(57)【要約】本明細書に開示されるのは、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む第１の抗原結合ドメインと、単一ドメイン抗体を含む第２の抗原結合ドメインと、を含む、多重特異性、例えば二重特異性抗原結合タンパク質である。この多重特異性抗原結合タンパク質を含む医薬組成物、キット及びその使用方法が更に提供される。本出願は、完全長４本鎖抗体又はそれらに由来する抗原結合フラグメントに融合した、１つ又は２つ以上の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む、多重特異性抗原結合タンパク質（ＭＡＢＰ）を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重特異性抗原結合タンパク質であって、
（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、を含み、前記ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、
（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する単一ドメイン抗体を含む、第２の抗原結合部分と、を含み、
前記第１の抗原結合部分及び前記第２の抗原結合部分が、互いに融合している、多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２】
前記第１のエピトープ及び前記第２のエピトープが、同一の抗原から形成される、請求項１に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３】
前記第１のエピトープ及び前記第２のエピトープが、異なる抗原から形成される、請求項１に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４】
前記多重特異性抗原結合タンパク質が二重特異性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項５】
前記第１の抗原結合部分が、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項６】
前記第１の抗原結合部分が、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む、抗体フラグメントである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項７】
前記第２の抗原結合部分が単一ポリペプチド鎖を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項８】
前記第２の抗原結合部分のＣ末端が、前記第１の抗原結合部分の少なくとも１本の重鎖のＮ末端に融合している、請求項７に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項９】
前記第２の抗原結合部分のＣ末端が、前記第１の抗原結合部分の少なくとも１本の軽鎖のＮ末端に融合している、請求項７に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
前記第２の抗原結合部分のＮ末端が、前記第１の抗原結合部分の少なくとも１本の重鎖のＣ末端に融合している、請求項７に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
前記第２の抗原結合部分のＮ末端が、前記第１の抗原結合部分の少なくとも１本の軽鎖のＣ末端に融合している、請求項７に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
前記第２の抗原結合部分が、ＣＨ１ドメインに融合した第１の単一ドメイン抗体を含む第１のポリペプチド鎖と、ＣＬドメインに融合した第２の単一ドメイン抗体を含む第２のポリペプチド鎖とを、含む、Ｆａｂ様ドメインである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
前記第１の抗原結合部分が、ヒト、ヒト化若しくはキメラ抗体、又はそれらの抗原結合フラグメントを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
前記第１の抗原結合部分がＦｃ領域を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
前記第２の抗原結合部分が、前記Ｆｃ領域のＮ末端に融合している、請求項１４に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
前記Ｆｃ領域がＩｇＧ１  Ｆｃである、請求項１４又は１５に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
前記Ｆｃ領域が、Ｓ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４  Ｆｃである、請求項１６に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１８】
前記第１の抗原結合部分及び前記第２の抗原結合部分が、ペプチド結合又はペプチドリンカーを介して互いに融合している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
前記ペプチドリンカーが約３０アミノ酸長以下である、請求項１８に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２０】
前記ペプチドリンカーが、配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２１】
前記第１の抗原結合部分及び前記第２の抗原結合部分が、化学的に互いに融合している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２２】
前記単一ドメイン抗体が、ラクダ科、ヒト化、又はヒトの単一ドメイン抗体である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２３】
前記第１のエピトープが免疫チェックポイント分子由来である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２４】
前記免疫チェックポイント分子が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０からなる群から選択される、請求項２３に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２５】
前記第１の抗原結合部分が、抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項２４に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２６】
前記抗ＰＤ−１抗体が、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される、請求項２５に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２７】
前記第１の抗原結合部分が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項２４に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２８】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、デュルバルマブ又はアテゾリズマブである、請求項２７に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項２９】
前記単一ドメイン抗体が免疫チェックポイント分子に特異的に結合する、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３０】
前記免疫チェックポイント分子が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０からなる群から選択される、請求項２９に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３１】
前記第２の抗原結合部分が、抗ＣＴＬＡ−４単一ドメイン抗体を含む、請求項３０に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３２】
前記第１のエピトープが腫瘍抗原由来である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３３】
前記腫瘍抗原が、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２０、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３８、及びＣＤ５２からなる群から選択される、請求項３２に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３４】
前記第１の抗原結合部分が、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項３３に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３５】
前記抗ＨＥＲ２抗体がトラスツズマブである、請求項３４に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３６】
前記第２の抗原結合部分が、抗ＣＤ３単一ドメイン抗体を含む、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３７】
前記第１の抗原結合部分が、抗Ａｎｇ２抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３８】
前記第２の抗原結合部分が、抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体である、請求項３７に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項３９】
前記第１のエピトープが炎症促進性分子由来である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４０】
前記炎症促進性分子が、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、及びエオタキシン−１からなる群から選択される、請求項３９に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４１】
前記第１の抗原結合部分が、抗ＴＮＦ−α抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項４０に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４２】
前記抗ＴＮＦ−α抗体がアダリムマブである、請求項４１に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４３】
前記第２の抗原結合部分が、抗ＩＬ−１β単一ドメイン抗体を含む、請求項４２に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４４】
前記第１の抗原結合部分が、抗ＩＬ−５抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項４０に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４５】
前記抗ＩＬ−５抗体がメポリズマブである、請求項４４に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４６】
前記第２の抗原結合部分が、抗エオタキシン−１単一ドメイン抗体を含む、請求項４５に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４７】
前記多重特異性抗原結合タンパク質が、少なくとも約１０ｍｇ／Ｌの発現レベルで組み換え的に産生され得る、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４８】
前記多重特異性抗原結合タンパク質が、少なくとも約６５℃の凝集開始温度を有する、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項４９】
前記多重特異性抗原結合タンパク質が、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬの溶解性を有する、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項５０】
前記多重特異性抗原結合タンパク質が、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で２５℃にて少なくとも約１週間安定である、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項５１】
前記多重特異性抗原結合タンパク質が、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で少なくとも約５回の凍結融解後に安定である、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
【請求項５２】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、医薬組成物。
【請求項５３】
個体に、有効量の請求項５２に記載の医薬組成物を投与することを含む、個体の疾患を治療する方法。
【請求項５４】
前記疾患が癌である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記癌が、乳癌、腎癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記疾患が、炎症性疾患又は自己免疫疾患である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記炎症性疾患又は自己免疫疾患が、関節炎、大腸炎、乾癬、重症喘息、及び中等度から重度のクローン病からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年７月２０日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０９０７０３号の優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出）
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：７６１４２２０００２４１ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１７年７月１０日、サイズ：１４ＫＢ）。
【０００２】
本発明は、少なくとも１つの単一ドメイン抗体を含む多重特異性抗原結合タンパク質（ＭＡＢＰ）及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、様々なヒト疾患、例えば癌及び自己免疫疾患を治療するための治療剤として広く使用されてきた。現在、マウス、完全ヒト化及びキメラ抗体などの３０種を超えるモノクローナル抗体が、治療的使用のためにＦＤＡによって承認されている。これらのうち、リツキシマブ及びトラスツズマブは、最も良く売れている癌に対するタンパク質治療薬である。最近、イピリムマブ（例えば、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））及びニボルマブ（例えば、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））などの免疫チェックポイント分子を標的とするモノクローナル抗体が、腫瘍に対してＴ細胞免疫を誘導することによって臨床成果を促進することが示されている。多くの患者が単剤療法にあまり応答しないため、モノクローナル抗体は、その有効性を高めるために、他の免疫調節法、例えば他の標的に対するモノクローナル抗体と組み合わせることが多い。例えば、臨床試験では、ニボルマブとイピリムマブとの組み合わせにより、黒色腫患者の客観的奏効率の改善が得られることが示されている。
【０００４】
分子クローニング技術が進歩し、抗体工学の知見が増すことで、多くのフォーマットが考え出され、治療用抗体の標的化能が拡大している。治療効果を増強し、潜在的有用性を広げるためには、多重特異性（二重特異性など）抗体を設計し、２つ以上の治療標的を同時に調節する。二重特異性抗体は、単純に２種類のモノクローナル抗体を併用するよりも有効であり得ることが報告されている。様々な多重特異性抗体フォーマットが開発されている。例えば、二重特異性抗体は、抗原結合性（Ｆａｂ）フラグメント又は単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をモノクローナル抗体と融合することによって作製されている（例えば、Ｗｅｉｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＆  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２０１３；１０：１〜１８参照）。腫瘍細胞を免疫細胞と架橋し、その比較的小さいサイズを利用して免疫シナプスを形成するための、ｓｃＦｖを用いる二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）が開発されている。ＩｇＧフォーマットの二重特異性抗体は、非対称性二重特異性抗体及びホモ二量体二重特異性抗体を含み、その全ての血中半減期が延長されており、自身の結晶性フラグメント（Ｆｃ）媒介機能を有する。異なるフォーマットでサイズが異なる多重特異性抗体は、様々な手法によって頻繁に製造され、異なるｉｎ  ｖｉｖｏ分布、組織浸透性、及び薬物動態特性を有する。
【０００５】
これらの概念的な利点にもかかわらず、既存の二重特異性抗体は、生物学的医薬品としての製造及び開発が難しい。人工構築物としては、二重特異性抗体は正常Ｂ細胞によって産生できない。二重特異性抗体の作製の初期の試みは、単一特異性抗体の化学的結合及びｍＡｂ発現細胞の融合が関与していたが、これらの方法では、低効率であり、多くの副産物からの精製する必要がある。タンパク質工学及び分子生物学における高度な方法は、様々な新規二重特異性抗体フォーマットの組み換え構築物を可能にしている。しかし、これら既知の遺伝子操作を受けた二重特異性抗体フォーマットに採用されると、個々の構成要素、例えばｓｃＦｖ及びｍＡｂは、有益な生化学的及び／若しくは生物物理学的特性、血清半減期、並びに／又は安定性を失い、効力が悪く、不安定で、かつ免疫原性が高くなる。例えば、Ｆａｎ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ  ＆  Ｏｎｃｏｌ，２０１５；８：１３０を参照されたい。更に、多くの既知の二重特異性抗体フォーマットは、工業的生産では非実用的な低い発現レベルと関連する。そのため、生物学的医薬品の実用的な生産及び開発のための二重特異性抗体基盤の必要性が残されている。
【０００６】
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、それぞれが単一の単量体抗体可変ドメインを有する抗体フラグメントである。２本の重鎖及び２本の軽鎖を有する一般的なモノクローナル抗体よりも大きさがはるかに小さいにもかかわらず、ｓｄＡｂは、ｍＡｂと同様の親和性及び特異性で抗原に結合できる。ｓｄＡｂは、構成要素として使用され、ＩｇＧのＦｃドメインと融合して、ＩｇＧ様抗体、例えば二価かつ二重特異性抗体を作製できる（例えば、Ｈｍｉｌａ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；４５：３８４７〜３８５６参照）。
本明細書で参照した全ての出版物、特許、特許出願、及び特許出願公開の開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｗｅｉｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＆  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２０１３；１０：１〜１８
【非特許文献２】Ｆａｎ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ  ＆  Ｏｎｃｏｌ，２０１５；８：１３０
【非特許文献３】Ｈｍｉｌａ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；４５：３８４７〜３８５６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本出願は、完全長４本鎖抗体又はそれらに由来する抗原結合フラグメントに融合した、１つ又は２つ以上の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む、多重特異性抗原結合タンパク質（ＭＡＢＰ）を提供する。
【０００９】
したがって、本出願の一態様は、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、ＭＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、第１のエピトープ及び第２のエピトープは、同じ抗原由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープ及び第２のエピトープは、異なる抗原由来である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは二重特異性である。
【００１０】
いくつかの上記ＭＡＢＰのうち任意の１つによる実施形態では、第１の抗原結合部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む、抗体フラグメントである。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、単一のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＣ末端は、第１の抗原結合部分の少なくとも１本の重鎖のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＣ末端は、第１の抗原結合部分の少なくとも１本の軽鎖のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＮ末端は、第１の抗原結合部分の少なくとも１本の重鎖のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＮ末端は、第１の抗原結合部分の少なくとも１本の軽鎖のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ＣＨ１ドメインに融合した第１のｓｄＡｂを含む第１のポリペプチド鎖と、ＣＬドメインに融合した第２のｓｄＡｂを含む第２のポリペプチド鎖とを、含む、Ｆａｂ様ドメインである。
【００１１】
いくつかの上記ＭＡＢＰのうち任意の１つによる実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒト、ヒト化若しくはキメラ抗体、又はそれらの抗原結合フラグメントを含む。
【００１２】
いくつかの上記ＭＡＢＰのうち任意の１つによる実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、Ｆｃ領域のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域はＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４  Ｆｃ、例えばＳ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４  Ｆｃである。
【００１３】
いくつかの上記ＭＡＢＰのうち任意の１つによる実施形態では、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、ペプチド結合又はペプチドリンカーを介して互いに融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、化学的に互いに融合している。
【００１４】
いくつかの上記ＭＡＢＰのうち任意の１つによる実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。
【００１５】
いくつかの上記ＭＡＢＰのうち任意の１つによる実施形態では、第１のエピトープは免疫チェックポイント分子由来である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ペンブロリズマブ（例えば、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））及びニボルマブ（例えば、ＯＰＶＩＤＯ（登録商標））からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、デュルバルマブ（duravalumab）又はアテゾリズマブである。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、免疫チェックポイント分子に特異的に結合し、例えば免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＣＴＬＡ−４ｓｄＡｂを含む。
【００１６】
いくつかの上記ＭＡＢＰのうち任意の１つによる実施形態では、第１のエピトープは腫瘍抗原由来である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２０、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３８、及びＣＤ５２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体はトラスツズマブである。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＣＤ３ｓｄＡｂを含む。
【００１７】
いくつかの上記ＭＡＢＰのうち任意の１つによる実施形態では、第１のエピトープは血管新生因子由来である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗Ａｎｇ２抗体又はその抗原結合フラグメント、例えばＬＣ１０である。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは第２の血管新生因子由来である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は抗ＶＥＧＦ  ｓｄＡｂである。
【００１８】
いくつかの上記ＭＡＢＰのうち任意の１つによる実施形態では、第１のエピトープは炎症促進性分子由来である。いくつかの実施形態では、炎症促進性分子は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、及びエオタキシン−１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＴＮＦ−α抗体又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦ−α抗体は、アダリムマブである。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は抗ＩＬ−１β  ｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＩＬ−５抗体又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−５抗体はメポリズマブである。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は抗エオタキシン−１ｓｄＡｂを含む。
【００１９】
いくつかの上記ＭＡＢＰのうち任意の１つによる実施形態では、ＭＡＢＰを、例えば哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中において、少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ以上の発現レベルで、組み換え的に産生させることができる。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ以上の溶解性を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、少なくとも約６５℃、例えば約６５℃〜約７５℃の凝集開始温度（Ｔａｇｇ）を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、少なくとも約６５℃、例えば約６５℃〜約７５℃の変性中間点温度（Ｔｍ）を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で２５℃にて少なくとも約１週間安定である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で３７℃にて少なくとも約１週間安定である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で少なくとも約５回の凍結融解後に安定である。
【００２０】
本出願の別の態様は、上述のＭＡＢＰのうち任意の１つと、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰの濃度は、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ以上である。
【００２１】
本出願の一態様では、有効量の上記医薬組成物のうち任意の１つを個体に投与することを含む、個体における疾患を治療する方法が更に提供される。いくつかの実施形態では、疾患は癌である。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、腎癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、疾患は、炎症性疾患又は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、炎症性疾患又は自己免疫疾患は、関節炎（例えば、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、及び潰瘍性大腸炎）、大腸炎、乾癬、重症喘息、及び中等度から重度のクローン病からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖を有する単一特異性完全長抗体と、ｓｄＡｂと、を含み、ｓｄＡｂのＮ末端が任意のペプチドリンカーを介して１本の重鎖のＣ末端に融合している、例示的な二重特異性抗原結合タンパク質（本明細書では「ＢＡＢＰ」とも称する）の概略構造図を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。ｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＬ−ＣＬ、（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ、（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、及び（４）ＶＬ−ＣＬのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、かつＶＨＨは、第２のエピトープに特異的に結合する。
【００２３】
【図２】２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖を有する単一特異性完全長抗体と、２つの同一のｓｄＡｂと、を含み、２つのｓｄＡｂが互いに融合しており、一方のｓｄＡｂのＮ末端が任意のペプチドリンカーを介して重鎖のＣ末端に融合している、例示的なＢＡＢＰの概略構造図を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。２つのｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＬ−ＣＬ、（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ−ＶＨＨ、（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、及び（４）ＶＬ−ＣＬのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、かつ各ＶＨＨは、第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。
【００２４】
【図３】２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖を有する単一特異性完全長抗体と、第１のｓｄＡｂと、第２のｓｄＡｂと、を含み、第１のｓｄＡｂと第２のｓｄＡｂが任意のペプチドリンカーを介して互いに融合しており、第１のｓｄＡｂのＮ末端が任意のペプチドリンカーを介して重鎖のＣ末端に融合している、例示的な三重特異性抗原結合タンパク質（本明細書では「ＴＡＢＰ」とも称する）の概略構造図を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。第１のｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。第２のｓｄＡｂは、第３のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＴＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＬ−ＣＬ、（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ１−ＶＨＨ２、（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、及び（４）ＶＬ−ＣＬのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）ＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨ１は、第２のエピトープに特異的に結合し、かつ、ＶＨＨ２は、第３のエピトープに特異的に結合する。
【００２５】
【図４】２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖を有する単一特異性完全長抗体と、２つの同一のｓｄＡｂと、を含み、各ｓｄＡｂのＮ末端が任意のペプチドリンカーを介して一方の重鎖のＣ末端に融合している、例示的なＢＡＢＰの概略構造図を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。２つのｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＬ−ＣＬ、（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ、（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ、及び（４）ＶＬ−ＣＬのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、各ＶＨＨは、第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替のフォーマットでは、各ｓｄＡｂを互いに融合したｓｄＡｂの２つのコピーに置き換えてもよい。
【００２６】
【図５】重鎖及び軽鎖を有する単一特異性Ｆａｂと、２つの同一のｓｄＡｂと、を含み、ｓｄＡｂのＮ末端が任意のペプチドリンカーを介して重鎖のＣ末端に融合しており、別のｓｄＡｂが任意のペプチドリンカーを介してＦａｂの軽鎖のＣ末端に融合している、例示的なＢＡＢＰの概略構造図を示す。Ｆａｂは、第１のエピトープに特異的に結合する。２つのｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは２本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ、及び（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨＨのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、かつ各ＶＨＨは、第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替のフォーマットでは、各ｓｄＡｂを省略してもよく、又は、互いに融合した２つの同一の若しくは異なるｓｄＡｂに置き換えてもよい。
【００２７】
【図６】２本の重鎖及び２本の軽鎖を有する二重特異性完全長抗体と、２つの同一のｓｄＡｂと、を含み、各ｓｄＡｂのＮ末端が任意のペプチドリンカーを介して一方の重鎖に融合している、例示的なＴＡＢＰの概略構造図を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、第３のエピトープに特異的に結合する第２の抗原結合部位とを有する。２つのｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＴＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＬ１−ＣＬ、（２）ＶＨ１−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ、（３）ＶＨ２−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ、及び（４）ＶＬ２−ＣＬのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ１及びＶＬ１は、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ２及びＶＬ２は、第３のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、かつ、各ＶＨＨは、第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替のフォーマットでは、各ｓｄＡｂを省略してもよく、又は、互いに融合した２つの同一の若しくは異なるｓｄＡｂに置き換えてもよい。
【００２８】
【図７】２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖を有する単一特異性完全長抗体と、第１のｓｄＡｂと、第２のｓｄＡｂと、を含み、各ｓｄＡｂのＮ末端が任意のペプチドリンカーを介して一方の重鎖に融合している、例示的なＴＡＢＰの概略構造図を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。第１のｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。第２のｓｄＡｂは、第３のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＴＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＬ−ＣＬ、（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ１、（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ２、及び（４）ＶＬ−ＣＬのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨ１は、第２のエピトープに特異的に結合し、かつ、ＶＨＨ２は、第３のエピトープに特異的に結合する。代替のフォーマットでは、各ｓｄＡｂを省略してもよく、又は、互いに融合した２つの同一の若しくは異なるｓｄＡｂに置き換えてもよい。単一特異性完全長抗体は、結合特異性を更に拡張するため、二重特異性完全長抗体に置き換えてもよい。
【００２９】
【図８】２本の重鎖及び２本の軽鎖を有する二重特異性完全長抗体と、第１のｓｄＡｂと、第２のｓｄＡｂと、を含み、各ｓｄＡｂのＮ末端が任意のペプチドリンカーを介して一方の重鎖に融合している、例示的な三重特異性抗原結合タンパク質の概略構造図を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する第１の抗原結合部位と、第３のエピトープに特異的に結合する第２の抗原結合部位とを有する。第１のｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。第２のｓｄＡｂは、第４のエピトープを特異的に結合する。例えば、三重特異性抗原結合タンパク質は４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＬ１−ＣＬ、（２）ＶＨ１−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ１、（３）ＶＨ２−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ２、及び（４）ＶＬ２−ＣＬのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ１及びＶＬ１は、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ２及びＶＬ２は、第３のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨ１は第２のエピトープに特異的に結合し、かつ、ＶＨＨ２は第４のエピトープに特異的に結合する。代替のフォーマットでは、各ｓｄＡｂを省略してもよく、又は、互いに融合した２つの同一の若しくは異なるｓｄＡｂに置き換えてもよい。
【００３０】
【図９】２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖を有する単一特異性完全長抗体と、２つの同一のｓｄＡｂと、を含み、各ｓｄＡｂのＣ末端が一方の重鎖のＮ末端に融合している、例示的なＢＡＢＰの概略構造図を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。２つのｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＬ−ＣＬ、（２）ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（３）ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、及び（４）ＶＬ−ＣＬのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、かつ、各ＶＨＨは第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替のフォーマットでは、各ｓｄＡｂを省略してもよく、又は、互いに融合した２つの同一の若しくは異なるｓｄＡｂに置き換えてもよい。単一特異性完全長抗体は、結合特異性を更に拡張するため、二重特異性完全長抗体に置き換えてもよい。
【００３１】
【図１０】２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖を有する単一特異性完全長抗体と、第１のｓｄＡｂと、第２のｓｄＡｂと、を含み、各ｓｄＡｂのＣ末端が一方の重鎖のＮ末端に融合している、例示的なＴＡＢＰの概略構造図を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。第１のｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。第２のｓｄＡｂは、第３のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＴＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＬ−ＣＬ、（２）ＶＨＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（３）ＶＨＨ２−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、及び（４）ＶＬ−ＣＬのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨ１は第２のエピトープに特異的に結合し、かつ、ＶＨＨ２は第３のエピトープに特異的に結合する。代替のフォーマットでは、各ｓｄＡｂを省略してもよく、又は、互いに融合した２つの同一の若しくは異なるｓｄＡｂに置き換えてもよい。単一特異性完全長抗体は、結合特異性を更に拡張するため、二重特異性完全長抗体に置き換えてもよい。
【００３２】
【図１１】２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖を有する単一特異性完全長抗体と、２つの同一のｓｄＡｂと、を含み、各ｓｄＡｂのＮ末端が任意のペプチドリンカーを介して一方の軽鎖のＣ末端に融合している、例示的なＢＡＢＰの概略構造図を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。２つのｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ、（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、及び（４）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、かつ、各ＶＨＨは第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替のフォーマットでは、各ｓｄＡｂを省略してもよく、又は、互いに融合した２つの同一の若しくは異なるｓｄＡｂに置き換えてもよい。単一特異性完全長抗体は、結合特異性を更に拡張するため、二重特異性完全長抗体に置き換えてもよい。
【００３３】
【図１２】２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖を有する単一特異性完全長抗体と、第１のｓｄＡｂと、第２のｓｄＡｂと、を含み、各ｓｄＡｂのＮ末端が任意のペプチドリンカーを介して一方の軽鎖のＣ末端に融合している、例示的なＴＡＢＰの概略構造図を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。第１のｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。第２のｓｄＡｂは、第３のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＴＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ１、（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、及び（４）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ２のとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨ１は第２のエピトープに特異的に結合、かつ、ＶＨＨ２は第３のエピトープに特異的に結合する。代替のフォーマットでは、各ｓｄＡｂを省略してもよく、又は、互いに融合した２つの同一の若しくは異なるｓｄＡｂに置き換えてもよい。単一特異性完全長抗体は、結合特異性を更に拡張するため、二重特異性完全長抗体に置き換えてもよい。
【００３４】
【図１３】２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖を有する単一特異性完全長抗体と、２つの同一のｓｄＡｂと、を含み、各ｓｄＡｂのＣ末端が任意のペプチドリンカーを介して一方の軽鎖のＮ末端に融合している、例示的なＢＡＢＰの概略構造図を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。２つのｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＨＨ−ＶＬ−ＣＬ、（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、及び（４）ＶＨＨ−ＶＬ−ＣＬのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、かつ、各ＶＨＨは第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替のフォーマットでは、各ｓｄＡｂを省略してもよく、又は、互いに融合した２つの同一の若しくは異なるｓｄＡｂに置き換えてもよい。単一特異性完全長抗体は、結合特異性を更に拡張するため、二重特異性完全長抗体に置き換えてもよい。
【００３５】
【図１４】２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖を有する単一特異性完全長抗体と、第１のｓｄＡｂと、第２のｓｄＡｂと、を含み、各ｓｄＡｂのＣ末端が任意のペプチドリンカーを介して一方の軽鎖のＮ末端に融合している、例示的なＴＡＢＰの概略構造図を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。第１のｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。第２のｓｄＡｂは、第３のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＴＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＨＨ１−ＶＬ−ＣＬ、（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、及び（４）ＶＨＨ２−ＶＬ−ＣＬのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨ１は第２のエピトープに特異的に結合、かつ、ＶＨＨ２は第３のエピトープに特異的に結合する。代替のフォーマットでは、各ｓｄＡｂを省略してもよく、又は、互いに融合した２つの同一の若しくは異なるｓｄＡｂに置き換えてもよい。単一特異性完全長抗体は、結合特異性を更に拡張するため、二重特異性完全長抗体に置き換えてもよい。
【００３６】
【図１５】２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖を有する単一特異性完全長抗体と、２つの同一の第１のｓｄＡｂと、２つの同一の第２のｓｄＡｂと、を含み、各第１のｓｄＡｂのＣ末端が任意のペプチドリンカーを介して一方の重鎖のＮ末端に融合しており、各第２のｓｄＡｂのＮ末端が任意のペプチドリンカーを介して一方の重鎖のＣ末端に融合している、例示的なＴＡＢＰの概略構造図を示す。完全長抗体は、第１のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。第１のｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。第２のｓｄＡｂは、第３のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＴＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＬ−ＣＬ、（２）ＶＨＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ２、（３）ＶＨＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ２、及び（４）ＶＬ−ＣＬのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、各ＶＨＨ１は第２のエピトープのコピーに特異的に結合し、かつ、各ＶＨＨ２は第３のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替のフォーマットでは、各ｓｄＡｂを省略してもよく、又は、互いに融合した２つの同一の若しくは異なるｓｄＡｂに置き換えてもよい。単一特異性完全長抗体は、結合特異性を更に拡張するため、二重特異性完全長抗体に置き換えてもよい。
【００３７】
【図１６】２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖を有する単一特異性完全長抗体と、２つの同一の第１のｓｄＡｂと、２つの同一の第２のｓｄＡｂと、を含み、各第１のｓｄＡｂのＣ末端が任意のペプチドリンカーを介して一方の軽鎖のＮ末端に融合しており、各第２のｓｄＡｂのＮ末端が任意のペプチドリンカーを介して一方の重鎖のＣ末端に融合している、例示的なＴＡＢＰの概略構造図を示す。完全長抗体は、第１のエピトープにそれぞれ特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。第１のｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。第２のｓｄＡｂは、第３のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＴＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＨＨ１−ＶＬ−ＣＬ、（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ２、（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ２、及び（４）ＶＨＨ１−ＶＬ−ＣＬのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬ第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、各ＶＨＨ１は第２のエピトープのコピーに特異的に結合し、かつ、各ＶＨＨ２は第３のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替のフォーマットでは、各ｓｄＡｂを省略してもよく、又は、互いに融合した２つの同一の若しくは異なるｓｄＡｂに置き換えてもよい。単一特異性完全長抗体は、結合特異性を更に拡張するため、二重特異性完全長抗体に置き換えてもよい。
【００３８】
【図１７】２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖を有する単一特異性完全長抗体と、４つの同一のｓｄＡｂと、を含み、各ｓｄＡｂのＣ末端が任意のペプチドリンカーを介して単一特異性完全長抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端に融合している、例示的なＢＡＢＰの概略構造図を示す。完全長抗体は、第１のエピトープにそれぞれ特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。各ｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＨＨ−ＶＬ−ＣＬ、（２）ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（３）ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、及び（４）ＶＨＨ−ＶＬ−ＣＬのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、かつ、各ＶＨＨは第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替のフォーマットでは、各ｓｄＡｂを省略してもよく、又は、互いに融合した２つの同一の若しくは異なるｓｄＡｂに置き換えてもよい。単一特異性完全長抗体は、結合特異性を更に拡張するため、二重特異性完全長抗体に置き換えてもよい。
【００３９】
【図１８】２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖を有する単一特異性完全長抗体と、４つの同一のｓｄＡｂと、を含み、各重鎖のＮ末端に融合しているのが２つの同一のｓｄＡｂであり、２つの同一のｓｄＡｂが任意のペプチドリンカーを介して互いに融合している、例示的なＢＡＢＰの概略構造図を示す。完全長抗体は、第１のエピトープにそれぞれ特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。各ｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＬ−ＣＬ、（２）ＶＨＨ−ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（３）ＶＨＨ−ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、及び（４）ＶＬ−ＣＬのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、かつ、各ＶＨＨは第２のエピトープのコピーを特異的に結合する。代替のフォーマットでは、各ｓｄＡｂを省略してもよく、又は、互いに融合した２つの同一の若しくは異なるｓｄＡｂに置き換えてもよい。単一特異性完全長抗体は、結合特異性を更に拡張するため、二重特異性完全長抗体に置き換えてもよい。
【００４０】
【図１９】２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖を有する単一特異性完全長抗体と、２つの同一のｓｄＡｂと、を含み、各ｓｄＡｂのＮ末端が任意のペプチドリンカーを介してＣＨ１領域のＣ末端に融合しており、各ｓｄＡｂのＣ末端が単一特異性完全長抗体のＣＨ２領域のＮ末端に融合している、例示的なＢＡＢＰの概略構造図を示す。完全長抗体は、第１のエピトープにそれぞれ特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。各ｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＬ−ＣＬ、（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨＨ−ＣＨ２−ＣＨ３、（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨＨ−ＣＨ２−ＣＨ３、及び（４）ＶＬ−ＣＬのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、かつ、各ＶＨＨは第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替のフォーマットでは、各ｓｄＡｂを省略してもよく、又は、互いに融合した２つの同一の若しくは異なるｓｄＡｂに置き換えてもよい。単一特異性完全長抗体は、結合特異性を更に拡張するため、二重特異性完全長抗体に置き換えてもよい。代替のフォーマットでは、特異性を拡張するため、２つのＦａｂフラグメントは異なるエピトープに特異的に結合でき、及び／又は、ＶＨＨフラグメントは異なるエピトープに特異的に結合できる。
【００４１】
【図２０】２つの同一の単鎖可変フラグメント（ｓｄＦｖ）と、２つの同一のｓｄＡｂと、結晶性フラグメント（Ｆｃ）領域と、を含み、各ｓｄＡｂのＮ末端が任意のペプチドリンカーを介してｓｃＦｖのＣ末端に融合しており、各ｓｄＡｂのＣ末端がＦｃ領域のＮ末端に融合している、例示的なＢＡＢＰの概略構造図を示す。各ｓｃＦｖは、第１のエピトープに特異的に結合する。各ｓｄＡｂは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰはそれぞれ２本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＬ−ＶＨ−ＶＨＨ−ＣＨ２−ＣＨ３のとおりであり、このとき、各ポリペプチド鎖のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープのコピーに特異的に結合するｓｃＦｖドメインを形成し、かつ、各ＶＨＨは第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替のフォーマットでは、ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−ＶＬを含んでよい。加えて、特異性を拡張するため、２つのｓｃＦｖは異なるエピトープに特異的に結合でき、及び／又は、ＶＨＨフラグメントは異なるエピトープに特異的に結合できる。
【００４２】
【図２１】２つの同一の抗原結合（Ｆａｂ）フラグメントと、それぞれが２つのＶＨＨフラグメントを含む２つの同一のＦａｂ様フラグメントと、Ｆｃ領域と、を含む、例示的なＢＡＢＰの概略構造図を示す。各Ｆａｂ様ドメインでは、ＶＨ及びＶＬ領域がそれぞれｓｄＡｂに置き換えられる。各Ｆａｂフラグメントは第１のエピトープに特異的に結合し、各Ｆａｂ様フラグメントは第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ−ＣＬ、（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、及び（４）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ−ＣＬのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、かつ、各ＶＨＨは第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替のフォーマットでは、特異性を拡張するため、２つのＦａｂフラグメントは異なるエピトープに特異的に結合でき、及び／又は、Ｆａｂ様フラグメントは異なるエピトープに特異的に結合できる。
【００４３】
【図２２】２つの同一のｓｃＦｖと、それぞれが２つのＶＨＨフラグメントを含む２つの同一のＦａｂ様フラグメントと、Ｆｃ領域と、を含む、例示的なＢＡＢＰの概略構造図を示す。各Ｆａｂ様ドメインでは、ＶＨ及びＶＬ領域がそれぞれｓｄＡｂに置き換えられる。例えば、ＢＡＢＰは４本のポリペプチド鎖からなり得、その構造は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＶＨＨ−ＣＬ、（２）ＶＬ−ＶＨ−ＶＨＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（３）ＶＬ−ＶＨ−ＶＨＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、及び（４）ＶＨＨ−ＣＬのとおりであり、このとき、ポリペプチド鎖（２）及び（３）のＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープのコピーに特異的に結合するｓｃＦｖをそれぞれ形成し、かつ、各ＶＨＨは第２のエピトープのコピーに特異的に結合する。代替のフォーマットでは、ｓｃＦｖのＣ末端は、ＶＨＨ−ＣＬを含むＦａｂ様フラグメント内の鎖のＮ末端に融合でき、及び／又は、ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端にＶＨ−ＶＬを含んでよい。加えて、特異性を拡張するため、２つのｓｃＦｖは異なるエピトープに特異的に結合でき、及び／又は、ＶＨＨフラグメントは異なるエピトープに特異的に結合できる。
【００４４】
【図２３】Ｃ５６ＢＬ／６  ＰＤ−１  ＫＩマウスのＭＣ３８同系モデルにおける、ＢＡＢＰ  ＢＣＰ−７５及びＢＣＰ−７９のｉｎ  ｖｉｖｏ効力試験の結果を示す。ＢＡＢＰの結果を、２本の主鎖を有する４本鎖抗体、つまり社内で発現させたバイオシミラー抗体であるペンブロリズマブ及びニボルマブの結果と比較する。
【００４５】
【図２４】Ｃ５６ＢＬ／６  ＣＴＬＡ−４  ＫＩマウスのＭＣ３８同系モデルにおける、ＢＡＢＰ  ＢＣＰ−７５及びＢＣＰ−７９のｉｎ  ｖｉｖｏ効力試験の結果を示す。ＢＡＢＰの結果を、ｓｄＡｂ−２又はｓｄＡｂ−３を含むＦｃ融合タンパク質と比較し、このときＦｃフラグメントは、社内で発現させたバイオシミラー抗体であるペンブロニズマブ及びニボルマブと同一である。この実験では、社内で発現させたＩｇＧ１アイソタイプであるイピリムマブを陽性対照として用いる。
【００４６】
【図２５】Ｃ５６ＢＬ／６  ＣＴＬＡ−４  ＫＩマウスのヒトＰＤ−Ｌ１  ＫＩ  ＭＣ３８同系モデルにおける併用療法と比較する、ＢＡＢＰ  ＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５のｉｎ  ｖｉｖｏ効力試験の結果を示す。
【００４７】
【図２６Ａ】ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスのＡ４３１異種移植モデルにおける併用療法と比較する、ＢＡＢＰ  ＢＣＰ−４９のｉｎ  ｖｉｖｏ効力試験の結果を示す。
【図２６Ｂ】ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスのＡ４３１異種移植モデルにおける併用療法と比較する、ＢＡＢＰ  ＢＣＰ−４９のｉｎ  ｖｉｖｏ効力試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本出願は、完全長抗体、又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗原結合フラグメントに融合した、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含むＭＡＢＰを提供する。ｓｄＡｂは、完全長抗体又は抗原結合フラグメントによって認識される標的とは別の標的（例えばエピトープ又は抗原）に特異的に結合することにより、幅広い標的化能を与える。ＭＡＢＰ中の構成要素として、ｓｄＡｂは、低サイズ、高溶解性及び安定性、ヒトにおける低免疫原性、及び様々なエピトープを標的にする能力が挙げられるが、これらに限定されない、現在知られている多重特異性抗体フォーマットで使用されるＦａｂ及びｓｃＦｖなどの他の抗原結合フラグメントを超えるいくつかの利点を有する。そのため、本明細書に記載されるＭＡＢＰは、完全長抗体又はその抗原結合フラグメントと比較して、同様の分子量と薬物動態特性を有することができる。例えば、ＭＡＢＰは、臨床的有効性及び安全性が証明されているモノクローナル抗体に、１つ又はそれ以上のｓｄＡｂを融合することによって設計され、多重特異性構築物の発現性を妨げずに、臨床的利点を増加させ、望ましい薬物動態特性を提供できる。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、２つの天然に産生する構成要素又はその誘導体、例えば、互いにポリペプチドリンカーによって融合された、天然に産生する又はヒト化したラクダ科ＶＨＨフラグメント及び天然に産生するモノクローナル抗体を含む。多くの既知の二重特異性抗体フォーマットとは異なり、本出願のＭＡＢＰは、優れた生産性、安定性及び溶解性を有する。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性データは、ＭＡＢＰが親抗体の抗腫瘍活性を保持していることを更に示している。ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍動物モデルにおいて、相乗活性も見いだされ、又は期待されている。本出願のＭＡＢＰフォーマットを利用して、種々の疾患関連エピトープ又は抗原の組み合わせ、例えば、免疫チェックポイント分子の組み合わせ、細胞表面抗原（腫瘍抗原など）の組み合わせ、又は炎症促進性分子の組み合わせを標的とすることによって、癌、炎症、及び自己免疫疾患などの多種多様な疾患及び状態の治療に有用な薬剤を提供できる。
【００４９】
したがって、本出願の一態様は、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、ＭＡＢＰを提供する。
【００５０】
本出願の一態様は、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の免疫チェックポイント分子に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の免疫チェックポイント分子に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、ＭＡＢＰを提供する。
【００５１】
本出願の一態様は、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の炎症促進性分子に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の炎症促進性分子に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、ＭＡＢＰを提供する。
【００５２】
本出願の一態様は、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原、又は免疫エフェクター細胞上の細胞表面抗原）に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、ＭＡＢＰを提供する。
【００５３】
また、ＭＡＢＰを含む医薬組成物、キット及び製品、並びに本明細書に記載されるＭＡＢＰを用いて疾患を治療する方法も提供される。
Ｉ．定義
【００５４】
本発明の実施において、具体的な反対の指示がない限り、当該技術分野の範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、ＤＮＡ組み換え技術における従来の方法が採用され、その多くを例示目的で以下に記載する。このような技術は、文献で詳細に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００９）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）及びその他類似の参考文献を参照されたい。
【００５５】
本明細書で使用するとき、用語「治療」は、臨床病理的過程で治療される個体又は細胞の自然経過を変更するように設計された臨床的介入を指す。治療の望ましい効果として、疾患進行率の低下、疾患状態の寛解又は緩和、及び寛解又は予後の改善が挙げられる。例えば、治療される疾患又は状態（例えば、癌、炎症性疾患又は自己免疫疾患）に関連する１つ又は２つ以上の症状が緩和又は除去された場合、本出願のＭＡＢＰにより個体は成功裏に「治療」される。
【００５６】
本明細書で使用するとき、「有効量」は、被検体における疾患又は状態を治療するのに有効な薬剤又は医薬品の量を指す。癌の場合、本出願の有効量のＭＡＢＰは、癌細胞数の減少、腫瘍の大きさの縮小、周辺臓器への癌細胞の浸潤抑制（すなわち、ある程度遅くする、好ましくは停止する）、腫瘍転移の抑制（すなわち、ある程度遅くする、好ましくは停止する）、腫瘍の増殖のある程度の抑制、及び／又は、癌に伴う１つ又は２つ以上の症状のある程度の緩和をすることができる。臨床的に理解されるように、有効量の薬剤、化合物、又は医薬組成物は、別の薬剤、化合物、又は医薬組成物と併用して実現しても、実現しなくてもよい。したがって、「有効量」は、１種類以上の治療薬を投与するという観点で考慮されてよく、単剤は、１種類以上の他の薬剤と併用され、所望の結果が実現する、又は実現し得る場合、有効量で投与されたとみなされ得る。
【００５７】
本明細書で使用するとき、「個体」又は「被検体」は、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類又は霊長類が挙げられるが、これらに限定されない、哺乳類を指す。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。
【００５８】
用語「抗体」として、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する完全長の４本鎖抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、及び単鎖分子、並びに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ）が挙げられる。本明細書では、用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、「抗体」と互換的に使用される。本明細書で意図される抗体には、重鎖抗体及びｓｄＡｂを含む。
【００５９】
基本となる４本鎖抗体ユニットは、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と、２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、ヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、基本ヘテロ四量体ユニットと共に、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドの５つから構成され、１０個の抗原結合部位を含有し、一方ＩｇＡ抗体は、重合し、Ｊ鎖と組み合わせて多価集合体を形成できる基本４本鎖ユニットのうち、２〜５つを備えている。ＩｇＧの場合、４本鎖ユニットは一般的には約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結され、一方２本のＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプによって１つ又は２つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。また、各Ｈ及びＬ鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端において可変ドメイン（ＶＨ）を、続けて、α及びγ鎖のそれぞれには３つの定常ドメイン（ＣＨ）を、μ及びεアイソタイプには４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端において可変ドメイン（ＶＬ）を、続けて別の末端に定常ドメインを有する。ＶＬはＶＨと並び、ＣＬは重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）と並ぶ。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の境界部を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬの対形成は、共に単一の抗原結合部位を形成する。異なる種類の抗体の構造及び特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｏｌｗ（ｅｄｓ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４，ｐａｇｅ  ７１及びＣｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。任意の脊椎動物由来のＬ鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる２種類の明らかに異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。重鎖（ＣＨ）の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンを異なる種類、つまりアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと指定される重鎖を有する、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭの５種類がある。γ及びαクラスは、ＣＨの配列及び機能における比較的わずかな違いに基づいて、更にサブクラスに分類され、例えば、ヒトは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のサブクラスを発現している。
【００６０】
「単離」抗体は、その産生環境（例えば、天然又は組み換え）の構成要素から、同定され、分離され、及び／又は回収されているものである。好ましくは、単離ポリペプチドは、その産生環境由来の他の全ての成分と会合しない。産生環境の混入成分、例えば、組み換えトランスフェクション細胞に起因するものは、典型的には、抗体の研究、診断又は治療用途を干渉する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を含む場合がある。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、（１）例えば、ローリー法によって測定されるとき、９５重量％超の抗体、いくつかの実施形態では、９９重量％超まで、（１）スピニングカップシークエネーターの使用による、少なくとも１５残基のＮ末端若しくは内部のアミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、又は、（３）クーマシーブルー若しくは好ましくは銀染色を用いる非還元若しくは還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで生成される。単離抗体は、工程の天然環境のうち少なくとも１つの構成要素が存在しないため、組み換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕ抗体を含む。しかし、通常は、単離ポリペプチドつまり抗体は、少なくとも１回の精製工程によって調製される。
【００６１】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「ＶＨ」及び「ＶＬ」と称される場合がある。これらのドメインは、一般に、（同じクラスの別の抗体に対して）抗体の最も可変である部分であり、抗原結合部位を含む。ラクダ科種由来の重鎖抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、これは「ＶＨＨ」と称される。したがって、ＨＨＨは、ＶＨの特殊型である。
【００６２】
用語「可変」は、可変ドメインのあるセグメントが抗体間で配列が広範囲に異なることを指す。Ｖドメインは、抗体結合に関与し、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を特徴付ける。しかし、可変性は、可変ドメイン全体にわたって均一に分布されていない。その代わり、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方にある超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのうちより良く保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ領域を含み、大部分がβシート構造を採用しており、３つのＨＶＲによって接続されて、βシート構造に連結する、場合によっては構造の一部を形成するループを形成する。各鎖のＨＶＲはＦＲ領域により近接して保持され、他の鎖由来のＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。
【００６３】
本明細書で使用するとき、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る自然発生突然変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）以外は同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原性部位に対するものであり、高特異性である。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物に比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンが混入しない点で有利である。修飾語である「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈されない。例えば、本出願に従って使用されるモノクローナル抗体を様々な手法で作製でき、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５〜９７（１９７５）；Ｈｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３〜２６０（１９９５），Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３〜６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）、ファージディスプレイ法（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４〜６２８（１９９１）参照）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９〜３１０（２００４）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３〜１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７〜１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１〜２）：１１９〜１３２（２００４）、及び、ヒト免疫グロブリン遺伝子座又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は前部を有する動物中でヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば、国際公開第１９９８／２４８９３号、同第１９９６／３４０９６号、同第１９９６／３３７３５号、同第１９９１／１０７４１号、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５〜２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、及び同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２〜８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５〜８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）；及びＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３（１９９５）参照）が挙げられる。
【００６４】
用語「Ｎａｋｅｄ抗体」は、細胞傷害性部分又は放射線標識に結合していない抗体を指す。
【００６５】
「完全長抗体」「無傷抗体」又は「全抗体」は、互換的に使用され、抗体フラグメントに対して実質的に完全な形の抗体を指す。具体的には、完全長４本鎖抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものを含む。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であってよい。いくつかの場合において、無傷抗体は、１つ又は２つ以上のエフェクター機能を有してよい。
【００６６】
「抗体フラグメント」は、無傷抗体の一部、好ましくは無傷抗体の抗原結合及び／又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント、ダイアボディ、線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７〜１０６２［１９９５］参照）、抗体フラグメントから形成される一本鎖抗体分子及び多特異性抗体が挙げられる。抗体をパパインで消化すると、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントと、残りの「Ｆｃ」フラグメント（この呼称は容易に結晶化できることを反映している）をもたらす。Ｆａｂフラグメントは、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）を伴うＬ鎖全体と、１本の重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とからなる。各Ｆａｂフラグメントは、抗原結合に関して１価であり、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体をペプシンで処理すると、異なる抗原結合活性を有する２箇所でジスルフィド結合したＦａｂフラグメントにほぼ相当し、依然として抗原の架橋が可能な、１つの大きなＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ又は２つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、少数の追加の残基を有することによって、Ｆａｂフラグメントとは異なる。本明細書では、Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を生じるＦａｂ’に対する表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、従来、これらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として産生された。また、抗体フラグメントのその他化学的結合も既知である。
【００６７】
Ｆｃフラグメントは、ジスルフィドによって共に保持される両Ｈ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体エフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列によって決定され、この領域は、ある種の細胞に見いだされるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によっても認識される。
【００６８】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識かつ結合部位を含む最小抗体フラグメントである。このフラグメントは、強く非共有結合的に会合している、１本の重鎖及び１本の軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これら２つのドメインが折り畳まれると、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を与える６つの超可変ループ（Ｈ及びＬ鎖それぞれに３つのループ）が延びる。しかし、結合部位全体よりも親和性は低いものの、単一可変ドメイン（つまり、抗原に特異的な３つのみのＨＶＲからなるＦｖの半分）であっても抗原を認識し、結合する能力を有する。
【００６９】
「単一鎖Ｆｖ」は、「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略され、単一のポリペプチド鎖内に連結されるＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む、抗体フラグメントである。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、これによって、ｓＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にする。ｓＦｖに関する総説は、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９〜３１５（１９９４）を参照されたい。
【００７０】
本明細書に記載される抗体の「機能性フラグメント」は、一般に、無傷抗体の抗原結合若しくは可変領域、又は、ＦｃＲ結合能を維持若しくは改変された結合能を有する抗体のＦｃ領域を含む、無傷抗体の一部を含む。抗体フラグメントの例として、線状抗体、単鎖抗体分子、及び、抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００７１】
用語「ダイアボディ」は、ＶＨとＶＬドメインとの間に短いリンカー（約５〜１０）残基）を有するＦｖフラグメント（上記パラグラフ参照）を構築することによって調製される小さい抗体フラグメントを指し、Ｖドメイン鎖内ではなく鎖間の対形成が達成されることによって、二価フラグメント、すなわち、２つの抗原結合部位を有するフラグメントが得られる。二重特異性ダイアボディは、２つの「クロスオーバー」するｓＦｖフラグメントのヘテロに量体であり、２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが、異なるポリペプチド鎖に存在する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第９３／１１１６１号、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８（１９９３）で詳細に説明されている。
【００７２】
本明細書のモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、これは、所望の生物活性を示す限りにおいて、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する、又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であり、一方鎖の残部は、別の種に由来する、又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であり、並びに、このような抗体のフラグメントである（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１〜６８５５（１９８４））。本明細書で対象とするキメラ抗体として、ＰＲＩＭＡＴＴＺＦＤ（登録商標）抗体が挙げられ、この抗体の抗原結合領域は、例えば、マカクザルを対象とする抗原で免役することによって産生される抗体由来である。本明細書で使用するとき、「ヒト化抗体」は、「キメラ抗体」のサブセットとして使用される。
【００７３】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最低限の配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここでは、レシピエントのＨＶＲ（以下で定義される）の残基が、所望の特異性、親和性及び／又は能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲの残基で置換される。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（「ＦＲ」）残基が、対応する非ヒト残基で置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体内にない残基を含んでもよい。結合親和性などの抗体の性能を更に改善するため、これらの修飾がなされる場合がある。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全ての少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、全て又は実質的に全ての超可変ループは、非ヒト免疫グロブリン配列のものと一致し、全て又は実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリン配列のものであり、ただし、ＦＲ領域は、抗体の性能、例えば結合親和性、異性化、免疫原性などを改善する、１つ又は２つ以上の個々のＦＲ残基の置換を含んでもよい。ＦＲ中のこれらのアミノ酸置換の数は、典型的にはＨ鎖では６以下であり、Ｌ鎖では３以下である。ヒト化抗体は、任意に、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むだろう。更なる詳細は、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２）を参照されたい。また、例えば、Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５〜１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５〜１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８〜４３３（１９９４）、並びに米国特許第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号も参照されたい。
【００７４】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体の配列に対応するアミノ酸配列を有し、及び／又は、本明細書に開示されるヒト抗体を作製するためのいずれかの手法を用いて作製された抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を、具体的に排除する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリなどの当該技術分野において既知の様々な手法を用いて作製できる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。また、ヒトモノクローナル抗体の調製には、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６〜９５（１９９１）に記載される方法も使用可能である。また、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：３６８〜７４（２００１）も参照されたい。ヒト抗体は、抗原投与に応答して、かかる抗体を産生するように改変されているが、内因性の遺伝子座が無効になっている、トランスジェニック動物、例えば、免疫化したｘｅｎｏｍｉｃｅに抗原を投与することによって調製できる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号参照）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって発生するヒト抗体に関しては、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７〜３５６２（２００６）も参照されたい。
【００７５】
本明細書で使用するとき、用語「可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」は、配列が超可変であり、及び／又は、構造的に画定されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、４本鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つのＨＶＲを含む。単一ドメイン抗体は、３つのＨＶＲ、例えばＶＨＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）を含む。天然の４本鎖抗体では、Ｈ３及びＬ３は、６つのＨＶＲのうち最も多様性を示し、特に、Ｈ３は、抗体に対する精密な特異性を与えるのに独自の役割を果たす。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７〜４５（２０００）；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１〜２５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）を参照されたい。実際に、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ科抗体は機能性を有し、軽鎖非存在下で安定である。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６〜４４８（１９９３）；Ｓｈｅｒｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３〜７３６（１９９６）を参照されたい。
【００７６】
用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔシステムによって定義される超可変領域を指すために使用される。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい。
【００７７】
多くのＨＶＲの記述が使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔの相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列多様性に基づくものであり、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。代わりに、Ｃｈｏｔｈｉａは構造ループの位置を参照している（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７））。ＡｂＭ  ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ  ＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａの構造ループとの間の妥協策を示し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアで使用されている。「ｃｏｎｔａｃｔ」ＨＶＲは、利用可能な複合結晶構造の解析に基づくものである。以下の表Ｉに、これらＨＶＲそれぞれに由来する残基を記す。
【表１】
2019524693.tif 000002
【００７８】
ＨＶＲは、ＶＬ中の２４−３６又は２４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７又は８９−９６（Ｌ３）、並びにＶＨ中の２６−３５（Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２（Ｈ３）である、「伸長されたＨＶＲ」を含んでよい。可変ドメイン残基は、これらの定義のそれぞれについて、Ｋａｂａｔｅｔ  ａｌ（上記）に従ってナンバリングされる。
【００７９】
「Ｋａｂａｔと同様の可変ドメイン残基のナンバリング」又は「Ｋａｂａｔと同様のアミノ酸位置ナンバリング」という表現及びその変形は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ（上記）における抗体の編集物の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに使用されるナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを使用すると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ中の短縮、又は挿入に対応して、より少ない又は追加的なアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後ろに１つのアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによると残基５２ａ）と、重鎖ＦＲ残基８２の後ろに挿入残基（Ｋａｂａｔによると、例えば８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含む場合がある。ある抗体について、「標準」Ｋａｂａｔナンバリング配列を有する抗体の配列の相同性の領域におけるアライメントによって、残基のＫａｂａｔナンバリングを決定することができる。
【００８０】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００８１】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」又は「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において、最も共通に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択肢は、可変ドメイン配列のサブグループである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）にあるようなサブグループである。例として、ＶＬについては、サブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ（上記）にあるような、サブグループκＩ、κＩＩ、κＩＩＩ又はκＩＶであってよい。また、ＶＨについては、サブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌにあるような、サブグループＩ、サブグループＩＩ又はサブグループＩＩＩであってよい。あるいは、ヒトコンセンサスフレームワークは、例えば、ドナーフレームワーク配列を様々なヒトフレームフレーム配列の集合とアライメントすることによって、ドナーフレームワークとの相同性に基づいてヒトフレームワーク残基を選択するときなど、特定の残基において、上記のもの由来である場合がある。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来である」アクセプターヒトフレームワークは、それらと同じアミノ酸配列を含んでよく、又は、予め存在するアミノ酸配列変化を含んでもよい。いくつかの実施形態では、予め存在するアミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。
【００８２】
特定の位置、例えば、Ｆｃ領域の「アミノ酸修飾」は、特定の残基の置換又は欠失、特定の残基近くへの少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を指す。特定の残基「近く」への挿入は、その１〜２残基内への挿入を意味する。挿入は、特定の残基のＮ末端又はＣ末端側であってよい。本明細書の好ましいアミノ酸修飾は、置換である。
【００８３】
「親和性成熟した」抗体は、その１つ又は２つ以上のＨＶＲに１つ又は２つ以上の変更を伴うものであり、その変更により、それらの変更を持たない親抗体と比較して、抗体の抗原に対する親和性の改善がもたらされる。一実施形態では、親和性成熟した抗体は、標的抗原に対してナノモル濃度又は更にはピコモル濃度の親和性を有する。親和性成熟した抗体は、当該技術分野において既知の手順によって作製される。例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９〜７８３（１９９２）は、ＶＨ−及びＶＬ−ドメインのシャッフリングによる親和性成熟について述べている。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム変異誘発は、例えば、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９〜３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １６９：１４７〜１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４〜２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０〜９（１９９５）；及びＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９〜８９６（１９９２）に記載されている。
【００８４】
本明細書で使用するとき、用語「特異的に結合する」又は「特異的」は、標的と抗体との間の結合などの、測定可能かつ再現性のある相互作用を指し、これは、生物学的分子などの分子の異種集団の存在下での、標的の存在を判定する。例えば、標的（エピトープであり得る）に特異的に結合する抗体は、別の標的に結合するよりも、この標的に、より高い親和性で、より強い結合活性で、より容易に、及び／又はより長時間結合する抗体である。一実施形態では、無関係の標的への抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で測定するとき、標的に対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、標的に特異的に結合する抗体の解離定数（Ｋｄ）は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦０．１ｎＭである。特定の実施形態では、抗体は、異種由来のタンパク質間で保存されているタンパク質のエピトープに特異的に結合する。別の実施形態では、特異的結合は排他的結合を含んでよいが、それは必須ではない。
【００８５】
用語「特異性」は、抗原の特定のエピトープに対する抗原結合タンパク質、つまり抗体の選択的認識を指す。例えば、天然の抗体は単一特異性である。本明細書で使用するとき、用語「多重特異性」は、抗原結合タンパク質、つまり抗体が、２つ以上の抗原結合部位を有し、そのうち少なくとも２つが異なる抗原又は同一の抗原の異なるエピトープに結合することを意味する。本明細書で使用するとき、「二重特異性」は、抗原結合タンパク質、つまり抗原が、２つの異なる抗原結合特異性を有することを意味する。本明細書で使用するとき、用語「単一特異性」抗体は、１つ又は２つ以上の結合部位を有し、それぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する抗体を意味する。
【００８６】
本明細書で使用するとき、用語「価」は、抗原結合タンパク質、つまり抗体分子内に、特定の数の結合部位が存在していることを意味する。例えば、天然抗体、つまり完全長抗体は、２つの結合部位を有し、二価である。このように、用語「三価」、「四価」、「五価」及び「六価」は、抗原結合タンパク質、つまり抗体分子内に、それぞれ２つの結合部位、３つの結合部位、４つの結合部位、５つの結合部位、及び６つの結合部位が存在していることを意味する。本出願のＭＡＢＰは、少なくとも「二価」であり、例えば、ＭＡＢＰは「三価」又は「四価」であってよい。
【００８７】
「遮断」抗体、つまり「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物活性を抑制又は低減するものである。いくつかの実施形態では、遮断抗体、つまりアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的に又は完全に抑制する。
【００８８】
「アゴニスト」、つまり活性化抗体は、結合する抗原によるシグナル伝達を増強又は開始するものである。いくつかの実施形態では、アゴニスト抗体は、天然リガンドが存在しなくてもシグナル伝達を引き起こし、又は活性化する。
【００８９】
「抗体エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異Ｆｃ領域）に起因するこれらの生物活性を指し、抗体アイソタイプによって変化する。抗体エフェクター機能の例として、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、Ｂ細胞活性化が挙げられる。抗体エフェクター機能の「低下又は最小化」は、野生型又は未修飾の抗体から、少なくとも５０％（あるいは６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）低下することを意味する。抗体エフェクター機能の決定は、当業者によって容易に判定可能かつ測定可能である。好ましい実施形態では、抗体エフェクター機能である補体結合、補体依存性細胞傷害及び抗体依存性細胞傷害が影響を受ける。いくつかの実施形態では、エフェクター機能は、グリコシル化を排除した定常領域における変異、例えば、「エフェクターレス変異」によって解消される。一態様では、エフェクターレス変異は、ＣＨ２領域におけるＮ２９７Ａ又はＤＡＮＡ（Ｄ２６５Ａ＋Ｎ２９７Ａ）変異である。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１〜６６０４（２００１）。あるいは、エフェクター機能の低下又は解消をもたらす追加の突然変異として、Ｋ３２２Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）が挙げられる。あるいは、エフェクター機能は、製造手法によって低下又は解消されることがあり、例えば、グリコシル化しない宿主細胞（例えば、大腸菌）又は、エフェクター機能の促進に無効であるか若しくは効果が低い、改変された変更されたグリコシル化パターンをもたらす宿主細胞（例えば、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６〜３４７３（２００３）中での発現である。
【００９０】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」つまりＡＤＣＣは、細胞傷害の一形態を指し、分泌されたＩｇが特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合すると、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原提示標的細胞に特異的に結合し、続いてその標的細胞を細胞毒で死滅することを可能にする。細胞傷害性細胞の抗体「アーム」は、このメカニズムによる標的細胞の死滅に必要である。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７〜９２（１９９１）の４６４ページ表３にまとめられている。対象分子のＡＤＣＣ活性の評価には、米国特許第５，５００，３６２号又は同５，８２１，３３７号に記載されるものなどの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを実施してもよい。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的又は追加的に、対象分子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば、動物モデル（例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：６５２〜６５６（１９９８）に開示されるもの）で評価してもよい。
【００９１】
本明細書で別途記載のない限り、免疫グロブリン重鎖中の残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ（上記）にあるようなＥＵインデックスのものである。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号を指す。
【００９２】
本明細書の用語「Ｆｃ領域」を用いて、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義し、天然配列のＦｃ領域と変異Ｆｃ領域を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、一般に、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０のアミノ酸残基位置から、そのカルボキシル末端にかけて延びると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の製造若しくは精製時、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え的に操作することによって、除かれてもよい。したがって、無傷抗体の構成は、全てのＫ４４７残基が除かれた抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、及びＫ４４７残基がある抗体とない抗体の混合物を有する抗体集団を含んでよい。本明細書に記載される抗体での使用に好適な天然配列Ｆｃ領域として、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が挙げられる。
【００９３】
「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を表す。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。更に、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）に結合するものであり、対立遺伝子変異体及び異なるスプライシングを受けた型を含む、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が挙げられ、ＦｃγＲＩＩ受容体として、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制受容体」）が挙げられ、これらは主に細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。抑制受容体ＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。（Ｍ．Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３〜２３４（１９９７）を参照されたい。ＦｃＲの総説は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７〜９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５〜３４（１９９４）；及びｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０〜４１（１９９５）にある。その他ＦｃＲ（将来同定されるものを含む）は、本明細書の用語「ＦｃＲ」に包含される。
【００９４】
また、用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、胎児への母体ＩｇＧの移動を担う、新生児期受容体であるＦｃＲｎも含む。Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４）。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は既知である（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：（１２）：５９２〜８（１９９７）；Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５（７）：６３７〜４０（１９９７）；Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３〜６（２００４）；国際公開第２００４／９２２１９号（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．参照）。ｉｎ  ｖｉｖｏのＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス若しくはトランスフェクトされたヒト細胞株、又は変異Ｆｃ領域を有するポリペプチドが投与された霊長類で評価することができる。国際公開第２００４／４２０７２号（Ｐｒｅｓｔａ）は、ＦｃＲへの結合が改善又は低下した抗体変異体について説明している。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１〜６６０４（２００１）も参照されたい。
【００９５】
「エフェクター細胞」は、１つ又は２つ以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を行う白血球である。一態様では、エフェクター細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を行う。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、及び好中球が挙げられる。エフェクター細胞は、天然源、例えば血液から単離されてよい。エフェクター細胞は、一般に、エフェクター相に関与し、サイトカイン産生機能があり（ヘルパーＴ細胞）、病原体に感染した細胞を殺滅し（細胞傷害性Ｔ細胞）、又は抗体を分泌する（分化したＢ細胞）リンパ球である。
【００９６】
「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的細胞を溶解することを指す。従来の補体経路の活性化は、補体系の第１の要素（Ｃ１ｑ）の、その同種抗原に結合する抗体（適切なサブクラスの）への結合によって開始される。補体活性化の評価には、ＣＤＣアッセイ、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されるものを実施してよい。Ｆｃ領域のアミノ酸配列が変更されており、Ｃ１ｑ結合能が増加又は低下している抗体変異体が、米国特許第６，１９４，５５１（Ｂ１）号及び国際公開第９９／５１６４２号に記載されている。これらの特許公報の内容は、具体的に参照することにより本明細書に組み込まれる。Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８〜４１８４（２０００）も参照されたい。
【００９７】
用語「重鎖抗体」又は「ＨＣＡｂ」は、重鎖を含むが通常抗体にある軽鎖を欠く、機能性抗体を指す。ラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ、又はアルパカ）は、ＨＣＡｂを産生することで知られている。
【００９８】
用語「単一ドメイン抗体」又は「ｓｄＡｂ」は、３つの相補的決定領域（ＣＤＲ）を有する単一抗原結合ポリペプチドを指す。ｓｄＡｂは単独で、対応するＣＤＲ含有ポリペプチドと対形成することなく抗原に結合することができる。いくつかの場合において、ｓｄＡｂは、ラクダ科のＨＣＡｂから遺伝子操作を受けており、本明細書ではそれらの重鎖可変ドメインを「ＶＨＨ」と称する。ラクダ科ｓｄＡｂは、最少の既知の抗原結合抗体フラグメントのうちの１種である（例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６〜８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：１６８〜７３（１９９５）；Ｈａｓｓａｎｚａｄｅｈ−Ｇｈａｓｓａｂｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ），８：１０１３〜２６（２０１３）参照）。
【００９９】
「結合親和性」は一般に、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合相手（例えば、抗原）との間の非共有性相互作用の強度の総和を指す。別途記載のない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体及び抗原）のメンバー間の１対１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの相手Ｙに対する親和性は、一般に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野において既知の一般的な方法により測定できる。低親和性の抗体は一般に、抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があるが、一方高親和性の抗体は一般に、抗原により早く結合し、より長く結合したままになる傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法は当該技術分野において既知であり、任意のものを本出願の目的で使用できる。結合親和性を測定するための特定例かつ代表的な実施形態を、以下に記載する。
【０１００】
本明細書で使用するとき、「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、一実施形態では、抗体のＦａｂ部及び抗原分子を用いて行われる放射線標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定され、このアッセイは以下に説明されており、一連の滴定用非標識抗原の存在下で、Ｆａｂを最小限の濃度の（１２５Ｉ）標識抗原と平衡化した後、抗Ｆａｂ抗体をコーティングしたプレートを用いて結合した抗原を捕捉することによって、抗原に対するＦａｂ溶液の結合親和性を測定するものである（Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５〜８８１）。アッセイ条件を確立するため、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）を、５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍＬの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）を用いて一晩コーティングし、続いて、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを用いて、室温（約２３℃）にて２〜５時間ブロッキングする。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ  ＃２６９６２０）中で、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を、連続希釈した対象とするＦａｂと混合する（Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３〜４５９９での抗ＶＥＧＦ抗体であるＦａｂ−１２の評価と同じ）。次いで、対象とするＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションを更に長時間（例えば、６５時間）継続し、平衡に達するのを確実にすることもできる。その後、混合物を捕捉プレートに移し、室温で１時間インキュベートする。続いて、溶液を除去し、プレートをＰＢＳ中０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で８回洗浄する。プレートが乾燥したときに、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ＭｉｃｒｏＳｃｈｉｎｔ−２０；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートを、Ｔｏｐｃｏｕｎｔガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間カウントする。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合的結合アッセイで用いるために選択する。
【０１０１】
別の実施形態によると、Ｋｄは、ＢＩＯＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＯＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．））を、〜１０応答単位（ＲＵ）の固定化抗原ＣＭ５チップと共に２５℃で用いる、表面プラズモン共鳴アッセイを用いることによって測定される。簡潔に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍＬ（〜０．２μＭ）まで希釈した後、５μＬ／分の流速で注入し、およそ１０応答単位（ＲＵ）の結合タンパク質を得る。抗原の注入後、１Ｍエタノールアミンを注入し、未反応基をブロックする。速度論的測定には、２倍に連続希釈したＦａｂ（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％  ＴＷＥＥＮ  ２０（商標）界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に、２５℃にて、およそ２５μＬ／分の流速で注入する。結合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、結合解離センサーグラムに同時にフィットさせることによる、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を用いて計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出する。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５〜８８１（１９９９）を参照されたい。上記表面プラズモン共鳴アッセイによるｏｎ速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を超えた場合は、分光計、例えば、流れ停止装置付き分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベット付き８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定するとき、濃度増加する抗原の存在下において、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の、２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増減を測定する蛍光消光法を用いて、ｏｎ速度を決定できる。
【０１０２】
本明細書で使用するとき、「ｏｎ速度」「結合の速度」「結合速度」又は「ｋｏｎ」は、ＢＩＯＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＯＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００システム（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．））を、約１０応答単位（ＲＵ）の固定化抗原ＣＭ５チップと共に２５℃で用いて、上記のように測定することもできる。簡潔に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（biosensor  ships）（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＣＤ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５ｍｇ／ｍＬ  ０．２μＭ）に希釈した後、５ｍＬ／分の流速で注入し、およそ１０応答単位（ＲＵ）の結合タンパク質を得る。抗原の注入後、１Ｍエタノールアミンを加え、未反応基をブロックする。速度論的測定には、２倍に連続希釈したＦａｂ（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に、２５℃にて、およそ２５μＬ／分の流速で注入する。結合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、結合解離センサーグラムに同時にフィットさせることによる、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアバージョン３．２）を用いて計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出した。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２９３：８６５〜８８１を参照されたい。しかし、上記表面プラズモン共鳴アッセイによるｏｎ速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を超えた場合は、好ましくは、分光計、例えば、流れ停止装置付き分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベット付き８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定するとき、濃度増加する抗原の存在下において、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の、２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増減を測定する蛍光消光法を用いて、ｏｎ速度を決定する。
【０１０３】
ペプチド、ポリペプチド又は抗体配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」及び「相同性」は、必要に応じて、最大割合の配列同一性を達成するため、配列をアライメントし、かつギャップを導入した後、配列同一性の部分としていかなる保存的置換を考慮せずに、特定のペプチド又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義する。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的においてアライメントは、当該技術分野における様々な方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、又はＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアライメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメント測定用の適切なパラメータを決定することができる。
【０１０４】
本明細書のＭＡＢＰ又はｓｄＡｂをコードする「単離された」核酸分子は、通常は産生された環境に関係する少なくとも１つの混入核酸分子から、単離され、かつ分離される核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は、産生環境に関係する全ての成分と会合しない。本発明のポリペプチド及び抗体をコードする単離された核酸分子は、自然に見いだされる形態又は状況以外の形態である。したがって、単離された核酸分子は、細胞内で天然に存在する本明細書のポリペプチド及び抗体をコードする核酸と区別される。
【０１０５】
用語「コントロール配列」は、特定の宿主生物における操作可能に連結されたコーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。例えば、原核生物に適したコントロール配列は、プロモーター、任意のオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
【０１０６】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に配置されるとき、「操作可能に連結」される。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーは、その配列の転写に影響する場合、コード配列に操作可能に連結され、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するために配置される場合、コード配列に操作可能に連結される。一般に、「操作可能に連結される」とは、連結されているＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合は、読まれるときに近接していることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。連結は、都合がいい制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、従来の方法によって合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【０１０７】
本明細書で使用するとき、「キャリア」は、使用される用量及び濃度に曝露されている細胞又は哺乳類に対して毒性がない、医薬的に許容されるキャリア、賦形剤、又は安定剤を含む。生理学的に許容されるキャリアは、水性ｐＨ緩衝液である。生理学的に許容されるキャリアの例として、緩衝液、例えばリン酸、クエン酸、及びその他有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びその他炭水化物、例えばグルコース、マンノース又はデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩生成対イオン、例えばナトリウム金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又は、非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【０１０８】
本発明の対象とする「希釈剤」は、医薬的に許容され（ヒトへの投与の安全であり毒性がない）、凍結乾燥後再溶解製剤などの液体製剤の調製に有用なものである。例示的な希釈剤として、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水）、無菌食塩水、リンゲル液又はデキストロース溶液が挙げられる。代替的な実施形態では、希釈剤として、塩及び／又は緩衝剤の水溶液が挙げられる。
【０１０９】
「保存剤」は、本明細書において製剤に添加し、細菌活性を低下することができる化合物である。保存剤の添加により、例えば、複数回使用（複数回投与）製剤の製造を容易にできる。可能性がある保存剤の例として、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物である塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）、塩化ベンゼニウムが挙げられる。他の種類の保存剤として、フェノール、ブチル、及びベンジルアルコールなどの芳香族アルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが挙げられる。本明細書において最も好ましい防腐剤は、ベンジルアルコールである。
【０１１０】
用語「医薬製剤」は、有効成分の生物活性が有効となることを可能にするような形態であり、その製剤が投与される被検体に許容されないほど毒性がある追加の成分を含まない、製剤を指す。このような製剤は無菌である。「無菌」製剤は無菌性であり、つまり、全ての生微生物及びその芽胞を含まない。
【０１１１】
「安定」製剤は、含まれるタンパク質が、保管によりその物理学的及び化学的安定性並びに完全性を実質的に保持しているものである。当該技術分野において、タンパク質の安定性の測定には様々な分析法があり、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７〜３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９〜９０（１９９３）で論説されている。安定性は、選択された期間にわたって選択された温度で測定してよい。迅速スクリーニングのため、製剤を４０℃で２週間〜１ヶ月保管し、その期間での安定性を測定してもよい。製剤が２〜８℃で保管される場合、一般に、３０℃又は４０℃で少なくとも１ヶ月間安定であり、及び／又は、２〜８℃で少なくとも２年間安定でなければならない。製剤が３０℃で保管される場合、一般に、３０℃で少なくとも２年間安定であり、及び／又は、４０℃で少なくとも６ヶ月間安定でなければならない。例えば、保管中の凝集の程度は、タンパク質安定性の指標として使用できる。したがって、「安定」製剤は、約１０％未満、好ましくは約５％未満のタンパク質が、製剤中の凝集体として存在するものであってよい。他の実施形態では、製剤の保管中に凝集体形成のなんらかの増加を判定してもよい。
【０１１２】
「再溶解」製剤は、タンパク質が全体に分散するように、凍結乾燥したタンパク質、つまり抗体製剤を希釈剤中に溶解することによって調製されているものである。再溶解製剤は、対象とするタンパク質を用いて治療される患者への投与（例えば、皮下投与）に適しており、特定の実施形態では、非経口的又は静脈内投与に適したものであってよい。
【０１１３】
「等張性」製剤は、ヒト血液と実質的に同じ浸透圧を有するものである。等張性製剤は、一般に約２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有することになる。用語「低張性」は、ヒト血液よりも低い浸透圧を有する製剤を説明する。同様に、用語「高張性」は、ヒト血液よりも高い浸透圧を有する製剤を説明するのに使用される。等張性は、例えば、蒸気圧式又は氷点式浸透圧計を用いて測定できる。本出願の製剤は、塩及び／又は緩衝剤の添加の結果高張性であってよい。
【０１１４】
「免疫チェックポイント分子」は、シグナルを増強するかシグナルを低下するかのいずれかである、免疫系の分子を指す。「刺激性免疫チェックポイント分子」又は「共刺激分子」は、免疫系のシグナルを増強する免疫チェックポイント分子である。「抑制性免疫チェックポイント分子」は、免疫系のシグナルを低下する免疫チェックポイント分子である。
【０１１５】
本明細書に記載される実施形態は、実施形態「からなる」及び／又は「から本質的になる」を含むことを理解されたい。
【０１１６】
本明細書に記載される「約」のついた値又はパラメータへの言及は、値又はパラメータ自体を被検体とする変形を含む（及び記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する説明は、「Ｘ」の説明を含む。
【０１１７】
本明細書で使用するとき、「〜されない」などの否定（not）を伴うある値又はパラメータへの言及は、その値又はパラメータ「以外」が肯定されることを一般に意味し、記載する。例えば、「方法は、タイプＸの癌を処置するのに使用されない」は、「方法は、Ｘ以外のタイプの癌を処置するのに使用される」を意味する。
【０１１８】
本明細書で使用する用語「約Ｘ〜Ｙ」は、「約Ｘ〜約Ｙ」と同一の意味を有する。
【０１１９】
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」で使用するとき、単数形の「ａ」、「ｏｒ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈から単数であることが明確に読み取れる場合を除き、対象の複数形も含まれるものとする。
ＩＩ．多重特異性抗原結合タンパク質（ＭＡＢＰ）
【０１２０】
本出願の一態様は、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性抗原結合タンパク質（ＭＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の免疫チェックポイント分子由来であり、第２のエピトープは第２の免疫チェックポイント分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープは第２の腫瘍抗原由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープはＣＤ３などの細胞表面分子由来である。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の炎症促進性分子由来であり、第２のエピトープは第２の炎症促進性分子由来である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は完全長４本鎖抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃ又はＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１２１】
本出願のＭＡＢＰは、少なくとも２つの異なるエピトープに特異的に結合できる、少なくとも２つの抗原結合部分を有する。ＭＡＢＰが２つの異なるエピトープに対する結合部位を有する限り、少なくとも２つの抗原結合部分の一部は同じであってもよい。ＭＡＢＰは、対称性又は非対称性であってよい。例えば、ＭＡＢＰは、１つ又は２つの第１の抗原結合部分のコピーと、１〜８つの第２の抗原結合部分のコピーとを含んでよい。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、それぞれが、異なる抗原結合部位を共に形成するＶＨドメインとＶＬドメインとを含む、２つの異なる抗原結合部分を含む。例えば、第１の抗原結合部分は二重特異性抗体であってよい。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、単一特異性完全長抗体又はその抗原結合フラグメント、例えばＦａｂである。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、それぞれがｓｄＡｂを含む、１、２、３、４、５、６、７、８つ、又はそれ以上の異なる抗原結合部分のうちいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、２つの同一のｓｄＡｂは互いに融合し、第１の抗原結合部分に更に融合する。いくつかの実施形態では、２つの異なるｓｄＡｂは互いに融合し、第１の抗原結合部分に更に融合する。
【０１２３】
ＭＡＢＰは、各エピトープに対して任意の好適な価数、及び任意の好適な数の特異性を有してよい。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、第１のエピトープに対して２価、３価、４価、５価、６価、又はそれ以上の価数である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、第２のエピトープに対して２価、３価、４価、５価、６価、又はそれ以上の価数である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは二重特異性である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは三重特異性である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは四重特異性である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは４つを超える特異性を有する。例示的なＭＡＢＰを図１〜２２に示す。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、１コピーの第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、１又は２以上（例えば２）コピーの第２の抗原結合部分と、を含み、第２の抗原結合部分の各コピーが第１の抗原結合部分に融合している、二重特異性抗原結合タンパク質（「ＢＡＢＰ」）が提供される。例を図５に示す。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂのうち１つ又は２つ以上は、それぞれが更に他の同一又は異なるｓｄＡｂに融合する。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、複数（例えば、２、３、４、５、６つ、又はそれ以上）の第１の抗原結合部分と、（ｂ）第１のエピトープとは異なるエピトープにそれぞれが特異的に結合する、複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８つ、又はそれ以上）の同一又は異なるｓｄＡｂと、を含み、ｓｄＡｂが互いに、及び／又は第１の抗原結合部分と融合している、ＭＡＢＰが提供される。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をそれぞれ含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、２コピーの第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、１コピーの第２の抗原結合部分と、を含み、第２の抗原結合部分が２コピーの第１の抗原結合部分のうち一方に融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。例を図１に示す。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をそれぞれ含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、２コピーの第１の抗原結合部分と、（ｂ）第１のエピトープとは異なるエピトープにそれぞれが特異的に結合する、複数（例えば、２、３、又は４つ）の同一又は異なるｓｄＡｂと、を含み、ｓｄＡｂが互いに、及び／又は第１の抗原結合部分と融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。例を図２、３、１７、１８、２１、及び２２に示す。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をそれぞれ含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、２コピーの第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂをそれぞれ含む、２コピーの第２の抗原結合部分と、を含み、１コピーの第２の抗原結合部分が第１の抗原結合部分のそれぞれのコピーに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。例を図４、９、１１、１３、１９、及び２０に示す。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂのうち１つ又は２つ以上は、それぞれが更に他の同一又は異なるｓｄＡｂに融合する。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をそれぞれ含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１のコピー及び第２のコピーの第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、（ｃ）第３のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、第３の抗原結合部分と、を含み、第２の抗原結合部分が第１のコピーの第１の抗原結合部分に融合しており、第３の抗原結合部分が第２のコピーの第１の抗原結合部分に融合している、多重特異性（例えば三重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。例を図７、１０、１２、及び１４に示す。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂのうち１つ又は２つ以上は、それぞれが更に他の同一又は異なるｓｄＡｂに融合する。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、（ａ）第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、第１のＶＨ及び第１のＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する第１の抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む１〜４コピーの第２の抗原結合部分と、（ｃ）第３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び第３の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、第３のＶＨ及び第３のＶＬが、第３のエピトープに特異的に結合する第３の抗原結合部位を共に形成する、第３の抗原結合部分と、を含み、第２の抗原結合部分が第１の抗原結合部分及び／又は第３の抗原結合部分に融合している、多重特異性（例えば三重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。例を図６に示す。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂのうち１つ又は２つ以上は、それぞれが更に他の同一又は異なるｓｄＡｂに融合する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、（ａ）第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、第１のＶＨ及び第１のＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する第１の抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む第２の抗原結合部分と、（ｃ）第３の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び第３の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、第３のＶＨ及び第３のＶＬが、第３のエピトープに特異的に結合する第３の抗原結合部位を共に形成する、第３の抗原結合部分と、（ｄ）第４のエピトープに特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む第４の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合しており、第３の抗原結合部分及び第４の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば四重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。例を図８に示す。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂのうち１つ又は２つ以上は、それぞれが更に他の同一又は異なるｓｄＡｂに融合する。
エピトープ及び抗原
【０１３２】
本明細書に記載されるＭＡＢＰのいずれかは、少なくとも２つの異なるエピトープに特異的に結合できる。認識される少なくとも２つの異なるエピトープは、同一の抗原上に、又は異なる抗原上に位置してよい。いくつかの実施形態では、抗原は細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、抗原は細胞外分子である。
【０１３３】
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の抗原に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は完全長４本鎖抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃ又はＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、第１のエピトープ及び／又は第２のエピトープは、免疫チェックポイント分子である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は刺激性免疫チェックポイント分子である。例示的な刺激性免疫チェックポイント分子として、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＨＶＥＭ、及びＴＣＲ（例えば、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は阻害性免疫チェックポイント分子である。例示的な阻害性免疫チェックポイント分子として、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、Ａ２ａ受容体、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＰＤ−１、ＩＤＯ、ＣＤ４７、及びそれらのリガンド、例えばＢ７．１、Ｂ７．２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＶＥＭ、Ｂ７−Ｈ４、ＮＫＴＲ−２１８、及びＳＩＲＰ−α受容体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の免疫チェックポイント分子に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の免疫チェックポイント分子に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１の免疫チェックポイント分子及び／又は第２の免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は完全長４本鎖抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、第１のエピトープ及び／又は第２のエピトープは、細胞表面抗原である。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、Ｔ細胞（例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞など）、Ｂ細胞、マクロファージ、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫エフェクター細胞上の抗原である。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、ＣＤ３などのＴ細胞表面抗原である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は腫瘍抗原である。腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介性免疫応答を誘発できる、腫瘍細胞により産生されるタンパク質である。本明細書に記載される標的抗原の選択は、治療される癌の特定の種類に依存する。例示的な腫瘍抗原として、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、前立腺、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、ｐｒｏｓｔｅｉｎ、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体及びメソセリンが挙げられる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連する１つ又は２つ以上の抗原性癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原となり得る多くのタンパク質を発現する。これらの分子として、組織特異的抗原、例えば、黒色腫のＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ及びｇｐ１００、並びに、前立腺癌の前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。他のターゲット分子は、癌遺伝子ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２などの形質転換関連分子の種類に属する。標的抗原の更に別の種類は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの癌胎児抗原である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に特有の完全に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における他の標的抗原候補である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ＴＳＡは、腫瘍細胞特有であり、体内の他の細胞で発生しない。ＴＡＡ関連抗原は、腫瘍細胞特有ではなく、その代わり、抗原に対する免疫寛容状態を誘発できない条件下で正常細胞にも発現している。腫瘍上の抗原発現は、免疫系を抗原に応答できるようにする条件下で起こり得る。ＴＡＡは、胎児発生中、免疫系が未熟で応答できないときに正常細胞上に発現する抗原であり、又は、正常細胞上で極めて低いレベルで通常存在している抗原であるが、腫瘍細胞上でははるかに高いレベルで発現する。
【０１４０】
ＴＳＡ又はＴＡＡの非限定例として、分化抗原、例えばＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ  １００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、及び、腫瘍特異的多系列抗原、例えば、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐｌ５；過剰発現胚抗原、例えばＣＥＡ；過剰発現癌遺伝子及び変異腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ；染色体転座に起因する固有腫瘍抗原、例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ；並びに、ウイルス抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ、及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７が挙げられる。その他大型のタンパク質系抗原として、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ−３、Ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３ＨＩ、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトプロテイン、β−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３＼ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ  １、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ−関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳが挙げられる。
【０１４１】
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の腫瘍抗原に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１の腫瘍抗原及び／又は第２の腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２０、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３８、及びＣＤ５２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は完全長４本鎖抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞）上の細胞表面抗原に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２０、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３８、及びＣＤ５２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は完全長４本鎖抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃ又はＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、第１のエピトープ及び／又は第２のエピトープは、炎症促進性分子である。「炎症促進性分子」は、炎症性反応を上方制御する免疫細胞（単球、マクロファージ、リンパ球、白血球など）によって産生され、又は発現される任意の分子を指す。いくつかの実施形態では、炎症促進性分子は、リンホカイン、モノカイン、ケモカイン、又はインターロイキンなどの炎症促進性サイトカインである。例示的な炎症促進性分子として、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６−、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、及びエオタキシン−１（すなわち、ＣＣＬ１１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の炎症促進性分子に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の炎症促進性分子に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１の炎症促進性分子及び／又は第２の炎症促進性分子は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、及びエオタキシン−１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は完全長４本鎖抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、第１のエピトープ及び／又は第２のエピトープは、Ａｎｇ２及びＶＥＧＦなどの血管新生因子である。したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の血管新生因子に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の血管新生因子に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。
融合ポリペプチド
【０１４６】
ＭＡＢＰの第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合（すなわち共有結合）している。したがって、本出願のＭＡＢＰは、１つ又は２つ以上の融合ポリペプチドを含む。各融合ポリペプチドは、第２の抗原結合部分と、第１の抗原結合部分由来のポリペプチドと、を含んでよい。
【０１４７】
第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、単一の化学的結合（ペプチド結合など）によって直接的に、又はペプチドリンカーを介して結合されてよい。第２の抗原結合部分は、第１の抗原結合部分のいずれか一方（それぞれを含む）のポリペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれかで融合してよく、又は、第１の抗原結合部分のいずれか一方（それぞれを含む）のポリペプチドの内部位置、例えば第１の抗原結合部分の重鎖中のＦｃ領域のＮ末端で融合してもよい。融合ポリペプチドは、組み換え的又は化学的のいずれかで得ることができる。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＣ末端は、第１の抗原結合部分のいずれか（それぞれを含む）のポリペプチドのＮ末端に、化学的結合（ペプチド結合など）又はペプチドリンカーによって融合される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＮ末端は、第１の抗原結合部分のいずれか（それぞれを含む）のポリペプチドのＣ末端に、化学的結合（ペプチド結合など）又はペプチドリンカーによって融合される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、アミノ酸の主鎖の化学基に関与するペプチド結合ではない、化学的結合を介して第１の抗原結合部位に融合される。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨと、ＶＬと、を含む単鎖抗原フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分はｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ｓｄＡｂを含む第２の抗原結合部分、任意のペプチドリンカー、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む、融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ｓｄＡｂを含む第２の抗原結合部分、任意のペプチドリンカー、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む、融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、任意のペプチドリンカー、及びｓｄＡｂを含む第２の抗原結合部分を含む、融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、任意のペプチドリンカー、及びｓｄＡｂを含む第２の抗原結合部分を含む、融合ポリペプチドを含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨドメインを含む重鎖と、ＶＬドメインを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、重鎖は、１つ又は２つ以上の重鎖定常ドメイン、例えばＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ４、及びＣＨ３、並びに／又は抗体ヒンジ領域（ＨＲ）を更に含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、例えばλＣＬドメイン又はκＣＬドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＮ末端は、重鎖のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＣ末端は、重鎖のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＮ末端は、軽鎖のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＣ末端は、軽鎖のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端に、重鎖、任意のペプチドリンカー、及びｓｄＡｂを含む第２の抗原結合部分を含む第１のポリペプチドと、軽鎖を含む第２のポリペプチドと、を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｄＡｂを含む第２の抗原結合部分、任意のペプチドリンカー、及び重鎖を含む第１のポリペプチドと、軽鎖を含む第２のポリペプチドと、を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖、任意のペプチドリンカー、及びｓｄＡｂを含む第２の抗原結合部分を含む第１のポリペプチドと、重鎖を含む第２のポリペプチドと、を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｄＡｂを含む第２の抗原結合部分、任意のペプチドリンカー、及び軽鎖を含む第１のポリペプチドと、重鎖を含む第２のポリペプチドと、を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖からなる、完全長モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端に、重鎖、任意のペプチドリンカー、及びｓｄＡｂを含む第２の抗原結合部分をそれぞれ含む２つの同一の第１のポリペプチドと、軽鎖をそれぞれ含む２つの第２のポリペプチドと、を含む（例えば、図４参照）。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｄＡｂを含む第２の抗原結合部分、任意のペプチドリンカー、及び重鎖をそれぞれ含む２つの同一の第１のポリペプチドと、軽鎖をそれぞれ含む２つの同一の第２のポリペプチドと、を含む（例えば、図９参照）。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖、任意のペプチドリンカー、及びｓｄＡｂを含む第２の抗原結合部分をそれぞれ含む２つの同一の第１のポリペプチドと、重鎖をそれぞれ含む２つの同一の第２のポリペプチドと、を含む（例えば、図１１参照）。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｄＡｂを含む第２の抗原結合部分、任意のペプチドリンカー、及び軽鎖をそれぞれ含む２つの同一の第１のポリペプチドと、重鎖を含む２つの同一の第２のポリペプチドと、を含む（例えば、図１３参照）。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（ａ）２本の重鎖及び２本の軽鎖からなり、第１のエピトープを特異的に認識する、完全長抗体と、（ｂ）第２のエピトープを特異的に認識する第１のｓｄＡｂと、（ｃ）第３のエピトープを特異的に認識する第２のｓｄＡｂと、を含み、第１のｓｄＡｂのＣ末端は各重鎖のＮ末端に融合しており、第２のｓｄＡｂのＮ末端は各重鎖のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端に、第１のｓｄＡｂ、任意のペプチドリンカー、重鎖、任意のペプチドリンカー、及び第２のｓｄＡｂをそれぞれ含む２つの同一の第１のポリペプチドと、軽鎖をそれぞれ含む２つの同一の第２のポリペプチドと、を含む。例えば、図１５を参照されたい。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（ａ）２本の重鎖及び２本の軽鎖からなり、第１のエピトープを特異的に認識する、完全長抗体と、（ｂ）第２のエピトープを特異的に認識する第１のｓｄＡｂと、（ｃ）第３のエピトープを特異的に認識する第２のｓｄＡｂと、を含み、第１のｓｄＡｂのＣ末端は各軽鎖のＮ末端に融合しており、第２のｓｄＡｂのＮ末端は各重鎖のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端に、重鎖、任意のペプチドリンカー、及び第２のｓｄＡｂをそれぞれ含む２つの同一の第１のポリペプチドと、第１のｓｄＡｂ、任意のペプチドリンカー、及び軽鎖をそれぞれ含む２つの同一の第２のポリペプチドと、を含む。例えば、図１６を参照されたい。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（ａ）第１及び第２の重鎖並びに第１及び第２の軽鎖からなり、第１のエピトープを特異的に認識する、完全長抗体と、（ｂ）第２のエピトープを特異的に認識する第１のｓｄＡｂと、（ｃ）第３のエピトープを特異的に認識する第２のｓｄＡｂと、（ｄ）第４のエピトープを特異的に認識する第３のｓｄＡｂと、（ｅ）第５のエピトープを特異的に認識する第４のｓｄＡｂと、を含み、第１のｓｄＡｂのＣ末端は第１の軽鎖のＮ末端に融合しており、第２のｓｄＡｂのＣ末端は第２の軽鎖のＮ末端に融合しており、第３のｓｄＡｂのＣ末端は第１の重鎖のＮ末端に融合しており、第４のｓｄＡｂのＣ末端は第２の重鎖のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端に、第３又は第４のｓｄＡｂ、任意のペプチドリンカー、及び重鎖をそれぞれ含む２つの同一の第１のポリペプチドと、第１又は第２のｓｄＡｂ、任意のペプチドリンカー、及び軽鎖をそれぞれ含む２つの同一の第２のポリペプチドと、を含む。例えば、図１７を参照されたい。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（ａ）２本の重鎖及び２本の軽鎖からなり、第１のエピトープを特異的に認識する、完全長抗体と、（ｂ）第２のエピトープを特異的に認識する第１のｓｄＡｂと、（ｃ）第３のエピトープを特異的に認識する第２のｓｄＡｂと、（ｄ）第４のエピトープを特異的に認識する第３のｓｄＡｂと、（ｅ）第５のエピトープを特異的に認識する第４のｓｄＡｂと、を含み、第１のｓｄＡｂのＣ末端は第２のｓｄＡｂのＮ末端に融合しており、第２のｓｄＡｂのＣ末端は一方の重鎖のＮ末端に融合しており、第３のｓｄＡｂのＣ末端は第４のｓｄＡｂのＮ末端に融合しており、第４のｓｄＡｂのＣ末端は別の重鎖のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端に、第１又は第３のｓｄＡｂ、任意のペプチドリンカー、第２又は第４のｓｄＡｂ、任意のペプチドリンカー、及び重鎖をそれぞれ含む２つの同一の第１のポリペプチドと、軽鎖をそれぞれ含む２つの同一の第２のポリペプチドと、を含む。例えば、図１８を参照されたい。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（ａ）２本の重鎖及び２本の軽鎖からなり、第１のエピトープを特異的に認識する、完全長抗体と、（ｂ）第２のエピトープを特異的に認識する第１のｓｄＡｂと、（ｃ）第３のエピトープを特異的に認識する第２のｓｄＡｂと、を含み、第１又は第２のｓｄＡｂのＮ末端は重鎖のＣＨ１領域のＣ末端に融合しており、第１又は第２のｓｄＡｂのＣ末端は重鎖のＣＨ２領域のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−ＣＨ１−任意のペプチドリンカー−ｓｄＡｂ−ＣＨ２−ＣＨ３をそれぞれ含む２つの同一の第１のポリペプチドと、軽鎖をそれぞれ含む２つの同一の第２のポリペプチドと、を含む。例えば、図１９を参照されたい。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（ａ）第１のエピトープを特異的に認識する第１のｓｃＦｖと、（ｂ）第２のエピトープを特異的に認識する第２のｓｃＦｖと、（ｃ）Ｆｃ領域と、（ｄ）第３のエピトープを特異的に認識する第１のｓｄＡｂと、（ｄ）第４のエピトープを特異的に認識する第２のｓｄＡｂと、を含み、各ｓｄＡｂのＮ末端はｓｃＦｖのＣ末端に融合しており、ｓｄＡｂのＣ末端はＦｃ領域のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｃＦｖ−任意のペプチドリンカー−ｓｄＡｂ−ＣＨ２−ＣＨ３をそれぞれ含む、２つの同一のポリペプチドを含む。例えば、図２０を参照されたい。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（ａ）第１のエピトープを特異的に認識する第１のＦａｂと、（ｂ）第２のエピトープを特異的に認識する第２のＦａｂと、（ｃ）Ｆｃ領域と、（ｄ）第３のエピトープを特異的に認識する第１のｓｄＡｂと、第４のエピトープを特異的に認識する第２のｓｄＡｂと、を含む第１のＦａｂ様ドメインと、（ｅ）第５のエピトープを特異的に認識する第３のｓｄＡｂと、第６のエピトープを特異的に認識する第４のｓｄＡｂと、を含む第２のＦａｂ様ドメインと、を含み、各Ｆａｂ様ドメインのＮ末端はＦａｂのＣ末端に融合しており、Ｆａｂ様ドメインの２つのＣ末端のうち一方はＦｃ領域のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−ＣＨ１−任意のペプチドリンカー−ｓｄＡｂ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３をそれぞれ含む２つの同一の第１のポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＬ−ＣＬ−任意のペプチドリンカー−ｓｄＡｂ−ＣＬをそれぞれ含む２つの同一の第２のポリペプチドと、を含む。例えば、図２１を参照されたい。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、（ａ）第１のエピトープを特異的に認識する第１のｓｃＦｖと、（ｂ）第２のエピトープを特異的に認識する第２のｓｃＦｖと、（ｃ）Ｆｃ領域と、（ｄ）第３のエピトープを特異的に認識する第１のｓｄＡｂと、第４のエピトープを特異的に認識する第２のｓｄＡｂと、を含む第１のＦａｂ様ドメインと、（ｅ）第５のエピトープを特異的に認識する第３のｓｄＡｂと、第６のエピトープを特異的に認識する第４のｓｄＡｂと、を含む第２のＦａｂ様ドメインと、を含み、各Ｆａｂ様ドメインの２つのＮ末端のうち一方はｓｃＦｖのＣ末端に融合しており、ｓｄＡｂの２つのＣ末端のうち一方はＦｃ領域のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｃＦｖ−任意のペプチドリンカー−ｓｄＡｂ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３をそれぞれ含む２つの同一の第１のポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｄＡｂ−ＣＬをそれぞれ含む２つの同一の第２のポリペプチドと、を含む。例えば、図２２を参照されたい。
【０１５９】
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む重鎖と、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む軽鎖と、を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第２の抗原結合部分のＮ末端が、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分の重鎖のＣ末端に融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の免疫チェックポイント分子由来であり、第２のエピトープは第２の免疫チェックポイント分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープは第２の腫瘍抗原由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープはＣＤ３などの細胞表面分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の炎症促進性分子由来であり、第２のエピトープは第２の炎症促進性分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の血管新生因子由来であり、第２のエピトープは第２の血管新生因子由来である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃ又はＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む重鎖と、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む軽鎖と、を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第２の抗原結合部分のＣ末端が、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分の重鎖のＮ末端に融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の免疫チェックポイント分子由来であり、第２のエピトープは第２の免疫チェックポイント分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープは第２の腫瘍抗原由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープはＣＤ３などの細胞表面分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の炎症促進性分子由来であり、第２のエピトープは第２の炎症促進性分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の血管新生因子由来であり、第２のエピトープは第２の血管新生因子由来である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃ又はＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む重鎖と、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む軽鎖と、を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第２の抗原結合部分のＮ末端が、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分の軽鎖のＣ末端に融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の免疫チェックポイント分子由来であり、第２のエピトープは第２の免疫チェックポイント分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープは第２の腫瘍抗原由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープはＣＤ３などの細胞表面分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の炎症促進性分子由来であり、第２のエピトープは第２の炎症促進性分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の血管新生因子由来であり、第２のエピトープは第２の血管新生因子由来である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃ又はＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む重鎖と、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む軽鎖と、を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第２の抗原結合部分のＣ末端が、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分の軽鎖のＮ末端に融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の免疫チェックポイント分子由来であり、第２のエピトープは第２の免疫チェックポイント分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープは第２の腫瘍抗原由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープはＣＤ３などの細胞表面分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の炎症促進性分子由来であり、第２のエピトープは第２の炎症促進性分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の血管新生因子由来であり、第２のエピトープは第２の血管新生因子由来である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃ又はＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、（ａ）２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む完全長抗体を含み、完全長抗体が、第１のエピトープに特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第２の抗原結合部分のＮ末端が、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分の２本の重鎖のうち一方又はそれぞれのＣ末端に融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の免疫チェックポイント分子由来であり、第２のエピトープは第２の免疫チェックポイント分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープは第２の腫瘍抗原由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープはＣＤ３などの細胞表面分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の炎症促進性分子由来であり、第２のエピトープは第２の炎症促進性分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の血管新生因子由来であり、第２のエピトープは第２の血管新生因子由来である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃ又はＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、（ａ）２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む完全長抗体を含み、完全長抗体が、第１のエピトープに特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第２の抗原結合部分のＣ末端が、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分の２本の重鎖のうち一方又はそれぞれのＮ末端に融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の免疫チェックポイント分子由来であり、第２のエピトープは第２の免疫チェックポイント分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープは第２の腫瘍抗原由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープはＣＤ３などの細胞表面分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の炎症促進性分子由来であり、第２のエピトープは第２の炎症促進性分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の血管新生因子由来であり、第２のエピトープは第２の血管新生因子由来である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃ又はＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、（ａ）２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む完全長抗体を含み、完全長抗体が、第１のエピトープに特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第２の抗原結合部分のＮ末端が、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分の２本の軽鎖のうち一方又はそれぞれのＣ末端に融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の免疫チェックポイント分子由来であり、第２のエピトープは第２の免疫チェックポイント分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープは第２の腫瘍抗原由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープはＣＤ３などの細胞表面分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の炎症促進性分子由来であり、第２のエピトープは第２の炎症促進性分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の血管新生因子由来であり、第２のエピトープは第２の血管新生因子由来である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃ又はＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、（ａ）２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む完全長抗体を含み、完全長抗体が、第１のエピトープに特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第２の抗原結合部分のＣ末端が、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分の２本の軽鎖のうち一方又はそれぞれのＮ末端に融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の免疫チェックポイント分子由来であり、第２のエピトープは第２の免疫チェックポイント分子由来である。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープは第２の腫瘍抗原由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープはＣＤ３などの細胞表面分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の炎症促進性分子由来であり、第２のエピトープは第２の炎症促進性分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の血管新生因子由来であり、第２のエピトープは第２の血管新生因子由来である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃ又はＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１６７】
本明細書に記載されるＭＡＢＰは、第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分との間に位置付けられる１つ又は２つ以上のペプチドリンカーを含んでよい。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分の重鎖ポリペプチドと第２の抗原結合部分との間のペプチドリンカーは、第１の抗原結合部分の軽鎖ポリペプチドと第２の抗原結合部分との間のペプチドリンカーと同一である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分の重鎖ポリペプチドと第２の抗原結合部分との間のペプチドリンカーは、第１の抗原結合部分の軽鎖ポリペプチドと第２の抗原結合部分との間のペプチドリンカーと異なっている。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、これらの間に配置されるペプチドリンカーを用いずに互いに直接融合している。
【０１６８】
ＭＡＢＰの様々な抗原結合部分が、ペプチドリンカーを介して互いに融合されていてよい。異なる抗原結合部分を連結するペプチドリンカーは、同一であっても異なっていてもよい。各ペプチドリンカーは独立して最適化され得る。ペプチドリンカーは任意の好適な長さを有してよい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０又はそれ以上のうちいずれかのアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５又はそれ以下のうちいずれかのアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーの長さは、約１個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約１個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約１個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、約５個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸長、約３０個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、又は約１個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸のうちいずれかである。
【０１６９】
ペプチドリンカーは、天然配列又は非天然配列を有してよい。例えば、重鎖抗体のヒンジ領域由来の配列をリンカーとして使用してよい。例えば、国際公開第１９９６／３４１０３号を参照されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは可動性リンカーである。例示的な可動性リンカーとして、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ（配列番号９）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号１０）及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１１）、このときｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、及び当該技術分野において既知のその他可動性リンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＩｇＧのヒンジ領域、例えばヒトＩｇＧ１のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号８）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＩｇＧのヒンジ領域、例えばヒトＩｇＧ１のヒンジ領域由来の修飾配列を含む。例えば、ＩｇＧのヒンジ領域中の１つ又は２つ以上のシステインがセリンに置換されていてもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰ（配列番号１２）を含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、化学的に互いに融合している。例えば、第２の抗原結合部位と第１の抗原結合部位の１つ又は２つ以上のポリペプチドは、連結基を介して１つ又は２つ以上の反応部位を用いて結合されてよい。化学的結合に有用なポリペプチド中の反応部位は当該技術分野において周知であり、アミノ酸残基上に存在する第一アミノ基、例えばリジンのεアミノ基及びＮ末端アミノ酸のαアミノ基、システイン残基中のチオール基、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシ基、並びにグリコシル化抗体中の炭水化物基が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、反応部位は、部位特異的突然変異誘発、セレノシステイン又は非天然型アミノ酸の取り込み、二官能性リンカー（ビスアルキル化試薬など）の取り込み、及び／又は糖鎖工学によって、第２の抗原結合部分又は第１の抗原結合部分内に導入される。いくつかの実施形態では、チオール反応性ポリペプチドへの結合のため、ポリペプチドの１つ又は２つ以上の第一アミノ基を、チオール含有基（例えば、システイン又はホモシステイン残基由来）、マレイミド基などの求電子性不飽和基、又はブロモアセチル基などのハロゲン化基に変換できる。当該技術分野において既知である任意の連結基及び結合方法を用いて、第２の抗原結合部分を第１の抗原結合部分に化学的に融合できる。いくつかの実施形態では、結合は、例えば、スクシンイミドエステル（例えば、サクシニミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、又はＮ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ））、グルタルアルデヒド、カルボジイミド（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ））、ベンジジン（ＢＤＢ）、過ヨウ素酸塩、又はイソチオシアネート（例えば、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン（ＮＡＨＴ））を用いることによって達成できる。
単一ドメイン抗体を含む抗原結合部分
【０１７１】
本出願のＭＡＢＰは、ｓｄＡｂを含む少なくとも１つの抗原結合部分を含む。例示的なｓｄＡｂとして、重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ又はＶＮＡＲ）、天然に軽鎖を欠く結合分子、従来の４本鎖抗体由来の単一ドメイン（例えば、ＶＨ又はＶＬ）、ヒト化重鎖抗体、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウス又はラットによって産生されたヒトｓｄＡｂ、並びに、抗体由来のもの以外の遺伝子操作を受けたドメイン及び単一ドメインスキャフォールドが挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野において既知であるか、又は本発明者らが開発した任意のｓｄＡｂを用いて、本出願のＭＡＢＰを構築できる。ｓｄＡｂは、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ、及びウシが挙げられるが、これらに限定されない、任意の種由来であってよい。本明細書において想定される単一ドメイン抗体として、ラクダ科及びサメ以外の種由来の天然に存在するｓｄＡｂ分子も挙げられる。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、軽鎖を欠く重鎖（本明細書において「重鎖抗体」とも称される）として既知である、天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子由来である。このような単一ドメイン分子は、例えば、国際公開第９４／０４６７８号及びＨａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６〜４４８に開示されている。明確性目的のため、従来の４本鎖免疫グロブリンのＶＨと区別するために、天然に軽鎖を欠く重鎖分子由来の可変ドメインは、本明細書においてＶＨＨとして既知である。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科、例えば、ラクダ、ラマ、ビクーニャ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びグアナコで生じる抗体由来であってよい。ラクダ科以外の他の種は、天然に軽鎖を欠く重鎖分子を産生でき、このようなＶＨＨは、本出願の範囲内にある。
【０１７３】
ラクダ科由来のＶＨＨ分子は、ＩｇＧ分子より約１０倍小さい。これらは単一のポリペプチドであり、非常に安定であって、極端なｐＨ及び温度条件に耐えることができる。また、従来の抗体では見られない、プロテアーゼの作用に抵抗することができる。更に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現（ＶＨＨの）により、適切に折り畳まれた機能性ＶＨＨが高収率で産生される。また、ラクダ科で産生された抗体は、抗体ライブラリの使用によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで、又はラクダ科以外の哺乳類の免疫化を介して産生された抗体が認識するもの以外のエピトープを認識できる（例えば、国際公開第９７４９８０５号参照）。このように、１つ又は２つ以上のＶＨＨドメインを含むＭＡＢＰは、従来の抗体よりもより効率的に標的と相互作用できる。ＶＨＨは空洞部や溝部などの「通常ではない」エピトープ内に結合することが知られているため、かかるＶＨＨを含むＭＡＢＰの親和性は、従来の多重特異性ポリペプチドよりも治療的処置に好適であり得る。
【０１７４】
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するＶＨＨドメインを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の免疫チェックポイント分子由来であり、第２のエピトープは第２の免疫チェックポイント分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープは第２の腫瘍抗原由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは腫瘍抗原由来であり、第２のエピトープはＣＤ３などの細胞表面分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは第１の炎症促進性分子由来であり、第２のエピトープは第２の炎症促進性分子由来である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＨドメインはヒト化されている。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は完全長４本鎖抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃ又はＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、軟骨魚類に存在する免疫グロブリンの可変領域由来である。例えば、ｓｄＡｂは、サメ血清中に存在する新規抗原受容体（Novel  Antigen  Receptor、ＮＡＲ）として知られている免疫グロブリンアイソタイプ由来であってよい。ＮＡＲ（「ＩｇＮＡＲ」）の可変領域由来の単一ドメイン分子の生成法は、国際公開第０３／０１４１６１号及びＳｔｒｅｌｔｓｏｖ（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１４：２９０１〜２９０９に記載されている。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、組み換え体、ＣＤＲグラフト化、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生させたもの（例えば、ファージディスプレイによって選択される）である。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウス又はラットによって産生されるヒトｓｄＡｂである。例えば、米国特許出願公開第２００９０３０７７８７（Ａ１）号、米国特許第８，７５４，２８７号、米国特許出願公開第２０１５０２８９４８９（Ａ１）号、同第２０１００１２２３５８（Ａ１）号、及び国際公開第２００４０４９７９４号を参照されたい。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは親和性成熟している。
【０１７７】
ＶＨＨドメインを含むｓｄＡｂは、ヒト化してヒト用配列を有することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＶＨＨドメインのＦＲ領域は、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれ以上のうちのいずれか１つであるアミノ酸配列相同性を含む。１つの典型的な種類のヒト化ＶＨＨドメインは、ＶＨＨが、Ｋａｂａｔナンバリングによる４５番目の位置において、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、アスパラギン、又はグルタミンからなる群由来のアミノ酸、例えば、Ｌ４５と１０３番目の位置におけるトリプトファンを有することを特徴とする。このように、この種類に属するポリペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して高いアミノ酸配列相同性を示し、かかるポリペプチドは、それによる望まれない免疫応答が予想されず、更なるヒト化の負担なく直接ヒトに投与できる。
【０１７８】
他の例示の種類のヒト化ラクダ科ｓｄＡｂは国際公開第０３／０３５６９４号に記載されており、ヒト由来又は他の種の従来の抗体に典型的に見られる疎水性ＦＲ２残基を含むが、二重鎖抗体由来のＶＨに存在する保存されたトリプトファン残基を置換している、１０３番目の位置の荷電アルギニン残基による親水性の損失を代償している。このように、これら２つの種類に属するペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して高いアミノ酸配列相同性を示し、かかるペプチドは、それによる望まれない免疫応答が予想されず、更なるヒト化の負担なく直接ヒトに投与できる。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、天然に産生されたｓｄＡｂ又はその誘導体、例えばラクダ科ｓｄＡｂ、又はラクダ科ｓｄＡｂ由来のヒト化を含む。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂはラマから得られる。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂを更に遺伝子操作し、ヒト抗体に通常は見られない配列（例えば、ＣＤＲ領域又はＣＤＲ−ＦＲ接合部）を除去する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、ＣＨ１ドメインに融合した第１のｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む第１のポリペプチド鎖と、ＣＬドメインに融合した第２のｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む第２のポリペプチド鎖とを、含む、Ｆａｂ様ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは、同じエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは、異なるエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、Ｆａｂ様ドメインの各ポリペプチド鎖は、第１の抗原結合部分のポリペプチド鎖のＮ末端、Ｃ末端又は内部位置に融合している。いくつかの実施形態では、Ｆａｂ様ドメインの２本のポリペプチド鎖のうち一方は、第１の抗原結合部分のポリペプチド鎖のＮ末端、Ｃ末端又は内部位置に融合している。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、１つ又は２つ以上のＦａｂ様ドメインを含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、そのエピトープに好適な親和性を有するｓｄＡｂを含む抗原結合部分を含む。例えば、ｓｄＡｂの親和性は、全体的親和性と、ＭＡＢＰの標的細胞又は組織への結合活性に影響を与える場合があり、それが更にＭＡＢＰの効力に影響を与え得る。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、高い親和性でそのエピトープに結合する。高親和性ｓｄＡｂは、低いナノモル（１０−９Ｍ）範囲の解離定数（Ｋｄ）、例えば、約５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭ、５ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭ、又はそれ以下のうち任意でそのエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、低い親和性でそのエピトープに結合する。低親和性ｓｄＡｂは、低いマイクロモル（１０−６Ｍ）範囲以上のＫｄで、例えば、約１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、又はそれ以上のうち任意でそのエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、中程度の親和性でそのエピトープに結合する。中程度の親和性のｓｄＡｂは、低親和性ｓｄＡｂよりも低いが、高親和性ｓｄＡｂよりも高いＫｄでそのエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、中程度の親和性のｓｄＡｂは、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約５００ｎＭ、約５００ｎＭ〜約１μｍ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、又は約１０ｎＭ〜約５００ｎＭ、又は約１ｎＭ〜約１μｍのうち任意の１つのＫｄで、そのエピトープに結合する。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分よりも、そのエピトープに対する強い親和性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分よりも、そのエピトープに対する弱い親和性を有する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂとそのエピトープと、ＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分とそのエピトープとの間の親和性間の差は、少なくとも約２×、５×、１０×、１００×、１０００×、又はそれ以上のうちいずれかである。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂとそのエピトープとの間の親和性は、ＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分とそのエピトープとの間のそれに匹敵する。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、免疫チェックポイント分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、刺激性免疫チェックポイント分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、阻害性免疫チェックポイント分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０からなる群から選択される、免疫チェックポイント分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、免疫チェックポイント分子に対するアゴニストである。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニストである。
【０１８４】
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープである免疫チェックポイント分子に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは、第２の免疫チェックポイント分子由来である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは、炎症促進性分子、例えば炎症促進性サイトカイン由来である。いくつかの実施形態では、炎症促進性分子は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、及びエオタキシン−１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に高い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に中程度の親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に低い親和性で結合する。
【０１８６】
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、エピトープである免疫チェックポイント分子に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＣＴＬＡ−４に特異的に結合するｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ｓｄＡｂによって特異的に認識されるエピトープとは異なるＣＴＬＡ−４のエピトープである。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、完全長抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブ）又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、完全長抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（例えば、デュルバルマブ又はアテゾリズマブ）又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に高い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に中程度の親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に低い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＴＩＭ−３に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＴＩＭ−３に高い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＴＩＭ−３に中程度の親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＴＩＭ−３に低い親和性で結合する。
【０１８８】
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、エピトープである免疫チェックポイント分子に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＴＩＭ−３に特異的に結合するｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、完全長抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブ）又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、完全長抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（例えば、デュルバルマブ又はアテゾリズマブ）又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＬＡＧ−３に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＬＡＧ−３に高い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＬＡＧ−３に中程度の親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＬＡＧ−３に低い親和性で結合する。
【０１９０】
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、エピトープである免疫チェックポイント分子に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＬＡＧ−３に特異的に結合するｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、完全長抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブ）又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、完全長抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（例えば、デュルバルマブ又はアテゾリズマブ）又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＶＩＳＴＡに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＶＩＳＴＡに高い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＶＩＳＴＡに中程度の親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＶＩＳＴＡに低い親和性で結合する。
【０１９２】
したがって、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、エピトープである免疫チェックポイント分子に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＶＩＳＴＡに特異的に結合するｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、完全長抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブ）又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、完全長抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（例えば、デュルバルマブ又はアテゾリズマブ）又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、細胞表面抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はナチュラルキラー細胞上の細胞表面抗原に特異的に結合する。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の腫瘍抗原に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１の腫瘍抗原及び／又は第２の腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２０、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３８、及びＣＤ５２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、完全長抗ＨＥＲ−２モノクローナル抗体（トラスツズマブなど）又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＤ３に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＤ３に高い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＤ３に中程度の親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＤ３に低い親和性で結合する。
【０１９６】
そのため、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、エピトープである腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＣＤ３に特異的に結合するｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２０、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３８、及びＣＤ５２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、完全長抗ＨＥＲ−２モノクローナル抗体（トラスツズマブなど）又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、細胞外タンパク質、例えば分泌タンパク質に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、炎症促進性分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、血管新生因子、例えばＶＥＧＦに特異的に結合する。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＩＬ−１βに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＩＬ−１βに高い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＩＬ−１βに中程度の親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＩＬ−１βに低い親和性で結合する。
【０１９９】
そのため、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、エピトープである炎症促進性分子に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＩＬ−１βに特異的に結合するｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。βいくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、炎症促進性分子は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、及びエオタキシン−１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、完全長抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体（アダリムマブなど）又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０２００】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、エオタキシン−１、すなわち、ＣＣＬ１１に特異的に結合する。
【０２０１】
そのため、いくつかの実施形態では、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、エピトープである炎症促進性分子に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）エオタキシン−１に特異的に結合するｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、炎症促進性分子は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、完全長抗ＩＬ−５モノクローナル抗体（メポリズマブなど）又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
ＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分
【０２０２】
本出願のＭＡＢＰは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、少なくとも１つの抗原結合部分を含む。このような抗原結合部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる従来の完全長抗体、又はそれら由来の抗原結合フラグメントであってよい。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨドメインを含む重鎖と、ＶＬドメインを含む及び軽鎖と、を含む、抗原結合フラグメントである。本明細書で想定される例示的な抗原結合フラグメントとして、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；二重特異性抗体：線状抗体；単鎖抗体分子（ｓｃＦｖなど）；並びに、抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えばヒトＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ分子、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブクラスのうち任意の１つ由来である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）及び／又はＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）などの抗体エフェクター機能を媒介することができる。例えば、野生型Ｆｃ配列を有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３サブクラスの抗体は、通常、ＣＩｑ及びＣ３結合を含む補体活性化を示し、一方ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、ＣＩｑ及び／又はＣ３に結合しない。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域のＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域はＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃは、２３３〜２３６番目の位置に、例えばＬ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａなどの１つ又は２つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域はＩｇＧ４  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４  Ｆｃは、３２７、３３０及び／又は３３１番目の位置に突然変異を含む。例えば、Ａｒｍｏｕｒ  ＫＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；２９：２６１３；及びＳｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：６５９１を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｐ３２９Ｇ変異を含む。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、２つの同一ではない重鎖のヘテロ二量体形成を促進する修飾を含む。このような修飾されたＦｃ領域は、非対称性設計を有する本明細書に記載されるＭＡＢＰに対して特に興味深いものであり得る。いくつかの実施形態では、かかる修飾は、重鎖又は重鎖融合ポリペプチドの一方へのノブ修飾と、重鎖又は重鎖融合ポリペプチドの他方へのホール修飾を含む、ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ修飾である。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＨ３ドメイン中の２本の重鎖間の境界部内に変異を含み、このとき、ｉ）一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基を側鎖がより大きいアミノ酸残基に置換することによって、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン中の境界部内に、他方の重鎖のＣＨ３ドメイン中の境界部内の空洞部（「ホール」）中に配置できる突出部（「ノブ」）が作製されており、ｉｉ）他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基を側鎖がより小さいアミノ酸残基に置換することによって、第１のＣＨ３ドメイン中の境界部内の突出部（「ノブ」）を内部に配置できる空洞部（「ホール」）が、第２のＣＨ３ドメイン中の境界部内に作製されている。ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ修飾の例は、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２８７００９号、同第２００７／０１７８５５２号、国際公開第９６／０２７０１１号、同第９８／０５０４３１号、及びＺｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：７８１〜７８８に記載されている。ヘテロ二量体形成を促進する別のＦｃ領域への修飾も本明細書において想定される。例えば、静電的操作効果をＦｃ領域内に遺伝子操作によって含め、Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を提供できる（例えば、米国特許第４６７６９８０号及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５））。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆａｂアーム交換を阻害する修飾を含む。例えば、ＩｇＧ４  Ｆｃ中のＳ２２８Ｐ変異は、Ｆａｂアーム交換を阻害する。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、κ軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、λ軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなるモノクローナル抗体（本明細書では「４本鎖抗体」とも称する）を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる多重特異性（例えば二重特異性）完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ１サブクラス、又は変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラスである、完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ２サブクラスである完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ３サブクラスである完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ４サブクラス、又は追加の変異Ｓ２２８Ｐを有するヒトＩｇＧ４サブクラスである、完全長抗体を含む。
【０２１０】
当該技術分野において既知である任意の完全長４本鎖抗体又はそれら由来の抗原結合フラグメントを、本出願のＭＡＢＰにおける第１の抗原結合部分として使用できる。臨床的に有効性、安全性、及び薬物動態プロファイルが証明されている抗体又は抗体フラグメントが特に興味深い。いくつかの実施形態では、当該技術分野において既知の抗体又は抗体フラグメントを更に遺伝子操作し、例えばヒト化又は変異誘発し、好適な親和性を有する変異体を選択した後、第２の抗原結合部分と融合してＭＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、当該技術分野において既知のモノクローナル抗体又は抗体フラグメントのＶＨ及びＶＬドメインと、修飾重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域と、を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、当該技術分野において既知のモノクローナル抗体と、修飾Ｆｃ領域、例えば、Ｓ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４  Ｆｃと、を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒト、ヒト化、又はキメラ型の完全長抗体又は抗体フラグメントを含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、承認されている（ＦＤＡ及び／又はＥＭＡによって）又は開発中のモノクローナル抗体又は抗体フラグメント（Ｆａｂなど）由来である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、承認されている（ＦＤＡ及び／又はＥＭＡによって）又は開発中のモノクローナル抗体又は抗体フラグメント（Ｆａｂなど）である。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、免疫チェックポイント分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、阻害性免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する、完全長抗体（アンタゴニスト抗体など）又はそれ由来の抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、刺激性免疫チェックポイント分子に特異的に結合する、完全長抗体（アゴニスト抗体など）又はそれ由来の抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ペンブロリズマブ及びニボルマブからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、デュルバルマブ又はアテゾリズマブである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＣＴＬＡ−４抗体又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体はイピリムマブである。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ペンブロリズマブ又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分はＩｇＧ４  Ｆｃを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分はＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２１４】
ペンブロリズマブ（例えば、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））は、癌免疫療法で使用されるヒト化抗体である。これは、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）受容体を標的とする。この薬物は、転移性黒色腫の治療において最初に使用された。２０１４年９月４日、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、ＦＤＡのファストトラック開発プログラム下でＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）を承認した。進行性黒色腫における使用が承認されている。２０１５年１０月２日に、米国ＦＤＡは、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）を、その腫瘍がＰＤ−Ｌ１を発現しており、別の化学療法剤による治療に失敗した患者における転移性非小細胞肺癌の治療に対して承認した。
【０２１５】
イピリムマブ（例えば、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））は、Ｔ細胞活性化の下方制御を阻止する、完全ヒト抗ＣＴＬＡ−４免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。イピリムマブは、ＣＴＬＡ−４経路によって誘導されるＴ細胞阻害性シグナルを阻止するＣＴＬＡ−４免疫チェックポイント阻害剤であり、腫瘍反応性Ｔエフェクター細胞の数を増加させる。イピリムマブをニボルマブ（例えば、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））と組み合わせて使用し、非ヒト霊長類におけるＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４受容体の同時阻害の効果が調べられた。ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）は、腎細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、及び一部のリンパ腫などのいくつかの腫瘍型の治療において、単剤療法として、又はイピリムマブとの組み合わせのいずれかにおいて、臨床効果が確認されている。最近、ＢＭＳは、黒色腫治療に対するＯＰＤＩＶＯ（登録商標）とイピリムマブの免疫併用療法の治療結果について発表した。イピリムマブ単剤療法と比較して、併用療法は、非常に高い客観的奏効率（６１％対１１％）と２２％の完全寛解率が得られた一方で、疾患進行率又は死亡リスクは６０％減少した。この種の治療は、癌の臨床治療における免疫療法剤の異なる組み合わせに対する大いなる可能性を示した。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２０、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３８、及びＣＤ５２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体はトラスツズマブである。
【０２１７】
最も良く売れている５大治療用抗体の１つであるトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））は、ＨＥＲ２陽性乳癌患者の生存率を有意に増加させている、ヒト化抗ＨＥＲ２受容体モノクローナル抗体である。ＨＥＲ受容体は、細胞膜に埋め込まれており、細胞外由来の分子シグナル（ＥＧＦと称される分子）を細胞内に伝え、遺伝子のオンオフを行うタンパク質である。ＨＥＲタンパク質、つまりヒト上皮成長因子受容体は、ヒト上皮成長因子に結合し、細胞増殖を刺激する。一部の癌、特にある種の乳癌では、ＨＥＲ２が過剰発現しており、癌細胞の無制限な複製の原因となる。しかし、乳癌患者のうち、１５〜２０％のみがヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を増幅かつ過剰発現を呈しており、ほとんどのＨＥＲ２患者はトラスツズマブに反応しない。また、ＨＥＲ２＋患者の一部は、初期治療後にトラスツズマブに対する抵抗性を生じる。上皮成長因子であるＲＴＫファミリーは４つのメンバー、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４からなるため、これらの抗原のうち２つを標的とするためにいくつかの二重特異性抗体が開発されており、従来の単一特異性抗体に対する利点を示している。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、血管新生因子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗Ａｎｇ２抗体又はその抗原結合フラグメント、例えばＬＣ１０である。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、炎症促進性分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、炎症促進性分子は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、及びエオタキシン−１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、抗ＴＮＦ−α抗体又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦ−α抗体は、アダリムマブである。
例示的な多重特異性抗原結合タンパク質
【０２２０】
いくつかの実施形態では、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブ）を含み、完全長抗体がＰＤ−１に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＣＴＬＡ−４に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に高い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に中程度の親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に低い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨを含む第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドと、を含み、ＶＨ及びＶＬが、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨがＣＴＬＡ−４に特異的に結合する、二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペンブロリズマブ又はニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ３及びＶＨＨドメインは、ペプチドリンカー、例えば配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合している。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＢＡＢＰは、図４に示すような構造を有する。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドと、を含み、ＶＨ及びＶＬが、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨがＣＴＬＡ−４に特異的に結合する、二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペンブロリズマブ又はニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＨＨドメインは、ペプチドリンカー、例えば配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合している。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＢＡＢＰは、図９に示すような構造を有する。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨを含む第２のポリペプチドと、を含み、ＶＨ及びＶＬが、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨがＣＴＬＡ−４に特異的に結合する、二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペンブロリズマブ又はニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＣＬ及びＶＨＨドメインは、ペプチドリンカー、例えば配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合している。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＢＡＢＰは、図１１に示すような構造を有する。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨＨ−ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドと、を含み、ＶＨ及びＶＬが、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨがＣＴＬＡ−４に特異的に結合する、二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペンブロリズマブ又はニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＬ及びＶＨＨドメインは、ペプチドリンカー、例えば配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合している。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＢＡＢＰは、図１３に示すような構造を有する。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨＨ−ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドと、を含み、ＶＨ及びＶＬが、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨがＣＴＬＡ−４に特異的に結合する、二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペンブロリズマブ又はニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＬ及びＶＨＨドメイン、並びに／又は、ＶＬ及びＶＨＨドメインは、ペプチドリンカー、例えば配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合している。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＢＡＢＰは、図１７に示すような構造を有する。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨＨ１−ＶＨＨ２−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドと、を含み、ＶＨ及びＶＬが、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨがＣＴＬＡ−４に特異的に結合する、二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペンブロリズマブ又はニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨＨ１及びＶＨＨ２ドメイン、並びに／又は、ＶＨ及びＶＨＨ２ドメインは、ペプチドリンカー、例えば配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合している。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＢＡＢＰは、図１８に示すような構造を有する。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨＨ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドと、を含み、ＶＨ及びＶＬが、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨがＣＴＬＡ−４に特異的に結合する、二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペンブロリズマブ又はニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ１及びＶＨＨドメインは、ペプチドリンカー、例えば配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合している。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＢＡＢＰは、図１９に示すような構造を有する。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｃＦｖ−ＶＨＨ−ＣＨ２−ＣＨ３を含むポリペプチドを含み、ｓｃＦｖがＰＤ−１に特異的に結合し、ＶＨＨがＣＴＬＡ−４に特異的に結合する、二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ペンブロリズマブ又はニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ及びＶＨＨドメインは、ペプチドリンカー、例えば配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合している。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＢＡＢＰは、図２０に示すような構造を有する。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ−ＣＬを含む第２のポリペプチドと、を含み、ＶＨ及びＶＬが、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨがＣＴＬＡ−４に特異的に結合する、二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペンブロリズマブ又はニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ１及びＶＨＨドメイン、並びに／又は、ＣＬ及びＶＨＨドメインは、ペプチドリンカー、例えば配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合している。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＢＡＢＰは、図２１に示すような構造を有する。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、ｓｃＦｖ−ＶＨＨ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨＨ−ＣＬを含む第２のポリペプチドと、を含み、ｓｃＦｖがＰＤ−１に特異的に結合し、ＶＨＨがＣＴＬＡ−４に特異的に結合する、二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ペンブロリズマブ又はニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ及びＶＨＨドメインは、ペプチドリンカー、例えば配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合している。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＢＡＢＰは、図２２に示すような構造を有する。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブ）を含み、完全長抗体がＰＤ−１に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＴＩＭ−３に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブ）を含み、完全長抗体がＰＤ−１に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＬＡＧ−３に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブ）を含み、完全長抗体がＰＤ−１に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＶＩＳＴＡに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるＶＨドメインを含む重鎖と、配列番号３のアミノ酸配列からなるＶＬドメインを含む軽鎖と、を含む、第１の抗原結合部分と、（ｂ）抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は完全長ペンブロリズマブである。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＮ末端は、任意のペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分の重鎖のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分のＣ末端は、任意のペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分の重鎖のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（例えば、デュルバルマブ又はアテゾリズマブ）を含み、完全長抗体がＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＣＴＬＡ−４に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に高い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に中程度の親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に低い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドと、を含み、ＶＨ及びＶＬが、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨがＣＴＬＡ−４に特異的に結合する、二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、アテゾリズマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＨＨドメインは、ペプチドリンカー、例えば配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合している。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＢＡＢＰは、図９に示すような構造を有する。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（例えば、デュルバルマブ又はアテゾリズマブ）を含み、完全長抗体がＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＴＩＭ−３に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（例えば、デュルバルマブ又はアテゾリズマブ）を含み、完全長抗体がＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＬＡＧ−３に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（例えば、デュルバルマブ又はアテゾリズマブ）を含み、完全長抗体がＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＶＩＳＴＡに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（トラスツズマブなど）を含み、完全長抗体がＨＥＲ２受容体に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＣＤ３に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（ＬＣ１０など）を含み、完全長抗体がＡｎｇ２に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＶＥＧＦに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  ＦＣを含む。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨを含む第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドと、を含み、ＶＨ及びＶＬが、Ａｎｇ２に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨがＶＥＧＦに特異的に結合する、二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ＬＣ１０由来である。いくつかの実施形態では、ＣＨ３及びＶＨＨドメインは、ペプチドリンカー、例えば配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合している。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＢＡＢＰは、図４に示すような構造を有する。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドと、を含み、ＶＨ及びＶＬが、Ａｎｇ２に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨがＶＥＧＦに特異的に結合する、二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ＬＣ１０由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＨＨドメインは、ペプチドリンカー、例えば配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合している。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＢＡＢＰは、図９に示すような構造を有する。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨを含む第２のポリペプチドと、を含み、ＶＨ及びＶＬが、Ａｎｇ２に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨがＶＥＧＦに特異的に結合する、二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ＬＣ１０由来である。いくつかの実施形態では、ＣＬ及びＶＨＨドメインは、ペプチドリンカー、例えば配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合している。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＢＡＢＰは、図１１に示すような構造を有する。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチドと、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨＨ−ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドと、を含み、ＶＨ及びＶＬが、Ａｎｇ２に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ＶＨＨがＶＥＧＦに特異的に結合する、二重特異性抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ＬＣ１０由来である。いくつかの実施形態では、ＶＬ及びＶＨＨドメインは、ペプチドリンカー、例えば配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合している。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来である。いくつかの実施形態では、ＢＡＢＰは、図１３に示すような構造を有する。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（アダリムマブなど）を含み、完全長抗体がＴＮＦ−αに特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＩＬ−１βに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（メポリズマブなど）を含み、完全長抗体がＩＬ−５に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）エオタキシン−１に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
ＭＡＢＰの特性
【０２４８】
本明細書に記載されるＭＡＢＰは、生物学的医薬品としての製造及び開発に適している。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、高発現レベルで組み換え的に産生できる。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、工業的製造に十分なレベルで組み換え的に産生できる。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、哺乳類細胞において一過性に発現できる。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞培養におけるＭＡＢＰの発現レベルは、親４本鎖抗体に匹敵しており、例えば、親４本鎖抗体として、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％以下のうちいずれか１つの溶解性である。本明細書で使用するとき、「親４本鎖抗体」は、第１の抗原結合部分であるＶＨ及びＶＬを含む、完全長４本鎖抗体などの抗体を指す。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞培養におけるＭＡＢＰの発現レベルは、親４本鎖抗体よりも高い。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞培養（例えば、ＣＨＯ細胞）におけるＭＡＢＰの発現レベルは、少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１１０ｍｇ／Ｌ、１２０ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、又はそれ以上のうちいずれか１つである。胞培養におけるＭＡＢＰの発現レベルは、当該技術分野において既知の方法、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）若しくは高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を用いる分析によって測定できる。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、組み換え発現により産生されたＭＡＢＰは、サイズ排除クロマトグラフィーによって均質又は実質的に均質になるまで精製してよい。いくつかの実施形態では、精製ＭＡＢＰ中の単分散性分子（例えば、４本のポリペプチド鎖からなる二量体タンパク質などの、単量体ＭＡＢＰ分子として）の割合は、例えば、クロマトグラフィーによって測定されるとき、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上のうちいずれか１つである。組成物中のＭＡＢＰの均質性は、当該技術分野において既知の方法、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、動的光散乱（ＤＬＳ）、又はＨＰＬＣ若しくはＦＰＬＣを用いる分析によって測定できる。いくつかの実施形態では、精製によるＭＡＢＰの収率は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれ以上のうちいずれか１つである。いくつかの実施形態では、精製によるＭＡＢＰの収率は、約７０％〜約９５％である。
【０２５０】
本明細書に記載されるＭＡＢＰは、生物学的医薬品としての使用に適する様々な生物物理学的特性、例えば、高い溶解性、高い長期安定性、及び熱安定性などを更に有する。ＭＡＢＰの安定性は、粒径に基づいて溶解している異なる分子集団を特徴付ける、動的光散乱（ＤＳＬ）などの当該技術分野において既知の方法によって測定できる。いくつかの実施形態では、組成物中のＭＡＢＰの少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、又はそれ以上は、非凝集体構造、すなわち、単一の単量体ＭＡＢＰ分子、例えば、４本のポリペプチド鎖からなる二量体タンパク質である。いくつかの実施形態では、組成物中の凝集レベル、すなわち、複数のＭＡＢＰ分子が複合体として会合しているレベルは、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、又はそれより高い割合以下のうち、いずれか１つである。いくつかの実施形態では、組成物中のＭＡＢＰの少なくとも約５％が凝集体を形成するまでの期間は、約４℃において、少なくとも約１日、３日、７日、２週間、３週間、４週間、又はそれ以上のうちいずれか１つである。いくつかの実施形態では、組成物中のＭＡＢＰの少なくとも約５％が凝集体を形成するまでの期間は、室温付近、例えば２５℃において、少なくとも約１日、３日、７日、２週間、３週間、４週間、又はそれ以上のうちいずれか１つである。いくつかの実施形態では、組成物中のＭＡＢＰの少なくとも約１０％が凝集体を形成するまでの期間は、体温付近、例えば３７℃において、少なくとも約１日、２日、３日、４日、６日、７日、１０日、２週間、又はそれ以上のうちいずれか１つである。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、親４本鎖抗体又はｓｄＡｂに匹敵する溶解性を有しており、例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％以下のうちいずれか１つの溶解性である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、親４本鎖抗体又はｓｄＡｂよりも高い溶解性を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、例えば、ｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液中に、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１７５ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２２５ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、又はそれ以上のうちいずれか１つの濃度で溶解できる。ＭＡＢＰの溶解性は、当該技術分野において既知の任意の方法を用いて、例えば、遠心分離フィルターを用いる濃縮後のタンパク質定量、又は、ＩｇＧを結合させた相互作用クロマトグラフィー（ＣＩＣ）カラムにＭＡＢＰを通すことによって測定できる。いくつかの実施形態では、相互作用クロマトグラフィー（ＣＩＣ）カラムにおけるＭＡＢＰの保持係数ｋ’は、約０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、又はそれ以下のうちいずれか１つ以下である。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、親４本鎖抗体又はその抗原結合フラグメントに匹敵する熱安定性を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、親４本鎖抗体又はその抗原結合フラグメントよりも高い熱安定性を有する。熱安定性は、当該技術分野において既知の方法、例えば、キャピラリー示差走査熱量測定（ＤＳＣ）及び段階的加熱を組み合わせたＤＬＳを用いて測定できる。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰの凝集開始温度（Ｔａｇｇ）は、少なくとも約６５℃、例えば少なくとも約６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、又はそれ以上のうちいずれか１つである。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、約６５℃〜約７５℃の凝集開始温度（Ｔａｇｇ）を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰの変性中間点温度（Ｔｍ）は、少なくとも約６５℃、例えば少なくとも約６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、又はそれ以上である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、約６５℃〜約７５℃の変性中間点温度（Ｔｍ）を有する。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、高い長期安定性を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、約４℃において、少なくとも約１日、３日、７日、２週間、３週間、４週間、又はそれ以上のうちいずれか１つの期間安定である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、高温で高い長期安定性を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、室温、例えば約２５℃以上において、少なくとも約１日、３日、７日、２週間、３週間、４週間、又はそれ以上のうちいずれか１つの期間安定である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、体温、例えば約３７℃以上において、少なくとも約１日、２日、３日、４日、６日、７日、１０日、２週間、又はそれ以上のうちいずれか１つの期間安定である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰの安定性を、加速安定性評価法、例えば、約４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、又はそれ以上のうちいずれか１つにおいて試験し、より低温でのＭＡＢＰの安定性を導き出す。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、高濃度、例えば少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、又はそれ以上のうちいずれか１つにおいて高い長期安定性を有する。本明細書で使用するとき、「安定」な組成物は、沈殿物及び／又は凝集体を実質的に含まない（例えば、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又は以下のうちいずれか未満）。沈殿物は、光学分光法によって検出できる。凝集体は、例えば、ＤＬＳによって検出できる。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、凍結融解サイクルにおいて高い安定性を有する。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰを含む組成物は、ＭＡＢＰの構造的完全性（例えば、凝集体形成）及び／又は活性を失うことなく、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０回、又はそれ以上のうちいずれか１つ、凍結融解できる。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰを含む組成物は、高濃度、例えば少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、又はそれ以上のうちいずれか１つにおいて凍結融解できる。
【０２５５】
本明細書に記載される多重特異性抗原結合タンパク質のうちいずれか１つ由来のフラグメント、例えばＦａｂ様ドメインが、更に提供される。
ＩＩＩ．医薬組成物
【０２５６】
本出願によって、ＭＡＢＰのうち任意の１つと、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、医薬組成物が更に提供される。医薬組成物は、所望の程度の純度を有するＭＡＢＰを、任意の医薬的に許容されるキャリア、賦形剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合し、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態にすることによって調製できる。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、高濃度のＭＡＢＰを有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物中のＭＡＢＰの濃度は、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１７５ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２２５ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、又はそれ以上のうちいずれか１つである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、高い熱安定性及び長期安定性を有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、室温付近（例えば、約２５℃）において、少なくとも約１日、３日、７日、２週間、３週間、４週間、又はそれ以上のうちいずれか１つの期間保管できる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、体温（例えば、約３７℃）において、少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、７日、１０日、２週間、又はそれ以上のうちいずれか１つの期間保管できる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＭＡＢＰの構造的完全性（例えば、凝集体形成）及び／又は活性を失うことなく、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０回、又はそれ以上のうちいずれか１つ、凍結融解できる。いくつかの実施形態では、医薬組成物の有効期間は、少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、２ヶ月、３ヶ月、又はそれ以上のうちいずれか１つである。
【０２５８】
許容されるキャリア、賦形剤又は安定剤は、使用される用量及び濃度においてレシピエントに毒性がないものであり、緩衝剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、二亜硫酸ナトリウム）、保存剤、等張化剤、安定剤、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）及び／又は非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０２５９】
緩衝剤は、特に安定性がｐＨ依存的である場合、治療有効性を最適化する範囲内のｐＨに制御するために使用される。緩衝剤は、好ましくは、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本出願での使用に好適な緩衝剤として、有機酸及び無機酸の両方、並びにそれらの塩が挙げられる。例えば、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩。また、緩衝剤は、ヒスチジン及び、Ｔｒｉｓなどのトリメチルアミン塩を含んでもよい。
【０２６０】
保存剤は、微生物の増殖を遅らせるために添加され、典型的には、０．２％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。本出願での使用に好適な保存剤として、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）；塩化ベンゼトニウム；チメロサール；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが挙げられる。
【０２６１】
「安定剤」として知られる場合がある等張化剤は、組成物中の液体の浸透圧を調整又は維持するために存在する。タンパク質及び抗体などの大型で帯電している生体分子と共に使用されると、これらは、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用でき、それによって分子間及び分子内相互作用の可能性を低下させるため、「安定剤」と呼ばれることが多い。等張化剤は、他の成分の相対量を考慮して、０．１％〜２５重量％、好ましくは１〜５％の間の任意の量で存在してよい。好ましい等張化剤として、多価糖アルコール、好ましくは三価以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールが挙げられる。
【０２６２】
追加の賦形剤として、（１）充填剤、（２）溶解性増強剤、（３）安定剤、及び（４）変性や容器壁への付着を防止する剤のうち、１つ又は２つ以上として作用できる剤が挙げられる。このような賦形剤として、多価糖アルコール（上記）；アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのアミノ酸；スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ、ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ、ガラクトース、ガラクチトール、グリセリン、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコールなどの有機糖又は糖アルコール；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は他の免疫グロブリンなどの低分子量タンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；単糖類（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖類（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）；ラフィノースなどの三糖類；及びデキストリン又はデキストランなどの多糖類が挙げられる。
【０２６３】
非イオン性界面活性剤又は洗剤（「湿潤剤」としても知られる）は、治療剤の可溶化を助け、並びに、治療用タンパク質を撹拌による凝集に対して保護するために存在し、更には、活性治療用タンパク質、つまり抗体の変性を起こすことなく、製剤を表面せん断応力に曝露可能にもする。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍＬ〜約０．２ｍｇ／ｍＬの範囲で存在する。
【０２６４】
好適な非イオン性界面活性剤として、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポロクサマー（polyoxamers）（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、並びにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。使用できるアニオン性洗剤として、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、及びスルホン酸ジオクチルナトリウムが挙げられる。陽イオン性洗剤として、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムが挙げられる。
【０２６５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される医薬組成物のためには、それらは無菌でなければならない。医薬組成物は、無菌濾過膜を通す濾過によって無菌化されてよい。本明細書の医薬組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈輸液バッグ又はバイアル内に入れられる。
【０２６６】
投与経路は、好適な方法、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、動脈内若しくは関節内経路による注射若しくは注入、局所投与、吸入、又は、持続放出若しくは長期間放出手段において、長期間にわたる単回又は複数回のボーラス又は持続など、既知の許容される方法に従う。
【０２６７】
持続放出性製剤を調製してもよい。好適な持続放出性製剤の例として、アンタゴニストを含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出性マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０２６８】
また、本明細書の医薬組成物は、治療される特定の適応に対して必要な、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する２種類以上の活性化合物も含有してよい。あるいは、又は追加的に、組成物は、細胞傷害性剤、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、又は成長阻害剤を含んでよい。このような分子は、適応とする目的に有効な量の組み合わせで好適に存在する。
【０２６９】
また活性成分は、例えば、コアセルベーション（coascervation）法又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル、及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションで閉じ込められてもよい。このような手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎに開示されている。
【０２７０】
ＭＡＢＰの例示的な製剤は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、マンニトール、ジエチレントリアミン五酢酸（ペンテト酸）、及びポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）を含む、ｐＨ６．０の液体製剤である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰを、４％スクロース、５０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭアルギニンを含む、ｐＨ６．０の液体処方中に配合する。
ＩＶ．使用方法
【０２７１】
本明細書に記載される多重特異性抗原結合タンパク質、及びその組成物（医薬組成物など）は、診断、分子アッセイ、及び治療などの様々な用途に有用である。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、疾患又は状態の治療を必要とする固体におけるその方法があり、ＭＡＢＰは、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は完全長４本鎖抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃ又はＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
癌の治療方法
【０２７３】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、腎癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は完全長４本鎖抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃ又はＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の免疫チェックポイント分子に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の免疫チェックポイント分子に特異的に結合するｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１の免疫チェックポイント分子及び／又は第２の免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、腎癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖と、ＶＬを含む及び軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、又は軽鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は完全長４本鎖抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブ）を含み、完全長抗体がＰＤ−１に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＣＴＬＡ−４に特異的に結合するｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に高い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に中程度の親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に低い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、腎癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブ）を含み、完全長抗体がＰＤ−１に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＴＩＭ−３に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、腎癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブ）を含み、完全長抗体がＰＤ−１に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＬＡＧ−３に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、腎癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブ）を含み、完全長抗体がＰＤ−１に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＶＩＳＴＡに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、腎癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなるペンブロリズマブを含む第１の抗原結合部分と、（ｂ）抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、腎癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１、８又は１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（例えば、デュルバルマブ又はアテゾリズマブ）を含み、完全長抗体がＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＣＴＬＡ−４に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に高い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に中程度の親和性で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ＣＴＬＡ−４に低い親和性で結合する。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、腎癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（例えば、デュルバルマブ又はアテゾリズマブ）を含み、完全長抗体がＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＴＩＭ−３に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、腎癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（例えば、デュルバルマブ又はアテゾリズマブ）を含み、完全長抗体がＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＬＡＧ−３に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、腎癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（例えば、デュルバルマブ又はアテゾリズマブ）を含み、完全長抗体がＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＶＩＳＴＡに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、腎癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の腫瘍抗原に特異的に結合するｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第１の腫瘍抗原及び／又は第２の腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２０、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３８、及びＣＤ５２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、完全長抗ＨＥＲ−２モノクローナル抗体（トラスツズマブなど）又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、腎癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞など）上の細胞表面抗原に特異的に結合するｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２０、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３８、及びＣＤ５２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、完全長抗ＨＥＲ−２モノクローナル抗体（トラスツズマブなど）又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、腎癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の血管新生因子（Ａｎｇ−２など）に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の血管新生因子（ＶＥＧＦなど）に特異的に結合するｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）を含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、腎癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、癌（乳癌など）の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（トラスツズマブなど）を含み、完全長抗体がＨＥＲ２受容体に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＣＤ３に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ４  Ｆｃを含む。
【０２８８】
本明細書に記載される方法は、固形癌及び液性癌の両方を含む様々な癌の治療に好適である。この方法は、初期、進行期及び転移性癌などの、全ての段階の癌に適用できる。本明細書に記載される方法を、アジュバント療法又はネオアジュバント療法中の、第１の療法、第２の療法、第３の療法、又は、当該技術分野において既知である別の種類のがん療法、例えば、化学療法、手術、放射線、遺伝子治療、免疫療法、骨髄移植、幹細胞移植、標的療法、低温療法、超音波療法、光線力学的療法、高周波アブレーションなどとの併用療法として用いることができる。
炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療方法
【０２８９】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、炎症性疾患又は自己免疫疾患は、関節炎（例えば、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、及び潰瘍性大腸炎）、大腸炎、乾癬、重症喘息、及び中等度から重度のクローン病からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、第１の炎症促進性分子に特異的に結合する抗原結合部位を共に形成する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の炎症促進性分子に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、炎症性疾患又は自己免疫疾患は、関節炎（例えば、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、及び潰瘍性大腸炎）、大腸炎、乾癬、重症喘息、及び中等度から重度のクローン病からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の炎症促進性分子及び／又は第２の炎症促進性分子は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、及びエオタキシン−１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（アダリムマブなど）を含み、完全長抗体がＴＮＦ−αに特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）ＩＬ−１βに特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、炎症性疾患又は自己免疫疾患は、関節炎（例えば、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、及び潰瘍性大腸炎）、大腸炎、乾癬、重症喘息、及び中等度から重度のクローン病からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗原結合タンパク質と、医薬的に許容されるキャリアと、を含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む、炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療を必要とする固体におけるその方法が提供され、ＭＡＢＰは、（ａ）２本の重鎖と２本の軽鎖からなる完全長抗体（メポリズマブなど）を含み、完全長抗体がＩＬ−５に特異的に結合する、第１の抗原結合部分と、（ｂ）エオタキシン−１に特異的に結合するｓｄＡｂを含む、第２の抗原結合部分と、を含み、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が互いに融合している。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ラクダ科、ヒト化、又はヒトｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、炎症性疾患又は自己免疫疾患は、関節炎（例えば、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、及び潰瘍性大腸炎）、大腸炎、乾癬、重症喘息、及び中等度から重度のクローン病からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２本の重鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端、又は、２本の軽鎖のうちの一方若しくはそれぞれのＣ末端において第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、化学的に第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ペプチド結合、つまりペプチドリンカーを介して第１の抗原結合部分に融合している。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約３０以下（例えば、約２５、２０、又は１５以下のうちいずれか１つ）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１  Ｆｃを含む。
投与量及び投与経路
【０２９３】
本出願の医薬組成物の投与量及び所望の薬物濃度は、想定される特定用途に応じて変わり得る。適切な投与量又は投与経路の決定は、当業者において周知である。動物実験は、ヒトの治療に対する有効量の決定において、信頼性のある指標を提供する。有効量の外挿は、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  Ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」，Ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９，ｐｐ．４２〜４６に著される原則に従って実施できる。
【０２９４】
本明細書に記載されるＭＡＢＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与が使用されるとき、通常の投与量は、哺乳類の体重１日あたり約１０ｎｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上で可変であってよく、投与経路によって、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日である。異なる製剤が異なる治療及び異なる疾患に有効であり、特定の器官又は組織の治療に意図された投与が、他の器官又は組織とは異なる方法での送達を必要とし得ることは、本出願の範囲内である。更に、投与量を、１回又は２回以上の別々の投与によって、又は持続的注入によって投与できる。数日以上にわたる繰り返し投与において、その状態に応じて、疾患症状の所望される抑制が生じるまで、治療を継続する。しかしながら、他の投与レジメンが有用であってよい。治療の進行は、従来技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数回（例えば２、３、４、５、６、又はそれ以上の回数のいずれか）投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、７ヶ月に１回、８ヶ月に１回、９ヶ月に１回、又は１年に１回、投与される。いくつかの実施形態では、投与間隔は、約１週間〜２週間、２週間〜１ヶ月、２週間〜２ヶ月、１ヶ月〜２ヶ月、１ヶ月〜３ヶ月、３ヶ月〜６ヶ月、又は６ヶ月〜１年のうち、いずれか１つである。特定の患者に対する最適な投与量及び治療レジメンは、疾患の兆候について患者をモニタリングし、それに応じて治療を調整することによって、医療分野における当業者によって容易に決定できる。
【０２９６】
再溶解製剤又は液体製剤などが挙げられるが、これらに限定されない本出願の医薬組成物は、ＭＡＢＰによる治療を必要とする固体、好ましくはヒトに、既知の方法、例えば、単回又は一定時間にわたる持続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、又は吸入経路によって投与される。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮下（すなわち、皮膚下）投与によって個体に投与される。このような目的のため、注射器を用いて医薬組成物を注入してよい。しかし、医薬組成物の投与には、注入装置、インジェクターペン、オートインジェクター装置、無針装置、及び皮下パッチ送達システムなどの他の装置が存在する。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、固体の静脈内に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、点滴静注などの注入によって固体に投与される。免疫療法に対する注入法は当該技術分野において既知である（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６（１９８８）参照）。
Ｖ．調製方法
【０２９９】
本出願は、ＭＡＢＰをコードする単離された核酸、かかる単離された核酸を含むベクター及び宿主細胞、並びに、ＭＡＢＰ産生のための組み換え法も提供する。
【０３００】
ＭＡＢＰの組み換え産生では、完全長抗体又は第１の抗原結合部分の抗原結合フラグメント、及びｓｄＡｂをコードする核酸が単離され、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクターに挿入される。いくつかの実施形態では、完全長抗体又は第１の抗原結合部分の抗原結合フラグメントをコードする核酸は、ペプチドリンカーをコードする拡散を任意に介して第２の抗原結合部分であるｓｄＡｂをコードする核酸に、互いに対して全てが翻訳に対してインフレームで組み換え的に融合され、ＭＡＢＰをコードする核酸を提供する。ＭＡＢＰ、その構成要素、又はｓｄＡｂをコードするＤＮＡは、従来手順を用いて容易に単離され、配列決定される（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブの使用による）。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、使用する宿主細胞に一部依存する。一般に、好ましい宿主細胞は、原核生物又は真核生物（通常は哺乳類）由来のいずれかである。別の方法としては、第１の抗原結合フラグメント及び第２の抗原結合フラグメントは、それぞれ第１の抗原結合フラグメント及び第２の抗原結合フラグメントをコードする核酸を含む原核生物又は真核生物の宿主細胞を用いて、それぞれ組み換え的に調製される。その後、発現された第１の抗原結合フラグメント及び第２の抗原結合フラグメントを化学的に結合し、精製してＭＡＢＰを提供する。
１．原核細胞中のタンパク質産生
ａ）ベクター構築
【０３０１】
本出願のＭＡＢＰのポリペプチド構成をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組み換え技術を用いて得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離され、配列決定できる。別の方法としては、ヌクレオチド合成装置やＰＣＲ法を用いてポリヌクレオチドを合成できる。得られた後、ポリペプチドをコードする配列を、原核宿主において異種ポリヌクレオチドを複製かつ発現できる組み換えベクターに挿入する。本出願の目的において、当該技術分野において利用可能かつ既知である多くのベクターを使用できる。適切なベクターの選択は、主にはベクターに挿入される核酸の大きさと、ベクターによって形質転換される特定の宿主細胞に依存するであろう。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅若しくは発現、又はその両方）、存在する特定の宿主細胞との適合性によって、様々な構成要素を含む。ベクターの構成要素としては、一般には、複製開始点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサート及び転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０２】
一般に、宿主細胞と適合する種に由来するレプリコン及びコントロール配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。ベクターは、通常は複製部位、並びに、形質転換細胞中での表現型選択が可能であるマーキング配列を含む。例えば、大腸菌は、典型的には、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含むため、形質転換細胞同定の簡便な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、又は他の微生物プラスミド若しくはバクテリオファージは更に、内因性タンパク質発現のために微生物によって使用できるプロモーターを含んでも、又は含むように修飾されてもよい。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６４８，２３７号に詳述されている。
【０３０３】
加えて、宿主微生物と適合するレプリコン及びコントロール配列を含むファージベクターは、これらの宿主に関連する形質転換ベクターとして使用できる。例えば、ＧＥＭ（商標）−１１などのバクテリオファージを、大腸菌ＬＥ３９２などの感受性のある宿主細胞の形質転換に使用できる組み換えベクターの作製に利用してよい。
【０３０４】
本明細書に記載される発現ベクターは、それぞれのポリペプチド要素をコードする２つ以上のプロモーター−シストロン対を含み得る。プロモーターは、発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置する、未翻訳の制御配列である。原核生物のプロモーターは、典型的には、誘導性及び恒常性の２種類に分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の変化、例えば、栄養素の有無、又は温度の変化に応答して、その制御下でシストロンの転写レベルの増加を開始するプロモーターである。
【０３０５】
様々な可能性のある宿主細胞によって認識される多くのプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化によって元のＤＮＡからプロモーターを除去し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入することによって、軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに操作可能に連結できる。標的遺伝子の直接増幅及び／又は発現に、天然のプロモーター配列及び多くの異種プロモーターの両方を使用できる。いくつかの実施形態では、一般に、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、転写率が高く、発現した標的遺伝子の収率を高くできるため、異種プロモーターを利用する。
【０３０６】
原核宿主での使用に好適なプロモーターとして、ＰｈｏＡプロモーター、ガラクタナーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、並びにハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターが挙げられる。しかし、細菌で機能する他のプロモーター（例えば、他の既知の細菌プロモーター又はファージプロモーター）も同様に好適である。これらのヌクレオチド配列は公表されているため、当業者は、任意の必要とする制限部位を含めるためのリンカー又はアダプターを用いて、標的とする軽鎖及び重鎖をコードするシストロンに操作可能にライゲーションできる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２０：２６９）。
【０３０７】
一態様では、組み換えベクター内の各シストロンは、膜を介して発現したポリペプチドを移動させる、分泌シグナル配列要素を含む。一般に、シグナル配列はベクターの要素であってよく、又は、ベクター内に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。本出願の目的のために選択されたシグナル配列は、宿主細胞によって認識されて処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものでなくてはならない。異種ポリペプチド由来のシグナル配列を認識せず、処理しない原核宿主細胞において、そのシグナル配列を、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、又は熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｅＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、及びＭＢＰからなる群から選択される、原核シグナル配列で置換する。いくつかの実施形態では、発現系の両シストロンで使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列又はその変化型である。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰの産生は、宿主細胞の細胞質内で起こることができ、そのため、各シストロン内の分泌シグナル配列の存在を必要としない。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分に任意に融合される第１の抗原結合部分のＶＨドメインをコードするポリペプチド、及び第２の抗原結合部分に任意に融合される第１の抗原結合部分のＶＬドメインをコードするポリペプチドなどのポリペプチド要素が、発現され、折り畳まれ、集合して細胞質内で機能性ＭＡＢＰを形成する。ある宿主株（例えば、大腸菌ｔｒｘＢ−株）は、細胞質をジスルフィド結合形成に適した条件にするため、発現したタンパク質サブユニットの適切な折り畳みと集合を可能にする。Ｐｒｏｂａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）。
【０３０９】
本出願は、分泌され、適切に集合した本出願のＭＡＢＰの収率を最大にするための、発現したポリペプチド要素の量的収率を調節できる発現系を提供する。このような調節は、ポリペプチド要素の翻訳強度を同時調節することによって、少なくとも部分的に達成される。翻訳強度を調節するための１つの手法は、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌの米国特許第５，８４０，５２３号に開示されている。これは、シストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異を利用するものである。あるＴＩＲについて、ある翻訳強度の範囲を伴う一連のアミノ酸又は核酸配列変異体を作製することによって、所望の発現レベルの特定の鎖に対してこの因子を調節するための簡便な手段を提供できる。ＴＩＲ変異は、アミノ酸配列を変更し得るコドン変化をもたらすための従来の変異誘発手法によって生じさせることができるが、ヌクレオチド配列中のサイレント変化が好ましい。ＴＩＲ中の変更として、例えば、シグナル配列の変更を伴うシャイン・ダルガーノ配列の数又はスペーシングの変更が挙げることができる。変異シグナル配列を生じるための１つの方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（すなわち、変化がサイレントである）コーディング配列の始めに「コドンバンク」を生成することである。これは、各コドンの３つ目のヌクレオチド位置を変化させることによって達成でき、また、ロイシン、セリン、アルギニンなどの一部のアミノ酸は、バンク作製を複雑にし得る複数の１つ目及び２つ目の位置を有する。この変異誘発法は、Ｙａｎｓｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４：１５１〜１５８に詳述されている。
【０３１０】
好ましくは、中に含まれる各シストロンについてある範囲のＴＩＲ強度を有する、ベクターセットを生じさせる。この限定セットにより、様々なＴＩＲ強度の組み合わせ下における、各鎖の発現レベル並びに所望のＭＡＢＰ産物の収率を比較する。ＴＩＲ強度は、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌの米国特許第５，８４０，５２３号に詳述されるように、レポーター遺伝子の発現レベルを定量することによって測定できる。翻訳強度の比較に基づき、所望の個々のＴＩＲが選択され、本出願の発現ベクター構築物に結合される。
ｂ）原核宿主細胞。
【０３１１】
本出願のＭＡＢＰの発現に好適な原核宿主細胞として、グラム陰性菌又はグラム陽性菌などの古細菌及び真正細菌が挙げられる。有用な細菌の例として、大腸菌類（例えば、大腸菌）、桿菌類（例えば、枯草菌）、腸内細菌、シュードモナス属（例えば、緑膿菌）、ネズミチフス菌、セラチア・マルセッセンス、クレブシェラ属、プロテウス属、シゲラ属、根粒菌、ビトレオシラ属、又はパラコッカス属が挙げられる。一実施形態では、グラム陰性細胞が使用される。一実施形態では、大腸菌細胞が宿主として使用される。大腸菌株の例として、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７）、ｐｐ．１１９０〜１２１９；ＡＴＣＣ寄託番号２７，３２５）及びその派生株、例えば、遺伝子型Ｗ３１１０  ＡｆｈｕＡ（ＡｔｏｎＡ）ｐｔｒ３  ｌａｃ  Ｉｑ  ｌａｃＬ８  ＡｏｍｐＴ  Ａ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１  ｋａｎＲを有する３３Ｄ３株（米国特許第５，６３９，６３５号）が挙げられる。大腸菌２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）及び大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ  ３１，６０８）などの他の株及びその派生株も適している。これらの例は、限定的なものではなく例示である。確定した遺伝子型を有する上記細菌のうち任意のものの派生株を構築する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９〜３１４（１９９０）に記載されている。一般的には、細菌細胞内のレプリコンの複製力を考慮して、適切な細菌を選択する必要がある。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０などの周知のプラスミドを用いてレプリコンを与えるとき、大腸菌、セラチア、又はサルモネラ属を宿主として好適に使用できる。
【０３１２】
典型的には、宿主細胞は、タンパク質分解酵素の分泌量が最小限でなくてはならず、望ましくは、追加的にプロテアーゼ阻害剤を細胞培養内に加える場合がある。
ｃ）タンパク質の産生
【０３１３】
宿主細胞を、上記発現ベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に改変された従来の栄養培地で培養する。形質転換は、ＤＮＡが染色体外要素として、又は染色体組み込み体によってのいずれかで複製可能であるように、原核宿主内にＤＮＡを導入することを意味する。使用する宿主細胞によって、当該細胞に適した標準的手法を用いて形質転換を行う。一般的に、塩化カルシウムを利用するカルシウム処理が、実質的に細胞壁バリアを含む細菌細胞に対して使用される。別の形質転換方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用される更に別の手法は、電気穿孔法である。
【０３１４】
本出願のＭＡＢＰの産生に使用される原核細胞は、当該技術分野において既知であり、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖される。好適な培地の例として、必要な栄養素を加えたＬ培地（ＬＢ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地は、発現ベクターの構築物に基づいて選択された選択剤も含み、発現ベクターを含む原核細胞の増殖を選択的に可能にする。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖には、アンピシリンを培地に添加する。
【０３１５】
単独で、又は複合窒素源などの別の添加物若しくは培地との混合物として投入される、炭素、窒素、無機リン酸塩源以外の任意の必要な添加物も、適切な濃度で含めてもよい。任意に、培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコール酸、ジチオエリトリトール及びジチオスレイトールからなる群から選択される、１つ又は２つ以上の還元剤を含有してよい。
【０３１６】
原核宿主細胞は、好適な温度で培養される。大腸菌の増殖では、例えば、好ましい温度は、約２０℃〜約３９℃、より好ましくは約２５℃〜約３７℃の範囲であり、更により好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５〜約９の範囲の任意のｐＨであってよい。大腸菌では、ｐＨは、好ましくは約６．８〜約７．４、より好ましくは約７．０である。
【０３１７】
発現ベクター中で誘導性プロモーターを用いる場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に好適な条件下で誘導される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの転写を制御するため、ＰｈｏＡプロモーターを用いる。したがって、形質転換された宿主細胞は、誘導のためにリン酸制限培地中で培養される。好ましくは、リン酸制限培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３〜１４７）。当該技術分野において既知であるように、使用したベクター構築物に応じて、様々な別の誘導因子を使用できる。
【０３１８】
発現した本出願のＭＡＢＰを宿主細胞のペリプラズム内に分泌させ、そこから回収する。タンパク質の回収は、典型的には、浸透圧刺激、超音波処理、又は細胞溶解などの一般的な手段によって微生物を破壊することを含む。細胞が破壊されると、細胞残屑又は細胞全体を、遠心分離又は濾過によって除去できる。タンパク質は、例えば、アフィニティー樹脂クロマトグラフィーによって更に精製できる。あるいは、タンパク質を培地中に移し、そこで単離してもよい。産生したタンパク質を更に精製するために、細胞を培養及び培養上清から取り出し、それを濾過して濃縮してもよい。発現したポリペプチドを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットアッセイなどの一般的な既知の方法を用いて、更に単離し、同定できる。
【０３１９】
別の方法としては、タンパク質産生を発酵法によって大容量で実施する。様々な大規模流加発酵法が、組み換えタンパク質の製造に利用できる。大規模発酵は、少なくとも１０００リットルの容積、好ましくは約１，０００〜１００，０００リットルの容積を有する。これらの発酵槽は、攪拌用インペラーを用いて、酸素及び栄養素、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分配させる。小規模発酵は一般に、容積が約１００リットル以下の発酵槽での発酵を指し、約１リットル〜約１００リットルの範囲であってよい。
【０３２０】
発酵プロセスの間、典型的には、細胞を好適な条件下で、所望の吸光度、例えば、細胞が初期静止期にある段階のＯＤ５５０が約１８０〜２２０まで増殖させた後に、タンパク質発現の誘導が開始される。当該技術分野において既知であり、上記されるように、使用したベクター構築物に応じて、様々な誘導因子を使用できる。細胞は、誘導に先立ってより短い期間増殖させてよい。細胞は、通常は約１２〜５０時間誘導されるが、より長い又はより短い誘導時間を使用してもよい。
【０３２１】
本出願のＭＡＢＰの製造収率及び品質を向上させるため、様々な発酵条件を変更してもよい。例えば、分泌されるポリペプチドの適切な集合と折り畳みを向上するため、シャペロンタンパク質、例えば、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び又はＤｓｂＧ）又はＦｋｐＡ（シャペロン活性を有するペプチジルプロリルシス，トランスイソメラーゼ）を過剰発現する追加のベクターを用いて、宿主原核細胞を同時形質転換してもよい。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞中で産生された異種タンパク質の適切な折り畳み及び溶解性を促進することが証明されている。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２７４：１９６０１〜１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０８３，７１５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０２７，８８８号；Ｂｏｔｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００〜１７１０５；Ｒａｍｍ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６〜１７１１３；Ａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９〜２１０。
【０３２２】
発現した異種タンパク質（特に、タンパク質分解しやすいもの）のタンパク質分解を最小限にするため、タンパク質分解酵素が欠損した特定の宿主株を本出願に使用できる。例えば、宿主細胞株を改変し、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩなど既知の細菌プロテアーゼ、及びこれらの組み合わせをコードする遺伝子中に遺伝的変異を起こしてもよい。いくつかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、Ｊｏｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）、上記；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３〜７２（１９９６）に記載されている。
【０３２３】
タンパク質分解酵素を欠損し、１つ又は２つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換された大腸菌株を、本出願のＭＡＢＰをコードする発現系において宿主細胞として使用できる。
ｄ）タンパク質の精製
【０３２４】
本明細書で産生されるＭＡＢＰを更に精製し、実質的に均質な調製物を更なるアッセイ及び用途のために得る。当該技術分野において既知の標準的なタンパク質精製法を利用できる。以下の方法、すなわち、イムノアフィニティカラム又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及び、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を用いるゲル濾過は、好適な精製法の例である。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、固相に固定化したプロテインＡを、本明細書に記載されるＦｃ領域を含むＭＡＢＰのイムノアフィニティ精製に使用する。プロテインＡは、抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌由来の４１１（Ｄの細胞壁タンパク質である。Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１〜１３。プロテインＡが固定化された固相は、好ましくはガラス又はシリカ表面を含むカラムであり、より好ましくは細孔が制御されたガラスカラム又はケイ酸カラムである。いくつかの用途において、カラムは、混入物質の非特異的付着を防止するために、グリセロールなどの試薬でコーティングされている。続いて、固相を洗浄し、固相に非特異的に結合している混入物質を除去する。最後に、溶出することによって所望のＭＡＢＰを固相から回収する。
２．真核細胞中のタンパク質産生
【０３２６】
真核発現には、ベクターコンポーネントは、一般的には、シグナル配列、複製開始点、１つ又は２つ以上のマーカー遺伝子、及びエンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうち、１つ又は２つ以上を非限定的に含む。
ａ）シグナル配列コンポーネント
【０３２７】
真核宿主で使用するベクターは、シグナル配列、又は、成熟タンパク質、つまりポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有する別のポリペプチドをコードするインサートも含んでよい。選択された異種シグナル配列は、好ましくは宿主細胞によって認識されて処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。哺乳類細胞発現では、哺乳類のシグナル配列並びにウイルスの分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスのｇＤシグナルを利用できる。
【０３２８】
このような前駆領域のＤＮＡを、本出願のＭＡＢＰをコードするＤＮＡに、読み枠でライゲーションする。
ｂ）複製開始点
【０３２９】
一般的に、複製開始点コンポーネントは、哺乳類発現ベクターに必要ではない（ＳＶ４０開始点が初期プロモーターに含まれるため、典型的にはそれのみを使用できる）。
ｃ）選択遺伝子コンポーネント
【０３３０】
発現及びクローニングベクターは、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含有してもよい。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又はその他トキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、又はテトラサイクリンに対する体制を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、又は（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素、例えば、桿菌類のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給するタンパク質をコードする。
【０３３１】
選択スキームの一例は、宿主細胞の増殖を停止する薬剤を利用するものである。異種遺伝子によって形質転換が成功したこれらの細胞は、薬剤耐性を与えるタンパク質を産生することによって、選択レジメンで生存する。このような優性選択の例は、薬剤であるネオマイシン、ミコフェノール酸及びヒグロマイシンを使用するものである。
【０３３２】
哺乳類細胞に好適な選択マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチン脱炭酸酵素などの、本出願のＭＡＢＰをコードする核酸を取り込む能力を有する細胞の同定を可能にするものである。
【０３３３】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、まず、ＤＨＦＲの競合的拮抗薬であるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培地中で全形質転換体を培養することによって識別される。野生型ＤＨＦＲを利用するときの適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）である。
【０３３４】
あるいは、ＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択マーカーをコードするポリペプチドによって、形質転換又は同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８などの選択剤を選択マーカーとして含有する培地中での細胞増殖によって選択できる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。
ｄ）プロモーター要素
【０３３５】
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、所望のポリペプチド配列をコードする核酸に操作可能に連結されたプロモーターを含む。実質的に全ての真核遺伝子は、転写が開始される部位よりも約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始点よりも７０〜８０塩基上流にある別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは任意のヌクレオチドであり得る）である。ほとんどの真核の３’末端は、コード配列の３’末端にポリアデニン鎖を付加するシグナルであり得る、ＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列の全てを、真核発現ベクターに挿入してよい。
【０３３６】
原核宿主での使用に好適な他のプロモーターとして、ｐｈｏＡプロモーター、−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、並びにハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターが挙げられる。しかし、他の既知の細菌性プロモーターが好適である。細菌系で使用するプロモーターは、ＭＡＢＰをコードするＤＮＡに操作可能に連結されるシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含むであろう。
【０３３７】
哺乳類宿主細胞中でのベクター由来のポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから、得られるプロモーターによって制御されるが、これらのプロモーターが宿主細胞系に適合していることを条件とする。
【０３３８】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製開始点も含むＳＶ４０制限酵素断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限酵素断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用する哺乳類宿主中でＤＮＡを発現する系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。このシステムの変法が、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下における、マウス細胞中でのヒトインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Ｒｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８〜６０１（１９８２）も参照されたい。別の方法としては、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復を、プロモーターとして使用できる。
ｅ）エンハンサー構成要素
【０３３９】
高等真核生物による本出願のＭＡＢＰをコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加する。哺乳類遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が、現在では既知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用するであろう。例として、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化に対するエンハンサー要素については、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７〜１８（１９８２）も参照されたい。エンハンサーを、ポリペプチドコード配列の５’又は３’の位置でベクター内にスプライスしてよいが、好ましくはプロモーターの５’側に位置付ける。
ｆ）転写終結コンポーネント
【０３４０】
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の多細胞生物由来の有核細胞）で使用される発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含むであろう。このような配列は、通常は５’に、時折３’に存在する、真核生物又はウイルスＤＮＡ又はｃＤＮＡの非翻訳領域である。これらの領域は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中に、ポリアデニル化フラグメントとして翻訳されたヌクレオチド部分を含む。１つの有用な転写終結コンポーネントは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号及びその明細書に開示される発現ベクターを参照されたい。
ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
【０３４１】
本明細書のベクター中でＤＮＡをクローニング又は発現するために好適な宿主細胞として、脊椎動物宿主細胞などの本明細書に記載される高等真核生物細胞が挙げられる。培養（組織培養）中の脊椎動物細胞の増殖は、一般的な手順になっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児性腎臓株（２９３、又は懸濁培養での増殖に対してサブクローンされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３〜２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；ｂｕｆｆａｌｏラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４〜６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；及び、ヒト幹細胞種株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０３４２】
宿主細胞を、ＭＡＢＰ産生のための上記発現ベクター又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に改変された従来の栄養培地で培養する。
ｈ）宿主細胞の培養
【０３４３】
本出願のＭＡＢＰの産生に使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養されてよい。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞の培養に適している。更に、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；又は同第５，１２２，４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；同第８７／００１９５号；又は米国特許第Ｒｅ．３０，９８５号に記載される培地のうち任意のものを、宿主細胞の培養培地として使用してよい。これらの培地のうち任意のものに、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬）、微量元素（通常はマイクロモルオーダーの最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、及びグルコース又は同等のエネルギー源を添加してもよい。任意のその他必要とされる添加物を、当業者に既知である適切な濃度で含めてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞においてこれまで使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
ｉ）タンパク質の精製
【０３４４】
組み換え手法を用いる場合、ＭＡＢＰは、細胞内、ペリプラズム領域内で産生されても、又は、培地中に直接分泌されてもよい。ＭＡＢＰ又はｓｄＡｂを細胞内で産生する場合、第１の工程として、微粒子残渣、宿主細胞又は溶解フラグメントのいずれかを、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去する。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３〜１６７（１９９２）は、大腸菌のペリプラズム領域に分泌された抗体を単離する方法を説明している。簡潔に言うと、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分かけて細胞ペーストを解凍する。細胞残渣を、遠心分離によって除去してよい。ＭＡＢＰ又はｓｄＡｂが培地中に分泌される場合、通常はまず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過ユニットを用いて、その発現系の上清を濃縮する。タンパク質分解を阻害するため、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の工程のいずれかに含めてよく、外来混入生物の増殖を阻害するため、抗生物質を含めてもよい。
【０３４５】
細胞から調製されたタンパク質組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製法である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、ＭＡＢＰ中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種類及びアイソタイプに依存する。プロテインＡを用いて、１、２、又は４本の重鎖を含むヒト免疫グロブリン系のＭＡＢＰを精製できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１〜１３（１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒト３に推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティリガンドが添加されているマトリックスは、ほとんどアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。細孔が制御されたガラス又はポリ（スチレン−ジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成できるよりも速い流速と、短い処理時間を可能にする。ＭＡＢＰがＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．））が精製に有用である。回収するＭＡＢＰやｓｄＡｂに応じて、タンパク質精製のためのその他手法、例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も利用できる。
【０３４６】
任意の予備的精製工程に続いて、所望のＭＡＢＰ又はｓｄＡｂ及び混入物質を含む混合物を、約２．５〜４．５のｐＨの溶出バッファーを用い、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行われる、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけてよい。
３．抗体の製造
【０３４７】
ＭＡＢＰのコンポーネント、例えば、従来の４本鎖抗体、抗原結合フラグメント、及びｓｄＡｂは、以下に記載する方法を含む、当該技術分野において既知の任意の方法を用いて製造できる。
【０３４８】
ｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）は、当該技術分野において既知の方法を用いて、例えば、ラクダ科（ラクダ又はラマなど）を免疫化し、そこからハイブリドーマを得ることによって、又は、当該技術分野において既知の分子生物学的手法を用いてｓｄＡｂのライブラリをクローニングし、未選択ライブラリの個々のクローンを用いるＥＬＩＳＡにより、若しくはファージディスプレイにより引き続き選択することによって、得ることができる。
１）モノクローナル抗体
【０３４９】
モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られ、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る自然発生突然変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）以外は同一である。したがって、修飾語である「モノクローナル」は、別々の抗体の混合物ではない抗体の特徴を指す。
【０３５０】
例えば、モノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって説明されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は、組み換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製してよい。
【０３５１】
ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫化し、免疫化に用いたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、又は産生能があるリンパ球を誘発する。別の方法としては、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化してもよい。続いて、リンパ球を、好適な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９〜１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。
【０３５２】
免疫剤は、典型的には抗原性タンパク質又はその融合変異体を含むであろう。一般に、ヒト由来細胞が望まれる場合は末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）を使用するか、又は、非ヒト哺乳類源が望まれる場合は脾臓細胞若しくはリンパ節細胞を使用するかのいずれかである。その後、リンパ球を、好適な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて不死化細胞株と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する。Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６），ｐｐ．５９〜１０３。
【０３５３】
不死化細胞株は、通常は、形質転換された哺乳類細胞、特に、げっ歯類、ウシ及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常は、ラット又はマウス骨髄腫細胞株を用いる。このように調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、未融合の親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１種又は２種以上の物質を含む好適な培養培地中に、播種し、増殖する。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防ぐ物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。
【０３５４】
好ましい不死化骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体産生を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性があるものである。これらのうち、好ましいものは、マウス骨髄腫株、例えば、ＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡ）から入手可能）及びＳＰ−２細胞（及びその派生株、例えば、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．ＵＳＡ）から入手可能）由来のものである。ヒトモノクローナル抗体の産生に対して、ヒト骨髄腫及びマウスヒトヘテロ骨髄腫細胞株も説明されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１〜６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０３５５】
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降法により、又は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって測定する。
【０３５６】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイできる。好ましくは、モノクローナル抗体の結合親和性及び特異性を、免疫沈降法により、又は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって測定できる。このような手法及びアッセイ法は、当該技術分野において既知である。例えば、結合親和性は、Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャチャード解析によって測定できる。
【０３５７】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、そのクローンを、限界希釈法によってサブクローニングし、標準的手法（Ｇｏｄｉｎｇ、上記）によって増殖させてよい。この目的のために好適な培地として、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。更に、ハイブリドーマ細胞を哺乳類中の腫瘍としてｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させてもよい。
【０３５８】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティクロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水、又は血清から適切に分離される。
【０３５９】
モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるもの、及び上記のような、組み換えＤＮＡ方法によって作製することもできる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来手順を用いて容易に単離され、配列決定される（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブの使用による）。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。単離後、ＤＮＡを発現ベクター中に挿入でき、それを続いて、組み換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成させるために、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は他に免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクトする。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組み換え発現に関する総説として、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６〜２６２（１９９３）及びＰｌｉｉｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１〜１８８（１９９２）が挙げられる。
【０３６０】
更なる実施形態では、抗体は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２〜５５４（１９９０）に記載される手法を用いて作製された、抗体ファージライブラリから単離できる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４〜６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１〜５９７（１９９１）には、ファージライブラリを用いる、それぞれマウス及びヒト抗体の単離について記載されている。後続の文献は、ｃｈａｉｎシャフリングによる高親和性（ｎＭオーダー）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９〜７８３（１９９２））、並びに、巨大ファージライブラリ構築戦略としてのコンビナトリアル感染及びｉｎ  ｖｉｖｏ組み換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２２６５〜２２６６（１９９３））について記載している。したがって、これらの手法は、モノクローナル抗体の単離に対する従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ法の実行可能な代替手段である。
【０３６１】
また、ＤＮＡを、例えば、相同的なマウス配列の代わりに、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置き換えることによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、又は、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部若しくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって修飾してもよい。典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換され、ある抗原への特異性を有する１つの抗原結合部位と、別の抗原への特異性を有する別の抗原結合部位と、を含む、キメラ二価抗体が形成される。
【０３６２】
本明細書に記載されるモノクローナル抗体は一価であってよく、その調製法は当該技術分野において既知である。例えば、１つの方法として、免疫グロブリン軽鎖及び修飾重鎖の組み換え発現が挙げられる。重鎖は、重鎖の架橋を防止するため、Ｆｃ領域中の任意の点において一般的に切断される。別の方法としては、架橋を防止するため、適切なシステイン残基を他のアミノ酸に置換し、又は、欠失させてもよい。一価抗体の調製には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法も適している。抗体のフラグメント、特にＦａｂフラグメントを産生するための消化は、当該技術分野において既知の従来手法を用いて実施できる。
【０３６３】
キメラ又はハイブリッド抗体も、架橋剤を含むものなどの合成タンパク質化学における既知の方法を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製できる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を構築できる。この目的のために好適な試薬の例として、イミノチオラート及びメチル−４−メルカプトブチリミダートが挙げられる。
２）ヒト化抗体
【０３６４】
抗体は、ヒト化又はヒト抗体を更に含んでよい。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はその他抗体の抗原結合サブ配列）である。ヒト化抗体として、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基で置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基で置換される。またヒト化抗体は、レシピエント抗体又は移入されたＣＤＲ若しくはフレームワーク配列においても見られない、残基も含んでよい。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全ての少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのものと一致し、全て又は実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリンのものである。ヒト化抗体は、最適には、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むだろう。Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９（１９８８）及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２）。
【０３６５】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト源から移入された１つ又は２つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には「移入」可変ドメインから取り込まれた「移入」残基と呼ばれることが多い。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒ及び共著者、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）の方法に従って、つまり、げっ歯類ＣＤＲ又はヒト抗体の配列に対応するＣＤＲ配列を置き換えることによって、本質的に実施できる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、完全なものより実質的に小さいヒト可変ドメインが、非ヒト種の対応する配列により置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基及び場合によりいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体の類似部位由来の残基で置換された、ヒト抗体である。
【０３６６】
ヒト化抗体の作製に使用される、ヒト可変ドメイン（軽鎖及び重鎖の両方）の選択は、抗原性の低減に非常に重要である。いわゆる「最適フィット」法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列について、既知のヒト可変ドメイン配列の完全ライブラリをスクリーニングする。続いて、このげっ歯類に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として認める。Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７）。別の方法は、全ヒト抗体の軽鎖及び重鎖の特定のサブグループのコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを利用するものである。いくつかのフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体に使用できる。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）。
【０３６７】
抗体が、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持したままヒト化されることが更に重要である。この目的を達成するため、好ましい方法に従って、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いる親配列及び様々な概念的ヒト化生成物の解析プロセスによって、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の推定される三次元立体配座構造を示して表示する、コンピュータプログラムが利用できる。これらの表示を精査すると、候補免疫グロブリン配列の機能におけるその残基の考えられる役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンの抗原結合能に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する親和性が増大するなど所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接的に、かつ最も実質的に関与する。
【０３６８】
種々の形態のヒト化抗体が意図される。例えば、ヒト化抗体は、免疫複合体を生成するために１つ又は２つ以上の細胞傷害性剤と任意に結合する、Ｆａｂなどの抗体フラグメントであってよい。別の方法としては、ヒト化抗体は、無傷ＩｇＧ１抗体などの無傷抗体であってよい。
【０３６９】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、抗原に対するドメインの従来の親和性を低下させることなく、かつ異種種に対する免疫原性を減少させて、修飾、例えばヒト化される。例えば、ラマ抗体の抗体可変ドメイン（ＶＨＨ）のアミノ酸残基を決定してよく、例えばフレームワーク領域内の１つ又は２つ以上のラクダ科アミノ酸を、そのポリペプチドが典型的な特性を失うことなく、すなわち、ヒト化が得られるポリペプチドの抗原結合能に顕著な影響を及ぼさずに、ヒトコンセンサス配列中に見られるヒト対応アミノ酸で置き換える。ラクダ科ｓｄＡｂのヒト化は、単一ポリペプチド鎖中の限られた量のアミノ酸の導入及び変異誘発を必要とする。これは、２本の鎖、軽鎖と重鎖のアミノ酸変化の導入と、両鎖の集合の保存を必要とする、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２及びＩｇＧのヒト化とは対照的である。
３）ヒト抗体
【０３７０】
ヒト化の代替として、ヒト抗体を産生してもよい。例えば、今では、免疫化によって、内因性免疫グロブリンを産生せずにヒト抗体の完全なレパートリーを産生可能な、トランスジェニック動物（例えば、マウス）の作製が可能である。例えば、キメラ及び生殖系変異マウスの抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ結合型欠失により、内因性抗体産生を完全に阻害すると言われている。ヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイをこのような生殖系変異マウスに導入すると、抗原誘発によってヒト抗体が産生する。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５〜２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；米国特許第５，５９１，６６９号及び国際公開第９７／１７８５２号を参照されたい。完全ヒトｓｄＡｂ産生能があるトランスジェニックマウス又はラットは、当該技術分野において既知である。例えば、米国特許出願公開第２００９０３０７７８７（Ａ１）号、米国特許第８，７５４，２８７号、米国特許出願公開第２０１５０２８９４８９（Ａ１）号、同第２０１００１２２３５８（Ａ１）号、及び国際公開第２００４０４９７９４号を参照されたい。
【０３７１】
別の方法としては、ファージディスプレイ法を用いて、非免疫化ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）領域遺伝子レパートリーからヒト抗体及び抗体フラグメントをｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造できる。ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５３（１９９０）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）。この手法によると、抗体Ｖドメイン遺伝子を、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄのメジャー又はマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかに、インフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面上の機能性抗体フラグメントとして提示する。繊維状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むため、抗体の機能性に基づく選択によって、その特性を提示する抗体をコードする遺伝子も選択する。これにより、ファージは、Ｂ細胞の一部の特性を模倣する。ファージディスプレイは、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ，ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：５６４〜５７１（１９９３）に論評されるように、様々な形態で実施できる。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイに使用できる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８（１９９１）は、免疫化マウスの脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムコンビナトリアルライブラリから、多種多様な抗オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーを構築でき、多種多様な抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７（１９９１）又はＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５〜７３４（１９９３）に記載される方法に本質的には従って単離できる。米国特許第５，５６５，３３２号及び同第５，５７３，９０５号も参照されたい。
【０３７２】
Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，の手法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できる（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６〜９５（１９９１）。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的に又は完全に不活性化されている、トランスジェニック動物、例えば、マウスに導入することによって、ヒト抗体を作製できる。誘発時、遺伝子再配列、集合、及び抗体レパートリーなどの全ての点において、ヒトで見られるものとよく似たヒト抗体産生が観察される。この方法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、並びに、次の科学文献、すなわち、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２〜１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５〜５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）及びＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３（１９９５）に記載されている。
【０３７３】
最終的に、ヒト抗体を、活性化Ｂ細胞によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生することもできる（米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号）。
４）抗体フラグメント
【０３７４】
特定の実施形態では、全抗体よりも抗体フラグメント、例えば抗原結合フラグメントを用いることが有利である。小さいサイズのフラグメントは迅速なクリアランスを可能にし、固形腫瘍へのアクセスを向上につながり得る。
【０３７５】
抗体フラグメントの産生のために、様々な手法が開発されている。従来は、これらのフラグメントは、無傷抗体のタンパク質分解によって得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄ．２４：１０７〜１１７（１９９２）；及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５））。しかし、これらのフラグメントは、今では、組み換え宿主細胞によって直接産生できる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖ抗体フラグメントは、全て、大腸菌中で発現し、そこから分泌され得るので、大量のこれらのフラグメントを容易に製造することができる。抗体フラグメントは、上記の抗体ファージライブラリから単離できる。別の方法としては、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを大腸菌から直接回収し、化学的に連結して、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成できる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３〜１６７（１９９２））。別の方法によると、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、組み換え宿主細胞培養から直接単離できる。ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が延長したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２は、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。他の実施形態では、選択される抗体は、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号、米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。抗体フラグメントは、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるような「線状抗体」であってもよい。このような線状抗体フラグメントは、単一特異性又は二重特異性であってもよい。
５）二重特異性及び多特異性抗体
【０３７６】
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、同じタンパク質又は別のタンパク質上のものなど、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。あるいは、標的抗原発現細胞に対する細胞防御機構を集中させ、局在化するために、一方のアームは標的抗原に結合でき、別のアームは、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ３）などの白血球上のトリガー分子、又は、ＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲ１（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームと結合できる。このような抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）由来であってよい。
【０３７７】
また、二重特異性抗体は、標的抗原を発現する細胞に細胞傷害性剤を局所化するためにも使用できる。このような抗体は、所望の抗原に結合する一方のアームと、細胞傷害性剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート又は放射性同位元素ハプテン）に結合する別のアームとを有する。既知の二重特異性抗体の例として、抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃｇＲＩＩＩ（国際公開第９６／１６６７３号）、抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃｇＲＩ（米国特許第５，８３７，２３４号）、抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３（米国特許第５，８２１，３３７号）が挙げられる。
【０３７８】
二重特異性抗体を作製する方法は、当該技術分野において既知である。完全長二重特異性抗体の従来の製造は、２本の免疫グロブリン重鎖／軽鎖対（この２本の鎖は異なる特異性を有する）の共発現に基づくものである。Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７〜５３９（１９８３）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の任意の組み合わせのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種類の異なる抗体分子を含む可能性がある混合物を生成し、これらのうち１種類のみが、正しい二重特異性構造を有する。通常はアフィニティクロマトグラフィー工程によって行われるが、正しい分子の精製はやや煩雑であり、生成物の収率は低い。類似の手順が、国際公開第９３／０８８２９号及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５〜３６５９（１９９１）に開示されている。
【０３７９】
異なる方法によると、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）を、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリンの重鎖定常ドメインと融合する。融合体の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む、第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、及び所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別々の発現ベクターに挿入し、好適な宿主生物に同時トランスフェクトされる。これにより、構築物に使用される３本のポリペプチド鎖の比率が異なると最適な収率が得られる実施形態において、３つのポリペプチドフラグメントの相互の割合の調節に、高い自由度を与える。しかしながら、少なくとも２本のポリペプチド鎖が同じ比率で発現すると高い収率が得られるとき、又は、比率が重要ではないときに、２本又は３本全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０３８０】
この方法の好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームに、第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームに、ハイブリッド免疫グロブリン重鎖軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）と、から構成される。この非対称構造によって、二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することで簡便な分離方法を提供するため、不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから所望の二重特異性化合物を分離することを促進することが発見された。この方法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体の生成に更なる詳細は、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【０３８１】
国際公開第９６／２７０１１号又は米国特許第５，７３１，１６８号に記載の他の方法によると、一対の抗体分子間の境界部を遺伝子操作し、組み換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化できる。好ましい境界部は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の境界部の１つ又は２つ以上の小型アミノ酸側鎖を、より大型の側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）に置換する。第２の抗体分子の境界部上に、大型アミノ酸側鎖をより小さいもの（例えば、アラニン又はスレオニン）と置換することによって、大側鎖と同一又は類似の大きさの補完「空洞部」が形成される。これは、ホモ二量体などの別の不要な最終生成物よりも、ヘテロ二量体の収率を増加させる仕組みを提供する。
【０３８２】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成するための手法は、文献に記載されている。例えば、化学的結合を用いて二重特異性抗体を調製できる。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）は、無傷抗体がタンパク質分解を受けて切断され、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる手順について記載している。これらのフラグメントは、ジチオール錯化剤である亜ヒ素ナトリウムの存在下で還元され、近接したジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止する。次に、生成されたＦａｂ’フラグメントをチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換する。その後、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つをＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体に再変換して、二重特異性抗体を形成する。作製された二重特異性抗体を、酵素の選択的固定の薬剤として使用できる。
【０３８３】
Ｆａｂ’フラグメントは、大腸菌から直接回収でき、化学的に結合させて、二重特異性抗体を形成できる。Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７〜２２５（１９９２）は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の作製について記載している。各Ｆａｂ’フラグメントを、大腸菌から別々に分泌させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで化学的結合させて、二重特異性抗体を形成した。このように形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞に結合することができると共に、ヒトの乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解作用を引き起こすことができた。
【０３８４】
二価抗体フラグメントを、組み換え細胞培養から直接作製し、単離する様々な手法についても説明されている。例えば、二価のヘテロ二量体は、ロイシンジッパーを用いて産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７〜１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結した。抗体のホモ二量体を、ヒンジ領域で還元して単量体を形成し、その後再酸化して、抗体のヘテロ二量体を形成した。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４〜６４４８（１９９３）によって説明される「ダイアボディ」法は、二重特異性／二価抗体フラグメントの作製の別の仕組みを提供している。このフラグメントは、同一鎖上で２つのドメイン間に対形成させるには短すぎるリンカーによって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。結果として、一方のフラグメントのＶＨ及びＶＬドメインが、別のフラグメントの相補的なＶＬ及びＶＨドメインと対形成させられることによって、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体を使用することによって、二重特異性／二価抗体フラグメントを作製する別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【０３８５】
３価以上の抗体が意図される。例えば、三重特異性抗体を調製してよい。Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０３８６】
例示的な二重特異性抗体は、ある分子上の２の異なるエピトープに結合し得る。あるいは、特定のタンパク質を発現している細胞に細胞防御機構を集中させるために、抗タンパク質アームは、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８又はＢ７）などの白血球上のトリガー分子、又は、ＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームと結合できる。また、二重特異性抗体は、特定のタンパク質を発現する細胞に細胞傷害性剤を局所化するためにも使用できる。このような抗体は、タンパク質結合アームと、細胞傷害性剤や放射性核種キレート剤、例えばＥＵＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ又はＴＥＴＡに結合するアームと、を有する。別の所望の二重特異性抗体は、所望のタンパク質に結合し、組織因子（ＴＦ）に更に結合する。
６）多価抗体
【０３８７】
多価抗体は、その抗体が結合する抗原を発現する細胞によって、二価抗体よりも速く内部移行（及び／又は分解）され得る。本出願のＭＡＢＰにおいて第１の抗原結合部分として使用される抗体は、３つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体（ＩｇＭクラス以外）（例えば四価抗体）であってよく、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組み換え発現によって容易に製造できる。多価抗体は、二量体化ドメイン及び３つ以上の抗原結合部位を含んでよい。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域又はヒンジ領域を含む（又はこれらからなる）。この状況では、抗体は、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端にある３つ以上の抗原結合部位とを含む。本明細書の好ましい多価抗体は、３〜約８つ、ただし好ましくは４つの抗原結合部位を含む（又はこれらからなるは）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、このときポリペプチド鎖は、２つ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含んでよく、このときＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＨ−ＣＨ１−可動性リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖、又は、ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含んでよい。本明細書の多価抗体は、好ましくは、少なくとも２つ（好ましくは４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドを更に含む。本明細書の多価抗体は、例えば、約２〜約８つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含んでよい。本明細書で意図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを含み、所望により、ＣＬドメインを更に含む。
７）ヘテロ共役抗体
【０３８８】
ヘテロ共役抗体を、本出願のＭＡＢＰの第１の抗原結合部分として用いることもできる。ヘテロ共役抗体は、共有結合した２つの抗体からなる。例えば、ヘテロ共役体中の一方の抗体をアビジンに、もう一方をビオチンに結合できる。このような抗体は、例えば、ＨＩＶ感染を治療するため、不要な細胞に対する免疫系細胞を標的化のために提案されている（米国特許第４，６７６，９８０号）。国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号、及び欧州特許第０３０８９３６号。抗体が、架橋剤を含むものなどの合成タンパク質化学における既知の方法を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製できることが意図される。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を構築できる。この目的のための好適な試薬の例として、イミノチオオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミド、及び、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されるものが挙げられる。ヘテロ共役抗体は、任意の適当な架橋法を用いて作製できる。好適な架橋剤は、当該技術分野において周知であり、多くの架橋法と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
８）エフェクター機能操作
【０３８９】
本出願のＭＡＢＰを、Ｆｃエフェクター機能に関して修飾する、例えば、抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を変更する（例えば、増強又は排除する）ことが望ましい場合がある。好ましい実施形態では、ＭＡＢＰのＦｃエフェクター機能を低減又は排除する。これは、抗体のＦｃ領域に１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成され得る。別の方法として又は追加的に、システイン残基をＦｃ領域に導入することにより、この領域での鎖間ジスルフィド結合形成を可能にできる。このように生成されたホモ二量体ＭＡＢＰは、内部移行能が向上している、及び／又は、補体媒介性細胞殺滅及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が増加していることがある。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１〜１１９５（１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８〜２９２２（１９９２）を参照されたい。向上した抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０〜２５６５（１９９３）に記載されるヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することもできる。別の方法としては、二重Ｆｃ領域を有し、それによって補体溶解及びＡＤＣＣ能が増強された抗体を操作することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９〜２３０（１９８９）を参照されたい。
【０３９０】
抗体の血清半減期を増加させるに、例えば米国特許第５，７３９，２７７号に記載されるように、ＭＡＢＰ内にサルベージ受容体結合エピトープを組み込むことができる。本明細書で使用するとき、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープであって、ＩｇＧ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期に延長に貢献するものを指す。
９）その他アミノ酸配列の修飾
【０３９１】
本明細書に記載されるＭＡＢＰの単鎖抗体又は抗体コンポーネントなどの、抗体のアミノ酸配列修飾が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又はその他生物学的特性を改善するのに望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体核酸内に適切なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。このような修飾として、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の、欠失及び／又は挿入及び／又は置換が挙げられる。最終構築物が所望の特性を有することを条件として、欠失、挿入、及び置換のいずれかの組み合わせを施して最終構築物に到達させる。アミノ酸変化により、グリコシル化部位の数や位置の変更など、抗体の翻訳後工程も変更できる。
【０３９２】
変異誘発に好ましい位置として抗体の特定の残基又は領域を同定する有用な方法は、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１〜１０８５（１９８９）に記載されている。ここでは、標的残基の１つ又は群の残基が同定され（例えば、アルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、及びグルタミン酸などの荷電残基）、中性又は負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）で置換されて、アミノ酸抗原の相互作用に影響を及ぼす。その後、置換に対する機能感受性を呈するアミノ酸位置は、置換部位に、又はそれに対して更なる又は別の変異を導入することによって洗練される。そのため、アミノ酸配列変異を導入する部位が予め定められる一方で、変異自体の性質を予め定める必要がない。例えば、ある部位における変異性能を分析するため、アラニンスキャニング又はランダム変異誘発を標的コドン又は領域にて実施し、発現した抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【０３９３】
アミノ酸配列挿入として、１つの残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまで長さに幅がある、アミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに、単一若しくは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例として、Ｎ末端がメチオニル残基である抗体、又は、細胞傷害性ポリペプチドに融合した抗体が挙げられる。抗体分子のその他の挿入変異体として、酵素に対する抗体のＮ−又はＣ末端への融合（例えば、ＡＤＥＰＴ向け）又は、抗体の血清半減期を延長するポリペプチドが挙げられる。
【０３９４】
他の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子内に、異なる残基によって置換された少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換型突然変異誘発に最も所望される部位として超可変領域が挙げられるが、ＦＲ変化も想定される。保存的置換を、「好ましい置換」という見出しで以下の表２に示す。このような置換が生物活性の変化をもたらす場合、表ＩＩに「例示的な置換」と示されているか、又はアミノ酸分類に関して以下に更に記載されているように、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングする。
【表２】
2019524693.tif 000003
【０３９５】
抗体の生物学的特性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えばシート若しくはらせん構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷若しくは疎水性、又は、（ｃ）側鎖の大きさ、を維持することについて、その効果が顕著に異なる置換を選択することによって達成される。自然に存在する残基を、共通する側鎖特性に基づいて分類する。
（１）疎水性：ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン
（２）中性親水性：システイン、セリン、スレオニン
（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸
（４）塩基性：アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン
（５）鎖の向きに影響を与える残基：グリシン、プロリン
（６）芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。
【０３９６】
非保存的置換は、これらの分類のうち１つを別の分類のものに交換することを伴う。
【０３９７】
抗体の正しい構造維持に関与していない任意のシステイン残基を、一般にはセリンと置換し、分子の酸化安定性を向上し、別の場所での架橋を防ぐこともできる。反対に、システイン結合を抗体に加え、その安定性を向上することもできる（特に、抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントのとき）。
【０３９８】
特に好ましい置換変異体の種類は、親抗体（例えばヒト化又はヒト抗体）の１つ又は２つ以上の超可変領域残基の置換を伴う。一般に、結果として得られ、更なる開発のために選択された変異体は、元になった親抗体に対して改善された生物学的特性を有するであろう。このような置換変異体を生成するための簡便な方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟を含む。簡潔に言うと、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を変異させ、各部位において可能な全てのアミノ置換を生じさせる。このようにして生成された抗体変異体を、各粒子内にパッケージングされたＭ１３のｇｅｎｅ  ＩＩＩへの融合体として、繊維状ファージ粒子から一価でディスプレイする。次に、このファージディスプレイ変異体を、本明細書に開示されるように、生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。変異に関する超可変領域部位の候補を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を行い、抗原結合に大きく寄与する超可変領域の残基を同定できる。別の方法として、又は追加的に、抗原とその標的（例えば、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７．１）との間の接点を特定するため、抗原抗体複合体の結晶構造分析が有用な場合がある。このような接触残基及び隣接する残基は、本明細書に詳述される手法による置換の候補である。このような変異体が生成されると、一連の変異体を本明細書に記載されるスクリーニングにかけ、１つ又は２つ以上の関連アッセイで優れた特性を有する抗体を、更なる開発のために選択できる。
【０３９９】
抗体のその他の種類のアミノ酸変異体は、抗体の従来のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、抗体内にある１つ又は２つ以上の炭水化物部分の欠損、及び／又は、その抗体に存在しない１つ又は２つ以上のグリコシル化部位の付加を意味する。
【０４００】
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ−結合又はＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付加を意味する。アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニンのトリペプチド配列（このとき、Ｘはプロリン以外のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付加のための認識配列である。そのため、ポリペプチド中にこれらトリペプチド配列のいずれかが存在することで、潜在的グリコシル化部位をもたらす。Ｏ−結合型グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースのうち１つへの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンの付加を指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンが用いられる場合もある。
【０４０１】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、上記トリペプチド配列のうち１つ又は２つ以上を含むように、アミノ酸配列を変更することにより簡便に達成される（Ｎ−結合型グリコシル化部位）。変更は、元の抗体の配列に１つ又は２つ以上のセリン又はスレオニン残基を付加、又はこれで置換することによっても達成できる（Ｏ−結合型グリコシル化部位）。
【０４０２】
本出願のＭＡＢＰに対するアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野において既知の様々な方法によって調製される。これらの方法として、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、又は、先に調製された変異体若しくは非変異体のオリゴヌクレオチド媒介性（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、若しくはカセット変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定されない。
１０）その他の修飾
【０４０３】
本出願のＭＡＢＰを更に修飾し、当該技術分野において既知であり、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含有することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロ−ル）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中安定性から、製造における利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であってよく、分枝型又は非分枝型であってよい。抗体に付加されたポリマー数は可変であってよく、２種類以上のポリマーが付加されている場合、それらは同一であっても異なっていてもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善する抗体の特定の性質又は機能が挙げられるが、これらに限定されない点、抗体誘導体を特定の条件下での治療に使用するか、などに基づいて決定できる。かかる手法及び別の好適な処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄ．，Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）に開示されている。
ＶＩ．キット及び製品
【０４０４】
本明細書に記載されるＭＡＢＰのうちいずれかを含む、キット、単位用量製品、及び製品が更に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物のうち任意の１つを含み、好ましくは使用説明書を提供するキットが提供される。
【０４０５】
本発明のキットは、好適なパッケージに入っている。好適なパッケージには、バイアル、ボトル、ジャー、可撓性パッケージ（例えば、密閉マイラー又はプラスチック袋）などが挙げられるが、これらに限定されない。キットは、任意追加的に、緩衝材及び解釈的情報など追加構成要素を提供してよい。したがって、本願はまた、バイアル（密閉バイアルなど）、ボトル、ジャー、可撓性パッケージなどを含む製品を提供する。
【０４０６】
製品は、容器と、この容器上にある又はこの容器に付随したラベル又は添付文書と、を含むことができる。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器などが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されてよい。一般に、容器は、本明細書に記載の疾患又は障害を処置するのに有効な組成物を保持するものであり、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈輸液バッグ又はバイアルであってよい）。ラベル又は添付文書は、組成物が、個体内の特定の状態を処置するために使用されることを表示する。ラベル又は添付文書は、組成物を個体に投与するための説明書を更に含むことになる。ラベルは、再溶解及び／又は使用に関する指示が示され得る。医薬組成物を保持する容器は、再溶解された製剤の繰り返し投与（例えば、２〜６回の投与）を可能にする、多回使用バイアルであってよい。添付文書は、治療用製品の商品パッケージに習慣的に含まれている、このような治療用製品の使用に関しての指示、使用法、用量、投与、禁忌及び／又は警告に関する情報を記載している説明書を参照する。加えて、製品は、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー液及びブドウ糖液など、医薬上許容される緩衝液を含む第２の容器を更に含んでよい。これは、他の緩衝液、希釈液、濾過器、針、及び注射器を含めて、商業上及び利用者の立場からの他の好ましい材料を更に含んでよい。
【０４０７】
キット又は製品は、医薬組成物の複数回の単位用量と、使用説明書と、を含んでよく、例えば、院内薬局及び調剤薬局など薬局での保管及び使用に十分な量でパッケージ化される。
【実施例】
【０４０８】
以下の実施例は、本発明の純粋な例示であると意図されるものであり、したがって、本発明をいかなる方法でも制限しないと見なすべきである。以下の実施例及び詳細な説明は例証のために提供され、それらには限定されない。
実施例１：ＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質の構築、発現、及び生物物理学的特徴。
【０４０９】
この実施例では、代表的なＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質（ＢＡＢＰ）の構築及び発現について説明する。それぞれ２本のポリペプチド鎖を以下のように含む、１５種類の構築物を設計して発現させた。
【０４１０】
構築物１〜３（ＢＣＰ−７３、ＢＣＰ−７４、ＢＣＰ−７５）：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（ＢＣＰ−７３にはｓｄＡｂ−１、ＢＣＰ−７４にはｓｄＡｂ−２、及びＢＣＰ−７５にはｓｄＡｂ−３）のＶＨＨドメイン、ペプチドリンカー（ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域由来の変更配列、例えば、配列番号１３）、ペンブロニズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ４の重鎖定常ドメインを含む。第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ペンブロニズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体κ軽鎖ＣＬドメインを含む。この３種類のＢＡＢＰは、図９の構成を有する。
【０４１１】
構築物４〜６（ＢＣＰ−７８、ＢＣＰ−７９、ＢＣＰ−８０）：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（ＢＣＰ−７８にはｓｄＡｂ−１、ＢＣＰ−７９にはｓｄＡｂ−２、及びＢＣＰ−８０にはｓｄＡｂ−３）のＶＨドメイン、ペプチドリンカー（配列番号１３）、ニボルマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ４の重鎖定常ドメインを含む。第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ニボルマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体κ軽鎖ＣＬドメインを含む。この３種類のＢＡＢＰは、図９の構成を有する。
【０４１２】
構築物７（ＢＣＰ−２）：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ペンブロリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、ＩｇＧ４の重鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ、配列番号１）、及び抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（ｓｄＡｂ−１）のＶＨＨドメインを含む。第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ペンブロニズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体κ軽鎖ＣＬドメインを含む。ＢＣＰ−２は、図４の構成を有する。
【０４１３】
構築物８（ＢＣＰ−１６）：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ペンブロニズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ４の重鎖定常ドメインを含む。第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（ｓｄＡｂ−１）のＶＨＨドメイン、ペプチドリンカー（ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、例えば、配列番号８）、ペンブロリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体κ軽鎖ＣＬドメインを含む。ＢＣＰ−１６は、図１３の構成を有する。
【０４１４】
構築物９（ＢＣＰ−１７）：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ペンブロニズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ４の重鎖定常ドメインを含む。第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ペンブロニズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、抗体κ軽鎖ＣＬドメイン、ペプチドリンカー（配列番号８）、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（ｓｄＡｂ−１）のＶＨＨドメインを含む。ＢＣＰ−１７は、図１１の構成を有する。
【０４１５】
構築物１０（ＢＣＰ−３１）：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（ｓｄＡｂ−１）のＶＨＨドメイン、ペプチドリンカー（配列番号１）、ペンブロニズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ４の重鎖定常ドメインを含む。第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（ｓｄＡｂ−１）のＶＨＨドメイン、ペプチドリンカー（配列番号１）、ペンブロリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体κ軽鎖ＣＬドメインを含む。ＢＣＰ−３１は、図１７の構成を有する。
【０４１６】
構築物１１（ＢＣＰ−３２）：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（ｓｄＡｂ−１）のＶＨＨドメイン、ペプチドリンカー（配列番号１）、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（ｓｄＡｂ−１）のＶＨＨドメイン、ペプチドリンカー（配列番号１）、ペンブロニズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ４の重鎖定常ドメインを含む。第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ペンブロニズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体κ軽鎖ＣＬドメインを含む。ＢＣＰ−３２は、図１８の構成を有する。
【０４１７】
構築物１２（ＢＣＰ−３３）：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ペンブロリズマブの重鎖可変領域、ＩｇＧ４の定常ＣＨ１領域、ペプチドリンカー（配列番号８）、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（ｓｄＡｂ−１）のＶＨＨドメイン、及びＩｇＧ１のＦｃ領域を含む。第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ペンブロニズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体κ軽鎖ＣＬドメインを含む。ＢＣＰ−３３は、図１９の構成を有する。
【０４１８】
構築物１３（ＢＣＰ−３４）：ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ペンブロニズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、ペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号１２）、ペンブロリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、ペプチドリンカー（配列番号８）、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（ｓｄＡｂ−１）のＶＨＨドメイン、及びＩｇＧ１のＦｃ領域を含む。ＢＣＰ−３４は、図２０の構成を有する。
【０４１９】
構築物１４（ＢＣＰ−３５）：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ペンブロリズマブの重鎖可変領域、ＩｇＧ４の定常ＣＨ１領域、ペプチドリンカー（配列番号８）、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（ｓｄＡｂ−１）のＶＨＨドメイン、ＩｇＧ４の定常ＣＨ１領域、及びＩｇＧ４のＦｃ領域を含む。第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ペンブロニズマブの軽鎖可変ドメイン、抗体κ軽鎖ＣＬドメイン、ペプチドリンカー（配列番号８）、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（ｓｄＡｂ−１）のＶＨＨドメイン、及び抗体κ軽鎖ＣＬドメインを含む。ＢＣＰ−３５は、図２１の構成を有する。
【０４２０】
構築物１５（ＢＣＰ−３６）：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ペンブロニズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、ペプチドリンカー（配列番号１２）、ペンブロリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、ペプチドリンカー（配列番号８）、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（ｓｄＡｂ−１）のＶＨＨドメイン、及びＩｇＧ１のＦｃ領域を含む。第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ（ｓｄＡｂ−１）のＶＨＨドメイン、及び抗体κ軽鎖ＣＣＬドメインを含む。ＢＣＰ−３６は、図２２の構成を有する。
【０４２１】
各ＢＡＢＰは、２コピーの第１のポリペプチドと、２コピーの第２のポリペプチドとからなる。Ｆａｂアーム交換を阻害するため、Ｓ２２８Ｐ変異をＩｇＧ４  Ｆｃ領域に導入してよい。更に、ＢＡＢＰのＦｃ領域は、異なるアイソタイプ、例えばＩｇＧ１アイソタイプのＩｇＧ  Ｆｃと交換してもよい。ＩｇＧ４アイソタイプのＦｃ領域はＦｃγＲに対する結合親和性が低いため、ＰＤ−１又はＣＴＬＡ−４陽性細胞のＡＤＣＣ介在性の枯渇を避けるために、いくつかの実施形態ではＩｇＧ１アイソタイプより好ましい。
産生
【０４２２】
上記１５種類のＢＡＢＰ構築物のプラスミドを調製し、ＣＨＯ−３Ｅ７細胞で一過性発現させた。ＢＡＢＰを一工程プロテインＡクロマトグラフィーによって精製し、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４に保存した。精製ＢＡＢＰの組成及び純度を、還元及び非還元の両方の条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ポリペプチド鎖、並びに完全長ＢＡＢＰ分子の大きさは、アミノ酸配列に基づいて計算された分子量と一致していた。溶液中のＢＡＢＰの物理学的特性を更に調べるため、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて各タンパク質を分析した。全てのＢＡＢＰが単一の主なピークを示したことは、単量体分子、すなわち、それぞれが２コピーの第１のポリペプチド鎖及び２コピーの第２のポリペプチド鎖を含む４本のポリペプチド鎖からなる二量体タンパク質である、非凝集ＢＡＢＰ分子としての物理学的均質性を示す。このデータの概要を表１に示す。表１中のデータは、ほとんどのＢＡＢＰの産生レベルが、通常のモノクローナル抗体に匹敵しており、ＢＡＢＰを哺乳類細胞で効率的に発現できることを示している。
【０４２３】
精製したＢＡＢＰを、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、マンニトール、ジエチレントリアミン五酢酸（ペンテト酸）、及びポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ｐＨ６．０を含有する溶液中に配合することもできた。
【表３】
2019524693.tif 000004
安定性分析
【０４２４】
種々のＢＡＢＰの熱安定性を、ＭＩＣＲＯＣＡＬ（商標）ＶＰ−キャピラリー示差走査熱量測定（ＤＳＣ、Ｍｉｃｒｏｃａｌ（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて調べた。ＭＩＣＲＯＣＡＬ（商標）ＶＰ−キャピラリーＤＳＣのユーザーマニュアルに従って、約３７０μＬの各ＢＡＢＰ（１ｍｇ／ｍＬ）及び対応する緩衝液を、９６ウェルのプレートに加えた。対照セル及びサンプルセルを清浄に保つため、各サンプルの実験間に洗剤洗浄プログラムを含めた。全てのサンプルを、９０℃・／時間（１．５℃／分）の走査速度で２０℃〜１００℃まで受動モードで走査した。収集したデータを、ＯＲＧＩＮ（商標）７．０（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）系のＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣソフトウェアを使用して分析した。全サーモグラムから対照とベースラインを差し引いて、タンパク質変性の見かけ上の中間点（Ｔｍ）及び見かけ上のエンタルピー（ΔＨ）を得た。様々なＢＡＢＰの変性中間点温度（Ｔｍ）を、表２（ＤＳＣ）に示す。
【０４２５】
加熱中のより大きなタンパク質凝集体の形成を、動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて監視した。１．５ｍｇ／ｍＬのサンプルについて、約０．７５℃の温度間隔で２５℃〜７５℃の温度勾配を、ＤＹＮＡＰＲＯ（登録商標）ＮＡＮＯＳＴＡＲ（登録商標）プレートリーダー（Ｗｙａｔｔ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））を用いて行った。２０μＬの各ＢＡＢＰサンプルを、ＷＹＡＴＴ（登録商標）使い捨てキュベットに加え、その後、蒸発を防ぐためにサンプルを１０μＬの鉱物油（Ｓｉｇｍａ  ８４１０）でカバーした。測定は３回行い（各測定当たり５回取得）、各ＢＡＢＰサンプルを平均した。選択された温度間隔での実験中、熱走査速度は１．５℃／分と算出された。目標温度である７５℃に達するまで熱を連続的に加えながら（〜４０分）、各サンプルを測定した。凝集温度（Ｔａｇｇ）を、ＤＹＮＡＭＩＣＳ（商標）７．６．０．４８ソフトウェア（Ｗｙａｔｔ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））におけるオンセット分析法を用いて分析した。様々なＢＡＢＰの測定した凝集開始温度（Ｔａｇｇ）を表２に示す。
【表４】
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【０４２６】
ヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）中、＞５０ｍｇ／ｍＬ濃度のＢＡＢＰサンプルを、４℃、２５℃、３７℃の一定温度で７日間インキュベートした。同様の組のサンプルについて、５回の凍結融解も行った。全てのサンプルの無傷の完全モノマー分子の画分をＳＥＣ−ＨＰＬＣで評価し、データを記録して、製造業者によって提供されたＣＨＲＯＭＥＬＥＯＮ（商標）ソフトウェアを使用して解析した。表３は、ＢＡＢＰが、加熱条件下において、９０％を超える完全性を維持していたことを示す。
【表５】
2019524693.tif 000006
溶解性分析
【０４２７】
精製したＢＡＢＰの溶解性について特徴を確認するため、１ｍｇ／ｍＬの各ＢＡＢＰ１０ｍｇを、ＭＩＣＲＯＣＯＮ（登録商標）−３０ｋＤＡ遠心濃縮器（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に、〜２．５ｍＬの量で加え、４０００×ｇ（４℃）で遠心分離した。量を定期的に確認し、残りのタンパク質溶液を使い切るまで、濃縮期にタンパク質を加えた。量が〜２０μＬに達するか、又は、減少が止まるまで、濃縮を２時間続けた。１μＬの濃縮ＢＡＢＰを１９９μＬの各対応する緩衝液に希釈して得られたサンプルのＵＶ測定を行うことによって、濃度を求めた。ＢＡＢＰを各対応する緩衝液で１ｍｇ／ｍＬに希釈後、分析用ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いてサンプルの凝集について評価した。表４は、ＢＡＢＰが、これらのストレス条件下において、完全性を維持していたことを示す。
【０４２８】
相互作用クロマトグラフィー（ＣＩＣ）カラムを用いて、精製したＢＡＢＰの溶解性も測定した。プールしたマウス血清から精製したマウスポリクローナル抗体を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（Ｉ５３８１）。マウスポリクローナル抗体は、〜３０ｍｇ／ｍＬで樹脂マトリックスに結合されていた。ＰＢＳ緩衝液中の精製ＢＡＢＰを、それぞれ０．０５〜０．２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で、マウスＩｇＧ結合カラム及び対照カラムに注入した。保持時間を用いて、表４に報告する保持係数ｋ’値を算出した。ｋ’＝（Ｖｒ−Ｖｏ）／Ｖｏ＝（Ｔｒ−Ｔｍ）／Ｔｍ。Ｖｒは、タンパク質結合カラムでのサンプルの溶出量を表し、Ｖｏは、対照カラムからの溶出量を表し、Ｔｒは、タンパク質結合カラムにおける保持時間を表し、Ｔｍは対照カラムにおける保持時間を表す。同一カラムにおいて、多くのサンプルを２回実験した。ｋ’値＞０．６である抗体は、一般に、顕著に溶解性が低い。表４によると、全てのＢＡＢＰが優れた溶解性を示した。
【表６】
2019524693.tif 000007
実施例２：ＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能性アッセイ。
【０４２９】
実施例１に記載の１５種類の代表的なＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質（ＢＡＢＰ）を、次のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで試験し、ＢＡＢＰによるＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４の機能的遮断を評価した。
標的結合アッセイ
【０４３０】
ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４へのＢＡＢＰの結合能は、表面プラズモン共鳴法（例えば、ＢＩＯＡＣＯＲＥ（登録商標））、酵素結合免疫吸着測定法、蛍光支援セルソーター法（ＦＡＣＳ）、又はこれらの組み合わせを用いて測定できる。分析は、活性化したＴ細胞で実施できる。
【０４３１】
ＣＨＯ細胞に発現したＰＤ−１への様々なＢＡＢＰの結合親和性を、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）−系アッセイを用いて測定した。ＦＡＣＳ分析用一次抗体として、ＢＡＢＰサンプルを調製した（１μＭから開始し、３倍の段階希釈で１０濃度）。ヒトＰＤ−１を発現しているＣＨＯ細胞を、接着培養フラスコから剥がし、様々な濃度のＢＡＢＰサンプルと混合した（両方とも９６−ウェルプレートで）。ペンブロニズマブ（例えば、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））又はニボルマブ（例えば、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））を、抗ＰＤ−１抗体陽性対照として用いた。混合物を、室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、二次抗体として使用されるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−共役抗ヒトκ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を加え、室温で１５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。データを、非直線回帰を用いてＰＲＩＳＭ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））で解析し、ＥＣ５０値を算出した。表５に示されるように、ＦＡＣＳ結合アッセイにより、ＢＡＢＰが、それぞれペンブロニズマブ（例えば、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））及びニボルマブ（例えば、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））に匹敵するＰＤ−１結合親和性を保持していたことが示された。
【０４３２】
ＣＨＯ細胞に発現したＣＴＬＡ−４への１５種類のＢＡＢＰの結合親和性を、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）−系アッセイを用いて測定した。ＦＡＣＳ分析用一次抗体として、ＢＡＢＰサンプルを調製した（１μＭから開始し、３倍の段階希釈で１０濃度）。ヒトＣＴＬＡ−４を発現しているＣＨＯ細胞を、接着培養フラスコから剥がし、様々な濃度の抗体と混合した（両方とも９６−ウェルプレートで）。ｓｄＡｂ−１−Ｆｃ、ｓｄＡｂ−２−Ｆｃ、ｓｄＡｂ−３−Ｆｃ、及びイピリムマブ（例えば、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））を、抗ＣＴＬＡ−４抗体陽性対照として用いた。混合物を、室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、二次抗体として使用されるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−共役抗ヒトκ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を加え、室温で１５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。データを、非直線回帰を用いてＰＲＩＳＭ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））で解析し、ＥＣ５０値を算出した。表５に示されるように、ＦＡＣＳ結合アッセイにより、ＢＡＢＰが、Ｆｃに融合した対応するｓｄＡｂに匹敵するＣＴＬＡ−４への結合親和性を呈することが示された。また、ＢＡＢＰは、イピリムマブ（例えば、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））に匹敵するＣＴＬＡ−４への結合親和性を示した。
【０４３３】
ＢＡＢＰのＰＤ−１に対する結合動態を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー、ＢＩＯＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて測定した。５０ｎＭから開始し、３倍の段階希釈によって、異なる濃度のＢＡＢＰサンプルを調製した。各ＢＡＢＰサンプルを、Ｆｃ捕捉法によってセンサーチップ上に固定した。抗原のＰＤ−１を、分析物として使用した。解離（ｋｄ）及び会合（ｋａ）速度定数は、ＢＩＯＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００評価用ソフトウェアを使用して得た。見かけの平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｄのｋａに対する割合から算出した。表５に示されるように、ＢＡＢＰは、ペンブロニズマブ（例えば、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））及びニボルマブ（例えば、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））に匹敵するＰＤ−１に対する結合動態を保持した。
【０４３４】
ＢＡＢＰのＣＴＬＡ−４に対する結合動態を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー、ＢＩＯＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて測定した。２００ｎＭから開始し、３倍の段階希釈によって、異なる濃度のＢＡＢＰサンプルを調製した。各ＢＡＢＰサンプルを、Ｆｃ捕捉法によってセンサーチップ上に固定した。抗原のＣＴＬＡ−４を、分析物として使用した。解離（ｋｄ）及び会合（ｋａ）速度定数は、ＢＩＯＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００評価用ソフトウェアを使用して得た。見かけの平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｄのｋａに対する割合から算出した。表５に示されるように、結合動態により、ＢＡＢＰが、Ｆｃに融合した対応するｓｄＡｂに匹敵するＣＴＬＡ−４への結合動態を呈することが示された。また、ＢＡＢＰは、バイオシミラーのイピリムマブと匹敵するＣＴＬＡ−４への結合動態を有している。
【表７】
2019524693.tif 000008
ＦＡＣＳ分析によるリガンド結合の阻害
【０４３５】
ＢＡＢＰによるリガンド結合の阻害を、ＦＡＣＳアッセイを用いて評価した。
【０４３６】
ＢＡＢＰによるＰＤ−Ｌ１の阻害を評価するため、ＢＡＢＰサンプルを調製した（１μＭから開始し、３倍の段階希釈で１０濃度）。ヒトＰＤ−１を発現しているＣＨＯ細胞を、接着培養フラスコから剥がし、様々な濃度の各ＢＡＢＰ及び、ビオチンラベルを有する０．５μＭ  ｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質と混合した。バイオシミラーのペンブロリズマブ又はバイオシミラーのニボルマブを、抗ＰＤ−１抗体陽性対照として使用した。混合物を、室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。次に、ＰＥ／Ｃｙ５ストレプトアビジン二次抗体を混合物に加え、室温で１５分間インキュベートした。続いて、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。データを、非直線回帰を用いてＰＲＩＳＭ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））で解析し、ＩＣ５０値を算出した（表５）。競合アッセイにより、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用に対する、低濃度（１〜１０μｇ／ｍＬ）でのＢＡＢＰの効率的阻害能が示された。表５の結合データは、代表的なＰＤ１／ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰの機能活性が、ペンブロニズマブ（例えば、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））及びニボルマブ（例えば、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））に非常に類似していることを示している。
【０４３７】
ＢＡＢＰによるＢ７−１（ＣＴＬＡ−４のリガンド）の阻害を評価するため、ＢＡＢＰサンプルを調製した（１μＭから開始し、３倍の段階希釈で１０濃度）。ヒトＢ７−１を発現しているＣＨＯ細胞を、接着培養フラスコから剥がし、様々な濃度の各ＢＡＢＰ及び、ビオチンラベルを有する０．５μＭ  ｈＣＴＬＡ−４−Ｆｃ融合タンパク質と混合した。ｓｄＡｂ−１−Ｆｃ、ｓｄＡｂ−２−Ｆｃ、ｓｄＡｂ−３−Ｆｃ、及びイピリムマブ（例えば、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））を、抗ＣＴＬＡ−４抗体陽性対照として用いた。混合物を、室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。次に、ＰＥ／Ｃｙ５ストレプトアビジン二次抗体を混合物に加え、室温で１５分間インキュベートした。続いて、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。データを、非直線回帰を用いてＰＲＩＳＭ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））で解析し、ＩＣ５０値を算出した（表５）。競合アッセイにより、ＣＴＬＡ４−Ｂ７−１相互作用に対する、低濃度（１〜１０μｇ／ｍＬ）でのＢＡＢＰの効率的阻害能が示された。表５の結合データは、代表的なＰＤ１／ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰの機能活性が、対応するＦｃに融合したｓｄＡｂ及びバイオシミラーのイピリムマブに類似していることを示している。
【０４３８】
ＢＡＢＰの発現特性及び二重結合特性は、４本鎖抗体のＶＨ及びＶＬの適切な対によって形成される抗原結合部位が提供する第１の特異性と、ＶＨＨが提供する第２の特異性と、を有する、ＢＡＢＰの二重特異性を明らかに示している。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイ
【０４３９】
ＢＡＢＰによるＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４経路の遮断は、Ｔ細胞増殖、ＩＦＮ−γ放出、ＩＬ−２分泌、又はＰＤ−１若しくはＣＴＬＡ−４経路のシグナル伝達によって駆動されるレポーター遺伝子の発現を監視する、種々バイオアッセイを用いて調べることができる。
【０４４０】
ＢＣＰ−７３、ＢＣＰ−７４、ＢＣＰ−７５、ＢＣＰ−７８、ＢＣＰ−７９及びＢＣＰ−８０の６種類のＢＡＢＰを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物活性評価のために選択した。ＰＤ−１／ＮＦＡＴレポーター−ジャーカット細胞を用いるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１細胞系アッセイでの抗ＰＤ−１中和抗体の生物活性の特徴を、表６に示す。この場合では、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ヒトＰＤ−Ｌ１及び遺伝子操作を受けたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化剤によって安定的に発現した。エフェクター細胞−ＰＤ−１／ＮＦＡＴレポータージャーカット細胞を、段階希釈したＢＡＢＰと３０分間予備インキュベートし、その後、遺伝子操作を受けたＣＨＯ−Ｋ１細胞と共に培養した。刺激〜６時間後、ＯＮＥ−ＳＴＥＰ（商標）ルシフェラーゼ試薬を細胞に加え、ＮＦＡＴ活性を測定した。データを、非直線回帰を用いてＰＲＩＳＭ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））で解析し、ＥＣ５０値を算出した。レポーターアッセイにより、ペンブロニズマブ（例えば、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、及びニボルマブ（例えば、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））と同様の、全てのＢＡＢＰのＮＦＡＴシグナルの効率的活性化能が示された。
【表８】
2019524693.tif 000009
【０４４１】
二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ−４細胞系遮断アッセイを用いる表６に示されるように、ＣＴＬＡ−４とＢ７−１との間の結合を効率的に阻害することがわかる。簡潔に言うと、単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって、ＰＢＭＣからヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞を精製した。各ウェルには、１０５個のＣＤ４＋  Ｔ細胞と、１０４個のＣＨＯ−Ｋ１／ヒトＣＤ８０（ヒトＣＤ８０を安定的に発現しているＣＨＯ−Ｋ１）を、最終実用量２００μＬで含めた。二重特異性抗体を、各ウェルに異なる濃度で加えた。抗体無添加を、バックグラウンド対照として使用した。ヒトＩｇＧ４を陰性対照として使用し、イピリムマブ（例えば、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））を陽性抗ＣＴＬＡ４抗体対照として使用した。ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｚ０３３７３−５０）を系に加え、反応を開始した。３７℃／５％  ＣＯ２インキュベーター中で２４時間のインキュベーション後、ＩＬ−２測定（Ｃｉｓｂｉｏ）のために各試験ウェルから１００μＬの培地を取り出した。ＣＴＬＡ−４遮断バイオアッセイでは、Ｔ細胞によるＩＬ−２の抗体濃度依存性分泌を利用して、試験抗体に対するＥＣ５０値を抽出するとともに、陽性対照である完全長抗ＣＴＬＡ−４抗体イピリムマブ（例えば、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））についても抽出した。
【０４４２】
ＢＡＢＰであるＢＣＰ−７４、ＢＣＰ−７５、ＢＣＰ−７９及びＢＣＰ−８０によるＰＤ−１経路の阻害は、ＰＤ−Ｌ１を発現している標的細胞（樹状細胞など）、活性化Ｔ細胞、及び各ＢＡＢＰを含む混合リンパ球反応液（ＭＬＲ）における、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γの分泌レベルを測定することによって調べた。単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＰＢＭＣからヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞及び同種単球を精製する。単球を樹状細胞に導入した。各ウェルには、１０５個のＣＤ４＋  Ｔ細胞と、１０４個の同種樹状細胞を、最終実用量２００μＬで含める。各ＢＡＢＰを、各ウェルに異なる濃度で加えた。抗体を含まないウェルを、バックグラウンド対照として使用した。ヒトＩｇＧ４を陰性対照として使用し、ペンブロニズマブ（例えば、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））を陽性抗ＰＤ−１抗体対照として使用した。５％  ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて７２時間のインキュベーション後、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γ測定（Ｃｉｓｂｉｏ）のために各試験ウェルから１００μＬの培地を取り出した。ＭＬＲ中のＩＬ−２及びＩＦＮ−γの濃度依存性分泌を利用して、ＰＤ−１に対するＢＡＢＰのＥＣ５０値を抽出し、対照ＰＤ−１抗体のＥＣ５０値と比較する（対照抗体は、ペンブロリズマブ例えば、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）である）。表７に示されるように、種々ＢＡＢＰは、ペンブロリズマブ（例えば、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））に匹敵する阻害力を呈する。
【表９】
2019524693.tif 000010
実施例３：ＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果。
【０４４３】
この実施例は、ＢＡＢＰのＢＣＰ−７５及びＢＣＰ−７９によるＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４の機能的遮断を評価する、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験について記載する。抗腫瘍効果は、ヒトＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１ノックインマウスにより腫瘍をきたしたモデルにおいて評価した。マウスにおけるＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１の両方のヒト化により、マウス腫瘍異種移植モデルでのＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰの効果の、ｉｎ  ｖｉｖｏでの直接評価を可能にした。
【０４４４】
マウス異種移植モデルは、腫瘍細胞をＮＳＧマウスに導入することによって作製できる。ＭＣ３８（マウス結腸腺癌細胞株）及びＣＴ２６（マウス結腸癌細胞株）などの腫瘍細胞株を用いて、結腸癌に対するマウスモデルを作製できる。マウス黒色腫細胞株であるＢ１６を用いて、黒色腫に対するマウスモデルを作製できる。マウス腎皮質腺癌細胞株であるＲｅｎｃａを用いて、腎癌に対するマウスモデルを作製できる。
【０４４５】
６〜８週齢のヒトＰＤ−１  ＫＩ雌性Ｃ５７／ＢＬ６マウスの背側下部を剃毛し、１×１０６個の結腸癌細胞株ＭＣ３８（７５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の標準濃度のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の懸濁液５０μＬ中）を皮下注入した。目視によって７日以内に腫瘍が生着しなかったマウスは、続く実験から除外した。ＭＣ３８の生着後の７日目に開始し、腫瘍を毎日測定した。マウスを個々に処置コホートに分類し、全例について生着約１０日後の、腫瘍が閾値である１５０ｍｍ３に達したときのみ、処置を開始した。処置期間中、デジタルノギス測定値及び体重測定値を３日毎に取得した。この実験では、１０ｍｇ／ｋｇのバイオシミラーのペンブロリズマブ、１０ｍｇ／ｋｇのバイオシミラーのニボルマブ、又は１２．３ｍｇ／ｋｇのＢＡＢＰ（ＢＣＰ−７５又はＢＣＰ−７９）にて、マウスを１６日間静脈内注射により処置した。この処置を４日毎に与えた。図２３に示されるように、ＢＣＰ−７５及びＢＣＰ−７９は両方とも、ＭＣ３８同系マウスモデルにおいて効果的に腫瘍増殖を制御し、バイオシミラーのペンブロニズマブ及びバイオシミラーのニボルマブに匹敵する機能活性を示した。モック対照と比較して、３つの処置群はいずれも、ＭＣ３８移植マウスの体重に影響を与えなかった（データなし）。
【０４４６】
６〜８週齢のヒトＣＴＬＡ−４  ＫＩ雌性Ｃ５７／ＢＬ６マウスの背側下部を剃毛し、１×１０６個の結腸癌細胞株ＭＣ３８（７５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の標準濃度のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の懸濁液５０μＬ中）を皮下注入した。目視によって７日以内に腫瘍が生着しなかったマウスは、続く実験から除外した。ＭＣ３８の生着後の７日目に開始し、腫瘍を毎日測定した。マウスを個々に処置コホートに分類し、全例について生着約１０日後の、腫瘍が閾値である１５０ｍｍ３に達したときのみ、処置を開始した。処置期間中、デジタルノギス測定値及び体重測定値を３日毎に取得した。この実験では、１０ｍｇ／ｋｇのバイオシミラーのイピリムマブ、１２．３ｍｇ／ｋｇのＢＡＢＰ（ＢＣＰ−７５又はＢＣＰ−７９）、又は６．７ｍｇ／ｋｇのｓｄＡｂ−２−Ｆｃ若しくはｓｄＡｂ−３−Ｆｃにて、マウスを１６日間静脈内注射により処置した。この処置を４日毎に与えた。図２４に示されるように、ＢＣＰ−７５及びＢＣＰ−７９は両方とも、ＭＣ３８同系マウスモデルにおいて効果的に腫瘍増殖を制御し、ｓｄＡｂ−２−Ｆｃ及びｓｄＡｂ−３−Ｆｃに匹敵する機能活性を示した。モック対照と比較して、３つの処置群はいずれも、ＭＣ３８移植マウスの体重に影響を与えなかった（データなし）。
実施例４：ＰＤ−Ｌ１／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質の構築、発現、及び生物物理学的特徴。
【０４４７】
この実施例では、代表的なＰＤ−Ｌ１／ＣＴＬＡ−４  ＢＡＢＰの構築及び発現について説明する。それぞれ２本のポリペプチド鎖を以下のように含む、２種類の構築物を設計して発現させた。
【０４４８】
ＢＣＰ−８４：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−２のＶＨＨドメイン、ペプチドリンカー（配列番号１３）、アテゾリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及び非グリコシル化ＩｇＧ１の重鎖定常ドメインを含む。第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、アテゾリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体κ軽鎖ＣＬドメインを含む。ＢＣＰ−８４は、図９の構成を有する。
【０４４９】
ＢＣＰ−８５：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂ−３のＶＨＨドメイン、ペプチドリンカー（配列番号１３）、アテゾリズマブの重鎖可変ドメインＶＨ、及び非グリコシル化ＩｇＧ１の重鎖定常ドメインを含む。第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、アテゾリズマブの軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体κ軽鎖ＣＬドメインを含む。ＢＣＰ−８５は、図９の構成を有する。
【０４５０】
ＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５はそれぞれ、２コピーの第１のポリペプチドと、２コピーの第２のポリペプチドとからなる。構築物のＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、非グリコシル化ＩｇＧ１である。更に、二重特異性抗原結合タンパク質のＦｃ領域は、異なるアイソタイプ、例えば、Ｓ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４に対する野生型ＩｇＧ１アイソタイプのＩｇＧ  Ｆｃと交換してもよい。非グリコシル化ＩｇＧアイソタイプのＦｃ領域はＦｃγＲに対する結合親和性がないため、ＰＤ−Ｌ１又はＣＴＬＡ−４陽性細胞のＡＤＣＣ介在性の枯渇を避けるために、いくつかの実施形態では野生型ＩｇＧ１アイソタイプより好ましい。
産生
【０４５１】
ＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５のプラスミドを調製し、ＣＨＯ細胞で一過性発現させた。ＢＡＢＰを一工程プロテインＡクロマトグラフィーによって精製し、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４に保存した。精製ＢＡＢＰの組成及び純度を、還元及び非還元の両方の条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ポリペプチド鎖、並びにＢＡＢＰ分子の完全長タンパク質の大きさは、アミノ酸配列に基づいて計算された分子量と一致していた。溶液中の２種のＢＡＢＰの物理学的特性を更に調べるため、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて各タンパク質を分析した。両ＢＡＢＰが単一の主なピークを示したことは、単量体ＢＡＢＰ分子としての物理学的均質性を示す。このデータの概要を表８に示す。
【表１０】
2019524693.tif 000011
安定性分析
【０４５２】
ＢＡＢＰの熱安定性及び凝集度を測定するため、ＤＳＣ（示差走査熱量測定）及びＤＬＳ（動的光散乱）の実験を、実施例１に記載するように実施した。表９に示されるように、ＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５のＴｍ及びＴａｇｇは、バイオシミラーのアテゾリズマブ（例えば、ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標））に匹敵している。
【表１１】
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実施例５：ＰＤ−Ｌ１／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能性アッセイ。
【０４５３】
ＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５を、次のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで試験し、ＢＡＢＰによるＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４の機能的遮断を評価した。
標的結合アッセイ
【０４５４】
ＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４へのＢＡＢＰの結合能は、表面プラズモン共鳴法（例えば、ＢＩＯＡＣＯＲＥ（登録商標））、酵素結合免疫吸着測定法、蛍光支援セルソーター法（ＦＡＣＳ）、又はこれらの組み合わせを用いて測定できる。分析は、活性化したＴ細胞で実施できる。
【０４５５】
ＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４の安定発現細胞株に発現したＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４への各ＢＡＢＰの結合を、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）−系アッセイを用いて測定した。ＢＡＢＰサンプルを調製し（１μＭから開始し、３倍の段階希釈で１０濃度）、ＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４細胞とインキュベートした。ＢＡＢＰのＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５に結合した細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。ＥＣ５０は、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（商標）バージョン６．０で算出した。
【０４５６】
ＰＤ−Ｌ１へのＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５の結合動態は、ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）に捕捉されたＨｉｓタグ付きヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質を用いて決定した。５０ｎＭから開始し、３倍の段階希釈によって、各ＢＡＢＰの６段階の異なるサンプルを調製した。各ＢＡＢＰサンプルを抗原コーティングしたチップ上に流し、表面プラズモン共鳴法を使用して結合活性を測定した。
【０４５７】
ＣＴＬＡ−４へのＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５の結合動態は、ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）にコーティングされたＨｉｓタグ付きヒトＣＴＬＡ−４タンパク質を用いて決定した。２００ｎＭから開始し、２倍の段階希釈によって、各ＢＡＢＰの６段階の異なるサンプルを調製した。各ＢＡＢＰサンプルを抗原コーティングしたチップ上に流し、表面プラズモン共鳴法を使用して結合活性を測定した。
【０４５８】
表１０に、ＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４へのＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５の親和性データを示す。
ＦＡＣＳ分析によるリガンド結合の阻害
【０４５９】
ＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５によるリガンド結合の阻害を、ＦＡＣＳアッセイによって評価した。
【０４６０】
ＢＡＢＰによるＰＤ−Ｌ１の阻害を評価するため、ヒトＰＤ−１を発現しているＣＨＯ細胞を、接着培養フラスコから剥がし、様々な濃度の各ＢＡＢＰ（１μＭから開始し、３倍の段階希釈で１０濃度）及び、ビオチンラベルを有する０．１μＭ  ｈＰＤ−１−Ｆｃ融合タンパク質と混合した。混合物を、室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。次に、ＰＥ／Ｃｙ５ストレプトアビジン二次抗体を混合物に加え、室温で１５分間インキュベートした。続いて、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。データを、非直線回帰を用いてＰＲＩＳＭ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））で解析してＩＣ５０値を算出し、表１０に示す。競合アッセイにより、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用に対する、バイオシミラーのアテゾリズマブと同様のＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５の効率的阻害能が示される。
【０４６１】
ＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５によるＢ７−１（ＣＴＬＡ−４リガンド）の阻害を評価するため、ヒトＢ７−１を発現しているＣＨＯ細胞を、接着培養フラスコから剥がし、様々な濃度の各ＢＡＢＰ（１μＭから開始し、３倍の段階希釈で１０濃度）及び、ビオチンラベルを有する０．１μＭ  ｈＣＴＬＡ−４−Ｆｃ融合タンパク質と混合した。混合物を、室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。次に、ＰＥ／Ｃｙ５ストレプトアビジン二次抗体を混合物に加え、室温で１５分間インキュベートした。続いて、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。データを、非直線回帰を用いてＰＲＩＳＭ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））で解析してＩＣ５０値を算出し、表１０に示す。競合アッセイにより、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１相互作用に対する、対応するｓｄＡｂ−Ｆｃ及びイピリムマブ（例えば、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））と同様のＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５の効率的阻害能が示される。
【表１２】
2019524693.tif 000013
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイ
【０４６２】
ＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５によるＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４経路の遮断は、Ｔ細胞増殖、ＩＦＮ−γ放出、ＩＬ−２分泌、又はＰＤ−１若しくはＣＴＬＡ−４経路のシグナル伝達によって駆動されるレポーター遺伝子の発現を監視する、種々バイオアッセイを用いて調べることができる。
【０４６３】
表１１は、ＰＤ−１／ＮＦＡＴレポーター−ジャーカット細胞を用いるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１細胞系アッセイでの抗ＰＤ−１中和抗体の生物活性に関するデータを示す。簡潔に言うと、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ヒトＰＤ−Ｌ１及び遺伝子操作を受けたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化剤によって安定的に発現した。エフェクター細胞−ＰＤ−１／ＮＦＡＴレポータージャーカット細胞を、段階希釈したＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５と３０分間予備インキュベートし、その後、遺伝子操作を受けたＣＨＯ−Ｋ１細胞と共に培養した。刺激〜６時間後、ＯＮＥ−ＳＴＥＰ（商標）ルシフェラーゼ試薬を細胞に加え、ＮＦＡＴ活性を測定した。データを、非直線回帰を用いてＰＲＩＳＭ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））で解析してＥＣ５０値を算出し、表１１に示す。競合アッセイにより、バイオシミラーのアテゾリズマブと同様の、ＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５の効率的ＮＦＡＴシグナル活性化能が示される。
【０４６４】
ＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５によるＰＤ−Ｌ１経路の阻害は、ＰＤ−Ｌ１を発現している標的細胞（樹状細胞など）、活性化Ｔ細胞、及びＢＡＢＰを含む混合リンパ球反応液（ＭＬＲ）における、ＩＬ−２の分泌レベルを測定することによって調べた。簡潔に言うと、単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＰＢＭＣからヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞及び同種単球を精製した。単球を樹状細胞に導入した。各ウェルには、１０５個のＣＤ４＋  Ｔ細胞と、１０４個の同種樹状細胞を、最終実用量２００μＬで含めた。各ＢＡＢＰを、各ウェルに異なる濃度で加えた。抗体を含まないウェルを、バックグラウンド対照として使用した。ヒトＩｇＧ１を陰性対照として使用し、バイオシミラーのアテゾリズマブを陽性抗ＰＤ−Ｌ１抗体対照として使用した。５％  ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて７２時間のインキュベーション後、ＩＬ−２測定（Ｃｉｓｂｉｏ）のために各試験ウェルから１００μＬの培地を取り出した。ＭＬＲ中のＩＬ−２の濃度依存性分泌を利用して、ＰＤ−Ｌ１に対するＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５のＥＣ５０値を抽出し、元の抗体であるアテゾリズマブのＥＣ５０値と比較した（表１２参照）。
【０４６５】
ＢＡＢＰによるＣＴＬＡ−４経路の阻害は、ＣＤ８０を発現している標的細胞、活性化Ｔ細胞、及び各ＢＡＢＰを含む混合リンパ球反応液における、ＩＬ−２の分泌レベルを測定することによって調べた。単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＰＢＭＣからヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞を精製した。各ウェルには、１０５個のＣＤ４＋  Ｔ細胞と、１０４個のＣＨＯ−Ｋ１／ヒトＣＤ８０（ヒトＣＤ８０を安定的に発現しているＣＨＯ−Ｋ１）を、最終実用量２００μＬで含めた。各ＢＡＢＰを、各ウェルに異なる濃度で加えた。抗体を含まないウェルを、バックグラウンド対照として使用した。ヒトＩｇＧ４を陰性対照として使用し、イピリムマブ（例えば、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））を陽性抗ＣＴＬＡ４抗体対照として使用した。ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｚ０３３７３−５０）を系に加え、反応を開始した。５％  ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて２４時間のインキュベーション後、ＩＬ−２測定（Ｃｉｓｂｉｏ）のために各試験ウェルから１００μＬの培地を取り出した。ＣＴＬＡ−４遮断バイオアッセイでのＩＬ−２の濃度依存性分泌を利用して、ＣＴＬＡ−４に対するＢＡＢＰのＥＣ５０値を抽出し、対照ＣＴＬＡ−４抗体のＥＣ５０値と比較した（対照抗体は、イピリムマブ（例えば、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））である）（表１１参照）。
【表１３】
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【表１４】
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実施例６：ＰＤ−Ｌ１／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗原結合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果。
【０４６６】
この実施例は、ＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５によるＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４の機能的遮断を評価する、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験について記載する。抗腫瘍効果は、ヒトＣＴＬＡ−４ノックインマウスにより腫瘍をきたしたモデルにおいて評価した。バイオシミラーのアテゾリズマブもマウスＰＤ−Ｌ１に結合するため、マウスにおけるＣＴＬＡ−４のヒト化により、マウス腫瘍異種移植モデルでのＢＡＢＰであるＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５の効果の、ｉｎ  ｖｉｖｏでの直接評価を可能にした。
【０４６７】
マウス異種移植モデルは、腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ／６  ＣＴＬＡ−４  ＫＩマウスに導入することによって作製した。このアッセイには、ヒトＰＤ−Ｌ１を安定発現しているマウス結腸腺癌細胞株ＭＣ３８を使用した。ＭＣ３８−ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＫＩ細胞（１０７個）を、８週齢のＣ５７ＢＬ／６  ＣＴＬＡ−４  ＫＩマウスに皮下注射した。腫瘍サイズをノギスでを測定し、楕円の公式を改変した長さ×（幅）２／２によって、腫瘍量を計算した。腫瘍量が約９０〜１３０ｍｍ３に達したとき、マウスを無作為に異なる処置群に割り当て、２〜６週間維持した。マウスには、腹腔内注射によって、溶媒対照、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（バイオシミラーのアテゾリズマブ）、抗ＣＴＬＡ−４抗体（ｓｄＡｂ−２−Ｆｃ、又はｓｄＡｂ−３−Ｆｃ）、バイオシミラーのアテゾリズマブ及び抗ＣＴＬＡ−４抗体（ｓｄＡｂ−２−Ｆｃ、又はｓｄＡｂ−３−Ｆｃ）の併用、又はＢＡＢＰ（ＢＣＰ−８４又はＢＣＰ−８５）を投与した。ＢＡＢＰの効果は、腫瘍サイズ及び腫瘍重量の阻害を調べることによって評価した。
【０４６８】
図２５に示されるように、マウス腫瘍モデルにおいて、バイオシミラーのアテゾリズマブと抗ＣＴＬＡ−４抗体（ｓｄＡｂ−２−Ｆｃ、又はｓｄＡｂ−３−Ｆｃ）の併用は、いずれの単剤療法よりも高い腫瘍阻害効果を示した。特に、ＢＣＰ−８４及びＢＣＰ−８５の抗腫瘍効果は、併用療法に匹敵していた。
実施例７：Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗原結合タンパク質の構築、発現、及び生物物理学的特徴。
【０４６９】
この実施例では、代表的なＡｎｇ２／ＶＥＧＦ  ＢＡＢＰの構築及び発現について説明する。それぞれ２本のポリペプチド鎖を以下のように含む、４種類の構築物を設計して発現させた。
【０４７０】
構築物１（ＢＣＰ−４９）：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、抗ＶＥＧＦ  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン、ペプチドリンカー（配列番号１３）、ＬＣ１０（抗Ａｎｇ２抗体）の重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ１の重鎖定常ドメインを含む。第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ＬＣ１０（抗Ａｎｇ２抗体）の軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体λ軽鎖ＣＬドメインを含む。ＢＣＰ−４９は、図９の構成を有する。
【０４７１】
構築物２（ＢＣＰ−５０）：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ＬＣ１０（抗Ａｎｇ２抗体）の重鎖可変ドメインＶＨ、ＩｇＧ１の重鎖定常ドメイン、ペプチドリンカー（配列番号１３）、及び抗ＶＥＧＦ  ｓｄＡｂのＶＨＨドメインを含む。第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ＬＣ１０（抗Ａｎｇ２抗体）の軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体λ軽鎖ＣＬドメインを含む。ＢＣＰ−５０は、図４の構成を有する。
【０４７２】
構築物３（ＢＣＰ−５１）：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ＬＣ１０（抗Ａｎｇ２抗体）の重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ１の重鎖定常ドメインを含む。第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、抗ＶＥＧＦ  ｓｄＡｂのＶＨＨドメイン、ペプチドリンカー（配列番号１３）、ＬＣ１０（抗Ａｎｇ２抗体）の軽鎖可変ドメインＶＬ、及び抗体λ軽鎖ＣＬドメインを含む。ＢＣＰ−５１は、図１３の構成を有する。
【０４７３】
構築物４（ＢＣＰ−５２）：第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ＬＣ１０（抗Ａｎｇ２抗体）の重鎖可変ドメインＶＨ、及びＩｇＧ１の重鎖定常ドメインを含む。第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ＬＣ１０（抗Ａｎｇ２抗体）の軽鎖可変ドメインＶＬ、抗体λ軽鎖ＣＬドメイン、ペプチドリンカー（配列番号１３）、抗ＶＥＧＦ  ｓｄＡｂのＶＨＨドメインを含む。ＢＣＰ−５２は、図１１の構成を有する。
【０４７４】
４種のＢＡＢＰのプラスミドを調製し、ＣＨＯ細胞で一過性発現させた。ＢＡＢＰを一工程プロテインＡクロマトグラフィーによって精製し、４％スクロース、５０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭアルギニン、ｐＨ６．０の緩衝液に保存した。精製ＢＡＢＰの組成及び純度を、還元及び非還元の両方の条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。鎖、並びにＢＡＢＰ分子の完全長タンパク質の大きさは、アミノ酸配列に基づいて計算された分子量と一致している。溶液中の４種のＢＡＢＰの物理学的特性を更に調べるため、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて各タンパク質を分析した。４種全てのＢＡＢＰが単一の主なピークを示したことは、単量体ＢＡＢＰ分子としての物理学的均質性を示す。このデータの概要を表１３に示す。
【表１５】
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実施例８：Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗原結合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能性アッセイ。
【０４７５】
ＢＡＢＰのｒｈＡｎｇ２及びｒｈＶＥＧＦに対する結合動態を、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いる、ＢＩＯＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００装置での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によって測定した。簡潔に言うと、標準的なアンミン結合キットを製造業者の説明書に従って使用して、ＣＭ５バイオセンサーチップ全体にヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体を直接固定した。精製したＦＩＴ−Ｉｇサンプルを、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的反応表面で捕捉するためにＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に希釈し、５μＬ／分の流速で反応マトリックス全体に注入した。会合及び解離速度定数である、ｋｏｎ及びｋｏｆｆを、３０μＬ／分の連続流量下で決定した。動態データを表１４に示す。Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ  ＢＡＢＰの抗体親和性は、対応する４本鎖抗体であるＬＣ１０、又はＦｃフラグメントに融合した抗ＶＥＧＦ  ｓｄＡｂと同様である。
【表１６】
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【０４７６】
ＶＥＧＦを標的とするＡｎｇ２／ＶＥＧＦ  ＢＡＢＰの生物活性を評価するため、分裂促進アッセイにＨＵＶＥＣ細胞を用いた。ＨＵＶＥＣ細胞を、１ウェル当たり６×１０３個の細胞密度で６ウェルのプレートに播種し、１０％仔ウシ血清、２ｍＭグルタミン、及び抗生物質を添加した低グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ）（増殖培地）中で培養した。続いて、Ｆｃフラグメントに融合した抗ＶＥＧＦ  ｓｄＡｂ（「ｓｄＡｂＶＥＧＦ−Ｆｃ」）を、１〜５０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で加えた。２〜３時間後、精製したｒｈＶＥＧＦ１６５を３ｎｇ／ｍＬの最終濃度で加えた。５〜６日後、細胞をトリプシンに曝して剥がし、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターで計測した。平均細胞数からの変動は、１０％を超えなかった。データを４パラメータのカーブフィッティングプログラムで解析した。表１４に示されるように、４種のＡｎｇ２／ＶＥＧＦ  ＢＡＢＰは全て、ｓｄＡｂＶＥＧＦ−Ｆｃと匹敵しているＶＥＧＦを標的とした生物活性を有する。
【０４７７】
ＢＡＢＰによるＡｎｇ−２阻害を評価するため、Ａｎｇ−２の阻害によって誘導されたＴｉｅ２のリン酸化を、次のように測定した。ＨＥＫ２９３−Ｔｉｅ２細胞を、ＬＣ１０抗体又は各ＢＡＢＰの存在下又は非存在下において、Ａｎｇ−２で５分間刺激した。次に、サンドイッチＥＬＩＳＡを製造業者の説明書に従って用いて、細胞溶解液中のリン酸化Ｔｉｅ２（「Ｐ−Ｔｉｅ２」）のレベルを定量した。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（商標）バージョン６を用いて決定した。表１４に示されるように、４種のＡｎｇ２／ＶＥＧＦ  ＢＡＢＰは全て、ＬＣ１０と匹敵しているＡｎｇ２を標的とした生物活性を有する。
実施例９：Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗原結合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ効果。
【０４７８】
Ａ３７５異種移植片を用いて、抗Ａｎｇ２  ｓｄＡｂ及び抗ＶＥＧＦ抗体の単剤療法又は併用療法と比較する、実施例７〜８に記載のＡｎｇ２／ＶＥＧＦ  ＢＡＢＰの抗腫瘍効果を評価した。
【０４７９】
１０７個のＡ３７５細胞を、６週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウスに皮下注射した。腫瘍サイズをノギスでを測定し、楕円の公式を改変した長さ×（幅）２／２によって、腫瘍量を計算した。腫瘍量が約９０〜１３０ｍｍ３に達したとき、マウスを無作為に異なる処置群に割り当て、２〜６週間維持した。マウスには、溶媒対照分、ＬＣ１０、ｓｄＡｂＶＥＧＦ−Ｆｃ、ＬＣ１０＋ｓｄＡｂＶＥＧＦ−Ｆｃ併用、又はＢＣＰ−４９を、１週間に２回静脈内投与した。
【０４８０】
１週間に２回腫瘍量を測定したデータを図２６Ａに示す。溶媒対照と比較して、ｓｄＡｂＶＥＧＦ−Ｆｃ、ＬＣ１０＋ｓｄＡｂＶＥＧＦ−Ｆｃ併用療法、及びＢＣＰ−４９処置群において、腫瘍増殖の有意な阻害が観察された。特に、併用療法群と比較して、ＢＣＰ４９処置群において相乗活性が観察された。
【０４８１】
研究終了後、腫瘍重量も測定した。図２６Ｂに示されるように、腫瘍量の結果と一致して、ＢＣＰ４９は、腫瘍重量の低下においてＬＣ１０＋ｓｄＡｂＶＥＧＦ−Ｆｃ併用療法よりも効果的であった。
【０４８２】
本開示全体の全ての引用文献は、参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019524693.tif 000047
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