(57)【要約】  本発明は、ヒト免疫系を用いて再構成された、免疫不全の非ヒト宿主におけるヒトマクロファージの生成を刺激する非抗ヒト抗体の使用に関する。ヒト異種移植片を用いたそのような生成方法及び宿主モデル、並びにがんの免疫療法の評価のためのそれらの使用も含まれる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト宿主ＣＳＦ−１Ｒに特異的に結合し、且つヒトＣＳＦ−１Ｒと交差反応せずに、ヒト免疫系を用いて再構成された、免疫不全の非ヒト宿主においてヒトマクロファージの生成を刺激する抗体の使用。
【請求項２】
非ヒト宿主において非ヒト宿主マクロファージが、ＩｇＧコントロール抗体と比較して少なくとも４０％減少する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
非ヒト宿主が、マウス、ラット、及びウサギからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
非ヒト宿主が、マウス及びラットからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項５】
非ヒト宿主がマウスである、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項６】
免疫不全の非ヒト宿主が、ヒトＣＤ３４陽性造血幹細胞を用いて再構成される、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
ヒトマクロファージが非リンパ組織中において生成される、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
ヒトマクロファージがリンパ組織中において生成される、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
非ヒト宿主が、ヒト腫瘍細胞を異種移植されたマウスである、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
ヒト腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の生成のための、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
非ヒト宿主ＣＳＦ−１Ｒに特異的に結合し、且つヒトＣＳＦ−１Ｒと交差反応しない抗体の、非ヒト宿主への投与を含む、ヒト免疫系を用いて再構成された、免疫不全の非ヒト宿主においてヒトマクロファージの生成を刺激する方法。
【請求項１２】
非ヒト宿主において非ヒト宿主マクロファージが、ＩｇＧコントロール抗体と比較して少なくとも４０％減少する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
非ヒト宿主が、ヒトＣＤ３４陽性造血幹細胞を用いて再構成されたマウスである、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１４】
ヒト腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の生成のために、マウスにヒト腫瘍細胞が異種移植されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法に従って生成された、ヒト腫瘍細胞を異種移植されたマウス。
【請求項１６】
がんの免疫療法の評価における使用のための、請求項１５に記載のマウス異種移植片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト免疫系を用いて再構成された、免疫不全の非ヒト宿主におけるヒトマクロファージの生成を刺激する非抗ヒト抗体の使用に関する。ヒト異種移植片を用いたそのような生成方法及び宿主モデル、並びにがんの免疫療法の評価のためのそれらの使用も含まれる。
【背景技術】
【０００２】
特に骨髄及びＮＫ細胞におけるヒト自然免疫系の再構成の不良は、がんの薬物開発のためにＨＩＳ（ヒト免疫系）マウスを用いるうえでの大きな制限の一つである。以前に報告されたように（Li Y, et al, Journal of immunology, 191 （2013） 3192-3199; Rathinam C, et al, Blood 118 （2011） 3119-3128; Rongvaux A, et al, Nature biotechnology 32 （2014） 364-372）、ヒト白血球は、ＨＩＳマウスにおいてリンパ系統（Ｂ及びＴ細胞）に偏っており、一方ＣＤ１４＋ＣＤ３３＋単球を含むヒトＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞は極めて不足している。
【０００３】
結果として、分化したヒト組織マクロファージは、ヒト免疫系（ＨＩＳ）を用いて再構成された免疫不全マウスにおいても極端に低い発生頻度でのみ存在する（図２左列）。
【０００４】
単球及びマクロファージの不足は、ヒトマクロファージコロニー刺激因子（ｈｕＣＳＦ−１）を発現させることにより克服することができ、このことは、これらマウスにおけるヒト単球及びマクロファージの分化及び生存のためにＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の役割が必須であることを示唆している（Li Y, et al, Journal of immunology, 191 （2013） 3192-3199; Rathinam C, et al, Blood 118 （2011） 3119-3128; Rongvaux A, et al, Nature biotechnology 32 （2014） 364-372）。マウスのＣＳＦ−１（ｍｕＣＳＦ−１）は、ｈｕＣＳＦ−１と比較して５００倍低い親和性でｈｕＣＳＦ−１Ｒに結合し（Elegheert J, et al, Structure 19 （2011） 1762-1772）；したがって、ｍｕＣＳＦ−１は、ｈｕＣＳＦ−１Ｒと交差反応しないと主張された。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、ｍｕＣＳＦ−１Ｒの抗体媒介性の遮断が、ヒト化マウスにおける宿主マクロファージの有意な減少及びｍｕＣＳＦ−１の１０００倍の増加に関連していることを初めて実証した。
【０００６】
ここで、本発明者らは、抗マウスＣＳＦ１Ｒ抗体（ヒトＣＳＦ−１Ｒと交差反応性でない）による、ヒト免疫系（ＨＩＳマウス）を用いて再構築された、免疫不全マウスの処理により、１）マウスマクロファージの枯渇がもたらされること、及び  ２）驚くべきことに、これらマウスのヒトマクロファージの改良された再構成においても、それがもたらされることを見出した。
【０００７】
このような変化を利用して、末梢血におけるヒト単球の発生頻度を上昇させ（ヒトＣＤ４５＋細胞総数の〜２５％）、且つリンパ組織及び非リンパ組織におけるヒトマクロファージのｄｅ  ｎｏｖｏ浸潤を増加させることができる。次いで、強化された再構成を、ｍｕＣＳＦ−１を遮断することによりｉｎ  ｖｉｖｏで逆転することができ、これによりヒト組織マクロファージが有意に減少する。
【０００８】
注目すべきことに、ヒトマクロファージは、最初の全体的なヒト再構成レベルに関係なく、再構成後の異なる時点での抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体処理により誘導することができる。
【０００９】
さらに、ヒト腫瘍細胞を異種移植されたＨＩＳマウスにおいて、抗マウスＣＳＦ１Ｒ抗体処理により、マウスはヒトマクロファージ腫瘍関連マクロファージによって置き換えられる。
【００１０】
腫瘍を有するＨＩＳマウス（ＯＶＣＡＲ５及びＨＴ２９）におけるヒトマクロファージ生成の刺激は、ヒトマクロファージの存在下において腫瘍増殖を遅らせる。詳細な分析において明らかになったのは、腫瘍が、Ｍ１−及びＭ２様というマクロファージサブタイプの両方により浸潤され、且つＴ細胞浸潤の増強を伴うことである。つまり、本発明者らは、既存の自然及び適応免疫細胞浸潤の状況においてがん免疫療法を評価する機会を提供する新規のヒト化モデルを開発した。
【００１１】
したがって、本発明は、非ヒト宿主ＣＳＦ−１Ｒに特異的に結合し、且つヒトＣＳＦ−１Ｒと交差反応せずに（ヒトＣＳＦ１Ｒに特異的に結合せずに）、ヒト免疫系を用いて再構成された、免疫不全の非ヒト宿主においてヒトマクロファージの生成を刺激する抗体の使用に関する。
【００１２】
本発明の別の態様は、ヒト免疫系を用いて再構成された、免疫不全の非ヒト宿主において、ヒトマクロファージの生成を刺激する方法であり、この方法は、非ヒト宿主ＣＳＦ−１Ｒに特異的に結合し、且つヒトＣＳＦ−１Ｒと交差反応しない（ヒトＣＳＦ１Ｒに特異的に結合しない）抗体の非ヒト宿主への投与を含む。
【００１３】
一実施態様において、非ヒト宿主中の非ヒト宿主マクロファージは、ＩｇＧコントロール抗体（非ヒト宿主ＣＳＦ−１Ｒに結合しない）と比較して、少なくとも４０％（一実施態様では、末梢血及び骨髄中において少なくとも５０％、一実施態様では、末梢血及び骨髄中において少なくとも６０％）減少する。
【００１４】
一実施態様では、非ヒト宿主は、マウス、ラット、及びウサギからなる群より選択される。
【００１５】
一実施態様では、非ヒト宿主は、マウス及びラットからなる群より選択される。
【００１６】
一実施態様では、非ヒト宿主はマウスである。
【００１７】
一実施態様では、免疫不全の非ヒト宿主は、ヒトＣＤ３４陽性造血幹細胞を用いて再構成される。
【００１８】
一実施態様では、ヒトマクロファージは、非リンパ組織において生成される。
【００１９】
一実施態様では、ヒトマクロファージは、リンパ組織において生成される。
【００２０】
一実施態様では、非ヒト宿主は、ヒト腫瘍細胞を（皮下に又は同所に）異種移植されたマウスである。また、抗マウスＣＳＦ−１Ｒ抗体は、ヒト腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の生成のために用いられる。
【００２１】
本発明の別の態様は、本発明による方法によって生成されたヒト腫瘍細胞を異種移植されたマウスである。
【００２２】
本発明の別の実施態様は、がん免疫療法の評価における使用のための前記マウス異種移植片である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ヒト免疫系を用いて再構成された（例えばヒトＣＤ３４陽性（ＣＤ３４＋）造血幹細胞を用いて再構成された）、免疫不全の非ヒト宿主（例えばマウス）の生成を示している。
【図２】ヒト免疫系を用いて再構成された免疫不全マウスのリンパ組織におけるヒトマクロファージの生成を示している。
【図３】ヒト免疫系を用いて再構成された免疫不全マウスにおけるヒト腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の生成を示している。
【図４Ａ−Ｅ】ヒト免疫系を用いて再構成された、免疫不全マウスにおけるマウスマクロファージの有意な減少を示している。（Ａ）は、２Ｇ２又はＭＯＰＣ２１で処理したＨＩＳ  ＢＲＧマウス（ｎ＝８〜９匹のマウス）の血清中におけるマウスＭ−ＣＳＦのレベルを示している。（Ｂ及びＣ）は、ＦＡＣＳ分析（ｎ＝８〜１０匹のマウス；２要因Ａｎｏｖａ；＊Ｐ＜０．０５）によって決定された、４用量のコントロール（ＭＯＰＣ２１）又は抗マウスＣＳＦ１Ｒ（２Ｇ２）抗体を注射されたヒト化マウスの末梢血中のマウスＣＤ４５＋細胞内部におけるＬｙ６Ｃ＋＋＋ＣＳＦ１Ｒ＋マウス単球又はマクロファージの発生頻度を示している。（Ｄ及びＥ）は、ＦＡＣＳ分析（ｎ＝８〜９匹のマウス；独立スチューデントのｔ検定）によって決定された、４用量のコントロール（ＭＯＰＣ２１）又は抗マウスＣＳＦ１Ｒ（２Ｇ２）抗体を注射されたヒト化マウスの骨髄又は脾臓中のマウスＣＤ４５＋細胞内部におけるＬｙ６Ｃ＋＋＋ＣＳＦ１Ｒ＋マウス単球又はマクロファージの発生頻度を示している。
【図４Ｆ−Ｇ】ヒト免疫系を用いて再構成された、免疫不全マウスにおけるマウスマクロファージの有意な減少を示している。（Ｆ＋Ｇ）は、４用量のコントロール（ＭＯＰＣ２１）又は抗マウスＣＳＦ１Ｒ（２Ｇ２）抗体を注射されたヒト化マウスの非代表的な脾臓又は骨髄切片上でのマウスＦ４８０の免疫組織化学的染色を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
多くの腫瘍は、マクロファージを含む、顕著な免疫細胞浸潤によって特徴付けられる。当初、免疫細胞は腫瘍に対する防御機構の一部と考えられていたが、最近のデータは、マクロファージを含む複数の免疫細胞集団が、実は腫瘍の進行を促進しているかもしれないという見解をサポートするものである。マクロファージはその可塑性によって特徴付けられる。サイトカインの微小環境に応じて、マクロファージはいわゆるＭ１又はＭ２サブタイプを呈することができる。Ｍ２マクロファージは、腫瘍免疫の抑制に関与している。Ｍ２マクロファージは、増殖を援助するために腫瘍によって取り込まれる血管新生及び組織リモデリングといった組織修復機能にも重要な役割を果たしている。腫瘍を促進するＭ２マクロファージとは対照的に、Ｍ１マクロファージは、炎症性サイトカイン及びそれらの抗原提示及び食作用への関与を介して抗腫瘍活性を呈する（Mantovani, A. et al., Curr. Opin. Immunol. 2 （2010） 231-237）。
【００２５】
コロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１）及びＩＬ−１０といった様々なサイトカインを分泌することにより、腫瘍細胞は、マクロファージをリクルートしてＭ２サブタイプに形成することができ、一方、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）といったサイトカインを分泌することにより、腫瘍細胞は、ＩＦＮ−ガンマプログラムマクロファージをリクルートしてＭ１サブタイプに形成することができる。免疫組織化学を使用して、ＣＤ６８とＣＤ１６３を共発現するマクロファージ部分母集団（Ｍ２マクロファージについて濃縮されうる）と、ＣＤ６８＋／ＭＨＣ  ＩＩ＋、又はＣＤ６８＋／ＣＤ８０＋免疫表現型を示すサブセット（Ｍ１マクロファージを含みうる）とを区別することが可能である。ＣＤ６８及びＣＤ１６３陽性マクロファージの細胞の形状、大きさ、及び空間分布は、例えば腫瘍と交差する基質及び重要な腫瘍領域におけるその優先的位置により、Ｍ２マクロファージの腫瘍を促進する役割に関する既文献の仮説と一致している。対照的に、ＣＤ６８＋／ＭＨＣクラスＩＩ＋マクロファージは、遍在的に見られる。食作用におけるそれらの仮説的役割は、ＣＤ６８＋／ＭＨＣクラスＩＩ＋のクラスターにより反映されるが、アポトーシス細胞及び壊死腫瘍領域に近いＣＤ１６３免疫表現型には反映されない。
【００２６】
Ｍ２マクロファージの腫瘍形成亢進機能を活発化するうえでのＣＳＦ−１の役割と一致して、希少肉腫又は局所侵襲性の結合組織腫瘍、例えばＣＳＦ−１遺伝子の転位置に一部起因する腱滑膜（Ｔｅｎｏｓｙｎｏｖｉａｌ）巨細胞腫（ＴＧＣＴ）及び色素性結節性滑膜炎（ＰＶＮＳ）における高いＣＳＦ−１発現は、ＣＳＦ−１の受容体、即ち腫瘤の大部分を形成するコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）を発現する単球及びマクロファージの蓄積に繋がる（West, R.B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3 （2006） 690-695）。これら腫瘍は、続いて遺伝子発現プロファイリングによりＣＳＦ−１依存性マクロファージシグネチャーを定義するために使用された。乳がん及び平滑筋肉腫患者の腫瘍において、このＣＳＦ−１応答遺伝子シグネチャーは、予後不良を予測する（Espinosa, I. et al., Am. J. Pathol. 6 （2009） 2347-2356; Beck, A. et al., Clin. Cancer Res. 3 （2009） 778-787）。
【００２７】
マウスＣＳＦ−１Ｒ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．  Ｐ０９５８１；Ｑ３Ｕ３Ｐ１；Ｑ９ＤＢＨ９；ＣＳＦ−１受容体；異名：Ｍ−ＣＳＦ受容体；マクロファージコロニー刺激因子１受容体、ｃ−ｆｍｓ）は、ｖ−ｆｍｓ及びヒトタンパク質に対し、それぞれ７６％及び７５％の相同性を有している。予測される膜タンパク質であるｃ−ｆｍｓ、は、アミノ末端シグナル配列と、外部の、膜貫通及び細胞質ドメインとを有している。マウスのｃ−ｆｍｓと、ｖ−ｆｍｓ又はヒトｃ−ｆｍｓとの相同性は、細胞質ドメイン内で最も強く（９０％−９５％）、外部ドメインで最も弱い（５９％−６３％）（Rothwell et al,  Oncogene Res. 1 （1987） 311-324; and  Sherr et al,  Cell 41 （1985） 665-676.）
【００２８】
ヒトＣＳＦ−１Ｒ（ＣＳＦ−１受容体；異名：Ｍ−ＣＳＦ受容体；マクロファージコロニー刺激因子１受容体、Ｆｍｓがん原遺伝子、ｃ−ｆｍｓ））は、１９８６年以来既知である（Coussens, L., et al., Nature 320 （1986） 277-280）。ＣＳＦ−１Ｒは、増殖因子であり、ｃ−ｆｍｓがん原遺伝子によりコードされる（例えば、Roth, P. and Stanley, E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181 （1992） 141-167に総説あり）。
【００２９】
ＣＳＦ−１Ｒは、ＣＳＦ−１ＲリガンドＣＳＦ−１（マクロファージコロニー刺激因子、Ｍ−ＣＳＦとも呼ばれる）（配列番号８６）及びＩＬ−３４（配列番号８７）の受容体であり、これらサイトカインの生物学的効果を媒介する（Sherr, C.J., et al., Cell 41 （1985） 665-676; Lin, H., et al., Science 320 （2008） 807-811）。コロニー刺激因子−１受容体（ｃ−ｆｍｓとも呼ばれる）のクローニングは、Roussel, M.F., et al., Nature 325 （1987）549-552に初めて記載された。この文献において、ＣＳＦ−１Ｒが、Ｃｂｌに結合することにより受容体の下方制御を調節する抑制性のチロシン９６９リン酸化の欠損を含むタンパク質のＣ末端鎖における変化に依存する変換能を有することが示された（Lee, P.S., et al., Embo J. 18 （1999） 3616-3628）。
【００３０】
ＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の主な生物学的効果は、マクロファージ系統（破骨細胞を含む）への、造血性前駆体細胞の分化、増殖、遊走、及び生存である。
【００３１】
本明細書において使用されるとき、「マウスＣＳＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体」は、２５℃において１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値の、一実施態様では２５℃において１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ以下のＤＫ値の結合親和性で、マウスＣＳＦ−１Ｒ抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標），ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）などの標準的な結合アッセイを２５℃で用いて決定される。したがって、本明細書において使用される「マウスＣＳＦ−１Ｒに結合する抗体」は、２５℃でＫＤ  １．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下（好ましくは２５℃で１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ−１．０×１０−１２ｍｏｌ／ｌ）の結合親和性でマウスＣＳＦ−１Ｒ抗原に特異的に結合する抗体を指す。
【００３２】
本明細書において使用される表現「ヒトＣＳＦ−１Ｒと交差反応しない」又は「ヒトＣＳＦ−１Ｒに特異的に結合しない」は、ヒトＣＳＦ−１Ｒ抗原に対する特異的結合相互作用（表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標），ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎなどの標準的な結合アッセイにおいて、２５℃で１．０×１０−６ｍｏｌ／ｌ以上のＫＤ値の結合親和性）を呈しない抗体を指す。
【００３３】
実施例において使用されるＩｇＧコントロール抗体は、非ヒト宿主ＣＳＦ−１Ｒに（特異的に）結合せず、このことは、同コントロール抗体が別の無関係な抗原に結合するか、又は結合をまったく示さないことを意味する。
【００３４】
用語、非ヒト宿主は、非ヒト動物を指す。好ましくは、前記非ヒト宿主動物又は非ヒト動物は、げっ歯類であり、さらに好ましくはマウス、ラット、又はウサギである。好ましい一実施態様では、前記非ヒト宿主動物又は非ヒト動物は、免疫不全宿主、好ましくはマウス又はラットである。好ましい一実施態様では、マウスは、Ｒａｇ２−／−γｃ−／−、ヌードＲａｇ２−／−、ＮＯＤ（ＮＯＤは、本発明によれば、好ましくはＮＯＤ．Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ  Ｐｒｆ１ｔｍ１Ｓｄｚ／ＳｚＪを意味する）又はＲＧ（ＢＡＬＢ／ｃＡ−Ｒａｇ２ｎｕｌｌＩｌ２ｒγｎｕｌｌ（ＢＲＧ）又はＣ５７ＢＬ／６−Ｒａｇ２ｎｕｌｌＩｌ２ｒγｎｕｌｌ（Ｂ６ＲＧ）マウス又はＳＣＩＤｂｅｉｇｅマウスであるか、又はラットはヌードラットである。好ましい一実施態様では、非ヒト宿主は免疫不全のマウスである。好ましい一実施態様では、非ヒト宿主はＢＡＬＢ／ｃＡ−Ｒａｇ２ｎｕｌｌＩｌ２ｒγｎｕｌｌ（ＢＲＧ）マウスである（Traggiai E, at al,  Science 304 （2004） 104-107）。
【００３５】
免疫不全のマウスは、例えばRyoji Ito et al,  Cellular & Molecular Immunology 9 （2012） 208-214に記載されており、各参照はその中に引用されている。マウスにおいて免疫機能を損なう様々な遺伝的変異が既知である。そのような変異株のいくつかは、様々な生理学的プロセス及び疾患プロセスを研究するために、サイトカインについての研究に広く用いられている。免疫不全マウスのモデルは、同種異系及び異種の腫瘍増殖及び進行を支持する機序の理解に有用である。これらマウスは、免疫系発達の個体発生を研究するため、リンパ腫及び白血病細胞型の増殖を調査するため、並びにサイトカインの影響及び新規治療戦略を研究するために、正常な血球新生のモデルとして使用される。複数の組織異種移植片を受け入れることにより、これらマウスは、以前は小動物モデルが利用できなかった宿主特異的で偏好性の生物体の中間体モデルとしても使用できる。免疫応答に影響する遺伝子座には、ｎｕ（ヌード）、ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全）、ｂｅｉｇｅ、及びｘｉｄ（伴性免疫不全）が含まれる。様々なマウス変異体は、異なる免疫学的特性を有し、したがって相補的研究を可能にする。これら変異のいくつかが免疫機能に干渉する程度は、遺伝的背景によって異なることがある。例えば、ＣＨ３  ＳＣＩＤマウスにおける免疫欠如は、元のＣＢ１７マウスより重症であることが示されている。
【００３６】
幹細胞という用語は、一般的に、未だ分化しておらず、且つ同型の子孫を生む能力と特定の発育線へと分化する能力の両方を保持するあらゆる細胞を意味する。成体幹細胞は、考慮対象の組織中における細胞数ホメオスタシスを維持する機能、即ち死んだ細胞を置き換える機能を有する。この理由のため、幹細胞は特に、高いストレスを受ける組織において見られる。成体幹細胞は、例えば、骨髄、脳、肝臓、皮膚、腸、角膜などといった、極めて広範な組織及び器官にみられる。骨髄において、造血幹細胞は、細胞の大部分の寿命が限定されていることに起因して血液中に新しい細胞が常に必要とされるため、それら新しい細胞を継続的に生成する。血液細胞の形成の開始点は、特定の機能がまだ決定されていない、多能性の未分化造血幹細胞である。幹細胞が分化するとき、それ自体を複製することはできず、特定の細胞型しか成熟させない前駆体細胞が最初に形成される。多能性幹細胞も種々の中間体段階も、細胞特異的な造血性機能を満たすことはできず；これを行うことができるのは、成熟した細胞だけである。特定の分化経路に入った祖先細胞は次いで、成熟が達成されるまでこの経路を保つ（拘束）。特に細胞表面マーカーのＣＤ３４が、ＣＤ３４を発現するヒト造血幹細胞、いわゆるヒトＣＤ３４陽性（ＣＤ３４＋）造血幹細胞を単離するために従来使用されてきた。一実施態様では、ＣＤ３４陽性（ＣＤ３４＋）造血幹細胞は、ヒトＣＤ３４陽性の造血性胎児肝幹細胞である。
【００３７】
用語「がん免疫療法」は、免疫系（例えば特定の免疫エフェクター細胞）と相互作用／免疫系を刺激して、がん、腫瘍増殖及び／又は転移を低減又は予防する治療剤又は療法を指す。一実施態様では、がん免疫療法は以下の群より選択される：
ａ）ヒトＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、又は４−１ＢＢに結合するアゴニスト抗体、Ｔ細胞二重特異性抗体（例えばＴ細胞結合ＢｉＴＥＴＭ抗体ＣＤ３−ＣＤ１９、ＣＤ３−ＥｐＣａｍ、ＣＤ３−ＥＧＦＲ）、ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、インターフェロン（ＩＦＮ）アルファ、並びにヒトＣＴＬＡ−４（例えばイピリムマブ）、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、又はＣＤ２５に結合する拮抗抗体より選択されるＴ細胞結合剤、
ｂ）免疫抑制の標的化：ＳＴＡＴ３又はＮＦｋＢシグナル伝達を標的化し、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３，ＴＮＦａ機能を遮断する抗体又は小分子，
ｃ）がんワクチン／樹状細胞機能の亢進：ＯｎｃｏＶｅｘ（腫瘍溶解性ウイルス分泌ＧＭ−ＣＳＦ）、アゴニストＣＤ４０抗体、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＴＬＲアゴニスト、組み換え融合タンパク質コード化ＭＡＧＥ−Ａ３、ＰＲＯＳＴＶＡＣ；又は
ｄ）養子細胞移入：ＧＶＡＸ（ＧＭ−ＣＳＦを発現する前立腺がん細胞株）、樹状細胞ワクチン、養子Ｔ細胞療法、養子ＣＡＲＴ細胞療法。
【００３８】
本発明の特定の実施態様
Ａ）
１．非ヒト宿主ＣＳＦ−１Ｒに特異的に結合し、且つヒトＣＳＦ−１Ｒと交差反応せずに（ヒトＣＳＦ１Ｒに特異的に結合せずに）、ヒト免疫系を用いて再構成された、免疫不全の非ヒト宿主においてヒトマクロファージの生成を刺激する抗体の使用。
２．非ヒト宿主において非ヒト宿主マクロファージが、ＩｇＧコントロール抗体（非ヒト宿主ＣＳＦ−１Ｒに結合しない）と比較して、少なくとも４０％（一実施態様では、末梢血及び骨髄中において少なくとも５０％、一実施態様では、末梢血及び骨髄中において少なくとも６０％）減少する、実施態様１に記載の使用。
３．非ヒト宿主が、マウス、ラット、及びウサギからなる群より選択される、実施態様１又は２に記載の使用。
４．非ヒト宿主が、マウス及びラットからなる群より選択される、実施態様１又は２に記載の使用。
５．非ヒト宿主がマウスである、実施態様１又は２に記載の使用。
６．免疫不全の非ヒト宿主が、ヒトＣＤ３４陽性造血幹細胞を用いて再構成される、実施態様１から５のいずれか一つに記載の使用。
７．ヒトマクロファージが非リンパ組織中において生成される、実施態様１から６のいずれか一つに記載の使用。
８．ヒトマクロファージがリンパ組織中において生成される、実施態様１から６のいずれか一つに記載の使用。
９．非ヒト宿主が、ヒト腫瘍細胞を（皮下又は同所に）異種移植されたマウスである、実施態様１から８のいずれか一つに記載の使用。
１０．ヒト腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の生成のための、実施態様９に記載の使用。
１１．ヒト免疫系を用いて再構成された、免疫不全の非ヒト宿主において、ヒトマクロファージの生成を刺激する方法であって、非ヒト宿主ＣＳＦ−１Ｒに特異的に結合し、且つヒトＣＳＦ−１Ｒと交差反応しない（ヒトＣＳＦ１Ｒに特異的に結合しない）抗体の非ヒト宿主への投与を含む方法。
１２．非ヒト宿主において非ヒト宿主マクロファージが、ＩｇＧコントロール抗体（非ヒト宿主ＣＳＦ−１Ｒに結合しない）と比較して、少なくとも４０％（一実施態様では、末梢血及び骨髄中において少なくとも５０％、一実施態様では、末梢血及び骨髄中において少なくとも６０％）減少する、実施態様１１に記載の方法。
１３．非ヒト宿主が、マウス、ラット、及びウサギからなる群より選択される、実施態様１１又は１２に記載の方法。
１４．非ヒト宿主が、マウス及びラットからなる群より選択される、実施態様１１又は１２に記載の方法。
１５．非ヒト宿主がマウスである、実施態様１１又は１２に記載の方法。
１６．免疫不全の非ヒト宿主が、ヒトＣＤ３４陽性造血幹細胞を用いて再構成される、実施態様１１から１５のいずれか一つに記載の方法。
１７．ヒトマクロファージが非リンパ組織中において生成される、実施態様１１から１６のいずれか一つに記載の方法。
１８．ヒトマクロファージがリンパ組織中において生成される、実施態様１１から１６のいずれか一つに記載の方法。
１９．非ヒト宿主が、ヒト腫瘍細胞を（皮下又は同所に）異種移植されたマウスである、実施態様１１から１８のいずれか一つに記載の方法。
２０．ヒト腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の生成のための、実施態様１９に記載の方法。
２１．実施態様１９又は２０に記載の方法に従って生成された、ヒト腫瘍細胞を異種移植されたマウス。
２２．がんの免疫療法の評価における使用のための、実施態様２１に記載のマウス異種移植片。
【００３９】
Ｂ）
１．マウスＣＳＦ−１Ｒに特異的に結合し、且つヒトＣＳＦ−１Ｒと交差反応せずに（ヒトＣＳＦ１Ｒに特異的に結合せずに）、ヒト免疫系を用いて再構成された、免疫不全のマウスにおいてヒトマクロファージの生成を刺激する抗体の使用。
２．マウスにおいてマウスマクロファージが、ＩｇＧコントロール抗体（非ヒト宿主ＣＳＦ−１Ｒに結合しない）と比較して、少なくとも４０％（一実施態様では、末梢血及び骨髄中において少なくとも５０％、一実施態様では、末梢血及び骨髄中において少なくとも６０％）減少する、実施態様１に記載の使用。
３．免疫不全のマウスが、ヒトＣＤ３４陽性造血幹細胞を用いて再構成される、実施態様１又は２に記載の使用。
４．ヒトマクロファージが非リンパ組織中において生成される、実施態様１から３のいずれか一つに記載の使用。
５．ヒトマクロファージがリンパ組織中において生成される、実施態様１から３のいずれか一つに記載の使用。
６．マウスが、ヒト腫瘍細胞を（皮下又は同所に）異種移植されている、実施態様１から８のいずれか一つに記載の使用。
７．ヒト腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の生成のための、実施態様６に記載の使用。
８．ヒト免疫系を用いて再構成された、免疫不全のマウスにおいて、ヒトマクロファージの生成を刺激する方法であって、非ヒト宿主ＣＳＦ−１Ｒに特異的に結合し、且つヒトＣＳＦ−１Ｒと交差反応しない（ヒトＣＳＦ１Ｒに特異的に結合しない）抗体の非ヒト宿主への投与を含む方法。
９．非ヒト宿主中において非ヒト宿主マクロファージが、ＩｇＧコントロール抗体（非ヒト宿主ＣＳＦ−１Ｒに結合しない）と比較して、少なくとも４０％（一実施態様では、末梢血及び骨髄中において少なくとも５０％、一実施態様では、末梢血及び骨髄中において少なくとも６０％）減少する、実施態様８に記載の方法。
１０．免疫不全の非ヒト宿主が、ヒトＣＤ３４陽性造血幹細胞を用いて再構成される、実施態様８又は９に記載の方法。
１１．ヒトマクロファージが非リンパ組織中において生成される、実施態様８から１０のいずれか一つに記載の方法。
１２．ヒトマクロファージがリンパ組織中において生成される、実施態様８から１０のいずれか一つに記載の方法。
１３．非ヒト宿主が、ヒト腫瘍細胞を（皮下又は同所に）異種移植されたマウスである、実施態様８から１２のいずれか一つに記載の方法。
１４．ヒト腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の生成のための、実施態様１３に記載の方法。
１５．実施態様１３又は１４に記載の方法に従って生成された、ヒト腫瘍細胞を異種移植されたマウス。
１６．がんの免疫療法の評価における使用のための、実施態様１５に記載のマウス異種移植片。
【実施例】
【００４０】
以下の実施例及び図面は、本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の真の範囲は特許請求の範囲に規定される。本発明の精神から逸脱することなく、記載された手順に改変を加えることが可能である。
【００４１】
実施例１
ヒト免疫系を用いて再構成された、免疫不全マウスにおける、トマクロファージの生成に付随したマウスマクロファージの減少
ヒト免疫系を用いて再構成された、免疫不全マウス（ＨＩＳマウス）の生成及び処理
Ａ）ヒト免疫系を用いて再構成された、免疫不全マウス（ＨＩＳマウス）の生成
妊娠した雌のＢＲＧマウス及びヒト化ＢＲＧは、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｐｅｎｚｂｅｒｇ）の動物保護施設において、特定病原体除去（ＳＰＦ）条件下に保たれる。すべてのマウス実験は、アッパーバイエルンの地方政府により承認される（参照番号５５．２−１−５４−２５３２−１５６−１１、参照番号５５．２−１−５４−２５３２．２−３３−１２）。時限妊娠させたＢＲＧマウスは、妊娠第１７日目に届けられ、出産まで毎日監視された。新生児（出生から３日以内）は、Ｃｓ−１３７照射器を用いて２．５Ｇｙ（２５０ｒａｄ）の線量を亜致死照射される。照射の２４時間後、５０μｌのＨＳＣ培地中〜２ｘ１０５のヒトＣＤ３４陽性（ＣＤ３４＋）ＦＬ細胞が、２９ゲージの針を用いて肝内に注射される（図１）。全体のヒト化レベル及びヒト白血球の組成物を、再構成の１４〜２６週後にヒト化マウスの末梢血において決定する。ヒト化レベルが＜２％であるマウスは、「非ヒト化」と命名されて分析から除外される。
【００４２】
Ｂ）ヒト免疫系を用いて再構成された、免疫不全マウス（ＨＩＳマウス）の抗マウス−ＣＳＦ−１Ｒ処理
ヒト化ＢＲＧマウスにおけるマクロファージの枯渇は、一回につき３０ｍｇ／ｋｇのモノクローナル抗マウスＣＳＦ−１Ｒ抗体（２Ｇ２）を四週連続で腹腔内注射することによって（１ｑ７ｄｘ４）、ＨＳＣ移行後の異なる時点で実施することができる。マウス単球及びマクロファージが枯渇すると、マウスのＭ−ＣＳＦは、ヒト化ＢＲＧマウスの血清中において〜１０００倍まで増加し、最終的にヒト血液単球のレベルを上昇させ、且つ組織浸潤ヒトマクロファージを生成する（図２）。ヒト腫瘍関連マクロファージは、マウスマクロファージがヒト化ＢＲＧマウスにおいて枯渇している場合にのみ生成することができる（図３）。これを行うため、２ｘ１０６個のＨＴ２９又は５ｘ１０６個のＯｖｃａｒ５  腫瘍細胞（１００μｌ）をヒト化ＢＲＧマウスの右脇腹に注射し、その後、一回につき３０ｍｇ／ｋｇのモノクローナル抗マウスＣＳＦ−１Ｒ抗体（２Ｇ２）を週に一回腹腔内注射する（１ｑ７ｄｘ４）。腫瘍増殖を、ノギス測定により週に二回監視し、腫瘍体積を、以下の式を用いて計算した：体積＝０．５×長さ２×幅。さらに、体重を、実験室スケールを用いて一日一回測定した。ヒトＭ１及びＭ２様腫瘍関連マクロファージの生成は、有意に減少した腫瘍増殖と、有意に増加した腫瘍浸潤Ｔ細胞の発生頻度と相関している。ヒト異種移植片腫瘍におけるヒトの自然及び適応免疫エフェクター細胞の誘導可能な浸潤は、新規のＣＩＴ薬物候補を評価するための新規試験系を提供する。
【００４３】
Ｃ）ヒト免疫系を用いて再構成された、免疫不全マウスにおけるマウスマクロファージの有意な減少／ＨＩＳ  ＢＲＧマウスにおける抗マウスＣＳＦ１Ｒ抗体の注射
ＨＩＳ  ＢＲＧマウスにおける抗マウスＣＳＦ１Ｒ抗体の注射。ヒト免疫系を用いて再構成された、免疫不全マウスに対し、３０ｍｇ／ｋｇ／週の２Ｇ２（抗マウスＣＳＦ−１Ｒ）又はマウスＩｇＧ１アイソタイプ（ＭＯＰＣ２１）の用量を４回連続して注射した。（ｔ０）の前及び末梢血における処理の間（ｔ１−ｔ４）と、脾臓及び骨髄における剖検の日（ｔ４）とに、複数の異なるパラメータを分析した。
【００４４】
結果を図４に示す。
（Ａ）は、２Ｇ２又はＭＯＰＣ２１で処理したＨＩＳ  ＢＲＧマウス（ｎ＝８〜９匹のマウス）の血清中におけるマウスＭ−ＣＳＦのレベルを示している。
（Ｂ及びＣ）は、ＦＡＣＳ分析（ｎ＝８〜１０匹のマウス；２要因Ａｎｏｖａ；＊Ｐ＜０．０５）によって決定された、４用量のコントロール（ＭＯＰＣ２１）又は抗マウスＣＳＦ１Ｒ（２Ｇ２）抗体を注射されたヒト化マウスの末梢血中のマウスＣＤ４５＋細胞内部におけるＬｙ６Ｃ＋＋＋ＣＳＦ１Ｒ＋マウス単球又はマクロファージの発生頻度を示している。
（Ｄ及びＥ）は、ＦＡＣＳ分析（ｎ＝８〜９匹のマウス；独立スチューデントのｔ検定）によって決定された、４用量のコントロール（ＭＯＰＣ２１）又は抗マウスＣＳＦ１Ｒ（２Ｇ２）抗体を注射されたヒト化マウスの骨髄又は脾臓中のマウスＣＤ４５＋細胞内部におけるＬｙ６Ｃ＋＋＋ＣＳＦ１Ｒ＋マウス単球又はマクロファージの発生頻度を示している。
（Ｆ＋Ｇ）は、４用量のコントロール（ＭＯＰＣ２１）又は抗マウスＣＳＦ１Ｒ（２Ｇ２）抗体を注射されたヒト化マウスの代表的な脾臓又は骨髄切片上でのマウスＦ４８０の免疫組織化学的染色を示している。
【００４５】
表：統計的有意性のレベルを記述するためのパラメータ
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｅ】
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【図４Ｆ−Ｇ】
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【国際調査報告】
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