(57)【要約】  本発明は、本明細書に記載されるような、親チャネルと比べて改善された特性を有する変異型光誘導性イオンチャネル、それをコードする核酸構築物、該核酸構築物を有する発現ベクター、前記核酸構築物または発現ベクターを含む細胞、及びそれらの各々の使用、並びに、変異型光誘導性イオンチャネル、核酸構築物、又は発現ベクターを含む非ヒト動物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1（Chrimson）の全長配列に対し少なくとも90%の類似性及び／又は少なくとも72%の同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型光誘導性イオンチャネルであって、
該変異型光誘導性イオンチャネルは、親光誘導性イオンチャネルと、配列番号1のY261、Y268、及びS267に相当する位置から選択された1つまたは複数の位置における置換のみ異なっており、
前記置換は、-60 mVのクランプ電位、140 mM NaCl, 2mM CaCl2, 2MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.4のバス溶液、及び110 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7.4のピペット溶液で、全細胞構成におけるパッチクランプ測定により比較したとき、前記親チャネルと比べて、前記変異型チャネルのオフキネティクスを加速する、前記変異型光誘導性イオンチャネル。
【請求項２】
前記変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号1（Chrimson）の全長に対し、少なくとも91%、好ましくは少なくとも92%、より好ましくは少なくとも93%、より好ましくは少なくとも94%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%の類似性を有する;及び／又は
前記変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号1（Chrimson）の全長に対し、少なくとも74%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも76%、より好ましくは少なくとも78%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも91%、より好ましくは少なくとも92%、より好ましくは少なくとも93%、より好ましくは少なくとも94%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%の同一性を有する、
請求項１に記載の変異型光誘導性イオンチャネル。
【請求項３】
前記変異型光誘導性イオンチャネルは、
位置Y261における置換、好ましくはここで置換はY261Fである;又は
位置Y268における置換、好ましくはここで置換はY268Fである;又は
位置S267における置換、好ましくはここで置換はS267Mである;を含む、
特に、ここで、前記変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号1の位置176に相当する位置においてArgを更に含む、請求項１又は２に記載の変異型光誘導性イオンチャネル。
【請求項４】
前記変異型光誘導性イオンチャネルは、位置Y261及び位置S267における置換を含む、好ましくはここで位置Y261における置換はY261Fである、そして好ましくはここで位置S267における置換はS267Mである;又は
前記変異型光誘導性イオンチャネルは、位置Y268及び位置S267における置換を含む、好ましくはここで位置Y268における置換はY268Fである、そして好ましくはここで位置S267における置換はS267Mである、
請求項１〜3のいずれか１項に記載の変異型光誘導性イオンチャネル。
【請求項５】
前記変異型光誘導性イオンチャネルは、位置Y261、位置Y268、及び位置S267における置換を含む、好ましくはここで位置Y261における置換はY261Fである、好ましくはここで位置Y268における置換はY268Fである、そして好ましくはここで位置S267における置換はS267Mである、請求項４に記載の変異型光誘導性イオンチャネル。
【請求項６】
配列番号1の位置176に相当する位置においてArgを更に含む、請求項４又は５に記載の変異型光誘導性イオンチャネル。
【請求項７】
前記変異型チャネルは、配列番号3：
Cys - Arg - Met - Val - Val - Lys - Leu - Met - Ala - Tyr - Ala - Xaa12 - Phe - Ala - Ser - Trp - Gly - Xaa18 - Xaa19 - Pro - Ile - Leu - Trp - Ala - Val
のモチーフ、
ここでXaa12はPhe又はTyrである、好ましくはここでXaa12はPheである;
ここでXaa18はMet又はSerである、好ましくはここでXaa18はMetである;および
ここでXaa19はPhe又はTyrである、好ましくはここでXaa19はPheである、
を含む、請求項１〜6のいずれか１項に記載の変異型光誘導性イオンチャネル。
【請求項８】
前記変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号1（Chrimson）のアミノ酸配列を含む、好ましくは配列番号1（Chrimson）のアミノ酸配列からなる、
但し、位置Y261、Y268、及びS267における前記置換、及び場合により配列番号1の位置176に相当する位置におけるArgを除く、
請求項１〜7のいずれか１項に記載の変異型光誘導性イオンチャネル。
【請求項９】
前記変異型光誘導性イオンチャネルは、赤色光吸収性チャネルロドプシンである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の変異型光誘導性イオンチャネル。
【請求項１０】
請求項１〜9のいずれか１項に記載の変異型光誘導性イオンチャネルをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
【請求項１１】
請求項１〜9のいずれか１項に記載の光誘導性イオンチャネルをコードするヌクレオチド配列又は請求項9に記載の核酸構築物を含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項10に記載の核酸構築物又は請求項11に記載の発現ベクターを含む細胞であって、
特にここで前記細胞は哺乳類細胞であり、好ましくはここで前記細胞は、
(a)海馬細胞、光受容体細胞、網膜桿状細胞、網膜錐状細胞、網膜神経節細胞、双極神経細胞、神経節細胞、偽単極性神経細胞、多極神経細胞、錐体神経細胞、プルキンエ細胞、又は顆粒細胞;あるいは、
(b)神経芽腫細胞、特にNG108-15細胞、HEK293細胞;COS細胞;BHK細胞;CHO細胞;骨髄腫細胞;又はMDCK細胞である、前記細胞。
【請求項１３】
ハイスループットスクリーニングにおける、請求項１〜9のいずれか１項に記載の光誘導性イオンチャネル又は請求項12に記載の細胞の使用。
【請求項１４】
神経細胞の光刺激のための、請求項１〜9のいずれか１項に記載の光誘導性イオンチャネルの非治療的使用。
【請求項１５】
医薬における使用のための請求項１〜8のいずれか１項に記載の光誘導性イオンチャネル。
【請求項１６】
請求項１〜9のいずれか１項に記載の光誘導性イオンチャネル、請求項10に記載の核酸構築物、請求項11に記載の発現ベクター、又は請求項12に記載の細胞、を含む非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特許請求の範囲にて規定されるような、親光誘導性イオンチャネルと比べて改善された特性を有する変異光誘導性イオンチャネル、それをコードする核酸構築物、該核酸構築物を有する発現ベクター、前記核酸構築物または発現ベクターを含む細胞、及びそれらの各々の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライトゲート型の内向き整流陽イオンチャネルであるチャネルロドプシン1（ChR1）とチャネルロドプシン2（ChR2）は、インビトロとインビボの両方で神経細胞の標的化光活性化に好ましいツールとなっている1-5。野生型（WT）ChR2は光誘導性脱分極に使用することができるが、将来的に可能性のある臨床応用のために、より迅速なキネティクスおよびより高い光感受性を有するChR2変異体の探索が進行中である（WO03/084994および6-8）。
【０００３】
2002年および2003年に初記載されて以来、赤色光吸収チャネルロドプシンを含むChR2の様々な変異体のセットが記載されている。様々な目的のために、ChRは、キネティクス、イオン選択性ならびに光吸収に関し改変されている。例としては、Chlamydomonas Chrimson由来の赤色光吸収チャネルロドプシン（WO2013/071231および9;受託番号KF992060）、Chrimson変異体ChrimsonR（K176R）、およびChlamydomonas Chrimson由来のアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドであるCsChrimson、およびChloromonasチャネルロドプシンCsChRに由来するアミノ酸配列が挙げられる（US2016/0039902の配列番号1、2および5および受託番号KJ995863も参照）。赤色光の動物組織への浸透深度はより低波長光の浸透深度よりも深いため、赤色光活性化チャネルロドプシンは、有益である（3,8）。さらに、赤色光活性化チャネルロドプシンの使用は、光毒性のリスクを低減する。
【０００４】
光感受性はチャネルの開放時間によって調節されるため、キネティクスが大きな問題となる。これは、単一チャネルコンダクタンス、開放確率、量子効率などの他のチャネルパラメータが不変であるためである。換言すれば、開放時間が長いチャネルでは低い光強度で最大の活性に達し、一方、寿命が短いチャネルでは、光飽和に関する飽和に達するためにより多くの光を必要とする。「高速」チャネルは活性化のためにより多くの光を必要とするが、様々な神経細胞の発火率の頻度が高いために、神経生物学における多くの用途には高速であることが不可欠である。これは例えば、最大1000 Hzの発火率に達する脳内の介在ニューロンの聴覚系における神経節細胞においていえる。したがって、強い発現とより迅速な応答キネティクスとを組み合わせた変異型光誘導性イオンチャネルが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、7回膜貫通ヘリックスモチーフのヘリックス6の改変によってChrimsonに関する系統的な研究を行った。光活性化中のヘリックス6の動きは、微生物型ロドプシンにおいて共通する特徴である（15,17）。したがって、チャネルの閉鎖時間を変更するためにヘリックス6を改変した。Chrimsonのヘリックス6における位置261、267、および268の変異がチャネルの閉鎖時間（オフキネティクス，off-kinetics）を加速し、これらの変異の組合せがオフキネティクスのさらなる加速をもたらすことを実証できた。
【０００６】
本開示は、ヘリックス6における特定の点変異により速度についてChrimsonを改変する一般的な方法を記載する。これらの新しい変異体を用いると、800〜1000Hzの限界まで神経細胞の光刺激がもたらされる。マウスの脳から得たNG108-15細胞（神経芽腫細胞）、HEK293細胞、および海馬細胞において、速度が増加したことを実験的に検証する試験をした。
【０００７】
従って、配列番号1（Chrimson）の全長配列に対し、少なくとも90%の類似性（similarlity）/相同性（homology）及び／又は少なくとも72%の同一性（identitiy）を有するアミノ酸配列を含む変異型光誘導性イオンチャネルであって、該変異型光誘導性イオンチャネルは、親光誘導性イオンチャネルと、配列番号1のY261、Y268、及びS267に相当する位置から選択された1つまたは複数の位置における置換のみ異なっており、前記置換は、-60 mVのクランプ電位、140 mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10 mM HEPES、pH 7.4のバス溶液、及び110 mM NaCl、2 mM MgCl2、10 mM EGTA、10 mM HEPES、pH 7.4のピペット溶液で、全細胞構成における（in the whole cell configuration）パッチクランプ測定により比較したとき、前記親チャネルと比べて、前記変異型チャネルのオフキネティクスを加速する、変異型光誘導性イオンチャネルを開示する。
【０００８】
更に、本明細書に開示の光誘導性イオンチャネルをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を提供する。
【０００９】
また、本明細書に開示の光誘導性イオンチャネルをコードするヌクレオチド配列又は核酸構築物を含む発現ベクターを提供する。
【００１０】
加えて、本明細書に開示の核酸構築物又は発現ベクターを含む細胞を提供する。
【００１１】
更に別の態様では、本発明は、ハイスループットスクリーニングにおける、及び／又は神経細胞を光刺激するための、本明細書に開示の光誘導性イオンチャネルの使用を提供する。医薬における変異型光誘導性イオンチャネルの使用も意図される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は、Chrimson及びChrimson Y261Fのオフキネティクスを示す。照明停止直後のChrimson-YFP及びChrimson-YFP Y261Fの典型的な光電流を示す。電流は比較のために正規化した。
【００１３】
【図２】図2は、Chrimson及びChrimson変異体の光電流を示す。594 nmの波長および23 mW/mm-2の飽和光強度を有する3 msの光パルスに応答して測定された典型的な光電流を示す。Chrimson-YFP、Chrimson-YFP K176R、Chrimson-YFP S267M、Chrimson-YFP Y268F、Chrimson-YFP Y261F、Chrimson-YFP S267M/Y268F、Chrimson-YFP Y261F/S267M、Chrimson-YFP K176R/S267M/Y268F、Chrimson-YFP Y261F/S267M/Y268F、Chrimson-YFP K176R/Y261F/S267M又はChrimson-YFP K176R/Y261F/S267M/Y268Fを異種発現しているNG108-15細胞を、以下の実施例に記載されるように、全細胞構成におけるパッチクランプ測定により調べた。電流は比較のために正規化した。
【００１４】
【図３】図3は、Chrimson及びChrimson変異体の作用スペクトルを示す。
【００１５】
2019517279.tif 000002
【００１６】
【図４】図4は、様々な光パルス周波数におけるスパイキングトレースを示す。A）Chrimson-YFP、B）Chrimson-YFP K176R/Y261F/S267M、及びC）Chrimson-YFP Y261F/S267Mを異種発現しているラット海馬神経細胞を、以下の実施例に記載されるように、全細胞構成におけるパッチクランプ測定により調べた。
【００１７】
【図５】図5は、AAV2/6-hSyn-Chrimson-YFP Y261F/S267Mを用いたSGNの出生後形質導入は非常に効率的であり、そして導入した耳にほぼ特異的であったことを示す。A：共焦点画像を、蝸牛神経節の3つの異なる領域におけるYFP及びカルレチニン免疫蛍光の最大強度投影（Zステップ：1 μm）として示す。スケールバー：50 μm。B：SGNにおけるYFP発現の定量化を、カルレチニン+SGNに対する比として算出し（左パネル）、SGN生存率を細胞/104 μm2として示す（右パネル）。記号は個々の動物の結果を示す。灰色及び黒色のバーは左蝸牛の平均値（導入）及び右蝸牛の平均値（対照）を表す。いずれの定量化においても同じグループ内（導入又は対照）で統計的な有意差は見られず、細胞生存率の定量化においても同じ蝸牛領域のグループ間で統計的な有意差は見られなかった（t検定、p> 0.05）。
【００１８】
【図６】図6は、Chrimson-YFP Y261F/S267Mが、1秒当たり数百という生理的速度で情報の光遺伝学的なコーディングを可能にすることを示す。A：最大強度（11 mW、10 Hzで1 ms）で594 nmの光刺激を用いてAAV6-Chrimson-YFP Y261F/S267Mを注入した4匹のマウスのoABRトレース（0〜2.5ms）。B：レーザー強度を増加させて（10 Hzで1 ms）で記録したAAV6-Chrimson-YFP Y261F/S267Mを注入した例示的なマウスのoABRトレース（0〜8ms）。oABRトレース（A、B）上に、記号を用いてP1およびN1（応答の定量化のための目印）をマークし、A〜Fを通じて同じマウスから得たデータポイントを識別する助けとする。C： レーザー強度（10 Hzで1 ms）の増加に伴うP1-N1振幅の増加（最大振幅に対し正規化した）。グループ平均は黒で表示する。D： 光パルス期間（●印付きの動物は10 Hzで5.5 mW、その他の動物は20 Hzで11 mW）の増加に伴うP1-N1振幅の増加（最大振幅に対し正規化した）。グループ平均は黒で表示する。E： レーザー強度（10 Hzで1 ms）の増加に伴うP1待ち時間の減少。グループ平均は黒で表示する。F： 刺激速度（◆および〇印付きの動物は5.5 mW、1 ms、その他の動物は6.6 mW、1 ms）の増加に伴うP1-N1振幅の減少（最大振幅に対して正規化した）。グループ平均は黒で表示する。C〜Fの網掛け部分は+/-標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示は、変異型光誘導性イオンチャネルに関し、該変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号1（Chrimson）の全長配列に対し少なくとも90%の類似性/相同性及び／又は少なくとも72%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、該変異型光誘導性イオンチャネルは、親光誘導性イオンチャネルと、配列番号1のY261、Y268、及びS267に相当する位置から選択された1つまたは複数の位置における置換のみ異なっており、前記置換は、-60 mVのクランプ電位、140 mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10 mM HEPES、pH 7.4のバス溶液、及び110 mM NaCl、2 mM MgCl2、10 mM EGTA、10 mM HEPES、pH 7.4のピペット溶液で、全細胞構成におけるパッチクランプ測定により比較したとき、前記親チャネルと比べて、前記変異型チャネルのオフキネティクスを加速する。変異体または親チャネルのオフキネティクスは、該変異体または親チャネルをそれぞれ異種発現するラット海馬細胞（下記実施例3参照）またはNG108-15神経芽腫細胞（下記実施例1参照）において測定することができる。好ましくは、変異型チャネルのオフキネティクスは、NG108-15細胞において測定される。タンパク質発現の成功は、例えば、EGFPまたはYFPによる蛍光によって証明できる。一般に、光電流は、23mW/mm 2の強度および594nmの波長を有する3msの光パルスに応答させて測定される。τoff値は、以下の実施例でさらに説明するように、照明の停止後の電流を単一指数関数にフィットすることによって決定される。
【００２０】
好ましい実施形態では、変異型光誘導性イオンチャネルは、位置Y261における置換を含む。特に好ましい実施形態では、置換は、Y261Fである。
【００２１】
位置Y261における置換の代わり又は加えて、変異型光誘導性イオンチャネルは、位置Y268における置換を含む。より好ましくは、置換は、Y268Fである。
【００２２】
更に別の好ましい実施形態では、変異型光誘導性イオンチャネルは、位置S267における置換を含む。特に好ましい実施形態では、置換は、S267Mである。更により好ましくは、前記置換は、位置Y261における置換、位置Y268における置換、又は位置Y261およびY268の両方における置換と組み合わせる。
【００２３】
よって、好ましい実施形態では、変異型光誘導性イオンチャネルは、位置Y261及び位置S267における置換を含む、好ましくはここで位置Y261における置換はY261Fである、そして好ましくはここで位置S267における置換はS267Mである。別の好ましい実施形態では、変異型光誘導性イオンチャネルは、位置Y268及び位置S267における置換を含む、好ましくはここで位置Y268における置換はY268Fである、そして好ましくはここで位置S267における置換はS267Mである。更に別の好ましい実施形態では、変異型光誘導性イオンチャネルは、位置Y261、位置Y268、及び位置S267における置換を含む、好ましくはここで位置Y261における置換はY261Fである、好ましくはここで位置Y268における置換はY268Fである、そして好ましくはここで位置S267における置換はS267Mである。
【００２４】
親光誘導性イオンチャネルは、パーセンテージ配列同一性および/または配列相同性/類似性が要求される範囲内にある限り、任意のChrimson様チャネルであってよい。好ましい一実施形態では、親光誘導性イオンチャネルは、配列番号1の位置176に相当する位置においてArgを含む。前記変異体は、ChrimsonR（K176R）として既知である。
【００２５】
好ましくは、前記変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号1（Chrimson）の全長に対し、少なくとも91%、好ましくは少なくとも92%、より好ましくは少なくとも93%、より好ましくは少なくとも94%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%の類似性/相同性を有する。
【００２６】
追加的に又は代替的に、前記変異型光誘導性イオンチャネルは配列番号1（Chrimson）の全長に対し、少なくとも74%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも76%、より好ましくは少なくとも78%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも91%、より好ましくは少なくとも92%、より好ましくは少なくとも93%、より好ましくは少なくとも94%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%の同一性を有する。
【００２７】
配列番号1の全長に対し少なくとも70%の類似性/相同性又は少なくとも70%の同一性を有する光誘導性イオンチャネルの例として、ChrimsonR変異体K176R、又はキメラCsChrimson（配列番号2、受託番号KJ995863）、およびそれらの任意の他のオルソログ又はアリル変異体が挙げられる。Chrimson及びCsChrimsonは、Chrimson（配列番号1）の全長に対し74%の同一性及び76.4%の相同性/類似性を共有する。
【００２８】
好ましくは、変異型光誘導性イオンチャネルは赤色光吸収性チャネルロドプシンである。
【００２９】
ヘリックス6が配列番号3のヘリックス6モチーフによって置換された、例えば、ヘリックス6がY268F、Y261F、及びS267Mの置換を含むChrimsonのヘリックス6によって置換されたChR-2（配列番号5）、VChR1（配列番号6）、又はReaChR（配列番号7）の光誘導性イオンチャネルのスワップ変異体（それぞれ、配列番号8、9、及び10）も企図される。
【００３０】
このようなスワップ変異体は、典型的には、配列番号1（Chrimson）の全長に対し、少なくとも56%の相同性/類似性を有する、好ましくは、配列番号1（Chrimson）の全長に対し、少なくとも58%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも62%、そして更に好ましくは少なくとも64%の相同性/類似性を有する。
【００３１】
追加的に又は代替的に、このようなスワップ変異体は、典型的には、配列番号1（Chrimson）の全長に対し、少なくとも42%、好ましくは少なくとも44%、より好ましくは少なくとも46%、より好ましくは少なくとも48%、より好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも52%、より好ましくは少なくとも54%、より好ましくは少なくとも56%の同一性を有する。
【００３２】
一般に、あるアミノ酸配列が、他のアミノ酸配列、例えば上述の配列番号1と、「少なくともx%の同一性」を有するとは、アラインされた配列に対するこれらの間の配列同一性が、前記他のアミノ酸配列、例えば配列番号1の全長にわたって少なくともx%であるときに言う。同様に、あるアミノ酸配列が、他のアミノ酸配列、例えば上述の配列番号1と、「少なくともx%の類似性/相同性」を有するとは、アラインされた配列に対するこれらの間の配列類似性/相同性が、前記他のアミノ酸配列、例えば配列番号1の全長にわたって少なくともx%であるときに言う。
【００３３】
このようなアラインメントは、例えば、公的に利用可能なコンピューター相同性プログラム、例えば、EMBLホームページ（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/）で提供されている「EMBOSS」プログラムをそのデフォルトの設定を使用して実施できる。一連のアミノ酸配列の配列同一性または配列類似性/配列相同性パーセンテージを計算するさらなる方法は、当技術分野で公知である。
【００３４】
しかし、特に好ましい実施形態では、変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号1（Chrimson）のアミノ酸配列を含む、好ましくは配列番号1（Chrimson）のアミノ酸配列からなる、但し、上述のように、位置Y261、Y268、及びS267における前記置換、及び場合により配列番号1の位置176に相当する位置におけるArgを除く。
【００３５】
本開示の光誘導性イオンチャネルは、少なくとも5回の膜貫通ヘリックスを有する膜タンパク質であり、感光性ポリエンに結合することができる。6回又は7回の膜貫通ヘリックスを有する膜タンパク質が好ましい。しかし、7回以上の膜貫通ヘリックスを有する膜タンパク質、例えば、8、9又は10回膜貫通ヘリックスも包含される。さらに、本発明は、膜貫通部分に加えてC末端および/またはN末端配列を含む膜貫通タンパク質も包含し、ここで、C末端配列は膜によって囲まれた内腔の内部、例えば、細胞の細胞質またはリポソームの内部へと延伸でき、あるいは、膜の外面に配置されてもよい。場合により存在するN末端配列についても同様であり、同様に内腔内部や膜外面のいずれに配置できる。C末端および/またはN末端配列の長さは原則として限定されないが、1〜1000個のアミノ酸、好ましくは1〜500個、特に好ましくは5〜50個のアミノ酸を有し膜に埋め込まれていないC末端配列を有する光誘導性イオンチャネルが好ましい。C末端配列の長さとは独立して、膜に埋め込まれていないN末端に位置する配列は、好ましくは1〜500個のアミノ酸、特に好ましくは5〜50個のアミノ酸を含む。膜貫通ヘリックスの概念は、当業者に周知である。これらは、一般に、αヘリックスタンパク質構造であり、一般に20〜25個のアミノ酸を含む。しかし、膜貫通セグメントは、天然の膜、例えば細胞または原形質膜、または合成膜であってもよい膜の性質に依存して、より短くても長くてもよい。例えば、人工膜中の膜貫通セグメントは、最大30個のアミノ酸を含んでもよく、一方、例えば12〜16個といった少ない数のアミノ酸を含んでもよい。
【００３６】
加えて、光誘導性イオンチャネルは、配列番号1と比較して更なる（半）保存的置換を含む。保存的置換は、側鎖および化学的性質に関連するアミノ酸のファミリー内で起こる。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖を有するアミノ酸、酸性側鎖を有するアミノ酸、非極性脂肪族側鎖を有するアミノ酸、非極性芳香族側鎖を有するアミノ酸、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、小さい側鎖を有するアミノ酸、大きい側鎖を有するアミノ酸などである。典型的な半保存的および保存的置換は、以下のとおりである。
【表１】
2019517279.tif 000003
【００３７】
さらに、当業者であれば、立体的な必要性がある位置でグリシンを置換すべきではなく、αヘリックスまたはβシート構造を有するタンパク質の部分にプロリンを導入してはならないことを理解するであろう。
【００３８】
好ましくは、変異型チャネルは、配列番号3：
Cys - Arg - Met - Val - Val - Lys - Leu - Met - Ala - Tyr - Ala - Xaa12 - Phe - Ala - Ser - Trp - Gly - Xaa18 - Xaa19 - Pro - Ile - Leu - Trp - Ala - Val
のヘリックス6モチーフ、
ここでXaa12はPhe又はTyrである、好ましくはここでXaa12はPheである;
ここでXaa18はMet又はSerである、好ましくはここでXaa18はMetである; および
ここでXaa19はTyr又はPheである、好ましくはここでXaa19はPheである、
を含む。
【００３９】
光誘導性イオンチャネルがコンセンサスモチーフL（I,A,C）DxxxKxxW（F,Y）（配列番号4）を含むことがさらに好ましい。各場合において、括弧内のアミノ酸は前出のアミノ酸で置換することができる。このコンセンサス配列は、レチナール結合性アミノ酸リジンを取り巻くモチーフである。
【００４０】
一般に、光誘導性イオンチャネルの機能に必要なレチナールまたはレチナール誘導体は、前記イオンチャネルでトランスフェクションされる細胞によって産生される。そのコンフォメーションに応じて、レチナールは、オールトランスレチナール、11-cis-レチナール、13-cis-レチナール、又は9-cis-レチナールであってもよい。しかし、本発明の変異型光誘導性イオンチャネルは、小胞、リポソームまたは他の人工細胞膜に組み込むこともできると考えられる。従って、本開示の光誘導性イオンチャネル及びレチナールまたはレチナール誘導体を含むチャネルロドプシンも開示される。好ましくは、レチナール誘導体は、3,4-デヒドロレチナール、13-エチルレチナール、9-dm-レチナール、3-ヒドロキシレチナール、4-ヒドロキシレチナール、ナフチルレチナール;3,7,11-トリメチル-ドデカ-2,4,6,8,10-ペンタエナール;3,7-ジメチル-deca-2,4,6,8-テトラエナール;3,7-ジメチル-オクタ-2,4,6-トリエナール;及び6-7回転ブロック（rotation-blocked）レチナール、8-9回転ブロックレチナール、及び10-11回転ブロックレチナールからなる群から選択される。
【００４１】
本開示は、上述の本明細書に開示の変異型光誘導性イオンチャネルをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物も開示する。
【００４２】
最適な発現を確実にするために、コードDNAは、例えば、適切な調節配列および/または標的配列を追加することによって、および/または選択された宿主の好ましいコドン使用にコードDNA配列を適合させることによって、適切に改変することもできる。標的配列は、細胞内の特定の部位または区画、例えばシナプスまたはシナプス後部位、軸索小丘、または小胞体に光誘導性イオンチャネルを標的とするC末端伸長をコードすることができる。本開示の変異型光誘導性イオンチャネルの配列を発現させるために、核酸を、例えば、プロモーターおよび転写開始および停止シグナル、並びに翻訳開始および停止シグナル、並びにポリアデニル化シグナルなどのさらなるエレメントと組み合わせてもよい。プロモーターは、誘導性または構成的、一般的または細胞特異的プロモーターであり得る。細胞特異的プロモーターの例は、双極細胞に特異的なmGlu6プロモーターである。プロモーター、ベクターおよび他のエレメントの選択は、当業者の通常の設計の範囲内である。多くのそのようなエレメントが文献に記載されており、市場の供給元から入手可能である。
【００４３】
また、本明細書に開示の光誘導性イオンチャネルをコードするヌクレオチド配列又は核酸構築物を含む発現ベクターを開示する。好ましい実施形態では、ベクターは遺伝子治療に適しており、特にウイルスによる遺伝子導入に適している。「ウイルスによる遺伝子導入に適している」という用語は、本明細書では、前記ベクターがウイルス内にパッキングできるので、目的の部位または細胞に送達されることを意味する。遺伝子治療に適しているウイルスの例は、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、狂犬病ウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびヘルペスウイルスである。これらのウイルスは、認識した感染可能細胞にどれほど良好に遺伝子を導入するか、並びに細胞のDNAを永久にまたは一時的に改変するのかが異なる。しかし、遺伝子治療は、裸のDNA、リポプレックスおよびポリプレックス、およびデンドリマーの適用といった非ウイルス的な方法も包含する。
【００４４】
上記のように、得られた核酸配列は、例えば、ウイルスを担体として使用するか、あるいは例えば化学的トランスフェクタント（例えば、Lipofectamine, Fugene等）を含むトランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈降や、DNAの直接拡散によって、細胞内に導入してもよい。細胞をトランスフェクトする方法は、実施例に詳述されているが、それぞれのレシピエント細胞に適合させてよい。DNAのトランスフェクションは、トランスフェクトされたDNAがゲノムに組み込まれている場合、安定した細胞または細胞株をもたらし、あるいは、トランスフェクトされたDNAが染色体外の形態で存在する場合、不安定な（一過性の）細胞または細胞系をもたらす。さらに、エピソーム複製プラスミドを使用することにより、安定な細胞株を得ることができ、これは、染色体外プラスミドの遺伝形質が、細胞ゲノムに組み込まれた制御エレメントによって制御されることを意味する。一般に、適切なベクターまたはプラスミドの選択は、対象の宿主細胞に依存する。
【００４５】
よって、本開示は、本明細書に開示の核酸構築物又は発現ベクターを含む細胞に関する。
【００４６】
天然の状態で対応するチャネルを発現しない細胞の膜への変異型光誘導性イオンチャネルの組み込みは、例えば、組換えDNA技術の既知の手順を使用して、このイオンチャネルをコードするDNAを最初に適切な発現ベクター、例えばプラスミド、コスミドまたはウイルスに組み込んで、その後これを用いて標的細胞を形質転換し、タンパク質を宿主内で発現させることによって可能である。次に、細胞は、タンパク質とレチナールとの間のシッフ塩基の連結を可能にするためにレチナールを用いるといった適切な様式で処理される。
【００４７】
本開示の光誘導性イオンチャネルの発現は、ある種の哺乳類細胞系において有利に行うことができる。したがって、好ましい実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。発現は、一過性発現としてのエピソームベクター、好ましくは神経芽腫細胞（例えば、NG108-15細胞）、メラノーマ細胞（例えば、BLM細胞株）、COS細胞（「アフリカミドリザル腎臓CV1細胞」より産生される）、HEK細胞（「ヒト胚性腎臓細胞」、例えば、HEK293細胞）、又はBHK-細胞（「ベビーハムスター腎臓細胞」）を用いて、あるいは、CHO細胞（「チャイニーズハムスター卵巣細胞」）、骨髄腫細胞またはMDCK細胞（「Madby-Darbyイヌ腎臓細胞」）における安定発現の形態において（ゲノムへの組込みによる）、あるいはバキュロウイルスを感染させたSf9昆虫細胞内で可能である。従って、より好ましい実施形態では、哺乳類細胞は、COS細胞;BHK細胞;HEK293細胞;CHO細胞;骨髄腫細胞;又はMDCK細胞である。
【００４８】
好ましい実施形態では、哺乳類細胞は、電気的に興奮性の細胞である。より好ましくは、細胞は、海馬細胞、光受容体細胞;網膜桿状細胞;網膜錐状細胞;網膜神経節細胞;双極神経細胞;神経節細胞;偽単極性神経細胞;多極神経細胞;錐体神経細胞、プルキンエ細胞;又は顆粒細胞である。
【００４９】
神経細胞は、電気的および化学的シグナル伝達によって情報を処理および伝達する電気的に興奮性の細胞であり、ここで、化学的シグナル伝達は他の細胞との特殊な接合であるシナプスを介して起こる。接触、音、光および感覚器官の細胞に影響を及ぼすその他多くの刺激に応答する感覚神経細胞、脳および脊髄からシグナルを受けて筋肉収縮を引き起こしたり腺に影響する運動神経細胞、ならびに脳または脊髄の同じ領域内で神経細胞同士を接続する介在神経細胞などの数多くの特殊なタイプの神経細胞が存在する。一般に、神経細胞は体細胞、樹状突起、および軸索を有する。樹状突起は、細胞体から生じ、しばしば数百ミクロンに広がり、複数回分岐するフィラメントである。軸索は、軸索小丘と呼ばれる部位で細胞体から生じる特殊な細胞性フィラメントである。神経細胞の細胞体はしばしば複数の樹状突起を生じるが、1つより多い軸索にはつながらない。しかし、軸索は終結する前に何百回も分枝することがある。ほとんどのシナプスでは、シグナルは、ある神経細胞の軸索から別の神経細胞の樹状突起に送られる。しかし、これらのルールは多くの例外があり、樹状突起を欠く神経細胞、軸索を持たない神経細胞、軸索を別の軸索に連結するシナプス、または樹状突起を別の樹状突起に連結するシナプスなどがある。ほとんどの神経細胞は、単極性または偽単極性（同じプロセスから現れる樹状突起および軸索）、双極性（軸索および体細胞の反対側にある単一の樹状突起）、多極性（2つ以上の樹状突起を有し、さらに（i）長く突出した軸索を有するゴルジI型神経細胞、例えば錐体神経細胞、プルキンエ細胞、前角細胞など、および（ii）軸索が局部的であるゴルジII型神経細胞、例えば顆粒細胞として分類される）として、更に解剖学的に特徴づけることができる。
【００５０】
光受容体細胞は、網膜に見られる光伝達が可能な特殊な神経細胞である。2つの古典的な光受容体は、桿体と錐体であり、それぞれが視覚系によって使用される情報に寄与する。網膜神経節細胞は、眼の網膜の内面の近くに位置する一種の神経細胞である。これらの細胞は、樹状突起、並びに保護層（中脳）、視床下部の視交叉上核、および外側膝状突起（視床）に突出する長い軸索を有する。視覚への寄与はほとんど又は全くないが、そられ自体は感光性である。それらの軸索は網膜視床下部路を形成し、そして概日リズム及び瞳孔の光反射、瞳孔のサイズ変更に寄与する。それらは2つの中間神経細胞型：双極細胞及びアマクリン細胞を介して光受容体から視覚的情報を受け取る。アマクリン細胞は網膜にある介在神経細胞であり、網膜神経節細胞への入力の70%を担う。網膜神経節への入力の残りの30%を担う双極細胞は、アマクリン細胞によって調節されている。網膜の一部として、双極細胞は光受容体（桿状細胞及び錐状細胞）と神経節細胞の間に存在する。それらは、直接または間接的に、光受容体から神経節細胞に信号を伝達するように作用する。
【００５１】
細胞は単離され（そして遺伝的に改変され）、適切な温度及びガス混合物（典型的には37℃、5% CO2）、場合により、当業者に知られているような細胞インキュベーター内や実施例における特定の細胞株や細胞型について例示されているような細胞インキュベーター内、で維持及び培養されてもよい。培養条件は細胞型によって異なってよく、また特定の細胞型に対する条件が変わると表現型が異なる場合がある。温度およびガス混合物の他に、細胞培養システムにおいて最も一般的に変化する因子は、増殖培地である。増殖培地の製法は、pH、グルコース濃度、増殖因子、および他の栄養成分の存在などがとりわけ様々である。増殖培地は市販されているかあるいはAmerican Tissue Culture Collection（ATCC）から入手可能な組成に従って調製することができる。補助培地に使用される増殖因子は、子牛血清などの動物の血液に由来することが多い。さらに、抗生物質を増殖培地に添加してもよい。培養細胞に対して行われる一般的な操作には、培地の交換および細胞の継代がある。
【００５２】
本開示は、更に、ハイスループットスクリーニングにおける、本明細書に開示の光誘導性イオンチャネル又は細胞の使用に関する。ハイスループットスクリーニング（HTS）は、特に創薬に使用され、科学的実験のための生物学および化学の分野に関連する方法である。HTSは、多くの場合、現代のロボット工学、データ処理および制御ソフトウェア、液体取り扱い装置や、高感度の検出器と組み合わせて、研究者が数百万の生化学的、遺伝学的または薬理学的試験を短時間で効果的に行うことを可能にする。このプロセスにより、特に、本発明に係る光誘導性イオンチャネル、Ca++誘導性カリウムチャネル、またはBKチャネルなどのイオンチャネルを改変する物質といった特定の生体分子経路を調節する活性薬剤を迅速に同定することができる。例えば、ある薬剤は、Ca++誘導性カリウムチャネルおよび光誘導性イオンチャネルを宿主細胞中で同時発現させることができる可能性もある。光により刺激すると、光誘導性チャネルが開き、細胞内Ca++濃度が上昇し、それによってカリウムチャネルを活性化する。したがって、膜電位の変化を受けるものがあり、この変化はRH421（N-（4-スルホブチル）-4-（4-（4-（ジペンチルアミノ）フェニル）ブタジエニル）ピリジニウム、内部塩）によりモニターできる。このようなHTSは、以下の工程を含んでもよい：（i）Ca++誘導性（カリウム）チャネルおよび本発明による光誘導性イオンチャネルを発現する細胞を、Ca++誘導性チャネルに対する候補薬剤に接触させること、（ii）光刺激を与え光誘導性チャネルを誘導すること、（iii）膜電位（混合シグナル）の変化を決定すること、および（iv）工程（iii）で決定されたシグナルを工程（ii）に供された本発明に係る光誘導性イオンチャネルのみを発現する細胞において決定されたシグナル（単一シグナル）と比較すること。膜電位の変化の減少は、Ca++誘導性（カリウム）チャネルの有望なモジュレーターの指標となるであろう。そのようなアプローチは、約5：1のシグナル対ノイズ比を生じさせると考えられ、Ca++誘導性チャネルのみを発現する細胞に対して行われる直接的な測定と比較してかなり改善されている。シグナル対ノイズ比が改善されるので、前記方法は、特に、光誘導性イオンチャネルを使用することによって、HTSに特に適する可能性がある。
【００５３】
本質的に、HTSは、比較的短時間に特定の標的に対する数多くの物質の効果に関する大量の実験データを収集するアプローチを使用する。この文脈では、スクリーンはより大規模な実験であり、単一の目標（通常は科学的な仮説を検証する）を有し、このデータすべてを適用可能である。本発明に係るHTS細胞は、例えば96ウェルプレートといったマルチウェルプレート等の組織プレートに播種してもよい。次いで、プレート内の細胞を、標的イオンチャネルと相互作用するのに十分な時間、試験物質と接触させる。試験物質は、プレートにわたってウェル毎に異なってもよい。インキュベーション時間が経過した後、手動または機械のいずれかで、そして場合により試験物質と接触していない細胞の測定値との比較により、すべてのプレートのウェルにわたって測定を行う。研究者がパッチクランプを使用し、未だ自動化ルーティーンで実施されない効果を検査する際は、手動による測定が必要な場合がある。さもなければ、専門の自動化分析装置を用いて、ウェル上で多数の実験（例えば、特定の周波数の光を解析する、または高スループットのパッチクランプ測定など）を行うことができる。この場合、装置は、数値のグリッドとして、1つのウェルから得られた値にマッピングする各数値を用いて各実験の結果を出力する。この最初のアッセイの結果に応じて、活性である（すなわち、細胞内環状ヌクレオチドレベルを改変する）と同定されたものと同様の物質を新しいアッセイプレートに使用し、同じスクリーン内でフォローアップアッセイを実施し、実験を再び行いさらなるデータを収集し、細胞に対する化学薬剤の効果を改善するために該薬剤の構造を最適化することができる。自動化はHTSの有用性において重要な要素である。１つの専門のロボットが、１つのアッセイプレートの寿命にわたって、作成から最終分析までほとんどのプロセスを担当することが多い。HTSロボットは、通常、多数のプレートを同時に調製し分析できるので、データ収集プロセスをさらに高速化することができる。本発明に係るHTSに適した装置の例は、蛍光イメージングプレートリーダー（Fluorometric Imaging Plate Reader：FLIPRTM; Molecular Devices）、FLEXstation TM（Molecular Devices）、電圧イオンプローブリーダー（Voltage Ion Probe Reader：VIPR; Aurora Biosciences）、Attofluor（登録商標）Ratio Vision（登録商標）（ATTO）が挙げられる。
【００５４】
従って、現在開示されている変異型光誘導性イオンチャネルは、電気的に興奮性の細胞、特に神経細胞の光刺激のための非治療的使用などの研究ツールとして特に有用である。例えば、海馬ニューロンの培養および海馬ニューロンからの電気生理学的な記録ならびにHEK293細胞における電気生理学的な記録に関するさらなる指針は、WO2012/032103号に見ることができる。
【００５５】
最後に、例えば、天然の視覚細胞がもはや機能していないのに全ての神経の接続が動作し続けてしまう多くの疾患がある。今日、網膜に人工セラミック光細胞を有する薄膜を埋め込むために様々な研究センターで試みが行われている。これらの光細胞は、網膜のまだ損なわれていない二次的な細胞を脱分極させ、それによって神経インパルス（バイオニック・アイ）を引き起こすことを意図している。これらの神経節細胞、アマクリン細胞または双極細胞における本開示による変異型光制御イオンチャネルを意図的に発現させることは、非常に優れた解決策であり、より大きな三次元的な視覚分解能を可能にする。したがって、本開示はまた、医薬における使用のための本開示に係る光誘導性イオンチャネルも企図する。
【００５６】
以下の実施例で原理の証明が実証されており、それぞれの目的に容易に適合可能である。これらのデータを考慮すると、本開示の光誘導性イオンチャネルは、聴覚障害者の聴覚活動の回復、または視覚障害者の視力の回復に使用できると考えられる。より具体的には、以下の実施例で実証すように、本開示の変異型光誘導性イオンチャネルは、十分な時間的忠実度を提供する。それらの赤方偏移したスペクトルは、光毒性のリスクが低いだけでなく、より深い光の浸透および組織内の散乱の減少に有利である。したがって、本開示の変異型光誘導性イオンチャネルが、光遺伝学的な聴覚回復および聴覚研究のための貴重なツールとなることが予測される。
【００５７】
さらに別の実施形態では、本開示の光誘導性イオンチャネルを、腕または脚といった四肢の感覚運動人工器官を改善するための求心性のフィードバックに使用できると考えられる。求心性フィードバックとは、身体の末梢神経から脳または脊髄に送られる神経信号を指す。本開示の光誘導性イオンチャネルは、さらに、疼痛、特に幻肢痛、または慢性疼痛の治療に使用することができると考えられる。
【００５８】
さらに、例えば、本開示の細胞についても記載されているように、神経細胞、特に螺旋神経節細胞などの電気的に興奮性の細胞において、本開示に係る光誘導性イオンチャンネルを機能的に発現する非ヒト動物についても開示する。同様に、本開示に係る細胞を含む非ヒト動物も企図される。
【００５９】
非ヒト動物は、ヒト以外の任意の動物であってよい。好ましい実施形態では、非ヒト動物は、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはマウスまたはラットなどのげっ歯類、あるいは霊長類である。
【００６０】
特に、以下のようなモデル生物が好ましい；カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）、アスナロウニ（Arbacia punctulata）、カタユウレイボヤ（Ciona intestinalis）、ショウジョウバエ（Drosophila）、通常、キイロショウジョウバエ種（Drosophila melanogaster）、ダンゴイカ（Euprymna scolopes）、ヒドラ（Hydra）、アメリカケンサキイカ（Loligo pealei）、プリスティオンクス・パキフィクス（Pristionchus pacificus）、アメリカムラサキウニ（Strongylocentrotus purpuratus）、Symsagittifera roscoffensis、及びコクヌストモドキ（Tribolium castaneum）。脊椎動物の中では、モルモット（Cavia porcellus）、ハムスター、マウス（Mus musculus）、及びラット（Rattus norvegicus）といったいくつかのげっ歯類の種、ならびにニワトリ（Gallus gallus domesticus）、ネコ（Felis cattus）、イヌ（Canis lupus familiaris）、ヤツメウナギ、ミナミメダカ（Oryzias latipes）、アカゲザル（Rhesus macaque）、シマウマヒツジ（Sigmodon hispidus）、ゼブラフィンチ（Taeniopygia guttata）、フグ（Takifugu rubripres）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）、及びゼブラフィッシュ（Danio rerio）といったその他の種がある。非ヒト霊長類、すなわちヒト属のメンバーでない霊長目に属するすべての種の動物、例えば、アカゲザル、チンパンジー、ヒヒ、マーモセット、およびミドリザルも好ましい。しかしながら、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６１】
ヒトまたは動物に実質的な医学的利益をもたらさない可能性があることによって特許法または管轄下で特許性の対象にはならない動物は排除されていることに留意されたい。さらに、当業者は、人間や動物に対する実質的な医学的利益が動物の苦しみを越えることを確実にするために、例えば、動物福祉の国際的ガイドラインに定められている適切な措置を講じる。
【００６２】
以下、本発明の範囲を限定する意図ではない図面および実施例によって本発明を説明する。
【００６３】
配列の表記
配列番号1（Chrimson;受託番号KF992060;ヘリックス6は太字で強調されている）
2019517279.tif 000004
【００６４】
配列番号2（CsChrimson;受託番号KJ995863;ヘリックス6は太字で強調されている）
2019517279.tif 000005
【００６５】
配列番号3（ヘリックス6コンセンサスモチーフ）
Cys - Arg - Met - Val - Val - Lys - Leu - Met - Ala - Tyr - Ala - Xaa12 - Phe - Ala - Ser - Trp - Gly - Xaa18 - Xaa19 - Pro - Ile - Leu - Trp - Ala - Val、
ここでXaa12はPhe又はTyrである、好ましくはここでXaa12はPheである;
ここでXaa18はMet又はSerである、好ましくはここでXaa18はMetである; かつ
ここでXaa19はPhe又はTyrである、好ましくはここでXaa19はPheである。
【００６６】
配列番号4（網膜結合部位コンセンサスモチーフ）
Xaa1-Asp-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Lys-Xaa7-Xaa8-Xaa9
ここでXaa1は、Leu、Ile、Ala、又はCysである;
ここでXaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa7、及びXaa8は、独立して任意のアミノ酸である;
ここでXaa9は、Thr、Phe、又はTyrである。
【００６７】
配列番号5（チャネルロドプシン2;ChR2;315aa;ヘリックス6は太字で強調されている）
2019517279.tif 000006
【００６８】
配列番号6（VChR1;受託番号EU622855;300aa;ヘリックス6は太字で強調されている）
2019517279.tif 000007
【００６９】
配列番号7（ReaChR;受託番号KF448069;352aa;ヘリックス6は太字で強調されている）
2019517279.tif 000008
【００７０】
配列番号8（ChR2;ヘリックス6スワップ変異体）
2019517279.tif 000009
【００７１】
配列番号9（VChR1ヘリックス6スワップ変異体）
2019517279.tif 000010
【００７２】
配列番号10（ReaChR;ヘリックス6スワップ変異体）
2019517279.tif 000011
【実施例】
【００７３】
本発明者らの目的は、変異によりオフキネティクスを加速することができるChrimsonの第6膜貫通ドメイン内の残基を同定することであった。
【００７４】
実施例1：NG108-15細胞におけるChrimson変異体の光電流
Chrimson-YFP及びChrimson-YFP変異体を一過的に発現するNG108-15細胞を、-60mVのクランプ電位で全細胞構成におけるパッチクランプ測定によって調べた。バス溶液は、140 mM NaCl、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2、10 mM HEPES、pH 7.4を含有し、ピペット溶液は、110 mM NaCl、2 mM MgCl2、10 mM EGTA、10 mM HEPES、pH 7.4を含有していた。光電流は、23mW/mm 2の強度および594nmの波長を有する3 ms光パルスに応答させて測定した。τoff値は、照明の停止後の電流を単指数関数へフィットさせることによって決定した。電流密度（J-60 mV）は、23mW/mm2の強度および594 nmの波長を有する500msの光パルスに応答する定常電流を、細胞の静電容量で除算することによって決定した。
【００７５】
結果を図1および2に示し、以下の表２に要約する。
【００７６】
【表２】
2019517279.tif 000012
【００７７】
表２：NG108-15細胞内で異種発現したChrimson及びChrimson変異体のオフキネティクス（τoff）及び電流密度（J-60mV）。平均τoff値（n=3-7）、平均電流密度（n=7-11）、及びそれらの標準偏差を示す。
【００７８】
上記のデータから分かるように、位置267、268および261に対応する位置における変異は、Chrimsonのオフキネティクス（τoff）を加速することができる。これらの変異の組み合わせは、Chrimsonのオフキネティクス（τoff）をさらに加速させる。これらの変異は、有利なように、互いにまたは既知のK176R変異と組み合わせることができる。
【００７９】
実施例2：NG108-15細胞におけるChrimson変異体の作用スペクトル
ChrimsonおよびChrimson変異体の作用スペクトルを、-60 mVのクランプ電位で全細胞構成におけるパッチクランプ測定により調べた。バス溶液は、140 mM NaCl、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2、10 mM HEPES、pH 7.4を含有し、ピペット溶液は、110 mM NaCl、2 mM MgCl2、10 mM EGTA、10 mM HEPES、pH 7.4を含有していた。Opolette 355可変レーザシステム（OPTOPRIM）を用いて、パルス長7nsの光パルスを発生させた。作用スペクトルの記録のために、様々な波長でのパルスエネルギーを、Chrimson野生型では1018光子/m2、Chrimson変異体では1019光子/m2の等光子数に対応する値に設定した。
【００８０】
結果を図3に示す。Y268F変異は、作用スペクトル（γmax=580 nm）の浅色偏移を生じる。注目すべきことに、Y268F変異を保有しない検査したChrimson変異体の作用スペクトルは、野生型Chrimsonの作用スペクトル（γmax=590 nm）と比較して有意に偏移しない。
【００８１】
実施例3：Chrimson変異体は、ラット海馬神経細胞においてスパイク頻度の増加を示す
神経細胞への適用に対するChrimson変異体の適合性を検査するために、構築物を培養ラット海馬神経細胞において発現させた。
【００８２】
海馬神経細胞の培養
生後のP1 Sprague-Dawleyラット（Jackson Laboratory）から海馬を単離し、37℃で20分間パパイン（20 U ml-1）で処理した。この海馬を10%ウシ胎児血清を添加したDMEM（Invitrogen/Gibco、高グルコース）で洗浄し、少量の当該溶液を用いて粉砕した。〜75,000個の細胞を、24ウェルプレート中のポリ-D-リジン/ラミニン被覆ガラスカバースリップ上にプレーティングした。3時間後、プレート培地を培養培地（2%B-27 supplement、2mM GlutamaxIを含むNeurobasal A）で置換した。
【００８３】
Chrimson-YFP、Chrimson-YFP Y261F/S267M及びChrimson-YFP K176R/Y261F/S267Mを異種発現するラット海馬神経細胞を、-70 mVのクランプ電位で全細胞構成におけるパッチクランプ測定により調べた。野生型Chrimsonまたは各Chrimson変異体の異種発現は、測定の14〜21日前にアデノ随伴ウイルスによる形質導入によって達成した。
【００８４】
簡潔には、プレーティングの4〜9日後に1×109ゲノムコピー/ml（GC/ml）のウイルスを各ウェルに添加した。発現は形質導入の5日後に見えるようになった。培養物の生存期間にわたり（〜5週間）、神経毒性は観察されなかった。本明細書に記載された実験では、オールトランスレチナールを培養培地または記録培地に添加しなかった。
【００８５】
アデノ随伴ウイルス（AAV2/1）
rAAV2/1ウイルスは、Chrimson-YFP野生型またはChrimson-YFP変異体を含むヒトシナプシンプロモーター（16）を保持するpAAV2ベクターを使用して、Dr. Botond Roska, FMI, Baselの研究室で調製した。ウイルス力価は名目上1×1012〜1×1013 GC/mlであった。
【００８６】
海馬神経細胞からの電気生理学的記録
培養海馬神経細胞における全細胞記録のために、3〜8MΩの抵抗を有するパッチピペットを、129mMグルコン酸カリウム、10mM HEPES、10mM KCl、4mM MgATPおよび0.3mM Na3GTPを含みpH7.2に滴定した溶液で満たした。Tyrode溶液を細胞外溶液（125mM NaCl、2mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、30mMグルコースおよび25mM HEPES、pH7.4に滴定）として用いた。興奮性シナプス伝達遮断薬、1,2,3,4-テトラヒドロ-6-ニトロ-2,3-ジオキソ-ベンゾ[f]キノキサリン-7-スルホンアミド（NBQX、10 μM、Sigma）およびD（-）-2-アミノ-5-ホスホノペンタン酸（AP-5、50 μM、Sigma）の存在下で記録を行った。τoff及びJ-70mVの測定は、1μM TTXの存在下で行った。
【００８７】
電気生理学的信号をAxopatch 200B増幅器（Axon Instruments、Union City、CA）を用いて増幅し、10kHzでろ過し、Axon Digidata 1322A（50Hz）でデジタル化し、pClamp9ソフトウェア（Axon Instruments）を用いて取得、分析した。
【００８８】
活動電位は、指示された周波数で40の光パルスによって引き起こされた。光パルスは3 msのパルス幅、λ=594 nmの波長および11〜30mW/mm2の飽和強度を有していた。
【００８９】
τoff値は、照明の停止後の電流を単指数関数へフィットさせることによって決定した。電流密度（J-70 mV）は、20〜40 mW/mm2の飽和強度および594 nmの波長を有する500 msの光パルスに応答する定常電流を、細胞の静電容量で除算することによって決定した。100%の確率で活動電位を誘起するのに必要な最小光強度（J100）を決定するために、様々な光強度の40のパルス（A=594 nm、パルス幅=3 ms、v=10 Hz）を適用した。スパイク確率は、光によって誘発されるスパイクの数を光パルスの総数で除算することによって計算した。
【００９０】
結果を図4に示す。野生型Chrimsonを発現するラット海馬神経細胞は、10Hzを超える周波数では100%の確率で活動電位を誘導することができず（図4A参照）、Chrimson変異体Y261F/S267M（図示せず）およびK176R/Y261F/S267M（図4B参照）は、20Hzおよび40Hzで活動電位を適切に誘導することができた。さらに、Chrimson変異体K176R/Y261F/S267M（図示せず）およびY261F/S267M（図4C参照）は、80〜100Hzという高い周波数でも活動電位を適切に誘導することさえできた。これらの測定は、本開示の高速Chrimson変異体が迅速な神経光刺激を可能にすることを明示している。
【００９１】
ラット海馬神経細胞において異種発現したChrimson変異体K176R/Y261F/S267MおよびChrimson変異体Y261F/S267Mの測定された特性を野生型Chrimsonと比較して以下の表３に示す。
【００９２】
【表３】
2019517279.tif 000013
【００９３】
表３：オフキネティクス（τoff）、電流密度（J-70mV）及びの100%の確率で活動電位を誘発するのに必要な最小光強度（J100）。平均τoff（n=3〜11）、平均J-70mV（n=10〜14）、平均J100（n=7）及びそれらの標準偏差を示す。
【００９４】
表３に示すように、Chrimson変異体K176R/Y261F/S267M及びChrimson変異体Y261F/S267Mでは、野生型と比較して、オフキネティックス（τoff）が有意に加速される。したがって、Chrimson Y261F/S267M及びChrimson K176R/Y261F/S267Mの電流密度（J-70mV）は、野生型Chrimsonと比較してわずかに減少するのみである。ラット海馬神経細胞におけるロバストな発現は、低い光強度での神経光刺激を可能にする。これらのデータは、本明細書の図4に示すように、NG108-15細胞（表２）で観察されるより高速なキネティクスを確認し、高周波数で活動電位が正確に誘導できることを説明するものである。
【００９５】
実施例4：聴覚経路の光遺伝学的な刺激
聴覚神経の光遺伝学的な刺激は、蝸牛インプラントや聴性脳幹インプラントのような聴覚プロテーゼによるサウンドコーディングの大きな前進を約束するものである。光が簡便に集束できるので、光学的な聴覚プロテーゼは、コーディングの周波数分解能の大幅な改善を約束する。現在利用可能な光遺伝学的なツールの制限事項の1つは、聴覚信号処理の速度と比較してキネティクスが遅いことである。ここでは、Hernandez et al. J Clin Invest. 2014;124（3）：1114-29に従前に記載されたシステムを適用し、マウスにおけるSGNの出生後のアデノ随伴ウィルス（AAV）による形質導入を用いて、蝸牛の光遺伝学に関し、急速にゲーティングするChrimson-YFP Y261F/S267Mの能力を検査した。AAV2/6-hSyn-Chrimson-YFP Y261F/S267Mを、p3マウスの蝸牛窓を介して鼓室内に注入し、注射後4〜8週間の発現および機能を分析した。注入されたマウスは、コロニーで明白な表現型を示さなかった。Chrimson-YFP Y261F/S267Mの発現およびSGN密度を、注入を行った耳および注入を行わなかった耳の凍結切片の免疫組織化学的解析並びにYFPおよびカルレチニン免疫蛍光の共焦点画像を用いて分析した（図5A,5B）。注入を行った全ての耳で、Chrimson-YFP Y261F/S267Mはすべての蝸牛転でSGNの約90%が注入耳に導入され（非注入耳では5%未満であった）、SGN密度は有意に変化しなかった（図1B）。形質導入率は、AAV2/6-hSyn-CatCh-YFPの子宮内注射を用いた我々の以前の研究で達成されたもの（Hernandez et al., 2014）よりもはるかに高く、それとは異なり、トノトピック位置から独立していた。後方鼓室切開術を行い、50 μm光ファイバーを円形窓を介して挿入し、595nm連続波レーザーの光を基底回転のSGNに投射した。光聴覚脳幹反応（optical auditory brainstem responses：oABR, 図6A）を容易に誘発でき、それは振幅及び波形が音響ABR（acoustic ABR：aABR）に類似していた。光強度が増すほどoABR振幅が増大しoABR待ち時間は短くなった（図6B,6E）。0.5 mWほどの低い刺激（図6C、刺激持続時間：1 ms、刺激レート：10 s-1）及び80 μsほどの短い刺激（図6D、刺激強度：11 mW、刺激レート：10 s-1）でoABRを駆動するのに十分であった。oABRの振幅および波形は動物によって異なる（図6A）が、通常は1桁を超える光強度の変化で変化する（図6C、出力ダイナミックレンジ> 20 dB）。刺激持続時間の減少または刺激速度の増加に従いoABR振幅は減少したが（図6D）、200HzまではoABRが見られた（図6F）。oABRは、５〜７ｍｓにわたって時間が延びる集団応答を反映することが注目され、そのために、応答がその後の刺激間の相互作用によって減弱されたのではと仮定される。Chrimson-YFP Y261F/S267Mが介在する蝸牛の光遺伝学的手法（Chrimson-YFP Y261F/S267M mediated cochlear optogenetics）により175Hz以上でSGNを駆動することができると結論づけられ、それは生理学的音声駆動SGN発火率の範囲内である（Liberman, M.C., J. Acoust. Soc. Am. 63, 442-455 （1978）; Winter, et al., Hear. Res. 45, 191-202 （1990））。要約すると、SGNの出生後形質導入が効率的に確立され、そして低光強度および短時間の刺激でSGN発火を達成した。十分な時間的忠実度を提供し、また、光がより深部へ浸透し、組織へ散乱が少なく、光毒性のリスクが低い点でブルーチャネルロドプシンよりも優れているChrimson-YFP Y261F/S267Mは、聴覚回復および聴覚研究に関する光遺伝学の貴重なツールになると予想される。
【００９６】
例えば、Hernandez et al.に記載されるように、本明細書に開示のヘリックス6モチーフその他の任意の変異を構築物に導入することは、ルーティーン作業である。あるいは、構築物におけるチャネルロドプシンのコーディング配列を、本開示の光誘導性イオンチャネルのコーディング配列に置換することは容易にできる。
【００９７】
実施例5：視力回復のための光遺伝学的アプローチ
Mace et al. Mol Ther. 2015;23（1）：7-16は、アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子治療による網膜神経細胞の光遺伝学的再活性化を記載する、本発明者らの一部によって執筆された初期の刊行物である。ほとんどの遺伝性網膜ジストロフィーでは、重度の視覚障害を引き起こす進行性の光受容体細胞変性を示す。アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子治療による網膜神経細胞の光遺伝学的再活性化は、患者特異的な変異にかかわらず視力を回復させる可能性がある。臨床的な翻訳可能性への挑戦は、脆弱な変性網膜のために外科的に安全な送達経路を用いながらできるだけ自然な視力に近い視力を回復することである。網膜内側の視覚処理を維持するために、疾患の後期の段階でも依然として存在するＯＮ双極細胞が標的とされる。安全な遺伝子送達のために、眼に容易にアクセス可能な硝子体液への注入後に双極細胞を形質導入することができる近年設計されたAAV変異体が使用される。ＯＮ双極細胞特異的プロモーター下でチャネルロドプシンをコードするAAVは、硝子体内投与後にＯＮ双極細胞に限定的な長期の遺伝子送達を仲介することが示されている。ＯＮ双極細胞におけるチャネルロドプシン発現は、網膜レベルおよび皮質レベルでのＯＮおよびＯＦＦ応答の回復をもたらす。さらに、光誘発性の運動器官の挙動が、治療を受けた盲目マウスにおいて回復される。
【００９８】
例えばMace et alによって記載されているように、本明細書で同定されたヘリックス６モチーフを構築物に導入することは、ルーティーン作業である。あるいは、構築物におけるチャネルロドプシンのコーディング配列を、本開示の光誘導性イオンチャネルのコーディング配列に置換することは容易にできる。本開示の新規な光誘導性イオンチャネルは、網膜の神経節細胞と同様にＯＮ双極細胞の活性化のためにカセットに挿入される。
【００９９】
引用文献のリスト
US 2016/0039902
WO 03/084994
WO 2012/032103
WO 2013/071231
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ）】
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【図４Ｂ）】
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【図４Ｃ）】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019517279.tif 000023
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