(57)【要約】  本発明は、ＢＬｙＳ抗体及びその製造方法と応用を開示する。前記ＢＬｙＳ抗体は、ＢＬｙＳ抗体の重鎖可変領域重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３中の一種又は多種、及び／又は、ＢＬｙＳ抗体の軽鎖可変領域軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３中の一種又は多種を含み、そのアミノ酸配列は、それぞれ本発明に記載の通りである。前記ＢＬｙＳは、高い親和力を有し、明らかにタンパク質レベル及び細胞レベルで効果的にＢＬｙＳタンパク質をブロックし、ＢＬｙＳタンパク質と受容体との結合を妨げることができる。前記のＢＬｙＳ抗体は、ヒトＡＰＲＩＬなど同類タンパク質抗原との交差反応が欠乏し、良好な生物学的活性を有し、それはＢＬｙＳ誘導のマウスＢ細胞の増殖を抑制することができる。したがって、ＢＬｙＳ発現又は機能異常に関連する疾患を予防又は治療するための薬物の製造に応用される。【選択図】【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＬｙＳ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）である重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３中の一種又は多種、及び／又は、ＢＬｙＳ抗体の軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２と軽鎖ＣＤＲ３中の一種又は多種を含み、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）配列は、配列表の配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、配列番号６６、配列番号７４、配列番号８２、配列番号９０又は配列番号９８に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２７、配列番号３５、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５９、配列番号６７、配列番号７５、配列番号８３、配列番号９１又は配列番号９９に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３６、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、配列番号９２又は配列番号１００に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４６、配列番号５４、配列番号６２、配列番号７０、配列番号７８、配列番号８６、配列番号９４又は配列番号１０２に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９、配列番号４７、配列番号５５、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７９、配列番号８７、配列番号９５又は配列番号１０３に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６又は配列番号１０４に示されたようであり、
又は、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、配列番号６６、配列番号７４、配列番号８２、配列番号９０又は配列番号９８に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２７、配列番号３５、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５９、配列番号６７、配列番号７５、配列番号８３、配列番号９１又は配列番号９９に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３６、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、配列番号９２又は配列番号１００に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４６、配列番号５４、配列番号６２、配列番号７０、配列番号７８、配列番号８６、配列番号９４又は配列番号１０２に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９、配列番号４７、配列番号５５、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７９、配列番号８７、配列番号９５又は配列番号１０３に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６又は配列番号１０４に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列に示されることを特徴とする単離されたタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項２】
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１１に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１２に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１９に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２６に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２７に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３４に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３５に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３６に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４３に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５０に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５１に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５２に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５８に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５９に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６０に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６６に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６７に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６８に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７４に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７５に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７６に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８２に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８３に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８４に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９０に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９１に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９２に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９８に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９９に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１００に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１６に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２２に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２３に示され、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３１に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３９に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４７に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４８に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５４に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５５に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５６に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６２に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６３に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６４に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７０に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７１に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７２に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７８に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７９に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８０に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８６に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８７に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８８に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９４に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９５に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９６に示されたようであり、
又は、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０２に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０３に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０４に示されたようであることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
ＢＬｙＳ抗体の重鎖フレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ａｒｅａ）及び／又は軽鎖フレームワーク領域を含むフレームワーク領域をさらに含み、
好ましくは、前記重鎖フレームワーク領域は、ヒト又はマウス抗体重鎖フレームワーク領域であり、及び／又は、前記軽鎖フレームワーク領域は、ヒト又はマウス抗体軽鎖フレームワーク領域であり、
さらに好ましくは、前記重鎖フレームワーク領域は、ヒト由来抗体重鎖フレームワーク領域であり、好ましくは、ヒト生殖細胞系抗体重鎖ＶＨエキソン（Ｅｘｏｎ）のＶＨ１−１８、ＶＨエキソンのＶＨ３−７又はＪＨエキソンのＪＨ−６、また前記軽鎖フレームワーク領域はヒト由来抗体軽鎖フレームワーク領域であり、好ましくは、人類抗体軽鎖ＶＫエキソンのＢ３、ＪＫエキソンのＪＫ−４又はＶＫエキソンのＡ１０であることを特徴とする請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記ＣＤＲとフレームワーク領域からなるＢＬｙＳ抗体の重鎖可変領域及び／又はＢＬｙＳ抗体の軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、配列番号６５、配列番号７３、配列番号８１、配列番号８９、配列番号９７、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１又は配列番号１５２に示されたようであり、
前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４５、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７７、配列番号８５、配列番号９３、配列番号１０１、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、又は配列番号１５７に示されたようであることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１３に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２１に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２９に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３３に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５３に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６１に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６９に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７３に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９３に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０１に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４０に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４０に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４２に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４２に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４３に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４３に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４４に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４４に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４６に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４６に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５３に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５４に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５０に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５３に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５０に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５４に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５３に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５４に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５１示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５２に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５２に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５６に示されたようであり、
又は前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５２に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５７に示されたようであることを特徴とする請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質は、抗体重鎖定常領域及び／又は抗体軽鎖定常領域をさらに含むことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記抗体重鎖定常領域は、ヒト由来又はマウス由来抗体重鎖定常領域であり、
前記抗体軽鎖定常領域は、ヒト由来又はマウス由来抗体軽鎖定常領域であることを特徴とする請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記抗体重鎖定常領域は、ヒト由来抗体重鎖定常領域であり、
前記抗体軽鎖定常領域は、ヒト由来抗体軽鎖定常領域であることを特徴とする請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記タンパク質は、ＢＬｙＳ抗体のモノクローナル抗体、抗体全長タンパク質、抗原−抗体結合ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）タンパク質断片、二重特異性抗体、多重特異性抗体、単一鎖抗体、単一ドメイン抗体又は単一ゾーン抗体であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載のタンパク質をコード（ｃｏｄｅ）する核酸。
【請求項１１】
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９又は配列番号１７０に示されたようであり、
及び／又は、前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列は、配列表の配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４又は配列番号１７５に示されたようであることを特徴とする請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１０に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１２に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１３に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１４に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２０に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２２に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２３に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２４に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１３０に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５８に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５８に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６０に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６０に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６２に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６２に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６３に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６３に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６４に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６４に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７１に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７２に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６８に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７１に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６８に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７２に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７１に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７２に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７３に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７４に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７０に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７３に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７０に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７４に示されたようであり、
又は前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７０に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７５に示されたようであることをとする請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載の核酸を含む組換え発現担体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組換え発現担体を含む組換え発現形質転換体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組換え発現形質転換体を培養し、培養物からＢＬｙＳ抗体を獲得する段階を含むことを特徴とするＢＬｙＳ抗体の製造方法。
【請求項１６】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載のタンパク質をインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で被験試料と接触させて、請求項１乃至９のいずれか一項に記載のタンパク質と前記被験試料の結合を検出する段階を含むことを特徴とするＢＬｙＳタンパク質を過剰発現する細胞の検出方法。
【請求項１７】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載のタンパク質を活性成分として含むことを特徴とするＢＬｙＳタンパク質を過剰発現する細胞を検出するための組成物。
【請求項１８】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載のタンパク質を活性成分と薬学的に許容される担体として含むことを特徴とする薬物組成物。
【請求項１９】
前記薬物組成物は、０．０１〜９９．９９％の請求項１乃至９のいずれか一項に記載の前記タンパク質と０．０１〜９９．９９％の薬用担体を含み、前記パーセンテージは、前記薬物組成物の質量パーセンテージであることを特徴とする請求項１８に記載の薬物組成物。
【請求項２０】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項１８又は１９に記載の薬物組成物がＢＬｙＳ発現又は機能異常に関連する疾患を予防又は治療するための薬物の製造に応用であって、
好ましくは、前記ＢＬｙＳ発現又は機能異常に関連する疾患は、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患又は増殖性疾患である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年７月６日に出願された、出願番号がＣＮ２０１６１０５２７９９６．０の中国特許出願に対して優先権を主張する。本出願は、当該中国特許出願の全文を引用する。
【０００２】
本発明は、抗体分野に属し、具体的にはＢＬｙＳ抗体及びその製造方法と応用に関する。
【背景技術】
【０００３】
自己免疫疾患（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｅａｓｅ）は、人体自身の免疫系が自身の正常な器官、組織、細胞を攻撃する疾患である。それは慢性疾患に属し、一旦病気にかかると、人体は弱くなり、完治にならなく、制御することしかできない。これは、患者が高い医療費を負担しなければならず、また生活品質が急激に低下されることで患者と彼らの家族、さらには社会に重大な負担を造成する。一般人によく知られている自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ，ＳＬＥ）又は関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ）など様々な疾患がある。ＳＬＥは、各種の器官に影響を与えることができ、現在はいつ発症するかを予測することができなく、それの自然な病気の経過は、病状の悪化と緩和との交替で多く表現される。ＳＬＥの全世界平均有病率は、１０万人あたり１２−３９人であり、中国におけるＳＬＥの罹患率は、１０万人あたり３０−７０人であり、黒人（１００／１０万人）に次ぐ世界第二位である。ＳＬＥは、通常若い女性に発生され、９０％以上の患者は女性である。ＲＡは、主に関節に影響を及ぼす長期の持続性疾患であり、それは、通常関節の発熱、腫脹、痛みを引き起こし、深刻なときには、関節表面の侵襲と破壊を引き起こすことができ，さらには、四肢奇形を引き起こす。統計学によると、関節リウマチの発病率は約０．３％ぐらいである。近年には、中国乃至世界の自己免疫疾患は、徐々に上昇する傾向を示す。中国は国土面積が広く、人口が多いので、この発症率に基づいて算出した患者の数は巨大である。しかし、現在はまだ非常に有効であり、副作用が少なく、特異性が強い介入治療手段を利用して早期にターゲット器官の損傷をブロックして、患者の予後を改善することが欠乏である。
【０００４】
研究によると、自己免疫疾患とＢ細胞腫瘍の患者において、Ｂリンパ球刺激因子（Ｂ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ，ＢＬｙＳ）の発現レベルの向上が検出される。例えば、血清中のＢＬｙＳの発現は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者の複数群の患者から、すべて血清中のＢＬｙＳの発現レベルが増加することを見出し、これは自己免疫抗体の生成及び疾患活動性指標に関する。［Ｓｔｏｈｅ  ｅｔ  ａｌ．２００８２００３，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ，４８（１２）：３４７５；Ｐｅｔｉｉ  ｅｔ  ａＬ．２００８，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ，５８（８）：２４５３を参照する］。関節リウマチ（ＲＡ）の患者の関節液（Ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ）中でも高レベルのＢＬｙＳが発見された［Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ ２００３，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ，４８（４）：９８２を参照する］。ＢＬｙＳ過剰発現とこれらの自己免疫疾患の臨床表現との相関性は、ＢＬｙＳの発現レベルを調節することが、これらの疾患の治療に対する新しい方法になり得ることが示されている。
【０００５】
ＢＬｙＳは、ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ、ＴＡＬＬ−１、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ又はｚＴＮＦ４とも言われるが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドスーパーファミリーのメンバーである［Ｂａｋｅｒ  ａｔ  ａｌ．２００３，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ，４８（１１）：３２５３を参照する］。ＢＬｙＳは、２８５個のアミノ酸からなるＩＩ型膜貫通タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、膜結合型と、切断後に１５２個のアミノ酸を有りする可溶型との二種類の形態が存在する。ＢＬｙＳは、単球、マクロファージと樹状細胞で全部発現があり、インターフェロンγ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎγ）とインターロイキン１０（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１０）刺激により発現レベルが向上される。インビトロで、組換えヒトＢＬｙＳは、Ｂ細胞の表面上の主要な受容体と結合することによって、Ｂ細胞増殖と抗体分泌を増加することができる。インビボで、組換えヒトＢＬｙＳは、マウスにおいて脾臓増殖を生じることができ、これは主に成熟Ｂ細胞の数の増加に起因する。ＢＬｙＳのマウスの体内への注射も血清中の抗体濃度の増加ならびにＴ細胞依存と非依存抗原に対する体液性免疫の増加をもたらすことができる。ＢＬｙＳの過剰発現は、発現レベルが異常に高い抗体を生成して、ＳＬＥ、ＲＡ及び他の自己免疫疾患をもたらすことができる。
【０００６】
近年、モノクローナル抗体薬物は、強い特異性、良好な治癒効果及び小さな副作用の利点のため、腫瘍、自己免疫疾患などの治療にますます広く応用されている。モノクローナル抗体薬物品の全世界年間売上高は、１９９７年の３億ドルから２０１２年には６６３億ドルに増加され、もうバイオ医薬業界で発展速度が一番速く、収益性が一番強い分野のうちの一つになって、広い発展空間を持つ。現在、ＢＬｙＳに対するモノクローナル抗体であるＢｅｌｉｍｕｍａｂは、半世紀以来に最初にＦＤＡ承認を受けたＳＬＥを治療するためのモノクローナル抗体であり、非常に重要な意味を持っている。
【０００７】
ＳＬＥを治療するためのモノクローナル抗体であるＢｅｌｉｍｕｍａｂには、まだいくつかの問題があるが、モノクローナル抗体は、シクロホスファミド（ＣｙｃｌＯｏｐｈＯｏｓｐｈａｍｉｄｅ）やホルモン（ｈＯｏＲｒｍＯｏｎｅ）などの免疫抑制剤に比べて、標的化特性を持ち、副作用が明らかに少ない。２０２２年までにＳＬＥを治療する薬物の売上高は、３９億ドルに達すると予測され、市場の潜在力は巨大である。したがって、新しくて、より安全で、より効果的なＢＬｙＳ抗体に対する抗体を獲得して、ＳＬＥなどの自己免疫疾患を治療することが期待される。
【発明の概要】
【０００８】
本発明が解決しようとする技術的課題は、現在、有効で安全なＢＬｙＳ抗体の欠乏の不足を克服するために、親和力が高く、特異性が強いヒト由来又は全ヒト由来抗体及びその製造方法と応用を提供することである。本発明に記載されたＢＬｙＳ抗体は、ＢＬｙＳとの親和力が高く、ＢＬｙＳとその受容体との結合を抑制することができ、ヒトＢＬｙＳに誘導されたマウスＢ細胞の増殖を抑制することができ、ヒトＡＰＲＩＬなどのＢＬｙＳ同族タンパク質抗原との交差反応が欠乏し、したがって、自己免疫疾患又は腫瘍などのＢＬｙＳ発現又は機能異常に関連する疾患の治療又は予防のための薬物の製造に使用することができる。
【０００９】
本発明者は、ファージディスプレイ及びハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）技術を利用して、ＢＬｙＳ抗体のリード抗体を獲得した。またリード抗体の予備生成、精製と同定により、抗体の親和力が高く（親和力ＫＤ＜５×１０−９Ｍ）、ＢＬｙＳと受容体の結合を効果的にブロックすることができ、ヒトＡＲＲＩＬなど同種のタンパク質抗原と交差反応が欠乏するなど、優れた生物活性のＢＬｙＳ抗体を獲得した。その後、分子生物学的方法により配列を検出して、ＢＬｙＳ抗体の重鎖可変領域とＢＬｙＳ抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）配列を知ることができた。
【００１０】
本発明は、単離されたタンパク質を提供し、前記タンパク質は、ＢＬｙＳ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ又はＣＤＲｓ）である重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３中の一種又は多種、及び／又は、ＢＬｙＳ抗体の軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３中の一種又は多種を含み、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、配列番号６６、配列番号７４、配列番号８２、配列番号９０又は配列番号９８に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２７、配列番号３５、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５９、配列番号６７、配列番号７５、配列番号８３、配列番号９１に示されたようであり、又は配列番号９９に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３６、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、配列番号９２又は配列番号１００に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４６、配列番号５４、配列番号６２、配列番号７０、配列番号７８、配列番号８６、配列番号９４又は配列番号１０２に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９、配列番号４７、配列番号５５、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７９、配列番号８７、配列番号９５又は配列番号１０３に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６又は配列番号１０４に示されたようであり、
又は、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、配列番号６６、配列番号７４、配列番号８２、配列番号９０又は配列番号９８に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２７、配列番号３５、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５９、配列番号６７、配列番号７５、配列番号８３、配列番号９１又は配列番号９９に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３６、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、配列番号９２又は配列番号１００に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４６、配列番号５４、配列番号６２、配列番号７０、配列番号７８、配列番号８６、配列番号９４又は配列番号１０２に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９、配列番号４７、配列番号５５、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７９、配列番号８７、配列番号９５又は配列番号１０３に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６又は配列番号１０４に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列に示される。
【００１１】
好ましくは、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１１に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１２に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１９に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２６に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２７に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３４に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３５に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３６に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４３に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５０に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５１に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５２に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５８に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５９に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６０に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６６に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６７に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６８に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７４に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７５に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７６に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８２に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８３に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８４に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９０に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９１に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９２に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９８に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９９に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１００に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１６に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２２に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２３に示され、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３１に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３９に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４７に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４８に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５４に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５５に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５６に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６２に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６３に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６４に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７０に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７１に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７２に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７８に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７９に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８０に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８６に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８７に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８８に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９４に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９５に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９６に示されたようであり、又は前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０２に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０３に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０４に示されたようである。好ましくは、前記タンパク質は、前記ＣＤＲとフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ａｒｅａ）からなるＢＬｙＳ抗体の重鎖可変領域及び／又はＢＬｙＳ抗体の軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、配列番号６５、配列番号７３、配列番号８１、配列番号８９又は配列番号９７に示されたようであり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４５、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７７、配列番号８５、配列番号９３又は配列番号１０１に示されたようである。
【００１２】
本発明は、単離されたタンパク質を提供し、前記タンパク質は、ＢＬｙＳ抗体の重鎖可変領域及び／又はＢＬｙＳ抗体の軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、配列番号６５、配列番号７３、配列番号８１、配列番号８９又は配列番号９７に示されたようであり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４５、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７７、配列番号８５、配列番号９３又は配列番号１０１に示されたようである。
【００１３】
好ましくは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５に示されたようであり、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１３に示されたようであり、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２１に示されたようであり、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２９に示されたようであり、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３３に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３７に示されたようであり、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４５に示されたようであり、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５３に示されたようであり、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６１に示されたようであり、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６９に示されたようであり、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７３に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７７に示されたようであり、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８５に示されたようであり、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９３に示されたようであり、又は前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０１に示されたようである。
【００１４】
本領域において、抗体と抗原との結合は、すべて１本の軽鎖可変領域及び１本の重鎖可変領域を含み、一つごとの可変領域は、すべてＣＤＲ１と、ＣＤＲ２と、ＣＤＲ３との三つのドメイン（ｄｏｍａｉｎ）を含む。
【００１５】
前述の内容を要約すると、前記アミノ酸配列の番号は表に示されたようである。
【表１】
2019533423.tif 000002
【００１６】
ここで、表１中の数字は配列表の配列番号であり、２−１Ｇ１１の重鎖タンパク質可変領域のアミノ酸配列は配列番号１であり、２−１Ｇ１１の重鎖タンパク質可変領域において、ＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列は、配列番号２に示されたようである。
【００１７】
本発明の単離されたタンパク質は、さらにＢＬｙＳ抗体のフレームワーク領域を（又はフレーム領域又は骨格領域と称する）を含んでもよく、前記フレームワーク領域は、重鎖フレームワーク領域及び／又は軽鎖フレームワーク領域を含み、好ましくは、前記重鎖フレームワーク領域は、ヒト又はマウス抗体の重鎖フレームワーク領域であり、及び／又は、前記軽鎖フレームワーク領域は、ヒト又はマウス抗体の軽鎖フレームワーク領域である。
【００１８】
さらに好ましくは、本発明の単離されたタンパク質がヒト由来抗体又は全ヒト由来抗体である時、前記重鎖フレームワーク領域はヒト由来抗体の重鎖フレームワーク領域であり、ヒト由来抗体の重鎖フレームワーク領域残基は、生殖細胞系のＤＰ４、ＤＰ７、ＤＰ８、ＤＰ９、ＤＰ１０、ＤＰ１４（ＶＨ１−１８）、ＤＰ３１、ＤＰ３３、ＤＰ３５（ＶＨ３−１１）、ＤＰ４５、ＤＰ４６、ＤＰ４７、ＤＰ４８、ＤＰ４９（ＶＨ３−３０）、ＤＰ５０、ＤＰ５１（ＶＨ３−４８）、ＤＰ５３、ＤＰ５４（ＶＨ３−７）、ＤＰ６５、ＤＰ６６、ＤＰ６７、ＤＰ６８とＤＰ６９、特にこれらの生殖細胞系のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＪＨ断片ＪＨ−１、ＪＨ−２、ＪＨ−３、ＪＨ−４、ＪＨ−４ｂ、ＪＨ−５とＪＨ−６、特にこれらの生殖細胞系のＦＲ４配列によってコード（ｃｏｄｅ）される、又は重鎖フレームワーク領域の共有配列を含むことができる。前記軽鎖フレームワーク領域は、ヒト由来抗体軽鎖フレームワーク領域であり、ヒト由来抗体軽鎖フレームワーク領域残基は、生殖細胞系のＯ２、Ｏ１２、ＤＰＫ１（Ｏ１８）、ＤＰＫ２、ＤＰＫ３、ＤＰＫ４、ＤＰＫ５、ＤＰＫ６、ＤＰＫ７、ＤＰＫ８、ＤＰＫ９、ＤＰＫ１０、ＤＰＫ１２（Ａ２）、ＤＰＫ１３、ＤＰＫ１５、ＤＰＫ１６、ＤＰＫＩ８、ＤＰＫ１９、ＤＰＫ２０、ＤＰＫ２１、ＤＰＫ２２、ＤＰＫ２３、ＤＰＫ２４（Ｂ３）、ＤＰＫ２５、ＤＰＫ２６（Ａ１０）とＤＰＫ ２８、特に、これらの生殖細胞系のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＪＫ断片ＪＫ１、ＪＫ２、ＪＫ３、ＪＫ４とＪＫ５、特にこれらの生殖細胞系のＦＲ４配列によってコードされる配列を含むことができる。そのようなフレームワーク領域配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公共のＤＮＡデータベー又は公開されたＤＮＡデータベースから得ることができる。たとえば、ヒト重鎖と軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列及びは、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｍｒｃ−ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ／）から獲得することができ、及びＫａｂａｔ（ＥＡなどの諸人、１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版）で見つけることができる。本発明のヒト化抗体のある好ましい実施例において、重鎖フレームワーク領域残基は、ヒト生殖細胞系抗体重鎖ＶＨエクソンのＶＨ１−１８、ＶＨエクソンのＶＨ３−７又はＪＨエキソン（Ｅｘｏｎ）のＪＨ−６であることが好ましく、軽鎖フレームワーク領域残基は、ヒト生殖細胞系抗体軽鎖のＶＫエクソンのＢ３、ＪＫエクソンのＪＫ−４又は外側ＶＫエクソンのＡ１０であることが好ましい。
【００１９】
好ましくは、タンパク質は、抗体重鎖定常領域及び／又は抗体軽鎖定常領域を含み、前記抗体重鎖定常領域は当該技術分野の通常のものであり、好ましくは、マウス由来抗体重鎖定常領域又はヒト由来抗体重鎖定常領域であり、さらに好ましくは、ヒト由来抗体重鎖定常領域である。前記抗体軽鎖定常領域は当該技術分野の通常のものであり、好ましくは、マウス由来抗体軽鎖定常領域又はヒト由来抗体軽鎖定常領域であり、さらに好ましくは、ヒト由来抗体軽鎖定常領域である。
【００２０】
ここで、アミノ酸配列は、配列番号２５、３３、４１、４９、５７、６５、７３、８１、８９又は９７に示された重鎖可変領域及び配列は、配列番号２９、３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５、９３又は１０１に示されるようである可変領域は、マウス由来重鎖定常領域及びマウス由来軽鎖定常領域とマウス化ＢＬｙＳ抗体を構成することができ、ヒト由来重鎖定常領域及びマウス由来軽鎖定常領域とＢＬｙＳキメラ抗体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を構成することができる。
【００２１】
さらに、前記キメラ抗体において、アミノ酸配列は、配列番号２５、３３、４１、４９、５７、６５、７３、８１、８９又は９７に示された重鎖可変領域において、Ｋａｂａｔ定義に従って決定された配列は、配列番号２６−２８，３４−３６、４２−４４、５０−５２、５８−６０、６６−６８、７４−７６、８２−８４、９０−９２又は９８−１００に示されたようである重鎖ＣＤＲ及び前記配列は、配列番号２９、３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５、９３又は１０１の軽鎖可変領域において、Ｋａｂａｔ定義に従って決定された配列は、配列番号３０−３２３８−４０、４６−４８、５４−５６、６２−６４、７０−７２、７８−８０、８６−８８、９４−９６又は１０１に示されたようである軽鎖ＣＤＲをそれぞれ選択されたヒト生殖細胞系鋳型に移植して、ヒト生殖細胞系鋳型のＣＤＲ領域を置き換えて、ヒト化抗体を得て、前記生殖細胞系鋳型の中の軽鎖フレームワーク領域と重鎖フレームワーク領域は前記のようであり、好ましくは、それぞれヒト生殖細胞系抗体の重鎖ＶＨエキソンのＶＨ１−１８、ＶＨエキソンのＶＨ３−７、ＪＨエキソンのＪＨ−６及び生殖細胞系抗体の軽鎖ＶＫエクソンのＢ３、ＪＫエクソンのＪＫ−４とＶＫエクソンのＡ１０から選ばれる。選択的に、抗体活性を保証するために、マウス由来の抗体の三次元構造に基づいて、埋め込まれた残基、ＣＤＲ領域と直接に相互作用する残基及びＶＨとＶＬ構想について重要な影響を与えるフレームワーク領域の残基に対して復帰変異を行う。
【００２２】
好ましくて、前記ＣＤＲ領域が選択されたヒト生殖細胞系の鋳型に移植され、またフレームワーク領域の残基が復帰変異を経過した後の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１又は配列番号１５２に示されたようであるのが好ましく、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、Ｎ１５６、又は配列番号１５７に示されたようであるのが好ましい。
【００２３】
配列は、配列番号１、９又は１７に示されたようである重鎖可変領域及び配列は、配列番号５、１３又は２１に示されたようである軽鎖可変領域は、ヒト由来抗体の重鎖定常領域及びヒト由来抗体の軽鎖定常領域と完全ヒト由来ＢＬｙＳ抗体を構成することができる。
【００２４】
前記タンパク質は、抗体タンパク質を指し、好ましくは、それは抗体全長タンパク質、抗原−抗体結合ドメインのタンパク質断片、二重特異性抗体、多重特異性抗体、単鎖抗体（Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体（Ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｓｄＡｂ）、シングル領域抗体（Ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の中の一種又は多種であり、及び前記抗体から製造されたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。前記モノクローナル抗体は、複数の経路とハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術などを含む技術によって開発されるが、主流としては、ハイブリドーマ技術によって、野生型又は遺伝子導入マウスからモノクローナル抗体を製造することである。
【００２５】
前記抗体完全長タンパク質は、当該技術分野における通常の抗体全長タンパク質であり、それは、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域と、重鎖定常領域と、軽鎖定常領域とを含む。前記タンパク質の重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、ヒト由来重鎖定常領域とヒト軽鎖定常領域は完全ヒト由来の抗体全長タンパク質を構成する。好ましくは、抗体全長タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である。
【００２６】
前記一本鎖抗体は、当該技術分野における通常の一本鎖抗体であり、それは、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域と、１５〜２０個アミノ酸の短いペプチドとを含む。
【００２７】
前記タンパク質断片の抗原−抗体結合ドメインのタンパク質断片は、当該技術分野における通常の抗原−抗体結合ドメインのタンパク質断片であり、それは、軽鎖可変領域と、軽鎖定常領域と、重鎖定常領域のＦｄ断片とをふくむ。好ましくは、前記抗原−抗体結合ドメインのタンパク質断片はＦａｂとＦ（ａｂ’）２である。
【００２８】
前記単一ドメイン抗体は、当該技術分野における通常の単一ドメイン抗体であり、それは、重鎖可変領域と重鎖定常領域とを含む。
【００２９】
前記単一領域抗体は、当該技術分野における通常の単一領域抗体あり、それは、重鎖可変領域のみを含む。
【００３０】
ここで、タンパク質の製造方法は、当該技術分野における通常の製造方法である。前記製造方法は、好ましくは、タンパク質を組換え発現する発現形質転換体から単離して獲得するか、又は人工的にタンパク質を合成することによって獲得される。前記タンパク質を組換え発現する発現形質転換体から単離して獲得す方法は、前記タンパク質をコードし、点突然変異を有する核酸分子を組換え担体中にクローンして、得られた組換え担体を形質転換体に形質転換させて、組換え発現の形質転換体が得られ、得られた組換え発現の形質転換体を培養することにより、前記当タンパク質を単離精製して、獲得することができる。
【００３１】
本発明は、前記タンパク質をコードする核酸をさらに提供する。
【００３２】
好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列は、配列表の配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１ｌ、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７又は配列番号１２９に示されたようであり、及び／又は、前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８又は配列番号１３０に示されたようである。
【００３３】
さらに好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列配列表は配列番号１０６に示されたようであり、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオシド配列は、配列表の配列番号１０８示されたようであり、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１０に示されたようであり、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１２にされたようであり、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１３示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１４に示されたようであり、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸の塩基配列は、配列表の配列番号１１６に示されたようであり、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸の塩基配列は、配列表の配列番号１１８に示されたようであり、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２０示されたようであり、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２２に示されたようであり、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列番号１２３の配列表に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２４に示されたようであり、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２６に示されたようであり、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２８に示されたようであり、又は前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１３０の配列表に示されたようである。
【００３４】
前述の内容を要約すると、前記ヌクレオチド配列の番号は表２に示されたようである。
【表２】
2019533423.tif 000003
【００３５】
ここで、表２中の数字は、配列表の配列番号であり、例えば２−１Ｇ１１をコードする重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１０５であり、２−１Ｇ１１をコードする軽鎖タンパク質のアミノ酸配列のヌクレオチド配列は、配列番号１０６である。
【００３６】
２−１Ｇ１１をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０５の７６位乃至１０５位であり、
２−１Ｇ１１をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０５の１４８位乃至１９８位であり、
２−１Ｇ１１をコードする重鎖可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０５の２９５位乃至３４２位であり、
２−１Ｇ１１をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０６の７０位乃至１０２位であり、
２−１Ｇ１１をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０６の１４８位乃至１６８位であり、
２−１Ｇ１１をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０６の２６５位乃至２９１位であり、
Ｌ９Ｇ７をコードする重鎖可変領域のＣＤＲ１ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０７の７６位乃至１０５位であり、
Ｌ９Ｇ７をコードする重鎖可変領域のＣＤＲ２ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０７の１４８位乃至１９８位であり、
Ｌ９Ｇ７をコードする重鎖可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０７の２９５位乃至３４２位であり、
Ｌ９Ｇ７をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０８の７０位乃至１０２位であり、
Ｌ９Ｇ７の軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０８の１４８位乃至１６８位であり、
Ｌ９Ｇ７をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０８の２６５位乃至２９１位であり、
Ｌ１Ｄ１２をコードする重鎖可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０９の７６位乃至１０５位であり、
Ｌ１Ｄ１２をコードする重鎖可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０９の１４８位乃至１９５位であり、
Ｌ１Ｄ１２をコードする重鎖可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０９の２９２位乃至３３０であり、
Ｌ１Ｄ１２をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１０の６７位乃至９９位であり、
Ｌ１Ｄ１２をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１０の１４５位乃至１６５位であり、
Ｌ１Ｄ１２をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１０の２６２位乃至２９７位であり、
３５Ｅ６Ｆ７Ｃ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１１の７６位乃至１０５位であり、
３５Ｅ６Ｆ７Ｃ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１１の１４８位乃至１９８位であり、
３５Ｅ６Ｆ７Ｃ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１１の２９５位乃至３２１位にあり、
３５Ｅ６Ｆ７Ｃ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１２の７０位乃至９９位であり、
３５Ｅ６Ｆ７Ｃ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１２の１４５位乃至１６５位であり、
３５Ｅ６Ｆ７Ｃ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１２の２６２位乃至２８８位までであり、
８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１３の７６位乃至１０５位であり、
８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１３の１４８位乃至１９８位であり、
８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１３の２９５位乃至３４２位であり、
８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１４の７０位乃至１１４位であり、
８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１４の１６０位乃至１８０位であり、
８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１４の２７７位乃至３０３位までである。
２０Ｄ１Ｂ６Ｅ９Ｅ５をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１５の７６位乃至１０５位であり、
２０Ｄ１Ｂ６Ｅ９Ｅ５をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１５の１４８位乃至１９８位であり、
２０Ｄ１Ｂ６Ｅ９Ｅ５をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１５の２９５位乃至３３９位であり、
２０Ｄ１Ｂ６Ｅ９Ｅ５をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１６の７０位乃至１１７位であり、
２０Ｄ１Ｂ６Ｅ９Ｅ５をコードする軽鎖タンパク可変領域のＣＤＲ２ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１６の１６３位乃至１８３位であり、
２０Ｄ１Ｂ６Ｅ９Ｅ５をコードする軽鎖タンパク可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列番号１１６の２８０位乃至３０６位であり、
７８Ｃ１１Ｄ２Ｄ１２をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１７の７６位乃至１０５位であり、
７８Ｃ１１Ｄ２Ｄ１２をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列番号１１７の配列表の１４８位乃至１９８位であり、
７８Ｃ１１Ｄ２Ｄ１２をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１７の２９５位乃至３１５に由来する、
７８Ｃ１１Ｄ２Ｄ１２をコードする軽鎖タンパク可変領域のＣＤＲ１ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１８の７０位乃至９９位であり、
７８Ｃ１１Ｄ２Ｄ１２をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１８の１４５位乃至１６５位であり、
７８Ｃ１１Ｄ２Ｄ１２をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１８の２６２位乃至２８８位であり、
８９Ａ２Ｇ５Ｅ７をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１９の７６位乃至１０５位であり、
８９Ａ２Ｇ５Ｅ７をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１９の１４８位乃至１９５位であり、
８９Ａ２Ｇ５Ｅ７をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１９の２９２位乃至３２７位であり、
８９Ａ２Ｇ５Ｅ７をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２０の７０位乃至１０５位であり、
８９Ａ２Ｇ５Ｅ７をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２０の１５１位乃至第１７１位であり、
８９Ａ２Ｇ５Ｅ７をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２０の２６８位乃至２９４位であり、
９７Ｅ７Ｂ３Ｆ２をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２１の７６位乃至１０５位であり、
９７Ｅ７Ｂ３Ｆ２をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２１の１４８位乃至１９８位であり、
９７Ｅ７Ｂ３Ｆ２をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２１の２９５位乃至３２１位であり、
９７Ｅ７Ｂ３Ｆ２をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２２の７０位乃至１１７位であり、
９７Ｅ７Ｂ３Ｆ２をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２２の１６３位乃至１８３位であり、
９７Ｅ７Ｂ３Ｆ２をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２２の２８０位乃至３０６位であり、
９７Ａ３Ｃ２Ｈ４をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２３の７６位乃至１０５位であり、
９７Ａ３Ｃ２Ｈ４をコードする重鎖可変領域のＣＤＲ２ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２３の１４８位乃至１９８位であり、
９７Ａ３Ｃ２Ｈ４をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２３の２９５位乃至３２７位であり、
９７Ａ３Ｃ２Ｈ４をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２４の７０位乃至１０２位であり、
９７Ａ３Ｃ２Ｈ４をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２４の１４８位乃至１６８位であり、
９７Ａ３Ｃ２Ｈ４をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２４の２６５位乃至２９１位までである。
６７Ａ２Ｅ１Ｄ１０をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２５の７６位乃至１０５位であり、
６７Ａ２Ｅ１Ｄ１０をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２５の１４８位乃至１９８位であり、
６７Ａ２Ｅ１Ｄ１０をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２５の位置２９５位乃至３３３位であり、
６７Ａ２Ｅ１Ｄ１０をコードするタンパク質軽鎖タンパク可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２６の７０位乃至１０２位であり、
６７Ａ２Ｅ１Ｄ１０をコードするタンパク質軽鎖タンパク可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２６の１４８位乃至１６８位であり、
６７Ａ２Ｅ１Ｄ１０をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２６の２６５位乃至２９１位であり、
１１１Ｄ１０Ｄ６Ｇ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２７の７６位乃至１０５位であり、
１１１Ｄ１０Ｄ６Ｇ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、 配列表の配列番号１２７の１４８位乃至１９８位であり、
１１１Ｄ１０Ｄ６Ｇ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２７の２９５位乃至３０９位であり、
１１１Ｄ１０Ｄ６Ｇ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２８の１０２位乃至７０であり、
１１１Ｄ１０Ｄ６Ｇ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２８の１４８位乃至１６８位であり、
１１１Ｄ１０Ｄ６Ｇ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列番号１２８の２６５位乃至２９１であり、
９３Ｃ６Ｆ１０Ｄ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２９の７６位乃至１０５であり、
９３Ｃ６Ｆ１０Ｄ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２９の１４８位乃至１９８位であり、
９３Ｃ６Ｆ１０Ｄ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２９の２９５位乃至３３６位であり、
９３Ｃ６Ｆ１０Ｄ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１３０の７０位乃至１０２位であり、
９３Ｃ６Ｆ１０Ｄ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１３０の１４８位乃至１６８であり、
９３Ｃ６Ｆ１０Ｄ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１３０の２６５位乃至２９１である。
【００３７】
本発明の好ましい実施例においては、前記ヒトによりフレームワーク領域が改造された本発明のヒト由来抗体の重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５８、配列番号１６０、 １６１、配列番号：配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６７、配列番号１６８、 Ｎ１６９又は配列番号１７０に示されたようであり、及び／又は前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、又は配列番号１７５に示されたようである。
【００３８】
前記核酸の製造方法は、当該技術分野における通常の製造方法であり、好ましくは、遺伝子クローニング技術によって前記タンパク質をコードする核酸分子を獲得する段階と、又は人工的に完全配列を合成する方法により、前記タンパク質をコードする核酸分子を得る段階とを含む。
【００３９】
当業者は、前記タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、適切な置換、欠失、変更、挿入又は付加により、一つのポリヌクレオチドのホモログを提供することができることを認識する。本発明において、ポリヌクレオチドのホモログは、タンパク質配列をコードする遺伝子の１つ又は複数の塩基に対して、抗体の活性を維持する範囲内で置換、欠失又は付加することによって製造することができる。
【００４０】
ここで、組換え発現担体は、当該技術分野における通常の方法により得ることができ、すなわち、本発明の核酸分子は、様々な発現担体に連結されて構築された。前記発現担体は、当該技術分野の通常の様々な担体であり、前記核酸分子を収容することができればよい。前記担体は、種々のプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄｓ）、コスミド（ｃｏｓｍｉｄｓ）、バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ）又はウイルス担体（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ）などを含むのが好ましい。
【００４１】
本発明は、前記組換え発現担体を含む組換え発現形質転換体をさらに提供する。
【００４２】
ここで、前記組換え発現形質転換体の製造方法は、当該分野で通常の製造方法であり、前記組換え発現担体を宿主細胞に形質転換させて製造することが好ましい。前記宿主細胞は、当該分野で常用される種々の宿主細胞であり、組換え発現担体を安定的に自己複製させることができ、また細胞内にキャリアされた前記核酸を効率的に発現することができればいい。好ましくは、前記宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１又はＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１細胞（一本鎖抗体又はＦａｂ抗体を発現する）又はＨＥＫ２９３又はＣＨＯ−Ｋ１細胞（全長ＩｇＧ抗体を発現する）である。前記組換え発現プラスミドを宿主細胞に形質転換し、本発明の好ましい組換え発現形質転換体を得ることができる。ここで、前記形質転換法は、当該分野で通常の形質転換法であり、好ましくは化学的形質転換法、熱ショック法又は電気的形質転換法である。
【００４３】
本発明は、前記組換え発現形質転換体を培養し、当該培養物からＢＬｙＳ抗体を獲得する段階を含む、ＢＬｙＳ抗体の製造方法をさらに提供する。
【００４４】
本発明は、前記タンパク質をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で被験試料と接触させ、前記タンパク質と前記被験試料の結合を検出する段階を含むＢＬｙＳタンパク質を過剰発現する細胞を検出する方法をさらに提供する。
【００４５】
前記過剰発現の意味は、当該技術分野の通常的な意味であり、ＢＬｙＳタンパク質が被験試料中のＲＮＡ又はタンパク質の過剰発現を意味する（転写の増加、転写後プロセシング、翻訳、翻訳後プロセッシング、及びタンパク質分解の変化のため）及びタンパク質の輸送モードの変化（核局在の増加）のため局所的過剰発現の増加と機能活性の向上（例えば、基質の酵素加水分解の作用が増加した場合）が起こる。
【００４６】
本発明において、前記結合の検出方法は、当該技術分野の通常的な検出方法であり、好ましくは、蛍光励起細胞ソーティング（ＦＡＣＳ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｘｃｉｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）検出である。
【００４７】
本発明は、前記タンパク質を活性成分として含むＢＬｙＳタンパク質を過剰発現する細胞を検出するための組成物を提供する。好ましくは、前記タンパク質の機能的断片を活性成分とする化合物をさらに含む。
【００４８】
本発明は、医薬品の製造における前記タンパク質の応用を提供する。
【００４９】
好ましくは、前記薬物は、ＢＬｙＳの発現又は機能異常に関連する疾患を予防又は治療するための医薬である。
【００５０】
本発明において、前記ＢＬｙＳの発現又は機能異常に関連する疾患は、当該技術分野の通常的なＢＬｙＳの発現又は機能異常に関連する疾患である。好ましくは、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患又は増殖性疾患である。本発明において、前記自己免疫疾患は、当該技術分野の通常的な自己免疫疾患であり、好ましくは、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、慢性甲状腺炎又は免疫不全症候群である。本発明において、前記炎症性疾患は、当該技術分野の通常的な炎症性疾患である、好ましくは、喘息又は過敏症である。本発明において、前記感染性疾患は、当該技術分野の通常的な感染性疾患であり、好ましくは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を得るものである。本発明において、前記増殖性疾患は、当該技術分野の通常的な増殖性疾患であり、好ましくは、白血病、腫瘍又はリンパ腫である。
【００５１】
本発明は、前記タンパク質を活性成分として含む薬物組成物を提供する。
【００５２】
好ましくは、前記薬物組成物は、ＢＬｙＳ発現又は機能異常に関連する疾患を予防又は治療するための薬物組成物である。
【００５３】
本発明による薬物組成物の投与経路は、好ましくは、注射によって投与されたり、又は経口投与される。前記注射投与は、好ましくは、静脈注射、筋肉注射、腹腔注射、皮内注射又は皮下注射などの経路を含む。前記薬物組成物は、当該分野の通常的な種々の製剤であり、好ましくは固体、半固体又は液体の形式であり、水溶液、非水溶液又は懸濁液であってもよいし、より好ましくは、錠剤、カプセル、顆粒剤、注射剤又は注入剤である。
【００５４】
本発明において、好ましくは、本発明の薬物組成物は、１種又は多種の薬用担体をさらに含む。前記薬用担体は、当該技術分野の通常的な薬用担体であり、前記薬用担体は、任意の適切な生理学的又は薬学的に許容される薬物補助剤であってもよい。前記薬物補助剤は、当該技術分野の通常的な薬物補助剤であり、好ましくは、薬学的に許容される薬物賦形剤、充填剤、希釈剤などを含む。より好ましくは、薬物組成物は、０．０１〜９９．９９％の前記タンパク質と０．０１〜９９．９９％の薬用担体を含み、前記パーセンテージは、前記薬物組成物の質量パーセンテージである。
【００５５】
本発明において、好ましくは、前記薬物組成物の使用量は、有効量であり、前記有効量は、疾患を緩和又は遅延させることができ、変性又は外傷性疾患の発展の量である。前記有効量は、個々に基づいて決定することができ、治療症状及び求められる結果の検討に部分的に基づいている。当業者は、個体の基礎などの前記の因子を使用することと、通常的な実験を超えない実験を使用することによって、有効量を決定することができる。
【００５６】
本発明は、ＢＬｙＳ発現又は機能不全に関連する疾患を予防又は治療するための薬物の製造における前記タンパク質の応用を提供する。好ましくは、前記ＢＬｙＳ発現又は機能不全に関連する疾患は、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患又は増殖性疾患である。
【００５７】
本発明は、ＢＬｙＳ発現又は機能不全に関連する疾患の予防又は治療のための薬物の製造における前記薬物組成物の応用を提供する。好ましくは、前記ＢＬｙＳ発現又は機能不全に関連する疾患は、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患又は増殖性疾患である。
【００５８】
当該分野における常識に合致する基礎に、前記の好ましい条件を任意に組み合わせて、本発明のそれぞれ好ましい実施例を得ることができる。
【００５９】
本発明で使用される試薬と原料は全部市販されている。
【００６０】
本発明の進歩的な効果は、本発明の前記タンパク質は、ヒト化又は完全ヒトＢＬｙＳ抗体であり、ＢＬｙＳタンパク質と高親和性（親和性ＫＤ（５×１０−９Ｍ）を有し、タンパク質と細胞レベルでＢＬｙＳタンパク質を効果的にブロックすることができ、ＢＬｙＳタンパク質と受容体の結合を阻止する。前記ＢＬｙＳ抗体は、ヒトＡＰＲＩＬなど同類タンパク質抗原との交差反応が欠乏する。Ｂ細胞増殖実験は、前記ＢＬｙＳ抗体は良好な生物学的活性を有するし、ＢＬｙＳ誘導の小鼠Ｂ細胞の増殖を抑制することができることを証明した。マウスにおけるインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）試験は、前記ＢＬｙＳ抗体が、ＢＬｙＳタンパク質により引き起こされるマウス脾細胞におけるＢ細胞の割合の増加を減少させることができることを証明した。したがって、前記ＢＬｙＳ抗体は、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患、又は増殖性疾患などのＢＬｙＳ発現又は機能不全に関連する疾患を検出、診断、治療又はスクリーニングするために単独又は他の薬物と組み合わせて使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
以下に、本発明の特徴及び利点を、添付した図面を参照して説明される。
【００６２】
【図１】精製されたｈＢＬｙＳ−ＥＣＤの生物活性を検出した結果図であり、ここで、ＲＬＵは相対光単位を表す。
【図２Ａ−Ｂ】ＣＨＯ−Ｋ１組換え細胞株ＢＬｙＳタンパク質の発現レベルを蛍光励起細胞ソーティング分析方法によって検出した結果を示す。ここで、２Ｃ４はクローン番号を表し、４Ｃ４はクローン番号を表し、抗体は、ＢＬｙＳ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入）を指し、陰性対照はアイソタイプ（Ｉｓｏｔｙｐｅ）抗体対照を指す。
【図３】免疫原免疫後のＢＡＬＢ／ｃとＳＪＬマウスの血清抗体力価をＥＬＩＳＡによって検出した結果図である。
【図４】ｈＢＬｙＳ−ＥＣＤ活性を酵素結合免疫吸着アッセイ（Ａｓｓａｙ）によって検出した結果図である。
【図５Ａ−Ｂ】酵素結合免疫吸着アッセイにおけるＢＬｙＳ精製抗体とビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）化されたｈＢＬｙＳ−ＥＣＤとの反応性活性の結果図である。
【図６Ａ−Ｂ】ＢＬｙＳ精製抗体とＢＬｙＳ同じ家族ＡＰＲＩＬタンパク質との反応を酵素結合免疫吸着アッセイによって検出した結果図である。
【図７】ＢＬｙＳ精製抗体とヒトＢＬｙＳ組み換え細胞の反応性活性を蛍光励起細胞ソーティング分析実験によって検出した結果図である。
【図８】ＢＬｙＳ精製抗体とサルＢＬｙＳ組み換え細胞の反応性活性を蛍光励起細胞ソーティング分析実験によって検出した結果図である。
【図９Ａ−Ｂ】ＢＬｙＳ精製抗体がＢＬｙＳ受容体ＢＡＦＦ Ｒとビオチン化のｈＢＬｙＳ−ＥＣＤの結合活性をブロックする結果図である。
【図１０】ＢＬｙＳ精製抗体がｈＢＬｙＳ−ＥＣＤで刺激したマウスＢ細胞の増殖の阻害作用に対する結果図である。
【図１１】ＢＬｙＳ精製抗体がマウスＢＬｙＳで刺激したマウスＢ細胞の増殖の阻害作用に対する結果図である。
【図１２】酵素結合免疫吸着アッセイにおけるＢＬｙＳキメラ抗体とビオチン化されたｈＢＬｙＳ−ＥＣＤとの反応性活性の結果図である。
【図１３】ＢＬｙＳキメラ抗体がＢＬｙＳ受容体ＢＡＦＦ Ｒとビオチン化のｈＢＬｙＳ−ＥＣＤの結合活性をブロックする結果図である。
【図１４】ＢＬｙＳキメラ抗体がｈＢＬｙＳ−ＥＣＤで刺激したマウスＢ細胞の増殖の阻害作用に対する結果図である。
【図１５Ａ−Ｃ】ＢＬｙＳキメラ抗体及び完全ヒト由来抗体がｈＢＬｙＳ−ＥＣＤ刺激後の脾細胞におけるマウスＢ細胞の割合に対する影響の結果図である。
【図１６】酵素結合免疫吸着アッセイにおける、ＢＬｙＳヒト化抗体とビオチン化のｈＢＬｙＳ−ＥＣＤとの反応性活性の結果図である。
【図１７】ＢＬｙＳヒト化抗体がＢＬｙＳ受容体ＢＡＦＦ Ｒとビオチン化のｈＢＬｙＳ−ＥＣＤの結合活性をブロックする結果図である。
【図１８】ＢＬｙＳヒト化抗体がｈＢＬｙＳ−ＥＣＤで刺激したマウスＢ細胞の増殖の阻害作用に対する結果図である。
【図１９Ａ−Ｂ】ＢＬｙＳヒト化抗体がｈＢＬｙＳ−ＥＣＤ刺激後の脾細胞におけるマウスＢ細胞の割合血清中のＩｇＡレベルに対する影響の結果図である。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
以下は、本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、これによって、本発明が記載された実施例の範囲に限定されることを意図するものではない。以下の実施例において、具体的な条件が指定されていない実験方法は、通常の方法及び条件に従って、又は製品マニュアルに従って選択される。
【００６４】
実施例に記載されている「室温」とは、試験を行う操作の間の温度を指し、一般に１５〜３０℃である。
【００６５】
実施例１ハイブリドーマ技術によるＢＬｙＳ抗体の製造
一、免疫原の製造
ヒト由来ＢＬｙＳタンパク質の細胞外領域（ＢＬｙＳ−ＥＣＤ）のＡｌａ１３４−Ｌｅｕ２８５をコードするアミノ酸配列を含むヌクレオチド配列（配列表の配列番号１３１に示さされたようであり）を、Ｈｉｓタグ付きのｐＣＰＣ担体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｖ０４４−５０から購入）にクローニングし、もう確立された標準的分子生物学的方法に従ってプラスミドを製造した。具体的な方法は、[Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）]を参照する。ＨＥＫ２９３細胞に対して、一時的にトランスフェクションし（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を用いて３７℃で拡大培養した。７日後、細胞培養液を回収し、細胞成分を遠心分離により除去して、ヒト由来ＢＬｙＳタンパク質の細胞外領域を含む培養上清液を得た。ＵＶ紫外線吸収値（Ａ２８０ｎｍ）の変化を紫外線（ＵＶ）検出器でモニタリングしながら、培養上清液をＮｉアフィニティークロマトグラフィーカラム（Ｎｉ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｌｕｍｎ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）に充填した。ローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）した後、ＵＶ吸光度がベースラインに戻るまで５％（ｖ／ｖ）スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）と０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−８０を含むリン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．４）でＮｉアフィニティークロマトグラフィーカラムを洗浄した後、０−５００ｍＭイミダゾール（Ｉｍｉｄａzｏｌｅ）でグラジエント（Ｇｒａｄｉｅｎｔ）溶出をした。Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出したＨｉｓタグ付きヒト由来ＢＬｙＳタンパク質の細胞外領域を回収し、５％（ｖ／ｖ）スクロースと０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−８０を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、限外濾過チューブで４℃で透析沈殿し、タンパク質の濃縮をした。透析したタンパク質を０．２２μｍで滅菌濾過し、−８０℃で保存して、免疫原としてのヒトＢＬｙＳタンパク質の精製された細胞外ドメイン（すなわち、ｈＢＬｙＳ−ＥＣＤ）を得た。前記免疫原は、使用前にタンパク質濃度、純度、分子量、生物学的活性などの検出のような一連の品質管理検出を行う。
【００６６】
ここで、免疫原の生物学的活性は、Ｂ細胞増殖アッセイによって検出される（方法については実施例５を参照）。結果は、図１及び表３に示されたようであり、前記免疫原は、マウスＢ細胞の増殖を刺激することができる。
【００６７】
【表３】
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【００６８】
二、ヒト又はサルのＢＬｙＳを発現する安定にトランスフェクションされた細胞株の構築
ヒト又はサルのＢＬｙＳ（すなわち、ｈＢＬｙＳ又はｃｙｎｏ ＢＬｙＳ）のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ中の遺伝子受託番号は、それぞれＱ９Ｙ２７５、ＥＨＨ５８７０４．１である）の１３２位をアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）からヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）に突然変異させて、構築された安定にトランスフェクションされた細胞株が完備したヒト又はサルのＢＬｙＳを発現するようにし、切断されない。突然変異した後のヒト又はサルの全長ＢＬｙＳアミノ酸配列のヌクレオチド配列を（配列表の配列番号１３２と配列番号１３３に示されたようである）ｐＬＶＸ担体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入）にクローニングし、上海吉馬製薬有限公司によってレンチウイルスパッケージング（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ）をした後に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株に感染させて、トランスフェクトされた後の細胞を得た（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）。７２時間後、既知のＢＬｙＳ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入）を用いて、蛍光励起細胞ソーティングにより検出を行った（Ｍａｎｅｔｔａ Ｊｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ Ｉｎｆｌａｍｍ Ｒｅｓ，２０（７）：１２１−１３１を参照）。トランスフェクトされた細胞がヒト又はサルＢＬｙＳを発現すると確定された場合、制限希釈によって９６ウェルプレート（Ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）にサブクローニング（Ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ）し、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で、３７℃でインキュベート（Ｉｎｃｕｂａｔｅ）する。約２週間後、部分的なモノクローナルウェル(Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｗｅｌｌ)を選択して、６ウェルプレートに拡大した。拡大したクローンを、公知のＢＬｙＳ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入）を用いて蛍光励起細胞ソーティングにより、さらにスクリーニングした。成長がより良く、蛍光強度がより高いモノクローナル細胞株を選択して、続けて拡大培養をし、液体窒素に凍結保存する。すなわち、ヒト又はサルのＢＬｙＳ安定にトランスフェクションされた細胞株を得る。具体的な選択結果は、表４と図２Ａ〜図２Ｂに示されたようであり、表４の陽性細胞（％）は、全細胞数における陽性細胞が占めるパーセンテージを示す。表４は、ＢＬｙＳ陽性に発現された一連のＣＨＯ−Ｋ１細胞株が製造されたことを説明する。
【００６９】
【表４】
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【００７０】
三、ハイブリドーマ細胞の製造と抗体のスクリーニング
Ａ、６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃとＳＪＬマウス（上海ＳＬＡＣ実験動物有限会社から購入）を使用し、マウスをＳＰＦ条件下で飼育した。初回免疫をする時、段階（一）で得られた免疫原（すなわち、ｈＢＬｙＳ−ＥＣＤ）をフロイントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）で乳化させた後、０．２ｍＬを腹腔に注射し、すなわち、各マウスに免疫原１００μｇを注射した。追加免疫をする時、免疫原は、フロイントの不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ'ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）で乳化させた後０．２ｍＬを腹腔に注射した。すなわち、各マウスに５０μｇの免疫原を注射した。初回免疫と最初の追加免疫との間隔は２週間であり、後に各追加免疫間の間隔は３週間後である。各追加免疫の１週間後に血液を採取し、血清中の免疫原の抗体力価と特異性をＥＬＩＳＡにより検出した。結果は、図３と表５に示されたようである。表５は、免疫原により免疫化されたマウスの血清は、免疫原に対して種々の程度の結合を有し、抗原抗体反応を示し、ここで、最も高い希釈度は約１００万であることを示している。ここで、ブランク対照は１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡであり、ここで、ロットは、２回目の追加免疫後の7日目のマウスの血清を指し、表中のデータはＯＤ４５０ｎｍ値である。
【００７１】
【表５】
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【００７２】
Ｂ、６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃとＳＪＬマウス（上海ＳＬＡＣ実験動物有限会社から購入）を使用し、マウスをＳＰＦ条件下で飼育した。初回免疫をする時、免疫原（ｈＢＬｙＳ−ＥＣＤ）、オリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（ＣｐＧ）とＧＥＲＢＵアジュバントを混合した後、マウスの足関節に２５μＬを注射した。すなわち、各マウス免疫原１０μｇを注射した。追加免疫をする時、免疫原とＧＥＲＢＵアジュバントを混合した後、足関節に２５μＬを注射した。すなわち、各マウスに免疫原を５μｇ注射した。初回免疫と追加免疫の間隔は３〜４日である。２回目の追加免疫の１週間後に採血し、血清中の抗体力価及び免疫原の特異性をＥＬＩＳＡにより検出した。２回目の追加免疫の後、ＥＬＩＳＡにより検出された血清抗体力価は、１：１００００以上に達した。
【００７３】
段階ＡとＢが完成する前に、５μｇまたは５０μｇの免疫原を、各選択された最後に免疫されたマウスの腹腔に又は足関節に注射し、マウスを５日後に屠殺して、脾臓細胞を収集した。ＮＨ４ＯＨを最終濃度１％（ｗ／ｗ）になるように加えて、脾臓細胞中にこぼれた赤血球を溶解させて脾臓細胞懸濁液を得た。細胞をＤＭＥＭ基礎培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で１０００ｒｐｍ／分間で３回遠心分離した後、高効率電気融合法（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、ＶＯＬ．２２０を参照）を用いて５：１の生存細胞数でマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣから購入）と混合した。融合後、細胞を２０％（ｗ／ｗ）ウシ胎仔血清と１％のＨＡＴを含むＤＭＥＭ培地に希釈した。次いで、９６ウェル細胞培養プレートに１ウェルあたり１×１０５個／２００μＬに加え、５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２、３７℃でインキュベーター中に置いた。１4日後、細胞融合プレートの上清を間接ＥＬＩＳＡによりスクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）し、ＥＬＩＳＡでＯＤ４５０ｎｍ＞１．０を有する陽性クローンを２４ウェルプレートに拡大し、１０％（ｗ／ｗ）ＨＴウシ胎仔血清の含有するＤＭＥＭを３７℃、５％（Ｖ／Ｖ）ＣＯ２で拡大培養した。３日間培養した後、２４ウェルプレートで培養液を遠心分離し、上清を回収し、上清液に対して抗体サブタイプ（Ｓｕｂｔｙｐｅ）分析をした。ここで、ｈＢＬｙＳ−ＥＣＤに対する（結合活性の方法については、それぞれ実施例３Ａと実施例３Ｂを参照）をＥＬＩＳＡにより決定し、抗体サンプルがＢＬｙＳ受容体に対するブロッキング活性（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、リガンド受容体（Ｌｉｇａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）結合アッセイにより決定した（ブロッキング活性検出方法は、それぞれ実施例４を参照）。
【００７４】
２４ウェルプレートスクリーニングの結果によると、ＥＬＩＳＡ実験でＯＤ４５０ｎｍ＞１．０とリガンド受容体結合実験においてハイブリドーマ細胞培養上清のブロッキング速度が６０％であるハイブリドーマ細胞が、ＢＬｙＳ受容体のブロッキング阻害率が６０％に達するハイブリドーマ細胞を要件を満たす陽性クローンとして選択され、選択されたハイブリドーマ細胞を、限界希釈することによって９６６ウェルプレートにサブクローニングし、１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２条件で培養した。サブクローンをした後１０日にＥＬＩＳＡにより最初のスクリーニングをし、単一の陽性モノクローナルを選択して、２４ウェルプレートに拡大し、継続して培養する。３日後に受容体リガンドアッセイを用いて結合活性を評価した。ここで、評価基準は、ＥＬＩＳＡ実験のＯＤ４５０ｎｍ＞１．０、またリガンド受容体結合実験においてハイブリドーマ細胞培養上清がＢＬｙＳ受容体ブロッキング阻害率が６０％に達するものである。
【００７５】
２４ウェルプレートサンプルの検出結果に基づいて、最優秀のクローンを選択し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）で１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を含むＤＭＥＭ培地中で、前記最優秀のクローンに対して拡大培養をし、液体窒素中で最適なハイブリドーマ細胞を凍結保存して得た後、繋がる抗体の生成及び精製に用いることができる。
【００７６】
四、リード抗体の生産と精製
ハイブリドーマ細胞はより生成された抗体の濃度が低いので、約１〜１０μｇ/ｍＬだけに、得られる抗体濃度は大きく変化する。培地中の細胞培養によって生成される様々なタンパク質と培地中に含まれるウシ胎児血清は、多くの生物活性の分析方法に種々の程度の干渉がありため、小規模（１〜５ｍＧ）の抗体生産、精製を実施する必要がある。
【００７７】
段階三から得られたハイブリドーマ細胞を、Ｔ−７５細胞培養フラスコに接種し、生産培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入したＨｙｂｒｉｄｏｍａ  ｓｅｒｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ）を用いて３回継代培養した。成長状態がよければ、接種細胞培養スピナーボトル（ｓｐｉｎｎｅｒ ｂｏｔｔｌｅ）をした。各２リットルの培養フラスコに５００ｍＬの生産培地を加え、接種細胞密度は、１．０×１０５個／ｍＬである。ボトルキャップを閉め、スピナーフラスコを３７℃インキュベーターボトルシェーカーに入れ、３ｒｐｍ／分間の速度である。１４日間の連続回転培養の後、細胞培養物を収集し、細胞を濾過により除去し、０．４５μｍのフィルターで濾過して培養上清を清澄化した。清澄化された培養上清は、直ちに精製するか、又は−３０℃で冷凍保存することができる。
【００７８】
ハイブリドーマ細胞を３００ｍＬの清澄化された培養上清中のモノクローナル抗体を、２ｍＬプロテインＧカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｃｏｌｕｍｎ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）を用いて精製した。プロテインＧカラムを平衡化緩衝液（ＰＢＳリン酸緩衝液、ｐＨ７．２）で平衡化し、次いで清澄化された培養上清をプロテインＧカラムにローディングし、３ｍＬ/分の流速でコントロールした。ローディング完了した後、プロテインＧカラムを平衡緩衝液で洗浄した。平衡緩衝液の容量は、プロテインＧカラムを充填したカラムの容量の４倍である。プロテインＧカラムに結合したモノクローナル抗体を溶出液（０．１Ｍグリシン塩酸（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）緩衝液、ｐＨ２．５）で溶出し、溶出状況を紫外線検出器（Ａ２８０紫外線吸収ピーク）でモニターした。溶出されたモノクローナル抗体を回収し、１０％（ｖ/ｖ）の１．０ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を添加することによりｐＨを中和した。次に直ちに透析をＰＢＳリン酸緩衝液中で一晩行った。翌日、液を一度交換し、透析を３時間続けた。透析されたモノクローナル抗体を回収し、０．２２μｍのフィルターを用いて滅菌濾過し、滅菌して保存して、精製されたＢＬｙＳ抗体をリード抗体として得る。
【００７９】
精製されたＢＬｙＳ抗体は、タンパク質濃度（Ａ２８０／１．４）、純度、エンドトキシン（Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）（Ｌｏｎｚａキット）等の検出分析をした。結果は、表６に示されたようである。結果、リード抗体のエンドトキシン濃度は１．０ＥＵ／ｍｇ以内であることを見つけだ。
【００８０】
【表６】
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【００８１】
実施例２：ＢＬｙＳ抗体のファージディスプレイ（Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）技術による製造
一、ＢＬｙＳタンパクのビオチン化
Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ−ＮＨＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入）と実施例１で製造した免疫原（ｈＢＬｙＳ−ＥＣＤ）を７：１のモル比で混合し、室温で３０分間放置した後、最終濃度５０ｍＭの１ＭのＮＨ４Ｃｌを加えて反応を停止させた。ＰＢＳリン酸緩衝液中で一晩透析して得て、遊離されたビオチンを除去して、ビオチン化された免疫原（すなわち、ビオチン化されたｈＢＬｙＳ−ＥＣＤ）を得た。ＢＣＡタンパク質濃度測定キットを用いて、ビオチン化ｈＢＬｙＳ-ＥＣＤの濃度を測定した。
【００８２】
ビオチン化されたｈＢＬｙＳ−ＥＣＤの活性はＥＬＩＳＡ方法により測定した。ＢＬｙＳ抗体（ＧＳＫから購入）をＰＢＳで１μｇ／ｍＬまでに希釈し、５０μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡマイクロプレート（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）に加え、４℃で一晩インキュベートし、細胞をＥＬＩＳＡブロッキング溶液[１％（Ｗ／ｖ）ＢＳＡとＴｗｅｅｎ−２０のＰＢＳリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）]で３７℃で２時間ブロッキングした後、また勾配希釈をしたビオチン化されたｈＢＬｙＳ−ＥＣＤを加え、３７℃で１時間インキュベートする。ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）標識されたホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（Ｓｉｇｍａから購入、製品番号Ｓ５５１２）を加え、室温で３０分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルのＴＭＢ発色現像液を加え、室温で１５分間インキュベートした後、１Ｎ塩酸５μＬを加えて呈色反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーでＯＤ４５０ｎｍの値を読み取る。結果は、図４と表７に示されたようであり、結果は、ビオチン化されたｈＢＬｙＳ−ＥＣＤがＢＬｙＳ抗体に結合することができることを説明する。
【００８３】
【表７】
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【００８４】
二、ファージディスプレイ技術スクリーニングＢＬｙＳ抗体
リード抗体は、天然ヒトモノクローナル抗体（ＳｃＦｖ）ファージディスプレイライブラリー（上海睿智化学研究有限公司か構築）を用いてスクリーニングした。４回のバイオパンニング（Ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）によって、ＢＬｙＳに結合する抗体が得られた。具体的なプロセスは次のとおりであり：
ストレプトアビジン用ＰＢＳを１２．５μｇ／ｍＬまでに希釈し、ウェルごとに１ｍＬを免疫チューブに加え、４℃で一晩インキュベートした。免疫チューブをＰＢＳで３回洗浄した後、免疫チューブの半分に、段階一で製造したビオチン化されたｈＢＬｙＳ−ＥＣＤを各チューブに５０μｇ加え、室温で１時間振動した。免疫チューブ用２％（ｗ／ｖ）のブロッキング溶液［２％（ｗ／ｖ）スキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）を含むＰＢＳ緩衝液］１０ｍＬを室温で２時間ブロックした。一方、免疫チューブの他の半分には、１ｍＬのファージＳｃＦｖ抗体ライブラリー（Ｌｉｂｒａｒｙ）とブロッキング溶液を加え、室温で２時間振動した。そして対照チューブをセットし、同じ溶液量のブロッキング溶液を添加する。ビオチン化されたｈＢＬｙＳ−ＥＣＤを加えた免疫チューブと対照チューブのブロッキング溶液を排出し、既にブロッキングされたファージＳｃＦｖ抗体ライブラリーを加え、室温で２時間振盪した。免疫化チューブと対照チューブを、最初にＰＢＳＴ [０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ緩衝液]で５回洗浄し、次いでＰＢＳ緩衝液で５回洗浄した。ここで、洗濯回数は１回につき５回増加した。洗浄後、１０μｇ／ｍＬパンクレアチン（ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ）１ｍＬを各チューブに加え、ビオチン化されたｈＢＬｙＳ−ＥＣＤに結合するファージを３７℃で３０分間インキュベートすることによって溶出した。対数増殖期の大腸菌ＴＧ１（ＬＵＣＩＧＥＮから購入）４ｍＬに１ｍＬパンクレアチン溶液を加え、３７℃で３０分間インキュベートして、ＴＧ１の培養液を得る。ＴＧ１の培養液を勾配希釈し、プレートにコーティングし、３７℃一晩培養する。ビオチン化されたｈＢＬｙＳ−ＥＣＤに結合した免疫チューブと対照チューブから得られたクローンの数を計算し、２０〜３０クローンを選択し、シークエンシングする。
【００８５】
一方、プレート上のクローン用２ＹＴ培地（２ＹＴ培地の調製方法としては、１０ｇ酵母エキス（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）、１６ｇトリプトンペプトン（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ ｐｅｐｔｏｎｅ）、５ｇのＮＡＣＬを１Ｌの水に加え、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し、オートクレーブする）を洗浄、回収し、新鮮な培地に接種し、３７℃で対数期まで培養した。ヘルパーファージ（Ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ）Ｍ１３ＫＯ７（ＮＥＢから購入、品番Ｎ０３１５Ｓ）を加え、混合し、３７℃で３０分間放置する。その後、３７℃で３０分間振盪しながら培養し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、細胞を回収し、新鮮な培地を加え、３０℃で４時間振盪培養した。４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上清を回収し、上清の容量の１／４容量の５×ＰＥＧを含む２．５ＭのＮＡＣＬ溶液を加え、氷上に一晩置いた。４℃、４０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離をし、沈殿したファーを回収し、ＰＢＳ緩衝液に溶解した。１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離して残留細胞残渣を除去し、上清を回収して次のラウンドのバイオパニングに用いた。
【００８６】
ＥＬＩＳＡによりスクリーニングしたｓｃＦｖ抗体は、ＢＬｙＳタンパックに対する結合活性を有することが確認された。ＯＤ４５０ｎｍ＞１．０のクローンを選択してシーケンシング（Ｓｅqｕｅｎｃｉｎｇ）して、異なるＨＣＤＲ３配列のクローンを獲得した。次に、またＦＡＣＳとリガンド受容体結合実験により、ＦＡＣＳ実験においてＭＦＩ値＞３０、またリガンド受容体結合実験においての細胞溶解上清がＢＬｙＳ受容体に対するブロッキング率が６０％に達するクローンを選択して、条件に満たす陽性クローンとした。
【００８７】
三、抗体の生産と精製
陽性クローンのシーケンシング結果に従って（詳細は、下記の実施例７を参照）、プライマーを設計し（詳細なプライマー配列は、表８に示されたようである）陽性クローンのシーケンシング結果に従って設計し（詳細は、下記の実施例７を参照）、それぞれＰＣＲ法により、軽鎖と重鎖可変領域を増幅した。トランスフェクションされた陽性クローン大腸菌ＴＧ１で抽出したプラスミド０.５μＬ、大腸菌ＴＧ１、各プライマー１０ｐｍｏｌ、ＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ及び緩衝系を含む５０μＬの反応系を構成した。９５℃で２分間初期変性、９５℃で１５秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）し、６８℃で４５秒間伸長させ、３０サイクル後に６８℃で１０分間伸長させるＰＣＲプログラムを設定して、ＰＣＲ産物を得る。ここで、ＰＣＲに用いたＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ１２３４４から購入し、緩衝体系は、前記ＤＮＡポリメラーゼとセットに購入して用いる緩衝体系である。５μＬのＰＣＲ産物を取り、アガロースゲル電気泳動（Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）検出し、陽性サンプルをカラム回収キット（Ｃｏｌｕｍｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｋｉｔ）で精製し、ここで、回収キットは、ＮｕｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ＆ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐであり、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬから購入し、品番はＣａｔ７４０６０９である。以下のようなライゲーション反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、即ち、断片３μＬを挿入し、酵素消化した担体０．５μＬ、リコンビナーゼ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）Ｅｘｎａｓｅ０．５μＬ、緩衝液２μＬ、反応系１０μＬを３７℃で３０分間反応させて連結物、即ち、構築済みの組換え担体を獲得した。ここで、組み換え酵素は、Ｖａｚｙｍｅから購入し、品番はＣ１１２−０１／０２であり、緩衝液は、前記組み換え酵素とセットに購入して用いる組み換え酵素であり、重鎖可変領域を、シグナルペプチドとヒト由来抗体の重鎖ＩｇＧ１定常領域を含む発現担体に指向的にクローニングし（ここで、発現担体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、組換え段階は、上海睿智化学研究有限公司から完成した）、軽鎖可変領域を、シグナルペプチド（Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）とヒト由来抗体の軽鎖ｋａｐｐａ又はｌａｍｂｄａ（以下に記載するＬ１Ｄ１２抗体の軽鎖についてのみ）定常領域を含む発現担体に指向的にクローニングした（ここで、発現担体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、組換え段階は、上海睿智化学研究有限公司から完成された）。ライゲーション産物１０μＬをコンピテント細胞（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）（Ｅｃｏｓ １０１ ｃｏｍｐｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、Ｙｅａｓｔｅｒｎから購入、品番：ＦＹＥ６０７）５０μＬに加え、３０分間氷冷した。また、４２℃水浴で１分間熱ショックした後、氷上で２分間放置した後、５００μＬの抗生物質を含まない２ＹＴ培地を加え、振盪器上で２００ＲＰＭ、３７℃で４５分間蘇生させ、２００μＬを取り出して、１００μｇ/ｍＬのアンピシリンを含有する固体培地にコーティングして、インキュベータで３７℃で一晩培養する。翌日、発現担体上のプライマー（Ｐｒ���ｍｅｒ）ｐＴＴ−ＥＦ１Ａ−ＦとｐＳＶ４０（ここで、ヌクレオチド配列はそれぞれ配列表の配列番号１３４〜１３５に示されたようであり）、を用いて、３０μＬの反応系を構成し、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）ＰＣＲを行った。コロニーＰＣＲシステムは：プライマー各１μＬずつ、ＰＣＲプレミックス（Ｐｒｅｍｉｘ）（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎから購入）であり、水で２０μＬになるように補充した。ピペットチップを用いてコロニーをつけてＰＣＲ反応系に吹き吸って、０．５μｌを吸い出して、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を含有する別のＬＢ固体プレート上にクリックして、コロニーを保存する。ＰＣＲ反応終了後、溶液５μＬを取り出して、アガロースゲル電気泳動検出を行い陽性サンプルをシーケンシングし、分析した[Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｍｄ．（１９９１）を参照]。
【００８８】
【表８】
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【００８９】
コロニーＰＣＲ検証後、前記配列の組み換え抗体をＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を一過性にトランスフェクトして抗体を生成した。トランスフェクションの際、２９３−Ｆ細胞の密度は１〜１．５×１０６細胞／ｍＬでなければならず、１００ｍＬの細胞は１００μＬの前記構築済みのＤＮＡ（ここで、重鎖担体と組換え軽鎖担体との質量比は３：２である）とトランスフェクション試薬ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）２００μｇを必要とする。担体ＤＮＡとＰＥＩをそれぞれ培地に加え、室温で５分間放置し、０．２２μｍメンブレンフィルター（Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ）でろ過した後、担体ＤＮＡとＰＥＩとの混合物を混合し、室温で１５分間放置した。次いで、前記混合物を細胞にゆっくり加え、３７℃、８％（ｖ／ｖ）ＣＯ２インキュベーターで、１２０ｒｐｍで培養した。トランスフェクションした後、翌日に０．５％（ｖ／ｖ）のタンタルペプトン（Ｔａｎｔａｌｕｍ ｐｅｐｔｏｎｅ）を細胞の培養液に加えた。６〜７日後、細胞を３５００ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収し、０．２２μｍフィルターで濾過した。
【００９０】
２００ｍＬの清澄化された上清中の免疫ルーロン抗体を、１ｍＬのプロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）を用いて精製した。プロテインＡカラムをまず平衡緩衝液（ＰＢＳリン酸緩衝液、ｐＨ７．２）で平衡化し、上清を３ｍＬ／分の流速にコントロールして、Ａカラムにロードした。ロード完了後、プロテインＡカラムを平衡化緩衝液で洗浄し、平衡化緩衝液の容量はプロテインＡカラムのカラム容量の５倍である。プロテインＧカラムに結合したＢＬｙＳ抗体を溶出液（０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液、ｐＨ２．５）で溶出し、溶出状況を紫外線検出器（Ａ２８０紫外線吸収ピーク）でモニターした。溶出された抗体を回収し、１０％（ｖ/ｖ）の１．０ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を添加することによりｐＨを中和し、次に直ちに透析をＰＢＳリン酸緩衝液中で一晩行い、翌日、液を一度交換して、透析を３時間続けた。透析されたＢＬｙＳ抗体を回収し、０．２２μｍのフィルターを用いて滅菌濾過し、滅菌して保存し、即ち精製されたＢＬｙＳ抗体をリード抗体として得る。
【００９１】
リード抗体は、タンパク質濃度（Ａ２８０／１．４）、純度、エンドトキシン（Ｌｏｎｚａキット）等の検出分析をした。結果は、表９に示されたようである。結果、リード抗体のエンドトキシン濃度は１．０ＥＵ／ｍｇ以内であることを示した。
【００９２】
【表９】
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【００９３】
実施例３：リード抗体（Ｐｉｌｏｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の検定
Ａ．抗体とＢＬｙＳタンパク質の結合の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による検出
実施例１と２で得られたリード抗体を、ヒトＢＬｙＳタンパク質とＢＬｙＳタンパク質ファミリーのヒトＡＰＲＩＬタンパク質とそれぞれ交差反応させた。
【００９４】
ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）用ＰＢＳを最終濃度が１．０μｇ／ｍＬになるまで希釈し、各ウェルに５０μＬずつで９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加え、プラスチックラップでよく密閉し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをプレート洗浄液で[０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ緩衝液を含有する]４回洗浄し、ブロッキング溶液[０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０と１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡのＰＢＳ緩衝液とを含有する]を加え、３７℃で２時間ブロックした。ブロッキング溶液を排液し、実施例２で得られたビオチン化されたｈＢＬｙＳ−ＥＣＤをＰＢＳで５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度に希釈し、各ウェルに５０μＬずつ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加え、３７℃で２時間インキュベートした。プレートをプレート洗浄液で[０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ緩衝液を含有する]４回洗浄し、実施例１と２で得られた精製リード抗体１００μｌを各ウェルに加えた。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをプレート洗浄液で[０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ緩衝液を含有する]４回洗浄した。ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ））で標識された二次抗体（Ｓｉｇｍａから購入）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをプレート洗浄液で[０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ緩衝液を含有する]４回洗浄した。ＴＭＢ基質１００μＬを各ウェルに加え、室温で５分間インキュベートした後、１００μＬの停止溶液（１．０ＮのＨＣｌ）を各ウェルに加えた。Ａ４５０ｎｍの値をＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５ｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓから購入）で読み取り、その結果は、図５Ａ〜図５Ｂと表１０に示されたようである。表１０は、精製された後の抗体がＥＬＩＳＡレベルでＢＬｙＳ組換えタンパク質に結合することを説明する。ここで、表中のデータはＯＤ４５０ｎｍ値である。
【００９５】
【表１０】
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【００９６】
ＢＬｙＳ抗体がヒトＡＰＲＩＬタンパク質と交差反応するかどうかを調べるために、ＡＰＲＩＬタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入）をＰＢＳで１．０μｇ／ｍＬの最終濃度になるように希釈し、次に各ウェルに５０μＬずつ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加え、プラスチックラップでよく密閉し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをプレート洗浄液で[０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ緩衝液とを含有する]４回洗浄し、ブロッキング溶液[０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０と１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡのＰＢＳ緩衝液とを含有する]を加え、３７℃で２時間ブロックした。ブロッキング溶液を排液し、実施例１と２で得られたリード抗体をウェルごとに１００μＬ加え、３７℃で２時間インキュベートした後、プレートをプレート洗浄液で[０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ緩衝液を含有する]４回洗浄した。ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）で標識された二次抗体（Ｓｉｇｍａから購入）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをプレート洗浄液で[０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ緩衝液を含有する]４回洗浄した。ＴＭＢ基質１００μＬを各ウェルに加え、室温で５分間インキュベートした後、１００μＬの停止溶液（１．０Ｎ ＨＣｌ）を各ウェルに加えた。Ａ４５０ｎｍの値をＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５ｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓから購入）で読み取り、その結果は、図６Ａ〜図６Ｂと表１１に示されたようである。表１１は、精製された後の抗体がＥＬＩＳＡレベルでＢＬｙＳ組換えタンパク質に結合しないことを説明する。ここで、ヒトＩｇＧ対照はヒトＩｇＧであり、表の中のデータはＯＤ４５０ｎｍ値である。
【００９７】
【表１１−１】
2019533423.tif 000012
【００９８】
【表１１−２】
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【００９９】
Ｂ、抗体とＢＬｙＳ発現細胞の結合の蛍光励起細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）による検出
実施例１の段階二で得られたＣＨＯ−Ｋ１ ｈＢＬｙＳ安定細胞株とＣＨＯ−Ｋ１ ｃｙｎｏＢＬｙＳ安定細胞株を、Ｔ−１７５細胞培養ボトルで９０％のコンフルエントまで増殖させた。培地を吸引し、ＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で１回洗浄し、次いで細胞溶解物（ＴｒｙｐＬＥＴＭ ＥｘｐｒＥｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入）で細胞を処理し、また収集した。具体的な段階は、細胞をＰＢＳ緩衝液で１回洗浄し、細胞計数をした後、細胞をＰＢＳ緩衝液で２×１０６個細胞／ｍｌに希釈し、２％（ｗ／ｗ）のウシ胎仔血清ブロッキング溶液を加え、氷上で３０分インキュベートした。ウェル当たり２００μＬを９６ウェルＦＡＣＳ反応プレートに加え、４℃で２０００ｒｐｍで遠心分離した後、各ウェルに実施例１と２で得られたリード抗体１００μＬを加え、氷上で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液[２％（ｗ／ｗ）ＦＢＳを含有するＰＢＳ緩衝液]で３回遠心洗浄し、各ウェルに蛍光（Ａｌｅｘａ  ４８８）標識された二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）１００μＬを加え、氷上で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回遠心洗浄する。細胞をＦＡＣＳ緩衝液２００μＬで懸濁させ、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ ＣＡＬｉＢｕｒ、ＢＤ会社から購入）を用いて検出し、結果を分析した。結果は図７〜８と表１２〜１３に示されたようであり、表１２〜１３は、リード抗体がヒト細胞表面ＢＬＹＳタンパク質に結合することができ、リード抗体とサルＢＬｙＳは交差反応が存在することを説明する。表中のデータは、ＭＦＩにより測定された細胞集団の平均蛍光強度値である。
【０１００】
【表１２】
2019533423.tif 000014
【０１０１】
【表１３】
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【０１０２】
Ｃ、ＢＬｙＳ抗体の親和定数の測定
ＢｉＡＣｏｒＥ Ｘ１００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）を用いて、親和定数の測定を行う。具体的な操作及び方法は、機器マニュアル及び製造業者が提供した詳細な方法に基づく。具体的には、ＣＭ５チップ（ＳＥｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）で親和力測定を行った。まず、ＣＭ５チップを５０ｍＭＮａＯＨと１：１の体積比で混合された５０ｍＭのＮＨＳ及び２００ｍＭのＥＤＣで順次的に活性化した。次いで、抗ヒトＦｃ断片抗体（Ｇｅｎｗａｙから購入）を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）緩衝液（０．１ｍＬ）で１６．４μｇ／ｍｌまでに希釈し、ＣＭ５チップとカップリング反応を行った。次いで、１Ｍエタノールアミン（Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）を注入して残りの活性化部位に対してブロックをした。被験抗体（すなわち、実施例２から製造されたＢＬｙＳ抗体）をチップに捕捉された後、７種類の異なる濃度勾配で希釈された実施例１で製造した免疫原（すなわち、ｈＢＬｙＳ−ＥＣＤ）注入し、Ｂｉａｃｏｒｅ機器により、抗体と抗原との結合と解離が検出される。次いで、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ＳｏｆｔｗａｒＥ ２．０ソフトウェアを使用して適合させ、結合定数と解離定数が得られ、親和力定数は解離定数対結合定数の比である。結果は、表１４に示されたようであり、ＢＬｙＳ抗体がｈＢＬｙＳ−ＥＣＤに対して高い親和力を有することを説明する。
【０１０３】
【表１４】
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【０１０４】
実施例４：ＢＬｙＳ精製抗体がＢＬｙＳタンパク質とその受容体ＢＡＦＦ Ｒの結合をブロックすることに関する検出
ＢＬｙＳタンパク質の受容体リガンド結合アッセイにより、ＢＬｙＳ抗体がＢＬｙＳタンパク質とその受容体ＢＡＦＦ Ｒの結合をブロックすることを検出した。
【０１０５】
ＢＡＦＦ Ｒ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入）を各ウェルに５０ｎｇずつ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加え、プラスチックラップでよく密閉し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをプレート洗浄液で[０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ緩衝液とを含有する]４回洗浄し、ブロッキング溶液[０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０と２％（ｗ／ｗ）ＢＳＡのＰＢＳ緩衝液とを含有する]を加え、室温で２時間ブロックした。ブロッキング溶液を排液し、まず、各ウェルに実施例１と２で得られたリード抗体５０μＬを加え、次いで各ウェルに実施例２で製造したビオチン化されたｈＢＬｙＳ−ＥＣＤ５０μＬ／ウェルを加え、混合後３７℃で２時間インキュベートした。プレートをプレート洗浄液で[０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ緩衝液を含有する]４回洗浄する。ウェル当たりＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）で標識されたアビジン（Ｓｉｇｍａから購入）１００μＬを加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをプレート洗浄液で[０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ緩衝液を含有する]４回洗浄した。ＴＭＢ基質１００μＬを各ウェルに加え、室温で５分間インキュベートした後、１００μＬの停止溶液（１．０ＮのＨＣｌ）を各ウェルに加えた。Ａ４５０ｎｍの値をＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５ｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓから購入）で読み取り、その結果は、図９Ａ〜図９Ｂと表１５に示されたようである。表１５は、ＢＬｙＳ抗体がＢＬｙＳタンパク質とその受容体ＢＡＦＦ Ｒの結合をブロックすることができることを説明している。
【０１０６】
【表１５−１】
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【０１０７】
【表１５−２】
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【０１０８】
実施例５：ＢＬｙＳ精製抗体のヒト又はマウスヒトＢＬｙＳタンパク質がＢ細胞増殖に対する作用のマウスＢ細胞増殖アッセイによる検出
一、マウス脾臓でＢ細胞単離
新しく採取したマウス脾臓を粉砕した後、１０％（ｗ／ｗ）ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、品番：Ａ１０４９１）に再懸濁させ、７０μｍ細胞ストレーナー（ＢＤから購入）でろ過した。４℃で１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、細胞沈殿を１５秒間ボルテックスシェイキング（Ｖｏｒｔｅｘ ｓｈａｋｉｎｇ）した。赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａから購入）を加え、室温で５分間放置した。１０％（ｗ／ｗ）のウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地で１５ｍＬまでに補足し、４℃で１５００ ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を得る。上清を４０μｍ細胞ストレーナ（ＢＤから購入）でろ過し、ろ過した上清を得て、次いで細胞計数をした。マウスＢ細胞をキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから購入）を用いて単離した。実験操作は、キットの指示書に厳密に従って行った。具体的な実験は以下のように要約される：過した後の上清を３００ｇの回転数で４℃で１０分間遠心分離した後、上清を捨てた。４０μｌの緩衝液[０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡとＥＤＴＡ２ｍＭを含有するＰＢＳ緩衝液]とキット中の結合した非Ｂ細胞のビオチン化された抗体混合物１０μｌを細胞あたり１０７個加え、混合した後４℃で５分間インキュベートした。１０７細胞あたり３０μＬの緩衝液[０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡと２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ緩衝液]及び２０μＬの抗アビジン標識された磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから購入）を次いで加え、混合した後４℃で１０分間インキュベートして、細胞懸濁液を得る。緩衝液で容量を５００μＬまでに補足した。ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから購入）を磁気スタンドに置き、３ｍＬの緩衝液ですすぎ、次いで細胞懸濁液を加えて、フロースルーを回収し、すなわち標識されない富化されたＢ細胞懸濁液を回収した。さらに３ｍＬの緩衝液を加え、フロースルーを回収し、前の段階のフロースルーと合わせて、即ちマウス脾臓から単離したＢ細胞を得た。
【０１０９】
二、マウスＢ細胞増殖実験
実施例５の段階一から得られたＢ細胞を９６穴細胞培養プレート上に１ウェルあたり５×１０４個細胞で播種し、２μｇ／ｍＬのＦ（ａｂ‘）断片化ヤギ抗マウスＩｇＭ二次抗体、１０ｎｇ／ｍＬの実施例１で製造された免疫原（ｈＢＬｙＳ−ＥＣＤ）又はマウスＢＬｙＳタンパク質抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入）と異なる濃度の実施例１又は２で製造されたリード抗体の溶液を加え、１ウェルあたり１００μＬの容量を保証する。反応プレートを３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２インキュベーター中で７２時間インキュベートした後、生細胞の数を計数した。生細胞の数は、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ(登録商標)Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａから購入）を用いて測定する。実験操作は、キットの指示書に厳密に従って行った。具体的な実験は以下のように要約される：９６ウェルプレートを測定の前に室温で３０分間平衡化し、細胞培養培地等容量のＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ(登録商標)試薬を細胞培養培地に加え、シェーカーに２分間入れて細胞溶解を誘導し、またウェルプレートを室温で１０分間放置して発光シグナルを安定化させ、最終的にプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３８４ｐＬｕｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）で値を読み取る。
【０１１０】
ＢＬｙＳ抗体の実施例５の段階二に記載の実験におけるマウスＢ細胞の増殖に対するＢＬｙＳ抗体の効果を検出した。その結果は、図１０〜図１１と表１６〜１７に示されたようである。図１１は、被験抗体Ｌ９Ｇ７がマウスＢＬｙＳ誘導Ｂ細胞増殖を阻害することができることを除いて、マウスＢＬｙＳと交差反応がないことを説明する。
【０１１１】
【表１６】
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【０１１２】
【表１７】
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【０１１３】
実施例６：ＢＬｙＳ抗体結合の抗原エピトープ（Ｅｐｉｔｏｐｅ）の同定
精製されたＢＬｙＳ抗体とハイブリドーマの抗体を競争酵素結合免疫吸着アッセイ行って、異なる抗体に結合された抗原エピトープを分析した。
【０１１４】
まず、精製されたＢＬｙＳ抗体用ＰＢＳを最終濃度１．０μｇ／ｍＬまでに希釈し、
各ウェルに５０μＬずつ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加え、プラスチックラップでよく密閉し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをプレート洗浄液で[０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ緩衝液を含有する]４回洗浄し、ブロッキング溶液[０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０と１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡのＰＢＳ緩衝液とを含有する]を加え、３７℃で１時間ブロックした。ブロッキング溶液を排液し、競争的抗体及びヒトＩｇＧ対照群用ＰＢＳを４０μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈し、次いで各ウェルに５０μＬずつ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加えた。次いで、ビオチン化されたｈＢＬｙＳ−ＥＣＤをＰＢＳで２ｎｇ／ｍＬの最終濃度まで希釈し、次いで各ウェルに５０μＬずつ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加えた。競合抗体及びｈＢＬｙＳ−ＥＣＤの最終濃度は、それぞれ２０μｇ／ｍＬ及び１ｎｇ／ｍＬに保証した。３７℃で２時間インキュベートした後。プレートをプレート洗浄液で[０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ緩衝液を含有する]４回洗浄し、実施例１と２で得られた精製リード抗体１００μｌを各ウェルに加えた。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをプレート洗浄液で[０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ緩衝液を含有する]４回洗浄した。ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）で標識されたストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａから購入）を加え、ウェルブごとに１００μＬを添加する。  ３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをプレート洗浄液で[０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ緩衝液を含有する]４回洗浄した。各ウェルにＴＭＢ基質１００μＬを加え、室温で５分間インキュベートした後、各ウェルに１００μＬの停止溶液（１．０Ｎ ＨＣｌ）を加えた。Ａ４５０ｎｍの読み取り値をＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５ｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓから購入）で読み取る。その結果は、表１８Ａ〜表１８Ｂに示されたようであり、ＢＬｙＳ抗体との間に程度が異なる競争性があり、すなわち異なるエピトープに結合することを説明する。ここで、表中のデータは、競争的抗体を加えた後、ｈＢＬｙＳ−ＥＣＤの結合のレベルに対する阻害率（％）である。
【０１１５】
【表１８Ａ】
2019533423.tif 000021
【０１１６】
【表１８Ｂ】
2019533423.tif 000022
【０１１７】
実施例７：軽重鎖可変領域アミノ酸配列の測定及びマウス−ヒトキメラ抗体の製造
全ＲＮＡの単離：実施例１で選択されたリード抗体に対応するサブクローン培養物から得られた上清液を抗原結合について試験し（すなわち、実施例３〜５の検定と活性検定後）、５×１０７個ハイブリドーマ細胞を遠心分離により収集し、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌを加えて混合し、１．５ｍＬ遠心管に移し、室温で５分間放置して、クロロホルム０．２ｍＬを加え、１５秒振動し、２分間静置した後、４℃、１２０００ｇで５分間遠心分離し、上清を取って新しい１．５ｍＬ遠心管に移し、イソプロパノール０．５ｍＬを加え、チューブの中の液体を穏やかに混合し、室温で１０分間静置した後、４℃、１２０００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。７５％（ｖ／ｖ）エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）１ｍＬを加え、静かに沈殿を洗浄し、４℃、１２０００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿を乾燥させ、４℃、１２０００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、ペレットを乾燥させ、ＤＥＰＣ処理したＨ２Ｏを加えて溶解して（５５℃の水浴で１０分間溶媒を促進する）全ＲＮＡを得る。
【０１１８】
逆転写とＰＣＲ：１μｇ全ＲＮＡをとり、２０μＬ系を構成し、逆転写酵素を加えた後、４２℃で６０分間反応させ、８５℃で１０分間反応させた後反応を停止させる。ＰＣＲシステムは、ｃＤＮＡ１μＬ、各プライマー２５ｐｍｏｌ、ＤＮＡポリメラーゼ１μＬ、及び相応する緩衝系を含む５０μＬのＰＣＲ系を構成し、９５℃で３分間初期変性、９５℃で１５秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３５秒間伸長し、３５サイクル後に７２℃で５分間伸長するＰＣＲプログラムを設定して、ＰＣＲ産物を得る。ここで、逆転写に用いたキットは、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘであり、Ｔａｋａｒａから購入し、品番はＲＲ０３６であり、ＰＣＲに使用したキットには、ＮＥＢから購入した品番はＭ０４９２であるＱ５スーパーフィデリティ酵素が含まれている。
【０１１９】
クローニングとシーケンシング：５μＬのＰＣＲ産物を取って、アガロースゲル電気泳動で行い、陽性サンプルを、検出する陽性サンプルは、カラム回収キットを用いて精製し、ここで、回収キットは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ  ＆  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐであり、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬから購入し、品番は７４０６０９である。ライゲーション反応：サンプル５０ｎｇ、Ｔ−担体０．５μＬ、リガーゼ（Ｌｉｇａｓｅ）０．５μＬ、緩衝液１μＬ、反応系を１０μＬとし、１６℃で３０分間反応させてライゲーション産物を得た。ここで、ライゲーションされたキットは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼであり、ＮＥＢから購入し、品番はＭ０４０２であり、ライゲーション産物５μＬをコンピテント細胞（Ｅｃｏｓ １０１ ｃｏｍｐｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、Ｙｅａｓｔｅｒｎから購入、品番ＦＹＥ６０７）１００μＬに加え、５分間氷浴した。また４２℃水浴で１分間熱ショックした後、氷上で１分間放置した後、６５０μＬの抗生物質を含まないＳＯＣ培地を加え、振盪器上で２００ＲＰＭ、３７℃で３０分間蘇生させ、２００μＬを取り出して、抗生物質を含有する固体培地にコーティングして、インキュベータで３７℃で一晩培養する。翌日、Ｔ−担体上のプライマーＭ１３ＦとＭ１３Ｒを用いて、３０μＬの反応系を構成し、コロニーＰＣＲを行い、ピペットチップを用いてコロニーをつけてＰＣＲ反応系に吹いて入れ、０．５μｌを吸い出して、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する別のＬＢ固体プレート上にクリックして、コロニーを保存し、ＰＣＲ反応終了後、溶液５μＬを取り出して、アガロースゲル電気泳動検出を行い、陽性サンプルをシーケンシングし、分析した[Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｍｄ．（１９９１）を参照]。
【０１２０】
本発明におけるファージにより製造された完全ヒトＢＬｙＳ抗体のクローニングとシーケンシングについては、実施例２の第三部分を参照し、このシーケンシングの結果も表１９、２０にもこの部分のシーケンス結果が含まれる。
【０１２１】
【表１９】
2019533423.tif 000023
【０１２２】
ここで、表１９中の数字は、配列表の配列番号であり、例えば、２−１Ｇ１１の重鎖タンパク質可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１であり、２−１Ｇ１１の重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号２である。
【０１２３】
【表２０】
2019533423.tif 000024
【０１２４】
ここで、表２０中の数字は、配列表の配列番号である。例えば、２−１Ｇ１１をコードする重鎖可変領域のアミノ酸配列の塩基配列は、配列番号１０５であり、２−１Ｇ１１をコードする軽鎖タンパク質可変領域のアミノ酸配列の塩基配列は、配列番号１０６である。
【０１２５】
２−１Ｇ１１をコードする重鎖可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０５の７６位乃至１０５位であり、
２−１Ｇ１１をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０５の１４８位乃至１９８位であり、
２−１Ｇ１１をコードする重鎖可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０５の２９５位乃至３４２位であり、
２−１Ｇ１１をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０６の７０位乃至１０２位であり、
２−１Ｇ１１をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０６の１４８位乃至１６８位であり、
２−１Ｇ１１をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０６の２６５位乃至２９１位であり、
Ｌ９Ｇ７をコードする重鎖可変領域のＣＤＲ１ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０７の７６位乃至１０５位であり、
Ｌ９Ｇ７をコードする重鎖可変領域のＣＤＲ２ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０７の１４８位乃至１９８位であり、
Ｌ９Ｇ７をコードする重鎖可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０７の２９５位乃至３４２位であり、
Ｌ９Ｇ７をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０８の７０位乃至１０２位であり、
Ｌ９Ｇ７の軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０８の１４８位乃至１６８位であり、
Ｌ９Ｇ７をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０８の２６５位乃至２９１位であり、
Ｌ１Ｄ１２をコードする重鎖可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０９の７６位乃至１０５位であり、
Ｌ１Ｄ１２をコードする重鎖可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０９の１４８位乃至１９５位であり、
Ｌ１Ｄ１２をコードする重鎖可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０９の２９２位乃至３３０であり、
Ｌ１Ｄ１２をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１０の６７位乃至９９位であり、
Ｌ１Ｄ１２をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１０の１４５位乃至１６５位であり、
Ｌ１Ｄ１２をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１０の２６２位乃至２９７位であり、
３５Ｅ６Ｆ７Ｃ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１１の７６位乃至１０５位であり、
３５Ｅ６Ｆ７Ｃ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１１の１４８位乃至１９８位であり、
３５Ｅ６Ｆ７Ｃ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１１の２９５位乃至３２１位にあり、
３５Ｅ６Ｆ７Ｃ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１２の７０位乃至９９位であり、
３５Ｅ６Ｆ７Ｃ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１２の１４５位乃至１６５位であり、
３５Ｅ６Ｆ７Ｃ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１２の２６２位乃至２８８位までである。
８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１３の７６位乃至１０５位であり、
８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１３の１４８位乃至１９８位であり、
８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１３の２９５位乃至３４２位であり、
８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１４の７０位乃至１１４位であり、
８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１４の１６０位乃至１８０位であり、
８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１４の２７７位乃至３０３位までである。
２０Ｄ１Ｂ６Ｅ９Ｅ５をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１５の７６位乃至１０５位であり、
２０Ｄ１Ｂ６Ｅ９Ｅ５をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１５の１４８位乃至１９８位であり、
２０Ｄ１Ｂ６Ｅ９Ｅ５をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１５の２９５位乃至３３９位であり、
２０Ｄ１Ｂ６Ｅ９Ｅ５をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１６の７０位乃至１１７位であり、
２０Ｄ１Ｂ６Ｅ９Ｅ５をコードする軽鎖タンパク可変領域のＣＤＲ２ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１６の１６３位乃至１８３位であり、
２０Ｄ１Ｂ６Ｅ９Ｅ５をコードする軽鎖タンパク可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列番号１１６の２８０位乃至３０６位であり、
７８Ｃ１１Ｄ２Ｄ１２をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１７の７６位乃至１０５位であり、
７８Ｃ１１Ｄ２Ｄ１２をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列番号１１７の配列表の１４８位乃至１９８位であり、
７８Ｃ１１Ｄ２Ｄ１２をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１７の２９５位乃至３１５に由来する、
７８Ｃ１１Ｄ２Ｄ１２をコードする軽鎖タンパク可変領域のＣＤＲ１ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１８の７０位乃至９９位であり、
７８Ｃ１１Ｄ２Ｄ１２をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１８の１４５位乃至１６５位であり、
７８Ｃ１１Ｄ２Ｄ１２をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１８の２６２位乃至２８８位であり、
８９Ａ２Ｇ５Ｅ７をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１９の７６位乃至１０５位であり、
８９Ａ２Ｇ５Ｅ７をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１９の１４８位乃至１９５位であり、
８９Ａ２Ｇ５Ｅ７をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１９の２９２位乃至３２７位であり、
８９Ａ２Ｇ５Ｅ７をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２０の７０位乃至１０５位であり、
８９Ａ２Ｇ５Ｅ７をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２０の１５１位乃至第１７１位であり、
８９Ａ２Ｇ５Ｅ７をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２０の２６８位乃至２９４位であり、
９７Ｅ７Ｂ３Ｆ２をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２１の７６位乃至１０５位であり、
９７Ｅ７Ｂ３Ｆ２をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２１の１４８位乃至１９８位であり、
９７Ｅ７Ｂ３Ｆ２をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２１の２９５位乃至３２１位であり、
９７Ｅ７Ｂ３Ｆ２をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２２の７０位乃至１１７位であり、
９７Ｅ７Ｂ３Ｆ２をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２２の１６３位乃至１８３位であり、
９７Ｅ７Ｂ３Ｆ２をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２２の２８０位乃至３０６位であり、
９７Ａ３Ｃ２Ｈ４をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２３の７６位乃至１０５位であり、
９７Ａ３Ｃ２Ｈ４をコードする重鎖可変領域のＣＤＲ２ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２３の１４８位乃至１９８位であり、
９７Ａ３Ｃ２Ｈ４をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２３の２９５位乃至３２７位であり、
９７Ａ３Ｃ２Ｈ４をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２４の７０位乃至１０２位であり、
９７Ａ３Ｃ２Ｈ４をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２４の１４８位乃至１６８位であり、
９７Ａ３Ｃ２Ｈ４をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２４の２６５位乃至２９１位までである。
６７Ａ２Ｅ１Ｄ１０をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２５の７６位乃至１０５位であり、
６７Ａ２Ｅ１Ｄ１０をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２５の１４８位乃至１９８位であり、
６７Ａ２Ｅ１Ｄ１０をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２５の位置２９５位乃至３３３位であり、
６７Ａ２Ｅ１Ｄ１０をコードするタンパク質軽鎖タンパク可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２６の７０位乃至１０２位であり、
６７Ａ２Ｅ１Ｄ１０をコードするタンパク質軽鎖タンパク可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２６の１４８位乃至１６８位であり、
６７Ａ２Ｅ１Ｄ１０をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２６の２６５位乃至２９１位であり、
１１１Ｄ１０Ｄ６Ｇ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２７の７６位乃至１０５位であり、
１１１Ｄ１０Ｄ６Ｇ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２７の１４８位乃至１９８位であり、
１１１Ｄ１０Ｄ６Ｇ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２７の２９５位乃至３０９位であり、
１１１Ｄ１０Ｄ６Ｇ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２８の１０２位乃至７０であり、
１１１Ｄ１０Ｄ６Ｇ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２８の１４８位乃至１６８位であり、
１１１Ｄ１０Ｄ６Ｇ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列番号１２８の２６５位乃至２９１であり、
９３Ｃ６Ｆ１０Ｄ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２９の７６位乃至１０５であり、
９３Ｃ６Ｆ１０Ｄ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２９の１４８位乃至１９８位であり、
９３Ｃ６Ｆ１０Ｄ３をコードする重鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２９の２９５位乃至３３６位であり、
９３Ｃ６Ｆ１０Ｄ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１３０の７０位乃至１０２位であり、
９３Ｃ６Ｆ１０Ｄ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１３０の１４８位乃至１６８であり、
９３Ｃ６Ｆ１０Ｄ３をコードする軽鎖タンパク質可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１３０の２６５位乃至２９１である。
【０１２６】
マウス−ヒトキメラＢＬｙＳ抗体の製造：抗体の重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列を、前記の段階のシーケンシング結果に従って得た。マウス−ヒトキメラＢＬｙＳ抗体の生産と製造は実施例２での段階三を参照し、即ち、１、組換え担体の製造として、重鎖可変領域を、シグナルペプチドとヒト由来抗体の重鎖ＩｇＧ１定常領域を含む発現担体に指向的にクローニングし（ここで、発現担体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入し、組換え段階は、上海睿智化学研究有限公司から完成した）、軽鎖可変領域を、シグナルペプチドとヒト由来抗体の軽鎖ｋａｐｐａ定常領域を含む発現担体に指向的にクローニングした（ここで、発現担体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入し、組換え段階は、上海睿智化学研究有限公司から完成した）、２、細胞トランスフェクション、３、抗体精製。また得られたＢＬｙＳキメラ抗体に対して特徴付けをした（実施例３〜５を参照）。得られたキメラ抗体を、対応するリード抗体クローン番号の前に最初の「ｃ」を付して命名した。例えば、キメラ抗体ｃ８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５に対応するリード抗体クローン番号は８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５である。
【０１２７】
結果は、図１２と表２１に示めされたようであり、表２１は、キメラ抗体がＥＬＩＳＡレベルでＢＬｙＳ組換えタンパク質に結合することを説明する。ここで、表中のデータは、ＯＤ４５０ｎｍ値である。
【０１２８】
【表２１】
2019533423.tif 000025
【０１２９】
Ｂｉａｃｏｒｅ機器により、抗体と抗原との結合と解離が検出される。結果は表２２に示されたようであり、ＢＬｙＳキメラ抗体がｈＢＬｙＳ−ＥＣＤに対して高い親和性を有することを説明する。
【０１３０】
【表２２】
2019533423.tif 000026
【０１３１】
結果は、図１３と表２３に示されたようである。表２３は、ＢＬｙＳキメラ抗体がＢＬｙＳタンパク質とその受容体ＢＡＦＦＲの結合をブロックすることができることを説明する。ここで、表中のデータは、ＯＤ４５０ｎｍ値である。
【０１３２】
【表２３】
2019533423.tif 000027
【０１３３】
結果は、図１４と表２４に示めされたようであり、表２４は、ＢＬｙＳキメラ抗体が、ｈＢＬｙＳ−ＥＣＤ刺激により引き起こされたマウスＢ細胞増殖を阻害することができることを説明する。
【０１３４】
【表２４】
2019533423.tif 000028
【０１３５】
実施例８：マウスのインビボでのＢＬｙＳ抗体中の中和活性の検出
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜９週齢、Lingchang Biotech Co., Ltd.から購入）を収容した後、ＳＰＦレベルで飼育し、１週間の順化後に実験を開始した。マウスに実施例２と６で製造したヒト化又はヒトマウスキメラＢＬＹＳモノクローナル抗体（免疫原注射の１時間前）を１日目及び３日目にマウスに静脈注射し、クローン番号は、それぞれ２−１Ｇ１１、Ｌ１Ｄ１２、Ｃ８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５、Ｃ２０Ｄ１Ｂ６Ｅ９Ｅ５、Ｃ３５Ｅ６Ｆ７Ｃ３、Ｃ９７Ａ３Ｃ２Ｈ４、Ｃ９３Ｃ６Ｆ１０Ｄ３、Ｃ１１１Ｄ１０Ｄ６Ｇ３であり、用量は３ｍｇ／ｋｇである。１日目から４日目に、毎日実施例１で製造した免疫原（ｈＢＬｙＳ−ＥＣＤ）を０．３ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射することにより刺激誘導を行った。５日目に全ての動物を屠殺し、マウスの脾臓重量、脾臓細胞におけるＢ細胞が占める割合と血清中のＩｇＡの濃度を測定した。
【０１３６】
部分的な実験結果は図１５Ａ〜図１５Ｃと表２５を参照する。ヒトＩｇＧ対照はヒトＩＧＧである。実験結果は、ＢＬｙＳ抗体がｈＢＬｙＳ−ＥＣＤ刺激により引き起こされたマウス脾細胞におけるＢ細胞の割合の増加を減少させることができることを示している。
【０１３７】
【表２５−１】
2019533423.tif 000029
【０１３８】
【表２５−２】
2019533423.tif 000030
【０１３９】
【表２５−３】
2019533423.tif 000031
【０１４０】
実施例９：ヒト化ＢＬｙＳ抗体の製造及び同定
前記キメラ抗体ｃ８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５又はｃ９７Ａ３Ｃ２Ｈ４の非ＣＤＲ領域に最適のヒト生殖系列抗体重鎖及び軽鎖可変領域鋳型を生殖系列データベースで選択した。ヒト化ＢＬｙＳ抗体の配列は、ヒト生殖系列エクソンのＶＨ、ＪＨ、Ｖｋ及びＪｋ配列から選択される。ここで、ｃ８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５抗体重鎖可変領域の鋳型は、ヒト生殖系列抗体重鎖ＶＨエキソンのＶＨ１−１８、ＪＨエキソンのＪＨ−６であり、軽鎖可変領域の鋳型は、ヒト生殖系列抗体重鎖ＶｋエキソンのＢ３、ＪｋエキソンのＪｋ−４である。ここで、ｃ９７Ａ３Ｃ２Ｈ４抗体重鎖可変領域の鋳型は、ヒト生殖系列抗体重鎖ＶＨエキソンのＶＨ３−７、ＪＨエキソンのＪＨ−６であり、軽鎖可変領域の鋳型は、ヒト生殖系列抗体重鎖ＶｋエキソンのＡ１０、ＪｋエキソンのＪｋ−４である。
【０１４１】
Ｋａｂａｔの定義に従って決定されたキメラ抗体ｃ８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５又はｃ９７Ａ３Ｃ２Ｈ４の重鎖と軽鎖ＣＤＲは、それぞれ選択されたヒト生殖系列鋳型のＣＤＲ領域に移植されて、生殖系列鋳型を置換し、ヒト化された抗体が得られる。マウス由来の抗体の三次元構造を基にし、埋め込まれた残基、ＣＤＲ領域と直接相互作用する残基及びＶＨとＶＬ構想について重要な影響を与えるフレームワク領域の残基にたいして復帰変異を行って、ヒト化された抗体が得られる。
【０１４２】
ヒト化ＢＬｙＳ抗体変異体の重鎖と軽鎖可変領域とキメラ抗体の重鎖と軽鎖可変領域とのアミノ酸配列アラインメントは、表2６に示されたようである。ここで、ヒト化ＢＬｙＳ抗体ｈ８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５変異体の重鎖可変領域の配列は、それぞれ配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６であり、軽鎖可変領域の配列は、それぞれ配列番号１４７、配列番号１４８である。ヒト化ＢＬｙＳ抗体ｈ９７Ａ３Ｃ２Ｈ４の変異体の重鎖可変領域の配列は、それぞれ配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２であり、軽鎖可変領域の配列は、それぞれ配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７である。
【０１４３】
ヒト生殖系列重鎖可変領域鋳型ＶＨ１−１８／ＪＨ６（配列番号１３６）
ＶＨ１−１８：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲ、
ＪＨ６：ＷＧＱＧＴＶＴＶＳＳ。
【０１４４】
ヒト生殖系列軽鎖可変領域鋳型Ｂ３／ＪＫ４（配列番号１３７）
Ｂ３：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣ、
ＪＫ４：ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ。
【０１４５】
ヒト生殖系列重鎖可変領域鋳型ＶＨ３−７／ＪＨ６（配列番号１３８）
ＶＨ３−７：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮＩＫＱＤＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ、
ＪＨ６：ＷＧＱＧＴＶＴＶＳＳ。
【０１４６】
ヒト生殖系列軽鎖可変領域鋳型Ａ１０／ＪＫ４（配列番号１３９）
Ａ１０：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＧＳＳＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＬＩＫＹＡＳＱＳＦＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣ、
ＪＫ４：ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ。
【０１４７】
【表２６−１】
2019533423.tif 000032
【０１４８】
【表２６−２】
2019533423.tif 000033
【０１４９】
ヒト化ＢＬｙＳ抗体バリアントの重鎖及び軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、表２７に示に示されたようである。ここで、ヒト化ＢＬｙＳ抗体ｈ８Ｅ７Ｄ９Ｃ７Ｆ５バリアントの重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４であり、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１６５、配列番号１６６である。ヒト化ＢＬｙＳ抗体ｈ９７Ａ３Ｃ２Ｈ４バリアントの重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０であり、軽鎖可変領域のヌクレオチドは、それぞれに配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５である。
【０１５０】
【表２７−１】
2019533423.tif 000034
【０１５１】
【表２７−２】
2019533423.tif 000035
【０１５２】
ヒト化ＶＨ又はＶＬドメインから合成された重複オリゴヌクレオチドを配列に基づいて、ＰＣＲオーバーラップ伸長を用いて各ドメインを組み立てた。ＰＣＲ産物に組み込まれた制限部位を用いて、ＶＨドメインを、シグナルペプチドとヒト由来抗体の重鎖ＩｇＧ１定常領域を含む発現担体に指向的にクローニングし（ここで、発現担体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入し、組換え段階は、上海睿智化学研究有限公司から完成した）、ＶＬドメインを、シグナルペプチドとヒト由来抗体の軽鎖ｋａｐｐａ定常領域を含む発現担体に指向的にクローニングして（ここで、発現担体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入し、組換え段階は、上海睿智化学研究有限公司から完成した）、得られた組換えプラスミドは、シークエンシング検証を通じて、高純度の組換えプラスミドを抽出し、０．２２μｍフィルターメンブレンの濾過を通じて、トランスフェクションの使用に提供される。ヒト化ＢＬｙＳ抗体の生産と製造は、実施例２中の第三段階を参考し、得られたＢＬｙＳ抗体について特徴づけを行った（実施例３〜５、７参照）。
【０１５３】
結果は、図１６と表２８に示されたようであり、表２８は、ヒト化ＢＬｙＳ抗体とＢＬｙＳ組み換えタンパク質がＥＬＩＳＡレベルで結合していることを説明する。ここで、表の中のデータはＯＤ４５０ｎｍ値である。
【０１５４】
【表２８】
2019533423.tif 000036
【０１５５】
Ｂｉａｃｏｒｅ機器により、抗体と抗原との結合と解離が検出される。結果は、表２９に示されたようであり、ＢＬｙＳヒト化抗体がｈＢＬｙＳ−ＥＣＤに対して高い親和性を有することを説明する。
【０１５６】
【表２９】
2019533423.tif 000037
【０１５７】
結果は、図１７と表３０に示されたようであり、表３０は、ＢＬｙＳヒト化抗体がＢＬｙＳタンパク質とその受容体ＢＡＦＦＲの結合をブロックすることができることを説明する。ここで、表中のデータは、ＯＤ４５０ｎｍ値である。
【０１５８】
【表３０】
2019533423.tif 000038
【０１５９】
結果は、図１８と表３１に示めされたようであり、表３１は、ＢＬｙＳヒト化抗体が、ｈＢＬｙＳ−ＥＣＤ刺激により引き起こされたマウスＢ細胞増殖を阻害することができることを説明する。
【０１６０】
【表３１】
2019533423.tif 000039
【０１６１】
一方、マウスの体内でＢＬｙＳヒト化抗体の中和活性が検出された。実験結果は、図１９Ａ〜１９Ｂと表３２に示されたようである。実験結果は、ＢＬｙＳヒト化抗体がｈＢＬｙＳ−ＥＣＤ刺激により引き起こされたマウス脾細胞におけるＢ細胞の割合の増加を低下させ、一方血清中のＩｇＡレベルを効果的に阻害できることを表明した。
【０１６２】
【表３２−１】
2019533423.tif 000040
【０１６３】
【表３２−２】
2019533423.tif 000041
【０１６４】
本出願において言及される全ての参考文献は、全部本発明で参考として引用され、各文献が個別に引用されることを参照とするようである。さらに、本発明の前記の内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更を加えることができ、そのような同等の形態も添付の特許請求の範囲に記載された請求項の範囲内に入ることが理解されるべきである。
【図１】
2019533423.tif 000042
【図２Ａ−Ｂ】
2019533423.tif 000043
【図３】
2019533423.tif 000044
【図４】
2019533423.tif 000045
【図５Ａ−Ｂ】
2019533423.tif 000046
【図６Ａ−Ｂ】
2019533423.tif 000047
【図７】
2019533423.tif 000048
【図８】
2019533423.tif 000049
【図９Ａ−Ｂ】
2019533423.tif 000050
【図１０】
2019533423.tif 000051
【図１１】
2019533423.tif 000052
【図１２】
2019533423.tif 000053
【図１３】
2019533423.tif 000054
【図１４】
2019533423.tif 000055
【図１５Ａ−Ｃ】
2019533423.tif 000056
【図１６】
2019533423.tif 000057
【図１７】
2019533423.tif 000058
【図１８】
2019533423.tif 000059
【図１９Ａ−Ｂ】
2019533423.tif 000060
【配列表】
2019533423000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月31日(2019.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＬｙＳ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）である重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３中の一種又は多種、及び／又は、ＢＬｙＳ抗体の軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２と軽鎖ＣＤＲ３中の一種又は多種を含み、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）配列は、配列表の配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、配列番号６６、配列番号７４、配列番号８２、配列番号９０又は配列番号９８に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２７、配列番号３５、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５９、配列番号６７、配列番号７５、配列番号８３、配列番号９１又は配列番号９９に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３６、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、配列番号９２又は配列番号１００に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４６、配列番号５４、配列番号６２、配列番号７０、配列番号７８、配列番号８６、配列番号９４又は配列番号１０２に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９、配列番号４７、配列番号５５、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７９、配列番号８７、配列番号９５又は配列番号１０３に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６又は配列番号１０４に示されたようであり、
又は、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、配列番号６６、配列番号７４、配列番号８２、配列番号９０又は配列番号９８に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２７、配列番号３５、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５９、配列番号６７、配列番号７５、配列番号８３、配列番号９１又は配列番号９９に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３６、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、配列番号９２又は配列番号１００に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４６、配列番号５４、配列番号６２、配列番号７０、配列番号７８、配列番号８６、配列番号９４又は配列番号１０２に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９、配列番号４７、配列番号５５、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７９、配列番号８７、配列番号９５又は配列番号１０３に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６又は配列番号１０４に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列に示されることを特徴とする単離されたタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【請求項２】
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１１に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１２に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１８に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１９に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２０に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２６に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２７に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３４に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３５に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３６に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４３に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５０に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５１に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５２に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５８に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５９に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６０に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６６に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６７に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６８に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７４に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７５に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７６に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８２に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８３に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８４に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９０に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９１に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９２に示されたようであり、
前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９８に示されたようであり、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９９に示されたようであり、また前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１００に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１６に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２２に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２３に示され、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２４に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３１に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３９に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４７に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４８に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５４に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５５に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５６に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６２に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６３に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６４に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７０に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７１に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７２に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７８に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７９に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８０に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８６に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８７に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８８に示されたようであり、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９４に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９５に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９６に示されたようであり、
又は、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０２に示されたようであり、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０３に示されたようであり、また前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０４に示されたようであることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
ＢＬｙＳ抗体の重鎖フレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ａｒｅａ）及び／又は軽鎖フレームワーク領域を含むフレームワーク領域をさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記重鎖フレームワーク領域は、ヒト又はマウス抗体重鎖フレームワーク領域であり、及び／又は、前記軽鎖フレームワーク領域は、ヒト又はマウス抗体軽鎖フレームワーク領域であることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記重鎖フレームワーク領域は、ヒト生殖細胞系抗体重鎖ＶＨエキソン（Ｅｘｏｎ）のＶＨ１−１８、ＶＨエキソンのＶＨ３−７又はＪＨエキソンのＪＨ−６、また前記軽鎖フレームワーク領域は、ヒト生殖細胞系抗体軽鎖ＶＫエキソンのＢ３、ＪＫエキソンのＪＫ−４又はＶＫエキソンのＡ１０であることを特徴とする請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記ＣＤＲとフレームワーク領域からなるＢＬｙＳ抗体の重鎖可変領域及び／又はＢＬｙＳ抗体の軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、配列番号６５、配列番号７３、配列番号８１、配列番号８９、配列番号９７、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１又は配列番号１５２に示されたようであり、
前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４５、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７７、配列番号８５、配列番号９３、配列番号１０１、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、又は配列番号１５７に示されたようであることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１３に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２１に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２９に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３３に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５３に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６１に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６９に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７３に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９３に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０１に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４０に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４０に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４２に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４２に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４３に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４３に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４４に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４４に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４６に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４６に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５３に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１４９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５４に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５０に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５３に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５０に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５４に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５３に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５４に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５１示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５７に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５２に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５２に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５６に示されたようであり、
又は前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５２に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１５７に示されたようであることを特徴とする請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記タンパク質は、抗体重鎖定常領域及び／又は抗体軽鎖定常領域をさらに含むことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記抗体重鎖定常領域は、ヒト由来又はマウス由来抗体重鎖定常領域であり、
前記抗体軽鎖定常領域は、ヒト由来又はマウス由来抗体軽鎖定常領域であることを特徴とする請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記抗体重鎖定常領域は、ヒト由来抗体重鎖定常領域であり、
前記抗体軽鎖定常領域は、ヒト由来抗体軽鎖定常領域であることを特徴とする請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記タンパク質は、ＢＬｙＳ抗体のモノクローナル抗体、抗体全長タンパク質、抗原−抗体結合ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）タンパク質断片、二重特異性抗体、多重特異性抗体、単一鎖抗体、単一ドメイン抗体又は単一ゾーン抗体であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のタンパク質をコード（ｃｏｄｅ）する核酸。
【請求項１３】
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９又は配列番号１７０に示されたようであり、
及び／又は、前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列は、配列表の配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４又は配列番号１７５に示されたようであることを特徴とする請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１０に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１２に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１３に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１４に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２０に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２２に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２３に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２４に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２５に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２８に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１３０に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５８に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５８に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６０に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６０に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６１に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６２に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６２に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６３に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６３に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６４に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６４に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６６に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７１に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６７に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７２に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６８に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７１に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６８に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７２に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７１に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７２に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７３に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７４に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１６９に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７５に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７０に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７３に示されたようであり、
前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７０に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７４に示されたようであり、
又は前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７０に示されたようであり、また前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１７５に示されたようであることをとする請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
請求項１２乃至１４のいずれか一項に記載の核酸を含む組換え発現担体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組換え発現担体を含む組換え発現形質転換体。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組換え発現形質転換体を培養し、培養物からＢＬｙＳ抗体を獲得する段階を含むことを特徴とするＢＬｙＳ抗体の製造方法。
【請求項１８】
請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のタンパク質をインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で被験試料と接触させて、請求項１乃至９のいずれか一項に記載のタンパク質と前記被験試料の結合を検出する段階を含むことを特徴とするＢＬｙＳタンパク質を過剰発現する細胞の検出方法。
【請求項１９】
請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のタンパク質を活性成分として含むことを特徴とするＢＬｙＳタンパク質を過剰発現する細胞を検出するための組成物。
【請求項２０】
請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のタンパク質を活性成分と薬学的に許容される担体として含むことを特徴とする薬物組成物。
【請求項２１】
前記薬物組成物は、０．０１〜９９．９９％の請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の前記タンパク質と０．０１〜９９．９９％の薬用担体を含み、前記パーセンテージは、前記薬物組成物の質量パーセンテージであることを特徴とする請求項２０に記載の薬物組成物。
【請求項２２】
ＢＬｙＳ発現又は機能異常に関連する疾患を予防又は治療するための請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項２０又は２１に記載の薬物組成物。
【請求項２３】
自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患又は増殖性疾患を予防又は治療するための請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項２０又は２１に記載の薬物組成物。
【国際調査報告】
2019533423.tif 000061
2019533423.tif 000062
2019533423.tif 000063
2019533423.tif 000064
2019533423.tif 000065
2019533423.tif 000066
2019533423.tif 000067
2019533423.tif 000068