(57)【要約】無機コアと、アポリポタンパク質などのレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）活性化因子と結合することができる脂質層とを有するナノ構造が本明細書に提供される。ナノ構造および関連するデバイスを使用する方法ならびに疾患もしくは状態を発症するリスクを評価するか、または疾患もしくは状態を処置するための組成物も提供される。上記ナノ構造は、現行のものにおいて数時間のうちに放射性物質を使用せずに結果を提供する単純で安価な無細胞アッセイについての可能性を提供する。
2019536003.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筐体と、
直接または間接のいずれかで少なくとも部分的に前記筐体の外側部分と接続された血液抽出要素と、
コア、および前記筐体の少なくとも一部分内でレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）活性化因子と結合することができるリン脂質シェルを含むナノ構造と
を備えるデバイス。
【請求項２】
ウェアラブルまたはポータブルデバイスである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記ナノ構造が固体のコアを含む、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記ナノ構造が、固体のコアと、脂質層とを含む、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項５】
前記ナノ構造が前記ＬＣＡＴ活性化因子と結合している、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項６】
前記ＬＣＡＴ活性化因子がアポリポタンパク質であり、前記ＬＣＡＴ活性化因子が直接検出され得る、請求項１から３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項７】
前記ナノ構造が、金のコアと、脂質二重層または単層とを有する、請求項６に記載のデバイス。
【請求項８】
運動および疾患リスク関連酵素を迅速に検出する方法であって、
生体試料を、固体のコアナノ粒子と、任意選択でレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）活性化因子と結合することができる脂質二重層または脂質単層と接触させるステップと、前記ナノ粒子が前記ＬＣＡＴ活性化因子と結合することができるように少なくとも１５分間、前記固体のコアナノ粒子を前記生体試料とインキュベートするステップと、前記生体試料中の運動、代謝または疾患関連酵素の存在の指標としてＬＣＡＴ活性化を測定するステップと
を含む、方法。
【請求項９】
前記生体試料が、血液、血液マトリックス、血清、血漿、痰、脳脊髄液、呼気凝縮液、唾液、尿および涙からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＬＣＡＴ活性化因子がアポリポタンパク質である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
標識が蛍光標識である、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記蛍光標識が、ナノ構造におけるホスファチジルコリン上にある、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される、請求項８から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体試料が対象から単離され、ウェアラブルまたはポータブルデバイスを使用することによって実施される、請求項８から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ナノ構造が、無機材料を含むナノ構造コアと、前記ナノ構造コアを取り囲み、それに付着している脂質層を含み、内面および外面を有するシェルとを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のデバイスまたは請求項６から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記脂質層が脂質二重層である、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記シェルにおける前記脂質が、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチオエタノール（ＤＰＰＴＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）から構成されている、請求項１５から１６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８】
無機コアと、リン脂質シェルとを有する脂質官能化ナノ粒子を含む組成物であって、前記脂質官能化ナノ粒子は、リン脂質、コレステロール脂質、およびリンを含有しないジアシル脂質を含む、蛍光標識された脂質を含む、組成物。
【請求項１９】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）機能を測定するための方法アッセイであって、
無機材料を含むナノ構造コアと、前記ナノ構造コアを取り囲み、それに付着しており、シェルが脂質の単層または二重層を有する、脂質層とから構成されているナノ粒子の溶液を、アポリポタンパク質を有する溶液と接触させるステップを含む、方法アッセイ。
【請求項２０】
前記アポリポタンパク質がアポリポタンパク質Ａ−Ｉである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶液が、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼも含有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
対象において心血管疾患または状態を発症するリスクを決定する方法であって、
（ａ）生体試料を前記対象から得るステップと、
（ｂ）前記生体試料をナノ構造と接触させるステップであって、
前記ナノ構造は、無機材料を含むナノ構造コアと、前記ナノ構造コアを取り囲み、それに付着している脂質層を含み、内面および外面を有するシェルとを含む、ステップと、
（ｃ）１種または複数のアポリポタンパク質を前記生体試料から隔離するのに十分な時間、前記ナノ構造を前記生体試料とインキュベートするステップと、
（ｄ）形成されたコレステリルエステルの量を検出するステップまたは前記ナノ構造と結合しているＬＣＡＴの量を検出するステップと、
（ｅ）前記生体試料中の形成されたコレステリルエステルの量または前記ナノ構造と結合しているＬＣＡＴの量を所定の値と比較するステップであって、前記所定の値は、心血管疾患または状態のいくらかのリスクを有する対象における形成されたコレステリルエステルのレベルまたはＬＣＡＴの量を表す、ステップと、
（ｆ）前記生体試料中の形成されたコレステリルエステルの量もしくは結合しているＬＣＡＴの量が前記所定の値であるか、もしくはそれより多い場合、前記対象が、前記心血管疾患もしくは状態を発症するリスクが低いこと、または前記生体試料中の形成されたコレステリルエステルの量もしくは結合しているＬＣＡＴの量が前記所定の値未満である場合、前記対象が、前記心血管疾患もしくは状態を発症するリスクが高いことを決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２３】
対象における心血管疾患または状態の改善に対する１つまたは複数の介入の効果を評価する方法であって、
（ａ）生体試料を前記対象から得るステップと、
（ｂ）前記生体試料をナノ構造と接触させるステップであって、
前記ナノ構造は、無機材料を含むナノ構造コアと、前記ナノ構造コアを取り囲み、それに付着している脂質層を含み、内面および外面を有するシェルとを含む、ステップと、
（ｃ）１種または複数のアポリポタンパク質を前記生体試料から隔離するのに十分な時間、前記ナノ構造を前記生体試料とインキュベートするステップと、
（ｄ）形成されたコレステリルエステルのレベルを検出するステップと、
（ｅ）前記対象を１つまたは複数の介入にさらし、ステップ（ａ）〜（ｄ）を反復するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において形成されたコレステリルエステルのレベルを、ステップ（ｄ）において形成されたコレステリルエステルのレベルと比較するステップと、
（ｇ）ステップ（ｅ）において形成されたコレステリルエステルの量が、ステップ（ｄ）において形成されたコレステリルエステルのレベルより多い場合、前記１つもしくは複数の介入が前記心血管疾患もしくは状態を改善したこと、またはステップ（ｅ）において形成されたコレステリルエステルのレベルが、ステップ（ｄ）において形成されたコレステリルエステルのレベルであるか、もしくはそれ未満である場合、前記１つもしくは複数の介入が前記心血管疾患もしくは状態を改善しなかったことを決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２４】
前記脂質層が脂質二重層である、請求項１９、２２または２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記シェルにおける前記脂質が、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチオエタノール（ＤＰＰＴＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）から構成されている、請求項１９、２２または２３から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記コアが金のコアである、請求項１９、２２または２３から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記金のコアが５〜６ｎｍの直径である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記アポリポタンパク質がアポリポタンパク質ＡＩ（アポ−ＡＩ）である、請求項１９、２２または２３から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ナノ構造上に２〜４個のアポ−ＡＩ分子が存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記シェルの外面に７１〜９５個の脂質が存在する、請求項１９、２２または２３から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記脂質がリン脂質である、請求項１９、２２または２３から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ナノ構造が、約１時間、前記生体試料とインキュベートされる、請求項１９、２２または２３から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
溶液がリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液である、請求項１９または２３から３２に記載の方法。
【請求項３４】
溶液が血清である、請求項１９または２３から３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記血清が、０．１％、０．５％、１％もしくは１０％の濃度に希釈されるか、または全く希釈されない、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記血清が１％の濃度に希釈される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記血清がアポＢを枯渇させてある、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記血清がＰＥＧ８０００を使用してアポＢを枯渇させてある、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象が哺乳動物である、請求項２２から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象がヒトである、請求項２２から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ナノ粒子を単離して前記コレステリルエステルのレベルを測定するステップをさらに含む、請求項２２から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記コレステリルエステルが比色アッセイによって測定され、前記コレステリルエステルのレベルが前記生体試料中のアポＡＩと直接相関している、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記介入が治療介入である、請求項２３から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記介入が運動である、請求項２３から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記介入が食事の改善である、請求項２３から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記生体試料が血清である、請求項２２から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記血清が、０．１％、０．５％、１％、１０％の濃度に希釈されるか、または全く希釈されない、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記血清が１％の濃度に希釈される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ナノ構造がＬＣＡＴをさらに含む、請求項２３から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ナノ構造が１種または複数のコレステロール分子をさらに含む、請求項２３から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
ｉｎ  ｓｉｔｕでナノ構造を合成する方法であって、無機材料を含むナノ構造コアと、前記ナノ構造コアを取り囲み、それに付着している脂質層を含み、内面および外面を有するシェルとを含むナノ構造を、１種または複数のアポリポタンパク質を生体試料から隔離するのに十分な時間、前記生体試料とインキュベートするステップを含む、方法。
【請求項５２】
前記脂質層が脂質二重層である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）機能を測定するためのキットであって、無機材料を含むナノ構造コアと、前記ナノ構造コアを取り囲み、それに付着している脂質層を含むシェルとを含むナノ構造を含み、前記シェルは、１種または複数のアポリポタンパク質を生体試料から隔離するのに十分な時間、前記生体試料とインキュベートされる内面を有する、キット。
【請求項５４】
ｉｎ  ｓｉｔｕでナノ構造を合成する方法であって、無機コアと、前記無機コアを取り囲み、それに付着しており、内面および／または外面を有する脂質シェルとを含むナノ構造を、生体試料中に存在する１種または複数のアポリポタンパク質を隔離するのに十分な時間、前記生体試料とインキュベートするステップを含む、方法。
【請求項５５】
前記ナノ構造がコレステロールを隔離する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
治療として前記生体試料を対象に投与するステップをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
対象におけるコレステロールを隔離する方法であって、
無機コアと、前記無機コアを取り囲み、それに付着しており、内面および／または外面を有する脂質シェルとから本質的になるナノ構造を対象に投与するステップであって、前記ナノ構造はｉｎ  ｖｉｖｏでアポリポタンパク質を隔離することができ、アポリポタンパク質はコレステロールを隔離する、ステップ
を含む、方法。
【請求項５８】
前記脂質シェルがリン脂質から構成されている、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記対象が、高コレステロールと関連する疾患を有する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
高コレステロールと関連する前記疾患が、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、がん、炎症、タンパク質貯蔵疾患、止血疾患、リウマチ性疾患、または神経疾患からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
無機コアと、前記無機コアを取り囲み、それに付着している脂質シェルとから本質的になるナノ構造を含み、ナノ粒子が薬学的に許容される担体中で製剤化されている、治療用または診断用組成物。
【請求項６２】
前記脂質シェルが脂質二重層である、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記脂質シェルが脂質単層である、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６４】
前記シェルにおける脂質が、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチオエタノール（ＤＰＰＴＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）から構成されている、請求項６２または６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記コアが金のコアである、請求項６１から６４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６６】
前記金のコアが５〜６ｎｍの直径である、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
アポリポタンパク質がアポリポタンパク質ＡＩ（アポ−ＡＩ）である、請求項６１から６６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６８】
前記ナノ構造が、２〜４個のアポ−ＡＩ分子を隔離するように構築され、配置される、請求項６１から６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６９】
前記シェルに７１〜９５個の脂質が存在する、請求項６１から６８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７０】
前記脂質がリン脂質である、請求項６１から６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７１】
生体試料中の代謝産物のレベルを評価するためのアッセイであって、
生体試料を、無機材料を含むナノ構造コアと、前記ナノ構造コアを取り囲み、それに付着している脂質層と、アポリポタンパク質を有する生体試料との、脂質の単層または二重層を有するシェルとから構成されているナノ粒子と接触させるステップと、前記ナノ構造を単離するステップと、生体試料中の前記代謝産物の尺度として前記ナノ構造と結合しているアポリポタンパク質の存在を検出するステップとを含む、アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年９月１５日に出願された米国仮出願番号第６２／３９５，２４５号に基づく米国特許法第１１９条（ｅ）項の下の利益を主張しており、その全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府支援
本発明は、米空軍資材コマンド法務局（ＡＦＭＣＬＯ／ＪＡＺ）によって授与されたＦＡ８６５０−１５−２−５５１８の下、政府支援でなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、概して、代謝マーカーおよび酵素マーカーの検出ならびに関連する製品および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
いくつかの試験は運動の間接的な態様を測定するが、現在、リアルタイムでの運動の生理的効果の正確かつ高感度の追跡を可能にする試験は存在しない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
本発明は、一部の態様では、筐体と、直接または間接のいずれかで少なくとも部分的に筐体の外側部分と接続された血液抽出要素と、筐体の少なくとも一部分内でＬＣＡＴ活性化因子と結合することができるナノ構造とを備えるデバイスである。一部の実施形態では、デバイスはウェアラブルまたはポータブルデバイスである。
【０００６】
他の実施形態では、ナノ構造は、固体のコアと、脂質層とを含む。
【０００７】
ＬＣＡＴ活性化因子は、一部の実施形態では、アポリポタンパク質である。
【０００８】
ナノ構造は、他の実施形態では、金のコアと、脂質二重層または単層とを有する。
【０００９】
一部の態様では、本発明は、運動または代謝関連酵素を迅速に検出する方法であって、生体試料を、ＬＣＡＴ活性化因子と結合することができる脂質を含有する標識されたナノ粒子と接触させるステップと、少なくとも１５分間、ナノ粒子を生体試料とインキュベートするステップと、生体試料中の運動関連酵素の存在の指標としてＬＣＡＴ活性化を測定するステップとを含む、方法である。一部の実施形態では、生体試料は血液である。
【００１０】
一部の実施形態では、ＬＣＡＴ活性化因子はアポリポタンパク質である。
【００１１】
他の実施形態では、標識は蛍光標識である。さらに他の実施形態では、蛍光標識はナノ構造におけるリン脂質上にある。
【００１２】
方法は、一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。一部の実施形態では、生体試料は対象から単離され、方法はウェアラブルまたはポータブルデバイスを使用することによって実施される。
【００１３】
一部の実施形態では、ナノ構造は、無機材料を含むナノ構造コアと、ナノ構造コアを取り囲み、それに付着している脂質層を含み、内面および外面を有するリン脂質単層または二重層を有するシェルとを含む。
【００１４】
一部の実施形態では、シェルにおける脂質の少なくとも８０％は天然のリン脂質である。さらに他の実施形態では、シェルにおける脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチオエタノール（ＤＰＰＴＥ）、ホスファチジルコリン（phosphotidylcholine）（ＰＣ）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）から構成されている。
【００１５】
本発明は、他の態様では、蛍光標識された、ホスファチジル（phophatidyl）コリンまたはコレステロール脂質などの脂質を含む組成物である。
【００１６】
任意選択で、構造はアポリポタンパク質を含む。脂質シェルは脂質二重層または脂質単層であってもよい。
【００１７】
一部の実施形態では、コアは金のコアなどの無機コアである。実施形態では、構造は金のコアに対して６０〜２５０倍過剰の脂質を有する。他の実施形態では、コアは有機コアである。
【００１８】
別の態様によれば、本発明は、ＨＤＬ機能を測定するための方法アッセイであって、無機材料を含むナノ構造コアと、ナノ構造コアを取り囲み、それに付着しており、シェルが脂質の単層または二重層を有する、脂質層とから構成されているナノ粒子の溶液を、アポリポタンパク質（apolipoportein）を有する溶液と接触させるステップを含み、一部の場合、アポリポタンパク質はアポリポタンパク質Ａ−Ｉであり、一部の場合、溶液はレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼも含有する。
【００１９】
別の態様によれば、本発明は、対象において心血管疾患または状態を発症するリスクを決定する方法であって、生体試料を対象から得るステップと、生体試料をナノ構造と接触させるステップであって、ナノ構造は、無機材料を含むナノ構造コアと、ナノ構造コアを取り囲み、それに付着しており、シェルが内面および外面を有する、脂質層とを含む、ステップと、１種または複数のアポリポタンパク質および一部の場合、コレステロールを試料から隔離するのに十分な時間、ナノ構造を生体試料とインキュベートするステップと、形成されたコレステリルエステルの量を検出するステップと、生体試料中の形成されたコレステリルエステルの量を所定の値と比較するステップであって、所定の値は、心血管疾患または状態のリスクが低減している可能性がある対象における形成されたコレステリルエステルのレベルを表す、ステップと、生体試料中の形成されたコレステリルエステルの量が所定の値であるか、もしくはそれより多い場合、対象が、心血管疾患または状態を発症するリスクが低いこと、または生体試料中の形成されたコレステリルエステルの量が所定の値未満である場合、対象が、心血管疾患もしくは状態を発症するリスクが高いことを決定するステップとを含む、方法である。
【００２０】
別の態様によれば、本発明は、対象における心血管疾患または状態の改善に対する１つまたは複数の介入の効果を評価する方法であって、生体試料を対象から得るステップと、生体試料をナノ構造と接触させるステップであって、ナノ構造は、無機材料を含むナノ構造コアと、ナノ構造コアを取り囲み、それに付着している脂質層を含み、内面および外面を有するシェルとを含む、ステップと、１種または複数のアポリポタンパク質、および一部の場合、コレステロール分子を生体試料から隔離するのに十分な時間、ナノ構造を試料とインキュベートするステップと、形成されたコレステリルエステルのレベルを検出するステップと、対象を１つまたは複数の介入にさらし、生体試料を対象から得るステップと、生体試料をナノ構造と接触させるステップであって、ナノ構造は、無機材料を含むナノ構造コアと、ナノ構造コアを取り囲み、それに付着している脂質層を含み、内面および外面を有するシェルとを含む、ステップと、１種または複数のアポリポタンパク質および一部の場合、コレステロールを生体試料から隔離するのに十分な時間、ナノ構造を試料とインキュベートするステップと、形成されたコレステリルエステルのレベルを検出するステップと、１つまたは複数の介入の前に形成されたコレステリルエステルのレベルを、１つまたは複数の介入の後に形成されたコレステリルエステルのレベルと比較するステップと、１つもしくは複数の介入の後に形成されたコレステリルエステルの量が、１つもしくは複数の介入の前に形成されたコレステリルエステルのレベルより多い場合、１つもしくは複数の介入が心血管疾患リスクもしくは状態を改善したこと、または１つもしくは複数の介入の後に形成されたコレステリルエステルのレベルが、１つもしくは複数の介入の前に形成されたコレステリルエステルのレベルであるか、もしくはそれ未満である場合、１つもしくは複数の介入が心血管疾患リスクもしくは状態を改善しなかったことを決定するステップとを含む、方法である。
【００２１】
一部の実施形態では、脂質層は脂質二重層または単層である。
【００２２】
一部の実施形態では、シェルにおける脂質の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％は天然のリン脂質である。一部の実施形態では、シェルにおける脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチオエタノール（ＤＰＰＴＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）から構成されている。
【００２３】
一部の実施形態では、コアは金のコアである。一部の実施形態では、金のコアは５〜６ｎｍの直径である。
【００２４】
一部の実施形態では、アポリポタンパク質はアポリポタンパク質ＡＩ（アポ−ＡＩ）である。一部の実施形態では、ナノ構造上に２〜４個のアポリポタンパク質−ＡＩ分子が存在する。
【００２５】
一部の実施形態では、シェルの外面に７１〜９５個の脂質が存在する。一部の実施形態では、脂質はリン脂質である。
【００２６】
一部の実施形態では、ナノ構造は、約１時間、生体試料とインキュベートされる。
【００２７】
一部の実施形態では、溶液はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液である。一部の実施形態では、溶液は血清である。一部の実施形態では、血清は、０．１％、０．５％、１％、１０％の濃度に希釈されるか、または全く希釈されない。
【００２８】
一部の実施形態では、血清はアポＢを枯渇させてある。ある特定の実施形態では、血清はＰＥＧ８０００を使用してアポＢを枯渇させてある。
【００２９】
一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、対象はヒトである。
【００３０】
ＬＣＡＴ活性の測定を含む本明細書に記載されている実施形態のいずれかでは、ＬＣＡＴ活性の測定は、結合タンパク質ならびに酵素活性の代替またはさらなる測定と置き換えることができる。一部の場合、結合タンパク質はアポＡＩ（酵素（ＬＣＡＴ）の特異的活性化因子とも称される）である。検出されたコレステリルエステルの量は、粒子によって隔離されたアポＡＩの量と相関し、両方は代替としてまたは追加として検出されてもよい。脂質官能化ナノ粒子は溶液に加えられてもよく、それによって、その脂質官能化ナノ粒子は、代謝と関連するか、または心血管疾患リスク評価にとって重要であるタンパク質（例えば、アポＡＩ、アポＢ１００など）を特異的に隔離し、次いで結合しているタンパク質の量が、タンパク質が結合している金ナノ粒子の量を測定することによって測定される。これは、粒子上および粒子外のアポＡ１を捕捉する抗体結合アッセイなどの結合アッセイによって達成することができるが、どれくらいの金が結合しているかを正確に見る手段として金を使用する（例えば、比色分析、銀増感、電気、分光計測などによって）。
【００３１】
一部の実施形態では、方法は、脂質官能化ナノ粒子の表面と結合する代謝関連タンパク質のレベルを測定するために、ナノ粒子を単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、タンパク質はアポリポタンパク質Ａ−Ｉである。タンパク質は、他の実施形態では、アポリポタンパク質Ｂ１００である。吸着タンパク質は、比色分析、分光法、電気によって、または無機ナノ粒子コアの存在に基づく当業者に公知の増感技術によって検出することができる。コアは金のナノ粒子であってもよい。コアは、一部の実施形態では、磁性ナノ粒子であってもよい。
【００３２】
一部の実施形態では、方法は、コレステリルエステルのレベルを測定するために、ナノ粒子を単離してステップをさらに含む。
【００３３】
他の実施形態では、方法は、ナノ粒子と結合しているＬＣＡＴ活性化因子のレベルを測定するために、ナノ粒子を単離するステップをさらに含む。
【００３４】
一部の実施形態では、コレステリルエステルは比色アッセイによって測定され、コレステリルエステルのレベルは生体試料中のアポＡＩと直接相関する。
【００３５】
一部の実施形態では、介入は治療介入である。一部の実施形態では、介入は運動である。一部の実施形態では、介入は食事の改善である。
【００３６】
一部の実施形態では、生体試料は血清である。一部の実施形態では、血清は、０．１％、０．５％、１％もしくは１０％の濃度に希釈されるか、または全く希釈されない。一部の実施形態では、血清は１％の濃度に希釈される。
【００３７】
一部の実施形態では、ナノ構造はＬＣＡＴをさらに含む。一部の実施形態では、ナノ構造は１種または複数のコレステロール分子をさらに含む。
【００３８】
別の態様によれば、本発明は、ｉｎ  ｓｉｔｕでナノ構造を合成する方法であって、無機材料を含むナノ構造コアと、ナノ構造コアを取り囲み、それに付着しており、シェルが内面および外面を有する、脂質層とを含むナノ構造を、１種または複数のアポリポタンパク質、および一部の場合、コレステロールを生体試料から隔離するのに十分な時間、生体試料とインキュベートするステップを含む、方法である。
【００３９】
一部の実施形態では、脂質層は脂質二重層である。
【００４０】
一部の実施形態では、シェルにおける脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチオエタノール（ＤＰＰＴＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）から構成されている。
【００４１】
一部の実施形態では、コアは金のコアである。一部の実施形態では、金のコアは５〜６ｎｍの直径である。
【００４２】
一部の実施形態では、アポリポタンパク質はアポリポタンパク質ＡＩ（アポ−ＡＩ）である。一部の実施形態では、ナノ構造上に２〜４個のアポリポタンパク質−ＡＩ分子が存在する。
【００４３】
一部の実施形態では、シェルの外面に７１〜９５個の脂質が存在する。一部の実施形態では、脂質はリン脂質である。
【００４４】
一部の実施形態では、生体試料は血清である。一部の実施形態では、血清は、０．１％、０．５％、１％または１０％の濃度に希釈される。一部の実施形態では、血清は１％の濃度に希釈される。
【００４５】
一部の実施形態では、ナノ構造はＬＣＡＴをさらに含む。一部の実施形態では、ナノ構造は１種または複数のコレステロール分子をさらに含む。
【００４６】
別の態様によれば、本発明は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）機能を測定するためのキットであって、無機材料を含むナノ構造コアと、ナノ構造コアを取り囲み、それに付着している脂質層を含むシェルとを含むナノ構造を含み、シェルは、１種または複数のアポリポタンパク質、および一部の場合、コレステロールを生体試料から隔離するのに十分な時間、生体試料とインキュベートされる内面を有する、キットである。
【００４７】
一部の実施形態では、脂質層は脂質二重層である。
【００４８】
一部の実施形態では、シェルにおける脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチオエタノール（ＤＰＰＴＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）から構成されている。
【００４９】
一部の実施形態では、コアは金のコアである。一部の実施形態では、金のコアは５〜６ｎｍの直径である。
【００５０】
一部の実施形態では、アポリポタンパク質はアポリポタンパク質ＡＩ（アポ−ＡＩ）である。一部の実施形態では、ナノ構造上に２〜４個のアポリポタンパク質−ＡＩ分子が存在する。
【００５１】
一部の実施形態では、シェルの外面に７１〜９５個の脂質が存在する。一部の実施形態では、脂質はリン脂質である。
【００５２】
一部の実施形態では、生体試料は血清である。一部の実施形態では、血清は、０．１％、０．５％、１％または１０％の濃度に希釈される。
【００５３】
一部の実施形態では、ナノ構造はＬＣＡＴをさらに含む。一部の実施形態では、ナノ構造は１種または複数のコレステロール分子をさらに含む。
【００５４】
別の態様によれば、本発明は、ｉｎ  ｓｉｔｕでナノ構造を合成する方法であって、ナノ構造無機コアと、ナノ構造無機コアを取り囲み、それに付着しており、内面および／または外面を有する脂質シェルとを含むナノ構造を、１種または複数のアポリポタンパク質、および一部の場合、コレステロールを生体試料から隔離するのに十分な時間、生体試料とインキュベートするステップを含む、方法である。次いでｉｎ  ｓｉｔｕで形成されたナノ構造は、ナノ構造を投与した後、またはここでｉｎ  ｓｉｔｕで形成されたナノ構造を含有する生体試料を個体に投与する際に治療として使用される。
【００５５】
他の態様では、本発明は、ｉｎ  ｓｉｔｕでナノ構造を合成する方法であって、無機コアと、無機コアを取り囲み、それに付着しており、内面および／または外面を有する脂質シェルとを含むナノ構造を、生体試料に存在する１種または複数のアポリポタンパク質を隔離するのに十分な時間、生体試料とインキュベートするステップを含む、方法である。
【００５６】
一部の実施形態では、ナノ構造はコレステロールを隔離する。他の実施形態では、方法は、治療として生体試料を対象に投与するステップをさらに含む。
【００５７】
他の態様では、本発明は、無機コアと、無機コアを取り囲み、それに付着しており、内面および／または外面を有する脂質シェルとから本質的になるナノ構造を対象に投与するステップであって、ナノ構造はｉｎ  ｖｉｖｏでアポリポタンパク質を隔離することができ、アポリポタンパク質はコレステロールを隔離する、ステップによって対象におけるコレステロールを隔離する方法である。
【００５８】
一部の実施形態では、脂質シェルはリン脂質から構成されている。他の実施形態では、対象は高コレステロールと関連する疾患を有する。高コレステロールと関連する疾患は、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、がん、炎症、タンパク質貯蔵疾患、止血疾患、リウマチ性疾患、または神経疾患からなる群から選択され得る。
【００５９】
治療用または診断用組成物が本発明の他の態様において提供される。組成物は、無機コアと、無機コアを取り囲み、それに付着している脂質シェルとから本質的になるナノ構造であり、ナノ粒子は薬学的に許容される担体中で製剤化されている。組成物はプロドラッグであってもよい。
【００６０】
一部の実施形態では、脂質シェルは脂質二重層または脂質単層である。他の実施形態では、シェルにおける脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチオエタノール（ＤＰＰＴＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）から構成されている。
【００６１】
一部の実施形態では、コアは、任意選択で５〜６ｎｍの直径である金のコアである。
【００６２】
一部の実施形態では、アポリポタンパク質はアポリポタンパク質ＡＩ（アポ−ＡＩ）である。ナノ構造は、２〜４個のアポ−ＡＩ分子を隔離し、任意選択でシェル内に７１〜９５個の脂質を有するように構築され、配置され得る。
【００６３】
一部の実施形態では、脂質はリン脂質である。
【００６４】
本発明の制限の各々は本発明の様々な実施形態を包含することができる。したがって、任意の１つの要素または要素の組合せを含む本発明の制限の各々は本発明の各態様に含まれ得ることが予測される。本発明は、本出願において、以下の説明に記載されているか、または図面に例示されている構築物の詳細および構成要素の配置に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な手段で実行または実施することができる。本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の詳細な説明、実施例、特許請求の範囲および図面に記載されている。本発明の他の特徴、目的および利点は、説明および特許請求の範囲から明らかになる。
【００６５】
ナノ粒子およびナノ構造という用語は、本明細書において交換可能に使用される。
【００６６】
本発明の限定しない実施形態は、添付の図に関して、例として記載されるものであり、これは、概略図であり、尺度通りに描画することを目的としていない。図において、例示されるそれぞれ同一のまたは、ほぼ同一の構成成分は、通常、単一の数値により表される。明確にする目的のために、すべての構成成分が、すべての図中で、標識されるわけではなく、例証が、必ずしも、当業者が本発明を理解することを可能にするものではない場合、本発明の各実施形態のすべての構成成分が示されるわけでもない。これらの図に関して、以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、例示的蛍光脂質として使用されるＴｏｐＦｌｕｏｒ  ＰＣによる、各構成ステップを伴うＨＤＬ−ＮＰの形成を示す概略図である。
【００６８】
【図２】図２は、精製済みのＬＣＡＴおよびコレステロールの混合物と共に、蛍光ＨＤＬ−ＮＰを２４時間インキュベートした結果、ＴｏｐＦｌｕｏｒ標識ＰＣ（図２、左側）およびＴｏｐＦｌｕｏｒ  ＴＭＲ標識ＰＣ（図２、右側）を使用して蛍光が増加することを実証するために、蛍光ホスファチジルコリンをＨＤＬ−ＮＰの外葉に取り込むアッセイの結果を示す１組のグラフである。
【００６９】
【図３】図３は、二重層ＮＰと称する、アポＡＩを含まない、ＴｏｐＦｌｕｏｒを担持したＨＤＬ−ＮＰのバリアントを利用したアッセイの結果を示すグラフである。ＬＣＡＴ活性についてのＨＤＬ−ＮＰの特異性を、図３のデータ中に示し、これによって、コレステロールおよびＬＣＡＴの存在下で、ＴｏｐＦｌｕｏｒ  ＨＤＬ  ＮＰからの蛍光シグナルは、二重層ＮＰ群よりも有意に増加し（ｐ＝０．０００１２）、コレステロールを担持させた二重層ＮＰは、ＬＣＡＴを含むまたは含まない蛍光シグナルの有意な変化を示さない（ｐ＝０．２２）ことが実証される。
【００７０】
【図４】図４は、ＴｏｐＦｌｕｏｒ標識ＨＤＬ−ＮＰおよび二重層ＮＰを、希釈されたヒト血清と共にインキュベートすることによって、ＴｏｐＦｌｕｏｒ  ＨＤＬ−ＮＰに対する酵素活性の時間経過が、かなり速やかであり、ＮＰへの血清付加の３０分以内に蛍光が有意に増加し（ｐ＝０．００００３）（図４）、数時間のインキュベーションが推奨される既存のＬＣＡＴアッセイに対して著しく改善することを示しているアッセイの結果を示すグラフである。
【００７１】
【図５】図５Ａ〜５Ｅは、（図５Ａ）アポＡＩ、コレステロールおよびＬＣＡＴでドープ処理したＰＢＳ中のｉｎ  ｓｉｔｕ  ＨＤＬ  ＮＰ（ＩＳＨＤＬ  ＮＰ）の合成を示す図である。（図５Ｂ）アポＡＩの量を増加させながらドープ処理したＰＢＳ中のインキュベーション後のＩＳ−ＨＤＬ  ＮＰについてのウエスタンブロットを示す図である。（図５Ｃ）ヒト血清中のＩＳ−ＨＤＬ  ＮＰの合成を示す図である。（図５Ｄ）ヒト血清の量を増加させながらインキュベートした後のアポＡＩについてのウエスタンブロットを示す図である。陽性対照は、アポＡＩ単独、１％ヒト血清、および従来の方法で合成されたＨＤＬ  ＮＰである。（図５Ｅ）アポＡＩ隔離後のＩＳＨＤＬ  ＮＰのコレステロール流出能力の確認を示す図である。
【００７２】
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、（図６Ａ）ＩＳＨＤＬ  ＮＰにおけるコレステロールエステル化の測定についての反応スキームを示す図である。ＩＳＨＤＬ  ＮＰを、コレステロールオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびａｍｐｌｅｘ  ｒｅｄ試薬の混合物に加えることにより、高蛍光生成物であるレゾルフィンが生成される。コレステロールエステラーゼを加えるまたは脱落させることにより、ＩＳＨＤＬ  ＮＰにおけるコレステリルエステル含有量の決定が可能になる。（図６Ｂ）ＰＢＳ中のアポＡＩ／コレステロール／ＬＣＡＴおよび（図６Ｃ）ヒト血清と共にインキュベートした後の、ＩＳＨＤＬ  ＮＰにおけるコレステロールの測定を示す図である。
【００７３】
【図７】図７は、血清アポＡＩ  対  血清インキュベーション後のＩＳＨＤＬ  ＮＰにおけるアポＡＩ含有量の相関プロットである。
【００７４】
【図８】図８は、ヒト血清試料中のアポＡＩ含有量  対  ＩＳＨＤＬ  ＮＰにおけるＬＣＡＴ活性（すなわち、ＣＥ）の相関プロットを示す図である。
【００７５】
【図９】図９は、ＨＤＬによって媒介されるコレステロール流出  対  アポＢ枯渇ヒト血清中でインキュベートした後のＩＳＮＰにおける、ＬＣＡＴ活性（すなわち、ＣＥ）の相関プロットである。
【００７６】
【図１０】図１０は、（Ａ）ＩＳＨＤＬ  ＮＰを生成するために、アポＢ枯渇ヒト血清をＢＬ−ＮＰと共にインキュベートすることによるＨＤＬ機能の測定を示す図である。ＩＳＨＤＬ  ＮＰを単離し、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（商標）コレステロールアッセイを行うことにより、ＣＥ量は、＜１日で測定することができる。（Ｂ）伝統的な細胞に基づくアッセイによるコレステロール流出パーセンテージの測定を示す図である。Ｊ７７４マクロファージを、１日目に播種し、その後、それぞれ２日目および３日目に、３Ｈ−コレステロールおよび環式ＡＭＰと共にインキュベートした。４日目に、アポＢ枯渇血清を、４時間細胞に加え、その後、上澄みを単離し、液体シンチレーションカウンティングにより３Ｈ−コレステロールを定量し、したがって、コレステロール流出能力、およびＨＤＬ機能の測定を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
詳細な説明
本発明は、一部の態様では、心血管疾患および他の健康状態のヒトのリスクならびに血清タンパク質レベルの変化およびコレステロール代謝に関与する酵素の活性に起因する運動の効果を測定することができる迅速な血液試験の発見を含む。アッセイは、例えば、急および長期的な運動に応答する心血管の健康の追跡を可能にするのに有用である。標的タンパク質および酵素の活性は、ベースラインレベルで存在し、次いで酵素活性は運動後に増加することが報告されている。本発明の方法は、分析のための血液（針で刺すことにより得られる）などの少量の生体試料のみを必要とする。方法は、タンパク質吸着および酵素活性をリアルタイムで正確に測定するための手段として合成脂質官能化ナノ粒子を使用して達成される。
【００７８】
方法は、患者からの少量の血液試料の除去を可能にする、任意の標準的な医療機器、健康モニター（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）または実験機器を使用して実施することができる。また、アッセイは、少量の採血を可能にするように改変されたフィットネストラッカーなどのウェアラブルデバイスまたは他のポータブルデバイスと共に使用され得ることも発見されている。
【００７９】
本発明において有用な合成ナノ粒子は、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）などの運動関連酵素の活性を追跡するためのより大きな特異性を可能にする。ＬＣＡＴレベルまたは活性を測定する既存の試験キットは、提供された基質に対して活性を示すホスホリパーゼＡ２などの他の酵素に起因して、血清試験において交絡変数を有し得る。これらのタイプのアッセイはまた、非常に遅い（数時間）。脂質ナノ構造の構造は、ＬＣＡＴの活性化因子であるタンパク質（アポＡＩ）の隔離を可能にし、これにより、既存の試験よりも特異性が改善した。さらに、現在の蛍光に基づく試験は、それによって活性の特異性を評価することができる、アポＡＩが結合している脂質ナノ構造などの固有のＬＣＡＴ活性化因子を含まない。
【００８０】
したがって、態様では、本発明は、血液中のアポＡ１などのＬＣＡＴ活性化因子を隔離するためにｉｎ  ｓｉｔｕでのナノ粒子（ＮＰ）の合成を利用して、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の活性を測定するための血液試験である。隔離したＬＣＡＴ活性化因子を含有するＮＰは、酵素活性についての基質として機能することができる。最小量の血清（例えば、１滴の血液または１マイクロリットルまでの血清）が測定に必要とされ、試験結果は数分以内に得られる。ＬＣＡＴは、その活性が運動後に急激に上昇し、次いで活性がより低いベースラインレベルまで低下すると考えられる酵素である。例えば、運動の前および後にＬＣＡＴ活性を測定することによって、それらの「分子適応度（molecular  fitness）」スコアに関する着想を得ることができる。
【００８１】
ＬＣＡＴは、ＨＤＬ−ＮＰの表面と強固に会合しているタンパク質である、アポリポタンパク質Ａ−１によって活性化されることが公知であり、それによってＬＣＡＴは遊離コレステロールをエステル化してコレステリルエステルを形成する。ＬＣＡＴの基質はコレステロールおよびリン脂質であり、それによってリン脂質のＳＮ２位におけるアルキル尾部は酵素によってコレステロール−ＯＨ基に転移される。ＮＰは、市販の５ｎｍのＡｕＮＰを使用して形成することができる。一部の実施形態では、アポＡ１は試料への曝露前にＮＰに添加されてもよく、他の実施形態では、生体試料中のアポＡ１はＮＰによって単に隔離される。ＮＰが表面上にアポＡ１を有して設計される場合、アポＡＩは５倍モル過剰で５ｎｍのＡｕＮＰの水溶液に加えられてもよい。一部の実施形態では、使用される脂質は、ａ）１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチオエタノール（ＤＰＰＴＥ）、ＡｕＮＰ３２の表面に共有結合して内葉を形成するチオール化脂質、ｂ）アシル鎖のｓｎ２位にコンジュゲートしたフルオロフォアを有するホスファチジルコリン（ＰＣ）脂質（例えば、ＴｏｐＦｌｕｏｒ  ＰＣ、１−パルミトイル−２−（ジピロメタンホウ素ジフルオリド）ウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）および最後に、ｃ）ＮＰ脂質二重層の外葉の大部分を形成する１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）である。図１は、蛍光脂質の例として使用したＴｏｐＦｌｕｏｒ  ＰＣによる、各成分段階でのＮＰの形成を示す。ＮＰはまた、リン脂質の表面単層または二重層を有する５ｎｍのＡｕＮＰの水溶液を、生体液などのアポＡ−Ｉを含有する溶液とインキュベートすることによって、ｉｎ  ｓｉｔｕで形成することができる。
【００８２】
蛍光リン脂質のさらなる非限定的な例には、限定されないが、脂肪酸標識化および頭部基標識化リン脂質が含まれる。蛍光標識されたリン脂質の非限定的な例には、ＴｏｐＦｌｕｏｒ（登録商標）により標識されたカルジオリピン、ＮＢＤまたはＤａｎｓｙｌにより標識されたホスファチジルセリン、およびダンシルにより標識されたホスファチジルエタノールアミン、ピレンフルオレセイン、リサミンローダミンＢ、ＮＢＤ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７などが含まれる。
【００８３】
これらの粒子は少なくとも２つの理由のために理想的である。アポＡ１が付着しているＮＰは、天然ＨＤＬと同様に遊離コレステロールを隔離することが以前に実証されている。また、アポＡ１タンパク質の含有は、ＬＣＡＴを活性化し、ＮＰと結合しているコレステロールに対するその活性を促進するための補因子として役立つ。蛍光ホスファチジルコリンをＮＰの外葉に組み込むことによって、精製したＬＣＡＴおよびコレステロールの混合物との蛍光ＮＰの２４時間のインキュベーションの結果、蛍光が増加することが実証されている。ＬＣＡＴ活性に対するＮＰの特異性もまた、実証されている。さらに、一部のアッセイにおいて、ＴｏｐＦｌｕｏｒ  ＮＰに対する酵素活性の経時変化は非常に迅速であり、ＮＰへの血清添加後３０分以内に蛍光が有意に増加することが決定された。したがって、本発明は迅速な試験を可能にする。一部の実施形態では、アッセイは５分で完了することができる。他の実施形態では、アッセイは、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４５分、６０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間または１０時間以内に完了することができる。
【００８４】
本明細書に記載されている発明は、一部の態様では、固体コアと、脂質シェルとを有するナノ粒子（ＮＰ）などの合成ナノ構造を使用したＬＣＡＴ活性の標的化測定のための多目的プラットフォームである。ＮＰは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて使用されてもよいか、または医療デバイスもしくはウェアラブルデバイスなどの担体に組み込まれてもよいか、またはＮＰは治療として使用されてもよい。
【００８５】
ナノ構造は、例えば、ＨＤＬ  ＮＰを含む。ＨＤＬ−ＮＰは、サイズおよび形状を制御するために金のコアなどのナノ粒子コア、ならびにＬＣＡＴ活性化因子を保有する修飾脂質を使用して合成される。合成高密度リポタンパク質ナノ粒子は、天然ＨＤＬ（「良好な」コレステロール）と類似の特徴で設計されている。
【００８６】
あるいは、ナノ構造は、サイズおよび形状を制御するために金のコアなどのナノ粒子コア、ならびにＬＣＡＴ活性化因子を保有するが、ＬＣＡＴ活性化因子を付加していない修飾脂質を使用して合成され得る。これらは単にＮＰと称される。ＮＰは、生体試料においてまたはｉｎ  ｖｉｖｏで対象においてＬＣＡＴ活性化因子と相互作用するように設計される。
【００８７】
さらに、心血管疾患（ＣＶＤ）は依然として先進国世界において最も一般的な死因であり、ＣＶＤを発症する個体のリスクを評価し、次いで特定の介入またはライフスタイルの改善がリスクをどのように変化させるかを追跡することが依然として重要である。コレステロール流出アッセイ（ＣＥＡ）は、心血管疾患または状態を発症するリスクを予測するデータを提供する。臨床的に検証されているが、ＣＥＡアッセイは、とりわけ、高価であり、訓練された人材を必要とし、放射性成分を使用し、ハイスループットまたは臨床用途に適さない。ＣＥＡの臨床移行における課題により、またＨＤＬ機能について利用可能な試験の幅を増加させるため、本明細書に記載されているアッセイは、重要なＨＤＬ機能パラメーターを捉えるために開発され、生成されたデータは臨床的に検証されたＣＥＡと相関する。
【００８８】
一部の態様では、本発明はＨＤＬ機能を評価するための新規方法を提供する。リン脂質二重層ナノ粒子（ＢＬ−ＮＰ）センサープラットフォームは、コレステリルエステルの定量により試料中のアポＡＩの量およびＬＣＡＴ活性を間接的に測定する。一部の態様では、無機コアを有するＢＬ−ＮＰは、ＬＣＡＴ活性を支援する、ＨＤＬ様ナノ粒子（ＨＤＬ−ＮＰ）を形成するために溶液からアポＡＩを自然に集合させるように表面官能化されている。ＢＬ−ＮＰは、試料中のアポＡＩの存在量に応じて純粋な溶液およびヒト血清からアポＡＩを迅速かつ優先的に吸着する。一部の実施形態では、血清を使用して、ｉｎ  ｓｉｔｕで形成されたＮＰ（ＩＳＨＤＬ−ＮＰ）は、ＩＳＨＤＬ−ＮＰにおけるコレステロールのＬＣＡＴ媒介性エステル化のためのアポＡＩおよび基質を提供する。ＩＳＨＤＬ  ＮＰにおけるアポＡＩはＬＣＡＴの補因子であり、一方で、ナノ粒子表面におけるコレステロールおよびリン脂質はＬＣＡＴのための基質である。ＨＤＬ−ＮＰの単離後、コレステリルエステルが検出され得る。コレステリルエステルのレベルは、試料中のＢＬ−ＮＰが結合しているアポＡＩと直接相関する。
【００８９】
特許請求されている本発明の利点の非限定的な例には以下が含まれる：（１）ＩＳＨＤＬ−ＮＰと結合するアポＡＩの量が試料中で利用可能なアポＡＩに依存するように、ＢＬ−ＮＰがアポＡＩを定量的に隔離すること（図５Ａ〜５Ｅ）；（２）アポＡＩのレベルが、血清中のＩＳＨＤＬ−ＮＰと結合しているコレステリルエステルの量と相関し、したがって、一部の態様では、血清中のアポＡＩのレベルの変化を検出するためのＩＳＨＤＬ  ＮＰについての可能性を実証すること。そして、（３）ＩＳＨＤＬ  ＮＰによって形成され、その中に隔離されたコレステリルエステルは、臨床的に検証されたＣＥＡを使用して測定された血清に対する総コレステロール流出と有意に相関する。さらに、ＢＬ−ＮＰバイオセンサープラットフォームは、数日間にわたって結果を提供し、放射性物質を使用する、ＣＥＡなどの現在の利用可能な方法と対照的に、数時間で結果を提供し、放射性物質を使用しない。
【００９０】
一部の態様では、コレステリルエステルを直接測定するための本明細書に記載されているＢＬ−ＮＰバイオセンサープラットフォームは、治療介入、運動または食事の改善などの介入から生じ得るアポＡＩおよびＬＣＡＴ活性の変化を検出する。
【００９１】
したがって、本明細書に記載されているＢＬ−ＮＰプラットフォームの複数の利点は、さらなる患者モニタリングに関する重要なＨＤＬ機能パラメーター（例えば、アポＡＩ、ＬＣＡＴ活性など）の広範なポイントオブケア、ハイスループット試験を可能にし得る。
【００９２】
また、本発明の態様によれば、単に無機コアと、脂質二重層または単層とから構成され、いかなるアポリポタンパク質も含まない最小構造を有するＮＰが、ｉｎ  ｖｉｖｏで送達されると活性剤として機能することも発見された。これらのＮＰは、高密度リポタンパク質ナノ粒子（ＨＤＬ  ＮＰ）と同様に機能し、それらの形状、サイズ、表面組成（アポリポタンパク質Ａ１、リン脂質）において天然の球状ＨＤＬを模倣し、細胞からコレステロールを機能的に流出させる能力を有する。高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、リン脂質、アポリポタンパク質およびコレステロールから血清中で動的に集合する天然に存在するナノ粒子である。ＨＤＬはコレステロールの逆輸送に関与しており、心血管疾患の発生率の低下と疫学的に相関している（Asztalos,  B.  F.、Tani,  M.およびSchaefer,  E.  J.ら、Metabolic  and  functional  relevance  of  HDL  subspecies.  Current  Opinion  in  Lipidology  ２２巻、１７６〜１８５頁（２０１１年）；Barter,  P.ら、HDL  cholesterol,  very  low  levels  of  LDL  cholesterol,  and  cardiovascular  events.  N.  Engl.  J.  Med.  ３５７巻、１３０１〜１３１０頁（２００７年）。天然ＨＤＬはスカベンジャー受容体Ｂ−１型（ＳＲ−Ｂ１）と結合することが公知であり、ＳＲ−Ｂ１はコレステリルエステルの取り込みならびに遊離コレステロールの取り込みおよび流出を媒介する。
【００９３】
全く予期せぬことに、アポＡ１を含まなかったＮＰが、生体試料中のコレステロールを依然として隔離することができることが発見された。これは、アポＡ１がコレステロールを隔離するプロセスにおける必須成分であるので驚くべきことであった。機構に拘束されないが、ＮＰは、血清および他の生体試料中でアポＡ１と結合することができ、ｉｎ  ｓｉｔｕまたはｉｎ  ｖｉｖｏでＨＤＬ−ＮＰを効果的に形成し、次いでコレステロールを隔離することができると考えられる。ＮＰはＨＤＬ−ＮＰに変換されるプロドラッグと同様に機能する。したがって、本明細書に記載されているＮＰは治療剤であり、過剰なコレステロールに関連する障害の処置に有用である。
【００９４】
本明細書に記載されているＮＰを投与することによって、循環血清ＨＤＬレベル（例えば、低いＨＤＬレベル）が増加し得る。これは、例えば、コレステロール逆輸送を増大させることによってアテローム性動脈硬化症を予防し、潜在的に好転させる有望な治療アプローチを提供することができる。他の実施形態では、本明細書に記載されている組成物および方法は、コレステロールまたはＬＤＬレベルを低下させる（例えば、高コレステロールＬＤＬレベルを低下させる）ために使用することができる。
【００９５】
本明細書に記載されている方法から利益を得ることができる高コレステロールレベルに関連する疾患状態には、例えば、アテローム性動脈硬化症、静脈硬化症またはコレステロールもしくは他の物質を含有するプラークの沈着物が静脈の内膜もしくは内側中膜（inner  media）内に形成される任意の静脈状態、急性冠症候群、安定狭心症、不安定狭心症を含む狭心症、炎症、敗血症、血管炎症、皮膚炎症、鬱血性心不全、冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）、心室性不整脈（ventricular  arrythmias）、末梢血管疾患、心筋梗塞、致死性心筋梗塞の発症、非致死性心筋梗塞、虚血、心血管虚血、一過性虚血性発作、心血管疾患に関連しない虚血、虚血再灌流障害、血管再生の必要性の減少、血液凝固障害、血小板減少症、深部静脈血栓症、膵炎、非アルコール性脂肪性肝炎、糖尿病性神経障害、網膜症、疼痛を伴う糖尿病性神経障害、跛行、乾癬、重症虚血肢、インポテンス、脂質異常症、高脂血症、高リポタンパク血症、低アルファリポタンパク血症、高トリグリセリド血症、虚血性病理に至るあらゆる狭窄状態、肥満、Ｉ型およびＩＩ型の両方を含む糖尿病、魚鱗癬（ichtyosis）、発作、脆弱性プラーク（vulnerable  plaque）、下肢潰瘍、重症冠動脈虚血、リンパ腫、白内障、内皮機能不全、黄色腫、末端器官機能不全、血管疾患、喫煙および糖尿病に起因する血管疾患、頸動脈および冠動脈疾患、退縮および収縮したプラーク、不安定プラーク、脆弱な血管内膜、不安定な血管内膜、内皮障害、外科処置の結果としての内皮損傷、血管疾患に関連する病的状態、動脈内腔における潰瘍、バルーン血管形成術の結果としての再狭窄、タンパク質貯蔵疾患（例えば、アルツハイマー病、プリオン疾患）、止血疾患（例えば、血栓症、栓友病、播種性血管内凝固症候群、血小板減少症、ヘパリン起因性血小板減少症、血栓性血小板減少性紫斑病）、リウマチ性疾患（例えば、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（systemic  lupus  erythematosis）、シェーグレン症候群、多発性筋炎／皮膚筋炎、強皮症）、神経疾患（neuroligical  diseases）（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病）、ならびにそれらの二次的な適応症（subindication）が含まれる。
【００９６】
さらに、ＮＰはがんを処置するために使用することができる。例えば、ＮＰは、天然ＨＤＬとスカベンジャー受容体Ｂ−１型（ＳＲ−Ｂ１）との間の相互作用を模倣するために、ｉｎ  ｖｉｖｏでアポＡ１と結合することができる。この受容体を発現するがん細胞、特に、リンパ腫、前立腺がんおよび乳がん細胞は、ＮＰによって選択的に標的化される。細胞毒性は、ＨＤＬ−ＮＰを使用して、心筋芽細胞（cardiomyoblast）に対するよりリンパ腫および上皮性悪性腫瘍において高いことが示されている。
【００９７】
シェルは、アポリポタンパク質が外側シェルに吸着され得、および／またはシェルの内面と外面との間に組み込まれ得るように、内面および外面を有することができる。一部の実施形態では、シェルは１種または複数のコレステロール分子を含む。
【００９８】
方法に使用され得るナノ構造の例は本明細書に記載され、ここで記載される。構造（例えば、合成構造または合成ナノ構造）はコアと、コアを取り囲むシェルとを有する。コアがナノ構造である実施形態では、コアは、１種または複数の成分が任意選択で付着され得る表面を含む。例えば、一部の場合、コアは、内面および外面を含むシェルによって取り囲まれたナノ構造である。シェルは、少なくとも部分的に、複数の脂質などの１種または複数の成分から形成されてもよく、それは、任意選択で、互いにおよび／またはコアの表面と会合することができる。例えば、成分は、コアに共有結合によって付着し、物理吸着し（physiosorbed）、化学吸着し、あるいはイオン相互作用、疎水性および／もしくは親水性相互作用、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、またはそれらの組合せを介してコアに付着することによってコアと会合することができる。１つの特定の実施形態では、コアは金のナノ構造を含み、シェルは金−チオール結合を介してコアに付着する。
【００９９】
任意選択で、成分は互いに架橋され得る。シェルの成分の架橋は、例えば、シェル内への、またはシェルの外部領域とシェルの内部領域との間の種の輸送の制御を可能にし得る。例えば、相対的に多くの量の架橋は、ある特定の小さい分子を、シェル内にまたはシェルを介して通過させることができるが、大きい分子を通過させることはできず、一方で、相対的に架橋が少ないか、または架橋がないと、より大きい分子をシェル内にまたはシェルを介して通過させることができる。さらに、シェルを形成する成分は、分子の輸送または隔離を促進できるか、または妨げることもできる単層または多層の形態であってもよい。１つの例示的な実施形態では、シェルは、本明細書に記載されているように、コレステロールを隔離し、および／または細胞からのコレステロール流出を制御するように配置される脂質二重層を含む。
【０１００】
コアを取り囲むシェルはコアを完全に取り囲む必要はないが、そのような実施形態も可能であり得ることを理解されたい。例えば、シェルは、コアの表面積の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％を取り囲むことができる。一部の場合、シェルはコアを実質的に取り囲む。他の場合、シェルはコアを完全に取り囲む。シェルの成分は、一部の場合、コアの表面にわたって均一に分布していてもよく、他の場合、不均一に分布していてもよい。例えば、シェルは、一部の場合、いかなる材料も含まない部分（例えば、穴）を含んでもよい。所望の場合、シェルは、ある特定の分子および成分のシェル内または外への浸透および／または輸送を可能にするが、他の分子および成分のシェル内または外への浸透および／または輸送を阻止するように設計されてもよい。シェル内におよび／またはシェルにわたって浸透および／または輸送するある特定の分子の能力は、例えば、シェルを形成する成分の充填密度ならびにシェルを形成する成分の化学的および物理的特性に依存し得る。シェルは材料の１つの層、または一部の実施形態では材料の多層を含んでもよい。
【０１０１】
ナノ構造のコアであるか、中空のコアであるかに関わらず、ナノ構造のコアは任意の適切な形状および／またはサイズを有してもよい。例えば、コアは、実質的に球形、非球形、楕円形、棒形、ピラミッド形、立方体状、ディスク形、ワイヤ形、または不規則な形状であってもよい。コア（例えば、ナノ構造のコアまたは中空のコア）は、例えば、約５００ｎｍ未満もしくはそれに等しい、約２５０ｎｍ未満もしくはそれに等しい、約１００ｎｍ未満もしくはそれに等しい、約７５ｎｍ未満もしくはそれに等しい、約５０ｎｍ未満もしくはそれに等しい、約４０ｎｍ未満もしくはそれに等しい、約３５ｎｍ未満もしくはそれに等しい、約３０ｎｍ未満もしくはそれに等しい、約２５ｎｍ未満もしくはそれに等しい、約２０ｎｍ未満もしくはそれに等しい、約１５ｎｍ未満もしくはそれに等しい、または約５ｎｍ未満もしくはそれに等しい最大断面寸法（または時には最小断面寸法）を有してもよい。一部の場合、コアは、約１：１より大きい、３：１より大きい、または５：１より大きい縦横比を有する。本明細書で使用される場合、「縦横比」とは、長さの幅に対する比を指し、ここで長さおよび幅は互いに対して垂直に測定され、長さとは、最も長い直線的に測定された寸法を指す。
【０１０２】
コアは無機材料から形成され得る。無機材料には、例えば、金属（例えば、Ａｇ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｆｅ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎおよび他の遷移金属）、半導体（例えば、ケイ素、ケイ素化合物および合金、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、ヒ化インジウムおよびリン化インジウム）、または絶縁体（例えば、酸化ケイ素などのセラミック）が含まれ得る。無機材料は、任意の適切な量、例えば、少なくとも１ｗｔ％、５ｗｔ％、１０ｗｔ％、２５ｗｔ％、５０ｗｔ％、７５ｗｔ％、９０ｗｔ％、または９９ｗｔ％でコアに存在してもよい。一実施形態では、コアは１００ｗｔ％の無機材料から形成される。一部の実施形態では、コアは、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、または１００ｎｍの直径である。ナノ構造のコアは、一部の場合、量子ドット、カーボンナノチューブ、カーボンナノワイヤ、またはカーボンナノロッドの形態であってもよい。一部の場合、ナノ構造のコアは、生物起源ではない材料を含むか、またはそれから形成される。一部の実施形態では、ナノ構造は、合成ポリマーおよび／または天然ポリマーなどの１種または複数の有機材料を含むか、またはそれらから形成されてもよい。合成ポリマーの例には、ポリメタクリレートなどの非分解性ポリマー、ならびにポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびそれらのコポリマーなどの分解性ポリマーが含まれる。天然ポリマーの例には、ヒアルロン酸、キトサン、およびコラーゲンが含まれる。
【０１０３】
さらに、構造のシェルは任意の適切な厚さを有してもよい。例えば、シェルの厚さは、少なくとも１０オングストローム、少なくとも０．１ｎｍ、少なくとも１ｎｍ、少なくとも２ｎｍ、少なくとも５ｎｍ、少なくとも７ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、少なくとも１５ｎｍ、少なくとも２０ｎｍ、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、または少なくとも２００ｎｍ（例えば、シェルの内面から外面まで）であってもよい。一部の場合、シェルの厚さは、２００ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、１５ｎｍ未満、１０ｎｍ未満、７ｎｍ未満、５ｎｍ未満、３ｎｍ未満、２ｎｍ未満、または１ｎｍ未満（例えば、シェルの内面から外面まで）である。このような厚さは、本明細書に記載されている分子の隔離の前または後に決定することができる。
【０１０４】
本明細書に記載されている構造のシェルは、疎水性材料、親水性材料、および／または両親媒性材料などの任意の適切な材料を含んでもよい。シェルは、ナノ構造のコアについて上記に列挙したものなどの１種または複数の無機材料を含んでもよいが、多くの実施形態では、シェルは脂質またはある特定のポリマーなどの有機材料を含む。シェルの成分は、一部の実施形態では、治療剤の結合能および結合親和性を促進するように選択され得る。例えば、外層における正に荷電した頭部基はドキソルビシンなどの治療剤の結合親和性を減少させることができ、一方、負に荷電した脂質頭部基はドキソルビシンの結合親和性を増加させる。ナノ粒子の脂質組成の変化は、治療剤とナノ構造との間の結合親和性を変化させるだけでなく、治療剤に対するナノ構造の結合能も変化させることができる。ナノ粒子の結合親和性は、コレステロール（脂質層の流動性をモジュレートする）、ポリ（スチレンスルホネート）（ドキソルビシン結合を増強するための負に荷電したポリマー）またはＤＮＡ（ドキソルビシン結合モチーフを有する）を合成ステップに含めることによってさらに変化させることができる。
【０１０５】
一部の実施形態では、有機材料の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または１００％は、シェルの外層において正に荷電した頭部基を有する。一部の実施形態では、有機材料の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または１００％は、シェルの外層において負に荷電した頭部基を有する。一部の実施形態では、有機材料の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または１００％は、シェルの外層において中性である頭部基を有する。
【０１０６】
一組の実施形態では、構造のシェルなどの本明細書に記載されている構造またはその一部は、１種または複数の天然または合成の脂質または脂質アナログ（すなわち、親油性分子）を含む。１種または複数の脂質および／または脂質アナログは、構造の単層または多層（例えば、二重層）を形成し得る。多層が形成される一部の例では、天然または合成の脂質または脂質アナログは互いに組み合っている（例えば、異なる層の間に）。天然または合成の脂質または脂質アナログの非限定的な例には、脂肪アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質（saccharolipid）およびポリケチド（ケトアシルサブユニットの縮合に由来する）、ならびにステロール脂質およびプレノール脂質（イソプレンサブユニットの縮合に由来する）が含まれる。
【０１０７】
特定の一組の実施形態では、本明細書に記載されている構造は１種または複数のリン脂質を含む。１種または複数のリン脂質には、例えば、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチオエタノール（ＤＰＰＴＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール、レシチン、β、γ−ジパルミトイル−α−レシチン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、Ｎ−（２，３−ジ（９−（Ｚ）−オクタデセニルオキシ））−プロパ−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、セファリン、カルジオリピン、セレブロシド、リン酸ジセチル、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン、ジ−ステアロイル−ホスファチジルコリン、ステアロイル−パルミトイル−ホスファチジルコリン、ジ−パルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン、ジ−ステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン、ジ−ミリストイル（myrstoyl）−ホスファチジルセリン、ジ−オレイル−ホスファチジルコリン、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチオエタノール、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）およびそれらの組合せが含まれ得る。一部の場合、構造のシェル（例えば、二重層）は５０〜２００種の天然または合成の脂質または脂質アナログ（例えば、リン脂質）を含む。例えば、シェルは、例えば構造のサイズに応じて、約５００種未満、約４００種未満、約３００種未満、約２００種未満、または約１００種未満の天然または合成の脂質または脂質アナログ（例えば、リン脂質）を含み得る。一部の実施形態では、ナノ構造は、１０〜１００種、２０〜１００種、３０〜１００種、４０〜１００種、５０〜１００種、６０〜１００種、７０〜１００種、８０〜１００種または９０〜１００種の天然または合成の脂質または脂質アナログ（例えば、リン脂質）を含む。ある特定の実施形態では、ナノ構造は７１〜９５種の天然または合成の脂質または脂質アナログ（例えば、リン脂質）を含む。一部の実施形態では、脂質はシェルの外面上にある。
【０１０８】
ステアリルアミン、ドデシルアミン（docecylamine）、パルミチン酸アセチル、および脂肪酸アミドなどのリンを含有しない脂質も使用されてもよい。他の実施形態では、脂肪、油、ワックス、コレステロール、ステロール、脂溶性ビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫ）、グリセリド（例えば、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド）などの他の脂質が、本明細書に記載されている構造の部分を形成するために使用されてもよい。
【０１０９】
ナノ構造のシェルまたは表面などの本明細書に記載されている構造の一部は、任意選択で構造に疎水性を付与する１つまたは複数のアルキル基、例えば、アルカン、アルケン、またはアルキン含有種を任意選択で含んでもよい。「アルキル」基とは、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む飽和脂肪族基を指す。アルキル基は、例えば、Ｃ２からＣ４０の間の様々な炭素数を有してもよく、一部の実施形態では、Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ１５、Ｃ２０、Ｃ２５、Ｃ３０、またはＣ３５より多くてもよい。一部の実施形態では、直鎖または分枝鎖アルキルは、その骨格に３０個またはそれ未満の炭素原子を有してもよく、一部の場合、２０個またはそれ未満の炭素原子を有してもよい。一部の実施形態では、直鎖または分枝鎖アルキルは、その骨格に１２個もしくはそれ未満の炭素原子（例えば、直鎖についてはＣ１〜Ｃ１２、分枝鎖についてはＣ３〜Ｃ１２）、６個もしくはそれ未満、または４個もしくはそれ未満の炭素原子を有してもよい。同様に、シクロアルキルは、それらの環構造に３〜１０個の炭素原子、または環構造に５、６もしくは７個の炭素を有してもよい。アルキル基の例には、限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、ヘキシル、シクロヘキシル（cyclochexyl）などが含まれる。
【０１１０】
アルキル基は、任意の適切な末端基、例えば、チオール基、アミノ基（例えば、非置換または置換アミン）、アミド基、イミン基、カルボキシル基、または硫酸基を含んでもよく、これらは、例えば、ナノ構造のコアに直接またはリンカーを介してリガンドを付着させることができる。例えば、不活性金属がナノ構造のコアを形成するために使用される場合、アルキル種は金属−チオール結合を形成するためにチオール基を含んでもよい。一部の場合、アルキル種は少なくとも第２の末端基を含む。例えば、種はポリエチレングリコールなどの親水性部分に結合していてもよい。他の実施形態では、第２の末端基は別の官能基に共有結合によって付着することができる反応基であってもよい。一部の場合、第２の末端基はリガンド／受容体相互作用（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン）に関与することができる。
【０１１１】
一部の実施形態では、シェルはポリマーを含む。例えば、両親媒性ポリマーが使用されてもよい。ポリマーは、例えば、１つのブロックが疎水性ポリマーであり、別のブロックが親水性ポリマーである、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマーなどであってもよい。例えば、ポリマーは、α−ヒドロキシ酸（例えば、乳酸）およびポリエチレングリコールのコポリマーであってもよい。一部の場合、シェルは、ある特定のアクリル、アミドおよびイミド、カーボネート、ジエン、エステル、エーテル、フルオロカーボン、オレフィン、スチレン（sytrene）、ビニルアセタール、塩化ビニルおよび塩化ビニリデン、ビニルエステル、ビニルエーテルおよびケトン、ならびにビニルピリジンおよびビニルピロリドンポリマーを含み得るポリマーなどの疎水性ポリマーを含む。他の場合、シェルは、ある特定のアクリル、アミン、エーテル、スチレン、ビニル酸、およびビニルアルコールを含むポリマーなどの親水性ポリマーを含む。ポリマーは、荷電されていてもよいか、または荷電されていなくてもよい。本明細書で述べられているように、シェルの特定の成分は構造にある特定の官能性を付与するように選択され得る。
【０１１２】
シェルが両親媒性材料を含む場合、材料はナノ構造のコアおよび／または互いに対して任意の適切な様式で配置され得る。例えば、両親媒性材料は、コアの方を向いている親水性基およびコアから離れて延びている疎水性基を含んでもよいか、または両親媒性材料は、コアの方を向いている疎水性基およびコアから離れて延びている親水性基を含んでもよい。各立体配置の二重層もまた、形成されてもよい。
【０１１３】
本明細書に記載されている構造はまた、１種または複数のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチド（例えば、合成ペプチド、両親媒性ペプチド）を含んでもよい。一組の実施形態では、構造は、構造のコレステロール転移率またはコレステロール運搬能を増加させることができるタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを含む。１種または複数のタンパク質またはペプチドは、コア（例えば、コアの表面またはコアに埋め込まれている）、シェル（例えば、シェルの内面および／もしくは外面、ならびに／またはシェルに埋め込まれている）、または両方と会合していてもよい。会合は、共有結合性または非共有結合性相互作用（例えば、疎水性および／または親水性相互作用、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用）を含んでもよい。
【０１１４】
本明細書に記載されている構造と会合していてもよい適切なタンパク質の例は、アポリポタンパク質Ａ（例えば、アポＡ−Ｉ、アポＡ−ＩＩ、アポＡ−ＩＶ、およびアポＡ−Ｖ）、アポリポタンパク質Ｂ（例えば、アポＢ４８およびアポＢ１００）、アポリポタンパク質Ｃ（例えば、アポＣ−Ｉ、アポＣ−ＩＩ、アポＣ−ＩＩＩ、およびアポＣ−ＩＶ）、ならびにアポリポタンパク質Ｄ、Ｅ、およびＨなどのアポリポタンパク質である。特に、アポＡ１、アポＡ２、およびアポＥは、代謝のために肝臓へのコレステロールおよびコレステリルエステルの転移を促進し、本明細書に記載されている構造に含めるのに有用であり得る。さらに、または代替として、本明細書に記載されている構造は、上記のものなどのアポリポタンパク質の１種または複数のペプチドアナログを含んでもよい。構造は、任意の適切な数、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または１０種のアポリポタンパク質またはそのアナログを含んでもよい。ある特定の実施形態では、構造は天然に存在するＨＤＬ粒子に類似する１〜６種のアポリポタンパク質を含む。一部の実施形態では、アポリポタンパク質は生体試料から得られた天然に存在するアポリポタンパク質である。他の実施形態では、アポリポタンパク質は合成または組換えである。もちろん、他のタンパク質（例えば、非アポリポタンパク質）もまた、本明細書に記載されている構造に含まれてもよい。
【０１１５】
一部の実施形態では、アポリポタンパク質Ｂを血清などの溶液から枯渇させてある。アポリポタンパク質Ｂは当業者に公知の方法を使用して溶液から枯渇され得る。アポリポタンパク質Ｂを枯渇させるための方法の非限定的な例には、ポリエチレングリコール、硫酸デキストラン／塩化マグネシウム、ヘパリンナトリウム／塩化マンガン、ＬｉｐｏＳｅｐ免疫沈降（Davidsonら、J  Lipid  Res（２０１６年）５７巻（４号）：６７４〜８６頁）およびＰＥＧ８０００の使用が含まれる。当業者に公知のアポリポタンパク質Ｂを枯渇させるためのさらなる方法もまた、本明細書に意図される。
【０１１６】
任意選択で、１種または複数の酵素もまた、本明細書に記載されている構造と会合されてもよい。例えば、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼは、遊離コレステロールをコレステリルエステル（コレステロールのより疎水性の形態）に変換する酵素である。天然に存在するリポタンパク質（例えば、ＨＤＬおよびＬＤＬ）において、コレステリルエステルはリポタンパク質のコア内に隔離され、リポタンパク質をディスク形状から球形状に変化させる。したがって、本明細書に記載されている構造は、ＨＤＬおよびＬＤＬ構造を模倣するレシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼを含んでもよい。ＨＤＬからＬＤＬ種へエステル化コレステロールを転移するコレステリルエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）などの他の酵素も含まれてもよい。
【０１１７】
上記の脂質、リン脂質、アルキル基、ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、酵素、生物活性剤、核酸、および標的化のための種（任意選択であり得る）などの、本明細書に記載されている成分は、任意の適切な様式で構造と会合されてもよく、かつ構造の任意の適切な部分、例えば、コア、シェルまたは両方と会合されてもよいことを理解されたい。例えば、１種または複数のこのような成分は、コアの表面、コアの内部、シェルの内面、シェルの外面と会合されてもよく、および／またはシェルに埋め込まれてもよい。
【０１１８】
本明細書に記載されているナノ構造を製造するために様々な方法を使用することができる。方法の例は、２００９年４月２４日に出願され、「Nanostructures  Suitable  for  Sequestering  Cholesterol  and  Other  Molecules」と題する国際特許公開第２００９／１３１７０４号に提供され、これはすべての目的のためにその全体が本明細書に参照として組み込まれている。
【０１１９】
一部の態様では、本発明は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）機能を測定するための方法アッセイであって、ＬＣＡＴを含む本明細書に記載されているナノ構造のいずれかを溶液または生体試料と接触させるステップと、１種または複数のアポリポタンパク質を溶液または生体試料から隔離するのに十分な時間、ナノ構造を溶液または生体試料とインキュベートするステップと、ＨＤＬの機能の尺度として形成されたコレステリルエステルの量を検出するステップとを含む、方法である。一部の態様では、溶液または生体試料中で利用可能なアポリポタンパク質の量は、形成されたコレステリルエステルの量およびＬＣＡＴの活性と正に相関する。
【０１２０】
一部の実施形態では、溶液はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液である。一部の実施形態では、溶液は対象から得られた血清である。一部の実施形態では、血清は、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の濃度に溶液中で希釈される。一部の実施形態では、血清は緩衝剤中で希釈される。一部の実施形態では、血清はＰＢＳ中で希釈される。
【０１２１】
一部の実施形態では、ナノ構造は、１種または複数のアポリポタンパク質（例えば、アポＡＩ）を生体試料または溶液から隔離するために、アポリポタンパク質を含む生体試料または溶液と、５分間、１０分間、３０分間、４５分間、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１５時間、２０時間、または２４時間インキュベートされる。一部の実施形態では、ナノ構造内に隔離されたアポリポタンパク質の量はタンパク質を検出するための当業者に公知の方法によって検出される。非限定的な例には、ウェスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着検定法、高速液体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー−質量分析、フローサイトメトリー、質量分析、イムノアッセイ、イムノブロットなどが含まれる。
【０１２２】
一部の実施形態では、アッセイは約４〜８時間で完了することができる。一部の実施形態では、アッセイは約６時間で完了することができる。本明細書に記載されているナノ粒子に基づくアッセイを完了するのに必要な時間は、臨床的に検証されたＣＥＡを完了するのに必要な時間（すなわち、約４日）よりも顕著に短い（すなわち、約６時間）。一部の実施形態では、アッセイ時間は、オキシダーゼに基づくシステムまたはオキシダーゼに基づく検出デバイスを使用してさらに減少させることができる。オキシダーゼに基づくシステムまたはオキシダーゼに基づく検出デバイスは血糖値測定器と類似しており、生体試料がナノ構造に曝露され、ナノ構造が、例えば、アポＡ−Ｉおよびコレステロールを隔離すると、それは次にＬＣＡＴのための基質として機能し、続いてコレステロールがエステル化される。この場合、このようなナノ構造を含有する試料はコレステロールオキシダーゼに曝露され、その結果、酵素はコレステロールを酸化し、過酸化水素を生成する。過酸化水素は、携帯式のポイントオブユース（point-of-use）デバイスを使用して容易に測定され得るソース分子から電子または蛍光を遊離させることができる分子を生成するために使用され得る。
【０１２３】
一部の実施形態では、形成されたコレステリルエステルの量は蛍光アッセイなどのアッセイを使用して検出される。例えば、コレステリルエステル（ＣＥ）の量は、コレステロールエステラーゼで処理された試料中のコレステロールの量（総コレステロール、ＴＣ）およびコレステロールエステラーゼで処理されていない試料中のコレステロールの量（遊離コレステロール、ＦＣ）を測定することによって決定される。コレステリルエステルは、総コレステロールから遊離コレステロールを差し引くことによって決定される（すなわち、ＣＥ＝ＴＣ−ＦＣ）。コレステロールエステラーゼの存在下で、コレステロールエステルはコレステロールに加水分解され、それは続いてコレステロールオキシダーゼによって酸化されて過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生じる。Ｈ２Ｏ２は、酵素である西洋ワサビペルオキシダーゼおよび１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン（Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（商標））を使用して検出され、ここで反応により蛍光生成物であるレゾルフィンが生じる。測定したコレステリルエステル量は、試料中のＨＤＬ−ＮＰが結合しているアポＡＩと直接相関する。当業者に公知のコレステリルエステルを測定する他の方法もまた、本明細書で意図される。コレステリルエステルを検出する主な方法は記載されており、コレステロールエステラーゼを含むおよび含まない総コレステロールを測定し、次いで試料中の遊離コレステロール（−コレステロールエステラーゼ）から総コレステロール（＋コレステロールエステラーゼ）を差し引くことからなる。また、本明細書で意図される非比色アッセイの非限定的な例には、蛍光に基づくアッセイ、電気伝導度に基づくアッセイ、濃度測定アッセイ、および電気抵抗アッセイ、ならびにラマン分光法および質量分析のような分光アッセイが含まれる。
【０１２４】
一部の態様では、本発明は、対象において疾患または状態を発症するリスクを決定する方法であって、試料を対象から得るステップと、試料を本明細書に記載されているナノ構造のいずれかと接触させるステップと、１種または複数のアポリポタンパク質を試料から隔離するのに十分な時間、ナノ構造を溶液中の試料とインキュベートするステップと、形成されたコレステリルエステルの量を検出するステップと、試料中の形成されたコレステリルエステルの量を所定の値と比較するステップであって、所定の値は、疾患または状態を有さない対象における形成されたコレステリルエステルのレベルを表す、ステップと、試料中の形成されたコレステリルエステルの量が所定の値より多いか、所定の値であるか、または所定の値未満であるかを比較することによって対象が疾患または状態を発症するリスクがあるかどうかを決定するステップと、を含む方法を提供する。
【０１２５】
一部の実施形態では、疾患または状態は心血管疾患または状態である。心血管疾患または状態は当業者に公知の任意の心血管疾患または状態であってもよい。心血管疾患または状態の非限定的な例には、心不全、動脈硬化症（例えば、アテローム性動脈硬化症、非アテローム性動脈硬化症（nonatheromatous  arteriosclerosis））、弁膜疾患、炎症、高血圧症（例えば、本態性高血圧症、腎血管性高血圧症）、心筋症、心筋梗塞および脳卒中が含まれる。例えば、試料中の形成されたコレステリルエステルの量がある所定の値であるか、もしくはそれより多い場合、対象は、心血管疾患もしくは状態を発症するリスクが高いとはみなされないか、または試料中の形成されたコレステリルエステルの量が所定の値未満である場合、対象は、心血管疾患もしくは状態を発症するリスクがある。
【０１２６】
一部の実施形態では、疾患または状態は、代謝疾患もしくは状態、神経疾患もしくは状態、感染、炎症、リウマチ状態、腎状態、肺状態、または当業者に公知の生殖疾患もしくは状態である。
【０１２７】
一部の実施形態では、試料は当業者に公知の方法によって対象から得られる。例えば、試料は医師によって得られた血液試料であり、それは遠心分離などの従来の方法によって血液試料の血清成分を単離するために処理される。
【０１２８】
一部の態様では、本発明は、対象における心血管疾患または状態に対する１つまたは複数の介入の効果を評価する方法であって、試料を対象から得るステップと、試料をナノ構造と接触させるステップと、１種または複数のアポリポタンパク質を試料から隔離するのに十分な時間、ナノ構造を試料とインキュベートするステップと、形成されたコレステリルエステルのレベルを検出するステップと、対象を１回または複数の処置にさらし、上述のステップを反復するステップと、１つまたは複数の介入の前に形成されたコレステリルエステルのレベルを、介入の後に形成されたコレステリルエステルのレベルと比較するステップと、１つまたは複数の介入が心血管疾患または状態を改善したかどうかを決定するステップとを含む、方法を提供する。例えば、１つまたは複数の介入は、１つまたは複数の介入の後に形成されたコレステリルエステルの量が、介入の前に形成されたコレステリルエステルのレベルより多い場合、心血管疾患または状態を改善するとみなされる。他方で、１つまたは複数の介入は、介入の後に形成されたコレステリルエステルの量が、介入の前に形成されたコレステリルエステルのレベルであるか、またはそれ未満である場合、心血管疾患または状態を改善するとみなされない。
【０１２９】
一部の実施形態では、介入は治療介入、運動、または食事の改善である。心血管疾患を処置するための治療介入の非限定的な例には、限定されないが、硝酸塩（例えば、ニトログリセリン、イソソルビドなど）、ベータ遮断薬（例えば、アテノロール、メトプロロール、ナドロール、オクスプレノロール、ピンドロール、プロプラノロール、チモロールなど）、アルファ遮断薬（例えば、ドキサゾシン、フェントラミン、インドラミン、フェノキシベンザミン、プラゾシン、テラゾシン、トラゾリンなど）、カルシウムチャネル遮断薬（例えば、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、イスラジピン、エホニジピン、フェロジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、プラニジピン、ジルチアゼム、ミベフラジル、ベプリジル、フルスピリレン、フェンジリンなど）、ループ利尿薬（例えば、ブメタニド、エタクリン酸、フロセミド、トルセミドなど）、チアジド系利尿薬（例えば、エピチジド、ヒドロクロロチアジド、クロロチアジド、ベンドロフルメチアジドなど）、チアジド様利尿薬（例えば、インダパミド、クロルタリドン、メトラゾンなど）、カリウム保持性利尿薬（例えば、アミロライド、トリアムテレン、スピロノラクトンなど）、ベータ遮断薬（例えば、アテノロール、メトプロロール、ナドロール、オクスプレノロール、ピンドロール、プロプラノロール、チモロールなど）、アルファ遮断薬（例えば、ドキサゾシン、フェントラミン、インドラミン、フェノキシベンザミン、プラゾシン、テラゾシン、トラゾリンなど）、混合アルファおよびベータ遮断薬（例えば、ブシンドロール、カルベジロール、ラベタロールなど）、ジヒドロピリジン（例えば、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、レルカニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニトレンジピンなど）、非ジヒドロピリジン（例えば、ジルチアゼム、ベラパミルなど）、ＡＣＥ阻害剤（例えば、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリル、ベナゼプリルなど）、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（例えば、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、オルメサルタン、テルミサルタン、バルサルタンなど）、アルドステロン受容体アンタゴニスト（例えば、エプレレノン、スピロノラクトンなど）、血管拡張剤（例えば、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジンなど）、アルファ−２−アゴニスト（例えば、クロニジン、グアナベンズ、メチルドパ、モクソニジンなど）、アドレナリン作動性ニューロン遮断薬（例えば、グアネチジン、レセルピンなど）、または当業者に公知の他の治療介入が含まれる。一部の実施形態では、治療介入、運動または食事の改善のうちの２つまたはそれよりも多くのものが同時にまたは連続して実施される。
【０１３０】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、コレステリルエステルのレベルを測定するために単離される。一部の実施形態では、ナノ粒子は、当業者に公知の方法によって単離される。単離方法の非限定的な例には、ナノ構造が金のコアなどの金属のコアを有する場合、遠心分離もしくは磁性の使用、あるいは抗体−抗原もしくはストレプトアビジン−ビオチンなどの公知の生物的相互作用、または受容体−リガンド相互作用に基づく単離が含まれる。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「対象」または「患者」とは、任意の哺乳動物（例えば、ヒト）を指す。対象または患者の例には、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはマウス、ラット、ハムスターもしくはモルモットなどのげっ歯動物が含まれる。概して、本発明はヒトでの使用に方向付けられている。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「生体試料」は、対象から得られる任意の細胞、体組織または体液試料である。体液の非限定的な例には、例えば、リンパ液、唾液、血液、血清、尿などが含まれる。本明細書に記載されている様々な方法における使用のための組織および／または細胞の試料は、限定されないが、パンチ生検および細胞剥離を含む組織生検、針生検、または吸引もしくは他の適切な方法による血液もしくは他の体液の採取を含む標準的な方法によって得られ得る。
【０１３３】
一部の実施形態では、本明細書に記載されているアッセイは、ウェアラブルブレスレット、アンクレット、または他のデバイスなどのウェアラブルデバイスを使用して実施することができる。デバイスは、本発明のアッセイを実施するためにのみ設計されてもよいか、または代替として、ウェアラブルバイオメトリックモニタリングコンポーネント（本明細書で「バイオメトリックトラッキングデバイス」、「バイオメトリックトラッキングモジュール」、「ウェアラブルフィットネスモニター」などとも称される）と共に使用するために設計されてもよい。多くの場合、ブレスレットまたはリストバンドとして着用されるように設計される、このようなデバイスは、ヒトの皮膚と接触する限定された領域を有する小さな筐体を有する。好ましくは本発明に使用されるデバイスはまた、デバイスの着用者から１滴または２滴の血液を抽出し、アッセイを開始するために血液をＮＰに送達することができる針またはブレード（例えば、マイクロブレード）などの血液抽出要素も含む。
【０１３４】
他の実施形態では、組成物は対象または生体試料に導入され、組成物の構造および／または対象もしくは生体試料は、対象または生体試料の疾患または状態を決定することができるアッセイ条件に曝露される。構造の少なくとも一部は対象または生体試料から回収されてもよく、アッセイは回収された構造を用いて実施されてもよい。構造は、構造に結合している分子の量および／または種類についてアッセイされてもよい。
【０１３５】
本明細書に記載されている場合、本発明の構造は、「医薬組成物」または「薬学的に許容される」組成物において使用することができ、これらの組成物は、１種または複数の薬学的に許容される担体、添加剤、および／または希釈剤と一緒に製剤化される、治療有効量の本明細書に記載されている構造の１つまたは複数を含む。本明細書に記載されている医薬組成物は、がんまたは他の状態を処置するのに有用であり得る。図面と関連して記載されているものを含む、本明細書に記載されている任意の適切な構造は、このような医薬組成物において使用され得ると理解されたい。一部の場合、医薬組成物における構造は、無機材料を含むナノ構造のコアと、実質的にナノ構造のコアを取り囲み、それに付着しているシェルとを有する。
【０１３６】
医薬組成物は、以下：経口投与、例えば、水薬（水性または非水性溶液または懸濁液）、錠剤、例えば、口腔内頬側、舌下、および全身性吸収を標的としたもの、ボーラス剤、散剤、顆粒剤、舌に適用するためのペースト剤；例えば、無菌溶液もしくは懸濁液、または徐放製剤としての、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射による非経口投与；例えば、皮膚、肺、または口腔に適用されるクリーム剤、軟膏剤、または制御放出パッチ剤もしくはスプレー剤としての局所適用；例えば、ペッサリー剤、クリーム剤またはフォーム剤としての腟内または直腸内；舌下；経眼；経皮；あるいは経鼻、経肺および他の粘膜表面に適合させたものを含む、固体または液体形態で投与するために、特別に製剤化されてもよい。
【０１３７】
「薬学的に許容される」という句は、本明細書では、良好な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なしにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、妥当な損益比に見合うそれらの構造、材料、組成物、および／または剤形を指すために用いられる。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という句は、ある臓器または身体の一部から別の臓器または身体の一部に対象化合物を運搬または輸送することに関与する、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、または溶媒被包材料などの、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、患者に傷害をもたらさないという意味で「許容される」ものでなくてはならない。薬学的に許容される担体として作用することができる材料のいくつかの例には、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；粉末化トラガント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；ｐＨ緩衝液；ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；患者へのｉｎ  ｖｉｖｏ投与のための自己ヒト血清または他の許容されるヒト血清；ならびに医薬製剤において用いられている他の非毒性の適合性のある物質が含まれる。
【０１３９】
湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および賦香剤、保存剤、ならびに抗酸化剤もまた、組成物に存在していてもよい。
【０１４０】
薬学的に許容される抗酸化剤の例には、アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；およびクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤が含まれる。
【０１４１】
本明細書に記載されている構造は、経口投与され、非経口投与され、皮下投与され、および／または静脈内投与され得る。ある特定の実施形態では、構造または医薬調製物は、経口投与される。他の実施形態では、構造または医薬調製物は、静脈内投与される。代替の投与経路には、舌下、筋肉内、および経皮投与が含まれる。
【０１４２】
本明細書に記載されている医薬組成物には、経口、経鼻、局所（口腔内頬側および舌下を含む）、直腸、膣内および／または非経口投与に適したものが含まれる。製剤は、単位剤形で好都合に提示することができ、調剤分野で周知の任意の方法によって調製することができる。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される宿主、および特定の投与様式に応じて変わる。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量である。一般に、この量は、約１％〜約９９％、約５％〜約７０％、または約１０％〜約３０％の活性成分の範囲である。
【０１４３】
経口投与に適した本発明の組成物は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤（香味付き基剤、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガントを使用する）、散剤、顆粒剤の形態、または水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油もしくは油中水液体エマルションとして、またはエリキシルもしくはシロップとして、またはトローチ剤として（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性な基剤を使用する）および／または洗口剤などの形態であってもよく、各々は、活性成分として、所定量の本明細書に記載されている構造を含有する。本発明の構造はまた、ボーラス剤、舐剤またはペースト剤として投与されてもよい。
【０１４４】
経口投与のための本発明の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤など）では、活性成分は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムなどの１種もしくは複数の薬学的に許容される担体、および／または以下のいずれか：デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤または増量剤；例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシアなどの結合剤；グリセロールなどの保湿剤；寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；パラフィンなどの溶解遅延剤；第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；例えば、セチルアルコール、グリセロールモノステアレート、および非イオン性界面活性剤などの湿潤剤；カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤；タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物などの滑沢剤；ならびに着色剤と混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、医薬組成物はまた、緩衝剤を含んでもよい。ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、軟質および硬質シェルのゼラチンカプセルにおける充填剤として、類似の種類の固体組成物も用いることもできる。
【０１４５】
錠剤は、任意選択で１種または複数の補助成分を用いて、圧縮または成型することによって作製することができる。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤または分散化剤を使用して調製することができる。成型錠剤は、粉末化構造の混合物を、不活性な液体希釈剤で湿潤させる適切な機械で作製することができる。
【０１４６】
糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤などの、本発明の医薬組成物の錠剤および他の固体剤形は、任意選択で刻み目をつけることができ、または腸溶コーティングおよび医薬製剤分野において周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製することができる。それらはまた、それらにおける活性成分が遅延または制御放出されるように、例えば、所望の放出プロファイルが提供されるような様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを使用して製剤化することもできる。それらは、急速放出のために製剤化することができ、例えば凍結乾燥させることができる。それらは、例えば、細菌保持フィルターによる濾過によって、または滅菌水もしくはいくらかの他の注射可能な滅菌媒体に使用直前に溶解させることができる無菌固体組成物の形態に滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。これらの組成物はまた、乳白剤を任意選択で含有することもでき、活性成分を、胃腸管だけで、または胃腸管のある特定部分で、任意選択で遅延方式により放出する組成であってもよい。使用され得る包埋組成物の例には、ポリマー物質およびワックスが含まれる。活性成分は、適切な場合、上記の賦形剤の１種または複数を含むマイクロカプセル化形態であってもよい。
【０１４７】
本明細書に記載されている構造の経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション剤、マイクロエマルション剤、溶液剤、分散剤、懸濁液剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。本発明の構造に加えて、液体剤形は、当該技術分野で一般に使用されている不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤など、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実、落花生、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシおよびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含有することができる。
【０１４８】
不活性希釈剤に加えて、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、賦香剤ならびに保存剤などのアジュバントを含むこともできる。
【０１４９】
活性な化合物に加えて、懸濁液剤は、懸濁化剤を、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガント、ならびにこれらの混合物として含有することができる。
【０１５０】
本明細書に記載されている医薬組成物の製剤（例えば、直腸または膣内投与のため）は、坐剤として提示することができ、これは、本発明の１つまたは複数の化合物を、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、坐剤ワックスまたはサリチル酸塩を含み、室温で固体であるが体温で液体になり、したがって体内で溶融し、構造を放出する、１種または複数の適切な非刺激性の賦形剤または担体と混合することによって調製することができる。
【０１５１】
本明細書に記載されている構造の局所または経皮投与のための剤形には、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、フォーム剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、溶液剤、パッチ剤および吸入剤が含まれる。活性化合物は、薬学的に許容される担体、および必要とされ得る任意の保存剤、緩衝液または噴霧剤と、無菌条件下で混合することができる。
【０１５２】
軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤およびゲル剤は、本発明の構造に加えて、動物性および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはこれらの混合物などの賦形剤を含有することができる。
【０１５３】
散剤およびスプレー剤は、本明細書に記載されている構造に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有することができる。スプレー剤は、通例の噴霧剤、例えばクロロフルオロ炭化水素および揮発性非置換炭化水素、例えばブタンおよびプロパンをさらに含有することができる。
【０１５４】
経皮パッチ剤は、本明細書に記載されている構造を身体に制御送達するさらなる利点を有する。適切な媒体に構造を溶解または分散させることによって、このような剤形を作製することができる。また、吸収促進剤は、皮膚を横切る構造の流動を増大するために使用することができる。律速膜を提供するか、またはポリマーマトリックスもしくはゲルに構造を分散させることによって、このような流動の速度を制御することができる。
【０１５５】
眼科用製剤、眼の軟膏剤、散剤、溶液剤なども、本発明の範囲内であると意図される。
【０１５６】
非経口投与に適した、本明細書に記載されている医薬組成物は、１つまたは複数の本発明の構造を、糖、アルコール、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、製剤を目的とする受容者の血液と等張にする溶質、または懸濁化もしくは増粘剤を含有することができる、１種または複数の薬学的に許容される無菌の等張水性もしくは非水性溶液剤、分散剤、懸濁液剤もしくはエマルション剤、または使用直前に注射可能な滅菌溶液剤もしくは分散剤に復元することができる滅菌散剤との組合せで含む。
【０１５７】
本明細書に記載されている医薬組成物において用いることができる適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、および適切なこれらの混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料を使用することによって、分散剤の場合には必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。
【０１５８】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散化剤などのアジュバントを含有することもできる。本発明の構造に対する微生物作用の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含むことによって容易に行うことができる。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含むことが望ましい場合もある。さらに、注射可能な薬学的形態の吸収の延長は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含むことによってもたらすことができる。
【０１５９】
本明細書に記載されている構造および組成物と共に使用するのに適した送達系には、本明細書に記載されているような、持続放出、遅延放出、徐放、または制御放出送達系が含まれる。このような系によって、多くの場合、構造の反復投与を回避して、対象および医師の利便性を増大することができる。多くのタイプの放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。それらには、例えば、ポリマーベースの系、例えば、ポリ乳酸および／またはポリグリコール酸、ポリ無水物、ならびにポリカプロラクトン；ステロール、例えば、コレステロール、コレステロールエステル、および脂肪酸または中性脂肪、例えばモノ−、ジ−およびトリグリセリドを含む、脂質ベースの非ポリマー系；ヒドロゲル放出系；サイラスティック系；ペプチドベースの系；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤；または部分的に融合したインプラントが含まれる。具体例として、組成物をマトリックス内の形態で含有する浸食系、または活性構成成分によって放出速度を制御する拡散系が含まれるが、それらに限定されない。組成物は、例えば、ミクロスフェア、ヒドロゲル、ポリマーリザーバー、コレステロールマトリックス、またはポリマー系として存在することができる。一部の実施形態では、この系では、例えば、製剤の拡散もしくは浸食／分解速度の制御によって、活性化合物の徐放または制御放出を生じさせることができる。さらに、一部の実施形態では、ポンプベースの機器送達系を使用することができる。本明細書に記載されている構造および組成物は、シリンジ、パッド、パッチ、チューブ、フィルム、ＭＥＭＳベースのデバイス、およびインプラント可能なデバイスなどの送達デバイスと組み合わせることもできる（例えばそれらと共に含有され得る）。
【０１６０】
一部の場合、長期間放出インプラントの使用が特に適している場合がある。本明細書で使用される場合、「長期間放出」は、インプラントが、治療レベルの組成物を、少なくとも約３０日間もしくは約４５日間、少なくとも約６０日間もしくは約９０日間、または一部の場合、さらにより長期間にわたって送達するように構築され、配置されることを意味する。長期間放出インプラントは、当業者に周知であり、上記の放出系のいくつかを含む。
【０１６１】
注射可能なデポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマーにおける、本明細書に記載されている構造のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製することができる。構造のポリマーに対する比、および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、構造の放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が含まれる。
【０１６２】
本明細書に記載されている構造は、医薬品としてヒトおよび動物に投与される場合、それら自体を与えることができ、または例えば約０．１％〜約９９．５％、約０．５％〜約９０％などの構造を薬学的に許容される担体との組合せで含有する医薬組成物として与えることができる。
【０１６３】
投与は、処置される状態に応じて、局所的でもよいし（例えば、特定の領域、生理系、組織、臓器、または細胞型に）または全身性であってもよい。例えば、組成物は、非経口（parental）注射、インプラント、経口、膣内、直腸内、口腔内頬側、肺、局所、経鼻、経皮、外科手術投与、または標的への組成物の到達を達成する任意の他の投与方法を介して投与することができる。本発明と共に使用することができる非経口様式の例には、静脈内、皮内、皮下、腔内、筋肉内、腹腔内、硬膜外、または髄腔内が含まれる。インプラント様式の例には、任意のインプラント可能または注射可能な薬物送達系が含まれる。経口投与は、患者の都合ならびに投与スケジュールのために、いくつかの処置にとって有用であり得る。
【０１６４】
選択された投与経路に関わらず、適切な水和形態で使用され得る、本明細書に記載されている構造および／または本発明の医薬組成物は、当業者に公知の従来の方法によって、薬学的に許容される剤形に製剤化される。
【０１６５】
本明細書に記載されている組成物は、任意の潜在的に有害な副作用を回避するか、または最小限に抑えながら、例えば最大量の投与量で与えることができる。組成物は、単独でまたは他の化合物と組み合わせて、有効量で投与することができる。例えば、がんを処置する場合、組成物は、本明細書に記載されている構造、およびがんを処置するために使用され得る他の化合物のカクテルを含むことができる。異常な脂質レベルと関連する状態を処置する場合、組成物は、本明細書に記載されている構造、および脂質レベルを低減するために使用され得る他の化合物（例えば、コレステロール降下剤）を含むことができる。
【０１６６】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という句は、任意の医学的処置に適用できる妥当な損益比にて対象における何らかの所望の治療効果をもたらすのに有効な本発明の構造を含む材料または組成物の量を意味する。したがって、治療有効量は、例えば、疾患もしくは身体状態と関連する疾患の進行を防止するか、最小限に抑えるか、または好転させることができる。疾患の進行は、当業者に明らかな臨床観察、実験および画像化調査によってモニタリングすることができる。治療有効量は、単回用量で有効な量または複数回投与療法の一部として有効な量、例えば２回もしくはそれよりも多くの用量で投与される量、または長期的に投与される量であり得る。
【０１６７】
本明細書に記載されている任意の１つまたは複数の構造の有効量は、体重１ｋｇ当たり約１０ｎｇ〜体重１ｋｇ当たり約１０００ｍｇであってもよく、投与頻度は、１日１回〜１ヶ月１回の範囲であってもよい。しかしながら、本発明はこれに関して限定されないので、他の投与量および投与頻度も使用することもできる。対象は、本明細書に記載されている１つまたは複数の構造を、本明細書に記載されている１つまたは複数の疾患または身体状態を処置するのに有効な量で投与され得る。
【０１６８】
有効量は、処置される特定の状態に依存し得る。有効量は、当然のことながら、処置される状態の重症度、年齢、身体状態、大きさおよび体重を含む個々の患者パラメーター、併用処置、処置頻度、または投与様式などの要因に依存する。これらの要因は、当業者に周知であり、日常的な実験だけを用いて対処することができる。一部の場合、最大用量、すなわち良好な医学的判断による安全な最高用量が使用される。
【０１６９】
本明細書に記載されている医薬組成物中の活性成分の実際の投与レベルは、患者に毒性を与えることなく、特定の患者、組成物、および投与様式に望ましい治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るために、変えることができる。
【０１７０】
選択された投与レベルは、用いられる本発明の特定の構造の活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の構造の排出または代謝速度、処置期間、用いられる特定の構造と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康、および既往歴、ならびに医療分野で周知の類似の要因を含む、様々な要因に依存する。
【０１７１】
当業者である医師または獣医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するのに必要とされるレベルより低いレベルで、医薬組成物に用いられる本明細書に記載されている構造の用量を開始することができ、次いで所望の効果が達成されるまで、投与量を徐々に増加させることができる。
【０１７２】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている構造または医薬組成物は長期的に対象に提供される。長期間処置には、１ヶ月もしくはそれよりも多くの月の間、１ヶ月から１年の間、１年もしくはそれよりも多くの年の間、またはそれらより長い間の反復投与などの長期間の反復投与の任意の形態が含まれる。多くの実施形態では、長期間処置は、対象の生涯にわたって構造または医薬組成物を反復して投与することを含む。例えば、長期間処置は、定期的な投与、例えば、１日１回もしくはそれよりも多くの回数、１週間に１回もしくはそれよりも多くの回数、または１ヶ月に１回もしくはそれよりも多くの回数を含んでもよい。一般に、本明細書に記載されている構造の１日用量などの適切な用量は、治療効果をもたらすのに有効な最低の用量である構造の量である。そのような有効用量は一般に、上記の要因に依存する。一般に、ある患者について本明細書に記載されている構造の用量は、示した効果のために使用される場合、１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．０００１〜約１００ｍｇの範囲である。１日投与量は、体重１ｋｇ当たり０．００１〜５０ｍｇの化合物、または体重１ｋｇ当たり０．０１〜約１０ｍｇの化合物の範囲であってもよい。しかしながら、より低いまたはより高い用量が使用されてもよい。一部の実施形態では、対象に投与される用量は、年齢、疾患の進行、体重、または他の要因に起因する対象の生理機能の変化に応じて変更されてもよい。
【０１７３】
所望の場合、活性化合物の有効な１日用量は、１日を通して適切な間隔で別々に投与される、２回、３回、４回、５回、６回またはそれよりも多くの回数の副用量（sub-dose）として、任意選択で単位剤形で投与されてもよい。例えば、使用説明書および方法は、特定の用量の組成物、特に特定のサイズ範囲を有する本明細書に記載されている構造を含む組成物が、副作用または望ましくない効果を低減させるか、または回避しながら、コレステロール（または他の脂質）の低減および／または疾患の処置を達成するように特定の時間間隔および特定の用量で投与される、投与レジメンを含んでもよい。
【０１７４】
本明細書に記載されている構造は単独で投与することができるが、上記のように医薬組成物として投与されてもよい。本発明はまた、任意選択で組成物を使用するための使用説明書を含む、キットに包装された、疾患または身体状態を診断し、予防し、処置するか、または管理するために有用な上述の組成物のいずれかを提供する。すなわち、キットは、異常な脂質レベルに関連するものを含む、任意の疾患または身体状態に関与する組成物の使用説明を含むことができる。キットは、本明細書に述べられている組成物の使用説明をさらに含むことができる。キットはまた、本明細書に記載されている２つまたはそれよりも多くの組成物の組合せを使用するための使用説明書を含むことができる。使用説明書はまた、経口、静脈内などの任意の適切な技術によって、または別の公知の薬物送達経路を介して組成物を投与するために提供されてもよい。
【０１７５】
本明細書に記載されているキットはまた、１つまたは複数の容器を含有することができ、それは、記載されている構造、シグナル伝達実体、および／または生体分子などの成分を含有することができる。キットはまた、化合物を混合し、希釈し、および／または投与するための使用説明書を含有することができる。キットはまた、１つまたは複数の溶媒、界面活性剤、保存剤、および／または希釈剤（例えば、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）、または５％デキストロース）を有する他の容器、ならびに成分を混合し、希釈し、または試料もしくはそのような処置を必要とする患者に投与するための容器を含むことができる。
【０１７６】
キットの組成物は、任意の適切な形態として、例えば、液体溶液として、または乾燥粉末として提供されてもよい。提供される組成物が乾燥粉末である場合、粉末は、同様に提供され得る適切な溶媒の添加によって復元することができる。組成物の液体形態が使用される実施形態では、液体形態は、濃縮されてもよいか、または使用準備済みであってもよい。溶媒は、特定の本発明の構造および使用または投与の様式に依存する。組成物に適した溶媒は周知であり、文献で入手可能である。
【０１７７】
キットは、一組の実施形態では、バイアル、チューブなどの１つまたは複数の容器を含むことができ、容器の各々は、方法に使用される別個の要素の１つを含む。例えば、容器の１つはアッセイにおける陽性対照を含んでもよい。さらに、キットは、他の成分、例えば、アッセイに有用な緩衝液のための容器を含んでもよい。
【０１７８】
本明細書で使用される場合、「対象」または「患者」とは、任意の哺乳動物（例えば、ヒト）、例えば、異常な脂質レベルに関連する疾患または身体状態などの疾患または身体状態に罹患しやすい可能性がある哺乳動物を指す。対象または患者の例には、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはマウス、ラット、ハムスター、もしくはモルモットなどのげっ歯動物が含まれる。概して、本発明はヒトでの使用に方向付けられている。対象は、ある特定の疾患もしくは身体状態を有すると診断されたか、またはそうでなければ疾患もしくは身体状態を有することがわかっている対象であってもよい。一部の実施形態では、対象は、疾患または身体状態を発症するリスクがあると診断されていてもよいか、またはリスクがあることがわかっていてもよい。
【実施例】
【０１７９】
（実施例１）
酵素レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）についての基質として、前もって開発した合成高密度ナノ粒子（ＨＤＬ−ＮＰ）を使用したアッセイを行った。ＨＤＬ−ＮＰを、市販の５ｎｍ  ＡｕＮＰを使用して形成した。アポＡＩを、５倍モル過剰量で５ｎｍ  ＡｕＮＰの水溶液に加え、室温で穏やかにかき混ぜながら１時間ナノ粒子表面に結合させた。このインキュベーション期間の後、エタノール（２０％、ｖ／ｖ）および脂質の混合物を、金ナノ粒子の濃度に対して２５０倍モル過剰量で溶液に加えて、ＡｕＮＰコアの周りに脂質二重層を形成させた。使用した脂質は、ａ）１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチオエタノール（ＤＰＰＴＥ）、ＡｕＮＰ３２の表面に共有結合して、内葉を形成するチオール化脂質、ｂ）アシル鎖（例えば、ＴｏｐＦｌｕｏｒ  ＰＣ、１−パルミトイル−２−（二フッ素化ジピロメテンボロン）ウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）のｓｎ２位にコンジュゲートしたフルオロフォアを有するホスファチジルコリン（ＰＣ）脂質、最後に、ｃ）ＨＤＬ−ＮＰ脂質二重層の外葉の大部分を形成する１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）であった。脂質二重層を、穏やかに振とうして室温で終夜、形成させた。終夜インキュベートした後、ＨＤＬ−ＮＰを、１５，０００×ｇで５０分間遠心分離することにより精製し、未反応の表面構成成分およびエタノールの除去を保証するために３回繰り返した。より大型のバッチのナノ粒子（初回５ｎｍ  ＡｕＮＰ溶液＞１０ｍｌ）の場合、遠心分離ステップは、省略してもよく、ナノ粒子を、タンジェント流濾過システムを使用して処理して、ＨＤＬ−ＮＰの最終溶液を濾過し濃縮してもよい。
【０１８０】
図１は、例示的蛍光脂質として使用されるＴｏｐＦｌｕｏｒ  ＰＣによる、各構成成分ステップを伴うＨＤＬ−ＮＰの形成を示す。
【０１８１】
蛍光ホスファチジルコリンを、ＨＤＬ−ＮＰの外葉に取り込むことにより、精製済みのＬＣＡＴおよびコレステロールの混合物と共に蛍光ＨＤＬ−ＮＰを２４時間インキュベートした結果、ＴｏｐＦｌｕｏｒ標識ＰＣ（図２、左側）およびＴｏｐＦｌｕｏｒ  ＴＭＲ標識ＰＣ（図２、右側）を使用して蛍光が増加することが実証される。二重層ＮＰと称する、アポＡＩを含まない、ＴｏｐＦｌｕｏｒを担持したＨＤＬ−ＮＰのバリアントを利用することにより、ＬＣＡＴ活性についてのＨＤＬ−ＮＰの特異性が実証されている。図３は、コレステロールおよびＬＣＡＴの存在下で、ＴｏｐＦｌｕｏｒ  ＨＤＬ  ＮＰからの蛍光シグナルは、二重層ＮＰ群よりも有意に増加し（ｐ＝０．０００１２）、しかもコレステロールを担持させた二重層ＮＰは、ＬＣＡＴを含むまたは含まない蛍光シグナルの有意な変化を示さない（ｐ＝０．２２）ことが実証される。さらに、希釈されたヒト血清と共にＴｏｐＦｌｕｏｒ標識ＨＤＬ−ＮＰおよび二重層ＮＰをインキュベートすることによって、ＴｏｐＦｌｕｏｒ  ＨＤＬ−ＮＰに対する酵素活性の時間経過が、かなり速やかであり、ＮＰへの血清付加の３０分以内に蛍光が有意に増加し（ｐ＝０．００００３）（図４）、数時間のインキュベーション時間が推奨される既存のＬＣＡＴアッセイに対して著しく改善することが決定されている。蛍光の有意差は、本実験の３０分間の間、血清と共にインキュベートしたＴｏｐＦｌｕｏｒ二重層ＮＰ対Ｔｏｐ  Ｆｌｕｏｒ二重層ＮＰ単独間で観察されず、再度、このセンサーにＬＣＡＴ特異性を付与する上でアポＡＩの重要性を例示している。蛍光シグナルの増加は、蛍光分子（ＴｏｐＦｌｕｏｒ）と、非常に近接している場合、蛍光の消光をもたらすナノ粒子との間の距離の増大によって生じる可能性があるが、コレステロールが結合し、コレステロールがＴｏｐＦｌｕｏｒのＳＮ２位で、蛍光アルキル末端脂質でエステル化される場合、得られた蛍光標識コレステリルエステルは、コア金ナノ粒子からＴｏｐＦｌｕｏｒリン脂質をさらに遠ざけ、またフルオロフォアが金ナノ粒子コアからさらに離れて位置するように、コレステリルエステル部分を位置させる。
【０１８２】
（実施例２）
コレステロール流出アッセイと相関する、アポリポタンパク質ＡＩ吸着およびレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性によってＨＤＬ機能を測定するためのナノ粒子に基づいたアッセイ
【０１８３】
ＬＤＬ−およびＨＤＬ−コレステロールの測定を使用して、心血管疾患（ＣＶＤ）リスクを推定する。「悪玉」のＬＤＬ−Ｃの低下は、ＣＶＤを予防する上で有用であることが証明されており；しかしながら、「善玉」のＨＤＬ−Ｃを増加させることを実現させることはあまり成功していない。最近では、データによると、ＨＤＬ−Ｃに対するＨＤＬ機能を測定することによって、より有用であるデータを提供することができることが実証されている。例えば、アポＢ枯渇ヒト血清が、培養されたマクロファージからコレステロールを除去する能力を測定する、コレステロール流出アッセイ（ＣＥＡ）の結果は、ＣＶＤの有病率の減少と有意に相関し、ＣＶＤを独立に予測する。残念ながら、ＣＥＡの複雑性、困難な性質、ならびに時間および費用により、その使用は限定される。より利用しやすいＨＤＬ機能試験を作製しようと努めて、リン脂質の二重層（ＢＬ−ＮＰ）で官能化された５ｎｍ直径の金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）表面を利用して、溶液からアポＡＩを自発的に集合させて、ＬＣＡＴ活性を補助するＨＤＬ様ナノ粒子（ＨＤＬ  ＮＰ）を形成させた。ＢＬ−ＮＰは、純粋な溶液および試料中のアポＡＩの存在量によるヒト血清から、アポＡＩを速やかにおよび優先的に吸着する。血清を使用して、ｉｎ  ｓｉｔｕで形成されたＨＤＬ  ＮＰ（ＩＳＨＤＬ  ＮＰ）は、ＨＤＬ  ＮＰにおいて、アポＡＩおよびコレステロールのＬＣＡＴによって媒介されるエステル化のための基質を提供する。ナノ粒子を単離した後、遊離コレステロール（ＦＣ）および総コレステロール（ＴＣ）［すなわち、ＦＣ＋コレステリルエステル（ＣＥ）］についての簡易比色アッセイ（ｓｉｍｐｌｅ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）を行った。測定したＣＥ量は、試料中でＢＬ−ＮＰにより結合したアポＡＩと直接相関する。さらに、アポＡ１およびＬＣＡＴが、ＣＥＡにおいて測定されたコレステロール流出を媒介している重要な因子であるため、ＢＬ−ＮＰアッセイで得られたＣＥとＣＥＡからの流出との間の相関を、アポＢ枯渇血清を使用して測定した。データによって、有意な相関が明らかになった。したがって、ＮＰアッセイの複数の利点は、ＣＥＡとの比較およびさらなる患者のモニタリングのための、アポＡＩおよびＬＣＡＴ活性のようなＨＤＬパラメーターの、広範なポイントオブケアのハイスループット試験を可能にし得る。
序文
【０１８４】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、血清中でナノ粒子を運搬する動的なコレステロールである。歴史的には、コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）の測定は、ＨＤＬ−臨床医に、ＨＤＬ−Ｃの増加が有病率およびリスクの低下を示唆するような、心血管疾患（ＣＶＤ）適応度の尺度を提供した。（１）しかしながら、血清中のＨＤＬ−Ｃの増加は、治療的に有用であることが最終的に証明されておらず（２）、測定し、心保護的なＨＤＬ機能を恐らく強めていることに注意が向けられている。他にも機能はあるがとりわけ、ＨＤＬは、遊離コレステロール（ＦＣ）が、末梢組織から除去され、最終的に、排出のために肝臓に送達される、コレステロール逆転送（ＲＣＴ）として公知のプロセスによって心血管疾患（ＣＶＤ）リスクを低下させると考えられる。ＨＤＬによるＲＣＴの３つの重要なステップには以下が含まれる：１）脂質を含むマクロファージのＨＤＬの関与およびこれらからのＦＣの流出、２）ＨＤＬ中のＦＣが、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）によってＣＥへとエステル化され、これは、コレステリルエステル（ＣＥ）が、さらにコレステロールに富むようになっていくＨＤＬ粒子のコアに詰め込まれることを可能にする、３）コレステロールに富むＨＤＬが、糞便での排出のために肝臓へコレステロールを送達する。コレステロールを取り込み、エステル化し、送達するＨＤＬの能力は、ＨＤＬを定義しているアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡＩ）の存在により支配される。（３）臨床上の必要性のため、ＨＤＬ機能を測定する診断検査は、決定的に可能となり得る。
【０１８５】
コレステロール流出アッセイ（ＣＥＡ）と呼ばれる、ＲＣＴのｅｘ  ｖｉｖｏ近似法は、放射能標識した３Ｈ−コレステロールで満たし、環式ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）で処置してＡＢＣＡ１受容体の発現を増加させたＪ７７４細胞（ネズミのマクロファージ細胞株）の使用を伴う。（４−９）データによって、ＡＢＣＡ１からＨＤＬに受け渡されるコレステロールは、マクロファージからのアテローム形成抑制的な流出に有意に寄与することが示される。（１０）アポＢ枯渇血清を加えることによって、マトリックス中のマクロファージからＨＤＬへのコレステロールの流出（例えば、３Ｈ−ＦＣ＋３Ｈ−ＣＥ）を定量化することができる。（６）ＣＥＡから得られた結果は、ＣＶＤリスクの低下の優れたマーカーであることが最近示され、他のすべての公知の危険因子について制御している場合でさえも、ＣＶＤを予測する。（６、７）明らかに、ＣＥＡに関する課題には、アッセイが、終了までに数日を要し、培養されたマクロファージ、放射能標識化または蛍光コレステロールの使用、経験豊かな人材を必要とし、高価であり、広範な臨床上の使用のために必要とされるハイスループットに適用できず、実験室によってアッセイの結果の著しい可変性があることが含まれる。（１１）ＨＤＬ機能を測定する新たな技術を同定することは、特に、ライフスタイルの改善および／またはＨＤＬ機能をモジュレートする医学療法の状況で、ＨＤＬ機能と心血管疾患との間の相関のより良い理解を得るために明らかに多大な利益となるはずである。（１２）
【０１８６】
いくつかのグループ（１３〜１５）は、生体模倣の高密度リポタンパク質様ナノ粒子（ＨＤＬ  ＮＰ）の合成および適用を以前に記載している。本グループは、２〜４コピーのアポリポタンパク質ＡＩ（アポＡＩ）およびリン脂質二重層の集合のための骨格として働く５ｎｍ金ナノ粒子コアを使用する。（１６〜１８）ＨＤＬ  ＮＰ構築物は、直径およそ１３ｎｍであり、アポＡＩ分子３±１およびＨＤＬ  ＮＰ膜の外葉におけるリン脂質８３±１２からなり、これは、好都合なことに、未変性の、成熟した球状ＨＤＬについての報告された値に匹敵する。先の研究によって、ＨＤＬ  ＮＰが、ＨＤＬのためのすべての公知の受容体を介してコレステロールを能動的に流出させ（１９）、ＬＣＡＴ活性を補助することが実証された。（２０）興味深いことに、ＨＤＬ  ＮＰにおけるアポＡＩの自発的な集合が、金ナノ粒子鋳型が直径およそ５〜６ｎｍであることを要するということが実証された。（２１）ナノ粒度のわずかな増加でさえも、アポＡＩ集合の減少ならびにコレステロールの結合および細胞のコレステロール流出に関する機能の大幅な減少をもたらした。したがって、ＰＬで官能化された直径５ｎｍのＡｕＮＰ表面は、アポＡ１の特異的な隔離およびＬＣＡＴ活性のためのプラットフォームを提供する。バイオセンサーアッセイの場合、コア金ナノ粒子のため、過度の速やかな単離および読み取りオプションが、アッセイ開発のために利用可能である。（２２〜３０）
【０１８７】
最終的に、培養されたマクロファージからＨＤＬアクセプターに流出し、ＣＥＡによって測定されたＴＣ（例えば、３Ｈ−ＦＣ＋３Ｈ−ＣＥ）の量は、アポＢ枯渇血清試料中のアポＡＩの量、および試料中の細胞からＨＤＬアクセプターへのＦＣ流動の勾配を維持するための、血清中のＬＣＡＴによるコレステロールエステル化に決定的に依存する。（１０、３１）ＣＥＡの結果を近似する新たな技術は、これらのパラメーターに応答可能であるべきである。アポＡＩが、サイズ範囲７〜１４ｎｍに及ぶ未変性のＨＤＬの生合成を制御し、データから、アポＡＩが、リン脂質で官能化された５ｎｍ直径のＡｕＮＰ表面に固く結合して、ＨＤＬ  ＮＰ（２１）を形成することが示されるため、ＰＬで官能化された５ｎｍ直径のＡｕＮＰ表面を、血清に単に加えると、アポＡＩの安定した結合およびＨＤＬナノ粒子（ＩＳＨＤＬ  ＮＰ）のｉｎ  ｓｉｔｕ形成を可能にするはずであるという仮説を立てた。アポＡＩ結合後、ＨＤＬ  ＮＰは、ＦＣを受動的に結合するための鋳型として働き、ＬＣＡＴ活性を補助する。（１８）ＨＤＬ  ＮＰが、アポＡＩ（血清中のＬＣＡＴの一次活性化因子）、コレステロール、およびアシル鎖のコレステロールへのエステル交換のためのナノ粒子膜の外葉から得られたＰＬのドナープールを提供するため、ＬＣＡＴ活性をアッセイするためのＩＳＨＤＬ  ＮＰの使用は、理想的である。まとめると、ＩＳＨＤＬ  ＮＰにおいて形成されるＣＥの量は、ＣＥＡから得られた出力を支配するパラメーター（すなわち、アポＡＩおよびＬＣＡＴ）の代替物であり、２つのアッセイから得られた結果が、有意に相関するはずであるという仮説を立てた。ＢＬ−ＮＰアッセイが、細胞または放射能標識化コレステロールを要さず、最小限のコストで行うことができ、速やかであり（時間対日）、ハイスループットの、同等のポイントオブケアの自動化に適用できるため、ＣＥＡアッセイのための有望な代替物としてＨＤＬ機能を追跡する新世代アッセイを提供するのも理解できる。
材料および方法
【０１８８】
リン脂質二重層ナノ粒子（ＢＬ−ＮＰ）の合成：ＢＬ−ＮＰを、以前に記載の通り、２０％エタノール／８０％水溶液中でリン脂質（ＡｕＮＰ濃度に対して、２５０倍のモル過剰量）で５ｎｍ直径の金ナノ粒子（ＡｕＮＰ、Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ、Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ）を、表面を官能化することにより合成した。（２１）使用したＰＬは、ａ）１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート］（ＰＤＰ−ＰＥ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）、ＡｕＮＰ（３２）の表面に共有結合して内葉を形成するジスルフィド含有脂質、およびｂ）ＢＬ−ＮＰ  ＰＬ二重層（１６、３２）の外葉の大部分を形成する１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）であった。ＰＬ二重層を、終夜室温で穏やかに振とうして形成させた。終夜インキュベートした後、ＢＬ−ＮＰを、Ｋｒｏｓ−Ｆｌｏタンジェント流濾過システム（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して精製して、任意の過剰のＰＬ、エタノールを除去し、ＢＬ−ＮＰを濃縮した。
【０１８９】
アポＡＩのＢＬ−ＮＰへの結合およびＬＣＡＴ活性の評価：「純粋系」における実験のために、ＰＢＳ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中のアポＡＩを、０：１、１：１、２：１、５：１、１０：１、および２０：１（ＭアポＡＩ：Ｍ  ＢＬ−ＮＰ）の比で、ＢＬ−ＮＰ（最終２５０ｎＭ）に加え、３７℃で１時間ＢＬ−ＮＰと共にインキュベートして、ＩＳＨＤＬ  ＮＰを形成させた。ＩＳＨＤＬ  ＮＰを、５０分間１５，０００×ｇで遠心分離を使用して精製し、３回繰り返して、未結合のアポＡＩの除去を保証した。ＬＣＡＴ活性の決定のために、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）１０μｇおよび１０ｎＭ  ＬＣＡＴ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）２．５μＬを溶液に加え、３７℃で１時間インキュベートした。再度、ナノ粒子を、遠心分離を使用して、過剰のコレステロールおよびＬＣＡＴから同様に分離した。血清中の実験のために、０％、０．５％、１％、３％における血清を、２５０ｎＭ  ＢＬ−ＮＰ（最終、１００μＬ最終体積）に加え、３７℃で１時間インキュベートして、ナノ粒子へのアポＡＩおよびコレステロールの結合を可能にし、ＬＣＡＴがコレステロールをエステル化するのを可能にした。再度、ナノ粒子を、上記の通り、遠心分離により血清から精製した。
【０１９０】
ＢＬ−ＮＰへのアポＡＩの結合の決定を、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡにより達成した。その精製後、１００ｎＭ  ＩＳＨＤＬ  ＮＰ  ２０μＬを、０．０５Ｍ  Ｉ２  ４μｌおよび４Ｘローディング緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）６μｌで４℃で１時間インキュベートした。次いで、これらの試料を、８分間煮沸し、１５，９００×ｇで３０分間高速回転させた。上澄み２５μｌを、４〜２０％トリス−ＨＣｌプレキャストゲル（ＢｉｏＲａｄ）にロードし、２００Ｖで３２分間運転した。ゲルを、ＰＶＤＦ膜（６０Ｖ  ９０分間；ＢｉｏＲａｄ）に移し、続いて、これを、トリス−緩衝食塩水含有０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＴＢＳＴ）中の５％遮断剤中で室温で３０分間遮断した。アポＡＩ抗体（Ａｂｃａｍ）を、１：１０００希釈で膜に加え、４℃で終夜インキュベートした。ＴＢＳＴ中ですすいだ後、二次抗体（ＢｉｏＲａｄ）を、１：２０００希釈で加えた。最後に、ブロットを、ＥＣＬ展開剤キット（ＧＥ）を使用して展開した。対照のために、アポＡＩを１０μｇ／ｍｌで担持し、血清を１％希釈で担持し、最後に、予め合成した２５ｎＭ  ＨＤＬ−ＮＰを、ＩＳＨＤＬ  ＮＰのために、前述した通り処理し、ゲルに担持した。
【０１９１】
ＥＬＩＳＡを使用したＩＳＨＤＬ  ＮＰにおけるアポＡＩ結合の定量のために、ヒトアポＡＩ  ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を、製造業者により提供された使用説明書の通りに利用した。
【０１９２】
ＩＳＨＤＬ  ＮＰにおけるＣＥの測定：Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄコレステロールアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を利用して、製造業者により提供された使用説明書によって、試料中の総コレステロール（ＴＣ）の量を決定した。プロトコールの唯一の改訂は、ＬＣＡＴ活性の決定のために試料中のコレステロールエステルの総量の定量を可能にする、試料のサブセットについてのコレステロールエステラーゼの削除であった。簡単にいうと、コレステロールエステラーゼの存在下で、コレステロールエステルをコレステロールに加水分解し、続いて、これを、コレステロールオキシダーゼにより酸化させて、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成することにより、アッセイを行う。Ｈ２Ｏ２を、西洋ワサビペルオキシダーゼおよび１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン（Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ）を使用して検出し、組合せによって、蛍光生成物、レゾルフィンの生成をもたらす。レゾルフィンを、プレートリーダーにおいてそれぞれ５６０ｎｍおよび５９０ｎｍの励起／発光で検出した。各試料中のコレステロールの量を、標準のコレステロール検量線と比較することにより得た。コレステロールエステル（ＣＥ）の決定のために、コレステロールエステラーゼを含む（総コレステロール、ＴＣ）および含まない（遊離コレステロール、ＦＣ）試料中の定量化された総コレステロールを使用し、ＣＥ＝ＴＣ−ＦＣであった。
【０１９３】
コレステロール流出アッセイ：コレステロール流出アッセイを、以前に記載の通り行った。（１９、２１）簡単にいうと、Ｊ７７４マウスマクロファージを、２４ウェルプレートに密度１．５×１０５細胞／ウェルで播種し、終夜付着させた。翌日、細胞を、ＲＰＭＩ、５％ＦＢＳ中３Ｈ−コレステロール２μＣｉ／ｍＬで標識し、ＡＣＡＴ阻害剤（Ｓａｎｄｏｚ  ５８−０３５、２μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した。２４時間標識した後、ＨＤＬ受容体ＡＢＣＡ１を、０．２％ＢＳＡおよびＡＣＡＴ阻害剤を含むＲＰＭＩ中の８−（４−クロロフェニルチオ）アデノシン３’，５’−環式一リン酸（ｃＡＭＰ、０．３ｍＭ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に、終夜、インキュベートすることによりアップレギュレートした。アポＢ枯渇ヒト血清を得るために、単一のドナーヒト血清試料（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｏｖｉ、ＭＩ、ＵＳＡ）を、血清：ＰＥＧ２．５：１（ｖ／ｖ）の比で、２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、平均ＭＷ＝８０００）、ｐＨ＝８の溶液と混合した。血清試料を、室温で２０分間インキュベートし、次いで、４℃で３０分間１２，７００×ｇで遠心分離した。次いで、上澄みを、１％ＨＥＰＥＳ、ＡＣＡＴ阻害剤２μｇ／ｍＬ、および０．０３ｍＭ  ｃＡＭＰを含有するＭＥＭに希釈し、Ｊ７７４細胞に加えた。４時間インキュベートした後、培養培地を除去し、濾過し、液体シンチレーション・カウンタ（カウント上清）で実行した。総細胞３Ｈ−コレステロールを、イソプロパノールを使用してインキュベーションの開始時（Ｔ０）にＪ７７４細胞から３Ｈ−コレステロールを抽出し、その後、液体シンチレーションカウンティング（カウント合計）により定量化した。いかなるアクセプターも存在しない細胞外のコレステロールの自由拡散であるバックグラウンド（カウントバックグラウンド）を、すべてのカウント上清から減算し、結果を、カウント合計で除し、１００を乗じて、コレステロール流出パーセント：％ＨＤＬ流出＝［（カウント上清−カウントバックグラウンド）／カウント合計）］×１００を生成した。
【０１９４】
統計：すべての統計的検定を、Ｒ、ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０．１で実施した。測定値間の相関の決定のために、Ｐｅａｒｓｏｎの積率相関試験を利用した。Ｐ＜０．０５は、統計的有意性を意味し、エラーバーは、平均の標準誤差を意味する。
結果
【０１９５】
リン脂質二重層ナノ粒子におけるアポＡＩの隔離：ＰＢＳまたは希釈血清中のアポＡＩ混合物中で１時間インキュベートした後、ＢＬ−ＮＰを、遠心を使用して単離し、精製し、ウエスタンブロット法によってアポＡＩ含有量について精査した（図５Ａ〜図５Ｅ）。これらの結果によって、アポＡＩの用量−依存的な増加が実証され、ＰＢＳおよび高希釈血清からアポＡＩを隔離するＢＬ−ＮＰの能力を確認し、ＨＤＬ  ＮＰ（ＩＳＨＤＬ  ＮＰ）のｉｎ  ｓｉｔｕ合成を本質的に達成した。また、ＢＬ−ＮＰによって結合されたアポＡＩの量は、試料中のアポＡＩの量に対して用量−反応である（図５Ａ〜図５Ｅ）。コレステロールを流出させる、異なる量のアポＡＩを有するＩＳＨＤＬ  ＮＰの活性を、伝統的に合成されたＨＤＬ  ＮＰ（ＡｕＮＰ：アポＡＩの比１：５）との比較を伴うコレステロール流出アッセイを使用して確認した（図５Ｅ）。データによって、ＩＳＨＤＬ  ＮＰおよびＨＤＬ  ＮＰが、同様に、培養細胞からコレステロールを流出させたことが示される［ＩＳＨＤＬ  ＮＰ（１：５）の場合の流出１．１７％対ＨＤＬ  ＮＰの場合の流出１．３６％］。
【０１９６】
アポＡＩ吸着の機能としてのＬＣＡＴ活性の検出：次に、インキュベーション培地の濃度の増加においてアポＡＩを隔離することによって、ＬＣＡＴへの曝露後にＢＬ−ＮＰにおけるＴＣおよびＣＥの検出が同時に増加されるか否かを決定した（図６Ａ〜図６Ｃ）。ＰＢＳから隔離したアポＡＩの量が増加すると、ＩＳＨＤＬ  ＮＰに結合したＣＥが増加することを決定した（図６Ｂ）。次に、希釈血清の量の増加と共にＢＬ−ＮＰをインキュベートしたところ、血清の量を増加させるにつれ、ＴＣおよびＣＥが漸進的に増加することが明らかになった。最終的に、ＩＳＨＤＬ  ＮＰにおけるＬＣＡＴの明確な活性を得るには血清濃度１％（すなわち、２５０ｎＭ  ＢＬ−ＮＰ１００μｌ中の血清１μｌ）が適していると考えられる（図６Ｃ）。
【０１９７】
血清アポＡＩの機能としてのアポＡＩおよびＣＥのＢＬ−ＮＰへの吸着：次に、ＢＬ−ＮＰが、天然のアポＡＩ変異を有する血清試料からアポＡＩを隔離することができるか否か、およびアポＡＩの増加が、ＣＥの増加、したがって、ＬＣＡＴ活性と相関するか否かを評価することを試みた。１０名の非特定化されたヒトドナー由来の市販の血清試料を購入し（表１）、各血清試料を、アポＡＩ、総コレステロール、およびＨＤＬ−Ｃについて特徴付けた。アポＡＩについてのＥＬＩＳＡを使用して、血清試料から得られたアポＡＩの可変量を隔離するＢＬ−ＮＰの能力を定量化した。図７中の結果は、血清試料のそれぞれにおけるアポＡＩの総量と１％血清を含むＢＬ−ＮＰの１時間のインキュベート後にＩＳＨＤＬ  ＮＰにおいて検出されたアポＡＩの量との間の相関プロットを示す。これらのデータから、有意な正相関が実証される（Ｒ＝０．６６８、ｐ＝０．０３５）。
【０１９８】
【表１】
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【０１９９】
さらに、１％血清との１時間のインキュベーション期間後のＩＳＨＤＬ  ＮＰと関連するＣＥの量を測定した。結果によって、血清中のアポＡＩレベルが、ＩＳＨＤＬ  ＮＰにおいて検出されたＣＥの数と相関することが示される（Ｒ＝０．７２９、ｐ＝０．０１６、図８）。
【０２００】
コレステロール流出能力の測定値についてのプラットフォームとしてのＢＬ−ＮＰ：最後に、ＢＬ−ＮＰにおけるコレステロールエステル化とＨＤＬコレステロール流出を測定する従来のＣＥＡ方法との関係を調査することを試みた。ＣＥＡにおいて、アポＢ枯渇血清が伝統的に使用され、ＰＥＧ８０００を加えることによりアポＢ含有リポタンパク質を血清から枯渇させることによって生成された。ＢＬ−ＮＰに基づいたアッセイにおける個人１０名由来のアポＢ枯渇血清試料を利用し、ＩＳＨＤＬ  ＮＰのＣＥ含有量とＣＥＡを使用して得られたコレステロール流出との間の正の相関を見出した（Ｒ＝０．７４９、ｐ＝０．０１３、図９）。
考察
【０２０１】
ＣＶＤが、依然として先進国における最も一般的な死亡原因であることから、ＣＶＤを発症する個体のリスクを評価し、次いで特定の介入またはライフスタイルの改善がリスクをどのように変化させるかを追跡することが依然として重要である。歴史的には、「善玉コレステロール」と称するＨＤＬ−Ｃの測定は、ＣＶＤリスクの軽減に相当するとみられていた。（１、３３）しかしながら、より最近では、ＨＤＬ−Ｃのスポット測定は、ＨＤＬ−Ｃを増加させることを狙いとした療法の失敗により、疑問視されている。（３４）そうであるから、最も詳細には、ＣＥＡを使用した、ＨＤＬ機能の測定は、ＣＶＤリスクを測定するのに強力に有効であることが示されている。（６、７、９、３５）さらに、より広範に、コレステロール流出を超えた他のＨＤＬ機能を測定することを狙いとした他の技術によって、リスクを軽減し得る多数のＨＤＬ特異的因子をより良く説明し、測定することへの関心が生じている。（１２）ＣＥＡの臨床移行における課題により、またＨＤＬ機能について利用可能な試験の幅を増加させるため、重要なＨＤＬ関数パラメーターを捉えているアッセイを開発しようと努め、データは、臨床的に検証されたＣＥＡと相関するはずである。
【０２０２】
ＢＬ−ＮＰセンサープラットフォームは、ＣＥの定量によって、試料中のアポＡＩの量およびＬＣＡＴ活性を間接的に測定する機会を提供する。さらに、ＩＳＨＤＬ  ＮＰに結合したＣＥは、ＣＥＡを使用して得られたデータと間接的に相関する。主な利点を強調する前に、アッセイの概念的な限界について論じることには価値がある。初めに、ＢＬ−ＮＰアッセイにおいて測定されたＦＣおよびＣＥは、マクロファージからのコレステロールの受容体によって媒介される除去によってもたらされたものではない。したがって、ＢＬ−ＮＰが、それがなければ、マクロファージからコレステロールを流出させないはずであるアポＡＩにとっての可能化基質（ｅｎａｂｌｉｎｇ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）となっており、その結果、ＢＬ−ＮＰアッセイは、偽陽性の結果をもたらすはずであるという可能性が存在する。アポＡ１のバリアントが、ＢＬ−ＮＰに結合することができないが、マクロファージに、コレステロール流出を補助させる上で活性である、反対の場合もあり得る。可能性は低いが、ＣＥＡと直接比較して、生化学的に特徴付けられる大量の血清試料をスクリーニングすることが、全範囲を認識するには確かには必要である。さらに、ある特定のアポＡ１タンパク質は、ＢＬ−ＮＰに結合することができるが、ＬＣＡＴ活性を補助しない。実際に、ＬＣＡＴ活性を補助しないアポＡＩバリアントが、公知である。（３６、３７）興味深いことに、これらのＴＣおよびＦＣ値が、測定されないＣＥと一貫して同じとなるはずであるため、ＢＬ−ＮＰアッセイは、これらの個体を同定するはずである。上記の場合と同様、さらなる研究が求められる。
【０２０３】
最後に、ＨＤＬ機能を測定するＢＬ−ＮＰ技術を使用したデータは、主な３つの理由で重要である。１）ＢＬ−ＮＰは、ＩＳＨＤＬ  ＮＰに結合したアポＡＩの程度が、培地中のアポＡＩの総量に依存するような、アポＡＩの定量的な隔離を可能にする基質を提供する（図５Ａ〜５Ｅ）。ＩＳＨＤＬ  ＮＰは、ナノ粒子表面におけるアポＡＩ補因子および基質、ＣおよびＰＬの存在により、ＬＣＡＴ活性についての特異的基質として働く。２）血清と共にインキュベートした後、アポＡＩの量とＩＳＨＤＬ  ＮＰにより結合されたＣＥとの間で、有意な正の相関を測定した。したがって、血清アポＡＩにおいて変異を検出するためのバイオセンサーとしてのＩＳＨＤＬ  ＮＰにおけるＣＥについての可能性が実証されている。３）データでは、ＩＳＨＤＬ  ＮＰによって形成され、ＩＳＨＤＬ  ＮＰ内に隔離されたＣＥが、ＣＥＡを使用して測定した血清への総コレステロール流出に有意に相関することが示される。
【０２０４】
この研究において実証されたＢＬ−ＮＰバイオセンサープラットフォームは、現行のものにおいて数時間のうちに放射性物質を使用せずに結果を提供する単純で安価な無細胞アッセイについての可能性を提供する（図１０）。同様に、ＣＥを直接測定するためのこのプラットフォームは、治療介入、食事の改善、または運動などの因子からもたらされ得るアポＡＩおよびＬＣＡＴ活性の変化に対して感度がよいバイオセンサーの基礎となる。上記の通り、将来の研究は、制御された設定において個別の患者から得られた、十分に注釈が付けられたおよび特徴付けされた血清試料との相関を必要とする。最後に、提案されるアッセイ時間を短縮し、将来のポイントオブケア系についてのより速い結果を提供するためのコレステロールオキシダーゼ−に基づいた頑健な検出デバイスの開発が、進行中である。
参照文献
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【０２０５】
本発明のいくつかの実施形態が、本明細書に記載および例示されているが、当業者は、機能を果たす、ならびに／または結果および／もしくは本明細書に記載されている利点の１つもしくは複数を得るための種々の他の手段および／または構造を容易に想定し、そのような変形形態および／または修飾の各々は、本発明の範囲内であると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載されているすべてのパラメーター、寸法、材料、および構成は、例示的であると意図されており、実際のパラメーター、寸法、材料、および／または構成は、本発明の教示が使用される、１つまたは複数の具体的用途に依存することを容易に理解するであろう。
【０２０６】
当業者は、日常的な実験だけを使用して、本明細書に記載されている本発明の具体的実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することができる。したがって、前述の実施形態は、一例のみとして提示され、添付の請求項およびその均等物の範囲内で、具体的に記載および請求されている以外の方法で本発明が実践され得ることを理解されたい。本発明は、本明細書に記載されている、各個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に方向付けられている。さらに、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾していなければ、２つまたはそれよりも多くのそのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組合せが、本発明の範囲内に含まれる。
【０２０７】
さらに、本発明は、挙げられている請求項の１つまたは複数から、１つまたは複数の限定、要素、節、および記述用語が別の請求項に導入されているすべての変形形態、組合せおよび置換を包含する。例えば、別の請求項に従属しているいずれかの請求項は、同じ基本請求項に従属している他のいずれかの請求項において見出される１つまたは複数の限定を含むように修飾することができる。要素がリストとして、例えばマーカッシュ群形式で提示されている場合、その要素の各下位群も開示されており、その群から任意の要素（複数も含む）を取り出すことができる。一般に、本発明、または本発明の態様が、特定の要素および／または特徴を含むものとして参照されている場合、本発明、または本発明の態様の特定の実施形態は、そうした要素および／または特徴からなる、またはから本質的になることを理解すべきである。簡潔にするために、それらの実施形態は、本明細書においてこの通りの言葉で具体的に示されてはいない。「含むこと」および「含有すること」という用語は、開放されていることを意図するものであり、追加的な要素またはステップの包含を許容することも留意されたい。範囲が与えられている場合、終点は包含される。さらに、別段の指定がないか、あるいは文脈および当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表されている値は、その文脈による別段の明らかな指定のない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１まで、本発明の異なる実施形態における記述範囲内の特定の任意の値または下位範囲を想定することができる。
【０２０８】
すべての定義は、本明細書で定義され、使用される場合、辞書の定義、参照することによって組み込まれた文書中の定義、および／または定義された用語の通常の意味に優先すると理解すべきである。
【０２０９】
本明細書および請求項で使用される場合、「１つの（ａおよびａｎ）」という不定冠詞は、明確に反対に示されない限り、「少なくとも１つの」を意味すると理解すべきである。
【０２１０】
また、明確に反対に示されない限り、１つより多いステップまたは作用を含む、本明細書で請求されている任意の方法では、方法のステップまたは作用の順序は、必ずしも方法のステップまたは作用が記載される順序に限定されないことを理解すべきである。
【０２１１】
請求項および上記の本明細書では、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「担持する」、「有する」、「含有する」、「伴う」、「保持する」、「からなる」などのすべての移行句は、オープンエンドである、すなわち、含むがそれらに限定されないことを意味すると理解されたい。「からなる」および「から本質的になる」という移行句のみが、United  States  Patent  Office  Manual  of  Patent  Examining  Proceduresに記載されているように、それぞれ、制約的または半制約的な移行句であるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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