(57)【要約】  本発明は、式Ｉの化合物（式中、Ｒは、フェニルまたはピリジニルを表し；フェニルは、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、アセチルアミノ、ハロゲンおよびニトロから独立して選択される１個または２個の置換基によって任意選択的に置換されており；かつピリジニルは、アミノまたはハロゲンによって任意選択的に置換されており；Ｒ１は、水素またはシアノ低級アルキルを表し、低級という接頭語が、最大で４個までの炭素原子を有する基を意味する）または薬剤として許容されるその誘導体に対する、脳腫瘍の応答を予測するための、バイオマーカーとしてのＥＢ１の使用であって、特に、標準値または標準値のセットに対する被験体からの試料中のＥＢ１レベルが高いことによって、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する脳腫瘍の感受性が予測される、使用を提供する。本発明は、本発明に従って用いられる治療方法およびキットも提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物
【化１】
2019503473.tif 000015
（式中、Ｒは、フェニルまたはピリジニルを表し；
フェニルは、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、アセチルアミノ、ハロゲンおよびニトロから独立して選択される１個または２個の置換基によって任意選択的に置換されており；かつ
ピリジニルは、アミノまたはハロゲンによって任意選択的に置換されており；
Ｒ１は、水素またはシアノ低級アルキルを表し、低級という接頭語が、最大で４個までの炭素原子を有する基を意味する）
または薬剤として許容されるその誘導体に対する脳腫瘍の応答を予測するための、バイオマーカーとしてのＥＢ１の使用。
【請求項２】
標準値または標準値のセットに対して、被験体から採取された試料中のＥＢ１レベルが高いことによって、前記式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する前記脳腫瘍の感受性が予測される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
標準値または標準値のセットに対して、被験体から採取された試料中の癌幹細胞（ＣＳＣ）におけるＥＢ１レベルが高いことによって、前記式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する前記脳腫瘍の感受性が予測される、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記応答が、前記式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する、前記脳腫瘍、好ましくは膠芽腫多形の癌幹細胞（ＣＳＣ）の応答である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記癌幹細胞（ＣＳＣ）が、ＡＬＤＨ１、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ−Ｇｌｉ活性、α６−インテグリン、ＡＢＣＢ５、β−カテニン活性、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ１６６、ＬＧＲ５、ＣＤ１５、ネスチン、ＣＤ１３、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１１７、ＣＤ２０、ＣＤ２７１、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＸＣＲ４、Ｎｏｄａｌ−アクチビン、α２β１−インテグリンおよびＴｒｏｐ２からなる群から選択される、好ましくはＣＤ１５、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、α６−インテグリン、ネスチン、およびＡ２Ｂ５からなる群から選択される、少なくとも１種類の癌幹細胞マーカーを発現する、請求項３または４に記載の使用。
【請求項６】
前記癌幹細胞（ＣＳＣ）が、前記マーカーＣＤ１３３および／またはＡ２Ｂ５を発現する、請求項３または４に記載の使用。
【請求項７】
前記バイオマーカーＥＢ１が、被験体から採取された試料において生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で測定される、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記被験体がヒトである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記試料が、正常な組織、腫瘍組織、細胞系、血液、脳脊髄液、循環腫瘍細胞または癌幹細胞（ＣＳＣ）に由来する、請求項７または８に記載の使用。
【請求項１０】
前記試料が、腫瘍組織に由来する、請求項７または８に記載の使用。
【請求項１１】
前記癌幹細胞（ＣＳＣ）が前記試料中で同定され、かつ前記ＥＢ１レベルが、前記癌幹細胞（ＣＳＣ）において測定される、請求項７から１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
ｉ）同じ腫瘍組織型を有する被験体からの標準値または標準値のセットに対する；または
ｉｉ）治療開始後に採取され、かつ治療開始前に同じ被験体から採取された試料と比較される；または
ｉｉｉ）正常細胞、組織または体液からの標準値または標準値のセットに対する；
前記試料中のＥＢ１レベルが高いことによって、前記脳腫瘍の感受性が予測される、請求項７から１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記感受性が、式Ｉの前記化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する、前記脳腫瘍の癌幹細胞（ＣＳＣ）の感受性である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記脳腫瘍が、グリアおよび非グリア腫瘍、星状細胞腫、乏突起細胞腫、上衣細胞腫、髄膜腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、頭蓋咽頭腫、原発性中枢神経系リンパ腫、胚細胞腫瘍、下垂体腫瘍、松果体部腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、髄芽腫、血管外皮細胞腫、髄膜腫、脊索腫を含む脊髄腫瘍、および神経線維腫症、末梢神経鞘腫瘍および結節性硬化症を含む遺伝子に駆動される脳腫瘍から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記脳腫瘍が膠芽腫多形である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
式Ｉの前記化合物、または薬剤として許容されるその誘導体における、Ｒ、ＹおよびＲ１が以下：
【表１】
2019503473.tif 000016
の通りに定義される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記化合物が、ＢＡＬ２７８６２
【化２】
2019503473.tif 000017
または薬剤として許容されるその誘導体である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記薬剤として許容される誘導体が、式Ｉの化合物の塩、溶媒和化合物、プロドラッグ、プロドラッグの塩からなる群から選択される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
前記薬剤として許容される誘導体がプロドラッグであり、かつ前記プロドラッグが、式Ｉの前記化合物のＲ基内に存在するアミノ基およびグリシン、アラニンまたはリジンのカルボキシ基から形成されるアミドである、請求項１から１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
前記化合物が、ＢＡＬ１０１５５３
【化３】
2019503473.tif 000018
または薬剤として許容されるその塩である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記薬剤として許容される塩が、その塩酸塩、さらに好ましくはその二塩酸塩である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
被験体からの試料中のＥＢ１のレベルを測定して、このレベルを表す値を得ることと、前記ＥＢ１のレベルが標準値または標準値のセットより高い場合に、請求項１、１７および２０のいずれか一項で定義される式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体で前記被験体を治療することと、を含む、脳腫瘍、好ましくは膠芽腫多形の治療において使用される、請求項１、１７および２０のいずれか一項で定義される式Ｉの化合物、または薬剤として許容されるその誘導体。
【請求項２３】
脳腫瘍、好ましくは膠芽腫多形の治療のための医薬の製造における、請求項１、１７および２０のいずれか一項で定義される式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体の使用であって、被験体からの試料中のＥＢ１のレベルを測定して、このレベルを表す値を得ることと、前記ＥＢ１のレベルが標準値または標準値のセットより高い場合に、請求項１、１７および２０のいずれか一項で定義される式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体で前記被験体を治療することと、を含む、使用。
【請求項２４】
その必要がある被験体において、脳腫瘍、好ましくは膠芽腫多形を治療する方法であって、
ａ）前記被験体の体から生体材料の試料を採取する工程；
ｂ）前記試料中のＥＢ１のレベルを決定する工程；および
ｃ）前記試料中のＥＢ１の前記レベルが標準値または標準値のセットより高い場合に、請求項１、１７および２０のいずれか一項で定義される式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体で、前記被験体を治療する工程；
を含む、方法。
【請求項２５】
前記化合物が請求項１７または２０で定義される、請求項２２に記載の化合物、請求項２３に記載の使用または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１、１７および２０のいずれか一項で定義される、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する、脳腫瘍、好ましくは膠芽腫多形の応答を予測するキットであって、試料中のＥＢ１の前記レベルを測定するのに必要な試剤を備え、好ましくは、前記試料中のＥＢ１の前記レベルに対して比較される標準値または標準値のセットを含むコンパレーターモジュールをさらに備える、キット。
【請求項２７】
前記化合物が請求項１７または請求項２０で定義される、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記試剤が、ＥＢ１の検出体を含む捕捉剤と、検出剤と、を含むキットであって、好ましくは前記捕捉剤が抗体である、請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項２９】
試料中のＥＢ１のレベルを測定するのに必要な試剤と、癌幹細胞（ＣＳＣ）を同定かつ／または捕捉するのに必要な試剤と、を含む、請求項２６から２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
ＢＡＬ１０１５５３
【化４】
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または薬剤として許容されるその塩、特にその二塩酸塩を備える、請求項２６から２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
請求項１、１７および２０のいずれか一項で定義される、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体を投与することによる、被験体における脳腫瘍、好ましくは膠芽腫多形の治療に対する応答を予測する方法であって：
ａ）前記被験体から採取された試料中のＥＢ１のレベルを測定して、このレベルを表す値を得る工程；および
ｂ）工程ａ）から得られた前記レベルの前記値を標準値または標準値のセットと比較し、その比較から、式Ｉの前記化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する奏効性が予測される、工程；
を含む、方法。
【請求項３２】
標準値または標準値のセットに対して、被験体から採取された試料中のＥＢ１のレベルが高いことによって、前記式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する前記脳腫瘍の感受性が予測される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物が請求項１７または２０で定義される、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料が体液に由来する、請求項１から８および１１から２１のいずれか一項に記載の使用、請求項２２または２５に記載の化合物、請求項２３または２５に記載の使用、請求項２４または２５に記載の方法、請求項２６から３０のいずれか一項に記載のキット、および請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料が血液に由来する、請求項３４に記載の使用、化合物、方法またはキット。
【請求項３６】
前記試料が血清に由来する、請求項３４に記載の使用、化合物、方法またはキット。
【請求項３７】
前記のより高いＥＢ１レベルの前記決定が、前記ＥＢ１タンパク質レベルまたはＥＢ１核酸レベルを測定することによって行われる、請求項２から２１および３４から３６のいずれか一項に記載の使用、請求項２２、２５および３４から３６のいずれか一項に記載の化合物、請求項２３、２５および３４から３６のいずれか一項に記載の使用、請求項２４、２５および３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−（４−｛１−［２−（４−アミノ−フェニル）−２−オキソ−エチル］−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル｝−フラザン−３−イルアミノ）−プロピオニトリル（ＢＡＬ２７８６２）およびその誘導体など、以下に記載の式Ｉの化合物に対する癌、特に脳腫瘍の応答を予測するためのバイオマーカーとしてのＥＢ１の使用に関する。他の態様において、本発明は、方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
微小管は、細胞骨格の構成要素の一つであり、αおよびβチューブリンのヘテロ二量体で構成される。微小管標的化剤（ＭＴＡ）は中でも、広域の活性を有する最も有効な細胞毒性化学療法薬である。それらは、例えば、血液悪性疾患および固形腫瘍、例えば肺癌、乳癌および前立腺癌などの治療に使用される。しかしながら、血液脳関門が臨床的に関連するＭＴＡの大部分を、腫瘍が位置する脳へと通過させないため、膠芽腫治療に対する使用は制限されている。
【０００３】
かかる薬剤に暴露した後に、ＭＴＡに対する耐性は、本来備わっているか、または獲得され得る。したがって、かかる耐性は、患者の生存率、ならびに治療様式の選択に影響を及ぼす。耐性のいくつかの潜在的なメカニズムが同定されている。これは、微小管標的自体の欠損、またはその生物学的性質を変化させる、従ってＭＴＡに対する奏効性を変化させる、公知の微小管付属タンパク質の欠損を含み得る。さらに、他の細胞タンパク質の欠損は、腫瘍細胞から薬物を能動的に押し出す排出トランスポーター（ｅｆｆｌｕｘ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）の過剰発現など、特定の微小管標的化剤に対する耐性と関連することが示唆されている。標準腫瘍学治療では、効果は不完全かつ一時的であることが多く、バルキー（ｂｕｌｋｙ）腫瘍が縮小されるだけであり、残りの腫瘍は、主に癌幹細胞（ＣＳＣ）の小分集団に存在する複数の耐性メカニズムのために、再発する傾向がある。ＣＳＣは、長寿命であり、広範囲の自己再生、および腫瘍形成および転移再増殖の能力を有する。
【０００４】
膠芽腫（ＧＢＭ）は、成人における神経膠腫の中で最も一般的かつ最も進行性の脳腫瘍である。進行にかかわらず、特に再発セッティングでは有効な治療法は限られている。ＧＢＭ腫瘍は、脳全体で急速に増殖し、かつ非常に浸潤性の挙動のために、死に至らせる。自己再生能力および化学療法および放射線治療に対する耐性があるために、腫瘍を維持し、かつ増殖させることができるＣＳＣから、悪性細胞の大部分が発生するという抵抗し難い証拠がある（Ｒｅｙａ  Ｔ．，Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，ｃａｎｃｅｒ，ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４１４：１０５−１１１；Ｐａｒｄａｌ  Ｒ．，Ａｐｐｌｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．２００２；３：８９５−９０２）。
【０００５】
脳腫瘍におけるＣＳＣの同定は、悪性神経またはグリア由来腫瘍細胞の発生を調査し、かつこれらの細胞を標的化する治療法を開発する、強力なツールを提供する。腫瘍の進行、維持および再発を担うＣＳＣの認識されている顕著な特徴は、その移行能力である（Ｏｒｔｅｎｓｉ  Ｂ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１３；４（１）：１８）。これは、その浸潤性および転移性挙動の本質的な性質であり、臨床的には、完全な腫瘍の切除はほぼ不可能である。最近の実験データから、ＧＢＭ  ＣＳＣは、ＧＢＭ浸潤性の原因であることがはっきりと示されている（Ｏｒｔｅｎｓｉ  Ｂ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１３；４（１）：１８）。ヒト原発性ＧＢＭ、ＧＢＭ異種移植片またはＧＢＭ細胞系のいずれかに由来する幹細胞マーカーＣＤ１３３に対して強化されたＧＢＭ細胞は、対応ＣＤ１３３ネガティブＧＢＭ腫瘍細胞と比較して、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で高い移行性および浸潤性の可能性を示す（Ｙｕ  Ｓ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｏｆ  ＣＤ１３３＋  ｇｌｉｏｍａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｈｉｎ  Ｍｅｄ  Ｊ．２０１１；１２４：２５９９−２６０４；Ａｎｎａｂｉ  Ｂ．，Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ＣＤ１３３＋  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＭＴ１−ＭＭＰ  ｉｎ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｍｏｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ．２００９；４８：９１０−９１９）。さらに、前浸潤性遺伝子がＣＳＣにおいてアップレギュレートされ、したがって、移動および浸潤のプロセスに関与するタンパク質が過剰発現されることが実証されている（例えば、ディスインテグリン、メタロプロテイナーゼ）（Ｏｒｔｅｎｓｉ  Ｂ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１３；４（１）：１８）。
【０００６】
微小管末端結合タンパク質１（ＥＢ１）は最初に、ＡＰＣ（腺腫性結腸ポリポーシス）腫瘍サプレッサーの結合パートナーとして発見された。ＥＢ１はＭＡＰＲＥ１遺伝子によってコードされ、微小管動態、細胞極性および有糸分裂中の染色体安定性の調節に関与するＲＰ／ＥＢファミリーのメンバーである（Ｄｏｎｇ  Ｘ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｅｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２０１０；２２０（３）：３６１−９；Ｗａｎｇ  Ｙ．，Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＥＢ１  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｒｏｂａｂｌｙ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ／ＴＣＦ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５；６５：１３０４−１３１０）。ＥＢ１／ＭＡＰＲＥ１は、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＨＧＮＣ）識別番号ＨＧＮＣ  ＩＤ：６８９０およびＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ２２９１９に割り当てられている。ヒトＥＢ１タンパク質および核酸に相当する配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）を介して参照番号ＮＭ＿０１２３２５（図１０，配列番号１＆２，ＮＭ＿０１２３２５）で入手可能である。ＡＰＣの重要な結合パートナーであるにもかかわらず、腫瘍形成におけるＥＢ１の一般的な役割は十分に確立されていない。しかしながら、最近のレポートから、ＥＢ１自体が発癌機能を有することが示唆されている。発現の研究によって、乳癌（Ｄｏｎｇ  Ｘ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｅｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ，Ｊ  Ｐａｔｈ．２０１０；２２０（３）：３６１−９）、胃癌、肝細胞癌、食道扁平上皮癌（Ｗａｎｇ  Ｙ．，Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＥＢ１  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｒｏｂａｂｌｙ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ／ＴＣＦ  ｐａｔｈｗａｙ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５；６５：１３０４−１３１０）においてＥＢ１が過剰発現されており、その発現レベルは、無増悪生存期間（ＰＦＳ）および全生存期間（ＯＳ）の低下など、悪い結果と相関することが実証されている。原発性ＧＢＭ患者１０９名のコホートにおけるごく最近に実施された研究でも、このことが実証されている（Ｂｅｒｇｅｓ  Ｒ．，Ｅｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ｔｏ  Ｖｉｎｃａ−ａｌｋａｌｏｉｄｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１４；Ｖｏｌ．５（２４）：１２７６９−８７）。高いＥＢ１発現は、調査されたＧＢＭ患者における低いＯＳ��ｐ＜０．００１）および低いＰＦＳ（ｐ＜０．００１）と相関した。
【０００７】
ＢＡＬ２７８６２が、腫瘍性疾患および自己免疫疾患の治療に関して、国際公開第２００４１０３９９４号パンフレットに記載されている。そのプロドラッグ（例えば、ＢＡＬ１０１５５３）は、国際公開第２０１１０１２５７７号パンフレットに記載されている。
【０００８】
驚くべきことに、ＥＢ１の存在が、ＢＡＬ１０１５５３治療に対するＧＢＭ  ＣＳＣの感受性の増加と関連することが判明した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の態様において、本発明は、式Ｉ
【化１】
2019503473.tif 000003
（式中、Ｒは、フェニルまたはピリジニルを表し；
フェニルは、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、アセチルアミノ、ハロゲンおよびニトロから独立して選択される１個または２個の置換基によって任意選択的に置換されており；かつ
ピリジニルは、アミノまたはハロゲンによって任意選択的に置換されており；
Ｒ１は、水素またはシアノ−低級アルキルを表し、かつ
低級という接頭語は、最大で４個までの炭素原子を有する基を意味する）
の化合物、または薬剤として許容されるその誘導体に対する脳腫瘍の応答を予想するための、バイオマーカーとしてのＥＢ１の使用を提供する。
【００１０】
式Ｉの化合物は微小管の不安定化剤（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｓｅｒ）であるが、それらは、他の微小管標的化剤、例えば他の微小管不安定化剤と比べて、細胞の表現型に対して異なる作用を有する。さらに、それらは、従来の微小管標的化剤と異なる様式で微小管生物学に影響を及ぼし、その結果、従来の微小管標的化剤に対して耐性である腫瘍モデルにおいて強力な活性を有する。国際公開第２０１２０９８２０８号パンフレット、国際公開第２０１２０９８２０７号パンフレット、国際公開第２０１２０９８２０３号パンフレット、国際公開第２０１２１１３８０２号パンフレットおよび国際公開第２０１２１３０８８７号パンフレットの実施例を参照のこと。したがって、特定の遺伝子の発現が式Ｉの化合物の作用に関与するのかどうか、またはどのように関与するのかに関して、従来の微小管標的化剤についての情報から予想することはできない。
【００１１】
好ましくは、その応答は、治療に対する、つまり式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体を使用した治療に対する応答である。
【００１２】
好ましくは、その応答は、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する脳腫瘍のＣＳＣの応答である。
【００１３】
一実施形態において、標準値または標準値のセットに対して、被験体から採取された試料中のＥＢ１レベルが高いことによって、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する脳腫瘍の感受性、特に脳腫瘍におけるＣＳＣの感受性が予測される。
【００１４】
更なる実施形態において、標準値または標準値のセットに対して、被験体から採取された試料中のＣＳＣにおけるＥＢ１レベルが高いことによって、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する脳腫瘍の感受性、特に脳腫瘍におけるＣＳＣの感受性が予測される。
【００１５】
更なる実施形態において、標準値または標準値のセットに対して、被験体から採取された試料中のＥＢ１レベルが低いことによって、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する脳腫瘍の耐性、特に脳腫瘍におけるＣＳＣの耐性が予測される。
【００１６】
更なる実施形態において、標準値または標準値のセットに対して、被験体から採取された試料中のＣＳＣにおけるＥＢ１レベルが低いことによって、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する脳腫瘍の耐性、特に脳腫瘍におけるＣＳＣの耐性が予測される。
【００１７】
ＥＢ１は、被験体から採取された試料において生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で測定される。
【００１８】
好ましくは、脳腫瘍は膠芽腫多形である。
【００１９】
好ましくは、式Ｉの化合物は、ＢＡＬ２７８６２またはそのプロドラッグＢＡＬ１０１５３３である。
【００２０】
更なる実施形態において、本発明は、ＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３に対する膠芽腫多形の応答を予測するためのバイオマーカーとしてのＥＢ１の使用を提供し、
バイオマーカーＥＢ１は、被験体から採取された試料中で生体外にて測定され；
標準値または標準値のセットに対して、被験体から採取された試料中のＥＢ１レベルが高いことによって、ＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３に対する膠芽腫多形の感受性が予測される。
【００２１】
更なる実施形態において、本発明は、ＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３に対する膠芽腫多形の応答を予測するためのバイオマーカーとしてのＥＢ１の使用を提供し、
バイオマーカーＥＢ１は、被験体から採取された試料中で生体外にて測定され；
ＥＢ１のレベルが、その試料中のＣＳＣにおいて、好ましくはＣＤ１３３および／またはＡ２Ｂ５を発現するＣＳＣにおいて測定され；
標準値または標準値のセットに対して、被験体から採取された試料中のＣＳＣにおけるＥＢ１レベルが高いことによって、ＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３に対する膠芽腫多形の感受性が予測される。
【００２２】
本発明の更なる態様において、本発明は、式Ｉの化合物の投与によって、被験体における脳腫瘍の治療に対する応答を予測する方法であって：
ａ）被験体から採取された試料中のＥＢ１のレベルを測定して、このレベルを表す値を得る工程；
ｂ）工程ａ）からのレベルの値を標準値または標準値のセットと比較し、その比較から式Ｉの化合物に対する奏効性を予測する、工程；
を含む方法を提供する。
【００２３】
上記の実施形態は、本発明のこの態様にあてはまる。特に、一実施形態において、本発明は、ＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３の投与によって、ヒト被験体における膠芽腫多形の治療に対する応答を予測する方法であって：
ａ）ヒト被験体から採取された試料中のＥＢ１のレベルを生体外で測定して、このレベルを表す値が得られる工程；
ｂ）工程ａ）からのレベルの値を標準値または標準値のセットと比較し、その比較からＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３に対する奏効性を予測する工程であって、
標準値または標準値のセットに対して、ヒト被験体から採取された試料中のＥＢ１レベルが高いことによって、ＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３に対する膠芽腫多形の感受性が予測される、工程；
を含む方法を提供する。
【００２４】
更なる実施形態において、本発明は、ＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３の投与によって、ヒト被験体における膠芽腫多形の治療に対する応答を予測する方法であって：
ａ）ヒト被験体から採取された試料中の、ＣＳＣにおける、好ましくはＣＤ１３３および／またはＡ２Ｂ５を発現するＣＳＣにおけるＥＢ１のレベルを生体外で測定して、このレベルを表す値が得られる工程；
ｂ）工程ａ）からのレベルの値を標準値または標準値のセットと比較し、その比較からＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３に対する奏効性を予測する工程であって、
標準値または標準値のセットに対して、ヒト被験体からの試料中のＣＳＣにおけるＥＢ１レベルが高いことによって、ＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３に対する膠芽腫多形の感受性が予測される、工程；
を含む方法を提供する。
【００２５】
更なる態様において、本発明は、被験体からの試料中のＥＢ１のレベルを測定して、このレベルを表す値を得ることと、ＥＢ１のレベルが標準値または標準値のセットよりも高い場合に、被験体を式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体で治療することと、を含む、脳腫瘍の治療において使用される、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体を提供する。
【００２６】
上記の実施形態は、本発明のこの態様にあてはまる。特に、一実施形態において、本発明は、ヒト被験体から採取された試料中のＥＢ１レベルを生体外で測定して、このレベルを表す値を得ることと、ＥＢ１レベルが標準値または標準値のセットよりも高い場合に、ヒト被験体をＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３で治療することと、を含む、膠芽腫多形の治療において使用される、ＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３を提供する。
【００２７】
更なる実施形態において、ヒト被験体から採取された試料中のＣＳＣにおける、好ましくはＣＤ１３３および／またはＡ２Ｂ５を発現するＣＳＣにおけるＥＢ１のレベルを生体外で測定して、このレベルを表す値を得ることと、試料中のＣＳＣにおけるＥＢ１のレベルが標準値または標準値のセットよりも高い場合に、ヒト被験体をＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３で治療することと、を含む、膠芽腫多形の治療において使用される、ＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３を提供する。
【００２８】
更なる態様において、本発明は、被験体からの試料中のＥＢ１のレベルを測定して、このレベルを表す値を得ることと、ＥＢ１のレベルが標準値または標準値のセットよりも高い場合に、被験体を式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体で治療することと、を含む、脳腫瘍の治療のための薬物の製造における式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体の使用を提供する。
【００２９】
上記の実施形態は、本発明のこの態様にあてはまる。特に、一実施形態において、本発明は、ヒト被験体から採取された試料中のＥＢ１のレベルを生体外で測定して、このレベルを表す値を得ることと、ＥＢ１のレベルが標準値または標準値のセットよりも高い場合に、ヒト被験体をＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３で治療することと、を含む、膠芽腫多形の治療のための薬物の製造におけるＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３の使用を提供する。
【００３０】
更なる実施形態において、本発明は、ヒト被験体から採取された試料中のＣＳＣにおける、好ましくはＣＤ１３３および／またはＡ２Ｂ５を発現するＣＳＣにおけるＥＢ１のレベルを生体外で測定して、このレベルを表す値を得ることと、試料中のＣＳＣにおけるＥＢ１のレベルが標準値または標準値のセットよりも高い場合に、ヒト被験体をＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３で治療することと、を含む、膠芽腫多形の治療のための薬物の製造におけるＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３の使用を提供する。
【００３１】
更なる態様において、本発明は、その必要がある被験体において脳腫瘍を治療する方法であって、
ａ）前記被験体の体から生体材料の試料を採取する工程；
ｂ）前記試料中のＥＢ１のレベルを決定する工程；
ｃ）前記試料中のＥＢ１のレベルが標準値または標準値のセットよりも高い場合に、被験体を式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体で治療する工程；
を含む方法を提供する。
【００３２】
上記の実施形態は、本発明のこの態様にあてはまる。特に、一実施形態において、本発明は、その必要があるヒト被験体において膠芽腫多形を治療する方法であって、
ａ）前記ヒト被験体の体から生体材料の試料を採取する工程；
ｂ）前記試料中のＥＢ１のレベルを決定する工程；
ｃ）前記試料中のＥＢ１のレベルが標準値または標準値のセットよりも高い場合に、ヒト被験体をＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３で治療する工程；
を含む方法を提供する。
【００３３】
更なる実施形態において、本発明は、その必要があるヒト被験体において膠芽腫多形を治療する方法であって、
ａ）前記ヒト被験体の体から生体材料の試料を採取する工程；
ｂ）前記試料中のＣＳＣにおける、好ましくはＣＤ１３３および／またはＡ２Ｂ５を発現するＣＳＣにおけるＥＢ１のレベルを決定する工程；
ｃ）前記試料中のＣＳＣにおけるＥＢ１のレベルが標準値または標準値のセットよりも高い場合に、ヒト被験体をＢＡＬ２７８６２またはＢＡＬ１０１５３３で治療する工程；
を含む方法を提供する。
【００３４】
更なる態様において、本発明は、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する脳腫瘍の応答を予測するキットであって、試料中のＥＢ１のレベルを測定するのに必要な試剤を備え、好ましくは、試料中のＥＢ１レベルがそれに対して比較される標準値または標準値のセットを含むコンパレーターモジュールをさらに備える、キットを提供する。好ましい実施形態において、そのキットはＢＡＬ２７８６２および／またはＢＡＬ１０１５３３を備える。
【００３５】
更なる態様において、本発明は、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する脳腫瘍の応答を予測するデバイスであって、試料中のＥＢ１のレベルを測定するのに必要な試剤を備え、好ましくは、試料中のＥＢ１のレベルがそれに対して比較される標準値または標準値のセットを含むコンパレーターモジュールをさらに備える、デバイスを提供する。好ましい実施形態において、そのデバイスはＢＡＬ２７８６２および／またはＢＡＬ１０１５３３を備える。
【００３６】
好ましい実施形態において、キットまたはデバイスにおける試剤は、ＥＢ１の検出体（ｄｉｔｅｃｔｏｒ）を含む捕捉剤（ｃａｐｔｕｒｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）と、検出剤（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｒｅａｇｅｎｔ）と、を含む。特に好ましくは、捕捉剤は抗体である。
【００３７】
更なる好ましい実施形態において、キットまたはデバイスは、試料中のＥＢ１のレベルを測定するのに必要な試剤と、ＣＳＣを同定し、かつ／または捕捉するのに必要な試剤と、を備える。
【００３８】
また好ましくは、脳腫瘍は、ＥＢ１のレベルが標準値または標準値のセットに対して高い場合に前記化合物での治療に対して感受性があると予測される。好ましい実施形態において、コンパレーターモジュールは、キットまたはデバイスそれぞれの使用説明書を意味する。代替の実施形態において、コンパレーターモジュールはディスプレイ装置の形をとる。
【００３９】
本発明の実施形態は、添付の図面を参照して一例として説明される。しかしながら、本発明は、これらの実施形態に限定されると解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＧＢＭ６およびＧＢＭ９  ＧＢＭ  ＣＳＣにおけるＥＢ１発現レベルを示す。
【図２】ＧＢＭ６およびＧＢＭ９  ＣＳＣにおける生体外での細胞移動の抑制を示す。定量化は、ＧＢＭ６およびＧＢＭ９それぞれに関して、対照細胞の１００％に対する移動細胞のパーセンテージとして表される。少なくとも３つの独立した実験から、結果を示す。アスタリスクは、＊＊：ｐ＜０．００５，＊＊＊：ｐ＜０．００１と示されるように、群の間での統計学的に有意な差を示す。
【図３】ｓｈＲＮＡによって抑制されたＥＢ１発現レベルを用いた、安定なＧＦＰ発現ＧＢＭ６ＣＳＣの分析を示す。
【図４】非細胞毒性濃度６ｎＭでのＢＡＬ２７８６２の抗移動（ａｎｔｉ−ｍｉｇｒａｔｏｒｙ）作用に対するＧＢＭ６  ＣＳＣにおけるＥＢ１ダウンレギュレーションの作用を示す。少なくとも３つの独立した実験から、結果を示す。アスタリスクは、対照に対する、または群の間での統計学的に有意な差：ｐ＜０．０５を示す。
【図５】ＥＢ１発現依存型手法においてＧＢＭ６ＣＳＣのクローン原性能力に対するＢＡＬ２７８６２の作用を示す。コロニー形成のパーセンテージは、接種された細胞の本来の数で形成されたコロニー数を割り、それに１００を掛けることによって計算された。少なくとも３つの独立した実験の平均値およびＳＥＭが示される。アスタリスクは、＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．００５と示される、対照に対する、または群の間での統計学的に有意な差を示す。
【図６】ＥＢ１発現依存型手法においてＧＢＭ６  ＣＳＣの生体外での分化に対するＢＡＬ２７８６２の作用を示す。Ａ２Ｂ５ポジティブ細胞のパーセンテージは、対照群の細胞数に対して計算された。グラフは、少なくとも３つの独立した実験の平均値およびＳＥＭを表す。アスタリスクは、未処置対照に対する統計学的に有意な差を示し（ｐ＜０．００５），ｎｓ：有意ではない。
【図７】ＥＢ１発現依存型手法において生体外でのＣＳＣ分化に対するＢＡＬ２７８６２の作用を示す。グラフは、少なくとも３つの独立した実験の平均値およびＳＥＭを表す。アスタリスクは、未処置対照に対する統計学的に有意な差を示し（ｐ＜０．００５），ｎｓ：有意ではない。
【図８】４５日目の生体内での同所性ＧＢＭ６腫瘍に対するＢＡＬ１０１５５３活性を示す。黒色の陰影は腫瘍位置およびサイズを示す。
【図９】同所性ＧＢＭ６における未分化ＣＳＣの割合に対するＢＡＬ１０１５５３処置の効果を示す。
【図１０Ａ】ヒトＥＢ１のアミノ酸配列（図１０Ａ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ０９４７１−配列番号：１）および核酸配列（図１０Ｂ）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ２４１６６−配列番号：２）を示す。
【図１０Ｂ】ヒトＥＢ１のアミノ酸配列（図１０Ａ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ０９４７１−配列番号：１）および核酸配列（図１０Ｂ）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ２４１６６−配列番号：２）を示す。
【図１１】ＧＢＭ１０腫瘍由来の３つの腫瘍におけるＥＢ１タンパク質の発現を示す。腫瘍抽出物の免疫ブロットは、ローディング対照としてのアクチン、およびＥＢ１抗体の特異性を裏付ける、非標的化対照（ＮＴＣ）ｓｉＲＮＡまたはＥＢ１  ｓｉＲＮＡで処理された細胞に由来するＨｅＬａ抽出物と共に示される。
【図１２】ＧＢＭ１０腫瘍保持マウスの血清に由来する細胞外小胞（エキソソームを含む）におけるＥＢ１の発現を示す。免疫ブロットは、ＥＢ１抗体の特異性を裏付ける、非標的化対照（ＮＴＣ）ｓｉＲＮＡまたはＥＢ１  ｓｉＲＮＡで処理された細胞に由来するＨｅＬａ抽出物を含む。ＣＤ９免疫ブロットは、細胞外小胞（ＥＶ）のマーカーとして作用し、健康なドナー（Ｈｕ）からのヒト血清に由来するエキソソームおよび非標的化対照（ＮＴＣ）ｓｉＲＮＡで処理された細胞に由来するＨｅＬａ抽出物が、ＣＤ９ポジティブコントロールおよびＣＤ９ネガティブコントロールとしてそれぞれ含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
式Ｉの化合物
式Ｉの好ましい化合物としては、式中、Ｒ、ＹおよびＲ１が以下：
【００４２】
【表１】
2019503473.tif 000004
【００４３】
【表２】
2019503473.tif 000005
【００４４】
【表３】
2019503473.tif 000006
【００４５】
【表４】
2019503473.tif 000007
【００４６】
【表５】
2019503473.tif 000008
【００４７】
【表６】
2019503473.tif 000009
のとおりに定義される、化合物、または薬剤として許容されるその誘導体が挙げられる。
【００４８】
特に好ましいのは、式中、Ｒ、ＹおよびＲ１が以下：
【００４９】
【表７】
2019503473.tif 000010
のとおりに定義される、化合物、または薬剤として許容されるその誘導体である。
【００５０】
特に好ましい化合物はＢＡＬ２７８６２である：
【化２】
2019503473.tif 000011
【００５１】
式Ｉの化合物の「薬剤として許容される誘導体」というフレーズにおける誘導体という用語は、その塩、溶媒和化合物および錯体、およびその塩の溶媒和化合物および錯体、ならびにそのプロドラッグ、多形、および異性体（光学、幾何、および互変異性体など）およびそのプロドラッグの塩にも関する。さらに好ましい実施形態において、それは、塩およびプロドラッグ、ならびにそのプロドラッグの塩に関する。
【００５２】
塩は好ましくは酸付加塩である。塩は、塩基性窒素原子を有する式（Ｉ）の化合物から、好ましくは有機酸または無機酸で形成され、特に薬剤として許容される塩である。適切な無機酸は、塩酸、硫酸、またはリン酸などのハロゲン酸である。適切な有機酸は、例えば、カルボン酸、リン酸、スルホン酸またはスルファミン酸、例えば酢酸、プロピオン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、グリコール酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アミノ酸、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、シクロヘキサンカルボン酸、アダマンタンカルボン酸、安息香酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、フタル酸、フェニル酢酸、マンデル酸、ケイ皮酸、メタン−またはエタン−スルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−二スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、１，５−ナフタレン−二スルホン酸、２−、３−または４−メチルベンゼンスルホン酸、メチル硫酸、エチル硫酸、ドデシル硫酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸、Ｎ−メチル−、Ｎ−エチル−またはｎ−プロピル−スルファミン酸、またはアスコルビン酸などの他の有機プロトン酸である。
【００５３】
本発明による化合物は、プロドラッグの形態で投与することができ、それはヒトまたは動物の体内で分解され、式Ｉの化合物が形成される。プロドラッグの例としては、式Ｉの化合物の生体内加水分解性エステルおよびアミドが挙げられる。考えられる特定のプロドラッグは、天然アミノ酸のエステルおよびアミドおよび小ペプチドのエステルまたはアミド、特に５個まで、好ましくは２個または３個のアミノン酸からなる小ペプチド、ならびにペグ化ヒドロキシ酸、好ましくはヒドロキシ酢酸および乳酸のエステルおよびアミドである。プロドラッグエステルは、アミノ酸の酸官能基またはペプチドのＣ末端および式Ｉの化合物における適切なヒドロキシ基から形成される。プロドラッグアミドは、アミノ酸の酸官能基またはペプチドのＮ末端および式Ｉの化合物における適切なカルボキシ基から形成されるか、あるいはアミノ酸の酸官能基またはペプチドのＣ末端および式Ｉの化合物における適切なアミノ基から形成される。特に好ましくは、プロドラッグアミドは、式ＩのＲ基内に存在するアミノ基から形成される。
【００５４】
さらに好ましくは、プロドラッグは、上記で定義される式Ｉの化合物のＲ基内に存在するアミノ基、およびグリシン、アラニンまたはリジンのカルボキシ基から形成されるアミドである。
【００５５】
またさらに好ましくは、式Ｉの化合物は、次式：
【化３】
2019503473.tif 000012
の化合物から選択されるプロドラッグの形をとる。
【００５６】
特に好ましい実施形態において、本発明による式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその塩、好ましくはその塩酸塩、最も好ましくはその二塩酸塩は、プロドラッグＢＡＬ１０１５５３：
【化４】
2019503473.tif 000013
の形をとる。
【００５７】
本発明のプロドラッグは、参照により本明細書に組み込まれる、例えば国際公開第２０１２／０９８２０７号パンフレットの３７〜３９ページに記載のように製造することができる。
【００５８】
疾患
脳新生物、例えば、脳腫瘍としては、限定されないが、グリアおよび非グリア腫瘍、星状細胞腫（膠芽腫多形および不特定の神経膠腫を含む）、乏突起細胞腫、上衣細胞腫、髄膜腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、頭蓋咽頭腫、原発性中枢神経系リンパ腫、胚細胞腫瘍、下垂体腫瘍、松果体部腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、髄芽腫、血管外皮細胞腫、脊髄腫瘍、例えば髄膜腫、脊索腫および遺伝的に由来する脳腫瘍、例えば神経線維腫症、末梢神経鞘腫瘍および結節性脳硬化症が挙げられる。好ましくは、脳新生物は、膠芽腫（膠芽腫多形とも呼ばれる）を意味する。
【００５９】
試料
ＥＢ１のレベルの測定は、被験体由来の生体組織の試料に関して生体外で行われる。その試料は、例えば、正常組織、腫瘍組織、細胞系、末梢血（循環腫瘍細胞またはＣＳＣなど）、脳脊髄液（ＣＳＣなど）、リンパ液、細胞溶解物、組織ライセート、尿および吸引液などの体から分離されたいずれかの生体材料であることができる。好ましくは、試料は、正常組織、腫瘍組織、細胞系、末梢血（循環腫瘍細胞またはＣＳＣなど）、脳脊髄液（ＣＳＣなど）に由来する。さらに好ましくは、試料は、末梢血または脳脊髄液由来の腫瘍細胞または癌幹細胞に由来する。またさらに好ましくは、試料は、末梢血由来の腫瘍組織またはＣＳＣに由来する。特に好ましい一実施形態において、試料は、腫瘍組織に由来する。例えば、癌細胞および／またはＣＳＣにおけるＥＢ１のレベルは、新鮮な、凍結された、またはホルマリン固定／パラフィンパラフィン包埋された腫瘍組織試料において測定され得る。代替方法として、試料が体液、例えば血液（例えば、末梢血）、血清および血漿、尿、脳脊髄液または唾液に由来する場合、ＥＢ１のレベルは、試料中の細胞外小胞において測定され得る。
【００６０】
バイオマーカーのレベルを測定することを含む方法工程に試料をかける前に、試料は被験体から予め採取される。被験体から試料を採取する方法は当技術分野でよく知られている。腫瘍から試料を取り出す方法は、例えば、パンチ生検、コア生検または細針吸引生検、内視鏡生検、または擦過生検による、例えば腫瘍切除または生検を含み得る。
【００６１】
脳ＣＳＣは脳の様々な部位に頻繁に広がり、二次病変および転移が形成される。そのため、脳ＣＳＣは、その周囲に浸潤し、それによって血液脳関門を支える構造も破壊し得る。浸潤プロセスの結果として、血液循環システムへのアクセスを獲得し、したがって末梢血から同定／精製することができる（Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｓ．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ−ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｂｙ  ｉｎｖａｄｉｎｇ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ５．２０１４；Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：４１９６；Ｄｉａｚ，Ｍ．，Ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３；８（４）；Ｂｅａｕｃｈｅｓｎｅ  Ｐ．，Ｅｘｔｒａ−Ｎｅｕｒａｌ  Ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｏｆ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｍｙｔｈ  ｏｒ  Ｒｅａｌｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒｓ．２０１１；３：４６１−４７７）。血液試料は、静脈穿刺によって採取され、さらに標準技術に従って処理される。循環腫瘍細胞および／または循環ＣＳＣは、例えば、サイズ（例えば、ＩＳＥＴ−Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｉｚｅ  ｏｆ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ；ｂｙ  Ｃｌｕｓｔｅｒ−ｃｈｉｐ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｉｚｅ  ｏｆ  ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ）または免疫磁気細胞濃縮（例えば、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標），Ｖｅｒｉｄｅｘ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ；ＭＡＣＳ（登録商標），Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ；ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標），ＥａｓｙＳｅｐ（商標）およびＲｏｂｏＳｅｐ（商標），ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）（例えば、ＢＤ  Ｓｔｅｍｆｌｏｗ  Ｋｉｔ，ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）または誘電性ベースとする細胞分離（ＡｐｏＳｔｒｅａｍ（登録商標），ＡＰＯＣＥＬＬ，ＵＳＡ）に基づいて、血液または脳脊髄液からも得ることができる。
【００６２】
脳腫瘍材料、例えばＧＢＭ材料は、外科手術または腫瘍生検を受ける患者から得られる。次いで、限定されないが、抗生物質１０〜１５％（ペニシリン／ストレプトマイシン）が補充された神経幹細胞（ＮＳＣ）基礎培地を含有する、氷上のチューブ内に腫瘍材料を入れる方法など、当技術分野で公知の方法によって、切除されたＧＢＭ腫瘍材料をさらに処理することができる。以下の手順は例として示される。ＧＢＭ腫瘍試料を滅菌ＰＢＳ／ＮＳＣ基礎培地で２〜３回洗浄し、血液および壊死組織片を除去する。滅菌ペトリ皿において、洗浄された腫瘍組織は、小片に切断され、メスで刻まれて、それをＦａｌｃｏｎチューブに移し、水浴中で３７℃にて、予め温められた０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ数ｍＬ中で１０〜１５分間トリプシン処理する。インキュベーション期間後、等容積のダイズトリプシン阻害剤を添加して、トリプシン酵素反応を停止する。８００ｒｐｍで５分間遠心分離（１１０ｇ）することによって、腫瘍細胞浮遊液をペレット化する。上清を廃棄し、ペレットを滅菌ＮＳＣ基礎培地１ｍＬに再懸濁する。上下に穏やかにピペッティングすることによって、凝集塊を解離させ、細胞浮遊液を４０μｍ細胞濾過器に通して、小さな壊死組織片を除去する（Ａｚａｒｉ，Ｈ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ａｓｓａｙ．Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２０１１；Ｏｃｔ  ３０（５６）：ｅ３６３３）。
【００６３】
代替のアプローチとして、限定されないが、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ９５６０２，ＵＳＡ．から市販の「Ｔｈｅ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ」などの市販のキットを使用して、腫瘍細胞浮遊液中への腫瘍組織の分離も行われ得る。
【００６４】
ＧＢＭと関連する腫瘍などの脳腫瘍は、血液中に細胞外小胞を放出し、次いでそれは体中を循環し得ることが知られている（Ａｒｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｏｎｉｚｉｎｇ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｅｘｏｓｏｍｅｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００６；６：６３８−６４８）。細胞外小胞としては、微小胞およびエキソソームが挙げられ、一般にナノメートルサイズの膜由来小胞である。細胞外小胞は、腫瘍生物学の顕著な特徴を含む起源の細胞を反映する、分子情報（タンパク質およびＲＮＡなど）を含有し（Ｒｅｄｚｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．Ｐｈａｒｍｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｅｒｓ．  Ｍｅｄ．，２０１４；７：６５−７７；Ｃａｐｅｌｌｏ  ｅｔ  ｓｌ．，Ｅｘｏｓｏｍｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｄｙ  ｆｌｕｉｄｓ：Ａ  ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒ  ｂｙ  ｔｈｅｍｓｅｌｖｅｓ？  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，２０１６；９６：９３−９８）、血液、例えば血清および血漿、尿、脳脊髄液および唾液などの体液においてアクセス可能である。これは、ＥＢ１がＧＢＭ腫瘍中に存在するかどうかを決定する代替方法を提供する。
【００６５】
細胞外小胞は、ａ）分画遠心（Ｔｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００６；３．２２．１−３．２２．２９）；ｂ）化学沈殿（例えば、Ｔｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ  ＵＳＡ；ＥｘｏＱｕｉｃｋＴＭ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ＳＢＩ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＵＳＡ；Ｅｘｏ−Ｐｒｅｐ  ｆｒｏｍ  ＨａｎｓａＢｉｏＭｅｄ，Ｔａｌｌｉｎｎ，Ｅｓｔｏｎｉａ）；およびｃ）例えば、ＥＬＩＳＡイムノプレート（例えば、ＨａｎｓａＢｉｏＭｅｄから市販されている）、イムノビーズ（例えば、ＨａｎｓａＢｉｏＭｅｄ）およびＪＳＲ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍから市販のＥｘｏＣａｐ（商標）を使用した、イムノアフィニティー捕捉（Ｚａｒｏｖｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｘｏｓｏｍｅ  ｓｈｕｔｔｌｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１５；８７：４６−５８）を含む、様々なプロトコルおよび市販のキットを使用して単離することができる。以下に記述するように標準技術によって、細胞外小胞中のＥＢ１核酸（好ましくは、ＲＮＡ）および／またはタンパク質のレベルを測定することができる。
【００６６】
癌幹細胞（ＣＳＣ）
試料中のＣＳＣは、例えば、免疫組織化学またはフローサイトメトリーを使用したＣＳＣマーカーの同定に基づく方法、および分化癌細胞によって保有されないが、ＣＳＣに特有の特性に対する選択に基づく方法、例えば多能性を有し、かつ／または生体外培養条件下にて増殖することができる細胞に対する選択に基づく方法など、当技術分野で公知の方法によって同定することができる。
【００６７】
ＣＳＣを同定するために使用され得るＣＳＣマーカーは、ＡＬＤＨ１、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ−Ｇｌｉ活性、α６−インテグリン、ＡＢＣＢ５、β−カテニン活性、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ１６６、ＬＧＲ５、ＣＤ１５、ネスチン、ＣＤ１３、ＡＢＣＧ２、ＣＤ１１７、ＣＤ２０、ＣＤ２７１、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＸＣＲ４、Ｎｏｄａｌ−アクチビン、α２β１−インテグリンおよびＴｒｏｐ２と同時にＣＤ１５、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、α６−インテグリン、ネスチンであり、Ａ２Ｂ５は膠芽腫多形におけるＣＳＣに対して特異的であり得る（Ｍｅｄｅｍａ  ＪＰ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：Ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｈｅａｄ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１３；１５：３３８−３４４）。本発明では、ＣＤ１３３および／またはＡ２Ｂ５が特に興味深い。（Ｔｃｈｏｇｈａｎｄｊｉａｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ２Ｂ５  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｈａｖｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．２０１０；１：２１１−２１）。
【００６８】
以下の手順は、被験体から採取された試料中の脳ＣＳＣを同定する例として示される。
【００６９】
予めポリ−ＤＬ−オルニチンでコートされた６−ウェルプレートに、幹細胞許容培地（５ｍｇ／ｍＬインスリン、０．１ｍＭプトレシン、１００ｍｇ／ｍＬトランスフェリン、２．１０−８Ｍプロゲステロン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、５０ｍｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ  ＵＳＡ）および１０ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子（ＥＧＦ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）およびＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの成長因子）中の瘍細胞浮遊液を３００’０００細胞／ウェルでシーディングする。４日後、細胞をトリプシン処理し、ＨＢＳＳ緩衝剤含有ブロッキング溶液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）中に懸濁し、Ａ２Ｂ５−ＡＰＣおよびＣＤ１３３−ＰＥ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）と共に１０分間インキュベートする。次いで、細胞を１０％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（商標），ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して分析した。１試料につき合計１００’０００のイベントがＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で獲得され、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ｓｏｆｔｗａｒｅおよびＤｅａｎ−Ｊｅｔ−Ｆｏｘモデル解析を用いて、データを分析した。代替方法としては、ＣＳＣは生体外で増殖し、スフィアを形成する能力を有することから、スフィア形成アッセイを用いて、ＣＳＣを同定することもできる、これに関して、ＣＳＣ許容培地３．５ｍＬ中で密度３０，０００細胞／２５ｃｍ３フラスコにて細胞をプレーティングし、ＣＯ２５％／Ｏ２９５％雰囲気中で維持する。倍率１０倍および較正マイクロメーター標線を用いて、スフィアの数およびサイズを２回評価する。
【００７０】
代替方法としては、ＤＭＥＭ−ＦＣＳ １０％中に脳腫瘍細胞を再懸濁し、抗Ａ２Ｂ５マウスＩｇＭ抗体（細胞上清１／２希釈，ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）と共に４℃で３０分間インキュベートし、続いて洗浄し、磁気マイクロビーズ標識化マウス特異的ＩｇＭラット抗体と共に４℃で３０分間インキュベートすることによって、脳ＣＳＣを試料中で同定することができる。Ａ２Ｂ５対照免疫染色によって評価される平均純度９３％（８５〜９８％の範囲）を有するＭＡＣＳカラムを使用して、ポジティブ磁気細胞分離（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を行うことができる。
【００７１】
代替方法としては、脳ＣＳＣは、商業的に利用可能な供給元からのＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別装置（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ））（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ［Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ］Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  Ｓ３（商標）細胞選別装置；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ［Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ］ＭｏＦｌｏ（商標）細胞選別装置；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）細胞選別装置）を使用して、細胞上での、蛍光標識化抗体の、例えば抗Ａ２Ｂ５および抗ＣＤ１３３抗体の、ＣＳＣマーカーへの結合に基づいて試料から分離することができる。
【００７２】
試料の比較
本発明による対照は、治療が必要なヒトまたは動物であり得る。好ましくは、被験体はヒトである。
【００７３】
バイオマーカーＥＢ１は、試料またはヒトもしくは動物の体から、好ましくはヒトの体から採取された試料中で生体外にて測定される。バイオマーカーのレベルを測定することを含む方法工程に試料をかける前に、試料は、ヒトもしくは動物の体から予め採取され、好ましくはヒトの体から予め採取される。
【００７４】
バイオマーカーは一般に、生物学的応答の指標として、好ましくは所定の治療に対する感受性の指標として使用される物質であり、その治療は、本発明の用途において、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体での治療である。
【００７５】
ＣＳＣにおけるＥＢ１レベルが高いほど、本発明の化合物に対する奏効性が予想され、または言い換えれば、ＣＳＣのレベルが低いほど、本発明の化合物に対する耐性が予想されることが本明細書において判明している。
【００７６】
好ましい一実施形態において、標準値または標準値のセットに対する試料中のＥＢ１のレベルが高いほど、奏効性が予想される。本明細書で使用される、標準レベルまたは標準レベルのセットに対する増加または比較的高い、または高い、またはより高いレベルとは、試料中のバイオマーカーの量または濃度が、標準レベルまたは標準レベルのセットに対して試料中で検出可能な程度に多いことを意味する。これは、標準に対して少なくとも約１％の増加、またはそれより高いレベル、好ましくは、標準に対して少なくとも約５％の増加を包含する。さらに好ましくは、それは、標準に対して少なくとも約１０％の増加、またはそれより高いレベルである。さらに詳しくは好ましくは、それは、標準に対して少なくとも約２０％の増加、またはそれより高いレベルである。例えば、かかる増加またはより高いレベルは、限定されないが、標準に対して少なくとも約１％、約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％または１００％を超える増加を含む。
【００７７】
好ましい一実施形態において、標準値または標準値のセットに対する試料中のＥＢ１のレベルが低いほど、耐性が予想される。本明細書で使用される、標準レベルまたは標準レベルのセットに対する減少または比較的低い、または低い、またはより低いレベルとは、試料中のバイオマーカーの量または濃度が、標準レベルまたは標準レベルのセットに対して試料中で検出可能な程度に少ないことを意味する。これは、標準に対して少なくとも約１％の減少、またはそれより低いレベル、好ましくは、標準に対して少なくとも約５％の減少を包含する。さらに好ましくは、それは、標準に対して少なくとも約１０％の減少、またはそれより低いレベルである。さらに詳しくは好ましくは、それは、標準に対して少なくとも約２０％の減少、またはそれより低いレベルである。例えば、かかる減少またはより低いレベルは、限定されないが、標準に対しても約１％、約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％の減少を含む。したがって、減少とは、試料中の検出可能なＥＢ１が存在しないことも含む。
【００７８】
好ましくは、
ｉ）同じ腫瘍組織型を有する被験体からの標準値または標準値のセットに対する；または
ｉｉ）治療開始後に採取され、治療開始前に、同じ被験体から採取された試料と比較される；または
ｉｉｉ）正常細胞、組織または体液からの標準値または標準値のセットに対する；
試料中のＥＢ１のレベルが高いほど、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する、脳腫瘍の感受性、好ましくは脳腫瘍のＣＳＣの感受性が予想される。
【００７９】
さらに好ましくは、
ｉ）同じ腫瘍組織型を有する被験体からの標準値または標準値のセットに対する；または
ｉｉ）治療開始後に採取され、治療開始前に、同じ被験体から採取された試料と比較される；
試料中のＥＢ１レベルが高いほど、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する、脳腫瘍の感受性、好ましくは脳腫瘍のＣＳＣの感受性が予想される。
【００８０】
特に好ましくは、同じ腫瘍組織型を有する被験体からの標準値または標準値のセットに対する試料におけるＥＢ１レベルが高いほど、感受性が予測される。
【００８１】
好ましい一実施形態において、ｉ）それが比較されるべき試料と同じ腫瘍組織型を有する被験体からの試料から得られる標準値または標準値のセットに対して、試料において測定が行われるケースでは、その標準値または標準値のセットは、その癌タイプを有する被験体の母集団から得られた試料から確立される。試料の起源が、標準と、比較される試料との間で一致している限り、これらの標準被験体から採取される試料は、例えば腫瘍組織、または循環腫瘍細胞、またはＣＳＣに由来し得る。
【００８２】
他の好ましい実施形態において、ｉｉ）測定が、治療開始後に採取された試料において比較され、治療開始前に同じ被験体から採取された試料と比較されるケースｉｉ）では、好ましくは、獲得された耐性を予測するために測定される。その試料は、同じ生物起源に由来する細胞または組織と比較される。次いで、獲得された耐性の予測から、その化合物での治療が中止されるべきであることが示される。したがって、バイオマーカーを使用して、その化合物での更なる治療によって、必要な応答（例えば、異常細胞の減少）が得られる可能性があるかどうか、あるいはかかる治療に対して細胞が非応答性または耐性となっているかどうかがモニターされる。
【００８３】
さらに他の好ましい実施形態において、ｉｉｉ）正常細胞、組織または体液から得られた標準値または標準値のセットに対して、試料において測定が比較される場合では、標準値または標準値のセットは、正常な（例えば、非腫瘍）細胞、組織または体液の試料から確立され得る。かかるデータは、標準値または標準値のセットを発展させるために、被験体の集団から収集され得る。
【００８４】
標準値または標準値のセットは、細胞系または動物腫瘍モデル、または好ましくは少なくとも１人のヒト被験体、さらに好ましくは被験体の平均（例えば、ｎ＝２〜１０００またはそれ以上）からの生体物質に由来し得る、予め入手された試料から生体外で確立される。
【００８５】
次いで、標準値または標準値のセットを式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体を用いた治療に対する、同じ細胞系または同じ被験体の応答データと相関させる。この相関性から、カットオフまたは閾値を任意選択的に含む、例えば相対的スケールまたはスコアリングシステムの形でコンパレーターモジュールを確立することができ、それによって、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する応答レベルの範囲と関連するバイオマーカーのレベルが示される。応答レベルの範囲は、その化合物の治療的活性に対する相対的感受性（例えば、高い感受性〜低い感受性）、ならびに治療的活性に対する耐性を含み得る。好ましい実施形態において、このコンパレーターモジュールは、カットオフ値または治療に対する感受性を予測する値のセットを含む。
【００８６】
例えば、免疫組織化学的方法を用いて、試料におけるＥＢ１のレベルを測定する場合、標準値は、スコアリングシステムの形をとり得る。かかるシステムは、ＥＢ１に対する染色が存在する、細胞のパーセンテージを計算に入れ得る。そのシステムは、個々の細胞における染色の相対強度も計算に入れ得る。次いで、ＥＢ１のレベルの標準値または標準値のセットが、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する、被験体または組織または細胞系の応答、特に感受性を示すデータと相関され得る。次いで、かかるデータは、コンパレーターモジュールの一部を形成し得る。
【００８７】
応答は、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体の活性、好ましくは治療的活性に対する、細胞系の、または好ましくは被験体の反応、またはさらに好ましくは被験体における疾患の反応である。応答レベルの範囲は、その化合物の活性、好ましくは治療的活性に対する相対的感受性（例えば、高い感受性〜低い感受性）、ならびに活性、好ましくは治療的活性に対する耐性を含み得る。その応答データは例えば、目標の応答率、疾患進行までの時間、無増悪生存期間、および全生存期間についてモニターされ得る。
【００８８】
癌性疾患の応答は、癌治療分野の当業者によく知られた基準、限定されないが、例えば、
固形癌効果判定基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ）（ＲＥＣＩＳＴ）ガイドライン，
引用：Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ  ＥＡ，Ｔｈｅｒａｓｓｅ  Ｐ，Ｂｏｇａｅｒｔｓ  Ｊ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＬＨ，Ｓａｒｇｅｎｔ  Ｄ，Ｆｏｒｄ  Ｒ，Ｄａｎｃｅｙ  Ｊ，Ａｒｂｕｃｋ  Ｓ，Ｇｗｙｔｈｅｒ  Ｓ，Ｍｏｏｎｅｙ  Ｍ，Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  Ｌ，Ｓｈａｎｋａｒ  Ｌ，Ｄｏｄｄ  Ｌ，Ｋａｐｌａｎ  Ｒ，Ｌａｃｏｍｂｅ  Ｄ，Ｖｅｒｗｅｉｊ  Ｊ．Ｎｅｗ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ：改訂ＲＥＣＩＳＴガイドライン（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１）．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００９；４５：２２８−４７；
ハイグレード神経膠腫に対するＲＡＮＯ基準（ＲＡＮＯ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｇｒａｄｅ  Ｇｌｉｏｍａｓ），引用：Ｗｅｎ  ＰＹ，Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ＤＲ，Ｒｅａｒｄｏｎ  ＤＡ，Ｃｌｏｕｇｈｅｓｙ  ＴＦ，Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＡＧ，Ｇａｌａｎｉｓ  Ｅ，Ｄｅｇｒｏｏｔ  Ｊ，Ｗｉｃｋ  Ｗ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＭＲ，Ｌａｓｓｍａｎ  ＡＢ，Ｔｓｉｅｎ  Ｃ，Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ  Ｔ，Ｗｏｎｇ  ＥＴ，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  ＭＣ，Ｓｔｕｐｐ  Ｒ，Ｌａｍｂｏｒｎ  ＫＲ，Ｖｏｇｅｌｂａｕｍ  ＭＡ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｎｔ  ＭＪ，Ｃｈａｎｇ  ＳＭ．Ｕｐｄａｔｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  ｇｌｉｏｍａｓ：ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１０；２８（１１）：１９６３−７２；
卵巣癌の応答に対するＣＡ−１２５  Ｒｕｓｔｉｎ基準（ＣＡ−１２５  Ｒｕｓｔｉｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ），引用：Ｒｕｓｔｉｎ  ＧＪ，Ｑｕｉｎｎ  Ｍ，Ｔｈｉｇｐｅｎ  Ｔ，ｄｕ  Ｂｏｉｓ  Ａ，Ｐｕｊａｄｅ−Ｌａｕｒａｉｎｅ  Ｅ，Ｊａｋｏｂｓｅｎ  Ａ，Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ  Ｅ，Ｓａｇａｅ  Ｓ，Ｇｒｅｖｅｎ  Ｋ，Ｖｅｒｇｏｔｅ  Ｉ，Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ  Ａ，Ｖｅｒｍｏｒｋｅｎ  Ｊ．Ｒｅ：Ｎｅｗ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｔｏ  ｅｖａｌｕａｔｅ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ（ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ）．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００４；９６（６）：４８７−８；および
前立腺癌の応答に対するＰＳＡワーキンググループ２基準（ＰＳＡ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ２  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ），引用：Ｓｃｈｅｒ  ＨＩ，Ｈａｌａｂｉ  Ｓ，Ｔａｎｎｏｃｋ  Ｉ，Ｍｏｒｒｉｓ  Ｍ，Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ＣＮ，Ｃａｒｄｕｃｃｉ  ＭＡ，Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ  ＭＡ，Ｈｉｇａｎｏ  Ｃ，Ｂｕｂｌｅｙ  ＧＪ，Ｄｒｅｉｃｅｒ  Ｒ，Ｐｅｔｒｙｌａｋ  Ｄ，Ｋａｎｔｏｆｆ  Ｐ，Ｂａｓｃｈ  Ｅ，Ｋｅｌｌｙ  ＷＫ，Ｆｉｇｇ  ＷＤ，Ｓｍａｌｌ  ＥＪ，Ｂｅｅｒ  ＴＭ，ＷｉｌｄｉｎｇＧ，Ｍａｒｔｉｎ  Ａ，Ｈｕｓｓａｉｎ  Ｍ；Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ．Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｃａｓｔｒａｔｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ：ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ．ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．２００８；２６（７）：１１４８−５９．
を用いて評価することができる。
【００８９】
感受性は、以下の：異常細胞、好ましくは癌性細胞の数の減少または異常細胞、好ましくは癌性細胞の非存在；癌性疾患については：腫瘍サイズの減少；抑制（つまり、更なる腫瘍成長がある程度まで遅くなる、好ましくは止まる）；ＰＳＡおよびＣＡ−１２５などの腫瘍マーカーレベルの減少、他の臓器への癌細胞浸潤（軟部組織および骨への癌の広がり）の抑制（つまり、ある程度まで遅くなる、好ましくは止まる）；腫瘍拡散転移の抑制（つまり、ある程度まで遅くなる、好ましくは止まる）；特定の癌に伴う症状の１つまたは複数の緩和；および罹患率および死亡率の低減；のうちの１つまたは複数における、観察可能な、かつ／または測定可能な減少、またはそのうちの１つまたは複数の存在と関連する。
【００９０】
好ましい実施形態において感受性とは、以下の基準：腫瘍サイズの減少；更なる腫瘍成長の抑制：他の臓器への癌細胞浸潤の抑制；および腫瘍拡散転移の抑制；のうちの１つまたは複数の観察可能な、かつ／または測定可能な減少がある、または無いことを意味する。
【００９１】
さらに好ましい実施形態において、感受性は、以下の基準：腫瘍サイズの減少；更なる腫瘍成長の抑制：他の臓器への癌細胞浸潤の抑制；および腫瘍拡散転移の抑制；のうちの１つまたは複数を意味する。
【００９２】
前述の感受性基準の測定は、癌性疾患の応答の測定について上記に示すガイドラインなど、癌治療分野の当業者にはよく知られている臨床ガイドラインに準拠している。
【００９３】
応答は、細胞増殖および／または細胞死を評価することによって生体外で確立することもできる。例えば、細胞死または増殖に対する作用は、以下の十分に確立されたアッセイのうちの１つまたは複数によって生体外で評価され得る：Ａ）アポトーシスの顕著な特徴である、細胞核モフォロジーおよびＤＮＡ断片化についての情報を提供する、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２色素での細胞核染色。Ｂ）原形質膜の外部脂質二重層のホスファチジルセリン含有量を反映するＡｎｎｅｘｉｎＶ結合アッセイ。この現象は、アポトーシスの早期の顕著な特徴とみなされる。Ｃ）ＴＵＮＥＬアッセイ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰ  Ｎｉｃｋ  Ｅｎｄ標識化アッセイ）、核酸の末端を標識することによってＤＮＡの断片化を測定することによる、アポトーシスまたは壊死を受けた細胞を評価する蛍光法。Ｄ）細胞の代謝活性を測定するＭＴＳ増殖アッセイ。生細胞は代謝的に活性であるのに対して、呼吸鎖が損なわれた細胞は、この試験で活性の減少を示す。Ｅ）細胞数に対する作用が、細胞成分の直接染色によってモニターされる、クリスタルバイオレット染色アッセイ。Ｆ）ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みによってＤＡＮ合成をモニターする増殖アッセイ。成長／増殖に対する抑制効果を直接決定することができる。Ｇ）膜不透過性、蛍光、単一シアニン、核酸染色を含むＹＯ−ＰＲＯアッセイであって、細胞生存率に干渉することなく瀕死細胞（例えば、アポトーシス性）の分析を可能にする、アッセイ。細胞の透過処理後に、細胞数に対する全体的な作用も分析することができる。Ｈ）細胞周期の異なる相の間の分布の変化を示す、細胞周期分布に関するヨウ化プロピジウム染色。細胞周期拘束ポイントを決定することができる。Ｉ）軟寒天においてコロニーに増殖する単一細胞浮遊液の能力を評価する、コロニー増殖アッセイなどの足場非依存性増殖アッセイ。
【００９４】
生体外での決定に関係する好ましい一実施形態において、感受性は、異常細胞の増殖速度の減少および／または異常細胞数の減少があることを意味する。さらに好ましくは、感受性とは、癌性細胞の増殖速度の減少および／または癌性細胞数の減少があることを意味する。異常な細胞、好ましくは癌性細胞の数の減少は、様々なプログラム細胞死および非プログラム細胞死メカニズムを介して起こり得る。アポトーシス、カスパーゼ非依存性プログラム細胞死および自己貪食細胞死は、プログラム細胞死の例である。しかしながら、本発明の実施形態に含まれる細胞死基準は、いずれか一つの細胞死メカニズムに限定されると解釈されない。
【００９５】
生体外での耐性の決定に関係する好ましい実施形態において、耐性とは、増殖速度の減少および／または異常細胞数の減少がないことを意味する。さらに好ましくは、耐性とは、癌性細胞の増殖速度の減少および／または癌性細胞数の減少がないことを意味する。異常な細胞、好ましくは癌性細胞の数の減少は、様々なプログラム細胞死および非プログラム細胞死メカニズムを介して起こり得る。アポトーシス、カスパーゼ非依存性プログラム細胞死および自己貪食細胞死は、プログラム細胞死の例である。しかしながら、本発明の実施形態に含まれる細胞死基準は、いずれか一つの細胞死メカニズムに限定されると解釈されない。
【００９６】
ＥＢ１
本明細書で使用されるＥＢ１という用語は、先に記載の同義語すべてを包含し、かつ核酸レベルとタンパク質レベルの両方で適宜、この実態を意味する。核酸レベルは、例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを意味し、タンパク質という用語は、翻訳ポリペプチドまたはタンパク質配列および翻訳後に修飾されたその形態を含む。
【００９７】
ＥＢ１（ヒトＥＢ１）のタンパク質配列の好ましい例は、配列番号：１に示される。しかしながら、ＥＢ１という用語は、この配列の相同体、変異形態、突然変異体、アイソタイプ、スプライスバリアントおよび等価物も包含する。好ましくは、それは、この配列のヒト相同体、変異体形態、突然変異体、アイソタイプ、スプライスバリアントおよび等価物も包含する。さらに好ましくは、それは、前記配列と少なくとも約７５％の同一性、特に好ましくは少なくとも約８５％の同一性、特に好ましくは少なくとも約９５％の同一性、およびさらに詳しくは好ましくは約９９％の同一性を有する配列を包含する。
【００９８】
特に好ましい実施形態において、ＥＢ１は、配列番号：１によって、またはこの配列と少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列によってタンパク質レベルで表される、核酸またはタンパク質レベルでの実体である。特に好ましい実施形態において、ＥＢ１は、配列番号：１によって表される。
【００９９】
ＥＢ１（ヒトＥＢ１）のｃＤＮＡ核酸配列の好ましい例は、配列番号：２によって表されるＮＣＢＩ参照配列Ｕ２４１６６を介してアクセス可能である。しかしながら、ＥＢ１という用語は、前記配列の修飾形態、より縮重された変異体、前記配列の補体、および前記配列の一つとハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドも包含する。かかる修飾としては、限定されないが、１つまたは複数のヌクレオチドの変異、挿入、欠失、および置換が挙げられる。さらに好ましくは、それは、前記配列と少なくとも約７５％の同一性、特に好ましくは少なくとも約８５％の同一性、特に好ましくは少なくとも約９５％の同一性およびさらに詳しくは好ましくは約９９％の同一性を有する配列を包含する。
【０１００】
さらに他の好ましい実施形態において、ＥＢ１は、配列番号２またはこの配列と少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列によって、核酸レベルで表される、核酸またはタンパク質レベルでの実体である。特に好ましい実施形態において、ＥＢ１は、配列番号２によって表される。
【０１０１】
ＥＢ１のレベル
ＥＢ１のレベルは、タンパク質レベルで、または核酸レベルで、例えばＲＮＡまたはｃＤＮＡで検出することができる。ＥＢ１のレベルは、当業者によく知られる技術的手段によって試料中でアッセイすることができる。それは、転写または翻訳レベルでアッセイされ得る。
【０１０２】
好ましい一実施形態において、試料中のＥＢ１核酸のレベル、好ましくはＥＢ１  ｍＲＮＡが測定される。核酸レベルでのＥＢ１のレベルの測定に適している、当技術分野で公知の遺伝子発現分析の方法の例としては、限定されないが、ｉ）ｍＲＮＡとハイブリッド形成することができる標識プローブ使用する方法；ｉｉ）ＥＢ１遺伝子配列をベースとする１つまたは複数のプライマーを含むＰＣＲを使用する方法、例えば標識プローブ、例えば、蛍光プローブを用いた定量的ＰＣＲ法、定量的リアルタイムＰＣＲなどを使用する方法；ｉｉｉ）マイクロアレイ；ＩＶ）ノーザンブロット法；Ｖ）網羅的遺伝子発現解析（ＳＡＧＥ）、ＲＥＡＤＳ（消化ｃＤＮＡの制限酵素増幅）、ディファレンシャルディスプレイおよびミクロＲＮＡの測定が挙げられる。
【０１０３】
好ましい実施形態において、タンパク質レベルでのＥＢ１のレベルが測定される。タンパク質レベルでのＥＢ１のレベルを測定するのに適している、当技術分野で公知のタンパク質発現解析の方法の例としては、限定されないが、ｉ）免疫組織化学（ＩＨＣ）分析、ｉｉ）ウエスタンブロット法ｉｉｉ）免疫沈降法ｉｖ）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）；ｖ）ラジオイムノアッセイ；ｖｉ）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）；ｖｉｉ）質量分析法、例えばマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）および表面エンハンス型レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ、例えばＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）が挙げられる。
【０１０４】
上記の方法の一部に含まれる抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、抗体断片、および／または合成抗体の種々のタイプ、例えばキメラ抗体、ＤＡＲＰＳ（設計アンキリンリピートタンパク質）またはＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーであり得る。検出することができるように、抗体を標識化することもできるし、あるいは例えば、標識化された二次抗体、または検出可能な結果を生むことができる二次抗体を使用して、１種または複数種の更なる種との反応後に検出することができる。ＥＢ１に特異的な抗体は、例えばＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から市販されており、あるいは、当業者によく知られた従来の抗体産生法によって製造することができる。
【０１０５】
タンパク質分析の好ましい方法は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ、蛍光顕微鏡検査法、質量分析技術、免疫組織化学およびウエスタンブロット法、さらに好ましくは、ＦＡＣＳ、ウエスタンブロット法および免疫組織化学である。ＦＡＣＳにおいて、蛍光標識抗体またはプローブが使用され、懸濁液中の全細胞（固定または天然）上の特異的な細胞タンパク質または抗原に結合させ、細胞抗原に結合された検出可能な標識からのシグナル強度は、その単細胞で発現されるタンパク質の量に相当し、定量化することができる。蛍光顕微鏡検査法において、蛍光標識抗体またはプローブが使用され、特異的な細胞タンパク質（抗原）に結合させ、そのタンパク質量および位置を検出可能な標識によって検出かつ測定することができる。免疫ブロット法としても知られるウエスタンブロット法において、標識抗体を使用して、タンパク質のレベルをアッセイすることができ、検出可能な標識からのシグナル強度はタンパク質の量に相当し、かつ例えばデンシトメトリーによって定量化することができる。
【０１０６】
免疫組織化学では再び、バイオマーカーの存在および相対量を検出するために標識抗体またはプローブが使用される。それを使用して、バイオマーカーが存在する、細胞のパーセンテージを評価することができる。それを使用して、個々の細胞におけるバイオマーカーの局在または相対量も評価することができ；後者は、染色の強度の関数として確かめられる。
【０１０７】
特異的なタンパク質を検出するために抗体または抗原に結合された酵素を使用することから、ＥＬＩＳＡは、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）を表す。ＥＬＩＳＡは一般に、以下のように行われる（方法論における他の変形形態が存在するが）：９６ウェルプレートなどの固体基材を一次抗体でコーティングし、その抗体はバイオマーカーを認識する。次いで、結合したバイオマーカーは、そのバイオマーカーに対して特異的な二次抗体によって認識される。これは、酵素に直接結合するか、または第３の抗免疫グロブリン抗体を使用して、それが酵素に結合される。基質を添加し、酵素が反応を触媒し、特定の色が生じる。この色の光学濃度を測定することによって、バイオマーカーの存在および量を測定することができる。
【０１０８】
ＥＢ１のレベルはＣＳＣにおいて測定されることが好ましい。これは、試料中のＣＳＣにおいてＥＢ１レベルを直接確認することによって、あるいはＥＢ１のレベルを測定する前に、ＣＳＣに対して試料を濃縮することによって、行われ得る。例えば、ＥＢ１のレベルは、ＣＳＣおよびＥＢ１を同時に特異的に可視化する試剤で染色することによって、あるいは、ＣＳＣを可視化する試剤で最初に染色し、次にＥＢ１を可視化する試剤で染色することによって、免疫組織化学、ＦＡＣＳまたは免疫蛍光法を用いて、ＣＳＣにおいて直接測定することができる。
【０１０９】
バイオマーカーの使用
好ましい一実施形態において、バイオマーカーを使用して、上記で定義される式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する、被験体における疾患の固有の感受性を予測する。
【０１１０】
他の好ましい実施形態において、バイオマーカーを使用して、上記で定義される式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する、被験体における疾患の獲得された耐性を予測する。
【０１１１】
バイオマーカーを使用して、上記で定義される式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体を用いた治療のために、疾患、好ましくは癌に罹患している被験体、また罹りやすい被験体を選択することができる。かかるバイオマーカーのレベルを用いて、かかる薬剤での治療に応答しそうな、または応答しそうにない、または応答を続けそうな、または応答を続けそうにない患者を同定することができる。不必要な治療法を避けるために、患者の層化が行われ得る。特に、バイオマーカーを用いて、その被験体からの試料が、標準レベルまたは標準レベルのセットに対して高いＥＢ１のレベルを示す被験体を同定することができ、次いで、かかる被験体は、上記で定義される式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体を用いた治療に選択される。
【０１１２】
バイオマーカーを使用して、投与量および投与スケジュールに関して、治療計画の決定を補助することもできる。さらに、バイオマーカーを使用して、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体、および他の化学療法（細胞毒性）剤など、被験体に投与される薬物の組み合わせの選択を補助することができる。さらに、バイオマーカーを使用して、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体が、標的療法、内分泌療法、生物製剤、放射線治療、免疫療法または外科的介入、またはこれらの組み合わせと併せて投与されるかどうかなど、被験体における治療方針の決定を補助することができる。
【０１１３】
ＥＢ１を他のバイオマーカーと併せて使用して、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する応答を予測し、治療方法を決定することもできる。さらに、それを化学感受性試験と併せて使用して、化学感受性を決定し、かつ治療方法を決定することができる。化学感受性試験は、被験体から採取された、例えば、血液悪性疾患または接触可能な固形腫瘍、例えば限定されないが、乳癌および頭頚部癌または黒色腫などを有する被験体から採取された細胞に式Ｉの化合物を直接適用して、化合物に対する細胞の応答を決定することを含む。
【０１１４】
治療の方法
本発明は、一部の態様において治療方法および治療方法で使用されるＥＢ１も含み、そのＥＢ１レベルが最初に、標準レベルまたは標準レベルのセットまたは予備処理開始レベルに対して確立され、次いで、上記で定義される式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体が、前記試料中のＥＢ１のレベルが標準値または標準値のセットよりも高いか、または予備処理開始レベルに対して減少していない場合に投与される。当業者によく知られているように、式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体は、医薬組成物の形で投与され得る。適切な組成および投薬量は、例えば国際公開第２００４／１０３９９４Ａ１号パンフレットの３５〜３９ページに開示されており、本明細書により明確に組み込まれる。温血動物、特にヒトへの、経腸投与、経鼻投与、口腔投与、直腸投与など、または特に経口投与、および静脈内、筋肉内または皮下投与などの非経口投与用の組成物が特に好ましい。さらに詳しくは、静脈内または経口投与用の組成物が好ましい。一実施形態において、経口投与用の組成物が特に好ましい。
【０１１５】
その組成物は、活性成分と、薬剤として許容される担体とを含む。組成物の一例としては、限定されないが、活性成分１ｍｇ、マンニトール９８ｍｇおよびステアリン酸マグネシウム１ｍｇ、または活性成分５ｍｇ、マンニトール９４ｍｇおよびステアリン酸マグネシウム１ｍｇを含有するハードカプセルが挙げられる。
【０１１６】
本発明は、一態様において、標準レベルまたは標準レベルのセット、または予備処理開始レベルと比較して、ＥＢ１レベルの低い試料を有する被験体におけるＥＢ１のレベルを最初に増加し、次いで上記で定義される式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体で被験体を治療することによって、腫瘍性疾患または自己免疫疾患、好ましくは癌を治療する方法に関する。ＥＢ１のレベルは、直接的もしくは間接的、化学的もしくは遺伝的手段によって増加され得る。かかる方法の例は、ウイルス、プラスミドまたはペプチド構築物、または抗体またはｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスのＥＢ１発現および標的化送達の増加が得られ、ＥＢ１のレベルがアップレギュレートされる、薬物を用いた治療である。例えば、ウイルスまたはプラスミド構築物を使用して、細胞におけるＥＢ１の発現を増加することができる。次いで、被験体は式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体で治療され得る。
【０１１７】
式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体は、単独で、または１種または複数種の他の治療薬と併せて投与することができる。可能性のある併用療法は、固定されたコンビネーション、または本発明の化合物と、交互にされるか、または互いに無関係に与えられる１種または複数種の他の治療薬との投与、または固定されたコンビネーションと１種または複数種の他の治療薬との併用投与の形をとり得る。
【０１１８】
式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体は、それに加えて、またはさらに、化学療法（細胞毒性療法）、標的療法、内分泌療法、生物製剤、放射線治療、免疫療法、外科的介入、またはこれらの組み合わせと併せて、特に腫瘍治療のために投与される。上述のように、他の治療方法の文脈におけるアジュバント療法のように、長期間の治療法が等しく可能である。他の可能な治療は、例えばリスクのある患者において、腫瘍退縮後または化学予防療法後の患者の状態を維持する療法である。
【０１１９】
キットおよびデバイス
一態様において、本発明は、上記で定義される式Ｉの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する、被験体における好ましくは疾患の応答を予測するための、試料中のＥＢ１のレベルを測定するのに必要な試剤を備えるキットに関し、他の態様では、デバイスに関する。好ましくは、その試剤は、ＥＢ１の検出体を含む捕捉剤と、検出剤と、を含む。
【０１２０】
キットおよびデバイスは好ましくは、試料中のＥＢ１のレベルがそれに対して比較される標準値または標準値のセットを含む、コンパレーターモジュールも備え得る。好ましい実施形態において、コンパレーターモジュールはキットの使用説明書に含まれる。他の好ましい実施形態において、コンパレーターモジュールは、ディスプレイ装置の形、例えば、耐性レベルを示すために、試料測定の読み取りの次に置かれるように設計された、色または数字でコード化された材料のストリップの形をとる。標準値または標準値のセットは上述のように決定され得る。
【０１２１】
ＥＢ１に関して、試剤は好ましくは、ＥＢ１に選択的に結合する、抗体または抗体断片である。適切な試料は、組織、腫瘍組織またはＣＳＣ試料、固定およびパラフィン包埋または凍結組織のセクション、腫瘍組織またはＣＳＣ標本、および血液、脳脊髄液および他の体液由来の試料（循環腫瘍細胞およびＣＳＣなど）である。好ましくは、試剤は、ＥＢ１に結合する１つの特異的な一次抗体の形態およびその一次抗体に結合し、かつ検出のためにそれ自体が標識化される二次抗体の形態をとる。一次抗体も、直接検出するために標識化してもよい。キットまたはデバイスは任意選択的に、洗浄後に他のバイオマーカーと比較して捕捉剤に対して結合したバイオマーカーの保持を選択的に可能にする、洗浄溶液も含有し得る。次いで、かかるキットをＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、免疫蛍光顕微鏡検査、免疫組織化学法または他の免疫化学法で使用して、バイオマーカーのレベルを検出することができる。ＥＢ１のレベルを検出するために、非抗体ベースの特異的プローブ、例えば、薬物親和性反応性標的安定性（ＤＡＲＴＳ）またはアプタマーも使用することができる。
【０１２２】
他の好ましい実施形態において、試剤は、試料中のＥＢ１のレベルを測定することができる試剤でもあり得る。適切な試料は、組織、腫瘍組織またはＣＳＣ試料、固定およびパラフィン包埋または凍結組織のセクション、腫瘍組織またはＣＳＣ標本および血液、脳脊髄液および他の体液由来の試料（循環腫瘍細胞およびＣＳＣなど）である。好ましくは、試剤は、試料中のＥＢ１核酸とハイブリダイゼーションするための標識プローブまたはプライマーを含む。ＰＣＲ増幅技術または標識プローブの検出をベースとする適切な検出システムによって、試料中のＥＢ１核酸を定量化することが可能となる。これは、ｉ）原位置での標本自体で、好ましくはパラフィン包埋または凍結標本のセクションで、ｉｉ）腫瘍、組織および脳脊髄液由来の標本（循環腫瘍細胞およびＣＳＣなど）からの抽出物（適切な試剤が核酸に対して選択的に濃縮する）で行うことができる。そのキットまたはデバイスによって、プローブ自体またはプライマーに結合されたレポーターの特異的な物理化学的性質に基づく方法によって、ｉ）標本とハイブリダイズされた標識プローブの原位置での量、またはｉｉ）プライマーベースの増幅産物の量の測定および定量化が可能となる。
【０１２３】
同様に、そのキットおよびデバイスは、ＣＳＳに選択的に結合する試剤を含有し得る。かかる試剤は、上述のようにＣＳＣマーカーを標的化し得る。
【０１２４】
さらに、デバイスは、測定されたシグナルをさらに処理し、コンパレーターモジュールにおいてあるスケールへと移行する、イメージング装置または測定装置（例えば、限定されないが、蛍光の測定）を含み得る。
【０１２５】
本明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、指定のアイテムまたはアイテムのグループの包含を意味すると理解されるが、他のいずれかのアイテムまたはアイテムのグループを排除するものではない。
【０１２６】
実験方法論
患者からの腫瘍試料
手術前に化学療法または放射線治療を受けていない患者からの膠芽腫（ＧＢＭ）試料（世界保健機関，ＩＶグレード）をインフォームド・コンセント後に入手した。新鮮な原発性ＧＢＭ試料を術後に、０．５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣｅｒｇｙＰｏｎｔｏｉｓｅ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１％ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＳａｉｎｔＡｕｂｉｎ，Ｆｒａｎｃｅ）に回収した。４時間以内に、腫瘍を洗浄し、切開し、Ｍｃｌｌｗａｉｎ組織チョッパーを使用して自動的に切片にし、トリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）５ｍｇ／ｍＬとＤＮＡｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２００Ｕ／ｍＬの両方で３７℃にて１０分間、酵素的に分離した。ＤＭＥＭ  １０％ＦＣＳを添加することによって、反応を停止した。懸濁液を濾過し、回収された細胞を遠心分離した。次いで、細胞をカウントし、トリパンブルー染色（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって、８０％を超える細胞生存率が確認された。次いで、Ａ２Ｂ５＋抗原発現に基づくその分離まで、細胞をＤＭＥＭ−ＦＣＳ１０％に再懸濁した。
【０１２７】
Ａ２Ｂ５＋抗原発現に基づくＧＢＭ  ＣＳＣの分離
腫瘍から単離された細胞を、リン酸緩衝生理食塩水、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁し、ブロッキング剤（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）と共に４℃で１０分間インキュベートした。次いで、抗Ａ２Ｂ５ミクロビーズを添加し、４℃で１５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ポジティブ磁気細胞分離（ＭＡＣＳ  ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を、ＭＡＣＳカラムを使用して行った。蛍光顕微鏡検査法によるＡ２Ｂ５対照−免疫染色によって評価された平均純度は、約９３％（８５〜９８％の範囲）であった。脳室下領域（ＧＢＭ６）および皮質（ＧＢＭ９）から生じる、２つの膠芽腫多形腫瘍からＡ２Ｂ５＋細胞を単離した。
【０１２８】
ＧＢＭ６およびＧＢＭ９細胞の培養
幹細胞許容培地として、ホルモン（５ｍｇ／ｍＬインスリン，０．１ｍＭプトレシン，１００ｍｇ／ｍＬトランスフェリン，２．１０−８Ｍプロゲステロン；すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０ｍｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１０ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む成長因子、２０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子（ＥＧＦ）、（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＢ２７（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補充された、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）３．５ｍＬ中のＧＢＭ６またはＧＢＭ９細胞を３０，０００細胞／２５ｃｍ３フラスコの密度でプレーティングし、ＣＯ２５％／Ｏ２９５％に維持した。培養物に週２回フィードし、スフィアを２週毎に分離した。
【０１２９】
細胞トランスフェクション
ヒトＥＢ１（ＮＭ＿０１２３２５）を特異的にノックダウンするｓｈＲＮＡプラスミドおよびネガティブｓｈＲＮＡ対照プラスミド（Ｍｉｓｓｉｏｎ（登録商標）非標的ｓｈＲＮＡ対照ベクター）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、細胞をトランスフェクトした。安定なクローンを確立するために、トランスフェクトから２４時間後に、２μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する培地中でｓｈＲＮＡ−トランスフェクト細胞および関連する対照クローンが選択された。
【０１３０】
ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．６ｍｇ／ｍＬジェネテシン（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）での選択を用いて、ｐｅＧＦＰ−Ｎ３ベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｇｅｒｍａｉｎ  ｅｎ  Ｌａｙｅ，Ｆｒａｎｃｅ）をトランスフェクトした後に、安定なＧＦＰ細胞系が得られた。
【０１３１】
ＥＢ１免疫ブロット分析
ＧＢＭ  ＣＳＣを溶解バッファー（トリス５０ｍＭ（ｐＨ８．０），ＮａＣｌ  ２５０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ×１００  １％、ＳＤＳ０．１％およびプロテアーゼとホスファターゼ阻害剤とのカクテル（すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））に溶解した。タンパク質ライセート全体の３０μｇを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にローディングした。ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｍａｒｎｅｓｌａ  Ｃｏｑｕｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を、０．１％Ｔｗｅｅｎ（ｐＨ７．４）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の５％ミルク（粉末）で１時間ブックし、次いでマウス抗ＥＢ１抗体（クローン５，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅ  ｐｏｎｔ  ｄｅＣｌａｉｘ，Ｆｒａｎｃｅ）（１／１０００）およびマウスα−チューブリン抗体（クローンＤＭ１Ａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に同じ溶液中でインキュベートした。次いで、ＰＢＳ−５％ミルク中で膜を１５分間３回洗浄し、次いで抗マウスペルオキシダーゼ結合型二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＵＳＡ）と共に１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ中で３回、１５分間洗浄した。次いで、化学発光検出キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓａｉｎｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎｅｎ  Ｙｖｅｌｉｎｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、結合した抗体を検出した。シグナルをＧ：ＢＯＸ（Ｓｙｎｇｅｎｅ／Ｏｚｙｍｅ，Ｓａｉｎｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  ｅｎ  Ｙｖｅｌｉｎｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）で記録し、定量化にはＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用した。
【０１３２】
細胞毒性アッセイ
予めポリ−ＤＬ−オルニチンでコートされたウェルプレートに、細胞（５０００細胞／ウェル）をシーディングし（１０μｇ／ｍＬ）、ＢＡＬ２７８６２で処理する前に２４時間増殖させた。７２時間後に、スルホロダミンＢアッセイキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、細胞の増殖抑制を測定した。マイクロプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ，Ｔｈｅｒｍｏ，Ｖｉｌｌｅｂｏｎ  ｓｕｒ  Ｙｖｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、細胞密度を分析し、ＥＣ５０の分析をＧｒａｐｈＰａｄ  ５．０統計ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＵＳＡ）で行った。少なくとも３つの独立した実験を行った。
【０１３３】
クローン原性生存率アッセイ
予めポリ−ＤＬ−オルニチンでコートされた６ウェルプレートで、細胞（１０００細胞／ウェル）を増殖させ、ＢＡＬ２７８６２で７２時間処理した後に、５日までの間インキュベートした。２０％メタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中の１％クリスタルバイオレット溶液でコロニーを染色した。５０個を超える細胞を有するコロニーをカウントした。少なくとも３つの独立した実験を行った。
【０１３４】
細胞移動アッセイ
ＤＭＥＭ中の幹細胞（５０，０００）をｔｒａｎｓｗｅｌｌ移動チャンバの上側（０．８μｍフィルター，ＢＤ）に注いだ。チャンバの下側をＤＭＥＭで満たし、１０％ＦＣＳを補充した。細胞を５時間移動させ、次いでチャンバを除去した。移動しなかった細胞は、フィルターの上部に留まり、綿棒でそれを除去し；フィルターの下側の細胞を１％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ）で固定し、２０％メタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中の１％クリスタルバイオレット溶液で染色した。洗浄し、乾燥させた後に、倍率１０倍で１条件につき６つの領域の写真を画像化し、移動細胞をカウントした。
【０１３５】
ＧＢＭ６脳腫瘍ＣＳＣのＦＡＣＳ分析
幹細胞許容培地（５ｍｇ／ｍＬインスリン，０．１ｍＭプトレシン，１００ｍｇ／ｍＬトランスフェリン，２．１０−８Ｍプロゲステロン，５０ｍｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンおよび成長因子、例えば１０ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ），２０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子（ＥＧＦ）およびＢ２７）中のＧＢＭ６細胞を３００，０００細胞／ウェルにて、ポリ−ＤＬ−オルニチンでコートされた６ウェルプレートにシーディングした（１０μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。１日後、細胞をＢＡＬ２７８６２で７２時間処理した。次いで、細胞をトリプシン処理し、ブロッキング溶液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を含有するハンクス液（ＨＢＳＳ）緩衝液（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に懸濁し、Ａ２Ｂ５−ＡＰＣ（クローン１０５ＨＢ２９，参照１３０−０９３−５８２）およびＣＤ１３３−ＰＥ（クローン２９３Ｃ３，参照１３０−０９０−８５３）抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）と共に１０分間インキュベートした。次いで、細胞を１０％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で２０分間固定し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（商標），ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。各試料に対して合計１００，０００のイベントがカウントされ、データをＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で記録し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）およびＤｅａｎ−Ｊｅｔ−Ｆｏｘモデル分析を用いて分析した。
【０１３６】
自己再生能力の決定
予めポリ−ＤＬ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でコートされた６ウェルプレートに、ＧＢＭ６細胞をシーディングした（１５０，０００細胞／ウェル）。２４時間後、細胞をＢＡＬ２７８６２で７２時間処理するか、または処理しなかった。処理の最後に、上清を除去し、細胞を収集し、単細胞へと分離し、９６ウェルプレートにプレーティングした（１〜５細胞／ウェル）。８日後、倒立光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ  ４０００Ｂ）（Ｌｅｉｃａ，Ｓａｉｎｔ  Ｊｏｒｉｏｚ，Ｆｒａｎｃｅ）下にてスフィアをカウントした。少なくとも３つの独立した実験を行った。
【０１３７】
同所性ＧＢＭ６異種移植片
ＧＢＭ６  ＧＦＰ  ｓｈ０またはｓｈＥＢ１細胞のおよそ１００，０００細胞を、６週齢無胸腺ヌードマウスの脳室下域内（ブレグマより前方０．５ｍｍ、後方−１ｍｍ、および皮質表面より深度−２．１ｍｍ）に注入した。移植されたマウスに、２５ｍｇ／ｋｇ  ＢＡＬ１０１５５３（神経膠腫移植から３０、３３および３６日後の時点で３回）または賦形剤（対照）を静脈内投与して処置した。移植から４５日後に、腫瘍体積（三次元脳再構成）の解析のために、またはＦＡＣＳ分析のために、各群の動物３匹を屠殺した。
【０１３８】
三次元脳再構成
腫瘍体積を解析するために、マウスを４％パラホルムアルデヒドで麻酔し、灌流した。脳を取り出し、４℃にて４％パラホルムアルデヒド中で２日間固定し、次いで、すすいで、解剖するまでＰＢＳ中で保存した。ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ）を使用して、矢状軸に沿って厚さ５０〜１００μｍ切片へと脳を全体的に切断した。合計６０切片／脳が得られた。Ｌｅｉｃａ  ＤＭＬＢ蛍光顕微鏡、Ｌｅｉｃａ  ＤＣ３００Ｆデジタルカメラ、およびＬｅｉｃａ  ＦＷ４０００イメージングソフトウェア（Ｌｅｉｃａ）を使用して、ＧＦＰ注入細胞および腫瘍のマッピングおよび分析を行った。ＦｒｅｅＤソフトウェア（Ａｎｄｒｅｙ  Ｐ．，Ｆｒｅｅ−Ｄ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｓｅｒｉａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５；１４５（１−２）：２３３−２４４）を使用して、三次元脳再構成が得られた。簡潔には、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ａｎｄ  Ｐａｘｉｎｏｓ  ａｔｌａｓに基づく、脳室および脳梁を含むデジタル化された脳切片を取り付けて、これらの切片内の細胞を局在化した。デジタル化矢状切片６０枚を用いて、マウスの脳全体を構築した。
【０１３９】
同所性ＧＢＭ６腫瘍からの脳腫瘍癌幹細胞のＦＡＣＳ分析
麻酔した後、動物をＰＢＳで灌流し、脳を除去し、２％ＦＢＳを含有するＨＢＳＳ緩衝液で保存した。Ｇｅｎｔｌｅ  ＭＡＣＳ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、酵素のカクテル（ＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ，Ｒｏｔｋｒｅｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、コラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ）およびコラゲナーゼＶ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））中で細胞を分離させた。１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭを添加して、反応を停止した。懸濁液を濾過し、細胞を４０％Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁した。遠心分離後、ミエリンを除去し、２％ＦＣＳを含有するＨＢＳＳ緩衝液に細胞を再懸濁した。２％ＦＣＳを含有するＨＢＳＳ中の細胞をＡ２Ｂ５−ＡＰＣおよびＣＤ１３３−ＰＥ抗体と共に１０分間インキュベートした。次いで、細胞を１０％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、フローサイトメトリーを使用して分析した。各試料に関して、合計１００，０００のイベントがカウントされ、データをＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅで記録し、Ｄｅａｎ−Ｊｅｔ−Ｆｏｘモデル分析を選択するＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．，ＳａｎＣａｒｌｏｓ，ＣＡ）用いて分析した。
【０１４０】
ＧＢＭ１０  ｆｌａｎｋ腫瘍抽出、および腫瘍保持マウスに由来する血清からの細胞外小胞（エキソソームを含む）単離
大きな（２５０〜４２０ｍｇ）ＧＢＭ１０  ｆｌａｎｋ腫瘍を保持するメス無胸腺ヌードマウス（無胸腺Ｎｃｒ−ｎｕ／ｎｕ）を標準手順に従って安楽死させ、心臓穿刺によって、シリコーンコートＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）血液採取チューブ（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）に最大量の血液を引き抜いた。以下の製造元の説明書に従って、血液から血清を分離し、使用するまで、−８０℃にて保存した。
【０１４１】
血清試料を２５℃の水浴中で解凍し、次いで遠心（３０分，２０００×ｇ，４℃（マイクロリットルローター４５°を備えたＨｅｒａｅｕｓ  Ｐｒｉｍｏ  Ｒ遠心機；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡＵＳＡ）にかけ、細胞および壊死組織片を除去した。２匹のマウスからの清澄血清をプールし、製造元の説明書に従ってＴｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、細胞外小胞の単離のために使用した。ペレットを５０μＬ  ２×ＳＤＳ試料緩衝液（０．１２５ＭトリスｐＨ６．８，４％ＳＤＳ，２０％グリセロール）に懸濁し、造元の説明書に従って、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）６６０ｎｍタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってタンパク質濃度を決定した。使用するまで、試料を−８０℃で保存した。屠殺した直後に、同じマウスからのＧＢＭ  １０ｆｌａｎｋ腫瘍を標準手順を用いて切開し、液体窒素で急速凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。腫瘍４５ｍｇにつき抽出緩衝液１ｍＬ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＥＧＴＡ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％ＮＰ−４０，１ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび２×プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］）を含有するｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳＭチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に、凍結された腫瘍を入れた。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）において勾配速度プログラムを用いて、腫瘍を４０秒間分離した。腫瘍抽出物を氷上で３０分間インキュベートし、続いて１０，０００ｒｐｍ（マイクロリットルローター４５°を備えたＨｅｒａｅｕｓ  ＰｒｉｍｏＲ遠心機；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて４℃で３０分間遠心した。上清を保持し、タンパク質濃度を上述のように決定した。使用するまで、試料を−８０℃で保存した。
【０１４２】
ＧＢＭ１０  ｆｌａｎｋ腫瘍および細胞外小胞（エキソソームなど）の分析
ＥＢ１免疫ブロット法対照を以下のようにｓｉＲＮＡトランスフェクションによって調製した：１．２×１０６ヒーラ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ；参照ＣＣＬ−２）をトランスフェクション前に７時間、７５ｃｍ２組織培養フラスコにプレーティングした。製造元の説明書に従って、ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）１０００μＬおよびＨｉｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）トランスフェクション試剤（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）６０μＬを使用して、非標的化対照（ＮＴＣ）ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ，ＵＳＡ；参照Ｄ−００１８１０−１０−２０）またはＥＢ１  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；参照Ｌ−００６８２４−００−０００５）２０ｎＭを細胞に一過的にトランスフェクトした。２×ＳＤＳ試料緩衝液中に回収する前に、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で、細胞を３７℃でさらに７２時間培養した。
【０１４３】
２×ＳＤＳ試料緩衝液中に調製された、ＧＢＭ１０腫瘍保持マウスの血清由来の細胞外小胞、健康なドナーからのヒト血清に由来する対照エキソソーム（Ｈａｎｓａ  ＢｉｏＭｅｄ；参照ＨＢＭ−ＰＥＳ−３０／２）およびＨｅＬａ細胞溶解物に、還元条件のために０．２Ｍ  ＤＴＴおよび０．０２％ブロモフェノールブルー、１×プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した。非還元条件のために（ＣＤ９免疫ブロット法のみで必要とされる）、ＤＴＴを省いた。腫瘍ライセート３つ分を４×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の１つ分および最終濃度３５５ｍＭの２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）と混合して、腫瘍抽出物を調製した。すべての試料を９５℃で５分間沸騰させた。
【０１４４】
タンパク質（腫瘍抽出物２０μｇ，ヒーラ細胞抽出物１０μｇ、およびＥＢ１またはＣＤ９免疫ブロット法にそれぞれ用いられる、健康なドナーからのヒト血清に由来する細胞外小胞または対照エキソソーム３０μｇまたは１０μｇ）をＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標），Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。ＰＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０中の５％ミルクで室温にて１時間ブロッキングした後、以下の一次抗体：抗ＥＢ１（Ｓｉｇｍａ；参照Ｅ３４０６）、抗ＣＤ９（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ，ＵＳＡ；参照Ａ１５００−５０）または抗アクチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭｅｒｃｋＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ  Ｇｅｒｍａｎｙ；参照ＭＡＢ１５０１）で４℃にて一晩、膜をプローブした。膜をヤギ抗ｒａｂｂｉｔ−ＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ；参照１１１−０３５−１４４）またはヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；参照１１５−０３５−１４６）と共に室温にて１時間インキュベートし、ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅウエスタンブロット検出試剤（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して、ラベル（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）タンパク質を可視化した。ＦＵＳＩＯＮＳＯＬＯＳ装置およびＦＵＳＩＯＮ−ＣＡＰＴソフトウェア（Ｖｉｌｂｅｒ  Ｌｏｕｒｍａｔ，ＭＡｒｎｅ−ｌａ−Ｖａｌｅｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、シグナルを記録した。
【０１４５】
詳細な実験
実施例１：ＧＢＭ６およびＧＢＭ９ＣＳＣに対するＢＡＬ２７８６２の細胞障害活性の比較
ＧＢＭ６およびＧＢＭ９  ＣＳＣに対するＢＡＬ２７８６２の細胞毒性活性の濃度反応曲線から、ＢＡＬ２７８６２が、ＥＣ５０約２０ｎＭで両方の細胞系に対する同等の細胞毒性活性を有することが分かる（表１参照）。
【０１４６】
【表８】
2019503473.tif 000014
【０１４７】
実施例２：ＧＢＭ６およびＧＢＭ９  ＧＢＭ  ＣＳＣにおけるＥＢ１タンパク質発現レベル
ＧＢＭ６対ＧＢＭ９  ＣＳＣにおけるＥＢ１発現レベルの免疫ブロット法による決定から、ＧＢＭ６細胞がＧＢＭ９よりも高いレベルのＥＢ１タンパク質を発現することが実証された（図１参照）。αチューブリンレベルに対して正規化すると、ＧＢＭ６は、ＧＢＭ９細胞よりも１７．９倍多い量のＥＢ１タンパク質を発現した。
【０１４８】
実施例３：ＢＡＬ２７８６２は、ＧＢＭ９  ＣＳＣよりもＧＢＭ６において、より効率的に生体外での細胞移動を抑制する
ＧＢＭ６およびＧＢＭ９細胞のＴｒａｎｓｗｅｌｌ移動アッセイは、非細胞毒性（６ｎＭ）および細胞毒性（２０ｎＭ）として定義される、２種類の異なるＢＡＬ２７８６２濃度で行われた（実施例１参照）。予想されるように、この細胞毒性濃度（２０ｎＭ）によって劇的に、両方の細胞系の移動が同様な程度まで抑制され、この濃度での細胞に対する一般的な細胞毒性が示されている。しかしながら、６ｎＭの非細胞毒性濃度で、ＧＢＭ６細胞は、細胞移動の統計学的に有意な抑制を示したのに対して、ＧＢＭ９細胞は応答しなかった（図２参照）。これは、ＢＡＬ２７８６２の低い非細胞毒性濃度、ＧＢＭ９と比べて高いＥＢ１レベルを伴う現象によって、ＧＢＭ６の移動を特異的に抑制することができることを示す。
【０１４９】
実施例４：ｓｈＲＮＡトランスフェクションによって抑制されたＥＢ１発現レベルを有する、安定なＧＦＰ発現性ＧＢＭ６  ＣＳＣの分析
ｓｈＲＮＡ（ｓｈＥＢ１）、非標的化対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈ０）をトランスフェクトされた安定なＧＦＰ発現性ＧＢＭ６細胞、および非処理ＧＢＭ６を、免疫ブロット法によってＥＢ１発現について試験した（図３参照）。測定されたシグナルは、α−チューブリン発現に対して正規化された。ｓｈＥＢ１を安定にトランスフェクトされたＧＢＭ６細胞は、対照ＧＢＭ６細胞と比較してＥＢ１発現レベルの６９％の減少を示す。
【０１５０】
実施例５：ＥＢ１ダウンレギュレーションによって、非細胞毒性ＢＡＬ２７８６２濃度の抗移動作用に対してＧＢＭ６  ＣＳＣが脱感作される
ＢＡＬ２７８６２濃度６ｎＭで測定された細胞移動は、対照ＥＢ１発現細胞おいて、細胞移動の統計学的に有意な抑制を示したのに対し、ＥＢ１ダウンレギュレートＧＢＭ６細胞では、ＢＡＬ２７８６２処理の抑制作用は劇的に減少した（図４参照）。これによって、ＥＢ１タンパク質が、ＧＢＭ  ＣＳＣにおけるＢＡＬ２７８６２の抗移動作用に関与することが実証されている。
【０１５１】
実施例６：ＢＡＬ２７８６２は、ＥＢ１発現依存的にＧＢＭ６  ＣＳＣのクローン原性能力を抑制する
ＤＭＳＯ対照または３、６および１０ｎＭ  ＢＡＬ２７８６２（非細胞毒性濃度）と共に７２時間インキュベートした後に、ＧＢＭ６  ＧＦＰ  ｓｈ０（正常なＥＢ１レベル）およびＧＢＭ６  ＧＦＰ  ｓｈＥＢ１（ダウンレギュレートされたＥＢ１レベル）のコロニー形成能力を評価した（図５参照）。ＢＡＬ２７８６２は、ＥＢ１発現細胞のみで統計学的に有意な手法で準毒性用量６および１０ｎＭにて、ＧＢＭ６  ＣＳＣのクローン原性能力を著しく損なった。これは、クローン原性アッセイにおいてＢＡＬ２７８６２の活性にＥＢ１が必要であることを示す。
【０１５２】
実施例７：ＢＡＬ２７８６２は、ＥＢ１発現依存的に生体外で幹細胞分化を促進する。
ＢＡＬ２７８６２処理後のＡ２Ｂ５ポジティブＧＭＢ６細胞数のＦＡＣ分析から、ＥＢ１が発現された場合のみ（ＧＢＭ６  ＧＦＰ  ｓｈ０細胞）、６ｎＭ  ＢＡＬ２７８６２処理によって有意な抑制が示された（図６参照）。それと対照的に、Ａ２Ｂ５に対してポジティブなＧＢＭ６細胞およびＥＢ１発現に対してネガティブなＧＢＭ６細胞（ＧＢＭ６  ＧＦＰ  ｓｈＥＢ１，ＥＢ１ダウンレギュレート細胞）は、６ｎＭ  ＢＡＬ２７８６２に対して感受性が低かった。Ａ２Ｂ５発現の減少は分化と関連することから、これは、ＢＡＬ２７８６２がＥＢ１発現依存的にＧＢＭ６  ＣＳＣの分化を誘導することを示す。
【０１５３】
実施例８：ＢＡＬ２７８６２は、ＥＢ１発現依存的に生体外で幹細胞分化を促進する。
ＢＡＬ２７８６２（６ｎＭ）処理は、ＧＢＭ６野生型およびＧＢＭ６  ＧＦＰ  ｓｈ０細胞（正常なＥＢ１レベルを有する）において用量依存的にスフィアの形成を統計学的に優位に妨げる（図７参照）。しかしながら、ＥＢ１ダウンレギュレーション（ＧＢＭ６  ＧＦＰ  ｓｈＥＢ１細胞）によって、ＧＢＭ６  ＣＳＣにおけるＢＡＬ２７８６２の阻害活性が抑制される。スフィアを形成する能力の低下は分化と関連することから、これは、ＢＡＬ２７８６２が、ＥＢ１発現依存的にＧＢＭ６  ＣＳＣの分化を誘導することを示す。
【０１５４】
実施例９：ＢＡＬ１０１５５３（ＢＡＬ２７８６２のプロドラッグ）は、ＥＢ１発現同所性ＧＢＭ６腫瘍に対して増加した活性を有する
０日目に脳室下領域内に定位的に移植されたＧＢＭ６  ＧＦＰ  ｓｈ０（正常なＥＢ１発現レベル）またはＧＢＭ６  ＧＦＰ  ｓｈＥＢ１（ＥＢ１ダウンレギュレートされた）細胞を受けたマウスを３０／３３／３６日目に、２５ｍｇ／ｋｇ  ＢＡＬ１０１５５３で静脈内投与にて、または賦形剤対照で処理し、脳を取り出すために４５日目に屠殺した。マウスの脳を連続矢状切片に処理し、次いで蛍光顕微鏡を使用して、それを分析かつ記録した。単一セクションから撮影された写真を三次元再構成に使用した。ＥＢ１発現腫瘍において賦形剤処理と比較して、ＢＡＬ１０１５５３処理した結果、腫瘍量（サイズ）および腫瘍の広がりが明らかに減少し、生体内での腫瘍成長および腫瘍細胞移動に対するＢＡＬ１０１５５３の抑制作用が示されている（図８参照）。しかしながら、ＢＡＬ１０１５５３のこの作用は、ＥＢ１ネガティブ腫瘍において最小であり、ＣＳＣに対するＢＡＬ２７８６２活性とＥＢ１発現がポジティブに相関する場合の生体外データと一致する。
【０１５５】
実施例１０：ＢＡＬ１０１５５３処理は、同所性ＧＢＭ６腫瘍における未分化ＣＳＣの割合を低減する
０日目に脳室下領域内に定位的に移植されたＧＢＭ６  ＧＦＰ  ｓｈ０（正常なＥＢ１発現レベル）またはＧＢＭ６  ＧＦＰ  ｓｈＥＢ１（ＥＢ１ダウンレギュレートされた）細胞を受けたマウスを３０／３３／３６日目に、２５ｍｇ／ｋｇ  ＢＡＬ１０１５５３で静脈内投与にて、または賦形剤対照で処理し、脳を取り出すために４５日目に屠殺した。マウスの脳を単一の細胞浮遊液中に分離し、抗Ａ２Ｂ５抗体を使用して、Ａ２Ｂ５ポジティブＧＢＭＣＳＣを染色し、ＦＡＣＳによって分析した。Ａ２Ｂ５ポジティブＧＢＭ６細胞に対するＡ２Ｂ５ネガティブ細胞の割合を計算した。ＥＢ１発現ＧＢＭ６腫瘍のＢＡＬ１０１５５３処理によって、腫瘍細胞の割合がＡ２Ｂ５ネガティブ細胞の方に強くシフトし（ポジティブ２０％に対してネガティブ８０％）、それは対照と比較して明確なシフトである（ポジティブ６０％に対してネガティブ４０％）（図９参照）。それと対照的に、ＥＢ１ダウンレギュレートＧＢＭ６腫瘍では、ＢＡＬ１０１５５３処理によって、Ａ２Ｂ５ポジティブ細胞の割合がむしろ増加し（およそ６０％から８０％へ）、ＥＢ１発現腫瘍と比較して、ＥＢ１ダウンレギュレート脳腫瘍において未分化ＧＢＭ６  ＣＳＣの含有率が高いことが示されている。
【０１５６】
実施例１１：ＥＢ１発現ＧＢＭ１０腫瘍保持マウスに由来する細胞外小胞（エキソソームを含む）は、ＥＢ１タンパク質に対してポジティブである
大きなＧＢＭ１０  ｆｌａｎｋ腫瘍を保持するマウスから単離された腫瘍および細胞外小胞を免疫ブロット法によって、ＥＢ１発現について分析した。健康なドナーからのヒト血清に由来する対照エキソソームおよび細胞外小胞（エキソソーム）マーカーとしてＣＤ９を使用して、細胞外小胞（エキソソームなど）の効率的な単離が確認された（Ｚａｒｏｖｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｘｏｓｏｍｅ  ｓｈｕｔｔｌｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｕｓｉｎｇｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１５；８７：４６−５８；Ｔｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｘｏｘｏｍｅｓ：Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎｈｓｃ７３．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９：３：５９９−６１０）。ＥＢ１発現に関する抽出腫瘍の免疫ブロット法から、３つの個々の腫瘍における一貫した発現が示された。ＥＢ１  ｓｉＲＮＡで処理された細胞に由来するＨｅＬａ抽出物を用いて、ＥＢ１に対する抗体の特性が確認され、非標的化ｓｉＲＮＡ対照（ＮＴＣ）抽出物と比較して、ＥＢ１の劇的な減少が示された（図１１）。さらに、腫瘍保持マウスの血清から得られた細胞外小胞（エキソソームを含む）もまた、ＥＢ１タンパク質を含有することが分かり、これは、ＧＢＭ腫瘍ＥＢ１発現分析の有用な代替源であり得ることを表す（図１２）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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