(57)【要約】  本発明は、（ａ）Ｌ−ＤＯＰＡを産生することができる第１の宿主細胞；及び（ｂ）Ｌ−ＤＯＰＡをヒドロキシチロソール（ＨＴｙ）に変換することができる改変宿主細胞を含む組成物であって、ここで、第１の宿主細胞及び第２の宿主細胞のいずれか一方又は両方は、遺伝子改変された宿主細胞である上記組成物を提供する。
2019524076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｌ−ＤＯＰＡを産生することができる第１の宿主細胞；及び（ｂ）Ｌ−ＤＯＰＡをヒドロキシチロソール（ＨＴｙ）に変換することができる第２の宿主細胞を含む組成物であって、ここで、第１の宿主細胞及び第２の宿主細胞のいずれか一方又は両方は、遺伝子改変された宿主細胞である組成物。
【請求項２】
第１の宿主細胞が第１の遺伝子改変された宿主細胞であり、第２の宿主細胞が第２の遺伝子改変された宿主細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
第１の宿主細胞が、ジヒドロプテリジンレダクターゼ（ＤＨＰＲ）、プテリン−４−アルファ−カルビノアミンデヒドラターゼ（ＰＣＤ）、及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、又はそれらの任意の相同な酵素を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ＤＨＰＲ、ＰＣＤ、及びＴＨのうちの１つ以上が、第１の宿主細胞に対して異種である、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
第１の宿主細胞が、操作されていない細胞と比較してチロシンを過剰産生するように操作され、第１の宿主細胞がチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）又はその相同な酵素を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
第１の宿主細胞がＡｒｏＧ若しくはその相同な酵素、及び／又はＴｙｒＡもしくその相同な酵素を過剰発現する、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
第１の宿主細胞が、Ｌ−チロシンの合成のための以下の酵素：ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ＰｐｓＡ）、トランスケトラーゼＡ（ＴｋｔＡ）、ＤＡＨＰシンターゼ（ＡｒｏＧ）、ＤＨＱシンターゼ（ＡｒｏＢ）、ＤＨＱデヒドラターゼ（ＡｒｏＤ）、キナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ＹｄｉＢ）、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ＡｒｏＥ）、シキミ酸キナーゼＩ／ＩＩ（ＡｒｏＫ／Ｌ）、ＥＰＳＰシンターゼ（ＡｒｏＫ／Ｌ）ＡｒｏＡ）、コリスミ酸シンターゼ（ＡｒｏＣ）、コリスミ酸ムターゼ／プレフェナ酸デヒドロゲナーゼ（ＴｙｒＡ）、及びチロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴｙｒＢ）若しくはその対応する相同な酵素のうちの１つ以上又はそれらのすべてをさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ＰｐｓＡ、ＴｋｔＡ、ＡｒｏＧ、ＡｒｏＢ、ＡｒｏＤ、ＹｄｉＢ、ＡｒｏＥ、ＡｒｏＫ／Ｌ、ＡｒｏＡ、ＡｒｏＣ、ＴｙｒＡ、及びＴｙｒＢのうちの１つ以上が、第１の宿主細胞に対して異種である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
第１の宿主細胞がＭ９Ｙ規定培地（１％グルコース）中で増殖又は培養される場合、第１の宿主細胞が２．０ｍＭ以上のＬ−チロシンを産生することができる、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
第１の宿主細胞がＭ９Ｙ規定培地（１％グルコース）中で増殖又は培養された場合、第１の宿主細胞が２．６ｍＭ以上のＬ−チロシンを産生することができる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
第２の宿主細胞が、Ｌ−ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ）、チラミンオキシダーゼ（ＴＹＯ）、及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、又はそれらの任意の相同な酵素を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
ＤＤＣ、ＴＹＯ、及びＡＤＨのうちの１つ以上が、第２の宿主細胞に対して異種である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
（ａ）Ｌ−ＤＯＰＡを産生することができる第１の宿主細胞を用意し；
（ｂ）第１の宿主細胞を培養して第１の培養物を生成し；
（ｃ）Ｌ−ＤＯＰＡをヒドロキシチロソール（ＨＴｙ）に変換することができる第２の宿主細胞を用意し；
（ｄ）第２の宿主細胞を培養して第２の培養物を生成し；
（ｅ）第１及び第２の培養物を組み合わせ又は混合して共培養物を生成し；
（ｆ）ＨＴｙが産生されるように組成物中で第１及び第２の宿主細胞を培養し；ならびに
（ｇ）場合により、共培養物からＨＴｙを抽出又は分離する
ことを含み、ここで、第１の宿主細胞及び第２の宿主細胞のいずれか一方又は両方が遺伝子改変された宿主細胞である、ヒドロキシチロソール（ＨＴｙ）を製造する方法。
【請求項１４】
第１の宿主細胞が第１の遺伝子改変された宿主細胞であり、第２の宿主細胞が第２の遺伝子改変された宿主細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第１の宿主細胞が、ジヒドロプテリジンレダクターゼ（ＤＨＰＲ）、プテリン−４−アルファ−カルビノアミンデヒドラターゼ（ＰＣＤ）、及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、又はそれらの任意の相同な酵素を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＨＰＲ、ＰＣＤ、及びＴＨのうちの１つ以上が、第１の宿主細胞に対して異種である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
第１の宿主細胞が、操作されていない細胞と比較してチロシンを過剰産生するように操作され、第１の宿主細胞が、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）又はその相同な酵素を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
第１の宿主細胞がＡｒｏＧ若しくはその相同な酵素、及び／又はＴｙｒＡ若しくはその相同な酵素を過剰発現する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
第１の宿主細胞が、Ｌ−チロシンの合成のための以下の酵素：ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ＰｐｓＡ）、トランスケトラーゼＡ（ＴｋｔＡ）、ＤＡＨＰシンターゼ（ＡｒｏＧ）、ＤＨＱシンターゼ（ＡｒｏＢ）、ＤＨＱデヒドラターゼ（ＡｒｏＤ）、キナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ＹｄｉＢ）、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ＡｒｏＥ）、シキミ酸キナーゼＩ／ＩＩ（ＡｒｏＫ／Ｌ）、ＥＰＳＰシンターゼ（ＡｒｏＫ／Ｌ）ＡｒｏＡ）、コリスミ酸シンターゼ（ＡｒｏＣ）、コリスミ酸ムターゼ／プレフェナ酸デヒドロゲナーゼ（ＴｙｒＡ）、及びチロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴｙｒＢ）若しくはその対応する相同な酵素のうちの１つ以上又はそれらのすべてをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＰｐｓＡ、ＴｋｔＡ、ＡｒｏＧ、ＡｒｏＢ、ＡｒｏＤ、ＹｄｉＢ、ＡｒｏＥ、ＡｒｏＫ／Ｌ、ＡｒｏＡ、ＡｒｏＣ、ＴｙｒＡ、及びＴｙｒＢのうちの１つ以上が、第１の宿主細胞に対して異種である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第１の宿主細胞がＭ９Ｙ規定培地（１％グルコース）中で増殖又は培養された場合、第１の宿主細胞が２．０ｍＭ以上のＬ−チロシンを産生することができる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第１の宿主細胞がＭ９Ｙ限定培地（１％グルコース）中で増殖又は培養された場合、第１の宿主細胞が２．６ｍＭ以上のＬ−チロシンを産生することができる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
第２の宿主細胞が、Ｌ−ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ）、チラミンオキシダーゼ（ＴＹＯ）、及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、又はそれらの任意の相同酵素を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
ＤＤＣ、ＴＹＯ、及びＡＤＨのうちの１つ以上が、第２の宿主細胞に対して異種である、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する特許出願
本出願は、その全体が参照により本明細書に援用される、２０１６年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／３５４，６５７号に対する優先権を主張する。
【０００２】
政府支援に関する陳述
本明細書に記載され、請求される発明は、契約番号ＤＥ−ＡＣ０２−０５ＣＨ１１２３１の下で米国エネルギー省によって供給された資金を利用してなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ヒドロキシチロソールの製造分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
芳香環のヒドロキシル化は、パーキンソン病の治療のためのＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）、ベンジルイソキノリンアルカロイド、及びメラトニンを含む多くの価値ある化合物の調製に使用される重要な反応である。有機溶媒中で金属酸化剤を頻繁に使用する化学反応と比較して、微生物による芳香環のヒドロキシル化は、高い位置選択性を有する、温和な条件下で単一工程にて所望の生成物を合成するための興味深く有望な方法である。微生物による芳香族ヒドロキシル化は、芳香族化合物の好気的代謝に関与し、主に、分解過程でオキシゲナーゼとチロシナーゼによって行われ、毒性を軽減するか、又は炭素源として使用するためにそれらを有機酸に代謝する。
【０００５】
チロシナーゼは酸化還元酵素であり、酸素運搬体としてヘモシアニンを含む３型銅タンパク質に属する（Ｏｌｉｖａｒｅｓ，２００９；Ｒｏｂｂ，１９８４）。この酵素は、酸化剤として分子状酸素を使用するＬ−チロシンの多重酸化反応を伴う；第一酸化工程はＬ−チロシンのＬ−ＤＯＰＡへのｏ−ヒドロキシル化であり、最も遅い工程であることが知られ、第二酸化工程はｏ−ジフェノールからのｏ−キノンの生成であり、それは速く、その後、ドーパクロムへの反応の非酵素的反応、メラニン経路の着色中間体となる。チロシンからＬ−ＤＯＰＡへの微生物変換は遅いプロセスであり、チロシナーゼが使用される場合、オルト−キノンへの過剰酸化は避けるのが難しい。アスコルビン酸などの還元剤の使用は、発酵ブロスからの生成物の精製のためのさらなる工程を追加する。
【０００６】
Ｌ−ＤＯＰＡは、多くの神経伝達物質の前駆体として使用されるため、特に動物において生細胞にとって重要な化合物であり、動物の脳において、Ｌ−ＤＯＰＡは、補因子としてテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）を有するチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）によって合成された（Ｋａｐｐｏｃｋ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９６；Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９９；Ｄａｕｂｎｅｒ，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２０１１）。酸化工程中のプテリン補因子の使用は、ＴＨ、ならびにフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）及びトリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ）などの関連酵素の独特の特徴である（Ｐｒｉｂａｔ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２０１０）。これは、チロシナーゼによる微生物Ｌ−ＤＯＰＡ産生における問題である、Ｌ−チロシンのｏ−キノン生成物への過剰酸化を防ぐのを助ける（Ｍａａｓｓ，２００３）。しかしながら、微生物代謝工学へのＴＨ酵素の適用は、微生物中に補酵素ＢＨ４が利用できないために報告されていない。ＢＨ４は、動物に見られる独特な補因子であり、Ｌ−ＤＯＰＡ又は関連代謝物の生合成にＢＨ４を使用することが報告された細菌系はない。
【０００７】
ヒドロキシチロソール（ＨＴｙ）は高価値の化合物であり、高純度のＨＴｙの安定かつ持続可能な製造に対する需要が高まっている。ＨＴｙは、抗腫瘍剤、抗アテローム剤、抗炎症剤及び／又は抗血小板凝集剤としての潜在的な生物学的機能を有する最も強力な抗酸化剤の１つである。それは、機能性食品、栄養補助食品、化粧品、及び動物飼料などの産業における広範囲の潜在的用途を有する。
【０００８】
現在、ＨＴｙは、化学的又は酵素的加水分解の後に濃縮オリーブ抽出物から製造される。しかしながら、この方法は、抽出物が類似の構造を有する化合物の複雑な混合物であるため、高純度の生成物に適用するのは困難である。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、（ａ）Ｌ−ＤＯＰＡを産生することができる第１の宿主細胞；（ｂ）Ｌ−ＤＯＰＡをヒドロキシチロソール（ＨＴｙ）に変換することができる第２の宿主細胞を含む組成物を提供し、ここで、第１の宿主細胞及び第２の宿主細胞のいずれか一方又は両方が遺伝子改変された宿主細胞である。いくつかの実施形態では、第１の宿主細胞は第１の遺伝子改変された宿主細胞であり、第２の宿主細胞は第２の遺伝子改変された宿主細胞である。
【００１０】
いくつかの実施形態では、第１の宿主細胞は、ジヒドロプテリジンレダクターゼ（ＤＨＰＲ）、プテリン−４−アルファ−カルビノアミンデヒドラターゼ（ＰＣＤ）、及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、又はそれらの任意の相同な酵素を含む。いくつかの実施形態では、ＤＨＰＲ、ＰＣＤ、及びＴＨのうちの１つ以上は、第１の宿主細胞に対して異種である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、第１の宿主細胞は、操作されていない細胞と比較してチロシンを過剰産生するように操作され、第１の宿主細胞はチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）又はその相同な酵素を含む。いくつかの実施形態では、第１の宿主細胞は、ＡｒｏＧ又はその任意の相同な酵素を過剰発現するための手段、及びＴｙｒＡ又はその相同な酵素を過剰発現するための手段を含むフィードバック耐性突然変異体である。いくつかの実施形態では、ＡｒｏＧを過剰発現させるための手段は、宿主細胞の染色体又はプラスミド上に組み込まれた、宿主細胞に導入された１コピー以上のａｒｏＧ遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＴｙｒＡを過剰発現させるための手段は、宿主細胞の染色体又はプラスミド上に組み込まれた、宿主細胞に導入された１コピー以上のｔｙｒＡ遺伝子である。いくつかの実施形態では、ａｒｏＧ及び／又はｔｙｒＡ遺伝子は、強力な構成的プロモーターから転写される。いくつかの実施形態では、第１の宿主細胞は、Ｌ−チロシンの合成のための以下の酵素：ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ＰｐｓＡ）、トランスケトラーゼＡ（ＴｋｔＡ）、ＤＡＨＰシンターゼ（ＡｒｏＧ）、ＤＨＱシンターゼ（ＡｒｏＢ）、ＤＨＱデヒドラターゼ（ＡｒｏＤ）、キナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ＹｄｉＢ）、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ＡｒｏＥ）、シキミ酸キナーゼＩ／ＩＩ（ＡｒｏＫ／Ｌ）、ＥＰＳＰシンターゼ（ＡｒｏＫ／Ｌ）ＡｒｏＡ）、コリスミ酸シンターゼ（ＡｒｏＣ）、コリスミ酸ムターゼ／プレフェナ酸デヒドロゲナーゼ（ＴｙｒＡ）、及びチロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴｙｒＢ）若しくはその対応する相同な酵素のうちの１つ以上又はそれらのすべてをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の宿主細胞は、第１の宿主細胞がＭ９Ｙ規定培地（１％グルコース）で増殖又は培養された場合、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５若しくは２．６ｍM、又はそれ以上のＬ−チロシンを産生することができる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、第２の宿主細胞は、Ｌ−ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ）、チラミンオキシダーゼ（ＴＹＯ）、及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、又はそれらの任意の相同な酵素を含む。いくつかの実施形態では、ＤＤＣ、ＴＹＯ、及びＡＤＨのうちの１つ以上は、第２の宿主細胞に対して異種である。
【００１３】
本発明は、ＨＴｙを生成する方法を提供し、該方法は、以下を含む：（ａ）第１の宿主細胞を用意し；（ｂ）第１の宿主細胞を培養して第１の培養物を生成し；（ｃ）第２の宿主細胞を用意し；（ｄ）場合により、第２の宿主細胞を培養して第２の培養物を生成し；（ｅ）第１及び第２の培養物を組み合わせ又は混合して、本発明の組成物を含む共培養物を生成し；及び（ｆ）ＨＴｙが産生されるように組成物中で第１及び第２の宿主細胞を培養し；ならびに（ｇ）場合により共培養物からＨＴｙを抽出又は分離する。
【００１４】
本発明は、以前に報告されたもの（Ｓａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４（２０１２）６０３−６１０）から力価が有意に改善されたＨＴｙを生成するための製造方法を提供する。いくつかの実施形態では、合成ＨＴｙ経路の効率を改善するための４つの代謝的及びプロセス工学的アプローチがある（図１）。
【００１５】
ＨＴｙ経路は、チロシンヒドロキシル化及びＬ−ＤＯＰＡのＨＴｙへの下流変換のための５つの異種酵素（すなわち、互いに異種である）を含む（図２）。
【００１６】
本発明はまた、本発明の組成物を含む産業用途のためのバイオリアクターデザインを提供する。
【００１７】
本発明はまた、本発明の方法に有用な遺伝子改変された宿主細胞を提供する。
【００１８】
前述の態様及び他の態様は、添付の図面と併せて読まれるとき、以下の例示的な実施形態の説明から当業者によって容易に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ヒドロキシチロソール生産者工学の概要。
【図２】ヒドロキシチロソール生成経路。ＴＨ：マウス由来のチロシンヒドロキシラーゼ、合成。ＤＤＣ：ブタ由来のＬ−ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ、合成。ＭＡＯ：Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ由来のモノアミンオキシダーゼ、クローン化。
【図３】ＪＷ１３８０（ｆｅａＢノックアウト）、ｐＢｂＥ１ｋ−ＴＨ−ＤＨＰＲ−ＰＣＤ（上部）、ｐＢｂＳ２ｃ−（補因子遺伝子）。培地Ｍ９Ｙ（１ｍＭのＬ−チロシン、アスコルビン酸）、３７ｍＬフラスコ培養、誘導ＯＤ０．５。ｐＴｒｃ（ＩＰＴＧ）下の上部：５００μＭ。ｐＴｅｔ（ａＴｃ）下の補因子遺伝子：４０ｎＭ。誘導時にチロシン及びアスコルビン酸を補足した。上清を誘導の６、１８、３２又は３９、５３時間後にＬＣ−ＭＳによって分析する。誤差バーは、三連の生物学的反復からの標準偏差を示す。
【図４】上部：ＪＷ１３８０、ｐＢｂＥ１ｋ−ＴＨ−ｒｅｇ、ｐＢｂＳ１ａ（空ベクター）。培地Ｍ９Ｙ（１ｍＭのＬ−チロシン）、５ｍＬチューブ培養、誘導ＯＤ０．４。ｐＴｒｃ（ＩＰＴＧ）下の上部：５００μＭ。誘導時にチロシン又は下流の化学物質を補給する。上清を誘導の２５、４２、７６時間後にＬＣ−ＭＳによって分析する。誤差バーは、三連の生物学的反復からの標準偏差を示す。
【図５Ａ】チロシンからの共培養スキームバージョン１。
【図５Ｂ】１ｍＭチロシンからの共培養の生成物プロフィール。共培養：上−ｆｏｌＥ：ＪＷ１３９０、ｐＢｂＥ１ｋ−ＴＨ−ｒｅｇ−ｆｏｌＥ、ｐＢｂＳ１ａ（空ベクター）。下部：ＪＷ１３８０、ｐＢｂＥ２ｋ−ＴＹＯ、ｐＢｂＡ１ａ−ＤＤＣ−ＲＦＰ。誘導の４時間後に下部細胞を回収し、上部株で懸濁し、さらに４０時間培養する（合計６５時間）。単一株：上部−ｆｏｌＥ＋ＤＤＣ−ＴＹＯ：ＪＷ１３８０、ｐＢｂＥ１ｋ−ＴＨ−ｒｅｇ−ｆｏｌＥ、ｐＢｂＳ１ａ−ＤＤＣ−ＴＹＯ。上清を誘導の４０時間後にＬＣ−ＭＳによって分析する。
【図６Ａ】ブドウ糖からの共培養スキームバージョン２。
【図６Ｂ】５ｇ／Ｌグルコースからの共培養の生成物プロフィール。上部：ＤＫ１７６、ｐＢｂＥ１ｋ−ＴＨ−ｒｅｇ−ｆｏｌＥ、ｐＢｂＳ１ａ（空ベクター）。下部：ＪＷ１３８０、ｐＢｂＥ２ｋ−ＴＹＯ、ｐＢｂＡ１ａ−ＤＤＣ−ＲＦＰ。培地Ｍ９Ｙ（５ｇ／Ｌグルコース）、１０ｍＬフラスコ培養、誘導ＯＤ０．４。
【図７Ａ】ＨＴｙ生成のための共培養スキーム（チロシンから）。
【図７Ｂ】生成物プロフィール（単一株培養対共培養）。上部＋下部（単一株）：ＪＷ１３８０、ｐＢｂＥ１ｋ−ＴＨ−ｒｅｇ、ｐＢｂＳ１ａ−ＤＤＣ−ＴＹＯ。上葉＋下（単一株）：ＪＷ１３８０、ｐＢｂＥ１ｋ−ＴＨ−ｒｅｇ−ｆｏｌＥ、ｐＢｂＳ１ａ−ＤＤＣ−ＴＹＯ。上部：ＪＷ１３８０、ｐＢｂＥ１ｋ−ＴＨ−ｒｅｇ、ｐＢｂＳ１ａ（空ベクター）。上部：ＪＷ１３８０、ｐＢｂＥ１ｋ−ＴＨ−ｒｅｇ−ｆｏｌＥ、ｐＢｂＳ１ａ（空ベクター）。下部Ａ：ＪＷ１３８０、ｐＢｂＥ２ｋ−ＴＹＯ、ｐＢｂＡ１ａ−ＤＤＣ−ＲＦＰ。下部Ｂ：ＪＷ１３８０、ｐＢｂＳ１ａ−ＤＤＣ−ＴＹＯ、ｐＢｂＥ１ｋ（空ベクター）。培地Ｍ９Ｙ（１ｍＭのＬ−チロシン）、５ｍＬチューブ培養、誘導ＯＤ０．４。ｐＴｒｃ（ＩＰＴＧ）下の上部：５００μＭ。チロシンを導入時に補足する。誘導の７３時間後に上清をＬＣ−ＭＳによって分析する。誤差バーは、三連の生物学的反復からの標準偏差を示す。
【図８Ａ】共培養スキーム（グルコースから）。
【図８Ｂ】グルコースからの共培養におけるＨＴｙ生成。上部：ＤＫ１７６、ｐＢｂＥ１ｋ−ＴＨ−ｒｅｇ−ｆｏｌＥ、ｐＢｂＳ１ａ（空ベクター）。下部Ａ：ＪＷ１３８０、ｐＢｂＥ２ｋ−ＴＹＯ、ｐＢｂＡ１ａ−ＤＤＣ−ＲＦＰ。培地Ｍ９Ｙ（５ｇ／Ｌグルコース）。誤差バーは、三連の生物学的反復からの標準偏差を示す。
【図８Ｃ】酢酸エチルで抽出することによる単純化された生成物プロファイル。各時点での上清を酢酸エチル抽出で精製する。
【図９】産業プロセスの概略図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明を詳細に説明する前に、特に明記しない限り、本発明は、特定の配列、発現ベクター、酵素、宿主微生物、又はプロセスに限定されず、それらは変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないこともまた理解されるべきである。
【００２１】
明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「発現ベクター」への言及は、単一の発現ベクター、ならびに同じ（例えば、同じオペロン）又は異なる複数の発現ベクターを含み、「細胞」への言及は、単一細胞ならびに複数の細胞を含む、などである。
【００２２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、以下の意味を有すると定義されるべきいくつかの用語を参照する。
【００２３】
本明細書で使用される「任意の」又は「任意に」という用語は、後述の特徴又は構造が存在してもよく又は存在しなくてもよく、あるいは後述の事象又は状況が発生してもよく又は発生しなくてもよいことを意味し、この記載は、特定の特徴又は構造が存在する場合、及び特徴又は構造が存在しない場合、あるいは事象又は状況が発生した場合、及びそれが発生しない場合を含むことを意味する。
【００２４】
「宿主細胞」及び「宿主微生物」という用語は、発現ベクターの挿入を介して形質転換することができる、微生物などの生きた生物学的細胞を指すために本明細書では互換的に使用される。したがって、本明細書に記載の宿主生物又は細胞は原核生物（例えば、真正細菌界の生物）又は真核細胞であり得る。当業者には理解されるように、原核細胞は膜結合核を欠いているが、真核細胞は膜結合核を有している。
【００２５】
本明細書で使用される「異種ＤＮＡ」という用語は、核酸のポリマーを指し、ここで、以下の少なくとも１つがあてはまる：（ａ）核酸の配列が所与の宿主微生物にとって外来である（すなわち、天然に見出されない）；（ｂ）配列は所与の宿主微生物中に天然に見出され得るが、非天然（例えば、予想よりも多い）量であり得る；又は（ｃ）核酸の配列が、本質的に互いに同じ関係で見いだされない２つ以上の部分配列を含む。例えば、例（ｃ）に関して、組換え的に生成される異種核酸配列は、新しい機能性核酸を作製するように配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列を有する。具体的には、本発明は、宿主微生物への発現ベクターの導入を記載し、ここで、発現ベクターは、宿主微生物では通常見られない酵素をコードする核酸配列を含む。続いて、宿主微生物のゲノムに関して、酵素をコードする核酸配列は異種である。
【００２６】
「発現ベクター」又は「ベクター」という用語は、宿主微生物を形質導入、形質転換、又は感染させ、それによって細胞に天然のもの以外の核酸及び／又はタンパク質を発現させ、又は細胞に天然ではない方法で発現させる化合物及び／又は組成物を指す。「発現ベクター」は、宿主微生物によって発現されるべき核酸（通常はＲＮＡ又はＤＮＡ）の配列を含む。ばあいにより、発現ベクターはまた、ウイルス、リポソーム、タンパク質コーティングなどの宿主微生物への核酸の侵入を達成するのを助けるための材料を含む。本発明での使用が企図される発現ベクターは、核酸配列を挿入することができるものを、任意の好ましい又は必要な操作エレメントとともに含む。さらに、発現ベクターは、宿主微生物に移入され、そこで複製され得るものでなければならない。好ましい発現ベクターはプラスミドであり、特に、よく文書化されており、核酸配列の転写に好ましい又は必要な操作エレメントを含む制限部位を有するものである。そのようなプラスミド、ならびに他の発現ベクターは、当業者に周知である。
【００２７】
本明細書で使用される「形質導入する」という用語は、宿主微生物又は細胞への核酸配列の導入を指す。核酸の配列が細胞によって安定して複製されるようになったときにのみ、宿主微生物又は細胞は「形質転換」されるようになる。当業者によって理解されるように、「形質転換」は、核酸配列の細胞ゲノムへの組み込み、すなわち染色体への組み込み、又は染色体外への組み込みのいずれかによって起こり得る。対照的に、発現ベクター、例えばウイルスは、それが宿主微生物を形質導入し、複製し、（いかなる相補的なウイルス又はベクターの恩恵もなしに）同種の後代発現ベクター、例えばウイルスを拡散するときに「感染性」である。ここでは、子孫発現ベクターが同じ複製能力を有する。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸配列」、「核酸の配列」、及びそれらの変形は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリン又はピリミジン塩基のＮ−グリコシドである任意の多種のポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー（ただし、ポリマーがＤＮＡ及びＲＮＡに見られるように塩基対合及び塩基スタッキングを可能にする配置で核酸塩基を含有する）に対する総称である。したがって、これらの用語は、既知の種類の核酸配列修飾、例えば、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドを類似体に置換すること；例えば、非荷電結合を有するもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）、負電荷結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、及び正電荷結合を有するもの（例えば、アミノアルキルホスホルアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）などのヌクレオチド内修飾；ペンダント部分を含むもの、例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどを含む）；インターカレーターを有するもの（例えば、アクリジン、ソラレンなど）；キレート剤を含むもの（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）を含む。本明細書中で使用される場合、ヌクレオチド及びポリヌクレオチドの記号は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．９：４０２２，１９７０）によって推奨されているものである。
【００２９】
用語「作動可能に連結される」とは、核酸発現制御配列（例えばプロモーター）と第二の核酸配列との間の機能的連結をいい、ここで、発現制御配列は、第二の配列に対応する核酸の転写を指示する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、この方法は、外因的に供給されたチロシン、又は適切な炭素源とともに遺伝子改変された宿主細胞を培養することを含む。本方法が適切な炭素源とともに遺伝子改変された宿主細胞を培養することを含む場合、遺伝子改変された宿主細胞は、天然生合成経路又は宿主細胞中の１つ以上の核酸に存在する異種生合成経路を使用してチロシンを合成することができ、ここで、１つ以上の核酸は、１つ以上のベクター上にあるか、又は宿主細胞染色体に安定に組み込まれている。宿主細胞が摂取及び代謝することができる適切な炭素源。そのような炭素源としては、グルコースなどの単糖などの糖が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本方法は以下を含む：（ａ）芳香族アミノ酸の酸化を触媒することができる酵素をコードする核酸構築物を遺伝子改変された宿主細胞に導入すること；及び（ｂ）酵素が宿主細胞中で発現されるように、遺伝子改変された宿主細胞を適切な条件下で培養すること；そのような培養は、遺伝子改変されたた宿主細胞が所望の生成物を産生することをもたらす。
【００３２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の酵素は、チロシンのＬ−ＤＯＰＡ、ドーパミン、３，４−ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、３，４−ジヒドロキシフェニルエタノール（ヒドロキシチロソール）、レチクリン、テバイン、及び／又はモルヒネへの酸化を触媒することができ、それにより、宿主細胞の培養は、Ｌ−ＤＯＰＡ、ドーパミン、３，４−ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、３，４−ジヒドロキシプロピルエタノール（ヒドロキシチロソール）、レチクリン、テバイン、及び／又はモルヒネの生成をもたらす。
【００３３】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、チロシン生合成経路の天然の酵素、又は宿主細胞に導入された異種チロシン生合成経路のいずれかによって、内因的にチロシンを産生することができる。いくつかの実施形態では、チロシン生合成経路は、以下の酵素：ＰｐｓＡ、ＴｋｔＡ、ＡｒｏＧ、ＡｒｏＢ、ＡｒｏＤ、ＹｄｉＢ、ＡｒｏＥ、ＡｒｏＫ／Ｌ、ＡｒｏＡ、ＡｒｏＣ、ＴｙｒＡ、及びＴｙｒＢのうちの１つ以上、又はそれらの任意の対応する相同な酵素を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＡｒｏＢ及び／又はＴｙｒＡ、あるいはそれらの任意の対応する相同な酵素を過剰生成する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＴＨ、ＤＤＣ、ＭＡＯ、及び／又はアルコールデヒドロゲナーゼ、あるいはそれらの相同な酵素を含むか又は発現することができ、ここで、１つ以上の酵素は修飾されていない宿主細胞と比較して過剰生成され、又は１つ以上の酵素は宿主細胞に対して異種である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、チロシン生合成経路の天然の酵素、又は宿主細胞に導入された異種チロシン生合成経路のいずれかによって、内因的にチロシンを生成することができる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、異種ＴＨ（マウスＴＨなど）、異種ＤＤＣ（ブタＤＤＣなど）、及び／又は異種ＭＡＯ（Ｍ．ルテウスのＭＡＯなど）、又はそれらの同種酵素を含み又は発現させることができる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを酢酸３，４−ジヒドロキシフェニルアセテート（３，４−ＤＨＰＡ）に触媒することができる酵素をコードする核酸、例えば、酵素フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを天然に含み、ここで、宿主細胞は酵素の発現が減少する。宿主細胞が大腸菌である場合、酵素はｆｅａＢ遺伝子によりコードされるフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼである。減少した発現は、減少した発現又は酵素の酵素活性を低下させる突然変異の結果であり得る。そのような突然変異の例は、ノックアウト変異などの切断遺伝子又は欠失遺伝子である。
【００３７】
ＭＨ４を宿主細胞に合成させる１つの手段は、宿主細胞に酵素ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ｆｏｌＥ）、ｆｏｌＸ、Ｐ−ａｓｅ、及びｆｏｌＭ、又はそれらの相同な酵素を含ませることである。
【００３８】
チロシンヒドロキシラーゼは、チロシン及びトリプトファンのそれぞれＬ−ＤＯＰＡ及び５−ヒドロキシ−トリプトファンへの触媒作用においてテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）又はＭＨ４を使用する酵素である。プテリン−４−アルファ−カルビノアミンデヒドラターゼ（ＰＣＤ）及びジヒドロプテリジンレダクターゼ（ＤＨＰＲ）は、ＢＨ４再生のための反応を触媒することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞がチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を含む場合、宿主細胞はさらにプテリン−４−アルファ−カルビノアミンデヒドラターゼ（ＰＣＤ）又はその相同な酵素、及びジヒドロプテリジンレダクターゼ（ＤＨＰＲ）又はその相同な酵素を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞が天然にＢＨ４を合成しない場合、宿主細胞はＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＦｏｌＥ）、６−ピルボイル−テトラヒドロプテリンシンターゼ（ＰＴＰＳ）、及びセピアプテリンレダクターゼ（ＳＲ）、又は１つ以上のその相同な酵素体をさらに含む。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態では、本方法は、生成された１つ以上の酸化生成物を回収する工程をさらに含み、回収工程は培養工程と同時又はその後である。
【００４０】
酵素、及びそれをコードする核酸
相同な酵素は、本明細書又は組み込まれた参考文献に記載されている酵素のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一であるポリペプチド配列を有する酵素である。相同な酵素は、酵素に関して保存されていると認識されているアミノ酸残基を保持している。相同な酵素は、置換されているか若しくは異なるアミノ酸であることが見出されている保存されていないアミノ酸、又は挿入若しくは欠失されたアミノ酸を有することができ、これは、相同な構造の酵素的活性において有意な効果に影響を及ぼさないか又は有意でない効果を有する。相同な酵素は、本明細書又は援用される参考文献に記載されているいずれかの酵素の酵素活性と同一又は本質的に同一の酵素活性を有する。相同な酵素は、天然に見い出されるか又はその遺伝子操作された突然変異体であり得る。
【００４１】
適切なチロシンヒドロキシラーゼ又はチロシン３−モノオキシゲナーゼは、以下のアミノ酸配列を有するマウスチロシンヒドロキシラーゼ（ＮＰ ０３３４０３）又はその相同な酵素である。
【００４２】
【化１】
2019524076.tif 000003
（配列番号１）
【００４３】
適切なプテリン−４−アルファ−カルビノアミンデヒドラターゼ（ＰＣＤ）は、以下のアミノ酸配列を有するヒトＰＣＤ（ＮＰ ０００２７２）又はその相同な酵素である。
【００４４】
【化２】
2019524076.tif 000004
（配列番号２）
【００４５】
適切なジヒドロプテリジンレダクターゼ（ＤＨＰＲ）は、以下のアミノ酸配列を有するヒトＤＨＰＲ（Ｐ０９４１７）又はその相同な酵素である。
【００４６】
【化３】
2019524076.tif 000005
（配列番号３）
【００４７】
適切なＬ−ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ）は、以下のヌクレオチド（配列番号４）及びアミノ酸（配列番号５）の配列を有するブタＤＤＣ又はその相同な酵素である。
【００４８】
【化４】
2019524076.tif 000006
【００４９】
【化５】
2019524076.tif 000007
【００５０】
適切なモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）は、以下のアミノ酸配列を有するミクロコッカス・ルテウスＭＡＯ（ＡＣＳ３０５４４．１）又はその相同な酵素である。
【００５１】
【化６】
2019524076.tif 000008
（配列番号６）
【００５２】
適切なＡｒｏＧは、以下のアミノ酸配列を有する大腸菌ＡｒｏＧ又はその相同な酵素である。
【００５３】
【化７】
2019524076.tif 000009
【００５４】
適切なＴｙｒＡは、以下のアミノ酸配列を有する大腸菌ＴｙｒＡ又はその相同な酵素である。
【００５５】
【化８】
2019524076.tif 000010
【００５６】
本発明の核酸構築物は、１つ以上の本酵素をコードする核酸配列を含む。本酵素の核酸は、適切な条件下で培養された宿主細胞中で本酵素が発現されるように、プロモーター及び場合により制御配列に作動可能に連結されている。プロモーター及び制御配列は、各宿主細胞種に特異的である。いくつかの実施形態では、発現ベクターは核酸構築物を含む。核酸構築物及び発現ベクターを設計及び作製するための方法は当業者に周知である。
【００５７】
本酵素をコードする核酸の配列は、例えば直接化学合成又はクローニングを含む、当業者に公知の任意の適切な方法によって調製される。直接化学合成のために、核酸ポリマーの形成は、典型的には、成長するヌクレオチド鎖の末端５’−ヒドロキシル基への３’−ブロック及び５’−ブロックヌクレオチドモノマーの逐次付加を伴う。ここで、各付加は、典型的には、ホスホトリエステル、ホスホルアミダイトなどのリン誘導体である、付加されたモノマーの３’位の成長している鎖の末端５’ヒドロキシル基の求核攻撃によってもたらされる。そのような方法論は当業者に公知であり、関連するテキスト及び文献に記載されている（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．５２１：７１９；米国特許第４，５００，７０７号；第５，４３６，３２７号；及び第５，７００，６３７号）。さらに、適切な制限酵素を使用してＤＮＡを分割し、ゲル電気泳動を使用してフラグメントを分離し、その後、当業者に公知の技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の利用（ＰＣＲ；例えば、米国特許第４，６８３，１９５号））を介してゲルから所望の核酸配列を回収することによって、天然の供給源から所望の配列を単離し得る。
【００５８】
所望の本酵素をコードする各核酸配列は発現ベクターに組み込むことができる。個々の核酸配列の組み込みは、例えば、発現ベクター（例えば、プラスミド）中の特定の部位を切断するための制限酵素（例えば、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｈａＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩなど）の使用を含む既知の方法によって達成することができる。制限酵素は、切断された発現ベクターの末端に相補的な配列を持つ末端を有する、又は有するように合成された核酸配列にアニーリングされ得る一本鎖末端を生成する。アニーリングは、適切な酵素、例えばＤＮＡリガーゼを用いて行われる。当業者には理解されるように、発現ベクター及び所望の核酸配列の両方は、しばしば同じ制限酵素で切断され、それによって発現ベクターの末端及び核酸配列の末端が互いに相補的であるように想定される。さらに、ＤＮＡリンカーを使用して、核酸配列の発現ベクターへの連結を容易にすることができる。
【００５９】
一連の個々の核酸配列はまた、当業者に公知の方法を利用することによって組み合わせることもできる（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号）。
【００６０】
例えば、所望の核酸配列の各々は、別々のＰＣＲにおいて最初に生成され得る。その後、ＰＣＲ産物の末端が相補的配列を含むように特異的プライマーを設計する。ＰＣＲ産物を混合し、変性し、再アニーリングすると、それらの３’末端に一致する配列を有する鎖は重なり合い、互いにプライマーとして作用することができる。ＤＮＡポリメラーゼによるこの重なりの伸長は、元の配列がともに「スプライスされる」分子を生成する。このようにして、一連の個々の核酸配列をともに「スプライス」し、続いて同時に宿主微生物に形質導入することができる。したがって、複数の核酸配列のそれぞれの発現がもたらされる。
【００６１】
次に、個々の核酸配列、又は「スプライスされた」核酸配列は、しばしば、発現ベクターに組み込まれる。本発明は、核酸配列が発現ベクターに組み込まれるプロセスに関して限定されない。当業者は、核酸配列を発現ベクターに組み込むために必要な工程に精通している。典型的な発現ベクターは、１つ以上の調節領域が先行する所望の核酸配列と、リボソーム結合部位、例えば、大腸菌において、長さが３〜９ヌクレオチドであり、開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド配列とを含む。Ｓｈｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５４：３４及びＳｔｅｉｔｚ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ｅｄ．Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ），ｖｏｌ．１，ｐ．３４９，１９７９，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。
【００６２】
調節領域は、例えば、プロモーター及びオペレーターを含むそれらの領域を含む。プロモーターは、所望の核酸配列に作動可能に連結されており、それによってＲＮＡポリメラーゼ酵素を介して核酸配列の転写を開始する。オペレーターは、リプレッサータンパク質が結合することができるタンパク質結合ドメインを含む、プロモーターに隣接する核酸の配列である。リプレッサータンパク質が存在しない場合、転写はプロモーターを介して開始される。存在する場合、オペレーターのタンパク質結合ドメインに特異的なリプレッサータンパク質はオペレーターに結合し、それによって転写を阻害する。このようにして、使用される特定の調節領域及び対応するリプレッサータンパク質の有無に基づいて、転写の制御が達成される。例としては、ラクトースプロモーター（ラクトースと接触するとＬａｃＩリプレッサータンパク質が立体構造を変化させ、それによってＬａｃＩリプレッサータンパク質がオペレーターに結合するのを妨げる）が挙げられる。別の例はｔａｃプロモーターである（ｄｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１〜２５を参照されたい）。当業者には理解されるように、これら及び他の発現ベクターを本発明において使用することができ、本発明はこの点において限定されない。
【００６３】
所望の配列を組み込むために任意の適切な発現ベクターを使用することができるが、容易に入手可能な発現ベクターとしては、限定されないが、プラスミド、例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３２２、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−３、ｐＵＲ、ｐＥＸ、ｐＭＲ１００、ｐＣＲ４、ｐＢＡＤ２４、ｐＵＣ１９；バクテリオファージ、例えば、Ｍ１３ファージ及びλファージが挙げられる。当然に、そのような発現ベクターは特定の宿主細胞にのみ適している場合がある。しかしながら、当業者は、任意の特定の発現ベクターが任意の所与の宿主細胞に適しているかどうかを日常的な実験を通して容易に決定することができる。例えば、発現ベクターを宿主細胞に導入することができ、次にそれをベクターに含まれる配列の生存率及び発現についてモニターする。さらに、発現ベクター及び任意の特定の宿主細胞に対するそれらの適合性について記載している関連するテキスト及び文献を参照することができる。
【００６４】
本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入又は移入しなければならない。発現ベクターを宿主細胞に移入するためのそのような方法は当業者に周知である。例えば、大腸菌を発現ベクターで形質転換する１つの方法は、発現ベクターがカルシウム沈殿物を介して導入される塩化カルシウム処理を伴う。他の塩、例えばリン酸カルシウムも同様の手順に従って使用することができる。さらに、エレクトロポレーション（すなわち、核酸配列に対する細胞の透過性を増加させるための電流の印加）を用いて、宿主微生物をトランスフェクトすることができる。また、核酸シーケンサーのマイクロインジェクションは、宿主微生物をトランスフェクトする能力を提供する。脂質複合体、リポソーム、及びデンドリマーなどの他の手段もまた使用され得る。当業者は、これら又は他の方法を用いて所望の配列で宿主細胞をトランスフェクトすることができる。
【００６５】
トランスフェクトされた宿主細胞を同定するために、種々の方法が利用可能である。例えば、潜在的にトランスフェクトされた宿主細胞の培養物は、適切な希釈を用いて個々の細胞に分離され、その後、個々に増殖され、所望の核酸配列の発現について試験され得る。さらに、プラスミドが使用される場合、しばしば使用される方法は、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏ、及びｈｙｇ遺伝子などの、発現ベクター内に意図的に含まれる遺伝子によって付与されている抗微生物耐性に基づく細胞の選択を伴う。
【００６６】
宿主細胞は少なくとも１つの発現ベクターで形質転換される。単一の発現ベクターのみを使用する場合（中間体を添加せずに）、そのベクターは必要な核酸配列の全てを含む。
【００６７】
宿主細胞が、発現ベクターで形質転換されると、宿主細胞は増殖することが可能になる。微生物宿主について、このプロセスは、細胞を適切な培地中で培養することを伴う。中間体が導入されていない場合、培地は糖（例えばグルコース）のような過剰の炭素源を含むことが重要である。
このようにして、芳香族アミノ酸の細胞生成が確実にされた。添加すると、中間体は培地中に過剰量で存在する。
【００６８】
宿主細胞が増殖及び／又は拡大するにつれて、酸化生成物を産生するのに必要な酵素の発現が影響を受ける。発現されると、酵素は、場合により芳香族アミノ酸生成、ＢＨ４生成、及び酸化生成物生成の工程を実施するのに必要な工程を触媒する。中間体が導入された場合、発現された酵素は、中間体をそれぞれの酸化生成物に変換するのに必要なそれらの工程を触媒する。宿主細胞から酸化生成物を回収するための任意の手段が使用され得る。例えば、宿主細胞を採取して低張条件に供し、それによって細胞を溶解することができる。次に、溶解物を遠心分離し、上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又はガスクロマトグラフィー（ＧＣ）にかけることができる。一旦酸化生成物が回収されると、所望に応じて酸化生成物に対して修飾を実施することができる。
【００６９】
宿主細胞
本発明の宿主細胞は、異種核酸が宿主細胞に導入されているという点で遺伝的に修飾されているので、遺伝的に修飾された宿主細胞は天然には生じない。適切な宿主細胞は、本明細書に記載の１つ以上の酵素をコードする核酸構築物を発現することができるものである。酵素をコードする遺伝子は、宿主細胞に対して異種であり得るか、又は遺伝子は宿主細胞に対して天然であり得るが、異種プロモーター及び１つ以上の制御領域に作動可能に連結され、それはその宿主細胞中の遺伝子の発現をより高くする。
【００７０】
酵素は、宿主細胞にとって天然のものでも異種のものでもよい。酵素が宿主細胞に固有のものである場合、宿主細胞は酵素の発現を調節するために遺伝的に修飾されている。この改変は、宿主細胞中の酵素をコードする染色体遺伝子の改変、又は酵素の遺伝子をコードする核酸構築物が宿主細胞に導入されることを含み得る。修飾の効果の１つは、非修飾宿主細胞における酵素の発現と比較して宿主細胞における酵素の発現の増加など、酵素の発現が宿主細胞において調節されることである。
【００７１】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼから３，４−ジヒドロキシフェニルアセテート（３，４−ＤＨＰＡ）への変換が可能な酵素、例えば酵素フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸を天然に含み、ここで、宿主細胞は酵素の発現が減少する。宿主細胞が大腸菌の場合、酵素はｆｅａＢ遺伝子によりコードされるフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼである。減少した発現は、減少した発現又は酵素の酵素活性を低下させる突然変異の結果であり得る。そのような突然変異の例は、ノックアウト突然変異などの短縮型又は欠失遺伝子である。
【００７２】
それが核酸の配列で形質転換された後に生存可能なままである限り、任意の原核生物又は真核生物宿主細胞が本方法において使用され得る。必ずというわけではないが、一般的に、宿主微生物は細菌性である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はグラム陰性菌である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、プロテオバクテリア門である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はガンマプロテオバクテリアクラスのものである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は腸内細菌のオーダーのものである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は腸内細菌科のものである。細菌宿主細胞の例としては、限定されないが、エシェリヒア属、エンテロバクター属、アゾトバクター属、エルウィニア属、バチルス属、シュードモナス属、クレブシエリア属、プロテウス属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、リゾビア属、ビトレオシカ属、及びパラコッカス属の分類学的クラスに割り当てられる。好ましくは、宿主細胞は、必要な核酸配列の形質導入、それに続くタンパク質（すなわち酵素）の発現、又はメバロン酸経路に関連する工程を実施するのに必要な得られる中間体によって悪影響を受けない。例えば、宿主細胞自身の代謝過程とメバロン酸経路に関連する過程との間に最小限の「クロストーク」（すなわち干渉）が生じることが好ましい。適切な真核細胞は、真菌、昆虫又は哺乳動物の細胞を含むがこれらに限定されない。適切な真菌細胞は、サッカロマイセス属の酵母細胞などの酵母細胞である。
【００７３】
本発明をその好ましい特定の実施形態と併せて説明してきたが、前述の説明は例示を意図したものであり、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
本発明の範囲内の他の態様、利点、及び改変は、本発明が属する分野の当業者に明らかである。
【００７４】
本明細書で言及されたすべての特許、特許出願、及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００７５】
本発明を説明してきたが、以下の実施例は本発明を限定ではなく、例示として説明するために提供される。
【実施例】
【００７６】
実施例１
大腸菌におけるヒドロキシチロソール生産の工学
ヒドロキシチロソール（ＨＴｙ）は、機能性食品、栄養補助食品、化粧品、及び動物用飼料などの産業において潜在的な用途を有する最も強力な抗酸化剤の１つである。合成経路でＨＴｙを産生することができる操作された大腸菌は、５つの異種遺伝子からなることが以前に報告されている。本明細書に記載されているのは、合成ＨＴｙ経路の効率を改善するための３つの代謝工学的努力である。
【００７７】
第一に、チロシンヒドロキシル化のための補因子生合成経路が設計されている。次に、下流化学物質によるチロシンヒドロキシル化の阻害が同定され、それを克服するように設計された共培養戦略が適用される。これらの技術により、チロシンからの生成物収率は約３倍向上する。
【００７８】
最後に、宿主株はチロシンを過剰生成するように操作される。チロシンのいかなる外部補足も伴わずにグルコースからのＬ−ＤＯＰＡの生成が確認され、得られたＬ−ＤＯＰＡは、前の結果から２５倍の改善を伴う共培養戦略によってさらにＨＴｙに変換される。
【００７９】
産業化の可能性を有する微生物ＨＴｙ製造方法が設計されている。現在、ＨＴｙは化学的又は酵素的加水分解後に濃縮オリーブ抽出物から製造される。安定した持続可能な生産への需要が高まっており、微生物発酵は有望な解決策になり得ると考えている。
【００８０】
図３は、チロシン水酸化のために設計された補因子生合成経路を示す。図３は、ＦｏｌＥ導入がチロシンからのＬ−ＤＯＰＡ産生を２倍増加させることを示す。下流の化合物によるチロシンヒドロキシル化の阻害が同定されている（図４）。図４は、ＴＨがヒドロキシチロソール及びドーパミンによって阻害されることを示す。共培養戦略を適用することによって、下流の化合物によるチロシン水酸化の阻害が克服され、チロシンからの生成物収率は約３倍以上改善される（図５）。経路酵素の遺伝子発現は、メタボロミクス及びプロテオミクスデータを使用して最適化される。宿主株はチロシンを過剰生成するように操作される。これらの改変により、グルコースからの生成物は共培養戦略を使用して約１０倍以上改善される（図６）。ＨＴｙ生成は、図７Ａ及び７Ｂに示される共培養戦略で３倍を超えて増加する。図８Ａ〜８Ｃは、グルコースから高純度のＨＴｙを得ることができることを示している。
【００８１】
この研究は、微生物ＨＴｙ生産の潜在的な工業的応用を示し、芳香族アミノ酸のヒドロキシル化を含む広範囲の化学物質の生産のための優れた再生可能な微生物プラットフォームを提供する。表１は、以前に報告されたヒドロキシチロソール収率（Ｓａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４（２０１２）６０３−６１０）と本明細書中に報告されたヒドロキシチロソール収率とを比較する。
【００８２】
表１．以前に報告されたヒドロキシチロソール収率と本明細書中に報告されたヒドロキシチロソール収率との比較。
【００８３】
【表１】
2019524076.tif 000011
【００８４】
実施例２
大腸菌Ｌ−チロシン過剰生成体の操作
いくつかのヒドロキシチロソール産生株について、Ｌ−チロシン過剰生成体が必要とされる。チロシン生成体のためのモジュラーシステムが利用可能である（Ｊｕｍｉｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）が、このシステムはすでに２つのプラスミドを利用しているため、他のモジュールと組み合わせることは困難である。チロシン生合成のための全経路を統合する代わりに、Ｌ−チロシン過剰生成体は、大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）のｐｙｋＦ遺伝子座にフィードバック耐性突然変異体ｔｙｒＡ及びａｒｏＧを統合することによって構築される。ＡｒｏＧはシキミ酸経路の入り口に位置し、ｔｙｒＡはチロシン合成のためのシキミ酸経路の最後の反応に位置する。これら２つの遺伝子は、チロシン合成の第１及び第２の制限反応であることが知られており、したがって、これら２つの遺伝子を増強することは、チロシン過剰生成株を作製するための優れた戦略である。ＤＫ１７６と命名された株は、ａｒｏＧ及びｔｙｒＡ遺伝子を親株に導入することによって構築される。ＤＫ１７６株をＭ９Ｙ培地（１％グルコース）中で培養すると、それは２．６８ｍＭのＬ−チロシンの収率を達成し、これはＬ−チロシン生成のための有意な改善である。
【００８５】
本発明をその特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の真の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更を加えたり、等価物を置き換えたりすることができることは当業者によって理解されるべきである。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスステップ又は複数のステップを本発明の目的、精神及び範囲に適合させるために多くの修正を加えることができる。そのような修正はすべて、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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