(57)【要約】  本発明は、異種ポリペプチドの排泄的産生を改善するためのシグナルポリペプチド、このシグナルポリペプチドを含むタンパク質、このシグナルポリペプチドをコードする核酸、およびこれらを使用する方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または１０〜２１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１または１０〜２１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のシグナルポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１または１０〜２１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のシグナルポリペプチド。
【請求項４】
（ｉ）配列番号１または１０〜２１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルポリペプチドと、（ｉｉ）異種ポリペプチドとを含むタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質は、（ｉ）配列番号１または１０〜２１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルポリペプチドと、（ｉｉ）異種ポリペプチドとを含む、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質は、（ｉ）配列番号１または１０〜２１のいずれか１つに対するアミノ酸配列を含むシグナルポリペプチドと、（ｉｉ）異種ポリペプチドとを含む、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記異種ポリペプチドは２０個超のアミノ酸を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記異種ポリペプチドは分子量が２５ｋＤａ〜５０ｋＤａである、請求項４〜７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記異種ポリペプチドは分子量が３０ｋＤａ〜３５ｋＤａである、請求項４〜８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記異種ポリペプチドは、酵素、毒素、抗体、抗体断片、抗原、治療用タンパク質およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４〜９のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１１】
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のシグナルポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のシグナルポリペプチド。
【請求項１４】
（ｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルポリペプチドと、（ｉｉ）異種ポリペプチドとを含むタンパク質。
【請求項１５】
前記タンパク質は、（ｉ）配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルポリペプチドと、（ｉｉ）異種ポリペプチドとを含む、請求項１４に記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記タンパク質は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むシグナルポリペプチドと、（ｉｉ）異種ポリペプチドとを含む、請求項１４に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記異種ポリペプチドは２０個超のアミノ酸を含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記異種ポリペプチドは分子量が２５ｋＤａ〜５０ｋＤａである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記異種ポリペプチドは分子量が３０ｋＤａ〜３５ｋＤａである、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記異種ポリペプチドは、酵素、毒素、抗体、抗体断片、抗原、治療用タンパク質およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２１】
前記異種ポリペプチドはアルファ毒素（ＡＴ）を含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２２】
前記異種ポリペプチドは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のアルファ毒素を含む、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２３】
前記アルファ毒素は、Ｈ３５に対応するアミノ酸位置で置換を含む、請求項２１または２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
前記置換はＨ３５Ｌ置換である、請求項２３に記載のタンパク質。
【請求項２５】
配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項２６】
請求項１〜３もしくは１１〜１３のいずれか一項に記載のシグナルポリペプチドまたは請求項４〜１０もしくは１４〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質を含む組成物。
【請求項２７】
請求項１〜３もしくは１１〜１３のいずれか一項に記載のシグナルポリペプチドまたは請求項４〜１０もしくは１４〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項２８】
（１）請求項１〜３または１１〜１３のいずれか一項に記載のシグナルポリペプチドをコードし、且つ（２）１箇所または複数箇所の制限酵素部位を含む核酸。
【請求項２９】
請求項２７または２８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３０】
複製起点をさらに含む、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３１】
前記核酸に作動可能に連結されたプロモーター配列をさらに含む、請求項２９または３０に記載のベクター。
【請求項３２】
前記プロモーター配列は原核生物中で作動可能である、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項３３】
前記ベクターは、プラスミド、トランスポゾンまたはウイルスベクターである、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項３４】
請求項４〜１０または１４〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質を発現するように操作された組換え細胞。
【請求項３５】
原核生物細胞である、請求項３４に記載の組換え細胞。
【請求項３６】
前記原核生物細胞はエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属である、請求項３４または３５に記載の組換え細胞。
【請求項３７】
前記原核生物細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項３８】
請求項２９〜３３のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項３９】
前記細胞は原核生物細胞である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
前記原核生物細胞はエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属である、請求項３８または３９に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
前記原核生物細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４２】
請求項４〜１０または１４〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質を製造する方法であって、前記タンパク質が発現される条件下で、前記タンパク質を発現するように操作された組換え細胞または前記タンパク質をコードするベクターで形質転換された宿主細胞を培養することを含む方法。
【請求項４３】
前記タンパク質が前記組換え細胞または前記宿主細胞から分泌される条件下で、前記組換え細胞または前記宿主細胞を細胞培養物中で培養する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記タンパク質から前記シグナルポリペプチドが開裂される条件下で、前記組換え細胞または前記宿主細胞を細胞培養物中で培養する、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞培養物から前記タンパク質を回収することをさらに含む、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記タンパク質を回収することは、細胞および／または細胞残屑を除去するための遠心分離を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記タンパク質を回収することは、細胞および／または細胞残屑を除去するためにろ過することを含む、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
細胞からのタンパク質分泌速度を増加させる方法であって、（ａ）前記タンパク質をコードする請求項２７に記載の核酸または請求項２９〜３３のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞を細胞培養物中で培養すること、（ｂ）前記タンパク質の発現を誘導すること、および（ｃ）前記細胞培養物の上清中に分泌された前記タンパク質を回収することを含み、前記タンパク質分泌速度を、ｄｓｂＡシグナルポリペプチドを有するタンパク質のタンパク質分泌速度と比較する、方法。
【請求項４９】
前記（ｃ）の回収することを、前記（ｂ）の誘導することから８〜１２時間後に行う、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記タンパク質分泌速度は１時間当たり２０％を超えて増加している、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
細胞から分泌されるタンパク質の量を増加させる方法であって、（ａ）前記タンパク質をコードする請求項２７に記載の核酸または請求項２９〜３３のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞を細胞培養物中で培養すること、（ｂ）前記タンパク質の発現を誘導すること、および（ｃ）前記細胞培養物の上清中に分泌された前記タンパク質を回収することを含み、前記分泌されたタンパク質の量を、ｄｓｂＡシグナルポリペプチドを有するタンパク質と比較する、方法。
【請求項５２】
前記細胞から分泌された前記タンパク質の量は、ｄｓｂＡシグナルポリペプチドを有するタンパク質と比較して２０％を超えて増加している、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞から分泌された前記タンパク質の量は、ｄｓｂＡシグナルポリペプチドを有するタンパク質と比較して１００％を超えて増加している、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
タンパク質を製造する方法であって、
ａ．請求項２７に記載の核酸または請求項２９〜３３のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞を培養し、その結果、前記核酸が発現され、それにより、前記宿主細胞中で前記核酸または前記ベクターが発現されると、前記核酸または前記ベクターにコードされるタンパク質が前記細胞から上清中に分泌される、培養すること、および
ｂ．前記上清から前記分泌されたタンパク質を単離すること
を含む方法。
【請求項５５】
前記宿主細胞または前記組換え細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項４１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記タンパク質から前記シグナルポリペプチドが開裂される条件下で、前記宿主細胞を細胞培養物中で培養する、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記分泌されたタンパク質を単離することは、細胞および／または細胞残屑を除去するための遠心分離を含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記分泌されたタンパク質を単離することは、細胞および／または細胞残屑を除去するためにろ過することを含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
請求項４２〜５８のいずれか一項に記載の方法により製造されたタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出しており、それにより全体が参照によって組み込まれる配列表を含む。２０１７年１０月１９日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーの名称はＮＳＰ４−１００−ＷＯ−ＰＣＴ−ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇであり、サイズは１７，０２１バイトである。
【０００２】
技術分野
本発明は、異種ポリペプチドの排泄的産生を改善するためのシグナルポリペプチド、このシグナルポリペプチドを含むタンパク質、このシグナルポリペプチドをコードする核酸、およびこれらを製造する方法に関する。例示的な実施形態として、アルファ毒素に付着した、改善されたシグナルポリペプチド、およびアルファ毒素を製造して単離する方法が挙げられる。
【背景技術】
【０００３】
細菌中での発現は、医薬用のおよび工業用のタンパク質の商業的製造のために選択される方法であり得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における商業的に重要な異種組換えタンパク質のペリプラズム中へのまたは培養培地中への分泌は、商業的に重要な組換えタンパク質の製造においていくつかの利点を提供し、この利点として下記が挙げられる：コストおよび時間の節約、内毒素の減少、安価な炭素源による増殖、迅速なバイオマス蓄積、高細胞密度発酵に対する適応性、ならびに単純なプロセススケールアップ（Ｍｅｒｇｕｌｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ２３：１７７−２０２（２００５）；Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ  ３０：４６５−５０６（１９９６））。これらの理由のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系での組換えタンパク質の分泌効率を改善すべく、シグナルペプチド改変およびシャペロンの共発現等の多くの研究が行われている（Ｂａｎｅｙｘ  ａｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２：１３９９−１４０８（２００４）；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６４：６２５−６３５（２００４）；Ｃｏｒｎｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １１：４５０−４５４（２０００）；Ｋｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  １１：９７−１０６（２０１２））。
【０００４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）分泌経路では、シグナルポリペプチドは、この分泌プロセスの最中での組換えタンパク質のトランスロケーションおよび分泌において重要な役割を果たす。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）系での組換えタンパク質の分泌を改善するために、多数のシグナルポリペプチドが研究されている（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２０：２５２−２６４（２０００）；Ｖｅｌａｉｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６４：５４３−５５０（２０１４）；Ｊｏｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：４８−５８（２０１２）；Ｉｓｍａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ３３：９９９−１００５（２０１１）；Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ３：３３４−３３８（２０１１）；Ｎａｇａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４４７：６５５−６５９（２０１４））。一般に、組換えタンパク質は細胞質膜を通ってペリプラズム空間中に分泌され、シグナルポリペプチドは、排出の最中にシグナルペプチダーゼにより開裂される。通常、分泌された組換えタンパク質は、ペリプラズム空間から外膜を通って培養培地中へと細胞外に放出される。
【０００５】
シグナルポリペプチドは組換えタンパク質前駆体のｎ末端領域に位置しており、このｎ末端領域は、分泌経路中で新生のポリペプチド鎖がリボソームから出現する場合にシグナル認識粒子（ＳＰＲ）により認識される。シグナルポリペプチドは長さが２０〜３０個のアミノ酸残基であり、３つの識別可能な構造的特徴を有する。これら３つの領域は、正味の正電荷を有するアミノ末端領域（ｎ領域）、それに続く疎水性領域（ｈ領域）、次いで開裂部位に対して−３（Ｐ３）位および−１（Ｐ１）位で小さい残基が優先されるプロテアーゼ認識配列（ｃ領域）で構成されている（Ｍｅｒｇｕｌｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖ  ２３：１７７−２０２（２００５）；Ｐａｅｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １８４３：１４９７−１５０８（２０１４）；Ｐａｅｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８７：２７−４９（２０００））。特に、このｈ領域は、分泌プロセスの最中に細菌の細胞質膜を横断するタンパク質トランスロケーションにとって重要な領域であり、なぜならば、トランスロケーション効率はｈ領域の長さおよび疎水性と共に増加し、且つ機能するためには最低限の疎水性が必要とされるからである（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７５：１０１５４−１０１５９（２０００））。多数の公開された文献には、シグナルポリペプチドの改変により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系における異種タンパク質の分泌が改善されたことが示されている（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２０：２５２−２６４（２０００）；Ｖｅｌａｉｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６４：５４３−５５０（２０１４）；Ｊｏｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：４８−５８（２０１２）；Ｉｓｍａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ３３：９９９−１００５（２０１１）；Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ３：３３４−３３８（２０１１）；Ｎａｇａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４４７：６５５−６５９（２０１４））。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルポリペプチドを対象とする。いくつかの実施形態では、このシグナルポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、このシグナルポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【０００７】
本開示はまた、（ｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルポリペプチドと、（ｉｉ）異種ポリペプチドとを含むタンパク質も対象とする。いくつかの実施形態では、このタンパク質は、（ｉ）配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルポリペプチドと、（ｉｉ）異種ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、このタンパク質は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むシグナルポリペプチドと、（ｉｉ）異種ポリペプチドとを含む。
【０００８】
本発明では様々な異種ポリペプチドを使用し得る。いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドは２０個超のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドは分子量が２５ｋＤａ〜５０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドは分子量が３０ｋＤａ〜３５ｋＤａである。いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドは、酵素、毒素、抗体、抗体断片、抗原、治療用タンパク質およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドはアルファ毒素（ＡＴ）を含む。いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のアルファ毒素を含む。いくつかの実施形態では、このアルファ毒素は、Ｈ３５に対応するアミノ酸位置で置換を含む。いくつかの実施形態では、この置換はＨ３５Ｌ置換である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質を対象とする。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で説明されたシグナルポリペプチドまたはタンパク質を含む組成物を対象とする。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で説明されたシグナルポリペプチド（例えば配列番号１）または本明細書で説明されたシグナルポリペプチドを含むタンパク質をコードする核酸を対象とする。いくつかの実施形態では、この核酸は、（１）本明細書で説明されたシグナルポリペプチドをコードし、且つ（２）１箇所または複数箇所の制限酵素部位を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で説明された核酸を含むベクターを対象とする。いくつかの実施形態では、このベクターは複製起点をさらに含む。いくつかの実施形態では、このベクターは、この核酸に作動可能に連結されたプロモーター配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、このプロモーター配列は原核生物中で作動可能である。いくつかの実施形態では、このベクターは、プラスミド、トランスポゾンまたはウイルスベクターである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本開示は、シグナルポリペプチドを含む、本明細書で説明されたタンパク質を発現するように操作された組換え細胞を対象とする。いくつかの実施形態では、この組換え細胞は原核生物細胞である。いくつかの実施形態では、この原核生物細胞はエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属である。いくつかの実施形態では、この原核生物細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で説明されたベクターで形質転換された宿主細胞を対象とする。いくつかの実施形態では、この宿主細胞は原核生物細胞である。いくつかの実施形態では、この原核生物細胞はエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属である。いくつかの実施形態では、この原核生物細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で説明されたタンパク質を製造する方法であって、このタンパク質が発現される条件下で、このタンパク質を発現するように操作された組換え細胞またはこのタンパク質をコードするベクターで形質転換された宿主細胞を培養することを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、このタンパク質を細胞培養物（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）から回収することを含む。いくつかの実施形態では、このタンパク質を回収することは、細胞および／または細胞残屑を除去するための遠心分離を含む。いくつかの実施形態では、このタンパク質を回収することは、細胞および／または細胞残屑を除去するためにろ過することを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、このタンパク質が組換え細胞または宿主細胞から分泌される条件下で、この組換え細胞または宿主細胞を細胞培養物中で培養する。いくつかの実施形態では、このタンパク質からシグナルポリペプチドが開裂される条件下で、この組換え細胞または宿主細胞を細胞培養物中で培養する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞からのタンパク質分泌速度を増加させる方法であって、（ａ）このタンパク質をコードする、本明細書で説明された核酸またはベクターを含む宿主細胞を細胞培養物中で培養すること、（ｂ）このタンパク質の発現を誘導すること、および（ｃ）この細胞培養物の上清中に分泌されたタンパク質を回収することを含み、このタンパク質分泌速度を、ｄｓｂＡシグナルポリペプチドを有するタンパク質のタンパク質分泌速度と比較する、方法を対象とする。いくつかの実施形態では、（ｃ）の回収することを、（ｂ）の誘導することから８〜１２時間後に行う。いくつかの実施形態では、このタンパク質分泌速度は１時間当たり２０％を超えて増加している。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞から分泌されるタンパク質の量を増加させる方法であって、（ａ）本明細書で説明されたタンパク質をコードする核酸またはベクターを含む宿主細胞を細胞培養物中で培養すること、（ｂ）このタンパク質の発現を誘導すること、および（ｃ）この細胞培養物の上清中に分泌されたタンパク質を回収することを含み、この分泌されたタンパク質の量を、ｄｓｂＡシグナルポリペプチドを有するタンパク質と比較する、方法を対象とする。いくつかの実施形態では、細胞から分泌されたタンパク質の量は、ｄｓｂＡシグナルポリペプチドを有するタンパク質と比較して２０％を超えて増加している。いくつかの実施形態では、細胞から分泌されたタンパク質の量は、ｄｓｂＡシグナルポリペプチドを有するタンパク質と比較して１００％を超えて増加している。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本開示は、タンパク質を製造する方法であって、ａ）本明細書で説明された核酸またはベクターを含む宿主細胞を培養し、その結果、この核酸が発現され、それにより、この宿主細胞中で核酸またはベクターが発現されると、この核酸またはベクターにコードされるタンパク質が細胞から上清中に分泌される、培養すること、およびｂ）この上清から、分泌されたタンパク質を単離することを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、この宿主細胞または組換え細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。いくつかの実施形態では、このタンパク質からシグナルポリペプチドが開裂される条件下で、この宿主細胞を細胞培養物中で培養する。いくつかの実施形態では、分泌されたタンパク質を単離することは、細胞および／または細胞残屑を除去するための遠心分離を含む。いくつかの実施形態では、分泌されたタンパク質を単離することは、細胞および／または細胞残屑を除去するためにろ過することを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で説明された方法のいずれかにより製造されたタンパク質を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｍｉｃｒｏ２４バイオリアクタによるフェドバッチプロセスにおける、ＡＴＨ３５Ｌに共役した細菌シグナルポリペプチドのスクリーニングを示す図である。試料を回収し、０．５ｍＭのＩＰＴＧによる誘導後１４時間で遠心沈殿させた。上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ変性ゲルにロードし、ＡＴＨ３５Ｌに対するモノクローナル抗体を使用してウエスタンブロットにより定量した。矢印は、培養培地中の分泌されたＡＴＨ３５Ｌタンパク質を示し、精製したＡＴＨ３５Ｌを参照としてロードした。
【図２】本研究で使用した新規のシグナルペプチド構築物の略図である。この図は、ＡＴＨ３５Ｌに共役した新規のシグナルポリペプチドの様々な構造上の組み合わせを示す。ＡＴＨ３５Ｌに共役した、使用したシグナルポリペプチドを、各構築物の左側で説明する。（図２Ａ）セットＩの新規のシグナルポリペプチドＮＳＰ１〜ＮＳＰ６を、ｄｓｂＡｓｓおよびｐｅｌＢｓｓの改変により作成した。（図２Ｂ）セットＩＩの新規のシグナルポリペプチドＮＳＰ４ａ〜ＮＳＰ４ｃを、ＮＳＰ４のｈ領域中でのアミノ酸シャフリングまたはロイシンもしくはアラニンによるアミノ酸の置き換えにより作成した。（図２Ｃ）セットＩＩＩの新規のシグナルポリペプチドＮＳＰ３ａ〜ＮＳＰ３ｄを、ＮＳＰ３のｈ領域中でのアミノ酸シャフリングにより作成した。ｈ領域中の各アミノ酸の隣の数字は、ｈ領域中のアミノ酸の位置を示す。（図Ａ、図Ｂおよび図Ｃ）Ｄ−Ｎ、Ｄ−ＨおよびＤ−Ｃはそれぞれ、ｄｓｂＡｓｓのｎ領域、ｈ領域およびｃ領域を表す。Ｐ−Ｎ、Ｐ−ＨおよびＰ−Ｃはそれぞれ、ｐｅｌＢｓｓのｎ領域、ｈ領域およびｃ領域を表す。
【図３】１Ｌのフェドバッチ培養における、セットＩの新規のシグナルポリペプチドによるＡＴＨ３５Ｌの分泌効率を示す図である。図３Ａおよび図３Ｂ。変性条件での電気泳動による、培養培地中での分泌されたＡＴＨ３５Ｌの評価。矢印は、分泌されたＡＴＨ３５Ｌタンパク質を示す。図３Ｃ。カスタマイズされたＯｃｔｅｔアッセイによる、培養培地中での分泌されたＡＴＨ３５Ｌの定量。ＮＳＰ２、ＮＳＰ４およびＮＳＰ６は、それらの構造において同一のｈ領域を共有する。興味深いことに、ＡＴＨ３５Ｌの分泌効率は、ＮＳＰ２およびＮＳＰ４により増強されたがＮＳＰ６により低下した。
【図４】１Ｌのフェドバッチ培養における、セットＩＩの新規のシグナルポリペプチドによるＡＴＨ３５Ｌの分泌効率を示す図である。分泌されたＡＴＨ３５Ｌの評価および定量をそれぞれ、変性条件での電気泳動およびカスタマイズされたＯｃｔｅｔアッセイにより実施した。ｈ領域中でのアミノ酸シャフリングはＡＴＨ３５Ｌの分泌効率に影響を及ぼす（ＮＳＰ４ａ）。ＮＳＰ４ｂのｈ領域は、ポリロイシンとして強い疎水性アミノ酸のみを含むが、ＡＴＨ３５Ｌの分泌効率は低下した。
【図５】１Ｌのフェドバッチ培養における、セットＩＩＩの新規のシグナルポリペプチドのｈ領域中でのアミノ酸シャフリングによるＡＴＨ３５Ｌの分泌効率を示す図である。アミノ酸シャフリングによる疎水性の変化は、ＡＴＨ３５Ｌの分泌効率に有意に影響を及ぼす。
【図６】１Ｌのフェドバッチ培養における、細胞外ＡＴＨ３５Ｌの産生性のための誘導の長さの最適化を示す図である。図６Ａおよび図６Ｂ。アスタリスクは、細胞の過剰増殖に起因して死滅した細胞から放出されたＡＴＨ３５Ｌプレタンパク質を示す。矢印は、分泌プロセスの最中に適切に分泌された成熟ＡＴＨ３５Ｌを示す。図６Ｃ。ＡＴＨ３５Ｌの定量を、カスタマイズされたＯｃｔｅｔアッセイにより測定した。
【図７】コドン最適化ＡＴＨ３５Ｌヌクレオチド配列（配列番号５）（図７Ａ）、ＡＴアミノ酸配列（配列番号３）（図７Ｂ）、ＡＴＨ３５Ｌアミノ酸配列（配列番号４）（図７Ｃ）およびＮＳＰ４ｓｓ＋ＡＴＨ３５Ｌ（配列番号２）（図７Ｄ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、シグナルポリペプチド、およびこのシグナルポリペプチドと異種ポリペプチドとを含むタンパク質であって、このシグナルポリペプチドはこの異種ポリペプチドの分泌を改善する、タンパク質を対象とする。
【００２２】
単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において用語「含む」と共に使用される場合、「１つ」を意味し得るが、「１つまたは複数（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」、「少なくとも１つ」および「１つまたは複数（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ）」の意味とも一致する。
【００２３】
本出願全体を通して、用語「約」は、値が、この値を決定するために利用される方法／装置に固有の誤差の変動または研究対象の間に存在する変動を含むことを示すために使用される。典型的には、この用語は、状況に応じて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％もしくは２０％またはこれら未満の変動性を包含することを意味する。
【００２４】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみを指すと明示的に示されていない限り、またはこの選択肢が互いに排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢のみならびに「および／または」を指す定義を支持する。
【００２５】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」等の含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）のあらゆる形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに、「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」等の有する（ｈａｖｉｎｇ）のあらゆる形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」等の含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）のあらゆる形態）、または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」等の含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）のあらゆる形態）は包括的またはオープンエンドであり、列挙されていない追加の要素または方法の工程を除外しない。本明細書で論じられたあらゆる実施形態を本開示のあらゆる方法またはポリペプチド、タンパク質、核酸およびベクターに関して実行し得、その逆もまた同様であると考えられる。さらに、本開示のポリペプチド、タンパク質、核酸およびベクターを使用して本開示の方法を達成し得る。
【００２６】
トランスロケーション系
作動可能に連結された目的のポリペプチドのペリプラズムへのまたは細胞外環境中へのターゲティングを促進する新規のシグナルポリペプチドが提供される。本発明の目的のために、用語「シグナルポリペプチド」、「分泌シグナル」、「分泌シグナルポリペプチド」、「シグナルポリペプチド」または「リーダー配列」は、作動可能に連結された目的のポリペプチドのペリプラズムへのまたは細胞外空間中へのターゲティングに有用であるペプチド配列を含むように意図されている。
【００２７】
本発明のシグナルポリペプチドにより、細菌中での組換えタンパク質のこれまでの産生方法が改善される。本明細書でのシグナルポリペプチドは、細胞内環境からのタンパク質の分泌を増加させることによりタンパク質の産生（回収）を増加させ得る。ペリプラズム空間中への分泌はまた、適切なジスルフィド結合形成を容易にするという公知の効果も有する（Ｍａｎｏｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：３５−４７（２０００））。組換えタンパク質の分泌の他の利点として下記が挙げられる：このタンパク質のより効率的な単離；活性型のタンパク質の割合を増加させる、トランスジェニックタンパク質の適切な折り畳みおよびジスルフィド結合形成；封入体の形成の減少および宿主細胞に対する毒性の減少；ならびに可溶性形態の組換えタンパク質の割合の増加。目的のタンパク質の培養培地中への排泄の可能性は、タンパク質産生のためのバッチ培養ではなく連続培養も潜在的に促進し得る。
【００２８】
グラム陰性菌では、細胞質から分泌されたタンパク質は、最終的にはペリプラズム空間中であり得る、外膜に付着し得る、または細胞外ブロス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｒｏｔｈ）中であり得る。本明細書中のシグナルポリペプチドは、細胞内環境からペリプラズム空間中への、外膜に付着する、または細胞外ブロス中へのタンパク質の分泌を増加させることにより、タンパク質の産生を増加させ得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法はまた、凝集タンパク質で形成されている封入体を減少させることおよび／または除去することもできる。
【００２９】
原核生物（例えばグラム陽性菌およびグラム陰性菌）は、この原核生物の膜を横断してタンパク質を能動的に輸送するために、多数の系を進化させてきている。グラム陰性菌中での分泌経路として例えば下記が挙げられる：細胞膜および外膜の両方を横断する一段階トランスロケーションのためのＡＢＣ（Ｉ型）経路、Ｐａｔｈ／Ｆｌａ（ＩＩＩ型）経路およびＰａｔｈ  ％Ｖｉｒ（ＩＶ型）経路；細胞膜を横断するトランスロケーションのためのＳｅｃ（ＩＩ型）経路、Ｔａｔ経路、ＭｓｃＬ経路およびＨｏｌｉｎｓ経路；ならびに細胞膜および外膜を横断する２段階トランスロケーションのためのＳｅｃ−プラス−フィンブリアルアッシャーポーリン（Ｓｅｃ−ｐｌｕｓ−ｆｉｍｂｒｉａｌ  ｕｓｈｅｒ  ｐｏｒｉｎ）（ＦＵＰ）経路、Ｓｅｃ−プラス−オートトランスポーター（Ｓｅｃ−ｐｌｕｓ−ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）（ＡＴ）経路、Ｓｅｃ−プラス−２パートナー分泌（Ｓｅｃ−ｐｌｕｓ−ｔｗｏ  ｐａｒｔｎｅｒ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）（ＴＰＳ）経路、Ｓｅｃ−プラス−メインターミナルブランチ（Ｓｅｃ−ｐｌｕｓ−ｍａｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｂｒａｎｃｈ）（ＭＴＢ）経路およびＴａｔ−プラス−ＭＴＢ経路。全ての細菌がこれらの分泌経路の全てを有しているとは限らない。そのため、一部の実施形態では、本発明は、本明細書で説明されたシグナルポリペプチドを使用して、ＡＢＣ（Ｉ型）経路、Ｐａｔｈ／Ｆｌａ（ＩＩＩ型）経路、Ｐａｔｈ  ％Ｖｉｒ（ＩＶ型）経路；Ｓｅｃ（ＩＩ型）経路、Ｔａｔ経路、ＭｓｃＬ経路、Ｈｏｌｉｎｓ経路、Ｓｅｃ−プラス−フィンブリアルアッシャーポーリン（ＦＵＰ）経路、Ｓｅｃ−プラス−オートトランスポーター（ＡＴ）経路、Ｓｅｃ−プラス−２パートナー分泌（ＴＰＳ）経路、Ｓｅｃ−プラス−メインターミナルブランチ（ＭＴＢ）経路およびＴａｔ−プラス−ＭＴＢ経路を使用して膜を横断するタンパク質のトランスロケーションを増加させる方法を対象とする。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されたシグナルポリペプチドはＳｅｃ分泌系を利用する。このＳｅｃ系は、Ｎ末端シグナルポリペプチドを有するタンパク質の細胞質膜を横断する排出に関与していることが報告されており（Ａｇａｒｒａｂｅｒｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｃｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１５１３：１−２４（２００１）；Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６６：１０７−１５７（２００１）を参照されたい）、これらの文献はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。Ｓｅｃファミリのタンパク質複合体は、原核生物および真核生物で普遍的に見出される。細菌Ｓｅｃ系は、輸送タンパク質、シャペロンタンパク質（ＳｅｃＢ）またはシグナル認識粒子（ＳＲＰ）、ならびにシグナルペプチダーゼ（ＳＰアーゼＩおよびＳＰアーゼＩＩ）からなる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のＳｅｃ輸送複合体は、３種の必須の内膜タンパク質であるＳｅｃＹ、ＳｅｃＥおよびＳｅｃＧと、細胞質ＡＴＰアーゼであるＳｅｃＡとからなる。ＳｅｃＡは、ＳｅｃＹ／Ｅ／Ｇ複合体を動員して、活性のトランスロケーションチャネルを形成する。シャペロンタンパク質ＳｅｃＢは、新生ポリペプチド鎖に結合してこの新生ポリペプチド鎖の折り畳みを防止し、この新生ポリペプチド鎖の標的をＳｅｃＡに定める。その後、この線状ポリペプチド鎖はＳｅｃＹＥＧチャネルを通って輸送され、シグナルポリペプチドの開裂後、タンパク質はペリプラズム中で折り畳まれる。３種の補助タンパク質（ＳｅｃＤ、ＳｅｃＦおよびＹａｊＣ）は、分泌に必須ではない複合体を形成するが、多くの条件下で（特に低温で）分泌を最大１０倍に刺激する。
【００３１】
ペリプラズム中に輸送されるタンパク質（即ち、ＩＩ型分泌系を介して輸送されるタンパク質）はまた、さらなる工程で細胞外培地中にも排出され得る。この機序は概して、オートトランスポーター、２パートナー分泌系、メインターミナルブランチ系またはフィンブリアルアッシャーポーリンを介してである。いくつかの実施形態では、本発明は、ＩＩ型分泌系を使用して、本明細書で説明されたシグナルポリペプチドを含むタンパク質の、膜を横断したトランスロケーションを増加させる方法を対象とする。
【００３２】
シグナルポリペプチドは分泌系のタンパク質と相互作用し、その結果、細胞はこのタンパク質をその適切な目的地へと正確に誘導する。８種の既知のシグナルポリペプチドベースの分泌系のうちの５種は、Ｓｅｃ系に関与するものである。これらの５種は、Ｓｅｃ依存性の細胞質膜トランスロケーションに関与するといわれており、このトランスロケーションで作動するこれらのシグナルポリペプチドは、Ｓｅｃ依存性のシグナルポリペプチドと称され得る。適切な分泌シグナルの開発での問題の１つは、このシグナルが適切に発現され、発現されたタンパク質から開裂されることを確実にすることである。
【００３３】
Ｓｅｃ経路用のシグナルポリペプチドは概して、下記の３つドメインからなる：（ｉ）正荷電したｎ領域、（ｉｉ）疎水性のｈ領域、および（ｉｉｉ）非荷電ではあるが極性のｃ領域。シグナルペプチダーゼ用の開裂部位はｃ領域に位置する。しかしながら、シグナルポリペプチドの保存および長さの程度、ならびに開裂部位の位置は、様々なタンパク質の間で異なり得る。
【００３４】
Ｓｅｃ依存性のタンパク質排出のシグネチャは、排出されるタンパク質中の短くて（約３０個のアミノ酸）主に疎水性のアミノ末端シグナルポリペプチドの存在である。このシグナルポリペプチドはタンパク質排出を助け、排出されたタンパク質がペリプラズムに達した場合にはペリプラズムのシグナルペプチダーゼにより開裂除去される。典型的なＮ末端Ｓｅｃシグナルポリペプチドは、少なくとも１個のアルギニン残基またはリシン残基を有するＮドメイン、続いて一続きの疎水性残基を含むドメイン、およびシグナルペプチダーゼ用の開裂部位を含むＣドメインを含む。
【００３５】
シグナルポリペプチド
本発明のいくつかの実施形態では、シグナルポリペプチドが提供され、このシグナルポリペプチドは、作動可能に連結された目的のタンパク質またはポリペプチドの（グラム陰性菌の）ペリプラズムへのまたは細胞外空間中へのターゲティングに使用され得る新規の分泌シグナルポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本発明のシグナルポリペプチドは、ＤａｂＡｓｓのＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインと、ＰｅｌＢｓｓのＨドメインとを含む。いくつかの実施形態では、本発明のシグナルポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、このシグナルポリペプチドは単離ポリペプチドである。好ましい実施形態では、このシグナルポリペプチドは、目的の異種ポリペプチドのＮ末端で付着している。
【００３６】
本発明のシグナルポリペプチドは、このシグナルポリペプチドの疎水性領域（ｈ領域）を示し、このｈ領域アミノ酸の位置は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのタンパク質の分泌効率に有意に影響を及ぼす。例えば、本明細書中に見出される実施例で実証されているように、本発明のシグナルポリペプチドに付着したアルファ毒素（ＡＴＨ３５Ｌタンパク質）は、ｄｓｂＡｓｓシグナルポリペプチドまたはｐｅｌＢｓｓシグナルポリペプチドのいずれかを含むアルファ毒素と比較して分泌効率が高い。加えて、本発明のシグナルポリペプチドは、多型を伴わないｈ領域アミノ酸の位置のシフトがタンパク質の分泌効率を変更したことを示す。
【００３７】
いくつかの実施形態では、このシグナルポリペプチドはＭＫＫＩＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号１）である。いくつかの実施形態では、このシグナルポリペプチドは、配列番号１と約７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、このシグナルポリペプチドは、配列番号１と約９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、このシグナルポリペプチドは、配列番号１と約９５％同一のアミノ酸配列を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、このシグナルポリペプチドは、配列番号１と実質的に相同である、または実質的に類似している。「実質的に相同」または「実質的に類似」は、標準的なパラメータを使用して、本明細書で説明されたアラインメントプログラムのうちの１つを使用して、参照配列と比較して少なくとも約６０％または６５％の配列同一性、約７０％または７５％の配列同一性、約８０％または８５％の配列同一性、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％またはより高い配列同一性を有するアミノ酸が意図されている。
【００３９】
いくつかの実施形態では、このシグナルポリペプチドは配列番号１の断片を含み、この断片は、アミノ末端またはカルボキシ末端から１個、２個、３個または４個のアミノ酸（好ましくは１個または２個のアミノ酸）がトランケートされているが生物活性（即ち、分泌シグナル活性）を保持する。いくつかの実施形態では、このシグナルポリペプチドは、１個、２個、３個または４個のアミノ酸（好ましくは１個または２個のアミノ酸）が欠失している、配列番号１のアミノ酸配列から欠失した内部アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、このシグナルポリペプチドは、１個、２個、３個または４個のアミノ酸が挿入されている、配列番号１のアミノ酸配列に挿入された内部アミノ酸または外部アミノ酸を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、このシグナルポリペプチドは配列番号１の断片を含み、この断片では、１個、２個、３個または４個のアミノ酸（好ましくは１個または２個のアミノ酸）が異なるアミノ酸で置き換えられている（即ち置換されている）。いくつかの実施形態では、置き換えられたアミノ酸は、保存的置換、高度に保存された置換、または非常に高度に保存された置換である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。保存的アミノ酸置換、高度に保存されたアミノ酸置換、および非常に高度に保存されたアミノ酸置換の例が表１に見られる。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
いくつかの実施形態では、欠失、置換または挿入は、このシグナルポリペプチドの類似の疎水性を維持する。例えば、いくつかの実施形態では、配列番号１のシグナルポリペプチドは、このシグナルポリペプチドのＨドメイン中に類似の（または場合によっては同一の）疎水性を有する。
【００４３】
場合によっては、配列番号１の１個、２個、３個または４個のアミノ酸は互いに位置を変える。いくつかの実施形態では、配列番号１のシグナルポリペプチドの欠失、置換または挿入は元々のポリペプチドの所望の機能を保持し、即ち、このシグナルポリペプチドは、付着したタンパク質の細胞内環境からペリプラズム空間中への分泌、外膜への付着、または細胞外ブロス中への分泌を促進し得る。
【００４４】
異種（ＨＥＴＥＲＯＬＯＵＧＯＵＳ）ポリペプチド
いくつかの実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルポリペプチドと、（ｉｉ）異種ポリペプチドとを含むタンパク質を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルポリペプチドと、（ｉｉ）異種ポリペプチドとを含むタンパク質を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むシグナルポリペプチドと、（ｉｉ）異種ポリペプチドとを含むタンパク質を対象とする。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「異種ポリペプチド」、「所望のポリペプチド」、「異種ポリペプチド／タンパク質」または「目的のタンパク質」は、天然に存在するおよび天然には存在しないポリペプチドまたはタンパク質等のあらゆるポリペプチドまたはタンパク質であり得る。本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は同義ではあるが、便宜上、場合によっては、用語「タンパク質」は、開裂されていないシグナルポリペプチドを含む「異種ポリペプチド」を指すために使用される。異種ポリペプチドは、完全なまたは部分的なタンパク質と、機能するタンパク質および機能しないタンパク質の両方とを指し得る。「ペプチド」は、ポリペプチドの断片または部分（好ましくは、完全なポリペプチド配列としての少なくとも１種の機能的活性を有する断片または部分）として定義される。
【００４６】
異種ポリペプチドに関して本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、長さが少なくとも３個のアミノ酸残基であるペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは長さが少なくとも約１０個のアミノ酸残基であり、例えば少なくとも１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個または１００個のアミノ酸残基であり、これら列挙した値のうちの任意の２つの間の範囲も挙げられる。いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドは２０個超のアミノ酸残基を含み、３０個超のアミノ酸残基を含み、４０個超のアミノ酸残基を含み、５０個超のアミノ酸残基を含み、６０個超のアミノ酸残基を含み、７０個超のアミノ酸残基を含み、８０個超のアミノ酸残基を含み、９０個超のアミノ酸残基を含み、１００個超のアミノ酸残基を含み、１２０個超のアミノ酸残基を含み、１５０個超のアミノ酸残基を含み、２００個超のアミノ酸残基を含み、２５０個超のアミノ酸残基を含み、３００個超のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドは２０個超のアミノ酸を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドは２０個未満のアミノ酸残基を含み、３０個未満のアミノ酸残基を含み、４０個未満のアミノ酸残基を含み、５０個未満のアミノ酸残基を含み、６０個未満のアミノ酸残基を含み、７０個未満のアミノ酸残基を含み、８０個未満のアミノ酸残基を含み、９０個未満のアミノ酸残基を含み、１００個未満のアミノ酸残基を含み、１２０個未満のアミノ酸残基を含み、１５０個未満のアミノ酸残基を含み、２００個未満のアミノ酸残基を含み、２５０個未満のアミノ酸残基を含み、３００個未満のアミノ酸残基を含み、４００個未満のアミノ酸残基を含み、または５００個未満のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドは５０個未満のアミノ酸を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドは１０〜３００個のアミノ酸残基を含み、１０〜２００個のアミノ酸残基を含み、１０〜１００個のアミノ酸残基を含み、１０〜５０個のアミノ酸残基を含み、１５〜４０個のアミノ酸残基を含み、２０〜４０個のアミン酸を含み、２５〜５０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドは２５〜４０個のアミノ酸を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドは分子量が５ｋＤａ〜２００ｋＤａであり、１０ｋＤａ〜１５０ｋＤａであり、１５ｋＤａ〜１２０ｋＤａであり、２０ｋＤａ〜１００ｋＤａであり、２５ｋＤａ〜７５ｋＤａであり、２５ｋＤａ〜５０ｋＤａであり、３０ｋＤａ〜４０ｋＤａであり、または３０ｋＤａ〜３５ｋＤａである。いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドは分子量が２５ｋＤａ〜５０ｋＤａであり、または３０ｋＤａ〜３５ｋＤａである。用語「ポリペプチド」はタンパク質をさらに含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドは単離され得る。「単離」タンパク質または「単離」ポリペプチドとは、これらが細胞中に存在している状態を超えた状態まで精製されているタンパク質またはポリペプチドのことである。ある特定の実施形態では、これらは少なくとも１０％純粋であり得、他では、これらは実質的に８０％もしくは９０％の純度またより高くまで精製され得る。単離タンパク質または単離ポリペプチドとして、本質的に純粋なタンパク質またはポリペプチド、化学合成によりまたは生物学的方法と化学的方法との組み合わせにより製造されたタンパク質またはポリペプチド、および単離されている組換えタンパク質または組換えポリペプチドが挙げられる。本明細書において「組換え」と称されるタンパク質またはポリペプチドとは、組換え核酸の発現により製造されるタンパク質またはポリペプチドのことである。
【００５１】
本発明の異種ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドであってもよい。あるいは、この異種ポリペプチドは、最大いくつかの整数個のアミノ酸変更を含んでもよい。そのようなタンパク質バリアントまたはポリペプチドバリアントは機能性を保持し、１個もしくは複数個のアミノ酸残基の付加、欠失もしくは置換により異なる変異体または１個もしくは複数個の改変残基を含む改変ポリペプチドおよび改変変異体を含む。このバリアントは、置換アミノ酸が類似の構造的特性または化学的特性を有する、１つまたは複数の保存的変化（例えば、イソロイシンによるロイシンの置き換え）を有し得る。変更は、参照ポリペプチド配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置で起こり得る、またはこれらの末端位置の間のいずれでも起こり得る、参照配列中のアミノ酸の間でいずれか個々に散在して起こり得る、または参照配列内の１つまたは複数の連続基で起こり得る。
【００５２】
ある特定の実施形態では、このバリアントポリペプチドは、その天然に存在するポリペプチドに対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。配列同一性のパーセントを、コンピュータプログラム（例えば、ＮＣＢＩおよび他の供給源から公的に利用可能なＢＬＡＳＴＰプログラムおよびＴＢＬＡＳＴＮプログラム）または直接配列比較を使用して算出し得る。ポリペプチドバリアントを、当分野で既知の技術（例えば、単離ポリペプチドへの直接改変、直接合成、または例えば組換えＤＮＡ技術を使用する、ポリペプチドをコードする核酸配列への改変）を使用して製造し得る。
【００５３】
改変異種ポリペプチド（例えば、翻訳後改変を有するもの）も本明細書で企図される。単離ポリペプチドを、例えばリン酸化、メチル化、ファルネシル化、カルボキシメチル化、ゲラニルゲラニル化、グリコシル化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミン酸化（ｐａｌｍｉｔａｔｉｏｎ）、アミド化、硫酸化、アシル化または他のタンパク質改変により改変し得る。この単離ポリペプチドを、直接的にまたは間接的に検出可能なシグナルを生じ得る標識（例えば、限定されないが放射性同位体または蛍光化合物）で改変してもよい。このポリペプチドは、標準的な方法により抗体を調製するための抗原として有用であり得る。
【００５４】
この異種ポリペプチドを、宿主細胞からのこの異種ポリペプチドの分泌を指示するために、（例えば組換え技術を使用して）本開示に係るシグナルポリペプチドに融合させ得る。いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドはシグナルポリペプチドに融合され得るが、このシグナルポリペプチドとこの異種ポリペプチドとの間にスペーサーポリペプチドを有する。このシグナルポリペプチドのこの異種ポリペプチドのへの融合を、当業者に既知の方法により（例えば組換え技術を使用して）達成させ得る。これに関連して、この異種ポリペプチドは、この異種ポリペプチドがペリプラズムまたは細胞外環境に輸送されると「分泌されたポリペプチド」と称され、完全ポリペプチドまたはポリペプチドの機能ドメインを含み得る。宿主細胞から分泌されることが望ましいあらゆる異種ポリペプチド（例えば、酵素または薬学的に活性なタンパク質等）は、本明細書で説明されたシグナルポリペプチとの使用に適している。シグナルポリペプチドは概して、分泌されるポリペプチドのアミノ末端に融合している。融合ポリペプチドは、分泌されるポリペプチドまたはそのドメインのアミノ末端に付着するシグナルペプチドをコードする融合核酸分子で形質移入された組換え細胞を培養することにより産生され得る。ある特定の実施形態では、この融合シグナルポリペプチドはまた、分泌される異種ポリペプチドの分泌の指示に加えて、この分泌される異種ポリペプチドの発現も増加させ得る。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「分泌される」および同類のものは、細胞により産生されるポリペプチドであって、膜を横断してまたは通り抜けて輸送され、細胞により、このポリペプチドが発現される細胞のペリプラズム、外膜または細胞外環境へと排出されるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、「分泌された」タンパク質として、このタンパク質が発現される細胞から完全に分泌されているタンパク質（例えば、可溶性タンパク質）が挙げられるがこれに限定されない。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは細胞に安定して付着していない。いくつかの実施形態では、分泌された異種ポリペプチドは細胞外環境で可溶である。いくつかの実施形態では、分泌された異種ポリペプチドはアンカーを含まない。
【００５６】
分泌されたタンパク質の細胞外での存在を、目的のタンパク質を検出するための当分野で既知の任意のアッセイにより検出し得る。例として、酵素活性アッセイ、特異的抗体による検出（イムノブロッティング、ＥＬＩＳＡ等）および他の適切な検出技術が挙げられる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％、９５％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸を含むポリペプチドと、（ｉｉ）異種ポリペプチドとを含むタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本発明に包含されるタンパク質は生物学的に活性であり、即ち、このタンパク質は、シグナルポリペプチドの付着の有無にかかわらず異種ポリペプチドの所望の生物学的活性を保持し続ける。「活性を保持する」は、タンパク質が、異種ポリペプチドの少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約１００％、約１１０％、約１２５％、約１５０％、少なくとも約２００％またはより高い活性を有するであろうことが意図されている。
【００５８】
いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチド／タンパク質は活性型で産生される。用語「活性」は生物学的活性の存在を意味し、この生物学的活性は、対応する天然のタンパク質またはポリペプチドの生物学的活性に匹敵する、または実質的に相当する。タンパク質の文脈では、このことは概して、標準的なパラメータを使用して、ポリペプチドが、対応する天然のタンパク質またはポリペプチドと比較して少なくとも約２０％、約５０％、好ましくは少なくとも約６０〜８０％、最も好ましくは少なくとも約９０〜９５％の活性を有する生物学的な機能または効果を含むことを意味する。タンパク質またはポリペプチドの活性の決定を、特定のタンパク質またはポリペプチドに関する、対応する標準的な標的化比較生物学的アッセイを利用して実施し得る。目的のタンパク質またはポリペプチドが生物学的活性を維持することの１つの指標は、このポリペプチドが天然ポリペプチドと免疫学的に交差反応性であるということである。
【００５９】
本発明の方法および組成物は、細胞発現系での、適切にプロセシングされた目的の異種ポリペプチド／タンパク質の高レベルの産生に有用である。目的のタンパク質またはポリペプチドは、あらゆる種およびあらゆるサイズであり得る。しかしながら、ある特定の実施形態では、この異種ポリペプチド／タンパク質は、治療上有用なタンパク質またはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチド／タンパク質は哺乳動物タンパク質（例えばヒトタンパク質）であり得、例えば成長因子、サイトカイン、ケモカインまたは血液タンパク質であり得る。この異種ポリペプチド／タンパク質を、天然のタンパク質またはポリペプチドと類似の方法でプロセシングし得る。ある特定の実施形態では、この異種ポリペプチドはシグナルポリペプチドに融合している。いくつかの実施形態では、本明細書で説明されたタンパク質はシグナルポリペプチドを含む。
【００６０】
本発明の異種ポリペプチドは、ペリプラズムまたは細胞外環境に有利にトランスロケートされるあらゆるポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドは商業的に重要なポリペプチドである。いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドは、酵素、毒素、抗体、抗体断片、抗原、治療用タンパク質およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。所望の異種ポリペプチド／タンパク質の追加の例として下記が挙げられるがこれらに限定されない：ルシフェラーゼ；蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）；成長ホルモン（ＧＨ）およびそのバリアント；インスリン様成長因子（ＩＧＦ）およびそのバリアント；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびそのバリアント；エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびそのバリアント；インスリン、例えばプロインスリン、プレプロインスリン、インスリン、インスリンアナログおよび同類のもの；抗体およびそのバリアント、例えばハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体；抗体の抗原結合性断片（Ｆａｂ断片）、抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ断片）；ジストロフィンおよびそのバリアント；凝固因子およびそのバリアント；嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）およびそのバリアント；ならびにインターフェロンおよびそのバリアント、ならびに同類のもの。いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチドは、ワクチンで使用される抗原である。
【００６１】
本発明に係る異種ポリペプチド／タンパク質の例として下記が挙げられ得る：分子、例えばレニン、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；トロンボポエチン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子およびフォン・ヴィルブランド因子；抗凝固因子、例えばプロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子（ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｕｒｉｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）；肺表面活性剤；プラスミノーゲンアクチベーター、例えばウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子αおよびβ；エンケファリナーゼ；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミュラー阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ポリペプチド；微生物タンパク質、例えばベータ−ラクタマーゼ；Ｄｎアーゼ；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子のレセプター；インテグリン；プロテインＡまたはＤ；リウマトイド因子；神経栄養因子、例えば脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５もしくはＮＴ−６）、または神経成長因子、例えばＮＧＦ−１３；カルジオトロフィン（心臓肥大因子）、例えばカルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子、例えばａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−１９；エリスロポエチン；骨誘導因子；：免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン−アルファ、−ベータおよび−ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１０；抗ＨＥＲ−２抗体；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン；調節タンパク質；抗体；ならびに上記で列挙したポリペプチドのいずれかの断片。
【００６２】
ある特定の実施形態では、この異種ポリペプチド／タンパク質は下記から選択され得る：ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２ｅｌａｓｔｉ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８ＢＰａ、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＶＩＰ、エリスロポエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＭＳＦ、ＦＬＴ−３リガンド、ＥＧＦ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ；例えば、α−ＦＧＦ（ＦＧＦ−１）、β−ＦＧＦ（ＦＧＦ−２）、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６もしくはＦＧＦ−７）、インスリン様成長因子（例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）；腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ、リンホトキシン）、神経成長因子（例えばＮＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮβ、ＩＦＮ−γ）；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；オンコスタチンＭ；幹細胞因子（ＳＣＦ）；形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−γ）；ＴＮＦスーパーファミリ（例えば、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、ＳＴＡＬＬ−１／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（ＢＬｙ５、ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ）、ＴＮＦアルファ／ＴＮＦＳＦ２およびＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２）；またはケモカイン（ＢＣＡ−１／ＢＬＣ−１、ＢＲＡＫ／Ｋｅｃ、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ３、ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ、エオタキシン−１、エオタキシン−２／ＭＰＩＦ−２、エクソダス−２／ＳＬＣ、フラクタルカイン／ニューロタクチン、ＧＲＯアルファ／ＭＧＳＡ、ＨＣＣ−１、Ｉ−ＴＡＣ、リンホタクチン／ＡＴＡＣ／ＳＣＭ、ＭＣＰ−１１ＭＣＡＦ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ／ＳＴＣＰ−１／ＡＢＣＤ−１、ＭＩＰ−４／ＰＡＲＣ／ＤＣ−ＣＫ１、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１、ＴＡＲＣもしくはＴＥＣＫ）。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態では、この異種ポリペプチド／タンパク質は、マルチサブユニットタンパク質またはマルチサブユニットポリペプチドの全てまたは一部であり得る。発現され得るマルチサブユニットタンパク質として、ホモマータンパク質およびヘテロマータンパク質が挙げられる。このマルチサブユニットタンパク質は、同一であってもよいし異なっていてもよい２個以上のサブユニットを含み得る。例えば、この異種ポリペプチド／タンパク質は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個またはより多くのサブユニットを含むホモマータンパク質であってもよい。同様に、この異種ポリペプチド／タンパク質は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個またはより多くのサブユニットを含むヘテロマータンパク質であってもよい。例示的なマルチサブユニットタンパク質として下記が挙げられる：レセプター、例えばイオンチャネルレセプター；細胞外マトリックスタンパク質、例えばコンドロイチン；コラーゲン；免疫調節物質、例えばＭＨＣタンパク質、全長鎖抗体（ｆｕｌｌ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）および抗体断片；酵素、例えばＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ；ならびに膜タンパク質。
【００６４】
別の実施形態では、この異種ポリペプチド／タンパク質は血液タンパク質であり得る。この実施形態で発現される血液タンパク質として下記が挙げられるがこれらに限定されない：担体タンパク質、例えばアルブミン、例えばヒトアルブミンおよびウシアルブミン、トランスフェリン、組換えトランスフェリン半分子、ハプトグロビン、フィブリノーゲンおよび他の凝固因子、補体成分、免疫グロブリン、酵素阻害物質、物質（例えばアンジオテンシンおよびブラジキニン）の前駆体、インスリン、エンドセリン、ならびにグロブリン、例えばアルファ−、ベータ−およびガンマ−グロブリン、ならびに主に哺乳動物の血液中で見出される他の種類のタンパク質、ポリペプチドおよびこれらの断片。ヒト血清アルブミンのアミノ酸配列（Ｌａｗｎ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９：６１０３−６１１４（１９８１））およびヒト血清トランスフェリンのアミノ酸配列（Ｙａｎｇ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：２７５２−２７５６（１９８４））等の多数の血液タンパク質のアミノ酸配列が報告されている（Ｓ．Ｓ．Ｂａｌｄｗｉｎ（１９９３）Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６ｂ：２０３−２１８を参照されたい）。
【００６５】
別の実施形態では、この異種ポリペプチド／タンパク質は、組換え酵素または組換え補助因子であり得る。この実施形態で発現される酵素および補助因子として下記が挙げられるがこれらに限定されない：アルドラーゼ、アミンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アスパルターゼ、Ｂ１２依存性酵素、カルボキシペプチダーゼ、カルボキシエステラーゼ、カルボキシリアーゼ、ケモトリプシン（ｃｈｅｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、ＣｏＡ要求酵素（ＣｏＡ  ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）、シアノヒドリンシンテターゼ、シスタチオンシンターゼ、デカルボキシラーゼ、デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、デヒドラターゼ、ジアホラーゼ、ジオキシゲナーゼ、エノエートレダクターゼ、エポキシドヒドラーゼ、フメラーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｓｆｅｒａｓｅ）、メチルトランスフェラーゼ、ニトリルヒドラーゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、オキシドレダクターゼ、オキシニトリラーゼ（ｏｘｙｎｉｔｉｌａｓｅ）、ペプチダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｓｆｅｒａｓｅ）、ペルオキシダーゼ、治療上活性なポリペプチドに融合した酵素、組織プラスミノーゲンアクチベーター；ウロキナーゼ、レプチラーゼ、ストレプトキナーゼ；カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ；Ｄｎアーゼ、アミノ酸ヒドロラーゼ（例えば、アスパラギナーゼ、アミドヒドロラーゼ）；カルボキシペプチダーゼ；プロテアーゼ、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、コラゲナーゼ、ノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｍｉｄａｓｅ）；ラクターゼ、マルターゼ、スクラーゼ、およびアラビノフラノシダーゼ。
【００６６】
別の実施形態では、この異種ポリペプチド／タンパク質は、一本鎖、Ｆａｂ断片および／もしくは完全長鎖抗体、またはこれらの断片もしくは一部であり得る。一本鎖抗体は、抗体の、１本の安定的に折り畳まれたポリペプチド鎖上の抗原結合領域を含み得る。Ｆａｂ断片は特定の抗体の断片であり得る。Ｆａｂ断片は抗原結合部位を含み得る。Ｆａｂ断片は２本の鎖を含み得、即ち、軽鎖断片および重鎖断片を含み得る。これらの断片は、リンカーまたはジスルフィド結合により連結され得る。
【００６７】
別の実施形態では、この異種ポリペプチド／タンパク質は、ワクチン（例えば市販のワクチン）で使用される抗原であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチド／タンパク質は、下記で見出される主要抗原である：ジフテリアワクチン、クロストリジウムワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ポリオワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、ヘモフィルスインフルエンザｂ菌ワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、ロタウイルスワクチン、肺炎球菌ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン、水痘ワクチン、ヒトパピローマウイルスワクチン、髄膜炎菌ワクチン、アデノウイルス４型ワクチン、アデノウイルス７型ワクチン、炭疽ワクチン、ポリオワクチン、髄膜炎菌ワクチン、狂犬病ワクチン、トガウイルス（ｔｏａｖｉｒｕｓ）ワクチン、黄熱病ワクチン、帯状疱疹ワクチンおよび／またはインフルエンザワクチン。
【００６８】
いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチド／タンパク質は、アルファ毒素（ＡＴ）としても知られているポア−フォーミングα−ヘモリシン（ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  α−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）である（Ｎａｔａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １７７８：１７３５−１７５６（２００８）。ＡＴはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））の大半により産生され、水溶性モノマーとして分泌される。ＡＴポリペプチドをプロセシングして、重量が約３３ｋＤａである２９３個のアミノ酸からなる成熟細胞外タンパク質が得られ（Ｂｅｒｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｎｓ  ５：１１４０−１１６６（２０１３））、このタンパク質は、最もよく特徴付けられている病原性因子のうちの１つである。このタンパク質は、宿主細胞膜上の七量体構造への結合およびオリゴマー化が可能であるが、ロイシンによるヒスチジン３５の置換（ＡＴＨ３５Ｌ）により、インビトロでの溶血活性および腹腔内マウスモデルでの致死性が失われていた（Ｍｅｎｚｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６２：１８４３−１８４７（１９９４））。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染の予防に利用可能なワクチンは存在しないことから、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染の予防を標的とするワクチンとして、部分的に弱毒化されたアルファ毒素タンパク質（ＡＴＨ３５Ｌ）が研究されている（Ａｄｈｉｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ３８５６７（２０１２）；Ｍｅｎｚｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６４：１８３９−１８４２（１９９６）；Ｒａｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７７：２７１２−２７１８（２００９）。いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチド／タンパク質は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のアルファ毒素（例えば配列番号３）を含む。いくつかの実施形態では、このアルファ毒素は、Ｈ３５に対応するアミノ酸位置で置換を含む。いくつかの実施形態では、このアルファ毒素はＨ３５Ｌ置換（ＡＴＨ３５Ｌ）を含む（例えば配列番号４）。いくつかの実施形態では、この異種ポリペプチド／タンパク質は、ＡＴＨ３５Ｌと本発明のシグナルポリペプチドとを含む（例えば配列番号２）。
【００６９】
ある特定の実施形態では、この異種ポリペプチドは天然タンパク質（例えば天然の哺乳動物タンパク質またはヒトタンパク質）である、またはこの天然タンパク質と実質的に相同である。この実施形態では、このタンパク質はコンカテマー形態では見出されないが、シグナルポリペプチドのみに連結されており、精製用および／または認識用のタグ配列に任意選択に連結されている。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書で説明されたシグナルポリペプチドと異種ポリペプチドとを含む組成物を対象とする。いくつかの実施形態では、この組成物は薬物または治療薬である。いくつかの実施形態では、この組成物は治療上有効である。いくつかの実施形態では、この組成物は薬学的に許容される。
【００７１】
核酸
「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、任意の長さのプリン含有ポリマーおよびピリミジン含有ポリマーである、ポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドのいずれかまたは混合ポリリボ−ポリデオキシリボヌクレオチドを指す。これは、一本鎖分子および二本鎖分子（即ち、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド）を含む。これはまた、改変塩基を含む核酸も含む。
【００７２】
本明細書において「単離された」と称される核酸は、この単離核酸の天然環境から取り出されている核酸、またはこの単離核酸の起源であるゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡの核酸から分離された核酸（例えば、この単離核酸が細胞中にまたはライブラリ等の核酸の混合物中に存在する場合）であり、さらなるプロセシングを受けていてもよい。単離核酸として、本明細書で説明された方法、類似の方法または他の適切な方法により得られる核酸が挙げられ、例えば、本質的に純粋な核酸、化学合成により、生物学的方法および化学的方法の組み合わせにより製造された核酸、ならびに単離されている組換え核酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書で説明された核酸はいずれも単離され得る。
【００７３】
本明細書において「組換え」と称される核酸は組換えＤＮＡ方法論により製造されている核酸であり、例えば、人工的な複製方法に依存する手順（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または制限酵素を使用するベクターへのクローニング）により生成されている核酸である。組換え核酸として、細胞の天然の機序を通して起こる組換え事象から生じるものも挙げられるが、所望の組換え事象を可能にするようにまたは所望の組換え事象が起こりそうに設計されている核酸の細胞への導入後に選択されている。いくつかの実施形態では、本明細書で説明された核酸は組換え核酸であり得る。
【００７４】
核酸を、その天然の供給源から単離し得る、または組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）もしくは化学合成を使用して製造し得る。核酸分子として、例えば、遺伝子、遺伝子の天然の対立遺伝子バリアント、コード領域またはその一部、ならびに改変が、核酸分子のポリペプチドをコードする能力または天然遺伝子単離物とストリンジェントな条件下で安定したハイブリッドを形成する能力を実質的に妨げない方法でのヌクレオチドの挿入、欠失、置換および／または反転により改変されたコード領域および／または調節領域が挙げられ得る。核酸分子は縮重を含み得る。本明細書で使用される場合、ヌクレオチド縮重は、１種のアミノ酸が様々なヌクレオチドコドンによりコードされ得る現象を指す。そのため、タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸分子の核酸配列は、縮重に起因して変化し得る。
【００７５】
核酸分子は、タンパク質活性を有するポリペプチドまたはタンパク質をコードする必要はない。核酸分子は、例えば、トランケートされた、変異したまたは不活性なタンパク質をコードし得る。
【００７６】
核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡまたはこれらの組み合わせを含む様々な供給源に由来し得る。そのような配列はゲノムＤＮＡを含み得、このゲノムＤＮＡは、天然に存在するイントロンを含んでもよいし含まなくてもよい。この配列、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを、いくつかの方法のうちのいずれかで得ることができる。ゲノムＤＮＡを、当分野で公知の手段により適切な細胞から抽出して精製し得る。あるいは、ｍＲＮＡを細胞から単離し得、逆転写または他の手段によりｃＤＮＡを製造するために使用し得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本発明はまた、（グラム陰性菌の）ペリプラズムへのまたは細胞外空間中への、作動可能に連結された目的の異種ポリペプチドの標的化に有用な新規のシグナルポリペプチドをコードする配列を有する核酸も含む。いくつかの実施形態では、この核酸は、配列番号１に対して少なくとも９０％、９５％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルポリペプチドをコードする。別の実施形態では、この核酸配列は、配列番号１の配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むシグナルポリペプチドをコードする。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＴＨ３５Ｌに作動可能に連結された、本明細書で説明された新規のシグナルポリペプチド（配列番号２）をコードする配列を有する単離核酸を含み、このシグナルポリペプチドは、ＡＴＨ３５Ｌを（グラム陰性菌の）ペリプラズムにまたは細胞外空間中にトランスロケートする。いくつかの実施形態では、この核酸は、配列番号２に対して少なくとも９０％、９５％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。別の実施形態では、この核酸は、配列番号２の配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
【００７９】
いくつかの実施形態では、この核酸は、本明細書で説明されたシグナルポリペプチドと、この核酸のベクターへのクローニングを助けるための１種または複数種の特徴とを含む。いくつかの実施形態では、この核酸は、１箇所または複数箇所の制限酵素部位を含む。
【００８０】
当業者は、コードされたシグナルポリペプチドの変化をもたらさない本発明のヌクレオチド配列への変異により変化が導入され得ることを認識するだろう。いくつかの実施形態では、当業者は、シグナルポリペプチドの生物学的活性を変更することなく、コードされたシグナルポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらす本発明のヌクレチドへの変異により導入し得る。そのため、コードされたタンパク質に１個または複数個のアミノ酸の置換、付加または欠失が導入されるように、本明細書で開示された、対応するヌクレオチド配列への１個または複数個のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより、バリアント単離核酸分子が作成され得る。標準的な技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）により、変異を導入し得る。そのようなバリアントヌクレオチド配列も本発明に包含される。
【００８１】
本発明の「バリアント」ポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドおよび化学的に変更されたポリヌクレオチドを含む。本発明の天然に存在するポリヌクレオチドバリアントは、（ｉ）自然界で（例えば、関連するウイルス種および非ウイルス種で）見出されるもの、（ｉｉ）本明細書で説明された化学的類似性を通じて本発明のポリヌクレオチドに関連するもの、ならびに（ｉｉｉ）コードされたポリペプチドが連結されている、本明細書で説明されたポリペプチドをコードするものである。いくつかの実施形態では、本核酸は１個または複数個のバリアントポリヌクレオチドを含み得る。
【００８２】
本明細書で開示された核酸を、宿主生物のコドン使用頻度に基づいて調整し得る。コドン使用頻度またはコドン優先度は当分野で公知である。選択されたコード配列を、細菌宿主細胞により利用されるものと一致するように遺伝子コードを変更することにより改変し得、このコード配列のコドン配列を、この宿主により利用されるものにさらに接近するように増強させ得る。遺伝子コード選択およびコドン頻度の増強を、当業者に既知の様々な方法のいずれか（例えばオリゴヌクレオチド特異的変異誘発）に従って実施し得る。このプロセスの支援に有用なオンラインのインターネットリソースとして、例えば下記が挙げられる：（１）ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎで利用可能なＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋａｚｕｓａ  ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（２−６−７  Ｋａｚｕｓａ−ｋａｍａｔａｒｉ，Ｋｉｓａｒａｚｕ，Ｃｈｉｂａ  ２９２−０８１８  Ｊａｐａｎ）、および（２）ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｎ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／−Ｔａｘｏｎｏｍｙ／Ｕｔｉｌｓ／ｗｐｒｉｎｔｇｃ．ｃｇｉ？ｍｏｄｅ＝ｃでＮＣＢＩ  Ｔａｘｏｎｏｍｙデータベースから利用可能なＧｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅｓ表。シグナルポリペプチド、本明細書の他の箇所で説明された目的の異種ポリペプチドのいずれかまたは両方のコード配列を、コドン使用頻度に関して調整し得ることが認識される。
【００８３】
発現ベクター
同様に本明細書で開示されているのは、本発明のシグナルペプチドおよび異種ポリペプチドを含むベクター（例えば発現ベクター）である。「ベクター」または「組換えベクター」とは、選択された核酸配列を操作するためのツールとして、またはそのような核酸配列を宿主細胞に導入するためのツールとして使用される核酸分子のことである。組換えベクターは、例えば選択された核酸配列を宿主細胞に発現させてまたは送達して組換え細胞を形成することにより、選択された核酸配列のクローニング、シークエンシングまたは他の操作での使用に適し得る。そのようなベクターは概して、選択された核酸配列に隣接して天然には見出されない異種核酸配列を含むが、このベクターは、選択された核酸配列に隣接して天然に見出されるまたはこの核酸分子の発現に有用である調節核酸配列（例えば、プロモーター、非翻訳領域）も含み得る。
【００８４】
「ベクター」または「発現ベククター」は、別のＤＮＡセグメント（即ち「挿入物」）が付着し、その結果、細胞中で付着したＤＮＡセグメントの複製が引き起こされ得るレプリコン（例えば、プラスミド、ファージ、ウイルス、トランスポゾン、ファージミドまたはコスミド）である。「ベクター」は、エピソームベクター（例えばプラスミド）および非エピソームベクターを含む。本開示のいくつかの実施形態では、このベクターはエピソームベクターである。いくつかの実施形態では、このベクターはプラスミドである。一般に、このベクターは、少なくとも１種の生物中で機能する複製起点、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および宿主細胞に対する選択マーカーを含み得る。
【００８５】
ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得る。このベクターは、染色体外要素（例えばプラスミド）として維持され得る、または組換え宿主細胞の染色体に組み込まれ得る。ベクター全体を宿主細胞内の適当な位置で保持し得る、または特定の条件下でプラスミドＤＮＡが欠失され得、選択された核酸分子が残る。組み込まれた核酸分子は、染色体プロモーターの制御下、天然もしくはプラスミドのプロモーターの制御下、またはいくつかのプロモーターの制御の組み合わせ下であり得る。この核酸分子の単一または複数のコピーを染色体に組み込み得る。組換えベクターは少なくとも１種の選択マーカーを含み得る。
【００８６】
用語「発現ベクター」は、ベクターであって、宿主細胞または他の（例えば細胞フリーの）発現系への挿入後に、このベクターにクローニングされている核酸配列の発現を指示し得るベクターを指す。核酸配列は、ｍＲＮＡ配列が生じるように転写される場合に「発現される」。本発明のほとんどの場合では、この転写物は、アミノ酸配列（例えば、本発明の異種ポリペプチド／タンパク質）が生じるように翻訳され得る。クローン化遺伝子は通常、発現制御配列の制御下に置かれる（即ち、この発現制御配列に作動可能に連結される）。語句「作動可能に連結される」は、宿主細胞中に導入される（即ち、形質転換される、形質導入される、形質移入される、共役する、または導かれる）場合に核酸分子が発現され得るような方法での、発現制御配列へのこの核酸分子の連結を指す。
【００８７】
組換えベクターおよび発現ベクターは、１個または複数個の調節配列または発現制御配列を含み得る。調節配列は、発現制御配列（例えば、転写制御配列または翻訳制御配列）ならびに宿主細胞中でのベクター複製を可能にする配列を広く包含する。転写制御配列とは、転写の開始、伸長または終結を制御する配列のことである。適切な調節配列として、組換え核酸分子が導入される宿主細胞中でまたは宿主生物中で機能し得るあらゆる配列（例えば転写開始を制御するもの（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、オペレーター配列およびリプレッサー配列））が挙げられる。さらなる調節配列として、翻訳調節配列、複製起点、および組換え細胞に適合する他の調節配列が挙げられる（例えばＤ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：３−７を参照されたい）。
【００８８】
発現ベクターは、目的のタンパク質の構成的発現または誘導性発現を可能にする要素を含み得る。本明細書で使用される場合、「プロモーター」、「プロモーター配列」または「プロモーター領域」は、ＲＮＡポリペラーゼに結合し得、且つ下流のコード配列または非コード配列の転写の開始に関与するＤＮＡ調節領域／配列を指す。本開示のいくつかの例では、プロモーター配列は転写開始部位を含み、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むように上流へ延びる。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、転写開始部位ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインを含む。誘導性プロモーター等の様々なプロモーターを使用して、本発明の様々なベクターを駆動させ得る。
【００８９】
多数の誘導性発現系および構成的発現系が当分野で既知である。例えば、プロモーター領域等の発現制御配列は、任意の所望の遺伝子から選択され得る。細菌プロモーターとして、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、Ｐｔａｃ１６、Ｐｔａｃ１７、ＰｔａｃＩＩ、ＰｌａｃＵＶ５、Ｔ７ｌａｃプロモーターおよびｔｒｃが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、Ｐｔａｃプロモーターを含むベクターは、ｌａｄ遺伝子の非存在下では構成的発現を可能にするが、このベクターがｌａｄ遺伝子も含む場合にはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により発現が誘導され得る。適切なプロモーターの選択は、十分に、当分野における通常の技術のレベルの範囲内である。
【００９０】
本発明に従って使用されるプロモーターは、構成的プロモーターであってもよいし、調節されたプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態では、このプロモーターは宿主細胞生物に由来しない。ある特定の実施形態では、このプロモーターは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）生物に由来する。
【００９１】
本発明に係る発現系で有用な非ｌａｃ型プロモーターの一般例は当業者に既知である。例えば、Ｊ．Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｏｍｅｒｏ＆Ｖ．Ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏ（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｒａｉｎｓ  ａｓ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，ｉｎ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａ．Ｄｅｍａｉｎ＆Ｊ．Ｄａｖｉｅｓ，ｅｄｓ．）ｐｐ．４６０−７４（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）；Ｈ．Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ（２００１）Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｏ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｔｏ  ｍｏｎｉｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：４３９−４４５；およびＲ．Ｓｌａｔｅｒ＆Ｒ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  （２０００）Ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  ＤＮＡ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｗａｌｋｅｒ＆Ｒ．Ｒａｐｌｅｙ，ｅｄｓ．）ｐｐ．１２５−５４（Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ））を参照されたい。選択された細菌宿主細胞に固有のプロモーターのヌクレオチド配列を有するプロモーター（例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）アントラニレートまたはベンゾエートオペロンプロモーター（Ｐａｎｔ、Ｐｂｅｎ））を使用して、標的ポリペプチドをコードする導入遺伝子の発現も制御し得る。配列が同一であるか異なるかにかかわらず、または同一の生物由来であるか異なる生物由来であるかにかかわらず、複数個のプロモーターが互いに共有結合的に付着しているタンデムプロモーター（例えば、Ｐａｎｔ−Ｐｂｅｎタンデムプロモーター（プロモーター中ハイブリッド）またはＰｌａｃ−Ｐｌａｃタンデムプロモーター）も使用し得る。
【００９２】
調節されたプロモーターは、このプロモーターが一部である遺伝子の転写を制御するために、プロモーター調節タンパク質を利用する。調節されたプロモーターが本明細書で使用される場合、対応するポロモーター調節タンパク質も、本発明に係る発現系の一部である。プロモーター調節タンパク質の例として下記が挙げられる：アクチベータータンパク質、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）カタボライトアクチベータータンパク質、ＭａｌＴタンパク質；ＡｒａＣファミリ転写アクチベーター；リプレッサータンパク質、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＡｃＩタンパク質；および二重機能調節タンパク質、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮａｇＣタンパク質。多くの調節されたプロモーター／プロモーター調節タンパク質対が当分野で既知である。
【００９３】
プロモーター調節タンパク質は、エフェクター化合物（即ち、プロモーターの制御下である遺伝子の少なくとも１つのＤＮＡ転写調節領域をこのタンパク質が放出することまたはこのＤＮＡ転写調節領域にこのタンパク質が結合することを可能にするように、この調節タンパク質と可逆的に不可逆的に会合する化合物）と相互作用し、それにより、この遺伝子の転写の開始でトランスクリプターゼ酵素の作用が許容される、または遮断される。エフェクター化合物は誘導因子またはコリプレッサーと分類され、これらの化合物として、天然のエフェクター化合物および無償性の誘導因子化合物が挙げられる。多くの調節されたプロモーター／プロモーター調節タンパク質／エフェクター化合物のトリオが当分野で既知である。エフェクター化合物は細胞培養または発酵の全体を通して使用され得るが、調節されたプロモーターが使用される好ましい実施形態では、宿主細胞バイオマスの所望の量または密度の増加後、適切なエフェクター化合物が、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする所望の遺伝子の発現を直接的にまたは間接的にもたらすために、培地に添加される。
【００９４】
例として、ｌａｃファミリプロモーターが利用される場合、この系中にはｌａｃＩ遺伝子も存在し得る。（通常は）構成的に発現される遺伝子であるｌａｃＩ遺伝子は、このプロモーターのｌａｃオペレーターに結合するＬａｃリプレッサータンパク質（ＬａｃＤタンパク質）をコードする。そのため、ｌａｃファミリプロモーターが利用される場合、この発現系ではｌａｃＩ遺伝子も含まれて発現され得る。ｌａｃプロモーターファミリメンバー（例えばｔａｃプロモーター）の場合では、エフェクター化合物は誘導因子であり、好ましくはＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、「イソプロピルチオガラクトシド」とも称される）等の無償性の誘導因子である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ｐＥＴ発現系が使用される。ｐＥＴ発現系ではタンパク質が高レベルで産生される。発現は、強いＴ７ｌａｃプロモーターにより誘導される。この系は、目的の遺伝子の高レベル転写のために、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの高い活性および特異性を利用する。このプロモーター領域に位置するｌａｃオペレーターは、従来のＴ７ベースのベクターと比べて厳密な調節を提供し、プラスミドの安定性および細胞生存率を改善する（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｆｆａｔｔ，Ｊ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １８９（１）：１１３−３０（１９８６）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ５６（１）：１２５−３５（１９８７））。Ｔ７発現系では、目的の遺伝子の高レベル転写のために、Ｔ７プロモーターおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ＲＮＡＰ）が使用される。Ｔ７発現系では高レベル発現が達成されており、なぜならば、Ｔ７  ＲＮＡＰは天然の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡＰと比べて加工性であり、且つ目的の遺伝子の転写に専念するからである。同定された遺伝子の発現は、宿主細胞中にＴ７  ＲＮＡＰの供給源を設けることにより誘導される。このことは、Ｔ７  ＲＮＡＰ遺伝子の染色体コピーを含むＢＬ２１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主を使用することにより達成される。Ｔ７  ＲＮＡＰ遺伝子は、ＩＰＴＧにより誘導され得るｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下である。Ｔ７  ＲＮＡＰは誘導時に発現され、目的の遺伝子を転写する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ｐＢＡＤ発現系が使用される。ｐＢＡＤ発現系は、特定の炭素源（例えば、グルコース、グリセロールおよびアラビノース）の存在により、目的のタンパク質またはポリペプチドの厳密に制御された、漸増可能な発現を可能にする（Ｇｕｚｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７（１４）：４１２１−３０（１９９５））。ｐＢＡＤベクターは、発現レベルの正確な制御を与えるように独自に設計されている。ｐＢＡＤベクターからの異種遺伝子発現はａｒａＢＡＤプロモーターで開始される。このプロモーターは、ＡｒａＣ遺伝子の産物により正および負の両方に調節される。ＡｒａＣは、Ｌ−アラビノースと複合体を形成する転写調節因子である。Ｌ−アラビノースの非存在下では、ＡｒａＣ二量体は転写を遮断する。最大の転写活性化には下記の２つの事象が必要とされる：（ｉ）Ｌ−アラビノースがＡｒａＣに結合して転写を開始させる、（ｉｉ）ｃＡＭＰアクチベータータンパク質（ＣＡＰ）−ｃＡＭＰ複合体がＤＮＡに結合し、プロモーター領域の正しい位置へのＡｒａＣの結合を刺激する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ｔｒｃ発現系が使用される。ｔｒｃ発現系は、ｔｒｃプロモーターからの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での高レベルの調節された発現を可能にする。ｔｒｃ発現ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での真核生物遺伝子の発現に最適化されている。ｔｒｃプロモーターは、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターおよびラクトース（ｌａｃ）プロモーターに由来する強いハイブリッドプロモーターである。ｔｒｃプロモーターは、ｌａｃＯオペレーターとｌａｃＩＱ遺伝子の産物とにより調節される（Ｂｒｏｓｉｕｓ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ  ２７：１６１−７２（１９８４））。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ｐＪ４１１発現系が使用される（ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）。発現は、Ｔ７プロモーターおよびカナマイシン耐性マーカーを含む。
【００９９】
別の実施形態では、発現ベクターは、シグナルポリペプチドのコード配列または目的の異種ポリペプチド／タンパク質のコード配列に隣接するタグ配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、このタグ配列は、タンパク質の同定、分離、精製および／または単離を可能にする。このタグ配列は、ヘキサ−ヒスチジン親和性タグ等の親和性タグであり得る。別の実施形態では、この親和性タグはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ分子であり得る。このタグはまた、蛍光分子（例えば、ＹＦＰもしくはＧＦＰ）またはそのような蛍光タンパク質の類似体でもあり得る。このタグはまた、抗体分子の一部、または精製に有用な既知の結合パートナー用の既知の抗原もしくはリガンドでもあり得る。そのため、いくつかの実施形態では、このベクターは、シグナルポリペプチドと、異種ポリペプチドと、タグ配列とを含むタンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
【０１００】
他の調節要素がベクターに含まれてもよい（「発現構築物」とも呼ばれる）。そのような要素として下記が挙げられるがこれらに限定されない：例えば、転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、他のプロモーター、アクチベーター、翻訳の開始シグナルおよび終止シグナル、転写ターミネーター、シストロニックレギュレーター、ならびにポリシストロニックレギュレーター。
【０１０１】
典型的には、ベクターは、シグナルポリペプチドと、１種または複数種の発現制御配列（例えば、転写制御配列または翻訳制御配列）に作動可能に連結された異種ポリペプチドとをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む。一態様では、発現ベクターは、発現させる異種ポリペプチド／タンパク質をコードし且つ少なくとも１種の調節配列に作動可能に連結された核酸に融合した、本明細書で説明されたシグナルポリペプチドをコードする核酸を含み得る。例示的な実施形態は、ＡＴＨ３５Ｌに融合した、本明細書で説明されたシグナルポリペプチド（配列番号２）をコードする核酸を含む発現ベクターを含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されるポリペプチドの種類等の因子に依存する場合があることを理解すべきである。
【０１０２】
一般に、ベクターは、複製起点と、形質転換された宿主細胞の同定および単離を可能にする選択マーカー（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のアンピシリン耐性遺伝子）と、下流の構造配列の直接転写に由来のプロモーターとを含むだろう。異種構造配列は翻訳の開始配列および終止配列と適切な相で組み立てられ、翻訳されたタンパク質のペリプラズム空間または細胞外培地への分泌を指示し得る、本明細書で説明されたシグナルポリペプチドを含む場合がある。細菌での使用に有用な発現ベクターは、機能的プロモーターにより作動可能な読み取り段階で、シグナルポリペプチドおよび異種ポリペプチドをコードする構造ＤＮＡ配列を、適切な翻訳の開始シグナルおよび終止シグナルと一緒に挿入することにより構築される。このベクターは、このベクターの維持を確実にするために、および望ましい場合には宿主内での増幅をもたらすために、１種または複数種の表現型選択マーカーと複製起点とを含み得る。
【０１０３】
本発明に係るベクターは、タンパク質コード配列に加えて、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と、転写ターミネーターと、翻訳の開始シグナルおよび終止シグナルとを含み得る。有用なＲＢＳを、本発明に係る発現系で宿主細胞として有用な種のいずれかから得ることができ、好ましくは、選択された宿主細胞から得ることができる。Ｄ．Ｆｒｉｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔａｒｔｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅｓ：ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ，Ｇｅｎｅ  ２３４（２）：２５７−６５（８  Ｊｕｌ．１９９９）；およびＢ．Ｅ．Ｓｕｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｓｔａｒｔ  ｃｏｄｏｎｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７（１２）：１１２３−３０（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００１）で説明されているものおよび言及されているもの等の、多くの具体的な且つ多様なコンセンサスＲＢＳが既知である。加えて、例えば欧州特許第０２０７４５９号明細書（合成ＲＢＳ）；Ｏ．Ｉｋｅｈａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８１（３）：５６３−７０（１９８９）（天然ＲＢＳ配列ＡＡＧＧＡＡＧ）で説明されているもの等の天然または合成のいずれかのＲＢＳを使用し得る。本発明で有用な方法、ベクター、ならびに翻訳エレメントおよび転写エレメント、ならびに他の要素のさらなる例は、例えば、Ｇｉｌｒｏｙへの米国特許第５，０５５，２９４号明細書およびＧｉｌｒｏｙ他への米国特許第５，１２８，１３０号明細書；Ｒａｍｍｌｅｒ他への米国特許第５，２８１，５３２号明細書；Ｂａｒｎｅｓ他への米国特許第４，６９５，４５５号明細書および同第４，８６１，５９５号明細書；Ｇｒａｙ他への米国特許第４，７５５，４６５号明細書；ならびにＷｉｌｃｏｘへの米国特許第５，１６９，７６０号明細書で説明されている。
【０１０４】
本明細書で説明されたタンパク質および異種ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターまたはプラスミドへのエンハンサー配列の挿入により増加する。典型的なエンハンサーは、転写を増加させるためにプロモーターに作用する、通常はサイズが約１０〜３００ｂｐである、ＤＮＡのシス作用エレメントである。例として、様々な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エンハンサーが挙げられる。
【０１０５】
一般に、ベクターは、複製起点と、宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカーと、下流の構造配列の転写を指示するために高度に発現される遺伝子に由来するプロモーターとを含むだろう。そのようなプロモーターは、特に３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、酸性ホスファターゼまたは熱ショックタンパク質等の酵素をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は翻訳の開始配列および終止配列と適切な相で組み立てられ、好ましくは、翻訳されたポリペプチドの分泌を指示し得るシグナルポリペプチドと適切な相で組み立てられる。任意選択で、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または単純化された精製）を付与するＮ末端同定ポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードし得る。
【０１０６】
ベクターは、選択マーカー、このベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。この遺伝子の存在により、適切な選択培地中で増殖される場合に、このベクターを発現する宿主細胞のみの増殖が可能となる。典型的な選択遺伝子は、抗生物質または他の毒性物質に対する耐性を付与するタンパク質、栄養要求性の欠乏を補完するタンパク質、または特定の培地からは得られない重要な栄養素を補給するタンパク質をコードする。マーカーは誘導性または非誘導性の遺伝子であり得、概して正の選択を可能にするだろう。選択マーカーの非限定的な例として、アンピシリン耐性マーカー（即ち、ベータ−ラクタマーゼ）、テトラサイクリン耐性マーカー、ネオマイシン／カナマイシン耐性マーカー（即ち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼおよび同類のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、選択マーカー遺伝子は、例えば、対応する形質（例えば、アミノ酸生合成等の生体触媒形質、またはヌクレオチド生合成形質、または炭素源利用形質）について栄養要求性である宿主細胞中でベクターが使用される原栄養回復遺伝子（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ−ｒｅｓｔｏｒｉｎｇ  ｇｅｎｅ）である。適切な選択マーカーの選択は、当業者により理解されるように、宿主細胞、および様々な宿主に適したマーカーに依存するだろう。
【０１０７】
多数の適切なベクター（この多くは内因性の調節ＤＮＡエレメントを含む）が当業者に既知であり、市販されている、または市販のベクターに由来し得る。代表的ではあるが非限定的な例として、細菌での使用に有用なベクターは、公知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝要素を含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌複製起点を含み得る。そのような市販のベクターとして、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ  １（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現される構造配列と組み合わされる。他の例示的な細菌ベクターとして、例えばｐＢｓ、ファージスクリプト（ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ）、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓ  ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖の後、選択されたプロモーターが適切な手段（例えば温度シフトまたは化学的誘導）により誘導され、または活性化され、細胞がさらなる期間にわたり培養される。
【０１０８】
有用なプラスミドベクターの他の例として下記が挙げられるがこれらに限定されない：例えば、Ｎ．Ｈａｙａｓｅ，ｉｎ  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０（９）：３３３６−４２（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９４）；Ａ．Ａ．Ｌｕｓｈｎｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３０：６５７−６２（１９８５）；Ｓ．Ｇｒａｕｐｎｅｒ＆Ｗ．Ｗａｃｋｅｍａｇｅｌ，ｉｎ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｅｎｇ．１７（１）：１１−１６．（Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０００）；Ｈ．Ｐ．Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，ｉｎ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２（５）：４３９−４５（Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００１）；Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ＆Ｋ．Ｎ．Ｔｉｍｍｉｓ，ｉｎ  Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：４７−６７（１９８２）；Ｔ．Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１６（３）：３０７−１３（Ｍａｒ．１，１９９４）；Ｉ．Ｎ．Ｏｌｅｋｈｎｏｖｉｃｈ＆Ｙ．Ｋ．Ｆｏｍｉｃｈｅｖ，ｉｎ  Ｇｅｎｅ  １４０（１）：６３−６５（Ｍａｒ．１１，１９９４）；Ｍ．Ｔｓｕｄａ＆Ｔ．Ｎａｋａｚａｗａ，ｉｎ  Ｇｅｎｅ  １３６（１−２）：２５７−６２（Ｄｅｃ．２２，１９９３）；Ｃ．Ｎｉｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｇｅｎｅ  ８７（１）：１４５−４９（Ｍａｒ．１，１９９０）；Ｊ．Ｄ．Ｊｏｎｅｓ＆Ｎ．Ｇｕｔｔｅｒｓｏｎ，ｉｎ  Ｇｅｎｅ  ６１（３）：２９９−３０６（１９８７）；Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｇｅｎｅ  １６（１−３）：２３７−４７（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９８１）；Ｈ．Ｐ．Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．（ＮＹ）２３：６９−８１（２００１）；Ｐ．Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｊ．Ｂａｃｔ．１７２（１）：４７７−８０（Ｊａｎｕａｒｙ  １９９０）；Ｄ．Ｏ．Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｊ．Ｂａｃｔ．１４５（３）：１４４８−５１（Ｍａｒｃｈ  １９８１）；およびＲ．Ｈｏｌｔｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４７（Ｐｔ  ２）：３３７−４４（Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００１）で説明されているベクター。
【０１０９】
宿主細胞
本発明は、本明細書で説明されたシグナルポリペプチドおよび異種ポリペプチドタンパク質を発現するように遺伝子操作された宿主細胞であって、このシグナルポリペプチドおよび異種ポリペプチドタンパク質をコードする核酸は、この細胞中でのポリヌクレオチドの発現を駆動する、このシグナルポリペプチドおよび／または異種ポリペプチド／タンパク質に作動可能に連結されたプロモーターを含む、宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、原核生物宿主細胞（例えばグラム陽性菌細胞またはグラム陰性菌細胞）であり得る。いくつかの実施形態では、このプロモーター配列は原核生物中で作動可能である。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書で説明されたタンパク質、異種ポリペプチド、および／またはシグナルポリペプチドを発現するように操作された組換え細胞を対象とする。用語「組換え細胞」は、本明細書で説明された核酸配列を含む宿主細胞を指し、この核酸は、本明細書で説明されたシグナルポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、シグナルポリペプチドをコードする核酸は１種または複数種のベクター上に存在する。いくつかの実施形態では、シグナルポリペプチドをコードする核酸は宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、この組換え細胞は原核生物細胞である。いくつかの実施形態では、この組換え細胞はエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属である。いくつかの実施形態では、この組換え原核生物細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書で説明されたシグナルポリペプチドを作動可能にコードする任意のベクターで形質転換された宿主細胞を対象とする。本明細書で開示されたベクターによる宿主細胞の形質転換を、当分野で既知の任意の形質転換方法論を使用して実施し得、細菌宿主細胞は、インタクトな細胞またはプロトプラスト（即ち、サイトプラストを含む）として形質転換され得る。例示的な形質転換方法論としてポレーション（ｐｏｒａｔｉｏｎ）方法論が挙げられ、例えば、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、細菌接合、および二価カチオン処理（例えば、塩化カルシウム処理もしくはＣａＣｌ／Ｍｇ２＋処理）、または当分野で公知の他の方法が挙げ得られる。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１３２：３４９−３５１（１９７７）；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１：３４７−３６２（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９８３），Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４））を参照されたい。
【０１１２】
例えば、そのような宿主細胞は、既知の形質転換、形質移入または感染方法を使用してこの宿主細胞に導入された本発明の核酸を含み得る。用語「形質転換」は、染色体外要素としてまたは染色体組込みによりＤＮＡが複製可能であるような、適切な宿主細胞へのＤＮＡの導入を指す。用語「形質移入」は、本明細書で使用される場合、任意のコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、適切な宿主細胞による発現ベクターの取込みを指す。用語「感染」は、ウイルスまたはウイルルベクターの使用による適切な宿主細胞への核酸の導入を指す。宿主細胞への組換え構築物の導入は、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥデキストラン媒介形質移入またはエレクトロポレーションにより達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【０１１３】
宿主細胞を、任意の適切な方法（例えば、エレクトロポレーション、塩化カルシウム−、塩化リチウム−、酢酸リチウム／ポリエチレングリコール−、リン酸カルシウム−、ＤＥＡＥ−デキストラン−、リポソーム−媒介ＤＮＡ取込み、スフェロプラスト化、注入、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルボンバードメント、ファージ感染、ウイルス感染、または他の確立された方法）により、必要に応じて形質転換し得る、形質移入し得る、または感染させ得る。例示的な実施形態は、本明細書で説明された１種または複数種の核酸分子または発現ベクターを発現する宿主細胞または細胞集団（例えば、遺伝子改変微生物）を含む。上記で説明されたように核酸が導入されている細胞には、そのような細胞の子孫も含まれる。
【０１１４】
本明細書で説明されたベクターを保有する宿主細胞（即ち、形質転換体またはクローン）を、ベクター構築の様式に依存してマーカーを使用して選択し得る。このマーカーは、同一のＤＮＡ分子上に存在してもよいし異なるＤＮＡ分子上に存在してもよい。原核生物宿主では、形質転換体は、例えばアンピシリン、テトラサイクリンまたは他の抗生物質に対する耐性により選択され得る。温度感受性に基づく特定の産物の産生も、適切なマーカーとして機能し得る。
【０１１５】
宿主細胞を適切な培地中で培養し得る。適切なまたは有効な培地は、遺伝子改変微生物等の宿主細胞が、培養された場合に増殖し得るおよび／または本発明の異種ポリペプチド／タンパク質を発現し得るあらゆる培地を指す。そのような培地は概して、炭素源、窒素源およびリン酸塩源を含む水性培地であるが、適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養素も含み得る。微生物および他の細胞を、従来のバイオリアクタ中でおよび任意のプロセス（例えば、バッチ、フェドバッチ、細胞再循環おより連続発酵）により培養し得る。培養培地のｐＨを、特定の生物の増殖およびタンパク質産生に適したｐＨに調節する。増殖に必要な酸素を供給するために且つ二酸化炭素の過剰な蓄積を回避するために、増殖チャンバーに通気し得る。様々な宿主細胞のための培養培地および条件が当分野で既知である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、この宿主細胞は原核生物細胞である。いくつかの実施形態では、この原核生物はグラム陰性菌であり、例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、モアクセラ（Ｍｏａｘｅｌｌａ）属、ヘロコバクター（Ｈｅｌｏｃｏｂａｃｔｅｒ）属、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、デロビブリオ（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ）属、レイオネラ（Ｌｅｉｏｎｅｌｌａ）属、シアノバクテリア、スピロヘータ（ｓｐｉｒｏｃｈａｓｅｔｅ）、緑色硫黄細菌、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属またはセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属の細菌である。いくつかの実施形態では、このグラム陰性菌はエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属であり、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、この宿主細胞は、目的のタンパク質またはポリペプチドを産生し得る任意の細胞（例えば、上記で説明されたグラム陰性原核生物のうちのいずれか１つ）であり得る。目的のタンパク質またはポリペプチドを産生するために最も一般的に使用される系は、比較的安価な増殖要求性および大規模なバッチ培養でタンパク質を産生する潜在的能力のために、ある特定の細菌細胞（特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））を含む。この系は十分に特徴付けられており、一般に許容されるレベルの総タンパク質発現をもたらし、比較的速く且つ安価である。典型的な細菌細胞が、例えば、ウェブサイトｗｗｗ．ｅｍｃ．ｍａｒｉｃｏｔｐａ．ｅｄｕ／ｆａｃｕｌｔｙ／ｆａｒａｂｅｅ／ＢＩＯＢＫ／ＢｉｏＢｏｏｋＤｉｖｅｒｓｉｔｙにてＥｓｔｒｅｌｌａ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ａｒｉｚｏｎａ，ＵＳＡのＤｒ  Ｍ  Ｊ  Ｆａｒａｂｅｅにより提供される”Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ａｒｃｈａｅａｎｓ”，ａ  ｃｈａｐｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｎ−Ｌｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂｏｏｋで説明されている。ある特定の実施形態では、この宿主細胞はエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）細胞であり得、典型的には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞であり得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、この宿主細胞は、細菌分類群のいずれかのメンバーであり得る。この細胞は、例えば、真正細菌の任意の種のメンバーであり得る。この宿主は、下記の分類群のうちのいずれか１つのメンバーであり得る：アシドバクテリウム門、アクチノバクテリア門、アクウィフェクス門、バクテロイデス門、緑色硫黄細菌門、クラミジア、緑色非硫黄細菌門、クリシオゲネス門、シアノバクテリア、デフェリバクター門、ディノコッカス属、ディクチオグロムス門、フィブロバクター門、ファーミキューテス門、フソバクテリウム門、ゲンマティモナス門、レンティスファエラ門、ニトロスピラ門、プランクトミケス門、プロテオバクテリア、スピロヘータ、サーモデスルフォバクテリア門、テルモミクロビウム綱、テルモトガ門、サーマス（サーマレス）またはベルコミクロビウム門。真性細菌宿主の一実施形態では、この細胞は真正細菌の任意の種のメンバーであり得る。
【０１１９】
この細菌宿主は、プロテオバクテリアの任意の種のメンバーでもあり得る。プロテオバクテリア宿主細胞は、下記の分類群のうちのいずれか１つのメンバーであり得る：アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア、ガンマプロテオバクテリア、デルタプロテオバクテリアまたはイプシロンプロテオバクテリア。加えて、この宿主は、分類群アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリアまたはガンマプロテオバクテリアのうちのいずれか１つのメンバーおよびガンマプロテオバクテリアの任意の種のメンバーであり得る。
【０１２０】
ガンマプロテオバクテリア宿主のいくつかの実施形態では、この宿主は、分類群エアロモナス目、アルテロモナス目、エンテロバクター目、シュードモナス目もしくはキサントモナス目のうちのいずれか１つのメンバー；またはエンテロバクター目もしくはシュードモナス目のいずれかの種のメンバーである。いくつかの実施形態では、この宿主細胞はエンテロバクター目であり得、この宿主細胞は腸内細菌科のメンバーであり、またはエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属またはセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属のうちの１つのメンバーもしくはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属のメンバーであってもよい。この宿主細胞がシュードモナス目である場合、この宿主細胞は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等のシュードモナス科のメンバーであり得る。ガンマプロテオバクテリア宿主として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）種のメンバーおよびシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）種のメンバーが挙げられる。
【０１２１】
分泌される異種タンパク質を製造する方法
本発明の方法は、本明細書で説明されたシグナルポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、本発明のシグナルポリペプチドに連結された目的の異種ポリペプチドを発現する宿主細胞を含む。この方法は、本明細書で開示されたシグナルポリペプチドに作動可能に連結された目的のタンパク質またはポリペプチドを含む組換えタンパク質をコードするベクターを含む宿主細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞）を準備すること、およびこのタンパク質またはポリペプチドが発現される条件下で、この細胞を増殖させることを含む。あるいは、同定されたシグナルポリペプチドを使用してタンパク質またはポリペプチドを発現させる方法を、他の原核生物起源の宿主細胞等の任意の所与の宿主系で使用し得る。このベクターは、上記で説明された特徴のいずれかを有し得る。いくつかの実施形態では、この宿主細胞は、本明細書において配列番号１として開示されたシグナルポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはそのバリアントおよび断片を含むベクターを含む。別の実施形態では、このベクターは、配列番号２のタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはそのバリアントおよび断片を含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質（例えば、本発明の異種ポリペプチド）を製造する方法であって、このタンパク質が発現される条件下で、このタンパク質を発現するように操作された組換え細胞またはこのタンパク質をコードするベクターで形質転換された宿主細胞を培養することを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、この組換え細胞または宿主細胞を、このタンパク質がこの組換え細胞または宿主細胞から分泌される条件下にて細胞培養物中で培養する。いくつかの実施形態では、この組換え細胞または宿主細胞を、このタンパク質からシグナルポリペプチドが開裂される条件下にて細胞培養物中で培養する。
【０１２３】
別の実施形態では、この宿主細胞はペリプラズムを有し、シグナルポリペプチドの発現により、目的の異種ポリペプチドの実質的に全てが細胞のペリプラズムに標的化される。ペリプラズム中で発現されるタンパク質のごく一部が細胞膜を通って細胞外空間に実際に漏出し得るが、標的ポリペプチドの大部分はペリプラズム空間内に残存することになることが認識される。
【０１２４】
本明細書で説明された宿主細胞の細胞増殖条件として、目的のタンパク質の発現を促進するもの、および／または発現された目的のタンパク質の発酵を促進するものが挙げられ得る。本明細書で使用される場合、用語「発酵」は、文字通りの発酵が利用される実施形態と、他の非発酵培養様式が利用される実施形態との両方を含む。いくつかの実施形態では、発酵培地は、富栄養培地、最少培地および無機塩培地の中から選択され得、富栄養培地が使用されてもよいが、好ましくは避けられる。別の実施形態では、最少培地または無機塩培地のいずれかが選択される。さらに別の実施形態では、最少培地が選択される。さらに別の実施形態では、無機塩培地が選択される。無機塩培地が特に好ましい。
【０１２５】
本発明に係る発現系をあらゆる発酵形式で培養し得る。例えば、バッチ発酵モード、フェドバッチ発酵モード、半連続発酵モードおよび連続発酵モードを本明細書で利用し得る。タンパク質が細胞外培地中に排泄される場合には連続発酵が好ましい。
【０１２６】
発酵をあらゆるスケールで実施し得る。そのため、例えば、マイクロリットルスケール、センチリットルスケールおよびデシリットルスケールの発酵量を使用してもよく、１リットルスケールおよびより大きい発酵量を使用し得る。いくつかの実施形態では、この発酵量は１リットル以上である。別の実施形態では、この発酵量は、５リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、５０リットル、７５リットル、１００リットル、２００リットル、５００リットル、１，０００リットル、２，０００リットル、５，０００リットル、１０，０００リットルまたは５０，０００リットル以上である。
【０１２７】
本発明では、形質転換された宿主細胞の増殖、培養および／または発酵を、この宿主細胞の生存を許容する温度範囲内で実施し、好ましくは、包括的に約４℃〜約５５℃の範囲内の温度で実施する。そのため、例えば、用語「増殖」（および「増殖する（ｇｒｏｗ）」、「増殖する（ｇｒｏｗｉｎｇ）」）、「培養する（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」（および「培養する（ｃｕｌｔｕｒｅ）」）、ならびに「発酵」（および「発酵する（ｆｅｒｍｅｎｔ）」、「発酵する（ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ）」）は、本発明の宿主細胞に関して本明細書で使用される場合、包括的に約４℃〜約５５℃の温度範囲内での「増殖」、「培養する（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」および「発酵」を本質的に意味する。加えて、「増殖」は、活発な細胞の分裂および／または拡大の生物学的状態、ならびに非分裂および／または非拡大の細胞が代謝的に維持さている生物学的状態の両方を示すために使用され、用語「増殖」の後者の使用は用語「維持」と同義である。
【０１２８】
本シグナルポリペプチドは、このシグナルポリペプチドが本異種ポリペプチドに連結されている形で発現され得、このシグナル連結ポリペプチドを細胞から精製し得る。従って、いくつかの実施形態では、この単離異種ポリペプチドは、このシグナルポリペプチドと目的の異種ポリペプチドとの融合タンパク質である。しかしながら、この異種ポリペプチドの標的をペリプラズムに定める場合、このシグナルポリペプチドを異種ポリペプチドから開裂させることもできる。いくつかの実施形態では、このシグナルポリペプチドとこの異種タンパク質または異種ポリペプチドとの間の連結は、このシグナルポリペプチドの開裂を増加させるように改変されている。
【０１２９】
発現により、細胞外異種ポリペプチドが産生され得る。この方法はまた、目的の異種ポリペプチドをペリプラズムまたは細胞外培地から精製する工程も含み得る。いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質（例えば異種ポリペプチド）を産生させること、次いでこのタンパク質を細胞培養物から回収することを含む。いくつかの実施形態では、このタンパク質を回収することは、細胞および／または細胞残屑を除去するための遠心分離を含む。いくつかの実施形態では、このタンパク質を回収することは、細胞および／または細胞残屑を除去するためにろ過することを含む。
【０１３０】
語句「タンパク質を回収すること」は、タンパク質を含む全培養培地を集めることを指し、分離または精製のさらなる工程を意味する必要はない。タンパク質を、様々な標準的タンパク質精製技術を使用して精製し得、例えば、アフィティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、示差可溶化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、分取ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣまたは向流分配を使用して精製し得る。このポリペプチドは、検出または精製を容易にする追加のタンパク質またはエピトープタグを含み得、例えば、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ポリヒスチジン、ＧＬＵ−ＧＬＵ、ＦＬＡＧ−タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を含み得る。そのようなタグを、このポリペプチドの回収後に除去し得る。
【０１３１】
本発明の方法により、宿主細胞内で目的のタンパク質またはポリペプチドの産生も増加し得る。産生の増加は、あるいは、産生されたタンパク質１グラム当たりのまたは宿主タンパク質１グラム当たりの、適切にプロセシングされたタンパク質またなポリペプチドのレベルの増加であり得る。産生の増加はまた、組換え体１グラム当たりのまたは宿主細胞タンパク質１グラム当たりの、産生された回収可能なタンパク質またはポリペプチドのレベルの増加でもあり得る。産生の増加はまた、総タンパク質のレベルの増加、適切にプロセシングされたタンパク質のレベルの増加、または活性タンパク質もしくは可溶性タンパク質のレベルの増加の任意の組み合わせでもあり得る。この実施形態では、用語「増加（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」は、本発明のシグナルポリペプチドなしで目的のタンパク質もしくはポリペプチドが細胞中で発現される場合に、産生された、適切にプロセシングされた、可溶性であるおよび／もしくは回収可能であるタンパク質またはポリペプチドのレベルとの比較であり、または目的のタンパク質もしくはポリペプチドがｄｓｂＡシグナルポリペプチドと共に発現される場合に、産生された、適切にプロセシングされた、可溶性であるおよび／もしくは回収可能であるタンパク質もしくはポリペプチドのレベルとの比較である。
【０１３２】
目的の異種ポリペプチドの発現の改善はまたは、このポリペプチドの溶解度の増加も指し得る。目的の異種ポリペプチドを産生させ、宿主細胞の細胞質、ペリプラズムまたは細胞外培地から回収し得る。この異種ポリペプチドは不溶性または可溶性であり得る。この異種ポリペプチドは、上記で論じたように、精製を助けるための１種または複数種の配列を含み得る。
【０１３３】
用語「可溶性」は、本明細書で使用される場合、異種ポリペプチドが、生理学的条件下にて緩衝液中で１０〜３０分にわたり回転させた場合に約５，０００×重量〜２０，０００×重量での遠心分離により沈降しないことを意味する。可溶性タンパク質は、封入体または他の沈殿物の一部ではない。同様に、「不溶性」は、タンパク質またはポリペプチドが、生理学的条件下にて緩衝液中で１０〜３０分にわたり回転させた場合に５，０００×重量〜２０，０００×重量での遠心分離により沈降し得ることを意味する。不溶性のタンパク質またはポリペプチドは、封入体または他の沈殿物の一部であり得る。用語「封入体」は、タンパク質またはポリペプチドの凝集体が隔離されている、細胞内に含まれる任意の細胞内体を含むことを意味する。
【０１３４】
本発明の方法により、宿主細胞のペリプラズムに局在する異種ポリペプチドが産生され得る。いくつかの実施形態では、この方法により、細胞中において、適切にプロセシングされた目的の異種ポリペプチドが産生される。別の実施形態では、シグナルポリペプチドの発現により、細胞中で目的の活性な異種ポリペプチドが産生され得る。本発明の方法により、目的の異種ポリペプチドが本発明のシグナルポリペプチドなしに発現される場合と比較して、またはこの異種ポリペプチドがｄｓｂＡシグナルポリペプチドと共に発現される場合と比較して、この異種ポリペプチドの収量も増加し得る。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、この方法により、ペリプラズム区画中に少なくとも０．１ｇ／Ｌのタンパク質が産生される。別の実施形態では、この方法により、細胞中に０．１〜１０ｇ／Ｌのペリプラズムタンパク質が産生される、または少なくとも約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９もしくは少なくとも約１．０ｇ／Ｌのペリプラズムタンパク質が産生される。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質またはポリペプチドの合計は、少なくとも１．０ｇ／Ｌである、少なくとも約２ｇ／Ｌである、少なくとも約３ｇ／Ｌである、約４ｇ／Ｌである、約５ｇ／Ｌである、約６ｇ／Ｌである、約７ｇ／Ｌである、約８ｇ／Ｌである、約１０ｇ／Ｌである、約１５ｇ／Ｌである、約２０ｇ／Ｌである、少なくとも約２５ｇ／Ｌである、またはより多い。いくつかの実施形態では、産生されるペリプラズムタンパク質の量は、産生される目的の異種ポリペプチドの合計の少なくとも約５％である、約１０％である、約１５％である、約２０％である、約２５％である、約３０％である、約４０％である、約５０％である、約６０％である、約７０％である、約８０％である、約９０％である、約９５％である、約９６％である、約９７％である、約９８％である、約９９％である、またはより高い。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、この方法により、少なくとも０．１ｇ／Ｌの正確にプロセシングされた異種ポリペプチドが産生される。正確にプロセシングされた異種ポリペプチドは、天然タンパク質のアミノ末端を有する。いくつかの実施形態では、目的の異種ポリペプチドの少なくとも５０％が天然アミノ末端を含む。別の実施形態では、この異種ポリペプチドの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはより多くが、天然タンパク質のアミノ末端を有する。様々な実施形態では、この方法により、細胞中に０．１〜１０ｇ／Ｌの正確にプロセシングされた異種ポリペプチドが産生され、例えば、少なくとも約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９または少なくとも約１．０ｇ／Ｌの正確にプロセシングされたタンパク質が産生される。別の実施形態では、産生された、正確にプロセシングされた目的の異種ポリペプチドの合計は、少なくとも１．０ｇ／Ｌである、少なくとも約２ｇ／Ｌである、少なくとも約３ｇ／Ｌである、約４ｇ／Ｌである、約５ｇ／Ｌである、約６ｇ／Ｌである、約７ｇ／Ｌである、約８ｇ／Ｌである、約１０ｇ／Ｌである、約１５ｇ／Ｌである、約２０ｇ／Ｌである、約２５ｇ／Ｌである、約３０ｇ／Ｌである、約３５ｇ／ｌである、約４０ｇ／ｌである、約４５ｇ／ｌである、少なくとも約５０ｇ／Ｌである、またはより多い。いくつかの実施形態では、産生された、正確にプロセシングされた異種ポリペプチドの量は、正確にプロセシングされた形態の組換えタンパク質の合計の少なくとも約５％である、約１０％である、約１５％である、約２０％である、約２５％である、約３０％である、約４０％である、約５０％である、約６０％である、約７０％である、約８０％である、約９０％である、約９５％である、約９６％である、約９７％である、約９８％、少なくとも約９９％である、またはより多い。
【０１３７】
本発明の方法により、目的の異種ポリペプチドの収率も増加し得る。いくつかの実施形態では、この方法により、全細胞タンパク質（ｔｃｐ）の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％またはより多いとして、目的の異種ポリペプチドが産生される。「全細胞タンパク質のパーセント」とは、凝集細胞タンパク質のパーセントとしての宿主細胞中の異種ポリペプチドの量のことである。全細胞タンパク質のパーセントの決定は当分野で公知である。
【０１３８】
特定の実施形態では、宿主細胞は、（即ち、約４℃〜約５５℃（例えば約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃および約５０℃）の温度範囲内で）増殖させた場合に、少なくとも１％ｔｃｐの発現レベルおよび少なくとも４０ｇ／Ｌの細胞密度で異種ポリペプチドまたはその断片を有し得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本発明は、宿主細胞からの異種ポリペプチド分泌速度の増加を対象とする。場合によっては、分泌速度は製造時間を有利に短縮し得、それによりコストを削減して効率を上昇させる。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞からのタンパク質分泌速度を増加させる方法であって、（ａ）シグナルポリペプチドを含むタンパク質をコードする、本明細書で説明された核酸またはベクターを含む宿主細胞を細胞培養物中で培養すること、（ｂ）このタンパク質の発現を誘導すること、および（ｃ）細胞培養物の上清中に分泌された、シグナルポリペプチドを含むタンパク質を回収することを含み、タンパク質分泌速度を、ｄｓｂＡシグナルポリペプチドを有するタンパク質のタンパク質分泌速度と比較する、方法を対象とする。タンパク質分泌速度を、経時的に分泌された細胞外環境（即ち、細胞培養物の上清）中へのタンパク質の量を測定することにより測定し得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、タンパク質分泌速度は、所望の量のタンパク質を製造するのに必要な時間を短縮する。例えば、いくつかの実施形態では、細胞培養物の上清中に分泌された、シグナルポリペプチドを含むタンパク質の回収は、このタンパク質の発現の誘導の６〜１５時間後、７〜１２時間後または８〜１０時間後に起こる。いくつかの実施形態では、タンパク質分泌速度は、このタンパク質分泌速度を、ｄｓｂＡシグナルポリペプチドを有するタンパク質のタンパク質分泌速度と比較した場合に、１時間当たり１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を超えて増加している。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞から分泌されるタンパク質の量を増加させる方法であって、（ａ）本明細書で説明された、シグナルポリペプチドをコードする核酸またはベクターを含む宿主細胞を細胞培養物中で培養すること、（ｂ）このタンパク質の発現を誘導すること、および（ｃ）この細胞培養物の上清中に分泌されたタンパク質を回収することを含み、分泌されたタンパク質の量を、ｄｓｂＡシグナルポリペプチドを有するタンパク質と比較する、方法を対象とする。いくつかの実施形態では、細胞から分泌されたタンパク質の量は、ｄｓｂＡシグナルポリペプチドを有するタンパク質と比較して２０％を超えて増加している。いくつかの実施形態では、細胞から分泌されたタンパク質の量は、ｄｓｂＡシグナルポリペプチドを有するタンパク質と比較して１００％を超えて増加している。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質を製造する方法であって、（ａ）本開示のシグナルポリペプチドをコードする、本明細書で説明された核酸またはベクターを含む宿主細胞を培養し、その結果、この核酸またはベクターが発現され、それにより、宿主細胞中でこの核酸またはベクターが発現されると、この核酸またはベクターにコードされるタンパク質が細胞から上清中に分泌される、培養すること、および（ｂ）この上清から、分泌されたタンパク質を単離することを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、この宿主細胞または組換え細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。いくつかの実施形態では、タンパク質からシグナルポリペプチドが開裂される条件下で、この宿主細胞を細胞培養物中で培養する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、細胞および／または細胞残屑を除去するための遠心分離を含む、分泌されたタンパク質を単離することを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、細胞および／または細胞残屑を除去するためにろ過することを含む、分泌されたタンパク質を単離することを含む。本発明は、本明細書で説明された方法により製造されたあらゆるタンパク質を対象とし得る。
【０１４３】
実際には、ペリプラズムを標的とする異種タンパク質は、場合によっては細胞外膜の損傷または流動性の増加に起因して、細胞外環境中で見出されることが多い。この「受動的」分泌速度は、細胞外膜を透過する下記の様々な機序を使用することにより増加し得る：コリシン（Ｍｉｋｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６７：１４３−１５０）；増殖速度（Ｓｈｏｋｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｐｐ  Ｍｉｏｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５８：３８６−３９２）；ＴｏｌＩＩＩ過剰発現（Ｗａｎ  ａｎｄ  Ｂａｎｅｙｘ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｕｒｉｆ．１４：１３−２２）；バクテリオシン放出タンパク質（Ｈｓｉｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：２６７−７１）、コリシンＡ溶解タンパク質（Ｌｌｏｕｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７５：４５１−８）、ペリプラズムタンパクスを漏出する変異体（Ｆｕｒｌｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ  （１９８９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｉｎｄｕｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．３０：１４１−８）；融合パートナー（Ｊｅｏｎｇ  ａｎｄ  Ｌｅｅ（２００２）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．６８：４９７９−４９８５）；浸透圧ショックによる回復（Ｔａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １０４９：２７８−８５）。操作されたタンパク質のペリプラズム空間への輸送およびその後のブロス中での局在化は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で適切に折り畳まれ且つ活性なタンパク質を産生するために使用さている（Ｗａｎ  ａｎｄ  Ｂａｎｅｙｘ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｕｒｉｆ．１４：１３−２２（１９９８）；Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．２６３：１３３−１４７（２００２）；Ｌｕｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．５：２１５−２７（１９９０））。
【０１４４】
本発明はまた、「活性な」異種ポリペプチド／タンパク質の回収も改善し得る。活性なタンパク質は、この配列が由来する天然のタンパク質またはポリペプチドの比活性の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、少なくとも約７０％、約８０％、約９０％または少なくとも約９５％の比活性を有し得る。さらに、基質特異性（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）は、任意選択で、天然のタンパク質またはポリペプチドと実質的に類似する。典型的には、Ｋｃａｔ／Ｋｍは、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはより高い。タンパク質およびポリペプチドの活性および基質特異性（ｋｃａｔ／Ｋｍ）の測定値をアッセイする方法および定量する方法は当業者に公知である。
【０１４５】
この異種ポリペプチド／タンパク質の活性を、既に確立された天然のタンパク質またはポリペプチドの標準活性とも比較し得る。あるいは、この異種ポリペプチド／タンパク質の活性を、天然のタンパク質またはポリペプチドとの同時または実質的に同時の比較アッセイで決定し得る。例えば、インビトロアッセイを使用して、目的のタンパク質またはポリペプチドと標的との間（例えば、発現された酵素と基質との間、発現されたホルモンとホルモンレセプターとの間、発現された抗体と抗原との間等）の任意の検出可能な相互作用を決定し得る。そのような検出として、比色変化の測定、増殖変化、細胞死滅、細胞忌避（ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｌｌｉｎｇ）、放射能の変化、溶解性の変化、ゲル電気泳動および／またはゲル排除法により測定した分子量の変化、リン酸化能、ＥＬＩＳＡアッセイ等の抗体特異性アッセイ等が挙げられ得る。一般に、そのような活性がアッセイ可能である限りは、任意のインビトロまたはインビボのアッセイを使用して、天然のタンパク質またはポリペプチドに対する比較分析を可能にする目的のタンパク質またはポリペプチドの活性性質を決定し得る。あるいは、本発明で製造された異種ポリペプチド／タンパク質を、このタンパク質またはポリペプチドと、通常はこのタンパク質またはポリペプチドと相互作用する分子（例えば、通常は天然タンパク質が相互作用するシグナル経路の基質または構成要素）との間の相互作用を刺激するまたは阻害する能力に関してアッセイし得る。そのようなアッセイは概して、このタンパク質またはポリペプチドが標的分子と相互作用することを可能にする条件下で、このタンパク質と基質分子とを組み合わせる工程、ならびにこのタンパク質および標的分子との相互作用の生物化学的帰結を検出する工程を含み得る。
【０１４６】
目的のタンパク質の収量、溶解性、高次構造および／または活性を測定するために、このタンパク質を宿主細胞および／または細胞外培地から単離することが望ましい場合がある。適正な測定を行うために使用するアッセイの必要条件に応じて、単離は、粗単離であってもよいし、半粗（ｓｅｍｉ−ｃｒｕｄｅ）単離であってもよいし、純粋単離であってもよい。ペリプラズムから標的タンパク質を遊離させるために、クロロホルム（Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６０：１１８１−１１８３）、グアニジン−ＨＣｌ、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｎａｇｌａｋ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ（１９９０）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１２：６０３−６１１）等の化学物質を伴う処理が使用されている。しかしながら、これらの化学物質は不活性ではなく、多くの組換えタンパク質産物またはその後の精製手順への悪影響を有する場合がある。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のグリシン処理は外膜の透過化を引き起こし、ペリプラズム内容物を放出させることも報告されている（Ａｒｉｇａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６８：２４３−２４６）。組換えタンパク質のペリプラズム放出の最も広く使用されている方法は、浸透圧ショック（Ｎｏｓａｌ  ａｎｄ  Ｈｅｐｐｅｌ（１９６６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４１：３０５５−３０６２；Ｎｅｕ  ａｎｄ  Ｈｅｐｐｅｌ（１９６５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４０：３６８５−３６９２）、雌鳥卵白（ＨＥＷ）−リゾチーム／エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）処理（Ｎｅｕ  ａｎｄ  Ｈｅｐｐｅｌ（１９６４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３９：３８９３−３９００；Ｗｉｔｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，４４３：５３４−５４４；Ｐｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＩＣｈｅｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｅｖｅｎｔ，２：９９５−９９７）、およびＨＥＷ−リゾチーム／浸透圧ショックの併用処理（Ｆｒｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈ．，１９：３３２−３３８）である。Ｆｒｅｎｃｈ法は、分画緩衝液中の細胞の再懸濁、およびそれに続くペリプラズム画分の回収を伴い、その際、浸透圧ショックはリゾチーム処理の直後である。
【０１４７】
典型的には、この手順は、浸透圧的に安定化されている培地中での初期破壊と、それに続く非安定化培地中での選択的放出とを含む。この培地の組成（ｐＨ、保護剤）および使用する破壊方法（クロロホルム、ＨＥＷ−リゾチーム、ＥＤＴＡ，超音波処理）は、報告されている具体的な手順の間で異なる。ＥＤＴＡの代わりに双極性イオン界面活性剤を使用するＨＥＷ−リゾチーム／ＥＤＴＡ処理の変形がＳｔａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８：３０７−３１４で論じられている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を破壊するための細胞内溶菌酵素系の使用の一般的な概説に関して、Ｄａｂｏｒａ  ａｎｄ  Ｃｏｏｎｅｙ（１９９０）ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４３，Ａ．Ｆｉｅｃｈｔｅｒ，ｅｄ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｂｅｒｌｉｎ），ｐｐ．１１−３０を参照されたい。
【０１４８】
米国特許第４，５９５，６５８号明細書には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズム空間に輸送されたタンパク質の外在化を促進する方法が開示されている。この方法により、細胞のリゾチーム処理、機械的粉砕または浸透圧ショック処理を必要とすることなく、ペリプラズム中に位置するタンパク質の選択的単離が可能となる。米国特許第４，６３７，９８０号明細書には、細菌産物の産生であって、この産物を直接的にまたは間接的にコードするＤＮＡ分子で温度感受性溶原菌を形質転換させ、この形質転換体を、細胞内で遺伝子産物を発現させることを許容する条件下で培養し、温度を上昇させて、ファージにコードされている機能を誘導することにより、この産物を外在化させることによる産生が開示されている。Ａｓａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ．，８３：５１１−５１６には、Ｔ４ファージ感染による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の同期破壊が開示されており、Ｔａｎｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ．，８５：７４−７８には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の緩やかな破壊のための、Ｔ４ファージ中にコードされている溶解遺伝子の制御された発現が開示されている。
【０１４９】
本発明のタンパク質を、当分野で公知の標準的技術により単離して実質的に純粋まで精製し得、この標準的技術として下記が挙げられるがこれらに限定されない：硫酸アンモニウム沈殿もしくはエタノール沈殿、酸抽出、アイオン交換クロマトグラフィーもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィティクロマトグラフィー、ニッケルクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、分取電気泳動、界面活性剤可溶化、カラムクロマトグラフィー等の物質による選択的沈殿、免疫精製法、および同類のもの。例えば、確立された分子付着特性を有するタンパク質を、リガンドと可逆的に融合させ得る。適切なリガンドにより、タンパク質を精製カラムに選択的に吸着させ、次いで、比較的純粋な形態で、このカラムから遊離させ得る。次いで、融合タンパク質を酵素活性により除去する。加えて、イムノアフィニティーカラムまたはＮｉ−ＮＴＡカラムを使用してタンパク質を精製し得る。一般的技術が、例えば、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；米国特許第４，５１１，５０３号明細書；Ｓ．Ｒｏｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｄ．Ｂｏｌｌａｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓａ，Ｉｎｃ．（１９９６）；Ａ  Ｋ  Ｐａｔｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，１８（２）：ｐ／１８２−９２（２０００）；およびＲ．Ｍｕｋｈｉｊａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １６５（２）：ｐ．３０３−６（１９９５）でさらに説明されている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７および定期的増補）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（１９９０）”Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８２およびこのシリーズの他の巻；Ｃｏｌｉｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９６および定期的増補）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ；ならびにタンパク質精製製品の使用に関する製造業者の文献、例えばＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，またはＢｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆも参照されたい。組換え技術との組み合わせにより、プロテアーゼにより除去可能な配列を介して融合され得る適切なセグメント（例えばＦＬＡＧ配列または等価物）への融合が可能となる。例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉ（１９８９）Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ  １２：６９−７０；Ｈｏｃｈｕｌｉ（１９９０）”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐ���ｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｅｌａｔｅ  Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ”  ｉｎ  Ｓｅｔｌｏｗ（ｅｄ．）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２：８７−９８，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；およびＣｒｏｗｅ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ：Ｔｈｅ  Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＆Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＱＵＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆも参照されたい。
【０１５０】
発現したタンパク質の検出は当分野で既知の方法に達成され、この方法として、例えば、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロッティング技術または免疫沈降が挙げられる。
【０１５１】
上清中に存在する異種ポリペプチドを、当業者に公知の標準的な分離技術により宿主タンパク質から分離し得る。例えば、最初の塩分画により、多くの望ましくない宿主細胞タンパク質（または細胞培養培地由来のタンパク質）を、目的の異種ポリペプチドから分離し得る。その一例は硫酸アンモニウムであり得る。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を効果的に低減させることによりタンパク質を沈殿させる。次いで、タンパク質は、その溶解度に基づいて沈殿する。タンパク質が疎水性であるほど、このタンパク質は、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する可能性が高い。典型的なプロトコルは、結果として硫酸アンモニウム濃度が２０〜３０％であるように飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に添加することを含む。この濃度により、最も疎水性のタンパク質が沈殿するだろう。次いで、（目的のタンパク質が疎水性である場合を除いて）沈殿物を廃棄し、目的のタンパク質を沈殿させることが分かっている濃度まで、上清に硫酸アンモニウムを添加する。次いで、この沈殿物を緩衝液で可溶化し、必要に応じて、透析または透析ろ過のいずれかにより過剰な塩を除去する。タンパク質の溶解度に依存する他の方法（例えば冷エタノール沈殿）も当業者に公知であり、複雑なタンパク質混合物を分画するために使用され得る。
【０１５２】
目的の異種ポリペプチドの分子量を使用し、様々な孔径の膜（例えばＡｍｉｃｏｎ膜またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ膜）に通す限外ろ過を使用して、より大きなサイズのタンパク質およびより小さなサイズのタンパク質から、この異種ポリペプチドを単離し得る。最初の工程として、タンパク質混合物を、目的のタンパク質の分子量と比べて小さい分子量カットオフを有する孔径の膜に通して限外ろ過し得る。次いで、この限外ろ過の保持液を、目的のタンパク質の分子量と比べて大きい分子量カットオフを有する膜に対して限外ろ過し得る。目的の異種ポリペプチドは、この膜を通り抜けてろ液に入る。次いで、下記で説明するように、このろ液をクロマトグラフィーにかけ得る。
【０１５３】
同様に、分泌された目的の異種ポリペプチドを、この異種ポリペプチドのサイズ、正味の表面電荷、疎水性、およびリガンドに対する親和性に基づいて、他のタンパク質から分離し得る。加えて、タンパク質に対して産生された抗体をカラムマトリクスに共役させ、このタンパク質を免疫精製し得る。これらの方法は全て、当分野で公知である。任意のスケールで、且つ多くの異なる製造業者（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））の機器を使用して、クロマトグラフィー技術を実施し得ることが当業者には明らかであるだろう。
【０１５４】
本発明のいくつかの実施形態では、産生されたシグナルポリペプチドを含む、発現された異種ポリペプチドまたは異種タンパク質の５０％超は、宿主細胞中で再生可能な形態で産生され得る。別の実施形態では、発現されたタンパク質の約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％は活性型で得られる、または活性型に再生され得る。
【実施例】
【０１５５】
実施例１
培養培地中での細胞外ＡＴＨ３５Ｌのレベルを改善する試みにおいて、ｄｓｂＡシグナルポリペプチドおよびｐｅｌＢシグナルポリペプチドの改変により、一連の新規のシグナルポリペプチドを設計した。ＡＴＨ３５Ｌのｎ末端に連結された、合成した新規のシグナルポリペプチドを、ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）でスクリーニングし、Ｏｃｔｅｔアッセイを使用して培養培地中の細胞外ＡＴＨ３５Ｌを定量し、ゲル電気泳動により分析した。
【０１５６】
材料および方法
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株および増殖条件
この研究では、構築したプラスミドの発現用の宿主として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）［ｆｈｕＡ２［ｌｏｎ］ｏｍｐＴ  ｇａｌ（λ  ｓＢａｍＨＩｏ  ΔＥｃｏＲＩ−Ｂ  ｉｎｔ：：（ｌａｃＩ：：ＰｌａｃＵＶ５：：Ｔ７遺伝子１）ｉ２１  Δｎｉｎ５）［ｄｃｍ］ΔｈｓｄＳ］およびＢＬ２１  Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）［Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−，ｍＢ−）ｇａｌｄｃｍｒｎｅ１３１（ＤＥ３）］を選択した。組換え細胞を、細胞の播種用の種培地（２０ｇ／Ｌの酵母抽出物）中で培養し、次いで３０℃での組換えＡＴＨ３５Ｌタンパク質の発現用に５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを補充した富栄養増殖培地（２０．３ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０．１ｇ／Ｌの硫酸ナトリウム無水物、および７ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４）で培養した。
【０１５７】
発現プラスミドの構築
ＡＴＨ３５Ｌ遺伝子に連結されたシグナルポリペプチドのＴ７プロモーアーにより駆動される発現用の発現ベクターとして、ＤＮＡ  ２．０  Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）により提供されるｐＪ４１１発現ベクターを使用した。発現プラスミド中の選択マーカーとして、カナマイシン遺伝子を使用した。ＡＴＨ３５Ｌに連結されたシグナルポリペプチドを含む全ての発現プラスミドの遺伝子合成、および合成したプラスミドの確認用のＤＮＡシークエンシング分析を、ＤＮＡ  ２．０  Ｉｎｃ．により実施した。この研究用のシグナルポリペプチドおよび組換えプラスミドの概要を表２に列挙する。
【０１５８】
【表２】
2019532656.tif 000004
【０１５９】
マイクロフェドバッチ培養プロセス
３ｍＬのワーキングボリュームにてＭｉｃｒｏ  ２４バイオリアクタ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｏｒｓｔｅｒ  ｃｉｔｙ，ＣＡ）で少量のフェドバッチ培養を実施した。フィード培地および他の栄養補助剤を、オートクレーブ処理または０．２２μｍ孔径フィルタによるろ過によって滅菌し、さらに富栄養増殖培地（２０．３ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０．１ｇ／Ｌの硫酸ナトリウム無水物および７ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４）を別にオートクレーブ処理した後、滅菌条件下で添加した。この培養物を、２．８％の培養物量で、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、７．６ｇ／Ｌの微量金属カクテル溶液（５５ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム二水和物、２７ｇ／ＬのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．９５ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ＬのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１．３ｇ／ＬのＺｎＣｌ２および２ｇ／ＬのＣａＣｌ２）ならびに１５．８ｇ／ＬのグリセロールＰＳＡを含む富栄養増殖培地に接種した。このフェドバッチ培養の間中、羽根車速度を最初に８００ｒｐｍに設定し、その後、溶存酸素レベル（ＤＯ）を６０％飽和で保つように制御した。フェドバッチの動作モードでは、５５体積／体積％のグリセロールおよび３３重量／体積％の酵母抽出物溶液をフィード培地溶液として使用した。細胞が１０の光学細胞密度（ＯＤ）６００に達した場合に、０．５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により組換えＡＴＨ３５Ｌ遺伝子発現を誘導し、１４時間にわたり３０℃にてフェドバッチモード条件でさらなるインキュベーションを実施した。誘導の１４時間後に培養細胞を集め、細胞外ＡＴＨ３５Ｌの分析および定量のために、５分にわたる１４，０００ｒｐｍでの遠心分離により、回収試料から培養培地の上清を集めた。ＰｅｒｉＰｒｅｐｓ（商標）Ｐｅｒｉｐｌａｓｔｉｎｇキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用して、ペリプラズム試料および細胞質試料を、回収試料の細胞溶解物から調製した。
【０１６０】
発酵槽フェドバッチ培養プロセス
１ＬのワーキングボリュームにてＤａｓＧｉｐ  Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ（ＳａｎｉＳｕｒｅ  Ｉｎｃ，Ｍｏｏｒｅｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）で大量のフェドバッチ培養を実施した。フィード／培養培地および他の栄養補助剤を、少量のフェドバッチ培養プロセスで既に説明したように調製した。この培養物を、２．８％の培養物量で、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、７．６ｇ／Ｌの微量金属カクテル溶液、１５．８ｇ／ＬのグリセロールＰＳＡおよび１体積／体積％のＰ２０００消泡剤溶液を含む調製培養培地に接種した。空間速度（ａｉｒ  ｓｐａｃｅ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ）は１ｖｖｍであり、温度を３０℃で維持した。ｐＨの維持のために、水酸化アンモニウム（２３．５体積／体積％）溶液および氷酢酸（５０体積／体積％）溶液を使用した。バッチ実験の間中、羽根車速度を最初に１，２００ｒｐｍに設定し、その後、溶存酸素レベル（ＤＯ）を６０％飽和で保つように制御した。フェドバッチの動作モードでは、５５体積／体積％のグリセロール溶液および３３重量／体積％の酵母抽出物溶液をフィード培地溶液として使用した。フィーディングの間中、羽根車速度を１２００ｒｐｍで一定に維持し、ＤＯ飽和を自動的に６０％で保った。細胞が８０のＯＤ６００に達した場合に、０．５ｍＭのＩＰＴＧの添加により組換えＡＴＨ３５Ｌ遺伝子発現を誘導し、１２時間にわたり３０℃にてフェドバッチモード条件でさらなるインキュベーションを実施した。誘導後の様々な時点で培養細胞を集め、分泌されたＡＴＨ３５Ｌタンパク質の産生性、浸透圧、ならびに培養培地中のグリセロールおよび酢酸塩の濃度のプロファイルを決定した。
【０１６１】
分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ変性ゲル電気泳動
ミニゲルタンク上で１０％プレキャストＢｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥ  ＳＤＳゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ変性ゲル電気泳動を実施した。電気泳動の泳動条件は、ＭＯＰＳ泳動緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ，ＵＳＡ）中で４５分にわたり２００Ｖで一定である。分離されたタンパク質バンドを、Ｓｉｍｐｌｅ  ｂｌｕｅ  ｓａｆｅ  ｓｔａｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ，ＵＳＡ）で染色することにより可視化した。
【０１６２】
ウエスタンブロットによるＡＴＨ３５Ｌタンパク質の検出
回収した試料を変性条件下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ｉｂｌｏｔ転写キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用してニトロセルロース膜に転写した。膜を、１時間〜１時間３０分にわたり室温にてブロッキング緩衝液（０．１％のＴＴＢＳ緩衝液中に５％のスキムミルク）でブロックした。次いで、膜を、１時間にわたり室温で、または４℃で一晩にわたり、０．１％のＴＴＢＳ緩衝液中の１μｇ／ｍＬのマウス抗ブドウ球菌アルファ溶血毒素ｍＡｂ（ＬＣ１０）（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）と共にインキュベートした。１０分にわたり室温にて０．１％のＴＴＢＳで膜を３回洗浄した後、１時間にわたり室温にて０．１％のＴＴＢＳ中の１μｇ／ｍＬのＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＡｂ（Ｂｅｔｈｙｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ，ＵＳＡ）と共にインキュベートした。全ての膜をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）で可視化し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ（商標）システム（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）でスキャンした。
【０１６３】
細胞外ＡＴＨ３５Ｌタンパク質の定量
培養培地中の細胞外ＡＴＨ３５Ｌ濃度を、カスタマイズされたＯｃｔｅｔアッセイで測定した。このアッセイをＯｃｔｅｔ  ＱＫｅ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ，ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）で実施し、ＬＣ１０  ｍＡｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して、培養培地中のＡＴＨ３５Ｌタンパク質を捕捉した。全ての試料を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）中において動態緩衝液（ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）により１：１０および１：２０の比で希釈した。Ｏｃｔｅｔアッセイのプロセスに関して、ＬＣ１０  ｍＡｂを、３００秒にわたり３００ｒｐｍでＰｒｏｔｅｉｎ  Ａバイオセンサ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）に結合させ、それに続く６０秒にわたる３００ｒｐｍでの動態緩衝液中におけるベースライン工程、１５０秒にわたる３００ｒｐｍでの試料会合工程、および基本動態モードでの６０秒にわたる３００ｒｐｍでの動態緩衝液中における解離工程を実施した。個々の試料に関して実験曲線を記録し、Ｏｃｔｅｔデータ分析ソフトウェア７．０（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用してデータを処理して分析した。最後に、親和性精製したＡＴＨ３５Ｌタンパク質の連続希釈から作成した標準曲線とのアラインメントにより試料を定量した。１：１０および１：２０の希釈試料の間の標準偏差値は１０％未満であった。
【０１６４】
培養培地からのＡＴＨ３５Ｌの精製
Ｎ末端ペプチド配列分析のために、硫酸アンモニウム沈殿およびＰｏｒｏｓ  ＸＳカチオン交換クロマトグラフィー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＵＳＡ）の組み合わせを使用して、培養培地中の細胞外ＡＴＨ３５Ｌを精製した。簡潔に言うと、ＡＴＨ３５Ｌ培養物を、培養培地を集めるために、３０分にわたる８５０ｇでの遠心分離により回収した。回収したＡＴＨ３５Ｌ培養培地を１Ｍの酢酸でｐＨ５．２に調整し、１５分にわたり９，５００ｇで遠心分離して沈殿剤を除去した。次いで、上清を、さらなる精製のために、硫酸アンモニウム沈殿を使用し、それに続いてＰｏｒｏｓ  ＸＳカチオン交換樹脂を使用して精製した。
【０１６５】
Ｎ末端ポリペプチドのシークエンシング
精製したＡＴＨ３５ＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、次いでｉｂｌｏｔ転写キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用してニトロセルロース膜上に転写した。単離したＡＴＨ３５Ｌ試料のＮ末端アミノ酸シークエンシング分析を、自動化タンパク質／ペプチドシークエンシングシステムを使用してＣｏｖａｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，ＩＮ，ＵＳＡ）により実施した。
【０１６６】
結果
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのＡＴＨ３５Ｌ分泌の増強のための同種および異種のシグナルペプチドのスクリーニング
シグナルペプチドの選択は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）系での組換えタンパク質分泌への大きな影響を有することから（Ｓｊｏｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．１９８７）、様々な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シグナルペプチドをスクリーニングして、効率的なＡＴＨ３５Ｌ分泌のためのシグナルペプチドを同定した。Ｓｅｃ経路のためのｄｓｂＡシグナル配列（ｄｓｂＡｓｓ）、ｐｅｌＢシグナル配列（ｐｅｌＢｓｓ）およびｐｈｏＡシグナル配列（ｐｈｏＡｓｓ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シグナルポリペプチドを、ＡＴＨ３５Ｌ分泌をスクリーニングするために選択した。加えて、細胞外タンパク質由来のシグナルペプチドの構造要素は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌としてのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の間で異なるが、いくつかのタンパク質は異種発現系においてそれらの天然シグナルペプチドを使用して成功裏に分泌されることから（Ｓｈａｈｈｏｓｅｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２００３）、本発明者らはまた、ＡＴの天然シグナルペプチド（ＮＴｓｓ）も評価した。スクリーニングしたシグナルペプチドの概要を表２に示す。様々なシグナルペプチド−ＡＴＨ３５Ｌ融合構築物を含む組換え細胞株を、マイクロ２４バイオリアクタシステムを使用してフェドバッチ培養で評価した。ＡＴＨ３５Ｌに連結されたシグナルポリペプチドを処理して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系中で約３３ｋＤａの分泌タンパク質を得る。シグナルポリペプチドは２０〜２６個のアミノ酸からなることから、成熟ＡＴＨ３５ＬおよびＡＴＨ３５Ｌプレタンパク質は、サイズの差異により変性ゲルで分離し得る。培養培地中で細胞外に分泌されたＡＴＨ３５Ｌを確認し、ウエスタンブロットを使用して相対的に定量した（図１）。ウエスタンブロット分析により、ＡＴＨ３５Ｌの細胞質空間からの排出後に、ＡＴＨ３５Ｌが細胞外環境（培養培地）中に（図１）およびペリプラズム空間中に（データは示さない）分泌されることを確認した。同様に、ウエスタブロットによる細胞外ＡＴＨ３５Ｌの相対的定量は、ｄｓｂＡｓｓが他のシグナルポリペプチドの中で最も高い効率の細胞外ＡＴＨ３５Ｌ産物を示し、ＮＴｓｓが最も低い効率の細胞外ＡＴＨ３５Ｌ産物を示すことを示した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シグナルポリペプチドとＮＴｓｓとの間のアミノ酸配列類似性は非常に低く（データは示さない）、この観察は、ＡＴの天然シグナルポリペプチドが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中においてＡＴＨ３５Ｌのトランスロケーションを効率的には導き得ないことを意味する。ｐｅｌＢｓｓ連結ＡＴＨ３５Ｌは、ｄｓｂＡｓｓと比較して低い細胞外ＡＴＨ３５Ｌ産生性を示した（図１）。ｄｓｂＡｓｓ、ｐｅｌＢｓｓおよびｐｈｏＡｓｓはアミノ酸配列の類似性が高く、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中において組換えタンパク質の分泌にＳＥＣ経路を使用したが（Ｎａｔａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １７７８：１７３５−１７５６（２００８））、本データは、様々な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シグナルポリペプチドがＡＴＨ３５Ｌの分泌効率に異なる影響を及ぼすことを示す。特に、ｄｓｂＡｓｓとｐｅｌＢｓｓとの間のアミノ酸配列の同一性は４５％である。本データは���シグナルポリペプチドがアミノ酸配列アラインメントの非常に高い類似性を有するが、シグナルポリペプチドの選択が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのＡＴＨ３５Ｌの分泌にとって重要であることを示唆する。加えて、ＡＴＨ３５Ｌ分泌は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）中とは異なり大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中では、このＡＴＨ３５Ｌの天然シグナルポリペプチドにより効率的に進行し得なかった。
【０１６７】
ＡＴＨ３５Ｌ分泌に関する、選択された細菌シグナルポリエプチドのスクリーニングは、ｄｓｂＡｓｓおよびｐｅｌＢｓｓはアミノ酸配列の高い類似性（４５％の同一性）を示すが、ＡＴＨ３５Ｌの分泌はｄｓｂＡｓｓとｐｅｌＢｓｓとの間で異なる影響を有する（図１）ことを示した。この結果は、個々のシグナルポリペプチドがＡＴＨ３５Ｌの分泌プロセスに影響を及ぼし、この分泌プロセスはシグナルポリペプチド中の各領域の機能に関連している可能性があることを示唆した。ほとんどのシグナルポリペプチドはいくつかの共通の構造的特徴を共有しており、これらのシグナルポリペプチドは、Ｎ末端極性領域（ｎ領域）ならびにそれに続く疎水性コア領域（ｈ領域）および極性開裂領域（ｃ領域）からなる。塩基性のｎ領域は２〜５個のアミノ酸長であり、正味の正電荷を有する。ｈ領域は通常、６〜１５個のアミノ酸残基を含み、トランスロケーションおよび膜貫通の標的化に関するシグナルポリペプチドの最も重要な部分であることが分かっている（Ｓｊｏｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．１９８７；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。このデータは、分泌効率が、２つの異なるシグナルポリペプチドの間の領域のスワイピング（ｓｗｉｐｉｎｇ）によるシグナルポリペプチドの構造変化の影響を受けた可能性があることを示唆する。ＡＴＨ３５Ｌの分泌効率を、２つのシグナルポリペプチドのドメインの構造的なスワイピングにより調べており、細胞外ＡＴＨ３５Ｌの収量が改善されている。この研究のための新規のシグナルポリペプチドおよび新規のシグナルポリペプチド構築物の模式図をそれぞれ表２および図２に表す。
【０１６８】
新規のシグナルポリペプチドによる細胞外ＡＴＨ３５Ｌの収量の改善
セットＩの新規のシグナルポリペプチドを、ｄｓｂＡｓｓおよびｐｅｌＢｓｓのｎ領域、ｈ領域およびｃ領域のスワイピングにより作成した（表２および図２Ａ）。セットＩの新規のシグナルポリペプチドに関して、６種の新規のシグナルポリペプチドを、ｄｓｂＡｓｓおよびｐｅｌＢｓｓの各領域のスワイピング（ＮＳＰ１〜ＮＳＰ６）、およびＮＳＰ１〜ＮＳＰ６、および得られたシグナルポリペプチドのＡＴＨ３５Ｌへの連結により作成した（プラスミド１４９１５３〜１４９１５８）（図２）。新規のシグナルポリペプチド連結ＡＴＨ３５Ｌを含む組換えプラスミドを、スクリーニングのために、１Ｌスケールのフェドバッチ条件で培養した。
【０１６９】
細胞密度が８０のＯＤ６００に達した場合に、０．５ｍＭのＩＰＴＧの添加により組換えＡＴＨ３５Ｌ遺伝子発現を誘導させ、それに続いて、さらに１２時間にわたりフェドバッチモードで３０℃にてインキュベートした。このフェドバッチプロセスの終了時のＯＤ６００の値は１２０〜１４０に達し、生存率≧９０％であった（データは示さない）。細胞外ＡＴＨ３５Ｌの分析のために、培養培地の上清を、誘導の１０時間後での遠心分離により、回収した培養試料から集めた。細胞外ＡＴＨ３５Ｌの濃度をＯｃｔｅｔアッセイにより測定し、培養培地中におけるプロセシングされた成熟ＡＴＨ３５Ｌのサイズを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した（図３）。このデータは、ＮＳＰ２およびＮＳＰ４が、ｄｓｂＡｓｓ（０．１５ｇ／Ｌ）と比較して、培養培地中における分泌されたＡＴＨ３５Ｌの収量をそれぞれ２．５倍（０．４ｇ／Ｌ）および５倍（０．８ｇ／Ｌ）増加させたことを示す。興味深いことに、これら２種の新規のシグナルペプチドは、これらの構造がｄｓｂＡｓｓのｎ領域およびｐｅｌＢｓｓのｈ領域を共有し、ｃ領域のみが異なる（表１）。ＮＳＰ２およびＮＳＰ４のｃ領域は、アミノ酸の付加またはトランケーションのいずれかにより変異しており、そのためシグナルペプチダーゼ（ＳＰ）開裂部位は改変されておらず、従ってＳＰによる開裂プロセスに影響を及ぼさなかった。観察した分泌の改善は、疎水性領域に続くアミノ酸が、シグナルペプチド中のｈ領域の構造形成および細胞質膜を横断するＡＴＨ３５Ｌのトランスロケーションに影響を及ぼし得ることを示唆する。
【０１７０】
加えて、分泌されたＡＴＨ３５Ｌの産生性は、ｄｓｂＡｓｓ（０．１５ｇ／Ｌ）と比較してＮＳＰ６（０．０２ｇ／Ｌ）で減少した。ＮＳＰ２およびＮＳＰ６は、それらの構造がｎ領域ドメインを除いて同一のｈ領域ドメインおよびｃ領域ドメインを共有する。本データは、ｄｓｂＡｓｓのｎ領域が、細胞質膜に容易に接近するためのＡＴＨ３５Ｌのトランスロケーションにおいて好ましい領域であることを示す（図３）。同様に、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４は、それらのシグナルポリペプチド構造がｈ領域を除いてｄｓｂＡｓｓのｎ領域ドメインおよびｐｅｌＢｓｓのｃ領域ドメインを共有するが、ＮＳＰ３は分泌ＡＴＨ３５Ｌの収量（０．１５ｇ／Ｌ）を改善し得ず、ＮＳＰ４はＡＴＨ３５Ｌの分泌の最大の産生性（０．８ｇ／Ｌ）を示した。
【０１７１】
この結果に基づいて、このデータは、ｈ領域の後に続くアミノ酸がシグナルポリペプチド構造の高次構造に有意に影響を及ぼし、ＡＴＨ３５Ｌが細胞質膜に接近することを実現可能にすることを示唆する。同様に、ｄｓｂＡｓｓのｎ領域とｐｅｌＢｓｓのｈ領域との共役ドメインは、分泌プロセスにおけるＡＴＨ３５Ｌのトランスロケーションにとって好ましい構造ドメインである。
【０１７２】
ｈ領域ドメイン中でのアミノ酸の位置の変更
セットＩの新規のシグナルポリペプチドのスクリーニングの結果は、疎水性領域が異なるＮＳＰ３とＮＳＰ４との間でＡＴＨ３５Ｌ分泌効率への効果が異なることを示した（図３）。ｈ領域は組換えタンパク質の細胞脂質膜へのトランスロケーションにおいて重要な役割を果たすことから（Ｈｉｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：４８８２−４８８８（１９９２）；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：２８７３−２８８０（１９９０）；ＭａｃＦａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３３：７６６−７７１（１９９５）；Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：１７０６９−１８０７３（１９９３）；Ｆｅｋｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ６３：１６１−１７３（１９９９））、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４のｈ領域中のアミノ酸の位置を変更することにより２組の新規のシグナルポリペプチドを作成し、このｈ領域中のアミノ酸位置の変更がＡＴＨ３５Ｌタンパク質の分泌効率に影響を及ぼすかどうかを調べた。ＮＳＰ３およびＮＳＰ４の構造では、ＮＳＰ３のｈ領域ドメインは、強い疎水性アミノ酸であるロイシンおよびバリンからなり、ＮＳＰ４のｈ領域ドメインは主に、ポリロイシンおよびポリアラニンからなる。ＮＳＰ４ｂおよびＮＳＰ４ｃを除くＮＳＰ３変異体およびＮＳＰ４変異体の生成では、アミノ酸の位置のみが変更されることから全体の疎水性およびｈ領域の残基長は変化していない。
【０１７３】
ＮＳＰ４の操作に関して、ｈ領域の疎水性を変化させるために、下記の３種の変異体を作成した（セットＩＩのシグナルポリペプチド）：ｉ）ｈ領域中のポリロイシンストレッチの位置およびポリアラニンストレッチの位置をスワイプさせた（ＮＳＰ４ａ）、ｉｉ）ｈ領域中の全ての残基をポリロイシン残基に置き換えて、強い疎水性アミノ酸のストレッチを作成した（ＮＳＰ４ｂ）、ｉｉｉ）ｈ領域中の全ての残基をポリアライン残基に置き換えて、弱い疎水性アミノ酸のストレッチを作成した（ＮＳＰ４ｃ）（図２ｂ）。図４は、ＮＳＰ４変異体シグナルポリペプチドがＡＴＨ３５Ｌ分泌レベルを全体的に低下させたことを示す。ＮＳＰ４は培養培地中に０．９ｇ／Ｌの分泌ＡＴＨ３５Ｌを産生したが、ＮＳＰ４ａがＡＴＨ３５Ｌに共役した場合には、分泌ＡＴＨ３５Ｌの収量は０．２８ｇ／Ｌまで減少した。ＮＳＰ４ａは、ｈ領域ドメイン中のポリロイシンおよびポリアラインの位置がＮＳＰ４と異なる。ｈ領域中において全体の疎水性または残基長に変化がないことに留意されたい。ｈ領域ドメイン中での疎水性アミノ酸の位置の変化は、ＡＴＨ３５Ｌタンパク質のトランスロケーションに有意に影響を及ぼした。同様に、ＮＳＰ４ｂ  ＡＴＨ３５ＬおよびＮＳＰ４ｃ  ＡＴＨ３５Ｌの両方での分泌ＡＴＨ３５Ｌの収量は０．０４ｇ／Ｌまで有意に減少した。ＮＳＰ４ｂのｈ領域はポリロイシンによる強い疎水性アミノ酸のみからなるが、この強い疎水性領域は、分泌プロセスでのＡＴＨ３５Ｌのトランスロケーションにおいて、より低い効率を示した（０．０４ｇ／Ｌ）。驚くことではないが、ウエスタンブロットによるＮＳＰ４ｃでの分泌ＡＴＨ３５Ｌの検出はなく、なぜならば、ＮＳＰ４ｃのｈ領域ドメインは、より弱い疎水性アミノ酸であるポリアラニンのみで構成されているからである。定量アッセイにより０．０４ｇ／ＬのＡＴＨ３５Ｌを検出したが、この量のＡＴＨ３５Ｌは、細胞死に起因して細胞内空間から放出されたＡＴＨ３５Ｌ前駆体を表す。フェドバッチ培養の最中に、ＮＳＰ４変異体は細胞増殖の特徴を変えた。具体的には、ＮＳＰ４ｃ  ＡＴＨ３５Ｌの細胞増殖速度は他の変異体構築物と比べて低かった。ＯＤ６００でのＮＳＰ４ｃ  ＡＴＨ３５Ｌの細胞増殖速度は、細胞アポトーシスの開始に起因して、誘導の１０時間後に低下した（データは示さない）。さらに、誘導の１２時間後またはより早い誘導時点のいずれかで、ＮＳＰ４ｃでの分泌ＡＴＨ３５Ｌを検出しなかった。ＮＳＰ４ｃ  ＡＴＨ３５Ｌの培養における細胞アポトーシスは誘導後のＡＴＨ３５Ｌの発現の最中に急速に起こり、これにより培養培地中の分泌ＡＴＨ３５Ｌが減少する。
【０１７４】
セットＩのシグナルポリペプチドのスクリーニングの結果に基づいて、ＮＳＰ３は、たとえＮＳＰ３がＮＳＰ４と同一のｎ領域ドメインおよびｃ領域ドメインを含んでいてもＡＴＨ３５Ｌの分泌を改善し得なかった（図２ａおよび図３）。同様に、分泌ＡＴＨ３５Ｌの収量は、ＮＳＰ４ａが、ポリロイシン残基およびポリアラニン残基の位置が変わっているＡＴＨ３５Ｌに連結されている場合に著しく変化している（図２ｂおよび図４）。そのため、このデータは、ｈ領域における疎水性プロットがＡＴＨ３５Ｌのトランスロケーションおいて重要な因子を有することを示す。ｈ領域ドメイン中のアミノ酸残基の位置を変更して、このｈ領域の様々な疎水性プロットを作ることにより、ＮＳＰ３の４種の変異体を作成した（図２ｃ）。ｈ領域ドメイン中でのアミノ酸の位置の変化は、ＡＴＨ３５Ｌの分泌効率に有意に影響を及ぼす（図５）。ＮＳＰ３ｂは、ＮＳＰ３（０．１８ｇ／Ｌ）と比較して分泌ＡＴＨ３５Ｌの収量を２倍（０．４８ｇ／Ｌ）改善した。対照的に、ＮＳＰ３ａおよびＮＳＰ３ｄはそれぞれ、分泌ＡＴＨ３５Ｌの収量を０．１ｇ／Ｌおよび０．１４ｇ／Ｌに減少させた（図５）。ＮＳＰ３ｂのｈ領域では、残基の位置を変えることにより、このｈ領域の中心に強い疎水性アミノ酸残基（例えばロイシンおよびバリン）が位置する。他のＮＳＰ３変異体シグナルポリペプチドでは、強い疎水性残基の位置がｎ領域またはｃ領域の近くであり、このことがＮＳＰ３ｂと異なる。これまでのいくつかの研究から、全体の疎水性および疎水性ドメイン長が、組換えタンパク質のトランスロケーションと、分泌機序に関与する因子による認識での基質特異性とにとって重要な因子であることが分かっている（Ｂａｎｋａｉｔｉｓ  ｅｔ．  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ３７：２４３−２５２（１９８４）；Ｅｍｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８５：８２−８５（１９８０）；Ｈｉｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：４８８２−４８８８（１９９２））。しかしながら、この結果は、疎水性アミノ酸残基の位置もタンパク質のトランスロケーションにとって重要な因子であることを示唆した。全体の疎水性および疎水性ドメインの長さに変化がないにもかかわらず、ｈ領域ドメイン中のアミノ酸残基の代替位置はＡＴＨ３５Ｌのトランスロケーションに影響を及ぼした。細胞増殖の特徴では、全ての変異体構築物の細胞増殖速度が、フェドバッチ培養プロセスの最中に様々であった。本研究は、ｈ領域ドメインの疎水性プロットが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのＡＴＨ３５Ｌの発現および分泌の最中でのＡＴＨ３５Ｌタンパク質のトランスロケーションプロセスおよび細胞増殖に有意に影響を及ぼすことを示唆する（図４および図５）。同様に、これまでの研究で示されているように（Ｅｍｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８０；Ｈｉｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）、ｈ領域の全体の疎水性はＡＴＨ３５Ｌタンパク質の分泌に不可欠である（図４）。
【０１７５】
ＡＴＨ３５Ｌの分泌へのＮＳＰ４のさらなる特徴付け。本研究により、ＮＳＰ４が、誘導の１０時間後にｄｓｂＡｓｓと比較して培養培地中の分泌ＡＴＨ３５Ｌの収量を≧５倍改善したことが実証されている（図３）。フェドバッチ培養の最中に、ＮＳＰ４  ＡＴＨ３５Ｌを含む細胞の特徴が誘導後に変化していることが示されている。ＮＢＰ４  ＡＴＨ３５Ｌに対して誘導時間の長さを最適化するために、本発明者らは、様々な誘導時点においてＮＳＰ４とｄｓｂＡｓｓとの間で分泌ＡＴＨ３５Ｌの収量を比較し、ゲル電気泳動によりＡＴＨ３５Ｌ前駆体混入を検証した。
【０１７６】
フェドバッチ培養の増大を、ＡＴＨ３５Ｌ遺伝子誘導のために３０℃、ｐＨ７でおよび０．５ｍＭのＩＰＴＧを使用して、１Ｌの発酵槽中で実行した。本研究では、組換えＡＴＨ３５Ｌ遺伝子発現用のフェドバッチ培養条件の詳細を説明する。ｄｓｂＡｓｓ＿ＡＴＨ３５ＬおよびＮＳＰ４＿ＡＴＨ３５Ｌの両方の培養試料を、誘導後２時間毎に集め、分泌ＡＴＨ３５Ｌの定量のための遠心分離により、この培養試料から、分泌ＡＴＨ３５Ｌを含む培養培地を分離した。分泌ＡＴＨ３５ＬおよびＡＴＨ３５Ｌ前駆体の検証を、ゲル電気泳動およびウエスタンブロットにより実施した（図６ａ、図６ｂ）。試料を誘導の８時間後に回収した場合には、ＮＳＰ４＿ＡＴＨ３５ＬおよびｄｓｂＡｓｓ＿ＡＴＨ３５Ｌはそれぞれ０．７ｇ／Ｌおよび０．１２ｇ／Ｌの分泌ＡＴＨ３５Ｌを産生した。誘導の１２時間後に、分泌ＡＴＨ３５Ｌの収量はＮＳＰ４により１ｇ／Ｌまで増加し、ｄｓｂＡｓｓにより０．２ｇ／Ｌまで増加した（図６ａ、図６ｂ）。定量データは、培養培地中における分泌ＡＴＨ３５Ｌの収量がｄｓｂＡｓｓ＿ＡＴＨ３５ＬおよびＮＳＰ４＿ＡＴＨ３５Ｌの両方において誘導の１２時間後に増加することを示した。しかしながら、電気泳動による分析データは、細胞アポトーシスに起因して誘導の１２時間後から、ＮＳＰ４＿ＡＴＨ３５ＬのＡＴＨ３５Ｌ前駆体が細胞内空間から培養培地中に漏出することを明らかにした。ｄｓｂＡｓｓ＿ＡＴＨ３５Ｌの細胞生存率は誘導の１２時間後に≧９０％であったが、ＮＳＰ４＿ＡＴＨ３５Ｌの細胞生存率は≦９０％まで低下し始めた（データは示さない）。細胞生存率の結果はゲル電気泳動分析と相関していた（図６ａ、図６ｂ）。これらのデータは、ＮＳＰ４はＡＴＨ３５Ｌのトランスロケーションに対して非常に効率的であり、誘導の６時間後にｄｓｂＡｓｓと比較して分泌ＡＴＨ３５Ｌの産生性を６倍増加させたことを示唆する（図６）。さらに、ＮＳＰ４は、短い誘導時間で成熟ＡＴＨ３５Ｌを放出した。組換えタンパク質産生のための培養プロセス時間の短縮は、プロセス時間を節約するための商業的活動において非常に有益であるだろう。
【０１７７】
組換えタンパク質の分泌プロセスでは、シグナルペプチダーゼによるシグナルポリペプチドの開裂は、成熟タンパク質をペリプラズム空間および細胞外環境に適切に放出するための、膜を横断するタンパク質トランスロケーションの重要な且つ有用な基準である。一般に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シグナルポリペプチドは、ｃ領域中に開裂認識部位としてＡｌａ−Ｘ−Ａｌａ特異的モチーフ（Ａ−Ｘ−Ａドメインを）有し、本研究における新規のシグナルポリペプチドの全てが、そのｃ領域中にＡ−Ｘ−Ａドメインを含む。シグナルポリペプチドからのＡＴＨ３５Ｌの開裂を検証するために、培養培地中の分泌ＡＴＨ３５Ｌを本研究で説明されたように精製し、精製したＡＴＨ３５Ｌタンパク質は、Ｎ末端ペプチドのシークエンシング分析を使用して、適切なスプライシングプロセスによる成熟ＡＴＨ３５Ｌの分泌を確認した。本発明者らは、Ｎ末端ペプチドのシークエンシング分析を使用して、本研究における新規のシグナルポリペプチドが、開裂プロセスを中断することなくＡＴＨ３５Ｌ前駆体から適切に開裂されることを確認した（表３）。
【０１７８】
【表３】
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【０１７９】
考察
シグナルポリペプチド連結ＡＴＨ３５Ｌは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系では可溶性タンパク質として発現されて分泌される（Ｍｅｎｚｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６４：１８３９−１８４１（１９９４））。本研究では、本発明者らは、ＡＴＨ３５Ｌタンパク質の培養培地への分泌に関して、ＡＴの天然シグナルポリペプチド（ＮＴｓｓ）、ＤｓｂＡｓｓ、ｐｅｌＢｓｓおよびｐｈｏＡｓｓをスクリーニングした。ＤｓｂＡｓｓ、ｐｅｌＢｓｓおよびｐｈｏＡｓｓ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シグナルポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＳＥＣ系での組換えタンパク質の分泌に一般に使用されている。スクリーニングでは、シグナルポリペプチド連結ＡＴＨ３５Ｌは、ペリプラズム空間から培養培地中へと細胞外に分泌されている。一部の可溶性ＡＴＨ３５Ｌは依然として細胞質空間中に可溶性タンパク質として残存しているが（データは示さない）、発現されたＡＴＨ３５Ｌタンパク質の３０％がペリプラズム空間および培養培地に分泌された。具体的には、ｄｓｂＡｓｓ連結ＡＴＨ３５Ｌは、選択されたシグナルポリペプチドの中で最も高い分泌効率を有し、ｐｅｌＢｓｓ連結ＡＴＨ３５Ｌは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シグナルポリペプチドの中でＡＴＨ３５Ｌの最も低い分泌効率を示した（図２）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シグナルポリペプチドの間ではアミノ酸配列の高い類似性が存在するが、これらのシグナルポリペプチドは、分泌プロセスの最中でのシグナルポリペプチド中の各領域の様々な機能に起因して、ＡＴＨ３５Ｌタンパク質の分泌への様々な効率を示した（Ｈｉｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｉｓｍａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｅｔｔ  ３３：９９９−１００５（２０１１），Ｖｅｌａｉｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６４：５４３−５５０（２０１４））。興味深いことに、ｐｅｌＢｓｓおよびｄｓｂＡｓｓの間のアミノ酸配列アラインメントは４５％同一性で高い類似性を示したが、ｐｅｌＢｓｓ連結ＡＴＨ３５Ｌは、ｄｓｂＡｓｓとは異なり、培養培地中に分泌ＡＴＨ３５Ｌを非効率的に分泌した（図２）。
【０１８０】
新規のシグナルポリペプチドを使用して細胞外ＡＴＨ３５Ｌ分泌産物の改善を調べ、具体的には細胞外ＡＴＨ３５Ｌの分泌への個々のシグナルポリペプチド領域の影響を確認した。この調査の最中に、ＡＴＨ３５Ｌ分泌に対する、新たに作成した新規シグナルポリペプチドＮＳＰ１、ＮＳＰ５およびＮＳＰ６は、ｄｓｂＡｓｓと比較して誘導の１０時間後に分泌ＡＴＨ３５Ｌの収量を減少させたが、ＮＳＰ２およびＮＳＰ４はそれぞれ、分泌ＡＴＨ３５Ｌの収量を３倍および５倍増加させることを発見した（図３）。セットＩのシグナルポリペプチドの構造では、これらのシグナルポリペプチドの間の大きな差異は、ＮＳＰ２およびＮＳＰ４がｄｓｂＡｓｓのｎ領域を含むが、ＮＳＰ１、ＮＳＰ５およびＮＳＰ６がｐｅｌＢｓｓのｎ領域を含むことである。この結果は、ｄｓｂＡＡのｎ領域が、ＡＴＨ３５Ｌタンパク質の翻訳後に、ｐｅｌＢｓｓのｎ領域と比べて新生シグナルポリペプチド認識粒子（ＳＲＰ）によるｎ領域の認識への良好な効率を有することを意味する。多くの研究は、組換えタンパク質の分泌を改善すべく、ｈ領域の全体の疎水性を増加させるために、またはシグナルポリペプチドのストレッチ長を変化させるために、シグナルポリペプチドを点変異誘発により変異させたことを示している（Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：２８７３−２８８０（１９９０），Ｈｉｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｊｏｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｋｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  １１：９７−１０６（２０１２））。本研究は、高い類似性を有する２種の異なる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シグナルポリペプチドの交差転移（ｃｒｏｓｓ−ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）により作成した新規のシグナルポリペプチドを調べ、この新規のシグナルポリペプチドは分泌ＡＴＨ３５Ｌの収量の改善に寄与した。
【０１８１】
分泌経路では、多くの構成要素が分泌プロセスに関与している。分泌プロセスの開始時に、シグナルポリペプチドの塩基性アミノ酸を有するｎ領域がＳＲＰにより認識されて細胞質膜に接近した。ＮＳＰ４構造は、ｐｅｌＢｓｓのｎ領域と比較してポリリシン等のより塩基性のアミノ酸残基を含むｄｓｂＡｓｓのｎ領域で構成さている。このｎ領域は、ＮＳＰ４を細胞質膜により容易に接近可能にする。ｈ領域もまた、組換えタンパク質をトランスロケートするための重要な因子であり、本研究は、組換えタンパク質の分泌効率が、全体の疎水性に関係なくｈ領域中の疎水性のアミノ酸残基の位置に応じて変化することを実証した。ＮＳＰ２およびＮＳＰ４の両方が分泌ＡＴＨ３５Ｌの収量を増加させ、これら２種のシグナルポリペプチドは、ｄｓｂＡｓｓのｎ領域およびｐｅｌＢｓｓのｈ領域を含む。しかしながら、ＮＳＰ４は、同量の細胞中でＮＳＰ２と比べて良好な量の分泌ＡＴＨ３５Ｌを産生した。両方のシグナルポリペプチドは、スプライシングプロセス用の開裂認識部位としてＡｌａ−Ｘ−Ａｌａ特異的部位を有する。それにもかかわらず、ｐｅｌＢｓｓのｈ領域およびｃ領域は、ｄｓｂＡｓｓのｈ領域およびｃ領域と比べてＡＴＨ３５Ｌのトランスロケーションおよび放出で良好な効率を示した。このデータは、２種のシグナルポリペプチドの間で総ＡＴＨ３５Ｌタンパク質発現に差異がないことから、ｐｅｌＢｓｓのｃ領域がｄｓｂＡｓｓのｃ領域と比べて開裂プロセスで効率的であり得ることを示唆する。あるいは、ｃ領域中のアミノ酸の一部はｈ領域ドメインの構造コンフォメーションに影響を及ぼし得、その結果、ＡＴＨ３５Ｌのトランスロケーション効率が影響を受ける。
【０１８２】
興味深いことに、ＮＳＰ３連結ＡＴＨ３５Ｌは、ＡＴＨ３５Ｌの分泌を有意に改善しなかったが、ＮＳＰ３は、ｈ領域を除いてＮＳＰ４の同一のｎ領域およびｃ領域を含む（図２および図３）。そのため、このデータは、ｐｅｌＢｓｓのｈ領域がＡＴＨ３５Ｌのトランスロケーションおよび分泌で重要な役割を果たすことを示す。ｈ領域ドメインの全体の疎水性は、組換えタンパク質がトランスロケーションのために細胞質膜に接近する場合に重要な因子である。この理由のために、シグナルポリペプチドのｈ領域は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での組換えタンパク質分泌を改善すべく全体の疎水性を変えるためのアミノ酸の付加またはトランケーションにより研究されている（Ｊｏｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）；Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ３：３３４−３３８（２０１１）；Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｅｔ  ａｌ．１９９３；Ｓｊｏｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．１９８７；Ｖｅｌａｉｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。本研究では、これら２種のシグナルポリペプチドが異なる疎水性領域を有するが同一のｎ領域およびｃ領域を有することから、これら２種のシグナルポリペプチドのｈ領域中のアミノ酸位置を変えることにより、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４の変異体を作成した（図２ｂおよび図２ｃ）。
【０１８３】
一般に、ｈ領域は、弱い疎水性アミノ酸残基および強い疎水性アミノ酸残基からなる。そのため、強い疎水性残基のみを有するｈ領域がＡＴＨ３５Ｌ分泌にどの程度の影響を及ぼすかを調べた（ＮＳＰ４ｂ）。ＮＳＰ４ｂの比較のために、シグナルポリペプチド構造の疎水性を破壊すべくポリアラニンのみで別の変異体を作成した（ＮＳＰ４ｃ）。興味深いことに、ＡＴＨ３５Ｌの分泌効率は、ＮＳＰ４ｂおよびＮＳＰ４ｃでも同様に有意に減少している（図４）。多くの研究から、シグナルポリペプチドでの疎水性の増加は組換えタンパク質の分泌効率を増強したことが分かっている（Ｂａｎｋａｉｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３７：２４３−２５２（１９８４）；Ｅｍｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）；Ｈｉｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２））。しかしながら、強い疎水性残基のみの構成は、ＡＴＨ３５Ｌのトランスロケーションを増強し得なかった。本データは、疎水性のバランスのために、ｈ領域が強い疎水性アミノ酸残基と弱い疎水性アミノ酸残基との適切な組み合わせを必要とすることを示唆する。
【０１８４】
全体の疎水性またはｈ領域のストレッチは、ＮＳＰ３変異体およびＮＳＰ４変異体では変化していないが、ＡＴＨ３５Ｌ分泌効率は、アミノ酸位置の変化によりこれらの変異体の間で顕著な差異を示した（図４および図５）。ｈ領域中のアミノ酸の位置は、分泌プロセスにおいて組換えＡＴＨ３５Ｌタンパク質のトランスロケーションに有意に影響を及ぼす。本研究は、ｈ領域ドメイン中のアミノ酸位置を変えることにより、組換えタンパク質の分泌効率が改善され得るという新たな発見である。
【０１８５】
シグナルポリペプチド変異体はまた、ＡＴＨ３５Ｌ遺伝子発現の誘導後の細胞増殖の特徴にも影響を及ぼす。フェドバッチ培養の最中に、このデータは、ＮＳＰ４に最適化された培養プロセス時間は、ＡＴＨ３５Ｌ産物の品質管理のために誘導後１０時間であったこと示唆する。対照的に、ｄｓｂＡｓｓに最適化された培養プロセス時間は、ＡＴＨ３５Ｌ産物の最大分泌を達成するために誘導後１２時間であった。ｄｓｂＡｓｓと比べて５倍高い、ＮＳＰ４からの分泌ＡＴＨ３５Ｌの収量を達成した（図６）。このデータは、ＮＳＰ４が、短い培養プロセス時間でＡＴＨ３５Ｌ分泌の改善に大きな影響を及ぼすことを示し、このことは、このシグナルポリペプチドが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系において商業レベルの分泌ＡＴＨ３５Ｌ産物に非常に有用であることを示唆する。
【０１８６】
まとめると、このデータは、合成シグナルポリペプチドの一部が、非改変シグナルポリペプチドと比較してＡＴＨ３５Ｌの分泌効率を改善したことを示す。具体的には、ＮＳＰ４は、フェドバッチ発酵プロセスにおいて、分泌されたＡＴＨ３５Ｌの収量を４倍改善した。本研究では、本発見は、ＡＴＨ３５Ｌの分泌効率がシグナルポリペプチドのｈ領域の改変により有意に改善され、ｈ領域中の残基の位置も分泌効率に影響を及ぼすことを示す。これらの新規のシグナルポリペプチドを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での異種タンパク質の分泌効率を改善し得る。
【０１８７】
結論として、本明細書のデータは下記を実証する：ｉ）追加の塩基性アミノ酸残基を含むｄｓｂＡｓｓのｎ領域は、ｐｅｌＢｓｓのｎ領域と比較して好ましいドメインであった、ｉｉ）ｈ領域の疎水性は、組換えタンパク質の細胞質膜へのトランスロケーションに重要である、ｉｉｉ）ｈ領域は、組換えタンパク質の効率的なトランスロケーションのために、弱いアミノ酸残基および強いアミノ酸残基の両方を適切に必要とする、ｉｖ）ｈ領域中の疎水性アミノ酸残基のシャフリングが、組換えタンパク質のトランスロケーションに有意に影響を及ぼす、ｖ）特に、ＮＳＰ４は、短い培養プロセスでＡＴＨ３５Ｌ分泌の改善に有意に影響を及ぼした。本発明者らは、本研究で設計された新規のシグナルペプチドを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現プラットフォームでの組換えタンパク質の分泌効率を改善し得たと考える。
【０１８８】
別途定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語ならびにあらゆる頭文字は、本発明の分野の当業者に一般に理解されるのを同じ意味を有する。本明細書で説明されているものと類似のまたは等価の情報を伝達するための任意のポリペプチド配列または核酸配列、タンパク質、ベクター、組成物、細胞、方法および手段を使用して、本発明を実施し得る。
【０１８９】
本明細書で引用された全ての参考文献は、法律により許容される限り参照により本明細書に組み込まれる。これらの参考文献の議論は、それらの著者によりなされた主張を要約することが意図されているにすぎない。あらゆる参考文献（またはあらゆる参考文献の一部）が、関連する先行技術であることを承認するものではない。出願人は、引用されたあらゆる参考文献の正確さおよび適切さに異議を唱える権利を保留する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019532656.tif 000014
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