(57)【要約】  シンガス、プロデューサーガス、及びＣＯ２と組み合わせた再生可能なＨ２などのガス状Ｃ１含有基質を、栄養バイオ生成物及び他の有用なバイオ生成物に変換する微生物並びにバイオプロセスが提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素原子を１つのみ含有する無機分子及び／又は有機分子を捕捉し、同化生合成によって生成される２以上の炭素原子を含有する有機分子に変換するための生物学的並びに化学的方法であって、
化学合成独立栄養微生物を維持するのに適する環境に、炭素原子を１つのみ含有する無機分子及び／又は有機分子を導入すること、
化学合成独立栄養微生物を維持するのに適する環境にガス状基質を導入することを含み、
炭素原子を１つのみ含有する無機分子及び／又は有機分子が、成長及び／又は生合成のために微生物によって炭素源として使用され；
炭素原子を１つのみ含有する無機分子及び／又は有機分子を、少なくとも１つの化学合成炭素固定反応及び化学合成独立栄養微生物内に含有される少なくとも１つの同化生合成経路によって環境内に２以上の炭素原子を含有する有機分子生成物に変換することを含み、
化学合成固定反応及び同化生合成経路が、化学的及び／若しくは電子化学的及び／若しくは熱化学的に作られたか、かつ／又は環境の外部にある少なくとも１つの供給源から環境内に導入される電子供与体及び電子受容体によって提供される化学並びに／又は電子化学エネルギーによって少なくとも部分的に促進される、
方法。
【請求項２】
前記微生物が細菌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ガス状基質が、炭素源としてＣＯ２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ガス状基質が、エネルギー源としてＨ２及び／又はＯ２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ガス状基質が、熱分解ガス又はプロデューサーガス又はシンガスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ガス状基質が、Ｈ２及び／又はＣＯ２及び／又はＣＯを含むガスの混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物が、微生物の成長及びバイオ生成物の生成に適する条件下で、ガス状基質の存在下で培養した時に、アミノ酸及び／又はタンパク質及び／又はビタミン及び／又はバイオマスを生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物が、カプリアビダス種又はラルストニア種である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物がカプリアビダス・ネカトールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物及び／又は前記微生物によって生成される栄養素が、１以上の他の生物に栄養を与えるか、又は提供するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物がｋｎａｌｌｇａｓ微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ガス状基質が、Ｈ２及び／又はＣＯ２を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ガス状基質が、熱分解ガス又はプロデューサーガス又はシンガスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ガス状基質が、都市固形廃棄物、黒液、農業廃棄物、木材廃棄物、残留天然ガス、バイオガス、サワーガス、メタンハイドレート、タイヤ、石油コークス、下水、肥料、わら、リグノセルロースエネルギー作物、リグニン、作物残留物、バガス、鋸屑、林業残留物、食品廃棄物、廃棄カーペット、廃プラスチック、埋立地ガス、ケルプ、海藻、及び／又はリグノセルロースバイオマスに由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アミノ酸及び／又はタンパク質及び／又はビタミン及び／又はバイオマスが、培地から回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
炭素原子を１つのみ含有する前記電子供与体及び／又は分子が、ガス化、熱分解、蒸気改質、自己改質のうちの少なくとも１つを含む有機物質に作用する熱化学プロセスを経て作られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
炭素原子を１つのみ含有する前記電子供与体及び／又は有機分子が、メタン蒸気改質を経て作られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ガス化及び／又は熱分解及び／又は自己改質及び／又は蒸気改質からの産出ガス中の一酸化炭素に対する水素の比が、ガスが微生物に送達される前に、水生ガスシフト反応を用いて調節される、請求項１６又は請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記微生物が、以下の属：カプリアビダス種、ロドコッカス種、ヒドロゲノビブリオ種、ロドシュードモナス種、水素細菌（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）種、ゴルドニア種、アルスロバクター種、ストレプトマイセス種、ロドバクター種、及び／又はキサントバクター種のうちの１以上から選択される微生物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記電子供与体が、以下の還元剤：アンモニア；アンモニウム；一酸化炭素；亜ジチオン酸塩；元素硫黄；炭化水素；水素；メタ亜硫酸塩；一酸化窒素；亜硝酸塩；チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）又はチオ硫酸カルシウム（ＣａＳ２Ｏ３）を含むが、これらに限定されないチオ硫酸塩などの硫酸塩；硫化水素などの硫化物；亜硫酸塩；チオネート；チオナイト；可溶化相又は固相の遷移金属若しくはそれらの硫化物、酸化物、カルコゲナイド、ハロゲン化物、水酸化物、オキシ水酸化物、リン酸塩、硫酸塩若しくは炭酸塩；及び固体電極材料中の伝導電子若しくは価電子帯電子のうちの１以上を含むが、これらに限定されない、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記電子受容体が、以下のもの：二酸化炭素；酸素；硝酸塩；亜硝酸塩；第２鉄又は他の遷移金属イオン；硫酸塩；又は固体電極材料中の価電子帯又は伝導帯ホールのうちの１以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
生物学的変換工程の前に、１以上の化学的前処理工程が先行し、その際、前記微生物が必要とする前記電子供与体及び／又は電子受容体及び／又は炭素源及び／又はミネラル栄養素が、少なくとも１つの投入化学物質から作られるか、かつ／又はそれから精製されるか、かつ／又は炭素固定工程から生じる化学物質からリサイクルされるか、かつ／又は他の産業、鉱業、農業、下水処理若しくは廃棄物発生プロセスからの廃棄物流から作られるか、又はその中に含有されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記電子供与体及び／又は電子受容体が、温室効果ガスの排出が低い再生可能な、代替の又は従来の動力源を用いて作られるか、又はリサイクルされ、前記動力源が、太陽光発電、太陽熱、風力、水力、原子力、地熱、向上した地熱、海洋熱、海洋波動、及び潮力のうちの少なくとも１つから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記電子供与体及び／又は電子受容体が、電気グリッド供給が電気グリッド需要を超える期間中、グリッド電気を用いて作られ、貯蔵タンクが、前記電子供与体及び／又は電子受容体の発生、並びに化学合成反応中のそれらの消費を減らす、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記有機化学生成物が、５個の炭素又はそれ以上である炭素骨格を有する化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
分子水素が、電子供与体として作用し、以下のもの：水の電気分解、水の熱化学分解、ブラインの電気分解、硫化水素の電気分解及び／又は熱化学分解のうちの少なくとも１つを用いる方法により作られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
水素生成のための水の電気分解が、以下のもの：プロトン交換膜（ＰＥＭ）、ＫＯＨなどの液体電解質、アルカリ電気分解、固体ポリマー電解質電気分解、高圧電気分解、水蒸気の高温電気分解（ＨＴＥＳ）のうちの１以上を用いて行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
水素生成のための水の熱化学分解が、以下のもの：酸化鉄サイクル、酸化セリウム（ＩＶ）−酸化セリウム（ＩＩＩ）サイクル、亜鉛−酸化亜鉛サイクル、硫黄−ヨウ素サイクル、銅−塩素サイクル、カルシウム−臭素−鉄サイクル、ハイブリッド硫黄サイクルのうちの１以上を用いて行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
分子水素が、電子供与体として作用し、以下のもの：炭素の捕捉及び隔離（ＣＣＳ）対応メタン蒸気改質；ＣＣＳ対応石炭ガス化；Ｋｖａｅｒｎｅｒプロセス及びカーボンブラック製品を作る他のプロセス；ＣＣＳ対応ガス化又はバイオマスの熱分解；バイオ炭副生成物を生成するバイオマスの熱分解のうちの１以上を含む、二酸化炭素の放出が少ない又は全く放出しない、水素を生成することが知られている電子化学又は熱化学プロセスにより作られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
アミノ酸及び／又はタンパク質及び／又はビタミン及び／又はバイオマスを生成する方法であって、微生物の成長並びにアミノ酸及び／又はタンパク質及び／又はビタミン及び／又はバイオマスの生成に適する条件下での成長及びバイオ産物生成のためのガス状基質並びに他の栄養素を含む培地を含むバイオリアクター中で、請求項１に記載の微生物を培養することを含み、前記微生物が、アミノ酸及び／又はタンパク質及び／又はビタミン及び／又はバイオマスを生成する、方法。
【請求項３１】
少なくとも１つの化学合成反応及び少なくとも１つの同化生合成経路が、アミノ酸；ペプチド；タンパク質；脂質；多糖；及び／又はビタミンのうちの少なくとも１つを含む生化学物質の形成をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
バイオマス及び／又は生化学物質が、前記少なくとも１つの化学合成反応を経て生成され、前記バイオマス及び／又は生化学物質が、以下のもの：発酵のための有機炭素源及び／又は窒素源；他の微生物若しくは生物の成長のための窒素源；ヒト用の窒素源若しくは食品成分；動物用の飼料；製造プロセス若しくは化学プロセス用の原料又は化学中間体；医薬品物質、医薬物質若しくは栄養物質の供給源；肥料；土壌添加物；並びに／又は土壌安定剤のうちの少なくとも１つとして適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記化学合成反応からの前記炭素源及び／又は窒素源が、市販の酵素、抗生物質、アミノ酸、タンパク質、食品、食品成分；ビタミン、脂質、バイオプラスチック、多糖、栄養補助食品、医薬品のうちの少なくとも１つを含む生化学物質を生成するための発酵に使用される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
動物用の前記飼料が、牛、羊、鶏、豚、魚、甲殻類、昆虫、無脊椎動物、及びサンゴのうちの１以上に餌を与えるために使用される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記甲殻類又はサンゴが、Ｃ１供給源から生合成される栄養素を用いて成長し、ＣＯ２をアルベドが多い固体無機質形態に隔離する炭酸塩材料を生成する、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年３月１９日出願の米国特許仮出願第６２／３１０，７０５号、及び２０１７年２月３日出願の同第６２／４５４，３４７号の利益を主張するものであり、両方とも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明の主題は、微生物系において、炭素源及びエネルギー源としてシンガス又はプロデューサーガス又は熱分解ガス又はＨ２とＣＯ２のガス混合物などのガス状基質を用いる、アミノ酸及びタンパク質及び他のバイオマス構成物の生物学的生成に関する。本発明はまた、栄養素を他の従属栄養生物、動物、又はヒトに供給又は提供するための、微生物のアミノ酸、タンパク質、及び他のバイオマス構成物の使用に関する。本発明に従って生成されるアミノ酸、タンパク質、及び他のバイオマス構成物は、食料及び他のバイオ系生成物の生成のための栄養素として他の生物によって消費及び使用され得る。
【０００３】
この開示は、シンガス、プロデューサーガス、ＣＯ２、一酸化炭素及び水素ガスを含有する一酸化炭素の混合物などの炭素含有ガスで成長する細菌及び他の微生物の培養によって、アミノ酸、タンパク質、及び他のバイオマス構成物を生成できる組成物並びにそれらの生成法に関する。この開示は、さらに、ガス状材料からアミノ酸、タンパク質、及び他の栄養素などの有用な有機分子に炭素を固定する方法に関する。本発明の細菌及び／又は微生物は、本明細書に記載の本発明の方法又は他の態様で使用するために遺伝子操作することができる。本明細書に記載の本発明のいくつかの他の態様において、該微生物は、遺伝子操作されない。
【０００４】
この開示は、さらに、ガスからアミノ酸、タンパク質、及び他の栄養素などの有用な有機分子に炭素を固定する方法に関する。本発明は、さらに、二酸化炭素、又は他の無機炭素源、及び無機化学物質からの化学エネルギーを含む無機エネルギー、又は電気供給源から直接、炭素系生成物、特に、商業的価値のあるアミノ酸、タンパク質、及び他の栄養素へ変換することによって炭素系生成物を生成する能力、並びに／又はそれらを生物が生成するのを増強する能力を生物に与える機構について記載する。
【０００５】
この開示は、さらに、人工生態学、操作された栄養システム、閉鎖生態システム、小世界、連続培養システム、生物再生システム及び閉ループ生命維持システムに関する。
【背景技術】
【０００６】
背景
アミノ酸、タンパク質、及び他の栄養素の持続可能で、再生可能な供給源が、増大する食料需要を満たすために必要とされている。大気への二酸化炭素及び他の温室効果ガス（ＧＨＧ）放出量を減少させる必要、並びに食料生成システムにおける石炭、油、及び天然ガスに基づく世界のエネルギー消費を減少させる必要もある。世界経済における需要が増大することで、陸及び水の資源にますます圧力がかかっている。食料及び他の農作物由来の生成物の生成のための伝統的な化石炭化水素材料にもますます圧力がかかっている。現代農業を含む多くの産業は、作物の生成及び加工のための材料としての化石炭化水素供給源の安定供給に大きく依存している。現在の義務的な実践の費用対効果の高い代替物は、土地利用、自然生息地、水、化石資源需要、原材料費、及び温室効果ガスの放出にかかる圧力の増大を軽減するのに役立ち得る。
【０００７】
自然生化学代謝プロセスを介したガス状炭素を固定する生物学的システムが知られている。高等植物作物における光合成に基づく現在の農業システムは、一例である。光合成反応によってＣＯ２から食料及び他の農作物を作るために、藻類系も開発された。糖などの固定炭素原料を利用する従属栄養反応及び生成も存在し、これらは光合成に間接的に依存する。現時点での畜産及び水産養殖は、一般に、最終的な材料として、様々な飼料形態の光合成の生成物を有する。所望のレベルの必須栄養素及びエネルギーを含有するように配合される飼料、及びビタミン及びミネラルプレミックスの混合物である人工飼料又は複合飼料が、一般に使用されている。これらの飼料は、農作物の生成物である場合が多い。又は、場合によって、それらは、自然界の野生生物の捕獲又は狩猟採集から調達される。これに基づく生成は、一般に、直接的又は間接的に消費される主要生産者の光合成栄養層である。野生の光合成主要生産者の直接消費を説明するのに役立つ食料生成の例としては、未耕地での家畜の放牧が挙げられる。野生の光合成主要生産者の関節消費を介した食料生成を説明するのに役立つ例としては、光合成藻類を餌にするイワシ及びアンチョビなどの野生の魚資源に由来する水産養殖における魚粉の使用が挙げられる。しかし、現在の農業、畜産、及び水産養殖の実践、並びに現在利用されている光合成に基づく飼料は、いくつかの問題及び限界に直面している。
【０００８】
世界人口の増加は、１人当たりの魚介の消費の増加と相まって、魚介の需要を絶えず増加させている。需要が上昇する一方で、多くの海産物資源が、すでに乱獲されている。水産養殖は、この増加している需要を満たすのに役立ち、世界の多くの箇所で栄養及び食料の保証を改善する。世界中の野生の魚の捕獲が停滞することで、専門家は、事実上、新しい魚介を養殖しなければならないと言っている。国連食料農業機関（ＦＡＯ）によると、現在の消費率を満たすために、２０３０年までに年間でさらに４千万トンの魚介類が世界中で必要とされ、「捕獲漁業生成が停滞し、水産養殖からの魚の食料生成の大幅な増加が予測され、２０３０年に１人当たりの消費量の現在のレベルを維持するために、さらに２７００万トンの水産養殖生成が必要とされる」。水産養殖の急成長に伴い、水産養殖用の飼料を生成する産業が成長している。
【０００９】
魚は、成長するのに最もエネルギー効率の良い動物の１種であり、水産養殖は、動物タンパク質を生成する最も資源効率の良い方法の１つである。具体的に、魚は、陸の動物よりも食べた食料の多くを体重に変換する。「飼料変換率」（ＦＣＲ）は、１ポンドの動物生成物を生成するのに、何ポンドの飼料が必要かを示す。サーモンは、最も飼料を多く消費する養殖魚であり、鶏、豚、又は牛などによるタンパク質生成の他の形態よりもはるかに効率的であることが判明した。サーモンのＦＣＲは１．２と報告されているが、鶏のＦＣＲ：１．９、豚：５．９、及び牛：８．７である。さらに、水産養殖の二酸化炭素排出量は、陸上の畜産の二酸化炭素排出量の一部である場合が多い。米国国立海洋大気局（ＮＯＡＡ）の水産養殖に関する基本的な質問ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｍｆｓ．ｎｏａａ．ｇｏｖ／ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ／Ｆａｑｓ／ｆａｑ＿ａｑ＿１０１．ｈｔｍｌは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１０】
養殖魚は、栄養ニーズのために特別に設計された食餌が与えられる。この飼料は、健康の維持及び成長に必要な全ての必須栄養素を含有し得、乾燥ペレットの形態である場合が多い。魚の栄養ニーズは、種によって変化する。草食魚は、植物タンパク質（例えば、大豆、トウモロコシ）、植物油、ミネラル、及びビタミンを含有し得る飼料混合物を食べる。野生では、サーモンなどの肉食魚は他の魚を食べる。しかしながら、肉食魚にとっても、多くの食餌には、植物タンパク質、油、ミネラル、及びビタミンが含まれ得る。
【００１１】
実際に、養殖飼料の実質的な割合は、動物性タンパク質源、及び、特に、魚粉が占める。養殖飼料の魚粉成分は、典型的には、野生捕獲魚に由来する。しかしながら、他の捕獲魚に餌を与えために野生の魚を捕獲することが広範に実践されることは、持続可能ではないと考えられる。水産養殖業が直面する大きな課題は、食物連鎖の底部での野生捕獲種への強い依存を減らすことである。世界的に、養殖魚介を１メートルトン生成するために、野生の魚全体の約０．５メートルトンを使用する。「フィッシュイン／フィッシュアウト（ＦＩＦＯ）」変換率として知られる、（食餌に）「入れる」魚の量に対する（魚介として）「出す」魚の量は、種間で大いに変化する。大豆及び漁業副産物から新たに作られた飼料は、乱獲資源への依存を低下させるのに役立つが、環境を荒廃させたり、海洋から他の種を枯渇させたりすることなく、養魚の拡大を確実にするのにはるかに多くの作業が必要であると専門家は警鐘を鳴らす。魚粉及び油の約３／４は、アンチョビ、ニシン、メンハーデン、カペリン、ピルチャード、イワシ、及びサバなどの飼料魚と呼ばれる小さな開放海洋（遠洋性）魚の収集から生成される。それらは、何十年もの間、豚及び家禽の飼料の主要成分であったが、過去２０年にわたる水産養殖の世界的成長により、水生生物飼料の製造に使用されている飼料魚資源の割合が増えている。飼料魚捕獲の水産養殖のシェアは、２０００年以来ほぼ２倍になり、現在は、世界の魚粉供給のほぼ７０％及び世界の魚油のほとんど９０％を消費する。これらの様々な使用のための収集は、イワシ、アンチョビ、及び他の天然飼料魚では衰退した。多くの国が、ペンギン、アシカ、及びクジラの主要食料源である小さなオキアミを年間２００，０００トン超捕獲するために南極に船を出している。現在の水産養殖実践の批評家は、これを「比較的安価なタンパク質のスラブを量産するための、食物連鎖の底部の吸収」と呼び、「生態学的狂気」と説明している。
【００１２】
見込まれている水産養殖が直面する課題は、効率及び持続可能性の増大である。魚粉の価格の上昇により、水産養殖生成者は、水産養殖飼料に使用するための費用対効果の高い、さらに健康的な代替物の開発を試みている。調査されている潜在的な代替物には、植物（一般的なタンパク質及び食用油の現在の最大の供給源）、魚類加工廃棄物、酵母、藻類、昆虫、虫、及び他の特別な食餌、並びに海藻が含まれる。
【００１３】
養殖業者はまた、大豆及び他の穀物を含有する飼料を容易に使用することができるティラピアのような雑食性の魚の養殖にますます傾倒してきている。ティラピアは、植物プランクトン、着生藻類、水生植物、小型無脊椎動物、底生動物、有機堆積物、細菌、及び有機堆積物に付着している細菌フィルムを餌とする雑食性の草食動物である。ナイルティラピアは、植物プランクトン及び細菌を含む懸濁粒子を頬腔内の粘膜上に捕捉することによって飼料を濾過することができるが、その主な栄養源は、付着藻類のマット上での表面放牧によって得られると報告されている。初期の未熟なティラピア及び若い魚は、雑食性であり、主に動物プランクトン及び底生動物を食べるが、有機堆積物、付着生物、及び植物プランクトンも食べる。ティラピアの胃のｐＨは、満腹感の程度で変化し、満腹時は、青緑藻及び緑藻及び珪藻の溶解が促進されるように１．４ほどの低さであり得る。タンパク質、脂質、ビタミン、ミネラル、及び炭水化物のティラピアの必須要件は、成熟度によって変化する。
【００１４】
初期の発達段階における魚の食餌要件は、成体の魚のそれとは異なる場合が多い。草食動物を含むほとんど全ての若い魚は、典型的には、肉食動物であり、動物プランクトン及び幼生、稚魚及び若齢段階の甲殻類などの小型無脊椎動物を食べている。ほとんどの海のフィンフィッシュの種の生成は、現在、孵化後初めての数週間、フィンフィッシュの幼生を維持するための生の飼料に依存する。この生の飼料は、動物プランクトンを含む場合が多く、新鮮な汽水性の水、又は海水又は他の塩水中で生活している微細な又は小さな生物である。動物プランクトン生物には、ワムシ［Ｐｈｙｌｕｍ  Ｒｏｔｉｆｅｒａ］、クラドセラン目（例えば、ミジンコ属、タマミジンコ属）、サブクラスのカイアシ目（例えば、シクロプス）、及びブラインシュリンプ（アネミア属）が含まれる。動物プランクトンの実用的生成は、特定の海のフィンフィッシュの水産養殖の成功を現在妨げることが報告されている。
【００１５】
科学者、経済学者、政策立案者の何人かは、２０５０年までに７０〜９０億人増えることが予想される世界の急成長している人口を養うための最良の選択肢の１つとして、本発明を水産養殖においてまだ実現されていない可能性として承認している。この可能性を完全に実現させるために、水産養殖試料用のタンパク質及び他の栄養素の新しい供給源が必要である。
【００１６】
細菌及び他の微生物細胞は、従属栄養発酵システム中で砂糖原料をタンパク質及びアミノ酸などの有用な有機化合物に加工するために適用されている。しかしながら、これらのシステムには顕著な欠点がある。固定炭素栄養素で成長し、生成株と競合することができる他の従属栄養微生物が周辺環境では偏在しているので、従属栄養発酵は汚染の影響を受けやすい。従属栄養技術はまた、基本的に食料供給源を用いて、別の食料供給源を作るので、一般に、現在の食料生成様式との競合の観点から限界に悩まされている。これは、多くの負の環境インパクトをもたらし得る。
【００１７】
順に消費されるか、若しくはペットとして飼われるか、又は別の方法で人間に利用される動物にエサを与える新しいタンパク質及び他の栄養供給減の必要に加えて、ヒトによる直接消費のための代替タンパク質及び他の栄養源が必要である。この必要が特に、緊急を要する１つの分野は、乗組員の必要なものであるＯ２、Ｈ２Ｏ、及び食料を供給し、かれらの排泄物であるＣＯ２、汚物、及び熱を排除する生命維持システムを必要とする人の宇宙飛行の分野である。食料供給は、より長いミッションにおける体重及び体積の主要源である。再供給なく、より長い期間動作する生命維持システムが必要である。そのようなシステムの必須要件は、ヒト及びキャビンの排泄物を、酸素、飲料水、食料、及び消耗品などの有用な生成物に変換する能力である。成長するにつれて食べられ、広範な信頼できる自動化された成長及び収穫に役立つ食料生成が必要である。生物学的システムのパワーペナルティは、重要な要因である。信頼できる原子力及び／又は太陽光発電システムを効率的に利用する生物システムが必要である。
【００１８】
化学合成独立栄養微生物は、上記の満たされていない多くの必要を対処することができ、本明細書に記載の光合成の制限を避けながら、Ｃ１原料からの炭素固定反応及び合成を触媒するために数十億年の酵素進化をなお利用する炭素固定プロセスで使用するための光合成生物の少し探索された代替物である。ＣＯ２、及び無機炭素の他の形態の固定のために化学合成独立栄養生物によって行われる有機化合物への化学合成反応は、光の放射エネルギーよりもむしろ、無機化学物質に蓄えられている位置エネルギーを動力源とする［Ｓｈｉｖｅｌｙら（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：１９１−２３０；Ｓｍｉｔｈら（１９６７）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ９４（４）：９７２−９８３；Ｈｕｇｌｅｒら（２００５）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８７（９）：３０２０−２７；Ｓｃｏｔｔ及びＣａｖａｎａｕｇｈ（２００７）  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７３（４）：１１７４−７９］。化学合成独立栄養生物に生じる炭素固定生化学経路には、還元的トリカルボン酸回路、カルビン−ベンソン−バッハム（Ｃａｌｖｉｎ−Ｂｅｎｓｏｎ−Ｂａｓｓｈａｍ）回路［Ｓｈｉｖｅｌｙら、上記、ｖａｎ  Ｋａｕｌｅｎら（１９９８）  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９１−２３０］、及びウッド・ユングダール（Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ）経路［Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ（１９８６）４０：４１５−５０；Ｌｅｅら（２００８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０１（２）：２０９−２２８；Ｆｉｓｃｈｅｒら（２００８）Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：２９５−３０４］が含まれる。化学合成独立栄養微生物は、一般に、光合成の暗反応のようなＣＯ２固定を行うことができるが、光合成の明反応によって内部生成する必要がない、無機外部供給源からＣＯ２固定に必要な還元剤を取り込むことができる微生物である。光合成の明反応に対応するエネルギー収集工程が生じなければならないが、例えば、光起電技術又は太陽熱技術での光エネルギーの収集などの非生物的プロセスを利用することができる。
【００１９】
化学合成独立栄養生物は、ＣＯ２から有機化学物質への変換のハイブリッド化学／生物学的プロセスに特に十分に適しており、生物学的工程はＣＯ２固定のみに限定される。このＣＯ２固定工程は、光合成で生じる暗反応におおよそ対応する。このハイブリッド化学／生物学的アプローチは、バイオベースの生成物の生成のより伝統的な従属栄養生物又は光合成バイオプロセスよりもはるかに注目されていない。しかしながら、このようなハイブリッドアプローチには、ＣＯ２炭素源から生化学生成プロセス全体に効率的かつクリーンに電力を供給するために、太陽ＰＶ、太陽熱、風力、地熱、水力、又は核などの多様な非生物的エネルギー変換技術と、ＣＯ２固定において数十億年の進化を経て獲得された酵素の性能を効率的に組み合わせる能力を含めて、いくつかの潜在的な利点がある。さらに、そのようなハイブリッドプロセスにおいて直接光を要求することなく炭素固定を実行する微生物は、光合成微生物の培養のために事実上使用することができるものよりも制御及び保護された環境に含まれ得、水及び栄養の喪失、汚染、又は天気被害による影響は低い。バイオリアクター容量の増加は、水平構造よりもむしろ垂直でより容易にもたらされ、潜在的にはるかにより多くの土地を効率的にさせ得る。ハイブリッド化学／生物学システムは、ＣＯ２及び他の単純な無機材料からの複雑で多様な有機合成の生物学的性能を保持しながら、光合成の多くの欠点を避けるＣＯ２から有機分子へのプロセスの可能性を提供する。
【００２０】
ＣＯ２ガスの捕捉及び固定炭素への変換における化学合成独立栄養微生物の適用は以前に記載されている。しかしながら、これらのアプローチの多くは、有効性、経済的実現可能性、実用性及び商業的採用を制限する欠点に悩まされている。
【００２１】
非常に大規模で、持続的な農業生産の著しい増加と関連するボトルネックを破壊する必要がある。水平に拡大し、多くの土地及び水を使用する伝統的な農業経営とは対照的に、コンパクトで、垂直に拡大する生物学的生成の必要がある。食料と自然の争い、土地利用に関する紛争、及び自然生息地の破壊を軽減する必要がある。
【００２２】
ガスから作る化学物質（ＧＴＣ）技術は、有機分子の生成における廃棄物炭素源の利用を可能にする利点を提供する。そのような潜在的な廃棄物源には、ガス化による合成ガス（シンガス）への変換による高リグノセルロース系廃棄物、及び例えば、二水素の提供による産業用排ガスから捕捉された廃棄ＣＯ２が含まれる。シンガスは、一般に、主要成分としてＨ２、ＣＯ、及びＣＯ２を含有するガスの混合物であり、メタン及び／又は液体石油ガス若しくはバイオガスの蒸気改質により、又はバイオマス、廃棄有機物、様々なポリマー、泥炭、及び石炭を含むが、これらに限定されない任意の有機可燃性炭素系材料のガス化により作ることができる。多くのガス化プロセスは、シンガスの生成に利用可能である。いくつかのガス化プロセスは、炭素系原料を高温（５００〜１５００℃）での部分酸化に供し、酸素供給は完全燃焼を防ぐために制限され、原料に依存する様々な組成物及びＨ２：ＣＯの比が０．５：１〜３：１の範囲であり得るような反応条件でシンガスを生成する。シンガス混合物中のＣＯ２を同時に増加させ、水性ガスシフト反応中の蒸気とＣＯとを反応させることにより、シンガスの水素成分を上昇させ、かつ／又はＣＯ成分を低下させることができる。
【００２３】
化学物質へのシンガスの変換のいくつかの主要な技術には、フィッシャー・トロプシュ（Ｆ−Ｔ）などの化学触媒プロセス及びメタノール又は他の混合アルコールの合成プロセス、アンモニア及び尿素の生成のためのハーバー・ボッシュ反応、並びに生物学的シンガス発酵プロセスが含まれる。
【００２４】
ガスバイオプロセスにおけるシンガス及び／又はＣＯ２及び／又は再生可能なＨ２の使用は、従属栄養又は光栄養の生合成を経て可能である場合よりも、持続可能な化学物質及び燃料の生物学的合成のためにより安価で、より柔軟で、より拡大縮小可能なエネルギー源及び／又は炭素源を利用する機会をもたらす。シンガスバイオプロセスにおいて、シンガスは、微生物培養のための炭素源とエネルギー源の両方として機能する。
【００２５】
シンガスなどのガス状原料に基づくバイオプロセスは、多くの土地及び水を必要とする従属栄養又は光栄養に基づく技術よりも、有機化合物の生物学的合成において環境及び食料生成の負の影響をはるかに低くすることを可能にすることができる。しかしながら、現在の生物学的ＧＴＬ及びＧＴＣ技術は、一般に、比較的単鎖のアルコール、又は他の単鎖の有機化合物を主要生成物として産生する。これらの現在の生物学的変換のいずれも、商業的に競合するアミノ酸、タンパク質及び他の生物学的栄養素を生成しない。現在の生物学的ＧＴＣ技術で使用されるシンガス消費微生物は、一般に、ほとんどのアミノ酸、タンパク質及び他の生物学的栄養素などの中程度〜長い炭素鎖分子の合成にあまり適さない。
【００２６】
単純なＣ１及びＨ２、ＣＯ２、ＣＯ、Ｈ２Ｏ、ＮＨ３、ＣＨ４、ＣＨ３ＯＨ、ＨＣＯＨなどの無機前駆体からのアミノ酸並びにペプチドの非生物的合成が知られているが、このようなアプローチは、ヒト、動物、及び他の従属栄養体の食餌にタンパク質又はタンパク質誘導体を供給する生物学的方法と比較して、現在、非競合的である。物理化学的、非生物的アプローチを妨げる課題には、低い収量及び潜在的に毒性のある副生成物をもたらす副反応が含まれる。
【００２７】
従来の拡大縮小可能な含有反応容器で成長することができ、特に、商業的に実現可能な方法で４を超える炭素原子長の、商業的に実行可能な有機炭素鎖のセットを生成する微生物のセットを特定する必要がある。糖などの典型的な固定炭素材料によって代謝的に制限されない微生物、並びにＨ２／ＣＯ２ガス混合物中間体を経て簡単に取り換えられる分子の合成に向けられるシンガス、プロデューサーガス、炭素及びエネルギーの様々な非生物的供給源もさらに利用することができる微生物を特定する必要がある。これは、同等の従属栄養系をはるかに超える原料フレキシビリティをもたらす。シンガス、プロデューサーガス中に存在し、また成長及び炭素固定のために非生物的で、再生可能な、かつ／又はＣＯ２放出エネルギーの低い様々な技術により容易に作られる水素などの電子供与体を利用することができる微生物を特定及び使用する必要がある。
【００２８】
低価格又は持続可能な原料からアミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素を生成する生物学的手段が必要である。低価格なシンガス及び／又はＣＯ２を、アミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素を含むが、これらに限定されないより高価格な有機化学物質に変換するバイオプロセスが必要である。
【発明の概要】
【００２９】
発明者らが本発明を行う際に気づいた当技術分野の必要に答えて、低価格で持続可能な原料からアミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素を含むが、これらに限定されない有機化学物質を生成するシステムが本明細書に提示される。いくつかの実施形態において、本発明は、これらの高価格な有機化合物の効率的な生成と、廃棄物炭素源の処分及び／又はＣＯ２捕捉とを組み合わせることができ、さらなる収入及び／又は社会的価値をもたらすことができる。
【００３０】
本発明は、ＣＯ２ガス及び／又はシンガス及び／又はプロデューサーガス及び／又はメタンを、より高価格な中程度〜長い炭素鎖長のアミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素に変換する天然の又は操作された微生物の使用を可能にする。本発明の技術は、簡単に取り換えられ、かつ現在、唯一、より高等の植物農作物又は動物供給源からバルクで生成される様々な比較的長い鎖の有機化合物を生成及び／又は分泌するために、ガスから化学物質（ＧＴＣ）への生物学的プロセス内でのシンガスバイオ処理のために使用することできる新しい天然の又は古典的に生育させた、かつ／又は遺伝子操作で強化された微生物株の開発を可能にする。
【００３１】
本発明は、生成微生物がガス培養下で目標とする化学生成物を合成するように、シンガス及び／又はＣＯ２などのガス状炭素源でバイオマスを成長及び合成する自然能力を有する水素酸化微生物、一酸化炭素酸化微生物、及びｋｎａｌｌｇａｓ微生物を含むが、これらに限定されない微生物の選択並びに／又は成育並びに／又は操作に関する。本発明の微生物及び方法は、石油化学製品及び高等植物由来のアミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素と価格で競合し得る低価格の生化学合成を可能にすることができる。ある実施形態において、これらのアミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素は、従属栄養又は微生物光栄養合成により生成されるアミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素よりも実質的に低い価格を有することが予想される。
【００３２】
本発明は、アンモニア、アンモニウム、及び／又は尿素を含むが、これらに限定されない窒素源と共に、シンガス及び／又はガス状ＣＯ２及び／又はＣＯ２ガスとＨ２ガスの混合物を、１以上のアミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素に変換する微生物を含む組成物に関する。いくつかの実施形態において、該組成物は、以下のもの：水素酸化化学合成独立栄養微生物；一酸化炭素酸化微生物；ｋｎａｌｌｇａｓ微生物の１以上である微生物を含む。ｋｎａｌｌｇａｓ微生物、水素栄養生物、カルボキシドトローフ、及び化学合成独立栄養生物は、生物学的成長を支持するために、より広範に、唯一の炭素源としてＣＯ２又はＣＯを捕捉することができる。いくつかの実施形態において、この成長は、アミノ酸及びタンパク質の生合成を含む。ｋｎａｌｌｇａｓ微生物及び他の水素栄養生物は、呼吸及び生化学合成の還元電子源としてＨ２を使用することできる。本発明のいくつかの実施形態において、ｋｎａｌｌｇａｓ微生物及び／又は水素栄養生物及び／又はカルボキシドトローフ及び／又は他の化学合成独立栄養微生物は、水溶液中に溶解した無機ミネラルと共に、以下のもの：ＣＯ２；ＣＯ；Ｈ２のうちの１以上を含むが、これらに限定されないガス流で成長する。いくつかの実施形態において、ｋｎａｌｌｇａｓ微生物及び／又は水素栄養生物及び／又はカルボキシドトローフ及び／又は他の化学合成独立栄養微生物及び／又はメタン資化性微生物は、温室効果ガス（ＧＨＧ）を、アミノ酸及びタンパク質を含む生体分子に変換する。
【００３３】
本発明のある実施形態において、藻類又は高等植物に基づくものなどのＣＯ２の捕捉及び変換のための光合成システムの周知の欠点は回避されるが、ＣＯ２から、限定されないがアミノ酸及びタンパク質などの有用な生化学物質を生成する複雑な有機合成のために数十億年超進化した独特の生物学的能力は、なお影響している。
【００３４】
いくつかの実施形態において、該組成物は、ロドコッカス属又はゴルドニア属から選択される微生物を含む。いくつかの実施形態において、該組成物は、ロドコッカス・オパクス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）である微生物を含む。いくつかの実施形態において、該組成物は、ロドコッカス・オパクス（ＤＳＭ  ４３２０５）又はロドコッカス種（ＤＳＭ  ３３４６）である微生物を含む。いくつかの実施形態において、該組成物は、ラルストニア属又はカプリアビダス属から選択される微生物を含む。いくつかの実施形態において、該組成物は、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）である微生物を含む。いくつかの非限定的な実施形態において、カプリアビダス・ネカトール株は、ＤＳＭ５３１又はＤＳＭ５４１である。
【００３５】
一態様において、プロデューサーガス又はシンガス又はＨ２及びＣＯ２、及び／若しくはＣＯ、及び／若しくはＣＨ４を含有する別のガス混合物などのガス状基質を、アミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素に変換できる天然の又は操作された微生物が提供される。ガス状基質は、炭素源及び／又はエネルギー源として微生物によって使用される。いくつかの実施形態において、ガス状基質で成長することができる微生物は、アミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素の生合成に必要な遺伝子をコードするポリヌクレオチドで形質転換される。いくつかの実施形態において、アミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素、又は全細胞生成物は、微生物細胞又は微生物成長培地から回収される。本明細書に記載の微生物成長プロセスで使用され得るプロデューサーガスは、廃棄原料及び／若しくはバイオマス残渣原料のガス化、又は産業プロセスからの排ガス又は天然ガス若しくはバイオガスの蒸気改質を含む供給源に由来し得る。
【００３６】
一態様において、炭素源及び／又はエネルギー源としてのガス状基質で成長することができる非天然微生物が提供され、該微生物は、少なくとも１つの外来核酸を含む。いくつかの実施形態において、該微生物は細菌細胞である。例えば、いくつかの実施形態において、該細菌細胞は、カプリアビダス種又はラルストニア種、例えば、限定されないが、カプリアビダス・ネカトールである。いくつかの非限定的な実施形態において、該微生物は、カプリアビダス・ネカトールＤＳＭ５３１又はＤＳＭ５４１である。いくつかの非限定的な実施形態において、該微生物は、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）Ｎ−１、ＤＳＭ  １３５１３である。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ガス状基質は、炭素源としてＣＯ２を含む。いくつかの実施形態において、ガス状基質は、エネルギー源としてＨ２及び／又はＯ２を含む。いくつかの実施形態において、ガス状基質は、プロデューサーガス、シンガス、又は熱分解ガスを含む。いくつかの実施形態において、ガス状基質は、Ｈ２及び／又はＣＯ２及び／又はＣＯを含むガスの混合物を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態において、該微生物は、微生物の成長及びバイオ生成物の生成に適する条件下で、ガス状基質の存在下で培養した場合に、アミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素を生成する。
【００３９】
いくつかの実施形態において、外来遺伝子は、幅広い宿主範囲のプラスミド上に担持され、非天然微生物中のコード配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、外来遺伝子コード配列は、非天然誘導プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、誘導プロモーターは、大腸菌ａｒａオペロンに由来する。
【００４０】
いくつかの実施形態において、外来遺伝子のコード配列（ＣＤＳ）は、本明細書に記載の微生物、例えば、限定されないがラルストニア種又はカプリアビダス種、例えば、カプリアビダス・ネカトールにおける発現のためにコドン最適化される。
【００４１】
別の態様において、炭素源及び／又はエネルギー源としてのガス状基質で成長でき、少なくとも１つの外来核酸を含む、本明細書に記載の操作された微生物を用いて、アミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素を生成する方法が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の非天然微生物は、微生物の成長に適する条件下での成長及びバイオ産物生成のための他の栄養素を含むガス状基質及び培地（例えば、液体成長培地）を含むバイオリアクター中で培養され、該微生物は、アミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素を生成する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、バイオリアクター中のガス状基質は、Ｈ２及び／又はＣＯ２を含む。いくつかの実施形態において、ガス状基質は、プロデューサーガス、シンガス、又は熱分解ガスである。いくつかの実施形態において、ガス状基質は、天然ガス又はバイオガスである。いくつかの実施形態において、ガス状基質は、都市固形廃棄物、黒液、農業廃棄物、木材廃棄物、残留天然ガス、バイオガス、サワーガス、メタンハイドレート、タイヤ、石油コークス、下水、肥料、わら、リグノセルロースエネルギー作物、リグニン、作物残留物、バガス、鋸屑、林業残留物、食品廃棄物、廃棄カーペット、廃プラスチック、埋立地ガス、及び／又はリグノセルロースバイオマスに由来する。
【００４３】
いくつかの実施形態において、アミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素は、培地から回収される。いくつかの実施形態において、培地は、水相及び有機相を含む二相液体培地であり、かつ／又は他の生物学的栄養素は、有機相の抽出又は反応抽出によって回収される。
【００４４】
別の態様において、アミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素を生成する微生物並びに方法が提供される。いくつかの実施形態において、炭素源及び／又はエネルギー源としてのガス状基質で成長することができる天然の又は非天然の微生物であって、ゼロ又は少なくとも１つの外来核酸を含み、アミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素を生合成する微生物が提供される。いくつかの実施形態において、炭素源及び／又はエネルギー源としてのガス状基質で成長することができ、ゼロ又は１以上の外来核酸を含み、アミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素を生合成する、本明細書に記載の天然の又は非天然の微生物内でアミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素を生成する方法であって、微生物の成長並びにアミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素の生成に適する条件下での成長及びバイオ産物生成のための他の栄養素を含むガス状基質及び培地（例えば、液体成長培地）を含むバイオリアクター中で天然の又は非天然の微生物を培養することを含み、該微生物がアミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素を生成する方法が提供される。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本発明の微生物は、産業用排ガスからＣＯ２を捕捉し、タンパク質に富むバイオマスを生成するために使用される。いくつかの実施形態において、タンパク質に富むバイオマスは商品である。いくつかの実施形態において、タンパク質に富むバイオマスは、単一細胞タンパク質（ＳＣＰ）として使用される。いくつかの実施形態において、タンパク質に富むバイオマスは、水産養殖飼料として又は水産養殖飼料配合物又は肥料中で使用される。いくつかの実施形態において、タンパク質に富むバイオマスは、水産養殖及び／又は他の動物飼料及び／又は植物肥料製品に使用される魚粉の高タンパク質代用品として使用される。いくつかの非限定的な実施形態において、本発明は、ＧＨＧ還元のため、及び動物飼料又は魚粉、カゼイン、乳清、又は脱脂大豆の代替物を含むが、これらに限定されない用途のための高タンパク質製品を生成するために使用される。
【００４６】
一態様において、炭素原子を１つのみ含有する無機分子及び／又は有機分子を捕捉し、同化生合成によって生成される２以上の炭素原子を含有する有機分子に変換するための生物学的並びに化学的方法であって、化学合成独立栄養微生物を維持するのに適する環境に、炭素原子を１つのみ含有する無機分子及び／又は有機分子を導入すること、化学合成独立栄養微生物を維持するのに適する環境にガス状基質を導入することを含み、炭素原子を１つのみ含有する無機分子及び／又は有機分子が、成長及び／又は生合成のために微生物によって炭素源として使用され、炭素原子を１つのみ含有する無機分子及び／又は有機分子を、少なくとも１つの化学合成炭素固定反応及び化学合成独立栄養微生物内に含有される少なくとも１つの同化生合成経路によって環境内に２以上の炭素原子を含有する有機分子生成物に変換することを含み、化学合成固定反応及び同化生合成経路が、化学的及び／若しくは電子化学的及び／若しくは熱化学的に作られたか、かつ／又は環境の外部にある少なくとも１つの供給源から環境内に導入される電子供与体及び電子受容体によって提供される化学並びに／又は電子化学エネルギーによって少なくとも部分的に促進される方法が提供される。
【００４７】
いくつかの実施形態において、前述の微生物は細菌細胞である。いくつかの実施形態において、前述の微生物はｋｎａｌｌｇａｓ微生物である。いくつかの実施形態において、前述の微生物は、カプリアビダス種又はラルストニア種である。いくつかの実施形態において、前述の微生物は、カプリアビダス・ネカトールである。いくつかの実施形態において、該微生物は、以下の属：カプリアビダス種、ロドコッカス種、ヒドロゲノビブリオ種、ロドシュードモナス種、水素細菌（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）種、ゴルドニア種、アルスロバクター種、ストレプトマイセス種、ロドバクター種、及び／又はキサントバクター種のうちの１以上から選択される微生物を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、前述のガス状基質は、炭素源としてＣＯ２を含む。いくつかの実施形態において、前述のガス状基質は、エネルギー源としてＨ２及び／又はＯ２を含む。いくつかの実施形態において、前述のガス状基質は、熱分解ガス又はプロデューサーガス又はシンガスを含む。いくつかの実施形態において、前述のガス状基質は、Ｈ２及び／又はＣＯ２及び／又はＣＯを含むガスの混合物を含む。いくつかの実施形態において、前述のガス状基質は、Ｈ２及び／又はＣＯ２を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態において、前述の微生物は、微生物の成長及びバイオ生成物の生成に適する条件下で、ガス状基質の存在下で培養した時に、アミノ酸及び／又はタンパク質及び／又はビタミン及び／又はバイオマスを生成する。いくつかの実施形態において、アミノ酸及び／又はタンパク質及び／又はビタミン及び／又はバイオマスは、培地から回収される。
【００５０】
いくつかの実施形態において、前述の微生物及び／又は前述の微生物によって生成される栄養素は、１以上の他の生物に栄養を与えるか、又は提供するために使用される。
【００５１】
いくつかの実施形態において、前述のガス状基質は、熱分解ガス又はプロデューサーガス又はシンガスである。いくつかの実施形態において、前述のガス状基質は、都市固形廃棄物、黒液、農業廃棄物、木材廃棄物、残留天然ガス、バイオガス、サワーガス、メタンハイドレート、タイヤ、石油コークス、下水、肥料、わら、リグノセルロースエネルギー作物、リグニン、作物残留物、バガス、鋸屑、林業残留物、食品廃棄物、廃棄カーペット、廃プラスチック、埋立地ガス、ケルプ、海藻、及び／又はリグノセルロースバイオマスに由来する。
【００５２】
いくつかの実施形態において、炭素原子を１つのみ含有する前述の電子供与体及び／又は分子は、ガス化、熱分解、蒸気改質、自己改質のうちの少なくとも１つを含む有機物質に作用する熱化学プロセスを経て作られる。いくつかの実施形態において、炭素原子を１つのみ含有する前述の電子供与体及び／又は有機分子は、メタン蒸気改質を経て作られる。いくつかの実施形態において、ガス化及び／又は熱分解及び／又は自己改質及び／又は蒸気改質からの産出ガス中の一酸化炭素に対する水素の比は、ガスが微生物に送達される前に、水生ガスシフト反応を用いて調節される。
【００５３】
いくつかの実施形態において、前述の電子供与体及び／又は電子受容体は、温室効果ガスの排出が低い再生可能な、代替の又は従来の動力源を用いて作られるか、又はリサイクルされ、前述の動力源は、太陽光発電、太陽熱、風力、水力、原子力、地熱、向上した地熱、海洋熱、海洋波動、及び潮力のうちの少なくとも１つから選択される。
【００５４】
いくつかの実施形態において、前述の電子供与体及び／又は電子受容体は、電気グリッド供給が電気グリッド需要を超える期間中、グリッド電気を用いて作られ、貯蔵タンクは、前述の電子供与体及び／又は電子受容体の発生、並びに化学合成反応中のそれらの消費を減らす。
【００５５】
いくつかの実施形態において、分子水素は電子供与体として作用し、以下のもの：水の電気分解、水の熱化学分解、ブラインの電気分解、硫化水素の電気分解及び／又は熱化学分解のうちの少なくとも１つを用いる方法により作られる。いくつかの実施形態において、水素生成のための水の電気分解は、以下のもの：プロトン交換膜（ＰＥＭ）、ＫＯＨなどの液体電解質、アルカリ電気分解、固体ポリマー電解質電気分解、高圧電気分解、水蒸気の高温電気分解（ＨＴＥＳ）のうちの１以上を用いて行われる。いくつかの実施形態において、水素生成のための水の熱化学分解は、以下のもの：酸化鉄サイクル、酸化セリウム（ＩＶ）−酸化セリウム（ＩＩＩ）サイクル、亜鉛−酸化亜鉛サイクル、硫黄−ヨウ素サイクル、銅−塩素サイクル、カルシウム−臭素−鉄サイクル、ハイブリッド硫黄サイクルのうちの１以上を用いて行われる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、分子水素は電子供与体として作用し、以下のもの：炭素の捕捉及び隔離（ＣＣＳ）対応メタン蒸気改質；ＣＣＳ対応石炭ガス化；Ｋｖａｅｒｎｅｒプロセス及びカーボンブラック製品を作る他のプロセス；ＣＣＳ対応ガス化又はバイオマスの熱分解；バイオ炭副生成物を生成するバイオマスの熱分解のうちの１以上を含む、二酸化炭素の放出が少ない又は全く放出しない、水素を生成することが知られている電子化学又は熱化学プロセスにより作られる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、前述の電子供与体は、以下の還元剤：アンモニア；アンモニウム；一酸化炭素；亜ジチオン酸塩；元素硫黄；炭化水素；水素；メタ亜硫酸塩；一酸化窒素；亜硝酸塩；チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）又はチオ硫酸カルシウム（ＣａＳ２Ｏ３）を含むが、これらに限定されないチオ硫酸塩などの硫酸塩；硫化水素などの硫化物；亜硫酸塩；チオネート；チオナイト；可溶化相又は固相の遷移金属若しくはそれらの硫化物、酸化物、カルコゲナイド、ハロゲン化物、水酸化物、オキシ水酸化物、リン酸塩、硫酸塩若しくは炭酸塩；及び固体電極材料中の伝導電子若しくは価電子帯電子のうちの１以上を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前述の電子受容体は、以下のもの：二酸化炭素；酸素；硝酸塩；亜硝酸塩；第２鉄又は他の遷移金属イオン；硫酸塩；又は固体電極材料中の価電子帯又は伝導帯ホールのうちの１以上を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態において、生物学的変換工程の前に、１以上の化学的前処理工程が先行し、その際、微生物が必要とする前述の電子供与体及び／又は電子受容体及び／又は炭素源及び／又はミネラル栄養素は、少なくとも１つの材料化学物質から作られるか、かつ／又はそれから精製されるか、かつ／又は炭素固定工程から生じる化学物質からリサイクルされるか、かつ／又は他の産業、鉱業、農業、下水処理若しくは廃棄物発生プロセスからの廃棄物の流れから作られるか、又はその中に含有されている。
【００５９】
いくつかの実施形態において、有機化学生成物には、５つの炭素又はそれ以上である炭素骨格を有する化合物が含まれる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、アミノ酸及び／又はタンパク質及び／又はビタミン及び／又はバイオマスを生成する方法であって、微生物の成長並びにアミノ酸及び／又はタンパク質及び／又はビタミン及び／又はバイオマスの生成に適する条件下での成長及びバイオ産物生成のための他の栄養素を含むガス状基質及び培地を含むバイオリアクター中で上記の微生物を培養することを含み、前述の微生物が、アミノ酸及び／又はタンパク質及び／又はビタミン及び／又はバイオマスを生成する方法が提供される。
【００６１】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの化学合成反応及び少なくとも１つの同化生合成経路は、アミノ酸；ペプチド；タンパク質；脂質；多糖；及び／又はビタミンのうちの少なくとも１つを含む生化学物質の形成をもたらす。
【００６２】
いくつかの実施形態において、バイオマス及び／又は生化学物質は、前述の少なくとも１つの化学合成反応を経て生成され、該バイオマス及び／又は生化学物質は、以下のもの：発酵のための有機炭素源及び／又は窒素源；他の微生物若しくは生物の成長のための窒素源；ヒト用の窒素源若しくは食品成分；動物用の飼料；製造プロセス若しくは化学プロセス用の原料又は化学中間体；医薬品物質、医薬物質若しくは栄養物質の供給源；肥料；土壌添加物；並びに／又は土壌安定剤のうちの少なくとも１つとして適用される。
【００６３】
いくつかの実施形態において、前述の化学合成反応からの炭素源及び／又は窒素源は、市販の酵素、抗生物質、アミノ酸、タンパク質、食品、食品成分；ビタミン、脂質、バイオプラスチック、多糖、栄養補助食品、医薬品のうちの少なくとも１つを含む生化学物質を生成するための発酵に使用される。いくつかの実施形態において、動物用の前述の飼料は、牛、羊、鶏、豚、魚、甲殻類、昆虫、無脊椎動物、サンゴのうちの１以上に餌を与えるために使用される。いくつかの実施形態において、前述の甲殻類又はサンゴは、Ｃ１供給源から生合成される栄養素を用いて成長し、ＣＯ２をアルベドが多い固体無機質形態に隔離する炭酸塩材料を生成する。
【００６４】
本発明の様々な目的、特徴、態様、及び利点は、同様の番号は同様の構成要素を表す添付図と共に、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになる。
【００６５】
本発明の非限定的な実施形態は、添付図を参照して例として記載され、添付図のいくつかは、模式的であり、一定の縮尺で描かれることを意図しない。明確にする目的で、全ての構成要素が全ての図にラベル付けされているわけではなく、本発明の各実施形態の構成要素も全ては示されておらず、図は、当業者が本発明を理解するのを可能にするために必ずしも必要とされない。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ｋｎａｌｌｇａｓ微生物の代謝経路を示す。
【図２】光学密度（ＯＤ）とバイオマス密度の相関を示す。
【図３】血清ボトル中のカプリアビダス・ネカトールのガスでの成長についての成長曲線を示す。
【図４】血清ボトル中のカプリアビダス・ネカトールのガスでの成長についての経時的な上部空間圧力の変化を示す。
【図５】血清ボトル中のカプリアビダス・ネカトールについての、消費されるＨ２モル当たりに生成される乾燥バイオマスを示す。
【図６】バイオリアクター中のＨ２／ＣＯ２／Ｏ２で成長したｋｎａｌｌｇａｓ微生物カプリアビダス・ネカトールについての成長曲線を示す。
【図７】異なる炭素源に対する化学栄養微生物及び油性微生物の成長の結果を示す。細菌成長を、示した日（括弧内）の後に、６５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）検出を用いて測定した。培地及び成長条件を以下の実施例に記載した。ＮＤは、未試験である。
【図８】ロドコッカス・オパクスＤＳＭ  ４３２０５の脂肪酸プロファイルを示す。
【図９】ロドコッカス種ＤＳＭ  ３３４６の脂肪酸プロファイルを示す。
【図１０】ガスでＣ．ネカトールを成長させるために使用されるバイオリアクター及び支持システムの模式図を示す。
【図１１】ドラフトチャンバー内で、ガスでＣ．ネカトールを成長させる２つの２０Ｌのバイオリアクターを示す。
【図１２】爆発性ガス検出システム、質量流量計、レベルコントローラー、塩基制御貯蔵所、培地添加貯蔵所、及び泡制御貯蔵所と共に、図１１のリアクターを作動するために使用したＡｐｐｌｉｋｏｎコントローラー及びコンソールを示す。
【図１３】油及びポリマーを含む、Ｃ．ネカトールからのヘキサン粗抽出物を含有する試験管を示す。
【図１４】唯一の炭素源としてのＣＯ２並びに水素及び電子の唯一の供給源としてのＨ２で成長させたＣ．ネカトールから抽出した油試料を示す。
【図１５】超音波処理前（左に示す）茶色の、及び超音波処理後（右に示す）のＣ．ネカトールのバイオマススラリーを示す。超音波処理前は、スラリーは茶色であり、超音波処理後は、細胞の完全破壊により、バイオマスは茶色からクリーム色に変化した。
【図１６】カプリアビダス・ネカトールから抽出した油に存在する脂肪酸の炭素鎖長のプロファイルを示す。
【図１７】バイオリアクター中で、Ｈ２、ＣＯ２、及びＯ２ガスの混合物で成長させたヒドロゲノビブリオ・マリナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ）株ＤＳＭ  １１２７１を示す。
【図１８】模式的に図解したロドシュードモナス・カプシュラータ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃａｐｓｕｌａｔａ）株ＤＳＭ  １７１０を成長させるために使用したガス送達システム及び培養ボトルを示す。
【図１９】Ｒ．カプシュラータの顕微鏡写真を示す。
【図２０】遠心分離後に回収したＲ．カプシュラータバイオマスのペレットを示す。
【図２１】成長のための唯一のエネルギー源及び炭素源としてＨ２、ＣＯ２、及びＯ２ガスの混合物でキサントバクター・オートトロフィカス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）株ＤＳＭ  ４３２を成長させるために使用する２リットルのガラス発酵槽システムの模式図を示す。
【図２２】模式的に図解した図２１に描写したバイオリアクターのヘッドプレートを示す。
【図２３】圧力計；ガス流量計；安全バルブ及びチェックバルブ；０．２ミクロンのフィルター；バイオリアクター容器、センサー、アクチュエータ、及びコントローラー；コンデンサー及び泡の捕捉；並びに排気ベンドを含むキサントバクター・オートトロフィカスを成長させるために使用されるリアクターシステムの模式図を示す。
【図２４】Ｘ．オートトロフィカスを成長させるために使用するガス送達システムの模式図を示す。
【図２５】Ｘ．オートトロフィカスについてのＯＤ６００と細胞乾燥重量（ＣＤＷ）の相関を示す。
【図２６】Ｈ２／ＣＯ２／Ｏ２で成長させたｋｎａｌｌｇａｓ微生物Ｘ．オートトロフィカスについての増殖曲線を示す。
【図２７】水産養殖飼料の生成のためのＣＯ２＋再生可能なＨ２を示す。
【図２８】化学合成独立栄養の主要産生株を有する複合マルチステージ生命維持システム又は生態系を示す。
【図２９】Ｃ．ネカトールシステムの部分的な物質収支を示す。
【図３０】Ｃ．ネカトール閉ループ生命維持システムの概略フロー図を示す。
【図３１】動物飼料又は他の栄養素又は栄養補助食品のためのタンパク質に富むバイオマスを生成するための、オキシハイドロジェン反応を実行することができる微生物によって実行されるＣＯ２捕捉を有する実施形態のプロセスフロー図を示す。
【図３２】廃棄ＣＯ２及びオフピークの断続的な再生可能エネルギーを高タンパク質飼料、肥料、及び栄養素に変換する統合システムの略図を示す。ＣＯ２の捕捉及び貴重な栄養素の生成に加えて、該システムは、需要が低い期間中の過剰な再生可能生成からのグリッドの歪みを軽減する。需要が低い期間中でさえ、再生可能エネルギーを生成し続けることを可能にすることによって再生可能な能力のより完全な利用も可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本明細書に提供されるのは、アミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素の生合成による生成の方法並びにシステムである。ある実施形態において、プロデューサーガス、シンガス、テールガス、熱分解、ｋｎａｌｌｇａｓ、並びにＨ２及びＣＯ２、及び／又はＣＯ及び／又はＣＨ４を含有するガス混合物を含むが、これらに限定されないガス状基質でアミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素を生成する天然又は操作された微生物が提供される。ガス状基質は、微生物の成長及びバイオ生成物の生合成のための炭素源及び／若しくはエネルギー源並びに／又は電子供与体及び／若しくは電子受容体の供給源として役立ち得る。
【００６８】
本発明の主題は、ある実施形態において、シンガス、又はプロデューサーガス、及び／又はＨ２、及び／又はＣＯ２、及び／又はＣＯ、及び／又はＣＨ４、及び／又は他の廃ガスで成長でき、リジン及び／又はメチオニンを含むが、これらに限定されないアミノ酸を生成できる野生型又は操作された微生物を含む。
【００６９】
本発明のある実施形態において、アミノ酸、及び／又はペプチド、及び／又はタンパク質及び／又はビタミンは、以下のもの：Ｈ２、ＣＯ２、ＣＯ、Ｈ２Ｏ、ＮＨ３、ＣＨ４、ＣＨ３ＯＨ、ＨＣＯＨ、尿素のうちの１以上を含むが、これらに限定されない単純Ｃ１及び無機前駆体から合成される。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本発明は、１以上のアミノ酸又はタンパク質又はビタミンを生成する方法であって、細菌細胞をシンガス及び／又はプロデューサーガス及び／又はガス状ＣＯ２及び／又はＨ２及び／又はＣＯ及び／又はＣＨ４に暴露することを含み、該細菌細胞は、ガス状ＣＯ２及び／又は他のＣ１分子を１以上のアミノ酸又はタンパク質又はビタミンに固定することができ、該微生物は、ゼロ又は少なくとも第１の外来核酸を含む方法に関する。いくつかの実施形態において、該細胞は、１以上のアミノ酸又はタンパク質又はビタミンの合成のための還元等価物及び／又は代謝エネルギーの供給源として前述のガス状基質を利用する。いくつかの実施形態において、該微生物は、その天然の機構によって、アミノ酸及び／又はタンパク質及び／又はビタミンを生成する。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本発明は、アミノ酸及び／又はタンパク質及び／又はタンパク質性バイオマス及び／又はビタミンを生成する方法であって、天然株又は操作された微生物を、シンガス及び／又はプロデューサーガス及び／又はＣＯ２及び／又はＨ２ガス及び／又はＣＯ及び／又はＣＨ４を含む原料を有するバイオリアクター又は溶液中で培養することを含む方法に関する。［２６８］いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載の組成物又は細菌細胞若しくは微生物細胞を含むバイオリアクターに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、１以上のアミノ酸、タンパク質、又は栄養素の生成システムであって、（ａ）本明細書に記載の細胞を含む微生物集団；（ｂ）シンガス又はプロデューサーガス及び／又はガス状のＣＯ２及び／又はＨ２及び／又はＣＯ及び／又はＣＨ４を含む原料の送達を可能にする原料供給源に連結された入口を含むバイオリアクターを含むシステムに関する。
【００７２】
本発明の別に態様において、本発明は、本明細書に記載の細胞又は組成物を含む微生物集団内で分子又は分子の混合物を生成する方法であって、シンガス又はプロデューサーガス及び／又はガス状のＣＯ２及び／又はＨ２及び／又はＣＯ及び／又はＣＨ４を含む原料中で、本明細書に記載の細胞又は組成物を含む微生物集団を培養することを含む方法に関する。［２７０］いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載の細胞又は組成物を含む微生物集団内でアミノ酸、又はタンパク質、又は他の栄養素を生成する方法であって、シンガス又はプロデューサーガス及び／又はガス状のＣＯ２及び／又はＨ２及び／又はＣＯ及び／又はＣＨ４を含む原料中で、本明細書に記載の細胞又は組成物を含む微生物集団を培養することを含む方法に関する。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本発明は、１以上のアミノ酸、又はタンパク質、又は他の栄養素を製造する方法であって、（ａ）シンガス又はプロデューサーガス及び／又はガス状のＣＯ２及び／又はＨ２及び／又はＣＯ及び／又はＣＨ４の存在下で、反応容器又はバイオリアクター中で本明細書に記載の細胞を培養し、該細胞は、細胞の乾燥細胞総質量の少なくとも１０％以上の量で、１以上のアミノ酸、若しくはタンパク質、若しくは他の栄養素を生成及び／又は分泌すること；（ｂ）反応容器から１以上のアミノ酸、又はタンパク質、又は他の栄養素、又は全細胞生成物を分離すること、を含む方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、さらに、反応容器又はバイオリアクターからの分離後に１以上のアミノ酸、又はタンパク質、又は他の栄養素、又は全細胞生成物を精製することを含む。いくつかの実施形態において、１以上のアミノ酸、又はタンパク質、又は他の栄養素、又は全細胞生成物は、別の生物に提供される飼料若しくは栄養供給又は肥料の成分、又はそれらの前駆体、又はそれらの中に含まれる。ある非限定的な実施形態において、他の生物は、従属栄養であり、あるそのような実施形態において、動物プランクトン、甲殻類又は他の無脊椎動物、魚、鳥、又は哺乳類のうちの１以上を含むが、これらに限定されない動物である。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本発明は、１以上のアミノ酸を生成する方法であって、細菌細胞及び／又は古細菌細胞及び／又は他の微生物細胞を、シンガス及び／又はガス状のＣＯ２及び／又はＨ２及び／又はＣＯ及び／又はＣＨ４に暴露することを含み、該細胞は、ガス状のＣＯ２及び／又は他のＣ１炭素源を、１以上のアミノ酸及び／又はタンパク質及び／又はビタミンに固定することができ、該化合物は、バイオリアクターから回収され、第２若しくはそれ以上のさらなるリアクター及び／又はプロセス工程に供給され、該化合物は、以下のもの：肥料、水産養殖飼料、動物飼料、ヒトの栄養素、又はビタミンのうちの１以上を含むが、これらに限定されない生成物を作るために後処理される方法に関する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本発明は、二酸化炭素含有ガス流並びに／又は大気二酸化炭素、又は１以上の炭素固定プロセス工程において、偏性若しくは通性化学合成独立栄養微生物、特に、化学合成無機独立栄養生物、及び／又は化学合成独立栄養微生物からの酵素を含有する細胞抽出物を利用する化学的及び生物学的プロセスを経て溶解、液化又は化学的に結合した形態の二酸化炭素から二酸化炭素を補足するための組成物並びに方法を与える。本発明はまた、無機炭素を、アミノ酸及び／又はタンパク質及び／又はビタミン及び／又はバイオマスを含むが、これらに限定されない中間体又は完成した化学物質である有機化合物に固定するために、化学合成独立栄養生物によって実行される化学合成反応の科学生成物の回収、処理、及び使用のための組成物並びに方法を与える。本発明はまた、化学合成に必要な電子供与体及び電子受容体の提供を含むが、これらに限定されない化学合成及び化学合成独立栄養培養の維持に必要な化学栄養素の作製、処理及び送達のための組成物並びに方法を与える。本発明はまた、化学合成及び化学合成独立栄養成長、並びに未使用の化学栄養素及びプロセス水の回収並びにそれらのリサイクルに有益な環境の維持のための組成物並びに方法を与える。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される微生物は、アミノ酸、又はタンパク質、及び他の生物学的栄養素の生合成による生成のための１以上の酵素を発現するように組み換え操作される。いくつかの実施形態において、基質又は中間体は、微生物細胞におけるアミノ酸、タンパク質、及び／又は他の生物学的栄養素の合成、例えば、アセチルＣｏＡ、ピルビン酸、又はマロニルＣｏＡに送達される。いくつかの非限定的な実施形態において、様々な生合成経路に沿って流れる炭素の一部の画分は、目的のアミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素の生合成に向けられる。
【００７７】
本発明のある実施形態の一態様は、一酸化炭素、メタン、メタノール、ギ酸塩、若しくはギ酸を含むが、これらに限定されないＣ１炭素源、及び／又は様々なガス化、熱分解、若しくは蒸気改質固定炭素原料及び／若しくはメタン原料から作られる様々なシンガス組成物を含むが、これらに限定されないＣ１化学物質を含有する混合物の変換のための全体的なプロセス内で、Ｃ１化学物質のより長い炭素鎖有機分子（すなわち、Ｃ２又はより長い、ある実施形態において、Ｃ５又はより長い炭素鎖分子）への変換のための生体触媒としての化学栄養微生物及び／又は化学栄養微生物の酵素を利用する１以上のプロセス工程の包含である。いくつかのこのような実施形態において、液体形態の又は溶液に溶解させたＣ１含有シンガス、又はプロセスガス、又はＣ１化学物質は、栄養培地及び化学栄養微生物を含有する容器又はエンクロージャーに送り込まれるか、又はそうでなければ添加される。いくつかのそのような場合において、化学栄養微生物は、Ｃ１化学物質中に保存された炭素及び電子、並びに／又は分子水素からの電子及び水素、並びに／又は固体電極材料中の価電子若しくは伝導電子、並びに／又は以下のもの：アンモニア；アンモニウム；一酸化炭素；亜ジチオン酸塩；元素硫黄；炭化水素；メタ亜硫酸塩；一酸化窒素；亜硝酸塩；チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）又はチオ硫酸カルシウム（ＣａＳ２Ｏ３）を含むが、これらに限定されないチオ硫酸塩などの硫酸塩；硫化水素などの硫化物；亜硫酸塩；チオネート；チオナイト；可溶化相又は固相の遷移金属若しくはそれらの硫化物、酸化物、カルコゲナイド、ハロゲン化物、水酸化物、オキシ水酸化物、硫酸塩、若しくは炭酸塩のうちの１以上を含むが、これらに限定されない栄養培地に送り込まれるか、若しくはそうでなければ提供される電子受容体の以下のリストのうちの１以上を用いて、Ｃ１化学物質をより長い炭素鎖有機化学物質に伸長させるために生化学合成を行う。電子供与体は、化学合成呼吸反応において電子受容体によって酸化され得る。ある実施形態において、本発明の微生物による呼吸に使用される電子受容体は、以下のもの：酸素、二酸化炭素、第２鉄又は他の遷移金属イオン、硝酸塩、亜硝酸塩、酸素、又は固体電極材料中のホールのうちの１以上を含むが、これらに限定されない。ある非限定的な実施形態において、前述の化学栄養微生物は、ｋｎａｌｌｇａｓ又は酸水素微生物である。
【００７８】
ある実施形態において、本発明は、ゼロ又はそれ以上の外来核酸配列を含む化学栄養細菌株に関する。本発明は、部分的に、化学栄養細菌及び特定の関連する微生物が、ガス状の廃棄炭素原料からの化学物質、タンパク質、飼料、肥料、モノマー、油、燃料、及び他の生物学的物質の経済的かつ大規模な生成に予期せぬ利点を提供するという発見、並びにまた、これらの用途における性能の向上のためにこれらの微生物を改変するための遺伝子技術及びシステムの発見から生じる。本発明の微生物によって合成されるタンパク質、脂質及び他の生物化学物質は、肥料、動物飼料、食料、パーソナルケア、及び化粧品中の成分としてのポリマー、滑剤の生成のための石油化学代替品、モノマー、原料を含むが、これらに限定されない使用に適用することができる。本発明のいくつかの実施形態において、酵素的及び化学的プロセスは、ビタミン、アミノ酸、及び／又はタンパク質を生成するために利用することができる。いくつかの実施形態は、動物飼料及び／又は肥料の生成を可能にする。加えて、本発明は、アミノ酸及び／若しくはタンパク質の収率の向上並びに／又は生成費用の低下のために化学栄養細菌を培養並びに／又は改変する方法を与える。いくつかの実施形態において、遺伝子改変細菌は、遺伝子改変されていない同じ細菌と比較して、ある１種類又は複数種類のビタミン又はアミノ酸分子をより多く生成する。
【００７９】
本発明は、偏性若しくは通性化学栄養生物において、これらの生物が、二酸化炭素及び／又は無機炭素の他の形態及び／又はシンガス及び／又はメタンなどの他のＣ１化合物及び／又は熱分解ガスなどの熱分解反応の液体、ガス状、及び固体の生成物及び／又は油を、目的の炭素系生成物に変換するように化学物質、モノマー、ポリマー、アミノ酸、タンパク質、多糖、ビタミン、栄養補助食品又は医薬品又はその中間体を含むが、これらに限定されない目的の炭素系生成物の生成及び／又は分泌を促す方法並びに機構、並びに特に、化学物質、モノマー、ポリマー、アミノ酸、タンパク質、多糖、ビタミン、動物飼料、肥料、栄養補助食品又は医薬品又はその中間体の商業生産のためのそのような生物の使用に関する。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本発明はまた、未精製未加工材料の化学物質を、化学合成炭素固定工程を支持するのに適するより精製された化学物質に変換する化学合成反応工程；エネルギー材料を、化学合成を促進するために使用することができる化学形態に、具体的には、電子供与体及び電子受容体の形態の化学エネルギーに変換する化学合成反応工程；産業若しくは大気若しくは水生生物の供給源から補足される無機炭素を、化学合成炭素固定を支持するのに適する条件下でプロセスの炭素固定工程（複数可）に向かわせる化学合成反応工程；さらに、アミノ酸及び／又はタンパク質及び／又はビタミン及び／又はバイオマスを含むが、これらに限定されない前述の生成物で、化学合成炭素固定工程の産出生成物を、保管、運送、及び販売に適する形態に処理する化学合成反応工程を順番に、かつ／又は並行して生じる化学プロセス工程の組成物及び方法を与える。生物学的化学合成炭素固定工程と組み合わされる完全な化学工程、非生物工程、プロセス工程は、本発明の全体的な炭素補足及び変換プロセスを構成する。本発明は、他の生命体と比較して、生体触媒としての化学プロセス流内に化学合成独立栄養微生物を組み込む特有の容易さを利用する。理論に束縛されることなく、この特有の性能及び能力は、化学合成独立栄養生物が自然界で、生物と非生物の化学の接点でそれらの存在の化学合成様式によって作用するという事実から生じるように思われる。
【００８１】
本明細書で特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、「微生物及び分子生物学の辞書（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、及びＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｋｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本発明で使用される多くの用語の一般的な辞書と共に、技術の１つを提供する。本明細書に記載のものと同じ又は同等の方法及び材料は、本発明の実施又は試験に使用することができる。
【００８２】
本発明の実施は、特に示さない限り、当業者の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、及び生化学の従来の技術を使用する。そのような技術は、文献、例えば、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）；オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）、１９８４；分子生物学の現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９４）；ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（Ｍｕｌｌｉｓら（編）、１９９４）；及び遺伝子の導入及び発現：実験室マニュアル（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０）で完全に説明されている。
【００８３】
本明細書に提供される番号の範囲は、範囲を定義する番号を含む。
【００８４】
特に示さない限り、それぞれ、核酸は５’から３’方向に左から右に書かれ、アミノ酸配列はアミノからカルボキシ方向に左から右に書かれる。
【００８５】
定義
「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その」は、文脈が明確に示さない限り、複数の言及を含み、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、不定冠詞「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、及び「その」は、反対のことが明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味することが理解されるべきである。
【００８６】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、語句「及び／又は」は、そのように結合された要素、すなわち、ある場合には結合的に存在し、他の場合には選言的に存在する要素の「いずれか又は両方」を意味することが理解されるべきである。反対のことが明確に示されない限り、具体的に特定される要素に関連しようと、関連しまいと、他の要素は、任意選択で「及び／又は」の句によって具体的に特定される要素以外に存在してよい。このように、非限定的な例として、「含む」などの上限がない言語と組み合わせて使用される時に、「Ａ及び／又はＢ」に対する言及は、一実施形態において、Ｂを含まないＡ（任意選択でＢ以外の要素を含む）を指し、別の実施形態において、Ａを含まないＢ（任意選択でＡ以外の要素を含む）を指し、さらに別の実施形態において、ＡとＢの両方（任意選択で他の要素を含む）などを指すことができる。
【００８７】
量、及び一時的な期間などの測定可能な値を言及する時に本明細書で使用される用語「約」は、特定の値から±２０％、±１０％、±５％、±１％、又は±０．１％の変動量を包含することを意味し、そのような変動は、開示される方法を実行するのに適する。
【００８８】
用語「アミノ酸」は、炭素に結合している、アルファ炭素と命名されたアミン基とカルボキシル基の両方を含有する分子を指す。適切なアミノ酸には、限定されないが、天然アミノ酸のＤ異性体とＬ異性体の両方、並びに有機合成及び他の代謝経路によって調製される非天然アミノ酸が含まれる。いくつかの実施形態において、単一「アミノ酸」は、伸長された脂肪族又は芳香族の骨格足場当たり利用可能な複数の側鎖部分を有してよい。文脈が特に具体的に示さない限り、本明細書で使用する用語アミノ酸は、アミノ酸類似体を含むことが意図される。
【００８９】
用語「Ａｕｆｗｕｃｈｓ」（「表面成長」又は「過成長」に対するドイツ語）は、根付き植物の一部などの水性環境中の開放面に接着する小動物及び植物の集合である。海洋と淡水環境の両方において、藻類−特に緑藻類及び珪藻類は、Ａｕｆｗｕｃｈｓコミュニティの優勢構成要素を構成する。小型の甲殻類、回虫類、及び原生動物も淡水及び海水によく見られるが、昆虫の幼虫、貧毛類及び緩歩動物は、淡水Ａｕｆｗｕｃｈｓ動物相に固有である。
【００９０】
用語「バイオマス」は、細胞の成長及び／又は増殖によって生成される材料を指す。バイオマスは、細胞及び／又は細胞内含有物並びに細胞によって分泌される化合物を含むが、これらに限定されない細胞外物質を含有することができる。
【００９１】
用語「バイオリアクター」又は「発酵槽」は、細胞が成長及び維持される閉鎖された又は部分的に閉鎖された容器を指す。細胞は、液体懸濁液中で保持されるが、必ずしもそうである必要はない。いくつかの実施形態において、液体懸濁液中で保持されること以外に、細胞は、代わりに、固体成長支持物質を含むが、これに限定されない別の液体ではない基質と接触して、基質で、若しくは基質中で成長及び／又は維持されてよい。
【００９２】
用語「触媒」は、化学反応が生じる速度を加速させる分子又は高分子の構造などの化学アクターを指し、１つ又は複数の反応物が１つ又は複数の生成物に変換される一方で、触媒それ自体は生成物に変わらないか、又はそうでなければ、化学反応の完了時に変化せず、消費もされない。触媒は１つの化学反応に関わった後、変化しないので、さらなる化学反応に関わり、さらなる反応物に作用して、さらなる生成物を作ることができる。化学反応を加速するために、触媒は、反応経路を横切る活性化エネルギー障壁を減少させ、より低い温度で化学反応が生じるのを可能にするか、又は所定の温度でより速く化学反応が生じるのを可能にする。このように、システムの化学平衡へのより迅速なアプローチが達成され得る。触媒は、タンパク質触媒である酵素を包含する。
【００９３】
用語「セルロース系材料」は、セルロース量が多い、一般的に、数百〜数千個のβ（１→４）結合Ｄ−グルコースモノマーの直鎖からなる式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｎを有する多糖である任意の材料を指す。セルロース系材料の供給源には、段ボール、綿、トウモロコシの茎葉、紙、木材チップ、おがくず、サトウダイコンパルプ、サトウキビバガス、及びスイッチグラスが含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
用語「ＣｏＡ」又は「補酵素Ａ」は、脂肪酸合成及び酸化、ピルビン酸酸化、アセチル又は他のアシル基転移、並びに他のアセチル化に関わる酵素を縮合するための有機補助因子を指す。
【００９５】
用語「補助因子」は、その触媒活性を実行する酵素が必要な全ての分子を包含する。いくつかの実施形態において、補助因子は、基質とは別の任意の分子である。
【００９６】
特許請求の範囲、並びに本明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「担持する」、「有する」、「含有する」、「関与する」、及び「保持する」などの全ての移行句は、上限がない、すなわち、含むが限定されないことを意味すると理解されるべきである。移行句「からなる」及び「から実質的になる」のみ、それぞれ閉鎖遷移句又は半閉鎖遷移句となる。
【００９７】
用語「外来遺伝子」は、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の合成をコードし、細胞に組換えで導入された核酸を意味する。いくつかの実施形態において、外来遺伝子は、形質転換によって導入される。いくつかの実施形態において、外来遺伝子は、電気穿孔により細胞に導入される。形質転換細胞は、さらなる外来遺伝子（複数可）が導入され得る組換え細胞と呼ばれ得る。宿主種に入れられる外来遺伝子は、異なる種から取得され得る（これは異種性と呼ばれる）か、又は同じ種内に天然に存在し得る（これは、以下に定義されるように同種である）。したがって、外来遺伝子は、遺伝子が天然位置とは異なるゲノム、エピソーム、又はプラスミドの領域に組み込まれるか、又はそれらに導入される相同遺伝子を包含する。外来遺伝子の複数コピーが細胞に導入され得る。外来遺伝子は、宿主細胞又は形質転換細胞内に２以上のコピーで存在し得る。いくつかの実施形態において、該微生物は、外来タンパク質をコードする核酸を１〜１０，０００コピー並びに１及び１０，０００コピー含む。いくつかの実施形態において、該微生物は、外来タンパク質をコードする核酸を１〜１，０００コピー並びに１及び１０，０００コピー含む。いくつかの実施形態において、該微生物は、外来タンパク質をコードする核酸を１〜１０，０００コピー並びに１及び１０，０００コピー含む。いくつかの実施形態において、該微生物は、外来タンパク質をコードする核酸を１〜１，０００コピー並びに１及び１，０００コピー含む。いくつかの実施形態において、該微生物は、外来タンパク質をコードする核酸を１〜５００コピー並びに１及び５００コピー含む。いくつかの実施形態において、外来遺伝子は、ゲノム内の挿入物として、又はエピソーム分子として細胞によって維持される。いくつかの実施形態において、該微生物は、１以上の外来タンパク質をコードする１以上の核酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は１０００以下のコピーを含む。
【００９８】
本明細書で使用する用語「発現形態」は、細胞内に存在する時に、コード配列が発現するように、酵素又は細胞に酵素活性を与えることができるその断片をコードするコード配列に作動可能に連結された必要な調節エレメントを含有する遺伝子構築物を指す。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の微生物又は細菌細胞を含む組成物は、外来核酸配列の１０以下の発現形態を含む。
【００９９】
用語「リグノセルロース系材料」は、セルロース、ヘミセルロース、及びリグニンで構成され、炭水化物ポリマー（セルロース及びヘミセルロース）がリグニンにしっかり結合されている任意の材料である。リグノセルロース系材料は、農業残留物（トウモロコシ茎葉及びサトウキビバガスを含む）、ほとんどのバイオマスエネルギー作物、木材残留物（製材所及び製紙工場の廃棄物を含む）、並びに実質的な割合の地方自治体廃棄物を包含する。
【０１００】
用語「脂質」は、非極性溶媒（限定されないが、クロロホルム及び／又はエーテルなど）に溶解することができ、また水への溶解性がほとんど又は全くない分子のカテゴリーを指す。脂質分子の疎水性は、典型的には、分子内の長鎖炭化水素部分の存在から生じる。脂質は、以下の分子の種類：炭化水素、脂肪酸（飽和及び不飽和）、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、ヒドロキシ酸、二酸、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロールなどのステロール及びステロイドホルモン、脂溶性ビタミン（ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ及びｋなど）、ポリケチド、テルペノイド、及びワックスを包含する。
【０１０１】
用語「可溶化液」は、細胞溶解から生じる混合物及び／又は細胞内容物の溶液を含有する液体を指す。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、細胞溶解物中の化学物質又は化学物質の混合物の精製を含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、細胞溶解物中のアミノ酸及び／又はタンパク質の精製を含む。
【０１０２】
用語「溶解」は、かなりの量の細胞内物質が細胞外空間に出るような、原形質膜及び存在する場合、細胞の細胞壁の破裂を指す。溶解は、電気化学的、機械的、浸透圧的、熱的、又はウイルスの手段を用いて実行することができる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、バイオリアクターの内容物から化学物質又は化学物質の混合物を分離するために、本明細書に記載の細胞又は微生物の溶解を実行することを含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、バイオリアクターの内容物からアミノ酸又はアミノ酸の混合物及び／又はタンパク質を分離するために、本明細書に記載の細胞又は微生物の溶解を実行することを含む。
【０１０３】
本明細書及び特許請求の範囲で使用する「又は」は、上記で定義した「及び／又は」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分ける場合、「又は」又は「及び／又は」は、包括的、すなわち、少なくとも１つの包含であるが、いくつかの要素又は要素のリスト、及び任意選択で、記載されていないさらなる要素のうちの２以上も含むと解釈されるべきである。「のうちの１つのみ」若しくは「のうちのちょうど１つ」又は特許請求の範囲で使用される場合、「からなる」などの反対のことが明確に示される唯一の用語は、いくつかの要素又は要素のリストのうちのちょうど１つの要素の包含を指す。一般に、本明細書で使用する用語「又は」は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちのたった１つ」、又は「のうちのちょうど１つ」などの排他性の用語に先行する場合、排他的な選択肢（すなわち、「一方又は他方であるが、両方ではない）を示すと唯一解釈されるべきである。特許請求の範囲で使用される場合、「から本質的になる」は、特許法の分野で使用されるその普通の意味を有する。
【０１０４】
「付着生物」は、ほとんどの水生生態系中の液内表面に付着している藻類、ラン藻、従属栄養性微生物、及び有機堆積物の複合混合物である。無脊椎動物、オタマジャクシ、及びいく種類かの魚のための重要な食料供給源として役立つ。
【０１０５】
「力価」は、微生物発酵プロセス中の単位体積あたり微生物によって生成される物質の量を指す。例えば、バイオマス力価は、溶液１Ｌあたり生成されるバイオマスのグラムとして表され得る。
【０１０６】
「収率」は、飼料物質の全てが生成物に変換される場合、生成される物質の総量に対する飼料材料（例えば、糖）から生成される生成物の量を指す。例えば、アミノ酸の収率は、飼料物質の１００％がアミノ酸に変換される場合、理論的収率に対する生成されたアミノ酸の％として表され得る。
【０１０７】
「生産性」は、微生物発酵プロセス中、単位時間あたり、単位体積あたり微生物によって生成される物質の量を指す。例えば、バイオマス生産性は、１時間あたり、溶液１Ｌあたり生成されるバイオマスのグラムとして表され得る。
【０１０８】
本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び／又は改変されたヌクレオチド若しくは塩基若しくはそれらの類似体を含むデオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドの類似体又は改変形態を含有する任意の長さ並びに任意の３次元構造並びに１本鎖若しくは複数鎖（例えば、１本鎖、２本鎖、３重らせん状など）のヌクレオチドのポリマー形態を指す。遺伝子コードは縮重しているので、２以上のコドンを、特定のアミノ酸をコードするために用いてもよく、本発明は、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを包含する。ポリヌクレオチドが、スクレアーゼ耐性を増強する改変（例えば、デオキシ、２’−Ｏ−Ｍｅ、ホスホロチオエートなど）を含めて、使用条件下で所望の機能を保持する限り、任意の種類の改変ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を用いてよい。標識、例えば、放射性若しくは非放射性標識又はアンカー、例えば、ビオチンも、検出又は捕捉の目的で取り込まれてよい。用語ポリヌクレオチドはまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。ポリヌクレオチドは、天然に存在しても、天然に存在しなくてもよい。用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」は、互換的に本明細書で使用される。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、若しくはその両方、並びに／又はそれらの改変形態及び／若しくは類似体を含有し得る。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。１以上のホスホジエステル結合は、代替結合基によって置換され得る。これらの代替結合基には、リン酸塩がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（「ホルムアセタール」）（式中、各Ｒ又はＲ’は、独立して、Ｈ、又は任意選択で、エーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を含有する置換若しくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）である）によって置換されている実施形態が含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要ない。ポリヌクレオチドは、直鎖若しくは環状であり得るか、又は直鎖と環状部分の組み合わせを含み得る。
【０１０９】
本明細書で使用する「ポリペプチド」は、アミノ酸で構成され、当業者がタンパク質として認める組成物を指す。アミノ酸残基の従来の１文字又は３文字コードを、本明細書で使用する。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書で互換的に使用される。ポリマーは、直鎖又は分枝鎖であってよく、改変アミノ酸を含んでよく、非アミノ酸によって中断されてよい。この用語はまた、自然に改変されるか、又は介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識成分との結合などの任意の他の操作若しくは改変によって改変されたアミノ酸ポリマーを包含する。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１以上の類似体、並びに当技術分野で知られている他の改変を含有するポリペプチドも定義内に含まれる。
【０１１０】
本明細書で使用する「ベクター」は、核酸を１以上の細胞型に導入するように設計されたポリヌクレオチド配列を指す。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、及びカセットなどが含まれる。
【０１１１】
本明細書で使用する用語「発現」は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成されるプロセスを指す。該プロセスは、転写と翻訳の両方を含む。
【０１１２】
本明細書で使用する「発現ベクター」は、宿主内でコード配列の発現をもたらすことができる１以上の適切な制御配列（複数可）に作動可能に連結されたＤＮＡコード配列（例えば、遺伝子配列）を含有するＤＮＡ構築物を指す。このような制御配列には、転写をもたらすプロモーター、かかる転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終結を制御する配列が含まれる。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は単に、潜在的なゲノム挿入物であり得る。適切な宿主内に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムとは独立に複製及び機能することができるか、又は場合によって、ゲノムそれ自体に組み込むことができる。プラスミドは、発現ベクターの最も一般的に使用される形態である。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たし、当技術分野で知られる、又は知られるようになる発現ベクターのかかる他の形態を含むことが意図される。
【０１１３】
「遺伝子」は、ポリペプチドの生成に関与し、コード配列の前後の領域及び個々のコード配列（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含むＤＮＡセグメントを指す。
【０１１４】
本明細書で使用する用語「宿主細胞」は、ポリペプチドの生成用の組換え発現ベクターがポリペプチドの発現のためにトランスフェクトされ得る細胞又は細胞株を指す。宿主細胞には、単一宿主細胞の子孫が含まれ、該子孫は、天然、偶発的、又は意図的な変異により、必ずしも元の親細胞と（形態又は全ゲノムＤＮＡ相補体において）完全に同一である必要はない。宿主細胞には、インビボで、発現ベクターでトランスフェクト又は形質転換される細胞が含まれる。
【０１１５】
用語「組換え体」は、改変ポリペプチドを生成するためのコード配列の変異、コード配列の別の遺伝子のコード配列への融合、異なるプロモーターの制御下への遺伝子の配置、異種生物内での遺伝子発現、減少した又は増加したレベルでの遺伝子発現、並びに天然発現プロファイルとは異なる方法での条件付き又は構成的な遺伝子発現などによって、その配列又は発現特性を変えるように改変された遺伝物質（すなわち、核酸、核酸がコードするポリペプチド、並びにかかるポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞）を指す。一般的に、それに基づく組換え核酸、ポリペプチド、及び細胞は、天然に見出される関連する核酸、ポリペプチド、及び細胞と同一ではないようにヒトによって操作されている。
【０１１６】
用語「由来する」は、用語「から派生する」、「から得られる」、「から得ることができる」、「から単離された」、及び「から作られた」を包含し、一般に、１つの特定の材料は、別の特定の材料から派生するか、又は別の特定の材料を参照して説明され得る特徴を有する。
【０１１７】
用語「培養」は、液体培地又は固体培地中での成長のための適切な条件下での細胞集団、例えば、微生物細胞の成長を指す。
【０１１８】
核酸配列を細胞に挿入する文脈での用語「導入」は、「トランスフェクション」、「形質転換」又は「形質導入」を含み、核酸配列が、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれるか、自己複製レプリコンに変換されるか、又は一過的に発現され得る核酸配列の真核細胞又は原核細胞への組み込みを指す。
【０１１９】
本明細書で使用する用語「形質転換」、「安定な形質転換」、及び「トランスジェニック」は、ゲノムに、又は複数世代を経て維持されるエピソームプラスミドとして組み込まれた非天然（例えば、異種若しくは外来）核酸配列を有する細胞を指す。
【０１２０】
本明細書で使用する用語「回収」、「単離」、「精製」、及び「分離」は、自然界で関連する少なくとも１つの成分から除去される物質（例えば、タンパク質、核酸、又は細胞）を指す。例えば、これらの用語は、例えば、無傷の生物系などの非変性状態に見出されるように、通常、それに伴う成分を実質的に又は本質的に含まない物質を指し得る。
【０１２１】
本明細書で使用する「野生型」、「未変性の」及び「天然の」タンパク質は、自然界に見出されるタンパク質である。用語「野生型配列」は、自然界に見出されるか、若しくは天然のアミノ酸配列又は核酸配列を指す。いくつかの実施形態において、野生型配列は、タンパク質工学プロジェクト、例えば、様々なタンパク質の生成の出発点である。微生物に関連する「野生型」は、天然に存在する微生物を指す。
【０１２２】
「化学合成独立栄養」は、化学電子受容体による化学電子供与体の酸化によってエネルギーを獲得し、生活及び成長するために微生物によって必要とされる全ての有機化合物を二酸化炭素から合成する生物を指す。
【０１２３】
「無機独立栄養」は、生物が、エネルギー源として無機化学電子受容体による無機化学電子供与体の酸化を利用する特定の種類の化学合成独立栄養生物を指す。
【０１２４】
用語「ｋｎａｌｌｇａｓ」は、分子水素及び酸素ガスの混合物を指す。「ｋｎａｌｌｇａｓ微生物」は、アデノシン−５’−３リン酸（ＡＴＰ）などの細胞内エネルギーキャリアーの作製のために呼吸で電子供与体として水素を、電子受容体として酸素を使用することができる微生物である。用語「酸水素」及び「酸水素微生物」は、それぞれ「ｋｎａｌｌｇａｓ」及び「ｋｎａｌｌｇａｓ微生物」と同義で使用され得る。ｋｎａｌｌｇａｓ微生物は、一般に、ヒドロゲナーゼによって分子水素を使用し、Ｈ２から供与される電子の一部はＮＡＤ＋の還元（及び／又は他の細胞内還元等価物）のために利用され、Ｈ２からの電子の一部は好気性呼吸のために使用される。ｋｎａｌｌｇａｓ微生物は、一般に、カルビン回路又は逆クエン酸回路を含むが、これらに限定されない経路によって独立栄養的にＣＯ２を固定する［「好熱性細菌（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」，Ｊａｋｏｂ  Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ、第５章、第ＩＩＩ節、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９２）］。
【０１２５】
「従属栄養」は、生活及び成長するために生物によって必要とされる全ての有機化合物を二酸化炭素から合成することができず、成長のために有機化合物を利用しなければならない生物を指す。
【０１２６】
「水素酸化細菌（Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｏｘｉｄｉｚｅｒ）」は、細胞内還元等価物の生成のため及び／又は呼吸において電子供与体として還元Ｈ２を利用する微生物を指す。
【０１２７】
「アセトゲン」は、嫌気性呼吸の生成物として酢酸及び／又は最大Ｃ４鎖長の他の短鎖有機酸を作る微生物を指す。
【０１２８】
「メタン生成菌」は、嫌気性呼吸の生成物としてメタンを作る微生物を指す。
【０１２９】
「メチロトローフ」は、成長のための炭素源として及び／又は電子供与体として、限定されないがメタノール又はメタンなどの還元された１炭素化合物を使用することができる微生物を指す。
【０１３０】
「極限環境微生物」は、典型的には、ほとんどの生命体によって許容される大地又は海洋の表面上の条件と比較して、物理的又は地球化学的な極限条件（例えば、高い若しくは低い温度、ｐＨ、又は高塩分）で育つ微生物を指す。
【０１３１】
「好熱菌」は、生活のために、４５〜１２２℃の比較的高い温度で育つ極限環境微生物の１種を指す。
【０１３２】
「超好熱菌」は、生活のために、６０℃（１４０°Ｆ）以上の極端に暑い環境で育つ極限環境微生物の１種を指す。
【０１３３】
「好酸球」は、高い産生条件下で（通常、ｐＨ２．０以下で）育つ極限環境微生物の１種を指す。
【０１３４】
「好塩菌」は、非常に高い塩濃度を有する環境で育つ極限環境微生物の１種を指す。
【０１３５】
「好冷菌」は、１０℃以下に及ぶ冷たい温度で成長及び繁殖できる極限環境微生物の１種を指す。
【０１３６】
「プロデューサーガス」は、様々な割合のＨ２、ＣＯ、及びＣＯ２を含有し、典型的には、標準条件下で単位体積あたり天然ガスの１／２〜１／１０の範囲の発熱量を有するガスの混合物を指す。プロデューサーガスは、ガス化、蒸気改質、又は炭素系原料の自己改質を含む様々な原料から、様々な方法で作ることができる。Ｈ２、ＣＯ、及びＣＯ２に加えて、プロデューサーガスは、作製プロセス及び原料に依存して、メタン、硫化水素、凝縮性ガス、タール、及び灰を含むが、これらに限定されない他の構成物を含有することができる。混合物中のＮ２の割合は、空気がリアクター中の酸化剤として使用されるか否か、かつ反応のための熱が直接燃焼によって、又は間接熱交換によって提供されるかに依存して、高いか又は低くなり得る。
【０１３７】
「シンガス」又は「合成ガス」は、プロデューサーガスのように、Ｈ２及びＣＯを含有するが、限定されないが、メタノール又はフィッシャー・トロプシュディーゼルなどの特定の種類の化学生成物の合成のためにＨ２及びＣＯの含有量並びに比、並びに不純物のレベルの点からより具体的に目的に合わせられたガス混合物の１種を指す。
【０１３８】
「炭素源」は、微生物が有機生合成に必要な炭素を得る分子の種類を指す。
【０１３９】
「エネルギー源」は、好気性呼吸で酸素によって酸化される電子供与体又は嫌気性呼吸で酸化される電子供与体と還元される電子受容体の組み合わせのいずれかを指す。
【０１４０】
「二相性成長環境」は、２つの混ざらない液体相を含有する成長環境を指す。
【０１４１】
用語「ガス化」は、炭素系材料を、合成ガス、シンガス又はプロデューサーガスと呼ばれる、水素、一酸化炭素、及び二酸化炭素を含むガスの混合物に変換する一般的に高い温度のプロセスを指す。このプロセスは、一般に、不十分な酸素が炭素系材料の完全燃焼のために存在するように酸素及び／又は蒸気の添加を制御しながら、部分燃焼及び／又は外部で作られる熱の適用を伴う。
【０１４２】
用語「疎水性」は、水への溶解度が低く、水相よりも疎水相への溶解度が高い物質を指す。
【０１４３】
用語「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」及び「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」は、細菌、真菌、及び藻類微生物を含むが、これらに限定されない微視的な単一細胞生命体を意味する。
【０１４４】
用語「分子」は、１以上の原子を含む明確な又は区別可能な構造単位を意味し、例えば、炭水化物、脂質、ポリペプチド、及びポリヌクレオチドを含む。
【０１４５】
用語「油性」は、油に富むか、又は多量に油を生成するものを指す。
【０１４６】
用語「有機化合物」は、無機とみなされるもの以外の以下のもの：炭化物、炭酸塩、炭素の単純酸化物、シアン化物、及びダイアモンド及びグラファイトなどの純粋な炭素の同素体を有する炭素原子を含有するガス状、液体、又は固体化合物を指す。
【０１４７】
用語「に対する前駆体」又は「の前駆体」は、完成した生成物の成分の１以上の生成に向かう中間体である。
【０１４８】
用語「生成」は、細胞内と細胞外の両方での化合物の生成を含み、細胞からの化合物の分泌を含むことになる。
【０１４９】
特に本明細書で定義されない限り、本開示と関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。さらに、特に文脈によって必要とされない限り、単数用語は複数を含み、複数用語は単数を含む。本開示の方法及び技術は、一般に、当技術分野で周知の従来の方法に従って実行される。一般に、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学並びにタンパク質及び核酸の化学並びにハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法、及びそれらの技術は、当技術分野で周知の及び当技術分野で一般に使用されるものである。本開示の方法及び技術は、特に示されない限り、一般的に当技術分野で周知の従来の方法に従い、かつ本明細書全体で引用及び議論される様々な一般的で、より具体的な参考文献に記載されているように実行される。
【０１５０】
ガス状エネルギー及び炭素基質からのアミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素の生成
いくつかの実施形態において、Ｈ２及び／又はＣＯ及び／又はＣＯ２及び／又はＣＨ４を含有するプロデューサーガス又はガス混合物を、アミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素に変換できる天然又は操作された微生物が提供される。いくつかの実施形態において、Ｈ２及び／又はＣＯ及び／又はＣＯ２及び／又はＣＨ４を含有するプロデューサーガス又はガス混合物をビタミンに変換できる天然又は操作された微生物が提供される。ある実施形態において、ビタミンは、以下のもの：ビタミンＢ１、Ｂ２、及び／又はＢ１２の１以上を含むが、これらに限定されないビタミンＢである。
【０１５１】
本発明の主題は、いくつかの実施形態において、シンガス、及び／又はＨ２及びＣＯ２、及び／又はＣＯ、及び／又はＣＨ４、及び／又は他の排ガスで成長でき、アミノ酸、タンパク質、及び他の生物学的栄養素を成長基質として前述のガスを用いて生成できる天然微生物を含む。本発明の主題は、いくつかの実施形態において、シンガス、及び／又はＨ２及びＣＯ２、及び／又はＣＯ、及び／又はＣＨ４、及び／又は他の排ガスで成長でき、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、及び／又はビタミンＢ１２及び／又は他のビタミンを生成できる天然微生物を含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、本発明は、バイオリアクター及び液体中で、炭素含有ガスと、シンガス、プロデューサーガス、ＣＯ２、一酸化炭素及び／若しくは水素ガスを含有する一酸化炭素の混合物；並びに／又はメタノール若しくはメタンを含むが、これらに限定されないガス状若しくは液体のＣ１化合物などの炭素含有ガスを、アミノ酸、タンパク質、及び／若しくはビタミンを含むが、これに限定されない他の生物学的栄養素に変換できる天然又は操作された微生物株とを組み合わせることによって、アミノ酸、タンパク質、及びビタミンを含むが、これに限定されない他の生物学的栄養素を生成する方法を提供する。
【０１５３】
該プロセスのいくつかの実施形態において使用されるプロデューサーガスは、廃棄原料及び／又はバイオマス残渣原料のガス化、又は産業プロセスからの排ガス、又は天然ガス、バイオガス、埋立地ガス、座礁した船の天然ガス及び／又は広がった天然ガスを含むが、これらに限定されないメタン含有ガスの改質を含む供給源から生じ得る。いくつかの実施形態において、メタンは、本明細書に記載の操作された若しくは天然の微生物及び方法を用いて、アミノ酸、タンパク質、及び／又はビタミンを含むが、これに限定されない他の生物学的栄養素に変換され得る。本発明のいくつかの実施形態において、本発明は、天然ガス価格が最低であり、米国、中東、西アフリカ、及びロシアなどの遠隔で、特に、座礁した船の及び／又は広がった天然ガスが生じることが知られている地域においてアミノ酸及び／又はタンパク質及び／又はビタミンの生成に利用される。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、本発明の主題は、１以上の外来遺伝子を有する操作された微生物を含む。
【０１５５】
化学合成独立栄養生物は、光合成を実行する微生物中のように光からの放射エネルギーよりむしろ、反応を促進する無機化学物質に貯蔵された潜在エネルギーを用いて、ＣＯ２、及び／又は無機炭素の他の形態を有機化合物に固定する化学合成反応を実行することができる［Ｓｈｉｖｅｌｙら（１９９８）上記；Ｓｍｉｔｈら（１９６７）上記；Ｓｃｏｔｔ及びＣａｖａｎａｕｇｈ（２００７）上記］。化学合成独立栄養生物に生じる炭素固定生化学経路には、還元的トリカルボン酸回路、カルビン−ベンソン−バッハム回路［Ｓｈｉｖｅｌｙら、（１９９８）上記］、及びウッド・ユングダール経路［Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ  （１９８６）上記；Ｌｅｅら（２００８）上記；Ｆｉｓｃｈｅｒら（２００８）上記］が含まれる。
【０１５６】
本発明のある限定されない実施形態は、野生型又は遺伝子改変された微生物及びかかる微生物を含む組成物に関し、該微生物はゼロ又は１以上の外来遺伝子を含み、該微生物は、炭素含有ガスで成長するか、又はシンガス、ＣＯ２、Ｈ２、ＣＯ、ＣＨ４、又はシンガス、ＣＯ２、Ｈ２、ＣＯ、若しくはＣＨ４から選択される１以上のガスを含むガスの混合物から選択されるガス状原料を利用する。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、本発明の主題の微生物は、ラルストニア微生物から選択される。いくつかの実施形態において、該微生物は、ラルストニア・ユートロファである。いくつかの実施形態において、該微生物は、カプリアビダス微生物から選択される。いくつかの実施形態において、該微生物は、カプリアビダス・ネカトールである。いくつかの実施形態において、該微生物は、カプリアビダス・ネカトールＤＳＭ５３１又はＤＳＭ５４１である。いくつかの実施形態において、該微生物は、水素細菌属から選択される。いくつかの実施形態において、該微生物は、好熱性水素細菌（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である。いくつかの実施形態において、該微生物は、逆クエン酸回路又は逆クレブス回路としても知られる逆トリカルボン酸サイクル（ｒＴＣＡ）を含有する［例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭｉｕｒａ，Ａ．，Ｋａｍｅｙａ，Ｍ．，Ａｒａｉ，Ｈ．，Ｉｓｈｉｉ，Ｍ．＆Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｙ．（好熱性水素細菌ＴＫ−６の還元的トリカルボン酸回路における可溶性ＮＡＤＨ依存性フマル酸還元酵素（Ａ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＮＡＤＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｙｃｌｅ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＫ−６）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９０：７１７０−７１７７，ｄｏｉ：ＪＢ．００７４７−０８［ｐｉｉ］１０．１１２８／ＪＢ．００７４７−０８（２００８）；Ｓｈｉｖｅｌｙら（１９９８）上記を参照されたい）。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、該微生物は、ロドコッカス・オパカス又はロドコッカス・ジョスティイ又はロドコッカス種である。いくつかの非限定的な実施形態において、該微生物は、ロドコッカス・オパカスＤＳＭ  ４３２０５及び／又はロドコッカス種ＤＳＭ  ３３４６である。いくつかの実施形態において、天然株又は改変株には、ロドコッカス属又はゴルドニア属、ラルストニア属又はカプリアビダス属を含むが、これらに限定されない水素利用微生物が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、該組成物は、自然界でＨ２／ＣＯ２及び／又はシンガスで成長することができ、自然界で細胞バイオマスの５０重量％以上まで脂質を蓄積できる微生物を含む。いくつかの実施形態において、該微生物は、高濃度の炭素を脂肪酸生合成経路に送り込む天然の能力を有する。いくつかの実施形態において、これらの特色を示す微生物は、ロドコッカス・オパカス（ＤＳＭ  ４３２０５又はＤＳＭ  ４３２０６又はＤＳＭ  ４４１９３）である。
【０１５９】
本発明は、ゼロ又は１以上の外来遺伝子を含む放線菌類の細胞及び細胞を含む組成物に関する。本発明はまた、ゼロ又は１以上の外来遺伝子を含むノカルジア科の細胞及び細胞を含む組成物に関する。本発明はまた、ゼロ又は１以上の外来遺伝子を含むコリネバクテリウム、ゴルドニア、ロドコッカス、マイコバクテリウム及びツカムレラの細胞及び細胞を含む組成物に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、マイコバクテリウム属の細胞ではない、ゼロ又は１以上の外来遺伝子を含むノカルジア科の細胞に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、ゼロ又は１以上の外来遺伝子を含むロドコッカス属の細胞及び細胞を含む組成物を提供し、いくつかの実施形態において、該細胞は、ロドコッカス種、ロドコッカス・オパカス、ロドコッカス・アエセリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｔｈｅｒｉｖｏｒａｎｓ）；ロドコッカス・アウランティアクス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）；ロドコッカス・バイコヌレンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｉｋｏｎｕｒｅｎｓｉｓ）；ロドコッカス・ボリトレランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｒｉｔｏｌｅｒａｎｓ）；ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）；ロドコッカス・コプロフィルス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ）；ロドコッカス・コリネバクテリオイデス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ）；ノカルジア・コリネバクテリオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ）（異名：ノカルジア・コリネバクテリオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ））；ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）；ロドコッカス・ファスシアンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ）；ロドコッカス・グロベルルス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）；ロドコッカス・ゴルドニアエ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉａｅ）；ロドコッカス・ジョスティイ；ロドコッカス・コレエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）；ロドコッカス・クランシャネンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｒａｎｓｈａｎｅｎｓｉｓ）；ロドコッカス・マリノナスセンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｏｎａｓｃｅｎｓ）；ロドコッカス・オパクス；ロドコッカス・ペルコラツス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｒｃｏｌａｔｕｓ）；ロドコッカス・フェノリクス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ）；ロドコッカス・ポリボルム（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｏｌｙｖｏｒｕｍ）；ロドコッカス・ピリジニボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｉｄｉｎｉｖｏｒａｎｓ）；ロドコッカス・ロドコロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）；ロドコッカス・ロドニイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｎｉｉ）；（異名：ノカルジア・ロドニイ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｒｈｏｄｎｉｉ））；ロドコッカス・ルーバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）（異名：ストレプトスリックス・ルブラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｔｈｒｉｘ  ｒｕｂｒａ））；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  種．Ｒ��Ａ１；ロドコッカス・トリアトマエ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｒｉａｔｏｍａｅ）；ロドコッカス・ツキサムエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｕｋｉｓａｍｕｅｎｓｉｓ）；ロドコッカス・ラティスラビエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ）（異名：ツカムレラ・ラティスラビエンシス（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ））；ロドコッカス・ユンナネンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）；又はロドコッカス・ゾフィー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｐｆｉｉ）の株である。いくつかの実施形態において、ゼロ又は１以上の外来遺伝子を含む細胞は、以下のもの：ロドコッカス・オパクスＤＳＭ番号４３２０５又は４３２０６；ロドコッカス・種  ＤＳＭ番号３３４６のうちの１以上である。いくつかの実施形態において、本発明は、ロドコッカス細胞又はロドコッカス細胞を含む組成物に関し、該細胞は、ロドコッカス・エクイ又はロドコッカス・ファスシアンスから選択される種ではない。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、該微生物は、コリネバクテリウム亜目又はバークホルデリア科由来である。いくつかの実施形態において、該細胞又は１以上の細胞を含む組成物は、大腸菌ではない。いくつかの実施形態において、本発明の細胞は、動物又は植物に病原性ではない。いくつかの実施形態において、本発明の細胞は、ヒトに対して病原性ではない。いくつかの実施形態において、該細胞又は１以上の細胞を含む組成物は、ラルストニア属由来である。いくつかの実施形態において、該細胞又は１以上の細胞を含む組成物は、ラルストニア・ユートロファ又はカプリアビダス・ネカトール又はカプリアビダス・メタッリデュランス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）由来である。いくつかの実施形態において、ゼロ又は１以上の外来遺伝子を含む細胞は、カプリアビダス・ネカトールＤＳＭ番号５３１又は５４１の株である。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、本発明の微生物は、全細胞質量の６０％超及び／又は７０％超及び／又は８０％超までタンパク質を蓄積することができる。いくつかの非限定的実施形態において、該微生物は、カプリアビダス・ネカトールＤＳＭ番号５３１又は５４１である。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、該組成物は、自然界でＨ２／ＣＯ２及び／又はシンガスで成長することができる微生物を含み、該微生物は、細胞バイオマスの５０重量％又はそれ以上までポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）又はポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を自然界で蓄積することができる。いくつかの実施形態において、該微生物は、高濃度の炭素に指示して、アセチルＣｏＡ代謝中間体を経て、ＰＨＡ及びＰＨＢ合成を含むいくつかの他の合成経路と共に脂肪酸生合成、並びにアミノ酸へと導くことができる天然の能力を有する。いくつかの実施形態において、これらの特徴を示す微生物は、カプリアビダス・ネカトール（ＤＳＭ  ５３１又はＤＳＭ  ５４１）である。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、天然又は遺伝子改変株には、コリネバクテリウム・オートトロフィカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、天然又は遺伝子改変株には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、該微生物は、ヒドロゲノビブリオ・マリナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ）である。いくつかの実施形態において、該微生物は、ロドシュードモナス・カプシュラータ、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、又はロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈａｅｒｏｉｄｅｓ）である。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、該微生物は、酸水素株又はｋｎａｌｌｇａｓ株である。いくつかの実施形態において、該微生物は、以下のｋｎａｌｌｇａｓ微生物：アクイフェックス・フィロフィルス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ）、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）、又は他のアクイフェックス種；カプリアビダス・ネカトール、カプリアビダス・メタッリデュランス、又は他のカプリアビダス種；コリネバクテリウム・オートトロフィカム又は他のコリネバクテリウム種；ゴルドニア・デスルフリカンス（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ）、ゴルドニア・ポリイソプレニボランス（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、ゴルドニア・ルブリペルティンクタ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｒｕｂｒｉｐｅｒｔｉｎｃｔａ、ゴルドニア・ヒドロフォビカ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａ）、ゴルドニア・ウェストファリカ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｗｅｓｔｆａｌｉｃａ）、及び他のゴルドニア種；ノカルジア・オートトロフィカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、ノカルジア・オパカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｏｐａｃａ）、及び他のノカルジア種；ロドバクター・スフェロイデス、ロドシュードモナス・パルストリス、ロドシュードモナス・カプシュラータ、ロドシュードモナス・ビリディス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｉｒｉｄｉｓ）、ロドシュードモナス・スルホビリディス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｕｌｆｏｖｉｒｉｄｉｓ）、ロドシュードモナス・ブラスティカ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｌａｓｔｉｃａ）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）、シュードモナス・アシドフィラ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）及び他のロドシュードモナス種及びロドバクター種を含むが、これらに限定されない紫色の非硫黄光合成細菌；ロドスピリラム・ラブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ）、及び他のロドスピリラム種；ロドコッカス・オパクス及び他のロドコッカス種；リゾビウム・ジャポニカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）及び他のリゾビウム種；チオカプサ・ロゼオペルシシナ（Ｔｈｉｏｃａｐｓａ  ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａ）及び他のチオカプサ種；シュードモナス・ファシリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆａｃｉｌｉｓ）、シュードモナス・フラバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｖａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・ヒドロゲノボラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｏｒａ）、シュードモナス・ヒドロゲノテルモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、シュードモナス・パレロニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｌｅｒｏｎｉｉ）、シュードモナス・シュードフラバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｌａｖａ）、シュードモナス・サッカロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）、シュードモナス・テルモフィレ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）、及��他のシュードモナス種；ヒドロゲノモナス・パントトロファ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｍｏｎａｓ  ｐａｎｔｏｔｒｏｐｈａ）、ヒドロゲノモナス・ユートロファ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｍｏｎａｓ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ヒドロゲノモナス・ファシリス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｍｏｎａｓ  ｆａｃｉｌｉｓ）、及び他のヒドロゲノモナス種；ヒドロゲノバクター・サーモフィラス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、ヒドロゲノバクター・ハロフィルス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ヒドロゲノバクター・ヒドロゲノフィルス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓ）、及び他のヒドロゲノバクター種；Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ及び他のヒドロゲノフィルス種；ヒドロゲノビブリオ・マリナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ）及び他のヒドロゲノビブリオ種；Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ及び他のヒドロゲノサーマス種；ヘリコバクター・ピロリ及び他のヘリコバクター種；キサントバクター・オートトロフィカス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、キサントバクター・フラバス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ｆｌａｖｕｓ）及び他のキサントバクター種；ヒドロゲノファーガ・フラバ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ  ｆｌａｖａ）、ヒドロゲノファーガ・パレロニ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ  ｐａｌｌｅｒｏｎｉｉ）、ヒドロゲノファーガ・シュードフラバ（ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ  ｐｓｅｕｄｏｆｌａｖａ）及び他のヒドロゲノファーガ種；ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）及び他のブラディリゾビウム種；ラストニア・ユートロファ及び他のラストニア種；アルカリジェネス・ユートロファ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、アルカリジェネス・ファシリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｃｉｌｉｓ）、アルカリジェネス・ヒドロゲノフィルス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓ）、アルカリジェネス・ラツス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）、アルカリジェネス・パラドクサス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、アルカリジェネス・ルーランディィ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｒｕｈｌａｎｄｉｉ）及び他のアル力リジェネス種；アミコラータ種；アクアスピリルム・オートトロフィカム（Ａｑｕａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）及び他のアクアスピリルム種；アルスロバクター株１１／Ｘ、アルスロバクター・メチロトロフス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）、及び他のアルスロバクター種；アゾスピリルム・リポフェルム及び他のアゾスピリルム種；バリオボラックス・パラドクス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、及び他のバリオボラックス種；アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）、及び他のアシドボラックス種；バチルス・シュレゲリイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉ）、バチルス・トゥシアエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｕｓｃｉａｅ）、及び他のバチルス種；Ｃａ��ｄｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｍ及び他のカルデロバクテリウム種；Ｄｅｒｘｉａ  ｇｕｍｍｏｓａ及び他のデルキシア種；フラボバクテリウム・オートテルモフィルム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｔｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）及び他のフラボバクテリウム種；ミクロシクラス・アクアティカス（Ｍｉｃｒｏｃｙｃｌｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ及び他のミクロシクラス種；マイコバクテリウム・ゴルドナエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄｏｎｉａｅ）及び他のマイコバクテリウム種；パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）及び他のパラコッカス種；パーセフォネラ・マリナ（Ｐｅｒｓｅｐｈｏｎｅｌｌａ  ｍａｒｉｎａ）、パーセフォネラ・グアイマセンシス（Ｐｅｒｓｅｐｈｏｎｅｌｌａ  ｇｕａｙｍａｓｅｎｓｉｓ）及び他のパーセフォネラ種；レノバクター・バキュオラツム（Ｒｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｖａｃｕｏｌａｔｕｍ及び他のレノバクター種；ストレプトマイセス・セリコフラバス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｆｌａｖｕｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・キサントクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｘａｎｔｈｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・サーモカルボキシダス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｒｂｏｘｙｄｕｓ）、及び他のストレプトマイセス種；サーモクリニス・ルーバー及び他のサーモクリニス種；ウォルテルシア種；アナベナ・オスシラリオイデス（Ａｎａｂａｅｎａ  ｏｓｃｉｌｌａｒｉｏｉｄｅｓ）、アナベナ・スピロイデス（Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐｉｒｏｉｄｅｓ）、アナベナ・シリンドリカ（Ａｎａｂａｅｎａ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）、及び他のアナベナ種、並びにアルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ・マキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ）及び他のアルスロスピラ種を含むが、これらに限定されないシアノバクテリア；セネデスムス・オブリクース（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ）及び他のセネデスムス種、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｉｉ）及び他のクラミドモナス種、アンキストロデスムス種、ラフィジウム・ポリモルフィウム（Ｒｈａｐｈｉｄｉｕｍ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｕｍ）及び他のラフィジウム種を含むが、これらに限定されない緑藻；並びに酸水素微生物を含む微生物の共同体のうちの１以上を含む。
【０１６５】
いくつかの非限定的な実施形態において、本発明は、メタン又は酢酸若しくは酪酸などの単鎖有機酸が共に生成されることなく、酸水素反応を含むが、これに限定されない無機電子供与体及び電子受容体を使用するＡＴＰの生成のためのエネルギー保存反応によって、ＡＴＰを消費する生合成反応及び細胞維持を支持するためにＡＴＰを生成する化学合成独立栄養代謝を含む組成物及びそれを用いる方法に関する。
【０１６６】
電子供与体及び／又は炭素源として一酸化炭素で成長できるいくつかの異なる微生物（すなわち、カルボキシド栄養性微生物）が特徴づけられている。場合によって、カルボキシド栄養性微生物はまた、電子受容体としてＨ２を使用し、かつ／又は混合栄養で成長することができる。場合によって、カルボキシド栄養性微生物は、通性化学合成無機独立栄養生物である（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｊ  Ｌｅｎｇｅｌｅｒ編集、Ｇ．Ｄｒｅｗｓ，Ｈ．Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｊｕｌ  １０，２００９）。いくつかの実施形態において、該微生物は、以下のカルボキシド栄養性微生物：アシネバクター種；アルカリジェネス・カルボキシダス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｃａｒｂｏｘｙｄｕｓ）及び他のアルカリジェネス種；アルスロバクター種；アゾモナス種；アゾトバクター種；バチルス・シュレゲリイ及び他のバチルス種；ヒドロゲノファーガ・シュードフラバ及び他のヒドロゲノファーガ種；シュードモナス・カルボキシドヒドロゲナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃａｒｂｏｘｙｄｏｈｙｄｒｏｇｅｎａ）、シュードモナス・カルボキシドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃａｒｂｏｘｙｄｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・コンプランソリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｍｐｒａｎｓｏｒｉｓ）、シュードモナス・ガゾトロファ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇａｚｏｔｒｏｐｈａ）、シュードモナス・サーモカルボキシドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｒｂｏｘｙｄｏｖｏｒａｎｓ）及び他のシュードモナス種；リゾビウム・ジャポニクム及び他のリゾビウム種；ストレプトマイセスＧ２６ストレプトマイセス・サーモオートトロフィカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）及び他のストレプトマイセス種のうちの１以上を含む。本発明のある実施形態において、カルボキシド栄養性微生物が使用される。ある実施形態において、化学合成無機独立栄養ができるカルボキシド栄養性微生物が使用される。ある実施形態において、呼吸及び／又は生合成において電子受容体としてＨ２を使用することができるカルボキシド栄養性微生物が使用される。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、該微生物は、以下のもの：アセトアナエロビウム種；アセトバクテリウム種；アセトゲニウム種；アクロモバクター種；アシディアヌス種；アシネトバクター種；アクチノマデュラ種；アエロモナス種；アルカリジェネス種；アルカリケネス（Ａｌｃａｌｉｑｅｎｅｓ）種；アクアスピリルム種；アルコバクター種；アウレオバクテリウム種；バチルス種；ベギアトア種；ブチリバクテリウム種；カルボキシドサーマス種；クロストリジウム種；コマモナス種；デハロバクター種；デハロコッコイデス（Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅ）種；デハロスピリルム種；デスルホバクテリウム種；デスルホモニル（Ｄｅｓｕｌｆｏｍｏｎｉｌｅ）種；デスルホトマクルム種；デスルホビブリオ種；デスルフォサルシナ種；エクトチオロドスオピラ種；エンテロバクター種；ユーバクテリウム種；フェロプラズマ種；ハロチオバチルス種；ヒドロゲノバクター種；ヒドロゲノモナス種；レプトスピリウム種；メタッロスパエラ種；メタノバクテリウム種；メタノブレビバクター種；メタノコッカス種；メタノココイデス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）種；メタノゲニウム種；メタノロブス種；メタノミクロビウム種；メタノプラヌス種；メタノサルシナ種；メタノスピリルム種；メタノサームス種；メタノスリックス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｒｉｘ）種；ミクロコッカス種；ニトロバクター種；ニトロバクテラセエ種；ニトロコッカス種；ニトロソコックス種；ニトロスピナ種；ニトロスピラ種；ニトロソロブス種；ニトロソモナス種；ニトロソスピラ種；ニトロソビブリオ種；ニトロスピナ種；オレオモナス種；パラコッカス種；ペプトストレプトコッカス種；プランクトミセス種；シュードモナス種；ラルストニア種；ロドバクター種；ロドコッカス種；ロドシクルス種；ロドミクロビウム種；ロドシュードモナス種；ロドスピリルム種；シェワネラ種；シデロコッカス種；ストレプトミセス種；スルホバチルス種；スルホロブス種；サーモスリックス種；チオバチルス種；チオミクロスピラ種；チオプロカ種；チオスフェラ種；チオスリックス種；チオブルム種；硫黄酸化細菌；水素酸化細菌；鉄酸化細菌；アセトゲン；及びメタノゲン；化学合成独立栄養生物を含む微生物のコンソーシアム；熱水噴出孔、地熱噴出孔、温泉、冷たい湧水、地下帯水層、塩湖、塩分形成、鉱山、酸性雨排水、鉱山掘削、油井、精製所排水、炭層、深い地下表面のうちの少なくとも１つに対して天然の化学合成独立栄養素；排水及び下水処理場；地熱発現所、スルファタラ（ｓｕｌｆａｔａｒａ）フィールド、及び土壌；並びに好熱菌、超好熱菌、好酸性物質、好塩素酸塩、及び好冷性細菌のうちの１以上から選択される極限細菌のうちの１以上を含む偏性及び／又は通性化学合成独立栄養微生物を含む。
【０１６８】
このような生物には、温度、放射線、圧力、重力、真空、乾燥、塩分、ｐＨ、酸素張力、及び化学物質などの様々な環境パラメーターで極限に耐えることができる極限微生物も含まれるが、これらに限定されない。それらには、ピロロブス・フマリイ（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ  ｆｕｍａｒｉｉ）などの超好熱菌；シネココッカス・リビダス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄｉｓなどの好熱菌；中好中球、及びサイクロバクターなどの好冷菌が含まれる。サーモプロテウス種、ピロディクティウム種、スルホロブス種、アシディアヌス種などの非常に好熱性の硫黄代謝菌。放射線耐性生物には、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）が含まれる。圧力耐性生物には、ピエゾフィル（ｐｉｅｚｏｐｈｉｌｅ）又は高圧菌が含まれる。乾燥耐性及び無水生物には、好乾性の微生物及び真菌が含まれる。塩分耐性生物には、ハロバクテリウム及びデュナリエラ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ）などの好塩性菌が含まれる。ｐＨ耐性生物には、ナトロノバクテリウム、バチルス・フィルムスＯＦ４、スピルリナ菌種などの好アルカリ菌、及びシアニジウム・カルダリウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ）、フェロプラズマ種などの好酸菌が含まれる。純粋なＣＯ２に耐性であるガス耐性生物にはシアニジウム・カルダリウムが含まれ、金属耐性生物には、フェロプラズマ・アシダルマヌス（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄａｒｍａｎｕｓ）、ラルストニア種などの金属耐性菌が含まれる。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、本発明はさらに組成物を提供し、該微生物は、水素酸化化学合成独立栄養生物及び／又はカルボキシドトローフ及び／又はメチルトローフ及び／又はメタノトローフである。いくつかの実施形態において、本発明はさらに組成物を提供し、該微生物は、唯一の電子供与体としてのシンガス及び／若しくはプロデューサーガス及び／若しくは熱分解ガス、並びに／又は還元水素原子の供給源、及び／若しくは炭素源で成長することができる。いくつかの実施形態において、本発明はさらに組成物を提供し、該微生物は、唯一の電子供与体として未処理の粗グリセロール、並びに／又は還元水素原子の供給源、及び／若しくは炭素源で成長することができる。
【０１７０】
本発明のある実施形態において、使用される微生物は、天然に存在し、かつ／又は遺伝子改変されていない（非ＧＭＯ）微生物であるか、かつ／又は非病原性であるか、かつ／又は周囲環境には存在しない、バイオプロセスによって提供される特定の環境条件に依存する。
【０１７１】
本発明のある実施形態は、水素及び／又はＣＯ及び／又はシンガス及び／又はメタンのうちの１以上を含むが、これらに限定されない目的の電子供与体の存在、並びに酸素及び／又は硝酸塩及び／又は第２鉄及び／又はＣＯ２のうちの１以上を含むが、これらに限定されない電子受容体の存在、並びに環境条件（例えば、温度、ｐＨ、圧力、ＤＯ、塩分、様々な不純物及び汚染物質などの存在）下での成長を経て、微生物学の分野で知られる方法を用いて環境試料から単離され、所望の微生物に富む微生物又は微生物のコンソーシアムを利用する。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、本発明はさらに、生合成及び／又は呼吸で利用される電子供与体が、以下の還元剤：アンモニア；アンモニウム；一酸化炭素；亜ジチオン酸塩；元素硫黄；水素；メタ亜硫酸塩；一酸化窒素；亜硝酸塩；チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）又はチオ硫酸カルシウム（ＣａＳ２Ｏ３）を含むが、これらに限定されないチオ硫酸塩などの硫酸塩；硫化水素などの硫化物；亜硫酸塩；チオネート；チオナイトのうちの１以上を含むが、これらに限定されない方法を提供する。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、該微生物はメタノトローフである。いくつかの実施形態において、該微生物はメチロコッカス属である。いくつかの実施形態において、該微生物は、メチロコッカス・カプスラタス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）である。いくつかの実施形態において、該微生物はメチロトローフである。いくつかの実施形態において、該微生物はメチロバクテリウム属にある。いくつかの実施形態において、該微生物は、以下の種：メチロバクテリウム・ザトマニイ（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｚａｔｍａｎｉｉ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、メチロバクテリウム・クロロメタニカム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ）のうちの１以上に由来する。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、本発明の特許請求の範囲の微生物は、成長するため、かつ／又は以下のもの：アミノ酸及び／又はタンパク質及び／又は他の栄養素のうちの１以上を合成するために光に依存しない。いくつかの実施形態において、本発明の特許請求の範囲の微生物は、成長するため、かつ／又は以下のもの：アミノ酸及び／又はタンパク質及び／又は他の栄養素のうちの１以上を合成するために、任意の種類の糖又は任意の他の種類の有機化合物又は任意の種類の固定炭素を必要としない。いくつかの実施形態において、本発明の特許請求の範囲の微生物は、通性微生物である。
【０１７５】
Ｃ４より長い炭素鎖長の有機分子の生成は、脂肪酸生合成経路［Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｋｌｅｉｎ−Ｍａｒｃｕｓｃｈａｍｅｒ，Ｓｔｅｐｈａｎｏｌｐｏｕｌｏｓ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００８）１０，２９５−３０４］、及び様々なアミノ酸生合成経路などの同化生合成経路を経て最も一般的かつ効率的に生物学的に達成される。脂肪酸生合成経路に最初に入る分子は、多くの高価値の生化学物質を誘導し得る中心の代謝産物のアセチル補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）である。いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＯ、ＣＯ２及び／又はＨ２及び／又はＣＨ４のアセチル−ＣｏＡへの変換のために、天然経路を有する微生物を利用する。いくつかの実施形態において、本発明は、還元的トリカルボン酸回路、カルビン−ベンソン−バッハム回路、及び／又はウッド・ユングダール経路を経て、ＣＯ及び／又はＣＯ２を固定することができる微生物を利用する。いくつかの実施形態において、本発明は、メタン資化性経路を経てＣ１化合物を固定する微生物を利用する。いくつかの実施形態において、該微生物は、アセチル−ＣｏＡ合成酵素、アセチル−ＣｏＡ合成酵素ジスルフィド還元酵素、コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、一酸化炭素脱水素酵素、ヒドロゲナーゼ、及びメチル転移酵素を含むが、これらに限定されないこのような酵素タンパク質と共に、還元剤としてシンガス及び／又はプロデューサーガス中に存在するガス状の電子供与体を利用するアセチル−ＣｏＡ、ピルビン酸、マロニル−ＣｏＡのうちの１以上を生成するために、ガス状の無機炭素の固定を触媒する酵素を自然界で生成する。
【０１７６】
正味のＡＴＰ生成と共に、又は純消費なく（すなわち、ＡＴＰ中性）、単鎖有機化合物（ｃ１〜Ｃ４）を生成することができるそれぞれメタン生成菌及び酢酸生成菌に存在するメタン生成、酢酸生成及びソルベント生成の経路とは異なり、脂肪酸生合成などの同化生合成経路は、正味のＡＴＰ消費が伴う。例えば、以下は、アセチル−ＣｏＡから出発して、パルミチン酸（Ｃ１６）の生合成の正味の反応を与える：
８アセチル−ＣｏＡ＋７ＡＴＰ＋Ｈ２Ｏ＋１４ＮＡＤＰＨ＋１４Ｈ＋→パルミチン酸＋８ＣｏＡ＋１４ＮＡＤＰ＋＋７ＡＤＰ＋７Ｐｉ
【０１７７】
アミノ酸、タンパク質、又は脂質などの同化生合成を経て作られる分子の生成のために、ＧＴＣプロセスにおいて偏性メタン生成菌又は酢酸生成菌を用いることによる欠点は、脂肪酸生合成又はアミノ酸生合成などの同化生合成に必要なＡＴＰを生成するために、呼吸において電子受容体としてＣＯ２を絶対的に使用しなければならないことである。Ｈ２が電子供与体である場合、酢酸生成菌又はメタン生成菌において呼吸のために消費されるＨ２あたりの生成されるＡＴＰは、比較的低く、メタンの呼吸生成については４Ｈ２あたり１個のＡＴＰ［参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＴｈａｕｅｒ，Ｒ．Ｋ．，Ｋａｓｔｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｓｅｅｄｏｒｆ，Ｈ．，Ｂｕｃｋｅｌ，Ｗ．＆  Ｈｅｄｄｅｒｉｃｈ，Ｒ．メタン生成古細菌：エネルギー保存における生態学的に関連する違い（Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃ  ａｒｃｈａｅａ：ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｅｎｅｒｇｙ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６，５７９−５９１，ｄｏｉ：ｎｒｍｉｃｒｏ１９３１（ｐｉｉ）］又は酢酸生成については４Ｈ２あたり１個のＡＴＰであり、酪酸生成については１０Ｈ２あたり１個のＡＴＰである［参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰａｐｏｕｔｓａｋｉｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９８４）２６，１７４−１８７；Ｈｅｉｓｅ，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９８９）５４７３−５４７８；Ｌｅｅ，Ｐａｒｋ，Ｊａｎｇ，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｋｉｍ，Ｊｕｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００８）１０１（２）２０９−２２８］。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、本発明は、メタン又は短鎖有機酸（２〜４個の炭素の長さの炭素鎖長を含む短鎖有機酸）の生合成なく、限定されないがＨ２及び／又はＣＯなどの無機電子供与体からＡＴＰを生成することができる微生物又は微生物を含む組成物に関する。いくつかの非限定的な実施形態において、本発明は、呼吸で使用されるＣＯ２以外に、電子受容体と結合した、限定されないが、Ｈ２及び／又はＣＯなどの無機電子供与体からＡＴＰを生成する微生物又は微生物を含む組成物に関する。
【０１７９】
本発明のある実施形態は、限定されないがＯ２などのＡＴＰ生成のためのエネルギー保存反応においてより電気陰性の電子受容体を使用する水素酸化及び／又はＣＯ酸化及び／又はＣＨ４酸化微生物を適用する。例えば、酸水素反応２Ｈ２＋Ｏ２→２Ｈ２ＯをＡＴＰ生成と結びつける水素化酸水素菌又はｋｎａｌｌｇａｓ微生物は、呼吸で電子受容体としてＣＯ２を使用する酢酸生成菌又はメタン生成菌よりも、呼吸のために消費されるＨ２及び／又は他の電子供与体あたりより多くのＡＴＰを生成することができる。例えば、ｋｎａｌｌｇａｓ微生物は、呼吸で消費されるＨ２あたり少なくとも２個のＡＴＰを生成することができ（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢｏｎｇｅｒｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，（Ｏｃｔ  １９７０）１４５−１５１）、呼吸で電子供与体としてＨ２及び電子受容体としてＣＯ２を使用して、メタン生成又は酢酸生成を行う微生物において生成され得る場合よりも、呼吸で消費されるＨ２あたり８倍のＡＴＰが生成される。このため、シンガス又はＨ２から、限定されないが、アミノ酸又はタンパク質又は脂肪酸の生合成などの同化生合成のために、限定されないが、ｋｎａｌｌｇａｓ微生物などの、呼吸及びＡＴＰ生成においてより多くの電気陰性電子受容体を利用することができる微生物を用いることは、現在、生物学的ＧＴＣ技術で使用されるものなどの酢酸生成菌又はメタン生成菌を用いる場合よりも、より効率的であり得る。
【０１８０】
ある実施形態において、呼吸で使用される酸水素反応は、酸化的リン酸化に酵素的に結びついている。ある実施形態において、このように形成されるＡＴＰ及び／又は他の細胞内エネルギー担体は、アミノ酸及び／又はタンパク質の同化生合成に利用される。いくつかの実施形態において、本発明は、ｋｎａｌｌｇａｓ微生物又はｋｎａｌｌｇａｓ微生物を含む組成物に関し、該微生物は、再生可能なＨ２又はＣＯ又はメタン含有ガスと組み合わさったシンガス又はプロデューサーガス又は廃棄ＣＯ２を含むが、これらに限定されない炭素含有ガス原料から、化学物質、モノマー、ポリマー、タンパク質、多糖、ビタミン、栄養補助食品、抗生物質、又は医薬品又はそれらの中間体を含むが、これらに限定されない興味の有用な炭素系生成物の生合成を可能にするゼロ以上の酵素をコードする少なくともゼロ又は１以上の外来核酸配列を含む。いくつかの非限定的な実施形態において、本発明は、微生物又は微生物を含む組成物に関し、該微生物は、呼吸を経て１個のＡＴＰを生成するために４未満のＨ２を必要とする。他の非限定的な実施形態において、本発明は、微生物又は微生物を含む組成物に関し、該微生物は、呼吸を経て消費されるＨ２あたり２以上のＡＴＰを生成する。他の非限定的な実施形態において、本発明は、微生物又は微生物を含む組成物に関し、該微生物は、呼吸を経て消費されるＨ２あたり少なくとも２個のＡＴＰ、又は呼吸を経て消費されるＨ２あたり少なくとも２．５個のＡＴＰを生成する。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、本発明は、シンガス及び／又はプロデューサーガス及び／又はガス状のＣＯ２及び／又はＨ２及び／又はＣＯ及び／又はＣＨ４を１以上の有機化合物に変換する微生物を含む組成物に関し、該微生物によって生成される有機化合物の１０重量％未満はメタンである。いくつかの実施形態において、本発明は、前述のガス状基質を１以上の有機化合物に変換する微生物を含む組成物に関し、生成される有機化合物の１０重量％未満は、４個の炭素又はそれ以下の炭素鎖長を有する遊離有機酸である。
【０１８２】
本発明のある実施形態において、該微生物は、ＣＯ２を還元し、細胞材料及びＨ２Ｏを生成する。ある実施形態において、この還元を実行する代謝経路に必要なエネルギーは、分子酸素で水素を酸化することによって得られる。本発明のある実施形態において、生物学的システム及び／又は成分は、ＣＯ２還元剤として直接機能するが、Ｏ２生成者としては機能しない。ある実施形態において、呼吸で利用されるＯ２は、別のシステムから得られ、生物学的システム及び／又は成分に提供される。ある実施形態において、他のシステムは、水の電気分解及び／又は熱分解を伴う。
【０１８３】
炭素捕捉用途及び／若しくはシンガス変換用途用の厳密に嫌気性の酢酸生成又はメタン生成微生物を上回る酸水素微生物を使用する利点は、酸水素微生物のより高い酸素耐性である。本発明のいくつかの実施形態において、好気性及び／又は微好気性条件に耐える微生物が利用される。酸水素微生物は、一般に、酸水素微生物のより高い酸素耐性により、排ガスからの炭素捕捉用途用の厳密に嫌気性の酢酸生成又はメタン生成微生物を上回る利点を有する。産業排ガスは本発明のある実施形態のための１つの意図されたＣＯ２供給源であるので、偏性嫌気性メタン生成菌又は酢酸生成菌と比較して、酸水素微生物の比較的高い酸素耐性は、典型的な排ガス中に見出される２〜６％のＯ２含有量がより耐性になるのを可能にする。本発明のある実施形態において、ＣＯ２含有排ガス、又は任意の他の種類の投入ガス混合物中の２％又はそれ以上のＯ２含有量は、微生物培養によって許容され、かつ／又は微生物呼吸で利用される。
【０１８４】
酢酸生成菌の使用を上回る炭素捕捉用途及び／又はシンガス変換用途のための酸水素微生物を使用するさらなる利点は、酸水素反応によって動力を供給された呼吸を経たＡＴＰ生成が、溶液のｐＨを低下させるか、又は阻害若しくは毒性レベルまで蓄積させることによって微生物を害し得る、一般に望まれない酸生成の酢酸又は酪酸生成物よりも、プロセス流に容易に組み込まれ得る水生成物をもたらすことである。本発明のいくつかの実施形態において、細胞呼吸の主要生成物は水である。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、該微生物は、唯一の電子供与体として、未処理の粗グリセロール及び／又はグルコース及び／又はメタノール及び／又は酢酸、並びに炭素源で成長することができる。いくつかの実施形態において、該微生物は、有機炭素源で、無機電子供与体又は炭素源を用いて、混合栄養学的に成長することができる。
【０１８６】
ある実施形態において、本発明によって提供される微生物は、真核植物、藻類、シアノバクテリア、緑硫黄バクテリア、緑色非硫黄バクテリア、紫色硫黄バクテリア、紫色非硫黄バクテリア、極限菌、酵母、真菌、プロテオバクテリア、それらの操作された生物、及び生合成生物から選択される細胞株を含む。ある実施形態において、スピルリナが利用される。
【０１８７】
ある実施形態において、以下の属：ファエオスピリルム（Ｐｈａｅｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ロドバカ（Ｒｈｏｄｏｂａｃａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドミクロビウム（Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、ロドピラ（Ｒｈｏｄｏｐｉｌａ）、ロドシュードモナス、ロドタラシウム（Ｒｈｏｄｏｔｈａｌａｓｓｉｕｍ）、ロドスピリルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ロドビブリオ（Ｒｏｄｏｖｉｂｒｉｏ）、及びロセオスピラ（Ｒｏｓｅｏｓｐｉｒａ）を含むが、これらに限定されない紫色非硫黄バクテリアが使用される。
【０１８８】
本発明と関連する細胞を成長させるために使用される液体培養は、当技術分野で知られ、使用される培養容器のいずれかに収容され得る。いくつかの実施形態において、バイオリアクター容器中での大規模生成は、大量の所望の分子及び／又はバイオマスを生成するために使用することができる。
【０１８９】
本発明のある実施形態の別の利点は、培養環境を含有し、単離し、かつ／又は保護するために使用されるバイオリアクターの容器に関する。以下のもの：アミノ酸、タンパク質、及び他の栄養素のうちの１以上を含むが、これらに限定されない有機化合物の生成用の微生物を培養及び成長させるために、本発明のいくつか非限定的な実施形態において使用され得る例示的な培養容器は、当業者に公知の大規模微生物培養のものを含む。本発明のある実施形態で使用され得るこのような培養容器には、以下のもの：エアリフトリアクター；生物学的スクラバーカラム；気泡塔；攪拌タンクリアクター；連続攪拌タンクリアクター；向流、上昇流、膨張床リアクター；下水処理及び廃水処理又はバイオレメディエーションの先行技術で公知のような蒸解釜、特に、蒸解釜システム；散水ろ床、回転式生物学的コンタクターフィルタ、回転ディスク、土壌フィルターを含むが、これらに限定されないフィルター；流動床リアクター；ガスリフト発酵槽；固定化された細胞リアクター；ループリアクター；膜バイオフィルムリアクター；パチューカタンク；充填床リアクター；プラグフロー型リアクター；スタティックミキサー；トリクル床リアクター；及び／又は垂直軸バイオリアクターのうちの１以上が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態において、容器の底、サイディング、壁、ライニング、及び／又は上部は、瀝青、セメント、セラミックス、粘土、コンクリート、エポキシ、ガラス繊維、ガラス、マカダム、プラスチック、砂、シーラント、土壌、鋼又は他の金属及びそれらの合金、石、タール、木材、並びにそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない１以上の材料から構成され得る。該微生物が、腐食性の成長環境を必要とするか、かつ／又は炭素固定反応を経て腐食性の化学物質を生成する本発明のある実施形態において、当技術分野及び工学分野で公知の耐腐食性材料を用いて、成長培地と接触する容器の内部を補強することができる。
【０１９０】
ある実施形態において、本発明で培養する微生物は、遺伝子改変の実施のために、及び／又は有機化合物、特に、ある実施形態において、以下のもの：アミノ酸、タンパク質、及び他の栄養素のうちの１以上の生成のために実行される。遺伝子操作の目的での微生物培養は、ベンチトップの小規模で、かつしばしば、遺伝的に改変された形質について選択する条件下で実行される。
【０１９１】
有機化合物、具体的には、アミノ酸、タンパク質、及び他の栄養素の商業的生成の目的での微生物培養は、典型的には、はるかに大きな規模（例えば、５００Ｌ、１，０００Ｌ、５，０００Ｌ、１０，０００Ｌ、５０，０００Ｌ、１００，０００Ｌ、１，０００，０００Ｌのバイオリアクター容量及びそれ以上）のバイオリアクター中で実行される。ある実施形態において、本発明の化学合成独立栄養は、本発明の方法を用いて、バイオリアクター内の液体培地中で成長する。いくつかの実施形態において、該微生物を含有するバイオリアクターは、ほぼ暗闇又は全くの暗闇の中で培養を維持する不透明な材料で構築されている。鋼及び／又は他の金属合金及び／又は強化コンクリート及び／又はガラス繊維及び／又は様々な高強度プラスチック材料などの不透明な材料で構築されたバイオリアクターは、大規模作業容量を有するように設計することができる。本発明のいくつかの実施形態において、鋼又は他の金属合金で構築され、５０，０００リットル以上の容量である発酵槽が利用される。本発明のいくつかの実施形態において、大気圧を超える正の上部空間圧力を含有することができるバイオリアクターが利用される。本発明のいくつかの実施形態において、３，０００，０００リットル以上の卵形若しくは円柱形の蒸解釜又は垂直シャフトバイオリアクターが利用される。いくつかの実施形態において、該微生物を含むバイオリアクターは、含有する液体容量の一部又はほとんど又は全てに光を透過させない。いくつかの実施形態において、細菌細胞又は微生物細胞は、顕著な又はいかなる光への暴露なく培養される。ある実施形態において、電気を光に変換することは必要ない。
【０１９２】
本発明の方法に従って、いくつかの実施形態において、該微生物は、光の非存在下で、限定されないが、シンガス若しくはプロデューサーガス若しくはテールガス若しくは熱分解ガス若しくはＨ２及びＣＯ２ガス混合物などのガス状の炭素源を含有する培地中で、アミノ酸、又はタンパク質、又は他の栄養素の生成、又は全細胞生成物の生成のために成長及び維持され、このような成長は、化学合成独立栄養成長として知られる。いくつかの実施形態において、本発明は、アミノ酸、又はタンパク質、又は他の栄養素、又は全細胞生成物の大規模生成のために細胞を培養する方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、低価格で、頑丈で、鋼若しくは他の金属合金若しくは強化コンクリート若しくはアースワークスなどの不透明材料で慣例的に構築された、５０，０００リットル又はそれ以上の容量のバイオリアクター中で細胞を培養する方法に関する。このようなバイオリアクターのサイズ、深さ、及び構造は、細胞がほとんど暗闇又は全くの暗闇で成長することを指示する。いくつかの実施形態において、該微生物は、光への暴露なく、本発明の方法に従って、主要な又は唯一の炭素源としてガス状の無機炭素を含有する培地中でアミノ酸、又はタンパク質、又は他の栄養素、又は全細胞生成物の合成のために培養される。この種の成長は、化学合成独立栄養成長として知られる。ある非限定的な実施形態において、ＣＯ２固定工程で使用される微生物は、光合成ではない。ある非限定的な実施形態において、バイオリアクター設計は、光合成微生物で一般に必要であるような、培養物を薄層に閉じ込めないか、又は光が容器を通過するのを可能にさせるように透明な壁を有する。
【０１９３】
本発明のいくつかの実施形態において、ＣＯ２を消費しながら、太陽光よりもむしろ酸化還元化学から成長に必要なエネルギーを直接導き出す化学合成独立栄養生物の能力は、日夜、１年中、全ての気象条件で、いかなる人工照明を必要とせず、連続的なＣＯ２捕捉作業を促進及び／又は可能にする。対照的に、藻類及びより高等な植物は、夜中又は低光レベルで、正味のＣＯ２放出体になり得る。本発明のある実施形態において、光を必要としないために、可視光に対して透明でない不透明材料で構築された、市販のバイオプロセスから導き出される従来の実証済みの機器及びインフラが、いかなる人工照明を必要とせず、本発明のある実施形態において適用される。本発明のある実施形態において、システム容量の増加は、水平方向のスケーリングのみよりも、垂直スケーリングによって満たされる。これは、ＣＯ２捕捉のために、藻類、シアノバクテリア、又はより高等な植物を用いる光栄養アプローチとは対照的である。様々な垂直農業スキームが光合成システムのために提案されてきたが、実用的かつ経済的に言えば、光栄養システムは、例えば、藻類の場合、浅い池又は光バイオリアクター中で水平に増殖しなければならない。これにより、巨大な地形のフットプリント及び多くの負の環境影響がもたらされる。
【０１９４】
そうでなければ、藻類又はより高等な植物などの光合成生物を成長させるのに人工照明が必要である垂直農業などの場合において、本発明のある垂直農業のような実施形態において、電気の光への変換は、ＣＯ２変換に必要ではない。本発明のある非限定的な実施形態において、水の電気分解は、独立栄養ＣＯ２摂取及び生合成を支持するために、電気の光への変換に置換される。本発明のある非限定的な実施形態において、限定されないが、電気分解を介した水素などの電子供与体への電気の変換において、電気の光への変換を上回る大きなエネルギー効率の利点がある。人工照明で成長した藻類又はより高等な植物系は、藻類による光エネルギーの非効率的な利用によって、及び電気エネルギーの光エネルギーへの非効率的な変換により欠点がある。本発明のある実施形態において、ＣＯ２捕捉及び／又はバイオマス生成の点で同等の、人工照明の下で成長させた藻類又はより高等な植物の培養は、本発明のＣＯ２捕捉及び／又はバイオマス生成システムよりも電力を必要とする。本発明のある実施形態において、ＣＯ２捕捉及び／又はバイオマス生成の点で同等の、人工照明の下で成長させた藻類又はより高等な植物の培養は、本発明のＣＯ２捕捉及び／又はバイオマス生成システムよりも少なくとも１０倍電力を必要とする。人工照明で成長させた藻類又はより高等な植物にとって、熱排除要件は、電気的材料にほとんど正比例する。本発明のある実施形態において、熱排除要件は、人工照明の下で成長させた、ＣＯ２捕捉及び／又はバイオマス生成の点で同等の藻類又はより高等な植物系よりも低い。本発明のある実施形態において、熱排除要件は、人工照明の下で成長させた、ＣＯ２捕捉及び／又はバイオマス生成の点で同等の藻類又はより高等な植物系に対して少なくとも１０倍低い。
【０１９５】
本発明のある実施形態において、周囲環境からバイオプロセスの単離によって提供される厄介な条件に対する比較的高い耐性は、藻類系又は伝統的な農業を広げるのに不利な条件で本発明のバイオプロセスが動作するのを可能にする。本発明のある非限定的な実施形態において、タンパク質を生成するためのＨ２とＣＯ２の反応は発熱であるので、冬の低温が、プロセスの冷却コストを削減するために使用される。
【０１９６】
本発明のある実施形態において、バイオリアクターの適用を説明するために、栄養培地を含有するバイオリアクターに生成細胞を接種する。一般に、細胞が２個になる前に誘導期を伴う。誘導期後に、細胞の倍加時間が減少し、培養が対数期に入る。対数期に続いて、最終的に、倍化時間が増加し、理論によって束縛されることを意図しないが、物質移動の制限、窒素若しくはミネラル源を含む栄養素の枯渇、又は抑制性化学物質の濃度の上昇、又は微生物によるクオラムセンシングのいずれかが生じると思われる。培養物が静止期に入ると、成長が減速し、次いで、止まる。ある実施形態において、静止期に先行して算術的な増殖期がある。細胞塊を収集するために、ある実施形態において、培養物は、対数期及び／又は算術期及び／又は静止期に収集される。脂質の蓄積は、一般に、窒素源又は炭素源若しくは電子源（例えば、水素）を除く別の重要な栄養素の枯渇によって開始され得る。いくつかの種において、これは、過剰の炭素源及びエネルギー源から生成される脂質を保存するように細胞に信号を送る。
【０１９７】
バイオリアクター又は発酵槽は、それらの生理学的サイクルの様々な期を経て、細胞を培養するために使用される。バイオリアクターは、成長曲線の特定の期で維持され得る細胞の培養のために利用される。バイオリアクターの使用は、多くの方法で化学合成独立栄養成長の培養に有利である。ある実施形態のために、タンパク質又は動物飼料を生成するために使用されるタンパク質に富む細胞塊は、液体懸濁液中で高密度になるまで成長する。一般に、溶解している二酸化炭素、酸素、及び水素などの他のガス、並びに他の溶解している栄養素、微量元素、温度及びｐＨの調整を含む成長条件の調節は、バイオリアクター中で促進される。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、プロセス条件は、天然の又は発現した酵素の生合成に対する効果を高めるために使用される。いくつかの実施形態において、天然の又は発現した酵素に対する効果を高めるために使用されるプロセス条件は、温度である。
【０１９９】
栄養培地及びガスは、培養物が成長及び／又は維持される期間にわたって、バッチ添加として、又は定期的に、又は検出される欠乏又はプログラムされた設定点に反応して、又は連続してバイオリアクターに添加することができる。ある実施形態について、接種時のバイオリアクターは、成長の初期に栄養培地及び／又はガスの出発バッチで満たされており、追加の栄養培地及び／又はガスは接種後に添加されない。ある実施形態について、栄養培地及び／又はガスは接種後に定期的に添加される。ある実施形態について、栄養培地及び／又はガスは、栄養及び／又はガスの検出される欠乏に反応して接種後に添加される。ある実施形態について、栄養培地及び／又はガスは接種後に連続して添加される。ある実施形態について、添加される栄養培地は、任意の有機化合物を含有しない。
【０２００】
ある実施形態において、培養物のバイオリアクターへの接種は、別のバイオリアクターに生息する既存の培養物からの培養物の移動、又はインキュベーター中で育てた種ストックからのインキュベーションを含むが、これらに限定されない方法によって実行される。ある実施形態において、株の種ストックは、輸送され、当業者に容易に認識され得る粉末、液体、凍結形態、又は凍結乾燥形態及び任意の他の適切な形態を含むが、これらに限定されない形態で保管され得る。ある非限定的な実施形態において、貯蔵細菌培養物は、リスタートに必要になるまで、代謝的に不活性で、凍結乾燥状態で保存される。ある実施形態において、巨大リアクター中での培養を確立する場合、培養物は、大規模容器に接種する前に、次第に大きくなる中間規模の容器で成長し、確立される。
【０２０１】
ある実施形態について、バイオリアクターは、以下のもの：回転式攪拌棒、ブレード、インペラー、又はタービン；回転、振盪、又は回転する容器；ガスリフト、スパージング；再循環導管による容器の底部から頂部までのブロスの再循環、ループ及び／又は静的ミキサーを介したブロスの流動のうちの１以上を含むが、これらに限定されない栄養培地の混合を可能にする機構を有する。培養培地は、連続的又は断続的に混合され得る。
【０２０２】
ある実施形態において、微生物含有栄養培地は、本発明のバイオリアクターから部分的に又は完全に、定期的に又は連続して除去され、ある実施形態において、対数増殖期に細胞培養物を維持するために、かつ／又は成長培地中の枯渇栄養素を補充するために、かつ／又は阻害性廃棄物を除去するために、ある実施形態において細胞を含まない新鮮な培地と置換される。
【０２０３】
バイオリアクター中の標準的なポートが、本発明の微生物を封入しているバイオリアクター容器に、及び／又はバイオリアクター容器から、気体、液体、固体、及び／若しくはスラリーを送達するか、又は取り除くために利用され得る。多くのバイオリアクターは、異なる目的のために複数のポート（例えば、培地添加、ガス添加、ｐＨ及びＤＯのためのプローブ、サンプリングのためのポート）を有し、所定のポートが発酵運転中に様々な目的のために使用され得る。一例として、ポートは、ある時点でバイオリアクターに栄養培地を添加するために使用され、別の時点ではサンプリングのために使用され得る。好ましくは、サンプリングポートの複数の使用は、成長環境に汚染又は侵入種を導入することなく実行することができる。試料の流れの制御若しくは連続サンプリングを可能にするバルブ又は他のアクチュエータを、サンプリングポートに提供することができる。ある実施形態については、バイオリアクターは、さらに、培地又はガスの添加を含む他の使用に役立ち得る培養物接種に適する少なくとも１つのポートを備えている。バイオリアクターポートは、ガス組成物及び培養環境への流速を制御することを可能にする。例えば、ポートは、ガスをポンプでくみ上げるバイオリアクターへのガス注入口として使用することができる。
【０２０４】
いくつかの実施形態について、バイオリアクターに投入され得るガスには、以下のもの：シンガス、プロデューサーガス、熱分解ガス、水素ガス、ＣＯ、ＣＯ２、Ｏ２、空気、空気／ＣＯ２混合物、天然ガス、バイオガス、メタン、アンモニア、窒素、アルゴンなどの貴ガス、及び他のガスのうちの１以上が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、システムに投入されるＣＯ２は、有機物質のガス化からのＣＯ２；生石灰ＣａＯを生成するための石灰石ＣａＣＯ３の焼成からのＣＯ２；アンモニア、メタノール、又は水素生成からのＣＯ２副産物などのメタン蒸気改質からのＣＯ２；燃焼、焼却、又は再燃からのＣＯ２；糖の嫌気性又は好気性発酵のＣＯ２副産物；廃水処理からのＣＯ２；リン酸ナトリウム生成からのＣＯ２副産物；地質学的若しくは地熱学的に生成又は放出されるＣＯ２；酸性ガス又は天然ガスから除去されるＣＯ２を含むが、これらに限定されない供給源から派生し得る。ある実施形態において、炭素源は、海水若しくは他の表面ボディ若しくは地下水中のＣＯ２及び／又は重炭酸塩及び／又は炭酸塩である。ある実施形態において、炭素源は、大気からのＣＯ２である。ある非限定的な実施形態において、ＣＯ２は、限定されないが、国際宇宙ステーション（ＩＳＳ）で利用されるＣＯ２除去アセンブリ（ＣＤＲＡ）などの装置を用いて、閉ループ生命維持システムの一部として閉鎖キャビネットから捕捉されている。
【０２０５】
本発明のある実施形態において、二酸化炭素含有排ガスは、未処理排気に特徴的な温度、圧力、及びガス組成物で煙突から捕捉され、最小限に変更されて炭素固定が起きる反応容器に導かれる。生物に有害な不純物が排ガス中に存在しないいくつかの実施形態において、反応容器に入る排ガスの変更は、ガス温度を下げるのに必要なリアクターシステム及び／又は熱交換を通って、微生物暴露に適するものへガスを汲み出すのに必要な圧縮に限定され得る。ある実施形態において、排ガス又は他の混合ガス流に存在するＣＯ２は、当技術分野で公知の炭素捕捉技術及びプロセスを用いてバイオリアクターに導入される前に、精製及び／又は濃縮される。
【０２０６】
二酸化炭素を有する排ガスが、二酸化炭素を（例えば、当技術分野で周知の炭素捕捉及び／又は微生物変換の）溶液に溶解するためのシステムを通って輸送される実施形態において、（一般に、窒素などの不活性ガスを主に含む）ＣＯ２含有量が低下し、不純物が取り除かれた排ガスは、ある実施形態において、大気に放出され得る。
【０２０７】
本発明のある実施形態において、炭素源は、産業煙又はオフガスに含まれる、かつ／又は地質学的供給源及び地熱源を含むが、これらに限定されない天然源からのＣＯ２及び／又はＣＯである。ある実施形態において、ＣＯ２及び／若しくはＣＯ含有排ガス並びに／又はオフガスは、以下の産業又はセクター：油、電気、天然ガス、セメント、化学物質、鋼、冶金、発酵、廃水処理のうちの１以上から放出される。本発明のある非限定的な実施形態において、比較的小さな土地面積は、以下のもの：化石発電所；石油精製所；タールサンドのアップグレード施設；天然ガス又は石油掘削作業；エタノール蒸留所；セメント製造業；アルミニウム製造業、クロロアルカリ製造業、鋼鋳造所；地熱発電所のうちの１以上を含むが、これらに限定されないＣＯ２及び／又は他の炭素廃棄物を生成する産業施設とのバイオプロセスのコロケーションを容易にする。本発明のある実施形態において、バイオマス乾燥を含むが、これに限定されない工程のために、産業排ガス源と関連する廃熱がさらに本発明の生成プロセスで利用される。
【０２０８】
ある実施形態において、二酸化炭素に加えて、又は代替炭素源としての二酸化炭素の代わりに、ガスは溶液に溶解されて、培養ブロスに供給され、かつ／又はガス状の電子供与体及び／若しくは炭素源（例えば、水素及び／若しくはＣＯ及び／若しくはメタンガス）を含むが、これらに限定されない培養ブロスに直接溶解される。本発明のある実施形態において、投入ガスは、限定されないが、他のガス構成成分及びシンガスの不純物（例えば、炭化水素）；アンモニア；硫化水素；及び／又は他のサワーガス；及び／又はＯ２；及び／又はミネラル含有微粒子及び灰などの他の電子供与体及び／又は電子受容体及び／又は炭素源及び／又はミネラル栄養素を含んでよい。
【０２０９】
本発明のある実施形態において、ガスは、限定されないが、以下のもの：水素、一酸化炭素、メタン、硫化水素又は他のサワーガス；限定されないが、以下のＣＯ２、ＣＯ、ＣＨ４のうちの１以上などのガス状の炭素源のうちの１以上などのガス状の電子供与体；並びに限定されないが、空気（例えば、２０．９％酸素）の中の、又は純粋なＯ２としての、又はＯ２に富むガスとしての酸素などの電子受容体を含むが、これに限定されない本発明の培養ブロスに溶解される。いくつかの実施形態において、溶液へのこれらの及び他のガスの溶解は、溶液中へのガスの分散のために広く使用される以下のシステム：散布装置；ドーム、筒、円盤又はドーナツの形状を含むが、これらに限定されない散布器；粗い又は微細な気泡通気装置；ベンチュリ装置のうちの１以上に供給される、発酵工学の技術者に公知のコンプレッサー、流量計、及びフローバルブのシステムを用いて達成される。本発明のある実施形態において、表面通気及び／又はガス物質移動はまた、パドル通気装置などを用いて実行され得る。本発明のある実施形態において、ガス溶解は、気泡サイズを小さくするためにインペラー又はタービン、並びに油圧剪断装置を用いた機械混合によって高められる。ガスを取り込む微生物を保持するリアクターシステムを通過させた後、ある実施形態において、残留ガスは、バイオリアクターに戻されて再循環させられるか、又は熱プロセスのために燃焼されるか、又は再燃されるか、又は地下に注入されるか、又は大気に放出され得る。電子供与体としてＨ２を利用する本発明のある実施形態において、Ｈ２は、培地全体にバブリングによって、又は液体培地と接する、当技術分野で公知の水素透過性水不透過性膜全体に拡散させることによって培養容器に供給され得る。
【０２１０】
ある実施形態において、該微生物は、微好気条件下でＨ２及びＣＯ２及び他の溶解栄養素で成長及び増幅する。ある実施形態において、限定されないが、一酸化炭素、メタン、メタノール、ギ酸塩、又はギ酸などのＣ１化学物質、及び／又は様々なガス化、熱分解、若しくは蒸気改質された固定炭素原料から作られる様々なシンガス組成物を含むが、これらに限定されないＣ１化学物質を含有する混合物は、以下の条件：好気性、微好気性、無酸素性、嫌気性、及び／又は通性の条件のうちの１以上で、より長い鎖の有機化学物質（すなわち、Ｃ２又はそれ以上、いくつかの実施形態において、Ｃ５又はそれ以上の炭素鎖分子）に生化学的に変換される。
【０２１１】
制御された量の酸素はまた、本発明のいくつかの実施形態の培養ブロス中で維持することができ、ある実施形態において、酸素は、培養ブロスに供給される溶液に積極的に溶解され、かつ／又は培養ブロスに直接溶解される。目標のＤＯレベルを維持するために、培養ブロスへの空気若しくは酸素のポンピングを必要とする本発明のある好気性又は微好気性の実施形態において、酸素の泡は、混合及び酸素移動に最適な直径でブロスに注入され得る。これは、環境研究ジャーナル（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ）５月／６月  １９９９年、３０７−３１５ページの中で２ｍｍであることが報告された。本発明のある好気性の実施形態において、酸素の泡をせん断するプロセスは、米国特許第７，３３２，０７７号に記載のように、この泡の直径を達成するために使用され得る。ある実施形態において、平均直径が７．５ｍｍ超でかつ／又はスラッギングしている泡は避けられる。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、本発明の主題は、シンガス、プロデューサーガス、熱分解ガス、バイオマス、テールガス、排ガス、ＣＯ、ＣＯ２、Ｈ２、及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されない排ガスを変換する。いくつかの実施形態において、排ガスの熱含有量は、標準立方フィート（ｓｃｆ）あたり少なくとも１００  ＢＴＵである。本発明のいくつかの実施形態において、バイオリアクターは、微生物を含有し、成長させるために使用され、ガス送達のための微細気泡拡散器及び／又は高せん断インペラーを備えている。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、酸素は、アミノ酸、又はタンパク質、又は他の栄養素、又は全細胞生成物の生合成のために使用される微生物の呼吸で電子受容体として使用される。いくつかの実施形態において、Ｏ２を含むが、これに限定されない強い電子受容体は、アミノ酸、脂肪酸、又はビタミンなどの同化経路を経て生成される生成物の効率及び収率を最大にするために使用される。電子受容体としてＯ２を使用する際の重要な課題は、爆発の危険性を最小限にするために、バイオリアクター中の可燃性のＨ２とＯ２の混合物、及び他の排ガス／Ｏ２混合物の適切で安全なレベルも維持しながら、好気性微生物が十分に成長及び効率的に同化生成物を作るのを可能にするのに十分に適するＯ２レベルを保持することである。いくつかの実施形態において、カスタムの又は特殊なリアクター設計が、危険なガス混合を避けながら、微生物に適するレベルでブロス中のＯ２を制御するために使用される。いくつかの実施形態において、細胞エネルギー、炭素固定のため、及びアミノ酸、又はタンパク質、又は他の栄養素、又は全細胞の生成に必要なレベルのこれらのガスを微生物に供給しながら、Ｈ２とＯ２の危険な混合物を避けるバイオリアクター設計が使用される。
【０２１４】
ガスが泡立つか又は培地全体に散布されるように、ガス注入口が液体培地の表面下に位置付けられる場合、バイオリアクターへのガスの導入及び／又はガス流量の上昇は、培養物の混合を高め、乱流を生じさせることができる。ある実施形態において、混合は、液体培地全体へのガスの気泡及び／又は散布及び／又はガスの閉塞によってもたらされる乱流によって高められる。いくつかの実施形態において、バイオリアクターは、ガス抜き及び圧力解放のためのガス出口ポートを含む。いくつかの実施形態において、ガスの入口及び出口は、好ましくは、ガスの逆流を防ぐためにチェックバルブを備えている。
【０２１５】
化学合成反応がバイオリアクター内で生じるある実施形態において、１種類以上の電子供与体及び１種類以上の電子受容体が、ポンピングされるか、又はそうでなければ、反応容器中にボーラス添加として添加されるか、又は化学栄養生物を含有する栄養培地に定期的に、若しくは連続的に添加される。細胞呼吸中に電子供与体から電子受容体への電子の移動によって促進される化学合成反応は、無機二酸化炭素及び／又は他の溶解炭酸塩及び／又は他の炭素酸化物を有機化合物及びバイオマスに固定する。
【０２１６】
ある実施形態において、当技術分野で公知の微生物成長に必要な適切なミネラル、塩、ビタミン、補因子、緩衝液、並びに他の成分を含有する水溶液を含む培養物の成長及び生成のための栄養培地が使用される［Ｂａｉｌｅｙ及びＯｌｌｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，第２版；ｐｐ３８３−３８４及び６２０−６２２；ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８６）］。
【０２１７】
ある実施形態において、当技術分野で公知の微生物培養の維持及び成長のために使用される化学物質は、本発明の栄養培地中に含まれる。ある実施形態において、これらの化学物質には、以下のもの：アンモニア、アンモニウム（例えば、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４））、硝酸塩（例えば、硝酸カリウム（ＫＮＯ３））、尿素又は有機窒素源などの窒素源；リン酸塩（例えば、リン酸二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、ジチオリン酸カリウム（Ｋ３ＰＳ２Ｏ２）、オルトリン酸カリウム（Ｋ３ＰＯ４）、リン酸ジカリウム（Ｋ２ＨＰＯ４））；硫酸塩；酵母エキス；キレート化鉄；カリウム（例えば、リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、硝酸カリウム（ＫＮＯ３）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、臭化カリウム（ＫＢｒ））；及び他の無機塩、ミネラル、及び微量栄養素（例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、硫化マグネシウム（ＭｇＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ）又は塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）又は炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）、硫化マグネシウム（ＭｎＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ）又は塩化マグネシウム（ＭｎＣｌ２）、塩化第二鉄（ＦｅＣｌ３）、硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ）又は塩化第一鉄（ＦｅＣｌ２  ４Ｈ２Ｏ）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）又は炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４）又は塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）、モリブデン酸アンモニウム（ＮＨ４ＭｏＯ４）又はモリブデン酸ナトリウム（Ｎａ２ＭｏＯ４  ２Ｈ２Ｏ）、硫酸第一銅（ＣｕＳＯ４）又は塩化銅（ＣｕＣｌ２  ２Ｈ２Ｏ）、塩化コバルト（ＣｏＣｌ２  ６Ｈ２Ｏ）、塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ３  ６Ｈ２Ｏ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、ホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）、塩化ニッケル（ＮｉＣｌ２  ６Ｈ２Ｏ）、塩化スズ（ＳｎＣｌ２  Ｈ２Ｏ）、塩化バリウム（ＢａＣｌ２  ２Ｈ２Ｏ）、セレン酸銅（ＣｕＳｅＯ４  ５Ｈ２Ｏ）又は亜セレン酸ナトリウム（Ｎａ２ＳｅＯ３）、メタバナジン酸ナトリウム（ＮａＶＯ３）、クロム塩）のうちの１以上が含まれ得るが、これらに限定されない。ある実施形態において、Ｓｃｈｌｅｇｅｌらによって配合されたミネラル塩培地（ＭＳＭ）が使用され得る［「好熱性細菌（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」，Ｊａｋｏｂ  Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ，チャプター５、第ＩＩＩ節，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９２）］。
【０２１８】
本発明の態様は、細菌細胞の成長及び／又は発現に関する。本発明に関連する細菌細胞は、いくつかの実施形態において、発酵培地を含む任意の種類（豊富又は最小）の培地、及び任意の組成物中で培養することができる。当業者によって理解されるように、日常的な最適化は、様々な種類の培地の使用を可能にする。選択された培地は、様々な追加の成分を補充することができる。補助成分のいくつかの非限定的な例として、グルコース、抗生物質、遺伝子誘導のためのＩＰＴＧ、及びＡＴＣＣ微量ミネラル補充が挙げられる。同様に、本発明の培地及び細胞の成長条件の他の態様は、日常的な実験を通して最適化され得る。例えば、ｐＨ及び温度は、最適化することができる要因の非限定的な例である。いくつかの実施形態において、培地、培地補充物質、及び温度の選択などの要因は、所望の分子の生成レベルに影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態において、補充成分の濃度及び量は最適化され得る。いくつかの実施形態において、培地が１以上の補充成分で補充される頻度、及び所望の分子を収集する前に培地が培養される期間が、最適化される。
【０２１９】
ある実施形態において、バイオマスの焼却又はガス化からの灰は、本発明で使用され得るミネラル栄養素を含有する。ある実施形態において、ミネラル含有灰をもたらす焼却又はガス化されるバイオマスには、以下のもの：排泄物、糞便及び／又は尿のうちの１以上が含まれるが、これらに限定されない。ある非限定的な実施形態において、尿は、窒素源を含むが、これに限定されない栄養素の供給源として使用される。ある非限定的な実施形態において、尿は水で希釈される。ある非限定的な実施形態において、尿及び／又は焼却又はガス化の生成物は、本発明の生物のための栄養素として使用される。ある非限定的な実施形態において、灰中のＣＯ２、水蒸気、Ｈ２、ＣＯ、及び／若しくは無機ミネラル栄養素を含むが、これらに限定されない焼却並びに／又はガス化の主要生成物は、本発明の生物によって容易に利用され得る。
【０２２０】
有機物質の好気性分解からの最終生成物は、一般に、二酸化炭素、水、硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩、及び類似の高度に酸化された化合物である。本発明のある実施形態において、活性汚泥法由来のＣＯ２及び／又は水及び／又は無機ミネラル栄養素は、本発明における原料及び／又は栄養素及び／又は電子受容体の供給源として利用される。本発明のある実施形態において、嫌気性汚泥消化由来のＣＨ４及び／又はＣＯ２及び／又は水及び／又はアンモニア及び／又は硫化水素及び／又は他の無機ミネラル栄養素は、本発明における原料及び／又は栄養素の供給源として利用される。ある実施形態において、腐植は、炭素源及び／又は電子受容体若しくは電子供与体として利用される。
【０２２１】
アンモニアを含むが、これに限定されない形態の窒素、及びリン、並びに死んだ魚を含み得る水産養殖汚染は、特に、養殖魚の９０％がいるアジアで、広範囲に危険になりつつある。本発明のある実施形態において、水産養殖汚染は、本発明の微生物によって、窒素及び／又はリンを含むが、これらに限定されない栄養源として利用される。ある実施形態において、通常は下水又は廃水処理場若しくは埋め立て処分場に運ばれる廃棄物は、代わりに、本発明の微生物プロセスのための栄養素の生成に利用される。ある実施形態において、これらの廃棄物の流れには、以下のもの：アンモニア、尿素、尿、糞便、魚廃棄物、及び／又は他の動物性廃棄物のうちの１以上が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態において、本発明の微生物態様は、養殖システムの再循環、及び／若しくは養殖システムからの排出を減少させることができる水並びに／又は栄養素の増加を可能にする。ある実施形態において、以下のもの：Ｈ２、ＣＯ、ＣＨ４、ＣＯ２のうちの１以上を含むが、これらに限定されない電子供与体及び／又は炭素源；及び／又は他の栄養素及び／又は水は、以下のもの：ガス化、熱分解、焼却、及び／又は嫌気性消化のうちの１以上を含むが、これらに限定されない周知のプロセスを経て、糞便及び／若しくは魚の頭などの魚の部分の廃棄物、及び／若しくは他の動物残渣及び／若しくは廃水処理による微生物細胞物質及び／若しくは有機物質を含むが、これらに限定されない魚廃棄物並びに／又は他の動物性廃棄物から作られる。ある実施形態において、ガス化及び／又は熱分解及び／又は焼却を経て作られるＨ２Ｏ並びに／又はＣＯ２並びに／又は他の凝縮性及び非凝縮性ガス及び／又は灰残渣及び／又は熱は、本発明において、限定されないが、以下のもの：炭素源としてのＣＯ２；プロセス水源としてのＨ２Ｏ；原料及び栄養源としての凝縮性並びに／又は非凝縮性ガス；無機ミネラル栄養源及び／又はｐＨ調整用の塩基性供給源としての灰；プロセスの熱及び／又はエネルギーの供給源としての熱のうちの１以上などの原料又は材料として利用される。病原性微生物は、嫌気性廃棄物処理プロセスを生き延びることができる。ある実施形態において、プロセスに入る未処理原料中に存在する全ての病原性微生物は、１以上のＣ１捕捉及び生物変換工程につながる上記のガス化及び／若しくは熱分解及び／若しくは焼却の工程（複数可）を経て死滅する。
【０２２２】
ある実施形態において、本発明の微生物バイオプロセスを経て生成される栄養素は、農業、水産養殖、アクアポニクス、又は水耕栽培システムの再循環に使用される。ある非限定的な実施形態において、前述の再循環水産養殖又はアクアポニクスシステムで生成される生物には、以下のもの：ティラピア、サーモン、コビア、マス、ティラピア、ナマズ、コイ、エビ、甲殻類のうちの１以上が含まれが、これらに限定されない。ある非限定的な実施形態において、前述の再循環水産養殖システム中の魚タンクは、地上に位置するか、水中に浮かんでいる。本発明のある実施形態において、微生物バイオプロセスは、浮遊養殖場の栄養源として利用される。このようなある実施形態において、浮遊養殖場は、改良されたオイルタンカー又は他の大きな海上船舶をベースとしている。ある実施形態において、本発明は、浮遊しているすなわち浮いている魚のケージのための栄養源として利用される。このようなある実施形態において、ケージは、サーモンの農場のために使用される。
【０２２３】
廃棄物由来の原料及び／又は栄養素を利用する本発明のある実施形態は、食料ループの閉鎖を可能にする。
【０２２４】
本発明のある実施形態において、耕地及び／又は新鮮な水及び／又は殺虫剤及び／又は除草剤及び／又は抗生物質を必要としない。ある実施形態において、肥料（例えば、微生物成長のための無機ミネラル又は有機栄養素）の必要性は、以下のもの：灰、バイオマス、下水、廃棄物の流出物のうちの１以上を含むが、これらに限定されない廃棄物源を用いて、部分的に又は完全に満たされる。本発明のある実施形態において、海の水は、プロセス水及び／又は無機炭素及び／又は他のミネラル栄養素及び／又は肥料の供給源として使用される。
【０２２５】
ある実施形態において、栄養化学物質（例えば、電子供与体及び受容体及び炭素源及び様々なミネラル栄養素）の濃度は、最適な炭素の取り込み及び／又は固定及び／又は変換及び／又は有機化合物の生成のためにそれぞれ最適なレベルに近いか、又は最適なレベルで、バイオリアクター内で維持され、利用される微生物に依存して変化するが、微生物培養分野の当業者には公知であるか、又は過度な実験を行うことなく決定可能である。
【０２２６】
本発明のある実施形態において、以下のパラメーター：廃棄物レベル；ｐＨ；温度：塩分；溶存酸素；溶存二酸化炭素ガス；液体流量；攪拌速度；ガス圧のうちの１以上は、バイオリアクター中で監視及び／又は制御される。ある実施形態において、化学合成独立栄養成長に影響する動作パラメーターは、センサー（例えば、電子供与体／電子受容体の濃度を正確に測定するための溶存酸素プローブ若しくは酸化−還元プローブ）で監視され、かつ／又は作動弁、ポンプ、及び攪拌機を含むが、これらに限定されない装置の使用によってセンサーからのフィードバックに基づいて手動又は自動で制御される。ある実施形態において、流入ブロス及び流入ガスの温度は、限定されないが、冷却器、加熱器、及び／又は熱交換器などの制御手段である。
【０２２７】
本発明のある実施形態において、微生物培養及び／又はバイオ反応は、細胞の汚染及び環境パラメーター（例えば、細胞密度、ｐＨ、ＤＯ、化学濃度）が経時的に定常レベルで標的化される定常状態で、栄養培地及び／又はバイオマスの連続流入並びに除去を用いて維持される。ある実施形態において、その定常レベルは、原料変換及び／又は目的の有機化合物の生成に最適なレベルである。ある実施形態において、細胞密度は、直接サンプリングによって、光学密度と細胞密度の相関、及び／又は粒径分析器によって監視することができる。ある実施形態において、水力及びバイオマスの保持時間は、ブロス化学と細胞密度の両方の独立した制御を可能にするために分離され得る。ある実施形態において、水力保持時間は、バイオマス保持時間と比較して比較的低く、細胞成長及び／又は原料変換及び／又は有機化合物の生成のために高度に補充されたブロスをもたらすように、希釈率は十分に高く保持され得る。ある実施形態において、希釈率は、培養ブロス及び栄養補給、及び／又は廃棄物の除去と、ポンピング、材料の増加、及び希釈率と共に上昇する他の需要からのプロセスコストの増加との間の最適な技術経済的トレードオフに設定される。
【０２２８】
本発明のある実施形態において、微生物培養のｐＨは調節される。ある実施形態において、ｐＨは、微生物の維持及び／又は成長及び／又は原料の変換及び／又は有機化合物の生成及び／又は生存に最適な範囲内で制御される。ｐＨを低下させるために、ある実施形態において、中和工程は、バイオリアクター環境内で、又は再循環ループによって培地を培養容器に戻してリサイクルする前に直接実行され得る。ある実施形態のブロス中の酸の中和は、以下のもの：石灰石、石灰、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化アンモニウム、苛性カリ、酸化マグネシウム、酸化鉄、アルカリ灰のうちの１以上を含むが、これらに限定されない塩基の添加によって達成され得る。ある実施形態において、利用される塩基は、以下のもの：酸化カルシウム、酸化マグネシウム、酸化鉄、鉄鉱石、金属酸化物を含有するオリビン、金属酸化物を含有する蛇紋石、金属酸化物を含有する超鉱物析出物、及び地下の塩基性生理食塩水帯水層からの液体のうちの１以上を含むが、これらに限定されない天然塩基性ミネラルなどの二酸化炭素排出のない供給源から生成された。石灰岩は中和のために使用され、次いで、二酸化炭素は一般に放出される。ある実施形態において、このＣＯ２は、大気に放出されるのではなく、化学合成による取り込みのためにバイオリアクターに保持されるか、若しくは戻されるか、かつ／又はいくつかの他の方法で利用及び／若しくは隔離され得る。
【０２２９】
ある実施形態において、バイオマスの燃焼、焼却、又はガス化由来の灰は、ｐＨ調整のために使用される。ある実施形態において、塩基性灰をもたらす焼却又はガス化されたバイオマスには、以下のもの：排泄物、糞便及び／又は尿のうちの１以上が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３０】
本発明のある実施形態において、化学合成独立栄養微生物の水性懸濁液は、１以上の電子供与体及びＣＯ２を原形質に変換する。ある実施形態において、水素酸化微生物の水性懸濁液は、水素及び二酸化炭素を細菌の原形質に変換するために使用することができる。ある実施形態において、一酸化炭素酸化微生物の水性懸濁液は、一酸化炭素及び水素及び／又は水を原形質に変換するために使用することができる。ある実施形態において、メタン酸化微生物の水性懸濁液は、メタンを原形質に変換するために使用することができる。ある実施形態において、懸濁液中の微生物は、細菌又は古細菌である。ある非限定的な実施形態において、Ｈ２酸化化学合成独立栄養微生物の水性懸濁液又はバイオフィルムは、いくつかの他の溶解したミネラル栄養素と共に、Ｈ２及びＣＯ２を生化学物質及び原形質に変換する。ある実施形態において、他の溶解したミネラル栄養素には、窒素源、リン源、及びカリウム源が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態において、生成される原形質は、ヒト及び／又は他の動物及び／又は他の従属栄養生物に価値のある食料である。ある実施形態において、特定の生化学物質は、原形質及び／又は細胞外ブロスから抽出することができ、栄養価、及び／又は様々な有機化学若しくは燃料用途における価値を有する。ある実施形態において、この原形質の生成を促進するための細胞内エネルギーは、電子受容体による電子供与体の酸化に由来する。ある非限定的な実施形態において、電子供与体には、以下のもの：Ｈ２；ＣＯ；ＣＨ４のうちの１以上が含まれるが、これらに限定されない。ある非限定的な実施形態において、電子受容体には、Ｏ２が含まれるが、これに限定されない。ある非限定的な実施形態において、エネルギー発生反応、又は呼吸の生成物には、水が含まれるが、これに限定されない。ある実施形態において、ＣＯ２からの生化学物質及び原形質のこの合成を促進するために使用される呼吸由来の細胞内エネルギーは、貯蔵され、ＡＴＰを含むがこれに限定されない生化学分子に運ばれる。本明細書のある実施形態において使用されるｋｎａｌｌｇａｓ微生物にとって、電子受容体はＯ２であり、呼吸の生成物は水である。
【０２３１】
いくつかの実施形態において、タンパク質生成及び生成されるアミノ酸分子の分布は、以下のもの：バイオリアクター条件の制御、栄養素レベルの制御、細胞の遺伝子改変のうちの１以上を経て最適化される。本発明のある実施形態において、アミノ酸、又はタンパク質、又は他の栄養素、又は全細胞生成物への経路は、特定の成長条件（例えば、窒素、酸素、リン、硫黄、無機イオンなどの微量マイクロ栄養素のレベル、及び存在する場合、一般に栄養素又はエネルギー源とみなされない任意の制御分子）を維持することによって化学生成物の生成のために制御及び最適化される。本発明のある実施形態において、溶存酸素（ＤＯ）は、生物の要求に応じて、好気性、微好気性、無酸素性、嫌気性、又は通性条件でブロスを維持することによって最適化することができる。通性環境は、水柱の層別化によって生じる好気性の上層及び嫌気性の下層を有するものであると考えられる。本発明で開示される微生物によるアミノ酸、タンパク質、又は他の栄養素、又は全細胞生成物の生合成は、炭素及びエネルギー及び他の栄養源の十分な供給があるという条件で、対数増殖期又はその後の細胞倍加が停止した時の静止期中に生じ得る。
【０２３２】
バイオリアクター、培養条件、従属栄養及び化学栄養の成長、維持の特定例、及びアミノ酸、又はタンパク質、又は他の栄養素、又は全細胞生成物の本明細書に記載の生成方法は、微生物の成長及びアミノ酸、又はタンパク質、又は他の栄養素、又は全細胞生成物の効率を改善するために、任意の適切な方法で組み合わせることができる。
【０２３３】
本発明のある非限定的な実施形態において、ＣＯ２の生合成還元は、水の電気分解によって作られるＯ２電子受容体及び／又はＨ２電子供与体を利用する。本発明のある非限定的な実施形態において、水の電気分解によって作られるＯ２の一部、及びＨ２の全ては、本発明の微生物の水性懸濁液に供給される。ある非限定的な実施形態において、Ｏ２のモルに対する微生物の水性懸濁液に供給されるＨ２のモル比は、２：１を超える。ある非限定的な実施形態において、Ｏ２電子受容体及びＨ２電子供与体は、水の電気分解によって作られ、本発明の微生物のＨ２及びＯ２の代謝要件の全てが満たされた後に、過剰なＯ２が残っている。あるそのような実施形態において、過剰なＯ２は、ヒト及び／又は他の好気性生命体に供給されるか、かつ／又は化学副生成物として貯蔵及び販売される。
【０２３４】
ある非限定的な実施形態において、ＣＯ２は、産業排ガスから除去されるか、又はそうでなければ大気に自然に放出される地質源から遮断されているか、閉鎖キャビン雰囲気から除去される。ある実施形態において、無機栄養塩は、プロセスの開始に、かつ／又はガスと同時に供給される。ある実施形態において、該微生物は、提供されるＨ２及びＣＯ２及び無機塩（栄養素）で成長並びに増加する。ある実施形態において、該微生物は、原形質の合成のためにエネルギー源としてＨ２を酸化する。ある非限定的な実施形態において、細胞は、定常状態集団及びガス取り込み率を維持するある固定率で収集される。本発明のある非限定的な実施形態は、閉ループ生命維持用途に使用される。ある非限定的な実施形態において、本発明は、Ｈ２及びＣＯ２をメタンに変換するサバティエ反応にとって代わるか、又は置換するために使用することができる。ある非限定的な実施形態において、Ｈ２及びＣＯ２からサバティエ反応を経てメタンを生成する代わりに、以下のもの：タンパク質、脂肪、及び多糖のうちの１以上を含むが、これらに限定されない栄養素は、Ｈ２及びＣＯ２を用いて生成される。ある非限定的な実施形態において、本発明は、以下のもの：ＣＯ２還元；食品使用のための最小限の変更を必要とするバイオマスの合成；並びに尿素及び尿中の他の栄養素の利用のうちの１以上を含むが、これらに限定されない有用な機能を実行する。ある非限定的な実施形態において、液体及び／若しくは固体の生物学的並びに／又は他の炭素系廃棄物のガス化、改質、又は焼却から生じる灰中のＣＯ２及び／又はＣＯ及び／又はミネラル栄養素が、本発明で使用される。例示目的で提供されるプロセスの非限定的な例の投入及び産出が、図２９に示されている。例示目的で与えられるプロセスの非限定的で模式的なフロー図が、図３０に示されている。
【０２３５】
本発明のある非限定的な実施形態において、以下の機能：ＣＯ２還元；食料又は栄養源として利用することができる細胞内物質の合成；窒素廃棄物の削減並びに尿素、アンモニア、アンモニウム、及び／又は硝酸塩の利用の１以上が実行される。
【０２３６】
本発明のある非限定的な実施形態において、閉鎖培養容器が使用され、圧力下で水素、酸素、及びＣＯ２が容器に供給される。ある非限定的な実施形態において、ガスのチャンバーへの流れは、チャンバー内の固定Ｈ２、Ｏ２、及びＣＯ２濃度を維持するために、ガスセンサーによって制御される。ある非限定的な実施形態において、ガス及び培養培地は、ガスの液体への拡散を最大にするために、容器内での機械的攪拌によって混合される。ある非限定的な実施形態において、水素及び酸素ガスは、水電気分解セルによって供給され、ＣＯ２は、廃棄物源又は通常は大気及びキャビンエアに放出される源から捕捉される。ある非限定的な実施形態において、プロセス流は、バイオマス収集ユニットへ流れる。ある非限定的な実施形態において、遠心作用は、固体と液体を分離するために使用される。ある非限定的な実施形態において、液体は、リサイクルされるか、又は水再生ユニットなどの水回収へ送られる。ある実施形態において、微生物の呼吸を経て生成されるか、かつ／又は微生物によって生成される栄養素を与えられる従属栄養生物によって生成される水は、電気分解セルへリサイクルされるか、かつ／又はバイオリアクターに戻されてリサイクルされ得る。ある実施形態において、水の副産物は、Ｈ２の電気分解生成のための水需要を部分的に相殺するために使用することができる。ある実施形態において、水の副産物は、植物若しくは他の生物の成長のために精製及び販売、若しくは提供され得るか、又はそうでなければ他の水消費者に提供され得る副生成物である。ある非限定的な実施形態において、そうでなければシステム内で作られる望ましくない物質は、水再生ユニットで除去される。ある非限定的な実施形態において、再生される水は、水電気分解セル内で再使用される。ある非限定的な実施形態において、栄養補給は、目的の培養培地組成物を維持するために、培養容器に供給される。ある非限定的な実施形態において、尿素は、栄養素として提供される。ある実施形態において、作られるバイオマスは、食料又は他のバイオ系生成物として使用するために処理される。
【０２３７】
本発明のある非限定的な実施形態において、本発明の１以上の微生物の連続培養又はバッチ又は供給されるバッチ培養は、ヒトの代謝廃棄物：尿素及び二酸化炭素を呼吸可能な酸素及び食料源及び／又は栄養補助食品に変換することに向けられる３工程の閉鎖生命維持サイクルの中間工程である。本発明のこれらに実施形態において、化学合成独立栄養のＣＯ２固定工程に加えて、完全サイクルの他の２工程は、（１）キャビン雰囲気から除去されるＣＯ２の収集及び回収、並びに（２）キャビン供給のための呼吸可能な酸素、及び閉鎖培養容器の気相に供給される副産物水素を生成するための水の電気分解である。ある非限定的な実施形態において、該細菌は、炭素源としてＣＯ２廃棄物と共に、成長中に一部又は唯一の窒素源として廃棄尿素を使用する。ある非限定的な実施形態において、定常状態培養物からの収集した過剰な細胞は、ヒト、動物、又は他の従属栄養生物及び／又は植物用の肥料にとって潜在的な食料である。
【０２３８】
理論に束縛されるものではないが、魚及び他の水産養殖生物の比較的高いＦＣＲは、冷血であり、浮遊環境に生息し、それゆえ重力があまりかからないなどの要因によると考えられている。ある非限定的な実施形態において、本発明によって生成されるタンパク質及び／又は他の栄養素を供給される生物は、冷血である食料生成種である。ある実施形態において、本発明によって生成されるタンパク質及び／又は他の栄養素を供給される生物は、限定されないが、微生物、真菌、動物細胞培養物、及び／又は発熱動物などの、吸熱ではない従属栄養生物である。ある非限定的な実施形態において、該細胞及び／又は生物は、浮遊環境中で生息している。ある非限定的な実施形態において、該生物は固着性である。
【０２３９】
ある実施形態において、本発明に従って生成されるタンパク質及び／又は他の栄養素は、以下のもの：孵化場；池培養；ケージ培養；再循環システム；統合された多栄養水産養殖；統合された農業及び水産養殖；アクアポニクスのうちの１以上を含むが、これらに限定されない魚を育てるための技法及び技術で使用される。
【０２４０】
本発明は、アミノ酸、又はタンパク質、又は他の栄養素への経路の酵素をコードする少なくとも１つの内因性又は外来の核酸配列を含む細胞を含むバイオリアクターに関する。いくつかの実施形態において、該システムは、２以上、３以上、又は４以上のバイオリアクターを含み、そのうちの少なくとも１つは、アミノ酸、又はタンパク質、又は他の栄養素への経路の酵素をコードする少なくとも１つの内因性又は外来の核酸配列を含む細胞を含む。いくつかの実施形態において、該バイオリアクターシステムは、少なくとも第１及び第２のバイオリアクターを含み、第１のバイオリアクターは、アミノ酸、又はタンパク質、又は他の栄養素への経路の酵素をコードする少なくとも１つの内因性又は外来の核酸配列を含む細胞を含み、第２のバイオリアクターは、異なる種由来の微生物を含み、異なる種からの微生物は、少なくとも１つの内因性又は外来の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該バイオリアクターシステムは、本発明の細胞を含む第１のバイオリアクターと、動物プランクトン、並びに／又は微小藻類、酵母、細菌、真菌、動物、及び／若しくは植物の細胞を含む第２のバイオリアクターを含む。いくつかの実施形態において、該システムは、本発明の細胞を含む第１のバイオリアクターと、多細胞動物及び／又は水産養殖を含む第２のタンク又は容器を含む。
【０２４１】
ある実施形態において、本発明の微生物は、水中フィルターフィーダーを供給するために使用される。ある実施形態において、水中フィルターフィーダーは、液体懸濁液から本発明の細胞及び／又は生合成生成物を収集する。ある実施形態において、固体−液体分離及び／又は脱水及び／又はバイオマスの乾燥に関連する費用は、水中フィルターフィーダーの作用によって本発明の細胞及び／又は生合成生成物を収集することによって抑えられる。ホンビノスガイは、２つの短い水管を用いてその殻の内外で水をろ過し、プランクトン、細菌、及び酸素を吸収する軟体動物である。カキは、窒素含有化合物（硝酸塩及びアンモニア）、リン、プランクトン、有機堆積物、細菌、及び溶存有機物を消費し、水からそれらを除去する。本発明のある実施形態において、限定されないが、ホンビノスガイ及び／又はカキなどのフィルターフィーダーが利用される。ある非限定的な実施形態において、イースタン・オイスターＣｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｖｉｒｇｉｎｉｃａが利用される。本発明のある実施形態において、利用するフィルターフィード生物のティラピア及び／又はシルバーコイ及び／又はビッグヘッドコイは、フィルターフィーダーの中に含まれる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＴａｕｂ，Ｂａｌｌａｒｄ，Ｋ，Ｐａｌｍｅｒ，Ｆ．（１９７３）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｂｙ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ａｌｇａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ａｓｓｏｃ．６３；１０−１１（Ａｂｓｔｒ．）及びＴａｕｂ，Ｆ．Ｂ．ら、１９７３、水産養殖飼料としての藻類培養物（Ａｌｇａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｓ  ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｅｅｄ）．漁業研究（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ）を参照されたい。
【０２４２】
本発明のある非限定的な実施形態において、本発明の微生物は、他の生きている生物と共生関係及び／又は栄養関係で維持される。本発明のある非限定的な実施形態において、本発明の微生物は、限定されないが、以下のもの：二枚貝；カキ；ムール貝；及び／又は他の軟体動物；ブラインシュリンプ；動物プランクトン；及び／又はフィルターフィード魚のうちの１以上などのフィルターフィード生物に供給される。ある実施形態において、本発明に従って生成されるタンパク質及び他の栄養素を提供される生物は、バイオリアクター；生物学的スクラバーカラム；充填床リアクター；プラグフロー型リアクター；大だる；タンク及び、特に、水産養殖の従来技術で知られるものなどのタンクシステム、アクアポニクス、及び水耕栽培；蒸解釜；塔屋；池；プール；貯水池；井戸；ラグーン；水槽；洞窟；洞窟；縦抗；及び採石場を含むが、これらに限定されない天然又は人工起源の容器中で成長させることができる。生物を含有する容器の壁、境界、又は構造の裏打ちは、鋼、他の金属及びそれらの合金、プラスチック、繊維ガラス、セラミック、ガラス、コンクリート、セメント、タール、瀝青、シーラント、木材、土壌、砂、粘土、石及びそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない１以上の材料で構成することができる。ある非限定的な実施形態において、限定されないが、フィルターフィード生物などの生物は、おりなどのより開放的な構造で成長させることもできる。
【０２４３】
本発明のある実施形態において、追加の二酸化炭素は、二酸化炭素及び／又は他の溶存炭酸塩が、酸化物又は水酸化物又は溶存金属カチオンを含むが、これらに限定されないミネラルと反応して、炭酸塩又は重炭酸塩生成物を形成する化学合成プロセス工程と直列又は並列で生じるプロセス工程で隔離することができる。ある実施形態において、さらなる二酸化炭素及び／又は他の溶存炭酸塩は、二酸化炭素及び／又溶存重炭酸塩及び／又は溶存炭酸塩及び／又は溶存金属カチオンを、生物学的工程（複数可）内で固体の炭酸塩又はバイオミネラルに変換する生物の触媒作用によって隔離することができる。
【０２４４】
ある実施形態において、自然界で、二酸化炭素及び／又は溶存重炭酸塩及び／又は溶存炭酸塩及び／又は溶存金属カチオンを固体の炭酸塩又はバイオミネラルに変換する１以上の生物は、本発明の微生物由来の微小微生物及び／又は栄養素を与えられる。ある前述の実施形態において、該生物は、殻又は礁の物質を含むが、これらに限定されない物質を含有する炭酸塩を生成する。ある実施形態において、炭酸塩を含有する物質を生成する生物は、フィルターフィーダーである。生成される甲殻類の全量のうち、７５〜９０％は殻からなる場合が多い。これらの殻は、９５％が炭酸カルシウムで構成され、残りは、有機物及び他の化合物である。
【０２４５】
ある非限定的な実施形態において、約９５％の炭酸カルシウム含有量を有する殻物質の７５〜９０重量％で構成される本発明の微生物プロセスで生成される栄養素は、甲殻類を成長させるために使用される。ある実施形態において、炭酸塩を含有する物質を生成する生物には、以下のもの：カキ、ハマグリ、イガイ、他の軟体動物、及びサンゴのうちの１以上が含まれるが、これらに限定されない。ある前述の実施形態において、食用生成物は、限定されないが肉、及び殻を含むがこれに限定されない固体の非食用炭酸塩含有物質などに形成される。ある実施形態において、肉及び殻を生成する生物には、カキ、ハマグリ、イガイ、及び他の軟体動物が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４６】
ある実施形態において、固体の炭酸生体物質に隔離される炭素は、生物の食用部分に含有される炭素を超える。ある実施形態において、殻に隔離される炭素は、本発明に従って生成される微生物バイオマスを、水産養殖餌としての微生物バイオマスを提供することによって食用殻バイオマスに栄養変換する際にＣＯ２として失われる炭素の影響をある程度和らげる。ある実施形態において、殻又はサンゴを含むが、これらに限定されない炭酸塩材料に隔離される炭素は、微生物細胞塊を、殻又はサンゴを含むが、これらに限定されない生物へ栄養的に変換する時に捕捉される炭素において正味の増加があるように、前述の栄養変換で失われる炭素を超える。
【０２４７】
ある実施形態において、本発明によって炭酸塩生体材料に隔離される炭素は、微生物バイオマスに固定される炭素よりもはるかに長期間、大気から隔離される。ある実施形態において、本発明によって炭酸塩生体材料に隔離される炭素は、本発明に従って生成される微生物及び／又はその栄養素を供給される生物の軟組織中に含有される炭素よりもはるかに長期間、大気から隔離される。ある実施形態において、殻及び／又はサンゴを含むが、これらに限定されない炭酸塩生体材料に捕捉される炭素は、１００年を超える間、隔離される。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭ．Ｒ．Ｈａｍｅｓｔｅｒ，Ｐ．Ｓ．Ｂａｌｚｅｒ，及びＤ．Ｂｅｃｋｅｒ，「カキ及びイガイの殻から得られる炭酸カルシウムの特徴付け及びポリプロピレンへの組込み（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｏｙｓｔｅｒ  ａｎｄ  ｍｕｓｓｅｌ  ｓｈｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）」、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．２０４−２０８，２０１２．［オンライン］．利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｌｏ．ｂｒ／ｓｃｉｅｌｏ．ｐｈｐ？ｓｃｒｉｐｔ＝ｓｃｉ＿ａｒｔｔｅｘｔ＆ｐｉｄ＝Ｓ１５１６−１４３９２０１２０００２００００６＆ｎｒｍ＝ｉｓｏ，並びにＧ．−Ｌ．Ｙｏｏｎ，Ｂ．−Ｔ．Ｋｉｍ，Ｂ．−Ｏ．Ｋｉｍ，及びＳ．−Ｈ．Ｈａｎ，「粉砕したカキの殻の化学機械的特徴付け（Ｃｈｅｍｉｃａｌ−ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃｒｕｓｈｅｄ  ｏｙｓｔｅｒ−ｓｈｅｌｌ）」、Ｗａｓｔｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，ｖｏｌ．２３，ｎｏ．９，ｐｐ．８２５−８３４，Ｊａｎ．２００３．［オンライン］．利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｓ０９５６−０５３ｘ（０２）００１５９−９，及び英国スウォンジー大学の持続可能な水産養殖研究センターのＩｎｇｒｉｄ  Ｌｕｐａｔｓｃｈによるプレゼンテーションの表題「生きたＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  Ｍｕｅｌｌｅｒｉを与えた若いパシフィックカキクラソスレアギガスのエネルギーとタンパク質の要求に関する研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｏｎ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  Ｏｆ  Ｊｕｖｅｎｉｌｅ  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｙｓｔｅｒ  Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  Ｇｉｇａｓ  Ｆｅｄ  Ｌｉｖｅ  Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  Ｍｕｅｌｌｅｒｉ）」を参照されたい。
【０２４８】
本発明のある実施形態は、フィルターフィード生物の成長のためのバッチ培養システム若しくは動物プランクトンの連続培養システム及び／又は水産養殖システムに関する。本発明のある非限定的な実施形態には、培養リアクター；リアクター内に動物プランクトン及び／又はフィルターフィード生物を保持するように構成されたスクリーニングシステム；本発明の１以上の微生物が動物プランクトン及び／又はフィルターフィード生物に供給される微生物供給ユニット；ｐＨ調整及び制御システム；並びに酸素送達システムが含まれ得る。ある実施形態において、フィルターフィード生物の卵が収集される。ある実施形態において、収集された卵はブラインシュリンプの卵である。ある実施形態において、ブラインシュリンプの卵は、ブラインシュリンプが育てられる囲いの水面から掬い取られる。ある実施形態において、収集された卵は、次いで、洗浄及び／又は凍結及び／又は塩漬及び／又は処理及び／又は乾燥される。
【０２４９】
本発明のある非限定的な実施形態の追加の特徴は、二酸化炭素及び／又は他のＣ１原料を有機化合物に固定するために、化学合成独立栄養微生物によって使用される供給源、生成、又は電子供与体のリサイクルに関する。二酸化炭素捕捉及び炭素固定に使用される電子供与体は、太陽光発電、太陽熱、風力、水力、原子力、地熱、向上した地熱、海洋熱、海洋波力、潮力を含むが、これらに限定されないいくつかの異なる再生可能及び／又は低炭素放出エネルギー技術からの力を電気化学的又は熱化学的に使用する本発明のある実施形態において生成又はリサイクルすることができる。化学合成独立栄養生物が成長することができる際に、還元される無機化学物質（例えば、Ｈ２、ＣＯ、Ｈ２Ｓ、第１鉄、アンモニウム、Ｍｎ２＋）の多くは、当技術分野で周知の電気化学的及び／又は熱化学的プロセスを用いて、並びに太陽光発電、太陽熱、風力、水力、原子力、地熱、向上した地熱、海洋熱、海洋波力、若しくは潮力を含むが、これらに限定されない様々な二酸化炭素を放出しない若しくは低炭素排出の及び／若しくは再生可能な力の源よって動力が与えられ得る化学工学の科学を用いて容易に生成することができる。
【０２５０】
電子供与体として分子水素を使用する本発明のある実施形態において、Ｈ２は、以下のもの：プロトン交換膜（ＰＥＭ）、ＫＯＨなどの液体電解質、アルカリ電気分解、固体ポリマー電解質電解、高圧電気分解、蒸気の高温電気分解（ＨＴＥＳ）を用いる手法を含むが、これらに限定されない水の電気分解による方法；並びに／又は酸化鉄サイクル、酸化セリウム（ＩＶ）−酸化セリウム（ＩＩＩ）サイクル、亜鉛−酸化亜鉛サイクル、硫黄−ヨウ素サイクル、銅−塩素サイクル、カルシウム−臭素−鉄サイクル、ハイブリッド硫黄サイクルを含むが、これらに限定されない方法による熱化学水分解による方法；並びに／又は硫化水素の電気分解；並びに／又は硫化水素の熱化学分解；並びに／又は炭素の捕捉及び隔離（ＣＣＳ）によるメタン改質、ＣＣＳによる石炭ガス化、Ｋｖａｅｒｎｅｒプロセス及びカーボンブラック生成物を作製する他のプロセス、ＣＣＳによるガス化若しくはバイオマスの熱分解を含むが、これらに限定されない二酸化炭素の排出量が少ない若しくは全くなく水素を生成することが知られている他の電気化学若しくは熱化学プロセスのうちの１以上を含むが、これらに限定されない当技術分野で周知の方法並びに化学及びプロセス工学の科学によって作られる。本発明のある実施形態において、Ｈ２を生成するアプローチには、再生可能電気エネルギー及び／又は低ＧＨＧ源からの電気によって動力が与えられる電気分解が含まれるが、これに限定されない。本発明のある実施形態において、電気分解は、以下のもの：太陽光発電及び／又は太陽熱を含むが、これらに限定されない太陽力；風力、水力；原子力；地熱；向上した地熱；海洋熱；海洋波力；潮力のうちの１以上によって動力が与えられる。
【０２５１】
本発明のある実施形態において、微生物バイオプロセスは、農業又は水産養殖プロセスに統合され、栄養素を提供する。ある実施形態において、前述の農業若しくは水産養殖プロセスの電気及び／又は熱の要件は、再生可能エネルギー及び／又は低ＧＨＧ源からのエネルギーを用いて満たされる。
【０２５２】
本発明のある実施形態において、電気グリッドのためにオフピークの需要時間中に生成される再生可能電力は、該プロセスのためにＨ２原料を生成するために使用される。本発明のある実施形態において、Ｈ２及びＣＯ２ガスの現場貯蔵により、再生可能発電が電気需要を超える期間中にのみ、グリッドからの電力転換が可能になる。ある実施形態において、力は、より高い需要の期間中に、通常通りグリッドに流れるのを可能にする。本発明のある実施形態において、該プロセスは、再生可能電力供給を混乱させるが、むしろ、限定されないが風及び太陽などの再生可能発電容量のより完全な利用を可能にする。本発明のある実施形態は、電気発電がグリッド需要を超える（例えば、オフピークの風又は太陽光発電）期間中でさえ、再生可能な操作及び発電の継続を可能にする。
【０２５３】
本発明のある実施形態において、水素電子供与体は、必ずしも、二酸化炭素をほとんど又は全く排出しないで作られる必要はないが、水素は、化学及びプロセス工学の分野で公知の方法を用いて、廃棄物から、エネルギー及び／又は炭素の持続可能な若しくは価値の低い供給源から生じる。このような方法には、限定されないが、一般に、以下のもの：都市固形廃棄物、黒液、農業廃棄物、木材廃棄物、残留天然ガス、バイオガス、サワーガス、メタンハイドレート、液体石油ガス、石油コークス、タイヤ、下水、肥料、わら、海草及び昆布、並びに価値の低い高リグノセルロースバイオマスのうちの１以上などの原料のガス化、熱分解、蒸気改質、又は自己熱改質が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５４】
本発明のある実施形態において、Ｈ２及び／又はＣＯ及び／又はＣＯ２を含有する合成ガス又はプロデューサーガスは、電子供与体として、かつ／又は炭素源として利用される。ある実施形態において、合成ガス又はプロデューサーガスに含有されるＨ２及び／又はＣＯ及び／又はＣＯ２は、再生可能及び／又は低ＧＨＧエネルギー源並びに本明細書に記載のもののうちの１以上などの変換プロセスを用いて作られるＨ２が補充される。
【０２５５】
ある実施形態において、本発明のバイオプロセス中で使用される電子供与体及び／又は炭素源を作るために使用されるガス化、熱分解、焼却、及び／又は嫌気性消化はまた、微生物バイオプロセス、及び／又は関連する農業若しくは水産養殖システムで利用される、かつ／又はグリッド若しくは施設に提供されるか、又はそうでなければ周囲の消費者に提供される電気及び／又はプロセス熱を含むが、これらに限定されない有用な副生成物を作る。
【０２５６】
ある実施形態において、ガス化、熱分解、又は蒸気改質などの方法による水素及び／又はＣＯの生成の副生成物として作られるプロセス熱は、全エネルギー効率を改善するために変換プロセス中のどこかで回収及び利用される。化学物質及び／又は熱及び／又は電気の副生成物は、例えば、効率を改善するために、本発明のある実施形態の変換プロセス中のどこかで可能な限り使用され得る分子水素及び／又はＣＯの作製を伴い得る。
【０２５７】
ある実施形態において、追加の化学副生成物（例えば、本発明のある実施形態の変換プロセス中で内部的に使用できるものを超える）は、収益の追加の流れを作るために販売用に調製することができる。分子水素及び／又はＣＯの生成における過剰な熱又は電気エネルギー副生成物（例えば、プロセス中で内部的に使用できるものを超える）は、販売用に、例えば、当技術分野で公知の、かつ電気グリッドに販売できる形態の電力へのプロセス熱の変換を含むが、これらに限定されない熱交換及び移送、及び発電及び伝送の科学で周知の手段によって別の化学及び／又は生物学的プロセスで使用するために送達され得る。
【０２５８】
電子供与体としてＨ２を利用する本発明のある実施形態において、再生可能な及び／又はＣＯ２排出のないエネルギー材料を用いるＨ２の作製において形成される化学副生成物が存在し得る。例えば、水は、水素源として使用されると、酸素は、電気分解又は熱化学水分解を含むが、これらに限定されないプロセスによって水分解の副生成物になり得る。水素源としての水及びｋｎａｌｌｇａｓ微生物を用いる本発明のある実施形態において、酸素副生成物の一部は、酸水素反応による呼吸によってＡＴＰ及び／又は他の細胞内エネルギーキャリアーの生成に使用することができる。本発明のある実施形態において、該システム中のｋｎａｌｌｇａｓ微生物及び／又は他の好気性生物による炭素固定並びに有機化合物生成に最適な条件を維持するために、呼吸に必要な過剰量で水分解によって生成される酸素は、当技術分野及び商業的な酸素ガス生成科学で公知のプロセス工程を経て販売に適する形態に処理され得る。
【０２５９】
本発明のある実施形態において、電子供与体はまた、以下のもの：プロセスガス；テールガス；強化された油回収ベントガス；残留天然ガス；バイオガス；埋立地ガス；及びサワーガスのうちの１以上を含むが、これらに限定されない汚染物質若しくは廃棄物から供給されるか、又は精製され得る。本発明のある実施形態において、Ｈ２及び／又はＣＨ４及び／又はＣＯを含有するテールガスは、電子供与体及び／又は炭素の供給源として使用される。ある実施形態において、石油精製からのテールガスは、電子供与体及び／又は炭素の供給源として使用される。
【０２６０】
ある非限定的な実施形態において、たった１つの炭素原子を含有する有機化合物は、バイオマスのガス化及び／又は熱化学及び／又は他の有機物質（例えば、廃棄物若しくは低価値供給源からのバイオマス及び／又は他の有機物質）によって；かつ／又はメタン若しくは天然ガス（例えば、残留天然ガス、又はそうでなければ燃やされるか若しくは大気に放出される天然ガス）、又はバイオガス、又は埋立地ガスのメタン蒸気改質によって作られ、かつシンガス及び／又は他のガス又はＣ１化合物の蒸気として微生物の培養物へ提供され、ある実施形態において、ガスが微生物培養物へ送達される前に、シンガス又はプロデューサーガス中の一酸化炭素に対する水素の比は、水ガスシフト反応などの手段によって調整され得、かつ／又はＣＯ２に対する水素の比は、炭素捕捉などの手段によって調整され得る。
【０２６１】
いくつかの実施形態において、本発明によって生成されるバイオマスは、動物飼料に変換されるか、又は動物飼料配合物に組み込まれるか、又はヒトの栄養源として利用される。
【０２６２】
より高等な植物のかなりの割合が、ヒト及び他の非反芻動物を含むが、これらに限定されない多くの異なる動物に食べられない。これは、望ましくない副産物又は廃棄物へのエネルギー及び炭素のチャネリングを含む多くの不都合をもたらし得る。これは、所望の生成物の収率を低下させ、廃棄物の処理及び処分についてのさらなる負担を追加し得る。
【０２６３】
本発明のある実施形態において、ＣＯ２捕捉及び／又はバイオマス生成の点で同等のより高等な植物作物の流れよりもより大きな炭素及び／又はエネルギーの流れは、目的とするバイオマス生成に向けられる。ある実施形態において、本発明で生成されるバイオマスの食用部分に対する非食用部分の比は、より高等な植物作物の比よりも低い。
【０２６４】
ある実施形態において、人工照明の元で育てられるより高等な植物培養物は、本発明よりも、生成される食用バイオマスの単位重量あたり少なくとも３０倍以上の電力を必要とする。より高等な植物作物の成長サイクルは比較的長く、その結果、食料収穫は定期的であり、消費は、一般的に生成と一致しない。この生成と消費の不一致は、一般的に、廃棄物を防ぐために比較的広範な保存及び保管を必要とする。
【０２６５】
本発明のある実施形態において、本発明の微生物によるバイオマス生成及び動物又は他の従属栄養生物によるバイオマス生成物の消費は、より高等な植物作物に基づく同等のシステムよりも、はるかにより緊密に一致する。本発明のある実施形態において、より高等な植物作物に基づく同等のシステムよりも、より少ないバイオマスの保存及び／又は保管を必要とする。本発明のある実施形態において、同等のより高等な植物作物よりも、食物廃棄物の量はより少ない。
【０２６６】
ある実施形態において、本発明の微生物は、液体培養懸濁液１Ｌあたり目的の炭素系生成物を少なくとも１ｍｇ生成する。いくつかの例において、生成物は、微生物によって培地中に分泌される。他の例において、生成物は、発酵過程中に生物内に保持される。場合によって、生成物は、細胞を溶解し、生成物を分離することによって回収することができる。他の場合において、生成物は、生物から生成物を著しく調製又は精製することなく、無傷の生物内で商業的価値を有し得る。
【０２６７】
ある実施形態において、生合成化学生成物の回収及び／又は水性ブロス溶液からの栄養素の消費は、プロセス工学の分野で公知の装置及び手法を用いて達成され、溶媒抽出；水抽出；蒸留；分別蒸留；セメント固定；化学的沈殿；アルカリ性溶液吸収；活性炭への吸収又は吸着；イオン交換樹脂又は分子篩；溶液のｐＨ及び／又は酸化還元電位の変更、蒸発器、分別結晶器、固体／液体分離器；ナノフィルトレーション、並びにそれらの全ての組み合わせを含むが、これらに限定されない本発明の特定の実施形態の化学生成物に向かうことを目的にさせることができる。
【０２６８】
本発明のある実施形態において、液体懸濁液からの細胞塊の分離が実行される。ある実施形態において、この分離は、微生物培養の分野で公知の方法によって実行される。細胞塊収集手法の例は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる１９９８年１月８日公開のＰＣＴ出願番号ＷＯ０８／００５５８；米国特許第５，８０７，７２２号；同第５，５９３，８８６号及び同第５，８２１，１１１号に提供されており、以下のもの：遠心分離；凝集；浮選；膜、中空糸、螺旋状に巻かれるか、若しくはセラミックのフィルターシステムを用いる濾過；真空濾過；接線フロー濾過；清澄；沈殿；ハイドロサイクロンのうちの１以上を含むが、これらに限定されない。細胞塊がマトリックス上に固定され得るある実施形態において、細胞塊は、重力沈降又は濾過を含むが、これらに限定されない方法によって取集され、擦過又は液体せん断力によって成長基材から分離され得る。
【０２６９】
ある実施形態において、細胞塊の除去後に残っている液体は、バイオプロセスの溶解化学生成物及び／若しくは未反応栄養素の除去並びに／又は回収のためのシステムにポンプで注入され得る。ある実施形態において、未反応の栄養素及び／又は水は、可能な限り回収及びリサイクルされ、かつ／又はある実施形態において、副生成物として販売されるか、かつ／又は適切に廃棄される。ある実施形態において、当技術分野で公知の方法及び技術を用いて廃棄物及び／又は夾雑物並びに／又は任意の阻害性及び／若しくは有害な化合物の除去は、バイオリアクター（複数可）に水及び／又は未反応の栄養素を戻す前に実行される。
【０２７０】
化学合成独立栄養微生物が係る本発明のある実施形態において、酸化金属カチオンの溶液は、化学合成反応工程（複数可）の後に残留し得る。他の非限定的な実施形態において、溶解した金属カチオンに富む溶液はまた、石炭燃焼プラント又は石炭若しくは都市固形廃棄物（ＭＳＷ）のガス化などのプロセスへ運ばれる特定のガス材料中の微粒子及び不純物から生じる得る。
【０２７１】
除去することが都合のよい金属カチオンがプロセス流中に存在する本発明のいくつかの実施形態において、スクラップ鉄、スチールウール、銅若しくは亜鉛ダスト上でのセメント固定；硫化物又は水酸化物の沈殿物としての化学的沈殿；特定の金属をメッキするための電解採取；活性炭又はイオン交換樹脂への吸収、溶液のｐＨ及び／又は酸化還元電位の変更、逆浸透及び／又は溶媒抽出を含むが、これらに限定されない方法によって、プロセス流から金属カチオンが取り除かれ得る。
【０２７２】
ある実施形態において、遊離及び／又は溶解した有機分子は、細胞の排出若しくは分泌又は細胞溶解を含むが、これらに限定されない手段によって微生物からプロセス流溶液に放出され得る。
【０２７３】
ある実施形態において、水溶液からの化学生成物及び／若しくは未反応栄養素の回収並びに／又はリサイクルは、本発明のある実施形態において、プロセス工学の分野で公知の装置及び手法を用いて達成され、溶媒抽出；水抽出；蒸留；分別蒸留；セメント固定；化学的沈殿；アルカリ性溶液吸収；活性炭への吸収又は吸着；イオン交換樹脂又は分子篩；溶液のｐＨ及び／又は酸化還元電位の変更、蒸発器、分別結晶器、固体／液体分離器；ナノフィルトレーション、逆浸透、並びにそれらの全ての組み合わせを含むが、これらに限定されない本発明の特定の実施形態の化学生成物に向かうことを目的にさせることができる。
【０２７４】
ある実施形態において、化学生成物及び／又は未反応栄養素は、他の生物の成長を支持する環境に流れる。ある実施形態において、流出水及び未反応栄養素は、より高等な植物を灌漑及び肥料化するために使用される。ティラピア及び他の水生動物は、培養水からミネラルを吸収することができる。ある実施形態において、未反応ミネラル栄養素は、ティラピア及び／又は他の水生動物の成長環境に流れる。本発明のある実施形態において、無機栄養素は、本発明の化学合成独立栄養バイオリアクターからティラピアを含むが、これに限定されない動物を含有する水産養殖システムに流れ、植物プランクトンを含むが、これに限定されない培養システム中で生きた食料用生物及び植物の生成を刺激する。ある実施形態において、バイオリアクター流出物からの無機及び／又は有機栄養素は、水産養殖及び／若しくはアクアポニクス及び／若しくは水耕栽培で使用される池並びに／又は他の囲いの一次生成を増加させる肥料として機能する。
【０２７５】
ある実施形態において、以下のもの：ＣＯ２、ＣＯ、ＣＨ４、ＣＨ３ＯＨのうちの１以上を含むが、これらに限定されない炭素源から生成される化学合成独立栄養的に作られる本発明のバイオマスは、農業及び／又は水産養殖及び／又はアクアポニクス及び／又は水耕栽培のシステムに流れるか、又はそうでなければ適用され、有機物及び生物堆積物を供給することによって、より高い栄養レベルを直接刺激するのに有機肥料を補充及び／又は置換する。ある実施形態において、前述の有機物は、ティラピアを含むが、これらに限定されない生物堆積物及び植物副産物を餌にすることができる種を含むが、これに限定されない種のためのすぐそばの食料源を表す。
【０２７６】
本発明のある非限定的な実施形態において、化学合成独立栄養的に生成される有機物質の乾燥重量は、魚バイオマスの２〜４％で毎日適用される。これらのうちのある実施形態において、水産養殖の囲いの中のＤＯ及び／又はｐＨ及び／又は水の透明性が監視される。これらのうちのある実施形態において、有機物の投入は、ＤＯが４．０ｍｇ／ｌ未満に低下し、かつ／又はｐＨが９．０を超え、かつ／又は水の透明性が２５ｃｍ未満に低下した時に中断される。
【０２７７】
ある実施形態において、ポリカルチャーは、本発明のバイオリアクターから流れる有機物質及び／又は無機栄養素を供給される。ある実施形態において、ポリカルチャーは、ティラピア及び／又はコイ及び／又はエビを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるナイルティラピア−肥料と施肥、国連食料農業機関（ＦＡＯ）（Ｎｉｌｅ  ｔｉｌａｐｉａ−Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓ  ａｎｄ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎａｔｉｏｎｓ（ＦＡＯ）），ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆａｏ．ｏｒｇ／ｆｉｓｈｅｒｙ／ａｆｆｒｉｓ／ｓｐｅｃｉｅｓ−ｐｒｏｆｉｌｅｓ／ｎｉｌｅ−ｔｉｌａｐｉａ／ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓ−ａｎｄ−ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ／ｅｎ／を参照されたい。
【０２７８】
本発明のある実施形態において、本発明の微生物プロセスで生成される栄養素は、ポリカルチャーが実施される池を施肥するために使用される。ある実施形態において、本発明の微生物プロセスを経て生成される栄養素は、イネを含むがこれに限定されない植物作物を施肥するために使用される。ある実施形態において、本発明の微生物プロセスで生成される栄養素は、以下のもの：フィンフィッシュ、アワビ、甲殻類、海草、ケルプ、及び／又はナマコを含むがこれに限定されない他の無脊椎動物のうちの１以上を含むが、これに限定されない統合多栄養水産養殖システムに供給される。
【０２７９】
ある化学合成独立栄養種が達成できる高い成長率は、光合成微生物にって達成され得るバイオマスの有効単位あたり炭素固定及び／又はバイオマス生成の最高率と一致するか、又はそれを上回るのを可能にすることができる。ある実施形態において、余剰のバイオマスが生成され得る。ある実施形態において、細胞塊の余剰成長は、バイオマス副生成物を生成するために、該システムから取り除くことができる。いくつかの実施形態において、細胞塊の余剰成長は、高い炭素捕捉及び固定率及び／又は原料変換率の継続のために、微生物培養物中の所望の（例えば、最適な）微生物集団及び細胞密度を維持するために、該システムから取り除くことができる。
【０２８０】
ある実施形態において、化学生成物の回収並びに／又は栄養素及び水のリサイクル並びに／又は廃棄物の除去のためのプロセスで使用される化学物質は、ヒトに対して低毒性であり、バイオリアクターに戻されてリサイクルされるプロセス流に晒される場合には、特定の微生物にとって毒性が低いか又は全くない化学物質が本発明のその特定の実施形態において使用される。
【０２８１】
本発明のある実施形態において、過剰の細胞が収集／分離／生成物回収プロセス中に培養物から除去された場合、十分及び／又は最適な細胞数並びに密度がバイオリアクター反応工程（複数可）で保持されるように、過剰の細胞は、特定の場合において、新鮮な栄養培地と共にバイオリアクター内の細胞培養物に戻され得る。ある実施形態において、これは、目的の及び／又は最適な原料変換及び／又は有機化合物の生成を達成することを容易にすることができる。ある実施形態において、収集／分離／生成物回収プロセスによって除去される細胞は、例えば、エアーリフト又は間欠ポンプを用いて、培養容器に戻されてリサイクルすることができる。ある実施形態において、培養容器に戻されてリサイクルされる細胞は、それらの薬剤が微生物に対して無毒である限り、凝集剤に暴露されない。
【０２８２】
バイオマス生成物を有用な生成物に処理することを補助するために、本発明のある実施形態において収集される微生物細胞は、以下のもの：ボールミル、キャビテーション圧力、超音波処理、均質化、又は機械的せん断のうちの１以上を含むが、これらに限定されない周知の方法を用いて破壊することができる。
【０２８３】
いくつかの実施形態において、収集されたバイオマスは、プロセス工程（複数可）中で乾燥され得る。バイオマスの乾燥は、以下のもの：遠心分離、ドラム乾燥、蒸発、凍結乾燥、加熱、噴霧乾燥、真空乾燥、及び／又は真空濾過のうちの１以上を含むが、これらに限定されない周知の技術を用いて本発明のある実施形態において実行することができる。本発明のある実施形態において、廃熱をバイオマスの乾燥に使用することができる。ある実施形態において、炭素源として使用される排ガスの産業資源からの廃熱を、バイオマスの乾燥に使用することができる。ある実施形態において、上記の電子供与体及び／又はＣ１炭素源の生成からの熱副生成物をバイオマスの乾燥に使用することができる。
【０２８４】
本発明のある実施形態においてバイオマスは、有用な生化学物質の分離及び生成を助けるために、乾燥後に、又は先行する乾燥工程を行うことなくさらに処理される。ある実施形態において、この追加の処理は、微生物バイオマスからのタンパク質又は脂質含有量又はビタミン又は他の目的の生化学物質の分離を伴う。ある実施形態において、脂質の分離は、限定されないが、ヘキサン、シクロヘキサン、エチルエーテル、アルコール（イソプロパノール、エタノールなど）、リン酸トリブチル、超臨界二酸化炭素、トリオクチルホスフィンオキシド、第２級及び第３級アミン、又はプロパンのうちの１以上などの脂質を抽出するための非極性溶媒を用いることによって実行することができる。ある実施形態において、他の有用な生化学物質は、クロロホルム、アセトン、酢酸エチル、及びテトラクロロエチレンのうちの１以上を含むが、これらに限定されない溶媒を用いて抽出することができる。
【０２８５】
いくつかの実施形態において、本発明は、アミノ酸生合成経路を含むが、これに限定されない１以上の生化学経路と、炭素含有ガスと、並びにシンガス、プロデューサーガス、ＣＯ２、一酸化炭素及び水素ガスを含有するそれらの混合物などの炭素含有ガス；並びに／又はメタノール及びメタンを含むが、これらに限定されないガス状若しくは液体のＣ１化合物をアミノ酸及び／又はタンパク質に変換する操作されたか又は天然の微生物とをバイオリアクター又は溶液中で組み合わせることによって、アミノ酸及び／又はタンパク質を生成する方法を提供する。いくつかの実施形態において、アミノ酸及び／又はタンパク質は、当技術分野並びに化学、化学工学の科学、及び食料科学で公知のプロセスを用いて動物飼料配合物に含まれている。
【０２８６】
本発明のある実施形態において、本発明によって生成されるタンパク質性バイオマスは、代替タンパク質供給源として使用される。ある実施形態において、それは、魚粉又はカゼイン又は乳清又は大豆ミールの代替物として使用される。本発明のある実施形態において、本発明に従って生成されるタンパク質は、魚粉又はカゼイン又は乳清又は大豆ミール又は他の植物タンパク質の代わりに飼料又は肥料配合物で使用される。本発明のある非限定的な実施形態において、タンパク質生成物は、任意の必須アミノ酸を不足していない。ある非限定的な実施形態において、タンパク質生成物は、リジン及び／又はメチオニンを不足していない。ある非限定的な実施形態において、タンパク質性バイオマスは、著しい量の抗栄養因子を含有しない。ある実施形態において、タンパク質性バイオマスは、著しい量の以下のもの：ゴシポール、グルコシノレート、サポニン、トリプシン阻害剤のうちの１以上を含有しない。ある実施形態において、タンパク質性バイオマスは、Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ  ｎｉｌｏｔｉｃｕｓを含むが、これに限定されない種に適する非従来型タンパク質源として役立つ。
【０２８７】
ｋｎａｌｌｇａｓ微生物の操作は、２０１２年９月１９日出願の表題「脂肪酸の改変のための産業用脂肪酸操作総合システム（ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＦＡＴＴＹ  ＡＣＩＤ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＧＥＮＥＲＡＬ  ＳＹＳＴＥＭ  ＦＯＲ  ＭＯＤＩＦＹＩＮＧ  ＦＡＴＴＹ  ＡＣＩＤＳ）」の米国特許出願第２０１３／００８９８９９号に記載されている。この出願は、全ての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８８】
高エネルギー密度分子中のシンガス、プロデューサーガス、又は他のＨ２及びＣＯ２及び／又はＣＯ含有ガス混合物の変換のためのｋｎａｌｌｇａｓ微生物の使用は、２０１２年１０月２６日出願の表題「非光合成炭素捕捉並びに無機及び／又はＣ１炭素源の有用な有機化合物への変換のための酸水素微生物の使用（ＵＳＥ  ｏｆ  ＯＸＹＨＹＤＲＯＧＥＮ  ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ  ＦＯＲ  ＮＯＮ−ＰＨＯＴＯＳＹＮＴＨＥＴＩＣ  ＣＡＲＢＯＮ  ＣＡＰＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＣＯＮＶＥＲＳＩＯＮ  Ｏｆ  ＩＮＯＲＧＡＮＩＣ  ＡＮＤ／ＯＲ  Ｃ１  ＣＡＲＢＯＮ  ＳＯＵＲＣＥＳ  ＩＮＴＯ  ＵＳＥＦＵＬ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ）」の米国特許出願第２０１３／０１４９７５５号に記載されている。この出願は、全ての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８９】
ＣＯ２の有用な有機化学物質への変換のための化学栄養微生物の使用は、米国特許出願第２０１３／００７８６９０号で公開されており、表題「二酸化炭素及び／又は他の無機炭素源の有機化合物への化学合成固定ための生物学的並びに化学的プロセスを利用する化学合成独立栄養微生物、並びに追加の有用な生成物の作製（ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＰＲＯＣＥＳＳ  ＵＴＩＬＩＺＩＮＧ  ＣＨＥＭＯＡＵＴＯＴＲＯＰＨＩＣ  ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＣＨＥＭＯＳＹＴＨＥＴＩＣ  ＦＩＸＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＣＡＲＢＯＮ  ＤＩＯＸＩＤＥ  ＡＮＤ／ＯＲ  ＯＴＨＥＲ  ＩＮＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＡＲＢＯＮ  ＳＯＵＲＣＥＳ  ＩＮＴＯ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ，ＡＮＤ  ＴＨＥ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ  Ｏｆ  ＡＤＤＩＴＩＯＮＡＬ  ＵＳＥＦＵＬ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ）」の０５／１２／２０１０出願のＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００１４０２に記載されている。この出願は、全ての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２９０】
本発明の態様は、産業用途のための分子の生成に使用するための操作された生物に関する。本明細書で使用する「操作された生物」及び「操作された微生物」及び「非天然微生物」は、互換的に使用され、少なくとも１つの外来遺伝子を含む核酸を組換え発現する生物を指す。いくつかの実施形態において、かかる核酸は、本明細書で論じる酵素をコードする。本発明と関連する遺伝子の相同体及び対立遺伝子は、従来の手法によって特定することができる。本明細書に記載の遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする「プライマー」又は「プライマーセット」と呼ばれる核酸も本発明に包含される。本明細書で使用する用語「ストリンジェントな条件」は、当技術分野で馴染みのパラメーターを指す。核酸ハイブリダイゼーションパラメーターは、かかる方法を収集する参考文献、例えば、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、第４版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０１２、又は分子生物学の現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋで見出され得る。
【０２９１】
本発明のいくつかの実施形態のさらなる特徴は、促進的な（例えば、紫外線又は化学処理を用いた）変異誘発、遺伝子の操作又は改変、ハイブリダイゼーション、合成生物学又は従来の選択的育種を含むが、これらに限定されない人工手段によって本発明の微生物を改変することを考慮する。微生物の可能な改変には、量及び／若しくは質が増強したアミノ酸、並びに／又はビタミン、並びに／又はタンパク質の生成を目的とするものが含まれるが、これらに限定されない。
【０２９２】
プロセス後の変換
動物又は水産養殖の飼料の生成
いくつかの実施形態において、本発明に従って生成されるタンパク質及び／又はタンパク質性バイオマスは、次いで、当技術分野並びに化学、化学工学の科学、及び食品科学で周知の方法並びにプロセスを用いて動物飼料に変換される。ある実施形態において、本発明によって生成される飼料は、以下のもの：他の微生物、酵母、真菌、動物プランクトン、甲殻類又は他の無脊椎動物；魚；鳥；哺乳類のうちの１以上を含むが、これらに限定されない生物を成長させるために使用される。ある非限定的な実施形態において、魚には、ティラピア；サーモン；スギのうちの１以上が含まれるが、これらに限定されない。ある非限定的な実施形態において、鳥には、ニワトリ又はシチメンチョウが含まれるが、これらに限定されない。ある非限定的な実施形態において、哺乳類には、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシのうちの１以上が含まれるが、これらに限定されない。ある非限定的な実施形態において、本発明によって生成される飼料は、順に、生命の最初の数週間にわたってフィンフィッシュの幼虫を維持する生の飼料を成長させるために使用される。ある実施形態において、この生の飼料は動物プランクトンを含む。ある実施形態において、本発明に従って生成される飼料は、以下のもの：ワムシ［輪形動物門］；ミジンコ目（例えば、ミジンコ属、タマミジンコ属）；カイアシ亜綱（例えば、ケンミジンコ）；ブラインシュリンプ（アネミア種）のうちの１以上を含むが、これらに限定されない動物プランクトン生物を成長させるために使用される。
【０２９３】
本発明のいくつかの実施形態において、細菌によって生成されるタンパク質の窒素の９０％超が、アミノ酸又はペプチド又はタンパク質又はタンパク質性バイオマスを消費する生物によって吸収される。いくつかの実施形態において、本発明の微生物細胞は、別の生物に提供される前に煮沸される。他の実施形態において、細胞は、別の生物に提供される前に、超音波処理されるか、又はそうでなければ溶解若しくは破壊される。
【０２９４】
食料生成のためのバイオシステムを利用する主な課題の１つは、タンパク質、炭水化物、及び脂肪の量の適切な食事バランスを取得することである。一般に食料生合成のために考慮される微生物システムは、タンパク質が不均衡に高いバイオマスを生成する傾向にある。本発明のある実施形態において、タンパク質含有量と比較してより高い割合の脂肪及び油を生成する油性株が使用される。ある実施形態において、利用される油性株は、ロドコッカスに属する。
【０２９５】
ある実施形態において、タンパク質含有量と比較してより高い割合の炭水化物又は多糖を生成する炭水化物又は多糖生成株が利用される。ある実施形態において、利用される炭水化物又は多糖生成株は、水素酸化細菌（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ）である。
【０２９６】
炭水化物含有材料の生成
ある実施形態において、本発明によって生成されるタンパク質及び／又は他の栄養素は、貝及び／又はサンゴを含むが、これらに限定されない炭酸塩含有生体材料を生合成する生物を成長させるために使用される。医薬製剤、ポリマー材料の構築又はポリマー材料の充填剤として使用することができるムール貝とカキの殻は、炭酸カルシウムの含有量が高い。
【０２９７】
ある実施形態において、本発明に従って成長したムール貝及び／又はカキの殻及び／又は他の甲殻類及び／又はサンゴの炭酸カルシウムは、構築材料として使用される。ある実施形態において、炭酸カルシウムは凝集体として使用される。
【０２９８】
ある実施形態において、カキ及び／又はハマグリ及び／又はホタテガイの殻を含むが、これらに限定されない本発明に従って生成される貝は、舗装又は垣根として使用される。ある実施形態において、貝は、砂利及び／又は砕石トッピングの代替物として使用される。ある実施形態において、貝は、通路及び／又は小道及び／又はパティオ及び／又は中庭及び／又はボッチェボール（ｂｏｃｃｅ  ｂａｌｌ）のコートを舗装するために使用される。ある実施形態において、カキの殻を含むが、これに限定されない殻は、造園材料及び／又は栄養豊富な土壌改質剤及び／又は天然の害虫抑制剤として使用される。
【０２９９】
ある実施形態において、本発明に従って生成されるカキの殻及び／又は他の殻又は石灰質材料は、建築材料組成物でフライアッシュ及び／又は溶鉱炉と共に利用される。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＧ．−Ｌ．Ｙｏｏｎ，Ｂ．−Ｔ．Ｋｉｍ，Ｂ．−Ｏ．Ｋｉｍ，及びＳ．−Ｈ．Ｈａｎ、「粉砕したカキの殻の化学−機械的特徴（Ｃｈｅｍｉｃａｌ−ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃｒｕｓｈｅｄ  Ｏｙｓｔｅｒ−ｓｈｅｌｌ）」、Ｗａｓｔｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，２３巻，９番，ページ８２５−８３４，Ｊａｎ．２００３．［オンライン］．利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ０９５６−０５３ｘ（０２）００１５９−９，；Ｅ．−Ｉ．Ｙａｎｇ，Ｓ．−Ｔ．Ｙｉ，及びＹ．−Ｍ．Ｌｅｅｍ，「微細凝集体に対して置換されたカキの殻のコンクリート特徴に対する効果（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｏｙｓｔｅｒ  ｓｈｅｌｌ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｆｏｒ  ｆｉｎｅ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｏｎ  ｃｏｎｃｒｅｔｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ：  Ｐａｒｔ  ｉ．ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、Ｃｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｒｅｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５巻，１１番，ページ２１７５−２１８２，Ｎｏｖ．２００５．［オンライン］．利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｍｃｏｎｒｅｓ．２００５．０３．０１６；Ｈ．Ｙｏｏｎ，Ｓ．Ｐａｒｋ，Ｋ．Ｌｅｅ及びＪ．Ｐａｒｋ，「モルタル中の凝集体の代わりのカキの殻（Ｏｙｓｔｅｒ  ｓｈｅｌｌ  ａｓ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｉｎ  ｍｏｒｔａｒ）」、Ｗａｓｔｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２巻，３番，ページ１５８−１７０，ＪＵＮ．２００４．［オンライン］．利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１７７／０７３４２４２ｘ０４０４２４５６を参照されたい。
【０３００】
ある実施形態において、カキの殻を含むが、これに限定されない本発明で生成される殻は、微粉砕され、幹線道路の舗装の成分として使用される。ある実施形態において、タビーは、本発明に従って作られた殻を用いて生成される。ある実施形態において、生石灰生成プロセスで放出されるＣＯ２は、本発明の微生物によって再捕捉され、再利用される。ある実施形態において、シェルクリート（ｓｈｅｌｌｃｒｅｔｅ）は、本発明で生成される殻から作られる。
【０３０１】
ある実施形態において、殻及び／又はサンゴを含むが、これらに限定されない生成された炭酸塩材料は反射する。ある実施形態において、かかる炭酸塩材料はアルベドが高い。ある実施形態において、かかる炭酸塩材料は、地球温暖化を低減するか、又はそれに対抗する反射面及び地球工学に利用される。ある実施形態において、炭酸塩材料は、反射的な垣根に使用される。ある実施形態において、炭酸塩材料は、より明るい色又は反射性の道路及び幹線道路に使用される。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＲ．Ｇ．Ｗａｔｔｓ，「地球規模の気候変動に対する工学的反応（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｃｌｉｍａｔｅ  Ｃｈａｎｇｅ）」：研究開発予定の計画（Ｐｌａｎｎｉｎｇ  ａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ａｇｅｎｄａ），Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，１９９７．［オンライン］．利用可能：ｈｔｔｐｓ：／／ｂｏｏｋｓ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｂｏｏｋｓ？ｉｄ＝ｎＡｒｑ−Ｋ７ＺｉａｃＣを参照されたい。
【０３０２】
ある実施形態において、カキの殻を含むが、これに限定されない本発明に従って作られる石灰質材料は、アスファルトの小さな石用の顆粒を作るために使用される。ある実施形態において、前述の小さな石は、白くされるか、かつ／又は反射性が高められるか、かつ／又はアルベドが増加している。ある実施形態において、カキの殻を含むが、これに限定されない本発明に従って生成される殻は、淡色又は太陽反射アスファルトのトッピングとして使用される。ある非限定的な実施形態において、かかるアスファルトは、ＵＶ分解が低く、かつ／又はより低い温度で維持され、流動する傾向が低いため、ブラックアスファルトよりも長くもつ。ある実施形態において、本発明の殻又は他の炭酸塩材料は、熱反射舗装を生成するために、舗装の上部に空隙を埋めるセメントモルタルに使用される。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳ．Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  ａｎｄ  Ｍ．Ｙａｍａｎａｋａ、持続可能な建設材料及び技術に関する第３回国際会議の「リサイクル材料を用いた舗装表面温度の熱制御（Ｈｅａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐａｖｅｍｅｎｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｃｙｃｌｅｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ）」，Ｐ．Ｃｌａｉｓｓｅ，Ｅ．Ｇａｎｊｉａｎ，及びＴ．Ｎａｉｋ（編）、コヴェントリー大学及び副産物利用のためのウィスコンシン大学ミルウォーキーセンター（Ｃｏｖｅｎｔｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｙ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ），Ｃｏｖｅｎｔｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｙ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ａｕｇ．２０１３．［オンライン］．利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌａｉｓｓｅ．ｉｎｆｏ／Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ．ｈｔｍ，並びにＪｏｈｎ  Ｗ．Ｇａｄｊａ及びＭａｒｔｈａ  Ｇ．ＶａｎＧｅｅｍによるポルトランドセメントコンクリート及びアスファルトセメントコンクリート舗装の６つの環境影響の比較（Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｘ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｐａｃｔｓ  ｏｆ  Ｐｏｒｔｌａｎｄ  Ｃｅｍｅｎｔ  Ｃｏｎｃｒｅｔｅ  ａｎｄ  Ａｓｐｈａｌｔ  Ｃｅｍｅｎｔ  Ｃｏｎｃｒｅｔｅ  Ｐａｖｅｍｅｎｔｓ）を参照されたい。ある実施形態において、本発明に従って生成されるカキの殻を含むが、これらに限定されない石灰質材料は、透水性コンクリート中で凝集体として使用される。ある実施形態において、本発明に従って生成される石灰質材料は、建築材料組成物において、フライアッシュ又は溶鉱炉のスラグなどの、消費前にリサイクルされる他のセメント材料と組み合わせることができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫ．Ｎ．Ｋｅｌｌｅｙ、「透水性コンクリート用の凝集体としてのリサイクルされたカキの殻の使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｒｅｃｙｃｌｅｄ  ｏｙｓｔｅｒ  ｓｈｅｌｌｓ  ａｓ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｆｏｒ  ｐｅｒｖｉｏｕｓ  ｃｏｎｃｒｅｔｅ）」、修士論文のテーマ、フロリダ大学、２００９を参照されたい。ある実施形態において、本発明に従って生成される殻は、検出可能な量のＨｇ及びＰｂを含有しない。ある実施形態において、本発明に従って生成される殻、サンゴ、又は他の炭酸塩材料は、サンゴ礁再建のために使用される。ある実施形態において、本発明に従って生成される殻又は他の炭酸塩材料は、家禽飼料産業に販売される。
【０３０３】
本発明は、図の説明に記載されているか、又は図示されている構成の詳細及び構成要素の配置への適用に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法での実践若しくは実行が可能である。
【０３０４】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、限定するものではない。
【０３０５】
実施例
実施例１
カプリアビダス・ネカトール株ＤＳＭ  ５３１を、成長用の唯一のエネルギー源及び炭素源としてＨ２とＣＯ２とＯ２ガスの混合物で成長させた。
【０３０６】
気密性血清ボトル中でガスの混合物を用いて実行する実験については、以下のプロトコルに従った。
【０３０７】
実験用接種材料：Ｈ２で成長させた別の血清ボトル培養物から取得した５体積％。
【０３０８】
最初にＨ２で成長させた血清ボトル培養物に、溶原ブロス（ＬＢ）で成長させたカプリアビダス・ネカトール接種材料の５％接種を施し、元のＬＢで成長させた培養物の接種後に、Ｈ２／ＣＯ２／Ｏ２ガス混合物で約７２時間成長させた。元のＬＢで成長させた接種材料は、−８０℃で保管したグリセロールストックから回収した。
【０３０９】
ガスでの血清ボトル成長を、栓をして、密封した１６０ｍｌのＷｈｅａｔｏｎ社製ガラス血清ボトル（ＶＷＲ製品番号１６１７１−３８５）中で実行した。液体培地の体積は２０ｍｌであった。これらのボトルを、Ｗｈｅａｔｏｎ社製Ｈａｎｄ−Ｏｐｅｒａｔｅｄ  Ｃｒｉｍｐｅｒ（ＶＷＲ  番号８００７８−９９６）を用いて、ゴム栓（ＶＷＲ  ♯１００４８３−７７４）及びアルミシール（ＶＷＲ  番号８９０４７−００８）で栓をした。２０ｍｌの作業容量には、Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，Ｊａｃｏｂ  Ｋ．Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ（編），１９９２，ｐ．８７、表４に記載の１９ｍｌの最小塩培地（ＭＳＭ）＋１ｍｌの接種材料（すなわち、５％接種材料）を含めた。
【０３１０】
ＭＳＭをボトルに分注し、ガス状化合物を以下のように添加した。滅菌ＭＳＭを、無菌条件下でボトルに移した。５％ガスで培養した接種物を無菌条件下でボトルに接種し、ボトルをゴム栓で栓をして、密封した。ガス混合物を、１５ｐｓｉｇでマニフォールドを通してボトルに添加した。ガス混合物を添加した後、血清ボトルを密封するために、シールをアルミニウムで圧着した。次いで、ボトルを振盪フラスコインキュベーターの中に置いた。
【０３１１】
以下の実験結果を、３０℃、２５０ＲＰＭでインキュベートした１６個の血清ボトル（１４個は実験複製物、２個は対照）から得た。全１６個の血清ボトルを、上記のようにマニフォールドを用いて６７％のＨ２、２４％の空気（４．８％のＯ２）、９％のＣＯ２ガス混合物を同時にパージした。マニフォールドを通して移動したガス組成物を、血清ボトルを連結する前に、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて確認した。ボトルを７つの時点での分析のために使った。それぞれＴ０及び最後の時点で、２つの陰性対照を使った。陰性対照ボトルは、接種物を含まない実験ボトルと同一の調製物を有し、いかなる汚染も、及び／若しくは生物も存在しないこと、又はボトルの上部空間からのガス漏れを検出するために使用した。ガス上部空間の圧力読み取り試料は、液体培地への任意の非生物的ＣＯ２及びＨ２吸収及び／又は漏れによるガス喪失を観察するために、陰性対照にて取得した。
【０３１２】
サンプリング及び分析の手順
全試料を、ボトル実験のためにシリンジ及び針を用いて無菌条件下で取得した。光学密度（ＯＤ）を、１００マイクロリットルの試料を用いて、６５０ｎｍで、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製ＤＵ７２０  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を用いて測定した。
【０３１３】
各時点で、１〜３個の実験複製ボトルを分析に使った。血清ボトル内のガスの消費を、針に連結した圧力計を用いて測定した。上部空間のガス圧を、それぞれ使用したボトルについて測定し、上部空間ガス試料を、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析のために、気密シリンジによって取得した。ＧＣによるガス上部空間試料の分析に、気密シリンジによってＧＣに注入した上部空間ガス試料を１００μＬ使用した。血清ボトル中のＨ２、ＣＯ２、Ｏ２、及びＮ２の上部空間ガス含有量を、各時点で定量化した。ブロスを採取するために、血清ボトルの隔壁をＥｔＯＨでふき、ボトルの全液体含有量を、ボトルの圧力を利用して、３０ｍＬシリンジに吸引した。１００μＬの試料を、６５０ｎｍでのＯＤ測定のためにピペットで取った。試料を４℃で、１５分間、１２，０００ｇで遠心分離した。ペレットを、１０ｍＬの無菌ＰＢＳに再懸濁し、ボルテックスして、予め計量した０．４５μｍフィルターを通して真空濾過した。フィルターを乾燥させ、フィルター＋バイオマスの残余分を秤量し、バイオマスの乾燥重量を決定した。２４時間、６０℃で乾燥させ、デシケーター中で室温まで冷却し、秤量することによって、膜フィルター（０．４５μｍ）上に収集された細胞の乾燥重量を決定した。乾燥及び再秤量のこのサイクルを、重量が一定になるまで継続した。ＯＤとバイオマス密度（体積あたりの乾燥細胞重量）の間に相関関係があった。
【０３１４】
ＯＤとバイオマス密度間の相関を図２に示す。この実験の成長曲線を図３に示す。個々の実験の複製について測定してＯＤをダイアモンドの印で表し、平均のＯＤを実線で表す。対数増殖は、９〜３０時間生じた。成長する培養物によるガスの消費による経時的な上部空間ガス圧の変化を図４に示す。
【０３１５】
上部空間ガスの理想のガス法則（ＰＶ＝ｎＲＴ）を仮定するために、サンプリング時の温度変動を考慮して、ガスの全モルを計算した。各ボトルの上部空間のそれぞれのガスの割合を、ＧＣによって決定した。上部空間ガスの結果及び測定した乾燥重量を用いて、消費したＨ２のモルに対する細胞重量の釣り合いを決定した。図５は、それぞれのボトルについて上部空間圧力測定及びＧＣ分析によって決定したように、各使用ボトルについて測定し、消費したＨ２のモルに対してプロットした乾燥バイオマスを示す。これらの結果は、消費したＨ２あたり６．７〜７．２グラムの乾燥細胞塊が合成され、１ｇのＨ２あたり３．３〜３．６グラムの細胞塊が合成された。
【０３１６】
実施例２
カプリアビダス・ネカトール株ＤＳＭ５３１を、成長のための唯一のエネルギー源及び炭素源としてＨ２、ＣＯ２、及びＯ２の混合物で、乾燥細胞密度１リットルあたり３８グラムまで成長させた。
【０３１７】
攪拌タンクバイオリアクター中にＨ２、ＣＯ２、及びＯ２を含むガス混合物を用いて実行する実験については、以下のプロトコルに従った。
【０３１８】
装置：ＰＥＥＫヘッドプレートを有するカスタムメイドの５００ｍＬのガラス発酵槽を用いて、培養物をバッチで成長させた。温度及びｐＨを、市販の調整器（Ｅｌｅｃｔｒｏｌａｂ，Ｆｅｒｍａｃ  ３６０、英国）で調整し、監視した。磁器攪拌棒と２８０ｍＬ／分の連続リサイクルの組み合わせを、混合のために使用した。リサイクルは、発泡を制御するために、リアクターの底の液体部分から吸引して、噴霧器を通して上部空間に戻すか、又は上部空間ガスをリサイクルし、ブロスの底に泡を形成するように逆に稼働させることができた。ガスの供給は、圧縮Ｈ２、圧縮ＣＯ２及びハウスの空気からのものであり、それぞれ２０ｐｓｉに調節した。Ｈ２及び空気を流量配分器（Ｍａｔｈｅｓｏｎ  Ｇ２−４Ｄ１５１−Ｅ４０１／Ｅ４０１、２０ｐｓｉ）に送達し、ガスの相対的な割合を設定した。次いで、Ｈ２／空気ガス混合物を、可変面積流量計を介して各発酵槽に送達した。同じＨ２／空気組成物の各発酵槽への流速は、流量計のニードル弁によって調整することができた。ＣＯ２ガスを、各発酵槽の個々の可変面積流量計へ分配及び送達した。ＣＯ２及びＨ２／空気ラインを発酵槽に送達される単一ラインにつなぐ。圧力計を用いて、発酵槽へのガス送達圧力を監視した。ガスを、４つの２ミクロン拡散石（ｐ／ｎ  ＫＥＧ５９２，ｈｔｔｐ：／／ｍｏｒｅｂｅｅｒ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ−ｓｔｏｎｅ−２−ｍｉｃｒｏｎ−ｏｘｙｇｅｎ．ｈｔｍｌ）を介して発酵槽ブロス中で混合し、リアクターからコンデンサーを介して泡があふれたボトルへ、次いで、排気システムへ放出した。
【０３１９】
培地：この実験に使用した培地を実施例１に記載する。ｐＨ調整を２ＮのＮＨ４ＯＨ又は２ＮのＮａＯＨを用いて行った。２ＮのＮＨ４ＯＨは、５ＭのＮＨ４ＯＨ、Ｆｌｕｋｅ  ３１８６１２（４℃保存（１２０ｍＬ）＋オートクレーブしたミリＱ−Ｈ２Ｏ）（１８０ｍＬ）から調製した。
【０３２０】
自己栄養接種物：カプリアビダス・ネカトールＤＳＭ５３１接種物を、Ｈ２／ＣＯ２／Ｏ２成長血清ボトル培養物から取得した。接種物を、−８０℃で保管したＤＳＭＺ５３１株の０．５ｍＬの保存グリセロールストックから調製した。再生培養を、実施例１に記載の血清ボトルプロトコルに従って、Ｈ２／ＣＯ２／Ｏ２ガス混合物で開始し、０．５ｍＬのグリセロールストックを、気密血清ボトル中の２０ｍＬの最小塩培地（ＭＳＭ）に添加した。次いで、この最初の血清ボトルを、標準のＨ２／ＣＯ２／Ｏ２上部空間ガス下で、２個の血清ボトル中で１ｍＬ〜２０ｍＬの新鮮なＭＳＭに継代培養した。これらの血清ボトルを３０℃、２５０ＲＰＭでインキュベートした。ガスでのグリセロールストックからの最初の再生に２日かかり、継代培養は成長するのにもう１日かかった。２個の血清ボトル培養物をバイオリアクターの接種物として提供した。接種物の光学密度（ＯＤ）をＤＮＡ分析用の試料と同様に取得した。ガスで成長させた接種物のＯＤは、約１であった。発酵槽には、最初のＯＤが約０．１になるように接種した。言い換えると、血清ボトルのブロスを、バイオリアクター中で１：１０の比で希釈した。接種物を、６０ｍＬのシリンジを用いて血清ボトルからバイオリアクターに移した。接種後、Ｔ０のＯＤを取得した。一般に、全てのＯＤ測定を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製ＤＵ７２０  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を用いて行った。
【０３２１】
発酵槽の操作：
塩基添加−ｐＨを２ＮのＮＨ４ＯＨで調整した。
泡の制御−泡が上部空間の１／２超を満たした場合は、上部空間噴霧又は再循環による制御を行わず、消泡剤を用いた（Ａ８０１１，Ｓｉｇｍａ  Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｃ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ，ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｓｉｇｍａ／ａ８０１１？ｌａｎｇ＝ｅｎ＆ｒｅｇｉｏｎ＝ＵＳ）。
栄養素の修正−ＮＨ４ＯＨの塩基添加によって提供される窒素栄養素に加えて、他のミネラル栄養素を稼働中に添加し、成長を延長させ、ミネラル栄養素の制限が生じるのを防いだ。
【０３２２】
実施例６に、このプロトコルに従ってＨ２／ＣＯ２／Ｏ２ガス基質で成長させたｋｎａｌｌｇａｓ微生物カプリアビダス・ネカトールの成長曲線の例を与える。Ｈ２／ＣＯ２／Ｏ２ガス基質での成長からの、６５０ｎｍで測定した最終ＯＤは１３２であり、最終乾燥バイオマス密度は３８グラム／リットルであった。対数増殖は最初の１．５日続いたが、バイオマスは、５日目の稼働の終了時にはまだ線形速度で蓄積していた。
【０３２３】
実施例３
ロドコッカス属の微生物及びカプリアビダス属の微生物を、異なる炭素源での成長能力について試験した（図７）。３０℃で、ＬＢ寒天プレート上で成長させた株のコロニーを、３〜２０日間、３０ＯＣ、２５０ｒｐｍで、示した１０％（ｖ／ｖ）の培地を含有するフラスコに移した。Ｒ．オパクス株ＤＳＭ  ４４１９３は、４０ｇ／Ｌのグルコースを補充したＭＳＭ培地（１Ｌの培地Ａ：１Ｌあたり９ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ、１．５ｇ  Ｈ２ＰＯ４、１．０ｇ  ＮＨ４Ｃｌ及び０．２ｇ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ；１０ｍｌの培地Ｂ：１００ｍｌあたり５０ｍｇのクエン酸第二鉄アンモニウム及び１００ｍｇのＣａＣｌ２；１０ｍｌの培地Ｃ：１００ｍｌあたり５ｇ  ＮａＨＣＯ３；並びに１ｍｌの微量ミネラル溶液：１Ｌあたり１００ｍｇ  ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、３０ｍｇ  ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、３００ｍｇ  Ｈ３ＢＯ３、２００ｍｇ  ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ  ＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ  ＮｉＣｌ２．６Ｈ２Ｏ及び３０ｍｇ  Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ）で、６５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定した時に、従属栄養増殖条件下でのみ成長を示した。Ｒ．オパクス株ＤＳＭ  ４３２０５は、従属栄養増殖条件下で同一の成長速度を示し、Ｏ．Ｄ＝９．０に達した。株ＤＳＭ  ４３２０５はまた、化学合成独立栄養条件（６６．７％のＨ２、９．５％のＣＯ２、５％のＯ２及び１８．８％のＮ２を補充したＭＳＭ培地）で成長することができた。ロドコッカス種（ＤＳＭ  ３３４６）は、従属栄養条件及び化学合成独立栄養条件（ＤＳＭＺ培地８１：無機栄養成長用の１Ｌのミネラル培地：１Ｌあたり２．９ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、２．３ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ  ＮＨ４Ｃｌ、０．５ｇ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ  ＮａＨＣＯ３、０．０１ｇ  ＣａＣｌ２．Ｈ２Ｏ及び０．０５ｇ  Ｆｅ（ＮＨ４）クエン酸；並びに８０％のＨ２、１０％のＣＯ２及び１０％のＯ２を補充した５ｍｌの微量ミネラル溶液）下で成長を示した。カプリアビダス・ネカトール（ＤＳＭ  ５３１）は、従属栄養条件及び化学合成独立栄養条件下（株ＤＳＭ  ４３２０５について記載した培地）で成長することができた（図７）。ｐＳｅｑＣＯ２で形質転換したカプリアビダス・ネカトール（ＤＳＭ  ５３１）は、３００、４００、及び５００μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充したＬＢ培地で成長することができ、それぞれＯＤ６００は１．４７、１．５２及び１．５１を示した。非形質転換細胞は、対照（ＬＢのみ）で成長を示し、一部は、３００μｇ／ｍｌのカナマイシンで成長したが、４００、及び５００μｇ／ｍｌのカナマイシンでの成長は検出されなかった。
【０３２４】
実施例４
実験の１グループにおいて、３０℃で、ＬＢ寒天プレート上で成長させたロドコッカス株のコロニーを、示した成長培地及びガス混合物を含有する気密血清ボトルに移した。（元のＬＢ成長接種物を、前もって、−８０℃で保管したグリセロールストックから回収した。）ガスでの血清ボトル成長を、栓をして、密封した１６０ｍｌのＷｈｅａｔｏｎ社製ガラス血清ボトル（ＶＷＲ製品番号１６１７１−３８５）中で行った。液体培地の体積は１０〜２０ｍｌであった。ボトルを、Ｗｈｅａｔｏｎ社製Ｈａｎｄ−Ｏｐｅｒａｔｅｄ  Ｃｒｉｍｐｅｒ（ＶＷＲ  ♯８００７８−９９６）を用いて、ゴム栓（ＶＷＲ  ♯１００４８３−７７４）及びアルミニウムシール（ＶＷＲ  ♯  ８９０４７−００８）で栓をした。無菌成長培地を無菌条件下でボトルに移した。接種物を無菌条件下でボトルに導入し、ボトルをゴム栓で栓をして、密封した。ガス混合物をボトルに添加した。ガス混合物を添加した後、血清ボトルを密封するために、シールをアルミニウムで圧着した。次いで、ボトルを振盪フラスコインキュベーター中に置いた。ボトルを３０℃、２５０ＲＰＭでインキュベートした。全ての試料を、シリンジ及び針を用いて無菌条件下で採取した。成長を、６５０ｎｍの分光光度計で光学密度（ＯＤ）の測定により評価した。
【０３２５】
ロドコッカス・オパクス株ＤＳＭ  ４３２０５は、以下の培地：６６．７％  Ｈ２、９．５％  ＣＯ２、５％  Ｏ２及び１８．８％  Ｎ２を含有するガス混合物を補充したＭＳＭ培地（１Ｌの培地Ａ：１Ｌあたり９ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ、１．５ｇ  Ｈ２ＰＯ４、１．０ｇ  ＮＨ４Ｃｌ及び０．２ｇ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ；１０ｍｌの培地Ｂ：１００ｍｌあたり５０ｍｇのクエン酸第二鉄アンモニウム及び１００ｍｇのＣａＣｌ２；１０ｍｌの培地Ｃ：１００ｍｌあたり５ｇ  ＮａＨＣＯ３；並びに１ｍｌの微量ミネラル溶液：１Ｌあたり１００ｍｇ  ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、３０ｍｇ  ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、３００ｍｇ  Ｈ３ＢＯ３、２００ｍｇ  ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ  ＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ  ＮｉＣｌ２．６Ｈ２Ｏ及び３０ｍｇ  Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ）中で、化学合成独立栄養条件下で成長を示した。液体体積は２０ｍｌであり、ガス上部空間体積は１４０ｍＬであった。
【０３２６】
ロドコッカス種ＤＳＭ  ３３４６は、以下の培地：８０％のＨ２、１０％のＣＯ２及び１０％のＯ２を含有するガス混合物を補充したＤＳＭＺ培地８１（無機栄養成長用の１Ｌのミネラル培地：１Ｌあたり２．９ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、２．３ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ  ＮＨ４Ｃｌ、０．５ｇ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ  ＮａＨＣＯ３、０．０１ｇ  ＣａＣｌ２．Ｈ２Ｏ及び０．０５ｇ  Ｆｅ（ＮＨ４）クエン酸；並びに５ｍｌの微量ミネラル溶液）中で、化学合成独立栄養条件下で成長を示した。液体体積は１０ｍＬであり、ガス上部空間体積は１５０ｍＬであった。
【０３２７】
細胞を７２時間後に取集し、各株によって生成されるトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）などの中性脂質中に含有される脂肪酸のプロファイルを、ガスクロマトグラフィー及び質量分析（ＧＣ／ＭＳ）によって決定した。ＤＳＭ  ４３２０５の脂肪酸プロファイルを図８に示し、ＤＳＭ  ３３４６の脂肪酸プロファイルを図９に示した。図８及び図９は、ｘ軸上に特定の脂肪酸鎖の種類を、ｙ軸上に脂肪酸鎖のそれぞれの種類が中性脂質画分から回収した全量の脂肪酸に寄与する割合を示す。ＤＳＭ４３２０５は、全脂肪酸の画分として、１６、１７及び１８個の炭素の脂肪酸をそれぞれ３６％、６％及び２７％生成した。ＤＳＭ  ３３４６は、全脂肪酸の画分として、１６、１７及び１８個の炭素の脂肪酸をそれぞれ６６％、４％、及び２７％生成した。
【０３２８】
実施例５
ロドコッカス・オパクス株ＤＳＭ  ４３２０５を、上記のように、ＭＳＭ培地及びＨ２／ＣＯ２／Ｏ２ガス混合物を用いてバイオリアクター中で培養した。ガス混合物の組成は、６６．７％  Ｈ２、９．５％  ＣＯ２、５％  Ｏ２及び１８．８％  Ｎ２であった。細胞塊を、遠心分離によって培養物の上清から分離した。上清を廃棄し、クロロホルム／メタノール（Ｃ／Ｍ）抽出をバイオマスペレットで行った。バイオマスからの粗抽出物の重量分析により、バイオマスの４０％がクロロホルム／メタノールに可溶性の脂質を含み、１４％がヘキサンに可溶性の脂質を含むことが示された。脂質をシリカ−６０カラムに塗布し、異なる脂質基を分離し、ヘキサン、クロロホルム、イソプロパノール、メタノール及びアセトンを含む有機溶媒でカラムから抽出した。非脂肪酸脂質をメチル化するために弱アルカリメチル化を行い、脂肪酸をメチル化するために酸メチル化を行った。脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）によって分析した。
【０３２９】
ＦＡＭＥ分析については、化合物を、ＨＰ１  ６０ｍカラム×０．２５ｍｍ  ＩＤを有するＡｇｉｌｅｎｔ社製６８９０Ｎ  ＧＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で検出した。試料を、５０Ｌのヘキサンの最終量で、ＧＣバイアルインサートに入れた。試料を、温度が２５０℃の自動注入器を用いて注入し、１００℃の初期ＧＣ温度でスプリットモート（ｓｐｌｉｔ  ｍｏｔｅ）（８：１）で稼働させ、１０℃／分で１５０℃の最終温度まで上昇させ、次いで、３℃／分で２５０℃まで、最後に１０℃／分で３１２℃まで上昇させ、７分間保持する。ＮＩＳＴ０８ライブラリー及び既知の標準物質（Ｓｕｐｅｌｃｏ  ３７  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＦＡＭＥ  Ｍｉｘ）との比較を通してピークＩＤを得た。注入（ウンデカン酸メチル）前に各試料に添加した外部標準物質によって定量化を行い、抽出効率を、内部標準物質（１，２−ジノナデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン）によって定量化した。
【０３３０】
ＧＣ−ＭＳ分析により、ガス混合物と共に培養したロドコッカス・オパクス株ＤＳＭ  ４３２０５はトリアシルグリセロールを生成し、パルミチン酸（Ｃ１６：１、９−ヘキサデセン酸としても知られる）及びバクセン酸（Ｃ１８：１、１１−オクタデセン酸としても知られる）を含めて多量のオメガ−７脂肪酸を含有していることが明らかになった。脂質含有量のさらなる分析により、全脂肪酸含有量の画分として、１３％  Ｃ１６：１  オメガ７脂肪酸（パルミトレイン酸）及び２１％  Ｃ１８：１  オメガ７脂肪酸（バクセン酸）が示された。
【０３３１】
実施例６
ロドコッカス・オパクス株ＤＳＭ  ４３２０５を、１リットルボトル中での成長のための唯一のエネルギー源及び炭素源としてＨ２とＣＯ２とＯ２のガス混合物で成長させた。接種物を、−８０℃で保管した水＋ＭＳＭストックアリコートから回収した。使用した培地は、上記のＭＳＭであった。−８０℃で保管したストックからのアリコートを、小さな血清ボトル中のＭＳＭ（２０ｍｌ）に接種した。ガスでの血清ボトル成長を、６７％のＨ２、２４％の空気（４．８％  Ｏ２）、９％のＣＯ２からなるガス混合物を有する栓をして、密封した１６０ｍｌのＷｈｅａｔｏｎ社製ガラス血清ボトル中で上記のように行った。ボトルを、振盪フラスコインキュベーターに入れ、３０℃、２５０ＲＰＭでインキュベートした。
【０３３２】
成長のおおよそ７２時間後に、高密度の継代培養接種物を、遠心分離し、新鮮なＭＳＭに再懸濁することによってガス血清ボトル培養物から調製した。高密度接種物を、ガスの流入及び流出を可能にする２つのバルブを有する気密キャップ付きの１Ｌガラスボトル中１００ｍｌのＭＳＭに接種した。以下の割合：Ｈ２：７１％；Ｏ２：４．２％；Ｎ２：１５．８％；ＣＯ２：９．０％のガス混合物を、１Ｌボトルの上部空間に提供した。
【０３３３】
ガス添加後、密封した１リットルボトルを、２８℃、２００ｒｐｍの振盪フラスコインキュベーターに入れた。ガスを１日１回交換した。６５０ｎｍの最終ＯＤがＯＤ＝１．２７に達するまで、培養物をガスで成長させた。
【０３３４】
最終培養物の株のアイデンティティーを確認するために、１Ｌボトル中のガスで成長させた後に回収した最終細胞にて、ＤＮＡ配列決定を行った。１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を、２７Ｆ及び８００Ｒプライマーを用いて決定した。両方のプライマーで、上位のＢＬＡＳＴヒットを、それぞれＧｅｎＢａｎｋ番号がＥＵ１２７４５２．１、ＡＢ０３２５６５．１、及びＡＹ９４００３８．１であるロドコッカス種、ロドコッカス・オパクス、ロドコッカス・ラティスラビエンシスと特定した。
【０３３５】
実施例７
多くの酸水素種は、公的に利用可能であるか、又は上記の手法を用いて単離することができる。例えば、少なくとも２３８種の異なるロドコッカス株及び少なくとも５５種の異なるカプリアビダス株が、公共ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）株保管庫から利用可能であり、ハイドロゲノビブリオ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、キサントバクター（ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、及びハイドロゲノサームス（ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｈｅｒｍｕｓ）を含む酸水素微生物を含む多くの他の属からの株が利用可能である。酸水素株はまた、濃縮法を用いて、土壌試料又は地熱流体試料からの単離などの日常的なプロセスによって取得することができる。
【０３３６】
請求項の化学合成条件下での酸水素成長、並びにアミノ酸及びタンパク質を含むが、これらに限定されない炭素数がＣ５又はそれ以上のものを含む有機化合物を生成する能力についての株の試験は、当技術分野では日常的である。例えば、炭素源としてＣＯ２を用いる酸水素条件下で成長するロドコッカス株の能力を、上記の実施例４〜６に記載したように実行することができる。炭素源としてＣＯ２を用いる酸水素（ｋｎａｌｌｇａｓ）条件下で成長させる他の方法は、「好熱性細菌（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、Ｊａｋｏｂ  Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ、第５章、第ＩＩＩ節、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９２、ｐｐ．８６−８８に記載されており、広範な属由来の多種多様な株で同様に機能することが判明している。酸水素種によって化学合成的に生成されるものなどの有機化合物の生成の評価も、当技術分野で日常的である。例えば、ガスクロマトグラフィー及び質量分析（ＧＣ／ＭＳ）を、実施例５に記載のように用いることができる。他の方法には、Ｗａｌｔｅｒｍａｎｎら（２０００）の「高価値単一細胞油の新しい供給源としてのロドコッカス・オパクス株ＰＤ６３０  トリアシルグリセロール及び他の貯蔵脂質の単離及び特徴付け（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＰＤ６３０  ａｓ  ａ  ｎｅｗ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｖａｌｕｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｏｉｌ？  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｌｉｐｉｄｓ）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６：１１４３−１１４９に記載の脂質抽出、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び質量分析（ＭＳ）が含まれる。
【０３３７】
実施例８
約５キログラムのバイオマス（乾燥重量）が、成長のための唯一のエネルギー源及び炭素源としてＨ２、ＣＯ２、及びＯ２ガス混合物で成長させたカプリアビダス・ネカトール株ＤＳＭ  ５３１によって生成された。このバイオマスから、ヘキサン可溶性油を抽出し、分析した。以下のプロトコルを、攪拌タンクバイオリアクター中でＨ２、ＣＯ２、及びＯ２原料からバイオマスを生成し、次いで、バイオマスから油を抽出するのに使用した。
【０３３８】
装置：Ｃ．ネカトール培養物を、Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）の２つの２０リットルリアクターを用いてバッチで成長させた。
【０３３９】
バイオリアクター：各バイオリアクターは、エラストマーシールを有するステンレス鋼ヘッドプレートを支持台上に取り付けたガラス容器からなっていた。ヘッドプレートは、多数のフィードスルーポートを有しており、それらの全ては、リアクターを出入りするガスの漏れを防ぐためにエラストマーシールを有していた。これらのフィードスルーは、サーモウェル、ｐＨプローブ、溶存酸素プローブ、ガス注入口、液体注入口、ガス出口、液体サンプリングポートを備え、より多くのものがヘッドプレート上に取り付けられる。
【０３４０】
バイオリアクターセンサー：サーモウェルに位置する温度プローブを用いて、温度を監視し、ヒーターの制御を可能にした。ｐＨプローブを用いて、ｐＨを監視し、必要であれば、より多くの又はより少ないｐＨ緩衝溶液のリアクターへの添加を制御した。泡センサーを用いて、消泡剤の添加を制御した。溶存酸素プローブを用いて、リアクターの液体中の酸素レベルを測定し、攪拌又はリアクターへのガス流の開／閉を制御することができた。全てのセンサーは、バイオリアクターコントローラー／制御盤によって動き、制御され、そこに材料を提供した。
【０３４１】
攪拌：撹拌機は、完全密封及び磁気結合でヘッドプレートを通過した。撹拌機は、攪拌軸の外部部分の周囲に適合する別々のアイテムである外部モーターを有していた。モーターの速度を、回転速度の正確な制御を可能にする外部コントローラーによって制御した。
【０３４２】
加熱／冷却：リアクターを、バイオリアクターシステムコントローラーによりＰｔ１００温度プローブによって制御される閉ループ比例−積分−微分コントローラー（ＰＩＤ）を用いる外部電熱ブランケットによって加熱した。温度を維持するために、撹拌モーターによる培地の過熱を防ぐために、冷却フィンガーも取り付けた。
【０３４３】
バイオリアクターの取り付け：バイオリアクターシステムを、金属三脚ホルダー上に取り付けた。クランプ又はチェーンを用いて、この三脚を、ドラフトチャンバー内に位置するストラットマウンティングに接着させ、リアクターが倒れるのを防いだ。三脚全体及びリアクターセットアップを浅いプラスチック容器に入れ、二次封じ込めを設けた。
【０３４４】
バイオリアクター及び支持システムの模式図を図１０に示す。２つの２０Ｌのバイオリアクターを、図１１に示すようにドラフトチャンバーに位置付けた。バイオリアクターを、水素ガスの放出を含むドラフトチャンバー内に設置した。制御及びガス供給源の全てを、ドラフトチャンバー並びにガスシリンダー、リアクターコントローラー、質量流量計、水素センサー、及びガス制御バルブの外に位置付けた。図１１に示すのは、唯一のエネルギー源及び炭素源としてのＨ２、ＣＯ２、及びＯ２ガスでのＣ．ネカトールの成長中に使用する２つの２０Ｌのリアクターである。
【０３４５】
コントローラー／制御盤：バイオリアクターシステムのコントローラー／制御盤は、バイオリアクターシステムを制御及び操作する構成要素を含有していた。これらのユニットは、電源、温度制御、攪拌制御、センサーから受け取ったインプット、センサーインプットに基づく供給ポンプのスイッチのオン及びオフ（酸、塩基、消泡剤、及び追加の栄養素）を提供し、電磁弁及びロータメータでのガス流のオン／オフに使用した。全てのステンレス鋼構成要素を欠くために、これらのユニットは、水素漏れのリスクを最小限に抑えるために水素の制御に使用しなかった。コントローラー／制御盤ユニットは、バイオリアクターから離れたドラフトチャンバーの外に位置付け、漏れの場合は、水素への暴露を最小限にし、作業者がバイオリアクターの周りで直接作業するのに費やす時間を最小限に抑えた。図１２は、リアクターを稼働するのに使用したＡｐｐｌｉｋｏｎ社製のコントローラー及び制御盤を示す。図１２に含まれるのは、コントローラー、制御盤、攪拌機制御、爆発性ガス検出システム、質量流量計、レベルコントローラー、塩基制御貯蔵所、培地添加貯蔵所、及び泡制御貯蔵所である。リアクター制御の全ては、ドラフトチャンバーの外に位置付けた。
【０３４６】
ガス送達：ガスを、ヘッドプレートを通過するスパージャーセットアップを介してバイオリアクターの底部に送達した。リアクターのすぐ外側に位置するバルブは、各リアクターで別々にガス流を手動でとめるのを可能にした。リアクターに取り付けたガス供給ラインは、汚染の可能性を最小限に抑えるために、リアクター頭部に設置した０．２ミクロンフィルターを有する柔軟なステンレス鋼ラインであった。ドラフトチャンバーの外に位置付けた質量流量計を用いて、リアクターへの流速を制御した。シリンダーと質量流量計の間のラインは、手動と自動の両方でのガスの遮断のための手動バルブと電磁弁の両方を有していた。実験室又はドラフトチャンバー内で水素が検出された場合、ガス流を自動的に停止する爆発性ガスセンサーに電磁弁を連結した。
【０３４７】
ガスの貯蔵：ガスキャビネットを用いて、水素シリンダーを収容した。ガスキャビネットを、適切な位置に取り付け、換気及びスプリンクラーを含めた。キャビネットには、古いシリンダーから新しいシリンダーへの簡単な切り替えを可能にする複数のシリンダーを収容する十分な場所が含まれていた。
【０３４８】
安全制御：爆発性ガス検出器を用いて、実験室内の水素の存在を決定した。複数のセンサーを、実験室の周囲及びドラフトチャンバー内の計画的な位置に位置付けた。これらのガス検知器を、水素が検出された場合に、ガス送達ライン上の電磁弁を遮断し、リアクターへのガスの流れを遮断するように構成した。
【０３４９】
ペリスタポンプ：追加のペリスタポンプをドラフトチャンバー内に位置付けた。このポンプを用いて、バッチ稼働の開始時にリアクターに新鮮な培地を移し、バッチ稼働の終了時に培地及びバイオマスを除去した。
【０３５０】
培地の貯蔵：プラスチックカーボーイ又はガラスボトルを用いて、バッチ稼働後に回収した新鮮な培地及びバイオマスを貯蔵した。
【０３５１】
培地：この実験に使用したＭＳＭ培地は、好熱性細菌（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，Ｊａｃｏｂ  Ｋ．Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ（編），１９９２、ｐ．８７、表４に記載されている。
【０３５２】
接種物：カプリアビダス・ネカトール接種物を、ＤＳＭＺ  ５３１株について−８０℃で保管した０．５ｍＬの保存グリセロールストックから調製した。再生培養を、実施例１に記載の血清ボトルプロトコルに従ってＨ２／ＣＯ２／Ｏ２ガス混合物で開始し、０．５ｍＬのグリセロールストックを気密血清ボトル中の２０ｍＬの最小塩培地（ＭＳＭ）に添加した。接種物を、無菌移送キャップアセンブリが装備されている単一無菌培地ボトルにバイオセーフティーキャビネットの内側で組み合わされる複数の容器に提供した。ＯＤ及び接種物のストリークを取得した。次いで、接種物を、無菌移送管及びペリスタポンプを用いてリアクターに移した。リアクターに接種した後、バッチの開始ＯＤを、試料アセンブリを用いて取得した。
【０３５３】
培地調製及び添加：培地の全てを、２０リットルの規模に必要なより多くの量を除いて、好熱性細菌（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，Ｊａｃｏｂ  Ｋ．Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ（編），１９９２、ｐ．８７、表４に提供される方法を用いて調製した。主な培地成分（Ａ）を、無菌液体移送キャップ及びフィルターアセンブリが装備されている２０リットルのＮａｌｇｅｎｅカーボーイ中で調製した。培地をカーボーイ中でオートクレーブし、汚染を防ぐために、無菌の管及びペリスタポンプを用いてオートクレーブしたリアクターに移した。より少ない培地成分（Ｂ及びＤ）を、より大きな貯蔵所で調製し、単回使用の無菌の０．２ミクロンフィルターを通して隔壁を用いてリアクターに直接溶液を注入することによって滅菌した。隔壁を用いることで、リアクターを開けるのを避けられるため、汚染のリスクを最小限に抑えられた。４番目に少ない培地成分（Ｃ）は、無菌移送キャップが装備されているより大きな貯蔵所に培地を入れ、オートクレーブし、培地を無菌の管お及びペリスタポンプを用いて移送するという点で、Ａと同様に扱った。
【０３５４】
バイオリアクターの準備及び起動：新鮮な接種バッチを開始する前に、バイオリアクターをオートクレーブして準備した。リアクターのヘッドプレートを適切な位置に取り付けた。移送ラインを連結し、固定し、末端をホイルでカバーし、オートクレーブテープで密封した。流入ガスを滅菌するために、スパージャーのガス注入口に０．２ミクロンフィルターを連結した。ベントラインを固定し、ホイルで密封した。サーモウェル、コンデンサー、泡レベルプローブ、冷却コイル、サンプリング装置、調節可能な液体引き抜き管、及び溶存酸素プローブを設置した。ｐＨプローブ用のポートを覆い、ホイルで密封した。次いで、リアクターを、乾燥サイクルで、６０分間、１３１℃でオートクレーブした。ｐＨプローブを、素早い火炎殺菌、エタノールとＵＶ光の組み合わせで滅菌した。バイオリアクターをオートクレーブし、室温まで冷却した後、ｐＨプローブをリアクターに挿入したが、リアクターとプローブの両方は、バイオセーフティーキャビネット内に存在した。次いで、リアクターをドラフトチャンバー内に取り付け、すなわち、冷却ライン、移送ライン、電子制御、ヒーター、攪拌モーターなどは全て連結した。できるだけ速く、培地成分Ａをリアクターに移し、ｐＨプローブを乾燥させる時間を最小限に抑えた。温度制御及び攪拌、必要であれば、冷却水もスイッチを入れた。培地の温度が所望の温度に達すると、培地成分Ｂ、Ｃ、及びＤを上記の方法によってリアクターに移した。次いで、ｐＨ制御を開始した。
【０３５５】
バイオリアクター接種：新鮮な接種を上記のように行った。いくつかの稼働で、次のバッチに接種するために使用される、典型的には１リットル未満の残量を除いて、前のバッチからの培地及びバイオマスをペリスタポンプによって除去した。培養物のバルクの除去後に、前のバッチからの残量を接種した時に、滅菌培地成分Ａを、室温で、バイオリアクターに移し、加熱を始めた。次いで、培地成分Ｂ、Ｃ、及びＤの残りを上記の方法によって移した。次いで、ガス流のスイッチを入れ、攪拌速度を上げ、ｐＨ制御のスイッチをオンにした。この時点で、稼働が開始したと判断し、最初のＯＤを取得した。リアクターが動作温度に達した後に、冷却のスイッチをオンにした。
【０３５６】
ガス組成及び流速：ガス組成は６６．７％  Ｈ２、２３．８％  空気、５％  Ｏ２、９．５％  ＣＯ２であった。比を、質量流量コントローラーを用いて制御した。ガス流速は、全ガス流の０．０５〜０．３ＶＶＭの範囲であった。典型的な流速は、両方のリアクターが動作し、泡が制御された時に、週末に０．０５ＶＶＭ及び１週間０．２ＶＶＭであった。泡制御を使用しなかった稼働では、０．０５〜０．０７５ＶＶＭの典型的な値を使用して、管理可能なレベルまで泡を減らした。
【０３５７】
ｐＨ制御：水酸化アンモニウム（２．０Ｍ）を用いて、バイオリアクター中の培地のｐＨを制御した。滅菌移送キャップ及びフィルターアセンブリを装備した２リットルの培地ボトル中で１２００ｍＬのミリＱ水をオートクレーブし、バイオセーフティーキャビネット内にフィルター滅菌した５．０Ｍの水酸化アンモニウムを８００ｍＬ添加することによって水酸化アンモニウム溶液を調製した。水酸化アンモニウムを、ｐＨプローブシグナルを用いてバイオリアクターコントローラーによって制御されるペリスタポンプによってリアクターに自動的に移した。
【０３５８】
栄養素の追加／変更：使用した栄養素変更溶液は、初期培地に使用したものと同じであるが、量が異なった。成長を延長し、ミネラル栄養素制限が生じるのを防ぐために、ミネラル栄養素を稼働中に添加した。変更溶液を、シリンジを用いてリアクターに直接添加し、０．２ミクロンフィルターを通して滅菌するか、又はペリスタポンプを用いてリアクターに連結された状態の滅菌管を通して添加した。リアクターの全量も、約１５．５Ｌの作業量を維持するために、少量のリアクター培地及びバイオマスを除去することによって定期的に（典型的には毎日）手動調節した。これは、安定した混合速度を維持し、オーバーフローを防ぐために、栄養素変更及び細胞呼吸による水の生成からの水の追加を補うために行った。
【０３５９】
サンプリング：培地溶液の一部を、液体試料アセンブリによってバイオリアクターから一定間隔で採取した。これらを用いて、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  ＰｌｕｓでのＯＤ６００測定を行い、かつＤＮＡ分析用の小型微量高速遠心機にかけた試料を提供した。小型微量高速遠心機にかけた試料を１０分間、１００００ｒｐｍで回転させ、デカントして、−２０℃で保管した。
【０３６０】
泡制御：約１５のＯＤに達した後、泡は上部空間を満たし始め、制御しなければ、０．２ＶＶＭのガス流速を用いた時に、一晩で、泡は２リットルのオーバーフロー貯蔵所を容易に満杯にするだろう。泡センサーを用いて、泡の存在を決定し、シリコン系消泡剤エマルジョン溶液を送達するポンプのスイッチを入れた。必要であれば、バッチ１１及び１２においてガス流速及び攪拌器の速度を調節し、過剰な泡の構築を防いだ。０．０５ＶＶＭ〜０．０７５ＶＶＭのガス流速で、バイオリアクターは、消泡剤なしで動作することができた。しかしながら、泡は上部空間を満たし、ガス出口を介して泡オーバーフロー容器に少量が流れ出た。
【０３６１】
温度、ｐＨ、及びＯＤを監視し、記録した。細胞純度を、画線プレートを用いて監視した。Ｃ．ネカトールを用いて、２０リットル規模で、全９バッチを行った。バッチの最終光学密度（ＯＤ）は、典型的には、３０〜５０であった。これらの２０リットルバッチの結果を、以下の表１にまとめる。
【０３６２】
【表１】
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【０３６３】
バッチのうちの８個が３９より高い最終ＯＤに達し、より低いガス流で稼働した１個（番号１１）は３０のＯＤに達し、低い攪拌速度に制限した１つのバッチ（番号５）のみが６．７のＯＤに達した。最高ＯＤ５０に達したのは、バッチ番号７であった。培養ブロスからの、成長させた全てのバイオマスを遠心分離した。
【０３６４】
バイオマスの遠心分離及び保管：Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製Ａｌｌｅｇｒａ  Ｘ−１２Ｒ遠心分離器を用いて、バイオマスを回収するために、バッチから収集したブロスを遠心分離した。Ａｌｌｅｇｒａ−１２Ｒは、−１０℃まで冷却でき、３，７５０ｒｐｍが可能なＳＸ４７５０スイングバケットローターを装備し、３Ｌ容量を有する。バッチ後、バイオマス及び培地を、ペリスタポンプを用いてバイオリアクターから１０リットルのポリプロピレンジェリー缶に移した。バイオマス及び培地のジェリー缶を、遠心分離まで冷蔵庫で保管した。バイオマスを、４つの７５０ｍＬポリカーボネート遠心ボトルに分けて、一度に３リットルを遠心分離した。遠心分離を、３０分間、４℃で、３，７５０ｒｐｍで動作させた。上清をデカントして取り除き、廃棄前に漂白剤で殺菌した。単一バッチの脱水バイオマスを組み合わせ、ポリプロピレンボトルで冷蔵庫保管した。
【０３６５】
実施例９
カプリアビダス・ネカトールの細胞破壊及び湿ったバイオマスからの油の抽出
湿った細胞物質試料からの効率的な油抽出を、以下に記載のイソプロパノール／ヘキサン油抽出手順を用いて行った。この手順を用いて、粗ヘキサン抽出物を、唯一の炭素源としてのＣＯ２で成長させたＣ．ネカトールのバイオマスから回収し、それから微生物油を取得した。図１３は、油及びポリマーを含む、Ｃ．ネカトールからの粗ヘキサン抽出物を含有する試験管を示す。図１４は、唯一の炭素源としてのＣＯ２並びに唯一の水素源及び電子源としてのＨ２で成長させたＣ．ネカトールから抽出した油試料を示す。
【０３６６】
湿ったバイオマスの水分含有量を推定するために、２つの空のバイアルにラベルをし、重量を記録して、湿った１グラムのバイオマスをそれぞれのバイアルに割り当て、真空オーブン（Ｂｉｎｄｅｒ  Ｓａｆｅｔｙ真空オーブン、モデルＶＤＬ  １１５−９０３０−００４０）を用いて６０℃で、１２時間乾燥させた。試料を二重に調べた。
【０３６７】
溶媒のヘキサン及び２−プロパノールを用いて脂質抽出のプロセスパラメータ及び動作条件を調べるために、湿ったバイオマスの１０ｇ（Ａ１）及び９．４ｇ（Ａ２）を、それぞれ３３．５ｍＬ及び３１．５ｍＬの２−プロパノール中で混合した。次いで、細胞懸濁液を２５０ｍＬのビーカーに移し、ビーカーを氷浴上に置き、２０分間、バッチモードで超音波処理した。湿ったバイオマスを、完全に細胞を破壊するために２−プロパノールで超音波処理し、微生物細胞から油を回収した。ＱＳｏｎｉｃａ  Ｑ７００超音波破砕機を用いた。温度プローブをビーカーに浸し、超音波中の温度変化を記録した。超音波破砕機又は超音波を用いた細胞の破壊は、細胞溶解の非常に一般的な方法であり、超音波は、２０ｋＨｚ〜数ギガヘルツの周波数を有する周期的な音圧波である。低圧力サイクル中、高強度超音波は、液体中に小さな真空泡を作る。泡は、エネルギーを吸収することができなくなる容積に達した時に、高圧サイクル中に激しく破裂し、生じるせん断力が細胞膜を破壊する。図１５に示すように、細胞の完全破壊後に、バイオマスの色は、茶色からクリーム色に変化した。超音波処理前のバイオマススラリーを図１５の左側に示し、超音波処理後を右側に示す。最初のバイオマス懸濁液は粘性を示したが、超音波処理後は、おそらく、巨大分子せん断効果により試料の粘性は低下した。
【０３６８】
２−プロパノール中の超音波処理による細胞溶解後に、３３．５ｍＬ及び３１．５ｍＬのヘキサンをそれぞれＡ１及びＡ２に添加し、１時間、６０℃でインキュベートした。混合物を１００ｒｐｍで攪拌した。１時間の反応時間後、試料を遠心管に移し、卓上遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社のｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｒ）を用いて１５分間、３２００ｇで遠心分離した。ヘキサン、２−プロパノール、及び溶解した油、脂質及びポリマーの混合物である上清をＲｏｔａｖａｐフラスコに移し、ロータリーエバポレーター（Ｒｏｔａｖａｐ  Ｒ−２１０／２１５）を用いて６０℃で蒸留した。ヘキサン及び２−プロパノールを、６０℃で、２００ミリバール未満の真空圧力で蒸発させた。ヘキサン及び２−プロパノールの蒸発後に、約４グラムの黄色油を回収した。一段階蒸留は、ポリマーから油を分離せず、代わりに、黄色ポリマーと油の混合物を混合フラスコ内で固化した。ヘキサンを添加し、ポリマーから油を溶解するために使用し、黄色ポリマーを沈殿させ、二段階蒸留を行い、油を単離し、回収した。
【０３６９】
バッチあたり２００〜２５０グラムの湿ったバイオマス抽出
小規模抽出結果を確認した後、大規模抽出の作業を始めた。４ｋｇの湿ったＣ．ネカトールバイオマスを抽出用の２０のバッチ（バッチあたり０．２ｋｇ）に分け、各バッチを振盪フラスコに移した。各フラスコに６５０ｍｌのイソプロパノールを添加した。湿ったバイオマス１．５グラムあたり５ｍＬの２−プロパノール溶媒を使用した。バイオマスを２−プロパノールと十分に混合し、均一な懸濁液を作製した。
【０３７０】
均一な懸濁液を作製した後、超音波を用いて、細胞を溶解した。完全に細胞を破壊するために、ＱＳｏｎｉｃａ  Ｑ７００超音波破砕機を連続モードで動作させた。超音波破砕機のｆｌｏｃｅｌｌをホーンに取り付け、ｆｌｏｃｅｌｌの入口及び出口ポートに管を連結した。ｆｌｏｃｅｌｌの入口管をペリスタポンプに通し、バイオマス懸濁液を含有するフラスコに浸し、ｆｌｏｃｅｌｌの出口管を同じフラスコに置き、循環させた。完全細胞破壊を実行するために、湿ったバイオマス１グラムあたり１〜１．２ｋＪのエネルギーを失った。温度プローブを試料ビーカーに浸し、超音波処理中の温度変化を記録した。
【０３７１】
４ｋｇの材料から作った２０部のそれぞれを、各１分の超音波破砕の間に３０秒間隔をあけ、３０分間、１００％振幅のバッチモードで超音波処理した。
【０３７２】
２−プロパノールを用いた超音波処理後に、湿ったバイオマス１グラムあたり５ｍＬのヘキサンを添加し、次いで、Ｋｕｈｎｅｒ  Ｓｈａｋｅｒ  Ｘを用いて、１時間、６０℃で試料をインキュベートした。６５０ｍｌのヘキサンを各バッチに添加し、次いで、６０℃で、６０分間インキュベートした。
【０３７３】
試料を遠心管に移し、１５分間、３２００ｇでＥｐｐｅｎｄｏｒｆ社製ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｒを用いて遠心分離した。バイオマスの各バッチを４×４００ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ社製ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｒ管に分配した。遠心分離機の回転速度を、１８ｃｍのローター半径について３２００ｇに値する４０００ｒｐｍに設定した。
【０３７４】
細胞ペレットを分離した後、有機抽出物、すなわち、上清をロータリーエバポレーター（Ｒｏｔａｖａｐ）混合フラスコに移した。Ｒｏｔａｖａｐを用いて、ヘキサン及び２−プロパノールから油及びポリマーを分離した。ヘキサン及び２−プロパノールを６０℃、１００〜２００ミリバールで蒸発させ、油を溶媒で乾燥させた。ヘキサン及び２−プロパノールを、６０℃での加熱浴によって加熱した。Ｒｏｔａｖａｐの混合フラスコは、高速蒸発に効果的な熱を伝達し、局所的な過熱を防ぎ、滑らかな有機抽出物の混合をもたらした。蒸発フラスコを均等に回転させ、蒸気管はヘキサン及び２−プロパノールの蒸気形態をコンデンサーに輸送した。受け取るフラスコに、濃縮したヘキサン及び２−プロパノールを集めた。ヘキサン及び２−プロパノールの沸騰温度は、それぞれ１０１３ミリバールで６９及び８２℃である。しかしながら、ヘキサン及び２−プロパノールは、それぞれ４０℃で１２０及び３６０ミリバールで蒸留することができる。蒸発性能は、蒸留圧力、加熱浴温度及び回転速度及び蒸発フラスコのサイズに依存することが観察される。
【０３７５】
大規模抽出のために、１００ミリバールの真空圧力及び６０℃の水過熱浴で最適蒸留条件に達したが、ヘキサン及び２−プロパノールを蒸発させた後、黄色ポリマー／油混合物が混合フラスコ内に残った。油を黄色ポリマーから分離するために、ヘキサンを再添加し、次いで、ポリマーを遠心分離により分離した。
【０３７６】
ポリマー／油／ヘキサン混合物を、１０分間、６０℃まで再加熱し、遠心管に移し、５分間、３２００ｒｐｍで回転させた。再加熱及び遠心分離後、油を分離し、単離して、分析した。油抽出物は、パーム油の主成分であるパルミチン酸を含むほとんど飽和及びモノ不飽和のＣ１６並びにＣ１８脂肪酸を含有することが判明した。乾燥バイオマス約１ｋｇに相当する４ｋｇの湿ったＣ．ネカトールバイオマスから８０グラムの粗ヘキサン抽出物（すなわち、ヘキサン可溶性油）を回収した。
【０３７７】
この節に記載の方法に従って、水素、電子、及び炭素の唯一の供給源としてＨ２並びにＣＯ２から生成された様々なカプリアビダス・ネカトールの試料から合計で約２３０ｍｌの油を抽出した。これは、約２１０グラムの油に相当する。この合計の中で、約１６０ｍｌ（約１４０グラム）の油を、この節に記載の２０リットルのバッチ稼働によって生成した試料から抽出し、残りを、Ｈ２／ＣＯ２基質での他の連続バッチ稼働から抽出した。
【０３７８】
粗油抽出物の分析
ＣＯ２から生成され、Ｃ．ネカトールから抽出された油を、ケイ酸カラム上に添加し、中性脂質（ＮＬ）、極性脂質（ＰＬ）及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の画分に分離した。各画分の脂質を、最初にメチルエステルに変換することによるアシル鎖分布について分析し、次いで、ガスクロマトグラフィーによって分析した。個々のピークの分子量をＧＣ／ＭＳによって確認した。脂肪族アシル炭素鎖分布についてのメチルエステルの重量パーセンテージ（重量％）を、分析用標準物質から確立された相対的応答係数を利用するピーク面積の総数から計算した。図１６は、カプリアビダス・ネカトールから抽出した油に存在する脂肪酸の鎖の長さのプロファイルを示す。油の主成分は、パルミチン酸であるＣ１６：０である。パルミチン酸はまた、パーム油の主成分である。
【０３７９】
油抽出後に残った残留バイオマスは、ＰＨＢ及びタンパク質が高いことが判明した。
【０３８０】
実施例１０
シンガス原料、又はその成分からのアミノ酸の生成
カプリアビダス・ネカトール株ＤＳＭ  ５３１及びＤＳＭ  ５４１を、Ｈ２／ＣＯ２／Ｏ２ガス混合物及びミネラル塩発酵培地を用いて培養した。培養物を、６６．７％  Ｈ２、９．５％  ＣＯ２、５％  Ｏ２及び１８．８％  Ｎ２を補充した血清ボトル中２０ｍｌのＭＳＭ培地（１Ｌの培地Ａ：１Ｌあたり９ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ、１．５ｇ  Ｈ２ＰＯ４、１．０ｇ  ＮＨ４Ｃｌ及び０．２ｇ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ；１０ｍｌの培地Ｂ：１００ｍｌあたり５０ｍｇのクエン酸第二鉄アンモニウム及び１００ｍｇのＣａＣｌ２；１０ｍｌの培地Ｃ：１００ｍｌあたり５ｇ  ＮａＨＣＯ３；並びに１ｍｌの微量ミネラル溶液：１Ｌあたり１００ｍｇ  ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、３０ｍｇ  ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、３００ｍｇ  Ｈ３ＢＯ３、２００ｍｇ  ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ  ＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ  ＮｉＣｌ２．６Ｈ２Ｏ及び３０ｍｇ  Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ）で、３０℃、２００ｒｐｍで、９６時間成長させた。
【０３８１】
成長培地中でのリジン検出について、１ｍｌの細胞（ＯＤ＝０．１）を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５分、室温）によって分離し、上清（２００マイクロリットル）をさらに濾過した（０．２２ミクロン）。上清試料を収集し、表２に示すように、リジン、チロシン、及びフェニルアラニンを含むアミノ酸などのアミノ含有化合物の分泌について分析した。リジンは６個の炭素分子であり、チロシン及びフェニルアラニンは９個の炭素分子である。Ｃ．ネカトール株ＤＳＭ５４１は、Ｃ．ネカトール株ＤＳＭ５３１と比較してより高い濃度のリジン、チロシン、及びフェニルアラニンを培地に分泌したことが観察された。２００μｌの滅菌濾過発酵培地にて分析を行った。化合物を単離し、浄化及び誘導体化キット（例えば、ＥＺ−ＦａａＳＴ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いて誘導体化し、その後、液体クロマトグラフィー−質量分析を行って、細菌株によって培地に分泌された化合物を分離及び特定した（表２）。ＤＳＭ５４１からの培地中で見出されたリジンレベルは、ＤＳＭ５３１よりも１２５倍高かった。
【０３８２】
【表２】
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【０３８３】
実施例１１
ヒドロゲノビブリオ・マリナス株ＤＳＭ  １１２７１を、乾燥細胞密度１リットルあたり８グラムを超えるまで、成長のための唯一のエネルギー源及び炭素源としてのＨ２、ＣＯ２、及びＯ２ガスの混合物で成長させた。攪拌タンクバイオリアクター中にＨ２、ＣＯ２、及びＯ２を含むガスの混合物を用いて行う実験については、以下のプロトコルに従った。
【０３８４】
装置：ＰＥＥＫヘッドプレートを有するカスタムメイドの５００ｍＬガラス発酵槽；０．２μｍのフィルターを有するガス送達用の管に連結された１つの多孔質ガラスフリットを有するスパージチューブ；変更送達用の隔壁ポート；無菌サンプリングアセンブリを有する底までの浸漬管、ガス出口に０．２μｍのフィルターを有するオーバーフロー容器への管を介して連結されたコンデンサー；滅菌シリンジに適合するルアーを有する基材送達用ポート及び基材送達用管；接地プローブ；消泡剤送達用ポート；ｐＨ／温度プローブ；酸化／還元プローブ（ＯＲＰ）を用いて、培養物をバッチで成長させた。市販のコントローラー（Ｅｌｅｃｔｒｏｌａｂ，Ｆｅｒｍａｃ  ３６０，イギリス）を用いて、温度は３７℃に制御し、ｐＨは６．５に制御した。目標温度を、リアクターの底部上の加熱パッド及び冷却水用の一体型ガラスジャケットによって維持した。ｐＨを、６ＮのＮＨ４ＯＨを用いて６．５に維持した。リアクターを攪拌プレート（ＶＷＲ  １２３６５−３４４）上に置き、磁器攪拌棒（十字型、ＶＷＲ  「ｓｐｉｎｐｌｕｓ」  番号５８９４７−８２８）を混合のために使用した。攪拌プレートを３００〜４００ＲＰＭに設定した。バイオリアクター中のガス流速は１ＶＶＭであった。ガス供給は、それぞれ２０ｐｓｉに調節された圧縮Ｈ２、圧縮ＣＯ２及び建物の空気からであった。Ｈ２及びＣＯ２は、ガスの相対的な割合を設定するフロープロポーショナー（Ｍａｔｈｅｓｏｎ  Ｇ２−４Ｄ１５１−Ｅ４０１／Ｅ４０１，２０ｐｓｉ）に送達される。空気は、可変面積流量計（Ｋｅｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  １Ｇ０３＿Ｒ５）に送達された。フロープロポーショナーからのＨ２／ＣＯ２ガス混合物を、空気に混ぜ、次いで、可変面積流量計を介して発酵槽に送達した。圧力計を用いて、発酵槽へのガス送達圧力を監視した。注入ガスを０．２μｍのフィルター（Ｐａｌｌ，ｐ／ｎ  ４２５１）を通して流し、次いで、１つの多孔性パイレックスフリット（４０〜６０μｍ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＣＬＳ３９５３３１２−Ｃ）を介して発酵ブロスに分散させ、コンデンサー（カバー付き及び冷却済み）を介してリアクターから２Ｌの泡オーバーフローボトルへ、次いで、別の０．２μフィルター（Ｐａｌｌ，ｐ／ｎ  ４２５１）を通って、最後に排気システムへ排気した。ＣＯ２の流れを最低ｃ．ｌ．＝５（ｃ．ｌ．＝フロントの中心線）に設定し、他のガスを、目標のガス組成を達成するように設定し、流量計テーブルに従って計算し、ＧＣによって組成を測定し、調節及び再測定した。ｃ．ｌ．Ｈ２＝２５、ｃ．ｌ．空気＝４５を用いて、それぞれＣＯ２／Ｏ２／Ｈ２が１１／６．３／５９の割合を有するガス混合物をもたらした。流入及び流出ラインにおけるＯ２の継続的な監視をフォクシー（Ｆｏｘｙ）プローブを用いて行った。その時々のガス試料をＧＣ分析のために（１Ｌのホイルバッグ、ｓｋｃｉｎｃ．ｃｏｍ  ｐ／ｎ  ２６２−０１に）取得した。
【０３８５】
培地：１リットルの基本培地に、２．０ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．０ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、５．０ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２９．３ｇ  ＮａＣｌ、０．２ｇ  ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、１０．０ｍｇ  ＣａＣｌ２、１０．０ｍｇ  ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．６ｍｇ  ＮｉＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、及び２．０ｍｌの微量元素溶液を含めた。微量元素溶液をＴｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，Ｊａｃｏｂ  Ｋ．Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ（編），１９９２，ｐ．８７、表４から取得した。
【０３８６】
自己栄養接種物：ガスで成長させた１０％接種用接種物を、５０ｍＬの液体培地を含有するストッパー付きの２つの５００ｍｌボトルに調製した。ＯＤ６００が０．７５の６１．５ｍＬ量の接種物を、上部空間での分散を防止するために液体レベル以下まで、浸漬管を介してバイオリアクターに注入した。浸漬管の中に閉じ込められた接種物を除去するために、接種後にこのラインに濾過空気を流した。
【０３８７】
発酵槽の操作：塩基添加−ｐＨを６Ｎ  ＮＨ４ＯＨで調整した；栄養素の変更−ＮＨ４ＯＨの塩基添加によって提供される窒素栄養素に加えて、ブロスのＯＤ＝３の時に、０．２グラムのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏを添加し、ブロスのＯＤ＝１０の時に、２グラムのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏを添加した。流入Ｏ２は約５％であると測定され、流出Ｏ２は３〜４％の範囲であった。試料を、２５ｍＬのボトルを有する無菌サンプリングシステムを用いてリアクターの底に伸びる管から取り出した。ＤＮＡ配列決定の結果から、稼働中に毎日画線し、寒天プレート上で成長したのはＨ．ｍａｒｉｎｕｓと確認され、汚染は観察されなかった。
【０３８８】
表３は、稼働中の様々な時点で測定した細胞乾燥重量（ＣＤＷ）を示す。ＣＤＷ密度は、５日間で８グラム／リットルを超えた。クロロホルム／メタノール可溶性脂質、ヘキサン可溶性脂質の含有量も、それぞれ様々な時点でサンプリングしたバイオマスのパーセンテージとして表３に示す。上記の方法を用いてＧＣ／ＭＳによって分析すると、脂質は、１４〜２０個の炭素長の範囲の脂肪酸を含有することが判明した。
【０３８９】
【表３】
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【０３９０】
実施例１２
ロドシュードモナス・カプシュラータ株ＤＳＭ  １７１０を、成長のための唯一のエネルギー源及び炭素源としてＨ２、ＣＯ２、及びＯ２ガスの混合物でＯＤ４．５まで成長させた。ガスの連続流を供給する１リットルの密封ボトル中にＨ２、ＣＯ２、及びＯ２を含むガスの混合物を用いて行う実験については、以下のプロトコルに従った。
【０３９１】
装置：培養物を、培養ボトルとして使用するために再使用される１リットルの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）溶媒送達ボトルを含むカスタムメイドのシステムを用いて、バッチで成長させた。これらの１リットル培養ボトルに、ガスタンク；ガス混合器；フィルター（０．２ミクロン）；流量計；及び加湿器のシステムから連続的にガスを供給した。このガス送達システム及び培養ボトルは、図１８に模式的に示されている。ガスを、多孔質ガラスフリットを用いて、溶液に分配及び混合した。培養ボトルは２００ｍＬの液体培地を含有しており、光が培地を透過するのを防ぐためにアルミホイルを巻いた。温度を、水浴に培養ボトルを浸すことによって制御した。化学緩衝液を培地に含めること以外に、ｐＨは調節しなかった。ガスを、０．２ミクロンフィルターを通して培養ボトルから排気し、システム全体をドラフトチャンバー内に設置した。ガス供給は、圧縮したＨ２とＣＯ２のガス混合物、並びに別のタンクの圧縮Ｏ２からであった。実験目的のガス混合物は、１０％  Ｏ２、５％  ＣＯ２、及び８５％  Ｈ２であった。Ｈ２／ＣＯ２ガスタンク混合物からの流量計を２５に設定し、Ｏ２からの流量計を３４に設定した。これにより、ＧＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ−８Ａ，ＴＣＤ検出器、及びＡｌｌｔｅｃｈ  ＣＴＲ  Ｉカラム）によって測定した時に１０．５％  Ｏ２、５％  ＣＯ２、及び８４．５％  Ｈ２のガス混合物が生じ、実験を行うのに十分に類似した目的混合物と判断した。
【０３９２】
培地：９７０ｍｌ  ＤＩ水；２０ｍｇ  Ｎａ２．ＥＤＴＡ；１２ｍｇ  ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ；２００ｍｇ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ；７５ｍｇ  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ；１ｇ  ＮａＣｌ；１ｇ  （ＮＨ４）２ＳＯ４；１ｍｇのチアミンＨＣｌ；１５ｇのビオチン；１ｍｌの微量元素溶液。微量元素溶液：２５０ｍＬ  ＤＩ水；７００ｍｇ  Ｈ３ＢＯ３；３９８ｍｇ  ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ；１８８ｍｇ  Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ；６０ｍｇ  ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ；１０ｍｇ  Ｃｕ（ＮＯ３）２。ｐＨを、オートクレーブ前に７．２に調節した。オートクレーブ後に、３０ｍｌの滅菌溶液に１．２ｇ  ＫＨ２ＰＯ４及び１．８ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４を添加した。ｐＨ＝７．２に戻るように、ｐＨを再び調節した。
【０３９３】
接種物：２５０ｒｐｍの振盪で、光の中で光従属栄養成長させたＲ．カプシュラータ培養物からもたらされた１０％接種物。Ｗａｌｌ，Ｊ．Ｄ．，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｂ．Ｃ．，Ｇｅｓｔ，Ｈ．（１９７７）、窒素代謝に欠陥のあるロドシュードモナス・カプシュラータの多面発現変異体（Ａ  Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃａｐｓｕｌａｔａ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）  Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１５：２５９−２６３に与えられるＲＣＶＢ培地を、暗緑色を呈した接種物の光従属栄養成長のために使用した。次に、この光従属栄養成長接種物を、−８０℃で保管した株のグリセロールストックから始めた。
【０３９４】
操作：１０％接種物の開始ＯＤは０．１５であった。ガスでの成長の８日後に、ＯＤは４．５に達した。ＯＤを、６５０ｎｍでＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＵ７２０  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を用いて測定した。光従属栄養成長培養物の色は、暗赤色であった。Ａｘｉｏｓｋｏｐ研究顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）での位相差光学を用いて、湿った培養物のマウントが観察された。イメージング及びデータ記録のためのＰｉｃｔｕｒｅＦｒａｍｅ（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ；  Ｇａｌｅｔａ，ＣＡ）ソフトウエアを用いるＭａｃｒｏＦＩＲＥ装置（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ；Ｇａｌｅｔａ，ＣＡ）により顕微鏡写真を作成した。Ｒ．カプシュラータの顕微鏡写真を図１９に示す。光従属栄養成長後に、培養物を１５分間、４℃、１０，０００ｇで遠心分離した。次いで、上清を捨て、バイオマスペレットを一時的に−２０℃で保管し、次いで、凍結乾燥させた。遠心分離後に回収したＲ．カプシュラータのバイオマスペレットの写真を図２０に示す。光合成のための唯一の水源、電子源及び炭素源としてＨ２及びＣＯ２で成長させたＲ．カプシュラータの１リットルの単一ボトルから合計２．５９グラムの湿ったバイオマスをこの方法で回収した。上記の方法を用いて、脂質を抽出し、ＧＣ／ＭＳによって分析し、主に１６又は１８個の炭素長である脂肪酸を含有することが判明した。
【０３９５】
実施例１３
ヒドロゲノバクター・サーモフィラスＤＳＭ  ６５３４を、１リットルの気密性ボトル中で、成長のための唯一のエネルギー源及び炭素源としてのＨ２及びＣＯ２及びＯ２ガス混合物で成長させた。ガス上部空間下での血清ボトル中のＨ．サーモフィラスＤＳＭ  ６５３４の生培養物をＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）から受け取った。この生培養物を用いて、Ｈ２：ＣＯ２：Ｏ２雰囲気が８：１：１の下で、「好熱性細菌（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」，Ｊａｋｏｂ  Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ，チャプター５、第ＩＩＩ節，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９２），ｐｐ．８６〜８８に与えられるＭＳＭ培地を含有する１６０ｍｌ血清ボトルに１０％接種物を提供した。接種後の６００ｎｍでの最初のＯＤは０．０３であった。温水浴に血清ボトルを浸すことによって、血清ボトルの温度を７０℃に保った。攪拌は適用しなかった。培地が混濁するのが観察され、６５時間後に、ＯＤは、１０倍超増加し０．３５４であると測定された。次いで、この血清ボトルを、１２０ｍＬのＭＳＭ培地を含有し、Ｈ２：ＣＯ２：Ｏ２雰囲気が８：１：１である１リットルの気密ボトル中に１０％接種物として継代培養した。培養ボトルを、水浴を用いて７０℃に保ち、攪拌しなかった。６４時間かけて、ガス上部空間を一度交換し、ＯＤは０．２５に増加した。さらに２４時間かけて、ＯＤは０．４２に増加した。上部空間ガスを再び交換し、２日後に、ＯＤは０．５６と測定された。１ｍＬの培養ブロスをＤＮＡ抽出及び配列決定のために採取した。
【０３９６】
１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列を決定し、上位のＢＬＡＳＴヒットをヒドロゲノバクター・サーモフィラスＴＫ−６株と特定した。次いで、培養ブロスを、１リットルボトルから除去し、４℃で、１５分間、１０，０００×ｇで遠心分離した。遠心分離後に生じた湿ったバイオマスのペレットの重量は２１２ｍｇであった。湿ったバイオマスのヘキサン抽出を、上記の実施例に記載したように行った。１５．２ｍｇのヘキサン可溶性脂質を湿ったバイオマスから回収した、すなわち湿ったバイオマスの７．２重量％はヘキサン可溶性脂質で構成されていた。上記の方法を用いて、脂質を抽出し、ＧＣ／ＭＳによって分析し、２０個の炭素長を有する比較的高い割合の脂肪酸を有することが判明した。
【０３９７】
実施例１４
キサントバクター・オートトロフィカス株ＤＳＭ  ４３２を、成長のための唯一のエネルギー源及び炭素源としてＨ２、ＣＯ２、及びＯ２ガスの混合物で、乾燥細胞密度１リットルあたり１４グラムまで成長させた。攪拌タンクバイオリアクター中にＨ２、ＣＯ２、及びＯ２を含むガスの混合物を用いて行う実験については、以下のプロトコルに従った。
【０３９８】
装置：培養物を、図２２に模式的に示すヘッドプレートを有する、図２１に模式的に示す２リットルのガラス発酵槽を用いてバッチで成長させた。温度及びｐＨを制御し、ｐＨ及び温度プローブ並びに市販のコントローラーを用いて監視した。ｐＨを２Ｎ  ＮａＯＨの自動添加により調整した。バイオリアクターのポートは、栄養素の補充及び消泡剤；接種物の送達；塩基；新鮮な培地の提供；及び無菌サンプリングに利用可能である。攪拌をタービンによって行い、ガスはガラスフリットを通して散布される。リアクターシステムを図２３に模式的に示す。リアクターシステムには、圧力計；ガス流量計；安全及びチェック用バルブ；０．２ミクロンフィルター；バイオリアクター容器、センサー、差動装置、及びコントローラー；コンデンサー及び泡トラップ；並びに出口弁が含まれた。ガス供給は、それぞれ２０ｐｓｉに調節された圧縮Ｈ２、圧縮ＣＯ２及び建物の空気からであった。ガス送達システムを図２４に模式的に示す。Ｈ２及びＣＯ２は、ガスの相対的な割合を設定するフロープロポーショナー（Ｍａｔｈｅｓｏｎ  Ｇ２−４Ｄ１５１−Ｅ４０１／Ｅ４０１，２０ｐｓｉ）に送達される。フロープロポーショナーに使用される設定は、ｃ．ｌ．Ｈ２＝３５；ｃ．ｌ  ＣＯ２＝１０；及びｃ．ｌ  空気＝５５であった。これにより、ＧＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ−８Ａ，ＴＣＤ検出器、及びＡｌｌｔｅｃｈ  ＣＴＲ  Ｉカラム）によって測定した時に、バイオリアクターに送達されるガス混合物は６４％  Ｈ２、１１％  ＣＯ２、５．４％  Ｏ２になった。
【０３９９】
培地：この実験に使用するＭＳＭ培地は、Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，Ｊａｃｏｂ  Ｋ．Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ（編），１９９２，ｐ．８７、表４に記載されている。
【０４００】
接種物：キサントバクター・オートトロフィカス株ＤＳＭ  ４３２接種物を、−８０℃で保管した１つのグリセロールストックバイアルから開始し、１リットルの気密ボトル中の２００ｍＬのＭＳＭに移した。Ｈ２／ＣＯ２／Ｏ２ヘッドスペースのガス圧は１０ｐｓｉｇであった。培養ボトルを、３０℃、１５０ｒｐｍで攪拌した。
【０４０１】
発酵槽の操作：接種前に、１．３リットルのＭＳＭをバイオリアクター容器に移した。ｐＨを、ＮａＯＨを用いて６．８に調整した。温度を３０℃に設定し、攪拌を５００ＲＰＭに設置した。試料を、ＯＤ及び脂質分析のために、無菌サンプリングアセンブリにより１日２回採取した。全てのＯＤ測定をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＵ７２０  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計で行った。１日１回、細胞形態を検査するために顕微鏡下で試料を調べた。全ての培養ブロス試料を１２，０００×ｇで遠心分離した。１ｍＬの上清を、−２０℃でＮＨ４＋分析のために保管した。湿ったバイオマスペレットを、−８０℃で一時的に保管し、次いで、凍結乾燥した。
【０４０２】
ＯＤ６００とＣＤＷ（ｍｇ／ｍｌ）の相関を図２５に示す。この相関に適合する直線はＣＤＷ＝０．９９４４＊（ＯＤ６００）＋０．４１０１で、Ｒ２＝０．９５７であった。図２６は、このプロトコルに従ってＨ２／ＣＯ２／Ｏ２ガス基質で成長させたｋｎａｌｌｇａｓ微生物キサントバクター・オートトロフィカスの成長曲線を示す。Ｈ２／ＣＯ２／Ｏ２ガス基質での成長からの、６００ｎｍで測定した最終ＯＤは１４．８であり、最終ＣＤＷは１３．８グラム／リットルであった。稼働の開始時の対数増殖の短い期間後、６日目の稼働の終了まで、ほぼ線形の速度でバイオマスが蓄積した。脂質を抽出し、上記の方法を用いてＧＣ／ＭＳによって分析し、１８個の炭素長の比較的高い割合の脂肪酸を有することが判明した。
【０４０３】
実施例１５
ＣＯ２で成長させたｋｎａｌｌｇａｓ株の幾何学的要因及び本質的に高い生産性のみを考慮する以下の計算は、光合成生物に基づくバイオプロセスを上回る本明細書に記載のｋｎａｌｌｇａｓ微生物の適用の利点を明らかに示す。最初に、比較のために、池の中で、ＣＯ２で成長させた藻類についての米国における単位面積あたりの平均バイオマス生産性、又は面生産性は、１３．２ｇ／ｍ２／日であると報告された［ＡＮＬ，ＮＲＥＬ，ＰＮＮＬ  ２０１２  藻類の脂質からの再生可能ディーゼル：調和のとれたモデルからのコスト、排出量及び資源の可能性の統合ベースライン（Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  ｄｉｅｓｅｌ  ｆｒｏｍ  ａｌｇａｌ  ｌｉｐｉｄｓ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｃｏｓｔ，ｅｍｉｓｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈａｒｍｏｎｉｚｅｄ  ｍｏｄｅｌ）ＡＮＬ／ＥＳＤ／１２−４；ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１００−５５４３１；ＰＮＮＬ−２１４３７．Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｉｌ：アルゴンヌ米国国立研究所；Ｇｏｌｄｅｎ  ＣＯ：米国国立再生可能エネルギー研究所；Ｒｉｃｈｌａｎｄ  ＷＡ：太平洋北西部国立研究所］。
【０４０４】
ｋｎａｌｌｇａｓ株カプリアビダス・ネカトールを、６日間にわたって乾燥バイオマス密度が４０ｇ／リットルまで、標準的な市販の実験室規模のバイオリアクター中でＨ２及びＣＯ２で成長させた。これは、およそ７ｇ／リットル／日の平均容積生産性に相当する。この実証された容積生産性を商業規模で予測される面生産性にするために、ｋｎａｌｌｇａｓ培養が商業的に実績のある産業用バイオリアクター及び発酵産業全体で使用される器具と互換性があることに留意されたい。これらのバイオリアクターは、１０〜４０メートルの深さの水カラムを有する作業容積を含有する場合が多い［Ｍａｄｓ  Ｏ．Ａｌｂａｅｋ，Ｋｒｉｓｔ  Ｇｅｒｎａｅｙ，Ｍｏｒｔｅｎ  Ｓ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｓｔｕａｒｔ  Ｍ．Ｓｔｏｃｋｓ．代替酵素生産技術の効率の評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（２０１２）；Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｗｅｓｔｌａｋｅ．単一細胞タンパク質の大規模連続生産（Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）．Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｇｅｎｉｅｕｒ  Ｔｅｃｈｎｉｋ，５８：９３４−９３７（Ｊａｎｕａｒｙ  １９８６）］。対照的に、光の要求、及び光遮断の問題のために、表面生物は内部生物に光を遮断し、藻類の池は、典型的には、深さ約１０センチメートルのみに制限される。１０〜４０メートルの水カラムにスケールアップした７ｇ／リットル／日の平均化学合成独立栄養容積生産性は、それぞれ１０ｍ及び４０ｍの深さの場合について、７０，０００〜２８０，０００ｇ／ｍ２／日の面生産性をもたらす。これは、単位面積あたりのＣＯ２での微細藻類生産性を５，０００〜２０，０００倍上回る利点を表す。微細藻類自体は、大豆又はトウモロコシなどの高等植物農業作物に対して２〜２０倍の面生産性の利点を有することができることに留意されたい。したがって、本発明に適用されるｋｎａｌｌｇａｓ微生物は、バイオマス面生産性及びＣＯ２捕捉において、従来の農業作物及びシステムを少なくとも１０，０００倍上回る利点を有することができた。
【０４０５】
簡単なバイオリアクターの設計変更は、Ｈ２及びＣＯ２基質で、Ｃ．ネカトールの容積生産性を１ｇ／リットル／時（すなわち、２４ｇ／リットル／日）まで増加させることができることが判明した。これらの単純な機械的な強化は、この生産性の大幅な向上につながる攪拌タンクバイオリアクター中の溶液へのガス送達の物質移動係数（ＫＬａ）を増加させる。さらに、リアクター容積、具体的には垂直寸法のスケールアップは、水カラムの増加した深さでの静水圧の増加により、Ｈ２及びＯ２などの低溶解度ガスの物質移動を増強する。ＫＬａを増加させるためのリアクター設計の改良とスケールアップにより増加した静水圧の組み合わせを用いて、少なくとも２ｇ／リットル／時（すなわち、４８ｇ／リットル／日）のバイオマス生産性は、控えめに達成可能である。
【０４０６】
経験的データセットからのこれらの計算は、収益性の高いバイオマス及びタンパク質生産のために、実用的な小面積単位への生物学的ＣＯ２捕捉を強化するｋｎａｌｌｇａｓシステムの破壊的な可能性を示す。
【０４０７】
実施例１６
総合システムは、図３０に提供される化学量論を有することができる。
【０４０８】
生合成反応式は、４．５分子のＣＯ２を細胞物質に還元するために、１６．４水素分子及び３．２酸素分子を利用するｋｎａｌｌｇａｓ微生物カプリアビダス・ネカトールについての経験的データから導かれる反応を表す。窒素源は、尿素であると想定される。ＣＯ２生成するためのヒトの食料の酸素による酸化は、ヒトの消化、呼吸、及び排泄についての式に示されており、窒素系廃棄物は尿素であると想定される。電気分解の式において、生合成及び呼吸の式に必要な、水を分割して、酸素及び水素を生成するエネルギーの投入が想定される。このバランスのとれたシステムは、ヒトの作業員及びカプリアビダス・ネカトールが関与する閉鎖システムの理想化された状況である。
【０４０９】
ある非限定な実施形態において、Ｃ．ネカトールによって行われるＣＯ２還元のエネルギー効率は、４０％を超える。ある非限定な実施形態において、宇宙における電解水のエネルギー効率は、７０％を超える。ある非限定な実施形態において、電気分解のエネルギー効率は、７５％を超える。ある非限定な実施形態において、全体的な末端間のＣＯ２から食料システムへの（すなわち、電気からタンパク質性バイオマスへの）エネルギー効率は、２８％を超える。ある非限定な実施形態において、システム全体のこの正味の効率は、同等の光合成システムの効率よりも１０倍超高い。ある実施形態において、電解槽及び化学合成独立栄養バイオリアクターを含むシステムの固定重量は、同等の藻類システムの光バイオリアクター及び光の重量よりも低い。ある実施形態において、電解槽及び化学合成独立栄養バイオリアクターを含むシステムの固定重量は、同等の藻類システムの光バイオリアクター及び光の重量、並びに／又は光及び水耕栽培システム及び／若しくはより高等な植物作物の同等のシステム用のプランターの重量よりも低い。
【０４１０】
実施例１７
図３１は、（Ａ）エネルギー材料及び未処理無機化学材料（例えば、水）からの化学合成を支持するのに適する電子供与体（例えば、分子水素電子供与体）の生成のためのプロセス工程；（Ｂ）ポイント産業用排ガス、又は他のＣＯ２源から捕捉されたＣＯ２と共に、その後の生成されたＨ２電子供与体及びＯ２電子受容体、水、ミネラル栄養素の、（Ｃ）化学合成反応により二酸化炭素を捕捉及び固定して、タンパク質性バイオマスを作製する酸水素微生物を利用する、１以上のバイオリアクター（４）を収容する化学合成反応工程（複数可）への送達；（Ｄ）平衡して、電子供与体生成工程からの余剰の化学副生成物（例えば、Ｏ２）を回収した後に、（Ｅ）プロセス流からのバイオマス生成物の回収のためのプロセス工程；並びに（Ｆ）未使用の栄養素及びプロセス水だけでなく、微生物培養を維持するのに必要な細胞塊を炭素固定反応工程に戻して（すなわち、バイオリアクターに戻して）リサイクルすること、を有する本発明のある実施形態の一般的なプロセス流の略図を示す。
【０４１１】
図３１に図解した特定の実施形態において、ＣＯ２含有排ガスは、ポイント供給源又はエミッターから捕捉される。このような供給源又はエミッターには、発電所、製油所、又はセメント生産者が含まれるが、これらに限定されない。化学合成に必要な電子供与体（例えば、Ｈ２）は、投入される無機化学物質及びエネルギーから生成され得る。ある実施形態において、水素は、二酸化炭素を放出しないプロセスによって生成される。水素生成のための二酸化炭素を放出しない例示的なプロセスには、例えば、当技術分野で公知の電気分解プロセス又は熱化学プロセスが含まれ、太陽光発電、太陽熱、風力、水力、原子力、地熱、向上した地熱、海洋熱、海洋波動、及び潮力を含むが、これらに限定されないエネルギー源によって駆動される。排ガスは、化学合成を促進するのに必要な電子供与体及び電子受容体、並びに化学合成によって微生物培養及び炭素固定を支持するのに適する培地と共に、酸水素微生物を含有するバイオリアクター（４）によって汲み出され得る。図３１に図解される非限定的な実施形態のセットにおいて、水素電子供与体並びに酸素及び二酸化炭素電子受容体は圧縮され、限定されないが、以下のもの：カプリアビダス・ネカトール、ロドコッカス・オパクス株及び／若しくは他のロドコッカス種、ヒドロゲノビブリオ・マリナス、ロドシュードモナス・カプシュラータ、ヒドロゲノバクター・サーモフィラス、並びに／又はキサントバクター・オートトロフィカスのうちの１以上などの１以上のｋｎａｌｌｇａｓ微生物を含有する１以上のバイオリアクターに組み入れられる、化学合成及び培養維持及び成長に必要な他の栄養素と共に、成長ブロスに連続的に添加される。図３１に図解する非限定な実施形態のセットにおいて、酸素は、酸化的リン酸化と結びついた酸水素反応によるＡＴＰの細胞内生成のための化学合成反応において電子受容体として役立つ。酸素は、排ガスから生じ得るか、かつ／又は水素生成に使用される水分解反応から生じ得るか、かつ／又は空気から取得され得る。図３１において、排ガスからの二酸化炭素は、呼吸の酸水素反応によって生成されるＡＴＰ、並びにＨ２によるＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋の細胞内の酵素触媒還元から生成されるＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨを利用する生化学経路によるものを含む、有機化合物の生合成のための電子受容体（非呼吸性；同化）として役立つ。細胞培養物は、連続的にバイオリアクターを出入りする。細胞培養物がバイオリアクターを離れた後、細胞塊は液体培地（５）から分離することができる。固体−液体分離は、限定されないが、細胞塊と液体を分離するために連続遠心分離又はブロスを膜フィルターを通して流すことなどの当技術分野で周知のプロセス及び設備を用いて達成することができる。所望の（例えば、最適な）レベルで細胞培養集団を補充するのに必要な細胞塊は、バイオリアクターに戻してリサイクルすることができる。余剰の細胞塊は、乾燥バイオマス生成物を形成するために乾燥させることができ（８）、さらに様々な飼料、タンパク質、栄養素、肥料、化学物質、又は燃料製品に後処理（９）することができる。タンパク質性バイオマスの、動物飼料及び／又は植物肥料製剤への後処理は、当技術分野で公知の方法に従って行うことができる。細胞分離工程後に、化学合成反応の細胞外化学生成物をプロセスフローから取り除き、回収することができる。次いで、存在する可能性のある望ましくない廃棄物は除去される（７）。必要であれば、交換用の水及び／又は栄養素をバイオリアクターに提供し、バイオマス生成物及び／又は他の流出流の損失を補うことができる。
【０４１２】
実施例１８
化学合成独立栄養株のスクリーニング
株を、最初に、Ａｌｍｏｒｅ社のＶａｃｕ−Ｑｕｉｃｋジャーシステムを用いて、プレート上で化学合成独立栄養についてスクリーニングした。次いで、有望株を液体培養で試験した。
【０４１３】
最小塩培地（ＭＳＭ）を上記のように調製し、組み合わせ、アガロース（１．５％）プレートに無菌的に添加した。以下の属：カプリアビダス；キサントバクター；ディエジア；ゴルドニア；マイコバクテリウム；ノカルジア；シュードノカルジア；アルスロバクター；アルカニボラックス；ロドコッカス種；ストレプトマイセス；ロドシュードモナス；ロドバクター；及びアシネトバクターから導かれた１６２種の候補株を試験した。
【０４１４】
各株を、最小塩培地（ＭＳＭ）＋アガロース（１．５％）プレート上に画線した。次いで、全てのそれぞれのプレートをＡｌｍｏｒｅ社のＶａｃｕ−Ｑｕｉｃｋジャーシステムに置いた。チャンバーの湿度を維持し、インキュベーション中にプレートを乾燥から守るために、各チャンバーの底に、滅菌水に浸漬した滅菌ペーパータオルを置いた。次いで、プレートで満たした気密チャンバーから気体を除き、その後に、Ｈ２：ＣＯ２：空気（７０／１０／２０）ガス混合物を供給した。ガスは、成長のための唯一のエネルギー源及び炭素源を提供した。ガスチャンバーを３０℃で、７〜１０日間インキュベートし、毎日新鮮なガス混合物をパージした。
【０４１５】
化学合成独立栄養成長を示したプレート／コロニーについて、コロニーをとって、新鮮な最小塩培地（ＭＳＭ）＋アガロース（１．５％）プレート上に画線し、その後、Ｈ２及びＣＯ２及び空気（７０／１０／２０）を供給したＡｌｍｏｒｅ社のＶａｃｕ−Ｑｕｉｃｋジャーシステム中での第２のインキュベーションを行った。次いで、この第２のインキュベーションで強いコロニー成長を示した株を液体の最小塩培地（ＭＳＭ）中で化学合成独立栄養試験に供した。
【０４１６】
硬いネオプレンゴム栓（Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎｏ．：２２４１００３３１）でキャップし、アルミニウムキャップで圧着したＨｕｎｇａｔｅ管（Ｃｈｅｍｇｌａｓｓ  ＣＬＳ−４２０９−１０、嫌気的、１８×１５０ｍｍ）中で、５ｍＬの作業量で実験を行った。ハイスループットスクリーニング用に設計したガス多岐管を用いて、Ｈ２及びＣＯ２及び空気（７０／１０／２０）のガス混合物で管をパージした。管を毎日新鮮なガス混合物でパージした。
【０４１７】
管を、角度４５°、６００ｒｐｍ、３０℃で９６時間、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ  Ｐｒｏ  Ｉｎｆｏｒｓ  ＨＴ振盪機中でインキュベートした。６００ｎｍでの光学密度を、２４時間ごとに分光光度計（Ｇｅｎｅｓｙｓ  １０Ｓ，ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定した。
【０４１８】
以下の細菌株：アルスロバクター・メチロトロフスＤＳＭ  １４００８；ロドコッカス・オパクスＤＳＭ  ４４３０４；ロドコッカス・オパクスＤＳＭ  ４４３１１；キサントバクター・オートトロフィカスＤＳＭ  ４３１；ロドコッカス・オパクスＤＳＭ  ４４２３６；ロドコッカス・ルーバーＤＳＭ  ４３３３８；ロドコッカス・オパクスＤＳＭ  ４４３１５；カプリアビダス・メタリデュランスＤＳＭ  ２８３９；ロドコッカス・アエセリボランスＤＳＭ  ４４７５２；ゴルドニア・デスルフリカンス（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ）ＤＳＭ  ４４４６２；ゴルドニア・ポリイソプレニボランス（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｐｏｌｙｉｓｏｐｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ）ＤＳＭ  ４４２６６；ゴルドニア・ポリイソプレニボランスＤＳＭ  ４４４３９；ゴルドニア・ルブリペルティンクタ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｒｕｂｒｉｐｅｒｔｉｎｃｔａ）ＤＳＭ  ４６０３９；ロドコッカス・ペルコラタス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｒｃｏｌａｔｕｓ）ＤＳＭ  ４４２４０；ロドコッカス・オパクスＤＳＭ  ４３２０６；ゴルドニア・ヒドロフォビカ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａ）ＤＳＭ  ４４０１５；ロドコッカス・ゾフィー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｐｆｉｉ）ＤＳＭ  ４４１８９；ゴルドニア・ウェストファリカ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｗｅｓｔｆａｌｉｃａ）ＤＳＭ  ４４２１５；キサントバクター・オートトロフィカスＤＳＭ  １６１８；キサントバクター・オートトロフィカスＤＳＭ  ２２６７；キサントバクター・オートトロフィカスＤＳＭ  ３８７４；ストレプトマイセス・セリコフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｆｌａｖｕｓ）ＤＳＭ  ４１４７１；ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）ＤＳＭ  ４０２３６；ストレプトマイセス種ＤＳＭ  ４０４３４；ストレプトマイセス・キサントクロモジェネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｘａｎｔｈｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）ＤＳＭ  ４０１１１；ストレプトマイセス・サーモカルボキシダス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｒｂｏｘｙｄｕｓ）ＤＳＭ  ４４２９３；ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＤＳＭ  １５８をｋｎａｌｌｇａｓ混合物での化学合成独立栄養と特定した。
【０４１９】
唯一の炭素源及びエネルギー源としてｋｎａｌｌｇａｓ混合物を有する液体ＭＳＭ培地中で成長させたｋｎａｌｌｇａｓ株において完全な近接解析を行った。Ｃ．ネカトールＤＳＭ  ５３１及びＤＳＭ  ５４１は、算術成長期中に取得した試料について、それぞれ全タンパク質を７０重量％超及び８０重量％超蓄積したことが観察された。Ｃ．ネカトールＤＳＭ  ５３１とＤＳＭ  ５４１の両方はまた、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、及びビタミンＢ１２を含むビタミンを合成することが観察された。
【０４２０】
実施例１９
本発明の特定の実施形態は、太陽及び風などの間欠的再生可能動力源を活用して、炭素固定に必要なＨ２を生成する。ＣＯ２源は、発電所などの産業資源である。電解槽は、一般に、低電力需要及び高い再生可能電力供給の期間中に電力を引き出す。低い需要及び高い再生可能生成のこのような期間中に、再生可能で、ＣＯ２放出のない電気供給の容量は、テキサス州、スコットランド及びドイツなどの地域で最高で９５％に達する。このように、実際に、電解槽は、水からＨ２生成のためのＣＯ２放出のない電力を利用し、ＣＯ２を大量に使用する電力をほとんど利用しない。このような地域において、高い再生可能電力供給及び低いグリッド需要の期間は、その時間のおよそ５０％に生じるので、電解槽は、その時間のおよそ５０％動作することが期待される。施設内のＨ２及びＣＯ２タンク貯蔵は、産業資源からのＣＯ２生成と電解槽からのＨ２生成の間の時間の差異を減らし、これらのガスの両方のＣＯ２固定バイオプロセスへの連続流を可能にする。化学合成独立栄養ｋｎａｌｌｇａｓ微生物は、ＣＯ２、Ｈ２、及びミネラル栄養素（すなわち、ＮＰＫ）を高タンパク質性バイオマスに変換する（図３２を参照されたい）。電解槽からのＯ２は、微好気性ｋｎａｌｌｇａｓバイオプロセスの要件を超える。この余剰のＯ２は、純粋なガス副生成物として販売することができるか、又はユニットの熱効率を増加させ、ユニットから出る排ガス流中のＣＯ２濃度を増加させるために、化石燃料若しくは動力装置にフィードバックされる。ＣＯ２濃度の増加は、炭素捕捉工程を促進する。
【０４２１】
いくつかの実施形態において、全体的な発明プロセスは、３つの主要部分を統合し、それらのうちの２つは、市販のユニット、化学合成独立栄養のＣＯ２固定バイオプロセス及び本明細書に記載の関連する後処理工程を適用することができる。バイオプロセスへのＣＯ２及びＨ２の提供のためのフロンドエンドの２つの市販のユニットは、ＣＯ２排ガスの不純物の除去、及び主な再生可能電力を用いる水の電気分解である。炭素の中立性を達成するために、該システムを、高い間欠的再生可能発電を有する地域に位置付けることができる。電解槽ユニットのみが、低電力需要及び再生可能電力の過剰供給の期間中に電力を引き出す。これは、間欠的再生可能エネルギーによって引き起こされる電気グリッドの負荷を緩和させる。電解槽技術のための主要な現在の適用は、再生可能電力の過剰供給の期間中に生成されるＨ２を、高い需要及び低い再生可能電力供給の期間中にグリッド電気に変換して戻すこと、実際には、Ｈ２から電気にバリュー・チェーンを落とすことである。本明細書に記載のプロセスは、Ｈ２及びＣＯ２をタンパク質に変換し、実際には、Ｈ２からタンパク質にバリュー・チェーンをさらに上げ続ける。
【０４２２】
前述の本発明は、理解の明確さの目的のために図及び実施例によってある程度詳細に記載されているが、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、特定の変更及び改変を実施することができることは当業者には明らかである。したがって、記述は、添付の特許請求の範囲に詳述される本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０４２３】
本発明で引用した全ての刊行物、特許、及び特許公開は、全ての目的のために、かつ各個々の刊行物、特許、及び特許公開が参照によりそのように組み込まれることが具体的かつ個別に示されるのと同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４２４】
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７．  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｈｕｇｌｅｒ，  Ｃａｒｌ  Ｏ．  Ｗｉｒｓｅｎ，  Ｇｅｏｒｇ  Ｆｕｃｈｓ，  Ｃｒａｉｇ  Ｄ．  Ｔａｙｌｏｒ，  ａｎｄ  Ｓｔｅｆａｎ  Ｍ．  Ｓｉｅｖｅｒｔ．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ  ＣＯ２  ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｙｃｌｅ  ｂｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ε  ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  １８７（９）：３０２０−３０２７，  Ｍａｙ  ２００５．
８．  Ｊ．  Ｋ．  Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ．  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，  １９９２．
９．  Ｓａｎｇ  Ｙ．  Ｌｅｅ，  Ｊｉｎ  Ｈ．  Ｐａｒｋ，  Ｓｅｈ  Ｈ．  Ｊａｎｇ，  Ｌａｒｓ  Ｋ．  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｊａｅｈｙｕｎ  Ｋｉｍ，  ａｎｄ  Ｋｗａｎｇ  Ｓ．  Ｊｕｎｇ．  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ  ｂｕｔａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  １０１（２）：２０９−２２８，  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００８．
１０．  Ｊ．  Ｌｅｎｇｅｌｅｒ，  Ｇ．  Ｄｒｅｗｓ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ．  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．  Ｗｉｌｅｙ，  ２００９．
１１．  Ｌ．  Ｇ．  Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ．  Ｔｈｅ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ａｃｅｔａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ４０（１）：４１５−４５０，  １９８６．
１２．  Ａｋａｎｅ  Ｍｉｕｒａ，  Ｍａｓａｆｕｍｉ  Ｋａｍｅｙａ，  Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  Ａｒａｉ，  Ｍａｓａｈａｒｕ  Ｉｓｈｉｉ，  ａｎｄ  Ｙａｓｕｏ  Ｉｇａｒａｓｈｉ．  Ａ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＮＡＤＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｙｃｌｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴＫ−６．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  １９０（２１）：７１７０−７１７７，  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００８．
１３．  Ｅｌｅｆｔｈｅｒｉｏｓ  Ｔ．  Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ．  Ｅｑｕａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ２６（２）：１７４−１８７，  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９８４．
１４．  Ｋａｔｈｌｅｅｎ  Ｍ．  Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｅｅｎ  Ｍ．  Ｃａｖａｎａｕｇｈ．  ＣＯ２  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｔｉｃ  ｃｈｅｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｂｉｖａｌｖｅ  ｓｏｌｅｍｙａ  ｖｅｌｕｍ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ７３（４）：１１７４−１１７９，  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００７．
１５．  Ｊ．  Ｍ．  Ｓｈｉｖｅｌｙ，  Ｇ．  ｖａｎ  Ｋｅｕｌｅｎ，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｇ．  Ｍｅｉｊｅｒ．  Ｓｏｍｅｔｈｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ａｌｍｏｓｔ  ｎｏｔｈｉｎｇ：  ｃａｒｂｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｅｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｓ．  Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ５２：１９１−２３０，  １９９８．
１６．  Ａｒｎｏｌｄ  Ｊ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｊａｃｋ  Ｌｏｎｄｏｎ，  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒ  Ｙ．  Ｓｔａｎｉｅｒ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｏｂｌｉｇａｔｅ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  Ｂｌｕｅ−Ｇｒｅｅｎ  ａｌｇａｅ  ａｎｄ  ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｉ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ９４（４）：９７２−９８３，  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９６７．
１７．  Ｆ．  Ｂ．  Ｔａｕｂ，  Ｆ．  Ｅ．  Ｐａｌｍｅｒ，  Ｒ．  Ｅ．  Ｃｏｎｄｒｅｙ，  Ｒ．  Ｂ．  Ｋｅｒｎ，  Ｋ．  Ａ．  Ｂａｌｌａｒｄ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｆ．  Ｋａｌａｍａｓｚ．  Ａｌｇａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｓ  ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｅｅｄ．  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ，  １９７３．
１８．  Ｆｒｉｅｄａ  Ｂ．  Ｔａｕｂ．  Ｃｌｏｓｅｄ  ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ，  ５：１３９−１６０，  １９７４．
１９．  Ｒｕｄｏｌｆ  Ｋ．  Ｔｈａｕｅｒ，  Ａｎｎｅ−Ｋｒｉｓｔｉｎ  Ｋａｓｔｅｒ，  Ｈｅｎｎｉｎｇ  Ｓｅｅｄｏｒｆ，  Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｂｕｃｋｅｌ，  ａｎｄ  Ｒｅｉｎｅｒ  Ｈｅｄｄｅｒｉｃｈ．  Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃ  ａｒｃｈａｅａ：  ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｅｎｅｒｇｙ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ６（８）：５７９−５９１，  Ｊｕｎｅ  ２００８．
２０．  Ｇｉｌ−Ｌｉｍ  Ｙｏｏｎ，  Ｂｙｕｎｇ−Ｔａｋ  Ｋｉｍ，  Ｂａｅｃｋ−Ｏｏｎ  Ｋｉｍ，  ａｎｄ  Ｓａｎｇ−Ｈｕｎ  Ｈａｎ．  Ｃｈｅｍｉｃａｌ−ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃｒｕｓｈｅｄ  ｏｙｓｔｅｒ−ｓｈｅｌｌ．  Ｗａｓｔｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，  ２３（９）：８２５−８３４，  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００３．
２１．  Ｈｙｕｎｓｕｋ  Ｙｏｏｎ，  Ｓａｎｇｋｙｕ  Ｐａｒｋ，  Ｋｉｈｏ  Ｌｅｅ，  ａｎｄ  Ｊｕｎｂｏｕｍ  Ｐａｒｋ．  Ｏｙｓｔｅｒ  ｓｈｅｌｌ  ａｓ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｉｎ  ｍｏｒｔａｒ．  Ｗａｓｔｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２２（３）：１５８−１７０，  Ｊｕｎｅ  ２００４．
２２．  Ｃｌｏｓｅｄ  Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ，  Ｖｏｌ．  ５  （１９７４），  ｐｐ．  １３９−１６０  ｂｙ  Ｆｒｉｅｄａ  Ｂ．  Ｔａｕｂ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｌ．  Ｄｒａｋｅ，  Ｃ．  Ｄ．  Ｋｉｎｇ，  Ｗ．  Ａ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  ａｎｄ  Ｅ．  Ａ．  Ｚｕｒａｗ，  “Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｓｐａｃｅ  ｍｉｓｓｉｏｎｓ  ｅｘｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｎｅ  ｙｅａｒ  ｉｎ  ｄｕｒａｔｉｏｎ，”  ＮＡＳＡ，  Ｔｅｃｈ．  Ｒｅｐ．  ＳＰ−１３４，  Ａｐｒ．  １９６６
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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