(57)【要約】  ２〜６０％、好ましくは１５〜３５％、さらに好ましくは２０〜２５％のモル濃度のカルボキシル基を有するグレード２硫酸化ヒアルロン酸であって、カルボキシル基が、アミド結合を介して直接、またはヒアルロン酸のカルボキシル基とアミド結合を形成するためのアミノ基、ならびにドーパミンのアミノ基とアミド結合を形成するためのカルボキシル基を有するスペーサーを用いて、共役されたドーパミンにより官能化されている、グレード２硫酸化ヒアルロン酸を開示する。【選択図】  図１
2019536850.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２〜６０％のモル濃度を有するカルボキシル基グレード２硫酸化ヒアルロン酸であって、前記カルボキシル基が、アミド結合を介して直接、またはヒアルロン酸のカルボキシル基とアミド結合を形成するためのアミノ基、およびドーパミンのアミノ基とアミド結合を形成するためのカルボキシル基を有するスペーサーを介して共役されたドーパミンにより官能化されている、グレード２硫酸化ヒアルロン酸。
【請求項２】
ドーパミンが、１５〜４０％、好ましくは２０〜３２％の前記硫酸化ヒアルロン酸カルボキシル基へのアミド結合を介して直接共役されている、請求項１に記載の硫酸化ヒアルロン酸。
【請求項３】
ドーパミンが、２〜２０％の前記硫酸化ヒアルロン酸のカルボキシル基とアミド結合を形成するためのアミノ基、および前記ドーパミンのアミノ基とアミド結合を形成するためのカルボキシル基を有するスペーサーを介して、硫酸化ヒアルロン酸と共役される、請求項１に記載の硫酸化ヒアルロン酸。
【請求項４】
前記スペーサーが式ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（式中、ｎは５〜１０、好ましくは５または１０の整数である）の化合物である、請求項３に記載の硫酸化ヒアルロン酸。
【請求項５】
前記スペーサーが式ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−［（ＣＨ２）２−Ｏ］ｍ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２（式中、ｎは１または２であり、ｍは１または２である）の化合物である、請求項３に記載の硫酸化ヒアルロン酸。
【請求項６】
１００，０００〜２５０，０００Ｄａ、特に１８０，０００〜２３０，０００Ｄａの重量平均分子量を有するヒアルロン酸から調製されたグレード２の硫酸化ヒアルロン酸の官能化によって得られる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の硫酸化ヒアルロン酸。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の硫酸化ヒアルロン酸と正電荷を有する医薬品との塩。
【請求項８】
前記正電荷を有する医薬品が、抗生物質、成長因子、および酸形態のジクロフェナクから選択される、請求項７に記載の塩。
【請求項９】
前記正電荷を有する医薬品が、アミノグリコシド系抗生物質、ダプトマイシン、シプロフロキサシン、メロペネム、バンコマイシン、ポリミキシン、コリスチン、およびバシトラシンから選択される、請求項８に記載の塩。
【請求項１０】
前記アミノグリコシド系抗生物質が、アミカシン、ゲンタマイシン、およびトブラマイシンから選択される、請求項９に記載の塩。
【請求項１１】
前記正電荷を有する医薬品が、ゲンタマイシン、ダプトマイシン、ポリミキシン、またはコリスチンである、請求項７に記載の塩。
【請求項１２】
医薬品用の担体として使用するための、請求項１〜６に記載の硫酸化ヒアルロン酸。
【請求項１３】
生物医学的物品のコーティングに使用するための、請求項１〜６に記載の硫酸化ヒアルロン酸。
【請求項１４】
請求項７〜１１に記載の塩でコーティングされたチタン製体内プロテーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミド結合によってドーパミンで官能化させた硫酸化ヒアルロン酸に関し、これは直接または、好適なスペーサー基を介し得る。本発明の化合物は、正電荷を有するイオン化可能基を有する医薬品、特に抗生物質と共に塩を形成する。本発明のさらなる目的は、生物または一般的に生物医学的装置に移植可能なチタン製体内プロテーゼをコーティングするための塩およびそれらの使用である。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの交互の残基からなるヘテロ多糖類であり、直鎖を有し、かつ入手する供給源および使用する調製方法に応じて、５００００〜１３ｘ１０６Ｄａの範囲の分子量を有する。
【０００３】
ヒアルロン酸は、実際に人体に広く存在しており、特に、皮膚、腱、筋肉および軟骨などの多くの組織の細胞の機械的支持体として、重要な役割を果たしている。ＨＡとそのＣＤ４４膜受容体およびオピオイド受容体との相互作用も公知である。
【０００４】
−ＯＨ基が硫酸によりエステル化されているＯ−硫酸化ＨＡ誘導体が公知である。Ｏ−硫酸化は、公知の技術によって実施できる（例えば、特許文献１および特許文献２を参照されたい）。「硫酸化度」は、ＨＡ二量体１モル当たりの硫酸基のモル数（ＤＳｍｏｌ）を意味する。具体的には、
グレード１硫酸化の定義は、０．５〜１．５の範囲のＤＳｍｏｌとする。
グレード２硫酸化の定義は、１．５〜２．５の範囲のＤＳｍｏｌとする。
グレード３硫酸化の定義は、２．５〜３．５の範囲のＤＳｍｏｌとする。
【０００５】
一般に、ＨＡＳは、皮膚バリアを容易に通過し、このため、皮膚バリアに関連する物質の通過が容易になることから、薬理学的および生物学的に活性な分子を皮膚吸収するための優れた担体である。
【０００６】
ＨＡＳが薬理学的性質を有することもまた発見されており（特許文献３、特許文献４）、このＨＡＳは、強力な抗炎症剤であり、多数の前炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの活性を有効に調節することによって、その作用を発揮する。したがって、ＨＡＳは、サイトカインレベルが変化することによって媒介される障害（関節リウマチ、喘息、全身性および皮膚性自己免疫疾患、ウイルス感染症、アトピー性皮膚炎、湿疹、白斑、リンパ腫など）の治療に使用するのに好適である。
【０００７】
ドーパミンの合成においてアミノ酸中間体であるＤＯＰＡ（１−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）は、公知の神経伝達物質であり、近年では、接着性物質としても研究された。かなりの濃度のＤＯＰＡ残基が、「ムラサキイガイ脚タンパク質（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ  ｆｏｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｍｅｆｐ、特にＭｅｆｐ−３およびＭｅｆｐ−５）と呼ばれるタンパク質のアミノ酸組成中に見出されている。これは、茎を構成するものであり、これにより、イガイとして一般に知られているムラサキイガイが表面に付着する。ＤＯＰＡの重要な特徴はカテコール基であり、これは、高濃度のカテコール単位が、ガラス、プラスチック、セラミック、ならびに金属および金属酸化物をベースにした表面など、複数の表面への接着を促進するのに重要な役割を果たすことを示唆している。こうした接着が生じるメカニズムはまだ完全には理解されていないが、カテコール基がキノンの形態をとるときに、接着が酸性媒体（ｐＨ＝５）およびアルカリ性媒体（ｐＨ＝８）の両方で生じることがわかっている。ドーパミン誘導体もまた同一の特徴を有するため、ＤＯＰＡおよびドーパミンは、接着活性の観点から科学文献において、無差別に定義され、使用されている。
【０００８】
ＨＡは、「そのまま」およびその硫酸化形態の両方で、生体適合性および血液適合性を促進するための金属（通常チタン）およびポリマー（例えばＰＵ）プロテーゼのコーティングにおいて、他のポリマーと組み合わせて使用されてきた（特許文献５）。
【０００９】
ＤＯＰＡは、また、金属コアを有する他の分子（通常はポリマー）との結合を促進するための接着剤としても既に使用されている（非特許文献１）。
【００１０】
最後に、金属プロテーゼが、抗生物質に結合でき、それによって細菌増殖の可能性を低下させ得るポリマーと共役させたＤＯＰＡでコーティングされている例がある。例えば、Ｌｅｅら（非特許文献２）は、チタン歯科用プロテーゼの骨結合を促進するために、ヘパリンと共役させ、抗生物質およびＢＭＰ２によりさらに官能化させたＤＯＰＡについて記載している。ヘパリンは、抱合体を全体的に負に電荷し、そのため、正に電荷した抗生物質に結合させ得る硫酸基を含むために、選択される。しかし、ヘパリンの存在は非常に重要である。なぜなら、そのよく知られている抗凝固活性が問題であり、移植中および移植後に異常な出血を引き起こす可能性があるためである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】欧州特許出願公開第７０２６９９号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第９４０４１０号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１０／１３０４６８号
【特許文献４】国際公開第２０１０／１３０４６６号
【特許文献５】欧州特許出願公開第１０６０２０４号明細書
【特許文献６】欧州特許出願公開第１３８５７２号明細書
【特許文献７】国際公開第２０１２／０３２１５４号
【特許文献８】欧州特許出願公開第０７０２６９９号
【特許文献９】イタリア国特許第１０２０１５００００７３０１６号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｌｅｅら、Ａｄｖ  Ｍａｔ、２００８、２０、４１５４−４１５７
【非特許文献２】Ｌｅｅら、Ｂｏｎｅ、２０１２、５０、９７４−９８２
【非特許文献３】Ｔｅｒｂｏｊｅｖｉｃｈら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１９８６，３６３−３７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
現在では、硫酸化ヒアルロン酸（ＨＡＳ）およびドーパミンの抱合体が、静電気的相互作用によって、正に電荷した生物学的および／または薬理学的に活性な抗生物質または分子を吸着するのに有利に使用できることが見出されている。医薬品または他の活性化合物で官能化されたＨＡＳおよびドーパミンの抱合体は、一般に生物医学的物品、特にチタンプロテーゼをコーティングして、これらを生体適合性にするのに、特にチタンプロテーゼの場合には、それらが移植される骨基質との統合を改善するのに有用である。本明細書に記載の硫酸化ヒアルロン酸（ＨＡＳ）とドーパミンとの抱合体は、コンパクトな構造を有する古典的なチタンプロテーゼ、または多孔質（小柱）架橋構造を有し、骨と完全に統合できる最新世代のプロテーゼのいずれかと共に使用される場合に特に有効である。移植後、本明細書に記載の抱合体で処理された小柱状プロテーゼは、生体適合性であるのみでなく、その特定の構造のために、細胞によってコロニー形成され、かつ骨と完全に一体化する。
【００１４】
本発明の目的を形成する硫酸化ヒアルロン酸（ＨＡＳ）とドーパミンとの抱合体もまた、インプラントから生じ得る感染症を減少させることにおいて主要な役割を果たす。こうした抱合体の態様は特に重要であり、プロテーゼの最初の検討後など、細菌の増殖およびそれに続くバイオフィルム形成が主な合併症となるため（人工膝、股関節などの一次移植の段階ではそれほど多くないが）、症例のうち５〜４０％において、除去する必要が生じる。プロテーゼを除去することとなる感染症のうちの約８０％が、細菌性バイオフィルムの形成に起因するものと推定されている。
【００１５】
バイオフィルムは、微生物（黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、ブドウ球菌など）が蓄積したものであり、高い細菌密度を有し、多糖類マトリックス内に被包され、かつ通常は抗生物質による全身的処理に耐性のある固体の生物学的表面または非生物学的表面に付着する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に従って使用される硫酸化ヒアルロン酸は、グレード２（ＨＡＳ２）、すなわちＨＡ二量体１モル当たりの硫酸基のモル数（ＤＳｍｏｌ）が１．５〜２．５の範囲であるＨＡＳである。
【００１７】
直接またはスペーサーを介して結合した、ドーパミンによるＨＡＳ２のカルボキシル基の官能化率は、直接結合および間接結合のいずれにおいても、２〜６０モル％の範囲であり、直接結合の場合、好ましくは１５〜４０％、さらにより好ましくは２０〜３２％の範囲であり、間接結合の場合には、好ましくは２〜２０％の範囲である。
【００１８】
ドーパミンとＨＡＳ２との間の結合はアミド型であり、スキームＡに示されるように直接（ドーパミンのＨＡ−ＮＨ２のＣＯＯＨ）であるか、またはスペーサーがドーパミンとＨＡＳとの間に挿入される場合は、常にアミド結合を介して結合される、間接的であってもよく、これにより、官能化されるチタン表面とドーパミンの相互作用が最大化し、それによってＨＡＳ２の立体効果が減少するようになる。使用されるスペーサーは、５〜１０メチレン単位、好ましくは５または１０メチレン単位の範囲の長さを有するアルキル鎖（スキームＢ）であるか、または式ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−［（ＣＨ２）２−Ｏ］ｍ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２（スキームＣ）のポリエチレングリコール鎖であり得る。
スキームＡ
【００１９】
【化１】
2019536850.tif 000003
スキームＢ
【００２０】
【化２】
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スキームＣ
【００２１】
【化３】
2019536850.tif 000005
【００２２】
したがって、スペーサーは、ヒアルロン酸のカルボキシル基とアミド結合を形成するためのアミノ基、およびドーパミンのアミノ基とアミド結合を形成するためのカルボキシル基を有する。
【００２３】
本発明のグレード２の硫酸化ヒアルロン酸の調製に使用するのに好適であるスペーサー化合物は次式を有する：
−ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（式中、ｎは５〜１０の整数であり、好ましくは５または１０である）。
−ＨＯＯＣ−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２（式中、ｍは、１または２である）。
【００２４】
本化合物は、既知であるかまたは既知の方法により調製できる。
【００２５】
ＨＡＳ２とドーパミンとの間の反応は、例えばカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）またはジイミドなどの縮合剤の存在下で、アミド結合を形成するための既知の条件を使用して生じる。
【００２６】
ドーパミンがスペーサーを介して硫酸化ヒアルロン酸に結合する誘導体を調製するためには、最初にドーパミン−スペーサー中間体を合成し、次に中間体をＨＡＳ２と共役させることが好ましい。アミノ基で好適に保護されているスペーサーは、従来の縮合剤および塩基の存在下で塩酸ドーパミンと反応させることができる。結果として得られた中間体は、保護基を除去した後、アミド結合の形成に関して上述の条件下で、ＨＡＳ２と反応させる。
【００２７】
出発ヒアルロン酸は、例えば、雄鶏のとさかからの抽出物（特許文献６）、発酵または生合成（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、特許文献７）による、任意の既知の供給源から誘導できる。この特定の場合には、１００，０００〜２５０，０００Ｄａ、特に１８０，０００〜２３０，０００Ｄａの範囲の重量平均ＭＷを有するＨＡから調製された、以下「ＭＷ２００ｋＤａ」と呼ばれるグレード２のＨＡＳが使用される。調製は既知の方法（特許文献８、特許文献９）により行われ、実施例に報告されている。
【００２８】
「平均分子量」（ＭＷ）は、「固有粘度」法（非特許文献３）によって算出される重量平均ＭＷを意味する。
【００２９】
本発明の化合物は、薬物担体として使用でき、また体内プロテーゼのコーティングに使用できる。
【００３０】
主にチタン系金属でできており、コンパクト構造、または小柱状構造を有する移植可能なプロテーゼは、本発明の化合物の溶液をプロテーゼ上に噴霧することによって単純にコーティングされ、続いて、バイオフィルム形成に対する抑制効果がわかっている抗生物質、または成長因子（ＢＭＰ−２；ＴＧＦ１β；ＩＧＦ）または合成分子など、生物学的もしくは薬理学的に活性な物質（酸形態のジクロフェナクなど）の溶液を選択的に噴霧することによって、正電荷を有するように好適に処理される。
【００３１】
使用可能な抗生物質は、正に電荷可能であるもの、特にゲンタマイシン、ダプトマイシン、バンコマイシン、シプロフロキサシン、メロペネム、アミカシン、トブラマイシン、ポリミキシン、コリスチン、およびバシトラシン、好ましくはゲンタマイシン、コリスチン、およびダプトマイシンである。
【００３２】
本抗生物質は、ドーパミンで官能化されたグレード２の硫酸化ヒアルロン酸と塩を形成する。この塩およびこれらの塩が吸着されているプロテーゼは、本発明のさらなる目的である。
【００３３】
本発明のＨＡＳ２−ドーパミン化合物は、先行技術に対して次の利点を有する：
−噴霧可能である。従来技術では、「接着性」ポリマーを含有する溶液中に、時には長期間（数時間）プロテーゼを浸漬することを必要としているが、本発明は、簡単な噴霧によって（手術室であれば直接）塗布され、むらなく、均一な被覆さえも確実に行い、無菌性を完全に維持し、とりわけプロテーゼを移植する前の接着時間および乾燥時間を大幅に短縮させ、さらには不要にすることさえある。
−金属プロテーゼに完全に接着する。
−生体適合性である。
−骨基質との統合を促進するために必要とされるプロテーゼの表面粗さを保持する。
−最も周知されている技術（ベータ線またはガンマ線の照射）によって滅菌可能であり、滅菌後に、その構造的特徴をそのまま維持し（ドーパミンの酸化的分解なし）、かつこのために、抗生物質と共役後も、その生物学的効果を維持する（不変の抗菌活性）。これは、必要に応じて、植え込まれるプロテーゼを手術室で使用するかなり前に保管した滅菌済みのＨＡＳ２−ＤＯＰＡでコーティングし、使用時に抗生物質を噴霧できることを意味し、この場合、手術室において、プロテーゼの接着時間および乾燥時間が終わるまで待つ必要がない。このことは、手術が長時間である場合に特に重要である。
−骨芽細胞の再生を促進する。
−正電荷を有する抗生物質（または一般に活性分子）との静電相互作用に好適である一連の負電荷を生成する。このようにして、細菌性バイオフィルムの形成が妨げられるか、または強く制限されるため、感染症の発症はかなり減少する。
−硫酸基を含むが、事実上ヘパリン様作用を有さない。このため異常出血が引き起こされることはない。
−非常に有効であり、迅速、かつ持続的な方法で作用する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】未処理のチタン製シリンダ表面のＥＳＥＭ像およびそれに対応する強調表示した領域のＸＰＳスペクトルを示す図である。
【図２】実施例３の誘導体でコーティングされたチタン製シリンダの表面のＥＳＥＭ像およびそれに対応する強調表示した領域のＸＰＳスペクトルを示す図である。
【図３】実施例３の誘導体で処理し、その後洗浄したシリンダ表面のＥＳＥＭ像を示す図である。
【図４】曲線が、実施例３のＨＡＳ２−ＤＯＰＡまたは実施例１２のＨＡ−ＤＯＰＡで官能化され、ゲンタマイシンがコーティングされた、チタン製シリンダ上での黄色ブドウ球菌の増殖の阻害を示す図である。
【図５】ゲンタマイシンに結合した実施例１１のヘパリン−ＤＯＰＡ（ＨＥＰＡ−ＤＯＰＡ）抱合体と比較した、実施例３のＨＡＳ２−ＤＯＰＡ抱合体の抗菌活性（ＣＦＵ／ｍＬ）を示す図である。
【図６】実施例１１のＨＥＰＡ−ＤＯＰＡとの比較による、実施例６のＨＡＳ２−ＤＯＰＡの抗凝固作用を示す図である。
【図７】実施例３および１２のＨＡＳ２−ＤＯＰＡの骨芽細胞増殖に対する影響をフィブロネクチンと比較して示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
グレード２の硫酸化ヒアルロン酸とドーパミンの抱合体（以下、ＨＡＳ２−ＤＯＰＡと称する）は、ＨＡＳ２の合成およびＨＡＳ２とドーパミンとの反応の２段階で合成される。次に、ＨＡＳ２は、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ；特許文献８）で塩化したＨＡまたはナトリウムで塩化したＨＡ（特許文献９）から調製できる。
【実施例１】
【００３６】
ＨＡ−ＴＢＡからのＨＡＳ２の調製
【００３７】
２．０ｇ  ｄ．ｍ．（３．２２×１０−３モル；１当量）のＨＡ−ＴＢＡ＋（ＭＷ２００ｋＤａ）を２００ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。溶解完了時に、３．５９ｇのＰｙｒ・ＳＯ３（８当量）を加えた。室温で一晩放置した後、生成物をＥｔＯＨで沈殿させ、得られた沈殿物を濾過し、ＥｔＯＨで２回洗浄し、１５０ｍＬの脱イオン水に再溶解させた。８ｍＬのＮａＣｌ飽和溶液および１１５ｍＬのＤＭＳＯを添加して、ｐＨを３Ｍ  ＮａＯＨにより３．４±０．１に補正した。生成物を４４０ｍＬのＥｔＯＨで沈殿させ、得られた沈殿物を濾過し、ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ混合物（８０：２０）およびＥｔＯＨで洗浄し、最後に３７℃で真空乾燥させた。
【実施例２】
【００３８】
ＨＡ−ＮａからのＨＡＳ２の調製
【００３９】
４．０ｇ  ｄ．ｍ．（９．９６×１０−３ｍｏｌ；１当量）のＨＡ−Ｎａ＋（平均分子量２００ｋＤａ）を２２０ｍＬのＤＭＳＯ中に分散させた。３．６ｍＬのメタンスルホン酸（５当量）を加え、混合物を室温で２４時間撹拌下に放置した。溶解完了時に、１２．８ｇのＰｙｒ・ＳＯ３（８当量）を加えた。室温で一晩放置した後、生成物をＥｔＯＨで沈殿させ、得られた沈殿物をグーチで濾過し、ＥｔＯＨで２回洗浄し、１５０ｍＬの脱イオン水に再溶解させた。８ｍＬのＮａＣｌ飽和溶液および１１５ｍＬのＤＭＳＯを添加して、ｐＨを３Ｍ  ＮａＯＨにより３．４±０．１に補正した。生成物を４４０ｍＬのＥｔＯＨで沈殿させ、得られた沈殿物を濾過し、ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ混合物（８０：２０）およびＥｔＯＨで洗浄し、最後に３７℃で真空乾燥させた。
【実施例３】
【００４０】
２３％の誘導体化を有するＨＡＳ２−ＤＯＰＡ抱合体の合成（直接結合）
【００４１】
実施例２のように調製した２．０ｇ  ｄ．ｍ．（３．３×１０−３ｍｏｌ、１当量）のＨＡＳ２ナトリウム塩を１００ｍＬの脱イオン水に溶解し、３．０ｇの塩化ベンザルコニウム（ＢＡ＋Ｃｌ−）を１００ｍＬの脱イオン水に別々に溶解させた。可溶化完了時に、ＢＡ＋Ｃｌ−溶液をＨＡＳ２溶液に添加して、これにより沈殿物を得て、これを濾過し、Ｈ２Ｏ中、ＥｔＯＨ中、次いでアセトン中で洗浄し、高真空下においてロータリーエバポレーター中で乾燥させた。単離した沈殿物を１６０ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。次いで、０．２６７ｇ（０．５当量）のＣＤＩおよび０．１ｍＬのメタンスルホン酸（０．５当量）を加えた。３０分後、４０℃で攪拌しながら、０．５ｇ（０．８当量）の塩酸ドーパミンを添加し、４０℃でゆっくり攪拌しながら反応を一晩継続させた。翌日、１６ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、生成物をＥｔＯＨで沈殿させた。得られた沈殿物を濾過し、ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ（８５：１５）からなる２容量の混合物で、次にＥｔＯＨで、最後にアセトンで洗浄した。得られた生成物を５０ｍＬの脱イオンＨ２Ｏに溶解し、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５）中で３日間、１ＭのＨＣｌを添加することによってｐＨを５に調整したＨ２Ｏ中において１日間透析した（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析膜、カットオフ値＝１２，０００〜１４，０００Ｄａ）。
【００４２】
透析時間を調整し、ＧＰＣにより透析膜中の遊離ドーパミンの消失を確認した。最後に、透析した生成物を凍結させ、凍結乾燥させた。
【実施例４】
【００４３】
５５％の誘導体化を有するＨＡＳ２−ＤＯＰＡ抱合体の合成（直接結合）
【００４４】
２ｇのＨＡＳ２ナトリウム塩から出発し、ＢＡで塩化し、１．３４ｇ（２．５当量）のＣＤＩおよび２．５ｇ（４．０当量）の塩酸ドーパミンと反応させて、誘導体を実施例３に記載のように合成し、特徴付けた。
【実施例５】
【００４５】
３１％の誘導体化を有するＨＡＳ２−ＤＯＰＡ抱合体の合成（直接結合）
【００４６】
２ｇのＨＡＳ２ナトリウム塩から出発し、ＢＡで塩化し、０．８０１ｇ（１．５当量）のＣＤＩおよび１．２５ｇ（２．０当量）の塩酸ドーパミンと反応させて、誘導体を実施例３に記載のように合成し、特徴付けた。
【実施例６】
【００４７】
２１％の誘導体化を有するＨＡＳ２−ＤＯＰＡ抱合体の合成（直接結合）
【００４８】
２ｇのＨＡＳ２ナトリウム塩から出発し、ＢＡで塩化し、０．１３４ｇ（０．２５当量）のＣＤＩおよび０．２５ｇ（０．４当量）の塩酸ドーパミンと反応させて、誘導体を実施例３に記載のように合成し、特徴付けた。
【実施例７】
【００４９】
６％の誘導体化を有するＨＡＳ２−ＤＯＰＡ抱合体の合成（直接結合）
【００５０】
２ｇのＨＡＳ２ナトリウム塩から出発し、ＢＡで塩化し、０．０６７ｇ（０．１２５当量）のＣＤＩおよび０．２５ｇ（０．４当量）の塩酸ドーパミンと反応させて、誘導体を実施例３に記載のように合成し、特徴付けた。
【実施例８】
【００５１】
５％の誘導体化を有するＨＡＳ２−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）１０−ＣＯＮＨ−ドーパミン抱合体の合成（１０個の炭素原子を有するアルキルスペーサーを介した間接結合）
【００５２】
間接結合は、２つのステップ、ドーパミン−スペーサー種を合成すること、およびその後、ＨＡＳ２によりドーパミン−スペーサーを合成することを含む。
−８．１：ドーパミン−スペーサーの合成：ＮＨ２−（ＣＨ２）１０−ＣＯＮＨ−ドーパミン
【００５３】
０．５５ｇの１１−（Ｂｏｃ−アミノ）ウンデカン酸を１０ｍＬのＤＭＦに溶解し、カルボキシルを０．５６ｇのＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）塩酸カルボジイミド）で活性化し、０℃で攪拌しながら、三級塩基（ＴＥＡ、０．３１ｍＬ）の存在下でＤＭＡＰ（０．０７ｇ）を加えた。１０分後に０．４ｇの塩酸ドーパミンを加え、混合物を室温で一晩撹拌下に放置した。次いで４０ｍＬのジクロロメタンおよび４０ｍＬのＨ２Ｏを添加し、有機相を抽出し、水中で洗浄し、ロータリーエバポレーターで乾燥させた。ＢＯＣ保護基は、５ｍＬの酸混合物ＴＦＡ１５％／Ｈ２Ｏ５％／ＤＣＭ８０％を加えることによって放出させ、得られた混合物を室温で２０分間撹拌下に放置した。次いで溶媒を蒸発させて、生成物を乾燥させた。
−８．２：ＨＡＳ２−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）１０−ＣＯＮＨ−ＤＯＰＡの合成
【００５４】
１ｇのＨＡＳ２ナトリウム塩から出発し、ＢＡで塩化し、０．４５ｇのＣＤＩおよび０．５ｇの実施例８．１と同様にして得られたＮＨ２−（ＣＨ２）１０−ＣＯＮＨ−ＤＯＰＡと反応させて、誘導体を実施例３に記載のとおりに合成し、特徴付けた。
【実施例９】
【００５５】
５％の誘導体化を有するＨＡＳ２−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯＮＨ−ドーパミン抱合体の合成（５個の炭素原子を有するアルキルスペーサーを介した間接結合）
【００５６】
ドーパミンスペーサーは、試薬として６−（Ｂｏｃ−アミノ）カプロン酸を使用し、実施例８．１に記載の手順に従って得た。
【００５７】
生成物ＨＡＳ２−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯＮＨ−ドーパミンは、実施例８．２に記載の手順に従って得た。
【実施例１０】
【００５８】
５％の誘導体化を有するＨＡＳ２−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−ＤＯＰＡ抱合体の合成（ポリエチレングリコールスペーサーによる間接結合）。
【００５９】
間接結合は、２つのステップ、ＤＯＰＡスペーサー種を合成すること、およびその後、ＨＡＳ２によりＤＯＰＡスペーサーを合成することを含む。
−ＤＯＰＡ−スペーサーの合成：ＮＨ２−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−ＤＯＰＡ
【００６０】
０．６４ｇのＢｏｃ−ＮＨ−（ＰＥＧ）−ＣＯＯＨ．ＤＣＨＡ（９つの原子）を１０ｍＬのＤＭＦに溶解し、カルボキシルを０．５６ｇのＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）塩酸カルボジイミド）で活性化し、０℃で攪拌しながら、三級塩基（ＴＥＡ、０．３１ｍＬ）の存在下でＤＭＡＰ（０．０７ｇ）を加えた。１０分後、ＤＯＰＡ（塩酸ドーパミン）を加え、室温で一晩撹拌下に放置した。次いで４０ｍＬのジクロロメタンおよび４０ｍＬのＨ２Ｏを添加し、有機相を抽出し、水中で洗浄し、ロータリーエバポレーターで乾燥させた。ＢＯＣ保護基は、５ｍＬの酸混合物ＴＦＡ１５％／Ｈ２Ｏ５％／ＤＣＭ８０％を加えることによって放出させ、室温で２０分間撹拌下に放置した。次いで溶媒を蒸発させて、生成物を乾燥させた。０．５ｇの生成物を得た（収率８３％）。
−ＨＡＳ２−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−ＤＯＰＡの合成
【００６１】
この誘導体は、ＨＡＳ２−ＤＯＰＡ誘導体について前述したように、ＨＡＳ２ナトリウム塩１ｇから出発し、ＢＡで塩化し、０．４５ｇのＣＤＩおよび０．５ｇのＮＨ２−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−ＤＯＰＡと反応させて合成した。
【実施例１１】
【００６２】
（比較例）
【００６３】
２１％の誘導体化を有するヘパリン（ＨＥＰＡ）−ＤＯＰＡ抱合体の合成（Ｌｅｅら、２０１２に従って調製した）
【００６４】
１．０ｇ  ｄ．ｍ．（３．３×１０−３ｍｏｌ、１当量）のヘパリンナトリウム（ＨＥＰＡ）を５０ｍＬの脱イオン水に溶解し、１．５ｇの塩化ベンザルコニウム（ＢＡ＋Ｃｌ−）を１００ｍＬの脱イオン水に別々に溶解させた。可溶化完了時に、ＢＡ＋Ｃｌ−溶液をＨＥＰＡ溶液に添加して、これにより沈殿物を得て、これを濾過し、Ｈ２Ｏ中、ＥｔＯＨ中、次いでアセトン中で洗浄し、高真空下においてロータリーエバポレーター中で乾燥させた。単離した沈殿物を８０ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。次いで、０．１３４ｇ（０．５当量）のＣＤＩおよび０．０５ｍＬのメタンスルホン酸（０．５当量）を加えた。３０分後、４０℃で攪拌しながら、０．２５ｇ（０．８当量）の塩酸ドーパミンを添加し、４０℃でゆっくり攪拌しながら反応を一晩継続させた。翌日、８ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を添加し、生成物をＥｔＯＨで沈殿させた。得られたｐｐｔを濾過し、ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ（８５：１５）からなる２容量の混合物で、次にＥｔＯＨで、最後にアセトンで洗浄した。得られた生成物を５０ｍＬの脱イオンＨ２Ｏに溶解し、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５）中で３日間、１ＭのＨＣｌを添加することによってｐＨを５に調整したＨ２Ｏ中において１日間透析した（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析膜（カットオフ値＝３，０００Ｄａ））。
【００６５】
透析時間を調整し、ＧＰＣにより透析膜中の遊離ドーパミンの消失を確認した。
【実施例１２】
【００６６】
（比較例）
【００６７】
２３％の誘導体化を有するＨＡ−ＤＯＰＡ抱合体の合成。
【００６８】
実施例３に記載の手順により、ＨＡナトリウム塩２００ｋＤａ  １．３２ｇ（０．００３３モル）から出発し、ＢＡで塩化し、０．２６７ｇ（０．５当量）のＣＤＩおよび０．５ｇ（０．８当量）の塩酸ドーパミンと反応させて、ＨＡ−ＤＯＰＡ誘導体を合成した。
【実施例１３】
【００６９】
ＨＡＳ２−ＤＯＰＡ誘導体の接着試験
【００７０】
ドーパミンは、さまざまなｐＨ値において、接着剤として機能するため、２つの最も代表的なｐＨ値、すなわち５および８でＰＢＳに溶解させて、ＨＡＳ２−ＤＯＰＡ抱合体（実施例５に記載のとおり調製された）をコーティングする能力の試験を行った：
−溶液Ａ：２０ｍｇのＨＡＳ２−ＤＯＰＡ（３１％）を含む４ｍＬの０．１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ５）。
−溶液Ｂ：２０ｍｇのＨＡＳ２−ＤＯＰＡ（３１％）を含む４ｍＬの０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ８）。
【００７１】
この試験には、任意のｐＨで正電荷を有する蛍光プローブ（塩酸サンギナリン）を使用して、生理的ｐＨにおいて、誘導体と正電荷を帯びた抗生物質との相互作用をシミュレートした。
【００７２】
２つのチタン製シリンダ（ｄ＝１５×ｈ＝１７ｍｍ）に、それぞれ溶液Ａと溶液Ｂを均一に噴霧し、脱イオン水で洗浄し、気流中で乾燥させ、０．１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ５）中、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のサンギナリン溶液の入った異なるバイアル内に浸漬させた。シリンダを室温で一晩穏やかに撹拌しながら放置した。翌日、シリンダを脱イオン水で再び洗浄し、Ｎ２気流下で乾燥させ、３６０ｎｍのＵＶランプで照射し、目視検査を行った。
【００７３】
処理されたシリンダが発する蛍光を評価して、ｐＨ８のドーパミン誘導体（溶液Ｂ）が表面に最もよく付着していることが推定された。この所見は、溶液Ｂが、本発明を具体化する目的のための理想的なアプローチであることを実証している。
１３．１：チタン表面コーティングの電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）分析
【００７４】
この試験では、シリンダの表面に噴霧することによって堆積させたＨＡＳ２−ＤＯＰＡ誘導体は、Ｔｉに均一に接着するのみでなく、プロテーゼと骨基質との骨結合を促進するのに必要な表面粗さを維持することが証明された。２５ｍｇ／ｍＬのＨＡＳ２−ＤＯＰＡを含む０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ８）（２３％；実施例３）溶液を調製し、この溶液１ｍｌをＴｉシリンダ上に噴霧し、風燥させて放置し、表面をＥＳＥＭ下で観察し、未処理シリンダと比較した（図１および図２）。写真によるスキャンに加えて、定性的ＸＰＳ分析（光電子Ｘ線分光、分析対象表面上での有機物の存在の検出）を行った。次いで、処理されたシリンダを洗浄して、インビボでの移植後など、生理学的流体の流れと接触している状況であっても、誘導体が表面に付着し続けるかを確認した（図３）。
【００７５】
処理された表面の画像には、ＸＰＳ分析によって確認されたとおり、材料の存在が明確に示されている。さらに、乾燥させた誘導体では、表面に粗い質感を与える表面の凹凸が作り出されており、これは、インプラントと骨基質との一体化を促進する上で重要なパラメータである。
【００７６】
洗浄後、誘導体残留物は依然として表面に見られ、誘導体がＴｉと活発に相互作用し、かつ洗浄後も引き続き接着していることが確認された。
【００７７】
このことは、ＨＡＳ２−ＤＯＰＡ抱合体が以下であることを示している：
−特にｐＨ＝８の溶液で調製した場合には、チタン表面に完全に接着する、
−洗浄後は、表面に結合したままである、
および
−金属表面に、プロテーゼの骨統合を促進するのに必要とされる粗い質感を付与する。
【実施例１４】
【００７８】
黄色ブドウ球菌の細菌増殖抑制のインビトロ試験（ＨＡＳ２−ＤＯＰＡまたはＨＡ−ＤＯＰＡおよびゲンタマイシンにより官能化させたチタン製シリンダ）
【００７９】
以下を調製した：
ＨＡＳ２−ＤＯＰＡ（２３％、実施例３）を含む０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ＝８）溶液。
ＨＡ−ＤＯＰＡ（２３％、実施例１２）を含む０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ＝８）溶液。
ゲンタマイシン溶液（２５ｍｇ／５ｍｌの０．２５Ｍ  ＭＥＳ、ｐＨ＝５．２）。
０．１ＭのＰＢＳ溶液、ｐＨ＝８（対照）。
【００８０】
２つのチタン製シリンダ（ｄ＝１５×ｈ＝１７ｍｍ）にＨＡＳ２−ＤＯＰＡ溶液を噴霧し、１５分間放置して風乾させ、ゲンタマイシン溶液を噴霧し、１５分間再び放置して、風乾させた。
【００８１】
同じサイズの他の２つのチタン製シリンダにも同一の処理を施し、上記の手順により、最初にＨＡ−ＤＯＰＡ誘導体溶液を、次にゲンタマイシン溶液を噴霧した。
【００８２】
最後に、上記手順により、同一サイズの他の２つのチタン製シリンダにＰＢＳ溶液を噴霧し、次いでゲンタマイシン溶液を噴霧した。
【００８３】
次いで、各シリンダ（合計６個）を５秒間ＭＱ水中に１回浸漬し、１５分間放置して風乾させ、培養ブロス（緩衝ペプトン水、ペプトン１０．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、無水リン酸ニナトリウム３．６ｇ／Ｌ、リン酸カリウム１．５ｇ／Ｌ、Ｂｉｏｋａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に入れ、黄色ブドウ球菌６００，０００，０００ＣＦＵ／ｍＬを播種した。ブロスを３７℃で培養し、予め設定した時間（６時間、１２時間、２４時間、４８時間、１４４時間）に１ｍＬの上清を取り、プレート播種のために（ＰＣＡ−プレートカウント寒天：トリプトン５．０ｇ／Ｌ、酵母エキス２．５ｇ／Ｌ、グルコース１．０ｇ／Ｌ、バクテリア寒天１２．０ｇ／Ｌ、Ｂｉｏｋａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製）、滅菌食塩水を用いて、１：１０にスカラー希釈した（細菌の成長に応じて）。次にＣＦＵ／ｍＬのカウントを行った。
【００８４】
図４には、６００，０００，０００ＣＦＵ／ｍＬの黄色ブドウ球菌の初期種菌と比較した、経時的な細菌増殖阻害率のデータを示す。
【００８５】
グラフは、以下を明確に示している：
−ＨＡＳ２−ＤＯＰＡは、対照（ＰＢＳ）よりはるかに効果的に作用する。これは、ＨＡＳ２−ＤＯＰＡが時間の経過とともに制御された一定の様式でゲンタマイシンを放出していることを意味するものである。
−ＨＡＳ２−ＤＯＰＡは、ＨＡ−ＤＯＰＡよりもはるかに有意な様式で作用する。
−驚くべきことに、最初の２４時間の総抗菌作用に加えて、ＨＡＳ２−ＤＯＰＡは、最大１４４時間、すなわち接種後７日までの間、長期間の抗菌被覆を維持し、一方で、ＨＡ−ＤＯＰＡは、黄色ブドウ球菌の増殖をわずか４８時間後に再開する。
【００８６】
同じ濃度のダプトマイシンを用いて同様の実験を行い、同一の活性プロファイルを得た。
【実施例１５】
【００８７】
比較試験：ゲンタマイシンに結合したヘパリン−ＤＯＰＡ（ＨＥＰＡ−ＤＯＰＡ）抱合体と比較したＨＡＳ２−ＤＯＰＡ抱合体の抗菌活性
【００８８】
実施例６のように、ＨＡＳ２−ＤＯＰＡ抱合体を調製し、実施例１１と同様にＨＥＰＡ−ＤＯＰＡ誘導体を調製した（誘導体化度：２１％）。
【００８９】
２つのチタン製シリンダ（ｄ＝１５×ｈ＝１７ｍｍ）に、それぞれｐＨ８のＰＢＳ中２０ｍｇ／ｍＬの濃度で、それぞれＨＡＳ２−ＤＯＰＡまたはＨＥＰＡ−ＤＯＰＡを噴霧し、続いて、ＭＥＳ（ｐＨ５．２）中、５ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンを噴霧した。次いで、ＭＱ水中で３回連続浸漬洗浄（５秒間）を行った。繰り返し洗浄する目的は、試験対象の種に実際に静電的に結合していないすべてのゲンタマイシンを除去するためである。次に、シリンダを黄色ブドウ球菌の種菌（６００，０００，０００ＣＦＵ／ｍＬ）と共に試験管に入れ、予め設定した時間に１ｍＬの上清を取り、その後、プレート播種（ＰＣＡ−プレートカウント寒天：トリプトン５．０ｇ／Ｌ、酵母エキス２．５ｇ／Ｌ、グルコース１．０ｇ／Ｌ、細菌寒天１２．０ｇ／Ｌ（Ｂｉｏｋａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））のために滅菌生理食塩水で１：１０（細菌の増殖に応じて）にスカラー希釈した。その後、図５に示すように、ＣＦＵ／ｍＬをカウントした。
【００９０】
この結果は、ＨＡＳ２−ＤＯＰＡ生成物が黄色ブドウ球菌増殖の抑制、誘導体化の程度、および濃度が同等であることにおいて、はるかに高い活性であり、こうした活性が、少なくとも３６時間持続していることを示すものである。この結果は、ＨＥＰＡ−ＤＯＰＡ誘導体がその抗菌活性を徐々にかつ急速に失い、３６時間後には、「対照」（抗菌活性を持たない）と等しいことを考慮すると、特に重要である。
【実施例１６】
【００９１】
ＨＡＳ２−ＤＯＰＡおよびＨＥＰＡ−ＤＯＰＡの抗凝固作用の比較
【００９２】
実施例６のＨＡＳ２−ＤＯＰＡ抱合体および実施例１１のＨＥＰＡ−ＤＯＰＡ誘導体を調製した。
【００９３】
抗凝固作用は、純粋なヘパリンを標準として用いて評価した。比色法を使用するキット（Ｈｙｐｈｅｎ  ＢｉｏＭｅｄ、Ｂｉｏｐｈｅｎ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＡＴ＋Ｒｅｆ  ２２１００７）（ヘパリンもしくは試験ポリマーによって複合体を形成していないかまたはこれらによって阻害されていない凝固因子Ｘａを測定する）を使用した。４０５ｎｍでの吸光度は、遊離Ｘａ因子に正比例し、したがって試験対象の種のヘパリン様活性に反比例する（図６）。
【００９４】
ＨＡＳ２−ＤＯＰＡの抗凝固作用は、濃度が等しい場合、ＨＥＰＡ−ＤＯＰＡの抗凝固作用よりはるかに少なく、ＨＡＳ２−ＤＯＰＡ系と同じ作用（Ａｂｓが５０％低下）を得るためには、約５０倍高い濃度が必要であることが明白である。このことは、ＨＡＳ２−ＤＯＰＡ抱合体は、ヘパリンとまったく同じように、硫酸化ポリマーを含んでいるが、既知の生成物よりも低い抗凝固作用を呈することを意味する。
【００９５】
ゲンタマイシンまたは同様の抗菌剤に結合したＨＡＳ２−ＤＯＰＡ抱合体は、噴霧により塗布できることに加えて、非常に短時間で使用することができ、ヘパリン様効果は実質的に有さず、このため、異常な出血を引き起こすことはなく、また既知の同等物よりもはるかに効果的であり、かつ迅速に、持続的な様式で作用するため、有利である。
【実施例１７】
【００９６】
インビトロでの骨芽細胞増殖に対するＨＡＳ２−ＤＯＰＡおよびＨＡ−ＤＯＰＡの作用の評価
【００９７】
以下を調製した：
−ＨＡＳ２−ＤＯＰＡの水溶液（２３％、実施例３）１０ｍｇ／ｍＬ
−ＨＡ−ＤＯＰＡの水溶液（２３％、実施例１２）１０ｍｇ／ｍＬ
−フィブロネクチン水溶液２０μｇ／ｍｌ（陽性対照）。
【００９８】
２つのチタン製シリンダ（ｄ＝１５×ｈ＝１７ｍｍ）の円形上面にＨＡＳ２−ＤＯＰＡ溶液を噴霧し、１５分間放置して風乾させ、同じサイズの他の２つのチタン製シリンダにも同じ処理を施し、これに上記の手順に従ってＨＡ−ＤＯＰＡ溶液を噴霧した。最後に、同一の大きさの他の２つのチタン製シリンダに、上記の手順に従って、フィブロネクチンを含む水溶液を噴霧した。フィブロネクチンは、細胞接着、増殖および遊走を刺激するので、インビトロでの細胞増殖実験における参照標準として広く使用されている。
【００９９】
次いで、各シリンダ（合計６個）をミリＱ水に５秒間１回浸漬し、１５分間放置して風乾させて、ウェルプレートに入れた。０．１０ｍＬの骨芽細胞（Ｓａｏｓ−２細胞系、骨肉腫由来）を含む培地（マッコイの５Ａ＋１０％ＦＢＳ）（チタン約５００００細胞／ｃｍ２の量）をその後、各シリンダの表面に堆積させた。細胞をチタン上において３７℃（５％  ＣＯ２）で４時間培養して接着させ、次に、シリンダが浸漬するまで培地を加え、同じ条件下で一晩培養を継続した。
【０１００】
翌日、培地を除去し、シリンダをＰＢＳで洗浄して、非接着細胞を除去し、次いで、等容量の同じ培地を１０％アラマーブルーの入った各シリンダに添加し、シリンダを３７℃（５％  ＣＯ２）で２４時間放置して培養した。培養後、蛍光読み取りを実施し（λ励起：５３０ｎｍおよび発光：５９０ｎｍ）、蛍光強度は、細胞代謝、したがって、生存骨芽細胞数に比例していた。
【０１０１】
この結果（図７）から、誘導体化の程度と濃度が等しいこと、ＨＡＳ２−ＤＯＰＡが、フィブロネクチンとほぼ同等であり、驚くべきことにＨＡ−ＤＯＰＡのほぼ２倍である、非常に高い骨結合活性を有することがわかる。これらの値は、統計的に有意である。
【０１０２】
Ｃ−骨芽細胞の播種を伴わない、陰性対照、すなわち「そのまま」のチタン製シリンダを表す。
【実施例１８】
【０１０３】
実施例３のように調製した２３％  ＨＡＳ２−ＤＯＰＡ粉末のベータ線およびガンマ線滅菌に対する安定性の評価
【０１０４】
実施例３に記載したように、１ｇの２３％  ＨＡＳ２−ＤＯＰＡ粉末サンプルを調製した。サンプルはそれぞれ、以下に曝露させた：
−ベータ線による滅菌、
−ガンマ線による滅菌、
−滅菌なし（対照）。
【０１０５】
次いで、サンプルを異なる既知の方法、すなわち重水（Ｄ２Ｏ）中に粉末を溶解させた後に、１Ｈ−ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴分光法）での構造分析によって、次いでＩＲ分析（ＫＢｒペレット）を用いて、最後に、水に溶解後に可視ＵＶ分析（ＵＶ−Ｖｉｓ）を用いて分析した。
【０１０６】
分析結果により、滅菌サンプルのシグナルが同一であり、とりわけ、これらのシグナルと非滅菌対照のシグナルとの間に差がないことが確認された。特に、副生成物の形成（ＮＭＲおよびＩＲ分析）によるシグナル、または例えばドーパミン酸化によるＵＶ−Ｖｉｓ吸収シグナルシフトのシグナルは、観察されなかった。
【０１０７】
したがって、ＨＡＳ２−ＤＯＰＡポリマーは安定しており、ベータ線またはガンマ線滅菌に適合する。
【実施例１９】
【０１０８】
ＨＡＳ２−ＤＯＰＡで官能化し、ベータ線により滅菌し、その後バンコマイシンで処理したチタン製シリンダにおける黄色ブドウ球菌の細菌増殖の抑制のインビトロ試験
【０１０９】
以下を調製した：
ＨＡＳ２−ＤＯＰＡ（２３％、実施例３）を含む１０ｍｇ／ｍＬの水溶液、
バンコマイシンを含む５ｍｇ／ｍｌの水溶液。
【０１１０】
１つのチタン製シリンダ（ｄ＝１５×ｈ＝１７ｍｍ）（サンプルＡ、対照）はいかなる処理も施していないが、同じ寸法の第２のチタン製シリンダ（サンプルＢ）にはＨＡＳ２−ＤＯＰＡ溶液を噴霧し、１５分間放置して風乾させた。
【０１１１】
両方のシリンダにベータ線の照射による滅菌を施し、続いて調製したバンコマイシン溶液を噴霧し、最後に１５分間放置して風乾させた。
【０１１２】
次いで、両方のシリンダを、存在している過剰の抗生物質を除去するために、５秒間異なるＭＱ水溶液に１０回浸漬し、１５分間放置して風乾させた。黄色ブドウ球菌懸濁液（２００μＬ、６５０ｎｍでのＯ．Ｄ．＞０．５）をプレート内においてＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の表面に均一に分配し、２つのチタン製シリンダのそれぞれを寒天表面の中央に配置し、播種させた。このプレートを３５℃で１８時間培養した後、抗生物質によって細菌の増殖が抑制された表面の直径を測定した。
【０１１３】
ＨＡＳ２−ＤＯＰＡで処理し、滅菌したサンプルＢは、滅菌のみを行った対照サンプルよりもはるかに効果的に細菌増殖を阻害することが証明された。
【０１１４】
これは、滅菌することにより、ＨＡＳ２−ＤＯＰＡの構造または性質が変化しなかったことを意味するものであり、つまり引き続きＴｉに固定されたままであり、その結果、バンコマイシンに結合した後、それを放出する能力を保持している。
【０１１５】
同様の実験を同じ濃度でゲンタマイシンを用いて行い、同じ条件、同じ濃度で架橋チタンサンプルにバンコマイシンを用いて行い、上記のものと同一の細菌増殖阻害プロファイルを得た。
【０１１６】
したがって、β線滅菌は、
チタンへのＨＡＳ２−ＤＯＰＡの付着を変化させるものではない、
ＨＡＳ２−ＤＯＰＡの構造的特性を変化させるものではない、
および、このために、ＨＡＳ２−ＤＯＰＡが抗生物質に結合して、所望の抗菌効果を発揮する能力を変化させるものではない。
【図１】
2019536850.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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2019536850.tif 000014
2019536850.tif 000015