(57)【要約】本発明は、ＤＴＢＰを利用した微生物濃縮方法及び核酸抽出方法に関するものであって、ＤＴＢＰを用いて微生物濃縮が可能な技術を開発し、また、濃縮された微生物から直ちに核酸抽出することができる方法を開発した。微生物濃縮と核酸抽出技術とを１つのチューブまたはチップで可能にすることにより、外部から来る汚染や、コスト、時間、複雑性などを確実に減らすと予想される。
2019524148.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミダート（ＤＴＢＰ）を有効成分として含む微生物濃縮用組成物。
【請求項２】
前記微生物は、バクテリア、ウイルスまたは細胞であることを特徴とする請求項１に記載の微生物濃縮用組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組成物を含む微生物濃縮キット。
【請求項４】
対象物にアミン基を導入して改質する段階（第１段階）と、
前記改質された対象物上に微生物が含有された試料とＤＴＢＰとを接触させる段階（第２段階）と、
を含む微生物濃縮方法。
【請求項５】
前記対象物は、薄膜装置、磁性ビーズ、リング共振器またはナノ粒子のうち何れか１つであることを特徴とする請求項４に記載の微生物濃縮方法。
【請求項６】
前記対象物は、表面にシラン化合物で改質されたことを特徴とする請求項４に記載の微生物濃縮方法。
【請求項７】
前記シラン化合物は、下記化学式１で表される化合物であることを特徴とする請求項６に記載の微生物濃縮方法。
【化１】
2019524148.tif 000007
前記式において、Ｒ１〜Ｒ３は、それぞれ同じか異なり、Ｃ１〜Ｃ４のアルキルまたはＣ１〜Ｃ４のアルコキシのうち何れか１つであり、Ｒ４は、アミノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、３−（２−アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたは３−［２−（２−アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルのうち何れか１つである。
【請求項８】
前記シラン化合物は、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン、（１−アミノメチル）トリエトキシシラン、（２−アミノエチル）トリエトキシシラン、（４−アミノブチル）トリエトキシシラン、（５−アミノペンチル）トリエトキシシラン、（６−アミノヘキシル）トリエトキシシラン、３−アミノプロピル（ジエトキシ）メチルシラン（ＡＰＤＭＳ）、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン、［３−（２−アミノエチルアミノ）プロピル］トリメトキシシラン（ＡＥＡＰＴＭＳ）、及び３−［（トリメトキシシリル）プロピル］ジエチレントリアミン（ＴＭＰＴＡ）からなる群から選択された何れか１つ以上であることを特徴とする請求項７に記載の微生物濃縮方法。
【請求項９】
前記微生物が含有された試料は、微生物に感染されたと疑われる客体の糞便、尿、涙、唾液、皮膚の外部分泌物、呼吸管の外部分泌物、腸管の外部分泌物、消化管の外部分泌物、血しょう、血清、血液、脊髓液、リンパ液、体液及び組織からなるグループから選択された何れか１つであることを特徴とする請求項４に記載の微生物濃縮方法。
【請求項１０】
ＤＴＢＰを有効成分として含む核酸抽出用組成物。
【請求項１１】
前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする請求項１０に記載の核酸抽出用組成物。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の組成物を含む核酸抽出キット。
【請求項１３】
対象物にアミン基を導入して改質する段階（第１段階）と、
前記改質された対象物上に核酸試料とＤＴＢＰとを注入し、核酸と前記ＤＴＢＰとの間の複合体を形成させる段階（第２段階）と、
前記複合体が形成された対象物に溶出緩衝液を処理して核酸を抽出する段階（第３段階）と、
を含む核酸抽出方法。
【請求項１４】
前記対象物は、薄膜装置、磁性ビーズ、リング共振器またはナノ粒子のうち何れか１つであることを特徴とする請求項１３に記載の核酸抽出方法。
【請求項１５】
前記対象物は、表面にシラン化合物で改質されたことを特徴とする請求項１３に記載の核酸抽出方法。
【請求項１６】
前記シラン化合物は、下記化学式１で表される化合物であることを特徴とする請求項１５に記載の核酸抽出方法。
【化２】
2019524148.tif 000008
前記式において、Ｒ１〜Ｒ３は、それぞれ同じか異なり、Ｃ１〜Ｃ４のアルキルまたはＣ１〜Ｃ４のアルコキシのうち何れか１つであり、Ｒ４は、アミノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、３−（２−アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたは３−［２−（２−アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルのうち何れか１つである。
【請求項１７】
前記シラン化合物は、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン、（１−アミノメチル）トリエトキシシラン、（２−アミノエチル）トリエトキシシラン、（４−アミノブチル）トリエトキシシラン、（５−アミノペンチル）トリエトキシシラン、（６−アミノヘキシル）トリエトキシシラン、３−アミノプロピル（ジエトキシ）メチルシラン（ＡＰＤＭＳ）、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン、［３−（２−アミノエチルアミノ）プロピル］トリメトキシシラン（ＡＥＡＰＴＭＳ）、及び３−［（トリメトキシシリル）プロピル］ジエチレントリアミン（ＴＭＰＴＡ）からなる群から選択された何れか１つ以上であることを特徴とする請求項１６に記載の核酸抽出方法。
【請求項１８】
ＤＴＢＰを有効成分として含む微生物濃縮及び核酸抽出用組成物。
【請求項１９】
前記微生物は、バクテリア、ウイルスまたは細胞であることを特徴とする請求項１８に記載の微生物濃縮及び核酸抽出用組成物。
【請求項２０】
前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする請求項１８に記載の微生物濃縮及び核酸抽出用組成物。
【請求項２１】
請求項１８から請求項２０のうち何れか一項に記載の組成物を含む微生物濃縮及び核酸抽出キット。
【請求項２２】
対象物にアミン基を導入して改質する段階（第１段階）と、
前記改質された対象物上に微生物が含有された試料とＤＴＢＰとを接触させて微生物を濃縮させる段階（第２段階）と、
前記濃縮された微生物から核酸を分離する段階（第３段階）と、
前記分離された核酸と前記ＤＴＢＰとの間の複合体を形成させる段階（第４段階）と、
前記複合体が形成された対象物に溶出緩衝液を処理して核酸を抽出する段階（第５段階）と、
を含む微生物濃縮と同時に前記濃縮された微生物から核酸を抽出する方法。
【請求項２３】
前記対象物は、表面にシラン化合物で改質されたことを特徴とする請求項２２に記載の微生物濃縮と同時に前記濃縮された微生物から核酸を抽出する方法。
【請求項２４】
前記シラン化合物は、下記化学式１で表される化合物であることを特徴とする請求項２３に記載の微生物濃縮と同時に前記濃縮された微生物から核酸を抽出する方法。
【化３】
2019524148.tif 000009
前記式において、Ｒ１〜Ｒ３は、それぞれ同じか異なり、Ｃ１〜Ｃ４のアルキルまたはＣ１〜Ｃ４のアルコキシのうち何れか１つであり、Ｒ４は、アミノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、３−（２−アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたは３−［２−（２−アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルのうち何れか１つである。
【請求項２５】
前記シラン化合物は、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン、（１−アミノメチル）トリエトキシシラン、（２−アミノエチル）トリエトキシシラン、（４−アミノブチル）トリエトキシシラン、（５−アミノペンチル）トリエトキシシラン、（６−アミノヘキシル）トリエトキシシラン、３−アミノプロピル（ジエトキシ）メチルシラン（ＡＰＤＭＳ）、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン、［３−（２−アミノエチルアミノ）プロピル］トリメトキシシラン（ＡＥＡＰＴＭＳ）、及び３−［（トリメトキシシリル）プロピル］ジエチレントリアミン（ＴＭＰＴＡ）からなる群から選択された何れか１つ以上であることを特徴とする請求項２４に記載の微生物濃縮と同時に前記濃縮された微生物から核酸を抽出する方法。
【請求項２６】
前記微生物が含有された試料は、微生物に感染されたと疑われる客体の糞便、尿、涙、唾液、皮膚の外部分泌物、呼吸管の外部分泌物、腸管の外部分泌物、消化管の外部分泌物、血しょう、血清、血液、脊髓液、リンパ液、体液及び組織からなるグループから選択された何れか１つであることを特徴とする請求項２２に記載の微生物濃縮と同時に前記濃縮された微生物から核酸を抽出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミダートを利用した微生物濃縮または核酸抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸は、疾病状態を確認するための重要な分析手段であり、ＤＮＡ生体標識子（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、突然変異またはＤＮＡメチル化は、研究者が癌の原因を探すように助け、疾病の初期段階の間の疾病の状態を診断し、観察することはもとより、予後と監視とに対する大きな機会の提供に重要な糸口を提供する。
【０００３】
ＤＮＡのような核酸は、タンパク質のような他の成分に比べて、非常に低い生理的濃度で存在するために（例えば、全血マイクロリットル当たり数十ナノグラムのＤＮＡ対数十マイクログラムのタンパク質）、臨床試料からＤＮＡを効果的に抽出し、予備濃縮することは、増幅及び検出のような以後の工程に非常に重要である。
【０００４】
既存の微生物検出のための方法は、患者サンプル１〜２ｍｌで全体溶液を全部利用できず、そのうち、一部のみを用いて核酸を抽出し、それを利用した検出を進めた。多量の微生物の場合には、大きな問題がないが、少量の微生物の場合、正確な検出にならず、追加的感染病に対する調節に問題が生じるが、１〜２ｍｌのサンプルで最大限あらゆる微生物を利用するための濃縮方法についての研究が必要である。
【０００５】
また、最近、生命工学を含めた診断医学、薬物医学、代謝医学など多様な分野で高純度に精製された核酸の使用量が増えることによって、多様な生物試料からより迅速かつ純粋に核酸を分離しようとする努力が続いている。
【０００６】
しかし、現在まで核酸の分離方法において、最も大きく発展した部分は、誘電体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、タンパク質、細胞残骸粒子など細胞溶解溶液内に含まれた多種の物質から特異的に核酸のみを吸着させる担体に関する技術などほとんどの研究の焦点は、核酸を吸着させる物質に関する研究と開発とに集中されている限界があった。
【０００７】
これにより、より迅速かつ純粋に核酸を分離するために、なによりも細胞残骸粒子とタンパク質変性凝集物、その他の多様な細胞分解物質から迅速に所望の核酸のみを分離することができる技術の開発が切実な実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミダート（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｄａｔｅ；以下、‘ＤＴＢＰ’）を有効成分として含む微生物濃縮用組成物、それを利用した微生物濃縮方法及びキット；ＤＴＢＰを有効成分として含む核酸抽出用組成物、それを利用した核酸抽出方法及びキット；及びＤＴＢＰを有効成分として含む微生物濃縮及び核酸抽出用組成物、それを利用した微生物濃縮と同時に前記濃縮された微生物から核酸を抽出する方法及びキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を果たすために、本発明は、ＤＴＢＰを有効成分として含む微生物濃縮用組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、前記組成物を含む微生物濃縮キットを提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記ＤＴＢＰに微生物が含有された試料を接触させる段階を含む微生物濃縮方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、ＤＴＢＰを有効成分として含む核酸抽出用組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、前記組成物を含む核酸抽出キットを提供する。
【００１４】
また、本発明は、対象物にアミン基を導入して改質する段階（第１段階）；前記改質された対象物上に核酸試料とＤＴＢＰとを注入し、核酸と前記ＤＴＢＰとの間の複合体を形成させる段階（第２段階）；及び前記複合体が形成された対象物に溶出緩衝液を処理して核酸を抽出する段階（第３段階）；を含む核酸抽出方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、ＤＴＢＰを有効成分として含む微生物濃縮及び核酸抽出用組成物を提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記組成物を含む微生物濃縮及び核酸抽出キットを提供する。
【００１７】
また、本発明は、対象物にアミン基を導入して改質する段階（第１段階）；前記改質された対象物上に微生物が含有された試料とＤＴＢＰとを接触させて微生物を濃縮させる段階（第２段階）；前記濃縮された微生物から核酸を分離する段階（第３段階）；前記分離された核酸と前記ＤＴＢＰとの間の複合体を形成させる段階（第４段階）；及び前記複合体が形成された対象物に溶出緩衝液を処理して核酸を抽出する段階（第５段階）；を含む微生物濃縮と同時に前記濃縮された微生物から核酸を抽出する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、ＤＴＢＰを利用した微生物濃縮または核酸抽出方法に関するものであって、本発明者らは、ＤＴＢＰを用いて微生物濃縮が可能な技術を開発し、また、濃縮された微生物から直ちに核酸抽出することができる方法を開発した。微生物濃縮と核酸抽出技術とを１つのチューブ（ｔｕｂｅ）またはチップ（ｃｈｉｐ）で可能にすることにより、外部から来る汚染や、コスト、時間、複雑性などを確実に減らすと予想される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明であるＤＴＢＰ／Ｔｈｉｎ  ｆｉｌｍ  Ｓａｍｐｌｅ分析の概略的模式図を示す図面である。
【図２】薄膜装置の構成を示す分解図である。
【図３】ＤＴＢＰ濃度変化によるＤＮＡ抽出効率を示す図面である。
【図４】大腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ；以下、‘ＨＣＴ１１６’）から抽出したＤＮＡのＥｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ＰＣＲ（ａ）及びＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（ｂ）を示す図面である。
【図５】乳癌細胞株（ＭＣＦ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ；以下、‘ＭＣＦ’）から抽出したＤＮＡのＥｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ＰＣＲ（ａ）及びＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（ｂ）を示す図面である。
【図６】ブルセラ・オビス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  Ｏｖｉｓ）から抽出したＤＮＡのＰＣＲ結果を示す図面である。Ｍ：ＤＮＡマーカー（ｍａｒｋｅｒ）、Ｑ：既存のＱｉａｇｅｎ方法で抽出したＤＮＡサンプル、ＤＴＢＰ：本発明のＤＴＢＰ方式を用いて抽出したＤＮＡサンプル、Ｎ：陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）。
【図７】ＲＮＡ抽出方法（ａ）及びＲＮＡとｃＤＮＡとの同時抽出する方法（ｂ）に対して示す図面である。（ａ）同じサンプルを４回繰り返して実験を行った。Ｌ：ＤＮＡマーカー、Ｎ：陰性対照群。（ｂ）同じサンプルを２回繰り返して実験を行った。Ｌ：ＤＮＡマーカー。
【図８】ＤＴＢＰを利用した病原菌（大腸菌）濃縮分析結果を示す。
【図９】ＤＴＢＰを用いて１つのチップで病原菌（大腸菌）濃縮と同時に核酸抽出分析を進行した結果を示す。
【図１０】ＤＴＢＰを利用した病原菌（ＰＩＶ３−ＲＮＡウイルス）濃縮分析結果を示す。Ｐ：陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｎ：陰性対照群、Ｌ：５０  ｂｐ  ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ、１番〜４番サンプル：既存のＱｉａｇｅｎ方法で抽出したＤＮＡサンプル、１−１番〜４−１番サンプル：ＤＴＢＰ方式を用いて濃縮して抽出したＤＮＡサンプル。１番サンプルの場合、既存の方法としては、陰性と診断されたが、ＤＴＢＰ濃縮した１−１番サンプルでは、陽性と確認された。２、３番サンプルの場合、既存の方法及びＤＴＢＰ濃縮したサンプルいずれも確実な陰性であり、４番サンプルの場合、既存に陽性であったサンプルのバンド強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をＤＴＢＰ濃縮した４−１番サンプルは、確実に増加させたことを確認した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、ＤＴＢＰを有効成分として含む微生物濃縮用組成物を提供する。
【００２１】
望ましくは、前記微生物は、バクテリア、ウイルスまたは細胞など負電荷を帯びるあらゆる微生物であり得る。
【００２２】
また、本発明は、前記組成物を含む微生物濃縮キットを提供する。前記キットには、効果的な微生物濃縮に必要なｐＨ調節などのための緩衝液などがさらに含まれうる。
【００２３】
また、本発明は、対象物にアミン基を導入して改質する段階（第１段階）；及び前記改質された対象物上に微生物が含有された試料とＤＴＢＰとを接触させる段階（第２段階）；を含む微生物濃縮方法を提供する。
【００２４】
本発明において、前記対象物は、表面にシラン化合物で改質されたものである。望ましくは、前記シラン化合物は、下記化学式１で表される化合物であり得るが、これに制限されるものではない。
【００２５】
【化１】
2019524148.tif 000003
【００２６】
前記式において、Ｒ１〜Ｒ３は、それぞれ同じか異なり、Ｃ１〜Ｃ４のアルキルまたはＣ１〜Ｃ４のアルコキシのうち何れか１つであり、Ｒ４は、アミノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、３−（２−アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたは３−［２−（２−アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルのうち何れか１つである。
【００２７】
より望ましくは、前記シラン化合物は、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ；ＡＰＴＥＳ）、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン（（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、（１−アミノメチル）トリエトキシシラン（（１−ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、（２−アミノエチル）トリエトキシシラン（（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、（４−アミノブチル）トリエトキシシラン（（４−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、（５−アミノペンチル）トリエトキシシラン（（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、（６−アミノヘキシル）トリエトキシシラン（（６−ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、３−アミノプロピル（ジエトキシ）メチルシラン（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ（ｄｉｅｔｈｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ；ＡＰＤＭＳ）、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（Ｎ−［３−（ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ］ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、［３−（２−アミノエチルアミノ）プロピル］トリメトキシシラン（［３−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ；ＡＥＡＰＴＭＳ）または３−［（トリメトキシシリル）プロピル］ジエチレントリアミン（３−［（ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ］ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ；ＴＭＰＴＡ）であり得るが、これらに制限されるものではない。さらに望ましくは、前記シラン化合物は、本発明の実施例で記載した（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）または３−アミノプロピル（ジエトキシ）メチルシラン（ＡＰＤＭＳ）が最も適している。
【００２８】
望ましくは、前記微生物が含有された試料は、微生物に感染されたと疑われる客体の糞便、尿、涙、唾液、皮膚の外部分泌物、呼吸管の外部分泌物、腸管の外部分泌物、消化管の外部分泌物、血しょう、血清、血液、脊髓液、リンパ液、体液及び組織であり得るが、これらに制限されるものではない。
【００２９】
また、本発明は、ＤＴＢＰを有効成分として含む核酸抽出用組成物を提供する。望ましくは、前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得るが、これらに制限されるものではない。
【００３０】
また、本発明は、前記組成物を含む核酸抽出キットを提供する。前記キットには、試料内細胞を溶解させて、細胞内部から核酸を放出させるための、溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）またはプロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）などがさらに含まれ、効果的な核酸抽出に必要なｐＨ調節などのための緩衝液などがさらに含まれうる。
【００３１】
また、本発明は、対象物にアミン基を導入して改質する段階（第１段階）；前記改質された対象物上に核酸試料とＤＴＢＰとを注入し、核酸と前記ＤＴＢＰとの間の複合体を形成させる段階（第２段階）；及び前記複合体が形成された対象物に溶出緩衝液を処理して核酸を抽出する段階（第３段階）；を含む核酸抽出方法を提供する。
【００３２】
望ましくは、前記対象物は、表面にシラン化合物で改質されたものである。より望ましくは、前記シラン化合物は、下記化学式１で表される化合物であり得るが、これに制限されるものではない。
【化２】
2019524148.tif 000004
【００３３】
前記式において、Ｒ１〜Ｒ３は、それぞれ同じか異なり、Ｃ１〜Ｃ４のアルキルまたはＣ１〜Ｃ４のアルコキシのうち何れか１つであり、Ｒ４は、アミノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、３−（２−アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたは３−［２−（２−アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルのうち何れか１つである。
【００３４】
さらに望ましくは、前記シラン化合物は、本発明の実施例で記載した（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）または３−アミノプロピル（ジエトキシ）メチルシラン（ＡＰＤＭＳ）が最も適している。
【００３５】
また、本発明は、ＤＴＢＰを有効成分として含む微生物濃縮及び核酸抽出用組成物を提供する。
【００３６】
望ましくは、前記微生物は、バクテリア、ウイルスまたは細胞など負電荷を帯びるあらゆる微生物であり得る。
【００３７】
望ましくは、前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得るが、これらに制限されるものではない。
【００３８】
また、本発明は、前記組成物を含む微生物濃縮及び核酸抽出キットを提供する。前記キットには、効果的な微生物濃縮及び核酸抽出に必要なｐＨ調節などのための緩衝液などがさらに含まれ、試料内細胞を溶解させて、細胞内部から核酸を放出させるための、溶解緩衝液またはプロテアーゼなどがさらに含まれうる。
【００３９】
また、本発明は、対象物にアミン基を導入して改質する段階（第１段階）；前記改質された対象物上に微生物が含有された試料とＤＴＢＰとを接触させて微生物を濃縮させる段階（第２段階）；前記濃縮された微生物から核酸を分離する段階（第３段階）；前記分離された核酸と前記ＤＴＢＰとの間の複合体を形成させる段階（第４段階）；及び前記複合体が形成された対象物に溶出緩衝液を処理して核酸を抽出する段階（第５段階）；を含む微生物濃縮と同時に前記濃縮された微生物から核酸を抽出する方法を提供する。
【００４０】
望ましくは、前記対象物は、表面にシラン化合物で改質されたものである。より望ましくは、前記シラン化合物は、下記化学式１で表される化合物であり得るが、これに制限されるものではない。
【００４１】
【化３】
2019524148.tif 000005
【００４２】
前記式において、Ｒ１〜Ｒ３は、それぞれ同じか異なり、Ｃ１〜Ｃ４のアルキルまたはＣ１〜Ｃ４のアルコキシのうち何れか１つであり、Ｒ４は、アミノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、３−（２−アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたは３−［２−（２−アミノ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアミノ）（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルのうち何れか１つである。
【００４３】
さらに望ましくは、前記シラン化合物は、本発明の実施例で記載した（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）または３−アミノプロピル（ジエトキシ）メチルシラン（ＡＰＤＭＳ）が最も適している。
【００４４】
望ましくは、前記微生物が含有された試料は、微生物に感染されたと疑われる客体の糞便、尿、涙、唾液、皮膚の外部分泌物、呼吸管の外部分泌物、腸管の外部分泌物、消化管の外部分泌物、血しょう、血清、血液、脊髓液、リンパ液、体液及び組織であり得るが、これらに制限されるものではない。
【００４５】
本発明において、「対象物」は、薄膜装置、磁性ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ）、リング共振器（ｒｉｎｇ  ｒｅｓｏｎａｔｏｒ）またはナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）のうち何れか１つであり得るが、これらに制限されるものではない。より望ましくは、前記対象物は、本発明の実施例で記載した入口ホールと出口ホールとがそれぞれ貫設された上部薄膜；前記上部薄膜から離隔配置された下部薄膜；その入口端及び出口端が、前記上部薄膜の入口ホール及び出口ホールにそれぞれ対応して連通するマイクロチャネルが内側にパターン形成され、前記マイクロチャネルの入口部と連通する注入路が、前記入口端に隣接して形成され、前記上部薄膜と下部薄膜との間に配されるマイクロチャネルチャンバ；及び前記上部薄膜及び下部薄膜の各側部を密封して、前記マイクロチャネルチャンバを密封させる密封手段；を含む薄膜装置であり得る。
【００４６】
以下、下記の実施例によって、本発明をより詳細に説明する。但し、このような実施例によって、本発明が限定されるものではない。
【００４７】
図１を参照すれば、本発明による核酸分析は、薄膜装置内でＤＴＢＰを利用した核酸分析であるＤＴＢＰ／Ｔｈｉｎ  ｆｉｌｍ  Ｓａｍｐｌｅ分析であって、試料溶出／培養、洗浄及び溶出の３つの段階を含んでおり、遠心分離せずに行う。例えば、シラン化合物として３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を通じて薄膜装置を改質し、このような改質によって、疎水性である薄膜装置を新水性に転換させる。
【００４８】
前記改質された薄膜装置上に核酸試料、及び溶出緩衝液とＤＴＢＰ溶液とを注入する。前記核酸のアミノ基とＤＴＢＰの二機能性アミン反応基との相互作用による核酸とＤＴＢＰとの間に架橋メカニズムを用いて、核酸とＤＴＢＰとの間の複合体を形成させ、試料からＤＮＡを抽出することができる。
【００４９】
この際、ＤＴＢＰは、下記化学式２の構造を有し、二機能性イミドエステル（ｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒｓ）及び二硫化（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）結合を含んでいるために、前記ＤＴＢＰは、可逆的な架橋構造を形成することにより、細胞、タンパク質及び核酸のアミノ反応性架橋剤として使われた。ＤＴＢＰとタンパク質との相互作用ではなく、ＤＴＢＰと核酸との間の迅速かつ強い相互結合を通じて核酸試料から高効率の核酸抽出が可能である。
【００５０】
【化４】
2019524148.tif 000006
以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【００５１】
＜実施例１＞薄膜装置製作及び前処理
【００５２】
１．薄膜装置製作
【００５３】
レーザカットティング機器（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＵＳＡ）を用いて、本発明の薄膜装置を製作した（図２参照）。まず、前記薄膜装置は、上部薄膜と下部薄膜、そして、上部薄膜と下部薄膜との間に挿入されたマイクロ流体チャンバで構成され、前記マイクロ流体チャンバは、核酸供給源からＤＮＡを抽出するために、チャンバ内の流路によって互いに連結された多数のスロット型マイクロウェルからなっている。
【００５４】
前記マイクロ流体チャンバを製作するために、３００μｍの厚さの両面テープ（１００μｍの厚さの両面テープの間に挟持された１００μｍの厚さのポリエステル膜）にマイクロ流体チャンバデザインをレーザカットティング機器で切断してマイクロ流体チャンバを製作した。薄膜（上部及び下部）は、レーザカットティング機器を用いてマイクロ流体チャンバと同じ寸法で切断した。
【００５５】
前記上部薄膜に貫通孔である入口（ｉｎｌｅｔ）と出口（ｏｕｔｌｅｔ）とを製作した。レーザカットティングマイクロ流体チャンバの上部及び下部の表面に永久接着剤を用いて、それぞれレーザカットティング薄膜（上部及び下部）を接着させた。前記マイクロ流体チャンバの高さは、約３００μｍであり、総体積は、３００μｌであった（３００μｌの量、８．４ｃｍ×３．７ｃｍ）。
【００５６】
核酸供給源を注入するためのチュービングアダプダは、３ｍｍの厚さを有するキャストアクリルシート（ＭＡＲＧＡ  ＣＩＰＴＡ、Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ）を両面テープの一面に付着し、レーザカットティング機器で切断及び穿孔して製造した。前記製造されたチュービングアダプダは、マイクロ流体チャンバの流入口と排出口とにそれぞれ付着した。以後、あらかじめ切断されたタイゴンチュービング（ＡＡＣ０２５４８；Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ、Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ、ＵＳＡ）をアダプダの孔に位置させた後、エポキシを使用して密封した。
【００５７】
このように製作された薄膜装置は、多様な容量の核酸試料（１００μｌ、３００μｌ、及び５００μｌ）を処理することができるという長所がある。
【００５８】
２．薄膜装置前処理
【００５９】
前記薄膜装置を利用したＤＮＡ分析のために、薄膜装置内部を１０分間酸素プラズマで処理した後、前記プラズマ処理された薄膜装置を６５℃で１０〜６０分間２％  ３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を含有した水溶液に浸漬させた後、脱イオン水で完全に洗浄した。洗浄後、薄膜装置を硬化（ｃｕｒｅ）させるために、前記洗浄された薄膜装置を迅速に窒素気流下で乾燥させて、薄膜装置をアミンで改質した。
【００６０】
Ｄｒｏｐ  Ｓｈａｐｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＤＳＡ１００、ＫＲＵＳＳ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用したアミン改質された薄膜装置の水接触角の測定を通じて温度及び培養時間によって薄膜装置の新水性が非常に変化したことが分かった。６５℃で１０分間前記薄膜装置をＡＰＴＥＳでシラン化（ｓｉｌａｎｉｚａｔｉｏｎ）した後、前記薄膜表面の新水性は増加した（約３０〜４０℃）。
【００６１】
＜実施例２＞ＤＴＢＰ／Ｔｈｉｎ  ｆｉｌｍ  Ｓａｍｐｌｅ分析
【００６２】
本発明では、予め製作された薄膜装置にジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミダート（ＤＴＢＰ）を適用した核酸分析法をＤＴＢＰと名付け、以下、実験でＤＴＢＰ分析を行った。
【００６３】
すなわち、前記アミンで改質された薄膜装置（３００μｌの量、８．４ｃｍ×３．７ｃｍ）を用いてＤＮＡを抽出するために、先に最適化された分析溶液を準備した。前記最適化された分析溶液は、１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）を含有する溶出緩衝液、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ、１０％のトリトンＸ−１００をＤＴＢＰ（１００ｍｇ／ｍｌ）と混合して準備した後、核酸分析試料として細胞、バクテリア、血液または尿由来の各試料１００μｌを前記分析溶液２００μｌと混合した。
【００６４】
前記混合された核酸分析試料と分析溶液とが混合された混合液をアミンで改質された薄膜装置の上部基板入口に流入させ、マイクロ流体チャンバ内に前記混合液が移動しながら、ＤＴＢＰの２個のアミン基とＤＮＡとが結合し、また、薄膜装置内の改質されたアミン基とＤＮＡとが結合して複合体を形成してＤＮＡを分離することができた。この際、薄膜装置は、核酸分析試料からＤＮＡを十分に抽出するために、２０分間恒温（５６℃）を保持した培養器またはコントローラ（Ａｌｐｈａ  Ｏｍｅｇａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を含んだ熱電冷却器（ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｏｏｌｅｒ；ＴＥＣ）のうち何れか１つに置いておいた。
【００６５】
ＤＴＢＰ−ＤＮＡ複合体のうち、異物を除去するために、ＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、溶出緩衝液（１０ｍＭの重炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．６）を使用してＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡの量と純度とを測定した後、Ｅｎｓｐｉｒｅ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて２６０ｎｍ（ＤＮＡ）及び２８０ｎｍ（タンパク質）での試料の光学密度の比率を決定した。従来のＤＮＡ抽出法と本発明のＤＴＢＰ分析とを比較するために、知られた方法（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によってＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔを使用して分析した。
【００６６】
図３のように、ＤＴＢＰ濃度別に結合力を確認した結果、ＤＴＢＰ濃度が１００ｍｇ／ｍｌである時、ＤＮＡ結合効率が最も高いと確認された。
【００６７】
＜実施例３＞ＤＴＢＰ分析を利用した真核細胞からのＤＮＡ抽出
【００６８】
５％  ＣＯ２雰囲気、３７℃の湿った培養器で１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ；以下、‘ＦＣＳ’）を補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のプラスチック培養プレートで２個の真核細胞であるＨＣＴ１１６及びＭＣＦをそれぞれ培養した後、実施例１と同じ方法で真核細胞からＤＮＡを抽出するが、ゲノムＤＮＡを抽出するために、タンパク質分解酵素であるプロテイナーゼＫを処理した。そして、比較のために、ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡミニキットを用いて真核細胞からＤＮＡを抽出した。本実施例で使用したＨＣＴ１１６及びＭＣＦは、米国ＡＴＣＣ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）で購入して使用した。
【００６９】
ＤＮＡの量と純度とを確認するために、Ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ−ＰＣＲ）を行った。一部の遺伝子（Ａｃｔｉｎ）の順方向及び逆方向プライマーを約２４塩基対の正常長さで合成した。Ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ＰＣＲは、１５分間９５℃で初期変性段階；９５℃で４５秒、５９℃で４５秒（Ａｃｔｉｎ）、及び７２℃で４５秒を１サイクルにして、総４５サイクル；及び７２℃、１０分間最終延長段階からなっている。５〜１０μｌのＤＮＡを１×ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）、２．５ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．２５ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、２５ｐｍｏｌの各プライマー、及びＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素１ユニットを含む総体積２５μｌで増幅した。
【００７０】
リアルタイムＰＣＲ分析のために、次の段階がＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０（ロシュ・ダイアグノスティックス）から提供された方法を下記のように変形した。５〜１０μｌのＤＮＡを４μｌのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒミックス、２５ｐｍｏｌの各プライマー、１×ＰＣＲ緩衝液２μｌ（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）、２．５ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．２５ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸、及び蒸留水を含む総体積２０μｌで増幅した。９５℃で１０分間最初に予備処理した後、９５℃で１０秒、５９℃で３０秒（Ａｃｔｉｎ）、及び７２℃で１０秒を１サイクルにして、総５０サイクルを行い、３０秒間４０℃で冷却段階を経た。ＳＹＢＲ緑色信号を有した増幅された生成物は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で行った。
【００７１】
そして、図４及び図５のＥｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ＰＣＲ（図４の（ａ）及び図５の（ａ））とリアルタイムＰＣＲ（図４の（ｂ）及び図５の（ｂ））を参照すれば、ＤＴＢＰを用いて抽出したＤＮＡのＥｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ＰＣＲ結果、Ｑｉａｇｅｎ製品に比べて、ＨＣＴ１１６は、約１．３倍、ＭＣＦは、約２．６倍高い量のＤＮＡが抽出されたことを確認することができ、リアルタイムＰＣＲ結果は、Ｑｉａｇｅｎ製品と大きく差がつかないことを確認することができた。
【００７２】
＜実施例４＞ＤＴＢＰ分析を利用したバクテリア細胞からのＤＮＡ抽出
【００７３】
バクテリア細胞でＤＴＢＰ分析能を確認するために、ＤＴＢＰ分析を用いて抽出されたＤＮＡを使用して、ＰＣＲ基盤のＤＮＡ増幅を実施した。あらゆるプライマーは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、マイコバクテリウムアブセサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、マイコバクテリウムゴルドネ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄｏｎａｅ）及びサルモネラ菌株（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｓｔｒａｉｎｓ）（サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・ニューポート（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｎｅｗｐｏｒｔ）、及びサルモネラ・セントポール（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｓａｉｎｔｐａｕｌ））の常用プライマーを使用した。本実施例で使用した当該菌株の常用プライマーは、米国ＩＤＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ）で購入して使用した。
【００７４】
最適化の反応のために、１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）を含有する溶出緩衝液、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ、１０％のトリトンＸ−１００及びリゾチーム２０ｍｇ／ｍｌをＤＴＢＰ（５０ｍｇ／ｍｌ）と混合した。本発明のＤＴＢＰ方法の有効性を検証するために、一般的なＰＣＲを行った。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１ブルー菌株（韓国微生物資源センターから購入；ｈｔｔｐｓ：／／ｋｃｔｃ．ｋｒｉｂｂ．ｒｅ．ｋｒ）を５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）とＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地に接種し、シェイキング状態（ｓｈａｋｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で３７℃で一日間培養し、１０３〜１０７のコロニー形成単位（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ；ＣＦＵ）の試料を試験のために使用した。ＤＴＢＰ分析及びキアゲンキット分析で使用するために、培養させた大腸菌、マイコバクテリウムアブセサス、マイコバクテリウムゴルドネ及びサルモネラ菌株（サルモネラ・ティフィムリウム、サルモネラ・ニューポート、サルモネラ・セントポール）、及びブルセラ・オビスからバクテリアＤＮＡを抽出した。本実施例で使用した菌株は、韓国微生物資源センター（ｈｔｔｐｓ：／／ｋｃｔｃ．ｋｒｉｂｂ．ｒｅ．ｋｒ）から購入して使用した。
【００７５】
バクテリア遺伝子の遺伝学的分析のために、ＤＴＢＰ分析及びキアゲンキット分析から抽出されたＤＮＡ２μｌを１×ＰＣＲ緩衝液（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）、２．５ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．２５ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸、各プライマー２５ｐｍｏｌ、及びＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素１ユニットを含む総体積２５μｌを使用して、１５分間９５℃で増幅した；９５℃で３０秒、６０℃で３０秒（マイコバクテリウムアブセサス、マイコバクテリウムゴルドネ、サルモネラ菌株、及びブルセラ・オビス）、及び７２℃で３０秒を１サイクルにして、総４５サイクル；及び７２℃、７分間最終延長段階。ＰＣＲ増幅物は、ＰＣＲ生成物を臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）（シグマアルドリッチ）を含有した２％アガロースゲル上から分離するゲル電気泳動法で可視化された。前記ゲルは、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して可視化された。ＤＮＡ濃度及び純度の測定は、ＵＶ分光分析器（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で行われた。
【００７６】
ＤＴＢＰを用いてブルセラ・オビスから抽出されたＤＮＡでＰＣＲ分析を行った結果、Ｑｉａｇｅｎ製品と大きく差がつかないことを確認することができた（図６）。
【００７７】
＜実施例５＞ＤＴＢＰ分析を利用したヒト体液からのＤＮＡ抽出
【００７８】
ヒトの体液でＤＴＢＰ分析能を検証するために、体液試料２００μｌ（全血及び尿）を前記薄膜装置に流入してＤＮＡを抽出した。まず、予め製作された薄膜装置内にプロテイナーゼＫとＤＴＢＰとを含んだ溶出緩衝液と体液試料とをそれぞれ流入した後、マイクロチャネルチャンバに移動させて、体液試料内のＤＮＡとＤＴＢＰとの間の複合体を形成させた後、実施例２と同じ方法でＤＮＡを抽出した。この際、溶出緩衝液と体液試料は、シリンジポンプ（ＫＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ）を使用して２個の他の入口にそれぞれ１．５ｍｌ／ｈｒの流速で１０分間流入させ、ＤＮＡの抽出及び精製のために、カートリッジを２０分間５６℃で培養した。そして、シリンジポンプによるＰＢＳ緩衝液流入のための入口の流速は、４ｍｌ／ｈｒで１０分間増加させた。最後に、抽出されたＤＮＡを１００μｌの溶出緩衝液で溶出した。また、比較のために、ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡミニキット（ヒルデン、ドイツ）を使用したゲノムＤＮＡの抽出に２００μｌの全血または尿を使用した。あらゆる抽出されたＤＮＡは、ＵＶ分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）によってＤＮＡ濃度及び純度が決定された。
【００７９】
＜実施例６＞ＤＴＢＰ分析を利用したＲＮＡ抽出
【００８０】
実施例２と同じ方法でＤＴＢＰ分析を用いてＲＮＡを抽出し、図７の（ａ）のように、外部でｃＤＮＡ合成後、１８Ｓ  ｒＲＮＡの増幅を通じてＲＮＡ抽出がよくできたことを確認した。
【００８１】
そして、図７の（ｂ）のように、ＤＴＢＰ分析を通じてＲＮＡ抽出とｃＤＮＡ合成とを１つの薄膜装置上で進行することができ、今後の１８Ｓ  ｒＲＮＡの増幅を通じて、このような方法がよく開発されたことを確認した。
【００８２】
＜実施例７＞ＤＴＢＰを利用した病原菌（大腸菌）濃縮及び核酸抽出
【００８３】
予め製作した薄膜装置を６５℃で１時間３−アミノプロピル（ジエトキシ）メチルシラン（ＡＰＤＭＳ）で表面処理した。病原菌を濃縮させるために、ＤＴＢＰ（１００ｍｇ／ｍｌ）と共に病原菌試料を１〜２ｍｌ注入し、１００μｌ／ｍｉｎの流速で常温で濃縮させた。濃縮された試料は、１００μｌに懸濁した。本実施例では、病原菌試料として大腸菌を使用した。一方、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ  ＫｉｔでＤＮＡを抽出して比較した。
【００８４】
その結果、ＤＴＢＰで濃縮を進行すれば、既存のＱｉａｇｅｎ方法で濃縮段階なしに核酸抽出を行う場合よりも、ＲＴ−ＰＣＲ  Ｃｔ値が絶対値（ａｂｓｏｌｕｔｅ）に近接するように短縮されることを確認した（図８）。
【００８５】
一方、本発明の１つのチップで病原菌（大腸菌）濃縮及び核酸抽出を同時に進行した時、他の方法に比べて、遥かにＣｔ値が短縮され、絶対値と類似しているように出ることを確認した。すなわち、本発明による方法が、１〜２ｍｌ内にある病原体を効果的に濃縮することができ、同時に核酸抽出効率も高いことを確認することができた（図９）。
【００８６】
＜実施例８＞ＤＴＢＰを利用した病原菌（ＰＩＶ３−ＲＮＡウイルス）濃縮
【００８７】
本発明による方法の病原菌（ウイルス）検出効率を確認するために、ＰＩＶ３−ＲＮＡウイルス感染が疑われる４個のサンプルに対して、既存に広く使われる方法であるＱｉａｇｅｎキットとの比較実験を行った。
【００８８】
すなわち、各サンプルを１ｍｌずつ取ってＱｉａｇｅｎキットで抽出して、ＰＩＶ３−ＲＮＡウイルス検出をテストした場合（図１０の１、２、３、４レーン）と本発明によってＤＴＢＰで濃縮して抽出後、ＰＩＶ３−ＲＮＡウイルス検出をテストした場合（図１０の１−１、２−１、３−１、４−１  レーン）とを比較した。
【００８９】
その結果、１ｍｌの試料でＰＩＶ３−ＲＮＡウイルスをＤＴＢＰ方式を用いて濃縮した時、１番サンプルの場合、既存の方法としては、陰性と診断されたが、本発明によるＤＴＢＰ濃縮後に陽性と確認された。２、３番サンプルの場合、確実な陰性であり、４番サンプルは、既存に陽性であったサンプルのバンド強度を確実に増加させたことを確認することができた（図１０）。
【００９０】
以上のように、本発明は、たとえ限定された実施例と図面とによって説明されたとしても、本発明は、これによって限定されず、当業者によって本発明の技術思想と下記に記載される請求範囲の均等範囲内とで多様な修正及び変形が可能であるということはいうまでもない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７（ａ）】
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【図７（ｂ）】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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2019524148.tif 000022
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