(57)【要約】本明細書で提供するのは、患者においてＥＲ＋、ＨＥＲ２−  ＨＲＧ＋乳癌（例えば、転移性ＥＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌）を治療するための組成物および方法であって、特定の臨床投与措置によって（すなわち、特定の用量で、かつ特定の投薬スケジュールによって）抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、セリバンツマブ）、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ）、および内分泌に基づく療法（例えば、レトロゾールまたはフルベストラント）を患者に投与することによる、方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
転移性ＥＲ＋、ＨＥＲ２−  ＨＲＧ＋乳癌を有する患者を治療する方法であって、患者に：
Ｉ）２１日連続で１日１回経口摂取される１つのパルボシクリブ１２５ｍｇカプセル、それに続き２８日の完全サイクルを構成する７日間の治療停止；
ＩＩ）ａ）が２８日サイクル全体で連続して１日１回投与されるレトロゾール２．５ｍｇであり、およびｂ）が第１日、第１５日、第２９日に、およびその後は月１回５００ｍｇの用量で投与されるフルベストラントであるａ）またはｂ）のいずれか；ならびに
ＩＩＩ）ＩＶ注入による２週間ごとの３ｇ用量でのセリバンツマブ
を同時に投与することを含む、方法。
【請求項２】
患者が、治療前の患者由来の腫瘍の生物学的試料において１＋またはそれより高いヘレグリンＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−ＩＳＨ）スコアが測定されている場合ＨＲＧ＋と同定される、請求項１の方法。
【請求項３】
治療が、安定な疾患、部分的応答、または完全な応答を示す患者をもたらす、請求項１または２の方法。
【請求項４】
パルボシクリブおよびホルモン療法で以前治療されており、その癌がこの治療に対して進行している転移性ＥＲ＋、ＨＥＲ２−  ＨＲＧ＋乳癌を有する患者を治療する方法であって、患者に：
Ｉ）２１日連続で１日１回経口摂取される１つのパルボシクリブ１２５ｍｇカプセル、それに続き２８日の完全サイクルを構成する７日間の治療停止；
ＩＩ）ａ）が２８日サイクル全体で連続して１日１回投与されるレトロゾール２．５ｍｇであり、およびｂ）が第１日、第１５日、第２９日に、およびその後は月１回５００ｍｇの用量で投与されるフルベストラントでありかつ患者が以前にフルベストラントで治療された場合、患者はａ）を投与され、および患者が以前にレトロゾールで治療された場合、患者はｂ）を投与されるａ）またはｂ）のいずれか；ならびに
ＩＩＩ）ＩＶ注入による２週間ごとの３ｇ用量でのセリバンツマブ
を同時に投与することを含む、方法。
【請求項５】
患者が、治療前の患者由来の腫瘍の生物学的試料において１＋またはそれより高いヘレグリンＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−ＩＳＨ）スコアが測定されている場合ＨＲＧ＋と同定される、請求項４の方法。
【請求項６】
治療が、安定な疾患、部分的応答、または完全な応答を示す患者をもたらす、請求項４または５の方法。
【請求項７】
ＥＲ＋、ＨＥＲ２−  ＨＲＧ＋乳癌を有する患者を治療する方法であって、患者に：（ｉ）非ステロイド性アロマターゼ阻害剤または選択的エストロゲン受容体分解剤；（ｉｉ）抗ＥｒｂＢ３抗体；および、場合によって（ｉｉｉ）ＣＤＫ４／６阻害剤を同時に投与することを含む、方法。
【請求項８】
ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−ＩＳＨ）によって測定される場合ＨＲＧを発現するＥＲ／ＰＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌を有する患者を治療する方法であって、２８日サイクルを含み：
ＩＩＩ）セリバンツマブがサイクルの第１日および第１５日に静脈内に（ＩＶ）３０００ｍｇの用量で投与され、かつ
ＩＶ）フルベストラントがサイクルの第１日および第１５日に筋内に（ＩＭ）５００ｍｇの用量で投与される、
方法。
【請求項９】
少なくとも１つの後続の治療サイクルを含む、請求項８の方法。
【請求項１０】
フルベストラントが、各後続の治療サイクルの第１日のみに投与される、請求項９の方法。
【請求項１１】
ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−ＩＳＨ）によって測定される場合ＨＲＧを発現するＥＲ／ＰＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌を有する患者を治療する方法であって、少なくとも１つの２８日サイクルを含み：
Ｉ）セリバンツマブがサイクルの第１日および第１５日に３０００ｍｇＩＶの用量で投与され、かつ
ＩＩ）レトロゾールがサイクル中に１日１回経口で２．５ｍｇの用量で投与される、
方法。
【請求項１２】
乳癌が、局所的に進行したまたは転移性の乳癌である、請求項８または９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年３月１５日出願の米国仮出願第６２／３０８，７８３号、２０１６年６月２９日出願の第６２／３５６，１２７号、および２０１６年１２月７日出願の第６２／４３１，２４２号に優先権を請求する。前述の出願の内容は、本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）および緊密に関連するサイクリン依存性キナーゼ６（ＣＤＫ６）は、哺乳動物有糸分裂の制御因子であり、細胞分裂の準備において、ＤＮＡ合成の開始を促進するよう作用する。ＣＤＫ４および６のいくつかの選択的阻害剤（「ＣＤＫ４／６」阻害剤）が多様な開発段階にあり、そのうちの１つ、パルボシクリブは、現在、米国において、内分泌に基づく療法であるレトロゾールまたはフルベストラントのいずれかとの組み合わせで、ホルモン受容体（ＨＲ）陽性ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性の進行性または転移性の乳癌の治療に認可されている。これらの組み合わせは非常に有効であり、迅速に、こうした患者の標準治療になってきている。
【０００３】
乳癌は、米国において最も一般的で致命的な癌の１つのままであり、２０１４年だけで、２３２，６７０の新規に診断された症例があり、４０，０００の関連死があると予測される。これらのうち、最大の分子診断下位群（〜７０％）は、ホルモン受容体陽性（ＥＲ＋／ＰＲ＋；ＥＲ＋／ＰＲ−；またはＥＲ−／ＰＲ＋）およびＨＥＲ２陰性（ＩＨＣ＜３＋非ＦＩＳＨ陽性）疾患を有する患者を含む。転移性疾患を有する患者に関しては、報告される生存中央値は１８〜３６ヶ月の範囲である。転移性乳癌は、治癒可能とは見なされない。しかし、生存における有意な改善が、改善された全身療法の導入と一致して得られてきている。
【０００４】
ＥＲ／ＰＲ陽性転移性乳癌を有するすべての患者に関する一般的な療法目的は、生存を延長させ生活の質を改善することである。これは、実現可能な場合は外科的介入、および投薬によって達成される。典型的には、内分泌（抗ホルモン）投薬が最初に用いられ、耐性が生じるまで維持される。これらは、有効で比較的非毒性でありかつ、それらの使用は化学療法に基づく措置の毒性を回避するので、好ましい。現在の米国総合癌情報ネットワーク（ＮＣＣＮ）治療指針は：「乳癌再発または病期ＩＶ疾患の全身治療は、生存を延長させ生活の質を増進させるが、治癒性ではない。したがって、最小限の毒性と関連する治療が好ましい」と言及する。
【０００５】
転移性疾患を有するＥＲ／ＰＲ陽性乳癌患者には、いくつかの第一の内分泌療法オプションがある。用語「第一の」は、この文脈において、患者が転移前セッティングで以前に治療されていたとしても、転移性疾患の出現後の第一の療法を示すために用いられる。転移性セッティングでは、フルベストラントまたはアロマターゼ阻害剤（ＡＩ、例えばレトロゾール）のいずれかが第一の療法の単一剤として、一般的に好ましい。フルベストラントは、選択的エストロゲン受容体下方制御剤（ＳＥＲＤ）であり、抗エストロゲン療法後に疾患進行を有する閉経後の患者におけるホルモン受容体陽性転移性乳癌の治療に適応される。アロマターゼ阻害剤は、エストロゲン合成の重要な段階を遮断する。
【０００６】
内分泌療法を受けておらずアジュバント療法の終了後＞１２ヶ月進行しているか、またはデノボ転移性乳癌を提示している、転移性乳癌を有する閉経後患者に関して、治療オプションは、ＡＩに加えてパルボシクリブ、あるいはフルベストラントまたはＡＩを用いる単剤療法を含む。
【０００７】
パルボシクリブ（以前のＰＤ０３３２９９１）は、サイクリン依存性キナーゼ４および６（ＣＤＫ４／６）の阻害剤である。レトロゾールを加えたパルボシクリブは２０１５年に、転移性ＥＲ陽性ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性乳癌治療に対する第一の療法として、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）加速認可を受けた。レトロゾールに加えたパルボシクリブでの治療は、組み合わせアームにおいて、無進行生存（ＰＦＳ）の統計的に有意な増加を生じた。全体の生存もまた、組み合わせアームで好ましいようであったが、統計的有意性には到達しなかった。転移性セッティングでは、第二の、内分泌療法オプションを越えた療法は限られており、ＡＩであるエキメスタンがより一般的に用いられる剤の１つであり、ＳＥＲＤであるフルベストラントが別の確立されたオプションである。
【０００８】
内分泌療法に対する生得的耐性および獲得耐性は、内分泌療法に対して継続的な感受性を有する患者のみが妥当に優れた生活の質を伴って長期生存するため、この背景において重大な療法的困難を課す。不運なことに、多くの患者は内分泌療法に対する耐性を発展させ、ときには非常に短い治療期間を生じ、細胞傷害性の化学療法を開始する必要性を加速する。
【０００９】
癌を治療するために用いられる他のキナーゼ阻害剤同様、ＣＤＫ４／６阻害剤の有効な使用は、ある場合にはあらかじめ存在し大部分の場合は治療後ある程度時間が経った後に発達する、耐性によって限定される。したがって、ＣＤＫ４／６阻害剤治療に対して耐性である患者を治療するための低毒性の方法に関する必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、内分泌療法およびＣＤＫ阻害療法に対して発達する耐性を防止するかまたは抑止する非毒性療法に関する必要性に取り組み、さらなる利点を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヘレグリンｍＲＮＡは、ヒトＥＲ陽性ＨＥＲ２陰性乳癌腫瘍において、広くみられる。（Ａ）ＥＲ陽性ＨＥＲ２陰性乳癌腫瘍に関するＴＣＧＡデータベースから抽出したＨＲＧ  ｍＲＮＡの発現。（Ｂ）ＨＲＧ  ＲＮＡ−ＩＳＨアッセイを用いて測定した、ＥＲ陽性ＨＥＲ２陰性乳癌を有する１９７の患者腫瘍試料中のＨＲＧ  ｍＲＮＡの発現。ここでどちらの方法も、試料のおよそ４５％がＨＲＧ  ｍＲＮＡを発現していることを見出した。
【図２】ＨＲＧは、ＥＲ陽性ＨＥＲ２陰性乳癌細胞株の増殖を促進する。ＭＣＦ７、Ｔ４７ＤおよびＨＣＣ１４２８細胞をＨＲＧで６日間刺激し、増殖をＣＴＧアッセイによって測定した。
【図３】ＨＲＧはＥＲ陽性ＨＥＲ２陰性乳癌細胞株においてフルベストラントの活性を増大し、セリバンツマブはフルベストラントの活性を回復させる。ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ細胞を、エストラジオール、フルベストラント、フルベストラントおよびエストラジオール、またはフルベストラントおよびエストラジオールに加えてセリバンツマブのいずれかで６日間処理し、増殖をＣＴＧアッセイによって測定した。
【図４】ＨＲＧはＥＲ陽性ＨＥＲ２陰性ＭＣＦ７乳癌細胞株においてＣＤＫ阻害剤の活性を阻害し、セリバンツマブは感受性を回復させる。（Ａ）ＭＣＦ７細胞を、パルボシクリブ、ＨＲＧ単独またはセリバンツマブと組み合わせてのいずれかで処理した。（Ｂ）ＭＣＦ７細胞を、アベマシクリブ、ＨＲＧ単独またはセリバンツマブと組み合わせてのいずれかで処理した。（Ｃ）ＭＣＦ７細胞を、パルボシクリブ、ＨＲＧ単独またはセリバンツマブと組み合わせてのいずれかで処理した。細胞を６日間処理し、増殖をＣＴＧアッセイによって測定した。
【図５】ＨＲＧはＥＲ陽性ＨＥＲ２陰性ＺＲ７５−１乳癌細胞株においてＣＤＫ阻害剤の活性を阻害し、セリバンツマブは感受性を回復させる。（Ａ）ＺＲ７５−１細胞を、パルボシクリブ、ＨＲＧ単独またはセリバンツマブと組み合わせてのいずれかで処理した。（Ｂ）ＺＲ７５−１細胞を、アベマシクリブ、ＨＲＧ単独またはセリバンツマブと組み合わせてのいずれかで処理した。（Ｃ）ＺＲ７５−１細胞を、リボシクリブ、ＨＲＧ単独またはセリバンツマブと組み合わせてのいずれかで処理した。細胞を６日間処理し、増殖をＣＴＧアッセイによって測定した。
【図６】ＨＲＧはＥＲ陽性ＨＥＲ２陰性ＭＣＦ７乳癌細胞株においてフルベストラントと組み合わせたＣＤＫ４／６阻害剤の活性を阻害し、セリバンツマブは感受性を回復させる。（Ａ）ＭＣＦ７細胞を、パルボシクリブ、ＨＲＧ、フルベストラントおよびセリバンツマブの組み合わせで処理した。（Ｂ）ＭＣＦ７細胞を、アベマシクリブ、ＨＲＧ、フルベストラントおよびセリバンツマブの組み合わせで処理した。（Ｃ）ＭＣＦ７細胞を、リボシクリブ、ＨＲＧ、フルベストラントおよびセリバンツマブの組み合わせで処理した。細胞を６日間処理し、増殖をＣＴＧアッセイによって測定した。
【図７】ＨＲＧはＥＲ陽性ＨＥＲ２陰性ＭＣＦ７乳癌細胞株においてタモキシフェンと組み合わせたＣＤＫ４／６阻害剤の活性を阻害し、セリバンツマブは感受性を回復させる。（Ａ）ＭＣＦ７細胞を、パルボシクリブ、ＨＲＧ、タモキシフェンおよびセリバンツマブの組み合わせで処理した。（Ｂ）ＭＣＦ７細胞を、アベマシクリブ、ＨＲＧ、タモキシフェンおよびセリバンツマブの組み合わせで処理した。（Ｃ）ＭＣＦ７細胞を、リボシクリブ、ＨＲＧ、タモキシフェンおよびセリバンツマブの組み合わせで処理した。細胞を６日間処理し、増殖をＣＴＧアッセイによって測定した。
【図８】ＨＲＧはＭＣＦ７乳癌細胞においてＣＤＫ２を活性化し、セリバンツマブはＣＤＫ２活性化に対するＨＲＧの活性化効果を遮断する。
【図９】フルベストラントはＭＣＦ７細胞においてＣＤＫ２活性化を阻害し、ＨＲＧはフルベストラントの存在下でＣＤＫ２を活性化できる。セリバンツマブは、フルベストラントの存在下でのＣＤＫ２活性化に対するＨＲＧの活性化効果を遮断する。
【図１０】ＣＤＫ４／６阻害剤はＭＣＦ７細胞においてＣＤＫ２活性化を減少させ、ＨＲＧはパルボシクリブまたはアベマシクリブの存在下でＣＤＫ２を活性化できる。セリバンツマブは、パルボシクリブまたはアベマシクリブの存在下でのＣＤＫ２活性化に対するＨＲＧの活性化効果を遮断する。
【図１１】ＨＲＧは、ＥＲ陽性ＨＥＲ２陰性乳癌細胞においてフルベストラント、パルボシクリブおよびそれらの組み合わせの活性を阻害する、非常に強力なリガンドである。ＭＣＦ７細胞を、ＥｒｂＢファミリー受容体（ＨＲＧ、ＢＴＣ、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦ−ａ、ＡＲ、ＥＰＧまたはＥＰＲ）、エストロゲン受容体（Ｅ２）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１）、ｃ−Ｍｅｔ（ＨＧＦ）、または線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦ）に対するリガンド１ｎＭの存在下で（Ａ）フルベストラント、（Ｂ）パルボシクリブおよび（Ｃ）それらの組み合わせで６日間処理し、増殖をＣＴＧアッセイによって測定した。
【図１２】ＨＲＧは、ＥＲ陽性ＨＥＲ２陰性乳癌細胞においてフルベストラント、パルボシクリブおよびそれらの組み合わせの活性を阻害する、非常に強力なリガンドである。Ｔ４７Ｄ細胞を、ＥｒｂＢファミリー受容体（ＨＲＧ、ＢＴＣ、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦ−ａ、ＡＲ、ＥＰＧまたはＥＰＲ）、エストロゲン受容体（Ｅ２）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１）、ｃ−Ｍｅｔ（ＨＧＦ）、または線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦ）に対するリガンド１ｎＭの存在下で（Ａ）フルベストラント、（Ｂ）パルボシクリブおよび（Ｃ）それらの組み合わせで６日間処理し、増殖をＣＴＧアッセイによって測定した。
【図１３】（Ａ）ＨＲＧはＥＲ＋ＨＥＲ２−細胞のＳ期細胞周期進行を促進し、ＨＲＧは、ＥＲ＋陽性ＨＥＲ２−陰性乳癌細胞におけるＤＮＡ合成およびＳ期進行に対する（Ｂ）単剤フルベストラントおよび（Ｃ）単剤パルボシクリブまたは（Ｄ）パルボシクリブおよびフルベストラントの組み合わせの活性を阻害する。セリバンツマブはこの組み合わせの阻害活性を回復させる。
【図１４】セリバンツマブ添加は、ＥＲ＋ＨＥＲ２−乳癌のヒト同所性異種移植片モデルにおいてフルベストラント、パルボシクリブ、ならびにフルベストラントおよびパルボシクリブの組み合わせの活性を増進する。
【図１５】ＨＲＧは、網膜芽細胞腫タンパク質（ＲＢ）のリン酸化を増進して、細胞周期遷移を促進しフルベストラントの活性を阻害する。ＲＢリン酸化に対するＣＤＫ４／６阻害剤パルボシクリブまたはアベマシクリブ、およびセリバンツマブは、ヒトＥＲ＋ＨＥＲ２−乳癌細胞においてＨＲＧの遮断によって活性を回復できる。（Ａ）フルベストラントはセリン８０７／８１１でＲＢのＲＢ活性化を阻害し、ＨＲＧはセリン８０７／８１１でＲＢの活性化を増進することによってフルベストラントに対抗する。セリバンツマブはＨＲＧを阻害して、ＲＢ活性化に対するフルベストラントの活性を回復させる。（Ｂ）ＣＤＫ４／６阻害剤（パルボシクリブおよびアベマシクリブ）は、セリン８０７／８１１でＲＢのＲＢ活性化を減少させる。ＨＲＧはセリン８０７／８１１でＲＢの活性化を増進することによって、パルボシクリブおよびアベマシクリブ活性に対抗する。セリバンツマブはＨＲＧを阻害して、ＲＢ活性化に対するパルボシクリブおよびアベマシクリブの活性を回復させる。（Ｃ）パルボシクリブおよびフルベストラントの組み合わせはセリン８０７／８１１およびセリン７８０でＲＢのＲＢ活性化を減少させ、ＨＲＧはセリン８０７／８１１およびセリン７８０でＲＢの活性化を増進することによって、パルボシクリブおよびフルベストラント活性に対抗する。セリバンツマブはＨＲＧを阻害して、パルボシクリブ−フルベストラントの組み合わせの活性を回復させる。
【図１６】セリバンツマブおよびレトロゾール同時治療は、ＭＣＦ−７Ｃａ異種移植片において耐性の開始を遅延させレトロゾールに対する感受性を回復させる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
概要
本明細書で提供するのは、ヒト患者においてＥＲ＋、ＨＥＲ２−  ＨＲＧ＋乳癌（例えば、転移性ＥＲ＋、ＨＥＲ２−  ＨＲＧ＋乳癌）を治療するための組成物および方法であって、特定の臨床投与措置によって（すなわち特定の用量で、かつ特定の投薬スケジュールによって）、患者に抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、セリバンツマブ）、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ、アベマシクリブ、またはリボシクリブ）、および内分泌に基づく療法（例えば、レトロゾールまたはフルベストラント）を投与することを含む、方法である。
【００１３】
例示的な抗ＥｒｂＢ３抗体は、セリバンツマブ（「ＭＭ−１２１」または「Ａｂ＃６」としてもまた公知である）またはその抗原結合性断片および変異体である。１つの態様において、抗ＥｒｂＢ３抗体は、セリバンツマブの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を含む。１つの態様において、抗体は、配列番号１０に示す配列を有するセリバンツマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列番号１２に示す配列を有するセリバンツマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインを含む。
【００１４】
別の態様において、抗体は、それぞれ、配列番号１、２、および３に示す配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれぞれ、配列番号４、５、および６に示す配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の態様において、抗体は、それぞれ、配列番号１０および配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するＶＨおよび／またはＶＬ領域を含む。別の態様において、抗ＥｒｂＢ３抗体は、それぞれ、配列番号９および１１に示す核酸配列にコードされるＶＨおよび／またはＶＬ領域を含む。別の態様において、抗ＥｒｂＢ３抗体は、それぞれ、配列番号７および配列番号８に示すアミノ酸配列を有する重鎖および／または軽鎖を含む。
【００１５】
別の態様において、上述の抗体と同じヒトＥｒｂＢ３上のエピトープとの結合に関して競合し、かつ／またはそれに結合する抗体が用いられる。特定の態様において、エピトープは、ヒトＥｒｂＢ３（配列番号１４）の残基９２〜１０４を含む。別の態様において、エピトープは、ヒトＥｒｂＢ３（配列番号１４）の９２〜１０４位内のアミノ酸残基を含む。別の態様において、抗体は、ヒトＥｒｂＢ３への結合に関してセリバンツマブと競合し、上述の抗ＥｒｂＢ３抗体と少なくとも９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、配列番号１０および配列番号１２との少なくとも約９０％、９５％または９９％の可変領域同一性）を有する。
【００１６】
例示的なＣＤＫ４／６阻害剤はパルボシクリブである。別の態様において、ＣＤＫ４／６阻害剤はアベマシクリブである。別の態様において、ＣＤＫ４／６阻害剤はリボシクリブである。
【００１７】
例示的な内分泌に基づく療法は、レトロゾールまたはフルベストラントである。
【００１８】
したがって、１つの側面において、ＥＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌を有するヒト患者を治療する方法であって、患者に抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、セリバンツマブ）、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ）、および内分泌に基づく療法（例えば、レトロゾールまたはフルベストラント）を投与することを含む、方法を提供する。
【００１９】
別の側面において、ＥＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌を有するヒト患者を治療する方法であって、患者に抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、セリバンツマブ）および内分泌に基づく療法（例えば、レトロゾールまたはフルベストラント）を投与することを含む、方法を提供する。１つの態様において、方法は、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ、アベマシクリブ、またはリボシクリブ）の投与を含まない。別の態様において、方法は、患者に抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、セリバンツマブ）およびフルベストラントを投与することを含む。別の態様において、方法は、患者に抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、セリバンツマブ）およびレトロゾールを投与することを含む。
【００２０】
１つの態様において、治療サイクル内でセリバンツマブと組み合わせて、３を越えない他の抗新生物剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤および／または内分泌に基づく療法）を投与する。別の態様において、治療サイクル内でセリバンツマブと組み合わせて、２を越えない他の抗新生物剤を投与する。別の態様において、治療サイクル内でセリバンツマブと組み合わせて、１を越えない他の抗新生物剤を投与する。
【００２１】
１つの態様において、治療サイクルは２１日間である。別の態様において、治療は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１サイクルを含む。治療を任意の適切な期間継続する（例えば、完全反応（ＣＲ）が達成されるまで）。１つの態様において、治療を少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、または１１ヶ月間投与する。別の態様において、治療を少なくとも１年間投与する。別の態様において、治療を少なくとも２年間投与する。
【００２２】
本明細書記載の療法剤（例えば、セリバンツマブ、パルボシクリブ、レトロゾール、およびフルベストラント）を、任意の適切な手段によって患者に投与できる。１つの態様において、セリバンツマブを静脈内投与用に配合する。１つの態様において、パルボシクリブを経口投与用に（例えば、カプセルまたは錠剤として）配合する。１つの態様において、レトロゾールを経口投与用に（例えば、カプセルまたは錠剤として）配合する。１つの態様において、フルベストラントを筋内注射用に滅菌溶液として配合する。
【００２３】
１つの態様において、抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、セリバンツマブ）、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ）および内分泌に基づく療法（例えば、レトロゾールまたはフルベストラント）の用量は、患者の体重に関わらず固定された用量である。例えば、セリバンツマブは、患者の体重に関わらず３ｇの固定用量で投与可能である。パルボシクリブは、患者の体重に関わらず１２５ｍｇカプセルの固定用量で投与可能である。レトロゾールは、患者の体重に関わらず２．５ｍｇの固定用量で投与可能である。フルベストラントは、患者の体重に関わらず５００ｍｇの固定用量で投与可能である。特定の態様において、投薬措置は、最適な所望の反応（例えば、有効反応）を提供するよう調整される。
【００２４】
１つの側面において、パルボシクリブ、レトロゾール、およびセリバンツマブを、特定の投薬措置によって組み合わせて投与する。１つの態様において、２８日間サイクルとして１２５ｍｇのパルボシクリブ・カプセルを連続２１日間１日１回経口投与し、７日間の治療停止がそれに続く。この態様において、２８日間サイクル全体で、２．５ｍｇのレトロゾールを１日１回継続して投与する。この態様において、サイクル全体で、セリバンツマブをＩＶ注入によって２週間ごとに３ｇの用量で投与する。
【００２５】
別の側面において、パルボシクリブ、フルベストラント、およびセリバンツマブを、特定の投薬措置によって組み合わせて投与する。この態様において、２８日間サイクルとして１２５ｍｇのパルボシクリブ・カプセルを連続２１日間１日１回経口投与し、７日間の治療停止がそれに続く。この態様において、フルベストラントを第１日、第１５日、第２９日、およびその後に月１回または２８日ごとに１回、５００ｍｇの用量で投与する。この態様において、サイクル全体で、セリバンツマブをＩＶ注入によって２週間ごとに３ｇの用量で投与する。
【００２６】
したがって、１つの側面において、ＥＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌を有する患者を治療する方法であって、患者に：
Ｉ）２１日連続で１日１回経口摂取される１つのパルボシクリブ１２５ｍｇカプセル、それに続き２８日の完全サイクルを構成する７日間の治療停止；
ＩＩ）ａ）またはｂ）いずれかであって、ここでａ）は２８日サイクル全体で連続して１日１回投与されるレトロゾール２．５ｍｇであり、ｂ）は第１日、第１５日、第２９日、およびその後は月１回または２８日ごとに１回、５００ｍｇの用量で投与されるフルベストラントである；ならびに
ＩＶ注入による２週間ごとの３ｇ用量でのセリバンツマブ
を投与することを含む、方法を提供する。
【００２７】
別の側面において、パルボシクリブおよびホルモン療法で以前に治療されており、その癌がこの治療に対して進行している患者を治療する方法であって、患者に：
Ｉ）２１日連続で１日１回経口摂取される１つのパルボシクリブ１２５ｍｇカプセル、それに続き２８日の完全サイクルを構成する７日間の治療停止；
ＩＩ）ａ）またはｂ）いずれかであって、ここでａ）は２８日サイクル全体で連続して１日１回投与されるレトロゾール２．５ｍｇであり、ｂ）は第１日、第１５日、第２９日、およびその後は月１回または２８日ごとに１回、５００ｍｇの用量で投与されるフルベストラントであり、患者が以前にフルベストラントで治療されていた場合、患者にａ）を投与し、患者が以前にレトロゾールで治療されていた場合、患者にｂ）を投与する；ならびに
ＩＶ注入による２週間ごとの３ｇ用量でのセリバンツマブ
を同時投与することを含む、方法を提供する。
【００２８】
別の側面において、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−ＩＳＨ）によって測定される際にＨＲＧを発現するＥＲ／ＰＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌の患者を治療する方法を提供する。１つの態様において、乳癌は局所進行性または転移性の乳癌である。別の態様において、方法は、２８日サイクルを含み：
Ｉ）セリバンツマブを３０００ｍｇの用量でサイクルの第１日および第１５日に静脈内（ＩＶ）投与し、
ＩＩ）フルベストラントを５００ｍｇの用量でサイクルの第１日および第１５日に筋内（ＩＭ）投与する。
【００２９】
１つの態様において、方法は少なくとも１つの後続の治療サイクルを含む。別の態様において、フルベストラントを各後続の治療サイクルの第１日目でのみ投与する。
【００３０】
別の側面において、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−ＩＳＨ）によって測定される際にＨＲＧを発現するＥＲ／ＰＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌の患者を治療する方法は、２８日サイクルを含み：
Ｉ）セリバンツマブを３０００ｍｇの用量でサイクルの第１日および第１５日にＩＶ投与し、
ＩＩ）レトロゾールを２．５ｍｇの用量でサイクル中１日１回経口投与する。
【００３１】
１つの態様において、１＋またはそれより高いヘレグリンＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−ＩＳＨ）スコアが治療前の患者由来の生物学的試料において測定されている。
【００３２】
本明細書に提供する治療法の有効性を、任意の適切な手段を用いて評価することも可能である。１つの態様において、治療は、腫瘍サイズの減少、転移の減少、完全な寛解、部分的寛解、安定な疾患、全体の応答率の増加、または病理学的に完全な応答からなる群より選択される少なくとも１つの療法効果を生じる。１つの態様において、治療は、安定な疾患、部分的応答、または完全な応答を示す患者を生じる。
【００３３】
さらに提供するのは、抗ＥｒｂＢ３抗体、例えばセリバンツマブ、ＣＤＫ４／６阻害剤、例えばパルボシクリブ、および内分泌に基づく療法、例えばレトロゾールまたはフルベストラントを含む、キットである。１つの態様において、キットは：（ａ）セリバンツマブの用量、（ｂ）パルボシクリブの用量、（ｃ）レトロゾールまたはフルベストラントの用量、および（ｄ）本明細書記載の方法において、セリバンツマブおよびパルボシクリブと組み合わせてレトロゾールまたはフルベストラントを用いるための説明書を含む。別の態様において、キットは：（ａ）セリバンツマブの用量、（ｂ）レトロゾールまたはフルベストラントの用量、および（ｃ）本明細書記載の方法において、セリバンツマブと組み合わせてレトロゾールまたはフルベストラントを用いるための説明書を含む。
【００３４】
詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書において用いられる用語「被験体」または「患者」は、ヒト患者（例えば、ＥＲ＋、ＨＥＲ２−  ＨＲＧ＋転移性乳癌を有する患者）である。
【００３５】
本明細書において用いられる用語「エストロゲン受容体陽性」（ＥＲ＋）は、腫瘍（例えば、癌腫）、典型的には乳房腫瘍を指し、ここで腫瘍細胞は、エストロゲン受容体（ＥＲ）に関して陽性とスコア付けされる（すなわち慣用的組織病理法を用いて）。米国病理医協会（ＣＡＰ）および米国臨床腫瘍学会（ＡＳＣＯ）によって提供される推奨によって、腫瘍は、試験した腫瘍細胞の少なくとも１％が（例えば、免疫組織化学によって）ＥＲ陽性とスコア付けされる場合ＥＲ＋である。
【００３６】
用語「ＥｒｂＢ２」、「ＨＥＲ２」、および「ＨＥＲ２受容体」は、本明細書において交換可能に用いられ、ＥｒｂＢ２癌遺伝子またはＨＥＲ２癌遺伝子ともまた称される、ヒトｎｅｕ癌遺伝子のタンパク質産物を指す。ＣＡＰおよびＡＳＣＯによって提供される指針によって、ＨＥＲ２陰性（ＨＥＲ２−）と称される腫瘍は、免疫組織化学（ＩＨＣ）試験などのイムノアッセイが染色を示さないかまたは腫瘍細胞の＜３０％での膜染色を示す、腫瘍である。ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（登録商標）として市販される１つのこうしたアッセイに関して、０または１＋のスコアはＨＥＲ２陰性と見なされ、２＋のスコアは不確かと見なされ最終的な特徴付けに蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によるさらなる試験を必要とし、３＋のスコアはＨＥＲ２陽性と見なされる。したがって、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴにより０または１＋とスコア付けされるか、あるいはＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴにより２＋とスコア付けされ、かつＦＩＳＨによる陰性を有する患者は、ＨＥＲ２陰性と見なされる一方、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴによって３＋とスコア付けされる患者またはＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴによって２＋とスコア付けされＦＩＳＨ陽性である患者は、ＨＥＲ２陽性と見なされる。
【００３７】
本明細書において用いられる「ＨＲＧ」は、ＥｒｂＢ３の天然存在リガンドのセットであるヘレグリン（ニューレグリン−１、「ＮＲＧ」）のあらゆるアイソタイプを示す。ＨＲＧ発現は、例えば本明細書に明白に援用されるＵＳＳＮ  １４／９６５，３０１；ＷＯ  ２０１５／１００４５９の実施例１に記載されるプロトコルによる、例えば、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に基づくアッセイを用いて評価可能である。１つの態様において、ＲＮＡ−ＩＳＨは、発色性シグナルを通じて読み取られる。特定の態様において、ＲＮＡ−ＩＳＨによってＨＲＧを検出するために用いられるプローブは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ−０１３９５６（配列番号１３）に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド４４２〜２９７７を含む核酸に、特異的にハイブリダイズする。特定の態様において、プローブは、ＨＲＧアイソフォームα、β１、β１ｂ、β１ｃ、β１ｄ、β２、β２ｂ、β３、β３ｂ、γ、γ２、γ３、ｎｄｆ４３、ｎｄｆ３４ｂ、およびＧＧＦ２の各々をコードするＲＮＡに、特異的にハイブリダイズする。別の態様において、ＨＲＧスコアは、ＨＲＧに特異的なプローブを用いるＲＴ−ＰＣＲによって決定される。
【００３８】
用語「ＥｒｂＢ３」および「ＨＥＲ３」は、本明細書において交換可能に用いられ、米国特許第５，４８０，９６８号に記載されるような、ヒトＥｒｂＢ３タンパク質を指す。ヒトＥｒｂＢ３タンパク質配列は、米国特許第５，４８０，９６８号の配列番号４に示され、ここで最初の１９アミノ酸（ａａ）が、成熟タンパク質から切断されるリーダー配列に対応する。ＥｒｂＢ３は、受容体のＥｒｂＢファミリーのメンバーであり、その他のメンバーはＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／Ｎｅｕ）およびＥｒｂＢ４を含む。ＥｒｂＢ３はそれ自体、チロシンキナーゼ活性を欠くが、ＥｒｂＢ３と別のＥｒｂＢファミリー受容体、例えば受容体チロシンキナーゼであるＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４と二量体化すると、それ自体リン酸化される。ＥｒｂＢファミリー受容体のリガンドは、ヘレグリン（ＨＲＧ）、ベータセルリン（ＢＴＣ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）、アンフィレグリン（ＡＲ）、エピゲン（ＥＰＧ）およびエピレグリン（ＥＰＲ）を含む。ヒトＥｒｂＢ３のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００１９７３．２（受容体チロシン−プロテインキナーゼｅｒｂＢ３アイソフォーム１前駆体）にて提供され、ＧｅｎｅＩＤ：２０６５を割り当てられている。
【００３９】
本明細書において用いられる用語「ＥｒｂＢ３阻害剤」は、ＥｒｂＢ３の活性を阻害するか、下方調節するか、抑制するかまたは下方制御する療法剤を含むと意図される。この用語は、化学化合物、例えば小分子阻害剤、および生物学的剤、例えば抗体、干渉ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、可溶性受容体等を含むと意図される。例示的なＥｒｂＢ３阻害剤は、抗ＥｒｂＢ抗体、例えばセリバンツマブである。
【００４０】
本明細書において用いられる用語「剤」は、活性分子、例えば治療的タンパク質、例えば薬剤を指す。
【００４１】
本明細書において用いられる「有効治療」は、有益な効果、例えば、疾患または障害の少なくとも１つの症状の寛解を生じる治療を指す。有益な効果は、ベースラインを超える改善、すなわち、本方法による療法の開始の前に行われた測定または観察を超える改善の形を取ってもよい。有効治療は、癌の少なくとも１つの症状の軽減を指してもよい。
【００４２】
本明細書において用いられる用語「有効量」は、所望の生物学的、療法的、および／または予防的結果を提供する剤の量を指す。この結果は、疾患の徴候、症状、または原因の１またはそれより多くの減少、寛解、緩和、低下、遅延、および／または軽減、あるいは生物学的系の他の任意の所望の改善であってもよい。有効量は、１またはそれより多い投与で投与されてよい。
【００４３】
本明細書において用いられる用語「投与する」または「投与」は、体の外側に存在するような物質（例えば本明細書に開示する分子の配合物）を、例えば粘膜、皮内、静脈内、筋内送達、および／または本明細書に記載されるかまたは当該技術分野に公知である任意の他の物理的送達法によって、患者中に注射するか別の方式で物理的に送達する行為を指す。疾患またはその症状を治療する際、物質の投与は典型的には、疾患またはその症状の開始後に起こる。疾患またはその症状を防止する際、物質の投与は、疾患またはその症状の開始前に起こる。
【００４４】
本明細書において用いられる用語「固定用量」、「均一用量」、および「均一固定用量」は、交換可能に用いられ、患者の体重または体表面積（ＢＳＡ）とはかかわりなく、患者に投与される用量を指す。固定または均一容量はしたがって、ｍｇ／ｋｇ用量として提供されず、むしろ剤の絶対量として提供される。
【００４５】
本明細書において用いられる用語「治療する」、「治療している」および「治療」は、本明細書に記載される療法的または予防的手段を指す。「治療」の方法は、疾患もしくは障害、または再発する疾患もしくは障害の１またはそれより多い症状を防止し、治癒させ、遅延させ、その重症度を減少させ、または寛解させるために、あるいはこうした治療の非存在下で予期されるよりも被験体の生存を延長させるために、本明細書に開示する組み合わせの被験体への投与を使用する。
【００４６】
本明細書で用いられる、補助的なまたは組み合わされる投与（共投与）は、同じまたは異なる投薬型での剤の同時投与、または剤の別個の投与（例えば連続投与）を含む。例えば、剤を別個の投与のために配合し、同時にまたは連続して投与できる。こうした同時または連続投与は好ましくは、治療される患者で同時に存在する剤を生じる。
【００４７】
ＩＩ．抗ＥｒｂＢ３抗体
本発明で使用するために適した抗ＥｒｂＢ３抗体（またはそこから得られるＶＨ／ＶＬドメイン）を、当該技術分野で周知の方法を用いて生成できる。あるいは、当該技術分野で認識される抗ＥｒｂＢ３抗体、例えば、ＡＶ−２０３（ＵＳ８４８１６８７に記載されるようなもの）、ＧＳＫ２８４９３３０（ＵＳ９０８５６２２に記載されるようなもの）、ＫＴＮ３３７９（ＵＳ９２２０７７５に記載されるようなもの）、デュリゴツズマブ（ＵＳ８５９７６５２に記載されるようなもの）、エルゲムツマブ（ＵＳ８７３５５５１に記載されるようなもの）、フツキシマブ（ＷＯ２００８／１０４１８３に記載されるようなもの）、ルムレツズマブ（ＵＳ８８５９７３７に記載されるようなもの）、およびパトリツマブ（ＵＳ７７０５１３０に記載されるようなもの）を用いることができる。ＥｒｂＢ３への結合に関して、これらの当該技術分野で認識される抗体のいずれかと競合する抗体もまた、使用できる。
【００４８】
例示的な抗ＥｒｂＢ３抗体は、セリバンツマブ（「ＭＭ−１２１」または「Ａｂ＃６」としても公知である）またはその抗原結合性断片および変異体である。セリバンツマブは、ヒトモノクローナル抗ＥｒｂＢ３  ＩｇＧ２である（例えば、その解説が本明細書に明白に援用される、米国特許第７，８４６，４４０号；第８，６９１，７７１号および第８，９６１，９６６号；第８，８９５，００１号、米国特許公報第２０１１００２７２９１号、第２０１４０１２７２３８号、第２０１４０１３４１７０号、および第２０１４０２４８２８０号）、ならびに国際公報第ＷＯ／２０１３／０２３０４３号、第ＷＯ／２０１３／１３８３７１号、第ＷＯ／２０１２／１０３３４１号、および米国仮特許出願第６２／０９０，７８０号を参照されたい）。
【００４９】
１つの態様において、抗ＥｒｂＢ３抗体は、セリバンツマブの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を含む。したがって、１つの態様において、抗体は、配列番号１０に示す配列を有するセリバンツマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列番号１２に示す配列を有するセリバンツマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の態様において、抗体は、それぞれ、配列番号１、２、および３に示す配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれぞれ、配列番号４、５、および６に示す配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の態様において、抗体は、それぞれ、配列番号１０および配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するＶＨおよび／またはＶＬ領域を含む。別の態様において、抗ＥｒｂＢ３抗体は、それぞれ、配列番号９および１１に示す核酸配列によってコードされるＶＨおよび／またはＶＬ領域を含む。別の態様において、抗ＥｒｂＢ３抗体は、それぞれ、配列番号７および配列番号８に示すアミノ酸配列を有する重鎖および／または軽鎖を含む。別の態様において、上述の抗体と同じヒトＥｒｂＢ３上のエピトープとの結合に関して競合し、かつ／またはそれに結合する抗体を用いる。特定の態様において、エピトープは、ヒトＥｒｂＢ３（配列番号１４）の残基９２〜１０４を含む。別の態様において、抗体は、ヒトＥｒｂＢ３への結合に関してセリバンツマブと競合し、上述の抗ＥｒｂＢ３抗体と少なくとも９０％の可変領域アミノ酸配列同一性を有する（例えば、米国特許第７，８４６，４４０号および米国特許公報第２０１００２６６５８４号を参照されたい）。
【００５０】
ＩＩＩ．ＣＤＫ４／６阻害剤
当該技術分野で認識されるＣＤＫ４／６阻害剤を用いることができる。例示的なＣＤＫ４／６阻害剤はパルボシクリブである。パルボシクリブ（コード名ＰＤ−０３３２９９１、商品名ＩＢＲＡＮＣＥ）は、ＥＲ陽性およびＨＥＲ２陰性の乳癌の治療のための薬剤である。この薬剤は、サイクリン依存性キナーゼＣＤＫ４およびＣＤＫ６の選択的阻害剤である。経口投与用のＩＢＲＡＮＣＥカプセルは、キナーゼ阻害剤であるパルボシクリブを１２５ｍｇ、１００ｍｇ、または７５ｍｇ含有する。パルボシクリブの分子式は、Ｃ２４Ｈ２９Ｎ７Ｏ２である。分子量は４４７．５４ダルトンである。化学名は６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−｛｛５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル｝アミノ｝ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オンであり、その構造式は：
【化１】
2019508428.tif 000002
である。
【００５１】
パルボシクリブは、７．４（二級ピペラジン窒素）および３．９（ピリジン窒素）のｐＫａを有する黄色〜橙色の粉末である。ｐＨ４またはそれ未満では、パルボシクリブは高溶解性化合物としてふるまう。ｐＨ４より高いときには、薬剤物質の溶解度は顕著に減少する。パルボシクリブは、以下の不活性成分を含有する：微結晶性セルロース、ラクトース一水和物、デンプングリコール酸ナトリウム、コロイド性二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、および硬ゼラチンカプセルシェル。明るい橙、明るい橙／キャラメル色およびキャラメル色で不透明なカプセルシェルは、ゼラチン、赤い酸化鉄、黄色い酸化鉄、および二酸化チタンを含有し；印刷用インクは、シェラック、二酸化チタン、水酸化アンモニウム、プロピレングリコールおよびシメチコンを含有する。
【００５２】
パルボシクリブの推奨される用量は、２１日連続で１日１回経口摂取される１２５ｍｇカプセルであり、その後に７日間の治療停止が続いて２８日の完全サイクルを構成する。ＩＢＲＡＮＣＥは食物と共に摂取すべきである。
【００５３】
パルボシクリブと同時投与される場合、レトロゾールの推奨される用量は、２８日サイクル全体で連続して１日１回投与される２．５ｍｇである。
【００５４】
パルボシクリブと同時投与される場合、フルベストラントの推奨される用量は、第１日、第１５日、第２９日に、およびその後は月１回投与される、５００ｍｇである。
【００５５】
別の例示的なＣＤＫ４／６阻害剤は、アベマシクリブである。アベマシクリブ（コード名ＬＹ２８３５２１９；商品名ＩＢＲＡＮＣＥ）は、多様なタイプの癌に対する治験薬である。この薬剤は、サイクリン依存性キナーゼＣＤＫ４およびＣＤＫ６の経口選択的阻害剤である。アベマシクリブの分子式は、Ｃ２７Ｈ３２Ｆ２Ｎ８である。分子量は５０６．６１ダルトンである。化学名は２−ピリミジンアミン、Ｎ−（５−（（４−エチル−１−ピペラジニル）メチル）−２−ピリジニル）−５−フルオロ−４−（４−フルオロ−２−メチル−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−６−イル）であり、その構造式は：
【化２】
2019508428.tif 000003
である。
【００５６】
別の例示的なＣＤＫ４／６阻害剤は、リボシクリブである。リボシクリブ（コード名ＬＥＥ０１１；商品名ＫＩＳＱＵＡＬＩ）は、ホルモン受容体陽性およびＨＥＲ２陰性の進行性または転移性の乳癌を含む、多様な癌の治療用の薬剤である。この薬剤は、経口で使用可能な、サイクリン依存性キナーゼＣＤＫ４およびＣＤＫ６の非常に選択的な阻害剤である。リボシクリブの分子式は、Ｃ２３Ｈ３０Ｎ８Ｏである。分子量は４３４．５５ダルトンである。化学名は、７−シクロペンチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（（５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）アミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミドであり、その構造式は：
【化３】
2019508428.tif 000004
である。
【００５７】
ＫＩＳＱＡＬＩ錠剤は、食品を伴いまたは伴わずに摂取されるよう推奨される。推奨される出発用量は、食品を伴いまたは伴わずに連続２１日間、１日１回経口摂取される６００ｍｇ（３つの２００ｍｇ錠剤）、それに続く７日間の治療停止である。
【００５８】
ＩＶ．内分泌に基づく療法
当該技術分野で認識される内分泌に基づく療法を用いることができる。例示的な内分泌に基づく療法は、非ステロイド性アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール、アノストロゾール）および選択的エストロゲン受容体分解剤（例えば、フルベストラント、ブリラネストラント、エラセストラント）を含む。
【００５９】
例示的な内分泌に基づく療法はレトロゾールである。レトロゾール（商品名ＦＥＭＡＲＡ）は、非ステロイド性アロマターゼ阻害剤（エストロゲン合成の阻害剤）である。レトロゾールは、酵素のチトクロムＰ４５０サブユニットのヘムに競合的に結合することによってアロマターゼ酵素を阻害し、すべての組織においてエストロゲン生合成の減少を生じる。この薬剤は化学的には、４，４’−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イルメチレン）ジベンゾニトリルと記載され、その構造式は
【化４】
2019508428.tif 000005
である。
【００６０】
レトロゾールは白色〜黄色がかった結晶性粉末であり、実質的に無臭で、ジクロロメタンに容易に溶解し、エタノールにわずかに溶解性であり、水に実質的に不溶性である。この薬剤は、２８５．３１の分子量、実験式Ｃ１７Ｈ１１Ｎ５、および１８４℃〜１８５℃の融解範囲を有する。
【００６１】
ＦＥＭＡＲＡ（レトロゾール錠剤）は、経口投与用の２．５ｍｇ錠剤として入手可能である。レトロゾールは、以下の不活性成分を含有する：コロイド性二酸化ケイ素、酸化第二鉄、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース一水和物、ステアリン酸マグネシウム、トウモロコシデンプン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、デンプングリコール酸ナトリウム、タルク、および二酸化チタン。
【００６２】
ＦＥＭＡＲＡ（レトロゾール錠剤）の推奨される用量は、食事に関わりなく、１日１回投与される１つの２．５ｍｇ錠剤である。
【００６３】
別の例示的な内分泌に基づく療法は、アナストロゾール（商品名ＡＲＩＭＩＤＥＸ）である。ＡＲＩＭＩＤＥＸ（アナストロゾール）は、末梢（性腺外）組織でエストロゲンへのアンドロゲンの変換を競合的に遮断する、経口で利用可能なアロマターゼ阻害剤である。化学名は、ａ．ａ．ａ’．ａ’．−テトラメチル−５−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イルメチル）−１，３−ベンゼンジアセトニトリルである。分子式はＣ１７Ｈ１９Ｎ５であり、その構造式は：
【化５】
2019508428.tif 000006
である。
【００６４】
アナストロゾールは、メタノール、アセトン、エタノール、およびテトラヒドロフランに容易に溶解し、アセトニトリルに非常によく溶解する。各錠剤は、不活性成分として：ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、および二酸化チタンを含有する。ＡＲＩＭＩＤＥＸは、経口投与用の１ｍｇ錠剤として入手可能であり、ＡＲＩＭＩＤＥＸの推奨される用量は１日１錠剤である。
【００６５】
別の例示的な内分泌に基づく療法は、フルベストラント（商品名ＦＡＳＬＯＤＥＸ）である。筋内投与用のＦＡＳＬＯＤＥＸ（フルベストラント）注射剤は、エストロゲン受容体アンタゴニストである。化学名は、７−アルファ−［９−（４，４，５，５，５−ペンタフルオロペンチルスルフィニル）ノニル］エストラ―１，３，５−（１０）−トリエン−３，１７ベータ−ジオールである。分子式はＣ３２Ｈ４７Ｆ５Ｏ３Ｓであり、その構造式は：
【化６】
2019508428.tif 000007
である。
【００６６】
フルベストラントは、６０６．７７の分子量を有する白色粉末である。注射用の溶液は透明、無色〜黄色の粘性液である。各注射は、不活性成分として：１０％  ｗ／ｖアルコール、ＵＳＰ、１０％  ｗ／ｖベンジルアルコール、ＮＦ、および１５％  ｗ／ｖ安息香酸ベンジル、共溶媒として、ＵＳＰを含有し、共溶媒および遊離速度修飾剤としてのひまし油、ＵＳＰにより１００％  ｗ／ｖにされる。
【００６７】
ＦＡＳＬＯＤＥＸの推奨される用量は５００ｍｇであり、第１日、第１５日、第２９日に、およびその後月に１回、各臀部に１回ずつ、２回の５ｍＬ注射として、臀部中にゆっくりと（注射あたり１〜２分間）筋内投与すべきである。２５０ｍｇの用量が、中程度の肝臓損傷を有する患者において推奨され、第１日、第１５日、第２９日に、およびその後月に１回、１回の５ｍＬ注射として、臀部中にゆっくりと（１〜２分間）筋内投与される。
【００６８】
別の例示的な内分泌に基づく療法は、ブリラネストラント（コード名：ＧＤＣ−０８１０、ＡＲＮ−８１０、ＲＧ−６０４６、ＲＯ−７０５６１１８）である。ブリラネストラントは、転移性エストロゲン受容体陽性乳癌の治療用の治験薬である。この剤は、非ステロイド性の組み合わされた選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）および選択的エストロゲン受容体分解剤（ＳＥＲＤ）である。化学名は、（２Ｅ）−３−｛４−［（１Ｅ）−２−（２−クロロ−４−フルオロフェニル）−１−（１Ｈ−インダゾール−５−イル）ブト―１−エン−１−イル］フェニル｝プロプ−２−エン酸である。分子式はＣ２６Ｈ２０ＣｌＦＮ２Ｏ２であり、その構造式は：
【化７】
2019508428.tif 000008
である。
【００６９】
ブリラネストラントは、経口で利用可能であり、筋内注射によって投与される必要はない。
【００７０】
別の例示的な内分泌に基づく療法は、エラセストラント（コード名：ＲＡＤ−１９０１、ＥＲ−３０６３２３）である。エラセストラントは、エストロゲン受容体陽性乳癌、子宮内膜癌、および腎臓癌の治療用の治験薬である。この剤は、非ステロイド性の組み合わされた選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）および選択的エストロゲン受容体分解剤（ＳＥＲＤ）である。化学名は、（６Ｒ）−６−｛２−［エチル（｛４−［２−（エチルアミノ）エチル］フェニル｝メチル）アミノ］−４−メトキシフェニル｝−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−オールである。分子式はＣ３０Ｈ３８Ｎ２Ｏ２であり、その構造式は：
【化８】
2019508428.tif 000009
である。
【００７１】
エラセストラントは経口的に利用可能であり、筋内注射によって投与される必要はない。
【００７２】
Ｖ．転帰
本明細書で提供するのは、ヒト患者においてＥＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌（例えば、転移性ＥＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌）を治療するための組成物および方法であって、特定の臨床投与措置によって（すなわち、特定の用量で、および特定の投薬スケジュールによって）抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、セリバンツマブまたはイスチラツマブ）、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ、アベマシクリブ、またはリボシクリブ）、および内分泌に基づく療法（例えば、レトロゾールまたはフルベストラント）を患者に投与することを含む、方法である。本明細書でまた提供するのは、ヒト患者においてＥＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌（例えば、転移性ＥＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌）を治療するための組成物および方法であって、特定の臨床投与措置によって（すなわち、特定の用量で、および特定の投薬スケジュールによって）抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、セリバンツマブまたはイスチラツマブ）、および内分泌に基づく療法（例えば、レトロゾールまたはフルベストラント）を患者に投与することを含む、方法である。
【００７３】
治療転帰を、腫瘍応答に関する標準測定を用いて評価できる。療法に対するターゲット病変（腫瘍）応答は、以下のように分類される：
【００７４】
完全応答（ＣＲ）：すべてのターゲット病変の消失。いかなる病的リンパ節（ターゲットでも非ターゲットでも）も、短軸で＜１０ｍｍに減少していなければならない；
【００７５】
部分応答（ＰＲ）：参照としてベースライン合計直径を用いて、ターゲット病変の直径合計での少なくとも３０％の減少；
【００７６】
進行性疾患（ＰＤ）：参照として研究中の最小合計（これは、それが研究中の最小であるならば、ベースライン合計を含む）を用いて、ターゲット病変の直径合計での少なくとも２０％の増加。２０％の相対増加に加えて、合計はまた、少なくとも５ｍｍの絶対増加も示さなければならない。（注：１またはそれより多い新規病変の出現もまた、進行と見なされる）；および
【００７７】
安定疾患（ＳＤ）：参照として研究中の最小の合計直径を用いて、ＰＲと見なすには十分な縮小がなく、またＰＤと見なすには十分な増加もない。（注：直径の合計を５ｍｍまたはそれより多く増加させない、２０％またはそれ未満の変化を、安定疾患とコードする）。安定疾患状態に割り当てられるためには、測定は、最低限６週間の間隔で、研究登録後に少なくとも１回、安定疾患基準を満たしていなければならない。
【００７８】
療法に対する非ターゲット病変応答は、以下のように分類される：
【００７９】
完全応答（ＣＲ）：すべての非ターゲット病変の消失および腫瘍マーカーレベルの正常化。すべてのリンパ節は、サイズが非病的でなければならない（＜１０ｍｍ短軸）。腫瘍マーカーが最初に正常上限より高かった場合、患者が完全臨床応答と見なされるためには、それらは正常化していなければならない。
【００８０】
非ＣＲ／非ＰＤ：１またはそれより多い非ターゲット病変の持続および／または正常上限を超える腫瘍マーカーレベルの維持；および
【００８１】
進行性疾患（ＰＤ）：１またはそれより多い新規病変の出現および存在する非ターゲット病変の明白な進行のいずれかまたは両方。この文脈において、明白な進行は、単一の病変増加ではなく、全体の疾患状態変化の代表でなければならない。
【００８２】
本明細書に開示する方法によって治療される患者は好ましくは、癌の少なくとも１つの徴候の改善を経験する。例えば、治療は、腫瘍サイズの減少、転移の減少、完全寛解、部分寛解、安定疾患、全体の応答率の増加、または病理学的に完全な応答からなる群より選択される少なくとも１つの療法効果を生じ得る。応答はまた、測定可能な腫瘍病変の量および／またはサイズの減少によって測定されてよい。測定可能な病変は、ＣＴスキャン（５ｍｍ以下のＣＴスキャンスライス厚）による＞１０ｍｍ、臨床検査による１０ｍｍノギス測定または胸部Ｘ線による＞２０ｍｍが、少なくとも１つの次元で正確に測定され得る（最長径が記録される）ものと定義される。非ターゲット病変、例えば、病的リンパ節のサイズもまた、改善のために測定されてよい。病変は、例えば、ｘ線、ＣＴ、またはＭＲＩ画像を用いて測定されてよい。顕微鏡、細胞診断または組織学を用いて、療法に対する応答性を評価することもまた可能である。測定可能な腫瘍がそうでなければ応答または安定疾患の基準を満たす場合、治療中に出現するかまたは悪化する浸出は、腫瘍進行を示すと見なされてよいが、浸出が新生物起源であることが細胞診断で確認される場合のみである。
【００８３】
別の態様において、こうして治療される患者は、腫瘍縮小および／または増殖率の減少、すなわち、腫瘍増殖の抑制を経験する。別の態様において、腫瘍細胞増殖は減少するかまたは阻害される。あるいは、以下の１またはそれより多くが、治療に対する有益な応答を示し得る：癌細胞の数が減少し得る；腫瘍サイズが減少し得る；末梢臓器への癌細胞浸潤が阻害され、遅延され、緩慢にされ、または停止され得る；腫瘍転移が緩慢にされるか阻害され得る；腫瘍増殖が阻害され得る；腫瘍の再発が防止されるか遅延され得る；癌に関連する症状の１またはそれより多くがある程度まで軽減され得る。好ましい応答の他の徴候は、測定可能な腫瘍病変または非ターゲット病変の量および／またはサイズの減少を含む。
【００８４】
ＶＩ．キットおよび単位投薬型
本明細書でまた提供するのは、前述の方法における使用のために適応された療法的有効量で、抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、セリバンツマブまたはイスチラツマブ）、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ、アベマシクリブ、またはリボシクリブ）および内分泌に基づく療法（例えば、レトロゾールまたはフルベストラント）を含むキットである。別の態様において、キットは、前述の方法における使用のために適応された療法的有効量で、抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、セリバンツマブまたはイスチラツマブ）および内分泌に基づく療法（例えば、レトロゾールまたはフルベストラント）を含む。キットはまた場合によって、実施者（例えば、医師、看護師、または患者）がキットに含有される療法剤を、癌を有する患者に投与することを可能にする、例えば、投与スケジュールを含む説明書を含んでもよい。キットはまた、シリンジを含んでもよい。薬学的組成物（単数または複数）を投与するために必要な説明書またはデバイスも、キットに含まれてよい。
【００８５】
１つの態様において、本発明は：（ａ）セリバンツマブまたはイスチラツマブの用量、（ｂ）パルボシクリブの用量、（ｃ）レトロゾールまたはフルベストラントの用量、および（ｄ）本明細書記載の方法において、セリバンツマブまたはイスチラツマブおよびパルボシクリブと組み合わせて、レトロゾールまたはフルベストラントを用いるための説明書を含む、キットを提供する。別の態様において、キットは：（ａ）セリバンツマブまたはイスチラツマブの用量、（ｂ）レトロゾールまたはフルベストラントの用量、および（ｃ）本明細書記載の方法において、セリバンツマブまたはイスチラツマブと組み合わせて、レトロゾールまたはフルベストラントを用いるための説明書を含む。
【００８６】
以下の実施例は、単なる例示であり、いかなる意味でも本開示の範囲を限定すると見なされてはならず、これは、本開示を読むと、当業者には、多くの変形および同等物が明らかになるためである。
【００８７】
本出願全体で引用される、すべての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋエントリー、特許および公開特許出願は、明白に本明細書に援用される。
【００８８】
実施例
材料および方法
細胞株、細胞培養、および試薬
ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＺＲ７５−１およびＨＣＣ−１４２８を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」、米国メリーランド州ロックビル）より得た。すべての細胞を、１０％  ｖ／ｖ熱不活化ＦＢＳ、５％  ｖ／ｖ  Ｌ−グルタミンおよび５％  ｖ／ｖペニシリン−ストレプトマイシン溶液を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。別に示さない限り、すべての培養試薬をＧｉｂｃｏから得た。ホルモン不含条件が必要である場合、細胞を、１０％  ｖ／ｖ活性炭処理熱不活化ＦＢＳ、５％  ｖ／ｖ  Ｌ−グルタミンおよび５％  ｖ／ｖペニシリン−ストレプトマイシン溶液を補充したフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。増殖因子刺激アッセイ用に低増殖因子条件を確実にするため、細胞を、他の培地構成要素を通常に補充して３％  ｖ／ｖ熱不活化ＦＢＳまたは１％  ｖ／ｖ熱不活化ＦＢＳなどの低血清条件で培養した。すべての細胞株を、９５％空気、５％ＣＯ２の加湿大気中にて３７℃で培養した。用いたすべての細胞の同一性を、ＡＴＣＣでのマイクロサテライト分析によって検証した。
【００８９】
組換えヘレグリン（ＨＲＧβ１）はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓに由来した（３９６−ＨＢ）。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ試薬はＰｒｏｍｅｇａに由来した。エストラジオール（Ｅ８８７５）およびフルベストラント（Ｉ４４０９）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈに由来した。タモキシフェン（Ｓ１９７２）、パルボシクリブ（Ｓ１５７９）、アベマシクリブ（Ｓ７１５８）およびリボシクリブ（Ｓ７４４０）はすべてＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍに由来した。
【００９０】
増殖アッセイ
細胞を、９６ウェルプレートである、透明な底を有する不透明な側面の９６ウェルプレート：９６ウェル、黒／透明、蓋つき平底、ＦＡＬＣＯＮ、３５３２１９中に、３％  ｖ／ｖ  ＦＢＳまたは１％  ｖ／ｖ  ＦＢＳのいずれかの減少血清条件下で、ウェルあたり１５００〜５０００細胞にて２つ組または３つ組で植え付けた。プレーティングの翌日、組換えＨＲＧβ１を、１０ｎＭの最終濃度を生じるように添加した。対照ウェルには、ＨＲＧβ１を含まない培地を加えた。プレートを次いで、９５％空気、５％ＣＯ２の加湿大気中３７℃で４〜６日の示される期間の間インキュベーションした。
【００９１】
ＨＲＧβ１およびＥｒｂＢ３ターゲティングｍＡｂ、セリバンツマブ（ＭＭ−１２１）あるいはパルボシクリブ、アベマシクリブまたはリボシクリブなどのＣＤＫ阻害剤を含む研究に関しては、細胞を、９６ウェルプレートである、透明な底を有する不透明な側面の９６ウェルプレート：ナノ培養プレート、ＭＳパターン、低結合性、ＳＣＩＶＡＸ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＮＣＰ−ＬＳ９６−１０中に、３％  ｖ／ｖ  ＦＢＳまたは１％  ｖ／ｖ  ＦＢＳのいずれかの減少血清条件下で、ウェルあたり１５００〜５０００細胞にて２つ組または３つ組で植え付けた。プレーティングの翌日、組換えＨＲＧβ１を、１０ｎＭの最終濃度を生じるように添加した。対照ウェルには、ＨＲＧβ１を含まない培地を加えた。示される場合、セリバンツマブを、最終濃度１μＭを達成するまたは希釈シリーズに渡ってプレートあたり１０の希釈を達成するよう添加して、列あたり２つの対照ウェルを有して用量応答曲線を達成した。示される場合、ＣＤＫ阻害剤を１０μＭで添加し、希釈を行って、列あたり２つの対照ウェルを有して用量応答曲線を作成した。プレートを次いで、９５％空気、５％ＣＯ２の加湿大気中３７℃で４〜６日の示される期間の間インキュベーションした。増殖阻害を、同じ期間に渡って、希釈のみで処理した細胞に対する増殖因子またはアンタゴニストのいずれかで処理した細胞の相対阻害または増殖の関数として計算した。
【００９２】
ＨＲＧβ１およびＥｒｂＢ３ターゲティングｍＡｂ、セリバンツマブ（ＭＭ−１２１）あるいはパルボシクリブ、アベマシクリブまたはリボシクリブなどのＣＤＫ阻害剤を含む研究に関しては、細胞を、９６ウェルプレートである、透明な底を有する不透明な側面の９６ウェルプレート：ナノ培養プレート、ＭＳパターン、低結合性、ＳＣＩＶＡＸ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＮＣＰ−ＬＳ９６−１０中に、３％  ｖ／ｖ  ＦＢＳまたは１％  ｖ／ｖ  ＦＢＳのいずれかの減少血清条件下で、ウェルあたり１５００〜５０００細胞にて２つ組または３つ組で植え付けた。プレーティングの翌日、組換えＨＲＧβ１を、１０ｎＭの最終濃度を生じるように添加した。対照ウェルには、ＨＲＧβ１を含まない培地を加えた。示される場合、セリバンツマブを、最終濃度１μＭを達成するまたは希釈シリーズに渡ってプレートあたり１０の希釈を達成するよう添加して、列あたり２つの対照ウェルを有して用量応答曲線を達成した。示される場合、ＣＤＫ阻害剤を１０μＭで添加し、希釈を行って、列あたり２つの対照ウェルを有して用量応答曲線を作成した。プレートを次いで、９５％空気、５％ＣＯ２の加湿大気中３７℃で４〜６日の示される期間の間インキュベーションした。
【００９３】
増殖を測定するため、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（ＣＴＧ）アッセイを製造者の指示にしたがって行った。具体的には、試薬１および試薬２を室温に平衡化し、その時点で試薬１を試薬２に添加しボルテックスによって混合した。細胞を含有する試験プレートを室温に３０分間平衡化し、その時点で等体積のＣＴＧ試薬を試験プレートの各ウェルに添加して、典型的には１００μｌ添加して、ウェルあたり最終体積２００μｌを生じた。各プレートを次いで、ホイルプレートシーラーで密封し、軌道振盪装置上で１０分間混合して、細胞を溶解させ細胞ＡＴＰを放出させた。混合後、プレートを室温で１５分間インキュベーションして、発光シグナルを安定化した。データを、発光プログラムを用いるＳｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１プレート読み取り装置で相対発光を測定することによって、収集した。増殖を計算し、各個々のプレート上の未刺激対照ウェルに対する相対値として表した。増殖阻害を、同じ期間に渡って、希釈のみで処理した細胞の増殖に対するアンタゴニストで処理した細胞の相対阻害の関数として計算した。データを次いで、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてプロットした。
【００９４】
実施例１：表現型的に異なるＨＲＧ陽性癌細胞は、転移性乳癌モデルにおけるケア療法の標準に影響を及ぼす。
ＥｒｂＢ３は、４つの受容体（ＥｒｂＢ１〜４）で構成されるヒト上皮増殖因子受容体（ＥｒｂＢまたはＨＥＲ）ファミリーのメンバーである。ＥｒｂＢネットワークの決定的な特徴は、ファミリーの２つのメンバー、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３が非自律性であることである。ＥｒｂＢ２は、増殖因子リガンドと相互作用する能力を欠き、一方、ＥｒｂＢ３のキナーゼ活性は欠損している。ＥｒｂＢ３リガンドであるヘレグリン（ＨＲＧ）は、増殖の強力な駆動因子と同定されており、生存を増進する。ＨＲＧ発現は、化学療法、抗ホルモン剤および他のターゲティング化療法剤を含む、多くの標準ケア（ＳＯＣ）療法の効果に応答不能であることによって特徴付けられる、特徴的な腫瘍細胞表現型を導く。
【００９５】
ＨＲＧ発現の調査において、ＨＲＧ＋細胞は、大部分の固形腫瘍タイプの症例のおよそ５０％に存在する。これらのＨＲＧ＋細胞はＳＯＣ療法の効果から保護されＳＯＣの存在下であっても増殖し続け、限定された臨床的利益を生じると仮定される。このモデルでは、ＨＲＧ活性が遮断されたならば、ＨＲＧ＋細胞はＳＯＣに感受性になり、増進された臨床的利益を生じる。セリバンツマブは、ＥｒｂＢ３へのＨＲＧの結合を阻害することによってＨＲＧ活性を遮断するように設計された、完全ヒト抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体である。セリバンツマブの存在下では、ＨＲＧ＋腫瘍細胞は、同時投与されるＳＯＣ療法に応答できると予測される。
【００９６】
ホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）乳癌に関して、ホルモン枯渇戦略は、アジュバントおよび転移セッティングでは臨床的に有益であることが立証されている。不運なことに、これらの療法からの臨床的利益は、ある患者では短期間でありうる。これらの患者の最適な臨床管理は、迅速な臨床的進行の駆動因子の包括的な分子的理解を必要とする。腫瘍試料において測定されるＨＲＧ  ｍＲＮＡ発現は、ＨＲＧを発現しない腫瘍を有する患者に比較してＳＯＣから限定された臨床的利益しか得ない患者の下位群を定義する。これは、エキセメスタンを用いた以前に公開された第２相臨床研究で、および現在ＨＲ＋、ＨＥＲ２陰性（ＨＥＲ２−）進行性乳癌に対する治療オプションの主力に相当する治療である、レトロゾールおよびフルベストラントを含む抗ホルモン剤の多数のクラスで前臨床的に、観察された。
【００９７】
このデータは、乳癌モデルで表現型的に別個のＨＲＧ＋細胞は、ＳＯＣおよび多様な新規クラスの療法での治療にもかかわらず、持続するという仮説を支持する。さらに、このデータは、これらの他の療法に対するセリバンツマブの添加は、治療応答持続に重要であることを示唆する。ＨＲＧ＋細胞の継続的な拡大は、ＳＯＣ療法で治療される乳癌患者における迅速な臨床的進行に対して重要でありうる。これらの知見は、ＨＲ＋、ＨＥＲ２−進行性乳癌における第３相臨床試験での抗ホルモン剤と組み合わせたセリバンツマブの開発を支持する。
【００９８】
実施例２：ヘレグリンｍＲＮＡは、ＥＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌を有する患者でよくみられる。
乳癌細胞でのＨＲＧ発現は、ＨＥＲ３シグナル伝達を活性化することによって、癌進行および療法に対する耐性に寄与しうる。この知見を詳述するため、ＨＲＧ  ｍＲＮＡの普及を、ＴＣＧＡ公的データベースにおいて、および臨床的に適切なＨＲＧ  ＲＮＡ−ＩＳＨアッセイを用いて１９７のＥＲ陽性ＨＥＲ２陰性乳癌腫瘍中のＨＲＧ  ｍＲＮＡを直接測定することによって、調べた。ＴＣＧＡデータベースおよび患者試料の両方が、ＨＲＧ  ｍＲＮＡに関して４５％の普及率を有することが見いだされた（図１）。
【００９９】
実施例３：ヘレグリンは、ＥＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌細胞株の増殖を誘導する。
ＥＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌細胞株をＨＲＧで６日間刺激し、増殖をｉｎ  ｖｉｔｒоで測定した。結果（図２）は、ＨＲＧが、すべてＥＲ＋、ＨＥＲ２−細胞モデルである、ＭＣＦ７、Ｔ４７ＤおよびＨＣＣ１４２８細胞株の増殖を誘導したことを示す。これらのデータは、ＨＲＧの存在が癌細胞増殖を駆動するという結論を支持する。
【０１００】
実施例４：ヘレグリンは、ＥＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌細胞株において抗ホルモン剤の活性を増大する。
フルベストラントは、選択的エストロゲン受容体分解剤「ＳＥＲＤ」と分類され、進行性ＥＲ＋乳癌患者を治療するために広く用いられる。ＳＥＲＤは受容体へのホルモン結合に拮抗し、かつ受容体タンパク質の分解を促進し、それによってホルモン受容体シグナル伝達および癌細胞増殖を阻害する二重の作用機構（ＭＯＡ）を有する。図３に示すように、ＨＲＧは、ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ細胞の増殖を顕著に増加させ、エストラジオール（Ｅ２）より高く増加させる。さらに、組み合わせたエストラジオールおよびＨＲＧは、両方の細胞株で増殖増加を生じた。フルベストラント（１００ｎＭ）は、ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ細胞株の両方で、エストラジオール誘導性増殖を阻害するのに有効であった。しかし、エストラジオールに加えてＨＲＧが存在する場合、フルベストラント活性は顕著に減少した（図３）。最後に、フルベストラントで処理した細胞にセリバンツマブを添加すると、エストラジオールおよびＨＲＧはフルベストラントの活性の回復を生じ、ＭＣＦ７細胞で最高の度合いの阻害が観察された。これらのデータは、ＥＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌において広くみられるＥｒｂＢ３リガンドＨＲＧが、乳癌細胞株の増殖を誘導でき、フルベストラントなどの抗ホルモン療法の有効性を阻害できることを示す。さらに、セリバンツマブは、ＨＲＧ仲介性フルベストラント耐性細胞において、フルベストラント感受性を回復できる。
【０１０１】
実施例５：ＨＲＧはＥＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌細胞株におけるＣＤＫ阻害剤の活性を阻害し、セリバンツマブは感受性を回復させる。
ＥＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌細胞を、ＨＲＧの非存在下または存在下でセリバンツマブの添加を伴いまたは伴わず、ＣＤＫ４／６阻害剤で処理し、その後ＣＴＧアッセイを用いて増殖を測定した（図４）。ある用量範囲（最も左のプロット、Ａ〜Ｃ、図４）に渡って単剤ＣＤＫ４／６阻害剤で処理されたＭＣＦ７細胞は、パルボシクリブ、アベマシクリブおよびリボシクリブが用量依存方式で同様の度合いに増殖を阻害することを立証した。ＭＣＦ７細胞をまた、同じ用量範囲に渡って飽和用量のＨＲＧ（１０ｎＭ）とともにＣＤＫ４／６阻害剤各々で処理した。ＨＲＧ刺激は、ＣＤＫ４／６阻害剤の活性を顕著に抑制し、増殖を増加させた（中央のプロット、Ａ〜Ｃ、図４）。セリバンツマブの添加は、ＣＤＫ阻害活性を回復させた（右側のプロット、Ａ〜Ｃ、図４）。類似の結果が別のＥＲ＋、ＨＥＲ２−細胞株、ＺＲ７５−１でも得られ、この場合、ＨＲＧは再びＣＤＫ４／６阻害剤の活性を阻害し、かつセリバンツマブが感受性を回復させた（図５Ａ〜５Ｃ）。要約すると、これらのデータは、ＨＲＧ−ＥｒｂＢ３シグナル伝達がＣＤＫ４／６阻害剤の増殖阻害効果に対する非感受性を促進することを示す。
【０１０２】
実施例６：ヘレグリンはＥＲ＋、ＨＥＲ２−転移性乳癌細胞株におけるＣＤＫ４／６阻害剤および内分泌療法の組み合わせの活性を阻害し、セリバンツマブは感受性を回復させる。
ＭＣＦ７細胞をまず、１）パルボシクリブまたはアベマシクリブまたはリボシクリブ、２）ＨＲＧ、３）フルベストラントおよび４）セリバンツマブの多様な組み合わせで処理し、増殖をＣＴＧアッセイによって測定した。ＭＣＦ７細胞をＣＤＫ４／６阻害剤に加えてフルベストラント（５０ｎＭ）の組み合わせで処理すると、増殖阻害の度合いは、ＣＤＫ４／６阻害剤単独の活性よりも高かった（図６Ａ〜６Ｃ）。さらに、各ＣＤＫ４／６阻害剤−フルベストラントの組み合わせに関して、この組み合わせの活性はＨＲＧの添加によって遮断され、セリバンツマブ添加はＣＤＫ４／６阻害剤−フルベストラントの組み合わせに対する感受性を回復させた（図６Ａ〜６Ｃ）。同じ実験設計を用いて、タモキシフェンをフルベストラントの代わりに用いたマッチした組み合わせを試験すると、類似の結果が得られた（図７Ａ〜７Ｃ）。
【０１０３】
実施例７：転移性乳癌に関して以前に治療されていない患者におけるパルボシクリブ、ホルモン療法、およびセリバンツマブでのＥＲ＋、ＨＥＲ２−転移性乳癌の治療。
ＥＲ＋、ＨＥＲ２−転移性乳癌を有する患者を、２１日連続で１日１回経口摂取される１つのパルボシクリブ１２５ｍｇカプセル、その後続く２８日の完全サイクルを構成する７日間の治療停止で治療する。患者を同時に、２８日サイクル全体で連続して１日１回投与されるレトロゾール２．５ｍｇ、または第１日、第１５日、第２９日、およびその後に月１回、５００ｍｇの用量で投与されるフルベストラントで治療する。患者をまた同時に、ＩＶ注入による２週間ごとの３ｇ用量でのセリバンツマブで治療する。こうした治療は、有益な結果、例えば、安定疾患、部分応答、または完全応答をもたらす。
【０１０４】
実施例８：以前にパルボシクリブおよびホルモン療法で治療されており、その癌がこの治療に対して進行している患者におけるパルボシクリブ、ホルモン療法、およびセリバンツマブでのＥＲ＋、ＨＥＲ２−転移性乳癌の治療。
パルボシクリブおよびレトロゾールまたはフルベストラントのいずれかで以前に治療されており、この治療に対して耐性となっているＥＲ＋、ＨＥＲ２−転移性乳癌を有する患者を、２１日連続で１日１回経口摂取される１つのパルボシクリブ１２５ｍｇカプセル、その後続く２８日の完全サイクルを構成する７日間の治療停止で治療する。患者を同時に、レトロゾール（患者が以前にフルベストラントで治療されている場合）またはフルベストラント（患者が以前にレトロゾールで治療されている場合）のいずれかで治療する。レトロゾールを、２８日サイクル全体で連続して１日１回２．５ｍｇの用量で投与し、またはフルベストラントを、第１日、第１５日、第２９日、およびその後に月１回、５００ｍｇの用量で投与する。患者をまた同時に、ＩＶ注入による２週間ごとの３ｇ用量でのセリバンツマブで治療する。こうした治療は、有益な結果、例えば安定疾患、部分応答、または完全応答をもたらす。
【０１０５】
実施例９：ヘレグリン（ＨＲＧ）によるＣＤＫ２活性化はＨＲ＋ＨＥＲ２−乳癌細胞においてフルベストラントまたはＣＤＫ４／６阻害剤活性を軽減し、セリバンツマブは活性を回復させる。
以下の実験は、ＨＥＲ３阻害剤が、パルボシクリブ、アベマシクリブおよびリボシクリブなどの薬剤によるＣＤＫ４／６阻害の存在下でのＨＲＧによる非標準的ＣＤＫ２複合体を遮断できることを示す。
【０１０６】
ＭＣＦ７細胞を、単独でまたは組み合わせてのいずれかで１０ｎＭ  ＨＲＧ、１００ｎＭフルベストラント、１００ｎＭパルボシクリブ、１００ｎＭアベマシクリブまたは１μＭのセリバンツマブで、図８〜１０に示すように２０〜２４時間処理した。細胞溶解物を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加したＭＰＥＲ溶解緩衝液中での氷上で３０分間の溶解によって調製した。細胞破片を、１０，０００ｒｐｍでの遠心分離によって除去した。タンパク質を、標準プロトコルにしたがうウェスタンブロッティングによって分析した。タンパク質装填を、β−アクチン抗体（β−アクチン（１３Ｅ５）ウサギｍＡｂ＃４９７０  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でのブロッティングにより概算し、ＣＤＫ２活性化を、ｐＣＤＫ２抗体（ホスホ−ＣＤＫ２（Ｔｈｒ１６０）抗体＃２５６１、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でＣＤＫ２のスレオニン−１６０でのリン酸化を検出することにより測定した。
【０１０７】
図８は、ＨＲＧがＨＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌細胞においてＣＤＫ２を活性化でき、セリバンツマブがＣＤＫ２活性化に対するＨＲＧの活性化効果を遮断できることを示す。さらに、抗ホルモン、フルベストラントおよびＣＤＫ４／６阻害剤、パルボシクリブまたはアベマシクリブの両方がＣＤＫ２の活性化を阻害し、ＨＲＧはこの阻害活性を遮断した（図９および１０）。さらに、セリバンツマブは、フルベストラント（図９）またはＣＤＫ４／６阻害剤、パルボシクリブまたはアベマシクリブ（図１０）の存在下でＣＤＫ２のＨＲＧ仲介性活性化を遮断した。
【０１０８】
これらの知見は、ＨＲＧが内分泌療法（例えばフルベストラント）およびＣＤＫ４／６阻害剤（例えばパルボシクリブまたはアベマシクリブ）の活性を阻害する機構の１つが、細胞周期遷移を促進するＣＤＫ２の非標準的活性化でありうることを示唆する。これらの結果は、セリバンツマブがＣＤＫ２のこの活性化を遮断し、したがってフルベストラントおよびＣＤＫ４／６阻害剤などの、標準ケア療法の活性を回復させることを示唆する。
【０１０９】
実施例１０：ＨＲＧは、ＥＲ陽性、ＨＥＲ２陰性乳癌細胞においてフルベストラント、パルボシクリブおよびその組み合わせの活性を阻害する非常に強力なリガンドである。
多数の受容体チロシンキナーゼリガンド（ＲＴＫＬ）またはエストロゲン（Ｅ２）でのＥＲ＋ＨＥＲ２−細胞株の処理は、ヘレグリン（ＨＲＧ）がフルベストラント、パルボシクリブ、またはフルベストラントおよびパルボシクリブの組み合わせの活性を阻害するのに最も有効なＲＴＫＬであることを例示する。
【０１１０】
この実験の目的は、抗エストロゲン療法（例えばフルベストラント）およびＣＤＫ４−６阻害剤（例えばパルボシクリブ）またはその組み合わせの活性に対するＨＲＧの観察された効果が、ＨＲＧに特異的であるかどうか、あるいは多様な癌で見られる他の増殖促進性ＲＴＫリガンドによって仲介され得るより広い効果があるかどうかを決定することであった。この仮説を試験するため、ＥＲ＋  ＨＥＲ２−細胞株、ＭＣＦ７（図１１）およびＴ４７Ｄ（図１２）を、以下のリガンド（濃度１ｎＭ）の存在下にて単剤としてのフルベストラント（５０ｎＭ）、パルボシクリブ（４０ｎＭ）またはパルボシクリブに加えてフルベストラントの組み合わせ（４０ｎＭ＋５０ｎＭ）で６日間処理し、その時点で細胞増殖を、ＣＴＧアッセイを用いて測定した。
【０１１１】
ＥＧＦファミリーリガンド：
上皮増殖因子（ＥＧＦ）
ヘレグリン（ＨＲＧ）
アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）
ベータセルリン（ＢＴＣ）
エピレグリン（ＥＰＲ）
ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）
トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦα）
他のリガンド：
エストラジオール（Ｅ２）
インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）
ＦＧＦ塩基性（ＦＧＦ２）
【０１１２】
データは、ＨＲＧがフルベストラント活性、パルボシクリブ活性、ならびにパルボシクリブおよびフルベストラントの組み合わせを阻害することにおいて試験したすべてのリガンドのうち最も有効なリガンドであることを示す。これらは、ＥＧＦファミリーリガンド、ならびにＥ２、ＩＧＦ１およびＦＧＦ２などの他のリガンドの両方を含む。
【０１１３】
実施例１１：ＨＲＧはＥＲ＋ＨＥＲ２−細胞のＳ期細胞周期進行を促進する。ＨＲＧはＥＲ＋陽性ＨＥＲ２−陰性乳癌細胞においてＤＮＡ合成に対するフルベストラントと組み合わせたパルボシクリブの活性を阻害する。セリバンツマブはこの組み合わせの阻害活性を回復させる。
この実験の目的は、細胞周期進行レベルでのパルボシクリブおよびフルベストラントの活性に対するＨＲＧの効果を決定することであった。さらに、この実験は、セリバンツマブがＨＲＧの効果を遮断することによって個々の構成要素の細胞周期阻害活性または臨床的に認可された薬剤の組み合わせの相加的活性を回復させるかどうかを決定するために設計された。
【０１１４】
ＭＣＦ７細胞を、パルボシクリブ、フルベストラント、ＨＲＧおよびセリバンツマブの組み合わせで２４時間処理し、１０μＭ  ＥｄＵで２時間パルス標識し、固定し、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）ＥｄＵ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８およびＦｘＣｙｃｌｅＴＭバイオレット染色で二重染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図１３は、細胞周期分布の代表的なＦＡＣＳプロットである。ゲートセッティングおよびＧ０／Ｇ１、ＳおよびＧ２／Ｍ期にある細胞の割合を示す。ＤＮＡ合成（Ｓ期）を、ＥｄＵ取り込みおよびＤＮＡ含量の両方に関して陽性である細胞を定量化することによって決定した。
【０１１５】
データは、ＨＲＧがＥＲ＋  ＨＥＲ２−乳癌細胞のＳ期細胞周期進行を促進できることを示し（図１３Ａ）ここで休止細胞のＳ期にある細胞の割合は１５．８％でありＨＲＧで処理した試料中のＳ期細胞の比率は５５％であり、ＨＲＧがＤＮＡ合成および有糸分裂に向けた細胞周期進行を仲介できることを示す。さらに、ＨＲＧの非存在下での単剤としてのフルベストラント（図１３Ｂ）またはパルボシクリブ（図１３Ｃ）いずれかでのＭＣＦ７細胞の処理は、これらの薬剤の両方がＳ期細胞周期進行を阻害するのに有効であることを示し、この知見は、これらの薬剤に関して提唱される作用機構および公表された文献と一致する。しかし、図１３Ａ〜１３Ｃに示されるように、これらの薬剤の細胞周期阻害活性はＨＲＧの存在によって著しく阻害され、セリバンツマブはこの活性を回復させる。
【０１１６】
最後に、パルボシクリブおよびフルベストラントの両方はＥＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌患者において組み合わせて一般的に用いられるため、組み合わせの活性に対するＨＲＧの効果、およびセリバンツマブがこの活性を回復できるかどうかを試験した。本発明者らの以前の知見と一致して、ＨＲＧはパルボシクリブ−フルベストラントの組み合わせの細胞周期阻害活性を遮断し、セリバンツマブはこの活性を回復させた（図１３Ｄ）。これらの知見は、ＨＲＧがＥＲ＋ＨＥＲ２−進行性乳癌に対する臨床的に適切で認可された薬剤の組み合わせの活性を遮断でき、セリバンツマブがこの活性を回復させるという本発明者らの他の知見と一致する。
【０１１７】
実施例１２：セリバンツマブはＥＲ＋、ＨＥＲ２−乳癌のヒト同所性異種移植片モデルにおいてフルベストラントまたはフルベストラントおよびパルボシクリブの組み合わせの活性を増進する。
この実験の目的は、フルベストラントまたはパルボシクリブまたはその組み合わせへのセリバンツマブの添加が、ＥＲ＋ＨＥＲ２−乳癌の同所性異種移植モデルにおいて有効性を増加させるかどうかを決定することであった。
【０１１８】
８〜１０週齢の雌ＳＨＯマウス（Ｃｈａｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、１７−ベータ−エストラジオールペレット（０．７２ｍｇ／ペレット）を移植し、２日後、１００μｌの５０％ＤＰＢＳ／５０％マトリジェル中に懸濁した５ｘ１０６ＭＣＦ７細胞を腹部乳房脂肪体内に注入した。腫瘍増殖を週２回監視し、腫瘍体積を公式にしたがって外部ノギス測定後に計算した（腫瘍サイズ＝π／６ｘ［長さｘ幅２］）。平均測定腫瘍体積がおよそ２００ｍｍ３に到達したら、マウスをランダムに群に分け、治療を投与した。全体で、群あたりの平均出発腫瘍体積は、すべての群に渡って同等であった。フルベストラントを、皮下送達によって週あたり１回マウスあたり５００μｇにて投与した。パルボシクリブを、月曜日〜金曜日の５日間、経口で毎日、２５ｍｇ／ｋｇにて投与した。セリバンツマブを、腹腔内注射によって週２回、マウスあたり６００μｇで投与した。
【０１１９】
図１４Ａ〜１４Ｂは、どちらかの剤を単独で用いた場合、セリバンツマブの添加が、フルベストラント（図１４Ａ）およびパルボシクリブ（図１４Ｂ）の抗腫瘍有効性を増加させたことを示す。さらに、図１４Ｃは、セリバンツマブがパルボシクリブおよびフルベストラントの組み合わせの増殖阻害を増加させることを示す。
【０１２０】
このデータは、ＨＲＧが、タモキシフェンまたはフルベストラント、ＣＤＫ４−６阻害剤（例えば、パルボシクリブ、リボシクリブまたはアベマシクリブ）、およびその組み合わせなどの抗内分泌療法の活性を遮断できるというより広いｉｎ  ｖｉｔｒоの知見と一致する。
【０１２１】
実施例１３：ＨＲＧはＲＢのリン酸化を増進して細胞周期遷移を促進し、ＲＢリン酸化に対するフルベストラント、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブまたはアベマシクリブ）の活性を阻害する。セリバンツマブはヒトＥＲ＋  ＨＥＲ２−乳癌細胞においてＨＲＧの遮断により活性を回復できる。
この実験の目的は、ＣＤＫ４／６活性を通じて細胞周期進行の仲介に関与する重要な細胞周期タンパク質ＲＢに対するＨＲＧの効果を調べることであった。ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ、リボシクリブおよびアベマシクリブ）は、サイクリンＤ−ＣＤＫ４／６複合体およびＲｂタンパク質に依存する作用機構を有する。ＣＤＫ４／６阻害剤はＲｂタンパク質の脱リン酸化を引き起こし、これはＥ２Ｆ遺伝子の転写を抑制し、したがって細胞周期阻害を抑制する。
【０１２２】
ＭＣＦ７細胞を上述のように培養した。図１５に示すように、細胞を、単独でまたは組み合わせてのいずれかで１０ｎＭ  ＨＲＧ、５０ｎＭフルベストラント、４０ｎＭパルボシクリブ、４０ｎＭアベマシクリブまたは１μＭのセリバンツマブで２０〜２４時間処理した。細胞溶解物を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加したＭＰＥＲ溶解緩衝液中での氷上で３０分間の溶解によって調製した。細胞破片を、１０，０００ｒｐｍでの遠心分離によって除去した。タンパク質を、標準プロトコルにしたがうウェスタンブロッティングによって分析した。タンパク質装填を、β−アクチン抗体（β−アクチン（１３Ｅ５）ウサギｍＡｂ＃４９７０  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ）でのブロッティングにより概算し、ＲＢ活性化を、ｐＲｂ（Ｓ８０７／８１１）：カタログ番号８５１６  ｐＲｂ（Ｓ７８０）：カタログ番号８１８０でのＲＢのリン酸化（ｐＲＢ）の検出により測定した。対照抗体は、以下の通りである。総ＡＫＴ：カタログ番号９２７２  ｐＡＫＴ：カタログ番号４０６０。
【０１２３】
図１５は、ＨＲＧがＲＢのリン酸化および活性化を促進し、これは単独かまたは組み合わせたかいずれかのフルベストラントならびにＣＤＫ４／６阻害剤、パルボシクリブおよびアベマシクリブの活性に対抗したことを示す。さらに、セリバンツマブは、単独かまたは組み合わせのいずれかでのフルベストラントならびにＣＤＫ４／６阻害剤、パルボシクリブおよびアベマシクリブの活性を回復させた。
【０１２４】
実施例１４：セリバンツマブおよびレトロゾールの同時治療はＭＣＦ−７Ｃａ異種移植片において耐性の開始を遅延させレトロゾールに対する感受性を回復させる。
閉経後ＥＲ＋乳癌のモデルを用いて、腫瘍増殖に対するＨＲＧ仲介性ＥＲＢ３シグナル伝達および／またはエストロゲン仲介性ＥＲ活性化を遮断する効果を決定した（図１６）。ＭＣＦ−７Ｃａ異種移植片腫瘍を雌の卵巣切除ヌードマウスにおいて生成し、これにランダムにビヒクル（「対照」：０．９％ＮａＣｌ中の０．３％ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、週２回（Ｑ２Ｗ）、腹腔内注射（ＩＰ）；１５マウス／群）、セリバンツマブ（７５０μｇ／マウス、Ｑ２Ｗ、ＩＰ；１５マウス／群）、レトロゾール（１０μｇ／マウス／日ｘ５日間／週（ＱＤｘ５）、皮下注射（ＳＱ）；６０マウス／群）、または単剤療法に関して示したものと同様に投与される、セリバンツマブと組み合わせたレトロゾール（１５マウス／群）を投与した。平均腫瘍体積（±ＳＥＭ）における変化を、ノギス測定によって毎週決定した。レトロゾールに対する耐性の発達後に（第１４週）、レトロゾールのみの群のマウスを１５マウス／群に再度ランダム化して：レトロゾール単独；セリバンツマブ単独；またはレトロゾールおよびセリバンツマブの組み合わせを投与した。
【０１２５】
ＭＣＦ−７Ｃａ由来異種移植片腫瘍は最初、レトロゾールに応答したが、治療のおよそ７〜８週後に耐性を発達させ始めた（図１６）。しかし、マウスをレトロゾールおよびセリバンツマブで同時治療すると、腫瘍増殖は阻害され、レトロゾールに対する耐性は実質的に遅延された。これは、ＨＲＧ／ＥＲＢＢ３シグナル伝達が、研究開始時に活性であったか、またはレトロゾール治療に応答して比較的迅速に発達したかのいずれかであったことを示唆する。レトロゾールに対する耐性が明らかに確立されたら（第１４週）、レトロゾール治療群のマウスを２つのコホートの１つに再度ランダムに割り当てた：（ｉ）レトロゾール単剤療法を続ける、または（ｉｉ）レトロゾールと組み合わせたセリバンツマブ。特に、レトロゾール耐性腫瘍は、レトロゾール単独での治療に比較してレトロゾールおよびセリバンツマブで同時治療された場合、腫瘍増殖の顕著な減少を示した。これは、エストロゲン／ＥＲおよびＨＲＧ／ＥｒｂＢ３３駆動シグナル伝達の両方の遮断が、どちらかの経路のみの遮断よりもより大きな抗腫瘍活性を提供するという仮説と一致する。
【０１２６】
実施例１５：ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−ＩＳＨ）によって測定される場合その腫瘍がＨＲＧを発現する、ＥＲ／ＰＲ陽性、ＨＥＲ２陰性、局所進行性または転移性乳癌を有する患者に、以下の２つの治療措置の１つを与える。
治療Ａ
・セリバンツマブ：各２８日のサイクルの第１日および第１５日に３０００ｍｇ  ＩＶの固定用量
・フルベストラント：サイクル１の第１日および第１５日、ならびに続く各２８日サイクルの第１日に５００ｍｇ筋内（ＩＭ）
治療Ｂ
・セリバンツマブ：各２８日のサイクルの第１日および第１５日に３０００ｍｇ  ＩＶの固定用量
・レトロゾール：１日１回２．５ｍｇ  ＰＯ
【０１２７】
こうした治療措置は、有益な結果、例えば、安定疾患、部分応答、または完全応答を生じる。
【０１２８】
いくつかの例において、患者は、以下の包含基準のいくつかまたはいずれかを満たす。
ａ）組織学的または細胞診断的に確認されたＥＲ＋および／またはＰＲ＋（＞１％の細胞の染色を伴う）乳癌
ｂ）外科的／天然閉経またはゴセレリンなどのゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニストでの卵巣抑制（サイクル１の第１日より少なくとも２８日前に開始される）による、確証された閉経後状態
ｃ）ＡＳＣＯ／ＣＡＰ指針にしたがうＨＥＲ２陰性
ｄ）非染色腫瘍組織の集中化試験によって決定されるような、≧１＋のスコアを有するヘレグリンに関する陽性ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）試験
ｅ）コア針生検または細針吸引のいずれかに適する少なくとも１つの病変を持たなければならない
ｆ）局所進行性または転移性疾患セッティングにおいて少なくとも１回であるが３回より多くない以前の全身療法後に進行している
・局所進行性または転移性疾患に関して以前にＣＤＫ阻害剤に基づく療法を受けている
・局所進行性または転移性疾患に関して以前に１より多くない一連の化学療法を受けている
ｇ）ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１．１によって定義されるような局所進行性または転移性疾患の立証された進行。例外：骨のみの転移性疾患を有する患者は、ＣＴまたはＭＲＩ上で確認できる少なくとも２つの溶解性病変を有しかつ新規病変の出現に基づき以前の療法に対し疾患進行が示されている場合、登録可能である。
・病変に対して放射線照射を受けたことのある骨のみの病変を有する患者は、放射線療法後の立証された進行がなければならない
ｈ）インフォームドコンセントを理解し、サインできる（またはそれができる法的代理人を有する）
ｉ）０または１のＥＣＯＧパフォーマンススコア（ＰＳ）
ｊ）以下によって立証されるように、適切な骨髄が保持されている：
・ＡＮＣ＞１５００μｌ
・血小板数＞１００，０００／μｌ；および
・ヘモグロブリン＞９ｇ／ｄＬ
ｋ）以下のように立証されるような適切な肝臓機能：
・ジルベール病を有する患者を除き、血清総ビリルビン≦１．５ｘＵＬＮ
・アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアルカリホスファターゼ≦２．５ｘＵＬＮ（肝臓転移が存在する場合≦５ｘＵＬＮが許容可能であり、骨転移が存在する場合≦５ｘＵＬＮのアルカリホスファターゼが許容可能である）
ｌ）血清クレアチニン≦１．５ｘＵＬＮによって立証されるような、適切な腎機能
ｍ）任意の以前の手術、放射線療法、または他の抗新生物療法の臨床的に有意な影響から回復している
ｎ）患者を、米国臨床腫瘍学協会（ＡＳＣＯ）指針にしたがって骨修飾剤、例えばビスホスホネートまたは核因子カッパ−Ｂの受容体活性化剤（ＲＡＮＫ）リガンド剤（例えばデノスマブ）で治療してよく；可能な場合は常に、骨修飾剤を必要とする患者は研究療法の＞７日間前に治療を開始すべきであり、かつ臨床的に変更を強制されない限り研究全体で同じ剤を続けるべきである
о）年齢≧１８歳
ｐ）メインコンセントにサインした６０日以内に静脈血栓塞栓症事象を経験した患者は、この研究の治療を開始する前に少なくとも７日間、抗凝固剤で治療されているべきである。
【０１２９】
いくつかの例において、患者は、以下の排除基準のいずれも満たさない：
ａ）抗ＥｒｂＢ３抗体での以前の治療
ｂ）局所進行性または転移性セッティングにおけるフルベストラントでの以前の治療
ｃ）未管理のＣＮＳ疾患または軟髄膜疾患の存在
ｄ）過去２年間での全身療法を必要とする別の活性悪性疾患の病歴。上皮内癌または基底細胞もしくは扁平細胞皮膚癌の以前の病歴を有する患者は登録可能である。
ｅ）研究者の意見では試験における患者の参加を損なうか研究転帰に影響を及ぼしうる、スクリーニング受診中または投薬の最初にスケジューリングされた日での活性感染、または説明不能な＞３８．５℃の発熱。研究者の裁量で、腫瘍熱を有する患者は登録可能である
ｆ）セリバンツマブ、フルベストラントの構成要素のいずれかに対する既知の過敏性、または完全ヒトモノクローナル抗体に対する過敏性反応を有するもの
ｇ）以下を含む、他の最近の抗腫瘍療法を受けたもの：
・この研究で最初のスケジューリングされた投薬日前の、２８日以内または５半減期以内のいずれか短い方で投与された研究療法
・この研究で最初のスケジューリングされた投薬日前の１４日以内の放射線照射または他の標準全身療法、さらに（必要な場合）、こうした放射線照射からの任意の実際のまたは予期される毒性の解消のための時間枠を含む
ｈ）ＮＹＨＡクラスＩＩＩまたはＩＶうっ血性心不全
ｉ）心疾患の重大な病歴（すなわち未管理の血圧、不安定狭心症、１年以内の心筋梗塞、または投薬を必要とする心室性不整脈）を有する患者もまた排除される
ｊ）ＩＶ抗生物質、抗ウイルス薬、または抗真菌薬を要する未管理の感染；あるいは活性ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、活性Ｂ型肝炎感染または活性Ｃ型肝炎感染
ｋ）研究者によって、患者がインフォームドコンセントにサインする能力に干渉するか、患者が研究に協力し参加する能力に干渉するか、または結果の解釈に干渉する可能性が高いと見なされる、任意の他の医学的状態
【０１３０】
配列要約
【表１】
2019508428.tif 000010
2019508428.tif 000011
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2019508428.tif 000020
【図６】
2019508428.tif 000021
【図７】
2019508428.tif 000022
【図８】
2019508428.tif 000023
【図９】
2019508428.tif 000024
【図１０】
2019508428.tif 000025
【図１１】
2019508428.tif 000026
【図１２】
2019508428.tif 000027
【図１３】
2019508428.tif 000028
【図１４】
2019508428.tif 000029
【図１５】
2019508428.tif 000030
【図１６】
2019508428.tif 000031
【配列表】
2019508428000001.app
【国際調査報告】
2019508428.tif 000032
2019508428.tif 000033
2019508428.tif 000034
2019508428.tif 000035
2019508428.tif 000036