挙げられる）の治療に適当である。本発明の抗体を使用して増殖が阻害され得るいくつかのがんは、一般的に、免疫療法に応答するがんを含む。治療のための他のがんの非限定的な例としては、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、明細胞癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン抵抗性前立腺癌）、乳癌、大腸癌及び肺癌（例えば、非小細胞性肺癌）が挙げられる。さらに、本発明は、本発明の抗体を使用して増殖が阻害され得る難治性または再発性悪性腫瘍を含む。本発明の方法を使用して治療し得る他のがんの例としては、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸の癌、腟の癌、外陰の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む慢性または急性白血病、幼児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱の癌、腎臓または尿管の癌、腎盂の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘導される癌を含む環境的に誘導される癌、及び前記癌の組み合わせが挙げられる。本発明は、転移性がん、特に、ＰＤ−Ｌ１を発現する転移性がんの治療にも有用である（Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１３３−１４４）。
【０３３１】
従って、いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第２の抗原結合部分を含む、抗ＣＴＬＡ−４構築物（例えば、ＭＡＢＰまたはＢＡＢＰ）を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、免疫療法応答性固形腫瘍（例えば、がん腫または腺癌、例えば、異常なＣＴＬＡ−４発現、活性、及び／またはシグナリングを有するがん、及び／または異常なＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１発現、活性、及び／またはシグナリング）の治療方法であって、ＶＨ及びＶＬは一緒に、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、または軽鎖のＣ末端で第２の抗原結合部分に融合される、治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−１完全長４鎖抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペムブロリズマブまたはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗原結合部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して融合される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、（例えば、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１に由来する）Ｆｃ断片を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１完全長抗体に融合したＣＴＬＡ−４を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、免疫療法応答性固形腫瘍（例えば、がん腫または腺癌、例えば、異常なＣＴＬＡ−４発現、活性、及び／またはシグナリング、及び／または異常なＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１発現、活性、及び／またはシグナリングを���するがん）の治療方法であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び適宜医薬的に許容可能な担体を含む、治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の少なくとも１つの重鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の少なくとも１つの重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、各抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、完全長抗体の各鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは一緒に融合され、完全長抗体の各重鎖のＮ末端にさらに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び第２の抗体部分（例えば、完全長抗体）は、ペプチドリンカー（例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含むペプチドリンカー）によって適宜連結される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、（ａ）配列番号１３４〜１４５、２９２〜２９６、３１９〜３２３、３５８、及び３５９のいずれかのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、（ａ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号３５４または３５５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、（ａ）配列番号３５６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号３５７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、（ａ）配列番号３６１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号３６２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、（ａ）配列番号３６３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号３６４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、配列番号３６０のアミノ酸配列を含むポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、（ａ）配列番号１４６〜１５７、２９７〜３０１、及び３２４〜３２８のいずれかのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号１６１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、（ａ）配列番号３１０〜３１８及び３２９〜３３７のいずれかのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍（例えば、大腸癌）である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身投与される（例えば、静脈内または腹腔内）。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与される（例えば、腫瘍内）。いくつかの実施形態では、方法は、追加のがん療法（例えば、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせ）を個体に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、がんの治療方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞の死滅（バイスタンダー死滅を含む）；（２）がん細胞の増殖の阻害；（３）腫瘍における免疫応答の誘導；（４）腫瘍サイズの減少；（５）がんを有する個体における１つ以上の症状の軽減；（６）腫瘍転移の阻害；（７）生存の延長；（８）がんの進行までの時間の延長；及び（９）がんの再発の可能性の防止、阻害、または低減の１つ以上を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介されるがん細胞の死滅方法は、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のいずれかの腫瘍細胞死率を達成することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介されるがん細胞の死滅方法は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のいずれかの（腫瘍溶解性ＶＶによって非感染な）バイスタンダー腫瘍細胞死率を達成することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介される腫瘍サイズの減少方法は、腫瘍サイズの少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか）を減らすことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介される腫瘍転移の阻害方法は、転移の少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか）を阻害することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介される個体（例えば、ヒト）の生存の延長方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、または２４ヵ月のいずれかだけ個体の生存を延ばすことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介されるがんの進行までの時間の延長方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間のいずれかだけがんの進行までの時間を延ばすことができる。
【０３３２】
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第２の抗原結合部分を含む、抗ＣＴＬＡ−４構築物（例えば、ＭＡＢＰまたはＢＡＢＰ）を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、免疫療法応答性固形腫瘍（例えば、がん腫または腺癌、例えば、異常なＣＴＬＡ−４発現、活性、及び／またはシグナリング、及び／または異常なＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１発現、活性、及び／またはシグナリングを有するがん）の治療方法であって、ＶＨ及びＶＬは一緒に、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、または軽鎖のＣ末端で第２の抗原結合部分に融合される、治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長４鎖抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、アテゾリズマブまたはデュルバルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全長抗体由来である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分（例えば、完全長抗体）は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して融合される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、（例えば、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１に由来する）Ｆｃ断片を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１完全長抗体に融合したＣＴＬＡ−４を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、免疫療法応答性固形腫瘍（例えば、がん腫または腺癌、例えば、異常なＣＴＬＡ−４発現、活性、及び／またはシグナリング、及び／または異常なＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１発現、活性、及び／またはシグナリングを有するがん）の治療方法であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ���、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び適宜医薬的に許容可能な担体を含む、治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の少なくとも１つの重鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の少なくとも１つの重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、各抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＣ末端は、完全長抗体の各鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、４つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含み、２つの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは一緒に融合され、完全長抗体の各重鎖のＮ末端にさらに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び第２の抗体部分（例えば、完全長抗体）は、ペプチドリンカー（例えば、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含むペプチドリンカー）によって適宜連結される。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、（ａ）配列番号１７１〜１８２、３０２〜３０６、及び３４５〜３４９のいずれかのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４構築物は、（ａ）配列番号１８３〜１９４のいずれかのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一なコピー、及び（ｂ）配列番号１９８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一なコピーを含む。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍（例えば、大腸癌）である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身投与される（例えば、静脈内または腹腔内）。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与される（例えば、腫瘍内）。いくつかの実施形態では、方法は、追加のがん療法（例えば、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせ）を個体に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、がんの治療方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞の死滅（バイスタンダー死滅を含む）；（２）がん細胞の増殖の阻害；（３）腫瘍における免疫応答の誘導；（４）腫瘍サイズの減少；（５）がんを有する個体における１つ以上の症状の軽減；（６）腫瘍転移の阻害；（７）生存の延長；（８）がんの進行までの時間の延長；及び（９）がんの再発の可能性の防止、阻害、または低減の１つ以上を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介されるがん細胞の死滅方法は、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のいずれかの腫瘍細胞死率を達成することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介されるがん細胞の死滅方法は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のいずれかの（腫瘍溶解性ＶＶによって非感染な）バイスタンダー腫瘍細胞死率を達成することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介される腫瘍サイズの減少方法は、腫瘍サイズの少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか）を減らすことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介される腫瘍転移の阻害方法は、転移の少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか）を阻害することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介される個体（例えば、ヒト）の生存の延長方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、または２４ヵ月のいずれかだけ個体の生存を延ばすことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介されるがんの進行までの時間の延長方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間のいずれかだけがんの進行までの時間を延ばすことができる。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、大腸癌、例えば、腺癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、黒色腫、または扁平上皮細胞癌の治療に適当である。
【０３３４】
本発明の医薬組成物の投与量及び所望の薬物濃度は、想定される特定の使用に応じて変動し得る。適切な投与量または投与経路の決定は、当業者の能力の十分に範囲内である。動物実験は、ヒトの治療のための有効量の決定のための信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．“Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  Ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ”，Ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９，ｐｐ．４２−４６に定められる原理に従って実施することができる。
【０３３５】
本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＣＴＬＡ−４構築物のインビボでの投与を使用する場合、通常の投与量は、投与経路に応じて、１日当たり約１０ｎｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）またはそれ以上、好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、約１〜３ｍｇ／ｋｇ／日、約２〜４ｍｇ／ｋｇ／日、約３〜５ｍｇ／ｋｇ／日、約４〜６ｍｇ／ｋｇ／日、約５〜７ｍｇ／ｋｇ／日、約６〜８ｍｇ／ｋｇ／日、約６〜６．５ｍｇ／ｋｇ／日、約６．５〜７ｍｇ／ｋｇ／日、約７〜９ｍｇ／ｋｇ／日、または約８〜１０ｍｇ／ｋｇ／日まで変動し得る。異なる製剤が異なる治療及び異なる疾病のために効果的であること、ならびに、特定の器官または組織を治療することを意図した投与が、別の器官または組織に対するそれと異なる様式での送達を必要とし得ることは、本発明の範囲内である。さらに、投与量を、１回もしくは複数回の別々の投与により、または持続注入により投与してもよい。数日間またはそれより長い反復投与のために、状態に応じて、治療を、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続する。しかしながら、他の投与計画が有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイにより簡単にモニターされる。
【０３３６】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回で投与される（例えば、ボーラス注射）。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数回で投与される（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、またはそれ以上の回数のいずれか）。複数回投与する場合、同じまたは異なる経路で行ってもよく、同じ部位または代替部位で行ってもよい。医薬組成物は、週２回、週３回、週４回、週５回、毎日、休み無く毎日、週１回、休み無く毎週、２週間に１回、３週間に１回、１ヵ月に１回、２ヵ月に１回、３ヵ月に１回、４ヵ月に１回、５ヵ月に１回、６ヵ月に１回、７ヵ月に１回、８ヵ月に１回、９ヵ月に１回、１０ヵ月に１回、１１ヵ月に１回、または１年に１回投与してもよい。投与間隔は、約２４時間〜４８時間、２日〜３日、３日〜５日、５日〜１週間、１週間〜２週間、２週間〜１ヵ月、１ヵ月〜２ヵ月、２ヵ月〜３ヵ月、３ヵ月〜６ヵ月、または６ヵ月〜１年のいずれか１つであってもよい。間隔は、不規則であってもよい（例えば、腫瘍進行後）。いくつかの実施形態では、投与スケジュール中に休みはない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、４日ごとに４回投与される。特定の患者に対する最適な投与量及び治療計画は、疾患の徴候について患者をモニターし、それに応じて治療を調整することにより、医学の当業者によって容易に決定され得る。
【０３３７】
本発明の医薬組成物は、限定はされないが、再構成された液体製剤を含み、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４構築物による治療を必要とする個体、好ましくはヒトへ、公知の方法に従って（例えば、ボーラスとしての静脈内投与、またはある期間にわたる持続的注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、静脈内（ｉ．ｖ．）、関節内、滑液内、髄腔内、経口、局所、または吸入経路によって）投与される。再構成された製剤は、本明細書に記載の凍結乾燥した抗ＣＴＬＡ−４構築物を、タンパク質が全体に分散されるように希釈剤中に溶解させることによって調製することができる。本発明での使用に適当な例示の医薬的に許容可能な（ヒトへの投与について安全かつ非毒性な）希釈剤としては、滅菌水、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、無菌生理食塩液、リンゲル液、またはデキストロース溶液、または塩及び／または緩衝剤の水溶液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮下（すなわち、皮膚の下）投与により個体に投与される。そのような目的のために、医薬組成物は、シリンジを使用して注射してもよい。しかしながら、医薬組成物の投与のための他のデバイス、例えば、注射デバイス；インジェクターペン；オートインジェクターデバイス、無針デバイス；及び皮下パッチ送達システムが利用可能である。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体の静脈内に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、注入、例えば、静脈内注入によって個体に投与される。免疫療法における注入技術は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆＭｅｄ．３１９：１６７６（１９８８）を参照されたい）。
【０３４０】
Ｖ．調製方法
本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４構築物（例えば、抗ＣＴＬＡ−４単一ドメイン抗体）は、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて、または本明細書に記載されるように調製され得る。実施例１〜４、６、及び８も参照されたい。
【０３４１】
単一ドメイン抗体の調製方法は記載されている。例えば、Ｅｌｓ  Ｐａｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，２０１４；９（３）：６７４を参照されたい。単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）は、当該技術分野で公知の方法、例えば、ラクダ科の種（例えば、ラクダまたはラマ）を免疫化して、それからハイブリドーマを得ることによって、または当該技術分野で公知の分子生物学技術を用いて単一ドメイン抗体のライブラリーをクローニングして、未選択ライブラリーの個別クローンによるＥＬＩＳＡによるその後の選択によって、またはファージ提示を用いることによって得られ得る。
【０３４２】
単一ドメイン抗体の組み換え産生の場合、単一ドメイン抗体をコードする核酸を単離し、複製可能なベクターに挿入し、さらにクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現させる。単一ドメイン抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）容易に単離され、配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。一般的に、好ましい宿主細胞は、原核生物または真核生物（一般的に、哺乳動物）起源のいずれかのものである。
【０３４３】
１．原核細胞における組み換え産生
ａ）ベクター構築
本発明の抗体をコードするポリ核酸配列は、標準的な組み換え技術を使用して得ることができる。所望のポリ核酸配列は、抗体産生細胞、例えば、ハイブリドーマ細胞から単離し、配列決定してもよい。あるいは、ポリヌクレオチドをヌクレオチドシンセサイザーまたはＰＣＲ技術を使用して合成することができる。一旦得られると、ポリペプチドをコードする配列を、原核生物宿主において異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することができる組み換えベクター中に挿入する。当該技術分野において利用可能で公知の多くのベクターを、本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、ベクター中に挿入される核酸のサイズ及びそのベクターを用いて形質転換される特定の宿主細胞に主に依存するであろう。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、または両方）及びそれが存在する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて、種々の成分を含む。ベクター成分は、一般的に、限定はされないが、以下：複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサート、及び転写終結配列を含む。
【０３４４】
一般的に、宿主細胞と適合する種に由来するレプリコン配列及び制御配列を含むプラスミドベクターを、これらの宿主に関連して使用する。ベクターは、通常、複製部位、ならびに形質転換細胞において表現型選択を提供することができる標識配列を持つ。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、典型的には、ｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミド）を使用して形質転換する。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含み、このように形質転換細胞を同定するための簡単な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物プラスミドもしくはバクテリオファージは、また、内因性タンパク質の発現のために微生物により使用されることができるプロモーターを含んでもよい、または含むように改変してもよい。特定の抗体の発現のために使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例が、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６４８，２３７号に詳細に記載されている。
【０３４５】
また、宿主微生物と適合するレプリコン配列及び制御配列を含むファージベクターを、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、バクテリオファージ（例えば、ＧＥＭ（商標）−１１など）を、感受性宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２など）を形質転換するために使用することができる組み換えベクターを作製する際に利用してもよい。
【０３４６】
本発明の発現ベクターは、ポリペプチド成分の各々をコードする２つ以上のプロモーター−シストロン対を含み得る。プロモーターは、その発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置付けられる非翻訳調節配列である。原核生物プロモーターは、典型的には、２つのクラス（誘導的及び恒常的）に分類される。誘導的プロモーターは、培養条件における変化（例えば、栄養分の存在もしくは非存在または温度における変化）に応答したその制御下での増加レベルのシストロンの転写を開始するプロモーターである。
【０３４７】
種々の潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが、周知である。選択されたプロモーターを、制限酵素消化を介した供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、単離したプロモーター配列を本発明のベクター中に挿入することにより、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作動可能に連結することができる。天然プロモーター配列及び多くの異種プロモーターの両方を使用し、標的遺伝子の増幅及び／または発現に向けてもよい。いくつかの実施形態では、異種プロモーターを利用する。なぜなら、それらは、一般的に、天然標的ポリペプチドプロモーターと比較して、発現された標的遺伝子のより大きな転写及びより高い産出を許すからである。
【０３４８】
原核生物宿主との使用のために適したプロモーターは、ＰｈｏＡプロモーター、ガラクタマーゼ及びラクトースプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、及びハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃまたはｔｒｃプロモーターなど）を含む。しかしながら、細菌において機能的である他のプロモーター（例えば、他の公知の細菌またはファージのプロモーターなど）も適している。それらのヌクレオチド配列が発表されており、それにより当業者が、それらを、標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロン（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２０：２６９）に、任意の要求される制限部位を供給するためのリンカーまたはアダプターを使用して作動可能に連結することが可能になる。
【０３４９】
一態様では、組み換えベクター内の各シストロンは、発現されたポリペプチドの膜を横断する転位に向ける分泌シグナル配列成分を含む。一般的に、シグナル配列は、ベクターの成分であり得る、または、それは、ベクター中に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であり得る。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞により認識され、処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものでなければならない。異種ポリペプチドに対して天然であるシグナル配列を認識し、処理しない原核生物宿主細胞について、シグナル配列が、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、及びＭＢＰからなる群より選択される原核生物シグナル配列により置換される。本発明のいくつかの実施形態では、発現系の両シストロンにおいて使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはその変異体である。
【０３５０】
いくつかの実施形態では、本発明による抗体の産生は、宿主細胞の細胞質中で起こり得るが、従って、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在は要求されない。いくつかの実施形態では、ポリペプチド成分、例えば、第１の抗原結合部分に適宜融合した第２の抗原結合部分のＶＨドメインをコードするポリペプチド、及び第１の抗原結合部分に適宜融合した第２の抗原結合部分のＶＬドメインをコードするポリペプチドは、発現され、折り畳まれ、組み立てられて、細胞質内に機能的な抗体が形成される。ある特定の宿主株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｒｘＢ−株）は、ジスルフィド結合形成に好ましい細胞質状態を提供し、それにより発現されたタンパク質サブユニットの適切な折り畳み及び組み立てを許す。Ｐｒｏｂａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）。
【０３５１】
本発明は、発現されるポリペプチド成分の定量的比率を、分泌されて適切に組み立てられる本発明の抗体の産出を最大限にするために調節することができる発現系を提供する。そのような調節は、少なくとも部分的に、ポリペプチド成分についての翻訳強度を同時に調節することにより達成される。翻訳強度を調節するための１つの技術が、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８４０，５２３号に開示される。それは、シストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異体を利用する。所与のＴＩＲについて、一連のアミノ酸または核酸配列変異体を、翻訳強度の範囲を用いて作製することができ、それにより特定の鎖の所望の発現レベルについてこの因子を調整するための便利な手段を提供する。ＴＩＲ変異体を、アミノ酸配列を変化させることができるコドン変化をもたらす従来の突然変異誘発技術により生成することができるが、核酸配列におけるサイレントな変化が好ましい。ＴＩＲにおける変化は、例えば、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列の数または間隔における変化を、シグナル配列における変化と共に含むことができる。突然変異シグナル配列を生成するための１つの方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（すなわち、変化がサイレントである）コード配列の開始での「コドンバンク」の生成である。これは、各コドンの３番目のヌクレオチド位置を変化させることにより達成することができる；加えて、いくつかのアミノ酸、例えば、ロイシン、セリン、及びアルギニンなどは、バンクを作製する際に複雑度を加えることができる複数の１番目及び２番目の位置を有する。突然変異誘発のこの方法は、Ｙａｎｓｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４：１５１−１５８に詳細に記載される。
【０３５２】
好ましくは、ベクターの組は、その中の各シストロンについてのＴＩＲ強度の範囲を用いて生成する。この限定された組は、各鎖の発現レベルの比較ならびに種々のＴＩＲ強度の組み合わせ下の所望のタンパク質産物の産出を提供する。ＴＩＲ強度を、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８４０，５２３号に詳細に記載されるレポーター遺伝子の発現レベルを定量化することにより決定することができる。翻訳強度比較に基づき、所望の個々のＴＩＲを選択し、本発明の発現ベクター構築物において組み合わせる。
【０３５３】
ｂ）原核生物宿主細胞
本発明の抗体を発現させるために適した原核生物宿主細胞は、古細菌と真正細菌、例えば、グラム陰性またはグラム陽性生物などを含む。有用な細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、腸内細菌、シュードモナス属（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、またはＰａｒａｃｏｃｃｕｓが挙げられる。いくつかの実施形態では、グラム陰性細胞を使用する。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を本発明のための宿主として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉ株の例としては、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０−１２１９；ＡＴＣＣＤｅｐｏｓｉｔ  Ｎｏ．２７，３２５）及びその誘導体が挙げられ、遺伝子型Ｗ３１１０  ＡｆｈｕＡ（ＡｔｏｎＡ）ｐｔｒ３  ｌａｃ  Ｉｑ  ｌａｃＬ８  ＡｏｍｐＴ  Ａ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１  ｋａｎＲ（米国特許第５，６３９，６３５号）を有する３３Ｄ３株を含む。他の株及びその誘導体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  １７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）及びＥ．ｃｏｌｉ  ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ  ３１，６０８）なども適する。これらの例は、限定的よりも、むしろ説明的である。定義された遺伝子型を有する上記の細菌のいずれかの誘導体を構築するための方法が、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）に記載される。一般的に、細菌の細胞におけるレプリコンの複製能を考慮に入れて適切な細菌を選択することが必要である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属が、周知のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０など）を、レプリコンを供給するために使用する場合、宿主として使用するのに適し得る。
【０３５４】
典型的には、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきであり、追加のプロテアーゼ阻害剤が望ましくは細胞培養に取り込まれ得る。
【０３５５】
ｃ）タンパク質産生
宿主細胞を上記の発現ベクターを用いて形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜改変された従来の栄養培地中で培養する。形質転換は、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、ＤＮＡが、染色体外エレメントとしてまたは染色体組み込み体のいずれかとして複製可能であることを意味する。使用する宿主細胞に応じて、形質転換は、そのような細胞に適切である標準的な技術を使用して行う。塩化カルシウムを用いたカルシウム処理は、実質的な細胞壁バリアを含む細菌細胞のために一般的に使用される。形質転換のための別の方法では、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用されるさらに別の技術は、エレクトロポレーションである。
【０３５６】
宿主細胞を上記の発現ベクターを用いて形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜改変された従来の栄養培地中で培養する。形質転換は、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、ＤＮＡが、染色体外エレメントとしてまたは染色体組み込み体のいずれかとして複製可能であることを意味する。使用する宿主細胞に応じて、形質転換は、そのような細胞に適切である標準的な技術を使用して行う。塩化カルシウムを用いたカルシウム処理は、実質的な細胞壁バリアを含む細菌細胞のために一般的に使用される。形質転換のための別の方法では、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用されるさらに別の技術は、エレクトロポレーションである。
【０３５７】
本発明の抗体を産生するために使用される原核細胞は、当該技術分野において公知の、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖される。適した培地の例としては、Ｌｕｒｉａ培地（ＬＢ）＋必要な栄養分補給が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地はまた、発現ベクターの構築に基づき選択された選択剤を含み、発現ベクターを含む原核細胞の増殖を選択的に許す。例えば、アンピシリンを、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用の培地に加える。
【０３５８】
任意の必要な補給剤（炭素、窒素、及び無機リン酸供給源の他）も、単独でまたは別の補給剤を伴う混合物もしくは培地（例えば、複雑な窒素供給源など）として導入された適切な濃度で含んでもよい。場合により、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリスリトール、及びジチオスレイトールからなる群より選択される１つ以上の還元剤を含んでもよい。原核生物宿主細胞を適した温度で培養する。Ｅ．ｃｏｌｉ増殖について、例えば、好ましい温度は、約２０℃〜約３９℃、より好ましくは２５℃〜約３７℃の範囲、さらにより好ましくは３０℃である。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５〜約９の範囲の任意のｐＨであり得る。Ｅ．ｃｏｌｉについて、ｐＨは、好ましくは約６．８〜約７．４、より好ましくは約７．０である。
【０３５９】
誘導性プロモーターを本発明の発現ベクター中で使用する場合、タンパク質発現を、プロモーターの活性化のために適した条件下で誘導する。本発明の一態様では、ＰｈｏＡプロモーターをポリペプチドの転写を制御するために使用する。従って、形質転換された宿主細胞を、誘導用のリン酸制限培地中で培養する。好ましくは、リン酸制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３−１４７を参照されたい）。種々の他の誘導因子を、用いられるベクター構築物に応じて、当該技術分野において公知の通りに使用してもよい。
【０３６０】
本発明の発現された抗体は、宿主細胞のペリプラズム中に分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、典型的には、微生物の破壊（一般的に、浸透圧ショック、超音波処理、または溶解などの手段による）を含む。一旦、細胞が破壊されると、細胞片または全細胞を遠心分離またはろ過により除去してもよい。タンパク質を、さらに、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーにより精製してもよい。あるいは、タンパク質を培養培地中に輸送し、その中で単離することができる。細胞を培養物から除去してもよく、培養上清を、産生されたタンパク質のさらなる精製のためにろ過及び濃縮する。発現されたポリペプチドを、さらに、一般的に公知の方法（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットアッセイなど）を使用して単離及び同定することができる。
【０３６１】
あるいは、タンパク質産生は、発酵プロセスにより大量に行われる。種々の大規模流加発酵手順を、組み換えタンパク質の産生のために利用可能である。大規模発酵は、少なくとも１０００リットルの能力、好ましくは約１，０００〜１００，０００リットルの能力を有する。これらの発酵槽ではアジテーターインペラを使用し、酸素及び栄養分、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー供給源）を分布させる。小規模発酵は、一般的に、約１００リットル以下の容積である、約１リットル〜約１００リットルの範囲であり得る発酵槽中での発酵を指す。
【０３６２】
発酵プロセスの間に、タンパク質発現の誘導は、典型的には、細胞が適した条件下で所望の密度（例えば、ＯＤ５５０が約１８０〜２２０）まで増殖させた後に開始され、その段階で細胞は初期の静止期にある。種々の誘導因子を、用いられるベクター構築物に応じて、当該技術分野において公知であり、上に記載する通りに使用してもよい。細胞を、誘導前に短い期間にわたり増殖させてもよい。細胞を、通常、約１２〜５０時間にわたり誘導するが、より長いまたはより短い誘導時間を使用してもよい。
【０３６３】
本発明の抗体の産出及び質を改善するために、種々の発酵プロセスを改変することができる。例えば、分泌されたポリペプチドの適切な組み立て及び折り畳みを改善するために、シャペロンタンパク質、例えば、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、及び／またはＤｓｂＧ）またはＦｋｐＡ（シャペロン活性を伴うペプチジルプロリルシス、トランスイソメラーゼ）などを過剰発現する追加のベクターを使用して、宿主原核細胞を同時形質転換することができる。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞において産生される異種タンパク質の適切な折り畳み及び溶解性を促進することが実証されている。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２７４：１９６０１−１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．,米国特許第６，０８３，７１５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．,米国特許第６，０２７，８８８号；Ｂｏｔｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００−１７１０５；Ｒａｍｍ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６−１７１１３；Ａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９−２１０。
【０３６４】
発現された異種タンパク質（特に、タンパク分解に感受性であるもの）のタンパク質分解を最小限にするために、タンパク質分解酵素が欠損したある特定の宿主株を本発明のために使用することができる。例えば、宿主細胞株を改変し、公知の細菌プロテアーゼ（例えば、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、及びその組み合わせなど）をコードする遺伝子における遺伝的突然変異（複数可）に効果を及ぼしてもよい。一部のＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損株を利用可能であり、例えば、Ｊｏｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），ｓｕｐｒａ；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．,米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．,米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３−７２（１９９６）に記載される。
【０３６５】
タンパク質分解酵素が欠損し、１つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドを用いて形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株を、本発明の抗体をコードする発現系において宿主細胞として使用してもよい。
【０３６６】
ｄ）タンパク質精製
本明細書において産生される抗体をさらに精製し、さらなるアッセイ及び使用のための実質的に均質である調製物を得る。当該技術分野において公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の手順：免疫親和性カラムまたはイオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上または陽イオン交換樹脂（例えば、ＤＥＡＥなど）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫安塩析、及びゲルろ過（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用）は、適した精製手順の例示である。
【０３６７】
一態様では、固相に固定化されるプロテインＡは、本発明のＦｃ領域を含む抗体の免疫親和性精製のために使用される。プロテインＡは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅａｓからの４１１（Ｄ細胞壁タンパク質であり、高親和性を伴い抗体のＦｃ領域に結合する。Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３。プロテインＡが固定化される固相は、好ましくは、ガラスまたはシリカ表面を含むカラム、より好ましくは制御された細孔ガラスカラムまたはケイ酸カラムである。一部の適用において、カラムを、混入物の非特異的付着を予防するために、試薬（例えば、グリセロールなど）を用いて被覆している。固相を次に洗浄し、固相に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、目的の抗体を、溶出により固相から回収する。
【０３６８】
２．真核細胞における組み換え産生
真核生物での発現のために、ベクター成分は、一般的に、限定はされないが、以下：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、ならびにエンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列の１つ以上を含む。
【０３６９】
ａ）シグナル配列成分
真核生物宿主における使用のためのベクターはまた、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドをコードするインサートを含んでもよい。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞により認識され、処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。哺乳動物細胞での発現において、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルを利用可能である。
【０３７０】
そのような前駆体領域のためのＤＮＡを、リーディングフレーム中で、本発明の抗体をコードするＤＮＡに連結する。
【０３７１】
ｂ）複製起点
一般的に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターのために必要とされない（ＳＶ４０起点を典型的に使用してもよい。なぜなら、ただ、それは初期プロモーターを含むからである）。
【０３７２】
ｃ）選択遺伝子成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択遺伝子（選択可能マーカーとも呼ばれる）を含んでもよい。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリン）に対して耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複雑な培地から利用可能ではない決定的な栄養分を供給するタンパク質をコードする（例えば、ＢａｃｉｌｌｉについてのＤアラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【０３７３】
選択計画の１例では、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を利用する。異種遺伝子を用いて成功裏に形質転換されるそれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、このように選択計画中に生存する。そのような優性選択の例では、薬物（ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシン）を使用する。
【０３７４】
哺乳動物細胞のための適した選択マーカーの別の例は、本発明の抗体をコードする核酸を取り込む能力がある細胞の同定を可能にするものである（例えば、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど）。
【０３７５】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子を用いて形質転換された細胞は、最初に、メトトレキサート（Ｍｔｘ）（ＤＨＦＲの競合的アンタゴニスト）を含む培地中で形質転換体の全てを培養することにより同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合での適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）である。
【０３７６】
あるいは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及び別の選択マーカー、例えば、アミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などを用いて形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）を、選択マーカー用の選択薬剤（例えば、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８など）を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。
【０３７７】
ｄ）プロモーター成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識され、所望のポリペプチド配列をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。事実上、全ての真核生物遺伝子が、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置付けられるＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、そこでＮは任意のヌクレオチドであり得る。大半の真核生物の３’末端は、ＡＡＴＡＡＡ配列であり、それはコード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであり得る。これらの配列の全てを、真核生物発現ベクター中に挿入してもよい。
【０３７８】
原核生物宿主との使用のために適した他のプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、ラクタマーゼ及びラクトースプロモーターシステム、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、及びハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーターなど）を含む。しかしながら、他の公知の細菌プロモーターが適する。細菌システムにおける使用のためのプロモーターはまた、抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結されたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列を含み得る。
【０３７９】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからのポリペプチド転写は、例えば、以下のウイルスのゲノムから得られるプロモーターにより制御される：例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）、異種哺乳動物プロモーターから、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターから（そのようなプロモーターが宿主細胞系に適合するという条件で）。
【０３８０】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限断片として便利に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として便利に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現させるためのシステムが、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。このシステムの改変が、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。また、マウス細胞における単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのヒトインターフェロンｃＤＮＡの発現に関するＲｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）を参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列をプロモーターとして使用することができる。
【０３８１】
ｅ）エンハンサーエレメント成分
より高い真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、しばしば、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増加される。多くのエンハンサー配列が、現在、哺乳動物遺伝子から公知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）。典型的には、しかしながら、真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用され得る。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。また、真核生物プロモーターの活性化のための増強エレメントに関するＹａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）を参照されたい。エンハンサーは、抗体コード配列に対する位置５’または３’でベクター中にスプライシングされ得るが、しかし、好ましくはプロモーターから部位５’に位置付けられる。
【０３８２】
ｆ）転写終結成分
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終結のために及びｍＲＮＡを安定化させるために必要な配列も含み得る。そのような配列は、一般的に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’及び、時には３’の非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びその中で開示される発現ベクターを参照されたい。
【０３８３】
ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書におけるベクター中でＤＮＡをクローン化または発現するための適した宿主細胞は、本明細書に記載のより高い真核細胞（脊椎動物宿主細胞を含む）を含む。培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、通常の手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、以下：ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞または浮遊培養中での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０３８４】
宿主細胞を、抗体産生のための上記の発現またはクローニングベクターを用いて形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜改変された従来の栄養培地中で培養する。
【０３８５】
ｈ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために使用される宿主細胞を、種々の培地中で培養してもよい。商業的に利用可能な培地、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などが、宿主細胞を培養するために適する。また、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；または同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許Ｒｅ．３０，９８５に記載される培地のいずれかを宿主細胞用の培養培地として使用してもよい。これらの培地のいずれかに、必要に応じて、以下を補給してもよい：ホルモン及び／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸など）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（例えば、アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物など）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、及びグルコースまたは等価のエネルギー供給源。任意の他の必要な補給剤を、また、当業者に公知であり得る適切な濃度で含めてもよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用されたものであり、当業者に明らかであろう。
【０３８６】
ｉ）タンパク質精製
組み換え技術を使用する場合、抗体は、細胞内に、ペリプラズム間隙中に産生され得る、または培地中に直接的に分泌され得る。抗体が細胞内に産生される場合、最初のステップとして、微粒子細片、宿主細胞または溶解断片のいずれかを、例えば、遠心分離または限外ろ過により除去する。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）には、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム間隙に分泌される抗体を単離するための手順が記載される。簡単に説明すると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在において約３０分にわたり溶解させる。細胞片を遠心分離により除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、そのような発現系からの上清を、一般的に、商業的に利用可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを使用して最初に濃縮する。プロテアーゼ阻害剤、例えば、ＰＭＳＦなどを、先のステップのいずれかに含め、タンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含め、外来性混入菌の増殖を予防してもよい。
【０３８７】
細胞から調製された抗体組成物を、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種類及びアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用し、１、２、または４の重鎖を含むヒト免疫グロブリンに基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧが全てのマウスアイソタイプについて及びヒト３について推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが付着するマトリクスは、最もしばしばアガロースであるが、しかしながら、他のマトリクスを利用可能である。機械的に安定なマトリクス、例えば、制御された細孔ガラスまたはポリ（スチレン−ジビニル）ベンゼンによって、アガロースを用いて達成することができるよりも速い流速及び短い処理時間が可能になる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ.Ｊ.）が精製のために有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えば、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫安塩析も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０３８８】
任意の予備精製ステップ（複数可）に続き、目的の抗体及び混入物を含む混合物を、ｐＨが約２．５〜４．５の溶出バッファーを使用し、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍ塩）で実施される、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してもよい。
【０３８９】
３．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、一般的に、関連抗原及びアジュバントの複数回の皮下（ｓ．ｃ．）または腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により動物において産生される。関連抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に、二官能性薬剤または誘導体化薬剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通じた抱合）、Ｎヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を通じて）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１は、独立してより低いアルキル基である）を使用して抱合することが有用であり得る。用いてもよいアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート）が挙げられる。免疫化プロトコルは、過度の実験なしに当業者により選択され得る。
【０３９０】
動物を、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して、例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質またはコンジュゲート（それぞれウサギまたはマウス用）を３容積のフロイント完全アジュバントと組み合わせることにより、及び、溶液を複数部位に皮内注射することにより免疫化する。１ヶ月後、動物に、フロイント完全アジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの最初の量の１／５〜１／１０を用いて、複数部位での皮下注射により追加免役する。７〜１４日後、動物を出血させ、血清を抗体価についてアッセイする。動物に、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。コンジュゲートも、タンパク質融合体として組み換え細胞培養において作製することができる。また、凝集剤（例えば、ミョウバンなど）が免疫応答を増強するために適する。
【０３９１】
４．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体を実質的に均質な抗体の集団から得る、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る、天然に生じる突然変異及び／または翻訳後改変（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。従って、改変語「モノクローナル」は、別々の抗体の混合物ではないとして抗体の特徴を示す。
【０３９２】
例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ方法を使用して作製してもよく、または組み換えＤＮＡ方法により作製してもよい（米国特許第４，８１６，５６７号）。
【０３９３】
ハイブリドーマ方法では、マウスまたは他の適切な宿主動物（例えば、ハムスターまたはラマなど）を本明細書で上に記載する通りに免疫化し、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。リンパ球を、次に、ミエローマ細胞と、適した融合剤（例えば、ポリエチレングリコールなど）を使用して融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０３９４】
免疫化薬剤は、典型的には、抗原性タンパク質またはその融合変異体を含み得る。一般的に、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が、ヒト由来細胞が所望である場合に使用され、または、脾細胞もしくはリンパ節細胞が、非ヒト哺乳動物の供給源が所望である場合に使用される。リンパ球を、次に、不死化細胞株と、適した融合剤（例えば、ポリエチレングリコールなど）を使用して融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する。Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６），ｐｐ．５９−１０３。
【０３９５】
不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に、齧歯類、ウシ、及びヒトに由来するミエローマ細胞である。通常、ラットまたはマウスミエローマ細胞株を用いる。このように調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは非融合親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む適した培養培地中に播種し、増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）（ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を予防する物質である）を含み得る。
【０３９６】
好ましい不死化ミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベル産生を支持し、培地（例えば、ＨＡＴ培地など）に感受性であるものである。これらの内、マウスミエローマ株、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから利用可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ＵＳＡから利用可能なＳＰ−２細胞（及びその誘導体、例えば、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３）などが好ましい。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０３９７】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によりまたはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）により決定する。
【０３９８】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、所望の抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、モノクローナル抗体の結合親和性及び特異性を、免疫沈降によりまたはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）により決定することができる。そのような技術及びアッセイは、当該技術分野において公知である。例えば、結合親和性を、Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャチャード分析により決定してもよい。
【０３９９】
所望の特異性、親和性、及び／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈手順によりサブクローン化し、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ，ｓｕｐｒａ）により増殖してもよい。この目的のための適した培養培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。また、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物において腫瘍としてインビボで増殖し得る。
【０４００】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、培養培地、腹水、または血清から、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィーなどにより適切に分離される。
【０４０１】
モノクローナル抗体は、また、組み換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるものなど）により、及び上に記載する通りに作製してもよい。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定される（例えば、ネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源としての役割を果たす。一旦、単離されると、ＤＮＡを発現ベクター中に置いてもよく、それを次に、本来なら免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエローマ細胞などにトランスフェクションする（そのような組み換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成するために）。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組み換え発現に関する概説文献は、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６−２６２（１９９３）及びＰｌｉｉｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１−１８８（１９９２）を含む。
【０４０２】
さらなる実施形態では、抗体を、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載される技術を使用して生成された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）には、ファージライブラリーを使用した、それぞれネズミ及びヒトの抗体の単離が記載されている。続く刊行物には、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ幅）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））、ならびに組み合わせ感染及び非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのインビボ組み換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））が記載されている。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替物である。
【０４０３】
ＤＮＡを、また、例えば、相同ネズミ配列の場所でヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインについてのコード配列を置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全部もしくは一部を共有結合的に連結させることにより改変してもよい。典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、抗体の定常ドメインについて置換し、または、それらを、抗体の抗原組み合わせ部位の可変ドメインについて置換し、抗原についての特異性を有する１つの抗原組み合わせ部位及び異なる抗原についての特異性を有する別の抗原組み合わせ部位を含むキメラ二価抗体を作製する。
【０４０４】
本明細書に記載のモノクローナル抗体は、一価であり得るが、その調製は、当該技術分野において周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖及び改変重鎖の組み換え発現を含む。重鎖は、重鎖の架橋を予防するように、Ｆｃ領域中の任意の点で一般的に切断される。あるいは、関連するシステイン残基を、架橋を予防するために、別のアミノ酸残基と置換してもよく、または欠失させる。インビトロでの方法が、また、一価抗体を調製するために適している。その断片、特に、Ｆａｂ断片を産生するための抗体の消化を、当該技術分野において公知の通常の技術を使用して達成することができる。
【０４０５】
キメラ抗体またはハイブリッド抗体を、また、合成タンパク質化学において公知の方法（架橋剤を含むものを含む）を使用してインビトロで調製してもよい。例えば、免疫毒素を、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することにより構築してもよい。この目的のための適した試薬の例としては、イミノチオラート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
【０４０６】
モノクローナルｓｄＡｂ産生について実施例１も参照されたい。
【０４０７】
５．ヒト化及びヒト抗体
ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含み、それにおいてレシピエントのＣＤＲからの残基が、非ヒト種（例えば、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、またはウサギ、ラクダ、またはラマ）（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置換される。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基により置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見出されない残基も含み得る。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的に２つの可変ドメインの実質的に全てを含み得るが、それにおいてＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも部分、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含む。例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【０４０８】
一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からその中に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入」残基と呼ばれ、それは典型的に「移入」可変ドメインから取られる。いくつかの実施形態によれば、ヒト化を、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従い、ヒト抗体の対応する配列についての齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列の置換を通じて実施することができる。従って、そのような「ヒト化」抗体は、抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、それにおいて実質的に無傷に満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種からの対応する配列により置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、一部のＣＤＲ残基及び恐らくは一部のＦＲ残基が非ヒト抗体（例えば、ラマＶＨＨドメイン）中の類似部位からの残基により置換されるヒト抗体である。
【０４０９】
ヒト化に対する代替物として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、免疫化時に、内因性の免疫グロブリン産生の非存在においてヒト抗体の完全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが現在可能である。例えば、キメラマウス及び生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失が、内因性の抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖系列突然変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原攻撃時でのヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，５９１，６６９号、同第５，５４５，８０７号；及びＷＯ９７／１７８５２を参照されたい。あるいは、ヒト抗体を、トランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されたマウス）中へヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することにより作製することができる。攻撃時、ヒト抗体産生が観察され、それは全ての点（遺伝子再配列、組み立て、及び抗体レパートリーを含む）でヒトにおいて見られるものと酷似している。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、及び第５，６６１，０１６号、ならびにＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。
【０４１０】
ヒト抗体は、インビトロで活性化されたＢ細胞（米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照されたい）によって、または当該技術分野で公知の種々の技術、例えば、ファージ提示ライブラリーを用いても産生され得る。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の技術は、ヒトモノクローナル抗体の調製のためにも利用可能である。Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６−９５（１９９１）。
【０４１１】
ＶＩ．製造品及びキット
単離された抗ＣＴＬＡ−４構築物（例えば、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性構築物（例えば、ＢＡＢＰ）、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１二重特異性構築物（例えば、ＢＡＢＰ））、単離された核酸もしくはそれをコードするベクター、または抗ＣＴＬＡ−４構築物をコードする単離された核酸もしくはベクターを含む単離された宿主細胞のいずれかを含むキット及び製造品がさらに提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物のいずれか１つを含むキットが提供され、好ましくは、その使用のための説明書を提供する。
【０４１２】
本発明のキットは、適当に包装されている。適当な包装には、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブル包装（例えば、密封マイラーまたはビニール袋）などがあるが、これらに限定されない。キットは、例えば、緩衝剤及び解説情報などの追加の成分を、場合により提供する。従って、本発明は、バイアル（例えば、密封バイアル）、ボトル、ジャー、フレキシブル包装などを含む製造品も提供する。
【０４１３】
製造品は、容器、及び容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書を含み得る。適当な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど種々の材料で形成され得る。一般的に、容器は、本明細書に記載の疾患または疾病（例えば、がん）を治療するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、または皮下注射針で突き刺すことができる栓を有するバイアルであってよい）。ラベルまたは添付文書は、その組成物が個体における特定の状態の治療に使用されることを示す。ラベルまたは添付文書は、組成物を個体に投与するための説明書をさらに含むであろう。ラベルは、再構成及び／または使用のための指示を示し得る。医薬組成物を保持する容器は、再構成製剤の反復投与（例えば、２〜６回投与）を可能にする複数回使用バイアルであり得る。添付文書は、そのような治療用製品の使用に関する適応、用途、投与量、投与、禁忌及び／または警告についての情報を含む、治療用製品の市販包装に通例含まれる指示書を指す。さらに、製造品は、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液などの医薬的に許容可能な緩衝剤を含む第２の容器をさらに含み得る。商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料、例えば、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針及びシリンジをさらに含み得る。
【０４１４】
キットまたは製造品は、複数単位用量の医薬組成物及び使用説明書を含んでもよく、薬局、例えば、病院薬局及び調剤薬局で貯蔵及び使用するために十分な量で包装されている。
【０４１５】
例示の実施形態
実施形態１．ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、前記単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４１６】
実施形態２．前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号１７〜３２及び２１３〜２２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９〜６４、２３３〜２４２、及び３３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１〜９６及び２５３〜２６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、実施形態１に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４１７】
実施形態３．前記ｓｄＡｂ部分が、以下：
（１）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（９）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１０）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１１）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１２）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１３）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１４）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１５）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１６）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１７）配列番号２１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１８）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１９）配列番号２１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２０）配列番号２１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２１）配列番号２１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２２）配列番号２１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２３）配列番号２１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２４）配列番号２２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２５）配列番号２２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２６）配列番号２２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；または
（２７）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体
のいずれか１つを含む、実施形態１または２に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４１８】
実施形態４．前記ｓｄＡｂ部分が、以下：
（１）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（９）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１０）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１１）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１２）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１３）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１４）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１５）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１６）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１７）配列番号２１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１８）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１９）配列番号２１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２０）配列番号２１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２１）配列番号２１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２２）配列番号２１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２３）配列番号２１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２４）配列番号２２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２５）配列番号２２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２６）配列番号２２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；または
（２７）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体
のいずれか１つを含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４１９】
実施形態５．前記ｓｄＡｂ部分が、以下：
ａ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｉ、Ｗ、Ｃ、Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｔ、及びＰからなる群から選択され；
ａ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｒ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｖ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｗ、Ｍ、及びＩからなる群から選択され；
ａ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｌ、Ｒ、Ｐ、Ｈ、Ｆ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、Ｅ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、Ｉ、Ｄ、及びＶからなる群から選択され；
ａ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｗ、Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｍ、Ｙ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ｑ、Ｐ、Ｅ、及びＣからなる群から選択され；及び
ａ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑ、Ｌ、Ｒ、Ｐ、Ｅ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ａ、及びＨからなる群から選択され；または
ｂ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶからなる群から選択され；
ｂ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ｅ及びＱからなる群から選択され；
ｂ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｒ及びＬからなる群から選択され；
ｂ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｗ、Ｒ、Ｇ、及びＳからなる群から選択され；及び
ｂ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑ及びＬからなる群から選択され；または
ｃ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶからなる群から選択され；
ｃ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＬからなる群から選択され；
ｃ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｌ、Ｒ、及びＣからなる群から選択され；
ｃ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｐ、Ｒ、及びＳからなる群から選択され；及び
ｃ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑ及びＬからなる群から選択される；
のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み、
前記アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔ番号付けに従っており、１０８位がＱである場合、１０８位が、Ｌに適宜ヒト化することができる、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４２０】
実施形態６．前記ｓｄＡｂ部分が、以下：
ａ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶからなる群から選択され；
ａ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＬからなる群から選択され；
ａ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｌ、Ｃ、及びＲからなる群から選択され；
ａ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｗ、Ｇ、及びＲからなる群から選択され；及び
ａ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑであり；または
ｂ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ及びＹからなる群から選択され；
ｂ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ｅ及びＱからなる群から選択され；
ｂ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｒ及びＬからなる群から選択され；
ｂ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｗであり；及び
ｂ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑであり；または
ｃ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ及びＹからなる群から選択され；
ｃ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ｇ、Ｅ、及びＱからなる群から選択され；
ｃ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｌ及びＲからなる群から選択され；
ｃ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｒ及びＳからなる群から選択され；及び
ｃ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑである；
のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み、
前記アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔ番号付けに従っており、１０８位のＱが、Ｌに適宜ヒト化することができる、実施形態５に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４２１】
実施形態７．前記ｓｄＡｂ部分が、以下：
ａ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ及びＹからなる群から選択され；
ａ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ｇ、Ｅ、及びＱからなる群から選択され；
ａ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｌ及びＲからなる群から選択され；
ａ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｗであり；及び
ａ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑであり；または
ｂ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆであり；
ｂ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ｅ及びＱからなる群から選択され；
ｂ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｒであり；
ｂ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｗであり；及び
ｂ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑであり；または
ｃ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆであり；
ｃ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ｇ、Ｅ、及びＱからなる群から選択され；
ｃ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｌ及びＲからなる群から選択され；
ｃ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｒ及びＳからなる群から選択され；及び
ｃ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑである；
のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み、
前記アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔ番号付けに従っており、１０８位のＱが、Ｌに適宜ヒト化することができる、実施形態６に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４２２】
実施形態８．前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つに対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するその変異体を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４２３】
実施形態９．前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つに対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するその変異体を含む、実施形態８に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４２４】
実施形態１０．前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つに対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するその変異体を含む、実施形態９に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４２５】
実施形態１１．前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメインにおいて最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、実施形態１０に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４２６】
実施形態１２．前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号１１４、１２９、２０１、２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む、実施形態１１に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４２７】
実施形態１３．前記ｓｄＡｂ部分とＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄが、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍである、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４２８】
実施形態１４．前記ｓｄＡｂ部分と前記ＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄが、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍである、実施形態１３に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４２９】
実施形態１５．前記ｓｄＡｂ部分と前記ＣＴＬＡ−４の間の結合のＫｄが、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍである、実施形態１４に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４３０】
実施形態１６．ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分が、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４３１】
実施形態１７．前記単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が、重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）である、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４３２】
実施形態１８．ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分が、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合される、実施形態１６に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４３３】
実施形態１９．前記ＨＣＡｂが、単量体または二量体である、実施形態１７または１８に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４３４】
実施形態２０．前記ＨＣＡｂが、配列番号１３０〜１３３、２８３〜２９１、及び３６６〜３７１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１７〜１９のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４３５】
実施形態２１．前記単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が、第２のエピトープを特異的に認識する第２の抗体部分をさらに含む、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４３６】
実施形態２２．前記第２の抗体部分が、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、またはｓｄＡｂである、実施形態２１に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４３７】
実施形態２３．前記抗ＣＴＬＡ−４構築物が、単一特異性である、実施形態２１または２２に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４３８】
実施形態２４．前記抗ＣＴＬＡ−４構築物が、多重特異性である、実施形態２１または２２に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４３９】
実施形態２５．前記抗ＣＴＬＡ−４構築物が、二重特異性である、実施形態２４に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４４０】
実施形態２６．ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分が、前記第２の抗体部分のＮ末端及び／またはＣ末端に融合される、実施形態２１〜２５のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４４１】
実施形態２７．ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分、及び前記第２の抗体部分が、ペプチドリンカーによって適宜連結される、実施形態２１〜２６のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４４２】
実施形態２８．前記ペプチドリンカーが、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む、実施形態２７に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４４３】
実施形態２９．前記第２の抗体部分が、ｓｄＡｂである、実施形態２１〜２８のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４４４】
実施形態３０．前記第２のエピトープが、ＣＴＬＡ−４由来である、実施形態２９に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４４５】
実施形態３１．前記単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が、ＣＴＬＡ−４に由来するエピトープ（複数可）を特異的に認識する２つ以上のｓｄＡｂを含む、実施形態３０に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４４６】
実施形態３２．前記第２のエピトープが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）由来である、実施形態２９に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４４７】
実施形態３３．前記第２の抗体部分が、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体である、実施形態２１〜２８のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４４８】
実施形態３４．ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分のＮ末端が、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される、実施形態３３に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４４９】
実施形態３５．ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分のＣ末端が、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される、実施形態３３に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４５０】
実施形態３６．ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分のＮ末端が、前記完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される、実施形態３３に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４５１】
実施形態３７．ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分のＮ末端が、前記完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される、実施形態３３に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４５２】
実施形態３８．ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分のＣ末端が、前記完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合される、実施形態３３に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４５３】
実施形態３９．前記完全長抗体が、ＰＤ−１を特異的に認識する、実施形態３３〜３８のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４５４】
実施形態４０．前記完全長抗体が、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態３９に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４５５】
実施形態４１．前記完全長抗体が、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態３９に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４５６】
実施形態４２．前記完全長抗体が、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態３９に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４５７】
実施形態４３．前記完全長抗体が、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つが、前記抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号１３４〜１４５、２９２〜２９６、及び３１９〜３２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態３３〜４２のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４５８】
実施形態４４．前記完全長抗体が、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つが、前記抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号１４６〜１５７、２９７〜３０１、及び３２４〜３２８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態３３〜４２のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４５９】
実施形態４５．前記完全長抗体が、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つが、前記抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号３１０〜３１８及び３２９〜３３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態３３〜４２のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４６０】
実施形態４６．前記完全長抗体が、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つが、前記抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、前記軽鎖融合ポリペプチドが、配列番号３５４及び３５５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態３３〜４２のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４６１】
実施形態４７．前記完全長抗体が、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂが、前記完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合され、前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号３５６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖融合ポリペプチドが、配列番号３５７のアミノ酸配列を含む、実施形態３３〜４２のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４６２】
実施形態４８．前記抗ＣＴＬＡ−４構築物が、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する４つの同一なｓｄＡｂを含み、前記完全長抗体の各重鎖のＮ末端に融合しているのが、２つの同一なｓｄＡｂであり、前記２つの同一なｓｄＡｂが、適宜ペプチドリンカーを介して互いに融合され、前記２つの同一なｓｄＡｂが、適宜ペプチドリンカーを介して前記完全長抗体の各重鎖のＮ末端に融合される、実施形態３３〜４２のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４６３】
実施形態４９．前記完全長抗体が、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む、実施形態５１に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４６４】
実施形態５０．前記完全長抗体が、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する、実施形態３３〜３８のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４６５】
実施形態５１．前記完全長抗体が、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態４３に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４６６】
実施形態５２．前記完全長抗体が、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態４３に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４６７】
実施形態５３．前記完全長抗体が、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つが、前記抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号１７１〜１８２、３０２〜３０６、及び３４５〜３４９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態３３〜３８及び５０〜５２のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４６８】
実施形態５４．前記完全長抗体が、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つが、前記抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂに融合され、前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号１８３〜１９４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態３３〜３８及び５０〜５２のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４６９】
実施形態５５．前記抗ＣＴＬＡ−４構築物が、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する４つの同一なｓｄＡｂを含み、前記完全長抗体の各重鎖のＮ末端に融合しているのが、２つの同一なｓｄＡｂであり、前記２つの同一なｓｄＡｂが、適宜ペプチドリンカーを介して互いに融合され、前記２つの同一なｓｄＡｂが、適宜ペプチドリンカーを介して完全長抗体の各重鎖のＮ末端に融合される、実施形態３３〜３８及び５０〜５２のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４７０】
実施形態５６．前記抗ＣＴＬＡ−４構築物が、（ａ）ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第２の抗原結合部分を含み、前記ＶＨ及びＶＬは一緒に、第２のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、前記第１の抗原結合部分及び前記第２の抗原結合部分は、互いに融合される、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４７１】
実施形態５７．前記第２のエピトープが、ＣＴＬＡ−４由来である、実施形態５６に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４７２】
実施形態５８．前記第２のエピトープが、ＣＴＬＡ−４由来でない、実施形態５６に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４７３】
実施形態５９．前記抗ＣＴＬＡ−４構築物が、二重特異性である、実施形態５６〜５８のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４７４】
実施形態６０．前記第２の抗原結合部分が、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体である、実施形態５６〜５９のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４７５】
実施形態６１．前記第２の抗原結合部分が、前記ＶＨを含む重鎖及び前記ＶＬを含む軽鎖を含む抗体断片である、実施形態５６〜５９のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４７６】
実施形態６２．前記第２の抗原結合部分が、Ｆａｂである、実施形態６１に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４７７】
実施形態６３．前記第１の抗原結合部分が、ＣＴＬＡ−４を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分を含む単一ポリペプチド鎖を含む、実施形態５６〜６２のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４７８】
実施形態６４．前記第１の抗原結合部分が、適宜ペプチドリンカーを介して一緒に融合したＣＴＬＡ−４を特異的に認識する２つの同一なｓｄＡｂ部分を含む、実施形態６３に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４７９】
実施形態６５．前記第１の抗原結合部分のＣ末端が、前記第２の抗原結合部分の少なくとも１つの重鎖のＮ末端に融合される、実施形態６３または６４に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４８０】
実施形態６６．前記第１の抗原結合部分のＣ末端が、前記第２の抗原結合部分の少なくとも１つの軽鎖のＮ末端に融合される、実施形態６３または６４に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４８１】
実施形態６７．前記第１の抗原結合部分のＮ末端が、前記第２の抗原結合部分の少なくとも１つの重鎖のＣ末端に融合される、実施形態６３または６４に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４８２】
実施形態６８．前記第１の抗原結合部分のＮ末端が、前記第２の抗原結合部分の少なくとも１つの軽鎖のＣ末端に融合される、実施形態６３または６４に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４８３】
実施形態６９．前記第１の抗原結合部分のＣ末端が、前記第２の抗原結合部分の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合される、実施形態６３または６４に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４８４】
実施形態７０．前記第２の抗原結合部分が、ｓｃＦｖである、実施形態５６〜５９及び６３のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４８５】
実施形態７１．前記第１の抗原結合部分のＣ末端が、前記第２の抗原結合部分のＮ末端に融合される、実施形態７０に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４８６】
実施形態７２．前記第１の抗原結合部分のＮ末端が、前記第２の抗原結合部分のＣ末端に融合される、実施形態７０に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４８７】
実施形態７３．前記第１の抗原結合部分が、ＣＨ１ドメインに融合したＣＴＬＡ−４を特異的に認識する第１のｓｄＡｂ部分を含む第１のポリペプチド鎖、及びＣＬドメインに融合したＣＴＬＡ−４を特異的に認識する第２のｓｄＡｂ部分を含む第２のポリペプチド鎖を含むＦａｂ様ドメインである、実施形態５６〜６２のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４８８】
実施形態７４．前記第１の抗原結合部分が、前記第２の抗原結合部分のＮ末端に融合される、実施形態７３に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４８９】
実施形態７５．前記第１の抗原結合部分が、前記第２の抗原結合部分のＣ末端に融合される、実施形態７３に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４９０】
実施形態７６．前記第１及び／または第２の抗原結合部分が、ヒト、ヒト化、ヒト、またはキメラ抗体、またはその抗原結合断片を含む、実施形態５６〜７５のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４９１】
実施形態７７．前記第２の抗原結合部分が、Ｆｃ領域を含む、実施形態５６〜７６のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４９２】
実施形態７８．前記第１の抗原結合部分が、前記Ｆｃ領域のＮ末端に融合される、実施形態７７に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４９３】
実施形態７９．前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１  Ｆｃである、実施形態７７または７８に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４９４】
実施形態８０．前記Ｆｃ領域が、Ｓ２２８Ｐ突然変異を有するＩｇＧ４  Ｆｃである、実施形態７９に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４９５】
実施形態８１．前記第１の抗原結合部分及び前記第２の抗原結合部分が、適宜ペプチドリンカーを介して互いに融合される、実施形態５６〜８０のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４９６】
実施形態８２．前記ペプチドリンカーが、配列番号１６２、１６３、３０７、または３６５のアミノ酸配列を含む、実施形態６４または８１に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４９７】
実施形態８３．前記第２のエピトープが、免疫チェックポイント分子由来である、実施形態５６〜８２のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４９８】
実施形態８４．前記免疫チェックポイント分子が、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１である、実施形態８３に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０４９９】
実施形態８５．前記第２の抗原結合部分が、抗ＰＤ−１抗体、またはその抗原結合断片である、実施形態８４に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０５００】
実施形態８６．前記抗ＰＤ−１抗体が、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態８５に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０５０１】
実施形態８７．前記抗ＰＤ−１抗体が、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態８５に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０５０２】
実施形態８８．前記完全長抗体が、配列番号３０８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３０９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態８５に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０５０３】
実施形態８９．配列番号１３４〜１４５、２９２〜２９６、３１９〜３２３、３５８、及び３５９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つのコピー、ならびに配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖の２つのコピーを含む、実施形態８５または８６に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０５０４】
実施形態９０．配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖の２つのコピー、及び配列番号３５４または３５５のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドの２つのコピーを含む、実施形態８５または８６に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０５０５】
実施形態９１．配列番号３５６のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つのコピー、及び配列番号３５７のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドの２つのコピーを含む、実施形態８５または８６に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０５０６】
実施形態９２．配列番号３６１のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つのコピー、及び配列番号３６２のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドの２つのコピーを含む、実施形態８５または８６に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０５０７】
実施形態９３．配列番号３６３のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つのコピー、及び配列番号３６４のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドの２つのコピーを含む、実施形態８５または８６に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０５０８】
実施形態９４．配列番号３６０のアミノ酸配列を含むポリペプチドの２つのコピーを含む、実施形態８５または８６に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０５０９】
実施形態９５．前記第２の抗原結合部分が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、またはその抗原結合断片である、実施形態８４に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０５１０】
実施形態９６．前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態９５に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０５１１】
実施形態９７．前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態９５に記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０５１２】
実施形態９８．前記単離抗ＣＴＬＡ−４構築物が、生物学的に活性なタンパク質またはその断片をさらに含む、実施形態１〜９７のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０５１３】
実施形態９９．ＣＴＬＡ−４を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む単離抗ＣＴＬＡ−４構築物であって、前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号１１３〜１２９、２００〜２０２、２７４〜２８２、３４１〜３４４、３５２、及び３５３のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、前記単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０５１４】
実施形態１００．実施形態１〜９９のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物と競合的にＣＴＬＡ−４に特異的に結合する、単離抗ＣＴＬＡ−４構築物。
【０５１５】
実施形態１０１．実施形態１〜１００のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物、及び医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【０５１６】
実施形態１０２．ＣＴＬＡ−４関連疾患を有する個体の治療方法であって、前記個体に有効量の実施形態１０１に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【０５１７】
実施形態１０３．前記ＣＴＬＡ−４関連疾患が、がんである、実施形態１０２に記載の方法。
【０５１８】
実施形態１０４．前記がんが、固形腫瘍である、実施形態１０３に記載の方法。
【０５１９】
実施形態１０５．前記がんが、大腸癌である、実施形態１０３に記載の方法。
【０５２０】
実施形態１０６．前記個体に追加のがん療法を投与することをさらに含む、実施形態１０２〜１０５のいずれか１つに記載の方法。
【０５２１】
実施形態１０７．前記追加のがん療法が、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせである、実施形態１０６に記載の方法。
【０５２２】
実施形態１０８．前記ＣＴＬＡ−４関連疾患が、病原性感染である、実施形態１０２に記載の方法。
【０５２３】
実施形態１０９．前記医薬組成物が、全身投与される、実施形態１０２〜１０８のいずれか１つに記載の方法。
【０５２４】
実施形態１１０．前記医薬組成物が、静脈内（ｉ．ｖ．）に投与される、実施形態１０９に記載の方法。
【０５２５】
実施形態１１１．前記医薬組成物が、腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与される、実施形態１０９に記載の方法。
【０５２６】
実施形態１１２．前記医薬組成物が、局所投与される、実施形態１０２〜１０８のいずれか１つに記載の方法。
【０５２７】
実施形態１１３．前記医薬組成物が、腫瘍内に投与される、実施形態１１２に記載の方法。
【０５２８】
実施形態１１４．前記個体が、ヒトである、実施形態１０２〜１１３のいずれか１つに記載の方法。
【０５２９】
実施形態１１５．実施形態１〜１００のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物をコードする、単離核酸。
【０５３０】
実施形態１１６．前記単離核酸が、配列番号９７〜１１２及び２６４〜２７３のいずれか１つの核酸配列を含む、実施形態１１５に記載の単離核酸。
【０５３１】
実施形態１１７．実施形態１１５または１１６に記載の単離核酸を含む、ベクター。
【０５３２】
実施形態１１８．実施形態１１５もしくは１１６に記載の単離核酸、または実施形態１１７に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
【０５３３】
実施形態１１９．実施形態１〜１００のいずれか１つに記載の単離抗ＣＴＬＡ−４構築物、実施形態１１５もしくは１１６に記載の単離核酸、実施形態１１７に記載のベクター、または実施形態１１８に記載の単離宿主細胞を含む、キット。
【０５３４】
実施形態１２０．（ａ）実施形態１１５もしくは１１６に記載の単離核酸、または実施形態１１７に記載のベクター、または実施形態１１８に記載の単離宿主細胞を含む宿主細胞を、コードされた抗ＣＴＬＡ−４構築物を発現するのに有効な条件下で培養すること；及び（ｂ）前記宿主細胞から、発現された抗ＣＴＬＡ−４構築物を得ることを含む、抗ＣＴＬＡ−４構築物の産生方法。
【０５３５】
実施形態１２１．ステップ（ａ）が、実施形態１１５もしくは１１６に記載の単離核酸、または実施形態１１７に記載のベクターを含む宿主細胞を産生することをさらに含む、実施形態１２０に記載の方法。
【実施例】
【０５３６】
以下の実施例は、完全に本発明の例であることを意図しており、従って決して本発明を限定すると考えられるべきではない。以下の実施例及び詳細な説明は、限定としてではなく例証として提供される。
【０５３７】
実施例１：抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂの生成
免疫化
最新の動物保護規制に全て従い、組み換えＣＴＬＡ−４  ＥＣＤタンパク質により３匹のラマを免疫化した。免疫化用に、抗原をＣＦＡ（一次免疫化）またはＩＦＡ（ブースト免疫化）による乳剤として製剤化した。抗原は、首の筋肉内にダブルスポット注射で投与した。各動物に、１００μｇのＣＴＬＡ−４  ＥＣＤを含む乳剤を２本注射し、続いて５０μｇの抗原を含む４本の注射を１週間間隔でした。免疫化の間の異なった時点で、動物から１０ｍｌの血液試料を回収し、血清を調製した。抗原特異的体液免疫応答の誘導は、固定化したＣＴＬＡ−４  ＥＣＤタンパク質を用いたＥＬＩＳＡに基づく実験で血清試料を用いて確認した（図１及び図２）。最後の免疫化から５日後、３００ｍｌの血液試料を回収した。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、ラマ重鎖免疫グロブリン（ＨｃＡｂ）の遺伝源として、血液試料３００ｍｌからＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて単離し、１×１０９個のＰＢＬを得た。抗体の最大多様性は、サンプリングしたＢリンパ球の数、すなわちＰＢＬの数の約１０％に等しいことが予想される（１×１０８個）。ラマにおける重鎖抗体の割合は、Ｂリンパ球の数の最大で２０％である。従って、血液試料３００ｍｌ中のＨＣＡｂの最大多様性は、２×１０７個の異なる分子として計算する。
【０５３８】
ライブラリー構築
ＰＢＬ及びリンパ節から抽出したＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲの出発物質として使用して、ｓｄＡｂをコードする遺伝子断片を増幅した。これらの断片を社内プラスミドベクターにクローニングした。ｓｄＡｂコード配列とインフレームで、ベクターは、Ｃ末端（Ｈｉｓ）６タグをコードしていた。ライブラリーサイズは、１×１０９個を超える。ライブラリーファージは、標準プロトコルに従って調製し、滅菌ろ過の後、さらなる使用のために４℃で保管した。
【０５３９】
選別及びハイスループットスクリーニング
選別は、固形パニングならびに細胞に基づくパニングを用いて、上記ライブラリーで実施した。両方の条件について選別を１回だけ行なった。各々の選別のアウトプットを濃縮係数（対照と比べた溶出液中に存在するファージの数）、多様性、及びＣＴＬＡ−４陽性クローンの割合（ＥＬＩＳＡ）について分析した。これらのパラメーターに基づき、さらなる分析のために最良の選別を選択した。そのために、各々の選別からのアウトプットを、ハイスループットスクリーニング用の可溶性発現ベクターにプールとして再クローニングした。ｓｄＡｂコード配列とインフレームで、ベクターは、Ｃ末端（Ｈｉｓ）６タグをコードしていた。コロニーを採取して、９６ディープウェルプレート（１ｍｌ容量）で培養し、ＩＰＴＧ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎを添加することにより上清中でｓｄＡｂ発現を誘導した。
【０５４０】
（ＥＬＩＳＡによって）ＣＴＬＡ−４  ＥＣＤタンパク質及び（ＦＡＣＳによって）ＣＴＬＡ−４安定細胞株に結合する能力について上清を分析した。陽性バインダーを配列決定し、固有のクローンを選別し、さらに特徴付けた（表２及び表６）。
【０５４１】
固有のクローンを２ＸＹＴ培地中で増殖させ、ＩＰＴＧにより上清中でｓｄＡｂ発現を誘導した。ＣＴＬＡ−４−Ｂ７−１相互作用を阻害する能力について、固有のバインダーの上清を分析した。そのために、上清をＣＴＬＡ−４  ＥＣＤタンパク質でインキュベートした後、複合体をＢ７−１安定細胞株に添加し、結合評価をした。Ｂ７−１細胞株上で負のシグナルを有するｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４インヒビターとみなされる。
【０５４２】
全ての潜在的インヒビターを選別し、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００機器上の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってオフレート分析した。解離相を使用して、個別のｓｄＡｂごとのｋｏｆｆ値を算出した。
【０５４３】
ｓｄＡｂ産生
Ｈｉｓ６標識ｓｄＡｂは、ＡＫＴＡによるペリプラズム抽出液から精製した。ＮＴＡ樹脂は、製造者の指示に従って処理した。調製したペリプラズム抽出液を、回転子上で室温にて３０分間、樹脂でインキュベートした。樹脂をＰＢＳで洗浄し、カラムに移した。充填した樹脂を１５ｍＭイミダゾールで洗浄した。１５０ｍＭイミダゾールを用いて、ｓｄＡｂをカラムから溶出した。溶出した画分を、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅにスポットすることで分析し、Ｐｏｎｃｅａｕで可視化した。タンパク質を含む画分をプールし、ＰＢＳで透析した。透析したタンパク質を回収し、ろ過滅菌し、濃度を測定し、−２０℃で保存した。
【０５４４】
純度を決定するために、タンパク質試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液１０μｌを精製タンパク質１０μｌ（２μｇ）に添加し、試料を９５℃で１０分間加熱し、冷却して、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。ゲルは、一般的な方法に従い処理し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色した。
【０５４５】
ＦＡＣＳ分析によるリガンド結合の阻害
リガンド結合の遮断は、フローサイトメトリーを用いて試験した。抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを評価するため、ヒトＢ７−１を発現するＣＨＯ細胞を接着培養フラスコから解離して、種々の濃度の抗体、及び一定濃度のビオチン標識ｈＣＴＬＡ−４／Ｆｃタンパク質と混合した（両方とも、９６ウェルプレート中で）。ヤーボイ（登録商標）は、抗ＣＴＬＡ−４抗体陽性対照として使用した。混合物を室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。その後、ＰＥ／Ｃｙ５ストレプトアビジン二次抗体を添加し、室温で１５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再び洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。非線形回帰を用いて、Ｐｒｉｓｍ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でデータを分析し、ＩＣ５０値を算出した。図３Ａから分かるように、低濃度（１〜１０μｇ／ｍｌ）でＣＴＬＡ４−Ｂ７−１相互作用を効果的に阻害する抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（Ａ３４３１１、Ａ３６５６６、及びＡ３６９２２）の能力が競合アッセイにより実証され、Ａ３４３１１が、約１４．５２ｎＭのＥＣ５０で最も強力なものであった。
【０５４６】
ｓｄＡｂ親和性決定
各ｓｄＡｂの親和定数（Ｋｄ）をＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００機器による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。
【０５４７】
抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのいくつかの親和性を決定するため、ＣＴＬＡ−４  ＥＣＤ（ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ）を約５０ＲＵの密度でＣＭ５センサーチップにアミンカップリングさせた。抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを１ｎＭ〜８１ｎＭの４つの異なる濃度で注入した。流速は、全ての実験で３０μｌ／分であった。結合相及び解離相は、それぞれ３分及び１０分であった。チップをグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を用いて再生させた。異なるｓｄＡｂ濃度での結合曲線を使用して、動態パラメーターｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及びＫｄを算出した（Ａ３４３１１  ｓｄＡｂ親和性データについて、図９を参照されたい）。
【０５４８】
残りの抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂの親和性は、ＣＴＬＡ−４−Ｈｉｓタンパク質を約５０ＲＵの密度でＣＭ５センサーチップにアミンカップリングさせることで決定した。抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを５ｎＭ〜１６０ｎＭの６つの異なる濃度で注入した。流速は、全ての実験で３０μｌ／分であった。結合相及び解離相は、それぞれ３分及び１０分であった。チップをグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を用いて再生させた。異なるｓｄＡｂ濃度での結合曲線を使用して、動態パラメーターｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及びＫｄを算出した（ＡＳ０７０１４  ｓｄＡｂ及びＡＳ０７１８９  ｓｄＡｂの親和性データについて、図２２Ａ〜２２Ｂを参照されたい）。
【０５４９】
ＣＴＬＡ−４に基づく封鎖アッセイ
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ）によってＰＢＭＣから精製した。各ウェルは、１０５個のＣＤ４＋Ｔ細胞及び１０４個のＣＨＯ−Ｋ１／ヒトＣＤ８０（ヒトＣＤ８０を安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１）を含み、２００μｌの最終作用体積であった。８つの試験精製ｓｄＡｂを異なる濃度で各ウェルに添加した。抗体は、バックグラウンド対照として使用しなかった。ヒトＩｇＧ４は、陰性対照として使用し、ヤーボイ（登録商標）は、陽性抗ＣＴＬＡ４抗体対照として使用した。ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｚ０３３７３−５０）をシステムに添加し、反応を開始させた。３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベーションした後、１００μｌ培地を各試験ウェルから採取し、ＩＬ−２を測定した（Ｃｉｓｂｉｏ）。ＣＴＬＡ−４遮断バイオアッセイにおけるＴ細胞によるＩＬ−２の抗体濃度依存的分泌を使用して、試験抗体ごとのＥＣ５０値、ならびに陽性対照の完全長抗ＣＴＬＡ−４抗体ヤーボイ（登録商標）のＥＣ５０値を抽出した。図４及び図２７Ａ〜２７Ｃから分かるように、９つのｓｄＡｂ（Ａ３７０６７、Ａ３４６２５、Ａ３４３１１、Ａ３４３１３、Ａ３６５６６、Ａ３６９２２、ＡＳ０７０１４、ＡＳ０７１８９、及びＡＳ０７７４５）は、ＣＴＬＡ−４とＢ７−１の間の結合を阻害し、その中で、Ａ３４３１１、Ａ３６５６６、Ａ３６９２２、ＡＳ０７０１４、ＡＳ０７１８９、及びＡＳ０７７４５  ｓｄＡｂは、より強い機能的活性を示した。
【０５５０】
実施例２：抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂヒト化
ｓｄＡｂ  Ａ３４３１１のタンパク質配列を、最も高い相同性を共有している５つの最も近いヒト生殖細胞系列配列と並べた。最良のヒト生殖細胞系列配列をヒトアクセプターとして選択した。ヒトアクセプターに対するフレームワーク領域中のアミノ酸差異は、濃い灰色で網掛けした（図６及び図３１Ａ）。ホモロジーモデルを作製した。モデル分析データに従って、抗原結合または抗体足場形成のために潜在的に重要な残基を放置した一方、ヒト対応物に変換するために残りを選択した。最初に、４〜６個の配列最適化変異体のパネルを生成した（ステージ１）。これらの変異体を多数のパラメーターについて分析し、得られた結果を使用して、第２セットのｓｄＡｂを設計した（ステージ２）。トップの４つのヒト化ｓｄＡｂ（ＡＳ０２６３６、ＡＳ０２６２６、ＡＳ０２６４０、及びＡ３４３１１ＶＨ１１）を、結合、安定性、及び機能的活性データに基づいて選択し、それらの配列アライメントを図６及び図３１Ａに示す（他のヒト化ｓｄＡｂも示す）。
【０５５１】
ＡＳ０７０１４のトップヒト化ｓｄＡｂ（ＡＳ０７０１４ＶＨ１１、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１Ｇ５４、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＡ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＱ、及びＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＳ）、及びＡＳ０７１８９のトップヒト化ｓｄＡｂ（ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１、ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１Ｆ２７、及びＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１ＦＹ）を同様に生成し、スクリーニングし、選別した。これらの配列アライメントを図３１Ｂ及び図３１Ｃに示す（他のヒト化ｓｄＡｂも示す）。
【０５５２】
ヒト化ｓｄＡｂ産生
ヒト化Ｈｉｓ６標識ｓｄＡｂは、ＡＫＴＡによるペリプラズム抽出液から精製した。ｓｄＡｂ産生及び純度決定プロトコルは、実施例１のものに従った。
【０５５３】
ＦＡＣＳ分析によるリガンド結合の阻害
精製ヒト化ｓｄＡｂは、実施例１に記載されるように、ＦＡＣＳ分析によってＣＴＬＡ−４−Ｂ７−１結合を阻害するそれらの能力について試験した。ヒト化ｓｄＡｂが低濃度（１〜１０μｇ／ｍｌ；例えば、図７のＡＳ０２６４０  ｓｄＡｂを参照されたい）でＣＴＬＡ４−Ｂ７−１相互作用を効果的に阻害できたことが競合アッセイ結果により実証された。
【０５５４】
ヒト化ｓｄＡｂの親和性決定
各ヒト化ｓｄＡｂの親和定数（Ｋｄ）は、実施例１に記載されるように、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００機器による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定された。異なるｓｄＡｂ濃度での結合曲線を使用して、動態パラメーターｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及びＫｄを算出した（図９）。図９から分かるように、ヒト化クローンＡＳ０２６４０の結合親和性は、野生型ｓｄＡｂ  Ａ３４３１１のものに匹敵した。
【０５５５】
ＣＴＬＡ−４に基づく封鎖アッセイ
ＣＴＬＡ−４に基づく封鎖アッセイは、実施例１に記載されるように行った。ヒト化ｓｄＡｂ  ＡＳ０２６４０は、Ｔ細胞によるＩＬ−２産生によって反映されるように、ＣＴＬＡ−４とＢ７−１の間の結合を効果的に阻害することが分かった（図８、図２７Ａ〜２７Ｃ）。
【０５５６】
実施例３：ＨＣＡｂ構築、産生、及び特徴付け
上記の研究から機能的活性及び遅いオフレートを有するｓｄＡｂ（Ａ３４３１１、Ａ３６５６６、Ａ３４３１３、及びＡ３６９２２  ｓｄＡｂ）を選択して、ＨＣＡｂ構築及び産生をした。選択されたｓｄＡｂのＤＮＡ配列をヒトＩｇＧ１  ＦｃのＤＮＡ配列と融合させて、ＨＣＡｂ構築物を作製した。ＨＣＡｂ構築物を哺乳動物細胞株にトランスフェクトして、ＨＣＡｂ発現させた。条件培地中の分泌ＨＣＡｂをプロテインＡカラムによって精製した。
【０５５７】
ＦＡＣＳ分析によるリガンド結合の阻害
精製抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ（Ａ３４３１１  ＨＣＡｂ、Ａ３６５６６  ＨＣＡｂ、及びＡ３６９２２  ＨＣＡｂ）は、実施例１に記載されるように、ＦＡＣＳ分析によってＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１結合を阻害するそれらの能力について試験した。図３Ｂから分かるように、低濃度（１〜１０μｇ／ｍｌ）でＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１相互作用を効果的に阻害する抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂの能力が競合アッセイ結果により実証された。ＦＡＣＳデータのＥＣ５０に従って、Ａ３４３１１  ＨＣＡｂ、Ａ３６５６６  ＨＣＡｂ、及びＡ３６９２２  ＨＣＡｂは、市場の薬ヤーボイ（登録商標）に匹敵する機能的活性を示した（図３Ｂ）。
【０５５８】
ＣＴＬＡ−４に基づく封鎖アッセイ
ＣＴＬＡ−４に基づく封鎖アッセイは、実施例１に記載されるように行った。図５Ａ〜５Ｆ及び図１０から分かるように、Ａ３４３１１  ＨＣＡｂ、Ａ３６５６６  ＨＣＡｂ、Ａ３６９２２  ＨＣＡｂ、及びＡ３４３１３  ＨＣＡｂは、ＣＴＬＡ−４とＢ７−１の間の結合の阻害において、市場の薬ヤーボイ（登録商標）に匹敵する機能的活性を示し、ＦＡＣＳに基づくリガンド競合アッセイ結果と一致した（図３Ｂ）。Ａ３４３１１  ＨＣＡｂとＡＳ０２６４０  ＨＣＡｂの機能的活性は、非常に近く（図１０）、抗体の親和性及び活性が、ｓｄＡｂヒト化後に影響を受けなかったことが示唆された。
【０５５９】
抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂの親和性決定
精製後、Ａ３４３１１  ＨＣＡｂの結合親和性パラメーターを、実施例１に記載のものと同様の方法で測定した。ヤーボイ（登録商標）は、抗ＣＴＬＡ−４抗体に対する陽性対照として使用した。簡単に言うと、抗体をＣＭ５センサーチップ上に固定化し、ＣＴＬＡ−４−Ｈｉｓタンパク質は、０．７８、１．５６、３．１５、６．２５、１２．５、２５、５０、及び１００ｎＭの濃度で分析物として流した。図１３Ｃ〜１３Ｅから分かるように、Ａ３４３１１  ＨＣＡｂのＣＴＬＡ−４に対する結合親和性は、ヤーボイ（登録商標）に非常に近かった。
【０５６０】
実施例４：抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む多価構築物または二重特異性抗体の生成及び特徴付け
本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、Ｃ末端抗ＨＳＡ  ｓｄＡｂ、９アミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（９ＧＳ）リンカー、及びＮ末端抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む二重特異性構築物として発現することもできる。さらに、Ｃ末端及びＮ末端に本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ、中央に抗ＨＳＡ  ｓｄＡｂを含み、場合により、９アミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーを介して全てが連結した三価及び二重特異性抗体を構築することができる。Ｃ末端またはＮ末端の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、抗ＰＤ−１  ｓｄＡｂまたは抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂと置換することができる。
【０５６１】
二重特異性抗体は、完全長抗体、例えば、抗ＰＤ−１抗体、例えば、キイトルーダ（登録商標）（ペンブロリズマブ）、オプジーボ（登録商標）（ニボルマブ）、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、テセントリク（登録商標）（アテゾリズマブ）、ＩＭＦＩＮＺＩ（商標）（デュルバルマブ）に融合した抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂで構築することができる。抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、リンカー（例えば、９アミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（９ＧＳリンカー）、ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）ヒンジ、または変異ｈＩｇＧ１ヒンジ）を介して、またはリンカーを介さずに、完全長抗体に連結することができる。抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、重鎖の少なくとも１つのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。
【０５６２】
二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１抗体産生
リンカー（９アミノ酸Ｇｌｙ／ＳｅｒリンカーまたはヒトＩｇＧ１ヒンジ）の有無に関わらず、抗ＰＤ−１完全長抗体（キイトルーダ（登録商標）（ペンブロリズマブ）またはオプジーボ（登録商標）（ニボルマブ））の重鎖のＮ末端またはＣ末端に融合した抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む二重特異性抗体（Ａ３４３１１またはＡＳ０２６４０）を構築した（生成した全てのＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１構築物について、表４を参照されたい）。リンカー（９アミノ酸Ｇｌｙ／ＳｅｒリンカーまたはヒトＩｇＧ１ヒンジ）の有無に関わらず、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体（テセントリク（登録商標）（アテゾリズマブ）またはＩＭＦＩＮＺＩ（商標）（デュルバルマブ））の重鎖のＮ末端またはＣ末端に融合した抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む二重特異性抗体（Ａ３４３１１またはＡＳ０２６４０）も構築した（生成した全てのＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１構築物について、表５を参照されたい）。ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１構築物のうち、Ａ３４３１１−９ＧＳ−テセントリク、Ａ３４３１１−ｈＩｇＧ１ヒンジ−テセントリク、Ａ３４３１１−テセントリク、ＡＳ０２６４０−９ＧＳ−テセントリク、ＡＳ０２６４０−ｈＩｇＧ１ヒンジ−テセントリク、ＡＳ０２６４０−テセントリク、Ａ３４３１１−９ＧＳ−デュルバルマブ、Ａ３４３１１−ｈＩｇＧ１ヒンジ−デュルバルマブ、Ａ３４３１１−デュルバルマブ、ＡＳ０２６４０−９ＧＳ−デュルバルマブ、ＡＳ０２６４０−ｈＩｇＧ１ヒンジ−デュルバルマブ、及びＡＳ０２６４０−デュルバルマブを構築し、発現し、次いで精製した；テセントリク−９ＧＳ−Ａ３４３１１、テセントリク−ｈＩｇＧ１ヒンジ−Ａ３４３１１、テセントリク−Ａ３４３１１、テセントリク−９ＧＳ−ＡＳ０２６４０、テセントリク−ｈＩｇＧ１ヒンジ−ＡＳ０２６４０、テセントリク−ＡＳ０２６４０、デュルバルマブ−９ＧＳ−Ａ３４３１１、デュルバルマブ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−Ａ３４３１１、デュルバルマブ−Ａ３４３１１、デュルバルマブ−９ＧＳ−ＡＳ０２６４０、デュルバルマブ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−ＡＳ０２６４０、及びデュルバルマブ−ＡＳ０２６４０を構築し、発現し、次いで精製する。
【０５６３】
二重特異性構築物をＣＨＯ細胞中で発現させ、次いで、親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって培養培地から精製した。
【０５６４】
二重特異性ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１抗体の親和性決定
精製後、二重特異性抗体の結合親和性パラメーターを、実施例１に記載のものと同様の方法で測定し、それらのモノマー抗体（抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂまたは抗ＰＤ−１  Ａｂ）と比較した。簡単に言うと、抗体をＣＭ５センサーチップ上に固定化し、ＣＴＬＡ−４−ＨｉｓまたはＰＤ−１−Ｈｉｓタンパク質は、０．７８、１．５６、３．１５、６．２５、１２．５、２５、５０、及び１００ｎＭの濃度で分析物として流した。
【０５６５】
２つの例示のＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体、ＢＣＰ−３１１Ｋ及びＢＣＰ−Ｋ３１１の結合動態データを図１２Ａ〜１２Ｄ及び図１３Ａ〜１３Ｅに示す。構築されたＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体のＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４に対する親和性は、それぞれ、それらのモノクローナル抗体である抗ＰＤ−１キイトルーダ（登録商標）（図１２Ａ〜１２Ｄ）、及びＡ３４３１１  ＨＣＡｂ、及び抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂヤーボイ（登録商標）（図１３Ａ〜１３Ｅ）に非常に近かったことが結果により実証された。
【０５６６】
ＦＡＣＳ分析によるリガンド結合の阻害
構築されたＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体の抗ＰＤ−１活性を評価するために、ヒトＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞を接着培養フラスコから解離して、種々の濃度の二重特異性抗体、及び一定濃度のビオチン標識ｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質と混合した（両方とも、９６ウェルプレート中で）。混合物を室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。その後、ＰＥ／Ｃｙ５ストレプトアビジン二次抗体を添加し、室温で１５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再び洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。非線形回帰を用いて、Ｐｒｉｓｍ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でデータを分析し、ＩＣ５０値を算出した。図１４から分かるように、低濃度（１〜１０μｇ／ｍｌ）でＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を効果的に阻害する構築二重特異性抗体の能力が競合アッセイにより実証された。抗体親和性データ（図１２Ａ〜１２Ｄ）と一致して、ＢＣＰ−３１１Ｋ及びＢＣＰ−Ｋ３１１の機能的活性は、それらのモノクローナル抗ＰＤ−１抗体に匹敵した（図１４）。
【０５６７】
構築されたＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体の抗ＣＴＬＡ−４活性を評価するために、ヒトＢ７−１を発現するＣＨＯ細胞を接着培養フラスコから解離して、種々の濃度の二重特異性抗体、及び一定濃度のビオチン標識ｈＣＴＬＡ−４−Ｆｃタンパク質と混合した（両方とも、９６ウェルプレート中で）。フローサイトメトリーアッセイは、前述と同様に実施した。図１５から分かるように、低濃度（１〜１０μｇ／ｍｌ）でＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１相互作用を効果的に阻害する構築二重特異性抗体の能力が競合アッセイにより実証された。抗体親和性データ（図１３Ａ〜１３Ｅ）と一致して、ＢＣＰ−３１１Ｋ及びＢＣＰ−Ｋ３１１の機能的活性は、Ａ３４３１１  ＨＣＡｂ及び抗ＣＴＬＡ−４ヤーボイ（登録商標）に匹敵した（図１５）。
【０５６８】
インビトロ機能的アッセイ
二重特異性抗体によるＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４経路の遮断は、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４経路中のシグナリング分子によって駆動されるレポーター遺伝子のＴ細胞増殖、ＩＦＮ−γ放出、ＩＬ−２分泌または発現をモニターする種々のバイオアッセイを用いて研究することができる。
【０５６９】
例えば、二重特異性抗体によるＰＤ−１阻害は、ＰＤ−Ｌ１及び活性化Ｔ細胞を発現する標的細胞を含む混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＩＬ−２分泌レベルを決定することによって研究することができ、二重特異性抗体は、種々の濃度で提供される。
【０５７０】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及び同種異系単球は、単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＰＢＭＣから精製した。単球を樹状細胞中に誘導した。各ウェルは、１０５個のＣＤ４＋Ｔ細胞及び１０４個の同種異系樹状細胞を含み、２００μｌの最終作用体積であった。ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体を異なる濃度で各ウェルに添加した。抗体は、バックグラウンド対照として使用しなかった。ヒトＩｇＧ４は、陰性対照として使用し、キイトルーダ（登録商標）は、陽性抗ＰＤ−１抗体対照として使用した。３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターで７２時間インキュベーションした後、１００μｌ培地を各試験ウェルから採取し、ＩＬ−２分泌測定をした（Ｃｉｓｂｉｏ）。ＭＬＲ中のＩＬ−２の抗体濃度依存的分泌を使用して、二重特異性抗体の抗ＰＤ−１活性のＥＣ５０値を抽出し、完全長抗ＰＤ−１抗体キイトルーダ（登録商標）のＥＣ５０値と比較した。ＦＡＣＳに基づくリガンド競合アッセイ結果（図１４）と一致して、ＰＤ−１を標的にするＢＣＰ−３１１Ｋ及びＢＣＰ−Ｋ３１１の機能的活性は、それらのモノクローナル抗体に匹敵した（図１７Ａ〜１７Ｄ）。
【０５７１】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＰＢＭＣから精製した。各ウェルは、１０５個のＣＤ４＋Ｔ細胞及び１０４個のＣＨＯ−Ｋ１／ヒトＣＤ８０（ヒトＣＤ８０（Ｂ７−１）を安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１）を含み、２００μｌの最終作用体積であった。ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体を異なる濃度で各ウェルに添加した。抗体は、バックグラウンド対照として使用しなかった。ヒトＩｇＧ４は、陰性対照として使用し、ヤーボイ（登録商標）は、陽性抗ＣＴＬＡ−４抗体対照として使用した。ｈＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｚ０３３７３−５０）をシステムに添加し、反応を開始させた。３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベーションした後、１００μｌ培地を各試験ウェルから採取し、ＩＬ−２分泌測定をした（Ｃｉｓｂｉｏ）。ＣＴＬＡ−４遮断バイオアッセイにおけるＴ細胞によるＩＬ−２の抗体濃度依存的分泌を使用して、二重特異性抗体の抗ＣＴＬＡ−４活性のＥＣ５０値を抽出し、完全長抗ＣＴＬＡ−４ヤーボイ（登録商標）（「ヤーボイバイオシミラー」）、ヤーボイ（登録商標）抗体、及びＨＣＡｂ  Ａ３４３１１の社内発現バイオシミラーのＥＣ５０値と比較した（図１６Ａ〜１６Ｆ）。ＦＡＣＳに基づくリガンド競合アッセイ結果（図１５）と一致して、ＣＴＬＡ−４を標的にするＢＣＰ−３１１Ｋ及びＢＣＰ−Ｋ３１１の機能的活性は、ヤーボイバイオシミラー、ヤーボイ（登録商標）抗体、及びＡ３４３１１  ＨＣＡｂに匹敵した（図１６Ａ〜１６Ｆ）。
【０５７２】
実施例５：抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂのインビボ有効性研究
６〜８週齢のヒトＣＴＬＡ−４  ＫＩ（ノックイン）雌のＣ５７／ＢＬ６マウスの低背部を剃毛し、７５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）培地密度マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の５０μＬ懸濁液中の１×１０６個の大腸癌細胞株ＭＣ３８を皮下注射した。腫瘍が目視検査によって７日以内に生着しなかったマウスは、さらなる研究から除外した。ＭＣ３８移植後の７日目に開始して、腫瘍を毎日測定した。マウスを治療コホートに個別に分類し、全ての場合において移植の約１０日後に腫瘍が閾値の１５０ｍｍ３に到達した場合にのみ治療を受け始めた。デジタルノギス測定及び体重測定は、治療の期間中３日ごとに行った（図１１Ａ）。実験では、マウスには、１０ｍｇ／ｋｇの社内製ヤーボイバイオシミラー抗体、または同等の量の抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ（Ａ３４３１１  ＨＣＡｂまたはＡＳ０２６４０  ＨＣＡｂ）で１６日間静脈内治療を与えた。治療は、４日ごとに実施した。マウスには、陰性対照として機能したＰＢＳを注入した。図１１Ｂから分かるように、Ａ３４３１１  ＨＣＡｂ及びそのヒト化クローンＡＳ０２６４０の両方とも、ＭＣ３８同系マウスモデル中の腫瘍増殖を効果的に制御し、市場の薬ヤーボイ（登録商標）のバイオシミラーと同等の機能的活性を有した。これらの治療は全て、モック対照と比較して、ＭＣ３８移植したマウスの体重に影響を与えなかった（図１１Ｃ）。
【０５７３】
実施例６：抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ構築、産生、及び特徴付け
上記の研究から機能的活性及び遅いオフレートを有するｓｄＡｂ（Ａ３４３１１、Ａ３６５６６、Ａ３６９２２、ＡＳ０７０１４、ＡＳ０７１８９、及びＡＳ０７７４５）及びヒト化抗ＣＴＬＡ−４変異体（ＡＳ０２６３６、ＡＳ０２６２６、ＡＳ０２６４０、Ａ３４３１１ＶＨ１１、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１Ｇ５４、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＡ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＱ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＳ、ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１、ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１Ｆ２７、及びＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１ＦＹ）を選択して、ＨＣＡｂ構築及び産生をした。選択されたｓｄＡｂのＤＮＡ配列をヒトＩｇＧ１  ＦｃのＤＮＡ配列と融合させて、ＨＣＡｂ構築物を作製した。ＨＣＡｂ構築物を哺乳動物細胞株にトランスフェクトして、ＨＣＡｂ発現させた。条件培地中の分泌ＨＣＡｂをプロテインＡカラムによって精製した。
【０５７４】
ＨＣＡｂの親和性決定
抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂの結合動態は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて決定した。抗原ＣＴＬＡ−４−Ｈｉｓ融合タンパク質をセンサーチップ上に固定化した。ＨＣＡｂは、５、１０、２０、４０、８０、及び１６０ｎＭの濃度で分析物として流した。解離（Ｋｄ）及び会合（ｋａ）速度定数のデータは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて得た。見かけの平衡解離定数（ＫＤ）は、Ｋｄ／ｋａの比から算出した。図２３Ａ〜２３Ｂ（Ａ３４３１１  ＨＣＡｂについて、図１３Ｄ及び図１３Ｅも参照されたい）で分かるように、ヒト化ＨＣＡｂ（Ａ３４３１１ＶＨ１１、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１Ｇ５４、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＡ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＱ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＳ、ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１、ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１Ｆ２７、及びＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１ＦＹ）のほとんどの結合親和性は、対応する親ＨＣＡｂ（Ａ３４３１１  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７０１４  ＨＣＡｂ、及びＡＳ０７１８９  ＨＣＡｂ）のものと非常に近く、抗体親和性が、ｓｄＡｂヒト化後に影響を受けなかったことが示唆された。
【０５７５】
ＦＡＣＳ分析によるＣＴＬＡ−４−ＣＨＯ結合
ＣＨＯ細胞上で発現されたヒトＣＴＬＡ−４へのＨＣＡｂの結合は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に基づくアッセイを用いて決定した。ヒトＣＴＬＡ−４を発現するＣＨＯ細胞を接着培養フラスコから解離して、種々の濃度の抗体と（９６ウェルプレート中で）混合した。ヤーボイ（登録商標）は、抗ＣＴＬＡ−４抗体陽性対照として使用した。混合物を室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。その後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗ヒトκ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、室温で１５分間インキュベートし、二次抗体として機能させた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再び洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。非線形回帰を用いて、Ｐｒｉｓｍ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でデータを分析し、ＥＣ５０値を算出した。図３２Ａ〜３２Ｂに示すように、種々のＨＣＡｂがヤーボイ（登録商標）と同等の結合能力を示したことがＦＡＣＳ結合アッセイにより実証された。
【０５７６】
ＦＡＣＳ分析によるリガンド結合の阻害
精製抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ（Ａ３４３１１  ＨＣＡｂ、Ａ３６５６６  ＨＣＡｂ、Ａ３６９２２  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７０１４  ＨＣＡｂ、及びＡＳ０７１８９  ＨＣＡｂ）及びヒト化抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ（Ａ３４３１１ＶＨ１１  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１  ＨＣＡｂ、ＡＳ０２６３６  ＨＣＡｂ、ＡＳ０２６２６  ＨＣＡｂ、ＡＳ０２６４０  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１Ｇ５４  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＡ  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＱ  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＳ  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１Ｆ２７  ＨＣＡｂ、及びＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１ＦＹ  ＨＣＡｂ）は、実施例１に同様に記載されるように、ＦＡＣＳ分析によってＣＴＬＡ−４−Ｂ７−１結合を阻害するそれらの能力について試験した。ヤーボイ（登録商標）は、陽性対照として使用した。図１８Ａ〜１８Ｊから分かるように（他の構築物の結果は不図示）、低濃度（１〜１０μｇ／ｍｌ）でＣＴＬＡ４−Ｂ７−１相互作用を効果的に阻害する抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂの能力が競合アッセイ結果により実証された。ＦＡＣＳデータのＩＣ５０に従って、Ａ３４３１１  ＨＣＡｂ、Ａ３６５６６  ＨＣＡｂ、Ａ３６９２２  ＨＣＡｂ、及びほとんどのヒト化抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ（Ａ３４３１１ＶＨ１１  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１  ＨＣＡｂ、ＡＳ０２６４０  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１Ｇ５４  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＡ  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＱ  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＳ  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１Ｆ２７  ＨＣＡｂ、及びＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１ＦＹ  ＨＣＡｂ）は、市場の薬ヤーボイ（登録商標）に匹敵する機能的活性を示した（図１８Ｊ；他の構築物の結果は不図示）。
【０５７７】
ＣＴＬＡ−４に基づく封鎖アッセイ
ＣＴＬＡ−４に基づく封鎖アッセイは、実施例１に同様に記載されるように行った。ヒトＩｇＧは、陰性対照として使用した。図２８Ａ〜２８Ｂから分かるように（他の構築ＨＣＡｂの試験結果は、不図示）、Ａ３４３１１  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７０１４  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７１８９  ＨＣＡｂ、及びほとんどのヒト化ＨＣＡｂ（Ａ３４３１１ＶＨ１１  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１Ｇ５４  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＱ  ＨＣＡｂ、及びＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１ＦＹ  ＨＣＡｂ）は、ＣＴＬＡ−４とＢ７−１の間の結合を阻害する市場の薬ヤーボイ（登録商標）に匹敵する機能的活性を示し、上述のＦＡＣＳに基づくリガンド競合アッセイ結果と一致した（図１８Ａ〜１８Ｊ）。
【０５７８】
実施例７：抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂのインビボ有効性研究
Ａ３４３１１  ＨＣＡｂ、ヒト化ＡＳ０７０１４ＶＨ１１  ＨＣＡｂ、及びヒト化ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１  ＨＣＡｂを、それらのインビボ有効性について試験した。６〜８週齢のヒトＣＴＬＡ−４  ＫＩ（ノックイン）雌のＣ５７／ＢＬ６マウスの低背部を剃毛し、７５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）培地密度マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の５０μＬ懸濁液中の１×１０６個の大腸癌細胞株ＭＣ３８を皮下注射した。腫瘍が目視検査によって７日以内に生着しなかったマウスは、さらなる研究から除外した。ＭＣ３８移植後の７日目に開始して、腫瘍を毎日測定した。マウスを治療コホートに個別に分類し、全ての場合において移植の約１０日後に腫瘍が閾値の１５０ｍｍ３に到達した場合にのみ治療を受け始めた。デジタルノギス測定及び体重測定は、治療の期間中３日ごとに行った（図３６Ａ）。実験では、マウスには、１０ｍｇ／ｋｇの社内製ヤーボイバイオシミラー抗体、または同等の量の抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂで１６日間静脈内治療を与えた。治療は、４日ごとに実施した。マウスには、陰性対照として機能したＰＢＳを注入した。図３６Ｂから分かるように、Ａ３４３１１  ＨＣＡｂ、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１  ＨＣＡｂ、及びＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１  ＨＣＡｂは、ＭＣ３８同系マウスモデル中の腫瘍増殖を効果的に制御し、市場の薬ヤーボイ（登録商標）のバイオシミラーと同等の機能的活性を有した。これらの治療は全て、モック対照と比較して、ＭＣ３８移植したマウスの体重に影響を与えなかった（ＰＢＳを注入；図３６Ｃ）。
【０５７９】
実施例８：ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む二重特異性抗体抗の生成及び特徴付け
ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗原結合タンパク質（ＢＡＢＰ）の構築
二重特異性抗体は、完全長抗体、またはＣ末端にＦｃ領域を有する完全長抗体のｓｃＦｖもしくはＦａｂ領域、例えば、抗ＰＤ−１抗体、例えば、キイトルーダ（登録商標）（ペンブロリズマブ）、オプジーボ（登録商標）（ニボルマブ）、ＰＤ１ＢＭｍｉｎ、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、テセントリク（登録商標）（アテゾリズマブ）、ＩＭＦＩＮＺＩ（商標）（デュルバルマブ）に融合した抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂで構築することができる。抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、リンカー（例えば、９アミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（９ＧＳリンカー）、ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）ヒンジ、または変異ｈＩｇＧ１ヒンジ）を介して、またはリンカーを介さずに、完全長抗体（またはＣ末端にＦｃ領域を有する完全長抗体のｓｃＦｖもしくはＦａｂ領域）に連結することができる。抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂは、重鎖の少なくとも１つ、軽鎖の少なくとも１つ、または重鎖及び軽鎖の両方に融合することができる。
【０５８０】
この例は、例示のＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗原結合タンパク質（ＢＡＢＰ）の構築及び発現について記述する。１０４個の構築物を設計した。６８個の構築物を発現させ（構築物１〜４３、６３〜７４、８７〜９４、及び９５〜９９）、３６個の構築物を発現させ（構築物４４〜６２、７５〜８６、及び１００〜１０４）、各々は、後述のように２組のポリペプチド鎖を含んだ（ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰ配列について、表４、表７、及び表９も参照されたい、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰ配列について、表５及び表８も参照されたい）。簡単に言うと、リンカー（９−アミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー、ヒトＩｇＧ１ヒンジリンカー、または変異ｈＩｇＧ１ヒンジリンカー）の有無に関わらず、抗ＰＤ−１完全長抗体（例えば、キイトルーダ（登録商標）（ペンブロリズマブ）、オプジーボ（登録商標）（ニボルマブ）、ＰＤ１ＢＭｍｉｎ）または抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体（例えば、テセントリク（登録商標）（アテゾリズマブ）、ＩＭＦＩＮＺＩ（商標）（デュルバルマブ））、または完全長抗体のｓｃＦｖもしくはＦａｂ領域に融合した抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含むＢＡＢＰ（Ａ３４３１１、ＡＳ０２６４０、Ａ３４３１１ＶＨ１１、Ａ３４３１１ＶＨ２、Ａ３４３１１ＶＨ２Ｆ５３、Ａ３４３１１ＶＨ１１Ｆ５３、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１、ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１、ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＱ、ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１ＦＹ、またはＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ２１ＦＹ）を構築した（構築物１〜４３、６３〜７４、８７〜９４、及び９５〜９９）、または構築する（構築物４４〜６２、７５〜８６、及び１００〜１０４）。
【０５８１】
構築物１〜５（ＢＣＰ−７３、ＢＣＰ−７４、ＢＣＰ−７５、ＢＣＰ−９０、ＢＣＰ−９１）：第１のポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（ＢＣＰ−７３のＡ３４３１１ＶＨ１１、ＢＣＰ−７４のＡＳ０７０１４ＶＨ１１、ＢＣＰ−７５のＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１、ＢＣＰ−９０のＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＱ、及びＢＣＰ−９１のＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１ＦＹ）、ペプチドリンカー（変異ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）ヒンジ領域、例えば、配列番号３０７）、ペムブロリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ４の重鎖定常ドメインのＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、ペムブロリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。５つのＢＡＢＰは、図４０の形式を有する。
【０５８２】
構築物６〜１０（ＢＣＰ−７８、ＢＣＰ−７９、ＢＣＰ−８０、ＢＣＰ−９４、ＢＣＰ−９５）：第１のポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（ＢＣＰ−７８のＡ３４３１１ＶＨ１１、ＢＣＰ−７９のＡＳ０７０１４ＶＨ１１、ＢＣＰ−８０のＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１、ＢＣＰ−９４のＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＱ、及びＢＣＰ−９５のＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１ＦＹ）、ペプチドリンカー（変異ｈＩｇＧ１ヒンジ領域、例えば、配列番号３０７）、ニボルマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ４の重鎖定常ドメインのＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、ニボルマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。５つのＢＡＢＰは、図４０の形式を有する。
【０５８３】
構築物１１〜１９（ＢＣＰ−１００、ＢＣＰ−１０１、ＢＣＰ−１０３／１０４／１０５／１０６／１０７／１０８／１０９）：第１のポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（ＢＣＰ−１００のＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１ＦＹ、ＢＣＰ−１０１のＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＱ、ＢＣＰ−１０３のＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ２１ＦＹ、ＢＣＰ−１０４のＡ３４３１１ＶＨ２、ＢＣＰ−１０５のＡ３４３１１ＶＨ２Ｆ５３、ＢＣＰ−１０６のＡ３４３１１ＶＨ１１、ＢＣＰ−１０７のＡ３４３１１ＶＨ１１Ｆ５３、ＢＣＰ−１０８のＡＳ０７０１４ＶＨ１１、及びＢＣＰ−１０９のＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１）、ペプチドリンカー（変異ｈＩｇＧ１ヒンジ領域、例えば、配列番号３０７）、ＰＤ１ＢＭＭｉｎの重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ４の重鎖定常ドメインのＮ末端からＣ末端を含む（ＰＤ１ＢＭＭｉｎ重鎖アミノ酸配列の配列番号３０８を参照されたい）。第２のポリペプチドは、ＰＤ１ＢＭＭｉｎの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む（ＰＤ１ＢＭＭｉｎ軽鎖アミノ酸配列の配列番号３０９を参照されたい）。９つのＢＡＢＰは、図４０の形式を有する。
【０５８４】
構築物２０〜２５（ＢＣＰ−３１１Ｋ、Ａ３４３１１−ｈＩｇＧ１ヒンジ−キイトルーダ、Ａ３４３１１−キイトルーダ、ＡＳ０２６４０−９ＧＳ−キイトルーダ、ＡＳ０２６４０−ｈＩｇＧ１ヒンジ−キイトルーダ、ＡＳ０２６４０−キイトルーダ）：第１のポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（ＢＣＰ−３１１Ｋ、Ａ３４３１１−ｈＩｇＧ１ヒンジ−キイトルーダ、及びＡ３４３１１−キイトルーダのＡ３４３１１、ＡＳ０２６４０−９ＧＳ−キイトルーダ、ＡＳ０２６４０−ｈＩｇＧ１ヒンジ−キイトルーダ、及びＡＳ０２６４０−キイトルーダのＡＳ０２６４０）、適宜ペプチドリンカー（ＢＣＰ−３１１Ｋ及びＡＳ０２６４０−９ＧＳ−キイトルーダの配列番号１６２、Ａ３４３１１−ｈＩｇＧ１ヒンジ−キイトルーダ及びＡＳ０２６４０−ｈＩｇＧ１ヒンジ−キイトルーダの配列番号１６３、Ａ３４３１１−キイトルーダ及びＡＳ０２６４０−キイトルーダに対するリンカーはない）、ペムブロリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ４の重鎖定常ドメインのＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、ペムブロリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。６つのＢＡＢＰは、図４０の形式を有する。
【０５８５】
構築物２６〜３１（Ａ３４３１１−９ＧＳ−オプジーボ、Ａ３４３１１−ｈＩｇＧ１ヒンジ−オプジーボ、Ａ３４３１１−オプジーボ、ＡＳ０２６４０−９ＧＳ−オプジーボ、ＡＳ０２６４０−ｈＩｇＧ１ヒンジ−オプジーボ、ＡＳ０２６４０−オプジーボ）：第１のポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（Ａ３４３１１−９ＧＳ−オプジーボ、Ａ３４３１１−ｈＩｇＧ１ヒンジ−オプジーボ、及びＡ３４３１１−オプジーボのＡ３４３１１、ＡＳ０２６４０−９ＧＳ−オプジーボ、ＡＳ０２６４０−ｈＩｇＧ１ヒンジ−オプジーボ、及びＡＳ０２６４０−オプジーボのＡＳ０２６４０）、適宜ペプチドリンカー（Ａ３４３１１−９ＧＳ−オプジーボ及びＡＳ０２６４０−９ＧＳ−オプジーボの配列番号１６２、Ａ３４３１１−ｈＩｇＧ１ヒンジ−オプジーボ及びＡＳ０２６４０−ｈＩｇＧ１ヒンジ−オプジーボの配列番号１６３、Ａ３４３１１−オプジーボ及びＡＳ０２６４０−オプジーボに対するリンカーはない）、ニボルマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ４の重鎖定常ドメインのＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、ニボルマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。６つのＢＡＢＰは、図４０の形式を有する。
【０５８６】
構築物３２〜３７（Ａ３４３１１−９ＧＳ−テセントリク、Ａ３４３１１−ｈＩｇＧ１ヒンジ−テセントリク、Ａ３４３１１−テセントリク、ＡＳ０２６４０−９ＧＳ−テセントリク、ＡＳ０２６４０−ｈＩｇＧ１ヒンジ−テセントリク、ＡＳ０２６４０−テセントリク）：第１のポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（Ａ３４３１１−９ＧＳ−テセントリク、Ａ３４３１１−ｈＩｇＧ１ヒンジ−テセントリク、及びＡ３４３１１−テセントリクのＡ３４３１１、ＡＳ０２６４０−９ＧＳ−テセントリク、ＡＳ０２６４０−ｈＩｇＧ１ヒンジ−テセントリク、及びＡＳ０２６４０−テセントリクのＡＳ０２６４０）、適宜ペプチドリンカー（Ａ３４３１１−９ＧＳ−テセントリク及びＡＳ０２６４０−９ＧＳ−テセントリクの配列番号１６２、Ａ３４３１１−ｈＩｇＧ１ヒンジ−テセントリク及びＡＳ０２６４０−ｈＩｇＧ１ヒンジ−テセントリクの配列番号１６３、Ａ３４３１１−テセントリク及びＡＳ０２６４０−テセントリクに対するリンカーはない）、アテゾリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及び非グリコシル化ＩｇＧ１の重鎖定常ドメインのＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、アテゾリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。６つのＢＡＢＰは、図４０の形式を有する。
【０５８７】
構築物３８〜４３（Ａ３４３１１−９ＧＳ−デュルバルマブ、Ａ３４３１１−ｈＩｇＧ１ヒンジ−デュルバルマブ、Ａ３４３１１−デュルバルマブ、ＡＳ０２６４０−９ＧＳ−デュルバルマブ、ＡＳ０２６４０−ｈＩｇＧ１ヒンジ−デュルバルマブ、ＡＳ０２６４０−デュルバルマブ）：第１のポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（Ａ３４３１１−９ＧＳ−デュルバルマブ、Ａ３４３１１−ｈＩｇＧ１ヒンジ−デュルバルマブ、及びＡ３４３１１−デュルバルマブのＡ３４３１１、ＡＳ０２６４０−９ＧＳ−デュルバルマブ、ＡＳ０２６４０−ｈＩｇＧ１ヒンジ−デュルバルマブ、及びＡＳ０２６４０−デュルバルマブのＡＳ０２６４０）、適宜ペプチドリンカー（Ａ３４３１１−９ＧＳ−デュルバルマブ及びＡＳ０２６４０−９ＧＳ−デュルバルマブの配列番号１６２、Ａ３４３１１−ｈＩｇＧ１ヒンジ−デュルバルマブ及びＡＳ０２６４０−ｈＩｇＧ１ヒンジ−デュルバルマブの配列番号１６３、Ａ３４３１１−デュルバルマブ及びＡＳ０２６４０−デュルバルマブに対するリンカーはない）、デュルバルマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ１の無効な重鎖定常ドメイン（ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性が無い操作されたＩｇＧ１）のＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、デュルバルマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。６つのＢＡＢＰは、図４０の形式を有する。
【０５８８】
構築物４４〜４８（ＢＣＰ−７３Ｃ、ＢＣＰ−７４Ｃ、ＢＣＰ−７５Ｃ、ＢＣＰ−９０Ｃ、ＢＣＰ−９１Ｃ）：第１のポリペプチドは、ペムブロリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、ＩｇＧ４の重鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー（変異ｈＩｇＧ１ヒンジ領域、例えば、配列番号３０７）、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（ＢＣＰ−７３ＣのＡ３４３１１ＶＨ１１、ＢＣＰ−７４ＣのＡＳ０７０１４ＶＨ１１、ＢＣＰ−７５ＣのＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１、ＢＣＰ−９０ＣのＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＱ、及びＢＣＰ−９１ＣのＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１ＦＹ）のＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、ペムブロリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。５つのＢＡＢＰは、図４１の形式を有する。
【０５８９】
構築物４９〜５３（ＢＣＰ−７８Ｃ、ＢＣＰ−７９Ｃ、ＢＣＰ−８０Ｃ、ＢＣＰ−９４Ｃ、ＢＣＰ−９５Ｃ）：第１のポリペプチドは、ニボルマブの重鎖可変ドメインＶＨ、ＩｇＧ４の重鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー（変異ｈＩｇＧ１ヒンジ領域、例えば、配列番号３０７）、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（ＢＣＰ−７８ＣのＡ３４３１１ＶＨ１１、ＢＣＰ−７９ＣのＡＳ０７０１４ＶＨ１１、ＢＣＰ−８０ＣのＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１、ＢＣＰ−９４ＣのＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＱ、及びＢＣＰ−９５ＣのＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１ＦＹ）のＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、ニボルマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。５つのＢＡＢＰは、図４１の形式を有する。
【０５９０】
構築物５４〜６２（ＢＣＰ−１００Ｃ、ＢＣＰ−１０１Ｃ、ＢＣＰ−１０３Ｃ／１０４Ｃ／１０５Ｃ／１０６Ｃ／１０７Ｃ／１０８Ｃ／１０９Ｃ）：第１のポリペプチドは、ＰＤ１ＢＭＭｉｎの重鎖可変ドメインＶＨ、ＩｇＧ４の重鎖定常ドメイン（ＰＤ１ＢＭＭｉｎ重鎖アミノ酸配列の配列番号３０８を参照されたい）、ペプチドリンカー（変異ｈＩｇＧ１ヒンジ領域、例えば、配列番号３０７）、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（ＢＣＰ−１００ＣのＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１ＦＹ、ＢＣＰ−１０１ＣのＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＱ、ＢＣＰ−１０３ＣのＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ２１ＦＹ、ＢＣＰ−１０４ＣのＡ３４３１１ＶＨ２、ＢＣＰ−１０５ＣのＡ３４３１１ＶＨ２Ｆ５３、ＢＣＰ−１０６ＣのＡ３４３１１ＶＨ１１、ＢＣＰ−１０７ＣのＡ３４３１１ＶＨ１１Ｆ５３、ＢＣＰ−１０８ＣのＡＳ０７０１４ＶＨ１１、及びＢＣＰ−１０９ＣのＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１）のＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、ＰＤ１ＢＭＭｉｎの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む（ＰＤ１ＢＭＭｉｎ軽鎖アミノ酸配列の配列番号３０９を参照されたい）。９つのＢＡＢＰは、図４１の形式を有する。
【０５９１】
構築物６３〜６８（ＢＣＰ−Ｋ３１１（ＢＣＰ−２）、キイトルーダ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−Ａ３４３１１、キイトルーダ−Ａ３４３１１、キイトルーダ−９ＧＳ−ＡＳ０２６４０、キイトルーダ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−ＡＳ０２６４０、キイトルーダ−ＡＳ０２６４０）：第１のポリペプチドは、ペムブロリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、ＩｇＧ４の重鎖定常ドメイン、適宜ペプチドリンカー（ＢＣＰ−Ｋ３１１及びキイトルーダ−９ＧＳ−ＡＳ０２６４０の配列番号１６２、キイトルーダ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−Ａ３４３１１及びキイトルーダ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−ＡＳ０２６４０の配列番号１６３、キイトルーダ−Ａ３４３１１及びキイトルーダ−ＡＳ０２６４０に対するリンカーはない）、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（ＢＣＰ−Ｋ３１１、キイトルーダ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−Ａ３４３１１、及びキイトルーダ−Ａ３４３１１のＡ３４３１１、キイトルーダ−９ＧＳ−ＡＳ０２６４０、キイトルーダ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−ＡＳ０２６４０、及びキイトルーダ−ＡＳ０２６４０のＡＳ０２６４０）のＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、ペムブロリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。６つのＢＡＢＰは、図４１の形式を有する。
【０５９２】
構築物６９〜７４（オプジーボ−９ＧＳ−Ａ３４３１１、オプジーボ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−Ａ３４３１１、オプジーボ−Ａ３４３１１、オプジーボ−９ＧＳ−ＡＳ０２６４０、オプジーボ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−ＡＳ０２６４０、オプジーボ−ＡＳ０２６４０）：第１のポリペプチドは、ニボルマブの重鎖可変ドメインＶＨ、ＩｇＧ４の重鎖定常ドメイン、適宜ペプチドリンカー（オプジーボ−９ＧＳ−Ａ３４３１１及びオプジーボ−９ＧＳ−ＡＳ０２６４０の配列番号１６２、オプジーボ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−Ａ３４３１１及びオプジーボ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−ＡＳ０２６４０の配列番号１６３、オプジーボ−Ａ３４３１１及びオプジーボ−ＡＳ０２６４０に対するリンカーはない）、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（オプジーボ−９ＧＳ−Ａ３４３１１、オプジーボ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−Ａ３４３１１、及びオプジーボ−Ａ３４３１１のＡ３４３１１、オプジーボ−９ＧＳ−ＡＳ０２６４０、オプジーボ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−ＡＳ０２６４０、及びオプジーボ−ＡＳ０２６４０のＡＳ０２６４０）のＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、ニボルマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。６つのＢＡＢＰは、図４１の形式を有する。
【０５９３】
構築物７５〜８０（テセントリク−９ＧＳ−Ａ３４３１１、テセントリク−ｈＩｇＧ１ヒンジ−Ａ３４３１１、テセントリク−Ａ３４３１１、テセントリク−９ＧＳ−ＡＳ０２６４０、テセントリク−ｈＩｇＧ１ヒンジ−ＡＳ０２６４０、テセントリク−ＡＳ０２６４０）：第１のポリペプチドは、アテゾリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、非グリコシル化ＩｇＧ１の重鎖定常ドメイン、適宜ペプチドリンカー（テセントリク−９ＧＳ−Ａ３４３１１及びテセントリク−９ＧＳ−ＡＳ０２６４０の配列番号１６２、テセントリク−ｈＩｇＧ１ヒンジ−Ａ３４３１１及びテセントリク−ｈＩｇＧ１ヒンジ−ＡＳ０２６４０の配列番号１６３、テセントリク−Ａ３４３１１及びテセントリク−ＡＳ０２６４０に対するリンカーはない）、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（テセントリク−９ＧＳ−Ａ３４３１１、テセントリク−ｈＩｇＧ１ヒンジ−Ａ３４３１１、及びテセントリク−Ａ３４３１１のＡ３４３１１、テセントリク−９ＧＳ−ＡＳ０２６４０、テセントリク−ｈＩｇＧ１ヒンジ−ＡＳ０２６４０、及びテセントリク−ＡＳ０２６４０のＡＳ０２６４０）のＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、アテゾリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。６つのＢＡＢＰは、図４１の形式を有する。
【０５９４】
構築物８１〜８６（デュルバルマブ−９ＧＳ−Ａ３４３１１、デュルバルマブ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−Ａ３４３１１、デュルバルマブ−Ａ３４３１１、デュルバルマブ−９ＧＳ−ＡＳ０２６４０、デュルバルマブ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−ＡＳ０２６４０、デュルバルマブ−ＡＳ０２６４０）：第１のポリペプチドは、デュルバルマブの重鎖可変ドメインＶＨ、ＩｇＧ１の無効な重鎖定常ドメイン（ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性の無い操作されたＩｇＧ１）、適宜ペプチドリンカー（デュルバルマブ−９ＧＳ−Ａ３４３１１及びデュルバルマブ−９ＧＳ−ＡＳ０２６４０の配列番号１６２、デュルバルマブ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−Ａ３４３１１及びデュルバルマブ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−ＡＳ０２６４０の配列番号１６３、デュルバルマブ−Ａ３４３１１及びデュルバルマブ−ＡＳ０２６４０に対するリンカーはない）、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（デュルバルマブ−９ＧＳ−Ａ３４３１１、デュルバルマブ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−Ａ３４３１１、及びデュルバルマブ−Ａ３４３１１のＡ３４３１１、デュルバルマブ−９ＧＳ−ＡＳ０２６４０、デュルバルマブ−ｈＩｇＧ１ヒンジ−ＡＳ０２６４０、及びデュルバルマブ−ＡＳ０２６４０のＡＳ０２６４０）のＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、デュルバルマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。６つのＢＡＢＰは、図４１の形式を有する。
【０５９５】
構築物８７（ＢＣＰ−１６）：第１のポリペプチドは、ペムブロリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ４の重鎖定常ドメインのＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（Ａ３４３１１）、ペプチドリンカー（ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、例えば、配列番号１６３）、ペムブロリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。ＢＣＰ−１６は、図４２の形式を有する。
【０５９６】
構築物８８（ＢＣＰ−１７）：第１のポリペプチドは、ペムブロリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ４の重鎖定常ドメインのＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、ペムブロリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、抗体カッパ軽鎖ＣＬドメイン、ペプチドリンカー（配列番号１６３）、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（Ａ３４３１１）のＮ末端からＣ末端を含む。ＢＣＰ−１７は、図４３の形式を有する。
【０５９７】
構築物８９（ＢＣＰ−３１）：第１のポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（Ａ３４３１１）、ペプチドリンカー（９ＧＳリンカー、例えば、配列番号１６２）、ペムブロリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ４の重鎖定常ドメインのＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（Ａ３４３１１）、ペプチドリンカー（９ＧＳリンカー、例えば、配列番号１６２）、ペムブロリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。ＢＣＰ−３１は、図４４の形式を有する。
【０５９８】
構築物９０（ＢＣＰ−３２）：第１のポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（Ａ３４３１１）、ペプチドリンカー（９ＧＳリンカー、例えば、配列番号１６２）、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（Ａ３４３１１）、ペプチドリンカー（配列番号１６２）、ペムブロリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ４の重鎖定常ドメインのＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、ペムブロリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。ＢＣＰ−３２は、図４５の形式を有する。
【０５９９】
構築物９１（ＢＣＰ−３３）：第１のポリペプチドは、ペムブロリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、ＩｇＧ１の定常ＣＨ１領域、ペプチドリンカー（配列番号１６３）、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（Ａ３４３１１）、及びＩｇＧ１のＦｃ領域のＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、ペムブロリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。ＢＣＰ−３３は、図４６の形式を有する。
【０６００】
構築物９２（ＢＣＰ−３４）：ポリペプチドは、ペムブロリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、ペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号３６５）、ペムブロリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、ペプチドリンカー（配列番号１６３）、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（Ａ３４３１１）、及びＩｇＧ１のＦｃ領域のＮ末端からＣ末端を含む。ＢＣＰ−３４は、図４７の形式を有する。
【０６０１】
構築物９３（ＢＣＰ−３５）：第１のポリペプチドは、ペムブロリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、ＩｇＧ４の定常ＣＨ１領域、ペプチドリンカー（配列番号１６３）、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（Ａ３４３１１）、ＩｇＧ４の定常ＣＨ１領域、及びＩｇＧ４のＦｃ領域のＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、ペムブロリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、抗体カッパ軽鎖ＣＬドメイン、ペプチドリンカー（配列番号１６３）、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（Ａ３４３１１）、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。ＢＣＰ−３５は、図４８の形式を有する。
【０６０２】
構築物９４（ＢＣＰ−３６）：第１のポリペプチドは、ペムブロリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、ペプチドリンカー（配列番号３６５）、ペムブロリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、ペプチドリンカー（配列番号１６３）、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（Ａ３４３１１）、ＩｇＧ１の定常ＣＨ１領域、及びＩｇＧ１のＦｃ領域のＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（Ａ３４３１１）、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。ＢＣＰ−３６は、図４９の形式を有する。
【０６０３】
構築物９５〜９９（ＢＣＰ−８３、ＢＣＰ−８４、ＢＣＰ−８５、ＢＣＰ−９２、ＢＣＰ−９３）：第１のポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（ＢＣＰ−８３のＡ３４３１１ＶＨ１１、ＢＣＰ−８４のＡＳ０７０１４ＶＨ１１、ＢＣＰ−８５のＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１、ＢＣＰ−９２のＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＱ、及びＢＣＰ−９３のＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１ＦＹ）、ペプチドリンカー（変異ｈＩｇＧ１ヒンジ領域、例えば、配列番号３０７）、アテゾリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及び非グリコシル化ＩｇＧ１の重鎖定常ドメインのＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、アテゾリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。５つのＢＡＢＰは、図４０の形式を有する。
【０６０４】
構築物１００〜１０４（ＢＣＰ−８３Ｃ、ＢＣＰ−８４Ｃ、ＢＣＰ−８５Ｃ、ＢＣＰ−９２Ｃ、ＢＣＰ−９３Ｃ）：第１のポリペプチドは、アテゾリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、非グリコシル化ＩｇＧ１の重鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー（変異ｈＩｇＧ１ヒンジ領域、例えば、配列番号３０７）、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン（ＢＣＰ−８３ＣのＡ３４３１１ＶＨ１１、ＢＣＰ−８４ＣのＡＳ０７０１４ＶＨ１１、ＢＣＰ−８５ＣのＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１、ＢＣＰ−９２ＣのＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＱ、及びＢＣＰ−９３ＣのＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１ＦＹ）のＮ末端からＣ末端を含む。第２のポリペプチドは、アテゾリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体カッパ軽鎖ＣＬドメインのＮ末端からＣ末端を含む。５つのＢＡＢＰは、図４１の形式を有する。
【０６０５】
上述の各ＢＡＢＰ（構築物９２（ＢＣＰ−３４）を除く）は、第１のポリペプチドの２つのコピー、及び第２のポリペプチドの２つのコピーからなる。構築物９２（ＢＣＰ−３４）は、ポリペプチドの２つのコピーからなる。Ｓ２２８Ｐ突然変異をＩｇＧ４  Ｆｃ領域に導入して、Ｆａｂアーム交換を阻害することができる。さらに、ＢＡＢＰのＦｃ領域は、異なるアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１アイソタイプまたはＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ  Ｆｃと交換してもよい。ＩｇＧ４アイソタイプのＦｃ領域は、ＦｃγＲに対する結合親和性が低いため、いくつかの実施形態では、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１またはＣＴＬＡ−４陽性細胞のＡＤＣＣ媒介枯渇を回避するように使用することができる。いくつかの実施形態では、ＢＡＢＰは、ＡＤＣＣを有する野生型ＩｇＧ１を含む。
【０６０６】
ＢＡＢＰ産生
６８個のＢＡＢＰ構築物（構築物１〜４３、６３〜７４、８７〜９４、及び９５〜９９）のプラスミドを調製し、ＣＨＯ−３Ｅ７細胞で一過性に発現させた。そのうち、１９個の例示のＢＡＢＰ構築物（ＢＣＰ−３１１Ｋ、ＢＣＰ−Ｋ３１１（ＢＣＰ−２）、ＢＣＰ−７３、ＢＣＰ−７４、ＢＣＰ−７５、ＢＣＰ−７８、ＢＣＰ−７９、ＢＣＰ−８０、ＢＣＰ−１６、ＢＣＰ−１７、ＢＣＰ−３１、ＢＣＰ−３２、ＢＣＰ−３３、ＢＣＰ−３４、ＢＣＰ−３５、ＢＣＰ−３６、ＢＣＰ−８３、ＢＣＰ−８４、及びＢＣＰ−８５）を一段階プロテインＡクロマトグラフィーによって精製し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で保存した。精製ＢＡＢＰの組成及び純度を、還元及び非還元の両方の条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ポリペプチド鎖ならびに完全長ＢＡＢＰ分子のサイズは、アミノ酸配列に基づいて算出されたそれらの分子質量と一致した。溶液中のＢＡＢＰの物理的特性をさらに研究するため、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、各タンパク質を分析した。全てのＢＡＢＰは単一の主要なピークを示し、単量体分子、すなわち、各々が第１のポリペプチド鎖の２つのコピー、及び第２のポリペプチド鎖の２つのコピーを含む４つのポリペプチド鎖からなる二量体タンパク質である非凝集ＢＡＢＰ分子としての物理的な均質性が実証された（ＢＣＰ−３４は、ポリペプチド鎖の２つのコピーからなる二量体タンパク質である）。いくつかのデータの概要を表１０に示す。表１０のデータは、ほとんどのＢＡＢＰの産生レベルが規則モノクローナル抗体のものに匹敵したことを実証し、哺乳動物細胞中で効果的に発現することができることが示された。
【０６０７】
３６個のＢＡＢＰ構築物（構築物４４〜６２、７５〜８６、及び１００〜１０４）のプラスミドを調製し、ＣＨＯ−３Ｅ７細胞で一過性に発現させた後、一段階プロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。
【表１０】
2019533719.tif 000011
【０６０８】
安定性分析
種々のＢＡＢＰの熱安定性は、ＭＩＣＲＯＣＡＬ（商標）ＶＰ−キャピラリー示差走査熱量法（ＤＳＣ、Ｍｉｃｒｏｃａｌ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて調べた。おおよそ３７０μｌの各ＢＡＢＰ（１ｍｇ／ｍｌ）及びその対応する緩衝液を、ＭＩＣＲＯＣＡＬ（商標）ＶＰ−キャピラリーＤＳＣユーザーマニュアルに従って９６ウェルプレートに添加した。洗剤洗浄プログラムを各試料ランの間に含め、参照及び試料細胞を清潔に保った。全ての試料を、パッシブモードにおいて９０℃／時間（１．５℃／分）の走査速度で２０℃〜１００℃まで走査した。収集したデータは、ＯＲＧＩＮ（商標）７．０（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）に基づくＶＰ−キャピラリーＤＳＣソフトウェアを用いて分析した。全てのサーモグラムを制御し、ベースラインを減算して、タンパク質アンフォールディングの見かけの中点（Ｔｍ）及び見かけのエンタルピー（ΔＨ）を得た。種々のＢＡＢＰのアンフォールディング中点温度（Ｔｍ）を表１１（ＤＳＣ）に示す。
【０６０９】
加熱中のより大きいタンパク質凝集物の形成は、動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いて追跡した。約０．７５℃の温度間隔を有する２５℃〜７５℃の温度傾斜を、ＤＹＮＡＰＲＯ（登録商標）ＮＡＮＯＳＴＡＲ（登録商標）プレートリーダー（Ｗｙａｔｔ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、１．５ｍｇ／ｍｌで試料について行った。２０μｌの各ＢＡＢＰ試料をＷＹＡＴＴ（登録商標）使い捨てキュベットに添加した後、試料を１０μｌの鉱油（Ｓｉｇｍａ  ８４１０）で覆い、蒸発を防いだ。三重測定（５個の取得／各測定）をＢＡＢＰ試料ごとに平均化した。選択された温度間隔による実験の最中に、熱走査速度は、１．５℃／分になるように算出した。各試料を測定しながら、標的温度が７５℃（約４０分）に到達するまで温度を継続的に加熱した。凝集温度（Ｔａｇｇ）は、ＤＹＮＡＭＩＣＳ（商標）７．６．０．４８ソフトウェア（Ｗｙａｔｔ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で開始分析方法により分析した。種々のＢＡＢＰの測定された凝集開始温度（Ｔａｇｇ）を表１１に示す。
【表１１】
2019533719.tif 000012
【０６１０】
表１１に示すように、ＢＣＰ−７３、ＢＣＰ−７４、及びＢＣＰ−７５のＴｍ及びＴａｇｇは、（例えば、キイトルーダ（登録商標）と比較して）バイオシミラーペムブロリズマブのものに匹敵し、ＢＣＰ−７８、ＢＣＰ−７９、及びＢＣＰ−８０のＴｍ及びＴａｇｇは、（例えば、オプジーボ（登録商標）と比較して）バイオシミラーニボルマブのものに匹敵し、ＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５のＴｍ及びＴａｇｇは、（例えば、テセントリク（登録商標）と比較して）バイオシミラーアテゾリズマブのものに匹敵した。
【０６１１】
ヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）中で＞５０ｍｇ／ｍｌの濃度のＢＡＢＰ試料を、４℃、２５℃及び３７℃の一定温度で７日間インキュベートした。同様の試料セットも５回凍結融解した。全ての試料の無傷で完全な単量体分子の画分をＳＥＣ−ＨＰＬＣで評価し、データを記録し、製造者によって提供されるＣＨＲＯＭＥＬＥＯＮ（商標）ソフトウェアを用いて分析した。表１２は、例示のＢＡＢＰが熱チャレンジ条件下で９０％を超える整合性を保持したことを示した。
【表１２】
2019533719.tif 000013
【０６１２】
溶解性分析
精製ＢＡＢＰの溶解性を特徴付けるため、１０ｍｇの各ＢＡＢＰを１ｍｇ／ｍｌで、約２．５ｍｌの体積でＭＩＣＲＯＣＯＮ（登録商標）−３０ｋＤａ遠心濃縮器（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に添加し、４０００×ｇ（４℃）で遠心分離した。体積を定期的にチェックし、タンパク質を、残りのタンパク質溶液が消費されるまで濃縮器に添加した。体積が約２０μｌに到達するかまたは下げ止まるまで、濃縮を２時間進行させた。濃度は、１μｌの濃縮ＢＡＢＰを１９９μｌのそれぞれの緩衝液に希釈することで得られた試料のＵＶ測定を行うことで決定した。ＢＡＢＰをそれぞれの緩衝剤中で１ｍｇ／ｍｌに希釈後、分析的ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて、試料の凝集について評価した。表１３は、ＢＡＢＰがこれらのこれらのストレス条件下で完全な整合性を保持したことを示した。
【０６１３】
また、精製ＢＡＢＰの溶解性は、交差相互作用クロマトグラフィー（ＣＩＣ）カラムを用いて測定した。プールマウス血清から精製したネズミポリクローナル抗体は、ＳｉｇＭａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｉ５３８１）から購入した。ネズミポリクローナル抗体を樹脂マトリックスに約３０ｍｇ／ｍＬで連結させた。ＰＢＳ緩衝液中の精製ＢＡＢＰを、ネズミＩｇＧ連結カラム及び対照カラムに０．０５〜０．２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でそれぞれ注入した。保持時間を使用して、表１３に報告された保持因子ｋ’値を算出した：ｋ’＝（Ｖｒ−Ｖｏ）／Ｖｏ＝（Ｔｒ−Ｔｍ）／Ｔｍ。Ｖｒは、タンパク質連結カラム上の試料の溶出体積を表し、Ｖｏは、対照カラムからの溶出体積を表し、Ｔｒは、タンパク質連結カラム上の保持時間を表し、Ｔｍは、対照カラム上の保持時間を表す。多くの試料を同じカラム上で２回ランさせた。ｋ’値＞０．６の抗体は、一般的に大幅に少ない可溶性である。表１３によれば、全てのＢＡＢＰは、優れた溶解性を示した。
【表１３】
2019533719.tif 000014
【０６１４】
二重特異性抗体の親和性決定
精製後、二重特異性抗体の結合親和性パラメーターを、実施例１に記載のものと同様の方法で測定し、それらのモノマー抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂ、抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ、または抗ＰＤ−１  Ａｂ）と比較した。ヤーボイ（登録商標）は、陽性抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂ対照として機能し、キイトルーダ（登録商標）及びオプジーボ（登録商標）は、陽性抗ＰＤ−１  Ａｂ対照として機能し、テセントリク（登録商標）は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の陽性対照として機能した。簡単に言うと、ＣＴＬＡ−４への結合親和性を決定するために、抗体をチップ上に固定化し、ＣＴＬＡ−４−Ｈｉｓタンパク質は、１２．５、２５、５０、１００、及び２００ｎＭの濃度で分析物として流し；ＰＤ−１への結合親和性を決定するために、抗体をチップ上に固定化し、ＰＤ−１−Ｈｉｓタンパク質は、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、及び１００ｎＭの濃度で分析物として流し；ＰＤ−Ｌ１への結合親和性を決定するために、抗体をチップ上に固定化し、ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓタンパク質は、１．５６、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、及び５０ｎＭの濃度で分析物として流した。
【０６１５】
８つの例示のＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体（ＢＣＰ−３１１Ｋ、ＢＣＰ−Ｋ３１１（ＢＣＰ−２）、ＢＣＰ−７３、ＢＣＰ−７４、ＢＣＰ−７５、ＢＣＰ−７８、ＢＣＰ−７９、及びＢＣＰ−８０）の結合動態データを図１２Ａ〜１２Ｄ、図１３Ａ〜１３Ｅ、図２４Ａ〜２４Ｂ、及び図２５Ａ〜２５Ｂに示す。構築されたＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体のＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４に対する親和性は、それぞれ、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体キイトルーダ（登録商標）及びオプジーボ（登録商標）（図１２Ａ〜１２Ｄ、図２５Ａ〜２５Ｂ）、及び抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体ヤーボイ（登録商標）（図１３Ａ〜１３Ｅ、図２４Ａ〜２４Ｂ）に非常に近かったことが結果により示された。
【０６１６】
３つの例示のＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（ＢＣＰ−８３、ＢＣＰ−８４、及びＢＣＰ−８５）の結合動態データを図２４Ａ〜２４Ｂ及び図２６Ａ〜２６Ｂに示す。構築されたＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体のＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４に対する親和性は、それぞれ、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体テセントリク（登録商標）（図２６Ａ〜２６Ｂ）、及び抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体ヤーボイ（登録商標）（図２４Ａ〜２４Ｂ）に非常に近かったことが結果により示された。
【０６１７】
ＰＤ−１に対するＢＣＰ−２、ＢＣＰ−１６、ＢＣＰ−１７、ＢＣＰ−３１、ＢＣＰ−３２、ＢＣＰ−３３、ＢＣＰ−３４、ＢＣＰ−３５、ＢＣＰ−３６の結合動態は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて決定した。異なる濃度のＢＡＢＰ試料は、５０ｎＭで開始して、３倍段階希釈で調製した。各ＢＡＢＰ試料は、Ｆｃ捕獲方法を介してセンサーチップ上に固定化した。抗原ＰＤ−１−Ｈｉｓは、分析物として使用した。解離（Ｋｄ）及び会合（ｋａ）速度定数は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて得た。見かけの平衡解離定数（ＫＤ）は、Ｋｄ／ｋａの比から算出した。表１４に示すように、ＢＡＢＰは、ペムブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））及びニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））と同等のＰＤ−１に対する結合動態を保持した。
【０６１８】
ＣＴＬＡ−４に対するＡ３４３１１  ＨＣＡｂ及びＢＡＢＰ  ＢＣＰ−２、ＢＣＰ−１６、ＢＣＰ−１７、ＢＣＰ−３１、ＢＣＰ−３２、ＢＣＰ−３３、ＢＣＰ−３４、ＢＣＰ−３５、ＢＣＰ−３６の結合動態は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて決定した。異なる濃度のＢＡＢＰ試料は、２００ｎＭで開始して、３倍段階希釈で調製した。各ＢＡＢＰ試料は、Ｆｃ捕獲方法を介してセンサーチップ上に固定化した。抗原ＣＴＬＡ−４−Ｈｉｓは、分析物として使用した。解離（Ｋｄ）及び会合（ｋａ）速度定数は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて得た。見かけの平衡解離定数（ＫＤ）は、Ｋｄ／ｋａの比から算出した。表１４に示すように、これらのＢＡＢＰが、Ｆｃに融合したそれらの対応する抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂと同等のＣＴＬＡ−４に対する結合動態を示したことが結合動態により実証された（Ａ３４３１１  ＨＣＡｂのデータを参照されたい）。また、これらのＢＡＢＰは、イピリムマブ（例えば、ヤーボイ（登録商標））と同等のＣＴＬＡ−４に対する結合動態を有した。
【表１４】
2019533719.tif 000015
【０６１９】
ＦＡＣＳアッセイによって評価された細胞上に発現されたＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、またはＰＤ−Ｌ１への結合
ＣＨＯ細胞上で発現されたヒトＣＴＬＡ−４へのＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体（ＢＣＰ−７３、ＢＣＰ−７４、ＢＣＰ−７５、ＢＣＰ−７８、ＢＣＰ−７９、及びＢＣＰ−８０）またはＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（ＢＣＰ−８３、ＢＣＰ−８４、及びＢＣＰ−８５）の結合は、サブセクション「ＦＡＣＳ分析によるＣＴＬＡ−４−ＣＨＯ結合」の下で実施例６に記載されるように、同様のＦＡＣＳに基づくアッセイを用いて決定した。図３３Ａ〜３３Ｂに示すように、精製ＢＡＢＰがヤーボイ（登録商標）と同等のＣＴＬＡ−４結合能力を示したことがＦＡＣＳ結合アッセイにより実証された。
【０６２０】
ＣＨＯ細胞上で発現されたヒトＰＤ−１へのＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体（ＢＣＰ−７３、ＢＣＰ−７４、ＢＣＰ−７５、ＢＣＰ−７８、ＢＣＰ−７９、及びＢＣＰ−８０）の結合は、ＦＡＣＳに基づくアッセイを用いて決定した。ヒトＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞を接着培養フラスコから解離して、種々の濃度の抗体と（両方とも９６ウェルプレート中で）混合した。キイトルーダ（登録商標）及びオプジーボ（登録商標）は、抗ＰＤ−１抗体陽性対照として使用した。ヒトＩｇＧは、陰性結合対照として使用した。混合物を室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。その後、二次抗体として使用したＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトカッパ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、室温で１５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再び洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。非線形回帰を用いて、Ｐｒｉｓｍ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でデータを分析し、ＥＣ５０値を算出した。図３４Ａ〜３４Ｂに示すように、これらのＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体が、キイトルーダ（登録商標）及びオプジーボ（登録商標）と同等のＰＤ−１結合能力を示したことがＦＡＣＳ結合アッセイにより実証された。
【０６２１】
ＣＨＯ細胞上で発現されたヒトＰＤ−Ｌ１へのＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（ＢＣＰ−８３、ＢＣＰ−８４、及びＢＣＰ−８５）の結合は、同様に決定された。テセントリク（登録商標）は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体陽性対照として使用した。図３５Ａ〜３５Ｂに示すように、これらのＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体がテセントリク（登録商標）と同等のＰＤ−Ｌ１結合能力を示したことがＦＡＣＳ結合アッセイにより実証された。
【０６２２】
ＣＨＯ細胞上で発現されたＰＤ−１へのＢＡＢＰ：ＢＣＰ−２、ＢＣＰ−１６、ＢＣＰ−１７、ＢＣＰ−３１、ＢＣＰ−３２、ＢＣＰ−３３、ＢＣＰ−３４、ＢＣＰ−３５、ＢＣＰ−３６の結合親和性は、上述のように同様のＦＡＣＳに基づくアッセイを用いて決定した。ＢＡＢＰ試料は、ＦＡＣＳ分析のための一次抗体として調製した（１μＭで開始し、１０濃度による３倍段階希釈）。表１４に示すように、これらのＢＡＢＰがペムブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））及びニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））と同等のＰＤ−１結合親和性を保持したことがＦＡＣＳ結合アッセイにより実証された。
【０６２３】
ＣＨＯ細胞上で発現されたＣＴＬＡ−４へのＢＡＢＰ：ＢＣＰ−２、ＢＣＰ−１６、ＢＣＰ−１７、ＢＣＰ−３１、ＢＣＰ−３２、ＢＣＰ−３３、ＢＣＰ−３４、ＢＣＰ−３５、ＢＣＰ−３６の結合親和性は、同様に決定された。ＢＡＢＰ試料は、ＦＡＣＳ分析のための一次抗体として調製した（１μＭで開始し、１０濃度による３倍段階希釈）。Ａ３４３１１  ＨＣＡｂ及びイピリムマブ（例えば、ヤーボイ（登録商標））は、抗ＣＴＬＡ−４抗体陽性対照として使用した。表１４に示すように、これらのＢＡＢＰが、Ｆｃに融合したそれらの対応するｓｄＡｂと同等のＣＴＬＡ−４に対する結合親和性を示したことがＦＡＣＳ結合アッセイにより実証された（Ａ３４３１１  ＨＣＡｂのデータを参照されたい）。また、これらのＢＡＢＰは、イピリムマブ（例えば、ヤーボイ（登録商標））と同等のＣＴＬＡ−４に対する結合親和性を示した。
【０６２４】
ＦＡＣＳ分析によるリガンド結合の阻害
ＢＡＢＰによるリガンド結合の阻害は、ＦＡＣＳアッセイを用いて評価した。
【０６２５】
ＢＡＢＰ：ＢＣＰ−７３、ＢＣＰ−７４、ＢＣＰ−７５、ＢＣＰ−７８、ＢＣＰ−７９、ＢＣＰ−８０、ＢＣＰ−２、ＢＣＰ−１６、ＢＣＰ−１７、ＢＣＰ−３１、ＢＣＰ−３２、ＢＣＰ−３３、ＢＣＰ−３４、ＢＣＰ−３５、及びＢＣＰ−３６によるＰＤ−１の阻害を評価するため、ＢＡＢＰ試料を調製した（１μＭで開始し、１０濃度による３倍段階希釈）。ヒトＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞を接着培養フラスコから解離して、種々の濃度の各ＢＡＢＰ及びビオチン標識を有する０．５μＭのｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質と混合した。ペンブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））またはニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））は、抗ＰＤ−１抗体陽性対照として使用した。混合物を室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。ＰＥ／Ｃｙ５ストレプトアビジン二次抗体を混合物に添加した後、室温で１５分間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再び洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。非線形回帰を用いて、Ｐｒｉｓｍ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でデータを分析し、ＩＣ５０値を算出した（表１４、図２０Ａ〜２０Ｊ）。低濃度（１〜１０μｇ／ｍｌ）でＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を効果的に阻害するＢＡＢＰの能力が競合アッセイにより実証された。表１４及び図２０Ｊの結合データは、例示のＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰの機能的活性がペムブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））及びニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））に非常に類似していることを示す。
【０６２６】
ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰ：ＢＣＰ−７３、ＢＣＰ−７４、ＢＣＰ−７５、ＢＣＰ−７８、ＢＣＰ−７９、ＢＣＰ−８０、ＢＣＰ−２、ＢＣＰ−１６、ＢＣＰ−１７、ＢＣＰ−３１、ＢＣＰ−３２、ＢＣＰ−３３、ＢＣＰ−３４、ＢＣＰ−３５、ＢＣＰ−３６、及びＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰ：ＢＣＰ−８３、ＢＣＰ−８４、ＢＣＰ−８５によるＢ７−１（ＣＴＬＡ−４リガンド）の阻害を評価するため、ＢＡＢＰ試料を調製した（１μＭで開始し、１０濃度による３倍段階希釈）。ヒトＢ７−１を発現するＣＨＯ細胞を接着培養フラスコから解離して、種々の濃度の各ＢＡＢＰ及びビオチン標識を有する０．５μＭのｈＣＴＬＡ−４−Ｆｃ融合タンパク質と混合した。Ａ３４３１１  ＨＣＡｂ及びイピリムマブ（例えば、ヤーボイ（登録商標））は、抗ＣＴＬＡ−４抗体陽性対照として使用した。混合物を室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。ＰＥ／Ｃｙ５ストレプトアビジン二次抗体を混合物に添加した後、室温で１５分間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再び洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。非線形回帰を用いて、Ｐｒｉｓｍ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でデータを分析し、ＩＣ５０値を算出した（表１４、図１９Ａ〜１９Ｌ）。低濃度（１〜１０μｇ／ｍｌ）でＣＴＬＡ４−Ｂ７−１相互作用を効果的に阻害するＢＡＢＰの能力が競合アッセイにより実証された。表１４及び図１９Ｌの結合データは、例示のＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰの機能的活性がＦｃに融合したそれらの対応する抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（Ａ３４３１１  ＨＣＡｂのデータを参照されたい）及びイピリムマブ（例えば、ヤーボイ（登録商標））に非常に類似していることを示した。
【０６２７】
ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰ：ＢＣＰ−８３、ＢＣＰ−８４、ＢＣＰ−８５によるＰＤ−Ｌ１の阻害を評価するため、ヒトＰＤ−Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞を接着培養フラスコから解離して、種々の濃度の各ＢＡＢＰ（１μＭで開始し、１０濃度による３倍段階希釈）及びビオチン標識を有する０．１μＭのｈＰＤ−１−Ｆｃ融合タンパク質と混合した。アテゾリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））は、抗ＰＤ−Ｌ１の陽性抗体対照として使用した。ヒトＩｇＧは、陰性対照として使用した。ペンブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））は、抗ＰＤ−１抗体の対照として使用した。これは、ｈＰＤ−１−Ｆｃ融合タンパク質に結合し、ＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１相互作用を遮断する。混合物を室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。ＰＥ／Ｃｙ５ストレプトアビジン二次抗体を混合物に添加した後、室温で１５分間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再び洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。非線形回帰を用いて、Ｐｒｉｓｍ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でデータを分析し、ＩＣ５０値を算出し、図２１Ａ〜２１Ｇに示した。アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録商標））及びペムブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））と同様にＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を効果的に阻害するこれらのＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰの能力が競合アッセイにより実証された。
【０６２８】
ＢＡＢＰの発現プロファイル及び二重結合特性は、４鎖抗体のＶＨ及びＶＬ（ＢＣＰ−３４の２鎖）の正しい対合により形成された抗原結合部位がもたらす第１の特異性、ならびにＶＨＨがもたらす第２の特異性を有するＢＡＢＰの二重特異性により明確に実証された。
【０６２９】
インビトロ機能的アッセイ
ＢＡＢＰ  ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１によるＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４経路の遮断、またはＢＡＢＰ  ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１によるＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４経路の遮断は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＴＬＡ−４経路中のシグナリング分子によって駆動されるレポーター遺伝子のＴ細胞増殖、ＩＦＮ−γ放出、ＩＬ−２分泌または発現をモニターする種々のバイオアッセイを用いて研究することができる。
【０６３０】
例えば、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体によるＰＤ−１阻害は、ＰＤ−Ｌ１及び活性化Ｔ細胞を発現する（表面上でＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４を発現する）標的細胞を含む混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＩＬ−２分泌レベルを決定することによって研究することができ、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体は、種々の濃度で提供される。
【０６３１】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及び同種異系単球は、単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＰＢＭＣから精製した。単球を樹状細胞中に誘導した。各ウェルは、１０５個のＣＤ４＋Ｔ細胞及び１０４個の同種異系樹状細胞を含み、２００μｌの最終作用体積であった。ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰ（ＢＣＰ−７３、ＢＣＰ−７４、ＢＣＰ−７５、ＢＣＰ−７８、ＢＣＰ−７９、ＢＣＰ−８０）またはＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰ（ＢＣＰ−８３、ＢＣＰ−８４、ＢＣＰ−８５）を異なる濃度で各ウェルに添加した。抗体は、バックグラウンド対照として使用しなかった。ヒトＩｇＧ４は、陰性対照として使用した。ヤーボイ（登録商標）は、陽性抗ＣＴＬＡ−４抗体対照として使用した。３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターで７２時間インキュベーションした後、１００μｌ培地を各試験ウェルから採取し、ＩＬ−２分泌測定をした（Ｃｉｓｂｉｏ）。ＭＬＲ中のＩＬ−２の抗体濃度依存的分泌を使用して、ＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰまたはＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰの抗ＣＴＬＡ−４活性（図２９Ｂ）のＥＣ５０値を抽出し、ヤーボイ（登録商標）のＥＣ５０値と比較した。ＦＡＣＳに基づくリガンド競合アッセイ結果と一致して（図１９Ｌを参照されたい）、ＣＴＬＡ−４に結合するＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰまたはＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰの機能的活性は、それらのモノクローナル抗体に匹敵した（図２９Ａ〜２９Ｂ）。
【０６３２】
ＰＤ−１／ＮＦＡＴレポータージャーカットＴ細胞（ヒトＰＤ−１の構成的発現によるＮＦＡＴ応答要素の制御下でホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現する組み換えＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞）を用いた、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１細胞に基づくアッセイにおけるＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰの生物学的活性の特徴付けを図３０Ａ〜３０Ｂに示す。この場合、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ヒトＰＤ−Ｌ１及び操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化因子で安定して発現された。エフェクター細胞ＰＤ−１／ＮＦＡＴレポータージャーカットＴ細胞を、操作ＣＨＯ−Ｋ１細胞と共培養する前にＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰの段階希釈で３０分間プレインキュベートした；または操作ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、エフェクター細胞ＰＤ−１／ＮＦＡＴレポータージャーカットＴ細胞と共培養する前にＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰの段階希釈で３０分間プレインキュベートした。約６時間の刺激後、ＯＮＥ−ＳＴＥＰ（商標）ルシフェラーゼ試薬を細胞に添加し、ＮＦＡＴ活性を測定した。非線形回帰を用いて、Ｐｒｉｓｍ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でデータを分析し、ＥＣ５０値を算出した（図３０Ｂ）。それらの単一特異性の親抗体キイトルーダ（登録商標）またはオプジーボ（登録商標）と同様にＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナリングを効果的に遮断し、ＮＦＡＴシグナル活性化を可能にする全てのＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１  ＢＡＢＰ（ＢＣＰ−７３、ＢＣＰ−７４、ＢＣＰ−７５、ＢＣＰ−７８、ＢＣＰ−７９、ＢＣＰ−８０）の能力；それらの単一特異性の親抗体と同様にＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナリングを効果的に遮断し、ＮＦＡＴシグナルを活性化させる全てのＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１  ＢＡＢＰ（ＢＣＰ−８３、ＢＣＰ−８４、ＢＣＰ−８５）の能力がレポーターアッセイにより実証された。
【０６３３】
実施例９：二重特異性抗体のインビボ有効性研究
ＰＤ−１に対する例示のＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体の腫瘍増殖に対する効果を、抗ＰＤ−１抗体（社内生成したオプジーボバイオシミラー及びキイトルーダバイオシミラー４鎖抗体）のものと比較した。６〜８週齢のヒトＰＤ−１  ＫＩ（ノックイン）雌のＣ５７／ＢＬ６マウスの低背部を剃毛し、７５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）培地密度マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の５０μＬ懸濁液中の１×１０６個の大腸癌細胞株ＭＣ３８を皮下注射した。腫瘍が目視検査によって７日以内に生着しなかったマウスは、さらなる研究から除外した。ＭＣ３８移植後の７日目に開始して、腫瘍を毎日測定した。マウスを治療コホートに個別に分類し、全ての場合において移植の約１０日後に腫瘍が閾値の１５０ｍｍ３に到達した場合にのみ治療を受け始めた。デジタルノギス測定及び体重測定は、治療の期間中３日ごとに行った（図３７Ａ〜３７Ｂ）。実験では、マウスには、１０ｍｇ／ｋｇのキイトルーダバイオシミラー抗体（ペムブロリズマブ）もしくはオプジーボバイオシミラー抗体（ニボルマブ）、または１２．３ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体（ＢＣＰ−７５、ＢＣＰ−７９、及びＢＣＰ−８０）で１６日間静脈内治療を与えた。治療は、４日ごとに実施した。マウスには、陰性対照として機能したＰＢＳを注入した。図３７Ａから分かるように、全ての二重特異性抗体は、ＭＣ３８同系マウスモデル中の腫瘍増殖を効果的に制御し、キイトルーダバイオシミラー及びオプジーボバイオシミラーと同等の機能的活性を有した。全ての治療は、モック対照と比較して、ＭＣ３８移植したマウスの体重に影響を与えなかった（図３７Ｂ）。
【０６３４】
ＣＴＬＡ−４に対する例示のＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体の腫瘍増殖に対する効果を、抗ＣＴＬＡ−４抗体（ヤーボイバイオシミラー）のものと比較した。６〜８週齢のヒトＣＴＬＡ−４  ＫＩ（ノックイン）雌のＣ５７／ＢＬ６マウスの低背部を剃毛し、７５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）培地密度マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の５０μＬ懸濁液中の１×１０６個の大腸癌細胞株ＭＣ３８を皮下注射した。腫瘍が目視検査によって７日以内に生着しなかったマウスは、さらなる研究から除外した。ＭＣ３８移植後の７日目に開始して、腫瘍を毎日測定した。マウスを治療コホートに個別に分類し、全ての場合において移植の約１０日後に腫瘍が閾値の１５０ｍｍ３に到達した場合にのみ治療を受け始めた。デジタルノギス測定及び体重測定は、治療の期間中３日ごとに行った（図３８Ａ〜３８Ｂ）。実験では、マウスには、１０ｍｇ／ｋｇのヤーボイバイオシミラー抗体、１２．３ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体（ＢＣＰ−７５、ＢＣＰ−７９、またはＢＣＰ−８０）、または６．７ｍｇ／ｋｇのそれらの対応する抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ（ＡＳ０７０１４ＶＨ１１  ＨＣＡｂまたはＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１  ＨＣＡｂ）で１６日間腹腔内（ｉ．ｐ．）治療を与えた。マウスには、モック対照として機能したＰＢＳを注入した。治療は、４日ごとに実施した。図３８Ａから分かるように、全てのＣＴＬＡ−４×ＰＤ−１二重特異性抗体は、ＭＣ３８同系マウスモデル中の腫瘍増殖を効果的に制御し、ヤーボイバイオシミラーと同等の機能的活性を有した。全ての治療は、モック対照と比較して、ＭＣ３８移植したマウスの体重に影響を与えなかった（図３８Ｂ）。
【０６３５】
ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−Ｌ１に対する例示のＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（ＢＣＰ−８４、ＢＣＰ−８５）の腫瘍増殖に対する効果は、ＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ／６  ＣＴＬＡ−４  ＫＩマウスに移植することで調製したマウス異種移植モデル上で試験した。ヒトＰＤ−Ｌ１を安定して発現するネズミ結腸腺癌細胞細胞株ＭＣ３８をこのアッセイで使用した。８週齢のＣ５７ＢＬ／６  ＣＴＬＡ−４  ＫＩマウスの低背部を剃毛し、１×１０７個のＭＣ３８−ｈＰＤ−Ｌ１  ＫＩ細胞を皮下注射した。腫瘍が目視検査によって７日以内に生着しなかったマウスは、さらなる研究から除外した。ＭＣ３８移植後の７日目に開始して、腫瘍を毎日測定した。腫瘍サイズは、キャリパーで測定し、腫瘍体積を修正楕円式：長さ×（幅）２／２で算出した。腫瘍がおおよそ９０〜１３０ｍｍ３の体積に到達した場合、マウスを異なる治療群に無作為に割り当て、２週間または６週間維持した。デジタルノギス測定及び体重測定は、治療の期間中３日ごとに行った（図３９Ａ〜３９Ｂ）。マウスには、３ｍｇ／ｋｇの社内発現されたテセントリクバイオシミラー抗体、同等量（３．７ｍｇ／ｋｇ）のＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（ＢＣＰ−８４またはＢＣＰ−８５）、同等量（１．６ｍｇ／ｋｇ）の対応する抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ（ＡＳ０７０１４ＶＨ１１  ＨＣＡｂまたはＡＳ０７１８９ＶＨ１１  ＨＣＡｂ）、または併用療法（テセントリクバイオシミラー＋ＡＳ０７０１４ＶＨ１１  ＨＣＡｂ、またはテセントリクバイオシミラー＋ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１  ＨＣＡｂ）で１６日間、腹腔内（ｉ．ｐ．）治療を与えた。マウスには、陰性対照として機能したＰＢＳを注入した。治療は、４日ごとに実施した。図３９Ａから分かるように、マウス腫瘍モデルにおけるいずれの単剤療法（対応する抗ＣＴＬＡ−４  ＨＣＡｂ、またはテセントリクバイオシミラー）を上回るより高い腫瘍阻害有効性が全てのＣＴＬＡ−４×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体群及び併用療法群により実証された（図３９Ａ）。特に、ＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５の抗腫瘍効果は、併用療法に匹敵した。全ての治療は、モック対照と比較して、ＭＣ３８移植したマウスの体重に影響を与えなかった（図３９Ｂ）。
配列表
配列番号９７（Ａ３４３１０  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＡＴＴＡＴＧＣＣＡＴＡＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＴＧＡＧＧＧＧＧＴＣＴＣＡＴＧＴＡＴＴＡＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＧＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＴＣＧＴＣＧＣＴＣＴＴＡＡＧＴＧＴＧＧＡＧＡＧＧＴＴＣＣＣＴＧＧＡＧＧＴＣＡＴＴＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＴＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＡＣＣＧＴＣＡＣＧＧＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号９８（Ａ３４３１１  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＧＣＴＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＣＴＣＴＧＧＴＣＧＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＡＣＧＡＴＴＡＣＴＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＴＣＡＧＴＴＴＧＴＡＧＣＧＴＣＴＣＡＴＡＧＴＴＧＧＡＣＴＧＡＴＡＡＴＡＡＣＣＣＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＴＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＧＧＧＡＡＣＡＧＧＧＴＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＣＡＴＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＡＧＣＡＡＣＣＧＣＴＡＧＡＡＧＡＴＣＡＴＴＣＧＴＧＧＧＴＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＡＣＡＣＴＧＡＡＧＣＡＣＧＣＣＡＧＴＡＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号９９（Ａ３４３１３  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧＴＡＣＧＣＡＣＣＣＣＣＣＴＣＡＧＴＡＡＣＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＧＴＧＡＧＴＴＴＧＴＡＧＣＡＧＣＡＡＴＴＡＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＡＣＡＴＣＧＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＣＴＣＧＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＴＣＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＴＡＧＣＧＧＧＧＡＴＧＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＴＣＴＴＴＡＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＡＧＴＡＴＡＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号１００（Ａ３４６２５  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＡＧＣＡＴＣＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＧＴＴＧＧＴＣＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＣＴＡＧＴＴＣＴＧＧＴＡＧＣＡＣＡＡＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＡＡＡＣＣＣＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＧＡＴＡＣＣＴＡＡＧＴＧＴＧＣＴＴＡＧＴＧＣＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号１０１（Ａ３６５６６  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＴＧＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＣＧＣＴＣＧＴＴＣＧＡＧＡＡＣＴＡＴＧＣＣＡＴＡＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＡＧＣＧＴＧＡＧＴＴＴＧＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＴＴＣＧＴＧＧＡＴＴＣＣＴＣＧＴＡＣＣＧＣＡＴＡＣＴＣＴＡＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＡＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＣＧＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＡＣＣＧＴＴＧＧＣＧＴＴＧＧＡＣＴＣＣＣＡＣＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号１０２（Ａ３６９２２  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＧＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＴＣＧＣＣＴＣＡＧＴＡＧＧＡＣＧＴＴＴＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＣＧＣＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＡＣＡＡＧＴＧＧＴＡＧＣＡＣＧＡＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＣＧＧＴＧＡＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＧＴＴＴＴＣＴＴＡＧＣＧＣＡＡＧＴＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＣＧ
配列番号１０３（Ａ３７０６７  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＧＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＧＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＣＡＡＣＧＣＣＡＴＧＧＣＡＴＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＧＧＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＴＣＧＣＡＡＧＴＡＴＴＡＣＴＡＧＧＧＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＣＴＡＴＡＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＧＡＧＣＧＧＴＴＴＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＡＴＴＡＴＧＧＴＴＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＴＣＧ
配列番号１０４（ＡＳ０７０１４  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＧＴＡＧＡＣＡＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＣＧＧＴＣＧＣＧＡＣＴＡＴＴＧＡＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＡＧＣＡＣＡＡＧＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＣＴＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＡＣＣＣＧＣＧＡＴＡＴＴＧＴＡＧＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＡＡＣＡＣＴＣＧＧＧＧＣＧＣＣＧＡＡＣＡＣＴＡＣＴＴＴＧＧＴＴＡＣＴＧＧＧＣＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号１０５（ＡＳ０７１７２  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＡＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＡＡＧＡＣＴＴＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＡＣＧＡＴＴＴＧＡＧＴＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣＧＡＡＧＡＧＧＴＣＧＣＡＡＣＴＡＴＴＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＴＴＡＡＧＡＣＡＡＡＴＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＧＡＧＡＡＴＡＧＴＣＴＡＣＧＣＧＴＡＡＡＴＴＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＧＧＣＡＧＡＴＴＧＧＡＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＧＧＡＴＴＡＧＣＧＧＡＣＴＴＴＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号１０６（ＡＳ０７１８９  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＴＣＣＴＡＧＴＧＴＧＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＧＧＧＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＧＣＡＧＣＧＣＧＡＧＧＡＧＧＴＣＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＡＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＧＴＴＴＴＡＣＡＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＣＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＴＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＡＡＡＡＴＧＧＧＧＧＡＣＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号１０７（ＡＳ０７３９２  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＴＴＡＴＡＧＴＧＴＧＡＡＧＴＡＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＧＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＣＣＡＧＣＧＣＧＡＧＧＡＧＧＴＣＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＡＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＧＴＴＴＴＡＣＡＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＴＣＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＴＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＣＡＡＡＴＧＧＧＧＧＡＣＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号１０８（ＡＳ０７６７８  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＧＴＡＧＧＴＡＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＣＧＧＴＣＧＣＡＡＣＴＡＴＴＧＡＴＡＴＴＧＡＴＧＧＴＡＧＣＡＣＡＡＧＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＴＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＣＴＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＧＣＣＧＡＡＣＣＣＧＣＧＡＴＡＴＴＧＴＡＧＴＧＧＣＧＣＡＧＴＣＴＡＣＡＣＴＣＧＧＧＧＣＧＣＣＧＡＡＣＡＣＴＡＣＴＴＴＧＧＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号１０９（ＡＳ０７６８８  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＴＴＡＴＡＧＴＧＴＧＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＧＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＧＣＡＧＣＧＣＧＡＧＧＡＧＧＴＣＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＡＴＧＣＣＡＣＧＧＧＴＧＧＣＡＣＧＴＴＴＴＡＣＡＧＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧ  ＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＣＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＴＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＣＡＡＡＴＧＧＧＧＧＡＣＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号１１０（ＡＳ０７７１２  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＣＡＴＡＣＡＣＣＧＡＣＡＧＡＣＧＣＴＡＣＴＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＧＴＣＧＣＡＡＣＴＡＴＧＧＡＴＡＣＴＧＡＴＧＧＴＡＧＴＡＣＡＡＧＧＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＴＧＧＧＧＣＣＧＡＡＣＣＣＧＣＧＡＴＡＴＴＧＴＡＧＴＧＧＣＧＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＣＧＧＧＧＣＧＣＣＧＡＡＣＡＣＴＡＣＴＴＴＧＧＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号１１１（ＡＳ０７７４５  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＡＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＡＴＴＴＡＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＡＧＴＡＡＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡ  ＣＧＧＣＣＣＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＣＣＣＣＡＡＧＧＧＧＴＧＣＴＣＡＣＧＧＡＣＣＴＡＣＡＴＡＴＴＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＴＡＣＴＡＣＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号１１２（ＡＳ０７８３２  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＡＣＴＡＣＡＡＴＡＧＧＴＡＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＣＧＧＴＣＧＣＡＡＣＴＡＴＴＧＡＴＡＣＧＧＡＴＧＧＴＡＧＣＡＣＡＡＧＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＣＴＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＧＣＣＧＡＡＣＣＣＧＣＧＡＴＡＴＴＧＴＡＧＴＧＧＣＧＣＧＧＴＣＡＡＣＡＣＴＣＧＧＧＧＣＧＣＣＧＡＡＣＡＣＴＡＣＴＴＴＧＧＴＴＡＣＴＧＧＧＣＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
【化１】
2019533719.tif 000016
【化２】
2019533719.tif 000017
配列番号１３０（Ａ３４３１１  ＨＣＡｂ単量体型アミノ酸配列）
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＬＰＧＥＳＬＲＬＳＣＥＡＳＧＲＴＩＴＴＩＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＱＦＶＡＳＨＳＷＴＤＮＮＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＩＩＳＲＤＮＡＧＮＲＶＹＬＱＭＨＳＬＥＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＡＲＲＳＦＶＧＲＱＷＹＴＥＡＲＱＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＷＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＷＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１３１（Ａ３４３１１  ＨＣＡｂ二量体型アミノ酸配列）
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＬＰＧＥＳＬＲＬＳＣＥＡＳＧＲＴＩＴＴＩＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＱＦＶＡＳＨＳＷＴＤＮＮＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＩＩＳＲＤＮＡＧＮＲＶＹＬＱＭＨＳＬＥＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＡＲＲＳＦＶＧＲＱＷＹＴＥＡＲＱＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＷＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１３２（ＡＳ０２６４０  ＨＣＡｂ単量体型アミノ酸配列）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＩＴＴＩＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＡＳＨＳＷＴＤＮＮＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＩＩＳＲＤＮＳＫＮＲＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＡＲＲＳＦＶＧＲＱＷＹＴＥＡＲＱＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＷＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１３３（ＡＳ０２６４０  ＨＣＡｂ二量体型アミノ酸配列）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＩＴＴＩＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＡＳＨＳＷＴＤＮＮＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＩＩＳＲＤＮＳＫＮＲＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＡＲＲＳＦＶＧＲＱＷＹＴＥＡＲＱＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＷＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
表４．抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１二重特異性抗体配列
【表４−１】
2019533719.tif 000018
【表４−２】
2019533719.tif 000019
【表４−３】
2019533719.tif 000020
【表４−４】
2019533719.tif 000021
【表４−５】
2019533719.tif 000022
【表４−６】
2019533719.tif 000023
配列番号１５８（キイトルーダ（登録商標）重鎖アミノ酸配列）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＶＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＹＭＹＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＳＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮＲＶＴＬＴＴＤＳＳＴＴＴＡＹＭＥＬＫＳＬＱＦＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＷＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＷＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＷＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号１６０（オプジーボ（登録商標）重鎖アミノ酸配列）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＤＣＫＡＳＧＩＴＦＳＮＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＫＲＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＮＤＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＷＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＷＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号１６２（リンカーペプチド（９ＧＳ）アミノ酸配列）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ
配列番号１６３（ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）ヒンジアミノ酸配列）
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ
表５．抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体配列
【表５−１】
2019533719.tif 000024
【表５−２】
2019533719.tif 000025
【表５−３】
2019533719.tif 000026
【表５−４】
2019533719.tif 000027
【表５−５】
2019533719.tif 000028
【表５−６】
2019533719.tif 000029
配列番号１９５（テセントリク（登録商標）重鎖アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＷＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＷＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＷＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１９７（デュルバルマブ重鎖アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮＩＫＱＤＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＧＷＦＧＥＬＡＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＷＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＷＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＷＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１９９（ｈＣＴＬＡ−４完全長アミノ酸配列、シグナルペプチドを有さない）
ＡＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＦＬＬＷＩＬＡＡＶＳＳＧＬＦＦＹＳＦＬＬＴＡＶＳＬＳＫＭＬＫＫＲＳＰＬＴＴＧＶＹＶＫＭＰＰＴＥＰＥＣＥＫＱＦＱＰＹＦＩＰＩＮ
配列番号１６４（ｈＣＴＬＡ−４細胞外ドメインアミノ酸配列）
ＡＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤ
配列番号２００（Ａ３４３１１直接グラフトアミノ酸配列）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＩＴＴＩＴＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＳＨＳＷＴＤＮＮＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＴＡＲＲＳＦＶＧＲＱＷＹＴＥＡＲＱＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２０１（ＡＳ０２６３６ヒト化ｓｄＡｂアミノ酸配列）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＩＴＴＩＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＱＦＶＡＳＨＳＷＴＤＮＮＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＩＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＡＲＲＳＦＶＧＲＱＷＹＴＥＡＲＱＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２０２（ＡＳ０２６２６ヒト化ｓｄＡｂアミノ酸配列、コンセンサスアミノ酸配列）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＩＴＴＩＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＡＳＨＳＷＴＤＮＮＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＩＩＳＲＤＮＳＫＮＲＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＡＲＲＳＦＶＧＲＱＷＹＴＥＡＲＱＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号２６４（ＡＳ０２６４０  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＧＣＡＡＣＣＧＧＧＴＣＧＴＡＧＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＣＧＴＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＧＧＴＴＣＣＧＴＣＡＧＧＣＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＧＧＴＣＴＴＧＡＡＴＴＴＧＴＧＧＣＧＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＧＡＣＡＡＣＡＡＣＣＣＧＴＡＣＴＡＴＧＣＧＧＡＴＡＧＣＧＴＴＡＡＧＧＧＣＣＧＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＡＧＣＣＧＴＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＣＧＴＣＧＴＡＧＣＴＴＴＧＴＴＧＧＴＣＧＴＣＡＡＴＧＧＴＡＣＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＴＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ
配列番号２６５（Ａ３４３１１ＶＨ１１  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＣＣＴＧＴＧＣＣＧＣＡＴＣＴＧＧＧＡＧＡＡＣＴＡＴＴＡＣＣＡＣＡＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＴＣＣＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＡＡＧＡＧＡＧＴＴＴＧＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＴＴＡＣＴＡＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＴＴＣＴＣＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴＡＣＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＡＣＴＧＣＧＡＣＣＣＧＡＡＧＡＴＡＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＡＧＣＴＡＣＣＧＣＴＣＧＡＣＧＧＡＧＣＴＴＣＧＴＣＧＧＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＡＣＡＣＣＧＡＡＧＣＡＡＧＡＣＡＧＴＡＴＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＴ
配列番号２６６（ＡＳ０７０１４ＶＨ１１  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＡＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＴＴＧＴＧＣＣＧＣＡＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＣＴＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴＧＣＣＴＧＧＧＡＴＧＧＴＴＣＣＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＧＡＧＡＧＧＣＣＧＴＧＴＣＴＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡＧＴＧＡＴＧＧＧＡＧＣＡＣＡＴＣＣＴＡＣＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＡＡＧＧＧＡＣＧＧＴＴＴＡＣＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＡＣＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＡＴＣＧＧＡＣＣＣＡＡＣＣＣＴＣＧＧＴＡＣＴＧＴＴＣＴＧＧＣＧＣＣＣＣＣＡＡＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＧＣＣＧＡＡＣＡＴＴＡＣＴＴＴＧＧＧＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ
配列番号２６７（ＡＳ０７０１４ＶＨ１１Ｇ５４  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＧＡＡＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＴＣＧＡＡＴＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＴＧＧＴＣＣＡＡＣＣＧＧＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＧＴＧＴＧＣＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＴＡＴＡＣＣＴＡＴＴＣＣＣＧＴＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧＧＴＴＧＧＴＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＡＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＡＧＴＡＣＣＡＴＴＧＡＴＴＣＣＧＧＣＧＧＴＡＧＣＡＣＧＴＣＴＴＡＴＧＣＧＧＡＣＴＣＡＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＧＣＧＣＧＡＴＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴＡＣＧＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＴＴＧＧＣＣＣＧＡＡＣＣＣＧＣＧＴＴＡＴＴＧＴＴＣＴＧＧＴＧＣＧＣＣＧＡＡＴＡＣＧＣＧＴＧＧＴＧＣＧＧＡＡＣＡＴＴＡＣＴＴＴＧＧＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＴＣＣＴＣＧ
配列番号２６８（ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＡ  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＧＡＡＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＴＣＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＣＣＧＧＧＣＧＧＣＴＣＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＧＴＧＴＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＣＴＡＴＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＧＴＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧＧＴＴＧＧＴＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＡＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＡＧＣＣＧＴＧＴＣＴＡＣＣＡＴＴＡＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＴＡＣＧＴＣＣＴＡＴＧＣＡＧＡＴＴＣＡＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＧＣＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴＡＣＧＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＴＡＴＴＧＧＣＣＣＧＡＡＴＣＣＧＣＧＴＴＡＴＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＣＧＣＣＧＧＣＣＡＣＧＣＧＣＧＧＣＧＣＡＧＡＡＣＡＣＴＡＴＴＴＣＧＧＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＣＡＣＧＣＴＧＧＴＴＡＣＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧ
配列番号２６９（ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＱ  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＧＡＡＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＴＣＧＡＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＣＣＧＧＧＣＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＡＴＣＧＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＡＴＡＧＣＣＧＴＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧＧＴＴＧＧＴＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＡＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＴＣＴＡＣＣＡＴＴＡＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＴＡＣＧＴＣＣＴＡＴＧＣＧＧＡＴＴＣＡＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＧＣＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴＡＣＧＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＴＴＧＧＣＣＣＧＡＡＴＣＣＧＣＧＴＴＡＴＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＣＧＣＣＧＣＡＡＡＣＧＣＧＴＧＧＴＧＣＧＧＡＡＣＡＴＴＡＣＴＴＴＧＧＴＴＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＧＴＴＡＣＧＧＴＴＴＣＧＴＣＧ
配列番号２７０（ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＳ  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＧＡＡＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＴＣＧＡＡＴＣＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＣＣＧＧＧＴＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＡＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＧＴＡＴＴＣＣＣＧＴＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧＧＴＴＧＧＴＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＡＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＡＧＣＡＣＣＡＴＴＡＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＴＡＣＧＴＣＣＴＡＴＧＣＧＧＡＴＡＧＣＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＣＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴＡＣＧＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＣＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＴＴＧＧＣＣＣＧＡＡＴＣＣＧＣＧＴＴＡＴＴＧＴＴＣＡＧＧＴＧＣＧＣＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＧＧＴＧＣＣＧＡＡＣＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＧＣＴＧＧＴＣＡＣＧＧＴＴＴＣＡＴＣＡ
配列番号２７１（ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＴＴＧＴＧＣＣＧＣＡＡＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＣＣＡＡＧＣＧＴＧＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＧＡＧＡＧＧＡＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣＡＴＣＴＡＣＣＣＴＡＣＣＧＧＣＧＧＧＡＣＡＴＴＣＴＡＴＡＣＴＧＡＣＴＣＴＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＴＡＣＣＡＴＴＡＧＴＡＧＡＧＡＴＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴＡＣＡＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＡＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＴＧＧＧＧＧＡＣＣＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＡＴＣＡ
配列番号２７２（ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１Ｆ２７  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＧＡＡＧＴＧＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＴＡＧＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＡＡＧＣＧＧＴＴＴＴＴＣＧＣＣＧＡＧＣＧＴＣＡＡＣＴＡＴＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＧＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＡＡＧＡＡＧＴＧＡＧＣＴＣＴＡＴＣＴＡＴＣＣＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＣＧＴＴＴＴＡＣＡＣＣＧＡＴＡＧＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＣＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＧＡＡＡＡＡＴＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＣＴＧＣＧＴＣＣＧＧＡＡＧＡＴＡＣＧＧＣＣＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＧＧＣＡＧＧＣＡＡＡＴＧＧＧＧＣＡＣＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＣＡＣＧＣＴＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＣＣ
配列番号２７３（ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１ＦＹ  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＴＴＧＴＧＣＣＧＣＡＴＣＴＧＧＧＴＴＴＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＧＡＧＡＧＧＡＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣＡＴＣＴＡＣＣＣＴＡＣＣＧＧＣＧＧＧＡＣＡＴＴＣＴＡＴＡＣＴＧＡＣＴＣＴＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＴＡＣＣＡＴＴＡＧＴＡＧＡＧＡＴＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴＡＣＡＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧＡＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＴＡＣＧＧＡＡＣＣＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣ
【化３】
2019533719.tif 000030
配列番号２８３（Ａ３４３１１ＶＨ１１  ＨＣＡｂ二量体型アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＩＴＴＩＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＡＳＨＳＷＴＤＮＮＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＡＲＲＳＦＶＧＲＱＷＹＴＥＡＲＱＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＷＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＷＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２８４（ＡＳ０７０１４ＶＨ１１  ＨＣＡｂ二量体型アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＹＳＲＨＣＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＡＶＳＴＩＤＳＤＧＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＧＰＮＰＲＹＣＳＧＡＰＮＴＲＧＡＥＨＹＦＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＷＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２８５（ＡＳ０７０１４ＶＨ１１Ｇ５４  ＨＣＡｂ二量体型アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＹＳＲＨＣＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＡＶＳＴＩＤＳＧＧＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＧＰＮＰＲＹＣＳＧＡＰＮＴＲＧＡＥＨＹＦＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＷＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２８６（ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＡ  ＨＣＡｂ二量体型アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＹＳＲＨＣＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＡＶＳＴＩＳＳＧＧＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＧＰＮＰＲＹＣＳＧＡＰＡＴＲＧＡＥＨＹＦＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２８７（ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＱ  ＨＣＡｂ二量体型アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＹＳＲＨＣＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＡＶＳＴＩＳＳＧＧＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＧＰＮＰＲＹＣＳＧＡＰＱＴＲＧＡＥＨＹＦＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２８８（ＡＳ０７０１４ＶＨ１１ＳＧＳ  ＨＣＡｂ二量体型アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＹＳＲＨＣＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＡＶＳＴＩＳＳＧＧＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＧＰＮＰＲＹＣＳＧＡＰＳＴＲＧＡＥＨＹＦＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＷＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＥＩＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＷＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２８９（ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１  ＨＣＡｂ二量体型アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＤＳＰＳＶＮＹＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＥＶＳＳＩＹＰＴＧＧＴＦＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＫＷＧＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＷＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２９０（ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１Ｆ２７  ＨＣＡｂ二量体型アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＰＳＶＮＹＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＥＶＳＳＩＹＰＴＧＧＴＦＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＫＷＧＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＷＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２９１（ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ１１ＦＹ  ＨＣＡｂ二量体型アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＰＳＶＮＹＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＥＶＳＳＩＹＰＴＧＧＴＦＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＫＹＧＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【表７−１】
2019533719.tif 000031
【表７−２】
2019533719.tif 000032
【表７−３】
2019533719.tif 000033
【表７−４】
2019533719.tif 000034
【表７−５】
2019533719.tif 000035
【表７−６】
2019533719.tif 000036
【表７−７】
2019533719.tif 000037
【表７−８】
2019533719.tif 000038
【表７−９】
2019533719.tif 000039
【表７−１０】
2019533719.tif 000040
【表８−１】
2019533719.tif 000041
【表８−２】
2019533719.tif 000042
【表８−３】
2019533719.tif 000043
配列番号３０７（変異ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）ヒンジアミノ酸配列）
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰ
配列番号３０８（ＰＤ１ＢＭｍｉｎ  重鎖アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＶＦＳＲＹＤＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＦＩＳＧＧＧＳＮＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＩＳＰＹＹＹＡＭＥＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＷＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【化４】
2019533719.tif 000044
表９．抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１二重特異性抗体配列
【表９−１】
2019533719.tif 000045
【表９−２】
2019533719.tif 000046
【表９−３】
2019533719.tif 000047
配列番号３６５（リンカーペプチドアミノ酸配列）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号３６６（ＡＳ０７０１４直接グラフトＨＣＡｂ二量体型アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＹＳＲＨＣＬＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＤＳＤＧＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＰＮＰＲＹＣＳＧＡＰＮＴＲＧＡＥＨＹＦＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＷＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３６７（ＡＳ０７１８９直接グラフトＨＣＡｂ二量体型アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＰＳＶＮＹＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＰＴＧＧＴＦＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＫＷＧＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３６８（ＡＳ０７１８９ＴＫＤＶＨ２１ＦＹ  ＨＣＡｂ二量体型アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＰＳＶＮＹＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＥＶＳＳＩＹＰＴＧＧＴＦＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＫＹＧＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３６９（Ａ３４３１１ＶＨ２  ＨＣＡｂ二量体型アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＩＴＴＩＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＡＳＨＳＷＴＤＮＮＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＡＲＲＳＦＶＧＲＱＷＹＴＥＡＲＱＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３７０（Ａ３４３１１ＶＨ２Ｆ５３  ＨＣＡｂ二量体型アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＩＴＴＩＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＡＳＨＳＦＴＤＮＮＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＡＲＲＳＦＶＧＲＱＷＹＴＥＡＲＱＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３７１（Ａ３４３１１ＶＨ１１Ｆ５３  ＨＣＡｂ二量体型アミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＩＴＴＩＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＡＳＨＳＦＴＤＮＮＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＡＲＲＳＦＶＧＲＱＷＹＴＥＡＲＱＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３７２（Ａ３４３１１コンセンサスアミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＩＴＴＩＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＡＳＨＳＷＴＤＮＮＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＡＲＲＳＦＶＧＲＱＷＹＴＥＡＲＱＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３７３（ＡＳ０７０１４コンセンサスアミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＹＳＲＨＣＬＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＡＶＳＴＩＤＳＧＧＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＩＧＰＮＰＲＹＣＳＧＡＰＮＴＲＧＡＥＨＹＦＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３７４（ＡＳ０７１８９コンセンサスアミノ酸配列）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＰＳＶＮＹＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＥＶＳＳＩＹＰＴＧＧＴＦＹＴＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＫＷＧＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３７５（リンカーアミノ酸配列、ｎは、少なくとも１の整数）
（Ｇ）ｎ
配列番号３７６（リンカーアミノ酸配列、ｎは、少なくとも１の整数）
（ＧＳ）ｎ
配列番号３７７（リンカーアミノ酸配列、ｎは、少なくとも１の整数）
（ＧＳＧＧＳ）ｎ
配列番号３７８（リンカーアミノ酸配列、ｎは、少なくとも１の整数）
（ＧＧＧＳ）ｎ
配列番号３７９（リンカーアミノ酸配列、ｎは、少なくとも１の整数）
（ＧＧＧＧＳ）ｎ
【図１】
2019533719.tif 000048
【図２】
2019533719.tif 000049
【図３】
2019533719.tif 000050
【図４】
2019533719.tif 000051
【図５−１】
2019533719.tif 000052
【図５−２】
2019533719.tif 000053
【図５−３】
2019533719.tif 000054
【図６】
2019533719.tif 000055
【図７】
2019533719.tif 000056
【図８】
2019533719.tif 000057
【図９】
2019533719.tif 000058
【図１０】
2019533719.tif 000059
【図１１】
2019533719.tif 000060
【図１２−１】
2019533719.tif 000061
【図１２−２】
2019533719.tif 000062
【図１３−１】
2019533719.tif 000063
【図１３−２】
2019533719.tif 000064
【図１３−３】
2019533719.tif 000065
【図１４】
2019533719.tif 000066
【図１５】
2019533719.tif 000067
【図１６−１】
2019533719.tif 000068
【図１６−２】
2019533719.tif 000069
【図１６−３】
2019533719.tif 000070
【図１７−１】
2019533719.tif 000071
【図１７−２】
2019533719.tif 000072
【図１８】
2019533719.tif 000073
【図１９】
2019533719.tif 000074
【図２０】
2019533719.tif 000075
【図２１】
2019533719.tif 000076
【図２２】
2019533719.tif 000077
【図２３Ａ】
2019533719.tif 000078
【図２３Ｂ】
2019533719.tif 000079
【図２４Ａ】
2019533719.tif 000080
【図２４Ｂ】
2019533719.tif 000081
【図２５】
2019533719.tif 000082
【図２６】
2019533719.tif 000083
【図２７】
2019533719.tif 000084
【図２８Ａ】
2019533719.tif 000085
【図２８Ｂ】
2019533719.tif 000086
【図２９】
2019533719.tif 000087
【図３０】
2019533719.tif 000088
【図３１Ａ】
2019533719.tif 000089
【図３１Ｂ】
2019533719.tif 000090
【図３１Ｃ】
2019533719.tif 000091
【図３２Ａ】
2019533719.tif 000092
【図３２Ｂ】
2019533719.tif 000093
【図３３】
2019533719.tif 000094
【図３４】
2019533719.tif 000095
【図３５】
2019533719.tif 000096
【図３６】
2019533719.tif 000097
【図３７Ａ】
2019533719.tif 000098
【図３７Ｂ】
2019533719.tif 000099
【図３８Ａ】
2019533719.tif 000100
【図３８Ｂ】
2019533719.tif 000101
【図３９Ａ】
2019533719.tif 000102
【図３９Ｂ】
2019533719.tif 000103
【図４０】
2019533719.tif 000104
【図４１】
2019533719.tif 000105
【図４２】
2019533719.tif 000106
【図４３】
2019533719.tif 000107
【図４４】
2019533719.tif 000108
【図４５】
2019533719.tif 000109
【図４６】
2019533719.tif 000110
【図４７】
2019533719.tif 000111
【図４８】
2019533719.tif 000112
【図４９】
2019533719.tif 000113
【配列表】
2019533719000001.app
【国際調査報告】
2019533719.tif 000114
2019533719.tif 000115
2019533719.tif 000116
2019533719.tif 000117
2019533719.tif 000118