(57)【要約】  本開示は、組織工学に関し、より具体的には、足場を含まない三次元設計された腱構築物を使用して、回旋筋腱板または他の腱断裂もしくは損傷を治療または修復するための方法に関する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腱構築物である回旋筋腱板修復構築物であって、
ｉ）骨固定末端であって、前記骨固定末端が、腱修復手術において骨に固定するための腱組織の単一カラムを含み、反対の末端で、前記カラムが分岐して、前記腱構築物の腱固定末端を形成している、骨固定末端と、
ｉｉ）２つ以上の腱叉を有する腱固定末端であって、各々が腱修復手術において腱に固定するための自由末端を有し、反対の末端で、前記叉末端が融合して、前記構築物の前記骨固定末端の１つの末端を形成している、腱固定末端と、を含む、回旋筋腱板修復構築物。
【請求項２】
前記骨固定末端が、およそ３〜６ｍｍの直径を有し、前記腱固定末端叉の各々の直径が、およそ２〜３ｍｍである、請求項１に記載の回旋筋腱板修復構築物。
【請求項３】
前記骨固定末端が、約２〜７ｃｍの長さである、請求項１または２に記載の回旋筋腱板修復構築物。
【請求項４】
前記腱固定末端叉の各々の長さが、およそ１〜５ｃｍである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の回旋筋腱板修復構築物。
【請求項５】
前記腱固定末端叉が、前記構築物全体の長さの約２分の１（１／２）〜３分の２（２／３）から始まる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の回旋筋腱板修復構築物。
【請求項６】
前記腱固定末端が、２、３、４、または５つの叉を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の回旋筋腱板修復構築物。
【請求項７】
回旋筋腱板断裂を治療または修復するための方法であって、
ａ）腱構築物である回旋筋腱板修復構築物であって、
ｉ）骨固定末端であって、前記骨固定末端が、腱修復手術において骨に固定するための腱組織の単一カラムを含み、反対の末端で、前記カラムが分岐して、前記腱構築物の腱固定末端を形成している、骨固定末端と、
ｉｉ）２つ以上の腱叉を有する腱固定末端であって、各々が腱修復手術において腱に固定するための自由末端を有し、反対の末端で、前記叉末端が融合して、前記構築物の前記骨固定末端の１つの末端を形成している、腱固定末端と、を含む、回旋筋腱板修復構築物を作製することと、
ｂ）前記回旋筋腱板修復構築物を、損傷または断裂した回旋筋腱板の部位に移植することと、を含む、方法。
【請求項８】
前記骨固定末端が、およそ３〜６ｍｍの直径を有し、前記腱固定末端叉の各々の直径が、およそ２〜３ｍｍである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記骨固定末端が、約２〜７ｃｍの長さである、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記腱固定末端叉の各々の長さが、およそ１〜５ｃｍである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記腱固定末端叉が、前記構築物全体の長さの約２分の１（１／２）〜３分の２（２／３）から始まる、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記腱固定末端が、２、３、４、または５つの叉を有する、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
野球ボール式ステッチを使用して、前記回旋筋腱板修復構築物の前記損傷した腱及び骨孔への通過を可能にすることを更に含む、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記骨固定末端が、骨孔に通過され、インビボで前記腱修復に対して遠位の前記末端で骨膜に縫合され、前記腱固定末端叉が、インビボで腱に縫合される、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記回旋筋腱板構築物が、移植前に凍結されている、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記回旋筋腱板構築物が、４℃で移植前に最大３時間解凍される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記断裂または損傷した腱が、棘上筋腱または棘下筋腱である、請求項７〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記回旋筋腱板構築物が、移植後にインビボで腱付着部を確立する、請求項７〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記回旋筋腱板移植片が、インビボで整列したコラーゲン細線維を呈する、請求項７〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
骨固定末端及び腱固定末端を有する骨−腱構築物である回旋筋腱板修復構築物を形成する方法であって、
（ａ）外因的な足場に髄間質細胞を配置することなく、線維形成成長培地内の基材上に前記細胞を配置し、前記細胞に集密的な腱単層を形成させることであって、三次元腱構築物が、前記基材からの前記単層の剥離を介して形成されることと、
（ｂ）前記三次元腱構築物が、およそ１〜２ｍｍの直径及び４〜１０ｃｍの長さになるまで、前記腱構築物を培養物中で成長させることと、
（ｃ）２つ以上の腱構築物を、線維形成分化培地中の培養物中に長さ方向に並べて配置することで、前記２つ以上の腱構築物の長さのおよそ２分の１（１／２）〜３分の２（２／３）が、ともに融合して、前記修復構築物の前記骨固定末端となり、前記腱構築物の残りのおよそ１／２〜１／３が、前記修復構築物の前記腱固定末端の個々の腱叉の形成のために保持されることと、を含む、方法。
【請求項２１】
前記腱固定末端が、２、３、４、または５つの叉を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
６つの単一腱構築物が、培養物中に配置され、前記骨固定末端が、６つ全ての構築物を前記構築物の長さのおよそ２分の１（１／２）〜３分の２（２／３）で融合することによって形成され、前記腱固定末端が、２つの腱構築物をともに対合させて、前記構築物の前記腱固定末端の前記腱叉のうちの単一腱叉を形成することによって形成される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記回旋筋腱板修復構築物が、少なくとも６週間培養物中で成長される、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも６週間の培養物中での成長後に、前記回旋筋腱板修復構築物を−８０℃±５℃で凍結することを更に含む、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記回旋筋腱板修復の前記骨固定末端が、およそ３〜６ｍｍの直径を有し、前記回旋筋腱板修復構築物の前記腱固定末端叉の各々の直径が、およそ２〜３ｍｍである、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記骨固定末端が、約２〜７ｃｍの長さである、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記腱固定末端叉の各々の長さが、およそ１〜５ｃｍである、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記腱固定末端叉が、前記構築物全体の長さの約２／３から始まる、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記線維形成成長培地が、塩基性線維芽細胞成長因子、デキサメタゾン、アスコルビン酸−２−ホスファターゼ、及びＬ−プロリンのうちの１つ以上を含む、請求項２０〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記線維形成分化培地が、デキサメタゾン、アスコルビン酸−２−ホスファターゼ、Ｌ−プロリン、及びトランスフォーミング成長因子ベータのうちの１つ以上を含む、請求項２０〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
腱構築物である回旋筋腱板修復構築物を形成するためのシステムであって、
ａ）基材と、
ｂ）外因的な足場に骨髄間質細胞を配設することなく、前記基材上に提供される前記細胞と、
ｃ）インビトロで培養されたときに前記細胞に細胞外マトリックスを生成させ、集密的な腱単層を形成するように自己組織化させる、前記骨髄間質細胞と接触して提供される線維形成成長培地であって、三次元腱構築物が、前記基材からの前記単層の剥離を介して形成される、線維形成成長培地と、
ｄ）（ｃ）で形成された２つ以上の単一腱構築物を、線維形成分化培地中の培養物中に長さ方向に並べて配置することで、前記２つ以上の腱構築物の長さのおよそ２分の１（１／２）〜３分の２（２／３）が、ともに融合して、骨に結合するための前記修復構築物の前記骨固定末端となり、前記腱構築物の残りのおよそ１／２〜１／３が、前記修復構築物の前記腱固定末端の個々の腱叉の形成のために保持されることと、を含む、システム。
【請求項３２】
前記腱固定末端が、２、３、４、または５つの叉を有する、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
（ｄ）において、６つの単一腱構築物が、培養物中に配置され、前記骨固定末端が、６つ全ての構築物を前記構築物の長さのおよそ１／２〜２／３について融合することによって形成され、前記腱固定末端が、２つの腱構築物をともに対合させて、前記構築物の前記腱固定末端の前記腱叉のうちの単一腱叉を形成することによって形成される、請求項３１または３２に記載のシステム。
【請求項３４】
前記骨固定末端が、およそ３〜６ｍｍの直径を有し、前記腱固定末端叉の各々の直径が、およそ２〜３ｍｍである、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３５】
前記骨固定末端が、約２〜７ｃｍの長さである、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３６】
前記腱固定末端叉の各々の長さが、およそ１〜５ｃｍである、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３７】
前記腱固定末端叉が、前記構築物全体の長さの約２／３から始まる、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３８】
前記線維形成成長培地が、塩基性線維芽細胞成長因子、デキサメタゾン、アスコルビン酸−２−ホスファターゼ、及びＬ−プロリンのうちの１つ以上を含む、請求項３１〜３７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３９】
前記線維形成分化培地が、デキサメタゾン、アスコルビン酸−２−ホスファターゼ、Ｌ−プロリン、及びトランスフォーミング成長因子ベータのうちの１つ以上を含む、請求項３１〜３８のいずれか１項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、組織工学に関し、より具体的には、足場を含まない腱構築物（複数可）、及び足場を含まない腱構築物（複数可）を使用して、腱（例えば、回旋筋腱板）断裂または損傷を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腱は、筋肉を骨に結合する線維性結合組織である。腱は、骨またはそれが結合している構造を動かす役割を果たす（Ｖｏｒｖｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｄｌｉｎｅ  Ｐｌｕｓ，Ｕ．Ｓ．ＮＬＭ，２０１４）。
【０００３】
回旋筋腱板（ＲＣ）断裂は、米国において最も一般的な整形外科障害のうちの１つで、年間７５，０００件を超える修復手順が実行されており（Ｖｉｔａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｈｏｕｌｄｅｒ  ａｎｄ  Ｅｌｂｏｗ  Ｓｕｒｇ１６（２）：１８１−１９７（２００７）、医療費は年間３００億ドルであると予想されている。現在の縫合技術または増強足場技術でのＲＣ断裂の治癒は、天然の腱骨界面を再生することができず、代わりに、破損しやすいより弱い線維血管性瘢痕を形成する。この界面の再生は、臨床成績を改善するために非常に重要である。
【０００４】
今日まで、回旋筋腱板修復の標準は、単列または複列の縫合技術である。縫合技術でのＲＣの修復は、天然の腱対骨界面または「腱付着部」の再生の欠如のために、２０〜５７％の割合で失敗する（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．３１（４）：６９３−７１２，２０１２、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｒｅｖ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ  Ｍｅｄ．４（４）：２２１−３０，２０１１、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ３０（４）：４３６−４３，２０１４、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ２９（４）：６２３−２９，２０１３）。現在、４２％のＲＣ修復（３０，０００件／年）は、生物学的パッチまたは合成パッチで機械的に強化されている。一般的に使用される生物学的パッチの有効性は、９１％に近い再断裂率で、見るに耐えないものである（Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ．４３（３）：８１９−３１，２０１５）。腱付着部の再生は、臨床成績を改善するために非常に重要である。
【発明の概要】
【０００５】
回旋筋腱板修復手順における腱の修復のための回旋筋腱板修復（ＥＴＧ−ＲＣ）のためにデザインされた、足場を含まない三次元（３Ｄ）組織の設計された腱移植片、ならびに回旋筋腱板修復構築物を作製するための方法及びシステムが本明細書に提供される。本構築物はまた、他の損傷した腱の修復においても有用である。本明細書の構築物は、腱修復中に１つの末端で腱構築物を骨に固定することを提供し、腱修復中に反対の末端で腱に固定することを提供し、インビボで腱付着部形成の徴候を示す完全に統合された組織構造をもたらす。
【０００６】
様々な実施形態において、本開示は、腱構築物である回旋筋腱板修復構築物であって、ｉ）骨固定末端であって、骨固定末端が、腱修復手術において骨に固定するための腱組織の単一カラムを含み、反対の末端で、カラムが分岐して、腱構築物の腱固定末端を形成している、骨固定末端と、ｉｉ）２つ以上の腱叉を有する腱固定末端であって、各々が腱修復手術において腱に固定するための自由末端を有し、反対の末端で、叉末端が融合して、構築物の骨固定末端の１つの末端を形成している、腱固定末端とを含む、回旋筋腱板修復構築物を提供する。腱構築物は、足場を含まない三次元組織構築物であることが企図される。腱修復構築物は、回旋筋腱板だけでなく、他の損傷した腱を修復するための腱修復構築物であることもまた企図される。
【０００７】
様々な実施形態において、腱固定末端は、２、３、４、または５つの叉を有する。
【０００８】
様々な実施形態において、骨固定末端は、およそ３〜６ｍｍの直径を有する。様々な実施形態において、腱固定末端叉の各々の直径は、およそ２〜３ｍｍである。
【０００９】
様々な実施形態において、腱構築物の全長は、約４ｃｍ〜約１０ｃｍである。様々な実施形態において、腱固定末端叉は、腱構築物全体の長さの約２分の１（１／２）〜３分の２（２／３）から始まる。様々な実施形態において、骨固定末端は、約２〜７ｃｍの長さである。様々な実施形態において、腱固定末端叉の各々の長さは、およそ１〜５ｃｍである。
【００１０】
一実施形態において、骨固定末端は、およそ２〜７ｃｍの長さ及び３〜６ｍｍの直径であり、腱固定末端は、およそ１〜５ｃｍの長さ及び２〜３ｍｍの直径である。様々な実施形態において、腱構築物は、骨固定末端、及び腱固定末端に３つの腱叉を含む。
【００１１】
様々な実施形態において、本開示は、対象において回旋筋腱板断裂を治療または修復するための方法であって、ａ）腱構築物である回旋筋腱板修復構築物であって、ｉ）骨固定末端であって、骨固定末端が、腱修復手術において骨に固定するための腱組織の単一カラムを含み、反対の末端で、カラムが分岐して、腱構築物の腱固定末端を形成している、骨固定末端と、ｉｉ）２つ以上の腱叉を有する腱固定末端であって、各々が腱修復手術において腱に固定するための自由末端を有し、反対の末端で、叉末端が融合して、構築物の骨固定末端の１つの末端を形成している、腱固定末端とを含む、回旋筋腱板修復構築物を作製することと、ｂ）回旋筋腱板修復構築物を、損傷または断裂した回旋筋腱板の部位に移植することとを含む、方法を提供する。
【００１２】
様々な実施形態において、本方法は、野球ボール式ステッチを使用して、回旋筋腱板修復構築物の損傷した腱及び骨孔への通過を可能にすることを更に含む。骨固定末端が、骨孔に通過され、インビボで腱修復に対して遠位の末端で骨膜に縫合され、腱固定末端叉が、インビボで腱に縫合されることが企図される。
【００１３】
様々な実施形態において、回旋筋腱板修復構築物は、移植前に凍結されている。様々な実施形態において、回旋筋腱板修復構築物は、−７０℃または−８０℃±５℃の範囲で凍結される。様々な実施形態において、回旋筋腱板修復構築物は、４℃で移植前に最大３時間解凍される。様々な実施形態において、回旋筋腱板修復構築物は、４℃で移植前に１、２、または３時間解凍される。
【００１４】
本明細書に記載される腱構築物を使用する回旋筋腱板修復のための方法は、一般的に縫合修復が実行されるあらゆる腱に有用であることが企図される。本開示は、回旋筋腱板修復構築物について明記される特徴を有する、例えば、本明細書に記載される骨固定末端及び腱固定末端を有する、腱修復構築物または腱縫合修復構築物を提供する。本明細書に記載される腱修復構築物を移植することを含む、腱を修復する方法もまた提供される。本明細書に記載される特徴を有する、例えば、本明細書に記載される骨固定末端及び腱固定末端を有する、腱修復構築物または腱縫合修復構築物を作製するための方法及びシステムもまた企図される。
【００１５】
様々な実施形態において、修復は、棘上筋腱、棘下筋腱、肩甲下筋腱、及び小円筋腱を含む、回旋筋腱板における腱の修復である。本方法を使用する腱修復において修復され得る他の腱としては、アキレス腱、指または手の腱、屈筋腱、伸筋腱、腓骨筋腱、二頭筋、三頭筋、膝蓋骨、肘、及び足首、膝、手、足、または肩の他の腱が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
様々な実施形態において、回旋筋腱板修復構築物は、移植後にインビボで腱付着部を確立する。様々な実施形態において、回旋筋腱板移植は、インビボで整列したコラーゲン細線維を呈する。
【００１７】
一実施形態において、回旋筋腱板または他の腱の機能障害は、未治療の対象と比較して、およそ１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはそれ以上低減される。一実施形態において、回旋筋腱板の可動性及び／または強度は、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、またはそれ以上改善される。機能障害及び可動性は、当業者にとって既知である技術を使用して測定される。
【００１８】
様々な実施形態において、治療を必要とする対象は、哺乳動物である。様々な実施形態において、治療を必要とする対象は、ヒトである。
【００１９】
骨固定末端及び腱固定末端を有する腱構築物である回旋筋腱板修復構築物を形成する方法であって、（ａ）外因的な足場に髄間質細胞を配置することなく、線維形成成長培地内の基材上に該細胞を配置し、該細胞に集密的な腱単層を形成させることであって、三次元腱構築物が、基材からの単層の剥離を介して形成される、形成させることと、（ｂ）三次元腱構築物が、およそ１〜２ｍｍの直径及び４〜１０ｃｍの長さになるまで、単一腱構築物を培養物中で成長させることと、（ｃ）２つ以上の単一腱構築物を、線維形成分化培地中の培養物中に長さ方向に並べて配置することで、２つ以上の腱構築物の長さのおよそ２分の１（１／２）〜３分の２（２／３）が、ともに融合して、骨に結合するための修復構築物の骨固定末端となり、腱構築物の残りのおよそ１／２〜３分の１（１／３）が、修復構築物の腱固定末端の個々の腱叉の形成のために保持されることとを含む、方法もまた企図される。
【００２０】
様々な実施形態において、６つの単一腱構築物は、培養物中に配置され、骨固定末端は、６つ全ての単一構築物を１つの末端で構築物の長さのおよそ１／２〜２／３について融合することによって形成され、腱固定末端は、２つの腱構築物をともに対合させて、構築物の腱固定末端の単一腱叉（この場合３つの叉をもたらす）を形成することによって形成される。
【００２１】
様々な実施形態において、腱構築物を含む回旋筋腱板構築物は、腱固定末端に２、３、４、または５つの腱叉を有する。様々な実施形態において、腱構築物は、腱固定末端に３つの腱叉を有する。
【００２２】
様々な実施形態において、回旋筋腱板修復構築物は、少なくとも６週間培養物中で成長される。例えば、修復構築物は、６、７、または８週間培養物中で成長され得る。
【００２３】
様々な実施形態において、本方法は、回旋筋腱板修復構築物を−８０℃±５℃で凍結することを更に含む。
【００２４】
様々な実施形態において、本方法は、少なくとも６〜８週間の培養物中での成長後に、回旋筋腱板修復構築物を−８０℃±５℃で凍結することを更に含む。
【００２５】
様々な実施形態において、線維形成成長培地は、塩基性線維芽細胞成長因子、デキサメタゾン、アスコルビン酸−２−ホスファターゼ、及びＬ−プロリンのうちの１つ以上を含む。様々な実施形態において、線維形成分化培地は、デキサメタゾン、アスコルビン酸−２−ホスファターゼ、Ｌ−プロリン、及びトランスフォーミング成長因子ベータのうちの１つ以上を含む。
【００２６】
腱構築物である回旋筋腱板修復構築物を形成するためのシステムであって、ａ）基材と、ｂ）外因的な足場に骨髄間質細胞を配設することなく、基材上に提供される該細胞と、ｃ）インビトロで培養されたときに該細胞に細胞外マトリックスを生成させ、集密的な腱単層を形成するように自己組織化させる、骨髄間質細胞と接触して提供される線維形成成長培地であって、三次元腱構築物が、基材からの単層の剥離を介して形成される、線維形成成長培地と、ｄ）（ｃ）で形成された２つ以上の腱構築物を、線維形成分化培地中の培養物中に長さ方向に並べて配置することで、２つ以上の腱構築物の長さのおよそ２分の１（１／２）〜３分の２（２／３）が、ともに融合して、修復構築物の骨固定末端となり、腱構築物の残りのおよそ１／２〜１／３が、修復構築物の腱固定末端の個々の腱叉の形成のために保持されることとを含む、システムもまた提供される。任意で、（ｄ）において、６つの腱構築物は、培養物中に配置され、骨固定末端は、６つ全ての構築物を融合することによって形成され、腱固定末端は、２つの腱構築物をともに対合させて、構築物の腱固定末端の腱叉のうちの１つの腱叉を形成することによって形成される。
【００２７】
本システムの様々な実施形態において、腱構築物の全長は、約４ｃｍ〜約１０ｃｍである。本システムの様々な実施形態において、腱固定末端叉は、腱構築物全体の長さの約２分の１（１／２）〜３分の２（２／３）から始まる。本システムの様々な実施形態において、骨固定末端は、約２〜７ｃｍの長さである。本システムの様々な実施形態において、腱固定末端叉の各々の長さは、およそ１〜５ｃｍである。
【００２８】
本システムの様々な実施形態において、骨固定末端は、およそ３〜６ｍｍの直径を有する。本システムの様々な実施形態において、腱固定末端叉の各々の直径は、およそ２〜３ｍｍである。
【００２９】
一実施形態において、骨固定末端は、およそ２〜７ｃｍの長さ及び３〜６ｍｍの直径であり、腱固定末端は、およそ１〜５ｃｍの長さ及び２〜３ｍｍの直径である。
【００３０】
本システムの様々な実施形態において、腱構築物を含む回旋筋腱板構築物は、腱固定末端に２、３、４、または５つの腱叉を有する。様々な実施形態において、腱構築物は、腱固定末端に３つの腱叉を有する。
【００３１】
本システムの様々な実施形態において、線維形成成長培地は、塩基性線維芽細胞成長因子、デキサメタゾン、アスコルビン酸−２−ホスファターゼ、及びＬ−プロリンのうちの１つ以上を含む。本システムの様々な実施形態において、線維形成分化培地は、デキサメタゾン、アスコルビン酸−２−ホスファターゼ、Ｌ−プロリン、及びトランスフォーミング成長因子ベータのうちの１つ以上を含む。
【００３２】
本システムはまた、離間関係で基材に固定された少なくとも２つのアンカーも含む。様々な実施形態において、培養物中の各構築物は、３Ｄ構築物の形成中にアンカーによって１つ以上の場所で保持される。本システムは、基材上に提供される、アスコルビン酸−２−ホスファターゼ、Ｌ−プロリン、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、及び／またはデキサメトアゾンのうちの１つ以上を含む、培養物中に細胞を含む分化培地を更に含み、３Ｄ組織のうちの少なくともいくつかは、アンカーと接触している。細胞は、細胞を集密的にし、３Ｄ組織へと自己組織化させる条件下、インビトロで培養され、アンカーは、単層が基材から剥離して、三次元腱構築物を形成する際に、単層を捕捉する。
【００３３】
上記の要約は、本発明の全態様を定義することが意図されず、追加の態様が、発明を実施するための形態などの他の節に記載される。本文書全体は、一体化した開示として関連することが意図され、特徴の組み合わせがこの文書の同じ文章、または段落、または節においてともに見出されない場合でも、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせが企図されることを理解されたい。
【００３４】
上記に加えて、本発明は、追加の一態様として、上記の特定の段落によって定義される変形形態よりも多少なりとも範囲がより狭い、本発明の全ての実施形態を含む。例えば、ある属として記載される本発明の特定の態様、ある属の全ての構成員が個々に本発明の一態様であることを理解されたい。また、ある属として記載されるか、ある属のある構成員を選択する態様は、その属の２つ以上の構成員の組み合わせを包含することを理解されたい。本出願者（ら）は、本明細書に記載される本発明の全範囲を発明したものの、本出願者らは、他者の先行技術に記載される主題について詳述することは意図しない。したがって、特許局または他の主体もしくは個人によって、ある段落の範囲内にある法定の先行技術が本出願者（ら）の気が付くところとなった場合、本出願者（ら）は、適用可能な特許法の下で修正権を行使して、法定の先行技術または法定の先行技術の明白な変形形態をそのような段落の範囲から具体的に排除するように、そのような段落の主題を再定義する権利を留保する。そのような修正段落によって定義される本発明の変形形態もまた、本発明の態様として意図される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】回旋筋腱板修復構築物を形成するための一例示的なプロセスの模式図である。
【図１Ｂ】骨固定末端でともに融合された６つの直線的腱組織からなり、３つの叉及び腱固定末端を有する回旋筋腱板構築物を示す。
【図２Ａ−２Ｆ】修復手術及び６ヶ月間の回復期間後のヒツジに由来する回旋筋腱板の腱付着部のＸ線検査及び肉眼形態を示す。肩関節のＸ線検査は、手術群のいずれにおいても回旋筋腱板関節の有意な分解を有さない、適切かつ一貫したアンカー配置を示した（図２Ａ〜２Ｃ）。剖検日の各群からの代表的な棘下筋腱の肉眼図（図２Ｄ〜２Ｆ）。
【図３】ヒツジ接線係数の対照及び修復した腱の回旋筋腱板の生体力学試験を示す。腱−骨界面の平均係数は、以下の通りであった：対側（１０６±２４ＭＰａ、ｎ＝２０、Ｐ＜０．０００１  ＥＴＧ−ＲＣ、Ｐ＜０．０００１  ＳＯ）、ＥＴＧ−ＲＣ修復（３３±１６ＭＰａ、ｎ＝１０、Ｐ＝０．３４）、及び縫合のみの修復（２１±７ＭＰａ、ｎ＝１１、Ｐ＝０．３４）。
【図４Ａ−４Ｋ】コラーゲン整列、線維軟骨形成、及び腱付着部のＨ＆Ｅを示す。ピクロシリウス染色した腱付着部（図４Ａ）対側の肩、（図４Ｂ）ＥＴＧ−ＲＣ修復、（図４Ｃ）縫合のみの修復。画像は偏光下で可視化し、４倍の拡大率で撮像した。（図４Ｄ）平均グレースケール値。（♯）対側の肩（ｐ＜０．０５）と比較しての統計学的有意性を表す。（＊）ＥＴＧ肩と比較しての統計学的有意性を表す。エラーバーは、＋／−標準偏差を表す。腱付着部での異染色した線維軟骨形成。（図４Ｅ）対側の肩、（図４Ｆ）ＥＴＧ−ＲＣ修復、（図４Ｇ）縫合のみの修復。画像は、４倍の拡大率で取得した。（図４Ｈ）腱付着部での異染色のパーセント。Ｈ＆Ｅ染色した腱付着部（図４Ｉ）対側の肩、（図４Ｊ）ＥＴＧ−ＲＣ修復、（図４Ｋ）縫合のみの修復。→は、腱−骨界面を指す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
回旋筋腱板断裂修復手順における腱の修復のための回旋筋腱板修復（ＥＴＧ−ＲＣ）のためにデザインされた、足場を含まない三次元組織の設計された腱移植片、ならびに回旋筋腱板修復構築物を作製するための方法及びシステムが本明細書に提供される。本明細書の構築物は、腱修復中に１つの末端で腱構築物を骨に固定することを提供し、腱修復中に反対の末端で腱に固定することを提供し、インビボで腱付着部形成の徴候を示す完全に統合された組織構造をもたらす。
【００３７】
別段述べられない限り、本明細書及び特許請求の範囲を含む本出願において使用される以下の用語は、以下に与えられる定義を有する。
【００３８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、不定冠詞「ａ（１つの）」及び「ａｎ（１つの）」ならびに定冠詞「ｔｈｅ（その）」は、別段文脈が明らかに指示しない限り、単数形の参照対象だけでなく複数形の参照対象も含む。
【００３９】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される、特定の値に許容される誤差を意味し、これは一部には、その値がいかに測定または決定されるかに依存する。特定の実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、１、２、３、または４以内の標準偏差を意味する。特定の実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、所与の値または範囲の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．０５％以内を意味する。「約」または「およそ」という用語が、一連の２つ以上の数値において最初の数値に先行する場合はいつでも、「約」または「およそ」という用語が、その一連の数値の各々それぞれに適用されることが理解される。
【００４０】
「周囲温度」及び「室温」という用語は、本明細書において互換的に使用され、周囲環境（例えば、反応が実行される部屋または組成物が保管される部屋）の「温度」を指す。特定の実施形態において、周囲温度または室温は、約１５℃〜約２８℃、または約１５℃〜約２５℃、または約２０℃〜約２８℃、または約２０℃〜約２５℃、または約２２℃〜約２８℃、または約２２℃〜約２５℃の範囲である。「凍結する」または「凍結した」という用語は、−２０℃、−７０℃、及び−８０℃を含む、０℃未満である周囲環境の温度を指す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「治療」（また「ｔｒｅａｔ（治療する）」または「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療する）」）という用語は、急性外傷であろうと、変性または特定の疾患、障害、及び／もしくは病態による外傷であろうと、回旋筋腱板または腱外傷を部分的もしくは完全に軽減、寛解、緩和、その重症度を低減、かつ／またはその１つ以上の症状もしくは特徴の発生率を低減する、回旋筋腱板修復構築物または腱構築物を移植することを指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、回旋筋腱板損傷または回旋筋腱板断裂などの腱損傷または断裂を「修復する」または「遅延させる」ことは、腱の領域内の外傷または損傷の部位、例えば、回旋筋腱板を治療する方法を指す。損傷は、損傷していない正常な回旋筋腱板腱と比較しての、対象における回旋筋腱板の腱構造内の断裂、擦過創、病変、または他の異常もしくは創傷を指す。いくつかの実施形態において、損傷は、回旋筋腱板が損傷されるような、回旋筋腱板または回旋筋腱板の周囲の領域に対する外傷から生じる。他の実施形態において、回旋筋腱板損傷は、正常な経時的分解による、または変性障害による回旋筋腱板の変性から生じる。回旋筋腱板または腱損傷を修復することは、回旋筋腱板における創傷を部分的または完全に治癒することである。損傷を遅延させることは、回旋筋腱板または腱における初期損傷の進行を短縮または緩徐化することにより、更なる損傷を予防することである。更なる損傷を予防することは、その部位において有意な追加の損傷が観察されないように、回旋筋腱板または腱における損傷の進行を緩徐化または停止することである。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「腱構築物」は、腱の特性を有する三次元構築物を形成する培養物中の細胞に由来し、１つの末端に、腱修復プロセスにおいて骨に固定するための単一円筒の腱組織である骨固定末端を有し、その反対の末端で、腱修復プロセスにおいて腱に固定するための腱様組織の別個の束または叉である腱固定末端を有する、構築物を指す。腱末端における腱叉は、腱修復手術中に骨に固定される構築物の骨固定末端の反対である構築物の骨固定末端内の組織に起源を持つか、それから由来するか、またはそれから分枝することが企図される。加えて、腱構築物を形成するとき、腱固定末端叉が１つの末端で融合されて、構築物の骨固定末端の１つの末端を形成するか、またはそれに融合されることもまた理解され得る。腱構築物の表現を、図１Ａ及び図１Ｂに提示する。様々な実施形態において、腱構築物は、インビボで固定するための２、３、４、または５つの腱叉を有する。
【００４４】
培養物中で使用して、腱構築物を形成するための細胞は、骨髄間質細胞、他の前駆幹細胞、及び脂肪幹細胞、ならびに一次腱線維芽細胞を含むが、これらに限定されない、多能性であり、適切な培地で培養したときに腱細胞を形成し得る細胞を含む。
【００４５】
回旋筋腱板外傷及び腱修復
回旋筋腱板は、腱として一体化して、腕の上腕骨の頭部のまわりの被覆を形成する４つの筋肉のネットワークである。この４つの腱は、棘上筋腱、棘下筋腱、肩甲下筋腱、及び小円筋腱を含む。ヒトにおける大部分の断裂は、棘上筋腱筋及び腱に発生するが、回旋筋腱板の他の部分もまた、断裂または損傷し得る。
【００４６】
回旋筋腱板断裂または腱に対する他の損傷の治療または修復が本明細書において企図される。回旋筋腱板断裂は、回旋筋腱板を損傷するが、それを完全には切断しない部分的断裂、または軟部組織を２つの断片に裂き、本質的に腱に孔を残し得る全層もしくは完全断裂のいずれかであり得る。大きな断裂は、３ｃｍを超える断裂と見なされる。断裂は、急性外傷の結果であるか、または回旋筋腱板における腱のうちの１つ以上に対する反復性もしくは変性損傷に由来し得る。
【００４７】
本明細書に企図される回旋筋腱板治療または修復を受ける対象としては、ヒト、非ヒト霊長類（チンパンジーなど）、ならびに他の類人猿及びサル種などの哺乳動物；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜；イヌ及びネコなどの飼育動物；ラット、マウス、及びモルモットなどの齧歯類を含む実験室動物などが挙げられる。
【００４８】
一実施形態において、回旋筋腱板または腱の機能障害は、未治療の対象と比較して、およそ１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはそれ以上低減される。一実施形態において、回旋筋腱板または腱の可動性及び／または強度は、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、またはそれ以上改善される。機能障害及び可動性は、当業者にとって既知である技術を使用して測定される。
【００４９】
様々な実施形態において、腱構築物の骨固定末端は、およそ３〜６ｍｍ、例えば、およそ３、４、５、または６ｍｍの直径を有する。様々な実施形態において、腱固定末端叉の各々の直径は、およそ２〜３ｍｍ、例えば、２または３ｍｍである。
【００５０】
様々な実施形態において、構築物の全長は、４〜１０ｃｍの長さである。様々な実施形態において、骨固定末端は、約２〜７ｃｍの長さ、例えば、およそ２、３、４、５、６、または７ｃｍの長さである。様々な実施形態において、腱固定末端叉の各々の長さは、およそ１〜５ｃｍ、例えば、１、２、３、４、または５ｃｍである。
【００５１】
様々な実施形態において、腱構築物の腱固定末端叉は、腱構築物全体の長さの約２分の１（１／２）〜３分の２（２／３）から始まる。一例示的な腱構築物を、図１に示す。
【００５２】
様々な実施形態において、腱構築物は、治療される対象のために修正されてもよく、例えば、それは、対象における回旋筋腱板挿入部位のサイズに応じて、より小さいまたは大きい長さまたは幅で作製されてもよい。
【００５３】
一実施形態において、腱構築物の骨固定末端は、およそ２〜７ｃｍの長さ及び３〜６ｍｍの直径であり、腱固定末端は、およそ１〜５ｃｍの長さ及び２〜３ｍｍの直径であり、任意で、構築物は、腱固定末端に３つの腱叉を有する。
【００５４】
一実施形態において、回旋筋腱板修復構築物は、回旋筋腱板損傷の治療または寛解に有用な１つ以上の他の活性剤と組み合わせて使用されてもよい。他の活性剤（複数可）は、回旋筋腱板修復構築物の効果を増強し得る、かつ／または回旋筋腱板修復構築物の薬理学的効果に加えた薬理学的効果を発揮し得る。活性剤としては、アスピリン、非ステロイド性抗炎症薬、及びコルチゾンなどの抗炎症化合物が挙げられる。
【００５５】
本開示はまた、回旋筋腱板腱に加えて、本腱構築物及び方法を使用する腱修復において、他の腱が修復され得ることも提供する。例示的な腱としては、アキレス腱、指または手の腱、屈筋腱、伸筋腱、腓骨筋腱、二頭筋、三頭筋、膝蓋骨、肘、及び足首、膝、手、足、または肩の他の腱が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
腱
骨と腱との間の界面は、腱付着部と称される。腱付着部組織の目的は、骨−腱界面で、従属する腱から強固な骨へと最小体積の組織にわたって高い忠実度で負荷を伝達することである。この組織は、２つの大いに異なる組織間の移行を補助する４つの異なる帯域からなる。腱付着部の４つの帯域は、腱、非石灰化線維軟骨、石灰化線維軟骨、及び骨である。成人組織において、腱から非石灰化線維軟骨への移行は徐々である一方で、非石灰化線維軟骨と石灰化線維軟骨との間には明確な境界が存在する。この境界は、タイドマークと称され、その極度好塩基性の性質のために、ヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用して特定され得る（Ｃｌａｕｄｅｐｉｅｒｒｅ  ａｎｄ  Ｖｏｉｓｉｎ，Ｊｏｉｎｔ  Ｂｏｎｅ  Ｓｐｉｎｅ７２：３２，２００５、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｎａｔ２０８：４７１，２００６）。線維軟骨帯域は、ＩＩ型コラーゲンならびにプロテオグリカン（アグリカン、バイグリカン、及びデコリンなど）からなる。線維軟骨内の細胞は、円形で、小窩内に対または列で配置された、軟骨細胞の表現型を有する。この型の組織に特有である分子マーカーは存在しないが、線維軟骨及び一般に腱付着部は、このタンパク質が隣接する靱帯及び骨組織に存在しないという事実のために、ＩＩ型コラーゲンの存在によって一般に特徴付けられる（Ｗａｇｇｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ１６：４５７，１９９８）。
【００５７】
腱は、筋肉と骨との間で力を伝達する、高度に組織化した線維性組織である。それらは、張力が発達している間は弾力性であるが、それらの機械的要求性の環境に従うのに十分に柔軟である。腱組織のこの機械的統合性は、コラーゲンの平行細線維に起因し得る。静止状態において、コラーゲン細線維は、クリンプと定義される波状の立体構造を呈する。腱が伸びると、クリンプしたコラーゲン細線維は真っすぐに伸び始め、結果として、増加する機械的歪みの適用によって腱はより強固となる。
【００５８】
天然の腱は、荷重負荷のコラーゲン細線維の組み立てを制御し、組織階層の形成に寄与する多くのタンパク質、グルコサミノグリカン、及びプロテオグリカンからなる、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を有する。線維芽細胞は、発達中、細胞−マトリックスシグナリング経路に依存して、細線維を適切に組み立て、成熟後に形状及び機能を維持する。以前の試みは、インビトロで生物学的に基づく腱を作製するために行われたが、インビボ環境と機械的かつ生物学的の両方に適合する構築物を作製する上での困難のために、これらは限定された成功を経験した。例えば、米国特許第８，０９７，４５５号を参照されたい。
【００５９】
自己組織化した３Ｄ腱は、アキレス腱から単離された細胞から設計されている（米国特許第７，４２２，９００号）。一次腱線維芽細胞は、それらの自体のＥＣＭを分泌し、組織化し、適切な条件下では外因的な足場の補助なしで円筒状構築物へと自己組み立てする。結果として得られる足場を含まない組織は、整列した小直径（５０ｎｍ）のコラーゲン細線維、多数の細胞、及び過剰な非コラーゲン性ＥＣＭからなり、これらは全て、胚腱の特徴である。構築物の応力歪み応答もまた、未熟な腱の非直線的挙動に似ており、究極的な引っ張り強さは、胚ニワトリ腱の引っ張り強さとおよそ等しい（およそ２ＭＰａ）。
設計された組織構築物
【００６０】
近年、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）から成長させ、複合足場のまわりに巻いた単層の細胞シートが、インビトロ及びインビボで骨に似ている構築物を形成することが示されている（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２８：８１４，２００７）。しかしながら、この方法は、依然として天然組織内に組み込まなくてはならない外因的な足場の使用を伴う。したがって、足場戦略は、骨形成原細胞または線維芽細胞成長を促進するように見えるものの、骨、腱、及び靱帯の修復に使用されるときには、足場の免疫拒絶反応、分解、及び非生理学的な機械的特性などの制限が考慮される必要がある。
【００６１】
ＢＭＳＣは、化学的シグナルに応答して、骨、軟骨、腱、靱帯、脂肪組織、及び筋肉へと分化し得る複能性間葉系幹細胞であり（Ａｌｈａｄｌａｑ  ａｎｄ  Ｍａｏ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ１３：４３６，２００４、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ９５：９，２００４）、それら自体の自家ＥＣＭを生成し、石灰化する。ＢＭＳＣは、自家及び同種供給源から容易に単離され得るため、組織工学のための魅力的な候補としての役割を果たす。
【００６２】
様々な実施形態において、ＢＭＳＣ単離及び拡大は、以下のように達成され得る。無菌条件下で、宿主の骨から骨髄が回収され得る。例えば、ヒトＢＭＳＣの単離は、Ｇｒｏｎｔｈｏｓら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４４９：４５−５７，２００８）及びＷｏｌｆｅら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４４９：３−２５，２００８）に記載される。特定の実施形態において、ヒツジまたは他の動物細胞が単離され、このような場合には、骨髄穿刺に由来する骨髄間質細胞は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから市販されているＦｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅキット（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ：２８−４０３９−５６ＡＣ）を使用して単離され、単層がＧＭ中で７２時間３Ｄ構築物を形成する際、単層を捕捉するために使用される束縛ピンを含有するように改変されている組織培養プレート上にプレーティングされる。細胞を培養物中で成長させるための追加の方法を、実施例に提示する。
【００６３】
培養物中のデキサメタゾンに加えて、ｂＦＧＦの分裂促進効果は、増殖を増加させ、故に小結節の形成ではなく単層形成を可能にし得る。ＴＧＦ−βは、２Ｄ対３Ｄ構築物形成を制御する因子であり得る。ＢＭＳＣに対するこの成長因子の全体的な効果は、完全には知られていないものの、それは、コラーゲン生成、マトリックス成熟化を刺激するため、かつ／またはＢＭＳＣからの軟骨形成分化を誘導するために、培養物中で一般に使用される。ＴＧＦ−βは、腱構築物発達の初期段階かつ骨形成分化前にコラーゲン生成の速度を増加させ得る。
【００６４】
上述したように、ＢＭＳＣは、複数の組織型へと分化し得る複能性細胞であるため、本発明に従う発達する構築物において組織を特定するためには、いくつかのマーカーが使用される。腱発達のマーカーとしては、Ｉ型コラーゲン、フィブロネクチン、及びエラスチン免疫染色が使用される。光及び電子顕微鏡を使用する細胞及びＥＣＭ構造の形態学的観察を使用して、発達する構築物における予想される細胞及び組織型の存在を特定することができる。
【００６５】
骨−靱帯−骨構築物は、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第８，７６４，８２８号に以前に記載された。
【００６６】
骨固定末端及び腱固定末端を有する腱構築物である回旋筋腱板修復構築物を形成する方法であって、（ａ）外因的な足場に髄間質細胞を配置することなく、線維形成成長培地内の基材上に該細胞を配置し、該細胞に集密的な腱単層を形成させることであって、三次元腱構築物が、基材からの単層の剥離を介して形成される、形成させることと、（ｂ）三次元腱構築物が、およそ１〜２ｍｍの直径及び４〜１０ｃｍの長さになるまで、単一腱構築物を培養物中で成長させることと、（ｃ）２つ以上の単一腱構築物を、線維形成分化培地中の培養物中に長さ方向に並べて配置することで、２つ以上の腱構築物の長さのおよそ２分の１（１／２）〜３分の２（２／３）が、ともに融合して、骨に結合するための修復構築物の骨固定末端となり、腱構築物の残りのおよそ１／２〜３分の１（１／３）が、修復構築物の腱固定末端の個々の腱叉の形成のために保持または使用されることとを含む、方法が本開示によって企図される。
【００６７】
腱構築物である回旋筋腱板修復構築物を形成するためのシステムであって、ａ）基材と、ｂ）外因的な足場に骨髄間質細胞を配設することなく、基材上に提供される該細胞と、ｃ）インビトロで培養されたときに該細胞に細胞外マトリックスを生成させ、集密的な腱単層を形成するように自己組織化させる、骨髄間質細胞と接触して提供される線維形成成長培地であって、三次元腱構築物が、基材からの単層の剥離を介して形成される、線維形成成長培地と、ｄ）（ｃ）で形成された２つ以上の腱構築物を、線維形成分化培地中の培養物中に長さ方向に並べて配置することで、２つ以上の腱構築物の長さのおよそ２分の１（１／２）〜３分の２（２／３）が、ともに融合して、修復構築物の骨固定末端となり、腱構築物の残りのおよそ１／２〜１／３が、修復構築物の腱固定末端の個々の腱叉の形成のために保持または使用されることとを含む、システムもまた提供される。任意で、（ｄ）において、６つの腱構築物は、培養物中に配置され、骨固定末端は、６つ全ての構築物を融合することによって形成され、腱固定末端は、２つの腱構築物をともに対合させて、構築物の腱固定末端の腱叉のうちの１つの腱叉を形成することによって形成される。
【００６８】
本方法またはシステムの様々な実施形態において、腱構築物の全長は、約４ｃｍ〜約１０ｃｍである。様々な実施形態において、腱固定末端叉は、腱構築物全体の長さの約２分の１（１／２）〜３分の２（２／３）から始まる。様々な実施形態において、骨固定末端は、約２〜７ｃｍの長さである。本システムの様々な実施形態において、腱固定末端叉の各々の長さは、およそ１〜５ｃｍである。腱構築物は、腱固定末端に２、３、４、または５つの腱叉を有し得る。
キット
【００６９】
方法を実施するためのそれらの使用を容易にする様式でパッケージ化された、本発明の方法において有用な１つ以上の腱構築物を含むキットもまた企図される。一実施形態において、そのようなキットは、本明細書に記載される腱構築物を含む、事前形成された回旋筋腱板修復構築物を含む。一実施形態において、キットは、培養物中に長さ方向に連続して配置して、インビトロで回旋筋腱板修復構築物を形成するための複数の腱構築物を含む。任意で、キットは、インビトロで腱構築物を成長させるための培地を含む。様々な実施形態において、回旋筋腱板修復構築物または腱構築物は、発送のために凍結される。キットは、特定の投与経路に従って回旋筋腱板修復構築物を移植するのに好適なデバイスを更に含み得る。
【００７０】
本発明の追加の態様及び詳細は、限定的ではなく説明的であることが意図される以下の実施例から明らかになるだろう。
【実施例】
【００７１】
実施例１．回旋筋腱板腱修復構築物の生成
様々な実施形態において、ＢＭＳＣ単離及び拡大は、以下のように達成され得る。無菌条件下で、穿刺法及び他の技術を使用して、当該技術分野において既知であり、かつ本明細書に記載されるように、宿主の骨から骨髄が回収され得る。以前に記載された方法を修正したものを使用して、腱構築物を形成する（米国特許第８，７６４，８２８号を参照されたい）。
【００７２】
構築物生成のために、全ての溶液及び培地を調製し、４℃で保管し、使用前に加熱ビーズ浴内で３７℃まで温めた。成長培地（ＧＭ）は、２０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）、２％の抗菌抗真菌剤（ＡＢＡＭ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）、１０−８Ｍのデキサメタゾン（ＤＥＸ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、６ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）、０．１３ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸−２−ホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、及び０．０５ｍｇ／ｍＬのＬ−プロリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を有する７８％のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）からなった。分化培地（ＤＭ）は、９１％のＤＭＥＭ、７％のウマ血清アルブミン（ＨＳ、Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）、２％のＡＢＡＭ、１０−８Ｍのデキサメタゾン（ＤＥＸ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、０．１３ｍｇ／ｍＬのａｓｃ−２−ｐｈｏｓ、０．０５ｍｇ／ｍＬのＬ−プロリン、及び２ｎｇ／ｍＬのトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）からなった。
【００７３】
ＢＭＳＣを腱系譜に誘導した。簡潔には、継代（３〜４）細胞を２１，０００個の細胞／ｃｍ２の密度で播種し、１日毎にＧＭを供給した。プレーティングの６日後、ＧＭをＤＭで置き換え、単層を更に５日間培養した。  単層は、ＤＭへの切り換えのおよそ４〜５日後に自然に自己層剥離する。単層が３Ｄ構築物を形成する際、単層を捕捉するために使用される束縛ピンを含有するように改変されている組織培養プレート上にＢＭＳＣをプレーティングした。３Ｄ形成後、１〜２ｍｍの直径及び６〜８ｃｍの長さの単一構築物を、元の細胞プレートから束縛ピンを有するＳｙｌｇａｒｄプレートへと移した。簡潔には、１００ｍｍの直径の細胞培養プレートを、１５ｍｌのＳｙｌｇａｒｄ（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ，ＵＳＡ、１８４型シリコーンエラストマー）で充填し、室温で３週間硬化させた。使用前に、プレートを紫外光（波長２５３．７ｎｍ）で６０分間除染し、７０％のＥｔＯＨ及びＤＰＢＳで濯いだ。
【００７４】
これらの単一腱構築物のうちの６つを並べて配置し、１つの末端で融合させたが、構築物の全体（４ｃｍ）の下およそ２／３で、６つの構築物を３つの末端に裂き（各々２つの構築物）、およそ３ｃｍの長さの３つ叉の領域を作製した（図１）。ＤＭ培地は、２〜３日毎に交換した。インビトロで７週間後、腱構築物が完全に形成された。凍結前に、回旋筋腱板構築物の全ての末端のおよそ５〜１０ｍｍを、非吸収性の５−０絹縫合糸を使用して野球ボール式ステッチで縫合した。各野球ボール式ステッチの末端には、６インチの余分な縫合を残しておいた。縫合の適用後、完全に形成された回旋筋腱板構築物を−８０℃（−１℃／分）で凍結した。手術移植前、構築物を冷凍庫から回収し、４℃の冷蔵庫内で最低１時間解凍させた。構築物の完全な解凍後、それを移植に使用した。
【００７５】
実施例２．設計された腱移植片回旋筋腱板（ＥＴＧ−ＲＣ）の移植
足場を含まない３Ｄ組織ＥＴＧ−ＲＣの移植を、ヒツジにおいて実行した。回旋筋腱板断裂修復手順における棘下筋腱の修復のための複列の縫合修復技術と組み合わせて、構築物を移植するために手術を実行した。最初に、構築物を腱に通し、野球ボール式ステッチ及び余分な縫合を使用して、構築物の末端を固定し、３つ叉末端の腱及び骨孔への通過を可能にし、その後、骨膜及び腱に固定した。この実験の対照動物は、腱移植片構築物は移植せず、縫合のみの修復であった。全ての修復を、修復していない対側の脚と比較した。６ヶ月間の回復期間の後、対照のヒツジ（図２Ａ及び２Ｄ）ならびに外植したヒツジ（図２Ｂ及び２Ｅ）ならびに縫合のみのヒツジ（図２Ｃ及び２Ｆ）の回旋筋腱板を、Ｘ線（図２Ａ〜２Ｃ）及び肉眼形態（図２Ｄ〜２Ｆ）によって撮像して、構築物の存在及び回旋筋腱板の修復を可視化した。  対側の対照側と比較して、修復した腱のＸ線は、ＥＴＧ−ＲＣ及び縫合修復のいずれにおいても回旋筋腱板関節へのいかなる有意な分解も示さなかった。肉眼形態は、両方の手術技術が回旋筋腱板腱で組織形成をもたらしたものの、ＥＴＧ−ＲＣが正常な組織再生を示した一方で、縫合修復は瘢痕形成を示したことを示す。
【００７６】
実施例３．ＥＴＧ−ＲＣの生体力学評価
移植の６ヶ月後、接線係数を測定することによって、ヒツジの対照及び移植した腱回旋筋腱板を生体力学に試験した（図３）。
【００７７】
６ヶ月間の回復後、ＥＴＧ−ＲＣまたは縫合技術のいずれかで修復した回旋筋腱板断裂は、修復群間で接線係数における差異を示さなかった。しかしながら、両方の修復群は、対側の肩よりも強固さが有意により少なかった。腱−骨界面の平均係数は、以下の通りであった：対側（１０６±２４ＭＰａ、ｎ＝２０、Ｐ＜０．０００１  ＥＴＧ−ＲＣ、Ｐ＜０．０００１  ＳＯ）、ＥＴＧ−ＲＣ修復（３３±１６ＭＰａ、ｎ＝１０、Ｐ＝０．３４）、及び縫合のみの修復（２１±７ＭＰａ、ｎ＝１１、Ｐ＝０．３４）。
【００７８】
接線係数試験において、構築物を移植したヒツジは、対照のヒツジと比較して、より低い接線係数を呈した（それぞれ、３３±１６ＭＰａ対１０６±２４ＭＰａ）。
【００７９】
修復した腱の０．０７５〜０．０９の歪み範囲内の係数（Ｍｐａ）は、対照の天然の腱よりも有意に少なかった（ｐ＜０．００１）。
【００８０】
実施例４．ＥＴＧ−ＲＣの組織学的評価
移植部位の肉眼形態及び移植の組織学的評価もまた実行した。肉眼形態は、ＥＴＧ−ＲＣ群及び縫合群の両方について、修復部位で結合組織の増加が存在したことを示した。対側の対照側と比較して、修復部位は、ＥＴＧ−ＲＣ修復及び縫合修復の両方について、最小量の瘢痕組織で被覆されていた。対側の対照側と比較して、修復した腱は一般に、ＥＴＧ−ＲＣ修復及び縫合修復の両方について、より幅広く、より長く、かつより厚かった。Ｘ線検査は、ＥＴＧ−ＲＣ群及び縫合群のいずれについても、回旋筋腱板の変性の徴候を示さなかった。
【００８１】
マッソンのトリクローム染色（Ｌｕｎａ  Ｌ．Ｇ．Ｍａｙｅｒ’ｓ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ  Ｓｔａｉｎ（Ｈ＆Ｅ）．Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（ｅｄ）．ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；１９６８）を使用して、腱付着部の線維軟骨領域を評価し、ＥＴＧ−ＲＣ修復の腱付着部が天然の腱付着部に似た段階的な帯域からなること、しかし縫合修復の付着部は段階的な構造を有さず、より少ない再生を示すことも示した。
【００８２】
ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）染色は一般に、組織片内のコラーゲンを組織学的に可視化するために使用される（Ｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｘ２：１２４−１３４，２０１５、Ｌａｔｔｏｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．６２：７５１−８，２０１４）。製造業者のプロトコルに従って、染色を実行した（ピクロシリウスレッド染色キット、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ、カタログ番号２４９０１−５００）。
【００８３】
ピクロシリウスレッド染色を使用して、腱付着部界面での組織コラーゲン整列を評価した。コラーゲン整列は、対側の肩及びＥＴＧの肩（図４Ｂ）が、縫合のみ（図４Ｃ）で修復した肩と比較して、有意により大きな整列を有することを示した。ＥＴＧ−ＲＣ修復した肩は、対側の肩と有意には異ならなかった（図４Ａ）。対側の肩は、８１±１８のグレースケール単位の平均輝度値を有した。ＥＴＧ−ＲＣ修復は、７５±１２の平均輝度グレースケール値を有した一方で、縫合のみの修復は、４７±９のグレースケール単位の値を有した（図４Ｄ）。ＥＴＧ−ＲＣ修復の輝度強度の増加は、適切に組織化したコラーゲン線維フレームワークへのコラーゲン線維構造の再造形の増加を示唆し、天然の腱付着部に似ている。対照的に、縫合のみの修復は、界面が組織化していない瘢痕組織で構成されているように見える。プロテオグリカン含有量を、腱付着部で、トリクローム染色片の異染色の領域を決定することによって評価した。ＥＴＧ−ＲＣ（図４Ｆ）または縫合のみの修復（図４Ｇ）において、線維軟骨形成の領域内で有意な差異は観察されなかったが、縫合のみの修復は、異染色形成がより高い傾向にあった。各群の腱付着部での異染色、または線維軟骨の領域パーセントは、以下の通りであった：対側の肩（４０±１９）、ＥＴＧ−ＲＣ修復（３０±１５）、及び縫合のみの修復（４２±１３）（図４Ｈ）。画像はまた、縫合のみの修復において腱付着部の構造がより無定形である一方で、ＥＴＧ−ＲＣが対照と比較して高度に整列した線維を有するという、線維の直線性も示した。
【００８４】
ヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色（Ｌｕｎａ  Ｌ．Ｇ．Ｍａｙｅｒ’ｓ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ  Ｓｔａｉｎ（Ｈ＆Ｅ）．Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（ｅｄ）．ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；１９６８）染色を実行して、修復を定性的、形態学的に評価した。両方の修復型は、血管新生及び細胞密度の増加によって示される再生の徴候を実証したが、表現型には明確な差が存在した。Ｈ＆Ｅ染色は、ＥＴＧ−ＲＣ修復（図４Ｊ）の腱付着部が一般に、天然の腱付着部構造に似た段階的な帯域（図４Ｉ）からなることを示した。この帯域配置は、ＥＴＧ−ＲＣ及び対側の肩よりも線維軟骨統合が少なく、組織化されたコラーゲン線維が少ない、縫合のみの修復（図４Ｋ）では観察されなかった。全体的に、縫合のみで修復した肩は、腱−骨界面における瘢痕様組織の突然の境界（図４Ｋ）を特徴とし、段階的な構造を有さず、これは緩徐な再生を示した。より高い拡大率での代表的なＥＴＧ−ＲＣの組織学は、直線的コラーゲン線維の密なバンドを示し、カルシウム堆積はほとんど〜全く示さなかった。
【００８５】
上記の説明的実施例において明記される本発明の数々の修正及び変形形態が、当業者に想起されることが予想される。したがって、添付の特許請求の範囲に現れる限定のみが、本発明に対して置かれるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ−２Ｆ】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｄ】
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【図４Ｅ−４Ｋ】
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【国際調査報告】
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