(57)【要約】直径約１００ｎｍ未満のコアナノ粒子と、コアを囲む必要に応じたシェルと、コアナノ粒子の表面に結合した、または存在する場合にはシェルの表面に結合した被覆とを含む分子ナノタグを開示する。分子ナノタグはまた、分子標的化リガンドに選択的に結合することができる固定数の結合部位を有する官能化末端も含む。コア、シェル、および被覆のうちのいずれか１つまたは任意の組み合わせが、顕微鏡によって、または蛍光および光散乱の強度もしくはパワーを測定する装置において検出可能である分子タグの蛍光、光散乱、および／またはリガンド結合特性に寄与する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ｉ）直径約１００ｎｍ未満のコアナノ粒子と、
（ｉｉ）前記コアを囲む必要に応じたシェルと、
（ｉｉｉ）第１の部分と第２の部分とを含む被覆であって、前記第１の部分は、前記コアナノ粒子の表面に結合するか、または存在する場合には前記シェルの表面に結合し、前記第２の部分は、前記コアナノ粒子にも前記シェルにも結合せず、固定数の結合部位を有する官能化末端を含む、被覆と
を含むナノスケール分子タグであって、
前記コア、前記シェル、および前記被覆のうちのいずれか１つまたは任意の組み合わせが、顕微鏡、または蛍光および／もしくは光散乱の強度もしくはパワーを測定する装置によって検出可能である前記分子タグの蛍光、光散乱、および／またはリガンド結合特性に寄与し、
構成要素（ｉ）および（ｉｉｉ）、または（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）が共に以下の機能性：
（ａ）アセンブルされた構造の光散乱の強度もしくはパワーが、前記光散乱の強度もしくはパワーを検出する前記装置の基準ノイズの特定のレベルより上で検出可能であること；
（ｂ）蛍光強度が、機器の検出限界より上で検出されるために十分な輝度を有すること；および／または
（ｃ）リガンド特異性がリガンド結合構成要素によって付与されること
を提供する、ナノスケール分子タグ。
【請求項２】
前記結合部位の固定数が１である、請求項１に記載のナノスケール分子タグ。
【請求項３】
前記コアナノ粒子が、光散乱の強度またはパワーを測定する前記装置によって検出可能である、高い屈折率、表面形状、または光散乱特性に寄与する他の属性を有するナノ材料からなる、請求項１または請求項２に記載のナノスケール分子タグ。
【請求項４】
単一のアセンブルされた分子ナノタグが、顕微鏡または光散乱の強度もしくはパワーを測定する前記装置で検出可能である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノスケール分子タグ。
【請求項５】
前記コアナノ粒子が、量子ナノ結晶、金、銀、銅、ＴｉＯ２、シリカ、カーボン、ＣｄＳｅ、ＺｎＳ、またはグラファイトを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノスケール分子タグ。
【請求項６】
前記ナノスケール分子タグの前記構成要素の累積的光学特性によって、１つまたは複数の光散乱波長に関する検出装置の感度限界（Ｙｌｉｍｉｔ）より大きいパワーの収集がもたらされ、前記累積光学特性が、屈折率、吸光係数、直径、共鳴、透過率、および反射のうちの１つまたは複数を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノスケール分子タグ。
【請求項７】
前記構成要素が、パラメータＮＲＡＱＤ＝ＮＲｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ，Ａｎｇｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｕｍ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  ａｎｄ  Ｄｉａｍｅｔｅｒを有し、式中ＮＲＡＱＤが、光散乱の強度またはパワーを測定する装置を使用して１つまたは複数の波長に関する検出限界（Ｙｌｉｍｉｔ）より大きくなければならず、強度またはパワーが、単位面積当たりのパワーの単位として定義される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノスケール分子タグ。
【請求項８】
前記被覆が、前記量子ナノ結晶の表面に対して親和性を有するポリマーを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノスケール分子タグ。
【請求項９】
前記ポリマーが、核酸分子、例えばホスホロチオエートＤＮＡを含む、請求項８に記載のナノスケール分子タグ。
【請求項１０】
前記ポリマーが、蛍光もしくは光散乱特性またはそれら両方についての属性を有する、請求項８または請求項９に記載のナノスケール分子タグ。
【請求項１１】
前記ポリマーが、前記分子タグの蛍光、光散乱および／またはリガンド結合特性に寄与する、請求項１０に記載のナノスケール分子タグ。
【請求項１２】
前記官能化末端が、第２の結合パートナーまたは標的リガンドに対して特異的に結合することができる第１の結合パートナーを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のナノスケール分子タグ。
【請求項１３】
前記第１の結合パートナーおよび前記第２の結合パートナーがそれぞれ、
ベンジルグアニンとＳＮＡＰ−タグ；
ベンジルグアニンとＣＬＩＰ−タグ；
クリックライゲーションコンジュゲート；
ビオチンとストレプトアビジン；
一本鎖オリゴヌクレオチドと相補的一本鎖オリゴヌクレオチド；
一本鎖オリゴヌクレオチドとアプタマー；
ＤＣＦＰｙＬと前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；または
抗体と抗原
から選択される、請求項１２に記載のナノスケール分子タグ。
【請求項１４】
前記抗原が、腫瘍関連抗原を含む、請求項１３に記載のナノスケール分子タグ。
【請求項１５】
前記抗原がタンパク質タグを含む、請求項１３に記載のナノスケール分子タグ。
【請求項１６】
フルオロフォアを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のナノスケール分子タグ。
【請求項１７】
フローサイトメーターにおいて、試料中の単一標的分子を検出するための方法であって；
前記試料に、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のナノスケール分子タグを接触させるステップであって、前記ナノスケール分子タグの官能化末端が、前記試料中に存在する場合には前記標的分子に特異的に結合する、ステップと、
光散乱の強度またはパワーを測定する機器を使用して前記試料を分析するステップであって、前記機器は、側方散乱もしくは前方光散乱の検出、または蛍光の検出、またはその任意の組み合わせによって、前記標的分子に結合した個々のナノスケール分子タグを検出するように小粒子を解析するために構成される、ステップと
を含む、方法。
【請求項１８】
前記試料が、例えば２つのチャネル、例えば２つの側方散乱チャネルにおいて少なくとも２つの検出角度を使用して光散乱の強度またはパワーを測定する前記装置において分析される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
第１の側方散乱チャネルがトリガーとして使用され、第２の側方散乱チャネルが検出器として使用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
並列した閾値下事象を検出するステップを含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料が生物試料である、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記生物試料が生体膜を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物試料が細胞外小胞を含む、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的分子が腫瘍抗原を含む、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記腫瘍抗原が、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＣＤ２４、ＣＤ１３３、ＣＤ４７、ＣＤ１４７、ＰＤ−Ｌ１、ＧＰＣ−１、Ｍｕｃ−１、ＣＤ４４、ＣＤ２６、ＣＤ１４７、ＥｐＣＡＭ、ＰＳＭＡ、またはＰＤ−Ｌ１を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
以下：
（ｉ）２００ｎｍまたは１００ｎｍまたは５０ｎｍ未満のアセンブルされた直径または長さを有する構成要素と、
（ｉｉ）所望の蛍光および光散乱特性に寄与する構成要素と、
（ｉｉｉ）第１の部分と第２の部分とを有する一本鎖核酸分子などの構成要素であって、前記第１の部分が、ナノ粒子の原子価を固定数（例えば、１）の機能的結合部位に低減する、コアナノ粒子の表面に結合するホスホロチオエートＤＮＡを含む、構成要素と、
（ｉｖ）指定された標的に関する機能的リガンドに被覆結合部位を接続するためのリンカーと、
（ｖ）指定された標的に関する機能的リガンド（タンパク質、ヌクレオチド、炭水化物、または他のリガンド結合要素からなる）と
を含むナノスケール分子タグであって、
前記コア、前記シェル、および前記被覆のうちのいずれか１つまたは任意の組み合わせが、顕微鏡、または蛍光および／もしくは光散乱の強度もしくはパワーを測定する装置によって検出可能である前記分子タグの蛍光、光散乱、および／またはリガンド結合特性に寄与する、ナノスケール分子タグ。
【請求項２７】
バイオマーカーを有するサブミクロン粒子、例えばＥＶを検出する方法であって、前記バイオマーカーが、請求項１〜１６または２６のいずれか一項に記載の分子ナノタグを用いて検出され、機能的リガンドが前記バイオマーカーに対して特異的である、方法。
【請求項２８】
前記バイオマーカーが、腫瘍抗原を含み、サブミクロン粒子が、請求項１〜１６または２６のいずれか一項に記載の分子ナノタグで染色され、前記機能的リガンドが前記腫瘍抗原に対して特異的であり、次いで顕微鏡または装置を使用して染色された前記粒子を検出する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記腫瘍抗原が、ＰＳＭＡ、メソテリン、ＥｐＣａｍ、ＨＥＲ２、ＥＧＲＦ、ＣＤ２４、ＣＤ１３３、ＣＤ４７、ＣＤ１４７、ＰＤ−Ｌ１、ＧＰＣ−１、またはＭｕｃ−１である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記バイオマーカーが、ウイルス抗原を含み、前記方法が、前記機能的リガンドが前記ウイルス抗原に対して特異的である請求項１〜１６または２６のいずれか一項に記載の分子ナノタグで前記サブミクロン粒子を染色するステップと、次いで顕微鏡または装置を使用して染色された前記サブミクロン粒子を検出するステップとを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ウイルス抗原が、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＴＬＶ−Ｉ、エプスタインバーウイルス、または他のウイルス病原体に由来する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記バイオマーカーが、免疫系細胞抗原またはマーカーを含み、前記方法が、前記機能的リガンドが前記免疫系抗原またはマーカーに対して特異的である請求項１〜１６または２６のいずれか一項に記載の分子ナノタグで前記サブミクロン粒子を染色するステップと、次いで顕微鏡または装置を使用して染色された前記サブミクロン粒子を検出するステップとを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫系抗原またはマーカーが、ＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、または他の任意の免疫細胞バイオマーカーを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記バイオマーカーが、疾患抗原またはマーカーを含み、前記方法が、前記機能的リガンドが前記疾患抗原またはマーカーに対して特異的である請求項１〜１５または２５のいずれか一項に記載の分子ナノタグで前記粒子を染色するステップと、次いで顕微鏡または装置を使用して染色された前記サブミクロン粒子を検出するステップとを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患抗原またはマーカーが、アルツハイマー病、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、糖尿病、炎症性腸疾患、リウマチ疾患、炎症性疾患、内分泌疾患、消化器疾患、神経疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、または腎疾患のマーカーを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
１つまたは複数のナノスケール分子タグを個々に検出するために、一般的なデコンボリューション法をスペクトル散乱データに適用する、１つまたは複数の標的を検出するための請求項１〜１６または２６に記載の１つまたは複数のナノスケール分子タグの使用。
【請求項３７】
下流のアッセイにおいて選別された標的の選別および使用のために、単一のまたはまれなエピトープ感度を用いて１つまたは複数の標的を検出するための、請求項１１〜１６または２６に記載の１つまたは複数のナノスケール分子タグの使用。
【請求項３８】
分析または選別のために１つまたは複数の標的を検出するためのアレイまたは多重化セットとしての、請求項１〜１６または２６に記載の１つまたは複数のナノスケール分子タグの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年１０月２１日に出願された米国仮出願第６２／４１１，３２４号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
政府助成の承認
本発明は、米国国立衛生研究所、米国がん研究所によるプロジェクト番号Ｚ０１ＢＣ０１１５０２の下で政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、ナノスケール分子タグおよび例えばフローサイトメーターにおける標的の検出のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
単一のナノ粒子を検出、解析、および／または選別するための改善された方法および装置があれば、臨床および研究目的の両方にとって有利であろう。例えば、それらは、重要な生物機能を有し、および治療剤、標的、またはバイオマーカーとしての使用に関して顕著な生物医学的潜在性を有する、細胞外小胞（ＥＶ）および細胞によって放出された他のナノスケール粒子を同定および分析するために有用であろう。ＥＶの構成要素および生物機能が、それらを産生する細胞のタイプおよびそれらが産生される条件に基づいて異なることは一般的に容認されている（ＲａｐｏｓｏおよびＳｔｏｏｒｖｏｇｅｌ、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００巻（４号）：３７３〜３８３頁、２０１３年）。しかし、細胞系統およびサブセットが定義されるようにこれらの粒子のサブセットを特徴付けることはこれまで可能ではなかった。同様に、他のナノスケール粒子ならびにこれらのナノスケール粒子の個々の分子構成要素を検出、選別、および計数することもこれまで困難であった。この技術の妨げとなっているのは、特定の属性に基づいて個々のナノスケール粒子を分析、選別、および機能的に試験するために利用可能なツールおよび試薬がないことであった。
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、１９７２年にＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇとその共同研究者によって導入されて以降、標識された細胞サブセットを同定および選別するために使用されているが（Ｊｕｌｉｕｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、６９巻（７号）：１９３４〜１９３８頁、１９７２年；Ｂｏｎｎｅｒら、Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍ、４３巻：４０４〜４０９頁、１９７２年）、およそ５００ｎｍより小さい粒子に関するサブミクロン亜集団の選別は、実現不可能であると考えられている。フローサイトメトリーにおける通常の知識では、１マイクロメートルより小さい粒子からのシグナルは、試料のデブリからのシグナルおよび電子ノイズにおいて失われ、したがって検出不能のままであると考えられる。ある特定の近代的な高分解能の機器では、ＥＶを検出することができる感度範囲が、約２００ｎｍのＥＶサイズおよび約１０個の蛍光分子検出限界まで拡大したが、現在、単一エピトープの検出に基づいて２００ｎｍ以下のＥＶを検出、分析、および選別することができる機器はない。したがって、ＥＶの表面上の単一の受容体などの単一分子の検出および定量を可能にする試薬、およびフローサイトメトリーなどの方法を強化する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ＲａｐｏｓｏおよびＳｔｏｏｒｖｏｇｅｌ、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２０１３年）２００巻（４号）：３７３〜３８３頁
【非特許文献２】Ｊｕｌｉｕｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９７２年）６９巻（７号）：１９３４〜１９３８頁
【非特許文献３】Ｂｏｎｎｅｒら、Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍ（１９７２年）４３巻：４０４〜４０９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
選別能を有するフローサイトメーターは、個々の細胞を選別および試験するために使用することができるが、単一エピトープの感度で２００ナノメートルより小さいナノ材料を検出および選別することができるフローサイトメーターまたは類似の機器は開発されていない。このギャップを克服するために、本発明者らは、近代的な高分解能のフローサイトメーターによって個々に検出することができ、したがって蛍光標識抗体などの標準的な方法によって検出するには小さすぎるかまたは少なすぎるエピトープを有する小さいＥＶまたは他のナノ生物材料の検出および選別を可能にする、マルチパラメータ標識（本明細書において分子ナノタグと呼ぶ）を開発した。
【０００７】
本明細書に開示される組成物および方法は、ナノスケール粒子／小胞の機能的選別および単一分子の検出に対するこれまでの障壁を克服する。本明細書において、顕微鏡、またはフローサイトメーターなどの蛍光および／もしくは光散乱の強度（本明細書において光散乱能とも呼ぶ）を測定する高分解能装置による単一分子の検出を可能にするナノスケール分子タグを開示する。分子タグは、例えば高分解能検出となるように構成されたフローサイトメーターにおいて使用することができる。例えば米国特許出願公開第２０１３００９５５７５号およびＭｏｒａｌｅｓ−Ｋａｓｔｒｅｓａｎａら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、７巻：１８７８頁、２０１７年に開示されているｎａｎｏＦＡＣＳ方法を参照されたい。
【０００８】
一部の実施形態では、ナノスケール分子タグは、直径約１００ｎｍ未満（例えば、直径４０ｎｍ未満、または２０ｎｍ未満、例えば約１０〜１００ｎｍ、１０〜５０ｎｍ、または４０〜８０ｎｍ、例えば１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、または１００ｎｍ）のコアナノ粒子と、コアを囲む必要に応じたシェルと、第１の部分と第２の部分とを有する被覆（ａｒｍｏｒ）であって、第１の部分がコアナノ粒子の表面に結合するか、または存在する場合にはシェルの表面に結合し、第２の部分が、コアナノ粒子にもシェルにも結合せず、固定数のおよび／または定量可能な数（例えば、１つ）の結合部位を有する官能化末端を含む被覆とを含む。コア、シェル、および被覆のうちのいずれか１つまたは任意の組み合わせが、フローサイトメトリー装置のような特定の機器の基準ノイズレベルより上の光散乱の強度を測定する高分解能装置によって検出可能である分子タグの蛍光、光散乱、および／または標的（例えば、リガンド）結合特性に寄与する。例えば、開示される分子ナノタグの弾性光散乱強度により、アセンブルされた構造は、（弾性）光散乱（一般的に側方または前方散乱と呼ばれる）の検出限界レベルより上で検出可能となり、蛍光またはラマン散乱光強度により、アセンブルされた構造は、機器の非弾性散乱光の検出限界より上で検出するために十分な輝度を有することができ、標的（例えば、リガンド）特異性により、広いスペクトルのナノスケール生物学的標的の同定および特徴付けが可能となる。それらのマルチパラメータ特徴の少なくとも１つを有する開示される分子ナノタグにより、機器による個々の分子ナノタグとしてのその検出が可能となり、このように開示される分子ナノタグを使用して、わずか１つのエピトープまたはリガンドを有するＥＶを検出することができる。
【０００９】
他のより特定の例では、ナノスケール分子タグは、直径１００ｎｍ未満のコアナノ粒子と、必要に応じたシェルと、第１の部分および第２の部分を有する被覆（例えば、ポリマー）とを含む。被覆の第１の部分は、ナノ粒子の原子価を固定数（例えば、１つ）の機能的結合部位に低減する被覆をコアナノ粒子の表面に付着させる共有結合部位を含み、第２の部分は、被覆の結合部位を、指定されたまたは予め選択された標的に関する機能的リガンドに接続するためのリンカー；および指定された標的に関する機能的リガンド（タンパク質、ヌクレオチド、または他のリガンド結合要素からなる）を提供し、コア、シェル、および被覆のうちのいずれか１つまたは任意の組み合わせが、顕微鏡、または蛍光および光散乱の強度を測定する高分解能装置によって検出可能である分子タグの蛍光、光散乱、および／またはリガンド結合特性に寄与する。他のより特定の例では、コアは、フローサイトメーターによって検出可能である光散乱特性に寄与する高い屈折率、表面形状または他の属性を有する量子ナノ結晶（必要に応じたシェルを有する）を含み、被覆は、結合パートナーまたは標的リガンドに特異的に結合することができるポリマーである。
【００１０】
開示される分子タグは、単一のナノ粒子、例えば量子ナノ結晶、およびそれに対して分子タグが結合する標的の検出能を提供する。異なる分子タグを組み合わせることによって、ナノスケール粒子を検出および選別することが可能であり、同様に、ナノスケール粒子の個々の分子構成要素、例えば細胞またはＥＶ上の表面受容体を検出および計数することも可能である。分子タグは、目的の個々の対応する標的に結合する制御された原子価（例えば、一価）を有することができる。そのような原子価制御結合により、例えばフローサイトメーター出力において、または光散乱と蛍光を同時に検出する他の方法を使用して、例えばシフトした検出シグナルピークにおける結合分子数を計数することが可能となる。単一分子を検出できることは、広い生物医学、生体防御、産業、環境、および他の適用を有する。例えば、分子タグを使用して、細胞外微小小胞およびウイルスの生物学的に関連するサブセットの特定の分子数を、良好な忠実度および関連するサブセットの単離能を伴って検出および決定することができる。他の例では、放射線曝露、疾患検出、臨床的予後、または治療的処置もしくはプロトコールの選択に関連するバイオマーカー（バイオシグネチャーを含む）を検出することができる。
【００１１】
同様に、光散乱および蛍光の同時検出を可能にする機器（例えば、フローサイトメーター）において標的を検出する方法も提供される。標的は、例えば試料中の単一の標的分子であり得る。一部の例では、方法は、試料に、本明細書に開示されるナノスケール分子タグを接触させるステップであって、ナノスケール分子タグの官能化末端が、試料中に存在する場合には標的分子に特異的に結合するステップと、小粒子を解析するように構成された機器を使用して試料を分析し、側方散乱の検出または蛍光の検出、またはその両方によって標的分子に結合した個々のナノスケール分子タグを検出するステップとを含む。
【００１２】
本開示の別の態様は、機能的リガンドが腫瘍抗原に対して特異的である分子ナノタグを使用して、腫瘍抗原を有する細胞外小胞（ＥＶ）または他のサブミクロン粒子を検出し、次いで顕微鏡、または蛍光および／もしくは光の散乱および強度を測定する高分解能装置を使用して染色された粒子を検出する方法を開示する。制限ではない例として、腫瘍抗原は、ＰＳＭＡ、メソテリン、ＥｐＣａｍ、ＨＥＲ２、ＥＧＲＦ、ＣＤ２４、ＣＤ１３３、ＣＤ４７、ＣＤ１４７、ＰＤ−Ｌ１、ＧＰＣ−１もしくはＭｕｃ−１、または詳細な説明において後に記載する他のマーカーであり得る。あるいは、方法は、感染性病原体抗原、例えばウイルス抗原を有するＥＶまたは他のサブミクロン粒子を、機能的リガンドがウイルス抗原に対して特異的である分子ナノタグを使用して検出する。例えばおよび限定ではないが、ウイルス抗原は、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ＨＴＬＶ−Ｉ、エプスタインバーウイルス、または本明細書において後に記載されるウイルスに由来する。なお他の実施形態では、方法は、機能的リガンドが免疫系抗原またはマーカーに対して特異的である免疫系抗原またはマーカーを検出する。例えばおよび限定ではないが、免疫系抗原またはマーカーは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、または本明細書に記載される他のマーカーである。別の実施形態では、方法は、疾患抗原またはマーカーを有するＥＶまたは他のサブミクロン粒子を検出し、疾患抗原またはマーカーは、例えばおよび限定ではないが、アルツハイマー病、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、糖尿病、炎症性腸疾患、リウマチ疾患、炎症性疾患、内分泌疾患、消化器疾患、神経疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、または腎疾患、または本明細書において後に記載される他のマーカーである。
【００１３】
開示される分子ナノタグは、その設計がモジュール性であることから、コア、被覆、およびリガンド結合構成要素のモジュール性の組み合わせを有する一組の分子ナノタグをアセンブルして多重分子ナノタグアレイを産生し、各々が弾性および非弾性光散乱特性に関して特有の属性を有し、各々のタイプが独自のリガンド特異性を有する複数のタイプの分子ナノタグを使用して、複数の異なる標的を同時または同時期に検出することができる。選別フローサイトメーターと共に使用する場合、分子ナノタグは、さらに下流のアッセイに使用するために、各分子ナノタグがわずか１つの特定のリガンド／エピトープに特異的に結合することに基づいてＥＶまたは他の標的の特定の亜集団の選別および下流の分析を可能にする。このように、一部の例では、開示される方法は、いくつかの異なるリガンドに会合したＥＶが同時または同時期に検出されるという点において多重化されている（例えば、その表面上に異なる標的分子を含むＥＶは、開示される分子ナノタグ、例えば各々が特定の標的ＥＶ集団に対して特異的である複数の異なる分子ナノタグ集団によって同時または同時期に検出することができる）。一部の例では、方法は多重化され、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも４０個の異なる分子ナノタグ集団が、例えば複数の異なる標的（例えば、抗原、ＥＶマーカー、およびその組み合わせ）を検出するために、開示される方法と共に使用される。
【００１４】
本開示の前述および他の目的および特徴は、例示のために限って提供され、添付の図面を参照して進められる以下の詳細な説明および実施例からより明らかとなるであろう。詳細な例は、他者が、本発明の範囲を限定することなく、本発明を作製および使用することができるための要件を満たす。
【００１５】
以下の図面の少なくとも一部は、カラーで提出されている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｂは、例示的な分子ナノタグの略図である。図１Ａは、高い複素屈折率（ＲＩ）を有するコア粒子１０、例えば量子ナノ結晶または他の高複素ＲＩナノ材料（例えば、銀または金）と、「被覆」１２、例えば単官能化ＤＮＡ末端を有するチオール化一本鎖ＤＮＡとを含む分子ナノタグを例証する。官能化ＤＮＡ末端１４は、特定の「鍵」、例えば標的リガンドに結合することができる「錠」（または「錠」の結合部位）として作用する。ｎａｎｏＦＡＣＳ法を使用して、単一粒子を側方散乱（ＳＳｃ）および／または蛍光によって解析することができ、一価のナノタグにより単一分子リガンドの列挙が可能となる。あるいは、単一粒子を、顕微鏡または他の光学的方法（例えば、ナノ粒子追跡またはＳＥＲＳ、例えば、Ｓｔｒｅｍｅｒｓｃｈら、Ｓｍａｌｌ、１２巻：３２９２〜３０１頁、２０１６年を参照されたい）によってイメージングすることができる。図１Ｂは、チオール化一本鎖ＤＮＡ被覆１２と、単官能化ＤＮＡ末端１４とを有する一価の被覆された量子ナノ結晶（例えば、ＱＤＯＴ（登録商標））２０の例を示す。被覆された量子ナノ結晶はまた、相補的ＤＮＡ末端を使用して縦列で使用することもできる。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｂは、例示的な分子ナノタグの略図である。図１Ａは、高い複素屈折率（ＲＩ）を有するコア粒子１０、例えば量子ナノ結晶または他の高複素ＲＩナノ材料（例えば、銀または金）と、「被覆」１２、例えば単官能化ＤＮＡ末端を有するチオール化一本鎖ＤＮＡとを含む分子ナノタグを例証する。官能化ＤＮＡ末端１４は、特定の「鍵」、例えば標的リガンドに結合することができる「錠」（または「錠」の結合部位）として作用する。ｎａｎｏＦＡＣＳ法を使用して、単一粒子を側方散乱（ＳＳｃ）および／または蛍光によって解析することができ、一価のナノタグにより単一分子リガンドの列挙が可能となる。あるいは、単一粒子を、顕微鏡または他の光学的方法（例えば、ナノ粒子追跡またはＳＥＲＳ、例えば、Ｓｔｒｅｍｅｒｓｃｈら、Ｓｍａｌｌ、１２巻：３２９２〜３０１頁、２０１６年を参照されたい）によってイメージングすることができる。図１Ｂは、チオール化一本鎖ＤＮＡ被覆１２と、単官能化ＤＮＡ末端１４とを有する一価の被覆された量子ナノ結晶（例えば、ＱＤＯＴ（登録商標））２０の例を示す。被覆された量子ナノ結晶はまた、相補的ＤＮＡ末端を使用して縦列で使用することもできる。
【００１７】
【図１−３】図１Ｃは、参照により本明細書に援用されている、Ｆａｒｌｏｗら、Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０巻（１２号）：１２０３〜１２０５頁（２０１３年）に開示されるタイプの一価の量子ナノ結晶の図を概略的に説明する。Ｆｏｗｌｅｒらの一価の量子ナノ結晶は、ＮａｎｏＦＡＣＳなどの高分解能フローサイトメトリーでは単一粒子として検出できない。粒子は、それらが大量に流される場合に限って検出され、そのため、粒子はレーザーをインターセプトする同時の複数の粒子の「群れ」として検出される。図はまた、標的に選択的に結合することができる分子複合構造を産生するためのその先行技術のアプローチの変化形も例証する。
【００１８】
【図１−４】図１Ｄは、上のパネルにおいて、第２の結合パートナー（例えば、標的、例えばタンパク質、例えばリガンド）１８に特異的に結合する第１の結合パートナー１６（例えば、標識またはタグ）に１つの末端１４で連結する被覆１２（例えば、一価のチオール化ＤＮＡ被覆、一価のポリアデニル化ＤＮＡ被覆（Ｙａｏら、ＮＰＧ  Ａｓｉａ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、７巻：ｅ１５９頁、２０１５年）；または全結合表面分子当たり１個の機能的リガンドを含む化学量論比の被覆分子（例えば、Ｌｅｄｕｃら、ＮａｎｏＬｅｔｔｅｒｓ、１３巻：１４８９〜９４頁、２０１３年））を有する量子ナノ結晶１０を含む、本開示に従う分子ナノタグ３０の図を説明する。同様に、下のパネルに、第１の被覆された量子ナノ結晶４０が、第２の量子ナノ結晶５０に連結し、これが第２の結合パートナー（例えば、標的、例えばタンパク質、例えばリガンド）１８に特異的に結合する第１の結合パートナー１６（例えば、標識またはタグ）に連結するという概念の変化形も表す。一例では、一価の被覆の設計により、１対１のリガンド対標識の結合、および列挙された標識数と測定された標的（ＥＶエピトープ）数との一致が確実となる。しかし、わずか１つの標的エピトープを検出する目的のために、多価表面化学、例えばストレプトアビジンまたはチオール−ＰＥＧ（Ｄｕｃｈｅｓｎｅら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２４巻：１３５７２〜８０頁、２００８年）を被覆として使用することができる。
【００１９】
【図２】図２は、予想される散乱光強度（線、ＭｉｅＰｌｏｔ、ｐｈｉｌｌｉｐｌａｖｅｎ．ｃｏｍによってモデル化されるミー理論に基づく）と、ｎａｎｏＦＡＣＳのために構成されたＡｓｔｒｉｏｓ−ＥＱによって検出された散乱光強度とを比較するプロットの図であり、その材料を示す。曲線および左の軸は、ＥＶ（ＲＩ＝１．４０）、ポリスチレンビーズ（ＲＩ＝１．６１）、およびシリカビーズ（ＲＩ＝１．４６）、ならびに媒体としての水（ＲＩ＝１．３３）に関する４８８ｎｍレーザーでのミー理論に基づく光散乱予測モデルである。曲線上の点は、Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱ機器で分析した実際の粒子の経験的な強度測定の中央値（標準偏差を伴う）を表し、それらがミーモデルによって数学的に予測された散乱と比較してどの程度適合するかを示している。例えば、金粒子（２０ｎｍ〜１００ｎｍ）は、金材料と入射レーザー光との量子相互作用により高い複素屈折率およびプラズモン共鳴が起こることにより、ポリスチレン、シリカまたはＥＶなどの材料より高い予測散乱強度を有する。
【００２０】
【図３】図３は、ｎａｎｏＦＡＣＳ法を使用した５６１ｎｍ  ＳＳＣおよび４８８  ＳＳＣでの側方散乱、ならびに蛍光による、個々の２９ｎｍ  ＰＥＧ化ＱＤＯＴＳ（登録商標）の検出の図である。
【００２１】
【図４】図４は、開示される分子ナノタグが、一部の例において、光を弾性的に（入射光と同じ波長範囲で）散乱するナノスケール光散乱要素（１つの描写される実施形態ではコアナノ粒子、例えば図１Ｂにおける１０）と、やはり光を特異的に非弾性的に散乱する要素（フルオロフォアまたはラマン散乱分子）（コアナノ粒子が量子ナノ結晶である場合には散乱強度に寄与する構成要素でもあり得るか、または弾性および非弾性散乱スペクトルの両方を産生する類似の構成要素であり得る）と、Ｆａｒｌｏｗら、Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０巻（１２号）：１２０３〜１２０５頁（２０１３年）のように、標的検出のための一価のリンカーとを含むモジュール性の構成要素を含む新しいクラスの標識であることを示す。分子ナノタグにより、単一のナノスケールサイズの小胞の表面上の単一分子の検出が可能となる。２９−ｎｍ  ＰＥＧ化ＱＤＯＴＳ（登録商標）の検出。ＱＤＯＴＳ（登録商標）は、ＡｓｔｒｉｏｓＥＱにおいて開示されるｎａｎｏＦＡＣＳ法を使用する場合、蛍光によって個々の（単一分子）粒子として十分に解析されることに加え、散乱光ノイズフロアおよびそれより上で観察される。ＰＢＳ単独を、機器のノイズを表すために使用した。同様に、ｎａｎｏＦＡＣＳシステムによって試験したＰＥＧ化ＱＤＯＴＳ（登録商標）の販売元が提供したＱＤＯＴ（登録商標）の仕様も示す。
【００２２】
【図５】図５は、バルク分析（ビーズベースのフローサイトメトリーを使用する）および単一ＥＶの分析による、前立腺細胞株からの細胞外小胞（ＥＶ）における前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）発現の検出を示す。
【００２３】
【図６】図６Ａは、特有の光散乱特性を有する４つの代表的な異なる材料の屈折率と波長の間の関係を示す一連の４つのグラフである。図６Ｂは、公開されているデータベース（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅｉｎｄｅｘ．ｉｎｆｏ）から得たプロットデータを示す。金は、弾性光散乱を増加させるためおよびバックグラウンドノイズレベルより上での検出を改善するために、量子ナノ結晶の反射率を増加させるために分子ナノタグにおいて使用することができる高複素屈折率材料の１つの具体例である。４０５ｎｍで、屈折率は１．５２３６であり、吸光係数は１．８４０９である。
【００２４】
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、（Ａ）金ナノスフェアおよび金ナノアーチン（ｎａｎｏｕｒｃｈｉｎ）の製造元の吸収の仕様である。（Ｂ）標準的な金ナノ粒子（上）および金ナノアーチン（下）は、様々なサイズ、例えば１５ｎｍから１００ｎｍまでで利用可能である。金ナノスフェアを金ナノアーチンと識別するのは、その表面形状であり、その表面が光とどのように相互作用するかである。金ナノ粒子およびナノアーチンを使用して、特有の吸収および光散乱パターンを達成することができ、これによって同じ材料（金）で構成されているにもかかわらず、および同じ平均直径であるにもかかわらず、溶液中のこれらの材料は異なる色であるという視覚的外観が得られる。これらの材料は、個々の物体として解析することができることから、およびそれらが特有の光散乱スペクトルを有することから、それらは直径のみならず、その吸光度および散乱プロファイルによっても識別することができる。このように、金ナノスフェアまたは金ナノアーチンなどのナノ材料を、開示される分子ナノタグにおいて高いＲＩを有するコア粒子（例えば、図１Ｂでの１０）として使用することができ、それらを、異なる特異的リガンド会合ＥＶを同定するために多重様式で使用することができる。その上、表面形状および粒子サイズの差によって、異なる光散乱特性が得られることから、異なるエピトープ特異性を有する分子ナノタグにおいてこれらの異なる材料をコアとして使用することにより、多重標識セットアッセイにおいて蛍光に基づく階層化が一般的に使用されるのと同じ様式で、コア材料の光散乱特性に基づく標識セットの階層化が可能となる（Ｋｒｕｔｚｋｉｋら、第６章、第６．３１項、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、２０１１年）。
【００２５】
【図８】図８は、金ナノスフェアと金ナノアーチンについて観察された光学特徴の比較である。金ナノ粒子（左）、金ナノアーチン（中央）、およびポリスチレンビーズ（右）（全て１００ｎｍ）の比較。構成要素材料の異なる波長での屈折率を、Ｇａｒｄｉｎｅｒら（参照により本明細書に援用されている、Ｊ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ、３巻：２５３６１頁、２０１４年）に記載されている方法によって記載されるように決定する。本実施例における金ナノアーチンおよび金ナノスフェアはいずれも、この方法によって約１．４またはそれより上の誘導ＲＩを有するが、ナノサイトビデオスクリーンショット（下）に見ることができるように、金ナノアーチンで見られた可視光は、金ナノアーチンの表面からの散乱光の回折がより大きいために、同じサイズの金ナノスフェアより大きい。光の回折の差は、これらのナノ材料間の散乱光特徴に１つの目に見える差をもたらし、他方は、図７Ａに示すように吸光度およびプラズモン共鳴である。
【００２６】
【図９】図９は、本明細書に開示される分子ナノタグのモジュール性構成要素の略図であり、これは一部の例において、強蛍光構成要素、光散乱構成要素、およびリガンド特異的結合構成要素を含む。強蛍光構成要素は、例えば、１００  ＭＥＳＦ（既知の可溶性蛍光分子数（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｆ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ）（ＭＥＳＦ））より強い蛍光を有し、強力かつ特有の光散乱特徴を有する構成要素はフローサイトメーターにおいてＦＳＣまたはＳＳＣによって解析可能であり、リガンド特異的結合構成要素は、例えばアプタマー、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）、抗体、または小分子リガンドである。
【００２７】
【図１０−１】図１０Ａは、開示される分子ナノタグと共に使用することができる小分子前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）リガンドを提供する（例えば、図１Ｂにおける１４、図１１Ａ〜１１Ｆを参照されたい）。
【００２８】
【図１０−２】図１０Ｂは、第２の合成ＰＳＭＡリガンド、ビオチン−ＰＥＧ−アミド−ＰＳＭＡ  ＣＣＷ−ＩＩ−３７２を提供する（例えば、図１Ｂにおける１４）。図１０Ｃは、開示された分子ナノタグと共に使用するための、ＮＣＩ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅによって合成された第３の合成ＰＳＭＡリガンド、ビオチン−ＰＥＧ８−ＰＳＭＡ  ＣＣＷ−ＩＩ−３６１を提供する（例えば、図１Ｂにおける１４）。
【００２９】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｆは、ＰＳＭＡ特異的分子ナノタグの状況で一価の量子ナノ結晶構築物（左）を以前の量子ナノ結晶−ＳＡ−ｍＡｂ（右）と対比させる図である。分子ナノタグとして構築されたそのような多価標識（図１１Ｆ）は、ＥＶ上の単一のエピトープを検出するための感度を提供するが、ＥＶ当たりのエピトープの計数または列挙にとって最も有用である１対１の結合化学量論を与えない。（Ａ）は、一般的なコアおよび一価の被覆の例であり、（Ｂ〜Ｄ）は、ビオチン化標的結合分子、例えばビオチン化抗体（Ｂ）、ビオチン化アプタマー（Ｃ）、またはビオチン化小分子リガンド（Ｄ）にカップリングさせるためのストレプトアビジンのリガンドとして機能する末端のビオチン化被覆を例証する。（Ｅ）は、クリックケミストリーによってＰＳＭＡリガンドＤＣＢＯ−ＴＥＧにコンジュゲートさせたナノ粒子の表面上のアジ化一価ポリマーを表す。（Ｆ）は、代表的な従来の多価ストレプトアビジンＱＤｏｔを示し、これは図１８に示すように、ＥＶに結合する抗ＰＳＭＡ抗体を含む、ビオチン化分子に結合するために使用される。図１１Ｂの設計はまた、ＰＳＭＡ結合アプタマー配列が、コア表面またはシェルのいずれかに結合する「被覆」する配列に隣接する合成オリゴヌクレオチドからもなり得る。
【００３０】
【図１２】図１２Ａは、分子ナノタグと共に使用するための３つのＰＳＭＡ結合アプタマーの構造を表す（配列番号１〜３）。ＰＳＭＡ結合アプタマー配列は、特定の例において、被覆ＤＮＡの末端に含まれた。図１２Ｂは、ＰＳＭＡの表面発現を検出するための５’−ＴＥＧスペーサーを付加したＡ９ｇの使用を実証する（右）。図１２Ｃは、標識のリガンドとしての使用を促進するためにＡ９ｇに行った修飾の模式図を提供する。図１２Ｄは、末端のリガンド結合要素１４としてこのＡ９ｇアプタマーを分子ナノタグ被覆配列１２に取り込む模式図を提供する。
【００３１】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｅは、ナノタグのシェルの深さを従来の６ｎｍ未満の深さから１０ｎｍより大きいシェルの深さ、例えば１０〜２０ｎｍに増加させると、分子ナノタグの過少計数を減少させることができることを実証する。シングル−ＮＱＤフォトルミネセンス試験からの例。（Ａ）典型的に１００個より多くの個々のｇ−ＮＱＤの分析から構築したＣｄＳｅ／１９ＣｄＳ  ｇ−ＮＱＤ集団のオン時間（ｏｎ−ｔｉｍｅ）のヒストグラム。個々のＣｄＳｅ／１９ＣｄＳ  ｇ−ＮＱＤの例としての蛍光の時間トレース（ヒストグラムを調製するために使用する）を（Ａ）の挿入図に示す。（Ｂ）異なるオン時間の「パーセントＮＱＤ集団」のＣｄＳシェル単層の数に対するプロット。２つの調製物／分析を、１０、１６、および１９シェルシステムに関してプロットし、（Ｂ）において実験変動の指標を提供する。（Ｃ）光退色挙動：経時的な発光ＮＱＤ画分のプロットを、ＣｄＳｅ／５ＣｄＳ（左上）、ＣｄＳｅ／１０ＣｄＳ（右上）、ＣｄＳｅ／１５ＣｄＳ（左下）、およびＣｄＳｅ／１９ＣｄＳ（右下）コアシェルＮＱＤに関して表す。観察時間の≧９９％で「オン」であるＮＱＤ（「非明滅」集団）（Ｄ）、および観察時間の≧８０％で「オン」であるＮＱＤ（「ほぼ非明滅」集団）（Ｅ）に関する、総観察時間（０．５、５、および５４分間）の関数としてのＮＱＤ集団のパーセントのシェルの厚さに対する比較。
【００３２】
【図１４−１】図１４Ａ〜１４Ｄは、ｎａｎｏＦＡＣＳを実施するためのＡｓｔｒｉｏｓＥＱの構成を例証する。（Ａ）側方散乱レーザー光の軌道（破線）、それと共にその対応する蛍光検出経路を直交の前方ではない検出経路に実線で示す。この略図は、コアの流れおよび試料粒子（流れの中心における点によって表される）がこれらの試験で使用した４つのレーザーによってインターセプトされる、シース液の流れを実証する。各レーザーは、特徴的な回折輪を生成するのみならず、暗い拡散した散乱光（ここでは例証するために緑色レーザーのみを示す）を生成する。（Ｂ）整列した位置でレーザーが流れをインターセプトする際のＡｓｔｒｉｏｓＥＱ調査チャンバーの画像は、流れのスイッチを切ると拡散した散乱光が存在すること、これは、流れのスイッチを入れると、レーザーインターセプトの平面（チャンバー壁およびドアに沿って）周囲の回折輪に沿って明るくなることを実証する。ＬＥＤパルサー（Ｃ）を使用した、候補トリガーチャネルにおけるノイズフロアの相対的比較、孤立した非使用ＰＭＴ検出器スロットにおける光トリガー（固定されたパルス速度）としてのＬＥＤパルサーの使用。（Ｄ）サブミクロン粒子（１００、２００、および５００ｎｍポリスチレンビーズ）の分析および各レーザーの解像能の比較のために、トリガー／閾値を５６１ｅｘ−ＳＳＣチャネルについて１秒間に１０〜１５ｋの事象の速度（ｅｐｓ）、最大試料ｅｐｓ速度の約１０〜１５％で拡散した散乱光の検出を可能にするように設定した。側方散乱シグナル検出により、４８８ｅｘ−ＳＳＣチャネルにおいて最大の小粒子の解析が実証されたが、５６１ｅｘ−ＳＳＣは、この機器における最善のシグナル：ノイズ分離をもたらした。
【図１４−２】図１４Ａ〜１４Ｄは、ｎａｎｏＦＡＣＳを実施するためのＡｓｔｒｉｏｓＥＱの構成を例証する。（Ａ）側方散乱レーザー光の軌道（破線）、それと共にその対応する蛍光検出経路を直交の前方ではない検出経路に実線で示す。この略図は、コアの流れおよび試料粒子（流れの中心における点によって表される）がこれらの試験で使用した４つのレーザーによってインターセプトされる、シース液の流れを実証する。各レーザーは、特徴的な回折輪を生成するのみならず、暗い拡散した散乱光（ここでは例証するために緑色レーザーのみを示す）を生成する。（Ｂ）整列した位置でレーザーが流れをインターセプトする際のＡｓｔｒｉｏｓＥＱ調査チャンバーの画像は、流れのスイッチを切ると拡散した散乱光が存在すること、これは、流れのスイッチを入れると、レーザーインターセプトの平面（チャンバー壁およびドアに沿って）周囲の回折輪に沿って明るくなることを実証する。ＬＥＤパルサー（Ｃ）を使用した、候補トリガーチャネルにおけるノイズフロアの相対的比較、孤立した非使用ＰＭＴ検出器スロットにおける光トリガー（固定されたパルス速度）としてのＬＥＤパルサーの使用。（Ｄ）サブミクロン粒子（１００、２００、および５００ｎｍポリスチレンビーズ）の分析および各レーザーの解像能の比較のために、トリガー／閾値を５６１ｅｘ−ＳＳＣチャネルについて１秒間に１０〜１５ｋの事象の速度（ｅｐｓ）、最大試料ｅｐｓ速度の約１０〜１５％で拡散した散乱光の検出を可能にするように設定した。側方散乱シグナル検出により、４８８ｅｘ−ＳＳＣチャネルにおいて最大の小粒子の解析が実証されたが、５６１ｅｘ−ＳＳＣは、この機器における最善のシグナル：ノイズ分離をもたらした。
【００３３】
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｉは、ｎａｎｏＦＡＣＳによる細胞外小胞（ＥＶ）の分析、選別、および再分析を例証する。１００ｎｍフルオロスフェア（Ａ）と共に、比較のために樹状細胞株（ＤＣ２．４）および乳癌細胞株（４Ｔ１）からのＥＶを、ナノサイトＮＴＡ（ＢおよびＣ）およびｎａｎｏＦＡＣＳ（それぞれ、Ｄ、Ｅ、およびＦ）によって特徴付けた。基準ノイズ（赤色の破線の枠）を、ノイズレベル（緑色の破線の枠）より上で検出された事象／材料に関するデータと共にモニターした。４Ｔ１およびＤＣ２．４細胞株からの腫瘍および免疫ＥＶ集団をそれぞれ、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒバイオレット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって標識した。非結合標識を、ＮＡＰ−５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）サイズ排除クロマトグラフィーによって除去し、ＥＶ集団を混合した後、（Ｇ）に示す選別ゲートによって分析および選別した。選別したＥＶ試料を遠心分離濃縮（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５、１０ｋＮＭＷＬ）によって濃縮し、再度分析した（ＨおよびＩ）。再分析により、純度が＞９５％（陽性選択ゲートにおける再分析事象の数を、陰性選択ゲートおよび二重陽性ゲートにおける再分析事象の合計で除することによって計算する）であることが実証され、選別されたＥＶのみが基準ノイズを超えて観察されたが、陰性選択ＥＶは観察されなかった。
【００３４】
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｅは、金、銀、ポリスチレン、白金、二酸化チタン、酸化鉄、および銅を含む３００〜８００ｎｍの多様な組成物のＵＶ−可視光スペクトルにおける（Ａ）２０ｎｍ、（Ｂ）４０ｎｍ、（Ｃ）６０ｎｍ、（Ｄ）８０、および（Ｅ）１００ｎｍ粒子のスペクトル散乱特性を例証する。
【００３５】
【図１７−１】図１７Ａ〜１７Ｂは、（Ａ）公表された屈折率および吸光率によりミー理論を使用してモデル化した４０ｎｍ金および銀ナノ粒子の断面散乱特徴を例証する。垂直の線は、ＡｓｔｒｉｏｓＥＱフローサイトメーターの照射波長を表す。（Ｂ）４０５、４８８、５６１、および６４０ｎｍ散乱チャネルで獲得した４０ｎｍ金（青色）および４０ｎｍ銀（赤色）の生データ。
【００３６】
【図１７−２】図１７Ｃは、適切なｓｓ検出器を使用して金および銀ナノ粒子を互いにどのように識別するかを数学的モデルに基づいて例証する。
【００３７】
【図１８】図１８は、フローサイトメトリーを使用して量子ドット（Ｑｄｏｔ）によって標識した細胞外小胞（ＥＶ）の検出を例証する。
【００３８】
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｃは、（Ａ）蛍光陽性（ＣＦＳＥ＋）細胞外小胞（ＥＶ）、（Ｂ）ＣＦＳＥ＋ＥＶ事象の４８８ｎｍ散乱強度のシフトを引き起こす、Ａｕナノタグに付着したＣＦＳＥ＋ＥＶの検出を例証する。（Ｃ）は、ＥＶの５６１ｎｍでの散乱強度のシフトを引き起こす、Ａｇナノタグで染色したＣＦＳＥ＋ＥＶを示す。
【００３９】
【図２０】図２０は、金で構成される４０ｎｍ、６０ｎｍ、または８０ｎｍナノ粒子、およびポリスチレンで構成される１００ｎｍナノ粒子を検出するためにＡｓｔｒｉｏｓ機器またはＳｙｍｐｈｏｎｙ機器を使用して得た生データを例証する。
【００４０】
【図２１】図２１は、ＥＶを単離、標識、および検出するためのプロトコールを例証する。
【００４１】
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｂは、（Ａ）Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱ（２４Ａ）および（Ｂ）ＦＡＣＳ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーターの収集光学（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｐｔｉｃｓ）を使用して、ポリスチレン（ビーズＲＩ＝１．６０４）、シリカ（ビーズＲＩ＝１．４３５〜１．４６５）、および細胞外小胞範囲（緑色）を表す屈折率によるミー理論を使用した球状粒子のモデル化を例証する。各図面に、モデル化した球状粒子に関連する獲得したポリスチレンおよびシリカビーズデータを重ねた。Ｙ軸は、フローサイトメーターの任意の単位のスケールを表し、絶対単位の予測データを任意の値に正規化した。１００ｎｍおよび１０００ｎｍの平均ＲＩの細胞外小胞のチャネル数を黒色の破線で示す。機器検出限界を強調する閾値およびシステムノイズを赤色の破線で表す。
【００４２】
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｄは、（Ａ）各集団が異なる量の赤色および緑色標識（示されるＰ１およびＰ２パラメータ）を有する３８個の異なるビーズ集団のフローサイトメトリー分析の検出を例証する。（Ｂ）ＥＶに結合した３つのビーズ集団をそのエピトープによって同定するための、３８個のビーズセットおよび異なるＥＶエピトープに対して特異的な標識抗体による血漿からのＥＶの捕捉および検出。（Ｃ）単一のエピトープおよび単一のＥＶ感度を可能にする多重ＥＶ分析アレイを生成するための分子ナノタグの使用を例証する。（Ｄ）ＥＶ上のＰＳＭＡの検出に基づいて選別したＥＶのｍｉＲＮＡプロファイルと、バルクＥＶ集団ｍｉＲＮＡまたはＰＳＭＡ陰性ＥＶのｍｉＲＮＡの比較。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
配列表
核酸配列を、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  １．８２２に定義されているようにヌクレオチド塩基の標準的な略号を使用して示す。各々の核酸配列の１つの鎖のみを示すが、相補鎖も、表示される鎖に対する任意の言及によって含まれると理解される。配列表は、２０１７年１０月２３日に４．００Ｋｂで作成され、本明細書と共に提出され、参照により本明細書に援用されている。
【００４４】
配列番号１は、Ａ１０−３．２  ＰＳＭＡアプタマー配列である。
配列番号２は、Ａ９ｇ  ＰＳＭＡアプタマー配列である。
配列番号３は、Ａ９ｇ．６  ＰＳＭＡアプタマー配列である。
以下の配列番号４〜１３に関しては、ホスホロチオエートＤＮＡ＝Ａ＊、Ｇ＊、Ｃ＊、Ｔ＊；ＲＮＡ＝ｒＡ、ｒＧ、ｒＣ、ｒＵ；ホスホロチオエートＲＮＡ＝ｒＡ＊、ｒＧ＊、ｒＣ＊、ｒＵ＊；２’Ｏ−メチルＲＮＡ＝ｍＡ、ｍＧ、ｍＣ、ｍＵ；ホスホロチオエート２’Ｏ−メチルＲＮＡ＝ｍＡ＊、ｍＧ＊、ｍＣ＊、ｍＵ；ロックド核酸（ＬＮＡ）＝＋Ａ、＋Ｇ、＋Ｃ、＋Ｔ（二重標識プローブに限って利用可能）；３’ビオチン−ＴＥＧ（テトラメチレングリコール）＝／３ＢｉｏＴＥＧ／；内部２’−フッ化ウリジン（ｆｌｕｏｒｏｄｉｎａｔｅｄ  Ｕｒｉｄｉｎｅ）＝／ｉ２ＦＵ／；３２ＦＵ＝ａ３’２−フルオロウリジン；５Ｂｉｏｓｇ、５’位置に単一のグリコールリンカーを有するビオチン；ＤＢＣＯジベンゾシルクロチル（ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｌｃｌｏｃｔｙｌ）＝クリック付着；混合塩基＝大文字の塩基（同様に、ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｐａｇｅｓ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ−ｖａｕｌｔ／ｒｅａｄｉｎｇ−ｒｏｏｍ／ｑｕｉｃｋ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ／ａｌｌ−ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓを参照されたい）。
【表２】
2019533156.tif 000002
【００４５】
Ｉ．略語
ＥＶ                    細胞外小胞
ＦＳｃ                  前方散乱
ｎａｎｏＦＡＣＳ        ナノスケール蛍光活性化細胞選別
ＰＭＴ                  光電子増倍管
ＰＳ                    ポリスチレン
ＰＳＭＡ                前立腺特異的膜抗原
ＱＤＯＴ（登録商標）    市販の量子ナノ結晶
ＳＰＤ                  小粒子検出器
ＳＰＯ                  小粒子のオプション
ＳＳｃまたはｓｓ        側方散乱
【００４６】
ＩＩ．用語および方法
特に示していない限り、技術用語は、通常の使用に従って使用される。一般的な用語（例えば、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、プローブ、細胞外小胞、および他の多く）の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｖ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓによる刊行、１９９４年（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．による刊行、１９９４年（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．による刊行、１９９５年（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見出され得る。
【００４７】
特に説明していない限り、本明細書で使用する全ての科学技術用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、本文が明らかにそれ以外であることを示していない限り、複数形を含む。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに関して与えられている全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、全ての分子量または分子質量の値は、概算であり、説明のために提供されるとさらに理解すべきである。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を、本開示の実践または試験に使用することができるが、適した方法および材料を以下に記載する。本明細書に援用されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用されている。矛盾する場合は、用語の説明を含む本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、制限的でないと意図される。
本開示の様々な実施形態の検討を容易にするため、特定の用語に関して以下の説明を提供する。
【００４８】
アプタマー：核酸アプタマーは、タンパク質およびペプチドなどの予め選択された標的に高い親和性および特異性で結合することができる一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ（ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ）分子である。ペプチドアプタマーは、特異的標的分子に結合するように選択または操作された人工タンパク質である。
【００４９】
被覆：本明細書に開示される分子タグを参照して、被覆は、ナノ粒子の表面を実質的に覆い、その結合が望ましくない他のポリマーが結合するのを排除することによって他のポリマーが結合しないように保護する、コアナノ粒子の表面上のポリマーを指す。一部の例では、排除は立体排除（ｓｔｅｒｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）である。したがって、被覆は、被覆されたナノ粒子の制御された原子価、例えば一価を確保するために役立つ。
【００５０】
アビジン／ストレプトアビジン：アビジンのビオチンに対する極めて高い親和性により、複雑な混合物中のビオチン含有分子を、アビジンに識別的に結合させることができる。アビジンは、卵白、ならびに鳥類、は虫類、および霊長類の組織に見出される糖タンパク質である。アビジンは、６７，０００〜６８，０００ダルトンの複合質量を有する４つの同一のサブユニットを含む。各々のサブユニットは、１２８個のアミノ酸からなり、ビオチン１分子に結合する。広範囲の化学修飾を行ってもアビジンの活性にはほとんど影響を及ぼさないことから、アビジンはタンパク質精製にとって特に有用である。
【００５１】
別のビオチン結合タンパク質は、ストレプトアビジンであり、これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉから単離され、質量６０，０００ダルトンを有する。アビジンとは対照的に、ストレプトアビジンは、炭水化物を有さず、わずかに酸性のｐＩ  ５．５を有する。アビジンの別の型は、ＮＥＵＴＲＡＶＩＤＩＮ（商標）ビオチン結合タンパク質（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能）であり、質量はおよそ６０，０００ダルトンである。
【００５２】
アビジン−ビオチン複合体は、タンパク質とリガンドとの間で既知の最も強い非共有結合相互作用（Ｋａ＝１０１５Ｍ−１）である。ビオチンとアビジンの間の結合の形成は、非常に急速であり、一度形成されると、極端なｐＨ、温度、有機溶媒、および他の変性剤によって影響を受けない。
【００５３】
ストレプトアビジンを、他のタイプのアビジンに置換することができる。用語「アビジン」は、アビジン、ストレプトアビジン、および類似のビオチン結合特徴を有する他の型のアビジン（例えば、その誘導体またはアナログ）を指すことを意味する。アビジン／ストレプトアビジンのアナログまたは誘導体には、ニトロストレプトアビジン、非グリコシル化アビジン、Ｎ−アシルアビジン（例えば、Ｎ−アセチル、Ｎ−フタリル、およびＮ−スクシニルアビジン）、および市販の製品であるＥＸＴＲＡＶＩＤＩＮ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｎｅｕｔｒａｌｉｔｅ  Ａｖｉｄｉｎ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）、およびＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるがこれらに限定されない。さらなるアビジン／ストレプトアビジンのアナログおよび誘導体が、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第５，９７３，１２４号および米国特許出願公開第２００４／０１９１８３２号；第２００７／０１０５１６２号；および第２００８／０２５５００４号を参照されたい）。
【００５４】
結合パートナー：関係する分子の三次元構造に依存する特異的非共有結合相互作用によって相互作用する分子対のメンバー。特異的結合パートナーの例示的な対には、抗原／抗体、ハプテン／抗体、リガンド／受容体、核酸鎖／相補的核酸鎖、基質／酵素、阻害剤／酵素、炭水化物／レシチン、ビオチン／アビジン（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン）、およびウイルス／細胞受容体が挙げられる。
【００５５】
バイオマーカー：その存在が、生物の観察可能な特徴（表現型）を示す、生物における測定可能な物質。バイオマーカーを使用して、疾患の存在、疾患の進行、および／または処置の効果を測定することができる。多様なバイオマーカーが当技術分野で公知であり、これには、生物試料に存在する小胞、マイクロＲＮＡ、またはタンパク質などの循環中のバイオマーカーが挙げられる。被験体または個体の表現型を特徴付けることは、疾患または状態の診断、疾患または状態の予後、疾患の病期または状態の病期の決定、薬物の有効性、生理状態、臓器の窮迫もしくは臓器の拒絶、疾患もしくは状態の進行、疾患もしくは状態に対する治療に関係する関連、または特定の生理的もしくは生物学的状態を含み得るがこれらに限定されない。
【００５６】
ビオチン：アビジンおよびストレプトアビジンに対して高い親和性で結合する分子（ビタミンＨまたはビタミンＢ７としても知られる）。ビオチンはしばしば、蛍光または酵素レポーター分子などの検出可能な標識に連結されたアビジンまたはストレプトアビジンによってその後に検出されるように、核酸およびタンパク質を標識するために使用される。分子（例えば、抗体または他のタンパク質試料）のビオチン化は、ビオチン上の遊離のカルボキシル基を、抗体またはタンパク質検体／アナログにおいて見出されるアミン基などのタンパク質上のアミン基と反応させることによって、当技術分野において日常的に達成される。特に示していない限り、用語「ビオチン」は、アビジンとの結合反応に関与する誘導体またはアナログを含む。ビオチンアナログおよび誘導体には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−イミノビオチン（ＮＨＳ−イミノビオチン）、２−イミノビオチンのアミノまたはスルフヒドリル誘導体、アミドビオチン、デスチオビオチン、ビオチンスルホン、カプロイルアミドビオチンおよびビオシチン、ビオチニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホ−スクシンイミド−イミノビオチン、ビオチンブロモアセチルヒドラジド、ｐ−ジアゾベンゾイルビオシチン、３−（Ｎ−マレイミドプロピオニル）ビオシチン、６−（６−ビオチンアミドヘキサンアミド）ヘキサノエートおよび２−ビオチンアミドエタンチオールが挙げられるがこれらに限定されない。ビオチン誘導体はまた、ＤＳＢ−Ｘ（商標）ビオチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのように市販されている。さらなるビオチンアナログおよび誘導体は公知である（例えば、米国特許第５，１６８，０４９号；米国特許出願公開第２００４／００２４１９７号、第２００１／００１６３４３号、および第２００５／００４８０１２号；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ１９９５／００７４６６を参照されたい）。
【００５７】
ビオチン結合タンパク質：意図される目的に関して十分に大きい親和性でビオチンに結合するタンパク質。ビオチン結合タンパク質の例は、当技術分野で周知であり、これには、アビジン、ストレプトアビジン、ＮＥＵＴＲＡＶＩＤＩＮ（商標）、およびビオチンに特異的に結合するモノクローナル抗体または受容体分子が挙げられる。本開示の文脈において、ストレプトアビジンを、他の任意のビオチン結合タンパク質またはビオチン結合タンパク質の組み合わせに交換することができる。
【００５８】
クリックコンジュゲーション：「クリック」ケミストリーを使用するコンジュゲーション、これはモジュール性で範囲が広く、非常に高い収量をもたらし、無害の副産物のみを生成する化学反応を記載する用語である。「クリック」反応の一例は、ヒュスゲン銅（Ｉ）触媒アジド−アルキン１，３−双極子環化付加（ＣＵＡＡＣ）であり、１，４−二置換五員環である１，２，３−トリアゾール環を生じる。アジドとアルキンの間のこの反応は、高い収率を与え、合成ポリマー、フルオロフォア、小分子などの多様な分子に、または生体分子の特定の位置に比較的容易に導入することができる官能基を伴う。生物学的目的のこの反応のポジティブな態様は、アジドおよびアルキン官能基が生物学的分子および水性環境に対してほぼ不活性であるという点である。より最近、ＤＣＢＯ−ＴＥＧおよびアジ化リンカーを使用して、銅不含クリックコンジュゲーションが利用できるようになった。
【００５９】
コンジュゲートされた：例えば共有結合によって共に結合した２つの分子を指す。コンジュゲートの一例は、検出可能な標識、例えばフルオロフォアにコンジュゲートして検出基質を形成する分子（例えば、アビジン／ストレプトアビジン）である。
接触させる：直接の物理的会合に置くことであり、固体型および液体型の両方を含む。本明細書で使用される場合、「接触させる」は、「曝露する」と互換的に使用される。
【００６０】
対照：参照標準、例えば陽性対照または陰性対照。陽性対照は、陽性の試験結果を提供することが既知である。陰性対照は、陰性の試験結果を提供することが既知である。しかし、参照標準は、理論的または計算された結果、例えば集団において得られた結果であり得る。
【００６１】
細胞外小胞およびエクソソーム：本明細書で使用される場合、細胞外小胞（ＥＶ）は、細胞から脱落した膜小胞である。そのような小胞または膜小胞には、循環中の微小小胞（ｃＭＶ）、微小小胞、エクソソーム、ナノ小胞、デクソソーム（ｄｅｘｏｓｏｍｅ）、ブレブ、小水泡（ｂｌｅｂｂｙ）、プロスタソーム（ｐｒｏｓｔａｓｏｍｅ）、微小粒子、内腔小胞、膜断片、内腔エンドソーム小胞、エンドソーム様小胞、エクソサイトーシスビヒクル（ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｖｅｈｉｃｌｅ）、エンドソーム小胞、エンドソームの小胞、アポトーシス体、多胞体、分泌小胞、リン脂質小胞、リポソーム小胞、アルゴソーム（ａｒｇｏｓｏｍｅ）、テキサソーム（ｔｅｘａｓｏｍｅ）、セクレソーム（ｓｅｃｒｅｓｏｍｅ）、トレロソーム（ｔｏｌｅｒｏｓｏｍｅ）、メラノソーム（ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ）、オンコソーム（ｏｎｃｏｓｏｍｅ）、またはエクソサイトーシスされたビヒクルが挙げられるがこれらに限定されない。小胞は、時にペイロードと呼ばれる可溶性の構成要素を含み得る内部区画を囲む細胞膜と類似の脂質二重層を有する球状構造を含む。循環中のＥＶは、診断目的にとって特に有用である。
【００６２】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、広範囲の哺乳動物細胞タイプによって分泌される直径約４０〜１５０ｎｍの小さい分泌小胞であるエクソソームを利用する。今日まで試験されたほとんどのエクソソームは、進化的に保存された一組のタンパク質分子、および異なる細胞タイプによって分泌されたエクソソームを識別する一組の組織／細胞タイプ特異的タンパク質を有する。エクソソーム中のＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含み、これは１つ細胞から別の細胞へと行き来し、レシピエント細胞のタンパク質産生に影響を及ぼし得る。エクソソームは、エンドソームの内側への出芽（ｉｎｗａｒｄ  ｂｕｄｄｉｎｇ）を通して内腔小胞（ＩＬＶ）を形成して多胞体（ＭＶＢ）を形成することによってその生合成が特徴付けられる。次に、これらのＭＶＢは、細胞外膜と融合し、ＩＬＶ（今ではエクソソーム）の積み荷を細胞外環境に放出する。エンドソームは、まずエンドサイトーシスによる細胞膜の内側への出芽によって形成されて脂質膜の逆転が起こり、細胞外環境の一部を内腔側に捕捉する。同様に、エンドソーム膜の第２の内側への出芽により、細胞のある体積の細胞質が捕捉され、正の配向のＩＬＶ脂質膜が得られる。ＩＬＶ（今ではエクソソーム）が、細胞外環境に放出されると、それらは細胞膜と同じ配向を有し、その細胞起源からの表面マーカーの多くを提示することが示されている。しかし、ＩＬＶ形成の際の膜タンパク質の選別プロセスは活性なプロセスであり、したがってエクソソーム表面タンパク質は、細胞起源からの表面マーカーの単純な１対１の表示ではない。小胞は、細胞から脱落した膜封入構造であり、血液、血漿、血清、乳、腹水、気管支肺胞洗浄液、および尿を含む複数の体液中に見出されている。
【００６３】
小胞は、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ウイルス、およびプリオンの輸送小胞として細胞間の連絡に関与し得る。生物試料中に存在する小胞は、バイオマーカーの供給源、例えば小胞内に存在するマーカー（小胞ペイロード）、または小胞の表面に存在するマーカーを提供する。小胞の特徴（例えば、サイズ、表面抗原、細胞起源の決定、ペイロード）はまた、診断、予後、または治療適応を提供し得る。小胞バイオマーカーの使用は、例えば米国特許出願公開第２０１４０２２８２３３号に開示されており、これは、１つまたは複数のｍＲＮＡ、例えばＡ２ＭＬ１、ＢＡＸ、Ｃ１０ｏｒｆ４７、Ｃ１０ｏｒｆ１６２、ＣＳＤＡ、ＥＩＦＣ３、ＥＴＦＢ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２、ＧＵＫ１、ＧＺＭＨ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＮＲＧＮ、ＰＲＤＸ５、ＰＴＭＡ、ＲＡＢＡＣ１、ＲＡＢＡＧＡＰ１Ｌ、ＲＰＬ２２、ＳＡＰ１８、ＳＥＰＷ１、ＳＯＸ１、またはその任意の組み合わせを含む単離された小胞の検出を開示している。他の小胞関連マーカーには、ＣＡ−１２５、ＣＡ  １９−９、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ＣＤ９５、ＦＡＰ−１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、ミオグロビン、テネイシンＣ、ＭＳＨ６、クローディン−３、クローディン−４、カベオリン−１、凝固因子ＩＩＩ、ＣＤ９、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ１３６、ＣＤ１４７、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｒａｂ１３、デスモコリン−１、ＥＭＰ−２、ＣＫ７、ＣＫ２０、ＧＣＤＦ１５、ＣＤ８２、Ｒａｂ−５ｂ、アネキシンＶ、ＭＦＧ−Ｅ８、ＴＩＭ−４、ＨＬＡ−ＤＲ、ｍｉＲ２００マイクロＲＮＡまたはその組み合わせが挙げられる。
【００６４】
一部の例では、小胞は、がん、例えば前立腺がんなどの状態に関して試験される、または状態を有することが既知である被験体の生物試料から単離され得る。あるいは、小胞は、細胞培養物、例えば前立腺細胞を含む培養物を含む生物試料から単離され得る。米国特許出願公開第２０１４０２２８２３３号（特に、表１および２を参照されたい）におけるバイオマーカーの開示は、参照により本明細書に組み込まれており、同様に米国特許出願公開第２０１４０１６２８８８号も参照により本明細書に組み込まれており、これは乳がん、卵巣がん、肺がん、結腸がん、腺腫／過形成性ポリープ、炎症性腸疾患、結腸直腸がん、前立腺がん、黒色腫、脳がん、心血管疾患、血液悪性疾患、肝細胞癌、子宮頸がん、子宮内膜がん、糖尿病、バレット食道、線維筋痛症、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、プリオン病、敗血症、慢性神経因性疼痛、統合失調症、双極性障害、抑うつ、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、腎細胞癌、肝硬変、食道がん、胃がん、自閉症、臓器拒絶、メチシリン耐性ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、不安定プラーク、およびその他などの疾患のさらなるバイオマーカーおよびバイオシグネチャーを開示している。その組み込まれた開示はまた、バイオシグネチャーを同定して表現型を特徴付ける方法、小胞上のバイオマーカーとして使用することができる小胞上のタンパク質をスクリーニングする方法、および小胞のバイオシグネチャーを評価することによって表現型を特徴付ける方法も記載する。これらの方法はいずれも、本明細書に開示される分子ナノタグに関連して使用することができる。
【００６５】
タイプおよび特徴付けを含む膜小胞の論評に関しては、Ｔｈｅｒｙら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００９年８月；９巻（８号）：５８１〜９３頁も参照されたい。
【００６６】
フローサイトメトリー機器：粒子が、電子検出装置による検出のためにコヒーレント光線、例えばレーザー光線の中を通過する際に、サイズまたは蛍光などの粒子の特徴に基づいて流体混合物中の個々の粒子を分析する任意の機器を含む。これは、１秒間に最大数千個の粒子の物理化学特性の同時のマルチパラメータ解析を可能にする。フローサイトメーターを、粒子の蛍光および光散乱能を検出するように構成してもよく、同様に粒子、例えば直径約１２０もしくは１４０ｎｍ未満の球相当径を有する粒子の高分解能が得られるように、または直径１００ｎｍ未満の球相当径を有するナノ粒子を検出するように構成してもよい。
【００６７】
蛍光：光または他の電磁放射線を吸収する物質による光の放射。蛍光強度は、当技術分野で公知の任意の手段によって、例えば米国国立衛生研究所から入手可能なＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、測定することができる強度の定量を指す。
【００６８】
フルオロフォア：特定の波長の光に曝露されると励起され、例えば異なる波長で光を放射する（すなわち、蛍光を発する）化学化合物。
【００６９】
本明細書に開示される方法に使用され得るフルオロフォアの例は、Ｎａｚａｒｅｎｋｏらに対する米国特許第５，８６６，３６６号に提供される：４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジンおよび誘導体、例えばアクリジンおよびアクリジンイソチオシアネート、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー、クマリンおよび誘導体、例えばクマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（クマリン１５１）；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸塩；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、塩化ダンシル）；４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオジンおよび誘導体、例えばエオジンおよびエオジンイソチオシアネート；エリスロシンおよび誘導体、例えばエリスロシンＢおよびエリスロシンイソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体、例えば５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、およびＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロスアニリン（ｐａｒａｒｏｓａｎｉｌｉｎｅ）；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリスリン；Ｒ−フィコエリスリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体、例えばピレン、酪酸ピレンおよび酪酸スクシンイミジル１−ピレン；リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ．ＲＴＭ．ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；ローダミンおよび誘導体、例えば６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１およびスルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸およびテルビウムキレート誘導体。
【００７０】
他の適したフルオロフォアには、およそ６１７ｎｍで発光するチオール反応性ユーロピウムキレートが挙げられる（ＨｅｙｄｕｋおよびＨｅｙｄｕｋ、Ａｎａｌｙｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２４８巻：２１６〜２７頁、１９９７年；Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４巻：３３１５〜２２頁、１９９９年）。
【００７１】
他の適したフルオロフォアには、ＧＦＰ、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ（商標）、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７−ジクロロローダミンおよびキサンテン（Ｌｅｅらに対する米国特許第５，８００，９９６号に記載）およびその誘導体が挙げられる。
【００７２】
蛍光タンパク質には、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ１、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰおよびＺｓＧｒｅｅｎ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＡｚｕｒｉｔｅおよびｍＴａｇＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、ｍＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ−Ｉｓｈｉ  Ｃｙａｎ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、およびｍＴＦＰ１）、黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＴａｇＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、およびｍＢａｎａｎａ）、オレンジ蛍光タンパク質（Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、およびｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｄＫｅｉｍａ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、ＡＱ１４３、ｔｄＴｏｍａｔｏ、およびＥ２−Ｃｒｉｍｓｏｎ）、オレンジ／赤色蛍光タンパク質（ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ−Ｔａｎｄｅｍ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔ１）およびＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ）、ならびにその修飾型が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７３】
多様な供給源から購入することができるフルオロフォアなどの当業者に公知の他のフルオロフォアを使用することもできる。これらのフルオロフォアのいずれも分子ナノタグの蛍光構成要素の蛍光を提供することができる。
【００７４】
ｎａｎｏＦＡＣＳ：光散乱測定と蛍光の両方を、複数のレーザーおよびそれらの様々なレーザーに対応する並列した検出路を使用して調査する（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）ことができるナノ材料の分析のための高分解能フローサイトメーターの構成。ほとんどのフローサイトメーターは、１つの側方散乱チャネルを調査するのみであるが、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＡｓｔｒｉｏｓＥＱでは、例えば１つのＳＳｃ検出器をトリガーとし、ＳＳｃパラメータを含む全ての他のピンホールからの単一事象を収集および使用することが可能である。ＡｓｔｒｉｏｓＥＱによる例では、最大のＳＳｃシグナル：ノイズ分離は、中央の（７個中４番目）ピンホールでの５６１ｎｍレーザーのＳＳｃ検出器によるトリガリング、その後第２のピンホールでの４８８ｎｍ検出器によるＳＳｃ分析によって達成され、これはＡｓｔｒｉｏｓＥＱの標準的な構成である。このアプローチにより、４８８ｎｍ  ＳＳｃ検出器（図１４Ａ〜１４Ｄ）および他の「並列した」チャネルにおいて「部分透過ウインドウ」が得られ、これによって並列したチャネルがトリガーチャネルとして使用されている場合には、事象を認識および調査し、並列した散乱チャネルの閾値として設定されているレベルより下の非常に低い強度で散乱する微粒子集団の比率を評価することができる。用語「並列した閾値下」事象は、並列したチャネルにおいて検出されるが、そのチャネルが、並列した閾値レベルの決定因子と同じ基準ノイズ比でトリガーチャネルとして使用されている場合の閾値よりは低い範囲で検出されるこれらの事象を記載するために使用される（ノイズ事象または粒子関連事象によらず）。基準ノイズ比を、機器の設定時に一次（トリガー）閾値を有するチャネルに設定したことから、この比を、シース液単独、基準ノイズにおけるバックグラウンドノイズ事象の大部分を構成する散乱光を産生する光：流れ相互作用に設定する。このようにして、シース液から並列した閾値下事象を調査することが可能である。シース液のみを流す場合、並列した閾値下の割合は基準比、または閾値チャネルにおいて検出された流れから外れた反射率にほぼ等しかった。試料を流す場合、並列した閾値下事象の割合は、トリガーチャネルの閾値レベルであるかまたはそれを超える粒子関連光散乱事象の割合が増加すると増加した。これを図１５Ａ〜１５Ｉにおいて代表的なＥＶ試料に関して例証する。基準ノイズ比を増加させるために閾値の値を低下させると、この操作が、そうでなければその個々の散乱特性に基づいて検出されていない事象の調査頻度を増加させることから、可視化される並列した閾値下粒子（試料中に存在する場合）の割合を増加させた。
【００７５】
５６１ｎｍ  ＳＳｃチャネルのトリガーレベルより下に予想される「ブラインド」領域が存在するが、並列した閾値下事象の有益な（とはいえ、単に代表的な）集団が４８８ｎｍ  ＳＳｃチャネルで検出された。これらの事象は、４８８ｎｍ  ＳＳｃチャネルをトリガーチャネルとして使用する場合は、４８８ｎｍ閾値によって除外されている検出レベルより下に入るが、５６１ｎｍ  ＳＳｃ閾値またはそれより上での事象の発生に関連して、４８８ｎｍ  ＳＳｃシグナルの一致に基づいて検出された。５６１ｎｍトリガー事象は、ノイズ事象または粒子散乱事象のいずれかであり得ることから、４８８ｎｍ  ＳＳｃの並列した閾値下領域において観察された試料事象は、基準ノイズの検出領域と重なり、トリガー閾値より上で光を散乱する粒子に起因するシグナル事象のみならず、流体の流れからの光の反射の一致により記録された並列した閾値下シグナルも含んだ。基準ノイズ事象の割合（すなわち、特定の機器および特定の実験に関する構成に対して固有である調査チャンバーにおけるシース液の流れからの散乱レーザー光により生じる事象の割合）は、粒子が流れていない場合には一定のままであり、シース液のみがレーザー調査ポイントで交叉した。血漿などの不均一な試料を分析する場合、割合はしばしば一定ではなく、たとえ現行のソフトウェアツールが、流体の流れから反射した光により生じる個々の事象を、個々の粒子の検出事象と識別できなくとも、並列した閾値下事象を調査して、割合および分布などの閾値下集団の一部の属性を識別することは有益であることが見出された。４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、および６４０ｎｍ  ＳＳｃ検出器の各々を比較すると、ＳＳｃトリガーの設定目的に関して、５６１ｎｍチャネルが最大の感度を提供したが、４８８ｎｍ  ＳＳｃチャネルは、ＡｓｔｒｉｏｓＥＱにおいて５６１ｎｍ  ＳＳｃトリガーと共に、並列したＳＳｃ検出器として最善のシグナル：ノイズ分離を提供した。本発明者らが使用する用語「基準ノイズ」は、閾値／トリガーレベルでのノイズ事象（閾値ノイズ）と並列した閾値下ノイズ事象の両方を集合的に指す。これらの特定のＳＳｃチャネルは、例証のために使用されているが、他の前方または側方散乱チャネルを、本例証に開示されている方法を使用してトリガーおよび検出器として選択することができる。
【００７６】
ナノ粒子：直径約１０〜約１００ナノメートル（ｎｍ）の粒子。開示されるナノタグは、貴金属、例えば金または銀（またはその両方）、または貴金属以外の材料、例えばＴｉＯ２、シリカ、カーボン、ＣｄＳｅ、ＺｎＳ、またはグラファイト、またはその任意の組み合わせで構成されるナノ粒子（例えば、図１Ａの１０）を含み得る。
【００７７】
ナノスケール：直径約１００ｎｍまたはそれ未満、例えば１０〜１００、例えば５０〜１００ｎｍを有する。
【００７８】
貴金属：空気中での腐食および酸化に耐える金属。これらには、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、オスミウム、イリジウム、白金、および金が挙げられる。本明細書における貴金属といういかなる言及も、銀および金などのこれらの金属のサブセットまたは組み合わせを含み得る。これらは、例えば量子ナノ結晶に対するシェルとして分子ナノタグにおいて使用するための高い屈折率材料を提供することができる材料の例である。
【００７９】
表現型：生物の観察可能な特徴の複合体。
【００８０】
ポリマー：反復単位で構成される天然または合成の物質、例えば反復単量体を含む高分子。ポリマー分子には、核酸分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、異種核酸（ＸＮＡ）、およびその組み合わせ、タンパク質ポリマー（例えば、微小管またはコラーゲン）、または合成の線形ポリマーが挙げられるがこれらに限定されない。核酸ポリマーは、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。開示されるナノタグは、ポリマーで構成される被覆を含み得る（例えば、図１Ａの１２）。
【００８１】
ＱＤＯＴ（登録商標）：一般的に直径約２〜１０ｎｍを有する、半導体材料からなる小さい粒子またはナノ結晶の商標。ＱＤＯＴ（登録商標）は、蛍光を発光し、その色は粒子のサイズに依存する。ＱＤＯＴ（登録商標）は、量子ナノ結晶の１タイプの特定の例である。「量子ドット」は、量子ナノ結晶を指すためにしばしば同義的に使用される別の登録されていない用語である。
【００８２】
屈折率：媒体の中を光がどのように伝播するかを説明する無次元数。屈折率は、媒体中で材料または変化に遭遇した場合にどれほど光が曲がるか、または屈折するかを決定する。一部の例では、屈折率は、光が材料とどのように相互作用するかを説明する。材料の屈折率は、材料の組成および入射波長に従って変化する（図６〜８を参照されたい）。多くの材料の屈折率が当技術分野で利用可能であり、例えばインターネット上のウェブサイト、例えばＲｅｆｒａｃｔｉｖｅＩｎｄｅｘ．Ｉｎｆｏで見出され得る。しかし、これらの屈折率の値は、一般的にナノスケール材料に関してはあまり知られておらず、フローサイトメトリーによって検出される適切な波長の完全な範囲では知られていない。本開示では、高い屈折率を有するナノ粒子を使用する。「高い」屈折率は、分子タグが、照射の入射波長で、例えばフローサイトメーターにおいて機器のノイズより上で解析することができる材料で構成されることを意味する。
【００８３】
試料：任意の生物試料（生物有機体から採取した）または環境試料（環境から採取した）を指す。生物試料は、生物有機体である被験体（例えば、ヒトまたは獣医学の被験体）から得た試料である。当技術分野で公知の特定の例では、生物試料は任意の体液、例えば末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、乳、気管支肺胞洗浄液、精液（前立腺液を含む）、カウパー腺液または尿道球腺液（ｐｒｅ−ｅｊａｃｕｌａｔｏｒｙ  ｆｌｕｉｄ）、潮吹き（ｆｅｍａｌｅ  ｅｊａｃｕｌａｔｅ）、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸水および腹水、心膜液、リンパ、キームス、乳び、胆汁、間質液、経血、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、水様便、膵液、副鼻腔洗浄液、気管支肺胞吸引液、または他の洗浄液に由来する生物学的流体試料である。生物試料はまた、卵割腔（ｂｌａｓｔｏｃｙｌ  ｃａｖｉｔｙ）、臍帯血、または胎児もしくは母親起源であり得る母体循環液も含み得る。生物試料はまた、そこから小胞および他の循環中のバイオマーカーが得られ得る組織試料または生検材料（細針吸引液を含む）であり得る。例えば、試料からの細胞を培養して、培養物から小胞を単離することができる。様々な実施形態では、バイオマーカーまたはより詳しくは本明細書に開示されるバイオシグネチャーを、そのような生物試料から直接評価することができる。バイオシグネチャーは、様々な方法、例えば血液、血漿、血清、もしくは前述の生物試料のいずれかからの核酸分子の抽出、ポリペプチド（または機能的断片）バイオマーカーを同定するためのタンパク質または抗体アレイの使用、ならびに他のアレイ、シークエンシング、ＰＣＲ、および核酸およびポリペプチド分子の同定および評価のために当技術分野で公知のプロテオミクス技術を利用した、複数または多数の生物マーカーまたはその機能的断片の存在またはレベルである。生物試料、バイオマーカー、および小胞の検出に関するさらなる情報は、参照により本明細書に援用されている、米国特許出願公開第２０１４０２２８２３３号に見出され得る。
【００８４】
散乱：それが通過する媒体中の不均一性の局在による、１つまたは複数の進路による線形軌道からの軌道（例えば、光の）の逸脱。電磁放射線（光を含む）の散乱のいくつかのタイプは、異なる屈折率の小さい球状体積によって散乱する。ミー理論は、均一な球体による電磁平面波の散乱を記載している。光の散乱は、入射波長に依存し、波長の範囲にわたって材料特異的強度プロファイルを有する。光は、異なる材料のナノ粒子および／または異なる表面形状と異なるように相互作用する（図８）。異なる多くの装置が光散乱の強度を測定するために公知であり、これにはフローサイトメーターおよび米国特許出願公開第２００９０２５１６９６号に示されている装置が挙げられる。
【００８５】
シェル：光散乱の強度を検出するためのフローサイトメーターなどの装置の基準ノイズより上で、アセンブルした粒子を検出可能にするために十分に高い屈折率または光散乱能を有する金または他の貴金属の層などの粒子を囲む層。あるいは、シェルの表面形状またはトポグラフィーは、回折などの散乱光の属性を増加させ、材料の表面プラズモン共鳴特性、例えばナノアーチンの棘状表面を修飾することができる。このように、例えば、開示されるナノタグは、シェルを含み得る（図１Ａ、１Ｂ、または１Ｄのいずれでも示していないが、示されるナノタグはそのようなシェルを含み得ると認識される）。
【００８６】
ＳＮＡＰおよびＣＬＩＰタグタンパク質標識システム：選択した分子の目的のタンパク質への特異的共有結合性の付着を可能にする構築物。システムを利用するために２つのステップが存在する：目的のタンパク質をＳＮＡＰ−タグ（登録商標）融合体としてクローニングおよび発現させるステップ、ならびに選択したＳＮＡＰ−タグ基質によって融合体を標識するステップ。ＳＮＡＰ−タグは、ＤＮＡ修復タンパク質であるヒトＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡ−アルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ）に基づく小さいタンパク質である。ＳＮＡＰ−タグ基質は、色素、フルオロフォア、ビオチン、またはベンジルリンカーを介してグアニンまたはクロロピリミジン脱離基にコンジュゲートされたビーズである。標識反応において、基質の置換されたベンジル基は、ＳＮＡＰ−タグに共有結合性に付着する。ＣＬＩＰ−タグ（商標）は、ベンジルグアニン誘導体ではなくてベンジルシトシンと反応するように操作されたＳＮＡＰ−タグの修飾型である。ＳＮＡＰ−タグと共に使用すると、ＣＬＩＰ−タグは、同じ細胞において同時に２つのタンパク質の直交性および相補的な標識を可能にする。これらの方法を実施する試薬は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓから入手可能である。
【００８７】
被験体：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む範疇の生きている多細胞脊椎生物。特定の例では、被験体はヒトまたは獣医学の被験体である。
【００８８】
腫瘍抗原：腫瘍特異的免疫応答を刺激することができる腫瘍細胞において産生された抗原。例示的な腫瘍抗原には、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＴＡＧ−７２、未成熟ラミニン受容体、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化塩素チャネル２、ＲＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、チロシナーゼ、サイクリン−Ｂ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、テロメラーゼ、メソテリン、ＳＡＰ−１、サバイビン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、糖タンパク質（ｇｐ）７５、ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、ベータ−カテニン、ＰＯＴＥ、ＰＲＡＭＥ、ＭＵＭ−１、ＷＴ−１、ＰＲ−１  ＢＡＧＥファミリー、ＣＡＧＥファミリー、ＧＡＧＥファミリー、ＭＡＧＥファミリー、ＳＡＧＥファミリー、ＸＡＧＥファミリー、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＣ１Ｒ、ＰＳＡ、ＣＤＫ４、ＢＲＣＡ１／２、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ＭＡＲＴ−２、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＧＦ−ベータＲＩＩ、およびＭＵＣ１が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８９】
腫瘍またはがん：新形成の産物は、新生物（腫瘍またはがん）であり、これは過度の細胞分裂に起因する組織の異常な成長である。転移しない腫瘍を「良性」と呼ぶ。周囲の組織に浸潤するおよび／または転移し得る腫瘍は「悪性」と呼ぶ。新生物は、増殖性障害の一例である。固形腫瘍は、嚢胞または液体領域を通常含まない組織の異常な塊である。
【００９０】
固形がん、例えば肉腫および癌腫の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫（ｓｙｎｏｖｉｏｍａ）、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ悪性疾患、膵臓がん、乳がん（例えば、腺癌）、肺がん、婦人科がん（例えば、子宮のがん（例えば、子宮内膜癌）、子宮頸部のがん（例えば、子宮頸癌、前腫瘍の子宮頸部異形成）、卵巣のがん（例えば、卵巣癌、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、類内膜腫瘍、セリオブラストーマ（ｃｅｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、明細胞癌、分類不能癌（ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、顆粒膜卵胞膜細胞腫（ｇｒａｎｕｌｏｓａ−ｔｈｅｃａｌ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒ）、セルトリ−ライディッヒ細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部のがん（例えば、扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、膣のがん（例えば、明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫）、胎児性横紋筋肉腫、および卵管のがん（例えば、癌腫））、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭状癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓がん、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、およびＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽腫）、ならびに皮膚がん（例えば、黒色腫および非黒色腫）が挙げられる。
【００９１】
血液腫瘍の例には、急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、および骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病）、慢性白血病（例えば慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病）を含む白血病、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（緩徐進行性形態および高悪性度形態）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリーセル白血病、および骨髄異形成が挙げられる。
【００９２】
ＩＩＩ．いくつかの実施形態の概要
本明細書に開示されるナノスケール分子タグは、ナノスケール粒子の機能的選別に対するこれまでの障壁を克服する。本明細書に開示されるナノスケール分子タグは、例えば顕微鏡、またはフローサイトメーター装置などの蛍光および光散乱の強度を検出するための装置を使用して、単一分子の検出を可能にする。分子タグは、光散乱特性および／または蛍光特性に基づいて、機能的形態でのサブミクロン粒子の選別を可能にする。開示される分子ナノタグはまた、例えば複数の異なる標的を検出するために、例えば各々が特定の標的に対して特異的である分子ナノタグの別個の集団を使用することによって多重化も可能にする。
【００９３】
開示される分子ナノタグは、それらが個々に検出および定量されることから、独自のものである。すなわち、分子ナノタグは、検出される標的の数を直接確認するために増分単位で解析および定量することができる。これに対し、フローサイトメトリーで使用される他の検出試薬は、単にバルクで検出することができるに過ぎない（例えば、複数の標識が１つの細胞の表面上、または内部に存在する場合）。ＣｙｔＴＯＦ質量分析に基づくシステムを含む多くのフローサイトメーターは、１，０００個の標識より少ない合計「シグナル」を検出することができない。単一の標識検出能を有すると記載されている１つのフローサイトメーターは、超高感度ｎａｎｏＦＣＭ機器である（Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．、２００９年、８１巻（７号）、２５５５〜２５６３頁）。しかし、開示される分子ナノタグは、個々に検出されることに限定されない。
【００９４】
個々の分子ナノタグの検出により、粒子（例えば、細胞、エクソソーム、細胞外小胞等）当たりに付着したナノタグの数の列挙（または決定）が可能となる。このように、開示されるナノタグおよび方法を使用して、多くのエピトープが存在する場合に限ってエピトープを検出することができる現代のフローサイトメトリー機器では検出できないほど少ないエピトープを有する粒子（例えば、細胞、エクソソーム、細胞外小胞等）を検出することができる（Ｎｏｌａｎら、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ、２８巻：２５６〜６２頁）。分子ナノタグは、標的粒子（例えば、細胞、エクソソーム、細胞外小胞等）に対して特異的な１つの結合部位を有し得る。しかし、一部の例では、粒子が１つより多くの結合部位を有し得ることから、１つより多くの分子ナノタグが粒子に結合する。各々が別個の標識（例えば、別個のコア、例えば金対銀が、別個の第１の結合パートナーを有し、例えば１つが標的Ａに対して特異的で、もう１つが標的Ｂに対して特異的である、またはその組み合わせ）を有するように２つを超えるまたはそれより多くの異なる分子ナノタグを使用する場合、２つまたはそれより多くの異なる分子ナノタグが、目的の粒子に結合して、これを検出することができ、一部の例では、これを例えばスペクトル散乱デコンボリューションを使用して定量することができる。同様に、異なるコア散乱および／または蛍光スペクトルおよび別個のリガンド結合特性によって互いに識別される複数の分子ナノタグを使用して、別個のタイプのＥＶを標識することができる（例えば、前立腺または他のＰＳＭＡ発現細胞から生じるＰＳＭＡ陽性ＥＶを、ＰＳＭＡに結合する金分子ナノタグによって認識することができ、造血起源の細胞から生じるＣＤ４５陽性ＥＶから識別および選別し、銀分子ナノタグによって認識することができる）。一部の例では、集団１が標的１に対して特異的で、集団２が標的２に対して特異的等である、分子ナノタグの少なくとも２つの異なる集団を同時に使用する。
【００９５】
一部の実施形態では、ナノスケール分子タグは、直径約１００ｎｍ未満のコアナノ粒子と、第１の部分および第２の部分を有する被覆であって、第１の部分がコアナノ粒子の表面に結合し、第２の部分がコアナノ粒子に結合せず、固定数の結合部位を有する官能化末端を含む被覆とを含む。例えば、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｄを参照して、ナノスケール分子タグ２０、４０、５０は、直径約１００ｎｍ未満のコアナノ粒子１０と、第１の部分および第２の部分を有する被覆であって、第１の部分１２がコアナノ粒子の表面に結合し、第２の部分１４がコアナノ粒子に結合せず、固定数の結合部位（例えば、１、２、３、または５つの結合部位）を有する官能化末端１６を含む被覆とを含む。
【００９６】
一部の例では、ナノスケール分子タグは、コアを囲むシェルをさらに含む。これらの実施形態では、被覆の第１の部分はコアではなくてシェルに結合し、被覆の第２の部分はシェルに結合しない。一部の例では、シェルは金、銀、両方、または他の貴金属の層である。一部の例では、シェルは核酸分子（例えば、ＤＮＡ）またはＰＥＧを含む。
【００９７】
コア、シェル、および被覆のうちのいずれか１つまたは任意の組み合わせが、フローサイトメーターによって検出可能である分子タグの蛍光、光の散乱、および／またはリガンド結合特性に寄与する。
【００９８】
一部の例では、コアナノ粒子の直径は、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、または約４０〜約６０ｎｍである。特定の非制限的な例では、コアナノ粒子は、約９５ｎｍ未満、約９０ｎｍ未満、約８５ｎｍ未満、約８０ｎｍ未満、約７５ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満、約６５ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５５ｎｍ未満、または約５０ｎｍ未満である。これらの例では、コアナノ粒子は、直径少なくとも２０ｎｍである。ナノ粒子が必要に応じたシェルを含む例では、コアおよびシェルの直径は合わせて、約２０〜約１００ｎｍであるか、またはこの段落で先に述べたコアそのものに関して言及した他の任意の寸法である。
【００９９】
一部の例では、結合部位の固定数は１である。他の例では、結合部位の固定数は、２、３、４、または５である。一部の例では、被覆は、コアおよび／またはシェルに対して親和性を有し、他の任意の分子またはポリマーのナノ粒子への結合を実質的に完全に排除するために、コアおよび／またはシェルの周囲を囲むポリマーを含む。一部の例では、排除は他のポリマーの立体排除であるか、または被覆がそれからなる選択されたポリマーの１つより多くの排除である。
【０１００】
一部の実施形態では、コアナノ粒子は、フローサイトメーターなどの蛍光および／または光散乱の強度を測定する装置によって検出可能であるナノスケール分子タグの光散乱特性に寄与する高い屈折率を有するナノ材料からなる。一部の例では、コアナノ粒子は、量子ナノ結晶、例えば量子ナノ結晶または量子ドット（例えば、ＱＤＯＴ（登録商標））を含む。一部の例では、コアナノ粒子またはそのシェルは、貴金属、例えば、金または銀（または両方）、または貴金属以外の材料、例えばＴｉＯ２、シリカ、カーボン、ＣｄＳｅ、ＺｎＳ、またはグラファイト、またはその任意の組み合わせを含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、コアおよび必要に応じたシェルは、パラメータＮＲＡＱＤ＝ＮＲｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ，Ａｎｇｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｕｍ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  ａｎｄ  Ｄｉａｍｅｔｅｒを有し、式中ＮＲＡＤは、フローサイトメトリーの検出限界（Ｙｌｉｍｉｔ）より大きい。分子ナノタグの構成要素の散乱および蛍光特性、またはアセンブルした分子ナノタグの光散乱および蛍光特性は、構成要素特異的な量子効果を実証し、ＮＲＡＤは、材料の量子特性に依存し、光の特定の波長と相互作用して、増加したまたは減少したシグナル（散乱または蛍光）を産生し、これをマルチパラメトリックフローサイトメトリーによって検出することができる。分子ナノタグ材料は、分子ナノタグ−標的（標的化エピトープを有するエクソソーム、例えば標的と分子ナノタグとの間に分子ナノタグの検出される散乱または蛍光強度を修飾する量子相互作用が存在する場合）に対して固有のまたはそうでなければ結合する材料構成要素に近接している。そのような量子修飾効果は、スペクトルまたは他のマルチパラメトリックサイトメトリーアプローチによってスペクトル的に定義され得る、ある特定の波長の検出のシフトに依存し、シフトに基づいて検出可能であると予想される。
【０１０２】
一部の例では、分子ナノタグに使用されるコアおよび必要に応じたシェルは、検出機器に応じて選択的である。例えば、４０５ｎｍ散乱の照射構成のフローサイトメーターを使用する場合、分子ナノタグのコアおよび必要に応じたシェルに銀を使用すると、コアおよび必要に応じたシェルに金を使用する場合より、コア直径１０ｎｍ〜４０ｎｍを有する小さい分子ナノタグの良好な散乱に基づく検出を提供する。しかし、ナノタグを検出するために使用するフローサイトメーターまたは他の装置が５３２ｎｍ散乱の照射構成を有する場合、金のコアおよび必要に応じたシェルからなる分子ナノタグは、銀の分子ナノタグより良好な散乱に基づく検出を提供するであろう。検出機器が、４０５ｎｍおよび５３２ｎｍ散乱の照射構成の両方を有する場合、分子ナノタグに使用されるコアおよび必要に応じたシェルは、金および銀であり得て（例えば、金と銀の両方を含む１つのナノタグ、または１つが金を含み、他方が銀を含む異なるナノタグ）、同時に使用することができる。
【０１０３】
一部の実施形態では、被覆はポリマーを含む。一部の例では、ポリマーは、分子タグの蛍光、光の散乱、および／またはリガンド結合特性に寄与する。一部の例では、ポリマーは、核酸、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡを含む。特定の非制限的な例では、ＤＮＡは、一本鎖ホスホロチオエートＤＮＡ（ｐｔＤＮＡ）である。
【０１０４】
被覆が一本鎖ＤＮＡを含む特定の例では、被覆の第１の部分は、約３０〜約１００ヌクレオチド長、例えば約４０〜約９０、約５０〜約８０、または約６０〜約７０ヌクレオチド長である。一部の例では、被覆の第１の部分は、全てホスホロチオエートアデノシンヌクレオチドからなる。
【０１０５】
被覆が一本鎖ＤＮＡを含む特定の例では、被覆の第２の部分は、約１０〜約３０ヌクレオチド長、例えば約１５〜約２５、約１８〜約２２、または約２０ヌクレオチド長である。
【０１０６】
被覆がポリマーを含む他の例では、ポリマーは、ポリエチレン、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体を含む。
【０１０７】
一部の実施形態では、被覆の官能化末端は、第２の結合パートナー、例えば標的（例えば、タンパク質、例えばリガンド）に特異的に結合することができる第１の結合パートナーを含む。特定の非制限的な例では、第１および第２の結合パートナーはそれぞれ、ベンジルグアニンとＳＮＡＰ−Ｔａｇ；ベンジルグアニンとＣＬＩＰ−Ｔａｇ；ビオチンとストレプトアビジン；一本鎖オリゴヌクレオチドと相補的一本鎖オリゴヌクレオチド；一本鎖オリゴヌクレオチドとアプタマー；ＤＣＦＰｙＬと前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体とリガンド；リガンドと受容体；抗原と抗体（例えば、疾患または感染症、例えば細菌もしくはウイルス感染症に関連する抗体）；または抗体と抗原、例えば腫瘍抗原またはペプチドタグ（例えば、ＨｉｓタグまたはＦＬＡＧタグ）から選択される。一部の例では、腫瘍抗原は、ＰＳＭＡ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＨＥＲ１、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＡ１２５、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＴＡＧ７２、ＣＤ１３３、ＣＤ４７、ＣＤ１４７、ＰＤ−Ｌ１、ＧＰＣ−１、ＣＥＡ、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、またはＭｕｃ−１を含む。このように、一部の例では、ナノスケール分子タグは、第１の結合パートナーとして、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ１、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＡ１２５、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＴＡＧ７２、ＣＤ１３３、ＣＤ４７、ＣＤ１４７、ＰＤ−Ｌ１、ＧＰＣ−１、ＣＥＡ、ＡＦＰ、またはＭｕｃ−１に対して特異的な結合剤（例えば、抗体、リガンド、またはアプタマー）を含む。一部の例では、腫瘍抗原はＰＳＭＡであり、ナノスケール分子タグは、抗ＰＳＭＡ抗体またはＰＳＭＡリガンド、例えばＤＣＦＢＣを含む（図１０Ａ〜１０Ｃおよび１１Ｅを参照されたい）。
【０１０８】
一部の例では、ナノスケール分子タグは、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を検出するために、標的リガンド、例えば細胞外小胞上のリガンドに対して特異的な結合剤（例えば、受容体）、例えばＴＩＭ−４受容体を含む。例えば、そのようなナノスケール分子タグを使用して、細胞死（例えば、一般的な細胞死、アポトーシス、化学物質誘導細胞死（例えば、化学療法による）または放射線誘導細胞死）をモニターすることができる。放射線照射後に高レベルのＰＳが予想されるが、全てのＥＶは、リン脂質表面において低いまたは中等度のＰＳを含む。ＴＩＭ−４は、ＰＳにカルシウム依存的に可逆的に結合する受容体であり、結合後に標識を溶出することが可能である。開示されるナノスケール分子タグに結合するように標的化することができる他の小胞関連マーカーには、ＣＡ−１２５、ＣＡ  １９−９、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ＣＤ９５、ＦＡＰ−１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、ミオグロビン、テネイシンＣ、ＭＳＨ６、クローディン−３、クローディン−４、カベオリン−１、凝固因子ＩＩＩ、ＣＤ９、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ１３６、ＣＤ１４７、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｒａｂ１３、デスモコリン−１、ＥＭＰ−２、ＣＫ７、ＣＫ２０、ＧＣＤＦ１５、ＣＤ８２、Ｒａｂ−５ｂ、アネキシンＶ、ＭＦＧ−Ｅ８、ＨＬＡ−ＤＲ、ｍｉＲ２００マイクロＲＮＡが挙げられる（例えば、ナノタグは、それらに対して特異的な結合試薬を含み得る）。
【０１０９】
一部の実施形態では、ナノスケール分子タグは、フルオロフォア、例えば本明細書に記載したフルオロフォアの１つまたは複数を含む。
【０１１０】
一部の実施形態では、ナノスケール分子タグは、直径１００ｎｍ未満のコアナノ粒子と；必要に応じたシェルと；例えば第１の部分と第２の部分とを有する一本鎖核酸分子などの被覆であって、第１の部分が、ナノ粒子の原子価を固定数の機能的結合部位（例えば、１、２、３、４、または５つの機能的結合部位）に低減させる、コアナノ粒子の表面に結合したホスホロチオエートＤＮＡを含む、被覆と；被覆結合部位を指定された標的の機能的リガンドに接続するリンカーと；指定された標的の機能的リガンド（タンパク質、ヌクレオチド、または他のリガンド結合要素からなる）とを含み、コア、シェル、および被覆のうちのいずれか１つまたは任意の組み合わせが、それらを検出する機器によって検出可能である分子タグの蛍光、光散乱、および／またはリガンド結合特性に寄与する。
【０１１１】
他の例では、コアは、蛍光を調節し、同様に結合表面を修飾することができるシェルによって取り囲まれた蛍光コアを有する量子ナノ結晶である。なお他の例では、被覆は、分子タグの蛍光および／または結合特性をさらに修飾することができる。
【０１１２】
本明細書において、試料中の単一の標的分子をフローサイトメーターにおいて検出する方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、試料に、本明細書に開示されるナノスケール分子タグを接触させるステップであって、ナノスケール分子タグの官能化末端が、試料中に存在する場合には標的分子に特異的に結合するステップと、小分子を解析するように構成されたフローサイトメトリー機器を使用して試料を分析し、側方散乱の検出または蛍光の検出、またはその両方によって、標的分子に結合した個々のナノスケール分子タグを検出するステップとを含む。
【０１１３】
一部の実施形態では、試料を、フローサイトメーターにおいて少なくとも２つの側方散乱チャネルを使用して分析する。一部の例では、第１の側方散乱チャネルを、トリガーとして使用し、第２の側方散乱チャネルを検出器として使用する。一部の例では、方法は、並列した閾値下事象を検出するステップを含む。一部の例では、４０５ｎｍ、４４５ｎｍ、４８８ｎｍ、５３２ｎｍ、５６１ｎｍ、５９２ｎｍ、および６４０ｎｍのうちの２つまたはそれより多くなどの少なくとも２つの側方散乱チャネルを検出器として使用する。一部の例では、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、および６４０ｎｍのうちの２つまたはそれより多くなどの少なくとも２つの側方散乱チャネルを検出器として使用する。一部の例では、少なくとも４０５ｎｍおよび５６１ｎｍ、または少なくとも４８８ｎｍおよび５６１ｎｍなどの少なくとも２つの側方散乱チャネルを検出器として使用する。一部の実施形態では、試料は生物試料、例えば生体膜、例えば細胞外小胞（ＥＶ）を含む試料である。他の例では、生物試料はウイルスを含む。他の実施形態では、試料は、環境試料、例えば水、土壌、または空気試料である。
【０１１４】
方法の一部の例では、標的分子は腫瘍抗原を含む。特定の非制限的な例では、腫瘍抗原は、ＰＳＭＡ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＨＥＲ１、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＡ１２５、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＴＡＧ７２、ＣＤ１３３、ＣＤ４７、ＣＤ１４７、ＰＤ−Ｌ１、ＧＰＣ−１、ＣＥＡ、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、またはＭｕｃ−１を含む。しかし、本明細書に開示される、または援用されている参考文献に開示されるマーカーのいずれも、本明細書に開示される方法において使用することができる。
【０１１５】
ＩＶ．フローサイトメトリー
フローサイトメトリーは、細胞を流体の流れに懸濁させ、それらを電子的検出装置によって通過させることによって、細胞の計数、細胞の選別、バイオマーカー検出、およびタンパク質工学において使用されるレーザーに基づく生物物理的技術である。これは、１秒間に最大数千個の粒子の物理化学特徴の同時のマルチパラメトリック分析を可能にする。フローサイトメトリーは、健康障害、特に血液のがんの診断において日常的に使用されているが、基礎研究、臨床での実践、および臨床試験において他の多くの適用を有する。一般的な変化形は、目的の集団を精製するために、その特性に基づいて粒子を物理的に選別することである。
【０１１６】
フローサイトメトリー機器は、毎秒数千個の粒子を「リアルタイムで」分析することができ、明記された特性を有する粒子を能動的に分離および単離することができる。フローサイトメーターは、フローサイトメトリーが細胞の画像を作成するのではなく、設定されたパラメータの「ハイスループット」（多数の細胞の）自動化定量を提供すること以外は、顕微鏡と類似である。固体組織を分析する場合は、単細胞懸濁物を最初に調製する。
【０１１７】
基本的なフローサイトメーターは、５つの主要な構成要素を有する：
（１）フローセル；試料からの物体（細胞、ＥＶ、または他の検出可能な物体）を、それらが光線の中に一列縦隊で通過して感知されるように、運搬および整列させる液体の流れ（シース液）；
（２）測定システム：インピーダンス（または導電率）の測定のために一般的に使用され、ランプ（水銀、キセノン）；高出力水冷レーザー（アルゴン、クリプトン、色素レーザー）；低出力空冷レーザー（アルゴン（４８８ｎｍ）、赤色−ＨｅＮｅ（６３３ｎｍ）、緑色−ＨｅＮｅ、ＨｅＣｄ（ＵＶ））；ダイオードレーザー（青色、緑色、赤色、紫色）などの光学システムによって光のシグナルをもたらす測定システム；
（３）光からの前方散乱光（ＦＳＣ）、および側方散乱光（ＳＳＣ）ならびに蛍光シグナルを生成して、コンピューターによって処理することができる電気シグナルにする検出器およびアナログデジタル変換（ＡＤＣ）システム；
（４）増幅システム（線形または対数）；ならびに
（５）シグナルを解析するコンピューター。
【０１１８】
フローサイトメーターを使用して試料からデータを収集するプロセスは、「獲得」と呼ばれる。獲得は、フローサイトメーターに物理的に接続されたコンピューター、およびサイトメーターとのデジタルインターフェースを処理するソフトウェアを介して行われる。ソフトウェアは、試験される試料のパラメータ（例えば、電圧および補正）を調節することができ、同様にパラメータが確実に正確に設定されるように試料データを獲得する際に初回試料情報を表示するのを助ける。
【０１１９】
現在利用可能な機器は、一般的に複数のレーザーおよび蛍光検出器を有する。レーザーおよび検出器の数を増加させることにより、複数の抗体標識が可能であり、その表現型マーカーによって標的集団をより正確に同定することができる。一部の機器は、個々の細胞のデジタル画像を撮影することができ、細胞内または細胞の表面上の蛍光シグナルの位置の分析を可能にする。
【０１２０】
ナノ材料分析に適用する場合のフローサイトメトリーに関するさらなる情報は、参照により本明細書に援用されている、米国特許出願公開第２１３０００９５５７５号に見出され得る。
【０１２１】
以下の実施例は、ある特定の特色および／または実施形態を説明するために提供される。これらの実施例は、本開示を、記載される特定の特色または実施形態に限定すると解釈すべきではない。
【実施例】
【０１２２】
（実施例１：分子ナノタグ）
本実施例は、顕微鏡、または例えば、援用されている米国特許出願公開第２０１３００９５５７５号およびＭｏｒａｌｅｓ−Ｋａｓｔｒｅｓａｎａら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、７巻：１８７８頁、２０１７年に記載されているＮａｎｏＦＡＣＳ法を使用するフローサイトメーターなどの蛍光および／もしくは光散乱の強度を測定する機器を使用して、ＥＶまたはウイルスの表面上の分子などの単一分子の検出を可能にする分子ナノタグを記載する。
【０１２３】
分子ナノタグは、標的特異性、蛍光、および光散乱属性を、複合分子ナノタグに付与するモジュール性の要素で構成され、それによって個々の分子ナノタグ（および個々の分子ナノタグ標的）を、ＡｓｔｒｉｏｓＥＱなどの高分解能フローサイトメーターにおいて蛍光および光散乱の両方によって検出することができる。分子ナノタグは、疾患関連バイオマーカー、例えば腫瘍由来細胞外小胞が有する腫瘍関連タンパク質の同定のための診断および予後試薬として使用することができる。
【０１２４】
ある特定の例では、分子ナノタグは、「被覆された」コアナノ粒子を含み、これは、一価であり、細胞外小胞の表面上などの標的リガンドに、錠：鍵（または「標的：ベイト」）機構を介して個々に付着する。１つの構成要素が単一の標識分解能で検出することができる弾性または非弾性散乱特性に寄与する限り、相補的属性を有するさらなる構成要素を追加すること（例えば、フルオロフォアを付加することなく、個々に検出することができる金または銀粒子に蛍光標識を付加すること）によって、多次元の分子ナノタグ設計および多重適用が可能となるが、１つのエピトープ／リガンドを検出するために分子ナノタグを使用するために必要であるのは単に１つの解析可能な構成要素に過ぎない。
【０１２５】
分子ナノタグは、ナノスケール光散乱要素（コアナノ粒子１０、フルオロフォア（例えば、コアナノ粒子がＱＤＯＴ（登録商標）である場合にはナノ結晶））、および標的を検出するための一価リンカー１４を含む（図１Ａ〜１Ｂ）。分子ナノタグは、単一のナノサイズ小胞の表面上で単一分子を検出する方法を提供するように設計される。本発明者らは、例えばＡｓｔｒｉｏｓＥＱにおいてｎａｎｏＦＡＣＳ法を使用する場合に、２９ｎｍ  ＰＥＧ化ＱＤＯＴＳ（登録商標）を、蛍光によって個々の（単一分子）粒子として完全に解析できることに加えて、散乱光ノイズフロアにおいておよびそれより上で観察することができることを実証した。
【０１２６】
援用されているＦａｒｌｏｗらの刊行物の既に開示された一価の量子ナノ結晶を、図１Ｃに示す。この参考文献に記載されているように、立体排除は、７０〜９０ｍｅｒのＤＮＡ配列、例えばｔｔＤＮＡおよびｐｔＤＮＡを使用する。ＤＮＡ配列は、別個のサイズ、形状、したがってスペクトル特性の一価のナノ粒子を効率よく生成した。動的光散乱分析により、ｐｔＤＮＡで包まれた一価ナノ結晶が、ＩｇＧ（破線）の直径と類似の直径１２ｎｍであり、従来のストレプトアビジン量子ナノ結晶（２２ｎｍ）のほぼ半分であることが明らかとなる。ＤＮＡで包まれた量子ナノ結晶は、オリゴヌクレオチドの３’修飾によって選択的に標的とすることができる。５’標的化修飾、例えばベンジルグアニン（ＢＧ）、ベンジルシトシン（ＢＣ）、または脂質を有する相補鎖により、ｍＱＤのストレプトアビジン、ＳＮＡＰ−タグ、ＣＬＩＰ−タグ、または細胞表面へのモジュール性の標的化が可能となる。これらの標的化技術はまた、本開示の分子ナノタグに関連して使用することができる。
【０１２７】
本発明の分子ナノタグによるこの標的化アプローチの使用を、図１Ｄに例証し、ここでは、被覆されたナノ粒子４０、５０（例えば、直径１〜３０を有する量子ナノ結晶）は、量子ナノ結晶半導体表面に対して親和性を有し、ナノ粒子の表面から他の分子（ポリマーを含む）を立体的に排除する核酸ポリマー（または別の分子、例えばＰＥＧ）１２によって被覆されている。リンカー１４は、被覆（例えば、核酸ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはＰＥＧ誘導体）を、別の被覆されたナノ粒子（図１Ｄの下部）、または標的リガンドに特異的に結合する標識１６（図１Ｄの上部）、例えば細胞外小胞（ＥＶ）上の標的リガンドに連結することができる。
【０１２８】
図４は、分子ナノタグが、ナノスケール光散乱要素（１つの例示された実施例におけるコアナノ粒子）、フルオロフォア（コアナノ粒子が量子ナノ結晶または類似の構成要素である場合には、散乱強度に寄与する構成要素でもあり得る）、および標的検出のための一価リンカーを含むモジュール性の構成要素を含む新規クラスの標識であることを例証する。図４に示す例では、量子ナノ結晶は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーの立体排除被覆によってＰＥＧ化されており、これによってアセンブルされたナノタグのサイズは、例えば５〜２５ｎｍ増加する。特定の例では、被覆された量子ナノ結晶は、直径５０ｎｍ未満、例えば２０〜４０ｎｍ以下、例えば３０ｎｍ以下を有する。図４に示す例では、例えばＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能であるＡｓｔｒｉｏｒＥＱソーターにおいてｎａｎｏＦＡＣＳ高分解能フローサイトメトリー法を使用した場合に、２９−ｎｍ  ＰＥＧ化量子ナノ結晶を、蛍光によって個々の（単一分子）粒子として完全に解析可能であることに加えて、散乱光ノイズフロアにおいておよびその上で観察することができる。ＰＢＳ単独は、機器のノイズを実証するために使用した。本実施例で使用したＱｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）６５５量子ナノ結晶は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから得て、図４に示す量子ナノ結晶の仕様は、２．１μＭの吸光度、６５６ｎｍでの最大蛍光発光、量子収率７４％であった。
【０１２９】
（実施例２：小分子ＰＳＭＡ標的化リガンド）
本明細書に開示される分子ナノタグは、多数の潜在的適用を有する標識の一クラスである。一例として、それらを、腫瘍関連細胞外小胞（ＥＶ）構成要素の標識の同定のために使用することができる。前立腺がんは、予後および処置応答パターンと高度に相関する適切な腫瘍バイオマーカーを有するＥＶを生じる腫瘍のタイプの一例である。前立腺がんは、米国の男性７人に１人において診断される一般的な悪性疾患である。予後は、診断時の腫瘍の病期（播種の程度）、悪性度（または腫瘍細胞の侵襲性）、および利用可能な処置、例えばアンドロゲン除去に対する腫瘍の感受性に依存する。前立腺腫瘍細胞上の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の表面発現は、アンドロゲン除去療法に対する応答性の欠如に関連しており、診断評価目的での分子イメージング試験、患者特異的処置選択の事前の選択の改善、および適応する処置指針の提供におけるＰＳＭＡリガンド（例えば、ＤＣＦＰｙＬ）の使用を調べる治験が進行中である。これらのイメージングモダリティは、少なくとも０．５ｃｍを超える腫瘍細胞の収集物のみを解析することができる。ＰＳＭＡ発現腫瘍細胞は、ＰＳＭＡ発現ＥＶを分泌し、多くの腫瘍細胞が、典型的に健康組織を上回る単一の腫瘍細胞あたり何十倍もの濃度のＥＶを産生することから、腫瘍関連ＥＶは、血漿、尿、および他の生物学的流体の試料において同定可能な腫瘍バイオマーカーとして試験されている。本開示は、例えば、ＰＳＭＡを有するＥＶを非侵襲性に分析および定量するための、高分解能フローサイトメーターおよびＰＳＭＡに対して特異的な分子ナノタグの使用を企図する。図５は、ＰＳＭＡを発現する単一のＥＶを、ｎａｎｏＦＡＣＳによって検出できることを実証している（方法の詳細に関しては、Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｋａｓｔｒｅｓａｎａら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、７巻：１８７８頁、２０１７年を参照されたい）。
【０１３０】
図１０Ａ〜１０Ｃは、ＥＶなどの標的上の前立腺特異的リガンドを標的とするために本開示の分子ナノタグ上の標識として使用することができる小分子ＰＳＭＡリガンドの例を例証する。例えば、ＰＳＭＡリガンドを、例えば被覆ポリマー、例えば他の連結を立体的に排除し、分子ナノタグの一価標識能を提供する核酸またはＰＥＧポリマーの遊離末端に連結することによって、被覆された量子ナノ結晶に付着させることができる。このように、図１Ｂを参照して、ＰＳＭＡを発現するＥＶを検出するために使用する分子ナノプローブは、被覆ポリマー１２、例えば核酸またはＰＥＧポリマーの遊離末端１４との連結によって被覆された量子ナノ結晶２０に付着したＰＳＭＡリガンド（例えば、図１０Ａ〜１０Ｃに記載のリガンド）を含み得る（例えば、図１１Ａ〜１１Ｆを参照されたい）。
【０１３１】
（実施例３：分子ナノタグに対する標的化リガンドの付着）
図１１Ａ〜１１Ｆは、分子ナノタグを標識する概念をさらに例証し、これは量子ナノ結晶表面をさらなる反応から立体的に排除するホスホロチオエートＤＮＡ（ｐｔＤＮＡ）の被覆を有する量子ナノ結晶を開示したＦａｒｌｏｗら（Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０巻（１２号）：１２０３〜１２０５頁、２０１３年）の過去の設計とは対比をなす。ｐｔＤＮＡは、量子ナノ結晶の表面などの半導体表面に対して親和性を有する。Ｆａｒｌｏｗらによって記載されているように、市販のＣｄＳｅ：ＺｎＳ  ＱＤを有機相から水相に移した後、量子ナノ結晶を様々な配列および長さのｐｔＤＮＡによって処理する。ＤＮＡ官能化は、アガロースゲル電気泳動によって官能化されていないＱＤとは容易に識別可能であるイオン特徴を有する量子ナノ結晶を産生する。６０５ｎｍ発光量子ナノ結晶を、５０アデノシンｐｔＤＮＡドメイン（ＡＳ５０）および２０ヌクレオチドｓｓＤＮＡ標的化テール（約７０ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドを産生する）を含むオリゴヌクレオチドの漸増濃度によって滴定する。ｐｔＤＮＡと量子ナノ結晶との間の化学量論比またはそれより高い比では、官能化されていない産物または多重官能化された産物の兆候は観察されず、一価産物の定量的形成と一貫する。Ｆａｒｌｏｗらはまた、これらの一価量子ナノ結晶が、生細胞イメージングのためにしばしば使用されるタンパク質または脂質タグに対してモジュール性かつ効率的に標的化されることも実証した。標的化官能基は、ｐｔＤＮＡの３’修飾によって、または一価量子ナノ結晶と、５’修飾を有する相補的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって導入される。これらの戦略を使用してそれらを、ビオチン、ベンジルグアニン（ＢＧ）、ベンジルシトシン（ＢＣ）、および脂質にコンジュゲートさせ、それによってそれらをそれぞれ、ストレプトアビジン、ＳＮＡＰ、ＣＬＩＰ、および細胞膜に標的化することができる。
【０１３２】
本開示の分子ナノタグは、Ｆａｒｌｏｗらの開示から変更されている。図１１Ｂに示す一例では、一価ポリマーの遊離末端をビオチン化してストレプトアビジン（ＳＡ）／ビオチン、抗ＰＳＭＡ抗体に連結する。別の例では、一価ポリマーの遊離末端をビオチン化して、ストレプトアビジン（ＳＡ）／ビオチン、抗ＰＳＭＡアプタマーに連結する（図１１Ｃ）。別の例では、一価ポリマーの遊離末端をビオチン化して、ＳＡ／ビオチン小分子ＰＳＭＡリガンドに連結する（図１１Ｄ）。あるいは、一価ポリマーの遊離末端をアジ化して、ＤＣＢＯ−ＴＥＧ−ＡＣＵＰＡ／ＤＣＬ（または他の小分子ＰＳＭＡリガンド）などのクリックパートナーに連結する（図１１Ｅ）。新規分子ナノタグは、ＥＶおよび生物学的に重要な他のナノ粒子標的の標的化、選別、および計数のために特に適合する。
【０１３３】
図１１Ｆにおける別の例示される実施形態では、分子ナノタグは、他の分子のナノタグコアの表面への付着を立体的に排除するＰＥＧコーティングによって被覆されたＣｄＳｅ量子ナノ結晶のコアを含む。ストレプトアビジン（ＳＡ）をＰＥＧコーティングに結合させると、ＳＡ結合パートナーであるビオチンが、ビオチンに対する抗ＰＳＭＡ特異的モノクローナル抗体にコンジュゲートする。例えば、ストレプトアビジンＱｄｏｔを使用して、抗体のリガンドを含むＥＶに結合したビオチン化抗体を検出することができる。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、結合／付着した分子ナノタグ標識を有するＥＶを、非結合分子ナノタグから分離することができる。なお他の実施形態では、ビオチンは、Ａ９ｇなどの抗ＰＳＭＡアプタマーまたはＤＣＬなどの抗ＰＳＭＡリガンドにコンジュゲートする（ＣｄＳｅコア−ＰＥＧ−ＳＡ−ビオチン−ｍＡｂの実施形態では具体的に例証していない）。市販のストレプトアビジンＱｄｏｔを使用して、抗体のリガンドを有するＥＶに結合したビオチン化抗体を検出した。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、標識を有するＥＶを非結合標識から分離した。
【０１３４】
（実施例４：抗ＰＳＭＡアプタマーおよびリガンド）
ＰＳＭＡアプタマーは、参照により本明細書に援用されている、Ｄａｓｓｉｅら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、２２巻（１１号）：１９１０〜１９２２頁（２０１４年）、１０．１０３８／ｍｔ．２０１４．１１７の試薬の一部を使用して設計することができる。簡単に説明すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを実施した。全てのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを、２’−フルオロピリミジン、２’−ヒドロキシプリン、およびＣ１２−ＮＨ２  ５’末端修飾によって修飾した化学合成ＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡまたはＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実施した。
【０１３５】
ＲＮＡアプタマーを、Ｄａｓｓｉｅらに既に記載されているように転写した。３つのアプタマーの構造を図１２Ａに示す。図１２Ｂに示すように、得られたＡ１０−３．２アプタマーは、ＰＳＭＡに結合するが、細胞の成長を阻害せず、Ａ９ｇアプタマーはＰＳＭＡに結合して細胞成長を阻害し、およびＡ９ｇ．６アプタマーはＰＳＭＡに結合せず、細胞成長を阻害しなかった。したがって、Ａ９ｇおよびＡ１０．３アプタマーを、本開示の分子ナノタグに関連するＰＳＭＡに対するＲＮＡアプタマーとして使用することができる。このように、図１Ｂを参照して、ＰＳＭＡ（例えば、ＥＶ上のＰＳＭＢＡ）を検出するために使用する分子ナノプローブは、被覆ポリマー１２、例えば核酸またはＰＥＧポリマーの遊離末端１４との連結によって、被覆された量子ナノ結晶２０に付着したＰＳＭＡアプタマー（例えば、Ａ９ｇまたはＡ１０．３）を含み得る。
【０１３６】
一部の例では、ナノ粒子の表面上のアジ化一価ポリマーを、ＰＳＭＡリガンド、例えばＤＣＢＯ−ＴＥＧにクリックケミストリーによってコンジュゲートする（図１１Ｅを参照されたい）。ナノ粒子にコンジュゲートすることができる他のＰＳＭＡリガンドには、Ｆｕｔｕｒｅｃｈｅｍ  Ｃｏ．，ＬｔｄのＰＳＭＡリガンド、例えば、ＤＫＦＺ−ＰＳＭＡ−１１（Ｇｌｕ−ＣＯ−Ｌｙｓ（Ａｈｘ）−ＨＢＥＤ−ＣＣ、Ｇｌｕ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｌｙｓ（Ａｈｘ）−ＨＢＥＤ−ＣＣ）；ｔｅｒｔ−ブチル−ＤＣＬ−ヘキシル−ＮＨＳエステル（（Ｓ）−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル２−（３−（（Ｓ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−６−（８−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−８−オキソオクタンアミド）−１−オキソヘキサン−２−イル）ウレイド）ペンタンジオエート）；ＤＣＬ（Ｎ−［Ｎ−［（Ｓ）−１，３−ジカルボキシプロピル］カルバモイル］−（Ｓ）−Ｌ−リシン，２−［３−［５−アミノ−１−カルボキシペンチル］−ウレイド］−ペンタン二酸）；およびｔｅｒｔ−ブチル−ＤＣＬ（２−｛３−［１−ｔｅｒｔ−ブチル−カルボキシレート−（５−アミノペンチル）］−ウレイド｝−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルペンタンジオエート）が挙げられる。このように、図１Ｂを参照して、ＰＳＭＡ（例えば、ＥＶ上のＰＳＭＢＡ）を検出するために使用する分子ナノプローブは、被覆ポリマー１２、例えば核酸またはＰＥＧポリマーのアジド１４を有する遊離末端との連結によって被覆された量子ナノ結晶２０に付着したＰＳＭＡリガンド（例えば、上記のリガンド）を含み得る。
【０１３７】
（実施例５：単一のエクソソームサイズの粒子および個々の分子の検出）
開示されるナノスケール分子タグは、例えば、エクソソームなどの細胞外小胞の生物学的に関連するサブセットに関連する特定の分子数を検出および決定するために使用することができる。
【０１３８】
一部の例では、エクソソームサブセットにおける腫瘍特異的および／または免疫特異的バイオマーカーを同定する。本明細書に開示される方法は、単一のエクソソーム（または他のナノ粒子）上または内での特定のバイオマーカーの同定を可能にする。単一の量子ナノ結晶（例えば、ＱＤＯＴ（登録商標））の検出が実証されている（図３）。一価量子ナノ結晶は、単一分子の検出、計数、および追跡を可能にし、任意の所望のバイオマーカーに関して作製することができる。
【０１３９】
例示的な量子ナノ結晶は、例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から販売されている。例えば、ＱＤＯＴ（登録商標）（または他の量子ナノ結晶）は、ＵＶ波長で最大に励起され、粒子に応じて、５２５ｎｍ、５４５ｎｍ、５６５ｎｍ、５８５ｎｍ、６０５ｎｍ、６２５ｎｍ、６５５ｎｍ、７０５ｎｍ、または８００ｎｍの最大蛍光発光を有する。官能化量子ナノ結晶は、球近似で約１０〜３０ｎｍ、例えば約２０ｎｍの全体サイズを有し得る。量子ナノ結晶は、例えばセレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）／硫化亜鉛（ＺｎＳ）、またはテルル化セレンカドミウム（ＣｄＳｅＴｅ）／ＺｎＳのコア／シェル組成を有し得る。シェルは、コアの蛍光特性を修飾し得る。
【０１４０】
（実施例６：フローサイトメトリーにおけるナノタグの使用方法）
開示される分子ナノタグは、生物試料中のサブミクロン粒子、例えばナノ粒子を検出するように構成されたフローサイトメーターにおいて使用することができる。そのような方法は、例えば参照により本明細書に援用されている、米国特許出願公開第２０１３００９５５７５号に開示されている。特に、ＮａｎｏＦＡＣＳ法を開示するその特許刊行物の実施例１および２を参照されたい。同様に、参照により本明細書に援用されている、Ｄａｎｉｅｌｓｏｎら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１６年、１１巻（１号）：ｅ０１４４６７８を参照されたい。
【０１４１】
ｎａｎｏＦＡＣＳは、分子ナノタグと組み合わせて有用となる多様な特色を有する。
【０１４２】
（１）蛍光パラメータは、ｎａｎｏＦＡＣＳの使用にとって必須であるが、ｎａｎｏＦＡＣＳは、蛍光トリガーの使用を必要としない。高分解能散乱パラメータの使用により、選別パラメータおよびゲートの選択に関して観察される、分析される、および管理される集団をより完全に表すことが可能となる。
【０１４３】
（２）ｎａｎｏＦＡＣＳは、ＥＶおよび他のナノ粒子を調べるために他のフローサイトメトリーアプローチで使用されるように、いくつかのＥＶの単一のビーズへの凝集を必要としない。ｎａｎｏＦＡＣＳを、適切な試料の希釈および機器構成によって実施すると、粒子は、真の単一粒子として可視化される。粒子の一重線（ｓｉｎｇｌｅｔ）の割合（＞９９％）もまた、粒子の９０％が一重線を表す単一粒子分析に関して公表されたビーズ結合アッセイに関して観察された単一のものの割合より優れている。粒子をビーズに結合させることなく、粒子単独を検出することにより、ｎａｎｏＦＡＣＳ法は、粒子の散乱属性、生物機能、およびサブセットの表現型決定能をより良好に保存する。
【０１４４】
（３）ｎａｎｏＦＡＣＳは、機能的活性を保存しながら、広範囲の生物学的または無機ナノ粒子の分取的選別のために使用することができる高速方法を提供する。（遅い）フローセルに基づくプラットフォームによるナノスケールのウイルス選別と比較すると、本明細書に記載される高速ジェットインエアシステムによるｎａｎｏＦＡＣＳアプローチの使用により、１時間当たり１００〜１０００倍多くの粒子の調製が可能となり、この速度は、ＥＶの分取的選別および機能的アッセイのためのウイルス研究にとって必要な速度である。
【０１４５】
（４）ｎａｎｏＦＡＣＳ法は、その意図される検出範囲の限度でフローサイトメーターを使用する。そのため、閾値は、流体の流れから散乱したレーザー光の検出により、良好に定義された基準ノイズ集団が閾値および閾値のすぐ上となるレベルに設定され、設定された閾値によって除外される目的の関連する粒子が存在し得る。その閾値で基準ノイズを産生する迷光反射（ｓｔｒａｙ  ｌｉｇｈｔ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）に関連して検出される粒子の部分的代表を提供するために並列した閾値下集団を使用すると、どの性質が検出に関して「漏れている」かに関する有用な情報を提供することができる。選別の際に、この情報は、オペレーターにどのタイプの閾値下事象が選択された選別集団と共に収集されているかを知らせ、代替の染色または分離戦略を試験すべきか否かを決定する。
【０１４６】
ｎａｎｏＦＡＣＳアプローチに関して、選択された機能的試験にとって良好な忠実度、および十分な分取量で、ナノスケールＥＶおよび他の亜集団を分析および選別することが可能である。本明細書に開示される方法により、生物活性を保存しながら分取量での単一の粒子として、例えば４０〜２００ｎｍ範囲のＥＶを選別するために、ならびに１００ｎｍ範囲のＨＩＶおよび他の小粒子を選別するために、生物学的サブミクロン粒子を分離するためにフロー機器を使用することができる。分子タグは、選別および計数のために個々の粒子を標識するために有効かつ有用である。
【０１４７】
（実施例７：過少計数を軽減するための修飾）
半導体ナノ結晶（時に量子ドットと呼ばれる）は、蛍光分子プローブとしての適用にとって優れた発光体である。その光学的に励起された発光は、効率的（量子効率は１に近づき得る）であり、ナローバンドであり、および調整可能、すなわち量子ナノ結晶組成およびサイズに応じて、光出力色を、紫外光から可視光を通って赤外光まで正確に調整可能である。吸収は、準広帯域であり、励起を促進し、「光学的バーコード化」を可能にする発光色の範囲に関して複数の量子ナノ結晶を励起させるために単一の励起源を使用する可能性を可能にする。しかし、量子ナノ結晶の光学特性は、表面の厚さに対して感受性であり、そしてそれらを分子計数（例えば、フローサイトメトリーにおいて）のために使用する場合「過少計数」されることをもたらし得る（図１３Ａ〜１３Ｅ）、「オフ（ｏｆｆ）」状態にあり得る。本発明の方法は、量子ナノ結晶のシェルをその従来の約６ｎｍの厚さから少なくとも１０ｎｍまで、例えば１０〜２０ｎｍの厚さ（「巨大な」量子ナノ結晶）に増加させることによってその欠点を克服する。
【０１４８】
「巨大」量子ナノ結晶を作製する方法は、例えば、Ｖｅｌａら、Ｊ．  Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、３巻（１０〜１１号）：７０６〜７１７頁（２０１０年）、およびＨｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．  ＳＰＩＥ、７１８９巻：７１８９０４頁（２００９年３月３日）に開示されている。開示されたこれらの「巨大」量子ナノ結晶を作製する方法は、参照により本明細書に援用されている。簡単に説明すると、明滅現象の抑制能を有する非常に厚く傷のない無機シェルの成長が、３〜４ｎｍ  ＣｄＳｅ量子ナノ結晶コアで出発して達成された。無機シェルの単層を逐次的に適用することによって、粒子を約１０〜２０ｎｍのサイズに成長させる。シェルの単層、典型的にＣｄＳ、しかしＣｄｘＺｎｙＳ合金の後にＺｎＳを交互にしたものは、逐次的なイオン層の吸収および反応（ＳＩＬＡＲ）法に基づいて、変更した手順を使用してＣｄＳｅコア上で成長させる。量子ナノ結晶コアの波動関数は、その表面から有効に分離され、コロイド状の巨大量子ナノ結晶が作製される。巨大量子ナノ結晶は、長期間観察しても光脱色しないことが見出されており、明滅現象が有意に抑制されることによって特徴付けられる。
【０１４９】
（実施例８：微小小胞のプロファイリング方法）
エクソソームを含む微小小胞のプロファイリング方法は、参照により本明細書に援用されている、米国特許出願公開第２０１３００９５５７５号ならびに第２０１４０２２８２３３号および第２０１４０１６２８８８号などの刊行物に開示されている。一部の例では、プロファイリングは、ＥＶなどの微小小胞のフローサイトメトリープロファイリングおよび多様な臨床および研究適用におけるプロファイリングの使用を含む。抗原提示細胞および中でも腫瘍細胞は、大量のサブミクロン粒子、すなわちエクソソームおよび微小粒子を産生し、これは腫瘍の免疫応答および腫瘍の微小環境を調節する。その分解能限界でフローサイトメーターを使用することにより、電子顕微鏡を使用することなく、または粒子の生物学的特性を変化させるビーズへの凝集を使用することなく、機能的形態でサブミクロン粒子の分析、選別、および試験が可能となる。既に開示したｎａｎｏＦＡＣＳ法において、サイトメーターは、小粒子の最大分解能のために構成される。非特異的バックグラウンドノイズは、フィルターおよび小粒子検出器の両方を追加することによって、ならびにドロップドライブ（ｄｒｏｐ  ｄｒｉｖｅ）ノイズを除去するためにノズル高さを調整することによって低減させることができる。本明細書に開示される分子ナノプローブの使用により、方法のプロファイリング能は大きく増強される。
【０１５０】
微小小胞は、任意の従来の生物試料から得られる。個体からの血清試料は、例示的な試料であり、これを、同定および選別のために親和性試薬との結合を含む様々な方法で処理してもよい。例えば、試料を、免疫細胞のマーカー、腫瘍マーカー、放射線曝露のマーカー等に選択的に結合する抗体で染色してもよい。微小小胞はまた、マイクロＲＮＡを含むＲＮＡなどの目的の核酸の存在に関して選別および分析してもよい。微小小胞の量および／または質（例えば、目的のタンパク質もしくは核酸マーカー、または他のマーカーの存在）を、細胞傷害性治療（例えば、化学療法および放射線療法）に対する腫瘍の反応、腫瘍ワクチンに対する免疫応答のモニタリング、移植片対宿主病の発症を含む移植後の免疫細胞のモニタリング、生体線量測定（ｂｉｏｄｏｓｉｍｅｔｒｙ）（核の事故、汚染爆弾等に由来する放射線曝露レベルの評価に関して）のために使用してもよい。そのような分析は、総血清タンパク質レベルに対する微小小胞の数を検出するステップを含み、微小小胞上のアネキシンＶの存在を決定するステップを含み得る。別の実施形態では、方法は、ヒト被験体であり得る哺乳動物被験体における臨床要因を評価するステップ、および評価を微小小胞の分析と組み合わせるステップを含み得る。
【０１５１】
一部の実施形態では、血清試料などの患者の試料を、目的のマーカーを含むエクソソームまたはＥＶであり得る微小小胞の存在に関して分析する。特定の実施形態では、分析は、本発明の方法によるフローサイトメトリーである。目的のマーカーには、放射線特異的マーカー、腫瘍特異的マーカー、病原体特異的マーカー、ならびに樹状細胞マーカー等などの抗原提示細胞を含む免疫細胞マーカーが挙げられる。患者における評価により、反応性に従って分類した患者を適切な薬剤によって処置することができる、改善されたケアが可能となる。患者を、症状の最初の提示の際に分類することができ、適切な治療を維持するために疾患の経過にわたって状況をさらにモニターすることができるか、または疾患進行の任意の適切な病期に分類することができる。治療レジメン（例えば、手術、薬学的処置、または放射線療法）を分析に基づいて選択および／または投与してもよい。一実施形態では、方法は、分析に基づいて被験体の処置の経過を決定するステップをさらに含む。
【０１５２】
より広義には、分子ナノタグを使用して、膜小胞またはＥＶなどの小胞を分析することによって個体の表現型を特徴付けることができる。表現型は、被験体の任意の観察可能な特徴もしくは形質、例えば疾患もしくは状態、疾患の病期もしくは状態の病期、疾患もしくは状態に対する感受性、疾患もしくは状態に対する感受性、疾患の病期または状態の予後、生理的状態、または治療に対する応答であり得る。疾患の表現型は、被験体の遺伝子発現ならびに環境的要因の影響および両者の間の相互作用、ならびに核酸配列に対するエピジェネティック修飾に起因し得る。被験体における表現型は、被験体から生物試料を得るステップ、および試料からの１つまたは複数の小胞を分析するステップによって特徴付けることができる。例えば、被験体または個体の表現型を特徴付けるステップは、疾患または状態を検出するステップ（症候性となる前の初期病期での検出を含む）、疾患もしくは状態の予後、診断、もしくはセラノシス（ｔｈｅｒａｎｏｓｉｓ）を決定するステップ、または疾患もしくは状態の病期もしくは進行を決定するステップを含み得る。表現型の特徴付けはまた、特定の疾患、状態、疾患の病期および状態の病期にとって適切な処置もしくは処置の有効性を同定するステップ、疾患進行、特に疾患再発、転移拡散、または疾患再燃の予測および尤度分析を含み得る。表現型はまた、がんまたは腫瘍などの状態または疾患の臨床的に別個のタイプまたはサブタイプであり得る。表現型の決定はまた、生理的状態の決定、または臓器の窮迫もしくは移植後などの臓器拒絶の評価であり得る。
【０１５３】
小胞の分析はまた、被験体が、疾患または障害の処置に反応する可能性があるか否かを予測するためにバイオシグネチャーの決定にも拡大され得る。表現型の特徴付けは、被験体のレスポンダー／ノンレスポンダー状態の予測を含み、レスポンダーは、疾患の処置に反応し、ノンレスポンダーは処置に反応しない。小胞を被験体において分析し、処置に反応するまたは反応しないことがわかっている過去の被験体の小胞の分析と比較することができる。被験体における小胞のバイオシグネチャーが、処置に反応することがわかっている過去の被験体のバイオシグネチャーにより密接に整列すれば、被験体はその処置に対してレスポンダーであると特徴付けることができる。同様に、被験体における小胞のバイオシグネチャーが、処置に反応しなかった過去の被験体のバイオシグネチャーにより密接に整列する場合、被験体は、その処置に対してノンレスポンダーであると特徴付けることができる。処置は、任意の適切な疾患、障害、または他の状態の処置であり得る。方法は、レスポンダー／ノンレスポンダー状態に相関する小胞のバイオシグネチャーが既知である任意の疾患の設定で使用することができる。バイオシグネチャーにより、被験体が、特定の処置のレスポンダーであることが示される場合、その処置をその被験体に投与することができる。
【０１５４】
一部の例では、米国特許第９，７３９，７００号またはＹａｎｇら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．、８１巻：２５５５〜６３頁、２００９年）（いずれも参照により本明細書に援用されている）に開示されるフローサイトメトリー装置または方法を使用する。
【０１５５】
（実施例９：疾患を特徴付けるための疾患標的の例）
細胞由来の小胞、特に細胞外小胞（ＥＶ）、例えば微小粒子（ＭＰ）および微小小胞およびエクソソームは、疾患を検出するために有用である。細胞外小胞プロファイリングに関するさらなる情報および可能性がある疾患特異的マーカーとしてのその使用は、例えば参照により本明細書に援用されている、Ｊｕｌｉｃｈら、Ｆｒｏｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５巻：４１３頁、２０１４年に見出され得る。表記の疾患の公知のＭＰ／ＭＶプロファイルおよびＭＰ／ＭＶマーカーは、Ｊｕｌｉｃｈらから得た以下を含む：
【表３】
2019533156.tif 000003
【０１５６】
炎症疾患における細胞外小胞の役割に関するさらなる情報は、参照により本明細書に援用されている、Ｂｕｚａｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、１０巻：３５６〜３６４頁（２０１４年）に提供される。
【０１５７】
腫瘍細胞由来ＥＶは、オートクライン／パラクライン様式で他の腫瘍細胞に腫瘍形成シグナルを伝達する。これらのＥＶは、腫瘍細胞の増殖、遊走、浸潤、および転移を促進することができる分子を有する。注目すべきことに、ＥＶは、そうでなければ分泌されない分子、例えば膜タンパク質の非標準の分泌を可能にし得る。その上、最近の研究は、腫瘍細胞によって分泌されるＥＶ  ｍｉＲＮＡが、がんの進行にも寄与し、および／または宿主保護を促進することを明らかにした。分子ナノタグ標的として作用することができる体液中の特定のＥＶは、参照により本明細書に援用されている、Ｋａｔｓｕｄａら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、１４巻：４１２〜４２５頁（２０１４年）、ｄｏｉ  １０．１００２／ｐｍｉｃ．２０１３００３８９において要約されている。
【０１５８】
特定の実施例では、標的は、援用されている米国特許出願公開第２０１４０１６２８８８号に記載されているように、前立腺がんのバイオマーカーまたはバイオシグネチャーであり得る。例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）を、ＢＰＨおよび前立腺がんを調べるために、または両者を識別するために使用してもよい。ｍｉＲは、患者の試料から直接単離することができ、および／または患者の試料由来の小胞を、小胞内に含まれるｍｉＲペイロードに関して分析することができる。試料は、精液、尿、血液、血清、もしくは血漿を含む体液、または組織もしくは生検試料であり得る。本明細書に開示されるｍｉＲを検出するために、複数の異なる方法論が利用可能である。一部の実施形態では、以下のバイオマーカー標的の１つまたは組み合わせを、そのような目的のために使用することができる。ＢＰＨとＰＣａとを識別するｍｉＲ（ｈｓａ−ｍｉＲ−３２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１４５のうちの１つまたは複数を限定せずに含む）は、ＰＣａ試料と比較してＢＰＨ試料において過剰発現され得る。あるいは、ＢＰＨとＰＣａとを識別するｍｉＲ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７９、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１０３のうちの１つまたは複数を限定せずに含む）は、ＢＰＨ試料と比較してＰＣａ試料において過剰発現され得る。
【０１５９】
特定の例では、米国特許出願公開第２０１４０１６２８８号からの以下の循環中のバイオマーカーのうちの１つまたは複数を、前立腺障害を評価するために、および微小小胞において有用に識別することができるバイオマーカーを同定するために、微小小胞において標的化してもよい：ＢＣＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＨＶＥＭ、ＩＬ−１  Ｒ４、ＩＬ−１０  Ｒｂ、Ｔｒａｐｐｉｎ−２、ｐ５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ、およびその組み合わせ。１つまたは複数の循環中のバイオマーカーは、以下ｈｓａ−ｍｉＲ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３７、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−５７０、ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｍｉＲ−８８５−３ｐ、およびその組み合わせから選択することができる。なおさらに、１つまたは複数の循環中のバイオマーカーは、以下：ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５４＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−１＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３１−��ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６から選択することができる。循環中のバイオマーカーは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１およびｈｓａ−ｍｉＲ−１６のうちの１つまたは複数であり得る。一実施形態では、循環中のバイオマーカーは、ＣＤ９、ＰＳＭＡ、ＰＣＳＡ、ＣＤ６３、ＣＤ８１、Ｂ７Ｈ３、ＩＬ６、ＯＰＧ−１３、ＩＬ６Ｒ、ＰＡ２Ｇ４、ＥＺＨ２、ＲＵＮＸ２、ＳＥＲＰＩＮＢ３、およびＥｐＣａｍのうちの１つまたは複数を含む。バイオマーカーは、ＦＯＸ０１Ａ、ＳＯＸ９、ＣＬＮＳ１Ａ、ＰＴＧＤＳ、ＸＰＯ１、ＬＥＴＭＤ１、ＲＡＤ２３Ｂ、ＡＢＣＣ３、ＡＰＣ、ＣＨＥＳ１、ＥＤＮＲＡ、ＦＲＺＢ、ＨＳＰＧ２、およびＴＭＰＲＳＳ２＿ＥＴＶ１融合体のうちの１つまたは複数を含み得る。その出願の全体が参照により本明細書に援用されている、ＷＯ２０１００５６９９３を参照されたい。
【０１６０】
別の実施形態では、循環中のバイオマーカーは、Ａ３３、ａ３３  ｎ１５、ＡＦＰ、ＡＬＡ、ＡＬＩＸ、ＡＬＰ、アネキシンＶ、ＡＰＣ、ＡＳＣＡ、ＡＳＰＨ（２４６−２６０）、ＡＳＰＨ（６６６−６８０）、ＡＳＰＨ（Ａ−１０）、ＡＳＰＨ（Ｄ０１Ｐ）、ＡＳＰＨ（Ｄ０３）、ＡＳＰＨ（Ｇ−２０）、ＡＳＰＨ（Ｈ−３００）、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＢＣＡ−２２５、ＢＣＮＰ１、ＢＤＮＦ、ＢＲＣＡ、ＣＡ１２５（ＭＵＣ１６）、ＣＡ−１９−９、Ｃ−Ｂｉｒ、ＣＤ１．１、ＣＤ１０、ＣＤ１７４（Ｌｅｗｉｓ  ｙ）、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ５９（ＭＥＭ−４３）、ＣＤ６３、ＣＤ６６ｅ  ＣＥＡ、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ９、ＣＤＡ、ＣＤＡＣ１  １ａ２、ＣＥＡ、Ｃ−Ｅｒｂ２、Ｃ−ｅｒｂＢ２、ＣＲＭＰ−２、ＣＲＰ、ＣＸＣＬ１２、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＤＬＬ４、ＤＲ３、ＥＧＦＲ、Ｅｐｃａｍ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ２（Ｈ−７７）、ＥＲ、ＥｒｂＢ４、ＥＺＨ２、ＦＡＳＬ、ＦＲＴ、ＦＲＴ  ｃ．ｆ２３、ＧＤＦ１５、ＧＰＣＲ、ＧＰＲ３０、Ｇｒｏ−アルファ、ＨＡＰ、ＨＢＤ１、ＨＢＤ２、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、ＨＳＰ、ＨＳＰ７０、ｈＶＥＧＦＲ２、ｉＣ３ｂ、ＩＬ６  Ｕｎｃ、ＩＬ−１Ｂ、ＩＬ６  Ｕｎｃ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ８、ＩＬ−８、ＩＮＳＩＧ−２、ＫＬＫ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＮ、ＬＤＨ、ＭＡＣＣ−１、ＭＡＰＫ４、ＭＡＲＴ−１、ＭＣＰ−１、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＦＧ−Ｅ８、ＭＩＣ１、ＭＩＦ、ＭＩＳ  ＲＩＩ、ＭＭＧ、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１  ｓｅｑ１、ＭＵＣ１  ｓｅｑ１１Ａ、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ２、Ｎｃａｍ、ＮＧＡＬ、ＮＰＧＰ／ＮＰＦＦ２、ＯＰＧ、ＯＰＮ、ｐ５３、ｐ５３、ＰＡ２Ｇ４、ＰＢＰ、ＰＣＳＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＧＰ９．５、ＰＩＭ１、ＰＲ（Ｂ）、ＰＲＬ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＭＥ３、ＰＴＥＮ、Ｒ５−ＣＤ９  Ｔｕｂｅ１、Ｒｅｇ  ＩＶ、ＲＵＮＸ２、ＳＣＲＮ１、セプラーゼ、ＳＥＲＰＩＮＢ３、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＢ、ＳＰＤＥＦ、ＳＲＶＮ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＥＡＰ１、ＴＦ（ＦＬ−２９５）、ＴＦＦ３、ＴＧＭ２、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＭＥＭ２１１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦ−アルファ、Ｔｒａｉｌ−Ｒ２、Ｔｒａｉｌ−Ｒ４、ＴｒＫＢ、ＴＲＯＰ２、Ｔｓｇ１０１、ＴＷＥＡＫ、ＵＮＣ９３Ａ、ＶＥＧＦ  Ａ、およびＹＰＳＭＡ−１のうちの１つまたは複数を含む。これらのマーカーの任意の組み合わせを、前立腺がんを評価するためのバイオシグネチャーにおいて使用することができる。循環中のバイオマーカーは、小胞、例えば小胞表面マーカーまたは小胞ペイロードに関連し得る。
【０１６１】
（実施例１０：量子ドットによって標識したＥＶの検出）
開示される分子ナノタグは、細胞外小胞（ＥＶ）を検出するために使用することができる。ストレプトアビジンリンカーおよび抗ＰＳＭＡを有するＱｄｏｔで構成される分子ナノタグを、前立腺がん細胞からのＥＶを検出するために使用した。ストレプトアビジンリンカー（ＳＡ−Ｑｄｏｔ）を有するが、ＰＳＭＡビオチンを有しないＱｄｏｔで構成される分子ナノタグを陰性対照として使用した。前立腺がん細胞株ＥＶを１００ｋＤａ  ＭＷ  Ｐａｌｌ  Ｊｕｍｂｏｓｅｐろ過装置を使用して濃縮し、次に１×１０１１個のＥＶを１０ｍＭフルオロフォアＣＦＳＥによって標識した後、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して残留ＣＦＳＥから精製した。ＥＶを抗ＰＳＭＡ−ＩｇＧ１−ビオチン抗体と共にインキュベートした後、残留抗体を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して除去した。次に、ＥＶ結合抗ＰＳＭＡ−ＩｇＧ１−ビオチン抗体を、ＱＤｏｔ  ６２５−ストレプトアビジン、４０ｎｍ金−ストレプトアビジン、４０ｎｍ銀−ストレプトアビジン、またはＰＥ−ストレプトアビジンのいずれかによって標識した。次に、得られた標識したＥＶを、４８８ｎｍまたは５６１ｎｍの散乱チャネルのいずれかに設定した閾値、低い流量、および以下の検出器：４０５ｎｍ  ＳＳＣ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ  ＳＳＣ、６４０ｎｍ  ＳＳＣ、ＰＥ、ＦＩＴＣ、およびＢＶ６０５によるフローサイトメトリーを使用して検出した。
【０１６２】
図１８に示すように、ストレプトアビジンリンカー（ＳＡ−Ｑｄｏｔ）およびＰＳＭＡ（ＣＦＳＥ＋ＰＳＭＡ−ＳＡ−ＱＤ＋ＥＶ）を有するＱｄｏｔで構成される分子ナノタグは、前立腺がん細胞由来のＥＶを検出することができた、右上象限を参照されたい。非結合ＱＤｏｔは、左上象限に見ることができ、ＣＦＳＥ  ＥＶは、右下象限に見ることができる。必ずしも全てのＣＦＳＥ  ＥＶが、右下から右上象限へとシフトしているわけではないが、これは機器の蛍光分解能の組み合わせにより、およびＱＤｏｔ  ６２５に関して最適なフィルターを有していないことによる可能性が最も高い。
【０１６３】
（実施例１１：金属ナノタグによって標識したＥＶの検出）
開示される分子ナノタグを使用して、ＥＶを検出することができる。銀または金をコーティングしたストレプトアビジンで構成される分子ナノタグを、抗ＰＳＭＡ−ＩｇＧ−ビオチンリガンド（または他のＰＳＭＡ結合リガンド、例えばＡ９ｇ−ＴＥＧ−ビオチン）と共に使用して、ＰＳＭＡ発現前立腺がん細胞に由来するＥＶを検出した。前立腺がん細胞由来ＥＶを、フルオロフォアＣＦＳＥによって標識し、残留ＣＦＳＥを、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。得られたＥＶを、ナノタグと共にインキュベートした。次に、得られた標識ＥＶを、４８８ｎｍおよび５６１ｎｍ  ｓｓ検出器を使用してフローサイトメトリーを使用して検出した。方法の詳細に関しては、参照により本明細書に援用されている、Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｋａｓｔｒｅｓａｎａら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、７巻：１８７８頁、２０１７年を参照されたい。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、標識が結合したまたは標識が結合していない分子ナノタグまたはＥＶなどの小分子および／または抗体を、高分子構造から分離した。具体的には、図１０Ｂまたは１０Ｃに示すように、ＮＡＰ５またはＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５タイプカラムを使用して、非結合小分子、例えば核酸およびＰＳＭＡ結合分子を、１５ｎｍより大きいコア構造を有する分子ナノタグを含む高分子構造から分離した。中間分解能のサイズ排除クロマトグラフィーは、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−２ＢまたはＳｅｐｐｈａｒｏｓｅ−４Ｂに基づく樹脂によって実施し、高分解能のサイズ排除クロマトグラフィーは、ＦＰＬＣによって、高分解能樹脂、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｉｎｃｒｅａｓｅを含むがこれらに限定されない樹脂を使用して実施した。ｎａｎｏＦＡＣＳ高分解能フローサイトメトリーは、Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｋａｓｔｒｅｓａｎａら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、７巻：１８７８頁、２０１７年に記載されているように実施した。
【０１６４】
図１９Ａに示すように、４８８ｎｍおよび５６１ｎｍ散乱パラメータを使用して検出した蛍光陽性（ＣＦＳＥ＋）ＥＶは、破線（ｙ＝ｘ）上に存在する。図１９Ｂは、４０ｎｍ−ストレプトアビジン−銀ナノ粒子を示し、これらの銀ナノタグによって標識した場合に、集団が４８８ｎｍ散乱においてどのように上方向にシフトするかを示す。逆に、図１９Ｃは、４０ｎｍ−ストレプトアビジン−金ナノ粒子を示し、これらの銀ナノタグによって標識した場合に、集団が５６１ｎｍ散乱においてどのように上方向にシフトするかを示す。
【０１６５】
（実施例１２：ナノ粒子の検出）
銀、銀と金、またはポリスチレンで構成されるナノ粒子を、ＡｓｔｒｉｏｓおよびＳｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーターを使用して検出した。
【０１６６】
図２０は、機器のベースラインノイズに対する金、銀、およびポリスチレン粒子（矢印の先）の相対的散乱能を示す。金または銀で構成される４０ｎｍに小さくした粒子は、Ａｓｔｒｉｏｓ機器において４８８  ＳＳＣに結合することなく検出することができることが認められ得る。これはまた、ＦＡＣＳ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ機器についても当てはまる。ナノ粒子は、個々に検出することができることから、それらを個々に定量することができる。このため、ナノ粒子は個々の凝集せずかつ多量体化していない個々の標識として使用することができる。
【０１６７】
（実施例１３：ＥＶの生成、標識、および検出）
図２１は、ＥＶを生成、標識、および検出する方法の概要を提供する。この方法は、個々のナノ材料の産生およびその後の定量／分析を可能にする。
【０１６８】
初代細胞、例えば腫瘍から得た細胞、または組織培養細胞であり得る細胞を使用して、上清を生成する。例えば、細胞を、ＥＶ除去培地において成長させ、例えば逐次的超遠心分離（ＵＣ）によって、または免疫原性捕捉を使用することによってＥＶを得る（例えば、詳細は、参照により本明細書に援用されているＭｏｒａｌｅｓ−Ｋａｓｔｒｅｓａｎａら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、７巻：１８７８頁、２０１７年を参照されたい）。ＥＶ結合分子ナノタグは、望ましければ、被覆（図１の１２を参照されたい）とリガンド結合要素（図１２の１４を参照されたい）との間の光切断可能リンカーを使用する分離によって、またはリガンド結合特性に基づく溶出（図１Ａの１４を参照されたい）によってフローサイトメトリー分析後に除去することができ、例えばリガンド結合要素が、例えばホスファチジルセリンにカルシウム依存的に結合する場合、ＥＤＴＡを使用してＥＶから分子ナノタグを分離してもよく、またはストレプトアビジン：ビオチン結合を使用してＥＶ結合リガンドに分子ナノタグを連結する場合には、デスチオビオチンを添加することによって、分子ナノタグを除去してもよい（Ｈｉｒｓｃｈら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２年）。得られたＥＶを、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）によって定量することができる。一部の例では、Ｍｅｈｄｉａｎｉら（Ｊ．  Ｖｉｓ．  Ｅｘｐ．、（９５巻）、ｅ５０９７４、ｄｏｉ：１０．３７９１／５０９７４、２０１５年、参照により本明細書に援用されている）の方法を使用してＥＶを調製する。
【０１６９】
単離または精製されたＥＶを、例えばフルオロフォアおよび本明細書に提供される分子ナノタグによって標識することができる。例えば、ＥＶを、Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｋａｓｔｒｅｓａｎａら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、７巻：１８７８頁、２０１７年（参照により本明細書に援用されている）に開示される方法を使用してＣＦＳＥ色素によって標識することができる。
【０１７０】
ＥＶはまた、本明細書に提供される分子ナノタグ、例えば金、銀、または両方、ナノ粒子、およびＥＶ上の第２の結合パートナー（例えば、ＥＶ膜タンパク質または腫瘍抗原）に対して特異的な第１の結合パートナー（例えば、抗体、核酸分子、またはリガンド）を含む分子ナノタグによって検出可能に標識することができる。例えば、ナノタグ（１×１０９）およびＥＶ（１×１０９）を４℃で３０分間インキュベートすることができる。
【０１７１】
得られた標識ＥＶを、サイズ排除クロマトグラフィーに供して、画分を収集することができる。このステップを使用して、非結合ナノタグおよび非取り込みフルオロフォアを除去することができる。
【０１７２】
１つまたは複数の分子ナノタグ（標的がＥＶ上に存在する場合）および一部の例ではフルオロフォアもここでは含む、溶出したＥＶを、本明細書に提供される方法を使用してフローサイトメトリーを使用して分析することができる。
【０１７３】
（実施例１４：ナノタグ組成物のスペクトル特性）
高い弾性散乱能を有する光学特性を有する単一の分子ナノタグ、または個々に定量可能である高い非弾性散乱（蛍光またはラマン散乱）を有する構成要素により、目的の単一のエピトープに対する結合に基づいてＥＶまたは他のナノ材料の検出および選別が可能となる。サブセットを表現型決定することは、一度に１つより多くのエピトープの標識を必要とする強力なツールである。１つより多くのエピトープを同時に標識するために、それを第１のナノタグと識別するために特有の光学特性を有する第２のまたはそれより多くのナノタグを使用することは有益であろう。異なる金属が、屈折率および吸光係数に関してＵＶ−可視光スペクトルにおいて特有の分散特性を有することが認められ得る（図６Ａ）。これらの光学特性は、ＲｅｆｒａｃｔｉｖｅＩｎｄｅｘ．ｉｎｆｏなどのオンラインデータベースから入手可能である（図６Ｂ）。
【０１７４】
ミー理論を使用して、これらの光学特性を使用して球体の散乱断面積を概算することが可能であり、したがって、異なる波長でのその散乱プロファイルにおける特有のピークまたはトラフを有することにより、どれほど多く複数の粒子を同時に使用することができるかを推定することが可能である。この方法は、ＡｓｔｒｉｏｓＥＱによって、例えば４０５ｎｍ  ＳＳＣ、４８８  ＳＳＣ、５６１  ＳＳＣ、６４０  ＳＳＣなどの異なるレーザー波長での複数の側方散乱（ＳＳＣ）検出器によって、フローサイトメーターが異なる直径および組成の粒子を検出する能力を予測するために有用である。異なるナノタグの特徴的な多波長側方散乱プロファイルを、不連続な波長または連続する波長範囲または複数の範囲を含む波長範囲にわたって検出された側方散乱値と比較することができる。このように、単色光および広帯域照射源を使用して、ナノタグを含む標的で側方散乱を生成することができる。
【０１７５】
このモデル化技術を、金、銀、ポリスチレン、白金、二酸化チタン、酸化鉄、および銅を含む異なる材料に適用した、図１６Ａ〜１６Ｅ。図１８Ａ〜１８Ｅに示すように、より小さい粒子、およそ２０〜６０ｎｍの球体によって、金および銀などの特有のスペクトルのピークまたはトラフが得られた。さらに、金、銅、および銀などの金属は、粒子の検出を増強すると予測されることが認められ得る（例えば、ポリスチレンと比較して）。
【０１７６】
図２２Ａ〜２２Ｂに示すように、１００ｎｍポリスチレン球体は、ＦＡＣＳ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙなどの従来のフローサイトメーターにおいて検出可能であり、４００〜８００ｎｍの波長にわたり約１×１０−１６ｍ２ｓｒ−１の散乱断面積を有する。２０ｎｍ  Ａｇ球体はまた、照射波長３８０ｎｍで約１×１０−１６ｍ２ｓｒ−１の散乱断面積を有し、４０ｎｍのａｕ球体は、照射波長５３２ｎｍで約１×１０−１６ｍ２ｓｒ−１の散乱断面積を有する。
【０１７７】
異なる組成を有する粒子のこれらの固有の散乱特性により、散乱を利用する代わりに蛍光を使用する標識に対して分光アプローチが可能となる。例えば、図１６Ｂでは、４０５ｎｍの照射波長で、４０ｎｍ銀粒子について収集された光散乱は、４０ｎｍ金粒子の約１００倍高い。しかし、５６１ｎｍの照射波長では、４０ｎｍ金粒子について収集された光散乱は、４０ｎｍ銀粒子より５〜１０倍高い。このモデル化データを、スペクトル散乱をどのように利用することができるかを評価するために、ＡｓｔｒｉｏｓＥＱ機器において、４０５、４８８、５６１、および６４０ｎｍの照射波長で４０ｎｍ銀球体および金球体を獲得することによって検証した（図１７Ｂ）。モデルから予測されるように、４０ｎｍ銀粒子（赤色）について収集された散乱は、４０ｎｍ金と比較して（青色）５６１ｎｍ散乱チャネルにおいてより少なく、４０ｎｍ銀粒子について収集された散乱は４０５ｎｍ散乱チャネルにおいて４０ｎｍ金より多かった。
【０１７８】
このように、機器において利用可能な特定のＳＳＣ検出器に基づいて、本明細書に記載される分子ナノタグを作製する適切な材料を選択することが可能である。例えば、機器が４０５ｎｍ  ＳＳＣ検出器を有する場合、銀ナノ粒子を使用することができ、機器が５６１または５３２ｎｍ  ＳＳＣ検出器を有する場合には、金ナノ粒子を使用することができる等々である。特定の例を以下の表１に示す。
【０１７９】
【表１】
2019533156.tif 000004
【０１８０】
これに対し、例えば金および銀に関する６４０ｎｍ（図１７Ａを参照されたい）のように、２つまたはそれより多くのナノ粒子のシグナルの間にほとんど差がないときに１つのｓｓ検出器を使用する場合、蛍光またはラマンスペクトルデータにスペクトルデコンボリューションを適用することができるのと同じように、デコンボリューションを使用して散乱の個々の寄与を決定することができる（ＦｏｇａｒｔｙおよびＷａｒｎｅｒ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５３巻：２５９頁、１９８１年；Ｌｉｕら、Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２巻：１６８〜１７１頁、２０１４年）。
【０１８１】
さらなる情報は、参照により本明細書に援用されている２０１７年１０月２３日に出願された米国特許出願第６２／５７５，９８８号に見出され得る。
【０１８２】
（実施例１５：ナノタグ組成物のスペクトル特性）
ミー理論を使用して、球状の粒子による光散乱量をモデル化するために、およびフローサイトメーターの光学を考慮に入れて、異なる屈折率の粒子を獲得する特定のフローサイトメーターに関する散乱−直径関係性のモデルを作製することが可能である、図２２Ａ〜２２Ｂ。
【０１８３】
Ｗｅｌｓｈの方法（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｓａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  Ｄｏｃｔｏｒａｌ  Ｔｈｅｓｉｓ、２０９頁、２０１６年）を使用して、Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱおよびＦＡＣＳ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーターをモデル化し、獲得したポリスチレンおよびシリカ粒子データをモデル化データにフィットさせた。この方法は、獲得したフローサイトメトリービーズデータと、モデル化ビーズデータとの間に非常に高い相関を生じ、図２２Ａ〜２２Ｂにおいて緑色で示したように、細胞外小胞などの低いおよび可変の屈折率を有する粒子に対するフローサイトメトリー機器の感度の推論を可能にする。
【０１８４】
この方法を利用して、細胞外小胞の直径の検出限界は、低い屈折率を有するＥＶでは、Ａｓｔｒｉｏｓ  ＥＱに関しておよそ１５０ｎｍ、Ｓｙｍｐｈｏｎｙに関して２００ｎｍに近づいた（図２２Ｂ）。ＥＶのモード直径は１００ｎｍの領域に存在する傾向があり、亜集団が１００ｎｍより下にしばしば出現することから、ほとんどのフローサイトメーターが１フルオレセインＭＥＳＦ等量を検出するために十分な感度ではないのと同様に、ほとんどの従来のフローサイトメーターは、散乱を使用して生物試料中の細胞外小胞の全集団を検出するには最適以下であることが強調されている（ＮｏｌａｎおよびＪｏｎｅｓ、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ、２８巻：２５６〜６２頁、２０１７年；Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｋａｓｔｒｅｓａｎａら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、７巻：１８７８頁、２０１７年）。
【０１８５】
（実施例１６：多重化によるＥＶの解析）
蛍光バーコード化を使用して、フローサイトメトリーを使用してビーズの複数の異なる集団を検出することができる。図２３Ａは、エクソソーム解析のための市販の多重ビーズセットのデータを示す。３８個の異なるビーズ集団は、異なる量の赤色および緑色標識を有する各集団によって特徴付けられ、それによってビーズ集団が規定のレベルの赤色および緑色標識（示されるＰ１およびＰ２パラメータ）に基づいて「バーコード化」される。各ビーズ集団はまた、ある特定のＥＶ上で見出される特定のヒトエピトープに対する抗体も有し、それによって３８個の異なるエピトープ特異性によってＥＶを捕捉する手段を提供する。
【０１８６】
図２３Ｂは、３８個のビーズセットによる血漿からのＥＶの捕捉後（ビーズあたり＞１００個のＥＶの結合能を有する）、３つのビーズ集団を同定するために異なるＥＶエピトープに対する染色抗体が、そのエピトープを有するＥＶに結合したことを示す。本実施例におけるビーズは、３ミクロンビーズであり、いかなるビーズの検出も、陽性となるためには、ＭＥＳＦ対照に基づいて、＞１００個の検出抗体結合フルオロフォアの存在を必要とする。
【０１８７】
図２３Ｃは、本発明者らのｎａｎｏＦＡＣＳ構成による分子ナノタグの使用を示す。分子ナノタグを使用して、単一のエピトープおよび単一のＥＶ感度を可能にする多重ＥＶ分析アレイを生成することができる。バーコード化は、被覆に異なるフルオロフォアのカスタマイズされた比率を組み入れることによって可能になるが、Ｎ個の異なるコアタイプの弾性散乱属性は、Ｎ層の付加を可能にし、例えば金および銀コアの使用は、Ｎ＝２の別個のコア構成要素を含み、それによって金コアを有する３８個の分子ナノタグによる分子ナノタグアレイを、銀コアを有する３８個の分子ナノタグと組み合わせることができ、７６個の分子ナノタグタイプの各々が１つのリガンドに対して特異性を有する分子にコンジュゲートされ、７６個の異なるエピトープに対する単一エピトープ感度によって、７６個の異なるエピトープを有するＥＶの検出を可能にする。このようにして、サイズ、材料、または形状に基づく異なるコア材料の特有の散乱特性は、蛍光に基づくバーコード化のみならず、光散乱バーコード化も含むように多重パネルを拡大する手段を提供する。ＥＶに結合した場合のこれらの分子ナノタグの集団を選別することにより、ｍｉＲＮＡ分析などの下流の解析を実行するための多重選別が可能となる。
【０１８８】
図２３Ｄは、各タイプの分子ナノタグによって捕捉されたＥＶの異なるサブセットの積み荷を調査することができることを示す。図２３Ｄは、ＥＶ上のＰＳＭＡの検出に基づいて選別されたＥＶのｍｉＲＮＡプロファイルと、バルクＥＶ集団ｍｉＲＮＡまたはＰＳＭＡ陰性ＥＶのｍｉＲＮＡとの比較を示す。
【０１８９】
開示される本発明の原理が適用され得る多くの可能性がある実施形態を考慮して、例証される実施形態は、単に本発明の例にすぎず、本発明の範囲を制限すると解釈すべきではないと認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および精神に含まれる全てを本発明として特許請求する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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