(57)【要約】  本明細書に記載のいくつかの実施形態は、キャピラリーにおける分析物含有サンプルを電気泳動により分離することを含む方法に関する。キャピラリーの長さ方向に沿った各位置の分析物の濃度及び／又は量の指標となるシグナルを生成するために、分析物（たとえば、ＨＲＰコンジュゲートタンパク質）に反応するように構成されるルミノールなどの化学発光剤がキャピラリーに入れられる。分析物及び化学発光剤を含有するキャピラリーの第１の像は、第１の時間にわたり撮像される。分析物及び化学発光剤を含有するキャピラリーの第２の像は、より長い第２の時間にわたり撮像される。第１の位置における分析物の第１の集団の濃度及び／又は量は、第１の像を用いて決定され、第２の位置における分析物の第２の集団の濃度及び／又は量は、第２の像を用いて決定される。
2019536009.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャピラリーにおけるタンパク質を含有するサンプルを電気泳動により分離することと、
前記タンパク質と反応し、前記キャピラリーの長さ方向に沿った複数の位置のそれぞれにおけるタンパク質の量の指標となるシグナルを生成するように構成される検出剤を、前記キャピラリーに入れることと、
前記タンパク質と前記検出剤とを含有する前記キャピラリーの第１の像を、第１の時間にわたり撮像することと、
前記タンパク質と前記検出剤とを含有する前記キャピラリーの第２の像を、前記第１の時間よりも長い第２の時間にわたり撮像するることと、
前記第１の像を用いて前記キャピラリーの第１の位置のタンパク質の濃度を決定することと、
前記第２の像を用いて前記キャピラリーの第２の位置のタンパク質の濃度を決定することと、
を含む方法。
【請求項２】
前記検出剤が化学発光剤又は発色剤の１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の像を撮像することと前記第２の像を撮像することとの間に、前記検出剤を注ぎ足すこと、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の像を撮像している間に、あらかじめ決められたシグナル強度閾値を超えるまでの時間の長さを測定することであって、第１の持続時間が前記時間の長さであること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の像を撮像している間に、あらかじめ決められたシグナル強度閾値を超えるまでの時間の長さを測定することであって、第１の持続時間が前記時間の長さであり、第２の持続時間が前記第１の持続時間の整数倍であること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記キャピラリーの前記第１の位置のタンパク質の前記濃度が、前記第２の位置のタンパク質の前記濃度の少なくとも３倍であり、前記方法が、
前記第１の像を撮像することと前記第２の像を撮像することとの間に、前記検出剤を検出剤で注ぎ足すことであって、前記第１の位置のタンパク質の前記濃度が前記第２の時間の間に前記第１の位置の検出剤の量を消費するのに十分であること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記キャピラリーの前記第１の位置のタンパク質の前記濃度が、前記第２の位置のタンパク質の前記濃度の少なくとも３倍であり、且つ
前記第２の位置のタンパク質の前記濃度の指標となるシグナルがわずかすぎて、前記第１の像に基づいて前記第２の位置のタンパク質の前記濃度を決定できない、
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の像及び前記第２の像に追加して複数の像のそれぞれを、前記複数の像の直前の像が撮像される時間よりも長い時間にわたり撮像することと、
タンパク質を含有する前記複数の位置のそれぞれのタンパク質の量を決定するための像を前記複数の像から選択することであって、各像が、共通のあらかじめ決められたシグナル強度閾値を超える位置のシグナルに基づいて選択されることと、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の像及び前記第２の像に追加して複数の像のそれぞれを、前記複数の像の直前の像が撮像される時間よりも長い時間にわたり撮像することと、
タンパク質を含有する前記複数の位置のそれぞれのタンパク質の量を決定するための像を前記複数の像から選択することであって、各像が、共通のあらかじめ決められたシグナル強度閾値を超える位置のシグナルに基づいて選択されることと、
前記第１の像に基づいて、前記あらかじめ決められた閾値を超える前記第１の位置に関連するシグナルの予測露出時間を計算することであって、第３の像が前記第１の像の直前に撮像され、且つ第４の像が前記第１の像の直後に撮像されることと、
前記あらかじめ決められた閾値を前記予測露出時間で除算することにより、前記第１の位置に関連する前記シグナルの初期強度を計算することであって、前記第１の位置に関連する前記シグナルの前記初期強度に基づいて決定された前記第１の位置のタンパク質の濃度を決定することと、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記キャピラリーの前記第１の位置が前記キャピラリーにおいて最も高い濃度のタンパク質を有し、前記方法が、
前記第１の像を撮像している間に、あらかじめ決められたシグナル強度閾値を超えるまでの時間の長さ測定することであって、第１の持続時間が前記時間の長さであり、前記第１の像が複数の像の第１のものであり、前記複数の像が前記第２の像を含むこと、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出剤がルミノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質の第１の集団がキャピラリーの長さ方向に沿って第１の位置に位置するように、且つタンパク質の第２の集団がキャピラリーの前記長さ方向に沿って第２の位置に位置するように、タンパク質の前記第１の集団とタンパク質の前記第２の集団とを含有するサンプルをキャピラリー電気泳動により分離することと、
前記キャピラリーの複数の像を撮像することであって、前記複数の像の各像が異なる露出時間を有することと、
タンパク質の前記第１の集団の量の指標となる第１の光学シグナルの強度があらかじめ決められた閾値を超える第１の像を前記複数の像から選択することと、
前記第１の光学シグナルの前記強度を前記第１の像の露出時間で除算することにより前記第１の光学シグナルの初期強度を決定することと、
前記第１の光学シグナルの前記初期強度に基づいてタンパク質の前記第１の集団の量を計算することと、
タンパク質の前記第２の集団の量の指標となる第２の光学シグナルの強度が前記あらかじめ決められた閾値を超える第２の像を前記複数の像から選択することと、
前記第２の光学シグナル及び前記第２の像の露出時間に基づいてタンパク質の前記第２の集団の量を計算することと、
を含む方法。
【請求項１３】
タンパク質の前記第１の集団の量がタンパク質の前記第２の集団の量の少なくとも１０倍である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の光学シグナルの前記強度を前記第２の像の前記露出時間で除算することにより前記第２の光学シグナルの初期強度を決定することであって、前記第２の光学シグナルの前記初期強度に基づいて前記第２の集団の前記量を計算すること、
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の像がそれぞれ公称露出時間を有するサブセットに分割され、各サブセットの各像の露出時間が前記サブセットの前記公称露出時間から５０％以下で変動する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数の像の各サブセットの像が、前記複数の像の直前のサブセットの像の公称露出時間の２倍の公称露出時間を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数の像の各像が前記複数の像の直前の像の露出時間の２倍の露出時間を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数の像から像を撮像する前に化学発光剤又は検出剤の１つを前記キャピラリーに添加すること、
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数の像から各像を撮像する前に化学発光剤又は発色剤の１つを前記キャピラリーに添加すること、
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
装置であって、
キャピラリーに配設された分析物の複数の集団の電気泳動分離を行うように構成された複数の電極と、
前記キャピラリーの長さ方向に沿って複数の位置の像を撮像するように構成された検出器であって、前記複数の位置のそれぞれが分析物の前記複数の集団の一集団に関連している、検出器と、
プロセッサーであって、
あらかじめ決められた閾値を超える第１の位置の第１のシグナルの強度に基づいて前記キャピラリーの前記長さ方向に沿った前記複数の位置の複数の像から第１の像を選択することであって、前記第１のシグナルの前記強度が分析物の前記複数の集団のうち前記第１の位置に位置する分析物の第１の集団の量の指標となることと、
前記分析物の前記第１の集団の前記量を計算することと、
前記あらかじめ決められた閾値を超える第２の位置の第２のシグナルの強度に基づいて前記キャピラリーの前記長さ方向に沿った前記複数の位置の前記複数の像から第２の像を選択することであって、前記第２のシグナルの前記強度が分析物の前記複数の集団のうち前記第２の位置に位置する分析物の第２の集団の量の指標となり、前記第２の像が前記第１の像の露出時間と異なる露出時間を有することと、
前記第２のシグナル及び第２の露出時間に基づいて、分析物の前記複数の集団の前記第２の位置に位置する前記分析物の前記第２の集団の前記量を計算することと、
を行うように構成されたプロセッサーと、
を含む装置。
【請求項２１】
前記検出器が、前記複数の像の少なくともいくつかが異なる露出時間を有するように、前記複数の位置の像を撮像するように構成される、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
前記検出器が前記複数の像から各像を撮像する前に前記キャピラリーにルミノールを注入するように構成されたルミノール注入器、
をさらに含む、請求項２０に記載の装置。
【請求項２３】
前記プロセッサーが、
前記第１のシグナルが前記あらかじめ決められた閾値に達する予測露出時間を計算することと、
前記あらかじめ決められた閾値を前記予測露出時間で除算することにより前記第１のシグナルの初期強度を計算することであって、前記分析物の前記第１の集団の前記量を前記第１のシグナルの前記初期強度に基づいて計算することと、
を行うようにさらに構成される、請求項２０に記載の装置。
【請求項２４】
前記プロセッサーが、
前記第１の像及び前記第１の像の直前に撮像された第３の像に基づいて前記第１のシグナルが前記あらかじめ決められた閾値に達する予測露出時間を計算することと、
前記あらかじめ決められた閾値を前記予測露出時間で除算することにより前記第１のシグナルの初期強度を計算することであって、前記分析物の前記第１の集団の前記量を前記第１のシグナルの前記初期強度に基づいて計算することと、
を行うようにさらに構成される、請求項２０に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１１月２９日出願の米国仮特許出願第６２／４２７，６２４号（その開示はその全体が本出願をもって参照により組み込まれる）に基づく優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの公知の技術及び機器は、タンパク質をクロマトグラフィー及び電気泳動により分離するのに好適である。たとえば、いずれも「Methods and Devices for Analyte Detection」という名称の米国特許第９，３０４，１３３号及び同第９，４００，２７７号（それらの開示はいずれもその全体が本出願をもって参照により組み込まれる）には、キャピラリー電気泳動によるタンパク質の分離が記載されている。
【０００３】
いくつかの場合には、１つ以上の位置で分析物の量及び／又は濃度を決定することが必要なことも又は望ましいこともありうる。強化された化学発光（ＥＣＬ）技術を用いて分析物の量及び／又は濃度を測定するいくつかの公知の方法が存在する。たとえば、キャピラリーの内壁に捕えられたタンパク質の量は、キャピラリー内でルミノールと反応して光子数／秒及び／又は検出数／秒の単位で測定可能な化学発光シグナルを生成する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素を有する抗体を用いて測定可能である。
【０００４】
伝統的なＥＣＬ技術は、ルミノールをキャピラリーに入れることと、ルミノールと反応するＨＲＰコンジュゲートタンパク質としてキャピラリーの１つ以上の像を撮像することと、を含む。伝統的なＥＣＬ技術は、各ピークが類似の量のタンパク質を含有する状況及び／又は分離が単一ピークをもたらす状況では好適でありうる。しかしながら、伝統的なＥＣＬ技術はダイナミックレンジが劣る。同様に述べられている伝統的なＥＣＬ技術は、分離が複数のピークを生成するとともに少なくとも２つのピークが有意差のある量のタンパク質を含有する状況では好適でない。かかる状況では、より高濃度のタンパク質を有するピークは検出器を飽和させたり及び／又は無効化したり、より高濃度を有するピークは利用可能なルミノールをすべて消費したり、及び／又はより低濃度のタンパク質を有するピークは検出不能になったりするであろう。これらはいずれも、タンパク質の量及び／又は濃度を決定可能な確度を低減するであろう。したがって、タンパク質の広範囲の量及び／又は濃度を同時に検出する方法及び装置の必要性が存在する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図面の簡単な説明
【図１】実施形態に従って分析物の広範囲の量及び／又は濃度を測定するように操作可能な機器の模式図である。
【図２】実施形態に従って分析物集団の濃度及び／又は量を測定する方法のフローチャートである。
【図３】経時的に検出されるＥＣＬ技術により生成される光のシミュレーションのプロットである。
【図４】分析物の濃度及び／又は量を測定する公知の技術と、本明細書に記載の方法に従って分析物の濃度及び／又は量を測定する方法と、の比較を表す。
【図５】分析物の濃度及び／又は量を測定する公知の技術と、本明細書に記載の方法に従って分析物の濃度及び／又は量を測定する方法と、の比較を表す。
【図６】実施形態に従ってルミノール消費量及び物質移動係数に基づいて測定誤差をシミュレートしたプロットである。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
詳細な説明
ＥＣＬ技術を用いた複数の技術に含まれるタンパク質の定量でとくに問題になるのは、キャピラリーのイメージングを行うのに適切な露出時間の選択である。露出時間が短すぎるとともにピークが少量及び／又は低濃度のタンパク質を有すると、検出及び／又は正確な定量ができなくなるおそれがある。露出時間が長すぎるとともにピークが大量及び／又は高濃度のタンパク質を有すると、検出器の飽和及び／又は無効化、近接ピークのウォッシュアウト、及び／又はすべての利用可能なルミノールの消費を引き起こすおそれがある。利用可能な妥協解決策の１つは、いくつかの比較的短い露出を逐次的に採用することである。次いで、各ピークの強度を時間に対してプロット可能であるとともに、シグナル対時間の予想変動の数学モデルを用いて初期強度（たとえば、光子数／秒単位で測定されるもの）を外挿可能である。ピークのタンパク質の濃度及び／又は量は、初期強度に基づいて決定可能である。しかしながら、かかる技術は、タンパク質濃度が低いと有意な統計誤差を生じるおそれがあり、而もタンパク質濃度が高いと系統誤差を生じるおそれがある。
【０００７】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、キャピラリーにおける分析物含有サンプルを電気泳動により分離することを含む方法に関する。キャピラリーの長さに沿った各位置の分析物の濃度及び／又は量の指標となるシグナルを生成するために、分析物（たとえば、ＨＲＰコンジュゲートタンパク質）に反応するように構成されたルミノールなどの化学発光剤がキャピラリーに入れられる。分析物及び化学発光剤を含有するキャピラリーの第１の像は、第１の時間にわたり撮像される。分析物及び化学発光剤を含有するキャピラリーの第２の像は、第２の時間にわたり撮像される。第２の時間は第１の時間よりも長い。同様のことを述べることになるが、キャピラリーの第２の像は、キャピラリーの第１の像よりも長い露出時間を有する。第１の位置における分析物の第１の集団の濃度及び／又は量は、第１の像を用いて決定され、第２の位置における分析物の第２の集団の濃度及び／又は量は、第２の像を用いて決定される。いくつかの実施形態では、化学発光剤の代わりに発色検出剤を本方法で使用可能である。
【０００８】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、分析物の第１の集団と分析物の第２の集団とを含有するサンプルをキャピラリー電気泳動により分離することを含む方法に関する。サンプルを分離することにより、キャピラリーの長さに沿って第１の位置に移動する分析物の第１の集団と、キャピラリーの長さに沿って第２の位置に移動する分析物の第２の集団と、をもたらしうる。キャピラリーの像は、異なる露出時間で撮像される。第１の像は、分析物の第１の集団の濃度及び／又は量の指標となる第１の光学シグナルの強度があらかじめ決められた閾値を超えるように選択可能である。第１の光学シグナルの初期強度は、第１の像で検出される第１の光学シグナルの強度を第１の像の露出時間で除算することにより決定可能である。第１の光学シグナルの初期強度は、分析物の第１の集団の濃度及び／又は量の計算に使用可能である。第２の像は、第２の光学シグナルの強度があらかじめ決められた閾値（たとえば、同一のあらかじめ決められた閾値）を超えるように選択可能である。第２の光学シグナルの初期強度は、第２の像で検出される第２の光学シグナルの強度を第２の像の露出時間で除算することにより決定可能である。第２の光学シグナルの初期強度は、分析物の第２の集団の濃度及び／又は量の計算に使用可能である。
【０００９】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、キャピラリーに配設された分析物（たとえばタンパク質）の複数の集団の電気泳動分離を行うように構成された装置に関する。検出器は、キャピラリーの長さに沿って複数の位置の像を撮像するように構成される。同様のことを述べることになるが、検出器は、キャピラリーの全列イメージングを実施するように操作可能でありうる。計算エンティティー（たとえばプロセッサー及び／又はメモリー）は、あらかじめ決められた閾値を超えるキャピラリーの長さに沿った第１の位置の第１のシグナルの強度に基づいて検出器により撮像される第１の像を選択するように構成される。第１のシグナルの強度は、第１の位置に位置する分析物の第１の集団の濃度及び／又は量の指標となる。分析物の第１の集団の濃度及び／又は量は、たとえば第１のシグナルの強度に基づいて計算可能である。検出器により撮像される第２の像は、あらかじめ決められた閾値（たとえば、同一のあらかじめ決められた閾値）を超えるキャピラリーの長さに沿った第２の位置の第２のシグナルの強度に基づいて選択可能である。第２の像は、第１の像の露出時間とは異なる露出時間を有しうる。第２のシグナルの強度は、第２の位置に位置する分析物の第２の集団の濃度及び／又は量の指標となる。分析物の第２の集団の濃度及び／又は量は、たとえば第２のシグナルの強度及び第２の露出時間に基づいて計算可能である。
【００１０】
図１は、実施形態に従って分析物（たとえばタンパク質）の濃度及び／又は量を測定する機器の模式図である。機器は、キャピラリー１１０と電極１１５と検出器１２０とを含む。キャピラリー１１０は、２つの容器１４０をブリッジ可能である。各容器は、たとえば、アノード液容器、カソード液容器、及び／又はサンプル容器でありうる。
【００１１】
機器は、サンプルを含有する分析物をキャピラリー１１０に引き込むように、さもなければサンプルを含有するキャピラリー１１０を受容するように構成可能である。サンプルの電気泳動分離を行うことが可能な電位は、電極１１５によりキャピラリー１１０の両端に印加可能である。同様のことを述べることになるが、分析物の集団は、電極１１５により電位が印加される結果としてキャピラリー１１０に沿って異なる位置に移動可能である。類似の性質（たとえば、運動性、等電点など）を有する分析物の集団は、キャピラリー１１０においてピーク又はバンドを形成可能である。
【００１２】
さらに詳細に本明細書で考察されるように、機器は、各ピークの分析物の濃度及び／又は量を決定可能である。いくつかの場合には、キャピラリー１１０の第１の位置の第１のピーク１５２は、キャピラリー１１０の第２の位置の第２のピーク１５４よりも有意に多い量及び／又は高い濃度の分析物を含みうる。同様のことを述べることになるが、第１のピーク１５２は、第２のピーク１５４の３倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、又はそれ以上の分析物を含みうる。
【００１３】
検出器１２０（たとえば、カメラ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、相補型金属−酸化物−半導体（ＣＭＯＳ）検出器など）は、キャピラリー１１０の像、キャピラリー１１０内の分析物、及び／又はキャピラリー１１０内のＥＣＬ反応により放出された光子を撮像するように構成される。検出器１２０は全列検出器でありうる。同様のことを述べることになるが、検出器１２０は、キャピラリー１１０の全長、キャピラリー１１０の長さの実質的部分（たとえば少なくとも８０％）、キャピラリー１１０の全分離領域を撮像するように、及び／又はキャピラリーの長さに沿って分離された少なくとも２つの異なる位置（たとえば、第１のピーク１５２及び第２のピーク１５４に関連する位置）を含有する像を撮像するように、操作可能でありうる。
【００１４】
プロセッサー１６２及びメモリー１６４は、検出器１２０に通信可能に接続される。プロセッサー１６２及びメモリー１６４は、まとめて計算エンティティーといえる。プロセッサー１６２は、たとえば、汎用プロセッサー、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、ディジタルシグナルプロセッサー（ＤＳＰ）、及び／又はそれらの類似品でありうる。プロセッサー１６２は、メモリー１６４などのメモリーからのデータの取出し及び／又はメモリーへのデータの書込みを行うように構成可能であり、こうしたメモリーは、たとえば、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、メモリバッファー、ハードドライブ、データベース、消去可能プログラマブルリードオンリーメモリー（ＥＰＲＯＭ）、電気的消去可能プログラマブルリードオンリーメモリー（ＥＥＰＲＯＭ）、リードオンリーメモリー（ＲＯＭ）、フラッシュメモリー、ハードディスク、フロッピーディスク、クラウド記憶装置、及び／又はその他いろいろでありうる。プロセッサー１６２及びメモリー１６４は、さらに詳細に本明細書に記載されるように、検出器１２０の露出時間を選択したり、検出器１２０から像を受け取ったり、検出器１２０から受け取った像を分析のために選択したり、及び／又は分析物集団の濃度及び／又は量を計算したりするように構成される。
【００１５】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、化学発光剤（たとえばルミノール）は、キャピラリーのイメージングを行う前及び／又はキャピラリーの各像を撮像する前にキャピラリーに注入される。同様のことを述べることになるが、機器はルミノール注入器１１５を含みうる。プロセッサー１６２は、ルミノール（又は任意の他の好適な化学発光剤）をルミノール注入器１１５からキャピラリーに貫流させるように操作可能でありうる。キャピラリー１１０は、キャピラリー１１０の壁に被覆しうるＨＲＰを含有しうる。分析物（又は分析物の集団）は、ＨＲＰに結合させてＨＲＰコンジュゲート分析物を形成するように構成可能である。ルミノールの注入後、ルミノールはキャピラリーの壁に拡散し、ＨＲＰコンジュゲート分析物に反応して検出器１２０により検出可能な光子を放出する。ルミノールとＨＲＰとの強化化学発光（ＥＣＬ）反応により放出される光子は、分析物の集団の指標となる。
【００１６】
キャピラリーの典型的内径（ＩＤ）は１００μｍであり且つ典型的長さは５ｃｍであるので、ルミノールは検出器１２０が測定（たとえば露出）を行う時間にわたりキャピラリーの長さに沿ってわずかな部分を拡散するにすぎないが、キャピラリーの壁に何回も衝突する。したがって、局所シグナルはＨＲＰコンジュゲート分析物の局所的存在の指標となるが、約１ｍｍ超離れたキャピラリーの長さに沿った他のシグナル又は他の分析物の存在に依存しない。同様のことを述べることになるが、ピーク１５２がピーク１５４から約１ｍｍ超の位置にある例では、ピーク１５２から放出される光の強度はピーク１５４から放出される光の強度に依存しない。
【００１７】
ＥＣＬ反応の初期光の強度（光子数／秒）は、キャピラリー内の特定の位置（たとえばピーク）のタンパク質（たとえば分析物）の量に比例する。したがって、初期光の強度を決定可能であれば、タンパク質の濃度及び／又は量を決定可能である。しかしながら、いくつかの課題は、初期光の強度を正確に決定する際に困難を呈する可能性がある。ルミノールは化学発光反応により消費されるので、利用可能なルミノールの量が少ない場合、たとえば、キャピラリーベースの技術の場合、初期光の強度は、多くの場合、光強度を何回か測定することと、減衰曲線を分析して初期光の強度を決定することと、により決定される。検出器を用いて何回も露出を行い、曲線を強度対時間に当てはめ、そして初期に戻すように外挿する。低濃度のタンパク質では、全強度がより低いうえに化学発光の減衰がより遅いので、比較的長い露出を行うことが望ましい。しかしながら、高濃度のタンパク質では、全強度がより高いうえに化学発光の減衰がより速いので、短い露出を行うことが望ましい。しかしながら、多くの場合、キャピラリーは、ある領域では高濃度のタンパク質を含有しうるとともに別のおそらく近接した領域では低濃度のタンパク質を含有しうる。そのような場合、長時間露出を行うと、高濃度の領域では、露出時に「バーンアウト」してすべて又はほとんどの利用可能なルミノールが消費され、その結果、誤った低濃度の読取り及び／又は近接した低濃度シグナルのマスキングを引き起こす可能性がある。それとは逆に、短い露出は、低タンパク質濃度で有意な統計誤差による影響を受けやすい。したがって、高ダイナミックレンジでタンパク質の量を正確に決定するシステム及び方法の必要性が存在する。同様のことを述べることになるが、高濃度のタンパク質及び低濃度のタンパク質の両方を有する領域を含有する円柱状物（たとえばキャピラリー）を正確に特徴付ける必要性が存在する。図１を参照しながら以上で説明した機器は、高ダイナミックレンジで量及び／又は濃度を正確に決定する方法を実施するように操作可能でありうる。
【００１８】
図２は、実施形態に従って分析物の量及び／又は濃度を決定する方法のフローチャートである。図２の方法は、図１を参照しながら以上で説明した機器により実施可能である。本方法は、２１０でサンプルを分離することと、２１５でルミノールをサンプルに入れることと、２２０でキャピラリーの像を撮像することと、を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、２１５でルミノールをキャピラリーに何回か入れることが可能である。ルミノールをキャピラリーに入れるごとに、２２０で少なくとも１回の露出を撮像可能である。露出長さは可変である。たとえば、ルミノールをキャピラリーに入れるごとに、たとえば、２５６秒間又は任意の他の好適な最大露出持続時間まで１秒間から２秒間さらには４秒間などに露出持続時間を２倍にしうる。露出持続時間は任意の好適な進展が可能である。たとえば、各露出は、前の露出持続時間の任意の整数倍（又は任意の他の複数倍）の持続時間を有しうる。
【００２０】
露出時間を変化させることにより、非常に少ない量のシグナル減衰で良好なシグナル対ノイズを有するいずれかの濃度のタンパク質に好適な少なくとも１つの露出を生成可能である（すなわち、積分シグナル対露出持続時間は依然として線形である）。同様のことを述べることになるが、高露出持続時間は、低タンパク質濃度を特徴付けるのにとくに好適でありうる。一方、低露出持続時間は、高タンパク質濃度を特徴付けるのに好適でありうる。いくつかの場合には、ハードウェア及び／又はランタイムの拘束条件が露出持続時間の限界を限定する可能性がある。たとえば、きわめて低い濃度は、最大露出持続時間により制限される可能性があり、一方、きわめて高い濃度は、最小露出持続時間により制限される可能性がある。
【００２１】
そのため、２３０では、分析物の第１の集団の濃度及び／又は量を決定する第１の像を選択可能である。分析物の第１の集団は、キャピラリーに沿って第１の位置に配設可能である。いくつかの実施形態では、タンパク質の第１の集団の指標となるシグナルが検出されたら、検出器はあらかじめ決められた閾値（たとえば２５，０００カウント）を超えるまでデータ（たとえば光子数）の撮像を継続可能である。かかる実施形態では、露出時間はあらかじめ決められた閾値に達するのに必要な時間により決定される。他の実施形態では、露出持続時間のシリーズ（たとえば、１秒間、２秒間、４秒間、８秒間など）は、以上で考察されるようにあらかじめ決められたものでありうる。露出持続時間をどのように決定するかにかかわらず、分析物の第１の集団の量を決定する第１の像は、第１の位置のシグナルがあらかじめ決められた強度閾値を超える最短露出持続時間を有する像を同定することにより選択可能である。以上で考察されるように、強化化学発光反応の初期強度は、その位置の分析物の量及び／又は濃度の指標となる。したがって、２３５では、分析物の第１の集団の量は第１の像で検出されたシグナルの強度（光子数又はカウント）を露出持続時間（秒）で除算することにより決定可能である。
【００２２】
分析物の集団の濃度及び／又は量を決定する像の選択は、ピークを有するキャピラリーに沿った各位置に対して繰返し可能である。たとえば、分析物の第２の集団は第２の位置に配設可能である。第２の像は、第２の位置のシグナルがあらかじめ決められた強度閾値を超える像を同定することにより２４０で選択可能である。第２の像で検出されたそのシグナルは第２の像の露出持続時間で除算することが可能であり、分析物の第２の集団の量は２４５で決定可能である。
【００２３】
像は、各ピーク又はバンドに対してこうして選択可能であり、且つ各ピーク内の分析物の濃度及び／又は量は同様に決定可能である。特定のピークに関連するシグナルがあらかじめ決められた閾値を超える像を選択することにより、公知のＥＣＬ技術に求められる適切な露出時間の選択に固有のトレードオフを軽減可能である。たとえば、非常に短い露出時間（たとえば１秒間）を用いて最も高い初期強度（ひいては濃度及び／又は量）を有するピークの量を決定可能である。かかる短い露出は、短すぎてキャピラリーの他のピークの量を決定できない可能性がある。同様のことを述べることになるが、他のピークは、短い露出時間を有する像の検出閾値以下でありうるし及び／又は低いシグナル対ノイズ比を有しうる。別の例として、比較的長い露出時間（たとえば６４秒間）を用いて低い初期強度（ひいては濃度及び／又は量）を有するピークの量を決定可能である。かかる長い露出は、より高い濃度及び／又はより多い量のアナライトを有する他のピークの濃度及び／又は量を決定するのに好適でない可能性がある。たとえば、６４秒間の測定（露出）にわたり、高強度ピークはすべての局所的に利用可能なルミノールを消費しうるし及び／又は高強度減衰の有意な非線形性が比較的大きな測定誤差を導入しうる。
【００２４】
いくつかの場合には、最短公称露出持続時間は、少なくとも１つのピークがあらかじめ決められたカウント閾値を超える最短露出を選択することにより選択可能である。あらかじめ決められたカウント閾値は、キャピラリー全体を通じて均一でありうるとともに、いかなる特定のサブ集団の濃度にも依存しない初期ルミノール濃度に関連付けられうる。このあらかじめ決められたカウント閾値では、あらかじめ決められた閾値を超えるシグナルは、典型的には、有意なシグナル減衰を伴うことなく好適なシグナル対ノイズ比を有するであろう。
【００２５】
以上で考察されるように、キャピラリーのマルチ像は撮像可能であり、且つ像は異なる持続時間を有しうる。いくつかの場合には、各露出は同一又はほぼ同一の露出持続時間を有する露出のシリーズを採用しうる。露出の第１のシリーズは、たとえば、最短公称露出持続時間を有しうる。たとえば、露出の第１のシリーズの各露出は、１秒間の露出持続時間を有しうる。露出の第２のシリーズは、それぞれたとえば、２秒間などの露出持続時間を有しうる。いくつかの場合には、露出のシリーズの各露出の露出持続時間は、公称露出持続時間と異なりうる。たとえば、露出の第２のシリーズが２秒間の公称露出持続時間を有する場合、露出は、１．６秒間、１．８秒間、２．０秒間、２．４秒間などの露出持続時間を有して撮像可能である。同様のことを述べることになるが、露出のシリーズの露出の露出持続時間は、そのシリーズの公称露出持続時間を中心に加重しうる。こうして、ある公称露出持続時間から別の公称露出持続時間への移行は平滑に行いうる。さらに詳細に本明細書に記載されるように、光強度は積分シグナル（検出された光子数及び／又はカウント）を実際の露出持続時間で除算することにより決定可能である。
【００２６】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、時間（ｔ）と、キャピラリー内の半径方向位置（ｒ）と、さらには半径（ｂ）を有するキャピラリーでのさまざまな反応速度対拡散率の比（物質移動ビオ数Ｂｉ）と、の関数としてルミノール濃度を予測する以下に示される丸形キャピラリーにおけるルミノールの拡散及び反応の数学モデルが利用される。このモデルによると、ルミノールの約１５％が消費されたときに積分シグナルを測定すれば（すなわち最大積分シグナルの１５％）、初期反応速度（標的タンパク質濃度に比例する）を近似する際のエラーは、Ｂｉ＜０．５では狭い範囲内（１５〜２５％）にあることが示される。Ｂｉ＜０．１では、エラーは消費ルミノール％に等しい（反応律速プロセス）。標的濃度の比のみに意味があるものなので（単位は任意である）、いずれの固定エラーパーセントもかかる比では相殺される。
【数１】
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【００２７】
シグナルがあらかじめ決められた閾値を超えるアナライトの各集団の像を選択することにより（たとえば、キャピラリーに沿った各位置）、露出時間にわたりそのシグナルの減衰を線形近似可能であることが、さらに詳細に本明細書で考察される以上のモデル及び図６から実証される。したがって、初期強度は、その像の強度を露出持続時間で除算することにより計算可能である。
【００２８】
露出時間にわたる実際の減衰は指数関数的である。したがって、あらかじめ決められた閾値が高くなるほど、線形近似は不正確になる。しかしながら、あらかじめ決められた閾値が低くなるほど、シグナル対ノイズ比は低くなる。したがって、適切なあらかじめ決められた閾値を選択することにより、線形性とノイズとのバランスがとれる。以下に示される表１は、適切なあらかじめ決められた閾値を選択するために使用される実験データを提示する。あらかじめ決められた閾値としてセンサーの飽和レベルの約２５％のシグナル強度を選択することにより、線形傾きと実際の減衰との比が好適なトレードオフである０．８９未満になることが、実験データから明らかである。他の好適な閾値は、センサーの飽和レベルの３０％〜センサーの飽和レベルの２０％でありうる。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
線形化誤差（及び強度曲線で生じる不連続ジャンプ）の空間変動を最小限に抑えるために、追加の補間工程を利用可能である。個別の露出時間を有するマルチ像で撮像されるシグナルは使用可能である。シグナルがあらかじめ決められた閾値に最も近い像（又はシグナルがあらかじめ決められた閾値を超える最短露出時間を有する像）を選択した後、追加の像、たとえば、直前及び／又は後続の像（たとえば、次に長い及び／又は次に短い露出持続時間を有する像）を分析し、これを用いて目標閾値を生じる予測露出時間を補間する。同様のことを述べることになるが、あらかじめ決められた閾値に達する予測露出時間を計算可能である。予測露出時間は、実際に撮像された画像の露出時間に対応しないこともある。かかる実施形態では、初期強度の計算は、あらかじめ決められた閾値を予測露出時間で除算することにより実施可能である。いくつかの実施形態では、予測露出時間は、あらかじめ決められた閾値のすぐ下の測定値と、あらかじめ決められた閾値のすぐ上の測定値との間を線形補間することにより計算可能である。
【実施例】
【００３１】
実施例１
図３は、本明細書に記載の技術を用いてシミュレートされたシグナルレベルを示す。図３は、３つの強度レベル「低」、「中」、及び「高」を表す。中強度レベルは低強度レベルの強度の４倍の強度を有し、且つ高強度レベルは中強度レベルの強度の４倍の強度を有する。あらかじめ決められたカウント閾値は２５，０００でありうる。これは、たとえば、以上で考察されるように検出器の感度及び／又は飽和に基づいて決定可能である。同様のことを述べることになるが、２５，０００のカウント閾値はセンサーの飽和レベルの２５％でありうる。低強度シグナルに対しては１６秒間の公称露出持続時間を選択可能であり、中強度シグナルに対しては４秒間の公称露出持続時間を選択可能であり、且つ高強度シグナルに対しては１秒間の公称露出持続時間を選択可能である。強度（光子数／秒）は積分シグナルを露出持続時間で除算することにより決定される。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
実施例２
本明細書に記載の技術は、公知の技術と比較してタンパク質濃度分析のダイナミックレンジを増加可能である。たとえば、図４及び５は、「マルチ像」と表示されたタンパク質濃度を決定する公知の方法を例示する。これは、広範囲のタンパク質濃度を処理したときに起こる「バーンアウト」現象を示す。バーンアウトは、低タンパク質濃度を正確に解像するのに好適な測定（露出）時に化学発光反応で利用可能なルミノールを高濃度のタンパク質が消費することに起因して起こる。同様のことを述べることになるが、低タンパク質濃度を解像するのに必要とされる露出持続時間は長すぎて、高タンパク質濃度の化学発光の減衰を検出できない。
【００３４】
図４及び５はまた、本明細書に記載の技術を用いた「ＨＤＲ」（高ダイナミックレンジ）分析を例示する。ＨＤＲ分析では、オリジナルのマルチ像技術により例示される高シグナルの大きな系統的過小評価を伴うことなく高濃度（６３６μｇ／ｍＬ）及び低濃度（６３．６ｐｇ／ｍｌ）の両方のタンパク質を検出可能であることが例示される。
【００３５】
以上に記載したように、バーンアウトは、タンパク質濃度を決定する公知の技術に悪影響を及ぼしうる。しかしながら、本明細書に記載の技術は、バーンアウトで奏効しうる。たとえば、ルミノールは非常にゆっくりとキャピラリー内を拡散するので、露出持続時間を短時間から長時間に増加させたとき、短い持続時間を用いて高濃度のタンパク質を有する領域を正確に定量可能である。露出持続時間を増加させるにつれて、高タンパク質濃度を有する領域は利用可能なルミノールを枯渇させうる。結果として、より低い強度を有する低濃度近傍のシグナルは、他の方法では高濃度に関連するより明るいシグナルによりマスキングされてしまうであろうが（たとえばセンサー無効化）、局所的に利用可能なルミノールが高濃度で消費された後、撮像されるより長い持続時間露出時に解像可能でありうるし及び／又はより正確に検出しうる。したがって、高濃度ピークが低濃度ピークの比較的近くにある場合には、ルミノールを注ぎ足させることなくマルチ像を撮像することが望ましいこともある。
【００３６】
各種実施形態を以上に説明してきたが、それらは限定ではなく単なる例として提示されたものにすぎないことを理解すべきである。以上に記載の方法にはある特定のイベントがある特定の順序で行われることが示されているが、ある特定のイベントの順序は変更しうる。そのほか、イベントのいくつかは可能であればパラレルプロセスで同時に行いうるとともに、以上に記載したように逐次的にも行いうる。
【００３７】
実施形態を特に示して説明してきたが、形態及び細部の各種変更を行いうることは理解されよう。成分の特定の特徴及び／又は組合せを有するものとして各種実施形態を説明してきたが、他の実施形態は、以上で考察されるいずれの実施形態のいずれの特徴及び／又は成分の組合せも有しうる。たとえば、いくつかの実施形態では、ルミノールは、たとえば、露出間でルミノールをキャピラリーに流入させることにより、及び／又はルミノールをキャピラリーに連続流入させることにより、露出のシリーズ間で注ぎ足しが可能である。いくつかの場合には、キャピラリー内のフローは、たとえば、キャピラリーの両端の静水圧をバランス調整することにより、イメージング時の電気泳動プロセスを省略することにより、その他の方法により、露出を行っている間、防止可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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