(57)【要約】  本発明は、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の局所用被覆組成物であって、局所用マトリックスに埋め込まれた間葉系幹細胞を含む組成物に関する。特に、本発明は、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、局所用マトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり最大約４００００個の間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、局所用マトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり最大約４００００個の間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、組成物を約２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、前記含まれる間葉系幹細胞の少なくとも約８０％が生存可能なままである、組成物。
【請求項２】
前記損傷を受けた皮膚組織が、外傷性創傷、外科的創傷、糖尿病性潰瘍、褥瘡、静脈性潰瘍、瘢痕、火傷、皮膚病変、湿疹および皮膚潰瘍を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組成物を約２５℃で少なくとも約１２ヶ月間保存した場合、前記含まれる間葉系幹細胞の少なくとも約８５％が生存可能なままである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記局所用被覆が、１平方センチメートル当たり最大約３５０００個の間葉系幹細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記局所用被覆が、１平方センチメートル当たり約１００００〜約３００００個の間葉系幹細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記局所用マトリックスがアルギナート、ポリウレタン、コラーゲン、キトサン、ペクチンおよびヒアルロン酸を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
溶液、懸濁液、エマルジョン、軟膏、フォーム、ペースト、ゲル、スプレー、包帯、パッチ、クリーム、ローションまたは粉末の形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
包帯またはパッチの形態である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記間葉系幹細胞が、対象の脂肪組織、骨髄、ホウォートンゼリー、歯系組織または臍帯に由来する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記間葉系幹細胞が自己移植または同種移植に適している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の包帯またはパッチの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、前記包帯またはパッチが局所用マトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり最大約４００００個の間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、組成物を約２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、前記間葉系幹細胞の少なくとも約８０％が生存可能なままである、組成物。
【請求項１２】
前記包帯またはパッチが無菌である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記包帯またはパッチが約０．５ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲の厚さを有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記損傷を受けた皮膚組織が、外傷性創傷、外科的創傷、糖尿病性潰瘍、褥瘡、静脈性潰瘍、瘢痕、火傷、皮膚病変、湿疹および皮膚潰瘍を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記間葉系幹細胞が脂肪組織に由来する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記局所用マトリックスが２％ｗ／ｖのアルギナート溶液を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１１に記載の貯蔵安定性局所用被覆組成物を調製する方法であって、
ａ）滅菌ガーゼシートをステンレス鋼鋳型上に置くステップと；
ｂ）間葉系幹細胞およびアルギナートマトリックスを前記滅菌ガーゼシートに施用するステップと；
ｃ）前記鋳型を塩化カルシウム溶液浴に入れるステップと；
ｄ）前記鋳型をリン酸緩衝液を含む浴に移して過剰のカルシウムを洗浄するステップと；
ｅ）インキュベーションのためにガーゼシートを培地フラスコに入れるステップと；
ｆ）前記ガーゼシートを３７℃、５％ＣＯ２で１４日間インキュベートするステップと；
ｇ）前記インキュベートしたガーゼシートを三層パウチに入れて前記局所用被覆組成物を得るステップと
を含む方法。
【請求項１８】
対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の二室型スプレーの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、（ｉ）一室の間葉系幹細胞および局所用マトリックス成分と、（ｉｉ）別室のゲル化成分とを含み、組成物を約２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、前記間葉系幹細胞の約８０％超が生存可能なままである、組成物。
【請求項１９】
対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用のゲルの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、前記ゲルが局所用マトリックスに埋め込まれた間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、前記局所用ゲルを約２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、前記間葉系幹細胞の約８０％超が生存可能なままである組成物。
【請求項２０】
対象において損傷を受けた皮膚組織を治療する方法であって、（ｉ）１平方センチメートル当たり最大約４００００個の間葉系幹細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物を前記損傷を受けた皮膚組織領域に施用するステップと、（ｉｉ）凍結乾燥粉末の形態の局所用マトリックスと、場合により薬学的に許容される賦形剤とを前記間葉系幹細胞組成物上に施用し、それによって前記損傷を受けた皮膚組織上に原位置スポンジを形成するステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の局所用被覆組成物であって、局所用マトリックスに埋め込まれた間葉系幹細胞を含む組成物に関する。特に、本発明は、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、局所用マトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり最大約４００００個の間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、その自己再生能および分化能を特徴とする。これらの細胞は、胚性幹細胞および成体幹細胞に分けられる。ほとんどの成体幹細胞は成体器官に見られる少数の集団であり、これらはその起源の組織の特定の細胞型、例えば間葉系幹細胞に分化することができる。適切な環境下で、間葉系幹細胞が中胚葉細胞、内胚葉細胞、およびさらには外胚葉細胞に分化することができることを示す一連の証拠がある。さらに、間葉系幹細胞は、宿主組織に移動および生着する能力を有し、組織再生の修復および増強を助けることができる。
【０００３】
間葉系幹細胞が媒介する免疫調節効果は、クローン病、１型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群および全身性硬化症などの種々の自己免疫障害の管理に応用することができる。しかしながら、免疫応答に対するそれらの重大な効果にもかかわらず、これらの療法は一定の患者において臨床的に有意な寛解を誘導しない。いくつかの文献論文および特許は、自己免疫障害および皮膚障害を含むいくつかの疾患の治療用の、患者から単離された血液成分の使用を開示している。
【０００４】
間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織、滑膜、乳歯、臍帯血および血管などのいくつかの組織に見られる多能性細胞である。間葉系幹細胞は、修復組織に分化する可能性があり、栄養および免疫調節的能力も有するので、治療のための有望な細胞型である。これらは損傷を受けた組織を改善することができることが示されているが、その寄与は長期の生着および分化から生じるようには思われない。このことは、間葉系幹細胞が、中胚葉系統の細胞に分化する能力に加えて、内因性組織修復を刺激することもできることを示唆している。さらに、ＭＳＣによって分泌されるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの増殖因子は、組織修復および免疫学的過程に影響を及ぼすことが示されている。間葉系幹細胞はまた「抗炎症性」特性を有する。これらの細胞は炎症を軽減し、正常な創傷の創傷治癒を促進する因子を分泌する。
【０００５】
いくつかの文献論文および特許は、皮膚疾患の治療における間葉系幹細胞の使用を開示している。Ｓｏｎｇら（２０１６）は、間葉系幹細胞の創傷被覆材を開示している。米国特許第８４３５７８７号明細書は、アルギナート技術を用いた肝細胞のマイクロカプセル化を開示している。Ｂｕｓｓｃｈｅら（２０１５）は、皮膚創傷治癒のためのマイクロカプセル化ウマ間葉系間質細胞を開示している。Ｓｃｈｍｉｔｔら（２０１５）は、ヒト間葉系細胞を含む系のマトリックスを開示している。Ｉｓａｋｓｏｎら（２０１５）は、フィブリンスプレーを用いた皮膚創傷治癒における間葉系幹細胞の使用を開示している。Ｍａｘｓｏｎら（２０１２）およびＤｕｓｃｈｅｒら（２０１４）は、創傷治癒における間葉系幹細胞の役割を開示している。米国特許出願公開第２０１２／０１４１４３３号明細書は、気化幹細胞誘導体の組成物、ならびに静脈瘤、慢性（長期）静脈不全、血栓静脈炎、および動静脈瘻などの皮膚の血管障害の治療におけるそれらの使用方法を開示している。
【０００６】
間葉系幹細胞は不安定であることが知られており、周囲条件で保存するとその生存率が損なわれる。間葉系幹細胞のほとんどが損傷を受けた皮膚組織の治療のために生存可能なままである、間葉系幹細胞を含む貯蔵安定性局所用被覆組成物を開発する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の１つの一般的な態様では、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の局所用被覆組成物であって、局所用マトリックスに埋め込まれた間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物が提供される。
【０００８】
本発明の別の一般的な態様では、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、局所用マトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり最大約４００００個の間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、組成物を約２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、含まれる間葉系幹細胞の少なくとも約８０％が生存可能なままである組成物が提供される。
【０００９】
本発明の別の一般的な態様では、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の包帯またはパッチの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、前記包帯またはパッチが局所用マトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり最大約４００００個の間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、組成物を約２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、間葉系幹細胞の少なくとも約８０％が生存可能なままである組成物が提供される。
【００１０】
本発明の別の一般的な態様では、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の二室型スプレーの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、（ｉ）一室の間葉系幹細胞および局所用マトリックス成分と、（ｉｉ）別室のゲル化成分とを含み、組成物を約２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、間葉系幹細胞の約８０％超が生存可能なままである組成物が提供される。
【００１１】
別の実施形態では、間葉系幹細胞成分（一室）が、塩化カルシウム溶液を含むゲル化成分（別室）から分離されている。
【００１２】
本発明の別の一般的な態様では、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用のゲルの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、前記ゲルが局所用マトリックスに埋め込まれた間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、局所用ゲルを約２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、間葉系幹細胞の約８０％超が生存可能なままである組成物が提供される。
【００１３】
本発明の別の一般的な態様では、対象において損傷を受けた皮膚組織を治療する方法であって、（ｉ）１平方センチメートル当たり最大約４００００個の間葉系幹細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物を損傷を受けた皮膚組織領域に施用するステップと、（ｉｉ）凍結乾燥粉末の形態の局所用マトリックスと、場合により薬学的に許容される賦形剤とを間葉系幹細胞組成物上に施用し、それによって損傷を受けた皮膚組織上に原位置スポンジを形成するステップとを含む方法が提供される。
【００１４】
本発明の一実施形態では、損傷を受けた皮膚組織が、外傷性（ｔｒａｕｍａｔｉｃ）創傷、外科的（ｓｕｒｇｉｃａｌ）創傷、糖尿病性潰瘍、褥瘡、静脈性潰瘍、瘢痕、火傷、皮膚病変、湿疹および皮膚潰瘍を含む。損傷を受けた皮膚組織の非限定的な例としては、糖尿病性足部潰瘍、尋常性天疱瘡、および表皮水疱症、膿痂疹、化膿性汗腺炎、ケロイド、扁平苔癬が挙げられる。
【００１５】
本発明の別の実施形態では、間葉系幹細胞が対象の脂肪組織、骨髄、ホウォートンゼリー、歯系組織または臍帯に由来し、好ましくは間葉系幹細胞が脂肪組織に由来し；間葉系幹細胞が自己移植または同種移植に適している。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、局所用被覆組成物が、血管内皮増殖因子、肝細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子および表皮増殖因子から選択される増殖因子を含む。
【００１７】
本発明の一実施形態では、局所用被覆が、１平方センチメートル当たり最大約４００００個、または約３５０００個、または約３００００個、または約２５０００個、または約２００００個、または約１５０００個または約１００００個の間葉系幹細胞を含む。好ましくは、局所用被覆が、１平方センチメートル当たり約１００００〜約３００００個、または約１５０００〜約２５０００個、または約２００００個の間葉系幹細胞を含む。
【００１８】
本発明の別の実施形態では、組成物を約２５℃で少なくとも約６ヶ月間保存した場合、含まれる間葉系幹細胞の約８５％超、または約８０％超が生存可能なままである。好ましくは、組成物を約２５℃で約１２ヶ月間、または約１８ヶ月間、または約２４ヶ月間保存した場合、間葉系幹細胞が生存可能なままである。
【００１９】
一実施形態では、組成物が、約２℃〜約８℃で保存した場合でも、安定である。好ましくは、組成物を約２℃〜約８℃で約６ヶ月間、約１２ヶ月間、または約１８ヶ月間、または約２４ヶ月間保存した場合、間葉系幹細胞が生存可能なままである。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態では、局所用マトリックスがアルギナート、ポリウレタン、コラーゲン、キトサン、ペクチンおよびヒアルロン酸を含む。別の実施形態では、局所用マトリックスが、２％ｗ／ｖのアルギナート溶液、または２％ｗ／ｖのキトサン溶液、または２％ｗ／ｖのヒアルロン酸溶液を含む。
【００２１】
本発明の別の実施形態では、組成物が、溶液、懸濁液、エマルジョン、軟膏、フォーム、ペースト、ゲル、スプレー、包帯、パッチ、クリーム、ローションまたは粉末の形態である。本発明の文脈においては、組成物が包帯またはパッチの形態である。
【００２２】
本発明の別の実施形態では、包帯またはパッチが無菌であり、包帯またはパッチが約０．５ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲の厚さを有する。
【００２３】
本発明の別の実施形態では、包帯またはパッチの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物を調製する方法であって、
ａ）滅菌ガーゼシートをステンレス鋼鋳型上に置くステップと；
ｂ）間葉系幹細胞およびアルギナートマトリックスを滅菌ガーゼシートに施用するステップと；
ｃ）鋳型を塩化カルシウム溶液浴に入れるステップと；
ｄ）鋳型をリン酸緩衝液を含む浴に移して過剰のカルシウムを洗浄するステップと；
ｅ）インキュベーションのためにガーゼシートを培地フラスコに入れるステップと；
ｆ）ガーゼシートを３７℃、５％ＣＯ２で１４日間インキュベートするステップと；
ｇ）インキュベートしたガーゼシートを三層パウチに入れて局所用被覆組成物を得るステップと
を含む方法が提供される。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、局所用被覆組成物中の間葉系幹細胞を安定化する方法であって、１平方センチメートル当たり最大約４００００個の間葉系幹細胞を薬学的に許容される賦形剤と共に局所用マトリックスに埋め込むステップを含み、組成物を約２５℃で少なくとも約６ヶ月間保存した場合、含まれる間葉系幹細胞の少なくとも約８０％が生存可能なままである方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ヒト対象における６週間の局所用被覆組成物の施用前および後の創傷表面の写真比較を示す図である。
【図２】ヒト対象における３ヶ月間の局所用被覆組成物の施用前および後の創傷表面の写真比較を示す図である。
【図３】ヒト対象におけるスポンジに含浸された間葉系幹細胞の写真提示を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明を具体的な実施形態に関して説明してきたが、一定の修正および等価物が当業者に明らかであり、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。
【００２７】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、急性または慢性創傷などの対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の間葉系幹細胞の有益な使用を見出した。本発明者らは、損傷を受けた皮膚組織を修復するための安定で有効な局所用被覆組成物であって、局所用マトリックスに埋め込まれた間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物を発明した。
【００２８】
本発明の１つの一般的な態様では、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の局所用被覆組成物であって、局所用マトリックスに埋め込まれた間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物が提供される。
【００２９】
本発明の別の態様では、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、局所用マトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり最大約４００００個の間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、組成物を約２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、含まれる間葉系幹細胞の少なくとも約８０％が生存可能なままである組成物が提供される。
【００３０】
本発明の別の態様では、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の包帯またはパッチの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、前記包帯またはパッチが局所用マトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり最大約４００００個の間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、組成物を約２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、間葉系幹細胞の少なくとも約８０％が生存可能なままである組成物が提供される。
【００３１】
本発明の別の態様では、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の二室型スプレーの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、（ｉ）一室の間葉系幹細胞および局所用マトリックス成分と、（ｉｉ）別室のゲル化成分とを含み、組成物を約２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、間葉系幹細胞の約８０％超が生存可能なままである組成物が提供される。
【００３２】
別の実施形態では、ゲル化成分が、第１の室から物理的に分離されている第２の室に含まれる塩化カルシウム溶液を含む。別の実施形態では、塩化カルシウム溶液は、作動時にスプレー中の間葉系幹細胞成分と混合しない。
【００３３】
本発明の別の一般的な態様では、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用のゲルの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、前記ゲルが局所用マトリックスに埋め込まれた間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、局所用ゲルを約２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、間葉系幹細胞の約８０％超が生存可能なままである組成物が提供される。
【００３４】
本発明の別の一般的な態様では、対象において損傷を受けた皮膚組織を治療する方法であって、（ｉ）１平方センチメートル当たり最大約４００００個の間葉系幹細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物を損傷を受けた皮膚組織領域に施用するステップと、（ｉｉ）凍結乾燥粉末の形態の局所用マトリックスと、場合により薬学的に許容される賦形剤とを間葉系幹細胞組成物上に施用し、それによって損傷を受けた皮膚組織上に原位置スポンジを形成するステップとを含む方法が提供される。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「貯蔵安定性」という用語は、組成物を約２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、間葉系幹細胞の少なくとも約８０％が生存可能なままである、間葉系幹細胞を含む局所用被覆組成物に関する。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「局所用被覆」という用語は、損傷皮膚組織部位における本発明の組成物の外用に関する。したがって、このような局所用被覆組成物は本発明において有用であり、組成物が治療される皮膚表面と直接接触することによって外的に施用される医薬形態を含む。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「治療」という用語は、本発明の局所用被覆組成物からの有益なまたは望ましい臨床結果を指す。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「損傷を受けた皮膚組織」という用語は、任意の種類の損傷を有する皮膚組織を指す。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「生存可能な」という用語は、活性で機能的なままである間葉系幹細胞を指す。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「間葉系幹細胞」という用語は、対象の脂肪組織、骨髄、ホウォートンゼリー、歯系組織または臍帯に由来する間葉系幹細胞を指す。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「自己」という用語、同じ対象に由来する細胞または組織を意味する。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「同種」という用語は、同じ種の別の、遺伝的に異なる対象に由来する細胞または組織を意味する。
【００４３】
本発明の一実施形態では、損傷を受けた皮膚組織が急性創傷および／または慢性創傷を含む。
【００４４】
間葉系幹細胞は、種々の異なる細胞型に分化し、骨、軟骨およびその他の間葉系組織を生じることができる非造血性の多能性細胞である。間葉系幹細胞は、いくつかの細胞突起を伴う小細胞体によって形態学的に特徴付けられる。細胞体は、核にはっきりとした外観を与える、微細分散クロマチン粒子によって囲まれた目立つ核小体を有する大きく丸い核を含む。細胞体の残りは少量のゴルジ体、粗面小胞体、ミトコンドリアおよびポリリボソームを含む。長く細い細胞が広く分散しており、隣接する細胞外マトリックスには少数の細網原線維が存在しているが、他の種類のコラーゲン原線維は存在しない。
【００４５】
本発明の一実施形態では、間葉系幹細胞が、対象の脂肪組織、骨髄、ホウォートンゼリー、歯系組織または臍帯に由来する。好ましくは、間葉系幹細胞は脂肪組織に由来し、このような間葉系幹細胞は自己移植または同種移植に適している。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、組成物が、血管内皮増殖因子、肝細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子および表皮増殖因子から選択される増殖因子を含む。
【００４７】
本発明の一実施形態では、局所用被覆が、１平方センチメートル当たり約１００００〜約３００００個、または約１５０００〜約２５０００個、または約２００００個の間葉系幹細胞を含む。
【００４８】
別の実施形態では、局所用被覆組成物が、１平方センチメートル当たり約１００００個、または約１５０００個、または約２００００個、または約２５０００個、または約３００００個、または約３５０００個、または約４００００個の間葉系幹細胞を含む。各量が本発明の代替実施形態を構成する。
【００４９】
本発明の別の実施形態では、組成物を約２５℃で少なくとも約６ヶ月間保存した場合、含まれる間葉系幹細胞の約８５％超、または約８０％超が生存可能なままである。好ましくは、組成物を約２５℃で約１２ヶ月間、または約１８ヶ月間、または約２４ヶ月間保存した場合、間葉系幹細胞が生存可能なままである。
【００５０】
一実施形態では、組成物が、約２℃〜約８℃で保存した場合でも、安定である。好ましくは、組成物を約２℃〜約８℃で約６ヶ月間、約１２ヶ月間、または約１８ヶ月間、または約２４ヶ月間保存した場合、間葉系幹細胞が生存可能なままである。
【００５１】
局所用マトリックスは、間葉系幹細胞が創傷部位から移動する傾向を減らすための潜在的な解決策である。マトリックスは細胞生存のために細胞を固定化するのを助ける。
【００５２】
本発明の別の実施形態では、局所用マトリックスがアルギナート、ポリウレタン、コラーゲン、キトサン、ペクチンおよびヒアルロン酸を含む。別の実施形態では、局所用マトリックスが、２％ｗ／ｖのアルギナート溶液、または２％ｗ／ｖのキトサン溶液、または２％ｗ／ｖのヒアルロン酸溶液を含む。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、組成物が、溶液、懸濁液、エマルジョン、軟膏、フォーム、ペースト、ゲル、スプレー、包帯、パッチ、クリーム、ローションまたは粉末の形態である。本発明の文脈においては、組成物が包帯またはパッチの形態である。
【００５４】
本発明の別の実施形態では、包帯またはパッチが無菌であり、包帯またはパッチが約０．５ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲、または約１ｍｍ、または約２ｍｍ、または約３ｍｍ、または約４ｍｍ、または約５ｍｍ、または約６ｍｍ、または約７ｍｍ、または約８ｍｍ、または約９ｍｍの厚さを有する。各量が本発明の代替実施形態を構成する。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、包帯またはパッチの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物を調製する方法であって、
ａ）滅菌ガーゼシートをステンレス鋼鋳型上に置くステップと；
ｂ）間葉系幹細胞およびアルギナートマトリックスを滅菌ガーゼシートに施用するステップと；
ｃ）鋳型を塩化カルシウム溶液浴に入れるステップと；
ｄ）鋳型をリン酸緩衝液を含む浴に移して過剰のカルシウムを洗浄するステップと；
ｅ）インキュベーションのためにガーゼシートを培地フラスコに入れるステップと；
ｆ）ガーゼシートを３７℃、５％ＣＯ２で１４日間インキュベートするステップと；
ｇ）インキュベートしたガーゼシートを三層パウチに入れて局所用被覆組成物を得るステップと
を含む方法が提供される。
【００５６】
本発明の一実施形態では、局所用被覆組成物が、場合により増粘剤、緩衝剤、界面活性剤、酸化防止剤、安定剤および溶媒から選択される薬学的に許容される賦形剤を含む。
【００５７】
本明細書で使用される「増粘剤」は、それだけに限らないが、アニオン性セルロース材料、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース；アニオン性ポリマー、例えばカルボキシビニルポリマー；非イオン性セルロース材料、例えばメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース；ヒドロキシエチルセルロース；カチオン性セルロース材料、例えばＰｏｌｙｍｅｒ  ＪＲ  ４００；カチオン性ガム材料、例えばＪａｇｕａｒ  Ｃ１３  Ｓ；他のガム材料、例えばアラビアガム、トラガント、ローカストビーンガム、グアーガムおよびカラギーナン；タンパク質、例えばアルブミンおよびタンパク質加水分解物；ならびに粘土材料、例えばベントナイト、ヘクトライト、マグネシウムアルミニウムシリケート、ケイ酸ナトリウムマグネシウムおよびこれらの組み合わせの１つまたは複数を含む。好ましい増粘剤はヒドロキシエチルセルロースである。
【００５８】
増粘剤の濃度は、組成物の約５重量％〜約２５重量％、または組成物の約１０重量％、または約１５重量％、または約２０重量％に及ぶ。この濃度の各々が本発明の代替実施形態を構成する。好ましい濃度は、組成物の約５重量％、または約１０重量％、または約１５重量％、または約２０重量％である。
【００５９】
本明細書で使用される「保存剤」には、それだけに限らないが、エタノール、安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、プロピオン酸ナトリウム、ならびにｐ−ヒドロキシ安息香酸のメチル、エチル、プロピルおよびブチルエステル、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、フェノキシエタノール、ジブロモジシアノブタン、ホルマリン、トリクロサンならびにこれらの組み合わせの１つまたは複数が含まれる。
【００６０】
保存剤の濃度は、組成物の０．１重量％〜２重量％、または約０．１重量％、または約０．２重量％、または約０．３重量％、または約０．４重量％、または約０．５重量％、または約０．６重量％、または約０．７重量％、または約０．８重量％、または約０．９重量％、または約１．０重量％、または約１．１重量％、または約１．２重量％、または約１．３重量％、または約１．４重量％、または約１．５重量％、または約１．６重量％、または約１．７重量％、または約１．８重量％、または約１．９重量％、または約２重量％に及ぶ。保存剤の好ましい濃度は、組成物の約０．３重量％、または約０．４５重量％、または約０．５重量％、または約０．６５重量％、または約０．７５重量％である。
【００６１】
本明細書で使用される「緩衝剤」には、それだけに限らないが、クエン酸、クエン酸一水和物、ホウ酸、およびリン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム二水和物、リン酸一カリウム、リン酸二ナトリウムおよびこれらの組み合わせの１つまたは複数が含まれる。
【００６２】
本明細書で使用される「界面活性剤」は、ナトリウムビス（２−エチルヘキシル）スルホサクシナート、ナトリウムビス（トリデシル）スルホサクシナート、ビス（ジアルキル）スルホサクシナート塩、ポリジメチルシロキサンおよびポリエチレン／ポリプロピレン−オキシドのコポリマー、ポリオキシプロピレン（１２）ジメチコン、セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン、ヘキシルラウラートおよびポリグリセリル−４−イソステアラート、ＰＥＧ−１０ジメチコン、ソルビタンモノラウラート、ソルビタンモノオレアート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレアート（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０）、ポリエトキシ化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン２０セチルエーテル、ポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル、ナトリウムジ（２−エチルヘキシル）ホスファート、ナトリウムジ（オレイル）ホスファート、ナトリウムジ（トリデシル）ホスファート、ナトリウムドデシルベンゼンスルホナート、ナトリウム３−ドデシルアミノプロパンスルホナート、ナトリウム３−ドデシルアミノプロピオナート、ナトリウムＮ−２−ヒドロキシドデシル−Ｎ−メチルタウラート、レシチン、スクロース脂肪酸エステル、２−エチルヘキシルグリセリン、カプリリルグリコール、モノアルキルグリコールの長鎖疎水性隣接ジオール、モノアルキルグリセロール、またはモノアシルグリセロール、ポリオキシルヒマシ油誘導体、ポリエチレングリコール硬化ヒマシ油、オレイン酸カリウム、オレイン酸ナトリウム、セチルピリジニウムクロリド、アルキルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化ベンザルコニウム、ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド、トリオクチルメチルアンモニウムブロミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、およびこれらの組み合わせの１つまたは複数を含む群から選択され得る。好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０、オレイン酸ナトリウム、レシチン、スクロース脂肪酸エステル、およびポリオキシルヒマシ油誘導体である。各々が本発明の代替実施形態を構成する。
【００６３】
本明細書で使用される適切な「酸化防止剤」は、アセチルシステイン、アスコルビン酸、アスコルビン酸ポリペプチド、ジパルミチン酸アスコルビル、アスコルビルメチルシラノールペクチナート、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、ＢＨＡ、ＢＨＴ、ｔ−ブチルヒドロキノン、システイン、システインＨＣｌ、ジアミルヒドロキノン、ジ−ｔ−ブチルヒドロキノン、ジセチルチオジプロピオナート、ジオレイルトコフェリルメチルシラノール、ジナトリウムアスコルビルサルファート、ジステアリルチオジプロピオナート、ジトリデシルチオジプロピオナート、没食子酸ドデシル、エリソルビン酸、アスコルビン酸のエステル、フェルラ酸エチル、フェルラ酸、没食子酸エステル、ヒドロキノン、チオグリコール酸イソオクチル、コウジ酸、アスコルビン酸マグネシウム、リン酸アスコルビルマグネシウム、アスコルビン酸メチルシラノール、天然植物性酸化防止剤、例えば緑茶またはブドウ種子エキス、ノルジヒドログアヤレチン酸、没食子酸オクチル、フェニルチオグリコール酸、アスコルビルトコフェリルリン酸カリウム、亜硫酸カリウム、没食子酸プロピル、キノン、ロスマリン酸、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、エリソルビン酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、スーパーオキシドジスムターゼ、チオグリコール酸ナトリウム、ソルビチル（ｓｏｒｂｉｔｙｌ）フルフラール、チオジグリコール、チオジグリコールアミド、チオジグリコール酸、チオグリコール酸、チオ乳酸、チオサリチル酸、トコフェレス（ｔｏｃｏｐｈｅｒｅｔｈ）−５、トコフェレス−１０、トコフェレス−１２、トコフェレス−１８、トコフェレス−５０、トコフェロール、トコフェルソラン、酢酸トコフェリル、リノール酸トコフェリル、ニコチン酸トコフェリル、コハク酸トコフェリル、トリス（ノニルフェニル）ホスファートおよびこれらの組み合わせの１つまたは複数を含む群から選択され得る。
【００６４】
本発明の別の実施形態では、間葉系幹細胞を、脂肪生成、軟骨形成、および骨形成分化培地を用いて分化する能力について評価する。細胞表面マーカーはフローサイトメトリーによって評価する。細胞の生存率はフローサイトメーターでの色素排除７ＡＡＤ分析によってアッセイする。細胞周期分析およびＤＮＡ倍数性は、Ｃｙｃｌｅ  Ｔｅｓｔ  ＢＤおよびＦＩＴＣ  ＢｒｄＵ  Ｆｌｏｗ  Ｋｉｔ（ＢＤ  ＢｉｓＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて確立する。マイコプラズマおよびｓｏｘ２、ｎａｎｏｇの発現は、それぞれＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲによって行う。内毒素および無菌性は、ＬＡＬアッセイキットおよび微生物培養法を用いて確立する。
【００６５】
別の実施形態では、間葉系幹細胞を培養し、その懸濁液を当業者に公知の増殖培地中で調製する。好ましい培地は、それだけに限らないが、リン酸緩衝食塩水、生理食塩水、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、ＤＭＥＭ−Ｆ１２およびＤＭＥＭ−低グルコースから選択される。最も好ましい培地はＤＭＥＭである。
【００６６】
別の実施形態では、本発明は、局所用被覆組成物中の間葉系幹細胞を安定化する方法であって、１平方センチメートル当たり最大約４００００個の間葉系幹細胞を薬学的に許容される賦形剤と共に局所用マトリックスに埋め込むステップを含み、組成物を約２５℃で少なくとも約６ヶ月間保存した場合、含まれる間葉系幹細胞の少なくとも約８０％が生存可能なままである方法に関する。
【００６７】
本発明の一実施形態では、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、局所用マトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり約１００００〜約３００００個の間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、組成物を約２５℃で少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１２ヶ月間保存した場合、含まれる間葉系幹細胞の少なくとも約８０％が生存可能なままである組成物が提供される。
【００６８】
本発明の一実施形態では、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、アルギナートマトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり約１５０００〜約２５０００個の間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、組成物を約２５℃で少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１２ヶ月間保存した場合、含まれる間葉系幹細胞の少なくとも約９０％が生存可能なままである組成物が提供される。
【００６９】
本発明の一実施形態では、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、アルギナートマトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり約１５０００〜約２２０００個の間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、組成物を約２℃〜約８℃で少なくとも１２ヶ月間、または少なくとも１８ヶ月間保存した場合、含まれる間葉系幹細胞の少なくとも約９０％が生存可能なままである組成物が提供される。
【００７０】
本発明の一実施形態では、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の包帯またはパッチの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、前記包帯またはパッチがアルギナートマトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり約１８０００〜約２２０００個の間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、組成物を約２５℃で少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１２ヶ月間保存した場合、間葉系幹細胞の少なくとも約９０％が生存可能なままである組成物が提供される。
【００７１】
本発明の一実施形態では、対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の包帯またはパッチの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、前記包帯またはパッチがアルギナートマトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり約２００００個の間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、組成物を約２℃〜約８℃で少なくとも１２ヶ月間、または少なくとも１８ヶ月間保存した場合、間葉系幹細胞の少なくとも約９０％が生存可能なままである組成物が提供される。
【００７２】
本発明の一実施形態では、対象の急性および／または慢性創傷の治療用の無菌包帯またはパッチの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、前記包帯またはパッチがアルギナートマトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり約１８０００〜約２２０００個の間葉系幹細胞と、積層パウチに充填された滅菌ガーゼとを含み、組成物を約２５℃で少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１２ヶ月間保存した場合、間葉系幹細胞の少なくとも約９０％が生存可能なままである組成物が提供される。
【００７３】
本発明の一実施形態では、対象の急性および／または慢性創傷の治療用の無菌包帯またはパッチの形態の局所用被覆組成物を含むパウチまたはサシェであって、前記包帯またはパッチがアルギナートマトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり約１８０００〜約２２０００個の間葉系幹細胞と、滅菌ガーゼとを含み、パウチまたはサシェを約２５℃で少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１２ヶ月間保存した場合、間葉系幹細胞の少なくとも約９０％が生存可能なままであるパウチまたはサシェが提供される。一実施形態では、パウチまたはサシェが、ポリエチレンテレフタラート、ポリプロピレン、アルミニウム、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、エチルビニリジンコポリマーおよびポリスチレンを含む材料からなる。
【００７４】
本発明の一実施形態では、対象の急性および／または慢性創傷の治療用の無菌包帯またはパッチの形態の局所用被覆組成物を含むパウチまたはサシェであって、前記包帯またはパッチがアルギナートマトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり約１８０００〜約２２０００個の間葉系幹細胞と、滅菌ガーゼとを含み、パウチまたはサシェを約２５℃で少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１２ヶ月間保存した場合、間葉系幹細胞の少なくとも約９０％が生存可能なままであるパウチまたはサシェが提供される。一実施形態では、パウチまたはサシェが、ポリエチレンテレフタラート、ポリプロピレン、アルミニウム、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、エチルビニリジンコポリマーおよびポリスチレンを含む材料からなる。
【００７５】
本発明の一実施形態では、（ｉ）対象の急性および／または慢性創傷の治療用の無菌包帯またはパッチの形態の局所用被覆組成物であって、前記包帯またはパッチがアルギナートマトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり約１８０００〜約２２０００個の間葉系幹細胞と、滅菌ガーゼとを含む組成物と、（ｉｉ）綿、ラップおよび創傷洗浄剤を含む外科用補助剤とを含むキットであって、パウチまたはサシェを約２５℃で少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１２ヶ月間保存した場合、間葉系幹細胞の少なくとも約９０％が生存可能なままであるキットが提供される。
【００７６】
以下の例により本発明をさらに説明するが、これは単に本発明の例示となるために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものではない。一定の修正および等価物が当業者に明らかであり、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。
【００７７】
例
例１：間葉系幹細胞の局所用包帯／パッチ組成物
対象の脂肪組織由来の間葉系幹細胞を０．０１Ｍ  ＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＢＳ完全培地（１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地）で予め湿らせた使い捨て培養フラスコの底に移し、加湿雰囲気中３７℃および５％ＣＯ２で１〜２時間インキュベートした。培地を３日毎に交換した。細胞が８０％超コンフルエンスに達したら、細胞を０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンおよび０．０２％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡでトリプシン処理し、２×１０４個細胞／ｃｍ２の密度で継代培養した。
【００７８】
間葉系幹細胞（約１００×１０８個細胞）および２％アルギン酸ナトリウムを含む５ｍＬ懸濁液をＤＭＥＭ培地中で調製した。
【００７９】
包帯／パッチの形態の局所用被覆組成物を調製するための手順：
ａ）滅菌ガーゼシートをステンレス鋼鋳型上に置いた；
ｂ）間葉系幹細胞およびアルギナートマトリックスを滅菌ガーゼシートに施用した；
ｃ）鋳型を塩化カルシウム溶液浴に入れた；
ｄ）鋳型をリン酸緩衝液を含む浴に移して過剰のカルシウムを洗浄した；
ｅ）インキュベーションのためにガーゼシートを培地フラスコに入れた；
ｆ）ガーゼシートを３７℃、５％ＣＯ２で１４日間インキュベートした；および
ｇ）インキュベートしたガーゼシートを三層パウチに入れて包帯／パッチの形態の局所用被覆組成物を得た。
【００８０】
例１Ａ：創傷治癒のための例１の局所用包帯／パッチ組成物の施用。
局所用包帯／パッチを、対象において損傷を受けた皮膚組織、すなわち創傷の治療のために使用した。例１の局所用被覆組成物の施用は、自己移植または同種移植に適している。例１によると、局所用包帯／パッチを無菌条件下で調製した。包帯／パッチを施用する前に、創傷を滅菌生理食塩水で穏やかに洗い流して懐死組織片を除去した。間葉系幹細胞を含む局所用パッチを創傷のある皮膚表面に施用した。局所用包帯／パッチを３〜７日間創傷上に残した。局所用包帯／パッチ施用を少なくとも３回、創傷閉鎖が観察されるまで繰り返した。３ヶ月間の治療終了時に観察されるように、創傷領域が有意に修復され、創傷が完全に閉鎖されたことが表１、表２および図１の結果から明らかである。
【表１】
2019531159.tif 000002
【表２】
2019531159.tif 000003
【００８１】
例１Ｂ：間葉系幹細胞の生存率についての安定性データ。
単離および培養した間葉系幹細胞を、脂肪生成、軟骨形成、および骨形成分化培地を用いて分化する能力について評価する。細胞表面マーカーはフローサイトメトリーによって評価する。細胞の生存率はフローサイトメーターでの色素排除７ＡＡＤ分析によってアッセイする。
【００８２】
試験のために、表３に言及される６種の局所用被覆組成物（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６）を、例１に示される手順に従って調製した。
【表３】
2019531159.tif 000004
【００８３】
組成物を約４℃および２５℃で１２ヶ月間保存した場合、間葉系幹細胞の少なくとも約８０％が生存可能なままであることが表２から明らかである。
【００８４】
例２：間葉系幹細胞および凍結乾燥アルギナート粉末の局所用組成物：
対象の脂肪組織由来の間葉系細胞を０．０１Ｍ  ＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＢＳ完全培地（１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地）で予め湿らせた使い捨て培養フラスコの底に移し、加湿雰囲気中３７℃および５％ＣＯ２で１〜２時間インキュベートした。培地を３日毎に交換した。細胞が８０％超コンフルエンスに達したら、細胞を０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンおよび０．０２％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡでトリプシン処理し、２×１０４個細胞／ｃｍ２の密度で継代培養した。
【００８５】
間葉系幹細胞（約１００×１０８個細胞）を含む５ｍＬ懸濁液をＤＭＥＭ培地中で調製した。２％ｗ／ｖアルギナート重合ゲルを調製し、凍結乾燥する。
【００８６】
例２Ａ：創傷治癒のための例２の局所用被覆組成物の施用：
局所用被覆組成物を、対象において損傷を受けた皮膚組織、すなわち創傷の治療のために使用した。例２の局所用被覆組成物の施用は、自己移植または同種移植に適している。例２によると、組成物を無菌条件下で調製した。組成物を施用する前に、創傷を滅菌生理食塩水で穏やかに洗い流して懐死組織片を除去した。間葉系幹細胞を含む組成物を創傷のある皮膚表面に施用した。凍結乾燥粉末を間葉系幹細胞の施用に適用し、それによって創傷表面上にスポンジを形成した。間葉系幹細胞を図３に示されるようにスポンジに含浸させた。組成物を１〜３日間創傷表面上に残した。組成物施用を少なくとも３回、創傷閉鎖が観察されるまで繰り返した。６週間の治療終了時に観察されるように、創傷領域が有意に修復され、創傷が閉鎖されたことが表４および図２の結果から明らかである。
【表４】
2019531159.tif 000005
【００８７】
例３：間葉系幹細胞、アルギナートおよび石灰化剤の二室型スプレー組成物：
対象の脂肪組織由来の間葉系細胞を０．０１Ｍ  ＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＢＳ完全培地（１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地）で予め湿らせた使い捨て培養フラスコの底に移し、加湿雰囲気中３７℃および５％ＣＯ２で１〜２時間インキュベートした。培地を３日毎に交換した。細胞が８０％超コンフルエンスに達したら、細胞を０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンおよび０．０２％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡでトリプシン処理し、２×１０４個細胞／ｃｍ２の密度で継代培養した。
【００８８】
間葉系幹細胞および２％アルギン酸ナトリウムを含む５ｍＬ懸濁液をＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）培地中で調製した。別に５ｍＬのＣａＣｌ２溶液（１５０ｍＭ）を調製した。間葉系幹細胞−アルギナート懸濁液および塩化カルシウム溶液を、２つの別々の室およびバルブを備えた容器に無菌的に充填し、以下のように二室型スプレーを得た：
【表Ａ】
2019531159.tif 000006
【表Ｂ】
2019531159.tif 000007
【００８９】
例３Ａ：創傷治癒のための例３の局所用被覆組成物の施用：
局所用被覆組成物を、対象において損傷を受けた皮膚組織、すなわち創傷の治療のために使用した。例３の局所用被覆組成物の施用は、自己移植または同種移植に適している。例３によると、組成物を無菌条件下で調製した。組成物を施用する前に、創傷を滅菌生理食塩水で穏やかに洗い流して懐死組織片を除去した。間葉系細胞を含む局所用スプレーを創傷のある皮膚表面に施用した。組成物を１〜３日間創傷表面上に残した。組成物施用を少なくとも３回、創傷閉鎖が観察されるまで繰り返した。８週間の治療終了時に観察されるように、創傷領域が有意に修復され、創傷が閉鎖されたことが表５の結果から明らかである。
【表５】
2019531159.tif 000008
【００９０】
例４：アルギナートマトリックスに埋め込まれた間葉系幹細胞のゲル組成物：
対象の脂肪組織由来の間葉系細胞を０．０１Ｍ  ＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＢＳ完全培地（１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地）で予め湿らせた使い捨て培養フラスコの底に移し、加湿雰囲気中３７℃および５％ＣＯ２で１〜２時間インキュベートした。培地を３日毎に交換した。細胞が８０％超コンフルエンスに達したら、細胞を０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンおよび０．０２％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡでトリプシン処理し、２×１０４個細胞／ｃｍ２の密度で継代培養した。
【００９１】
間葉系幹細胞および２％アルギン酸ナトリウムを含む懸濁液をＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）培地中で調製した。プロピレングリコールとヒドロキシエチルセルロースの混合物を調製した。間葉系幹細胞を含む懸濁液を、プロピレングリコールとヒドロキシエチルセルロースの混合物に混合しながらゆっくり添加した。最後に、食塩水（０．９％ｗ／ｖの塩化ナトリウム溶液）を添加して体積を調整してゲル組成物を得た。全ての工程を無菌条件下で行った：
【表Ｃ】
2019531159.tif 000009
【００９２】
例４Ａ：創傷治癒のための例４の局所用組成物の施用：
局所用組成物を使用して患者の皮膚創傷を修復した。例４によると、局所用組成物を無菌条件下で調製した。組成物を施用する前に、創傷を滅菌生理食塩水で穏やかに洗い流して懐死組織片を除去した。間葉系細胞を含む局所用組成物を創傷のある皮膚表面に施用した。局所用組成物を１〜３日間創傷上に残した。局所用組成物施用を少なくとも３回、創傷閉鎖が観察されるまで繰り返した。６週間の治療終了時に観察されるように、創傷領域が有意に修復され、創傷が閉鎖されたことが表６から明らかである。
【表６】
2019531159.tif 000010
【００９３】
例５：間葉系幹細胞の局所用被覆組成物
対象の脂肪組織由来の間葉系細胞を０．０１Ｍ  ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で洗浄し、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）完全培地（１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）培地）で予め湿らせた使い捨て培養フラスコの底に移し、加湿雰囲気中３７℃および５％ＣＯ２で１〜２時間インキュベートした。培地を３日毎に交換した。細胞が８０％超コンフルエンスに達したら、細胞を０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンおよび０．０２％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡでトリプシン処理し、２×１０４個細胞／ｃｍ２の密度で継代培養した。間葉系幹細胞および２％アルギン酸ナトリウムを含む５ｍＬ懸濁液をＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）培地中で調製して局所用組成物を得た。全ての工程を以下のように無菌条件下で行った：
【表Ｄ】
2019531159.tif 000011
【００９４】
例６：間葉系幹細胞の局所用被覆組成物
対象の脂肪組織由来の間葉系細胞を０．０１Ｍ  ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で洗浄し、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）完全培地（１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）培地）で予め湿らせた使い捨て培養フラスコの底に移し、加湿雰囲気中３７℃および５％ＣＯ２で１〜２時間インキュベートした。培地を３日毎に交換した。細胞が８０％超コンフルエンスに達したら、細胞を０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンおよび０．０２％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡでトリプシン処理し、２×１０４個細胞／ｃｍ２の密度で継代培養した。
【００９５】
間葉系幹細胞を含む５ｍＬ懸濁液をＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）培地中で調製して、局所用組成物を得た。全ての工程を以下のように無菌条件下で行った：
【表Ｅ】
2019531159.tif 000012
【図１】
2019531159.tif 000013
【図２】
2019531159.tif 000014
【図３】
2019531159.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月18日(2019.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の包帯またはパッチの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、前記包帯またはパッチが０．５ｍｍ〜１０ｍｍの範囲の厚さを有し、局所用アルギナートマトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり１００００〜４００００個の間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、組成物を２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、前記含まれる間葉系幹細胞の少なくとも８０％が生存可能なままである、組成物。
【請求項２】
前記損傷を受けた皮膚組織が、外傷性創傷、外科的創傷、糖尿病性潰瘍、褥瘡、静脈性潰瘍、瘢痕、火傷、皮膚病変、湿疹または皮膚潰瘍を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組成物を２５℃で少なくとも１２ヶ月間保存した場合、前記含まれる間葉系幹細胞の少なくとも８５％が生存可能なままである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
１平方センチメートル当たり１００００〜３５０００個の間葉系幹細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
１平方センチメートル当たり１００００〜３００００個の間葉系幹細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記局所用アルギナートマトリックスが２％ｗ／ｖのアルギナート溶液を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記包帯またはパッチが１ｍｍ〜５ｍｍの範囲の厚さを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記間葉系幹細胞が、対象の脂肪組織、骨髄、ホウォートンゼリー、歯系組織または臍帯に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記間葉系幹細胞が自己移植または同種移植に適している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の包帯またはパッチの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、前記包帯またはパッチが１ｍｍ〜５ｍｍの範囲の厚さを有し、２％ｗ／ｖのアルギナート溶液を含む局所用マトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり１００００〜４００００個の間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、組成物を２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、前記間葉系幹細胞の少なくとも８５％が生存可能なままである、組成物。
【請求項１１】
前記間葉系幹細胞が脂肪組織に由来する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の貯蔵安定性局所用被覆組成物を調製する方法であって、
ａ）滅菌ガーゼシートをステンレス鋼鋳型上に置くステップと；
ｂ）間葉系幹細胞およびアルギナートマトリックスを前記滅菌ガーゼシートに施用するステップと；
ｃ）前記鋳型を塩化カルシウム溶液浴に入れるステップと；
ｄ）前記鋳型をリン酸緩衝液を含む浴に移して過剰のカルシウムを洗浄するステップと；
ｅ）インキュベーションのためにガーゼシートを培地フラスコに入れるステップと；
ｆ）前記ガーゼシートを３７℃、５％ＣＯ２で１４日間インキュベートするステップと；
ｇ）前記インキュベートしたガーゼシートを三層パウチに入れて前記局所用被覆組成物を得るステップと
を含む方法。
【請求項１３】
対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の二室型スプレーの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、（ｉ）一室の間葉系幹細胞および局所用マトリックス成分と、（ｉｉ）別室のゲル化成分とを含み、組成物を２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、前記間葉系幹細胞の８０％超が生存可能なままである、組成物。
【請求項１４】
対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用のゲルの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、前記ゲルが２％ｗ／ｖのアルギナート溶液を含む局所用マトリックスに埋め込まれた間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、前記局所用ゲルを２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、前記間葉系幹細胞の８０％超が生存可能なままである組成物。
【請求項１５】
前記損傷を受けた皮膚組織が、外傷性創傷、外科的創傷、糖尿病性潰瘍、褥瘡、静脈性潰瘍、瘢痕、火傷、皮膚病変、湿疹または皮膚潰瘍を含む、請求項１〜１１及び１３〜１４に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、局所用被覆組成物中の間葉系幹細胞を安定化する方法であって、１平方センチメートル当たり最大約４００００個の間葉系幹細胞を薬学的に許容される賦形剤と共に局所用マトリックスに埋め込むステップを含み、組成物を約２５℃で少なくとも約６ヶ月間保存した場合、含まれる間葉系幹細胞の少なくとも約８０％が生存可能なままである方法に関する。
他との重複もあるが、本発明を以下に示す。
［発明１］
対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、局所用マトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり最大約４００００個の間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、組成物を約２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、前記含まれる間葉系幹細胞の少なくとも約８０％が生存可能なままである、組成物。
［発明２］
前記損傷を受けた皮膚組織が、外傷性創傷、外科的創傷、糖尿病性潰瘍、褥瘡、静脈性潰瘍、瘢痕、火傷、皮膚病変、湿疹および皮膚潰瘍を含む、発明１に記載の組成物。
［発明３］
組成物を約２５℃で少なくとも約１２ヶ月間保存した場合、前記含まれる間葉系幹細胞の少なくとも約８５％が生存可能なままである、発明１に記載の組成物。
［発明４］
前記局所用被覆が、１平方センチメートル当たり最大約３５０００個の間葉系幹細胞を含む、発明１に記載の組成物。
［発明５］
前記局所用被覆が、１平方センチメートル当たり約１００００〜約３００００個の間葉系幹細胞を含む、発明１に記載の組成物。
［発明６］
前記局所用マトリックスがアルギナート、ポリウレタン、コラーゲン、キトサン、ペクチンおよびヒアルロン酸を含む、発明１に記載の組成物。
［発明７］
溶液、懸濁液、エマルジョン、軟膏、フォーム、ペースト、ゲル、スプレー、包帯、パッチ、クリーム、ローションまたは粉末の形態である、発明１に記載の組成物。
［発明８］
包帯またはパッチの形態である、発明７に記載の組成物。
［発明９］
前記間葉系幹細胞が、対象の脂肪組織、骨髄、ホウォートンゼリー、歯系組織または臍帯に由来する、発明１に記載の医薬組成物。
［発明１０］
前記間葉系幹細胞が自己移植または同種移植に適している、発明１に記載の組成物。
［発明１１］
対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の包帯またはパッチの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、前記包帯またはパッチが局所用マトリックスに埋め込まれた１平方センチメートル当たり最大約４００００個の間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、組成物を約２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、前記間葉系幹細胞の少なくとも約８０％が生存可能なままである、組成物。
［発明１２］
前記包帯またはパッチが無菌である、発明１１に記載の組成物。
［発明１３］
前記包帯またはパッチが約０．５ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲の厚さを有する、発明１１に記載の組成物。
［発明１４］
前記損傷を受けた皮膚組織が、外傷性創傷、外科的創傷、糖尿病性潰瘍、褥瘡、静脈性潰瘍、瘢痕、火傷、皮膚病変、湿疹および皮膚潰瘍を含む、発明１１に記載の組成物。
［発明１５］
前記間葉系幹細胞が脂肪組織に由来する、発明１１に記載の組成物。
［発明１６］
前記局所用マトリックスが２％ｗ／ｖのアルギナート溶液を含む、発明１１に記載の組成物。
［発明１７］
発明１１に記載の貯蔵安定性局所用被覆組成物を調製する方法であって、
ａ）滅菌ガーゼシートをステンレス鋼鋳型上に置くステップと；
ｂ）間葉系幹細胞およびアルギナートマトリックスを前記滅菌ガーゼシートに施用するステップと；
ｃ）前記鋳型を塩化カルシウム溶液浴に入れるステップと；
ｄ）前記鋳型をリン酸緩衝液を含む浴に移して過剰のカルシウムを洗浄するステップと；
ｅ）インキュベーションのためにガーゼシートを培地フラスコに入れるステップと；
ｆ）前記ガーゼシートを３７℃、５％ＣＯ２で１４日間インキュベートするステップと；
ｇ）前記インキュベートしたガーゼシートを三層パウチに入れて前記局所用被覆組成物を得るステップと
を含む方法。
［発明１８］
対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用の二室型スプレーの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、（ｉ）一室の間葉系幹細胞および局所用マトリックス成分と、（ｉｉ）別室のゲル化成分とを含み、組成物を約２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、前記間葉系幹細胞の約８０％超が生存可能なままである、組成物。
［発明１９］
対象において損傷を受けた皮膚組織の治療用のゲルの形態の貯蔵安定性局所用被覆組成物であって、前記ゲルが局所用マトリックスに埋め込まれた間葉系幹細胞と、場合により薬学的に許容される賦形剤とを含み、前記局所用ゲルを約２５℃で少なくとも６ヶ月間保存した場合、前記間葉系幹細胞の約８０％超が生存可能なままである組成物。
［発明２０］
対象において損傷を受けた皮膚組織を治療する方法であって、（ｉ）１平方センチメートル当たり最大約４００００個の間葉系幹細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物を前記損傷を受けた皮膚組織領域に施用するステップと、（ｉｉ）凍結乾燥粉末の形態の局所用マトリックスと、場合により薬学的に許容される賦形剤とを前記間葉系幹細胞組成物上に施用し、それによって前記損傷を受けた皮膚組織上に原位置スポンジを形成するステップとを含む方法。
【国際調査報告】
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