(57)【要約】本明細書では網膜疾患の処置のための組成物および方法が提供される。組成物および方法は硝子体成分結合性部分にコンジュゲートしている治療薬を含む。硝子体成分結合性部分は、硝子体液の構造上の成分（例えば、ヒアルロン酸、コラーゲンまたはビトロネクチン）に結合するアプタマーまたは小分子でもよい。本開示は、硝子体の成分に特異的に結合し、それによってこれらの分子のクリアランス速度を下げ、硝子体内滞留時間を増やすオリゴヌクレオチドおよび他の分子を提供する。硝子体結合オリゴヌクレオチドは治療薬にコンジュゲートしてもよく、次に、眼の硝子体成分に治療薬を運搬してドッキングさせるのに使用することができ、それによって治療薬の硝子体内滞留を増強する。硝子体結合オリゴヌクレオチドは、最小粘度の液体溶液に製剤化し、それによって、単回硝子体内注射により被験体に送達可能な最大用量を増強することも可能である。
2019508405.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
硝子体成分に特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含む組成物。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドがアプタマーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アプタマーがＲＮＡアプタマーまたは改変ＲＮＡアプタマーである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記アプタマーがＤＮＡアプタマーまたは改変ＤＮＡアプタマーである、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記アプタマーが、ＤＮＡ、改変ＤＮＡ、ＲＮＡ、および改変ＲＮＡからなる群より選択される少なくとも２種類の核酸を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが治療薬にコンジュゲートしている、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
二重特異性アプタマーである、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２〜７のいずれか１つに従った配列を含むか、または配列番号２〜７のいずれか１つに少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記硝子体成分がヒアルロナン、コラーゲン、またはビトロネクチンである、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
硝子体成分結合性部分にコンジュゲートされた治療薬を含む組成物であって、前記硝子体成分結合性部分がペプチドタグではない、組成物。
【請求項１１】
前記硝子体成分結合性部分が硝子体液の成分に結合する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記硝子体液の成分が、コラーゲン、ヒアルロナン、フィブリリン、ビトロネクチン、オプテティシン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記硝子体液の成分が、ヒアルロナン、コラーゲン、またはビトロネクチンである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記硝子体成分結合性部分が約１ｍＭ未満のＫｄで硝子体液の成分に結合する、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
ヒトで少なくとも６日の硝子体内半減期、ウサギで少なくとも２日の硝子体内半減期、または非ヒト霊長類で少なくとも３日の硝子体内半減期を有する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記治療薬が網膜疾患の処置のために使用される治療薬である、請求項６から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記網膜疾患が、ウェット型加齢黄斑変性、ドライ型加齢黄斑変性、地図状萎縮、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、およびぶどう膜炎からなる群より選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記治療薬が、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、アンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、Ｄ因子、Ｐ因子、補体成分５（Ｃ５）、補体成分３（Ｃ３）またはインテグリンの阻害剤である、請求項６から１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を阻害するアプタマーを含む、請求項６から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記治療薬が、アプタマー、抗体またはその誘導体、ペプチド、タンパク質、小分子およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項６から１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
約１ｋＤａから約２１０ｋＤａの分子量を有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
分子量が３０ｋＤａよりも大きいポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを含まない、請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記治療薬が、ある期間にわたり前記硝子体成分結合性部分から解離する、請求項６から２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記硝子体成分結合性部分が、配列番号２〜７のいずれか１つに従ったオリゴヌクレオチド配列または配列番号２〜７のいずれか１つに少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１０から２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
配列番号９〜１１、１３、もしくは１５のいずれか１つに従ったオリゴヌクレオチド配列または配列番号９〜１１、１３、もしくは１５のいずれか１つに少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
４０ｋＤａ未満の分子量を有し、かつ４０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーを含む組成物の硝子体内保持時間に匹敵する硝子体内保持時間を有する、請求項１から２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物がそれぞれ硝子体内投与に適した液体製剤で製剤化される場合、４０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーを含む組成物の半分以下の粘度を有する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１から２７のいずれか一項に記載の組成物を含む液体製剤であって、前記液体製剤が硝子体内投与のために製剤化される場合、前記組成物が前記液体製剤中少なくとも４０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する、液体製剤。
【請求項２９】
５０μＬ容積で製剤化され１／２インチ２７ゲージ針で投与される場合、約３８，８００センチポイズから約９７０，８００センチポイズの動的粘度を有する、請求項２８に記載の液体製剤。
【請求項３０】
５０μＬ容積で製剤化され１／２インチ３０ゲージ針で投与される場合、約１３，１００センチポイズから約３２５，０００センチポイズの動的粘度を有する、請求項２８に記載の液体製剤。
【請求項３１】
５０μＬ容積で製剤化され１／２インチ３３ゲージ針で投与される場合、約２，８００センチポイズから約７５，０００センチポイズの動的粘度を有する、請求項２８に記載の液体製剤。
【請求項３２】
被験体において網膜疾患を処置する方法であって、治療有効量の、請求項１から２７のいずれか一項に記載の組成物を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項３３】
前記投与することが、硝子体内投与により前記被験体に前記組成物を投与することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記投与することが、８週間ごとに少なくとも１回前記組成物を投与することを含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物を投与することが、２７〜３３ゲージ針を使用して前記組成物を投与することを含む、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記２７〜３３ゲージ針が１／２インチまたはそれ未満の長さを有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記投与することが、単回硝子体内投与で前記被験体に少なくとも２ｍｇの前記組成物の用量を投与することを含む、請求項３２から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記治療有効量が、眼あたり約１５μｌから約１００μｌ中約０．１ｍｇから約５０ｍｇである、請求項３２から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記被験体に少なくとも１つの追加の治療薬を共に投与することをさらに含む、請求項３２から３８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１６年２月８日に出願された米国仮出願第６２／２９２，８１７号（この出願は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
網膜の疾患および状態は、米国の多くの人々に影響を及ぼしている。網膜療法の硝子体内（ＩＶＴ）投与は、網膜疾患の処置のための一般的投与様式である。眼の後眼部の疾患の処置は、許容可能な投与間隔を置いて有用な持続期間での標的抑制を送達するのに十分な期間治療薬が眼の後区分（すなわち、硝子体液）に治療濃度で保持され、同時に治療効果を与えるのに十分な標的占有を供給するのに十分疾患組織内の標的にまで拡散することもできることを必要とする。網膜疾患では、治療薬は一般に硝子体網膜境界を通って拡散して疾患組織の意図された標的に接近し、特異的適応症に応じて、網膜色素上皮（ＲＰＥ）層に到達して疾患部位の意図された標的に到達することを含めて、網膜組織内深くに浸透する必要があるようである。
【０００３】
アプタマーは、密集した形状で８〜１５ＫＤａの範囲の典型的な分子量を有し、網膜浸透にとり理想的な分子量であるが、その低い分子サイズおよび分子量のせいで硝子体から迅速に排除される。硝子体滞留を増加させるために、アプタマーは典型的には高分子量ＰＥＧ（例えば、４０ＫＤａ）にコンジュゲートされ、このＰＥＧはその大きい流体力学半径のせいで、網膜組織に浸透するその能力を大きく損なうことなくそのクリアランス速度を下げる。しかし、ＰＥＧは薬物製剤の粘度を大きく増加させ、そのせいで適切な製剤中に存在することが可能な薬物の最大濃度が制限される。硝子体内注射により投与可能なのはごくわずかな容積であることを考慮すると、高分子量ＰＥＧの使用は単回注射で眼に投与することが可能な潜在的最大用量を制限する。
【０００４】
本明細書に開示される組成物および方法は、良好な網膜組織浸透を可能にする分子サイズを維持しつつ、クリアランス速度を下げることにより改良されたＩＶＴ半減期を示す分子を提供する。一部の例では、本明細書に開示される組成物および方法は硝子体成分に結合することにより硝子体からのクリアランスの速度が減少した分子を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、硝子体の成分に特異的に結合し、それによってこれらの分子のクリアランス速度を下げ、硝子体内滞留時間を増やすオリゴヌクレオチドおよび他の分子を提供する。硝子体結合オリゴヌクレオチドは治療薬にコンジュゲートしてもよく、次に、眼の硝子体成分に治療薬を運搬してドッキングさせるのに使用することができ、それによって治療薬の硝子体内滞留を増強する。硝子体結合オリゴヌクレオチドは、最小粘度の液体溶液に製剤化し、それによって、単回硝子体内注射により被験体に送達可能な最大用量を増強することも可能である。
【０００６】
一部の態様では、硝子体成分結合性部分にコンジュゲートされた治療薬を含む組成物であって、硝子体成分結合性部分がペプチドタグではない、組成物が提供される。
【０００７】
一部の態様では、硝子体成分結合性部分にコンジュゲートされた治療薬を含む組成物であって、硝子体成分結合性部分がアプタマーを含む、組成物が提供される。
【０００８】
他の態様では、硝子体成分結合性部分にコンジュゲートされた治療薬を含む組成物であって、硝子体成分結合性部分が小分子を含む、組成物が提供される。
【０００９】
一部の場合、前述の組成物のいずれかの硝子体成分結合性部分は硝子体液の成分に結合する。一部の場合、硝子体液の成分は、コラーゲン、ヒアルロナン、フィブリリン、ビトロネクチン、オプテティシン（ｏｐｔｉｃｉｎ）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびその任意の組み合わせからなる群より選択される。一例では、硝子体液の成分はヒアルロナンである。別の例では、硝子体液の成分はコラーゲンまたはコラーゲン線維である。さらに別の例では、硝子体液の成分はビトロネクチンまたはビトロネクチン線維である。一部の場合、硝子体成分結合性部分は、約１ｍＭ未満のＫｄで硝子体液の成分に結合する。一部の場合、硝子体成分結合性部分は、約１００μＭ未満のＫｄで硝子体液の成分に結合する。他の場合、硝子体成分結合性部分は、約１０μＭ未満のＫｄで硝子体液の成分に結合する。さらに他の場合、硝子体成分結合性部分は、約１μＭ未満のＫｄで硝子体液の成分に結合する。さらに他の場合、硝子体成分結合性部分は、約１００ｎＭ未満のＫｄで硝子体液の成分に結合する。一部の場合、前述のいずれかの組成物はヒトで少なくとも６日の硝子体内半減期を有する。一部の場合、前述のいずれかの組成物はヒトで少なくとも８日の硝子体内半減期を有する。他の場合、前述のいずれかの組成物はヒトで少なくとも１０日の硝子体内半減期を有する。さらに他の場合、前述のいずれかの組成物はヒトで少なくとも１２日の硝子体内半減期を有する。さらに他の場合、前述のいずれかの組成物はヒトで少なくとも１４日の硝子体内半減期を有する。一部の場合、前述のいずれかの組成物はヒトで少なくとも１６日の硝子体内半減期を有する。一部の場合、前述のいずれかの組成物はヒトで少なくとも１８日の硝子体内半減期を有する。他の場合、前述のいずれかの組成物はヒトで少なくとも２０日の硝子体内半減期を有する。一部の場合、前述の組成物のいずれかの治療薬は網膜疾患の処置のために使用される治療薬である。一部の例では、網膜疾患は、加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、およびぶどう膜炎からなる群より選択される。一部の場合、加齢黄斑変性はウェット型加齢黄斑変性、ドライ型加齢黄斑変性または地図状萎縮である。一部の場合、前述の組成物のいずれかの治療薬は、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、アンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、Ｄ因子、Ｐ因子、補体成分５（Ｃ５）、補体成分３（Ｃ３）またはインテグリンの阻害剤である。一部の場合、前述の組成物のいずれかの治療薬は、アプタマー、抗体またはその誘導体、ペプチド、タンパク質、小分子およびその任意の組み合わせからなる群より選択される。一部の場合、前述のいずれかの組成物は、約１ｋＤａから約２１０ｋＤａの分子量を有する。一部の場合、前述のいずれかの組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーをさらに含む。一部の場合、前述の組成物のいずれかの治療薬は、ある期間にわたり硝子体成分結合性部分から解離する。
【００１０】
別の態様では、被験体において網膜疾患を処置するための方法であって、治療有効量の、硝子体成分結合性部分にコンジュゲートされた治療薬を含む組成物を被験体に投与することを含み、硝子体成分結合性部分がペプチドタグではない、方法が提供される。
【００１１】
別の態様では、被験体において網膜疾患を処置するための方法であって、治療有効量の、硝子体成分結合性部分にコンジュゲートされた治療薬を含む組成物を被験体に投与することを含み、硝子体成分結合性部分がアプタマーである、方法が提供される。
【００１２】
さらに別の態様では、被験体において網膜疾患を処置するための方法であって、治療有効量の、硝子体成分結合性部分にコンジュゲートされた治療薬を含む組成物を被験体に投与することを含み、硝子体成分結合性部分が小分子である、方法が提供される。
【００１３】
一部の場合、前述の方法のいずれかの網膜疾患は、加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、およびぶどう膜炎からなる群より選択される。一部の例では、加齢黄斑変性はウェット型加齢黄斑変性、ドライ型加齢黄斑変性または地図状萎縮である。一部の場合、前述の方法のいずれかの投与は硝子体内投与を含む。一部の場合、前述の方法のいずれかの硝子体成分結合性部分は硝子体液の成分に結合する。一部の例では、硝子体液の成分は、コラーゲン、ヒアルロナン、フィブリリン、ビトロネクチン、オプテティシン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびその任意の組み合わせからなる群より選択される。一例では、硝子体液の成分はヒアルロナンである。別の例では、硝子体液の成分はコラーゲンまたはコラーゲン線維である。さらに別の例では、硝子体液の成分はビトロネクチンまたはビトロネクチン線維である。一部の場合、硝子体成分結合性部分は、約１ｍＭ未満のＫｄで硝子体液の成分に結合する。一部の場合、硝子体成分結合性部分は、約１００μＭ未満のＫｄで硝子体液の成分に結合する。他の場合、硝子体成分結合性部分は、約１０μＭ未満のＫｄで硝子体液の成分に結合する。さらに他の場合、硝子体成分結合性部分は、約１μＭ未満のＫｄで硝子体液の成分に結合する。さらに他の場合、硝子体成分結合性部分は、約１００ｎＭ未満のＫｄで硝子体液の成分に結合する。一部の場合、前述の方法のいずれかの組成物はヒトで少なくとも６日の硝子体内半減期を有する。一部の場合、前述の方法のいずれかの組成物はヒトで少なくとも８日の硝子体内半減期を有する。他の場合、前述の方法のいずれかの組成物はヒトで少なくとも１０日の硝子体内半減期を有する。他の場合、前述の方法のいずれかの組成物はヒトで少なくとも１２日の硝子体内半減期を有する。一部の場合、前述の方法のいずれかの組成物はヒトで少なくとも１４日の硝子体内半減期を有する。一部の場合、前述の方法のいずれかの組成物はヒトで少なくとも１６日の硝子体内半減期を有する。一部の場合、前述の方法のいずれかの組成物はヒトで少なくとも１８日の硝子体内半減期を有する。他の場合、前述のいずれかの組成物はヒトで少なくとも２０日の硝子体内半減期を有する。一部の場合、前述の方法のいずれかの治療薬は、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、アンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、Ｄ因子、Ｐ因子、補体成分５（Ｃ５）、補体成分３（Ｃ３）またはインテグリンの阻害剤である。一部の場合、前述の方法のいずれかの治療薬は、アプタマー、抗体またはその誘導体、ペプチド、タンパク質、小分子およびその任意の組み合わせからなる群より選択される。一部の場合、前述の方法のいずれかの組成物は２週間ごとに１回投与される。一部の場合、前述の方法のいずれかの組成物は毎月１回投与される。一部の場合、前述の方法のいずれかの組成物は２ヶ月ごとに１回投与される。他の場合、前述の方法のいずれかの組成物は３ヶ月に１回投与される。他の場��、前述の方法のいずれかの組成物は４ヶ月に１回投与される。さらに他の場合、前述の方法のいずれかの組成物は５ヶ月に１回投与される。さらに他の場合、前述の方法のいずれかの組成物は６ヶ月に１回投与される。一部の場合、前述の方法のいずれかの治療有効量は、眼あたり約１５μｌから約１００μｌ中約０．１ｍｇから約５０ｍｇである。一部の場合、前述のいずれかの方法は被験体に少なくとも１つの追加の治療薬を共に投与することをさらに含む。一部の場合、前述の方法のいずれかの組成物は、１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーをさらに含む。一部の場合、前述の方法のいずれかの組成物は、約１ｋＤａから約２１０ｋＤａの分子量を有する。一部の場合、前述の方法のいずれかの治療薬は、ある期間にわたり硝子体成分結合性部分から解離する。
【００１４】
別の態様では、硝子体成分に特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。一部の場合、オリゴヌクレオチドはアプタマーである。アプタマーはＲＮＡアプタマーでも改変ＲＮＡアプタマーでもよい。アプタマーはＤＮＡアプタマーでも改変ＤＮＡアプタマーでもよい。一部の例では、アプタマーは、ＤＮＡ、改変ＤＮＡ、ＲＮＡおよび改変ＲＮＡからなる群より選択される少なくとも２種類の核酸を含む。前述の組成物のいずれか１つでは、オリゴヌクレオチドは治療薬にコンジュゲートされていてもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、組成物は二重特異性アプタマーでもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、オリゴヌクレオチドは配列番号２〜７のいずれか１つに従った配列を含む、または配列番号２〜７のいずれか１つに少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、硝子体成分はヒアルロナン、コラーゲン、またはビトロネクチンである。
【００１５】
さらに別の態様では、硝子体成分結合性部分にコンジュゲートされた治療薬を含む組成物であって、硝子体成分結合性部分がペプチドタグではない、組成物が提供される。硝子体成分結合性部分は硝子体液の成分に結合してもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、硝子体液の成分は、コラーゲン、ヒアルロナン、フィブリリン、ビトロネクチン、オプテティシン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびその任意の組み合わせからなる群より選択してもよい。一部の例では、硝子体液の成分は、ヒアルロナン、コラーゲン、またはビトロネクチンでもよい。前述の請求項のいずれか１つでは、硝子体成分結合性部分は、約１ｍＭ未満のＫｄで硝子体液の成分に結合してもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、組成物はヒトで少なくとも６日の硝子体内半減期、ウサギで少なくとも２日の硝子体内半減期、または非ヒト霊長類で少なくとも３日の硝子体内半減期を有することがある。前述の組成物のいずれか１つでは、治療薬は網膜疾患の処置のために使用される治療薬であってよい。網膜疾患は、ウェット型加齢黄斑変性、ドライ型加齢黄斑変性、地図状萎縮、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、およびぶどう膜炎からなる群より選択してもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、治療薬は、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、アンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、Ｄ因子、Ｐ因子、補体成分５（Ｃ５）、補体成分３（Ｃ３）またはインテグリンの阻害剤でもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、組成物は血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を阻害するアプタマーを含んでいてもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、治療薬は、アプタマー、抗体またはその誘導体、ペプチド、タンパク質、小分子およびその任意の組み合わせからなる群より選択してもよい。前述の請求項のいずれか１つでは、組成物は約１ｋＤａから約２１０ｋＤａの分子量を有していてもよい。前述の請求項のいずれか１つでは、組成物は、分子量が３０ｋＤａよりも大きいポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを含まない。前述の組成物のいずれか１つでは、治療薬は、ある期間にわたり硝子体成分結合性部分から解離してもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、硝子体成分結合性部分は、配列番号２〜７のいずれか１つに従ったオリゴヌクレオチド配列、または配列番号２〜７のいずれか１つに少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含んでいてもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、組成物は配列番号９〜１１、１３、もしくは１５のいずれか１つに従ったオリゴヌクレオチド配列または配列番号９〜１１、１３、もしくは１５のいずれか１つに少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含んでいてもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、組成物は、４０ｋＤａ未満の分子量を有し、４０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーを含む組成物の硝子体内滞留時間に匹敵する硝子体内滞留時間を有していてもよい。組成物がそれぞれ硝子体内投与に適した液体製剤で製剤化される場合、組成物は、４０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーを含む組成物の半分以下の粘度を有していてもよい。
【００１６】
別の態様では、前述の組成物のいずれか１つの組成物を含み、組成物が硝子体内投与のために製剤化された場合、液体製剤中少なくとも４０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する、液体製剤が提供される。一部の場合、組成物は、硝子体内投与のために製剤化された場合、液体製剤中少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも６０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも９０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度を有する。一部の場合、液体製剤は、５０μＬ容積で製剤化され１／２インチ２７ゲージ針で投与される場合、約３８，８００センチポイズから約１９４，１００センチポイズ、約９７，０００センチポイズから約４８５，５００センチポイズ、または約１９４，１００センチポイズから約９７０，８００センチポイズの動的粘度（ｄｙｎａｍｉｃ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）を有していてもよい。一部の場合、液体製剤は、５０μＬ容積で製剤化され１／２インチ３０ゲージ針で投与される場合、約１３，１００センチポイズから約６５，０００センチポイズ、約３２，７００センチポイズから約１６４，０００センチポイズ、または約６５，０００センチポイズから約３２５，０００センチポイズの動的粘度を有していてもよい。一部の場合、液体製剤は、５０μＬ容積で製剤化され１／２インチ３３ゲージ針で投与される場合、約２，８００センチポイズから約１４，５００センチポイズ、約７，３００センチポイズから約３６，５００センチポイズ、または約１４，５００から約７５，０００センチポイズの動的粘度を有していてもよい。
【００１７】
別の態様では、被験体において網膜疾患を処置するための方法であって、治療有効量の、前述の組成物のいずれか１つに従った組成物を被験体に投与することを含む方法が提供される。投与は、硝子体内投与により被験体に組成物を投与することを含んでいてもよい。前述の方法のいずれか１つの投与は、８週ごとに少なくとも１回組成物を投与することを含んでいてもよい。前述の方法のいずれか１つの投与は、２７〜３３ゲージ針を使用して組成物を投与することを含んでいてもよい。２７〜３３ゲージ針は１／２インチまたはそれ未満の長さを有していてもよい。前述の方法のいずれか１つの投与は、少なくとも２ｍｇの組成物の用量を単回硝子体内投与で被験体に投与することを含んでいてもよい。前述の方法のいずれか１つでは、治療有効量は、眼あたり約１５μｌから約１００μｌ中約０．１ｍｇから約５０ｍｇである。前述の方法のいずれか１つでは、方法は少なくとも１つの追加の治療薬を被験体に共に投与することをさらに含んでいてもよい。
【００１８】
一部の実施形態では、前述のいずれかの組成物は４０ｋＤａ未満の分子量を有する。一部の実施形態では、前述のいずれかの組成物は３０ｋＤａ未満の分子量を有する。
【００１９】
参照による組込み
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的に個々に示されている場合と同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【００２０】
本発明の新規の特長は添付の特許請求の範囲に詳細に述べられている。本発明の特長および利点についてのもっとよい理解は、図解的実施形態を述べている以下の詳細な説明を参照することにより得られ、この実施形態では本発明の原理が利用され、その添付図面は以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、アプタマー番号８、ならびにアプタマー番号９、１０および１１の一部と同じアプタマーによるＰＤＧＦ依存性細胞増殖阻害を描写する。
【００２２】
【図２】図２は、選択されたアプタマーにより阻害されるＨＡへのＴＳＧ−６結合を描写する。
【００２３】
【図３】図３は、蛍光眼底血管造影により測定した場合の、ペグ化アプタマー番号８を単独でまたは抗ＶＥＧＦｍＡｂと組み合わせて用いた処置によるＰＤＧＦＢチャレンジにより誘導される血管漏出の阻害を描写する。
【００２４】
【図４】図４は、蛍光眼底血管造影により測定した場合の、抗ＶＥＧＦｍＡｂを用いた処置によるＶＥＧＦチャレンジにより誘導される血管漏出の阻害を描写する。
【００２５】
【図５】図５は、エバンスブルー（ＥＢ）により測定した場合の、ペグ化アプタマー番号８と抗ＶＥＧＦｍＡｂを別々にまたは組み合わせて投与した処置によるＰＤＧＦＢまたはＶＥＧＦチャレンジにより誘導される血管漏出の阻害を描写する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本開示は、硝子体液などの眼の区画に治療薬を運搬しドッキングさせるのに使用することが可能であるターゲティングオリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）を提供する。組成物は一般に、硝子体の成分に対するオリゴヌクレオチドの親和性のせいで改良されたまたは増強された硝子体内（ＩＶＴ）半減期を示す。一般に、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは容易に眼に浸透し、最小粘度の液体製剤で提供することが可能である。したがって、組成物は、単回硝子体内注射などの単回投与で治療有効用量の薬物を送達するのに使用することができる。
【００２７】
本明細書に開示される組成物および方法は、網膜疾患の処置のために使用することができる。組成物は治療薬を含むことができる。一部の場合、治療薬は網膜疾患または網膜障害を処置するのに使用される治療薬である。治療薬は硝子体成分結合性部分にコンジュゲートさせることが可能である。硝子体成分結合性部分は、ヒアルロナン、コラーゲン、またはビトロネクチンなどの硝子体液の成分に対して結合親和性を有する。硝子体成分結合性部分が硝子体成分に結合すると、硝子体内中のコンジュゲートされた治療薬の拡散速度が遅くなり、したがって硝子体からのクリアランス速度が低下することがある。一部の場合、本明細書で想定されるコンジュゲートされた治療薬は、コンジュゲートされていない治療薬と比べて増加した硝子体内半減期を有する。
【００２８】
本明細書で開示されるいくつかの実施形態の実施は、他の方法で指示されていなければ、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来の技法を用いるが、こうした技法は当技術分野の範囲内である。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＧｒｅｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第４版（２０１２年）；  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編）；  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）、ＰＣＲ  ２：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｍ．Ｊ．  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５年））、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８年）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第６版（Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（２０１０年））を参照されたい。
【００２９】
本明細書で使用される用語「アプタマー」とは、特定の標的分子に結合することが可能なオリゴヌクレオチドおよび／または核酸類似物をいう。アプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ、任意の核酸類似物、および／またはその組み合わせを含むことが可能である。アプタマーは一本鎖オリゴヌクレオチドであり得る。理論に縛られることを望まないが、アプタマーは三次元構造の標的分子に結合すると考えられている。アプタマーは単量体（単一ユニットで構成されている）または多量体（複数のユニットで構成されている）でもよい。多量体アプタマーは、ホモマー（複数の同一のユニットで構成されている）またはヘテロマー（複数の同一ではないユニットで構成されている）であり得る。
【００３０】
用語「被験体」および「患者」は本明細書では互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトを指す。哺乳動物は、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物（ｓｐｏｒｔ  ａｎｉｍａｌ）、および愛玩動物を含むがこれらに限定されない。ｉｎ  ｖｉｖｏで得られるまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される生物学的実体の組織、細胞およびその子孫も包含されている。
【００３１】
硝子体液（本明細書では「硝子体」とも呼ばれる）は、ヒトおよび他の脊椎動物の眼球の水晶体と網膜の間の空間を満たしているゼリー状物質である。硝子体液は大部分が水で構成されており（その容積の約９８〜９９％）、その残りは無機塩、脂質、コラーゲン線維、ヒアルロン酸、および硝子体細胞（ヒアルロン酸およびコラーゲンを硝子体に供給する細胞）で構成されている。硝子体液の追加の成分は、フィブリリン、ビトロネクチン、オプテティシン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、グロブリン、凝固タンパク質、補体因子、および低分子量タンパク質を含む。眼の前方部の眼房水などの眼の他の流体と違って、硝子体液は停滞しており無変化のままである。硝子体液は網膜と直接接触しているので、治療薬の硝子体内投与（すなわち、直接硝子体液への投与）は、網膜疾患の処置のための好ましい投与である場合が多い。
【００３２】
本開示の一部の態様では、硝子体成分結合性部分などの硝子体の成分に結合する組成物が提供される。成分は、上記の硝子体の任意の成分でも可能であり、一部の場合、硝子体の構造上の成分である。一部の場合、成分はヒアルロナンまたはヒアルロン酸である。ヒアルロナンは硝子体全体に広く分布している陰イオン性非硫酸化グリコサミノグリカンである。他の場合、成分はコラーゲンである。コラーゲン分子には少なくとも２７の異なる種類があり、これらのコラーゲンは集合して原線維またはシート状構造体になることが可能である。硝子体では、コラーゲンのほぼすべてが、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＸ型、およびＶ／ＸＩ型コラーゲンを含有する細く均一でヘテロタイプの原線維の形態である。次に本明細書の組成物はＩ型、ＩＩ型、ＩＸ型、もしくはＶ／ＸＩ型コラーゲンまたはその組み合わせで構成されたコラーゲン線維に結合することができる。他の場合、成分はビトロネクチンである。ビトロネクチンは、硝子体に存在する単量体、または原線維多量体として存在することが可能な高度にグリコシル化されたタンパク質である。本明細書の組成物は、ビトロネクチンの原線維の単量体ビトロネクチンに結合することができる。一部の場合、成分はフィブリリン、オプテティシン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはヘパラン硫酸プロテオグリカンであり、組成物はこれらの成分のうちの１つまたは複数に結合する。
【００３３】
用語「硝子体内半減期」または「ＩＶＴ半減期」は互換的に使用してもよく、物質（例えば、治療薬）の量が硝子体中でその量の半分にまで下がるのに必要な時間を指す。例えば、硝子体中に注射され８日でその注射された量の５０％まで下がる治療薬はＩＶＴ半減期８日を有すると考えられる。ＩＶＴ半減期は、多数の要因、薬剤の安定性、硝子体からの薬剤のクリアランス、および薬剤と硝子体環境の相互作用を含む非限定的例により影響を受けることがある。
【００３４】
改良されたＩＶＴ半減期を有する組成物が本明細書では企図されている。組成物は治療薬、一部の場合、網膜疾患を処置するのに使用され、ＩＶＴ半減期を改良するように改変または変更されている治療薬でもよい。改変または変更は、１つまたは複数の硝子体成分結合性部分を治療薬に付加することを含んでいてよい。本明細書で使用される用語「硝子体成分結合性部分」とは、硝子体の成分に対する結合親和性を有する任意の分子をいう。一部の場合、硝子体成分結合性部分はアプタマー（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー）である。一部の場合、硝子体成分結合性部分は小分子である。硝子体成分結合性部分は、ペプチド、タンパク質、抗体またはその誘導体、脂質、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ａｎｋｙｒｉｎ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＤＡＲｐｉｎ）および同類の物も包含してよい。一部の場合、硝子体成分結合性部分はヒアルロナン（ヒアルロン酸）に対する結合親和性を有する。一部の場合、硝子体成分結合性部分はコラーゲンまたはコラーゲン線維に対する結合親和性を有する。一部の場合、硝子体成分結合性部分は、フィブリリン、ビトロネクチン、オプテティシン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する結合親和性を有する。
【００３５】
結合親和性とは、受容体とそのリガンドの間などの、２つの結合パートナー間の相互作用の強さを指してもよい。一部の場合、結合親和性とは、硝子体成分結合性部分とそれが結合する硝子体成分の間の相互作用の強さを指してもよい。結合親和性は、解離定数（Ｋｄ）、２つの結合パートナーが互いにどれくらい堅固に結合しているか、例えば、硝子体成分結合性部分（ＶＢＭ）が硝子体成分（ＶＣ）にどれくらい堅固に結合しているかの尺度として表すことが可能である。一般に、より低いＫｄは、より堅固な結合と等しい。解離定数は：Ｋｄ＝［ＶＣ］［ＶＢＭ］／［ＶＣ＊ＶＢＭ］として定義することができ、［ＶＣ］は硝子体成分のモル濃度であり、［ＶＢＭ］は硝子体成分結合性部分のモル濃度であり、［ＶＣ＊ＶＢＭ］は硝子体成分結合性部分が結合した硝子体成分のモル濃度である。次に、Ｋｄ値は、硝子体成分の濃度の半分が硝子体成分結合性部分に結合しており硝子体成分の濃度の半分が結合していない、硝子体成分結合性部分の濃度（Ｍ）である。
【００３６】
本明細書で提供される組成物は、ｍＭからμＭの範囲でＫｄ値を有していてもよい。ｎＭからｐＭの範囲のＫｄ値を利用することは可能であるが、組成物のＩＶＴ半減期の改良と最終的な硝子体からの組成物のクリアランスとの釣り合いを考慮しなければならない。ｐＭの範囲のＫｄを有する組成物は、硝子体成分にあまりに堅固に結合して、組成物が網膜表面に接近するのを妨げることがある。したがって、一部の場合、より高いＫｄ値を有する組成物を利用してこれを克服することができる。一部の場合、組成物は硝子体の成分に約１ｍＭ未満、約１００μＭ未満、約１０μＭ未満、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫｄで結合する。
【００３７】
硝子体成分結合性部分は本質的には、硝子体成分に対して結合親和性を有する任意の分子であり得る。一部の場合、硝子体成分結合性部分はアプタマーである。本明細書で使用される用語アプタマーとは、非ワトソンクリック塩基対合相互作用を通じた高親和性および特異性で標的（例えば、タンパク質）に結合するオリゴヌクレオチド分子（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ）をいう。ｍＲＮＡなどの多くの天然に存在するオリゴヌクレオチドはその線形の塩基配列に情報をコードしているが、アプタマーは、標的分子へのアプタマーの結合が、保存された線形塩基配列のその相補体への結合というよりむしろアプタマーの二次および三次構造に依存しており、アプタマーは一般にその線形の塩基配列に情報をコードしてはいない点でこれら天然に存在するオリゴヌクレオチドと区別することが可能である。一般に、本明細書に記載されるアプタマーは単離された、天然には存在しないオリゴヌクレオチド（すなわち、合成的に生成される）である。アプタマーが硝子体成分結合性部分として利用される場合、硝子体の成分に結合するように設計することができる。例えば、アプタマーはヒアルロナンに結合することが可能である（例えば、抗ヒアルロナンアプタマー）。他の場合、アプタマーはコラーゲンまたはコラーゲン線維に結合することが可能である（例えば、抗コラーゲンアプタマー）。さらに他の場合、アプタマーはビトロネクチンまたはビトロネクチン線維に結合することが可能である。
【００３８】
一部の例では、硝子体成分結合性部分は硝子体成分に特異的に結合するアプタマーである。一部の場合、硝子体成分結合性部分はヒアルロナンに特異的に結合するアプタマーである。一部の例では、硝子体成分結合性部分は下の表１に記載される配列を含むアプタマーである。
【表１】
2019508405.tif 000003
【００３９】
一部の場合、本開示のアプタマーは配列番号２〜７のいずれか１つに従った配列を有するオリゴヌクレオチドまたは配列番号２〜７のいずれか１つの少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含む。ＤＮＡ骨格が記載されている場合、前記ＤＮＡは、改変ＲＮＡおよび改変ＤＮＡからなる群より選択される１つまたは複数種類の核酸で置換してもよいことは理解されるべきである。
【００４０】
一部の場合、本開示のアプタマーは、本明細書に記載される任意のアプタマーと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有していてもよい。例えば、本開示のアプタマーは、表１に記載される任意のアプタマーと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有していてもよい。一部の場合、本開示のアプタマーは、本明細書に記載される任意のアプタマーと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有していてもよい。例えば、本開示のアプタマーは、表１に記載される任意のアプタマーと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有していてもよい。
【００４１】
特定のヌクレオチド改変が記載されているような場合、任意の数のおよび種類のヌクレオチド改変でも置換することができると理解されるべきである。ヌクレオチド改変の非限定的例が本明細書では提供されている。一部の例では、本開示のアプタマーのヌクレオチドのすべてが改変されている。一部の例では、本開示のアプタマーのヌクレオチドの少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が改変されてもよい。
【００４２】
一部の場合、硝子体成分結合性部分は小分子である。一部の場合、小分子はヒアルロナンに結合することが可能である。他の場合、小分子はコラーゲンまたはコラーゲン線維に結合することが可能である。そのような分子の非限定的例は、米国特許第７，４８８，７９２号に記載される小分子のうちのいずれかならびにタンニン酸、没食子酸エピガロカテキン、エピカテキンガレート、および没食子酸などのガロイル含有化合物を含む。
【００４３】
本明細書に記載されるアプタマーは、アプタマーの機能または親和性に影響を与えることが可能な任意の数の改変を含んでいてもよい。例えば、アプタマーは非改変でもよくまたは安定性、ヌクレアーゼ耐性もしくは送達特徴を改良する改変されたヌクレオチドを含有していてもよい。そのような改変の例は、糖および／またはリン酸および／または塩基位置での、例えば、リボースの２’位、ピリミジンの５位、およびプリンの８位での化学的置換、種々の２’−改変ピリミジンならびに２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）置換基での改変を含んでいてもよい。一部の場合、本明細書に記載されるアプタマーは、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を増加する２’−ＯＭｅ改変を含む。一部の場合、本明細書に記載されるアプタマーは、硝子体成分に対するアプタマーの親和性および特異性を改良する改変ヌクレオチドを含む。改変ヌクレオチドの例は、グアニジン、インドール、アミン、フェノール、ヒドロキシメチル、またはボロン酸で改変されたヌクレオチドを含む。他の場合、ピリミジンヌクレオチド三リン酸類似物またはＣＥ−ホスホルアミダイトは、例えば、５−ベンジルアミノカルボニル−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）；５−［Ｎ−（フェニル−３−プロピル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）；５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）；５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）；５−（Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）；５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）；５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）；５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）；５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）；５−イソブチルアミノカルボニル−２’−デオキシウリジン（ＩｂｄＵ）；５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）；５−（Ｎ−イソブチルアミノカルボニル−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）；５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−Ｒ−トレオニニルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジ���、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアモニウム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｏｎｉｕｍ））プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン；５−［Ｎ−（１−モルホリノ−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＭＯＥｄｕ）；Ｒ−テトラヒドロフラニルメチル−２’−デオキシウリジン（ＲＴＭｄＵ）；３−メトキシベンジル−２’−デオキシウリジン（３ＭＢｎｄＵ）；４−メトキシベンジル−２’−デオキシウリジン（４ＭＢｎｄＵ）；３，４−ジメトキシベンジル−２’−デオキシウリジン（３，４ＤＭＢｎｄＵ）；Ｓ−テトラヒドロフラニルメチル−２’−デオキシウリジン（ＳＴＭｄＵ）；３，４−メチレンジオキシフェニル−２−エチル−２’−デオキシウリジン（ＭＰＥｄＵ）；４−ピリジニルメチル−２’−デオキシウリジン（ＰｙｒｄＵ）；または１−ベンゾイミダゾール−２−エチル−２’−デオキシウリジン（ＢｉｄＵ）；５−（アミノ−１−プロペニル）−２’−デオキシウリジン；５−（インドール−３−アセトアミド−１−プロペニル）−２’−デオキシウリジン；または５−（４−ピバロイルベンズアミド−１−プロペニル）−２’−デオキシウリジンを生成するために５位で改変されてもよい。
【００４４】
本開示で企図されているアプタマーの改変は、追加の電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電気相互作用、および官能性を核酸アプタマー塩基にまたは核酸アプタマー全体に組み込む他の化学基を提供する改変を限定せずに含む。ヌクレアーゼに対して耐性であるオリゴヌクレオチド集団を生成するための改変は、１つまたは複数の代わりのヌクレオチド間結合、変更された糖、変更された塩基、またはその組み合わせも含むことが可能である。そのような改変は、２’位糖改変、５位ピリミジン改変、８位プリン改変、環外アミンでの改変、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換；骨格改変、ホスホロチオエートまたはアルキルホスフェート改変、メチル化、ならびにイソ塩基イソシチジンおよびイソグアノシンなどの希な塩基対合の組み合わせを含むがこれらに限定されない。改変は、キャッピング、例えば、エキソヌクレアーゼ耐性を増加させる３’−３’−ｄＴキャップの付加などの３’および５’改変も含むことが可能である。
【００４５】
アプタマーの長さは可変であり得る。一部の場合、アプタマーの長さは１００ヌクレオチド未満である。一部の場合、アプタマーの長さは１０ヌクレオチドよりも大きい。一部の場合、アプタマーの長さは１０から９０ヌクレオチドの間である。アプタマーは、限定せずに、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、または約９０ヌクレオチド長が可能である。
【００４６】
一部の場合、治療アプタマーへの硝子体成分結合性アプタマーのコンジュゲーションを可能にするため、反応性部分を有するリンカーをアプタマーに結合させてコンジュゲーションのための特定の部位を提供することが可能である。種々のリンカーおよび結合化学は当技術分野では公知である。非限定的例では、６−（トリフルオロアセトアミド）ヘキサノール（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイトを使用して、ヘキシルアミノリンカーを合成されたアプタマーの５’末端に付加することが可能である。このリンカーは、本明細書に提供されるその他のアミノリンカーの場合と同じように、アミンを保護する基が取り除かれると、ＰＥＧ−ＮＨＳエステルと反応させて共有結合によって連結したＰＥＧアプタマーを生成することが可能である。リンカーホスホルアミダイトの他の非限定的例は、構造：
【化１】
2019508405.tif 000004
を有するＴＦＡ−アミノＣ４  ＣＥＤホスホルアミダイト；
構造：
【化２】
2019508405.tif 000005
を有する５’−アミノ改変因子（ａｍｉｎｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）Ｃ３  ＴＦＡ；
構造：
【化３】
2019508405.tif 000006
を有するＭＴアミノ改変因子Ｃ６  ＣＥＤホスホルアミダイト；
構造：
【化４】
2019508405.tif 000007
を有する５’−アミノ改変因子５；
構造：
【化５】
2019508405.tif 000008
を有する５’−アミノ改変因子Ｃ１２；
および構造：
【化６】
2019508405.tif 000009
を有する５’チオール−改変因子Ｃ６
を含んでいてもよい。
【００４７】
５’−チオール改変リンカーは、例えば、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−ビニルスルホン、ＰＥＧ−ヨードアセトアミドおよびＰＥＧ−オルトピリジル−ジスルフィドと一緒に使用してもよい。一例では、アプタマーはマレイミドまたはビニルスルホン官能基を通じて５’−チオールに結合していてもよい。
【００４８】
治療（Ｔｘ）アプタマーに共有結合している硝子体成分結合性（ＶＢ）アプタマーからなる二重特異性アプタマー組成物は、標準ホスホルアミダイト化学を使用する固相オリゴヌクレオチド合成により生成することが可能である。一例では、ＶＢアプタマーは固体支持体上で３’から５’方向に、続いて連結リンカー（Ｌ）およびＴｘアプタマーも３’から５’方向に合成される。この戦略は５’−Ｔｘ−Ｌ−ＶＢ−３’  幾何の二重特異性アプタマーを生成する。代わりに、先ずＴｘアプタマーが固体支持体上で３’から５’方向に合成され、続いて連結リンカーおよびＶＢアプタマーも３’から５’方向に合成される。この戦略は５’−ＶＢ−Ｌ−Ｔｘ−３’幾何の二重特異性アプタマーを生成する。本開示のリンカーは一般に、＜５，０００Ｄａの炭素原子またはヘキサエチレングリコール反復で構成されている不活性リンカーである。
【００４９】
一非限定的例では、ＴｘとＶＢアプタマーを連結するのに使用されるリンカーは式：
【化７】
2019508405.tif 000010
の３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピル−１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイトであり、これは二重特異性アプタマーに組み込まれると３炭素リンカーが得られる。
【００５０】
別の非限定的例では、ＴｘとＶＢアプタマーを連結するのに使用されるリンカーは式：
【化８】
2019508405.tif 000011
の６−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ヘキサンジオール−１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイトであり、これは二重特異性アプタマーに組み込まれると６炭素リンカーが得られる。
【００５１】
別の非限定的例では、ＴｘとＶＢアプタマーを連結するのに使用されるリンカーは式：
【化９】
2019508405.tif 000012
の８−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）トリエチレンオキシド−１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイトであり、これは二重特異性アプタマーに組み込まれるとトリエチレングリコールリンカーが得られる。
【００５２】
別の非限定的例では、ＴｘとＶＢアプタマーを連結するのに使用されるリンカーは式：
【化１０】
2019508405.tif 000013
の１７−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ヘキサエチレンオキシド−１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイトであり、これは二重特異性アプタマーに組み込まれるとヘキサエチレングリコールリンカーが得られる。
【００５３】
治療（Ｔｘ）アプタマーに共有結合している硝子体成分結合性（ＶＢ）アプタマーからなる二重特異性アプタマー組成物は、二官能性リンカーを使用する部位特異的コンジュゲーションにより生成することが可能である。一例では、チオールなどの反応性部分がＶＢアプタマーの５’末端に組み込まれ、第一級アミンなどの異なる反応性部分がＴｘアプタマーの５’末端に組み込まれる。二官能性リンカーを使用する２つのそのようなアプタマーのコンジュゲーションにより３’−Ｔｘ−Ｌ−ＶＢ−３’幾何の二重特異性アプタマーが生成される。別の例では、チオールなどの反応性部分がＶＢアプタマーの５’末端に組み込まれ、第一級アミンなどの異なる反応性部分がＴｘアプタマーの３’末端に組み込まれる。二官能性リンカーを使用する２つのそのようなアプタマーのコンジュゲーションにより５’−Ｔｘ−Ｌ−ＶＢ−３’幾何の二重特異性アプタマーが生成される。さらに別の例では、チオールなどの反応性部分がＶＢアプタマーの３’末端に組み込まれ、第一級アミンなどの異なる反応性部分がＴｘアプタマーの３’末端に組み込まれる。二官能性リンカーを使用する２つのそのようなアプタマーのコンジュゲーションにより５’−Ｔｘ−Ｌ−ＶＢ−５’幾何の二重特異性アプタマーが生成される。そのような実施形態は例としてのみ提供される。数多くのバリエーション、変化、および置換を必要に応じて利用することができる。
【００５４】
一部の例では、硝子体成分結合性アプタマーはＣ６−ジスルフィドリンカーを用いて生成することが可能であり、治療アプタマーはＣ６−アミノリンカーを用いて生成し、以下の通りにコンジュゲートすることが可能である。Ｃ６−アミノリンカーを有するＴｘアプタマーを一般式ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）−［ＰＥＧ］ｎ−マレイミドからなるリンカーにコンジュゲートすることができ、脱離基および未反応のリンカーは透析または類似する方法により取り除いてもよく、次に硝子体結合性アプタマー上のリンカーのジスルフィドを還元してＴｘ−［ＰＥＧ］ｎ−ＭＡＬと反応させて、Ｔｘ−［ＰＥＧ］ｎ−ＶＢ二重特異性アプタマーを生成させてもよく、これは続いてクロマトグラフィーおよび脱塩により精製することができる。一部の場合、この反応は約ｐＨ６から約ｐＨ１０、またはｐＨ７から９または約ｐＨ８で実行して、マレイミドの完全性を維持しつつＮＨＳエステルとアプタマー上の第一級アミンの反応を促進する。代わりに、Ｃ６−アミノリンカーをＶＢアプタマーに組み込みＣ６−ジスルフィドリンカーをＴｘアプタマーに組み込んで類似する様式でコンジュゲーションを実施することが可能である。
【００５５】
一非限定的例では、ＴｘアプタマーとＶＢアプタマーをコンジュゲートするのに使用されるリンカーは、式：
【化１１】
2019508405.tif 000014
のマレイミド−ＰＥＧ２−スクシンイミジルエステルであり、これは二重特異性アプタマーを形成するとジエチレングリコールリンカーが得られる。
【００５６】
別の非限定的例では、ＴｘアプタマーとＶＢアプタマーをコンジュゲートするのに使用されるリンカーは、式：
【化１２】
2019508405.tif 000015
のマレイミド−ＰＥＧ４−スクシンイミジルエステルであり、これは二重特異性アプタマーを形成するとテトラエチレングリコールリンカーが得られる。
【００５７】
別の非限定的例では、ＴｘアプタマーとＶＢアプタマーをコンジュゲートするのに使用されるリンカーは、式：
【化１３】
2019508405.tif 000016
のマレイミド−ＰＥＧ８−スクシンイミジルエステルであり、これは二重特異性アプタマーを形成するとオクタエチレングリコールリンカーが得られる。
【００５８】
別の非限定的例では、ＴｘアプタマーとＶＢアプタマーをコンジュゲートするのに使用されるリンカーは、式：
【化１４】
2019508405.tif 000017
のマレイミド−ＰＥＧ１２−スクシンイミジルエステルであり、これは二重特異性アプタマーを形成するとドデカエチレングリコールリンカーが得られる。
【００５９】
別の非限定的例では、ＴｘアプタマーとＶＢアプタマーをコンジュゲートするのに使用されるリンカーは、式：
【化１５】
2019508405.tif 000018
のマレイミド−ＰＥＧ２４−スクシンイミジルエステルであり、これは二重特異性アプタマーを形成するとテトラコサエチレングリコールリンカーが得られる。そのような実施形態は例としてのみ提供される。数多くのバリエーション、変化、および置換を必要に応じて利用することができる。
【００６０】
一部の態様では、治療薬と硝子体成分結合性部分は直接コンジュゲートされる（例えば、リンカーの非存在下で）。他の態様では、治療薬と硝子体成分結合性部分は、本明細書に記載されるリンカーによりコンジュゲートされる。
【００６１】
一部の場合、本明細書に記載される硝子体成分結合性アプタマーは、所望の生物学的特性を有する１つまたは複数の分子に結合しているまたはコンジュゲートしていてもよい。任意の数の分子がアプタマーに結合しているまたはコンジュゲートしていることが可能であり、非限定的例は抗体、ペプチド、タンパク質、炭水化物、酵素、ポリマー、薬物、小分子、金ナノ粒子、放射性標識、蛍光標識、色素、ハプテン（例えば、ビオチン）、他のアプタマー、または核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。一部の場合、アプタマーは、アプタマーの安定性、溶解度または生物学的利用能を増加する分子にコンジュゲートされていてもよい。非限定的例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、炭水化物および脂肪酸を含む。一部の場合、細胞浸透ペプチドなどの、アプタマーの輸送または送達を改良する分子を使用してもよい。細胞浸透ペプチドの非限定的例は、Ｔａｔ由来のペプチド、ペネトラチン、ポリアルギニンペプチドＡｒｇ８配列、トランスポータン、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のＶＰ２２タンパク質、ブフォリン（Ｂｕｆｏｒｉｎ）ＩおよびＳｙｎＢなどの抗菌ペプチド、ポリプロリンスイートアローペプチド（ｓｗｅｅｔ  ａｒｒｏｗ  ｐｅｐｔｉｄｅ）分子、Ｐｅｐ−１ならびにＭＰＧを含むことが可能である。一部の実施形態では、アプタマーは、コレステロール、ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、または非免疫原性水溶性の薬学的に許容されるポリマーなどの親油性化合物にコンジュゲートしている。
【００６２】
一部の場合、本開示に従って製剤化されたアプタマーはリポソーム内への封入により改変してもよい。他の場合、本開示に従って製剤化されたアプタマーはミセル内への封入により改変してもよい。リポソームおよびミセルはいかなる脂質からなるものでもよく、一部の場合、脂質はホスファチジルコリンを含む、リン脂質でもよい。
【００６３】
一部の例では、組成物は、例えば、硝子体成分結合性部分の分解によりその硝子体結合能力を失うように設計される。他の例では、組成物は、治療薬が硝子体成分結合性部分から解離することができるように設計される。これは、治療薬と硝子体成分結合性部分の間に１つまたは複数の切断可能な結合を導入することにより達成することができる。１つまたは複数の切断可能な結合は、例えば、酵素、化学物質により切断されてもよく、または自然に分解して硝子体から治療薬を放出してもよい。
【００６４】
本明細書の組成物は一般に１つまたは複数の治療薬を含む。１つまたは複数の治療薬は１つまたは複数の硝子体成分結合性部分にコンジュゲートされていてもよい。「コンジュゲートされた」は共有結合または非共有結合を意味することも可能である。治療薬は疾患の処置に使用されるいかなる治療薬でもよい。一部の場合、治療薬は網膜疾患の処置に使用される。
【００６５】
多くの場合、本明細書に記載される組成物は一般に、５０ｋＤａ未満の分子量を有する。例えば、組成物は、１０ｋＤａ未満、２０ｋＤａ未満、２５ｋＤａ未満、３０ｋＤａ未満、３５ｋＤａ未満、４０ｋＤａ未満、または４５ｋＤａ未満の分子量を有していてもよい。
【００６６】
一部の場合、本明細書に記載される組成物は、少なくとも１ｋＤａよりも大きい、多くの場合１ｋＤａよりも実質的に大きい分子量を有していてもよい。例えば、組成物は、少なくとも１０ｋＤａ、少なくとも２０ｋＤａ、少なくとも３０ｋＤａ、少なくとも４０ｋＤａ、少なくとも５０ｋＤａ、少なくとも６０ｋＤａ、少なくとも７０ｋＤａ、少なくとも８０ｋＤａ、少なくとも９０ｋＤａ、少なくとも１００ｋＤａ、少なくとも１２０ｋＤａ、少なくとも１４０ｋＤａ、少なくとも１６０ｋＤａ、少なくとも１８０ｋＤａ、少なくとも２００ｋＤａまたは２００ｋＤａよりも大きい分子量を有していてもよい。
【００６７】
平均滞留時間とは、本開示の組成物が注射後硝子体に残っている平均時間を指していてもよい。組成物の平均滞留時間は、ＩＶＴ半減期を含むいくつかの要因に依存していることがある。一部の態様では、組成物は、非コンジュゲート治療薬と比べて増加したまたは改良されたＩＶＴ平均滞留時間を有する。本明細書に記載される１つまたは複数の硝子体成分結合性部分にコンジュゲートしている治療薬は、その非コンジュゲート等価物と比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超長い平均滞留時間を示すことができる。一部の場合、本明細書の組成物の平均滞留時間は、およそ少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、少なくとも１８日、少なくとも１９日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日または３０日よりも長い。
【００６８】
一部の場合、本明細書に記載されるアプタマーは、非ヒト動物（例えば、齧歯類／ウサギ／非ヒト霊長類）で少なくとも１日の眼内半減期を有する。一部の場合、本明細書に記載されるアプタマーは、齧歯類、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト動物で、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日またはそれよりも長い眼内半減期を有する。特定の例では、本明細書に記載されるアプタマーはウサギで少なくとも２日の眼内半減期を有する。別の特定の例では、本明細書に記載されるアプタマーは非ヒト霊長類で少なくとも３日の眼内半減期を有する。
【００６９】
一部の態様では、本明細書で提供される組成物は、硝子体内保持を促進するために高分子量分子（例えば、４０ｋＤａまたは４０ｋＤａよりも大きいポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー）を使用する製剤よりも優れた特性を有することができる。一部の場合、同じように製剤化した場合、本明細書で提供される組成物は、ＰＥＧ分子を含む組成物と比べて類似するまたは優れた眼内保持時間を有するが、ＰＥＧ分子を含む組成物よりも粘度は低い（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または５０％超未満）。一部の場合、本明細書で提供される組成物は、哺乳動物系では少なくとも２日の、少なくとも３日の、少なくとも４日の、少なくとも５日の、少なくとも６日の、または少なくとも７日の眼内半減期を有するが、４０ｋＤａのＰＥＧを含有する類似の製剤の粘度の５０％未満を有する製剤で提供される。
【００７０】
一部の態様では、組成物は、非コンジュゲート治療薬と比べて増加したまたは改良されたＩＶＴ半減期を有する。例えば、本明細書に記載される１つまたは複数の硝子体成分結合性部分にコンジュゲートしている治療薬は、その非コンジュゲート等価物と比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超長いＩＶＴ半減期を示すことができる。一部の場合、本明細書の組成物のＩＶＴ半減期は、およそ少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、少なくとも１８日、少なくとも１９日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日または３０日よりも長い。
【００７１】
一部の場合、本明細書に記載される組成物は、１つまたは複数の硝子体成分結合性部分にコンジュゲートされている治療薬を含む。治療薬は、限定せずに、小分子、抗体またはその誘導体、ペプチド、アプタマー、および同類の物が可能である。一部の場合、治療薬はアプタマーである。他の場合、治療薬は抗体である。
【００７２】
一部の場合、治療薬は拮抗活性（例えば、タンパク質の機能を阻害する）を有していてもよい。他の場合、治療薬はアゴニスト活性（例えば、タンパク質の機能を増強するまたは増加する）を有していてもよい。治療薬は生体細胞（例えば、網膜細胞）の機能を調節するまたは変更してもよい。治療薬は硝子体のタンパク質または他の成分の機能を調節するまたは変更してもよい。
【００７３】
一部の場合、治療薬は血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）またはＶＥＧＦシグナル伝達の阻害剤である。治療薬は、ＶＥＧＦのその正常な生物学的効果を発揮する能力を減少するいかなる種類の分子でも可能である。例えば、化合物は、ＶＥＧＦそれ自体、その受容体、またはＶＥＧＦによる結合に続いてＶＥＧＦ受容体が活性化されると活性化されるおよび／もしくは合成される細胞内シグナル伝達タンパク質もしくは転写因子に結合して阻害するか、それらの産生を減少することができる。一部の場合、治療薬は、抗ＶＥＧＦまたは抗ＶＥＧＦＲアプタマーもしくは抗体である。本明細書に記載される組成物中で使用することができる治療薬の非限定的例は、ＶＥＧＦのキナゾリン誘導体阻害剤（米国特許出願公開第２００７／２６５２８６号、米国特許出願公開第２００３／１９９４９１号および米国特許第６，８０９，０９７号に記載されている）、ケルセチン（国際公開第０２／０５７４７３号に記載されている）、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼのキナゾリン誘導体阻害剤（米国特許出願公開第２００７／０２７１４５号に記載されている）、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼのアミノ安息香酸誘導体阻害剤（米国特許第６，７２０，４２４号に記載されている）、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼのピリジン誘導体阻害剤（米国特許出願公開第２００３／１５８４０９号に記載されている）、セジラニブ（国際公開第０７／０６０４０２号に記載されている）、スニチニブ（国際公開第０８／０３１８３５号および米国特許第６，５７３，２９３号に記載されている）、ペガプタニブ（米国特許第６，０５１，６９８号に記載されている）、アキシチニブ（国際公開第２００４／０８７１５２号に記載されている）、ソラフェニブ（国際公開第０７／０５３５７３号に記載されている）、ＶＥＧＦＲ−Ｉ結合ペプチド（米国特許出願公開第２００５／１００９６３号に記載されている）、受容体へのＶＥＧＦ結合を遮断するアルギニンリッチ抗血管内皮成長因子ペプチド（米国特許第７，２９１，６０１号に記載されている）、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから市販されており、米国特許出願公開第２００５／０３２６９９号に記載されている）、可溶性ＶＥＧＦ受容体（米国特許出願公開第２００６／１１０３６４号およびＴｓｅｎｇら、２００２年に記載されている）、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄペプチド模倣阻害剤（米国特許出願公開第２００２／０６５２１８号に記載されている）、ＰＡＩ−Ｉ（米国特許出願公開第２００４／１２１９５５号に記載されている）、ならびに米国特許出願公開第２００２／０６８６９７号、国際公開第０２／０８１５２０号、米国特許出願公開第２００６０２３４９４１号、および米国特許出願公開第２００２／０５８６１９号に記載される阻害剤を含む。一部の場合、治療薬は、ベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体（米国特許第６，０５４，２９７号に記載されている）、ラニビズマブ（米国特許第６，４０７，２１３号に記載されている）、ならびに米国特許第５，７３０，９７７号および米国特許出願公開第２００２／０３２３１５号に記載されている抗体；米国特許出願公開第２００４／００５６７１号および国際公開第０���／１４０５３４号に記載されている抗体を含む抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体；米国特許第６，４０３，０８８号に記載されている抗体を含む抗ＶＥＧＦ−Ｃ抗体；米国特許第７，０９７，９８６号に記載されている抗体を含む抗ＶＥＧＦ−Ｄ抗体；米国特許出願公開第２００３／０８８０７５号に記載されている抗体を含む抗ＶＥＧＦＲ−１抗体；米国特許第６，３４４，３３９号；国際特許第９９／４０１１８号および米国特許出願公開第２００３／１７６６７４号に記載される抗体を含む抗ＶＥＧＦＲ−２抗体；ならびに米国特許第６，８２４，７７７号に記載される抗体を含む抗ＶＥＧＦＲ−３抗体を限定せずに含む抗体または抗体関連分子またはその断片である。
【００７４】
一部の態様では、本開示の組成物は、抗ヒアルロナンアプタマーに連結されている抗ＶＥＧＦアプタマーを含む二重特異性アプタマーである。一部の場合、ＨＡ−ＶＥＧＦ二重特異性アプタマーは下の表２に記載される配列を含む。
【表２】
2019508405.tif 000019
【００７５】
一部の場合、治療薬は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）、またはそのいずれかと関連するシグナル伝達経路の阻害剤である。一部の場合、治療薬は抗ＰＤＧＦアプタマーまたは抗体である。これらの種類の治療薬の非限定的例は、イマチニブ、イマチニブメシル酸塩、チロホスチンＡ２３、チロホスチンＡＧ１２９５、チロホスチン９、ＡＧ４９４、マシチニブ（ｍａｓｉｔｉｎｉｂ）、ＡＰ２４５３４、モテサニブ二リン酸塩、ＤＭＰＱ二塩酸塩、オキシインドールＩ、ＡＧ−３７０、ＲＧ−１３０２２、３−（４−イソプロピルベンジリデンイル）−インドリン−２−オン、チボザニブ、ＰＰ１２１、（５−ヒドロキシ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（１Ｈ−インドール−２−イル）メタノン；（５−ブタノエート−１Ｈ−２−インドリル）（１Ｈ−２−インドリル）メタノン；スニチニブリンゴ酸塩、４−（６，７−ジメトキシキナゾリン−４−イル）−Ｎ−（４−フェノキシフェニル）ピペラジン−１−カルボキサミド；セマクサニブ（ｓｅｍａｘａｎｉｂ）；パゾパニブ塩酸塩；パゾパニブ；ＰＤ１６１５７０；ドビチニブ（ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ）；チロホスチン４７；および４，４’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニルを含む。
【００７６】
一部の態様では、本開示の組成物は、抗ヒアルロナンアプタマーに連結されている抗ＰＤＧＦアプタマーを含む二重特異性アプタマーである。一部の場合、ＨＡ−ＰＤＧＦ二重特異性アプタマーは下の表３に記載される配列を含む。
【表３−１】
2019508405.tif 000020
【表３−２】
2019508405.tif 000021
【００７７】
一部の場合、治療薬は低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）の阻害剤である。一部の場合、治療薬はＨＩＦ−１の誘導性サブユニットである、ＨＩＦ−１αの阻害剤である。一部の場合、治療薬は抗ＨＩＦ−１アプタマーまたは抗体である。ＨＩＦ−１を標的にする治療薬の非限定的例は、エキノマイシン；ＢＤＤＦ−Ｉ（国際公開第０８／００４７９８号に記載されている）；Ｓ−２−アミノ−３−［４’−Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルプロピオン酸Ｎ−オキシド二塩酸塩（ＰＸ−４７８）（米国特許出願公開第２００５０４９３０９号に記載されている）；ケトミン（ｃｈｅｔｏｍｉｎ）；３−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）−１−ベンジルインダゾール（ＹＣ−Ｉ）；１０３Ｄ５Ｒ；キノカルマイシン（ｑｕｉｎｏｃａｒｍｙｃｉｎ）モノクエン酸塩およびその誘導体；３−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）−１−ベンジルインダゾール（米国特許出願公開第２００４１９８７９８号に記載されている）；ＮＳＣ−１３４７５４；ＮＳＣ−６４３７３５；ジゴキシン；ラパマイシン；２−メトキシエストラジオール；トポテカン；ＬＡＱ８２４；１７−ＡＡＧ；シクロスポリン；アクリフラビン；ドキソルビシン；ボルテゾミブ；アンホテリシンＢ；イマチニブ；イブプロフェン；エルロチニブ；ゲフィチニブならびにトラスツズマブを含んでいてもよい。
【００７８】
他の例では、治療薬は補体第二経路成分の阻害剤である。例えば、治療薬は、補体Ｄ因子、Ｐ因子、補体成分３（Ｃ３）、または補体成分５（Ｃ５）の阻害剤でもよい。一部の例では、治療薬は抗Ｄ因子または抗Ｐ因子アプタマーである。他の例では、治療薬は抗Ｄ因子または抗Ｐ因子抗体または抗体誘導体またはその断片である。補体第二経路の阻害剤は、例えば、ドライ型加齢黄斑変性および地図状萎縮を含む進行型を含む加齢黄斑変性の処置に適している可能性がある。一部の場合、治療薬はＨ因子またはＩ因子などの補体経路成分のアゴニストである。
【００７９】
一部の態様では、本開示の組成物は、抗ヒアルロナンアプタマーに連結されている抗Ｃ５アプタマーを含む二重特異性アプタマーである。一部の場合、ＨＡ−Ｃ５二重特異性アプタマーは下の表４に記載される配列を含む。
【表４】
2019508405.tif 000022
【００８０】
一部の場合、本開示のアプタマーは配列番号８〜１５のいずれか１つに従った配列を有するオリゴヌクレオチドまたは配列番号８〜１５のいずれか１つの少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含む。ＤＮＡ骨格が記載されている場合、前記ＤＮＡは、改変ＲＮＡおよび改変ＤＮＡからなる群より選択される１つまたは複数種類の核酸で置換してもよい、ならびにＲＮＡ骨格が記載されている場合、前記ＲＮＡは、改変ＲＮＡ、ＤＮＡおよび改変ＤＮＡからなる群より選択される１つまたは複数種類の核酸で置換してもよいことは理解されるべきである。
【００８１】
一部の場合、本開示のアプタマーは、本明細書に記載される任意のアプタマーと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有していてもよい。例えば、本開示のアプタマーは、表２〜４に記載される任意のアプタマーと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有していてもよい。一部の場合、本開示のアプタマーは、本明細書に記載される任意のアプタマーと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有していてもよい。例えば、本開示のアプタマーは、表２〜４に記載される任意のアプタマーと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有していてもよい。
【００８２】
治療薬は、網膜疾患を処置するために本質的にいかなる生物学的標的に向けることも可能である。生物学的標的の他の非限定的例は、アンジオポエチン−２（Ａｎｇ２）、ＩＬ−２、ＩＬ−６およびＩＬ−８を含むインターロイキン、ならびにインテグリンを含んでいてもよい。
【００８３】
治療薬の他の非限定的例は、そのいずれも本明細書に記載される組成物で使用するのに適しており：トロンビン阻害剤；抗血栓形成剤；血小板溶解剤（プラスミノーゲン活性化因子、またはＴＰＡおよびストレプトキナーゼなど）；線維素溶解剤；血管攣縮阻害剤；カルシウムチャネル遮断薬；血管拡張薬；降圧薬；凝固カスケード因子（例えば、プロテインＳ）；抗凝固化合物（例えば、ヘパリンおよびナドロパリン、または低分子量ヘパリン）；抗生物質（テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリミキシン、グラミシジン、セファレキシン、オキシテトラサイクリン、クロラムフェニコール、リファンピシン、シプロフロキサシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン、スルホンアミド、スルファジアジン、スルファセタミド、スルファメチゾール、スルフイソキサゾール、ニトロフラゾン、プロピオン酸ナトリウム、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、バンコマイシン、カナマイシン、セファロスポリン（セファロチン、セファピリン、セファゾリン、セファレキシン、セフラジン（ｃｅｐｈａｒｄｉｎｅ）、セファドロキシル、セファマンドール、セフォキシチン、セファクロル、セフロキシム、セフォニシド、セフォラニド、セフォタキシム（ｃｅｆｉｔａｘｉｍｅ）、モキサラクタム、セフチゾキシム（ｃｅｔｉｚｏｘｉｍｅ）、セフトリアキソン、セフォペラゾンなど）、ゲルダナマイシンおよび類似物などの抗菌薬；抗真菌薬（アンホテリシンＢおよびミコナゾールなど）、ならびに抗ウイルス薬（イドクスウリジントリフルオロチミジン、アシクロビル、ガンシクロビル、インターフェロン、α−メチル−Ｐ−アダマンタンメチルアミン、ヒドロキシ−エトキシメチル−グアニン、アダマンタナミン、５−ヨード−デオキシウリジン、トリフルオロチミジン、インターフェロン、アデニンアラビノシドなど）；表面糖タンパク質受容体の阻害剤；抗血小板薬（例えば、チクロピジン）；抗有糸分裂薬；微小管阻害剤；抗分泌薬；活性阻害剤；リモデリング阻害剤；アンチセンスヌクレオチド（モルフォリノホスホロジアミデートオリゴマーなど）；代謝拮抗薬；抗増殖薬（抗血管新生薬、タキソール、シロリムス（ラパマイシン）、ラパマイシンの類似物（「ラパログ」）、タクロリムス、アボット社製のＡＢＴ−５７８、エベロリムス、パクリタキセル、タキサン、ビノレルビンを含む）；抗がん化学療法薬；抗炎症薬（ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン酢酸塩、デキサメタゾン２１−リン酸塩、フルオシノロン、メドリゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン２１−リン酸塩、プレドニゾロン酢酸塩、フルオロメトロン（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈａｌｏｎｅ）、ベタメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニドなど）；非ステロイド性抗炎症薬（サリチル酸塩、インドメタシン、イブプロフェン、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、ピロキシカムなど）；抗アレルギー剤（クロモグリク酸ナトリウム、アンタゾリン、メタピリレン（ｍｅｔｈａｐｙｒｉｌｉｎｅ）、クロルフェニラミン、セチリジン（ｃｅｔｒｉｚｉｎｅ）、ピリラミン、プロフェンピリダミンなど）；抗増殖剤（１，３−シスレチノイン���など）；鬱血除去薬（フェニレフリン、ナファゾリン、テトラヒドロゾリン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒａｚｏｌｉｎｅ）など）；縮瞳薬および抗コリンエステラーゼ薬（ピロカルピン、サリチル酸塩、カルバコール、塩化アセチルコリン、フィゾスチグミン、エゼリン、ジイソプロピルフルオロリン酸塩、ホスホリンヨウ素（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｎｅ  ｉｏｄｉｎｅ）、臭化デメカリウムなど）；散瞳薬（アトロピン、シクロペントラート、ホマトロピン、スコポラミン、トロピカミド、オイカトロピン、ヒドロキシアンフェタミンなど）；交感神経模倣薬（エピネフリンなど）；抗腫瘍薬（カルムスチン、シスプラチン、フルオロウラシルなど）；免疫薬（ワクチンおよび免疫刺激薬など）；ホルモン剤（エストロゲン、エストラジオール、プロゲステロール（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｌ）、プロゲステロン、インスリン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ペプチドおよびバソプレシン視床下部放出因子など）；ベータアドレナリン遮断薬（チモロールマレイン酸塩、レボブノロールＨＣｌ、ベタキソロールＨＣｌなど）；免疫抑制薬、成長ホルモン拮抗薬、成長因子（上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、トランスフォーミング成長因子ベータ、ソマトトロピン、フィブロネクチン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）など）；炭酸脱水酵素阻害薬（ジクロルフェナミド（ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎａｍｉｄｅ）、アセタゾラミド、メタゾラミドなど）；血管新生の阻害剤（アンジオスタチン、アネコルタブ酢酸塩、トロンボスポンジン、抗ＶＥＧＦ断片などの抗ＶＥＧＦ抗体−ラニビズマブなど）；ドパミンアゴニスト；放射性治療剤；ペプチド、タンパク質、酵素；核酸および核酸断片；細胞外マトリクス成分；ＡＣＥ阻害薬；フリーラジカルスカベンジャー；キレート薬；抗酸化剤；抗ポリメラーゼ；光線力学的治療薬；遺伝子治療薬；ならびにプロスタグランジン、抗プロスタグランジン、プロスタグランジン前駆体、および同類の物などの他の治療薬を含む。
【００８４】
一部の場合、治療薬は防腐薬である。防腐薬の非限定的例は、スルファジアジン銀、クロルヘキシジン、グルタルアルデヒド、過酢酸、次亜塩素酸ナトリウム、フェノール、フェノール化合物、ヨードフォア化合物、四級アンモニウム化合物、および塩素化合物を含む。
【００８５】
一部の場合、治療薬は酵素阻害薬である。酵素阻害薬の非限定的例は、クロフォニウム（ｃｈｒｏｐｈｏｎｉｕｍ）塩化物；Ｎ−メチルフィゾスチグミン；ネオスチグミン臭化物；フィゾスチグミン硫酸塩；タクリンＨＣＬ；タクリン；１−ヒドロキシマレイン酸塩；ヨードツベルシジン；ｐ−ブロモテトラミソール；１０−（α−ジエチルアミノプロピオニル）−フェノチアジン塩酸塩；カルミダゾリウム塩化物；ヘミコリニウム−３，３，５−ジニトロカテコール；ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤１；ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤ＩＩ；３−フェニルプロパルギルアミン；Ｎ−モノメチル−Ｌ−アルギニン酢酸塩；カルビドパ；３−ヒドロキシベンジルヒドラジンＨＣｌ；ヒドラジンＨＣｌ；クロルジリンＨＣｌ；デプレニルＨＣｌ；Ｌ（−）デプレニルＨＣｌ；イプロニアジドリン酸塩；６−ＭｅＯ−テトラヒドロ−９Ｈ−ピリド−インドール；ニアラミド；パルギリンＨＣｌ；キナクリンＨＣｌ；セミカルバジドＨＣｌ；トラニルシプロミンＨＣｌ；Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル−２，２−ジフェニル吉草酸塩酸塩；３−イソブチル−１−メチルキサンチン；パパベリンＨＣｌ、インドメタシン；２−シクロオクチル−２−ヒドロキシエチルアミン塩酸塩；２，３−ジクロロ−α−メチルベンジルアミン（ＤＣＭＢ）；８，９−ジクロロ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンザゼピン塩酸塩；ｐ−アミノグルテチミド；ｐ−アミノグルテチミド酒石酸塩；Ｒ（＋）ｐ−アミノグルテチミド酒石酸塩；Ｓ（−）３−ヨードチロシン；アルファ−メチルチロシン；Ｌ（−）アルファメチルチロシン；Ｄ，Ｌ（−）セタゾラミド；ジクロロフェナミド；６−ヒドロキシ−２−ベンゾチアゾールスルフォンアミド；およびアロプリノールを含む。
【００８６】
一部の場合、治療薬は解熱薬または抗炎症性薬である。解熱薬または抗炎症性薬の非限定的例は、アスピリン（サリチル酸）、インドメタシン、ナトリウムインドメタシン三水和物、サリチルアミド、ナプロキセン、コルヒチン、フェノプロフェン、スリンダク、ジフルニサル、ジクロフェナク、インドプロフェンおよびサリチルアミドナトリウムを含む。
【００８７】
一部の場合、治療薬は局所麻酔薬、例えば、局在領域で麻酔効果がある物質である。局所麻酔薬の非限定的例は、プロカイン、リドカイン、テトラカインおよびジブカインを含む。
【００８８】
医薬組成物
本明細書の組成物は網膜疾患の処置のための任意の数の医薬組成物を含むことができる。医薬組成物は、本明細書に記載される任意の組成物（例えば、１つまたは複数の硝子体成分結合性部分にコンジュゲートされた治療薬）の治療有効量を含むことができる。用語「治療有効量」とは、被験体において治療的または所望の応答を誘発する組成物の量をいう。医薬組成物は任意の数の賦形剤、ビヒクルまたは担体をさらに含むことができる。例えば、医薬組成物は、有効量の組成物を単独でまたは１つもしくは複数のビヒクル（例えば、薬学的に許容される組成物または、例えば、薬学的に許容される担体）と組み合わせて含むことができる。賦形剤はあらゆる全ての溶媒、滑沢剤、保存剤、希釈剤、およびビヒクル（または担体）を含んでいてもよい。一般に、賦形剤は本明細書に記載される組成物と適合する。医薬組成物は、湿潤または乳化剤などの非毒性補助物質、ｐＨ緩衝剤、ならびに、例えば、酢酸ナトリウムおよびトリエタノールアミンオレイン酸塩などの他の物質を少量含有していてもよい。
【００８９】
本明細書の医薬組成物は一般に、硝子体に注射により投与してもよい（すなわち、硝子体内（ＩＶＴ）投与）。ＩＶＴ投与は、片方の目のみが網膜疾患に冒されている場合は片方の目に、両方の目が冒されている場合は両方の目に行ってよい。本明細書の医薬組成物は、硝子体内投与に適している製剤でよい。例えば、医薬組成物は、硝子体への注射のために液体製剤で調製することができる。
【００９０】
本明細書で提供される液体製剤は、低粘度、例えば、硝子体内注射に適している粘度を有していてよいが、比較的高濃度のアプタマーまたは二重特異性アプタマー（例えば、５ｍｇ／ｍｌ超、１０ｍｇ／ｍｌ超、２０ｍｇ／ｍｌ超、３０ｍｇ／ｍｌ超、４０ｍｇ／ｍｌ超、８０ｍｇ／ｍｌ超、１００ｍｇ／ｍｌ超、１５０ｍｇ／ｍｌ超、またはそれよりも高い）を含有していてもよい。特定の例では、本明細書で提供される液体製剤は、硝子体内投与のために製剤化された場合、３０ｍｇ／ｍｌを超える濃度のアプタマーまたは二重特異性アプタマーを有していてもよい。本明細書で提供される剤形の動的粘度（または濃度）は、５０μＬ容積で製剤化され１／２インチ２７ゲージ針で投与される場合、約３８，８００センチポイズから約１９４，１００センチポイズ、約９７，０００センチポイズから約４８５，５００センチポイズ、または約１９４，１００センチポイズから約９７０，８００センチポイズでもよい。例えば、本明細書で提供される剤形の動的粘度（または濃度）は、５０μＬ容積で製剤化され１／２インチ２７ゲージ針で投与される場合、約２５，０００；５０，０００；７５，０００；１００，０００；１５０，０００；２００，０００；２５０，０００；３００，０００；３５０，０００；４００，０００；４５０，０００；５００，０００；５５０，０００；６００，０００；６５０，０００；７００，０００；７５０，０００；８００，０００；８５０，０００；９００，０００；９５０，０００；または１，０００，０００でもよい。本明細書で提供される剤形の動的粘度（または濃度）は、５０μＬ容積で製剤化され１／２インチ３０ゲージ針で投与される場合、約１３，１００センチポイズから約６５，０００センチポイズ、約３２，７００センチポイズから約１６４，０００センチポイズ、または約６５，０００センチポイズから約３２５，０００センチポイズでもよい。例えば、本明細書で提供される剤形の動的粘度（または濃度）は、５０μＬ容積で製剤化され１／２インチ３０ゲージ針で投与される場合、約１０，０００；２０，０００；３０，０００；４０，０００；５０，０００；６０，０００；７０，０００；８０，０００；９０，０００；１００，０００；１５０，０００；２００，０００；２５０，０００；３００，０００；または３５０，０００センチポイズでもよい。同様に、本明細書で提供される剤形の動的粘度（または濃度）は、５０μＬ容積で製剤化され１／２インチ３３ゲージ針で投与される場合、約２，８００センチポイズから約１４，５００センチポイズ、約７，３００センチポイズから約３６，５００センチポイズ、または約１４，５００センチポイズから約７５，０００センチポイズでもよい。例えば、本明細書で提供される剤形の動的粘度（または濃度）は、５０μＬ容積で製剤化され１／２インチ３３ゲージ針で投与される場合、約２，０００；３，０００；４，０００；５，０００；６，０００；７，０００；８，０００；９，０００；１０，０００；１５，０００；２０，０００；２５，０００；３０，０００；３５，０００；４０，０００；４５，０００；５０，０００；５５，０００；６０，０００；６５，０００；７０，０００；または７５，０００センチポイズでもよい。一部の場合、本明細書で提供される液体製剤は事前充填注射器で製剤化される。一部の場合、液体製剤は１０μＬ、２０μＬ、３０μＬ、４０μＬ、５０μＬ、６０μＬ、７０μＬ、８０μＬ、９０μＬ、１００μＬまたは１００μＬよりも大きい容積で製剤化される。
【００９１】
本明細書に記載される医薬組成物の送達に適した他の製剤は、眼疾患の処置中に移植される、生分解性マイクロサイズポリマー系、例えば、マイクロデバイス、マイクロ粒子、もしくはスポンジ、または他の緩徐放出経強膜デバイスの外科移植による、あるいは眼科送達デバイス、例えば、ポリマーコンタクトレンズ持続性送達デバイスによる、徐放性ゲルまたはポリマー製剤を含んでいてもよい。一部の場合、製剤はポリマーゲル、自己組織化ゲル、耐久性植込物、溶出性植込物、生分解性マトリクスまたは生分解性ポリマーである。一部の場合、製剤は、眼の表面から後側まで組成物を駆動するのに電流を使用するイオン導入により投与することができる。一部の場合、製剤は、硝子体内レザバ、硝子体外レザバまたはその組み合わせを用いて外科的に移植されたポートにより投与することができる。植込み型眼科デバイスの例は、限定せずに、Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂが開発したＤｕｒａｓｅｒｔ（商標）技術、Ｏｎ  Ｄｅｍａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓが開発したＯＤＴｘデバイス、ＦｏｒＳｉｇｈｔ  ＶＩＳＩＯＮ４が開発したＰｏｒｔ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、およびＲｅｐｌｅｎｉｓｈ，Ｉｎｃ．が開発したＲｅｐｌｅｎｉｓｈ  ＭｉｃｒｏＰｕｍｐ（商標）Ｓｙｓｔｅｍを含むことが可能である。一部の場合、ナノテクノロジーを使用すれば、ナノスフェア、ナノ粒子、ナノカプセル、リポソーム、ナノミセルおよびデンドリマーを含む医薬組成物を送達することが可能である。
【００９２】
本明細書で提供される製剤は、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１１０ｍｇ／ｍｌ、１２０ｍｇ／ｍｌ、１３０ｍｇ／ｍｌ、１４０ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度の本明細書に提供される組成物（例えば、二重特異性アプタマー）を含有していてもよい。本明細書で提供される製剤は、少なくとも５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭまたは１０ｍＭを超える濃度の本明細書に提供される組成物（例えば、二重特異性アプタマー）を含有していてもよい。一部の場合、製剤は、比較的低い全容積が眼に投与される場合であっても、被験体が単回投与で治療有効用量を受けるように、被験体に投与される。一部の場合、治療有効用量（例えば、２ｍｇよりも多い、３ｍｇよりも多い、５ｍｇよりも多い、１０ｍｇよりも多い、２０ｍｇよりも多い、またはそれよりも多い）は、１５μｌから約１００μｌ、例えば、１５μｌ、２５μｌ、３０μｌ、４０μｌ、５０μｌ、６０μｌ、７０μｌ、８０μｌ、９０μｌ、１００μｌの全容積で被験体に投与される。一部の場合、全容積は１５０μｌ未満、１２５μｌ未満、１００μｌ未満、９０μｌ未満、８０μｌ未満、７０μｌ未満、６０μｌ未満、５０μｌ未満、４０μｌ未満、３０μｌ未満、または２０μｌ未満である。
【００９３】
本明細書に記載される治療薬は、１つまたは複数の硝子体成分結合性部分にコンジュゲートすることにより、その非コンジュゲート対応物と比べた場合、改良された硝子体内半減期を示すことができる。したがって、これらの治療薬を含む医薬組成物は、非コンジュゲート治療薬よりも少ない頻度での投与しか必要としない可能性がある。本明細書の医薬組成物は、毎週１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、５週ごとに１回、６週ごとに１回、７週ごとに１回、８週ごとに１回、９週ごとに１回、１０週ごとに１回、１１週ごとに１回、１２週ごとに１回、４ヶ月毎に１回、５ヶ月毎に１回、６ヶ月毎に１回、７ヶ月毎に１回、８ヶ月毎に１回、９ヶ月毎に１回、１０ヶ月毎に１回、１１ヶ月毎に１回、１２ヶ月毎に１回または年１回未満でさえ投与することが可能である。
【００９４】
一部の態様では、治療有効量の組成物が投与される。「治療有効量」または「治療有効用量」は本明細書では互換的に使用され、被験体において治療的または所望の応答を誘発する治療薬の量を指す。一部の場合、治療的または所望の応答とは疾患または障害に付随する１つまたは複数の症状の軽減をいう。一部の場合、治療的または所望の応答とは疾患または障害の予防的処置である。医薬組成物は、被験体に治療上の利益をもたらすのに十分な用量で投与することができる。用量は、使用するために選択される治療薬および硝子体成分結合性部分を含む種々の要因に応じて変動してもよい。一部の場合、本明細書に記載されるコンジュゲートされた治療薬の治療有効量は、本明細書の組成物が、より長いＩＶＴ半減期または平均滞留時間を有し得るので、非改変または非コンジュゲート治療薬よりも少なくてもよい。一部の場合、本開示の組成物は、眼あたり約１５μｌから約１００μｌの容積中約０．１ｍｇから約５０ｍｇまでの範囲の量で投与される。
【００９５】
本明細書に記載される組成物は、１つまたは複数の追加の治療薬と共に投与してもよい。１つまたは複数の追加の治療薬は、本明細書に記載される硝子体成分結合性部分にコンジュゲートされていてもよく、またはコンジュゲートされていなくてもよい。１つまたは複数の追加の治療薬は、全体を通じて記載される治療薬から選択してもよく、本明細書に提供される組成物と組み合わせて増強するまたは相乗的に作用してもよい。
【００９６】
適応症
本明細書に記載される組成物はそれを必要とする被験体に投与される。一部の場合、それを必要とする被験体は眼疾患に罹っている患者である。一部の場合、眼疾患は網膜疾患である。本明細書に記載される組成物および方法を使用する処置に適している眼疾患および／または網膜疾患の非限定的例は、アレルギー性または巨大乳頭性結膜炎を含む、炎症性結膜炎、黄斑浮腫、ぶどう膜炎、眼内炎、強膜炎、角膜潰瘍、ドライアイ症候群、緑内障、虚血性網膜疾患、角膜移植拒絶、眼内レンズ挿入術などの眼内手術に関連する合併症および白内障手術に付随する炎症、ベーチェット病、シュタルガルト病、免疫複合体幹脈管炎、フックス病（Ｆｕｃｈ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、フォークト・小柳・原田症候群、網膜下線維症、角膜炎、硝子体網膜炎症、眼の寄生生物の外寄生／移行、網膜色素変性症、サイトメガロウイルス網膜炎、脈絡膜炎症、眼瞼外反、兎眼、眼瞼皮膚弛緩症、眼瞼下垂、瞼の黄色板腫、瞼の寄生生物の外寄生、瞼の皮膚炎、涙腺炎、流涙症、甲状腺異常眼球突出（ｄｙｓｔｈｙｒｏｉｄ  ｅｘｏｐｈｔｈａｌｍｏｓ）、結膜炎、強膜炎、角膜炎、角膜潰瘍、角膜擦過傷、雪眼炎、アーク眼（ａｒｃ  ｅｙｅ）、タイゲソン表層性点状角膜症（Ｔｈｙｇｅｓｏｎ’ｓ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｐｕｎｃｔａｔｅ  ｋｅｒａｔｏｐａｔｈｙ）、角膜血管新生、フックスジストロフィー、円錐角膜、乾性角結膜炎、虹彩炎、ぶどう膜炎、交感性眼炎、白内障、脈絡網膜性炎症、限局性脈絡網膜性炎症（ｆｏｃａｌ  ｃｈｏｒｉｏｒｅｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、限局性脈絡網膜炎（ｆｏｃａｌ  ｃｈｏｒｉｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）、限局性脈絡膜炎、限局性網膜炎、限局性網脈絡膜炎（ｆｏｃａｌ  ｒｅｔｉｎｏｃｈｏｒｏｉｄｉｔｉｓ）、播種性脈絡網膜性炎症、播種性脈絡網膜炎、播種性脈絡膜炎、播種性網膜症、播種性網脈絡膜炎、滲出性網膜炎、後側毛様体炎（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｃｙｃｌｉｔｉｓ）、毛様体扁平部炎、原田病、脈絡網膜性瘢痕、後極の黄斑瘢痕（ｍａｃｕｌａ  ｓｃａｒｓ）、日光網膜症、脈絡膜変性、脈絡膜萎縮症、脈絡膜硬化症、網膜色素線条症、遺伝性脈絡膜ジストロフィー、全脈絡膜萎縮、脈絡膜ジストロフィー（中心輪紋状（ｃｅｎｔｒａｌ  ａｒｅａｌｏｒ））、脳回転状萎縮症（脈絡膜）、オルニチン血症（ｏｒｎｉｔｈｉｎａｅｍｉａ）、脈絡膜出血および破裂、脈絡膜出血（別途指定されていない場合）、脈絡膜出血（排出性）、脈絡膜剥離、網膜分離症、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、高血圧性網膜症、糖尿病性網膜症、網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、標的黄斑症、網膜上膜、末梢性網膜変性症、遺伝性網膜ジストロフィー、網膜色素変性症、網膜出血、網膜層の分離、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、黄斑浮腫、緑内障−視神経症、緑内障疑い−高眼圧症、原発開放隅角緑内障、原発閉塞隅角緑内障、飛蚊症、レーバー遺伝性視神経症、視神経乳頭ドルーゼン、斜視、眼麻痺、進行性外眼筋麻痺、内斜視、外斜視、屈折および調節の障害、遠視、近視、乱視（ａｓｔｉｇｍａｓｔｉｓｍ）、不同視、老視、内眼筋麻痺、弱視、レーバー先天性黒内障、暗点、失明（ａｎｏｐｓｉａ）、色盲、色覚異常、マスクン（ｍａｓｋｕｎ）、夜盲症、盲目���河川盲目症、小眼球症（ｍｉｃｒｏｐｔｈａｌｍｉａ）、コロボーマ、目の充血（ｒｅｄ  ｅｙｅ）、アーガイル・ロバートソン瞳孔、角膜真菌症、眼球乾燥症、無虹彩症、鎌状赤血球網膜症、眼血管新生、網膜血管新生、網膜下血管新生；虹彩ルベオーシス炎症性疾患（ｒｕｂｅｏｓｉｓ  ｉｒｉｔｉｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、慢性後部および汎ぶどう膜炎、新生物、網膜芽細胞腫、偽神経膠腫、血管新生緑内障；併用硝子体切除−２と水晶体切除に続いて生じる血管新生、血管疾患、網膜虚血、脈絡膜血行不全（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）、脈絡膜血栓症、視神経の血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、嚢胞様黄斑浮腫、増殖性硝子体網膜症、ならびに眼の貫入または眼科傷害に起因する血管新生を含む。
【００９７】
一部の場合、医薬組成物を使用すれば網膜疾患を処置することが可能である。一部の場合、網膜疾患は加齢黄斑変性である。一部の場合、網膜疾患は滲出（「ウェット」）型の加齢黄斑変性である。一部の場合、網膜疾患は非滲出（「ドライ」）型の加齢黄斑変性である。一部の場合、網膜疾患は、地図状萎縮などの進行型の加齢黄斑変性である。例えば、地図状萎縮の処置のための医薬組成物は、硝子体成分結合性部分にコンジュゲートされた補体Ｄ因子またはＰ因子を標的にする治療薬を含むことができる。
【００９８】
一部の場合、医薬組成物を使用すれば糖尿病性黄斑浮腫を処置することが可能である。一部の場合、医薬組成物を使用すれば糖尿病性網膜症を処置することが可能である。一部の場合、医薬組成物を使用すれば網膜静脈閉塞症を処置することが可能である。一部の場合、医薬組成物を使用すればぶどう膜炎を処置することが可能である。
【実施例】
【００９９】
以下の例は本発明の種々の実施形態を説明する目的で与えられ、本発明をいかなる形でも限定することを意図していない。本実施例は、本明細書に記載される方法と一緒に、目下、好ましい実施形態を表しており、見本であり、本発明の範囲を限定する物として意図されていない。特許請求の範囲により定義される本発明の精神内に包含されるその中での変更および他の使用は当業者であれば浮かぶであろう。
【０１００】
（実施例１  ヒアルロン酸（ＨＡ）に対するアプタマーの同定）
標準ＤＮＡアプタマーの選択は、表５に列挙されているＤＮＡライブラリー（配列番号１）を使用してヒアルロン酸（ＨＡ）ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）分子量０．６〜１．１ＭＤａに対して行った。選択の全１２ラウンドのうちラウンド３で始めて、オオムギ由来のβ−Ｄ−グルカン、分子量４８５ＫＤａを、ＨＡに特異的なアプタマーの選択を促進するための事前の排除（ｐｒｅ−ｃｌｅａｒｉｎｇ）ステップで使用した。選択は、硝子体環境を模倣し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１２０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２および５ｍＭのＫＣｌからなる塩緩衝液で行った。
【表５】
2019508405.tif 000023
【０１０１】
選択のラウンド９〜１２は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のために提出され、得られた配列データを解析して、ラウンド９から１０、１０から１１および１１から１２の配列ごとに、頻度の増加として定義される、最も高い濃縮率を有する配列を同定した。全体のアプタマー集団と比べて高い濃縮率を示した配列は、表５に列挙されるアプタマー２、４および６（配列番号２、４および６）を含んでいた。
【０１０２】
ＨＡに対するアプタマー２、４および６、ならびにこれらのアプタマーの無作為領域由来部分のみからなる関連するアプタマー３、５および７（配列番号３、５および７）の親和性は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した。手短に言えば、ビオチン−ＨＡ（２０ＫＤａ）を高密度Ｃ７デキストランチップ上に固定化し、アプタマーを、１０℃、２５μＭから０．３９ｎＭまでの範囲の濃度で、ＨＡが固定された表面および対照のＨＡを含有しない表面上に流した。ＨＡ結合タンパク質ＴＳＧ−６およびアグリカンは、ＳＰＲアッセイにおいて特異的ＨＡ結合の対照としての役目を果たした。ＨＡを含有しない表面上に流した場合、アプタマー、ＴＳＧ−６またはアグリカンについてバックグランドより上の共鳴は観測されなかった。ＨＡ固定化表面についての得られたＳＰＲシグナルは、１対１結合モデルを仮定して解析され、アプタマー２〜７に対する親和性が決定された（表６）。ＨＡに対する表６に提示されているアプタマーの親和性は、アプタマー長の減少、デオキシリボース上の２’位、ピリミジンの５位またはプリンヌクレオチドの８位への化学修飾によりさらに改良される可能性がある。
【表６】
2019508405.tif 000024
【０１０３】
アプタマーのそれぞれは、アプタマー４の例外はあるが、ＳＰＲにより決定した場合、３０から４０μＭの見かけの親和性（ＫＤ）でＨＡに結合した。選択は、５’および３’固定領域を遮断して行われたので、一部の完全長配列はＨＡに結合せず、無作為領域由来のアプタマーはＨＡに結合できると予想されるが、これは、アプタマー５が由来した完全長配列による見かけＨＡ結合の非存在下でアプタマー５がＨＡに結合するのが観測されたことを説明している。
【０１０４】
（実施例２  ＨＡアプタマーの眼での保持）
後眼部の疾患の処置は、治療薬が、許容できる投与間隔で有用な持続期間の標的抑制を送達するのに十分な期間治療濃度で眼の後区間（すなわち、硝子体液）で保持され、同時に治療効果をもたらすのに十分な標的占有を提供するため疾患組織内の標的まで十分に拡散することもできる必要がある。網膜疾患では、治療薬は一般に、硝子体−網膜境界を通って拡散し疾患組織の意図された標的に接近しなければならず、特異的適応症に応じて、疾患部位の意図された標的に到達するために網膜色素上皮（ＲＰＥ）層に達することを含めて、網膜組織に深く浸透する必要がある場合がある。硝子体内投与後の硝子体での薬物の保持時間または半減期は、薬物代謝と関連する硝子体からの薬物のクリアランスの関数である。類似の代謝速度を有する治療薬では、クリアランス速度は、十分な濃度および半減期を達成する治療薬の能力に最大の影響を及ぼす（ｄｅｌ  Ａｍｏ，  Ｅ．Ｍ、Ｋ．−Ｓ．  Ｖｅｌｌｏｎｅｎ、Ｈ．  Ｋｉｄｒｏｎ、およびＡ．  Ｕｒｔｔｉ、２０１５年、Ｅｕｒ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、９５巻：２１５〜２２６頁）。硝子体からのクリアランスの速度は分子サイズの関数であり、より小さく、より低分子量の分子ほど、より高分子量の分子に比べて迅速に排除される（Ｓｈａｔｚ，  Ｗ．、Ｐ．Ｅ．  Ｈａｓｓ、Ｍ．  Ｍａｔｈｉｅｕ、Ｈ．Ｓ．  Ｋｉｍ、Ｋ．  Ｌｅａｃｈ、Ｍ．  Ｚｈｏｕ、Ｙ．  Ｃｒａｗｆｏｒｄ、Ａ．  Ｓｈｅｎ、Ｋ．  Ｗａｎｇ、Ｄ．Ｐ．  Ｃｈａｎｇ、Ｍ．  Ｍａｉａ、Ｓ．Ｒ．  Ｃｒｏｗｅｌｌ、Ｌ．  Ｄｉｃｋｍａｎ、Ｊ．Ｍ  ＳｃｈｅｅｒおよびＲ．Ｆ．  Ｋｅｌｌｅｙ、２０１６年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、１３巻：２９９６〜３００３頁）。例えば、＜５０ＫＤａの分子はウサギの眼では３日またはそれよりも短い半減期を有することがあるが、＞８０ＫＤａの分子量を有する分子はウサギの眼では６日またはそれよりも長い半減期を示すことがある（Ｓｈａｔｚ，  Ｗ．ら、２０１６年）。
【０１０５】
網膜に浸透し網膜組織で標的操作に従事する分子の能力も、分子サイズの関数であり、分子量が低い分子ほど、分子量が大きい分子に比べてより大きい網膜浸透を示す（Ｐｉｔｋａｅｎｅｎ，  Ｌ．、Ｖ．−Ｐ．  Ｒａｎｔａ、Ｈ．  Ｍｏｉｌａｎｅｎ、およびＡ．  Ｕｒｔｔｉ、２００５年、Ｉｎｖ．  Ｏｐｈｔｈ  ａｎｄ  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ、４６巻：６４１〜６４６頁）。これの古典的な例が、分子量約５０ＫＤａのＦａｂ抗体断片による網膜浸透の比較であり、この抗体断片は、分子量約１５０ＫＤａの完全長ｍＡｂ（これは、内境界膜を越えての網膜中での乏しい拡散を示す）と比べた場合、網膜組織に容易に深く浸透し、有効にＲＰＥに到達する（Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，  Ｊ．、Ａ．  Ｃｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎ、Ｎ．  Ｆｅｒｒａｒａ、Ｋ．  Ｔｈｏｍｓｅｎ、Ｌ．  Ｂｅｒｌｅａｕ、Ｖ．  Ｌｉｃｋｏ、Ｐ．Ｃ．  Ａｌｌｅｎ、Ｃ．Ｒ．、Ｖａｌｖｅｒｄｅ、Ｙ．Ｇ．  Ｍｅｎｇ、Ｄ．Ｔ．Ｗ．  Ｆｅｉ、Ｋ．Ｍ．  Ｆｏｕｒｒｅ、およびＡ．Ｍ．  Ｒｙａｎ、１９９９年、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２７巻：５３６〜５４４頁）。アプタマーは、密集した形状で８〜１５ＫＤａの範囲の典型的分子量を有し、網膜浸透には理想的な分子量であるが、その低分子サイズおよび分子量のせいで硝子体から迅速に排除される。硝子体保持を増加するため、アプタマーは高分子量のＰＥＧ（例えば、４０ＫＤａまたはそれよりも大きい）にコンジュゲートしてもよく、このＰＥＧはその大きい流体力学半径のせいで、網膜組織に浸透するその能力を大いに損なうことなくそのクリアランス速度を低下させる。しかし、ＰＥＧは実際には薬物製剤の粘度を大幅に増加させ、これによって適切な製剤での薬物の最大濃度が制限され、このため、特に、硝子体内注射により投与可能な量がわずかであることを考慮すると、粘度が注射可能性（ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）に負わせる制限のせいで、眼に投与される潜在的最大用量を大幅に制限してしまう。
【０１０６】
治療アプタマーに連結されたＨＡアプタマーで構成された二重特異性アプタマーは２０から３０ＫＤａの分子量を有することができる。したがって、その密集したサイズと比較的低い分子量のせいで、そのような分子は網膜に容易に浸透することができるが、もっぱらそのサイズと分子量に基づいて高いクリアランス速度を示すことがある。しかし、硝子体内でのアプタマーとＨＡの間の相互作用は、硝子体成分と相互作用をしない類似の分子量のアプタマーと比べて、硝子体液でのアプタマーの拡散速度、したがって、前記アプタマーの硝子体内投与に続く眼からのクリアランス速度を減少させることができる。これを試験するため、アプタマー番号５を、その５’末端の６炭素アミンリンカーとともに合成し、ＮＨＳ−活性化蛍光色素ＶｉｖｏＴａｇ（登録商標）−Ｓ６８０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で標識し、蛍光分子トモグラフィー（ＦＭＴ）により眼において定量化することができる分子を生成した。末端アミンを有する高分子量ＰＥＧ（４０ＫＤａ分岐ＰＥＧ）を同様にＶｉｖｏＴａｇ（登録商標）−Ｓ６８０で標識して、硝子体内投与に続いてアプタマーと関連する分子の硝子体内保持を大幅に増強することが分かっている担体のベンチマークとして利用した。
【０１０７】
ラットを、それぞれの群の平均体重を全体平均の１０％内に維持するように蛍光色素標識アプタマー番号５または４０ＫＤａ  ＰＥＧの処置群に分配した。処置の日、ラットはケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（６ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射で麻酔をかけた。十分に麻酔がかかると、無菌プロパラカインＨＣｌ（０．５％）溶液を局所麻酔および無痛のために両目に局所投与した。ラットは、眼が手術用顕微鏡下で見えるように配置した。試験物は、１０μｌのガラス注射器に取り付けた３３Ｇ取り外し可能針を用いて吸い上げた。針は、毛様体の真上に強膜に対して４５度の角度で刺した。ラットには、３μｌ全容積の硝子体内投与量でＶｉｖｏＴａｇ（登録商標）−Ｓ６８０色素濃度に基づいて、０．２から２ｎモルの範囲の試験物の用量で右および左目に単回硝子体内注射を施した。注射後、針を抜き綿先端スワブを使用してあらゆる漏出物を吸収した。
【０１０８】
単回硝子体内注射に続く、時間をわたっての眼での保持は、蛍光分子トモグラフィー（ＦＭＴ）を使用して評価した。このアプローチは、連続ＦＭＴ測定を行い目的のエリアの蛍光強度を、処置された眼ごとに試験物投与後の０から５分で測定された蛍光強度に対して正規化することにより、それぞれの処置された眼に時間をわたって残っているパーセント用量の計算を可能にする。ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＦＭＴはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＦＭＴ  ２５００（商標）ＬＸ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）上で実施した。画像化の直前に、ラットは空気中２％イソフルランガス麻酔を使用して麻酔をかけ、画像化セッションを通じて２％イソフルラン下に維持された。麻酔をかけられたラットは、画像化用カセットに側臥位で置いて、確実に眼が画像化システムの走査野内に位置するようにした。それぞれのラットは、右目を画像化するには左側を横向きに、左目を画像化するには右側を横向きに配置した。次に、画像化用カセットをＦＭＴ画像化チャンバーの加熱ドッキングシステム（３７℃に調節）に挿入した。それぞれのラットは、画像化セッションを通じて２％イソフルラン麻酔下に維持された。走査領域は、蛍光走査に先立って被験体の頭部上に手動で配置された。それぞれの走査点でのレーザー出力および曝露時間は、飽和を回避しつつ高いシグナル  対  ノイズを与えるようにシステムにより自動的に調整された。全走査時間は走査ごとに約２〜４分であった。走査中、透過照明された動物の画像は、光源位置ごとに励起波長と蛍光波長の両方で捉えられた。ＦＭＴシステムの定量化精度は、近赤外色素（ＶｉｖｏＴａｇ（登録商標）−Ｓ６８０）で評価した。
【０１０９】
収集された蛍光データ画像は、眼内の蛍光シグナルの定量化のためにＦＭＴシステムソフトウェア（ＴｒｕＱｕａｎｔ（商標）；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により再構築した。目的の三次元領域（ＲＯＩ）は眼の周囲に描かれた。蛍光色素の全量（ピコモル）は、濃度が分かっている適切な蛍光色素を用いて生成される内部標準と比較して自動的に計算された。試験ごとに、用量後の時間０または５分での平均蛍光は１００％に等しく、次に、試験内のそれぞれのラットをそれに従って正規化した。
【０１１０】
０．８ｎモル用量のそれぞれの試験物の投与後時間０および４８時間でのＰＥＧと比べたアプタマー番号５の保持は表７に示されている。４８時間時点はコンパレータ時点として選択された。なぜならば、４８時間時点は、残留ＰＥＧ濃度が画像化システムでの定量化下限より上で確実に定量化できる実質的なクリアランスウインドウを提供するからである。表７に示すように、アプタマー番号５によるＨＡ結合は、４０ＫＤａのＰＥＧに匹敵する投与された硝子体内用量の保持を提供し、ＨＡへのアプタマーの結合が硝子体でのその保持時間を増加させ、それよりもはるかに大きくより高分子量のＰＥＧ担体分子の保持時間に匹敵することを実証している。アプタマー番号５の硝子体内保持は、例えば、２’Ｏメチルもしくは２’フルオロヌクレオチドでのＤＮＡヌクレオチド置換、またはホスホロチオエートおよびジチオエートなどの骨格改変の導入によりその代謝安定性を増加させることにより、さらに改良することが可能であると予想される。けれども、アプタマー番号５の硝子体内保持のさらなる改良は実施例１に記載されるなどのＨＡに対する親和性を増加させる化学置換により得られる可能性がある。
【表７】
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【０１１１】
（実施例３  二重特異性ＨＡ−ＰＤＧＦアプタマー）
本明細書の実施例は、生物学的活性を有するタンパク質、例えば、成長因子などのタンパク質に結合して阻害もし、硝子体細胞外マトリクス成分、例えば、ＨＡにも結合する分子の活性を決定するアッセイを記載している。例えば、分子は、小分子、タンパク質または核酸でもよい。一部の例では、分子は、ＰＤＧＦに直接結合して細胞増殖のＰＤＧＦ活性化を阻害し、ＨＡにも直接結合することが可能な三次元構造を形成する核酸である。
【０１１２】
一例では、ＰＤＧＦとＨＡに結合する２つの繋ぎ合わされた三次構造物を生じるように合成される連続する核酸配列上には２つの活性が存在する。別の例では、独立して合成され、次に、ＰＤＧＦとＨＡに結合する２つの繋ぎ合わされた三次構造物を生じるように化学的に連結される２つの別々の核酸配列に２つの活性が存在する。
【０１１３】
本開示は、ＰＤＧＦ依存性細胞増殖アッセイにおいて血小板由来成長因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）阻害剤の同定を提供する。ＰＤＧＦ−Ｂに直接結合してその活性を選択的に阻害する抗ＰＤＧＦアプタマー（配列番号８、表８）が開発された（Ｆｌｏｅｇｅ  Ｊ．  Ｔ．  Ｏｓｔｅｎｄｏｒｆ、Ｕ．  Ｊａｎｓｓｅｎ、Ｍ．  Ｂｕｒｇ、ＨＨ  Ｒａｄｅｋｅ、Ｃ．  Ｖａｒｇｅｅｓｅ、ＳＣ  Ｇｉｌｌ、Ｌ．Ｓ．  ＧｒｅｅｎおよびＮ．  Ｊａｎｊｉｃ、１９９９年、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ  １５４巻：１６９〜１７９頁）。一例では、抗ＰＤＧＦ結合アプタマーは固相オリゴヌクレオチド合成により合成され、続いてリンカーとしてのヘキサエチレンスペーサー、次にＨＡアプタマーが合成され、それによって硝子体内で抗ＰＤＧＦアプタマーをＨＡに繋ぎ合わせることが可能なＨＡ−ＰＤＧＦ二重特異性アプタマーを生成し、硝子体内投与に続いて低い硝子体クリアランスおよびそれによる増強された硝子体半減期を有する治療薬を生成する。
【表８】
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【０１１４】
ＨＡ結合モジュールに続いて抗ＰＤＧＦモジュールを含有するアプタマーの３つの例はアプタマー番号９（配列番号９）、１０（配列番号１０）、および１１（配列番号１１）であり、これらのアプタマーはそれぞれアプタマー番号８（表８）と組み合わされたアプタマー番号３、５および７の二重特異性体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）を含む。繋ぎ合わされた第２のドメインを有するこれらのアプタマーがＰＤＧＦ−Ｂ活性を保持していたのかどうかを決定するため、ＰＤＧＦ−Ｂ刺激された細胞増殖を阻害する能力についてアプタマー番号８と比較した（図１）。アプタマー番号９、１０および１１はすべて、アプタマー番号８に類似するＰＤＧＦ−Ｂ阻害活性を保持していた。
【０１１５】
マウス３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）でのＰＤＧＦ−Ｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ２２０−ＢＢ）による細胞増殖の刺激は、生細胞でのミトコンドリアコハク酸デヒドロゲナーゼによるＭＴＴ（Ｒｏｃｈｅ  １１−４６５−００７−００１）のホルマザン（Ｆｏｒｍｏｚａｎ）への還元により定量化した。平底９６ウェルプレートに、１００μＬのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中１５，０００  ３Ｔ３細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。細胞培地は９０μＬの予熱されたＤＭＥＭ／０．８％のＦＢＳで置き換え、細胞は３７℃で３時間インキュベートした。５μＬのアプタマーは５μＬのＰＤＧＦ−Ｂと混合して、２ｎＭの最終ＰＤＧＦ−Ｂ濃度、および８０、４０、２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５または０μＭの最終アプタマー濃度を得、それぞれのウェル中９０μＬ培地に添加した。細胞は３７℃、５％のＣＯ２で３日間インキュベートし、次に、１０μＬのＭＴＴ溶液を添加し、３７℃、５％のＣＯ２でさらに１．５時間インキュベートした。次に、培地は取り除き、２００μＬの１００％イソプロパノールをそれぞれのウェルに添加し、その後、ホルマザン形成は５７０ｎｍでのその吸光度により定量化した。
【０１１６】
本開示は、ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイにおいて、ＨＡに結合する腫瘍壊死因子刺激性遺伝子（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ）−６（ＴＳＧ−６）との競合により決定した場合のＨＡに結合する分子の同定を提供する。ＴＳＧ−６は、ＴＳＧ−６のリンクモジュールを介してＨＡに結合するタンパク質である（Ｈｉｇｍａｎ，  Ｖ．Ａ．、Ｄ．Ｃ．  Ｂｒｉｇｇｓ、Ｄ．Ｊ．  Ｍａｈｏｎｅｙ、Ｃ．Ｄ  Ｂｌｕｎｄｅｌｌ、Ｂ．Ｍ．  Ｓａｔｔｅｌｌｅ、Ｄ．Ｐ．  Ｄｙｅｒ、Ｄ．Ｅ．  Ｇｒｅｅｎ．  Ｐ．Ｌ  ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ、Ａ．  Ａｌｍｏｎｄ、Ｃ．Ｍ．  ＭｉｌｎｅｒおよびＡ．Ｊ．  Ｄａｙ、２０１４年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２８９巻：５６１９〜５６３４頁）。ＴＳＧ−６はＨＡの八糖単位に最適に結合し、これは反復二糖のＤ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからなる高分子量細胞外マトリクス多糖である（Ｈｉｇｍａｎら、２０１４年）。
【０１１７】
２０ＫＤａモノビオチン化ＨＡへの１０Ｘ−Ｈｉｓ−ＴＳＧ６の結合は、Ｍａｂ抗６Ｈｉｓ−Ｔｂクリプテートゴールド（Ｃｉｓｂｉｏ  ＃６１Ｈ１２ＴＬＡ）およびストレプトアビジン−ＸＬｅｎｔ（Ｃｉｓｂｉｏ  ＃６１１ＳＡＸＬＡ）を使用して、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）またはホモジニアス時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）により検出される。Ｔｂクリプテートタグ付抗ｈｉｓ抗体が１０Ｘ−Ｈｉｓ−ＴＳＧ６に結合し、ＸＬｅｎｔタグ付ストレプトアビジンがビオチン化ＨＡに結合すると、ＴｂクリプテートアクセプターへのＸｌｅｎｔドナーの近接により、より高いＨＴＲＦシグナルが生じる。このシグナルは２つの波長、６２０ｎｍドナー蛍光および６６５ｎｍアクセプター蛍光で測定され、アクセプターの蛍光  対  ドナーの蛍光の比が計算されて、形成される複合体の相対量を決定する。このＨＴＲＦシグナルはＨＡに結合するＴＳＧ−６の量に比例し、ＨＡへのＴＳＧ−６結合について競合するＨｉｓタグが付いていない分子はＨＴＲＦシグナルの減少を引き起こす。
【０１１８】
平底３８４ウェルプレートでは、次の試薬：抗６ＸＨｉｓ−Ｔｂクリプテートゴールド＋ＴＳＧ６＋モノビオチン標識ヒアルロナン＋最大１２５μＭのアプタマーが全容積１５μＬで、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４（１０ｍＭのリン酸緩衝液、１３７．５ｍＭのＮａＣｌ、５．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ）に添加される。室温で３０分間インキュベートした後、ストレプトアビジン−ＸＬｅｎｔが添加されＨＴＲＦシグナルが６６５／６２０ｎｍで読み取られる。
【０１１９】
一態様では、ＨＡに結合するコンフォメーションをとる核酸は、ＴＳＧ−６が同じＨＡ分子に同時に結合するのを立体的に阻害し、ＨＴＲＦシグナルが減少する。ＨＡに結合する例となる改変された核酸配列はアプタマー番号９、１０および１１であり、これらのアプタマーは１２５μＭで、ＨＡへのＴＳＧ−６結合をそれぞれ３０、３２、および２７％減少させる（表９および図２）。
【表９】
2019508405.tif 000027
【０１２０】
アプタマー番号９、１０および１１は、ＰＤＧＦ阻害ドメインとＨＡ結合ドメインを有する二重特異性分子である。実施例２においてアプタマー番号５により示された増加した硝子体内保持を考慮すると、アプタマー番号９、１０および１１は、匹敵する分子量の分子と比べて硝子体での増加した保持、したがって、硝子体内半減期およびＰＤＧＦ阻害効果の持続時間の延長を示すと予測されるＨＡ−ＰＤＧＦ二重特異性アプタマーである。
【０１２１】
（実施例４  齧歯類チャレンジモデルにおける効果のＨＡ−ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦ二重特異性アプタマー持続時間についての評価）
ＨＡ治療二重特異性アプタマーの作用持続時間は齧歯類チャレンジモデルにおいて評価することが可能である。本実施例では、ラットＰＤＧＦ−ＢＢチャレンジモデルおよびラットＶＥＧＦチャレンジモデルを使用して、ラットの眼へのそれぞれＰＤＧＦ−ＢＢまたはＶＥＧＦの硝子体内（ＩＶＴ）投与により誘導される血管漏出を減少するまたは予防するＨＡ−ＰＤＧＦＢ分子またはＨＡ−ＶＥＧＦ二重特異性アプタマーの有効性を評価した。ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＶＥＧＦ誘導血管漏出に続く眼血管漏出濃度および時間応答は、蛍光血管造影（ＦＡ）およびエバンスブルー漏出（ＥＢ）アッセイにより定量化された。ＰＤＧＦ−ＢＢチャレンジモデルでは、３０ｎｇ／眼でのＰＤＧＦ−ＢＢのＩＶＴ投与により眼に血管漏出が誘導された。ＶＥＧＦチャレンジモデルでは、１ｎｇ／眼でのＶＥＧＦのＩＶＴ投与により眼に血管漏出が誘導された。眼の血管漏出は蛍光血管造影およびエバンスブルー漏出アッセイにより評価された。これらの試験では、治療薬の効果の持続時間は、ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＶＥＧＦチャレンジの投与に先立って異なる日でのＨＡ治療二重特異性アプタマーの投与により決定することが可能である。例えば、ＨＡ治療二重特異性アプタマーは、成長因子チャレンジが投与される時点で有効量の治療薬が眼に残っているかどうかを評価するために、チャレンジの３、７、１４、２１または２８日前に投与することが可能である。治療アプタマーがＨＡアプタマーにコンジュゲートされると作用持続時間が増加することを実証するために、ペグ化されたバージョンおよび非コンジュゲートバージョンの治療アプタマーを使用する比較群を含むことも可能である。
【０１２２】
本実施例では、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＶＥＧＦチャレンジモデルを検証するため、ペグ化アプタマー番号８を使用してＰＤＧＦ−ＢＢ活性への血管漏出の依存性を決定するパイロット研究を行い、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂを使用してＶＥＧＦ療法への血管漏出の依存性を決定し、それぞれの薬剤は単独で、および組み合わせて試験した。ラットは、ケタミン／キシラジン（約７５ｍｇ／ｋｇ：１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔にかけ、ペグ化アプタマー番号８（３μＬ中７３μｇ）、または抗ＶＥＧＦ療法（１μＬ中１０μｇ）、またはペグ化アプタマー番号８および抗ＶＥＧＦ療法、または生理食塩水／ＰＢＳをラットの左および右目の硝子体内に投与した。単剤療法を受けた群では、１または３μＬの第２のＰＢＳ注射を投与して、ＰＤＧＦ＋ＶＥＧＦ処置群での複数回注射を構成した。３日目、血管漏出を１μＬの３０ｎｇ／μＬ  ＰＤＧＦ−ＢＢ、または１ｎｇ／μＬ  ＶＥＧＦ−Ａ１２１（１μＬ）または１μＬの生理食塩水で誘導した。硝子体内注射は、３０ゲージ針を有する１０または２５μＬのＨａｍｉｌｔｏｎ注射器を使用して顕微鏡下で行った。
血管漏出は蛍光眼底血管造影（ＦＡ）により評価した。蛍光眼底血管造影は、試験物またはＰＢＳの投与直前に、ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＶＥＧＦ投与直前に、ならびに用量後２４、４８，７２、および９６時間で実施した。定性的フルオレセイン漏出のスコア化では、動物はケタミン／キシラジン（約７５ｍｇ／ｋｇ：１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔にかけ、次に、網膜血管系を視覚化するために０．５ｍＬ／ｋｇ  １０％Ｎａ−フルオレセインを腹腔内に投与した。網膜の写真とビデオは、注射後１〜６分でＭｉｃｒｏｎ  ＩＩＩ眼底カメラで記録し、初期と後期血管造影図の両方を記録しスコア化した。画像評価を無作為化し、マスクされた画像は：スコア０−網膜血管からの漏出の徴候なし；スコア１−網膜血管からのフルオレセイン漏出を示唆する濁り；認知される漏出がわずかである場合、蛇行の増加を使用して１のスコアを確かめることが可能である；スコア２−網膜血管の大部分または全てにわたる明白なフルオレセイン漏出、に従って漏出についてスコア化した。ＦＡ漏出スコアは初期と後期の個々のＦＡスコアの差として決定された。図３に示すように、ペグ化アプタマー番号８単独でのまたは抗ＶＥＧＦ療法と組み合わせた投与により、ＦＡにより測定される血管漏出が減少し、このモデルでのＰＤＧＦ活性への血管漏出の依存が確認されている。同様に、図４に示すように、抗ＶＥＧＦ療法の投与により、ＦＡにより測定される血管漏出が減少し、このモデルでのＶＥＧＦ活性への血管漏出の依存性が確認されている。
【０１２３】
エバンスブルー（ＥＢ）色素はアルブミンに共有結合し、脈管構造から網膜へのアルブミン漏出の感度の良い定量的インジケーターとしての役割を果たす。深麻酔下では、無菌ヘパリン処理生理食塩水中のＥＢを尾部静脈を通じて静脈内に注射した（３０ｍｇ／ｍＬ；３０ｍｇ／ｋｇ）。１時間後、ＥＢは３７℃まで予熱して、穏やかな注射器潅流を使用して、無菌ヘパリン処理クエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）中１％パラホルムアルデヒドを使用して脈管構造の潅流を通じて洗い出し、眼球を除去し、網膜を取り除いた。ＥＢ含有量は色素抽出に続いて分光光度法により決定した。図５に示すように、ペグ化アプタマー番号８単独でのまたは抗ＶＥＧＦ療法と組み合わせてのならびに抗ＶＥＧＦ療法単独での処置は、ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＶＥＧＦにより誘導される血管漏出を量的に減少させ、それぞれのＰＤＧＦ−ＢＢおよびＶＥＧＦ活性へのこのモデルでの血管漏出の依存性をさらに実証している。
【０１２４】
治療アプタマーの治療効果の持続時間を増加するＨＡアプタマーの能力は、ラットＰＤＧＦ−ＢＢチャレンジモデルを使用して実証される。ラットは、ペグ化アプタマー番号８（３μＬ中７５μｇ）、またはＨＡ−ＰＤＧＦ二重特異性アプタマー番号９（３μＬ中７５μｇ）またはＰＢＳでの処置に割り当てられる。処置ごとに、ラットの群は、３０ｎｇのＰＤＧＦ−ＢＢの投与の２８、２１、１４、７または３日前にペグ化アプタマー番号８またはアプタマー番号９またはＰＢＳで処置される。次に、血管漏出は上記の通りに決定される。ＰＤＧＦ−ＢＢチャレンジの３日前に処置される群では、ペグ化アプタマー番号８および番号９は匹敵する有効性を示す。７または１４日目に処置される群では、アプタマー番号９は、ペグ化アプタマー番号８で処置された動物よりも有意に大きい治療効果を示しており、ＰＥＧへのコンジュゲーションと比べた場合、ＨＡアプタマーへの治療アプタマーのコンジュゲーションにより与えられる治療効果の持続時間が増加していることを実証している。同様に、ペグ化アプタマー番号８の治療効果がないのに比べて、アプタマー番号９の一部の治療効果は、２１および２８日用量群では持続する。
【０１２５】
治療アプタマーの治療効果の持続時間を増加するＨＡアプタマーの能力は、ラットＶＥＧＦチャレンジモデルを使用して実証される。ラットは、ペグ化アプタマー番号１２（３μＬ中５μｇ）、またはＨＡ−ＶＥＧＦ二重特異性アプタマー番号１３（３μＬ中５μｇ）またはＰＢＳでの処置に割り当てられる。処置ごとに、ラットの群は、１ｎｇのＶＥＧＦ−Ａ１６５の投与の２８、２１、１４、７または３日前にペグ化アプタマー番号１２またはアプタマー番号１３またはＰＢＳで処置される。次に、血管漏出は上記の通りに決定される。ＶＥＧＦチャレンジの３日前に処置される群では、ペグ化アプタマー番号１２および番号１３は匹敵する有効性を示す。７または１４日目に処置される群では、アプタマー番号１３は、ペグ化アプタマー番号１２で処置された動物よりも有意に大きい治療効果を示しており、ＰＥＧへのコンジュゲーションと比べた場合、ＨＡアプタマーへの治療アプタマーのコンジュゲーションにより与えられる治療効果の持続時間が増加していることを実証している。同様に、ペグ化アプタマー番号１２の治療効果がないのに比べて、アプタマー番号１３の一部の治療効果は、２１および２８日用量群では持続する。
【０１２６】
（実施例５  ＨＡ−ＰＤＧＦ二重特異性アプタマーを用いたウェット型加齢黄斑変性（ｗＡＭＤ）の処置）
４０ＫＤａ  ＰＥＧ（Ｅ１００３０）にコンジュゲートされたアプタマー番号８は、ＰＤＧＦの実証された強力な阻害および抗ＶＥＧＦ療法と組み合わせたウェット型加齢黄斑変性（ｗＡＭＤ）の処置についての第２相試験での臨床的有効性を有する抗ＰＤＧＦ−Ｂアプタマーである。しかし、ｗＡＭＤの処置についての第３相試験では、Ｅ１００３０は抗ＶＥＧＦ標準治療に加えられた場合、抗ＶＥＧＦ標準治療単独を超える改良を示せなかった。本実施例では、Ｅ１００３０のアプタマー成分である、アプタマー番号８を固相合成によりアプタマー番号３に繋ぎ合わせてＨＡ結合ドメインとＰＤＧＦ阻害ドメインからなる二重特異性アプタマーを生成してアプタマー番号９を得る。その分子量はおおよそ２２，７５０Ｄａであった（表８）。代わりに、アプタマー番号３をＣ６−ジスルフィドリンカーを用いて生成し、先ずアプタマー番号８をマレイミド−ＰＥＧ８−ＮＨＳリンカーと反応させ、続いてアプタマー番号３上のジスルフィドを還元してマレイミド−ＰＥＧ８−Ｃ６−アプタマー番号８と反応させることによりアプタマー番号８にコンジュゲートして、ＰＥＧ８リンカーを介してアプタマー番号８の５’末端に繋ぎ合わされたアプタマー番号３の５’末端からなる二重特異性構築物を生成した。
【０１２７】
Ｅ１００３０は、オリゴヌクレオチド分子量に基づいて３０ｍｇ／ｍＬの濃度で等張中性ｐＨ製剤として提示され、２７ゲージ針により最大用量１．５ｍｇ／眼の５０μＬの容積で硝子体内に投与される。Ｅ１００３０の最大用量は、薬物製品溶液の粘度により、２７ゲージ針による５０μＬ注射容積中１．５ｍｇに制限される。Ｅ１００３０を用いてより高いゲージの針を使用すれば投与可能な最大用量はさらに減少すると考えられる。これとは対照的に、一実施形態では、アプタマー番号９は、５０μＬ注射容積中５ｍｇの用量で２７〜３３ゲージ針により投与可能な事前充填注射器中１００ｍｇ／ｍｌの濃度で提示される。本明細書で提供される剤形の動的粘度（または濃度）は、１／２インチ２７ゲージ針の付いた５０μＬ事前充填注射器で製剤化される場合、約３８，８００センチポイズから約１９４，１００センチポイズ、約９７，０００センチポイズから約４８５，５００センチポイズ、または約１９４，１００センチポイズから約９７０，８００センチポイズでもよい。本明細書で提供される剤形の動的粘度（または濃度）は、１／２インチ３０ゲージ針の付いた５０μＬ事前充填注射器で製剤化される場合、約１３，１００センチポイズから約６５，０００センチポイズ、約３２，７００センチポイズから約１６４，０００センチポイズ、または約６５，０００センチポイズから約３２５，０００センチポイズでもよい。同様に、本明細書で提供される剤形の動的粘度（または濃度）は、１／２インチ３３ゲージ針の付いた５０μＬ事前充填注射器で製剤化される場合、約２，８００センチポイズから約１４，５００センチポイズ、約７，３００センチポイズから約３６，５００センチポイズ、または約１４，５００センチポイズから約７５，０００センチポイズでもよい。別の実施形態では、Ｅ１００３０と比べてアプタマー番号９の粘度が低いことを考慮すると、２００から２５０ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える提示は、５０μＬ注射容積中１０から１５ｍｇまたはそれよりも多い用量を提供するため２７〜３３ゲージ針で投与するのに十分低い粘度を有すると予想される。一般に、ＨＡアプタマー結合モジュールにコンジュゲートされたアプタマーは、ｐＨ７．４もしくはほぼ７．４の希釈リン酸緩衝液（例えば、５から１０ｍＭホスフェートの範囲で）で、またはｐＨ７．４もしくはほぼ７．４に調整された純水で製剤化される。緩衝塩を含む添加物は、ＵＳＰおよびＦＤＡからの最近の公布によれば、たとえ使用したとしても、控えめなら使用してもよい。
【０１２８】
アプタマー番号９などの治療アプタマーの提示は、Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）、Ｆｏｖｉｓｔａ（登録商標）およびＺｉｍｕｒａ（登録商標）で使用される分岐４０ＫＤａ  ＰＥＧなどの高分子量ＰＥＧにコンジュゲートされた同じアプタマーと比べて、硝子体内投与に好ましい提示を提供すると予想される。アプタマーへのＰＥＧのコンジュゲーションは硝子体内半減期を延長するという所望の効果を与えるが、このコンジュゲーションは実質的には溶液の粘度にも寄与する。ＰＥＧは周知の剪断増粘剤（ｓｈｅａｒ  ｔｈｉｃｋｅｎｅｒ）であり、これは所与の濃度の溶液の粘度が、固定されたパラメータではなく、その溶液に適用される剪断力の増加と共に増加することを意味する。この現象はペグ化されたアプタマーの投与に重大な限界をもたらす。なぜならば、投与溶液の濃度と薬物を投与するのに使用される針の直径の間には妥協を成立させなければならないからである。ＨＡアプタマーへの治療アプタマーのコンジュゲーション（ＨＡ−治療アプタマー二重特異性体）は、ずり増粘に遭遇せずに薬物製品の必要な臨床濃度を達成する機会を与える。さらに、ＨＡ−治療アプタマー二重特異性体のより低い全体サイズおよび分子量は、４０キロダルトンＰＥＧにコンジュゲートされたアプタマーの約４０％にすぎない。したがって、ＨＡ−治療アプタマー二重特異性体は、匹敵するペグ化アプタマーよりも密集した構造体であり、分子間相互作用は少なくなると予想される。ＨＡ−治療アプタマー二重特異性臨床製品は、ゲージ２８、ゲージ３０、またはさらにはゲージ３３の針での投与を可能にする粘度で必要な臨床濃度を達成する可能性がより高い。したがって、投与中の重篤な傷害のリスクのような患者への不快感は最小限になる。
【０１２９】
アプタマー番号９は、１／２インチ３０〜３３ゲージ針を用いる注射用の５０μＬからなる事前充填注射器により上記の製剤を使用して５から１５ｍｇ／眼の用量でｗＡＭＤに罹った患者に投与することが可能である。アプタマー番号９は抗ＶＥＧＦ療法と組み合わせて投与してもよく、抗ＶＥＧＦ療法は１．２５ｍｇのＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）、０．５ｍｇのＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）または２ｍｇのＥｙｌｅａ（登録商標）からなっていてもよく、これらの注射は独立して実施することが可能である。
【０１３０】
アプタマー番号９は、３から６ヶ月毎の投与を支持するのに硝子体では１０から２８日の半減期を有すると予想され、一方、抗ＶＥＧＦ療法は、選択された抗ＶＥＧＦ療法用のパッケージインサートに基づいて１または２ヶ月毎に投与することが可能である。
【０１３１】
抗ＶＥＧＦ療法と組み合わせたアプタマー番号９の投与は、１２ヶ月の療法によりベースラインからの視力（ＥＴＤＲＳ文字）の平均変化を改良すると予想されている。抗ＶＥＧＦ療法と組み合わせたアプタマー番号９の投与は、眼検査、眼内圧、蛍光眼底血管造影、光干渉断層撮影、ＥＣＧおよび臨床検査変数の変化を含む、有害事象についてモニターすることが可能である。全体として、アプタマー番号９と抗ＶＥＧＦ療法の組み合わせは、投与される抗ＰＤＧＦＢ治療薬の用量が増加するので、Ｅ１００３０と抗ＶＥＧＦ療法の併用療法よりも有効であると予想される。さらに、Ｅ１００３０と比べてアプタマー番号９の効果の持続時間がより長いことを考慮すると、アプタマー番号９を用いた処置により、処置期間にわたりより高いゲージ針を用いて注射の回数を少なくすることを考慮すると、副作用も少なくなることが可能であると予想される。
【０１３２】
（実施例６  ＨＡ−ＶＥＧＦ二重特異性アプタマーを用いるｗＡＭＤの処置）
４０ＫＤａ  ＰＥＧにコンジュゲートされたアプタマー番号１２（Ｒｕｃｋｍａｎ，  Ｊ．、Ｌ．Ｓ．  Ｇｒｅｅｎ、Ｊ．  Ｂｅｅｓｏｎ、Ｓ．  Ｗａｕｇｈ、Ｗ．Ｌ．  Ｇｉｌｌｅｔｔｅ、Ｄ．Ｄ．  Ｈｅｎｎｉｎｇｅｒ、Ｌ．  Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ、およびＮ．  Ｊａｎｊｉｃ、１９９８年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７３巻：２０５５６〜２０５６７頁）（ＮＸ１８３８、Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標））は、ＶＥＧＦの実証された強力な阻害およびウェット型加齢黄斑変性（ｗＡＭＤ）の処置での臨床的有効性を有するＶＥＧＦのヘパリン結合ドメインに結合する抗ＶＥＧＦアプタマーである。本実施例では、ＮＸ１８３８のアプタマー成分（アプタマー番号１２）を固相合成によりアプタマー番号５に繋ぎ合わせてＨＡ結合ドメインとＶＥＧＦ阻害ドメインからなる二重特異性アプタマーを生成してアプタマー番号１３を得る。その分子量はおおよそ２２，１００Ｄａであった（表１０）。代わりに、アプタマー番号５をＣ６−ジスルフィドリンカーを用いて生成し、先ずアプタマー番号１２をマレイミド−ＰＥＧ８−ＮＨＳリンカーと反応させ、続いてアプタマー番号５上のジスルフィドを還元してマレイミド−ＰＥＧ８−Ｃ６−アプタマー番号１２と反応させることによりアプタマー番号１２にコンジュゲートして、ＰＥＧ８リンカーを介してアプタマー番号１２の５’末端に繋ぎ合わされたアプタマー番号５の５’末端からなる二重特異性構築物を生成する。
【表１０】
2019508405.tif 000028
【０１３３】
Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）は、オリゴヌクレオチド分子量に基づいて３．５ｍｇ／ｍＬの濃度で等張中性ｐＨ製剤として提示され、３０ゲージ１／２インチ長針により最大用量０．３ｍｇ／眼の９０μＬの容積で硝子体内に投与される。Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）の最大用量は、薬物製品溶液の粘度により、３０ゲージ針による９０μＬ注射容積中０．３ｍｇに制限される。ペガプタニブを用いてより高いゲージの針を使用すれば投与可能な最大用量はさらに減少すると考えられる。これとは対照的に、一実施形態では、アプタマー番号１３は、５０μＬ注射容積中５ｍｇの用量で２７〜３３ゲージ針により投与可能な事前充填注射器中１００ｍｇ／ｍＬの濃度で提示される。本明細書で提供される剤形の動的粘度（または濃度）は、１／２インチ２７ゲージ針の付いた５０μＬ事前充填注射器で製剤化される場合、約３８，８００センチポイズから約１９４，１００センチポイズ、約９７，０００センチポイズから約４８５，５００センチポイズ、または約１９４，１００センチポイズから約９７０，８００センチポイズでもよい。本明細書で提供される剤形の動的粘度（または濃度）は、１／２インチ３０ゲージ針の付いた５０μＬ事前充填注射器で製剤化される場合、約１３，１００センチポイズから約６５，０００センチポイズ、約３２，７００センチポイズから約１６４，０００センチポイズ、または約６５，０００センチポイズから約３２５，０００センチポイズでもよい。同様に、本明細書で提供される剤形の動的粘度（または濃度）は、１／２インチ３３ゲージ針の付いた５０μＬ事前充填注射器で製剤化される場合、約２，８００センチポイズから約１４，５００センチポイズ、約７，３００センチポイズから約３６，５００センチポイズ、または約１４，５００センチポイズから約７５，０００センチポイズでもよい。
【０１３４】
別の実施形態では、ペガプタニブ（ｐｅｇａｐｔｉｎｉｂ）と比べてアプタマー番号１３の粘度が低いことを考慮すると、２００から２５０ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える提示は、５０μＬ注射容積中１０から１５ｍｇまたはそれよりも多い用量を提供するため２７〜３３ゲージ針で投与するのに十分低い粘度を有すると予想される。
【０１３５】
一般に、ＨＡアプタマー結合モジュールにコンジュゲートされたアプタマーは、ｐＨ７．４もしくはほぼ７．４の希釈リン酸緩衝液（例えば、５から１０ｍＭホスフェートの範囲で）で、またはｐＨ７．４もしくはほぼ７．４に調整された純水で製剤化してもよい。緩衝塩を含む添加物は、ＵＳＰおよびＦＤＡからの最近の公布によれば、たとえ使用したとしても、控えめなら使用される。
【０１３６】
ＨＡアプタマーにコンジュゲートされたアプタマー番号１２などの治療アプタマーの提示は、Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）、Ｆｏｖｉｓｔａ（登録商標）およびＺｉｍｕｒａ（登録商標）で使用される分岐４０ＫＤａ  ＰＥＧなどの高分子量ＰＥＧにコンジュゲートされた同じアプタマーと比べて、硝子体内投与に好ましい提示を提供すると予想される。アプタマーへのＰＥＧのコンジュゲーションは硝子体内半減期を延長するという所望の効果を与えるが、このコンジュゲーションは実質的には溶液の粘度にも寄与する。ＰＥＧは周知の剪断増粘剤であり、これは所与の濃度の溶液の粘度が、固定されたパラメータではなく、その溶液に適用される剪断力の増加と共に増加することを意味する。この現象はペグ化されたアプタマーの投与に重大な限界をもたらす。なぜならば、投与溶液の濃度と薬物を投与するのに使用される針の直径の間には妥協を成立させなければならないからである。ＨＡアプタマーへの治療アプタマーのコンジュゲーション（ＨＡ−治療アプタマー二重特異性体）は、ずり増粘に遭遇せずに薬物製品の必要な臨床濃度を達成する機会を与える。さらに、ＨＡ−治療アプタマー二重特異性体のより低い全体サイズおよび分子量は、４０キロダルトンＰＥＧにコンジュゲートされたアプタマーの約４０％にすぎない。したがって、ＨＡ−治療アプタマー二重特異性体は、匹敵するペグ化アプタマーよりも密集した構造体であり、分子間相互作用は少なくなると予想される。ＨＡ−治療アプタマー二重特異性臨床製品は、ゲージ２８、ゲージ３０、またはさらにはゲージ３３の針での投与を可能にする粘度で必要な臨床濃度を達成する可能性がより高い。したがって、投与中の重篤な傷害のリスクのような患者への不快感は最小限になる。
【０１３７】
アプタマー番号１３は、１／２インチ３０〜３３ゲージ針を用いる注射用の５０μＬからなる事前充填注射器により上記の製剤を使用して最大５から１５ｍｇ／眼の用量でｗＡＭＤに罹った患者に投与することが可能である。毎月投与されるＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）またはＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）、６週ごとに投与されるＭａｃｕｇｅｎ（登録商標）、または毎月もしくは隔月（２ヶ月毎）に投与することが可能なＥｙｌｅａ（登録商標）と比べて、アプタマー番号１３は２から６ヶ月毎に投与される。
【０１３８】
アプタマー番号１３の投与は、既存の抗体ベースのＶＥＧＦ療法に匹敵する１２ヶ月の療法によりベースラインからの視力（ＥＴＤＲＳ文字）の平均変化を改良するまたは維持すると予想され、投与される用量が増加するのでＭａｃｕｇｅｎ（登録商標）よりも有効であると予想される。アプタマー番号１３の投与は、眼検査、眼内圧、蛍光眼底血管造影、光干渉断層撮影、ＥＣＧおよび臨床検査変数の変化を含む、有害事象についてモニターしてもよい。さらに、他のＶＥＧＦ療法と比べてアプタマー番号１３の効果の持続時間がより長いことを考慮すると、アプタマー番号１３を用いた処置が、処置期間にわたりより高いゲージ針を用いて注射の回数を少なくすることを考慮すると副作用も少なくなることが可能であると予想される。
【０１３９】
（実施例７  ＨＡ−Ｃ５二重特異性アプタマーを用いる地図状萎縮（ＧＡ）の処置）
４０ＫＤａ  ＰＥＧにコンジュゲートされたアプタマー番号１４（ＡＲＣ−１９０５、Ｚｉｍｕｒａ（登録商標））は、補体活性の実証された強力な阻害およびＧＡの処置での治療効果を有する抗補体Ｃ５アプタマーである（Ｂｉｅｓｅｃｋｅｒ，  Ｇ．、Ｌ．Ｄｉｈｅｌ，  Ｋ．  Ｅｎｎｅｙ、およびＲ．Ａ．  Ｂｅｎｄｅｌｅ、１９９９年、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、４２巻：２１９〜２３０頁）。本実施例では、Ｚｉｍｕｒａ（登録商標）のアプタマー成分（アプタマー番号１４）を固相合成によりアプタマー番号７に繋ぎ合わせてＨＡ結合ドメインとＣ５阻害ドメインからなる二重特異性アプタマーを生成してアプタマー番号１５を得る。その分子量はおおよそ２４，７５０Ｄａである（表１１）。代わりに、アプタマー番号７をＣ６−ジスルフィドリンカーを用いて生成し、先ずアプタマー番号１４をマレイミド−ＰＥＧ８−ＮＨＳリンカーと反応させ、続いてアプタマー番号７上のジスルフィドを還元してマレイミド−ＰＥＧ８−Ｃ６−アプタマー番号１４と反応させることによりアプタマー番号１４にコンジュゲートして、ＰＥＧ８リンカーを介してアプタマー番号１４の５’末端に繋ぎ合わされたアプタマー番号７の５’末端からなる二重特異性構築物を生成する。
【表１１】
2019508405.tif 000029
【０１４０】
Ｚｉｍｕｒａ（登録商標）は、オリゴヌクレオチド分子量に基づいて３０〜４０ｍｇ／ｍＬの濃度で等張中性ｐＨ製剤として提示され、最大用量２．０ｍｇ／眼の５０〜７５μＬの容積で硝子体内に投与される。Ｚｉｍｕｒａ（登録商標）の最大用量は、薬物製品溶液の粘度により制限される。これとは対照的に、一実施形態では、アプタマー番号１５は、５０μＬ注射容積中５ｍｇの用量で２７〜３３ゲージ針により投与可能な事前充填注射器中１００ｍｇ／ｍｌの濃度で提示される。本明細書で提供される剤形の動的粘度（または濃度）は、１／２インチ２７ゲージ針の付いた５０μＬ事前充填注射器で製剤化される場合、約３８，８００センチポイズから約１９４，１００センチポイズ、約９７，０００センチポイズから約４８５，５００センチポイズ、または約１９４，１００センチポイズから約９７０，８００センチポイズでもよい。本明細書で提供される剤形の動的粘度（または濃度）は、１／２インチ３０ゲージ針の付いた５０μＬ事前充填注射器で製剤化される場合、約１３，１００センチポイズから約６５，０００センチポイズ、約３２，７００センチポイズから約１６４，０００センチポイズ、または約６５，０００センチポイズから約３２５，０００センチポイズでもよい。同様に、本明細書で提供される剤形の動的粘度（または濃度）は、１／２インチ３３ゲージ針の付いた５０μＬ事前充填注射器で製剤化される場合、約２，８００センチポイズから約１４，５００センチポイズ、約７，３００センチポイズから約３６，５００センチポイズ、または約１４，５００センチポイズから約７５，０００センチポイズでもよい。
【０１４１】
別の実施形態では、Ｚｉｍｕｒａ（登録商標）と比べてアプタマー番号１５の粘度が低いことを考慮すると、２００から２５０ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える提示は、５０μＬ注射容積中１０から１５ｍｇまたはそれよりも多い用量を提供するため２７〜３３ゲージ針で投与するのに十分低い粘度を有すると予想される。一般に、ＨＡアプタマー結合モジュールにコンジュゲートされたアプタマーは、ｐＨ７．４もしくはほぼ７．４の希釈リン酸緩衝液（例えば、５から１０ｍＭホスフェートの範囲で）で、またはｐＨ７．４もしくはほぼ７．４に調整された純水で製剤化してもよい。緩衝塩を含む添加物は、ＵＳＰおよびＦＤＡからの最近の公布によれば、たとえ使用したとしても、控えめなら使用してもよい。
【０１４２】
アプタマー番号１５などの治療アプタマーの提示は、Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）、Ｆｏｖｉｓｔａ（登録商標）およびＺｉｍｕｒａ（登録商標）で使用される分岐４０ＫＤａ  ＰＥＧなどの高分子量ＰＥＧにコンジュゲートされた同じアプタマーと比べて、硝子体内投与に好ましい提示を提供すると予想される。アプタマーへのＰＥＧのコンジュゲーションは硝子体内半減期を延長するという所望の効果を与えるが、このコンジュゲーションは実質的には溶液の粘度にも寄与する。ＰＥＧは周知の剪断増粘剤であり、これは所与の濃度の溶液の粘度が、固定されたパラメータではなく、その溶液に適用される剪断力の増加と共に増加することを意味する。この現象はペグ化されたアプタマーの投与に重大な限界をもたらす。なぜならば、投与溶液の濃度と薬物を投与するのに使用される針の直径の間には妥協を成立させなければならないからである。ＨＡアプタマーへの治療アプタマーのコンジュゲーション（ＨＡ−治療アプタマー二重特異性体）は、ずり増粘に遭遇せずに薬物製品の必要な臨床濃度を達成する機会を与える。さらに、ＨＡ−治療アプタマー二重特異性体のより低い全体サイズおよび分子量は、４０キロダルトンＰＥＧにコンジュゲートされたアプタマーの約４０％にすぎない。したがって、ＨＡ−治療アプタマー二重特異性体は、匹敵するペグ化アプタマーよりも密集した構造体であり、分子間相互作用は少なくなると予想される。ＨＡ−治療アプタマー二重特異性臨床製品は、ゲージ２８、ゲージ３０、またはさらにはゲージ３３の針での投与を可能にする粘度で必要な臨床濃度を達成する可能性がより高い。したがって、投与中の重篤な傷害のリスクのような患者への不快感は最小限になる。
【０１４３】
アプタマー番号１５は、１／２インチ３０〜３３ゲージ針を用いる注射用の５０μＬからなる事前充填注射器により上記の製剤を使用して５から１５ｍｇ／眼の用量でＧＡに罹った患者に投与することが可能である。アプタマー番号１５は、単独でまたは抗ＶＥＧＦ療法と組み合わせて投与してもよく、抗ＶＥＧＦ療法は１．２５ｍｇのＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）、０．５ｍｇのＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）または２ｍｇのＥｙｌｅａ（登録商標）からなっていてもよく、これらの注射は独立して実施することが可能である。
【０１４４】
アプタマー番号１５は、３から６ヶ月毎の投与を支持するのに１０から２８日の半減期を有すると予想され、一方、抗ＶＥＧＦ療法は、選択された抗ＶＥＧＦ療法用のパッケージインサートに基づいて１または２ヶ月毎に投与することが可能である。
【０１４５】
アプタマー番号１５単独でのまたは抗ＶＥＧＦ療法と組み合わせた投与は、１２ヶ月の療法によりベースラインからの視力（ＥＴＤＲＳ文字）の平均変化を改良し、最高矯正視力を改良し、ＯＣＴにより測定した場合ドルーゼン容積および網膜増粘を減少させると予想される。アプタマー番号１５単独でのまたは抗ＶＥＧＦ療法と組み合わせた投与は、眼検査、眼内圧、蛍光眼底血管造影、光干渉断層撮影、ＥＣＧおよび臨床検査変数の変化を含む、有害事象についてモニターしてもよい。全体的には、アプタマー番号１５単独でのまたは抗ＶＥＧＦ療法と組み合わせた使用は、投与される抗Ｃ５治療薬の用量が増加しているので、Ｚｉｍｕｒａ（登録商標）単独または抗ＶＥＧＦ療法との組み合わせよりも有効であると予想される。さらに、Ｚｉｍｕｒａ（登録商標）と比べてアプタマー番号１５の効果の持続時間がより長いことを考慮すると、アプタマー番号１５を用いた処置が、処置期間にわたりより高いゲージ針を用いて注射の回数を少なくすることを考慮すると副作用も少なくなることが可能であると予想される。
【０１４６】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され記載されてきたが、そのような実施形態は例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。数多くのバリエーション、変化、および置換が本発明から逸脱することなく今や当業者に浮かぶであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の種々の代替案は本発明を実行するのに用いてもよいことは理解するべきである。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これら特許請求の範囲内の方法および構造体ならびにその等価物はそれにより包含されることが意図されている。
【図１】
2019508405.tif 000030
【図２】
2019508405.tif 000031
【図３】
2019508405.tif 000032
【図４】
2019508405.tif 000033
【図５】
2019508405.tif 000034
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月10日(2018.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
硝子体成分に特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含む組成物。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドがアプタマーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アプタマーがＲＮＡアプタマーまたは改変ＲＮＡアプタマーである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記アプタマーがＤＮＡアプタマーまたは改変ＤＮＡアプタマーである、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記アプタマーが、ＤＮＡ、改変ＤＮＡ、ＲＮＡ、および改変ＲＮＡからなる群より選択される少なくとも２種類の核酸を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが治療薬にコンジュゲートしている、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
二重特異性アプタマーである、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２〜７のいずれか１つに従った配列を含むか、または配列番号２〜７のいずれか１つに少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記硝子体成分がヒアルロナン、コラーゲン、またはビトロネクチンである、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
硝子体成分結合性部分にコンジュゲートされた治療薬を含む組成物であって、前記硝子体成分結合性部分がペプチドタグではない、組成物。
【請求項１１】
前記硝子体成分結合性部分が硝子体液の成分に結合する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記硝子体液の成分が、コラーゲン、ヒアルロナン、フィブリリン、ビトロネクチン、オプテティシン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記硝子体液の成分が、ヒアルロナン、コラーゲン、またはビトロネクチンである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記硝子体成分結合性部分が約１ｍＭ未満のＫｄで硝子体液の成分に結合する、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
ヒトで少なくとも６日の硝子体内半減期、ウサギで少なくとも２日の硝子体内半減期、または非ヒト霊長類で少なくとも３日の硝子体内半減期を有する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記治療薬が網膜疾患の処置のために使用される治療薬である、請求項６から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記網膜疾患が、ウェット型加齢黄斑変性、ドライ型加齢黄斑変性、地図状萎縮、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、およびぶどう膜炎からなる群より選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記治療薬が、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、アンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、Ｄ因子、Ｐ因子、補体成分５（Ｃ５）、補体成分３（Ｃ３）またはインテグリンの阻害剤である、請求項６から１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を阻害するアプタマーを含む、請求項６から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記治療薬が、アプタマー、抗体またはその誘導体、ペプチド、タンパク質、小分子およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項６から１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
約１ｋＤａから約２１０ｋＤａの分子量を有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
分子量が３０ｋＤａよりも大きいポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを含まない、請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記治療薬が、ある期間にわたり前記硝子体成分結合性部分から解離する、請求項６から２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記硝子体成分結合性部分が、配列番号２〜７のいずれか１つに従ったオリゴヌクレオチド配列または配列番号２〜７のいずれか１つに少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１０から２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
配列番号９および１９〜２１；１０、２２および２３；１１、２４および２５；１３および１６；あるいは１５および２６のいずれか１つに従ったオリゴヌクレオチド配列または配列番号９および１９〜２１；１０、２２および２３；１１、２４および２５；１３および１６；あるいは１５および２６のいずれか１つに少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
４０ｋＤａ未満の分子量を有し、かつ４０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーを含む組成物の硝子体内保持時間に匹敵する硝子体内保持時間を有する、請求項１から２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物がそれぞれ硝子体内投与に適した液体製剤で製剤化される場合、４０ｋＤａ
ＰＥＧポリマーを含む組成物の半分以下の粘度を有する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１から２７のいずれか一項に記載の組成物を含む液体製剤であって、前記液体製剤が硝子体内投与のために製剤化される場合、前記組成物が前記液体製剤中少なくとも４０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する、液体製剤。
【請求項２９】
５０μＬ容積で製剤化され１／２インチ２７ゲージ針で投与される場合、約３８，８００センチポイズから約９７０，８００センチポイズの動的粘度を有する、請求項２８に記載の液体製剤。
【請求項３０】
５０μＬ容積で製剤化され１／２インチ３０ゲージ針で投与される場合、約１３，１００センチポイズから約３２５，０００センチポイズの動的粘度を有する、請求項２８に記載の液体製剤。
【請求項３１】
５０μＬ容積で製剤化され１／２インチ３３ゲージ針で投与される場合、約２，８００センチポイズから約７５，０００センチポイズの動的粘度を有する、請求項２８に記載の液体製剤。
【請求項３２】
被験体において網膜疾患を処置する方法であって、治療有効量の、請求項１から２７のいずれか一項に記載の組成物を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項３３】
前記投与することが、硝子体内投与により前記被験体に前記組成物を投与することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記投与することが、８週間ごとに少なくとも１回前記組成物を投与することを含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物を投与することが、２７〜３３ゲージ針を使用して前記組成物を投与することを含む、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記２７〜３３ゲージ針が１／２インチまたはそれ未満の長さを有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記投与することが、単回硝子体内投与で前記被験体に少なくとも２ｍｇの前記組成物の用量を投与することを含む、請求項３２から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記治療有効量が、眼あたり約１５μｌから約１００μｌ中約０．１ｍｇから約５０ｍｇである、請求項３２から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記被験体に少なくとも１つの追加の治療薬を共に投与することをさらに含む、請求項３２から３８のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
さらに別の態様では、硝子体成分結合性部分にコンジュゲートされた治療薬を含む組成物であって、硝子体成分結合性部分がペプチドタグではない、組成物が提供される。硝子体成分結合性部分は硝子体液の成分に結合してもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、硝子体液の成分は、コラーゲン、ヒアルロナン、フィブリリン、ビトロネクチン、オプテティシン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびその任意の組み合わせからなる群より選択してもよい。一部の例では、硝子体液の成分は、ヒアルロナン、コラーゲン、またはビトロネクチンでもよい。前述の請求項のいずれか１つでは、硝子体成分結合性部分は、約１ｍＭ未満のＫｄで硝子体液の成分に結合してもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、組成物はヒトで少なくとも６日の硝子体内半減期、ウサギで少なくとも２日の硝子体内半減期、または非ヒト霊長類で少なくとも３日の硝子体内半減期を有することがある。前述の組成物のいずれか１つでは、治療薬は網膜疾患の処置のために使用される治療薬であってよい。網膜疾患は、ウェット型加齢黄斑変性、ドライ型加齢黄斑変性、地図状萎縮、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、およびぶどう膜炎からなる群より選択してもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、治療薬は、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、アンジオポエチン−２（ＡＮＧ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、Ｄ因子、Ｐ因子、補体成分５（Ｃ５）、補体成分３（Ｃ３）またはインテグリンの阻害剤でもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、組成物は血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を阻害するアプタマーを含んでいてもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、治療薬は、アプタマー、抗体またはその誘導体、ペプチド、タンパク質、小分子およびその任意の組み合わせからなる群より選択してもよい。前述の請求項のいずれか１つでは、組成物は約１ｋＤａから約２１０ｋＤａの分子量を有していてもよい。前述の請求項のいずれか１つでは、組成物は、分子量が３０ｋＤａよりも大きいポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを含まない。前述の組成物のいずれか１つでは、治療薬は、ある期間にわたり硝子体成分結合性部分から解離してもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、硝子体成分結合性部分は、配列番号２〜７のいずれか１つに従ったオリゴヌクレオチド配列、または配列番号２〜７のいずれか１つに少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含んでいてもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、組成物は配列番号９および１９〜２１；１０、２２および２３；１１、２４および２５；１３および１６；あるいは１５および２６のいずれか１つに従ったオリゴヌクレオチド配列または配列番号９および１９〜２１；１０、２２および２３；１１、２４および２５；１３および１６；あるいは１５および２６のいずれか１つに少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含んでいてもよい。前述の組成物のいずれか１つでは、組成物は、４０��Ｄａ未満の分子量を有し、４０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーを含む組成物の硝子体内滞留時間に匹敵する硝子体内滞留時間を有していてもよい。組成物がそれぞれ硝子体内投与に適した液体製剤で製剤化される場合、組成物は、４０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーを含む組成物の半分以下の粘度を有していてもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
一部の態様では、本開示の組成物は、抗ヒアルロナンアプタマーに連結されている抗ＶＥＧＦアプタマーを含む二重特異性アプタマーである。一部の場合、ＨＡ−ＶＥＧＦ二重特異性アプタマーは下の表２に記載される配列を含む。
【表２】
2019508405.tif 000035
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
一部の態様では、本開示の組成物は、抗ヒアルロナンアプタマーに連結されている抗ＰＤＧＦアプタマーを含む二重特異性アプタマーである。一部の場合、ＨＡ−ＰＤＧＦ二重特異性アプタマーは下の表３に記載される配列を含む。
【表３−１】
2019508405.tif 000036
【表３−２】
2019508405.tif 000037
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
一部の態様では、本開示の組成物は、抗ヒアルロナンアプタマーに連結されている抗Ｃ５アプタマーを含む二重特異性アプタマーである。一部の場合、ＨＡ−Ｃ５二重特異性アプタマーは下の表４に記載される配列を含む。
【表４】
2019508405.tif 000038
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
一部の場合、本開示のアプタマーは配列番号８、１７および１８；９および１９〜２１；１０、２２および２３；１１、２４および２５；１２；１３および１６；１４；あるいは１５および２６のいずれか１つに従った配列を有するオリゴヌクレオチドまたは配列番号８、１７および１８；９および１９〜２１；１０、２２および２３；１１、２４および２５；１２；１３および１６；１４；あるいは１５および２６のいずれか１つの少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含む。ＤＮＡ骨格が記載されている場合、前記ＤＮＡは、改変ＲＮＡおよび改変ＤＮＡからなる群より選択される１つまたは複数種類の核酸で置換してもよい、ならびにＲＮＡ骨格が記載されている場合、前記ＲＮＡは、改変ＲＮＡ、ＤＮＡおよび改変ＤＮＡからなる群より選択される１つまたは複数種類の核酸で置換してもよいことは理解されるべきである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
本開示は、ＰＤＧＦ依存性細胞増殖アッセイにおいて血小板由来成長因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）阻害剤の同定を提供する。ＰＤＧＦ−Ｂに直接結合してその活性を選択的に阻害する抗ＰＤＧＦアプタマー（配列番号８、１７および１８、表８）が開発された（Ｆｌｏｅｇｅ  Ｊ．  Ｔ．  Ｏｓｔｅｎｄｏｒｆ、Ｕ．  Ｊａｎｓｓｅｎ、Ｍ．  Ｂｕｒｇ、ＨＨ  Ｒａｄｅｋｅ、Ｃ．  Ｖａｒｇｅｅｓｅ、ＳＣ  Ｇｉｌｌ、Ｌ．Ｓ．  ＧｒｅｅｎおよびＮ．  Ｊａｎｊｉｃ、１９９９年、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ  １５４巻：１６９〜１７９頁）。一例では、抗ＰＤＧＦ結合アプタマーは固相オリゴヌクレオチド合成により合成され、続いてリンカーとしてのヘキサエチレンスペーサー、次にＨＡアプタマーが合成され、それによって硝子体内で抗ＰＤＧＦアプタマーをＨＡに繋ぎ合わせることが可能なＨＡ−ＰＤＧＦ二重特異性アプタマーを生成し、硝子体内投与に続いて低い硝子体クリアランスおよびそれによる増強された硝子体半減期を有する治療薬を生成する。
【表８】
2019508405.tif 000039
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
ＨＡ結合モジュールに続いて抗ＰＤＧＦモジュールを含有するアプタマーの３つの例はアプタマー番号９（配列番号９および１９〜２１）、１０（配列番号１０、２２および２３）、および１１（配列番号１１、２４および２５）であり、これらのアプタマーはそれぞれアプタマー番号８（表８）と組み合わされたアプタマー番号３、５および７の二重特異性体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）を含む。繋ぎ合わされた第２のドメインを有するこれらのアプタマーがＰＤＧＦ−Ｂ活性を保持していたのかどうかを決定するため、ＰＤＧＦ−Ｂ刺激された細胞増殖を阻害する能力についてアプタマー番号８と比較した（図１）。アプタマー番号９、１０および１１はすべて、アプタマー番号８に類似するＰＤＧＦ−Ｂ阻害活性を保持していた。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
２０ＫＤａモノビオチン化ＨＡへの１０Ｘ−Ｈｉｓ−ＴＳＧ６の結合は、Ｍａｂ抗６Ｈｉｓ−Ｔｂクリプテートゴールド（配列番号２７として開示される「６ｘＨｉｓ」）（Ｃｉｓｂｉｏ  ＃６１Ｈ１２ＴＬＡ）およびストレプトアビジン−ＸＬｅｎｔ（Ｃｉｓｂｉｏ  ＃６１１ＳＡＸＬＡ）を使用して、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）またはホモジニアス時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）により検出される。Ｔｂクリプテートタグ付抗ｈｉｓ抗体が１０Ｘ−Ｈｉｓ−ＴＳＧ６に結合し、ＸＬｅｎｔタグ付ストレプトアビジンがビオチン化ＨＡに結合すると、ＴｂクリプテートアクセプターへのＸｌｅｎｔドナーの近接により、より高いＨＴＲＦシグナルが生じる。このシグナルは２つの波長、６２０ｎｍドナー蛍光および６６５ｎｍアクセプター蛍光で測定され、アクセプターの蛍光  対  ドナーの蛍光の比が計算されて、形成される複合体の相対量を決定する。このＨＴＲＦシグナルはＨＡに結合するＴＳＧ−６の量に比例し、ＨＡへのＴＳＧ−６結合について競合するＨｉｓタグが付いていない分子はＨＴＲＦシグナルの減少を引き起こす。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
平底３８４ウェルプレートでは、次の試薬：抗６ＸＨｉｓ−Ｔｂクリプテートゴールド（配列番号２７として開示される「６ｘＨｉｓ」）＋ＴＳＧ６＋モノビオチン標識ヒアルロナン＋最大１２５μＭのアプタマーが全容積１５μＬで、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４（１０ｍＭのリン酸緩衝液、１３７．５ｍＭのＮａＣｌ、５．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ）に添加される。室温で３０分間インキュベートした後、ストレプトアビジン−ＸＬｅｎｔが添加されＨＴＲＦシグナルが６６５／６２０ｎｍで読み取られる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
（実施例６  ＨＡ−ＶＥＧＦ二重特異性アプタマーを用いるｗＡＭＤの処置）
４０ＫＤａ  ＰＥＧにコンジュゲートされたアプタマー番号１２（Ｒｕｃｋｍａｎ，  Ｊ．、Ｌ．Ｓ．  Ｇｒｅｅｎ、Ｊ．  Ｂｅｅｓｏｎ、Ｓ．  Ｗａｕｇｈ、Ｗ．Ｌ．  Ｇｉｌｌｅｔｔｅ、Ｄ．Ｄ．  Ｈｅｎｎｉｎｇｅｒ、Ｌ．  Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ、およびＮ．  Ｊａｎｊｉｃ、１９９８年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７３巻：２０５５６〜２０５６７頁）（ＮＸ１８３８、Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標））は、ＶＥＧＦの実証された強力な阻害およびウェット型加齢黄斑変性（ｗＡＭＤ）の処置での臨床的有効性を有するＶＥＧＦのヘパリン結合ドメインに結合する抗ＶＥＧＦアプタマーである。本実施例では、ＮＸ１８３８のアプタマー成分（アプタマー番号１２）を固相合成によりアプタマー番号５に繋ぎ合わせてＨＡ結合ドメインとＶＥＧＦ阻害ドメインからなる二重特異性アプタマーを生成してアプタマー番号１３を得る。その分子量はおおよそ２２，１００Ｄａであった（表１０）。代わりに、アプタマー番号５をＣ６−ジスルフィドリンカーを用いて生成し、先ずアプタマー番号１２をマレイミド−ＰＥＧ８−ＮＨＳリンカーと反応させ、続いてアプタマー番号５上のジスルフィドを還元してマレイミド−ＰＥＧ８−Ｃ６−アプタマー番号１２と反応させることによりアプタマー番号１２にコンジュゲートして、ＰＥＧ８リンカーを介してアプタマー番号１２の５’末端に繋ぎ合わされたアプタマー番号５の５’末端からなる二重特異性構築物を生成する。
【表１０】
2019508405.tif 000040
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
（実施例７  ＨＡ−Ｃ５二重特異性アプタマーを用いる地図状萎縮（ＧＡ）の処置）
４０ＫＤａ  ＰＥＧにコンジュゲートされたアプタマー番号１４（ＡＲＣ−１９０５、Ｚｉｍｕｒａ（登録商標））は、補体活性の実証された強力な阻害およびＧＡの処置での治療効果を有する抗補体Ｃ５アプタマーである（Ｂｉｅｓｅｃｋｅｒ，  Ｇ．、Ｌ．Ｄｉｈｅｌ，  Ｋ．  Ｅｎｎｅｙ、およびＲ．Ａ．  Ｂｅｎｄｅｌｅ、１９９９年、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、４２巻：２１９〜２３０頁）。本実施例では、Ｚｉｍｕｒａ（登録商標）のアプタマー成分（アプタマー番号１４）を固相合成によりアプタマー番号７に繋ぎ合わせてＨＡ結合ドメインとＣ５阻害ドメインからなる二重特異性アプタマーを生成してアプタマー番号１５を得る。その分子量はおおよそ２４，７５０Ｄａである（表１１）。代わりに、アプタマー番号７をＣ６−ジスルフィドリンカーを用いて生成し、先ずアプタマー番号１４をマレイミド−ＰＥＧ８−ＮＨＳリンカーと反応させ、続いてアプタマー番号７上のジスルフィドを還元してマレイミド−ＰＥＧ８−Ｃ６−アプタマー番号１４と反応させることによりアプタマー番号１４にコンジュゲートして、ＰＥＧ８リンカーを介してアプタマー番号１４の５’末端に繋ぎ合わされたアプタマー番号７の５’末端からなる二重特異性構築物を生成する。
【表１１】
2019508405.tif 000041
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され記載されてきたが、そのような実施形態は例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。数多くのバリエーション、変化、および置換が本発明から逸脱することなく今や当業者に浮かぶであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の種々の代替案は本発明を実行するのに用いてもよいことは理解するべきである。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これら特許請求の範囲内の方法および構造体ならびにその等価物はそれにより包含されることが意図されている。
例えば、本発明の実施形態において、以下の項目が提供される。
（項目１）
硝子体成分に特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含む組成物。
（項目２）
前記オリゴヌクレオチドがアプタマーである、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記アプタマーがＲＮＡアプタマーまたは改変ＲＮＡアプタマーである、項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記アプタマーがＤＮＡアプタマーまたは改変ＤＮＡアプタマーである、項目２に記載の組成物。
（項目５）
前記アプタマーが、ＤＮＡ、改変ＤＮＡ、ＲＮＡ、および改変ＲＮＡからなる群より選択される少なくとも２種類の核酸を含む、項目２に記載の組成物。
（項目６）
前記オリゴヌクレオチドが治療薬にコンジュゲートしている、項目１から５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７）
二重特異性アプタマーである、項目１から６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８）
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２〜７のいずれか１つに従った配列を含むか、または配列番号２〜７のいずれか１つに少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、項目１から７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
前記硝子体成分がヒアルロナン、コラーゲン、またはビトロネクチンである、項目１から８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）
硝子体成分結合性部分にコンジュゲートされた治療薬を含む組成物であって、前記硝子体成分結合性部分がペプチドタグではない、組成物。
（項目１１）
前記硝子体成分結合性部分が硝子体液の成分に結合する、項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
前記硝子体液の成分が、コラーゲン、ヒアルロナン、フィブリリン、ビトロネクチン、オプテティシン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびその任意の組み合わせからなる群より選択される、項目１０または１１に記載の組成物。
（項目１３）
前記硝子体液の成分が、ヒアルロナン、コラーゲン、またはビトロネクチンである、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
前記硝子体成分結合性部分が約１ｍＭ未満のＫｄで硝子体液の成分に結合する、項目１０から１３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１５）
ヒトで少なくとも６日の硝子体内半減期、ウサギで少なくとも２日の硝子体内半減期、または非ヒト霊長類で少なくとも３日の硝子体内半減期を有する、項目１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１６）
前記治療薬が網膜疾患の処置のために使用される治療薬である、項目６から１５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１７）
前記網膜疾患が、ウェット型加齢黄斑変性、ドライ型加齢黄斑変性、地図状萎縮、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、およびぶどう膜炎からなる群より選択される、項目１６に記載の組成物。
（項目１８）
前記治療薬が、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、アンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、Ｄ因子、Ｐ因子、補体成分５（Ｃ５）、補体成分３（Ｃ３）またはインテグリンの阻害剤である、項目６から１７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１９）
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を阻害するアプタマーを含む、項目６から１８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２０）
前記治療薬が、アプタマー、抗体またはその誘導体、ペプチド、タンパク質、小分子およびその任意の組み合わせからなる群より選択される、項目６から１９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２１）
約１ｋＤａから約２１０ｋＤａの分子量を有する、項目１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２２）
分子量が３０ｋＤａよりも大きいポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを含まない、項目１から２１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２３）
前記治療薬が、ある期間にわたり前記硝子体成分結合性部分から解離する、項目６から２２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２４）
前記硝子体成分結合性部分が、配列番号２〜７のいずれか１つに従ったオリゴヌクレオチド配列または配列番号２〜７のいずれか１つに少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含む、項目１０から２３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２５）
配列番号９および１９〜２１；１０、２２および２３；１１、２４および２５；１３および１６；あるいは１５および２６のいずれか１つに従ったオリゴヌクレオチド配列または配列番号９および１９〜２１；１０、２２および２３；１１、２４および２５；１３および１６；あるいは１５および２６のいずれか１つに少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含む、項目１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２６）
４０ｋＤａ未満の分子量を有し、かつ４０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーを含む組成物の硝子体内保持時間に匹敵する硝子体内保持時間を有する、項目１から２５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２７）
前記組成物がそれぞれ硝子体内投与に適した液体製剤で製剤化される場合、４０ｋＤａ
ＰＥＧポリマーを含む組成物の半分以下の粘度を有する、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
項目１から２７のいずれか一項に記載の組成物を含む液体製剤であって、前記液体製剤が硝子体内投与のために製剤化される場合、前記組成物が前記液体製剤中少なくとも４０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する、液体製剤。
（項目２９）
５０μＬ容積で製剤化され１／２インチ２７ゲージ針で投与される場合、約３８，８００センチポイズから約９７０，８００センチポイズの動的粘度を有する、項目２８に記載の液体製剤。
（項目３０）
５０μＬ容積で製剤化され１／２インチ３０ゲージ針で投与される場合、約１３，１００センチポイズから約３２５，０００センチポイズの動的粘度を有する、項目２８に記載の液体製剤。
（項目３１）
５０μＬ容積で製剤化され１／２インチ３３ゲージ針で投与される場合、約２，８００センチポイズから約７５，０００センチポイズの動的粘度を有する、項目２８に記載の液体製剤。
（項目３２）
被験体において網膜疾患を処置する方法であって、治療有効量の、項目１から２７のいずれか一項に記載の組成物を前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目３３）
前記投与することが、硝子体内投与により前記被験体に前記組成物を投与することを含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記投与することが、８週間ごとに少なくとも１回前記組成物を投与することを含む、項目３２または３３に記載の方法。
（項目３５）
前記組成物を投与することが、２７〜３３ゲージ針を使用して前記組成物を投与することを含む、項目３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記２７〜３３ゲージ針が１／２インチまたはそれ未満の長さを有する、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記投与することが、単回硝子体内投与で前記被験体に少なくとも２ｍｇの前記組成物の用量を投与することを含む、項目３２から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記治療有効量が、眼あたり約１５μｌから約１００μｌ中約０．１ｍｇから約５０ｍｇである、項目３２から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記被験体に少なくとも１つの追加の治療薬を共に投与することをさらに含む、項目３２から３８のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019508405000001.app
【国際調査報告】
2019508405.tif 000042
2019508405.tif 000043
2019508405.tif 000044
2019508405.tif 000045