(57)【要約】  高速熱サイクルを実施するための計器、方法、およびキットが開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第２段階反応ゾーンに流体接続された第１段階チャンバを備える試料容器を提供するステップであって、前記第２段階反応ゾーンが、複数の第２段階反応ウェルを備える、ステップと、
（ｂ）試料を前記試料容器内に導入するステップと、
（ｃ）前記試料容器を計器内に挿入するステップであって、前記計器が温度制御要素を備える、ステップと、
（ｄ）前記温度制御要素と前記第１段階チャンバとを整列させて、前記第１段階チャンバ内で前記試料の熱サイクルを行うステップと、
（ｅ）前記第１段階チャンバ内の前記試料の熱サイクルを行った後に、前記第１段階チャンバからの前記試料由来の生成物の少なくとも一部分を前記第２段階反応ゾーン内の前記複数の第２段階反応ウェル内へ移動させるステップと、
（ｆ）前記温度制御要素と前記第２段階反応ゾーンとを整列させて、前記第２段階反応ゾーン内で前記試料の前記一部分の熱サイクルを行うステップとを含む、熱サイクルの方法。
【請求項２】
前記温度制御要素は、ペルチェ素子、抵抗加熱器、誘導加熱器、電磁加熱器、薄膜加熱器、印刷素子加熱器、正温度係数加熱器、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の加熱器または冷却器デバイスを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記温度制御要素は、第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンを含み、前記第１の温度ゾーンは、前記第２の温度ゾーンよりも熱い、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｆ）は、前記温度制御要素を前記第２段階反応ゾーンに対して繰り返し移動させることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｆ）は、前記第２段階反応ゾーンを前記温度制御要素に対して繰り返し移動させることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記計器は、ワイパ要素をさらに備え、ステップ（ｄ）は、前記ワイパ要素の回転運動が前記試料の第１の部分を前記第１の温度ゾーンの熱制御から前記第２の温度ゾーンの熱制御へ移動させながら、同時に前記試料の第２の部分を前記第２の温度ゾーンの熱制御から前記第１の温度ゾーンの熱制御へ移動させるように、前記ワイパ要素を前記温度制御要素および前記第１段階チャンバと整列させることをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記試料容器は、前記第１段階チャンバに流体接続された試料調製ゾーンをさらに備え、ステップ（ｄ）の前に、前記方法は、
前記試料を前記試料調製ゾーン内に導入するステップと、
前記試料調製ゾーンを溶解装置と接触させて溶解物を生成するステップと、
前記溶解物から核酸を回収するステップと、
前記回収した核酸を前記第１段階チャンバ内へ移動させるステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記試料から核酸を回収するステップは、
前記溶解物を複数の磁気ビーズと接触させることと、
前記磁気ビーズを前記溶解物から分離するために磁石を配置することと、
前記磁気ビーズを洗浄することと、
前記磁気ビーズを前記磁石で再捕捉することと、
前記磁気ビーズを溶出緩衝液と接触させて前記核酸を前記磁気ビーズから解放することと、
前記磁気ビーズを前記磁石で再捕捉し、溶出した前記核酸を前記磁気ビーズから分離することとをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記試料調製ゾーンおよび前記第１段階チャンバは、前記試料容器内の別々のチャンバである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法のステップ（ｆ）は、第２の核酸増幅ゾーンを、前記温度制御要素の前記第１の温度ゾーンおよび次いで前記第２の温度ゾーンと整列させて、前記第２の核酸増幅ゾーン内の前記試料を熱サイクルさせることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法の前記ステップは、２０分以下、１５分以下、または好ましくは、１０分以下で完了される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第１の核酸増幅ゾーンおよび前記第２の核酸増幅ゾーンの各熱サイクルは、８秒以下、６秒以下、または好ましくは、４秒以下で完了される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記整列させるステップを制御するように、および前記温度制御要素の温度を制御するように構成されたコンピューティングデバイスを提供するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
試料を熱サイクルさせるための計器であって、前記試料は、可撓性試料容器内に提供され、前記計器は、
前記試料の第１の部分を第１の温度へと調節するための前記可撓性試料容器の第１の部分に隣接する第１の加熱器と、
前記試料の第２の部分を前記第１の温度とは異なる第２の温度へと調節するための前記可撓性試料容器の第２の部分に隣接する第２の加熱器と、
前記試料のこれらの部分が同時に前記加熱器の各々の制御下にあるように、前記試料の前記第１の部分を前記可撓性試料容器の前記第２の部分へと移動させながら前記試料の前記第２の部分を前記可撓性試料容器の前記第１の部分へと移動させるワイパ要素とを備える、計器。
【請求項１５】
前記ワイパ要素は、前記試料を、少なくとも第１のセクションおよび第２のセクションを含む少なくとも２つの別々のセクションへと分割し、それにより、前記第１の部分が前記第１のセクションに含まれ、前記第２の部分が前記第２のセクションに含まれるようにする刃をさらに備える、請求項１４に記載の計器。
【請求項１６】
前記ワイパ要素は、前記試料の前記第１の部分が前記第１の加熱器の制御下にあり、前記試料の前記第２の部分が前記第２の加熱器の制御下にあり、前記試料の第３の部分が、前記第１の加熱器および前記第２の加熱器の制御の間の遷移にあるように、前記試料内に旋回流および渦を作る、請求項１４に記載の計器。
【請求項１７】
前記ワイパ要素は、前記試料の部分を前記試料容器の反対の部分へと繰り返し移動させて前記試料を熱サイクルさせる、請求項１４〜１６のいずれかに記載の計器。
【請求項１８】
前記試料器は、ＰＣＲのための核酸および構成要素を含む、請求項１４に記載の計器。
【請求項１９】
前記ワイパ要素は、前記可撓性試料容器を圧縮して前記試料の一部分を排出するように移動可能であり、前記ワイパ要素は、前記試料の前記一部分を排出する前には第１の速度、および前記試料の前記一部分を排出した後にはより速い第２の速度を有する、請求項１４に記載の計器。
【請求項２０】
前記ワイパ要素と前記可撓性試料容器との間に設置された圧縮可能部材をさらに備え、前記圧縮可能部材は、前記試料容器に向かって付勢される、請求項１４に記載の計器。
【請求項２１】
前記試料容器に流体接続されたアレイをさらに備え、前記アレイは、前記試料の少なくとも一部分を受容するように構成され、前記計器は、前記アレイ内の前記試料の前記一部分の温度に順次影響を与えるように移動可能である複数の加熱器をさらに備える、請求項１４に記載の計器。
【請求項２２】
試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に少なくとも第１の反応チャンバを有する可撓性試料容器を位置付けるための受け口と、
第１の加熱器要素および第２の加熱器要素を備える加熱器組立体と、
前記第１の反応チャンバが前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素のうちの少なくとも一方の温度制御下にあるように前記第１の反応チャンバを前記加熱器組立体の第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素に対して横方向に整列させるために、前記受け口、前記可撓性試料容器、または前記加熱器組立体のうちの少なくとも１つに機械的に結合された移動装置とを備え、
前記計器は、前記少なくとも１つの反応チャンバ内の流体試料を熱サイクルさせるために、前記第１の反応チャンバを前記第１の加熱器要素と、次いで第２の加熱器要素と、繰り返し整列させるように構成される、計器。
【請求項２３】
前記第１の加熱器要素は、約９０℃〜１１０℃の範囲の温度に設定され、前記第２の加熱器要素は、約５５℃〜約６５℃の範囲の温度に設定される、請求項２２に記載の計器。
【請求項２４】
前記加熱器組立体は、前記移動装置に結合され、前記移動装置は、前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素が前記第１の反応チャンバにおける制御された温度ゾーンを画定することができるように、前記加熱器組立体を前記第１の反応チャンバに対して横方向に移動させるように構成される、請求項２２に記載の計器。
【請求項２５】
前記受け口は、前記移動装置に結合され、前記移動装置は、前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素が前記第１の反応チャンバにおける制御された温度ゾーンを画定することができるように、前記受け口およびその中に位置付けられた前記可撓性試料容器を前記加熱器組立体に対して横方向に移動させるように構成される、請求項２２に記載の計器。
【請求項２６】
前記可撓性試料容器は、前記移動装置に結合され、前記移動装置は、前記第１の反応チャンバが前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素の温度制御下にあるように、前記可撓性試料容器を前記加熱器組立体に対して移動させるように構成される、請求項２２に記載の計器。
【請求項２７】
前記可撓性試料容器は、前記第１の反応チャンバから下流に第２の反応チャンバをさらに備え、前記移動装置は、前記第２の反応チャンバが前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素の温度制御下にあるように、前記第２の反応チャンバを前記加熱器組立体の前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素に対して横方向に整列させるように構成される、請求項２２に記載の計器。
【請求項２８】
前記第２の反応チャンバは、前記第１の反応チャンバに流体接続された個別の増幅ウェルのアレイを含み、前記アレイは、前記第１の反応チャンバから増幅生成物の少なくとも一部分を受容するように構成される、請求項２７に記載の計器。
【請求項２９】
前記受け口は、前記加熱器組立体の前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素が、前記受け口内に位置付けられたときに前記可撓性試料容器の１つまたは複数の部分に接触することを可能にするように位置付けられた１つまたは複数の開口部を有する実質的に平面の表面を含む、請求項２２に記載の計器。
【請求項３０】
前記加熱器組立体は、第１の加熱器要素、第２の加熱器要素、および第３の加熱器要素を含む、請求項２２に記載の計器。
【請求項３１】
前記第１の加熱器要素、前記第２の加熱器要素、および前記第３の加熱器要素は、直線的に設置される、請求項３０に記載の計器。
【請求項３２】
前記第１の加熱器要素および前記第３の加熱器要素は、約９０℃〜１１０℃の範囲の温度に設定され、前記第２の加熱器要素は、約５５℃〜約６５℃の温度に設定される、請求項３１に記載の計器。
【請求項３３】
可撓性試料容器を中に受容するための受け口であって、前記可撓性試料容器が、熱サイクルされることになる試料を中に含む第１段階チャンバを有する、受け口と、
前記可撓性試料容器の第１の側面に位置付けられた、少なくとも第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンを含む加熱器要素と、
前記試料容器の第２の側面に位置付けられたワイパ要素であって、前記試料を少なくとも第１の部分および第２の部分に分割するために前記第１段階チャンバに接触するように構成される、ワイパ要素とを備え、
前記受け口、前記加熱器要素、前記ワイパ要素、または前記可撓性試料容器のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第１段階チャンバを前記ワイパ要素ならびに前記加熱器要素の前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンに対して整列させ、
前記ワイパ要素は、前記試料の前記第１の部分を前記第２の部分へ移動させながら前記試料の前記第２の部分を前記第１の部分へ移動させて、それにより前記第１の部分および前記第２の部分が前記加熱器要素の前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンの温度制御下にあるようにするために前記第１段階チャンバに隣接して回転するように構成される、熱サイクルシステム。
【請求項３４】
前記可撓性試料容器は、試料調製ゾーンを含み、前記試料調製ゾーンは、前記第１段階チャンバからの上流のうちの１つであるか、または前記試料調製ゾーンおよび前記第１段階チャンバは、単一のゾーンを含む、請求項３３に記載の熱サイクルシステム。
【請求項３５】
前記ワイパ要素は、前記試料を前記試料調製ゾーン内で混合するために前記試料容器に接触するように構成される、請求項３４に記載の熱サイクルシステム。
【請求項３６】
前記ワイパ要素および前記加熱器要素は、試料調製を行うように共同して働き、また核酸増幅を行うように共同して働く、請求項３５に記載の熱サイクルシステム。
【請求項３７】
前記ワイパ要素は、前記試料内の細胞を溶解するために前記試料内に旋回流、渦、およびキャビテーション気泡のうちの１つまたは複数を作る、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の熱サイクルシステム。
【請求項３８】
前記第１段階チャンバは、細胞溶解を高めるために研磨要素を含む、請求項３３に記載の熱サイクルシステム。
【請求項３９】
前記計器は、前記試料調製ゾーンに接触するように構成された溶解構成要素をさらに備え、前記溶解構成要素は、任意選択的に前記ワイパ要素の構成要素である、請求項３３に記載の熱サイクルシステム。
【請求項４０】
前記ワイパ要素は、前記試料を熱サイクルさせるために、前記試料の前記第１の部分を第２の部分へ繰り返し移動させながら前記試料の前記第２の部分を移動させる、請求項３３に記載の熱サイクルシステム。
【請求項４１】
前記可撓性試料容器は、前記第１段階チャンバから下流に第２段階チャンバをさらに備え、前記受け口、前記可撓性試料容器、または前記加熱器要素のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第２段階チャンバが前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンの温度制御下にあるように前記第２段階チャンバを前記加熱器要素に対して整列させる、請求項３３に記載の熱サイクルシステム。
【請求項４２】
前記第２段階チャンバは、前記第１段階チャンバに流体接続された個別の増幅ウェルのアレイを含み、前記アレイは、前記第１段階チャンバから生成物の少なくとも一部分を受容するように構成される、請求項４１に記載の熱サイクルシステム。
【請求項４３】
前記加熱器要素は、少なくとも第１の温度ゾーン、第２の温度ゾーン、および第３の温度ゾーンをさらに含み、２つの温度ゾーンは、前記第１段階チャンバを熱サイクルさせるために整列され、３つの温度ゾーンは、前記第２段階チャンバを熱サイクルさせるために、一度に１つずつ整列される、請求項４１に記載の熱サイクルシステム。
【請求項４４】
前記受け口は、前記加熱器要素が可撓性試料容器の１つまたは複数の部分に接触することを可能にするように位置付けられた１つまたは複数の開口部を有する実質的に平面の表面を含む、請求項３３〜４３のいずれかに記載の熱サイクルシステム。
【請求項４５】
前記可撓性試料容器の少なくとも１つの部分から光学データを集めるように構成された、光源およびカメラ要素を含む光学アレイをさらに備える、請求項３３〜４４のいずれかに記載の熱サイクルシステム。
【請求項４６】
前記可撓性試料容器は、核酸および核酸増幅用の試薬を含有する試料を含む、請求項３３〜４５のいずれかに記載の熱サイクルシステム。
【請求項４７】
前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンおよび／または前記可撓性試料容器の前記第１段階チャンバに圧力を印加するように構成された１つまたは複数の圧力部材をさらに備える、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の熱サイクルシステム。
【請求項４８】
前記１つまたは複数の圧力部材は、前記可撓性試料容器に隣接して配置可能な少なくとも１つの磁石をさらに備える、請求項４７に記載の熱サイクルシステム。
【請求項４９】
前記ワイパ要素は、前記可撓性試料容器に隣接して配置可能な少なくとも１つの磁石をさらに備える、請求項３３に記載の熱サイクルシステム。
【請求項５０】
試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に可撓性試料容器を位置付けるための受け口であって、前記可撓性試料容器が、第１段階チャンバ、および第２段階反応ウェルのアレイを有する第２段階反応チャンバを含む、受け口と、
第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンを含む加熱器要素と備え、
前記受け口、前記試料容器、または前記加熱器要素のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第１段階チャンバおよび前記第２段階反応チャンバを前記加熱器要素に対して整列させ、
前記受け口および前記加熱器要素は、前記第１段階チャンバ内で、次いで前記第２段階反応チャンバ内で熱サイクルおよび核酸増幅を行うために、前記加熱器要素が、まず前記第１段階チャンバを、次に前記第２段階反応チャンバを加熱することを可能にするように構成される、計器。
【請求項５１】
前記第１段階チャンバに接触し、前記第１段階チャンバを少なくとも第１の容積および第２の容積へと分割するように構成された少なくとも１つの刃を有するワイパ要素をさらに備え、
前記加熱器要素は、前記第１の容積が前記第１の温度ゾーンの上に位置付けられ、かつ前記第２の容積が前記第２の温度ゾーンの上に位置付けられるように、前記第１段階チャンバの真下に整列され、
前記ワイパ要素は、前記第１の容積および前記第２の容積が前記温度ゾーンの各々の制御下にあるように、前記第１の容積を前記第２の温度ゾーンへ移動させながら前記第２の容積を前記第１の温度ゾーンへ移動させるために回転するように構成される、請求項５０に記載の計器。
【請求項５２】
前記可撓性試料容器は、試料調製ゾーンを含む、請求項５１に記載の計器。
【請求項５３】
前記試料調製ゾーンは、前記第１段階チャンバから上流にある、請求項５２に記載の計器。
【請求項５４】
前記試料調製ゾーンおよび前記第１段階チャンバは、単一のチャンバを備える、請求項５２に記載の計器。
【請求項５５】
前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンに接触するように構成される、請求項５２に記載の計器。
【請求項５６】
試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に可撓性試料容器を位置付けるための受け口であって、前記可撓性試料容器が少なくとも１つの反応チャンバを含む、受け口と、
第１の加熱器要素、第２の加熱器要素、および第３の加熱器要素を備える加熱器組立体であって、前記第１の加熱器要素および前記第３の加熱器要素が前記第２の加熱器要素よりも高い温度に保持される、加熱器組立体とを備え、
前記計器は、少なくとも１つの反応チャンバ内の流体試料を熱サイクルさせるために、前記少なくとも１つの反応チャンバを前記第１の加熱器要素、前記第２の加熱器要素、および前記第３の加熱器要素と整列させるように構成される、計器。
【請求項５７】
前記第１の加熱器要素および前記第３の加熱器要素は、約９０℃〜１１０℃の範囲の温度に設定され、前記第２の加熱器要素は、約５５℃〜６５℃の温度に設定される、請求項５６に記載の計器。
【請求項５８】
前記第１の加熱器要素および前記第３の加熱器要素は、抵抗性加熱器要素を備え、前記第２の加熱器要素は、ペルチェ素子を備える、請求項５６に記載の計器。
【請求項５９】
前記第１の加熱器要素または前記第３の加熱器要素のうちの一方は、ペルチェ素子の上に敷設された抵抗性加熱器要素を備える、請求項５８に記載の計器。
【請求項６０】
前記加熱器組立体は、前記可撓性試料容器に隣接して回転されるように構成される円形取付部を備える、請求項５６に記載の計器。
【請求項６１】
前記加熱器組立体は、前記可撓性試料容器に隣接して移動されるように構成される線形取付部を備える、請求項５６に記載の計器。
【請求項６２】
請求項５６〜６１のいずれか一項に記載の計器を使用したポリメラーゼ連鎖反応方法であって、
（ａ）少なくとも１つの反応チャンバを備える試料容器を提供するステップと、
（ｂ）試料を前記反応チャンバ内に導入するステップであって、前記試料が、標的核酸、前記標的核酸を増幅するための少なくとも１つのプライマー、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む、ステップと、
（ｃ）前記試料容器を前記計器内へ挿入するステップと、
（ｄ）前記第１の加熱器要素を前記反応チャンバと整列させ、次いで前記第２の加熱器要素を前記反応チャンバと整列させ、次いで前記第３の加熱器要素を前記反応チャンバと整列させるステップであって、
前記第１の加熱器要素および前記第３の加熱器要素は、変性温度に設定され、前記第２の加熱器要素は、アニーリング温度に設定され、
ステップ（ｄ）は、変性、アニーリング、および延伸／変性の１つのサイクルを含む、ステップと、
（ｆ）ステップ（ｄ）を繰り返すステップとを含む、方法。
【請求項６３】
試料容器内に提供される核酸を増幅するための計器であって、前記核酸はアレイ内で構成され、
前記試料容器を受容するための開口部と、
複数の加熱器であって、各々の加熱器が異なる温度で提供される、複数の加熱器と、
前記加熱器を前記開口部に隣接する位置に順次移動させ、それにより前記位置にある前記加熱器のみが前記試料容器内の前記核酸の温度を制御するようにする移動部とを備える、計器。
【請求項６４】
前記試料容器は、核酸を増幅するための構成要素をさらに備え、
前記複数の加熱器は、アニーリング温度にある第１の加熱器および変性温度にある第２の加熱器を少なくとも備える、請求項６３に記載の計器。
【請求項６５】
前記複数の加熱器は、延伸温度にある第３の加熱器をさらに備える、請求項６４に記載の計器。
【請求項６６】
前記試料は、増幅された核酸の検出のために構成された蛍光体をさらに含み、前記計器は、前記アレイからの蛍光を検出するように位置付けられた光検出器をさらに備える、請求項６４に記載の計器。
【請求項６７】
（ａ）ある容積を有するＰＣＲ混合物を試料器内に提供するステップと、
（ｂ）第１の回数のサイクルだけ熱サイクルさせるステップであって、前記第１の回数のサイクルの各々が第１のサイクル時間を有する、ステップと、
（ｃ）前記試料容器内の前記ＰＣＲ混合物の前記容積を第２の容積まで減らすステップであって、前記第２の容積が前記第１の容積よりも小さい、ステップと、
（ｄ）第２の回数のサイクルだけ熱サイクルさせるステップであって、前記第２の回数のサイクルの各々が第２のサイクル時間を有し、前記第２のサイクル時間が前記第１のサイクル時間より短い、ステップとを含む、ＰＣＲを実施するための方法。
【請求項６８】
（ｅ）前記試料容器内の前記ＰＣＲ混合物の前記容積を第３の容積まで減らすステップであって、前記第３の容積が前記第２の容積よりも小さい、ステップと、
（ｆ）第３の回数のサイクルだけ熱サイクルさせるステップであって、前記第２の回数のサイクルの各々が第３のサイクル時間を有し、前記第３のサイクル時間が前記第２のサイクル時間より短い、ステップとをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記試料器は、圧縮可能であり、前記減らすステップは、前記試料の一部分を前記試料器から排出することによって実施される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記試料器は、少なくとも２つの温度ゾーンと接触状態にあり、前記熱サイクルさせるステップは、前記試料を前記温度ゾーン間で移動させることを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記試料器は、いくつかの温度間で熱サイクルさせる加熱器によって加熱される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
流体試料を容器の試料区画内へ導入するステップであって、前記流体試料が標的核酸および前記標的核酸を増幅するための試薬を含む、ステップと、
前記容器を加熱装置内へ導入するステップであって、前記加熱装置が、第１の加熱器、第２の加熱器、および前記試料区画内の前記流体試料を移動させるための移動部を備え、前記第１の加熱器が第１の温度に設定され、前記第２の加熱器が第２の温度に設定され、前記第１の温度が前記第２の温度よりも高く、前記試料区画の第１の部分が前記第１の加熱器に近接して設置されているため、前記第１の加熱器が前記試料区画の前記第１の部分に対して熱制御を呈し、前記試料区画の第２の部分が前記第２の加熱器に近接して設置されているため、前記第２の加熱器が前記試料区画の前記第２の部分に対して熱制御を呈する、ステップと、
前記流体試料の少なくとも一部分を前記試料区画の前記第１の部分と前記試料区画の前記第２の部分との間で選択的に移動させ、それにより前記試料のこれらの部分が同時に前記加熱器の各々の制御下にあるようにするステップとを含む、試料内の核酸を増幅する方法。
【請求項７３】
（ａ）流体試料を容器の第１の区画内へ導入するステップであって、前記流体試料が標的核酸および前記標的核酸を増幅するための試薬を含み、前記第１の区画が、アニーリング温度未満である温度（低アニーリング温度）に設定される第１の加熱器の制御下にある、ステップと、
（ｂ）前記第１の加熱器の温度を前記アニーリング温度まで上げるステップと、
（ｃ）前記流体試料を容器の第２の区画へ移動させるステップであって、前記第２の区画が、延伸温度を上回る温度（高延伸温度）に設定される第２の加熱器の制御下にある、移動させるステップと、および、前記流体試料を前記第２の区画へ移動させた後に、前記第１の加熱器の温度を低アニーリング温度まで下げるステップと、を行うステップと、
（ｄ）前記第２の加熱器の温度を前記延伸温度まで下げるステップと、
（ｅ）前記第２の加熱器の温度を少なくとも変性温度まで上げるステップと、
（ｆ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップとを含む、試料内の核酸を増幅する方法。
【請求項７４】
ステップ（ａ）が繰り返されるとき、前記第２の加熱器の温度が前記高延伸温度へ移される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記低アニーリング温度は、前記アニーリング温度より２度から２０度低い、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記高延伸温度は、前記延伸温度より２度から１０度高い、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
ステップ（ｅ）は、前記第２の加熱器の温度を、前記変性温度を上回る温度まで上げることを含み、ステップ（ａ）は、前記流体試料が前記変性温度に達するとすぐに繰り返される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に第１段階チャンバを有する可撓性試料容器を位置付けるための受け口と、
少なくとも第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンを含む加熱器要素とを備え、
前記受け口または前記加熱器要素のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第１段階チャンバを前記加熱器要素の前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンに対して位置付け、
前記受け口および前記加熱器要素は、前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンが前記第１段階チャンバの温度を制御してその中で熱サイクルおよび核酸増幅を行うことを可能にするように構成される、計器。
【請求項７９】
前記可撓性試料容器は、試料調製ゾーンを含む、請求項７８に記載の計器。
【請求項８０】
前記試料調製ゾーンは、前記第１段階チャンバから上流にある、請求項７９に記載の計器。
【請求項８１】
前記計器は、前記試料容器の第１の側面に位置付けられたワイパ要素をさらに備え、前記ワイパ要素は、前記試料を前記試料調製ゾーン内および前記第１段階チャンバ内で混合するために前記試料容器に接触するように構成され、
前記受け口、前記ワイパ要素、または前記加熱器要素のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記可撓性試料容器を前記ワイパ要素および前記加熱器要素に対して位置付け、
前記ワイパ要素および前記加熱器要素は、試料調製を行うように共同して働き、また核酸増幅を行うように共同して働く、請求項７９に記載の計器。
【請求項８２】
前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンと前記第１段階チャンバとの間で移動可能であり、前記加熱器要素は、前記試料調製ゾーンおよび前記第１段階チャンバにおいて制御された温度ゾーンを画定するために移動可能である、請求項８１に記載の計器。
【請求項８３】
前記受け口は、前記試料調製ゾーンおよび前記第１段階チャンバにおいて混合温度および画定された温度ゾーンを提供するために、前記ワイパ要素および前記加熱器に対して移動可能である、請求項８１に記載の計器。
【請求項８４】
前記受け口、前記ワイパ要素、前記加熱器要素のうちの少なくとも２つは、前記試料調製ゾーンおよび前記第１段階チャンバにおいて混合温度および画定された温度ゾーンを提供するために移動可能である、請求項８１に記載の計器。
【請求項８５】
前記加熱器要素は、前記試料調製ゾーン内に存在する試料を加熱するために、前記試料調製ゾーンへ移動可能であり、前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンに接触して、前記試料内の細胞を溶解するために前記試料をブレンドするように構成される少なくとも１つの刃を有する、請求項８１に記載の計器。
【請求項８６】
前記ワイパ要素は、前記試料内の細胞を溶解するために前記試料内に旋回流、渦、およびキャビテーション気泡のうちの１つまたは複数を作る、請求項８５に記載の計器。
【請求項８７】
前記試料調製ゾーンは、細胞溶解を高めるために研磨要素を含む、請求項８６に記載の計器。
【請求項８８】
前記ワイパ要素は溶解構成要素を含む、請求項８１に記載の計器。
【請求項８９】
前記加熱器要素は、前記試料の第１の部分が前記第１の温度ゾーンに隣接して位置付けられ、かつ前記試料の第２の部分が前記第２の温度ゾーンに隣接して位置付けられるように、前記第１段階チャンバに隣接して位置付け可能であり、前記計器は、前記第１段階チャンバを少なくとも第１の部分および第２の部分を含む少なくとも２つの別々のセクションに分割するように、および、前記試料の前記第１の部分および前記第２の部分が前記温度ゾーンの各々の制御下にあるように、前記試料の前記第１の部分を前記第２の温度ゾーンへ移動させながら前記試料の前記第２の部分を前記第１の温度ゾーンに移動させるために回転するように構成される少なくとも１つの刃を有するワイパ要素をさらに含む、請求項７８に記載の計器。
【請求項９０】
前記刃は、前記試料を、少なくとも第１のセクションおよび第２のセクションを含む少なくとも２つの別々のセクションへと分割し、それにより、前記第１の部分が前記第１のセクションに含まれ、前記第２の部分が前記第２のセクションに含まれるようにする、請求項８９に記載の計器。
【請求項９１】
前記ワイパ要素は、前記試料の前記第１の部分が前記第１の温度ゾーンの制御下にあり、前記試料の前記第２の部分が前記第２の温度ゾーンの制御下にあり、前記試料の第３の部分が、前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンの制御の間の遷移にあるように、前記試料を移動させる、請求項８９に記載の計器。
【請求項９２】
前記ワイパ要素は、前記試料の部分を前記試料容器の反対の部分へと繰り返し移動させて前記試料を熱サイクルさせる、請求項８９〜９１のいずれかに記載の計器。
【請求項９３】
前記容器は、前記第１段階チャンバから下流に第２の核酸増幅ゾーンをさらに含み、前記受け口、前記可撓性試料容器、または前記加熱器要素のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第２の核酸増幅ゾーンにおいて、制御された温度ゾーンを画定するために前記第２の核酸増幅ゾーンを前記加熱器要素に対して位置付ける、請求項７８に記載の計器。
【請求項９４】
前記第２の核酸増幅ゾーンは、前記第１の核酸増幅ゾーンに流体接続された個別の増幅ウェルのアレイを含み、前記アレイは、前記試料の少なくとも一部分を受容するように構成される、請求項９３に記載の計器。
【請求項９５】
前記容器は、前記第１段階チャンバと前記アレイとの間にウェルを含み、前記ウェルは、前記試料の既知の容積を前記第１段階チャンバから受容し、前記既知の容積を前記アレイに送達するように構成される、請求項９４に記載の計器。
【請求項９６】
前記容器は、前記ウェルと前記アレイとの間に希釈ゾーンを含み、前記希釈ゾーンは、前記既知の容積を前記ウェルから受容し、前記既知の容積をある容積の流体で希釈して、希釈された試料を得て、前記希釈された試料を前記アレイに送達するように構成される、請求項９５に記載の計器。
【請求項９７】
前記受け口は、前記加熱器要素が前記受け口に挿入された可撓性試料容器の１つまたは複数の部分に接触することを可能にするように位置付けられた１つまたは複数の開口部を有する実質的に平面の表面を含む、請求項７８に記載の計器。
【請求項９８】
前記容器の少なくとも１つの部分から光学データを集めるように構成された、光源およびカメラ要素を含む光学アレイをさらに備える、請求項７８に記載の計器。
【請求項９９】
前記加熱器要素は、第１の加熱器部分、第２の加熱器部分、および第３の加熱器部分を含む、請求項７８に記載の計器。
【請求項１００】
前記第１の加熱器部分は、抵抗性加熱器であり、前記第２の加熱器部分は、ペルチェ素子であり、前記第３の加熱器部分は、抵抗性加熱器である、請求項９９に記載の計器。
【請求項１０１】
前記第３の加熱器部分は、ペルチェ素子の上に抵抗性加熱器を備え、前記抵抗性加熱器は、前記第３の加熱器部分を加熱するために使用され、前記ペルチェ素子は、前記第３の加熱器部分を冷却するために実質的に同時に使用される、請求項１００に記載の計器。
【請求項１０２】
前記第１の加熱器部分、前記第２の加熱器部分、および前記第３の加熱器部分は、直線的に設置される、請求項１０１に記載の計器。
【請求項１０３】
前記計器の１つまたは複数の構成要素を制御するように、および／またはそこからデータを集めるように構成されたコンピューティングデバイスをさらに備える、請求項７８〜１０２のいずれか一項に記載の計器。
【請求項１０４】
可撓性試料容器を受容するための開口部であって、前記可撓性試料容器が少なくとも１つの反応ゾーンを含む、開口部と、
複数の加熱器であって、前記加熱器の各々が異なる温度に設定されるように構成され、各加熱器を前記少なくとも１つの反応ゾーンと順次整列させて、その中の試料を加熱または冷却することができるように、前記加熱器が実質的に平面の取付部に位置付けられる、複数の加熱器とを備える、試料内の核酸を増幅するための計器。
【請求項１０５】
前記実質的に平面の取付部は、前記可撓性試料容器に隣接して回転されるように構成される円形取付部を備える、請求項１０４に記載の計器。
【請求項１０６】
前記円形取付部は、時計回り方向および反時計回り方向の両方に回転するように構成される、請求項１０５に記載の計器。
【請求項１０７】
反応ウェルのアレイを有する反応チャンバであって、前記アレイの前記ウェルの各々が、選択的に開放可能および選択的に密封可能な充填チャネルに流体接続される、反応チャンバを備える、可撓性試料容器。
【請求項１０８】
前記可撓性試料容器は、第１のフィルム層、前記第１のフィルム層に少なくとも部分的に付着された第２のフィルム層、前記第２のフィルム層および前記アレイの前記反応ウェルが形成されるカード層の１つの表面に付着された接着剤層、ならびに第３の外側フィルム層および前記カード層の反対表面に付着された第２の接着剤層から製作され、
前記充填チャネルは、前記第１のフィルム層と前記第２のフィルム層との間に開放空間を残すことによって形成される、請求項１０７に記載の可撓性試料容器。
【請求項１０９】
前記充填チャネルは、前記第１のフィルム層および前記第２のフィルム層を前記反応ウェルの前記アレイの周りで一緒に密封するシール線によって画定される、請求項１０８に記載の可撓性試料容器。
【請求項１１０】
前記充填チャネルは、前記第２のフィルム層および前記第１の接着剤層内の選択的な切欠きによって形成された充填孔によって前記アレイの前記ウェルの各々に流体接続される、請求項１０８に記載の可撓性試料容器。
【請求項１１１】
前記充填孔は、前記アレイのウェルに隣接して、かつその上を流れるウェル充填チャネルに流体接続され、前記ウェル充填チャネルは、前記アレイの前記ウェルに隣接する前記カード層内に切欠きを、および前記第２の接着剤層内に別の切欠きを作製することによって形成される、請求項１１０に記載の可撓性試料容器。
【請求項１１２】
前記充填孔は、前記アレイのウェル内へ流れるウェル充填チャネルに流体接続され、前記ウェル充填チャネルは、前記充填孔を前記アレイの前記ウェルに流体接続する前記第１の接着剤層内の切欠きを作製することによって形成される、請求項１１０に記載の可撓性試料容器。
【請求項１１３】
前記充填チャネルはヒートシール可能である、請求項１０７に記載の可撓性試料容器。
【請求項１１４】
単一のヒートシールが、充填チャネルから複数の充填チャネルへの流れを密封し、前記ウェルを互いから密封する、請求項１１３に記載の可撓性試料容器。
【請求項１１５】
前記充填チャネルは、前記アレイに対して圧力を印加することによって密封可能である、請求項１０７に記載の可撓性試料容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府所有権
[0001]本発明は、米国国防省の助成を受けたＷ９１１ＱＹ−１３−Ｄ−００８０の下、政府支援により行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
[0002]本発明は、２０１６年２月２２日出願の米国仮出願第６２／２９８，３１１号、２０１６年５月２日出願の米国仮出願第６２／３３０，７０１号、および２０１６年１０月１８日出願の米国仮出願第６２／４０９，８２９号の利益および優先権を主張するものであり、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
[0003]本開示の実施形態は、概して、核酸を増幅するための方法およびデバイスに関する。
【背景技術】
【０００４】
[0004]米国、カナダ、および西欧では、感染症は人間の死亡率のおよそ７％を占めるが、発展途上地域では、感染症は人間の死亡率の４０％超を占める。感染症は、様々な臨床症状をもたらす。中でもよくある明白な症状は、発熱、肺炎、髄膜炎、下痢、および血液を含む下痢である。これらの身体的症状は、いくつかの病原体を示唆し、それ以外のものを病原因子としては除外するが、様々な潜在的原因物質が残り、明確な診断は、様々なアッセイ(分析、検定)が実施されることを必要とすることが多い。病原体を診断するための従来の微生物学技法は、数日または数週間かかることがあり、多くの場合、適切な一連の治療を遅らせる。
【０００５】
[0005]近年では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、感染因子の迅速な診断のための一般的に好まれる方法となっている。ＰＣＲは、感染症を診断するための迅速で繊細かつ特殊なツールであり得る。ＰＣＲを診断の一次手段として使用するにあたっての課題は、可能性のある様々な原因細菌またはウイルス、およびいくつかの病理組織標本内に存在する低値の細菌またはウイルスである。可能性のある原因細菌またはウイルスは、大部分が陰性であることが予想されるなか、それら各々について１つずつ、ＰＣＲアッセイの大パネル(large panels of PCR assays)を実行することは実現困難であることが多い。この問題は、病原体核酸が低濃度であり、十分な反応テンプレートを集めるためには大量の試料を必要とするときには、悪化され得る。場合によっては、可能性のあるすべての病原因子をアッセイするには不十分な試料しか存在しない。解決策は、試料が単一反応において複数の標的について同時にアッセイされる「多重ＰＣＲ」を実行することである。多重ＰＣＲは一部のシステムにおいては役立つことが証明されているが、高次多重反応のロバスト性および複数の生成物の明確な分析の難しさに関する欠点が存在する。これらの問題を解決するために、このアッセイは、後に複数の二次ＰＣＲに分割され得る。一次生成物内で二次反応物をネスト化することがロバスト性を増大させる。ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）（ＢｉｏＦｉｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、ＵＴ）などの閉システムは、操作を低減し、それにより汚染危険を少なくする。
【０００６】
[0006]ＰＣＲは、概念的に３つの反応に分割され得、各々は通常、３つの温度の各々において経時的に発生すると仮定される。そのようなＰＣＲの「平衡パラダイム」は、各サイクル３つの時間期間にわたって３つの温度で発生する３つの反応（変性、アニーリング、および伸長）に関しては理解が容易である。しかしながら、この平衡パラダイムは、物理的現実にはうまく適合しない。瞬時温度変化が発生せず、試料温度を変化させるのに時間がかかる。さらには、個別の反応速度は、温度によって様々であり、プライマーアニーリングが発生すると、直ちにポリメラーゼ伸長がそれに続く。より正確なのは、迅速なＰＣＲについては特に、反応速度および温度が常に変化している動的パラダイムである。ＰＣＲ中に温度を一定に保つことは、生成物が変性しプライマーがアニールする限りは必要でない。ＰＣＲの動的パラダイムのもとでは、生成物変性、プライマーアニーリング、およびポリメラーゼ伸長は、一時的に重複し得、それらの速度は継続して温度により様々である。平衡パラダイムのもとでは、サイクルは、各々がある時間期間にわたって保持される３つの温度によって画定される一方、動的パラダイムは、遷移速度および標的温度を必要とする。平衡および動的パラダイムの例示的な時間／温度プロファイルは、図５ａ〜図５ｂに示される。しかしながら、これらの温度プロファイルは例示にすぎず、ＰＣＲのいくつかの実装形態においては、アニーリングおよび伸長ステップは組み合わされるため、２つの温度のみが必要とされるということが理解される。
【０００７】
[0007]１９８０年代後半にＰＣＲが最初に実用化されたとき、このプロセスは緩徐であった。典型的なプロトコルは、変性については９４℃で１分、アニーリングについては５５℃で２分、伸長については７２℃で３分であった。温度間の遷移のための時間を含めると、８分のサイクルが典型的であり、結果として４時間では３０サイクルの完了をもたらした。サイクル時間の２５パーセントは、温度遷移に費やされた。サイクル速度が増大すると、温度遷移に費やされる時間の割合も増大したため、動的パラダイムがますます妥当となった。迅速サイクルＰＣＲ中、温度は通常、変化している。短い生成物の迅速サイクルＰＣＲ（＜１００ｂｐｓ）では、１００％の時間が温度遷移に費やされ得、保持時間は必要ではない。より長い生成物の迅速サイクルＰＣＲでは、最適な伸長温度に保持された温度が含まれ得る。
【０００８】
[0008]単独で、「迅速ＰＣＲ」という用語は、相対的かつ曖昧である。１時間のＰＣＲは、４時間と比較すると迅速であるが、１５分と比較すると緩徐である。さらに、ＰＣＲプロトコルは、より高いテンプレート濃度で開始するか、またはより少ないサイクルを使用する場合、短くすることができる。より具体的な尺度は、各サイクルに必要とされる時間である。したがって、「迅速サイクル（ｒａｐｉｄ  ｃｙｃｌｅ）ＰＣＲ」（または「迅速サイクル（ｒａｐｉｄ  ｃｙｃｌｉｎｇ）」は、１９９４年には、３０サイクルが１０〜３０分で完了し、結果として各２０〜６０秒のサイクルをもたらすと定義された。各サイクルのこの実際の時間は、多くの場合には変性、アニーリング、および伸長のためにプログラムされた時間の合計よりも長く、それはこれらの段階の各々の間で温度を傾斜させるために時間が必要とされるからである。１９９０年代初期における最初の研究は、温度制御のために毛細管および熱風を使用して迅速サイクルの実現可能性を確立した。長い年月をかけて、システムはより高速になり、変性、アニーリング、および伸長の動的要件はより明確になった。
【０００９】
[0009]迅速プロトコルは、変性およびアニーリング温度での瞬間または「０」秒保持を使用する。すなわち、温度−時間プロファイルは、変性およびアニーリングについては、上下温度を保持することなく温度スパイクを示す。変性およびアニーリングは、非常に素早く発生し得る。
【００１０】
[0010]この初期の研究からの結論は、１）ＰＣＲ生成物の変性が、変性温度を保持する必要なく非常に迅速であり、２）プライマーのアニーリングが、より高いプライマー濃度では特に、非常に素早く発生し得、かつアニーリング温度保持が必要でない場合があり、３）必要な伸長時間が、ＰＣＲ生成物長およびポリメラーゼ濃度に依存するということである。また、迅速サイクルＰＣＲはより高速なだけでなく、温度が正確に制御される限りは、特殊性および収率に関してもより優れている。
【００１１】
[0011]サイクル時間を減少させる１つのやり方は、温度サイクル要件を緩和するためにＰＣＲプロトコルに変動を導入することである。より高いＴｍを有するより長いプライマーは、より高いアニーリング温度を可能にする。生成物長およびそのＴｍを制限することによって、変性温度を生成物Ｔｍのすぐ上まで下げることができる。より高いアニーリング温度およびより低い変性温度は、組み合わせると、増幅の成功に必要な温度範囲を減少させる。３ステップサイクル（変性、アニーリング、および伸長）を２ステップ（変性および組み合わされたアニーリング／伸長ステップ）に減少させることも、温度サイクル要件を単純化する。しかしながら、２ステップサイクルは、組み合わされたアニーリング／伸長ステップが、特に高速傾斜率で、ポリメラーゼが最も活発である７０〜８０℃の温度最適条件よりも低い温度で実施される場合には、ポリメラーゼ伸長速度を犠牲にする。ポリメラーゼ伸長速度は、約７０〜８０℃までは温度と対数線形あり、報告された最大点は６０〜１２０ｂｐ／ｓである。
【００１２】
[0012]プロトコル変動があるとしても、制御反応と比較すると、サイクル時間が＜２０秒の場合は増幅効率性および収率は乏しいことが多い。より高速のＰＣＲを目指したこれらの試みは、生化学にはほとんど焦点を当てずに設計することが多数派を占めるようである。サイクル時間が２０秒から２秒に減少すると、ＰＣＲ収率は減少し、最終的には消えて、高コピー数で単純な標的を用いる場合さえもロバスト性の欠如を示す。
【００１３】
[0013]最近では、サイクル当たり１０秒未満、およびいくつかの実施形態ではサイクル当たり１秒未満の速度で、熱サイクルさせるために薄壁の毛細管およびウォーターバスを使用するか、または誘導加熱を使用するシステムが報告されている（ＵＳ２０１５／０１１８７１５、ＷＯ２０１５／０６９７４３、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ポリメラーゼおよびプライマー濃度が増大されるこの「エクストリームＰＣＲ」の化学作用の調節は、ポリメラーゼ連鎖反応がそのような速い速度で進むことを可能にする。
【００１４】
[0014]エクストリームＰＣＲの一例において、ポリメラーゼは、少なくとも０．５μΜの濃度で提供され、プライマーは各々少なくとも２μΜの濃度で提供され、いくつかの例では、プライマー濃度は２．５μΜ以上である。非限定的な例により、アニーリング時間は、アニーリング時間＝ｋｌ／［プライマー］によって規定され得、式中、ｋｌは定数であり、［プライマー］は各プライマーの濃度であり、延伸温度での時間は、延伸時間＝ｋ２（伸長の長さ）／（［ポリメラーゼ］＊（ポリメラーゼ速度））によって規定され得、式中、ｋ２は比例定数であり、［ポリメラーゼ］はポリメラーゼの濃度であり、ポリメラーゼ速度はヌクレオチド内の塩基のポリメラーゼ混入の速度である。エクストリームＰＣＲの別の例において、ポリメラーゼ対プライマー比は、例示的には（約０．０３〜約０．４ポリメラーゼ）：（総プライマー濃度）であり、ポリメラーゼ濃度は少なくとも０．５μΜである。ポリメラーゼユニット定義は分かりにくい場合があることに留意されたい。天然のＴａｑポリメラーゼの場合、０．４Ｕ／１０μｌは、典型的な迅速サイクル条件下では約１．５ｎＭである。
【００１５】
[0015]化学作用の改善がＷＯ２０１３／１７７４２９において報告されているが、このデバイスは、大きなウォーターバスを必要とし、それは理想的には防水キャビネット内に置かれる。市販の設備においてＷＯ２０１３／１７７４２９の化学作用を使用する１０秒以下のサイクル時間を有する迅速な温度サイクルが望まれる。そのような迅速な温度サイクルを密閉容器内で実施することも望ましい。
【００１６】
[0016]本発明は、例示的には密閉容器内での、高速ＰＣＲのためのデバイス、キット、および方法を提供することによって、汚染危険を含む高速ＰＣＲに関連した様々な問題に対処する。
【発明の概要】
【００１７】
[0017]本明細書に説明されるのは、可撓性試料容器における核酸の迅速な増幅のためのデバイス（計器およびシステム）ならびに方法である。例示的な実施形態において、可撓性試料容器は、第２段階反応ゾーンに流体接続された第１段階チャンバを含み得、第２段階反応ゾーンは、複数の第２段階反応ウェルを備える。従来、核酸増幅のための熱サイクルデバイスは、アニーリング、延伸、および変性のいくつかのサイクルを達成するために、試料の温度を上げ下げする加熱器を含む。対照的に、本明細書に説明されるデバイスは、第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンを含む温度制御要素を含み得る。１つの例では、第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンの温度は一定に保持され得、ここでは例示的に、一方のゾーンが延伸温度に保持され得、他方のゾーンが変性温度に保持され得る。代替的に、第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンは、限定範囲（例えば５〜２０℃の範囲）内で熱的にサイクルされ得る。温度制御ユニットおよび可撓性試料容器の様々な部分は、核酸増幅のための温度サイクルを達成するために整列され得る。本明細書に詳細に説明されるデバイスの他の構成要素は、熱サイクルを達成するために温度制御ユニットと共同して働き得る。第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンの温度は一定に保持されるか、または狭い範囲でサイクルされるため、核酸増幅のための温度変化をより素早く達成することができる。
【００１８】
[0018]１つの実施形態において、熱サイクルの方法が説明される。本方法は、（ａ）第２段階反応ゾーンに流体接続された第１段階チャンバを備える試料容器を提供するステップであって、第２段階反応ゾーンが、複数の第２段階反応ウェルを備える、ステップと、（ｂ）試料を試料容器内に導入するステップと、（ｃ）試料容器を計器内に挿入するステップであって、計器が温度制御要素を備える、ステップとを含む。本方法は、（ｄ）温度制御要素および第１段階チャンバを整列させて、第１段階チャンバ内で試料の熱サイクルを行うステップと、（ｅ）第１段階チャンバ内で試料の熱サイクルを行った後に、第１段階チャンバからの試料由来の生成物の少なくとも一部分を第２段階反応ゾーン内の複数の第２段階反応ウェル内へ移動させるステップと、（ｆ）温度制御要素および第２段階反応ゾーンを整列させて、第２段階反応ゾーン内で試料の一部分の熱サイクルを行うステップとをさらに含む。
【００１９】
[0019]１つの態様において、温度制御要素は、限定されるものではないがペルチェ素子、抵抗加熱器、誘導加熱器、電磁加熱器、薄膜加熱器、印刷素子加熱器、正温度係数加熱器、およびそれらの組み合わせなどの１つまたは複数の加熱器または冷却器デバイスを含み得る。１つの態様において、温度制御要素は、第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンを含み、第１の温度ゾーンは、第２の温度ゾーンよりも熱い。
【００２０】
[0020]１つの態様において、ステップ（ｆ）で温度制御要素および第２段階反応ゾーンを整列させることは、温度制御要素を第２段階反応ゾーンに対して繰り返し移動させることを含む。別の態様において、ステップ（ｆ）で温度制御要素および第２段階反応ゾーンを整列させることは、第２段階反応ゾーンを温度制御要素に対して繰り返し移動させることを含む。
【００２１】
[0021]１つの態様において、計器は、ワイパ要素をさらに含み、ステップ（ｄ）は、ワイパ要素の回転運動が試料の第１の部分を第１の温度ゾーン熱制御から第２の温度ゾーンの熱制御へ移動させながら、同時に試料の第２の部分を第２の温度ゾーンの熱制御から第１の温度ゾーンの熱制御へ移動させるように、ワイパ要素を温度制御要素および第１段階チャンバと整列させることをさらに含む。
【００２２】
[0022]１つの態様において、試料容器は、第１段階チャンバに流体接続された試料調製ゾーンを含み、かつ、ステップ（ｄ）の前に、本方法は、試料を試料調製ゾーン内に導入するステップと、試料調製ゾーンを溶解装置と接触させて溶解物を生成するステップと、溶解物から核酸を回収するステップと、および回収された核酸を第１段階チャンバ内へ移動させるステップとをさらに含む。別の態様において、試料から核酸を回収するステップは、溶解物を複数の磁気ビーズと接触させることと、磁気ビーズを溶解物から分離するために磁石を配置することと、磁気ビーズを洗浄することと、磁気ビーズを磁石で再捕捉することと、磁気ビーズを溶出緩衝液と接触させて核酸を磁気ビーズから解放することと、磁気ビーズを磁石で再捕捉し、溶出した核酸を磁気ビーズから分離することとを含む。
【００２３】
[0023]１つの態様において、本方法のステップ（ｆ）は、第２の核酸増幅ゾーンを、温度制御要素の第１の温度ゾーンおよび次いで第２の温度ゾーンと整列させて、第２の核酸増幅ゾーン内の試料を熱サイクルさせることをさらに含む。
【００２４】
[0024]１つの態様において、本方法のステップは、２０分以下、１５分以下、または好ましくは、１０分以下で完了され得る。別の態様において、第１および第２の核酸増幅ゾーンの各熱サイクルは、８秒以下、６秒以下、または好ましくは、４秒以下で完了される。
【００２５】
[0025]別の実施形態において、可撓性試料容器内に提供される試料を熱サイクルさせるための計器が説明される。本計器は、試料の第１の部分を第１の温度に調節するための可撓性試料容器の第１の部分に隣接する第１の加熱器と、試料の第２の部分を第１の温度とは異なる第２の温度に調節するための可撓性試料容器の第２の部分に隣接する第２の加熱器と、試料のこれらの部分が同時に加熱器の各々の制御下にあるように、試料の第１の部分を可撓性試料容器の第２の部分へと移動させながら試料の第２の部分を可撓性試料容器の第１の部分へと移動させるワイパ要素とを含む。１つの態様において、ワイパ要素は、試料を、少なくとも第１のセクションおよび第２のセクションを含む少なくとも２つの別々のセクションへと分割し、それにより第１の部分が第１のセクションに含まれ、第２の部分が第２のセクションに含まれるようにする刃を含む。１つの態様において、ワイパ要素は、試料の部分を試料容器の反対の部分へと繰り返し移動させて試料を熱サイクルさせる。
【００２６】
[0026]一実施形態において、試料を熱サイクルさせるための別の計器が説明される。本計器は、少なくとも第１の反応チャンバを有する可撓性試料容器を計器内に位置付けるための受け口と、第１の加熱器要素および第２の加熱器要素を含む加熱器組立体と、第１の反応チャンバが第１の加熱器要素および第２の加熱器要素のうちの少なくとも一方の温度制御下にあるように第１の反応チャンバを加熱器組立体の第１の加熱器要素および第２の加熱器要素に対して横方向に整列させるために、受け口、可撓性試料容器、または加熱器組立体のうちの少なくとも１つに機械的に結合された移動装置とを含む。本計器は、少なくとも１つの反応チャンバ内の流体試料を熱サイクルさせるために、第１の反応チャンバを第１の加熱器要素と、次いで第２の加熱器要素と、繰り返し整列させるように構成される。
【００２７】
[0027]さらに別の実施形態において、熱サイクルシステムが説明される。熱サイクルシステムは、可撓性試料容器を中に受容するための受け口であって、可撓性試料容器が、熱サイクルされることになる試料を中に含む第１段階チャンバを有する、受け口と、可撓性試料容器の第１の側面に位置付けられた、少なくとも第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンを含む加熱器要素と、試料容器の第２の側面に位置付けられたワイパ要素であって、試料を少なくとも第１の部分および第２の部分に分割するために第１段階チャンバに接触するように構成される、ワイパ要素とを含む。受け口、加熱器要素、ワイパ要素、または可撓性試料容器のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、第１段階チャンバをワイパ要素ならびに加熱器要素の第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンに対して整列させ、ワイパ要素は、試料の第１の部分を第２の部分へ移動させながら試料の第２の部分を第１の部分へ移動させて、それにより第１の部分および第２の部分が加熱器要素の第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンの温度制御下にあるようにするために、第１段階チャンバに隣接して回転するように構成される。
【００２８】
[0028]さらに別の実施形態において、試料を熱サイクルさせるための別の計器が説明される。本計器は、計器内に可撓性試料容器を位置付けるための受け口を含む。１つの実施形態において、可撓性試料容器は、第１段階チャンバ、および第２段階反応ウェルのアレイを有する第２段階反応チャンバを含む。本計器は、少なくとも第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンを含む加熱器要素をさらに含み、受け口、試料容器、または加熱器要素のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、第１段階チャンバおよび第２段階反応チャンバを加熱器要素に対して整列させ、受け口および加熱器要素は、第１段階チャンバ内で、次いで第２段階反応チャンバ内で熱サイクルおよび核酸増幅を行うために、加熱器要素が、まず第１段階チャンバを、次に第２段階反応チャンバを加熱することを可能にするように構成される。
【００２９】
[0029]１つの態様において、本計器は、第１段階チャンバに接触し、第１段階チャンバを少なくとも第１の容積および第２の容積に分割するように構成された少なくとも１つの刃を有するワイパ要素をさらに含む。加熱器要素は、第１の容積が第１の温度ゾーンの上に位置付けられ、かつ第２の容積が第２の温度ゾーンの上に位置付けられるように、第１段階チャンバの真下に整列され、ワイパ要素は、第１の容積および第２の容積が温度ゾーンの各々の制御下にあるように、第１の容積を第２の温度ゾーンへ移動させながら第２の容積を第１の温度ゾーンへ移動させるために回転するように構成される。
【００３０】
[0030]さらに別の実施形態において、試料を熱サイクルさせるためのさらに別の計器が説明される。本計器は、計器内に可撓性試料容器を位置付けるための受け口を含む。１つの態様において、可撓性試料容器は、少なくとも１つの反応チャンバを含む。本計器は、第１の加熱器要素、第２の加熱器要素、および第３の加熱器要素を含む加熱器組立体をさらに含む。第１の加熱器要素および第３の加熱器要素は、第２の加熱器要素よりも高い温度に保持され、本計器は、少なくとも１つの反応チャンバ内の流体試料を熱サイクルさせるために、少なくとも１つの反応チャンバを第１の加熱器要素、第２の加熱器要素、および第３の加熱器要素と整列させるように構成される。１つの態様において、第１の加熱器要素および第３の加熱器要素は、約９０℃〜１１０℃の範囲の温度に設定され、第２の加熱器要素は、約５５℃〜６５℃の温度に設定される。
【００３１】
[0031]依然としてさらに別の実施形態において、前の段落において説明された計器を使用したポリメラーゼ連鎖反応方法が含まれる。本方法は、（ａ）少なくとも１つの反応チャンバを備える試料容器を提供するステップと、（ｂ）試料を反応チャンバ内に導入するステップであって、試料が、標的核酸、標的核酸を増幅するための少なくとも１つのプライマー、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む、ステップと、（ｃ）試料容器を計器内に挿入するステップと、（ｄ）第１の加熱器要素を反応チャンバと整列させ、次いで第２の加熱器要素を反応チャンバと整列させ、次いで第３の加熱器要素を反応チャンバと整列させるステップとを含む。第１の加熱器要素および第３の加熱器要素は、変性温度に設定され、第２の加熱器は、アニーリング温度に設定され、ステップ（ｄ）は、変性、アニーリング、および延伸／変性の１つのサイクルを含む。本方法は、核酸増幅を達成するために、選択された回数のサイクルだけ（少なくとも１回）ステップ（ｄ）を繰り返すステップをさらに含む。
【００３２】
[0032]依然としてさらに別の実施形態において、核酸を増幅するためのさらに別の計器が説明される。核酸は、試料容器内に提供され、核酸はアレイ内で構成される。本計器は、試料容器を受容するための開口部と、複数の加熱器であって、各加熱器が異なる温度で提供される、複数の加熱器と、加熱器を開口部に隣接する位置に順次移動させ、それにより上記位置にある加熱器のみが試料容器内の核酸の温度を制御するようにする移動部とを含む。１つの態様において、試料容器は、核酸を増幅するための構成要素をさらに含み、複数の加熱器は、アニーリング温度にある第１の加熱器および変性温度にある第２の加熱器を少なくとも含む。別の態様において、複数の加熱器は、延伸温度にある第３の加熱器をさらに含む。
【００３３】
[0033]依然としてさらに別の実施形態において、ＰＣＲを実施するためのさらに別の方法が説明される。本方法は、（ａ）ある容積を有するＰＣＲ混合物を試料器内に提供するステップと、（ｂ）第１の回数のサイクルだけ熱サイクルさせるステップであって、第１の回数のサイクルの各々が第１のサイクル時間を有する、ステップと、（ｃ）試料容器内のＰＣＲ混合物の容積を第２の容積まで減らすステップであって、第２の容積が第１の容積よりも小さい、ステップと、（ｄ）第２の回数のサイクルだけ熱サイクルさせるステップであって、第２の回数のサイクルの各々が第２のサイクル時間を有し、第２のサイクル時間が第１のサイクル時間より短い、ステップとを含む。１つの態様において、本方法は、（ｅ）試料容器内のＰＣＲ混合物の容積を第３の容積まで減らすステップであって、第３の容積が第２の容積よりも小さい、ステップと、（ｆ）第３の回数のサイクルだけ熱サイクルさせるステップであって、第２の回数のサイクルの各々が第３のサイクル時間を有し、第３のサイクル時間が第２のサイクル時間より短い、ステップとをさらに含む。
【００３４】
[0034]依然としてさらに別の実施形態において、試料内の核酸を増幅するためのさらに別の方法が説明される。本方法は、流体試料を容器の試料区画内へ導入するステップであって、流体試料が標的核酸および標的核酸を増幅するための試薬を含有する、ステップと、容器を加熱装置内へ導入するステップであって、加熱装置が、第１の加熱器、第２の加熱器、および試料区画内の流体試料を移動させるための移動部（例えばワイパまたは圧搾器）を備え、第１の加熱器が第１の温度に設定され、第２の加熱器が第２の温度に設定され、第１の温度が第２の温度よりも高く、試料区画の第１の部分が第１の加熱器に近接して設置されているため、第１の加熱器が試料区画の第１の部分に対して熱制御を呈し、試料区画の第２の部分が第２の加熱器に近接して設置されているため、第２の加熱器が試料区画の第２の部分に対して熱制御を呈する、ステップと、流体試料の少なくとも一部分を試料区画の第１の部分と試料区画の第２の部分との間で選択的に移動させ、それにより試料のこれらの部分が同時に加熱器の各々の制御下にあるようにするステップとを含む。
【００３５】
[0035]依然としてさらに別の実施形態において、試料内の核酸を増幅するためのさらに別の方法が説明される。本方法は、（ａ）流体試料を容器の第１の区画内へ導入するステップであって、流体試料が標的核酸および標的核酸を増幅するための試薬を含み、第１の区画が、アニーリング温度未満である温度（低アニーリング温度）に設定される第１の加熱器の制御下にある、ステップと、（ｂ）第１の加熱器の温度をアニーリング温度まで上げるステップと、（ｃ）流体試料を容器の第２の区画へ移動させることであって、第２の区画が、延伸温度を上回る温度（高延伸温度）に設定される第２の加熱器の制御下にある、移動させること、および、流体試料を第２の区画へ移動させた後に、第１の加熱器の温度を低アニーリング温度まで下げること、を行うステップと、（ｄ）第２の加熱器の温度を延伸温度まで下げるステップと、（ｅ）第２の加熱器の温度を少なくとも変性温度まで上げるステップと、（ｆ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップとを含む。１つの態様において、ステップ（ａ）が繰り返されるとき、第２の加熱器の温度は高延伸温度へ移される。別の態様において、ステップ（ｅ）は、第２の加熱器の温度を、変性温度を上回る温度まで上げることを含み、ステップ（ａ）は、流体試料が変性温度に達するとすぐに繰り返される。
【００３６】
[0036]依然としてさらに別の実施形態において、少なくとも第１段階チャンバを有する可撓性試料容器内に提供される試料を熱サイクルさせるためのさらに別の計器が説明される。１つの実施形態において、本計器は、計器内に可撓性試料容器を位置付けるための受け口と、少なくとも第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンを含む加熱器要素とを含む。受け口または加熱器要素のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、第１段階チャンバを加熱器要素の第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンに対して位置付け、受け口および加熱器要素は、第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンが第１段階チャンバの温度を制御してその中で熱サイクルおよび核酸増幅を行うことを可能にするように構成される。
【００３７】
[0037]１つの態様において、加熱器要素は、試料の第１の部分が第１の温度ゾーンの上に位置付けられ得、かつ試料の第２の部分が第２の温度ゾーンの上に位置付けられるように、第１段階チャンバの真下に位置付け可能であり得る。本計器は、第１段階チャンバの内容物の熱サイクルおよび核酸増幅を行うために、試料の第１の部分および第２の部分が温度ゾーンの各々の制御下にあるように、試料の第１の部分を第２の温度ゾーンへ移動させながら試料の第２の部分を第１の温度ゾーンへ移動させるために第１段階チャンバに接触して回転するように構成され得る少なくとも１つの刃を有するワイパを有する混合構成要素をさらに含む。
【００３８】
[0038]別の態様において、可撓性試料容器は、試料調製ゾーンを含み得、ここでは、例えば、試料内の細胞が溶解され得、核酸が第１段階チャンバでの増幅のために回収され得る。別の態様において、可撓性試料容器は、第１段階チャンバから下流に第２の核酸増幅ゾーンを含み得る。第２の核酸増幅ゾーンは、第１段階チャンバから希釈された増幅生成物の一部分を受容し、この希釈された増幅生成物を、試料の内容物をアッセイするために選択された特定のプライマーセットを用いてウェルのアレイ内でさらに増幅するように構成され得る。
【００３９】
[0039]依然としてさらに別の実施形態において、試料内の核酸を増幅するためのさらに別の計器が説明される。本計器は、可撓性試料容器を受容するための開口部であって、可撓性試料容器が少なくとも１つの反応ゾーンを含む、開口部と、複数の加熱器であって、各加熱器が異なる温度に設定されるように構成され、各加熱器を少なくとも１つの反応ゾーンと順次整列させて、その中の試料を加熱または冷却することができるように、加熱器が実質的に平面の取付部に位置付けられる、複数の加熱器とを含む。１つの態様において、実質的に平面の取付部は、可撓性試料容器に隣接して回転されるように構成される円形取付部を備える。
【００４０】
[0040]本明細書に説明される計器および方法は、自動化された試料調製、第１段階ＰＣＲ、第２段階ＰＣＲ、および可撓性試料容器内の第２段階ＰＣＲ生成物の自動分析を含み得るか、またはそれらのために構成され得る。例えば、受け口、加熱器要素、または混合構成要素のうちの１つまたは複数は、加熱および冷却試料調製、第１段階ＰＣＲ、および第２段階ＰＣＲのために可撓性試料容器に対して位置付け可能であり得る。
【００４１】
[0041]依然としてさらに別の実施形態において、可撓性試料容器が説明される。可撓性試料容器は、反応ウェルのアレイを有する反応チャンバを含み、アレイのウェルの各々が、選択的に開放可能および選択的に密封可能な充填チャネルおよび充填孔に流体接続される。１つの態様において、充填孔は、アレイのウェルに隣接して、かつその上を流れるウェル充填チャネルに流体接続され、ウェル充填チャネルは、アレイのウェルに隣接する層内に切欠きを、および第２の層内に別の切欠きを作製することによって形成される。別の態様において、充填孔は、アレイのウェル内へ流れるウェル充填チャネルに流体接続され、ウェル充填チャネルは、充填孔をアレイのウェルに流体接続する層内の切欠きを作製することによって形成される。
【００４２】
[0042]本発明の実施形態のさらなる特徴および利点は、以下に続く説明において明記されるものとし、またはそのような実施形態の実践により習得され得る。そのような実施形態の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲において具体的に指し示される計器および組み合わせを用いて実現および取得され得る。これらの特徴および他の特徴は、以下の説明および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるものであり、または以後明記されるそのような実施形態の実践により習得され得る。
【００４３】
[0043]本発明の上に列挙した利点および特徴ならびに他の利点および特徴を取得することができる様式を説明するために、上に簡単に説明された本発明のより具体的な説明は、添付の図面に例証されるそれらの特定の実施形態を参照して提供されるものとする。これらの図面は本発明の典型的な実施形態を描写するにすぎず、したがってその範囲を制限するものと見なされないということを理解して、本発明は、添付の図面を使用することによりさらなる特殊性および詳細を用いて記載および説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】[0044]自己完結型ＰＣＲに有用な可撓性ポーチを示す図である。
【図２】[0045]本発明の実施形態例に従う、図１のポーチを含む、図１のポーチと共に使用するための計器の分解斜視図である。
【図３】[0046]図１のポーチが破線で示されている、図２の内袋構成要素を含む、図２の計器の部分断面図である。
【図４】[0047]図２の計器の１つの例示的な実施形態で使用されるモータを示す図である。
【図５】[0048]図５Ａは、ＰＣＲの平衡パラダイムの例示的なプロファイルを示す図である。図５Ｂは、ＰＣＲの動的パラダイムの例示的なプロファイルを示す図である。黒色は変性を表し、縞はアニーリングを表し、白色は熱サイクル中の核酸の伸長を表す。
【図６】[0049]図２の計器の第１段階ＰＣＲの代替的な加熱実施形態の分解図である。
【図７】[0050]図６の加熱形式の上面図である。
【図８】[0051]図８Ａは、本開示の１つの実施形態に従う、図７の断面図を示し、またワイパがどのように流体が充填されたブリスタに接触し得るかを例証する図である。図８Ｂは、本開示の１つの実施形態に従う、図７の断面図を示し、またワイパがどのように流体が充填されたブリスタに接触し得るかを例証する図である。図８Ｃは、本開示の１つの実施形態に従う、図７の断面図を示し、またワイパがどのように流体が充填されたブリスタに接触し得るかを例証する図である。図８Ｄは、本開示の１つの実施形態に従う、図７の断面図を示し、またワイパがどのように流体が充填されたブリスタに接触し得るかを例証する図である。
【図９】[0052]図９Ａは、図７に類似しているが、ワイパの代替実施形態を示す図である。図９Ｂは、図７に類似しているが、ワイパの代替実施形態を示す図である。図９Ｃは、図７に類似しているが、ワイパの代替実施形態を示す図である。
【図１０】[0053]図１０は、図６〜図９Ｃに例証される熱サイクル実施形態で使用することができるワイパシステムの実施形態を例証する図である。
【図１１】[0054]図１１Ａは、本開示の１つの実施形態に従うワイパヘッドを例証する図である。図１１Ｂは、本開示の１つの実施形態に従うワイパヘッドを例証する図である。
【図１２Ａ】[0055]本開示の１つの実施形態に従う、ワイパシステムと少なくとも２つの温度ゾーンを含む加熱器とを組み込む熱サイクル計器を例証する図である。
【図１２Ｂ】本開示の１つの実施形態に従う、ワイパシステムと少なくとも２つの温度ゾーンを含む加熱器とを組み込む熱サイクル計器を例証する図である。
【図１３Ａ】[0056]本開示の１つの実施形態に従う、ワイパシステムと少なくとも２つの温度ゾーンを含む加熱器とを組み込む別の熱サイクル計器を例証する図である。
【図１３Ｂ】本開示の１つの実施形態に従う、ワイパシステムと少なくとも２つの温度ゾーンを含む加熱器とを組み込む別の熱サイクル計器を例証する図である。
【図１４】[0057]図１４Ａは、自己完結型ＰＣＲに有用な可撓性ポーチを示す図である。[0058]図１４Ｂは、線Ｂ−Ｂに沿った図１４Ａのポーチの部分断面図である。
【図１５Ａ】[0059]図１４Ａのポーチに含まれ得る第２段階ＰＣＲアレイの概略図である。
【図１５Ｂ】[0060]アレイの１つのウェルおよびウェルを充填するための一連のチャネルを例証する、線Ｂ−Ｂに沿った図１５Ａのアレイの切断図である。
【図１５Ｃ】[0061]アレイの１つのウェルおよびウェルを充填するための代替のシステムを例証する、図１５Ａのアレイの切断図である。
【図１６Ａ】[0062]図１４Ａのポーチと共に、図１３Ａおよび図１３Ｂの計器によって実施され得る核酸の調製ならびに増幅のための一連の操作の例を例証する図である。
【図１６Ｂ】図１４Ａのポーチと共に、図１３Ａおよび図１３Ｂの計器によって実施され得る核酸の調製ならびに増幅のための一連の操作の例を例証する図である。
【図１６Ｃ】図１４Ａのポーチと共に、図１３Ａおよび図１３Ｂの計器によって実施され得る核酸の調製ならびに増幅のための一連の操作の例を例証する図である。
【図１６Ｄ】図１４Ａのポーチと共に、図１３Ａおよび図１３Ｂの計器によって実施され得る核酸の調製ならびに増幅のための一連の操作の例を例証する図である。
【図１６Ｅ】図１４Ａのポーチと共に、図１３Ａおよび図１３Ｂの計器によって実施され得る核酸の調製ならびに増幅のための一連の操作の例を例証する図である。
【図１６Ｆ】図１４Ａのポーチと共に、図１３Ａおよび図１３Ｂの計器によって実施され得る核酸の調製ならびに増幅のための一連の操作の例を例証する図である。
【図１７】[0063]図１２Ａおよび図１２Ｂならびに図１３Ａおよび図１３Ｂの熱サイクル計器に含まれ得る加熱器システムを概略的に例証する図である。
【図１８】[0064]図２の計器の第２段階ＰＣＲの代替的な加熱実施形態の斜視図である。
【図１９】[0065]図６〜図８の計器のプロトタイプを使用した増幅の結果を、標準的なプレートベースの熱サイクラを使用した増幅と比較して示す図である。
【図２０】[0066]ブロック熱サイクラ（円）およびプロトタイプワイパ刃設定（正方形）における第１段階ＰＣＲについて異なる回数のサイクルを実行することから結果として生じる第２段階ＰＣＲ  Ｃｐのグラフである。
【図２１】[0067]２つの加熱器を使用した３つの温度ＰＣＲプロトコルについての加熱プロファイルを示す図である。伸長／変性加熱器温度は、実線として示され、アニーリング加熱器温度は、破線として示され、試料温度は、点線として示される。
【図２２】[0068]第１段階増幅について図６〜図８または図１２Ａ〜図１３Ｂの計器に類似したプロトタイプ計器を使用した多重増幅のＤＮＡ融解曲線を示す図である。第１段階増幅の後、増幅生成物は、第２段階ＰＣＲのために希釈され増幅されて、Ｒｏｃｈｅ  ＬＣ４８０リアルタイムＰＣＲ計器内で融解していた。
【図２３】[0069]第２段階シングルプレックスＤＮＡ増幅反応のリアルタイムＤＮＡ増幅データを示す図である。第１段階ＰＣＲにはＲｏｃｈｅ  ＬＣ４８０リアルタイムＰＣＲ計器を使用した。第１段階ＰＣＲからの増幅生成物を希釈し、第２段階ＰＣＲマスターミックスと混合し、第２段階増幅のために図１４Ａのアレイ１４３０に類似したアレイ内へ注入した。増幅のための熱サイクルは、図１６Ｅおよび図１６Ｆを参照して説明される第２段階ＰＣＲ手順に類似した手順を使用して実施した。
【図２４】[0070]図２３の第２段階増幅のＤＮＡ融解曲線を示す図である。
【図２５】[0071]図１３Ａおよび１３Ｂに描写される計器に類似した計器を使用した第１段階および第２段階増幅の結果を描写し、サイクル数の関数として第２段階ＰＣＲアレイのウェル内の蛍光の増加を描写する図である。
【図２６】図１３Ａおよび１３Ｂに描写される計器に類似した計器を使用した第１段階および第２段階増幅の結果を描写し、増幅されている生成物が正しい生成物であることを確実にするための融解実験の結果を描写するものであり、生の融解曲線を示す図である。
【図２７】図１３Ａおよび１３Ｂに描写される計器に類似した計器を使用した第１段階および第２段階増幅の結果を描写し、増幅されている生成物が正しい生成物であることを確実にするための融解実験の結果を描写するものであり、融解曲線の負の一次導関数（ｄＦ／ｄｔ）を示す図である。
【図２８】[0072]図１６Ｅおよび図１６Ｆに例証される手順と類似した熱サイクル手順を用いて、アレイ１４３０またはアレイ１５００に類似したアレイのウェル内の流体の温度応答を試験するように設計された一連の実験の結果を例証するものであり、８秒のサイクル時間（各温度で４秒保持する）での温度応答を例証する図である。
【図２９】図１６Ｅおよび図１６Ｆに例証される手順と類似した熱サイクル手順を用いて、アレイ１４３０またはアレイ１５００に類似したアレイのウェル内の流体の温度応答を試験するように設計された一連の実験の結果を例証するものであり、８秒のサイクル時間での別の温度応答実験を例証する図である。
【図３０】図１６Ｅおよび図１６Ｆに例証される手順と類似した熱サイクル手順を用いて、アレイ１４３０またはアレイ１５００に類似したアレイのウェル内の流体の温度応答を試験するように設計された一連の実験の結果を例証するものであり、４秒のサイクル時間（各温度で２秒保持する）での温度応答を例証する図である。
【図３１】図１６Ｅおよび図１６Ｆに例証される手順と類似した熱サイクル手順を用いて、アレイ１４３０またはアレイ１５００に類似したアレイのウェル内の流体の温度応答を試験するように設計された一連の実験の結果を例証するものであり、２秒のサイクル時間（各温度で１秒保持する）での温度応答を例証する図である。
【図３２Ａ】[0073]本開示の１つの実施形態に従う磁石システムを有するワイパヘッドを例証する図である。
【図３２Ｂ】本開示の１つの実施形態に従う磁石システムを有するワイパヘッドを例証する図である。
【図３２Ｃ】本開示の１つの実施形態に従う磁石システムを有するワイパヘッドを例証する図である。
【図３３】[0074]本開示の１つの実施形態に従う一対の反応ブリスタを例証する図である。
【図３３Ａ】[0075]図３２Ａ〜図３２Ｃのワイパヘッドと相互作用する際の図３３の反応ブリスタを例証する図である。
【図３３Ｂ】図３２Ａ〜図３２Ｃのワイパヘッドと相互作用する際の図３３の反応ブリスタを例証する図である。
【図３３Ｃ】図３２Ａ〜図３２Ｃのワイパヘッドと相互作用する際の図３３の反応ブリスタを例証する図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
[0076]実施形態例は、添付の図面を参照して以下に説明される。本開示の趣旨および教示から逸脱することなく、多くの異なる形態および実施形態が可能であるため、本開示は、本明細書に明記される実施形態例に限定されるものと解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態例は、本開示が徹底的かつ完全であり、当業者に本開示の範囲を伝えるものであるように提供される。図面においては、層および領域のサイズおよび相対サイズは、明確性のために誇張される場合がある。本説明を通して、同様の参照番号は同様の要素を指す。
【００４６】
[0077]別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本開示に関係する当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。共通して使用される辞書などにおいて定義されるような用語は、本出願および関連技術の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、理想化されたまたは過度に形式にとらわれた意味で解釈することは、本明細書において明白にそのように定義されない限りは、なされるべきではないことをさらに理解されたい。本明細書において本発明の説明に使用される言葉は、特定の実施形態を説明する目的のためだけのものであり、本発明を限定することは意図されない。本明細書において説明されるものと同様または同等のいくつかの方法および材料を本開示の実践において使用することができるが、本明細書では例示的な材料および方法のみが説明される。
【００４７】
[0078]本明細書内で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、または他の参照文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。用語に矛盾がある場合、本明細書が方針を決定する。
【００４８】
[0079]デバイス、システム、方法などを含む本開示の様々な態様は、１つまたは複数の例示的な実装形態を参照して例証され得る。本明細書において使用される場合、「例の」および「例示的な」という用語は、「例、事例、または例示としての役割を果たすこと」を意味し、本明細書に開示される他の実装形態よりも必ずしも好ましいまたは有利であると見なされるべきではない。加えて、本開示または発明の「実装形態」または「実施形態」への言及は、本開示または発明の１つまたは複数の実施形態への特定の言及を含み、またその逆も然りであり、以下の説明によるものではなく添付の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲を制限することなく例示的な例を提供することが意図される。
【００４９】
[0080]本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容により明確に別段の定めがない限りは、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ａ  ｔｉｌｅ（タイル）」への言及は、１つ、２つ、またはそれ以上のタイルを含む。同様に、複数の指示対象への言及は、内容および／または文脈により別段の定めのない限り、単一の指示対象および／または複数の指示対象を含むものと解釈されるべきである。したがって、「ｔｉｌｅｓ（タイル）」への言及は、必ずしも複数のそのようなタイルを必要としない。むしろ、語形の変化に関係なく、本明細書では１つまたは複数のタイルが企図されることが理解される。
【００５０】
[0081]本出願全体にわたって使用されるように、「ｃａｎ」および「ｍａｙ」という言葉は、義務的意味（すなわち、必須を意味する）ではなく、許容的意味（すなわち、そのような可能性を有することを意味する）で使用される。加えて、例示的には、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」という用語、それらの変異形（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｅｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」など）、および同様の用語は、特許請求の範囲を含め、本明細書において使用される場合、包含的および／またはオープンエンドであるものとし、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉およびそれらの変異形（例えば、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）と同じ意味を有するものとし、追加の列挙されていない要素または方法ステップを排除しない。
【００５１】
[0082]本明細書において使用される場合、「上部」、「底部」、「左」、「右」、「上」、「下」、「上方」、「下方」、「内」、「外」、「内側」、「外側」、「内部」、「外部」、「近位」、「遠位」、「前」、「裏」などの指向性および／または恣意的な用語は、相対的な方向および／または配向を示すためだけに使用され得、本明細書、発明、および／または特許請求の範囲を含む、本開示の範囲を限定することを別段意図しない場合がある。
【００５２】
[0083]ある要素が、別の要素に「結合される」、「接続される」、または別の要素に対して「応答する」、または別の要素の「上」にあると言及されるとき、それは、直接的に、他方の要素に連結される、接続される、もしくは他方の要素に対して応答する、もしくは他方の要素の上にあり得るか、または、介在する要素も存在する場合があることを理解されたい。対照的に、ある要素が、別の要素に「直接連結される」、「直接接続される」、または別の要素に対して「直接的に応答する」、または別の要素の直接上にあると言及されるとき、介在する要素は存在しない。
【００５３】
[0084]本発明的概念の実施形態例は、実施形態例の理想化された実施形態（および中間構造）の概略図である断面図を参照して本明細書に説明される。そのようなものとして、例えば製造技術および／または製作公差の結果として例示の形状からの変異形が予期されるものとする。したがって、本発明的概念の実施形態例は、本明細書に例証される領域の特定の形状に限定されるものと解釈されるべきではなく、例えば製造から結果として生じる形状の逸脱を含むものとする。したがって、図に例証される領域は、本質的に概略的であり、それらの形状は、デバイスのある領域の実際の形状を例証することは意図されず、また実施形態例の範囲を限定することは意図されない。
【００５４】
[0085]「第１」「第２」などの用語が、様々な要素を説明するために本明細書で使用され得るが、これらの要素は、これらの用語によって限定されるべきではないということを理解されたい。これらの用語は、１つの要素を別のものと区別するためだけに使用される。したがって、「第１の」要素は、本実施形態の教示から逸脱することなく、「第２の」要素と呼ばれてもよい。
【００５５】
[0086]本明細書に説明される様々な実装形態を、本開示の範囲から逸脱することなく、説明または開示される任意の他の実装形態と組み合わせて利用することができるということも理解される。したがって、本開示の特定の実装形態に従う生成物、部材、要素、デバイス、装置、システム、方法、プロセス、構成物、および／またはキットは、本開示の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される他の実装形態（システム、方法、装置、および／または同様のものを含む）において説明される特性、特徴、構成要素、部材、要素、ステップ、および／または同様のものを、含む、組み込む、または別途備えることができる。したがって、１つの実装形態に関連した特定の特徴への言及は、その実装形態内だけでの適用に限定されるものと解釈されるべきではない。
【００５６】
[0087]本明細書に使用される見出しは、整理の目的のためだけのものであり、本説明の範囲または特許請求の範囲を限定するために使用することを意味しない。理解を促進するため、同様の参照番号は、可能な場合には、図に共通した同様の要素を指定するために使用されている。さらには、可能な場合には、要素の同様の番号付けが様々な図において使用されている。さらには、特定の要素の代替的な構成は各々、要素番号に付加された別個の文字を含み得る。
【００５７】
[0088]「約」という用語は、本明細書では、およそ、ほぼ、ざっと、または近くを意味するために使用される。「約」という用語が数範囲と併せて使用される場合、それは、明記される数値より境界を上および下に延長することによってその範囲を修正する。一般に、「約」という用語は、本明細書では、数値を記された値より上および下に５％の相違で修正するために使用される。そのような範囲が表されるとき、別の実施形態は、一方の特定の値から、および／または他方の特定の値までを含む。同様に、先行して「約」を使用することにより値が近似で表されるとき、その特定の値は別の実施形態を形成することを理解されたい。範囲の各々の終点は、他方の終点に関連して、および他方の終点とは関係なく、いずれにおいても有意であることをさらに理解されたい。
【００５８】
[0089]「または」という言葉は、本明細書において使用される場合、特定のリストのうちの任意の１つの構成メンバを意味し、またそのリストのうちの構成メンバのいかなる組み合わせも含む。
【００５９】
[0090]「試料」とは、動物；動物からの組織もしくは器官；細胞（対象内、対象内から直接取られたもの、または培養物内に維持される細胞もしくは培養された細胞株からの細胞のいずれか）；細胞溶解物（または溶解物画分）もしくは細胞抽出物；細胞、細胞性物質、もしくはウイルス性物質（例えばポリペプチドまたは核酸）由来の１つもしくは複数の分子を含有する溶液；または天然に存在しない核酸を含有する溶液を意味し、本明細書に説明されるようにアッセイされる。試料はまた、宿主細胞もしくは病原体細胞、細胞成分、または核酸を含有する場合としない場合がある任意の体液または排泄物（例えば、限定されるものではないが、血液、尿、便、唾液、涙、胆汁、または脳脊髄液）であり得る。試料はまた、限定されるものではないが、土、水（真水、廃水など）、大気監視システム試料（例えば、エアフィルタ濾材に捕捉された物質）、表面スワブ、および媒介生物（例えば、蚊、ダニ、ノミなど）などの環境試料を含み得る。
【００６０】
[0091]「核酸」という表現は、本明細書において使用される場合、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであるにしろ、一本鎖または二本鎖であるにしろ、センスまたはアンチセンスであるにしろ、ワトソン‐クリック型塩基対によって相補性核酸へのハイブリダイゼーションが可能である天然に存在するかまたは合成のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。本発明の核酸はまた、ヌクレオチド類似体（例えばＢｒｄＵ）、および非リン酸ジエステルヌクレオシド間結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはチオジエステル結合）を含み得る。具体的には、核酸は、制限なく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００６１】
[0092]「プローブ」、「プライマー」、または「オリゴヌクレオチド」とは、相補的配列を含有する第２の核酸分子に塩基対合できる所定の配列の一本鎖核酸分子（「標的」）を意味する。結果として生じる混成物の安定性は、長さ、ＧＣ含量、および発生する塩基対合の程度に依存する。塩基対合の程度は、プローブと標的分子との間の相補性の度合いおよびハイブリダイゼーション条件の厳密性の度合いなどのパラメータによって影響を受ける。ハイブリダイゼーション厳密性の度合いは、温度、塩濃度、およびホルムアミドなどの有機分子の濃度などのパラメータによって影響を受け、当業者に知られている方法によって決定される。プローブ、プライマー、およびオリゴヌクレオチドは、当業者によく知られている方法によって、放射活性、蛍光性、または非放射活性のいずれかで検出可能なように標識化され得る。ｄｓＤＮＡを検出するために、ｄｓＤＮＡ結合色素が使用され得る。「プライマー」は、ポリメラーゼによって伸長されるように特に構成されるが、「プローブ」または「オリゴヌクレオチド」はそのように構成される場合とされない場合とがあることが理解される。
【００６２】
[0093]「ｄｓＤＮＡ結合色素」とは、二本鎖ＤＮＡに結合されるときに、通常はより強力に蛍光を発することによって、一本鎖ＤＮＡに結合されるかまたは溶液中で遊離であるときとは異なって蛍光を発する色素を意味する。ｄｓＤＮＡ結合色素についての言及がなされるが、任意の好適な色素が使用され得、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，３８７，８８７号にはいくつかの非限定の例示的な色素が説明されていることが理解される。他のシグナル生成物質が、核酸増幅および融解を検出するために使用され得、例示的には、当該技術分野において知られているように、酵素、抗体などがある。
【００６３】
[0094]「特異的にハイブリタイズする」とは、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドが、高厳密性条件下で、実質的に相補性の核酸（例えば、試料核酸）を認識し、それと物理的に相互作用（すなわち、塩基対合）し、実質的に他の核酸と塩基対合しないことを意味する。
【００６４】
[0095]「高厳密性条件」とは、典型的には、約融解温度（Ｔｍ）マイナス５℃（すなわち、プローブのＴｍより５度低い）で発生することを意味する。機能的には、高厳密性条件は、少なくとも８０％配列相同性を有する核酸配列を識別するために使用される。
【００６５】
[0096]ＰＣＲは本明細書内の例において使用される増幅方法であるが、プライマーを使用する任意の増幅方法が好適であり得ることが理解される。そのような好適な手順としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、カスケードローリングサイクル増幅（ＣＲＣＡ）、ループ介在等温ＤＮＡ増幅（ＬＡＭＰ）、等温キメラプライマー核酸増幅（ＩＣＡＮ）、標的ベースのヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）、転写増幅（ＴＭＡ）などが挙げられる。したがって、ＰＣＲという用語が使用されるときは、他の代替的な増幅方法を含むことを理解されたい。離散したサイクルのない増幅方法では、反応時間は、サイクル数、倍加時間、または交差点（Ｃｐ）について測定が行われる場合に使用され得、さらなるＰＣＲサイクルが本明細書に説明される実施形態において追加される場合にはさらなる反応時間が追加され得る。プロトコルはそれに従って調整される必要があり得ることが理解される。
【００６６】
[0097]本明細書内の様々な例は、ヒト標的およびヒト病原体を参照するが、これらの例は例示にすぎない。本明細書に説明される方法、キット、およびデバイスは、ヒト、家畜、産業、および環境を含む多種多様な試料から多種多様な核酸配列を検出しシークエンシングするために使用され得る。
【００６７】
[0098]本明細書に開示される様々な実施形態は、例示的には単一の閉システムにおいて、様々な生体物質、例示的には抗原および核酸配列の存在について試料をアッセイするために、自己完結型核酸分析ポーチを使用する。ポーチ、およびポーチと一緒に使用するための計器を含むそのようなシステムは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３９４，６０８号および第８，８９５，２９５号、ならびに米国特許出願第２０１４−０２８３９４５号においてより詳細に開示されている。しかしながら、そのようなポーチは例示にすぎず、本明細書で論じられる核酸調製および増幅反応は、当該技術分野において知られているような様々な核酸精製および増幅システムを使用して、９６ウェルプレート、他の構成のプレート、アレイ、カルーセルなどを含む当該技術分野で知られているような様々な開または閉システム試料器のいずれかにおいて実施され得るということが理解される。「試料ウェル」、「増幅ウェル」、「増幅容器」などの用語が本明細書内で使用されるが、これらの用語は、これらの増幅システムにおいて使用されるようなウェル、チューブ、および様々な他の反応容器を包含することが意味される。１つの実施形態において、ポーチは、複数の病原体についてアッセイするために使用される。ポーチは、例示的には閉システムにおいて、試料ウェルとして使用される１つまたは複数のブリスタを含み得る。例示的には、様々なステップは、核酸調製、一次大容積多重ＰＣＲ、一次増幅生成物の希釈、および二次ＰＣＲを含め、最終的に任意選択のリアルタイム検出または融解曲線分析などの増幅後分析に至るまで、任意選択的に使い捨てのポーチ内で実施され得る。さらに、様々なステップが本発明のポーチ内で実施され得るが、ステップのうちの１つまたは複数は、特定の用途においては省かれる場合があり、ポーチ構成はそれに従って変更され得ることが理解される。
【００６８】
[0099]図１は、様々な実施形態で使用され得るか、または様々な実施形態のために再構成され得る例示的なポーチ５１０を示す。ポーチ５１０は、米国特許第８，８９５，２９５号の図１５に類似しており、同様のアイテムには同じ番号が付けられている。金具５９０は、試薬貯蔵所または廃物貯蔵所としての役割も果たす入口チャネル５１５ａ〜５１５ｌを備える。例示的に、試薬は、金具５９０内で凍結乾燥されて、使用前に再水和され得る。それぞれのチャネル５１４、５３８、５４３、５５２、５５３、５６２、および５６５を有するブリスタ５２２、５４４、５４６、５４８、５６４、および５６６は、米国特許第８，８９５，２９５号の図１５の同じ数字のブリスタに類似している。図１の第２段階反応ゾーン５８０は、米国特許出願第８，８９５，２９５号のものに類似しているが、高密度アレイ５８１の第２段階ウェル５８２は、いくらか異なるパターンで配置される。図１の高密度アレイ５８１のより円形のパターンは、角のウェルを削除し、第２段階ウェル５８２のより均一な充填を結果としてもたらし得る。示されるように、高密度アレイ５８１は、１０２個の第２段階ウェル５８２を備える。ポーチ５１０は、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）計器（ＢｉｏＦｉｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、ＵＴ）での使用に好適である。しかしながら、ポーチ実施形態は例示にすぎないということが理解される。
【００６９】
[00100]他の容器が使用され得るが、例示的には、ポーチ５１０は、可撓性プラスチックフィルム、またはポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレートなどの他の可撓性材料、押し出し加工、プラズマ蒸着、ならびにラミネーションを含む当該技術分野において知られている任意のプロセスによって作製され得るそれらの混合物、組み合わせ、および層の２つの層で形成され得る。例えば、各層は、一緒にラミネートされる単一の種類または２つ以上の種類の材料の１つまたは複数の層からなり得る。アルミニウムラミネーションを有する金属箔またはプラスチックも使用され得る。ブリスタおよびチャネルを形成するために一緒に密閉され得る他のバリヤ材料が、当該技術分野において知られている。プラスチックフィルムが使用される場合、層は、例示的にはヒートシールによって、一緒に結合され得る。例示的には、この材料は、核酸結合力が弱い。
【００７０】
[00101]蛍光モニタリングを用いる実施形態では、動作波長において吸収度および自動蛍光が十分に低いプラスチックフィルムが好ましい。そのような材料は、異なるプラスチック、異なる可塑剤、および混合比、ならびにフィルムの異なる厚さを試験することによって特定され得る。アルミニウムまたは他の箔ラミネーションを有するプラスチックでは、蛍光検出デバイスによって読み取られることになるポーチの一部分には箔がないことがある。例えば、ポーチ５１０の第２段階反応ゾーン５８０の第２段階ウェル５８２内で蛍光がモニタされる場合、ウェル５８２における１つまたは両方の層には箔がないことがある。ＰＣＲの例においては、約０．１２１９ｍｍ（０．００４８インチ）厚のポリエステル（Ｍｙｌａｒ、ＤｕＰｏｎｔ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ  ＤＥ）および０．０２５〜０．０７６ｍｍ（０．００１〜０．００３インチ）厚のポリプロピレンフィルムからなるフィルムラミネートが良い効果を発揮する。例示的には、ポーチ５１０は、入射光のおよそ８０％〜９０％を透過することができる透明材料製であり得る。
【００７１】
[00102]例示的な実施形態において、本材料は、ブリスタおよびチャネルへの圧力、例示的には空気圧の印加によって、ブリスタ間で移動される。したがって、圧力を用いる実施形態において、ポーチ材料は、例示的には、圧力により所望の効果を有するのに十分に可撓性である。本明細書では、「可撓性」という用語は、ポーチの材料の物理的特性を説明するために使用される。本明細書では、「可撓性」という用語は、本明細書で使用される圧力のレベルによって、亀裂、破砕、ひび、または同様のものなしに容易に変形可能であると定義される。例えば、Ｓａｒａｎ（商標）ラップおよびＺｉｐｌｏｃ（登録商標）バッグなどの薄プラスチックシート、ならびにアルミニウム箔などの薄金属箔は可撓性である。しかしながら、空気圧を用いる実施形態においてさえ、可撓性である必要があるのは、ブリスタおよびチャネルの特定の領域だけである。さらに、ブリスタおよびチャネルが容易に変形可能である限りは、可撓性である必要があるのは、ブリスタおよびチャネルの１つの側面だけである。ポーチ５１０の他の領域は、剛性材料製であり得るか、または剛性材料で補強され得る。したがって、「可撓性ポーチ」または「可撓性試料容器」などの用語が使用されるとき、ポーチまたは試料容器の部分のみが可撓性である必要があるということが理解される。
【００７２】
[00103]例示的には、プラスチックフィルムが、ポーチ５１０のために使用され得る。隆起した表面のパターンを有するダイを作成するために、金属、例示的にはアルミニウムのシート、または他の好適な材料が、粉砕され得るか、または別のやり方で切断され得る。例示的には１９５℃の動作温度に調整される空気プレス（例示的には、Ａ−５３０２−ＰＤＳ、Ｊａｎｅｓｖｉｌｌｅ  Ｔｏｏｌ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｔｏｎ  ＷＩ）に差し込まれると、空気プレスが印刷機のように機能して、ダイがフィルムに接触する唯一の場所であるプラスチックフィルムの密封表面を融解する。同様に、ポーチ５１０のために使用されるプラスチックフィルムは、レーザ切断および溶接デバイスを使用してまとめて切断および溶接され得る。ＰＣＲプライマー（例示的には、フィルム上にスポッティングされて乾燥される）、抗原結合基板、磁気ビーズ、およびケイ酸ジルコニウムビーズなどの様々な構成要素は、ポーチ５１０が形成される際に様々なブリスタの内側に密封され得る。試料処理のための試薬は、密封の前に、まとめて、または別々のいずれかで、フィルム上にスポッティングされ得る。１つの実施形態において、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）が、ポリメラーゼおよびプライマーとは別にフィルム上にスポッティングされ、反応が水性試料によって水和され得るまでポリメラーゼの活性を本質的に除去する。水性試料が水和の前に加熱されている場合、これが、真のホットスタートＰＣＲのための条件を作成し、高価な化学的ホットスタート成分の必要性を低減または除去する。別の実施形態において、構成要素は、粉末または丸薬の形態で提供され得、最終密封の前にブリスタ内に置かれる。
【００７３】
[00104]ポーチ５１０は、米国特許８，８９５，２９５号に記載されるものに類似した様式で使用され得る。１つの例示的な実施形態において、試験されるべき試料（１００μｌ）および溶解緩衝液（２００μｌ）を含む３００μｌ混合物が、入口チャネル５１５ａ近くの金具５９０内の注入口（図示されず）に注入され得、この試料混合物は、入口チャネル５１５ａへ引き入れられ得る。水も入口チャネル５１５１に隣接する金具５９０の第２の注入口（図示されず）に注入され得、金具５９０内に提供されるチャネル（図示されず）を介して分配され、それにより、各々が事前に入口チャネル５１５ｂから５１５１において乾燥形態で提供されている最大１１の異なる試薬を水和する。試料および水和流体（例えば、水または緩衝液）を注入するための例示的な方法およびデバイスは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１４−０２８３９４５号に開示されているが、これらの方法およびデバイスは例示にすぎず、試料および水和流体をポーチ５１０内へ導入する他のやり方は、本開示の範囲内であるということが理解される。これらの試薬は、例示的には、乾燥凍結ＰＣＲ試薬、ＤＮＡ抽出試薬、洗浄液、免疫アッセイ試薬、または他の化学物質を含み得る。例示的には、試薬は、核酸抽出、第１段階多重ＰＣＲ、多重反応の希釈、および第２段階ＰＣＲ試薬の調製、ならびに制御反応のためのものである。図１に示される実施形態において、注入される必要があるのは、一方の注入口内に試料溶液および他方の注入口内に水がすべてである。注入後、２つの注入口は密封され得る。ポーチ５１０および金具５９０の様々な構成に関するさらなる情報については、すでに参照により組み込まれている米国特許第８，８９５，２９５号を参照されたい。
【００７４】
[00105]注入後、試料は、チャネル５１４を介して注入チャネル５１５ａから溶解ブリスタ５２２へと移動され得る。溶解ブリスタ５２２は、セラミックビーズまたは他の研磨要素などのビーズまたは粒子５３４を備え、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）計器内に提供される回転刃またはパドルを使用した衝突により旋回流形成するように構成される。ケイ酸ジルコニウム（ＺＳ）ビーズ５３４などの溶解する粒子の存在下での試料の揺動、旋回流形成、超音波処理、および同様の処理によるビーズ粉砕は、溶解物を形成する効果的な方法である。本明細書において使用される場合、「溶解する」、「溶解」、および「溶解物」などの用語は、細胞を破壊することに限定されず、そのような用語は、ウイルスなどの非細胞粒子の崩壊を含むことが理解される。
【００７５】
[00106]図４は、支持部材８０２の第１の側面８１１に取り付けられ得る刃８２１を備える、図２に示される計器８００のビードたたきモータ８１９を示す。刃は、スロット８０４を通って延在してポーチ５１０に接触し得る。しかしながら、モータ８１９は、計器８００の他の構造体に取り付けられ得ることが理解される。１つの例示的な実施形態において、モータ８１９は、支持部材８０２に取り付けられるＭａｂｕｃｈｉ  ＲＣ−２８０ＳＡ−２８６５  ＤＣモータ（千葉、日本）である。１つの例示的な実施形態において、モータは、５，０００〜２５，０００ｒｐｍ、より例示的には１０，０００〜２０，０００ｒｐｍ、およびさらにより例示的にはおよそ１５，０００〜１８，０００ｒｐｍで回転される。Ｍａｂｕｃｈｉモータの場合、７．２Ｖが溶解に十分なｒｐｍを提供することが分かっている。しかしながら、刃８２１がポーチ５１０に衝突するときには実際の速度はいくらか遅くなり得ることが理解される。使用されるモータおよびパドルによっては、他の電圧および速度が溶解のために使用され得る。任意選択的に、制御された少量の空気が、溶解ブリスタ５２２に隣接する内袋８２２内へ提供され得る。いくつかの実施形態においては、隣接する内袋に１回または複数回少量の空気を部分的に充填することが、溶解プロセス中に溶解ブリスタを位置付けることおよび支持することを手助けすることが分かっている。代替的に、他の構造体、例示的には剛性もしくは弾性ガスケットまたは溶解ブリスタ５２２の周りの他の保持構造体が、溶解中にポーチ５１０を保持するために使用され得る。また、モータ８１９は例示にすぎず、他のデバイスが試料を粉砕、揺動、旋回流形成するために使用され得ることが理解される。いくつかの実施形態において、機械的な溶解に加えて、またはその代わりに、化学作用または熱が使用され得る。
【００７６】
[00107]試料材料が適切に溶解されると、試料は、核酸抽出ゾーンへ、例示的にはチャネル５３８を通ってブリスタ５４４へ、およびチャネル５４３を通ってブリスタ５４６へと移動され、ここで試料は、シリカ被覆磁気ビーズ５３３などの核酸結合物質と混合される。代替的に、磁気ビーズ５３３は、例示的には入口チャネル５１５ｃ〜５１５ｅのうちの１つから提供される流体を使用して、再水和され得、次いでチャネル５４３を通ってブリスタ５４４へ、次にチャネル５３８を通ってブリスタ５２２へと移動され得る。混合物は、適切な長さの時間、例示的にはおよそ１０秒〜１０分間、培養される。ブリスタ５４６に隣接して計器内に位置する引き込み式磁石が、溶液から磁気ビーズ５３３を捕捉し、ブリスタ５４６の内表面に対してペレットを形成する。培養がブリスタ５２２内で起こる場合、複数回分の溶液が、捕捉のためにブリスタ５４６へ移動される必要があり得る。次いでこの液体は、ブリスタ５４６から外へ移動され、ブリスタ５４４を通って、今度は廃物受け口として使用されるブリスタ５２２へと戻される。注入チャネル５１５ｃ〜５１５ｅのうちの１つまたは複数からの１つまたは複数の洗浄緩衝液は、ブリスタ５４４およびチャネル５４３を介してブリスタ５４６へ提供される。任意選択的に、磁石は引き込まれ、磁気ビーズ５３３は、チャネル５４３を介してビーズをブリスタ５４４および５４６から行ったり来たり移動させることによって洗浄される。磁気ビーズ５３３が洗浄されると、磁気ビーズ５３３は、磁石の活性化によりブリスタ５４６内で再捕捉され、次いで洗浄液がブリスタ５２２へ移動される。このプロセスは、溶解緩衝液および核酸結合磁気ビーズ５３３からの試料デブリを洗浄するのに必要なだけ繰り返され得る。
【００７７】
[00108]洗浄後、注入チャネル５１５ｆに格納された溶出緩衝液が、ブリスタ５４８へと移動され、磁石が引き込まれる。溶液は、チャネル５５２を介してブリスタ５４６と５４８との間で循環され、ブリスタ５４６内の磁気ビーズ５３３のペレットを破壊し、捕捉された核酸がビーズから解離して溶液になることを可能にする。磁石がもう一度活性化されて、ブリスタ５４６内の磁気ビーズ５３３を捕捉し、溶出した核酸溶液がブリスタ５４８内へ移動される。
【００７８】
[00109]注入チャネル５１５ｇからの第１段階ＰＣＲマスターミックスは、ブリスタ５４８内の核酸試料と混合される。任意選択的に、この混合物は、チャネル５５３を介して混合物を５４８と５６４との間に強制的に押し込むことによって混合される。いくつかの混合サイクル後、溶液はブリスタ５６４内に含有され、ここで第１段階ＰＣＲプライマーのペレット、各標的に対してプライマーの少なくとも１つのセットが提供され、第１段階多重ＰＣＲが実施される。ＲＮＡ標的が存在する場合、ＲＴステップは、第１段階多重ＰＣＲの前に、またはそれと同時に実施され得る。ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）計器内の第１段階多重ＰＣＲ温度サイクルは、例示的には、１５〜２０サイクルにわたって実施されるが、特定の用途の要件によっては他のレベルの増幅が望ましい場合がある。第１段階ＰＣＲマスターミックスは、当該技術分野において知られているような様々なマスターミックスのうちのいずれかであり得る。１つの例示的な例において、第１段階ＰＣＲマスターミックスは、サイクル当たり２０秒以下を要するＰＣＲプロトコルと共に使用するための、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５／０１１８７１５に開示される化学作用のいずれかであり得る。
【００７９】
[00110]第１段階ＰＣＲが所望の回数のサイクルだけ進められた後、試料は、例示的には試料の大部分をブリスタ５４８内へと強制的に押し込んで、ブリスタ５６４内には少量のみを残し、注入チャネル５１５ｉから第２段階ＰＣＲマスターミックスを添加することによって、希釈され得る。代替的に、５１５ｉからの希釈緩衝液が、ブリスタ５６６へと移動され得、次いで流体をブリスタ５６４と５６６との間で行ったり来たり移動させることによって、ブリスタ５６４内の増幅された試料と混合される。所望の場合、希釈は、注入チャネル５１５ｊおよび５１５ｋからの希釈緩衝液を使用して数回繰り返され得るか、または注入チャネル５１５ｋは、例示的には、シークエンシングまたは他のＰＣＲ後分析のために確保され得、次いで第２段階ＰＣＲマスターミックスを注入チャネル５１５ｈから希釈済みの増幅された試料の一部またはすべてに添加する。希釈のレベルは、希釈ステップの数を変更することによって、または、希釈緩衝液、もしくは増幅のための成分、例示的にはポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、および好適な緩衝液を含むが、特に非ＰＣＲ増幅方法の場合は他の成分が好適であり得る第２段階ＰＣＲマスターミックスと混合する前に廃棄される試料の割合を変更することによって調節され得ることが理解される。所望の場合、試料および第２段階ＰＣＲマスターミックスのこの混合物は、第２段階増幅のために第２段階ウェル５８２への移動の前にブリスタ５６４内で事前加熱され得る。そのような事前加熱は、第２段階ＰＣＲ混合物内のホットスタート成分（抗体、化学的、または別のやり方）の必要性を無くし得る。
【００８０】
[00111]例示的な第２段階ＰＣＲマスターミックスは、不完全であり、プライマー対が欠けており、１０２個の第２段階ウェル５８２の各々は、特定のＰＣＲプライマー対で前処置される。所望の場合、第２段階ＰＣＲマスターミックスは、他の反応成分に欠けていてもよく、これらの成分は、同様に第２段階ウェル５８２内で前処置され得る。各プライマー対は、第１段階ＰＣＲプライマー対に類似しているか、もしくはそれと同一であり得るか、または第１段階プライマー対内でネスト化され得る。ブリスタ５６４から第２段階ウェル５８２への試料の移動により、ＰＣＲ反応混合物が完成する。高密度アレイ５８１が充填されると、個別の第２段階反応は、当該技術分野において知られているような任意の数の手段によって、それらのそれぞれの第２段階ブリスタ内に密封される。相互汚染なしに高密度アレイ５８１を充填および密封する例示的な方法は、すでに参照により組み込まれている米国特許第８，８９５，２９５号において論じられている。例示的に、高密度アレイ５８１のウェル５８２内の様々な反応は、例示的には１つまたは複数のペルチェ素子を用いて、同時にまたは個別に熱サイクルされるが、熱サイクルのための他の手段が当該技術分野において知られている。
【００８１】
[00112]特定の実施形態において、第２段階ＰＣＲマスターミックスは、増幅を表すシグナルを生成するために、ｄｓＤＮＡ結合色素ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ（ＢｉｏＦｉｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ）を含有する。しかしながら、この色素は例示にすぎず、当該技術分野において知られているような、例えば蛍光的、放射活性的、化学発光的、酵素的にラベル付けされる他のｄｓＤＮＡ結合色素およびプローブなど、他のシグナルが使用され得ることが理解される。代替的に、アレイ５８１のウェル５８２は、シグナルなしで提供され得、結果は後続の処理により報告される。
【００８２】
[00113]ポーチ５１０内の材料を移動させるために空気圧が使用されるとき、１つの実施形態において、「内袋」が用いられ得る。その一部分が図２〜図３に示される内袋組立体８１０は、複数の膨張可能な内袋８２２、８４４、８４６、８４８、８６４、および８６６を収容する内袋プレート８２４を含み、これらの内袋の各々は、例示的には圧縮ガス源により個別に膨張可能であり得る。内袋組立体８１０は、圧縮ガスに供され、複数回使用され得るため、内袋組立体８１０は、ポーチよりも丈夫なまたは厚い材料製であり得る。代替的に、内袋８２２、８４４、８４６、８４８、８６４、および８６６は、ガスケット、シール、バルブ、およびピストンと一緒に留められる一連のプレートから形成され得る。他の配置は本発明の範囲内である。代替的に、アレイまたは機械的アクチュエータおよびシールが、チャネルを密封し、ブリスタ間の流体の移動を管理するために使用され得る。本明細書に説明される計器のために適合され得る機械的シールおよびアクチュエータのシステムは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮出願第６２／３６８，０９５号に詳細に説明される。
【００８３】
[00114]二次ＰＣＲ反応の成功は、多重第１段階反応によって生成されるテンプレートに依存する。典型的には、ＰＣＲは、高純度のＤＮＡを使用して実施される。フェノール抽出または市販のＤＮＡ抽出キットなどの方法は、高純度のＤＮＡを提供する。ポーチ５１０を通って処理される試料は、低純度の調製を補うために対処がなされることが必要とされ得る。ＰＣＲは、生体試料の成分によって抑制され得、それは潜在的な障害である。例示的には、ホットスタートＰＣＲ、Ｔａｑポリメラーゼ酵素のより高い濃度、ＭｇＣｌ２濃度の調節、プライマー濃度の調節、およびアジュバント（ＤＭＳＯ、ＴＭＳＯ、またはグリセロール）の添加が、任意選択的に、より低い核酸純度を補うために使用され得る。純度の問題はどちらかというと第１段階増幅での懸念である可能性が高いが、同様の調節が第２段階増幅においても同様に提供され得ることが理解される。
【００８４】
[00115]ポーチ５１０が計器８００内に置かれるとき、内袋組立体８１０は、ポーチ５１０の１つの面に対して押圧されるため、特定の内袋が膨張される場合、その圧力が、液体をポーチ５１０内の対応するブリスタから外に押し出すことになる。ポーチ５１０のブリスタの多くに対応する内袋に加えて、内袋組立体８１０は、ポーチ５１０の様々なチャネルに対応する、内袋または空気駆動式ピストンなどのさらなる空気式アクチュエータを有し得る。図２〜図３は、ポーチ５１０のチャネル５３８、５４３、５５３、および５６５に対応する例示的な複数のピストンまたはハードシール８３８、８４３、８５２、８５３、および８６５、ならびに金具５９０内への逆流を最小限にするシール８７１、８７２、８７３、８７４を示す。作動されるとき、ハードシール８３８、８４３、８５２、８５３、および８６５は、対応するチャネルをピンチオフして閉めるためにピンチバルブを形成する。液体をポーチ５１０の特定のブリスタ内に閉じ込めるために、ハードシールがブリスタに出入りするチャネルに対して作動され、それによりアクチュエータがピンチバルブとして機能してチャネルをピンチして閉鎖する。例示的に、異なるブリスタ内の２つの容積の液体を混合するために、接続チャネルを密封するピンチバルブアクチュエータが作動され、ブリスタの上の空気式内袋が交互に加圧され、液体を、ブリスタを接続するチャネルを通して行ったり来たりさせて、その中の液体を混合する。ピンチバルブアクチュエータは、様々な形状およびサイズのものであり得、２つ以上のチャネルを同時にピンチオフするように構成され得る。空気式アクチュエータが本明細書では論じられるが、リニアステッパモータなどの様々な電気機械式アクチュエータ、モータ駆動カム、空気によって駆動される剛性パドル、水力もしくは電磁石力、ローラ、ロッカアーム、およびいくつかの場合においてはコックばねを含む、ポーチに圧力を提供する他の方法が企図されることが理解される。加えて、チャネルの軸に垂直に圧力を印加することに加えて、可逆的または不可逆的にチャネルを閉じる様々な方法が存在する。これらは、チャネルにわたってバッグをねじれさせること、ヒートシール、アクチュエータを回転させること、およびバタフライバルブおよびボールバルブなどのチャネル内に密封される様々な物理的バルブを含む。加えて、小型のペルチェ素子または他の温度調節器がチャネルに隣接して置かれ、流体を凍結させてシールを効果的に形成するのに十分な温度に設定され得る。また、図１の設計は、ブリスタおよびチャネルの各々の上に位置付けられたアクチュエータ要素を特徴とする自動化計器のために適合されるが、アクチュエータが静止したままである場合、さらには少ない数のアクチュエータが試料崩壊、核酸捕捉、第１および第２段階ＰＣＲを含む処理ステーション、ならびに免疫アッセイおよび免疫ＰＣＲなどのポーチ５１０の他の用途のための処理ステーションのいくつかのために使用され得るように、ポーチ５１０が遷移される場合も企図される。チャネルおよびブリスタに対して作用するローラは、ポーチ５１０がステーション間を移動される構成において特に有用であることが判明し得る。したがって、空��式アクチュエータが本開示の実施形態においては使用されるが、「空気式アクチュエータ」という用語が本明細書で使用されるとき、ポーチおよび計器の構成によっては、他のアクチュエータおよび圧力を提供する他の方法が使用され得ることが理解される。
【００８５】
[00116]図２に戻ると、各空気式アクチュエータは、バルブ８９９を介して圧縮空気源８９５に接続される。図２にはいくつかのホース８７８のみが示されているが、各空気式部品は、ホース８７８を介して圧縮ガス源８９５に接続されることが理解される。圧縮ガス源８９５は、圧縮器であり得るか、または代替的に、圧縮ガス源８９５は、炭酸ガスシリンダなどの圧縮ガスシリンダであり得る。圧縮ガスシリンダは、携帯性が所望される場合は特に有用である。他の圧縮ガス源は本発明の範囲内である。同様の空気制御が、図１２〜図１６の実施形態においては、ポーチ１４００内の流体の制御のために提供され得るか、または他のアクチュエータ、サーボなどが提供され得る。
【００８６】
[00117]計器８１０のいくつかの他の構成要素もまた、圧縮ガス源８９５に接続される。支持部材８０２の第２の側面８１４に装着される磁石８５０は、例示的には、ホース８７８を介して圧縮ガス源８９５からのガスを使用して配備され引き込まれるが、磁石８５０を移動させる他の方法が当該技術分野において知られている。磁石８５０は、支持部材８０２内の凹所８５１にある。凹所８５１は、支持部材８０２を通る通路であり得るため、磁石８５０は、ポーチ５１０のブリスタ５４６に接触することができるということが理解される。しかしながら、支持部材８０２の材料によっては、凹所８５１は、磁石８５０が配備されるときに磁石８５０がブリスタ５４６において十分な磁界を提供するのに十分に近く、かつ磁石８５０が完全に引き込まれるときに磁石８５０がブリスタ５４６内に存在するいかなる磁気ビーズ５３３にも実質的に影響を与えない限りは、支持部材８０２の初めから終わりまで延在する必要はないということが理解される。磁石８５０を引き込むことについての言及がなされるが、電磁石が使用され得、電磁石は、電磁石を通る電気の流れを制御することによって作動および無効化され得るということが理解される。したがって、本明細書は、磁石を撤退させるまたは引き込むことを論じているが、これらの用語は十分に幅広いため、磁界を撤退させる他のやり方を組み込むことができることが理解される。空気式接続は、空気式ホースまたは空気式エアマニホールドであり、したがって必要なホースまたはバルブの数を減少させ得ることが理解される。同様の磁石および磁石を作動させるための方法が、図１２〜図１６の実施形態において使用され得ることが理解される。
【００８７】
[00118]空気式ピストンアレイ８６９の様々な空気式ピストン８６８も、ホース８７８を介して圧縮ガス源８９５に接続される。空気式ピストン８６８を圧縮ガス源８９５に接続する２つのみのホース８７８が示されるが、空気式ピストン８６８の各々が圧縮ガス源８９５に接続されることが理解される。１２個の空気式ピストン８６８が示される。
【００８８】
[00119]一対の温度制御要素は、支持８０２の第２の側面８１４に装着される。本明細書において使用される場合、「温度制御要素」という用語は、試料に熱を追加するか、試料から熱を取り除くデバイスを指す。温度制御要素の例示的な例としては、限定されるものではないが、加熱器、冷却器、ペルチェ素子、抵抗加熱器、誘導加熱器、電磁加熱器、薄膜加熱器、印刷素子加熱器、正温度係数加熱器、およびそれらの組み合わせが挙げられる。温度制御要素は、複数の加熱器、冷却器、ペルチェなどを含み得る。１つの態様において、所与の温度制御要素は、２種類上の加熱器または冷却器を含み得る。例えば、温度制御要素の例示的な例は、ペルチェの上面および／または底面に適用される別個の抵抗性加熱器を有するペルチェ素子を含み得る。本明細書全体を通して「加熱器」という用語が使用されるが、他の温度制御要素が試料の温度を調節するために使用され得ることが理解される。
【００８９】
[00120]上に論じられるように、第１段階加熱器８８６は、第１段階ＰＣＲのためにブリスタ５６４の内容物を加熱および冷却するように位置付けられ得る。図２に見られるように、第２段階加熱器８８８は、第２段階ＰＣＲのために、ポーチ５１０のアレイ５８１の第２段階ブリスタ５８２の内容物を加熱および冷却するように位置付けられ得る。しかしながら、これらの加熱器はまた、他の加熱目的のために使用され得、また特定の用途に適切な場合には他の加熱器が含まれ得ることが理解され得る。
【００９０】
[00121]上に論じられるように、２つ以上の温度間で熱サイクルするペルチェ素子は、ＰＣＲには効果的であるが、いくつかの実施形態においては加熱器を一定の温度に維持することが望ましい場合がある。例示的には、これは、試料温度を遷移させるために必要とされる時間を超えて加熱器温度を遷移させるために必要とされる時間を除去することによって、ランタイムを減少させるために使用され得る。また、そのような配置は、はるかに大きな（より熱質量の多い）ペルチェ素子ではなく、より小さい試料および試料器を熱的にサイクルさせることが必要なだけであるため、システムの電気効率を改善することができる。図１８は、加熱器組立体９８８によって置き換えられる第２段階加熱器８８８の代替的な実施形態を示す。例示的には、加熱器組立体９８８は、各加熱器がアレイ５８１に隣接する位置に順次移動される際に一度に１つの加熱器がアレイ５８１に接触するように、例示的には円形取付部９３４にはめ込まれ、モータ９３３によって輪状に駆動される３つの加熱器９３０、９３１、および９３２を含む。第１段階ＰＣＲを参照して、好適な加熱器のタイプが上に論じられる。例示的には、加熱器９３０は、アニーリング温度、例示的には６０℃に設定され得、加熱器９３１は、延伸温度、例示的には７２℃に設定され得、加熱器９３２は、変性温度、例示的には９４℃に設定され得る。しかしながら、これらの温度は例示にすぎず、他の温度および他の数の加熱器が使用され得ることが理解される。多くの用途では、２つの加熱器が十分であり得る。この実施形態では、加熱器９３０、９３１、９３２は、アレイ５８１に接触するように移動する。取付部９３４は、一方向にのみ移動して、加熱器９３０、９３１、９３２の各々が順にアレイ５８１に接触し得るか、または取付部は時計回りおよび反時計回り両方の方向に移動して、例示的には各ＰＣＲサイクル後に方向を変え得る。
【００９１】
[00122]加熱器９３０、９３１、９３２は、取付部９３４内に提供され、アレイ５８１に対して移動されるが、これは例にすぎず、第１段階ＰＣＲのための図６〜図８に示される実施形態にあるように、２つ以上の静止した加熱器が提供され得、アレイ５８１が加熱器に対して回転され得ることが理解される。同様に、加熱器は、例えば、図１２Ａ〜図１３Ｂおよび図１７に例証される実施形態にあるように直線的に配置され得る。そのような例において、熱サイクルは、加熱器をアレイに対して移動させることによって、またはアレイを加熱器に対して移動させることによって達成され得る。
【００９２】
[00123]蛍光検出が所望される場合、光学アレイ８９０が提供され得る。図２に示されるように、光学アレイ８９０は、例示的にはフィルタ処理したＬＥＤ光源、フィルタ処理した白色光、またはレーザ照射である光源８９８と、カメラ８９６とを含む。カメラ８９６は、例示的には複数の光検出器を有し、その各々がポーチ５１０内の第２段階ウェル５８２に対応する。代替的に、カメラ８９６は、第２段階ウェル５８２のすべてを含む画像を撮影し得、この画像は、第２段階ウェル５８２の各々に対応する別個の区域に分割され得る。構成によっては、光学アレイ８９０は静止状態にあり得るか、または光学アレイ８９０は、１つまたは複数のモータに取り付けられた移動部上に置かれ、各個別の第２段階ウェル５８２からシグナルを獲得するために移動され得る。他の配置が可能であることが理解される。図１８に示される第２段階加熱器の実施形態は、ポーチ５１０の図２に示されるものとは反対側に加熱器を提供する。そのような配向は例示にすぎず、計器内の空間的制約によって決定され得る。第２段階反応ゾーン５８０が光学的に透明の材料で提供される限り、光検出器および加熱器は、アレイ５８１の左右に存在し得る。
【００９３】
[00124]示されるように、コンピュータ８９４は、圧縮空気源８９５のバルブ８９９を制御し、したがって計器８００の空気のすべてを制御する。加えて、計器内の空気式システムの多くは、他の実施形態においては、機械式アクチュエータ、圧力印加手段などと置き換えられ得る。コンピュータ８９４はまた、加熱器８８６および８８８、ならびに光学アレイ８９０を制御する。これらの構成要素の各々は、例示的にはケーブル８９１を介して電気的に接続されるが、他の物理的またはワイヤレス接続は本発明の範囲内である。コンピュータ８９４は、計器８００内に収容され得るか、または計器８００の外部にあり得ることが理解される。さらに、コンピュータ８９４は、構成要素の一部またはすべてを制御するビルトイン回路基板を含み得、光学アレイからデータを受信して表示するためにデスクトップまたはラップトップＰＣなどの外部コンピュータも含み得る。温度、サイクル時間などの情報および変数を入力するためのキーを含む、インターフェース、例示的にはキーボードインターフェースが提供され得る。例示的には、ディスプレイ８９２も提供される。ディスプレイ８９２は、例えば、ＬＥＤ、ＬＣＤ、または他のそのようなディスプレイであり得る。
【００９４】
[00125]他の先行技術計器は、密封された可撓性容器内でのＰＣＲを教示している。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６４５，７５８号および同第６，７８０，６１７号、ならびに米国特許出願第２０１４／００３８２７２号を参照されたい。しかしながら、密封されたＰＣＲ器内での細胞溶解を含むことは、試験されるべき試料がバイオハザードを含有し得る場合には特に、使い易さおよび安全性を改善することができる。本明細書に例証される実施形態において、細胞溶解からの廃物、ならびにすべての他のステップからの廃物は、密封されたポーチ内に留まる。それでも、ポーチ内容物がさらなる試験のために取り出され得ることが理解される。
【００９５】
[00126]図２は、ポーチ５１０と一緒に使用され得る例示的な計器８００を示す。計器８００は、ケーシングの壁を形成し得るか、ケーシング内に装着され得る支持部材８０２を含む。計器８００はまた、ポーチ５１０の挿入および撤退を可能にするために、任意選択的に支持部材８０２に対して移動可能である第２の支持部材（図示されず）を含み得る。例示的には、ポーチ５１０が計器８００内へ挿入されると、蓋がポーチ５１０を覆い得る。別の実施形態において、両方の支持部材は、ポーチ５１０が他の機械的手段または空気圧によって適所に保持された状態で固定され得る。
【００９６】
[00127]例示的な例において、加熱器８８６および８８８は、支持部材８０２に装着される。しかしながら、この配置は例示にすぎず、他の配置が可能であることが理解される。例示的な加熱器は、ブリスタ８６４の内容物および第２段階反応ゾーン５８０を熱サイクルさせるために、ペルチェ、ならびに当該技術分野において知られているような他のブロック加熱器、抵抗加熱器、電磁加熱器、および薄膜加熱器を含む。内袋８２２、８４４、８４６、８４８、８６４、８６６を有する内袋プレート８１０と、ハードシール８３８、８４３、８５２、８５３と、シール８７１、８７２、８７３、８７４とが、内袋組立体８０８を形成し、この内袋組立体８０８は例示的には、空気式アクチュエータがポーチ５１０と接触した状態で置かれるように、ポーチ５１０に向かって移動され得る移動可能な支持構造体に装着され得る。ポーチ５１０が計器８００内へ挿入され、移動可能な支持部材が支持部材８０２に向かって移動されるとき、ポーチ５１０の様々なブリスタは、空気式アクチュエータの作動が、ポーチ５１０のブリスタのうちの１つまたは複数から液体を押し出し得るか、またはポーチ５１０の１つまたは複数のチャネルと共にピンチバルブを形成し得るように、内袋組立体８１０の様々な内袋および組立体８０８の様々なシールに隣接する位置にある。ポーチ５１０のブリスタおよびチャネルと組立体８０８の内袋およびシールとの関係は、図３により詳細に例証される。
【００９７】
[00128]加熱器８８６、８８８を熱サイクルさせることによって、ＰＣＲ部分のランタイムは必ず、加熱器が各遷移において好適な温度に達するのにかかるのと少なくとも同じ長さである必要がある。加熱器の温度を変える必要がない場合にはランタイムは減少され得ることが理解される。図６〜図８は、第１段階ＰＣＲ増幅の別の実施形態を示す。この例示的な実施形態において、ブリスタ５４８および５６４は、単一のブリスタ５４９と置き換えられ得、この例示的な計器は、加熱器９８６および９８７を含む温度制御要素を備え得る。しかしながら、ブリスタ５４８もしくは５６４のうちの一方が使用され得、より小さい加熱器９８６、９８７が使用され得ること、または、ブリスタ５４９が、細胞溶解および／もしくはさらなる増幅のための構成要素を含む場合と含まない場合があり得る他の実施形態と組み合わせて、単独で使用され得ることが理解される。加熱器９８６、９８７は、ペルチェ素子、抵抗加熱器、誘導加熱器、電磁加熱器、薄膜加熱器、印刷素子加熱器、正温度係数加熱器、当該技術分野において知られているような他の加熱器、または加熱器タイプの組み合わせ（例えば、ペルチェ熱電加熱器／冷却器デバイスおよび抵抗性加熱器を含む加熱器要素）であり得る。しかしながら、アニーリングと変性温度との間で熱サイクルするために提供される加熱器８８６とは異なり、１つの例では、加熱器９８６は、好適な変性温度、例示的には９４℃で提供され得、加熱器９８７は、好適なアニーリング温度、例示的には６０℃で提供され得るが、他の例示的な変性およびアニーリング温度が、当該技術分野において知られているように使用され得る。いくつかの実施形態において、加熱器９８６を９４℃より高く設定し、加熱器９８７を６０℃より低い温度に設定することは、流体が温度に達すると流体はこれらの加熱器の各々の制御によって循環され得、それによりランプ速度を増大させることから、望ましい場合がある。そのような実施形態は、高められたプライマーおよびポリメラーゼ濃度と共に使用するのに好適であり得る。例示的には、絶縁スペーサ９８３が、加熱器９８６と加熱器９８７との間に提供され得る。泡沫、プラスチック、ゴム、空気、真空、ガラス、または例示的には低伝導の任意の他の好適な材料を含む、任意の好適な絶縁材料が使用され得る。加熱器９８６および９８７が全体的に一定の温度に保持される実施形態において、ランタイムおよびエネルギー使用は、実質的に減少され得る。
【００９８】
[00129]例示的な例において、ワイパ９８９を備えるワイパヘッド９１０は、ブリスタ５４９の上表面５４９ｂに係合する。流体がブリスタ５４９内へ移動されるとき、ワイパ９８９は、ワイパ９８９の本体９１３がブリスタ５４９を加熱器９８６、９８７と接触状態にさせ、それによりブリスタ５４９の一部分が加熱器の各々と接触状態にあるように移動されて、加熱器の各々からブリスタ５４９の一部分への熱伝達を可能にする。次いで、試料５７２をブリスタ５４９の１つのエリアからブリスタ５４９の別のエリアへと移動させるために、１つまたは複数のブレード９４９が使用され得る。
【００９９】
[00130]多くの場合は流体がコンパートメントに入るとき、流体は、そのコンパートメントへの入口近くに留まり得るか、またはコンパートメントの内容物は完全には混合されないことがある。これは図８Ａに概略的に例証されており、ここでは例証されたブリスタ５４９は、不規則な形状を取っており、加熱器９８６および９８７と十分な接触状態にない可能性がある。ブリスタ５４９の容積、追加される試料５７２の容積、試料の内容物などに応じて、流体５７２は不規則な形状をとり得、この流体の大部分は試料がブリスタ内に注入される場所の近くで集められている。これは、コンパートメントが拡張可能であり、かつ流体の添加の前は部分的もしくは完全に潰れている場合、または流体が、コンパートメントを完全に充填するのに十分な量よりも少ない場合がある他の状況において、特に当てはまり得る。試料５７２がチャネル５５２ａを通ってブリスタ５４９に入り、チャネル５５２ａ近くに留まり、その結果、ブレード９４９の係合が試料５７２の大部分またはすべてをセクション５４９ｃ内に閉じ込めるという実施形態を想像することが可能である。したがって、ブレードの係合の前に流体をコンパートメント全体に拡散させることが望ましい場合がある。したがって、図８Ｂに例証されるように、ワイパヘッド９１０は、それがブリスタ５４９に接触して試料５７２をブリスタ５４９全体に拡散させるまで下げられて、流体５７２をブリスタ５４９内に均一に分散させ、ブリスタ５４９に規則的な形状を取らせ、またブリスタ５４９を加熱器９８６および９８７と十分な一貫した接触状態になるように押圧し得る。
【０１００】
[00131]１つの実施形態において、ワイパヘッド９１０は、ブリスタ５４９に圧力をかけ、試料５７２をブリスタ５４９全体に拡散させる圧力部材９８１を備え得る。例示的には、部材９８１の使用には、いくつかのメリットがある。１つは、試料５７２のより多くが薄層内の加熱器９８６、９８７全体にわたって拡散され得ることにより、表面積対容積比を増大させ、それが試料５７２へのおよび試料５７２からの熱伝達を改善することになるということである。同様に、流体は迅速に熱サイクルされているため、すなわち、試料５７２の液体は加熱器９８６および９８７によって迅速に温度を上下されているため、液体をブリスタ５４９内の薄層内へ拡散させることが、任意の所与の温度における滞留時間を減少させ、試料のより多くがより素早く標的温度に達することを可能にし得る。また、ワイパ９８９の形状によっては、以下に論じられるように、部材９８１からブリスタ５４９への圧力が、試料５７２を拡散させ、その結果、ワイパ９８９のブレード９４９の係合がブリスタ５４９内の試料５７２を比較的均一または均整の取れた容積に分割する。ブレード９４９の係合前の部材９８１からの圧力は、試料５７２の一部をブリスタ５４９のセクションの各々の中へ押し込む。
【０１０１】
[00132]１つの実施形態において、部材９８１は、圧縮可能または半圧縮可能である（例えば、圧縮可能または半圧縮可能材料で形成されるか、それを含む）。そのような材料は、圧縮可能または半圧縮可能な泡沫、プラスチック、もしくはゴムを含むか、またはより硬い材料であるが、部材９８１とワイパ本体９１３との間にばね荷重、エラストマー、もしくは他の付勢部材あるいは力を有し、それにより、試料５７２がブリスタ５４９内へ移動されるとき、試料５７２は、ブリスタ５４９全体に拡散されるが、部材９８１は、試料５７２に十分な空間を許すように適切に圧縮する。他の圧縮可能または半圧縮可能材料が、当該技術分野において知られているように使用され得る。代替的に、部材９８１は、実質的に剛性であり、試料５７２を押し込んでブリスタ５４９全体に拡散させるために部材９８１と加熱器９８６、９８７との間に十分な空間のみを提供するような位置に設定され得る。
【０１０２】
[00133]例示的な実施形態において、ワイパ９８９は、図６に例証されるように、部材９８１を通って延在し、ワイパ９８９を４つのセクション９４５、９４６、９４７、９４８に分割するｘ形状のブレード９４９を有する。図８Ｃおよび図８Ｄに例証されるように、ワイパ９８９およびブレード９４９は、少なくとも２つのモードでブリスタに接触し得る。図８Ｃに例証されるように、ワイパ９８９は、部材９８１が部分的に圧縮され、かつブレード９４９がブリスタ５４９に部分的に衝突するまで下げられ得る。ワイパヘッド９１０が図８Ｃのモードで回転される場合、ブリスタ５４９の内容物５７２を完全に混合するための撹拌作用を提供するために、ブレード９４９の作用が使用され得る。
【０１０３】
[00134]図８Ｄに例証されるように、部材９８１がさらに圧縮され、ブレード９４９がブリスタ５４９に完全に衝突するように、ワイパヘッドがさらに下げられる場合、ブレードはブリスタを別々のセクションへと分割し得る。例えば、図７に例証されるように、ｘ形状のブレード９４９では、ブレード９４９は、ブレード９４９がブリスタ５４９を対応する４つのセクション５４９ａ、５４９ｂ、５４９ｃ、５４９ｄに分割するように十分な圧力でブリスタ５４９に接触し得る。軸９９３の周りのワイパ９８９の回転は、ブリスタ５４９内の流体にブリスタ５４９の周りの円運動を強いる。１つの実施形態において、ブレード９４９は、加熱器９８６および９８７の各々によって同時に流体の部分が加熱されることを可能にし、流体の部分を一方の加熱器の温度制御から移動させながら、流体の他の部分が他方の加熱器の制御下にあるようにする。部材９８１は、ブリスタ５４９の内容物を圧縮する。したがって、ブリスタ５４９内に流体５７２を拡散させることおよびブリスタ５４９と加熱器９８６および９８７との接触を改善することに加えて、部材９８１はまた、ブリスタ５４９の内容物を別のブリスタへ投入し得る。例えば、第１段階熱サイクルが完了した後、出口チャネルが開放され得、それにより、部材９８１がその元の形状に戻る際に流体がブリスタから外へ流れるための通路を開放する。１つの実施形態において、流体は、チャネルと流体接続されているブリスタの象限からのみ外へ流れ得る。ワイパ９８９は、各象限が順に出口チャネルと接続されるように回転され得る。
【０１０４】
[00135]例示的には、ブレード９４９は、ゴムもしくはエラストマー材料、またはブリスタ５４９をセクションに分割してブリスタ５４９内の流体を移動させるのには十分であるが、ブリスタ５４９を破裂または分裂させない硬さを有するＴｅｆｌｏｎもしくはＤｅｌｒｉｎなどの非粘着材料であり得るが、そのような材料は例示にすぎず、当該技術分野において知られているように他の材料が使用され得ることが理解される。ブレード９４９は、代替的に、ローラまたはブリスタ５４９内の流体の移動を可能にするための他の構成によって置き換えられ得る。ワイパ９８９およびブレード９４９を含むワイパヘッド９１０は、所定位置に移動され、当該技術分野において知られているように、任意のモータ、カム、クランク、ギア機序、油圧、空気、または他の手段によって回転され得る。そのような移動は、連続的であり得るか、またはワイパ９８９およびブレード９４９は、例示的には０．１秒から１分以上の間を置いて段階的に移動され得、これにより、次の位置に移動される前に試料の部分を加熱器９８６、９８７の各々の制御内に保持し、試料の異なる部分を加熱器９８６、９８７の各々の制御内に保持する。ワイパ９８９の運動は、時計回りもしくは反時計周りの円状運動であり得るか、または時計回りと反時計回りとを交互に方向を逆転し得る。ワイパ本体９１３およびブレード９４９は、単一の固定ユニットであり、単一の固体ユニットとして移動し得るか、または本体９１３は、ブレード９４９の移動とは独立してブリスタ５４９と接触状態および非接触状態になるように移動され得ることが理解される。ブリスタ５４９の円形形状および回転運動は例示にすぎず、他の試料器形状が可能であり、線運動、曲線運動、および半円運動などのブレードまたはローラの非回転運動も可能であることも理解される。ワイパの特定の実施形態の追加の特徴は、図１１Ａ〜Ｂを参照して説明される。
【０１０５】
[00136]上に論じられるように、ワイパ９８９は、ｘ形状のブレード９４９を備え、それにより、図６において最もよく見られるように、ワイパを４つのセグメント９４５、９４６、９４７、９４８に区分けし、また同様に、図７において最もよく見られるように、ブリスタ５４９を４つのセグメント５４９ａ、５４９ｂ、５４９ｃ、および５４９ｄに分割する。しかしながら、これは例示にすぎず、例示的にはブリスタ５４９の直径に実質的に対応する単一の線形ブレード、ｓ形状のブレードもしくはらせん状のブレードを含む単一または複数の非線形ブレード、ブリスタ５４９の半径に対応する単一のブレード（時計の針に類似している）、およびブリスタ５４９を複数のセグメントに分割する複数のブレードなど、いかなる形状のブレード９４９も使用され得ることが理解される。ブリスタ５４９を複数の同様のセグメントに分割するブレードは、全セグメントが同時にアニーリングおよび変性温度にあるという異なるセグメント間のより制御された加熱を提供する傾向がある一方で、ｓ形状、らせん状、および放射状のブレードは、複数の旋回流(vortex)、渦(eddy)、および様々な混合パターンを生成して、加熱器９８６、９８７によって作成される熱表面にわたって試料を移動させることが理解される。より少ないブレード材料は、試料のより多くが加熱器と緊密な接触状態にあることを可能にするが、より多くのブレード材料は、流体移動をよりうまく制御することが理解される。ブレードパターンが何であるにしろ、ブリスタ５４９内の流体の部分がアニーリング温度にある一方で、他の部分は変性温度にあるということ、またさらに他の部分は温度間の遷移にあり得、すべてが単一の試料容器内にあることが理解される。ブレード９４９の形状の選択は、ブリスタのサイズおよび厚さならびに加熱器のサイズと、第１段階熱サイクルが完了した後にブリスタ５４９から材料を排出するためにワイパ９８９を使用することの望ましさとに依存し得る。
【０１０６】
[00137]例示的な実施形態において、加熱器９８６、９８７は、平坦表面を提供し、この平坦表面に対してブリスタ５４９が押圧され得る。しかしながら、これは例示にすぎず、加熱器９８６、９８７は、試料均質性のために混合することを助けるためにテクスチャ表面を提供し得ることが理解される。
【０１０７】
[00138]例示的な実施形態において、加熱器９８６および９８７は各々が、一定温度、例示的にはそれぞれ９４℃および６０℃で提供され得る。しかしながら、いくつかの実施形態において、加熱器９８６および９８７の温度を使用中に調節することが望ましい場合がある。例えば、試料が最初にブリスタ５４９に導入されるときに一方または両方の加熱器の温度を上昇させて、流体がブリスタ５４９に入る際に流体の冷却器温度を補うことが望ましい場合がある。以下の説明に適用可能な別の例において、加熱器がブリスタ内の流体の標的温度をより迅速に達成することを可能にするために加熱器を「過熱状態にする」ことが望ましい場合がある。例えば、熱サイクルの標的温度が９４℃および６０℃である場合、加熱器は、試料内の流体をより迅速に加熱および冷却するために、高い方の温度より上（例えば９５〜１１０℃の範囲内）および低い方の温度より下（例えば５９〜５０℃の範囲内）に設定され得る。加えて、２つの加熱器が示されるが、任意の数の加熱器が使用され得る。１つの例示的な例は、３つの加熱器を使用し、１つは変性温度に設定され、１つはアニーリング温度に設定され、３つ目は延伸温度に設定されている。別の例示的な例においては、第１の加熱器は、第２の加熱器よりも大きい場合があり、その結果、試料はサイクルのより長い部分にわたって第１の温度のままである。さらには、ブリスタ５４９およびその内容物は、静止したままであり得、加熱器９８６、９８７が、回転されるかまたは横方向に移動され得ることが理解される。
【０１０８】
[00139]例示的には、流体は、例示的には図１のポーチのブリスタ５４６に類似した核酸抽出ゾーンからチャネル５５２ａを通ってブリスタ５４９に入り得、次いでチャネル５５２ａが閉じられ得る。次いで部材９８１がブリスタ５４９を押圧して、ブリスタ５４９の加熱器９８６および９８７との接触を促進し、次いでブレード９４９が、加熱器９８６、９８７に向かって移動され、ブリスタ５４９をセグメント５４９ａ、５４９ｂ、５４９ｃ、および５４９ｄに分割する。ワイパ９８９が回転されると、４つのセグメント５４９ａ、５４９ｂ、５４９ｃ、および５４９ｄの各々の中の試料は、加熱器９８６との接触から移動されて、加熱器９８７と接触し、再び元に戻る。セグメントの各々の中の試料を加熱および冷却するために必要とされる時間量は、ブリスタ５４９上のフィルムの厚さ、ブリスタ５４９内の流体層の厚さ、ブリスタ５４９内の試料の混合、および加熱器との接触量などのいくつかの因子に依存する。しかしながら、この例示的な実施形態においては、ワイパ９８９の１回の完全な回転は、概して、ＰＣＲの１つのサイクルに対応することが理解される。
【０１０９】
[00140]特定のアッセイでは、標的核酸は、非常に少量で存在し得る。したがって、標的核酸の十分な複製が存在するようにさせるためには、ブリスタ５４９における十分な容積の試料で開始する必要があり得る。例示的には、ブリスタ５４９は１０μＬ〜１ｍＬ、例示的には２５μＬ〜２００μＬの流体を含有するが、システムの構成に応じて他の容積が適切であり得る。任意選択的に、数サイクル後、例示的には２〜１０サイクル後、標的核酸の量がいくらか増幅されたとき、チャネル５５２ａ（または別のチャネル）が開放され得、本体９１３が、加熱器９８６、９８７のより近くに移動されてブリスタ５４９を絞り、それにより流体の一部分を、チャネル５５２ａを通じてブリスタ５４９から排出し得る。次いでチャネル５５２ａは閉じられ得る。試料の少なくとも一部分はまた、ｓ形状のブレードのようにブレード９４９が試料の少なくとも一部分を外向きに押し込むように形作られる場合には特に、ブレード９４９の運動によって排出され得る。例示的には、試料容積の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、もしくは５０％以上、またはこれらの間の任意の量が取り除かれ得る。圧縮可能または半圧縮可能部材９８１が使用される場合、加熱器９８６、９８７に向かう本体９１３の運動は、試料容積の適切な低減を達成するためにこの圧縮を補うように調節される必要があり得ることが理解される。ブリスタ５４９内の流体の容積がここで低減されるため、流体を適切な温度にするために加熱器９８６、９８７の各々との接触に必要とされる時間は少なくなり得、またワイパ９８９回転の速度が増大され、それによりサイクル時間を減少させ得る。例示的には、試料容積が５０％低減されるとき、サイクル時間は２５〜５０％減少され得る。１つの例では、試料容積が５０％低減されると、サイクル時間は約３５％減少された。さらに数サイクル後には、容積のさらなる低減が、それに対応するサイクル時間の減少を伴って、発生し得る。複数回の低減、例示的には１〜５回の低減が発生し得る。効率的な反応が各サイクルで標的配列を本質的に倍増させることが理解される。したがって、いくつかの実施形態において、より高速のランタイムを得るために早いサイクルにおいて一部の試料容積を失うことは、優れたトレードオフであり得る。
【０１１０】
[00141]図９ａ〜図９ｃは、（例えば、試料５７２の容積を低減するため、または流体をブリスタ５４９から排出するため）用いられ得る別の実施形態を示す。この実施形態において、ワイパ１０８９は、２つのアーム１０４９ａおよび１０４９ｂを有するブレード１０４９を備える。図９ａに示されるように、２つのアーム１０４９ａおよび１０４９ｂは、直線的配置で提供され、したがってブリスタ５４９を２つの実質的に均等な半体に分割する。矢印によって示されるように、ブレード１０４９は、時計回り方向に移動され得るが、上に論じられるように、他の運動が可能である。しかしながら、この実施形態において、アーム１０４９ａおよび１０４９ｂは、独立して移動され得る。容積を低減するために、アーム１０４９ｂは、アーム１０４９ａに向けて回転されて所望の場所に達し得る。この移動は、本体９１３を加熱器９８６、９８７から離れる方へ移動させることを伴って、または伴わずに行われ得る。ワイパ１０８９がこの移動の間に加熱器９８６、９８７から引き込まれる場合、本体９１３は、この移動が完了した後に加熱器９８６、９８７の方へ戻るように移動され得る。図９ｂに最もよく見られるように、アーム１０４９ａおよび１０４９ｂが所望の位置にある状態になると、チャネル５５２ａが開放され得、またブレード１０４９ａおよび１０４９ｂが、例示的には図９ｂの矢印に示される方向にあるブレード１０４９ｂを図９ｃの位置に達するように移動させることによって、互いから離れる方へ移動され得る。約１００度の回転が図９ｃに示されるが、これは例示にすぎず、容積の適切な低減を達成するため、またはブリスタを空にするために、回転の量は調節され得る。アーム１０４９ａおよび１０４９ｂの一方または両方は、この容積低減を達成するために移動され得ることが理解される。次いで、チャネル５５２ａは密封され得、アーム１０４９ａおよび１０４９ｂは、それらの直線的配置に戻るように移動され得、熱サイクルは継続し得る。
【０１１１】
[00142]容積の低減およびサイクル時間の減少は、本明細書に開示される実施形態のいずれかと共に、または多種多様な試料器および加熱構成を使用する他の実施形態と共に使用され得ることが理解される。容積を低減しサイクル時間を減少させるこの方法は、生のＰＣＲ成分の導入と組み合わせて使用され得ることも理解される。そのようなことは、組み合わせたＲＴ−ＰＣＲ反応が所望されるとき、またはそのような追加がネステッド増幅のためもしくはユニバーサルプライマーとの使用のためのプライマーを含み得る場合に有用であり得る。
【０１１２】
[00143]熱サイクルが完了すると、チャネル５６２ａは開放され得る。例示的には、特にブレード９４９が湾曲しているときは、ワイパ９８９の方向は、流体をブリスタ５４９からチャネル５６２ａ内へポンピングするように使用され得る。代替的に、ブリスタ５４９は、ブリスタ５４９がＰＣＲ反応物を受容した後に密封されるように、試料を熱サイクルさせるためのスタンドアローン容器であり得る。ブリスタ５４９は、熱サイクルを必要とする様々な試料タイプのいずれかのために使用され得る。
【０１１３】
[00144]図１０は、例えば、熱サイクルのためにブリスタの内容物を２つの加熱ゾーン間で移動させるために、図６〜図９Ｃに例証される加熱器デバイスと一緒に使用され得るワイパシステム１０００の実施形態を例証する。ワイパシステム１０００は、シャフト１０７０およびコネクタ１０６０によって回転モータ１０３０に取り付けられ得るワイパヘッド１０１０を含む。回転モータ１０３０は、支持体１０４０に結合され得、モータ１０３０およびワイパヘッド１０１０は、支持体１０４０上、例えば、レール１０５０上を矢印１０２０によって示されるように上げ下げされ得る。ワイパシステム１０００は、加熱器９８６、９８７（図６〜図７に示される）の上に装着され得、それらの間には試料ブリスタが挿入される空間がある。
【０１１４】
[00145]１つの実施形態において、ワイパシステム１０００は、試料器内のブリスタが基部１０８０の下に置かれ得るように計器に装着され得る。１つの例では、ヘッド１０１０およびモータ１０３０組立体は、流体充填されたブリスタに接触するために基部１０８０を過ぎて下げられ得る。モータ１０３０は、ワイパヘッド１０１０が流体充填されたブリスタの内容物を移動させることができるように回転され得る。流体充填されたブリスタが別個の加熱ゾーン（例えば９４℃のゾーンおよび６０℃の別個のゾーン）を有する加熱器デバイス（例えば加熱器９８６および９８７）と接触状態にある場合、モータ１０３０およびワイパヘッド１０１０は、ワイパヘッド１０１０のブレードがブリスタを別個の分離した容積に分割するように下げられ得、また図６〜図９Ｃを参照して上に説明されるように、ＰＣＲのための熱サイクルために、流体充填されたブリスタの内容物を移動させるために使用され得る。
【０１１５】
[00146]上に説明される熱サイクルデバイスに加えて、本明細書に説明される加熱器および混合器システムはまた、封入されたポーチ内での自動化された試料調製のために使用され得る。例えば、以下にさらに詳細に説明されるように、５４９のようなブリスタを加熱器９８６および９８７のうちの一方または両方を用いて加熱しながら、混合器システム１０００を用いて試料調製ブリスタの内容物を混合することは、細胞（例えばバクテリア細胞および哺乳動物細胞）を溶解し、その中の核酸を解放するために使用され得る。代替的に、または加えて、ブリスタは、カオトロピック試薬、洗剤、および／または溶解ビーズを含み得る（例えば、図１のポーチ５１０の溶解ブリスタ５２２を参照されたい）。同様に、熱電冷却デバイス（すなわち、ペルチェ素子）を用いて加熱および冷却して、混合することが、他の試料調製プロセスの効率を増大させるために使用され得る。例えば、核酸は、より低い温度（例えば約０〜１０℃）でより効率的に磁気ビーズ（例えば図１の磁気ビーズ５３３）に結合し、より高い温度（例えば約６０〜９０℃）でより効率的に磁気ビーズから溶出される。したがって、溶解は、例示的には、ブリスタ５４９が加熱器／冷却器９８６と接触状態にあるときに発生し得るが、磁石ビーズ結合は、例示的には、ブリスタ５４９が加熱器／冷却器９８７と接触状態にあるときに発生し得、これらの加熱器は、図１２〜図１３を参照して以下に論じられるように、横方向に移動し得る。
【０１１６】
[00147]これより図１１Ａおよび図１１Ｂを参照すると、図１０のワイパシステムにおいて含まれ得るワイパヘッド１１００の実施形態が例証される。ワイパヘッド１１００は、例えば、ワイパヘッドの遠位端であるチャック１１７０を介して図１０のワイパシステム１０００のシャフト１０７０に取り付けられ得る。ワイパヘッド１１００の近位端は、ワイパブレード１１４９を有するワイパ本体１１１０を含む。ワイパヘッド１１００はまた、ばね部材１１４０と、上体１１６０の上方部分をワイパ本体１１１０に結合するピン、ねじ、または同様のものなど１１５０とを含む。１つの実施形態において、ワイパヘッドは、ワイパヘッド１１１０およびワイパブレード１１４９が流体充填されたブリスタに対して加えることができる圧力量をばね部材１１４０が調整することができるように構成され得る。
【０１１７】
[00148]例証されたワイパ本体１１１０はまた、例示的には、ワイパブレード１１４９間の象限内に設置される圧力部材１１８１ａ〜１１８１ｄを含み得る。１つの実施形態において、圧力部材１１８１ａ〜１１８１ｄは、図８Ａ〜図８Ｄに関連して説明される圧力部材９８１のように機能するように一緒に働き得る。すなわち、圧力部材１１８１ａ〜１１８１ｄは、ワイパブレード１１４９が流体充填されたブリスタと接触状態にされるときに圧力部材１１８１ａ〜１１８１ｄが一貫した予測可能な圧力を印加することができるように、ワイパブレード１１４９に対して位置付けられ得る。しかしながら、図１１Ｂを参照すると、流体充填されたブリスタに圧力を印加するために圧力部材１１８１ａ〜１１８１ｄがワイパブレード１１４９に対して配備されるか、移動されるか、または下げられ得る別の実施形態が例証される。例証された例において、圧力部材１１８１ａ〜１１８１ｄは、ブレード１１４９および圧力部材１１８１ａ〜１１８１ｄが流体充填されたブリスタに対して実質的に平坦の表面を提示するまでワイパヘッド１１００を下げることによって配備され得る。１つの実施形態において、圧力部材１１８１ａ〜１１８１ｄは、ワイパヘッド１１００を、ワイパブレード１１４９がブリスタに接触する地点を過ぎて下げることによって配備され得、ワイパヘッド１１００を下げ続けることにより、ワイパブレード１１４９を上に圧迫すること、および／または圧力部材１１８１ａ〜１１８１ｄを下に押圧することができる。ばね部材１１４０は、ブレード１１４９に対する圧力の量を調整するように構成され得、圧力部材を配備するためにプランジャヘッド１１１０が必要とされる。ワイパブレードおよび圧力部材が実質的に平面の表面を形成するまでワイパヘッド１１００を下へと下げることは、例えば、液体をブリスタ内に均質に拡散させるため、または液体を１つのブリスタから別のブリスタへと投入するために使用され得る。別の実施形態（図示されず）において、圧力部材は、例えば、流体充填されたブリスタに圧力を加えてブリスタとその下の加熱器との間の接触を改善するために、同様の機序によって中間位置に配備され得る。１つまたは複数の実施形態において、ワイパヘッド１１００は、ブレード１１４９および圧力部材１１８１ａ〜１１８１ｄが流体充填されたブリスタに印加できる圧力の量を調節または調整するために、ワイパブレード１１４９および／または圧力部材１１８１ａ〜１１８１ｄに関連付けられる複数のばね部材タイプを含み得る。
【０１１８】
[00149]これより図１２Ａおよび図１２Ｂを参照すると、図１０を参照して論じられるワイパシステム１０００の特徴、図１１Ａおよび１１Ｂを参照して論じられるワイパヘッド１１００、ならびに図６の加熱器９８６および９８７の特徴の多くを含む、計器１２００が例証される。例示的な例において、計器１２００は、ヒンジ付きカバー１２１０およびシャーシカバー１２２０を含む。ヒンジ付きカバー１２１０は、ヒンジ付きカバー１２１０とシャーシカバー１２２０との間の計器内への自己完結型ＰＣＲのための可撓性ポーチの挿入のために開放され得る。シャーシカバー１２２０は、計器１２００の内部構成要素の上に横たわり、計器内に図１４Ａに例証されるもののような可撓性ポーチを位置付けるための受け口を画定し得、ここでは受け口は、ポーチの一部分と同一の広がりをもつ。以下にさらに詳細に説明されるように、受け口は、計器内に可撓性ポーチを受容し、計器の様々な構成要素が可撓性ポーチと相互作用できるように可撓性ポーチを整列させるように構成され得る。同様に、受け口は、計器の内部構成要素が可撓性容器に接触できるように開口部および同様のものを含み得る。同様に、ヒンジ付きカバー１２１０は、計器の外部構成要素が可撓性容器と相互作用できるように開口部および同様のものを含み得る。カバー１２１０および１２２０の上に、計器１２００は、駆動モータ１０３０および先に説明したワイパヘッドを含むワイパシステム１０００と、蛍光データの収集のためのカメラ／蛍光光度計１２５０および取付部１２６０とを含む。先の例において、ワイパシステムは、ポーチに接触するために、基部１０８０内の孔１２４０を通り、かつヒンジ付きカバー１２１０内の１つまたは複数の孔を通って、矢印１０２０によって示されるように上下に移動され得る。
【０１１９】
[00150]加えて、例証された実施形態において、ワイパシステムは、例示的にはレール１２３０上を左右に移動され得、それによりワイパシステム１０００は、計器１２００内に挿入されるポーチの異なる領域に接触することができる。１つの実施形態において、ワイパシステム１０００は、ワイパ１１００がポーチの異なる部分と相互作用することができるように移動され得る。例えば、以下にさらに詳細に説明されるように、ワイパシステム１０００は、ポーチ内試料調製および第１段階ＰＣＲステップのために使用され得る。代替的な実施形態において、ワイパシステム１０００は、静止状態に保持され得、ポーチは、ワイパがポーチの異なる部分に接触することができるように移動され得る。しかしながら、この配置は例示にすぎず、ワイパ、加熱器、および試料容器を移動および整列させる他の配置が企図されることが理解される。ワイパ、加熱器、およびポーチの任意の組み合わせが、移動可能な要素の上に置かれ得ること、ならびにワイパ、加熱器、ポーチ、および同様のものの移動が論じられるとき、そのような移動は、任意の実施形態においては、移動可能な要素と協働するワイパ、加熱器、またはポーチの反対の移動と置き換えられ得、この任意の実施形態では、そのような反対の移動が他の要素の配置と一致することが理解される。いくつかの実施形態において、ポーチおよび他の計器要素の回転運動も企図される。
【０１２０】
[00151]これより特に図１２Ｂを参照すると、計器１２００の内部をより明確に見ることができるようにカバー１２１０および１２２０が取り除かれている。計器１２００の内部は、例示的には、例えばレール１２９２上を、矢印１２９４によって示されるように移動装置によって前後に移動され得る加熱器組立体１２７０を含む。加熱器組立体１２７０は、第１の加熱器要素１２８６および第２の加熱器要素１２８７を含む。例証された実施形態において、加熱器組立体は、例示的には駆動モータ１２９６および駆動部材（例えば、ねじ付き釘）１２９８を含む移動装置に機械的に結合され得る。加熱器組立体１２７０は、加熱器１２８６および１２８７が計器内に据え付けられたポーチの異なる領域と相互作用することができるように、例えばレール１２９２上を前後に移動され得る。しかしながら、モータおよびレールは例示にすぎず、他の線形および非線形移動装置が使用され得ることが理解される。図６〜図９Ｃを参照して上に詳細に論じられたように、加熱器組立体は、ブリスタの部分（例えば、第１段階ＰＣＲブリスタ）が、図６〜図８に示されるものに類似して、同時に第１の加熱器要素１２８６および第２の加熱器要素１２８７の温度制御下にあることができるように位置付けられ得る。同様に、全ブリスタが、１つの加熱器によって一度に制御され得、ブリスタ（例えば、第１段階ＰＣＲブリスタまたは第２段階ＰＣＲブリスタ）は、選択されたブリスタが第１の加熱器１２８６および次いで第２の加熱器１２８７などの温度制御下に繰り返してあるように移動装置を用いて加熱器組立体１２７０を前後に移動させることによって熱サイクルされ得る。例証された実施形態は移動することができる加熱器を含むが、加熱器組立体を移動させる代わりに加熱器に対してポーチを移動させることによって同じ効果が達成され得ること、およびこの運動が、例えば、線状経路、弓線状経路、または回転経路に沿っていてもよいことを理解するものとする。
【０１２１】
[00152]加熱器１２８６および１２８７は、ペルチェ素子、抵抗加熱器、誘導加熱器、電磁加熱器、薄膜加熱器、印刷素子加熱器、正温度係数加熱器、または当該技術分野において知られているような任意の他の加熱器であり得る。加熱器タイプはまた、単一のユニット内で組み合わされ得る（例えば、加熱器ユニットは、一定温度を維持するのを助けるためならびに／または加熱および冷却の効率および速度を増大させるために、ペルチェの前および／または裏側に抵抗性加熱器を有するペルチェ素子を含み得る）ことを理解するものとする。「加熱器」という用語は、要素１２８６および１２８７を指すために使用されるが、試料の温度を調節するために他の温度制御要素または要素の組み合わせが使用され得ることが理解される。アニーリングと変性温度との間を熱サイクルさせるために提供されるＰＣＲデバイス内に典型的に含まれる加熱器とは異なり、加熱器１２８７および１２８６は、一定温度に保持され得るか、または限られた温度範囲内（例えばアニーリング温度と延伸温度との間）で熱サイクルされ得る。例えば、図６〜図９Ｃを参照して上に詳細に説明されるように、試料は、液体充填されたブリスタの内容物を２つの静温度ゾーン間で移動させることによって熱サイクルされ得る。１つの例では、加熱器１２８７は、好適な変性温度、例示的には９４℃で提供され得、加熱器１２８６は、好適なアニーリング温度、例示的には６０℃で提供され得るが、当該技術分野において知られているように、他の例示的な変性およびアニーリング温度が使用され得る。また、特定のプロトコルには３つ以上の加熱器が望ましい場合がある。
【０１２２】
[00153]１つの実施形態において、加熱器１２８６および１２８７の一方または両方は、ペルチェ素子を含み得る。加熱器１２８６および１２８７は熱サイクルされない場合があるが、例えば、加熱器１２８６および１２８７の一方または両方にペルチェ素子を含むことが望ましい場合がある。典型的な抵抗加熱器とは異なり、ペルチェ素子は、試料をアクティブに冷却ならびに加熱することができる。例えば、試料を変性温度（例えば９４℃）からアニーリング温度（例えば６０℃）へ移す際、試料は、アニーリング温度まで冷まされなければならない。これは、放熱／伝導によって起こるが、これらのプロセスは比較的緩徐である。迅速な熱サイクルのため、例えば、６０℃に設定されたペルチェの「冷たい」側面と、より高い温度に設定され得る「熱い」側面とを有するペルチェ素子を用いて試料をアクティブに冷却することが好ましい場合があり、この「熱い」側面において、余熱は、例示的にはヒートシンクによりポンピングされ処理され得る。
【０１２３】
[00154]計器１２００はまた、ワイパ１１００、加熱器１２８６および１２８７、熱サイクルパラメータ（例えば、ワイパの移動、加熱器の温度、試料容器とワイパおよび加熱器との整列など）、試料容器内の流体移動などのうちの１つまたは複数を制御するように構成され得るコンピュータ１２９９を含む。同様に、コンピュータ１２９９は、光学システム１２５０からなど計器１２００からのデータ取得および分析のために構成され得る。これらの構成要素の各々は、例示的にはケーブル１２９１を介して電気的に接続されるが、他の物理的またはワイヤレス接続は本発明の範囲内である。コンピュータ１２９９は、計器１２００内に収容され得るか、または計器１２００の外部にあり得ることが理解される。さらに、コンピュータ１２９９は、構成要素の一部またはすべてを制御するビルトイン回路基板を含み得、計器１２００からデータを受信して表示するためにデスクトップまたはラップトップＰＣなどの外部コンピュータも含み得る。温度、サイクル時間などの情報および変数を入力するためのキーを含む、インターフェース、例示的にはキーボードインターフェースが提供され得る。例示的には、ディスプレイも提供され得る。ディスプレイは、例えば、ＬＥＤ、ＬＣＤ、または他のそのようなディスプレイであり得る。
【０１２４】
[00155]これより図１３Ａおよび図１３Ｂを参照すると、別の計器１３００が例証される。計器１３００は、多くの点において計器１２００に類似しているが、但し計器１３００は２つの混合器／ワイパを有するワイパシステム１３０５を含む。したがって、１つの実施形態において、ワイパ／混合器が計器１３００内に据え付けられたポーチの異なる部分と相互作用することができるようにワイパを水平に移動させる必要がない場合がある。
【０１２５】
[00156]計器１３００は、第１および第２のワイパモータ１３１０ａおよび１３１０ｂと第１および第２のワイパヘッド１１００ａおよび１１００ｂとを含むワイパシステム１３０５を含む。この計器はまた、第１および第２のカバー１３１５および１３２０と、カメラ１３２５と、カメラ支持体１３３０とを含む。これより図１３Ｂを参照すると、計器１３００は、レール１３５０上を水平に移動され得る加熱器システム１３３５と、第１および第２の加熱器要素１３８６および１３８７とをさらに含む。「加熱器」という用語は、要素１３８６および１３８７を指すために使用されるが、試料の温度を調節するために他の温度制御要素または要素の組み合わせが使用され得ることが理解される。加熱器システム１３３５は、加熱器システムの移動のために駆動モータ１３６０および駆動部材１３６５に機械的に結合される。例示的には、加熱器１３８６は、約９０〜９５℃の範囲内の温度で提供され得、加熱器１３８７は、約５５〜６５℃の範囲内の温度で提供され得るが、他の温度および配置が可能である。
【０１２６】
[00157]計器１３００はまた、ワイパ１１００ａおよび１１００ｂ、加熱器１３８６および１３８７、熱サイクルパラメータ（例えば、ワイパの移動、加熱器の温度、試料容器とワイパおよび加熱器との整列など）、試料容器内の流体移動などのうちの１つまたは複数を制御するように構成され得るコンピュータ１３９９を含む。同様に、コンピュータ１３９９は、光学システム１３２５からなど計器１３００からのデータ取得および分析のために構成され得る。これらの構成要素の各々は、例示的にはケーブル１３９９を介して電気的に接続されるが、他の物理的またはワイヤレス接続は本発明の範囲内である。コンピュータ１３９９は、計器１３００内に収容され得るか、または計器１３００の外部にあり得ることが理解される。さらに、コンピュータ１３９９は、構成要素の一部またはすべてを制御するビルトイン回路基板を含み得、計器１３００からデータを受信して表示するためにデスクトップまたはラップトップＰＣなどの外部コンピュータも含み得る。温度、サイクル時間などの情報および変数を入力するためのキーを含む、インターフェース、例示的にはキーボードインターフェースが提供され得る。例示的には、ディスプレイも提供され得る。ディスプレイは、例えば、ＬＥＤ、ＬＣＤ、または他のそのようなディスプレイであり得る。
【０１２７】
[00158]これより図１４Ａおよび図１４Ｂならびに図１５Ａ〜図１５Ｆを参照すると、計器１２００および１３００において使用され得る可撓性ポーチまたは化学作用カードの実施形態が説明され（図１４Ａ）、試料調製、第１段階ＰＣＲ、および第２段階ＰＣＲのために計器１２００および１３００によって実施され得る動作の手順が図１５Ａ〜図１５Ｆに説明される。
【０１２８】
[00159]図１４Ａの例示的な可撓性ポーチ１４００は、試料調製、核酸増幅、および検出が発生し得るいくつかのゾーンまたはブリスタを含む実質的に平面の領域１４０２を含む。１つの実施形態において、ポーチ１４００は、ポーチ１４００を形成するために一緒に密封されるいくつかの材料層（同じ材料の層または異なる種類の材料の層）から製作され得る。図１４Ｂでは、線Ｂ−Ｂに沿った層を例証する切断が示される。例示的なポーチは、第１のフィルム層１４９０、感圧性接着剤層１４９２、カード層１４９４、第２の感圧性接着剤層１４９６、および第２のフィルム層１４９８を含む。１つの例示的な例において、ポーチ１４００内のブリスタエリアは、カード層１４９４内に適切な切欠きを作製することによって形成され得る。代替的に、ポーチのブリスタエリアは、フィルム層（例えばフィルム層１４９０および１４９８）を、カード層ありまたはなしの液体ブリスタとしての役割を果たす層間に開放空間を残して一緒にラミネートまたは溶接することによって形成され得る。他の構成が可能であることを理解するものとする。例示的なブリスタエリアは可撓性であるが、カード層１４９４は任意選択的に、より可撓性が低い場合があり得、また剛性であり得、さらには可撓性試料容器の部分であり得ることが理解される。したがって、「可撓性ポーチ」は特定のゾーンにおいてのみ可撓性である必要があることが理解される。充填チャネル１４４０〜１４６０、およびブリスタエリア１４６５〜１４８５を接続するチャネルは、第１の感圧性接着剤層１４９２もしくは第２の感圧性接着剤層１４９６のいずれかにおいて適切な切欠きを作製することによって、またはカード層１４９４内にチャネルを提供することによって形成され得る。代替的に、または加えて、ブリスタエリア間のフローチャネルは、フィルム層１４９０の上またはフィルム層１４９８の下に別のフィルム層を追加して、層間に開放したブリスタエリアおよびチャネルを残してそれらの層を一緒に溶接することによって形成され得る。
【０１２９】
[00160]他の材料が使用され得るが、例示的には、ポーチ１４００のフィルム層は、図１に説明されるポーチ５１０に類似した可撓性プラスチックフィルムまたは他の可撓性材料から形成され得る。例えば、ポーチ１４００は、限定されるものではないが、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレートなどの材料、押し出し加工、プラズマ蒸着、およびラミネーションを含む当該技術分野において知られている任意のプロセスによって作製され得るそれらの組み合わせ、混合物、およびラミネートされる層から製作され得る。同様の材料（例えばポリカーボネート）がカード層１４９４のために使用され得る。アルミニウムラミネーションを有する金属箔またはプラスチックなどの他の材料も使用され得る。ブリスタおよびチャネルを形成するために一緒に密封され得る他のバリヤ材料が、当該技術分野において知られている。プラスチックフィルムが使用され得る場合、層は、例示的にはヒートシールによって、一緒に結合され得る。例示的には、この材料は、核酸結合力が弱い。蛍光検出が使用される場合、光学的に透明の材料がポーチの適切なエリア（例えば第２段階アレイの付近）において使用され得る。
【０１３０】
[00161]図１４Ａに戻ると、例示的なポーチ１４００は、増幅され分析されることになる核酸を含有する試料がポーチ１４００内へと導入される場所である試料調製ブリスタ１４０５を含む。ポーチは、第１段階ＰＣＲブリスタ１４１０、第２段階ＰＣＲの前に第１段階ＰＣＲからの生成物の一部分を測定するための容積測定ウェル１４１５、および第２段階ＰＣＲのための反応ウェル１４３０のアレイをさらに含む。容積測定ウェル１４１５はまた、第２段階ＰＣＲのための試薬が導入される場所である試薬ブリスタ１４２５と、混合ブリスタ１４２０とに流体結合され得る。第２段階ＰＣＲのための試料は、ブリスタ１４２０とブリスタ１４２５との間の容積測定ウェル１４１５の内容物を繰り返し混合することによって調製され得る。第２段階アレイ１４３０はまた、廃物受け口１４３５に流体接続され得る。代替的に、ブリスタ１４１０は、試料調製および第１段階ＰＣＲの両方に使用され得、ブリスタ１４０５は、例えば試料調製廃物のための廃物受け口として使用され得る。試料および試薬をポーチ１４００内に導入するための手段は、図１４Ａには例証されないが、図１の金具５９０に形態が類似したデバイスが、ポーチ１４００内への試料および試薬の導入のためにポーチ１４００に差し込まれて使用され得ることを理解するものとする。同様に、密封可能ポート（図示されず）が、ポーチ１４００内への試料の導入のために提供され得、１つまたは複数の密封可能ポートは、液体試薬または水和緩衝液の導入のために提供され得る。加えて、ポーチ１４００は、金具内の脱水された（例えば凍結乾燥された）試薬、またはポーチの使用前に好適な水和緩衝液により脱水され得る同様の構造体を含み得る。
【０１３１】
[00162]これより図１５Ａを参照すると、第２段階ＰＣＲに使用され得るウェルのアレイ１５００がより詳細に例証される。アレイ１５００は、スタンドアローンアレイであり得るか、またはアレイ１４３０の一部などより幅広のアレイの一部として含まれ得る。アレイ１５００は、個別のウェル１５１０ａ〜１５１０ｅを含む。ウェル１５１０ａ〜１５１０ｅの各々は、第２段階ＰＣＲ反応に使用され得る。例証される実施形態において、ウェル１５１０ａ〜１５１０ｅは、充填チャネル１５２０に流体接続され、孔１５３０ａ〜１５３０ｅは、ウェルの各々を充填するために充填チャネル内に形成される。１つの実施形態において、ウェル１５１０ａ〜１５１０ｅは、１５６５に例証される領域内または領域周辺にシール（例えばヒートシール）を適用するかまたは圧力を印加することによって、充填チャネル１５２０から、および互いから封止され得る（すなわち、ウェル間のクロストークを防ぐことができる）。したがって、単一のシール１５６５が、ウェル１５１０ａ〜１５１０ｅを充填チャネル１５２０からおよび互いから閉鎖し得る。アレイ１５００の横断面構造およびウェルを充填するためのフローパスは、以下に図１５Ｂおよび図１５Ｂ’に例証される。アレイ１５００は充填チャネル１５２０と関連付けられた５つのウェル１５１０ａ〜１５１０ｅを有して例証されるが、より多くのまたはより少ない反応ウェルが充填チャネルと関連付けられ得ること、および複数の充填チャネルがウェルの複数のクラスタに流体接続され得ることを理解するものとする。複数のアレイ１５００は、より大きなアレイを作成するために組み合わせて使用され得る。
【０１３２】
[00163]これより図１５Ｂおよび図１５Ｃを参照すると、断面図が図１５Ａの線Ｂ−Ｂに沿って例証される。ウェル充填システムの２つの異なる実施形態の断面図が示される。図１５Ｂおよび図１５Ｃに断面で例証されるアレイ１５００の部分は、図１４Ｂに示されるものに類似した層でできているが、アレイ１５００は、図１４Ａに示されるポーチ１４００の一部として含まれ得ることに留意されたい。アレイ１５００は、第１のフィルム層１５３５、第２のフィルム層１５４０、接着剤層１５４５、アレイのウェル１５１０が中に形成され得るカード層１５５０、第２の接着剤層１５５５、および第３の（外側の）フィルム層１５６０から製作される。
【０１３３】
[00164]図１５Ｂでは、充填チャネル１５２０は、第１のフィルム層１５３５と第２のフィルム層１５４０との間に液体が流れることができる空隙を残すことによって形成され得る。図１５Ｃは、第１のフィルム層１５３５ｃと第２のフィルム層１５４０ｃとの間に空隙を残すことによって形成される類似した充填チャネル１５２０ｃを示す。充填チャネルは、第１および第２のフィルム層をアレイの周りで一緒に密封する溶接線１５７０または１５７０ｃによって画定され得る。これらの溶接１５７０がどのように適用されるかの例は図１５Ａに示される。図１５Ｂでは、充填孔１５３０は、第２のフィルム層１５４０および第１の接着剤層内に選択的な切欠きを作製することによって形成され得る。図１５Ｃでは、充填孔１５３０ｃは、第２のフィルム層１５４０ｃ内に選択的な切欠きを作製することによって形成され得る。
【０１３４】
[00165]図１５Ｂでは、ウェル１５１０を充填するためにウェル１５１０の周りおよび上を流れるウェル充填チャネルは、カード層内に切欠き１５７５、および接着剤層１５５５内に切欠き１５８０を作製することによって形成され得るが、これらのチャネル形成する他の方法が可能である。図１５Ｂのウェル充填チャネルの設計は、例えば、フローパスが入り組んでいることが理由でウェル間のクロストークを抑制するのを助け得る。同様に、充填チャネル１５２０および充填孔１５３０が２つのフィルム層１５３５および１５４０間に形成されるため、充填孔１５３０およびアレイ１５００は、例示的にはヒートシールデバイスを用いて、または圧力によって、例示的にはアレイ１５００に対して膨張する内袋によって、密封され得る。図１５Ｃでは、ウェル充填チャネルは、ウェル１５１０ｃ内へ直接流れ、充填孔１５３０ｃをウェル１５１０ｃに流体接続する第１の接着剤層１５４５ｃ内の切欠き１５８５ｃを作製することによって形成され得る。図１５Ｃの充填設計はまた、ウェル間のクロストークを全体的に抑制することが期待される。しかしながら、図１５Ｃの設計は、例示的には、圧力のみよりもより良好な密封を提供し得るヒートシールデバイスを用いて密封され得る。１つの実施形態において、第２段階アレイのウェル（例えばウェル１５１０）は、流体を充填チャネル１５２０からウェル１５１０内へと引き入れることを促進するために部分真空下にあり得る。別の実施形態（図示されず）において、第２段階アレイのウェルは、ポーチおよびアレイを真空下に維持する必要なく流体が充填チャネル１５２０からウェル１５１０内へと流れることができるように、空気および過剰流体を逃がすための出口孔および下流廃物受け口を含み得る。
【０１３５】
[00166]これより図１６Ａ〜図１６Ｆを参照すると、試料調製、第１段階ＰＣＲ、および第２段階ＰＣＲのためにポーチ１４００を使用して計器１３００によって実施され得る例示的な動作の手順が説明される。図１３Ａに描写されるカバー１３１５および１３２０は明確性のために取り除かれているが、それらは通常、計器が動作中の間は適所にあり、ポーチ１４００は、例示的には、ポーチをワイパ、加熱器、および同様のものに対して位置付けるために外側カバーと内側カバーとの間に挿入されることに留意されたい。図１６Ａでは、試料はすでにポーチ１４００に添加されており、ポーチが計器１３００内に位置付けられていることが理解される。しかしながら、いくつかの実施形態において、本計器は、ポーチが計器内にあるときに試料をポーチ内へ注入するように構成され得る。以下にさらに詳細に説明されるように、試料は、充填チャネル１４４０を介してブリスタ１４０５内に導入され得、それは図１４Ａに例証される。第１のステップにおいて、加熱器組立体１３３５は、加熱器要素が加熱および冷却された試料調製のためのブリスタ１４０５と接触状態にあるように移動され得る。この図では、加熱器要素１３８６および１３８７は見えないが、例えば、加熱器要素１３８６は、加熱器組立体１３３５がレール１３９２に沿って移動され、それより試料が細胞溶解のために加熱され、磁気ビーズでの核酸回収のために加熱器１３８７によって冷却され（例えば約５〜１０℃）、磁石ビーズ洗浄ステップのために加熱器１３８７によって冷却され（例えば約５〜１０℃）、磁気ビーズからの溶出のために加熱器要素１３８６によって加熱される（例えば約５０〜６０℃）ように位置付けられ得る。図１６Ｂでは、ワイパヘッド１１００ａは、ワイパブレード（図示されず）がブリスタ１４０５に接触するまで下げられ得る。次いで、ワイパヘッド１１００ａは、モータ１３１０ａと一緒に回転され得、加熱およびかくはんの組み合わせは、大部分の細胞およびウイルスタイプを効果的に溶解するのに十分であり得る。しかしながら、混合装置は溶解のために描写されるが、この混合装置は、限定されるものではないが、超音波処理デバイス、ビードビーターモータ、凍結／解凍機序、パドルビーター、レーザ溶解、スリッププレートハンマー機序、ハンマードリルビーター機序、ホモジナイザ、それらの組み合わせ、または当該技術分野において知られている別の細胞溶解装置などの溶解のための他の手段と置き換えられ得ることが理解される。試料調製は、省かれるか、または前もって実施され得、このステップが省かれ得ることも理解される。
【０１３６】
[00167]これより図３２Ａを参照すると、溶解物からの核酸の回収ために使用され得るワイパヘッド１８００の実施形態が例証される。ワイパヘッド１８００は、ワイパヘッド１１００に類似しているが、但しワイパヘッド１８００は、細胞溶解物から核酸を回収するための本明細書に説明されるいくつかの実施形態に使用され得る磁気ビーズを選択的に隔離するために使用され得る磁石システムを含む。ワイパヘッド１８００の近位端は、ワイパブレード１８４９を有するワイパ本体１８１０を含む。ワイパヘッド１８００はまた、外側ばね部材１８５０、上体１８６０、およびワイパヘッドの上方部分を下方部分に結合するピン１８６５ａ〜１８６５ｄ（ピン１８６５ｃは図示されず）を含む。１つの実施形態において、ワイパヘッドは、ワイパヘッド１８１０およびワイパブレード１８４９が流体充填されたブリスタに対して加えることができる圧力量をばね部材１８５０およびピン１８６５ａ〜１８６５ｄが調整することができるように構成され得る。
【０１３７】
[00168]例証されたワイパ本体１８１０はまた、１つの態様においては流体充填されたブリスタに圧力をかけるために下向きに配備され得（例えば図３２Ｂを参照されたい）、別の態様においてはブリスタの流体内容物を別のブリスタへと絞り出すためにさらに下向きに配備され得る（例えば図３３Ｃのブリスタ２０２０を参照されたい）、ワイパブレード１８４９間の象限内に設置された圧力部材１８８１ａ〜１８８１ｄ（圧力部材１８８１ｃは図示されず）を含む。例証された例において、圧力部材１８８１ａ〜１８８１ｄは、ワイパヘッド１８００を、ワイパブレード１８４９がブリスタに接触する地点を過ぎて下げることによって配備され得、ワイパヘッド１８００を下げ続けることにより、磁石１８８２ａ〜１８８２ｄが磁石ビーズを集めることができるまで、または圧力部材１８８１ａ〜１８８１ｄがブリスタに対して平坦に押圧されて流体を圧縮してブリスタの外へ出すまでさらに遠くへ、ワイパブレード１８４９を上に圧迫すること、および／または圧力部材１８８１ａ〜１８８１ｄを下に押圧することができる。
【０１３８】
[00169]図３２Ｂ〜図３２Ｃおよび図３３〜図３３Ｃと併せて図３２Ａをさらに参照すると、ワイパヘッド１８００の一連の図、磁石１８８２ａ〜１８８２ｄの磁石システム、およびそれらが流体充填されたブリスタに対してどのように作用するかが例証される。図３３は、ポーチ１４００に類似した試料カード内に含まれ得る、相互接続流体チャネル２０３０を有する一対のブリスタ２０１０および２０２０を例証する。１つの実施形態において、ブリスタ２０１０および２０２０は、図１４Ａのポーチ１４００に含まれる試料調製ブリスタ１４０５および第１段階ブリスタ１４１０に類似し得る。別の実施形態において、ブリスタ２０１０は、試料調製ブリスタであり得、ブリスタ２０２０は、廃物受け口であり得、カードは、第１段階ＰＣＲのための別のブリスタ（図示されず）を含み得る。図３３では、ブリスタ２０１０は、２０１５に概略的に例証される細胞溶解物のスラリーおよび磁気ビーズを含有するように示される。磁気ビーズは、細胞溶解物から核酸を結合することおよび単離することができるシリカ被覆磁石材料または同様のものを含み得る。溶解物からの核酸の磁石ビーズ回収のための例示的なプロセスは、本明細書内の他の場所において、例えば図１を参照して、詳細に論じられ、そのようなプロセスは、この実施形態および本明細書内の他の実施形態において使用され得る。
【０１３９】
[00170]これより図３２Ａおよび図３３Ａを参照すると、ワイパヘッド１８００の第１の状態およびワイパブレード１８４９がどのようにブリスタ２０１０と相互作用し得るかが例証される。第１の状態では、ワイパブレード１８４９は、例えば溶解物への磁気ビーズの曝露のために、ワイパヘッド１８００の回転がスラリー２０１５を混合し得るように、ブリスタ２０１０内へ押圧され得る。図３２Ｂおよび図３３Ｂは、例えば、圧力部材１８８１ａ〜１８８１ｄがブリスタ２０１０により近づき、それにより磁石１８８２ａ〜１８８２ｄが磁気ビーズを集め始めることができるようにヘッド１８００がさらに下げられている第２の状態を例証する。部分的に集められた磁気ビーズが２０１６に示され、部分的に除去されたスラリーが２０１７に概略的に示される。圧力部材および磁石がブリスタのより近くに移動されると、磁気ビーズは、例えば、ワイパヘッドを小さい弧状（例えば約＋／−５〜２０°の範囲内）で前後に回転させることによって、統合され得る。磁気ビーズが磁石によって完全に捕捉され完全に統合されると、ワイパヘッド１８００は完全に下げられ得、その結果、圧力部材１８８１ａ〜１８８１ｄがブリスタ２０１０を平坦に押圧してチャネル２０３０を通じて溶解物をブリスタ２０２０内へと絞る。これは、図３２Ｃおよび図３３Ｃに例証される。補足された磁気ビーズは２０１８に示され、廃物溶解物は２０１９に示される。図３２Ａ〜図３２Ｃおよび図３３〜図３３Ｃに例証されるステップは、ビーズ２０１８を洗浄し、それに続いてそこから捕捉された核を溶出するために繰り返され得る。
【０１４０】
[00171]再び図１６Ａ〜図１６Ｆを参照すると、溶解および核酸回収に続いて、回収された核酸は、第１段階ＰＣＲのためにブリスタ１４１０に移動され得る。これは図１６Ｃに例証され、ここではワイパヘッドの圧力部材がブリスタに押し付けられ（例えば、図１１Ｂに示されるように）、それによりワイパヘッドがブリスタ１４０５の内容物の少なくとも一部分をブリスタ１４１０に投入することができるように、ワイパヘッド１１００ａが下げられている。ほぼ同じ時に（すなわち、それより前に、同時に、または後に）、加熱器組立体１３３５は、ブリスタ１４１０が図６に関連して説明されるように加熱器１３８６および１３８７の両方の温度制御下にあるように再位置付けされ得る。これは図１６Ｄに描写される。さらに図１６Ｄでは、ワイパヘッド１１００ｂは、ワイパブレード（図示されず）がブリスタ１４１０に接触するまで下げられる。１つの混合器を用いる代替的な実施形態においては、ポーチが移動され得るか、または混合ヘッド１１００がポーチの様々なブリスタに接触し得るように混合器が移動され得る。加熱器１３８６および１３８７ならびにワイパヘッド１１００ｂが適所にある状態で、第１段階ＰＣＲは、ワイパブレードが第１段階ＰＣＲを別個の離散した容積に分割するように混合ヘッド１１００を下げ、図６〜図９Ｃを参照して先に説明されるように、ブリスタ１４１０の内容物を２つの加熱器１３８６および１３８７の間で移動させるためにワイパヘッドを回転させることによって達成され得る。代替的な実施形態において、第１段階ＰＣＲ熱サイクルは、ブリスタ１４１０の内容物が、加熱器１３８６（例えば変性）、次いで加熱器１３８７（例えばアニーリング）、次いで加熱器１３８６（例えば延伸および変性）などの温度制御下に繰り返しあるように、加熱器組立体１３３５またはポーチ１４００をレール１３９２に沿って前後に移動させることによって達成され得る。
【０１４１】
[00172]１つの実施形態において、加熱器組立体１３３５またはポーチ１４００の移動による熱サイクルは、例えば図８Ｃに例証される、ワイパヘッド１１００の混合作用と組み合わされ得る。例えば、ワイパヘッド１１００を使用した混合は、ブリスタ１４１０の内容物を混合してブリスタ内の流体の温度均一性を増大させるために、加熱器組立体１３３５の移動による熱サイクルと組み合わされ得る。同様に、ブリスタ内の流体を混合することは、効果的な拡散速度を増大させてＰＣＲの化学作用を改善するために、加熱器組立体１３３５の移動による熱サイクルと組み合わされ得る。１つの態様において、例えば加熱器組立体が前後に移動されている間に、ワイパヘッドが一定の速度で回転され得るか、またはワイパヘッドは、例えば、加熱器１３８７および次いで加熱器１３８６の制御下にあるブリスタの遷移に対応してタイミングが計られた間隔で回転され得る。
【０１４２】
[00173]ブリスタ１４１０内での第１段階ＰＣＲに続いて、増幅された核酸の一部分は、容積測定ウェル１４１５へ移動され、ブリスタ１４２０と１４２５との間で混合することによって第２段階ＰＣＲ試薬（ポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓなど）と混合され得る。混合は、図２の内袋システム８０８に類似した内袋システムまたは別の圧力印加システムを用いて達成され得る。いくつかの実施形態において、第２段階ＰＣＲのための試料を、熱を用いて調製することが望ましい場合がある。これは、図１６Ａ〜図１６Ｆには描写されないが、加熱器組立体１３３５は、真のホットスタートが所望される場合には加熱器１３８６をブリスタ１４１５、１４２０、および１４２５に隣接して移動させることによって、そのようなステップのために位置付けられ得る。第２段階ＰＣＲ試薬が各第２段階ウェル内に提供され得ることも理解される。
【０１４３】
[00174]ブリスタ１４１５、１４２０、および１４２５内での第２段階ＰＣＲのための試料の調製に続いて、試料は、第２段階ＰＣＲのためにアレイ１４３０に移動され得る。図１６Ｅおよび図１６Ｆに描写されるように、第２段階ＰＣＲのための熱サイクルは、アレイおよび個別のウェルの内容物が加熱器１３８６（例えば変性）、次いで加熱器１３８７（例えばアニーリング）、次いで加熱器１３８６（例えば延伸および変性）などの温度制御下にあるように、加熱器組立体１３３５をアレイ１４３０に対して移動させることによって達成され得る。これらの図では描写されないが、圧力印加手段（例えば、ブリスタに圧力を印加しながら同時にまたは実質的に同時に蛍光測定を可能にするように構成された透明の可撓性内袋など、膨張可能な内袋）が、アレイの上に位置付けられて、ウェル内の個別のウェルの内容物を密封し、ウェル間のクロストークを防止し得る。同様に、そのような圧力印加手段はまた、アレイと加熱器との間の接触を改善し、したがって熱伝達の効率を増大させ得る。ウェルは、ヒートシールなどの他の手段によって密封され得ることが理解される。これらの図には描写されないが、アレイ１４３０内の核酸増幅は、図１３Ａおよび図１３Ｂに描写されるカメラ１３２５などの光学アレイを用いてモニタされ得る。
【０１４４】
[00175]図１６Ａ〜図１６Ｆは計器１３００を描写するが、これらの図において実施される動作は、計器１２００または同様の計器においても実施され得ることを理解するものとする。同様に、これらの図に描写される動作は、ポーチ１４００を用いて実施されるが、これらの図に描写される動作が他のポーチタイプおよび構成を用いて実施され得る限りにおいてこれは単に例にすぎない。
【０１４５】
[00176]これより図１７を参照すると、加熱器組立体１７００の代替的な実施形態が例証される。図１２Ｂおよび図１３Ｂの計器１２００および１３００は、２つの加熱器要素を有する加熱器組立体１２７０および１３３５を描写するが、加熱器組立体１７００は、ハウジング１７３５内に収容される３つの加熱器要素１７１０、１７２０、および１７３０を含む。１つの実施形態において、加熱器１７１０および１７３０は、同じ温度（例えば、約９０℃〜１１０℃の範囲内の変性温度）に設定され、加熱器１７２０は、例示的にはアニーリングのために中間の温度（例えば約５５℃〜約６５℃）に設定され得る。１つの実施形態において、ブリスタ（例えば図１４のブリスタ１４１０またはアレイ１４３０）の流体内容物の熱サイクルは、３つすべての加熱器を使用し得る。例えば、熱サイクルされることになるブリスタは、変性のために加熱器１７１０で開始され得、次いで加熱器組立体１７００が、ブリスタがアニーリングのために加熱器１７２０の温度制御下にあり得るように移動され得、次いで加熱器組立体１７００は、ブリスタが延伸／変性のために加熱器１７３０の温度制御下にあるように移動され得、次いでこのプロセスは、反対方向に移動する加熱器組立体により繰り返され得る。２つではなく３つの加熱器を用いた熱サイクルは、例えば、より良好な温度均一性を提供し、先端におけるブリスタの部分が所与の温度にある時間が少ないいわゆる「エッジ効果」を低減させる。加熱器組立体１７００が変性からアニーリングへ、また変性への遷移を各方向において可能にするため、ブリスタのすべての部分が所与の温度へのより均等な曝露を受けると考えられる。別の実施形態において、３つの加熱器は、３つの異なる温度、例示的には、アニーリング温度、延伸温度、および変性温度に設定され得る。
【０１４６】
[00177]加熱器１７１０、１７２０、および１７３０は、ペルチェ素子、抵抗加熱器、誘導加熱器、電磁加熱器、薄膜加熱器、印刷素子加熱器、正温度係数加熱器、または当該技術分野において知られているような任意の他の加熱器であり得る。１つの実施形態において、加熱器１７２０は、ペルチェ素子を含み得る。加熱器１２８６および１２８７を参照して上に論じられるように、加熱器１７２０は熱サイクルされない場合があるが、例えば、ペルチェ素子を含むことが望ましい場合がある。典型的な抵抗加熱器とは異なり、ペルチェ素子は、試料をアクティブに冷却ならびに加熱することができる。別の実施形態において、加熱器１７１０または１７３０のうちのいずれか一方または両方がまた、ペルチェ素子を含み得る。例えば、加熱器１７１０または１７３０のうちの一方または両方は、限定されるものではないが、ペルチェ素子によって提供される細かい温度制御およびアクティブな冷却から恩恵を受け得る、加熱された／冷却された試料調製、ホットスタート、および同様のものなどのステップに参加するために位置付けられ得る。例示的には、絶縁スペーサ１７１５および１７２５が、加熱器１７１０と１７２０との間および１７２０と１７３０との間にそれぞれ提供され得る。泡沫、プラスチック、ゴム、空気、真空、ガラス、または例示的には低伝導の任意の他の好適な材料を含む、任意の好適な絶縁材料が使用され得る。加熱器１７１０、１７２０、および１７３０が全体的に一定温度に保持される実施形態において、ランタイムおよびエネルギー使用は、実質的に減少され得る。
【０１４７】
[00178]再び図１４Ａを参照すると、ポーチを充填し、試料を調製し、第１段階ＰＣＲを実施し、第２段階ＰＣＲを実施するための２つの代替的な手順が説明される。第１の方法において、試料調製および第１段階ＰＣＲは、別個のブリスタ内で実施される。これは、本明細書では「３ゾーン法」と称される。第１のステップでは、試料は、充填チャネル１４４０を介してブリスタ１４０５内へ注入される。１つの実施形態において、細胞、ウイルス、および同様のものは、本明細書内の他の場所に詳細に説明されるワイピングシステムを使用してブリスタ１４０５内で溶解される。代替的に、細胞溶解は、限定されるものではないが、超音波処理デバイスもしくはビードビーターなどの代替的な溶解デバイスを用いて、または化学的溶解によって達成され得る。溶解は、本明細書内の他の場所に詳細に説明される加熱器組立体の１つまたは複数の加熱器要素を用いて試料を加熱すること（例えば約７０〜９０℃）によって助けられ得る。溶解に続いて、試料は、磁気ビーズに結合することを助けるために熱電冷却器要素（すなわち、ペルチェ素子）を用いて約０℃〜約２０℃（例えば約１０〜１５℃）の範囲内の温度まで冷却され得る。他の冷却器要素は、限定されるものではないが、流体またはガス加熱交換要素、ファン冷却ヒートシンク、ヒートパイプ、凝縮ユニット、および同様のものを含む。
【０１４８】
[00179]磁気ビーズは、溶解物から核酸を回収するために充填チャネル１４４０を介してブリスタ１４０５内に注入され得、それは、溶解の前または溶解の後であり得る。例示的には、磁気ビーズおよび溶解物は、冷やして混合され得る（例えば約０〜１０℃の範囲内、例示的には加熱器のうちの１つの温度を調節することによって）。磁気ビーズおよび溶解物が、十分な時間にわたって完全に混合されると、磁気ビーズは、例示的には計器内に提供される磁石を用いてブリスタ１４０５内に集められ得、廃溶解物が、チャネル１４４５を介して廃液へと送られ得る。次いで、洗浄緩衝液が充填チャネル１４４０を介して注入され得る。洗浄緩衝液および磁気ビーズは、冷やして混合され得る（例えば約０〜１０℃の範囲内）。磁気ビーズは再び集められ得、廃洗浄緩衝液は、チャネル１４４５を介して廃液へと洗い流され得る。洗浄サイクルは、少なくともさらに１回繰り返され得る。洗浄に続いて、溶出緩衝液（＋第１段階ＰＣＲプライマー）が、充填チャネル１４４０を介してブリスタ１４０５内へ注入され得る。溶出緩衝液（＋第１段階ＰＣＲプライマー）および磁気ビーズは、例示的には１つまたは複数の加熱器の制御下で、温めて混合され得る（例えば約７０〜９０℃で）。
【０１４９】
[00180]第１段階ＰＣＲでは、ＰＣＲマスターミックス（例えば、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、および当該技術分野において知られている他の増幅成分）が、充填チャネル１４５０を介してブリスタ１４１０内へ注入され得る。ＰＣＲマスターミックスは、磁気ビーズからの溶出物の導入の前に、（例えば約５７℃まで）加熱され得る。ブリスタ１４０５内では、磁気ビーズが再び集められ得、溶出物は、チャネル１４６５を介してブリスタ１４１０に送られ得る。
【０１５０】
[00181]第１段階ＰＣＲは、本明細書内の他の場所に詳細に説明されるようにブリスタ１４１０が２つの加熱器の温度制御下にある状態での回転移動によりブリスタ１４１０内で実施され得る。代替的に、第１段階ＰＣＲ熱サイクルは、ブリスタ１４１０が１つの加熱器および次いで別の加熱器の制御下にあり得るように加熱器組立体またはポーチ１４００を移動させることによって実施され得る。ブリスタ１４１０を出入りするチャネルは、第１段階ＰＣＲの間、例示的にはハードシールにより閉じられる。いくつかの実施形態において、容積低減プロトコルを用いることによって、ポーチ内の第１段階ＰＣＲを速めることが可能な場合がある。例えば、容積低減プロトコルは、ブリスタ１４１０内の初期の容積（例えば約１００μＬ）を用いていくつかのＰＣＲサイクル（例えば５〜１０回）を実施し、ブリスタ１４１０の容積のおよそ半分をパージし、さらにいくつかのＰＣＲサイクル（例えば５〜１０回）を実施し、ブリスタ１４１０の容積のおよそ半分を再度パージすることを含み得る。液体の容積が小さいほど、熱質量は少なくなり、より大きい容積よりも素早く熱サイクルされ得るため、容積低減によりＰＣＲ反応のサイクル時間を減少させることができる。
【０１５１】
[00182]十分な回数の第１段階ＰＣＲサイクル（例えば２０〜３０サイクル）に続いて、第１段階ＰＣＲの少量の試料（例えば約１〜５μｌ）が希釈ウェル１４１５に送られ得る。チャネル１４７０は開放され得、チャネル１４７５〜１４８５は閉じられる。第２段階ＰＣＲのための試料は、チャネル１４６０を介して第２段階ＰＣＲマスターミックスをブリスタ１４２５内へ注入することによって調製され得る。シールは、チャネル１４７０および１４８５において閉じられ、シールは、チャネル１４７５および１４８０において開放される。ブリスタ１４２０および１４２５ならびにウェル１４１５は、加熱され得る。ウェル１４１５内の試料は、第２段階ＰＣＲのために第１段階ＰＣＲ生成物を希釈するために、ブリスタ１４２５および１４２０とウェル１４１５との間で混合することによってマスターミックスと混合され得る。次いで、第２段階ＰＣＲミックスが第２段階ＰＣＲアレイ１４３０内へ移送され得るように、チャネル１４８５が開放される。別の実施形態において、ポーチ１４００は、ウェル１４１５ならびにブリスタ１４２５および１４２０から下流かつアレイ１４３０から上流に１つまたは複数の追加の希釈ウェルと、混合ブリスタのセットとを含み得る。例えば、濃縮された第１段階ＰＣＲプライマーまたは高濃縮生成物を用いるいくつかの実施形態においては、１つの希釈ウェルを用いて達成できるものよりも高い度合いまで第１段階プライマーおよび生成物を希釈することが望ましい場合がある。第２段階ＰＣＲのための混合物は、第２段階ＰＣＲアレイ１４３０内への注入の前に、物理的な「ホットスタート」のために加熱され得る。アレイ１４３０内での第２段階ＰＣＲのための熱サイクルは、例示的には、先に説明されるように加熱器組立体を前後に移動させることによって達成され得る。
【０１５２】
[00183]第２の方法において、試料調製および第１段階ＰＣＲは、同じブリスタ内で実施される。これは、本明細書では「２ゾーン法」と称される。第１のステップでは、試料は、充填チャネル１４５０を介してブリスタ１４１０内へ注入され得る。１つの実施形態において、細胞、ウイルス、および同様のものは、本明細書内の他の場所に詳細に説明されるワイピングシステムを使用してブリスタ１４１０内で溶解される。代替的に、細胞溶解は、限定されるものではないが、超音波処理デバイスもしくはビードビーターなどの代替的な溶解デバイス、または化学的溶解によって達成され得る。溶解は、本明細書内の他の場所に詳細に説明される加熱器組立体の１つまたは複数の加熱器要素を用いて試料を昇温度に加熱すること（例えば約７０〜９０℃）によって助けられ得る。溶解に続いて、試料は、任意選択的に、熱電冷却器要素（すなわち、ペルチェ素子）を用いて、下降温度（例えば、制限されるものではないが約０〜１０℃などの周囲温度未満の温度）まで冷却され得る。
【０１５３】
[00184]磁気ビーズは、溶解物から核酸を回収するために充填チャネル１４５０を介してブリスタ１４１０内へ注入され得る。磁気ビーズは、充填チャネル１４５０を介してブリスタ１４１０内へ注入される。磁気ビーズおよび溶解物は、冷やして混合され得る（例えば約０〜１０℃の範囲内の温度）。磁気ビーズおよび溶解物が、十分な時間にわたって完全に混合されると、磁気ビーズは、磁石を用いてブリスタ１４１０内に集められ得、廃溶解物が、チャネル１４６５を介してブリスタ１４０５（すなわち、この例では、廃液ブリスタ）廃液へと送られ得る。次いで、洗浄緩衝液が充填チャネル１４５０を介してブリスタ１４１０内に注入され得る。洗浄緩衝液および磁気ビーズは、冷やして混合され得る（例えば約０〜１０℃の範囲内の温度）。磁気ビーズは再び集められ得、廃洗浄緩衝液は、ブリスタ１４０５へと洗い流され得る。洗浄サイクルは、所望の場合、１回または複数回繰り返され得る。磁気ビーズは、ブリスタ１４１０の上流半体内へと収集され、チャネル１４６５を介して廃物ブリスタ１４０５へと送られ得る。
【０１５４】
[00185]第１段階ＰＣＲでは、ワイパシステムが設定され得、溶出緩衝液（＋プライマー）は、チャネル１４５０内へ注入され得、昇温度（例えば約５７℃）に保持され得る。同時に、第１段階ＰＣＲマスターミックスが、チャネル１４５５内へ注入され、真のホットスタートが所望され得る場合には、任意選択的に、昇温度（例えば約５７℃）に保持され得る。第１段階ＰＣＲマスターミックスは、ブリスタ１４１０内でプライマーおよびテンプレートと混合され得、第１段階ＰＣＲが上に説明されるように実施され得る。
【０１５５】
[00186]第１段階ＰＣＲに続いて、磁気ビーズが集められ、希釈が所望される実施形態においては、第１段階ＰＣＲ生成物の少量の試料（例えば１〜５μｌ）が、希釈ウェル１４１５内へ移送され得る。チャネル１４７０は開放され、チャネル１４７５〜１４８５は閉じられる。第２段階ＰＣＲのための試料は、チャネル１４６０を介して第２段階ＰＣＲマスターミックスをブリスタ１４２５内へ注入することによって調製され得る。シールは、チャネル１４７０および１４８５において閉じられ、シールは、チャネル１４７５および１４８０において開放される。ブリスタ１４２０および１４２５ならびにウェル１４１５は加熱される。ウェル１４１５内の試料は、第２段階ＰＣＲのために第１段階ＰＣＲ生成物を希釈するために、ブリスタ１４２５および１４２０とウェル１４１５との間で混合することによってマスターミックスと混合され得る。次いで、第２段階ＰＣＲミックスが第２段階ＰＣＲアレイ１４３０内へ移送され得るように、チャネル１４８５が開放される。アレイ１４３０内での第２段階ＰＣＲのための熱サイクルは、ペルチェの使用により、または先に説明されるような他の手段により、加熱器組立体を移動させることによって達成され得る。
【０１５６】
[00187]蛍光検出が所望される場合、光学アレイ（例えば図１２Ａおよび図１３Ａのカメラシステム１２５０および１３２５を参照されたい）が提供され得る。光学アレイは、光源、例示的にはフィルタ処理したＬＥＤ光源、フィルタ処理した白色光、または照射と、カメラとを含み得る。カメラは、例示的には複数の光検出器を有し、その各々がポーチ１４００のアレイ１４３０内の第２段階ウェルに対応する。代替的に、カメラは、第２段階ウェルのすべてを含む画像を撮影し得、画像は、第２段階ウェルの各々に対応する別個の区域に分割され得る。構成によっては、光学アレイは、静止状態にあり得るか、または光学アレイは、１つまたは複数のモータに取り付けられた移動部上に置かれ、各個別の第２段階ウェルからシグナルを獲得するために移動され得る。他の配置が可能であることが理解される。
【実施例１】
【０１５７】
[00188]高密度ＰＣＲ
[00189]１つの例では、一般的な呼吸器ウイルスのための標準的な市販の免疫蛍光アッセイは、アデノウイルス、ＰＩＶ１、ＰＩＶ２、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、インフルエンザＡ、およびインフルエンザＢの７つのウイルスを検出できることが知られている。より完全なパネルは、例示的には、コロナウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ライノウイルス、および非ＨＲＶエンテロウイルスなどの他のウイルスのためのアッセイを含む。アデノウイルスまたはＨＲＶなどの多様性の高いウイルスについては、ウイルスの種族の枝のすべてを標的にするために複数のプライマーを使用することが望ましい（例示的には、それぞれ４つのアウタープライマーおよび４つのインナープライマーのセット）。コロナウイルスなどの他のウイルスについては、季節によって異なることのない４つの明白な種族（２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１）が存在するが、それらは、別個のプライマーセットが必要とされるほどに十分に分岐している。ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｐａｎｅｌ（ＢｉｏＦｉｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ  ｏｆ  Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、ＵＴ）は、アデノウイルス、コロナウイルスＨＫＵ１、コロナウイルスＮＬ６３、コロナウイルス２２９Ｅ、コロナウイルスＯＣ４３、ヒトメタニューモウイルス、ヒトライノウイルス／エンテロウイルス、インフルエンザＡ、インフルエンザＡ／Ｈ１、インフルエンザＡ／Ｈ３、インフルエンザＡ／Ｈ１−２００９、インフルエンザＢ、パラインフルエンザウイルス１、パラインフルエンザウイルス２、パラインフルエンザウイルス３、パラインフルエンザウイルス４、および呼吸器合胞体ウイルスを含む。これらのウイルスに加えて、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｐａｎｅｌは、百日咳菌、クラミドフィラニューモニエ、およびマイコプラズマニューモニエの３つの細菌を含む。高密度アレイ５８１は、単一のポーチ５１０内にそのようなパネルを収納することを可能にする。他のパネルが、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）に利用可能であり、各々が少なくとも２０の病原体をアッセイする。
【実施例２】
【０１５８】
[00190]高速ＰＣＲ
[00191]ＤＮＡを増幅するために、図６〜図８のポーチおよび加熱器構成を使用したプロトタイプ計器を使用した。１１０ｂｐ合成ＤＮＡ分子の１０，０００個の複製、ならびに１０倍高いプライマー（各プライマー５μΜ）およびＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ）濃度（すでに参照により組み込まれているＵＳ２０１５−０１１８７１５において教示されるような標準ＰＣＲ濃度と比較して）を、０．４５ｍＭのｄＮＴＰｓ、および５ｍＭ  Ｍｇ＋＋と共に含む７５μｌ試料。検出のためにＩＸ  ＬＣＧｒｅｅｎを使用した。反応混合物は例示にすぎないことが理解される。サイクル時間によっては、高められたプライマーおよびポリメラーゼ濃度が有益であり得る。高められたプライマーおよびポリメラーゼ濃度に関するさらなる情報については、すでに参照により組み込まれている米国特許出願第２０１５−０１１８７１５号を参照されたい。例えば、２０秒未満のサイクル時間の場合、少なくとも０．５μΜポリメラーゼと、多重反応においては各プライマー少なくとも１μΜまたはシングルプレックス反応においては各プライマー２μΜとを有することが望ましい。加熱器９８６は９０℃に設定し、加熱器９８７は５７℃に設定した。この混合物を、ブリスタ５４９内へ密封し、１０秒につき１回のフル回転の速度で回転するワイパ９８９を用いて実行した。回転速度はサイクル時間に対応することが理解される。
【０１５９】
[00192]対照群として、ＰＣＲ化学反応物（プライマーおよびポリメラーゼ濃度の上昇を伴う）を、ハードウェアが許す限り速く（サイクル当たり４８秒、１秒保持）、９６℃〜６０℃の間で標準的なブロック熱サイクラ内でサイクルした。２つのシステムについて増幅の効率を比較するために、同一のＰＣＲ反応物を、５、１０、１５、および２０サイクルの「サイクルコース」にわたって各計器内で増幅した。第１段階ＰＣＲの後、これらの反応物を１００倍希釈してネステッド第２段階ＰＣＲ反応物にし、Ｒｏｃｈｅ  ＬＣ４８０リアルタイムＰＣＲ計器内で増幅した。
【０１６０】
[00193]図１９〜図２０は、図６〜図８のプロトタイプ計器におけるＰＣＲの結果を示す。図１９において、異なる速度でのワイパシステムにおける第１段階反応物の融解曲線が、ＬＣ４８０内での増幅の融解曲線と比較される。図２０は、サイクルコースの結果を示す。図６〜図８のプロトタイプにおける増幅およびＬＣ４８０ブロック熱サイクラにおける増幅は重複し、Ｒ２値＞０．９９を有する線によりフィッティングされる。図２０では、これらの線の傾斜は、プロトタイプにおける１つのサイクルと比較してＬＣ４８０における１つのサイクルの相対的な効率を示す。ブロックサイクラの効率（１．０８の傾斜）は、およそ３分２０秒では、ブロック熱サイクラの完全効率よりわずかに低いことを示すワイパブレードシステムの効率（０．９３）よりもわずかに高い。
【実施例３】
【０１６１】
[00194]２つの温度ゾーンを使用した３温度ＰＣＲ
[00195]上に論じられるように、いくつかのＰＣＲプロトコルは、アニーリングのための第１の温度、例示的には酵素活性に基づいて選択される伸長のためのいくらかより高い温度、および変性のための第３の最も高い温度という３つの温度を使用する。図１８は、３つの加熱器９３０、９３１、９３２を使用する実施形態を示すが、いくつかの実施形態においては、より大きな容積を素早く熱サイクルさせることが望ましい場合がある。例示的には、３つの温度によって第１段階ＰＣＲを熱サイクルさせることが望ましい場合があり、ここでは加熱器組立体９８８などの加熱器は、所望するほど迅速にはブリスタ５６４の内容物を加熱および冷却することができない場合がある。
【０１６２】
[00196]１つのそのような実施形態において、図１のポーチ５１０内での第１段階ＰＣＲにおいて３ステップＰＣＲプロトコルを使用することが望ましい場合がある。上に論じられるように、図２の第１段階加熱器８８６は、第１段階ＰＣＲのためにブリスタ５６４の内容物を加熱および冷却するように位置付けられる。１つの実施形態において、加熱器８８７は、ブリスタ５４８の内容物の温度を制御するために提供され得、ここで加熱器８８６および８８７は、一緒に制御されかつ一緒にサイクルする。別の実施形態において、加熱器８８６および８８７は、別個の制御下にあり得、例示的には、加熱器８８７は好適なアニーリング温度を維持するために提供され得る一方、ブリスタ８８６は、好適な変性温度を維持するために提供され得るが、これは例示にすぎず、これらの加熱器は逆転され得ることが理解される。他の構成が可能である。２つの加熱ゾーンを使用した２温度ＰＣＲは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１４−００３８２７２号により詳細に論じられる。
【０１６３】
[00197]１つの実施形態において、ペルチェ加熱器または参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１５／０９９，７２１号に開示されるものなどの加熱器が、加熱器８８７、８８８および本明細書に論じられる他の加熱器に使用され得るが、当該技術分野において知られているような他の加熱器または加熱器組立体が、これらの加熱器の温度が調節可能であることを条件として、２つの温度ゾーン内での３温度サイクルを獲得するために使用され得る。１つの実施形態において、これらの加熱器のアクティブな制御が望ましい。
【０１６４】
[00198]１つの例は図２１に例証され、ここでは点線は試料の温度を示す。この実施例においては、加熱器８８７がアニーリング温度のために使用され得る場合、加熱器８８７の温度は、所望のアニーリング温度、例示的には６０℃に設定され得るが、この温度は例示にすぎず、プライマーの長さおよびＧＣ内容物に応じて他のアニーリング温度が使用され得ることが理解される。試料がブリスタ５４８内へ移動されると、試料全体がアニーリング温度に達するまで、試料はブリスタ５４８内に保持され得る。いくつかの例示的なプロトコルにおいては、試料がアニーリング温度に達した後ある時間期間にわたって試料をブリスタ５４８内に保持することが望ましい場合がある。別の例示的な実施形態において、破線により図２１に例証されるように、加熱器８８７は、アニーリング温度より数度低い温度、例示的にはアニーリング温度より２〜２０度低い温度（「低アニーリング温度」）、例示的には５５℃に保持され得るが、他の温度が好適であり得る。試料が、加熱器８８６の制御下にありかつアニーリング温度より実質的に熱いブリスタ５６４から移動されると、加熱器８８７はアニーリング温度未満であるため、試料は、より素早くアニーリング温度まで冷却され得る。任意選択的に、内袋８４８の移動が、ブリスタ５４８内の流体試料を混合して、ブリスタ５４８内のより均一な温度を獲得し得る。試料流体が、流体の実質的にすべてがアニーリング温度にあるか、またはアニーリング温度近くにある時間の長さにわたってブリスタ５４８内に存在した後、加熱器８８７は、図２１内の破線（−−−）によって示されるように、アニーリング温度に調節され得る。例示的には２秒〜５秒間の保持が、適切なアニーリングを可能にし得るが、使用される化学作用によっては、保持は不必要な場合がある。次いで、試料はブリスタ５６４に移動され得る。試料がブリスタ５４８を出ると、図２１に示されるように、次いで加熱器８８７の温度は、次のサイクルの準備のために低アニーリング温度に調節して戻され得る。多くの加熱器は加熱よりも冷却により多くの時間を要し、またブリスタ５４６が空でありかつ加熱器８８７に対する熱負荷が最小限であるときには、加熱器８８７を冷却する方が速い場合があることが理解される。
【０１６５】
[00199]１つの例では、好適な伸長温度は、例示的には７２℃が選択されるが、像副産物長、ＧＣ内容物、およびポリメラーゼの選択によっては他の伸長温度が好適であり得る。図２１内の実線（―）によって示されるように、試料が依然としてブリスタ５４８内にある間に、加熱器８８６は、伸長温度より数度高い温度、例示的には伸長温度より２〜１０度高い温度（「高伸長温度」）に調節され得る。試料流体が、流体の実質的にすべてが伸長温度にあるか、または伸長温度近くにある時間の長さにわたってブリスタ５６４内に存在した後、加熱器８８７は、図２１内の実線によって示されるように、高伸長温度から伸長温度に調節され得る。ブリスタ５４８に関して上に論じられるように、内袋８６４の任意選択的な移動が、ブリスタ５６４内の流体試料を混合して、ブリスタ５６４内のより均一な温度を獲得し得る。例示的には０秒〜５秒の保持が、プロトコルに応じて適切な伸長を可能にし得る。この保持の後、次いで加熱器８８６は、核酸を変性させるために、変性温度に、または変性温度より数度高く調節され得る。加熱器８８６が変性温度より高い温度に調節される場合、流体試料はより素早く変性に達し得ることが理解される。ここでも、内袋８６４の任意選択的な移動が、ブリスタ５６４内の流体試料を混合して、ブリスタ５６４内のより均一な温度を獲得し得る。任意選択的に変性温度での保持ありまたはなしで試料が変性された後、試料は、ブリスタ５４８へと戻るように移動され得、加熱器８８６の温度は、ブリスタ５６４内に試料がないと獲得するのがより効率的であり得る高伸長温度に調節され得、このサイクルは、増幅のために十分な回数繰り返される。これが第１段階ＰＣＲである場合、減少された回数のサイクル、つまり標的の富化には十分なサイクル数が望ましい場合がある一方、これが第２段階または単一段階である場合、プラトー相に至るまで熱サイクルするか、プラトー相を過ぎることを望む場合があるということが理解される。
【０１６６】
[00200]３温度サイクルは、標準的なＰＣＲサイクルプロトコルにおいて、例示的にはサイクル当たり２０秒以上の長さで、標準的なＰＣＲ化学作用を使用して実施され得る。所望の場合、ポリメラーゼまたはプライマーの高められた濃度を使用したエクストリームＰＣＲ化学作用が追加され得、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１５−０１１８７１５号に開示されるように、より高速な熱サイクルプロトコルが使用され得る。ポリメラーゼまたはプライマーの高められた濃度は、サイクル時間が減少されない限り、増大されたプライマーダイマーおよび他の非特異性の増幅生成物の形成を結果としてもたらし得ること、また、使用されるポリメラーゼまたはプライマーの濃度が高いほど、サイクル時間はより速くなり、ここではポリメラーゼおよびプライマーはサイクル時間のおよそ比例した減少に伴って増大され得ることが理解される。１０秒以下のサイクル時間が可能なはずである。
【実施例４】
【０１６７】
[00201]高速多重ＰＣＲ
[00202]図６〜図８のものと類似したポーチおよび加熱器構成を使用したプロトタイプ計器を、試料内のＤＮＡの多重増幅のために使用した。テンプレートは、天然および合成テンプレートの混合であった。このテンプレートは、１０５ｂｐの長さを有する合成増幅産物（内部的に「メフィスト」と称される）、１６４ｂｐの長さを有する合成増幅産物（内部的に「Ｂａａｌ３」と称される）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ配列（天然、増幅産物長３６４ｂｐ、内部的には「ビール」と称される）、Ｍ１３（天然、増幅産物長２６４ｂｐ）、およびＭＳ２（天然、増幅産物長３０９ｂｐ）であった。各テンプレートの１０００個の複製、各テンプレートに固有の順方向および逆方向プライマー（各プライマー５μΜ）、ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ）、０．４５ｍＭのｄＮＴＰｓ、および５ｍＭ  Ｍｇ＋＋を含む１５０μｌおよび７５μｌ試料を調製した。検出のためにＩＸ  ＬＣＧｒｅｅｎを使用した。反応混合物は例示にすぎず、他の混合が使用され得ることが理解される。これらの混合物を１５０μｌおよび７５μｌアリコート内でブリスタ（例えばブリスタ５４９）内に密封した。１５０μｌ反応物については、第１の加熱器（例えば加熱器９８６）を１０３℃に設定し、第２の加熱器（例えば加熱器９８７）を５５℃に設定した。７５μｌ反応物については、第１の加熱器（例えば加熱器９８６）を１０２℃に設定し、第２の加熱器（例えば加熱器９８７）を５５℃に設定した。これらの反応物を、例えば、ブリスタと接触状態にあるワイパブレード９４９と、８秒ごとに１回のフル回転の速度（例えば、１８０°の回転、４秒間保持、１８０°回転、４秒間保持など、または９０°回転、２秒間保持、９０°回転、２秒間保持などのサイクルであり、回転時間はごくわずかであった）で回転するワイパヘッド９８９とを用いた図６〜図８に説明される手順に従って熱サイクルさせた。回転速度はサイクル時間に対応し、各フル回転が１つのサイクルを表していることが理解される。また、各４分の１回転後の保持がこの例では使用されるが、そのようなものは例示にすぎず、連続回転が企図される。第１段階ＰＣＲの後、これらの反応物を１００倍希釈してネステッド第２段階ＰＣＲ反応物にし、Ｒｏｃｈｅ  ＬＣ４８０リアルタイムＰＣＲ計器内で増幅した。
【０１６８】
[00203]図２２は、第２段階ＰＣＲにおける融解実験の結果を示し、第１段階ＰＣＲ反応のすべてが成功であったことを示している。テンプレートのすべてを、第１段階ＰＣＲおよび第２段階ＰＣＲにおいて増幅し、生成物のすべてがそれらの予期される温度で融解した。これは、プロトタイプシステムを多重第１段階ＰＣＲに使用できることを実証する。
【実施例５】
【０１６９】
[00204]高速ＰＣＲ
[00205]この実施例では、標準的なＰＣＲプロトコルに従って、合成ＤＮＡテンプレート（メフィスト）を、第１段階ＰＣＲのためにＬＣ４８０計器内で増幅した。第１段階反応からの増幅生成物を、第２段階増幅混合物（例えば、固有の順方向および逆方向プライマー（各プライマー５μΜ）、ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ）、０．４５ｍＭのｄＮＴＰｓ、５ｍＭ  Ｍｇ＋＋、および検出のためのＩＸ  ＬＣＧｒｅｅｎ色素）と１：１００で希釈し、図１４Ａのアレイ１４３０または図１５Ａのアレイ１５００に類似した５ウェルアレイ内へ注入した。アレイの各ウェルの容積はおよそ０．５μＬである。この試料を、第２段階ＰＣＲのために、図１２Ａ〜図１３Ｂに示される計器に類似したプロトタイプ計器内で熱サイクルさせた。９６℃に設定した第１の加熱器および６０℃に設定した第２の加熱器を有する加熱器組立体１２７０および１３３５に類似した２つの要素加熱器を用いてアレイを熱サイクルさせた。図１６Ａ〜図１６Ｆを参照して、具体的には図１６Ｅおよび図１６Ｆを参照して論じられる手順に従って、このアレイ上で第２段階ＰＣＲを実行した。第２段階ＰＣＲ試料を有するアレイを、８秒／サイクル（９６℃で４秒、６０℃で４秒など）で４０サイクルにわたり熱サイクルさせた。
【０１７０】
[00206]図２３および図２４は、第２段階ＰＣＲ反応の結果を例証する。図２３は、サイクル数の関数としての、アレイのウェルの各々における蛍光の変化を示し、図２４は、アレイのウェルの各々におけるＤＮＡ生成物（存在する場合）の融解曲線を示す。図２３および図２４は、反応がアレイのウェル１で最も成功したこと（図２３）、および生成物がメフィスト生成物の予期される温度で融解転移を有したこと（図２４）を示す。この実施例は、加熱器組立体をアレイに対して移動させることによってアレイを温度から温度へ遷移させる加熱器を有する２つの温度加熱器ユニットによって、第２段階ＰＣＲを満足に実行することができることを例証する。熱サイクルはまた、アレイを加熱器要素に対して移動させることによって、例えば、試料容器または試料容器を計器内に位置付ける受け口を横方向に移動させることによって達成され得ることが理解されるものとする。
【実施例６】
【０１７１】
[00207]高速第１段階および第２段階ＰＣＲ
[00208]この実施例では、合成ＤＮＡテンプレート（メフィスト）を、第１段階ＰＣＲおよび第２段階ＰＣＲのために、図１４Ａに例証されるポーチ１４００に類似した反応容器内で増幅した。第１段階ＰＣＲについては、テンプレートＤＮＡの約７５，０００個の複製、各テンプレートに固有の順方向および逆方向プライマー（各プライマー５μΜ）、ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ）、０．４５ｍＭのｄＮＴＰｓ、および５ｍＭ  Ｍｇ＋＋を混ぜ合わせて、第１段階ＰＣＲ反応のために７５μＬをブリスタ（例えばブリスタ１４１０）内へ注入して密封した。ＰＣＲ増幅のために反応容器を計器１３００に類似した計器内に置いた。
【０１７２】
[00209]第１段階ＰＣＲについては、第１の加熱器（例えば加熱器１３８７）を５８℃に設定し、第２の加熱器（例えば加熱器１３８６）を１０６℃に設定した。加熱器組立体（例えば加熱器組立体１３３５）を、反応ブリスタのおよそ半分の温度が第１の加熱器によって制御され得、残部の温度が第２の加熱器によって制御され得るように位置付けた。反応ブリスタの内容物を、例えば、ブリスタと接触状態にあるワイパブレード（例えばワイパブレード１１４９）と、８秒のサイクル時間（例えば９０°の回転、２秒間保持、９０°回転、２秒間保持などのサイクル）で回転するワイパヘッド（例えばワイパヘッド１１００）とを用いた図６〜図８に説明される手順に従って、計器内で熱サイクルさせた。回転速度はサイクル時間に対応し、１つのフル回転が１つのサイクルに匹敵することが理解される。
【０１７３】
[00210]第１段階ＰＣＲ反応ブリスタ（例えばブリスタ１４１０）内での２０サイクルの第１段階ＰＣＲに続いて、第１段階ＰＣＲ反応物の一部分（例えば約１μＬ）を容積測定ウェル（例えば容積測定ウェル１４１５）へ移動させ、第２段階ＰＣＲ試薬（ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ）、０．４５ｍＭのｄＮＴＰｓ、２ｍＭ  Ｍｇ＋＋、および検出のためのＩＸ  ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ）と、ポーチの２つのより大きい容積ブリスタ（例えばブリスタ１４２０および１４２５）間で混合することによって、混合した。希釈のレベルは、容積測定ウェルの容積を変更することによって、または第１段階ＰＣＲから試料に添加される希釈試薬（例示的には、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、および好適な緩衝液であるが、特に非ＰＣＲ増幅方法の場合には他の成分が好適であり得る）の容積を変更することによって、調節され得ることが理解される。所望の場合、試料および第２段階ＰＣＲマスターミックスのこの混合物は、第２段階増幅のために第２段階アレイへの移動の前に容積測定ウェル１４１５ならびにブリスタ１４２０および１４２５内で事前に加熱され得る。そのような事前加熱およびマスターミックスからのプライマーの分離は、第２段階ＰＣＲ混合物内のホットスタート成分（抗体、化学的、または別のやり方）の必要性を無くし得る。
【０１７４】
[00211]例えば、容積測定ウェル１４１５ならびにブリスタ１４２０および１４２５内での第２段階ＰＣＲのための試料の調製に続いて、試料は、第２段階ＰＣＲのためにアレイ１４３０に類似したアレイに移動され得る。アレイのウェルの各々は、特有の順方向および逆方向ＰＣＲプライマーで前処理される。プライマーは、２．５μΜまたは５μΜのいずれかでアレイのウェル内にスポッティングした。アレイのウェルは、アレイを第２段階ＰＣＲマスターミックスで充満させることによって充填される。アレイのウェルは、充填チャネルへのアクセスを封鎖するために、ヒートシールされ得、および／または透明の可撓性内袋をアレイに対して膨張させることによって密封され得る。過剰の第２段階ＰＣＲマスターミックスもまた、透明の可撓性内袋をアレイに対して膨張させることによってアレイからパージされ得る。この場合、透明の可撓性内袋を、およそ２０ｐｓｉの圧力で膨張させた。図１６Ｅおよび図１６Ｆに描写されるように、第２段階ＰＣＲのための熱サイクルは、アレイおよび個別のウェルの内容物が第２の加熱器（例えば変性のための加熱器１３８６）、次いで第１の加熱器（例えばアニーリングおよび延伸のための加熱器１３８７）、次いで第２の加熱器（再び変性のため）などの温度制御下にあるように、加熱器組立体１３３５をアレイ下で前後に移動させることによって達成され得る。この実施例では、第２の加熱器を１０２℃に設定して第２の加熱器において２秒間保持し、第１の加熱器を６５℃に設定して６秒間保持した。第２段階反応を、合計３０サイクルにわたり熱サイクルさせた。アレイ内での核酸増幅およびＤＮＡ融解を、図１３Ａおよび図１３Ｂに描写されるカメラ１３２５に類似したカメラを用いてモニタした。
【０１７５】
[00212]図２５〜図２７は、第２段階ＰＣＲ反応の結果を描写する。図２５は、サイクル数の関数としての、アレイのウェルにおける蛍光の増加を描写する。見て分かるように、ＤＮＡ増幅は、アレイのすべてのウェル内で発生した。同様に、増幅のための同様の時間コース（例えば交差点）が、ウェルの各々において観察された。図２６および図２７は、増幅されている生成物が正しい生成物であることを確実にするための融解実験の結果を描写する。図２６は、生の融解曲線であり、図２７は、融解曲線の負の一次導関数（ｄＦ／ｄｔ）を描写する。図２６および図２７に見られるように、ウェルのすべてにおける生成物は、本質的に同じ温度での融解転移を有する。ウェルのすべてについて融解転移はおよそ８４℃で発生するが、それはこの特定の合成増幅産物について予測される融解温度である。
【実施例７】
【０１７６】
[00213]第２段階ＰＣＲアレイにおける温度較正および熱サイクル速度
[00214]これより図２８〜図３１を参照すると、結果は、アレイ１４３０またはアレイ１５００に類似したアレイのウェル内の流体の温度応答を試験するために設計された一連の実験を例証するものである。実験において、小型熱電対をアレイの１つまたは複数のウェル内に挿入し、フィルム層間で密封した。熱サイクルのため、アレイに水性ＰＣＲ緩衝液を充填し、このアレイを計器１２００または１３００に類似した計器内へ挿入し、図１６Ｅおよび図１６Ｆを参照して説明されるプロトコルに従って熱サイクルに供した。これらの実験では、計器内の透明の可撓性内袋をおよそ２０ＰＳＩまでアレイに対して膨張させた。これらの実験は、高温度および低温度加熱器における異なる滞留時間でのアレイ内の流体の温度応答を示し、例証された例における滞留時間にかかわらず、加熱器の遷移時間（例えば、高温度から低温度へ、または低温度から高温度へ）は、滞留時間と比べて迅速である。これらのデータおよび図示されない他のデータは、使用者が熱サイクル、および様々なプライマーセットを有する様々なテンプレートの増幅のためにアレイ内の流体について高い標的温度および低い標的温度を容易に設定することができるように、加熱器の設定点、各温度での滞留時間、ならびにアレイおよびその中の流体の熱応答を含む温度モデルを開発するために使用されている。
【０１７７】
[00215]図２８に例証される実験において、標的終点温度は９５℃および６２℃であった。加熱器は、９８℃および６２℃に設定され、各温度ゾーンにおいて４秒の保持時間（すなわち、滞留時間）を伴った。標的終点温度は、９５℃および６２℃であった。この実験は、比較的長い保持時間を含むため、加熱器に対する設定点および標的温度は比較的互いに近い。図２８に見られるように、ウェル内の流体（約０．５μＬ）を、これらの加熱器設定点、保持時間、および本明細書の他の場所に説明される移動加熱器プロトコルを用いて、約９５℃〜約６２℃で熱サイクルさせることができた。
【０１７８】
[00216]図２９に例証される実験において、加熱器は、９７℃および６２℃に設定され、各温度ゾーンで４秒の保持時間を伴った。この実験において目指している標的終点温度は、９４℃および６２℃であった。図２９に見られるように、ウェル内の流体（約０．５μＬ）を、これらの加熱器設定点、保持時間、および移動加熱器プロトコルを用いて、約９４℃〜約６３℃で熱サイクルさせることができた。
【０１７９】
[00217]図３０に例証される実験において、加熱器は、９９℃および５６℃に設定され、各温度ゾーンで２秒の保持時間を伴った。標的終点温度は、９６℃および６１℃であった。図３０に見られるように、ウェル内の流体（約０．５μＬ）を、これらの加熱器設定点、保持時間、および移動加熱器プロトコルを用いて、約９６℃〜約６１℃で熱サイクルさせることができた。
【０１８０】
[00218]図３１に例証される実験において、加熱器は、１０８℃および５２℃に設定され、各温度ゾーンで１秒の保持時間を伴った。標的終点温度は、９５℃および６３℃であった。図３１に見られるように、ウェル内の流体（約０．５μＬ）を、１秒という短い保持期間でさえも、これらの加熱器設定点および移動加熱器プロトコルを用いて約９５℃〜約６３℃で熱サイクルさせることができた。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１５／０１１８７１５号および米国特許公開第２０１６／０２８９７３６号に説明されるように、ポリメラーゼおよびプライマー濃度が増大されるという化学作用の調節により、８秒、４秒、２秒、またはより短いサイクル時間に対応する速度でポリメラーゼ連鎖反応を進ませることができる。
【０１８１】
[00219]本発明は、その趣旨および本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で具現化されてもよい。説明された実施形態は、あらゆる点において例示にすぎず、限定的ではないと見なされるものとする。したがって、本発明の範囲は、先述の説明によってではなく添付の特許請求の範囲により示される。特定の実施形態および詳細事項は、本発明を例証する目的のために本明細書および添付の発明開示に含まれているが、当業者にとっては、本明細書に開示される方法および装置において様々な変更が添付の特許請求の範囲において規定される本発明の範囲から逸脱することなく行われ得ることは明白であるものとする。特許請求の範囲の同等性の意味および範囲内に入るすべての変更は、それらの範囲内に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月10日(2019.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第２段階反応ゾーンに流体接続された第１段階チャンバを備える試料容器を提供するステップであって、前記第２段階反応ゾーンが、複数の第２段階反応ウェルを備える、ステップと、
（ｂ）試料を前記試料容器内に導入するステップと、
（ｃ）計器を提供するステップであって、前記計器が温度制御要素を備え、前記温度制御要素は、第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンを含み、前記第１の温度ゾーンは、前記第２の温度ゾーンよりも熱い、ステップ、と、
（ｄ）前記第１段階チャンバが前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンのうちの少なくとも一方の温度制御下にあるように前記温度制御要素と前記第１段階チャンバとを整列させて、前記第１段階チャンバ内で前記試料の熱サイクルを行うステップと、
（ｅ）前記第１段階チャンバ内の前記試料の熱サイクルを行った後に、前記第１段階チャンバからの前記試料由来の生成物の少なくとも一部分を前記第２段階反応ゾーン内の前記複数の第２段階反応ウェル内へ移動させるステップと、
（ｆ）前記温度制御要素と前記第２段階反応ゾーンとを整列させて、前記第２段階反応ゾーン内で前記試料の前記一部分の熱サイクルを行うステップとを含み、
前記温度制御要素と前記第２段階反応ゾーンとを整列させて熱サイクルを行うステップは、前記第２段階反応ゾーンが前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンの温度制御下にあるように、前記温度制御要素または前記第２段階反応ゾーンの１つを繰り返し移動させることを含む、熱サイクルの方法。
【請求項２】
前記温度制御要素は、ペルチェ素子、抵抗加熱器、誘導加熱器、電磁加熱器、薄膜加熱器、印刷素子加熱器、正温度係数加熱器、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の加熱器または冷却器デバイスを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｆ）は、前記温度制御要素を前記第２段階反応ゾーンに対して繰り返し移動させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｆ）は、前記第２段階反応ゾーンを前記温度制御要素に対して繰り返し移動させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記計器は、ワイパ要素をさらに備え、ステップ（ｄ）は、前記ワイパ要素の回転運動が前記試料の第１の部分を前記第１の温度ゾーンの熱制御から前記第２の温度ゾーンの熱制御へ移動させながら、同時に前記試料の第２の部分を前記第２の温度ゾーンの熱制御から前記第１の温度ゾーンの熱制御へ移動させるように、前記ワイパ要素を前記温度制御要素および前記第１段階チャンバと整列させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試料容器は、前記第１段階チャンバに流体接続された試料調製ゾーンをさらに備え、ステップ（ｄ）の前に、前記方法は、
前記試料を前記試料調製ゾーン内に導入するステップと、
前記試料調製ゾーンを溶解装置と接触させて溶解物を生成するステップと、
前記溶解物から核酸を回収するステップと、
前記回収した核酸を前記第１段階チャンバ内へ移動させるステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記試料から核酸を回収するステップは、
前記溶解物を複数の磁気ビーズと接触させることと、
前記磁気ビーズを前記溶解物から分離するために磁石を配置することと、
前記磁気ビーズを洗浄することと、
前記磁気ビーズを前記磁石で再捕捉することと、
前記磁気ビーズを溶出緩衝液と接触させて前記核酸を前記磁気ビーズから解放することと、
前記磁気ビーズを前記磁石で再捕捉し、溶出した前記核酸を前記磁気ビーズから分離することとをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試料調製ゾーンおよび前記第１段階チャンバは、前記試料容器内の別々のチャンバである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記方法のステップ（ｆ）は、第２の核酸増幅ゾーンを、前記温度制御要素の前記第１の温度ゾーンおよび次いで前記第２の温度ゾーンと整列させて、前記第２の核酸増幅ゾーン内の前記試料を熱サイクルさせることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法の前記ステップは、２０分以下、１５分以下、または好ましくは、１０分以下で完了される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第１の核酸増幅ゾーンおよび前記第２の核酸増幅ゾーンの各熱サイクルは、８秒以下、６秒以下、または好ましくは、４秒以下で完了される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記整列させるステップを制御するように、および前記温度制御要素の温度を制御するように構成されたコンピューティングデバイスを提供するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
試料を熱サイクルさせるための計器であって、前記試料は、可撓性試料容器内に提供され、前記計器は、
前記試料の第１の部分を第１の温度へと調節するための前記可撓性試料容器の第１の部分に隣接する第１の加熱器と、
前記試料の第２の部分を前記第１の温度とは異なる第２の温度へと調節するための前記可撓性試料容器の第２の部分に隣接する第２の加熱器と、
前記試料のこれらの部分が同時に前記加熱器の各々の制御下にあるように、前記試料の前記第１の部分を前記可撓性試料容器の前記第２の部分へと移動させながら前記試料の前記第２の部分を前記可撓性試料容器の前記第１の部分へと移動させるワイパ要素とを備える、計器。
【請求項１４】
前記ワイパ要素は、前記試料を、少なくとも第１のセクションおよび第２のセクションを含む少なくとも２つの別々のセクションへと分割し、それにより、前記第１の部分が前記第１のセクションに含まれ、前記第２の部分が前記第２のセクションに含まれるようにする刃をさらに備える、請求項１３に記載の計器。
【請求項１５】
前記ワイパ要素は、前記試料の前記第１の部分が前記第１の加熱器の制御下にあり、前記試料の前記第２の部分が前記第２の加熱器の制御下にあり、前記試料の第３の部分が、前記第１の加熱器および前記第２の加熱器の制御の間の遷移にあるように、前記試料内に旋回流および渦を作る、請求項１３に記載の計器。
【請求項１６】
前記ワイパ要素は、前記試料の部分を前記試料容器の反対の部分へと繰り返し移動させて前記試料を熱サイクルさせる、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の計器。
【請求項１７】
前記試料器は、ＰＣＲのための核酸および構成要素を含む、請求項１３に記載の計器。
【請求項１８】
前記ワイパ要素は、前記可撓性試料容器を圧縮して前記試料の一部分を排出するように移動可能であり、前記ワイパ要素は、前記試料の前記一部分を排出する前には第１の速度、および前記試料の前記一部分を排出した後にはより速い第２の速度を有する、請求項１３に記載の計器。
【請求項１９】
前記ワイパ要素と前記可撓性試料容器との間に設置された圧縮可能部材をさらに備え、前記圧縮可能部材は、前記試料容器に向かって付勢される、請求項１３に記載の計器。
【請求項２０】
前記試料容器に流体接続されたアレイをさらに備え、前記アレイは、前記試料の少なくとも一部分を受容するように構成され、前記計器は、前記アレイ内の前記試料の前記一部分の温度に順次影響を与えるように移動可能である複数の加熱器をさらに備える、請求項１３に記載の計器。
【請求項２１】
試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に少なくとも第１の反応チャンバを有する可撓性試料容器を位置付けるための受け口と、
第１の加熱器要素および第２の加熱器要素を備える加熱器組立体と、
前記第１の反応チャンバが前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素のうちの少なくとも一方の温度制御下にあるように前記第１の反応チャンバを前記加熱器組立体の第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素に対して横方向に整列させるために、前記受け口、前記可撓性試料容器、または前記加熱器組立体のうちの少なくとも１つに機械的に結合された移動装置とを備え、
前記計器は、前記少なくとも１つの反応チャンバ内の流体試料を熱サイクルさせるために、前記第１の反応チャンバを前記第１の加熱器要素と、次いで第２の加熱器要素と、繰り返し整列させるように構成される、計器。
【請求項２２】
前記第１の加熱器要素は、約９０℃〜１１０℃の範囲の温度に設定され、前記第２の加熱器要素は、約５５℃〜約６５℃の範囲の温度に設定される、請求項２１に記載の計器。
【請求項２３】
前記加熱器組立体は、前記移動装置に結合され、前記移動装置は、前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素が前記第１の反応チャンバにおける制御された温度ゾーンを画定することができるように、前記加熱器組立体を前記第１の反応チャンバに対して横方向に移動させるように構成される、請求項２１に記載の計器。
【請求項２４】
前記受け口は、前記移動装置に結合され、前記移動装置は、前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素が前記第１の反応チャンバにおける制御された温度ゾーンを画定することができるように、前記受け口およびその中に位置付けられた前記可撓性試料容器を前記加熱器組立体に対して横方向に移動させるように構成される、請求項２１に記載の計器。
【請求項２５】
前記可撓性試料容器は、前記移動装置に結合され、前記移動装置は、前記第１の反応チャンバが前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素の温度制御下にあるように、前記可撓性試料容器を前記加熱器組立体に対して移動させるように構成される、請求項２１に記載の計器。
【請求項２６】
前記可撓性試料容器は、前記第１の反応チャンバから下流に第２の反応チャンバをさらに備え、前記移動装置は、前記第２の反応チャンバが前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素の温度制御下にあるように、前記第２の反応チャンバを前記加熱器組立体の前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素に対して横方向に整列させるように構成される、請求項２１に記載の計器。
【請求項２７】
前記第２の反応チャンバは、前記第１の反応チャンバに流体接続された個別の増幅ウェルのアレイを含み、前記アレイは、前記第１の反応チャンバから増幅生成物の少なくとも一部分を受容するように構成される、請求項２６に記載の計器。
【請求項２８】
前記受け口は、前記加熱器組立体の前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素が、前記受け口内に位置付けられたときに前記可撓性試料容器の１つまたは複数の部分に接触することを可能にするように位置付けられた１つまたは複数の開口部を有する実質的に平面の表面を含む、請求項２１に記載の計器。
【請求項２９】
前記加熱器組立体は、第１の加熱器要素、第２の加熱器要素、および第３の加熱器要素を含む、請求項２１に記載の計器。
【請求項３０】
前記第１の加熱器要素、前記第２の加熱器要素、および前記第３の加熱器要素は、直線的に設置される、請求項２９に記載の計器。
【請求項３１】
前記第１の加熱器要素および前記第３の加熱器要素は、約９０℃〜１１０℃の範囲の温度に設定され、前記第２の加熱器要素は、約５５℃〜約６５℃の温度に設定される、請求項３０に記載の計器。
【請求項３２】
可撓性試料容器を中に受容するための受け口であって、前記可撓性試料容器が、熱サイクルされることになる試料を中に含む第１段階チャンバを有する、受け口と、
前記可撓性試料容器の第１の側面に位置付けられた、少なくとも第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンを含む加熱器要素と、
前記試料容器の第２の側面に位置付けられたワイパ要素であって、前記試料を少なくとも第１の部分および第２の部分に分割するために前記第１段階チャンバに接触するように構成される、ワイパ要素とを備え、
前記受け口、前記加熱器要素、前記ワイパ要素、または前記可撓性試料容器のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第１段階チャンバを前記ワイパ要素ならびに前記加熱器要素の前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンに対して整列させ、
前記ワイパ要素は、前記試料の前記第１の部分を前記第２の部分へ移動させながら前記試料の前記第２の部分を前記第１の部分へ移動させて、それにより前記第１の部分および前記第２の部分が前記加熱器要素の前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンの温度制御下にあるようにするために前記第１段階チャンバに隣接して回転するように構成される、熱サイクルシステム。
【請求項３３】
前記可撓性試料容器は、試料調製ゾーンを含み、前記試料調製ゾーンは、前記第１段階チャンバからの上流のうちの１つであるか、または前記試料調製ゾーンおよび前記第１段階チャンバは、単一のゾーンを含む、請求項３２に記載の熱サイクルシステム。
【請求項３４】
前記ワイパ要素は、前記試料を前記試料調製ゾーン内で混合するために前記試料容器に接触するように構成される、請求項３３に記載の熱サイクルシステム。
【請求項３５】
前記ワイパ要素および前記加熱器要素は、試料調製を行うように共同して働き、また核酸増幅を行うように共同して働く、請求項３４に記載の熱サイクルシステム。
【請求項３６】
前記ワイパ要素は、前記試料内の細胞を溶解するために前記試料内に旋回流、渦、およびキャビテーション気泡のうちの１つまたは複数を作る、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の熱サイクルシステム。
【請求項３７】
前記第１段階チャンバは、細胞溶解を高めるために研磨要素を含む、請求項３２に記載の熱サイクルシステム。
【請求項３８】
前記計器は、前記試料調製ゾーンに接触するように構成された溶解構成要素をさらに備え、前記溶解構成要素は、任意選択的に前記ワイパ要素の構成要素である、請求項３２に記載の熱サイクルシステム。
【請求項３９】
前記ワイパ要素は、前記試料を熱サイクルさせるために、前記試料の前記第１の部分を第２の部分へ繰り返し移動させながら前記試料の前記第２の部分を移動させる、請求項３２に記載の熱サイクルシステム。
【請求項４０】
前記可撓性試料容器は、前記第１段階チャンバから下流に第２段階チャンバをさらに備え、前記受け口、前記可撓性試料容器、または前記加熱器要素のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第２段階チャンバが前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンの温度制御下にあるように前記第２段階チャンバを前記加熱器要素に対して整列させる、請求項３２に記載の熱サイクルシステム。
【請求項４１】
前記第２段階チャンバは、前記第１段階チャンバに流体接続された個別の増幅ウェルのアレイを含み、前記アレイは、前記第１段階チャンバから生成物の少なくとも一部分を受容するように構成される、請求項４０に記載の熱サイクルシステム。
【請求項４２】
前記加熱器要素は、少なくとも第１の温度ゾーン、第２の温度ゾーン、および第３の温度ゾーンをさらに含み、２つの温度ゾーンは、前記第１段階チャンバを熱サイクルさせるために整列され、３つの温度ゾーンは、前記第２段階チャンバを熱サイクルさせるために、一度に１つずつ整列される、請求項４０に記載の熱サイクルシステム。
【請求項４３】
前記受け口は、前記加熱器要素が可撓性試料容器の１つまたは複数の部分に接触することを可能にするように位置付けられた１つまたは複数の開口部を有する実質的に平面の表面を含む、請求項３２〜４２のいずれか一項に記載の熱サイクルシステム。
【請求項４４】
前記可撓性試料容器の少なくとも１つの部分から光学データを集めるように構成された、光源およびカメラ要素を含む光学アレイをさらに備える、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の熱サイクルシステム。
【請求項４５】
前記可撓性試料容器は、核酸および核酸増幅用の試薬を含有する試料を含む、請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の熱サイクルシステム。
【請求項４６】
前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンおよび／または前記可撓性試料容器の前記第１段階チャンバに圧力を印加するように構成された１つまたは複数の圧力部材をさらに備える、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の熱サイクルシステム。
【請求項４７】
前記１つまたは複数の圧力部材は、前記可撓性試料容器に隣接して配置可能な少なくとも１つの磁石をさらに備える、請求項４６に記載の熱サイクルシステム。
【請求項４８】
前記ワイパ要素は、前記可撓性試料容器に隣接して配置可能な少なくとも１つの磁石をさらに備える、請求項３２に記載の熱サイクルシステム。
【請求項４９】
試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に可撓性試料容器を位置付けるための受け口であって、前記可撓性試料容器が、第１段階チャンバ、および第２段階反応ウェルのアレイを有する第２段階反応チャンバを含む、受け口と、
第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンを含む加熱器要素と備え、
前記受け口、前記試料容器、または前記加熱器要素のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第１段階チャンバおよび前記第２段階反応チャンバを前記加熱器要素に対して整列させ、
前記受け口および前記加熱器要素は、前記第１段階チャンバ内で、次いで前記第２段階反応チャンバ内で熱サイクルおよび核酸増幅を行うために、前記加熱器要素が、まず前記第１段階チャンバを、次に前記第２段階反応チャンバを加熱することを可能にするように構成される、計器。
【請求項５０】
前記第１段階チャンバに接触し、前記第１段階チャンバを少なくとも第１の容積および第２の容積へと分割するように構成された少なくとも１つの刃を有するワイパ要素をさらに備え、
前記加熱器要素は、前記第１の容積が前記第１の温度ゾーンの上に位置付けられ、かつ前記第２の容積が前記第２の温度ゾーンの上に位置付けられるように、前記第１段階チャンバの真下に整列され、
前記ワイパ要素は、前記第１の容積および前記第２の容積が前記温度ゾーンの各々の制御下にあるように、前記第１の容積を前記第２の温度ゾーンへ移動させながら前記第２の容積を前記第１の温度ゾーンへ移動させるために回転するように構成される、請求項４９に記載の計器。
【請求項５１】
前記可撓性試料容器は、試料調製ゾーンを含む、請求項５０に記載の計器。
【請求項５２】
前記試料調製ゾーンは、前記第１段階チャンバから上流にある、請求項５１に記載の計器。
【請求項５３】
前記試料調製ゾーンおよび前記第１段階チャンバは、単一のチャンバを備える、請求項５１に記載の計器。
【請求項５４】
前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンに接触するように構成される、請求項５１に記載の計器。
【請求項５３】
試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に可撓性試料容器を位置付けるための受け口であって、前記可撓性試料容器が少なくとも１つの反応チャンバを含む、受け口と、
第１の加熱器要素、第２の加熱器要素、および第３の加熱器要素を備える加熱器組立体であって、前記第１の加熱器要素および前記第３の加熱器要素が前記第２の加熱器要素よりも高い温度に保持される、加熱器組立体とを備え、
前記計器は、少なくとも１つの反応チャンバ内の流体試料を熱サイクルさせるために、前記少なくとも１つの反応チャンバを前記第１の加熱器要素、前記第２の加熱器要素、および前記第３の加熱器要素と整列させるように構成される、計器。
【請求項５６】
前記第１の加熱器要素および前記第３の加熱器要素は、約９０℃〜１１０℃の範囲の温度に設定され、前記第２の加熱器要素は、約５５℃〜６５℃の温度に設定される、請求項５５に記載の計器。
【請求項５７】
前記第１の加熱器要素および前記第３の加熱器要素は、抵抗性加熱器要素を備え、前記第２の加熱器要素は、ペルチェ素子を備える、請求項５５に記載の計器。
【請求項５８】
前記第１の加熱器要素または前記第３の加熱器要素のうちの一方は、ペルチェ素子の上に敷設された抵抗性加熱器要素を備える、請求項５７に記載の計器。
【請求項５９】
前記加熱器組立体は、前記可撓性試料容器に隣接して回転されるように構成される円形取付部を備える、請求項５５に記載の計器。
【請求項６０】
前記加熱器組立体は、前記可撓性試料容器に隣接して移動されるように構成される線形取付部を備える、請求項５５に記載の計器。
【請求項６１】
請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の計器を使用したポリメラーゼ連鎖反応方法であって、
（ａ）少なくとも１つの反応チャンバを備える試料容器を提供するステップと、
（ｂ）試料を前記反応チャンバ内に導入するステップであって、前記試料が、標的核酸、前記標的核酸を増幅するための少なくとも１つのプライマー、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む、ステップと、
（ｃ）前記試料容器を前記計器内へ挿入するステップと、
（ｄ）前記第１の加熱器要素を前記反応チャンバと整列させ、次いで前記第２の加熱器要素を前記反応チャンバと整列させ、次いで前記第３の加熱器要素を前記反応チャンバと整列させるステップであって、
前記第１の加熱器要素および前記第３の加熱器要素は、変性温度に設定され、前記第２の加熱器要素は、アニーリング温度に設定され、
ステップ（ｄ）は、変性、アニーリング、および延伸／変性の１つのサイクルを含む、ステップと、
（ｆ）ステップ（ｄ）を繰り返すステップとを含む、方法。
【請求項６２】
試料容器内に提供される核酸を増幅するための計器であって、前記核酸はアレイ内で構成され、
前記試料容器を受容するための開口部と、
複数の加熱器であって、各々の加熱器が異なる温度で提供される、複数の加熱器と、
前記加熱器を前記開口部に隣接する位置に順次移動させ、それにより前記位置にある前記加熱器のみが前記試料容器内の前記核酸の温度を制御するようにする移動部とを備える、計器。
【請求項６３】
前記試料容器は、核酸を増幅するための構成要素をさらに備え、
前記複数の加熱器は、アニーリング温度にある第１の加熱器および変性温度にある第２の加熱器を少なくとも備える、請求項６２に記載の計器。
【請求項６４】
前記複数の加熱器は、延伸温度にある第３の加熱器をさらに備える、請求項６３に記載の計器。
【請求項６５】
前記試料は、増幅された核酸の検出のために構成された蛍光体をさらに含み、前記計器は、前記アレイからの蛍光を検出するように位置付けられた光検出器をさらに備える、請求項６３に記載の計器。
【請求項６６】
（ａ）ある容積を有するＰＣＲ混合物を試料器内に提供するステップと、
（ｂ）第１の回数のサイクルだけ熱サイクルさせるステップであって、前記第１の回数のサイクルの各々が第１のサイクル時間を有する、ステップと、
（ｃ）前記試料器内の前記ＰＣＲ混合物の前記容積を第２の容積まで減らすステップであって、前記第２の容積が前記第１の容積よりも小さい、ステップと、
（ｄ）前記試料器において第２の回数のサイクルだけ熱サイクルさせるステップであって、前記第２の回数のサイクルの各々が第２のサイクル時間を有し、前記第２のサイクル時間が前記第１のサイクル時間より短い、ステップとを含む、ＰＣＲを実施するための方法。
【請求項６７】
（ｅ）前記試料容器内の前記ＰＣＲ混合物の前記容積を第３の容積まで減らすステップであって、前記第３の容積が前記第２の容積よりも小さい、ステップと、
（ｆ）第３の回数のサイクルだけ熱サイクルさせるステップであって、前記第３の回数のサイクルの各々が第３のサイクル時間を有し、前記第３のサイクル時間が前記第２のサイクル時間より短い、ステップとをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記試料器は、圧縮可能であり、前記減らすステップは、前記試料の一部分を前記試料器から排出することによって実施される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記試料器は、少なくとも２つの温度ゾーンと接触状態にあり、前記熱サイクルさせるステップは、前記試料を前記温度ゾーン間で移動させることを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記試料器は、いくつかの温度間で熱サイクルさせる加熱器によって加熱される、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
水性流体試料を容器の試料区画内へ導入するステップであって、前記水性流体試料が標的核酸および前記標的核酸を増幅するための試薬を含む、ステップと、
前記容器を加熱装置内へ導入するステップであって、前記加熱装置が、第１の加熱器、第２の加熱器、および前記試料区画内の前記水性流体試料を移動させるための移動部を備え、前記第１の加熱器が第１の温度に設定され、前記第２の加熱器が第２の温度に設定され、前記第１の温度が前記第２の温度よりも高く、前記試料区画の第１の部分が前記第１の加熱器に近接して設置されているため、前記第１の加熱器が前記試料区画の前記第１の部分に対して熱制御を呈し、前記試料区画の第２の部分が前記第２の加熱器に近接して設置されているため、前記第２の加熱器が前記試料区画の前記第２の部分に対して熱制御を呈する、ステップと、
前記水性流体試料の少なくとも第１の部分と第２の部分を前記試料区画の前記第１の部分と前記試料区画の前記第２の部分との間で相互に移動させるステップとを含む、試料内の核酸を増幅する方法。
【請求項７２】
（ａ）流体試料を容器の第１の区画内へ導入するステップであって、前記流体試料が標的核酸および前記標的核酸を増幅するための試薬を含み、前記第１の区画が、アニーリング温度未満である温度（低アニーリング温度）に設定される第１の加熱器の制御下にある、ステップと、
（ｂ）前記第１の加熱器の温度を前記アニーリング温度まで上げるステップと、
（ｃ）前記流体試料を容器の第２の区画へ移動させるステップであって、前記第２の区画が、延伸温度を上回る温度（高延伸温度）に設定される第２の加熱器の制御下にある、移動させるステップと、および、前記流体試料を前記第２の区画へ移動させた後に、前記第１の加熱器の温度を低アニーリング温度まで下げるステップと、を行うステップと、
（ｄ）前記第２の加熱器の温度を前記延伸温度まで下げるステップと、
（ｅ）前記第２の加熱器の温度を少なくとも変性温度まで上げるステップと、
（ｆ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップとを含む、試料内の核酸を増幅する方法。
【請求項７３】
ステップ（ａ）が繰り返されるとき、前記第２の加熱器の温度が前記高延伸温度へ移される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記低アニーリング温度は、前記アニーリング温度より２度から２０度低い、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記高延伸温度は、前記延伸温度より２度から１０度高い、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
ステップ（ｅ）は、前記第２の加熱器の温度を、前記変性温度を上回る温度まで上げることを含み、ステップ（ａ）は、前記流体試料が前記変性温度に達するとすぐに繰り返される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に第１段階チャンバを有する可撓性試料容器を位置付けるための受け口と、
少なくとも第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンを含む加熱器要素とを備え、
前記受け口または前記加熱器要素のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第１段階チャンバを前記加熱器要素の前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンに対して位置付け、
前記受け口および前記加熱器要素は、前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンが前記第１段階チャンバの温度を制御してその中で熱サイクルおよび核酸増幅を行うことを可能にするように構成される、計器。
【請求項７８】
前記可撓性試料容器は、試料調製ゾーンを含む、請求項７７に記載の計器。
【請求項７９】
前記試料調製ゾーンは、前記第１段階チャンバから上流にある、請求項７８に記載の計器。
【請求項８０】
前記計器は、前記試料容器の第１の側面に位置付けられたワイパ要素をさらに備え、前記ワイパ要素は、前記試料を前記試料調製ゾーン内および前記第１段階チャンバ内で混合するために前記試料容器に接触するように構成され、
前記受け口、前記ワイパ要素、または前記加熱器要素のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記可撓性試料容器を前記ワイパ要素および前記加熱器要素に対して位置付け、
前記ワイパ要素および前記加熱器要素は、試料調製を行うように共同して働き、また核酸増幅を行うように共同して働く、請求項７８に記載の計器。
【請求項８１】
前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンと前記第１段階チャンバとの間で移動可能であり、前記加熱器要素は、前記試料調製ゾーンおよび前記第１段階チャンバにおいて制御された温度ゾーンを画定するために移動可能である、請求項８０に記載の計器。
【請求項８２】
前記受け口は、前記試料調製ゾーンおよび前記第１段階チャンバにおいて混合温度および画定された温度ゾーンを提供するために、前記ワイパ要素および前記加熱器に対して移動可能である、請求項８０に記載の計器。
【請求項８３】
前記受け口、前記ワイパ要素、前記加熱器要素のうちの少なくとも２つは、前記試料調製ゾーンおよび前記第１段階チャンバにおいて混合温度および画定された温度ゾーンを提供するために移動可能である、請求項８０に記載の計器。
【請求項８４】
前記加熱器要素は、前記試料調製ゾーン内に存在する試料を加熱するために、前記試料調製ゾーンへ移動可能であり、前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンに接触して、前記試料内の細胞を溶解するために前記試料をブレンドするように構成される少なくとも１つの刃を有する、請求項８０に記載の計器。
【請求項８５】
前記ワイパ要素は、前記試料内の細胞を溶解するために前記試料内に旋回流、渦、およびキャビテーション気泡のうちの１つまたは複数を作る、請求項８４に記載の計器。
【請求項８６】
前記試料調製ゾーンは、細胞溶解を高めるために研磨要素を含む、請求項８５に記載の計器。
【請求項８７】
前記ワイパ要素は溶解構成要素を含む、請求項８０に記載の計器。
【請求項８８】
前記加熱器要素は、前記試料の第１の部分が前記第１の温度ゾーンに隣接して位置付けられ、かつ前記試料の第２の部分が前記第２の温度ゾーンに隣接して位置付けられるように、前記第１段階チャンバに隣接して位置付け可能であり、前記計器は、前記第１段階チャンバを少なくとも第１の部分および第２の部分を含む少なくとも２つの別々のセクションに分割するように、および、前記試料の前記第１の部分および前記第２の部分が前記温度ゾーンの各々の制御下にあるように、前記試料の前記第１の部分を前記第２の温度ゾーンへ移動させながら前記試料の前記第２の部分を前記第１の温度ゾーンに移動させるために回転するように構成される少なくとも１つの刃を有するワイパ要素をさらに含む、請求項７７に記載の計器。
【請求項８９】
前記刃は、前記試料を、少なくとも第１のセクションおよび第２のセクションを含む少なくとも２つの別々のセクションへと分割し、それにより、前記第１の部分が前記第１のセクションに含まれ、前記第２の部分が前記第２のセクションに含まれるようにする、請求項８８に記載の計器。
【請求項９０】
前記ワイパ要素は、前記試料の前記第１の部分が前記第１の温度ゾーンの制御下にあり、前記試料の前記第２の部分が前記第２の温度ゾーンの制御下にあり、前記試料の第３の部分が、前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンの制御の間の遷移にあるように、前記試料を移動させる、請求項８８に記載の計器。
【請求項９１】
前記ワイパ要素は、前記試料の部分を前記試料容器の反対の部分へと繰り返し移動させて前記試料を熱サイクルさせる、請求項８８〜９０のいずれか一項に記載の計器。
【請求項９２】
前記容器は、前記第１段階チャンバから下流に第２の核酸増幅ゾーンをさらに含み、前記受け口、前記可撓性試料容器、または前記加熱器要素のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第２の核酸増幅ゾーンにおいて、制御された温度ゾーンを画定するために前記第２の核酸増幅ゾーンを前記加熱器要素に対して位置付ける、請求項７７に記載の計器。
【請求項９３】
前記第２の核酸増幅ゾーンは、前記第１の核酸増幅ゾーンに流体接続された個別の増幅ウェルのアレイを含み、前記アレイは、前記試料の少なくとも一部分を受容するように構成される、請求項９２に記載の計器。
【請求項９４】
前記容器は、前記第１段階チャンバと前記アレイとの間にウェルを含み、前記ウェルは、前記試料の既知の容積を前記第１段階チャンバから受容し、前記既知の容積を前記アレイに送達するように構成される、請求項９３に記載の計器。
【請求項９５】
前記容器は、前記ウェルと前記アレイとの間に希釈ゾーンを含み、前記希釈ゾーンは、前記既知の容積を前記ウェルから受容し、前記既知の容積をある容積の流体で希釈して、希釈された試料を得て、前記希釈された試料を前記アレイに送達するように構成される、請求項９４に記載の計器。
【請求項９６】
前記受け口は、前記加熱器要素が前記受け口に挿入された可撓性試料容器の１つまたは複数の部分に接触することを可能にするように位置付けられた１つまたは複数の開口部を有する実質的に平面の表面を含む、請求項７７に記載の計器。
【請求項９７】
前記容器の少なくとも１つの部分から光学データを集めるように構成された、光源およびカメラ要素を含む光学アレイをさらに備える、請求項７７に記載の計器。
【請求項９８】
前記加熱器要素は、第１の加熱器部分、第２の加熱器部分、および第３の加熱器部分を含む、請求項７７に記載の計器。
【請求項９９】
前記第１の加熱器部分は、抵抗性加熱器であり、前記第２の加熱器部分は、ペルチェ素子であり、前記第３の加熱器部分は、抵抗性加熱器である、請求項９８に記載の計器。
【請求項１００】
前記第３の加熱器部分は、ペルチェ素子の上に抵抗性加熱器を備え、前記抵抗性加熱器は、前記第３の加熱器部分を加熱するために使用され、前記ペルチェ素子は、前記第３の加熱器部分を冷却するために実質的に同時に使用される、請求項９９に記載の計器。
【請求項１０１】
前記第１の加熱器部分、前記第２の加熱器部分、および前記第３の加熱器部分は、直線的に設置される、請求項１００に記載の計器。
【請求項１０２】
前記計器の１つまたは複数の構成要素を制御するように、および／またはそこからデータを集めるように構成されたコンピューティングデバイスをさらに備える、請求項７７〜１０１のいずれか一項に記載の計器。
【請求項１０３】
可撓性試料容器を受容するための開口部であって、前記可撓性試料容器が少なくとも１つの反応ゾーンを含む、開口部と、
複数の加熱器であって、前記加熱器の各々が異なる温度に設定されるように構成され、各加熱器を前記少なくとも１つの反応ゾーンと順次整列させて、その中の試料を加熱または冷却することができるように、前記加熱器が実質的に平面の取付部に位置付けられる、複数の加熱器とを備える、試料内の核酸を増幅するための計器。
【請求項１０４】
前記実質的に平面の取付部は、前記可撓性試料容器に隣接して回転されるように構成される円形取付部を備える、請求項１０３に記載の計器。
【請求項１０５】
前記円形取付部は、時計回り方向および反時計回り方向の両方に回転するように構成される、請求項１０４に記載の計器。
【請求項１０６】
反応ウェルのアレイを有する反応チャンバであって、前記アレイの前記ウェルの各々が、選択的に開放可能および選択的に密封可能な充填チャネルに流体接続される、反応チャンバを備える、可撓性試料容器。
【請求項１０７】
前記可撓性試料容器は、第１のフィルム層、前記第１のフィルム層に少なくとも部分的に付着された第２のフィルム層、前記第２のフィルム層および前記アレイの前記反応ウェルが形成されるカード層の１つの表面に付着された接着剤層、ならびに第３の外側フィルム層および前記カード層の反対表面に付着された第２の接着剤層から製作され、
前記充填チャネルは、前記第１のフィルム層と前記第２のフィルム層との間に開放空間を残すことによって形成される、請求項１０６に記載の可撓性試料容器。
【請求項１０８】
前記充填チャネルは、前記第１のフィルム層および前記第２のフィルム層を前記反応ウェルの前記アレイの周りで一緒に密封するシール線によって画定される、請求項１０７に記載の可撓性試料容器。
【請求項１０９】
前記充填チャネルは、前記第２のフィルム層および前記第１の接着剤層内の選択的な切欠きによって形成された充填孔によって前記アレイの前記ウェルの各々に流体接続される、請求項１０７に記載の可撓性試料容器。
【請求項１１０】
前記充填孔は、前記アレイのウェルに隣接して、かつその上を流れるウェル充填チャネルに流体接続され、前記ウェル充填チャネルは、前記アレイの前記ウェルに隣接する前記カード層内に切欠きを、および前記第２の接着剤層内に別の切欠きを作製することによって形成される、請求項１０９に記載の可撓性試料容器。
【請求項１１１】
前記充填孔は、前記アレイのウェル内へ流れるウェル充填チャネルに流体接続され、前記ウェル充填チャネルは、前記充填孔を前記アレイの前記ウェルに流体接続する前記第１の接着剤層内の切欠きを作製することによって形成される、請求項１０９に記載の可撓性試料容器。
【請求項１１２】
前記充填チャネルはヒートシール可能である、請求項１０６に記載の可撓性試料容器。
【請求項１１３】
単一のヒートシールが、充填チャネルから複数の充填チャネルへの流れを密封し、前記ウェルを互いから密封する、請求項１１２に記載の可撓性試料容器。
【請求項１１４】
前記充填チャネルは、前記アレイに対して圧力を印加することによって密封可能である、請求項１０６に記載の可撓性試料容器。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
[00219]本発明は、その趣旨および本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で具現化されてもよい。説明された実施形態は、あらゆる点において例示にすぎず、限定的ではないと見なされるものとする。したがって、本発明の範囲は、先述の説明によってではなく添付の特許請求の範囲により示される。特定の実施形態および詳細事項は、本発明を例証する目的のために本明細書および添付の発明開示に含まれているが、当業者にとっては、本明細書に開示される方法および装置において様々な変更が添付の特許請求の範囲において規定される本発明の範囲から逸脱することなく行われ得ることは明白であるものとする。特許請求の範囲の同等性の意味および範囲内に入るすべての変更は、それらの範囲内に包含されるものとする。
以上説明したように、本発明は以下の形態を有する。
［形態１］
（ａ）第２段階反応ゾーンに流体接続された第１段階チャンバを備える試料容器を提供するステップであって、前記第２段階反応ゾーンが、複数の第２段階反応ウェルを備える、ステップと、
（ｂ）試料を前記試料容器内に導入するステップと、
（ｃ）前記試料容器を計器内に挿入するステップであって、前記計器が温度制御要素を備える、ステップと、
（ｄ）前記温度制御要素と前記第１段階チャンバとを整列させて、前記第１段階チャンバ内で前記試料の熱サイクルを行うステップと、
（ｅ）前記第１段階チャンバ内の前記試料の熱サイクルを行った後に、前記第１段階チャンバからの前記試料由来の生成物の少なくとも一部分を前記第２段階反応ゾーン内の前記複数の第２段階反応ウェル内へ移動させるステップと、
（ｆ）前記温度制御要素と前記第２段階反応ゾーンとを整列させて、前記第２段階反応ゾーン内で前記試料の前記一部分の熱サイクルを行うステップとを含む、熱サイクルの方法。
［形態２］
前記温度制御要素は、ペルチェ素子、抵抗加熱器、誘導加熱器、電磁加熱器、薄膜加熱器、印刷素子加熱器、正温度係数加熱器、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の加熱器または冷却器デバイスを備える、形態１に記載の方法。
［形態３］
前記温度制御要素は、第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンを含み、前記第１の温度ゾーンは、前記第２の温度ゾーンよりも熱い、形態１に記載の方法。
［形態４］
ステップ（ｆ）は、前記温度制御要素を前記第２段階反応ゾーンに対して繰り返し移動させることを含む、形態３に記載の方法。
［形態５］
ステップ（ｆ）は、前記第２段階反応ゾーンを前記温度制御要素に対して繰り返し移動させることを含む、形態３に記載の方法。
［形態６］
前記計器は、ワイパ要素をさらに備え、ステップ（ｄ）は、前記ワイパ要素の回転運動が前記試料の第１の部分を前記第１の温度ゾーンの熱制御から前記第２の温度ゾーンの熱制御へ移動させながら、同時に前記試料の第２の部分を前記第２の温度ゾーンの熱制御から前記第１の温度ゾーンの熱制御へ移動させるように、前記ワイパ要素を前記温度制御要素および前記第１段階チャンバと整列させることをさらに含む、形態３に記載の方法。
［形態７］
前記試料容器は、前記第１段階チャンバに流体接続された試料調製ゾーンをさらに備え、ステップ（ｄ）の前に、前記方法は、
前記試料を前記試料調製ゾーン内に導入するステップと、
前記試料調製ゾーンを溶解装置と接触させて溶解物を生成するステップと、
前記溶解物から核酸を回収するステップと、
前記回収した核酸を前記第１段階チャンバ内へ移動させるステップとをさらに含む、形態１に記載の方法。
［形態８］
前記試料から核酸を回収するステップは、
前記溶解物を複数の磁気ビーズと接触させることと、
前記磁気ビーズを前記溶解物から分離するために磁石を配置することと、
前記磁気ビーズを洗浄することと、
前記磁気ビーズを前記磁石で再捕捉することと、
前記磁気ビーズを溶出緩衝液と接触させて前記核酸を前記磁気ビーズから解放することと、
前記磁気ビーズを前記磁石で再捕捉し、溶出した前記核酸を前記磁気ビーズから分離することとをさらに含む、形態７に記載の方法。
［形態９］
前記試料調製ゾーンおよび前記第１段階チャンバは、前記試料容器内の別々のチャンバである、形態７に記載の方法。
［形態１０］
前記方法のステップ（ｆ）は、第２の核酸増幅ゾーンを、前記温度制御要素の前記第１の温度ゾーンおよび次いで前記第２の温度ゾーンと整列させて、前記第２の核酸増幅ゾーン内の前記試料を熱サイクルさせることをさらに含む、形態１に記載の方法。
［形態１１］
前記方法の前記ステップは、２０分以下、１５分以下、または好ましくは、１０分以下で完了される、形態１０に記載の方法。
［形態１２］
第１の核酸増幅ゾーンおよび前記第２の核酸増幅ゾーンの各熱サイクルは、８秒以下、６秒以下、または好ましくは、４秒以下で完了される、形態１に記載の方法。
［形態１３］
前記整列させるステップを制御するように、および前記温度制御要素の温度を制御するように構成されたコンピューティングデバイスを提供するステップをさらに含む、形態１に記載の方法。
［形態１４］
試料を熱サイクルさせるための計器であって、前記試料は、可撓性試料容器内に提供され、前記計器は、
前記試料の第１の部分を第１の温度へと調節するための前記可撓性試料容器の第１の部分に隣接する第１の加熱器と、
前記試料の第２の部分を前記第１の温度とは異なる第２の温度へと調節するための前記可撓性試料容器の第２の部分に隣接する第２の加熱器と、
前記試料のこれらの部分が同時に前記加熱器の各々の制御下にあるように、前記試料の前記第１の部分を前記可撓性試料容器の前記第２の部分へと移動させながら前記試料の前記第２の部分を前記可撓性試料容器の前記第１の部分へと移動させるワイパ要素とを備える、計器。
［形態１５］
前記ワイパ要素は、前記試料を、少なくとも第１のセクションおよび第２のセクションを含む少なくとも２つの別々のセクションへと分割し、それにより、前記第１の部分が前記第１のセクションに含まれ、前記第２の部分が前記第２のセクションに含まれるようにする刃をさらに備える、形態１４に記載の計器。
［形態１６］
前記ワイパ要素は、前記試料の前記第１の部分が前記第１の加熱器の制御下にあり、前記試料の前記第２の部分が前記第２の加熱器の制御下にあり、前記試料の第３の部分が、前記第１の加熱器および前記第２の加熱器の制御の間の遷移にあるように、前記試料内に旋回流および渦を作る、形態１４に記載の計器。
［形態１７］
前記ワイパ要素は、前記試料の部分を前記試料容器の反対の部分へと繰り返し移動させて前記試料を熱サイクルさせる、形態１４〜１６のいずれかに記載の計器。
［形態１８］
前記試料器は、ＰＣＲのための核酸および構成要素を含む、形態１４に記載の計器。
［形態１９］
前記ワイパ要素は、前記可撓性試料容器を圧縮して前記試料の一部分を排出するように移動可能であり、前記ワイパ要素は、前記試料の前記一部分を排出する前には第１の速度、および前記試料の前記一部分を排出した後にはより速い第２の速度を有する、形態１４に記載の計器。
［形態２０］
前記ワイパ要素と前記可撓性試料容器との間に設置された圧縮可能部材をさらに備え、前記圧縮可能部材は、前記試料容器に向かって付勢される、形態１４に記載の計器。
［形態２１］
前記試料容器に流体接続されたアレイをさらに備え、前記アレイは、前記試料の少なくとも一部分を受容するように構成され、前記計器は、前記アレイ内の前記試料の前記一部分の温度に順次影響を与えるように移動可能である複数の加熱器をさらに備える、形態１４に記載の計器。
［形態２２］
試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に少なくとも第１の反応チャンバを有する可撓性試料容器を位置付けるための受け口と、
第１の加熱器要素および第２の加熱器要素を備える加熱器組立体と、
前記第１の反応チャンバが前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素のうちの少なくとも一方の温度制御下にあるように前記第１の反応チャンバを前記加熱器組立体の第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素に対して横方向に整列させるために、前記受け口、前記可撓性試料容器、または前記加熱器組立体のうちの少なくとも１つに機械的に結合された移動装置とを備え、
前記計器は、前記少なくとも１つの反応チャンバ内の流体試料を熱サイクルさせるために、前記第１の反応チャンバを前記第１の加熱器要素と、次いで第２の加熱器要素と、繰り返し整列させるように構成される、計器。
［形態２３］
前記第１の加熱器要素は、約９０℃〜１１０℃の範囲の温度に設定され、前記第２の加熱器要素は、約５５℃〜約６５℃の範囲の温度に設定される、形態２２に記載の計器。
［形態２４］
前記加熱器組立体は、前記移動装置に結合され、前記移動装置は、前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素が前記第１の反応チャンバにおける制御された温度ゾーンを画定することができるように、前記加熱器組立体を前記第１の反応チャンバに対して横方向に移動させるように構成される、形態２２に記載の計器。
［形態２５］
前記受け口は、前記移動装置に結合され、前記移動装置は、前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素が前記第１の反応チャンバにおける制御された温度ゾーンを画定することができるように、前記受け口およびその中に位置付けられた前記可撓性試料容器を前記加熱器組立体に対して横方向に移動させるように構成される、形態２２に記載の計器。
［形態２６］
前記可撓性試料容器は、前記移動装置に結合され、前記移動装置は、前記第１の反応チャンバが前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素の温度制御下にあるように、前記可撓性試料容器を前記加熱器組立体に対して移動させるように構成される、形態２２に記載の計器。
［形態２７］
前記可撓性試料容器は、前記第１の反応チャンバから下流に第２の反応チャンバをさらに備え、前記移動装置は、前記第２の反応チャンバが前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素の温度制御下にあるように、前記第２の反応チャンバを前記加熱器組立体の前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素に対して横方向に整列させるように構成される、形態２２に記載の計器。
［形態２８］
前記第２の反応チャンバは、前記第１の反応チャンバに流体接続された個別の増幅ウェルのアレイを含み、前記アレイは、前記第１の反応チャンバから増幅生成物の少なくとも一部分を受容するように構成される、形態２７に記載の計器。
［形態２９］
前記受け口は、前記加熱器組立体の前記第１の加熱器要素および前記第２の加熱器要素が、前記受け口内に位置付けられたときに前記可撓性試料容器の１つまたは複数の部分に接触することを可能にするように位置付けられた１つまたは複数の開口部を有する実質的に平面の表面を含む、形態２２に記載の計器。
［形態３０］
前記加熱器組立体は、第１の加熱器要素、第２の加熱器要素、および第３の加熱器要素を含む、形態２２に記載の計器。
［形態３１］
前記第１の加熱器要素、前記第２の加熱器要素、および前記第３の加熱器要素は、直線的に設置される、形態３０に記載の計器。
［形態３２］
前記第１の加熱器要素および前記第３の加熱器要素は、約９０℃〜１１０℃の範囲の温度に設定され、前記第２の加熱器要素は、約５５℃〜約６５℃の温度に設定される、形態３１に記載の計器。
［形態３３］
可撓性試料容器を中に受容するための受け口であって、前記可撓性試料容器が、熱サイクルされることになる試料を中に含む第１段階チャンバを有する、受け口と、
前記可撓性試料容器の第１の側面に位置付けられた、少なくとも第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンを含む加熱器要素と、
前記試料容器の第２の側面に位置付けられたワイパ要素であって、前記試料を少なくとも第１の部分および第２の部分に分割するために前記第１段階チャンバに接触するように構成される、ワイパ要素とを備え、
前記受け口、前記加熱器要素、前記ワイパ要素、または前記可撓性試料容器のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第１段階チャンバを前記ワイパ要素ならびに前記加熱器要素の前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンに対して整列させ、
前記ワイパ要素は、前記試料の前記第１の部分を前記第２の部分へ移動させながら前記試料の前記第２の部分を前記第１の部分へ移動させて、それにより前記第１の部分および前記第２の部分が前記加熱器要素の前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンの温度制御下にあるようにするために前記第１段階チャンバに隣接して回転するように構成される、熱サイクルシステム。
［形態３４］
前記可撓性試料容器は、試料調製ゾーンを含み、前記試料調製ゾーンは、前記第１段階チャンバからの上流のうちの１つであるか、または前記試料調製ゾーンおよび前記第１段階チャンバは、単一のゾーンを含む、形態３３に記載の熱サイクルシステム。
［形態３５］
前記ワイパ要素は、前記試料を前記試料調製ゾーン内で混合するために前記試料容器に接触するように構成される、形態３４に記載の熱サイクルシステム。
［形態３６］
前記ワイパ要素および前記加熱器要素は、試料調製を行うように共同して働き、また核酸増幅を行うように共同して働く、形態３５に記載の熱サイクルシステム。
［形態３７］
前記ワイパ要素は、前記試料内の細胞を溶解するために前記試料内に旋回流、渦、およびキャビテーション気泡のうちの１つまたは複数を作る、形態３３〜３６のいずれか一項に記載の熱サイクルシステム。
［形態３８］
前記第１段階チャンバは、細胞溶解を高めるために研磨要素を含む、形態３３に記載の熱サイクルシステム。
［形態３９］
前記計器は、前記試料調製ゾーンに接触するように構成された溶解構成要素をさらに備え、前記溶解構成要素は、任意選択的に前記ワイパ要素の構成要素である、形態３３に記載の熱サイクルシステム。
［形態４０］
前記ワイパ要素は、前記試料を熱サイクルさせるために、前記試料の前記第１の部分を第２の部分へ繰り返し移動させながら前記試料の前記第２の部分を移動させる、形態３３に記載の熱サイクルシステム。
［形態４１］
前記可撓性試料容器は、前記第１段階チャンバから下流に第２段階チャンバをさらに備え、前記受け口、前記可撓性試料容器、または前記加熱器要素のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第２段階チャンバが前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンの温度制御下にあるように前記第２段階チャンバを前記加熱器要素に対して整列させる、形態３３に記載の熱サイクルシステム。
［形態４２］
前記第２段階チャンバは、前記第１段階チャンバに流体接続された個別の増幅ウェルのアレイを含み、前記アレイは、前記第１段階チャンバから生成物の少なくとも一部分を受容するように構成される、形態４１に記載の熱サイクルシステム。
［形態４３］
前記加熱器要素は、少なくとも第１の温度ゾーン、第２の温度ゾーン、および第３の温度ゾーンをさらに含み、２つの温度ゾーンは、前記第１段階チャンバを熱サイクルさせるために整列され、３つの温度ゾーンは、前記第２段階チャンバを熱サイクルさせるために、一度に１つずつ整列される、形態４１に記載の熱サイクルシステム。
［形態４４］
前記受け口は、前記加熱器要素が可撓性試料容器の１つまたは複数の部分に接触することを可能にするように位置付けられた１つまたは複数の開口部を有する実質的に平面の表面を含む、形態３３〜４３のいずれかに記載の熱サイクルシステム。
［形態４５］
前記可撓性試料容器の少なくとも１つの部分から光学データを集めるように構成された、光源およびカメラ要素を含む光学アレイをさらに備える、形態３３〜４４のいずれかに記載の熱サイクルシステム。
［形態４６］
前記可撓性試料容器は、核酸および核酸増幅用の試薬を含有する試料を含む、形態３３〜４５のいずれかに記載の熱サイクルシステム。
［形態４７］
前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンおよび／または前記可撓性試料容器の前記第１段階チャンバに圧力を印加するように構成された１つまたは複数の圧力部材をさらに備える、形態３３〜３５のいずれか一項に記載の熱サイクルシステム。
［形態４８］
前記１つまたは複数の圧力部材は、前記可撓性試料容器に隣接して配置可能な少なくとも１つの磁石をさらに備える、形態４７に記載の熱サイクルシステム。
［形態４９］
前記ワイパ要素は、前記可撓性試料容器に隣接して配置可能な少なくとも１つの磁石をさらに備える、形態３３に記載の熱サイクルシステム。
［形態５０］
試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に可撓性試料容器を位置付けるための受け口であって、前記可撓性試料容器が、第１段階チャンバ、および第２段階反応ウェルのアレイを有する第２段階反応チャンバを含む、受け口と、
第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンを含む加熱器要素と備え、
前記受け口、前記試料容器、または前記加熱器要素のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第１段階チャンバおよび前記第２段階反応チャンバを前記加熱器要素に対して整列させ、
前記受け口および前記加熱器要素は、前記第１段階チャンバ内で、次いで前記第２段階反応チャンバ内で熱サイクルおよび核酸増幅を行うために、前記加熱器要素が、まず前記第１段階チャンバを、次に前記第２段階反応チャンバを加熱することを可能にするように構成される、計器。
［形態５１］
前記第１段階チャンバに接触し、前記第１段階チャンバを少なくとも第１の容積および第２の容積へと分割するように構成された少なくとも１つの刃を有するワイパ要素をさらに備え、
前記加熱器要素は、前記第１の容積が前記第１の温度ゾーンの上に位置付けられ、かつ前記第２の容積が前記第２の温度ゾーンの上に位置付けられるように、前記第１段階チャンバの真下に整列され、
前記ワイパ要素は、前記第１の容積および前記第２の容積が前記温度ゾーンの各々の制御下にあるように、前記第１の容積を前記第２の温度ゾーンへ移動させながら前記第２の容積を前記第１の温度ゾーンへ移動させるために回転するように構成される、形態５０に記載の計器。
［形態５２］
前記可撓性試料容器は、試料調製ゾーンを含む、形態５１に記載の計器。
［形態５３］
前記試料調製ゾーンは、前記第１段階チャンバから上流にある、形態５２に記載の計器。
［形態５４］
前記試料調製ゾーンおよび前記第１段階チャンバは、単一のチャンバを備える、形態５２に記載の計器。
［形態５５］
前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンに接触するように構成される、形態５２に記載の計器。
［形態５６］
試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に可撓性試料容器を位置付けるための受け口であって、前記可撓性試料容器が少なくとも１つの反応チャンバを含む、受け口と、
第１の加熱器要素、第２の加熱器要素、および第３の加熱器要素を備える加熱器組立体であって、前記第１の加熱器要素および前記第３の加熱器要素が前記第２の加熱器要素よりも高い温度に保持される、加熱器組立体とを備え、
前記計器は、少なくとも１つの反応チャンバ内の流体試料を熱サイクルさせるために、前記少なくとも１つの反応チャンバを前記第１の加熱器要素、前記第２の加熱器要素、および前記第３の加熱器要素と整列させるように構成される、計器。
［形態５７］
前記第１の加熱器要素および前記第３の加熱器要素は、約９０℃〜１１０℃の範囲の温度に設定され、前記第２の加熱器要素は、約５５℃〜６５℃の温度に設定される、形態５６に記載の計器。
［形態５８］
前記第１の加熱器要素および前記第３の加熱器要素は、抵抗性加熱器要素を備え、前記第２の加熱器要素は、ペルチェ素子を備える、形態５６に記載の計器。
［形態５９］
前記第１の加熱器要素または前記第３の加熱器要素のうちの一方は、ペルチェ素子の上に敷設された抵抗性加熱器要素を備える、形態５８に記載の計器。
［形態６０］
前記加熱器組立体は、前記可撓性試料容器に隣接して回転されるように構成される円形取付部を備える、形態５６に記載の計器。
［形態６１］
前記加熱器組立体は、前記可撓性試料容器に隣接して移動されるように構成される線形取付部を備える、形態５６に記載の計器。
［形態６２］
形態５６〜６１のいずれか一項に記載の計器を使用したポリメラーゼ連鎖反応方法であって、
（ａ）少なくとも１つの反応チャンバを備える試料容器を提供するステップと、
（ｂ）試料を前記反応チャンバ内に導入するステップであって、前記試料が、標的核酸、前記標的核酸を増幅するための少なくとも１つのプライマー、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む、ステップと、
（ｃ）前記試料容器を前記計器内へ挿入するステップと、
（ｄ）前記第１の加熱器要素を前記反応チャンバと整列させ、次いで前記第２の加熱器要素を前記反応チャンバと整列させ、次いで前記第３の加熱器要素を前記反応チャンバと整列させるステップであって、
前記第１の加熱器要素および前記第３の加熱器要素は、変性温度に設定され、前記第２の加熱器要素は、アニーリング温度に設定され、
ステップ（ｄ）は、変性、アニーリング、および延伸／変性の１つのサイクルを含む、ステップと、
（ｆ）ステップ（ｄ）を繰り返すステップとを含む、方法。
［形態６３］
試料容器内に提供される核酸を増幅するための計器であって、前記核酸はアレイ内で構成され、
前記試料容器を受容するための開口部と、
複数の加熱器であって、各々の加熱器が異なる温度で提供される、複数の加熱器と、
前記加熱器を前記開口部に隣接する位置に順次移動させ、それにより前記位置にある前記加熱器のみが前記試料容器内の前記核酸の温度を制御するようにする移動部とを備える、計器。
［形態６４］
前記試料容器は、核酸を増幅するための構成要素をさらに備え、
前記複数の加熱器は、アニーリング温度にある第１の加熱器および変性温度にある第２の加熱器を少なくとも備える、形態６３に記載の計器。
［形態６５］
前記複数の加熱器は、延伸温度にある第３の加熱器をさらに備える、形態６４に記載の計器。
［形態６６］
前記試料は、増幅された核酸の検出のために構成された蛍光体をさらに含み、前記計器は、前記アレイからの蛍光を検出するように位置付けられた光検出器をさらに備える、形態６４に記載の計器。
［形態６７］
（ａ）ある容積を有するＰＣＲ混合物を試料器内に提供するステップと、
（ｂ）第１の回数のサイクルだけ熱サイクルさせるステップであって、前記第１の回数のサイクルの各々が第１のサイクル時間を有する、ステップと、
（ｃ）前記試料容器内の前記ＰＣＲ混合物の前記容積を第２の容積まで減らすステップであって、前記第２の容積が前記第１の容積よりも小さい、ステップと、
（ｄ）第２の回数のサイクルだけ熱サイクルさせるステップであって、前記第２の回数のサイクルの各々が第２のサイクル時間を有し、前記第２のサイクル時間が前記第１のサイクル時間より短い、ステップとを含む、ＰＣＲを実施するための方法。
［形態６８］
（ｅ）前記試料容器内の前記ＰＣＲ混合物の前記容積を第３の容積まで減らすステップであって、前記第３の容積が前記第２の容積よりも小さい、ステップと、
（ｆ）第３の回数のサイクルだけ熱サイクルさせるステップであって、前記第２の回数のサイクルの各々が第３のサイクル時間を有し、前記第３のサイクル時間が前記第２のサイクル時間より短い、ステップとをさらに含む、形態６７に記載の方法。
［形態６９］
前記試料器は、圧縮可能であり、前記減らすステップは、前記試料の一部分を前記試料器から排出することによって実施される、形態６７に記載の方法。
［形態７０］
前記試料器は、少なくとも２つの温度ゾーンと接触状態にあり、前記熱サイクルさせるステップは、前記試料を前記温度ゾーン間で移動させることを含む、形態６７に記載の方法。
［形態７１］
前記試料器は、いくつかの温度間で熱サイクルさせる加熱器によって加熱される、形態６７に記載の方法。
［形態７２］
流体試料を容器の試料区画内へ導入するステップであって、前記流体試料が標的核酸および前記標的核酸を増幅するための試薬を含む、ステップと、
前記容器を加熱装置内へ導入するステップであって、前記加熱装置が、第１の加熱器、第２の加熱器、および前記試料区画内の前記流体試料を移動させるための移動部を備え、前記第１の加熱器が第１の温度に設定され、前記第２の加熱器が第２の温度に設定され、前記第１の温度が前記第２の温度よりも高く、前記試料区画の第１の部分が前記第１の加熱器に近接して設置されているため、前記第１の加熱器が前記試料区画の前記第１の部分に対して熱制御を呈し、前記試料区画の第２の部分が前記第２の加熱器に近接して設置されているため、前記第２の加熱器が前記試料区画の前記第２の部分に対して熱制御を呈する、ステップと、
前記流体試料の少なくとも一部分を前記試料区画の前記第１の部分と前記試料区画の前記第２の部分との間で選択的に移動させ、それにより前記試料のこれらの部分が同時に前記加熱器の各々の制御下にあるようにするステップとを含む、試料内の核酸を増幅する方法。
［形態７３］
（ａ）流体試料を容器の第１の区画内へ導入するステップであって、前記流体試料が標的核酸および前記標的核酸を増幅するための試薬を含み、前記第１の区画が、アニーリング温度未満である温度（低アニーリング温度）に設定される第１の加熱器の制御下にある、ステップと、
（ｂ）前記第１の加熱器の温度を前記アニーリング温度まで上げるステップと、
（ｃ）前記流体試料を容器の第２の区画へ移動させるステップであって、前記第２の区画が、延伸温度を上回る温度（高延伸温度）に設定される第２の加熱器の制御下にある、移動させるステップと、および、前記流体試料を前記第２の区画へ移動させた後に、前記第１の加熱器の温度を低アニーリング温度まで下げるステップと、を行うステップと、
（ｄ）前記第２の加熱器の温度を前記延伸温度まで下げるステップと、
（ｅ）前記第２の加熱器の温度を少なくとも変性温度まで上げるステップと、
（ｆ）ステップ（ａ）から（ｅ）を繰り返すステップとを含む、試料内の核酸を増幅する方法。
［形態７４］
ステップ（ａ）が繰り返されるとき、前記第２の加熱器の温度が前記高延伸温度へ移される、形態７３に記載の方法。
［形態７５］
前記低アニーリング温度は、前記アニーリング温度より２度から２０度低い、形態７３に記載の方法。
［形態７６］
前記高延伸温度は、前記延伸温度より２度から１０度高い、形態７３に記載の方法。
［形態７７］
ステップ（ｅ）は、前記第２の加熱器の温度を、前記変性温度を上回る温度まで上げることを含み、ステップ（ａ）は、前記流体試料が前記変性温度に達するとすぐに繰り返される、形態７３に記載の方法。
［形態７８］
試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に第１段階チャンバを有する可撓性試料容器を位置付けるための受け口と、
少なくとも第１の温度ゾーンおよび第２の温度ゾーンを含む加熱器要素とを備え、
前記受け口または前記加熱器要素のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第１段階チャンバを前記加熱器要素の前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンに対して位置付け、
前記受け口および前記加熱器要素は、前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンが前記第１段階チャンバの温度を制御してその中で熱サイクルおよび核酸増幅を行うことを可能にするように構成される、計器。
［形態７９］
前記可撓性試料容器は、試料調製ゾーンを含む、形態７８に記載の計器。
［形態８０］
前記試料調製ゾーンは、前記第１段階チャンバから上流にある、形態７９に記載の計器。
［形態８１］
前記計器は、前記試料容器の第１の側面に位置付けられたワイパ要素をさらに備え、前記ワイパ要素は、前記試料を前記試料調製ゾーン内および前記第１段階チャンバ内で混合するために前記試料容器に接触するように構成され、
前記受け口、前記ワイパ要素、または前記加熱器要素のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記可撓性試料容器を前記ワイパ要素および前記加熱器要素に対して位置付け、
前記ワイパ要素および前記加熱器要素は、試料調製を行うように共同して働き、また核酸増幅を行うように共同して働く、形態７９に記載の計器。
［形態８２］
前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンと前記第１段階チャンバとの間で移動可能であり、前記加熱器要素は、前記試料調製ゾーンおよび前記第１段階チャンバにおいて制御された温度ゾーンを画定するために移動可能である、形態８１に記載の計器。
［形態８３］
前記受け口は、前記試料調製ゾーンおよび前記第１段階チャンバにおいて混合温度および画定された温度ゾーンを提供するために、前記ワイパ要素および前記加熱器に対して移動可能である、形態８１に記載の計器。
［形態８４］
前記受け口、前記ワイパ要素、前記加熱器要素のうちの少なくとも２つは、前記試料調製ゾーンおよび前記第１段階チャンバにおいて混合温度および画定された温度ゾーンを提供するために移動可能である、形態８１に記載の計器。
［形態８５］
前記加熱器要素は、前記試料調製ゾーン内に存在する試料を加熱するために、前記試料調製ゾーンへ移動可能であり、前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンに接触して、前記試料内の細胞を溶解するために前記試料をブレンドするように構成される少なくとも１つの刃を有する、形態８１に記載の計器。
［形態８６］
前記ワイパ要素は、前記試料内の細胞を溶解するために前記試料内に旋回流、渦、およびキャビテーション気泡のうちの１つまたは複数を作る、形態８５に記載の計器。
［形態８７］
前記試料調製ゾーンは、細胞溶解を高めるために研磨要素を含む、形態８６に記載の計器。
［形態８８］
前記ワイパ要素は溶解構成要素を含む、形態８１に記載の計器。
［形態８９］
前記加熱器要素は、前記試料の第１の部分が前記第１の温度ゾーンに隣接して位置付けられ、かつ前記試料の第２の部分が前記第２の温度ゾーンに隣接して位置付けられるように、前記第１段階チャンバに隣接して位置付け可能であり、前記計器は、前記第１段階チャンバを少なくとも第１の部分および第２の部分を含む少なくとも２つの別々のセクションに分割するように、および、前記試料の前記第１の部分および前記第２の部分が前記温度ゾーンの各々の制御下にあるように、前記試料の前記第１の部分を前記第２の温度ゾーンへ移動させながら前記試料の前記第２の部分を前記第１の温度ゾーンに移動させるために回転するように構成される少なくとも１つの刃を有するワイパ要素をさらに含む、形態７８に記載の計器。
［形態９０］
前記刃は、前記試料を、少なくとも第１のセクションおよび第２のセクションを含む少なくとも２つの別々のセクションへと分割し、それにより、前記第１の部分が前記第１のセクションに含まれ、前記第２の部分が前記第２のセクションに含まれるようにする、形態８９に記載の計器。
［形態９１］
前記ワイパ要素は、前記試料の前記第１の部分が前記第１の温度ゾーンの制御下にあり、前記試料の前記第２の部分が前記第２の温度ゾーンの制御下にあり、前記試料の第３の部分が、前記第１の温度ゾーンおよび前記第２の温度ゾーンの制御の間の遷移にあるように、前記試料を移動させる、形態８９に記載の計器。
［形態９２］
前記ワイパ要素は、前記試料の部分を前記試料容器の反対の部分へと繰り返し移動させて前記試料を熱サイクルさせる、形態８９〜９１のいずれかに記載の計器。
［形態９３］
前記容器は、前記第１段階チャンバから下流に第２の核酸増幅ゾーンをさらに含み、前記受け口、前記可撓性試料容器、または前記加熱器要素のうちの１つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第２の核酸増幅ゾーンにおいて、制御された温度ゾーンを画定するために前記第２の核酸増幅ゾーンを前記加熱器要素に対して位置付ける、形態７８に記載の計器。
［形態９４］
前記第２の核酸増幅ゾーンは、前記第１の核酸増幅ゾーンに流体接続された個別の増幅ウェルのアレイを含み、前記アレイは、前記試料の少なくとも一部分を受容するように構成される、形態９３に記載の計器。
［形態９５］
前記容器は、前記第１段階チャンバと前記アレイとの間にウェルを含み、前記ウェルは、前記試料の既知の容積を前記第１段階チャンバから受容し、前記既知の容積を前記アレイに送達するように構成される、形態９４に記載の計器。
［形態９６］
前記容器は、前記ウェルと前記アレイとの間に希釈ゾーンを含み、前記希釈ゾーンは、前記既知の容積を前記ウェルから受容し、前記既知の容積をある容積の流体で希釈して、希釈された試料を得て、前記希釈された試料を前記アレイに送達するように構成される、形態９５に記載の計器。
［形態９７］
前記受け口は、前記加熱器要素が前記受け口に挿入された可撓性試料容器の１つまたは複数の部分に接触することを可能にするように位置付けられた１つまたは複数の開口部を有する実質的に平面の表面を含む、形態７８に記載の計器。
［形態９８］
前記容器の少なくとも１つの部分から光学データを集めるように構成された、光源およびカメラ要素を含む光学アレイをさらに備える、形態７８に記載の計器。
［形態９９］
前記加熱器要素は、第１の加熱器部分、第２の加熱器部分、および第３の加熱器部分を含む、形態７８に記載の計器。
［形態１００］
前記第１の加熱器部分は、抵抗性加熱器であり、前記第２の加熱器部分は、ペルチェ素子であり、前記第３の加熱器部分は、抵抗性加熱器である、形態９９に記載の計器。
［形態１０１］
前記第３の加熱器部分は、ペルチェ素子の上に抵抗性加熱器を備え、前記抵抗性加熱器は、前記第３の加熱器部分を加熱するために使用され、前記ペルチェ素子は、前記第３の加熱器部分を冷却するために実質的に同時に使用される、形態１００に記載の計器。
［形態１０２］
前記第１の加熱器部分、前記第２の加熱器部分、および前記第３の加熱器部分は、直線的に設置される、形態１０１に記載の計器。
［形態１０３］
前記計器の１つまたは複数の構成要素を制御するように、および／またはそこからデータを集めるように構成されたコンピューティングデバイスをさらに備える、形態７８〜１０２のいずれか一項に記載の計器。
［形態１０４］
可撓性試料容器を受容するための開口部であって、前記可撓性試料容器が少なくとも１つの反応ゾーンを含む、開口部と、
複数の加熱器であって、前記加熱器の各々が異なる温度に設定されるように構成され、各加熱器を前記少なくとも１つの反応ゾーンと順次整列させて、その中の試料を加熱または冷却することができるように、前記加熱器が実質的に平面の取付部に位置付けられる、複数の加熱器とを備える、試料内の核酸を増幅するための計器。
［形態１０５］
前記実質的に平面の取付部は、前記可撓性試料容器に隣接して回転されるように構成される円形取付部を備える、形態１０４に記載の計器。
［形態１０６］
前記円形取付部は、時計回り方向および反時計回り方向の両方に回転するように構成される、形態１０５に記載の計器。
［形態１０７］
反応ウェルのアレイを有する反応チャンバであって、前記アレイの前記ウェルの各々が、選択的に開放可能および選択的に密封可能な充填チャネルに流体接続される、反応チャンバを備える、可撓性試料容器。
［形態１０８］
前記可撓性試料容器は、第１のフィルム層、前記第１のフィルム層に少なくとも部分的に付着された第２のフィルム層、前記第２のフィルム層および前記アレイの前記反応ウェルが形成されるカード層の１つの表面に付着された接着剤層、ならびに第３の外側フィルム層および前記カード層の反対表面に付着された第２の接着剤層から製作され、
前記充填チャネルは、前記第１のフィルム層と前記第２のフィルム層との間に開放空間を残すことによって形成される、形態１０７に記載の可撓性試料容器。
［形態１０９］
前記充填チャネルは、前記第１のフィルム層および前記第２のフィルム層を前記反応ウェルの前記アレイの周りで一緒に密封するシール線によって画定される、形態１０８に記載の可撓性試料容器。
［形態１１０］
前記充填チャネルは、前記第２のフィルム層および前記第１の接着剤層内の選択的な切欠きによって形成された充填孔によって前記アレイの前記ウェルの各々に流体接続される、形態１０８に記載の可撓性試料容器。
［形態１１１］
前記充填孔は、前記アレイのウェルに隣接して、かつその上を流れるウェル充填チャネルに流体接続され、前記ウェル充填チャネルは、前記アレイの前記ウェルに隣接する前記カード層内に切欠きを、および前記第２の接着剤層内に別の切欠きを作製することによって形成される、形態１１０に記載の可撓性試料容器。
［形態１１２］
前記充填孔は、前記アレイのウェル内へ流れるウェル充填チャネルに流体接続され、前記ウェル充填チャネルは、前記充填孔を前記アレイの前記ウェルに流体接続する前記第１の接着剤層内の切欠きを作製することによって形成される、形態１１０に記載の可撓性試料容器。
［形態１１３］
前記充填チャネルはヒートシール可能である、形態１０７に記載の可撓性試料容器。
［形態１１４］
単一のヒートシールが、充填チャネルから複数の充填チャネルへの流れを密封し、前記ウェルを互いから密封する、形態１１３に記載の可撓性試料容器。
［形態１１５］
前記充填チャネルは、前記アレイに対して圧力を印加することによって密封可能である、形態１０７に記載の可撓性試料容器。
【国際調査報告】
2019513411.tif 000057
2019513411.tif 000058
2019513411.tif 000059