(57)【要約】  本発明は、ヒトＭＩＣＡポリペプチドに結合し得る抗原結合タンパク質を提供する。抗原結合タンパク質は、ＭＩＣＡ発現細胞により特徴づけられる障害、特に癌の治療において増加した活性を有する。
2019517993.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＭＩＣＡポリペプチドに結合するモノクローナル抗体または抗体断片であって、
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
または
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
を含む抗体または抗体断片。
【請求項２】
配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ヒトＭＩＣＡポリペプチドに結合する抗体または抗体断片であって、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９８％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９８％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨは、７２ｃ位におけるリジン（Ｋ）残基および７４位におけるグルタミン（Ｑ）残基を含み、前記ＶＬは、７１位におけるチロシン（Ｙ）を含み、残基の番号付与は、Ａｂｎｕｍ番号付与に従う）抗体または抗体断片。
【請求項５】
前記ＶＬが、Ａｂｎｕｍ８３位におけるフェニルアラニン（Ｆ）を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＶＨが、Ａｂｎｕｍ３０位におけるトレオニン（Ｔ）、６７位におけるバリン（Ｖ）および７１位におけるアルギニン（Ｒ）を含む、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＶＨが、Ａｂｎｕｍ４８位におけるイソロイシン（Ｉ）を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＶＨが、Ａｂｎｕｍ４８位におけるメチオニン（Ｍ）を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＶＨヒトアクセプターフレームワークが、ＩＧＨＶ４−ｂからのものであり、Ｊセグメントが、ＩＧＨＪ６からのものである、請求項４〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＶＬドメインヒトアクセプターフレームワークが、ＩＧＫＶ３−１１からのものであり、前記Ｊセグメントが、ＩＧＫＪ２からのものである、請求項４〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗体が、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含む細胞表面ＭＩＣＡポリペプチドに配列番号２のアミノ酸配列を含む細胞表面ＭＩＣＡポリペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を含む細胞表面ＭＩＣＡポリペプチド、および配列番号４のアミノ酸配列を含む細胞表面ＭＩＣＡポリペプチドに結合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭＩＣＡポリペプチドを表面において発現するように作製されたＣ１Ｒ細胞、配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＩＣＡポリペプチドを表面において発現するように作製されたＣ１Ｒ細胞、配列番号３のアミノ酸配列を含むＭＩＣＡポリペプチドを表面において発現するように作製されたＣ１Ｒ細胞、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＭＩＣＡポリペプチドを表面において発現するように作製されたＣ１Ｒ細胞への結合についての１μｇ／ｍｌ以下または任意選択で、０．２μｇ／ｍｌ以下のフローサイトメトリーにより測定されるＥＣ５０により特徴づけられる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗体が、配列番号３６のアミノ酸配列を含む細胞表面ＭＩＣＢポリペプチドにさらに結合する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗体が、膜結合ヒトＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を遮断する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＶＨが、ヒト重鎖定常ドメインに融合しており、前記ＶＬが、ヒト軽鎖定常領域に融合している、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
ヒトＦｃγＩＩＩＡ受容体に結合するヒト重鎖定常領域を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記抗体が、表面プラズモン共鳴により測定されるＭＩＣＡポリペプチドへの二価結合についての１０−９Ｍ未満のＫｄを有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、単鎖抗体断片、または異なる抗体からの断片を含む多重特異的抗体から選択される抗体断片である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
毒性剤にコンジュゲートまたは共有結合している、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
検出可能な部分にコンジュゲートまたは共有結合している、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗体を含み、任意選択で、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗体を特異的に認識する標識二次抗体をさらに含むキット。
【請求項２４】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体を産生する組換え宿主細胞。
【請求項２５】
疾患の治療または予防が必要とされる個体における疾患の治療または予防に使用される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体または請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
ＭＩＣＡ発現細胞を同定するインビトロ方法であって、個体から生物学的試料を得ること、前記試料を請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体と接触させること、ならびに前記抗体が前記試料中のＭＩＣＡおよび／またはＭＩＣＢポリペプチドに結合するか否かを評価することを含む方法。
【請求項２７】
ＭＩＣＡ発現疾患関連細胞を同定するインビトロ方法であって、疾患関連細胞を含む個体から生物学的試料を得ること、前記疾患関連細胞を請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体と接触させること、ならびに前記抗体が疾患関連細胞に結合するか否かを評価することを含み、前記抗体が疾患関連細胞に結合するという知見は、前記個体が疾患を有すること、前記個体が疾患関連細胞を保有することおよび／または前記疾患関連細胞がＭＩＣＡを発現することを示す方法。
【請求項２８】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体による治療に応答する疾患を有する個体を選択するインビトロ方法であって、前記個体中の腫瘍細胞および／または免疫抑制マクロファージまたは骨髄細胞がＭＩＣＡポリペプチドを発現するか否か、任意選択で、前記細胞が上昇レベルのＭＩＣＡポリペプチドを発現するか否かを決定することを含み、ＭＩＣＡポリペプチドまたは上昇レベルのＭＩＣＡポリペプチドの発現は、レスポンダー個体を示す方法。
【請求項２９】
請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法によりＭＩＣＡポリペプチドまたはＭＩＣＡ発現細胞を有することが見出された個体における癌の治療または予防において使用される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体または請求項２２に記載の組成物。
【請求項３０】
前記疾患が癌である、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の組成物または方法。
【請求項３１】
前記個体が、ＭＩＣＡ＊００１、ＭＩＣＡ＊００４、ＭＩＣＡ＊００７およびＭＩＣＡ＊００８からなる群から選択されるＭＩＣＡアレルを担持する細胞を有する、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の組成物または方法。
【請求項３２】
同一の投与レジメンを使用し、細胞がＭＩＣＡ＊００１を発現する患者、細胞がＭＩＣＡ＊００４を発現する患者、細胞がＭＩＣＡ＊００７を発現する患者、および細胞がＭＩＣＡ＊００８を発現する患者を治療する、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の組成物または方法。
【請求項３３】
前記方法が、個体中で発現される特定のＭＩＣＡアレルのアイデンティティを決定する治療前のステップを有さない、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の組成物または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年３月１５日に出願された米国仮出願第６２／３０８，４４３号明細書の利益を主張し；それは任意の図面および配列表を含め参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、電子フォーマットの配列表とともに出願されている。配列表は、２０１７年３月１３日に作出され、４４ＫＢサイズの標題「ＭＩＣＡ２  ＰＣＴ＿ＳＴ２５  ｔｘｔ」のファイルとして提供される。配列表の電子フォーマット中の情報は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、ＭＩＣＡポリペプチドに結合し得る抗原結合タンパク質を提供する。抗原結合タンパク質は、ＭＩＣＡ発現細胞、特に癌により特徴づけられる障害の治療における増加された活性を有する。
【背景技術】
【０００４】
免疫受容体ＮＫＧ２Ｄは、通常、ヒトＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδＴ細胞）およびＮＫ細胞上で発現される。事前に活性化されたＣＤ８＋細胞上で、ＮＫＧ２ＤはＤＡＰ１０会合を介するＣＤ２８およびＴＣＲシグナリングの相乗共刺激因子として機能する一方、ＮＫ細胞中では、それは直接的活性化因子として機能する。したがって、リガンドエンゲージメント時、ＮＫＧ２Ｄは、対合ＤＡＰ１０アダプタータンパク質を介して活性化または共刺激シグナルを直接運搬し、それにより癌および感染性疾患免疫を促進する。
【０００５】
ヒトＮＫＧ２Ｄ（ｈＮＫＧ２Ｄ）についての種々のリガンド、例として、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ関連鎖ＡおよびＢポリペプチド（ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ）、ＵＬ１６−結合タンパク質（ＵＬＢＰ）ファミリー、およびレチノイン酸初期転写産物−１（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｅａｒｌｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ−１）（ＲＡＥＴ１）ファミリーが同定および特徴決定されている。ＭＩＣＡは、上皮腫瘍と会合することが多く、微生物感染により誘導され、ある自己免疫疾患病巣中で異常発現される。ＭＩＣＡの構造は、α１α２プラットフォームドメインおよび膜近位Ｉｇ様α３ドメインを有するＭＨＣクラスＩのタンパク質フォールドと類似する（非特許文献１）。ＭＩＣＡおよびその近縁ＭＩＣＢは、ＮＫＧ２Ｄについてのリガンドとしても機能し、両方とも多型性であり、多型はＮＫＧ２Ｄについての親和性に影響することが示されている（非特許文献２）。
【０００６】
ＭＨＣクラスＩ鎖（ＭＩＣ）遺伝子を欠くマウスにおいて、ＵＬＢＰと構造的に関連するタンパク質のファミリーであるレチノイン酸初期（ＲＡＥ−１）分子がＮＫＧ２Ｄについてのリガンドとして機能する。ＲＡＥ−１発現は、発癌性物質により誘導され、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を刺激することが示されている。しかしながら、ネズミＮＫＧ２Ｄは、ヒトＭＩＣＡポリペプチドを認識する（非特許文献３）。
【０００７】
癌生物学におけるＭＩＣＡの役割は、ＭＩＣＡが腫瘍細胞の細胞表面（例えば、＊０１９アレル）から、およびエキソソームの表面上（＊０８アレル）で可溶性形態として放出されるという事実により複雑化されている（非特許文献４）。可溶性ＭＩＣＡ（ｓＭＩＣＡ）は、例えば、胃腸悪性腫瘍を有する患者の血清中で高レベルにおいて検出することができる（非特許文献５）。ＭＭＰ、ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７、ならびにジスルフィドイソメラーゼＥｒｐ５は、ＭＩＣＡの開裂およびシェディングにおける役割を有することが報告されている（非特許文献６；非特許文献７；および非特許文献８）。膜結合ＭＩＣＡは、ＮＫおよび／またはＴ細胞上でのＮＫＧ２Ｄの発現を下方モジュレートすることが報告されている（非特許文献９）。特に、前掲の非特許文献３は、ＭＩＣＡＴｇマウスを試験し、非トランスジェニック脾細胞上での表面ＮＫＧ２Ｄの下方調節が、ＭＩＣＡトランスジェニックマウスからの脾細胞とのインビトロでの共培養後に最も明白であり、Ｈ２Ｋｂ−ＭＩＣＡマウスからの血清による処理後にわずかに明白であるにすぎない一方、対照細胞および非ｔｇＬＭからの血清とのインキュベーションはそれぞれ効果を有さないことを結論づけ、その全データは、Ｈ２−Ｋ−ＭＩＣＡ  ＮＫ細胞上の低減された表面ＮＫＧ２ＤがＮＫＧ２Ｄ機能不全をもたらすことおよびインビボでＮＫＧ２Ｄ下方調節が主として細胞結合ＭＩＣＡへの持続曝露により引き起こされることを示唆する。
【０００８】
ＮＫ細胞上のＮＫＧ２ＤがｓＭＩＣＡにより下方調節され（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）、より低い反応性のＮＫ細胞をもたらす報告も現れている。この根拠は明らかになり得る。それというのも、類似の系が観察されており、数あるタンパク質ファミリーのうち、例えば、Ｉｇ様およびＴＮＦスーパーファミリーは、可溶性形態として放出され、分子のその放出はリガンド密度の低減により細胞間相互作用に影響し、それぞれの受容体を担持するＮＫ細胞をモジュレートすることが示されているためである（非特許文献８）。結果的に、抗ＭＩＣＡ抗体を生成する試みは、ＭＩＣＡシェディングを阻害する抗体の開発に集中している。
【０００９】
健常細胞上のＮＫＧ２ＤリガンドＭＩＣＡおよびＭＩＣＢの発現は、免疫活性化とトレランスとの間の平衡を破壊し、自己免疫を誘引し得ることも報告されている。遺伝的連鎖研究は、一部のＭＩＣＡアレルが１型糖尿病に正に関連し、Ｒａｅ１を島細胞上で発現する前糖尿病ＮＯＤマウスにおける疾患の発達を、自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡張および機能を低減させるＮＫＧ２Ｄ遮断ｍＡｂによる処理により完全に予防することができることを示している。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ分子は、ＲＡ滑膜細胞中でも大幅に上方調節され、ＮＫＧ２Ｄ依存的にＴ細胞を活性化させる。さらに、関節リウマチ患者は、血清および炎症関節中の高レベルのＩＬ−１５およびＴＮＦ−ａを有し、それがＣＤ４＋ＣＤ２８−サブセットのＴ細胞上でＮＫＧ２Ｄの発現を誘導することが報告されている。セリアック病において、腸内での上皮内ＮＫＧ２Ｄ＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球の大量浸潤が報告されており、ＭＩＣタンパク質は活性疾患を有する患者における上皮細胞の表面上で強力に発現されるようになる。炎症性腸障害において、ＭＩＣ発現のレベルの増加が腸上皮細胞上で見出され、ＮＫＧ２Ｄを発現する腸上皮ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は腸炎症と相関することが見出された。
【００１０】
ＮＫＧ２Ｄ系に基づき炎症を治療するこれまでのアプローチは、ＮＫＧ２ＤリガンドではなくＮＫＧ２Ｄ自体の遮断に集中している（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５。１つの可能性は、ＮＫＧ２ＤリガンドではなくＮＫＧ２Ｄへのこの集中が種々のリガンドおよび一部の場合において多数のアレルを含むＮＫＧ２Ｄリガンド系を標的化する困難性の認識に起因することである。
【００１１】
ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢについて、９７を超えるＭＩＣＡアレルおよび少なくとも３１のＭＩＣＢアレルが認識されている。α１α２ドメイン（ＮＫＧ２Ｄ界面に関与するドメイン）におけるＭＩＣポリペプチドにわたる４３％のアミノ酸同一性が存在するにすぎず、アミノ酸置換の８０％が非保存的であり（非特許文献１６；非特許文献１７）、そのことは、集団における大多数の個体に有効な抗体を得る可能性が低いことを示唆する。さらに、ＭＩＣＡ中の１２９位におけるメチオニン／バリン二形性は、ＮＫＧ２Ｄ結合の差を決定し、残基１２９の側鎖は部分的に埋め込まれており、第１のα２ヘリカルストレッチ中のグルタミン１３６、アラニン１３９およびメチオニン１４０との疎水性相互作用を形成するが、それはＭＩＣＡのバリン１２９形態との比較においてこのドメインにおける立体構造の差に関連し得る（非特許文献１６）。
【００１２】
まとめると、治療剤によりＭＩＣＡを標的化する新たなアプローチが必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００１  Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４３
【非特許文献２】Ｓｔｅｉｎｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５３：２７９
【非特許文献３】Ｗｉｅｍａｎｎ（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：８２０−８２９
【非特許文献４】Ａｓｈｉｒｕ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０（２）：４８１−４８９
【非特許文献５】Ｓａｌｉｈ  ｅｔ  ａｌ，２００２  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：４０９８
【非特許文献６】Ｗａｌｄｈａｕｅｒ（２００８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６８（１５）６３６８−７６
【非特許文献７】Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｎａｔｕｒｅ
【非特許文献８】Ｓａｌｉｈ（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：４０９８−４１０２
【非特許文献９】Ｖｏｎ  Ｌｉｌｉｅｎｆｅｌｄ−Ｔｏａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．
【非特許文献１０】Ｇｒｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ
【非特許文献１１】Ａｒｒｅｙｇｕｅ−Ｇａｒｃｉａ（２００８）ＢＭＣ
【非特許文献１２】Ｊｉｎｕｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．
【非特許文献１３】Ｏｇａｓａｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０（６）：７５７−７６７
【非特許文献１４】Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．６３（９）：２６１７−２６２９
【非特許文献１５】Ｓｔｅｉｇｅｒｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ（２００９）ＭＡｂｓ１（２）：１１５−１２７
【非特許文献１６】Ｓｔｅｉｎｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５３：２７９−２８７
【非特許文献１７】Ｓｔｅｉｎｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１２５１０−１２５１５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
一態様において、本発明は、とりわけ、ヒトＭＩＣＡアレルにわたる（ならびに非ヒト霊長類ＭＩＣＡに対する）高親和性を有する抗体の発見から生じる。
【００１５】
一実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗原結合ドメイン、またはその抗原結合ドメインを含むタンパク質（例えば、モノクローナル抗体、多重特異的結合タンパク質、二重特異的抗体など）であって、前記抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％または９８％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％または９８％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む抗ＭＩＣＡ抗原結合ドメイン、またはその抗原結合ドメインを含むタンパク質が提供される。
【００１６】
一実施形態において、ＶＬは、Ａｂｎｕｍ７１位（ＦＲ３中）におけるチロシン（Ｙ）アミノ酸残基を含む。一実施形態において、ＶＬは、Ａｂｎｕｍ８３位におけるフェニルアラニン（Ｆ）を含む。
【００１７】
一実施形態において、重鎖可変領域（ＶＨ）は、７２ｃ位における残基とＡｂｎｕｍ７４位における残基との間のＨ結合により互いに相互作用し得る、Ａｂｎｕｍ７２ｃ位（ＦＲ２中）および７４位（ＦＲ３中）におけるアミノ酸残基を含む。一実施形態において、ＶＨは、Ａｂｎｕｍ７２ｃ位におけるリジン（Ｋ）アミノ酸残基および７４位におけるグルタミン残基を含む。一実施形態において、ＶＨは、Ａｂｎｕｍ３０位におけるトレオニン（Ｔ）を含む。一実施形態において、ＶＨは、Ａｂｎｕｍ４８位におけるイソロイシン（Ｉ）を含む。一実施形態において、ＶＨは、Ａｂｎｕｍ６７位におけるバリン（Ｖ）を含む。一実施形態において、ＶＨは、Ａｂｎｕｍ７１位におけるアルギニン（Ｒ）を含む。
【００１８】
一実施形態において、ＶＨヒトアクセプターフレームワークのＶＨセグメントはＩＧＨＶ４−ｂ（例えば、ＩＧＨＶ４−ｂ＊０２）からのものであり、ＪセグメントはＩＧＨＪ６（例えば、ＩＧＨＪ６＊０１）からのものである。一実施形態において、ＶＨのＣＤＲ１、２および３は、それぞれ配列番号３０、３１および３２のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＶＬドメインヒトアクセプターフレームワークはＩＧＫＶ３−１１（例えば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１）からのものであり、ＪセグメントはＩＧＫＪ２（例えば、ＩＧＫＪ２＊０１）からのものである。一実施形態において、ＶＬのＣＤＲ１、２および３は、それぞれ配列番号３３、３４および３５のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ヒト重鎖および／または軽鎖アクセプターフレームワークは、アミノ酸が、非ヒト哺乳動物（例えば、ネズミ、ラット）中の特定の位置に存在するアミノ酸により置換されている１つ以上の復帰突然変異を含む。一実施形態において、ヒト重鎖アクセプターフレームワーク１（ＦＲ１）は、Ａｂｎｕｍ３０位におけるトレオニン（Ｔ）を含み、天然存在ヒトＶＨセグメントと比較して他の突然変異を含有しない。一実施形態において、ヒト重鎖アクセプターフレームワーク２（ＦＲ２）は、天然存在ヒトＶＨセグメントと比較して突然変異を有さない。一実施形態において、ヒト重鎖アクセプターフレームワーク３（ＦＲ３）は、Ａｂｎｕｍ７１位におけるアルギニン（Ｒ）を含み、天然存在ヒトＶＨセグメントと比較して他の突然変異を含有しない。一実施形態において、ヒト重鎖アクセプターフレームワーク４（ＦＲ４）は、天然存在ヒトＶＨセグメントと比較して突然変異を有さない。一実施形態において、ヒト軽鎖アクセプターフレームワーク３（ＦＲ３）は、Ａｂｎｕｍ７１位におけるチロシンを含み、天然存在ヒトＶＨセグメントと比較して他の突然変異を含有しない。一実施形態において、ヒト軽鎖アクセプターフレームワーク１、２および４（ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ４）は、天然存在ヒトＶＨセグメントと比較して突然変異を有さない。
【００１９】
本明細書の任意の態様の一実施形態において、ＶＨは、配列３０、３１および３２に示されるそれぞれのアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。一実施形態において、ＶＬは、配列番号３３、３４および３５に示されるそれぞれのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
【００２０】
一実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗原結合ドメイン、またはその抗原結合ドメインを含むタンパク質（例えば、モノクローナル抗体、多重特異的結合タンパク質、二重特異的抗体など）であって、
（ａ）任意選択で、フレームワーク領域中の１、２または３つのアミノ酸残基置換をさらに含む配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）任意選択で、フレームワーク領域中の１、２または３つのアミノ酸残基置換をさらに含む配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗ＭＩＣＡ抗原結合ドメイン、またはその抗原結合ドメインを含むタンパク質が提供される。
【００２１】
一実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗原結合ドメイン、またはその抗原結合ドメインを含むタンパク質（例えば、モノクローナル抗体、多重特異的結合タンパク質、二重特異的抗体など）であって、
（ａ）任意選択で、フレームワーク領域中の１、２または３つのアミノ酸残基置換をさらに含む配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）任意選択で、フレームワーク領域中の１、２または３つのアミノ酸残基置換をさらに含む配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗ＭＩＣＡ抗原結合ドメイン、またはその抗原結合ドメインを含むタンパク質が提供される。
【００２２】
実施形態のいずれかの一態様において、軽鎖可変領域は、７１位（Ａｂｎｕｍ番号付与）におけるチロシン（Ｙ）残基を含む。
【００２３】
実施形態のいずれかの別の態様において、重鎖可変領域は、７２ｃ位（Ａｂｎｕｍ番号付与）としてのリジン（Ｋ）残基を含む。
【００２４】
一実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗原結合ドメイン、またはその抗原結合ドメインを含むタンパク質（例えば、モノクローナル抗体、多重特異的結合タンパク質、二重特異的抗体など）であって、前記抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体結合ドメイン；
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体結合ドメイン；ならびに
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体結合ドメイン
からなる群から選択される抗ＭＩＣＡ抗原結合ドメイン、またはその抗原結合ドメインを含むタンパク質が提供される。
【００２５】
一実施形態において、ヒトＭＩＣＡに結合するモノクローナル抗体であって、
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体；ならびに
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
からなる群から選択されるモノクローナル抗体が提供される。
【００２６】
一態様において、改変塩橋を有するヒトフレームワークを有する抗ＭＩＣＡ抗体であって；タンパク質中の塩橋は、互いに十分に近接しており静電気引力が認められる逆荷電残基間のＨ結合である抗体が提供される。一態様において、軽鎖ＦＲ３中のアミノ酸置換を有するヒトフレームワークを有する抗ＭＩＣＡ抗体が提供される。一態様において、抗体は、７２ｃ位および７４位（Ａｂｎｕｍ番号付与）における残基間の重鎖ＦＲ３領域中のＨ結合を含む。
【００２７】
抗体は、特に、ＭＩＣＡの主なファミリーを表すことが決定される２つの主要なＭＩＣＡ群のそれぞれからの主要なＭＩＣＡアレルに結合する：ＮＫＧ２Ｄに強力に結合するグループ１アレル（例として、ＭＩＣＡ＊００１、＊００２、＊００７、＊０１２、＊０１７および＊０１８）およびＮＫＧ２Ｄに弱く結合するグループ２（ＭＩＣＡ＊００４、＊００６、＊００８、＊００９および＊０１９）。サブセットＭＩＣＡ＊００１、＊００４、＊００７および＊００８または＊００１、＊００４、＊００７、＊００８および＊０１９上に存在するエピトープに結合することにより、抗体は、ほとんど全ての個体に存在する両方の群のアレルをカバーする。任意選択で、抗体は、＊００１を表面において発現するように作製された細胞への、＊００４を表面において発現するように作製された細胞への、＊００７を表面において発現するように作製された細胞への、および＊００８を表面において発現するように作製された細胞への結合についての１μｇ／ｍｌ以下、任意選択で０．５μｇ／ｍｌ以下、０．３μｇ／ｍｌ以下または０．２μｇ／ｍｌ以下のフローサイトメトリーにより測定されるＥＣ５０を有する。任意選択で、抗体は、＊００４を表面において発現するように作製された細胞、＊００７を表面において発現するように作製された細胞、および＊００８を表面において発現するように作製された細胞への結合についての０．１μｇ／ｍｌ以下、任意選択で、０．０７μｇ／ｍｌ以下のフローサイトメトリーにより測定されるＥＣ５０を有する。抗体は、任意選択で、ヒトＭＩＣＢポリペプチドを発現する細胞にさらに結合する。
【００２８】
一実施形態において、ＭＩＣＡアレルに結合し得る抗体は、それぞれのＭＩＣＡポリペプチドを表面において発現する細胞（それぞれのＭＩＣＡアレルの一方が形質移入されたが、他方のＭＩＣＡアレルを発現しない細胞）への結合についてのフローサイトメトリーにより測定されるヒトＭＩＣＡ＊００４、＊００７および／または＊００８についてのその結合親和性と１−ｌｏｇ未満だけ異なるヒトＭＩＣＡ＊００１への結合についてのＥＣ５０を有する。一実施形態において、抗体は、ヒトＭＩＣＡ＊００４、＊００７および／または＊００８を表面において発現する細胞への結合についてのフローサイトメトリーにより測定される０．５ｌｏｇ、０．３ｌｏｇまたは０．２ｌｏｇ以下だけ互いに異なるヒトＭＩＣＡ＊００４、＊００７および／または＊００８ポリペプチドへの結合についてのＥＣ５０を有する。
【００２９】
任意選択で、ＥＣ５０は、本明細書の実施例の方法に従って、またはＰＣＴ公開の国際公開第２０１３／１１７６４７号パンフレットの実施例３、例えば、目的のＭＩＣＡ核酸を含有するＲＳＶ．５ｎｅｏベクター（ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）、アクセッション番号Ｍ８３２３７のもの）が形質移入されたＣ１Ｒ細胞（ＡＴＣＣ参照番号ＣＲＬ−１９９３（商標））、フローサイトメトリーによるデータ収集および４パラメーターモデルを使用するＥＣ５０計算に従って測定する。
【００３０】
高い親和性結合は、とりわけ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣを効率的に媒介するために抗体について有利である。
【００３１】
本開示の抗体は、細胞（例えば、腫瘍細胞）の表面上のＭＩＣＡと、ＮＫＧ２Ｄ（例えば、ＮＫ細胞およびＴ細胞上）との相互作用を遮断し得る。したがって、Ｆｃγ受容体により結合されるＦｃドメインを含む場合のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性の誘導に加え、それらの抗体は、ＮＫＧ２Ｄの膜ＭＩＣＡ誘導下方モジュレーションを遮断し得るそれらの能力のために、例えば、癌および／または感染性疾患の治療に有用である。さらに、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を媒介する能力に加え、またはその代替として、それらの抗体は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞活性のＭ２マクロファージ媒介抑制を低減させるそれらの能力のために有用である。他の実施形態において、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を実質的に誘導しない（例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体により結合されるＦｃドメインを含まない）抗体は、ＮＫＧ２Ｄの膜ＭＩＣＡ誘導下方モジュレーションを遮断し得、ならびに／またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞活性のＭ２マクロファージ媒介抑制を低減させ得るその能力のために、炎症および／または自己免疫障害の治療に有用であり得る。いっそうさらなる実施形態において、抗体は、毒性剤（例えば、細胞毒性部分）にコンジュゲートさせ、ＭＩＣＡ発現細胞（例えば、腫瘍細胞）の枯渇または死滅を引き起こすために使用することができる。
【００３２】
一態様において、本発明の抗ＭＩＣＡ抗体を使用する治療方法が提供される。抗体は、本明細書の実施形態のいずれかにおいて予防的または治療的治療として使用することができ、治療有効量の抗体を予防有効量の抗体を交換することができる。一態様において、癌、自己免疫障害または炎症障害を有する個体を治療する方法であって、個体にＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合する本開示による薬学的有効量の抗原結合化合物を投与することを含む方法が提供される。
【００３３】
一態様において、個体におけるＭＩＣＡ発現細胞（例えば、癌細胞）を排除する方法であって、患者にＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合する本開示による薬学的有効量の抗原結合化合物を投与することを含む方法が提供される。一態様において、癌を有する個体におけるＮＫ細胞および／またはＴ細胞活性の骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）媒介抑制を克服し、または低減させる方法であって、個体にＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合する本開示による薬学的有効量の抗原結合化合物を投与することを含む方法が提供される。一態様において、癌を有する個体における骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）および／またはＭ２マクロファージ、例えば、腫瘍組織滞留ＭＤＳＣまたはＭ２細胞の免疫抑制活性を排除または阻害する方法であって、個体にＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合する本開示による薬学的有効量の抗原結合化合物を投与することを含む方法が提供される。
【００３４】
別の態様において、患者がＭＩＣＡポリペプチド、例えば、本開示の抗体により結合されるＭＩＣＡポリペプチド（１つ以上のＭＩＣＡアレル）を発現する疾患関連細胞（例えば、腫瘍細胞）を有するか否かを評価することを含む方法（例えば、診断アッセイ、レスポンダーアッセイなどを実施する方法）が提供される。前記方法は、例えば、疾患関連細胞を含む患者からの生物学的試料を得ること、前記疾患関連細胞をそのような抗体と接触させること、および抗体が疾患関連細胞に結合するか否かを評価することを含み得る。ＭＩＣＡが疾患関連細胞により発現されるという知見は、患者がＭＩＣＡ発現細胞により特徴づけられる病態を有し、および／または本開示の抗ＭＩＣＡ抗体による治療に好適であることを示す。患者は、ＭＩＣＡ発現細胞により特徴づけられる特定の疾患に好適な治療によりさらに治療することができる。任意選択で、患者は、抗ＭＩＣＡ抗体により治療する。一実施形態において、本方法は、癌を有する対象を選択するために使用し、疾患関連細胞は癌細胞である。
【００３５】
これらの態様は本明細書に提供される詳細な説明においてより完全に記載され、追加の態様、特徴部および利点はその詳細な説明から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】抗ＭＩＣＡｍＡｂ１が、ヒトＫＨＹＧ−１ＣＤ１６発現ＮＫ細胞による陰性対照（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体）と、およびその親（非改変）キメラ抗体と比較したＣ１Ｒ−ＭＩＣＡ＊００１および＊００８細胞の特異的溶解を誘導したことを示し、それにより、それらの抗体がＭＩＣＡ＊００１および＊００８発現標的細胞に対するＡＤＣＣを誘導することを示す。
【図２】抗ＭＩＣＡｍＡｂ１が、Ｍ１またはＭ２マクロファージを用いてまたは用いずに７２１．２２１−ＭＩＣＡ＊００１腫瘍細胞に対するＮＫ細胞活性化の強力な増加を引き起こしたことを示す。対照的に、アイソタイプ対照においてはＮＫ活性化が一般にかなり低いだけでなく、Ｍ２マクロファージとの腫瘍細胞およびＮＫ細胞のインキュベーションもＮＫ活性化の強力な減少を引き起こした。
【図３】アイソタイプ対照または１μｇの抗ＭＩＣＡ抗体ｍＡｂ１を受けたマウスが注射後１００日間生存しなかった一方、少なくとも１０μｇの抗ＭＩＣＡ抗体を受けたマウスにおいて有意に改善された生存期間が観察されたことを示す。１００μｇの用量において、抗ＭＩＣＡ抗体ｍＡｂ１は全てのマウスにおいて１００日間の生存期間を達成した。
【図４】左側パネルにアイソタイプ対照を受けたマウス、および右側パネルに抗ＭＩＣＡ抗体ｍＡｂ１を受けたマウスを示す。個々の腫瘍容積を示す。ＣＲ＝完全奏功。抗ＭＩＣＡ抗体ｍＡｂ１による処理は、腫瘍容積の減少を引き起こした。
【図５】抗ＭＩＣＡ抗体ｍＡｂ１により処理されたマウスが、アイソタイプ対照により処理されたマウスと比較して減少した腫瘍細胞数を示したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明の抗体は、ＭＩＣＡ発現細胞ならびにＭＩＣＢ発現細胞、特に腫瘍細胞および炎症または自己免疫プロセスに関与する細胞を直接的に、および特異的に標的化し得る。
【００３８】
ＭＩＣＡ（ＰＥＲＢ１１．１）は、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｑ２９９８３参照）、その遺伝子およびｃＤＮＡならびにその遺伝子産物、またはその天然バリアントを指す。ＭＩＣＡ遺伝子およびタンパク質の命名は、異なるアレルについての配列のアクセッション番号への参照と一緒に、Ｆｒｉｇｏｕｌ  Ａ．ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ−Ｐ．Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔ．，３（２００５）：９５−１４５  ＩＳＢＮ：８１−７７３６−２４４−５に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＭＩＣＡ遺伝子およびタンパク質配列は、タンパク質およびＤＮＡレベルにおける多型を含み、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＵＫおよびＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （ＥＢＩ）により維持されるｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌからも利用可能である。
【００３９】
ＭＩＣＡのアミノ酸配列は、Ｂａｈｒａｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：６２５９−６２６３およびＢａｈｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４４：８０−８１に最初に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＭＩＣＡ遺伝子は多型性であり、細胞外α１、α２、およびα３ドメイン中の多数のバリアントアミノ酸の特有の分布を示す。ＭＩＣＡの多型をさらに定義するため、Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）は、共通のおよび希少なＨＬＡ遺伝子型を有する２７５個体の中でそのアレルを試験した。ヒトＭＩＣＡの細胞外α１、α２、およびα３ドメインのアミノ酸配列を配列番号１〜５に示す。完全ＭＩＣＡ配列は、２３アミノ酸のリーダー配列、ならびに膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをさらに含む。選択ヒトＭＩＣＡアレルの細胞外α１、α２、およびα３ドメインのアミノ酸配列を配列番号１〜５に示す。ＭＩＣＡ＊００１のアミノ酸配列を配列番号１に示し、それはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４１０６０に対応する。ヒトＭＩＣＡアレルＭＩＣＡ＊００４のアミノ酸配列を配列番号２に示し、それはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４１０６３に対応する。ヒトＭＩＣＡアレルＭＩＣＡ＊００７のアミノ酸配列を配列番号３に示し、それはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４１０６６に対応する。ヒトＭＩＣＡアレルＭＩＣＡ＊００８のアミノ酸配列を配列番号４に示し、それはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４１０６７に対応する。ヒトＭＩＣＡアレルＭＩＣＡ＊０１９のアミノ酸配列を配列番号５に示し、それはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ２７００８に対応する。ヒトＭＩＣＢのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＩ１８７４７に示される（配列番号３６）。
【００４０】
【表１】
2019517993.tif 000003
【００４１】
ＭＩＣＡ遺伝子は、ＭｈｃＳＦおよびＩｇＳＦに属するタンパク質をコードする。このタンパク質は、膜貫通ＭＨＣ−Ｉ−アルファ様（Ｉ−アルファ様）鎖であり、３つの細胞外ドメイン、２つの遠位Ｇ様ドメイン、Ｇ−アルファ１様（「Ｄ１」または「α１」とも称される）およびＧ−アルファ２様（「Ｄ２」または「α２」とも称される）、および細胞膜に近位のＣ様ドメイン（「Ｄ３」または「α３」とも称される）、ならびに３つの領域、結合領域、膜貫通領域および細胞質領域（ＩＭＧＴ（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））のＩＭＧＴ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｈａｒｔ、ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｏｒｇおよびＬｅＦｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００５；５：４５−６０による標識）を含む。リーダー、ＥＣＤ、ＴＭおよびＣＹドメインを含むＭＩＣＡ成熟タンパク質は、３６０〜３６６アミノ酸から構成され、差は、膜貫通領域中のマイクロサテライト多型から生じる。α１、α２およびα３は、任意の好適な番号付与系（例えば、ＩＭＧＴ番号付与系）に従って定義することができる。一実施形態において、α１ドメインは、配列番号１のＭＩＣＡポリペプチドの残基位置１〜８８を含み；α２ドメインは、配列番号１のＭＩＣＡポリペプチドの残基位置８９〜１８１を含み；α３ドメインは、配列番号１のＭＩＣＡポリペプチドの残基位置１８２〜２７４を含む。α１およびα２ドメインは、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ鎖、ＡＢ、ＢＣおよびＣＤターンならびにへリックスをそれぞれ含む。α３ドメインは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ鎖、ＢＣループ、ＣＤ鎖、ＤＥターンおよびＦＧループを含む。Ｏ−グリカン（セリンまたはトレオニンに結合しているＮ−アセチルラクトサミン）および／またはＮ−グリカンを含む、α１中に２つ、α２中に１つおよびα３ドメイン中に５つの８つの潜在的グリコシル化部位を有するＭＩＣＡタンパク質は、高度にグリコシル化される。ＭＩＣＡは、ある細胞中で構成的に発現される一方、低レベルのＭＩＣＡ発現は、通常、宿主免疫細胞接着を生じさせない。しかしながら、ＭＩＣＡは、急速に増殖する細胞、例えば、腫瘍細胞上で上方調節される。全てのＮＫＧ２ＤリガンドのＭＩＣＡは最も高度に発現され、それは広範な腫瘍タイプ（例えば、一般の癌種、膀胱癌、黒色腫、肺癌、肝細胞癌、膠芽細胞腫、前立腺癌、一般の血液悪性腫瘍、急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病および慢性リンパ球性白血病にわたり見出されている。近年、Ｔｓｕｂｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）（ＥＭＢＯ  Ｊ：１−１３）は、Ｏ−グリカン分枝酵素、コア２β−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２ＧｎＴ）がＭＩＣＡ発現腫瘍細胞中で活性であることおよび腫瘍細胞からのＭＩＣＡがコア２Ｏ−グリカン（Ｎ−アセチルガラクトサミンに連結しているＮ−アセチルグルコサミン分枝を含むＯ−グリカン）を含有することを報告した。
【００４２】
Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：７２７−７２９，１９９９は、ＮＫＧ２Ｄについてのストレス誘導性リガンドとしてのＭＩＣＡについての役割を提供した。本明細書において使用される「ＭＩＣＡ」は、ＭＩＣＡ遺伝子の任意のバリアント、誘導体、もしくはアイソフォームまたはそれらが指すコードされるタンパク質を含む任意のＭＩＣＡポリペプチドを指す。ＭＩＣＡ遺伝子は多型性であり、細胞外アルファ−１、アルファ−２、およびアルファ−３ドメイン中の多数のバリアントアミノ酸の特有の分布を示す。種々のアレルバリアントは、ＭＩＣＡポリペプチド（例えば、ＭＩＣＡ）について報告されており、それらのそれぞれは、それぞれの用語、例として、例えば、ヒトＭＩＣＡポリペプチドＭＩＣＡ＊００１、ＭＩＣＡ＊００２、ＭＩＣＡ＊００４、ＭＩＣＡ＊００５、ＭＩＣＡ＊００６、ＭＩＣＡ＊００７、ＭＩＣＡ＊００８、ＭＩＣＡ＊００９、ＭＩＣＡ＊０１０、ＭＩＣＡ＊０１１、ＭＩＣＡ＊０１２、ＭＩＣＡ＊０１３、ＭＩＣＡ＊０１４、ＭＩＣＡ＊０１５、ＭＩＣＡ＊０１６、ＭＩＣＡ＊０１７、ＭＩＣＡ＊０１８、ＭＩＣＡ＊０１９、ＭＩＣＡ＊０２０、ＭＩＣＡ＊０２２、ＭＩＣＡ＊０２３、ＭＩＣＡ＊０２４、ＭＩＣＡ＊０２５、ＭＩＣＡ＊０２６、ＭＩＣＡ＊０２７、ＭＩＣＡ＊０２８、ＭＩＣＡ＊０２９、ＭＩＣＡ＊０３０、ＭＩＣＡ＊０３１、ＭＩＣＡ＊０３２、ＭＩＣＡ＊０３３、ＭＩＣＡ＊０３４、ＭＩＣＡ＊０３５、ＭＩＣＡ＊０３６、ＭＩＣＡ＊０３７、ＭＩＣＡ＊０３８、ＭＩＣＡ＊０３９、ＭＩＣＡ＊０４０、ＭＩＣＡ＊０４１、ＭＩＣＡ＊０４２、ＭＩＣＡ＊０４３、ＭＩＣＡ＊０４４、ＭＩＣＡ＊０４５、ＭＩＣＡ＊０４６、ＭＩＣＡ＊０４７、ＭＩＣＡ＊０４８、ＭＩＣＡ＊０４９、ＭＩＣＡ＊０５０、ＭＩＣＡ＊０５１、ＭＩＣＡ＊０５２、ＭＩＣＡ＊０５３、ＭＩＣＡ＊０５４、ＭＩＣＡ＊０５５、ＭＩＣＡ＊０５６およびさらなるＭＩＣＡアレルＭＩＣＡ＊０５７〜ＭＩＣＡ＊０８７により包含される。
【００４３】
本明細書において使用される「ｈＮＫＧ２Ｄ」および、特に記載のない限り、または文脈により矛盾がない限り、用語「ＮＫＧ２Ｄ」、「ＮＫＧ２−Ｄ」、「ＣＤ３１４」、「Ｄ１２Ｓ２４８９Ｅ」、「ＫＬＲＫ１」、「キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＫ、メンバー１」、または「ＫＬＲＫ１」は、ヒトキラー細胞活性化受容体遺伝子、そのｃＤＮＡ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００７３６０）、およびその遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３１３８６）、またはその天然バリアントを指す。ＮＫおよびＴ細胞中で、ｈＮＫＧ２Ｄは、タンパク質、例えば、ＤＡＰ１０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＧ２９４２５、ＡＡＤ５０２９３）とヘテロダイマーまたはより高次の複合体を形成し得る。本明細書においてｈＮＫＧ２Ｄに起因する任意の活性、例えば、細胞活性化、抗体認識などは、ヘテロダイマーの形態のｈＮＫＧ２Ｄ、例えば、ｈＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０、またはそれら２つの（および／または他の）成分とのより高次の複合体にも起因し得る。
【００４４】
ＮＫＧ２Ｄとの複合体中のＭＩＣＡの三次元構造は、決定されている（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；２：４４３−４５１；コード１ｈｙｒ、およびＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ（Ｋａａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４；３２：Ｄ２０８−Ｄ２１０）参照）。ＭＩＣＡがＮＫＧ２Ｄホモダイマーとの複合体中に存在する場合、ＭＩＣＡα２の残基６３〜７３（ＩＧＭＴ番号付与）が配列され、ほぼ２つのへリックスのターンを付与する。ＮＫＧ２Ｄの２つのモノマーは、ＭＩＣＡとの相互作用に等しく寄与し、それぞれのＮＫＧ２Ｄモノマー中の７つの位置がＭＩＣＡα１またはα２へリックスドメインの１つと相互作用する。
【００４５】
本発明は、本明細書に開示の抗ＭＩＣＡ抗体を使用する方法を提供し；例えば、細胞増殖または活性を阻害する方法、分子を細胞（例えば、毒性分子、検出可能マーカーなど）に送達する方法、細胞を標的化、同定または精製する方法、細胞を枯渇、殺傷または排除する方法、細胞増殖を低減させる方法であって、細胞、例えば、ＭＩＣＡポリペプチドを発現する腫瘍細胞を、ＭＩＣＡポリペプチドに結合する本開示の抗原結合化合物に曝露することを含む方法が提供される。本明細書における目的のため、「細胞増殖」は、細胞の成長または増殖の任意の態様、例えば、細胞成長、細胞分裂、または細胞周期の任意の態様を指し得ることが認識される。細胞は、細胞培養物（インビトロ）または哺乳動物（インビボ）、例えば、ＭＩＣＡ発現病変を罹患する哺乳動物中に存在し得る。またＭＩＣＡポリペプチドを発現する細胞の死滅を誘導し、またはその細胞を増殖もしくは活性を阻害する方法であって、細胞を、細胞の死滅を誘導し、および／または細胞の増殖を阻害するために有効な量の毒性剤に結合しているＭＩＣＡポリペプチドに結合する抗原結合化合物に曝露させることを含む方法も提供される。したがって、また増殖疾患、およびＭＩＣＡポリペプチドの細胞発現の病原性拡張により特徴づけられる任意の病態を罹患する哺乳動物を治療する方法であって、例えば、癌の治療のために、医薬有効量の本明細書に開示の抗体を投与することを哺乳動物に含む方法も提供される。
【００４６】
定義
本明細書において使用される「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。特許請求の範囲において使用され、語「含む」とともに使用される場合、語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは２つ以上を意味し得る。本明細書において使用される「別の」は、少なくとも第２以上を意味し得る。
【００４７】
「含む」が使用される場合、これは、任意選択で、「〜から本質的になる」、または「〜からなる」により置き換えることができる。
【００４８】
本明細書全体内で「癌の治療」などは、抗ＭＩＣＡ結合剤（例えば、抗体）に関して挙げられる場合、それらは、（ａ）癌を治療する方法であって、（例えば、薬学的に許容可能な担体材料中の）抗ＭＩＣＡ結合剤を、そのような治療が必要とされる個体、哺乳動物、特にヒトに、癌の治療を可能とする用量（治療有効量）で、任意選択で、本明細書で規定される用量（量）で（少なくとも１つの治療のために）投与するステップを含む方法；（ｂ）癌の治療のための、抗ＭＩＣＡ結合剤の使用、または前記治療（特にヒト）において使用される抗ＭＩＣＡ結合剤；（ｃ）癌の治療のための医薬調製物の製造のための、抗ＭＩＣＡ結合剤の使用、癌の治療のための医薬調製物の製造のために抗ＭＩＣＡ結合剤を使用する方法であって、抗ＭＩＣＡ結合剤を薬学的に許容可能な担体と混合することを含む方法、もしくは癌の治療に適切な有効用量の抗ＭＩＣＡ結合剤を含む医薬調製物；または（ｄ）ａ）、ｂ）、およびｃ）の任意の組合せを意味し、本出願が出願される国において特許化の許容可能な主題に従う。
【００４９】
本明細書において使用される用語「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を指す。重鎖中の定常ドメインのタイプに応じて、抗体は、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの１つに割り当てられる。これらのいくつかは、サブクラスまたはアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などにさらに分類される。例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、テトラマーを含む。それぞれのテトラマーは、２つの同一のポリペプチド鎖ペアから構成され、それぞれのペアは、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。それぞれの鎖のＮ末端は、主として抗原認識を担う約１００〜１１０以上のアミノ酸からなる可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、「アルファ」、「デルタ」、「イプシロン」、「ガンマ」および「ミュー」と称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。ＩｇＧは、それらが生理学的状況における最も一般的な抗体であるため、およびそれらが研究室の環境において最も容易に作製されるため、本明細書で用いられる例示的なクラスの抗体である。任意選択で、抗体は、モノクローナル抗体である。抗体の特定の例は、ヒト化、キメラ、ヒト、またはそれ以外ではヒトに好適な抗体である。「抗体」として、本明細書に記載の抗体のいずれかの任意の断片または誘導体も挙げられる。
【００５０】
用語「に特異的に結合する」は、抗体が、好ましくは、競合結合アッセイにおいて、タンパク質の組換え形態、その中のエピトープ、または単離標的細胞の表面上に存在する天然タンパク質のいずれかを使用して評価される場合、結合パートナー、例えばＭＩＣＡおよびＭＩＣＢに結合し得ることを意味する。競合結合アッセイおよび特異的結合を決定する他の方法は、下記にさらに記載され、当分野において周知である。
【００５１】
抗体が特定のモノクローナル抗体「と競合する」と言われる場合、それは、抗体が、組換えＭＩＣＡ分子または表面発現ＭＩＣＡ分子のいずれかを使用する結合アッセイにおいてモノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、試験抗体が結合アッセイにおいてＭＩＣＡポリペプチドまたはＭＩＣＡ発現細胞への参照抗体の結合を低減させる場合、抗体は、参照抗体とそれぞれ「競合する」と言われる。
【００５２】
本明細書において使用される用語「親和性」は、抗体のエピトープへの結合強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］（式中、［Ａｂ−Ａｇ］は抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は未結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は未結合抗原のモル濃度である）として定義される解離定数Ｋｄにより与えられる。親和性定数Ｋａは、１／Ｋｄにより定義される。ｍＡｂの親和性を測定する方法は、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８）、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２、１９９３）、およびＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９−６０１（１９８３）に見出すことができ、その参照文献は参照により全体として本明細書に組み込まれる。ｍＡｂの親和性を測定する当分野において周知の１つの標準的方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置による分析によるもの）の使用である。
【００５３】
本明細書の範囲内で、「決定基」は、ポリペプチド上での相互作用または結合の部位を指定する。
【００５４】
用語「エピトープ」は、抗原決定基を指し、抗体が結合する抗原上の区域または領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基、および特異的抗原結合抗体またはペプチドにより有効に遮断されるアミノ酸残基、すなわち抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。それは、例えば、抗体または受容体と結合し得る複合抗原分子上の最も単純な形態または最小の構造領域である。エピトープは、直鎖または立体構造的／構造的であり得る。用語「直鎖エピトープ」は、アミノ酸の直鎖配列（一次構造）上で連続するアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。用語「立体構造的または構造的エピトープ」は、全てが連続しておらず、したがって、分子のフォールディング（二次、三次および／または四次構造）により互いに近接されるアミノ酸の直鎖配列の分離部分を表すアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。立体構造的エピトープは、三次元構造に依存する。したがって、用語「立体構造的」は、「構造的」と交換可能に使用されることが多い。
【００５５】
ＭＩＣＡ発現細胞に関する用語「枯渇させる」または「枯渇させること」は、殺傷、排除、溶解またはそのような殺傷、排除もしくは溶解の誘導をもたらして試料中または対象中に存在するそのようなＭＩＣＡ発現細胞の数に負の影響を与えるプロセス、方法、または化合物を意味する。
【００５６】
用語「抗体依存性細胞媒介細胞毒性」または「ＡＤＣＣ」は、当分野において十分理解されている用語であり、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞毒性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する非特異的細胞毒性細胞としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好中球、および好酸球が挙げられる。
【００５７】
用語「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」は、当分野において十分理解されている用語であり、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を指す。補体活性化経路は、コグネイト抗原と複合体化している分子（例えば、抗体）への補体系の第１の補体（Ｃ１ｑ）の結合により開始される。
【００５８】
用語「薬剤」は、化合物、化合物の混合物、生物学的巨大分子、または生物学的材料から作製された抽出物を示すために本明細書において使用される。用語「治療剤」は、生物学的活性を有する薬剤を指す。
【００５９】
本明細書における目的のため、「ヒト化」または「ヒト」抗体は、１つ以上のヒト免疫グロブリンの定常および可変フレームワーク領域が、動物免疫グロブリンの結合領域、例えばＣＤＲと融合している抗体を指す。そのような抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性を維持するが、非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するように設計される。そのような抗体は、抗原チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を産生するように「遺伝子操作」されたトランスジェニックマウスまたは他の動物から得ることができる（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ７：１３；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６：５７９参照、それらの全教示は、参照により本明細書に組み込まれる）。完全ヒト抗体は、遺伝子または染色体形質移入（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）法、およびファージディスプレイ技術により構築することもでき、それらは全て当分野において公知である（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３参照）。ヒト抗体は、インビトロで活性化されたＢ細胞により生成することもできる（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号明細書および米国特許第５，２２９，２７５号明細書参照、それらは全て、参照により全体として組み込まれる）。
【００６０】
本明細書において使用される用語「抗原結合ドメイン」は、エピトープに免疫特異的に結合し得る三次元構造を含むドメインを指す。したがって、一実施形態において、前記ドメインは、超可変領域、任意選択で、抗体鎖のＶＨおよび／またはＶＬドメイン、任意選択で、少なくともＶＨドメインを含み得る。別の実施形態において、結合ドメインは、抗体鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。別の実施形態において、結合ドメインは、非免疫グロブリン足場からのポリペプチドドメインを含み得る。
【００６１】
用語「超可変領域」は、本明細書において使用される場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；開示（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）参照）および／または「超可変ループ」からの残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  １９８７；１９６：９０１−９１７）、または抗原結合を担う必須アミノ酸を決定する類似の系を含む。Ｋａｂａｔ番号付与系を使用することにより、ペプチドの実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮またはそれらへの挿入に対応してより少ないまたは追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲＨ２の残基５２の後の単一アミノ酸インサート（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）および重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付与は、所与の抗体について、「標準」Ｋａｂａｔ番号付与配列との抗体の配列の相同性の領域におけるアラインメントにより決定することができる。別の好適な番号付与系は、Ａｂｎｕｍ系である。特に規定のない限り、免疫グロブリンについてのＡｂｎｕｍアミノ酸番号付与命名法を使用してＶＨおよびＶＬドメインの位置を指す（Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，（２００８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４５：３８３２−３８３９参照、その開示は参照により組み込まれる）。Ａｂｎｕｍ系を使用する配列番号付与は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ａｂｎｕｍにおいて自動生成することもできる。しかしながら、当業者は代替番号付与系を使用し、Ａｂｎｕｍ番号付与に対応する位置を同定することができることが認識される。本明細書における「Ａｍｂ位」、「Ａｂｍ番号付与」および「Ａｂｍに従う」などの語句は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについてのこの番号付与系を指す。
【００６２】
本明細書において使用される「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、ＣＤＲとして定義される領域を除く抗体可変ドメインの領域を意味する。それぞれの抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲにより離隔される連続領域にさらに下位分類することができる（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）。
【００６３】
用語「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」および「Ｆｃ領域」は、抗体重鎖、例えば、約アミノ酸（ａａ）２３０〜約ａａ４５０（Ｋａｂａｔ番号付与）のヒトγ（ガンマ）重鎖、または他のタイプの抗体重鎖（例えば、ヒト抗体についてのα、δ、εおよびμ）におけるその相当配列、またはその天然アロタイプのＣ末端断片を指す。
【００６４】
用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」は、通常、天然状態で見出される場合に材料に付随する成分を実質的または本質的に有さない材料を指す。純度および等質性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。調製物中に存在する優勢種であるタンパク質は、実質的に精製される。
【００６５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体である場合のアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。
【００６６】
用語「組換え体」は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入もしくは天然核酸もしくはタンパク質の変化により改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞内で見出されない遺伝子を発現し、または発現され、もしくは全く発現されない下で他で異常発現される天然遺伝子を発現する。
【００６７】
本明細書における文脈内で、ポリペプチドまたはエピトープに「結合する」抗体という用語は、前記決定基に特異性および／または親和性を有して結合する抗体を指す。
【００６８】
用語「同一性」または「同一である」は、２つ以上のポリペプチドの配列間の関係において使用される場合、２つ以上のアミノ酸残基の文字列間でのマッチの数によって決定された、ポリペプチド間の配列の関連性の程度を示す。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）により対処されるギャップアラインメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列の小さい方の間での同一のマッチのパーセントの尺度である。関連するポリペプチドの同一性は、公知の方法により容易に計算することができる。そのような方法としては、限定されるものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載のものが挙げられる。
【００６９】
同一性を決定するための方法は、試験される配列間で最大マッチを与えるように設計される。同一性を決定するための方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて記述されている。２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータプログラムの方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ、例としてＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他のソース（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、前掲）から公的に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して同一性を決定することもできる。
【００７０】
抗体の産生
本発明は、部分的には、得られる抗ＭＩＣＡ可変領域が高い物理化学的安定性および主要なヒトＭＩＣＡアレルについての高い結合親和性を有するように抗体ＣＤＲを取り込むことができる改変ヒトアクセプターフレームワーク配列の発見に基づく。さらに、ヒトアミノ酸配列の高い含有率を有する抗体が提供され、それによりヒト個体に投与された場合の免疫原性のリスク減少を提供する。有利には、抗体は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を誘発する低い潜在性を有する。
【００７１】
抗ＭＩＣＡ抗体ＶＨおよびＶＬ配列を以下の表１に提供し、それぞれのＶＨドメインおよびＶＬドメイン間で異なるアミノ酸に下線を付す。
【００７２】
【表２】
2019517993.tif 000004
【００７３】
本明細書におけるＶＨおよびＶＬドメインの位置は、免疫グロブリンについてのＡｂｎｕｍアミノ酸番号付与命名法を使用して記載される（Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，（２００８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４５：３８３２−３８３９参照、その開示は、参照により組み込まれる）。Ａｂｎｕｍ系を使用する配列番号付与は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ａｂｎｕｍにおいて自動生成することもできる。しかしながら、当業者は代替番号付与系を使用し、Ａｂｎｕｍ番号付与に対応する位置を同定することができることが認識される。
【００７４】
一実施形態において、抗体は、ヒトサブグループＩＧＨＶ４−ｂ（例えば、ＩＧＨＶ４−ｂ＊０２）からの重鎖フレームワークを含み、ＪセグメントはＩＧＨＪ６（例えば、ＩＧＨＪ６＊０１）からのものである。一実施形態において、ヒト化抗体は、ヒトサブグループＩＧＫＶ３−１１（例えば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１）からの軽鎖フレームワークを含み、ＪセグメントはＩＧＫＪ２（例えば、ＩＧＫＪ２＊０１）からのものである。
【００７５】
抗体は、例えば、その抗体の親和性、安定性、または他の特性を向上させるためのヒトフレームワーク配列中の１つ以上の突然変異をさらに含み得る。
【００７６】
抗ＭＩＣＡ抗体のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列の例を配列番号６〜２１にそれぞれ示す。一態様において、ヒトＭＩＣＡポリペプチドに結合する単離抗体であって、配列番号３０に記載のアミノ酸配列ＳＤＹＡＷＮを含むＨＣＤＲ１領域、またはその少なくとも３もしくは４つのアミノ酸の配列；配列番号３１に記載のアミノ酸配列ＦＶＳＹＳＧＴＴＫＹＮＰＳＬＫＳを含むＨＣＤＲ２領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０の連続アミノ酸の配列；配列番号３２に記載のアミノ酸配列ＧＹＧＦＤＹを含むＨＣＤＲ３領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０の連続アミノ酸の配列；配列番号３３に記載のアミノ酸配列ＳＡＴＳＳＩＳＳＩＹＦＨを含むＬＣＤＲ１領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０の連続アミノ酸の配列；配列番号３４に記載のアミノ酸配列ＲＴＳＮＬＡを含むＬＣＤＲ２領域、またはその少なくとも３、４もしくは５つの連続アミノ酸の配列；配列番号３５に記載のアミノ酸配列ＱＱＧＴＴＩＰＦＴを含むＬＣＤＲ３領域、またはその少なくとも５、６、７、もしくは８つの連続アミノ酸の配列を含む抗体が提供される。
【００７７】
一態様において、ヒトＭＩＣＡポリペプチドに結合する抗原結合ドメインまたは抗体であって、
（ａ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；
（ｂ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；
（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；
（ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；
（ｅ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；
（ｆ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３；および
（ｇ）ヒト重鎖および軽鎖フレームワーク配列
を含み、
配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％または９８％同一のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％または９８％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗原結合ドメインまたは抗体が提供される。
【００７８】
一実施形態において、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ＶＬのＣＤＲ１内のアミノ酸との非共有結合を形成し得るＡｂｎｕｍ７１位（ＦＲ３中）におけるアミノ酸残基を含む。一実施形態において、ＶＬは、Ａｂｎｕｍ７１位（ＦＲ３中）におけるチロシン（Ｙ）アミノ酸残基を含む。一実施形態において、ＶＬは、Ａｂｎｕｍ８３位におけるフェニルアラニン（Ｆ）を含む。
【００７９】
一実施形態において、重鎖可変領域（ＶＨ）は、互いに相互作用してＡｂｎｕｍ７２ｃ位における残基と７４位における残基との間の塩橋、例えば、Ｈ結合を形成し得るＡｂｎｕｍ７２ｃ位（ＦＲ２中）および７４位（ＦＲ３中）におけるアミノ酸残基を含む。一実施形態において、ＶＨは、Ａｂｎｕｍ７２ｃ位におけるリジン（Ｋ）アミノ酸残基および７４位におけるグルタミン残基を含む。一実施形態において、ＶＨは、Ａｂｎｕｍ３０位におけるトレオニン（Ｔ）を含む。一実施形態において、ＶＨは、Ａｂｎｕｍ４８位におけるイソロイシン（Ｉ）を含む。一実施形態において、ＶＨは、Ａｂｎｕｍ６７位におけるバリン（Ｖ）を含む。一実施形態において、ＶＨは、Ａｂｎｕｍ７１位におけるアルギニン（Ｒ）を含む。
【００８０】
一実施形態において、ＶＨは、ヒトサブグループＩＧＨＶ４−ｂ（例えば、ＩＧＨＶ４−ｂ＊０２）からの重鎖フレームワークを含み、ＪセグメントはＩＧＨＪ６（例えば、ＩＧＨＪ６＊０１）からのものである。一実施形態において、ＶＬは、ヒトサブグループＩＧＫＶ３−１１（例えば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１）からの軽鎖フレームワークを含み、ＪセグメントはＩＧＫＪ２（例えば、ＩＧＫＪ２＊０１）からのものである。
【００８１】
任意選択で、ヒトＶＨおよび／またはＶＬフレームワーク（例えば、またはその重鎖または軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４）は、非ヒト哺乳動物（例えば、マウスまたはラット）中の特定の位置に存在する残基を導入するための１つ以上の突然変異、例えば、復帰突然変異を含んでも含まなくてもよい。抗体は、例えば、その抗体の親和性、安定性、または他の特性を向上させるためのヒトフレームワーク配列中の１つ以上の追加の突然変異（例えば、復帰突然変異）をさらに含んでも含まなくてもよい。
【００８２】
別の態様において、配列番号６または８のＶＨドメインと少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％以上の同一性）を有するＶＨドメインを含む抗ＭＩＣＡ抗体が提供される。別の態様において、配列番号７または９のＶＨドメインと少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％以上の同一性）を有するＶＬドメインを含む抗ＭＩＣＡ抗体が提供される。
【００８３】
抗体をコードするＤＮＡを調製し、適切な宿主中への形質移入に適切な発現ベクター中で配置することができる。次いで、その宿主を抗体、またはそのバリアント、例えば、そのモノクローナル抗体のヒト化バージョン、抗体の活性断片、抗体の抗原認識部分を含むキメラ抗体、または検出可能部分を含むバージョンの組換え産生に使用する。
【００８４】
本開示のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用の手順を使用して（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離し、配列決定することができる。一態様において、本明細書の任意の実施形態の抗ＭＩＣＡ抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸が提供される。ＤＮＡは、単離したら、発現ベクター中に配置することができ、次いでそれを他の場合には免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞中に形質移入して組換え宿主細胞中のモノクローナル抗体の合成を得る。本明細書の他箇所に記載のとおり、そのようなＤＮＡ配列は、多数の目的のいずれかのために、例えば、抗体のヒト化、断片もしくは誘導体の産生のため、または例えば、抗体の結合特異性を最適化するための抗原結合部位中の抗体の配列の改変のために改変することができる。一実施形態において、抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする単離核酸配列、ならびにそのような核酸を（例えば、ゲノム中で）含む組換え宿主細胞が提供される。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現は、当分野において周知である（例えば、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，ｐｐ．２５６（１９９３）；およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０，ｐ．１５１（１９９２）参照。
【００８５】
典型的には、本明細書において提供される抗ＭＩＣＡ抗体は、約１０４〜約１０１１Ｍ−１（例えば、約１０８〜約１０１０Ｍ−１）の範囲のＭＩＣＡポリペプチドについての親和性を有する。例えば、特定の態様において、本開示は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置による分析による）により測定されるＭＩＣＡに関して１×１０−９Ｍ未満の平均解離定数（ＫＤ）を有する抗ＭＩＣＡ抗体を提供する。より特定の例示的態様において、本開示は、ＭＩＣＡ（例えば、ＭＩＣＡ＊００１、＊００４、＊００７および＊００８アレル）についての約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ、または約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１ＭのＫＤを有する抗ＭＩＣＡ抗体を提供する。
【００８６】
抗体は、例えば、約１００、６０、１０、５、または１ナノモル濃度以下（すなわち、それよりも良好な親和性）、好ましくは、サブナノモル濃度または任意選択で、約５００、２００、１００または１０ピコモル濃度以下の平均ＫＤにより特徴づけすることができる。ＫＤは、例えば、例えば、組換え産生ヒトＭＩＣＡタンパク質をチップ表面上に固定化し、次いで試験すべき抗体を溶液中でアプライすることにより測定することができる。一実施形態において、本方法は、本開示の抗体とＭＩＣＡへの結合について競合し得る（ｂ）からの抗体を選択するステップ（ｄ）をさらに含む。
【００８７】
試験抗体がそのＶＨおよび／ＶＬ中の改変を有する場合、対照（例えば、配列番号６および７のＶＨおよびＶＬを有する抗体、または配列番号８および９のＶＨおよびＶＬを有する抗体）および試験抗体を混合（または予備吸着し）、ＭＩＣＡポリペプチドを含有する試料にアプライする単純な競合アッセイを用いることができる。ウエスタンブロッティングに基づくプロトコルおよびＢｉａｃｏｒｅ（商標）分析の使用は、そのような競合試験における使用に好適である。
【００８８】
ある実施形態において、対照抗体を、変動量の試験抗体と、ＭＩＣＡ抗原試料にアプライする前のある期間、予備混合する（例えば、約１：１０または約１：１００）。他の実施形態において、対照および変動量の試験抗体は、ＭＩＣＡ抗原試料に曝露させる間、単純に混合することができる。（例えば、未結合抗体を除去するための分離または洗浄技術を使用することにより）結合抗体を遊離抗体から、かつ（例えば、種特異的もしくはアイソタイプ特異的二次抗体を使用し、または対照抗体を検出可能な標識により特異的に標識することにより）対照抗体を試験抗体から区別することができる限り、試験抗体が対照抗体の抗原への結合を低減させるか否かを決定することができ、それは試験抗体が対照抗体と実質的に同一のエピトープを認識することが示す。完全に無関連な抗体の不存在下での（標識）対照抗体の結合は、高値の対照として機能し得る。低値の対照は、標識対照抗体を全く同一のタイプの未標識抗体とインキュベートすることにより得ることができ、この場合、競合が生じ、標識抗体の結合を低減させる。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下での標識抗体の反応性における有意な低減は、実質的に同一のエピトープを認識する試験抗体、すなわち、標識対照抗体と「交差反応する」または競合する抗体を示す。対照抗体のＭＩＣＡ抗原への結合を、少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、またはより好ましくは少なくとも約８０％もしくは９０％（例えば、約６５〜１００％）だけ低減させる任意の試験抗体を、約１：１０〜約１：１００の対照抗体：試験抗体の任意の比において、対照抗体と実質的に同一のエピトープまたは決定基に結合する抗体であるとみなす。一実施形態において、そのような試験抗体は、対照抗体のＭＩＣＡ抗原への結合を、少なくとも約９０％（例えば約９５％）だけ低減させる。
【００８９】
競合は、例えばフローサイトメトリー試験により評価することもできる。そのような試験において、所与のＭＩＣＡポリペプチドを担持する細胞は、最初に例えば、対照抗体と、次いで蛍光色素またはビオチンにより標識された試験抗体とインキュベートすることができる。飽和量の対照抗体とのプレインキュベーション時に得られる結合が、対照抗体とのプレインキュベーションなしの抗体により得られる（蛍光を介して計測される）結合の、約８０％、任意選択で約５０％、約４０％以下（例えば、約３０％、２０％または１０％）である場合、抗体は、対照抗体と競合すると言われる。あるいは、飽和量の試験抗体とプレインキュベートされた細胞上の（蛍光色素またはビオチンによる）対照抗体抗体について得られる結合が、試験抗体とのプレインキュベーションなしの場合に得られる結合の、約８０％、任意選択で約５０％、約４０％以下（例えば、約３０％、２０％または１０％）である場合、抗体は、対照抗体と競合すると言われる。
【００９０】
試験抗体を、ＭＩＣＡ抗原が固定化された表面に飽和濃度において予備吸着およびアプライする単純な競合アッセイを用いることもできる。単純な競合アッセイにおける表面は、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（商標）チップ（または表面プラズモン共鳴分析に好適な他の媒体）である。次いで、対照抗体（例えば、配列番号６および７のＶＨおよびＶＬを有する抗体または配列番号８および９のＶＨおよびＶＬを有する抗体）を、ＭＩＣＡ飽和濃度において表面と接触させ、対照抗体のＭＩＣＡおよび表面結合を計測する。対照抗体のこの結合を、試験抗体の不存在下での対照抗体のＭＩＣＡ含有表面への結合と比較する。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下での対照抗体によるＭＩＣＡ含有表面の結合の有意な低減は、試験抗体が対照抗体と実質的に同一のエピトープを認識し、その結果、試験抗体が対照抗体と「交差反応する」ことを示す。対照抗体のＭＩＣＡ抗原への結合を少なくとも約３０％以上、好ましくは約４０％だけ低減させる任意の試験抗体を、対照抗体と実質的に同一のエピトープまたは決定基に結合する抗体であるとみなすことができる。好ましくは、そのような試験抗体は、対照抗体のＭＩＣＡ抗原への結合を少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％以上）だけ低減させる。対照および試験抗体の順序は入れ替えることができ、すなわち、競合アッセイにおいて、最初に対照抗体を表面に結合させることができ、その後に試験抗体を表面と接触させることが認識される。好ましくは、ＭＩＣＡ抗原についてより高い親和性を有する抗体を最初に表面に結合させる。それというのも、二次抗体について見られる結合の減少（抗体が交差反応していると想定）がより顕著な大きさであると予期されるためである。そのようなアッセイのさらなる例が、例えば、Ｓａｕｎａｌ（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３：３３−４１に提供され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９１】
抗体がエピトープ領域内で結合するか否かの決定は、当業者に公知の手法において実施することができる。そのようなマッピング／特徴決定方法の一例として、抗ＭＩＣＡ抗体についてのエピトープ領域を、ＭＩＣＡタンパク質中の露出アミン／カルボキシルの化学修飾を使用するエピトープ「フットプリンティング」により決定することができる。そのようなフットプリンティング技術の１つの具体例は、ＨＸＭＳ（質量分析により検出される水素−重水素交換）の使用であり、この場合、受容体およびリガンドタンパク質のアミドプロトンの水素／重水素交換、結合、および逆交換が生じ、タンパク質結合に関与する骨格アミド基は逆交換から保護され、したがって重水素化されたままになる。関連領域は、この箇所において、ペプシンタンパク質加水分解、高速マイクロボア高速液体クロマトグラフィー分離、および／またはエレクトロスプレーイオン化質量分析により同定することができる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ  Ｈ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６７（２）ｐｐ．２５２−２５９（１９９９）Ｅｎｇｅｎ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｌ．（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，２５６Ａ−２６５Ａ参照。好適なエピトープ同定技術の別の例は核磁気共鳴エピトープマッピング（ＮＭＲ）であり、この場合、典型的には、遊離抗原および抗原結合ペプチド、例えば抗体と複合体化された抗原の二次元ＮＭＲスペクトルにおけるシグナルの位置を比較する。抗原は、典型的には、ＮＭＲスペクトルにおいて、抗原に対応するシグナルのみが見られ、抗原結合ペプチドからのシグナルが全く見られないように、１５Ｎにより選択的に同位体標識する。抗原結合ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸から生じる抗原シグナルは、典型的には、複合体のスペクトルにおける位置を、遊離抗原のスペクトルと比較してシフトさせ、結合に関与するアミノ酸をそのように同定することができる。例えば、Ｅｒｎｓｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ．２００４；（４４）：１４９−６７；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８１（１）ｐｐ．６１−６７（１９９８）；およびＳａｉｔｏ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９６  Ｊｕｎ；９（３）：５１６−２４参照。
【００９２】
エピトープマッピング／特徴決定は、質量分析法を使用して実施することもできる。例えば、Ｄｏｗｎａｒｄ，Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００  Ａｐｒ；３５（４）：４９３−５０３およびＫｉｓｅｌａｒ  ａｎｄ  Ｄｏｗｎａｒｄ，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９  Ｍａｙ  １；７１（９）：１７９２−１８０１参照。プロテアーゼ消化技術も、エピトープマッピングおよび同定に関して有用であり得る。抗原決定基関連領域／配列は、プロテアーゼ消化により、例えばトリプシンをＭＩＣＡに対して約１：５０の比またはｐＨ７〜８における一晩消化において使用し、次いでペプチド同定のための質量分析（ＭＳ）分析を行うことにより決定することができる。続いて、抗ＭＩＣＡ結合剤によりトリプシン開裂から保護されるペプチドを、トリプシン消化を受けた試料と、抗体とインキュベートされ、次いで、例えば、トリプシンによる消化を受けた試料との比較により同定することができる（それにより、結合剤についてのフットプリントが明らかになる）。他の酵素、例えば、キモトリプシン、ペプシンなどをさらに、または代替的に類似のエピトープ特徴決定方法において使用することができる。さらに、酵素消化は、潜在的な抗原決定基配列が、表面露出されておらず、したがって、免疫原性／抗原性に関して最も関連性が少ないＭＩＣＡポリペプチドの領域内に存在するか否かを分析する迅速な方法を提供し得る。
【００９３】
部位特異的突然変異誘発は、結合エピトープの解明に有用な別の技術である。例えば、「アラニンスキャニング」において、タンパク質セグメント内のそれぞれの残基をアラニン残基により置き換え、結合親和性についての結果を計測する。突然変異が結合親和性の有意な低減をもたらす場合、それは結合に関与する可能性が最も高い。構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体（すなわち、フォールディングされていないタンパク質に結合しない抗体）を使用し、アラニン置換がタンパク質のフォールディング全体に影響を与えないことを確認することができる。例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５；２６７：３８３-３８６；およびＷｅｌｌｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９６；９３：１−６参照。
【００９４】
エピトープ「フットプリンティング」に電子顕微鏡を使用することもできる。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５５：２７５−２７８は、天然ササゲモザイクウイルスのカプシド表面上のＦａｂ断片の物理的フットプリントを測定するため、低温電子顕微鏡観察、三次元画像再構成、およびＸ線結晶分析の協調的適用を使用した。
【００９５】
エピトープ評価のための「ラベルフリー」アッセイの他の形態としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標））および反射干渉分光法（ＲｉｆＳ）が挙げられる。例えば、Ｆａｅｇｅｒｓｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  １９９０；３：２０８−１４；Ｎｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ−ｔｏｇｒ．１９９３；６４６：１５９-１６８；Ｌｅｉｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．１９９８；３７：３３０８-３３１１；Ｋｒｏｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２００２；１７：９３７−９４４参照。
【００９６】
抗体と同一または実質的に同一のエピトープに結合する抗体を、本明細書に記載の例示的競合アッセイの１つ以上において同定することができることにも留意すべきである。一実施形態において、α１α２ドメイン遮断抗体は、Ｅ１００、Ｄ１０１およびＮ１０２からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、Ｓ１０３、Ｔ１０４およびＲ１０５からなる群から選択される１、２もしくは３つの残基、Ｎ１２１およびＥ１２３からなる群から選択される１もしくは２つの残基、ならびに／またはＴ１２４およびＥ１２６からなる群から選択される１もしくは２つの残基を含むエピトープに結合する。一実施形態において、α１α２ドメイン遮断抗体は、残基：（配列番号１を参照）：Ｅ１００、Ｄ１０１、Ｎ１０２、Ｓ１０３、Ｔ１０４、Ｒ１０５、Ｎ１２１、Ｅ１２３、Ｔ１２４およびＥ１２６からなる群から選択される１、２、３、４、５、６つ以上の残基を含むヒトＭＩＣＡポリペプチド上のエピトープに結合する。
【００９７】
一実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗体は、（配列番号１の野生型ヒトＭＩＣＡポリペプチドと比較してＥ１００Ａ、Ｄ１０１Ｓ、Ｎ１０２Ａ置換を有する突然変異ヒトＭＩＣＡポリペプチドへの減少した結合を有する。一実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗体は、（配列番号１の野生型ヒトＭＩＣＡポリペプチドと比較してＳ１０３Ａ、Ｔ１０４Ｓ、Ｒ１０５Ａ置換を有する突然変異ヒトＭＩＣＡポリペプチドへの減少した結合を有する。一実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗体は、（配列番号１の野生型ヒトＭＩＣＡポリペプチドと比較してＮ１２１Ａ、Ｅ１２３Ｓ置換を有する突然変異ヒトＭＩＣＡポリペプチドへの減少した結合を有する。一実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗体は、（配列番号１の野生型ヒトＭＩＣＡポリペプチドと比較してＴ１２４ＡおよびＥ１２６Ａ置換を有する突然変異ヒトＭＩＣＡポリペプチドへの減少した結合を有する。
【００９８】
一実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗体は、ＭＩＣＡポリペプチドに少なくとも部分的にＭＩＣＡのα２ドメイン内で結合する。任意選択で、抗体は、ＮＫＧ２Ｄ結合表面近傍のＭＩＣＡの側面におけるα２ドメインに結合し、このことは、この抗体が細胞表面ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの相互作用を遮断する知見と一致する。
【００９９】
ＡＤＣＣおよびＣＤＣを誘導する抗ＭＩＣＡ抗体の能力の観点から、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞毒性、マスト細胞脱顆粒、および食作用、ならびに免疫調節シグナル、例えば、リンパ球増殖および抗体分泌の調節に影響し得るＦｃ受容体に結合するそれらの能力を増加させる改変を有する抗体を有利には作製することができる。典型的な改変としては、少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、置換、欠失、挿入）、および／または変化されたタイプのグリコシル化、例えば、低フコシル化を含む改変ヒトＩｇＧ１定常領域が挙げられる。そのような改変は、Ｆｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）との相互作用に影響し得る。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、活性化（すなわち、免疫系向上）受容体である一方、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は、阻害（すなわち、免疫系減衰）受容体である。改変は、例えば、エフェクター（例えば、ＮＫ）細胞上のＦｃγＲＩＩＩａへのＦｃドメインの結合を増加させ得る。
【０１００】
抗ＭＩＣＡ抗体は、任意選択で改変されているヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプのＦｃドメイン（またはその一部）を含む。ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ００２２８）の２３０〜４４７位配列のアミノ酸配列を以下に示す：
【化１】
2019517993.tif 000005
【０１０１】
残基２３０〜３４１（Ｋａｂａｔ  ＥＵ）は、ＦｃＣＨ２領域である。残基３４２〜４４７（Ｋａｂａｔ  ＥＵ）は、ＦｃＣＨ３領域である。抗ＭＩＣＡ抗体は、１つ以上の位置中の１つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、欠失、挿入）を有するバリアントＦｃ領域を含み得、その改変は、ＦｃγＲ（例として、活性化および阻害ＦｃγＲ）についてのバリアントＦｃ領域の親和性およびアビディティーを増加させる。一部の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸改変は、ＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡについてのバリアントＦｃ領域の親和性を増加させる。別の実施形態において、バリアントＦｃ領域は、同等の親抗体（すなわち、Ｆｃ領域中の１つ以上のアミノ酸改変を除き本明細書の抗体と同一のアミノ酸配列を有する抗体）のＦｃ領域よりも低い親和性でＦｃγＲＩＩＢにさらに特異的に結合する。例えば、Ｋａｂａｔアミノ酸３１０および４３５位におけるヒスチジン残基の一方または両方は、例えば、リジン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリンまたはトレオニンにより置換されていてよく（例えば、ＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０８０２７７号パンフレット参照）；そのような置換定常領域は、活性ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を減少させずに阻害ＦｃγＲＩＩＢへの結合の減少を提供する。一部の実施形態において、そのような改変は、親抗体に対してＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡについてのバリアントＦｃ領域の親和性を増加させ、ＦｃγｙＲＩＩＢについてのバリアントＦｃ領域の親和性も向上させる。他の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸改変は、親抗体のＦｃ領域に対してＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡについてのバリアントＦｃ領域の親和性を増加させるが、ＦｃγＲＩＩＢについてのバリアントＦｃ領域の親和性を変化させない。別の実施形態において、前記１つ以上のアミノ酸改変は、親抗体に対してＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＡについてのバリアントＦｃ領域の親和性を向上させるが、ＦｃγＲＩＩＢについての親和性を低減させる。親和性および／またはアビディティーの増加は、（改変Ｆｃ領域を有さない）親分子の結合活性を細胞中で検出することができない低レベルのＦｃγＲを発現する細胞中での検出可能なＦｃγＲへの結合またはＦｃγＲ関連活性をもたらす。
【０１０２】
一実施形態において、Ｆｃ領域のアミノ酸の前記１つ以上の改変は、１つ以上のＦｃγＲ受容体についての抗体の親和性およびアビディティーを低減させる。具体的な実施形態において、抗体は、バリアントＦｃ領域であって、前記バリアントＦｃ領域は、野生型Ｆｃ領域に対する少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、バリアントＦｃ領域は、１つのＦｃγＲにのみ結合し、前記ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＡであるバリアントＦｃ領域を含む。
【０１０３】
ＦｃγＲＩＩＩａまたはＦｃＲｎ結合に影響する（それを向上させる）ＩｇＧ１中の規定の突然変異も以下に記載する。
【０１０４】
【表３】
2019517993.tif 000006
【０１０５】
ＦｃγＲについての抗体の親和性および結合特性は、抗体−抗原またはＦｃ−ＦｃγＲ相互作用、すなわち、それぞれ抗体への抗原の特異的結合またはＦｃγＲへのＦｃ領域の特異的結合を測定する当分野において公知のインビトロアッセイ（生化学または免疫ベースアッセイ）、例として、限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイを使用して測定することができる。
【０１０６】
一部の実施形態において、バリアントＦｃ領域を含む抗体は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ以上のアミノ酸改変を有する）を含む。他の実施形態において、抗体は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ以上のアミノ酸改変を有する）を含むバリアントＦｃ領域を含む。一部の実施形態において、抗体は、少なくとも２つのアミノ酸改変（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９つ以上のアミノ酸改変を有する）を含み、少なくとも１つのそのような改変はＣＨ３領域中に存在し、少なくとも１つのそのような改変はＣＨ２領域中に存在する。任意選択で、抗体は、ヒンジ領域中のアミノ酸改変を含み得る。一実施形態において、任意選択で、Ｋａｂａｔ２１６〜２３０位（Ｋａｂａｔ  ＥＵ番号付与）のアミノ酸のスパン内のＦｃ領域のＣＨ１ドメイン中のアミノ酸改変が提供される。
【０１０７】
Ｆｃ改変の任意の組合せ、例えば、米国特許第７，６３２，４９７号明細書；米国特許第７，５２１，５４２号明細書；米国特許第７，４２５，６１９号明細書；米国特許第７，４１６，７２７号明細書；米国特許第７，３７１，８２６号明細書；米国特許第７，３５５，００８号明細書；米国特許第７，３３５，７４２号明細書；米国特許第７，３３２，５８１号明細書；米国特許第７，１８３，３８７号明細書；米国特許第７，１２２，６３７号明細書；米国特許第６，８２１，５０５号明細書および米国特許第６，７３７，０５６号明細書；ＰＣＴ公開の国際公開第２０１１／１０９４００号パンフレット；国際公開第２００８／１０５８８６号パンフレット；国際公開第２００８／００２９３３号パンフレット；国際公開第２００７／０２１８４１号パンフレット；国際公開第２００７／１０６７０７号パンフレット；国際公開第０６／０８８４９４号パンフレット；国際公開第０５／１  １５４５２号パンフレット；国際公開第０５／１１０４７４号パンフレット；国際公開第０４／１０３２２６９号パンフレット；国際公開第００／４２０７２号パンフレット；国際公開第０６／０８８４９４号パンフレット；国際公開第０７／０２４２４９号パンフレット；国際公開第０５／０４７３２７号パンフレット；国際公開第０４／０９９２４９号パンフレットおよび国際公開第０４／０６３３５１号パンフレット；ならびにＰｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０（４）：４８７−４９０；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６；２７７（３０）：２６７３３−２６７４０およびＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６６０４）に開示される異なる改変の任意の組合せを作製することができる。
【０１０８】
本開示は、バリアントＦｃ領域を含む抗ＭＩＣＡ抗体であって、バリアントＦｃ領域は、分子が野生型Ｆｃ領域を含む分子に対して向上されたエフェクター機能を有するように、野生型Ｆｃ領域に対する少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ以上のアミノ酸改変を有する）を含み、任意選択で、バリアントＦｃ領域は、２２１、２４３、２４７、２５５、２５６、２５８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１６、３２０、３２２、３２６、３２９、３３０、３３２、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３５９、３６０、３７０、３７３、３７６、３７８、３９２、３９６、３９９、４０２、４０４、４１６、４１９、４２１、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８および／または４３９位のいずれか１つ以上における置換を含む抗体を提供する。
【０１０９】
本開示は、バリアントＦｃ領域を含む抗ＭＩＣＡ抗体であって、バリアントＦｃ領域は、分子が野生型Ｆｃ領域を含む分子に対して向上されたエフェクター機能を有するように、野生型Ｆｃ領域に対する少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ以上のアミノ酸置換を有する）を含み、任意選択で、バリアントＦｃ領域は、Ｋａｂａｔ３２９、２９８、３３０、３３２、３３３および／または３３４位のいずれか１つ以上における置換（例えば、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａおよび／またはＫ３３４Ａ置換）を含む抗体を提供する。一実施形態において、バリアントまたは野生型Ｆｃ領域を有する抗体は、抗体のＦｃ受容体結合能を増加させる変化されたグリコシル化パターンを有し得る。そのような炭水化物改変は、例えば、変化されたグリコシル化機序を有する宿主細胞中で抗体を発現させることにより達成することができる。変化したグリコシル化機序を有する細胞は、当分野において記載されており、組換え抗体を発現し、それにより変化したグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１、ならびに欧州特許第１，１７６，１９５号明細書；ＰＣＴ公開の国際公開第０６／１３３１４８号パンフレット；国際公開第０３／０３５８３５号パンフレット；国際公開第９９／５４３４２号パンフレット参照、そのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
一般に、変化されたグリコシル化を有するそのような抗体は、抗体が、ある所望の特性、例として、限定されるものではないが、非改変抗体または天然定常領域を有し、ネズミ骨髄腫ＮＳＯおよびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｃｈｕ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１，１２：１８０−７）により生産される抗体、本明細書の実施例セクション、または組換え治療抗体を産生するために一般に使用される他の哺乳動物宿主細胞系において産生されるＨＥＫ２９３Ｔ発現抗体と比較して向上されたＡＤＣＣおよびエフェクター細胞受容体結合活性を産生する特定のＮ−グリカン構造を有するように、「糖最適化（ｇｌｙｃｏ−ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）」されている。
【０１１１】
哺乳動物細胞系中で産生されるモノクローナル抗体は、それぞれの重鎖のＡｓｎ２９７におけるＮ−結合グリコシル化部位を含有する。抗体上のグリカンは、典型的には、極めて低い分岐Ｎ−アセチルグルコサミン（分岐ＧｌｃＮＡｃ）を有しまたは有さず、高レベルのコアフコシル化を有する複雑な二分岐（ｂｉａｔｅｎｎａｒｙ）構造である。グリカン末端は、極めて低い末端シアル酸を含有しまたは含有せず、変動量のガラクトースを含有する。抗体機能に対するグリコシル化の効果の観点については、例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２６−３１（１９９７）参照。多数の研究が、抗体グリカン構造の糖組成の変化がＦｃエフェクター機能を変化させ得ることを示す。抗体活性に寄与する重要な炭水化物構造は、Ｆｃ領域Ｎ−結合オリゴ糖の最内部のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌａｃＮＡｃ）残基へのアルファ−１，６結合を介して結合しているフコース残基であると考えられる（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０１１２】
ＦｃγＲ結合は、ヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３タイプのＦｃ領域中の保存Ａｓｎ２９７において共有結合しているオリゴ糖の存在を要求する。近年、非フコシル化オリゴ糖構造は、インビトロＡＤＣＣ活性の大幅な増加に関連している。「Ａｓｎ２９７」は、Ｆｃ領域中の約２９７位において局在しているアミノ酸アスパラギンを指し；抗体のマイナー配列変異に基づき、Ａｓｎ２９７は、上流または下流（通常、＋３以下のアミノ酸）に局在している一部のアミノ酸でもあり得る。
【０１１３】
歴史的に、ＣＨＯ細胞中で産生される抗体は、非フコシル化された種の約２〜６％を含有する。ＹＢ２／０（ラット骨髄腫）およびＬｅｃｌ３細胞系（アルファ６−フコシルトランスフェラーゼの基質であるＧＤＰ−フコースまたはＧＤＰ糖中間体の欠損をもたらす欠損ＧＤＰマンノース４，６−デヒドラターゼを有するＣＨＯ系のレクチン突然変異体は、７８〜９８％の非フコシル化種を有する抗体を産生することが報告されている。他の例において、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはノックアウト技術を用いて細胞を遺伝子操作してＦＵＴ８ｍＲＮＡ転写産物レベルを減少させ、または遺伝子発現を完全にノックアウトすることができ、そのような抗体は、最大７０％の非フコシル化グリカンを含有することが報告されている。
【０１１４】
本開示は、Ａｓｎ２９７における糖鎖によりグリコシル化されているＭＩＣＡに結合する抗体であって、ＦｃγＲＩＩＩへのＦｃ部分を介する増加された結合親和性を示す抗体を提供する。一実施形態において、抗体は、ＦｃｙＲＩＩＩａへの抗体結合および／またはＡＤＣＣを改善するＦｃ領域中の少なくとも１つのアミノ酸変化を含む定常領域を含む。
【０１１５】
一態様において、抗体は、それらの定常領域中で低フコシル化されている。そのような抗体は、アミノ酸変化を含み得、またはアミノ酸変化を含み得ないが、そのような低フコシル化を生じさせるための条件下で産生または処理することができる。一態様において、抗体組成物は、本明細書に記載のキメラ、ヒトまたはヒト化抗体を含み、組成物中の抗体種の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７５、８５、９０、９５％または実質的に全ては、フコースを欠くコア炭水化物構造（例えば、複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造）を含む定常領域を有する。一実施形態において、フコースを有するコア炭水化物構造を含む抗体を有さない抗体組成物が提供される。コア炭水化物は、好ましくは、Ａｓｎ２９７における糖鎖である。
【０１１６】
一実施形態において、抗体組成物、例えば、ＭＩＣＡに結合し、Ａｓｎ２９７における糖鎖によりグリコシル化されている組成物であって、抗体は、部分的にフコシル化されている組成物が開示される。部分的にフコシル化されている抗体は、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースを欠く組成物中の抗ＭＩＣＡ抗体の比率が２０％〜９０％、例えば、２０％〜８０％、例えば、２０％〜５０％、５５％、６０％、７０％もしくは７５％、３５％〜５０％、５５％、６０％、７０％もしくは７５％、または４５％〜５０％、５５％、６０％、７０％もしくは７５％であることを特徴とする。任意選択で、抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３タイプのものである。
【０１１７】
糖鎖は、任意の特徴（例えば、複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造の存在および比率）、例として、ヒト細胞からの抗体の、または齧歯類細胞、ネズミ細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）もしくは鳥類細胞中で組換え発現される抗体のＡｓｎ２９７に結合しているＮ−結合グリカンの特徴をさらに示し得る。
【０１１８】
一実施形態において、抗体は、細胞系がコア炭水化物中のフコースを欠くタンパク質を産生するように、フコシルトランスフェラーゼ酵素を欠いている細胞中で発現させる。例えば、細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（アルファ（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）を欠き、その結果、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９細胞系中で発現される抗体はそれらのコア炭水化物上のフコースを欠く。これらの細胞系は、２つの置換ベクターを使用するＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中でのＦＵＴ８遺伝子の標的化破壊により作出された（Ｙａｍａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許出願公開第２００４０１１０７０４号明細書；およびＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８７：６１４−２２参照、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。他の例としては、ＦＵＴ８遺伝子を機能的に破壊するためのアンチセンス抑制、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）干渉、ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）干渉またはイントロン含有ヘアピンＲＮＡ（ｉｈｐＲＮＡ）干渉の使用が挙げられる。一実施形態において、抗体は、細胞系中で発現される抗体がアルファ１，６結合関連酵素の低減または排除による低フコシル化を示すように、機能的に破壊された、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系中で発現させる。
【０１１９】
一実施形態において、抗体は、遺伝子操作細胞系中で発現される抗体が抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす分岐ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＨＩ））を発現するように遺伝子操作された細胞系中で発現させる（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．によるＰＣＴ公開の国際公開第９９／５４３４２号パンフレット；およびＵｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１２０】
別の実施形態において、抗体を発現させ、フコシダーゼ酵素を使用してフコシル残基を開裂させる。例えば、フコシダーゼアルファ−Ｌ−フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６−５５２３）。他の例において、抗体を産生する細胞系をグリコシル化阻害剤により処理することができ；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．９９：６５２−６６５（２００８）は、非フコシル化オリゴマンノースタイプＮグリカンを有する抗体の産生をもたらすアルファ−マンノシダーゼＩ阻害剤、キフネンシンによるＣＨＯ細胞の処理を記載した。
【０１２１】
一実施形態において、抗体は、フコシルを抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンに付加するための低い酵素活性を天然で有し、またはその酵素活性を有さない細胞系、例えば、ラット骨髄腫細胞系ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）中で発現させる。細胞系の他の例としては、フコシルをＡｓｎ（２９７）結合炭水化物に結合させる能力の低減を有し、宿主細胞中で発現される抗体の低フコシル化ももたらすバリアントＣＨＯ細胞系、Ｌｅｄ３細胞が挙げられる（国際公開第０３／０３５８３５号パンフレット（Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ）；およびＳｈｉｅｌｄｓ，ＲＸ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。別の実施形態において、抗体は、鳥類細胞、任意選択で、低フコース含有量を有する抗体を天然に生じさせるＥＢｘ（登録商標）細胞（Ｖｉｖａｌｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）中で発現させる、例えば、国際公開第２００８／１４２１２４号パンフレット。低フコシル化グリカンは、植物起源の細胞系中で産生することもでき、例えば、国際公開第０７／０８４９２６Ａ２号パンフレット（Ｂｉｏｌｅｘ  Ｉｎｃ．）、国際公開第０８／００６５５４号パンフレット（Ｇｒｅｅｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧＭＢＨ）、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
一実施形態において、抗体は、プロテアーゼによる開裂に対する減少した感受性を付与するアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、腫瘍形成と関連するプロテイナーゼの最も優勢なファミリーを表す。癌細胞はＭＭＰを発現し得る一方、細胞外ＭＭＰの大部分は腫瘍に浸潤する産生する異なるタイプの間質細胞により提供され、それぞれはプロテイナーゼおよびプロテイナーゼインヒビターの規定のセットを産生し、それらが細胞外空間中に放出され、腫瘍周囲の環境を特異的に変更する。腫瘍微小環境中に存在するＭＭＰはヒンジ領域内で抗体を開裂し得、したがって、腫瘍部位内で機能するように設計される治療抗体の不活性化をもたらし得る。一実施形態において、アミノ酸置換を含むＦｃドメインは、ＧｌｕＶ８、ＩｄｅＳ、ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ２）、ゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−７（ＭＭＰ−７）、ストロメリシン（ＭＭＰ−３）、およびマクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）からなる群から選択されるプロテアーゼのいずれか１、２、３つ以上（または全て）による開裂に対する減少した感受性を有する。一実施形態において、開裂に対する感受性が減少した抗体は、残基Ｅ２３３−Ｌ２３４および／またはＬ２３５におけるアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。一実施形態において、抗体は、Ｋａｂａｔ残基Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５およびＧ２３６におけるアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。一実施形態において、抗体は、例えば、Ｅ２３３−Ｌ２３４−Ｌ２３５−Ｇ２３６配列がＰ２３３−Ｖ２３４−Ａ２３５（Ｇ２３６は欠失している）により置き換えられるように、１つ以上の残基２３３〜２３８におけるアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。例えば、国際公開第９９／５８５７２号パンフレットおよび国際公開第２０１２０８７７４６号パンフレット参照、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２３】
抗原結合化合物を得たら、それを、ＮＫＧ２ＤとＭＩＣＡ（例えば、膜結合ＭＩＣＡ）との間の相互作用を遮断するその能力、ＮＫまたはＣＤ８Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄの膜結合ＭＩＣＡ誘導下方モジュレーションを阻害するその能力、ＭＩＣＡ発現細胞（例えば、腫瘍細胞）の死滅を引き起こすその能力、ＭＩＣＡ発現標的細胞に対してＡＤＣＣもしくはＣＤＣを誘導するその能力、および／またはＭＩＣＡ発現標的細胞の増殖を阻害し、および／もしくはその排除を引き起こすその能力について評価することができる。
【０１２４】
ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの間の結合を低減させ、またはその相互作用を遮断する抗原結合化合物の能力の評価は、例えば、ＰＣＴ公開の国際公開第２０１３／１１７６４７号パンフレットの実施例におけるように本方法の任意の好適な段階において実施することができる。例えば、ＭＩＣＡを表面上で発現する腫瘍細胞を、ＮＫＧ２Ｄを表面上で発現する細胞（例えば、エフェクター細胞）と、候補抗ＭＩＣＡ抗体を添加してまたは添加せずに接触させることができる。ＭＩＣＡ発現細胞とＮＫＧ２Ｄ発現細胞との間の結合を評価することができ、結合を低減させない抗体を選択する。別の可能性は、単離ＭＩＣＡポリペプチドを単離ＮＫＧ２Ｄポリペプチド、またはＮＫＧ２Ｄポリペプチドを表面において発現する細胞と接触させること、およびＭＩＣＡとＮＫＧ２ＤポリペプチドまたはＮＫＧ２Ｄを発現する細胞との間の結合を評価することを含む。別の可能性は、単離ＮＫＧ２ＤポリペプチドをＭＩＣＡポリペプチドを表面において発現する細胞と接触させること、およびＭＩＣＡポリペプチドまたはＭＩＣＡを発現する細胞との間の結合を評価することを含む。
【０１２５】
例えば、薬剤がＮＫＧ２ＤとのＭＩＣＡ相互作用を遮断するか否かを決定するため、以下の試験を実施する：ＭＩＣＡが形質移入された細胞系Ｃ１ＲまたはＲＭＡを、増加濃度の試験抗ＭＩＣＡｍＡｂの存在下または不存在下で可溶性ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質とインキュベートする。細胞を洗浄し、次いでＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分を認識する二次抗体とインキュベートし、再度洗浄し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で標準的方法により分析する。抗ＭＩＣＡｍＡｂの不存在下で、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質は、Ｃ１ＲまたはＲＭＡ細胞に十分結合する。ＮＫＧ２ＤへのＭＩＣＡ結合を遮断する抗ＭＩＣＡｍＡｂの存在下で、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃの細胞への結合が低減する。
【０１２６】
一実施形態において、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの間の結合を低減させ、またはその相互作用を遮断する抗原結合化合物の能力の評価は、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞（例えば、ＮＫまたはＴ細胞）の機能に対する抗ＭＩＣＡ抗体の効果を評価することにより実施することもできる。任意選択で、ＮＫＧ２Ｄを発現するが、ＣＤ１６を発現しないＮＫまたはＴ細胞を使用してＣＤ１６媒介ＡＤＣＣ効果のいかなる寄与も回避する。抗ＭＩＣＡ抗体がＭＩＣＡ−ＮＫＧ２Ｄ相互作用を低減させ、または遮断する場合、ＮＫまたはＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介活性化を減衰させることが予測される。したがって、ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの結合を低減させず、その相互作用を遮断もしない抗体は、ＮＫまたはＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介活性化を実質的に低減も遮断もしない。これは、例が本明細書に記載の典型的な細胞毒性アッセイにより評価することができる。多数の細胞ベースアッセイのいずれか、例として、遺伝子発現ベース活性、細胞毒性ベースアッセイ、および増幅アッセイを使用してＮＫＧ２Ｄ活性を評価することができる。一態様において、インビトロアッセイは、受容体の発現が細胞の活性を検出可能に変化させ、例えば、ＮＫＧ２Ｄリガンドにより活性化可能とする限り、ヒト患者からのＮＫ細胞もしくはＴ細胞、または例えば、ＮＫＧ２Ｄコードトランス遺伝子が形質移入されたＴ細胞系を使用する。ＮＫＧ２Ｄ活性を反映する任意の好適な生理学的変化を使用して試験化合物または抗体の有用性を評価することができる。例えば、種々の効果、例えば、遺伝子発現、サイトカイン産生、細胞成長、細胞増殖、ｐＨ、細胞内セカンドメッセンジャー、例えば、Ｃａ２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、もしくはｃＡＭＰ、または活性、例えば、細胞毒性活性もしくは他のＴ細胞を活性化させる能力の変化を計測することができる。一実施形態において、受容体の活性は、ＮＫＧ２Ｄ応答遺伝子、例えば、ＣＤ２５、ＩＦＮ−ガンマ、またはＴＮＦ−アルファの発現を検出することにより評価する（例えば、Ｇｒｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＰＮＡＳ  １００：９４５２−９４５７；Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３４：１−１１参照）。一実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ活性は、ＮＫＧ２Ｄ＋ＴまたはＮＫ細胞をＭＩＣＡ発現細胞および抗ＭＩＣＡ抗体の存在下でインキュベートし、ＴまたはＮＫ細胞によるＴＮＦ−アルファまたはＩＦＮ−ガンマの放出を阻害する化合物または試験抗体の能力を評価することにより評価する。
【０１２７】
標的細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介殺傷を評価する例示的な細胞毒性アッセイも、本明細書の実施例に記載される。ここでは、５１Ｃｒの標的細胞放出を計測することにより、ＭＩＣＡ＊００１またはＭＩＣＡ＊００８形質移入Ｃ１Ｒの主要なＮＫ細胞媒介殺傷を低減させ、または阻害する抗ＭＩＣＡ抗体の能力。インビトロ細胞毒性アッセイは、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）の例に記載の当分野において周知の標準的方法により実施する。ＭＩＣＡ発現標的細胞を、５１Ｃｒにより標識してからＮＫ細胞を添加し、次いで殺傷を、殺傷の結果としての細胞から培地への５１Ｃｒの放出に比例して推定する。
【０１２８】
ＡＤＣＣ、ＣＤＣを誘導し、またはそうでなければ（例えば、毒性剤の送達による）ＭＩＣＡ発現標的細胞の活性の排除もしくは阻害をもたらす抗原結合化合物の能力の評価は、任意の好適な段階において実施することができる。この評価は、治療的使用が予定される抗体（または他の化合物）の改変、産生および／または発達に関与する種々のステップの１つ以上において有用であり得る。例えば、活性は、抗原結合化合物を改変する方法、抗原結合化合物を発現する細胞（例えば、組換え抗原結合化合物を発現する宿主細胞）を得、機能抗体（または他の化合物）を産生するその能力について評価する方法、および／またはある量の抗原結合化合物を産生し、（例えば、産物のバッチまたはロットを試験するために）活性について評価すべき方法において評価することができる。一般に、抗原結合化合物は、ＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合することが公知である。このステップは、複数（例えば、高スループットスクリーニング法を使用して極めて多数またはより少数）の抗原結合化合物を試験することを含み得る。
【０１２９】
ＣＤＣおよびＡＤＣＣの試験を実施することができ、種々のアッセイ、例として、本明細書の実験実施例に記載のものにより測定することができる。ＡＤＣＣの試験は、典型的には、結合した抗ＭＩＣＡ抗体を有するＭＩＣＡ発現標的細胞（例えば、癌または他のＭＩＣＡ発現細胞）が補体の関与なしでエフェクター細胞（例えば、Ｆｃ受容体を担持する白血球）により認識される細胞媒介細胞毒性を評価することを含む。ＭＩＣＡ抗原を発現しない細胞を任意選択で対照として使用することができる。ＮＫ細胞の細胞毒性の活性化は、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γ産生）または細胞毒性マーカー（例えば、ＣＤ１０７動員）の増加を計測することにより評価する。任意選択で、抗体は、標的（ＭＩＣＡ発現）細胞の存在下で対照抗体（例えば、ＭＩＣＡに結合しない抗体、ネズミ定常領域を有するＭＩＣＡ抗体）と比較して少なくとも２０％、５０％、８０％、１００％、２００％または５００％のサイトカイン産生、細胞毒性マーカーの発現、または標的細胞溶解の増加を誘導する。別の例において、標的細胞の溶解は、例えば、クロム放出アッセイにおいて検出し、任意選択で、抗体は、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％の溶解を誘導する。
【０１３０】
本発明の抗体の断片および誘導体（特に記載がなくまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、本出願において使用される用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」により包含される）は、当分野において公知の技術により産生することができる。「断片」は、インタクト抗体の一部、一般に抗原結合部位または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；連続アミノ酸残基の不断配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体断片（本明細書において「単鎖抗体断片」または「単鎖ポリペプチド」と称される）が挙げられる。
【０１３１】
一態様において、本明細書の実施形態のいずれかの抗体の超可変領域（例えば、ＶＨおよびＶＬ）および目的抗原（ＭＩＣＡ以外）に結合する超可変領域（例えば、ＶＨおよびＶＬ）を含む多重特異的（例えば、二重特異的）抗体または抗原結合タンパク質が提供される。一態様において、目的抗原は、免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞）の表面において発現される受容体（例えば、活性化受容体）である。一態様において、超可変領域を含むタンパク質またはポリペプチドが提供される。
【０１３２】
細胞により発現される本開示の抗体または抗体断片、およびそれらを使用する癌の治療方法も包含される。例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞を構築することができる。ＣＡＲは、典型的には、Ｔ細胞抗原受容体複合体ゼータ鎖の細胞内シグナリングドメインに融合している細胞外単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含み、エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞により発現された場合にモノクローナル抗体の特異性に基づく抗原認識を再指向する能力を有するように遺伝子操作する。一態様において、一般に、細胞表面膜上で、細胞内シグナリングドメイン、膜貫通ドメイン（ＴＭ）およびＭＩＣＡ特異的細胞外ドメイン（例えば、抗体または抗体断片またはＭＩＣＡに特異的に結合するモノクローナル抗体の可変重鎖および軽鎖領域に由来し、またはそれを含むドメイン）を含むＭＩＣＡ特異的キメラ免疫受容体を発現し、担持する遺伝子操作された免疫細胞が提供される。一実施形態において、ＶＨおよびＶＬは、ＶＨおよびＶＬまたは本開示である。ＭＩＣＡ特異的キメラ免疫受容体、その受容体をコードするＤＮＡ構築物、およびその構築物を発現に適切な方向で含有するプラスミド発現ベクターも提供される。
【０１３３】
抗ＭＩＣＡ抗体は、医薬配合物中に１ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で取り込むことができ、前記配合物は、２．０〜１０．０のｐＨを有する。配合物は、緩衝液系、保存剤、等張化剤、キレート化剤、安定剤および表面活性剤をさらに含み得る。一実施形態において、医薬配合物は、水性配合物、すなわち、水を含む配合物である。そのような配合物は、典型的には、液剤または懸濁液である。さらなる実施形態において、医薬配合物は、水性液剤である。用語「水性配合物」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む配合物として定義される。同様に、用語「水性液剤」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む液剤として定義され、用語「水性懸濁液」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液として定義される。別の実施形態において、医薬配合物は、医師または患者が使用前に溶媒および／または希釈剤を添加する凍結乾燥配合物である。別の実施形態において、医薬配合物は、いかなる事前の溶解も不要の即時使用の乾燥配合物（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥）である。さらなる態様において、医薬配合物は、そのような抗体の水溶液、および緩衝液を含み、抗体は、１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で存在し、前記配合物は、約２．０〜約１０．０のｐＨを有する。別の実施形態において、配合物のｐＨは、約２．０〜約１０．０、約３．０〜約９．０、約４．０〜約８．５、約５．０〜約８．０、および約５．５〜約７．５からなるリストから選択される範囲である。さらなる実施形態において、緩衝液は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸またはそれらの混合物からなる群から選択される。これらの規定の緩衝液のそれぞれのものは、代替実施形態を構成する。さらなる実施形態において、配合物は、薬学的に許容可能な保存剤をさらに含む。さらなる実施形態において、配合物は、等張剤をさらに含む。さらなる実施形態において、配合物は、キレート化剤も含む。さらなる実施形態において、配合物は、安定剤をさらに含む。さらなる実施形態において、配合物は、界面活性剤をさらに含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５が簡便に参照される。他の成分がペプチド医薬配合物中に存在し得ることが考えられる。そのような追加の成分としては、湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、増量剤、等張性改変剤、キレート化剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチンまたはタンパク質）および両性イオン（例えば、アミノ酸、例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジンおよびヒスチジン）を挙げることができる。そのような追加の成分は、無論、医薬配合物の全安定性に悪影響を与えるべきではない。
【０１３４】
抗体を含有する医薬組成物は、そのような治療が必要とされる患者に、いくつかの部位において、例えば、局所部位、例えば、皮膚および粘膜部位において、吸収を避ける部位において、例えば、動脈中、静脈中、心臓中の投与で、ならびに吸収を伴う部位において、例えば、皮膚中、皮膚下、筋肉中、または腹部中の投与で投与することができる。医薬組成物の投与は、そのような治療が必要とされる患者に対する、いくつかの投与経路、例えば、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、舌、舌下、頬、口腔内、経口、胃および小腸内、鼻腔、肺を介するもの、例えば、細気管支および肺胞またはその組合せ、上皮、皮膚、経皮、膣、直腸、眼球、例えば、結膜、尿管、および非経口を介するものであり得る。
【０１３５】
悪性腫瘍の診断および治療
一態様において、細胞の表面上のＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合する本開示による抗原結合剤（例えば、抗体）を含む医薬組成物が提供される。抗体は、一実施形態において、細胞の成長もしくは活性（例えば、免疫抑制活性）を阻害し、ならびに／またはＭＩＣＡ陽性細胞の排除を、任意選択で、ＣＤＣおよび／もしくはＡＤＣＣの誘導を介してもたらす。組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【０１３６】
一態様において、ＭＩＣＡ陽性細胞の成長もしくは活性の阻害、および／またはその枯渇が必要とされるヒト個体におけるＭＩＣＡ陽性細胞の成長もしくは活性を阻害し、および／またはそれを枯渇させる方法であって、前記個体に、本開示による組成物を投与するステップを含む方法が提供される。そのような治療方法は、多数の障害、例として、限定されるものではないが、癌の治療に使用することができる。
【０１３７】
一態様において、ＭＩＣＡ陽性免疫細胞、任意選択でＭＤＳＣまたはＭ２マクロファージ、任意選択で腫瘍浸潤免疫抑制免疫細胞の免疫抑制活性の排除または阻害が必要とされるヒト個体におけるＭＩＣＡ陽性免疫細胞、任意選択でＭＤＳＣまたはＭ２マクロファージ、任意選択で腫瘍浸潤免疫抑制免疫細胞の免疫抑制活性を排除または阻害する方法であって、前記個体に、本開示による組成物を投与するステップを含む方法が提供される。
【０１３８】
一態様において、ＭＩＣＡ陽性癌細胞の免疫抑制活性の排除および／または低減が必要とされるヒト個体におけるＭＩＣＡ陽性癌細胞の免疫抑制活性を排除し、および／または低減させる方法であって、前記個体に、本開示による組成物を投与するステップを含む方法が提供される。
【０１３９】
一実施形態において、同一の投与レジメンを使用し、細胞がＭＩＣＡ＊００１を発現する個体、細胞がＭＩＣＡ＊００４を発現する個体、細胞がＭＩＣＡ＊００７を発現する個体、および細胞がＭＩＣＡ＊００８を発現する個体を治療する。一実施形態において、投与レジメンは、個体（または個体の腫瘍）において発現されるＭＩＣＡの特定のアレルに関係なく、同一の投与方式、同一の投与量および同一の投与頻度を含む。
【０１４０】
一態様において、治療の方法は、個体に、ＭＩＣＡに結合する抗原結合化合物を治療有効量で含む組成物を投与することを含む。治療有効量は、例えば、インビボでのＭＩＣＡ細胞の枯渇、もしくはその枯渇の増加、またはＭＩＣＡ発現腫瘍細胞に対するＮＫＧ２Ｄ＋エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞）の活性化、反応性、細胞毒性および／もしくはＩＦＮγ産生の頻度の増加を引き起こすために十分な量であり得る。治療有効量は、例えば、ＮＫ細胞および／またはＴ細胞活性のＭ２マクロファージ媒介抑制を克服し、または低減させるために十分な量であり得る。別の例において、治療有効量は、例えば、ＮＫ細胞および／もしくはＴ細胞活性の骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）媒介抑制を克服し、もしくは低減させるために十分な量、または例えば、腫瘍組織中で骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）および／もしくはＭ２マクロファージを排除するために十分な量であり得る。
【０１４１】
方法は、有利には、癌および他の増殖疾患、例として、限定されるものではないが、癌種、例として、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌）、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、頸癌、甲状腺癌および皮膚癌、例として、扁平上皮癌腫；リンパ球系の造血腫瘍、例として、白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫およびバーキットリンパ腫；骨髄細胞系の造血腫瘍、例として、急性および慢性骨髄性白血病、ならびに前骨髄球性白血病；間葉起点の腫瘍、例として、線維肉腫および横紋筋肉腫；他の腫瘍、例として、神経芽細胞腫および神経膠腫；中枢神経系および末梢神経系の腫瘍、例として、星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫および神経鞘腫；間葉起点の腫瘍、例として、線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫；ならびに他の腫瘍、例として、黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌、および奇形癌の治療に利用される。治療することができる他の例示的障害としては、リンパ球系の造血腫瘍、例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞腫瘍、例として、限定されるものではないが、Ｔ細胞障害、例えば、Ｔ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、例として、小細胞および脳状細胞タイプのもの；任意選択で、Ｔ細胞タイプの大型顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病性リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄＴ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫（多形性および免疫芽球性亜型）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心性（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；未分化（Ｋｉ１＋）大細胞リンパ腫；腸Ｔ細胞リンパ腫；Ｔリンパ芽球性；およびリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）が挙げられる。
【０１４２】
一部の実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗体または組成物の投与前に、患者の細胞上（例えば、腫瘍細胞）上のＭＩＣＡの存在を評価し、例えば、患者中のＭＩＣＡ陽性細胞の相対レベルおよび活性を測定し、患者の細胞への抗体の結合効力を確認する。次いで、腫瘍細胞がＭＩＣＡを発現する患者を、抗ＭＩＣＡ抗体または組成物により治療することができる。このことは、障害の部位からｓＰＢＬまたは腫瘍細胞の試料を得、例えば、イムノアッセイを使用して試験してＭＩＣＡおよび任意選択で細胞上のさらなる他のマーカーの相対的優位性を測定することにより達成することができる。他の方法、例えば、ＲＮＡベースの方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはノザンブロッティングを使用してＭＩＣＡおよび他の遺伝子の発現を検出することもできる。任意選択で、ＭＩＣＡを表面において発現する腫瘍細胞の存在についてのマーカーとして可溶性ＭＩＣＡを使用する。一実施形態において、個体から血清試料を得、可溶性ＭＩＣＡの存在を評価し、個体からの血清中の可溶性ＭＩＣＡの検出は、その個体が、表面におけるＭＩＣＡ（膜結合ＭＩＣＡ）を発現する腫瘍細胞を含む腫瘍を有することを示す。
【０１４３】
一実施形態において、患者のＭＩＣＡ陽性細胞の活性もしくは成長を阻害し、またはその細胞を枯渇させることが求められる場合、患者のＭＩＣＡ陽性細胞の増殖を阻害し、またはその細胞を枯渇させる抗ＭＩＣＡ抗体の能力を評価する。ＭＩＣＡ陽性細胞を抗ＭＩＣＡ抗体または組成物により枯渇させる場合、患者を抗ＭＩＣＡ抗体または組成物による治療に応答性であることを決定し、任意選択で、患者を抗ＭＩＣＡ抗体または組成物により治療する。
【０１４４】
治療は、抗ＭＩＣＡ抗体または化合物投与の複数のラウンドを含み得る。例えば、投与の初回ラウンド後、（例えば、個体の血清中の可溶性ＭＩＣＡの存在および／またはレベルを検出することにより）個体中のＭＩＣＡ発現細胞のレベルおよび／または活性を一般に再計測し、依然として上昇している場合、投与の追加のラウンドを実施することができる。このようにして、ＭＩＣＡ検出および抗体または化合物投与の複数ラウンドを、例えば、障害が管理下になるまで実施することができる。
【０１４５】
一部の実施形態において、本方法は、前記患者に、免疫調節剤、ホルモン剤、化学療法剤、またはＭＩＣＡ発現細胞上に存在するポリペプチドに結合する二次抗体（例えば、枯渇抗体）から選択される適切な追加（第２）の治療剤を投与する追加のステップを含み得る。そのような追加の薬剤は、前記患者に、前記抗体と一緒に単一剤形として、または別個の剤形として投与することができる。抗体の投与量（または集合的に抗体および追加の治療剤の投与量）は、患者における治療応答を検出可能に誘導し、促進し、および／または向上させるために十分である。別個に投与する場合、抗体、断片、または誘導体および追加の治療剤は、望ましくは、患者に検出可能な併用治療利益をもたらす（例えば、タイミング、用量数などに関する）条件下で投与する。
【０１４６】
腫瘍（例えば、固形腫瘍）治療のため、例えば、本開示の抗ＭＩＣＡ抗体組成物の投与は、古典的なアプローチ、例えば、手術、放射線療法、化学療法などとの組合せで使用することができる。したがって、本開示は、本抗体を手術または放射線治療と同時に、その前もしくはその後に使用し；または慣用の化学療法剤、放射線療法剤もしくは抗血管新生剤、もしくは標的化免疫毒素もしくはコアギュリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）とともに、その前もしくはその後に患者に投与する併用療法を提供する。
【０１４７】
例示的な抗癌抗血管新生剤は、受容体チロシンキナーゼ、例として、限定されるものではないが、ＦＧＦＲ（線維芽細胞成長因子受容体、ＦＧＦ−１，２）、ＰＤＧＦＲ（血小板由来成長因子受容体）、アンギオポエチン受容体（Ａｎｇ−１，２）、ＨＧＦＲ（肝細胞成長因子受容体）、エフリン受容体（Ｅｐｈ）、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ−２，３ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、ＣＳＦ−１Ｒ、ＭＥＴ、Ｆｌｔ−３、ｃ−Ｋｉｔ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ｐ３８アルファおよびＦＧＦＲ−１によるシグナリングを阻害する。さらなる抗血管新生剤としては、ＶＥＧＦ発現および産生の種々の調節物質、例えば、ＥＧＦＲ、ｆｌｔ−１、ＫＤＲ、ＨＥＲ−２、ＣＯＸ−２、またはＨＩＦ−１αの１つ以上を阻害する薬剤を挙げることができる。別の好ましいクラスの薬剤としては、ＩＭｉＤ（免疫調節薬）、広範な効果、例として、免疫および非免疫関連効果の両方を有するサリドマイドに由来するアナログが挙げられる。ＩＭｉＤクラスの代表例としては、ＣＣ−５０１３（レナリドミド、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（商標））、ＣＣ−４０４７（Ａｃｔｉｍｉｄ（商標））、およびＥＮＭＤ−０９９５が挙げられる。別のクラスの抗血管新生剤としては、シレンギチド（ＥＭＤ１２１９７４、インテグリン阻害剤）、メタロプロテイナーゼ（ＭＰＰ）、例えば、マリナスタット（ｍａｒｉｎａｓｔａｔ）（ＢＢ−２５１）が挙げられる。別のクラスの抗血管新生剤としては、ファルネシル化阻害剤、例えば、ロナファルニブ（Ｓａｒａｓａｒ（商標））、チピファルニブ（Ｚａｒｎｅｓｔｒａ（商標））が挙げられる。他の抗血管新生剤、例えば、ベバクジマブ（Ｂｅｖａｃｕｚｉｍａｂ）（ｍＡｂ、阻害ＶＥＧＦ−Ａ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ＩＭＣ−１１２１Ｂ（ｍＡｂ、阻害ＶＥＧＦＲ−２、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＣＤＰ−７９１（ペグ化ＤｉＦａｂ、ＶＥＧＦＲ−２、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；２Ｃ３（ｍＡｂ、ＶＥＧＦ−Ａ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＶＥＧＦトラップ（可溶性ハイブリッド受容体ＶＥＧＦ−Ａ、ＰｌＧＦ（胎盤成長因子）Ａｖｅｎｔｉｓ／Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）も、好適であり得る。別の好ましいクラスの薬剤としては、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）クラス、例として、例えば、ＰＴＫ−７８７（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、バタラニブ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＡＥＥ７８８（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−２およびＥＧＦＲ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＺＤ６４７４（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３、ＥＧＦＲ、Ｚａｃｔｉｍａ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＡＺＤ２１７１（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＳＵ１１２４８（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、ＰＤＧＦＲ、スニチニブ、Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＧ１３９２５（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＧ０１３７３６（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、Ｐｆｉｚｅｒ）；ＣＥＰ−７０５５（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３、Ｃｅｐｈａｌｏｎ）；ＣＰ−５４７，６３２（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、Ｐｆｉｚｅｒ）；ＧＷ７８６０２４（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ＧＷ７８６０３４（ＴＫＩ、��ＥＧＦＲ−１、−２、−３、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ソラフェニブ（ＴＫＩ、Ｂａｙ４３−９００６、ＶＥＧＦＲ−１、−２、ＰＤＧＦＲ  Ｂａｙｅｒ／Ｏｎｙｘ）；ＳＵ４３１２（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、Ｐｆｉｚｅｒ）、ＡＭＧ７０６（ＴＫＩ、ＶＥＧＦＲ−１、−２、−３、Ａｍｇｅｎ）、ＸＬ６４７（ＴＫＩ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＶＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ４、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＸＬ９９９（ＴＫＩ、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、Ｆｌｔ−３、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＫＣ４１２（ＴＫＩ、ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲ、ＰＫＣ、ＦＬＴ３、ＶＥＧＦＲ−２、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＥＥ７８８（ＴＫＩ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＶＥＧＦＲ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＯＳＩ−９３０（ＴＫＩ、ｃ−ｋｉｔ、ＶＥＧＦＲ、ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＯＳＩ−８１７（ＴＫＩ、ｃ−ｋｉｔ、ＶＥＧＦＲ、ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＤＭＰＱ（ＴＫＩ、ＥＲＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ｅｒｂＢ２、ｐ５６、ｐｋＡ、ｐｋＣ）、ＭＬＮ５１８（ＴＫＩ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＣＴ５３５１８、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、レスタウリニブ（ｌｅｓｔａｕｒｉｎｉｂ）（ＴＫＩ、ＦＬＴ３、ＣＥＰ−７０１、Ｃｅｐｈａｌｏｎ）、ＺＤ１８３９（ＴＫＩ、ＥＧＦＲ、ゲフィチニブ、Ｉｒｅｓｓａ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＯＳＩ−７７４（ＴＫＩ、ＥＧＦＲ、エルロチニブ、Ｔａｒｃｅｖａ、ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ラパチニブ（ＴＫＩ、ＥｒｂＢ−２、ＥＧＦＲ、ＧＤ−２０１６、Ｔｙｋｅｒｂ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）が挙げられる。ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＰＤＧＦＲ−α、β、Ｆｌｔ−３、ｃ−Ｋｉｔ、ｐ３８アルファ、ＭＥＴ、ｃ−ＲＡＦ、ｂ−ＲＡＦ、ｂｃｒ／ａｂｌおよびＦＧＦＲ−１からなる群から選択される１つ以上の受容体チロシンキナーゼを阻害するチロシンキナーゼ阻害剤の例。
【０１４８】
一実施形態において、第２の薬剤は、エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞）活性化受容体の天然リガンドまたはＮＫＧ２Ｄ以外のＮＫ細胞活性化受容体に結合し、その受容体を活性化させる抗体である。一実施形態において、薬剤は、標的細胞（例えば、感染細胞、腫瘍細胞、炎症促進細胞）の表面上のＮＫＧ２Ｄ以外のＮＫ細胞活性化受容体の天然リガンドの存在を増加させる薬剤である。ＮＫ細胞活性化受容体としては、例えば、天然細胞毒性受容体、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４または活性化ＫＩＲ受容体（ＫＩＲ２ＤＳ受容体、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４）が挙げられる。本明細書において使用される用語「活性化ＮＫ受容体」は、刺激された場合、ＮＫ活性に関連する当分野において公知の任意の特性または活性の計測可能な増加、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α産生、細胞内遊離カルシウムレベル、例えば、本明細書の他箇所に記載の再指向殺傷アッセイにおいて細胞を標的化する能力、またはＮＫ細胞増殖を刺激する能力の増加を引き起こすＮＫ細胞の表面上の任意の分子を指す。用語「活性化ＮＫ受容体」としては、限定されるものではないが、活性化形態またはＫＩＲタンパク質（例えば、ＫＩＲ２ＤＳタンパク質）、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１８ＲおよびＩＬ−２１Ｒが挙げられる。
【０１４９】
一実施形態において、抗癌剤は、腫瘍細胞の表面上のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を上方調節する化学療法剤または放射線である。これとしては、周知の化学療法、例として、イオン化およびＵＶ照射、ＤＮＡ複製の阻害剤、ＤＮＡポリメラーゼの阻害剤、クロマチン改変処理、ならびにアポトーシス誘導剤、例えば、ＨＤＡＣ阻害剤トリコスタチンＡおよびバルプロ酸が挙げられる。好ましい治療は、ＤＮＡ損傷応答経路を活性化させるもの、例えば、ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症変異）もしくはＡＴＲ（ＡＴＭ−およびＲａｄ３関連）タンパク質キナーゼ、もしくはＣＨＫ１、またはさらにＣＨＫ２もしくはｐ５３を活性化させるものである。後者の例としては、イオン化放射、ＤＮＡ複製の阻害剤、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤およびクロマチン改変剤または処理、例として、ＨＤＡＣ阻害剤が挙げられる。ＮＫＧ２Ｄリガンドを上方調節する組成物は、Ｇａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３６（７０５４）：１１８６−９０にさらに記載されている。ＮＫＧ２Ｄは、数あるリガンドのうち、ＭＨＣクラスＩ関連ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ糖タンパク質と相互作用する活性化受容体である。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ（Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：７２７−７２９、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）は、抗原提示における役割を有さず、一般に、腸管上皮中にのみ見出され、ウイルスおよび細菌感染、悪性形質転換、ならびに増殖により許容タイプの細胞中でストレス誘導され得る。ＮＫＧ２Ｄは、ＣＤ２８と類似する会合ＤＡＰ１０アダプタータンパク質を介してシグナリングするＣ型レクチン様活性化受容体である。それは、ほとんどのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞ＣＤ８Ｔ細胞およびＴ細胞上で発現されるが、一般に、ＣＤ４Ｔ細胞上では発現されない。他のＮＫＧ２Ｄリガンドとしては、例えば、最初はヒトサイトメガロウイルス糖タンパク質ＵＬ１６についてのリガンドとして同定されたＵＬＢＰタンパク質、例えば、ＵＬＢＰ−１、−２、−３、−４、−５および−６が挙げられる（Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，（２００１）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １４：１２３−１３３、およびＲａｕｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ，（２０１３）Ａｎｎ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３１：４１３−４１、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１５０】
さらなる抗癌剤としては、アルキル化剤、細胞毒性抗生物質、例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、植物誘導体、ＲＮＡ／ＤＮＡ代謝拮抗剤、および抗有糸分裂剤が挙げられる。好ましい例としては、例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロスウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、タキソール、ゲムシタビン、ナベルビン、トランス白金（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサート、または上記の任意のアナログもしくは誘導体バリアントを挙げることができる。
【０１５１】
治療方法において、本開示の抗ＭＩＣＡ抗体および第２の治療剤は、別個に、一緒に、もしくは連続的に、またはカクテルで投与することができる。一部の実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗体は、第２の治療剤の投与前に投与する。例えば、抗ＭＩＣＡ抗体は、第２の治療剤の投与の約０〜３０日前に投与することができる。一部の実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗体は、第２の治療剤の投与の約３０分〜約２週間、約３０分〜約１週間、約１時間〜約２時間、約２時間〜約４時間、約４時間〜約６時間、約６時間〜約８時間、約８時間〜１日、または約１〜５日前に投与する。一部の実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗体は、治療剤の投与と同時に投与する。一部の実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗体は、第２の治療剤の投与後に投与する。例えば、抗ＭＩＣＡ抗体は、第２の治療剤の投与の約０〜３０日後に投与することができる。一部の実施形態において、抗ＭＩＣＡ抗体は、第２の治療剤の投与の約３０分〜約２週間、約３０分〜約１週間、約１時間〜約２時間、約２時間〜約４時間、約４時間〜約６時間、約６時間〜約８時間、約８時間〜１日、または約１〜５日後に投与する。
【０１５２】
本開示の抗ＭＩＣＡ抗体は、キットに含めることができる。キットは、任意選択で、任意数の抗体および／または他の化合物、例えば、１、２、３、４、または他の任意数の抗ＭＩＣＡ抗体および／または他の化合物をさらに含有し得る。キットの内容物についての本説明が決して限定されるものではないことが理解される。例えば、キットは、他のタイプの治療または診断剤を含有し得る。キットは、例えば本明細書に記載の方法を詳述する、抗体および／または薬剤を使用するための説明書も含み得る。
【実施例】
【０１５３】
実施例１
改変抗ＭＩＣＡ抗体の産生
以下に示されるＶＨおよびＶｋ可変領域を有する抗体を、本明細書に記載のヒトフレームワークおよびネズミＫａｂａｔ  ＣＤＲを有するヒトＩｇＧ１抗体として産生した。簡潔に述べると、それぞれの抗体のＶＨおよびＶｋ配列を、ｈｕＩｇＧ１由来定常ドメインおよびｈｕＣｋ定常ドメインをそれぞれ含有するベクター中にクローニングした。２つの得られたベクターをＣＨＯ細胞系中に同時形質移入した。樹立された細胞プールを使用して抗体をＣＨＯ培地中で産生した。次いで、プロテインＡを使用して抗体を精製した。
【０１５４】
異なるヒトＶＨ遺伝子セグメントに基づく３Ｄモデルを重ね合わせ、全てのアミノ酸の差異を１つずつ精査した。
【０１５５】
軽鎖のＣＤＲ１の位置決めに影響し得る塩橋の導入がＭＩＣＡへの結合に順次影響し得るか否かを調査するため、軽鎖中の残基Ｆ７１（Ａｂｍ番号付与）を、トリペプチドＤＦＴ内でチロシン（Ｙ）により置換し、ＤＹＴとした（Ｆ７１Ｙ置換）。ＣＤＲ＿Ｌ１ループ直下の残基７１におけるＹによるＦの置換は、ＣＤＲ残基とのＨ結合を形成し得る。
【０１５６】
さらに、さらなるバリアント軽鎖において、二重置換（Ｓ７０Ｄ／Ｆ７１Ｙ置換）を作製してＤ７０をＳ７０（Ａｂｎｕｍ番号付与）により置き換え、依然としてＴ７２の置換を用いず；したがって、得られたＡｂｎｕｍ残基７０〜７２におけるトリペプチドをＳＹＴからＤＦＴに変化させた。最後に、残基８３（Ａｂｍ番号付与）における置換を、単一Ｆ７１Ｙ置換を導入した軽鎖のバリアント中で作製した。Ｖ８３基はＶＬ／ＣＫ界面において露出される一方、Ｆ８３基はＶＬドメインの疎水性空孔内側に埋め込まれる。
【０１５７】
重鎖においては、Ａｂｎｕｍ残基３０における置換（Ｓ３０Ｔ置換、フレームワーク１）およびＡｂｎｕｍ残基７１における置換（Ｖ７１Ｒ置換、フレームワーク３）を全て有する４つのバリアント鎖を構築し、ネズミ抗体中に存在する残基をヒト配列中の残基について置換した。残基３０は、抗原に面し得るＣＤＲフランキング残基である。残基７１は、ＣＤＲ＿Ｈ２ループの頂部直下の重要な位置を占め、ＣＤＲ＿Ｈ２残基とのｈ結合を形成する。
【０１５８】
これらのバリアント鎖の３つ（鎖２、３および４）において、フレームワーク２中にＡｂｎｕｍ残基４８においてさらなる置換を導入した。イソロイシンをメチオニンにより置換した（Ｉ４８Ｍ置換）。Ｍ４８は、ＣＤＲ＿Ｈ２直下に局在するＶｅｒｎｉｅｒ帯域残基である。これは、ネズミ抗体中の隣接残基とのいかなるｈ結合も形成しない一方、Ｖｅｒｎｉｅｒ帯域残基はＣＤＲ位置決めに重要であり得る。
【０１５９】
さらに、２つのバリアント重鎖（鎖３および４）において、さらなるフレームワーク３置換をＡｂｎｕｍ残基７２ｃにおいて作製した（Ｋ７２ｃＥ置換）。Ｋ７２ｃは、ネズミフレームワーク中のＱ７４とのＨ結合を形成する。Ｅ７２ｃおよびＫ７２ｃは、主にＫ７２ｃとＱ７４との間で形成されるｈ結合のため多様な立体構造を示す。したがって、考えられる塩橋は、残基７２〜７４において除去された。
【０１６０】
最後に、１つのバリアント重鎖（鎖４）において、さらなるフレームワーク３置換をＡｂｎｕｍ残基６７において作製した（Ｖ６７Ｉ置換）。Ｉ６７は、ＣＤＲ＿Ｈ２の下方に局在するＶｅｒｎｉｅｒ帯域残基である。
【０１６１】
軽鎖において、Ａｂｎｕｍ残基７０、７１および８３は、配列表（例えば、配列番号７または９）の７１、７２および８４位における残基にそれぞれ対応する。重鎖において、Ａｂｎｕｍ残基３０、４８、６７、７１、７２ｃおよび７４は、配列表（例えば、配列番号６または８）の３０、４９、６８、７２、７６および７８位における残基にそれぞれ対応する。
【０１６２】
それぞれの重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を以下の表２に示す。
【０１６３】
【表４】
2019517993.tif 000007
【０１６４】
【表５】
2019517993.tif 000008
【０１６５】
実施例２
ＭＩＣＡアレルへの結合
実施例１の表２の抗体の結合を、Ｃ１Ｒ−ＭＩＣＡ＊００１、Ｃ１Ｒ−ＭＩＣＡ＊００４、Ｃ１Ｒ−ＭＩＣＡ＊００７およびＣ１Ｒ−ＭＩＣＡ＊００８と称されるＳａｌｉｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２（４）：１３８９−９１３９６に記載のＲＳＶ．５ｎｅｏベクター（ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）、アクセッション番号Ｍ８３２３７のもの）が形質移入されたＭＩＣＡ発現Ｃ１Ｒ形質移入細胞（ＡＴＣＣ参照番号ＣＲＬ−１９９３（商標））への結合について試験した。結合をフローサイトメトリーにより分析した。
【０１６６】
フローサイトメトリー。細胞を回収し、ＰＢＳ１×／ＢＳＡ０，２％／ＥＤＴＡ２ｍＭの緩衝液中である用量範囲の抗ＭＩＣＡｍＡｂを使用して４℃において３０分の間染色した。染色緩衝液中での２回の洗浄後、細胞をマウス抗ヒトＩｇＧ１−ＰＥモノクローナル抗体（１／１１）により４℃において３０分間染色した。２回の洗浄後、染色をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ上で得、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。
【０１６７】
結果。表３の抗体のそれぞれは、ＭＩＣＡアレルの全てにわたり高い親和性結合を示した。しかしながら、驚くべきことに、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２は、ＭＩＣＡアレル＊０１、＊０４および＊０７についての結合親和性の特に強力な改善を示した。ＭＩＣＡ＊０１についての親和性は、ネズミ親ＶＨおよびＶＬを有し、ｍＡｂ１〜１２および他のヒトフレームワーク抗体と同一のヒト定常領域を共有する親抗体と比較して２倍超（ｍＡｂ１について２．４倍、ｍＡｂ２について約３倍）だけ改善された。ｍＡｂ３も、親キメラ抗体と比較して改善された結合親和性を示したが、ｍＡｂ１および２よりも小さい程度であった。結果を以下の表３に示す。
【０１６８】
ｍＡｂ１、２および３は、全て、リジン（Ｋ）が７２ｃ位（Ａｂｎｕｍ）に存在する重鎖を共有する。この位置におけるリジン酸は、残基７２ｃと７４との間の塩橋を導入し得る。塩橋は、ＶＨ中の残基７２ｃにおけるグルタミン酸（Ｅ）を有する種々の他のｍＡｂにおいて使用された他の重鎖において導入されなかった。ｍＡｂ１、２および３の重鎖は、４８位におけるイソロイシンをさらに有する。ｍＡｂ１および２は、チロシン（Ｙ）がＣＤＲＬ１ループ直下の７１位（Ａｂｍ番号付与）においてフェニルアラニンを置き換えてＣＤＲ残基との考えられる塩橋（Ｈ結合）を形成し、それによりＣＤＲの位置決めを変化させると考えられる軽鎖を使用した。ｍＡｂ３は、フェニルアラニン（Ｆ）がｍＡｂ１および２中のＶＬ中の８３位に存在する一方、ｍＡｂ３は軽鎖中の８３位（Ａｂｎｕｍ番号付与）におけるバリン（Ｖ）を有するという点でｍＡｂ１および２と異なる。
【０１６９】
【表６】
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【０１７０】
実施例３
抗体は、ＡＤＣＣを介してＭＩＣＡ発現標的を殺傷し得る
ｍＡｂを、ＭＩＣＡ＊００８（Ｃ１Ｒ−ＭＩＣＡ＊００８）またはＭＩＣＡ＊００１（Ｃ１Ｒ−ＭＩＣＡ＊００１）が形質移入されたＣ１Ｒ腫瘍細胞に対するＡＤＣＣを媒介するその能力について試験した。
【０１７１】
手短に述べると、ヒトＣＤ１６（Ｆアイソフォーム）が形質移入されたヒトＮＫ細胞系ＫＨＹＧ−１の細胞溶解活性を、（Ｇｒｅｉｎｅｒ）からのＶ底９６ウェルプレート中で古典的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて評価した。手短に述べると、Ｃ１Ｒ−ＭＩＣＡ＊００８細胞を５１Ｃｒ（１００μＣｉ（３．７ＭＢｑ）／１×１０６個の細胞）により標識し、次いでｈＣＤ１６Ｆ（ヒトＩｇＧ１に結合させるため）が形質移入されたＫＨＹＧと、１０に等しいエフェクター／標的比において示される濃度における抗体の存在下で混合した。短時間の遠心分離および３７℃における４時間のインキュベーション後、５０μＬの上清を取り出し、５１Ｃｒ放出をＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴベータ検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）により計測した。全ての実験群をトリプリケートで分析し、特異的溶解の割合を以下のとおり決定した：１００×（平均ｃｐｍ実験放出−平均ｃｐｍ自発放出）／（平均ｃｐｍ全放出−平均ｃｐｍ自発放出）。全放出の割合は２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）における標的細胞の溶解により得た。
【０１７２】
ｍＡｂ１についての結果を図１に示す。ｍＡｂ１およびキメラ親抗体は、それぞれ、陰性対照（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体）と比較してヒトＫＨＹＧ−１ｈＣＤ１６ＦＮＫ細胞系によるＣ１Ｒ−ＭＩＣＡ＊００８および＊００１細胞の特異的溶解を誘導し、それにより、それらの抗体がＭＩＣＡ＊００８および＊００１発現標的細胞に対するＡＤＣＣを誘導することを示した。標的細胞溶解の程度は細胞への抗体結合に相関し（図１）；ｍＡｂ１は、キメラ親抗体よりもいくらか大きい＊００１細胞の特異的溶解を誘導した。
【０１７３】
実施例４
抗ＭＩＣＡ抗体は、ＮＫ細胞活性のＭ２マクロファージ媒介抑制を克服する
ＮＫ細胞を、自己インビトロ単球由来Ｍ１またはＭ２マクロファージと２４時間インキュベートした。次いで、非接着ＮＫ細胞を含有する培養上清を、ＭＩＣＡ＊００１が形質移入されたＬＣＬ−７２１．２２１細胞（ＥＢＶ形質移入Ｂ細胞系）（ＬＣＬ−７２１．２２１−ＭＩＣＡ＊００１細胞）とさらに２４時間インキュベートした。ＮＫ上の活性化マーカーＣＤ１３７をフローサイトメトリーにより計測した。抗ＭＩＣＡ抗体ｍＡｂ１またはアイソタイプ対照（ＩＣ）を１０μｇ／ｍＬにおいて使用した。
【０１７４】
結果を図２に示す。平均＋／−ＳＤ、ｎ＝４〜７の独立健常ドナー。抗ＭＩＣＡｍＡｂ１は、Ｍ１またはＭ２マクロファージを用いるまたは用いない腫瘍細胞を含め７２１．２２１−ＭＩＣＡ＊００１腫瘍細胞に対するＮＫ細胞活性化の強力な増加を引き起こした。腫瘍細胞およびＮＫ細胞とＭ２マクロファージとのインキュベーションは、ｍＡｂ１の存在下でＮＫ細胞活性化の実質的な減少を引き起こさなかった。対照的に、アイソタイプ対照において、ＮＫ活性化が一般にかなり低いだけでなく、腫瘍細胞およびＮＫ細胞とＭ２マクロファージとのインキュベーションもＮＫ活性化の強力な減少を引き起こした。
【０１７５】
実施例５
ネズミＲａｊｉ腫瘍モデルにおける抗ＭＩＣＡ抗体のインビボ効力
第１部：静脈内投与、単回投与
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、ＭＩＣＡ＊００１が形質移入されたＲａｊｉヒトバーキットリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ−ＭＩＣＡ＊００１細胞）を静脈内（ｉ．ｖ．）移植し、同日に１μｇ、１０μｇ、５０μｇもしくは１００μｇの抗ＭＩＣＡｍＡｂ１または示される用量（μｇ／マウス、ｉ．ｖ．）のアイソタイプ対照（ＩＣ）の単回注射により処理した。
【０１７６】
結果を図３に示す。アイソタイプ対照または１μｇの抗ＭＩＣＡ抗体ｍＡｂ１を受けたほとんどのマウスが注射後１００日間生存しなかった一方、少なくとも１０μｇの抗ＭＩＣＡ抗体を受けたマウスにおいて有意に改善された生存期間が観察された。１００μｇの用量において、抗ＭＩＣＡ抗体ｍＡｂ１は全てのマウスにおいて１００日間の生存期間を達成した。ログランク（マンテル−コックス）検定、１０μｇ  ｐ＝０．０３０３、５０μｇ  ｐ＝０．００８１、１００μｇ  ｐ＝０．００２４。
【０１７７】
第２部：皮下、反復投与
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（ｎ＝１２／群）にＲａｊｉ−ＭＩＣＡ＊００１細胞を皮下移植した。マウスを１０日目（腫瘍容積約１２０ｍｍ３）に無作為化し、次いで抗ＭＩＣＡ抗体またはアイソタイプ対照（ＩＣ）（２５０μｇ／マウス、ｉ．ｖ．、３週間、週２回）により処理した。
【０１７８】
結果を図４に示す。左側パネルはアイソタイプ対照を受けたマウスを示し、右側パネルは抗ＭＩＣＡ抗体ｍＡｂ１を受けたマウスを示す。個々の腫瘍容積を示す。ＣＲ＝完全奏功。抗ＭＩＣＡ抗体ｍＡｂ１による処理は、腫瘍容積の減少を引き起こした。さらに、ｍＡｂ１により処理されたマウスの１７％に、アイソタイプ対照を受けたマウスの８％と比較して完全奏功が認められた。
【０１７９】
実施例６
ネズミＡ５４９腫瘍モデルにおける抗ＭＩＣＡ抗体のインビボ効力
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（ｎ＝７／群）にＡ５４９細胞（ヒト肺癌腫；ＡＴＣＣ参照番号ＣＣＬ−１８５）を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）し、抗ＭＩＣＡ抗体ｍＡｂ１１またはアイソタイプ対照（ＩＣ）（１０μｇ／マウス、ｉ．ｖ．）の単回注射により処理した。腹腔洗浄液（ＰＣＬ）中のＡ５４９細胞数を処理２４時間後に評価した。
【０１８０】
結果を図５に示す。抗ＭＩＣＡ抗体ｍＡｂ１により処理されたマウスは、アイソタイプ対照により処理されたマウスと比較して減少した腫瘍細胞数を示した。個々のマウスおよび中央値を表示する。マン−ホイットニー比較  ｐ＝０．００２３。
【０１８１】
本明細書に引用される全ての参照文献、例として、刊行物、特許出願、および特許は、参照により全体として本明細書に、ならびにあたかもそれぞれの参照文献が参照により取り込まれることが個別具体的に示され、全体として本明細書に記載されるのと同程度（法により許容される最大の程度）に、本明細書の他箇所で特定の文献の任意の別個に提供される組み込みに関係なく組み込まれる。
【０１８２】
用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに類似の参照の使用は、本明細書において特に示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を包含するものと解釈すべきである。
【０１８３】
特に記載のない限り、本明細書に提供される全ての正確な値は、対応する近似値を代表する（例えば、特定の因子または計測値に関連して提供される全ての正確な例示値は、適宜「約」により修飾される、対応する近似測定値も提供するものとみなすことができる）。
【０１８４】
１つ以上の要素に関して「含む」、「有する」、「例として」、または「含有する」などの用語を使用する本明細書の任意の態様または実施形態の本明細書の記載は、本明細書において特に示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、その特定の１つ以上の要素「からなる」、「から本質的になる」、または「を実質的に含む」という本明細書の類似の態様または実施形態への支持を提供するものとする（例えば、特定の要素を含むとして本明細書に記載の組成物は、本明細書において特に示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、その要素からなる組成物を記載するものとしても理解すべきである）。
【０１８５】
本明細書に提供される任意のおよび全ての実施例、または例示的な語（例えば、「例えば」）の使用は、本発明をより良好に説明するものにすぎず、特に特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書の語は、本発明の実施に必須のいかなる非特許請求の要素も示さないと解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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