(57)【要約】本発明は、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）酵素、ＧＴ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明はまた、これらのＧＴ酵素を使用してβ−グルコース結合を有する生成物を生成するための方法を提供する。本発明は、基質をグリコシル化してβ−グリコシル化生成物を生成するための方法であって、少なくとも１つのグリコシル基ドナー、少なくとも１つのグリコシル基アクセプター、および少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素を提供する工程；グリコシル基ドナーおよびグリコシル基アクセプターを、グリコシル基アクセプターがグリコシル化されて、β−グルコース結合を有する生成物を生成するような条件下で、グリコシルトランスフェラーゼ酵素と接触させる工程を含む、方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質をグリコシル化してβ−グリコシル化生成物を生成するための方法であって、少なくとも１つのグリコシル基ドナー、少なくとも１つのグリコシル基アクセプター、および少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素を提供する工程；前記グリコシル基ドナーおよび前記グリコシル基アクセプターを、前記グリコシル基アクセプターがグリコシル化されて、少なくとも１つの、β−グルコース結合を有する生成物を生成するような条件下で、前記グリコシルトランスフェラーゼ酵素と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記グリコシル基ドナーがグリコシルホスフェートである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記グリコシル基ドナーがグルコース−１−リン酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記グリコシル基アクセプターが、グリコシル基、アルコキシ基、カルボキシ基、アミノカルボニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、カルボキシアルキル基、アミノアルキル基、ハロアルキル基、アルキルチオアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロアリール基、およびヘテロアリールアルキル基から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記β−グルコース結合を有する生成物がステビオールグリコシドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記グリコシル基アクセプターがステビオシドであり、前記グリコシル基ドナーがα−グルコース−１−リン酸であり、前記β−グルコース結合を有する生成物がレバウジオシドＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、および１４に記載のポリペプチドから選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
グルコース−１−リン酸の生成方法であって、ホスホリラーゼ、無機ホスフェート、および前記ホスホリラーゼのジサッカリド基質、トリサッカリド基質、またはオリゴサッカリド基質を提供する工程；前記ホスホリラーゼ、前記無機ホスフェート、および前記サッカリドを、前記サッカリドが切断されてモノサッカリドおよびグルコース−１−リン酸を生成するような条件下で接触させる工程を含む、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法と組み合わせた請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記グリコシル基アクセプターが、グリコシル基、アルコキシ基、カルボキシ基、アミノカルボニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、カルボキシアルキル基、アミノアルキル基、ハロアルキル基、アルキルチオアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロアリール基、およびヘテロアリールアルキル基から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ホスホリラーゼがスクロースホスホリラーゼであり、前記サッカリドがスクロースであり、生成された前記モノサッカリドがスクロースであり、生成された前記グルコース−１−リン酸がα−グルコース−１−リン酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ホスホリラーゼが、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項８〜１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１６年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３５０，４５０号（これは、全ての目的のためにその全体が参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）酵素、ＧＴ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明はまた、これらのＧＴ酵素を使用してβ−グルコース結合を有する生成物を生成するための方法を提供する。
【０００３】
ＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出される「配列表」、表、またはコンピュータ・プログラム一覧付属物の参照
配列表の写しを、ファイル名「ＣＸ８−１５５ＵＳＰ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日２０１６年６月１４日、およびサイズ９８，３０４バイトのＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂから明細書と同時に提出している。ＥＦＳ−Ｗｅｂから提出した配列表は、本明細書の一部を構成し、その全体が本明細書中で参照によって組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）は、翻訳後にグリコシル残基を活性化されたヌクレオチド糖から単量体および重合体のアクセプター分子（例えば、他の糖、タンパク質、脂質、および他の有機基質）に転移する酵素である。これらのグリコシル化分子は、種々の代謝経路および代謝過程に関与する。グルコシル部分の転移は、アクセプターの生物活性、溶解度、および細胞内の輸送特性を変化させることができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明は、グリコシルトランスフェラーゼ酵素、ＧＴ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明はまた、これらのＧＴ酵素を使用してβ−グルコース結合を有する生成物を生成するための方法を提供する。
【０００６】
本発明は、基質をグリコシル化してβ−グリコシル化生成物を生成するための方法であって、少なくとも１つのグリコシル基ドナー、少なくとも１つのグリコシル基アクセプター、および少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ酵素を提供する工程；グリコシル基ドナーおよび前記グリコシル基アクセプターを、グリコシル基アクセプターがグリコシル化されて、少なくとも１つの、β−グルコース結合を有する生成物を生成するような条件下で、前記グリコシルトランスフェラーゼ酵素と接触させる工程を含む、方法を提供する。方法のいくつかの実施形態では、グリコシル基ドナーはグリコシルホスフェートである。方法のいくつかの追加の実施形態では、グリコシル基ドナーはグルコース−１−リン酸である。方法のいくつかのさらなる実施形態では、グリコシル基アクセプターは、グリコシル基、アルコキシ基、カルボキシ基、アミノカルボニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、カルボキシアルキル基、アミノアルキル基、ハロアルキル基、アルキルチオアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロアリール基、およびヘテロアリールアルキル基から選択される。方法のいくつかのさらに追加の実施形態では、β−グルコース結合を有する生成物はステビオールグリコシドである。方法のいくつかのさらなる実施形態では、グリコシル基アクセプターはステビオシドであり、グリコシル基ドナーはα−グルコース−１−リン酸であり、β−グルコース結合を有する生成物はレバウジオシドＡである。方法のいくつかの追加の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、および１４に記載のポリペプチドから選択される。
【０００７】
本発明は、グルコース−１−リン酸の生成方法であって、ホスホリラーゼ、無機ホスフェート、およびホスホリラーゼのジサッカリド基質、トリサッカリド基質、またはオリゴサッカリド基質を提供する工程；ホスホリラーゼ、無機ホスフェート、およびサッカリドを、サッカリドが切断されてモノサッカリドおよびグルコース−１−リン酸を生成するような条件下で接触させる工程を含む、方法も提供する。方法のいくつかの実施形態では、この方法は、前に記載された方法と組み合わせられる。方法のいくつかの追加の実施形態では、グリコシル基アクセプターは、グリコシル基、アルコキシ基、カルボキシ基、アミノカルボニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、カルボキシアルキル基、アミノアルキル基、ハロアルキル基、アルキルチオアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロアリール基、およびヘテロアリールアルキル基から選択される。方法のなおいくつかの追加の実施形態では、ホスホリラーゼはスクロースホスホリラーゼであり、サッカリドはスクロースであり、生成されたモノサッカリドはスクロースであり、生成されたグルコース−１−リン酸はα−グルコース−１−リン酸である。方法のいくつかのさらなる実施形態では、ホスホリラーゼは、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２から選択されるポリペプチド配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、グリコシルトランスフェラーゼが、グリコシルホスフェート（例えば、グルコース−１−リン酸）からアクセプター（例えば、Ｒ−ＯＨ（式中、Ｒは、任意のグリコシル、アルコキシ、カルボキシ、アミノカルボニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、またはヘテロアリールアルキル基である））へのグリコシル基の転移を触媒する酵素反応スキームを示す。
【０００９】
【図２】図２は、図１に記載の酵素反応を基質ステビオシドに適用し、グリコシルホスフェートがα−グルコース−１−リン酸であり、β−グルコース結合の形成を触媒して生成物レバウジオシドＡを生成するという本発明の１つの実施形態の略図を示す。
【００１０】
【図３】図３は、グルコース−１−リン酸のｉｎ  ｓｉｔｕ生成のために２つの酵素反応を対にするという本発明の１つの実施形態の略図を示す。一方の反応では、スクロースホスホリラーゼが無機ホスフェートを使用してスクロースを切断することによりα−グルコース−１−リン酸およびフルクトースが得られ、他方の反応では、グリコシル基が、α−グルコース−１−リン酸からアクセプターに転移される。Ｒは、任意のグリコシル基、アルコキシ基、カルボキシ基、アミノカルボニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、カルボキシアルキル基、アミノアルキル基、ハロアルキル基、アルキルチオアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロアリール基、またはヘテロアリールアルキル基である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の説明
本発明は、グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）酵素、ＧＴ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明はまた、これらのＧＴ酵素を使用してβ−グルコース結合を有する生成物を生成するための方法を提供する。
【００１２】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、一般に、本発明に属する当業者が一般的に理解している意味と同じ意味を有する。一般に、本明細書中で使用した命名法ならびに下記の細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学、および核酸化学の実験手順は、当該分野で周知であり、且つ一般的に使用されている。かかる技術は周知であり、当業者に周知の多数のテキストおよび参考文献に記載されている。標準的な技術またはその修正形態を、化学合成および化学分析のために使用する。前出および下記の本明細書中で言及した全ての特許、特許出願、論文、および刊行物は、本明細書中で参考として明確に援用される。
【００１３】
本明細書中に記載の方法および材料に類似するか等価な任意の適切な方法および材料が本発明の実施で使用されるが、いくつかの方法および材料を本明細書中に記載する。記載の特定の方法論、プロトコール、および試薬は、当業者が使用する状況に応じて変動し得るので、本発明はこれらに限定されないと理解すべきである。したがって、直後に定義した用語は、本発明全体を参照することによってより完全に説明される。
【００１４】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は例示および説明のみを目的とし、本発明を制限しないと理解すべきである。本明細書中で使用した節の表題は、まとめのみを目的とし、記載の主題を制限すると解釈されない。数値範囲は、範囲を規定する数を含む。したがって、本明細書中に開示のあらゆる数値範囲は、より狭い数値範囲が全て本明細書中に明示されているかのように、より広い数値範囲に含まれるあらゆるかかるより狭い数値範囲を含むことが意図される。本明細書中に開示のあらゆる最大（または最小）の数値の限度が、より低い（またはより高い）数値の限度が本明細書中に明示されているかのように、あらゆるかかるより低い（またはより高い）数値の限度を含むことも意図される。
【００１５】
略語：
遺伝的にコードされたアミノ酸のために使用した略語は慣習的な略語であり、これらを以下に示す。
【表Ａ】
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【００１６】
三文字略語を使用する場合、「Ｌ」または「Ｄ」が明確に前置されないか、略語を使用した文脈から明確で無い限り、アミノ酸は、α−炭素（Ｃα）についてＬ型またはＤ型の立体配置のいずれかであり得る。例えば、「Ａｌａ」がα−炭素についての立体配置を特定しないでアラニンを示すのに対して、「Ｄ−Ａｌａ」および「Ｌ−Ａｌａ」は、Ｄ−アラニンおよびＬ−アラニンをそれぞれ示す。一文字略語を使用する場合、大文字はα−炭素についてＬ−立体配置のアミノ酸を示し、小文字はα−炭素についてＤ−立体配置のアミノ酸を示す。例えば、「Ａ」はＬ−アラニンを示し、「ａ」はＤ−アラニンを示す。ポリペプチド配列を一連の一文字略語または三文字略語（またはその混合）として示す場合、配列を、慣習にしたがってアミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）への方向で示す。
【００１７】
遺伝的にコードするヌクレオシドのために使用される略語は慣習的な略語であり、以下に示す：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）；およびウリジン（Ｕ）。特に記載しないかぎり、省略したヌクレオシドは、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのいずれかであり得る。ヌクレオシドを、個別または凝集体に基づいてリボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのいずれかであると特定することができる。核酸配列を一連の一文字略語として示す場合、配列を、慣習にしたがって５’から３’への方向で示し、リン酸塩は示さない。
【００１８】
定義：
本発明に関して、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、他で具体的に定義しないかぎり、当業者によって一般的に理解される意味を有するであろう。したがって、以下の用語は以下の意味を有することを意図する。
【００１９】
本明細書中で使用する場合、文脈上明らかに他の意味を示さない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」という表記には１つを超えるポリペプチドが含まれる。
【００２０】
同様に、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」「ｉｎｃｌｕｄｅ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」は、相互に交換可能であり、本発明を制限することを意図しない。したがって、本明細書中で使用する場合、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」およびその同語源語を、包含の意味（すなわち、用語「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」およびその対応する同語源語と等価）で使用する。
【００２１】
種々の実施形態の説明で用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の例では、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ」という用語を使用して実施形態を代わりに説明することができるとさらに理解すべきである。
【００２２】
用語「約」は、特定の値の許容可能な誤差を意味する。いくつかの例では、「約」は、所与の値の範囲の０．０５％、０．５％、１．０％、または２．０％以内を意味する。いくつかの例では、「約」は、所与の値の１、２、３、または４標準偏差以内を意味する。
【００２３】
「ＥＣ」番号は、国際生化学・分子生物学連合の命名法委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法をいう。ＩＵＢＭＢ生化学分類は、酵素が触媒する化学反応に基づいた酵素についての数値による分類システムである。
【００２４】
「ＡＴＣＣ」は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）をいい、その生物所蔵物は遺伝子および株を含む。
【００２５】
「ＮＣＢＩ」は、米国国立生物学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および同センターが提供する配列データベースをいう。
【００２６】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」を、長さや翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、またはリン酸）と無関係にアミド結合によって共有結合した少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すために本明細書中で互換的に使用する。Ｄ型およびＬ型アミノ酸、およびＤ型およびＬ型アミノ酸の混合物、ならびにＤ型およびＬ型アミノ酸、およびＤ型およびＬ型アミノ酸の混合物を含むポリマー、が本定義の範囲内に含まれる。
【００２７】
「アミノ酸」は、本明細書中で、アミノ酸の一般的に知られている三文字表記またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨されている一文字表記によって言及される。クレオチドを、同様に、その一般的に許容されている一文字コードによって言及し得る。
【００２８】
本明細書中で使用する場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、相互に共有結合した２つまたはそれを超えるヌクレオシドをいう。ポリヌクレオチドを、リボヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ）から完全に構成することができ、２’デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ）またはリボヌクレオシドおよび２’デオキシリボヌクレオチドの混合物から完全に構成することができる。典型的にはヌクレオシドが標準的なホスホジエステル結合を介して相互に連結する一方で、ポリヌクレオチドは、１つまたはそれを超える非標準的な連結を含み得る。ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であり得るか、一本鎖領域および二本鎖領域の両方を含み得る。さらに、ポリヌクレオチドは典型的には天然に存在するコードヌクレオベース（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、およびシトシン）から構成される一方で、ポリヌクレオチドは１つまたはそれを超える改変および／または合成ヌクレオベース（例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなど）を含み得る。いくつかの実施形態では、かかる改変または合成ヌクレオベースは、アミノ酸配列をコードするヌクレオベースである。
【００２９】
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の部分をいう。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、用語「生物触媒作用」、「生物触媒作用の」、「生体内変化」、および「生合成」は、有機化合物に対して化学反応を引き起こすための酵素の使用をいう。
【００３１】
「グリコシルトランスフェラーゼ」は、グリコシル残基を活性化した糖（例えば、ヌクレオチド二リン酸糖またはリン酸糖）から単量体および重合体のアクセプター分子に転移させる酵素の能力を有するポリペプチドをいう。
【００３２】
「ホスホリラーゼ」は、無機ホスフェートを使用してグリコシド結合を切断し、それにより、ホスホグリコシドおよび単量体または重合体の生成物を放出する酵素の能力を有するポリペプチドをいう。逆方向では、ホスホリラーゼは、グリコシル残基をホスホグリコシド（例えば、グルコース−１−リン酸）から単量体および重合体のアクセプターに転移させることによってグリコシルトランスフェラーゼとして作用し得る。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、「グリコシル化」は、グリコシル残基とアクセプター分子との間のグリコシド結合の形成をいう。
【００３４】
本明細書中で使用する場合、「グルコシル化」は、グルコース残基とアクセプター分子との間のグリコシド結合の形成をいう。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、「グリコシル」は、モノサッカリド、低級オリゴサッカリド、またはオリゴサッカリド誘導体の環状形態からヘミアセタールのヒドロキシル基を除去することによって得られる一価のフリーラジカルまたは置換基構造である有機基をいう。グリコシル基は、無機酸（例えば、リン酸）と反応してエステル（例えば、グルコース１−リン酸）を形成する。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、「グリコシド」は、グリコシド結合によって炭水化物（例えば、糖）が別の官能基に結合した分子をいう。グリコシドを加水分解して糖および非糖（すなわち、アグリコン）成分を生成することができる。
【００３７】
本明細書中で使用する場合、用語「ステビオールグリコシド」は、ステビオールのグリコシド（天然に存在するステビオールグリコシド（例えば、ステビオシド、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＢ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＭ（レバウジオシドＸとしても公知）、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ）、および合成ステビオールグリコシド（例えば、酵素的にグルコシル化されたステビオールグリコシド）、ならびにその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない）をいう。ステビオールおよびそのグリコシドの化学構造を以下に示す（ＷＯ２０１３／１７６７３８号を参照のこと）。
【表Ｂ】
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【００３８】
本明細書中で使用する場合、「野生型」および「天然に存在する」は、天然に見出される形態をいう。例えば、野生型のポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然供給源から単離することができ、且つ人為的に意図的に改変されていない生物中に存在する配列である。
【００３９】
本明細書中で使用する場合、「組換え」、「操作された」および「天然に存在しない」は、細胞、核酸、またはポリペプチドに関して使用する場合、材料、すなわち、他の点では天然に存在しないと考えられる様式で改変された材料の天然または未変性の形態に対応する材料をいう。いくつかの実施形態では、細胞、核酸、またはポリペプチドは、天然に存在する細胞、核酸、またはポリペプチドと同一であるが、合成材料および／または組換え技術を使用した操作によって産生または誘導されている。非限定的な例には、とりわけ、細胞の未変性（非組換え）形態内に見出されない遺伝子を発現するか、他の方法で異なるレベルで発現される未変性遺伝子を発現する組換え細胞が含まれる。
【００４０】
用語「配列同一率（％）」を、ポリヌクレオチド間またはポリペプチド間の比較をいうために本明細書中で使用し、比較ウィンドウにわたる２つの最適にアラインメントした配列の比較によって決定し、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列部分またはポリペプチド配列部分は、２配列の最適なアラインメントのために参照配列と比較した場合に付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一率を得ることによって百分率を計算することができる。あるいは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に生じるか、核酸塩基またはアミノ酸残基をギャップを用いてアラインメントした位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一率を得ることによって百分率を計算することができる。当業者は、２つの配列をアラインメントするために利用可能な確立されたアルゴリズムが多数存在すると認識する。比較のための配列の最適アラインメントを、これらに限定されないがＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，  ２：４８２［１９８１］）の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：４４３［１９７０］）の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４［１９８８］）の類似性検索法、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実行（例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査を含む任意の適切な方法によって、当該技術分野において知られているように行うことができる。配列同一率および配列類似率の決定に適切なアルゴリズムの例は、これらに限定されないがＡｌｔｓｃｈｕｌらによって記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム（それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５：  ４０３−４１０［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３３８９−３４０２［１９７７］を参照のこと）を含む。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターウェブサイトから公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードとアラインメントした場合にいくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するか満たすクエリー配列中の長さＷのショートワードの同定による高スコア配列対（ｈｉｇｈ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐａｉｒ）（ＨＳＰ）の第１の同定を含む。Ｔを、隣接ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）という（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出を参照のこと）。これらの最初の隣接ワードヒットは、これらのワードヒットを含むより長いＨＳＰを見出すための検索開始のためのシードとして働く。次いで、ワードヒットを、累積アラインメントスコアを増加させることができるかぎり、各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアを、ヌクレオチド配列についてはパラメーターＭ（一致する残基対のための報酬スコア；常に０超）およびＮ（ミスマッチ残基のためのペナルティスコア；常に０未満）を使用して計算する。アミノ酸配列について、スコア行列を使用して、累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；１つまたはそれを超える負スコアの残基アラインメントの蓄積によって累積スコアが０またはそれ未満に進行した場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワードレングス（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワードレングス（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５［１９８９］を参照のこと）を使用する。例示的な配列アラインメントおよび配列同一率の決定には、提供されたデフォルトパラメーターを使用したＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）中のＢＥＳＴＦＩＴプログラムまたはＧＡＰプログラムを使用することができる。
【００４１】
本明細書中で使用する場合、「参照配列」は、配列および／または活性比較の基本として使用される定義された配列をいう。参照配列は、より大きな配列のサブセット（例えば、全長の遺伝子配列またはポリペプチド配列のセグメント）であり得る。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長またはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、少なくとも１００残基長または核酸もしくはポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、それぞれ、（１）２配列間で類似する配列（すなわち、完全配列の一部）を含むことができ、（２）２配列間で異なる配列をさらに含むことができるので、２つ（またはそれを超える）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較を、典型的には、配列が類似する局所領域を同定および比較するための「比較ウィンドウ」にわたる２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列の比較によって行う。いくつかの実施形態では、「参照配列」は一次アミノ酸配列に基づくことができ、ここで、参照配列は一次配列中に１つまたはそれを超える変化を有し得る配列である。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個の連続するヌクレオチドの位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントをいい、ここで、ある配列を少なくとも２０個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウィンドウ中の配列の一部が２配列の最適なアラインメントのために参照配列（付加や欠失を含まない）と比較した場合に２０％またはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較ウィンドウは、２０個の連続残基よりも長いことが可能であり、任意選択的に、３０、４０、５０、１００、またはそれより長いウィンドウが含まれる。
【００４３】
本明細書中で使用する場合、「〜に相当する」、「〜に関する」、または「〜に関連する」は、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の付番の文脈で使用する場合、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較した場合に指定した参照配列の残基の付番をいう。換言すれば、所与のポリマーの残基番号または残基の位置を、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の番号の位置によるよりもむしろ参照配列に関して命名する。例えば、所与のアミノ酸配列（操作されたグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列など）を、２配列間の残基マッチを最適にするためのギャップの導入によって参照配列とアラインメントすることができる。これらの場合、ギャップが存在するにもかかわらず、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列中の残基を、アラインメントした参照配列に関して付番する。
【００４４】
本明細書中で使用する場合、「実質的な同一性」は、少なくとも２０残基の位置の比較ウィンドウにわたって、頻繁には、少なくとも３０〜５０残基のウィンドウにわたって参照配列と比較した場合に、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％同一性、および少なくとも８９〜９５％配列同一性、またはより通常には少なくとも９９％配列同一性を有するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列をいい、ここで、配列同一率を、比較ウィンドウにわたって合計で２０％またはそれ未満の参照配列が付加または欠失した配列との参照配列の比較によって計算する。ポリペプチドに適用したいくつかの特定の実施形態では、用語「実質的な同一性」は、２つのポリペプチド配列が、デフォルトギャップウェイトを使用したプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインメントした場合、少なくとも８０％配列同一性、好ましくは少なくとも８９％配列同一性、少なくとも９５％配列同一性、またはそれを超える配列同一性（例えば、９９％配列同一性）を共有することを意味する。いくつかの実施形態では、比較されている配列において同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【００４５】
本明細書中で使用する場合、「アミノ酸の相違」および「残基の相違」は、参照配列中の対応する位置のアミノ酸残基と比較したポリペプチド配列の位置のアミノ酸残基の相違をいう。アミノ酸の相違の位置を、一般に、本明細書中で「Ｘｎ」といい、ここで、ｎは残基の相違に基づいた参照配列中の対応する位置をいう。例えば、「配列番号４と比較した場合のＸ９３位の残基の相違」は、配列番号４の９３位に対応するポリペプチドの位置でのアミノ酸残基の相違をいう。したがって、配列番号４の参照ポリペプチドが９３位にセリンを有する場合、「配列番号４と比較した場合のＸ９３位の残基の相違」は、配列番号４の９３位に対応するポリペプチドの位置でのセリン以外の任意の残基のアミノ酸置換をいう。本明細書中のほとんどの例では、ある位置での特異的なアミノ酸残基の相違を「ＸｎＹ」として示し、ここで、「Ｘｎ」は上記の対応する位置を指定し、「Ｙ」は操作されたポリペプチド中に見出されるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチド中の残基と異なる残基）の一文字識別子である。いくつかの場合、本発明はまた、従来の表示法「ＡｎＢ」で示す特異的なアミノ酸の相違を提供し、ここで、Ａは参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は参照配列中の残基の位置の番号であり、Ｂは操作されたポリペプチド配列中の残基置換の一文字識別子である。いくつかの例では、本発明のポリペプチドは、参照配列と比較した１つまたはそれを超えるアミノ酸残基の相違を含むことができ、この相違は、参照配列と比較した場合に残基の相違が存在する特定の位置のリストによって示される。いくつかの実施形態では、１つを超えるアミノ酸をポリペプチドの特定の残基の位置で使用することができる場合、使用することができる種々のアミノ酸残基を、「／」によって分ける（例えば、Ｘ３０７Ｈ／Ｘ３０７ＰまたはＸ３０７Ｈ／Ｐ）。所与のバリアント内に複数の置換を示すためにスラッシュを使用することもできる（すなわち、所与の配列内に１つを超える置換が存在する）。いくつかの実施形態では、本発明は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換を含む１つまたはそれを超えるアミノ酸の相違を含む操作されたポリペプチド配列を含む。いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換の両方を含む操作されたポリペプチド配列を提供する。
【００４６】
本明細書中で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」は、ある残基の類似の側鎖を有する異なる残基との置換をいい、したがって、典型的には、ポリペプチド中のアミノ酸の同一または類似と定義されたアミノ酸クラス内のアミノ酸との置換を含む。制限されない例として、それぞれ、脂肪族側鎖を有するあるアミノ酸を、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）と置換し；ヒドロキシル側鎖を有するあるアミノ酸を、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）と置換し；芳香族側鎖を有するあるアミノ酸を、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン）と置換し；塩基性側鎖を有するあるアミノ酸を、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リジンおよびアルギニン）と置換し；酸性側鎖を有するあるアミノ酸を、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）と置換し；かつ／またはある疎水性または親水性のアミノ酸を、別の疎水性または親水性のアミノ酸と置換する。
【００４７】
本明細書中で使用する場合、「非保存的置換」は、ポリペプチド中のアミノ酸の有意に特性が異なる側鎖を有するアミノ酸との置換をいう。非保存的置換は、定義した群内よりもむしろ群間のアミノ酸を使用することができ、（ａ）置換領域中のペプチド骨格の構造（例えば、グリシンのプロリンへの置換）、（ｂ）電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さに影響を及ぼす。制限されない例として、例示的な非保存的置換は、塩基性アミノ酸または脂肪族アミノ酸に置換された酸性アミノ酸；小アミノ酸に置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸に置換された親水性アミノ酸であり得る。
【００４８】
本明細書中で使用する場合、「欠失」は、参照ポリペプチドからの１つまたはそれを超えるアミノ酸の除去によるポリペプチドの改変をいう。欠失は、操作されたグリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を保持し、そして／またはその改良された特性を保持しながら、参照酵素を構成する１またはそれを超えるアミノ酸、２またはそれを超えるアミノ酸、５またはそれを超えるアミノ酸、１０またはそれを超えるアミノ酸、１５またはそれを超えるアミノ酸、または２０またはそれを超えるアミノ酸、全アミノ酸数の１０％まで、または全アミノ酸数の２０％までを除去することができる。欠失は、ポリペプチドの内部および／または末端部が対象であり得る。種々の実施形態では、欠失は、連続的なセグメントを含むことができるか、不連続であり得る。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、「挿入」は、参照ポリペプチドに対する１つまたはそれを超えるアミノ酸の付加によるポリペプチドの改変をいう。ポリペプチドの内部またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端に挿入することができる。本明細書中で使用される挿入には、当該分野で公知の融合タンパク質が含まれる。挿入は、アミノ酸の連続セグメントであり得るか、天然に存在するポリペプチド中で１つまたはそれを超えるアミノ酸によって分離され得る。
【００５０】
「機能的フラグメント」および「生物学的に活性なフラグメント」を、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失および／または内部欠失を有するが、残存するアミノ酸配列が、このアミノ酸配列と比較される配列（例えば、本発明の操作された全長グリコシルトランスフェラーゼ）内の対応する位置と同一であり、かつ全長ポリペプチドの活性の実質的に全てを保持するポリペプチドをいうために本明細書中で互換的に使用する。
【００５１】
本明細書中で使用する場合、「単離されたポリペプチド」は、ポリペプチドに天然に付随している他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されたポリペプチドをいう。この用語は、その天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞内で、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成を介して）から除去または精製されているポリペプチドを含む。組換えグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、細胞内に存在することができるか、細胞培地中に存在することができるか、種々の形態（溶解物または単離された調製物など）で調製することができる。そのようなものとして、いくつかの実施形態では、組換えグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
【００５２】
本明細書中で使用する場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が主に存在する種である（すなわち、モルベースまたは重量ベースで、組成物中の任意の他の個別の高分子種よりも豊富に存在する）組成物をいい、一般に、モルまたは重量％で存在する高分子種の少なくとも約５０％を対象種が占める場合、実質的に精製された組成物である。しかし、いくつかの実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼを含む組成物は、５０％未満純粋（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％）であるグリコシルトランスフェラーゼを含む。一般に、実質的に純粋なグリコシルトランスフェラーゼ組成物は、モルまたは重量％で組成物に存在する全高分子種の約６０％またはそれを超えて、約７０％またはそれを超えて、約８０％またはそれを超えて、約９０％またはそれを超えて、約９５％またはそれを超えて、および約９８％またはそれを超えて含まれる。いくつかの実施形態では、対象種を、本質的に均一（すなわち、従来の検出方法によって組成物中の夾雑種を検出できない）まで精製し、ここで、組成物は、本質的に単一の高分子種からなる。溶媒種、小分子（５００ダルトン未満）、および元素イオン種は、高分子種と見なさない。いくつかの実施形態では、単離された組換えグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【００５３】
本明細書中で使用する場合、「改良された酵素の特性」は、少なくとも１つの改良された酵素の特性をいう。いくつかの実施形態では、本発明は、基準グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドおよび／または野生型グリコシルトランスフェラーゼポリペプチド、および／または別の操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドと比較して任意の酵素の特性の改良を示す操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。したがって、「改良」レベルを決定し、種々のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド（野生型および操作されたグリコシルトランスフェラーゼを含む）の間で比較することができる。改良された特性には、タンパク質発現の増加、熱活性の増加、熱安定性の増加、ｐＨ活性の増加、安定性の増加、酵素活性の増加、基質特異性または基質親和性の増加、比活性の増加、基質または最終産物阻害に対する耐性の増加、化学安定性の増加、化学選択性の改良、溶媒安定性の改良、酸性ｐＨに対する耐性の増加、タンパク質分解活性に対する耐性の増加（すなわち、タンパク質分解に対する感受性の低下）、凝集の低下、溶解度の増加、および温度プロフィールの変化などの特性が含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書中で使用する場合、「酵素活性の増加」および「酵素活性の増強」は、操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの特性の改良をいい、この酵素活性の増加を、参照グリコシルトランスフェラーゼ酵素と比較した場合の比活性（例えば、生成された生成物／時間／タンパク質重量）の増加または基質の生成物への変換率（例えば、特定の量のグリコシルトランスフェラーゼを使用した特定の時間における出発量の基質の生成物への変換率）の増加によって示すことができる。例示的な酵素活性の決定方法を、実施例に示す。酵素活性に関する任意の特性（その変化によって酵素活性が増加し得るＫｍ、Ｖｍａｘ、またはｋｃａｔの古典的な酵素の特性が含まれる）が影響を受け得る。酵素活性の改良は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．２倍から、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドが由来する天然に存在するグリコシルトランスフェラーゼまたは別の操作されたグリコシルトランスフェラーゼよりも酵素活性が２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、またはそれを超えるまでであり得る。
【００５５】
本明細書中で使用する場合、「変換」は、基質の対応する生成物への酵素変化（または生体内変化）をいう。「変換率」は、特定の条件下での時間内の生成物に変換した基質の百分率をいう。したがって、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」を、特定の期間における基質の生成物への「変換率」として示すことができる。
【００５６】
「ゼネラリスト特性」を有する酵素（または「ゼネラリスト酵素」）は、親配列と比較して広範囲の基質に対して改良された活性を示す酵素をいう。ゼネラリスト酵素は、必ずしもあらゆる可能性のある基質に対して改良された活性を示すわけではない。いくつかの実施形態では、本発明は、ゼネラリスト特性を有するグリコシルトランスフェラーゼバリアントであって、このバリアントが広範囲の立体的および電子的に多様な基質について親遺伝子と比較して類似するか改良された活性を示すという点で、ゼネラリスト特性を有するグリコシルトランスフェラーゼバリアントを提供する。さらに、本明細書中に提供するゼネラリスト酵素を、広範囲の多様な分子にわたって代謝産物／生成物の生成が増加するように改良されるように操作した。
【００５７】
用語「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」は、本明細書中で、核酸ハイブリッドが安定な条件をいう。当業者に公知のように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融点（Ｔｍ）に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含量、およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのＴｍ値を、公知の融点の予測方法を使用して計算することができる（例えば、Ｂａｌｄｉｎｏら、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １６８：７６１−７７７［１９８９］；Ｂｏｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ４８：１３９０［１９６２］；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：８８９３−８８９７［１９８６］；Ｆｒｅｉｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７［１９８６］；Ｋｉｅｒｚｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５：７８４０−７８４６［１９８６］；Ｒｙｃｈｌｉｋら、１９９０，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８：６４０９−６４１２［１９９０］（ｅｒｒａｔｕｍ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９：６９８［１９９１］）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）；Ｓｕｇｇｓら、１９８１，  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、Ｂｒｏｗｎら（編）ｐｐ．  ６８３−６９３，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ［１９８１］；およびＷｅｔｍｕｒ，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２６：２２７−２５９［１９９１］を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に開示のポリペプチドをコードし、定義した条件下で（中程度にストリンジェントな条件または高ストリンジェントな条件など）、本発明の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする配列の相補物とハイブリッド形成する。
【００５８】
本明細書中で使用する場合、「ハイブリッド形成ストリンジェンシー」は、核酸のハイブリッド形成における洗浄条件などのハイブリッド形成条件をいう。一般に、ハイブリッド形成反応を、低い方のストリンジェンシーの条件下で実施後、多様であるが高い方のストリンジェンシーで洗浄する。用語「中程度のストリンジェントなハイブリッド形成」は、標的−ＤＮＡが標的ＤＮＡに対して約６０％同一、好ましくは約７５％同一、約８５％同一、標的−ポリヌクレオチドに対して約９０％を超える同一性で相補核酸に結合可能な条件をいう。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、４２℃での５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳでのハイブリッド形成後、４２℃での０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳでの洗浄に等価な条件である。「高ストリンジェンシーハイブリッド形成」は、一般に、定義されたポリヌクレオチド配列についての溶液条件下で決定した熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれ未満低い温度の条件をいう。いくつかの実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、６５℃で０．０１８Ｍ  ＮａＣｌにて安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみがハイブリッド形成することが可能な条件をいう（すなわち、ハイブリッドが６５℃の０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中で安定ではない場合、本明細書中で意図するように、高ストリンジェンシー条件下で安定でないであろう）。高ストリンジェンシー条件を、例えば、４２℃の５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ後、６５℃で０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳでの洗浄に等価な条件でのハイブリッド形成によって提供することができる。別の高ストリンジェンシー条件は、６５℃の０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含む５×ＳＳＣでのハイブリッド形成および６５℃の０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣの洗浄に等価な条件でのハイブリッド形成である。他の高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件および中程度にストリンジェントな条件は、上記で引用した文献に記載されている。
【００５９】
本明細書中で使用する場合、「コドン最適化」は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、コードされたタンパク質が目的の生物中で効率的に発現されるように特定の生物中で優先的に使用されるコドンへの変化をいう。ほとんどのアミノ酸がいくつかのコドンによって示されるという点で遺伝暗号が縮重している（「同義語」または「同義」コドンと呼ばれる）にもかかわらず、特定の生物によるコドン使用頻度が非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏っていることが周知である。このコドン使用頻度の偏りは、所与の遺伝子、共通の機能または起源となる祖先の遺伝子、低コピー数タンパク質に対する高発現タンパク質、および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域に関して高い可能性がある。いくつかの実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを、発現のために選択された宿主生物における最適な産生のためにコドン最適化することができる。
【００６０】
本明細書中で使用する場合、「好ましい」コドン、「最適な」コドン、および「高コドン使用頻度バイアス」コドンは、単独または組み合わせて使用される場合、同一アミノ酸をコードする他のコドンよりもタンパク質コード領域中でより高い頻度で使用されるコドンを互換的にいう。好ましいコドンを、単一の遺伝子、共通の機能または起源の遺伝子組、高発現遺伝子におけるコドン使用頻度、全生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、関連する生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはその組み合わせに関して決定することができる。遺伝子発現レベルに伴って頻度が増加するコドンは、典型的には、発現に最適なコドンである。特定の生物におけるコドン頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的な同義語コドン使用頻度）およびコドン優先度（例えば、クラスター分析またはコレスポンデンス分析を使用した多変量解析が含まれる）ならびに遺伝子中で使用された有効コドン数を決定するための種々の方法が公知である（例えば、ＧＣＧ  ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ；ＣｏｄｏｎＷ，Ｐｅｄｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ  １４：３７２−７３［１９９８］；Ｓｔｅｎｉｃｏら，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２２４３７−４６［１９９４］；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇｅｎｅ  ８７：２３−２９［１９９０］を参照のこと）。コドン使用頻度表は、多くの異なる生物に利用可能である（例えば、Ｗａｄａら，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８［１９９２］；Ｎａｋａｍｕｒａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２  ［２０００］；Ｄｕｒｅｔら，ｓｕｐｒａ；Ｈｅｎａｕｔ  ａｎｄ  Ｄａｎｃｈｉｎ，“Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，”Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら，（Ｅｄｓ．），ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ｐ．２０４７−２０６６［１９９６］を参照のこと）。コドン使用頻度を得るためのデータソースは、タンパク質をコードすることができる任意の利用可能なヌクレオチド配列に依存し得る。これらのデータ・セットは、発現したタンパク質をコードすることが実際に公知の核酸配列（例えば、完全タンパク質コード配列−ＣＤＳ）、発現配列タグ（ＥＳＴＳ）、またはゲノム配列の推定コード領域）を含む（例えば、Ｍｏｕｎｔ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，［２００１］；Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２５９−２８１［１９９６］；およびＴｉｗａｒｉら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：２６３−２７０［１９９７］を参照のこと）。
【００６１】
本明細書中で使用する場合、「調節配列」は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要であるか有利な全ての成分を含む。各調節配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して未変性または外来であり得る。かかる調節配列には、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターが含まれるが、これらに限定されない。最小限でも、調節配列は、プロモーター、転写停止シグナル、および翻訳停止シグナルを含む。調節配列に、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域内の調節配列のライゲーションを容易にする特異的な制限部位を導入するためのリンカーを提供することができる。
【００６２】
「作動可能に連結された」は、本明細書中で、調節配列が目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指示または制御するように目的のポリヌクレオチドに関連する位置に調節配列が適切に（すなわち、機能的関係において）配置された構成と定義する。
【００６３】
「プロモーター配列」は、目的のポリヌクレオチド（コード配列など）の発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列をいう。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、最適な宿主細胞中で転写活性を示す任意の核酸配列であってよく（変異プロモーター、短縮プロモーター、およびハイブリッドプロモーターが含まれる）、宿主細胞と同種または異種のいずれかの細胞外または細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【００６４】
「適切な反応条件」という語句は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドが基質を所望の生成物化合物に変換することができる酵素変換反応溶液中の条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒の範囲など）をいう。いくつかの例示的な「適切な反応条件」が、本明細書中に提供される。
【００６５】
本明細書中で使用する場合、「化合物負荷」、または「酵素負荷」などにおける「負荷」は、反応開始時の反応混合物中の成分の濃度または量をいう。
【００６６】
本明細書中で使用する場合、酵素変換反応プロセスの文脈における「基質」は、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドが作用する化合物または分子をいう。  
【００６７】
本明細書中で使用する場合、酵素変換プロセスの文脈中の「生成物」は、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの気質に対する作用に起因する化合物または分子をいう。  
【００６８】
本明細書中で使用する場合、用語「培養」は、任意の適切な条件下での（例えば、液体培地、ゲル培地、または固体培地を使用した）微生物細胞集団の成長をいう。
【００６９】
組換えポリペプチドを、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して産生することができる。目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子を、プラスミドなどのベクター内でクローン化し、大腸菌などの所望の宿主内で発現させることができる。組換えポリペプチドのバリアントを、当該分野で公知の種々の方法によって生成することができる。実際に、多種多様な当業者に周知の異なる変異誘発技術が存在する。さらに、変異誘発キットはまた、多数の、分子生物学の商業的供給業者から入手可能である。規定のアミノ酸での特異的置換（部位指定）、遺伝子の局在化領域内での特異的変異もしくはランダム変異（領域特異的）、または全遺伝子にわたるランダム変異誘発（例えば、飽和変異誘発）を行うための方法が利用可能である。酵素バリアントを生成するための多数の適切な方法（ＰＣＲを使用した一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの部位指定変異誘発、カセット式変異誘発、遺伝子合成、誤りがちのＰＣＲ、シャフリング、および化学飽和変異誘発、または当該分野で公知の任意の他の適切な方法が含まれるが、これらに限定されない）が当業者に公知である。ＤＮＡ工学およびタンパク質工学のために使用される方法の非限定的な例は、以下の特許に提供されている：米国特許第６，１１７，６７９号；米国特許第６，４２０，１７５号；米国特許第６，３７６，２４６号；米国特許第６，５８６，１８２号；米国特許第７，７４７，３９１号；米国特許第７，７４７，３９３号；米国特許第７，７８３，４２８号；および米国特許第８，３８３，３４６号。バリアントが産生された後、これらを任意の所望の特性（例えば、高活性もしくは活性の増加、または低活性もしくは活性の低下、熱活性の増加、熱安定性の増加、および／または酸性ｐＨ安定性など）についてスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、「組換えグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド」（本明細書中で「操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド」、「バリアントグリコシルトランスフェラーゼ酵素」、および「グリコシルトランスフェラーゼバリアント」とも呼ばれる）を使用する。
【００７０】
本明細書中で使用する場合、「ベクター」は、細胞内にＤＮＡ配列を導入するためのＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ配列にコードされたポリペプチドを適切な宿主内で発現させることができる適切な調節配列に作動可能に連結された発現ベクターである。いくつかの実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞内での発現を駆動するため、ＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子）に作動可能に連結されたプロモーター配列を有し、いくつかの実施形態では、転写ターミネーター配列も含む。
【００７１】
本明細書中で使用する場合、用語「発現」には、ポリペプチド産生に関与する任意の工程（転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。いくつかの実施形態では、この用語はまた、細胞からのポリペプチドの分泌を含む。
【００７２】
本明細書中で使用する場合、用語「産生する」は、細胞によるタンパク質および／または他の化合物の産生をいう。この用語は、ポリペプチド産生に関与する任意の工程（転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾が含まれるが、これらに限定されない）を含むことが意図される。いくつかの実施形態では、この用語はまた、細胞からのポリペプチドの分泌を含む。
【００７３】
本明細書中で使用する場合、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列など）は、この配列および別の配列の２つが天然では関連しない場合に、作動可能に連結された別の配列に対して、「異種である」。例えば、「異種ポリヌクレオチド」は、実験技術によって宿主細胞に導入された任意のポリヌクレオチドであり、宿主細胞から取り出し、実験操作に供し、次いで、宿主細胞に再導入されるポリヌクレオチドが含まれる。
【００７４】
本明細書中で使用する場合、用語「宿主細胞」および「宿主株」は、本明細書中に提供したＤＮＡ（例えば、グリコシルトランスフェラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド）を含む発現ベクターに適切な宿主をいう。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築されたベクターを使用して形質転換されているかトランスフェクトされている原核細胞または真核細胞である。
【００７５】
用語「アナログ」は、基準ポリペプチドと７０％を超える配列同一性を有するが、１００％未満の配列同一性（例えば、７５％、７８％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超える配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、アナログは、１つまたはそれを超える天然に存在しないアミノ酸残基（ホモアルギニン、オルニチン、およびノルバリンが含まれるが、これらに限定されない）および天然に存在するアミノ酸を含むポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、アナログはまた、１つまたはそれを超えるＤ−アミノ酸残基および２つまたはそれを超えるアミノ酸残基の間の非ペプチド結合を含む。
【００７６】
用語「有効量」は、所望の結果を得るために十分な量を意味する。当業者は、日常的な実験を使用することによって有効量を決定し得る。
【００７７】
用語「単離された」および「精製された」を、天然で関連している少なくとも１つの他の成分から取り出された分子（例えば、単離された核酸、単離されたポリペプチドなど）または他の成分をいうために使用する。用語「精製された」は、完全に純粋である必要はなく、むしろ、相対的な定義であることが意図される。
【００７８】
「立体選択性」は、化学反応または酵素反応における、一方の立体異性体の他方の立体異性体を超える優先的形成をいう。立体選択性は、一方の立体異性体の形成が他方よりも好まれる場合は部分的であり得、一方の立体異性体のみが形成される場合は完全であり得る。立体異性体が鏡像異性体である場合、立体選択性は、エナンチオ選択性（両方の合計中の１つの鏡像異性体の分率（典型的には、百分率として報告される））をいう。エナンチオ選択性は、代わりとして、式［主な鏡像異性体−少数の鏡像異性体］／［主な鏡像異性体＋少数の鏡像異性体］にしたがって鏡像異性体から計算した鏡像体過剰率（ｅ．ｅ．）（典型的には百分率として）として当該分野で一般的に報告されている。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性をジアステレオ選択性（２つのジアステレオマーの混合物のうちの一方のジアステレオマーの分率（典型的には、百分率として報告される））といい、一般に、代わりとして、ジアステレオマー過剰率（ｄ．ｅ．）として報告される。鏡像体過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃ  ｅｘｃｅｓｓ）の一形態である。
【００７９】
本明細書中で使用する場合、用語「位置選択性」および「位置選択的反応」は、結合の１つの作製方向または破壊方向が全ての他の可能性のある方向より優先されて起こる反応をいう。反応は、この区別が完全である場合は完全に（１００％）位置選択性であり得、一方の部位での反応生成物が他方の部位での反応生成物より優位である場合（例えば、生成化合物（ｐｒｏｄｕｃｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（２）（すなわち、２Ｓ，３Ｓ０−ヒドロキシピペコリン酸の、望ましくない生成物（２Ｓ，５Ｓ）−ヒドロキシピペコリン酸より優先的な形成）、実質的に位置選択性（少なくとも７５％）であり得るか、部分的に位置選択性（ｘ％、百分率は目的の反応に応じて設定される）であり得る。
【００８０】
本明細書で使用されるとき、「熱安定性」は、同じ高温に暴露された野生型酵素と比較して一定期間（例えば、０．５〜２４時間）高温（例えば、４０〜８０℃）に暴露後に類似の活性（例えば、６０％〜８０％を超える）を維持するグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをいう。
【００８１】
本明細書で使用されるとき、「溶媒安定性」は、同じ濃度の同じ溶媒に暴露された野生型酵素と比較して一定期間（例えば、０．５〜２４時間）種々の濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒（エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）に曝露後に類似の活性（例えば、６０％〜８０％を超える）を維持するグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをいう。
【００８２】
本明細書で使用されるとき、「熱および溶媒安定性」は、熱安定性および溶媒安定性の両方を示すグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをいう。
【００８３】
本明細書中で使用する場合、「還元剤」は、Ｆｅ＋３をＦｅ＋２に変換することができる化合物または薬剤をいう。例示的な還元剤は、一般にＬ−アスコルビン酸の形態のアスコルビン酸である。
【００８４】
「アルキル」は、１〜１８個の炭素原子（両端の数を含む）、直鎖または分岐鎖のいずれかであり、より好ましくは１〜８個の炭素原子（両端の数を含む）、最も好ましくは１〜６個の炭素原子（両端の数を含む）の飽和炭化水素基をいう。特定の数の炭素原子を有するアルキルを丸括弧内に示す（例えば、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルは１〜６個の炭素原子のアルキルをいう）。
【００８５】
「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含むが、任意選択的に１つを超える二重結合を含む直鎖または分岐鎖のいずれかの２〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）の炭化水素基をいう。
【００８６】
「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を含むが、任意選択的に１つを超える三重結合を含み、さらに、任意選択的に１つまたはそれを超える二重結合部分を含む直鎖または分岐鎖の２〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）の炭化水素基をいう。
【００８７】
「アルキレン」は、任意選択的に１つまたはそれを超える適切な置換基で置換されている、１〜１８個の炭素原子（両端の数を含む）、より好ましくは１〜８個の炭素原子（両端の数を含む）、最も好ましくは１〜６個の炭素原子（両端の数を含む）を有する直鎖または分岐鎖の２価の炭化水素ラジカルをいう。例示的な「アルキレン」には、メチレン、エチレン、プロピレン、およびブチレンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
「アルケニレン」は、任意選択的に１つまたはそれを超える適切な置換基で置換されている、２〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）および１つまたはそれを超える炭素――炭素二重結合、より好ましくは２〜８個の炭素原子（両端の数を含む）、最も好ましくは２〜６個の炭素原子（両端の数を含む）を有する直鎖または分枝鎖の２価の炭化水素ラジカルをいう。
【００８９】
「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、およびヘテロアルキニル」は、それぞれ、１つまたはそれを超える炭素原子が同一または異なるヘテロ原子またはヘテロ原子基にそれぞれ独立して置き換えられた本明細書中に定義のアルキル、アルケニル、およびアルキニルをいう。炭素原子と置き換えることができるヘテロ原子および／またはヘテロ原子基には、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｏ−、−ＮＲγ−、−ＰＨ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）ＮＲγ−、および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲγ−など（その組み合わせが含まれる）（式中、各Ｒγは、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択される）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
「アリール」は、単一の環（例えば、フェニル）または複数の縮合した環（例えば、ナフチルまたはアントリル）を有する、６〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）の不飽和芳香族炭素環基をいう。例示的なアリールには、フェニル、ピリジル、およびナフチルなどが含まれる。
【００９１】
「アリールアルキル」は、好ましくはアルキル部分中に１〜６個の炭素原子（両端の数を含む）を有し、アリール部分中に６〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）を有する、アリールに置換されたアルキル（すなわち、アリール−アルキル基）をいう。かかるアリールアルキル基の例は、ベンジルおよびフェネチルなどである。
【００９２】
「アリールオキシ」は、−ＯＲλ基（式中、Ｒλは任意選択的に置換され得るアリール基である）をいう。
【００９３】
「シクロアルキル」は、１〜３個のアルキル基に任意選択的に置換することができる単一の環または複数の縮合した環を有する３〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）の環状アルキル基をいう。例示的なシクロアルキル基には、単環構造（シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル、１−メチルシクロプロピル、２−メチルシクロペンチル、および２−メチルシクロオクチルなど）または多環構造（アダマンチルなどの架橋環系が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
「シクロアルキルアルキル」は、好ましくは、アルキル部分中に１〜６個の炭素原子（両端の数を含む）を有し、シクロアルキル部分中に３〜１２個の炭素原子（両端の数を含む）を有する、シクロアルキルに置換されたアルキル（すなわち、シクロアルキル−アルキル基）をいう。かかるシクロアルキルアルキル基の例は、シクロプロピルメチルおよびシクロヘキシルエチルなどである。
【００９５】
「アミノ」は、−ＮＨ２基をいう。置換アミノは、−ＮＨＲη基、ＮＲηＲη基、およびＮＲηＲηＲη基（式中、各Ｒηは、置換または非置換のアルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルコキシカルボニル、スルファニル、スルフィニル、およびスルホニルなどから独立して選択される）をいう。典型的なアミノ基には、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチル（ｍｅｔｈｙｌｙ）スルホニルアミノ、およびフラニル−オキシ−スルファミノなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
「アミノアルキル」は、１つまたはそれを超える水素原子が１つまたはそれを超えるアミノ基（置換アミノ基が含まれる）に置き換えられたアルキル基をいう。
【００９７】
「アミノカルボニル」は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２をいう。置換アミノカルボニルは、−Ｃ（Ｏ）ＮＲηＲη（式中、アミノ基ＮＲηＲηは本明細書中に定義の通りである）をいう。
【００９８】
「オキシ」は、異なるオキシ基（エーテルおよびエステルが含まれる）を形成するための種々の置換基を有し得る２価の−Ｏ−基をいう。
【００９９】
「アルコキシ」または「アルキルオキシ」を、本明細書中で、−ＯＲζ基（式中、Ｒζは、アルキル基（任意選択的に置換されたアルキル基が含まれる）である）をいうために互換的に使用する。
【０１００】
「カルボキシ」は−ＣＯＯＨをいう。
【０１０１】
「カルボニル」は、異なるカルボニル基を形成するための種々の置換基（酸、酸ハライド、アルデヒド、アミド、エステル、およびケトンが含まれる）を有し得る−Ｃ（Ｏ）−をいう。
【０１０２】
「カルボキシアルキル」は、水素原子のうちの１つまたはそれより多くが１つまたはそれを超えるカルボキシ基に置換されたアルキルをいう。
【０１０３】
「アミノカルボニルアルキル」は、本明細書中に定義のアミノカルボニル基に置換されたアルキルをいう。
【０１０４】
「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードをいう。
【０１０５】
「ハロアルキル」は、１つまたはそれを超える水素原子をハロゲンと置き換えたアルキル基をいう。したがって、用語「ハロアルキル」は、モノハロアルキル、ジハロアルキル、トリハロアルキルなどからペルハロアルキルまでが含まれることを意味する。例えば、語句「（Ｃ１  Ｃ２）ハロアルキル」には、１−フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、１−フルオロエチル、１，１−ジフルオロエチル、１，２−ジフルオロエチル、１，１，１トリフルオロエチル、ペルフルオロエチルなどが含まれる。
【０１０６】
「ヒドロキシ」は−ＯＨをいう。
【０１０７】
「ヒドロキシアルキル」は、水素原子のうちの１つまたはそれより多くが１つまたはそれを超えるヒドロキシ基に置換されたアルキル基をいう。
【０１０８】
「チオール」または「スルファニル」は、−ＳＨをいう。置換されたチオールまたはスルファニルは、−Ｓ−Ｒη（式中、Ｒηは、アルキル、アリール、または他の適切な置換基である）をいう。
【０１０９】
「アルキルチオ」は、−ＳＲζ（式中、Ｒζは、任意選択的に置換することができるアルキルである）をいう。典型的なアルキルチオ基には、メチルチオ、エチルチオ、およびｎ−プロピルチオなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
「アルキルチオアルキル」は、アルキルチオ基（−ＳＲζ（式中、Ｒζは、任意選択的に置換することができるアルキルである））に置換されたアルキルをいう。
【０１１１】
「スルホニル」は、−ＳＯ２−をいう。置換スルホニルは、−ＳＯ２−Ｒη（式中、Ｒηはアルキル、アリール、または他の適切な置換基である）をいう。
【０１１２】
「アルキルスルホニル」は、−ＳＯ２−Ｒζ（式中、Ｒζは、任意選択的に置換することができるアルキルである）をいう。典型的なアルキルスルホニル基には、メチルスルホニル、エチルスルホニル、およびｎ−プロピルスルホニルが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１３】
「アルキルスルホニルアルキル」は、アルキルスルホニル基−ＳＯ２−Ｒζ（式中、Ｒζは、任意選択的に置換することができるアルキルである）に置換されたアルキルをいう。
【０１１４】
「ヘテロアリール」は、環内に１〜１０個の炭素原子（両端の数を含む）および１〜４個の酸素、窒素、および硫黄から選択されるヘテロ原子（両端の数を含む）を含む芳香族複素環基をいう。かかるヘテロアリール基は、単一の環（例えば、ピリジルまたはフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル）を有することができる。
【０１１５】
「ヘテロアリールアルキル」は、好ましくは、アルキル部分中に１〜６個の炭素原子（両端の数を含む）を有し、ヘテロアリール部分中に５〜１２個の環原子（両端の数を含む）を有する、ヘテロアリールに置換されたアルキル（すなわち、ヘテロアリール−アルキル基）をいう。かかるヘテロアリールアルキル基の例は、ピリジルメチルなどである。
【０１１６】
「ヘテロ環」、「複素環」、および、互換的に「ヘテロシクロアルキル」は、単環または複数の縮合環、環内に２〜１０個の炭素環原子（両端の数を含む）および１〜４個の窒素、硫黄、または酸素から選択されるヘテロ環原子（両端の数を含む）を有する飽和または不飽和の基をいう。かかる複素環基は、単一の環（例えば、ピペリジニルまたはテトラヒドロフリル）または複数の縮合した環（例えば、インドリニル、ジヒドロベンゾフラン、またはキヌクリジニル）を有することができる。ヘテロ環の例には、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、およびインドリンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１７】
「ヘテロシクロアルキルアルキル」は、好ましくは、アルキル部分中に１〜６個の炭素原子（両端の数を含む）を有し、ヘテロシクロアルキル部分中に３〜１２個の環原子（両端の数を含む）を有する、ヘテロシクロアルキルに置換されたアルキル（すなわち、ヘテロシクロアルキル−アルキル基）をいう。
【０１１８】
「員環」は、任意の環状構造を含むことを意味する。用語「員」の前の数字は、環を構成する骨格原子の数を示す。したがって、例えば、シクロヘキシル、ピリジン、ピラン、およびチオピランは６員環であり、シクロペンチル、ピロール、フラン、およびチオフェンは５員環である。
【０１１９】
本明細書で使用されるとき、「縮合二環」は、各環内に５〜８個の原子を有し、環は２個の共通の原子を有する、非置換または置換の炭素環および／または複素環部分の両方をいう。
【０１２０】
特段述べられない限り、前述の基における水素によって占められる位置を、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、メトキシ、エトキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメトキシ、ハロアルコキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ハロ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、トリフルオロメチル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、チオ、アルキルチオ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキサミド、置換カルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、置換スルホンアミド、シアノ、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシルアミノ、アミジノ、アミドキシモ（ａｍｉｄｏｘｉｍｏ）、ヒドロキサモイル、フェニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ピリジル、イミダゾリル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、ヘテロ環、（ヘテロ環）オキシ、および（ヘテロ環）アルキルによって例示されるが、これらに限定されない置換基でさらに置換することができ；好ましいヘテロ原子が酸素、窒素、および硫黄であることを意味する。開殻価電子（ｏｐｅｎ  ｖａｌｅｎｃｅ）がこれらの置換基上に存在する場合、開殻価電子をアルキル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、および／またはヘテロ環基にさらに置換することができ、これらの開殻価電子が炭素上に存在する場合、開殻価電子を、ハロゲンならびに酸素、窒素、または硫黄に結合した置換基にさらに置換することができ、複数のかかる開殻価電子が存在する場合、結合の直接形成または新規のヘテロ原子、好ましくは酸素、窒素、または硫黄への結合の形成のいずれかによってこれらの基を接合させて環を形成することができると理解される。水素の置換基への置き換えによって本発明の分子が許容できない不安定性を生じず、かつ他の点で化学的に妥当であるという条件で、上記置換を実施することができることがさらに理解される。
【０１２１】
本明細書中で使用する場合、「任意選択的な」および「任意選択的に」は、その後に記載される事象または状況が生じても生じなくてもよく、この記載には事象または状況が生じる場合および生じない場合が含まれることを意味する。当業者は、１つまたはそれを超える任意選択の置換基を含む任意の分子に関して、立体的に実用的および／または合成的に実行可能な化合物のみが含まれることを意味すると理解するであろう。「任意選択的に置換された」は、その後に来る１つの用語または一連の化学基の全てを修飾することをいう。例えば、用語「任意選択的に置換されたアリールアルキル」では、分子の「アルキル」部分および「アリール」部分を置換しても置換しなくてもよく、一連の用語「任意選択的に置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール」について、アルキル基、シクロアルキル基、アリール基、およびヘテロアリール基を、他の基から独立して、置換しても置換しなくてもよい。
【０１２２】
グリコシル化
グリコシル化は、天然生成物および合成生成物の多数の特性（安定性、薬力学、溶解度、および膜輸送が含まれる）を変化させることができる。多数の分子（抗菌性、抗腫瘍性、天然の甘味特性などを有する多数の二次代謝物が含まれる）は、β−グリコシド結合で改変された非リボソームペプチド、ポリケチド、またはテルペノイドの骨格を含む。植物Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉから抽出されたジテルペングリコシドの多くは、β結合グルコース分子を含む。天然には、これらの分子は、ＵＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ酵素を使用してｉｎ  ｖｉｖｏでグリコシル化される。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用する場合、ＵＤＰ−グルコースは、法外に高価であり、そして／または利用不能であり得る。本発明では、２つの異なる酵素クラスを使用してグルコース部分をα−グルコース−１−リン酸から試料基質（例えば、ステビオシド）に転移させて１つまたはそれを超えるβ−グルコース結合生成物を生成する新規の反応スキーム（図２を参照のこと）を提供する。いくつかの実施形態では、天然のステビオシドＵＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼは、α−グルコース−１−リン酸を使用してレバウジオシドＡを形成する活性を有することが示されている（図１を参照のこと）。いくつかのさらなる実施形態では、ラミナリビオースホスホリラーゼは、逆方向で作用して、α−グルコース−１−リン酸およびステビオシドからβ−グルコース結合ステビオシド化合物および無機ホスフェートを形成する。
【０１２３】
したがって、グリコシル化は、天然甘味料（香草Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉ由来の甘味料など）の生成で用いられる。前述の通り、この植物は、多くの他の強力な甘味料より優れた高強度の甘味および感覚特性を特徴とする多数のジテルペングリコシドを生成する。前述の甘味グリコシドは、共通のアグリコン（すなわち、ステビオール）を有し、Ｃ１３位およびＣ１９位の炭水化物残基の数およびタイプによって異なる。ステビオールグリコシドは、相互にその分子構造だけでなく、その味覚特性も異なる。通常、ステビオシドの甘さがスクロースより１１０〜２７０倍であることが報告されている一方で、レバウジオシドＡの甘さはスクロースの１５０倍と３２０倍との間であることが報告されており、レバウジオシドＣの甘さはスクロースの４０〜６０倍であることが報告されている。これらの共通の化合物のうちで、レバウジオシドＡは、収斂が最も低く、苦味が最も少なく、後味が最も長引かない。したがって、レバウジオシドＡは、主なステビオールグリコシドのうちで最も好ましい感覚特徴を有する。しかし、レバウジオシドＡは、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉから単離される総グリコシドの微量画分しか構成せず（２〜１０％）、他の化合物（ステビオシド（２〜１０％）およびレバウジオシドＣ（１〜２％）が含まれる）が残りを構成している。
【０１２４】
いくつかの基質のグリコシル化パターンを変化させることは、精製の単純化および／またはあまり望ましくない分子（例えば、ステビオシド）のより望ましい化合物（例えば、レバウジオシドＡ）への変換のいずれかにおいて使用される。いくつかの場合、化学合成法によってグリコシル化を達成する。しかし、これらの方法は、典型的には、望ましくない化学物質およびプロセスを有する複数の合成工程を必要とし、混合生成物（例えば、結合の位置が不正確であり、そして／または望ましくないアノマー配置を有する）を生じ得る。
【０１２５】
対照的に、グリコシル化酵素は、穏やかな条件下で活性であり得、単一の工程で高い位置選択性および立体特異性を付与することができる。多数の天然に誘導されたグリコシル化代謝産物を、種々の糖ヌクレオチドから糖部分を転移するグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）酵素を使用してｉｎ  ｖｉｖｏで生成する。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセスで使用する場合、これらの酵素が必要とする糖ヌクレオチドドナーは法外に高価であり得、大規模で利用できないかもしれない。したがって、より安価であり、そして／またはより都合の良い糖ドナーを使用してグリコシル化分子を生成することができる酵素が必要である。
【０１２６】
操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド
本発明は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ポリペプチドの調製方法、およびポリペプチドの使用方法を提供する。記述がポリペプチドに関する場合、本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも記載していると理解すべきである。
【０１２７】
上記の操作されたポリペプチドの改良された特性によってトランスフェラーゼ反応が行われる適切な反応条件を、以下および実施例にさらに記載するように、以下の濃度または量に関して決定することができる：ポリペプチド、基質、共基質、遷移金属、還元剤、緩衝液、共溶媒、ｐＨ、温度および反応時間を含む条件、および／または固体支持体上に固定したポリペプチドを使用した条件。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、特にステビオールグリコシドのさらにグリコシル化されたステビオールグリコシドへの変換において改良された特性を有するグリコシルトランスフェラーゼ活性を有する例示的な操作されたポリペプチドは、配列番号２、４、６、および／または８と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２９】
これらの他の残基の位置での残基の相違により、ポリペプチドがトランスフェラーゼ反応を実施する能力に悪影響を与えずにアミノ酸配列をさらに変動させることができる。いくつかの実施形態では、配列は、配列番号２、４、６および／または８と比較した場合に他のアミノ酸残基の位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、または１〜５０個の残基の相違を含む。いくつかの実施形態では、参照配列と比較したアミノ酸残基の相違の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個の残基の位置にあり得る。いくつかの実施形態では、参照配列と比較したアミノ酸残基の相違の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の残基の位置にあり得る。これらの他の位置での残基の相違は、保存的変化または非保存的変化であり得る。いくつかの実施形態では、残基の相違は、配列番号２、４、６および／または８の天然に存在するグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドと比較した場合に保存的置換および非保存的置換を含むことができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本発明はまた、操作されたグリコシルトランスフェラーゼの機能活性および／または改良された特性を保持する本明細書中に記載の任意の操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドのフラグメントを含む操作されたポリペプチドを提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、適切な反応条件下でトランスフェラーゼ反応が可能なポリペプチドフラグメントであって、このフラグメントが、本発明のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド（配列番号２、４、６および／または８の天然に存在するグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドなど）の全長アミノ酸配列の少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む、ポリペプチドフラグメントを提供する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、本明細書中に記載のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド（配列番号２、４、６および／または８の天然に存在するグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドなど）のうちのいずれか１つの欠失を含むアミノ酸配列を有することができる。
【０１３２】
したがって、本発明の操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの各実施形態およびあらゆる実施形態のために、アミノ酸配列は、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの１つまたはそれを超えるアミノ酸、２またはそれを超えるアミノ酸、３またはそれを超えるアミノ酸、４またはそれを超えるアミノ酸、５またはそれを超えるアミノ酸、６またはそれを超えるアミノ酸、８またはそれを超えるアミノ酸、１０またはそれを超えるアミノ酸、１５またはそれを超えるアミノ酸、または２０またはそれを超えるアミノ酸、総アミノ酸数の１０％まで、総アミノ酸数の１０％まで、総アミノ酸数の２０％まで、または総アミノ酸数の３０％までの欠失を含むことができ、本明細書中に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼの関連する機能活性および／または改良された特性が維持される。いくつかの実施形態では、欠失は、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、または１〜５０個のアミノ酸残基を含むことができる。いくつかの実施形態では、欠失数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸残基数であり得る。いくつかの実施形態では、欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸残基の欠失を含むことができる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本明細書中の操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、本明細書中に記載のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド（配列番号２、４、６および／または８の天然に存在するグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドなど）のうちのいずれか１つと比較した場合に挿入を含むアミノ酸配列を有することができる。したがって、本発明のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドのいくつかの実施形態、挿入は、１つまたはそれを超えるアミノ酸、２またはそれを超えるアミノ酸、３またはそれを超えるアミノ酸、４またはそれを超えるアミノ酸、５またはそれを超えるアミノ酸、６またはそれを超えるアミノ酸、８またはそれを超えるアミノ酸、１０またはそれを超えるアミノ酸、１５またはそれを超えるアミノ酸、２０またはそれを超えるアミノ酸、３０またはそれを超えるアミノ酸、４０またはそれを超えるアミノ酸、または５０またはそれを超えるアミノ酸を含むことができ、本明細書中に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼの関連する機能活性および／または改良された特性が維持される。挿入は、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端または内部に存在し得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、または１〜５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列数は、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
【０１３５】
上記の実施形態では、操作されたポリペプチドの適切な反応条件は、実施例に提供されている。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、操作されたポリペプチドが他のポリペプチド（制限されない例として、抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープ）、精製配列（例えば、金属への結合のためのＨｉｓタグ）、および細胞局在化シグナル（例えば、分泌シグナル）など）に融合した融合ポリペプチドである。したがって、本明細書中に記載の操作されたポリペプチドを、他のポリペプチドに融合するか融合せずに使用することができる。
【０１３７】
本明細書中に記載のポリペプチドが遺伝的にコードされたアミノ酸に制限されないと理解すべきである。遺伝的にコードされたアミノ酸に加えて、本明細書中に記載のポリペプチドは、その全体または一部が、天然に存在し、そして／または合成によるコードされないアミノ酸から構成され得る。本明細書中に記載のポリペプチドを構成することができる一定の一般的に認められる非コードアミノ酸には、以下が含まれるが、これらに限定されない：遺伝的にコードされたアミノ酸のＤ−ステレオマー；２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ−ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２−クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３−フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２−ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３−ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４−ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２−メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３−メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４−メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２−ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３−ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２−シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４−アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４−ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４−アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド−２−イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド−３−イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド−４−イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフト−１−イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフト−２−イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルアラニン（ｓｔｙｒｙｌｋａｌａｎｉｎｅ）（ｓＡｌａ）；アントリルアラニン（ａｕｔｈｒｙｌａｌａｎｉｎｅ）（ａＡｌａ）；３，３−ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３−アミノ−５−フェニルペンタン酸（３−ａｍｉｎｏ−５−ｐｈｅｎｙｐｅｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）−ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリジン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（ｈｏｍｏｇｌｕｔａｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ｈＧｌｕ）；１−アミノシクロペント−（２または３）−エン−４  カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）、アゼチジン−３−カルボン酸（ＡＣＡ）；１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸；アリルグリシン（ａＧｌｙ）；プロパルギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）、ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）。本明細書中に記載のポリペプチドを構成することができるさらなるコードされないアミノ酸は、当業者に明らかであろう（例えば、Ｆａｓｍａｎ，ＣＲＣ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ｐｐ．３−７０［１９８９］、および引用文献（その全てが本明細書中で参照によって組み込まれる）に記載の種々のアミノ酸を参照のこと）。これらのアミノ酸は、Ｌ立体配置またはＤ立体配置のいずれかであり得る。
【０１３８】
当業者は、側鎖保護基を保有するアミノ酸または残基が本明細書中に記載のポリペプチドを構成することもできると認識するであろう。この場合に芳香族カテゴリーに属するかかる保護されたアミノ酸の非限定的な例には、以下が含まれるが、これらに限定されない（カッコ内に保護基を列挙する）：Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ−ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ−δ−キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ−ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ−ベンジル）、およびＴｙｒ（Ｏ−ベンジル）。
【０１３９】
本明細書中に記載のポリペプチドを構成することができるコンフォメーションが拘束された非コードアミノ酸には、Ｎ−メチルアミノ酸（Ｌ−立体配置）；１−アミノシクロペント−（２または３）−エン−４−カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン−３−カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、例えば、実質的に精製された酵素としての単離された調製物、酵素をコードする遺伝子を使用して形質転換されたホールセル、ならびに／またはかかる細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解物などの種々の形態である。酵素は、以下でさらに考察するように、凍結乾燥形態、噴霧乾燥形態、沈殿形態、または粗ペースト形態であり得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドを、固体支持体（膜、樹脂、固体キャリア、または他の固相材料など）上に提供する。固体支持体は、有機ポリマー（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミドなど）、ならびにそのコポリマーおよびグラフトから構成され得る。固体支持体は、ガラス、シリカ、孔制御ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金属（金または白金など）などの無機固体支持体でもあり得る。固体支持体の構成は、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、膜、または面の形態であり得る。面は、平面、実質的平面、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であってよく、膨潤性または非膨潤性であり得る。固体支持体を、ウェル、窪み、または他の容器、管の形態、特徴、または位置で構成することができる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本発明のグリコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを、このポリペプチドが配列番号２、４、６および／または８の参照のポリペプチドと比較した場合に改良された活性、立体選択性、および／または他の改良された特性を保持するように固体支持体上に固定することができる。かかる実施形態では、固定されたポリペプチドは、基質化合物の生成物への生体触媒変換を容易にすることができ、反応完了後に容易に保持され（例えば、ポリペプチドが固定されたビーズの保持による）、次いで、その後の反応で再利用またはリサイクルされる。かかる酵素の固定化プロセスによりさらに効率が上がり、経費が抑えられる。したがって、本発明のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの任意の使用方法を、固体支持体に結合または固定された同一のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを使用して実施することができることがさらに意図される。
【０１４３】
酵素の固定方法は、当該分野で周知である。操作されたポリペプチドを、非共有結合または共有結合することができる。固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）への酵素の種々のコンジュゲーションおよび固定方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｙｉら，Ｐｒｏｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４２（５）：８９５−８９８［２００７］；Ｍａｒｔｉｎら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７６（４）：８４３−８５１［２００７］；Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，６３：３９−４４［２０１０］；Ｔｒｕｐｐｏら，Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｏｐ２００１５７ｃ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍ［２００８］；Ｍａｔｅｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１８（３）：６２９−３４［２００２］；およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｉｅｍｅｙｅｒ（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ［２００４］（それぞれの開示は、本明細書中で参照によって組み込まれる）を参照のこと）。本発明の操作されたグリコシルトランスフェラーゼの固定に有用な固体支持体には、エポキシド官能基を有するポリメタクリラート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリラート、スチレン／ＤＶＢコポリマー、またはオクタデシル官能基を有するポリメタクリラートを含むビーズまたは樹脂が含まれるが、これらに限定されない。本発明の操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの固定に有用な固体支持体の例には、キトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃ、およびＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）（以下の異なるタイプのＳＥＰＡＢＥＡＤが含まれる：ＥＣ−ＥＰ、ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９、およびＥＸＥ１２０）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のポリペプチドを、キットの形態で提供される。キット中の酵素は、個別に存在し得るか、複数の酵素として存在し得る。キットは、酵素反応を行うための試薬、酵素活性を評価するための基質、および生成物を検出するための試薬をさらに含むことができる。キットはまた、試薬用ディスペンサーおよびキットの使用説明書を含むことができる。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本発明のキットは、異なるアドレス可能位置に複数の異なるグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを含むアレイを含み、異なるポリペプチドが、それぞれが少なくとも１つの異なる改良された酵素の特性を有する参照配列の異なるバリアントである。いくつかの実施形態では、固体支持体上に固定した複数のポリペプチドは、ロボットによる試薬送達のためにアドレス可能であるか、検出方法および／または検出装置によってアレイの種々の位置に構成される。アレイを使用して、ポリペプチドによる変換について種々の基質化合物を試験することができる。複数の操作されたポリペプチドを含むかかるアレイおよびその使用方法は当該分野で公知である（例えば、ＷＯ２００９／００８９０８Ａ２号を参照のこと）。
【０１４６】
操作されたグリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドを、遺伝子発現を調節する１つまたはそれを超える異種制御配列に作動可能に連結してポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作製することができる。操作されたグリコシルトランスフェラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応するグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを発現させる。
【０１４７】
当業者に明らかなように、タンパク質配列の利用可能性および種々のアミノ酸に対応するコドンの知識により、対象ポリペプチドをコードすることができる全てのポリヌクレオチドが説明される。同一のアミノ酸が代替コドンまたは同義語コドンによってコードされる遺伝暗号の縮重により、非常に多数の核酸を作製することが可能であり、その核酸の全てが改良されたグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする。したがって、特定のアミノ酸配列の知識を有することにより、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変えない方法で１つまたはそれを超えるコドンの配列を改変するだけでいくつもの異なる核酸を作製することができる。これに関して、本発明は、可能なコドンの選択に基づいた組み合わせの選択による本明細書中に記載のポリペプチドをコードする作製可能なポリヌクレオチドのそれぞれおよびあらゆる可能なバリエーションを具体的に意図し、全てのかかるバリエーションは、本明細書中に記載の任意のポリペプチド（本明細書中で参照によって組み込まれた配列表に配列番号１〜３２のうち偶数番号の配列として開示したアミノ酸配列が含まれる）について具体的に開示されると見なされるものとする。
【０１４８】
種々の実施形態では、タンパク質が生成される宿主細胞に適合するようにコドンを選択することが好ましい。例えば、細菌中で遺伝子を発現するために細菌中で使用される好ましいコドンを使用し；酵母中での発現のために酵母中で使用される好ましいコドンを使用し；哺乳動物細胞中での発現のために哺乳動物中で使用される好ましいコドンを使用する。いくつかの実施形態では、天然の配列が好ましいコドンを含み、好ましいコドンの使用が全てのアミノ酸残基に必要でないかもしれないので、全てのコドンがグリコシルトランスフェラーゼのコドン使用頻度を最適化するために置換される必要はない。したがって、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、全長コード領域のコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を超える位置で好ましいコドンを含み得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、および／または８によって示される天然に存在するグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドアミノ酸配列をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜３２中の偶数番号の配列をコードするコドン最適化された核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を含む核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜３２中の奇数番号の配列におけるコドン最適化された核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を含む核酸配列を有する。配列番号１〜３２中の奇数番号の配列のコドン最適化された配列は、コードされた野生型グリコシルトランスフェラーゼの発現を増強し、それにより、本明細書中に記載のトランスフェラーゼ活性を有し得る酵素が調製される。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたポリヌクレオチド配列は、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｓｉｓｔｏｍｙｃｉｆｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、および／またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＹＭ１由来の天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して少なくとも１．２倍、１．５倍、または２倍、またはそれを超えてグリコシルトランスフェラーゼの発現を増強する。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１〜３２の奇数番号の配列から選択される参照配列またはその相補物とハイブリッド形成することができ、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、上記のように、ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６および／または８と比較した場合に改良された特性を有するグリコシルトランスフェラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは、参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性、および配列番号１〜３２のうち偶数番号から選択される配列と比較した場合に１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、参照配列は配列番号１〜３２中の偶数番号の配列から選択される。いくつかの実施形態では、参照配列は配列番号２である。いくつかの実施形態では、参照配列は配列番号４である。いくつかの実施形態では、参照配列は配列番号８である。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６および／または８と比較した場合に改良された特性を有する本明細書で提供されるトランスフェラーゼ反応が可能なグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは、配列番号２、４、６および／または８の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、および配列番号２、４、６および／または８と比較した場合に１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６および／または８と比較した場合に改良された特性を有する本明細書で提供されるトランスフェラーゼ反応が可能なグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは、配列番号２、４、６および／または８の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、および配列番号２、４、６および／または８と比較した場合に１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６および／または８と比較した場合に改良された特性を有する本明細書で提供されるトランスフェラーゼ反応が可能なグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは、配列番号２、４、６および／または８の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、および配列番号２、４、６および／または８と比較した場合に１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１〜３２の奇数番号の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、高ストリンジェント条件下で配列番号１〜３２中の奇数番号の配列から選択される基準ポリヌクレオチド配列またはその相補物とハイブリッド形成することができ、本明細書中に記載の改良された特性のうちの１つまたはそれより多くを有するグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、高ストリンジェント条件下でハイブリッド形成することができるポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、および／または８と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２、４、６、および／または８と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を有するグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする。
【０１５７】
本明細書で提供される操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発現させる種々の方法で操作する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を制御するための１つまたはそれを超える調節配列が存在する発現ベクターとして提供する。発現ベクターに応じて単離されたポリヌクレオチドをベクターへの挿入前に操作することが望ましいか必要かもしれない。組換えＤＮＡ法を利用したポリヌクレオチドおよび核酸配列の改変技術は、当該分野で周知である。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、調節配列には、他の配列の中でも、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが含まれる。当該技術分野で公知のように、適切なプロモーターを、使用する宿主細胞に基づいて選択することができる。細菌宿主細胞のために、本出願の核酸構築物の転写の指示に適切なプロモーターには、これらに限定されないが、大腸菌ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、および原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子（例えば、Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１［１９７８］を参照のこと）から得たプロモーター、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５［１９８３］を参照のこと）が含まれる。糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターには、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（例えば、ＷＯ９６／００７８７号を参照のこと）の遺伝子から得たプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、その変異プロモーター、短縮プロモーター、およびハイブリッドプロモーターが含まれる。例示的な酵母細胞プロモーターは、任意の適切な供給源に由来し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａ��ｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子を含む。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは当該分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８［１９９２］を参照のこと）。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、調節配列は、適切な転写終結配列（転写を終結させるために宿主細胞によって認識される配列）である。終結配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞で機能する任意のターミネーターを、本発明で有用である。例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのα−グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターを、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロム  Ｃ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための種々の他の有用なターミネーターは、当該分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら，前出を参照のこと）。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、調節配列は、適切なリーダー配列（宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞で機能する任意のリーダー配列を使用することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得る。酵母宿主細胞に適切なリーダーは、これらに限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られるものが挙げられる。
【０１６１】
調節配列はまた、ポリアデニル化配列（核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写時に転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞によって認識される配列）であり得る。最適な宿主細胞で機能する任意のポリアデニル化配列を、本発明で使用することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列として、これらに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  α−グルコシダーゼの遺伝子に由来するものが挙げられる。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、当該分野で公知である（例えば、Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．，１５：５９８３−５９９０［１９９５］を参照のこと）。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結したアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に方向づけるシグナルペプチドコード領域である。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと共に翻訳読み枠中に天然に連結したシグナルペプチドコード領域を固有に含むことができる。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来のシグナルペプチドコード領域を含むことができる。発現されたポリペプチドを最適な宿主細胞の分泌経路に方向づける任意のシグナルペプチドコード領域は、本明細書で提供される操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの発現に有用である。細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域として、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣｌＢ  １１８３７マルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  α−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  β−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡの遺伝子から得たシグナルペプチドコード領域が挙げられる。さらなるシグナルペプチドは、当該分野で公知である（例えば、Ｓｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５７：１０９−１３７［１９９３］を参照のこと）。糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域として、これらに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得たシグナルペプチドコード領域が挙げられる。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドとして、これらに限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子に由来するものが挙げられる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に配置されたアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域である。得られたポリペプチドは、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」またはいくつかの場合「酵素原」と称される。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的切断または自己触媒的切断によって活性な成熟ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域として、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子由来のものが挙げられる（例えば、ＷＯ９５／３３８３６号を参照のこと）。シグナルペプチド領域およびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端に隣接し、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端に隣接する。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、制御配列も使用される。これらの配列は、宿主細胞の成長に関連するポリペプチドの発現の制御を促進する。制御系の例は、化学的刺激または物理的刺激（制御化合物の存在が含まれる）に応答して遺伝子発現をオンまたはオフにする制御系である。原核生物宿主細胞では、適切な制御配列には、これらに限定されないが、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐのオペレーター系が含まれる。酵母宿主細胞では、適切な制御系には、これらに限定されないが、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が含まれる。糸状菌では、適切な制御配列には、これらに限定されないが、ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが含まれる。
【０１６５】
別の態様では、本発明はまた、操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および導入される宿主のタイプに応じて１つまたはそれを超える発現制御領域（プロモーターおよびターミネーターなど）、複製起点などを含む組換え発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、上記の種々の核酸および調節配列を共に接合して組換え発現ベクターを産生し、この組換え発現ベクターは、１つまたはそれを超える都合の良い制限部位を含み、この制限部位は、かかる部位でのバリアントグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換が可能である。あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列を、ポリヌクレオチド配列または該ポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物を発現に適切なベクター内に挿入することによって発現する。発現ベクターの作製では、コード配列が発現に適切な調節配列と作動可能に連結されるようにコード配列をベクター中に配置する。
【０１６６】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に都合よく供することができ、且つバリアントグリコシルトランスフェラーゼポリヌクレオチド配列を発現することができる任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターとベクターを導入すべき宿主細胞との適合性に依存するであろう。ベクターは、線状プラスミドまたは閉じた環状プラスミドであり得る。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、自己複製ベクター（すなわち、染色体外実体として存在するベクターであり、その複製は染色体複製、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体から独立している）である。ベクターは、自己複製を保証する任意の手段を含むことができる。いくつかの代替的な実施形態では、、ベクターは、宿主細胞に導入された場合にゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と共に複製されるベクターであり得る。さらに、単一のベクターまたはプラスミドまたは宿主細胞のゲノムに導入されるべきＤＮＡの全てを共に含む２つまたはそれを超えるベクターまたはプラスミド、またはトランスポゾンを使用することができる。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、形質転換した細胞を容易に選択することができる１つまたはそれを超える選択マーカーを含むことが好ましい。選択マーカーは、その産物が殺生物剤耐性またはウイルス耐性、重金属耐性、および栄養素要求体に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。細菌選択マーカーの例として、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、あるいは、抗生物質耐性（アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリンへの耐性など）を付与するマーカーが挙げられる。酵母宿主細胞に適切なマーカーには、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３が含まれるが、これらに限定されない。糸状菌宿主細胞で用いる選択マーカーには、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにその等価物が含まれるが、これらに限定されない。別の態様では、本発明は、本出願の少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、このポリヌクレオチドが宿主細胞中で操作されたグリコシルトランスフェラーゼ酵素の発現のための１つまたはそれを超える調節配列に作動可能に連結されている、宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによってコードされたポリペプチドの発現で用いる宿主細胞は、当該分野で周知であり、細菌細胞（大腸菌細胞、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞など）；真菌細胞（酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞［ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８］）など）；昆虫細胞（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞など）；動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞など）；および植物細胞が含まれるが、これらに限定されない。例示的な宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株（例えば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１）である。
【０１６９】
したがって、別の態様では、本発明は、操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを生成する方法であって、ポリペプチドの発現に適切な条件下で操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書中に記載のように、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを単離および／または精製する工程をさらに含む。
【０１７０】
上記宿主細胞の適切な培養培地および成長条件は当該分野で周知である。グリコシルトランスフェラーゼポリヌクレオチド発現のためのポリヌクレオチドを、当該分野で公知の種々の方法によって細胞に導入することができる。技術には、とりわけ、エレクトロポレーション、遺伝子銃粒子衝突、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が含まれる。
【０１７１】
本明細書中に開示の特性を有する操作されたグリコシルトランスフェラーゼを、天然に存在するか操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当該分野で公知であり、且つ本明細書中に記載の変異誘発法および／または定向進化法（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）に供することによって得ることができる。例示的な定向進化技術は、変異誘発および／またはＤＮＡシャフリングである（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１［１９９４］；ＷＯ９５／２２６２５号；ＷＯ９７／００７８号；ＷＯ９７／３５９６６号；ＷＯ９８／２７２３０号；ＷＯ００／４２６５１号；ＷＯ０１／７５７６７号、および米国特許第６，５３７，７４６号を参照のこと）。使用することができる他の定向進化手順には、とりわけ、付着伸長プロセス（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳｔＥＰ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え（例えば、Ｚｈａｏら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：２５８−２６１［１９９８］を参照のこと）、変異誘発ＰＣＲ（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，３：Ｓ１３６−Ｓ１４０［１９９４］を参照のこと）、およびカセット式変異誘発（例えば、Ｂｌａｃｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：３５２５−３５２９［１９９６］を参照のこと）が含まれる。
【０１７２】
例えば、変異誘発法および定向進化法を、発現、スクリーニング、およびアッセイが可能なバリアントライブラリーを生成するために、ポリヌクレオチドに容易に適用することができる。変異誘発法および定向進化法は当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８３０，７２１号、同第６，１３２，９７０号、同第６，４２０，１７５号、同第６，２７７，６３８号、同第６，３６５，４０８号、同第６，６０２，９８６号、同第７，２８８，３７５号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２９７，０５３号、同第６，５７６，４６７号、同第６，４４４，４６８号、同第５，８１１２３８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２９１，２４２号、同第６，９９５，０１７号、同第６，３９５，５４７号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５０６，６０３号、同第６，４１３，７７４号、同第６，５７３，０９８号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３７２，４９７号、同第７，８６８，１３８号、同第５，８３４，２５２号、同第５，９２８，９０５号、同第６，４８９，１４６号、同第６，０９６，５４８号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３５８，７４２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，３３５，１６０号、同第６，６５３，０７２号、同第６，３５５，４８４号、同第６，３０３，３４４号、同第６，３１９，７１３号、同第６，６１３，５１４号、同第６，４５５，２５３号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，４０６，８５５号、同第６，９４６，２９６号、同第７，５３４，５６４号、同第７，７７６，５９８号、同第５，８３７，４５８号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３０９，８８３号、同第７，１０５，２９７号、同第７，７９５，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，２５１，６７４号、同第６，７１６，６３１号、同第６，５２８，３１１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３７９，９６４号、同第７，１４８，０５４号、同第７，６２９，１７０号、同第７，６２０，５００号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３５８，７４０号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４３６，６７５号、同第６，９６１，６６４号、同第６，５３７，７４６号、同第７，４３０，４７７号、同第７，８７３，４９９号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第６，３７６，２４６号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４７９，６５２号、同第６，３１９，７１４号、同第６，５２１，４５３号、同第６，３６８，８６１号、同第７，４２１，３４７号、同第７，０５８，５１５号、同第７，０２４，３１２号、同第７，６２０，５０２号、同第７，８５３，４１０号、同第７，９５７，９１２号、同第７，９０４，２４９号、同第８，３８３，３４６号、同第８，５０４，４９８号、同第８，７６８，８７１号、同第８，７６２，０６６号、同第８，８４９，５７５号および全ての関連非米国対応出願；Ｌｉｎｇら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５４：１５７−７８［１９９７］；Ｄａｌｅら、Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５７：３６９−７４［１９９６］；Ｓｍｉｔｈ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １９：４２３−４６２［１９８５］；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２９：１１９３−１２０１［１９８５］；  Ｃａｒｔｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ２３７：１−７［１９８６］；Ｋｒａｍｅｒら、Ｃｅｌｌ，  ３８：８７９−８８７  ［１９８４］；  Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ，  ３４：３１５−３２３［１９８５］；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら、  Ｃｕｒｒ．    Ｏｐ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ３：２８４−２９０［１９９９］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １７：２５９−２６４［１９９９］；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１：２８８−２９１［１９９８］；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １５：４３６−４３８［１９９７］；Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．    Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９４：４５０４−４５０９［１９９７］；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １４：３１５−３１９［１９９６］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３７０：３８９−３９１［１９９４］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９１：１０７４７−１０７５１［１９９４］；ＷＯ  ９５／２２６２５；ＷＯ  ９７／００７８；ＷＯ  ９７／３５９６６；ＷＯ  ９８／２７２３０；ＷＯ  ００／４２６５１；ＷＯ  ０１／７５７６７；ＷＯ  ２００９／１５２３３６、ＷＯ  ２００９／１０２９０１、ＷＯ  ２００９／１０２８９９、ＷＯ  ２０１１／０３５１０５、ＷＯ  ２０１３／１３８３３９、ＷＯ  ２０１３／００３２９０、ＷＯ  ２０１４／１２０８１９、ＷＯ  ２０１４／１２０８２１、ＷＯ  ２０１５／０１３４３１５、およびＷＯ  ２０１５／０４８５７３を参照のこと（その全てが、本明細書中で参照によって組み込まれる））。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、変異誘発処理後に得られた酵素クローンを、酵素を規定の温度（または広範な基質にわたる酵素活性の試験などの他のアッセイ条件）に供し、熱処理または他のアッセイ条件後の酵素活性の残存量を測定することによってスクリーニングする。次に、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むクローンを配列決定してヌクレオチド配列の変化（存在する場合）を同定し、これを使用して宿主細胞中で酵素を発現させる。発現ライブラリー由来の酵素活性の測定を、当該技術分野において公知の任意の適切な方法（例えば、標準的な生化学技術（ＨＰＬＣ分析など））を使用して行うことができる。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、変異誘発処理後に得られたクローンを、１つまたはそれを超える望ましい改良された酵素特性（例えば、改良されたトランスフェラーゼ活性）を有する操作されたグリコシルトランスフェラーゼについてスクリーニングすることができる。発現ライブラリー由来の酵素活性の測定を、当該技術分野で知られるように、標準的な生化学技術（ＨＰＬＣ分析、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析および／または生成物の誘導体化（分離前または分離後）（例えば、ダンシルクロリドまたはＯＰＡを使用；例えば、Ｙａｅｇａｋｉら、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  ３５６（１）：１６３−７０［１９８６］を参照のこと）など）を使用して行うことができる。
【０１７５】
既知の配列の操作されたポリペプチドについて、酵素をコードするポリヌクレオチドを、公知の合成方法にしたがった標準的な固相法によって調製することができる。いくつかの実施形態では、約１００塩基までのフラグメントを、個別に合成し、次いで、接合して（例えば、酵素的もしくは化学的なライゲーション（ｌｉｔｉｇａｔｉｏｎ）法、またはポリメラーゼ媒介法による）、任意の所望の連続配列を形成することができる。例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを、自動化合成法で典型的に実施される古典的なホスホルアミダイト法（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−６９［１９８１］；およびＭａｔｔｈｅｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，３：８０１−０５［１９８４］を参照のこと）を使用した化学合成によって調製することができる。ホスホルアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドを（例えば、自動ＤＮＡ合成機で）合成し、精製し、アニーリングし、適切なベクター中にライゲーションし、クローニングする。
【０１７６】
操作されたポリペプチドの配列が既知の場合、酵素をコードするポリヌクレオチドを、公知の合成方法にしたがった標準的な固相法によって調製することができる。いくつかの実施形態では、約１００塩基までのフラグメントを、個別に合成し、次いで、接合して（例えば、酵素的もしくは化学的なライゲーション（ｌｉｔｉｇａｔｉｏｎ）法、またはポリメラーゼ媒介法による）、任意の所望の連続配列を形成することができる。例えば、グリコシルトランスフェラーゼの一部をコードするポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを、自動化合成法で典型的に実施されるように、当該技術分野で知られる通りに（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−６９［１９８１］の古典的なホスホルアミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，３：８０１−０５［１９８４］によって記載される方法）を使用した化学合成によって調製することができる。ホスホルアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドを、（例えば、自動ＤＮＡ合成機で）合成し、精製し、アニーリングし、適切なベクター中にライゲーションし、クローニングする。さらに、本質的に任意の核酸を、種々の販売者のうちのいずれかから得ることができる。いくつかの実施形態では、さらなるバリエーションを、欠失、挿入、および／または置換を含むオリゴヌクレオチドを合成し、種々の順序でオリゴヌクレオチドを組み合わせて特性が改良された操作されたグリコシルトランスフェラーゼを作製することによって作製することができる。  
【０１７７】
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチドを調製する方法は、（ａ）配列番号２、４、６、および／または８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２、４、６、および／または８と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成する工程；および（ｂ）前述のポリヌクレオチドによってコードされるグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを発現させる工程を含む。
【０１７８】
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチドを調製する方法は、（ａ）配列番号２、４、６、および／または８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２、４、６、および／または８と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成する工程；および（ｂ）前述のポリヌクレオチドによってコードされるグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを発現させる工程を含む。
【０１７９】
方法のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、任意選択的に１つまたは数個の（例えば、３、４、５まで、または１０までの）アミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する操作されたグリコシルトランスフェラーゼをコードする。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、または１〜５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、宿主細胞で発現された任意の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ酵素は、タンパク質精製のための周知の技術（とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心、およびクロマトグラフィが含まれる）のうちの任意の１つまたは複数を使用して細胞および／または培養培地から回収することができる。大腸菌などの細菌の溶解および高効率のタンパク質抽出に適切な溶液は、市販されている（例えば、ＣｅｌＬｙｔｉｃ  ＢＴＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）。
【０１８１】
グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィ技術には、とりわけ、逆相クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、およびアフィニティクロマトグラフィが含まれる。特定の酵素の精製条件は、その一部が、正味荷電、疎水性、親水性、分子量、分子の形状などの要因に依存し、その条件は当業者に明らかであろう。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、親和性技術を使用して、改良されたグリコシルトランスフェラーゼ酵素を単離することができる。アフィニティクロマトグラフィ精製のために、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用することができる。抗体生成のために、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどが含まれるが、これらに限定されない）を、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはそのフラグメントを使用した注射によって免疫化することができる。グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはフラグメントを、側鎖官能基または側鎖官能基に取り付けたリンカーによって適切なキャリア（ＢＳＡなど）に取り付けることができる。いくつかの実施形態では、親和性精製は、グリコシルトランスフェラーゼによって結合した特異的リガンド（ポリ（Ｌ−プロリン）など）または色素アフィニティカラム（例えば、欧州特許第０６４１８６２号；およびＳｔｅｌｌｗａｇｅｎ，“Ｄｙｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，”Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｕｎｉｔ  ９．２−９．２．１６［２００１］を参照のこと）を使用することができる。
【０１８３】
目的のβ−グリコシル化化合物に対してグリコシルトランスフェラーゼを使用する方法
いくつかの実施形態では、本明細書中に提供した方法、プロセス、および系は、基質のβ−グリコシル化生成物への変換を容易にする。いくつかの実施形態では、基質ステビオシドを、β−グリコシル化生成物であるレバウジオシドＡに変換する。いくつかの実施形態では、このグリコシル化反応を、酵素によって触媒する。いくつかの実施形態では、酵素がグリコシルトランスフェラーゼである一方で、いくつかの代替的な実施形態では、酵素はホスホリラーゼである。いくつかのさらなる実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼまたはホスホリラーゼは、グルコシルドナーとしてグルコース−１−リン酸（例えば、α−グルコース−１−リン酸）を使用する。いくつかのさらなる実施形態では、基質の特定の部分（例えば、ヒドロキシル基）は、グリコシル（例えば、グルコシル）アクセプターとして作用する。本発明で使用されるグリコシルトランスフェラーゼのいくつかの非限定的な例には、乱雑な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）細菌ＵＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、配列番号４、６、または１２のグリコシルトランスフェラーゼ）およびα−グルコース−１−リン酸を生成するためのβ−グリコシル切断活性を保有するホスホリラーゼ（例えば、配列番号８または１４などのラミナリビオースホスホリラーゼ）が含まれる。いくつかの実施形態では、酵素はｉｎ  ｖｉｔｒｏで基質と接触する一方で、いくつかの代替的な実施形態では、酵素はｉｎ  ｖｉｖｏで基質と接触する。なおいくつかのさらなる実施形態では、基質および酵素を生成し、操作された宿主細胞内で接触させる。
【０１８４】
当業者は、ポリペプチドが変換する適切な反応条件を決定することができる。実施例は、例示的な反応条件（ポリペプチドの濃度または量、基質、補基質（例えば、グルコース−１−リン酸）、緩衝液、共溶媒、ｐＨ、温度、および反応時間が含まれる）を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、５ｍＭまでの基質濃度または溶解限度の基質、５ｍＭまでの補基質、または溶解限度の補基質を使用して、０〜２０％エタノールを含む２５〜１００ｍＭ緩衝液（ｐＨ５〜８）中にて３０〜６５℃で５分間〜１８時間反応させる。いくつかの実施形態では、より安価な様式での反応の実行に有用な、ｉｎ  ｓｉｔｕでグルコース−１−リン酸を再生するための補酵素および第２の補基質を使用してさらに反応を実行させることができる。例えば、補酵素は、保持型ホスホリラーゼ（スクロースホスホリラーゼ（例えば、偶数番号の配列番号１６〜３２）など）であり得、さらなる補基質は、適切なα結合したジサッカリド、トリサッカリド、またはオリゴサッカリド酵素基質（スクロースなど）であり得る。補酵素は反転型ホスホリラーゼ（セロビオースホスホリラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．１．２０）など）であり得、さらなる補基質は、適切なβ結合したジサッカリド、トリサッカリド、またはオリゴサッカリド酵素基質（セロビオースなど）であり得る。しかし、本発明が実施例に記載の特定の反応および条件に制限されることを意図しない。本発明の種々の特徴および実施形態を以下の代表例で例示しているが、この代表例は例示を意図し、本発明を制限することを意図しない。
【０１８５】
実験
以下の実施例（達成された実験および結果が含まれる）を、例示のみを目的として提供し、この実施例は、本発明を制限すると解釈されない。
【０１８６】
以下に開示の実験では、以下の略語を適用する：Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時間）；Ｕ（ユニット）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ｐｓｉおよびＰＳＩ（ポンド／平方インチ）；℃（摂氏）；ＲＴおよびｒｔ（室温）；ＣＡＭおよびｃａｍ（クロラムフェニコール）；ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシンＢ）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）；ＵＧＴ（ウリジン５’−ジホスホグルコースグリコシルトランスフェラーゼ）；ＧＤＨ（グルコースデヒドロゲナーゼ）；ＦＤＨ（ギ酸デヒドロゲナーゼ）；ＬＢ（Ｌｕｒｉａブロス）；ＴＢ（ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス）；ＳＦＰ（振盪フラスコ粉末）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；大腸菌Ｗ３１１０（一般的に使用される研究用大腸菌株，ｔｈｅ  Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴから利用可能）；ＨＴＰ（高処理）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）；ＭＳ（質量分析）；ＦＩＯＰＣ（ポジティブコントロールに対する改良の倍数）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，  Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，  ＭＡ）；ＣｈｒｏｍａＤｅｘ（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ，  Ｉｎｃ．，  Ｉｒｖｉｎｅ，  ＣＡ）；およびＴｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ，  Ｈｏｌｌａｎｄ，  ＭＩ）。
【実施例】
【０１８７】
実施例１
グルコシル化活性を有するＵＧＴ酵素の合成、最適化、およびアッセイ
この実施例では、グルコシル化活性を有するＵＧＴ酵素の合成、最適化、およびアッセイで使用する方法を記載する。
【０１８８】
遺伝子の合成および最適化：
ステビオールビオシドをレバウジオシドＢにグルコシル化し、ステビオシドをレバウジオシドＡにグルコシル化することが報告されている野生型Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａポリペプチド（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１）を、配列番号９の遺伝子としてコドン最適化し、合成した。野生型Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｓｉｓｔｏｍｙｃｉｆｉｃｕｓグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド（配列番号４）をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号３）は、オレアンドマイシンをグリコシル化し、他のヌクレオチド糖ドナーとの、および他の基質への乱雑な活性を有することが報告されている野生型Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓオレアンドマイシングリコシルトランスフェラーゼ（配列番号５）配列のホモログ（８２％配列同一性を有する）であり、このポリヌクレオチド配列を同様にコドン最適化し、合成した（配列番号１１）。これらの合成遺伝子（配列番号９および１１）を、ｐＣＫ１１０９００ベクター系に個別にクローン化し（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１９５９４７号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）、その後に大腸菌Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）内で発現させた。大腸菌Ｗ３１１０株に、ｌａｃプロモーターの調節下でＵＧＴ酵素を発現させた。
【０１８９】
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）の生成：
振盪フラスコ手順を使用して、本明細書に記載の生体触媒プロセスにおいて使用される特徴付けアッセイのためにグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を生成した。酵素の振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）調製により、ＨＴＰアッセイで使用した細胞溶解物と比較した場合に、より精製された酵素の調製物（例えば、総タンパク質の３０％まで）が得られ、また、より濃縮した酵素溶液の使用が可能である。目的の操作されたポリペプチドをコードするプラスミドを含む大腸菌の単一コロニーを、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１％グルコースを含む５ｍＬ  Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉブロスに播種した。細胞を、２５０ｒｐｍで振盪したインキュベーター中にて３０℃で一晩（少なくとも１６時間）成長させた。培養物を、１Ｌフラスコ中にて３０μｇ／ｍｌ  ＣＡＭを含む２５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（１２ｇ／Ｌバクト−トリプトン、２４ｇ／Ｌ酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌグリセロール、６５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４）で６００ｎｍ（ＯＤ６００）の光学密度０．２に希釈し、３０℃で成長させた。培養物のＯＤ６００が０．６〜０．８である場合に最終濃度１ｍＭまでのＩＰＴＧの添加によってグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を誘導した。次いで、インキュベーションを一晩（少なくとも１６時間）継続した。細胞を、遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）によって回収し、上清を破棄した。細胞ペレットを、２体積の２５ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁し、標準的な大腸菌の溶解設定を使用し、４℃に維持したＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ（登録商標）高圧ホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）に通した。細胞デブリを遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、４５分間、４℃）によって除去した。清澄化されたライセート上清を回収し、−８０℃で凍結し、次いで、凍結乾燥させて粗ポリペプチドの乾燥振盪フラスコ粉末を生成した。
【０１９０】
ステビオシドグルコシル化についてのＳＦＰのアッセイ：
ＳＦＰを再構成して２０ｇ／Ｌ粉末を得た。次いで、５０μＬのこれらのストックを、３ｍＭ  ＭｇＳＯ４および１ｍＭステビオシド（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ、純度９４％超）を含み、且つ５ｍＭ  α−グルコース−１−リン酸を含むかまたは含まない、総反応体積が２００μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈した。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎタイタープレートシェーカー中、３００ＲＰＭで振盪させながら３０℃で１６〜１８時間反応させた。
【０１９１】
ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
上記の反応を、２％ギ酸を含む０．５体積／体積アセトニトリルでクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化ステビオシド生成物を、以下に示す装置およびパラメーターを使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって検出した：
【表Ｃ】
2019517807.tif 000005
【０１９２】
配列番号９および１１によってコードされるポリペプチドについて新規の活性が検出された。配列番号９によってコードされるグルコシルトランスフェラーゼポリペプチドについて、２つの生成物が検出され、一方は、レバウジオシドＡと同時溶離し、もう一方は２．２２分で溶離した。これらの生成物は、α−グルコース−１−リン酸の存在下で検出されたが、α−グルコース−１−リン酸の非存在下では検出されなかった。これらの生成物は、ネガティブコントロール試料中に存在しなかった。配列番号１１によってコードされるグルコシルトランスフェラーゼポリペプチドについて、保持時間１．７６分および２．１８分で２つの生成物が検出された。これらの生成物は、α−グルコース−１−リン酸の存在下で検出され、α−グルコース−１−リン酸の非存在下で低レベルにて検出された。これらの生成物は、ネガティブコントロール試料中に存在しなかった。したがって、本発明は、新規のステビオールグリコシド基質のグリコシル化プロセスを提供する。さらに、本発明は、ステビオール基質をグリコシル化するためにウリジン５’−ジホスホグルコースの代わりにα−グルコース−１−リン酸と共に使用されるこのクラスの第１の酵素（配列番号２および４によってコードされる野生型酵素が含まれる）を提供する。
【０１９３】
実施例２
グルコース−１−リン酸のｉｎ  ｓｉｔｕ形成
この実施例では、基質のＵＤＰ−グルコース非依存性グルコシル化のためのグルコース−１−リン酸のｉｎ  ｓｉｔｕ形成を評価するための実験を記載する（図３を参照のこと）。遺伝子の合成および最適化ならびに振盪フラスコ粉末の生成を、実施例１に記載のように行う。
【０１９４】
ＳＦＰのアッセイ：
ＳＦＰを、２０ｇ／Ｌ粉末に再構成する。次いで、２０μＬの配列番号９または１１を発現する大腸菌由来のＳＦＰおよび１０μＬの奇数の配列番号１５〜３１または別のジサッカリドホスホリラーゼもしくはネガティブコントロールを発現する大腸菌由来のＳＦＰを、総反応体積が２００μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（３ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．３Ｍスクロース（またはジサッカリドホスホリラーゼに対応するジサッカリド）、５ｍＭ無機ホスフェート、および１ｍＭステビオシド（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ、純度９４％超）を含む）（ｐＨ７．５）中で、０〜５ｍＭ  α−グルコース−１−リン酸と共に希釈する。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎタイタープレートシェーカー中、３００ＲＰＭで振盪させながら３０℃で１６〜１８時間反応させた。
【０１９５】
ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
実施例１に記載のように反応をクエンチし、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析する。α−グルコース−１−リン酸のｉｎ  ｓｉｔｕ形成は、ネガティブコントロールを発現する大腸菌由来のＳＦＰの存在下での同一の試料と比較した奇数の配列番号１５〜３１または別のジサッカリドホスホリラーゼを発現する大腸菌由来のＳＦＰの存在下における保持時間１．７６分、２．１８分、２．２２分、および２．３５分でのステビオシドのグルコシル化生成物への変換の増加によって証明される。
【０１９６】
実施例３
バリアントの進化およびスクリーニング
本実施例は、α−グルコース−１−リン酸を使用した基質グルコシル化の改良のための配列番号９および１１由来の操作されたポリペプチドの進化およびスクリーニング中に行った実験を記載する。
【０１９７】
定向進化を、出発「骨格」遺伝子配列として、それぞれ、配列番号１０または１２のポリペプチドをコードする配列番号９または１１のポリヌクレオチドから開始する。操作されたポリペプチドのライブラリーを、種々の周知の技術（例えば、飽和変異誘発、予め同定した有益なアミノ酸の相違の組換え）を使用して生成し、実施例１および２に記載されるように、グルコース−１−リン酸、または安価な二糖、無機ホスフェート、および  野生型または操作されたジサッカリドホスホリラーゼからなるグルコース−１−リン酸のための再利用システムを使用してＨＴＰアッセイおよび操作されたポリペプチドが所望の基質のグルコシル化を実施する能力を測定する分析方法を使用してスクリーニングする。
【０１９８】
スクリーニング後、出発骨格配列を超える最高の改良を示す操作されたポリペプチドを、さらなるライブラリーの構築のための骨格配列として使用し、スクリーニングプロセスを繰り返して、所望の活性を得るためにポリペプチドを進化させる。種々の基質に対して酵素が乱雑であることに起因して、このプロセスを繰り返して、多数の目的の基質のグルコシル化のために安価な補基質を使用する生体触媒を開発することができる。
【０１９９】
実施例４
グルコシル化活性を有するホスホリラーゼ酵素の合成、最適化、およびアッセイ
この実施例では、グルコシル化活性を有するホスホリラーゼ酵素を合成、最適化、およびアッセイするために行った実験を記載する。
【０２００】
遺伝子の合成および最適化：
ラミナリビオースを加リン酸分解（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｙｓｅ）してグルコースを放出し、α−グルコース−１−リン酸を形成することが報告されている野生型Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＹＭ１ラミナリビオースホスホリラーゼポリペプチド（配列番号８）をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７）をコドン最適化し、配列番号１３の遺伝子として合成した。配列番号１３の合成遺伝子を、ｐＣＫ１１０９００ベクター系にクローン化し（例えば、米国特許出願公開第２００６０１９５９４７号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）、その後に大腸菌Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）内で発現させた。大腸菌Ｗ３１１０株に、ｌａｃプロモーターの調節下で酵素を発現させた。
【０２０１】
高処理（ＨＴＰ）ライセートの生成：
目的のポリペプチド遺伝子を発現する大腸菌細胞を成長させ、９６ウェルプレート中に誘導し、ペレット化し、室温でタイタープレートシェーカー上、２時間にわたり低速振盪しながら２５０μＬ溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５中、０．５ｇ／Ｌリゾチームおよび０．５ｇ／Ｌ  ＰＭＢＳ）中で溶解した。次いで、プレートを４０００ｒｐｍにて４℃で２０分間遠心分離し、清澄化したライセート上清を本明細書中に記載のアッセイ反応で使用した。
【０２０２】
ステビオシドのグルコシル化についてのアッセイ：
このアッセイでは、５０μＬの清澄化ライセートを、総反応体積が２００μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）（１．６５ｍＭ  α−グルコース−１−リン酸および０．５ｍＭステビオシド（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ、純度９４％超）を含む）で希釈した。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎタイタープレートシェーカー中、３００ＲＰＭで振盪させながら４０℃で１８時間反応させた。
【０２０３】
ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
実施例１に記載のように反応をクエンチし、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。ラミナリビオースホスホリラーゼの存在下では保持時間２．１８分にグルコシル化ステビオシド生成物が認められたが、ネガティブコントロール試料においては認められなかった。この結果は、ステビオシドおよび他の基質のα−グルコシド化のための新規の方法として、ラミナリビオースホスホリラーゼをα−グルコース−１−リン酸と共に使用することができることを示す。実施例３に記載するように、α−グルコース−１−リン酸を、安価なジサッカリド、無機ホスフェート、およびジサッカリドホスホリラーゼを使用して再利用することができる。
【図１】
2019517807.tif 000006
【図２】
2019517807.tif 000007
【図３】
2019517807.tif 000008
【配列表】
2019517807000001.app
【国際調査報告】
2019517807.tif 000009
2019517807.tif 000010
2019517807.tif 000011