(57)【要約】堆積物中の液滴を特定する方法と関連シーケンサ  液滴ストリーム中の個々の液滴の内容物を特定する方法であって、各液滴は初期の非蛍光状態においてフルオロフォアを含む、少なくとも１つの開口管に液滴をひとつずつ導入してその中に液滴の堆積物を作成するステップと、液滴中のフルオロフォアを活性化してそれらに蛍光を発させるステップと、管から液滴堆積物中の各液滴を放出し、また、それが出現すると各液滴に関連付けられたフルオロフォアを、管の主軸に沿って検出するステップと、に特徴付けられる方法が開示される。また、（１）その構成単量体の順序づけられたストリーム中に生体高分子を漸次消化するステップと、（２）単量体を含む水性液滴の対応するストリームへと単量体のストリームを変換するステップであって、各液滴は（ａ）単量体を補捉することが可能であり、また（ｂ）その後、消化されて捕捉された前記単量体に特徴的な消光されていないフルオロフォアを放出することが可能なプローブを追加的に含む、ステップと、（３）少なくとも１つの開口管の入口端にステップ（２）で作成された前記液滴のストリームを導入してその中に液滴の堆積物を作成するステップと、（４）前記管の出口端から各液滴を放出し、また、各液滴が出現すると各液滴中のフルオロフォアを検出するステップと、に特徴付けられる、生体高分子の配列決定に適した方法が開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液滴ストリーム中の、フルオロフォアを含む各液滴の内容物を特定する方法であって、少なくとも１つの開口管に前記液滴をひとつずつ導入してその中に前記液滴の堆積物を作成するステップと、前記管から前記液滴堆積物中の前記各液滴を放出し、また、それが出現すると前記各液滴に関連付けられた蛍光を、前記管の主軸に沿って検出するステップとを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記液滴は前記管の入口端に導入されて、出口端から放出されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記管は鉛直に並べられ、また、前記各液滴は前記液滴堆積物の底部から出口を介して放出されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記液滴中の前記フルオロフォアは初期の非蛍光状態であり、また、前記方法は、前記液滴が前記液滴堆積物中に位置している間、前記フルオロフォアを活性化するステップをさらに備えることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記フルオロフォアは、ユーザが特定を望む検体分子に対し、選択性が高く、また特徴的なプローブ分子に関連付けられることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
検出された前記蛍光シグナルに基づき、前記液滴を選別する、または特徴付けする追加的なステップを備えることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第１の端部から前記管が前記液滴を充填される間、前記管に負圧が付与されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記管の前記内径は前記液滴の前記直径の２倍未満であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記液滴堆積物中の前記液滴は、非混和性溶媒中で懸濁されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記管の内面には疎水性コーティング領域と親水性コーティング領域とが設けられることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記液滴の屈折率が１．３〜１．４の範囲内であり、また、前記溶媒の前記屈折率が１．３〜１．７の範囲内であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
基板内に平行に配置された管のアレイが使用され、また、液滴の堆積物は各管内に作成されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記基板は、１．４〜１．７の範囲内の屈折率を有する、必要に応じて光吸収性のガラスで形成されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
電磁放射で前記管を照射し、各液滴が出現するとそこから生じる蛍光放射シグナルを検出するステップを含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記水性液滴、前記溶媒、および前記ガラスの屈折率は、出現した前記液滴によって生成された前記蛍光シグナルと、その後ろの前記堆積物中の他の液滴との間で１０％未満のクロストークを起こす導波モードが確立されるように選ばれることを特徴とする、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
検出される前記液滴からの前記電磁放射の拡散は、例えば前記管内の前記導波路モードを調整することにより、その後ろの前記堆積物内の前記液滴による前記電磁放射の増進を抑制することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
（１）その構成単量体の順序づけられたストリーム中へと生体高分子を漸次消化するステップと、（２）前記単量体のストリームを、対応する単量体を含む水性液滴のストリームへ変換するステップであって、各液滴は（ａ）前記単量体を補捉することが可能であり、また（ｂ）その後消化されて、捕捉された前記単量体に特徴的な消光されていないフルオロフォアを放出することが可能なプローブを追加的に含む、ステップと、（３）少なくとも１つの開口管の入口端にステップ（２）で作成した液滴のストリームを導入してその中に液滴の堆積物を作成するステップと、（４）前記管の出口端から各液滴を放出し、各液滴が現れると各液滴中にフルオロフォアを検出するステップとを特徴とする、生体高分子の特徴付けに適した請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
次に現れる前記液滴についてステップ（４）を繰り返す前に、前記出口から前記液滴を取り除くさらなるステップ（５）を特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体高分子は核酸であり、また、前記単量体はヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
核酸は、自然起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（３）と（４）との間にインキュベーション期間が存在することを特徴とする、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
その構成単量体の対応するストリーム中へと前記生体高分子が漸次消化される検体受け場所を含む消化ユニットと、
対応する液滴のストリームとして前記単量体のストリームを分配する、少なくとも１つの液滴分配ノズルを含む分配ユニットと、
開口管のアレイがそれを通して設けられた基板であって、各開口管が対向面上に入口と出口とを有し、また、各開口管の主軸は前記液滴が分配されることになる方向に対し平行に配置される基板と、
前記管の前記主軸に対し垂直な少なくとも一つの方向で前記基板の前記入口面に対して前記液滴分配ノズルを前進させ、それによって前記液滴が前記管内へと分配されることを可能にする手段と、
前記管内に液滴堆積物を作成し、必要に応じて、前記出口を通して前記堆積物から前記液滴を放出するコントローラと、
前記基板の前記出口面で前記出口を照らすよう適合した少なくとも１つの電磁放射線源と、
前記出口の前記照射をそこからの前記液滴の出現と同期させる手段と、
前記出口から生じる同期した蛍光放射シグナルを検出するよう適合した少なくとも１つの光検出器と
を備えることを特徴とする、核酸またはタンパク質等の生体高分子を配列決定する装置。
【請求項２３】
前記液滴堆積物中の二次液滴からクロストーク蛍光シグナルを減少し、または排除する、各管に関連付けられた導波路をさらに備えることを特徴とする、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記消化ユニットと前記分配ユニットとの間に配置された、ピロホスファターゼを導入するチャンバまたは流体合流部をさらに備えることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の装置。
【請求項２５】
基板が１．４５〜１．６５の範囲の屈折率を有する光吸収性ガラスから形成されることを特徴とする、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２６】
前記管は、その壁に疎水性コーティング領域と親水性コーティング領域とが設けられた毛細管であることを特徴とする、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２７】
前記コントローラは  前記入口と前記出口との間に負圧を付与する手段と、開閉されて前記出口を通る前記液滴堆積物からの各液滴の放出をコントロールし得る微小電気機械ゲートとを備えることを特徴とする、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２８】
前記管は鉛直に並べられ、前記コントローラは前記液滴堆積物の前記底部から各液滴を放出することを特徴とする、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２９】
自然起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを配列決定する、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液滴堆積物中の液滴を特定する改良された方法及び装置に関する。これはとりわけ、単量体単位を分析する前に微小液滴中のその構成単量体単位を捕捉することにより、核酸等の生体高分子を配列決定するのに役立つ。
【背景技術】
【０００２】
我々が以前に出願した、国際公開第２０１４０５３８５４号の特許出願と国際公開第２０１４１６７３２３号の特許出願とにおいて、最初に、対応する前駆体の検体から単一ヌクレオチドの順序づけられたストリームを作成するステップを含む方法、例えば、漸進的加ピロリン酸分解またはエキソヌクレアーゼ分解により、合成および自然発生のＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸を配列決定する方法を開示した。その後、水の微小液滴中で単一ヌクレオチドを捕捉し、ここでそれらは、捕捉が発生した後に、漸進的エキソヌクレアーゼ分解を受けて消光されていないフルオロフォア（蛍光色素分子）を有する単一ヌクレオチドを検出可能な状態に解放する、消光した、フルオロフォア標識オリゴヌクレオチドプローブシステムであって、その特徴的な蛍光放出は、元々捕捉されたヌクレオチドが確実に特定されることを可能にするシステムで、処理される。この目的に適したプローブおよび方法の実施例は、国際公開第２０１４０５３８５３号と国際公開第２０１６０１２７８９号とを含む、これらおよび他の特許出願に記載されている。
【０００３】
例えばシリコーン油等の非混和性キャリア媒体中に分散した液滴のストリームを作成し、また操作することによって、上記で説明した方法を行うことができる一方、我々は最近、液滴が形成されるときに平坦な基板の表面に直接液滴をプリントすることによって、有利に、また、より効率的に当該方法を行い得ることがわかった。我々はこの液滴プリント方法と保存方法との変形例を、米国特許出願公開第２０１６１２２８０２号および欧州特許出願第１５００２００７．１号において記載した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１４０５３８５４号
【特許文献２】国際公開第２０１４１６７３２３号
【特許文献３】国際公開第２０１４０５３８５３号
【特許文献４】国際公開第２０１６０１２７８９号
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１６１２２８０２号
【特許文献６】欧州特許出願第１５００２００７．１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このアプローチを使うことによる１つの潜在的欠点は、大きい核酸フラグメントが分析される場合に多数の液滴が含まれることにより、基板が非常に大きい必要があること、および、事実上、時折、複数の基板が必要となり得ることとである。これは特に、元の検体が数千、さらには数百万もの、有機体の遺伝子または染色体に特徴的なヌクレオチドを備える場合に同様である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この欠点を克服するため、我々は、プリントされた液滴を、基板の表面に保存するのではなく、分析を行う準備ができるまで基板内に配置された毛細管内に堆積させる方法を発明した。そして、前記で教示したように、液滴を適切なときに管から出現させ、その時点で液滴を分光学的に分析し得る。この手段により、我々は開発中の対応するシーケンサの重要部分のサイズをかなり減少させることができた。さらに、我々はこの方法が、それらの個々の蛍光特性に基づいた大きい液滴ストリーム中の液滴の選別において、より一般的な有用性を有すると信じている。
【０００７】
したがって、本発明の第１の態様では、液滴ストリーム中の、フルオロフォアを含む各液滴の内容物を特定する方法であって、少なくとも１つの開口管に液滴をひとつずつ導入してその中に液滴の堆積物を作成するステップと、管から液滴堆積物中の各液滴を放出し、また、それが出現すると各液滴に関連付けられた蛍光を、管の主軸に沿って検出するステップとによって特徴付けられる方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
一実施形態では、方法は、蛍光シグナルの検出と同期した１つ以上の選別ゲート、例えば微小電気機械ゲート、を使用するステップを含む、検出された蛍光に基づき液滴を特徴付けする、または選別する追加的なステップを含む。別の実施形態では、液滴は管の入口端に導入されて、対応する出口端から取り除かれる。別の実施形態では、管は鉛直に並べられ、液滴は頂部の入口に導入され、底部の出口端の液滴堆積物から取り除かれる。
【０００９】
一つの好ましい実施形態では、フルオロフォアを含む液滴は初期の非蛍光状態（非フルオロフォア状態）で管内へ導入され、また、方法は液滴が液滴堆積物中に位置している間、フルオロフォアを活性化する追加的なステップを含む。別の実施形態では、フルオロフォアは、ユーザが間接的に特定を望む検体分子に対し選択性が高く、また特徴的なプローブ分子、例えばオリゴヌクレオチドプローブに関連付けられる。管の性質、どのように（例えば固体基板内に）管を配置し得るか、そして液滴の性質および内容に関するさらなる詳細は、当該方法の１つの適切な応用例である、生体高分子の構成単量体単位を特徴付けることによる生体高分子の配列決定に対し特定の参照を行って、以下により詳細に説明する。
【００１０】
したがって、本発明の第２の態様において、（１）その構成単量体の順序づけられたストリーム中へと生体高分子を漸次消化するステップと、（２）単量体のストリームを対応する単量体を含む水性液滴のストリームへ変換するステップであって、各液滴は（ａ）単量体を補捉することが可能であり、また（ｂ）その後、消化されて捕捉された単量体に特徴的な消光されていないフルオロフォアを放出することが可能なプローブを追加的に含む、ステップと、（３）少なくとも１つの開口管の入口端にステップ（２）で作成された液滴のストリームを導入してその中に液滴の堆積物を作成するステップと、（４）管の出口端から各液滴を放出し、各液滴が出現すると各液滴中のフルオロフォアを検出するステップと、に特徴付けられる生体高分子の特徴付けに適した方法が開示される。
【００１１】
この特定の方法は核酸またはタンパク質等の生体高分子の配列決定に適した対応するシーケンサの作用原理を形成し得ることがまた理解される。したがって、本発明の第３の態様において、構成単量体の対応するストリーム中へと生体高分子が漸次消化される検体受け場所を含む消化ユニットと、対応する液滴のストリームとして単量体のストリームを分配する少なくとも１つの液滴分配ノズルを含む分配ユニットと、開口管のアレイがそれを通して設けられた基板であって、各開口管が対向面上に入口と出口とを有し、また、各開口管の主軸は液滴が分配されることになる方向に対し平行に配置される、基板と、管の主軸に対し垂直な少なくとも一つの方向で基板の入口面を渡って液滴分配ノズルを前進させ、それによって液滴が管内へ分配されることを可能にする手段と、必要に応じて管内に液滴堆積物を作成し、また、出口を通して堆積物から液滴を放出する、コントローラと、基板の出口面で出口を照らすよう適合した少なくとも１つの電磁放射線源と、出口の照射をそこからの液滴の出現と同期させる手段と、出口から生じる同期した蛍光放射シグナルを検出するよう適合した少なくとも１つの光検出器と、を備えることにより特徴付けられる、生体高分子を配列決定する装置が提供される。
【００１２】
一実施形態では、生体高分子は核酸であり、また、単量体単位はヌクレオチドであり、
例えば、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸またはヌクレオシド一リン酸である。別の実施形態では、生体高分子はタンパク質であり、また、単量体はアミノ酸分子である。
【００１３】
対応するシーケンサの消化ユニットにおいて行われる、本発明の第２の態様の方法のステップ（１）考慮すると、生体高分子が核酸である一実施形態では、それは前駆体の核酸検体の漸進的加ピロリン酸分解またはエキソヌクレアーゼ分解により行われる。対応するシーケンサでは、これは、例えば検体がチャンバの壁またはマイクロ流体チャネルに、直接的に、または、例えば負圧吸引または磁気吸引によってその位置に保持されるよう適合した官能基化されたビーズ等の中間的要素を介して取り付けられる、消化ユニット内の検体受け場所で起きる。
【００１４】
核酸検体は原則として、遺伝子または染色体内で認識されるそれに達する任意のヌクレオチド鎖長のＤＮＡまたはＲＮＡのフラグメントを含む、任意の自然起源または合成起源の核酸であり得る。ＤＮＡまたはＲＮＡが自然起源である一実施形態では、核酸は、特徴的な核酸塩基であるチミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびウラシル（Ｕ）の１つを担持するヌクレオチドから成る。本発明の方法および装置によって分析できる他の核酸、ヌクレオチド、および核酸塩基の領域および範囲についてのさらなる情報に関し、読者には上記で参照した我々の特許出願が案内される。
【００１５】
一実施形態では、核酸検体は、水媒体中で漸進的な加ピロリン酸分解または漸進的エキソヌクレアーゼ分解によって単一ヌクレオシド三リン酸または単一ヌクレオシド一リン酸のどちらかの対応する順序づけられたストリーム中へと消化され、ここで順序づけは検体のヌクレオチド配列に対応する。この消化は、上記で参照した我々の特許出願において開示した必要な試薬と酵素とを含む流動媒体中で適切に行われる。好ましくは、ヌクレオチドは、関連する加ピロリン酸分解挙動を示す、ピロリン酸塩とポリメラーゼとの存在下での検体の漸進的な加ピロリン酸分解によって生成されたヌクレオシド三リン酸である。一実施形態では、チャンバまたは流体合流部を備える領域を消化ユニットの下流に設け、それにより無機ピロホスファターゼを導入して任意の残留ピロリン酸塩イオンを加水分解し得る。
【００１６】
シーケンサの分配ユニットにおいて行われるよう設計された方法のステップ（２）では、ヌクレオチドのストリームはヌクレオチドを含む水性液滴の対応する順序づけられたストリームに変換させられる。理論上、ストリームにおける各液滴はヌクレオチドを含むストリームから得られたヌクレオチドを含み得る。しかしながら、各充填された液滴が１つのヌクレオチド、および１つのヌクレオチドのみを含むことを確実にするため、液滴ストリーム中の各充填された液滴が多くの空の液滴によって分離されるよう、ヌクレオチドを含むストリームの流量率に対する液滴生成の速度を調整することが一般に好ましい。一実施形態では、ストリーム中の各充填された液滴は、１〜２０の空の液滴、好ましくは２〜１０の空の液滴によって分離される。
【００１７】
ヌクレオチドに加えて、液滴ストリーム中の各液滴は、その中に導入されたヌクレオチドを捕捉することが可能なプローブを適切に含む。実際には、ＤＮＡとＲＮＡに関して、これは、液滴が、それぞれが異なった特徴的な核酸塩基に対し選択性が高く、また、それに対応して異なったフルオロフォアタイプを担持する、１、２、３または４つの異なったプローブタイプを含むことを意味する。好ましいプローブタイプの実施例は、我々の出願である国際公開第２０１４０５３８５３号、国際公開第２０１４０５３８５４号、国際公開第２０１４１６７３２３号、および国際公開第２０１６０１２７８９号に記載されたものを含み、読者は、プローブタイプの性質と合成とに関し、これらに案内される。これらのすべてのプローブタイプの共通する特徴は、（１）それらがリガーゼおよびポリメラーゼ等の酵素の存在下で、選択的に単一ヌクレオチドを捕捉するよう適合されることと、（２）それらが未使用の状態では、それらはエキソヌクレアーゼ分解に耐性があるが、それらの対応する単一ヌクレオチドが捕捉された後に、エキソヌクレアーゼ分解により容易に消化できることと、（３）それらは、使用されたプローブまたは構成要素がしたがって消化されるまで、消光されたままである、特徴的なフルオロフォアから成ることと、である。したがって、プローブとヌクレオチドに加えて、各液滴が、リガーゼ挙動、ポリメラーゼ挙動、およびエクソヌクレアーゼ挙動を示すことが可能な酵素をさらに含む場合、観察者はインキュベーション期間の後に各液滴中に捕捉された特定のヌクレオチドに特徴的な蛍光シグナルの増加を観察する。特に好ましいのは、（ａ）消光状態の特徴的なフルオロフォアで標識された第１の一本鎖オリゴヌクレオチドと、（ｂ）標的単一ヌクレオシド三リン酸、リガーゼ、およびポリメラーゼの存在下で、第１のオリゴヌクレオチド上の相補性領域とハイブリッド形成し、それにより本質的に二本鎖の使用済プローブを作成することが可能な第２および第３の一本鎖オリゴヌクレオチド、とを備える多成分性のオリゴヌクレオチドプローブである。その後、使用済みプローブの第１の一本鎖の構成要素をエキソヌクレアーゼ分解により消化して、消光されず、したがって検出可能な状態で、フルオロフォアを放出することができる。一つの好ましい実施形態では、第２および第３の一本鎖オリゴヌクレオチドは、それ自体がヌクレオチドから成り得るリンカー領域によって互いに接続した、オリゴヌクレオチド領域である。この実施形態では、プローブによる標的ヌクレオチドの捕捉は、第２および第３の領域を含む、それ自体がエキソヌクレアーゼ分解に高い耐性がある環状一本鎖オリゴヌクレオチド構成要素を作成する。その後、両方のケースにおいて、また、第１のオリゴヌクレオチド構成要素が消化されてそのフルオロフォアを放出すると、もう一方のオリゴヌクレオチド鎖は、蛍光シグナルの急速な成長を確実にする周期的なプロセスにおいて、さらに使用済みのプローブとハイブリッド形成し、また、さらに使用済みのプローブを作成をすることができる。これらのプローブと、適切なフルオロフォアおよび消光剤と、捕捉方法とに関するさらなる情報は、国際公開第２０１６０１２７８９号において見ることができる。
【００１８】
適切には、プロセスのステップ（２）において、また、シーケンサの分配ユニットにおいて作成された液滴は、１００ミクロン未満、好ましくは５０ミクロン未満、より好ましくは２０ミクロン未満、さらにより好ましくは１５ミクロン未満の有限直径を有する微小液滴である。すべてのそれらの直径のうち、２ミクロン〜２０ミクロンの範囲内がもっとも好ましい。一実施形態では、方法と分配ユニットとのステップ（２）で使用される微小液滴生成率は、１秒あたり５０〜３０００の微小液滴数の範囲内であり、好ましくは１秒あたり１００〜２０００の微小液滴数である。
【００１９】
任意の適切な方法を使用して、分配ユニットのデザインにおいて反映されるヌクレオチドを含むストリームから液滴ストリームを作成することができる。一実施形態では、分配ユニットは、ステップ（３）において管の入口内へと液滴を分配する１つ以上の液滴分配ノズルに取り付けられたチャンバから成る。このデザインの一実施形態では、複数のフィードラインを、ノズルに隣接して、または直接的に、取り付け得る。そのうちの１つは、ステップ（ａ）から水性のヌクレオチドを含むストリームを備え、他のものはプローブ、および、様々な酵素および他の必要な化学試薬用である。そして、ノズルヘッド内、またはノズルヘッド付近での混合は、分配された各液滴が、ヌクレオチドおよびプローブが機能するために必要な全ての構成要素を含むことを確実にする。別の実施形態では、ノズルを使用して、ヌクレオチドを含むストリームとその後加えられた他の構成要素とから液滴ストリームを作成し得る。これは、例えばマイクロインジェクション法、ピコインジェクション法により、または液滴を、コントローラの動作により開管にそれらが導入される前に、引き続いてそれらの上にプリントされた他の構成要素を含む同様の二次液滴と基板の表面上で合体させることによって、できる。
【００２０】
方法のステップ（３）では、ヌクレオチドと様々なプローブ構成要素とを含む液滴のストリームは、少なくとも１つの管に導入され、相互に積み重なる液滴の堆積物を作成する。液滴の順序付けが堆積物中で維持されていることを確実にするため、管の内径は液滴の直径の２倍未満にされるべきである。一実施形態では、そして、液滴の完全性を維持するため、管はシリコーン油等の非水混和性溶媒でプレフィルされる。別の実施形態では、堆積物が発生するときに管を通る液滴の動きを容易にするため、管の内面には疎水性コーティング、または好ましくは、疎水性領域および親水性領域とから成るコーティングが設けられる。以下のステップ（４）における液滴中の蛍光の確実な検出を容易にするため、液滴と溶媒とを備える水媒体の屈折率は、それぞれ１．３〜１．４の範囲内と、１．３〜１．７の範囲内とであることが好ましい。典型的には、溶媒用の屈折率の選択は水媒体のそれで決定され、これはまた、液滴中に含まれたプローブと他の試薬との正確な濃度に依存する。一実施形態では、管は、１つの中空コア光ファイバ、または中空コア光ファイバの束を備え得る。
【００２１】
適切には、液滴は、出口への負圧の付与により、管内へと引き入れられる。これは、管の出口領域に接続された領域またはチャンバへ吸引力を付与することにより、最も簡便に達成できる。一実施形態では、所与の管の液滴堆積物が作成されると、ステップ（４）を開始するときまでに、負圧を取り除くことができる。これは、ステップ（３）と（４）との間で、液滴が堆積物中でのインキュベーション期間を経ることを可能にし、当該期間の間、プローブの付与に関連する様々な酵素的プロセスの動作を通して、蛍光能力が発達することが可能となる。
【００２２】
上記で定義したシーケンサで利用されるステップ（３）の好ましい一実施形態では、基板内に配置された開口管のアレイが使用される。そして、これらの管の入口と出口とは、入口面が液滴分配ノズルのすぐ下に配置される状態で、基板の対向する入口面と出口面とに配置される。そして、管の主軸は液滴分配の方向と平行である方向に延在する。一実施形態では、配置構造は鉛直面内にあり、重力、および／または、吸引力の動作により管が充填されることを可能にする。一実施形態では、基板は、毛細管の規則的アレイがその中に配置されている、金属、半導体、プラスチックまたはガラス等の材料のシートまたはブロックである。一つの好ましい実施形態では、基板それ自体は、その中に毛細管が組み立てられた、シリコン、ガラスまたはプラスチックのブロックであり、また、別の好ましい実施形態では、それらの毛細管の内面は、上記で説明したようにコーティングされている。適切には、それが吸光度を有するようにガラスまたはプラスチック基板は処理される。一つの好ましい実施形態では、ガラス基板は１．４〜１．７の範囲内、好ましくは１．４５〜１．６５の範囲内の屈折率を有する。
【００２３】
液滴分配ノズルによって管が充填されることを可能にするため、シーケンサは、管の主軸に垂直な少なくとも１つの方向で、適切にはそれに対し垂直な両軸に沿って、基板の入口面に対して液滴分配ノズルを前進させる手段を含む。これを行う方法は、従来のプリンタ技術の考察から容易に分かるであろう。一実施形態では、ノズルは、固定された基板に対する２つの面において、コンピュータ制御電動機によって移動可能なアセンブリ上に取り付けられ得る。別の実施形態では、基板はそのようなアセンブリ上に取り付けられ、プリンタノズルの位置は固定される。さらに別の実施形態では、ノズルと基板との両方は別々の移動可能なアセンブリ上に取り付けられる。
【００２４】
基板には各管内に液滴堆積物を作成し、必要に応じて各管から液滴を放出するコントローラが関連付けられている。上記で説明したように、適切にコンピュータ制御されているコントローラは、負圧を作成する吸引装置と、必要に応じて負圧をオンとオフとに切り換える手段とを含む。またそれは、好ましくは、各管の出口に関連付けられた一連の微小電気機械ゲートであって、開閉して、各液滴が出口を通って堆積物から放出されることを制御するゲートを含む。一実施形態では、これらのゲートは微小電気機械バルブまたは出口面を渡って移動可能な有孔平板を備える。
【００２５】
一実施形態では、出口面に関連付けて、付随する電磁放射の影響を受けてプラズモニック共振を受けることが可能な金属粒子または金属層を用いることができる。この手段により、各液滴中のフルオロフォアからの蛍光シグナルをさらに高め、以下に示す液滴クロストークを減少させることと併せて、装置の精度の改善がされる。
【００２６】
方法のステップ（４）では、液滴は出口端で堆積物から放出され、出現が発生するとき、そこに含まれたフルオロフォアが検出されることを可能にする。管が鉛直に並べられる場合、出口は堆積物の底部にある。これらのフルオロフォアの検出は、従来の手段、すなわち、フルオロフォアに蛍光を発させることが可能な波長の電磁放射（例えば、可視光または紫外線光）で各液滴を照らす手段によって、適切に行われる。その後、光検出器等の装置が、生成された任意の蛍光の検出に使用される。
【００２７】
液滴の照射が管の主軸と実質的に平行な方向で適切に行われる場合、検出された蛍光シグナルの特定の状況においては、調査されている液滴の後ろにある残りの堆積物中の液滴から発せられる二次蛍光シグナルによって複雑にされるというリスクがある。この現象が作成する蛍光シグナル「クロストーク」は、上記引用した範囲内からの液滴、溶媒、およびガラス基板の相対的屈折率と、使用される特定のフルオロフォアの性質、そしてある程度は基板の材質、偏光、および形態との慎重な選択により、実質的に管理され、減少され、さらには取り除かれ得る。一実施形態では、暗色化ガラスまたは周辺部が黒くコーティングされたガラスで形成された基板が使用される。別の実施形態では、基板形態は、管内に長距離導波路モードを支持しないように選ばれる。換言すると、確立される任意のモードは短距離であり、最大５つの隣接する堆積物中の液滴の上で急速に減退する。導波路はこの達成を支援するために使用され得る。一実施形態では、１０％未満の、好ましくは５％未満のシグナルクロストークが観測されるよう、これらのパラメータが最適化されることが好ましい。他の実施形態では、検出される液滴からの電磁放射の拡散は、例えば管内の導波路モードを調整することにより、その後ろの堆積物中の液滴による電磁放射の増進を抑制する。
【００２８】
上記で定義したシーケンサでは、入射電磁放射線源は典型的には、補助的な光学系（レンズ、鏡等）によって出口を含む領域に焦点を合わせることができるＬＥＤ、レーザまたは他の高輝度光源である。適切には、当該光源は出口の照射を出口からの液滴の出現と同期する手段に接続される。一実施形態では、これは光源を微小電気機械ゲートの開閉と同期するマイクロプロセッサから成る。
【００２９】
最後に、シーケンサは、同期された蛍光シグナルを検出する少なくとも１つの光検出器または同様のものを備える。典型的に、この構成要素はすべての出口で同時に同期測定をするよう設計された光検出器のアレイから成る。そして、光検出器によって生成されたシグナルは、さらなる分析のためにマイクロプロセッサまたはスタンドアロンＰＣに移されるデータストリームの中に編成される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の方法を使用した核酸シーケンサの断面概略図を示す。
【００３１】
ここで、本発明による方法とシーケンサとを、本発明の方法を使用した核酸シーケンサの断面概略図を示す添付の図を参照して示す。ビーズ１に取り付けられたＤＮＡのサンプルは、そこを通してピロリン酸塩と消化をもたらすために必要な他の試薬とを含む水媒体ストリーム３が加えられる消化チャンバ２内で、ポリメラーゼにより漸進的な加ピロリン酸分解を受ける。ここで単一ヌクレオチド三リン酸塩４の順序づけられたストリームを含む２、３の下流は、マイクロ流体管５を介して液滴分配ノズル７を含む液滴分配ユニット６へと通過する。インジェクタライン８は、３から成る液滴１０が作成され、また、我々の特許出願である国際公開第２０１６０１２７８９号によるプローブ、無機ピロホスファターゼおよびエクソヌクレアーゼがピコインジェクション法によって導入されるインジェクタライン９を通過させられる、６の頂部にシリコーン油を供給する。そして、１．３の屈折率を有する水性液滴１０であって、４を有するその少なくともいくつかは、それらが基板１１のブロックまたはシート上へと分配される７から出現させられる。１１は１．５の屈折率を有する光吸収性暗色ガラスで形成されており、少なくとも矢印で示した方向Ｘに移動可能なアセンブリ１２上に取り付けられる。１１には、各管に入口オリフィス１４と出口オリフィス１５とが設けられた、開口毛細管の長方形アレイがさらに設けられる。使用されていない状態では、１１の入口面と管１３は、それぞれ、１．５の屈折率のシリコーン油１６でコーティングされ、充填される。１３の直径は液滴１０の直径の１．７５倍である。
【００３２】
１１の出口面のすぐ下には、電動機（図示せず）を使用して軸線Ｙ−Ｙ’に沿って前後に移動可能して出口オリフィス１５を部分的に開閉する、有孔平板１７がある。１１の出口面は、そこに吸引力が管１９とコンピュータ制御ポンプ（図示せず）とを介して遠隔操作によって付与され得るチャンバ１８内に包み込まれ、１４と１５それぞれの間に負圧を確立する。この手段と、１７によって部分的に閉鎖される各１５によって、各液滴１０は、１６を通過して各入口オリフィス１４内へと分配され、そこで液滴はその管１３内へと引き入れられ、各管がいっぱいになるまで堆積させられる。その後、１１はその開始位置へ戻り、１０の内容物はしばらくの間インキュベートする。
【００３３】
液滴１０の内容物が分析される用意ができた場合、１７は（１１に対し側方への移動によって）作動して、各１５を開閉し、それによって堆積物中の各１０が、１３から、１７のすぐ下の１１の表面上へと引き出されることを可能にする。１７の開閉と同時に、放出された液滴は、管の軸線から少々外れるレーザ（図示せず）等の高輝度コヒーレント光源で照らされ、これは各放出された１０中の活性フルオロフォアに蛍光を発させる。これとまた同期して、１５に対し平行に後方拡散した任意の蛍光は各１５と関連づけられた光検出器２０のアレイによって検出され、これにより、１の配列を再構築するためにマイクロプロセッサ（図示せず）によって分析用データストリームの中に編成され得るヌクレオチドに特徴的なシグナルの多様性が生成される。同期は、マイクロプロセッサ２１によって達成される。
【図１】
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【国際調査報告】
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