(57)【要約】  活性酸素種（ＲＯＳ）阻害剤を含有する、化学的に誘発された脱毛症（ＣＩＡ）の冷却療法および治療における使用のための組成物。
2019524664.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学的に誘発された脱毛症（ＣＩＡ）の治療のための冷却療法において使用するための、活性酸素種（ＲＯＳ）阻害剤を含有する組成物。
【請求項２】
前記組成物が１種以上のＲＯＳ阻害剤を含み、および冷却療法が頭皮冷却を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物を制御された温度環境で送達する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物を局所的に投与する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＲＯＳ阻害剤を含有する組成物を頭皮に適用する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＲＯＳ阻害剤が、細胞透過性抗酸化剤および／またはＲＯＳスカベンジャーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＲＯＳ阻害剤が直接薬理学的阻害剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＲＯＳ阻害剤がＮ−アセチル−システイン（ＮＡＣ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＲＯＳ阻害剤が合成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記阻害剤が合成されたＮＡＣである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＲＯＳ阻害剤が、１種以上の天然化合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＲＯＳ阻害剤がビタミンＣを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＲＯＳ阻害剤が、１種以上のフラボノイドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＲＯＳ阻害剤が、１種以上のフラバノールを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＲＯＳ阻害剤がケルセチンを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記１種以上のＲＯＳ阻害剤が細胞透過性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＲＯＳ阻害剤が、ＲＯＳ生合成（ＲＯＳ生成細胞シグナル伝達経路）を妨げる細胞透過性の生物学的または薬理学的阻害剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
化学療法誘発性脱毛症の治療のための薬剤であって、ＲＯＳ阻害剤および局所適用に適した担体を含む、薬剤。
【請求項１９】
冷却することによっておよびＲＯＳ阻害剤を含む組成物を使用することによって毛髪または毛包を保護する方法。
【請求項２０】
少なくとも頭皮の局所領域を周囲温度より低い温度および／または体温より低い温度に冷却する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
制御された温度環境でのＲＯＳ阻害化合物または組成物の送達を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記冷却を、冷却装置を用いて身体部分上で局所的に実施する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記身体部分が頭皮である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記冷却装置がスカルキャップおよび／または同様のものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物を局所的に投与する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が、身体または頭皮に適用されるＲＯＳ阻害剤を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記温度が体温（実質的に３７℃）未満である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物を適用し、隣接温度または周囲環境を２６℃以下に低下させるかまたは冷却する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物を適用し、隣接温度または周囲環境を２４℃以下に低下させるかまたは冷却する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物を適用し、隣接温度または周囲環境を２２℃以下に低下させるかまたは冷却する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記冷却が、実質的に１８〜２６℃の範囲にする、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
冷却装置またはキャップを用いて患部または頭皮の領域を冷却する、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願が関連する発明は、化学療法誘発性脱毛症（ＣＩＡ）、化学療法剤誘発性脱毛、毛包死および／または成長期脱毛症に対抗するための組成物および装置によるこの組成物の使用である。
【背景技術】
【０００２】
以下の説明は、もっぱらヒトケラチノサイト、特に頭皮毛包における化学療法剤誘発毒性の予防に言及するが、当業者は、本発明が身体の異なる部分の毛包または実際に異なる動物の毛包に関して使用できることを理解する。
【０００３】
化学療法剤は、毛包発達の段階の移行を妨げる、毛包ジストロフィを刺激する、または早期毛包退行を誘導することによってＣＩＡを誘導する（Ｐａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９４；Ｔｒｕｅｂ，２００９；Ｙｅａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。休止期脱毛症は、成長期の毛髪のより大きな割合が早期に休止期へと進行する場合に起こる；例えば、シクロホスファミドはこの機構によってＣＩＡを引き起こす（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。成長期脱毛症は、任意の所与の時点で最大９０％までの頭髪が成長期にあり、細胞傷害性薬剤の投与後数日から数週間以内に起こるため、最も一般的な種類のＣＩＡである（Ｏｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）；これは、アルキル化剤、代謝拮抗物質、ビンカアルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンおよびタキサンによって刺激される（Ｅｓｐｉｎｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．２００３；Ｙｕｎ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。毛包は、上述したように、その９０％までが成長期にあり（Ｂａｔｃｈｅｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１）、その関連するマトリックスケラチノサイトは最も急速に分裂する細胞サブセットであるため、化学療法剤に特に感受性であり、したがって細胞複製標的剤によって特に標的とされる。
【０００４】
現在、頭皮冷却は化学療法誘発性脱毛症を予防するための唯一の利用可能なアプローチであり、様々な可能性のある機構を介してＣＩＡを妨げ得る。第一に、冷却は血管の収縮を生じさせ、これは、頭皮の血流を通常の割合の２０〜４０％に減少させることが示されている（Ｊａｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。これは、毛包に送達される化学療法剤の減少をもたらすことが示唆されている（Ｂｕｌｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．１９８５）。別の可能性は、形質膜を横切る薬剤拡散の割合が冷却によって低減し、したがって細胞に侵入し得る有効薬剤用量がより低くなることである（Ｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８７）。さらに、細胞分裂は代謝によって駆動されるので、温度がＧ１およびＳなどの期に特に影響を及ぼし得るため、この過程が冷却によって減速され得る可能性があり（Ｗａｔａｎａｂｅ  ａｎｄ  Ｏｋａｄａ．１９６７）、これは、有糸分裂を標的とする微小管破壊薬などの、細胞周期の特定の期を標的とする薬剤にとって特に重要であり得る。また、毛包の細胞の代謝活性の低下も、化学療法剤の細胞傷害性のより全般的な低減を引き起こし得る（Ｂｕｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．１９８５）。実際には、これらの方法の組み合わせが、ＣＩＡを低減するうえでの頭皮冷却の成功に役割を担う可能性が高い。
【０００５】
いずれにしても、頭皮冷却は全ての症例に奏効するわけではなく、効果は人によって異なる。
【０００６】
化学療法剤誘発性脱毛、毛包死および／または成長期脱毛症を治療するための組成物を提供することが本発明の１つの目的である。
【０００７】
化学療法剤誘発性脱毛、毛包死および／または成長期脱毛症を治療するための改善された方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
【０００８】
化学療法剤誘発性脱毛、毛包死および／または成長期脱毛症の治療を改善するための装置と組み合わせた組成物を提供することが本発明のなおさらなる目的である。
【０００９】
組成物および／または患部を冷却するための組成物および／または装置を使用して化学療法剤誘発性脱毛、毛包死および／または成長期脱毛症を治療する改善された方法を提供することが本発明のなおさらなる目的である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の第一の態様では、ＣＩＡの冷却療法に使用するための活性酸素種（ＲＯＳ）阻害剤を含有する組成物が提供される。
【００１１】
さらに、冷却することによっておよびＲＯＳ阻害剤を含む組成物を使用することによって毛髪または毛包を保護するための方法が提供される。典型的には、少なくとも頭皮の局所領域を周囲温度より低い温度および／または体温より低い温度に冷却する。
【００１２】
典型的には、組成物は、１種以上のＲＯＳ阻害剤を含む。このように、１つ以上のＲＯＳ阻害剤を含有する組成物は、例えば頭皮冷却と組み合わせて、冷却療法と組み合わせることによってケラチノサイトの化学療法薬誘発毒性からの保護を強化する。１種以上のＲＯＳ阻害剤を含む組成物は、冷却療法との併用によって、例えば頭皮冷却と組み合わせて、化学療法剤誘発毒性からのケラチノサイトの保護を増強する。
【００１３】
本発明の第二の態様では、化学療法誘発性脱毛症治療に使用するための活性酸素種（ＲＯＳ）阻害剤を含む組成物が提供され、前記治療は冷却を含む。
【００１４】
一態様では、本発明は、制御された温度環境でのＲＯＳ阻害化合物または組成物の送達を含む。
【００１５】
冷却は、典型的には冷却装置を用いて身体部分上で局所的に実施される。典型的には、身体部分は頭皮である。さらに典型的には、冷却装置はスカルキャップおよび／または同様のものである。
【００１６】
一実施形態では、組成物を局所的に投与する。典型的には、組成物は、身体に適用されるＲＯＳ阻害剤を含む。さらに典型的には、ＲＯＳ阻害剤を含有する組成物を頭皮に適用する。
【００１７】
一実施形態では、組成物を、冷却された環境でまたは周囲の温度が環境温度未満であるように投与する。
【００１８】
一実施形態では、組成物を適用し、少なくとも低い局所温度および／または冷却を適用する。
【００１９】
典型的には、温度は体温（実質的に３７℃）未満である。さらに典型的には、組成物を適用し、隣接温度または周囲環境を２６℃以下に低下させるかまたは冷却する。
【００２０】
一実施形態では、組成物を適用し、隣接温度または周囲環境を２４℃以下に低下させるかまたは冷却する。
【００２１】
一実施形態では、組成物を適用し、隣接温度または周囲環境を２２℃以下に低下させるかまたは冷却する。典型的には、冷却は、実質的に１８〜２６℃の範囲にする。
【００２２】
本発明の第三の態様では、化学療法誘発性脱毛症（ＣＩＡ）の治療のための方法において使用するための活性酸素種（ＲＯＳ）阻害剤を含有する組成物が提供される。
【００２３】
本発明のさらなる態様では、毛包の保護剤として頭皮冷却の方法において使用するためのＲＯＳ阻害剤を含有する物質が存在する。
【００２４】
典型的には、保護は、化学療法治療の間および／またはＣＩＡから存在する。
【００２５】
一実施形態では、物質は局所適用のために提供される。典型的には、物質は、クリーム、ゲル、ペーストおよび／または同様のものなどの液体である。
【００２６】
一実施形態では、物質を冷却キャップに適用する。典型的には、使用前に物質を冷却キャップに適用する。
【００２７】
本発明のさらなる態様では、薬剤がＲＯＳ阻害剤を含むことを特徴とする、局所冷却によるＣＩＡの治療のための薬剤を製造するための、１種以上のＲＯＳ阻害剤を含有する化合物の使用が提供される。
【００２８】
このアプローチは、頭皮冷却の使用と、ヒトケラチノサイトにおけるＲＯＳの産生を媒介する分子細胞内シグナル伝達経路の阻害剤とを組み合わせる。
【００２９】
典型的には、冷却装置（Ｐａｘｍａｎ  Ｏｒｂｉｓ冷却キャップなど）を用いて患部または頭皮の領域を冷却する。
【００３０】
一実施形態では、ＲＯＳ阻害剤は、細胞透過性抗酸化剤および／またはＲＯＳスカベンジャーである。典型的には、ＲＯＳ阻害剤は直接薬理学的阻害剤である。
【００３１】
一実施形態では、ＲＯＳ阻害剤はＮ−アセチル−システイン（ＮＡＣ）である。
【００３２】
一実施形態では、ＲＯＳ阻害剤は合成物である。典型的には、阻害剤は合成されたＮＡＣ誘導体である。
【００３３】
一実施形態では、ＲＯＳ阻害剤は、１種以上の天然化合物を含む。一実施形態では、ＲＯＳ阻害剤はビタミンＣを含む。
【００３４】
一実施形態では、ＲＯＳ阻害剤は、１種以上のフラボノイドを含む。典型的には、ＲＯＳ阻害剤は、１種以上のフラバノールを含む。一実施形態では、ＲＯＳ阻害剤はケルセチンを含む。
【００３５】
一実施形態では、１種以上のＲＯＳ阻害剤は細胞透過性である。典型的には、ＲＯＳ阻害剤は、ＲＯＳ生合成（ＲＯＳ生成細胞シグナル伝達経路）を妨げる、細胞透過性の生物学的または薬理学的阻害剤である。
【００３６】
本発明のなおさらなる態様では、化学療法誘発性脱毛症の治療のための薬剤が提供され、前記薬剤は、ＲＯＳ阻害剤および局所適用に適した担体を含む。
【００３７】
典型的には、ＲＯＳ阻害剤はＮＡＣまたはその誘導体である。
【００３８】
典型的には、ＲＯＳ送達方法には、
−皮膚による直接吸収（例えばクリームを介して）による、局所的
−ナノ粒子またはリポソームベースの標的化経路
−他のベクター／生物学的ツール（例えばウイルス）
の任意の１つまたはこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００３９】
本発明のなおさらなる態様では、化学的に誘発された脱毛症（ＣＩＡ）の冷却療法および治療における使用および／またはそれらの増強のための組成物であって、活性酸素種（ＲＯＳ）阻害剤を含有する組成物が提供される。
【００４０】
本発明のなおさらなる態様では、活性酸素種（ＲＯＳ）阻害剤を含有する組成物を使用した、化学的に誘発された脱毛症（ＣＩＡ）の冷却療法治療の増強が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【００４２】
実験および例
ＨａＣａＴａ細胞を６ウェルプレートにおいてＫＳＦＭ培地中で培養し、３７℃で２時間、３μｇ／ｍＬのドキソルビシンで処理し、次いで、細胞内ＲＯＳのレベルを測定するために、処理後の指示されている時点で５μＭのＨ２ＤＣＦ−ＤＡで標識した（３０分間）。その後、細胞を採取し、フローサイトメトリによって分析した。細胞内ＲＯＳ産生レベルの指標としての蛍光強度をＦＬ−１（またはＦＬ−２チャネル）で検出し、図１において蛍光測定の時点（ｘ軸）に対する中央値蛍光強度またはＭＦＩ（ｙ軸）として表示した。
【００４３】
結果は、化学療法剤による細胞の処理後のＲＯＳ検出のための最適な時点が３０分であることを示す。この特定の最適時点で、フローサイトメトリ法は、細胞内ＲＯＳの正確で高感度な検出を可能にする。
【００４４】
図２を参照すると、ＨａＣａＴａ細胞を、種々の冷却条件を模倣するために３μｇ／ｍＬのドキソルビシンで３７℃で２時間、または２２℃、１８℃および１４℃で処理した。上記で最適化したように（図１）、細胞を５μＭのＨ２ＤＣＦ−ＤＡで標識した後、フローサイトメトリによって分析した。代表的な結果をオーバーレイヒストグラムとしてプロットし、表示されている条件を脚注に示す（図の右側に、Ｃｏｎ  ３７℃を２として、３７℃を４として、Ｃｏｎ  ２２℃を６として、ならびに２２℃、１８℃および１４℃を８として示している）。
【００４５】
結果は、冷却がヒトケラチノサイトにおけるＲＯＳの産生を防止できること、および使用される温度が低いほどＲＯＳ産生の程度が低下することを示す。興味深いことに、２２℃はＲＯＳ産生を有意に減少させるが、温度を１８℃および１４℃に低下させると、ＲＯＳ産生をほぼ完全に減弱させ、これは、これら２つの温度値がこれらの細胞における細胞傷害性をほぼ完全に予防する能力と直接相関する（Ａｌ−Ｔａｍｅｅｍｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４に報告されているように、本発明者らの公表所見）。
【００４６】
図３を参照すると、ＨａＣａＴａ細胞を９６ウェルプレートにおいてＫＳＦＭ中で５×１０３／ウェルの密度で培養し、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。細胞の一部を０．６２５ｍＭのＮＡＣで１時間前処理した（ＮＡＣの最適濃度は予め滴定実験によって決定した）。その後、細胞を、３７℃で２時間（対照条件）、またはＮＡＣを含むおよび含まない適切な培地（ｐＨ７．４）中で冷却条件（２２℃）下に、様々な濃度のドセタキセル、ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ）またはシクロホスファミドの活性代謝物である４−ヒドロキシシクロホスファミド（４−ＯＨ−ＣＰ）（Ｎｉｏｍｅｃｈ）で処理した。溶媒（ＤＭＳＯ）対照（最も高い薬剤濃度に対応するＤＭＳＯの最大量である）を全ての実験に含めた。処理後、薬剤を除去し、ＰＢＳを用いて細胞を２回洗浄し、新鮮な培地を添加した。次いで、培養物を３７℃で７２時間インキュベートした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞増殖を評価した。簡単に述べると、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ試薬２０μｌを各ウェルに添加し、プレートを５％ＣＯ２条件下に３７℃で４時間インキュベートした後、４９２ｎｍで分光光度的に吸光度読み取り値を得た。結果を対照（未処理細胞）に対する％として表す。「ｄｏｘ」、「ｄｃｅ」および「ＣＰ」は、それぞれドキソルビシン、ドセタキセルおよび４−ＯＨ−ＣＰを意味する。３７℃での薬剤処理を１０として示し、２２℃での薬剤を１２として、３７℃での薬剤＋ＮＡＣを１４として、および２２℃での薬剤＋ＮＡＣを１６として示している。
【００４７】
結果は、冷却またはＮＡＣ単独での処理はある程度の細胞保護作用を提供することができるが、冷却と抗酸化剤／ＲＯＳスカベンジャーＮＡＣとの組み合わせは、各薬剤単独よりもはるかに良好な保護を提供することを示す。結果は、より高い薬剤濃度（ボックスで示している）について特により顕著であった。
【００４８】
図４を参照すると、ＨａＣａＴａ細胞を９６ウェルプレートにおいてＫＳＦＭ中で５×１０３／ウェルの密度で培養し、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。細胞の一部を０．６２５ｍＭのＮＡＣで１時間前処理した（ＮＡＣの最適濃度は予め滴定実験によって決定した）。その後、細胞を、３７℃で２時間（対照条件）、またはＮＡＣを含むおよび含まない適切な培地（ｐＨ７．４）中で冷却条件（２６℃）下に、様々な濃度のドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ）または４−ヒドロキシシクロホスファミド（４−ＯＨ−ＣＰ、Ｎｉｏｍｅｃｈ）で処理した。溶媒（ＤＭＳＯ）対照（最も高い薬剤濃度に対応するＤＭＳＯの最大量である）を全ての実験に含めた。処理後、薬剤を除去し、ＰＢＳを用いて細胞を２回洗浄し、新鮮な培地を添加した。次いで、培養物を３７℃で７２時間インキュベートした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞増殖を評価した。簡単に述べると、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ試薬２０μｌを各ウェルに添加し、プレートを５％ＣＯ２条件下に３７℃で４時間インキュベートした後、４９２ｎｍで分光光度的に吸光度読み取り値を得た。結果を対照（未処理細胞）に対する％として表す。「ｄｏｘ」および「ＣＰ」は、それぞれドキソルビシンおよび４−ＯＨ−ＣＰを意味する。３７℃での薬剤処理を１０として示し、３７℃での薬剤＋ＮＡＣを１４として、２６℃での薬剤を１８として、および２６℃での薬剤＋ＮＡＣを２０として示している。
【００４９】
結果は、冷却またはＮＡＣ単独での処理はある程度の細胞保護作用を提供することができるが、冷却と抗酸化剤／ＲＯＳスカベンジャーＮＡＣとの組み合わせは、各薬剤単独よりもはるかに良好な保護を提供することを示す。結果は、より高い薬剤濃度（ボックスで示している）について特により顕著であった。重要な点として、この図のボックス内のデータを同じＣＰ濃度について図３のデータと比較すると、２６℃では、細胞は２２℃と比較してより高いレベルの細胞傷害性を示すが、ＲＯＳの阻害により、２６℃での冷却は高度に細胞保護的になる。
【００５０】
図５を参照すると、ＨａＣａＴａ細胞を９６ウェルプレートにおいてＫＳＦＭ中で５×１０３／ウェルの密度で培養し、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。細胞の一部を０．６２５ｍＭのＮＡＣで１時間前処理した（ＮＡＣの最適濃度は予め滴定実験によって決定した）。その後、細胞を、３７℃で２時間（対照条件）、またはＮＡＣを含むおよび含まない適切な培地（ｐＨ７．４）中で冷却条件（２２℃）下に、様々な濃度のドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ）または４−ヒドロキシシクロホスファミド（４−ＯＨ−ＣＰ、Ｎｉｏｍｅｃｈ）で処理した。溶媒（ＤＭＳＯ）対照（最も高い薬剤濃度に対応するＤＭＳＯの最大量である）を全ての実験に含めた。処理後、薬剤を除去し、ＰＢＳを用いて細胞を２回洗浄し、新鮮な培地を添加した。次いで、培養物を３７℃で７２時間インキュベートした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞増殖を評価した。簡単に述べると、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ試薬２０μｌを各ウェルに添加し、プレートを５％ＣＯ２条件下に３７℃で４時間インキュベートした後、４９２ｎｍで分光光度的に吸光度読み取り値を得た。結果を任意の吸光度単位として示す。３７℃での薬剤処理を１０として示し、３７℃での薬剤＋ＮＡＣを１４として、２２℃での薬剤を１２として、および２２℃での薬剤＋ＮＡＣを１６として示している。
【００５１】
この図の結果は、４−ＯＨ−ＣＰの薬剤濃度範囲を拡大することによって図３に示す本発明者らの所見を強化した。結果は、薬剤の用量が完全な細胞毒性（完全な死滅）をもたらすこの特定の薬剤の極めて高い用量（赤色のボックス）でさえも、冷却＋ＲＯＳ阻害剤の組み合わせは薬剤誘発毒性からの著しく高いレベルの保護を提供することを実証する。
【００５２】
図６を参照すると、ＨａＣａＴａ細胞を９６ウェルプレートにおいてＫＳＦＭ中で５×１０３／ウェルの密度で培養し、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。細胞の一部を０．６２５ｍＭのＮＡＣで１時間前処理した（ＮＡＣの最適濃度は予め滴定実験によって決定した）。その後、細胞を、３７℃で２時間（対照条件）、またはＮＡＣを含むおよび含まない適切な培地（ｐＨ７．４）中で冷却条件（２６℃）下に、様々な濃度のドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ）で処理した。溶媒（ＤＭＳＯ）対照（最も高い薬剤濃度に対応するＤＭＳＯの最大量である）を全ての実験に含めた。処理後、薬剤を除去し、ＰＢＳを用いて細胞を２回洗浄し、新鮮な培地を添加した。次いで、培養物を３７℃で７２時間インキュベートした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞増殖を評価した。簡単に述べると、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ試薬２０μｌを各ウェルに添加し、プレートを５％ＣＯ２条件下に３７℃で４時間インキュベートした後、４９２ｎｍで分光光度的に吸光度読み取り値を得た。結果を対照（未処理細胞）に対する％として表す。３７℃での薬剤処理を１０として示し、３７℃での薬剤＋ＮＡＣを１４として、２６℃での薬剤を１８として、および２６℃での薬剤＋ＮＡＣを２０として示している。
【００５３】
この図の結果は、ドキソルビシンの薬剤濃度範囲を拡大することによって図３および図４に示す本発明者らの所見を強化した。結果は、薬剤の用量がほぼ完全な細胞毒性（死滅）をもたらすこの特定の薬剤の極めて高い用量（赤色のボックス）でさえも、冷却＋ＲＯＳ阻害剤の組み合わせは、２６℃でも薬剤誘発毒性からの著しく高いレベルの保護を提供することを実証する。
【００５４】
図７を参照すると、ＨａＣａＴａ細胞を９６ウェルプレートにおいてＫＳＦＭ中で５×１０３／ウェルの密度で培養し、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。細胞の一部を０．６２５ｍＭのＮＡＣで１時間前処理した（ＮＡＣの最適濃度は予め滴定実験によって決定した）。その後、細胞を、３７℃でのＡＣの組み合わせ（対照条件）で、またはＮＡＣを含むおよび含まない適切な培地（ｐＨ７．４）中にて冷却条件（２６℃または２２℃）下で処理した。特に、ドキソルビシン（アドリアマイシンのＡ）および４−ＯＨ−ＣＰ（シクロホスファミドのＣ）での連続的な処理を、３μｇ／ｍｌのドキソルビシン（１時間）および５μｇ／ｍｌの４−ＯＨ−ＣＰ（１時間）を使用して行った。その後、細胞を洗浄し、培地を交換した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて７２時間後に細胞増殖を評価した。簡単に述べると、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ試薬２０μｌを各ウェルに添加し、プレートを５％ＣＯ２条件下に３７℃で４時間インキュベートした後、４９２ｎｍで分光光度的に吸光度読み取り値を得た。結果を対照（未処理細胞）に対する％として表す。３７℃での処理を２２として示し、２６℃での処理を２４として、および２２℃での処理を２６として示している。
【００５５】
結果は、２６℃または２２℃での冷却は有意な細胞保護作用を示すが、ＲＯＳ阻害剤／スカベンジャーＮＡＣと冷却の組み合わせはより良好な細胞保護をもたらすことを示す。これらの所見は、冷却＋ＲＯＳ阻害が、冷却単独よりも、単剤のみならず併用薬剤治療によって引き起こされる細胞毒性からもより良好に保護することを実証する。
【００５６】
抗酸化剤ケルセチンの使用による結果を図８に示す。ＨａＣａＴａ細胞（５×１０３細胞／ウェル）を、９６ウェルプレートにおいて１００μｌ／ウェルのＫＳＦＭ中で培養し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。２４時間後、細胞を３μＭのケルセチンまたは０．６２５ｍＭのＮＡＣで前処理した。抗酸化剤を含有しない対照も含めた。１時間の前処理後、細胞を０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌのドキソルビシンで処理した。次いで、細胞を３７℃で２時間（対照条件）または冷却条件（２６℃）下でインキュベートした。次いで、培養物を３７℃で７２時間インキュベートした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞増殖を評価した。結果を、抗酸化剤を含有するがドキソルビシンを含まない対照に対する％として表す。
【００５７】
結果は、冷却またはケルセチン単独での処理はある程度の細胞保護を提供することができるが、冷却＋抗酸化剤／ＲＯＳスカベンジャーケルセチンの組み合わせは、各薬剤単独よりもはるかに良好な保護を提供することを示す（赤色のボックスで示すように）。
【００５８】
３７℃でのＤＯＸ単独を３０として示し、２６℃でのＤＯＸ単独を３２として、３７℃でのＮＡＣ＋ＤＯＸを３４として、２６℃でのＮＡＣ＋ＤＯＸを３６として、３７℃でのケルセチン＋ＤＯＸを３８として、２６℃でのケルセチン＋ＤＯＸを４０として、＋ＮＡＣを１４として、２６℃での薬剤を１８として、および２６℃での薬剤＋ＮＡＣを２０として示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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