(57)【要約】  本発明は、部分的に、改変Ｅ４０ＲＦ１＋内皮細胞を含む血液脳関門様組織、ならびにかかる血液脳関門様組織をインビトロとインビボの両方で作製および使用するために有用な様々な組成物および方法に関する。
2019532626.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞を含む、インビトロの血液脳関門（ＢＢＢ）システム。
【請求項２】
内皮細胞が、マウス内皮細胞である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
内皮細胞が、ヒト内皮細胞である、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
内皮細胞が、脳内皮細胞である、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
脳内皮細胞が、脳微小血管内皮細胞である、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
脳内皮細胞が、脳腫瘍に由来する、請求項４に記載のシステム。
【請求項７】
脳内皮細胞が、神経膠腫に由来する、請求項４に記載のシステム。
【請求項８】
脳内皮細胞が、神経膠芽腫（ＧＢＭ）に由来する、請求項４に記載のシステム。
【請求項９】
Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞が、透過性固体支持体上に配置される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
固体透過性支持体が、膜またはフィルターである、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
透過性固体支持体が、ポリエステル、ポリカーボネート、ニトロセルロース、セルロース、またはガラス繊維を含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１２】
透過性固体支持体が、１つまたは複数の細胞外マトリックス構成要素でコーティングされる、請求項９に記載のシステム。
【請求項１３】
細胞外マトリックス構成要素が、アストロサイト細胞外マトリックス、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、コラーゲン、およびマトリゲルからなる群から選択される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
アストロサイト、ペリサイト、および神経幹／前駆細胞（ＮＳＰＣ）からなる群から選択される追加の細胞型をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
アストロサイトが、マウスアストロサイトである、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
アストロサイトが、ヒトアストロサイトである、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
アストロサイトが、内皮細胞と直接接触している、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１８】
内皮細胞が、本質的にコンフルエントな内皮細胞単層である、請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
アストロサイトの本質的にコンフルエントな単層を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２０】
内皮細胞単層が、約２５Ω・ｃｍ２より大きい、または約５０Ω・ｃｍ２より大きい、または約７５Ω・ｃｍ２より大きい、または約１００Ω・ｃｍ２より大きい、または約１２５Ω・ｃｍ２より大きい、または約１５０Ω・ｃｍ２より大きい、または約１７５Ω・ｃｍ２より大きい、または約２００Ω・ｃｍ２より大きい経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を有する、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２１】
内皮細胞単層が、約２．５×１０−６ｃｍ／秒未満のルシファーイエロー透過係数（Ｐｃ）を有する、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２２】
候補作用物質の血液脳関門透過性を評価する方法における、請求項１に記載のシステムの使用。
【請求項２３】
候補作用物質の血液脳関門透過性を評価する方法であって、請求項１に記載のシステム中の内皮細胞を候補作用物質と接触させることを含む、方法。
【請求項２４】
候補作用物質の血液脳関門透過性を評価する方法であって、（ａ）請求項１に記載のＢＢＢシステム中の内皮細胞単層の一面を候補作用物質と接触させること、および（ｂ）候補作用物質が、内皮細胞単層の他面上に存在するかどうか決定することを含み、候補作用物質が内皮細胞単層の他面上に存在する場合、作用物質は血液脳関門透過性であり、候補作用物質が、内皮細胞単層の他面上に存在しない場合、作用物質は、血液脳関門透過性ではない、方法。
【請求項２５】
血液脳関門の透過性に対する作用物質の効果を評価する方法における、請求項１に記載のシステムの使用。
【請求項２６】
血液脳関門の透過性に対する作用物質の効果を評価する方法であって、請求項１に記載のシステムにおいて内皮細胞を候補作用物質と接触させることを含む、方法。
【請求項２７】
血液脳関門の透過性に対する作用物質の効果を評価する方法であって、（ａ）請求項１に記載のＢＢＢシステムにおいて内皮細胞を候補作用物質と接触させること、および（ｂ）ＢＢＳシステムの経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を決定することを含み、候補作用物質が、ＢＢＢシステムのＴＥＥＲ値を候補作用物質の非存在下でのＴＥＥＲ値と比較して低下させる場合、候補作用物質は、ＢＢＢシステムの透過性を増加させ、候補作用物質が、ＢＢＢシステムのＴＥＥＲ値を候補作用物質の非存在下でのＴＥＥＲ値と比較して増加させる場合、候補作用物質は、ＢＢＢシステムの透過性を低下させる、方法。
【請求項２８】
血液脳関門の透過性に対する作用物質の効果を評価する方法であって、請求項１に記載のＢＢＢシステム中の内皮細胞を候補作用物質と接触させ、ＢＢＢシステムの透過係数（Ｐｃ）を決定することを含み、候補作用物質が、ＢＢＢシステムのＰｃ値を候補作用物質の非存在下でのＰｃ値と比較して低下させる場合、候補作用物質は、ＢＢＢの透過性を低下させ、候補作用物質が、ＢＢＢシステムのＰｃ値を候補作用物質の非存在下でのＰｃ値と比較して増加させる場合、候補作用物質は、ＢＢＳの透過性を増加させる、方法。
【請求項２９】
Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞およびアストロサイトを含み、（ａ）ペリサイトおよび／または（ｂ）神経幹／前駆細胞（ＮＳＰＣ）を含んでいてもよい、組成物。
【請求項３０】
内皮細胞が、マウスＥ４ＯＲＦ１＋内皮細胞である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞が、ヒトＥ４ＯＲＦ１＋内皮細胞である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞が、脳内皮細胞である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３３】
脳内皮細胞が、脳微小血管内皮細胞である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
脳内皮細胞が、脳腫瘍に由来する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
脳内皮細胞が、神経膠腫に由来する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３６】
脳内皮細胞が、神経膠芽腫に由来する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３７】
アストロサイトが、マウスアストロサイトである、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３８】
アストロサイトが、ヒトアストロサイトである、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３９】
アストロサイトが、内皮細胞と直接接触している、請求項２９に記載の組成物。
【請求項４０】
内皮細胞が、本質的にコンフルエントな内皮細胞単層で存在する、請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
アストロサイトが、本質的にコンフルエントな単層で存在する、請求項２９〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
組成物が、治療用組成物である、請求項２９〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
組成物が、１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤をさらに含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
血液脳関門の欠陥、疾患、または障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞を含む組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４５】
対象が、マウスであり、内皮細胞が、マウス内皮細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
対象が、ヒトであり、内皮細胞が、ヒト内皮細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
内皮細胞が、脳内皮細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
脳内皮細胞が、脳微小血管内皮細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
脳内皮細胞が、脳腫瘍に由来する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
脳内皮細胞が、神経膠腫に由来する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
脳内皮細胞が、神経膠芽腫に由来する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
内皮細胞が、自己内皮細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５３】
内皮細胞が、同種内皮細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５４】
対象に、アストロサイトを含む組成物を投与することをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
アストロサイトおよび内皮細胞が、同じ組成物中に存在する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
アストロサイトおよび内皮細胞が、別個の組成物中に存在する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
対象が、マウスであり、アストロサイトが、マウスアストロサイトである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
対象が、ヒトであり、アストロサイトが、ヒトアストロサイトである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
アストロサイトが、自己アストロサイトである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
アストロサイトが、同種アストロサイトである、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１６年９月１３日に出願された米国仮特許出願番号第６２／３９３，７７４号の優先権の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が援用される。
【０００２】
本明細書で言及される刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献の全ては、それらの全体が参照により援用される。
【背景技術】
【０００３】
血液脳関門（ＢＢＢ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞外液および細胞から、循環血液を分離する。インビボにおいて、ＢＢＢは、密着結合により互いに結合された脳内皮細胞、基底膜、およびグリア細胞の一種であるアストロサイトによって形成される。ＢＢＢは、高い電気抵抗およびＣＮＳへのある特定の分子および微生物（細菌など）の接近を制限する機能を有する一方で、受動的拡散または選択的能動的輸送のいずれかによって水、一部のガス、および一部の必須の分子（グルコースおよびアミノ酸など）がＣＮＳに入ることを可能にする。
【０００４】
ＢＢＢの関門機能は、インビボにおいて必須の安全機構、即ち脳および脊髄組織の保護を与える一方で、その同じ関門機能が、薬物がＢＢＢを横切る能力が有益となるＣＮＳの処置のための治療剤の開発の障害となる可能性がある。逆に、ＣＮＳ組織に対して悪影響を与え得る薬物の開発の場合、ＢＢＢを横切ることができない作用物質を開発することが望ましい可能性がある。したがって、治療剤のＢＢＢを横切る能力を研究するため、および所望のＢＢＢ透過性を有する作用物質をスクリーニングするためのみならず、正常と疾患状況の両方でのＢＢＢの他の生物学的特性を研究するために使用され得るモデルシステムが、当該技術分野で必要とされている。
【０００５】
また、インビボにおいて起こるＢＢＢに対する損傷、例えば、外傷、疾患、または感染の結果としての損傷を処置し、修復し、または置き換える手段が、当該技術分野で必要とされている。
【０００６】
本発明は、これらの必要性の全てに対処することを目的とする。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、一つには、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１タンパク質を発現するように改変された内皮細胞が、インビボにおいてＢＢＢの重要な特性の多くを忠実に複製するのみならず、重要なことには、ナイーブ（即ち、非Ｅ４ＯＲＦ１発現性）内皮細胞を用いるＢＢＢシステムに対して幾つかの重要な点で優れている血液脳関門様組織を生成するのに使用することができるという意外な発見に基づく。例えば、本特許出願の実施例のセクションにより詳細に記載するように、ここでは、改変Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞は、ナイーブＥＣを含むＢＢＢシステムと比較してかなり改善された関門機能（経内皮電気抵抗（「ＴＥＥＲ」）の増加および透過性共係数の低下）を有するＢＢＢ様組織を生成するのに使用することができることが実証されている。既に、Ｅ４ＯＲＦ１発現が培養液中のＥＣ細胞生存率を改善することは公知であったが（米国特許第８，４６５，７３２号を参照。また、Seandel et al. (2008), PNAS, 105(49):19288-93を参照）、内皮関門機能に対するこのＥ４ＯＲＦ１の効果は、予想外であった。
【０００８】
さらに、本特許出願の実施例のセクションにより詳細に記載するように、ナイーブＥＣと違って、改変Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣは、アストロサイトと直接接触した状態を長期維持できること、および改変Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣの関門機能は、このように細胞がアストロサイトと同時培養される場合にかなり改善されることも見出された。ここでも、内皮−アストロサイト相互作用に対するこのＥ４ＯＲＦ１の効果は予想外であった。
【０００９】
ＢＢＢ様組織またはシステムの生成においてナイーブＥＣに代わって改変Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣを使用することのさらなる利点は、培養液中の長期生存のために血清および／または成長因子（ＶＥＧＦなどの）を必要とするナイーブＥＣと違って、改変Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣが、血清および成長因子の非存在下でさえも長期培養（例えば、１ヶ月を超える）で維持され得ることである。このことは、血清および成長因子（ＶＥＧＦなど）は、本出願の図４で確認されるＢＢＢの望ましくない漏出性を引き起こす（すなわち、抵抗を低下させる／透過性を増加させる）ことがわかっていることから、ＢＢＢ組織／システムの場合に特に重要な利点を与える。
【００１０】
これらの発見に加えて、本特許出願の実施例および図面のセクションに記載されるそれ以外のものに基づいて、本発明は、幾つかの新しい改善されたＢＢＢシステム、組成物、および方法を提供する。
【００１１】
例えば、幾つかの実施形態では、本発明は、例えば、ある特定の疾患状態（例えば、がん）または傷害への応答における薬物試験／スクリーニングならびにＢＢＢ透過性およびＢＢＢ機能の研究で有用であり得るインビトロの血液脳関門（ＢＢＢ）システムを提供する。したがって、一実施形態では、本発明は、Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞を含むインビトロの血液脳関門（ＢＢＢ）システムを提供する。幾つかのかかる実施形態では、内皮細胞は、マウス内皮細胞である。他の実施形態では、内皮細胞は、ヒト内皮細胞である。幾つかのかかる実施形態では、内皮細胞は、脳内皮細胞である。幾つかのかかる実施形態では、インビトロＢＢＢシステムはまた、透過性固体支持体を含み、内皮細胞は典型的にはその上に配置される。幾つかのかかる実施形態では、ＢＢＢシステムはまた、アストロサイトを含み、これは、内皮細胞と直接接触していてもよい。
【００１２】
さらに他の実施形態では、本発明は、ある特定の疾患状態（例えば、がん）または傷害への応答における薬物試験／スクリーニングならびに／またはＢＢＢ透過性およびＢＢＢ機能の研究のためのスクリーニング方法を提供する。
【００１３】
他の実施形態では、本発明は、Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞（例えば、Ｅ４ＯＲＦ１＋脳内皮細胞）とアストロサイトの両方を含む組成物を提供する。他の実施形態では、かかる組成物はまた、ペリサイトおよび／または神経幹／前駆細胞（ＮＳＰＣ）を含むが、これらに限定されない１つまたは複数の追加の細胞型を含んでもよい。幾つかの実施形態では、かかる組成物は、列挙した細胞型、または列挙した細胞型の混合物の実質的に純粋な集団を含む。かかる組成物は、研究用途および治療用途を含む様々な状況で有用であり得る。
【００１４】
よりさらなる実施形態では、本発明は、血液脳関門を冒す欠陥、疾患、または障害の処置の方法を提供し、かかる方法は、Ｅ４ＯＲＦ１＋脳内皮細胞などのＥ４ＯＲＦ１＋内皮細胞を生物対象、例えば、ヒト対象に投与することを含む。
【００１５】
本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、本特許開示の他のセクションにおいてさらに記載される。さらに、当業者に明らかであるように、本明細書中に記載する様々な実施形態のある特定の修飾および組合せは、本発明の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞（ＥＣ）（３週齢のマウス皮質に由来する）の単層の免疫組織化学染色を示す蛍光顕微鏡である。細胞は、密着結合マーカークローディン５およびＣＮＳ特異的ＥＣマーカーＭＦＳＤ２Ａに対して特異的な一次抗体ならびに蛍光標識二次抗体を使用して標識した。クローディン−５タンパク質は、細胞境界で検出した一方で、ＭＦＳＤ２Ａタンパク質は、細胞内で検出した。内皮細胞は、３週齢マウスの皮質に由来した。
【図２】（Ａ）野生型（ＷＴ）マウス脳ＥＣ、マウスアストロサイトと同時培養されたＷＴマウス脳ＥＣ、Ｅ４ＯＲＦ１＋マウス脳ＥＣ、およびマウスアストロサイトと同時培養されたＥ４ＯＲＦ１＋マウス脳ＥＣの単層培養液から記録されたΩ・ｃｍ２単位でのＴＥＥＲ測定値を示すグラフである。ＴＥＥＲ値は、培養３日後に測定した。本明細書中で使用する場合、「ＷＴ」は、Ｅ４ＯＲＦ１を発現するように改変されていないＥＣを指す。（Ｂ）Ｅ４ＯＲＦ１＋マウス脳ＥＣおよびマウスアストロサイトと同時培養されたＥ４ＯＲＦ１＋マウス脳ＥＣの単層培養液から記録されたＴＥＥＲ測定値を示すグラフである。ＴＥＥＲ値は、培養３日後に測定した。ＴＥＥＲ測定値は、アストロサイト同時培養液の非存在下で得られたＴＥＥＲ値に対する百分率で表す。Ｅ４ＲＯＦ１＋ＥＣが直接接触方式でアストロサイトと同時培養された場合に、ＴＥＥＲ値のおよそ２０％の増加が観察された。
【図３】ヒト脳、ヒト臍帯静脈（「ＨｕＶｅｃ」）、ヒト肺、ヒト腎臓、またはヒト心臓に由来するＥ４ＯＲＦ１＋ＥＣの単層培養液から記録されたΩ・ｃｍ２単位でのＴＥＥＲ測定値を示すグラフである。この図で使用する場合の用語「ＶｅｒａＶｅｃ」は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣを指す。ＴＥＥＲ値は、培養３日後に測定した。
【図４】おおよそ２４日の期間にわたってＥ４ＯＲＦ１＋ヒト脳ＥＣの単層培養液から記録されたΩ・ｃｍ２単位でのＴＥＥＲ測定値を示すグラフである。矢印は、ＶＥＧＦが培養液に添加された時点およびＶＥＧＦ含有培地が、ＶＥＧＦを含有しない新鮮培地で置き換えられた時点を示す。
【図５】ルシファーイエロー（ＭＷ＝０．４ｋＤａ）を使用して測定した、空のトランスウェル（即ち、細胞を含まない）、ヒト２９３Ｔ細胞、ヒト脳／ＧＢＭ由来ナイーブＥＣ、ヒト腎臓由来Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣ、およびヒト脳／ＧＢＭ由来Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣの単層の透過係数（Ｐｃ）を示すグラフである。（Ａ）Ｐｃデータは、ｃｍ／秒の単位で表す。（Ｂ）Ｐｃデータは、空のトランスウェル（即ち、細胞を含まない）で得られたＰｃ値に対する百分率として表す。この図で使用する場合の用語「ＶｅｒａＶｅｃ」は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣを指す。
【図６】グレードＡおよびグレードＢのＧＢＭに由来するＥ４ＯＲＦ１＋ヒト脳ＥＣの単層培養液でおおよそ８日の期間にわたって記録された、Ω・ｃｍ２単位でのＴＥＥＲ測定値を示すグラフである。
【図７】Ｅ４ＯＲＦ１＋ヒト脳ＥＣの３つの異なる単層培養液でおおよそ８日の期間にわたって記録された、Ω・ｃｍ２単位でのＴＥＥＲ測定値を示すグラフである。４日目に、示されるように、ＧＢＭ腫瘍細胞を３つの培養液のうち２つに添加した（「＋ＧＢＭ」）。２つのＥＣ／ＧＢＭ同時培養液について、示されるように、一方を血清を含まない条件（「ＳＦ」）で維持し、他方を血清の存在下で培養した。この図で使用する場合の用語「ＶｅｒａＶｅｃ」は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣを指す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本特許開示の「発明の概要」、「図面」、「図面の簡単な説明」、「実施例」および「特許請求の範囲」のセクションは、本発明の主な実施形態について記載する。この「発明を実施するための形態」のセクションは、本発明の組成物および方法に関するある特定のさらなる説明を提供し、本特許開示の全ての他のセクションと併せて読まれることが意図されている。さらに、また当業者に明らかであるように、本特許開示全体にわたって記載される種々の実施形態は、多様な方法で組み合わせることができるか、または組み合わせることが意図されている。本明細書中に記載する特定の実施形態のかかる組合せは、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。
【００１８】
定義
ある特定の定義を以下に提供する。他の用語は、本特許開示の他の箇所で定義されるか、それらが使用される文脈から明確な意味を有するか、または当該技術分野におけるそれらの通常の意味に従って使用される。
【００１９】
本明細書中で使用する場合、「約」および「およそ」という用語は、数値に関して使用する場合、記載された値の＋または−２０％以内を意味する。
【００２０】
「培養すること」という用語は本明細書中で使用する場合、様々な種類の培地上または培地中での細胞の増殖を指す。「同時培養すること」は、様々な種類の培地上もしくは培地中での２つまたはそれ以上の別個の型の細胞の増殖を指し、例えば、幾つかの実施形態では、内皮細胞およびアストロサイトが同時培養され得る。
【００２１】
本明細書中で使用する場合、「有効量」という用語は、本明細書中に記載する成果の１つまたは複数に対して検出可能な効果に達するのに十分である、本明細書中に記載される特定の作用物質または細胞集団（例えば、Ｅ４ＯＲＦ１ポリペプチド、Ｅ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする核酸分子、またはＥ４ＯＲＦ１＋改変内皮細胞の集団）の量を指す。例えば、内皮細胞におけるＥ４ＯＲＦ１の発現の場合、内皮細胞へ導入／デリバリーされるべき核酸分子（例えば、ベクター中）の有効量は、任意の適切な対照（例えば、Ｅ４ＯＲＦ１−内皮細胞）の内皮細胞関門機能と比較した場合に、ＢＢＢモデル中の内皮細胞関門機能の検出可能な増加をもたらすものであってもよい。
【００２２】
Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞を対象へ投与することを含む方法の場合、有効量は、任意の適切な対照（例えば、Ｅ４ＯＲＦ１−内皮細胞）の生物学的または治療的指標と比較した場合に、１つまたは複数の望ましい生物学的または治療的指標の検出可能な改善（例えば、ＢＢＢ機能の改善など）をもたらすものであり得る。適切な「有効量」は、任意の個々の場合において、例えば、用量漸増研究などの当該技術分野において公知の標準的な技法を使用して、経験的に決定してもよく、計画的使用、デリバリー／投与の計画的様式、デリバリー／投与の所望の頻度等のような因子を考慮して決定してもよい。さらに、「有効量」は、ＢＢＢ機能への影響を評価するための、本特許開示の実施例のセクションに記載されるものなどのアッセイを使用して決定してもよい。
【００２３】
「改変」という用語は、本明細書中で細胞に関して使用する場合、列挙した表現型（例えば、Ｅ４ＯＲＦ１＋）を生じるように、または列挙した核酸分子もしくはポリペプチドを発現するようにヒトによって改変された細胞を指す。「改変細胞」という用語は、自然に存在する細胞を包含することを意図せず、代わりに、例えば、組換え核酸分子を含む細胞、またはそうでなければ人工的に（例えば、遺伝的修飾によって）変更された細胞を包含することを意図し、例えば、その結果、それらは、そうでなければ発現しないポリペプチドを発現するか、またはそれらは、未改変内皮細胞において観察されるレベルよりも実質的に高いレベルでポリペプチドを発現する。
【００２４】
本明細書中で使用する場合、「単離された」という用語は、天然でも、または合成的に作製された場合でも、その天然に存在する状態で結合される少なくとも１つの他の生成物、化合物、または組成物から分離される生成物、化合物、または組成物を指す。
【００２５】
本明細書中で使用する場合、「組換え」という用語は、分子生物学および遺伝子工学（分子クローニングなど）の方法を使用してヒトによって（機械によることを含む）生成され、そうでなければ天然には存在しないヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。したがって、組換え核酸分子は、天然に、例えば生物のゲノム中に存在する核酸分子と区別されるべきである。したがって、相当するゲノムＤＮＡ配列中に見出されるようないずれの介在イントロン配列も伴わないｍＲＮＡ配列の相補ＤＮＡ、即ち「ｃＤＮＡ」コピーを含む核酸分子は、組換え核酸分子とみなされる。例として、組換えＥ４ＯＲＦ１核酸分子は、プロモーターおよび／またはコード配列が、天然に存在するアデノウイルスゲノムでは通常関連付けられない他の遺伝子要素に作動可能に連結されるＥ４ＯＲＦ１コード配列を含み得る。
【００２６】
「対象」または「患者」という用語は本明細書中で互換的に使用され、示されている場合を除いて、ヒトおよび非ヒト霊長類、ならびにウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタおよび他の哺乳動物種などの哺乳動物を指す。
【００２７】
「実質的に純粋な」という語句は、細胞集団に関して本明細書中で使用する場合、細胞集団全体を構成する細胞の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５〜８０％、より好ましくは少なくとも約８５〜９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％である、２つまたはそれ以上の異なる細胞型が一緒に使用される実施形態における特定型（例えば、１つまたは複数の特定細胞マーカーの発現、形態学的特性、または機能的特性によって決定されるような）の、または特定型（複数）の細胞の集団を指す。したがって、「実質的に純粋な細胞集団」は、約５０％よりも少ない、好ましくは約２０〜２５％よりも少ない、より好ましくは約１０〜１５％よりも少ない、最も好ましくは約５％よりも少ない特定型（単数または複数）ではない細胞を含有する細胞の集団を指す。
【００２８】
核酸分子およびポリペプチド
本明細書中に記載する本発明の実施形態の幾つかは、Ｅ４ＯＲＦ１＋である改変内皮細胞を含む。Ｅ４ＯＲＦ１＋細胞は、アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドを発現し、これは、Ｅ４ＯＲＦ１核酸分子によってコードされる。幾つかの実施形態では、本発明は、Ｅ４ＯＲＦ１ポリペプチドおよび／またはアデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
【００２９】
本発明のポリペプチドおよび本発明の核酸分子は、本明細書中で明記するか、または当該技術分野で公知であるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有してもよく、あるいはかかるアミノ酸またはヌクレオチド配列の変異体、誘導体、突然変異体、または断片であるアミノ酸またはヌクレオチド配列を有してもよい。但し、かかる変異体、誘導体、突然変異体、または断片は、本明細書中に記載する機能的特性（これらとしては、ＢＢＢ機能に関連付けられるものが挙げられるが、これらに限定されない）の１つまたは複数を有するか、またはこれらを有するポリペプチドをコードする。
【００３０】
アデノウイルスＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドを含む実施形態では、使用するポリペプチド配列は、ヒトアデノウイルス２、３、５、７、９、１１、１２、１４、３４、３５、４６、５０、または５２型などの任意の適切なアデノウイルス型または株に由来し得る。幾つかの好ましい実施形態では、使用するポリペプチド配列は、ヒトアデノウイルス５型に由来する。かかるアデノウイルスポリペプチドのアミノ酸配列、およびかかるポリペプチドをコードする核酸配列は、当該技術分野において周知であり、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースなどの周知の公的に利用可能なデータベースにおいて入手可能である。例えば、適切な配列として、下記が挙げられる：ヒトアデノウイルス９（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＩ０５９９１）、ヒトアデノウイルス７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＲ８９９７７）、ヒトアデノウイルス４６（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＸ７０９４６）、ヒトアデノウイルス５２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢＫ３５０６５）、ヒトアデノウイルス３４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＷ３３５０８）、ヒトアデノウイルス１４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＷ３３１４６）、ヒトアデノウイルス５０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＷ３３５５４）、ヒトアデノウイルス２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００１９６）、ヒトアデノウイルス１２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００１４１）、ヒトアデノウイルス３５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００６０７）、ヒトアデノウイルス７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００５７０）、ヒトアデノウイルス１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００５３３）、ヒトアデノウイルス１１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＰ．ｓｕｂ．−−０００４７４）、ヒトアデノウイルス３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢＢ  １７７９２）およびヒトアデノウイルス５型（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｄ１２５８７）。
【００３１】
幾つかの実施形態では、本発明のポリペプチドおよび核酸分子は、本明細書中で具体的に列挙するか、または当該技術分野において（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースなどの、公的な配列データベースにおいて）公知であるものと同じアミノ酸またはヌクレオチド配列を有する。幾つかの実施形態では、本発明のポリペプチドおよび核酸分子は、かかる配列の変異体、誘導体、突然変異体、または断片、例えばかかる配列に対して８５％よりも大きい配列同一性を有する変異体、誘導体、突然変異体、または断片であるアミノ酸またはヌクレオチド配列を有し得る。幾つかの実施形態では、変異体、誘導体、突然変異体、または断片は、公知の配列に対して約８５％同一性、または公知の配列に対して約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、公知のヌクレオチド配列に対して約５０個のヌクレオチド、または約４５個のヌクレオチド、または約４０個のヌクレオチド、または約３５個のヌクレオチド、または約３０個のヌクレオチド、または約２８個のヌクレオチド、２６個のヌクレオチド、２４個のヌクレオチド、２２個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、１８個のヌクレオチド、１６個のヌクレオチド、１４個のヌクレオチド、１２個のヌクレオチド、１０個のヌクレオチド、９個のヌクレオチド、８個のヌクレオチド、７個のヌクレオチド、６個のヌクレオチド、５個のヌクレオチド、４個のヌクレオチド、３個のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、または１個のヌクレオチド分の長さが異なる、公知のヌクレオチド配列の変異体、誘導体、突然変異体、または断片が使用される。幾つかの実施形態では、公知のアミノ酸配列に対して約５０個のアミノ酸、または約４５個のアミノ酸、または約４０個のアミノ酸、または約３５個のアミノ酸、または約３０個のアミノ酸、または約２８個のアミノ酸、２６個のアミノ酸、２４個のアミノ酸、２２個のアミノ酸、２０個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、９個のアミノ酸、８個のアミノ酸、７個のアミノ酸、６個のアミノ酸、５個のアミノ酸、４個のアミノ酸、３個のアミノ酸、２個のアミノ酸、または１個のアミノ酸分の長さが異なる、公知のアミノ配列の変異体、誘導体、突然変異体、または断片が使用される。
【００３２】
Ｅ４ＯＲＦ１核酸またはアミノ酸配列が使用される実施形態では、かかる配列は、アデノウイルスＥ４領域由来の他の配列を伴わずに使用され、例えば、Ｅ４領域全体のヌクレオチド配列の状況では使用されず、またはＥ４領域によってコードされる他のポリペプチドと一緒に使用されない。しかしながら、幾つかの他の実施形態では、かかる配列は、Ｅ４ＯＲＦ２、Ｅ４ＯＲＦ３、Ｅ４ＯＲＦ４、Ｅ４ＯＲＦ５またはＥ４ＯＲＦ６配列などのＥ４領域由来の１つまたは複数の他の核酸またはアミノ酸配列、あるいはそれらの変異体、突然変異体または断片と併用され得る。例えば、Ｅ４ＯＲＦ１配列が、他の配列、遺伝子、またはコード領域（プロモーター、マーカー遺伝子、抗生物質耐性遺伝子等など）を含有するコンストラクト（ウイルスベクターなど）において使用することができるが、ある特定の実施形態では、Ｅ４ＯＲＦ１配列は、Ｅ４領域全体を含有しないか、またはＥ４ＯＲＦ２、Ｅ４ＯＲＦ３、Ｅ４ＯＲＦ４、Ｅ４ＯＲＦ５および／またはＥ４ＯＲＦ６などのＥ４領域全体由来の他のＯＲＦを含有しないコンストラクトにおいて使用される。
【００３３】
本発明の核酸分子は、所望の用途に応じて、様々な他の核酸配列、遺伝子、またはコード領域、例えば、抗生物質耐性遺伝子、レポーター遺伝子または発現タグ（例えば、ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列など）、または望ましい可能性がある任意の他のヌクレオチド配列または遺伝子を含有するコンストラクトにおいて使用され得る。本発明のポリペプチドは、単独で、または融合タンパク質の一部として発現させることができる。
【００３４】
幾つかの実施形態では、本発明の核酸分子は、発現を可能にするために１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり得る。所望の細胞型において核酸配列の発現を駆動することが可能な任意のプロモーターを使用することができる。適切なプロモーターの例として、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−ＬｔｒおよびＭＭＬプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターはまた、アデノウイルスゲノム、またはその変異体由来のプロモーターであり得る。例えば、Ｅ４ＯＲＦ１が使用される場合、プロモーターは、アデノウイルスにおいて相当する遺伝子の発現を駆動するのに使用されるプロモーターであり得る。
【００３５】
幾つかの実施形態では、本発明の核酸分子は、誘導プロモーターの制御下に配置させることができ、その結果、核酸配列の発現は、望ましい場合にオンまたはオフにすることができる。例えば、テトラサイクリン誘導発現系、またはホルモン誘導発現系などの任意の適切な誘導発現系が使用され得る。例えば、本発明の核酸分子は、それらが必要とされる間に発現させることができ、続いて所望の成果が達成されたら、例えば内皮細胞の十分な成長または増殖が見られたら、スイッチを切ることができる。発現をオンまたはオフにする能力は、インビボ用途に特に有用であり得る。
【００３６】
本発明の核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド、合成ヌクレオチド、またはそれらの組合せを含み得る。例えば、幾つかの実施形態では、本発明の核酸分子は、細胞内で安定であり、細胞内で直接タンパク質発現／産生を導くのに使用することができる合成修飾ＲＮＡなどのＲＮＡを含み得る。他の実施形態では、本発明の核酸分子は、ＤＮＡを含み得る。ＤＮＡが使用される実施形態では、ＤＮＡ配列は、細胞内で発現を可能にする（および／または、促進、増強もしくは調節する）ために１つまたは複数の適切なプロモーターおよび／または調節エレメントに作動可能に連結されてもよく、１つまたは複数の適切なベクターまたはコンストラクト中に存在してもよい。本発明の核酸分子は、同じ核酸コンストラクトにおいて内皮細胞へ導入することができるか、またはそれらは、別個の核酸コンストラクトにおいて導入することができる。
【００３７】
本発明の核酸分子は、トランスフェクション技法およびウイルス媒介性形質導入技法を含むが、これらに限定されない当該技術分野において公知の任意の適切な系を使用して、内皮細胞へ導入することができる。本発明に従って使用され得るトランスフェクション方法として、リポソーム媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、および微粒子銃が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るウイルス媒介性形質導入方法として、レンチウイルス媒介性形質導入、アデノウイルス媒介性形質導入、レトロウイルス媒介性形質導入、アデノ随伴ウイルス媒介性形質導入およびヘルペスウイルス媒介性形質導入が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含有する発現ベクターを含むベクターを提供する。例えば、一実施形態では、本発明は、Ｅ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。幾つかのかかる実施形態では、発現ベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００３９】
幾つかの実施形態では、ペプチド模倣体が使用される。ペプチド模倣体は、ポリペプチドを模倣するように設計された小タンパク質様鎖である。かかる分子は、本発明のポリペプチド（例えば、Ｅ４ＯＲＦ１ポリペプチド）のいずれかを模倣するように設計され得る。ペプチドを修飾して、ペプチド模倣体を創出するか、または他の場合ではペプチド模倣体を設計する多種多様な方法が当該技術分野において公知であり、本発明のポリペプチドの１つのペプチド模倣体を創出するのに使用することができる。
【００４０】
本発明のポリペプチドおよび核酸分子の取扱い、操作および発現は、分子生物学および細胞生物学の従来の技法を使用して実施され得る。かかる技法は、当該技術分野において周知である。例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1989、the series Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.)、あるいはヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を取扱い、操作し、また発現する際に使用するのに適した技法に関するガイダンス用の任意の他の標準的な教本の教示を参照し得る。Ｅ４ＯＲＦ１配列の取扱いまたは発現に関するさらなる態様は、米国特許第８，４６５，７３２号に記載され、それらの内容は、参照により本明細書に援用される。
【００４１】
内皮細胞
幾つかの実施形態では、本発明は、Ｅ４ＯＲＦ１＋改変内皮細胞などの改変内皮細胞を提供する。改変内皮細胞は、当該技術分野で公知の内皮細胞の任意の適切な供給源に由来し得る。例えば、幾つかの実施形態では、内皮細胞は、血管内皮細胞である。幾つかの実施形態では、内皮細胞は、初代内皮細胞である。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、ヒトもしくは非ヒト霊長類細胞、もしくはウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタまたは他の哺乳動物細胞などの哺乳動物細胞である。幾つかの実施形態では、内皮細胞は、初代ヒト内皮細胞である。幾つかの実施形態では、内皮細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）などの臍帯静脈内皮細胞（ＵＶＥＣ）である。使用され得る他の適切な内皮細胞は、米国特許第８，４６５，７３２号においてＥ４ＯＲＦ１発現に適しているとこれまでに記載されているものを含み、それらの内容は、参照により本明細書に援用される。好ましい実施形態では、内皮細胞は、脳微小血管内皮細胞などの脳内皮細胞である。
【００４２】
幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、具体的に列挙した分子（例えば、Ｅ４ＯＲＦ１）の発現に加えて、またそれとは別に、１つまたは複数の遺伝的修飾を含むように遺伝子修飾される。例えば、かかる細胞は、内皮細胞を冒すかもしくはＢＢＢ機能を冒す疾患もしくは障害に関与することが知られているか、またはそれに関与している疑いのある遺伝子の修正版、あるいは内皮細胞において供給するか、または改変内皮細胞を使用して投与もしくはデリバリーすることが望ましい可能性がある治療上有用な遺伝子などの任意の他の遺伝子を含み得る。
【００４３】
本発明の改変内皮細胞は、様々な形態で存在し得るか、または様々な形態で供給され得る。例えば、幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、細胞の単離集団などの細胞の集団を含み得る。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、インビトロにおける細胞の集団を含み得る。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、細胞の実質的に純粋な集団を含み得る。例えば、幾つかの実施形態では、細胞集団全体を構成する細胞の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５〜８０％、より好ましくは約８５〜９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％が、本発明の改変内皮細胞である。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、改変細胞および１つまたは複数のさらなる構成成分を含有する組成物の形態で供給され得る。例えば、幾つかの実施形態では、本発明は、生理食塩水、細胞懸濁培地、細胞培養培地等などの担体溶液と一緒に本明細書中に記載されるような改変内皮細胞の集団を含む組成物を提供し得る。幾つかの実施形態では、かかる組成物は、改変内皮細胞の集団およびヒト対象などの対象への投与に適している担体溶液を含む治療用組成物であり得る。望ましい場合には、他の治療上許容される作用物質を含むことができる。当業者は、目的の用途に応じて、治療用組成物中に含まれるのに適した作用物質を容易に選択することができる。
【００４４】
幾つかの実施形態では、本発明の改変内皮細胞は、本発明の改変内皮細胞および１つまたは複数のさらなる細胞型を含有する組成物（例えば、治療用組成物）の形態で供給され得る。かかるさらなる細胞型は、例えば、改変内皮細胞の存在下で（例えば、「フィーダー」細胞として本発明の改変内皮細胞を使用して）維持、培養または増殖させることができる細胞型、または例えばインビトロモデル系における使用のために、もしくは対象への同時投与における使用のために、本発明の改変内皮細胞と一緒に使用することが望ましい可能性がある任意の他の細胞型であり得る。幾つかの好ましい実施形態では、本発明の改変内皮細胞は、本発明の改変内皮細胞とアストロサイトの両方を含有する組成物（例えば、治療用組成物）において供給されてもよい。
【００４５】
アストロサイト
本発明の実施形態の幾つかはアストロサイトを含む。任意の適切なアストロサイトが使用され得る。幾つかの実施形態では、アストロサイトは、マウスアストロサイトである。幾つかの実施形態では、それらは、ヒトアストロサイトである。アストロサイトは、初代アストロサイト（例えば、ＣＮＳ組織から単離された）であり得るかまたはそれらは、培養アストロサイト株であり得る。アストロトロサイトを得、培養する方法は、当該技術分野で公知であり、いずれのかかる方法も、本発明と併用され得る。
【００４６】
モデルシステム、方法および用途
幾つかの実施形態では、本発明は、ＢＢＢモデルシステム、かかるシステムにおいて有用な組成物およびキット、ならびにかかるＢＢＢモデルを用いるスクリーニング方法を提供する。薬物スクリーニングおよび／または生物学的研究のためのＢＢＢモデルシステムの使用は、当該技術分野で公知であり、本発明の新規なＢＢＢモデルシステムは、当該技術分野で公知であるシステムと同じかまたは同様の方法で用いられ得る。例えば、Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞は、典型的には他のＢＢＢモデルシステムにおいて使用されるナイーブ（非Ｅ４ＯＲＦ１＋）内皮細胞の代わりに使用され得る。典型的には、かかるシステムは、内皮細胞が、内皮細胞層の両側で２つのチャンバを物理的に分離する関門を形成するように固体透過性支持体で成長したコンフルエント内皮細胞単層を含む。このように、一方の物理的区画から他方の物理的区画に内皮細胞関門を通って横切る作用物質の能力を研究することができる。
【００４７】
上述のように、かかるＢＢＢモデルシステムは、薬物スクリーニングに使用され得る。例えば、幾つかの実施形態では、本発明は、候補作用物質の血液脳関門透過性を評価する方法を提供し、かかる方法は、ＢＢＢモデルシステム中のＥ４ＯＲＦ１＋内皮細胞を１つまたは複数の候補作用物質と接触させることを含む。同様に、幾つかの実施形態では、本発明は、血液脳関門の透過性に対する１つまたは複数の候補作用物質の効果を評価する方法を提供し、かかる方法は、ＢＢＢモデルシステム中のＥ４ＯＲＦ１＋内皮細胞を１つまたは複数の候補作用物質と接触させることを含む。同様に、幾つかの実施形態では、本発明は、血液脳関門の透過性に対する１つまたは複数の試験細胞型の効果を評価する方法を提供し、かかる方法は、Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞含有ＢＢＳモデルシステム中に１つまたは複数の試験細胞型を含み、ＢＢＢ関門機能および透過性に対するその試験細胞型の効果を試験すること含む。かかるスクリーニング／試験方法（ＢＢＢ関門機能および透過性を評価する適切なアッセイを含む）のそれぞれのさらなる詳細は、実施例および特許請求の範囲を含む本特許出願中の他の部分に記載される。
【００４８】
幾つかの実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、有効量の本発明の改変内皮細胞（またはかかる改変内皮細胞を含む組成物）を投与することによって、かかる対象を治療する方法などの、様々な治療方法を提供する。かかる治療方法では、細胞は、当該技術分野において公知の任意の適切な手段を使用して、対象に投与することができる。例えば、細胞は、所望の位置にて、注射または注入によって血流または組織へ投与することができる。例えば、ＣＮＳの疾患、障害または症状の治療の場合、本発明による改変細胞は、血管系の罹患領域へ直接、または脳または脊髄の罹患領域の近傍に投与され得る。幾つかの実施形態では、改変内皮細胞は、１つまたは複数のさらなる細胞型と一緒に投与され得る。かかるさらなる細胞型は、例えば、アストロサイトであり得る。改変内皮細胞は、単回投与で、または複数回投与で投与することができる。当業者は、所望の用途に従って、適切な投与方法を、また所望の用途に応じて、適切な投薬レジメンを選択することが可能である。
【００４９】
幾つかの実施形態では、本発明の改変内皮細胞は、例えば、研究目的で、または治療用途でインビボにおいて創出され得る。例えば、幾つかの態様では、本発明は、治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象中の内皮細胞が、かかる核酸分子でトランスフェクトまたは形質導入されて、インビボにおいて改変内皮細胞になるように、かかる対象に、有効量のＥ４ＯＲＦ１ポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、適切なベクター中の、および／または適切なプロモーターの制御下にある）を投与することを含む方法などの様々な治療方法を提供する。かかる方法では、ヌクレオチド分子は、当該技術分野において公知の任意の適切な手段を使用して、対象に投与され得る。例えば、ヌクレオチド分子（例えば、適切なベクター中の）は、所望の位置で、注射または注入によって血流または組織へ投与することができる。核酸分子は、単回用量で、または複数回用量で投与することができる。当業者は、所望の用途に従って、適切な投与方法を、また所望の用途に応じて、適切な投薬レジメンを選択することが可能である。
【００５０】
幾つかの実施形態では、本発明の改変内皮細胞は、それらが複製することができないように使用（例えば、治療上の使用）に先立って有糸分裂的に不活性化される。これは、例えば、マイトマイシンＣなどの化学物質を使用することによって、または改変内皮細胞を照射することによって達成することができる。
【００５１】
細胞培養方法
細胞を培養する方法は、当該技術分野において周知であり、任意の適切な細胞培養方法を使用することができる。例えば、本発明の改変内皮細胞は、他の内皮細胞を培養するのに有用であると知られている方法、または例えば、米国特許第８，４６５，７３２号に記載されるようなＥ４ＯＲＦ１発現内皮細胞を培養するのに有用であることが知られている方法を使用して培養することができ、それらの内容は、参照により本明細書に援用される。幾つかの実施形態では、本発明の改変内皮細胞は、血清の非存在下で、または外因性増殖因子の非存在下で、または血清および外因性増殖因子の両方の非存在下で培養され得る。本発明の改変内皮細胞はまた、冷凍保存され得る。R. Ian FreshneyによるCulture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition (2000)に記載される方法（「Freshney」）などの細胞培養および細胞冷凍保存に関する様々な方法が、当業者に公知であり、それらの内容は、参照により本明細書に援用される。
【００５２】
幾つかの実施形態では、本発明は、例えば、Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞およびアストロサイトの同時培養を含む、同時培養方法を提供する。かかる同時培養方法は、Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞およびアストロサイトを同じ培養容器中で一緒に培養することを含んでもよい。幾つかの実施形態では、Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞およびアストロサイトは、直接の細胞対細胞接触（関門、例えば、Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞をアストロサイトから分離する膜なしで）であってもよい。幾つかのかかる実施形態では、改変内皮細胞は、培養容器またはある他の固体だが透過性の基材の表面上にコンフルエント単層を形成し得、アストロサイトは、内皮細胞単層の上に置かれ得る。
【００５３】
キット
本発明はまた、本発明のＢＢＢモデルシステムを作製するための、および／または本明細書に記載する組成物もしくは方法のいずれかを作製、使用もしくは実施するためのキットを提供する。かかるキットは、本明細書に記載するいずれの構成成分を含有してもよく、ヌクレオチド配列（例えば、ベクター中）、改変内皮細胞、アストロサイト、改変内皮細胞またはアストロサイトを維持または増殖するのに有用な培地もしくは組成物、内皮細胞単層の培養のための固体透過性支持体、またはそれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されない。かかるキットは全て、使用説明書、容器、培養容器等を含んでもよい。ラベルは、キットに添付し、キットの内容物の使用に関する説明または他の情報を提供する電子またはコンピューター読み込み可能な形式であり得る任意の書き込みまたは記録材料（例えば、ディスク、光ディスク、メモリーチップまたはテープ）を含んでもよい。
【００５４】
本発明のある特定の態様は、下記の非限定的な実施例においてさらに記載され得る。
【実施例】
【００５５】
マウス脳微小血管内皮細胞の単離および培養
５〜８匹の３週齢マウスを致死させ、脳を解剖用培地中に単離した。２つの脳半球をピンセットで抜き離して、髄膜および嗅球を注意深く取り出した。微細なはさみを使用して、組織を小片（約０．５ｍｍ直径）に細かく刻んだ。小組織片を収集し、解剖用培地とともに１５ｍｌのコニカルチューブ中に移した。組織片をおよそ１〜２分間沈降させ、次いで、解剖用培地から注意深く取り出した。６〜８ｍｌのＴｒｙｐＬＥをコニカルチューブに添加し、キャップをしっかり閉じた。チューブを３回上下にフリップし、続いて、チューブを時々旋回させながら、チューブを水浴中に３７℃で１５分間置いた。次いで、ＴｒｙｐＬＥを、ダイスカットした組織を乱すことなく取り出し、１〜２ｍｌのマウス内皮用培地（http://angiocrinebioscience.com/wp-content/uploads/VeraVec-Mouse-Brain-Instruction-sheet.pdf）を添加した。チューブを頻繁にタッピングすることにより撹拌しながら、ＤＮＡｓｅを１分間添加した。次いで、組織片をマウス内皮用培地で３回すすぎ洗いした。次いで、組織片および培地を１０回上下に通すことによって組織片をおよそ１ｍｌのマウス内皮用培地中で粉砕し、続いて、フレームポリッシュしたガラスピペットを使用して組織片および培地を１回粉砕した。次いで、粉砕細胞懸濁液を４００ｇで５分間遠心分離し、次いで上清を取り出した。細胞ペレットを完全マウス内皮用培地で再懸濁させ、フィブロネクチンでコーティングされたＴ７５フラスコ中にプレーティングした。培地を培養液がコンフルエンスに達するまで１日置きに新鮮マウス内皮用培地で置き換えた。ＣＤ３１抗体を使用して、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により脳微小血管内皮細胞を精製した。選別後に得られた細胞を、フィブロネクチンでコーティングしたウェル（６ウェルプレート）上にウェル当たりおよそ細胞４００，０００個で再プレーティングした。次の日、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ、抗生物質なしの培地）を使用して、細胞をＥ４ＯＲＦ１レンチウイルス（４０〜５０μｌ濃縮ウイルス）で形質導入した。２４時間後、感染培地を正規のマウス内皮用培地で置き換えた。細胞をコンフルエンスに達したときに継代した。
【００５６】
ヒト脳微小血管内皮細胞の単離および培養
ヒト脳組織を、てんかんの患者から、または神経膠芽腫（ＧＢＭ）の患者からの外科的除去によって得た。次いで、かかるヒト組織を、マウス組織について上に記載したように処理および培養した。
【００５７】
経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）およびルシファーイエロー透過性アッセイ
０日目に、内皮細胞を、１２ウェルプレートに適合するトランスウェルインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、３５３１８０）中にプレーティングした。細胞は翌日までにコンフルエンスに達した（およそ細胞２００，０００〜４００，０００個／インサート）。経内皮電気抵抗（「ＴＥＥＲ」）の毎日の測定を１日目に始めた。ヒドロコルチゾン、ｃＡＭＰ、ＰＫＡ、ホスホジエテラーゼ阻害剤、レチノイン酸、インスリン、トランスフェリン、および亜セレン酸ナトリウムを含有する「ＴＥＥＲブースタ」培地で、培地を置き換えた。アストロサイト同時培養実験の場合、２日目に（ＥＣの単層がトランスウェルインサートで形成した後に）、アストロサイトが内皮細胞と直接接触するように、アストロサイトをトランスウェルインサートにインサート当たり細胞５０，０００個の密度で添加した。ＧＢＭ細胞共培養実験の場合、ＧＢＭ細胞を、トランスウェルインサートを（ＥＣ単層とともに）保持するウェルの底部に４日目に添加した。
【００５８】
ルシファーイエロー（ＬＹ）ベースの透過性アッセイの場合、以下のプロトコルを実施した。１日目に、細胞を、それらが次の日までにコンフルエンスに達するように、１２ウェルプレートに適合するインサートにプレーティングした。（細胞約２００，０００〜４００，０００個／インサート）。２日目に、ヒドロコルチゾン、ｃＡＭＰ、ＰＫＡ、ホスホジエテラーゼ阻害剤、レチノイン酸、インスリン、トランスフェリン、および亜セレン酸ナトリウムを含有する「ＴＥＥＲブースタ」培地で、培地を置き換えた。３日目に、培地を、血清を含まない「ＴＥＥＲブースタ」培地（Ｎ２およびＢ２７を有する神経前駆細胞用培地）で置き換えた。４日目に、ＬＹベースの透過性アッセイの実施前にＴＥＥＲ測定を行った。ＬＹアッセイは、市販のアッセイを本質的に製造業者の説明書（http://ebiotrade.com/buyf/productsf/BD%20Falcon/insert_protocol_lucifer_yellow_permeabilty_assay.pdf）どおりに使用して実施した。ＬＹアッセイを製造業者の説明書どおりに使用して、透過係数すなわち「Ｐｃ」（ｃｍ／秒）を決定した。Ｐｃ＝（Ｖ／（ＡｘＣｉ））×（Ｃｆ／Ｔ）（式中、Ｖは、基底チャンバの容積（ｍＬ）であり、Ａは、膜インサートの面積（ｃｍ２）であり、Ｃｉは、ＬＹの初期濃度であり、Ｃｆは、ＬＹの最終濃度であり、Ｔは、秒単位でのアッセイ時間である（Ｔは、１時間（３６００秒）および／または４時間であった））。この系を使用して計算したＰｃ値は、関門の完全性および機能の定量的尺度を与える。一般に、ルシファーイエローベースのアッセイにおけるＰｃ＜２．５×１０−６ｃｍ／秒は、ＢＢＢ品質の関門機能を示す。
【００５９】
免疫細胞化学
Ｅ４ＯＲＦ１＋マウス脳内皮細胞（ＥＣ）の単層を、クローディン５およびＭＦＳＤ２Ａに特異的な抗体を使用した免疫細胞化学試験を実施する前に４％パラホルムアルデヒドで固定した。
【００６０】
結果
Ｅ４ＯＲＦ１＋マウス脳内皮細胞の単層は、密着結合マーカークローディン５およびＣＮＳ特異的ＥＣ  ＭＦＳＤ２Ａの両方を発現することが見出された（図１を参照）。
【００６１】
マウス脳内皮細胞におけるＥ４ＯＲＦ１の発現は、ナイーブ（非Ｅ４ＯＲＦ１＋）マウス脳ＥＣで観察されるものと比較してＴＥＥＲ値を増加させることが見出され、Ｅ４ＯＲＦ１＋マウス脳内皮細胞とアストロサイトとの同時培養は、ＴＥＥＲ値／関門機能をより一層増加させた（図２Ａおよび図２を参照−培養の３日目のＴＥＥＲ測定値）。アストロサイトは、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣと直接接触して単層を形成することができたが、一方でナイーブ（非Ｅ４ＯＲＦ１＋）ＥＣを使用した場合、アストロサイトは、ＥＣの「海」の中でアストロサイトの「島」を形成し（Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣを使用した場合に観察される多層化アストロサイト／ＥＣ構造の形成とは対照的に）、ＴＥＥＲ値（関門機能を示す）は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣとは対照的に、アストロサイトをナイーブ（非Ｅ４ＯＲＦ１＋）ＥＣと培養した場合により低かった（図２Ａを参照）。
【００６２】
図３に示されるように、ヒト脳Ｅ４ＯＲＦ１＋内皮細胞は、ヒト臍帯、肺、腎臓または心臓に由来するＥ４ＯＲＦ１＋ＥＣ（約２５Ω・ｃｍ２）と比較して比類なく高いＴＥＥＲ値（２日目に約２００Ω・ｃｍ２）を示した。（注記−図３中、用語「ＶｅｒａＶｅｃ」は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣを指す）。さらに、ヒト脳Ｅ４ＯＲＦ１＋脳内皮細胞の単層のＴＥＥＲ値は、６週間高いままであった（おおよそ２００Ω・ｃｍ２）。さらに、ヒト脳Ｅ４ＯＲＦ１＋脳内皮細胞の単層の透過性は、ＢＢＢ透過性に影響を与えることが知られた細胞外刺激、例えば、ＶＥＧＦに応答性であることが示された（図４を参照）。
【００６３】
図５は、ヒトＥＯＲＦ１＋脳内皮細胞を、アッセイにおいてナイーブ（非Ｅ４ＯＲＦ１発現性）ヒト脳内皮細胞、ヒトＥ４ＯＲＦ１＋腎臓内皮細胞、ヒト２９３Ｔ細胞、および空のトランスウェル（即ち、細胞を含まない）と比較して、ＴＥＥＲ値を測定し、透過係数（Ｐｃ）を決定した実験の結果を示す。（注記−図５中、用語「ＶｅｒａＶｅｃ」は、Ｅ４ＯＲＦ１＋ＥＣを指す）。得られたＰｃおよびＴＥＥＲ値は、以下のとおりであった：（ａ）細胞なしのインサート−Ｐｃ＝７．１１±１．０７×１０−６ｃｍ／秒；ＴＥＥＲ＝０；（ｂ）２９３Ｔ細胞−Ｐｃ＝４．８６±０．４４×１０−６ｃｍ／秒、ＴＥＥＲ＝約５Ω・ｃｍ２、（ｃ）ナイーブヒトＧＢＭ  ＥＣ−Ｐｃ＝４．２６±０．４０×１０−６／ｃｍ、ＴＥＥＲ＝約５０Ω・ｃｍ２、（ｄ）Ｅ４ＯＲＦ１＋ヒト腎臓ＥＣ−Ｐｃ＝３．５７±０，１３×１０−６ｃｍ／秒、ＴＥＥＲ＝約３５Ω・ｃｍ２、および（ｅ）Ｅ４ＯＲＦ１＋ヒトＧＢＭ  ＥＣ−Ｐｃ＝１．６９±０．１２×１０−６ｃｍ／秒、ＴＥＥＲ＝約１２０Ω・ｃｍ２。ヒトＥＯＲＦ１＋脳内皮細胞は、最低のＰｃ値、即ち、最良の関門機能を示した。
【００６４】
別の実験では、ヒトＥＯＲＦ１＋脳内皮細胞を、２つの異なるＧＢＭ試料から生成した。一方は、腫瘍の中心／コアから得（グレードＢと称す）、他方は、正常な組織に隣接する領域中の腫瘍の周辺から得た（グレードＡと称す）。図６に示されるように、グレードＡとグレードＢのヒトＥＯＲＦ１＋脳内皮細胞の間のＴＥＥＲ値の有意な差が観察された。
【００６５】
図７は、てんかんの患者に由来するヒトＥ４ＯＲＦ１＋脳内皮細胞をヒトＧＢＭ腫瘍細胞と同時培養した実験の結果を示す。ＴＥＥＲ値は、ＧＢＭ腫瘍細胞同時培養後に降下した。同時培養を血清の非存在下で実施した場合、ＴＥＥＲ値は、Ｅ４ＯＲＦ１＋脳内皮細胞を単独で（ＧＢＭ腫瘍細胞なしで）培養した場合に観察された値の約５０％に降下した。同時培養をウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で実施した場合、ＴＥＥＲ値は２日間低下したが、同時培養の３日目に回復した。本発明者らは、この回復は、ＦＢＳ処理により誘導されたＧＢＭ細胞の分化のためであった可能性があると仮定した。
【００６６】
これらの結果は、本発明のモデルシステムが、ＢＢＢの多くの重要な機能特性を示すことを示し、様々な環境要因に応答性である透過性を高抵抗の関門に付与することを含むが、これに限定されない。
【００６７】
本発明は、併記の特許請求の範囲によってさらに記載される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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