(57)【要約】  標準培地と比較してパルボウイルス産生を増加させるのに適した本質的に無血清の培地を含むパルボウイルス産生のための、好ましくはＨ−１ＰＶ産生のための最適化された方法が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルボウイルスＨ−１に感染したプロデューサー細胞株ＮＢ−３２４Ｋを増殖させるための方法であって、１６〜２２ｍＭのグルコース、３〜５ｍＭのグルタミン、０．１〜０．６ｍＭのグルタミン酸塩、０．５〜１．０ｍＭの乳酸塩、０．３ｍＭ未満のアンモニウム及び３〜１０μｇ／μｌのタンパク質を含む無血清培地で感染ＮＢ−３２４Ｋ細胞を培養し、該培地は７．０〜７．５のｐＨを有する、上記方法。
【請求項２】
前記培地が、１９．１４ｍＭのグルコース、４．２５ｍＭのグルタミン、０．１７４ｍＭのグルタミン酸塩、０．６６９ｍＭの乳酸塩、０．０５ｍＭ未満のアンモニウム、並びにインスリン、上皮成長因子及び野菜成分を含む約５μｇ／μｌのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物成分が大豆ペプチドに基づいている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記培地が１７．４９ｍＭのグルコース、４．２５ｍＭのグルタミン、０．４８６ｍＭのグルタミン酸塩、０．６４１の乳酸塩、０．１８ｍＭのアンモニウム及び７．５μｇ／μｌの上皮増殖因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記大豆ペプチドがＨｙｐｅｐ  １５１０（登録商標）である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ｐＨが約７．２である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標準培地と比較してパルボウイルス産生を増加させるのに適した本質的に無血清の培地を使用するパルボウイルス産生のための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｈ−１ＰＶは、パルボウイルス科のパルボウイルス亜科内のプロトパルボウイルス属に属する（Ｃｏｔｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）。それは直径２５ｎｍの非エンベロープ二十面体キャプシドからなり、非構造タンパク質−特にＮＳ１（８３ｋＤａ）及びＮＳ２（２５ｋＤａ）−をコードする長さ約５ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノム及びキャプシドタンパク質ＶＰ１（８１ｋＤａ）及びＶＰ２（６５ｋＤａ）を含む。別のキャプシドタンパク質、ＶＰ３（６３ｋＤａ）は、ＶＰ２の翻訳後切断によって生成される（Ｆａｉｓｓｔら、１９９５年；Ｈａｌｄｅｒら、２０１２年；Ｈａｎｓｏｎ及びＲｈｏｄｅ、１９９１年；Ｔｏｏｌａｎら、１９６０年）。プロトパルボウイルスはＳ期依存的に複製し、許容細胞の感染後に溶解サイクルを経る（Ｂｕｒｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）。
【０００３】
Ｈ−１ＰＶの天然宿主はラットであるが、このウイルスは、それが多数のヒト腫瘍細胞を含む形質転換細胞において優先的に複製するので、最近多くの関心を集めている。したがって、ウイルスは、様々な細胞培養及び動物モデルにおいて実証されている腫瘍崩壊性及び腫瘍抑制性を有する（Ｎｕｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２；Ｒｏｍｍｅｌａｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）。異種移植モデルにおいて、Ｈ−１ＰＶは、子宮頸部腫瘍（Ｆａｉｓｓｔら、１９９８；Ｌｉら、２０１３）、膵臓腫瘍（Ａｎｇｅｌｏｖａら、２００９ｂ；Ｇｒｅｋｏｖａら、２０１１）、乳癌（Ｄｕｐｒｅｓｓｏｉｒら、１９８９）、神経膠腫（Ｇｅｌｅｔｎｅｋｙら、２０１０；ｋｉｐｒｉａｎｏｖａら、２０１１）、及びリンパ腫（Ａｎｇｅｌｏｖａら、２００９ａ）を含む多数のヒト腫瘍を抑制することが示されている。さらに、Ｈ−１ＰＶは癌幹細胞の排除に成功していることが示されている（ＥＰ２４０４６０９Ａ１）。これらの前臨床概念実証に基づいて、再発性膠芽腫の患者に対して、２０１１年にＨ−１ＰＶの最初の臨床試験（フェーズＩ／ＩＩａ）が開始された（Ｇｅｌｅｔｎｅｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）。
【０００４】
Ｈ−１ＰＶの治療的可能性を試験し、最終的に利用するためには、前臨床又は臨床適用又は基礎研究に適した培地中での精製ウイルス（ベクター）ストックの産生を最適化することが必要である。
【０００５】
しかしながら、細胞培養培地処方は、文献に詳しく記載されており、多くの培地が市販されている。Ｈ−１ＰＶ産生は、標準的な細胞培養培地を用いて、ヒトＮＢ−３２４Ｋ細胞などの様々な細胞培養物中で日常的に行われている。
【０００６】
インビトロでのヒト細胞培養の要件は、基本的な栄養物質に加えて、一連の複雑な成長因子を含む（Ｗｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３）。動物血清を標準的な細胞培養培地に添加することは、細胞増殖、代謝、及び増殖の促進に不可欠である。最も広く使用されている血清は、成体又は新生動物の、又は１０〜２０％ｖ／ｖの範囲の胎児起源のウシ血清である。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、細胞の付着、成長及び増殖に必要な因子の大部分のカクテルであり、したがって、ほとんどの種類のヒト及び動物細胞に有効なほぼ普遍的な増殖サプリメントとして使用されている（ＷＯ２０１１／１５７４４７Ａ２；Ａｌｌａｕｍｅら、２０１２）。しかしながら、細胞培養における動物血清の使用もまた多くの不利益をもたらす。血清は一般に培地中の成分の明確に定義されていない混合物であるので、これらの不利な点は細胞生物学的観点からも見られる。また、ヒト治療薬のバイオテクノロジー的生産のためには、動物由来成分を培養プロトコルに適用することはできない。例えば、特にサプリメントが培養される細胞の供給源とは異なる動物に由来し、免疫学的反応を誘導する場合、それから精製された培地又は生成物が免疫原性であり得るというリスクがある。
【０００７】
内皮細胞の培養をサポートするように設計されたものなど、多くの無血清培地製剤が市販されている（ＷＯ２０１２／０３３３２８Ａ２）。無血清培地は、血清を添加した培地よりもタンパク質含有量が低いため、精製プロセスが簡略化され、最終製品の収量が増加し、細胞培養条件の管理が改善され、ロット間の一貫性が向上し、特定の細胞型に対して製剤が最適化される。さらに、細胞培養培地の特徴及び組成は、特定の細胞要件に応じて変わる。重要なパラメータには、浸透圧、ｐＨ、及び栄養配合が含まれる。
【０００８】
無血清培地における動物性タンパク質の使用の制限を克服するために、動物性タンパク質を完全に含まない動物細胞培養培地を構築するためのいくつかの試みがなされてきた。例えば、いくつかの培地は、酵母細胞の抽出物を基礎培地に組み込んで、窒素源及び他の必須栄養素を提供している（英国特許出願第ＧＢ  ９０１６７３号；Ｋｅａｙ、Ｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１７：７４５‐７６４（１９７５））。
【０００９】
しかしながら、これらのアプローチのいずれも、前臨床又は臨床適用のためのＨ１−ＰＶの大規模生産のための非市販のＮＢ−３２４Ｋ細胞の培養に最適な培地を提供しなかった。ＮＢ‐３２４Ｋ細胞は一般に増殖するのが困難であるので、他の商業的生物の培養から知られている培地を単に適合させることは不可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、Ｈ−１ＰＶの生産性を高めるためにＮＢ−３２４Ｋ細胞の増殖を促進する、本質的に無血清の培養培地が依然として必要とされている。そのような培養培地は、培養されたＮＢ‐３２４Ｋ細胞によって産生されるパルボウイルスのより容易でより費用効果的な産生及び精製を可能にするはずであり、より一貫した結果を提供するであろう。
【００１１】
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、本質的に無血清の培地中でパルボウイルスの大規模生産を最適化することである。 
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記技術的問題の解決は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態を提供することによって達成される。 
【００１３】
腫瘍崩壊性プロトパルボウイルス研究は、再発性の切除可能な悪性神経膠腫患者におけるＨ−１ＰＶの第Ｉ／ＩＩａ相研究で、臨床診療への転換の段階に達している（Ｇｅｌｅｔｎｅｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）。この試験は、有効性を評価し、膵臓癌などの他の癌へのアプローチを拡大することを目的としたさらなる臨床試験が続くと予想される（臨床試験：“ＰａｒｖＯｒｙｘ０２”；ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２６５３３１３）又は神経芽細胞腫（Ｌａｃｒｏｉｘ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３）。これらの開発は、大規模でのプロトパルボウイルス産生のための強力な手順の利用可能性に依存している。
【００１４】
本発明をもたらす実験の間に、ＦＢＳを通して細胞培養培地中の望ましくない汚染物質を排除しながら、Ｈ１−ＰＶ産生の最適化のための主要な革新が導入された。本発明者らは、抗癌ウイルス療法における前臨床及び臨床適用のためのＨ−１ＰＶの産生のための基礎として、本質的に無血清の培地を開発することに焦点を合わせた。
【００１５】
本発明の方法は、グルコース、グルタミン、グルタミン酸塩、乳酸塩、アンモニウム、タンパク質（例えば増殖因子、インスリンなど）の成分を含む本質的に無血清の細胞培養培地を使用し、ここで培地はＨ−１ＰＶの産生のためのインビトロでの上皮細胞、好ましくはＮＢ−３２４Ｋ細胞の培養をサポートすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１ａと１ｂ：ＦＢＳを含まないＨ１−ＰＶ生産性向上のための異なる培地  図１ａは、ＦＢＳを含まないＮＢ‐３２４Ｋ細胞におけるＨ‐１ＰＶ産生に対するＭＥＭ‐Ｈｅｐｅｓ、ＶＰ‐ＳＦＭ及びＯｐｔｉ‐Ｐｒｏ  ＳＦＭ培地の効果を示す棒グラフを表す。ＰＦＵ力価をプラーク形成アッセイにより決定し、播種した細胞の数に対して表す。  図１ｂは、ＦＢＳを含まないＮＢ‐３２４Ｋ細胞におけるＨ‐１ＰＶ産生に対するＭＥＭ‐Ｈｅｐｅｓ、ＶＰ‐ＳＦＭ及びＯｐｔｉ‐Ｐｒｏ  ＳＦＭ培地の効果を示す棒グラフを表す。ＦＢＳを含まないＶＰ‐ＳＦＭとＯｐｔｉ‐Ｐｒｏ  ＳＦＭのＰＦＵ比は、５％ＦＢＳを含むＭＥＭ‐Ｈｅｐｅｓ培地に対して表した。
【００１７】
【図２】図２ａ及び２ｂ：５％ＦＢＳを含むＨ１‐ＰＶ生産性向上のための異なる培地  図２ａは、５％ＦＢＳを含むＮＢ‐３２４Ｋ細胞におけるＨ‐１ＰＶ産生に対するＭＥＭ‐Ｈｅｐｅｓ、ＶＰ‐ＳＦＭ及びＯｐｔｉ‐Ｐｒｏ  ＳＦＭ培地の効果を示す棒グラフを表す。ＰＦＵ力価をプラーク形成アッセイにより決定し、播種した細胞の数に対して表す。  図２ｂは、５％ＦＢＳを含むＮＢ‐３２４Ｋ細胞におけるＨ‐１ＰＶ産生に対するＭＥＭ‐Ｈｅｐｅｓ、ＶＰ‐ＳＦＭ及びＯｐｔｉ‐Ｐｒｏ  ＳＦＭ培地の効果を示す棒グラフを表す。５％ＦＢＳを含むＶＰ‐ＳＦＭ及びＯｐｔｉ‐Ｐｒｏ  ＳＦＭのＰＦＵ比は、５％ＦＢＳを含むＭＥＭ‐Ｈｅｐｅｓ培地に対して表した。
【００１８】
【図３】Ｈｙｐｅｐ  １５１０又はＳｈｅｆｆ−Ｖａｘ  Ｐｌｕｓ  ＡＣＦを添加したＦＢＳを含む又は含まないＶＰ−ＳＦＭ培地  図３は、ＮＢ‐３２４Ｋ細胞におけるＨ‐１ＰＶ産生に対する５％ＦＢＳを補充したＶＰ‐ＳＦＭ、Ｈｙｐｅｐ  １５１０を補充したＶＰ‐ＳＦＭ及びＳｈｅｆｆ‐Ｖａｘ  Ｐｌｕｓ  ＡＣＦを補充したＶＰ‐ＳＦＭの効果を示す棒グラフである。ＰＦＵ力価をプラーク形成アッセイにより決定し、播種した細胞の数に対して表す。
【００１９】
【図４】Ｈ−１ＰＶ生産性のｐＨの影響  図４は、ＮＢ‐２３４Ｋ細胞におけるＨ‐１ＰＶ産生に対する、ＨＣｌ又はＮａＯＨを用いてＭＥＭ‐Ｈｅｐｅｓ培地中で調整した６．５、７．０、７．２、７．５、７．８、８．０及び８．５のｐＨの効果を示す棒グラフを示す。ＰＦＵ力価はプラーク形成アッセイにより決定した。
【００２０】
【図５】異なる培地中のＮＢ−２３４Ｋの形態  図５は、光学顕微鏡によるＭＥＭ‐Ｈｅｐｅｓ、ＶＰ‐ＳＦＭ及びＯｐｔｉ‐Ｐｒｏ ＳＦＭ培地中のＮＢ‐３２４Ｋ細胞の形態を示す。
【００２１】
【図６】免疫蛍光染色  図６は、マスター細胞株（ＭＣＢ）が、比較された２９３Ｔヒト胚腎臓細胞株のような上皮細胞株であり、線維芽細胞株（ＨＥＦ）とは異なることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
用語「細胞培養」は、人工のインビトロ環境における細胞の維持を意味する。本発明の培地は、付着性哺乳動物細胞、すなわち培養容器に付着する細胞、好ましくはＮＢ‐３２４Ｋ細胞のような上皮細胞を培養するために使用することができる。
【００２３】
「培養」という用語は、細胞の活性状態又は静止状態での増殖、分化又は継続的な生存率に有利な条件下でのインビトロでの細胞の維持を意味する。
【００２４】
「細胞培養培地」という語句は、細胞を培養するための栄養溶液を指す。
【００２５】
「ＥＧＦ」という用語は、その受容体ＥＧＦＲに結合することによって増殖及び分化を刺激する上皮成長因子を指す。さらに、ＥＧＦは腸上皮細胞の遊走及び細胞増殖を調節する。ＥＧＦは、好ましくはヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）である。
【００２６】
「成分」という用語は、化学的起源又は生物学的起源にかかわらず、細胞の増殖の成長を維持又は促進するために細胞培養培地中で使用することができる任意の化合物を指す。「成分」（コンポーネント）、「栄養素」及び「成分」（イングレディエント）という用語は互換的に使用することができ、すべてそのような化合物を指すことを意味する。細胞培養培地に使用される典型的な成分には、グルコース、グルタミン、グルタミン酸塩、乳酸塩、アンモニウム、成長因子、インスリン及びタンパク質が含まれる。
【００２７】
「無血清」の培地は、血清を含まないものである。無血清の培地は、低血清の培地及び本質的に無血清の培地とは区別され、これらは両方とも血清を含む。 
【００２８】
本発明は、無血清培地中でＨ‐１感染プロデューサー細胞株ＮＢ‐３２４Ｋ（「マスター細胞バンク」又は「マスター細胞株」）を増殖させることによってパルボウイルスＨ‐１を製造するための方法に関し、ここで培地は後述の成分を含む。実施例の部に示されるように、本発明は、標準のＦＢＳ含有培地で通常達成されるよりも４倍高いパルボウイルス力価を生成する。
【００２９】
本発明の方法は、グルコース、グルタミン、グルタミン酸塩、乳酸塩、アンモニウム、タンパク質（例えば成長因子、インスリンなど）の成分を含む無血清の細胞培養培地を使用し、ここでこの培地はＨ−１ＰＶの産生のための上皮細胞、好ましくはＮＢ−３２４Ｋ細胞のインビトロでの培養をサポートすることができる。
【００３０】
本発明の培地に使用される好ましい成長因子は上皮成長因子（ＥＧＦ）、好ましくはヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）であり、一方好ましいインスリンはヒト組換え体である。本培地のタンパク質成分は、ヒト又は動物由来ではなく、タンパク質濃度は超低濃度、好ましくは１０μｇ／μｌ未満である。
【００３１】
本発明の培地は、ヒト上皮細胞、好ましくはＮＢ‐３２４Ｋ細胞を高密度まで増殖させるために、及び／又はパルボウイルス産生を増大させるために使用することができる。１つの好ましい実施形態において、本発明の方法は、約１６〜２２ｍＭのグルコース、３〜５ｍＭのグルタミン、０．１〜０．６ｍＭのグルタミン酸塩、０．５〜１．０ｍＭの乳酸塩、０．３ｍＭ未満のアンモニウム、及び３〜１０μｇ／μｌのタンパク質を含有する本質的に無血清の細胞培養培地を使用する。ここで培地は、Ｈ−１ＰＶの産生のためのＮＢ−３２４Ｋ細胞の培養をサポートすることができる。
【００３２】
好ましくは、培養培地は、１７〜２０ｍＭのグルコース、約４ｍＭのグルタミン、約０．１５〜０．５ｍＭのグルタミン酸塩、約０．７ｍＭの乳酸塩、０．２ｍＭ未満のアンモニウム及び４〜８μｇ／μｌのタンパク質（例えば、サプリメント、上皮成長因子及びインスリン）を含有する。
【００３３】
特に好ましい実施形態では、培養培地は、１９．１４ｍＭのグルコース、４．２５ｍＭのグルタミン、０．１７４ｍＭのグルタミン酸塩、０．６６９ｍＭの乳酸塩、０．０５ｍＭ未満のアンモニウム及び約５μｇ／μｌのタンパク質を含む。これらのタンパク質には、ＥＧＦ、インスリン、及びタンパク質性サプリメントが含まれる。この培地は「ＶＰ−ＳＦＭ」と呼ばれる。
【００３４】
別の好ましい実施形態では、培養培地は１７．４９ｍＭのグルコース、４．２５ｍＭのグルタミン、０．４８６ｍＭのグルタミン酸塩、０．６４１ｍＭの乳酸塩、０．１８ｍＭのアンモニウム、７．５ｎｇ／μｌのｒＥＧＦ及び約７．５μｇ／μｌのタンパク質を含有する。これらのタンパク質にはＥＧＦとタンパク質性サプリメントが含まれる。この培地は「Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ」と呼ばれる。
【００３５】
本培地に添加され得るサプリメントとしては、インスリン、ダイズペプチド（例えば、Ｈｙｐｅｐ  １５１０）、Ｓｈｅｆｆ‐Ｖａｘ  Ｐｌｕｓ  ＡＣＦ、インスリン−トランスフェリン−セレンＡ、インスリン−トランスフェリン−セレンＸ及びＣＤ脂質濃縮物が挙げられる。インスリンは、例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から市販されている。大豆ペプチドは、例えばＱｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｎｏｒｗｉｃｈ、ＮＹ）から市販されている。
【００３６】
好ましい実施形態では、本発明の培地はサプリメント、好ましくは大豆タンパク質と組み合わされる。１つの適切な大豆タンパク質は、大豆の限外濾過酵素消化物、例えば、Ｈｙｐｅｐ  １５１０（登録商標）（Ｋｅｒｒｙ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ＆Ｆａｖｏｒｓ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、ＮＹ、ＵＳＡ）である。他の適切なサプリメントは、成長因子及び微量元素を含有する植物成分ベースの加水分解物であるＳｈｅｆｆ−Ｖａｘ  Ｐｌｕｓ  ＡＣＦ（登録商標）（Ｋｅｒｒｙ、Ｉｎｃ．、Ｋｉｌｄｉｒｅ、Ｉｒｅｌａｎｄ）である。
【００３７】
さらに好ましい態様において、本発明の培地のｐＨは約７．０〜７．５、好ましくは約７．２に調整されるべきである。
【００３８】
本発明の培地は、上皮細胞の培養を容易にするために使用され得る。特に、これらの培地は、上皮細胞株であることを本発明者らが見出したＮＢ−３２４Ｋ細胞に基づくマスター細胞株を培養するために使用され得る。本培地は上皮細胞を培養するのに特に有用であるが、上皮細胞をインビトロで培養することができる方法で細胞を増殖させるかどうかにかかわらず、培地は任意の標準的な細胞培養プロトコルに使用できることが理解される。
【００３９】
さらに、本培地は無血清で低タンパク質濃度であるため、パルボウイルス、例えばＨ‐１ＰＶの迅速生産に使用することができる。本出願において、グルタミン及び大豆ペプチドを添加したＶＰ‐ＳＦＭ中のＨ１‐ＰＶの生産は、ＦＢＳ含有培地と比較して同じ収率を示し、無血清生産のための適切な代替物であることが実証された。他の適切な培地は、グルタミンを添加したＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭである。
【００４０】
以下の実施例は例示を意図したものであり、本発明を限定するものではない。そのような例は使用され得るものの典型であるが、代わりに当業者に知られている他の方法が利用されてもよい。
【実施例】
【００４１】
例１
材料と方法
（Ａ）細胞培養及びＨ−１ＰＶ産生用培地
ＭＥＭ培地に２ｍＭのＬ‐グルタミンを補充した。ＶＰ−ＳＦＭ及びＯｐｔｉＰｒｏ−ＳＦＭにそれぞれ４ｍＭのＬ−グルタミンを補充した。
【００４２】
【表１】
2019531071.tif 000002
【００４３】
（Ｂ）細胞培養及びＨ−１ＰＶ産生
シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）で形質転換したＮＢ−３２４Ｋヒト新生児腎臓細胞（マスター細胞バンク）（Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ  ａｎｄ  Ｂｒａｔｔｏｎ、１９８３）を異なる培地中で３７℃で培養した（上記参照）。
【００４４】
ＭＣＢ細胞を各培地に移した後、細胞を少なくとも２週間細胞に適応させた。産生のために、ＮＢ‐３２４Ｋ細胞を３．６×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、細胞当たり０．０１プラーク形成単位（ＰＦＵ）の感染多重度（ＭＯＩ）でＨ‐１ＰＶを直ちに感染させた。顕微鏡下で観察された剥離細胞の百分率として測定される細胞変性効果（ＣＰＥ）が少なくとも３０％に達するまで、感染細胞を５％ＣＯ２下、３７℃で４日間インキュベートした。生細胞を０．４％トリパンブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、ドイツ）で染色することによって細胞密度及び生存率を測定した。細胞をＣｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）セルカウンター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ）で計数し、形態を顕微鏡観察する。
【００４５】
採取のために、培地を吸引し、感染細胞をＰＢＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡで処理した。培地上清及び剥離細胞を５，０００×ｇで５分間遠心分離した。ペレットをＰＢＳで洗浄し、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するウイルスＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ８．７（ＶＴＥ）に再懸濁し、３回の凍結／解凍サイクルにかけた。５，０００×ｇで５分間遠心分離した後、細胞片を捨てた。次いで、細胞溶解物をＳｏｎｏｒｅｘＳｕｐｅｒ  １０Ｐ超音波ホモジナイザー（Ｂａｎｄｅｌｉｎ、ドイツ）中で４８Ｗで１分間超音波処理し、ＤＮＡｓｅ（５０Ｕ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、ドイツ）で３７℃で３０分間処理した。
【００４６】
（Ｃ）プラーク形成アッセイ（ＰＦＵ）
プラークアッセイは本質的にＴａｔｔｅｒｓａｌｌ  ａｎｄ  Ｂｒａｔｔｏｎ、１９８３により記載されたようにして行った。ＮＢ−３２４Ｋ細胞を５％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び２ｍＭＬ−グルタミンを含むＭＥＭ培地中で単層培養で増殖させた。それらを６０％コンフルエンスでＨ−１ＰＶの段階希釈物に感染させ、３７℃で１時間インキュベートした。次に接種材料をバクト寒天オーバーレイ（５％ＦＢＳを含有するＭＥＭ中１．７％）と交換した。感染後４日目に、生細胞を、バクト寒天（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ドイツ）を含有する０．０２％トルイレンレッド染色溶液（Ｓｉｇｍａ、ドイツ）の添加により１８〜２４時間染色した。皿を５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートした。プラーク形成単位を、感染後５日目にライトボックス上で計数し、それらの濃度をＰＦＵ／ｍｌで表した。
【００４７】
（Ｄ）免疫蛍光試験
免疫蛍光試験は、特定の細胞外及び細胞内構造を証明することができる特異的抗原に結合する蛍光標識抗体の使用に基づいている。この原理は、上皮細胞の証拠のために、ＣＨ／ＨＫ−ケラチン抗体とともに染色するケラチンに対して使用される。それ故、細胞をスライド上で１４５ｃｍ２の細胞培養フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）中で培養した。ＮＢ‐３２４Ｋヒト新生児腎臓細胞（マスター細胞バンク）に３Ｅ６細胞／フラスコの密度で播種した。ケラチン染色のために、１．２Ｅ６細胞／フラスコ又は５Ｅ６細胞の細胞密度を有するＨＥＦ（ヒト胚性線維芽細胞）及びＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト上皮腎臓細胞）を対照として播種した。２４時間のインキュベーション時間の後、スライド上の細胞をＰＢＳ中で洗浄し、メタノール中で１０分間、その後アセトン中で５分間固定した。両方の液体は‐２０℃になる前に予備冷却された。ケラチン検出のために、スライドを０．０５％ＢＳＡを含むＰＢＳでプレブロックし、その後ＣＨ／ＨＫ−ケラチン抗体と共に１時間インキュベートした。その後、スライドを０．１％Ｔｒｉｔｏｎを含むＰＢＳで洗浄した後、二次抗体Ｃｙ３ｇｐ（Ｄｉａｎｏｖａ）を１時間インキュベートした。未結合の二次抗体を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎを含むＰＢＳ中で３回洗浄することによって除去した。スライドをエタノールに浸して乾燥させた。スライドを、細胞の核を染色する１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩを含むスライドマウント培地（ＣＥＬＬ  ＬＡＢ）で包埋した。分析は蛍光顕微鏡ＢＺ−９０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ）で行った。
【００４８】
（Ｅ）細胞の顕微鏡観察
光学顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２５）を用いて、細胞形態、密度及び形状を観察する。
【００４９】
例２
ＦＢＳを含まないＭＥＭ−Ｈｅｐｅｓ、ＶＰ−ＳＦＭ及びＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ培地のＨ−１ＰＶ生産性の比較
本発明者らは、まず、それぞれＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含まない、ＭＥＭ‐Ｈｅｐｅｓ、グルタミンを補充したＶＰ‐ＳＦＭ（ＶＰ‐ＳＦＭ＊）、及びグルタミンを補充したＯｐｔｉ‐Ｐｒｏ  ＳＦＭ（Ｏｐｔｉ‐Ｐｒｏ  ＳＦＭ＊）培地を含む異なる培地中のＨ‐１ＰＶの生産性を決定した。上の表で述べたように、ＶＰ−ＳＦＭ＊とＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ＊はタンパク質性成分としてＥＧＦを含んでいる。細胞を上記のように収集し、感染性粒子をＰＦＵアッセイにより分析した。
【００５０】
図１ａに示すように、０％ＦＢＳを含むＶＰ‐ＳＦＭ＊及びＯｐｔｉ‐Ｐｒｏ  ＳＦＭ＊培地中で培養したＨ‐１ＰＶ感染ＮＢ‐３２４Ｋ細胞は、０％ＦＢＳを含む標準培地ＭＥＭ‐Ｈｅｐｅｓと比較してより高い力価のＨ‐１ＰＶを生じた。
【００５１】
これらの結果は、ＦＢＳを含まないＶＰ−ＳＦＭ＊及びＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ＊培地が、ＦＢＳを含まない標準培地ＭＥＭ−Ｈｅｐｅｓと比較してＨ−１ＰＶの迅速な産生を促進することを実証している（図１ａ参照）。０％ＦＢＳを含むＶＰ‐ＳＦＭ＊（０．９±０．５）及び０％ＦＣＳを含むＯｐｔｉ‐Ｐｒｏ  ＳＦＭ＊（１．５±０．５）は、ＭＥＭ‐Ｈｅｐｅｓ  ５％ＦＢＳと比較して、生産性において同じ又はさらには増加する生産性を示した（図２ｂと図１ｂの比較）。さらに、０％ＦＢＳを含む標準培地ＭＥＭ‐Ｈｅｐｅｓは、生産性の実質的な減少を示すか、又はほとんど生産性を示さなかった（図１ａ）。
【００５２】
ＶＰ−ＳＦＭ＊とＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ＊は、標準培地ＭＥＭ−ＨｅｐｅｓとはＥＧＦの存在によって異なる。これは、成長因子ＥＧＦが細胞増殖を刺激する可能性があることを示しており（Ｆａｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８４）、これがＨ１−ＰＶ生産性を促進する可能性がある。
【００５３】
実施例３
５％ＦＢＳを含むＭＥＭ−Ｈｅｐｅｓ、ＶＰ−ＳＦＭ及びＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ培地におけるＨ−１ＰＶ生産性の比較
各５％ＦＢＳを含むＭＥＭ‐Ｈｅｐｅｓ、ＶＰ‐ＳＦＭ＊及びＯｐｔｉ‐Ｐｒｏ  ＳＦＭ＊培地中のＨ‐１ＰＶ生産性を調べるために、ＮＢ‐３２４Ｋ細胞を上記のように収集し、感染性粒子をＰＦＵアッセイにより分析した。
【００５４】
図２ｂに示されるように、ＶＰ‐ＳＦＭ＊（＋５％ＦＢＳ）は、比較培地ＭＥＭ‐Ｈｅｐｅｓ（＋５％ＦＢＳ）よりもＨ‐１ＰＶ生産性において約４．０ｘ±２．３良好であった。Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ＊（＋５％ＦＢＳ）培地は、比較培地ＭＥＭ−Ｈｅｐｅｓ（＋５％ＦＢＳ）よりも低いＰＦＵ値を示す（ＭＥＭ−Ｈｅｐｅｓの約１０％）。
【００５５】
これらの結果は、Ｏｐｔｉ‐Ｐｒｏ  ＳＦＭ＊が、５％ＦＢＳを添加した場合と比較して、ＦＢＳを添加しなくてもより良好な生産性を有することを実証している（図１ａ及び図２ａ）。対照的に、標準培地ＭＥＭ−Ｈｅｐｅｓは、ＦＢＳを含まない場合と比較して、５％ＦＢＳを用いた方がはるかに優れた生産性を示した（図１ａ及び図２ａ）。
【００５６】
実施例４
Ｈｙｐｅｐ  １５１０又はＳｈｅｆｆ−Ｖａｘ  Ｐｌｕｓ  ＡＣＦを添加し、ＦＢＳを添加しないＶＰ−ＳＦＭ培地におけるＨ−１ＰＶ生産性の測定
Ｈｙｐｅｐ  １５１０（登録商標）及びＳｈｅｆｆ−Ｖａｘ  Ｐｌｕｓ  ＡＣＦ（登録商標）を、ＦＢＳに代わるＶＰ−ＳＦＭ中の添加剤として使用した。細胞を、ＶＰ−ＳＦＭ中の、及びＨｙｐｅｐ  １５１０（登録商標）又はＳｈｅｆｆ−Ｖａｘ  Ｐｌｕｓ  ＡＣＦ（登録商標）を添加した無血清ＶＰ−ＳＦＭ中の５％ＦＢＳと共に培養した。細胞を上記のように収集し、感染性粒子をＰＦＵアッセイにより分析した。
【００５７】
図３に示すように、Ｈｙｐｅｐ  １５１０（１．８７×１０３ＰＦＵ／細胞）を添加したＶＰ‐ＳＦＭは、５％ＦＢＳを含むＶＰ‐ＳＦＭ（１．６９×１０３ＰＦＵ／細胞）と比較して生産性の増加を示した。
【００５８】
これらの結果は、Ｈｙｐｅｐ  １５１０を補充したＶＰ−ＳＦＭにおけるＨ１−ＰＶの産生が、５％ＦＢＳを補充したＶＰ−ＳＦＭと比較して同じ収率を示したことを実証する。したがって、本発明のＶＰ‐ＳＦＭ培地は、Ｈｙｐｅｐ  １５１０を補充した場合、無血清培地中でＨ‐１ＰＶ感染ＮＢ‐３２４Ｋ細胞を培養するために使用することができ、５％ＦＢＳを補充した培地で得られるのと匹敵する結果が得られる。
【００５９】
実施例５
Ｈ‐１ＰＶ生産性に対する感染中のｐＨの影響
Ｈ−１  ＰＶ産生に理想的なｐＨを決定する必要がある。したがって、６．５、７．０、７．２、７．５、７．８、８．０及び８．５のｐＨを、ＨＣｌ又はＮａＯＨのいずれかを用いてＭＥＭ培地中で調整した。Ｈ‐１ＰＶウイルス感染の間の安定したｐＨを確実にするために、蓋を閉めた細胞培養ボトルを４時間のガス交換を避けるために使用した。細胞を培養するためにはＣＯ２ガスが必要であるので、４時間のインキュベーション後、フィルター付きの蓋を４日間のインキュベーションに使用した。細胞を上記のように収集し、感染性粒子をＰＦＵアッセイにより分析した。
【００６０】
図４に示されるように、ｐＨは、感染性粒子の任意の収率を達成するために７．０〜７．５の範囲、好ましくは約７．２に調整されるべきである。
【００６１】
実施例６
ＭＥＭ‐Ｈｅｐｅｓ、ＶＰ‐ＳＦＭ及びＯｐｔｉ‐Ｐｒｏ  ＳＦＭ培地中のＮＢ‐３２４Ｋの形態
光学顕微鏡写真を介して図５に示されるように、形態は、３つの培地全てにおいて規則的な寸法及びサイズを有する同じ多角形を実証する。
【００６２】
免疫蛍光を介して図６に示されるように、マスター細胞株（ＭＣＢ）は、比較された２９３Ｔヒト胚腎臓細胞株のような上皮細胞株であり、線維芽細胞株ＨＥＦとは異なる。
【００６３】
参照文献のリスト
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【図１】
2019531071.tif 000003
【図２】
2019531071.tif 000004
【図３】
2019531071.tif 000005
【図４】
2019531071.tif 000006
【図５】
2019531071.tif 000007
【図６】
2019531071.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月29日(2018.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルボウイルスＨ−１に感染したプロデューサー細胞株ＮＢ−３２４Ｋを増殖させるための方法であって、１６〜２２ｍＭのグルコース、３〜５ｍＭのグルタミン、０．１〜０．６ｍＭのグルタミン酸塩、０．５〜１．０ｍＭの乳酸塩、０．３ｍＭ未満のアンモニウム、並びに上皮成長因子及び大豆ペプチドを含む３〜１０μｇ／μｌのタンパク質を含む無血清培地で感染ＮＢ−３２４Ｋ細胞を培養し、該培地は７．０〜７．５のｐＨを有する、上記方法。
【請求項２】
前記培地が、１９．１４ｍＭのグルコース、４．２５ｍＭのグルタミン、０．１７４ｍＭのグルタミン酸塩、０．６６９ｍＭの乳酸塩、０．０５ｍＭ未満のアンモニウム、並びにインスリン、上皮成長因子及び大豆ペプチドを含む約５μｇ／μｌのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地が１７．４９ｍＭのグルコース、４．２５ｍＭのグルタミン、０．４８６ｍＭのグルタミン酸塩、０．６４１の乳酸塩、０．１８ｍＭのアンモニウム、７．５μｇ／μｌの上皮増殖因子及び大豆ペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記大豆ペプチドがＨｙｐｅｐ  １５１０（登録商標）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ｐＨが約７．２である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2019531071.tif 000009
2019531071.tif 000010
2019531071.tif 000011