(57)【要約】  本出願は、植物性油脂を準備する段階；前記植物性油脂、第１脂肪酸エチルエステル及びリパーゼを反応器内で混合してエステル交換反応する段階；前記反応器内に存在するトリグリセリド及びジグリセリドを除去する段階；及び前記反応器から第２脂肪酸エチルエステルを整流して分離する段階を含む、脂肪酸エチルエステルを製造する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）植物性油脂を準備する段階；
（ｂ）前記植物性油脂、第１脂肪酸エチルエステル及びリパーゼを反応器内で混合してエステル交換反応する段階；
（ｃ）前記反応器内に存在するトリグリセリド及びジグリセリドを除去する段階；及び
（ｄ）前記反応器から第２脂肪酸エチルエステルを整流（rectification）して分離する段階を含む、脂肪酸エチルエステルを製造する方法。
【請求項２】
前記（ｄ）段階で分離された第２脂肪酸エチルエステルの純度は９２〜１００％である、請求項１に記載の脂肪酸エチルエステルを製造する方法。
【請求項３】
前記（ｂ）段階の前記植物性油脂と前記第１脂肪酸エチルエステルのモル比は、２：１〜１：５である、請求項１に記載の脂肪酸エチルエステルを製造する方法。
【請求項４】
前記（ｃ）段階は、真空度１〜３ｍｍｂａｒ、還流比１〜３、２２０〜２４５℃の条件の蒸留塔で行われる、請求項１に記載の脂肪酸エチルエステルを製造する方法。
【請求項５】
前記（ｄ）段階は、真空度１〜３ｍｍｂａｒ、還流比１〜３、２０５〜２４０℃の条件の蒸留塔で行われる、請求項１に記載の脂肪酸エチルエステルを製造する方法。
【請求項６】
前記植物性油脂は、パーム油、ヒマワリ油、キャノーラ油、及びヤシ油からなる群から選択される１以上であり、前記植物性油脂は、１．３−ジパルミトイル−２−オレオイルグリセロール（1,3-dipalmitoyl-2-oleoylglycerol:POP）を３５〜７０重量％含み、ヨウ素価は３５〜５５である、請求項１に記載の脂肪酸エチルエステルを製造する方法。
【請求項７】
前記第１脂肪酸エチルエステルは、ステアリン酸エチルエステル、オレイン酸エチルエステル、リノール酸エチルエステル、パルミチン酸エチルエステル、カプリル酸エチルエステル及びカプリン酸エチルエステルからなる群から選択された１以上の脂肪酸エチルエステルである、請求項１に記載の脂肪酸エチルエステルを製造する方法。
【請求項８】
前記第２脂肪酸エチルエステルは、ステアリン酸エチルエステル、オレイン酸エチルエステル、及びパルミチン酸エチルエステルからなる群から選択された１以上の脂肪酸エチルエステルである、請求項１に記載の脂肪酸エチルエステルを製造する方法。
【請求項９】
前記方法は、有機溶媒を添加する段階を含まない、請求項１に記載の脂肪酸エチルエステルを製造する方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法で製造された脂肪酸エチルエステルを含む食品組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法で製造された脂肪酸エチルエステルを含む化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、植物性油脂を準備する段階；前記植物性油脂、第１脂肪酸エチルエステル及びリパーゼを反応器内で混合してエステル交換反応する段階；前記反応器内に存在するトリグリセリド及びジグリセリドを除去する段階；及び前記反応器から第２脂肪酸エチルエステルを整流（rectification）して分離する段階を含む、脂肪酸エチルエステルを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸エステルは、脂肪酸とアルコールがエステル結合した形態であり、結合されるアルコールの種類は、主にメタノール（Methanol）、エタノール（Ethanol）、プロパノール（Propanol）、ブタノール（Butanol）などであり、これにより、脂肪酸メチルエステル（Fatty acid methyl ester）、脂肪酸エチルエステル（Fatty acid ethyl ester）、脂肪酸プロピルエステル（Fatty acid propyl ester）、脂肪酸ブチルエステル（Fatty acid butyl ester）などが製造される。
【０００３】
脂肪酸エステルの使用範囲は多様であるが、最も多く活用されている分野はバイオディーゼルである。炭化水素の燃焼により排出される排気ガスが地球温暖化の主な原因として環境問題を引き起こしている中で、これを解決するために、経済性、環境にやさしい代替燃料としてバイオディーゼルが注目されるようになった。植物性油脂は、燃料として使用する程度の高カロリーを有しているが、高分子物質として粘度が高い欠点がある。これを解決するために、アルコール類とエステル交換反応（Transesterification）して低分子の構造に変更した脂肪酸アルキルエステル（Fatty acid alkyl ester）がバイオディーゼルとして使用されており、この中でも、経済性に優れた脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステルが主に使われている。
【０００４】
脂肪酸エステルで使用されるアルコール類の経済的な面で利点があるものは、メタノールとエタノールである。メタノールは、主に石油から得ているが、エタノールは、トウモロコシ、サトウキビなどから得ることにより、メタノールに比べて再生可能であり、環境にやさしい利点がある。また、メタノールは、人体に有害であり、失明及び深刻な嘔吐などを誘発することがあると言われているが、エタノールは、体内で代謝されて酢酸（Acetic acid）に転換されることにより、メタノールに比べて人体有害性が少ないと言われている。
【０００５】
したがって、食品及び化粧品の分野のように安全性が優先される業界では、脂肪酸エチルエステルの選好度が高い。現在、デカン酸エチルエステル（Decanoic ethyl ester、Ethyl decanoate、Ethyl caprate）、オクタン酸エチルエステル（Octanoic ethyl ester、Ethyl octanoate、Ethyl caprylate）、パルミチン酸エチルエステル（Palmitic ethyl ester、Ethyl palmitate、Ethyl hexadecanoate）、ステアリン酸エチルエステル（Stearic ethyl ester、Ethyl stearate、Ethyl octadecanoate）など、多数の脂肪酸エチルエステルは着香料として食品に使用されている。また、脂肪酸エチルエステルは、食用油脂の改質のための方法で酵素的エステル交換による脂肪酸の構成を変更する際に脂肪酸の原料として使用されることもある。また、多様な組成の脂肪酸エチルエステルが化粧品において着香剤、ヘアコンディショニング剤、皮膚コンディショニング剤（柔軟剤）などとして使用されている。
【０００６】
脂肪酸エチルエステルは、一般的にパーム油、大豆油、キャノーラ油、魚油、ココナッツオイルなど、動・植物性油脂及び動・植物性油脂に由来する遊離脂肪酸をアルコール及び触媒を使用し、高温（７０〜９０℃）でエステル交換反応で脂肪酸エチルエステルを製造した後、グリセリン、未反応脂肪酸、未反応エタノールなどを分離する工程を通じて得ることができる。
【０００７】
最近、化学的合成法に対する環境問題など否定的な認識が拡散されるにつれて酵素を利用した脂肪酸エチルエステルの製造法が開発されている。Ｎｅｌｓｏｎなどは植物性油脂とアルコール類をＭｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ、Ｃ．  ａｎｔａｒｔｉｃａ、Ｐｓｅｕｄｏｍａｎｏｓ  ｃｅｐａｃｉａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｕｍなどの多様な微生物で発現されたリパーゼ（Lipase）を使用して脂肪酸エチルエステル、脂肪酸メチルエステルを製造した（J Am Oil Chem Soc 73(8):1191-1195、1996（非特許文献１））。また、大韓民国特許１０−１３５７２９８（特許文献１）では、オメガ−３系高度不飽和脂肪酸エチルエステルを製造工程中、カンジダ（Candida）属、リゾプス（Rhizopus）属、ムコール（Mucor）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、及びシュードモナス（Pseudomonas）属からなる群から選択される１つ以上の微生物から抽出された酵素触媒の存在下でエタノールを用いてエタノリシス（Ethanolysis）して脂肪酸エチルエステルを製造した。
【０００８】
しかし、前記製造方法は、エタノールなど、有機溶媒を使用する工法であり、酵素反応後、残留エタノールを除去する工程がさらに必要であり、エタノールの引火点が１６℃であり、工程中、火災など、安全上の問題が発生する可能性がある。また、最終製品においてエタノール残留の可能性があり、特に、化粧品の分野では、皮膚刺激などの問題が発生する余地があるという欠点がある。前記従来の技術では、脂肪酸エチルエステルを製造するために、脂肪酸及び動・植物性油脂と低級アルコールを使用して化学的、酵素的触媒として製造するのに焦点を置いて研究してきており、エタノールを使用せずに酵素工法で脂肪酸エチルエステルを製造することについて重点的に議論されたことはなかった。また、油脂から脂肪酸エチルエステルを製造した後に、特定の脂肪酸エチルエステルのみが、高純度で分離することが非常に重要である。しかし、これを高純度で分離することに関する技術が詳細には公知となっていない。
【０００９】
そこで、本出願人は、エタノールのような有機溶媒を使用せずに植物性油脂に含まれる特定の脂肪酸を酵素的エステル交換反応（Enzymatic transesterification）として脂肪酸エチルエステルを製造するとともに、食品及び化粧品で使用可能な高純度の脂肪酸エチルエステルを開発するために研究した結果、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】大韓民国特許１０−１３５７２９８号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】J Am Oil Chem Soc 73(8):1191-1195、1996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本出願の一つの目的は、植物性油脂を準備する段階；前記植物性油脂、第１脂肪酸エチルエステル及びリパーゼを反応器内で混合してエステル交換反応する段階；前記反応器内に存在するトリグリセリド及びジグリセリドを除去する段階；及び前記反応器から第２脂肪酸エチルエステルを整流（rectification）して分離する段階を含む、脂肪酸エチルエステルを製造する方法を提供することにある。
【００１３】
本出願の他の一つの目的は、前記方法で製造された脂肪酸エチルエステルを含む食品組成物を提供することにある。
【００１４】
本出願のまた他の目的は、前記方法で製造された脂肪酸エチルエステルを含む化粧料組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本出願人は、エタノールのような有機溶媒を使用せずに植物性油脂に含まれる特定の脂肪酸を酵素的エステル交換反応（Enzymatic transesterification）で脂肪酸エチルエステルを製造するとともに、食品及び化粧品で使用可能な高純度の脂肪酸エチルエステルを開発するために研究した結果、本発明を完成した。
【発明の効果】
【００１６】
本出願の脂肪酸エチルエステルの製造方法は、人体に有害または刺激を与えうる化合物質の使用を排除することができるため、これにより製造された脂肪酸エチルエステルは、食品組成物や化粧料組成物に広く使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
前記目的を達成するための、一実施例は、植物性油脂を準備する段階；前記植物性油脂、第１脂肪酸エチルエステル及びリパーゼを反応器内で混合してエステル交換反応する段階；前記反応器内に存在するトリグリセリド及びジグリセリドを除去する段階；及び前記反応器から第２脂肪酸エチルエステルを整流（rectification）して分離する段階を含む、脂肪酸エチルエステルを製造する方法を提供する。
【００１８】
一実施例は、前記方法で製造された脂肪酸エチルエステルを含む食品組成物を提供する。
【００１９】
一実施例は、前記方法で製造された脂肪酸エチルエステルを含む化粧料組成物を提供する。
【００２０】
以下、本出願を詳しく説明する。
【００２１】
一実施例によると、（ａ）植物性油脂を準備する段階；（ｂ）前記植物性油脂、第１脂肪酸エチルエステル及びリパーゼを反応器内で混合してエステル交換反応する段階；（ｃ）前記反応器内に存在するトリグリセリド及びジグリセリドを除去する段階；及び（ｄ）前記反応器から第２脂肪酸エチルエステルを整流（rectification）して分離する段階を含む、脂肪酸エチルエステルを製造する方法が提供される。
【００２２】
前記植物性油脂は、植物性油脂自体またはその分画物を含むことができる。本発明に使用することができる、前記植物性油脂の非限定的な例は、キャノーラ油（canola oil）、ヤシ油（coconut oil）、パーム核油（palm kernel oil）、パーム油（palm oil）、菜種油（canola oil）、ヒマワリ油（sun flower oil）、大豆油（soy bean oil）、綿実油（cotton seed oil）、米糠油、トウモロコシ油、オリーブオイル、シア脂（shea fat）、マンゴ核脂（mango kernel fat）、ボルネオ脂（Borneo tallow、Shorea stenoptera or Pentadema butyracea）、サル脂（sal、Sherea robusta）、コクム脂（kokum、Garcinia indica）を含むことができるが、これに限定されず、当業界で使用される任意の植物性油脂を全て含むことができる。好ましくは、パーム核油、パーム油及びヒマワリ油であってもよいが、これらに限定されない。
【００２３】
または、前記植物性油脂を分画して１．３−ジパルミトイル−２−オレオイルグリセロール（1,3-dipalmitoyl-2-oleoylglycerol:POP）を含有する油脂分画を使用することができる。前記分画は、乾式分別（dry fractionation）または溶剤分別（solvent fractionation）を通じて行うことができるが、これに限定されず、当業界において公知となった植物性油脂原料から飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の含有量に差があるＰＯＰ含有油脂を提供する方法を制限なく使用することができる。例えば、使用する植物性油脂原料の特徴に応じて分別方法を選択的に利用することができる。溶剤分別の場合、ヘキサン、アセトン、メチルエチルケトン、エタノールなどの原料油脂を溶解させる有機溶媒を制限なく使用して行うことができる。本発明で使用する植物性油脂は、１．３−ジパルミトイル−２−オレオイルグリセロール（1,3-dipalmitoyl-2-oleoylglycerol:POP）を３５〜７０重量％含み、３５〜５５のヨウ素価を有する油脂であってもよい。
【００２４】
一実施例によると、前記脂肪酸エチルエステルを製造する方法は、（ｂ）前記植物性油脂、第１脂肪酸エチルエステル及びリパーゼを反応器内で混合してエステル交換反応する段階を含む。前記（ｂ）段階で行う、エステル交換反応は、下記のような反応式で表記することができる。
【００２５】
【化１】
2019533735.tif 000002
【００２６】
前記酵素的エステル交換反応に使用されるリパーゼは、ムコール・ミエヘイ由来のリパーゼまたはサーモミセス・ラヌギノサス由来のリパーゼであってもよいが、由来に制限されず、当該技術分野において公知となったリパーゼであれば、いずれのものも使用することができる。本発明で使用してもよいリパーゼは、前記反応式に示すように、植物性油脂のトリグリセリドに置換されたＲ１をこれと反応させる第１脂肪酸エチルエステルに置換されたＲ２と交換させてＲ１が置換された第２脂肪酸エチルエステルを生産する触媒の役割をする物質であり、より具体的には、ｓｎ−１，３の位置に特異性を有するリパーゼまたは位置特異性のないリパーゼであってもよい。前記酵素との反応は、３０〜６０℃で１〜３０時間行うことができるが、これらに限定されない。
【００２７】
一実施例によると、前記第１脂肪酸エチルエステルは、ステアリン酸エチルエステル（Stearic acid ethyl ester）、オレイン酸エチルエステル（Oleic acid ethyl ester）、リノール酸エチルエステル（Linoleic acid ethyl ester）、パルミチン酸エチルエステル（Palmitic acid ethyl ester）、カプリル酸エチルエステル（Caprylic acid ethyl ester）及びカプリン酸エチルエステル（Capric acid ethyl ester）からなる群から選択された１以上の脂肪酸エチルエステルであってもよい。
【００２８】
一方、一実施例によれば、前記（ｂ）段階の植物性油脂と第１脂肪酸エチルエステルのモル比は、２：１〜１：５であってもよい。
【００２９】
一方、一実施例によると、前記第２脂肪酸エチルエステルは、ステアリン酸エチルエステル（Stearic acid ethyl ester）、オレイン酸エチルエステル（Oleic acid ethyl ester）及びパルミチン酸エチルエステル（Palmitic acid ethyl ester）からなる群から選択された１以上の脂肪酸エチルエステルであってもよい。
【００３０】
一実施例によれば、前記脂肪酸エチルエステルの製造方法は、（ｃ）前記反応器内に存在するトリグリセリド及びジグリセリドを除去する段階を含む。
【００３１】
前記（ｂ）段階のエステル交換反応を通じて得られた、反応物は、脂肪酸エチルエステル以外にも、トリグリセリド及びジグリセリドを含むことができる。したがって、高純度の脂肪酸エチルエステルを得るために、これらを除去する段階が必要である。例えば、単蒸留（Simple distillation）もしくは５段以下の蒸留塔（Distillation column）を活用し、真空度１〜３ｍｍｂａｒ、１００〜２５０℃で蒸留してトリグリセリド及びジグリセリドを除去し、脂肪酸エチルエステルを得ることができる。前記除去工程を通じて、脂肪酸エチルエステルと分離されたトリグリセリド及びジグリセリドは、加工油脂としてさらに活用することができ、経済的に有利である。
【００３２】
前記（ｃ）段階は、単蒸留（Simple distillation）、あるいは１５段以下の蒸留塔において、真空度１〜３ｍｍｂａｒ、還流比１〜３、温度２２０〜２４５℃の条件において行うことができる。真空度、還流比及び温度は、前記範囲内で調節することができ、いずれか一つの数値が調節されることにより、他の残りの数値も調節することができる。
【００３３】
本出願の方法は、（ｄ）前記反応器から第２脂肪酸エチルエステルを整流（rectification）して分離する段階を含む。前記（ｃ）段階でトリグリセリド及びジグリセリドを除去することにより、脂肪酸エチルエステルの含有量の割合は高くなる。しかし、前記（ｃ）段階を経た生成物内には、依然として原料に含まれていた多様な脂肪酸の種類による多様な脂肪酸エチルエステルが混在していることがある。したがって、分離及び精製しようとする脂肪酸エチルエステルのみを選択的に高純度で整流（rectification）する段階が要求される。前記整流は、揮発される類似した沸点の物質を繰り返し還流を通じて精密に分離する方法を指す。より詳しくは、揮発度が類似した成分を分離しようとしたときに平衡蒸留を使用すると、凝縮された蒸気と残留液体の純度が良くないため、発生した蒸気を蒸留器に戻された凝縮液の一部と向流（countercurrent）を接触させて蒸気の凝縮熱を利用し、再び沸点が低い成分を蒸発させる。このような過程を繰り返すことにより、より精度に物質を分離し、濃縮させる方法を整流（rectification）といい、単蒸留を直列に連結し、蒸気が還流（reflux）と接触しながら蒸気が濃縮される。例えば、前記（ｃ）段階を経た生成物を１５〜３０段の蒸留塔において真空度１〜３ｍｍｂａｒ、１００〜２５０℃、還流比１〜５の条件で整流し、目的とする脂肪酸エチルエステルのみを分離することができる。ただし、前記整流の詳細な条件は、前述された事項に限定されず、分離しようとする脂肪酸エチルエステルの種類に応じて、より詳細な真空度、温度、還流比などを調節することができる。前記整流工程を通じて純度９２〜１００％、具体的には、純度９５％以上、より具体的には、純度９８％以上の脂肪酸エチルエステルを得ることができる。
【００３４】
前記（ｄ）段階は、単蒸留（Simple distillation）、あるいは１５段以下の蒸留塔において、真空度１〜３ｍｍｂａｒ、還流比１〜３、２０５〜２４０℃の条件において行うことができる。真空度、還流比及び温度は、前記範囲内で調節することができ、いずれか一つの数値が調節されることにより、他の残りの数値も調節することができる。
【００３５】
前記脂肪酸エチルエステルの製造方法は、酵素を使用するエステル交換反応によるもので、有機溶媒を添加する段階を含まないことが特徴である。従来の化学触媒を使用する反応では、有機溶媒を使用することが一般的である。しかし、溶媒として使用された物質は、その後の生成物である脂肪酸エチルエステルから完全に除去されないことがあるため、これを食品組成物や化粧料組成物として人体に適用する場合、刺激を与えたり、有害であったりする。したがって、本出願の製造方法は、人体に有害である有機溶媒などを使用しないため、これにより製造された物質は、食品組成物や化粧料組成物に使用するのに有利である。
【００３６】
また、一実施例によると、前記方法で製造された脂肪酸エチルエステルを含む食品組成物を提供することができる。前記脂肪酸エチルエステルは、食感を増進させるための目的であるが、着香剤などの添加剤として食品組成物に使用することができる。
【００３７】
前記方法で製造された脂肪酸エチルエステルを含む食品組成物を用いて製造することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、それ以外にも通常の意味における食品のすべてを含む。
【００３８】
さらに、生体防御、生体リズムの調節、疾病の防止と回復など生体調節機能を生体に対して発揮することが知られている有効成分をさらに含めて健康補助の目的で使用される健康機能食品として製造することもできる。
【００３９】
さらに、一実施例によると、前記方法で製造された脂肪酸エチルエステルを含む化粧料組成物を提供することができる。
【００４０】
前記化粧料組成物は、溶液、外用軟膏、クリーム、フォーム、栄養化粧水、柔軟化粧水、顔パック、柔軟水、乳液、メイクアップベース、エッセンス、リップバーム、石鹸、液体洗浄料、入浴剤、日焼け止めクリーム、サンオイル、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、ローション、パウダー、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、パッチ及びスプレーで構成された群から選択される剤形で製造することができるが、これらに限定されるものではない。具体的には、前記化粧料組成物において、前記方法で製造した脂肪酸エチルエステルは、他の有効成分の溶解度を向上させたり安定化させるための目的の可溶化剤、乳化剤、分散剤、着香剤、柔軟剤などの添加剤として使用することができる。
【００４１】
また、前記化粧料組成物は、一般的な皮膚化粧料に配合される化粧品学的に許容可能な担体を１種以上さらに含むことができ、通常の成分として、例えば、油分、水、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、キレート剤、色素、防腐剤、香料などを適切に配合することができるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
または前記化粧料組成物に抗酸化効果、しわ改善効果、老化防止効果及び／または日焼け止め効果を有する成分をさらに含み、機能性化粧品に剤形化することができる。前記抗酸化効果、しわ改善効果、老化防止効果及び／または日焼け止め効果を有する成分としては、当業界において公知となった機能性化粧品に使用される有効成分を制限なく使用することができる。
【００４３】
本出願は、酵素的エステル交換反応を通じて、有機溶媒や化学触媒を使用しなくても脂肪酸エチルエステルを製造する方法を提供することができ、これにより製造された脂肪酸エチルエステルは、人体に有害であったり刺激を与える化学物質が残留する可能性を排除することができるため、食品組成物や化粧料組成物に使用することができる。
【００４４】
以下、実施例を挙げて本出願をより詳しく説明する。これら実施例は、本出願をより具体的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれら実施例により限定されるものではない。
【００４５】
実施例１：酵素的エステル交換反応を通じた脂肪酸エチルエステルの製造
本実施例では、以下のような方法でパルミチン酸エチルエステルを製造した。原料である植物性油脂としては、パルミチン酸の含有量が高いパーム油由来の画分油脂を選定した。このとき、パーム油由来の分画油脂のＰＯＰ含有量は３５〜７０％、ヨウ素価は３５〜５５であった。前記パーム油由来の分画油脂とともに脂肪酸置換及びエチル基を提供するための用途として使用される脂肪酸エチルエステルとしては、ステアリン酸エチルエステルを使用した。
【００４６】
具体的には、パーム油由来の分画油脂とステアリン酸エチルエステルを１：０．５〜１：５のモル比（molar ratio）で混合した。前記混合物を５重量％のムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）由来のリパーゼと混合した後、攪拌機が設置された反応器でエステル交換反応を行った（攪拌式エステル交換反応）。一方、これとは別途に二重ジャケット形態（double jacket type）のガラスカラムに酵素を充填し、これに前記原料混合物を連続的に通過させながらエステル交換反応を行った（連続式エステル交換反応）。この時、反応温度は５０℃と一定に維持した。反応時間により生成されたパルミチン酸エチルエステルを含有量別に得た。
【００４７】
実施例２：トリグリセリドの分離
前記実施例１に基づいてエステル交換反応を通じて得たステアリン酸エチルエステルとパルミチン酸エチルエステルからトリグリセリドを分離するために蒸留を実施した。
【００４８】
【表１】
2019533735.tif 000003
【００４９】
４段蒸留塔で真空度２ｍｍｂａｒ、塔下部の温度２２０〜２４５℃、及び還流比１の条件で蒸留してトリグリセリドを除去し、脂肪酸エチルエステルであるステアリン酸エチルエステルとパルミチン酸エチルエステルを得た。
【００５０】
実施例３：脂肪酸エチルエステルの組成及び含有量の分析
３．１．ＧＣ−ＦＩＤ分析
前記実施例２から得た脂肪酸エチルエステルの組成及び含有量をＧＣ（gas chromatography）を利用して分析した。具体的な分析条件は、下記表２に示した。分析に先立ち、脂肪酸エチルエステルは、通常の油脂の脂肪酸を分析するための方法でメチル化（methylation）することができ、得られた脂肪酸エチルエステル５０μｌを１ｍＬのヘキサン（hexane）に溶解して使用することができる。本実施例では、メチル化の過程を省略し、分析を行った。
【００５１】
【表２】
2019533735.tif 000004
【００５２】
３．２．脂肪酸エチルエステルの組成分析
前記実施例２に基づいて蒸留工程を通じて得た脂肪酸エチルエステルの組成及び含有量を分析した。ＧＣ−ＦＩＤにより確認された脂肪酸エチルエステル組成を下記表３に示した。
【００５３】
【表３】
2019533735.tif 000005
【００５４】
前記表３に示すように、パーム油由来の分画油脂に対するステアリン酸エチルエステルのモル比が増加するにつれて、同一反応時間を基準として生成物であるパルミチン酸エチルエステルの含有量が増加することを確認した。ただし、パーム油由来の分画油脂に対するステアリン酸エチルエステルのモル比が１：２から１：５に増加しても、パルミチン酸エチルエステルの含有量には大きな差がなかったところ、工程の効率の面で最も適した割合は１：２であり、この時、パルミチン酸エチルエステルの含有量は４３．５％であった。
【００５５】
実施例４：パルミチン酸エチルエステルの純度向上
前記実施例２から得た脂肪酸エチルエステル混合物から原料物質であるステアリン酸エチルエステルを分離し、生成物であるパルミチン酸エチルエステルの純度を向上させるために整流（Rectification）段階を実施した。具体的には、２２段の蒸留塔で真空度２ｍｍｂａｒ、塔下部の温度２３５℃、及び還流比３の条件で蒸留して高純度のパルミチン酸エチルエステルを得た。
【００５６】
実施例５：精製されたパルミチン酸エチルエステルの純度分析
前記実施例４による整流を通じて得たパルミチン酸エチルエステルの純度を分析した。本分析は、前記実施例３と同様にＧＣ−ＦＩＤを用いて行い、その結果を下記表４に示した。
【００５７】
【表４】
2019533735.tif 000006
【００５８】
前記表４に示すように、パルミチン酸エチルエステルの純度は、追加の蒸留工程により９８．６％まで増加することを確認した。蒸留した後、蒸留塔の下部で発生するステアリン酸エチルエステルは、水素添加工程を通じて純度９８％以上のステアリン酸エチルエステルを得ることができるため、実施例１の酵素反応に脂肪酸エチルエステルの原料として再利用することができる。
【００５９】
実施例６：脂肪酸エチルエステルの種類の多様化評価
前記実施例１に基づいて植物性油脂としてパーム中部油を使用して製造したパルミチン酸エチルエステル以外に、植物性油脂の種類に応じて、多様な脂肪酸組成を含有することに着目し、パーム中部油の代わりにハイオレイックヒマワリ油、キャノーラ油、及びヤシ油を原料として使用して実施例１と類似の酵素的エステル交換反応を通じて脂肪酸エチルエステルを製造した。前記３種の植物性油脂とステアリン酸エチルエステルを１：２のモル比で混合し、５ｗｔ％のムコール・ミエヘイ由来のリパーゼを添加した後、攪拌機が設置された反応器で１２時間反応させた。この時、反応温度は４５℃に維持した。
【００６０】
前記エステル反応を通じて得られた混合物は、実施例２と同様の方法でトリグリセリドを除去し、脂肪酸エチルエステルを分離した。前記分離された脂肪酸エチルエステルの組成及び含有量を実施例３と類似の方法（ＧＣ−ＦＩＤ）で分析し、その結果を下記表５に示した。
【００６１】
【表５】
2019533735.tif 000007
【００６２】
前記表５に示すように、ハイオレイックヒマワリ油からオレイン酸エチルエステルを、キャノーラ油からオレイン酸エチルエステル及びリノレン酸エチルエステルを、ヤシ油からカプリル酸及びカプリン酸エチルエステルを製造した。得られた脂肪酸エチルエステルは、実施例４と類似に、蒸留塔を用いた整流を通じて純度を向上させることができる。
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月22日(2019.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）植物性油脂を準備する段階；
（ｂ）前記植物性油脂、第１脂肪酸エチルエステル及びリパーゼを反応器内で混合してエステル交換反応する段階；
（ｃ）前記反応器内に存在するトリグリセリド及びジグリセリドを除去する段階；及び
（ｄ）前記反応器から第２脂肪酸エチルエステルを整流（rectification）して分離する段階を含む、脂肪酸エチルエステルを製造する方法。
【請求項２】
前記（ｄ）段階で分離された第２脂肪酸エチルエステルの純度は９２〜１００％である、請求項１に記載の脂肪酸エチルエステルを製造する方法。
【請求項３】
前記（ｂ）段階の前記植物性油脂と前記第１脂肪酸エチルエステルのモル比は、２：１〜１：５である、請求項１に記載の脂肪酸エチルエステルを製造する方法。
【請求項４】
前記（ｃ）段階は、真空度１〜３ｍｂａｒ、還流比１〜３、２２０〜２４５℃の条件の蒸留塔で行われる、請求項１に記載の脂肪酸エチルエステルを製造する方法。
【請求項５】
前記（ｄ）段階は、真空度１〜３ｍｂａｒ、還流比１〜３、２０５〜２４０℃の条件の蒸留塔で行われる、請求項１に記載の脂肪酸エチルエステルを製造する方法。
【請求項６】
前記植物性油脂は、パーム油、ヒマワリ油、キャノーラ油、及びヤシ油からなる群から選択される１以上であり、前記植物性油脂は、１．３−ジパルミトイル−２−オレオイルグリセロール（1,3-dipalmitoyl-2-oleoylglycerol:POP）を３５〜７０重量％含み、ヨウ素価は３５〜５５である、請求項１に記載の脂肪酸エチルエステルを製造する方法。
【請求項７】
前記第１脂肪酸エチルエステルは、ステアリン酸エチルエステル、オレイン酸エチルエステル、リノール酸エチルエステル、パルミチン酸エチルエステル、カプリル酸エチルエステル及びカプリン酸エチルエステルからなる群から選択された１以上の脂肪酸エチルエステルである、請求項１に記載の脂肪酸エチルエステルを製造する方法。
【請求項８】
前記第２脂肪酸エチルエステルは、ステアリン酸エチルエステル、オレイン酸エチルエステル、及びパルミチン酸エチルエステルからなる群から選択された１以上の脂肪酸エチルエステルである、請求項１に記載の脂肪酸エチルエステルを製造する方法。
【請求項９】
前記方法は、有機溶媒を添加する段階を含まない、請求項１に記載の脂肪酸エチルエステルを製造する方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法で製造された脂肪酸エチルエステルを含む食品組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法で製造された脂肪酸エチルエステルを含む化粧料組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
前記（ｂ）段階のエステル交換反応を通じて得られた、反応物は、脂肪酸エチルエステル以外にも、トリグリセリド及びジグリセリドを含むことができる。したがって、高純度の脂肪酸エチルエステルを得るために、これらを除去する段階が必要である。例えば、単蒸留（Simple distillation）もしくは５段以下の蒸留塔（Distillation column）を活用し、真空度１〜３ｍｂａｒ、１００〜２５０℃で蒸留してトリグリセリド及びジグリセリドを除去し、脂肪酸エチルエステルを得ることができる。前記除去工程を通じて、脂肪酸エチルエステルと分離されたトリグリセリド及びジグリセリドは、加工油脂としてさらに活用することができ、経済的に有利である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
前記（ｃ）段階は、単蒸留（Simple distillation）、あるいは５段以下の蒸留塔において、真空度１〜３ｍｂａｒ、還流比１〜３、温度２２０〜２４５℃の条件において行うことができる。真空度、還流比及び温度は、前記範囲内で調節することができ、いずれか一つの数値が調節されることにより、他の残りの数値も調節することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本出願の方法は、（ｄ）前記反応器から第２脂肪酸エチルエステルを整流（rectification）して分離する段階を含む。前記（ｃ）段階でトリグリセリド及びジグリセリドを除去することにより、脂肪酸エチルエステルの含有量の割合は高くなる。しかし、前記（ｃ）段階を経た生成物内には、依然として原料に含まれていた多様な脂肪酸の種類による多様な脂肪酸エチルエステルが混在していることがある。したがって、分離及び精製しようとする脂肪酸エチルエステルのみを選択的に高純度で整流（rectification）する段階が要求される。前記整流は、揮発される類似した沸点の物質を繰り返し還流を通じて精密に分離する方法を指す。より詳しくは、揮発度が類似した成分を分離しようとしたときに平衡蒸留を使用すると、凝縮された蒸気と残留液体の純度が良くないため、発生した蒸気を蒸留器に戻された凝縮液の一部と向流（countercurrent）を接触させて蒸気の凝縮熱を利用し、再び沸点が低い成分を蒸発させる。このような過程を繰り返すことにより、より精度に物質を分離し、濃縮させる方法を整流（rectification）といい、単蒸留を直列に連結し、蒸気が還流（reflux）と接触しながら蒸気が濃縮される。例えば、前記（ｃ）段階を経た生成物を１５〜３０段の蒸留塔において真空度１〜３ｍｂａｒ、１００〜２５０℃、還流比１〜５の条件で整流し、目的とする脂肪酸エチルエステルのみを分離することができる。ただし、前記整流の詳細な条件は、前述された事項に限定されず、分離しようとする脂肪酸エチルエステルの種類に応じて、より詳細な真空度、温度、還流比などを調節することができる。前記整流工程を通じて純度９２〜１００％、具体的には、純度９５％以上、より具体的には、純度９８％以上の脂肪酸エチルエステルを得ることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
前記（ｄ）段階は、単蒸留（Simple distillation）、あるいは１５段以下の蒸留塔において、真空度１〜３ｍｂａｒ、還流比１〜３、２０５〜２４０℃の条件において行うことができる。真空度、還流比及び温度は、前記範囲内で調節することができ、いずれか一つの数値が調節されることにより、他の残りの数値も調節することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
【表１】
2019533735.tif 000008
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
４段蒸留塔で真空度２ｍｂａｒ、塔下部の温度２２０〜２４５℃、及び還流比１の条件で蒸留してトリグリセリドを除去し、脂肪酸エチルエステルであるステアリン酸エチルエステルとパルミチン酸エチルエステルを得た。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
前記実施例２から得た脂肪酸エチルエステル混合物から原料物質であるステアリン酸エチルエステルを分離し、生成物であるパルミチン酸エチルエステルの純度を向上させるために整流（Rectification）段階を実施した。具体的には、２２段の蒸留塔で真空度２ｍｂａｒ、塔下部の温度２３５℃、及び還流比３の条件で蒸留して高純度のパルミチン酸エチルエステルを得た。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
【表４】
2019533735.tif 000009
【国際調査報告】
2019533735.tif 000010
2019533735.tif 000011
2019533735.tif 000012
2019533735.tif 000013