(57)【要約】  本発明は、ＭＡＧＥ−Ａ４タンパク質由来のＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束ペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）を結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。本発明のＴＣＲは、このＭＡＧＥエピトープに対する優れた特異性プロファイルを示す。ＴＣＲをコードする核酸、ＴＣＲを提示するように改変された細胞、ＴＣＲをコードする発現ベクターを宿している細胞、および本発明のＴＣＲ、核酸または細胞を含む医薬組成物も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶型のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用して２５℃、ｐＨ７．１から７．５の間で表面プラズモン共鳴で測定されるときに約０．０５μＭから約２０．０μＭまでの解離定数で、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１と複合体形成したＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）に結合する特性を有し、かつＨＬＡ−Ａ＊０２０１と複合体形成したＧＶＹＤＧＡＹＶＳＶ（配列番号２）に対する結合を超えＨＬＡ−Ａ＊０２０１と複合体形成した配列番号１に対する結合について少なくとも１０倍の選択性を有するＴＣＲであって、前記ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメインおよびＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲ可変ドメインが、ＧＶＤＧＫＳＤＳＶ（配列番号１）の少なくとも残基Ｖ２、Ｙ３およびＤ４との接触を形成する、前記ＴＣＲ。
【請求項２】
アルファ鎖ＴＲＡＶ１０＋ＴＲＡＣ定常ドメイン配列およびベータ鎖ＴＲＢＶ２４−１＋ＴＲＢＣ−２定常ドメイン配列を有する、アルファ−ベータヘテロ二量体である、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項３】
ＶαおよびＶβがそれぞれＴＣＲα可変領域およびＴＣＲβ可変領域であり、ＣαおよびＣβがそれぞれＴＣＲα定常領域およびＴＣＲβ定常領域であり、Ｌがリンカー配列である、型Ｖα−Ｌ−Ｖβ、Ｖβ−Ｌ−Ｖα、Ｖα−Ｃα−Ｌ−Ｖβ、またはＶα−Ｌ−Ｖβ−Ｃβの単鎖形式である、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項４】
検出可能な標識、治療剤またはＰＫ修飾部分と結合された、請求項１から３のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項５】
前記アルファ鎖可変ドメインが、配列番号３のアミノ酸残基１〜１０５の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３に示されている番号付けを参照して
【表１】
2019513383.tif 000023
の変異を有し、かつ／または前記ベータ鎖可変ドメインが、配列番号４のアミノ酸残基１〜１０５の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４に示されている番号付けを参照して
【表２】
2019513383.tif 000024
の変異のうちの少なくとも１つを有する、請求項１から４のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項６】
前記アルファ鎖可変ドメインが、配列番号３もしくは配列番号５もしくは配列番号７〜８のアミノ酸残基１〜１０５のアミノ酸配列または
そのアミノ酸残基１〜２７、３４〜４７および５４〜９０がそれぞれ配列番号３もしくは配列番号５もしくは配列番号７〜８のアミノ酸残基１〜２７、３４〜４７および５４〜９０の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２８〜３４、４８〜５３および９１〜１０５がそれぞれ配列番号３もしくは配列番号５もしくは配列番号７〜８のアミノ酸残基２８〜３３、４８〜５３および９１〜１０５の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項７】
前記アルファ鎖可変ドメインが、配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸残基１〜１０５のアミノ酸配列または
そのアミノ酸残基１〜２７、３４〜４７および５５〜８９がそれぞれ配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸残基１〜２７、３４〜４７および５５〜８９の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２８〜３３、４８〜５３および９１〜１０５がそれぞれ配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸残基２８〜３３、４８〜５３および９１〜１０５の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項８】
前記アルファ鎖可変ドメインにおいて
（ｉ）そのアミノ酸残基１〜２７の配列が、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基１〜２６の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｉｉ）アミノ酸残基２８〜３３の配列が、ＶＳＰＦＳＮであり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３４〜４７の配列が、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基３３〜４７の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｉｖ）アミノ酸残基４８〜５３の配列が、ＬＴＩＭＴＦまたはＬＴＲＭＴＦまたはＬＴＩＶＴＦまたはＬＴＩＬＴＦであり、
（ｖ）そのアミノ酸残基５４〜９０の配列が、配列番号３のアミノ酸残基５５〜８９の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、またはそれに対して相対的に１つ、２つまたは３つの挿入、欠失もしくは置換を有し、
（ｖｉ）アミノ酸９１〜１０５の配列が、ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦである、
請求項１から７のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項９】
前記ベータ鎖可変ドメインが、配列番号４もしくは配列番号６もしくは配列番号９のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸残基１〜４５、５１〜６７および７４〜１０９がそれぞれ配列番号４もしくは配列番号６もしくは配列番号９のアミノ酸残基１〜４５、５１〜６７および７４〜１０９の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基４６〜５０、６８〜７３および１０９〜１２３がそれぞれ配列番号４もしくは配列番号６もしくは配列番号９のアミノ酸残基４６〜５０、６８〜７３および１０９〜１２３の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項１０】
前記ベータ鎖可変ドメインにおいて
（ｉ）そのアミノ酸残基１〜４５の配列が、（ａ）配列番号４の残基１〜２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｉｉ）アミノ酸残基４６〜５０の配列が、ＫＧＨＤＲであり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５１〜６７の配列が、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基５１〜６７の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｉｖ）アミノ酸残基６８〜７３の配列が、ＳＦＤＶＫであり、
（ｖ）そのアミノ酸残基５４〜９０の配列が、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基５４〜９０の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｖｉ）アミノ酸１０９〜１２３の配列が、ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＮＥＱＦＦまたはＣＡＴＳＧＱＧＡＹＲＥＱＦＦである、
請求項１から９のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載のＴＣＲをコードする核酸。
【請求項１２】
請求項１から１２のいずれか１項に記載のＴＣＲを提示している、単離されたまたは天然に存在しない細胞、特に、Ｔ細胞。
【請求項１３】
（ａ）単一のオープンリーディングフレーム内に、もしくは前記アルファ鎖および前記ベータ鎖をそれぞれコードする２つの異なるオープンリーディングフレーム内に、請求項１３に記載の核酸を含むＴＣＲ発現ベクター、または
（ｂ）請求項１から１２のいずれか１項に記載のＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および請求項１から１２のいずれか１項に記載のＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を宿している細胞。
【請求項１４】
１種または複数の薬学的に許容される担体または添加剤と一緒に、請求項１から１０のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項１１の核酸、または請求項１２もしくは請求項１３に記載の細胞を含む医薬組成物。
【請求項１５】
薬における使用のための、請求項１から１２のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項１３の核酸、または請求項１４もしくは請求項１５の細胞。
【請求項１６】
がんを治療する方法における使用のための、請求項１５に記載の使用のためのＴＣＲ、核酸または細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）Ａ４タンパク質（アミノ酸２３０〜２３９）由来のＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束デカペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶを結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。本発明のＴＣＲは、このＭＡＧＥエピトープに対する優れた特異性プロファイルを示す。
【背景技術】
【０００２】
がん・精巣抗原（ＣＴＡ）は、約１４０遺伝子によってコードされる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）のサブクラスである。これらの抗原の発現は、精巣、胎盤および胎児卵巣などの免疫特権部位に限定される；それらは、他の組織内では通常は発現されない。これらの遺伝子の発現は、悪性腫瘍において認められている。ＣＴＡの免疫原性は、多くの固形腫瘍においてこれらの抗原を標的にするがんワクチンの広範な開発を導いてきた。このＴＡＡの大きなクラスの中で、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）は、がん免疫療法のための有望な候補として浮かび上がってきている。
【０００３】
３０を超えるがん・精巣（ＣＴ）遺伝子が、染色体Ｘ上の遺伝子クラスター内に編成されている多遺伝子ファミリーのメンバーとして報告されている（ＣＴ−Ｘ抗原）。ＣＴ遺伝子クラスターは、Ｘｑ２４およびＸｑ２８の間に位置し、ＭＡＧＥおよびＮＹ−ＥＳＯ−１などの遺伝子ファミリーを含む。Ｉ型ＭＡＧＥ遺伝子クラスターは、最も広範囲に特徴づけられており、ＭＡＧＥ−Ａ、ＭＡＧＥ−ＢおよびＭＡＧＥ−Ｃファミリーを含む。ＭＡＧＥ−Ａタンパク質は、異なる１２のＭＡＧＥ−Ａ遺伝子ファミリーメンバー（ＭＡＧＥ−Ａ１からＭＡＧＥ−Ａ１２）によってコードされ、ＭＡＧＥ相同ドメイン（ＭＨＤ）と呼ばれる、保存された１６５〜１７１アミノ酸塩基によって定義される。ＭＨＤは、すべてのＭＡＧＥ−Ａファミリーメンバーによって共有されたアミノ酸の領域のみに相当する。
【０００４】
Ｔ細胞は、ヒト白血球抗原（「ＨＬＡ」）、または主要組織適合複合体（「ＭＨＣ」）と呼ばれる、細胞表面分子とペプチドとの複合体を認識してそれらと相互作用する。ペプチドは、より大きな分子に由来し、これは、細胞によってプロセシングされ、ＨＬＡ／ＭＨＣ分子も示す。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチド複合体との相互作用は限定され、ＨＬＡ分子およびペプチドの特定の組合せに特異的なＴ細胞を必要とする。特異的なＴ細胞が存在しない場合には、そのパートナー複合体が存在するとしてもＴ細胞応答はない。同様に、特定の複合体がない場合には、応答はないが、Ｔ細胞は存在する。このメカニズムは、感染に対する免疫系の応答に、自己免疫疾患に、かつ腫瘍などの異常に対する応答に関与している。
【０００５】
いくつかのＭＡＧＥ遺伝子ファミリータンパク質は、生殖細胞およびがんにおいてのみ発現される（ＭＡＧＥ−ＡからＭＡＧＥ−Ｃファミリー）。他は、正常組織において広範に発現される（ＭＡＧＥ−ＤからＭＡＧＥ−Ｈ）。これらすべてのＭＡＧＥタンパク質ファミリーは、他のＭＡＧＥタンパク質の配列と近似した相同領域を有し、かつ免疫認識においてＨＬＡ／ペプチド複合体として提示されるペプチドを含む。したがって、所望のＭＡＧＥペプチド／ＨＬＡ−Ａ２抗原に特異性が高いＴＣＲ臨床候補を選択することは重要である。
【０００６】
ＭＡＧＥ  Ａ４は、ＭＡＧＥ  Ａ遺伝子ファミリーのＣＴＡメンバーである。それは胚発生において役割を果たしうると考えられているが、その機能はまだ知られていない。腫瘍病因論では、それは、腫瘍形質転換または腫瘍進行の局面に関与するようである。ＭＡＧＥ  Ａ４は、精上皮腫、先天性角化不全症、黒色腫、肝細胞癌、腎細胞癌、膵臓がん、肺がん、大腸がんおよび乳がんを含む、多数の腫瘍に関与するとされている。ペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）は、既知のＭＡＧＥ−Ａ４タンパク質のアミノ酸残基番号２３０〜２３９に相当する。
【０００７】
ＭＡＧＥ  Ｂ２は、ＭＡＧＥ  Ｂ遺伝子ファミリーのＣＴＡである。ＭＡＧＥ  Ｂ２は、精巣および胎盤、ならびに多様な組織学的な型の腫瘍の顕著な画分において発現される。ペプチドＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ（配列番号２）は、ＭＡＧＥ  Ａ４と交差反応性を示し、それによって、ある種のＴＣＲが、両方のペプチドを提示しているＨＬＡ分子に結合することができるようになる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、ＭＡＧＥ  Ｂ２に優先して、ＭＡＧＥ  Ａ４ペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶを提示しているＨＬＡ分子に結合するＴＣＲを開発した。第１の態様では、本発明は、可溶型のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用して２５℃、ｐＨ７．１から７．５の間で表面プラズモン共鳴で測定されるときに約０．０５μＭから約２０．０μＭまでの解離定数で、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１と複合体形成したＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）に結合する特性を有するＴＣＲであって、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメインおよびＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含み、ＴＣＲ可変ドメインは、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）の少なくとも残基Ｖ２、Ｙ３およびＤ４との接触を形成する、ＴＣＲを提供する。
【０００９】
実施形態では、本発明によるＴＣＲは、可溶型のＴＣＲを使用して２５℃、ｐＨ７．１から７．５の間で表面プラズモン共鳴で測定されるときに約２０μＭから約５０μＭまでの解離定数で、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１と複合体形成したＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ（配列番号２）に結合する特性を有し、ここで、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメインおよびＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、解離定数は、５０マイクロＭを超え、例えば、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭまたはそれ以上などである。
【００１０】
したがって、本発明によるＴＣＲは、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶを提示しているＨＬＡに効率良く結合する能力があるが、ＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶを提示しているＨＬＡに効率良く結合する能力はない。
【００１１】
一部の実施形態では、ＴＣＲのアルファ鎖可変ドメインは、配列番号３（アルファ鎖）のアミノ酸残基１〜１１１の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／またはベータ鎖可変ドメインは、配列番号４（ベータ鎖）のアミノ酸残基１〜１１１の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１と複合体形成したＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）に結合する特性を有し、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメインおよびＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
アルファ鎖可変ドメインは、配列番号３のアミノ酸残基１〜１１１の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または
ベータ鎖可変ドメインは、配列番号４のアミノ酸残基１〜１１１の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＴＣＲを提供する。
【００１３】
ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ  ＨＬＡ−Ａ２複合体は、本発明のＴＣＲが標的としうるがんマーカーを提供する。本発明は、がん細胞に細胞傷害剤または免疫エフェクター剤を送達する目的に有用な、かつ／または養子療法における使用に有用な、こうしたＴＣＲを提供する。
【００１４】
ＴＣＲは、国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）ＴＣＲ命名法、およびＴＣＲ配列のＩＭＧＴ公的データベースへのリンクを使用して記載されている。天然のアルファ−ベータヘテロ二量体ＴＣＲは、アルファ鎖およびベータ鎖を有する。概して、それぞれの鎖は、可変領域、連結領域および定常領域を含み、ベータ鎖は、通常、可変領域と連結領域との間に短い多様性領域も含むが、この多様性領域は、連結領域の部分とみなされることが多い。それぞれの可変領域は、フレームワーク配列内に埋め込まれた３つのＣＤＲ（相補性決定領域）を含み、１つは、ＣＤＲ３と命名された超可変領域である。それらのフレームワーク、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列によって、ならびに部分的に定義されたＣＤＲ３配列によって、区別されるいくつかの型のアルファ鎖可変（Ｖα）領域およびいくつかの型のベータ鎖可変（Ｖβ）領域がある。Ｖα型は、ＩＭＧＴ命名法において固有のＴＲＡＶ番号によって称される。したがって、「ＴＲＡＶ２１」は、ＴＣＲからＴＣＲまでで保存されているがＴＣＲからＴＣＲまでで異なるアミノ酸配列も含むアミノ酸配列によって部分的に定義される固有のフレームワークおよびＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列、ならびにＣＤＲ３配列を有するＴＣＲ  Ｖα領域を定義する。同様の方法で、「ＴＲＢＶ５−１」は、固有のフレームワークおよびＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を有するＴＣＲ  Ｖβ領域を定義するが、部分的にのみ定義されたＣＤＲ３配列を有する。
【００１５】
ＴＣＲの連結領域は、固有のＩＭＧＴ  ＴＲＡＪおよびＴＲＢＪ命名法によって、定常領域は、ＩＭＧＴ  ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ命名法によって、同様に定義される。
【００１６】
ベータ鎖多様性領域は、ＩＭＧＴ命名法において略語ＴＲＢＤによって称され、上記のように、連鎖状のＴＲＢＤ／ＴＲＢＪ領域は、連結領域と一緒とみなされることが多い。
【００１７】
αβＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、一般に、それぞれ２つの「ドメイン」、すなわち、可変ドメインおよび定常ドメインを有するとみなされる。可変ドメインは、可変領域および連結領域の連鎖からなる。本明細書および特許請求の範囲において、「ＴＣＲアルファ可変ドメイン」という用語は、したがって、ＴＲＡＶおよびＴＲＡＪ領域の連鎖を指し、ＴＣＲアルファ定常ドメインという用語は、細胞外ＴＲＡＣ領域、またはＣ末端トランケート型ＴＲＡＣ配列を指す。同様に、「ＴＣＲベータ可変ドメイン」という用語は、ＴＲＢＶおよびＴＲＢＤ／ＴＲＢＪ領域の連鎖を指し、ＴＣＲベータ定常ドメインという用語は、細胞外ＴＲＢＣ領域、またはＣ末端トランケート型ＴＲＢＣ配列を指す。
【００１８】
ＩＭＧＴ命名法によって定義される固有の配列は、ＴＣＲ分野における当業者に広く知られており、利用可能である。例えば、それらは、ＩＭＧＴ公的データベースにおいて見出されうる。“Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ”，（２００１）ＬｅＦｒａｎｃ  ａｎｄ  ＬｅＦｒａｎｃ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−１２−４４１３５２−８も、ＩＭＧＴ命名法によって定義される配列を開示しているが、その公開日および結果として生じる時間のずれのため、その中の情報は、時に、ＩＭＧＴデータベースの参照による確認を必要とする。
【００１９】
本発明による１つのＴＣＲは、配列番号２（ＴＲＡＶ１０＋ＴＲＡＣ）に示されているようなアルファ鎖細胞外ドメインおよび配列番号３（ＴＲＢＶ２４−１＋ＴＲＢＣ−２）に示されているようなベータ鎖細胞外ドメインを含む。「親ＴＣＲ」、「親ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲ」という用語は、本明細書において同義的に使用され、配列番号２および３それぞれの細胞外アルファ鎖およびベータ鎖を含むこのＴＣＲを指す。ペプチド−ＨＬＡ複合体に対して親ＴＣＲよりも高い親和性および／または遅い解離速度を有する、親ＴＣＲに対して相対的に変異または修飾されたＴＣＲを提供することは望ましい。
【００２０】
こうした変異または修飾されたＴＣＲの結合プロファイルが比較されうるものに対する参照ＴＣＲを提供する目的で、配列番号３に示されている親ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲアルファ鎖の細胞外配列および配列番号４に示されている親ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲベータ鎖の細胞外配列を有する本発明による可溶性ＴＣＲを使用することは都合がいい。そのＴＣＲは、本明細書において、「参照ＴＣＲ」または「参照ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲ」と称される。配列番号５は、配列番号３の親アルファ鎖細胞外配列を含み、またＴ１６２（すなわち、ＴＲＡＣのＴ４８）からＣ１６２に置換されていることに留意されたい。同様に、配列番号６は、配列番号４の親ベータ鎖細胞外配列であり、またＳ１６９（すなわち、ＴＲＢＣ２のＳ５７）からＣ１６９に置換され、Ｃ１８７からＡ１８７に置換され、Ｎ２０１からＤ２０１に置換されている。親アルファ鎖および親ベータ鎖細胞外配列に対して相対的なこれらのシステイン置換は、リフォールディングされた可溶性ＴＣＲ、すなわち、細胞外アルファ鎖およびベータ鎖をリフォールディングすることによって形成されたＴＣＲを安定化する鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。安定なジスルフィドで連結された可溶性ＴＣＲを参照ＴＣＲとして使用することにより、結合親和性および結合半減期のさらに好都合な評価が可能となる。本発明のＴＣＲは、上記の変異を含んでいてもよい。
【００２１】
本発明のＴＣＲは、天然に存在しないものであってもよく、かつ／または精製および／もしくは改変されていてもよい。本発明のＴＣＲは、親ＴＣＲに対して相対的なアルファ鎖可変ドメインおよび／またはベータ鎖可変ドメインに存在する２つ以上の変異を有していてもよい。「改変ＴＣＲ」および「変異体ＴＣＲ」は、本明細書において同義的に使用され、親ＴＣＲに対して相対的に、特に、そのアルファ鎖可変ドメインおよび／またはベータ鎖可変ドメイン内に、導入された１つまたは複数の変異を有するＴＣＲを一般に意味する。これらの変異は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１０１と複合体形成したＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）に対する結合親和性を改良しうる。ある特定の実施形態では、アルファ鎖可変ドメイン内に１、２、３、４、５、６、７つまたは８つの変異、例えば、４つまたは８つの変異があり、かつ／またはベータ鎖可変ドメイン内に１、２、３、４つまたは５つの変異、例えば、５つの変異がある。一部の実施形態では、本発明のＴＣＲのα鎖可変ドメインは、配列番号３のアミノ酸残基１〜１１１の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、本発明のＴＣＲのβ鎖可変ドメインは、配列番号４のアミノ酸残基１〜１１１の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００２２】
本発明のＴＣＲのアルファ鎖可変ドメインは、配列番号３に示されている番号付けを参照して
【表１】
2019513383.tif 000002
の変異を有していてもよく、かつ／または
ベータ鎖可変ドメインは、配列番号４に示されている番号付けを参照して
【表２】
2019513383.tif 000003
の変異のうちの少なくとも１つを有していてもよい。
【００２３】
本発明のＴＣＲのアルファ鎖可変ドメインは、配列番号３もしくは５もしくは７〜８のアミノ酸残基１〜１０５のアミノ酸配列
またはそのアミノ酸残基１〜２７、３４〜４７および５４〜９０がそれぞれ配列番号３もしくは５もしくは７〜８のアミノ酸残基１〜２７、３４〜４７および５４〜９０の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２８〜３３、４８〜５３および９１〜１０５がそれぞれ配列番号３もしくは５もしくは７〜８のアミノ酸残基２８〜３３、４８〜５３および９１〜１０５の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含んでいてもよい。
【００２４】
アルファ鎖可変ドメインにおいて
（ｉ）そのアミノ酸残基１〜２６の配列は、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基１〜２６の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよく、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有していてもよく、
（ｉｉ）アミノ酸残基２８〜３３の配列は、ＶＳＰＦＳＮであり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３３〜４９の配列は、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基３４〜４７の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよく、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有していてもよく、
（ｉｖ）アミノ酸残基４８〜５３の配列は、ＬＴＩＭＴＦまたはＬＴＲＭＴＦまたはＬＴＩＶＴＦまたはＬＴＩＬＴＦであってもよく、
（ｖ）そのアミノ酸残基５５〜８９の配列は、配列番号３のアミノ酸残基５４〜９０の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよく、またはそれに対して相対的に１つ、２つまたは３つの挿入、欠失もしくは置換を有していてもよく、
（ｖｉ）アミノ酸９０〜９３の配列は、ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦであってもよい。
【００２５】
本発明のＴＣＲのベータ鎖可変ドメインは、配列番号４もしくは６もしくは９のアミノ酸配列
またはそのアミノ酸残基１〜４５、５１〜６７、７４〜１０９がそれぞれ配列番号４もしくは９のアミノ酸残基１〜４５、５１〜６７、７４〜１０９の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基４６〜５０、６８〜７３および１０９〜１２３がそれぞれ配列番号４もしくは９のアミノ酸残基４６〜５０、６８〜７３および１０９〜１２３の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含んでいてもよい。
【００２６】
ベータ鎖可変ドメインにおいて
（ｉ）そのアミノ酸残基１〜４５の配列は、（ａ）配列番号４の残基１〜４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよく、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有していてもよく、
（ｉｉ）アミノ酸残基４６〜５０の配列は、ＫＧＨＤＲであってもよく、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５１〜６７の配列は、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基５１〜６７の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよく、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有していてもよく、
（ｉｖ）アミノ酸残基６８〜７３の配列は、ＳＶＦＤＫであってもよく、
（ｖ）そのアミノ酸残基５４〜９０の配列は、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基５４〜９０の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有していてもよく、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有していてもよく、
（ｖｉ）アミノ酸１０９〜１２３の配列は、ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＮＥＱＦＦまたはＣＡＴＳＧＱＧＡＹＲＥＱＦＦである。
【００２７】
本発明のＴＣＲは、以下のアルファ鎖およびベータ鎖可変ドメインの組合せのうちの１つを有していてもよい：
【表３】
2019513383.tif 000004
【００２８】
本明細書中に開示されている本発明のいずれのＴＣＲの表現型的にサイレントなバリアントも本発明の範囲内である。本明細書中で使用される場合、「表現型的にサイレントなバリアント」という用語は、上記のものに加えて１つまたは複数のさらなるアミノ酸変更を組み込むＴＣＲであって前記変更を含まない対応するＴＣＲと類似した表現型を有するＴＣＲを指すことが理解される。本出願の目的で、ＴＣＲ表現型には、抗原結合特異性（ＫＤおよび／または結合半減期）および抗原特異性が含まれる。表現型的にサイレントなバリアントは、同一条件下で（例えば、２５℃、同じＳＰＲチップ上で）測定されたときに、前記変更を含まない対応するＴＣＲの測定されたＫＤおよび／または結合半減期の１０％以内の、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）  ＨＬＡ−Ａ＊０２０１複合体に対するＫＤおよび／または結合半減期を有していてもよい。好適な条件は、実施例３においてさらに定義されている。抗原特異性は、以下でさらに定義されている。当業者に知られているように、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）  ＨＬＡ−Ａ＊０２０１複合体との相互作用のための親和性を変えることなく、上記に詳述されているものと比較して、その定常ドメインおよび／または可変ドメイン内に変更を組み込むＴＣＲを作製することが可能でありうる。特に、こうしたサイレントな変異は、抗原結合に直接に関与しないことが知られている配列の部分内（例えば、ＣＤＲの外側）に組み込まれうる。こうした些細なバリアントは、本発明の範囲内に含まれる。１つまたは複数の保存的置換がなされているＴＣＲも、本発明の部分を構成する。
【００２９】
変異は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいたもの、制限酵素に基づいたクローニング、またはライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）手順を含むが、これらに限定されない、任意の適切な方法を使用して行われうる。これらの方法は、多くの標準的な分子生物学教科書の中で詳述されている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および制限酵素に基づいたクローニングに関するさらなる詳細については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄ．）ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）手順についてのさらなる情報は、Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎ，（１９９５）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６（１）：３０−６において見出されうる。
【００３０】
本発明のＴＣＲは、ＭＡＧＥ−Ａ４ペプチド、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）  ＨＬＡ−Ａ２複合体を結合する特性を有する。本発明のＴＣＲは、他の、関連性のないエピトープに対して相対的に、そのＭＡＧＥエピトープに対する特異性が高いことが見出されており、したがって、そのエピトープを提示している細胞および組織に治療剤または検出可能な標識を送達するためのターゲティングベクターとして特に好適である。本発明のＴＣＲの文脈における特異性は、ペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶについて陰性であるＨＬＡ−Ａ＊０２０１標的細胞、またはＭＡＧＥ  Ｂ２ペプチドＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶを提示するＨＬＡ細胞を認識するきわめて低い能力を有するのに対して、該ペプチドＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶについて陽性であるＨＬＡ−Ａ＊０２０１標的細胞を認識する本発明のＴＣＲの能力に関する。特異性を試験するために、ＴＣＲは、可溶型であってもよく、かつ／またはＴ細胞の表面上で発現されてもよい。認識は、ＴＣＲおよび標的細胞の存在下におけるＴ細胞活性化のレベルを測定することによって決定されうる。この場合には、ペプチド陰性またはＭＡＧＥ  Ｂ２標的細胞の最低限の認識は、同じ条件下で測定されたときに、ペプチド陽性標的細胞の存在下で産生されるレベルの１０％未満、好ましくは、５％未満、より好ましくは、１％未満のＴ細胞活性化のレベルとして定義される。本発明の可溶性ＴＣＲについて、特異性は、治療的に関連するＴＣＲ濃度で決定されうる。治療的に関連する濃度は、１０−９Ｍ以下のＴＣＲ濃度として、かつ／または対応するＥＣ５０値よりも最高１００倍、好ましくは、最高１０００倍高い濃度として定義されうる。ペプチド陽性細胞は、ペプチドをパルスすることによって得られてもよく、または、より好ましくは、それらは天然に存在する前記ペプチドであってもよい。好ましくは、ペプチド陽性細胞およびペプチド陰性細胞の両方がヒト細胞である。
【００３１】
本発明のある特定のＴＣＲは、養子療法における使用にきわめて好適であることが見出されている。こうしたＴＣＲは、２００μＭ未満、例えば、約０．０５μＭから約２０μＭまたは約１００μＭまでの、複合体に対するＫＤを有していてもよく、かつ／または約０．５秒から約１２分までの範囲内の、複合体に対する結合半減期（Ｔ１／２）を有していてもよい。一部の実施形態では、本発明のＴＣＲは、約０．０５μＭから約２０μＭ、約０．１μＭから約５μＭまたは約０．１μＭから約２μＭまでの、複合体に対するＫＤを有しうる。理論に拘束されることを望むものではないが、養子細胞療法における治療的使用を伴うＴＣＲに対する親和性の最適枠があるようである。腫瘍抗原からエピトープを認識する天然に存在するＴＣＲは、一般に、親和性が低すぎ（２０マイクロＭから５０マイクロＭ）、（ナノモル範囲内またはそれより高い）きわめて高い親和性のＴＣＲは、交差反応性の問題を持つ（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０  ６１１６−６１３１；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９  ５８４５−５８５４；Ｓｃｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８４  ４９３６−４９４６）。
【００３２】
本発明のＴＣＲは、αβヘテロ二量体であってもよくまたは単鎖形式であってもよい。単鎖形式には、Ｖα−Ｌ−Ｖβ、Ｖβ−Ｌ−Ｖα、Ｖα−Ｃα−Ｌ−ＶβまたはＶα−Ｌ−Ｖβ−Ｃβ型のαβＴＣＲポリペプチドが含まれ、ＶαおよびＶβはそれぞれＴＣＲα可変領域およびＴＣＲβ可変領域であり、ＣαおよびＣβはそれぞれＴＣＲα定常領域およびＴＣＲβ定常領域であり、Ｌはリンカー配列である。治療剤を抗原提示細胞に送達するためのターゲティング剤としての使用のために、ＴＣＲは、可溶型（すなわち、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを有していない）であってもよい。安定性のために、可溶性αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、ＷＯ０３／０２０７６３に、記載されているように、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を有することが好ましい。本発明のαβヘテロ二量体内に存在する定常ドメインのうちの１つまたは両方は、例えば、多くとも１５個、または多くとも１０個もしくは多くとも８個の、またはそれより少ないアミノ酸だけ、Ｃ末端でトランケートされていてもよい。養子療法における使用のために、αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインの両方を有する完全長の鎖としてトランスフェクトされてもよい。養子療法における使用のためのＴＣＲは、自然界においてそれぞれのアルファ定常ドメインとベータ定常ドメインとの間に見出されるものと一致しているジスルフィド結合を含んでいてもよく、付加的にまたは代替的に、天然でないジスルフィド結合が存在していてもよい。
【００３３】
当業者には明らかであろうように、ＴＣＲの結合特性に実質的に影響を及ぼすことなく、所与の配列をそのＣ末端および／またはＮ末端で、１、２、３、４、５つまたはそれ以上の残基だけ、トランケートすることも可能でありうる。すべてのこうした些細なバリアントは、本発明によって包含される。
【００３４】
本発明のアルファ−ベータヘテロ二量体ＴＣＲは、通常、アルファ鎖ＴＲＡＣ定常ドメイン配列およびベータ鎖ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列を含む。アルファ鎖およびベータ鎖定常ドメイン配列は、ＴＲＡＣのエクソン２のＣｙｓ４とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のエクソン２のＣｙｓ２との間の天然のジスルフィド結合を欠失させるためのトランケーションまたは置換によって修飾されていてもよい。アルファ鎖およびベータ鎖定常ドメイン配列は、ＴＲＡＣのＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のＳｅｒ５７についてのシステイン残基の置換によっても修飾されていてもよく、前記システインは、ＴＣＲのアルファ定常ドメインとベータ定常ドメインとの間でジスルフィド結合を形成する。
【００３５】
本発明のいくつかのＴＣＲは、参照ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲのものよりも実質的に高いＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に対する結合親和性、および／または結合半減期を有する。天然のＴＣＲの結合親和性を高めると、そのペプチド−ＭＨＣリガンドに対するＴＣＲの特異性が低下されることが多く、これは、Ｚｈａｏ  Ｙａｎｇｂｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔｓ，ＵＳ，ｖｏｌ．１７９，Ｎｏ  ９，１  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００７，５８４５−５８５４において実証されている。しかし、親ＴＣＲに由来する本発明のＴＣＲは、親ＴＣＲよりも実質的に高い結合親和性を有しているにもかかわらず、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に対する特異的を維持している。さらに、それらは、ＭＡＧＥ−Ｂ２を超えＭＡＧＥ−Ａ４について親ＴＣＲよりも顕著に（例えば、少なくとも１０倍）選択的である。
【００３６】
結合親和性（平衡定数ＫＤに反比例する）および結合半減期（Ｔ１／２と表される）は、本明細書中の実施例３の表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）法を使用して決定されうる。測定は、可溶型のＴＣＲを使用して２５℃、ｐＨ７．１から７．５の間で行われうる。ＴＣＲの親和性が２倍になると、結果としてＫＤは半分になることは理解されよう。Ｔ１／２は、解離速度（ｋｏｆｆ）によって除算されたｌｎ２として算出される。したがって、Ｔ１／２が２倍になると、結果としてｋｏｆｆは半分になる。ＴＣＲについてのＫＤおよびｋｏｆｆ値は、通常、可溶型、すなわち、トランケートされて疎水性膜貫通ドメイン残基が除去された形態のＴＣＲについて測定される。したがって、所与のＴＣＲは、そのＴＣＲの可溶型がその必要条件を満たす場合には、それが、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に対する結合親和性、および／または結合半減期を有するという必要条件を満たすことが理解されるべきである。好ましくは、所与のＴＣＲの結合親和性または結合半減期は、同じアッセイプロトコールを使用して、数回、例えば、３回以上測定され、結果の平均がとられる。参照ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲは、その方法によって測定された場合に約６５μＭのＫＤを有し、そのｋｏｆｆは約０．７３／秒である（すなわち、Ｔ１／２は約０．９５秒である）。
【００３７】
さらなる態様では、本発明は、本発明のＴＣＲをコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、ｃＤＮＡである。一部の実施形態では、本発明は、本発明のＴＣＲのα鎖可変ドメインをコードする配列を含む核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、本発明のＴＣＲのβ鎖可変ドメインをコードする配列を含む核酸を提供する。核酸は、天然に存在しないものであってもよく、かつ／または精製および／もしくは改変されていてもよい。
【００３８】
別の態様では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。好ましくは、ベクターは、ＴＣＲ発現ベクターである。
【００３９】
本発明は、本発明のベクター、好ましくは、ＴＣＲ発現ベクターを宿している細胞も提供する。ベクターは、単一のオープンリーディングフレーム、または２つの異なるオープンリーディングフレームにおいて、アルファ鎖およびベータ鎖をそれぞれコードする本発明の核酸を含んでいてもよい。別の態様は、本発明のＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および本発明のＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクターを宿している細胞を提供する。こうした細胞は、養子療法において特に有用である。本発明の細胞は、単離されていてもよく、かつ／または組換え体および／または天然に存在しないものであってもよく、かつ／または改変されていてもよい。
【００４０】
本発明のＴＣＲは、養子療法における有用性を有するので、本発明には、本発明のＴＣＲを提示している、天然に存在しないかつ／または精製および／もしくは改変された細胞、特に、Ｔ細胞が含まれる。本発明は、本発明のＴＣＲを提示しているＴ細胞の増殖した集団も提供する。本発明のＴＣＲをコードする核酸（ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡなど）でのＴ細胞のトランスフェクションに好適ないくつかの方法がある（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：６１１６−６１３１を参照されたい）。本発明のＴＣＲを発現しているＴ細胞は、養子療法に基づいたがんの治療における使用に好適となる。当業者には知られているであろうように、養子療法が行われうるいくつかの好適な方法がある（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ８（４）：２９９−３０８を参照されたい）。
【００４１】
本発明の可溶性ＴＣＲは、抗原提示細胞および抗原提示細胞を含む組織に対する検出可能な標識または治療剤を送達するのに有用である。したがって、（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ−ＨＬＡ−Ａ２複合体を提示している細胞の存在を検出するためにＴＣＲが使用される、診断目的のための）検出可能な標識；治療剤；または（例えば、ペグ化による）ＰＫ修飾部分と（共有結合または他の方法で）結合されていてもよい。
【００４２】
診断目的のための検出可能な標識としては、例えば、蛍光標識、放射標識、酵素、核酸プローブおよびコントラスト試薬が含まれる。
【００４３】
本発明のＴＣＲと結合されうる治療剤としては、免疫調節物質、放射性化合物、酵素（例えばパーフォリン）または化学療法剤（例えばシスプラチン）が含まれる。毒性作用が望ましい部位において果たされることを確実にするために、毒素は、化合物がゆっくりと放出されるように、ＴＣＲに連結されたリポソームの中にあってもよい。これは、体内での輸送中の損傷作用を防止することになり、関連する抗原提示細胞に対するＴＣＲの結合後に毒素が最も高い効果を有することを確実にする。
【００４４】
他の好適な治療剤としては、
・  小分子細胞傷害剤、すなわち、７００ダルトン未満の分子量を有し、哺乳動物細胞を死滅させる能力を有する化合物。こうした化合物としては、細胞傷害作用を有する能力のある毒性金属も含まれうる。さらに、これらの小分子細胞傷害剤としては、プロドラッグ、すなわち、生理学的な条件下で壊変してまたは変換されて細胞傷害剤を放出する化合物も含まれることが理解されるべきである。こうした作用剤の例には、シスプラチン、メイタンシン誘導体、ラシェルマイシン、カリケアマイシン、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーソディウムフォトフリンＩＩ（ｓｏｒｆｉｍｅｒ  ｓｏｄｉｕｍｐｈｏｔｏｆｒｉｎ  ＩＩ）、テモゾロミド、トポテカン、トリメトレートグルクロネート（ｔｒｉｍｅｔｒｅａｔｅ  ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）、オーリスタチンＥ  ビンクリスチンおよびドキソルビシンが含まれる；
・  ペプチド細胞毒素、すなわち、哺乳動物細胞を死滅させる能力を有するタンパク質またはその断片。例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼ；
・  放射性核種、すなわち、α粒子もしくはβ粒子、またはγ線のうちの１つまたは複数の同時発生的な放出を伴って壊変する元素の不安定同位体。例えば、ヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イットリウム９０、ビスマス２１０および２１３、アクチニウム２２５ならびにアスタチン２１３；高親和性ＴＣＲ、またはその多量体に対するこれらの放射性核種の結合を促進するためにキレート化剤が使用されてもよい；
・  免疫刺激剤、すなわち、免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子。例えば、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γなどのサイトカイン、
・  スーパー抗原およびその変異体；
・  ＴＣＲ−ＨＬＡ融合体；
・  ケモカイン、例えば、ＩＬ−８、血小板第４因子、黒色腫増殖刺激タンパク質など；
・  抗Ｔ細胞または抗ＮＫ細胞決定因子抗体（例えば、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８または抗ＣＤ１６）を含む、抗体またはその断片；
・  抗体様結合特性を有する代替のタンパク質足場
・  補体活性化因子；
・  異種のタンパク質ドメイン、同種異系のタンパク質ドメイン、ウイルス／細菌のタンパク質ドメイン、ウイルス／細菌のペプチド
が含まれる。
【００４５】
好ましい一実施形態は、抗ＣＤ３抗体、または前記抗ＣＤ３抗体の機能的な断片もしくはバリアントと（通常、アルファ鎖またはベータ鎖のＮ末端またはＣ末端への融合によって）結合された本発明のＴＣＲによって提供される。本明細書に記載の組成物および方法における使用に好適である抗体断片およびバリアント／アナログとしては、ミニボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｄｓＦｖおよびｓｃＦｖ断片、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）（Ａｂｌｙｎｘ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって市販されている、これらのコンストラクトは、ラクダ科動物（例えば、ラクダまたはラマ）抗体に由来する合成単一免疫グロブリン可変重鎖ドメインを含む）ならびにドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）、親和性が成熟した単一の免疫グロブリン可変重鎖ドメインまたは免疫グロブリン可変軽鎖ドメインを含む）または抗体様結合特性を示す代替のタンパク質足場、ほんの少し例を挙げれば、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（Ｓｗｅｄｅｎ）、改変されたプロテインＡ足場を含む）またはＡｎｔｉｃａｌｉｎｓ（Ｐｉｅｒｉｓ（Ｇｅｒｍａｎ）、改変されたアンチカリンを含む）などが含まれる。
【００４６】
いくつかの目的のために、本発明のＴＣＲは、数種類のＴＣＲを含む複合体に凝集されて多価ＴＣＲ複合体を形成していてもよい。多価ＴＣＲ複合体の生成において使用されうる、多量体化ドメインを含むいくつかのヒトタンパク質がある。例えば、ｐ５３の四量体化ドメイン、これは、単量体ｓｃＦｖ断片と比較して、血清残留性の上昇および解離速度の顕著な低下を示す、ｓｃＦｖ抗体断片の四量体を生成するために利用されてきた（Ｗｉｌｌｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（１７）１４３８５−１４３９２）。ヘモグロビンも、この種類の適用に潜在的に使用されうる四量体化ドメインを有する。本発明の多価ＴＣＲ複合体は、多量体でない野生型または本発明のＴ細胞受容体ヘテロ二量体と比較して、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ  ＨＬＡ−Ａ２複合体に対する増強された結合能力を有しうる。したがって、本発明のＴＣＲの多価複合体も本発明の範囲内に含まれる。本発明によるこうした多価ＴＣＲ複合体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで特定の抗原を提示している細胞をトラッキングまたはターゲティングするのに特に有用であり、こうした使用を有するさらなる多価ＴＣＲ複合体の生成のための中間体としても有用である。
【００４７】
当技術分野においてよく知られているように、ＴＣＲには、翻訳後修飾が行われうる。グリコシル化は、１つのこうした修飾であり、これは、ＴＣＲ鎖における定められたアミノ酸に対するオリゴ糖部分の共有結合的付加を含む。例えば、アスパラギン残基、またはセリン／スレオニン残基は、よく知られているオリゴ糖付加のための部位である。特定のタンパク質のグリコシル化状態は、タンパク質配列、タンパク質高次構造および特定の酵素の有用性を含む、いくつかの要因に依存する。さらに、グリコシル化状態（すなわち、オリゴ糖型、共有結合および付加の総数）は、タンパク質機能に影響しうる。したがって、組換えタンパク質を製造するとき、グリコシル化を制御するのが望ましいことが多い。制御されたグリコシル化は、抗体に基づいた療法を改良するために使用されてきた。（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  Ｒ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２００９  Ｍａｒ；８（３）：２２６−３４．）。本発明の可溶性ＴＣＲに対して、グリコシル化は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、特定の細胞株を使用することによって、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、化学修飾によって、制御されてもよい。グリコシル化は、薬物動態を改良すること、免疫原性を低下させること、および天然のヒトタンパク質をより密接に模倣することができるので、こうした修飾は望ましい（Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ＡＭ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ  Ｓ．，Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．２００５  Ａｕｇ；９４（８）：１６２６−３５）。
【００４８】
患者への投与のために、（通常、検出可能な標識または治療剤と結合された）本発明のＴＣＲ、核酸および／または細胞は、薬学的に許容される担体または添加剤と一緒に医薬組成物中で提供されてもよい。本発明による治療用またはイメージング用ＴＣＲは、通常、薬学的に許容される担体を通常は含むであろう無菌の医薬組成物の部分として供給されることになる。この医薬組成物は、（患者にそれを投与する望ましい方法に依存して）いかなる好適な形態であってもよい。それは、単位剤形で提供されてもよく、一般には密封された容器内で提供されることになり、キットの部分として提供されてもよい。こうしたキットには、通常は（必ずではないが）、使用のための説明書が含まれるはずである。それは、複数の前記単位剤形を含んでいてもよい。
【００４９】
医薬組成物は、任意の適切な経路、好ましくは、非経口（皮下、筋肉内、または好ましくは静脈内を含む）経路による投与用に構成されていてもよい。こうした組成物は、製薬の分野において知られている任意の方法によって、例えば、無菌条件下で活性成分を担体または添加剤と混合することによって調製されうる。
【００５０】
本発明の物質の用量は、治療される疾患または障害、治療される個体の年齢および状態などによって広い範囲の間で変化しえ、医師が、使用される適切な用量を最終的に決定することになる。
【００５１】
本発明のＴＣＲ、医薬組成物、ベクター、核酸および細胞は、実質的に純粋な形態で、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％純粋で、提供されてもよい。
【００５２】
本発明によってさらに提供されるのは、以下である：
・  医学における使用のための、好ましくは、がん、例えば、固形腫瘍（例えば、肺、肝臓および胃の転移巣）および／または扁平上皮癌などを治療する方法における使用のための、本発明のＴＣＲ、核酸または細胞。
・  がんを治療するための医薬品の製造における本発明のＴＣＲ、核酸または細胞の使用。
・  患者に本発明のＴＣＲ、核酸または細胞を投与することを含む、患者においてがんを治療する方法。
【００５３】
本発明のそれぞれの態様の好ましい特徴は、必要な変更を加えて他の態様のそれぞれについてのものと同様である。本明細書において言及されている従来技術文献は、法律によって許可される最大限の範囲まで組み込まれている。
【００５４】
本発明は、以下の非限定的な実施例においてさらに記載される。
【００５５】
添付の配列が参照され、そこでは、
配列番号１は、ＭＡＧＥ  Ａ４ペプチドであり
配列番号２は、ＭＡＧＥ  Ｂ２ペプチドである
【００５６】
配列番号３は、親ＭＡＧＥ−Ａ４特異的ＴＣＲのアルファ鎖の細胞外部分のアミノ酸配列であり、かつ配列番号４は、親ＭＡＧＥ−Ａ４特異的ＴＣＲベータ鎖アミノ酸配列のベータ鎖の細胞外部分のアミノ酸配列を示す。
【００５７】
配列番号５は、（本明細書において「参照ＴＣＲ」と称される）天然のＬｅｎｔｉ  ＴＣＲのアルファ鎖のアミノ酸配列を示す。配列は、Ｔ１６２（すなわち、ＴＲＡＣ定常領域のＴ４８）にシステインが置換されることを除いて親ＴＣＲのものと同じである。配列番号６は、（本明細書において「参照ＴＣＲ」と称される）天然のＬｅｎｔｉ  ＴＣＲのベータ鎖である。配列は、システインがＳ１６９（すなわち、ＴＲＢＣ２定常領域のＳ５７）に置換され、Ａ１８７がＣ１８７に置換され、Ｄ２０１がＮ２０１に置換されることを除いて親ＴＣＲのものと同じである。
【００５８】
配列番号７および８は、本発明のＴＣＲ内に存在しうるアルファ鎖の配列を示す。ＣＤＲ領域を形成している部分配列、またはＣＤＲ領域の実質的な部分は、下線付きである。
【００５９】
配列番号９は、本発明のＴＣＲ内に存在しうるベータ鎖の配列を示す。ＣＤＲ領域を形成している部分配列、またはＣＤＲ領域の実質的な部分は下線付きである。
【００６０】
配列番号１０から１５は、ＴＣＲ  Ａ、ＢおよびＣの可溶性のアルファ鎖およびベータ鎖の配列を示す。これらのＴＣＲのいずれも、本発明による機能的ＴＣＲに発展させることはできなかった。
【実施例】
【００６１】
［実施例１］
ｐＧＭＴ７に基づく発現プラスミド内への参照ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲアルファ鎖およびベータ鎖可変領域配列のクローニング
それぞれ配列番号３および４の親ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲ可変アルファドメインおよびＴＣＲ可変ベータドメインは、ＣαまたはＣβのいずれかを含むｐＧＭＴ７に基づく発現プラスミド内に、（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）に記載されている標準的な方法によってクローニングされた。プラスミドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用してシークエンスされた。それぞれ配列番号４および５の参照ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲ可変アルファドメインおよびＴＣＲ可変ベータドメインは、同様の方法でクローニングされた。
【００６２】
ＴＣＲアルファ鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列は、制限酵素で切断された、ｐＥＸ９５６内にライゲーションされた。ＴＣＲベータ鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列は、同じく制限酵素で切断された、ｐＥＸｂ２１内にライゲーションされた。
【００６３】
ライゲーションされたプラスミドは、コンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞内に形質転換され、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ／寒天プレート上に播種された。３７℃で一晩インキュベーション後、単一コロニーが採取され、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ中で３７℃で振盪しながら一晩培養された。クローニングされたプラスミドは、Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製され、プラスミドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用してシークエンスされた。
【００６４】
［実施例２］
可溶性参照ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲの発現、リフォールディングおよび精製
実施例１において調製されるような、参照ＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれ含む発現プラスミドが大腸菌株ＢＬ２１ｐＬｙｓＳ内に別々に形質転換され、単一のアンピシリン耐性コロニーがＴＹＰ（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）培地中で３７℃で約０．６〜０．８のＯＤ６００まで培養された後に、０．５ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質発現が誘発された。細胞は、導入３時間後に、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ−６Ｂ内で４０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって回収された。細胞ペレットは、ＭｇＣｌ２およびＤＮアーゼＩの存在下で２５ｍｌのＢｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ（ＮｏｖａＧｅｎ）で溶解された。封入体ペレットは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−２１遠心分離機内で１３０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって回収された。次いで、３回の界面活性剤での洗浄が行われて細胞デブリおよび膜成分が除去された。封入体ペレットは、毎回、Ｔｒｉｔｏｎバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ  ｐＨ８．０、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＥＤＴＡ）中でホモジナイズされた後に、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−２１内で１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によってペレット化された。次いで、以下のバッファー：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＮａＥＤＴＡ中での同様の洗浄によって界面活性剤および塩が除去された。最終的に、封入体は、３０ｍｇの一定分量に小分けされて−７０℃で凍結された。封入体タンパク質の収量は、６Ｍのグアニジン−ＨＣｌで可溶化することによって定量化され、ＯＤ測定は、日立Ｕ−２００１分光光度計上で行われた。次いで、吸光係数を使用してタンパク質濃度が算出された。
【００６５】
約１５ｍｇのＴＣＲα鎖および１５ｍｇのＴＣＲβ鎖の可溶化封入体が凍結ストックから解凍され、確実に完全に鎖変性するように、１０ｍｌのグアニジン溶液（６Ｍ  塩酸グアニジン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．１、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ）中に希釈された。完全に還元および変性されたＴＣＲ鎖を含むグアニジン溶液は、次いで、０．５リットルの以下のリフォールディングバッファー：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．１、４００ｍＭ  Ｌ−アルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５Ｍ  尿素中に注入された。酸化還元対（塩酸システアミンおよび二塩酸シスタミン）がそれぞれ６．６ｍＭおよび３．７ｍＭの最終濃度まで添加され、約５分後に、変性されたＴＣＲ鎖が添加された。溶液は、約３０分間放置された。リフォールディングされたＴＣＲは、Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ１メンブレン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ；製品番号１３２６７０）において１０ＬのＨ２Ｏに対して１８〜２０時間透析された。この時間の後に、透析バッファーは、新しい１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．１（１０Ｌ）に２回交換され、透析は、５℃±３℃でさらに約８時間継続された。
【００６６】
可溶性ＴＣＲは、透析されたリフォールディング物をＰＯＲＯＳ  ５０ＨＱ陰イオン交換カラム上にロードすることによっておよび結合したタンパク質をＡｋｔａ精製装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して５０カラム容量を超える１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．１中の０〜５００ｍＭのＮａＣｌの勾配で溶出することによって分解産物および夾雑物から分離された。ピーク画分がプールされ、プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）が添加された。プールされた画分は、次いで、４℃で保存され、クマシーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析された後にプールおよび濃縮された。最終的に、可溶性ＴＣＲは、ＰＢＳバッファー（Ｓｉｇｍａ）中で予め平衡化されたＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ＨＲゲル濾過カラムを使用して精製および特性評価された。約５０ｋＤａの相対分子量で溶出していたピークがプールされ、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴解析による特性評価の前に濃縮された。
【００６７】
［実施例３］
結合特性評価
ＢＩＡｃｏｒｅ解析
表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００（商標））は、可溶性ＴＣＲの、そのペプチド−ＭＨＣリガンドに対する結合を解析するために使用されうる。これは、ストレプトアビジンでコーティングされた結合表面（センサーチップ）に固定されうる可溶性ビオチン化ペプチド−ＨＬＡ（「ｐＨＬＡ」）複合体を作製することによって容易になる。センサーチップは、異なる４種のｐＨＬＡ複合体に対するＴ細胞受容体の結合を同時に測定することを可能にする４つの個別のフローセルを含む。ｐＨＬＡ複合体の手動注入により、固定されたクラスＩ分子の正確なレベルを容易に操作することが可能となる。
【００６８】
ビオチン化されたクラスＩのＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子は、構成サブユニットタンパク質および合成ペプチドを含む、細菌で発現された封入体からｉｎ  ｖｉｔｒｏでリフォールディングされ、その後、精製されて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで酵素によりビオチン化された（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６６：９−１５）。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１重鎖は、適切なコンストラクトにおいてタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを置き換えるＣ末端ビオチン化タグ付きで発現された。１リットルの細菌培養液あたり約７５ｍｇの封入体発現レベルが得られた。ＭＨＣ軽鎖またはβ２−ミクログロブリンも、適切なコンストラクトから大腸菌における封入体として、１リットルの細菌培養液あたり約５００ｍｇのレベルで発現された。
【００６９】
大腸菌細胞は溶解され、封入体は約８０％の純度まで精製された。封入体からのタンパク質は、６Ｍ  グアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．１、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で変性され、０．４Ｍ  Ｌ−アルギニン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．１、３．７ｍＭ  二塩酸シスタミン、６．６ｍＭ  塩酸システアミン、ＨＬＡ−Ａ＊０２分子によるロードが必要とされる４ｍｇ／ＬのＭＡＧＥ−Ａ４  ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶまたはＭＡＧＥ−Ｂ２  ＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶペプチド中に３０ｍｇ／リットル  重鎖、３０ｍｇ／リットル  β２ｍの濃度で、変性タンパク質の単一パルスを＜５℃のリフォールディングバッファー中に添加することによってリフォールディングされた。リフォールディングは、４℃で少なくとも１時間で完了に到達することが可能にされた。
【００７０】
バッファーは、１０容量の１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．１中での透析によって交換された。バッファーの２回の交換は、溶液のイオン強度を十分に低下させるために必要とされた。次いで、タンパク質溶液は、１．５μｍのセルロースアセテートフィルターを通して濾過され、ＰＯＲＯＳ  ５０ＨＱ陰イオン交換カラム（８ｍｌのベッド容量）上にロードされた。タンパク質は、Ａｋｔａ精製装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．１中の直線的な０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配で溶出された。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−ペプチド複合体は、約２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出され、ピーク画分が収集されて、プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）が添加され、それらの画分が氷上で冷却された。
【００７１】
ビオチンタグ付きｐＨＬＡ分子は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．１、５ｍＭ  ＮａＣｌ中で平衡化されたＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの高速脱塩カラムを使用して、同バッファー中にバッファー交換された。溶出されるとすぐに、タンパク質含有分画は氷上で冷却され、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）が添加された。次いで、ビオチン化試薬：１ｍＭ  ビオチン、５ｍＭ  ＡＴＰ（ｐＨ８に緩衝された）、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および５μｇ／ｍｌ  ＢｉｒＡ酵素（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６６：９−１５に従って精製された）が添加された。次いで、この混合物は、室温で一晩インキュベート可能にされた。
【００７２】
ビオチン化されたｐＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子は、ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して精製された。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ＨＲ  １０／３０カラムは、濾過されたＰＢＳで予め平衡化されて１ｍｌのビオチン化反応混合物がロードされ、そのカラムは、Ａｋｔａ精製装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＰＢＳを用いて０．５ｍｌ／分で展開された。ビオチン化されたｐＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子は、約１５ｍｌで単一のピークとして溶出された。タンパク質を含む画分は、プールされて、氷上で冷却され、プロテアーゼ阻害剤カクテルが添加された。タンパク質濃度は、クマシー結合アッセイ（ＰｅｒＢｉｏ）を使用して決定され、ビオチン化されたｐＨＬＡ−Ａ＊０１分子の一定分量は、−２０℃で凍結保存された。
【００７３】
こうした固定された複合体は、Ｔ細胞受容体および補助受容体ＣＤ８ααの両方を結合することができ、その両方が可溶相に注入されうる。可溶性ＴＣＲのｐＨＬＡ結合特性は、ＴＣＲが可溶相または固定相のいずれかにおいて使用される場合、質的にも量的にも類似していることが認められる。これは、可溶種の部分活性についての重要な対照であり、ビオチン化ｐＨＬＡ複合体が生物学的に非ビオチン化複合体と同じくらい活性であることも示唆する。
【００７４】
ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーは、小さなフローセル内のセンサー表面付近のレスポンスユニット（ＲＵ）で表される屈折率における変化を測定し、受容体リガンド相互作用を検出するためおよびそれらの親和性および動態パラメーターを解析するために使用されうる原理である。ＢＩＡｃｏｒｅ実験は、２５℃の温度で、ランニングバッファーとしてＰＢＳバッファー（Ｓｉｇｍａ、ｐＨ７．１〜７．５）を使用し、タンパク質試料の希釈物を調製して行われた。ストレプトアビジンは、標準的なアミンカップリング法によってフローセルに固定された。ｐＨＬＡ複合体は、ビオチンタグを介して固定された。次いで、異なるフローセルの表面上を一定流速で通過する可溶性ＴＣＲによってアッセイが行われ、その際のＳＰＲレスポンスが測定された。
【００７５】
平衡結合定数
平衡結合定数を決定するために、上記のＢＩＡｃｏｒｅ解析法が使用された。ジスルフィドで連結された可溶性ヘテロ二量体形態の参照ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲの段階希釈物が調製され、１つめは約１０００ＲＵの特異的なＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ  ＨＬＡ−Ａ＊０２０１複合体でコーティングされ、２つめは約１０００ＲＵの非特異的な複合体でコーティングされた、２つの異なるフローセル上に毎分５μｌの一定流速で注入された。レスポンスは、対照細胞からの測定値を使用して各濃度について標準化された。標準化されたデータレスポンスは、ＴＣＲ試料の濃度に対してプロットされ、平衡結合定数ＫＤを算出するために非線形曲線適合モデルに適合された。（Ｐｒｉｃｅ＆Ｄｗｅｋ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｉｎ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）１９７９，Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。ジスルフィドで連結された可溶型の参照ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲ（実施例２）は、約２．００μＭのＫＤを示した。同じＢＩＡｃｏｒｅデータより、Ｔ１／２は約０．９５秒であった。
【００７６】
動態パラメーター
上記のＢＩＡｃｏｒｅ解析法は、平衡結合定数および解離速度を決定するためにも使用された。
【００７７】
高親和性ＴＣＲ（下記の実施例４を参照されたい）のために、ＫＤは、解離速度定数、ｋｏｆｆ、および結合速度定数、ｋｏｎを実験的に測定することによって決定された。平衡定数ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出された。
【００７８】
１つめは約１０００ＲＵの特異的なＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ  ＨＬＡ−Ａ＊０２０１複合体でコーティングされ、２つめは約１０００ＲＵの非特異的な複合体でコーティングされた２つの異なるセルにＴＣＲが注入された。流速は、５０μｌ／分に設定された。典型的には、約１μＭの濃度の２５０μｌのＴＣＲが注入された。次いで、レスポンスがベースラインに戻るまでまたは＞２時間が経過するまでバッファーが流された。動態パラメーターは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して算出された。解離相は、半減期の算出を可能にする単一指数関数的減衰方程式に適合された。
【００７９】
［実施例４］
本発明の高親和性ＴＣＲの調製
ＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれ含む発現プラスミドは、実施例１におけるように調製された：
【表４】
2019513383.tif 000005
【００８０】
プラスミドが大腸菌株ＢＬ２１ｐＬｙｓＳ内に別々に形質転換され、単一のアンピシリン耐性コロニーがＴＹＰ（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）培地中で３７℃で約０．６〜０．８のＯＤ６００まで培養された後に、０．５ｍＭのＩＰＴＧでタンパク質発現が誘発された。細胞は、導入３時間後に、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ−６Ｂ内で４０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって回収された。細胞ペレットは、ＭｇＣｌ２およびＤＮアーゼＩの存在下で２５ｍｌのＢｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で溶解された。封入体ペレットは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−２１遠心分離機内で１３０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって回収された。次いで、３回の界面活性剤での洗浄が行われて細胞デブリおよび膜成分が除去された。封入体ペレットは、毎回、Ｔｒｉｔｏｎバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ  ｐＨ８．０、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＥＤＴＡ）中でホモジナイズされた後に、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−２１内で１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によってペレット化された。次いで、以下のバッファー：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＮａＥＤＴＡ中での同様の洗浄によって界面活性剤および塩が除去された。最終的に、封入体は、３０ｍｇの一定分量に小分けされて−７０℃で凍結された。封入体タンパク質の収量は、６Ｍのグアニジン−ＨＣｌで可溶化することによって定量化され、ＯＤ測定は、日立Ｕ−２００１分光光度計上で行われた。次いで、吸光係数を使用してタンパク質濃度が算出された。
【００８１】
確実に完全に鎖変性するように、本発明の各ＴＣＲのための約１０ｍｇのＴＣＲα鎖および１０ｍｇのＴＣＲβ鎖の可溶化封入体は、１０ｍｌのグアニジン溶液（６Ｍ  塩酸グアニジン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．１、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ）中に希釈された。完全に還元および変性されたＴＣＲ鎖を含むグアニジン溶液は、次いで、０．５リットルの以下のリフォールディングバッファー：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．１、４００ｍＭ  Ｌ−アルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５Ｍ  尿素中に注入された。酸化還元対（塩酸システアミンおよび二塩酸シスタミン）がそれぞれ６．６ｍＭおよび３．７ｍＭの最終濃度まで添加され、約５分後に、変性されたＴＣＲ鎖が添加された。溶液は、約３０分間放置された。リフォールディングされたＴＣＲは、Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ１メンブレン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ；製品番号１３２６７０）において１０ＬのＨ２Ｏに対して１８〜２０時間透析された。この時間の後に、透析バッファーは、新しい１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．１（１０Ｌ）に２回交換され、透析は、５℃±３℃でさらに約８時間継続された。
【００８２】
可溶性ＴＣＲは、透析されたリフォールディング物をＰＯＲＯＳ  ５０ＨＱ陰イオン交換カラム上にロードすることによっておよび結合したタンパク質をＡｋｔａ精製装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１５カラム容量を超える１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．１中の０〜５００ｍＭのＮａＣｌの勾配で溶出することによって分解産物および夾雑物から分離された。プールされた画分は、次いで、４℃で保存され、クマシーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析された後にプールおよび濃縮された。最終的に、可溶性ＴＣＲは、ＰＢＳバッファー（Ｓｉｇｍａ）中で予め平衡化されたＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ＨＲゲル濾過カラムを使用して精製および特性評価された。約５０ｋＤａの相対分子量で溶出していたピークがプールされ、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴解析による特性評価の前に濃縮された。
【００８３】
ＭＡＧＥ−Ａ４エピトープまたはＭＡＧＥ−Ｂ２に対するこうして調製されたＴＣＲの親和性プロファイルは、実施例３の方法を使用して評価され、参照ＴＣＲと比較された。結果は、以下の表に記載されている：
【表５】
2019513383.tif 000006
【００８４】
配列番号１０／１１、１２／１３、１４／１５の組合せに基づいた高親和性ＴＣＲを調製するために試行も行われた。
【００８５】
配列番号１０のアルファ鎖と配列番号１１のベータ鎖とを合わせ持つ、ＴＣＲ  Ａの場合には、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ１０およびＰＲＡＭＥの間で交差反応性が認められた。変異および選択によってこの交差反応性をなくすことは不可能であった。
【００８６】
ＴＣＲ  Ｂは、配列番号１２のアルファ鎖と配列番号１３のベータ鎖とを合わせ持つ。ＴＣＲ  Ｂは、可溶性ＴＣＲを形成するようにフォールディングさせることができなかったため、結合特性評価は不可能であった。
【００８７】
ＴＣＲ  Ｃは、配列番号１４のアルファ鎖と配列番号１５のベータ鎖とを合わせ持つ。このＴＣＲは、発現されたときに可溶性であってかつ抗原に結合することができた。しかし、Ｔ細胞において発現されたときには、ＴＣＲ  Ｃは、活性を示さなかった。
【００８８】
［実施例５］
親ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲおよびバリアントＭＡＧＥ−Ａ１０  ＴＣＲでのＴ細胞のトランスフェクション
（ａ）Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｉｎを介した２９３Ｔ細胞の一過的トランスフェクションによるレンチウイルスベクター調製
望ましいＴＣＲをコードする遺伝子を含むレンチウイルスベクターをパッケージングするために、第３世代レンチウイルスパッケージングシステムが使用された。Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｉｎを介したトランスフェクション（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、２９３Ｔ細胞は、４種のプラスミド（実施例５ｃ（以下）に記載のＴＣＲアルファ鎖−Ｐ２Ａ−ＴＣＲベータ鎖単一ＯＲＦ遺伝子を含む１種のレンチウイルスベクター、および感染性であるが複製不可能なレンチウイルス粒子を構築するために必要な他の構成要素を含む３種のプラスミド）でトランスフェクトされた。
【００８９】
トランスフェクションのために、指数関数的な増殖期にある２９３Ｔ細胞の１つのＴ１５０フラスコが回収され、細胞は、プレート上に均一に分散され、わずかに５０％を超えるコンフルエントであった。Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｉｎの一定分量は、室温にされた。３ｍＬの無血清培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）が無菌の１５ｍｌのコニカルチューブ内に入れられた。１７４μｌのＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｎ試薬が無血清培地中に直接に添加された（これは、３．６：１の試薬対ＤＮＡの重量比を実現する）。これは、３〜４回チューブを逆さにすることによって完全に混合されて、室温で５〜２０分間インキュベートされた。
【００９０】
別の１．５ｍｌのマイクロチューブ内で、予め混合されたパッケージング混合物一定分量（１８μｇのｐＲＳＶ．ＲＥＶ（Ｒｅｖ発現プラスミド）、１８μｇのｐＭＤＬｇ／ｐ．ＲＲＥ（Ｇａｇ／Ｐｏｌ発現プラスミド）、７μｇのｐＶＳＶ−Ｇ（ＶＳＶ糖タンパク質発現プラスミド）を含む、通常約２２μｌ）に１５μｇのプラスミドＤＮＡが添加され、ＤＮＡ混合物を確実に均一にさせるために上および下にピペッティングされた。このＤＮＡ混合物に約１ｍＬのＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｎ／無血清培地が滴下で添加され、次いで、上および下に穏やかにピペッティングされた後に、残りのＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｎ／無血清培地に移し戻された。チューブは、３〜４回逆さにされて、室温で１５〜３０分間インキュベートされた。細胞のフラスコから古い培地が除去された。２９３Ｔ細胞の直立型フラスコの底にＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｎ／培地／ＤＮＡ（３ｍＬ）複合体が直接に添加された。ゆっくりと、フラスコは、細胞を覆うように平らに置かれ、確実に分散するようにきわめて穏やかに揺動された。１分後、２２ｍｌの新しい培地（Ｒ１０＋ＨＥＰＥＳ：ＲＰＭＩ１６４０、熱失活された１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）が添加され、フラスコは、インキュベーターに注意深く戻された。これは、３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートされた。２４時間後、パッケージングされたレンチウイルスベクターを含む培地が回収された。
【００９１】
パッケージングされたレンチウイルスベクターを回収するために、細胞培養液上清は、０．４５ミクロンのナイロンシリンジフィルターを通して濾過され、培養液は、１０，０００ｇで１８時間（または１１２，０００ｇで２時間）遠心分離され、（ペレットを乱さないように注意しながら）上清の大部分が除去され、残りの数ｍＬ（チューブあたり３１ｍｌの開始容量から、通常、約２ｍｌ）の上清中にペレットが再懸濁された。これは、１ｍｌずつの一定分量でドライアイス上でスナップ凍結され、−８０℃で保存された。
【００９２】
（ｂ）目的の遺伝子を含むパッケージングされたレンチウイルスベクターでのＴ細胞の形質導入
パッケージングされたレンチウイルスベクターでの形質導入前に、健常な志願者の血液からヒトＴ細胞（ＣＤ８もしくはＣＤ４または必要条件によっては両方）が単離された。これらの細胞は、計数され、４８ウェルプレート内で、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲ１０中、１ｍｌあたり１×１０６細胞（０．５ｍＬ／ウェル）で、１細胞あたり３個のビーズの比率で、予め洗浄された抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体コーティング付きマイクロビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｄｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に一晩インキュベートされた。
【００９３】
一晩の刺激後、０．５ｍｌの無希釈のパッケージングされたレンチウイルスベクターが、望ましい細胞に添加された。これは、３７℃／５％ＣＯ２で３日間インキュベートされた。形質導入３日後、細胞は、計数され、０．５×１０６細胞／ｍｌまで希釈された。ＩＬ−２を含む新しい培地が必要に応じて添加された。ビーズは、形質導入５〜７日後に除去された。２日間隔で、細胞が計数され、ＩＬ−２を含む新しい培地が交換または添加された。細胞は、０．５×１０６細胞／ｍＬおよび１×１０６細胞／ｍＬの間で維持された。細胞は、３日目からフローサイトメトリーによって解析され、５日目から機能アッセイ（例えば、ＩＦＮγ放出についてのＥＬＩＳｐｏｔ、実施例６を参照されたい）に使用された。１０日目から、または細胞が分裂を遅延させ、大きさが減少したときに、細胞は、保存のために（９０％ＦＢＳ／１０％ＤＭＳＯ中に１×１０７細胞／ｍｌで）少なくとも４×１０６細胞／バイアルの一定分量で凍結される。
【００９４】
［実施例６］
ＭＡＧＥ  Ａ４  ＴＣＲ改変Ｔ細胞の活性化
腫瘍細胞株に応答した、ＴＣＲ形質導入した細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化を実証するために、以下のアッセイを行った。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して測定されるような、ＩＦＮ−γ産生を、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性化についての読み出しとして使用した。
【００９５】
ＥＬＩＳＰＯＴ
試薬
アッセイ培地：  １０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２０１１−０９）、８８％ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号４２４０１）、１％グルタミン（Ｇｉｂｃｏカタログ番号２５０３０）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１５０７０−０６３）。
洗浄バッファー：０．０１Ｍ  ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０
ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１００１０）
関連したＡＥＣ基質セット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５１９５１）と共に、捕捉抗体および検出抗体ならびにヒトＩＦＮ−γ  ＰＶＤＦ  ＥＬＩＳＰＯＴ  ９６ウェルプレートを含むヒトＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；カタログ番号５５１８４９）
【００９６】
方法
標的細胞の調製
この方法において使用される標的細胞は、天然のエピトープ提示細胞：両方ＨＬＡ−Ａ２＋  ＭＡＧＥ  Ａ１０＋であるＡ３７５ヒト黒色腫細胞であった。ＨＬＡ−Ａ２＋  ＭＡＧＥ  Ａ１０−である、ＨＣＴ１１６ヒト結腸がんは、陰性対照として使用された。十分な標的細胞（５０，０００細胞／ウェル）は、Ｍｅｇａｆｕｇｅ（登録商標）１．０（Ｈｅｒａｅｕｓ）内で１２００ｒｐｍで１０分の遠心分離３回によって洗浄された。細胞は、次いで、アッセイ培地中に１０６細胞／ｍｌで再懸濁された。
【００９７】
エフェクター細胞調製
この方法において使用されるエフェクター細胞（Ｔ細胞）は、ＣＤ１４およびＣＤ２５マイクロビーズキット（それぞれＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号１３０−０５０−２０１および１３０−０９２−９８３）を使用して、健常な志願者の静脈血から新たに単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から負の選択によって得られた、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）であった。細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティング付きビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｄｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で刺激され、（実施例５に記載のコンストラクトに基づいた）目的の全αβＴＣＲをコードする遺伝子を運ぶレンチウイルスで形質導入され、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含むアッセイ培地中で形質導入１０日後および１３日後の間まで増殖した。これらの細胞は、次いで、アッセイ培地中に入れられた後に、Ｍｅｇａｆｕｇｅ（登録商標）１．０（Ｈｅｒａｅｕｓ）内で１２００ｒｐｍで１０分の遠心分離によって洗浄された。細胞は、次いで、４×最終的に必要とされる濃度でアッセイ培地中に再懸濁された。
【００９８】
プレートは、以下のように調製された：１００μＬの抗ＩＦＮ−γ捕捉抗体は、１プレートあたり１０ｍｌの無菌ＰＢＳ中に希釈された。次いで、各ウェル内に１００μＬの希釈された捕捉抗体が分注された。プレートは、次いで、４℃で一晩インキュベートされた。インキュベーション後、プレートは、洗浄（プログラム１、プレート型２、Ｕｌｔｒａｗａｓｈ  Ｐｌｕｓ  ９６ウェルプレート洗浄機；Ｄｙｎｅｘ）されて捕捉抗体が除去された。プレートは、次いで、各ウェルに２００μＬのアッセイ培地を添加することによってブロッキングされ、室温で２時間インキュベートされた。アッセイ培地は、次いで、プレートから洗浄され（プログラム１、プレート型２、Ｕｌｔｒａｗａｓｈ  Ｐｌｕｓ  ９６ウェルプレート洗浄機、Ｄｙｎｅｘ）、残りのすべての培地は、ＥＬＩＳＰＯＴプレートをペーパータオル上で軽く振り払うことおよび軽く叩くことによって除去された。
【００９９】
次いで、以下の順序でアッセイの成分がＥＬＩＳＰＯＴプレートに添加された：
５０μＬの標的細胞１０６細胞／ｍｌ（合計５０，０００個の標的細胞／ウェルにする）
５０μＬ  培地（アッセイ培地）
５０μＬ  エフェクター細胞（２０，０００個のＴＣＲ形質導入ＰＢＬ細胞／ウェル）
【０１００】
プレートは、次いで、一晩インキュベートされた（３７℃／５％ＣＯ２）。翌日、プレートは、洗浄バッファーで３回洗浄され（プログラム１、プレート型２、Ｕｌｔｒａｗａｓｈ  Ｐｌｕｓ  ９６ウェルプレート洗浄機、Ｄｙｎｅｘ）、ペーパータオル上で軽く叩かれて乾燥されて余分な洗浄バッファーが除去された。１００μｌの一次検出抗体は、次いで、各ウェルに添加された。一次検出抗体は、製造業者の説明書に明記された希釈を使用して、１０ｍＬの希釈バッファー（単一のプレートに必要とされる容量）中に希釈された。プレートは、次いで、室温で少なくとも２時間インキュベートされた後に洗浄バッファーで３回洗浄された（プログラム１、プレート型２、Ｕｌｔｒａｗａｓｈ  Ｐｌｕｓ  ９６ウェルプレート洗浄機、Ｄｙｎｅｘ）；余分な洗浄バッファーは、プレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって除去された。
【０１０１】
二次検出は、各ウェルに１００μＬの希釈されたストレプトアビジン−ＨＲＰを添加してプレートを室温で１時間インキュベートすることによって行われた。ストレプトアビジン−ＨＲＰは、製造業者の説明書に明記された希釈を使用して、１０ｍＬの希釈バッファー（単一のプレートに必要とされる容量）中に希釈された。プレートは、次いで、洗浄バッファーで３回洗浄され（プログラム１、プレート型２、Ｕｌｔｒａｗａｓｈ  Ｐｌｕｓ  ９６ウェルプレート洗浄機、Ｄｙｎｅｘ）、ペーパータオル上で軽く叩かれて余分な洗浄バッファーが除去された。プレートは、次いで、ＰＢＳで各ウェルに２００μＬを添加することによって２回洗浄され、バッファーが軽く振り出され、ペーパータオル上で軽く叩かれて余分なバッファーが除去された。使用前１５分以内に、１滴（２０ｕＬ）のＡＥＣ色素原が各１ｍｌのＡＥＣ基質に添加されて混合された。各プレートについて１０ｍｌのこの溶液が調製された；１ウェルあたり１００μＬが添加された。プレートは、次いで、ホイルを使用して光から保護され、通常、５〜２０分以内に生じる、スポット発色が定期的にモニターされる。プレートは、発色反応を終了させるために水道水中で洗浄され、それらが３つの成分に分解される前に振盪乾燥された。プレートは、次いで、室温で少なくとも２時間乾燥可能にされた後に、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（登録商標）プレートリーダー（ＣＴＬ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を使用してスポットが計数された。
【０１０２】
［実施例７］
すべての代替アミノ酸での置換による結合モチーフの同定
それぞれの位置のアミノ酸残基が１９種すべての代替の天然に存在するアミノ酸で順次置き換えられた天然のＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドのバリアントが得られ、それによって、全部で１７１種のペプチドが調製された。天然のペプチドおよびアミノ酸置換されたペプチドが、抗原提示細胞上にパルスされ、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して測定されるような、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）産生が、ＴＣＲ４で形質導入されたＴ細胞の活性化についての読み出しとして使用された。不可欠な位置は、天然のペプチドに対して相対的に５０％を超えるＴ細胞活性における低下によって定義された。
【０１０３】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、実施例６に記載のように行われた。
【０１０４】
ペプチドの各位置における許容される残基は、以下に示される。下線付きのアミノ酸は、ペプチド内の該当位置における天然の残基を表す。
【０１０５】
【表６】
2019513383.tif 000007
【０１０６】
したがって、抗原提示細胞の表面上でＨＬＡ−Ａ＊０２０１と複合体形成しているときに、ＭＡＧＥ  Ａ４  ＴＣＲ４が、ペプチド（配列番号１）の少なくともＶ２  Ｙ３およびＤ４と接触することは明らかである。
【０１０７】
配列番号１  ＭＡＧＥ  Ａ４エピトープ
【化１】
2019513383.tif 000008
配列番号２  ＭＡＧＥ  Ｂ２エピトープ
【化２】
2019513383.tif 000009
配列番号３  アルファ可変鎖
【化３】
2019513383.tif 000010
配列番号４  ベータ可変鎖
【化４】
2019513383.tif 000011
配列番号５  アルファ鎖  可溶型
【化５】
2019513383.tif 000012
配列番号６  ベータ鎖  可溶型
【化６】
2019513383.tif 000013
配列番号７  変異型アルファ可変鎖
【化７】
2019513383.tif 000014
配列番号８  変異型アルファ可変鎖
【化８】
2019513383.tif 000015
配列番号９  変異型ベータ可変鎖
【化９】
2019513383.tif 000016
配列番号１０  アルファ鎖  可溶型
【化１０】
2019513383.tif 000017
配列番号１１  ベータ鎖  可溶型
【化１１】
2019513383.tif 000018
配列番号１２  アルファ鎖  可溶型
【化１２】
2019513383.tif 000019
配列番号１３  ベータ鎖  可溶型
【化１３】
2019513383.tif 000020
配列番号１４  アルファ鎖  可溶型
【化１４】
2019513383.tif 000021
配列番号１５  ベータ鎖  可溶型
【化１５】
2019513383.tif 000022
【配列表】
2019513383000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月7日(2018.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶型のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用して２５℃、ｐＨ７．１から７．５の間で表面プラズモン共鳴で測定されるときに約０．０５μＭから約２０．０μＭまでの解離定数で、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１と複合体形成したＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）に結合する特性を有し、かつＨＬＡ−Ａ＊０２０１と複合体形成したＧＶＹＤＧＥＥＨＳＶ（配列番号２）に対する結合を超えＨＬＡ−Ａ＊０２０１と複合体形成した配列番号１に対する結合について少なくとも１０倍の選択性を有するＴＣＲであって、前記ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメインおよびＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲ可変ドメインが、ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号１）の少なくとも残基Ｖ２、Ｙ３およびＤ４との接触を形成する、前記ＴＣＲ。
【請求項２】
アルファ鎖ＴＲＡＶ１０＋ＴＲＡＣ定常ドメイン配列およびベータ鎖ＴＲＢＶ２４−１＋ＴＲＢＣ−２定常ドメイン配列を有する、アルファ−ベータヘテロ二量体である、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項３】
ＶαおよびＶβがそれぞれＴＣＲα可変領域およびＴＣＲβ可変領域であり、ＣαおよびＣβがそれぞれＴＣＲα定常領域およびＴＣＲβ定常領域であり、Ｌがリンカー配列である、型Ｖα−Ｌ−Ｖβ、Ｖβ−Ｌ−Ｖα、Ｖα−Ｃα−Ｌ−Ｖβ、またはＶα−Ｌ−Ｖβ−Ｃβの単鎖形式である、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項４】
検出可能な標識、治療剤またはＰＫ修飾部分と結合された、請求項１から３のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項５】
前記アルファ鎖可変ドメインが、配列番号３のアミノ酸残基１〜１０５の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３に示されている番号付けを参照して
【表１】
2019513383.tif 000025
の変異を有し、かつ／または前記ベータ鎖可変ドメインが、配列番号４のアミノ酸残基１〜１０５の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４に示されている番号付けを参照して
【表２】
2019513383.tif 000026
の変異のうちの少なくとも１つを有する、請求項１から４のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項６】
前記アルファ鎖可変ドメインが、配列番号３もしくは配列番号５もしくは配列番号７〜８のアミノ酸残基１〜１０５のアミノ酸配列または
そのアミノ酸残基１〜２７、３４〜４７および５４〜９０がそれぞれ配列番号３もしくは配列番号５もしくは配列番号７〜８のアミノ酸残基１〜２７、３４〜４７および５４〜９０の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２８〜３４、４８〜５３および９１〜１０５がそれぞれ配列番号３もしくは配列番号５もしくは配列番号７〜８のアミノ酸残基２８〜３３、４８〜５３および９１〜１０５の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項７】
前記アルファ鎖可変ドメインが、配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸残基１〜１０５のアミノ酸配列または
そのアミノ酸残基１〜２７、３４〜４７および５５〜８９がそれぞれ配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸残基１〜２７、３４〜４７および５５〜８９の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基２８〜３３、４８〜５３および９１〜１０５がそれぞれ配列番号７もしくは配列番号８のアミノ酸残基２８〜３３、４８〜５３および９１〜１０５の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項８】
前記アルファ鎖可変ドメインにおいて
（ｉ）そのアミノ酸残基１〜２７の配列が、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基１〜２６の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｉｉ）アミノ酸残基２８〜３３の配列が、ＶＳＰＦＳＮであり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基３４〜４７の配列が、（ａ）配列番号３のアミノ酸残基３３〜４７の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｉｖ）アミノ酸残基４８〜５３の配列が、ＬＴＩＭＴＦまたはＬＴＲＭＴＦまたはＬＴＩＶＴＦまたはＬＴＩＬＴＦであり、
（ｖ）そのアミノ酸残基５４〜９０の配列が、配列番号３のアミノ酸残基５５〜８９の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、またはそれに対して相対的に１つ、２つまたは３つの挿入、欠失もしくは置換を有し、
（ｖｉ）アミノ酸９１〜１０５の配列が、ＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦである、
請求項１から７のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項９】
前記ベータ鎖可変ドメインが、配列番号４もしくは配列番号６もしくは配列番号９のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸残基１〜４５、５１〜６７および７４〜１０９がそれぞれ配列番号４もしくは配列番号６もしくは配列番号９のアミノ酸残基１〜４５、５１〜６７および７４〜１０９の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有し、アミノ酸残基４６〜５０、６８〜７３および１０９〜１２３がそれぞれ配列番号４もしくは配列番号６もしくは配列番号９のアミノ酸残基４６〜５０、６８〜７３および１０９〜１２３の配列に対して少なくとも９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項１０】
前記ベータ鎖可変ドメインにおいて
（ｉ）そのアミノ酸残基１〜４５の配列が、（ａ）配列番号４の残基１〜２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｉｉ）アミノ酸残基４６〜５０の配列が、ＫＧＨＤＲであり、
（ｉｉｉ）そのアミノ酸残基５１〜６７の配列が、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基５１〜６７の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｉｖ）アミノ酸残基６８〜７３の配列が、ＳＦＤＶＫであり、
（ｖ）そのアミノ酸残基５４〜９０の配列が、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基５４〜９０の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、または（ｂ）（ａ）の配列に対して相対的に挿入もしくは欠失された１つ、２つまたは３つのアミノ酸残基を有し、
（ｖｉ）アミノ酸１０９〜１２３の配列が、ＣＡＴＳＧＱＧＡＹＮＥＱＦＦまたはＣＡＴＳＧＱＧＡＹＲＥＱＦＦである、
請求項１から９のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載のＴＣＲをコードする核酸。
【請求項１２】
請求項１から１２のいずれか１項に記載のＴＣＲを提示している、単離されたまたは天然に存在しない細胞、特に、Ｔ細胞。
【請求項１３】
（ａ）単一のオープンリーディングフレーム内に、もしくは前記アルファ鎖および前記ベータ鎖をそれぞれコードする２つの異なるオープンリーディングフレーム内に、請求項１３に記載の核酸を含むＴＣＲ発現ベクター、または
（ｂ）請求項１から１２のいずれか１項に記載のＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および請求項１から１２のいずれか１項に記載のＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を宿している細胞。
【請求項１４】
１種または複数の薬学的に許容される担体または添加剤と一緒に、請求項１から１０のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項１１の核酸、または請求項１２もしくは請求項１３に記載の細胞を含む医薬組成物。
【請求項１５】
薬における使用のための、請求項１から１２のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項１３の核酸、または請求項１４もしくは請求項１５の細胞。
【請求項１６】
がんを治療する方法における使用のための、請求項１５に記載の使用のためのＴＣＲ、核酸または細胞。
【国際調査報告】
2019513383.tif 000027
2019513383.tif 000028
2019513383.tif 000029