(57)【要約】本明細書では、抗がん剤を被包している、または抗がん剤に複合されるナノ粒子を用いて対象の少なくとも１つの骨のがんを治療するための組成物、システム、キット及び方法が提供される。他の実施形態において、ＲＡＮＫＬ阻害剤を被包しているまたはＲＡＮＫＬ阻害剤に複合されるナノ粒子を用いて対象の骨疾患（例えば、骨粗鬆症）を治療するための組成物、システム、キット及び方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、ナノ粒子は、中性またはほぼ中性の電荷（例えば、−５〜＋５ｍＶのゼータ電位）及び平均２５０ｎｍ未満の直径（例えば、平均１００〜２００ｎｍの直径を有する）である。
2019513756.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを治療する方法であって、組成物を対象に投与することを含み、
ここで前記組成物は薬物を被包している、及び／または薬物に複合されたナノ粒子を含み、
ここで前記ナノ粒子は中性またはほぼ中性の電荷及び平均で２５０ｎｍ未満の直径であり、
ここで前記対象は少なくとも１つの骨にがん細胞を有し、
ここで前記薬物は抗がん剤であり、及び
ここで前記投与により前記少なくとも１つの骨において、少なくとも一部の前記がん細胞を殺傷する、前記方法。
【請求項２】
前記ナノ粒子がポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ナノ粒子がポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）及び表面ポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記表面ポリマーがポリ（ビニルアルコール）を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ナノ粒子が−５〜＋５ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ナノ粒子が−３〜＋３ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ナノ粒子が、平均約１００〜２００ｎｍの直径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記がん細胞が、骨癌細胞、骨肉腫細胞、軟骨肉腫細胞、ユーイング肉腫細胞、線維肉腫細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、甲状腺癌細胞、及び腎臓癌細胞から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抗がん剤が、その結合フラグメントの抗がん性モノクローナル抗体、抗がん性小分子、及び前記抗がん性モノクローナル抗体またはその前記結合フラグメント及び前記抗がん性小分子の組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ナノ粒子がさらにＲＡＮＫＬ（核内因子κＢリガンド受容体活性因子）阻害剤を被包する及び／またはＲＡＮＫＬ阻害剤に複合される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＡＮＫＬ阻害剤が、オステオプロテゲリン（ＯＳＧ）、抗ＲＡＮＫＬ抗体、またはその結合フラグメントから成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
薬物を被包している及び／または薬物に複合されるナノ粒子を含有する組成物であって、
ここで前記ナノ粒子は中性またはほぼ中性の電荷で、かつ平均で２５０ｎｍ未満の直径であり、前記薬物が抗がん剤である、前記組成物。
【請求項１３】
前記ナノ粒子がポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ナノ粒子がポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）及び表面ポリマーを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記表面ポリマーがポリ（ビニルアルコール）を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ナノ粒子が−５〜＋５ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ナノ粒子が−３〜＋３ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ナノ粒子が、平均約１００〜２００ｎｍの直径を有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１９】
前記抗がん剤が、その結合フラグメントの抗がん性モノクローナル抗体、抗がん性小分子、及び前記抗がん性モノクローナル抗体またはその前記結合フラグメント及び前記抗がん性小分子の組み合わせから選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ナノ粒子がさらにＲＡＮＫＬ（核内因子κＢリガンド受容体活性因子）阻害剤を被包する及び／またはＲＡＮＫＬ阻害剤に複合される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＲＡＮＫＬ阻害剤がオステオプロテゲリン（ＯＳＧ）、抗ＲＡＮＫＬ抗体、またはその結合フラグメントから成る群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
対象に組成物を投与することを含む骨疾患の治療方法であって、
ここで前記組成物はＲＡＮＫＬ阻害剤を被包している及び／またはＲＡＮＫＬ阻害剤に複合されるナノ粒子を含み、
ここで前記ナノ粒子は中性またはほぼ中性の電荷及び平均で２５０ｎｍ未満の直径であり、
ここで前記対象は少なくとも１つの骨に骨疾患を有する、前記方法。
【請求項２３】
前記ＲＡＮＫＬ阻害剤が、オステオプロテゲリン（ＯＳＧ）、抗ＲＡＮＫＬ抗体、またはその結合フラグメントから成る群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＲＡＮＫＬ阻害剤がデノスマブを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記骨疾患が骨粗鬆症及び／または骨減少症である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ナノ粒子がポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ナノ粒子がポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）及び表面ポリマーを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記表面ポリマーがポリ（ビニルアルコール）を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ナノ粒子が−５〜＋５ｍＶのゼータ電位を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記ナノ粒子が−３〜＋３ｍＶのゼータ電位を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記ナノ粒子が、平均約１００〜２００ｎｍの直径を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
ＲＡＮＫＬ阻害剤を被包している及び／またはＲＡＮＫＬ阻害剤に複合されるナノ粒子を含む組成物であって、
ここで前記ナノ粒子は中性またはほぼ中性の電荷で、かつ平均で２５０ｎｍ未満の直径である前記組成物。
【請求項３３】
前記ナノ粒子がポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ナノ粒子がポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）及び表面ポリマーを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記表面ポリマーがポリ（ビニルアルコール）を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ナノ粒子が−５〜＋５ｍＶのゼータ電位を有する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ナノ粒子が−３〜＋３ｍＶのゼータ電位を有する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ナノ粒子が、平均約１００〜２００ｎｍの直径を有する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３９】
前記抗がん剤が、その結合フラグメントの抗がん性モノクローナル抗体、抗がん性小分子、及び前記抗がん性モノクローナル抗体またはその前記結合フラグメント及び前記抗がん性小分子の組み合わせから選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ナノ粒子がさらに抗がん剤を被包する及び／または抗がん剤に複合される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ＲＡＮＫＬ阻害剤がオステオプロテゲリン（ＯＳＧ）、抗ＲＡＮＫＬ抗体、またはその結合フラグメントから成る群から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ＲＡＮＫＬ阻害剤がデノスマブを含む、請求項３２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年４月８日に出願された米国仮特許出願第６２／３１９，９２６号に対する優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所により付与されたＲ０１ＣＡ２０６１８９、１Ｒ０１ＣＡ１４９３５９、及び１Ｒ０１ＥＢ００３９７５の下、政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本明細書では、抗がん剤を被包している、または抗がん剤に複合されるナノ粒子を用いて対象の少なくとも１つの骨のがんを治療するための組成物、システム、キット及び方法が提供される。他の実施形態では、ＲＡＮＫＬ阻害剤を被包しているまたはＲＡＮＫＬ阻害剤に複合されるナノ粒子を用いて対象の骨疾患（例えば、骨粗鬆症）を治療するための組成物、システム、キット及び方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、ナノ粒子は、中性またはほぼ中性の電荷（例えば、−５〜＋５ｍＶのゼータ電位）及び平均２５０ｎｍ未満の直径（例えば、平均１００〜２００ｎｍの直径を有する）である。
【背景技術】
【０００４】
骨は、多くのヒトのがん（例えば乳癌及び前立腺癌）の転移の共通部位であり、それは主に骨髄内の比較的ゆるやかな血流や、骨髄毛細血管内皮細胞の接着受容体の存在が、骨におけるがん細胞の局在化を支えているためである。これらの特性は、骨髄が増殖因子及びサイトカインが豊富な環境であるという事実と合わせて、全てが骨転移の進行を促す［１、２］。骨へ転移するがんの中で、前立腺癌は非常に高い発生率を示す（患者の約７０〜８０％が骨転移となる）。骨転移を伴う患者の５年生存率は、その疾患が限局的な患者と比較すると非常に低い（２０％対１００％）。前立腺癌と同様に、進行期の乳癌の患者の大部分は、死亡の時点までに骨格転移の形跡を示す［３］。骨転移の結果は多くの場合致命的である。骨転移は骨リモデリングに影響して骨の痛み、骨折及び神経圧迫を引き起こし、前立腺疾患において骨転移は、前立腺癌関連の罹患率及び死亡率の主な原因である［４］。骨は軟組織の器官より多く灌流されないので（心拍出量の３０％が肝臓へ届けられるのに対して心拍出量の７％が骨に届けられる）［５］、静脈内投与された抗がん化学療法剤は、骨転移部位で腫瘍増殖を抑制するための十分な治療用量に達しない。投与された薬物の大部分は、多くの場合肝臓のプロセスを介して排泄及び／または代謝されるか、または骨髄に十分量が到達する前に、他のより多く灌流される体の区画または組織に蓄積され得るかのいずれかである。
【０００５】
この課題を解決するために、抗がん剤［６］または薬剤封入ナノ粒子（ＮＰ）を骨誘導剤（例えばビスホスホネート［７］、テトラサイクリン［８］、またはＥ−セレクチン（骨髄内皮に過剰発現される）［９］）に複合するような、かかるアプローチが検討されているが、これらは非効率的なままである。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．［１０］は、ウシ血清アルブミンで作製したＮＰに複合したビスホスホネートが、骨の主要成分であるハイドロキシアパタイトに対し、非複合ＮＰよりも非常に高い親和性を有することをｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果で示したにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨を標的化しないことを見出した。骨髄腫の骨転移モデルに関する最近の研究において、Ｓｗａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．［１１］は、非複合ＮＰまたは薬物単独と比較して、プロテアソーム阻害剤のボルテゾミブを封入したアレンドロン酸（ビスホスホネート）複合ＮＰの有効性（骨減少、腫瘍量、及び生存率）に有意な差は見られなかった。がん化学療法を成功させるには、転移性及び進行期の腫瘍の有効な治療が重要であることが、ますます認識されている。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書では、抗がん剤を封入している、または抗がん剤に複合されるナノ粒子を用いて対象の少なくとも１つの骨のがんを治療するための組成物、システム、キット及び方法が提供される。他の実施形態では、ＲＡＮＫＬ（核内因子κＢリガンド受容体活性因子）阻害剤を被包している、またはＲＡＮＫＬ阻害剤に複合されるナノ粒子を用いて対象の骨疾患（例えば、骨粗鬆症）を治療するための組成物、システム、キット及び方法が本明細書で提供される。ナノ粒子は、ある実施形態では、中性またはほぼ中性の電荷（例えば、−５〜＋５ｍＶのゼータ電位）及び平均２５０ｎｍ未満の直径（例えば、平均１００〜２００ｎｍの直径を有する）である。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本明細書は対象に組成物を投与することを含む、がんを治療する方法を提供し、ここで組成物は、薬物を被包している及び／または薬物に複合されたナノ粒子を含み、ナノ粒子は中性またはほぼ中性の電荷かつ平均で２５０ｎｍ未満の直径であり、対象は少なくとも１つの骨にがん細胞を有し、薬物は抗がん剤であり、及び投与することにより少なくとも１つの骨のがん細胞の少なくとも一部を死滅させる。
【０００８】
ある特定の実施形態において、本明細書では薬物を被包しているナノ粒子及び／または薬物に複合されているナノ粒子を含むキット、システム、及び組成物が提供され、そのナノ粒子は中性またはほぼ中性の電荷かつ平均で２５０ｎｍ未満の直径であり、及びその薬物は抗がん剤である。
【０００９】
特定の実施形態において、ナノ粒子はポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）を含む。他の実施形態において、ナノ粒子はポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）及び表面ポリマーを含む。ある特定の実施形態において、表面ポリマーはポリ（ビニルアルコール）を含む。追加の実施形態において、ナノ粒子は−５〜＋５ｍＶのゼータ電位を有する（例えば、−５、−４、−３、−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、＋４、または＋５ｍＶ）。他の実施形態において、ナノ粒子は、−３〜＋３ｍＶのゼータ電位を有する。ある特定の実施形態において、ナノ粒子は平均約１００〜約２５０ｎｍの直径を有する（例えば、１００・・・１５０・・・２００・・・または２５０ｎｍ）。
【００１０】
ある特定の実施形態において、がん細胞は、骨癌細胞、骨肉腫細胞、軟骨肉腫細胞、ユーイング肉腫細胞、線維肉腫細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、甲状腺癌細胞、及び腎臓癌細胞から成る群から選択される。さらなる実施形態において、抗がん剤は、その結合フラグメントの抗がん性モノクローナル抗体、抗がん性小分子、及び抗がん性モノクローナル抗体またはその結合フラグメント及び抗がん性小分子の組み合わせから選択される。ある特定の実施形態において、ナノ粒子は、さらにＲＡＮＫＬ（核内因子κＢリガンド受容体活性因子）阻害剤を被包する及び／またはＲＡＮＫＬ阻害剤に複合されている。いくつかの実施形態において、ＲＡＮＫＬ阻害剤はオステオプロテゲリン（ＯＳＧ）、抗ＲＡＮＫＬ抗体、またはその結合フラグメントから成る群から選択される。特定の実施形態において、ＲＡＮＫＬ阻害剤はデノスマブを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明では対象（例えばヒト対象）に組成物を投与することを含む、骨疾患を治療する方法を提供し、ここで組成物はＲＡＮＫＬ阻害剤を被包している及び／またはＲＡＮＫＬ阻害剤に包含されるナノ粒子を含み、ナノ粒子は中性またはほぼ中性の電荷かつ平均で２５０ｎｍ未満の直径であり、対象は少なくとも１つの骨に骨疾患を有する。
【００１２】
特定の実施形態において、本明細書ではＲＡＮＫＬ阻害剤を被包している及び／またはＲＡＮＫＬ阻害剤に包含されるナノ粒子を含むキット、システム、及び組成物を提供し、ここでナノ粒子は中性またはほぼ中性の電荷かつ平均で２５０ｎｍ未満の直径である。
【００１３】
ある特定の実施形態において、ＲＡＮＫＬ阻害剤はオステオプロテゲリン（ＯＳＧ）、抗ＲＡＮＫＬ抗体、またはその結合フラグメントから成る群から選択される。他の実施形態において、ＲＡＮＫＬ阻害剤はデノスマブを含む。他の実施形態において、骨疾患は骨粗鬆症及び／または骨減少症である。ある特定の実施形態において、関節リウマチは本明細書に記載のＮＰと共にＲＡＮＫＬ阻害剤で治療される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】異なるＮＰ製剤の物理的特性の結果を示す。Ａ）動的光錯乱（ＤＬＳ）による粒度及び粒度分布に対するアニオン性、中性、及びカチオン性のＮＰの特性。ＮＰ粒度及び形状は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により測定した。Ｂ）アニオン性、中性、及びカチオン性のＮＰと表面結合したＰＶＡの量。データは、平均値±平均値の標準誤差として示す。ｎ＝３。Ｃ）浸漬条件下での薬物封入した中性ＮＰに由来する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＴＸの放出。データは平均値±平均値の標準誤差として示し、ｎ＝３。
【図２】異なる表面電荷を有するＮＰの体内分布を示す。Ａ）経時的に撮影した全身画像は、体内の中性ＮＰの長期的な停留を示す。Ｂ）Ｍａｅｓｔｒｏを用いて経時的に測定された皮膚の関心領域（ＲＯＩ）の定量で、中性ＮＰはアニオン性またはカチオン性のＮＰよりも、より長期的な体内停留を示す。データは平均値±平均値の標準誤差として示し、＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３。
【図３】骨における異なる表面電荷のＮＰの局在性を示す。Ａ）Ｍａｅｓｔｒｏを用いて測定した場合の、脛骨内ＮＰ局在化による蛍光シグナルの定量では、中性ＮＰの取り込み及び持続的な停留は、アニオン性またはカチオン性ＮＰの取り込み及び持続的な停留よりも高いことを示す。Ｂ）中性ＮＰを注射されたマウスの骨格の腹側画像は、骨全体、特に骨盤、長骨、胸骨、及び椎骨におけるＮＰの局在化を示す。Ｃ）脊柱のクローズアップ画像は、腰椎よりも頸椎でＮＰ局在化がより高いことを示す。Ｄ）外科的に切除した脛骨の画像は、骨髄（矢印）に中性ＮＰの局在化を示すが、石灰化骨には中性ＮＰの局在化を示さない。Ｅ）フローサイトメトリー分析では、骨髄細胞によるＮＰの取り込みを示す。Ｆ）フローサイトメトリーの定量データは、骨髄細胞の９０％超が中性ＮＰを内部移行することを示す。データは平均値±平均値の標準誤差で示され、＊Ｐ＜０．０５、ｎｓ＝有意差なし。Ｂ〜Ｄに示されるデータはＮＰ投与後２４時間である。
【図４】骨の腫瘍転移部位での中性ＮＰの局在性を示す。Ａ）ＩＶＩＳ（登録商標）を用いて測定された、接種後７日目のＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ前立腺癌細胞による生物発光シグナル及びＢ）がん細胞接種後７日目での骨のマイクロＣＴ画像。Ｃ）蛍光イメージング、及びＤ）Ｍａｅｓｔｒｏを用いて測定したシグナル強度の定量化（正常な反対側の脛骨よりも腫瘍を伴う脛骨においてＮＰの局在性が高いことを実証している）。Ｅ）ＮＰ投与後２４時間の骨内腫瘍を伴う骨のＥｘ  ｖｉｖｏ画像（Ｍａｅｓｔｒｏによる）。矢印は、転移腫瘍のある骨を示す。Ｆ）がん細胞による生物発光シグナル及び転移した腫瘍塊へのＮＰの局在を示す、ＮＰの蛍光。上記の共局在性の検討について、がん細胞による生物発光シグナル及びＮＰによる蛍光シグナルの両方を、ＩＶＩＳ（登録商標）を用いて捕捉した。脛骨において腫瘍に隣接して見られる明るいスポット（図４Ｆ、蛍光シグナル）は、リンパ節及び他の組織に注入されたＮＰの局在に起因する。データは平均値±平均値の標準誤差として示し、＊Ｐ＜０．０５。
【図５】骨転移モデルにおけるパクリタキセルを封入した中性ＮＰの有効性を示す。Ａ）処置後３週間の間でＩＶＩＳ（登録商標）を用いて測定した、骨のがん細胞による生物発光シグナルの変化。２週間目のＰＴＸ−ＮＰ及び他の群間は＊Ｐ＜０．０５、３週間目のＰＴＸ−ＮＰ及びＰＴＸ−ＣｒＥＬ間で＊Ｐ＜０．０５、３週間目のＰＴＸ−ＮＰ及び生理食塩水間で＊＊統計的な有意性なし。Ｂ）処置後３週間目の、ＩＶＩＳ（登録商標）を用いて捕捉した、腫瘍を伴う骨の代表的な生物発光画像。Ｃ）処置後５週間目の腫瘍量は、腫瘍を伴う足の重量から正常な反対側の足の重量を差し引くことにより決定した。Ｄ）処置後５週間目の異なる群に由来するマウスの脛骨の代表的なマイクロＣＴ。ＰＴＸ−ＮＰで処置した動物は骨減少を示さなかった。Ｅ）処置後の動物の体重変化。データは平均値±平均値の標準誤差として示し、ＰＴＸ−ＮＰ及び対照対ＰＴＸ−ＣｒＥＬで＊Ｐ＜０．０５、ＰＴＸ−ＮＰ対対照で有意差なし、ｎ＝５〜６。
【図６】骨格における中性ＮＰとの比較において、ラージサイズＮＰの相対的な蓄積を示す。中性ＮＰは、ラージサイズＮＰより骨に７倍高い蓄積を示す。データは平均値±平均値の標準誤差として示し、＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３。
【図７】ＰＴＸ封入アニオン性ＮＰによる骨内腫瘍の抑制結果を示す。（Ａ）３週間目の対照及びＰＴＸ−ＮＰでの処置における、生物発光画像の変化及び（Ｂ）３週間時の対照及びＰＴＸ−ＮＰでの処置における、生物発光シグナル倍率変化。この場合、各動物を各動物自体の対照（腫瘍接種後７日目のシグナルをベースラインとして取得した）として扱った。処置後３週間では、未処置の対照と比較して、ＰＴＸ封入アニオン性ＮＰで処置したマウスの骨内腫瘍に由来する生物発光シグナルの間に有意差はない。データは平均値±平均値の標準誤差として示し、Ｐ＞有意性なし、ｎ＝４。
【図８】前立腺癌の骨内腫瘍モデルにおける、骨転移の進行抑制の結果を示す。ＰＣ−３＿Ｌｕｃ細胞（２０μＬ中５×１０５）をヌードマウスの右脛骨の内腔に注入した。がん細胞による生物発光シグナル強度の変化を測定した。治療群（１２ｍｇ／ｋｇドセタキセル、ＴＸＴ等価薬用量のＴＸＴ−ＮＰ）は腫瘍接種後１週間目に尾静脈から投与された。一方で、対照群はいずれの処置も受けなかった。
【図９】ミネラル骨基質におけるＲＡＮＫＬ阻害剤デノスマブの作用概要を示す。
【図１０】骨髄の洞様毛細血管の概略図を示す。
【図１１】ナノ粒子の一実施形態の概略図を示しており、薬物をその中に含む生分解性ポリマーで作製されたコアマトリックスと外側表面ポリマー層とを有し、一般にほぼ球状の形を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書では、抗がん剤を被包している、または抗がん剤に複合されるナノ粒子を用いて対象の少なくとも１つの骨のがんを治療するための組成物、システム、キット及び方法が提供される。他の実施形態では、ＲＡＮＫＬ阻害剤を被包しているまたはＲＡＮＫＬ阻害剤に複合されるナノ粒子を用いて対象の骨疾患（例えば、骨粗鬆症）を治療するための組成物、システム、キット及び方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、中性またはほぼ中性の電荷（例えば、−５〜＋５ｍＶのゼータ電位）及び平均２５０ｎｍ未満の直径（例えば、平均１００〜２００ｎｍの直径を有する）である。
【００１６】
ある特定の実施形態において、本明細書では、骨髄に効率的に局在化して骨転移の部位へＮＰ媒介性の抗がん剤送達を向上させてがんの進行を抑制し、かつ骨減少を防ぐ、生分解性ＮＰが提供される。本開示の実施形態の開発中に実施された研究により、（ａ）静脈内（ＩＶ）投与後、中性の表面電荷を有するＮＰは、骨髄への局在化及び骨髄内停留においてアニオン性またはカチオン性のＮＰより効果的であり、（ｂ）薬物封入した中性ＮＰ（例えば、ＰＴＸ−ＮＰ）の単回投与が骨転移の進行を阻害し、かつ骨減少を防いだことが実証された。
【００１７】
本開示は使用されるナノ粒子の種類によって限定されない。ナノ粒子は中性またはほぼ中性の電荷（例えば−５〜＋５ｍＶのゼータ電位）かつ平均２５０未満の直径（例えば平均で１００〜２００ｎｍの直径）でなければならない。ナノ粒子は生分解性ポリマー（例えば実施例１及び２に示される）構成されてもよく、または金属ナノ粒子であってもよい。ナノ粒子は、例えば遷移金属粒子、例えばチタン、タンタル、ニオブ、鉄、銅、ルテニウム、モリブデン、ニッケル、コバルト、白金、パラジウム、金、もしくは銀のナノ粒子またはそれらの合金などを含む、中性であり、かつ例えば１００ｎｍ〜２５０ｎｍの平均直径を有する金属ナノ粒子であり得る。とりわけ、銅、金、及び銀などの導電性材料が使用され得る。ある特定の実施形態において、中性またはほぼ中性のナノ粒子はＡｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、ＩｎＡｓ、Ｓｉ、ＩｎＳｂ、ＩｎＰ、Ｇｅ、ＳｉＧｅ、酸化物ナノ粒子及び／またはそれらの材料の混合物で構成される。使用される脂質は、トリグリセリド（例えば、トリステアリン）、部分グリセリド（Ｉｍｗｉｔｏｒ）、脂肪酸（ステアリン酸、パルミチン酸）、及びステロイド（例えば、コレステロール）、ワックス（例えば、パルミチン酸セチル）またはそれらの組み合わせで構成され得る。ナノ粒子はリポソームであってもよい。固体脂質ＮＰ及びリポソームは、異なる脂質及びポロキサマー１８８、大豆ホスファチジルコリン、Ｃｏｍｐｒｉｔｏｌ、パルミチン酸セチル、Ｔｅｇｏ  Ｃａｒｅ４５０またはポリマー、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ４５００、Ｔｗｅｅｎ８５、オレイン酸エチル、アルギン酸ナトリウム７０％、エタノール／ブタノール、トリステアリングリセリド、ＰＥＧ４００、ミリスチン酸イソプロピル、プルロニックＦ６８、Ｔｗｅｅｎ８０等の界面活性剤から構成される。
【００１８】
ナノ粒子は均一な構造を有することができる。例えば、ナノ粒子は１つの材料または成分を粒子の中に含むことができる。ナノ粒子は固体であり得るか、コアシェル構造を有する。ナノ粒子は脂質ベースのナノ粒子であり得る。ナノ粒子はコアの中に１つの材料または成分を、またはシェルの中に１つの材料または成分を含むことができる。ナノ粒子はナノ結晶であり得る。ナノ粒子は例えば安定剤及び界面活性剤を使用して安定性を提供するように調整することができる。ナノ粒子は磁性ナノ粒子であり得る。
【００１９】
ある特定の実施形態において、ナノ粒子はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含まないが、他の実施形態においてナノ粒子はＰＥＧを含む。特定の実施形態において、ナノ粒子はポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）から形成される。かかるＰＬＧＡを生成する方法が下記の実施例１及び２、ならびにＳａｈ  ａｎｄ  Ｓａｈ，“Ｒｅｃｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｂｙ  Ｍｉｘｉｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｓｏｌｖｅｎｔ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｖｏｌｕｍｅ２０１５，ｐａｇｅｓ  １−２２で提供され、ナノ粒子を生成することについて、それらに記載された方法を含め、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２０】
ある特定の実施形態において、薬物（例えば、抗がん剤）またはＲＡＮＫＬ阻害剤は固体脂質ナノ粒子として形成される（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第８，９８０，８６４号を参照）。固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は平均１０〜２５０ｎｍ、または１００〜２００ｎｍの直径を有する球であってもよい。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、界面活性剤及び／または乳化剤で安定化され得る固体脂質コアマトリックスを有する。さらなる実施形態において、脂質ナノ粒子は自己集合脂質−ポリマーナノ粒子であってもよい（本明細書にその全体が参照によって組み込まれる、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，２００８，２（８），ｐｐ１６９６−１７０２を参照）。当技術は、中性かつ２５０ｎｍ未満の様々な種類のナノ粒子を作製する方法の説明を提供する（２５０ｎｍ未満である薬物部分を含有しているまたは薬物部分に複合された中性ナノ粒子を作製する方法の説明を含め、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＳＡによって２００７年、Ｔｈａｓｓｕ、Ｄｅｌｅｅｒｓ、及びＰａｔｈａｋにより編集された、「Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」というタイトルの本（ＩＳＳＢＮ：１０：０−８４９３−９０７３−７）を参照）。
【００２１】
ある特定の実施形態において、ＮＰは単一の水中油乳濁液溶媒蒸発法（例えば、一般的に最適化された条件で、同様のサイズかつ中性またはほぼ中性の電荷のＮＰを得る）によって形成される。例えば、中性またはほぼ中性の表面電荷であるＮＰは、ＮＰに結合される表面ポリマー（例えば、ＰＶＡ）の量を調節することにより、または表面ポリマー（例えば、ＰＶＡ、前述した手順にあるように［２１、２２］）と組み合わせてカチオン界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）を用いることにより形成される。表面ポリマーにはエチレンオキシド／プロピレンオキシドジブロック及びトリブロックポリ（エチレングリコール）、プルロニック及びテトロニック、アクリル酸及びアクリル酸アルキル、脂肪酸、ラウリル硫酸ナトリウム、ならびにαオレフィンスルホン酸塩が含まれるが、これらに限定されない。表面結合乳化剤は、洗浄を繰り返しても界面でＮＰと結合したままであることが知られている。乳化剤は、界面でのポリマーマトリックスと乳化剤の疎水性部分（ＰＶＡの場合はポリビニルアセテートまたはＣＴＡＢの場合はアシル鎖）のアンカリング及び組み込みのために残る。ある特定の研究において、生理学的及び生物学的特性に対する残留ＰＶＡの役割（細胞内取り込みや細胞内輸送）がＰＬＧＡ−ＮＰに関して決定されている［２３〜２６、これらの全ては参照によって本明細書に組み込まれる］。
【００２２】
特定の実施形態において、ナノ粒子は（例えば主として）生分解性ポリマー、（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）またはカプロラクトンポリマー、キトサン、ヒドロキシ酪酸、ポリ酸無水物、ポリエステル、ポリホスファゼン、ポリホスホエステル、Ｌｉｐｏｄｉｓｑなどの別のポリマー、もしくはそれらの任意の組み合わせから形成される。ある特定の実施形態において、生分解性ポリマーは、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（乳酸）、ポリ（アルキレングリコール）、ポリブチルシアノアクリレート、ポリ（メチルメタクリレート−コ−メタクリル酸）、ポリアルキルアミン、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００２３】
ある特定の実施形態において、ナノ粒子は一般的に図１１に示されるような、薬物をその中に含む生分解性ポリマーで作られたコアマトリックスと外側表面ポリマー層を有する、一般に球状の形を示す。このような実施形態において、表面は表面ポリマー（例えばＰＶＡ）で修飾される。アニオン性またはカチオン性のナノ粒子を作成するには、ナノ粒子の表面に結合する表面ポリマーの量を調節する。表面ポリマー（例えばＰＶＡ）の量を多くすると、ナノ粒子は一般的に中性になるのに対して、より少量にするとナノ粒子は一般的にアニオン性になる。ナノ粒子をカチオン性にするには、表面ポリマー及びカチオン性界面活性剤（例えばＣＴＡＢ、セチルトリメチルアンモニウムブロミド）を添加することができる。
【００２４】
ある特定の実施形態において、ナノ粒子を作製するために使用されるポリマーは、生分解性ポリマー（例えば体内で分解されて除去されるもの）であり、かつ生体適合性である。ある特定の実施形態において、かかるポリマーは疎水性である。いくつかの実施形態において、ポリマーは水の存在下で分解して内容物をゆっくりと放出する長鎖ポリマーである。特定の実施形態において、ポリマーは疎水性及び／または親水性単位の直鎖または分枝鎖である。いくつかの実施形態において、ポリマーは官能化もしくはエステル化された異なるポリマー部位を組み合わせた直鎖及び／または分枝鎖あるいはブロックコポリマーである。
【００２５】
ある特定の実施形態において、表面ポリマーは疎水性鎖及び親水性鎖を有する。ＰＶＡの場合、疎水性であるポリビニルアセテートと、一部のポリビニルアセテートが加水分解されてできる親水性のポリビニルアルコールの組み合わせである。いくつかの実施形態において、表面ポリマーは疎水性部位と親水性部位の均衡を有することにより、界面でポリマーの表面に固着する（例えば、アセテート部位はマトリックスに埋め込まれる一方でアルコール部位はナノ粒子の外側にある）。
【００２６】
進行期の前立腺癌は、多くの場合骨に転移するが、静脈内投与された抗がん剤の骨内での体内分布の乏しさにより治療不能となる。ビスホスホネートは現在、骨格関連事象のリスクを低減し、骨の痛みを改善するために使用されているが、生存率は改善しない。注射薬または骨親和性の薬物に複合された薬物封入ナノ担体は、骨転移の治療において非効率的である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、（例えば骨転移のための治療法としての）骨（骨髄の内皮細胞間の細胞内間隙）へのナノ粒子（ＮＰ）媒介性薬物送達のための経路である。
【００２７】
ＰＥＧ化ＮＰは、それらの親水性表面のために、骨髄毛細血管の有窓を通して効率的に血管外遊出するのではなく循環に留まる。本明細書で提供されるアプローチは、静脈内投与後に、これらのＮＰが骨髄の洞様毛細血管の開口部を通って血管外遊出するような特性（サイズ、電荷及び表面組成）を有する非ＰＥＧ化ＮＰを提供する。
【００２８】
前立腺癌のＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ細胞誘導骨溶解性の骨内マウスモデルを用いた、本開示の実施形態の開発中に行われた研究により、（ａ）静脈内注射後、これらのＮＰは、転移部位内の骨髄において局所的な蓄積を実証し、及び（ｂ）薬物封入ＮＰの単回投与は、骨転移の進行を有意に阻害し、骨減少を完全に防止した。
【００２９】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるＮＰは骨にＲＡＮＫＬ阻害剤を送達するために使用される。いくつかの実施形態において、ＲＡＮＫＬ阻害剤はデノスマブ（ＤＮｍｂ）であり、これは核内因子κＢリガンド受容体活性因子（ＲＡＮＫＬ）に結合するモノクローナル抗体である。骨の微小環境におけるＲＡＮＫＬの過剰発現は、骨転移及び骨吸収の進行の悪循環を引き起こす。ある特定の実施形態において、抗がん剤及びＲＡＮＫＬ阻害剤は同時に使用される。例えば、ＤＮｍｂはＲＡＮＫＬの標的リガンドとして用いられ、ドセタキセルはＮＰと組み合わされる。骨に効果的に局在化する本明細書中のＮＰ及びＤＮｍｂとＴＸＴのそれらの補完的な作用機序を有する組み合わせは、骨転移の進行を抑制し、骨減少を防止するために使用される（図９参照）。
【００３０】
骨は、多くのヒトがんにおいて壊滅的な結果を伴う転移の共通部位であり、そして骨転移は、前立腺癌と乳癌患者の罹患率及び死亡率の主な原因である。５年生存率はがんが骨へ転移した場合、非常に低い（限局性の場合１００％であるのに対して約２０％）。骨は他の器官より多く灌流されないため、（肝臓へは心拍出量の３０％であるのに対して骨へは心拍出量の７％）静脈内投与した化学療法剤は、骨の転移部位の治療レベルに達することができない。骨への薬物送達のための新しいアプローチが、骨転移を効果的に治療するために必要とされている。これらの重要性にもかかわらず、骨転移を治療するための薬物送達用ナノ担体は、依然として十分に研究されていない分野であり、ほとんどのアプローチは軟組織腫瘍の治療に焦点を当てている。骨髄は、内皮細胞間に１７０ｎｍの幅の細胞間間隙を伴う洞様毛細血管を有するが、長い体循環時間及び小さなサイズ（骨髄の毛細血管の有窓よりも小さい）にもかかわらず、ＰＥＧ化ナノ粒子（ＮＰ）は骨へ効果的に血管外遊出できない。
【００３１】
本開示の実施形態の開発中に実施された研究は（ａ）これらのＮＰは、ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ細胞誘導骨溶解性の骨内モデルにおいて骨転移の部位に局在化し、そして（ｂ）薬物（例えばパクリタキセル（ＰＴＸ）封入ＮＰの単回投与での静脈注射により骨転移の進行が遅くなり、骨減少が抑制され、及び急性薬物毒性が低減した。対照的に、急速に薬物放出するクレモフォールＥＬ製剤を用いて送達された等価用量のＰＴＸは、腫瘍増殖を悪化させ、体重減少を引き起こした。
【００３２】
ある特定の実施形態において、ＮＰを伴う抗がん剤は、ドセタキセル（ＴＸＴ）である。ＴＸＴはＰＴＸよりも強力であり、転移性の前立腺癌の治療のための選択薬である。いくつかの実施形態において、ＤＮｍｂ及びＴＸＴの組み合わせ（またはＲＡＮＫＬ阻害剤と抗がん剤の他の組み合わせ）は、骨吸収及びがん進行の予防において、それらの補完的な役割のために使用される。特定の実施形態においてＤＮｍｂは転移骨の微小環境において、ＲＡＮＫＬに対するＮＰのためのターゲティングリガンドとして使用される。
【００３３】
本発明はいかなる特定の機構にも限定されず、かつ機構の理解は本発明を実施するために必要ではないが、静脈内注射後にＮＰを介して送達されるＲＡＮＫＬ阻害剤（例えばデノスマブ（ＤＮｍｂ）は、転移した骨髄に貯蔵所を形成して、被包された阻害剤（例えば、ＤＮｍｂ）を腫瘍骨環境内でゆっくりと放出させて、過剰なＲＡＮＫＬレベルを制御することでａ）破骨細胞の分化、機能、生存、及びその結果の骨吸収を防ぐためにＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ相互作用を抑制することができると考えられている。正常な環境下では、骨芽細胞によって産生されるオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）は、ＲＡＮＫＬと結合してバランスを維持するが、腫瘍の骨環境内では、ＯＰＧ産生は副甲状腺ホルモン関連ペプチドなどの因子及び腫瘍細胞によって産生され分泌される他の因子（ＩＬ−６、プロスタグランジンＥ２、ＴＮＦ及びマクロファージコロニー刺激因子）などによってダウンレギュレーションされ、破骨細胞形成を刺激する、より高いＲＡＮＫＬ利用能の方へとバランスがシフトし、ｂ）分化した破骨細胞によって産生される増殖因子が、がん細胞の成長及び増殖を促進し、骨転移をさらに進行させ、ｃ）前立腺癌細胞によって産生されるＲＡＮＫＬの効果により骨芽細胞の破骨細胞への形質転換が促進され、ｄ）ＲＡＮＫＬは化学誘引物質と考えられるため、循環する前立腺癌細胞を骨髄へ移動させる。さらに、ＴＸＴ（または類似の薬剤）、骨髄におけるがん細胞死を誘導することができる微小管阻害剤の同時送達は、ＲＡＮＫＬ阻害剤−ＮＰと相乗的であり得る（図９）。したがって、ＲＡＮＫＬ阻害剤−ＮＰ（例えば、ＤＮｍｂナノ粒子）のみ、または抗がん剤ＮＰ（例えば、ＴＸＴナノ粒子）との組み合わせを介した複数の経路があり、進行期のがん（例えば、前立腺癌）の治療に有効であり得、かつ骨転移に共通する骨格関連事象を最小化し得る。
【００３４】
その重要性にもかかわらず、骨転移を治療するためのナノテクノロジーを使用した骨の薬物送達は、まだ十分に研究されていない領域である（４２）。骨髄脈管構造及びＮＰの特性を理解することは重要であり、両方とも、骨髄自体への骨髄毛細血管を介したＮＰの血管外遊出に重要である。骨髄は、内皮細胞間の細胞内間隙を有する洞様毛細血管を有し、これらの間隙の一部は、幅広いもので１７０ｎｍの幅である（図１０参照）（及び参考文献４３、４４を参照）。
【００３５】
ある特定の実施形態において、ＮＰは以下の特性、１）骨髄の洞様毛細血管を通過して骨髄に保持されるのに十分小さい、２）肝臓や腎臓の洞様毛細血管を通過しないように十分大きい、３）骨髄の洞様毛細血管を通って血管外遊出するのに十分な時間循環内に留まる、４）タンパク質との相互作用を減少させて、ＲＥＳの器官によるクリアランスを回避する及び５）非ＰＥＧ化することにより骨髄毛細血管を介して血管外遊出するのではなく循環中に留まり得る、の一部または全てを用いて構築される。ある特定の実施形態において、ＮＰの表面は、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞によるＮＰの取り込みを減らすように調節されることにより、肝臓の取り込みを回避すると同時に補体活性化タンパク質との相互作用を最小限に抑え、細網内皮系（ＲＥＳ）の器官によるクリアランスを低減させる。加えて、治療有効性のためには、転移性腫瘍部位の骨髄における血管外遊出したＮＰの持続的な保持も重要である。
【００３６】
従来、ＮＰは循環の中にいる時間を持続させるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ＰＥＧ化ＮＰ）またはプルロニックなどの親水性ポリマーで修飾される。これは、血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果を介する血管新生された原発腫瘍への抗がん治療薬の送達のために一般的に探求されているアプローチである（４８）。ＰＥＧ／プルロニックによるＮＰの修飾は、ＮＰの生体適合性を改善し、粒子凝集を低減し、そしてＰＥＧはリガンドに対して標的化のための複合の容易さ及び柔軟な化学的性質を提供することが示されている（４９）。さらに、ＰＥＧ化ＮＰは、他の用途において有用であることが示されている（例えば、それらは、非ＰＥＧ化ＮＰよりも粘液層を介してより効率的に拡散する）（５０、５１）。しかし、ＰＥＧ化／プルロニック修飾ＮＰは、骨髄への血管外遊出に有効ではない（５２）。いくつかの研究では、長い体循環時間及び骨髄毛細血管の有窓の開口部よりも小さいサイズにもかかわらず、骨髄におけるこれらのＮＰの取り込みは不十分なままであると報告されている（５３）。これは、親水性の表面が、骨髄毛細血管の有窓を通って血管外遊出させるのではなく、それらを循環内に留めるためであり得る。さらに、ＰＥＧ化は、ＮＰの表面を親水性にするため標的細胞による薬物取り込みの低下を引き起こし（５４）、そしてまた、ＰＥＧによる立体障害は、ＰＥＧを複合に使用しない場合の相互作用と比較して、リガンド−受容体相互作用を数百倍減少させる（５５）。ＰＥＧのこれらの対照的な作用は、一般に「ＰＥＧ化ジレンマ」と称される（５６）。ＢＩＮＤ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓが開発した、ＰＳＭＡ−アプタマーＰＥＧ複合化ＮＰは、現在がん治療の第ＩＩ相臨床試験中で、骨髄の洞様毛細血管を通過するには大きすぎる（約４００〜６００ｎｍの流体力学的直径）（３２）。骨髄毛細血管の有窓の開口部（約１７０ｎｍ）よりも小さな粒子サイズ（約１３０ｎｍ）を有するにもかかわらず、ＮＰアルブミン結合（ｎａｂ）ＰＴＸ（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））は、実際には乳癌転移の動物モデルにおいて骨を含む転移の発生を増加させることが示されている（５７）。この効果は、急速な薬物放出特性（１時間未満）に起因する可能性があり、したがって、骨転移部位に治療用量の薬物を直接送達及び持続させることができない（この点についてのさらなる議論は、以下の研究戦略を参照）。
【００３７】
本発明の実施形態の開発中に実施された研究では、アニオン性、中性またはカチオン性の表面電荷を有するＮＰを、ＮＰに結合するＰＶＡの量を調節することによって、または前述の手順に従ってＰＶＡと組み合わせてカチオン性界面活性剤セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を使用することによって製剤化した（６４、６５）。ＮＰの洗浄を繰り返しても、表面結合乳化剤はＮＰ表面に結合したままであることに注意することが重要である。この状態は、界面でのポリマーマトリックスと乳化剤の疎水性部分（ＰＶＡの場合はポリビニルアセテートまたはＣＴＡＢの場合はアシル鎖）のアンカリング及び組み込みのために生じる。いくつかの研究では、ＰＬＧＡ−ＮＰの（細胞内取り込み及び細胞内輸送）の生理学的及び生物学的特性に対する残留ＰＶＡの役割が究明されている（６６〜６９）。同様に、乳化剤として使用される場合、ＰＶＡとカチオン性界面活性剤との組み合わせは、ＰＬＧＡ−ＮＰにカチオン電荷を付与し得ることが示された（７０）。重要なことに、ＰＢＳ中で３７℃にてインキュベートした場合、ＰＶＡのかなりの部分が数日間にわたりＮＰと結合したままである（７１）。これは、ＮＰの表面組成が、それらの静脈内注射後に一定の期間維持されることを意味する。本明細書で行われた研究では、高圧均質化条件（ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ  Ｃ５、Ａｖｅｓｔｉｎ、１０，０００ｐｓｉで１０サイクル）を最適化して所望のサイズ範囲のＮＰを得た。
【００３８】
ある特定の実施形態において、様々な添加剤（例えば、可塑剤及びポア形成剤）が、本明細書に記載されるＮＰからの薬物（例えば、Ｕ−８６９８３などの疎水性薬物）の放出を調節するために使用される。ある特定の研究において、天然のＬ−酒石酸から製造された低分子化合物（ＭＷ＝１７８）であるＬ−酒石酸ジメチルエステル（ＤＭＴＡ）が薬物放出速度の調節に有効であることが見出された（９８）。ＤＭＴＡは不活性で有機溶媒及び水溶媒の両方に可溶性であり、ＰＬＧＡと相溶性であり、細孔を形成するのに有効であり、したがって可塑剤として作用する。ある特定の研究において、マトリックスからの薬物放出速度は、ポリマー塊に添加されたＤＭＴＡ（５％〜２０％ｗ／ｗ）の割合に依存することが見出された。１０％ＤＭＴＡでは、薬物放出速度はＤＭＴＡなしの速度の約５倍であった。したがって、いくつかの実施形態において、ＮＰは、ＮＰからの薬物の放出を調節するために、３〜３５％のＤＭＴＡまたは類似の薬剤を含む。例えば、このアプローチはＰＬＧＡ−ＮＰからのＴＸＴ放出速度を調節するために用いられてもよい。ＮＰを製剤化するために、ＴＸＴに加えてＤＭＴＡ（５％〜２０％ｗ／ｗポリマー重量）及びＰＬＧＡまたは他の生分解性ポリマーは、有機溶媒に溶解させてから乳化させる。
【００３９】
ある特定の実施形態において、ＲＡＮＫＬ阻害剤を有するＮＰが使用される。例えば、ＤＮｍｂ−ＮＰは、添加されるＤＭＴＡ（または他のポア形成剤）とともにＰＬＧＡ（または他の生分解性ポリマー）を用いて製剤化される。そのポア形成能のために、ＰＬＧＡポリマーに組み込まれるＤＭＴＡ（１：９ｗ／ｗ）は、ポリマー分解の結果として形成される酸性オリゴマー（ポリ乳酸及びポリグリコール酸）の自由拡散を可能にする。これらの酸性オリゴマーがＮＰに捕捉された場合、被包された酵素／タンパク質を変性させてそれらの生物学的活性に影響を与えて放出を不完全にすることが知られている（９９）。２４時間で８．２±１．６％、１週間で２６．８±１．５％、４週間で４１．５±３．２％、及び約３ヶ月で７８±９．３％の累積放出を伴う、活性型の持続放出酵素（スーパーオキシドジスムターゼ、ＳＯＤ及びカタラーゼ、ＣＡＴ）が以前から示されている（１００）。この製剤の組成物は、２４時間で１２％、５週間で６０％、及び９週間で１００％の累積放出を伴う活性型の他のタンパク質（血管内皮増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子）の持続放出に効果的であることも以前から示されている（１０１）。同様のアプローチを使用してＤＮｍｂ−ナノ（ＤＮｍｂの分子量は１４７ＫＤであるのに対して、ＳＯＤの分子量は３２．５ＫＤ、ＣＡＴの分子量は６８．９ＫＤ）を調製し、上述のようにＤＭＴＡに対して異なる比のポリマーを用いて放出速度を調節する。
【００４０】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載のＮＰは抗がん剤を含む、または抗がん剤に複合される。表５は、本明細書に記載のナノ粒子と共に使用することができる例示的な抗がん剤のリストを提供する。
【００４１】
【表１】
2019513756.tif 000003
2019513756.tif 000004
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【実施例】
【００４２】
以下の実施例は実例であり、本発明の範囲を限定することを目的としない。
【００４３】
［実施例１］
〔前立腺癌の骨内モデルにおける、表面調節された薬剤封入ナノ粒子による骨減少の抑制〕
本実施例において、生分解性ナノ粒子（ＮＰ）の表面電荷／組成物は、それらの血液循環時間が持続するように調節され、骨の洞様毛細血管の開口部を通って血管外遊出するのに十分小さく作製されることで骨髄に局在する。ＮＰ表面結合乳化剤組成物を調節することによって得られる中性の表面電荷を有するＮＰは、カチオン性またはアニオン性の表面電荷を有するＮＰよりも骨髄に局在する上でより有効であった。これらの小さな中性ＮＰ（通常が約３２０ｎｍであるのに対し、約１５０ｎｍ）はまた、大きなＮＰよりも骨髄に局在化するのに約７倍有効であった。
【００４４】
このようなＮＰは骨髄に局在することにより骨転移部位へのＮＰ介在性抗がん剤送達を改善し、それによってがんの進行を抑制し、骨減少を防止する。前立腺癌のＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ細胞誘導性骨溶解性骨内モデルにおいて、これらの小さな中性ＮＰは、骨髄における腫瘍塊との共局在化だけでなく、正常な反対側の骨よりも転移部位内の骨で蓄積が多いことを示した。重要なことに、パクリタキセルを封入したこれらの小さな中性ＮＰ（ＰＴＸ−ＮＰ）の単回静脈内投与は、骨転移の進行を遅らせたが、アニオン性ＰＴＸ−ＮＰでは遅らせなかった。さらに、中性ＰＴＸ−ＮＰは骨減少を防いだが、急速放出製剤であるクレモフォールＥＬ（ＰＴＸＣｒＥＬ）または生理食塩水（対照）で処置した動物は５０％を超える骨量減少を示した。中性ＰＴＸ−ＮＰは急性毒性を引き起こさなかったが、ＰＴＸ−ＣｒＥＬで処置した動物は体重減少があった。
【００４５】
〔材料及び方法〕
材料には以下のものが含まれた。ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ、５０：５０、０．２６〜０．５４ｄＬ／ｇの固有粘度）をＬＡＣＴＥＬ  Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）から購入した。ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ、８７〜９０％加水分解、分子量３０，０００〜７０，０００）、スクロース、クレモフォールＥＬ（ＣｒＥＬ）及びセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。近赤外（ＮＩＲ）色素（ＳＤＢ５７００）はＨ．Ｗ．Ｓａｎｄｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｊｕｐｉｔｅｒ、ＦＬ）から入手した。クロロホルムはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）から入手した。パクリタキセル（ＰＴＸ）は、ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）から購入した。
【００４６】
〔異なる表面電荷のＮＰの製剤化及び特性決定〕
ＮＰは単一の水中油乳濁液溶媒蒸発法によって製剤化されたが、条件を最適化して、サイズは同じであるが表面電荷が異なるＮＰを得た。簡潔には、前述した手順に従って、アニオン性、中性またはカチオン性の表面電荷を有するＮＰは、ＮＰに結合するＰＶＡの量を調節することによって、またはＰＶＡと組み合わせてカチオン性界面活性剤ＣＴＡＢを用いることによって調製した［２１、２２］（別記の材料を参照）。留意すべきことは、表面結合乳化剤が洗浄を繰り返しても界面でＮＰと結合したままであることである。乳化剤は、界面でのポリマーマトリックスと乳化剤の疎水性部分（ＰＶＡの場合はポリビニルアセテートまたはＣＴＡＢの場合はアシル鎖）のアンカリング及び組み込みのために残る。いくつかの以前の研究において、物理的及び生物学的特性（細胞内取り込み及び細胞内輸送）に対する残留ＰＶＡの役割が、ＰＬＧＡ−ＮＰについて特定された［２３〜２６、これらの全ては、特にナノ粒子生成について参照により本明細書に組み込まれる］。サイズの影響を調べるために、上記で使用されたものより大きなサイズのＰＬＧＡ  ＮＰも製剤化し、骨におけるそれらの局在について試験した（さらに下記参照）。ｉｎ  ｖｉｖｏでの体内分布をモニターするために、ＮＰにＮＩＲ色素のＳＤＢ５７００を封入した。この色素は、以前に、乳房［２７］及び前立腺［２２］異種移植モデルにおけるＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏイメージング及び体内分布について評価されている。この色素は、安定したシグナル（レーザー照射を繰り返した後でも）、高蛍光収率、バックグラウンドシグナルがないこと、及びＮＰからの色素浸出の量が僅かであること（色素の疎水性及び少ない封入量（０．１％ｗ／ｗポリマー重量）のため）を含む、いくつかの利点を提供する［２２］。
【００４７】
ＰＴＸを封入したＮＰを製剤化して、治療効果を判定した。流体力学的直径及びＮＰのζ電位をＮＩＣＯＭＰ  ３８０  ＺＬＳ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を用いた動的光散乱により、水中で測定した。さらに、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて表面結合ＰＶＡ、表面形態及びサイズについてＮＰを特性決定した［２２］。ＮＰ中に封入しているＰＴＸは、メタノールを用いてＮＰから薬物を抽出することによって測定した。ＮＰからのＰＴＸ放出は、前述のように浸漬条件下で、二重拡散チャンバー内で行った［２８］。試料のＰＴＸレベルは高速液体クロマトグラフィー（ＮＰの製剤及び特性決定に用いられる詳細な方法については、さらに下記を参照）により分析した。
【００４８】
〔動物試験〕
Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ＣｌｉｎｉｃのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅは全ての動物の手続きを承認し、これらは連邦及び施設内ガイドラインに従って実施された。試験は、５〜６週齢の雄の胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を用いて行った。
【００４９】
〔Ｎｐの体内分布〕
生理食塩水中ＮＩＲ色素を封入したＮＰ（３０ｍｇ／ｍＬ）の１００μＬ懸濁液の１回投与量を、各マウスに尾静脈を介して注射し、暴露時間をそれぞれ５００ｍｓ（青色フィルター）及び１２００ｍｓ（ＮＩＲフィルター）で設定したＭａｅｓｔｒｏ  ＥＸ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、動物を注射後の異なる時点で画像化した。骨のＮＰに起因するシグナル強度（カウント）の局在化及び相対的定量化を可視化するため、皮膚、筋肉及び脂肪を除去して骨格を露出させてから上記のように画像化した。脛骨に局在するＮＰに起因する相対的なシグナル強度を定量化するために、脛骨全体をカバーする関心領域（ＲＯＩ）を使用した。他の骨はＮＰ局在化について分析されたが、本実施例では、以下に記載するように、腫瘍誘導に使用される最も一般的な部位であることから、脛骨に焦点を当てている。
【００５０】
〔骨転移の誘導及びイメージング〕
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ細胞（ＮＩＨから入手）を、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。骨転移は、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．［２９］に記載されるように誘導した。簡潔には、ケタミン／キシラジン麻酔下のマウスに、２０μＬのＰＢＳ中４×１０５個のＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ細胞を右脛骨の内腔に骨内注射し、次いで生物発光シグナル強度（光子／秒／平方センチメートル／ステラジアン［ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒ］）及び骨減少を測定するためのマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）における変化を用いて骨転移誘導及びその進行をモニターした。生物発光については、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、ルシフェリン（２００ｍｇ／ｋｇ、ＶｉｖｏＧｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の腹腔内注射の１５分後に動物を画像化した。さらに、ＩＶＩＳ（登録商標）ＬｕｍｉｎａＩＩを用いて、がん細胞の生物発光シグナル及び転移した骨における色素封入ＮＰの蛍光シグナルを同時登録した。骨減少を測定するために、前臨床試験手順用のｉｎ  ｖｉｖｏでのマイクロＣＴ（ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｌｏｃｕｓ  ＲＳ  Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、大腿骨の頭部で切除された肢を画像化した。マイクロＣＴ画像は、Ｘ線管（８０ｋＶ、４９０μＡ）を用いて１．８秒の露光時間で取得した。検出器ビンは２０μｍの最大解像度を提供する、１ｘ１空間分解能に設定された。画像は回転度ごとに取得され、３６０の生データ投影図を作成した。これらの投影図は、走査された標本の完全な３次元再構成を作成するためにＧＥ独自の再構成アルゴリズムを使用して補正され、歪み補正され、再構成された。
【００５１】
〔骨髄細胞のフローサイトメトリー分析〕
骨髄におけるＮＰの細胞内取り込みを測定するために、腫瘍のない動物に、ＮＩＲ色素を封入したＮＰ（１００μＬ生理食塩水中３ｍｇ）を注射し、注射後２４時間で安楽死させた。それらの大腿骨を切除し、骨髄を回収するために生理食塩水で洗い流した。採取した骨髄を赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で１０分間インキュベートし、遠心分離して有核細胞を回収し、生理食塩水で２回洗浄した。フローサイトメトリーは、赤色チャネルの有核細胞に対して行い、色素を封入したＮＰを有する細胞のパーセンテージを決定した（ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）。
【００５２】
〔ＰＴＸ封入ＮＰの有効性を判定するための治療〕
マイクロＣＴ及び生物発光シグナルにより、接種後７日目に骨髄で腫瘍の誘導を確認した。この時点で、確認された骨内転移を有するマウスを３つの群に分け、（ａ）クレモフォール／エタノール中のＰＴＸ（ＰＴＸ−ＣｒＥＬ）、（ｂ）ＰＴＸ−ＮＰ（ＰＴＸの用量＝７ｍｇ／ｋｇまたは１１０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ−ＮＰ）、または（ｃ）対照として生理食塩水の単回投与のＩＶ注射を行った。ＰＴＸの投与量は、前立腺癌患者に用いられた１７５ｍｇ／ｍ２の標準用量から算出した。腫瘍の増殖は、ＩＶＩＳ（登録商標）を用いた、がん細胞の生物発光イメージングによって毎週モニターした。処置の５週間後に、動物を安楽死させ、両方の後肢を回収した。反対側の肢と腫瘍を有する肢の重量の差を用いて腫瘍量を算出した［３０、３１］。
【００５３】
〔異なる表面電荷及びサイズのＮＰの製剤化〕
典型的な手順において、９０ｍｇのＰＬＧＡを３ｍＬのクロロホルムに溶解させ、これを１２ｍＬの１％ｗ／ｖ  ＰＶＡ溶液に加えてアニオン性ＮＰを形成させるか、２％ｗ／ｖ  ＰＶＡに加えて中性ＮＰを形成させた。カチオン性ＮＰを調製するために、４ｍＭセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を含有する１％ＰＶＡ溶液にポリマー溶液を乳化させた。ポリマーとＰＶＡの溶液を３０秒間ボルテックスしてからプローブソニケーター（ＸＬ  ２０１５  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ，Ｍｉｓｏｎｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を用いて氷浴中で３分間超音波処理した。得られた乳濁液を高圧ホモジナイザー（ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ  Ｃ５；Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｏｔｔａｗａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）に５，０００〜１０，０００ｐｓｉで１０サイクル通して粒径を小さくした。カチオン性ＮＰについては、乳濁液を５分間上記のように超音波処理したが、均質化はしなかった。乳濁液をドラフト内で一晩攪拌し、形成されたＮＰを４℃、３０分間、３０，０００ｒｐｍ（Ｒｏｔｏｒ  ５０．２Ｔｉ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｌ８０，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）の超遠心分離によって回収した。ＮＰを水で２回洗浄し、３％ショ糖の水溶液に再懸濁させた後、−４８℃、３．５Ｐａ（ＦｒｅｅＺｏｎｅ  ４．５，Ｌａｂｃｏｎｃｏ  Ｃｏｒｐ．，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）で２日間凍結乾燥した。色素を封入したＮＰを調製するために、１００μｇのＳＤＢ５７００をポリマー溶液に添加してアニオン性及び中性のＮＰを製剤化し、２００μｇのＳＤＢ５７００を使用してカチオン性ＮＰを製剤化した。カチオン性ＮＰを製剤化するのに必要な色素の量が、アニオン性または中性のＮＰに対して使用された量より多かったのは、ポリマー溶液に添加された色素の一部が、外側の水相中に形成されたＣＴＡＢミセルに分配されたためである。異なる製剤に使用された色素の量は、全てのＮＰのシグナル強度が極めて類似するように最適化された。ラージサイズＮＰは、アニオン性ＮＰを作製するために使用されたものと同一のプロトコルを用いて製剤化されたが、均質化ステップは使用しなかった。ＰＴＸ封入中性ＮＰを製剤化するために、６ｍｇのＰＴＸをポリマー溶液に添加して上記のように処理した。
【００５４】
〔異なる表面電荷を有するＮＰの特性決定〕
ナノ粒子（ＮＰ）の平均流体力学的直径は、Ｎｉｃｏｍｐ  ３８０  ＺＬＳ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を用いた動的光散乱法により測定した。水中のＮＰの１００μｇ／ｍＬ懸濁液を氷上で３０秒間超音波処理し、分粒のために５０μＬのアリコートをホウケイ酸ガラスの使い捨て培養チューブ（Ｋｉｍｂｌｅ  Ｃｈａｓｅ，Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮＪ）に添加した。同じＮＰ懸濁液を使用して、二相解析及び電流モードでのゼータ電位を散乱角−１４ｏで測定した。ＮＰの表面形態については、シリコンウェハー上に被覆され、空気乾燥したＮＰを原子間力顕微鏡で測定した。使用前に、シリコンウェハー（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）をＨ２Ｏ／Ｈ２Ｏ２／ＮＨ４ＯＨ（４：１：１体積）の混合液に８０℃で５分間浸漬することにより洗浄し、超純水ですすぎ、そして連続的なＮ２気流下で乾燥させた。水中で新たに調製したＮＰ懸濁液の１００μＬアリコートは、ＮＰが均一に広がることを確実にするために２５度の角度に傾斜した洗浄済みシリコンウェハー上に塗布し、無塵環境で乾燥させた。約３００Ｈｚの共振周波数及び１０ｎｍ未満の先端半径（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ、Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｄｉｎｇ）を有する１２５μｍの長さのシリコンプローブを使用するＢｉｏＳｃｏｐｅ  ＩＩ原子間力顕微鏡（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）は、０．５Ｈｚの走査速度及び５１２×５１２ピクセルの解像度で１．０の設定値比でのタッピングモードにおけるイメージングのために使用された。画像はＮａｎｏｓｃｏｐｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．３０（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）の二次平坦化（ｓｅｃｏｎｄ−ｏｒｄｅｒ  ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）手順を使用して画像を平坦化した。
【００５５】
〔ＮＰに結合するＰＶＡの量の評価〕
ＮＰに結合するポリビニルアルコール（ＰＶＡ）の量を測定するため、水中の各ＮＰ（１ｍｇ／ｍＬ）の懸濁液１ｍＬに、０．５Ｍ  ＮａＯＨを２ｍＬ添加し、６０℃で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、９００μＬの１Ｍ  ＨＣｌを各懸濁液に加え、１．１ｍＬの水で希釈した。上記の懸濁液に、３ｍＬのホウ酸を添加し、続いて０．５ｍＬのＩ２／ＫＩ（０．０５Ｍ／０．１５Ｍ）を添加し、１．５ｍＬの水を加えて反応混合物の全体積を最大１０ｍＬにした。反応は室温で１５分間続けられた。形成されたヨウ素−ＰＶＡ複合体の吸光度を分光光度計（ＤＵ  ６４０Ｂ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を用いて６９０ｎｍで測定した。ＰＶＡの検量線は、水中０〜１０００μｇ／ｍＬのＰＶＡの濃度範囲で作成した。中性ＮＰは、アニオン性ＮＰより３８％及びカチオン性ＮＰより１８％多い残留ＰＶＡを示す。
【００５６】
〔ＰＴＸ−ＮＰ由来の封入薬物及び薬物放出〕
ＮＰに封入しているＰＴＸは、アセトニトリル中で２ｍｇのＮＰを４℃で４８時間インキュベートすることによってＮＰからＰＴＸを抽出して測定した。ＮＰからの薬物放出は、０．１μｍメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）によって分離された二重拡散チャンバー内で行った。浸漬条件は、保存剤として０．１％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−８０（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて得た。各拡散チャンバーのドナーチャンバーには、２ｍｇのＮＰを含む２ｍＬの緩衝液を封入したのに対して、レシーバーチャンバーにはＮＰを含まない２ｍＬの遊離緩衝液を入れた。封入した拡散チャンバーをオービタルシェーカー上で１００ｒｐｍ、３７℃で回転させた。レシーバーチャンバーの全内容物を異なる時点で回収し、新たな遊離緩衝液と置き換えた。回収した試料を−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。各試料からのＰＴＸをアセトニトリル３００μＬで抽出した。各試料のＰＴＸの量は、アセトニトリル／水（５０：５０）を移動相として使用したＫｉｎｅｔｅｘ  Ｃ−１８カラム（Ｐｅｎｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）での高速液体クロマトグラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）により測定した。注入量は２５μＬであった。ＰＴＸは２２８ｎｍの紫外線検出器で、５．１分の溶出時間で検出された。０〜１０００μｇ／ｍＬの濃度範囲のＰＴＸについて検量線を作成した。薬物封入量を測定するために、ＮＰから抽出したＰＴＸを上記の方法を用いて分析した。
【００５７】
〔骨へのラージサイズＮＰ及び中性ＮＰの蓄積の評価〕
生理食塩水中のＮＩＲ色素封入ＮＰ（３０ｍｇ／ｍＬ）の懸濁液１００μＬを尾静脈注射後２４時間でマウスを屠殺した。皮膚、筋肉及び脂肪を注意深く除去して、骨格を露出させ、暴露時間をそれぞれ５００ｍｓ（青色フィルター）及び１２００ｍｓ（ＮＩＲフィルター）で設定したＭａｅｓｔｒｏ  ＥＸ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、画像化した。関心領域を骨格全体で作成し、骨内に局在するＮＰの相対量を定量化した。
【００５８】
〔ＰＴＸ封入アニオン性ＮＰの有効性〕
２０μＬのＰＢＳ中４×１０５個のＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ細胞を右脛骨の内腔に注入することにより、骨内腫瘍を誘導した。接種の７日後に骨内腫瘍を確認後、マウスは異なる処置群に分けられ、ＰＴＸ封入アニオン性ＮＰ（ＰＴＸ＝７ｍｇ／ｋｇもしくはＰＴＸ−ＮＰ１１０ｍｇ／ｋｇの用量）または生理食塩水のいずれかの単回静脈内注射を受けた。腫瘍の進行は、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩを用いた生物発光イメージングにより、処置後３週間追跡した。
【００５９】
〔統計解析〕
全ての数値データは、平均±平均値の標準誤差として表した。骨髄細胞によるＮＰ取り込み及び転移部位におけるそれらの局在性の両方についての統計学的有意性を、スチューデントｔ検定によって決定した。一元配置分散分析を行って、脛骨における異なるＮＰ製剤の体内分布及び局在性を解析し、治療有効性試験についても解析した。統計学的有意性は、Ｐ＜０．０５に設定した。
【００６０】
［結果］
〔ＮＰ製剤及び特性決定〕
全ての小さなＮＰ製剤は、同様の流体力学的直径及び粒度分布（多分散指数）を示したが、それらの表面電荷（ζ電位）は異なっていた（表１、図１）。ＮＰのＡＦＭ画像は、表面電荷にかかわらず球形を示した（図１Ａ）。ＡＦＭによって測定された平均ＮＰ直径は、動的光散乱法を用いて水中で測定された流体力学的直径よりも小さかった（表１）。より大きなＮＰは、３２１ｎｍの平均流体力学的直径（２４８〜４６０ｎｍの範囲、０．１の多分散指数）及び−１５ｍＶのζ電位を有した。測定されたように、表面結合ＰＶＡは、カチオン性ＮＰ（１２５μｇ／ｍｇ  ＮＰ）またはアニオン性ＮＰ（１０６μｇ／ｍｇ  ＮＰ）よりも中性ＮＰ（１４６μｇ／ｍｇ  ＮＰ）で大きかった（図１Ｂ）。色素または薬物なしで製剤化されたそれぞれのＮＰと比較して、色素または薬物封入ＮＰのサイズ及びζ電位に有意差はなかった（表１）。ＮＰ中のＰＴＸ封入量は６．４±０．３％ｗ／ｗであり、７週間にわたって２８％の累積薬物放出を示した（図１Ｃ）。また、色素は疎水性の色素のため、組み込まれた色素のほんの僅かな量しかＮＰから浸出しないので（浸漬条件下で４日間にわたって５％）、ＰＬＧＡポリマーにおけるその高い固体溶解度（相分離なし）［３２］、及びＮＰ中の非常に低い色素封入量（約０．１％ｗ／ｗ）により、本発明者らは、観察されたシグナルは主にＮＰ自体からであり、遊離色素由来ではないと考えた。異なる表面電荷を有する３つの小さなＮＰ製剤は全て、ＮＰの単位重量あたりのシグナル強度が類似していたため（ＮＰ１マイクログラムあたり約１４カウント）、Ｍａｅｓｔｒｏを用いて測定した光シグナル強度に基づく相対的体内分布（骨髄を含む）を比較可能であった。ラージＮＰのシグナル強度は、１μｇのＮＰあたり１３カウントであった。
【００６１】
【表２】
2019513756.tif 000015
【００６２】
〔異なる表面電荷を有するＮＰの体内分布〕
最初の体内分布研究は正常なマウス（腫瘍なし）で実施され、どのＮＰの製剤が骨髄において、より良好な局在化及び滞留を示すかを決定した。イメージングデータは、ＮＰの体内分布の差を、特に経時的に、その電荷に応じて示した。注射直後（２分）に、ＮＰの全ての製剤は主に肝臓に局在性を示したが、この体内分布は時間が経過するにつれて変化した（図２Ａ）。循環中のＮＰに起因するシグナルと考えられた、左下腹部の「皮膚」に対する関心領域（ＲＯＩ）の定量では、中性ＮＰがアニオン性及びカチオン性ＮＰよりも循環内に長く留まることを示した（図２Ｂ）。ＮＰの相対循環時間を測定するために皮膚のシグナルを追跡するこの方法は、以前から使用されている［２１、３３］。血液中のＮＰの直接測定は、ＮＰの絶対定量のために必要であるが、皮膚追跡の方法は、循環内ＮＰの長期的な経時的モニタリングを可能し、かつ直接的な血液測定値と相関する。ＮＰ投与２４時間後の脛骨のＲＯＩの定量化では、中性のＮＰの蓄積は、カチオン性ＮＰより５２％、及びアニオン性ＮＰより４１％大きいことをそれぞれ示した。注射後９６時間で、脛骨内の中性ＮＰの蓄積は、アニオン性またはカチオン性ＮＰよりも２．５倍高かった（図３Ａ）。個々の一連の実験では、動物を安楽死させ、中性ＮＰの注射の２４時間後に解剖して、他の骨におけるそれらの体内分布を視覚化した。脛骨及び胸骨の局在性に加えて、中性のＮＰは全ての骨に見られた。シグナル強度に基づいて中性ＮＰのより多い蓄積が、肋骨及び頭蓋顔面骨よりも骨盤及び脊柱において確認された（図３Ｂ）。脊柱において、中性ＮＰは腰椎よりも胸部により多く見られた（図３Ｃ）。脛骨のクローズアップ画像は、骨組織中ではなく骨髄中に中性ＮＰの局在を示し（図３Ｄ）、これは骨髄のフローサイトメトリー分析によりさらに確認され、ＮＰを有する有核細胞は９０％を示した（図３Ｅ、Ｆ）。脛骨に見られるように、大腿骨の切除された部位も骨髄中にＮＰの局在性を示した（画像は示されない）。全身骨格イメージングから、骨中の小さな中性ＮＰの蓄積はラージＮＰより約７倍多いことが示された（図６）。
【００６３】
〔転移した骨におけるナノ粒子の局在性〕
生物発光及びマイクロＣＴ画像により、ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ細胞による骨髄の接種後１週間以内に脛骨内腔に骨内腫瘍の誘導を確認した（図４Ａ、Ｂ）。画像データは、静脈内投与後の中性ＮＰは、正常な反対側の脛骨よりも、転移を伴う脛骨で２倍多い蓄積を示した（図４Ｃ、Ｄ）。これらの動物から回収された骨のＥｘ  ｖｉｖｏイメージングにより、正常な反対側の脛骨より転移脛骨内に中性ＮＰの局在性が高いことをさらに確認した（図４Ｅ）。さらに、がん細胞の生物発光シグナル及びＮＰの蛍光シグナルの共局在性（図４Ｆ）は、骨髄中の腫瘍塊への中性ＮＰの送達を示した。
【００６４】
〔パクリタキセルを封入したＮＰによる骨転移の阻害〕
生物発光イメージングは、ＰＴＸ−ＣｒＥＬまたは対照の生理食塩水よりもＰＴＸ−ＮＰで処置した動物で骨転移の進行がより遅いことを示した（図５Ａ）。興味深いことに、ＰＴＸ−ＣｒＥＬで処置された動物は、生理食塩水を投与された動物よりも腫瘍の進行が比較的早いことを示した。処置後２週間での生物発光シグナル強度に基づいて、ＰＴＸ−ＮＰで処置された動物は、生理食塩水で処置された対照より８９％またはＰＴＸＣｒＥＬで処置された動物より９６％低い腫瘍量をそれぞれ示した（Ｐ＜０．０５）。処置の３週間後、ＰＴＸ−ＮＰを投与された動物は依然としてより低い腫瘍量を示し、すなわち未処置対照より６１％またはＰＴＸ−ＣｒＥＬで処置した動物より１４３％それぞれ低かった（図５Ａ、Ｂ）。研究終了時（処置後５週）に、腫瘍を有する肢と反対側の正常な肢との重量の差から計算した腫瘍量は、未処置の生理食塩水対照またはＰＴＸ−ＣｒＥＬで処置した動物よりも、ＰＴＸＮＰで処置した動物において有意に少ない腫瘍量を示す（Ｐ＜０．０５）（図５Ｃ）。アニオン性ＮＰ及びカチオン性ＮＰは、同様の骨髄内取り込み及び滞留を有しているため（図３）、ＰＴＸ封入アニオン性ＮＰの骨転移の阻害について試験した。このデータは、３週間の終わりの処置及び生理食塩水対照の生物発光シグナルにおいて僅かな差を示す（図７）。マイクロＣＴを用いた処置後５週間で回収された脛骨の分析は、ＰＴＸ−ＮＰ処置動物において骨減少を示さなかったが、ＰＴＸ−ＣｒＥＬ処置動物は、５０％を超える骨吸収を示し、生理食塩水対照動物で確認された骨減少と類似していた（図５Ｄ）。ＰＴＸ−ＣｒＥＬで処置した動物は体重減少を示したが、対照的に、ＰＴＸ−ＮＰで処理した動物は体重増加し、ＮＰに被包されたＰＴＸ送達による急性薬物毒性がなかったことを示している（図５Ｅ）。全ての群の動物は、３週時点の体重と比較して５週時点で体重減少を示したが、ＰＴＸ−ＣｒＥＬで処置した動物は、生理食塩水対照またはＰＴＸ−ＮＰで処置した動物よりも大きな体重減少を示した。
【００６５】
がんナノ医療の分野における進歩は、いくつかのＮＰをベースとした治療法の登場や、様々な種類のがんを治療するために進行中の臨床試験が増加していることから、明らかである［３４、３５］。一般に、ＮＰの有効性は、薬物単独と比較して、がん組織への良好で直接的な薬物送達及び／または低減した毒性のいずれかに起因する。しかしながら、これらのアプローチの大部分は、原発軟組織、高度に血管新生した固形腫瘍の治療に焦点が当てられてきた。がん関連死亡率の主な原因である、進行期がん転移に起因する腫瘍に対して有効な治療は、依然として課題が残っている。本実施例では、血液骨髄毛細血管の洞様血管の性質を調査して骨髄にＮＰを送達させ、そして中性ＰＴＸ−ＮＰが骨転移の進行を遅らせること、及び骨転移の骨内モデルにおける骨減少を抑制することにおいて、明らかに有効であることを見出した。中性ＮＰはアニオン性ＮＰ及びカチオン性ＮＰと比較して循環時間が長く、また骨髄内皮細胞の細胞間間隙の開口部よりも小さいため、中性ＮＰは骨髄内に局在化することにおいて、より効果的である（図３）。
【００６６】
中性ＮＰは、タンパク質と相互作用する傾向が低いと報告されており、これは、荷電したＮＰよりも循環中の時間が比較的長いことが理由である可能性がある［３６］。さらに、本発明はいかなる特定の機構にも限定されず、そして機構の理解は本発明を実施するために必要ではないが、アニオン性ＮＰまたはカチオン性ＮＰよりも中性ＮＰ上により多い量で存在する表面結合ＰＶＡは、血流中のＮＰの滞留時間を持続させる役割を担った可能性があると考えられている。
【００６７】
ＰＶＡは、疎水性部分と親水性部分の両方を含むコポリマーである。疎水性ポリビニルアセテート部分はＰＬＧＡ−ＮＰマトリックス内に組み込むのに対し、親水性部分はオプソニン化を低減させることもできる外側のコロナを形成する［３６］。ＰＢＳ中で３７℃にてインキュベートした場合、ＰＶＡのかなりの部分が数日間にわたってＮＰと結合したままであることが、これまでに示されている［３７］。この知見は、ＮＰの表面組成がＩＶ注射後に一定期間維持され得ることを意味し、このことは、ＮＰの表面特性が生体分布を決定することから重要である。
【００６８】
循環内にＮＰを保持するために使用される一般的な戦略は、循環している単球によるＮＰの認識、ならびにそれに続く細網内皮系（ＲＥＳ）、特に肝臓及び脾臓の器官によるＮＰのクリアランスを防止することである。本実施例において、ＮＰ投与後２分のＮＰに起因する肝臓のシグナルは、特に中性ＮＰについて経時的に低下することが確認された（図２Ａ）。この低下は、これらのＮＰの大部分が肝臓の血管コンパートメントに含まれ、クッパー細胞または肝細胞に取り込まれないことを示唆する。肝臓には心拍出量の３０％が届けられる。したがって、肝臓で確認される最初の高い蛍光シグナルは、肝臓への血流とともに運ばれるＮＰに起因する可能性がある［３８］。
【００６９】
一般に、クッパー細胞によって取り込まれたＮＰは、ゆっくりと分解するが、肝細胞によって取り込まれたＮＰは、肝臓の胆管を介して消化管に排出される。このプロセスは、アニオン性ＮＰよりもカチオン性ＮＰでより速く起こることが知られているが［３９］、中性ＮＰについてはまだ報告されていない。カチオン性ＮＰまたはアニオン性ＮＰよりも中性ＮＰを注射した動物において、本実施例で確認された肝臓シグナルの低下が比較的急速であることは、中性ＮＰがアニオン性ＮＰまたはカチオン性ＮＰよりもクッパー細胞または肝細胞による取り込みの回避において、より優れていることを示唆する（図２Ａ、Ｂ）。骨髄への送達のために、骨髄中の洞様毛細血管を通過するのに十分長く循環内に留まるように、ＮＰが肝臓による捕捉を回避することが重要である。
【００７０】
本実施例において、中性ＮＰは、それらの低減したオプソニン化を通して肝臓による捕捉を回避することで、循環している単球によるＮＰの取り込みや、その後に生じる肝臓及び脾臓などのＲＥＳの器官によるクリアランスを阻むようである。さらに、中性ＮＰ（約１５０ｎｍの流体力学的直径、ＡＦＭを用いて測定された乾燥状態で１１２ｎｍ）は、肝臓の類洞壁内皮細胞裏の有窓の開口部（約７５ｎｍ）より大きいが［４０］、骨髄内皮細胞毛細血管の開口部（１７０ｎｍ）より小さい［１６、１７、４１］。この点について、中性ＮＰは、２つの手段、すなわち最初に肝臓を回避して循環内に留まることによる手段の他、その後で（骨の洞様毛細血管を通過した後）骨髄の比較的ゆるやかな血流のために、骨髄内に捕捉される手段で上記のバランスを成し遂げていると思われる［４２］（図２Ｂ及び図３Ａ）。非常に均一なサイズ分布（表１）にもかかわらず、製剤中に存在するより小さなＮＰの一部は、肝臓の洞様毛細血管を通過した可能性がある。したがって、これらのＮＰの肝臓取り込みを完全に防止することはできなかったが、特定の狭い範囲内で粒子サイズを制御することによってさらに最小限に抑えられ得る。
【００７１】
通常、ＮＰは、循環内にいる時間を延ばすためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ＰＥＧ化ＮＰ）またはプルロニックなどの親水性ポリマーで修飾される。これは、血管新生した原発腫瘍への抗がん治療薬の送達のために、血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果を介して一般的に探求されているアプローチである［４３］。しかしながら、ＰＥＧ化／プルロニック修飾ＮＰは骨髄に効果的に血管外遊出することができない［４４］。これらのＮＰの骨髄への取り込みはごく僅かなままであると報告されている［４５］。表面結合ＰＥＧ／プルロニックによる立体障害は、これらのＮＰの骨髄への血管外遊出を妨げた可能性がある。最近の文献における相当なデータから、ＰＥＧ化によってＮＰの循環時間は増加するが、ＮＰの細胞内取り込み及び組織内取り込みは減少するという付随的な負の効果を有することが示唆されている。この立体障害はＮＰ表面に水和したＰＥＧ鎖が突き出していることによると考えられている［３６、４６］。同様に、本発明はいずれの特定の機構にも限定されないが、本発明者らは、骨髄の細胞や組織との、その低減した相互作用によって骨髄へ効率よく血管外遊出するのではなく、ＰＥＧ化ＮＰは血液循環中に留まるものと推測する。
【００７２】
電荷に加えて、ＮＰのサイズは、骨髄におけるＮＰの局在性に影響を及ぼすことが知られている。本実施例のデータは、中性ＮＰがより大きなＮＰ（流体力学的直径約１５０ｎｍ対約３２０ｎｍ）よりも約７倍高い骨髄内局在性を有することを示し、このことは約１７０ｎｍである骨髄内の内皮細胞の間の細胞間間隙が、骨髄へのＮＰの送達を調節することを意味している［１６、１７］。ビスホスホネートは骨吸収を抑制できるので、現在では、骨転移を有する患者は、有害な骨格関連事象のリスクを低減し、骨の痛みを改善するためにビスホスホネートで治療される［４７］。いくつかの研究では、ビスホスホネートが間接的に骨転移の進行を遅らせることも報告されており［４８］、これは破骨細胞媒介性の骨吸収及び、それによるがん細胞の増殖と分化、そしてそれに続く骨の腫瘍形成の促進に必要である増殖因子の放出を阻害することによる［４９］。しかし、別の臨床試験のデータの最新レビューでは、ビスホスホネートで治療された患者の生存率はプラセボ対照と比較して統計的に有意な改善を示さなかった［５０］。さらに、ビスホスホネートは、慢性的な使用による用量制限毒性を示し、顎の骨壊死を引き起こす。これは循環している血管内皮前駆細胞に対するそれらの影響の結果であると考えられ、健康な組織を維持するのに必要な血管形成及び脈管形成の正常過程を妨害する［５１］。
【００７３】
本実施例では、ＮＰが骨自体にではなく、骨転移が開始及び進行する骨髄に局在化して保持されることを示している。さらに、正常な骨と比較してがんに侵襲されている骨におけるＮＰの蓄積増加は、腫瘍増殖の結果として血液−骨微小血管系の透過性の増加による可能性がある。ＮＰもまた転移性腫瘍塊に局在するので、この治療法は骨転移の進行を抑制するのに有効である（図５）。本実施例の１つの重要な知見は、中性ＰＴＸ−ＮＰの単回用量ＩＶ注射が骨減少を防止したことであり（図５Ｄ）、このことは骨基質においてＰＣ−３細胞の侵襲を防ぐため、骨髄への薬剤送達におけるＮＰの有効性を示唆している。
【００７４】
ＰＴＸは、核内因子κＢリガンド受容体活性因子（ＲＡＮＫＬ）誘導性破骨細胞形成を、破骨細胞前駆細胞の有糸分裂を停止させることで阻害することが知られており、これにより病理学的な骨溶解に至る骨転移の進行を阻害する［５２］。前立腺癌が骨に転移する場合、骨減少は、重大な臨床的問題である。
【００７５】
ＰＬＧＡベースのＮＰは典型的に、三相の放出特性、すなわち、界面での薬物の拡散を介して媒介される第１の放出相、続いて、被包された薬物の僅かな量が放出される第２の安定した放出相、及びポリマーマトリックスが分解して残りの被包された薬物が放出される第３相、を示す。したがって、ＰＴＸのかなりの割合がＮＰ内に依然として捕捉されているように思われる。以前、ＰＬＧＡをベースとしたＮＰの類似製剤からのＰＴＸの完全放出はｉｎ  ｖｉｔｒｏで約９０日にわたり生じることが報告された［５３］。したがって、ＮＰからの薬物放出速度を調節して、骨転移部位におけるＮＰの保持（約９６時間である）と合わせることで（図３Ａ）、さらに結果は改善するはずである。
【００７６】
多くのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験では、短期間にわたり抗がん剤の反復投与を使用することで、化学療法に対してがん細胞を持続的に暴露させる。本実施例において、動物はＰＴＸ−ＣｒＥＬの単回投与を受けたが、これは一部のチームが報告したように、治療量以下のＰＴＸしか骨の転移部位に到達せず、これががん細胞の増殖を刺激している可能性がある［５４、５５］。ＰＴＸ−ＣｒＥＬ（４時間で７０％のＰＴＸ放出かつ１２時間で１００％のＰＴＸ放出）［５６］と異なり、ＰＴＸ−ＮＰは、ＰＴＸの連続的な局所投与量（約０．７％／日）をもたらし、ＰＴＸの速放性製剤と徐放性製剤の間のそれらの有効性に対する比較を提供する。ＮＰアルブミン結合（ｎａｂ）ＰＴＸは、骨髄毛細血管の有窓の開口部（約１７０ｎｍ）より小さな粒子サイズ（約１３０ｎｍ）を有するにもかかわらず、実際には、乳癌転移の動物モデルにおいて骨を含める転移の発生を増加させることが示されている［５７］。ＰＴＸ−ＣｒＥＬと同様に、ｎａｂ−ＰＴＸは速放性薬物製剤であり、ＰＴＸ−ＣｒＥＬと同様のクリアランス特性を有する［５８］。
【００７７】
ＰＴＸ−ＣｒＥＬを用いた本実施例のデータ及びｎａｂ−ＰＴＸを用いた知見は、骨転移の進行を抑制するための徐放性薬物送達の重要性を示す。化学療法の欠点の中には、時に骨髄抑制及び体重減少として現れる、正常組織で見られる重度の副作用がある［５９、６０］。本実施例の研究において、本発明者らはＰＴＸ−ＮＰで急性毒性を認めなかったが、これは徐放性、被包されたＰＴＸのほんの一部しか実験期間中にＮＰから放出されないこと、及び／またはＮＰを有するＰＴＸの体内分布の変化、の複合効果である可能性があり、このことは他の研究者も報告している［６１、６２］。
【００７８】
本発明者らはまた、脛骨に加えて、前立腺及び乳癌で転移の共通部位である骨盤及び椎骨に中性ＮＰが局在することも示した。前立腺癌の後期では、肋骨、胸骨、及び長骨を含む骨への著しい転移が存在する［４、６３、６４］。中性ＮＰはこれらの部位に局在するので（図３Ｂ及びＣ）、後期骨転移を制御するための薬物送達に使用され得る。前立腺癌の骨転移は通常造骨性であり、そして乳癌の骨転移は骨溶解性であるが、本発明者らの研究に用いたＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ細胞は溶骨性であった［６５］。全てのがんの種類が本発明に関して意図される。ＮＰは多くの場合、ＥＰＲ効果により漏出性の腫瘍脈管構造を通って血管外遊出するので、軟組織腫瘍に局在化するのに十分な時間をＮＰに与えるために持続的な循環時間が重要であると考えられている［６６］。したがって、中性ＮＰは原発腫瘍と骨に転移した腫瘍の両方の治療において有効である可能性が高い。
【００７９】
［例示的な結論］
本実施例は、中性ＮＰがアニオン性ＮＰまたはカチオン性ＮＰより骨髄に局在し、そして中性の表面電荷を有するＰＴＸ封入ＮＰが骨腫瘍の転移の進行を遅らせ、腫瘍量を減少させ、骨減少を抑制するのに有効であることを示した。骨転移による骨格合併症は、生活の質の低下、医療費の増加、運動障害、及び生存への悪影響を含む多くの帰結と関連している。したがって、骨髄への効果的な薬物送達戦略は、別な方法では治療することが非常に難しい骨転移の治療において、非常に幅広い治療的影響を持つ。
【００８０】
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［２７］Ｆｏｙ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，４（２０１０）５２１７−５２２４。
［２８］Ｇｏｒｄｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，５（２００５）９５３−９６４。
［２９］Ｐａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，Ｃｈ．１４，Ｕｎｉｔ  １４．１５（２００１）。
［３０］Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６５（２００５）３７０７−３７１５。
［３１］Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，９８（２００６）７８３−７９３。
［３２］Ｐａｎｙａｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，９３（２００４）１８０４−１８１４。
［３３］Ｂａｌｌｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ，１５（２００４）７９−８６。
［３４］Ｄａｍａｓｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，９２（２００１）２５９２−２６０２。
［３５］Ｈａｒｒｉｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２３（２００５）７７６８−７７７１。
［３６］Ｏｗｅｎｓ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，３０７（２００６）９３−１０２。
［３７］Ｐａｎｙａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，９２（２００３）１７３−１８７。
［３８］Ｗｙｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，９（１９８９）２９７−３０１。
［３９］Ｓｏｕｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３１（２０１０）５５６４−５５７４。
［４０］Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１７（２０１０）３２−３８。
［４１］Ｍｏｇｈｉｍｉ，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ，１７（１９９５）６１−７３。
［４２］Ｋａｈｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８３（１９９４）９５８−９６３。
［４３］Ｃａｂｒａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９０（２０１４）４６５−７６。
［４４］Ｋｗｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１６４（２０１２）１０８−１１４。
［４５］Ｖａｎｄｏｒｐｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１８（１９９７）１１４７−１１５２。
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［６３］Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，２５（１９９４）１４１−１４６。
［６４］Ｍｕｎｄｙ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，２（２００２）５８４−５９３。
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【００８１】
［実施例２］
〔表面調節されたドセタキセル封入ナノ粒子による骨減少の抑制〕
本実施例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏモデルでの前立腺癌細胞株におけるＴＸＴ−ＮＰの細胞毒性効果を決定するためにドセタキセル（ＴＸＴ）封入ナノ粒子（ＴＸＴ−ＮＰ）を評価した。
【００８２】
〔ＴＸＴ−ＮＰの製剤化〕
ＴＸＴはＰＴＸよりも強力であることから、一般的に前立腺癌の治療に使用される好ましい薬物であるため、本実施例では、ＴＸＴ−ＮＰの有効性を評価した。したがって、本発明者らは両方の薬物が類似の化学構造及び物理的特性、特にオクタノール−水分配係数に基づく疎水性を有することを考慮して、ＰＴＸ（上記の実施例１）に使用したのと同じプロトコルを使用してＴＸＴを封入したＮＰの製剤を設計及び開発し始めた。ＰＴＸ−ＮＰを作製するために使用されるＰＬＧＡポリマーは、ポリマーから薬物の相分離が起こり、ＮＰの形成時にＴＸＴ結晶化及び大きな凝集体形成をもたらすため、ＴＸＴと適合しないことが見出された。これにより、薬物の相分離を引き起こさないポリマー（複数可）を同定するために、異なるＰＬＧＡベースのポリマーにおけるＴＸＴの固体の溶解度を測定する研究につながった。本実施例では、クロロホルム中にポリマーと薬物の溶液（異なる％での薬物対ポリマー）をスライドガラス上のフィルムにキャストした。ドラフト内で一晩クロロホルムの溶媒蒸発後、キャストフィルムを光学顕微鏡下で観察した。相分離は、ポリマーフィルム中の薬物の結晶化から非常に明白であったのに対して、相分離がない場合には、フィルムは均一であった。
【００８３】
表２に示すように、ＰＴＸ及びＴＸＴは、ポリマー中でかなり異なる固体の溶解度特性を有する。
【００８４】
【表３】
2019513756.tif 000016
【００８５】
ＰＴＸまたはＴＸＴのいずれかの相分離を示したポリマーはあるが、両方の薬物について相分離を示さなかったポリマーはほとんどない。このデータはまた、相分離なしにポリマーに組み込むことができる薬物の最適な量の例を示す。本発明者らは、ＮＰをそれぞれのポリマーで製剤化することによって固体の溶解度データを確認し、相分離を示さないポリマーが薬物結晶を含まないＮＰの製剤となり、及び相分離を示すポリマーが薬物結晶を含むＮＰの製剤となることを見出した（すなわち、相分離を示すポリマーは薬物結晶化及び凝集体形成を引き起こす）。固体データに基づいて、本発明者らは、ＴＸＴ−ＮＰの製剤について、ＰＬＧＡ５０：５０、固有粘度０．６９を選択した（表２、陰影で示す）。
【００８６】
相分離も示さなかった固有粘度０．３９及び０．１６（ラクチド：グリコリド比５０：５０）を有するポリマーのＰＬＧＡも試験したが、０．６９の固有粘度で製剤化した薬物被包効率よりも低い薬物被包効率となった。１つのＰＴＸ−ＮＰに関する問題は、被包された薬物の徐放であった。ＴＸＴの放出を促進するために、本発明者らはポア形成剤、ジメチル酒石酸（ＤＭＴ、１０％ｗ／ｗ）を製剤に組み込んだ。
【００８７】
〔前立腺癌細胞におけるインビトロでの細胞傷害性試験〕
ＴＸＴ  ＮＰの有効性を確認するために、本発明者らは、ＰＣ−３及びＤＵ１４５細胞において、薬物及びＮＰに被包された薬物のＩＣ５０を決定した。このデータは、薬物が被包されているか否かにかかわらず、低いＩＣ５０値から明らかなように、薬物が非常に有効であることを示す（表４）。
【００８８】
【表４】
2019513756.tif 000017
【００８９】
〔ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＸＴ−ＮＰの評価〕
ＴＸＴ−ＮＰは、骨転移の進行を抑制する効果を保証するために、少数の動物でその有効性について試験された。このために、前立腺癌の骨内モデルを使用し、ＰＣ−３−Ｌｕｃ細胞を脛骨に注射した。ヌードマウスの右脛骨の内腔にＰＣ−３＿Ｌｕｃ細胞（２０μＬ中５×１０５）を注射した。生物発光シグナル強度の変化を測定した。治療群（１２ｍｇ／ｋｇ  ＴＸＴ等価薬用量のＴＸＴ−ＮＰ）では、腫瘍接種後１週間目に尾静脈から投与したが、対照群はいずれの処置も受けなかった。このデータは、未処置の対照群と比較して、ＴＸＴ−ＮＰの単回静脈内注射後の骨転移の抑制を示す（図８）。これらの結果はさらに、ＴＸＴとＰＴＸは類似の構造及び物理的特性を有するが、ポリマーとの固体溶解度が異なっており、これは各薬物に対するＮＰを調製するためのポリマーの選択に大きな影響を与えることを示す。これらの結果はまた、製剤化されたＴＸＴ−ＮＰが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養において、かつｉｎ  ｖｉｖｏでの前立腺癌の骨転移モデルにおいて有効であることも示す。これらの結果は、ＴＸＴ−ＮＰの単回静脈内注射が骨転移の進行を抑制するのに有効であることを示す。
【００９０】
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４２．Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １２，３９−５０（２０１２）。
４３．Ｓａｒｉｎ，Ｈ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ｕｐｐｅｒ  ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｂｌｏｏｄ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｕａｌ  ｐｏｒｅ  ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．Ｊ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓ  Ｒｅｓ  ２，１４（２０１０）。
４４．Ｔａｉｃｈｍａｎ，Ｒ．Ｓ．Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ：ｔｗｏ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｗｈｏｓｅ  ｆａｔｅｓ  ａｒｅ  ｉｎｔｅｒｔｗｉｎｅｄ  ｔｏ  ｃｒｅａｔｅ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｎｉｃｈｅ．Ｂｌｏｏｄ  １０５，２６３１−２６３９（２００５）。
４５．Ｐｅｔｅｒ  Ｋｌｉｎｋｅｎ，Ｓ．Ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３４，１５１３−１５１８（２００２）。
４６．Ｓｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｂｙ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２８，２６５５−２６６６（２００７）。
４７．Ｗａｒｒｅｎ，Ａ．，Ｃｏｇｇｅｒ，Ｖ．Ｃ．，Ａｒｉａｓ，Ｉ．Ｍ．，ＭｃＣｕｓｋｅｙ，Ｒ．Ｓ．＆Ｌｅ  Ｃｏｕｔｅｕｒ，Ｄ．Ｇ．Ｌｉｖｅｒ  ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｆｅｎｅｓｔｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｖｅｏｌｉｎ−１  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ．Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １７，３２−３８（２０１０）。
４８．Ｃａｂｒａｌ，Ｈ．＆Ｋａｔａｏｋａ，Ｋ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇ−ｌｏａｄｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ｉｎｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ（２０１４）。
４９．Ｋｏｌａｔｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．ＰＥＧ−Ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １９２Ｃ，６７−８１（２０１４）。
５０．Ｃｕ，Ｙ．＆Ｓａｌｔｚｍａｎ，Ｗ．Ｍ．Ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｓｔｅａｌｔｈ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｇｉｖｅ  ｍｕｃｕｓ  ｔｈｅ  ｓｌｉｐ．Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  ８，１１−１３（２００９）。
５１．Ｙａｎｇ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｇｉｎａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｖｉａ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｎｏｎ−Ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ｃｅｒｖｉｃａｌ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ．Ａｄｖ  Ｈｅａｌｔｈｃ  Ｍａｔｅｒ  ３，１０４４−１０５２（２０１４）。
５２．Ｋｗｏｎ，Ｉ．Ｋ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｃ．，Ｈａｎ，Ｂ．＆Ｐａｒｋ，Ｋ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １６４，１０８−１１４（２０１２）。
５３．Ｖａｎｄｏｒｐｅ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｎｇ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙ（ｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙ（ｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）−ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １８，１１４７−１１５２（１９９７）。
５４．Ｖｅｒｈｏｅｆ，Ｊ．Ｊ．Ｆ．＆Ａｎｃｈｏｒｄｏｑｕｙ，Ｔ．Ｊ．Ｑｕｅｓｔｉｏｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ  ３，４９９−５０３（２０１３）。
５５．Ｌｅｈｔｉｎｅｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｓ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ４６，１２１−１３０（２０１２）。
５６．Ｈａｔａｋｅｙａｍａ，Ｈ．，Ａｋｉｔａ，Ｈ．＆Ｈａｒａｓｈｉｍａ，Ｈ．Ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｔｙｐｅ  ｎａｎｏ  ｄｅｖｉｃｅ（ＭＥＮＤ）ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＥＰＲ  ｅｆｆｅｃｔ：ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  ｔｈｅ  ＰＥＧ  ｄｉｌｅｍｍａ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ６３，１５２−１６０（２０１１）。
５７．Ｅｒｎｓｔｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｄｏｃｅｔａｘｅｌ−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｏｕｔｐｅｒｆｏｒｍｓ  ｔｈｅ  ａｐｐｒｏｖｅｄ  ｔａｘａｎｅ  ｎａｎｏｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ａｂｒａｘａｎｅ，ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １６２，５７５−５８１（２０１２）。
５８．Ｃｈｅｎｇ，Ｚ．，Ａｌ  Ｚａｋｉ，Ａ．，Ｈｕｉ，Ｊ．Ｚ．，Ｍｕｚｙｋａｎｔｏｖ，Ｖ．Ｒ．＆Ｔｓｏｕｒｋａｓ，Ａ．Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ｃｏｓｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｂｅｎｅｆｉｔ  ｏｆ  ａｄｄｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３８，９０３−９１０（２０１２）。
５９．Ａｒｖｉｚｏ，Ｒ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｔｕｍｏｒ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６，ｅ２４３７４（２０１１）。
６０．Ａｓａｔｉ，Ａ．，Ｓａｎｔｒａ，Ｓ．，Ｋａｉｔｔａｎｉｓ，Ｃ．＆Ｐｅｒｅｚ，Ｊ．Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｅ−ｃｈａｒｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｃｅｒｉｕｍ  ｏｘｉｄｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ４，５３２１−５３３１（２０１０）。
６１．Ｈｉｒｓｃｈ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｈａｒｇｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏａｔｅｄ  ＳＰＩＯＮｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ，ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ５，３７２３−３７３２（２０１３）。
６２．Ｐｒａｅｔｎｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｔｏ  ｂｌｏｏｄ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｉｏｎｉｃ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３１，６６９２−６７００（２０１０）。
６３．Ｌｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ｔ．Ｓ．，Ｒａｍｍｏｈａｎ，Ｒ．，Ｌｕｋｙａｎｏｖ，Ａ．Ｎ．，Ｗｈｉｔｅｍａｎ，Ｋ．Ｒ．＆Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ：ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ｓｅｐａｒａｔｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｈａｒｇｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏａｔｉｎｇ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ２４０，９５−１０２（２００２）。
６４．Ｓｈａｒｍａ，Ｂ．，Ｐｅｅｔｌａ，Ｃ．，Ａｄｊｅｉ，Ｉ．Ｍ．＆Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ，Ｖ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｐｉｄｓ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ３３４，２２８−２３６（２０１３）。
６５．Ａｄｊｅｉ，Ｉ．Ｍ．，Ｐｅｅｔｌａ，Ｃ．＆Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ，Ｖ．Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）９，２６７−２７８（２０１４）。
６６．Ｐａｎｙａｍ，Ｊ．＆Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ，Ｖ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２０，２１２−２２０（２００３）。
６７．Ｐａｎｙａｍ，Ｊ．＆Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ，Ｖ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｄｒｕｇｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  １，７７−８４（２００４）。
６８．Ｐａｎｙａｍ，Ｊ．，Ｚｈｏｕ，Ｗ．Ｚ．，Ｐｒａｂｈａ，Ｓ．，Ｓａｈｏｏ，Ｓ．Ｋ．＆Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ，Ｖ．Ｒａｐｉｄ  ｅｎｄｏ−ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｅｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ＤＬ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １６，１２１７−１２２６（２００２）。
６９．Ｓａｈｏｏ，Ｓ．Ｋ．，Ｐａｎｙａｍ，Ｊ．，Ｐｒａｂｈａ，Ｓ．＆Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ，Ｖ．Ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅｉｒ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ８２，１０５−１１４（２００２）。
７０．Ｓｈａｒｍａ，Ｂ．，Ｐｅｅｔｌａ，Ｃ．，Ａｄｊｅｉ，Ｉ．Ｍ．＆Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ，Ｖ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｐｉｄｓ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ３３４，２２８−２３６（２０１３）。
７１．Ｐａｎｙａｍ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）ｎａｎｏ−ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ９２，１７３−１８７（２００３）。
７２．Ｆｏｙ，Ｓ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｆｉｅｌｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ４，５２１７−５２２４（２０１０）。
７３．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｃｏｌｕｍｎ．Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２５，１４１−１４６（１９９４）。
７４．Ｍｕｎｄｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｔｏ  ｂｏｎｅ：ｃａｕｓｅｓ，ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２，５８４−５９３（２００２）。
７５．Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｉ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｊ．，ＭｃＣａｕｌｅｙ，Ｌ．Ｋ．＆Ｇａｌｌｉｃｋ，Ｇ．Ｅ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ｉｎ  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００１）。
７６．Ｎｉｅ，Ｓ．，Ｈｓｉａｏ，Ｗ．Ｗ．，Ｐａｎ，Ｗ．＆Ｙａｎｇ，Ｚ．Ｔｈｅｒｍｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７−ｂａｓｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ，ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ａｎｄ  ｕｐｔａｋｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６，１５１（２０１１）。
７７．Ｖａｓｓｉｌｅｖａ，Ｖ．，Ａｌｌｅｎ，Ｃ．Ｊ．＆Ｐｉｑｕｅｔｔｅ−Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ７，６３０−６３７（２００８）。
７８．Ｖａｓｓｉｌｅｖａ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９９，２０３７−２０４３（２００８）。
７９．Ｄｅｓａｉ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ−ｆｒｅｅ，ａｌｂｕｍｉｎ−ｂｏｕｎｄ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，ＡＢＩ−００７，ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ−ｂａｓｅｄ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２，１３１７−１３２４（２００６）。
８０．Ｋａｒａｐａｎａｇｉｏｔｏｕ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ  ａｎｄ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｒｅｏｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １８，２０８０−２０８９（２０１２）。
８１．Ｇｒｅｅｎ，Ｈ．，Ｋｈａｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｊａｋｏｂｓｅｎ−Ｆａｌｋ，Ｉ．，Ａｖａｌｌ−Ｌｕｎｄｑｖｉｓｔ，Ｅ．＆Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ＣＹＰ３Ａ５＊３  ａｎｄ  ＣＹＰ２Ｃ８−ＨａｐＣ  ｏｎ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ／ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  １００，４２０５−４２０９（２０１１）。
８２．Ｆａｒｏｋｈｚａｄ，Ｏ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ａｐｔａｍｅｒ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３，６３１５−６３２０（２００６）。
８３．Ｋａｌａｒｉａ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｈａｒｍａ，Ｇ．，Ｂｅｎｉｗａｌ，Ｖ．＆Ｒａｖｉ  Ｋｕｍａｒ，Ｍ．Ｎ．Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ：ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｐｈａｒｍａ  Ｒｅｓ  ２６，４９２−５０１（２００９）。
８４．Ｗａｎｇ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｈｏｍｅ  ｔｏ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ−ｒｉｃｈ  ａｒｅａｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ（２０１４）。
８５．Ｏｗｅｎｓ，Ｄ．Ｅ．，３ｒｄ  ＆Ｐｅｐｐａｓ，Ｎ．Ａ．Ｏｐｓｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ３０７，９３−１０２（２００６）。
８６．Ｋａｋｉｎｏｋｉ，Ａ．，Ｋａｎｅｏ，Ｙ．，Ｔａｎａｋａ，Ｔ．＆Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｙ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）−ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ａｓ  ａ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｄｒｕｇ．Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  ３１，９６３−９６９（２００８）。
８７．Ｔａｂａｔａ，Ｙ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｙ．＆Ｉｋａｄａ，Ｙ．Ｔｕｍｏｒ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｉｚｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５０，１２３−１３３（１９９８）。
８８．Ｙａｍａｏｋａ，Ｔ．，Ｔａｂａｔａ，Ｙ．＆Ｉｋａｄａ，Ｙ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｂｏｄｙ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）ｗｉｔｈ  ｏｔｈｅｒ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４７，４７９−４８６（１９９５）。
８９．Ｄａｖｄａ，Ｊ．＆Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ，Ｖ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｂｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ２３３，５１−５９（２００２）。
９０．Ｑａｄｄｏｕｍｉ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌａｔｈｒｉｎ  ａｎｄ  ｃａｖｅｏｌｉｎ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｒａｂｂｉｔ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：ｒｏｌｅ  ｉｎ  ＰＬＧＡ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ９，５５９−５６８（２００３）。
９１．Ｍａｅｄａ，Ｈ．Ｔｈｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＲ）ｅｆｆｅｃｔ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ：ｔｈｅ  ｋｅｙ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ａｄｖ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ  ４１，１８９−２０７（２００１）。
９２．Ｗｏｌｆｒａｍ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｎａｎｏ−ｐｌａｓｍａ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｒｏｎａ．Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ  Ｂ  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ（２０１４）。
９３．Ｌｕｎｄｑｖｉｓｔ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｒｏｎａ  ａｒｏｕｎｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：Ａ  Ｔｅｓｔ  Ｓｔｕｄｙ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ５，７５０３−７５０９（２０１１）。
９４．Ｌｙｎｃｈ，Ｉ．＆Ｄａｗｓｏｎ，Ｋ．Ａ．Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｎｏ  Ｔｏｄａｙ  ３，４０−４７（２００８）。
９５．Ｊａｉｎ，Ｔ．Ｋ．，Ｒｅｄｄｙ，Ｍ．Ｋ．，Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｍ．Ａ．，Ｌｅｓｌｉｅ−Ｐｅｌｅｃｋｙ，Ｄ．Ｌ．＆Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ，Ｖ．Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｃｌｅａｒａｎｃｅ，ａｎｄ  ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ５，３１６−３２７（２００８）。
９６．Ｓｏｕｒｉｓ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｈａｒｇｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒａｐｉｄ  ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ  ｓｉｌｉｃａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３１，５５６４−５５７４（２０１０）。
９７．Ｋａｈｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｅｌｖｉｓ  ａｎｄ  ｌｕｍｂａｒ  ｖｅｒｔｅｂｒａｅ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ｎｏｒｍａｌ  ａｄｕｌｔｓ  ［ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｅｒｒａｔｕｍ  ａｐｐｅａｒｓ  ｉｎ  Ｂｌｏｏｄ  １９９４  Ｎｏｖ  １５；８４（１０）：３６０２］．Ｂｌｏｏｄ  ８３，９５８−９６３（１９９４）。
９８．Ｓｏｎｇ，Ｃ．Ｘ．，Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ，Ｖ．＆Ｌｅｖｙ，Ｒ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｕ−８６９８３  ｆｒｏｍ  ｄｏｕｂｌｅ−ｌａｙｅｒ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｍａｔｒｉｃｅｓ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ４５，１７７−１９２（１９９７）。
９９．Ｌｉｕ，Ｙ．＆Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎ，Ｓ．Ｐ．Ｍａｐｐｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｃｌｉｍａｔｅ  ｐＨ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎｓｉｄｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ＰＬＧＡ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ９，１３４２−１３５０（２０１２）。
１００．Ｒｅｄｄｙ，Ｍ．Ｋ．＆Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ，Ｖ．Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ：ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ｒｅｄｕｃｅ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２３，１３８４−１３９５（２００９）。
１０１．Ｄａｖｄａ，Ｊ．＆Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ，Ｖ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １，７４−８２（２００５）。
１０２．Ｐｏｕｒｖａｓｅｉ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓａｍｐｌｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｃｏｍｐａｒａｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｄｅｎｏｓｕｍａｂ  ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ｓｉｔｅ  ｃｈａｎｇｅｓ．ＡＡＰＳ  Ｊ  １５，７０−７７（２０１３）。
１０３．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｅ．Ｗ．＆Ｏｕｒｓｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４５５，１９−３５（２００８）。
１０４．Ｓｈｉｎ，Ｊ．−Ｗ．，Ｓｅｏｌ，Ｉ．−Ｃ．＆Ｓｏｎ，Ｃ．−Ｇ．Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｄｏｓｅ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  Ｄｏｓｅ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｏｒｉｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３１，１−７（２０１０）。
１０５．Ｋｏｓｔｅｎｕｉｋ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ，ａ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＲＡＮＫＬ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｂｏｎｅ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ＢＭＤ  ｉｎ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ（ｍｕｒｉｎｅ／ｈｕｍａｎ）ＲＡＮＫＬ．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ２４，１８２−１９５（２００９）。
【００９１】
本明細書で言及した及び／または以下に記載される全ての刊行物及び特許は、参照により本明細書に組み込まれる。記載された本発明の方法及びシステムの種々の修飾及び変形は、本発明の範囲及び主旨から逸脱することなく当業者に明白であろう。本発明を特定の実施形態に関連して記載してきたが、特許請求の範囲に記載されるような本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、関連分野の技術者に明らかである、本発明を実施するために記載された方法の様々な修飾は、本発明の範囲内であると意図される。
【図１−１】
2019513756.tif 000018
【図１−２】
2019513756.tif 000019
【図２】
2019513756.tif 000020
【図３−１】
2019513756.tif 000021
【図３−２】
2019513756.tif 000022
【図４−１】
2019513756.tif 000023
【図４−２】
2019513756.tif 000024
【図５】
2019513756.tif 000025
【図６】
2019513756.tif 000026
【図７】
2019513756.tif 000027
【図８】
2019513756.tif 000028
【図９】
2019513756.tif 000029
【図１０】
2019513756.tif 000030
【図１１】
2019513756.tif 000031
【国際調査報告】
2019513756.tif 000032