(57)【要約】  プロテオミクスデータを使用して、ＮＳＣＬＣのシスプラチン／ペメトレキセド療法の治療転帰を予測する。とりわけ、ＥＲＣＣ１は、２値マーカーとして用いられ得、タンパク質の存在または不在が、質量分析により測定され、追加のタンパク質は、特にＰＦＳの予測のためのさらなる予測マーカーとして利用され得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非小細胞肺癌を有し、シスプラチンおよびペメトレキセドでの治療を受ける患者の全生存および無増悪生存の少なくとも１つを予測する方法であって、
患者試料におけるＥＲＣＣ１の定量的質量分析データを得、前記定量データが閾値を下回る場合「検出不能」として、および前記定量データが閾値を上回る場合「検出可能」として、前記定量データを分類することと、
前記定量データが「検出不能」である場合、シスプラチン／ペメトレキセドでの治療後、改善された全生存および／または無増悪生存を有するとして、患者記録を更新または作成すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記患者試料における、Ｅ−カドヘリン、ＨＥＲ２、ＴＩＴＦ１、ＭＳＬＮ、ＫＲＴ７、ＦＲ−α、ＨＥＲ３、ＦＰＧＳおよびＲＯＳ１の少なくとも１つについての追加の定量的質量分析データを得ることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記追加の定量的質量分析データを使用して、無増悪生存を予測する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｅ−カドヘリン、ＨＥＲ２、ＴＩＴＦ１、ＭＳＬＮ、ＫＲＴ７、ＦＲ−α、ＨＥＲ３、ＦＰＧＳおよびＲＯＳ１の少なくとも１つの発現が増加すると、前記無増悪生存が増加する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記患者試料が、新鮮生検材料、凍結生検試料、およびホルマリン固定パラフィン包理試料からなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記定量的質量分析データが、選択反応モニタリング質量分析から得られる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記閾値が、背景信号の標準偏差の２〜５倍である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記閾値が１ｆｍｏｌ以下である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記患者記録が電子記録である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者記録が、シスプラチン／ペメトレキセドを投与する治療の推奨を含むように更新される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者試料が、新鮮生検材料、凍結生検試料、およびホルマリン固定パラフィン包理試料からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記定量的質量分析データが、選択反応モニタリング質量分析から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記閾値が、背景信号の標準偏差の２〜５倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記閾値が１ｆｍｏｌ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者記録が電子記録である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記患者記録が、シスプラチン／ペメトレキセドを投与する治療の推奨を含むように更新される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
シスプラチンおよびペメトレキセドでの治療を受ける非小細胞肺癌を有する患者の全生存および無増悪生存の少なくとも１つを予測するための、患者試料におけるＥＲＣＣ１の定量的質量分析データの使用であって、
前記定量データが閾値を下回る場合「検出不能」として、および前記定量データが閾値を上回る場合「検出可能」として前記定量データが分類され、
前記定量データが「検出不能」である場合、前記患者が、シスプラチン／ペメトレキセドでの治療後、改善された全生存および／または無増悪生存を有すると判断される、
前記使用。
【請求項１８】
前記患者の無増悪生存を予測するための、前記患者試料におけるＥ−カドヘリン、ＨＥＲ２、ＴＩＴＦ１、ＭＳＬＮ、ＫＲＴ７、ＦＲ−α、ＨＥＲ３、ＦＰＧＳおよびＲＯＳ１の少なくとも１つの発現の使用をさらに含む、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
Ｅ−カドヘリン、ＨＥＲ２、ＴＩＴＦ１、ＭＳＬＮ、ＫＲＴ７、ＦＲ−α、ＨＥＲ３、ＦＰＧＳおよびＲＯＳ１の少なくとも１つの発現が増加すると、前記無増悪生存が増加する、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記患者試料が、新鮮生検材料、凍結生検試料、およびホルマリン固定パラフィン包理試料からなる群から選択される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記定量的質量分析データが、選択反応モニタリング質量分析から得られる、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記閾値が、背景信号の標準偏差の２〜５倍である、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
前記閾値が１ｆｍｏｌ以下である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は２０１６年３月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／３１１３６８号の優先権を主張するものであり、また２０１６年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／３３７２０９号の優先権を主張するものであり、仮特許出願はいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明の分野は、とりわけ、非小細胞肺癌、ＥＲＣＣ１状態、および無再発生存／全生存に関する、選択されたマーカーと臨床転帰との関連のシステムおよび方法である。
【背景技術】
【０００３】
背景説明は、本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。本明細書に記載の情報のいずれかが、本請求項に関わる発明に対する先行技術であるか、もしくはそれに関連していること、または具体的もしくは暗示的に言及されるいずれかの刊行物が先行技術であることの承認ではない。
【０００４】
本明細書に記載のすべての刊行物および特許出願は、各個別の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれることを具体的におよび個別に示されているような程度において、参照により組み込まれる。組み込まれた参照文献における用語の定義または使用は、本明細書で提供される用語の定義と一貫しないまたは矛盾する場合、本明細書で提供されたその用語の定義が適用され、参照文献のその用語の定義は適用されない。
【０００５】
ＥＲＣＣ１、除去修復１エンドヌクレアーゼ非触媒サブユニットは、ヌクレオチド除去修復経路で機能し、ＵＶ光により誘導されるか、またはシスプラチンを含む求電子性化合物により形成されるものなど、ＤＮＡ損傷の修復に必要とされる。ＥＲＣＣ１タンパク質は、ＥＲＣＣ４エンドヌクレアーゼとヘテロ二量体を形成し、ヘテロ二量体エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ損傷の除去のプロセスで５’切除を触媒する。ヘテロ二量体エンドヌクレアーゼは、組み換えＤＮＡ修復および鎖間架橋の修復にも関与している。機構的には、ＥＲＣＣ１は、様々な癌において少なくとも多少重要な役割を果たすと思われる。例えば、ＤＮＡ修復酵素ＥＲＣＣ１の発現欠損は、結腸癌と関連することが報告されており（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｔｅｇｒ．２０１２；３：３；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１４、４：４３１３）、ＥＲＲＣ１遺伝子の転写は、グリオーマの大部分において低下することが示された（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１０年４月１５日；１２６（８）：１９４４〜５４）。
【０００６】
少なくとも観察視点から、ＥＲＣＣ１状態は、有望な候補であると思われたが、現在公知のシステムでは、とりわけシスプラチンベースによる治療の指標としてＥＲＣＣ１を使用する、無再発生存（ＰＦＳ）／全生存（ＯＳ）を予測できる統計的に有意なモデルが得られなかった。確かに、ＥＲＣＣ１タンパク質の腫瘍発現の低下または不在から、プラチナ治療ＮＳＣＬＣＬ患者の生存の改善を予測できると以前に仮定された。しかし、免疫組織化学法により行われるＥＲＣＣ１の評価は、信頼性を欠くことが判明したため、早期ＮＳＣＬＣ（ＴＡＳＴＥ）試験におけるテーラーメイド術後療法のフェーズ３は中止された。
【０００７】
したがって、様々な方法のＥＲＣＣ１試験が当技術分野で公知であるが、それらのすべてまたはほとんどすべてに様々な欠点がある。したがって、癌、およびとりわけＮＳＣＬＣにおける無再発生存／全生存を予測するシステムおよび方法の改善が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の主題は、治療後の癌における無再発生存および／または全生存を予測する組成および方法であって、とりわけ癌がＮＳＣＬＣであり、治療がシスプラチン／ペメトレキセドである、前記組成および方法を対象とする。
【０００９】
本発明の主題の一態様において、本発明者らは、シスプラチン／ペメトレキセドでの治療を受ける非小細胞肺癌を有する患者の全生存および／または無増悪生存を予測する方法を意図する。このような方法は、典型的には、患者試料におけるＥＲＣＣ１の定量的質量分析データを得るステップと、定量データが閾値を下回る場合「検出不能」として、および定量データが閾値を上回る場合「検出可能」として定量データを分類する別のステップとを含む。さらに別のステップにおいて、定量データが「検出不能」である場合、患者が、シスプラチン／ペメトレキセドでの治療後、（「検出可能」レベルのＥＲＣＣ１を有する患者と比較して）改善された全生存および／または無増悪生存を有することを示すように、患者記録を更新または作成する。
【００１０】
さらに意図される態様において、典型的には無増悪生存を予測するために、患者試料におけるＥ−カドヘリン、ＨＥＲ２、ＴＩＴＦ１、ＭＳＬＮ、ＫＲＴ７、ＦＲ−α、ＨＥＲ３、ＦＰＧＳおよび／またはＲＯＳ１についての追加の定量的質量分析データが得られ得る。一般に、Ｅ−カドヘリン、ＨＥＲ２、ＴＩＴＦ１、ＭＳＬＮ、ＫＲＴ７、ＦＲ−α、ＨＥＲ３、ＦＰＧＳおよび／またはＲＯＳ１の発現が（例えば、ＮＳＣＬＣを有する多数の患者の平均と比較して）増加すると、無増悪生存が増加する。最も典型的には、患者試料は、新鮮生検材料、凍結生検試料またはホルマリン固定パラフィン包理試料である。
【００１１】
定量的質量分析データは、典型的ではあるが、必ずしも選択反応モニタリング質量分析（ＳＲＭ−ＭＳ）から得られるわけではなく、および／または閾値は背景信号の標準偏差の２〜５倍（例えば、１．０ｆｍｏｌ、または０．５ｆｍｏｌ、または０．１ｆｍｏｌ以下）である。患者記録は電子記録であり、これはシスプラチン／ペメトレキセドを投与する治療の推奨を含むように作成または更新され得ることがさらに意図される。
【００１２】
したがって、および異なる視点から見て、本発明者らは、シスプラチン／ペメトレキセドでの治療を受ける非小細胞肺癌を有する患者の全生存および無増悪生存の少なくとも１つを予測するための、患者試料におけるＥＲＣＣ１の定量的質量分析データの使用も意図する。上記のように、定量データは、定量データが閾値を下回る場合「検出不能」として、および定量データが閾値を上回る場合「検出可能」として好ましくは分類される。次いで、定量データが「検出不能」である場合、患者は、シスプラチン／ペメトレキセドでの治療後、改善された全生存および／または無増悪生存を有すると判断される。
【００１３】
意図される使用は、患者の無増悪生存を予測するための、患者試料におけるＥ−カドヘリン、ＨＥＲ２、ＴＩＴＦ１、ＭＳＬＮ、ＫＲＴ７、ＦＲ−α、ＨＥＲ３、ＦＰＧＳおよび／またはＲＯＳ１の発現の使用であって、そこで最も典型的には、Ｅ−カドヘリン、ＨＥＲ２、ＴＩＴＦ１、ＭＳＬＮ、ＫＲＴ７、ＦＲ−α、ＨＥＲ３、ＦＰＧＳおよびＲＯＳ１の少なくとも１つの発現が（例えば、ＮＳＣＬＣを有する多数の患者の平均と比較して）増加すると、無増悪生存が増加する、前記使用をさらに含み得る。
【００１４】
本発明の主題の様々な目的、特徴、態様および利点は、添付の図面と共に好ましい実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本明細書で行われるデータ分析の例示的フローチャートを示す図である。
【図２】全生存（２Ａ）および無再発生存（２Ｂ）のＥＲＣＣ１プロテオミクスレベルで二分された試験患者の例示的カプランマイヤー曲線を示す図である。
【図３】ＩＨＣおよびＭＳプロテオミクスにより測定されたＥＲＣＣ１レベルの一致の欠如を示す例示的な図であり、図３Ａは、連続測定のウォーターホール図を示し、図３Ｂは、２値測定のモザイク図を示す。
【図４】試験中の全１４６人の患者で３８個のプロテオームマーカー間での対相関の例示的なヒートマップを示す図である。
【図５】測定されたマーカーに基づく患者の非監視クラスタリングからの例示的グラフを示す図である。図５Ａは、スケール化されたマーカーレベルのヒートマップであり、図５Ｂは、患者サブタイプにより層別化された無再発生存のカプランマイヤー曲線を示す。
【図６】２値ＥＲＣＣ１状態およびＫＲＴ７を用いて予測相対リスクに基づき二分された試験患者の例示的カプランマイヤー曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の主題は、様々な癌についての改善された統計および生化学分析のための、ならびにとりわけシスプラチンおよびペメトレキセドを組み合わせた非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療についての予測分析のためのシステムおよび方法を示す。とりわけ好ましい態様において、本発明者らは、ＥＲＣＣ１タンパク質レベルを、免疫組織化学法（およびとりわけ腫瘍試料の定量的質量分析プロテオーム解析）以外の方法を用いて定量的に測定したとき、このようにして得られたＥＲＣＣ１の結果が、特に発見された、選択された他のマーカーの発現レベルと組み合わせて全生存および／または無増悪生存を予測するのに十分な統計的検出力を有することを意外にも発見した。免疫組織化学法により測定されたＥＲＣＣ１レベルは、以前は信頼性を欠くとみなされていたため、このような知見は特に意外であった（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１４、３２：１２５６〜１２６１参照）。
【００１７】
さらに、十分な統計的検出力で治療転帰、およびとりわけＰＦＳを予測するために、追加のマーカーが考慮され得ることが、さらなる定量的プロテオミクス分析により判明した。用語「無再発生存」（ＲＦＳ）および「無増悪生存」（ＰＦＳ）は、本明細書において互換的に用いられる。とりわけ、および以下により詳細に示すように、マーカーは、３種類に分類され得、カプランマイヤー曲線から明らかなように、ある種類からは、ＰＦＳの増加が予測される。
【００１８】
したがって、および以下でもより詳細に示される結果に基づき、本発明者らは、非小細胞肺癌を有する患者の全生存および／または無増悪生存を予測する方法であって、患者が、シスプラチンおよびペメトレキセドの組み合わせで治療されるべきである、前記方法を意図する。このような予測を使用して、ＤＮＡ修復を妨げる１つ以上の薬物での治療に対する患者の適格性を評価するか、または患者群を、ＤＮＡ複製および修復を妨げる１つ以上の薬物での治療の影響を受けやすい患者に層別化することができる。例えば、ＤＮＡ複製および修復を妨げる好適な薬物として、塩基除去修復、ヌクレオチド除去修復、ＤＮＡポリメラーゼ、相同組み換え修復、二本鎖切断修復およびＰＡＲＰの１つ以上を阻害する抗新生物薬が挙げられるる。異なる視点から見ると、患者試料におけるＥＲＣＣ１の定量的質量分析データを使用して、ＤＮＡ複製および修復を妨げる１つ以上の薬物（およびとりわけシスプラチン／ペメトレキセド）での治療を受けるＮＳＣＬＣを有する患者の全生存および／または無増悪生存を予測することができる。
【００１９】
意図される試料に関して、試料は、ＮＳＣＬＣと診断された患者に由来することが一般に好ましく、新鮮生検試料、凍結生検試料およびホルマリン固定パラフィン包埋試料等、このような腫瘍試料すべてが、本明細書での使用に好適であるとみなされる。最も典型的には、意図される試料は、プロテオミクス分析、および特に定量的プロテオミクス分析に適しているであろう。しかし、別の態様において、試料は、ＮＳＣＬＣに限定される必要はないが、様々な他の腫瘍、ならびにとりわけＤＮＡ複製および修復を妨げる１つ以上の薬物、とりわけシスプラチンおよびペメトレキセドでの治療に感受性である腫瘍からの試料であり得ることが意図される。したがって、好適な腫瘍として、精巣癌、卵巣癌、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌、子宮頸癌、肺癌、中皮腫、食道癌、脳腫瘍および神経芽細胞腫と診断された患者から得られた腫瘍が挙げられる。
【００２０】
意図される試料は、タンパク質特異的な定量的発現結果が得られるように１つ以上のワークフローで処理されることをさらに認識すべきである。特定の種類の試料に応じて、定量結果を得る方法が異なってもよく、タンパク質を定量化する方法すべてが、本明細書での使用に適しているとみなされることを認識すべきである。例えば、好ましい分析方法として、出発物質として細胞抽出物またはさらにＦＦＰＥ試料を使用し得る様々な質量分析方法が挙げられる。所望される場合、試料は、ＥＲＣＣ１および／もしくはもう一つの目的のタンパク質で富化されてもよく、または直接用いられてもよい。他の方法の中で、様々な選択反応モニタリング方法（例えば、連続反応モニタリング、複数反応モニタリング、並行反応モニタリング）が好ましい。よりさらに意図される定量方法において、ＥＲＣＣ１および他のタンパク質の量は、相対定量方法、例えば、同位体コード化親和性タグ（ＩＣＡＴ）、同重体標識（タンデムマスタグ（ＴＭＴ）ならびに相対および絶対定量化のための同重体タグ（ｉＴＲＡＱ））、非標識定量金属コードタグ（ＭｅＣＡＴ）、Ｎ末端標識、細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）および基質の末端アミン同位体標識（ＴＡＩＬＳ）により定量化され得る。よりさらに、定量化には、タンパク質特異的リガンドを使用する同位体および／またはフルオロフォア標識を含む、間接的方法も含まれ得る。
【００２１】
したがって、得られた特定の種類のデータは、かなり異なり得ることを認識すべきである。しかし、定量タンパク質の生データは、絶対タンパク質値に変換されることが一般に好ましい。例えば、絶対タンパク質値は、典型的には、特定のパラメーターに対して正規化される。例えば、絶対定量データは、測定される単位試料あたりの絶対重量（例えば、試料あたりのピコグラムで表される）、固定された測定基準に対する相対発現（例えば、ｆｍｏｌタンパク質／μｇ総タンパク質、またはｆｍｏｌ／１０００細胞）、または比較タンパク質と比較した相対アバンダンス（例えば、アクチンの％）もしくは特定の癌と診断された患者の腫瘍におけるタンパク質を代表する平均値もしくは中央値と比較した相対発現レベル（例えば、ｎ−倍の過剰または過小発現、線形または対数ベース）で表され得る。
【００２２】
ＥＲＣＣ１データに関して、その場合には、定量データを２値スキーマに分類して、データを定性的に表現することが好ましい。例えば、このような表現は、定量データが、所定の閾値を下回る場合「検出不能」（または不在、またはゼロ、またはＮ／Ｄなど）として分類され得、定量データが所定の閾値を上回る場合「検出可能」（または存在、または１、またはプラスなど）として分類され得る。このような変換は、高度に選択的および特異的な分析（典型的には質量分析）の利点を完全に無効にするように思われるが、本発明者らの結果からは、２値変換により、従来公知の定量的ＩＨＣ法では得られなかった統計的に有意な予測結果が意外にも得られることが示された。
【００２３】
最も典型的には、「検出不能」としての分類に対する閾値は、特定の定量方法の検出限界であるか、またはほぼ検出限界であり、そのようなものとして少なくとも部分的には、用いられる特定の分析方法に依存する。したがって、本発明の主題の一態様において、閾値は、定量測定における背景信号の標準偏差値の２倍、または３倍、または４倍、または５倍であり得る。例えば、大部分の質量分析方法に関して、好適な閾値には、（例えば、細胞あたり）０．１ｆｍｏｌ、または０．５ｆｍｏｌ、または１．０ｆｍｏｌ、または５ｆｍｏｌ、または１０ｆｍｏｌ、および場合により、それより高い値が含まれる。したがって、閾値を超えるすべての定量ＥＲＣＣ１値は、「検出」として分類されるであろう。異なる視点から見て、ＥＲＣＣ１の測定量が、定量測定における背景信号の標準偏差値の２倍、または３倍、または４倍、または５倍を超える場合、ＥＲＣＣ１値は、「検出」に分類され得る。例えば、１００ｆｍｏｌ、または２５０ｆｍｏｌ、または２０００ｆｍｏｌのＥＲＣＣ１の絶対値は「検出」に分類され得る。
【００２４】
追加のマーカータンパク質（およびとりわけ以下に考察されるようなもの）の定量化にプリセットすることで、定量化は、２値スキーマへの変換が不要である。追加のマーカータンパク質の定量化は、最も典型的ではあるが、必ずしもＥＲＣＣ１の定量化と同じ方法を用いて行われるわけではなく、しかし、データは、典型的には、非腫瘍細胞における正常な発現レベルと比較して（または、場合によっては、ＤＮＡ複製および修復を妨げる薬物（複数化）に対するその感受性にかかわらず腫瘍組織の発現の平均値または中央値と比較して）、上方調節された（過剰発現された）または下方調節された（過少発現された）として表される。
【００２５】
以下でより詳細に考察されるように、次いで、結果と全生存および／または無増悪生存の増加との関連を、ＥＲＣＣ１の定量結果の分類、および所望される場合、選択された追加のマーカーの発現レベルに基づき行う。驚くべきことに、ＥＲＣＣ１の定量データが「検出不能」であった場合、シスプラチン／ペメトレキセドでの治療後、全生存および無増悪生存が改善することが判明した。したがって、このような関連は、新しいまたは既存の患者記録に記録され得る。本明細書で行われた試験から分かるように、およびカプランマイヤー曲線で明示されるように、改善された全生存は、「検出可能」レベルのＥＲＣＣ１を有する患者の全生存結果と比較している。同様に、追加のマーカータンパク質（およびとりわけＥ−カドヘリン、ＨＥＲ２、ＴＩＴＦ１、ＭＳＬＮ、ＫＲＴ７、ＦＲ−α、ＨＥＲ３、ＦＰＧＳおよび／またはＲＯＳ１）を測定した場合、本明細書で行われた試験から分かるように、およびカプランマイヤー曲線で明示されるように、無増悪生存は、追加のマーカータンパク質の過剰発現を示す患者において実質的に改善される。
実施例
【００２６】
ＴＡＳＴＥ試験（ＩＦＣＴ−０８０１ＴＡＳＴＥ）からの１５０人の患者の臨床およびバイオマーカーデータをエクセル形式で受領し、．ｔｘｔ形式で保存し、データ前処理および統計分析のためにＲに読み込んだ。ＥＲＣＣ１と無再発生存（ＰＦＳ）および全生存（ＯＳ）との関連の一次および二次分析、ならびに様々なバイオマーカー間の相関を評価する探索的分析に利用できる患者を詳述するコンソートダイアグラムを、以下の図１に示す。ＥＲＣＣ１プロテオームデータを、腫瘍組織を得るためのレーザー顕微解剖およびその後の選択反応モニタリング質量分析を受けたＦＦＰＥ生検試料から得た。
【００２７】
入力プロテオームバイオマーカーデータを、数値変数に変換し、そこで所与のバイオマーカーの検出不能レベルを示す「ＮＤ」を０とみなし、データの欠損を示す「ＮＲ」をＮＡで置き換えた。生存エンドポイントをＳＴＥＥＰシステムにより定義した。全生存期間を、算入日と死亡日との間の期間として計算し、無再発生存（ＲＦＳ）期間を、算入日と再発日または死亡日（いずれか早い方）との間の期間として計算した。イベント（再発または死亡）を経験しなかった患者は、最後の公知の経過観察時点で打ち切りとした。
【００２８】
一次転帰分析を次のように行った：ＥＲＣＣ１プロテオームレベルを、連続変数と２値変数（マイナス、すなわち＝０対プラス、すなわち＞０）の両方で評価した。単変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルを使用して、連続および／または２値ＥＲＣＣ１レベルが、ＯＳおよび／またはＲＦＳと関連しているかどうかを評価し、有意性は尤度比検定を用いて評価した。多重度調整は使用しなかった。以下の表１は、単変量Ｃｏｘ分析からの結果を示す（*はＥＲＣＣ１レベルの１標準偏差増加に関連するハザード比を示す）。
【００２９】
連続変数として、ＥＲＣＣ１プロテオームレベルは、ＯＳまたはＰＦＳと有意に関連していなかった。しかし、二分されたＥＲＣＣ１群は、単変量Ｃｏｘ分析において、ＯＳとの有意な関連を示し、ＥＲＣＣ１陽性患者では、ＥＲＣＣ１陰性患者と比較して死亡リスクが増加した（ＨＲ＝１．３、ｐ＝０．０２）。関連についての同様の傾向は、２値ＥＲＣＣ１群とＰＦＳとの間で認められた。
【００３０】
パネル（Ａ）が全生存を示し、パネル（Ｂ）が無再発生存を示す、（プロテオミクスレベルにより）二分されたＥＲＣＣ１群のカプランマイヤー生存曲線を図２に示す。
【表１】
2019513982.tif 000003
【００３１】
二次転帰分析を次のように行った：病期、喫煙状態、年齢および性別で調整した多変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルを使用して、連続および／または２値ＥＲＣＣ１レベルが、これらの臨床共変量と独立してＯＳおよび／またはＰＦＳと関連しているかどうかを評価した。有意性は、臨床共変量を含有するモデルに追加されたＥＲＣＣ１の時期と関連する尤度比ｐ値として評価した。
【００３２】
モデルの収束性の問題を緩和するために、本発明者らは、最初に連続および／または２値ＥＲＣＣ１レベルと臨床共変量との間の関連を評価した。ＥＲＣＣ１レベルと関連する各臨床変数について、本発明者らは二変量Ｃｏｘモデルを使用して、ＥＲＣＣ１レベルがＯＳ／ＲＦＳと独立に関連したままであるかどうかの評価時点で１つの臨床共変量で調整した。表２（*はＥＲＣＣレベルの１標準偏差増加と関連するハザード比を示す；†は年齢の１歳増加と関連するハザード比を示す）は、多変量Ｃｏｘ全生存分析からの結果を示す。２値ＥＲＣＣ１群は、病期、喫煙、年齢および性別で調整した後、ＯＳと独立に関連したままである。表３（*はＥＲＣＣレベルの１標準偏差増加と関連するハザード比を示す；†は年齢の１歳増加と関連するハザード比を示す）は、多変量Ｃｏｘ無再発生存分析からの結果を示す。連続または２値ＥＲＣＣ１レベルのいずれもＲＦＳと関連していない。
【表２】
2019513982.tif 000004
【表３】
2019513982.tif 000005
【００３３】
以下の表４は、病期、喫煙状態および性別で層別化された連続および／または２値プロテオームＥＲＣＣ１レベルの分布を要約している。連続ＥＲＣＣ１レベルとこれらの臨床変数との間で有意な関連は認められなかった。禁煙した患者の中でプロテオームＥＲＣＣ１陽性患者の割合は高いと思われたが、病期または性別間でのプロテオームＥＲＣＣ１陽性患者の割合に差はなかった。ＥＲＣＣ１は、連続変数（Ｒｐ＝−０．０６、ｐ＝０．５１）または連続変数（ウィルコクソン順位和検定ｐ＝０．４１）のいずれかとして考えた場合、年齢と関連していなかった。
【表４】
2019513982.tif 000006
【００３４】
上記の分析に基づき、本発明者らは、２値プロテオームＥＲＣＣ１レベルおよび喫煙状態の関数として全生存の二変量モデルを使用し、２値ＥＲＣＣ１レベルが、喫煙状態で調整した後、ＯＳ（尤度比ｐ＝０．０３）と有意に関連したままであることを認めた。
【００３５】
探索的分析−バイオマーカー間の相関：バイオマーカーデータを有する１４６人の患者は、図１に示す分析で利用できた。
【００３６】
プロテオームＥＲＣＣ１レベルとＩＨＣ（免疫組織化学的）ＥＲＣＣ１レベルとの間の関連：本発明者らは、連続および２値プロテオームＥＲＣＣ１レベルとＩＨＣ  ＥＲＣＣ１状態とを比較した。最初に、本発明者らは、ＡＮＯＶＡを使用して、ＩＨＣで定義されたＥＲＣＣ１サブセット３つ（陽性、陰性、中間）内の患者間でプロテオームＥＲＣＣ１レベルに有意差があるかどうかを評価した。同様に、本発明者らは、カイ二乗検定を使用して、ＩＨＣで定義されたサブセット３つ内のプロテオームＥＲＣＣ１陽性患者の分布に有意差があるかどうかを評価した。
【００３７】
本発明者らは、連続変数または２値変数のいずれかとしてのプロテオームＥＲＣＣ１レベルとＥＲＣＣ１  ＩＨＣ状態との間に何らかの有意な関連を認められなかった。図３Ａは、各ＩＨＣで定義されたＥＲＣＣ１サブセット内のＥＲＣＣ１タンパク質レベルのウォーターホール図を示しており、図３Ｂは、ＥＲＣＣ１  ＩＨＣ状態別の検出可能なプロテオームＥＲＣＣ１レベルを有する患者のモザイク図を示す。全体的に、プロテオームＥＲＣＣ１レベルとＥＲＣＣ１  ＩＨＣ状態との間の一致は低く、ＩＨＣ  ＥＲＣＣ１陽性患者３６人中１２人は検出可能なプロテオームＥＲＣＣ１レベルを有しておらず、ＩＨＣ  ＥＲＣＣ１−陰性患者８８人中７０人は、プロテオミクスにより検出可能なＥＲＣＣ１レベルを有していることが、分析から示唆される。
【００３８】
プロテオミクスバイオマーカー間の相関：このＴＡＳＴＥ試験コホート内の４９個のさらなるバイオマーカーを、プロテオミクスにより評価した。４個のバイオマーカー（ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＨＥＲ４、ＭＤＭ２）は、全１４６人の患者で検出不能であり、別の７個のマーカー（ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＨＧＦ、ＭＲＰ１、ＭＣＬ１、ＤＨＦＲ、ＴＬＥ３）は、患者の２０％超において欠損値を有していた。これらのバイオマーカーを除去した結果、相関分析に利用できるバイオマーカーは３８個となった。対ピアソン相関を全患者の各バイオマーカー対間で計算し、非監視クラスタリング（平均連結）を行った。さらに、患者のバイオマーカーデータに基づく各患者対間の平方ユークリッド距離、およびウォード最小分散法に基づく患者のクラスタリングを行った。この非監視分析からの患者サブセットと生存（ＯＳおよびＲＦＳ）との間の関連を、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて評価した。アーカイブされた腫瘍組織を顕微解剖し、可溶化した。各液化試料において、ＥＲＣＣ１を含む４０個のタンパク質バイオマーカーを、多重質量分析アッセイで定量化した。
【００３９】
図４は、全１４６人の患者で３８個のバイオマーカー間での対相関のヒートマップを示す。全般に、マーカー間の対相関は、わずかであると思われる（中央値＝−０．００９、範囲＝−０．３３〜１）。非監視クラスタリングにより、３つの主サブセットが生成された。とりわけ、ＥＲＣＣ１は、ＤＮＡ複製および修復と関連する遺伝子、例えば、ｈＥＮＴ１、ＸＲＣＣ１、ＴＹＭＳ、ＴＯＰＯ１およびＴＯＰＯ２Ａと共に（バイオマーカークラスターＣ３で）共クラスタリングする。
【００４０】
患者を、そのバイオマーカープロファイルに基づきクラスタリングしたとき、図５Ａから分かるように、３つの別個の患者サブセットが認められた。これらの患者サブセットは、別個のＲＦＳ転帰を有し、そこで、図５Ｂに示すように、クラスターＣ１バイオマーカーのタンパク質レベルが高い患者は、Ｃ３バイオマーカーのレベルが高い患者よりも良好なＲＦＳを有すると思われる。患者サブセット間でＯＳの有意差は認められなかった。図５Ａは、（平均０および標準偏差１に）スケール化されたバイオマーカーレベルのヒートマップであり、患者は、列に配置され、バイオマーカーは、行に配置されている。患者サブタイプはＩ（黄色）、ＩＩ（オレンジ）、ＩＩＩ（赤）であり、四角形を用いてハイライト表示されている。図５Ｂは、患者サブタイプで層別化されたＲＦＳを示すカプランマイヤー生存曲線を示しており、ハザード比およびウォードｐ値は、凡例に示されている。
【００４１】
探索的分析−生存転帰と関連する追加のバイオマーカー：本発明者らは、ＥＲＣＣ１に加えて、連続または２値（検出可能対検出不能）としての他のプロテオームバイオマーカーが、ＯＳおよび／またはＲＦＳと関連しているかどうかを単変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて評価した。利用可能な転帰およびバイオマーカーデータを有する、ＣＤＤＰ−ペメトレキセドで治療した患者１２２人を用いて分析を行った。
【００４２】
最初に、相関分析で評価された３８個のバイオマーカーを検討した。しかし、データをさらに見直したときに、少なくとも２０％の試料において非ゼロレベルとする追加のフィルタリング基準が導入され、この分析で利用可能な１セット２２個のバイオマーカーが残った。これらの２２個のバイオマーカーの内４個（ＧＡＲＴ、ＫＲＴ７、ビメンチンおよびＴＹＭＰ＿ＤＧＰ）が、この分析で検討した全１２２人の患者において検出可能なレベルを有しており、したがって、連続バイオマーカーとしてのみ評価された。全体的に、４０個のバイオマーカー変数（２２個の連続、１８個の２値）を各々個別に試験し、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ偽発見率（ＢＨ  ＦＤＲ）補正を使用して、多重仮説検定で調整した。
【００４３】
以下の表５は、バイオマーカーレベルの関数としてＯＳの単変量Ｃｏｘ分析からの結果を示す。試験された２値ＥＲＣＣ１レベルを含むバイオマーカー変数の内６個が、多重検定調整前にＯＳとの有意な単変量関連を示した。しかし、２値Ｅ−カドヘリンレベルのみが、ＢＨ  ＦＤＲ補正後、有意性を保持していた。２値Ｅ−カドヘリンデータの見直しにより、検出不能Ｅ−カドヘリンレベルを有する患者はわずか４人であることが判明した。これらの患者の内２人は死亡した。この知見は、統計的に有意（ＢＨ  ＦＤＲ補正済みｐ＜０．０５）であるが、Ｅ−カドヘリン陰性サブセットサイズが小さいため、この結果は慎重に解釈される必要がある。以下の表６は、バイオマーカーレベルの関数としてＲＦＳの単変量Ｃｏｘ分析からの結果を示す。試験した変数の内６個は、ＲＦＳと単変量関連を示すが、多重検定補正後、有意性を保持していなかった。
【表５】
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【表６】
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【００４４】
探索的分析−生存転帰の多遺伝子予測：交差検証と共にＣｏｘモデルの弾性ネット（ＲのＧｌｍｎｅｔパッケージで実施）を使用して、生存転帰の多遺伝子予測子を構築した。２値ＥＲＣＣ１状態と共に２２個の連続バイオマーカー変数を検討した。この分析は、完全なバイオマーカーデータを有する患者８０人のサブセットに制限された。ＥＲＣＣ１は、目的の主要変数であるため、２値ＥＲＣＣ１状態の縮小は、それが常にモデルに含まれるように０に設定された。最小（３倍）交差検証部分尤度を生成するモデルが選択される。
【００４５】
２値ＥＲＣＣ１状態と共にＫＲＴ７を含有する弾性ネットモデルは、再発の相対リスクの最適な予測を提供すると思われた。このモデルを使用すると、予測相対リスク＜１の患者は、予測相対リスク＞１の患者よりも有意に良好なＲＦＳを有する（尤度比ｐ＝０．０２）。２値ＥＲＣＣ１状態およびＫＲＴ７の弾性ネットモデルを用いて予測相対リスクに基づき二分された患者の曲線を示す、これらの患者サブセットのカプランマイヤー生存図を図６に示す。
【００４６】
ペメトレキセドに対するタンパク質バイオマーカーの応答も定量化した。ＦＲ−α＞１６３９ａｍｏｌ／μｇの腫瘍発現を有する患者は、低ＦＲ−αレベルを有する患者よりも長いＯＳを有していた。ＴＹＭＳ発現＜１５０ａｍｏｌ／μｇからは、同様にＯＳが予測された。ＥＲＣＣ１は、応答の低いＤＮＡ損傷マーカーＴＹＭＳおよびｐ１６と共にクラスタリングし、ＦＲ−αおよびＥ−カドヘリンを発現する患者は、明らかに良好な生存転帰を有していた。
【００４７】
当業者には、既に記載されたもの以外にさらに多くの改良が、本明細書の発明の概念から逸脱せずに可能であることが明らかであろう。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲以外においては限定されない。さらに、明細書と特許請求の範囲の両方の解釈において、すべての用語は、文脈と一致してできるだけ広範に解釈されるべきである。特に、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、非排他的に要素、成分またはステップを指し、言及される要素、成分またはステップが、明白に言及されていない他の要素、成分またはステップと共に存在するか、または利用されるか、または組み合わせられてもよいことを示すと解釈されるべきである。本明細書の特許請求の範囲が、Ａ、Ｂ、Ｃ．．．およびＮからなる群から選択されるいずれかの少なくとも１つを指す場合、この文章は、Ａ＋Ｎ、またはＢ＋Ｎなどではなく、その群からの１つの要素のみを必要とするように解釈されるべきである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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