(57)【要約】様々な実施形態では、単一分子の分子センサーのためのシグナル増強プロセスを、新しい修飾ｄＮＴＰと共に開示する。概して、増強プロセスは、ポリメラーゼを含む分子電子センサーを提供することと、ポリメラーゼに、適切な緩衝液中のヌクレオチド鋳型および修飾ｄＮＴＰを提供することとを含み、ポリメラーゼ酵素の作用中の修飾ｄＮＴＰの組み込みは、対応するネイティブｄＮＴＰでの性能と比較して、組み込み事象についての電気シグナルの増強またはシグナル対ノイズ比の改善を提供する。
2019524764.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物［１６］、
【化３０】
2019524764.tif 000032
により表される構造を含む修飾ヌクレオチドであって、
式中、
Ｎｕｃは、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧから選択されるＤＮＡ塩基であり；
Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＢまたはＩから選択され；
ｎは、２〜５の整数であり；
Ｒ１は、
【化３１】
2019524764.tif 000033
【化３２】
2019524764.tif 000034
【化３３】
2019524764.tif 000035
【化３４】
2019524764.tif 000036
【化３５】
2019524764.tif 000037
から選択され、
前記修飾ヌクレオチドが、ＤＮＡ配列決定中のＤＮＡ鋳型の複製においてＤＮＡポリメラーゼにより組み込まれる、修飾ヌクレオチド。
【請求項２】
Ｙが、Ｏであり；Ｎｕｃが、シトシンであり；ｎが、３であり；Ｒ１が、
【化３６】
2019524764.tif 000038
である、請求項１に記載の修飾ヌクレオチド。
【請求項３】
Ｙが、Ｏであり；Ｎｕｃが、シトシンであり；ｎが、３であり；Ｒ１が、
【化３７】
2019524764.tif 000039
である、請求項１に記載の修飾ヌクレオチド。
【請求項４】
Ｙが、Ｏであり；Ｎｕｃが、シトシンであり；ｎが、３であり；Ｒ１が、
【化３８】
2019524764.tif 000040
である、請求項１に記載の修飾ヌクレオチド。
【請求項５】
Ｙが、Ｏであり；Ｎｕｃが、シトシンであり；ｎが、３であり；Ｒ１が、
【化３９】
2019524764.tif 000041
である、請求項１に記載の修飾ヌクレオチド。
【請求項６】
Ｙが、Ｏであり；Ｎｕｃが、シトシンであり；ｎが、３であり；Ｒ１が、
【化４０】
2019524764.tif 000042
である、請求項１に記載の修飾ヌクレオチド。
【請求項７】
Ｙが、Ｏであり；Ｎｕｃが、シトシンであり；ｎが、５であり；Ｒ１が、
【化４１】
2019524764.tif 000043
である、請求項１に記載の修飾ヌクレオチド。
【請求項８】
Ｙが、Ｏであり；Ｎｕｃが、シトシンであり；ｎが、５であり；Ｒ１が、
【化４２】
2019524764.tif 000044
である、請求項１に記載の修飾ヌクレオチド。
【請求項９】
Ｙが、Ｏであり；Ｎｕｃが、シトシンであり；ｎが、５であり；Ｒ１が、
【化４３】
2019524764.tif 000045
である、請求項１に記載の修飾ヌクレオチド。
【請求項１０】
Ｙが、Ｏであり；Ｎｕｃが、シトシンであり；ｎが、５であり；Ｒ１が、
【化４４】
2019524764.tif 000046
である、請求項１に記載の修飾ヌクレオチド。
【請求項１１】
Ｙが、Ｏであり；Ｎｕｃが、シトシンであり；ｎが、５であり；Ｒ１が、
【化４５】
2019524764.tif 000047
である、請求項１に記載の修飾ヌクレオチド。
【請求項１２】
Ｙが、Ｏであり；Ｎｕｃが、シトシンであり；ｎが、５であり；Ｒ１が、
【化４６】
2019524764.tif 000048
である、請求項１に記載の修飾ヌクレオチド。
【請求項１３】
Ｙが、Ｏであり；Ｎｕｃが、アデノシンであり；ｎが、３であり；Ｒ１が、
【化４７】
2019524764.tif 000049
である、請求項１に記載の修飾ヌクレオチド。
【請求項１４】
Ｙが、Ｏであり；Ｎｕｃが、シトシンであり；ｎが、３であり；Ｒ１が、
【化４８】
2019524764.tif 000050
である、請求項１に記載の修飾ヌクレオチド。
【請求項１５】
Ｙが、Ｏであり；Ｎｕｃが、アデノシンであり；ｎが、３であり；Ｒ１が、
【化４９】
2019524764.tif 000051
である、請求項１に記載の修飾ヌクレオチド。
【請求項１６】
Ｙが、Ｏであり；Ｎｕｃが、アデノシンであり；ｎが、３であり；Ｒ１が、
【化５０】
2019524764.tif 000052
である、請求項１に記載の修飾ヌクレオチド。
【請求項１７】
化合物［１８］、
【化５１】
2019524764.tif 000053
により表される構造を含む修飾ヌクレオチドであって、
式中、
Ｎｕｃは、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧから選択されるＤＮＡ塩基であり；
Ｙは、ＯＨ、ＳＨまたはＢＨ３から選択され；
ｎは、２〜５の整数であり；
Ｒ３は、Ｈまたはハロゲンから選択され；
Ｒ１は、Ｈ、任意選択でハロゲン、ＭｅもしくはＯＭｅもしくは−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＭｅ（式中、ｘは１〜２０の整数である）で置換されている直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキルもしくはアリールから選択され；
Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｑ−（式中、ｑは１〜１０の整数である）、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙ−（式中、ｙは１〜約８の整数である）、−（ＣＨ２）ｑ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−（式中、ｑは１〜約１０の整数であり、ｙは１〜約８の整数である）、−ＣＯ（ＣＨ２）ｒ−（式中、ｒは１〜約１０の整数である）、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｚ−（式中、ｚは１〜６の整数である）、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｍは１〜６の整数である）、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｐは１〜６の整数である）、１，４−ベンゼンジイル、１，３−ベンゼンジイルもしくは１，２−ベンゼンジイル（炭素原子は任意選択で、かつ独立して、ハロゲン、Ｍｅ、Ｅｔ、ＯＨ、ＯＭｅもしくはＣＦ３で置換されている）または
【化５２】
2019524764.tif 000054
から選択され；
Ｒ４およびＲ５は独立して、Ｈ、フェニル、
【化５３】
2019524764.tif 000055
【化５４】
2019524764.tif 000056
から選択される、修飾ヌクレオチド。
【請求項１８】
Ｎｕｃが、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣであり；Ｙが、ＯＨであり；ｎ＝３または５であり；Ｒ１が、Ｈであり；Ｒ３が、Ｈであり；Ｌ２が、−（ＣＨ２）４−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）８−ＣＨ２−であり；Ｒ４が、フェニル、
【化５５】
2019524764.tif 000057
である、請求項１７に記載の修飾ヌクレオチド。
【請求項１９】
バイオセンサーから発生した電気シグナルを増強させる方法であって、
（ａ）ソース電極およびドレイン電極ならびに前記電極を架橋する架橋分子に結合したポリメラーゼを含むバイオセンサーを提供して、電気回路を完成させるステップと、
（ｂ）配列決定されるヌクレオチド鋳型を前記ポリメラーゼと連通させるステップと、
（ｃ）修飾ｄＮＴＰを前記ポリメラーゼと連通させるステップと、
（ｄ）前記ポリメラーゼにより前記ヌクレオチド鋳型を転写するステップ
を含み、ここで、
前記転写するステップは、前記ポリメラーゼにより前記修飾ｄＮＴＰを組み込むことを含み、
前記修飾ｄＮＴＰを組み込むことが、対応する非修飾ｄＮＴＰを組み込むことと比較して増強された電気シグナルをもたらす、
方法。
【請求項２０】
前記修飾ｄＮＴＰが、請求項１から１８に記載の修飾ヌクレオチドのいずれか１つを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記増強された電気シグナルが、前記ヌクレオチド鋳型におけるＡ、Ｇ、ＣおよびＴを識別する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記増強された電気シグナルが、修飾ｄＡＴＰ、修飾ｄＧＴＰ、修飾ｄＴＴＰおよび修飾ｄＣＴＰの各々の組み込みについて独特である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ヌクレオチド鋳型を転写する方法であって、
（ａ）前記ヌクレオチド鋳型を転写することができるポリメラーゼを提供するステップと、
（ｂ）前記ヌクレオチド鋳型を前記ポリメラーゼと連通させるステップと、
（ｃ）修飾ｄＮＴＰを前記ポリメラーゼと連通させるステップと、
（ｄ）前記修飾ｄＮＴＰを組み込むことにより前記ヌクレオチド鋳型を前記ポリメラーゼで転写するステップと
を含み、前記修飾ｄＮＴＰが、請求項１から１８に記載の修飾ヌクレオチドのいずれか１つを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｎｓｏｒｓ」との表題の２０１６年８月１日に出願された米国仮特許出願第６２／３６９，６９６号、および「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｓｅｎｓｏｒｓ」との表題の２０１７年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／４５２，４６６号（これらの開示は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
本開示は概して、分子電子バイオセンサーの分野に、特に分子電子センサーにより生成されたシグナルを増強させるための修飾デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の設計および使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
分子電子工学は概して、電子回路の構成要素としての単一分子または分子アセンブリの使用を指す。特に、かかる回路は、単一分子が、試験溶液と相互作用して試験溶液の組成に関連する電気シグナルを生成する変換器を構成する、センシング回路を含み得る。センサー複合体が、試験溶液中のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子の特性をセンシングする能力を提供するためのポリメラーゼ酵素を含む適用が重要である。このタイプのバイオセンサーでは、ポリメラーゼは、相補鎖の重合のための鋳型としてのＤＮＡまたはＲＮＡ分子と相互作用し、相補鎖は、ポリメラーゼが試験溶液中に提供されるｄＮＴＰを組み込むことにより生成され、その際、分子回路のパラメーターをモジュレートして電気シグナルを生成する。このクラスのポリメラーゼベースのバイオセンサーについて、性能の１つの重要な因子は、溶液のｄＮＴＰ含有量である。
【０００４】
分子センサーにおける進歩およびポリメラーゼ酵素を含む分子センサーの精巧化のレベルにもかかわらず、ヌクレオチド組み込み事象に関連する全体的なシグナルおよび／またはシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）は、ｄＮＴＰ間を識別するのに、または特定の分子事象を検出するのに十分ではない場合がある。それゆえに、ポリメラーゼ酵素を含む分子センサーにおける全体的なシグナルおよび／またはシグナル対ノイズ比を改善し得るｄＮＴＰの可能な修飾を含む、これらのセンサーへのさらなる改善は、持続的に保証される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示の様々な実施形態では、修飾ｄＮＴＰ、修飾ｄＮＴＰの合成および分子センサーにおける修飾ｄＮＴＰの使用を開示する。本開示に従う修飾ｄＮＴＰは、ポリメラーゼ酵素を含む分子センサーにおけるヌクレオチド組み込み事象に関連する、全体的なシグナルを増強させること、特徴的なシグナル形状を提供することおよび／またはシグナル対ノイズ比を改善することを含む、分子センサーにおけるシグナリング性能を改善することが示される。
【０００６】
様々な実施形態では、修飾ヌクレオチド（修飾ｄＮＴＰ）を開示する。修飾ヌクレオチドは、化合物［１６］、
【化１】
2019524764.tif 000003
により表される構造を含み、式中、Ｎｕｃは、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり；Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＢまたはＩから選択され；ｎは、２〜５の整数であり；Ｒ１は、
【化２】
2019524764.tif 000004
【化３】
2019524764.tif 000005
【化４】
2019524764.tif 000006
【化５】
2019524764.tif 000007
【化６】
2019524764.tif 000008
【化７】
2019524764.tif 000009
（式中、ｎ＝１〜１００である）
から選択され、修飾ヌクレオチドは、ＤＮＡ配列決定中のＤＮＡ鋳型の複製においてＤＮＡポリメラーゼにより組み込まれる。様々な実施形態では、修飾ｄＮＴＰは、天然三リン酸部分の代わりに、四リン酸または六リン酸部分を含み得る。
【０００７】
様々な態様では、修飾ヌクレオチドは、Ｙが、Ｏであり、Ｎｕｃが、シトシンであり、ｎが、３であり、Ｒ１が、置換基：
【化８】
2019524764.tif 000010
である、化合物［１６］である。
【０００８】
他の態様では、修飾ヌクレオチドは、Ｙが、Ｏであり、Ｎｕｃが、シトシンであり、ｎが、３であり、Ｒ１が、置換基：
【化９】
2019524764.tif 000011
である、化合物［１６］である。
【０００９】
ある特定の態様では、修飾ヌクレオチドは、Ｙが、Ｏであり、Ｎｕｃが、シトシンであり、ｎが、３であり、Ｒ１が、置換基：
【化１０】
2019524764.tif 000012
である、化合物［１６］である。
【００１０】
他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、Ｙが、Ｏであり、Ｎｕｃが、シトシンであり、ｎが、３であり、Ｒ１が、置換基：
【化１１】
2019524764.tif 000013
である、化合物［１６］である。
【００１１】
様々な例では、修飾ヌクレオチドは、Ｙが、Ｏであり、Ｎｕｃが、シトシンであり、ｎが、３であり、Ｒ１が、置換基：
【化１２】
2019524764.tif 000014
である、化合物［１６］である。
【００１２】
他の態様では、修飾ヌクレオチドは、Ｙが、Ｏであり、Ｎｕｃが、シトシンであり、ｎが、５であり、Ｒ１が、置換基：
【化１３】
2019524764.tif 000015
である、化合物［１６］である。
【００１３】
様々な実施形態では、修飾ヌクレオチドは、Ｙが、Ｏであり、Ｎｕｃが、シトシンであり、ｎが、５であり、Ｒ１が、置換基：
【化１４】
2019524764.tif 000016
である、化合物［１６］である。
【００１４】
一部の例では、修飾ヌクレオチドは、Ｙが、Ｏであり、Ｎｕｃが、シトシンであり、ｎが、５であり、Ｒ１が、置換基：
【化１５】
2019524764.tif 000017
である、化合物［１６］である。
【００１５】
様々な態様では、修飾ヌクレオチドは、Ｙが、Ｏであり、Ｎｕｃが、シトシンであり、ｎが、５であり、Ｒ１が、置換基：
【化１６】
2019524764.tif 000018
である、化合物［１６］である。
【００１６】
一部の例では、修飾ヌクレオチドは、Ｙが、Ｏであり、Ｎｕｃが、シトシンであり、ｎが、５であり、Ｒ１が、置換基：
【化１７】
2019524764.tif 000019
である、化合物［１６］である。
【００１７】
様々な実施形態では、修飾ヌクレオチドは、Ｙが、Ｏであり、Ｎｕｃが、シトシンであり、ｎが、５であり、Ｒ１が、置換基：
【化１８】
2019524764.tif 000020
である、化合物［１６］である。
【００１８】
他の態様では、修飾ヌクレオチドは、Ｙが、Ｏであり、Ｎｕｃが、アデノシンであり、ｎが、３であり、Ｒ１が、置換基：
【化１９】
2019524764.tif 000021
である、化合物［１６］である。
【００１９】
ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、Ｙが、Ｏであり、Ｎｕｃが、シトシンであり、ｎが、３であり、Ｒ１が、置換基：
【化２０】
2019524764.tif 000022
である、化合物［１６］である。
【００２０】
様々な実施形態では、修飾ヌクレオチドは、Ｙが、Ｏであり、Ｎｕｃが、アデノシンであり、ｎが、３であり、Ｒ１が、置換基：
【化２１】
2019524764.tif 000023
（式中、ｎ＝１〜１００である）
である、化合物［１６］である。
【００２１】
ある特定の態様では、修飾ヌクレオチドは、Ｙが、Ｏであり、Ｎｕｃが、アデノシンであり、ｎが、３であり、Ｒ１が、置換基：
【化２２】
2019524764.tif 000024
である、化合物［１６］である。
【００２２】
本開示の様々な実施形態では、修飾ヌクレオチド（修飾ｄＮＴＰ）を記載する。修飾ヌクレオチド構造は、化合物［１８］、
【化２３】
2019524764.tif 000025
により表され、
式中、
Ｎｕｃは、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧから選択されるＤＮＡ塩基であり；
Ｙは、ＯＨ、ＳＨまたはＢＨ３から選択され；
ｎは、２〜５の整数であり；
Ｒ３は、Ｈまたはハロゲンから選択され；
Ｒ１は、Ｈ、任意選択でハロゲン、ＭｅもしくはＯＭｅもしくは−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＭｅ（式中、ｘは１〜２０の整数である）で置換されている直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキルもしくはアリールから選択され；
Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｑ−（式中、ｑは１〜１０の整数である）、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙ−（式中、ｙは１〜約８の整数である）、−（ＣＨ２）ｑ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−（式中、ｑは１〜約１０の整数であり、ｙは１〜約８の整数である）、−ＣＯ（ＣＨ２）ｒ−（式中、ｒは１〜約１０の整数である）、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｚ−（式中、ｚは１〜６の整数である）、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｍは１〜６の整数である）、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２−（式中、ｐは１〜６の整数である）、１，４−ベンゼンジイル、１，３−ベンゼンジイルまたは１，２−ベンゼンジイル（炭素原子は任意選択で、かつ独立して、ハロゲン、Ｍｅ、Ｅｔ、ＯＨ、ＯＭｅもしくはＣＦ３で置換されている）から選択され、または
【化２４】
2019524764.tif 000026
であり；
Ｒ４およびＲ５は独立して、Ｈ、フェニル、
【化２５】
2019524764.tif 000027
（式中、ｎ＝１〜１００である）
から選択される。
【００２３】
様々な態様では、修飾ヌクレオチドは、Ｎｕｃが、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣであり；Ｙが、ＯＨであり；ｎ＝３または５であり；Ｒ１が、Ｈであり；Ｒ３が、Ｈであり；Ｌ２が、二価リンカー−（ＣＨ２）４−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）８−ＣＨ２−であり；Ｒ４が、フェニル、
【化２６】
2019524764.tif 000028
から選択される、化合物［１８］である。
【００２４】
本開示の様々な実施形態では、バイオセンサーから発生した電気シグナルを増強させる方法を記載する。本方法は、（ａ）ソース電極およびドレイン電極ならびに電気回路を完成させるために電極を架橋する架橋分子に結合したポリメラーゼを含むバイオセンサーを提供するステップと、（ｂ）配列決定されるヌクレオチド鋳型をポリメラーゼと連通させるステップと、（ｃ）修飾ｄＮＴＰをポリメラーゼと連通させるステップと、（ｄ）ポリメラーゼによりヌクレオチド鋳型を転写するステップであって、ポリメラーゼにより修飾ｄＮＴＰを組み込むことを含み、修飾ｄＮＴＰを組み込むことが、対応する非修飾ｄＮＴＰを組み込むことと比較して増強された電気シグナルをもたらす、ステップとを含む。一部の場合、シグナリングの増強は、より大きな電流スパイク、特徴的な電流対時間ピーク形状またはシグナル対ノイズ比の改善のうちの少なくとも１つを含む。
【００２５】
ある具体的な例では、修飾ｄＮＴＰは、本明細書で開示する修飾ヌクレオチドのいずれか１つを含み得る。さらに、修飾ｄＮＴＰにより可能になった電気シグナルの増強は、ヌクレオチド鋳型におけるＡ、Ｇ、ＣおよびＴを識別し、ヌクレオチド鋳型の配列決定をより信頼できるものにする。他の例では、電気シグナルの増強は、修飾ｄＡＴＰ、修飾ｄＧＴＰ、修飾ｄＴＴＰおよび修飾ｄＣＴＰの各々の組み込みについて独特である。
【００２６】
本開示の様々な実施形態では、ヌクレオチド鋳型を転写する方法を記載する。本方法は、（ａ）ヌクレオチド鋳型を転写することができるポリメラーゼを提供するステップと、（ｂ）ヌクレオチド鋳型をポリメラーゼと連通させるステップと、（ｃ）修飾ｄＮＴＰをポリメラーゼと連通させるステップと、（ｄ）修飾ｄＮＴＰを組み込むことによりヌクレオチド鋳型をポリメラーゼで転写するステップとを含み、修飾ｄＮＴＰは、本明細書で開示する修飾ヌクレオチドのいずれか１つを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ＤＮＡ配列決定のための分子電子バイオセンサーの一実施形態の略図である。
【図２】図２は、ポリメラーゼを含む分子センサー構造２００の一実施形態を例示する。
【図３】図３は、分子センサー上の電気測定のための試験設定の一実施形態の図解を例示する。
【図４】図４は、架橋分子を結合するために使用可能な金属金ドット接点をさらに含む、金属電極対の電子顕微鏡像を示す。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、ポリメラーゼベースのセンサーからのシグナリングを増強させるための修飾ｄＮＴＰの使用を例示する。図５Ａは、標準のｄＮＴＰで（左）、および修飾ｄＮＴＰで（右）作動中のセンサーを例示する。図５Ｂは、標準のｄＮＴＰで（左）作動中の、および修飾ｄＮＴＰで（右）作動中のセンサーから記録した、例示的な電流対時間プロットを例示する。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、ポリメラーゼベースのセンサーからのシグナリングを増強させるための修飾ｄＮＴＰの使用を例示する。図５Ａは、標準のｄＮＴＰで（左）、および修飾ｄＮＴＰで（右）作動中のセンサーを例示する。図５Ｂは、標準のｄＮＴＰで（左）作動中の、および修飾ｄＮＴＰで（右）作動中のセンサーから記録した、例示的な電流対時間プロットを例示する。
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、鋳型を標準のｄＮＴＰを含む配列Ｇ４Ａ８−Ｇ４Ａ８−Ｇ４Ａ８−Ｇ４Ａ８（配列番号１）で加工処理しながら、ポリメラーゼセンサーから得た配列決定シグナルを例示する。
【図６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、鋳型を標準のｄＮＴＰを含む配列Ｇ４Ａ８−Ｇ４Ａ８−Ｇ４Ａ８−Ｇ４Ａ８（配列番号１）で加工処理しながら、ポリメラーゼセンサーから得た配列決定シグナルを例示する。
【図７】図７は、修飾ｄＮＴＰでの配列決定シグナルを例示する。これらのシグナルは、修飾ｄＧＴＰ（つまり、デアザｄＧＴＰ）を含むＤＮＡ鋳型｛ＧＴＣＡ｝１０−ＧＡＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣ（配列番号２）について得られた。
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、修飾ｄＮＴＰでの配列決定シグナルの別の実施形態を例示する。配列決定シグナルデータは、修飾ｄＧＴＰ（デアザｄＧＴＰ）を含むＤＮＡ鋳型｛ＧＴＣＡ｝１０−ＧＡＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣ（配列番号２）について得られた。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、修飾ｄＮＴＰでの配列決定シグナルの別の実施形態を例示する。配列決定シグナルデータは、修飾ｄＧＴＰ（デアザｄＧＴＰ）を含むＤＮＡ鋳型｛ＧＴＣＡ｝１０−ＧＡＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣ（配列番号２）について得られた。
【図９】図９は、修飾ｄＮＴＰでの配列決定シグナルの別の実施形態を示す。配列決定シグナルデータは、修飾ｄＧＴＰ（デアザｄＧＴＰ）を含むＤＮＡ鋳型Ａ２０−Ｃ３−Ａ３０−Ｇ（配列番号３）について得られた。
【図１０】図１０は、修飾ｄＮＴＰでの配列決定シグナルの別の実施形態を示す。配列決定シグナルデータは、ガンマ−リン酸修飾ｄＣＴＰ（等量で混合したｄＣ４Ｐ−ラクトースおよびｄＣ４Ｐ−Ｃｙ７）を含むＤＮＡ鋳型（ＧＴ１０−Ｔ３−ＧＴ１０−Ａ３−ＧＴ１０−Ｃ３−ＧＴ１０）（配列番号４）について得られた。
【図１１】図１１は、修飾ｄＮＴＰが、分子電子センサーにおいてポリメラーゼ活性からのシグナルを増強させることができる機構を示す。
【図１２】図１２は、標準のｄＮＴＰを示し、ポリメラーゼ酵素により十分に許容される修飾を作製し得る化学構造について（「星」の位置により）示す。
【図１３】図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄは、修飾ｄＮＴＰの実施形態を例示し、「星」は、天然ｄＮＴＰからの修飾の部位を示す。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、デアザプリン構造を含む修飾ｄＮＴＰの実施形態を例示し、７位の「星」は、Ｃ原子がＮ原子を置き換えた位置を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃは、三リン酸（ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のγ−リン酸（γ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の様々な誘導体化を含む修飾ｄＮＴＰの実施形態を例示し、天然ｄＮＴＰにクーロン力電荷の増加を付加する能力を例示する。
【図１５Ｂ】図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃは、三リン酸のγ−リン酸の様々な誘導体化を含む修飾ｄＮＴＰの実施形態を例示し、天然ｄＮＴＰにクーロン力電荷の増加を付加する能力を例示する。
【図１５Ｃ】図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃは、三リン酸のγ−リン酸の様々な誘導体化を含む修飾ｄＮＴＰの実施形態を例示し、天然ｄＮＴＰにクーロン力電荷の増加を付加する能力を例示する。
【図１６】図１６は、一般的なクラスの修飾ｄＮＴＰ化合物の一実施形態を例示する。
【図１７】図１７は、一般的なクラスの修飾ｄＮＴＰ化合物の別の実施形態を例示する。
【図１８】図１８は、一般的なクラスの修飾ｄＮＴＰ構造の別の実施形態を例示する。
【図１９】図１９は、図１７中の構造［１７］部類（ｇｅｎｕｓ）で見られる二価リンカー部分Ｌ１についての選択肢を例示する。
【図２０Ａ】図２０Ａ〜２０Ｆは、γ−修飾ｄＣＴＰの特定の実施形態を例示する。
【図２０Ｂ】図２０Ａ〜２０Ｆは、γ−修飾ｄＣＴＰの特定の実施形態を例示する。
【図２０Ｃ】図２０Ａ〜２０Ｆは、γ−修飾ｄＣＴＰの特定の実施形態を例示する。
【図２０Ｄ】図２０Ａ〜２０Ｆは、γ−修飾ｄＣＴＰの特定の実施形態を例示する。
【図２０Ｅ】図２０Ａ〜２０Ｆは、γ−修飾ｄＣＴＰの特定の実施形態を例示する。
【図２０Ｆ】図２０Ａ〜２０Ｆは、γ−修飾ｄＣＴＰの特定の実施形態を例示する。
【図２１】図２１は、修飾ｄＮＴＰの機能試験として使用したポリメラーゼ伸長アッセイからのゲル画像である。
【図２２】図２２は、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ（化合物［ＩＶ］）の合成を例示する。
【図２３】図２３は、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−一リン酸（化合物［Ｖ］）の合成を例示する。
【図２４Ａ】図２４Ａ〜２４Ｂは、ｄＣ４Ｐ−ＤＢＣＯ（化合物［ＶＩＩＩ］）の合成を例示する。
【図２４Ｂ】図２４Ａ〜２４Ｂは、ｄＣ４Ｐ−ＤＢＣＯ（化合物［ＶＩＩＩ］）の合成を例示する。
【図２５Ａ】図２５Ａ〜２５Ｂは、ｄＣＴＰ−ｐｉｐＤＭＡ（化合物［Ｘ］）の合成を例示する。
【図２５Ｂ】図２５Ａ〜２５Ｂは、ｄＣＴＰ−ｐｉｐＤＭＡ（化合物［Ｘ］）の合成を例示する。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜２６Ｂは、ｄＣＴＰ−Ｃｙ７（化合物［ＸＩＩ］）の合成を例示する。
【図２６Ｂ】図２６Ａ〜２６Ｂは、ｄＣＴＰ−Ｃｙ７（化合物［ＸＩＩ］）の合成を例示する。
【図２７Ａ】図２７Ａ〜２７Ｂは、ｄＣＴＰ−ＴＰＭＤ（化合物［ＸＩＶ］）の合成を例示する。
【図２７Ｂ】図２７Ａ〜２７Ｂは、ｄＣＴＰ−ＴＰＭＤ（化合物［ＸＩＶ］）の合成を例示する。
【図２８Ａ】図２８Ａ〜２８Ｂは、ｄＣＴＰ−ラクトース（化合物［ＸＶＩ］）の合成を例示する。
【図２８Ｂ】図２８Ａ〜２８Ｂは、ｄＣＴＰ−ラクトース（化合物［ＸＶＩ］）の合成を例示する。
【図２９Ａ】図２９Ａ〜２９Ｂは、ｄＣＴＰ−ＰＥＧ９（化合物［ＸＶＩＩＩ］）の合成を例示する。
【図２９Ｂ】図２９Ａ〜２９Ｂは、ｄＣＴＰ−ＰＥＧ９（化合物［ＸＶＩＩＩ］）の合成を例示する。
【図３０Ａ】図３０Ａ〜３０Ｂは、Ｒ１上の正電荷と分子センサーの伝導部分との直接相互作用を提供する、Ｒ１置換基の２つの実施形態を例示する。
【図３０Ｂ】図３０Ａ〜３０Ｂは、Ｒ１上の正電荷と分子センサーの伝導部分との直接相互作用を提供する、Ｒ１置換基の２つの実施形態を例示する。
【図３０Ｃ】図３０Ｃ〜３０Ｄは、Ｒ１上の負電荷と分子センサーの伝導部分との直接相互作用を提供する、Ｒ１置換基の２つの実施形態を例示する。
【図３０Ｄ】図３０Ｃ〜３０Ｄは、Ｒ１上の負電荷と分子センサーの伝導部分との直接相互作用を提供する、Ｒ１置換基の２つの実施形態を例示する。
【図３１】図３１Ａ〜３１Ｄは、Ｒ１上の芳香族環と分子センサーの伝導部分との直接π−πおよび疎水性相互作用を提供する、Ｒ１置換基の４つの実施形態を例示する。
【図３２】図３２Ａ〜３２Ｂは、例示されるＲ１置換基を有する修飾ｄＮＴＰと分子センサーの伝導部分との間の電荷およびπ相互作用の両方を提供する、Ｒ１置換基の２つの実施形態を例示する。
【図３３】図３３Ａ〜３３Ｂは、例示されるＲ１置換基を有する修飾ｄＮＴＰと分子センサーの伝導部分との間のラジカルアニオン電荷またはラジカルカチオン電荷相互作用を提供する、Ｒ１置換基の２つの実施形態を例示する。
【図３４】図３４は、２つの伝導体（ｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）間の伝導性連結を創出および破壊することを通した独特な電気シグナル発生のための機構を提供する、Ｒ１置換基の一実施形態を例示する。
【図３５Ａ】図３５Ａは、修飾ｄＡＴＰの一実施形態を例示する。
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、分子センサーにおいてポリメラーゼと架橋分子との間で共有結合され得る特別なテザーの一実施形態を例示し、ここでそれは、組み込み事象中に様々な修飾ｄＮＴＰと相互作用するのに利用可能であり得る。
【図３６】図３６は、修飾ｄＡＴＰの組み込み中にポリメラーゼのコンフォメーション変化を変更することができる修飾ｄＡＴＰを示す。
【図３７】図３７は、様々な修飾ｄＮＴＰの化学構造を、これらの修飾ｄＮＴＰを試験するために使用したポリメラーゼ伸長アッセイからのゲル画像と共に例示する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本開示の様々な実施形態では、ポリメラーゼベースの分子電子センサーのシグナリング性能を、センサーが分析する試験溶液中に含まれる修飾ｄＮＴＰの使用により増強させる。多くのかかるｄＮＴＰ修飾は、センサーにおけるポリメラーゼにより許容される。ある特定の態様では、修飾ｄＮＴＰにより提供されるシグナル増強は、本明細書で説明する通り、様々な機構を通して起こる場合があり、これらの機構は、かかる修飾の合理的設計のための鋳型として使用することができる。
【００２９】
様々な実施形態では、ＤＮＡ配列決定に使用可能な分子センサーは、センサーを機能させるポリメラーゼ酵素を含む。また、センサーは、伝導性架橋分子（「分子ワイヤー」とも呼ばれる）を含む。一部の態様では、伝導性架橋分子は、長さが約１０ｎｍ程度であり得る。伝導性架橋分子は、コンジュゲートしたポリメラーゼを、ソース電極およびドレイン電極ならびに電極対を架橋する分子ワイヤー（分子）を含む回路に「配線する」。かかる分子ワイヤーは、ソース電極とドレイン電極とを接続するＤＮＡオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）、タンパク質アルファヘリックス架橋または他の生体分子を含み得る。ある特定の態様では、分子ワイヤーエレメントにカップリングしたポリメラーゼ酵素は、センサーにおいて電流測定回路を完成させる。ポリメラーゼがヌクレオチドを組み込むときの電流対時間の測定は、別個のシグナルスパイク（例えば電流対時間のトレースにおける電流スパイク）として組み込み事象を示すシグナルトレースを生成し、これらのスパイクの詳細な形状および／またはサイズにより組み込まれている異なる塩基を区別および特定する。得られるシグナルは、鋳型の配列を決定するために加工処理される。
【００３０】
かかる分子センサーによりモニターされる重要な酵素活性は、様々なデオキシヌクレオチド三リン酸（または「ｄＮＴＰ」）の組み込みである。本開示の主題は概して、ＤＮＡ配列を決定するためのポリメラーゼに基づく分子センサーの能力を結果として改善する、得られるシグナルを増強させるためのこのプロセスの変更である。
【００３１】
ｄＮＴＰ
ｄＮＴＰの４種の特定の形態は、ＤＮＡの４種の塩基／文字に対応し、これらは、塩基組成においてのみ異なる、ｄＡＴＰ（アデノシン）、ｄＣＴＰ（シチジン）、ｄＧＴＰ（グアノシン）およびｄＴＴＰ（チミジン）である。本明細書で、分子上の塩基は、文字（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）により、または一般的には「Ｎｕ」もしくは「Ｎｕｃ」により示され得る。全ての天然ｄＮＴＰは、三リン酸部分を有し、３つのリン酸基は、デオキシリボースの５’ＯＨに結合したリン酸で始まるα、βおよびγとして示される。ポリメラーゼが触媒するＤＮＡ鎖伸長では、デオキシリボース上の３’ＯＨ基および５’α−リン酸部位が、組み込みおよび鎖伸長に参加する。４種の特定のｄＮＴＰは、ＤＮＡポリメラーゼが、鋳型鎖によりガイドされて伸長鎖に組み込む化学基質である。このプロセスの最も重要な特色は、伸長中の鎖の３’ＯＨ基が、入ってきたヌクレオチドの５’炭素−α−リン酸基とカップリングするとき、βおよびγ−リン酸基が、ポリメラーゼ酵素の作用によりピロリン酸基として共に放出されることである。
【００３２】
天然ｄＮＴＰを化学修飾したのにも関わらず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中にポリメラーゼ酵素により認識され、組み込まれ得る程度は、大部分未知である。一般的に、５’炭素／α−リン酸または３’ＯＨ基への修飾は、これらの部位が、鎖を形成する際に重要なカップリング反応に関与しているので、非常に制限される。ｄＮＴＰ上の全ての他の部位は典型的に、ある程度の化学修飾を許容する。これは、修飾が、組み込み中にポリメラーゼによりｄＮＴＰから放出されるβ−および／もしくはγ−リン酸基上にあるか、または伸長鎖で保持される塩基、デオキシリボース基もしくはα−リン酸上のどこかにあるかどうかによって、ネイティブ形態のＤＮＡが生成されることをもたらすことも、またはもたらさないこともある。具体的な例として、塩基に結合した大きな色素標識基を有する許容されるｄＮＴＰが挙げられる（Ｗａｇｇｏｎｅｒら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９４年）２２巻（１６号）：３４１８〜３４２２頁を参照のこと）。この修飾は、得られるＤＮＡ産物で保持される。リンカーおよび色素分子がポリメラーゼを阻害することなく結合され得る、γ−リン酸への修飾の具体的な例は、Ｆｕｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、２４巻（５〜７号）：４０１〜４０８頁、（２００５年）で見られる。これらの修飾は、得られるＤＮＡ産物で保持されない。一般的に、色素標識化ｄＮＴＰの組み込みは、光学レポーターストラテジを使用する多くのＤＮＡ分析方法の基礎である。
【００３３】
広範なクラスのｄＮＴＰ修飾を、本明細書で開示する。これらの修飾は概して、修飾が、修飾ｄＮＴＰからポリメラーゼにより合成されるＤＮＡにおいて保持されないような、β−および／またはγ−リン酸への修飾であるが、また、本明細書の一部の修飾は、α−リン酸基への修飾であり、合成したＤＮＡにおいて保持される。様々な実施形態では、これらの形態は、γ−リン酸からシグナリング基へのリンカーなどの、リンカーを含み得る。シグナリング基は、その電荷がセンサー回路において電流に影響を及ぼすように、センサー作動に使用される緩衝条件下で荷電している（例えば＋１、＋２または−１、−２など）基を含み得る。例えば、シグナリング基は、スルホン酸基（−１電荷を有する、−ＳＯ３−）または四級アンモニウム置換基（＋１電荷を有する、−Ｒ３Ｎ＋）を含み得る。ｄＮＴＰに結合した他のシグナリング基は、色素、糖、多環芳香族置換基または他の基を含み得る。ある特定の態様では、リンカーは、リンカーおよびシグナリング基を有する修飾ｄＮＴＰの組み込み中に、シグナリング基がセンサーの分子架橋に近接するようになることを可能にし、それによって、シグナル効果を増強させる。例えば、シグナルの塩基区別を増強させるための、様々な塩基についての様々なシグナリング基が存在し得る。修飾ｄＮＴＰの化学構造、合成有機化学法によるそれらの合成およびポリメラーゼに基づく分子センサーにおけるそれらの使用を、本明細書で詳述する。
【００３４】
図２で例示される通り、ノイズを低減させ、様々なｄＮＴＰにより提供される電荷変更を可能にして、分子回路のより大きな部分に影響を及ぼすために、分子センサーのサイズが１０ｎｍ程度である場合、修飾ｄＮＴＰはとりわけ有効であることが判明している。本明細書の目的のために、分子センサーのサイズは、約３ｎｍ〜約３０ｎｍの範囲、約５ｎｍ〜約１５ｎｍの範囲または約６ｎｍ〜約１２ｎｍの範囲であり得る。
【００３５】
ＤＮＡ配列決定のための例示的な分子電子バイオセンサー
本明細書で使用されるとき、様々な化学化合物は、アラビア数字により標識および特定され得る（例えば、化合物［１］、［２］、［３］など）。他の化合物は、ローマ数字により標識および特定され得る（例えば、化合物［ＶＩ］、［ＶＩＩ］、［ＶＩＩＩ］など）。アラビア数字で標識される化合物は、同等のローマ数字で標識される化合物とは異なる。一例として、化合物［１６］および化合物［ＸＶＩ］は、異なる化合物である。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、反復塩基を伴う配列は、便宜上、簡便な表記で記載される場合があり、下付きの整数は、下付きの整数の直前の特定の塩基の総数を示す。例えば、簡便な表記Ａ２０−Ｃ３−Ａ３０−Ｇ（配列番号３）は、配列、Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ（配列番号３）を示す。
【００３７】
図１は、ＤＮＡ配列決定のための分子電子バイオセンサーの一実施形態を例示する。ここで、分子複合体は、ＤＮＡ鎖と係合するポリメラーゼなどの酵素を含み、感度のよい電流計を伴う分子電子回路を形成する。センサーのポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型と係合して、それを転写し、個々のｄＮＴＰが組み込まれるときに時間をわたり電流シグナルをもたらす。例示的なシグナリングを、図１で、センサーの図解の直下に電流対時間プロットにて示す。測定された電流シグナルは理想的には、異なるＤＮＡ塩基に対応する特有のスパイクを含有し、塩基配列が決定されることを可能にする。図１で示す例は、塩基配列ＧＡＴＴＡＣＡ（配列番号５）が電流対時間のプロットにおける電流スパイクから推定されたことを示す。
【００３８】
図２は、様々な修飾ｄＮＴＰを試験するために使用され得る、ポリメラーゼを含む分子センサー構造２００の一実施形態を例示する。分子センサー構造２００は、２つの電極２０１および２０２を含む。電極２０１および２０２は、回路におけるソース電極およびドレイン電極を含み得る。電極２０１および２０２は、約１０ｎｍのナノ間隙により分離されている。他の長さの生体分子架橋に適応するには、他の間隙距離が必要とされ得る。この例では、架橋分子２０３は、長さが約２０ｎｍ（例えば、６０塩基）の二本鎖ＤＮＡ分子を含み、チオール基２０４および２０５は、各金属電極２０１および２０２上に提供される金接点２０６および２０７への架橋分子２０３のカップリングのために３’および５’末端の両方にある。この場合のプローブ分子は、ポリメラーゼ２１０、例えばＥ．ｃｏｌｉ  Ｐｏｌ  Ｉを含み、これは、ストレプトアビジンタンパク質２１２に共有結合２１１で化学架橋され、次にストレプトアビジンタンパク質２１２は、合成ＤＮＡオリゴ２０３におけるビオチン化ヌクレオチドにより結合部位２１４にカップリングされている。作動中、センサー２００は、ポリメラーゼ２１０により加工処理されるＤＮＡ鎖２２０をさらに含む。図は、分子および原子の相対的サイズに近づけている。
【００３９】
図３は、分子センサーにおける様々な電気構成要素および接続の一実施形態を例示する。図の上部では、電極−基板構造３００の断面が例示され、電圧を印加し、センサーの架橋分子を通る電流を測定するための分析器３０１への結合が例示される。図の下部では、回路を架橋するために使用可能な、電極アレイ３０２の透視図が例示される。各電極対は、第１の金属（例えば、「金属−１」）および電極を分離する間隙の近くの各電極末端に第２の金属の接点ドットまたはアイランド（例えば、「金属−２」）を含む。他の例では、金属−１および金属−２は、同じ金属を含み得る。他の態様では、接点ドットは、異なる金属を含む金属電極の頂部の金（Ａｕ）アイランドである。様々な実験で、接点ドットは、例えばチオール−金結合による、電極対間の各間隙にわたる単一架橋分子の自己組立を支持する金（Ａｕ）ビーズまたは金（Ａｕ）コーティングされた電極チップを含む。
【００４０】
図４は、架橋結合に使用可能な金属金ドット接点を有する金属電極の電子顕微鏡像（Ａ）（Ｂ）および（Ｃ）を示す。電極は、例えばｅビームリソグラフィーにより生成されたシリコン基板上にある。（Ａ）の像は、金ドット接点を有するチタン電極のアレイを示す。示される通り、一対の電極における各電極の幅は、約２０ｎｍである。（Ｂ）の像は、約７ｎｍの電極間隙の近接写真であり、金ドット接点は約１５ｎｍ離れている。（Ｃ）の像は、単一の電極対のさらなる近接写真およびナノ間隙の特徴である。像は、電極間のナノ間隙が約７ｎｍであり、金ドット間隔が約１０ｎｍであることを明確に示す。ＥＭ像で見られる通り、金ドットは、ナノ間隙に隣接して位置する。
【００４１】
ＤＮＡ配列決定適用のための修飾ｄＮＴＰの使用
図５Ａは、センサーのポリメラーゼ周囲の溶液中の様々な標準のｄＮＴＰで作動するセンサーの図解を例示する。図５Ａの右の模式図は、同じセンサーであるが、ポリメラーゼ周囲の溶液中に修飾ｄＮＴＰを含むものを示す。図５Ａの左で、分子電子ＤＮＡ配列センサーの一実施形態は、電気回路を完成させるための架橋分子に取り付けられたポリメラーゼを含み、溶液中のｄＮＴＰを組み込むことによる鋳型の加工処理は、組み込み事象および組み込まれた塩基の正体を示すスパイクを生成する。
【００４２】
図５Ｂは、標準のｄＮＴＰの代わりに修飾ｄＮＴＰを使用することにより可能なシグナリングの改善を例示する。図５Ｂの左は、ネイティブｄＮＴＰのみを含む分子組み込み事象中に記録された電流対時間のプロットである。示される通り、かかる電流スパイクをノイズから、および電流スパイク同士を見分けることが困難であり得る。図５Ｂの右は、修飾ｄＮＴＰを含む分子組み込み事象中の電流対時間のプロットである。図５Ｂの右のプロットは、修飾ヌクレオチドが、シグナリングを増強させて別個の組み込み事象についてより明らかなシグナルを提供し、組み込まれる異なる塩基を区別するシグナルを提供し、それによって配列をセンシングし得ることを例示する。様々な態様では、シグナリングの増強は、より大きな電流スパイクおよび／または異なる電流スパイク形状を含み得る。
【００４３】
一部の例では、ｄＮＴＰへの修飾は、分子のγ−リン酸への様々な基の付加を含む。修飾は、形式電荷（例えば、＋１、−１など）、極性（例えば、−Ｃ＝Ｏ、−ＯＨ官能性）、非極性特徴（例えば、−ＣＨ２−のような非極性官能性の使用を通した疎水性）、立体効果（例えば、大きな縮合環系）を提供する化学部分を含み得る。これらおよび他の化学部分は、ポリメラーゼ酵素上のネイティブの特徴と、ポリメラーゼ上の、操作された特徴と、架橋分子と、またはポリメラーゼと架橋分子との間で結合された分子と相互作用し得る。様々な態様では、ｄＮＴＰへの修飾は、例えばリン酸基の総数によって、ポリリン酸電荷を−３（ネイティブｄＮＴＰの）から−４、−５、−６、−７、−８または−９に拡張し得る。ある特定の実施形態では、ｄＮＴＰへの最初の修飾は、ポリリン酸鎖の末端へのクリック化学基の付加を含む場合があり、これは、標的修飾ｄＮＴＰを効率的に合成するために使用可能な反応性部分（例えば、アルキン基）を提供する。
【００４４】
様々な実施形態では、修飾ｄＮＴＰは、ポリメラーゼ反応（例えば、ＰＣＲ、プライマー伸長もしくは逆転写反応またはこれらの酵素が機能する様々な生物有機体におけるｉｎ  ｖｉｖｏ条件）に通常使用される標準の緩衝条件と比較して、シグナル増強に有効であるために適切な緩衝溶液を必要とし得る。特に、一部の実施形態のための緩衝液調節は、緩衝液中で使用される塩濃度の、より高い塩またはより低い塩条件いずれかへの変更を含み得る。ある特定の実施形態では、２倍〜１０倍、〜１００倍、〜１０００倍、１００万倍、最大１０億倍の範囲の塩濃度の低減は、有益であり得る。利点は、溶液中の電場の塩ベースの遮蔽（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）もしくは溶液中のデバイ距離の増大の減少のため、またはかかるより低いイオン濃度からのイオン伝導からの電気測定ノイズの減少のためでもあり得る。他の例では、２倍〜１０倍、〜１００倍、〜１０００倍、１００万倍、最大１０億倍の範囲の塩濃度の増大は、有益であり得る。
【００４５】
ある特定の態様では、センサー系への変更は概して、修飾ｄＮＴＰの効果を増強させ得る。これらの変更は、ｄＮＴＰの濃度、使用する緩衝溶液の性質、印加される電極およびゲート電圧の最適化ならびにセンサーにおいて使用される特定の種類のポリメラーゼまたは変異ポリメラーゼを挙げることができるが、これらに限定されない。これらの変更の任意の組み合わせは、修飾ｄＮＴＰにより可能になる効果を増強させるために使用することができる。例えば、修飾ｄＮＴＰ上の荷電基のデバイ半径を拡張するために緩衝液のイオン濃度を低下させることは、組み込み事象中の分子架橋伝導体に対するｄＮＴＰのより大きな電気的影響を可能にすることにより増強効果を有し得る。
【００４６】
他の態様では、緩衝液は、酵素活性に必要な金属多価カチオンの変更された濃度または組成を有し得る。例えば、二価カチオンは、ｄＮＴＰとポリメラーゼとの間の相互作用の媒介において重要な役割を果たすことが公知である。これに関連する緩衝液変更は、Ｍｇ濃度の変更を含み得るか、または他の金属多価カチオン、例えば二価カチオン、例えばＭｎ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ｃｏ、Ｃａ、Ｃｄ、Ｂａ、Ｓｒ、ＣｕもしくはＣｒの濃度の使用を含み得る。緩衝液への洗剤または分散剤の添加は、修飾ｄＮＴＰの凝集を低減もしくは防止するか、または系の他の分子とのそれらの凝集を低減もしくは防止するために、一部の実施形態について重要であり得る。
【００４７】
図６Ａおよび６Ｂは、ポリメラーゼを含むバイオセンサーにおける天然ｄＮＴＰ組み込み事象から得た、実験的な配列決定シグナルの一実施形態を例示する。ポリメラーゼセンサーからのこれらのシグナルは、配列Ｇ４Ａ８−Ｇ４Ａ８−Ｇ４Ａ８−Ｇ４Ａ８（配列番号１）で鋳型を加工処理することにより得られる。シグナルは、実験操行中の電流対時間を示す。また、図６Ａは、図６Ｂで見られる拡大挿入図を示す点線円を示す。図６Ｂで例示される挿入図は、およそｔ＝３４秒〜およそｔ＝３９秒のプロット部分であり、元になる配列を反映する電気シグナルを示す。かかるシグナルを増強させることは、より正確な配列決定を提供し得る。
【００４８】
図７は、修飾ｄＮＴＰを使用した結果を示す。この例では、７−デアザ−ｄＧＴＰ（図１４Ｂを参照のこと）を修飾ｄＧＴＰとして使用した。シグナルは、７−デアザ修飾ｄＧＴＰを含む、ＤＮＡ鋳型｛ＧＴＣＡ｝１０−ＧＡＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣ（配列番号２）について得られた。鋳型のＣ塩基に対するこの修飾ｄＧＴＰの組み込みは、シグナル増強をもたらし得る。
【００４９】
図８は、修飾ｄＮＴＰを使用した場合の配列決定センシングの別の実施形態を示す。この実施形態では、シグナルデータは、修飾ｄＧＴＰ（図１４Ｂの７−デアザｄＧＴＰ）が使用された場合の、ＤＮＡ鋳型｛ＧＴＣＡ｝１０−ＧＡＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣ（配列番号２）について得られる。およそｔ＝３３秒〜およそｔ＝３７．５秒のプロット部分が拡大されている図８Ｂの挿入図で示す通り、鋳型のＣ塩基に対するこの組み込みは、シグナル増強をもたらし得る。図８Ｂは、修飾ｄＧＴＰの使用から生じ得る、ＧＧ組み込みシグナルの増強の可能性を有するデータの解釈を示す。
【００５０】
図９は、修飾ｄＮＴＰでの配列決定センシングの別の実施形態を示す。このプロットは、修飾ｄＧＴＰ（図１４Ｂの７−デアザｄＧＴＰ）が使用された場合の、ＤＮＡ鋳型Ａ２０−Ｃ３−Ａ３０−Ｇ（配列番号３）についての配列決定シグナルデータを示す。鋳型のＣ塩基に対するこの組み込みは、シグナリングの増強をもたらし得る。図９は、Ｔ組み込みからのシグナルが修飾ｄＧＴＰ組み込みのシグナルとは区別されるデータの解釈を示し、ここでＴシグナルは電流の増大であり、修飾ｄＧＴＰシグナルは電流の低減として見られる。これらのシグナルが畳み込まれる場合、それは、修飾ｄＧＴＰの効果として、より広い増強した電流の中部における電流の下落を伴って、見られる正味のシグナルを生成し得る（これらの詳細については四角い挿入図内の拡大プロットを参照のこと）。
【００５１】
図１０は、修飾ｄＮＴＰでの配列決定センシングの別の実施形態を示す。このプロットは、γ−リン酸修飾ｄＣＴＰ、つまりｄＣ４Ｐ−ラクトース（図２０Ｆおよび図２８Ｂ中の化合物［ＸＶＩ］）およびｄＣ４Ｐ−Ｃｙ７（図２０Ｂおよび図２６Ｂ中の化合物［ＸＩＩ］）の等量混合物が使用された場合の、ＤＮＡ鋳型（ＧＴ１０−Ｔ３−ＧＴ１０−Ａ３−ＧＴ１０−Ｃ３−ＧＴ１０）（配列番号４）についての配列決定シグナルデータを示す。鋳型のＧ塩基に対するこれらの修飾ｄＣＴＰの組み込みは、シグナル増強をもたらし得る。図１０のプロットは、ｔ＝２０秒付近のデータにおける電流スパイクとして見られる、複数の組み込み事象にわたる電流対時間データを示す。これらのシグナルスパイクの高さは、修飾ｄＣＴＰ形態の使用により増強される可能性がある。
【００５２】
ここで図１１を参照して、修飾ｄＮＴＰが、分子電子センサーにおいてポリメラーゼ活性中に得たシグナルを増強させ得る、可能性のある機構が例示される。可能性のある機構として、（Ａ）電流をゲートするための局在電荷（＋または−）の付加、（Ｂ）鋳型が結合している間のポリメラーゼ作用の速度の減速、（Ｃ）ポリメラーゼのコンフォメーションを変化させること、例えば示される通り、酵素の一部のフィンガー運動（ｆｉｎｇｅｒ  ｍｏｔｉｏｎ）を増大させること、および（Ｄ）電流をモジュレートするために架橋分子との直接相互作用を作製することが挙げられるが、これらに限定されない。機構（Ｄ）では、ｄＮＴＰと架橋分子との直接相互作用は、ｄＮＴＰから好適な長さの付属物を繋いで、ポリメラーゼ酵素との相互作用中に繋がれた付属物を架橋分子との直接接触へと引っ張ることができる修飾ｄＮＴＰを作製することにより、可能にすることができる。
【００５３】
様々な実施形態では、バイオセンサーでのＤＮＡ配列決定における修飾ｄＮＴＰの使用を開示する。ＤＮＡまたはゲノム配列決定適用において、例えば、架橋分子、例えばＤＮＡオリゴヌクレオチドはポリメラーゼにコンジュゲートされ、ポリメラーゼはプライムされた一本鎖鋳型ＤＮＡと結合し、電子バイオセンサーは組み込みのためのｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸）を含有する緩衝液を提供される。鋳型ＤＮＡの相補鎖の合成において、様々なｄＮＴＰがポリメラーゼにより組み込まれるとき、架橋分子を通る電流がモニターされる。様々な実施形態では、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む、ネイティブまたは「標準」のｄＮＴＰが使用される。しかしながら、他の態様では、これらの標準のｄＮＴＰのいずれかまたは全ては、対応する修飾ｄＮＴＰにより置き換えることができる。
【００５４】
図１２は、標準の（「天然」）ｄＮＴＰを、ｄＮＴＰの組み込みシグナルを増強させ得るか、または異なる塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）組み込み事象間の差が増強したシグナルを生成し得る様々な分子修飾がｄＮＴＰになされ得る位置と共に例示する。ｄＮＴＰの化学修飾の可能性のある非限定的な部位を、「星」により示す。星は、組み込まれ、ポリメラーゼにより伸長されるｄＮＴＰの能力に影響を及ぼすことなく、ｄＮＴＰへの修飾がなされ得る部位を示す。様々な実施形態では、修飾ｄＮＴＰは、これらの部位で１つまたは複数の修飾を含む。図の左では、ポリリン酸鎖（例えば、α、β、γ）または糖（例えば、誘導体化に利用可能な丸を付けた３’ＯＨ基）上の許容される部位が示される。ｄＮＴＰの左の３つの星は、修飾が、任意の組み合わせで、３つのリン酸基のいずれか１つにてなされ得ることを示す。図１２の右では、２つの塩基プリンおよびピリミジンが示され、星は、一般的に修飾に許容される部位の位置を示す。各ｄＮＴＰ上に他にも位置はあるが、例えば、プリン上の６および／もしくは７位を誘導体化してもよく、またはピリミジンの２および／もしくは５位を誘導体化してもよい。一部の例では、７−デアザ修飾が利用される。様々な例では、鋳型配列の決定においてより高い正確度が提供される（例えば、図５Ａおよび５Ｂで例示される通り）。
【００５５】
本開示に従うｄＮＴＰ修飾の非限定的な例を、図１３〜２０で示す。ｄＮＴＰ修飾として、例えば７−デアザ形態もしくは８−ブロモ形態を生成するための、塩基の修飾；例えばα−もしくはβ−リン酸基のチオール化形態もしくは臭素化誘導体を生成するための、これらのリン酸への修飾；または例えば元の三リン酸基から四、五もしくは六リン酸もしくはさらにより長いリン酸鎖を形成するための余分のリン酸基の付加を含むγ−リン酸修飾が挙げられるが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、γ−リン酸に付加される多くの多様な基に関して非常に寛容である。三リン酸鎖の末端上に別の基を付加することによるｄＮＴＰの修飾は、大きなクラスの修飾ｄＮＴＰ、例えば図１３〜２０および本開示全体で示すものを提供する。
【００５６】
例えば、図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄは、ポリメラーゼ酵素に基づく分子センサーにおいて組み込み事象のシグナルを増強させるために有用な、修飾ｄＮＴＰの実施形態である。図１３Ａは、プリンの６位での塩素置換の一例である。図１３Ｂは、三リン酸のα−リン酸基のスルホキシド誘導体化の一例である。図１３Ｃは、ピリミジンの２位のスルホキシド誘導体化の一例である。最後に、図１３Ｄは、ピリミジンの５位での臭素置換の一例である。
【００５７】
ポリメラーゼ酵素を含むバイオセンサーからのシグナルを増強させるために使用可能な修飾ｄＮＴＰの追加の例を、図１４Ａおよび１４Ｂに示す。例示される修飾ｄＮＴＰは、「デアザ」プリンであり、プリン中の窒素原子、７−窒素が炭素原子で（これらの例では、「星」の位置で）置き換えられていることを意味する。図１４Ａは、７−デアザ−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸の化学構造を例示する。図１４Ｂは、７−デアザ−２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸の化学構造を例示する。これらの分子は、四リチウム塩として示されるが、混合塩を含む他の塩は、ポリメラーゼによる組み込み事象において修飾ｄＮＴＰとして使用可能であり得る。
【００５８】
図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃは、標準のｄＣＴＰの三リン酸のγ−リン酸での様々な誘導体化を含む、修飾ｄＮＴＰのさらなる例を示す。これらの修飾化合物各々は、γ−リン酸に付加された基を特色とし、各々を、六リン酸鎖の末端リン酸基から伸びたテザーとして、様々なエーテル結合（例えば、ＰＥＧ）を伴う六リン酸に延長する。図１５Ａの化合物は、「クリック化学」を使用するさらなる誘導体化に使用可能なＤＢＣＯ部分をさらに含む。ＤＢＣＯ（またはＡＤＩＢＯ）は、図１５Ａの分子の左端に見られ得る置換基、アザジベンゾシクロオクチンの頭字語である。図１５Ａの化合物は、好適なＤＢＣＯ−ＰＥＧリンカーと六リン酸修飾ｄＣＴＰとの反応により得られる。クリック化学の試薬は、他にも供給業者はあるが、ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから得ることができる。次に、アザシクロオクタン環のアルキン三重結合は、図１５Ａの化合物（例えば、図１５Ｂおよび１５Ｃの化合物を生成するための）のさらなる誘導体化に利用可能である。
【００５９】
図１５Ａで示す修飾ｄＣＴＰは、ＰＥＧ部分とデオキシリボース部分との間の六リン酸基の存在のために−６の電荷を有する。「＋」記号および分子の上部にわたる矢印は、ネイティブｄＣＴＰ分子に付加された分子の部分を示す。
【００６０】
図１５Ｂで示す修飾ｄＣＴＰは、示される通り、トリアゾール−アザシクロオクタン縮合環系を形成するための、アザシクロオクチン環上の三重結合と適切に置換されたアジドとの反応により、図１５Ａの化合物から誘導される。
【００６１】
さらに、図１５Ｃで示す修飾ｄＣＴＰは、中性脱離基として四級化部分を置換する、適切に置換されたアミドとの反応により、図１５Ｂの化合物から誘導される。
【００６２】
ポリメラーゼベースのセンサーからのシグナルを増強させるために、修飾ｄＮＴＰ（他にも修飾ｄＮＴＰはあるが、中でも、例えば、図１３Ａ〜１３Ｄ、図１４Ａおよび１４Ｂならびに図１５Ａ〜１５Ｃで例示されるもの）を使用する１つの利点は、鋳型ＤＮＡ、合成したＤＮＡまたはｄＮＴＰの標識化が必要でなく、任意の他の検出可能な標識の使用も必要でないことである。本明細書の修飾ｄＮＴＰの使用は、他方で、ポリメラーゼ−架橋複合体の伝導特性を調節し、それによって、酵素活性中に複合体が生成した生じるシグナルを直接増強させる。これは、標識を検出する手段が、かかるアプローチを支配、制約、複雑化または限定する他の標識化方法と比較して利点である。
【００６３】
図１〜４の分子電子配列決定センサーで代表的な修飾ｄＮＴＰを使用する特定の実験を、図７、８および９（デアザ−修飾ｄＧＴＰの使用を例示する）ならびに図１０（γ−リン酸修飾ｄＣＴＰ−Ｃｙ７およびｄＣＴＰ−ラクトースの使用を例示する）に示した。
【００６４】
本開示の様々な実施形態では、化学修飾ｄＮＴＰの使用は、ポリメラーゼ酵素を含む分子電子センサーの電気シグナルパラメーターを増強させる。
【００６５】
他の実施形態では、修飾ｄＮＴＰは、単に、特定のネイティブもしくは変異もしくは化学修飾ポリメラーゼ酵素の使用または適切な緩衝液の使用または適切な架橋分子の使用も含む系において、有益な、またはより大きなレベルのシグナル増強を達成し得る。
【００６６】
様々な実施形態では、修飾ｄＮＴＰを含み、センサーに提供される試験溶液中の緩衝液のｐＨおよび／または化学的構成は、修飾ｄＮＴＰ上の様々な基、例えばリン酸基、他のイオン化可能基、例えばスルホン酸基、またはプロトン化され得るアミン基上の電荷に影響を及ぼし得る。例えば、修飾ｄＮＴＰ上のリン酸基は、全て負に荷電していてもよく、または−ＯＨ基として部分的に、もしくは完全にプロトン化していてもよい。本開示に従って、三、四、五、六などのリン酸鎖の様々なリン酸基は、様々な図において、塩、部分塩として、または−ＯＨ基にプロトン化されるリン酸基の各々を伴って示され得る。ポリリン酸鎖上の電荷について図で示されるものは限定ではないこと、および様々なリン酸基が全て負に荷電されるか、部分的にプロトン化されるか、または完全にプロトン化される（全て−ＯＨ基をもたらす）場合があることが理解される。さらに、また、任意の負に荷電したリン酸基酸素原子上の対イオンは限定ではなく、任意のＭ＋種（例えば、Ｌｉ＋）、Ｍ２＋種（例えば、Ｍｇ２＋）または任意のアンモニウム塩（例えば、Ｒ３ＮＨ＋）であってもよい。同様に、スルホン酸基は、それらの酸形態（−ＳＯ３Ｈ）で、または脱プロトン化スルホン酸アニオン（−ＳＯ３−）として示され得る。
【００６７】
様々な実施形態では、ｄＮＴＰ修飾、ポリメラーゼ修飾、緩衝液調節および架橋分子の適切な組み合わせは、所望のシグナル増強をもたらし得る。同様に、シグナル増強のための修飾ｄＮＴＰは、かかる修飾ポリメラーゼ、調節した緩衝液または調節した架橋の使用を通した追加の増強を提供する可能性があり得る。本開示の追加の利点は、修飾ｄＮＴＰの様々な実施形態と比較した、追加のシグナル増強が、これらの他の主要な系パラメーターの最適化により可能であることである。
【００６８】
図１６、１７および１８は、ポリメラーゼ酵素を含むバイオセンサーにおけるシグナリングの増強に使用可能な、一般的なクラスの修飾ｄＮＴＰを例示する。これらの一般化合物［１６］、［１７］および［１８］それぞれで見られる様々な置換基は、独立して選択され、これらの置換基の選択は、ＤＮＡ配列決定適用において生成される電気シグナルの塩基区別を提供するために、特定のヌクレオチド塩基（「Ｎｕｃ」）について異なり得る。様々な態様では、置換基（化合物［１６］、［１７］および［１８］で様々に示す通り、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｌ１、Ｌ２およびＹ）は、独立して選択されて、以下の機構のいずれか１つまたは組み合わせに従うシグナリングの増強を提供することができるｄＮＴＰを生成し得る：
（１）置換基上の負電荷または正電荷と分子センサーの伝導部分との直接相互作用を通して。特定の実施形態を、限定ではなく、図３０Ａ〜３０Ｄに示す；
（２）置換基の１つまたは複数により提供される芳香族環と分子センサーの伝導部分との直接π−πおよび疎水性相互作用を通して。特定の実施形態を、限定ではなく、図３１Ａ〜３１Ｄに示す；
（３）例えば、Ｎ−アルキル−ピリジニウム（正の）置換基またはピレンスルホン酸（負の）置換基との、電荷およびπ−π相互作用の両方を通して。特定の実施形態を、限定ではなく、図３２Ａおよび３２Ｂに示す；
（４）（例えば、フェロセンまたはヒドロキノンなどの可逆的に酸化可能な基についての）Ｒ１の電気化学的還元および酸化を通して。特定の実施形態を、限定ではなく、図３３Ａおよび３３Ｂに示す；
（５）Ｒ１が、伝導性分子構成要素、例えばグラフェンナノリボン、ポリチオフェンポリマーまたは多環芳香族炭化水素環リボン構造を含有し、センサーが、２つの接続切断された伝導体（各々が異なる金属電極に連結している）を含有する場合、前記２つの伝導体間の伝導性連結を創出および破壊することを通して。特定の実施形態を、限定ではなく、図３４に示す；
（６）Ｒ１が、リン酸末端の付近で狭く、他の末端で広い、長く硬い分子である場合、Ｒ１の長さに依存する様式でリンカーと伝導体との間の相互作用を変更する、ポリメラーゼから伝導体へリンカーを引き伸ばす伝導体と広い末端との立体相互作用を通して。様々な態様では、リンカーは、伝導体に結合し、会合または解離に際して伝導性を変更し得る複数の基、例えば芳香族環を含有し得る。リンカー上に複数の基があるので、リンカーが短い場合、伝導体からの基の解離がないこと、リンカーが中間の長さの場合、一部の基の部分解離、およびリンカーが十分に長い場合、基の完全解離を観察することが可能であり、各々は、別個の電気シグナルを有する。Ｒ１の硬さおよび広い末端は、十分に長いＲ１の場合、この分子が結合したときに、基の部分または完全解離が起こるように、伝導体がポリメラーゼに接触しポリメラーゼから突き離されることを確実にする。特定の実施形態を、限定ではなく、図３５Ａおよび３５ＢでＲ１および伝導体とポリメラーゼとの間のリンカーについて示す；
（７）間接的に、修飾ｄＮＴＰの組み込み中にポリメラーゼのコンフォメーション変化を変更することにより。様々な実施形態では、Ｒ１は、ｄＮＴＰまたはＤＮＡ結合部位付近のポリメラーゼ上の特異的部位に結合し得るか、またはリンカーとポリメラーゼとの相互作用を変更し得る。また、置換基、ｎおよびＹの変化は、ポリメラーゼにおけるコンフォメーション変化の時間依存性または動態に影響を及ぼす場合があり、これは、電極間の導電性がコンフォメーション変化に感受性である場合、シグナルを増幅し得る。ｄＮＴＰ誘導体構造の具体的な例を、限定ではなく、図３６Ａおよび３６Ｂに示す。
【００６９】
特定の種類の修飾ｄＮＴＰが示され、説明される場合、様々な置換基の選択がさらに理解される。
【００７０】
図１６の一般化学構造［１６］を参照して、Ｎｕｃは、ＤＮＡ塩基、例えば非修飾Ａ、Ｔ、ＣまたはＧを表し、ｎは、２以上の整数であり、例えば三、四、五、六などのポリリン酸鎖長を含むいくつかの種類の化合物を生成する。Ｙは、ｄＮＴＰのネイティブ酸素または許容される代替物、例えば硫黄、ホウ素もしくはヨウ素であり得る。鎖中の最後のリン酸基にキャップをする末端基Ｒ１は、上述の数字で列挙し、本明細書で説明する機能カテゴリーの少なくとも１つを達成することができる任意の置換基を含み得る。ｎ、ＹおよびＲ１の選択は、独立してなされ、ＤＮＡ配列決定適用において生成される電気シグナルの塩基区別を提供するために、各ヌクレオチド塩基について異なってもよい。化合物［１６］において、Ｒ１は、Ｈ、アルキル（例えば、直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ５）、シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ８）、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＭｅ（ｘは１〜約２０の整数である）またはアリールから選択され、任意のアルキルは、任意の程度まで分岐し、任意のアルキル、シクロアルキルまたはアリール置換基は任意選択で、ハロゲン、ＭｅまたはＯＭｅで置換され；Ｙ＝ＯＨ、ＳＨまたはＢＨ３であり、ただし、Ｙ＝Ｏであり、かつｎ＝２である場合、Ｒ１は、Ｈではない（言い換えれば、化合物［１６］の範囲は、天然ｄＮＴＰを除外する）。
【００７１】
修飾ｄＮＴＰのクラス
図１７は、ポリメラーゼ酵素を含む分子センサーにおけるシグナル増強に有用な、別の一般的なクラスの修飾ｄＮＴＰを例示する。これらの化合物［１７］は、ＤＮＡ骨格への修飾としてのＹ、ｎ≧１のポリリン酸鎖および連結／結合二価基Ｌ１およびＬ２を伴う一般基Ｒ１を許容し、置換基Ｒ３を介した追加の許容される修飾を伴う。化合物［１７］では、Ｒ１は、Ｈ、アルキル（例えば、直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ５）、シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ８）、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＭｅ（ｘは１〜約２０の整数である）またはアリールから選択され、任意のアルキルは、任意の程度まで分岐し、任意のアルキル、シクロアルキルまたはアリール置換基は任意選択で、ハロゲン、ＭｅまたはＯＭｅで置換されている。また、化合物［１７］では、Ｙ＝ＯＨ、ＳＨまたはＢＨ３であり、Ｎｕｃは、ＤＮＡ塩基、例えば非修飾Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである。さらに化合物［１７］について、二価部分−Ｌ１−および−Ｌ２−は任意選択で、かつ独立して、共有結合、リンカー／スペーサー、例えば−（ＣＨ２）ｑ−（ｑは１〜約１０の整数である）、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙ−（ｙは１〜約８の整数である）、−（ＣＨ２）ｑ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−（ｑは１〜約１０の整数であり、ｙは１〜約８の整数である）、−ＣＯ（ＣＨ２）ｒ−（ｒは１〜約１０の整数である）、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｚ−（ｚは１〜約６の整数である）、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ−（ｍは１〜約６の整数である）、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２−（ｐは１〜約６の整数である）、１，４−ベンゼンジイル、１，３−ベンゼンジイルまたは１，２−ベンゼンジイル（炭素原子は任意選択で、かつ独立して、ハロゲン、Ｍｅ、Ｅｔ、ＯＨ、ＯＭｅまたはＣＦ３で置換され、任意の炭素原子（複数可）は任意選択で、かつ独立して、窒素原子（複数可）で置き換えられている）である。
【００７２】
図１７の化学化合物［１７］を続けて参照して、Ｌ１および／またはＬ２は、「クリック化学」を通して形成され得る基、例えば１，２，３−トリアゾール環（例えば、アルキン＋アジドから形成される）を含有し得る。１，２，３トリアゾールは任意選択で、好ましくは８員環／トリアゾール縮合を含む、１つまたは複数の追加の環に縮合され得る。化合物［１７］において、末端キャップ基Ｒ２は、任意選択で、かつ独立してハロゲン、アルキル（直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ１０）、Ｏ−アルキル（直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ１０）、ＣＦ３、ＣＨＦ２Ｏ、ＲＳＯ２、アミンまたはアミドで置換されているアルキル（例えば、直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ２０）、シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ１２）、アリール（最大１０環の多環式置換基を含む）、ヘテロアリール（最大１０環の多環式置換基を含む）、フェロセン、オリゴチオフェン、ヘテロアリール−アルキル、アリールアルキルから選択される。また、Ｒ２は、任意選択でＯ−アルキル（直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ１０）、Ｏ−ベンジル、Ｏ−スルフェート、メチル−（ＰＥＧ）ｎ（ｎは、約１〜約２０である）または−Ｏ２Ｃ−アルキル（直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ８）で置換されているオリゴ糖、例えば様々なシクロデキストリンを含む。Ｒ３は、Ｈまたはハロゲン、例えばＦから選択される。
【００７３】
図１８は、ポリメラーゼベースのバイオセンサーにおいてシグナリングを増強させるために使用可能な、別のクラスの修飾ｄＮＴＰを表す一般化合物［１８］を示す。これらの化合物［１８］において、ケトン（または代替的に、アルデヒド）およびアルコキシアミン化学は、様々な分子を形成するために使用される。化合物［１８］部類は、ＤＮＡ骨格への修飾としてのＹ置換、ｎ＞１のリン酸の鎖および連結／結合基Ｌ２を伴う一般基Ｒ１を許容し、追加の許容される修飾Ｒ３ならびに一対の基Ｒ５およびＲ４を伴う。特に、これらの形態は、ケトン（またはアルデヒド）およびアルコキシアミン化学が分子を形成するために使用される場合、得ることができる。
【００７４】
ここで一般構造［１８］を参照して、Ｒ１は、Ｈ、アルキル（例えば、直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ５）、シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ８）、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＭｅ（ｘは１〜約２０の整数である）またはアリールから選択され、任意のアルキルは、任意の程度まで分岐し、任意のアルキル、シクロアルキルまたはアリール置換基は任意選択で、ハロゲン、ＭｅまたはＯＭｅで置換されている。Ｒ３は、Ｈまたはハロゲンから選択される。さらに化合物［１８］では、Ｙ＝ＯＨ、ＳＨまたはＢＨ３であり、Ｎｕｃは、ＤＮＡ塩基、例えば、非修飾Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである。化合物［１８］のＲ４およびＲ５は独立して、Ｈ、任意選択で、かつ独立してハロゲン、アルキル（直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ１０）、Ｏ−アルキル（直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ１０）、ＣＦ３、ＣＨＦ２Ｏ、ＲＳＯ２、アミンもしくはアミドで置換されているアルキル（例えば、直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ２０）、シクロアルキル（例えば、Ｃ３〜Ｃ１２）、アリール（最大１０環の多環式置換基を含む）、ヘテロアリール（最大１０環の多環を含む）、フェロセン、オリゴチオフェン、ヘテロアリール−アルキル、アリールアルキルから選択される。また、Ｒ４およびＲ５は独立して、任意選択でＯ−アルキル（直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ１０）、Ｏ−ベンジル、Ｏ−スルフェート、メチル−（ＰＥＧ）ｎ（ｎは約１〜約２０である）または−Ｏ２Ｃ−アルキル（直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ８）で置換されている、様々なシクロデキストリンを含むオリゴ糖を含む。
【００７５】
図１８および化合物［１８］部類を続けて参照して、Ｌ２は、化合物［１７］のＬ１および／またはＬ２の通りに選択される。様々な実施形態では、−Ｌ２−は、共有結合、リンカー／スペーサー、例えば−（ＣＨ２）ｑ−（ｑは１〜約１０の整数である）、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｙ−（ｙは１〜約８の整数である）、−（ＣＨ２）ｑ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ−ＣＨ２−（ｑは１〜約１０の整数であり、ｙは１〜約８の整数である）、−ＣＯ（ＣＨ２）ｒ−（ｒは１〜約１０の整数である）、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｚ−（ｚは１〜約６の整数である）、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍ−（ｍは１〜約６の整数である）、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２−（ｐは１〜約６の整数である）、１，４−ベンゼンジイル、１，３−ベンゼンジイルまたは１，２−ベンゼンジイル（炭素原子は任意選択で、かつ独立して、ハロゲン、Ｍｅ、Ｅｔ、ＯＨ、ＯＭｅまたはＣＦ３で置換され、任意の炭素原子（複数可）は任意選択で、かつ独立して、窒素原子（複数可）で置き換えられている）から選択される。さらに、Ｌ２は、「クリック化学」を通して形成され得る基、例えば１，２，３−トリアゾール環（例えば、アルキン＋アジドから形成される）を含有してもよく、Ｌ１について図１９で示される選択肢を含んでもよい。
【００７６】
図１９は、図１７の化合物［１７］部類で使用可能な、二価リンカー置換基、Ｌ１の非限定的な実施形態を例示する。また、これらの選択肢は、図１８の化合物［１８］のＬ２についての可能性も兼ねる。示す通り、様々な例は、２つの異なるトリアゾール／ジベンゾアザシクロオクタン縮合環系［１９ａ］および［１９ｂ］ならびにトリアゾール／シクロオクタン／シクロプロパン縮合環系［１９ｃ］を含む。説明する通り、これらおよび他の構造におけるトリアゾールは、クリック化学において例示されるような、アジドとシクロオクチン環のアルキン部分との間の反応により形成することができる。
【００７７】
ｄＣＴＰに基づく修飾ｄＮＴＰの様々な実施形態を、図２０Ａ〜２０Ｆに示す。図２０Ｂ〜２０Ｆに示す実施形態は、１，２，３−トリアゾール部分をさらに含む。これらの例示的な修飾ｄＣＴＰは、例示の目的のためにのみ示され、本明細書で開示する修飾ｄＮＴＰの範囲を限定するとは意味されない。例えば、これらのようなｄＮＴＰは、ｄＣＴＰの他にも他のｄＮＴＰに基づくことができ、かつ／または異なる付属物、例えば反復単位（−（ＣＨ２）ｘ−、ＰＥＧ、ポリリン酸など）のいずれかについての他の鎖長を含むことができる。図２０Ａ〜２０Ｆの化合物は、特定のＣ−四リン酸を含み、多様な基が、ＤＢＣＯクリック化学リンカーを介して末端リン酸に付加されている。図２０Ｂおよび図２０Ｆは、それぞれ、図１０の電流対時間プロットを発生するセンサー実験において使用した化合物ｄＣＴＰ−Ｃｙ７およびｄＣＴＰ−ラクトースにおけるγ−リン酸修飾をさらに例示する。これらの修飾ｄＮＴＰに付加された様々な基は、異なる電荷（ＤＢＣＯ、Ｃｙ７、ｐｉｐＤＭＡ）、異なるサイズ（例えば、分子長）（ＰＥＧ９）および異なる極性形態（ＴＰＭＤ、ラクトース）を提供する。
【００７８】
ポリメラーゼ伸長機能アッセイは、ポリメラーゼが、これらおよび他の修飾ｄＮＴＰを組み込み得ることを示す。図２１は、かかるポリメラーゼ伸長アッセイからのゲル画像を示す。この結果に到達するために、プライムされた一本鎖鋳型を、ポリメラーゼおよび様々なｄＮＴＰ混合物とインキュベートする。酵素がｄＮＴＰを組み込み、伸長し得る場合、二本鎖ＤＮＡ産物が生成し、対応するゲルレーンにおいてバンドをもたらす。このプライマー伸長アッセイのための実験条件は、以下の通りであった：
鋳型：プライマーをアニールした、１μＭの一本鎖鋳型ＤＮＡ；
鋳型配列：（７０塩基、ポリＡＣＴＧ）：５’−ＣＧＣ  ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＡＣＴＧ  ＡＣＴＧ  ＡＣＴＧ  ＡＣＴＧ  ＡＣＴＧ  ＡＣＴＧ  ＡＣＴＧ  ＡＣＴＧ  ＡＣＴＧ  ＡＣＴＧ  ＴＴＧ  ＣＡＴ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＴＧＡ−３’（配列番号６）；
プライマー配列：（１５塩基）：５’−ＴＣＡ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＣＡＡ−３’（配列番号７）
緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ；
ｄＮＴＰ濃度：２．５ｍＭの各ヌクレオチド、１０μＭの総ｄＮＴＰ濃度；
酵素：５ユニットのクレノウ  ｅｘｏ−；
条件：３７℃で３０分間インキュベーション；
画像化：臭化エチジウム染料を含むＴＡＥ中の３．５％アガロースゲル。
【００７９】
レーンは、以下の数字キーで示す通りである。レーン４は、天然ｄＮＴＰからの産物を示す。レーン６は、４種の修飾ｄＮＴＰを使用する。レーン７、８および９は、γ−リン酸修飾のうちの３つを示す。このように、試験した全ての修飾ｄＮＴＰは、ＤＮＡ産物を生成する。レーン５は、伸長され得ないターミネーターヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を使用し、結果は、陰性対照としての産物なし／バンドなしである。また、レーン２および３は、伸長に必要な全ての反応物を含まない陰性対照である。レーン１０および１１は、さらなる陰性対照である。
ポリメラーゼ活性アッセイにおけるレーンについてのキーは、以下の通りである：
１−１００塩基ＤＮＡサイズラダー
２−ＤＮＡのみ（ポリメラーゼもｄＮＴＰもなし）
３−ＤＮＡ＋クレノウポリメラーゼのみ（ｄＮＴＰなし）
４−４種のｄＮＴＰ（ネイティブ形態）
５−４種のｄｄＮＴＰ（ジデオキシターミネーター）
６−４種の修飾ｄＮＴＰ
５−ブロモ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸
７−デアザ−２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸
７−デアザ−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸
２−チオチミジン−５’−三リン酸（２チオｄＴＴＰ）
７−ｄＣ４Ｐ−ＤＭＡ、他のｄＮＴＰネイティブ
８−ｄＣ４Ｐ−ＤＢＣＰ、他のｄＮＴＰネイティブ
９−ｄＣ４Ｐ−Ｃｙ７、他のｄＮＴＰネイティブ
１０−ｄＣ４Ｐ−ＤＭＡ＋クレノウポリメラーゼのみ、鋳型ＤＮＡなし
１１−ｄＣ４Ｐ−ＤＭＡのみ、ポリメラーゼなし
１２−低分子量ＤＮＡサイズラダー
【００８０】
図２１のポリメラーゼ活性アッセイは、これらの形態のうちの３つが、ポリメラーゼ酵素で機能的であることを示す。また、図２１で示すアッセイは、図１３Ａ〜１３Ｄおよび図１４Ａ〜１４Ｂからの修飾ｄＮＴＰのうちの４種もまた、機能的であることを示す。当該のポリメラーゼが逆転写酵素ポリメラーゼである場合、ほぼ同様の考察が、ＲＮＡの配列決定に当てはまる。
【００８１】
様々な実施形態の合成は、以下の合成有機化学のセクションで概説する。
【００８２】
合成有機化学
図２０Ａ〜２０Ｆで示す修飾ｄＮＴＰの合成を含む、本明細書中の様々な修飾ｄＮＴＰを生成するために使用した化学合成を開示する。これらの分子のうちの３つの機能性を、図２１で示す伸長アッセイ結果で例示し、これは、ポリメラーゼ酵素がこれらの分子を組み込み、伸長し得ることを示す。以下のこれらの分子は、最初の分子生成物に基を付加するためにＤＢＣＯ媒介クリック化学のプロセスに由来するが、他のクリック化学は、かかる分子のファミリーの基礎として同様に利用され得ることがさらに留意される。
【００８３】
ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＯＨ（化合物［ＩＶ］）の合成
ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＯＨ（化合物［ＩＶ］）の合成について図２２を参照されたい。
【００８４】
室温の２ｍｌの無水ＤＣＭ中の２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エタン−１−オール（化合物［Ｉ］、０．２６７ｇ、１．７８９ｍｍｏｌ）の溶液に、２ｍｌの無水ＤＣＭ中のＤＢＣＯ−ＮＨＳ（化合物［ＩＩ］、０．２４ｇ、０．５９６ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくりと添加した。添加完了後、反応溶液を室温で２時間撹拌した。ＨＰＬＣは、スクシンイミドの完全な消失を示した。反応を、冷凍庫内で−２０℃にて暗所で維持した。翌朝、反応溶液を室温まで加温し、３ｍｌのＤＣＭで希釈した。シリカゲル（５ｇ）を添加し、スラリーをロータリーエバポレーター中で乾燥するまで蒸発させた。残留粉末をＩＳＣＯローディングカートリッジ上にロードし、カラムクロマトグラフィー（１２ｇシリカゲルカラム、５〜２０％メタノール／ＤＣＭ）により精製して、０．２ｇのＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＯＨ（化合物［ＩＶ］）を得た。収率：７７％。
1H NMR (499 MHz, クロロホルム-d) δ 7.65 (dd, J = 7.6, 1.3Hz, 1H), 7.53−7.42 (m, 1H), 7.42−7.17 (m, 6H), 6.41 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 5.12 (d, J =13.9 Hz, 1H), 3.75−3.49 (m, 10H), 3.44 (dddd, J= 28.0, 10.0, 6.3, 4.0 Hz, 2H), 3.36−3.21 (m, 2H), 2.78(ddd, J = 16.8, 8.5, 6.2 Hz, 1H), 2.41 (ddd, J = 14.8, 8.5, 6.1Hz, 1H), 2.16 (dt, J = 15.1, 6.2 Hz, 1H), 2.01−1.86(m, 1H).
質量：Ｃ２５Ｈ２８Ｎ２Ｏ５の計算値、［Ｍ］：４３６．２０、実測値：［Ｍ＋２３］４５９．５  陽イオン質量（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍａｓｓ）で。
ＨＰＬＣ：１０分間ＨＴ−ＬＣ−ＭＳ法、生成物の保持時間：６．５分。
【００８５】
ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−一リン酸（化合物［Ｖ］）の合成
ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−一リン酸（化合物［Ｖ］）の合成について図２３を参照されたい。
【００８６】
ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＯＨ（化合物［ＩＶ］、３５．８ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）を、無水アセトニトリル（２×１ｍｌ）と共沸させ、次にリン酸トリメチル（０．４２ｍｌ）中に溶解した。オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３、１６μＬ、０．６４ｍｍｏｌ）を、この冷却および撹拌した溶液に添加し、反応混合物を２時間撹拌した。この反応混合物を、ピロリン酸トリブチルアンモニウム（１当量、０．０８２ｍｍｏｌ、無水ＤＭＦ中の０．５Ｍ溶液）に５分間にわたり滴下して加え、トリブチルアミン（７６ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を添加し、６０分間撹拌した。５ｍｌのＴＥＡＢ（０．１Ｍ）緩衝液を添加して反応をクエンチさせた。溶媒を真空下で除去し、得られた残留物を冷蔵庫で一晩維持した。翌朝、残留物をＣ１８  ＩＳＣＯカラム（１５．５ｇ  Ｃ１８カラム、０〜１００％アセトニトリル／水中の０．１ＭのＴＥＡＡ）により精製して、約４５ｍｇの化合物［Ｖ］を得た。残留リン酸トリメチルのため、意味がある如何なるＮＭＲスペクトルも得られなかった。化合物［Ｖ］を、化合物［ＶＩＩＩ］の合成のために次のステップで直接使用した。
ＨＰＬＣ：１０分間ＨＴ−ＬＣ−ＭＳ法、出発物質ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−アルコールの保持時間：６．５分；生成物の保持時間：１群の３つのピーク：５．０分、５．２分および５．５分。
質量：Ｃ２５Ｈ３１Ｎ２Ｏ１４Ｐ３の計算値、［Ｍ］：６７６．４、実測値：［Ｍ−１］６７５．３  陰イオン質量（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍａｓｓ）で。
【００８７】
ｄＣ−Ｐ４−クリック（化合物ＶＩＩＩ）の合成
ｄＣ−Ｐ４−クリック（化合物［ＶＩＩＩ］）の合成について図２４Ａ〜２４Ｂを参照されたい。
【００８８】
ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−一リン酸（化合物［Ｖ］、４５ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（２×１ｍｌ）と共沸させ、次に無水ＤＭＦ（１．０ｍｌ）中に溶解した。カルボニルジイミダゾール（化合物［ＶＩ］、４当量、３８．７ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で４時間撹拌した。次に、メタノール（６当量、１４．７μＬ）を添加し、撹拌を３０分間継続した。反応混合物に、０．５ｍｌのＤＭＦ中のｄＣＴＰ（ビス）トリブチルアンモニウム塩（７０．２ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）の溶液およびＭｇＣｌ２（５７ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を一晩撹拌した。翌朝、ＨＰＬＣは、より極性の弱い出発物質ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−三リン酸からより極性の強い反応生成物へのシフトを示した。粗生成物をＩＳＣＯ上の逆相Ｃ１８カラム（１５．５ｇ  Ｃ１８カラム、０〜１００％  ＡＣＮ／ＨＰＬＣグレード水中の０．１Ｍ  ＴＥＡＡ）により精製した。３０〜４０％  ＡＣＮ／ＨＰＬＣグレード水中の０．１Ｍ  ＴＥＡＡ付近で溶離した１群のピークがあった。最初の２つの画分Ｐ１（ｆ２６＋ｆ２７）を収集し、溶媒を除去し、残留物を真空下で乾燥させて９．２ｍｇの化合物［ＶＩＩＩ］を得た。中間の２つの画分Ｐ２（ｆ２８＋ｆ２９）を収集し、溶媒を除去し、残留物を真空下で乾燥させて追加の１０．７ｍｇの化合物［ＶＩＩＩ］を得た。最後の２つの画分Ｐ３（ｆ３０＋ｆ３１）を収集し、溶媒を除去し、残留物を高真空下で乾燥させてさらなる６．５ｍｇの化合物［ＶＩＩＩ］を得た。質量により、最初のピークは、主にｄ−Ｃ−Ｐ４−クリックであり、第２のピークは、ｄ−Ｃ−Ｐ４−クリックと、痕跡量のｄ−Ｃ−Ｐ５−クリック、ｄ−Ｃ−Ｐ６−クリックおよびｄ−Ｃ−Ｐ７−クリックとの混合物である。
ＨＰＬＣ：１０分間ＨＴ−ＬＣ−ＭＳ法、出発物質の保持時間：１群の３つのピーク：５．０分、５．２分および５．５分。生成物ＣＰ４−クリックの保持時間：４．８および４．９分、２つのピーク。
1H NMR (500 MHz, 酸化ジュウテリウム) δ 7.96 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 7.66(d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.60−7.30 (m, 7H), 6.33 (t,J = 6.7 Hz, 1H), 6.15 (q, J = 7.8 Hz, 1H), 5.09 (d, J =14.4 Hz, 1H), 4.78 (s, 100H), 4.67−4.53 (m, 1H), 4.21(d, J = 5.0 Hz, 4H), 4.13 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 3.83 (d, J= 14.4 Hz, 1H), 3.75 (q, J = 7.1, 6.0 Hz, 2H), 3.69 (q, J = 6.5,5.2 Hz, 2H), 3.63−3.54 (m, 2H), 3.47 (dt, J =10.6, 5.3 Hz, 1H), 3.38 (dq, J = 11.3, 5.9 Hz, 1H), 3.24−3.05 (m, 54H), 2.53 (dt, J = 15.5, 5.8 Hz, 1H), 2.44−2.32 (m, 1H), 2.24 (tdq, J = 20.8, 14.3, 7.0 Hz, 4H), 1.91(d, J = 1.2 Hz, 9H), 1.26 (td, J = 7.4, 1.0 Hz, 82H).
リンＮＭＲ：−１１．０（ｍ、積分１００）、−２２．４（ｍ、積分１００）。
質量分析。Ｍ＝９６５  陰イオン：Ｍ−Ｈの計算値：９６４．６  実測値：９６４．３。
【００８９】
ｄＣ−Ｐ４−ｐｉｐ−ＤＭＡ（化合物［Ｘ］）の合成
ｄＣ−Ｐ４−ｐｉｐ−ＤＭＡ（化合物［Ｘ］）の合成について図２５Ａ〜２５Ｂを参照されたい。
【００９０】
ＭＩＲ９６−ＩＮ−１−アジド（化合物［ＩＸ］、３．７ｍｇ、６．２８μｍｏｌ）およびｄＣ−Ｐ４−クリック（化合物［ＶＩＩＩ］、７．５ｍｇ、５．９μｍｏｌ）を、０．３ｍｌの１：１水／アセトニトリル中で混合し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。ＨＰＬＣは、出発物質ｄＣＰ４−クリックの消失およびいくつかの新しく、より極性の弱い生成物の形成を示した。粗質量は、所望の化合物［Ｘ］の形成を示した。溶媒を除去し、残留物を真空下で乾燥させて８．６ｍｇの粗化合物［Ｘ］を得た。
【００９１】
ＨＰＬＣ：１０分間ＨＴ−ＬＣ−ＭＳ法；出発物質ｄＣＰ４−クリックの保持時間：４．８および４．９分、２つのピーク；ＭＩＲ９６−アジドの保持時間：９．６分；クリック付加物の保持時間：５．４９分。
1H NMR (500 MHz, メタノール-d4) δ 8.12 (d, J =7.3 Hz, 1H), 8.01 (dot, J = 8.7, 3.2 Hz, 3H), 7.60 (d, J = 7.5Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 20.4, 11.8 Hz, 4H), 7.43−7.20(m, 2H), 7.16 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 6.38−6.19 (m, 1H), 6.02 (t, J = 16.7 Hz, 0H), 5.85 (d, J =16.2 Hz, 0H), 4.67−4.51 (m, 1H), 4.51−4.21 (m, 3H), 4.07 (s, 2H), 3.78 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 3.73−3.32 (m, 9H), 3.27−3.07 (m, 25H), 3.09−2.70 (m, 6H), 2.66 (s, 1H), 2.33 (q, J = 9.4, 8.5 Hz, 1H),2.27−1.95 (m, 3H), 1.82−1.53(m, 2H), 1.54−1.35 (m, 18H).
リンＮＭＲ：−１０．６３（ｍ、積分１００）、−２２．０６（ｍ、積分１０８）。
質量：Ｍ＝１５５４．４  陰イオン：Ｍ−１の計算値：１５５３．４（Ｍ−１である）、実測値：１５５２．８  Ｍ＋Ｎａ−２Ｈの計算値：１５７５．４  実測値：１５７４．８。
【００９２】
ｄＣＰ４−Ｃｙ７（化合物［ＸＩＩ］）の合成
ｄＣＰ４−Ｃｙ７（化合物［ＸＩＩ］）の合成について図２６Ａ〜２６Ｂを参照されたい。
【００９３】
Ｃｙ７−アジド（化合物［ＸＩ］、５．０ｍｇ、４．３７μｍｏｌ）およびｄＣＰ４−クリック（化合物［ＶＩＩＩ］、７．５ｍｇ、５．９μｍｏｌ）を、０．３ｍｌの１：１水／アセトニトリル溶液中で混合し、室温で一晩撹拌した。ＨＰＬＣは、出発物質ｄＣＰ４−クリックの消失およびいくつかの新しい生成物の形成を示した。反応混合物中に、いくらかの過剰のＣｙ７−アジド［ＸＩ］がまだ存在していた。粗質量は、所望の生成物の形成を示した。溶媒を除去し、残留物を真空下で乾燥させて７．３ｍｇの化合物［ＸＩＩ］を得た。
ＨＰＬＣ：１０分間ＨＴ−ＬＣ−ＭＳ法；出発物質ｄＣＰ４−クリックの保持時間：４．８および４．９分、２つのピーク；Ｃｙ７−アジドの保持時間：４．５９分；クリック付加物の保持時間：４．４８分。
1H NMR (500 MHz, メタノール-d4) δ 7.96−7.76 (m, 1H), 7.74 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.67−7.42 (m, 1H), 7.41−7.21 (m, 2H), 7.17−7.01 (m, 1H), 6.42 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 4.53 (d, J =37.3 Hz, 1H), 4.38−3.99 (m, 3H), 3.80−3.40 (m, 3H), 3.28−3.11 (m, 17H), 3.08−2.97 (m, 1H), 2.94 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.78 (t, J =6.4 Hz, 2H), 2.60−2.43 (m, 1H), 2.21 (p, J = 7.1Hz, 3H), 2.11−1.97 (m, 1H), 1.74 (p, J = 6.8 Hz,1H), 1.22 (t, J = 4.3 Hz, 6H).
リンＮＭＲ：妥当なリンＮＭＲを得るために利用可能な物質が少なすぎた。シグナルは非常に弱かった。しかしながら、所望の生成物は、質量スペクトルデータから明らかであった。
質量：Ｍ＝２０２１．９  陰イオン、Ｍ−６Ｈ＋５Ｎａの計算値：２１３０．９  実測値：２１３４  陰イオンで。陽イオン、Ｍ−３Ｈ＋５Ｎａの計算値：２１３２．９。実測値：２１３６  陽イオンで。（注釈：１３Ｃおよび２Ｈは観測質量を増大させる）。
【００９４】
全てのＨＰＬＣを１０分間：添加剤として酢酸アンモニウムを伴うＨＴ−ＬＣＭＳ法で行った。溶媒：２５ｍＭ酢酸アンモニウムを伴うアセトニトリルおよび水。方法：０〜０．５分：５％アセトニトリル／水；０．５〜６．５分：５〜９５％アセトニトリル／水；６．５〜９分：９５％アセトニトリル／水；９〜９．５分：９５％〜５％アセトニトリル／水；９．５〜１０分：５％アセトニトリル／水。
【００９５】
ｄＣＰ４−ＴＰＭＤ（化合物［ＸＩＶ］）の合成
ｄＣＰ４−ＴＰＭＤ（化合物［ＸＩＶ］）の合成について図２７Ａ〜２７Ｂを参照されたい。
【００９６】
ＴＭＰＤ−アジド−２ＨＣｌ（化合物［ＸＩＩＩ］、２．２８ｍｇ、８．８５μｍｏｌ）およびｄＣＰ４−クリック（化合物［ＶＩＩＩ］、７．５ｍｇ、５．９μｍｏｌ）を、０．３８ｍｌの１：１水／アセトニトリル中で混合し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。アセトニトリルを除去し、濃縮した物質を４ｇのＣ１８カラム上に直接ロードし、０〜１００％  ＡＣＮ／水中の０．１Ｍ  ＴＥＡＡを使用して精製した。３２％  ＡＣＮ／水中の０．１Ｍ  ＴＥＡＡ付近で大きなピークが溶離するのが観察された。溶離液から溶媒を除去し、残留物を真空下でさらに乾燥させて４．９ｍｇの化合物［ＸＩＶ］を得た。
【００９７】
ｄＣＰ４−ラクトース（化合物［ＸＶＩ］）の合成
ｄＣＰ４−ラクトース（化合物［ＸＶＩ］）の合成について図２８Ａ〜２８Ｂを参照されたい。
【００９８】
２−アジドエチル−β−Ｄ−ラクトピラノシド（化合物［ＸＶ］、３．２３ｍｇ、１０．４μｍｏｌ）およびｄＣＰ４−クリック（化合物［ＶＩＩＩ］、１０ｍｇ、７．８６μｍｏｌ）を、０．５ｍｌの１：１水／アセトニトリル中で混合し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。アセトニトリルを除去し、濃縮した物質を４ｇのＣ１８カラムに直接ロードし、０〜１００％  ＡＣＮ／水中の０．１Ｍ  ＴＥＡＡを使用して精製した。２５％  ＡＣＮ／水中の０．１Ｍ  ＴＥＡＡ付近で大きなピークが溶離するのが観察された。溶離液から溶媒を除去し、残留物を真空下で乾燥させて１０．４ｍｇの化合物［ＸＶＩ］を得た。ＨＴラボからの質量により、所望の質量が観察されたことが確認される。ＨＰＬＣは、生成物が出発物質ｄＣＰ４−クリック［ＶＩＩＩ］とは異なる保持時間を有することを示す。
【００９９】
ｄＣＰ４−ＰＥＧ９（化合物［ＸＶＩＩＩ］）の合成
ｄＣＰ４−ＰＥＧ９（化合物［ＸＶＩＩＩ］）の合成について図２９Ａ〜２９Ｂを参照されたい。
【０１００】
ＰＥＧ９−アジド（化合物［ＸＶＩＩ］、３．４ｍｇ、８μｍｏｌ）およびｄＣＰ４−クリック（化合物［ＶＩＩＩ］、７．５ｍｇ、５．９μｍｏｌ）を、０．３８ｍｌの１：１水／アセトニトリル中で混合し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。アセトニトリルを除去し、濃縮した混合物を４ｇのＣ１８カラムに直接ロードし、０〜１００％  ＡＣＮ／水中の０．１Ｍ  ＴＥＡＡを使用して精製した。３３％  ＡＣＮ／水中の０．１Ｍ  ＴＥＡＡで大きなピークが溶離するのが観察された。溶媒除去および真空下で２時間乾燥後、５．０ｍｇの化合物［ＸＶＩＩＩ］を得た。質量スペクトルにより、化合物［ＸＶＩＩＩ］としての正体が確認された。ＨＰＬＣは、出発物質ｄＣＰ４−クリック［ＶＩＩＩ］とは異なる保持時間を示した。
【０１０１】
修飾ｄＮＴＰのさらなる実施形態および考察
ここで、図３０Ａおよび図３０Ｂを参照して、ｄＮＴＰの末端に正電荷を提供するＲ１の例を示す。これらの例示的なＲ１部分のいずれかは、一般構造［１７］、［１８］または［１９］で使用することができる（図１６〜１９を参照のこと）。これらのＲ１選択肢は、Ｒ１上の正電荷と分子センサーの伝導部分（例えば、架橋分子）との直接相互作用を通して、組み込み事象について独特な電気シグナル発生を提供する。図３０Ａでは、正電荷は、ｐＨ依存的であり、以下の部分構造：
【化２７】
2019524764.tif 000029
で示す通り、プロトン化により三級窒素原子のいずれかまたは両方に位置する。
【０１０２】
図３０Ｂで同様に、ｄＮＴＰのＲ１基上の正電荷は、ｐＨ依存的であり、以下の部分構造：
【化２８】
2019524764.tif 000030
で示す通り、プロトン化により三級窒素に位置する。
【０１０３】
ここで、図３０Ｃおよび図３０Ｄを参照して、ｄＮＴＰのシグナリング末端に負電荷を提供するＲ１の例を示す。これらの例示的なＲ１部分のいずれかを置換すると、一般構造［１７］、［１８］または［１９］になり得る（図１６〜１９を参照のこと）。これらのＲ１選択肢は、Ｒ１上の負電荷と分子センサーの伝導部分（例えば、架橋分子）との直接相互作用を通して、独特な電気シグナル発生を提供する。図３０ＣのＲ１部分は、スルホン酸基が脱プロトン化されてスルホン酸アニオン（すなわち、ＳＯ３−）になった場合、単一の負電荷を提供する。同様に、図３０ＤのＲ１部分は、４つ全てのスルホン酸基が各々脱プロトン化されてそれらの各々のスルホン酸アニオンになった場合、４個の負電荷を提供することができ、インドールの四級化窒素が永久正電荷を有することおよび好適な緩衝液中に含まれる場合、分子全体が最大で−３電荷を有することを認識する。様々な緩衝条件で、図３０ＤのＲ１置換基を有する修飾ｄＮＴＰは、０、−１、−２または−３の全体の電荷を有し得る。
【０１０４】
図３１Ａ〜３１Ｄは、Ｒ１上の芳香族環と分子センサーの伝導部分（例えば、架橋分子）との直接π−πおよび疎水性相互作用を通して独特な電気シグナル発生のための機構を提供する、Ｒ１の４つの別々の選択肢を例示する。概して、これらの置換基は、主にＰＥＧ単位を含むテザーとの組み合わせの芳香族環系（ベンゼン、ナフタレン、アントラセンなど）を含む。テザーの長さは、例えば、修飾ｄＮＴＰがポリメラーゼにより組み込まれたときに芳香族シグナリング基がセンサーの伝導部分と相互作用する可能性を最適化するために、単位の付加または削減により調整することができる。
【０１０５】
図３２Ａ〜３２Ｂは、電荷およびπ相互作用の両方を通して独特な電気シグナル発生のための機構を提供する、Ｒ１についての２つのさらなる選択肢を例示する。図３２Ａの例は、Ｎ−アルキルピリジニウム部分（正電荷）を含み、一方で、図３２Ｂの例は、ピレンスルホン酸部分（負電荷）を含む。
【０１０６】
図３３Ａは、電気化学酸化を通して独特な電気シグナル発生のための機構を提供する、Ｒ１の選択肢を例示する。この例では、Ｒ１上の１，４−ベンゾキノン部分は、対応するラジカルアニオンに還元可能であり、それは、かかる修飾ｄＮＴＰがポリメラーゼにより組み込まれたときにセンサーの伝導部分と相互作用することができる。同様に、図３３Ｂは、電気化学酸化を通して独特な電気シグナル発生のための機構を提供する、Ｒ１の選択肢を例示する。この例では、Ｒ１上に存在するフェロセン（Ｆｅ（ｎ５−Ｃ５Ｈ５）２）部分は、１電子酸化還元プロセスを受けてフェロセニウムラジカル（［Ｃｐ２Ｆｅ］・＋）になり、それは、かかる修飾ｄＮＴＰがポリメラーゼにより組み込まれたときにセンサーの伝導部分と相互作用することができる。
【０１０７】
図３４は、図１６の化合物［１６］のＲ１基の選択肢を例示する。この置換基を検討する別の方法は、図１８の化合物［１８］のＲ４、Ｒ５、Ｌ２およびＲ１の組み合わせとしてである。この置換基は、修飾ｄＮＴＰに組み込まれると、２つの電極間の伝導性連結を創出および破壊することにより独特な電気シグナル発生のための機構を提供する。図３４の置換基は、長い伝導性ポリチオフェンポリマー部分（その長さは、整数ｎ＝１〜１００に依存する）を含む。任意の修飾ｄＮＴＰの非存在下では、ポリメラーゼと架橋分子との組み合わせ構造は、ソース電極とドレイン電極との間で非常にわずかな電流しか流さないと仮定される。また、好適な伝導性のポリマーにより橋渡しされた場合、識別可能な程はるかに高い電流を提供し得るように、電極への左右の伝導性経路があると仮定される。入ってくる修飾ｄＮＴＰが、例示するＲ１基を介してこの伝導性ポリマー接続を一過的に提供することが意図される。言い換えれば、別の場合に開放している回路（ポリメラーゼ、架橋分子および電極を含む）は、図３４で示すＲ１の伝導性ポリマー部分が、組み込み事象中に架橋の非伝導性領域にわたって置かれた場合、閉じられ得る。したがって、図３４は、組み込み事象中に別の場合に開放している回路を閉じるために使用され得る、伝導性ポリマーの１つの好適なファミリーを示す。Ｒ１の様々な実施形態では、ｎは、例えば約０．５ｎｍ〜約５０ｎｍの範囲のＲ１の長さを提供するために、１〜約１００の整数であり得る。他の実施形態では、ｎは、Ｒ１の長さが約１ｎｍ〜約２０ｎｍであるように、選択され得る。
【０１０８】
様々な実施形態では、架橋分子は、架橋分子をポリメラーゼに連結する分岐点にシクロヘキサン−１，４−ジイルなどの絶縁性連結を故意に含み得る。図３４のＲ１は、ｄＮＴＰの伝導性ポリマー部分とポリリン酸との間のＲ１（ここでは、γ−リン酸Ｏ原子に接続し得る、短いＰＥＧ−４スパン（ｓｐａｎ）、オキシム官能性およびテトラメチレン部分であることが示される）の整数ｎおよびリンカー部分の構造によって、活性部位へのｄＮＴＰ結合中、組み込み後、または両方のときに、絶縁性連結を横切って伝導性連結を創出し得る。Ｒ１は、架橋の任意の他の絶縁性セグメントにわたる一過性伝導性連結を同様に創出し、伝導性経路を完成し得る。
【０１０９】
図３５Ａは、別のシリーズの独特な修飾ｄＡＴＰ分子を示す。これらの修飾ｄＡＴＰについて、ｎは、１〜約１００の整数である。様々な例では、ｎは、分子の反復部分の長さが約０．５ｎｍ〜約５０ｎｍまたは約１ｎｍ〜約２０ｎｍの長さになるように選択され得る。図３５Ａの修飾ｄＡＴＰは、独特な電気シグナル発生のための機構を提供する。四リン酸部分の最後のリン酸基で始まり、分子の末端まで及ぶ、ｄＡＴＰ分子のＲ１部分は、リン酸連結付近で立体的に狭く始まり、反対の末端で立体的に大きく終わる、長く硬い「ステム（ｓｔｅｍ）」構造を含み、これは、嵩高い縮合環系、回転するアミド結合および２つのピリジン置換基を含むことが分かる。ＤＮＡ架橋、グラフェンナノリボン架橋または芳香族環を含む他の架橋を含むセンサーにおいて、図３５Ａの修飾ｄＡＴＰの広い末端は、センサーの架橋分子と立体的に相互作用して、リンカー部分（すなわち、反復ピラジン／ピペラジンサブユニット）をポリメラーゼから伝導性架橋に伸ばし、Ｒ１の長さに依存した様式でリンカー部分と伝導性架橋との間の相互作用を変更する。
【０１１０】
図３５Ｂは、図３５Ａで示すｄＡＴＰなどの様々な修飾ｄＮＴＰとの相互作用のために、分子センサーにおいてポリメラーゼと架橋分子との間に結合され得る特別なテザーを示す。図３５Ｂの例は、伝導性架橋に結合し、会合および解離に際して伝導性を変更し得る複数の芳香族環（テザーの骨格の脇に断続的な付属物として配置されるベンゼン、ナフタレン、ピレンなど）を含む。図３５Ｂで示すようにテザー上に複数の基があるので、テザーが短い場合、伝導性架橋からの基の解離がないこと、テザーが中間の長さの場合、一部の基の部分解離、およびテザーが十分に長い場合、基の完全解離を観察することが可能であり、これらの各々は、伝導性架橋とのこの相互作用を通して別個の識別可能な電気シグナルを生成する。したがって、かかる様々な形態のテザーは、様々なＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔ修飾ｄＮＴＰが、識別可能なシグナルを生成する手段を提供する。リンカーの硬さおよびＲ１基の遠位の広い末端は、十分に長いＲ１の場合、これが結合したときに、基の部分解離または完全解離が起こるように伝導性架橋がポリメラーゼと接触しポリメラーゼから突き放されることを確実にする。
【０１１１】
図３５Ａの修飾ｄＡＴＰと図３５Ｂの共有結合したテザーとの組み合わせは、修飾ｄＡＴＰの組み込み中にシグナリングの増強のための独特な機会を提供する。図３５Ｂのテザーのスルフィド末端は、ポリメラーゼのアミノ酸に（スルフィドまたはジスルフィド結合を介して）共有結合し得る。テザーの他の末端は、いくつかの可能性を介して架橋分子に共有結合し得る。多環芳香族炭化水素伝導体架橋分子（例えば、グラフェン）について、テザーの他の末端は、Ｃ−Ｃ結合、Ｏ−Ｃ結合またはＳ−Ｃ結合を通して架橋に、例えばアリール連結を通して（例えば、アレンジアゾニウム塩を使用して形成される）伝導体に、またはアジレン連結もしくはシクロプロピル連結を通して（ナイトレンまたはカルベンを使用して形成される）伝導体に、共有結合し得る。ＤＮＡ架橋分子について、テザーは、デオキシリボースの２’位に、修飾塩基上の位置に、またはＰ−ＳもしくはＰ−Ｃ結合を通してリン酸基に連結し得る。
【０１１２】
図３５Ａの修飾ｄＡＴＰが、組み込み中にポリメラーゼ活性部位において非共有結合した場合、修飾ｄＡＴＰは、図３５Ｂのテザーと立体的に相互作用する。修飾ｄＡＴＰ（図３５Ａ）と特別なテザー（図３５Ｂ）との相互作用は、架橋との断続的な相互作用により、または架橋へのポリメラーゼの距離もしくは配向を変えること（例えばテザーに結合することによりテザーを短縮または延長すること）によりシグナリング電流に影響を及ぼす。概して、修飾ｄＮＴＰ、例えば図３５Ａの修飾ｄＡＴＰは、テザーと相互作用し、それによって架橋に対するポリメラーゼのコンフォメーションまたは距離を変更し、その手段により架橋電流をモジュレートし、シグナルを生成するように設計され得る。
【０１１３】
図３６は、伝導性架橋／ポリメラーゼ−テザーの例を示し、ここではポリメラーゼ−テザーは、ポリメラーゼのコンフォメーションを変更し、それゆえにシグナルに影響を及ぼすように図３５Ａの修飾ｄＮＴＰとの相互作用を提供する。この修飾ｄＮＴＰはそれによって、組み込み事象中のポリメラーゼのコンフォメーション変化を変更することにより間接的に、独特な電気シグナル発生のための機構を提供する。概して、図３５の修飾ｄＮＴＰなどの修飾ｄＮＴＰは、テザーと相互作用し、それによって架橋に対するポリメラーゼのコンフォメーションまたは距離を変更し、その手段により架橋電流をモジュレートし、シグナルを生成するように設計され得る。
【０１１４】
図３７は、いくつかの修飾ｄＮＴＰおよびこれらの修飾ｄＮＴＰについてのポリメラーゼ活性アッセイの結果を示す。この実験の目的は、クレノウポリメラーゼがこれらの多様な化学修飾で活性であり得ることを示すことである。
【０１１５】
追加の修飾ｄＮＴＰとして、チオまたはボラノ修飾を含む以下の化合物：
【化２９】
2019524764.tif 000031
が挙げられる。
【０１１６】
上記の構造により示す通り、チオおよびボラノ修飾は、ｄＮＴＰの三リン酸のα−、β−またはγ−リン酸に存在し得る。塩基に近接したこれらの小規模な修飾の設置は、酵素作用の変更または分子架橋への修飾の近接を通して、これらの修飾ｄＮＴＰを含む組み込みでさえもシグナリングを増強することができ、一方で、それでも酵素により非常に十分に許容される。また、同様の数の結合を組み込む他の原子レベル修飾は、硫黄およびホウ素置換の範囲を超えて（例えば、ヨウ素原子）考慮することができる。
【０１１７】
修飾ｄＮＴＰのアフィニティ基
本開示のさらなる実施形態は、分子センサーを通る電流に対するシグナリング基の影響をさらに増強させるための、センサー上に位置する対応するアフィニティ相補体（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を伴う修飾ｄＮＴＰのアフィニティ基の使用を含む。様々な実施形態では、アフィニティ基は、テザーのシグナリング基末端により近接して、ポリリン酸鎖とシグナリング基との間に提供される。この配置の目的は、センサーの分子複合体に対するシグナリング基の最も影響力のある位置決めを促進することおよびｄＮＴＰとセンサーの伝導性架橋分子との相互作用の持続期間を増大させることである。複合体上に存在するアフィニティ相補体は、修飾ｄＮＴＰ上の電荷基の位置決めおよび滞在時間（ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ）が、架橋を通る電流に対してより大きな影響を有するように促進する。ある特定の例では、様々なアフィニティ基は、ｄＮＴＰの各々の塩基（Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ）についてｄＮＴＰ上で用いられ得る。アフィニティ基は、センサーの分子架橋として使用されるＤＮＡオリゴの相補的部分にアフィニティを有し得る一本鎖ＤＮＡ５ｍｅｒのように、非常に特異的であってもよく、またはそれは、架橋分子上の正電荷に引き付けられるｄＮＴＰ上の負電荷のように、電荷アフィニティを単に示してもよい。
【０１１８】
また、ＤＮＡアナログを含む相補的オリゴは、より短いオリゴで調節可能な結合エネルギーを提供し得るので、この目的のために有益であり得る。例えば、かかるオリゴは、ネイティブＤＮＡの代わりにＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）もしくはＬＮＡ（ロックド核酸）または塩基アナログ、例えばイノシンを含み得る。グラフェンナノリボン架橋の場合について、ピレンを含む基は、ピレンとグラフェンとのパイ−パイスタッキング相互作用により架橋へのアフィニティを有し得る。より一般的には、架橋に結合したピレン基およびｄＮＴＰ上に位置するピレン基は、π−πスタッキングにより互いにアフィニティを有し得る。他のアフィニティ基は、架橋に結合した物質と同族の物質結合ペプチド；またはタンパク質複合体の２つの構成要素などの相互作用タンパク質；または小分子もしくはペプチド抗原および架橋にコンジュゲートしたＦａｂ抗体結合ドメインの同族抗体；またはアプタマーを使用し得る。これらの相互作用を秒の時間尺度を超えて持続させることは望ましくなく、１０ミリ秒〜１００ミリ秒の尺度でのみ好ましいので、かかる結合は好ましくは、より弱い結合または一過的な相互作用の条件下で選択され、行われ得る。様々なｄＮＴＰアフィニティ基について同じまたは異なる、１つまたは複数のアフィニティ相補体が、センサー複合体上に存在し得る。様々な実施形態では、３ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ範囲のＤＮＡオリゴは、修飾ｄＮＴＰについて選択可能な特異的アフィニティ基として十分であり、ＤＮＡの修飾形態を使用するオリゴまたはＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡアナログも十分である。
【０１１９】
ポリメラーゼを含む分子センサーにおけるＤＮＡ配列決定中のｄＮＴＰ組み込み事象のシグナリングの増強のための修飾ｄＮＴＰ、修飾ｄＮＴＰを合成する方法および修飾ｄＮＴＰの使用が提供される。本明細書中の詳細な説明において、「様々な実施形態」、「一実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「一実施形態（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「例の実施形態」などについての言及は、説明される実施形態が特定の特色、構造または特徴を含み得るが、どの実施形態も特定の特色、構造または特徴を必ずしも含まなくてもよいことを示す。さらに、かかる句は、同じ実施形態を必ずしも言及していない。さらに、特定の特色、構造または特徴が一実施形態と関連して説明される場合、明白に説明されているかどうかにかかわらず、他の実施形態と関連してかかる特色、構造または特徴に影響を及ぼすことは当業者の知識の範囲内であることが提示される。本説明を読めば、代替の実施形態においてどのように本開示を実行するかは、関連分野の当業者に明らかである。
【０１２０】
特定の実施形態について、利益、他の利点および問題に対する解決策が、本明細書で説明されている。しかしながら、利益、利点、問題に対する解決策および任意の利益、利点または解決策が起こるか、またはより明白になることをもたらし得る任意の要素は、本開示の重要な、必要な、または本質的な特色または要素として解釈されるべきではない。本開示の範囲はしたがって、付属の特許請求の範囲のみによって限定されるべきであり、ここで、単数形の要素についての言及は、明白に示さない限り「１つおよびただ１つ」を意味するとは意図されず、むしろ「１つまたは複数」を意味すると意図される。さらに、特許請求の範囲または明細書で「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つ」または「Ａ、ＢまたはＣのうちの少なくとも１つ」と同様の句が使用される場合、句は、Ａ単独が一実施形態に存在し得ること、Ｂ単独が一実施形態に存在し得ること、Ｃ単独が一実施形態に存在し得ること、または要素Ａ、ＢおよびＣの任意の組み合わせ、例えばＡおよびＢ、ＡおよびＣ、ＢおよびＣもしくはＡおよびＢおよびＣが単一の実施形態に存在し得ることを意味すると解釈されることが意図される。
【０１２１】
当業者に公知の上述の様々な実施形態の要素の全ての構造的、化学的および機能的均等物は、参照により本明細書に明白に組み込まれ、本特許請求の範囲により包含されると意図される。さらに、分子、組成物または使用は、それが本特許請求の範囲により包含されるために、本開示により解決されることが求められる各問題およびどの問題にも取り組むことが必要ではない。さらに、本開示の化学物質、構成要素または使用は、化学物質、構成要素または使用が特許請求の範囲に明白に列挙されているかどうかにかかわらず、公に捧げられるとは意図されない。要素が「のための手段（ｍｅａｎｓ  ｆｏｒ）」という句を使用して明白に列挙されない限り、請求要素は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２（ｆ）の適用を受けることは意図されない。本明細書で使用されるとき、「を含む」、「を含むこと」という用語またはそれらの任意の他の変形は、要素のリストを含む化学物質、化学組成物、プロセス、方法、物品または装置がそれらの要素のみを含むのではなく、明白に列挙されていないか、またはかかる化学物質、化学組成物、プロセス、方法、物品もしくは装置に固有の他の要素を含み得るように、非排他的包含を含むと意図される。
【図１】
2019524764.tif 000058
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2019524764.tif 000063
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
2019524764.tif 000069
【図１０】
2019524764.tif 000070
【図１１】
2019524764.tif 000071
【図１２】
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【図１３】
2019524764.tif 000073
【図１４】
2019524764.tif 000074
【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
2019524764.tif 000079
【図１８】
2019524764.tif 000080
【図１９】
2019524764.tif 000081
【図２０Ａ】
2019524764.tif 000082
【図２０Ｂ】
2019524764.tif 000083
【図２０Ｃ】
2019524764.tif 000084
【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
2019524764.tif 000086
【図２０Ｆ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
2019524764.tif 000090
【図２４Ａ】
2019524764.tif 000091
【図２４Ｂ】
2019524764.tif 000092
【図２５Ａ】
2019524764.tif 000093
【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
2019524764.tif 000099
【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
2019524764.tif 000104
【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２】
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【図３３】
2019524764.tif 000112
【図３４】
2019524764.tif 000113
【図３５Ａ】
2019524764.tif 000114
【図３５Ｂ】
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【図３６】
2019524764.tif 000116
【図３７】
2019524764.tif 000117
【配列表】
2019524764000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月2日(2019.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
【図１】図１は、ＤＮＡ配列決定のための分子電子バイオセンサーの一実施形態の略図である。
【図２】図２は、ポリメラーゼを含む分子センサー構造２００の一実施形態を例示する。
【図３】図３は、分子センサー上の電気測定のための試験設定の一実施形態の図解を例示する。
【図４】図４は、架橋分子を結合するために使用可能な金属金ドット接点をさらに含む、金属電極対の電子顕微鏡像を示す。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、ポリメラーゼベースのセンサーからのシグナリングを増強させるための修飾ｄＮＴＰの使用を例示する。図５Ａは、標準のｄＮＴＰで（左）、および修飾ｄＮＴＰで（右）作動中のセンサーを例示する。図５Ｂは、標準のｄＮＴＰで（左）作動中の、および修飾ｄＮＴＰで（右）作動中のセンサーから記録した、例示的な電流対時間プロットを例示する。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、ポリメラーゼベースのセンサーからのシグナリングを増強させるための修飾ｄＮＴＰの使用を例示する。図５Ａは、標準のｄＮＴＰで（左）、および修飾ｄＮＴＰで（右）作動中のセンサーを例示する。図５Ｂは、標準のｄＮＴＰで（左）作動中の、および修飾ｄＮＴＰで（右）作動中のセンサーから記録した、例示的な電流対時間プロットを例示する。
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、鋳型を標準のｄＮＴＰを含む配列Ｇ４Ａ８−Ｇ４Ａ８−Ｇ４Ａ８−Ｇ４Ａ８（配列番号１）で加工処理しながら、ポリメラーゼセンサーから得た配列決定シグナルを例示する。
【図６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、鋳型を標準のｄＮＴＰを含む配列Ｇ４Ａ８−Ｇ４Ａ８−Ｇ４Ａ８−Ｇ４Ａ８（配列番号１）で加工処理しながら、ポリメラーゼセンサーから得た配列決定シグナルを例示する。
【図７】図７は、修飾ｄＮＴＰでの配列決定シグナルを例示する。これらのシグナルは、修飾ｄＧＴＰ（つまり、デアザｄＧＴＰ）を含むＤＮＡ鋳型｛ＧＴＣＡ｝１０−ＧＡＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣ（配列番号２）について得られた。
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、修飾ｄＮＴＰでの配列決定シグナルの別の実施形態を例示する。配列決定シグナルデータは、修飾ｄＧＴＰ（デアザｄＧＴＰ）を含むＤＮＡ鋳型｛ＧＴＣＡ｝１０−ＧＡＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣ（配列番号２）について得られた。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、修飾ｄＮＴＰでの配列決定シグナルの別の実施形態を例示する。配列決定シグナルデータは、修飾ｄＧＴＰ（デアザｄＧＴＰ）を含むＤＮＡ鋳型｛ＧＴＣＡ｝１０−ＧＡＡＣＣＧＡＧＧＣＧＣＣＧＣ（配列番号２）について得られた。
【図９】図９は、修飾ｄＮＴＰでの配列決定シグナルの別の実施形態を示す。配列決定シグナルデータは、修飾ｄＧＴＰ（デアザｄＧＴＰ）を含むＤＮＡ鋳型Ａ２０−Ｃ３−Ａ３０−Ｇ（配列番号３）について得られた。
【図１０】図１０は、修飾ｄＮＴＰでの配列決定シグナルの別の実施形態を示す。配列決定シグナルデータは、ガンマ−リン酸修飾ｄＣＴＰ（等量で混合したｄＣ４Ｐ−ラクトースおよびｄＣ４Ｐ−Ｃｙ７）を含むＤＮＡ鋳型（ＧＴ１０−Ｔ３−ＧＴ１０−Ａ３−ＧＴ１０−Ｃ３−ＧＴ１０）（配列番号４）について得られた。
【図１１】図１１は、修飾ｄＮＴＰが、分子電子センサーにおいてポリメラーゼ活性からのシグナルを増強させることができる機構を示す。
【図１２】図１２は、標準のｄＮＴＰを示し、ポリメラーゼ酵素により十分に許容される修飾を作製し得る化学構造について（「星」の位置により）示す。
【図１３】図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄは、修飾ｄＮＴＰの実施形態を例示し、「星」は、天然ｄＮＴＰからの修飾の部位を示す。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、デアザプリン構造を含む修飾ｄＮＴＰの実施形態を例示し、７位の「星」は、Ｃ原子がＮ原子を置き換えた位置を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃは、三リン酸（ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のγ−リン酸（γ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の様々な誘導体化を含む修飾ｄＮＴＰの実施形態を例示し、天然ｄＮＴＰにクーロン力電荷の増加を付加する能力を例示する。
【図１５Ｂ】図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃは、三リン酸のγ−リン酸の様々な誘導体化を含む修飾ｄＮＴＰの実施形態を例示し、天然ｄＮＴＰにクーロン力電荷の増加を付加する能力を例示する。
【図１５Ｃ】図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃは、三リン酸のγ−リン酸の様々な誘導体化を含む修飾ｄＮＴＰの実施形態を例示し、天然ｄＮＴＰにクーロン力電荷の増加を付加する能力を例示する。
【図１６】図１６は、一般的なクラスの修飾ｄＮＴＰ化合物の一実施形態を例示する。
【図１７】図１７は、一般的なクラスの修飾ｄＮＴＰ化合物の別の実施形態を例示する。
【図１８】図１８は、一般的なクラスの修飾ｄＮＴＰ構造の別の実施形態を例示する。
【図１９】図１９は、図１７中の構造［１７］部類（ｇｅｎｕｓ）で見られる二価リンカー部分Ｌ１についての選択肢を例示する。
【図２０Ａ】図２０Ａ〜２０Ｆは、γ−修飾ｄＣＴＰの特定の実施形態を例示する。
【図２０Ｂ】図２０Ａ〜２０Ｆは、γ−修飾ｄＣＴＰの特定の実施形態を例示する。
【図２０Ｃ】図２０Ａ〜２０Ｆは、γ−修飾ｄＣＴＰの特定の実施形態を例示する。
【図２０Ｄ】図２０Ａ〜２０Ｆは、γ−修飾ｄＣＴＰの特定の実施形態を例示する。
【図２０Ｅ】図２０Ａ〜２０Ｆは、γ−修飾ｄＣＴＰの特定の実施形態を例示する。
【図２０Ｆ】図２０Ａ〜２０Ｆは、γ−修飾ｄＣＴＰの特定の実施形態を例示する。
【図２１】図２１は、修飾ｄＮＴＰの機能試験として使用したポリメラーゼ伸長アッセイからのゲル画像である。
【図２２】図２２は、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ（化合物［ＩＶ］）の合成を例示する。
【図２３】図２３は、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−一リン酸（化合物［Ｖ］）の合成を例示する。
【図２４Ａ】図２４Ａ〜２４Ｂは、ｄＣ４Ｐ−ＤＢＣＯ（化合物［ＶＩＩＩ］）の合成を例示する。
【図２４Ｂ】図２４Ａ〜２４Ｂは、ｄＣ４Ｐ−ＤＢＣＯ（化合物［ＶＩＩＩ］）の合成を例示する。
【図２５Ａ】図２５Ａ〜２５Ｂは、ｄＣＴＰ−ｐｉｐＤＭＡ（化合物［Ｘ］）の合成を例示する。
【図２５Ｂ】図２５Ａ〜２５Ｂは、ｄＣＴＰ−ｐｉｐＤＭＡ（化合物［Ｘ］）の合成を例示する。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜２６Ｂは、ｄＣＴＰ−Ｃｙ７（化合物［ＸＩＩ］）の合成を例示する。
【図２６Ｂ】図２６Ａ〜２６Ｂは、ｄＣＴＰ−Ｃｙ７（化合物［ＸＩＩ］）の合成を例示する。
【図２７Ａ】図２７Ａ〜２７Ｂは、ｄＣＴＰ−ＴＰＭＤ（化合物［ＸＩＶ］）の合成を例示する。
【図２７Ｂ】図２７Ａ〜２７Ｂは、ｄＣＴＰ−ＴＰＭＤ（化合物［ＸＩＶ］）の合成を例示する。
【図２８Ａ】図２８Ａ〜２８Ｂは、ｄＣＴＰ−ラクトース（化合物［ＸＶＩ］）の合成を例示する。
【図２８Ｂ】図２８Ａ〜２８Ｂは、ｄＣＴＰ−ラクトース（化合物［ＸＶＩ］）の合成を例示する。
【図２９Ａ】図２９Ａ〜２９Ｂは、ｄＣＴＰ−ＰＥＧ９（化合物［ＸＶＩＩＩ］）の合成を例示する。
【図２９Ｂ】図２９Ａ〜２９Ｂは、ｄＣＴＰ−ＰＥＧ９（化合物［ＸＶＩＩＩ］）の合成を例示する。
【図３０Ａ】図３０Ａ〜３０Ｂは、Ｒ１上の正電荷と分子センサーの伝導部分との直接相互作用を提供する、Ｒ１置換基の２つの実施形態を例示する。
【図３０Ｂ】図３０Ａ〜３０Ｂは、Ｒ１上の正電荷と分子センサーの伝導部分との直接相互作用を提供する、Ｒ１置換基の２つの実施形態を例示する。
【図３０Ｃ】図３０Ｃ〜３０Ｄは、Ｒ１上の負電荷と分子センサーの伝導部分との直接相互作用を提供する、Ｒ１置換基の２つの実施形態を例示する。
【図３０Ｄ】図３０Ｃ〜３０Ｄは、Ｒ１上の負電荷と分子センサーの伝導部分との直接相互作用を提供する、Ｒ１置換基の２つの実施形態を例示する。
【図３１】図３１Ａ〜３１Ｄは、Ｒ１上の芳香族環と分子センサーの伝導部分との直接π−πおよび疎水性相互作用を提供する、Ｒ１置換基の４つの実施形態を例示する。
【図３２】図３２Ａ〜３２Ｂは、例示されるＲ１置換基を有する修飾ｄＮＴＰと分子センサーの伝導部分との間の電荷およびπ相互作用の両方を提供する、Ｒ１置換基の２つの実施形態を例示する。
【図３３】図３３Ａ〜３３Ｂは、例示されるＲ１置換基を有する修飾ｄＮＴＰと分子センサーの伝導部分との間のラジカルアニオン電荷またはラジカルカチオン電荷相互作用を提供する、Ｒ１置換基の２つの実施形態を例示する。
【図３４】図３４は、２つの伝導体（ｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）間の伝導性連結を創出および破壊することを通した独特な電気シグナル発生のための機構を提供する、Ｒ１置換基の一実施形態を例示する。
【図３５Ａ】図３５Ａは、修飾ｄＡＴＰの一実施形態を例示する。
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、分子センサーにおいてポリメラーゼと架橋分子との間で共有結合され得る特別なテザーの一実施形態を例示し、ここでそれは、組み込み事象中に様々な修飾ｄＮＴＰと相互作用するのに利用可能であり得る。
【図３６】図３６は、修飾ｄＡＴＰの組み込み中にポリメラーゼのコンフォメーション変化を変更することができる修飾ｄＡＴＰを示す。
【図３７Ａ】図３７は、様々な修飾ｄＮＴＰの化学構造を、これらの修飾ｄＮＴＰを試験するために使用したポリメラーゼ伸長アッセイからのゲル画像と共に例示する。
【図３７Ｂ】同上。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【国際調査報告】
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