(57)【要約】  本発明は、ネオアガロオリゴ糖混合物を有効成分として含む新規用途の組成物を提供する。本発明による組成物の有効成分であるネオアガロオリゴ糖混合物などは、破骨細胞の誘導因子であるＲＡＮＫＬの発現を減少させ、単核細胞の破骨細胞への分化を効果的に抑制することができる。従って、本発明による組成物は、関節炎（特に、関節リウマチ）または骨粗しょう症を予防、改善または治療するための薬品または機能性食品として使用することができる。
2019533720.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネオアガロオリゴ糖混合物を有効成分として含む組成物であって、
前記ネオアガロオリゴ糖混合物は、ネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）を含み、
単核細胞の破骨細胞への分化によって発生するか進行される関節炎または骨粗しょう症を予防または治療するための用途の薬学組成物。
【請求項２】
前記ネオアガロオリゴ糖混合物は、ネオアガロオリゴ糖混合物の総重量を基準としてネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）１〜１０重量％、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）５５〜７５重量％、及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）２０〜４０重量％を含むことを特徴とする請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項３】
寒天（Ａｇａｒ）またはアガロース（Ａｇａｒｏｓｅ）から選択される基質とストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のベータ−アガラーゼであるＤａｇＡとの酵素反応産物またはその精製物を有効成分として含む組成物であって、
前記酵素反応産物またはその精製物は、
ネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）を含み、
単核細胞の破骨細胞への分化によって発生するか進行される関節炎または骨粗しょう症を予防または治療するための用途の薬学組成物。
【請求項４】
前記酵素反応産物またはその精製物は、
ネオアガロオリゴ糖総重量を基準としてネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）１〜１０重量％、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）５５〜７５重量％、及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）２０〜４０重量％を含むことを特徴とする請求項３に記載の薬学組成物。
【請求項５】
ネオアガロオリゴ糖混合物を有効成分として含む組成物であって、
前記ネオアガロオリゴ糖混合物は、ネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）を含み、
単核細胞の破骨細胞への分化によって発生するか進行される関節炎または骨粗しょう症を予防または改善するための用途の食品組成物。
【請求項６】
前記ネオアガロオリゴ糖混合物は、
ネオアガロオリゴ糖混合物の総重量を基準としてネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）１〜１０重量％、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）５５〜７５重量％、及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）２０〜４０重量％を含むことを特徴とする請求項５に記載の食品組成物。
【請求項７】
寒天（Ａｇａｒ）またはアガロース（Ａｇａｒｏｓｅ）から選択される基質とストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のベータ−アガラーゼであるＤａｇＡとの酵素反応産物またはその精製物を有効成分として含む組成物であって、
前記酵素反応産物またはその精製物は、
ネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）を含み、
単核細胞の破骨細胞への分化によって発生するか進行される関節炎または骨粗しょう症を予防または改善するための用途の食品組成物。
【請求項８】
前記酵素反応産物またはその精製物は、
ネオアガロオリゴ糖総重量を基準としてネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）１〜１０重量％、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）５５〜７５重量％、及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）２０〜４０重量％を含むことを特徴とする請求項７に記載の食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節炎または骨粗しょう症の予防、改善または治療用組成物に関し、本発明の関節炎または骨粗しょう症の予防、改善または治療用組成物は、単核細胞の破骨細胞への分化を効果的に抑制することを特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
寒天（Ａｇａｒ）は、従来から食品添加物、医薬品、化粧品、家畜飼料及び工業原料などとして広く利用されている代表的な海藻類由来の多糖類であり、韓国では、毎年その生産量が約２０００〜５０００トンにいたる比較的豊富な水産資源の一つである。しかし、実際の利用面では、全体生産量の一部だけが単純加工処理されて安価な原料として使用されるだけであり、その残りは、大部分放置されており、賦存資源量に比べて付加価値が非常に低い実情である。従って、豊富な国内寒天の新しい用途開発と付加価値の向上に関する研究が大きく要求されている実情である。
【０００３】
寒天は、少量のタンパク質、灰分及び脂肪を除けば大部分多糖類からなるが、上記寒天を構成する多糖類には、中性多糖類のアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）と酸性多糖類のアガロペクチン（ａｇａｒｏｐｅｃｔｉｎ）がある。アガロースは、Ｄ−ガラクトース（Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）と３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（３，６−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｌ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）がβ−１，４形態で結合したアガロビオース（ａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）を単位体として有し、アガロビオースがα−１，３結合で繰り返して連結された直鎖構造からなりゲル（ｇｅｌ）化力が強い。一方、アガロペクチンは、アガロースと同様にアガロビオースを単位体として有するが、硫酸基などのような酸性基を含有しており、ゲル化力が弱い。
【０００４】
その中で、アガロースは、β−１，４結合に作用するベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）によってネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）を経てネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）に分解され、続けてα−１，３結合に作用するアルファ−アガラーゼ（α−ａｇａｒａｓｅ）によってガラクトース（Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）と３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（３，６−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｌ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）に最終的に分解される。また、アガロースは、薄い酸やアルファ−アガラーゼ（α−ａｇａｒａｓｅ）によってアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）に分解される。一般的に、ネオアガロオリゴ糖は、寒天またはアガロースをベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）で加水分解して得られるネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）、ネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）、ネオアガロオクタオース（ｎｅｏａｇａｒｏｏｃｔａｏｓｅ）などのように、単糖が２〜１０個程ほど結合したオリゴ糖を意味する。また、アガロオリゴ糖は、寒天またはアガロースを薄い山やアルファ−アガラーゼ（α−ａｇａｒａｓｅ）に加水分解して得られるアガロビオース（Ａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）、アガロテトラオース（Ａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）アガロヘキサオース（Ａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）、アガロオクタオース（Ａｇａｒｏｏｃｔａｏｓｅ）などのように、単糖が２〜１０個ほど結合したオリゴ糖を意味する。ネオアガロオリゴ糖は、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（３，６−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｌ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を非還元末端として有する一方、アガロオリゴ糖は、Ｄ−ガラクトース（Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を非還元末端として有し、このような構造的差異のため生理学的活性の側面から互いに異なる性質を示したりもする。
【０００５】
一方、放線菌であるストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）は、寒天を分解するアガラーゼを細胞外（細胞外に分泌される）タンパク質の形態で生産すると知られており（Ｓｔａｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９４２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．；Ｈｏｄｇｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｔｅｒ，１９８１，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）、該アガラーゼは、ＤａｇＡ遺伝子でコーディングされている。ＤａｇＡ遺伝子は、放線菌でその機能が唯一に知られたベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）遺伝子であるため、放線菌を通じたアガラーゼ生産研究において重要な位置を有する。特に、ストレプトマイセスセリカラーは、放線菌の分子生物学的研究に最も広く使用される菌株として、２００２年イギリスのＳａｎｇｅｒ  ｃｅｎｔｒｅによって染色体ＤＮＡの配列が分析され、現在公開されている（Ｂａｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ）。
【０００６】
ネオアガロオリゴ糖の製造または用途と関連して、特許文献１には、寒天分解能を有するタラソモナス属菌株ＳＬ−５（Ｔｈａｌａｓｓｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＳＬ−５）ＫＣＣＭ  １０７９０Ｐと、前記菌株が生産するベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）を利用してネオアガロビオース、ネオアガロテトラオース及びネオアガロヘキサオースからなる群から選択された１種以上のネオアガロオリゴ糖を製造する方法が開示されている。また、特許文献２には、寒天分解能を有するグラシエコラ属菌株ＳＬ−１２  ＫＣＣＭ  １０９４５Ｐ（Ｇｌａｃｉｅｃｏｌａ  ｓｐ．ＳＬ−１２  ＫＣＣＭ  １０９４５Ｐ）と前記菌株が生産するベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）を利用してネオアガロビオース、ネオアガロテトラオース及びネオアガロヘキサオースからなる群から選択された１種以上のネオアガロオリゴ糖を製造する方法が開示されている。また、特許文献３には、シュードアルテロモナス属（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ）菌株から分離されたベータ−アガラーゼ及びこれを利用してネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）からなる群から選択された１種以上のネオアガロオリゴ糖を生産する方法が開示されている。また、特許文献４には、サッカロファガス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ  ｓｐ）菌株から分離されたベータ−アガラーゼ及びこれを利用してネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）からなる群から選択された１種以上のネオアガロオリゴ糖を生産する方法が開示されている。また、特許文献５には、サッカロファガス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ  ｓｐ）菌株から分離されたベータ−アガラーゼを寒天、ネオアガロテトラオース及びネオアガロヘキサオースからなる群から選択された１種以上の基質と反応させて、ネオアガロビオースを生産する方法が開示されている。また、特許文献６には、寒天分解活性を有するフラメオバーガ属ｍｂｒｃ−１菌株ＫＣＣＭ  １１１５１Ｐ（Ｆｌａｍｍｅｏｖｉｒｇａ  ｓｐ．ｍｂｒｃ−１  ＫＣＣＭ  １１１５１Ｐ）及び前記菌株が生産するベータ−アガラーゼ（β−ａｇａｒａｓｅ）を寒天と反応させて、ネオアガロビオース、ネオアガロテトラオース及びネオアガロヘキサオースからなる群から選択された１種以上のネオアガロオリゴ糖を製造する方法が開示されている。また、特許文献７には、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のアガラーゼ（ａｇａｒａｓｅ）とアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）またはアガ（ａｇａｒ）を反応させることを特徴とするネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）の製造方法が開示されている。また、特許文献８には、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のトリプシン遺伝子（ｓｐｒＴ）のプロモーターとシグナルペプチドコード部（ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を含んでなる配列番号７の塩基配列で表されるＤＮＡ断片��及びストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のベータ−アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）でシグナルペプチドコード部が除去された配列番号２の塩基配列で表されるＤＮＡ断片；を含み、原核生物を形質転換させることができるベータ−アガラーゼ組換え発現ベクターとこれを利用してベータ−アガラーゼを生産する方法が開示されている。また、特許文献９には、新規なベータ−アガラーゼ生産遺伝子を利用したネオアガロビオースまたはネオアガロテトラオースの酵素的生産方法が開示されている。また、特許文献１０には、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）を有効成分として含む肌美白組成物が開示されている。以上で説明したように、従来技術は、主にベータ−アガラーゼを遺伝子として含む新規菌株、新規菌株や組換え菌株を通じてベータ−アガラーゼを生産する方法、またはベータ−アガラーゼを利用して寒天などからネオアガロオリゴ糖を製造する方法に集中しており、ネオアガロオリゴ糖、特に、特定のベータ−アガラーゼを利用して製造したネオアガロオリゴ糖の様々な生理学的機能については研究が殆どなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】大韓民国登録特許第１０−０７９４５９３号
【特許文献２】大韓民国登録特許公報第１０−１０７２５０３号
【特許文献３】大韓民国登録特許第１０−１３０３８３９号
【特許文献４】大韓民国登録特許公報第１０−１２９５６５９号
【特許文献５】大韓民国登録特許公報第１０−１２１２１０６号
【特許文献６】大韓民国登録特許公報第１０−１２０６００６号
【特許文献７】大韓民国登録特許公報第１０−１３０２６５５号
【特許文献８】大韓民国登録特許公報第１０−１１９００７８号
【特許文献９】大韓民国公開特許公報第１０−２０１４−００６００４５号
【特許文献１０】大韓民国公開特許公報第１０−２００９−００４４９８７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来の技術的な背景下で導出されたもので、本発明の目的は、ネオアガロオリゴ糖の新規な食医薬的用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を解決するために、本発明の一例は、ネオアガロオリゴ糖混合物を有効成分として含む組成物であって、前記ネオアガロオリゴ糖混合物は、ネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）を含み、単核細胞の破骨細胞への分化により発生するか進行される関節炎または骨粗しょう症を予防、改善または治療するための用途の組成物を提供する。
【００１０】
上記目的を解決するために、本発明の他の例は、寒天（Ａｇａｒ）またはアガロース（Ａｇａｒｏｓｅ）から選択される基質とストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のベータ−アガラーゼであるＤａｇＡとの酵素反応産物またはその精製物を有効成分として含む組成物であり、前記酵素反応産物または精製物は、ネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びネオアガロヘキサオース（Ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）を含み、単核細胞の破骨細胞への分化により発生するか進行される関節炎または骨粗しょう症を予防、改善または治療するための用途の組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明による組成物の有効成分であるネオアガロオリゴ糖混合物などは、破骨細胞の誘導因子であるＲＡＮＫＬの発現を減少させ、単核細胞の破骨細胞への分化を効果的に抑制することができる。従って、本発明による組成物は、関節炎（特に、関節リウマチ）または骨粗しょう症を予防、改善または治療するための薬品または機能性食品として使用することができる。さらに、本発明による組成物の有効成分は、容易に入手可能な寒天（Ａｇａｒ）またはアガロース（Ａｇａｒｏｓｅ）のような基質とストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のベータ−アガラーゼであるＤａｇＡとの酵素反応を通じて収得することができるため、比較的安価なコストで生産することができ、副作用がなく誰もが容易に摂取可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明においてＤａｇＡ遺伝子をクローニングするために使用されたｐＵＷＬ２０１ｐｗベクターの配列地図である。
【図２】ｐＵＷＬ２０１ｐｗベクターにＤａｇＡ遺伝子が導入された組換えベクターの配列地図である。
【図３】本発明の実施例３で収得した部分精製されたＤａｇＡ酵素反応産物をＨＰＬＣ−ＥＬＳＤで分析した結果を示すグラフである。
【図４】ネオアガロオリゴ糖混合物（ＮＡＯ）が関節リウマチ患者の滑膜細胞で破骨細胞の誘導因子であるＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａ−Ｂ  ｌｉｇａｎｄ）の発現に及ぼす影響を示したものである。
【図５】ネオアガロオリゴ糖混合物（ＮＡＯ）が関節リウマチ患者の滑膜細胞で炎症性サイトカインであるＩＬ−６の発現に及ぼす影響を示したものである。
【図６】ネオアガロオリゴ糖混合物（ＮＡＯ）が末梢血単核細胞の破骨細胞への分化誘導条件で破骨細胞への分化に及ぼす影響を示したものである。
【図７】ネオアガロオリゴ糖混合物（ＮＡＯ）が末梢血単核細胞の破骨細胞への分化誘導条件で破骨細胞の分化マーカーの発現に及ぼす影響を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明で使用した用語を説明する。
【００１４】
本発明で使用される用語「薬学的に許容可能な」及び「食品学的に許容可能な」とは、生物体を相当に刺激することなく投与活性物質の生物学的活性及び特性を阻害しないことを意味する。
【００１５】
本発明で使用される用語「予防」とは、本発明の組成物の投与により特定疾患の症状を抑制するか進行を遅延させる全ての行為を意味する。
【００１６】
本発明で使用される用語「改善」とは、治療される状態と関連したパラメーター、例えば、症状の程度を少なくとも減少させる全ての行為を意味する。
【００１７】
本発明で使用される用語「治療」とは、本発明の組成物の投与により特定疾患の症状を好転または良く変更させる全ての行為を意味する。
【００１８】
本発明で使用される用語「投与」とは、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。この時、個体とは、本発明の組成物を投与して特定疾患の症状が好転可能な疾患を持つヒト、猿、犬、山羊、豚またはラットなどの全ての動物を意味する。
【００１９】
本発明で使用される用語「薬学的に有効な量」とは、医学的な治療に適用可能な合理的な受益または危険の割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、これは、個体の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素、及びその他の医学分野でよく知られた要素によって決定することができる。
【００２０】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００２１】
本発明の一例による関節炎または骨粗しょう症の予防、改善または治療用組成物は、ネオアガロオリゴ糖混合物を有効成分として含む。前記ネオアガロオリゴ糖混合物は、ネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）を含む。また、前記ネオアガロオリゴ糖混合物は、構成成分の相乗効果を考慮すると、ネオアガロオリゴ糖混合物の総重量を基準として、ネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）１〜１０重量％、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）５５〜７５重量％及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）２０〜４０重量％を含むことが好ましく、ネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）２〜４重量％、ネオアガロテトラオース（Ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）６５〜７０重量％及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）２５〜３０重量％を含むことがさらに好ましい。また、前記ネオアガロオリゴ糖混合物は、寒天（Ａｇａｒ）またはアガロース（Ａｇａｒｏｓｅ）から選択される基質とストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のベータ−アガラーゼであるＤａｇＡとの酵素反応産物またはその精製物であることができる。基質とＤａｇＡとの酵素反応を通じてネオアガロオリゴ糖混合物を収得する方法は後で詳しく説明する。
【００２２】
本発明の他の例による関節炎または骨粗しょう症の予防、改善または治療用組成物は、寒天（Ａｇａｒ）またはアガロース（Ａｇａｒｏｓｅ）から選択される基質とストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のベータ−アガラーゼであるＤａｇＡとの酵素反応産物またはその精製物を有効成分として含む。前記酵素反応産物または精製物は、ネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）を含む。また、前記酵素反応産物または精製物は、ネオアガロオリゴ糖総重量を基準としてネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）１〜１０重量％、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）５５〜７５重量％及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）２０〜４０重量％を含むことが好ましく、ネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ）２〜４重量％、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ）６５〜７０重量％及びネオアガロヘキサオース（Ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ）２５〜３０重量％を含むことがさらに好ましい。また、前記酵素反応は、３５〜４５℃の温度、及び６〜８のｐＨで行われることが好ましい。また、前記酵素反応は、０．５〜５％（ｗ／ｖ）の寒天またはアガロース溶液にＤａｇＡを２〜２５０ｕｎｉｔ／ｍlの濃度、好ましくは１０〜１５０ｕｎｉｔ／ｍlの濃度、さらに好ましくは１０〜１００ｕｎｉｔ／ｍlの濃度で添加してなることが好ましい。この時、酵素の活性を示す１Ｕｎｉｔは、０．２％（ｗ／ｖ）の濃度でアガロースを溶かした５０ｍＭ  ＰＢＳ溶液（ｐＨ７）３．９ｍlを４０℃で５分間反応した後（反応液４ｍl）、反応液と同量のＤＮＳ試薬（ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ６．５ｇ、２Ｍ  ＮａＯＨ  ３２５ｍl及びｇｌｙｃｅｒｏｌ  ４５ｍlを蒸留水１lに溶解して製造する）を入れて、１０分間煮沸した後、冷やして、吸光度を５４０ｎｍで測定した時、５４０ｎｍにおける吸光度０．００１を生成する酵素の量として定義される。
【００２３】
以下、本発明による組成物の有効成分を基質とＤａｇＡとの酵素反応を通じて収得する方法について説明する。本発明において、ストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のＤａｇＡは、配列番号２の３１〜３０９番の間のアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し、ストレプトマイセスセリカラーから生産されるか異種菌株から生産されるタンパク質または機能が全く異なるものに変更されるか、またはアガラーゼ活性を失わない範囲内で通常の遺伝子組み換え方法、つまり、精製を有利にするために標識アミノ酸を含ませるか、異種発現のためのアミノ酸配列を変更するなどの方法により組換えられたタンパク質を全て含む。ＤａｇＡは、本来ストレプトマイセスセリカラーのベータ−アガラーゼ遺伝子から翻訳する時に、配列番号２の３０９個のアミノ酸を有し、分子量が約３５ｋＤａの状態で生産され、Ｎ−末端３０個のアミノ酸シグナルペプチドが切られて完成された細胞外形タンパク質（３２ｋＤａ）の状態で分泌される。ストレプトマイセスセリカラーのＤａｇＡ遺伝子は、配列番号１の塩基配列として表示することができる。配列番号１は、ストレプトマイセスセリカラーＡ３（２）のゲノムに存在する遺伝子の塩基配列として、ＮＣＢＩ（米国国立生物情報センター）のデータベース上に「ＳＣＯ３４７１」と命名されている。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験によって確認されたところ、ＤａｇＡ遺伝子の転写はＲＮＡ重合酵素の少なくとも異なる３つの完全酵素（ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ）によって認知される４つまたは５つの他のプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）によって調節される。ＤａｇＡ遺伝子の転写段階の分析によると、ＤａｇＡの転写は、暗号化配列の上部３２、７７、１２５及び２２０番目の塩基で開始されることが表れた。
【００２４】
本来、ＤａｇＡの生産菌株であるストレプトマイセスセリカラーの培養を通じて本発明で使用されるＤａｇＡを生産することができるが、生産効率を高めるために、異種菌株であるストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）の発現システムを利用することが好ましい。前記ＤａｇＡ遺伝子を放線菌用ベクターに挿入して組換えベクターを製造した後、組換えベクターでストレプトマイセスリビダンスを形質転換し、形質転換体を培養する方法を使用してＤａｇＡを生産することができる。この場合、組換えベクターは、ＤａｇＡ遺伝子の転写が放線菌由来のプロモーターによって調節されるように構成することが好ましい。放線菌由来のプロモーターには、ｓｇｔＲプロモーター（ｓｇｔＲｐ）、ｅｒｍＥプロモーター（ｅｒｍＥｐ）、ｔｉｐＡプロモーター（ｔｉｐＡｐ）などの様々なプロモーターが存在するので、組換えベクターを製造する時にこれらを選択して使用することができる。これらのプロモーターによって転写が調節されるように構成された様々な種類のベクターが開発されており、このベクターにＳＣＯ３４７１をクローニングすれば、放線菌由来のプロモーターによって転写が調節される構造の組み換えベクターを製造することができる。形質転換体は、宿主菌株をＤａｇＡ遺伝子がクローニングされた組換えベクターに形質転換して製造することができるが、宿主菌株によって形質転換方法が多様に存在するので、適切な方法を選択して使用することができる。例えば、ストレプトマイセスリビダンスを宿主菌株として使用する場合、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）を媒介とした形質転換方法を使用することができる。形質転換体などのようなＤａｇＡ生産菌株を液体培地で培養すればＤａｇＡを生産することができ、培養液を収得して限外ろ過法のような通常のタンパク質精製方法を利用することで、高純度のＤａｇＡを生産することができる。この時、液体培地に寒天またはアガロースを含めれば、より効率的にＤａｇＡを生産することができる。
【００２５】
このように生産されたＤａｇＡを寒天またはアガロースのような基質溶液に添加し、特定温度及びｐＨ条件で反応させると、本発明による組成物で有効成分として使用される酵素反応産物を収得することができる。また、前記酵素反応産物を限外ろ過法で部分精製するかゲルろ過クロマトグラフィーに通過し分画すると、酵素反応産物の精製物を収得することができる。
【００２６】
本発明による組成物の有効成分であるネオアガロオリゴ糖混合物は、破骨細胞の誘導因子であるＲＡＮＫＬまたは炎症性サイトカインであるＩＬ−６の発現を減少させ、単核細胞の破骨細胞への分化を効果的に抑制する。破骨細胞（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）は、骨組織の破壊、吸収の機能を有する多核大型細胞であり、関節炎または骨粗しょう症に関与すると知られている。骨組織は、造骨細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収過程が繰り返して維持される力動的な器官であり、単核細胞の破骨細胞への分化が増加すれば、骨の生成よりも吸収が多くなり、関節炎（特に、関節リウマチ）または骨粗しょう症が発生するか進行される。このような理由のため、関節炎（特に、関節リウマチ）または骨粗しょう症の治療薬開発に関する研究が破骨細胞の形成を抑制するか、破骨細胞の活性化を抑制する素材の探索に集中している。従って、本発明による組成物の有効成分であるネオアガロオリゴ糖混合物は、関節炎（特に、関節リウマチ）または骨粗しょう症を予防、改善または治療するための素材として使用することができる。本発明による組成物は、使用目的または様相によって、薬学組成物、食品添加物、食品組成物（特に、機能性食品）、飼料添加物等として具体化することができ、組成物内における有効成分の含量も組成物の具体的な形態、使用目的または様相によって多様な範囲で調整することができる。
【００２７】
本発明による関節炎または骨粗しょう症の予防、改善または治療用組成物が薬学組成物として具体化される場合、薬学組成物において、有効成分の含量は大きく制限されず、例えば、組成物の総重量を基準として０．１〜９９重量％、好ましくは０．５〜５０重量％、さらに好ましくは１〜３０重量％であることができる。また、本発明の薬学組成物は、有効成分の他に薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤のような添加物をさらに含むことができる。本発明の薬学組成物に含まれることができる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、でん粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムフォスフェイト、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油などが挙げられる。また、本発明の薬学組成物は、ネオアガロオリゴ糖の他に関節炎または骨粗しょう症の予防、改善または治療効果を有する公知の有効成分を１種以上さらに含有することができる。本発明の薬学組成物は、通常の方法によって経口投与のための剤形または非経口投与のための剤形として製剤化することができ、製剤化する場合に通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製することができる。経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、有効成分である複合抽出物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、でん粉、カルシウムカーボネート（Ｃａｌｃｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、ラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）またはゼラチンなどを混ぜて調製することができる。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムスチレートタルクのような潤滑剤も使用することができる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、油剤、及びシロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。非経口投与のための製剤としては、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、座剤が含まれることができる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物性油、エチルオレートなどの注射可能なエステルなどが使用されることができる。座剤の基剤としては、ウィテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トゥウィーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されることができる。さらに、当分野の適正な方法として、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（最新版）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡに開示されている方法を利用して、各疾患によってまたは成分によって好ましく製剤化すること���できる。本発明の薬学組成物は、目的の方法によってヒトを含む哺乳動物に経口投与または非経口投与することができ、非経口投与方式としては、皮膚外用、腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射の注入方式などがある。本発明の薬学組成物の投与量は、薬学的に有効な量であれば大きく制限されず、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度によってその範囲が多様である。本発明の薬学組成物の通常の１日投与量は大きく制限されず、例えば、有効成分である複合抽出物を基準として０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇであることが好ましく、１〜５００ｍｇ／ｋｇであることがさらに好ましく、１日１回または数回に分けて投与することができる。
【００２８】
また、本発明による関節炎または骨粗しょう症の予防、改善または治療用組成物が食品組成物として具体化される場合、食品組成物で有効成分の含量は大きく制限されず、組成物の総重量を基準として０．０１〜５０重量％、好ましくは０．１〜２５重量％、さらに好ましくは０．５〜１０重量％であることができる。本発明の食品組成物は、丸剤、粉末、顆粒、針剤、錠剤、カプセル、または液剤などの形態を含み、具体的な食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種のスープ、ドリンク、お茶、機能水、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、通常の意味で健康食品を全て含む。本発明の食品組成物は、有効成分の他に様々な香味剤または天然炭水化物などの追加成分として含有することができる。また、本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。その他に、本発明の食品組成物は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料、及び野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は、独立してまたは混合して使用することができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖などのモノサッカライド、マルトース、スクロースなどのジサッカライド、及びデキストリン、シクロデキストリンなどのポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。香味剤としては、タウマチン、ステビア抽出物などの天然の香味剤やサッカリン、アスファルタムなどの合成香味剤などを使用することができる。
【００２９】
本発明の他の例は、必要とする個体にネオアガロオリゴ糖混合物を有効な量で投与して、関節炎または骨粗しょう症を予防、改善または治療する方法を提供する。また、本発明は、必要とする個体にネオアガロオリゴ糖混合物を含む組成物を有効な量で投与して、関節炎または骨粗しょう症を予防、改善または治療する方法を提供する。また、本発明は、必要とする個体に寒天（Ａｇａｒ）またはアガロース（Ａｇａｒｏｓｅ）から選択される基質とストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のベータ−アガラーゼであるＤａｇＡとの酵素反応産物またはその精製物を有効な量で投与して、関節炎または骨粗しょう症を予防、改善または治療する方法を提供する。また、本発明は、必要とする個体に寒天（Ａｇａｒ）またはアガロース（Ａｇａｒｏｓｅ）から選択される基質とストレプトマイセスセリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のベータ−アガラーゼであるＤａｇＡとの酵素反応産物またはその精製物を含む組成物を有効な量を投与して、関節炎なたは骨粗しょう症を予防、改善または治療する方法を提供する。
【００３０】
以下では、本発明の実施例を通じてより具体的に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の技術的特徴を明確に例示するためのものであり、本発明の保護範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３１】
実施例１：ＤａｇＡ酵素の生産
ストレプトマイセスセリカラーＡ３（２）の染色体ＤＮＡをテンプレートとし、下記のプライマー及びＥｘ−Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）重合酵素を利用して重合連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）を行い、その結果、増幅されたＤａｇＡ遺伝子断片（ＤａｇＡのシグナルペプチド及び完成型ペプチドが暗号化された９４７ｂｐ長さの断片として、配列番号１の塩基配列両末端にプライマーの一部配列が連結された状態に該当する）を収得した。
【００３２】
＊ＤａｇＡ遺伝子断片の増幅に使用されたプライマー
Ａｓｍ−Ｆ（フォワードプライマー）：５’−ＧＡＣＡＴＡＴＧＧＴＧＧＴＣＡＡＣＣＧＡＣＧＴＧＡＴＣ−３’（ＮｄｅＩ）（配列番号３）
Ａｓｍ−Ｒ（リバースプライマー）：５’−ＧＧＴＧＧＡＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＧＣＣＴＧＡＴＡＣＧ−３’（ＢａｍＨＩ）（配列番号４）
【００３３】
その後、増幅されたＤａｇＡ遺伝子断片の制限酵素部位（ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ）を利用してＤａｇＡ遺伝子を図１のｐＵＷＬ２０１ｐｗベクターにクローニングして図２の組換えベクターを製作した。図２の組換えベクターでは、ＤａｇＡ遺伝子の転写がｅｒｍＥプロモーターによって調節される。その後、図２の組換えベクターでストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４菌株を形質転換して組換え菌株を製造し、前記組換え菌株をＤａｇＡの生産のために使用した。
【００３４】
具体的に、前記組換え菌株を０．３％（ｗ／ｖ）の寒天が含まれたＲ２ＹＥ液体培地に接種し、２８℃の温度及び１２０ｒｐｍの撹拌条件で約６０時間前培養を実施した。前培養過程を経た後、約６０時間本培養を実施した。本培養を通じて収得した培養液を遠心分離して菌体を除去し、上澄液を限外ろ過膜（５ｋＤａ  カットオフ膜）でろ過して分離及び精製した。ろ過膜を通過できなかった酵素濃縮液を凍結乾燥して固形化し、固形化されたＤａｇＡ酵素を保管して、以後の実験に使用した。
【００３５】
実施例２：ＤａｇＡ酵素のアガラーゼ活性の測定
上記実施例１で収得したＤａｇＡ酵素のアガラーゼ活性を還元当量検証方法（ＤＮＳ  ｍｅｔｈｏｄ）で測定した。実施例１で収得したＤａｇＡ酵素をＰＢＳ溶液に１０ｍｇ／ｍlの濃度で溶解させて製造したＤａｇＡ酵素液１００μlと０．２％（ｗ／ｖ）の濃度でアガロースを溶かした５０ｍＭ  ＰＢＳ溶液（ｐＨ７）３．９ｍlを混合し、４０℃で５分間反応させた後、これにＤＮＳ試薬（ジニトロサリチル酸  ６．５ｇ、２Ｍ  ＮａＯＨ  ３２５ｍl及びｇｌｙｃｅｒｏｌ  ４５ｍlを蒸留水１lに溶解して製造した）４ｍlを入れて１０分間沸騰してから冷やし、吸光度を５４０ｎｍで測定した。酵素１Ｕ（Ｕｎｉｔ）は、５４０ｎｍにおける吸光度が０．００１である活性で定義した。
【００３６】
実施例３：ＤａｇＡ酵素反応産物の製造
１．５％（ｗ／ｖ）の濃度で寒天を溶かした２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液１lを製造し、１００℃で約１０分間加熱した後、４０℃に温度を下げ、これに１２５Ｕ／ｍl濃度のＤａｇＡ酵素水溶液を全体試料の量を基準として２０，０００Ｕとなるように処理して、約２４時間反応させた。その後、酵素反応産物を遠心分離して未分解された寒天を除去し、上澄液を回収した後、ＴＬＣを利用して酵素反応生成物を確認した。回収した上澄液を限外ろ過膜（５ＫＤａ  カットオフ膜）でろ過して部分精製した。ろ過膜を通過したＤａｇＡ酵素反応産物を凍結乾燥して固形化し、固形化されたＤａｇＡ酵素反応産物を保管して、以後の実験に使用した。上記過程を繰り返しながら、４バッチに該当する部分精製された酵素反応産物を収得した。
【００３７】
実施例４：ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析を通じたＤａｇＡ酵素反応産物のネオアガロオリゴ糖の組成確認
上記実施例３で収得した酵素反応産物のネオアガロオリゴ糖組成をＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析を通じて確認した。ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析条件は、以下の通りである。
【００３８】
＊カラム：ＮＨ２  Ｐ−５０  ４Ｅマルチモードカラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）
＊移動相：アセトニトリルと水との混合溶液（アセトニトリル：水の体積比は６５：３５である）
【００３９】
図３は、実施例３で収得した部分精製されたＤａｇＡ酵素反応産物をＨＰＬＣ−ＥＬＳＤで分析した結果を示すグラフである。図３で示される４つのピークグラフは、４バッチ（ｂａｔｃｈ）でそれぞれ得られた部分精製された酵素反応産物に対応するものである。また、図３において、表中の面積（％）は、それぞれのネオアガロオリゴ糖に該当するピークの面積を全体ピーク面積に対して百分率で示したものであり、当業界で重量％と同一の意味で解釈することができる。図３に示すように、ＤａｇＡ酵素反応産物は、主成分がネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ、以下、「ＤＰ２」という）、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ、以下、「ＤＰ４」という）及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ、以下、「ＤＰ６」という）などのようなネオアガロオリゴ糖であると表れた。ＤａｇＡ酵素反応産物でネオアガロオリゴ糖の含量は、固形分（ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析で検出されていない成分を含む）の全体重量を基準として約６５±５重量％であると表れたが、酵素反応条件により、上記含量は多様な範囲で選択されることができる。例えば、ＤａｇＡ酵素反応産物でネオアガロオリゴ糖の含量は、固形分全体重量を基準として６５±２０重量％であることができる。また、ＤａｇＡ酵素反応産物でＤＰ２、ＤＰ４及びＤＰ６の含量は、ＤＰ２、ＤＰ４及びＤＰ６を合わせたネオアガロオリゴ糖全体重量を基準として、それぞれ２〜４重量％、６５〜７０重量％、及び２５〜３０重量％であると表れたが、酵素反応条件によって、上記含量は、多様な範囲で選択されることができる。例えば、ＤａｇＡ酵素反応産物でＤＰ２、ＤＰ４及びＤＰ６の含量は、ＤＰ２、ＤＰ４及びＤＰ６を合わせたネオアガロオリゴ糖全体重量を基準として、それぞれ１〜１０重量％、５５〜７５重量％及び２０〜４０重量％であることができる。
【００４０】
実施例５：ゲルろ過クロマトグラフィーを用いたＤａｇＡ酵素反応産物の精製
上記実施例３で収得した部分精製された酵素反応産物をゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＰＣ；製品名：ＢｉｏＧｅｌ  Ｐ−２  ｇｅｌ、Ｂｉｏｒａｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１５０−４１１５）を通じてネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘａｏｓｅ、ＤＰ６）、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ、ＤＰ４）及びネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ、ＤＰ２）と分離及び精製した。その後、精製した産物を凍結乾燥して固形化し、固形化されたＤａｇＡ酵素精製産物を保管して、以後の実験に使用した。精製した産物であるＤＰ２、ＤＰ４及びＤＰ６の純度をＴＬＣとＨＰＬＣを通じて確認したところ、約８５％（ｗ／ｗ）のレベルであった。
【００４１】
実施例６：ネオアガロオリゴ糖混合物の関節リウマチ及び骨粗しょう症の改善効能の確認試験
６−１．実験方法
（１）関節リウマチ患者の滑膜細胞の培養
関節リウマチ患者の関節置換手術時に関節組織を分離した後、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅで処理して滑膜細胞を分離した。分離した関節リウマチ患者の滑膜細胞を１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）の濃度が１０重量％であるＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）培地で培養した。本実験では、継代（ｐａｓｓａｇｅ）が５〜１０の細胞を使用し、細胞を６−ウェルプレートにウェル当り３×１０５の量で接種し、炎症性サイトカインであるＩＬ−１７で刺激を与え、ネオアガロオリゴ糖混合物の効果を得るために滑膜細胞を実施例３で収得した部分精製されたＤａｇＡ酵素反応産物（以下、「ＮＡＯ」という）で前処理した。
【００４２】
（２）ヒトの末梢血単核細胞の分離と破骨細胞への分化誘導
血液をＰＢＳ溶液と１：１の体積比で混ぜて血液緩衝液を製造した。以後、血液緩衝液が収容されたチューブにフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）をフィコール層が乱れないようにゆっくり浮上した後（フィコール対血液緩衝液の重量比は１：４である）、２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離してバフィーコート（ｂｕｆｆｙ  ｃｏａｔ）層だけを取った。その後、取ったバフィーコート（ｂｕｆｆｙ  ｃｏａｔ）層を新しいチューブに入れて、ＰＢＳで洗浄し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収得した。その後、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を４８−ウェルプレートにウェル当り５×１０５の量で接種し培養した。末梢血単核細胞の破骨細胞への分化誘導のためにＭ−ＣＳＦとＩＬ−１７刺激を与え、ネオアガロオリゴ糖混合物の分化抑制効果を得るために末梢血単核細胞を実施例３で収得した部分精製されたＤａｇＡ酵素反応産物（以下、「ＮＡＯ」という）で前処理した。
【００４３】
（３）Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを通じて特定遺伝子の発現レベルを分析した。ＰＣＲを行う時に使用した特定の遺伝子別プライマーを表１に示した。
【００４４】
【表１】
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また、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを分析する時に、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して核酸を標識し、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を使用して蛍光強度を測定した。
【００４５】
（４）ＴＲＡＰ（酒石酸塩耐性ホスファターゼ）染色
４８−ウェルプレートの各ウェルに細胞を入れ、細胞固定のために各ウェルにフォルムアルデヒド１ｍlを入れた後、常温で１０分間放置した。その後、固定液を吸引（ｓｕｃｔｉｏｎ）して、蒸留水で３回洗浄した。その後、各ウェルにＴＲＡＰ染色溶液（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を入れて、３７℃のインキュベーターで３０分間反応させた。その後、各ウェルに蒸留水を入れて吸引することを３回繰り返した後、顕微鏡で測定した。
【００４６】
６−２．実験の結果
（１）関節リウマチ患者の滑膜細胞でネオアガロオリゴ糖混合物の破骨細胞誘導因子の抑制効果
図４は、ネオアガロオリゴ糖混合物（ＮＡＯ）が関節リウマチ患者の滑膜細胞で破骨細胞誘導因子であるＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａ−Ｂ  ｌｉｇａｎｄ）の発現に及ぼす影響を示したものである。図４に示すように、関節リウマチ患者の滑膜細胞に炎症性サイトカインであるＩＬ−１７を処理すると、破骨細胞誘導因子であるＲＡＮＫＬの活性が増加するが、ネオアガロオリゴ糖混合物（実施例３で収得した部分精製されたＤａｇＡ酵素反応産物、ＮＡＯ）を処理すると、濃度依存的にＲＡＮＫＬの発現を減少させた。
【００４７】
（２）関節リウマチ患者の滑膜細胞でネオアガロオリゴ糖混合物のＩＬ−６抑制効果
図５は、ネオアガロオリゴ糖混合物（ＮＡＯ）が関節リウマチ患者の滑膜細胞で炎症性サイトカインであるＩＬ−６の発現に及ぼす影響を示したものである。図５に示すように、関節リウマチ患者の滑膜細胞に炎症性サイトカインであるＩＬ−１７を処理すると、炎症性サイトカインであるＩＬ−６の活性が増加するが、ネオアガロオリゴ糖混合物（実施例３で収得した部分精製されたＤａｇＡ酵素反応産物、ＮＡＯ）を処理すると、濃度依存的にＩＬ−６の発現を減少させた。
【００４８】
（３）末梢血単核細胞の破骨細胞への分化誘導条件下でネオアガロオリゴ糖混合物の破骨細胞への分化抑制の効果
ヒト末梢血単核細胞を分離し、破骨細胞への分化を誘導するために炎症性サイトカインであるＩＬ−１７を処理して刺激を与え、ネオアガロオリゴ糖混合物で前処理した群と前処理しなかった対照群のＴＲＡＰ染色を行った。図６は、ネオアガロオリゴ糖混合物（ＮＡＯ）の末梢血単核細胞の破骨細胞への分化誘導条件で破骨細胞への分化に及ぼす影響を示したものである。図６に示すように、ヒト末梢血単核細胞にネオアガロオリゴ糖混合物（実施例３で収得した部分精製されたＤａｇＡ酵素反応産物、ＮＡＯ）を高濃度で処理する場合、破骨細胞への分化が顕著に抑制された。
【００４９】
図７は、ネオアガロオリゴ糖混合物（ＮＡＯ）の末梢血単核細胞の破骨細胞への分化誘導条件で、破骨細胞の分化マーカーの発現に及ぼす影響を示したものである。図７に示すように、ヒト末梢血単核細胞にネオアガロオリゴ糖混合物（実施例３で収得した部分精製されたＤａｇＡ酵素反応産物、ＮＡＯ）を前処理する場合、破骨細胞への分化誘導条件下で濃度依存的に破骨細胞分化マーカーであるＴＲＡＰ、カルシトニンレセプター、カテプシンＫの発現を減少させた。
【００５０】
以上のように、本発明を上記の実施例を通じて説明したが、本発明が必ずしもこれに限定されるものではなく、本発明の範疇と思想を逸脱しない範囲内で様々な変形実施が可能なことはもちろんである。従って、本発明の保護範囲は、特定の実施形態に限られるものではなく、本発明に添付の特許請求の範囲に属する全ての実施形態を含むと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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