(57)【要約】  本明細書で提供するのは、特に、例えば約１５０ｂｐ〜１．５Ｋｂ長の短鎖ＤＮＡ断片のトランスポザーゼ５媒介タグ化および増幅のための様々な方法である。幾つかの態様では、本方法は、バーコードトランスポザーゼを使用し第１のプライマー配列を用いたＤＮＡ断片のタグ化、次に例えばランダムまたは遺伝子特異的プライマーを使用して、第２のプライマー配列を導入するためのプライマー伸長反応を含む。この方法を実施するためのキットも提供する。
2019517250.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アダプタータグ化断片を生成するために、１５０ｂｐ〜１．５Ｋｂの平均長を有する二本鎖ＤＮＡ断片を含む試料と、それぞれアダプターが装着された複数のトランスポザーゼデュプレックスとを接触させるステップと、ここで、アダプターが、トランスポザーゼ認識配列を含むデュプレックス領域と第１のプライマー配列を含む５’オーバーハング領域とを含み、
（ｂ）ランダムプライマー伸長産物を生成するために、ランダムプライマーを使用してアダプタータグ化断片にプライマー伸長反応を実施するステップと、ここで、ランダムプライマーが、ランダム３’配列と第２のプライマー配列とを含む５’配列を含み、
（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物を生成するために、その３’末端に第１のプライマー配列を含むフォワードプライマーと、その３’末端に第２のプライマー配列を含むリバースプライマーとを使用して、ＰＣＲにより（ｂ）のランダムプライマー伸長産物を増幅するステップと
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）の前に、
（ｉ）５’オーバーハング領域を充填しアダプタータグ化断片のギャップを充填するために、アダプタータグ化断片に伸長または伸長／ライゲーション反応を実施するステップと、
（ｉｉ）その３’末端に第１のプライマー配列を含む直鎖増幅プライマーを用いて少なくとも１回の直鎖増幅反応を実施するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｉｉ）が２〜３０回の直鎖増幅反応を実施することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のプライマー配列が第１のシーケンシングプライマー配列であり、前記フォワードプライマーが第１のシーケンシングプライマー配列を含む５’テールを含み、または前記アダプターが前記第１のプライマー配列の下流に第１のシーケンシングプライマー配列をさらに含み、かつ
前記第２のプライマー配列が第２のシーケンシングプライマー配列であり、前記リバースプライマーが第２のシーケンシングプライマー配列を含む５’テールを含み、または前記ランダムプライマーが前記第２のプライマー配列の下流に第２のシーケンシングプライマー配列をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１および第２のシーケンシングプライマー配列が次世代シーケンシング用である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アダプターが前記第１のシーケンシングプライマー配列の下流にバーコードをさらに含み、かつ／または
前記ランダムプライマーが前記第２のシーケンシングプライマー配列の下流にバーコードをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記アダプターおよび／またはランダムプライマー中の前記バーコードが試料特異的バーコードである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アダプターおよび／またはランダムプライマー中の前記バーコードが縮重塩基領域（ＤＢＲ）を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
試料中のＤＮＡ断片の少なくとも一部分に関する配列の読み枠を得るために、ＰＣＲ増幅産物をシーケンシングするステップと、配列の読み枠をコンティグに構築するステップとをさらに含む、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ断片の試料を臨床試料から単離する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記臨床試料が体液から抽出した無細胞ＤＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記体液が血液である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記臨床試料がホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）試料である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）アダプタータグ化断片を生成するために、１ｋｂ未満の平均長を有する二本鎖ＤＮＡ断片を含む試料とそれぞれアダプターが装着された複数のトランスポザーゼデュプレックスとを接触させるステップと、ここで、アダプターが、トランスポザーゼ認識配列を含むデュプレックス領域と、第１のプライマー配列を含む５’オーバーハング領域とを含み、
（ｂ）ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を使用して、アダプタータグ化断片の上部鎖にオリゴ−ｄＮテールを加えてテールアダプタータグ化断片を生成するステップと、
（ｃ）テールプライマー伸長産物を生成するために、テールプライマーを使用してテールアダプタータグ化断片にプライマー伸長反応を実施するステップと、ここで、テールプライマーが、オリゴ−ｄＮテールとハイブリダイズする３’配列と、第２のプライマー配列を含む５’配列とを含み、
（ｄ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物を生成するために、その３’末端に第１のプライマー配列を含むフォワードプライマーと、その３’末端に第２のプライマー配列を含むリバースプライマーとを使用して、ＰＣＲにより（ｃ）のテールプライマー伸長産物を増幅するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
試料中のＤＮＡ断片の少なくとも一部分に関する配列の読み枠を得るためにＰＣＲ増幅産物をシーケンシングするステップと、配列の読み枠をコンティグに構築するステップとをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ断片の試料が臨床試料から単離されたものであり、臨床試料がホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）試料である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
トランスポザーゼ認識配列を含むデュプレックス領域と、第１のプライマー配列を含む５’オーバーハング領域とを含むアダプターが、それぞれ装着された複数のトランスポザーゼデュプレックス、
ランダム３’配列と第２のプライマー配列を含む５’配列とを含むランダムプライマー、またはオリゴ−ｄＮテールとハイブリダイズする３’配列および第２のプライマー配列を含む５’配列を含むテールプライマー、
その３’末端に前記第１のプライマー配列を含むフォワードプライマー、
その３’末端に前記第２のプライマー配列を含むリバースプライマー、および
請求項１または１４に記載の方法を実施するための１つまたは複数の追加的試薬を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術によって全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）は普通のことになり、様々な標的富化法によって研究者は、最も重要な目的の領域に関するシーケンシング力に焦点を当てることが可能となっている。しかしながら、ホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）固形腫瘍試料、無細胞または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ／ｃｔＤＮＡ）、または損傷ＤＮＡサンプルなどの難しい標的ＤＮＡにＮＧＳを適用する、より良い方法が依然必要とされている。このような標的のシーケンシングに関する問題には、ＤＮＡ量が非常に少ない可能性、ＤＮＡが非常に短いか（例えば、断片状ＤＮＡ）または化学修飾される可能性、および対立遺伝子頻度が非常に低い可能性が含まれる。これらの問題は多くのＤＮＡ鋳型の捕捉を必要とする。
【０００２】
特に、トランスポザーゼベースのタグ化方法を使用して、ゲノムＤＮＡの小断片をシーケンシングすることは難題である。多くのこれらの方法は、各末端に適切なシーケンシングプライマー結合部位を有する断片を生成するのに２つの隣接トランスポザーゼの挿入を必要とし、このような小断片は隣接トランスポザーゼを収容するほど充分な長さではないことが多いからである。とりわけ本開示は、下流分析、例えば次世代シーケンシング用の、このようなＤＮＡ試料のタグ化と増幅を改善するための組成物および方法を提供する。
【発明の概要】
【０００３】
本開示の幾つかの態様は、（ａ）アダプタータグ化断片を生成するために、二本鎖ＤＮＡ断片を含む試料と、それぞれアダプターが装着された複数のトランスポザーゼデュプレックスとを接触させるステップと、ここで、アダプターが、トランスポザーゼ認識配列を含むデュプレックス領域と第１のプライマー配列を含む５’オーバーハング領域とを含み、（ｂ）ランダムプライマー伸長産物を生成するために、ランダムプライマーを使用してアダプタータグ化断片にプライマー伸長反応を実施するステップと、ここで、ランダムプライマーが、第２のプライマー配列を含むランダム３’ヌクレオチド配列と５’ヌクレオチド配列とを含み、（ｃ）ＰＣＲ増幅産物を生成するために、その３’末端に第１のプライマー配列を含むフォワードプライマーおよびその３’末端に第２のプライマー配列を含むリバースプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により（ｂ）のランダムプライマー伸長産物を増幅するステップと含む、試料中のＤＮＡ断片をタグ化するための方法を含む。生成するＰＣＲ増幅産物は、アダプター由来配列とランダムプライマー由来配列との間の、試料中のＤＮＡ断片由来の核酸配列を含み得る。１つまたは複数のバーコード、１つまたは複数の縮重塩基領域、１つまたは複数の制限部位、１つまたは複数の他のプライマー配列、１つまたは複数の検出可能標識、１つまたは複数の捕捉タグなどに限られないが、これらを含めた、他の機能性配列および／または部分がアダプターおよび／またはランダムプライマー中に存在し得ることに留意されたい。ある実施形態では、試料中のＤＮＡ断片は１ｋｂ未満の平均長を有する。
【０００４】
循環腫瘍ＤＮＡまたはＦＦＰＥ切片から回収したＤＮＡを分析するため方法を施用するときなど、特定施用に関して、試料中のＤＮＡの量は限られている、かつ／または比較的少ない。多くのトランスポザーゼベースのライブラリー調製法は標的断片あたり２つの挿入部位を必要とするが、一方で本発明の方法は、標的ＤＮＡあたり１つの挿入部位のみを必要とする。したがって、本発明の方法を使用して、高い効率で標的断片を捕捉することができる。
【０００５】
代替的な実施形態では、ランダムプライマー伸長反応を、（ｉ）テールアダプタータグ化断片を生成するために、ターミナルトランスフェラーゼを使用してアダプタータグ化断片の上部鎖にオリゴ−ｄＮテールを加えるステップと（５’オーバーハング領域を有するアダプター配列をトランスポザーゼが連結させる鎖として上部鎖を定義する）、（ｉｉ）テールプライマー伸長産物を生成するために、テールプライマーを使用してテールアダプタータグ化断片にプライマー伸長反応を実施するステップと、ここで、テールプライマーが、オリゴ−ｄＮテールとハイブリダイズする３’配列と第２のプライマー配列を含む５’配列とを含む、に置き換えることができることに留意されたい。あるいは、１つまたは複数の遺伝子特異的プライマーをプライマー伸長反応において使用して、第１および第２のプライマー配列を有する遺伝子特異的伸長産物を生成することができる。このような実施形態を使用して遺伝子特異的ライブラリーを生成することができ、またはこれらを標的遺伝子の富化に使用することができる。
【０００６】
本明細書に記載する方法を実施するためのキットも提供する。
【０００７】
本明細書に記載する方法は、ＤＮＡ断片あたり２つのトランスポザーゼアダプターを加えることを必要とする、現在のタグ化プロトコールに優る明らかな利点を提供する。具体的には、ＤＮＡ断片あたり１つのトランスポザーゼアダプターのみを加えるので、本開示の方法によってユーザーは、タグ化部位の片側上のゲノムＤＮＡ配列、従来のトランスポザーゼライブラリー調製法において失われる配列を回収することができる。さらに、（例えば、図３、オプション（ｉｉ）において示したように）直鎖増幅ステップの包含によって限定的な試料投入に関する問題を克服することができる。
【０００８】
当業者は、以下に記載する図面は単なる例示目的であることを理解する。これらの図面は、決して本教示の範囲の限定を意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本開示の態様によるアダプターの構造特徴を概略的に例示する図である。図１の上部に示すアダプターは、トランスポザーゼ認識配列と、５’オーバーハング領域を含む二本鎖領域（Ｒ１と表記する）とを含む。図１の下部に示すアダプターは上部のアダプターと構造が類似しており、Ｒ１中に含まれ得る２つの特異的配列（プライマー配列とバーコード）を示す。
【図２】２つの同一アダプターと複合体形成した（またはそれらが装着された）トランスポザーゼ二量体を概略的に例示する図である。
【図３】本開示の特定態様に従い、ＤＮＡ断片をタグ化し増幅する方法を概略的に例示する図である。この実施形態は、プライマー伸長反応用のランダムプライマーを利用して、トランスポザーゼアダプタータグ化断片から伸長産物を生成する。
【図４】トランスポザーゼアダプタータグ化断片へのオリゴ−ｄＡタグの付加、次いで３’ポリ−ｄＴ配列を有するテールプライマーを使用したプライマー伸長反応の実施形態を概略的に例示する図である。これは図３中に示すランダムプライマーステップの代替となり得る。
【図５】ＦＦＰＥ試料由来の肺腫瘍ＤＮＡ断片の配列分析の結果を示す表である（実施例１参照）。
【図６】ＦＦＰＥ試料由来の乳房腫瘍および胃腫瘍ＤＮＡ断片の配列分析の結果を示す表である（実施例２参照）。
【００１０】
［定義］
例示的な実施形態をさらに詳細に記載する前に、以下の定義を言及して、本記載中で使用する用語の意味および範囲を例示し定義する。
【００１１】
数値の範囲はその範囲を定義する数字を含む。他に示さない限り、それぞれ、核酸は左から右、５’から３’方向に記載し、アミノ酸配列は左から右、アミノ方向からカルボキシ方向に記載する。
【００１２】
他に示さない限り、本発明を実施して、当技術分野の技術範囲内にある従来の有機化学、ポリマー技術、（組換え技術を含めた）分子生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の技法および記載を利用することができる。このような従来の技法には、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および標識を使用したハイブリダイゼーションの検出がある。適切な技法の具体的な例示は、本明細書の以下の実施例を参照することによって得られる。しかしながら、他の同等な従来手順も当然ながら使用することができる。このような従来の技法および記載は、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ）、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（いずれもＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓから）、Ｓｔｒｙｅｒ、Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ  Ｅｄ．）Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｇａｉｔ、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」１９８４、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｘ（２０００）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ａ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５ｔｈ  Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙなどの標準的な研究室マニュアルにおいて見ることができ、これらはいずれもその全体があらゆる目的で参照により本明細書の一部をなすものとする。
【００１３】
本明細書および添付の特許請求の範囲中で使用するように、文脈が明らかに他のことを示さない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。例えば、用語「プライマー」は１つまたは複数のプライマー、すなわち１つのプライマーおよび多数のプライマーを指す。特許請求の範囲を立案して如何なる任意選択の要素も排除できることをさらに留意されたい。このように、この陳述は、特許請求の範囲の要素の詳説に関して、例えば「唯一」、「のみ」などの排他的術語の使用、または「否定的」限定の使用の先行基盤として働くものとする。
【００１４】
本明細書で使用する用語「試料」は、典型的には、必ずしもそうではないが、１つまたは複数の目的の検体を含有する、液状形の物質または物質の混合物に関する。一実施形態では、その広義で使用するこの用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する任意の植物、動物またはウイルス性物質、例えば、個体から単離した（血漿、血清、脳脊髄液、リンパ液、涙、唾液および組織切片を非制限的に含む）、保存組織から単離した（ＦＦＰＥ切片など）、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養成分から単離した組織または体液など、および環境から単離した試料を指す。
【００１５】
本明細書で使用する用語「核酸試料」は、核酸を含有する試料を示す。本明細書で使用する核酸試料は、それらがヌクレオチド配列を含有する多数の異なる分子を含有する点において複合状態であり得る。哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）由来のゲノムＤＮＡ試料は複合タイプの試料である。複合試料は１０４、１０５、１０６または１０７個を超える異なる核酸分子を有する可能性がある。さらに、複合試料は数個の分子のみを含む可能性があり、この場合分子は一括して１０４、１０５、１０６または１０７個を超えるかまたはそれより多くのヌクレオチドを有する。ＤＮＡ標的は、ゲノムＤＮＡ、または人工ＤＮＡ構築物などの任意の供給源に由来し得る。核酸、例えば組織培養細胞から作製したゲノムＤＮＡを含有する任意の試料、または組織の試料を本明細書において利用することができる。
【００１６】
用語「ヌクレオチド」は、周知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の複素環構造塩基も含有する部分を含むことを意図する。このような修飾は、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、アルキル化リボースまたは他の複素環構造塩基を含む。さらに用語「ヌクレオチド」は、ハプテンまたは蛍光標識を含有する部分を含み、従来のリボースおよびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も含有し得る。例えば、１つまたは複数のヒドロキシル基がハロゲン原子または脂肪族官能基に置換され、エーテル、アミンなどとして官能基化される場合、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドも糖部分に修飾を含む。
【００１７】
用語「核酸」と「ポリヌクレオチド」は本明細書では同義で使用して、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成される、任意の長さ、例えば約２塩基より長い、約１０塩基より長い、約１００塩基より長い、約５００塩基より長い、１０００塩基より長い、最大約１０，０００またはそれより長い塩基のポリマーを記載し、これは酵素によってまたは合成によって生成することができ（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号およびその中に引用された参照文献中に記載されたＰＮＡ）、２つの天然に存在する核酸のそれと同様に配列特異的形式で天然に存在する核酸とハイブリダイズすることができ、例えばワトソン−クリックの塩基対形成相互作用に関与し得る。天然に存在するヌクレオチドには、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、およびウラシルがある（それぞれＧ、Ｃ、Ａ、ＴおよびＵ）。ＤＮＡとＲＮＡはそれぞれデオキシリボースおよびリボース糖骨格を有し、一方ＰＮＡの骨格はペプチド結合によって連結した反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成される。
【００１８】
本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、約２〜２００ヌクレオチド、最大５００ヌクレオチド長のヌクレオチドの一本鎖多量体を示す。オリゴヌクレオチドは合成的であってよく、または酵素によって作製することができ、幾つかの実施形態では、３０〜１５０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドはリボヌクレオチドモノマーを含有することができ（すなわち、オリゴリボヌクレオチドであってよく）、またはデオキシリボヌクレオチドモノマー、またはリボヌクレオチドモノマーとデオキシリボヌクレオチドモノマーの両方を含有することができる。オリゴヌクレオチドは、例えば１０〜２０、１１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８０〜１００、１００〜１５０または１５０〜２００ヌクレオチド長であり得る。
【００１９】
用語「プライマー」は、ポリヌクレオチド鋳型とデュプレックスを形成するとき、核酸合成の開始地点として作用することができ、伸長デュプレックスが形成されるように鋳型に沿ってその３’末端から伸長することができる、天然または合成いずれかのオリゴヌクレオチドを意味する。したがってプライマーは、標的核酸中の配列とハイブリダイズし核酸合成地点として作用するほど充分に相補的である、３’核酸配列を含む。プライマーは、３’ハイブリダイズ配列の上流に標的とハイブリダイズしない他の配列（例えば、５’配列）も含み得る。このような他の配列は、目的の領域（例えば、バーコード、他のプライマー配列など）を加える目的であり得る。伸長プロセス中に加えるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。プライマーは、例えばＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得る。プライマーは一般に、プライマー伸長産物の合成におけるそれらの使用に適した長さであり、通常例えば１０〜７５、１５〜６０、１５〜４０、１８〜３０、２０〜４０、２１〜５０、２２〜４５、２５〜４０などの８〜１００ヌクレオチド長の間の範囲、より典型的には１８〜４０、２０〜３５、２１〜３０ヌクレオチド長の範囲、および言及範囲間の任意の長さである。典型的プライマーは、例えば１５〜４５、１８〜４０、２０〜３０、２１〜２５などの１０〜５０ヌクレオチド長の間の範囲、および言及範囲間の任意の長さであり得る。幾つかの実施形態では、プライマーは通常約１０、１２、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０ヌクレオチド長を超えない。
【００２０】
増幅における最大効率のためプライマーは通常一本鎖であるが、代替的に二本鎖である可能性もある。二本鎖である場合、プライマーは通常、伸長産物を調製するため使用する前にその鎖を分離するよう最初に処理する。この変性ステップは典型的には熱により行うが、代替的にアルカリの使用、次に中和によって実施することができる。したがって、「プライマー」は鋳型と相補的であり、水素結合またはハイブリダイゼーションにより鋳型と複合体形成しポリメラーゼによる合成開始のプライマー／鋳型複合体を生成し、これはＤＮＡ合成のプロセス中、鋳型と相補的なその３’末端で連結した共有結合塩基の付加によって伸長される。
【００２１】
用語「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」は、第２の相補的核酸鎖との正常なハイブリダイゼーション条件下、および同じ正常なハイブリダイゼーション条件下で無関係な核酸分子と安定状態のデュプレックスを形成しない条件下で、核酸鎖がアニーリングし、安定状態のデュプレックス、ホモデュプレックスまたはヘテロデュプレックスのいずれかを形成するプロセスを指す。デュプレックスの形成は、ハイブリダイゼーション反応における２つの相補的核酸鎖（またはアニーリングするほど充分相補的な配列）のアニーリングによって実施される。ハイブリダイゼーション反応は、２つの核酸鎖がほぼまたは完全に相補的である特異的配列中に特定数のヌクレオチドを含有しない限り、その２つの核酸鎖間のハイブリダイゼーションが安定状態のデュプレックス、例えば正常なストリンジェンシー条件下で二本鎖形成の領域を保持するデュプレックスを形成しないように、そのハイブリダイゼーション反応が起こる下での（ハイブリダイゼーションストリンジェンシーと呼ばれることが多い）ハイブリダイゼーション条件の調節によって非常に特異的に行うことができる。任意の所与のハイブリダイゼーション反応に関して「正常なハイブリダイゼーションまたは正常なストリンジェンシー条件」は容易に決定される。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、またはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。本明細書で使用する用語「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション」は、塩基対形成により核酸の鎖が相補鎖と結合する任意のプロセスを指す。
【００２２】
中〜高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で２つの配列が互いに特異的にハイブリダイズする場合、核酸は参照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。中〜高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３ｒｄ  ｅｄ．、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９５  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ、Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照）。高ストリンジェンシー条件の一例には、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、０．５％ＳＤＳおよび１００ｕｇ／ｍｌ変性担体ＤＮＡ中の約４２℃におけるハイブリダイゼーション、次に室温における２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で２回、および４２℃における０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中でのさらに２回の洗浄がある。
【００２３】
本明細書で使用する用語「デュプレックス」または「デュプレックス状態」は、塩基対形成した、すなわち一緒にハイブリダイズした２つの相補的ポリヌクレオチドを記載する。
【００２４】
本明細書で使用する用語「増幅」は、鋳型核酸の片鎖または両鎖と相補的である核酸分子を合成するプロセスを指す。核酸分子の増幅は、鋳型核酸の変性、プライマーの融解温度未満である温度における鋳型核酸へのプライマーのアニーリング、および酵素でプライマーから延長して増幅産物を生成することを含み得る。変性、アニーリングおよび延長ステップは、それぞれ１回または複数回実施することができる。特定の場合、増幅産物の量がしばしば指数関数的倍数に増大するように、変性、アニーリングおよび延長ステップが多数回実施されるが、指数関数的増幅は本発明の方法に必要とされない。典型的に増幅は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、およびポリメラーゼ酵素の最適活性に適したバッファーおよび／またはコファクターの存在を必要とする。用語「増幅産物」は、本明細書で定義する増幅プロセスから生じる核酸配列を指す。
【００２５】
「複数」は少なくとも２つの要素を含有する。特定の場合、複数は少なくとも１０個、少なくとも１００個、少なくとも１００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１０６個、少なくとも１０７個、少なくとも１０８個または少なくとも１０９個またはそれより多くの要素を有し得る。
【００２６】
２つの核酸が「相補的」である場合、それらは高ストリンジェンシー条件下で互いにハイブリダイズする。用語「完全に相補的」を使用して、核酸の１つの各塩基が他の核酸中の相補的ヌクレオチドと塩基対形成するデュプレックスを記載する。多くの場合、相補的である２つの配列は相補性である少なくとも１０個、例えば少なくとも１２または１５個のヌクレオチドを有する。
【００２７】
アダプターまたは標的ポリヌクレオチドの文脈では、「プライマー結合部位」または「プライマー配列」は、プライマー（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー）がハイブリダイズするアダプターまたは標的ポリヌクレオチド中の部位を指す。オリゴヌクレオチドがあるプライマー用のプライマー結合部位またはプライマー配列を与えるかまたはそれを含む場合、次いでプライマーはそのオリゴヌクレオチドまたはその相補体（例えば、アダプタータグ化ポリヌクレオチド中のプライマー結合部位／プライマー配列）にハイブリダイズすることができる。
【００２８】
本明細書で使用する用語「ジェノタイピング」は任意のタイプの核酸配列の分析を指し、シーケンシング、多型性（ＳＮＰ）分析、および再編成を確認するための分析を含む。
【００２９】
本明細書で使用する用語「シーケンシング」は、それによってポリヌクレオチドの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの同一性（例えば、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個または少なくとも２００個またはそれより多くの連続ヌクレオチドの同一性）が得られる方法を指す。
【００３０】
用語「次世代シーケンシング」は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏ、ａｎｄ  Ｒｏｃｈｅなどにより現在利用されている、いわゆる並行的シーケンシング→合成またはシーケンシング→ライゲーションプラットフォームを指す。次世代シーケンシング法は、ナノポアシーケンシング法、またはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより実用化されたＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ技術などの電子検出ベース法も含み得る。
【００３１】
本明細書で使用する用語「伸長する」は、ポリメラーゼを使用したヌクレオチドの付加によるプライマーの伸長を指す。核酸にアニーリングするプライマーが伸長する場合、核酸は伸長反応の鋳型として作用する。
【００３２】
本明細書で使用する用語「バーコード」、「バーコード配列」または「分子バーコード」は、ａ）反応中のポリヌクレオチドの源を確認および／または追跡するため、および／またはｂ）（例えば、試料中のほぼ全ての分子が異なる配列でタグ化され、次いでその試料を増幅する場合）初期分子が何回シーケンシングされたか数えるために使用する、特有のヌクレオチド配列を指す。バーコード配列は大きさと組成が幅広く変わる可能性があり、以下の参照文献は特定の実施形態に適したバーコード配列のセットの選択に関する指針を与える：Ｃａｓｂｏｎ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１１、２２ｅ８１）、Ｂｒｅｎｎｅｒ、米国特許第５，６３５，４００号；Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９７：１６６５−１６７０（２０００）；Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４：４５０−４５６（１９９６）；Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ、欧州特許公開０７９９８９７Ａ１；Ｗａｌｌａｃｅ、米国特許第５，９８１，１７９号など。特定の実施形態では、バーコード配列は４〜３６ヌクレオチド、または６〜３０ヌクレオチド、または８〜２０ヌクレオチドの範囲の長さを有し得る。
【００３３】
バーコード中の「縮重塩基領域」または「ＤＢＲ」は、ＤＢＲが加えられた断片を識別するのを助けるほど充分な複雑性を有するタイプの分子バーコードを指す。幾つかの場合、ほぼ全てのタグ化断片は異なるＤＢＲ配列を有し得る。これらの実施形態では、高い複雑性のＤＢＲ（例えば、少なくとも１０，０００または１００，０００配列で構成されるＤＢＲ）を使用することができる。他の実施形態では、数個の断片を同じＤＢＲ配列でタグ化することができるが、これらの断片は（ｉ）ＤＢＲ配列、（ｉｉ）断片の配列、（ｉｉｉ）断片の末端の配列、および／または（ｉｖ）断片中へのＤＢＲの挿入部位の組合せによってさらに識別することができる。幾つかの実施形態では、少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％の標的ポリヌクレオチドが異なるＤＢＲ配列と結合した状態になる。幾つかの実施形態では、ＤＢＲは（ＩＵＰＡＣコードにより定義された）Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｋ、Ｍ、Ｂ、Ｄ、Ｈ、Ｖ、Ｎから選択される１つまたは複数の（例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または５〜３０個またはそれより多くの）ヌクレオチドを含むことができる。
【００３４】
幾つかの場合、ＤＢＲはエラー修正であり得る。例示的なエラー確認（またはエラー修正）配列の記載は文献全体で見ることができる（例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開ＵＳ２０１０／０３２３３４８およびＵＳ２００９／０１０５９５９中に記載されている）。エラー修正可能コードは分子の絶対数を定量化するのに必要であり得る。文献中の多くの報告は、バイナリーシステムのエラー修正用に本来開発されたコード（Ｈａｍｍｉｎｇコード、Ｒｅｅｄ  Ｓｏｌｏｍｏｎコードなど）を使用し、またはクアターナリーシステムにこれらを適用する（例えば、クアターナリーＨａｍｍｉｎｇコード；Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ＤＮＡ  ｂａｒｃｏｄｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｈａｍｍｉｎｇ  ｃｏｄｅｓ、Ｂｙｓｔｒｙｋｈ２０１２ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２  ７：ｅ３６８５２を参照）。
【００３５】
幾つかの実施形態では、ＤＢＲをさらに使用して、分析された初期標的ポリヌクレオチド分子の数を決定することができる、すなわち分析された初期標的ポリヌクレオチド分子の数を「数える」ことができる。ＤＢＲでタグ化された分子のＰＣＲ増幅によって、異なる第二次集団のそれぞれが１つのタグ化分子から増幅される点でクローン関係にある、産物の多数の第二次集団をもたらす。明らかとなるように、任意のクローン関係にあるＰＣＲ産物の第二次集団中には数千または数百万またはそれより多くの分子が存在する可能性があり、これらのクローン関係にある第二次集団中の標的分子の数は大幅に変わる可能性があるが、方法の第１のステップ中でタグ化した分子の数は、ＰＣＲ産物の集団中に現れる標的配列と結合したＤＢＲ配列の数を数えることによって推定することができる。ある実施形態では、この方法を使用して作製したＰＣＲ産物の集団をシーケンシングして複数の配列を生成することができるので、この数値は有用である。標的ポリヌクレオチドの配列と結合した異なるＤＢＲ配列の数を数えることができ、（例えば、断片の配列、断片の末端の配列、および／または断片中へのＤＢＲの挿入部位と共に）この数値を使用して、シーケンシングされた初期鋳型核酸分子の数を推定することができる。
【００３６】
用語「試料識別子配列」は、標的ポリヌクレオチドに追加することができるタイプのバーコードであり、この配列は標的ポリヌクレオチドの源（すなわち、どの試料に標的ポリヌクレオチドが由来するか）を特定する。使用中、それぞれの試料は異なる試料識別子配列でタグ化し（例えば、一配列をそれぞれの試料に追加し、この場合異なる試料に異なる配列を追加し）、タグ化試料をプールする。プールした試料をシーケンシングした後、試料識別子配列を使用して配列の源を確認することができる。
【００３７】
本明細書で使用する用語「鎖」は、共有結合、例えばホスホジエステル結合によって１つに結合したヌクレオチドで構成される核酸を指す。細胞中、通常ＤＮＡは二本鎖型で存在し、このように、本明細書で「上部」鎖および「下部」鎖と呼ぶ核酸の２つの相補鎖を有する。特定の場合、染色体領域の相補鎖は、「プラス」鎖および「マイナス」鎖、「第１の」鎖および「第２の」鎖、「コード」鎖および「非コード」鎖、「ワトソン」鎖および「クリック」鎖、または「センス」鎖および「アンチセンス」鎖と呼ぶことができる。上部鎖および下部鎖としての鎖の割り当ては任意であり、如何なる特定の方向、機能または構造も意味しない。幾つかの例示的な哺乳動物染色体領域（例えば、ＢＡＣ、アセンブリー、染色体など）の第１の鎖のヌクレオチド配列は知られており、例えばＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベース中で見ることができる。
【００３８】
本明細書で使用する用語「上部鎖」は、核酸の両鎖ではなく核酸の片鎖を指す。オリゴヌクレオチドまたはプライマーが「上部鎖のみと」結合またはアニーリングするとき、それは一鎖とのみ結合し他の鎖とは結合しない。本明細書で使用する用語「下部鎖」は、「上部鎖」と相補的である鎖を指す。オリゴヌクレオチドが「一鎖のみと」結合またはアニーリングするとき、それは一鎖、例えば第１の鎖または第２の鎖とのみ結合し他の鎖とは結合しない。
【００３９】
用語「リバースプライマー」および「フォワードプライマー」は、二本鎖ＤＮＡ分子中の異なる鎖とハイブリダイズするプライマーを指し、この場合ポリメラーゼによるプライマーの伸長は他のプライマーに向かう方向である。ＰＣＲにおいて、標的核酸を増幅するために使用するフォワードプライマーとリバースプライマーは「プライマー対」と呼ばれる。
【００４０】
本明細書で使用する用語「１ｋｂ長未満のＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片の集団」は、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の断片分子が１ｋｂ長未満である断片の集団を指す。幾つかの実施形態では、このような集団は５０〜５００ｂｐ、例えば１００〜４００ｂｐの範囲内の平均断片長を有し得る。
【００４１】
本明細書で使用する用語「オリゴ−ｄＮテール」は、ターミナルトランスフェラーゼの作用によりＤＮＡ分子の鎖の３’末端に加えられたＧｓ、Ａｓ、ＴｓまたはＣｓのテールを指す。テールは１０個〜１００個を超えるヌクレオチドを有し得る。
【００４２】
本明細書で使用する用語「オリゴ−ｄＮテールとハイブリダイズするプライマー」は、その３’末端に８〜２０個またはそれより多くの塩基のオリゴ−ｄＧ、オリゴ−ｄＡ、オリゴ−ｄＴまたはオリゴ−ｄＣ領域を有するプライマーを指し、この場合これらの塩基は断片に加えられた相補的ホモポリマーテールとハイブリダイズする。
【００４３】
本明細書で使用する用語「バーコードの配列」は、バーコードを構成するヌクレオチドの配列を指す。バーコードの配列は少なくとも３ヌクレオチド長、幾つかの場合５〜３０以上のヌクレオチド長であり得る。
【００４４】
本明細書で使用する用語「マッチ」は、２配列を比較した作用状態を指し、それらが同一、相補的、または非常に類似的（例えば、エラー修正バーコードを使用したとき）である場合、それらはマッチした状態として示される。幾つかの実施形態では、マッチした配列が一群中に配列する。
【００４５】
本明細書で使用する用語「マッチした配列読み枠の構築」は、マッチした読み枠（すなわち、同一または非常に類似したバーコードを含有する配列またはその相補体）を互いに一直線に並べて、マッチした配列読み枠によってもたらされるサブ配列（ｓｕｂ−ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）で構成された構築配列を得る、コンピューターによって行われるステップを指す。幾つかの実施形態では、配列構築は同一バーコードを有する配列読み枠からのコンセンサス配列の作製、および次いでそのコンセンサス配列からの配列の構築を含み得る。構築配列は時折「コンティグ」と呼ばれる。
【００４６】
本明細書で使用する用語「またはその変異体」は、周知の活性を有するタンパク質と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を指し、変異体は周知の活性のタンパク質と同じ活性を少なくともある程度有する。例えば、野生型トランスポザーゼの変異体は、ＤＮＡへの対応するトランスポザーゼの挿入を触媒することができるはずである。
【００４７】
用語「充填反応」または「ギャップの充填」は、ＤＮＡデュプレックスの一鎖中の（ヌクレオチドを欠く）５’オーバーハング領域および／または内部鎖切断部またはギャップを（例えば、ＤＮＡポリメラーゼの作用により）鋳型特異的形式で充填し、必要なときは、（例えば、ＤＮＡリガーゼの作用により）１つに連結させる酵素触媒反応を指す。
【００４８】
他の用語の定義は本明細書を通じて出現する可能性がある。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
様々な実施形態を記載する前に、本開示の教示は記載する特定の実施形態に限られず、そのように、当然ながら変わり得ることを理解されたい。本教示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用する術語は単に特定の実施形態を記載する目的であり、限定的であることは意図しないことも理解されたい。
【００５０】
本明細書で使用する項目の見出しは単なる編成目的であり、決して記載する主題を限定するものとして解釈すべきではない。本教示は様々な実施形態に関して記載するが、本教示がこのような実施形態に限定されることは意図しない。反対に、当業者によって理解されるように、本教示は様々な代替、変更形態、および均等物を包含する。
【００５１】
他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様または同等の任意の方法および材料も、本教示の実施または試験において使用することはできるが、幾つかの例示的な方法および材料をここに記載する。
【００５２】
任意の刊行物の引用は出願日より前のその開示のためであり、本発明の特許請求の範囲が、従来の発明によるこのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈すべきでない。さらに、示された公開日は、別個に確認する必要があり得る実際の公開日とは異なる可能性がある。
【００５３】
本開示を読むことによって当業者に明らかとなるように、本明細書で記載し例示する個々の実施形態のそれぞれが、本教示の範囲または趣旨から逸脱せずに、他の幾つかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離するかまたはそれらと組み合わせることができる、別々の成分および特徴を有する。任意の列挙した方法は、引用した事象の順序または理論上可能である任意の他の順序で実施することができる。
【００５４】
本明細書で言及する全ての特許および刊行物は、このような特許および刊行物内で開示された全ての配列を含めて、明示的に参照により本明細書の一部をなすものとする。
【００５５】
本明細書で提供するのは、２つの同一アダプターが装着されたトランスポザーゼ二量体を使用して、短鎖ＤＮＡ断片を含有する試料をタグ化するための様々な方法である。ある実施形態では、短鎖ＤＮＡ断片は約２００ｂｐ、５００ｂｐ、７００ｂｐ、９００ｂｐ、１Ｋｂ、１．２Ｋｂ、１．５Ｋｂの平均長を含めた約１５０ｂｐ〜約１．５Ｋｂの平均長、およびこの間の平均長を有する。幾つかの実施形態では、例えばエンドヌクレアーゼを用いたせん断または処置により、ＤＮＡ試料を処理してこの範囲内の平均長を得る。図１は、トランスポザーゼ認識配列およびＲ１と指定する５’オーバーハング領域を含む二本鎖領域（鎖の５’および３’末端を示す）を有する一般的アダプター（上部アダプター）を示す。Ｒ１は一本鎖であり、任意の数個の異なる機能性配列またはドメインを含み得る。例えば、（図１中の下部アダプター中に示したように）Ｒ１領域はプライマー配列およびバーコードを含み得る。図２は、２つの同一アダプターと複合体形成した／それらが装着されたトランスポザーゼ二量体を示す。
【００５６】
幾つかの方法を利用して、植物、動物（例えば、爬虫類、哺乳動物、昆虫、蠕虫、魚類など）、組織試料、細菌、真菌（例えば、酵母）、ファージ、ウイルス、死体組織、古細菌／古代生物試料などに限られないが、これらを含めた、ほぼ任意の生物由来のゲノムＤＮＡを分析することができる。ある実施形態では、方法中で使用するゲノムＤＮＡは哺乳動物に由来する可能性があり、ある実施形態では、哺乳動物はヒトである。例示的実施形態では、試料はヒト、マウス、ラット、またはサル細胞などの哺乳動物細胞由来のゲノムＤＮＡを含有し得る。試料は、培養細胞または臨床試料の細胞、例えば生検材料組織、スクレープ（ｓｃｒａｐｅ）または洗浄液または法医学用試料の細胞（すなわち、犯罪現場で回収した試料の細胞）から作製することができる。特定の実施形態では、核酸試料を、細胞、組織、体液、および大便などの生物学的試料から得ることができる。目的の体液には、血液、血清、血漿、唾液、粘液、痰、脳脊髄液、胸膜液、涙、乳腺液、リンパ液、喀痰、滑液、尿、羊水、および精液があるが、これらに限られない。特定の実施形態では、試料を対象、例えばヒトから得ることができる。
【００５７】
幾つかの実施形態では、試料は、臨床試料由来、例えばがん、炎症性疾患もしくは妊娠などの疾患または状態を有するかまたはこれらを有する疑いがある患者由来のＤＮＡ断片を含む。幾つかの実施形態では、保管された患者の試料、例えばホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料から断片状ＤＮＡを抽出することによって、試料を作製することができる。他の実施形態では、患者の試料は、体液、例えば末梢血由来の無細胞循環ＤＮＡの試料であり得る。方法の初期ステップ中で使用するＤＮＡ断片は、事前に変性していない非増幅ＤＮＡでなければならない。機械的に（例えば、超音波処理、噴霧、またはせん断によって）、または二本鎖ＤＮＡフラグメンターゼ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ）を使用して酵素により、試料を断片化することができる。他の実施形態では、初期試料中のＤＮＡが既に断片化している可能性がある（例えば、ＦＦＰＥ試料および循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、例えばｃｔＤＮＡに関する場合）。初期試料中の断片は１ｋｂ未満である（例えば、５０ｂｐ〜５００ｂｐ、８０ｂｐ〜４００ｂｐ、または１００ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲内の）平均サイズを有し得るが、この範囲外の平均サイズを有する断片を使用することができる。無細胞または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、すなわちがん患者の血液中を自由に循環する腫瘍ＤＮＡは、平均断片サイズ約１６５〜２５０ｂｐで高度に断片化される（Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１４  ２０：５４８−５４）。全血を遠心分離して全細胞を除去し、次いで残存血漿を分析することによりｃｆＤＮＡを得ることができる。
【００５８】
幾つかの実施形態では（および図３中に示すように）、本方法は、アダプタータグ化断片を生成するために、二本鎖ＤＮＡ断片を含む試料２とそれぞれアダプターが装着された複数のトランスポザーゼデュプレックス１を接触させるステップを含み得る（１つのみのＤＮＡ断片とトランスポザーゼデュプレックスを示す）。ある実施形態では、ＤＮＡ断片は１ｋｂ未満の平均長を有する。アダプターは、トランスポザーゼ認識配列を含むデュプレックス領域（図１中の黒塗り部分）および第１のプライマー（タグ）配列を含む５’オーバーハング領域（図１中の白塗り部分）を含む。使用するトランスポザーゼおよび／または試料の量を調整して、比較的高い割合のタグ化断片、例えば少なくとも２５％、少なくとも５０％、または少なくとも７５％のタグ化断片、特に５００ｂｐ長未満である小断片が平均１箇所挿入されるように、８０〜５００ｂｐ毎（例えば、１００〜３００ｂｐ毎）にトランスポザーゼ挿入部分を生成することができる。生成するタグ化断片の集団３は、１つの末端に結合した１つのアダプターを含有する断片の集団を含有する（１つのタグ化ＤＮＡ断片のみを図３中に示す）。このタグ化ＤＮＡ断片の上部鎖は、５’から３’方向に、５’オーバーハング配列（Ｒ１と示す白塗り部分）、トランスポザーゼ認識配列（黒塗り部分）の一本鎖、およびＤＮＡ断片の一本鎖を含む。下部鎖は、３’から５’方向に、トランスポザーゼ認識配列の相補鎖、ギャップ／ニック（スペース）、およびＤＮＡ断片の相補鎖を含む。このタグ化ＤＮＡ断片の非タグ化末端は（示したように）不均一または平滑（示さず）であり得ることに留意されたい。
【００５９】
本方法のこのステップ中で使用するトランスポザーゼは、Ｔｎトランスポザーゼ（例えば、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、Ｔｎ１０、Ｔｎ５５２、Ｔｎ９０３）、ＭｕＡトランスポザーゼ、Ｖｉｂｈａｒトランスポザーゼ（例えば、ビブリオハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）由来）、Ａｃ−Ｄｓ、Ａｓｃｏｔ−１、Ｂｓ１、Ｃｉｎ４、Ｃｏｐｉａ、Ｅｎ／Ｓｐｍ、Ｆエレメント、ｈｏｂｏ、Ｈｓｍａｒ１、Ｈｓｍａｒ２、ＩＮ（ＨＩＶ）、ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３、ＩＳ４、ＩＳ５、ＩＳ６、ＩＳ１０、ＩＳ２１、ＩＳ３０、ＩＳ５０、ＩＳ５１、ＩＳ１５０、ＩＳ２５６、ＩＳ４０７、ＩＳ４２７、ＩＳ６３０、ＩＳ９０３、ＩＳ９１１、ＩＳ９８２、ＩＳ１０３１、ＩＳＬ２、Ｌ１、Ｍａｒｉｎｅｒ、Ｐエレメント、Ｔａｍ３、Ｔｃ１、Ｔｃ３、Ｔｅｌ、ＴＨＥ−１、Ｔｎ／Ｏ、ＴｎＡ、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、Ｔｎ１０、Ｔｎ５５２、Ｔｎ９０３、Ｔｏｌ１、Ｔｏｌ２、ＴｎｌＯ、Ｔｙｌ、これらの変異体を含めたトランスポザーゼであってよい。幾つかの場合、１つまたは複数の陽イオンを加えることにより挿入を助長および／または誘発することができる。陽イオンは、例えばＣａ２＋、Ｍｇ２＋およびＭｎ２＋などの二価陽イオンであってよい。
【００６０】
ある実施形態では、本方法の次のステップは、ランダムプライマー伸長産物５を生成するために、ランダムプライマー４を使用しアダプタータグ化断片の上部鎖１１にプライマー伸長反応を実施するステップ（図３中の下向き矢印（ｉ））を含み得る。ランダムプライマーは、ランダム３’配列（Ｎが任意のヌクレオチドである「Ｎｓ」によって示される）および第２のプライマー配列を含む５’配列（ハッシュがけ領域）を含む。伸長は破線矢印によって示す。好ましいＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換またはニックトランスレーション（５’−３’エクソ）活性を示し、上部鎖の最も３’末端へのランダムプライマーのアニーリング、および短鎖下流産物を置換しながらの完全長産物の合成を可能にする。
【００６１】
代替的な実施形態では、ランダムプライマーの代わりに１つまたは複数の遺伝子特異的プライマーを使用して、プライマー伸長反応を実施する。これらの実施形態では、アダプタータグ化断片の上部鎖１１を、遺伝子特異的プライマーを使用して伸長させ（示さず）遺伝子特異的プライマー伸長産物を生成する。このように、多くのアダプタータグ化断片は、その内部配列に特異的である遺伝子特異的プライマーが存在しないため伸長しない。遺伝子特異的プライマーは、（図３中のランダムプライマー４と類似した）第２のプライマー配列を含む遺伝子特異的３’配列および５’配列を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子特異的プライマーのプールを使用して１つまたは複数の特異的遺伝子（または他の遺伝子座）を伸長させ、任意の所望数の異なるプライマー、例えば２〜１０，０００個の異なる遺伝子特異的プライマーを含有し得る。
【００６２】
他の実施形態では、ランダムプライマー伸長反応（および図３中の下向き矢印（ｉｉ））の前に、本方法は、完全なトランスポザーゼタグ化断片デュプレックス８を形成するために、トランスポザーゼタグ化断片、Ｒ１配列と相補的な配列の下部鎖を充填し、ギャップを充填する（破線矢印６および上向き矢印７）ためのアダプタータグ化断片に伸長または伸長／ライゲーション反応を実施するステップを含むことができる（Ｒ１と相補的な配列はＲ１’で示す）。次いでこれらの完全なトランスポザーゼタグ化断片デュプレックスに、その３’末端に第１のプライマー配列を含む直鎖増幅プライマーＰ１を用いて直鎖増幅反応を施し、デュプレックス９を生成することができる。直鎖増幅反応は（「反復」矢印で示したように）反復することができ、これによってデュプレックス９の上部鎖のさらなるコピーが生じる（示さず）。直鎖増幅反応は、任意の所望回数、例えば２〜４０回、例えば４回、１０回、２０回、３０回など実施することができる。
【００６３】
次いで、直鎖増幅反応産物に、前に記載したようにランダムプライマー伸長を施し、ランダムプライマー伸長産物５を生成することができる。
【００６４】
ある実施形態では、アダプターおよび／またはランダムプライマーのいずれかが少なくとも１つの他の領域を含む。例えば、アダプターおよび／またはランダムプライマーはバーコードを含むことができる。バーコードは試料特異的バーコード、すなわちＤＮＡ断片が由来する試料を確認するために使用されるバーコードであってよい。幾つかの実施形態では、バーコードは縮重塩基領域（ＤＢＲ）を含み、その使用は前で詳細に記載している。アダプターおよび／またはリバースプライマーにおいてバーコードの任意の組合せを使用することができる。アダプターとランダムプライマーの両方がバーコードを含む実施形態では、バーコードはアダプターとリバースプライマーにおいて同じである可能性があり、またはそれらは、ユーザーの要望、および下流プロセス／分析中でのバーコードの使用のされ方に応じて１箇所または複数個所で異なる可能性がある。
【００６５】
次に、本方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物１０を生成するために、その３’末端に第１のプライマー配列を含むフォワードプライマーＰ１およびその３’末端に第２のプライマー配列を含むリバースプライマーＰ２を使用し、ＰＣＲによりランダムプライマー伸長産物５を増幅するステップを含む。これらの産物は、試料由来のＤＮＡ断片由来配列（グレー）およびドメインＲ１とＲ２の全体または一部（例えば、フォワードプライマーＰ１とリバースプライマーＰ２によって結合したドメインＲ１とＲ２の一部）を含有する。
【００６６】
ある実施形態では、図３中に示したランダムプライマー伸長反応は他の直鎖増幅プロセスに置き換えることができる。例えば、図４中に示したように、本方法は、テールアダプタータグ化断片１２を生成するために、鋳型非依存的ポリメラーゼ活性を有するターミナルトランスフェラーゼまたは修飾ＤＮＡポリメラーゼを使用し、アダプタータグ化断片の上部鎖１１にオリゴ−ｄＮテールを加えるステップを含むことができる（この場合、ｄＮテールはポリ−Ａテールである）。次いでプライマー伸長反応を、テールプライマー１３を使用しテールアダプタータグ化断片１２に実施してテールプライマー伸長産物１４を生成する。テールプライマーは、オリゴ−ｄＮテールとハイブリダイズする３’配列（この場合ポリ−Ｔ配列）および第２のプライマー配列Ｐ２を含む５’配列Ｒ２を含む。これらのテールプライマー伸長産物１４は、その３’末端に第１のプライマー配列Ｐ１を含むフォワードプライマーおよびその３’末端に第２のプライマー配列Ｐ２を含むリバースプライマーを使用し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅してＰＣＲ増幅産物１５を生成することができる（前に記載したＰＣＲ増幅と同様）。
【００６７】
これらのＰＣＲ増幅産物は、ユーザーによって望まれるように任意の所望の下流プロセスまたは分析に使用することができる。
【００６８】
ユーザーは、所望により、試料富化ステップ、試料浄化ステップ、および／または酵素不活性化または除去ステップを含めることができることをここで留意されたい。例えば、ＤＮＡ断片の初期試料を、例えばハイブリダイゼーションベースの標的富化（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔまたはＨａｌｏＰｌｅｘ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を使用して、目的の特定の標的配列（複数可）に関して富化することができる。さらに、方法の任意の１ステップにおいて生成した産物を、例えば、増幅産物精製（例えば、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ精製キット）、次のステップを実施する前に精製することができる。この点に関する制約は考えられない。
【００６９】
ある実施形態では、本方法はＰＣＲ増幅産物１０のシーケンシングをさらに含むことができる。明らかであろうが、これらの実施形態では、所望のシーケンシングプラットフォームに適した配列を、例えばアダプター、ランダムプライマー、直鎖増幅プライマー、フォワードプライマー、またはリバースプライマーの一部として、方法中のいずれかの好都合なステップで断片に加えることができる。このように、２つのシーケンシングプライマー配列をシーケンシングプラットフォームで使用する実施形態では、第１のシーケンシングプライマー配列は、（ｉ）第１のプライマー配列、（ｉｉ）フォワードＰＣＲプライマーの５’テール上、または（ｉｉｉ）アダプター中の第１のプライマー配列の下流であってよく、第２のシーケンシングプライマー配列は、（ｉ）第２のプライマー配列、（ｉｉ）リバースプライマーの５’テール上、または（ｉｉｉ）ランダムプライマー上の第２のプライマー配列の下流であってよい。Ｉｌｌｕｍｉｎａの可逆的ターミネーター法、Ｒｏｃｈｅのパイロシーケンシング法（４５４）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのライゲーションによるシーケンシング（ＳＯＬｉＤプラットフォーム）、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｏｎ  ＴｏｒｒｅｎｔプラットフォームまたはＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの蛍光ベースの切断法に限られないが、これらを含めた任意の適切な方法を使用して産物をシーケンシングすることができる。このような方法の幾つかの例は以下の参照文献、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ２００５  ４３７：３７６−８０）；Ｒｏｎａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９６  ２４２：８４−９）；Ｓｈｅｎｄｕｒｅ（Ｓｃｉｅｎｃｅ２００５  ３０９：１７２８）；Ｉｍｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｒｉｅｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２００９  １０：６０９−１８）；Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；５５３：７９−１０８）；Ａｐｐｌｅｂｙ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；５１３：１９−３９）Ｅｎｇｌｉｓｈ（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２  ７：ｅ４７７６８）およびＭｏｒｏｚｏｖａ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００８  ９２：２５５−６４）中に記載されており、これらは、各ステップに関する全ての出発物質、試薬、および最終産物を含めた方法および方法の特定のステップの一般的記載に関して、参照により本明細書の一部をなすものとする。
【００７０】
シーケンシングステップは、ＤＮＡ断片配列の少なくとも一部分の配列、およびアダプターおよび／またはリバース／テールプライマー中に存在するタグ化ＤＮＡ断片中の他の配列、例えばバーコードの配列を含む複数の配列の読み枠をもたらす。配列の読み枠をマッチさせ構築して、試料中のＤＮＡ断片の平均配列長より長い配列を表す構築配列（例えば、コンティグ）を得ることができる。このようなコンティグは、初期試料が由来した個体由来の所望のポリヌクレオチド配列（例えば、遺伝子、遺伝子座、ｃＤＮＡなど）の大部分または全体を表し得る。明らかとなるように、方法のこの部分は、少なくとも幾つかの配列読み枠中のバーコードを互いに比較してマッチを得ること、およびマッチした配列読み枠を構築して目的の配列を得ることを含み得る。幾つかの実施形態では、試料特異的バーコードを有する異なる試料由来の（例えば、異なる個体由来の）ＤＮＡ断片を、バーコードを加えた後およびシーケンシングステップ前の、いずれかの好都合なステップで組み合わせる。試料特異的バーコードの配列を含むこれらの組合せ試料由来の配列は、望む場合デコンボリューション処理（ｄｅ−ｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）および構築することができる。
【００７１】
前に記載した任意の方法において、方法は、何個のＤＢＲ配列が特定の配列と結合しているか決定し、それによって初期試料中のその配列のコピー数の推定値を得ることをさらに含むことができる。このような方法は、他の刊行物間ではＣａｓｂｏｎ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１１、２２ｅ８１）中に記載されている。
【００７２】
ある実施形態では、分析対象の初期ＤＮＡは１つの供給源（例えば、１つの生物、ウイルス、組織、細胞、対象など）に由来してよく、一方他の実施形態では、核酸試料は複数の供給源から抽出した核酸のプール（例えば、複数の生物、ウイルス、組織、細胞、対象などに由来する核酸のプール）であってよく、この場合「複数」によって２個以上を意味する。このように、ある実施形態では、１つのトランスポザーゼタグ化試料を、他の供給源、例えば２個以上の供給源、３個以上の供給源、５個以上の供給源、１０個以上の供給源、５０個以上の供給源、１００個以上の供給源、５００個以上の供給源、１０００個以上の供給源、５０００個以上の供給源、最大約１０，０００個またはそれより多くの供給源由来の複数のトランスポザーゼタグ化試料と組み合わせることができ、トランスポザーゼの分子バーコードによって、それらを分析した後に異なる供給源由来の配列を識別できる。
【００７３】
理解されるであろうが、方法の幾つかの分析ステップ、例えば比較ステップと構築ステップはコンピューターで実行することができる。ある実施形態では、一般目的のコンピューターを本明細書で開示する方法およびプログラム向けの機能機構に設定することができる。このようなコンピューターのハードウェアアーキテクチャーは当業者にはよく知られており、１つまたは複数のプロセッサー（ＣＰＵ）、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリー（ＲＯＭ）、内部または外部データ記憶媒体（例えば、ハードディスクドライブ）を含めたハードウェアコンポーネントを含み得る。コンピューターシステムは、グラフィック情報を処理しディスプレイ手段に出力するための１つまたは複数のグラフィックボードも含み得る。前述のコンポーネントは、コンピューター内でバスを介して適切に相互接続することができる。コンピューターは、例えばモニター、キーボード、マウス、ネットワークなどの一般目的外部コンポーネントと通信するのに適したインターフェースをさらに含むことができる。幾つかの実施形態では、コンピューターは並列処理をすることができ、または本発明の方法およびプログラムに関する処理能力を高めるための並列または分散コンピューティング用に設定されたネットワークの一部であり得る。幾つかの実施形態では、記憶媒体からのプログラムコードの読み取り値を、コンピューターに挿入された拡張ボード、もしくはコンピューターに接続した拡張ユニット、および拡張ボードに備えられたＣＰＵなどに与えられたメモリーに書き込むことができ、または拡張ユニットは、プログラムコードの命令に従いオペレーションの一部もしくは全部を実際に実行して、以下に記載する機能を果たすことができる。他の実施形態では、クラウドコンピューティングシステムを使用して方法を実施することができる。これらの実施形態では、データファイルおよびプログラミングを、プログラムを走らせユーザーに出力を返すクラウドコンピューターにエクスポートすることができる。
【００７４】
システムは、ある実施形態では、ａ）セントラルプロセッシングユニット、ｂ）ソフトウェアおよびデータ記憶用の１つまたは複数のハードドライブを含み得るメイン不揮発性記憶ドライブ、ここにおいて記憶ドライブはディスクコントローラーによって制御される、ｃ）不揮発性記憶ドライブからロードされたプログラムおよびデータを含めたシステムコントロールプログラム、データ、およびアプリケーションプログラムの記憶用のシステムメモリー、例えば高速ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、ここにおいてシステムメモリーは読み出し専用メモリー（ＲＯＭ）も含み得る、ｄ）マウス、キーパッド、およびディスプレイなどの１つまたは複数の入力または出力デバイスを含めたユーザーインターフェース、ｅ）任意の有線またはワイヤーレス通信ネットワーク、例えばプリンターと接続するための任意選択のネットワークインターフェースカード、およびｆ）前述のシステムの構成部品と相互接続するための内部バスを含むコンピューターを含む。
【００７５】
＜キット＞
本開示によってさらに提供するのは、前に記載したように主題の方法を実施するためのキットである。ある実施形態では、キットはそれぞれアダプターが装着された複数のトランスポザーゼデュプレックス（またはこのようなデュプレックスを作製するための別のトランスポザーゼおよびアダプター試薬）を含むことができ、アダプターは、トランスポザーゼ認識配列を有するデュプレックス領域および第１のプライマー配列を含む５’オーバーハング領域、ランダム３’配列および第２のプライマー配列を含む５’配列を有するランダムプライマー、またはオリゴ−ｄＮテールとハイブリダイズする３’配列および第２のプライマー配列を含む５’配列を有するテールプライマー、その３’末端に第１のプライマー配列を有するフォワードプライマー、およびその３’末端に第２のプライマー配列を有するリバースプライマーを含む。幾つかの実施形態では、キットは別々の容器中に多数の異なるアダプターを含むことができ、それぞれの異なるアダプターは異なる試料由来のタグＤＮＡ断片と異なるバーコード配列を有する。キットは、本明細書に記載する任意の方法を実施するための、他の試薬を含むことができる。例えばキットは、酵素（例えば、リガーゼ、ポリメラーゼ、耐熱性ポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼなど）、ヌクレオチド、バッファー、核酸精製試薬などを含むことができる。
【００７６】
キットの様々な成分は別々の容器中に存在する可能性があり、または望む場合、特定の適合成分を１つの容器中で予め組み合わせることができる。前に記載した試薬以外に、キットは、前に記載した方法中で使用するいずれか他の成分、例えば１つまたは複数の酵素および／またはバッファーなどを含有し得る。
【００７７】
前述の成分以外に、主題のキットは、キットの成分を使用して主題の方法を実施するための説明書、すなわち試料分析用の説明書をさらに含むことができる。主題の方法を実施するための説明書は、一般に適切な記録媒体上に記録されている。例えば説明書は、紙またはプラスチックなどの基体上に印刷することができる。このように、説明書は、添付文書として、キットの容器またはその成分のラベルで（すなわち、パッケージングまたはサブパッケージング（ｓｕｂｐａｃｋａｇｉｎｇ）などに付随して）キット中に存在し得る。他の実施形態では、説明書は適切なコンピューター可読記憶媒体、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケットなどの上に電子媒体記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の説明書はキット中に存在しないが、リモートソースから、例えばインターネットを介して説明書を得るための手段を提供する。この実施形態の一例はウェブアドレスを含むキットであり、この場合説明書はウェブアドレスで見ることができ、および／またはそこから説明書をダウンロードすることができる。説明書に関して、説明書を得るためのこの手段は適切な基体に記録される。
【実施例】
【００７８】
以下の実施例を言及して、これらは本発明の作製および使用の仕方に関する完全な開示と記載を当業者に示し、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定するものではなく、以下の実験が実施した全てまたは唯一の実験であることを表すものでもない。使用した数値（例えば、量、温度など）に関する精度を保証するための努力は尽くしたが、ある程度の実験誤差および偏差は考慮しなければならない。
【００７９】
［材料および方法］
＜試料ＤＮＡの断片化およびＲ１アダプター配列の挿入＞
トランスポザーゼ装着配列：（１Ａ）５’−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＡＴＣＡＣＡＡＧＴ−３’（配列番号１）；５’−ＧＣＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＡＣＴＴＧＴＧＡＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号２）。（１Ａ）を装着した１００ｎｇのトランスポザーゼをＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＱＸＴバッファー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐ／Ｎ  ５１９０−７０５３）中で１０ｎｇの試料ＤＮＡと混合する。次いで試料を４２℃で１０分間インキュベートする。試料を４℃に冷却し、次いで３２μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＱＸＴ反応停止液（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐ／Ｎ  ５１９０−７０５９）を加え、室温で１分間インキュベートする。試料の浄化：試料ＤＮＡを５０μｌのＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐ／Ｎ  Ａ６３８８２）と結合させ、７０％エタノールで２回洗浄し、３７℃においてヒートブロック上で乾燥させ、２０μｌの水中にＤＮＡを溶出する。
【００８０】
＜１Ａを用いた第１の鎖の直鎖環状化＞
第１の鎖の直鎖環状化用プライマー：５’−ＧＣＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＡＣＴＴＧＴＧＡ−３’（配列番号３）。反応設定（５０μｌ）：１７．５μｌの水、１０μｌのＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ反応用バッファー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐ／Ｎ  ６００６７５−５２）、０．５μｌのｄＮＴＰそれぞれ２００μＭ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐ／Ｎ  ２００４１５−５１）、２μＭの第１の鎖の直鎖環状化用プライマー、１μＭのＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐ／Ｎ  ６００６７２−５１）、および２０μｌの断片状試料ＤＮＡ。環状化パラメーター：６８℃で８分間、９８℃で２分間、９８℃で３０秒間、５７℃で３０秒間、および７２℃で１分間（４サイクル）、７２℃で５分間。試料の浄化：試料ＤＮＡを５０μｌのＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐ／Ｎ  Ａ６３８８２）と結合させ、７０％エタノールで２回洗浄し、３７℃においてヒートブロック上で乾燥させ、２０μｌの水中にＤＮＡを溶出する。
【００８１】
＜第２の鎖の反応およびＲ２アダプター配列の挿入＞
第２の鎖のランダムプライマー配列：５’−ＡＧＣＴＧＴＧＣＧＴＡＧＡＴＧＴＧＡＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮ−３’（配列番号４）。反応設定（５０μｌ）：２３μｌの水、５μｌのＮＥＢｕｆｆｅｒ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｐ／Ｎ  Ｂ７００２Ｓ）、０．５μｌのｄＮＴＰ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐ／Ｎ  ２００４１５−５１）、０．５μｌの第２の鎖のランダムプライマー（１００μＭ）、２０μｌの第１の鎖の直鎖環状化ＤＮＡまたは２０μｌの断片状試料ＤＮＡ、および変性後に加える１μｌのエクソ（−）クレノウ断片（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓバルク酵素５０Ｕ／μｌ）。環状化パラメーター：９５℃で２分間、４℃で１５分間、４℃＋１℃サイクル毎（３２サイクル）、３７℃で１時間および３０分、７０℃で１０分間。試料の浄化：試料ＤＮＡを５０μｌのＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐ／Ｎ  Ａ６３８８２）と結合させ、７０％エタノールで２回洗浄し、３７℃においてヒートブロック上で乾燥させ、２０μｌの水中にＤＮＡを溶出する。
【００８２】
＜Ｒ１およびＲ２プライマーを使用した第２の鎖のＤＮＡのＰＣＲ増幅＞
フォワードＲ１プライマー：５’−ＧＣＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＡＣＴＴＧＴＧＡ−３’（配列番号３）、リバースＲ２プライマー：５’−ＣＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＣＧＴＡＧＡＴＧＴＧＡＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号５）。反応設定（５０μｌ）：１８．２５μｌの水、１０μｌのＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ反応用バッファー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐ／Ｎ  ６００６７５−５２）、０．５μｌのｄＮＴＰそれぞれ２００μＭ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐ／Ｎ  ２００４１５−５１）、それぞれ０．２５μＭのフォワードおよびリバースプライマー、１μｌのＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐ／Ｎ  ６００６７２−５１）、および２０μｌの第２の鎖のＤＮＡ。環状化パラメーター：９８℃で２分間、９８℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、および７２℃で１分間（１４サイクル）、７２℃で５分間。試料の浄化：試料ＤＮＡを５０μｌのＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐ／Ｎ  Ａ６３８８２）と結合させ、７０％エタノールで２回洗浄し、３７℃においてヒートブロック上で乾燥させ、１３μｌの水中にＤＮＡを溶出する。ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＱＸＴ標的富化キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐ／Ｎ  Ｇ９６８１Ｂ）を使用して標的富化を実施した。
【００８３】
＜データの定義＞
図５および６中の表は以下の情報を含む。Ｔｎ（ｎｇ）＝それぞれ５０μｌＤＮＡの断片化反応において使用した装着トランスポザーゼの量ｎｇ、第１の鎖のサイクル＝第１の鎖のサイクルの数、維持された読み枠の％＝フィルタリング後参照ゲノムにマッピングされる読み枠の割合、非マッピング読み枠の％＝参照ゲノムにマッピングされない読み枠および低率の読み枠の割合、複製％＝複製として示され特有ではないマッピング配列の割合、標的における％＝捕捉用擬似ライブラリーまたはゲノムの標的領域に再度マッピングし位置合わせした読み枠の割合、倍率１倍、１０倍、２０倍＝少なくとも１倍、１０倍、または２０倍の倍率で得た塩基の割合。高レベルの倍率では、それぞれの塩基は多数の位置合わせした配列読み枠に覆われ、したがって高レベルの信頼度でベースコール（ｂａｓｅ  ｃａｌｌｓ）を作製することができる。
【００８４】
［実施例１］
＜肺腫瘍ＦＦＰＥのＤＮＡ断片のタグ化−第１の鎖の合成サイクルおよびバーコード化＞
ＥＳ配列の分子バーコード化によって第１の鎖の富化法を実施することができる。
【００８５】
方法：１０ｎｇのＦＦＰＥ／ＦＲ  ＤＮＡ  Ｉｎｐｕｔ  ＣｌｅａｒＳｅｑ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｎｅｌ、８０万の読み枠、２×１００の塩基、１２のＰｒｅ−ｈｙｂ  ＰＣＲサイクル。
【００８６】
シーケンシングの結果は図５中に要約する。４サイクルの第１の鎖の合成サイクルを使用した方法によって複雑性が改善し、複製％は低下し、標的における％は増大する。これによって、より良いシーケンシングの結果が生じることを実証する。
【００８７】
［実施例２］
＜乳房腫瘍および胃腫瘍ＦＦＰＥのＤＮＡ断片のタグ化−第１の鎖の合成サイクルなし、およびバーコード化なし＞
方法：１０ｎｇのＦＦＰＥ／ＦＲ  ＤＮＡ  Ｉｎｐｕｔ、ＣｌｅａｒＳｅｑ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｎｅｌ、８０万の読み枠、２×１００の塩基、１２のＰｒｅ−ｈｙｂ  ＰＣＲサイクル。
【００８８】
シーケンシングの結果は図６中に要約する。第１の鎖の合成サイクルなし、またはバーコード化を使用しない方法は高倍率を示す。
【００８９】
［実施形態］
本開示のある実施形態の非制限的な例を以下に与える。
【００９０】
１．本開示の幾つかの態様は、（ａ）アダプタータグ化断片を生成するために、１５０ｂｐ〜１．５Ｋｂの平均長を有する二本鎖ＤＮＡ断片を含む試料と、それぞれアダプターが装着された複数のトランスポザーゼデュプレックスとを接触させるステップと、ここで、アダプターが、トランスポザーゼ認識配列を含むデュプレックス領域と第１のプライマー配列を含む５’オーバーハング領域とを含み、（ｂ）ランダムプライマー伸長産物を生成するために、ランダムプライマーを使用してアダプタータグ化断片にプライマー伸長反応を実施するステップと、ここで、ランダムプライマーが、ランダム３’配列と第２のプライマー配列とを含む５’配列を含み、（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物を生成するために、その３’末端に第１のプライマー配列を含むフォワードプライマーと、その３’末端に第２のプライマー配列を含むリバースプライマーとを使用して、ＰＣＲにより（ｂ）のランダムプライマー伸長産物を増幅するステップとを含む方法を含む。
【００９１】
２．ステップ（ｂ）の前に、（ｉ）５’オーバーハング領域を充填しアダプタータグ化断片のギャップを充填するために、アダプタータグ化断片に伸長または伸長／ライゲーション反応を実施するステップと、（ｉｉ）その３’末端に第１のプライマー配列を含む直鎖増幅プライマーを用いて少なくとも１回の直鎖増幅反応を実施するステップとをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
【００９２】
３．ステップ（ｉｉ）が２〜３０回の直鎖増幅反応を実施することを含む、実施形態２に記載の方法。
【００９３】
４．第１のプライマー配列が、第１のシーケンシングプライマー配列であり、フォワードプライマーが、第１のシーケンシングプライマー配列を含む５’テールを含み、またはアダプターが、第１のプライマー配列の下流に第１のシーケンシングプライマー配列をさらに含み、かつ、第２のプライマー配列が、第２のシーケンシングプライマー配列であり、リバースプライマーが、第２のシーケンシングプライマー配列を含む５’テールを含み、またはランダムプライマーが、第２のプライマー配列の下流に第２のシーケンシングプライマー配列をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
【００９４】
５．第１および第２のシーケンシングプライマー配列が次世代シーケンシング用である、実施形態４に記載の方法。
【００９５】
６．アダプターが第１のシーケンシングプライマー配列の下流にバーコードをさらに含み、かつ／またはランダムプライマーが第２のシーケンシングプライマー配列の下流にバーコードをさらに含む、実施形態４に記載の方法。
【００９６】
７．アダプターおよび／またはランダムプライマー中のバーコードが試料特異的バーコードである、実施形態６に記載の方法。
【００９７】
８．アダプターおよび／またはランダムプライマー中のバーコードが縮重塩基領域（ＤＢＲ）を含む、実施形態６に記載の方法。
【００９８】
９．試料中のＤＮＡ断片の少なくとも一部分に関する配列の読み枠を得るために、ＰＣＲ増幅産物をシーケンシングするステップと、配列の読み枠をコンティグに構築するステップとをさらに含む、実施形態４から８のいずれか１実施形態に記載の方法。
【００９９】
１０．ＤＮＡ断片の試料を臨床試料から単離する、実施形態１に記載の方法。
【０１００】
１１．臨床試料が体液から抽出した無細胞ＤＮＡである、実施形態１０に記載の方法。
【０１０１】
１２．体液が血液である、実施形態１１に記載の方法。
【０１０２】
１３．臨床試料がホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）試料である、実施形態１０に記載の方法。
【０１０３】
１４．本開示の幾つかの態様は、（ａ）アダプタータグ化断片を生成するために、１ｋｂ未満の平均長を有する二本鎖ＤＮＡ断片を含む試料とそれぞれアダプターが装着された複数のトランスポザーゼデュプレックスとを接触させるステップと、ここで、アダプターが、トランスポザーゼ認識配列を含むデュプレックス領域と、第１のプライマー配列を含む５’オーバーハング領域とを含み、（ｂ）ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を使用して、アダプタータグ化断片の上部鎖にオリゴ−ｄＮテールを加えてテールアダプタータグ化断片を生成するステップと、（ｃ）テールプライマー伸長産物を生成するために、テールプライマーを使用してテールアダプタータグ化断片にプライマー伸長反応を実施するステップと、ここで、テールプライマーが、オリゴ−ｄＮテールとハイブリダイズする３’配列と、第２のプライマー配列を含む５’配列とを含み、（ｄ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物を生成するために、その３’末端に第１のプライマー配列を含むフォワードプライマーと、その３’末端に第２のプライマー配列を含むリバースプライマーとを使用して、ＰＣＲにより（ｃ）のテールプライマー伸長産物を増幅するステップとを含む方法を含む。
【０１０４】
１５．試料中のＤＮＡ断片の少なくとも一部分に関する配列の読み枠を得るためにＰＣＲ増幅産物をシーケンシングするステップと、配列の読み枠をコンティグに構築するステップとをさらに含む、実施形態１４に記載の方法。
【０１０５】
１６．ＤＮＡ断片の試料が臨床試料から単離されたものであり、臨床試料がホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）試料である、実施形態１４に記載の方法。
【０１０６】
１７．本開示の幾つかの態様は、トランスポザーゼ認識配列を含むデュプレックス領域と第１のプライマー配列を含む５’オーバーハング領域とを含むアダプターがそれぞれ装着された複数のトランスポザーゼデュプレックス、ランダム３’配列と第２のプライマー配列を含む５’配列とを含むランダムプライマー、またはオリゴ−ｄＮテールとハイブリダイズする３’配列および第２のプライマー配列を含む５’配列を含むテールプライマー、その３’末端に第１のプライマー配列を含むフォワードプライマー、その３’末端に第２のプライマー配列を含むリバースプライマー、および実施形態１または１４に記載の方法を実施するための１つまたは複数の追加的試薬を含むキットを含む。
【図１】
2019517250.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2019517250000001.app
【国際調査報告】
2019517250.tif 000009
2019517250.tif 000010