(57)【要約】  適切な輸送およびプロセシングのために最適化された組換えポリトープを生成するために使用される腫瘍ネオエピトープの選択が可能なシステムおよび方法が提示される。好ましい方法において、ポリトープは、治療剤として使用されるウイルス発現系においてコードされる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫療法のための発現ベクターを作製する方法であって、
前記方法は、ポリトープをコードする配列を有する組換え核酸を構築することであって、前記ポリトープが、前記ポリトープを発現させるためにプロモーターに作動可能に連結され、
前記ポリトープは、細胞質、リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、リソソームおよび細胞外膜からなる群から選択される細胞内の位置に前記ポリトープを向ける輸送エレメントを含むか、または前記輸送エレメントにより前記ポリトープが細胞外空間に向けられており、
前記ポリトープが、複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列を含む、構築することを含む、方法。
【請求項２】
前記ウイルス発現ベクターが、Ｅ１およびＥ２ｂ遺伝子の欠失を有するアデノウイルス発現ベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記プロモーターが、低酸素、ＩＦＮ−ガンマ、またはＩＬ−８によって誘導可能である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記輸送エレメントが、切断可能なユビキチン、切断不能なユビキチン、ＣＤ１ｂリーダー配列、ＣＤ１ａテール、ＣＤ１ｃテール、およびＬＡＭＰ１膜貫通配列からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列は、同じ患者の腫瘍と適合する正常とを比較することによってフィルタ処理される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列が、２００ｎＭ以下のＭＨＣ複合体に対する結合親和性を有するようにフィルタ処理される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列が、既知のヒトＳＮＰおよび体細胞多様体に対してフィルタ処理される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列は、前記ポリトープが、所定の閾値未満である疎水性配列またはシグナルペプチドの存在の可能性および／または強度を有するように前記ポリトープ内に配置を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列がＭＨＣ−Ｉに結合し、前記輸送エレメントが前記ポリトープを前記細胞質またはプロテアソームに向ける、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列がＭＨＣ−Ｉに結合し、前記輸送エレメントが前記ポリトープを前記リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソームまたはリソソームに向ける、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列がＭＨＣ−ＩＩに結合し、前記輸送エレメントが前記ポリトープを前記リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、またはリソソームに向ける、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換え核酸が、第２のポリトープをコードする配列をさらに含み、前記第２のポリトープが、前記第２のポリトープを異なる細胞内位置に向ける第２の輸送エレメントを含み、前記第２のポリトープが、第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちの少なくともいくつか、および前記第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちのいくつかは、同一である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組換え核酸が、共刺激分子、免疫刺激性サイトカイン、およびチェックポイント阻害に干渉するかまたはこれらを下方制御するタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする配列をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記共刺激分子が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＴＬ１Ａ、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫刺激性サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＡＬＴ８０３）、ＩＬ−２１、ＩＰＳ１、およびＬＭＰ１からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
干渉する前記タンパク質が、抗体またはＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ１受容体、２Ｂ４またはＣＤ１６０のアンタゴニストである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記輸送エレメントが、切断可能なユビキチン、切断不能なユビキチン、ＣＤ１ｂリーダー配列、ＣＤ１ａテール、ＣＤ１ｃテール、およびＬＡＭＰ１膜貫通配列からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列は、同じ患者の腫瘍と適合する正常とを比較することによってフィルタ処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列が、２００ｎＭ以下のＭＨＣ複合体に対する結合親和性を有するようにフィルタ処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列が、既知のヒトＳＮＰおよび体細胞多様体に対してフィルタ処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列は、前記ポリトープが、所定の閾値未満である疎水性配列またはシグナルペプチドの存在の可能性および／または強度を有するように前記ポリトープ内に配置を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列がＭＨＣ−Ｉに結合し、前記輸送エレメントが前記ポリトープを前記細胞質またはプロテアソームに向ける、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列がＭＨＣ−Ｉに結合し、前記輸送エレメントが前記ポリトープを前記リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソームまたはリソソームに向ける、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列がＭＨＣ−ＩＩに結合し、前記輸送エレメントが前記ポリトープを前記リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、またはリソソームに向ける、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記組換え核酸が、第２のポリトープをコードする配列をさらに含み、前記第２のポリトープが、前記第２のポリトープを異なる細胞内位置に向ける第２の輸送エレメントを含み、前記第２のポリトープが、第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちの少なくともいくつか、および前記第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちのいくつかは、同一である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記組換え核酸が、共刺激分子、免疫刺激性サイトカイン、およびチェックポイント阻害に干渉するかまたはこれらを下方制御するタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記共刺激分子が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＴＬ１Ａ、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫刺激性サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＡＬＴ８０３）、ＩＬ−２１、ＩＰＳ１、およびＬＭＰ１からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
干渉する前記タンパク質が、抗体またはＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ１受容体、２Ｂ４またはＣＤ１６０のアンタゴニストである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
免疫療法のための組換え発現ベクターであって、
ポリトープを発現させるためにプロモーターに作動可能に連結された前記ポリトープをコードする配列を含み、
前記ポリトープは、細胞質、リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、リソソームおよび細胞外膜からなる群から選択される細胞内の位置に前記ポリトープを向ける輸送エレメントを含むか、または前記輸送エレメントにより前記ポリトープが細胞外空間に向けられており、
前記ポリトープが、複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列を含む、ベクター。
【請求項３５】
前記組換え発現ベクターが、Ｅ１およびＥ２ｂ遺伝子の欠失を有するアデノウイルス発現ベクターである、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３６】
前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３７】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３８】
前記プロモーターが、低酸素、ＩＦＮ−ガンマ、またはＩＬ−８によって誘導可能である、請求項３７に記載のベクター。
【請求項３９】
前記輸送エレメントが、切断可能なユビキチン、切断不能なユビキチン、ＣＤ１ｂリーダー配列、ＣＤ１ａテール、ＣＤ１ｃテール、およびＬＡＭＰ１膜貫通配列からなる群から選択される、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４０】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列は、同じ患者の腫瘍と適合する正常とを比較することによってフィルタ処理される、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４１】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列が、２００ｎＭ以下のＭＨＣ複合体に対する結合親和性を有するようにフィルタ処理される、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４２】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列が、既知のヒトＳＮＰおよび体細胞多様体に対してフィルタ処理される、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４３】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列は、前記ポリトープが、所定の閾値未満である疎水性配列またはシグナルペプチドの存在の可能性および／または強度を有するように前記ポリトープ内に配置を有する、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４４】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列がＭＨＣ−Ｉに結合し、前記輸送エレメントが前記ポリトープを前記細胞質またはプロテアソームに向ける、請求項３４〜４３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４５】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列がＭＨＣ−Ｉに結合し、前記輸送エレメントが前記ポリトープを前記リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソームまたはリソソームに向ける、請求項３４〜４３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４６】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列がＭＨＣ−ＩＩに結合し、前記輸送エレメントが前記ポリトープを前記リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、またはリソソームに向ける、請求項３４〜４３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４７】
前記組換え核酸が、第２のポリトープをコードする配列をさらに含み、前記第２のポリトープが、前記第２のポリトープを異なる細胞内位置に向ける第２の輸送エレメントを含み、前記第２のポリトープが、第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列を含む、請求項３４〜４６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４８】
前記複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちの少なくともいくつか、および前記第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちのいくつかは、同一である、請求項４７に記載のベクター。
【請求項４９】
前記組換え核酸が、共刺激分子、免疫刺激性サイトカイン、およびチェックポイント阻害に干渉するかまたはこれらを下方制御するタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする配列をさらに含む、請求項３４〜４８のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項５０】
前記共刺激分子が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＴＬ１Ａ、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３からなる群から選択される、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５１】
前記免疫刺激性サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＡＬＴ８０３）、ＩＬ−２１、ＩＰＳ１、およびＬＭＰ１からなる群から選択される、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５２】
干渉する前記タンパク質が、抗体またはＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ１受容体、２Ｂ４またはＣＤ１６０のアンタゴニストである、請求項４９に記載のベクター。
【請求項５３】
前記輸送エレメントが、切断可能なユビキチン、切断不能なユビキチン、ＣＤ１ｂリーダー配列、ＣＤ１ａテール、ＣＤ１ｃテール、およびＬＡＭＰ１膜貫通配列からなる群から選択される、請求項３４に記載のベクター。
【請求項５４】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列は、同じ患者の腫瘍と適合する正常とを比較することによってフィルタ処理される、請求項３４に記載のベクター。
【請求項５５】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列が、２００ｎＭ以下のＭＨＣ複合体に対する結合親和性を有するようにフィルタ処理される、請求項３４に記載のベクター。
【請求項５６】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列が、既知のヒトＳＮＰおよび体細胞多様体に対してフィルタ処理される、請求項３４に記載のベクター。
【請求項５７】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列は、前記ポリトープが、所定の閾値未満である疎水性配列またはシグナルペプチドの存在の可能性および／または強度を有するように前記ポリトープ内に配置を有する、請求項３４に記載のベクター。
【請求項５８】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列がＭＨＣ−Ｉに結合し、前記輸送エレメントが前記ポリトープを前記細胞質またはプロテアソームに向ける、請求項３４に記載のベクター。
【請求項５９】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列がＭＨＣ−Ｉに結合し、前記輸送エレメントが前記ポリトープを前記リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソームまたはリソソームに向ける、請求項３４に記載のベクター。
【請求項６０】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列がＭＨＣ−ＩＩに結合し、前記輸送エレメントが前記ポリトープを前記リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、またはリソソームに向ける、請求項３４に記載のベクター。
【請求項６１】
前記組換え核酸が、第２のポリトープをコードする配列をさらに含み、前記第２のポリトープが、前記第２のポリトープを異なる細胞内位置に向ける第２の輸送エレメントを含み、前記第２のポリトープが、第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列を含む、請求項３４に記載のベクター。
【請求項６２】
前記複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちの少なくともいくつか、および前記第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちのいくつかは、同一である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記組換え核酸が、共刺激分子、免疫刺激性サイトカイン、およびチェックポイント阻害に干渉するかまたはこれらを下方制御するタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする配列をさらに含む、請求項３４に記載のベクター。
【請求項６４】
前記共刺激分子が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＴＬ１Ａ、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３からなる群から選択される、請求項６３に記載のベクター。
【請求項６５】
前記免疫刺激性サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＡＬＴ８０３）、ＩＬ−２１、ＩＰＳ１、およびＬＭＰ１からなる群から選択される、請求項６３に記載のベクター。
【請求項６６】
干渉する前記タンパク質が、抗体またはＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ１受容体、２Ｂ４またはＣＤ１６０のアンタゴニストである、請求項６３に記載のベクター。
【請求項６７】
請求項３４〜５２のいずれか一項に記載のベクターを含む組換えウイルス。
【請求項６８】
前記ウイルスが複製欠損ウイルスである、請求項６７に記載の組換えウイルス。
【請求項６９】
前記ウイルスがアデノウイルスである、請求項６７または６８に記載の組換えウイルス。
【請求項７０】
前記アデノウイルスが欠失Ｅ１およびＥ２ｂ遺伝子を有する、請求項６９に記載の組換えウイルス。
【請求項７１】
請求項５３〜６６のいずれか一項に記載のベクターを含む組換えウイルス。
【請求項７２】
前記ウイルスが複製欠損ウイルスである、請求項７１に記載の組換えウイルス。
【請求項７３】
前記ウイルスがアデノウイルスである、請求項７１に記載の組換えウイルス。
【請求項７４】
前記アデノウイルスが欠失Ｅ１およびＥ２ｂ遺伝子を有する、請求項７１に記載の組換えウイルス。
【請求項７５】
請求項６７に記載の組換えウイルスを含む、医薬組成物。
【請求項７６】
注射または鼻腔内投与用に配合される、請求項７５に記載の医薬組成物。
【請求項７７】
請求項７１に記載の組換えウイルスを含む医薬組成物。
【請求項７８】
注射または鼻腔内投与用に配合される、請求項７７に記載の医薬組成物。
【請求項７９】
癌の治療における、請求項６７に記載の組換えウイルスの使用。
【請求項８０】
癌の治療のための医薬品の製造における、請求項６７に記載の組換えウイルスの使用。
【請求項８１】
癌の治療における、請求項７１に記載の組換えウイルスの使用。
【請求項８２】
癌の治療のための医薬品の製造における、請求項７１に記載の組換えウイルスの使用。
【請求項８３】
個体を治療する方法であって、
前記個体の細胞に組換えウイルスをトランスフェクトすることを含み、
前記組換えウイルスは、前記細胞内において前記ポリトープを発現させるためにプロモーターに作動可能に連結されたポリトープをコードする配列を含み、
前記ポリトープは、細胞質、リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、リソソームおよび細胞外膜からなる群から選択される細胞内の位置に前記ポリトープを向ける輸送エレメントを含むか、または前記輸送エレメントにより前記ポリトープが細胞外空間に向けられており、
前記ポリトープが、複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列を含む、方法。
【請求項８４】
前記組換えウイルスがＥ１およびＥ２ｂ遺伝子の欠失を有するアデノウイルスである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記プロモーターが、低酸素、ＩＦＮ−ガンマ、またはＩＬ−８によって誘導可能である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記輸送エレメントが、切断可能なユビキチン、切断不能なユビキチン、ＣＤ１ｂリーダー配列、ＣＤ１ａテール、ＣＤ１ｃテール、およびＬＡＭＰ１膜貫通配列からなる群から選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８９】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列は、同じ患者の腫瘍と適合する正常とを比較することによってフィルタ処理される、請求項８３に記載の方法。
【請求項９０】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列が、２００ｎＭ以下のＭＨＣ複合体に対する結合親和性を有するようにフィルタ処理される、請求項８３に記載の方法。
【請求項９１】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列が、既知のヒトＳＮＰおよび体細胞多様体に対してフィルタ処理される、請求項８３に記載の方法。
【請求項９２】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列は、前記ポリトープが、所定の閾値未満である疎水性配列またはシグナルペプチドの存在の可能性および／または強度を有するように前記ポリトープ内に配置を有する、請求項８３に記載の方法。
【請求項９３】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列がＭＨＣ−Ｉに結合し、前記輸送エレメントが前記ポリトープを前記細胞質またはプロテアソームに向ける、請求項８３に記載の方法。
【請求項９４】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列がＭＨＣ−Ｉに結合し、前記輸送エレメントが前記ポリトープを前記リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソームまたはリソソームに向ける、請求項８３に記載の方法。
【請求項９５】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列がＭＨＣ−ＩＩに結合し、前記輸送エレメントが前記ポリトープを前記リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、またはリソソームに向ける、請求項８３に記載の方法。
【請求項９６】
前記組換え核酸が、第２のポリトープをコードする配列をさらに含み、前記第２のポリトープが、前記第２のポリトープを異なる細胞内位置に向ける第２の輸送エレメントを含み、前記第２のポリトープが、第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項９７】
前記複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちの少なくともいくつか、および前記第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちのいくつかは、同一である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記個体の別の細胞に第２の組換えウイルスをトランスフェクトするステップをさらに含み、前記ステップでは、前記第２の組換えウイルスは、前記別の細胞において前記第２のポリトープを発現させるためにプロモーターに作動可能に連結された第２のポリトープをコードする第２の配列を含み、前記第２のポリトープが、細胞質、リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、リソソームおよび細胞外膜からなる群から選択される第２の細胞内の位置に前記ポリトープを向ける第２の輸送エレメントを含み、または前記輸送エレメントが、前記ポリトープを細胞外空間に向け、かつ前記細胞内の位置と前記第２の細胞内の位置とが異なり、前記第２のポリトープが、フィルタ処理された第２の複数のネオエピトープを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項９９】
前記複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちの少なくともいくつか、および前記第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちのいくつかは、同一である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記組換えウイルスが、共刺激分子、免疫刺激性サイトカイン、およびチェックポイント阻害に干渉するかまたはこれらを下方制御するタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする配列をさらに含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項１０１】
前記共刺激分子が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＴＬ１Ａ、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３からなる群から選択される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記免疫刺激性サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＡＬＴ８０３）、ＩＬ−２１、ＩＰＳ１、およびＬＭＰ１からなる群から選択される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
干渉する前記タンパク質が、抗体またはＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ１受容体、２Ｂ４またはＣＤ１６０のアンタゴニストである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
個体におけるネオエピトープに対する免疫応答をＣＤ４＋偏向免疫応答に偏らせる方法であって、
前記個体の細胞を組換えウイルスでトランスフェクトすることであって、
前記組換えウイルスは、前記細胞における前記ポリトープを発現させるためにプロモーターに作動可能に連結されたポリトープをコードする配列を含み、前記ポリトープは前記ネオエピトープを含み、
前記ポリトープは、リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、およびリソソームからなる群から選択される細胞内の位置に前記ポリトープを向ける輸送エレメントを含む、トランスフェクトすることと、
前記ポリトープを前記配列から発現させ、輸送させ、かつタンパク質分解プロセシングを行って、ＭＨＣ−ＩＩ複合体上に前記ネオエピトープを提示し、それによってＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激することを含む、方法。
【請求項１０５】
前記ネオエピトープがＭＨＣ−Ｉに結合するように計算される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ネオエピトープがＭＨＣ−ＩＩに結合するように計算される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記輸送エレメントが、ＣＤ１ｂリーダー配列、ＣＤ１ａテール、ＣＤ１ｃテール、およびＬＡＭＰ１膜貫通配列からなる群から選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
前記組換えウイルスが、共刺激分子、免疫刺激性サイトカイン、およびチェックポイント阻害に干渉するかまたはこれらを下方制御するタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする配列をさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０９】
前記共刺激分子が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＴＬ１Ａ、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３からなる群から選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記免疫刺激性サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＡＬＴ８０３）、ＩＬ−２１、ＩＰＳ１、およびＬＭＰ１からなる群から選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
干渉する前記タンパク質が、抗体またはＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ１受容体、２Ｂ４またはＣＤ１６０のアンタゴニストである、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１２】
個体におけるネオエピトープに対する免疫応答をＣＤ８＋偏向免疫応答に偏らせる方法であって、
前記個体の細胞を組換えウイルスでトランスフェクトすることであって、
前記組換えウイルスは、前記細胞における前記ポリトープを発現させるためにプロモーターに作動可能に連結されたポリトープをコードする配列を含み、前記ポリトープは前記ネオエピトープを含み、
前記ポリトープは、前記ポリトープを前記プロテアソームに向ける輸送エレメントを含み、
前記ポリトープを前記配列から発現させ、輸送させ、かつタンパク質分解プロセシングを行って、ＭＨＣ−Ｉ複合体上に前記ネオエピトープを提示し、それによってＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激することを含む、方法。
【請求項１１３】
前記ネオエピトープがＭＨＣ−Ｉに結合するように計算される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ネオエピトープがＭＨＣ−ＩＩに結合するように計算される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１５】
前記輸送エレメントが、ＣＤ１ｂリーダー配列、ＣＤ１ａテール、ＣＤ１ｃテール、およびＬＡＭＰ１膜貫通配列からなる群から選択される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１６】
前記組換えウイルスが、共刺激分子、免疫刺激性サイトカイン、およびチェックポイント阻害に干渉するかまたはこれらを下方制御するタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする配列をさらに含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１７】
前記共刺激分子が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＴＬ１Ａ、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３からなる群から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記免疫刺激性サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＡＬＴ８０３）、ＩＬ−２１、ＩＰＳ１、およびＬＭＰ１からなる群から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
干渉する前記タンパク質が、抗体またはＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ１受容体、２Ｂ４またはＣＤ１６０のアンタゴニストである、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２０】
免疫療法のためのポリトープを生成する方法であって、
複数のネオエピトープ配列を得ることと、
それぞれが前記複数のネオエピトープ配列の別の線状配置を有する、ポリトープ配列のセットを生成することと、
前記ポリトープ配列の各々について、疎水性配列またはシグナルペプチドの存在の可能性および／または強度を表すスコアを計算することと、
前記スコアを使用して前記ポリトープ配列をランク付けし、前記ランクを基準にして、前記複数のネオエピトープ配列の前記線状配置を選択することと、を含む、方法。
【請求項１２１】
前記スコアは、ウェイトマトリックス行列およびニューラルネットワーク予測のうちの少なくとも１つを使用して計算される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記ネオエピトープ配列が、ＭＨＣ結合強度、既知のヒトＳＮＰおよび体細胞多様体のうちの少なくとも１つによってフィルタ処理され、同じ患者の腫瘍と適合する正常とを比較する、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
前記ポリトープ配列の各々が、少なくとも５つのネオエピトープ配列を含む、請求項１２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年３月２５日に出願の米国仮出願シリアル番号第６２／３１３６２１号、２０１６年３月２４日に出願の同第６２／３１２９７４号、および２０１６年３月２８日に出願の同第６２／３１４３６６号を優先し、これらはすべて参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野は、改善されたネオエピトープをベースとした免疫治療剤の組成物および方法であり、特に癌治療のための組換えウイルス治療剤の調製に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景に関する説明には、本発明の理解に有用であり得る情報を含む。本明細書で提供される情報のいずれかが先行技術であるか、もしくは現在請求されている発明と関連していること、または具体的もしくは暗示的に参照されているあらゆる出版物が先行技術であることを認めるものではない。
【０００４】
本明細書中のすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれると示されているのと同じ程度に、参照により組み込まれる。組み込まれた参考文献において用語の定義または使用が矛盾しているか、または本明細書において提供されるその用語の定義に反する場合、本明細書において提供されるその用語の定義が適用され、参考文献におけるその用語の定義は適用されない。
【０００５】
特定の癌に共通する特定の抗原を標的とする癌免疫療法は、一部の患者において顕著な反応をもたらしている。残念なことに、同じ抗原が明らかに発現しているにもかかわらず、多くの患者は、こうした免疫療法に応答しなかった。このように応答しない理由の１つは、免疫系の様々なエフェクター細胞が十分な量で存在していないか、または枯渇している可能性があることが考えられる。さらには、患者間の細胞内抗原プロセシングおよびＨＬＡの可変性により、抗原のプロセシングおよび／または抗原ディスプレイが不十分となり、治療上無効となるか、または応答が乏しい可能性がある。
【０００６】
近年では、免疫療法の標的の選択肢を増やすにあたって、ランダム突然変異が考慮されている。これは、腫瘍細胞におけるいくつかのランダム突然変異により固有の腫瘍特異的抗原（ネオエピトープ）が生じる可能性があるためである。したがって、少なくとも概念的には、ネオエピトープは、免疫療法のための独特の正確な標的となり得る。さらに、細胞溶解性Ｔ細胞応答は、非常に少量のペプチドによって引き起こされ得ることが示されている（例えば、Ｓｙｋｕｌｅｖら,Ｉｍｍｕｎｉｔｙ,第４巻,第６号,ｐ５６５−５７１,１９９６年６月１日）。さらに、多くの癌において突然変異の数が比較的多いために、考えられる標的の数は比較的多い。これらの知見を考慮して、治療標的としての癌ネオエピトープの同定が非常に注目されている。残念ながら、現在のデータは、すべてまたはほとんどすべての癌ネオエピトープが患者および特定の腫瘍に固有のものであり、いずれのネオエピトープが治療上有効な免疫療法剤に有用であり得るかについてのいかなる特定の指示ももたらすものではないことを示唆していると考えられる。
【０００７】
免疫療法の、多数の可能性のある標的に関連する問題の少なくとも一部を克服するために、ネオエピトープは、突然変異のタイプについて突然変異した遺伝子の転写を確認するため（例えば、ミスセンスまたはナンセンス突然変異を明らかにするため）、およびタンパク質の発現を確認するために転写レベルについて、フィルタ処理を行うことができる。さらに、このようにフィルタ処理されたネオエピトープは、国際公開第２０１６／１７２７２２号に記載されているように、患者のＨＬＡ系への特異的結合についてさらに分析することができる。このような系では、比較的多数の潜在的なネオエピトープが都合よく減少するが、治療結果に関するこれらのネオエピトープの有意性は依然として不明である。さらにまた、特に複数のペプチドが抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）において発現するときの、ネオエピトープを生成するための前駆タンパク質のプロセシングは完全には理解されておらず、したがって治療の奏功を予測できない一因となっている。
【０００８】
したがって、ネオエピトープの同定方法、および様々な細胞へのネオエピトープの送達方法が複数、当技術分野で知られているが、それらのすべてまたはほとんどすべてが様々な不利な点を有している。結果として、免疫療法における治療応答の可能性を高めるネオエピトープを選択および産生するための改善された系および方法を有することが望ましいであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の主題は、複数の選択されたネオエピトープを組み合わせて、輸送シグナルを有する合理的に設計されたポリペプチドを形成し、抗原プロセシングおよび提示を増やし、これにより治療効果を最大にする、様々な免疫治療組成物および方法、ならびに特に組換えウイルス発現系に関する。
【００１０】
本発明の主題の一態様では、本発明者らは、免疫療法のための発現ベクターを作製する方法を企図する。好ましい態様では、このような方法は、ポリトープを発現させるためにプロモーターに作動可能に連結されたポリトープをコードする配列を有する組換え核酸を構築するステップを含み、ポリトープは複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列を含む。最も典型的には、ポリトープは、発現させたポリトープを、細胞質、プロテアソーム、リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、リソソームまたは細胞外膜などの特定の細胞内の位置に向けるための１つ以上の輸送エレメントを含む。あるいは、輸送エレメントは、分泌のためにポリトープを細胞外空間に向けることもできる。
【００１１】
最も好ましくは、ウイルス発現ベクターは、Ｅ１およびＥ２ｂ遺伝子の欠失を有するアデノウイルス発現ベクターであり、プロモーターは構成的プロモーターである。あるいは、プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよく、特に腫瘍微小環境において共通である条件下で誘導可能であってもよい。したがって、好適なプロモーターは、低酸素、ＩＦＮ−ガンマ、および／またはＩＬ−８によって誘導可能であり得る。
【００１２】
適切な輸送エレメントについては、すべての輸送エレメントが好適であることが企図されるが、好ましい輸送エレメントとしては、切断可能なユビキチン、切断不能なユビキチン、ＣＤ１ｂリーダー配列、ＣＤ１ａテール、ＣＤ１ｃテール、およびＬＡＭＰ１−膜貫通配列が挙げられる。さらに、フィルタ処理されたネオエピトープ配列は、同じ患者の腫瘍と適合する正常とを比較することによって、ＭＨＣ複合体への結合親和性が２００ｎＭ以下であるという決定によってフィルタ処理され、かつ／またはフィルタ処理されたネオエピトープ配列が既知のヒトＳＮＰおよび体細胞多様体に対してフィルタ処理されることが企図される。
【００１３】
フィルタ処理されたネオエピトープ配列は、ポリトープが、所定の閾値以下である疎水性配列またはシグナルペプチドの存在の可能性および／または強度を有するような配置をポリトープ内に有することがさらに企図される。企図されるフィルタ処理されたネオエピトープ配列は、ＭＨＣ−Ｉに結合し（典型的には２００ｎＭ未満の親和性で）、輸送エレメントがポリトープを細胞質もしくはプロテアソームに向けるか、またはＭＨＣ−Ｉに結合し（典型的には２００ｎＭ未満の親和性で）、輸送エレメントがポリトープをリサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、もしくはリソソームに向けるか、またはＭＨＣ−ＩＩに結合して（典型的には２００ｎＭ未満の親和性で）、輸送エレメントがポリトープをリサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、もしくはリソソームに向けることができる。
【００１４】
さらに企図される態様では、組換え核酸は、第２のポリトープをコードする配列をさらに含んでもよく、第２のポリトープは、第２のポリトープを異なる細胞内の位置に向ける第２の輸送エレメントを含み、第２のポリトープは、第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列を含む（例えば、複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちの少なくともいくつか、および第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちのいくつかは同一である）。
【００１５】
所望であれば、組換え核酸はまた、１つ以上の共刺激分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＴＬ１Ａ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ３）、１つ以上の免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＡＬＴ８０３）、ＩＬ−２１、ＩＰＳ１、およびＬＭＰ１）、ならびに／またはチェックポイント阻害に干渉するか、またはこれらを下方制御する１つ以上のタンパク質（例えば、抗体またはＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ１受容体、２Ｂ４、またはＣＤ１６０のアンタゴニスト）をコードする配列を含んでもよい。
【００１６】
異なる観点から見ると、本発明者らは、ポリトープを発現させるためにプロモーターに作動可能に連結されたポリトープ（例えば、複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列を含む）をコードする配列を含む免疫療法用の組換え発現ベクターも企図している。最も典型的には、ポリトープは、ポリトープを細胞内の位置（例えば、細胞質、リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、リソソーム、細胞外膜）に向ける輸送エレメントを含むか、または輸送エレメントは、ポリトープを分泌するために細胞外空間にポリトープを向ける。
【００１７】
好ましい組換え発現ベクターは、特にＥ１およびＥ２ｂ遺伝子の欠失を有するアデノウイルス発現ベクターである。このような発現ベクターおよび他の発現ベクターは、構成的プロモーターまたは（好ましくは低酸素、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−８によって誘導される）誘導性プロモーターを有し得る。上記のとおり、輸送エレメントは、切断可能なユビキチン、切断不能なユビキチン、ＣＤ１ｂリーダー配列、ＣＤ１ａテール、ＣＤ１ｃテールおよび／またはＬＡＭＰ１膜貫通配列であることが企図される。
【００１８】
フィルタ処理されたネオエピトープ配列に関しては、同一の患者の腫瘍と適合する正常とを比較することによってその配列がフィルタ処理され、ＭＨＣ複合体への結合親和性が２００ｎＭ以下を有するようにフィルタ処理されるか、かつ／または既知のヒトＳＮＰおよび体細胞多様体に対してフィルタ処理されることが企図される。さらに、フィルタ処理されたネオエピトープ配列は、好ましくは、所定の閾値未満であり、これによりポリトープの誤った方向付けが回避されるような、疎水性配列またはシグナルペプチドの存在の可能性および／または強度をポリトープが有するような配置をポリトープ内に有する。
【００１９】
例えば、フィルタ処理されたネオエピトープ配列は、ＭＨＣ−Ｉに結合し（典型的には２００ｎＭ未満の親和性で）、輸送エレメントがポリトープを細胞質もしくはプロテアソームに向けるか、またはフィルタ処理されたネオエピトープ配列は、ＭＨＣ−Ｉに結合し（典型的には２００ｎＭ未満の親和性で）、輸送エレメントがポリトープをリサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、もしくはリソソームに向けるか、またはフィルタ処理されたネオエピトープ配列は、ＭＨＣ−ＩＩに結合して（典型的には２００ｎＭ未満の親和性で）、輸送エレメントがポリトープをリサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、もしくはリソソームに向けることができる。
【００２０】
さらに、組換え核酸は、第２のポリトープをコードする配列をさらに含み得、第２のポリトープは、第２のポリトープを異なる細胞内の位置に向ける第２の輸送エレメントを含み、第２のポリトープは、第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列を含むことが企図される。例えば、複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちの少なくともいくつかと、第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちのいくつかは、同一である。所望であれば、組換え核酸は、１つ以上の共刺激分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＴＬ１Ａ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ３）、１つ以上の免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＡＬＴ８０３）、ＩＬ−２１、ＩＰＳ１、およびＬＭＰ１）、ならびに／またはチェックポイント阻害に干渉するか、またはこれらを下方制御する１つ以上のタンパク質（例えば、抗体またはＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ１受容体、２Ｂ４、またはＣＤ１６０のアンタゴニスト）をコードする配列をさらに含んでもよい。
【００２１】
したがって、本発明者らはまた、本明細書に記載の組換えベクターを含む組換えウイルスを企図する。最も典型的には、ウイルスは複製欠損ウイルス（例えば、好ましくはＥ１およびＥ２ｂ遺伝子の欠失を有するアデノウイルス）である。このようなウイルスは、その後、典型的には、注射または鼻腔内投与用に配合される医薬組成物中に含まれ得る。本発明の主題に限定されるものではないが、このような組換えウイルスは、癌の治療および／または癌の治療のための医薬品の製造に使用され得る。
【００２２】
結果として、本発明者らは、個体の細胞に組換えウイルスをトランスフェクトするステップを典型的に含む、個体を治療する方法も企図しており、このステップでは、組換えウイルスは、細胞内においてポリトープを発現させるためにプロモーターに作動可能に連結されたポリトープをコードする配列を含む。ポリトープは、細胞質、リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、リソソームおよび細胞外膜からなる群から選択される細胞内の位置にポリトープを向ける輸送エレメントを含むか、または輸送エレメントによりポリトープが細胞外空間に向けられる。最も典型的には、このような方法におけるポリトープは、複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列を含む。
【００２３】
組換えウイルス、プロモーター、輸送エレメント、およびフィルタ処理されたネオエピトープ配列に関しては、上記と同じ考慮が適用される。上記のとおり、組換え核酸は、第２のポリトープをコードする配列をさらに含み得、第２のポリトープは、第２のポリトープを異なる細胞内の位置に向ける第２の輸送エレメントを含み、第２のポリトープは、第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列を含むことが企図される。
【００２４】
さらに企図される方法では、個体の別の細胞に第２の組換えウイルスをトランスフェクトするステップが含まれてもよく、このステップでは、第２の組換えウイルスは、別の細胞において第２のポリトープを発現させるためにプロモーターに作動可能に連結された第２のポリトープをコードする第２の配列を含み、第２のポリトープが、細胞質、リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、リソソームおよび細胞外膜からなる群から選択される第２の細胞内の位置にポリトープを向ける第２の輸送エレメントを含み、または輸送エレメントが、ポリトープを細胞外空間に向け、かつ細胞内の位置と第２の細胞内の位置とが異なり、第２のポリトープが、フィルタ処理された第２の複数のネオエピトープを含む。例えば、複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちの少なくともいくつかと、第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちのいくつかは、同一であってもよい。
【００２５】
このような方法における企図された組換えウイルスは、１つ以上の共刺激分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＴＬ１Ａ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ３）、１つ以上の免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＡＬＴ８０３）、ＩＬ−２１、ＩＰＳ１、およびＬＭＰ１）、ならびに／またはチェックポイント阻害に干渉するか、またはこれらを下方制御する１つ以上のタンパク質（例えば、抗体またはＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ１受容体、２Ｂ４、またはＣＤ１６０のアンタゴニスト）をコードする配列をさらに含んでもよい。
【００２６】
さらに別の観点から見ると、本発明者らは、個体のネオエピトープに対する免疫応答をＣＤ４＋偏向免疫応答に偏らせる方法を企図している。このような方法は、典型的には、個体の細胞に組換えウイルスをトランスフェクトするステップを含み、この方法では、組換えウイルスは、細胞内においてポリトープを発現させるためにプロモーターに作動可能に連結されたポリトープをコードする配列を含み、ポリトープは、ネオエピトープを含む。最も典型的には、ポリトープは、リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、およびリソソームからなる群から選択される細胞内の位置にポリトープを向ける輸送エレメントを含む。さらなるステップでは、ポリトープを配列から発現させ、輸送し、タンパク質分解により処理して、ＭＨＣ−ＩＩ複合体上にネオエピトープを提示し、これによってＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激する。
【００２７】
好適なネオエピトープは、（典型的には２００ｎＭ未満の親和性で）ＭＨＣ−Ｉに結合するか、またはＭＨＣ−ＩＩに結合するように（典型的には２００ｎＭ未満の親和性で）計算されてもよく、および／または好適な輸送エレメントはＣＤ１ｂリーダー配列、ＣＤ１ａテール、ＣＤ１ｃテール、およびＬＡＭＰ１−膜貫通配列を含む。上記のように、組換えウイルスは、共刺激分子、免疫刺激性サイトカイン、およびチェックポイント阻害に干渉するか、またはこれらを下方制御するタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする配列をさらに含み得る。
【００２８】
同様に、本発明者らはまた、個体のネオエピトープに対する免疫応答をＣＤ８＋偏向免疫応答に偏らせる方法を企図する。このような方法は、典型的には、個体の細胞に組換えウイルスをトランスフェクトするステップを含み、この方法では、組換えウイルスは、細胞内においてポリトープを発現させるためにプロモーターに作動可能に連結されたポリトープをコードする配列を含み、ポリトープは、ネオエピトープを含む。最も典型的には、ポリトープはポリトープをプロテアソームに向ける輸送エレメントを含む。さらなるステップでは、ポリトープを配列から発現させ、輸送し、タンパク質分解により処理して、ネオエピトープをＭＨＣ−Ｉ複合体に提示させ、それによってＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激する。
【００２９】
好適なネオエピトープは、（典型的には２００ｎＭ未満の親和性で）ＭＨＣ−Ｉに結合するか、またはＭＨＣ−ＩＩに結合するように（典型的には２００ｎＭ未満の親和性で）計算されてもよく、および／または好適な輸送エレメントはＣＤ１ｂリーダー配列、ＣＤ１ａテール、ＣＤ１ｃテール、およびＬＡＭＰ１−膜貫通配列を含む。上記のように、組換えウイルスは、共刺激分子、免疫刺激性サイトカイン、およびチェックポイント阻害に干渉するか、またはこれらを下方制御するタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする配列をさらに含み得る。
【００３０】
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、免疫療法のためのポリトープを生成する方法を企図する。このような方法は、好ましくは、複数のネオエピトープ配列を取得するステップと、ポリトープ配列のセットを生成するステップであって、それぞれが複数のネオエピトープ配列の別の線状配置を有するステップと、を含む。別のステップでは、ポリトープ配列の各々について、疎水性配列またはシグナルペプチドの存在の可能性および／または強度を表すスコアが計算され、さらに別のステップでは、このスコアを使用して、ポリトープ配列のランク付けを行う。次に、このランクに基づいて、複数のネオエピトープ配列の線状配置が選択される。
【００３１】
最も好ましくは、スコアは、ウェイト行列およびニューラルネットワーク予測の少なくとも１つを用いて計算され、かつ／またはネオエピトープ配列は、ＭＨＣ結合強度、既知のヒトＳＮＰおよび体細胞多様体の少なくとも１つによって、かつ同じ患者の腫瘍と適合する正常とを比較することによってフィルタ処理される。典型的には、ポリトープ配列の各々は、少なくとも５つのネオエピトープ配列を含む。
【００３２】
本発明の主題の様々な目的、特徴、態様および利点は、同様の数字が同様の構成要素を表す添付の図面とともに、以下の好ましい実施形態の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】様々なネオエピトープ配列を示す略図である。
【図２】ネオエピトープの好ましい配置を選択するための例示的な部分概略図である。
【図３】先行技術の細胞質およびＭＨＣ−Ｉ提示における抗原プロセシングを示す概略図である。
【図４】先行技術のリソソームおよびエンドソーム区画およびＭＨＣ−ＩＩ提示における抗原プロセシングを示す概略図である。
【図５】Ａ−Ｃ。細胞質およびＭＨＣ−Ｉ提示におけるクラスＩ抗原プロセシングのための例示的な配列配置を示す図である。
【図６】Ａ−Ｃ。細胞質およびＭＨＣ−ＩＩ提示におけるクラスＩ抗原プロセシングのための例示的な配列の配置を示す図である。
【図７】Ａ−Ｃ。細胞質およびＭＨＣ−ＩＩ提示におけるクラスＩＩ抗原プロセシングのための例示的な配列の配置を示す図である。
【図８】Ｂ１６〜Ｆ１０メラノーマの例示的な予防的ワクチン接種スケジュールを示す図である。
【図９】Ａ−Ｃ。ワクチンの皮下注射を用いた抗腫瘍ワクチン接種の例示的な結果を示すグラフである。
【図１０】Ａ−Ｃ。ワクチンの静脈注射を用いた抗腫瘍ワクチン接種の例示的な結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明者らは、ネオエピトープベースの免疫療法は、発現された患者特異的および腫瘍特異的ネオエピトープをプロセシングおよび／または特異的細胞表面提示または分泌に向けて標的化することによってさらに改善され得ること、ならびにチェックポイント阻害、サイトカインを介した免疫刺激、および／または骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＣＳ）、Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）、またはＭ２マクロファージのインヒビターを用いてネオエピトープベースの療法をさらに増強させ得ることを見出した。最も好ましくは、このような治療構成要素は、組換え核酸からインビボで発現され、特に好適な組換え核酸には、プラスミドおよびウイルス核酸が含まれる。ウイルス核酸が使用される場合、核酸は、ウイルスによる患者または患者細胞の感染を介して送達されることが特に好ましい。
【００３５】
異なる観点から見ると、本明細書に提示される組成物および方法は、標的治療を可能にするために、患者および患者の腫瘍に特異的な１つ以上のネオエピトープを含むことを理解されたい。さらに、このような治療は、ＣＤ４＋偏向免疫応答、ＣＤ８＋偏向免疫応答、抗体偏向免疫応答、および／または刺激免疫応答（例えば、チェックポイント阻害の減少および／またはサイトカインを用いた免疫コンピテントセルの活性化による）など、１つ以上の特異的免疫反応を達成するために、有利にも調整され得る。最も典型的には、このような効果は、組換え核酸に由来するネオエピトープの状況において達成される。
【００３６】
ネオエピトープは、固有の腫瘍特異的抗原が作り出されている腫瘍細胞において発現したランダム突然変異として特徴付けられ得る。したがって、異なる観点から見ると、ネオエピトープは、突然変異（例えば、非センス、ミスセンス、フレームシフトなど）のタイプ（例えば、欠失、挿入、トランスバージョン、トランジション、トランスロケーション）および影響を考慮することによって同定され得る。したがって、これらは、サイレント突然変異および他の関連性のない（例えば、非発現の）突然変異が排除されるコンテンツフィルタとして機能し得る。また、ネオエピトープ配列は、比較的短い長さ（例えば、８〜１２ｍｅｒまたは１４〜２０ｍｅｒ）の配列ストレッチとして定義することができ、こうしたストレッチは、アミノ酸配列の変化（複数可）を含むと理解されるべきである。必須ではないが、最も典型的には、変化したアミノ酸は中心アミノ酸位置またはその近くにある。例えば、典型的なネオエピトープは、Ａ４−Ｎ−Ａ４またはＡ３−Ｎ−Ａ５、またはＡ２−Ｎ−Ａ７、またはＡ５−Ｎ−Ａ３、またはＡ７−Ｎ−Ａ２の構造を有することができ、Ａは、タンパク質を構成する（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ）野生型アミノ酸または正常（すなわち、同じ患者の対応する健常組織由来の）アミノ酸であり、Ｎは変化したアミノ酸である（野生型または適合する正常と比較して）。したがって、本明細書で企図されるネオエピトープ配列は、比較的短い長さ（例えば、５〜３０ｍｅｒ、より典型的には８〜１２ｍｅｒ、または１４〜２０ｍｅｒ）の配列ストレッチを含み、こうした配列ストレッチには、アミノ酸配列の変化（複数可）が含まれている。所望の場合には、追加のアミノ酸は、例えば、細胞の種々の区画における追加の抗原プロセシング（例えば、細胞質ゾルにおけるプロテアソームプロセシング、またはエンドソームおよび／またはリソソーム区画における特異的プロテアーゼプロセシング）を可能にするために、変化したアミノ酸の上流または下流に置かれてもよい。
【００３７】
したがって、変化したアミノ酸の位置に応じて、変化したアミノ酸を含む多数のネオエピトープ配列に単一のアミノ酸変化が提示され得ることを理解されたい。有利なことに、このような配列の可変性により、複数の選択肢のネオエピトープが可能になり、したがって、１つ以上の望ましい形質（例えば、患者ＨＬＡ型に対する最も高い親和性、最も高い構造安定性など）を基準にして選択することができる有用であり得る標的の数を増やすことができる。最も典型的には、ネオエピトープは、２〜５０個のアミノ酸、より典型的には５〜３０個のアミノ酸、最も典型的には８〜１２個のアミノ酸または１４〜２０個のアミノ酸の長さを有すると計算され、変化したアミノ酸は、好ましくは、中央に位置するか、またはそうでなければＭＨＣへの結合を改善する様式で置かれる。例えば、エピトープがＭＨＣ−Ｉ複合体によって提示される場合、典型的なネオエピトープ長は約８〜１２個のアミノ酸であるが、ＭＨＣ−ＩＩ複合体を介して提示するための典型的なネオエピトープ長は約１４〜２０個のアミノ酸長を有する。容易に理解されるように、ネオエピトープにおける変化したアミノ酸の位置は中央以外であってもよいため、実際のペプチド配列およびそのネオエピトープの実際のトポロジーでは、かなり変動剃る可能性があり、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの提示に対する所望の結合親和性を有するネオエピトープ配列および／または所望のプロテアーゼプロセシングには、典型的には特定の配列を要求する。
【００３８】
当然のことながら、ネオエピトープの同定または発見は、生検、凍結または他の方法で保存された新鮮な組織または細胞サンプル、循環腫瘍細胞、エキソソーム、様々な体液（および特に血液）などの様々な生体物質から出発し得ることを理解されたい。したがって、好適なオミックス分析方法としては、核酸シーケンシング、特にＤＮＡ上で操作するＮＧＳ法（例えば、イルミナシーケンシング、イオントレントシーケンシング、４５４パイロシーケンシング、ナノポアシーケンシングなど）、ＲＮＡシーケンシング（例えば、ＲＮＡｓｅｑ、逆転写ベースのシーケンシング）、場合によっては、タンパク質シーケンシング、または質量分析ベースのシーケンシング（例えば、ＳＲＭ、ＭＲＭ、ＣＲＭなど）が挙げられる。
【００３９】
したがって、特に核酸ベースのシーケンシングの場合、腫瘍組織のハイスループットゲノムシーケンシングにより、ネオエピトープの迅速な同定が可能になることは、特に認識されているべきである。しかし、このようにして得られた配列情報を標準的な参照と比較させると、同様に通常患者内に生じる変異（例えば、ＳＮＰ、短いｉｎｄｅｌ、異なるリピート数などに起因する）ならびにヘテロ接合性が、比較的多数の潜在的な偽陽性ネオエピトープをもたらすことを理解されたい。特に、このような不正確さは、患者の腫瘍サンプルが同じ患者の適合する正常（すなわち、非腫瘍）サンプルと比較される場合には、排除され得る。
【００４０】
本発明の主題の１つの特に好ましい態様では、ＤＮＡ分析は、腫瘍および適合する正常サンプルの両方の全ゲノム配列決定および／またはエクソームシーケンシングにより（典型的には少なくとも１０倍、より典型的には少なくとも２０倍のカバレッジ深度にて）実施される。あるいは、ＤＮＡデータは、同じ患者の以前の配列決定から既に確立されている配列記録（例えば、ＳＡＭ、ＢＡＭ、ＦＡＳＴＡ、ＦＡＳＴＱ、またはＶＣＦファイル）から提供されてもよい。したがって、本明細書での使用に好適であるデータセットとしては、未処理データセットまたは処理済みデータセットが挙げられ、例示的な好ましいデータセットとしては、ＢＡＭフォーマット、ＳＡＭフォーマット、ＧＡＲフォーマット、ＦＡＳＴＱフォーマット、またはＦＡＳＴＡフォーマット、ならびにＢＡＭＢＡＭ、ＳＡＭＢＡＭおよびＶＣＦデータセットを有するデータセットが挙げられる。しかし、米国特許明細書第２０１２／００５９６７０（Ａ１）号および同第２０１２／００６６００１（Ａ１）号に記載されているように、データセットがＢＡＭフォーマットで、またはＢＡＭＢＡＭ  ｄｉｆｆオブジェクトとして提供されることが特に好ましい。さらに、データセットは、同じ患者の腫瘍および適合する正常サンプルを反映していることに留意すべきである。したがって、腫瘍を生じさせない遺伝的生殖系列の改変（例えば、サイレント突然変異 、ＳＮＰなど）は排除することができる。もちろん、腫瘍サンプルは、初期腫瘍由来、治療開始時での腫瘍由来、再発腫瘍および／または転移部位由来などであってもよいことが認識されているべきである。ほとんどの場合、患者の適合する正常サンプルは、血液、または腫瘍と同じ組織型の非罹患組織である。
【００４１】
同様に、配列データのコンピュータ解析は、多数の様式で実施することができる。しかし、最も好ましい方法では、解析は、例えば、米国特許明細書第２０１２／００５９６７０号および同第２００２／００６６００１号に開示されているように、ＢＡＭファイルおよびＢＡＭサーバを用いて、腫瘍および正常サンプルの位置誘導同期アライメント（ｌｏｃａｔｉｏｎ−ｇｕｉｄｅｄ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ）によって、インシリコで実施される。このような解析では、有利にも、偽陽性ネオエピトープを減少させ、記憶および計算資源に対する要求が著しく低下している。
【００４２】
いかなるコンピュータ向け言語もサーバ、インタフェース、システム、データベース、エージェント、ピア、エンジン、コントローラ、または個別にもしくはまとめて動作する他のタイプのコンピューティングデバイスなど、コンピューティングデバイスの任意の好適な組み合わせを含むように読み込む必要があることに留意されたい。コンピューティングデバイスは、有形の非一時的なコンピュータ可読記憶媒体（例えば、ハードドライブ、ソリッドステートドライブ、ＲＡＭ、フラッシュ、ＲＯＭなど）に記憶されたソフトウェア命令を実行するように構成されたプロセッサを備えることを理解されたい。ソフトウェア命令は、開示された装置に関して以下に説明するように、役割、責任、または他の機能を提供するようにコンピューティングデバイスを構成することが好ましい。さらに、開示された技術は、プロセッサにコンピュータベースのアルゴリズム、プロセス、方法、またはその他の命令の実施に関連する開示されたステップを実行させるソフトウェア命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体を備えるコンピュータプログラム製品として実装することができる。特に好ましい実施形態では、標準化プロトコルまたはアルゴリズムを使用している様々なサーバ、システム、データベース、インタフェース交換データは、可能であればＨＴＴＰ、ＨＴＴＰＳ、ＡＥＳ、公衆−秘密鍵交換、ウェブサービスＡＰＩ、既知の金融取引プロトコル、または他の電子情報交換法に基づく。デバイス間のデータ交換は、パケット交換ネットワーク、インターネット、ＬＡＮ、ＷＡＮ、ＶＰＮ、または他のタイプのパケット交換ネットワーク、回線交換ネットワーク、セル交換ネットワーク、または他のタイプのネットワークを介して行うことができる。
【００４３】
異なる観点から見ると、所定の長さ、例えば５〜２５個のアミノ酸を有し、少なくとも１つの変化したアミノ酸を含むネオエピトープをコードする患者特異的および癌特異的配列のインシリココレクションを確立することができる。各変化したアミノ酸のこうしたコレクションは、典型的には、各変化したアミノ酸の位置が同一でない少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのメンバーを含む。このようなコレクションは、有利には、免疫療法に好適である潜在的候補分子を増加させ、その後、以下により詳細に記載するように、さらに（例えば、細胞内の位置、転写／発現レベル、ＭＨＣ−Ｉおよび／またはＩＩ親和性などにより）フィルタ処理するために使用され得る。
【００４４】
例えば、本発明者らは、腫瘍および適合する正常配列データに対する同期位置誘導解析を使用して、以下の癌の種類などの様々な癌および患者由来の様々な癌性ネオエピトープをこれまでに同定した：ＢＬＣＡ、ＢＲＣＡ、ＣＥＳＣ、ＣＯＡＤ、ＤＬＢＣ、ＧＢＭ、ＨＮＳＣ、ＫＩＣＨ、ＫＩＲＣ、ＫＩＲＰ、ＬＡＭＬ、ＬＧＧ、ＬＩＨＣ、ＬＵＡＤ、ＬＵＳＣ、ＯＶ、ＰＲＡＤ、ＲＥＡＤ、ＳＡＲＣ、ＳＫＣＭ、ＳＴＡＤ、ＴＨＣＡ、およびＵＣＥＣ。これらの癌の例示的なネオエピトープデータは、本明細書中に参照によって援用される国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／２９２４４に見出すことができる。
【００４５】
癌の種類および段階、ならびに患者の免疫状態に応じて、同定されたネオエピトープのすべてが、必ずしも患者において治療上同等に有効な反応を導くわけではないことが認識されているべきである。実際、当技術分野では、わずかなネオエピトープのみが免疫応答を生じることは周知である。治療的に望ましい応答の可能性を高めるために、最初に同定されたネオエピトープをさらにフィルタ処理することができる。当然のことながら、下流分析では、本明細書に提示される方法の目的のためにサイレント突然変異を考慮する必要はないことを理解されたい。しかし、好ましい突然変異分析では、特定のタイプの突然変異（例えば、欠失、挿入、トランスバージョン、トランジション、トランスロケーション）に加えて、突然変異（例えば、非センス、ミスセンスなど）の影響に関する情報ももたらされ、それ自体は、サイレント突然変異が除去される第１のコンテンツフィルタとして機能し得る。例えば、ネオエピトープは、突然変異がフレームシフト、非センスおよび／またはミスセンス突然変異であるさらなる考察のために選択することができる。
【００４６】
さらなるフィルタ処理アプローチにおいて、ネオエピトープは、細胞内の位置パラメータについての詳細な分析の対象となり得る。例えば、ネオエピトープが、膜関連位置を有するものとして同定される場合（例えば、細胞の細胞膜の外側に位置する場合）、および／またはインシリコ構造計算によって、ネオエピトープが溶媒に暴露される可能性があることを確認するか、もしくは構造的に安定なエピトープを提示する（例えば、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０１４）場合などは、ネオエピトープ配列がさらなる考察のために選択され得る。
【００４７】
ネオエピトープのフィルタ処理について、ネオエピトープは、オミクス（または他の）分析において、ネオエピトープを実際に発現させることが明らかである本明細書での使用に特に好適であると一般に考えられている。ネオエピトープの発現および発現レベルの同定は、当技術分野で公知のあらゆる様式で実施することができ、好ましい方法としては、定量的ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡまたはｍＲＮＡ）分析および／または定量的プロテオミクス分析が挙げられる。最も典型的には、ネオエピトープを含むための閾値レベルは、対応する適合する正常配列の発現レベルの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％の発現レベルであり、したがって、（ネオ）エピトープは、確実に、免疫系にとって少なくとも潜在的に「認識」できる。結果として、オミクス分析はまた、遺伝子発現分析（トランスクリプトーム解析）も含み、突然変異を有する遺伝子の発現レベルを同定するのを補助することが一般に好ましい。
【００４８】
多くのトランスクリプトーム分析方法が当技術分野で公知であり、既知の方法のすべてが本明細書での使用に適していると考えられる。例えば、好ましい物質としては、ｍＲＮＡおよび一次転写物（ｈｎＲＮＡ）が挙げられ、ＲＮＡ配列情報は、同じ患者の腫瘍サンプルおよび適合する正常（健康）サンプルから順に得られる逆転写ポリＡ＋−ＲＮＡから得ることができる。同様に、ポリＡ＋−ＲＮＡはトランスクリプトームの表現として典型的には好ましいが、ＲＮＡの他の形態（ｈｎ−ＲＮＡ、非ポリアデニル化ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）も本明細書での使用に好適であると考えられることに留意されたい。好ましい方法としては、定量的ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡまたはｍＲＮＡ）分析および／または定量的プロテオミクス分析、特にＲＮＡｓｅｑなどの分析が挙げられる。他の態様では、ＲＮＡｓｅｑ、ｑＰＣＲおよび／またはｒｔＰＣＲをベースとした方法を用いてＲＮＡ定量および配列決定が行われるが、様々な代替方法（例えば、固相ハイブリダイゼーションをベースとした方法）もまた好適であると考えられる。別の観点から見ると、トランスクリプトーム解析は、（単独で、またはゲノム分析と組み合わせて）、癌および患者特異的突然変異を有する遺伝子を同定および定量するために好適であり得る。
【００４９】
同様に、プロテオミクス分析は、ネオエピトープのＲＮＡの実際の翻訳を確認するために多数の様式で実施することができ、プロテオミクス分析のすべての既知の様式が本明細書において企図される。しかし、特に好ましいプロテオミクス法としては、抗体をベースとした方法および質量分析法が挙げられる。さらに、プロテオミクス分析は、タンパク質そのものに関する定性的または定量的情報を提供し得るのみでなく、タンパク質が触媒活性または他の機能的活性を有するタンパク質活性データも含み得ることに留意すべきである。プロテオミクス分析を実施するための１つの例示的な技術は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許明細書第７４７３５３２号に記載されている。タンパク質発現の同定およびさらには定量化のためのさらに好適な方法としては、種々の質量分析（例えば、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）および連続的反応モニタリング（ＣＲＭ））が挙げられる。結果として、上記の方法は、ネオエピトープを含むタンパク質の細胞内の位置（例えば、膜の位置）、発現強度（例えば、同じ患者の適合する正常と比較して過剰発現している）によってさらにフィルタ処理され得る、患者および腫瘍特異的ネオエピトープを提供することを理解されたい。
【００５０】
フィルタ処理のさらに別の態様では、ネオエピトープは、（例えば、患者または患者コレクションの）既知のヒト配列を含むデータベースと比較してもよく、これによりこうしたヒト同一配列の使用を避けることができるようになる。さらに、フィルタ処理は、ＳＮＰが腫瘍および適合する正常配列の両方に存在する患者におけるＳＮＰが原因で、ネオエピトープ配列が除去されることを含むこともできる。例えば、ｄｂＳＮＰ（Ｔｈｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  Ｄａｔａｂａｓｅ）は、国立ヒトゲノム研究所（ＮＨＧＲＩ）と協力して国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって開発され運営されている様々な生物種間内の遺伝的多様体のための無料の公開アーカイブである。データベース名は、多型の１つのクラス（一塩基多型（ＳＮＰ））のコレクションを意味するが、実際には、（１）ＳＮＰ、（２）短い欠失および挿入多型（ｉｎｄｅｌ／ＤＩＰ）、（３）マイクロサテライトマーカーまたは短いタンデムリピート（ＳＴＲ）、（４）多ヌクレオチド多型（ＭＮＰ）、（５）ヘテロ接合配列、および（６）名前の付けられた多様体の広い範囲の分子多様体を含む。ｄｂＳＮＰは、実際には、中性の多型、既知の表現型に対応する多型、および変異のない領域を受け入れる。上記のようなデータベースおよび他のフィルタ処理オプションを使用して、患者および腫瘍特異的ネオエピトープをフィルタ処理することで、それらの既知の配列を除去し、実質的に減少している偽陽性を有する複数のネオエピトープ配列を有する配列セットを得ることができる。
【００５１】
ネオエピトープに対する所望のレベルのフィルタ処理（例えば、腫瘍対正常、および／または発現レベル、および／または細胞内の位置、および／または患者特異的ＨＬＡ適合、および／または既知の多様体によりフィルタ処理されたネオエピトープ）が達成されると、ネオエピトープによって影響される遺伝子型を考慮したさらなるフィルタ処理ステップが企図される。例えば、好適な遺伝子型としては、癌ドライバー遺伝子、細胞分裂調節に関連する遺伝子、アポトーシス関連遺伝子、およびシグナルトランスダクション関連遺伝子が挙げられる。しかし、特に好ましい態様では、癌ドライバー遺伝子が特に好ましい（これは、受容体遺伝子、シグナルトランスダクション遺伝子、転写調節遺伝子などの様々な遺伝子型の機能を含み得る）。さらに企図される態様では、好適な遺伝子型は、既知のパッセンジャー遺伝子および代謝に関与する遺伝子であってもよい。
【００５２】
遺伝子を癌ドライバー遺伝子として同定すること、または他の決定（例えば、予測）を行うことについては、様々な方法および予測アルゴリズムが当該分野で公知であり、本明細書での使用に好適であると考えられている。例えば、好適なアルゴリズムとしては、ＭｕｔｓｉｇＣＶ（Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４，５０５（７４８４）：４９５−５０１）、ＡｃｔｉｖｅＤｒｉｖｅｒ（Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  ２０１３，９：６３７）、ＭｕＳｉＣ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２０１２，２２（８）：１５８９−１５９８）、ＯｎｃｏｄｒｉｖｅＣｌｕｓｔ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０１３，２９（１８）：２２３８−２２４４）、ＯｎｃｏｄｒｉｖｅＦＭＬ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ２０１６，１７（１）：１２８）、Ｔｕｍｏｒ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ａｎｄ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ（ＴＵＳＯＮ）（Ｃｅｌｌ  ２０１３，１５５（４）：９４８−９６２）、２０／２０＋（https://github.com/KarchinLab/2020plus）、およびｏｎｃｏｄｒｉｖｅＲＯＬＥ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１４）３０（１７）：ｉ５４９−ｉ５５５）が挙げられる。あるいは、またはそれに加えて、癌ドライバー遺伝子の同定には、既知の癌ドライバー遺伝子の様々な供給源およびこれらの特定の癌との関連を用いることもできる。例えば、ドライバー突然変異のＩｎｔｏｇｅｎカタログ（２０１６．５；ＵＲＬ：www.intogen.org）には、２８の腫瘍型の膵癌コホートの６，７９２個のエキソームにわたってＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｅｒによって行われたドライバー分析の結果が含まれている。
【００５３】
それでも、フィルタ処理が行われたとしても、すべてのネオエピトープが免疫系にとって認識できるようになるわけではない。これは、例えば、ポリトープ内など、ある広義の状況下にあり、患者のＭＨＣ複合体上に提示される場合には、ネオエピトープも処理する必要があるためである。この状況では、全ネオエピトープの一部のみが提示のために十分な親和性を有することが理解されなければならない。したがって、特に免疫療法の状況において、ネオエピトープが適切に処理され、ＭＨＣ複合体に結合され、かつ提示される場合、ネオエピトープがより効果的である可能性があることは明らかである。別の観点から見ると、治療の成功は、ＭＨＣ複合体を介して提示され得るネオエピトープの数が増加するにつれて増し、このようなネオエピトープは、患者のＨＬＡ型に対して最低限の親和性を有する。したがって、効果的な結合および提示は、ネオエピプトープの配列と患者の特定のＨＬＡ型とを組み合わせた機能であることを理解されたい。したがって、典型的には、患者組織のＨＬＡ型の決定が必要である。最も典型的には、ＨＬＡ型の決定としては、少なくとも３つのＭＨＣ−Ｉサブタイプ（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ）、および少なくとも３つのＭＨＣ−ＩＩサブタイプ（例えば、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ）が挙げられ、好ましくは各サブタイプは少なくとも２桁または少なくとも４桁の深さまで決定される。しかし、より深い深さ（例えば、６桁、８桁）も企図される。
【００５４】
患者のＨＬＡ型が確認されると（既知の化学またはインシリコの決定を使用して）、ＨＬＡ型の構造解がデータベースから計算され、かつ／またはデータベースから得られ、次いでこれがインシリコのドッキングモデルで使用され、（典型的にはフィルタ処理された）ネオエピトープのＨＬＡ構造解までの結合親和性を決定する。以下にさらに論じるように、結合親和性を決定するための好適なシステムとしては、ＮｅｔＭＨＣプラットフォームが挙げられる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００８年７月１日；３６（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５０９−Ｗ５１２を参照されたい）。予め決定されたＨＬＡ型に対して高親和性（例えば、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満）を有するネオエピトープが、患者のＭＨＣ−Ｉ／ＩＩサブタイプに関する知識と共に、治療創出のために選択される。
【００５５】
ＨＬＡの決定は、当該技術分野において周知の湿式化学における種々の方法を用いて行うことができ、これらの方法のすべては、本明細書での使用に好適であると考えられる。しかし、特に好ましい方法では、ＨＬＡ型は、既知および／または共通のＨＬＡ型の大部分またはすべてを含む参照配列を用いて、インシリコのオミクスデータから予測することもできる。例えば、本発明の主題による１つの好ましい方法では、染色体６ｐ２１．３（またはＨＬＡ対立遺伝子が発見される場所に近い他の任意の場所／その場所）にマッピングする比較的多数の患者配列のリードがデータベースまたはシーケンシング装置によって提供される。最も典型的には、配列のリードは約１００〜３００塩基の長さを有し、リード品質、アライメント情報、配向、位置などのメタデータを含む。例えば、好適なフォーマットとしては、ＳＡＭ、ＢＡＭ、ＦＡＳＴＡ、ＧＡＲなどが挙げられる。本発明の主題に限定されるものではないが、患者配列のリードが、少なくとも５倍、より典型的には少なくとも１０倍、さらにより典型的には少なくとも２０倍、最も典型的には少なくとも３０倍のカバレッジ深さとなることが一般に好ましい。
【００５６】
企図された方法は、患者配列のリードに加えて、既知の別個のＨＬＡ対立遺伝子の複数の配列を含む１つ以上の参照配列をさらに使用する。例えば、典型的な参照配列は、少なくとも１つのＨＬＡ型の配列セグメントを含み、そのＨＬＡ型の複数のＨＬＡ対立遺伝子を有する合成（対応するヒトまたは他の哺乳類対応物はない）配列であり得る。例えば、好適な参照配列として、ＨＬＡ−Ａの少なくとも５０の異なる対立遺伝子の既知のゲノム配列のコレクションを含む。あるいは、またはさらに、参照配列は、ＨＬＡ−Ａの少なくとも５０の異なる対立遺伝子について、既知のＲＮＡ配列のコレクションを含むこともできる。当然のことながら、さらに詳細に後述するように、参照配列はＨＬＡ−Ａの５０個の対立遺伝子に限定されず、ＨＬＡ型および対立遺伝子の数／組成に関して代替の組成を有してもよい。最も典型的には、参照配列はコンピュータ可読フォーマットであり、データベースまたは他のデータ記憶装置から提供される。例えば、好適な参照配列フォーマットとしては、ＦＡＳＴＡ、ＦＡＳＴＱ、ＥＭＢＬ、ＧＣＧ、またはＧｅｎＢａｎｋフォーマットが挙げられ、直接得るか、公的データレポジトリ（例えば、ＩＭＧＴ、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム、またはＴｈｅ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｎｅｔデータベース、ＥＵＲＯＳＴＡＭ、ＵＲＬ：www.allelefrequencies.net）のデータから構築され得る。あるいは、参照配列は、対立遺伝子頻度、民族対立遺伝子分布、共通または希少対立遺伝子型などの１つ以上の所定の基準に基づいて、個々の既知のＨＬＡ対立遺伝子から構築されてもよい。
【００５７】
現在は、参照配列を使用して、患者配列のリードをｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎグラフに通して、最良適合を有する対立遺伝子を同定できるようになった。この状況において、各個体は各ＨＬＡ型について２つの対立遺伝子を保有し、これらの対立遺伝子は非常に類似しているか、場合によっては同一であってもよいことに留意すべきである。このような高度の類似性は、従来のアライメントスキームについて重要な問題を提起する。本発明者は、現在、ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎグラフで、配列リードを比較的小さいｋ−ｍｅｒ（典型的には１０〜２０塩基の長さを有する）に分解することによって、および各患者配列のリードが、対立遺伝子の配列と適合しているその配列のリードのｋ−ｍｅｒに基づいて、対立遺伝子の各々についての投票（「定量的リード支援」）を提供する加重投票プロセスを実施することによって構築されるアプローチを使用して、ＨＬＡ対立遺伝子、および非常に関連した対立遺伝子さえも解明され得ることを見出している。次いで、対立遺伝子について累積的に最も高い投票は、最も可能性の高い予測されるＨＬＡ対立遺伝子を示す。さらに、対立遺伝子に対して適合を有する各断片が、その対立遺伝子の全体的なカバレッジおよびカバレッジ深さを計算するためにも使用されることが、一般に好ましい。
【００５８】
スコアリングは、特にトップヒットの多くが類似している場合（例えば、これらのスコアのかなりの部分が多く共有されたｋ−ｍｅｒのセット場合）、必要に応じてさらに改善または改良することができる。例えば、スコアの改良には、現在のトップヒットと実質的に類似している（例えば、＞９９％、または他の所定の値）対立遺伝子が将来の検討から除外される重み付けスキームを含むことができる。現在のトップヒットによって使用されるｋ−ｍｅｒの数は、係数（例えば、０．５）によって再び重み付けられ、各ＨＬＡ対立遺伝子のスコアは、これらの予測される数を合計することによって再計算される。この選択プロセスは、新たなトップヒットを見つけるために繰り返される。この方法の精度は、時にはＤＮＡに存在する２つの対立遺伝子のうちの１つのみであり得る腫瘍によって発現される対立遺伝子の同定を可能にするＲＮＡ配列データを用いてさらに改善され得る。企図されるシステムおよび方法のさらなる有利な態様では、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡの両方の組み合わせを処理して、非常に正確であり得、かつ腫瘍または血液ＤＮＡまたはＲＮＡから生じ得るＨＬＡ予測を行うことができる。高精度インシリコＨＬＡタイピングのさらなる態様、好適な方法および考察は、参照として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０３５３９２号に記載されている。
【００５９】
患者および腫瘍特異的ネオエピトープおよびＨＬＡ型が同定されると、ネオエピトープをＨＬＡにインシリコでドッキングし、例えば、ＮｅｔＭＨＣを用いて、最良の結合剤（例えば、最低ＫＤは、例えば５００ｎＭ未満、または２５０ｎＭ未満、または１５０ｎＭ未満、または５０ｎＭ未満）を決定することによってさらなるコンピュータ分析を実施することができる。このようなアプローチは、患者および腫瘍にとって本物である特定のネオエピトープを同定するだけでなく、細胞上に提示される可能性が最も高いネオエピトープおよび治療効果を有する免疫応答を誘発する可能性が最も高いネオエピトープも同定することを理解されたい。当然のことながら、このように同定されたＨＬＡ適合ネオエピトープは、さらに後述するように、エピトープをコードする核酸をペイロードとしてウイルスに含める前に、インビトロにおいて生化学的に確認できることも理解されたい。
【００６０】
当然のことながら、患者のＨＬＡ型と患者特異的ネオエピトープおよび癌特異的ネオエピトープとのマッチングは、ＮｅｔＭＨＣ以外のシステムを用いて行うことができ、好適なシステムとしては、ＮｅｔＭＨＣ  ＩＩ、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ、ＩＥＤＢ分析リソース（ＵＲＬimmuneepitope.org）、ＲａｎｋＰｅｐ、ＰＲＥＤＥＰ、ＳＶＭＨＣ、Ｅｐｉｐｒｅｄｉｃｔ、ＨＬＡＢｉｎｄｉｎｇなど（例えば、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１１；３７４：１−４を参照されたい）が挙げられることを理解されたい。最も高い親和性を計算する際には、改変されたアミノ酸の位置が移動しているネオエピトープ配列のコレクション（上記）を用いることができることに留意すべきである。あるいは、またはさらに、ネオエピトープに対する修飾は、発現させたネオエピトープの患者のＨＬＡ型への結合をさらに増やすためにＮ−および／またはＣ−末端修飾を加えることによって行ってもよい。したがって、ネオエピトープは、特定のＨＬＡ型にさらに適合するように、同定されたとおり天然型であるか、またはさらに修飾されてもよい。さらに、所望の場合、確実に高い示差親和性となるように対応する野生型配列（すなわち、アミノ酸変化のないネオエピトープ配列）の結合を計算することができる。例えば、ネオエピトープとその対応する野生型配列との間のＭＨＣ結合における特に好ましい高い示差的親和性は、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍である、少なくとも１０００倍などである）。
【００６１】
結合親和性、特に示差的結合親和性は、様々なシステムおよび方法を用いてインビトロで決定することもできる。例えば、患者の抗原提示細胞または適合ＨＬＡ型を有する細胞は、核酸（例えば、ウイルス、プラスミド、直鎖ＤＮＡ、ＲＮＡなど）をトランスフェクトして、以下により詳細に記述している構築物を用いて１つ以上のネオエピトープを発現させることができる。次いで、発現および抗原プロセシングに際して、ネオエピトープは、ネオエピトープへの特異的結合剤を使用するか、またはＴ細胞の活性化または細胞傷害性ＮＫ細胞の活動がインビトロで観察され得る細胞ベースのシステム（例えば、患者のＰＢＭＣ）を使用して、細胞外のＭＨＣ複合体において同定することができる。次に、異なる活性（対応する野生型エピトープと比較してより強いシグナルまたは免疫応答を誘発する）を有するネオエピトープが、治療創出のために選択される。
【００６２】
所望のネオエピトープを同定する際に、ネオエピトープの配列情報を用いて１つ以上の免疫治療剤を調製することができる。他の剤の中でも、同定されたネオエピトープのうちの少なくとも１つの発現を導く、以下にさらに論じるような核酸構築物で遺伝子改変されているウイルスにより患者を治療し、腫瘍に対して免疫応答を開始させ得ることが特に好ましい。例えば、好適なウイルスとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなどが挙げられる。しかし、アデノウイルスが特に好ましい。さらに、ウイルスは、複製欠損および非免疫原性ウイルスであることがさらに好ましい。これらのウイルスは、典型的には、選択されたウイルスタンパク質（例えば、Ｅ１、Ｅ３タンパク質）の標的化された欠失によって得られる。このような望ましい特性は、Ｅ２ｂ遺伝子機能を消失させることによってさらに増強され得、高力価の組換えウイルスは、最近報告されている遺伝子改変ヒト２９３細胞を用いて達成され得る（例えば、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９８年２月；７２（２）：９２６−９３３）。
【００６３】
組換えウイルスのタイプにかかわらず、ウイルスは、患者（または非患者）細胞にエクスビボまたはインビボで感染させるために使用できることが企図される。例えば、ウイルスは、皮下もしくは静脈内に注射することができ、または患者の細胞、特に抗原提示細胞に感染させるために、鼻腔内もしくは吸入を介して投与することができる。あるいは、患者（または同種異系の供給源）の免疫コンピテントセル（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞など）をインビトロで感染させ、次いで患者に輸血することができる。あるいは、免疫療法はウイルスに頼る必要はなく、所望の細胞中、特に免疫コンピテントセルにおいて、ＲＮＡまたはＤＮＡ、またはネオエピトープの発現を導く他の組換えベクター（例えば、単一ペプチド、タンデムミニ遺伝子など）を用いた核酸トランスフェクションまたはワクチン接種により実施することができる。
【００６４】
最も典型的には、（ウイルス感染細胞から発現させるための）所望の核酸配列は、当技術分野で周知の適切な調節エレメントの制御下にある。例えば、好適なプロモーターエレメントとしては、強力な構成的プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＥＦ１Ａ、ＰＧＫ、ＣＡＧＧプロモーター）が挙げられ、特に誘導条件が腫瘍微小環境にとって典型的である場合には、誘導性プロモーターもまた本明細書での使用に好適であると考えられる。例えば、誘導性プロモーターとしては、低酸素に感受性の高いプロモーターおよびＴＧＦ−βまたはＩＬ−８に対して感受性が高いプロモーター（例えば、ＴＲＡＦ、ＪＮＫ、Ｅｒｋまたは他の応答エレメントプロモーターを介して）が挙げられる。他の例において、好適な誘導性プロモーターとしては、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ミクソウイルス耐性１（Ｍｘ１）プロモーターなどが挙げられる。
【００６５】
この状況において、本発明者らは、ネオエピトープの配置様式であり、かつ合理的に設計されたネオエピトープの輸送が、様々な免疫治療組成物の有効性に対して実質的な影響を有し得ることを見出したことを理解されたい。例えば、単一のネオエピトープは、単一のプラスミド、ウイルス発現構築物などとして送達されるそれぞれの組換え構築物から個々に発現させ得る。あるいは、複数のネオエピトープを個々のプロモーターから個別に発現させて、個々のｍＲＮＡを形成し、次いでそれぞれのネオエピトープに個々に翻訳し得るか、または各ネオエピトープ配列の個々の翻訳開始点を含む単一のｍＲＮＡから（例えば２ＡまたはＩＲＥＳシグナルを使用して）個別に発現され得る。特に、このような配置により、一般に、適切なネオエピトープペプチドの制御された送達が可能になると考えられているが、このような発現系の有効性は望ましいものではない（データは示さず）。
【００６６】
対照的に、複数のネオエピトープが単一の転写物から発現されて、単一の転写物を形成し、その後単一のポリトープ（すなわち一連のコンカテマー結合したネオエピトープ、任意により介在リンカー配列を有するポリペプチド）に翻訳される場合、発現、プロセシングおよび抗原提示は効果的であることが判明した。注目すべきことに、ポリトープの発現には、細胞内の適切なプロテアーゼ（例えばプロテアソーム、エンドソームプロテアーゼ、リソソームプロテアーゼ）によりプロセシングを行って、ネオエピトープ配列を生じさせる必要があり、ポリトープは、個々のネオエピトープの発現と比較して大部分のネオエピトープにおいて、特に、個々のネオエピトープが比較的短い長さ（例えば、２５個未満のアミノ酸；結果は示さず）を有する場合、抗原プロセシングおよび提示の改善となった。さらに、このようなアプローチでは、ネオエピトープペプチド配列間のプロテアーゼ感受性配列モチーフを合理的に設計し、特定のプロテアーゼによるプロセシングを確実に行うか、または回避することもできるようになる。これは、プロテアソーム、エンドソームプロテアーゼ、およびリソソームプロテアーゼが明確な切断優先度を有するためである。従って、ポリトープは、ネオエピトープを空間的に分離するリンカー配列だけでなく、特異的プロテアーゼによって優先的に切断される配列部分（例えば、３〜１５個のアミノ酸）も含むように設計され得る。
【００６７】
したがって、本発明者らは、ポリトープをコードする核酸セグメントを含む組換え核酸および発現ベクター（例えばウイルス発現ベクター）を企図し、この場合、ポリトープは所望のプロモーターエレメントに作動可能に連結され、かつ個々のネオエピトープは、リンカーおよび／またはプロテアーゼ切断または認識配列によって任意により分離されている。例えば、図１は、アデノウイルス発現系（ここではＥ１およびＥ２ｂ遺伝子の欠失を伴うＡｄＶ５）から発現させるために企図されたネオエピトープの種々の配置を例解する。ここで、構築物１は、介在リンカー配列を有さないコンカテマー系列において、全長１５個のアミノ酸を含む８個のネオエピトープ（「ミニ遺伝子」）を含むネオエピトープの配置を例解し、構築物２は、各ネオエピトープ配列間に９個のアミノ酸リンカーを含む構築物１の配置を示している。当然のことながら、先に述べたように、ネオエピトープ配列の正確な長さは１５個のアミノ酸に限定されものではなく、正確な長さはかなり変化し得ることが認識されているべきである。しかし、多くの場合、８〜１２個のアミノ酸のネオエピトープ配列がさらなるアミノ酸に隣接する場合、全長は、典型的には、２５個のアミノ酸、または３０個のアミノ酸、または５０個のアミノ酸を超えないものとする。同様に、図１はＧＳリンカーを示すが、種々の他のリンカー配列も本明細書での使用に好適であることに留意すべきである。このような比較的短いネオエピトープは、ＭＨＣ−Ｉ複合体を介してネオエピトープの提示が行われることが意図される場合に特に有益である。
【００６８】
この状況において、好適なリンカー配列により、２つの隣接するネオエピトープの立体的な柔軟性および分離がもたらされることが理解されるべきである。しかし、免疫原性であり得る／既に患者に存在するエピトープを形成し得るリンカーのアミノ酸を選択しないように注意しなければならない。結果として、ポリトープ構築物は、患者において見出され得るエピトープの存在について（例えば、正常な配列の一部として、またはＳＮＰまたは他の配列変異のために）、もう一度フィルタ処理されることが一般に好ましい。このようなフィルタ処理は、既に上述したのと同じ技術および基準を適用する。
【００６９】
同様に、構築物３では、介在リンカー配列のないコンカテマー系列において８個のネオエピトープを含むネオエピトープ配置を例解し、構築物４は、各ネオエピトープ配列間に９個のアミノ酸リンカーを含む構築物３の配置を示している。先に述べたように、こうしたネオエピトープ配列の正確な長さは２５個のアミノ酸に限定されものではなく、正確な長さはかなり変化し得ることが認識されているべきである。しかし、多くの場合、１４〜２０個のアミノ酸のネオエピトープ配列がさらなるアミノ酸に隣接する場合、全長は、典型的には、３０個のアミノ酸、または４５個のアミノ酸、または６０個のアミノ酸を超えないものとする。同様に、図１はこれらの構築物のＧＳリンカーを示すが、種々の他のリンカー配列も本明細書での使用に好適であることに留意すべきである。このような比較的長いネオエピトープは、ＭＨＣ−Ｉ複合体を介してネオエピトープの提示が行われることが意図される場合に特に有益である。
【００７０】
この例では、１５−ａａのミニ遺伝子は、いずれかの側の天然配列の７個のアミノ酸で選択されたＭＨＣクラスＩ標的腫瘍突然変異であり、２５−ａａのミニ遺伝子は、両側の天然配列の１２のアミノ酸で選択されたＭＨＣクラスＩＩ標的腫瘍突然変異であることを理解されたい。例示的な９個のアミノ酸リンカーは、隣接するミニ遺伝子間に、「非天然」ＭＨＣクラスＩエピトープが形成されないように十分な長さを有すると考えられる。ポリトープ配列は単一のネオエピトープよりも効率よくプロセシングされて提示される傾向があり（データは示さず）、ＭＨＣ−Ｉ提示のための１２個のアミノ酸を超えるアミノ酸を添加すること、およびＭＨＣ−Ｉ提示のための２０個のアミノ酸を超えるアミノ酸を添加することで、いくらか改善されたプロテアーゼプロセシングが可能になると考えられる。
【００７１】
カスタマイズされたタンパク質配列がＨＬＡ複合体によるプロセシングおよび提示のために細胞内に留まる可能性を最大化するために、ネオエピトープ配列は、細胞膜または細胞外空間への輸送を指示し得る疎水性配列を最小限にする様式で配置され得る。最も好ましくは、疎水性配列またはシグナルペプチドの検出は、配列をウェイト行列と比較することによって、（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８６年６月１１日；１４（１１）：４６８３−４６９０を参照されたい）、またはシグナル配列を含むペプチド上で訓練したニューラルネットワーク（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００４年，第３３８巻，Ｉｓｓｕｅ  ５，１０２７−１０３６を参照されたい）を用いることによって行われる。図２は、複数のポリトープ配列が分析される配置選択の例示的スキームを示す。ここでは、すべてのネオエピトープのすべての位置順列が計算され、配置コレクションが生成される。次いで、このコレクションは、疎水性配列またはシグナルペプチドの存在の可能性および／または強度を表すスコアを生成するために、ウェイト行列および／またはニューラルネットワーク予測によって処理される。次いで、すべての位置順列がスコアごとにランク付けされ、疎水性配列またはシグナルペプチドの存在の可能性および／または強度についての所定の閾値または最低スコア以下のスコアを有する順列（複数可）が、カスタマイズされたネオエピトープ発現カセットを構築するために使用される。
【００７２】
ポリトープ中のネオエピトープ配列の総数については、ポリトープは、少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも５個、または少なくとも８個、または少なくとも１０個のネオエピトープ配列を含むことが一般に好ましい。実際に、組換えＤＮＡのペイロードの能力は、一般に、フィルタ処理された適切なネオエピトープの利用可能性に加えて、制限因子であると考えられている。したがって、アデノウイルス発現ベクター、特にＡｄｖ５は、このようなベクターが組換えペイロードに最大で１４ｋｂを収容することができるため、特に好ましい。
【００７３】
本発明の主題のさらなる企図された態様において、ネオエピトープ／ポリトープは、特定の細胞内区画（例えば、細胞質ゾル、エンドソーム、リソソーム）に対して向けられ得、これにより特定のＭＨＣ提示型に対して向けられることを留意されたい。このようにして向けられた発現、プロセシング、および提示は、ＣＤ８＋型応答（ポリトープが細胞質空間に向けられている）またはＣＤ４＋型応答（ポリトープがエンドソーム／リソソーム区画に向けられている）に対して免疫応答を向けるように企図された組成物を調製することができるため、特に有利である。さらに、ＭＨＣ−Ｉ経路を介して通常提示されるポリトープは、ＭＨＣ−ＩＩ経路を介して提示され得る（したがって、ネオエピトープの交差提示を模倣する）ことを認識されたい。したがって、ネオエピトープおよびポリトープ配列は、適切な配列エレメントを用いて設計され、一方または両方のＭＨＣ提示経路に向けられ得ることを理解されたい。こうした発現されたネオエピトープの所望のＭＨＣ系までの経路に関して、ＭＨＣ−Ｉ提示ペプチドは、典型的にプロテアソーム処理および小胞体を介する送達により細胞質から生じることに留意されたい。したがって、ＭＨＣ−Ｉ提示を企図したエピトープの発現は、以下でさらに詳細に論じるように、概して細胞質に向けられる。一方、ＭＨＣ−ＩＩ提示ペプチドは、典型的には、細胞膜へ送達される前に酸性プロテアーゼ（例えば、レグマイン、カテプシンＬおよびカテプシンＳ）による分解およびプロセシングによってエンドソームおよびリソソーム区画から生じる。
【００７４】
さらに、ポリトープのタンパク質分解は、様々な方法を用いても亢進できることが企図されており、特に企図される方法としては、切断可能なもしくは切断不能なユビキチン部分をＮ末端に付加すること、および／または１つ以上の不安定化アミノ酸（例えば、Ｎ、Ｋ、Ｃ、Ｆ、Ｅ、Ｒ、Ｑ）を、提示がＭＨＣ−Ｉに向けられているポリトープのＮ末端に置くことが挙げられる。一方、提示がＭＨＣ−ＩＩに向けられる場合、特定のエンドソームまたはリソソームプロテアーゼの切断部位を操作してポリトープに入れ、これにより抗原プロセシングの促進を容易にすることができる。
【００７５】
したがって、本発明の主題の企図された態様において、シグナルおよび／またはリーダーペプチドは、ネオエピトープおよび／またはポリトープをエンドソームおよびリソソーム区画へ輸送するため、またはこれらを細胞質スペースにおいて保持するために使用され得る。例えば、ポリトープがエンドソームおよびリソソーム区画に搬出される場合、ＣＤ１ｂリーダーペプチドなどのリーダーペプチドを用いて、（新生）タンパク質を細胞質から隔離することができる。追加的に、または代替的に、標的プレ配列および／または標的ペプチドを使用することができる。標的ペプチドのプレ配列は、Ｎ末端および／またはＣ末端に付加され得、典型的には、６〜１３６個の塩基性および疎水性アミノ酸を含む。ペルオキシソームが標的である場合、標的配列はＣ末端にあり得る。他のシグナル（例えば、シグナルパッチ）を使用してもよく、これにはペプチド配列において分離し、適切なペプチドフォールディングの際に機能的になる配列エレメントを含んでもよい。さらに、グリコシル化などのタンパク質の修飾は、標的化を誘導し得る。本発明者らは、他の適切な標的シグナルの中でも、ペルオキシソーム標的シグナル１（ＰＴＳ１）、Ｃ末端トリペプチド、およびＮ末端近くに位置するノナペプチドであるペルオキシソーム標的シグナル２（ＰＴＳ２）を企図している。
【００７６】
さらに、エンドソームおよびリソソームへのタンパク質のソーティングは、タンパク質の細胞質ゾルドメイン内のシグナルによって媒介され得、典型的には短い線状配列を含む。いくつかのシグナルは、チロシンベースのソーティングシグナルと呼ばれ、ＮＰＸＹまたは
【数１】
2019513021.tif 000002
コンセンサスモチーフに適合する。ジロイシンベースのシグナルとして知られる他のシグナルは、［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］またはＤＸＸＬＬコンセンサスモチーフに適合する。これらのシグナルはすべて、膜の細胞質面と周辺に関連するタンパク質コートの成分によって認識される。
【数２】
2019513021.tif 000003
および［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］シグナルは、アダプタータンパク質（ＡＰ）複合体ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−３およびＡＰ−４によって特徴的な微細特異性で認識されるが、ＤＸＸＬＬシグナルは、ＧＧＡとして知られているアダプターの別のファミリーによって認識される。また、空胞タンパク質のソーティングおよびエンドソーム機能に関連するＦＹＶＥドメインを加えることができる。さらなる態様において、エンドソーム区画は、ヒトＣＤ１テール配列を用いて標的化することもできる（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２２，５２２−５３１を参照されたい）。例えば、リソソームの標的化は、ＬＡＭＰ１−ＴＭ（膜貫通）配列を使用して達成され得るが、リサイクリングエンドソームは、ＣＤ１ａテール標的配列を介して標的化され得、ソーティングエンドソームは、ＣＤ１ｃテール標的配列を介して標的化され得る。これらは以下に詳細に示す。
【００７７】
さらに企図される態様では、ポリトープはまた、腫瘍関連抗原（例えば、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＭＵＣ１、ＡＦＰ、ＭＡＧＥ、ＨＥＲ２、ＨＣＣ１、ｐ６２、ｐ９０など）の少なくとも一部、より典型的には全腫瘍関連抗原を含むキメラポリトープとして設計され得る。最も重要なことに、腫瘍関連抗原は、一般に、ＭＨＣ−ＩＩ経路を介してプロセシングされ提示される。したがって、ＭＨＣ−ＩＩの標的化には、区画特異的シグナル配列および／またはリーダー配列を使用する代わりに、腫瘍関連抗原のプロセシング機構を用いることができる。
【００７８】
細胞質ゾル区画への輸送または細胞質ゾル区画内での保持は、必ずしも１つ以上の特定の配列エレメントを必要とするものではない。しかし、少なくともいくつかの態様では、膜固着タンパク質または膜固着タンパク質の膜固着ドメインなどのＮ−またはＣ−末端細胞質保持シグナルを加えて、タンパク質が細胞質ゾルに面している細胞内に保持されるようにしてもよい。例えば、膜固着タンパク質としては、ＳＮＡＰ−２５、シンタキシン、シナプトプレビン（ｓｙｎａｐｔｏｐｒｅｖｉｎ）、シナプトタグミン、小胞関連膜タンパク質（ＶＡＭＰ）、シナプス小胞糖タンパク質（ＳＶ２）、高親和性コリン輸送体、ニューレキシン、電位依存性カルシウムチャネル、アセチルコリンエステラーゼ、およびＮＯＴＣＨが挙げられる。
【００７９】
本発明の主題のさらなる企図された態様では、ポリトープは、処理後にネオエピトープを細胞膜の外側に向け、免疫コンピテントセルにとって認識できるようにする１つ以上の膜貫通セグメントを含むこともできる。当技術分野で公知の多数の膜貫通ドメインが存在し、それらのすべてが、単一のαヘリックス、複数のαヘリックス、α／βバレルなどを有するものを含む、本明細書での使用に適していると考えられる。例えば、企図される膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、またはＰＡＧ／Ｃｂｐのα、β、またはζ鎖の膜貫通領域（複数可）を含んでもよい。融合タンパク質が所望される場合、組換えキメラ遺伝子は、膜貫通領域（複数可）をコードする第１の部分を有し、第１の部分は、阻害タンパク質をコードする第２の部分とインフレームでクローニングされることが企図される。このような提示では、ＭＨＣ複合体の提示となることはなく、したがって、ＭＨＣ／Ｔ細胞受容体の相互作用とは独立して、ネオエピトープ提示をもたらすことに留意されたい。これにより、免疫認識のさらなる道が開かれ、ネオエピトープに対する抗体産生を誘発し得る。
【００８０】
代替的に、または追加的に、ポリトープは、１つ以上のネオエピトープのタンパク質搬出のためのシグナル配列を含むようにも設計され得、それによって、トランスフェクトされた細胞に１つ以上のネオエピトープを産生および分泌させる。例えば、ＳＰＡＲＣリーダー配列をネオエピトープまたはポリトープ配列に付加して、インビボでネオエピトープまたはポリトープ配列を細胞外空間に分泌させてもよい。好都合なことに、次いで、このように分泌させたネオエピトープまたはポリトープは、免疫コンピテントセル、特に抗原提示細胞および樹状細胞によって取り込まれ、次いで、典型的にはＭＨＣ−ＩＩ経路を介してネオエピトープをプロセシングして表示する。
【００８１】
代替的に、または追加的に、ネオエピトープまたはポリトープはペプチドとして投与されてもよく、任意により担体タンパク質に結合させてペプチドワクチンとして作用してもよい。他の適切な担体タンパク質の中でも、ヒトアルブミンまたはラクトフェリンが特に好ましい。このような担体タンパク質は、天然のコンフォメーションであってもよいか、またはネオエピトープもしくはポリトープを連結させることができる、露出した疎水性ドメインを有するナノ粒子を形成するように前処理されてもよい（例えば、Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．２０１５；９８：１２１−４３を参照されたい）。最も典型的には、ネオエピトープまたはポリトープの担体タンパク質への連結は、非共有結合である。分泌されたネオエピトープまたはポリトープと同様に、担体タンパク質に結合されたネオエピトープまたはポリトープは、免疫コンピテントセル、特に抗原提示細胞および樹状細胞によって取り込まれ、次いで、ネオエピトープを、典型的にはＭＨＣ−ＩＩ経路を介してプロセシングして表示する。
【００８２】
したがって、免疫治療組成物は、１つ以上のネオエピトープを様々な細胞内位置に送達し、それにより異なる免疫応答を生成することができるように調製され得ることが理解されるべきである。例えば、先行技術の図３は、ポリトープが細胞質のプロテアソームにおいて主にプロセシングされ、ＭＨＣ−Ｉ複合体を介して提示され、これがＣＤ８＋Ｔ細胞のＴ細胞レセプターによって認識されるシナリオを概略的に例解している。結果的に、細胞質ゾル区画に対してポリトーププロセシングを標的化するには、ＣＤ８＋型応答に対する免疫応答を歪めることになる。その一方で、先行技術の図４では、ポリトープがエンドソーム区画において主にプロセシングされ、かつＭＨＣ−ＩＩ複合体を介して提示され、これがＣＤ４＋Ｔ細胞のＴ細胞レセプターによって認識されるシナリオを概略的に例解している。結果的に、エンドソームまたはリソソーム区画に対してポリトーププロセシングを標的化すると、ＣＤ４＋型応答に対する免疫応答が歪められる。さらに、このような標的化方法では、たとえペプチドがＭＨＣサブタイプによって提示されなくても、そのペプチドとの最も高い親和性を有するＭＨＣサブタイプへポリトープまたはネオエピトープペプチドを特異的に送達できることを理解されたい。したがって、先に述べたように、ＭＨＣ−Ｉ提示のためのペプチドは、一般に８〜１２個のアミノ酸（加えて、プロテアーゼプロセシングにおける柔軟性のための追加のアミノ酸を含む）を有するように設計され、ＭＨＣ−ＩＩ提示のためのペプチドは、１４〜２０個のアミノ酸（加えて、プロテアーゼプロセシングにおける柔軟性のための追加のアミノ酸）を有するように設計される。以下の実施例では、さらなるアミノ酸を加えて、細胞質区画、プロテアソーム区画、またはエンドソーム区画における処理の柔軟性を可能にした。
【００８３】
本発明の主題のさらに企図された態様では、ネオエピトープまたはポリトープの輸送モードは、１つ以上の特定の目的に適応するように組み合わされ得ることに留意すべきである。例えば、異なる標的を有する同じネオエピトープまたはポリトープの逐次投与は、プライムブーストレジメンにおいて、特に有益であり得る。プライムブーストレジメンでは、最初の投与で、患者に組換えウイルスを接種させ、患者の細胞を感染させ、細胞内から発生する第１の免疫応答となる抗原発現、プロセシング、または提示（例えば、主にＭＨＣ−Ｉ提示）を導くものである。次いで、アルブミンに結合させた同じネオエピトープの第２の投与は、このように送達されたタンパク質が抗原提示細胞によって取り込まれ、ほとんどの場合、別個の抗原提示（例えば、主にＭＨＣ−ＩＩ提示）をもたらすので、ブーストとして使用されてもよい。同じネオエピトープまたはポリトープが、細胞表面結合ＭＨＣ非依存性提示のために細胞表面に輸送される場合、ＡＤＣＣ応答またはＮＫ媒介細胞死が促進され得る。さらなる企図される態様では、および以下の実施例に例解されるように、ネオエピトープの免疫原性は、交差提示またはＭＨＣ−ＩＩに向けた提示によって増強され得る。注目すべきことに、癌細胞ネオエピトープは、典型的には内部で生成され再循環され、これによりＭＨＣ−Ｉ系を介して優先的に提示されるので、ここで企図される系および方法は、ＭＨＣ−ＩＩを介した、以下に詳細に示すとおり免疫原性が高い可能性があるこのようなネオエピトープの提示を可能にする。さらに、同じネオエピトープまたはポリトープの複数の別々の輸送は、細胞性および体液性免疫系の種々の異なる成分の刺激により、免疫応答を有利に増加または補足し得る。
【００８４】
当然のことながら、同じネオエピトープまたはポリトープの複数の別々の輸送は、多数の方法で達成され得ることは理解されたい。例えば、別々に輸送されるネオエピトープまたはポリトープは、同じ（例えばウイルス発現ベクター）または異なる（例えば、ウイルス発現ベクターおよび結合されたアルブミン）様式を用いて別々に投与され得る。同様に、特に治療剤が発現系（例えば、ウイルスまたは細菌）である場合、組換え核酸は、別々に輸送されるネオエピトープまたはポリトープであるにもかかわらず、それをコードする２つの異なる部分を含み得る（例えば、第１の位置（例えば、細胞質ゾル、またはエンドソーム、またはリソソーム）に輸送される第１の部分、および第２の別の位置（例えば、細胞質ゾルまたはエンドソームまたはリソソームであるか、分泌された、膜結合された位置）に輸送される第２の部分）。同様に、第１の投与には、細胞質標的化ネオエピトープまたはポリトープのウイルス送達を用いることができ、第２の投与は、典型的には、最初の投与から少なくとも１日、２日、４日、１週間、または２週間後であり、エンドソームまたはリソソームで標的化または分泌させたネオエピトープまたはポリトープのウイルス送達を用いてもよい。
【００８５】
さらに、発現構築物（例えば、組換えウイルス発現ベクターまたはプラスミド）は、少なくとも１種、より典型的には少なくとも２種、さらにより典型的には少なくとも３種、および最も典型的には少なくとも４種の共刺激分子をさらにコードして、感染細胞（例えば、抗原提示細胞）とＴ細胞との間の相互作用を増強し得ることが企図される。例えば、好適な共刺激分子としては、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬが挙げられ、定義されていない（または理解されていない）作用機序を有する他の刺激分子としては、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＴＬ１Ａ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ３、およびＳＬＡＭファミリーのメンバーが挙げられる。しかし、癌関連配列との協調発現のために特に好ましい分子としては、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、およびＣＤ１１（ＬＦＡ−１）が挙げられる。本発明者らは、共刺激分子に加えて、１つ以上のサイトカインまたはサイトカイン類似体を組換え核酸から発現させ得ることも企図しており、特に好ましいサイトカインおよびサイトカイン類似体としては、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−ａ５スーパーアゴニスト（ＡＬＴ−８０３）が挙げられる。さらに、共刺激分子および／またはサイトカインの発現を好ましくは協調させて、これによりネオエピトープまたはポリトープを１つ以上の共刺激分子および／またはサイトカインと同時に発現させるようにすることは理解されたい。したがって、典型的には、共刺激分子および／またはサイトカインは、例えば、内部リボソーム進入部位または２Ａ配列を用いて単一の転写物（ポリトープをコードする配列部分を含んでも含まなくてもよい）から、または複数の転写物から産生されることが企図される。
【００８６】
同様に、ウイルスベクターは、チェックポイント受容体に結合する１つ以上のペプチドリガンドをコードする配列部分も含み得ることが企図される。最も典型的には、結合は、受容体を介するシグナル伝達を阻害するか、または少なくとも減少させ、特に企図される受容体としてはＣＴＬＡ−４（特にＣＤ８＋細胞）、ＰＤ−１（特にＣＤ４＋細胞）、ＴＩＭ１受容体、２Ｂ４およびＣＤ１６０が挙げられる。例えば、好適なペプチド結合剤は、抗体断片および特にｓｃＦｖを含むことができるが、受容体に特異的に結合する低分子ペプチドリガンド（例えば、ＲＮＡディスプレイまたはファージパニングによって単離される）も含み得る。もう一度、ペプチド分子の発現を好ましくは協調させて、これによりネオエピトープまたはポリトープを１つ以上のペプチドリガンドと同時に発現させるようにすることを理解されたい。したがって、典型的には、ペプチドリガンドは、例えば、内部リボソーム進入部位または２Ａ配列を用いて単一の転写物（ポリトープをコードする配列部分を含んでも含まなくてもよい）から、または複数の転写物から産生されることが企図される。
【００８７】
上記の共刺激遺伝子およびチェックポイント阻害に干渉する／これらを下方制御する阻害タンパク質をコードする遺伝子のすべてが当技術分野で周知であり、ＮＣＢＩ、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑなどでアクセス可能な配列データベースなど、様々な公的リソースから、これらの遺伝子、アイソフォームおよび多様体の配列情報を検索することができることを理解されたい。さらに、上記の例示的な刺激分子は、好ましくは、ヒトで発現されるとき、全長形態で発現されるが、修飾型および非ヒト型も、これらの形態がＴ細胞の刺激または活性化を助けるものである限り好適であることが企図される。したがって、突然変異タンパク質、切断型およびキメラ型が本明細書において明白に企図される。
【００８８】
結果として、企図される発現構築物は、好ましくは、１つ以上のポリトープをコードする配列部分を含み、ポリトープの少なくとも１つ、より典型的には少なくとも２つ、またはポリトープのすべてが、少なくとも１つ、より典型的には少なくとも２つの異なる細胞内の位置へのポリトープの優先的な輸送をもたらす輸送シグナルを含む。例えば、第１のポリトープは、細胞質に向けられてもよく（追加の切断可能または切断不能なユビキチンを含んでもよい）、第２のポリトープは、エンドソームまたはリソソーム区画に向けられてもよい。または、第１のポリトープは、エンドソームもしくはリソソーム区画に向けられてもよく、第２のポリトープは、細胞膜に向けられるか、または分泌されてもよい。前述のように、コードされたポリトープは、任意によりリンカーによって分離されている少なくとも２つのネオエピトープを含む。さらに、このように企図された発現構築物は、１つ以上の共刺激分子および／またはサイトカインをコードする配列部分も含み、また、チェックポイント阻害に干渉する／これを下方制御する１つ以上の阻害タンパク質を含んでもよい。最も典型的には、発現構築物はまた、ポリトープおよび共刺激分子、サイトカイン、および／または阻害タンパク質の同時発現を引き起こすために、上記配列部分に作動可能に連結された調節配列を含む。好適なプロモーターエレメントは当該分野で公知であり、特に好ましいプロモーターとしては、上で論じた構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターが挙げられる。
【００８９】
発現構築物がウイルス発現構築物（例えば、アデノウイルス、およびＥ１およびＥ２ｂの欠失を有するＡｄＶ）である場合、組換えウイルスは、個々にまたは組み合わせて医薬組成物中の治療ワクチンとして使用され得、典型的には、１投与単位当たり１０６〜１０１３個のウイルス粒子、より典型的には１０９〜１０１２個のウイルス粒子のウイルス力価を有する滅菌注射用組成物として配合されることが企図される。あるいは、ウイルスを用いてエクスビボで患者（または他のＨＬＡ適合）細胞を感染させ、次いで、このように感染させた細胞を患者に輸血することができる。さらなる例において、ウイルスを用いる患者の処置は、裸の形態であるか、またはネオエピトープ（複数可）、腫瘍関連抗原、もしくはウイルスと同じペイロードを標的とする抗体を発現するキメラ抗原レセプターを担持している、同種移植または自家ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞を伴ってもよい。患者由来のＮＫ−９２細胞株を含むナチュラルキラー細胞は、ＣＤ１６も発現させ得、抗体と連結させ得る。
【００９０】
必要に応じて、単独で、または自家もしくは同種異系ＮＫ細胞、特にｈａＮＫ細胞またはｔａＮＫ細胞（両方ともＮａｎｔＫｗｅｓｔ（９９２０  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｂｌｖｄ．Ｃｕｌｖｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ９０２３２）から市販されている）と組み合わせて、ネオエピトープベース（例えば、国際公開第２０１６／１７２７２２号に記載されているネオエピトープに対する合成抗体）であり得る追加の治療様式を用いてもよい。ｈａＮＫまたはｔａＮＫ細胞が使用される場合には、ｈａＮＫ細胞が、処置された患者のネオエピトープに結合するＣＤ１６多様体上に組換え抗体を保有していることが特に好ましく、ｔａＮＫ細胞が使用される場合には、ｔａＮＫ細胞のキメラ抗原受容体が、処置された患者のネオエピトープに結合していることが好ましい。追加の治療様式はまた、ネオエピトープとは独立していてもよく、特に好ましい様式としては、活性化ＮＫ細胞（例えば、ＮａｎｔＫｗｅｓｔ（９９２０  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｂｌｖｄ．Ｃｕｌｖｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ  ９０２３２）から市販されているａＮＫ細胞）などの細胞ベースの治療法、ならびに化学療法および／または放射線などの非細胞ベースの治療法が挙げられる。さらに別の企図される態様では、免疫刺激性サイトカイン、特にＩＬ−２、ＩＬ１５、およびＩＬ−２１は、単独で、または１種以上のチェックポイント阻害剤（例えば、イピリムマブ、ニボルマブなど）と組み合わせて投与され得る。同様に、追加の薬学的介入は、免疫抑制細胞、特にＭＤＳＣ  ＴｒｅｇおよびＭ２マクロファージを阻害する１種以上の薬物の投与を含み得ることがさらに企図される。したがって、好適な薬物としては、ＩＬ−８、またはインターフェロン−γ阻害剤、またはＩＬ−８もしくはインターフェロンγに結合する抗体、ならびにＭＤＳＣを不活性化し、ＭＤＳＣ（例えば、ＩＬ−１２、ＶＥＧＦインヒビター、ビスホスホネート）に対する細胞の発達もしくは分化をブロックする薬物（例えば、ＮＯ阻害剤、アルギナーゼ阻害剤、ＲＯＳ阻害剤）、またはＭＤＳＣに対して毒性のある剤（例えば、ゲムシタビン、シスプラチン、５−ＦＵ）が挙げられる。同様に、シクロホスファミド、ダクリズマブ、および抗ＧＩＴＲまたは抗ＯＸ４０抗体などの薬物は、Ｔｒｅｇを阻害するために使用され得る。
【００９１】
ストレスシグナルの過剰発現または転写を引き起こすために、患者用の化学療法および／または放射線を、低用量レジメンを用いて、好ましくはメトロノーム様式で行うことも企図されている。例えば、このような治療では、タンパク質発現、細胞分裂および細胞周期のうちの少なくとも１つに影響を及ぼすために、好ましくはアポトーシスを誘導するために、またはストレス関連遺伝子（特にＮＫＧ２Ｄリガンド）の発現を少なくとも誘導または増加させるために有効な用量を使用することが一般に好ましい。したがって、さらに企図される態様では、このような治療は、１種以上の化学療法剤を用いる低用量治療を含む。最も典型的には、低線量治療は、曝露時に化学療法剤のＬＤ５０またはＩＣ５０が７０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、または５％以下である。さらに、有利な場合には、このような低用量レジメンは、例えば、米国特許明細書第７７５８８９１号、米国特許明細書第７７７１７５１号、米国特許明細書第７７８０９８４号、米国特許明細書第７９８１４４５号、および米国特許明細書第８０３４３７５号に記載されているメトロノーム様式で行うことができる。
【００９２】
このような低用量レジメンで使用される特定の薬物に関して、すべての化学療法剤が適切であると考えられることが企図されている。他の好適な薬物の中でも、キナーゼ阻害剤、受容体作動薬および拮抗薬、抗代謝薬、細胞分裂抑制薬、および細胞傷害薬がすべて本明細書において企図されている。しかし、特に好ましい剤としては、腫瘍の成長または発達を促す経路の成分に干渉するかまたはこれらを阻害するように同定された剤が挙げられる。好適な薬物は、例えば国際公開第２０１１／１３９３４５号および国際公開第２０１３／０６２５０５号に記載されているオミクスデータの経路分析を使用して同定することができる。最も注目すべきことに、腫瘍細胞におけるストレス関連遺伝子のこのように達成された発現は、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＰ３０、ＮＫＰ４４および／またはＮＫＰ４６リガンドの表面提示をもたらし、次にＮＫ細胞を活性化して、腫瘍細胞を特異的に破壊する。したがって、低用量化学療法は、腫瘍細胞において、ストレス関連タンパク質を発現させ、提示し、次いで、ＮＫ細胞の活性化および／またはＮＫ細胞媒介の腫瘍細胞の死滅を引き起こすトリガーとして使用され得ることを理解されたい。さらに、ＮＫ細胞媒介死滅は、細胞内腫瘍特異的抗原の放出に関連しており、このことが、免疫応答をさらに増強すると考えられている。
【００９３】
結果として、本発明者らは、組換え核酸が（好ましくはインビボでのウイルストランスフェクションの形態で）患者に投与され、この組換え核酸が１つ以上のポリトープをコードする配列部分を含む、患者における癌の様々な治療方法を企図する。最も好ましくは、ポリトープの少なくとも１つ、より典型的には少なくとも２つ、またはポリトープのすべてが、少なくとも１つ、または少なくとも２つの異なる細胞内位置へのポリトープの優先的な輸送となる輸送シグナルを含む（例えば、すべての発現したポリトープのうちの少なくとも７０％、より典型的には少なくとも８０％、最も典型的には少なくとも９０％は、標的化された細胞内区画において見出される）。例えば、第１のポリトープは、細胞質に向けられてもよく（追加の切断可能または切断不能なユビキチンを含んでもよい）、第２のポリトープは、エンドソームまたはリソソーム区画に向けられてもよい。または、第１のポリトープは、エンドソームもしくはリソソーム区画に向けられてもよく、第２のポリトープは、細胞膜に向けられるか、または分泌されてもよい。上で論じたように、コードされたポリトープは、任意によりリンカーによって分離された少なくとも２つのネオエピトープを含む。
【００９４】
企図される方法の少なくともいくつかでは、企図される発現構築物はまた、１つ以上の共刺激分子および／またはサイトカインをコードする配列部分を含み、また、チェックポイント阻害に干渉する／これを下方制御する１種以上の阻害タンパク質を含んでもよい。したがって、ポリトープの発現は、共刺激分子、サイトカイン、および／または阻害タンパク質の発現を伴い得る。このため、発現構築物は、ポリトープおよび共刺激分子、サイトカイン、および／または阻害タンパク質の同時発現を引き起こすために、上記配列部分に作動可能に連結された調節配列を含む。
【００９５】
容易に理解されるように、同一の（または異なる）ポリトープは、同時に、またはその後の投与において、例えば、同時に、または時間的に間隔をおいて投与される異なる発現構築物を用いて、異なる細胞内区画へ企図された方法で標的化されてもよい。結果として、および異なる区画（および細胞外空間であっても）を標的とする可能性のために、企図された組成物および方法を使用して、ＣＤ８＋偏向免疫応答（細胞傷害性Ｔ細胞の刺激）を引き起こしてもよく、ＣＤ４＋偏向免疫応答（Ｂ細胞、抗体産生およびメモリー細胞を刺激するためのＴｈ１および／またはＴｈ２サイトカインの産生）、抗体偏向免疫応答、ならびに／または刺激免疫応答（チェックポイント阻害の少なくとも部分的逆転、ならびに／またはＮＫ細胞およびＴ細胞の細胞傷害性活性の増加）を引き起こしてもよい。従って、異なる視点から見ると、患者が腫瘍に対して不十分なＮＫ細胞の活性およびＴ細胞毒性を有する場合、企図される組成物および方法を使用して、ポリトープを細胞質抗原提示経路に向けて標的化することによってこのような活性を支持するか、または増強し、こうしてＭＨＣ−Ｉ提示を増やし、ＣＤ８＋偏向免疫応答を増強してもよい。その一方で、患者が不十分なＣＤ４＋型免疫応答を有する場合、企図された組成物および方法を使用して、ポリトープをエンドソームおよび／またはリソソーム抗原提示経路に向けて標的化することによってこのような活性を支持するか、または増強し、こうしてＭＨＣ−ＩＩ提示を増やし、かつこれによりＣＤ４＋偏向免疫応答を増強してもよい。
【００９６】
本明細書で使用される場合、医薬組成物または薬物の「投与」という用語は、医薬組成物または薬物の直接投与および間接投与の両方を指し、医薬組成物または薬物の直接投与は、典型的には医療従事者（例えば、医師、看護師など）によって行われ、間接投与は、直接投与（例えば、注射、注入、経口送達、局所送達などによる）用に、医療従事者に医薬組成物または薬物を提供するか、または使用できるようにするステップを含む。最も好ましくは、組換えウイルスは、皮下注射または真皮下注射によって投与される。しかし、他の企図されている態様では、投与は静脈内注射であってもよい。代替的には、または追加的には、抗原提示細胞を、患者の細胞から単離または増殖させ、インビトロで感染させ、次いで患者に輸血してもよい。したがって、企図されたシステムおよび方法は、高度個別化癌治療のための完全な薬物送達システム（例えば、薬物送達、治療プロトコル、バリデーションなど）と考えることができることを理解されたい。
実施例
例示的な配列の配置
【００９７】
ネオエピトープ配列は、ＢＡＭファイルおよびＢＡＭサーバを用いて、例えば米国特許明細書第２０１２／００５９６７０号および米国特許明細書第２０１２／００６６００１号に開示されているように、腫瘍および正常サンプルの位置誘導同期アライメントによってインシリコで決定された。具体的には、腫瘍のＤＮＡ分析は、Ｂ１６−Ｆ１０マウスメラノーマ系統由来であり、適合する正常はＣ５７ｂｌ／６親マウスＤＮＡ由来の血液であった。結果は、この腫瘍細胞株のＲＮＡシーケンシングにより、発現のためにフィルタ処理された。発見され、発現されたネオエピトープを、マウスＭＨＣ−Ｉ（ここではＫｂ）およびＭＨＣ−ＩＩ（ここではＩ−Ａｂ）に対する結合親和性についてさらに分析した。選択された結合剤（２００ｎＭ以下の親和性を有する）は、ｄｂＳＮＰフィルタ処理のさらなるステップの後に、すべてのネオエピトープの位置順列を用いてさらに分析し、その後、ウェイトマトリックスおよびニューラルネットワーク予測によって処理して、疎水性配列またはシグナルペプチドの存在の可能性および／または強度を表すスコアを生成した。ポリトープについて、最良のスコアとなる（疎水性配列またはシグナルペプチドの可能性が最も低い）配置（図示せず）をさらなる実験に使用した。ネオエピトープは、ネオエピトープ突然変異を有する特定の遺伝子の発現強度を生じさせるＲＮＡｓｅｑまたは他の定量系における検出によって優先順位をつけた。
【００９８】
表１には、ＲＮＡｓｅｑによって決定されたときに発現させた例示的ネオエピトープを、遺伝子名、および突然変異アミノ酸、ならびに突然変異アミノ酸の位置とともに示す。＊付きの列挙したネオエピトープは、そのネオエピトープが集団の２８％において多様体Ｒｓ７１２５７４４３として生じたので、ｄｂＳＮＰフィルタ処理後に廃棄した。
【表１】
2019513021.tif 000004
【００９９】
表２は、突然変異アミノ酸の位置が変化したネオエピトープのさらなる例を示し、ＭＨＣ−Ｉ提示（９−ｍｅｒ）およびＭＨＣ−ＩＩ提示（１５−ｍｅｒ）のさらなる代替配列を示す。ＭＨＣ−ＩＩ提示のためのネオエピトープ配列を対応する核酸配列に逆翻訳した。これも表２に示す。
【表２】
2019513021.tif 000005
配列輸送
【０１００】
モデル癌：マウスＢ１６−Ｆ１０メラノーマ（Ｃ５７／Ｂｌ６マウス由来）を使用し、腫瘍を上記の腫瘍対正常の様式でスクリーニングし、発現させた突然変異エピトープをＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞株で同定した。シーケンシングデータ分析およびマウスＭＨＣＩ（Ｈ２−Ｋｂ、Ｈ２−Ｄｄ）およびＭＨＣＩＩ（Ｉ−Ａｂ）に対する結合分析を使用して、上記のように候補ネオエピトープをさらにフィルタ処理した。次いで、様々な輸送スキームを試験するために９つの異なるポリトープ構築物を調製し、ＣＭＶプロモーターの制御下で対応する組換え核酸として各構築物を調製した。各構築物は、Ｅ１およびＥ２ｂ遺伝子の欠失を有するＡｄＶ５発現ベクターにクローニングし、次いで得られた組換えウイルスを以下にさらに論ずるようにマウスのトランスフェクションに使用した。
【０１０１】
より具体的には、３つのポリトープ構築物は、ＭＨＣ−Ｉ提示のためのＭＨＣ−Ｉ結合ネオエピトープを含み、したがって、細胞質区画を標的とした。１つの構築物は未修飾Ｎ末端を有するが、別の構築物はＮ末端切断不能なユビキチンを有し、さらに別の構築物はＮ末端切断可能ユビキチンを有するものとした。ユビキチン化は、細胞質ゾル中のプロテアソームを標的化するために使用した。３つのさらなるポリトープ構築物は、ＭＨＣ−ＩＩ提示のためのＭＨＣＩ結合ネオエピトープを含み、したがって、リソソーム／エンドソーム区画を標的とした。１つの構築物がリソソーム標的配列を有し、別の構築物はリサイクリングエンドソーム標的配列を有し、さらに別の構築物はソーティングエンドソーム標的配列を有するものとした。３つの追加のポリトープ構築物は、ＭＨＣ−ＩＩ提示のためのＭＨＣＩＩ結合ネオエピトープを含み、またリソソーム／エンドソーム区画を標的とした。ここでも、１つの構築物はリソソーム標的配列を有し、別の構築物はリサイクリングエンドソーム標的配列を有し、さらに別の構築物はソーティングエンドソーム標的配列を有するものとした。これらの９つの構築物は、以下の配列の配置を有していた。
【０１０２】
以下の例示的な配列では、ＭＨＣ−Ｉ提示の場合、プロテアソーム標的化のためにユビキチン（切断可能および切断不能）を使用し、ＣＤ１ｂリーダーペプチドは、すべてのＭＨＣ−ＩＩに向けた配列に対して、細胞質ゾルからポリペプチドを輸送するために、搬出リーダーペプチドとして使用した。ＬＡＭＰ１−ＴＭ／細胞質テールは、リソソーム標的配列として使用し、ＬＡＭＰ１−ＴＭ／ＣＤ１ａテールは、リサイクリングエンドソーム標的配列として使用し、ＬＡＭＰ１−ＴＭ／ＣＤ１ｃテールは、ソーティングエンドソーム標的ドメインとして使用した。
【０１０３】
さらに、発現および提示を説明するために、上記のポリペプチドにおいて種々の内部対照も使用されたことに留意すべきである。より具体的には、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドは、ＭＨＣＩ拘束（Ｋｂ）ペプチドエピトープの内部対照として使用し、Ｅｓａｔ６ペプチドは、ＭＨＣＩＩ提示のための分泌タンパク質の内部対照として使用した。発現を検出するための内部対照エピトープとしてＦＬＡＧタグを使用し、単純なタンパク質検出のための内部対照タグとしてｃＭＹＣを使用した。
ＭＨＣ−Ｉ提示（プロテアソーム、細胞質標的を通る輸送）に向けられたＭＨＣ−Ｉエピトープのための例示的構築物：
ポリエピトープのみ：12aa-Am-12aa-AAAA-12aa-Bm-12aa-AAAA-(12aa-Xm-12aa-AAAA)n-SIINFEKL-AAAA-Esat6-cMYC。図５Ａは、ＳＩＩＮＦＥＫＬモチーフを下線で示し、Ｅｓａｔ６モチーフをイタリックで示し、ｃＭＹモチーフを太字フォントで示す配置のポリペプチド構造を例示的に示す。図５Ａのヌクレオチド配列は配列番号９であり、図５Ａのポリペプチド配列は配列番号１２である。
【０１０４】
ポリエピトープおよび切断可能なユビキチンＧＧＲ  Ｎ末端：ユビキチン-GGR-12aa-Am-12aa-AAAA-12aa-Bm-12aa-AAAA-(12aa-Xm-12aa-AAAA)n-SIINFEKL-AAAA-Esat6-cMYC。図５Ｂは、切断可能ユビキチン部分をイタリックおよび下線で示し、ＳＩＩＮＦＥＫＬモチーフを下線で示し、Ｅｓａｔ６モチーフをイタリックで示し、ｃＭＹモチーフを太字フォントで示す配置のポリペプチド構造を例示的に示す。図５Ｂのヌクレオチド配列は配列番号１０であり、図５Ｂのポリペプチド配列は配列番号１３である。
【０１０５】
ポリエピトープおよび切断不能ユビキチンＧ  Ｎ末端：ユビキチン-G-12aa-Am-12aa-AAAA-12aa-Bm-12aa-AAAA-(12aa-Xm-12aa-AAAA)n-SIINFEKL-AAAA-Esat6-cMYC。図５Ｃは、切断可能ユビキチン部分をイタリックおよび下線で示し、ＳＩＩＮＦＥＫＬモチーフを下線で示し、Ｅｓａｔ６モチーフをイタリックで示し、ｃＭＹモチーフを太字フォントで示す配置のポリペプチド構造を例示的に示す。図５Ｃのヌクレオチド配列は配列番号１１であり、図５Ｃのポリペプチド配列は配列番号１４である。
ＭＨＣ−ＩＩ提示（細胞質からの搬出、エンド／リソソームによる輸送）に向けられたＭＨＣ−Ｉエピトープのための例示的構築物：
【０１０６】
Ｋｂエピトープペプチドのリソソーム標的化：（ＣＤ１ｂリーダーペプチド)-20aa-Am-20aa-GPGPG-20aa Bm-20aa-GPGPG-(20aa-Xm-20aa-GPGPG-)n-Esat6-FlagTag-LAMP1TM/細胞質テール。図６Ａは、ＣＤ１ｂリーダーペプチド部分を太字で示し、Ｅｓａｔ６モチーフを下線で示し、Ｆｌａｇタグモチーフをイタリックで示し、ＬＡＭＰ１ＴＭ／細胞質テールが太字／下線のフォントである配置のポリペプチド構造を例示的に示す。図６Ａのヌクレオチド配列は配列番号１５であり、図６Ａのポリペプチド配列は配列番号１８である。
【０１０７】
Ｋｂエピトープペプチドのリサイクリングリソソームの標的化：（ＣＤ１ｂリーダーペプチド)-20aa-Am-20aa-GPGPG-20aa Bm-20aa-GPGPG-(20aa-Xm-20aa-GPGPG-)n-Esat6-FlagTag-LAMP1TM/CD1aテール。図６Ｂは、ＣＤ１ｂリーダーペプチド部分を太字で示し、Ｅｓａｔ６モチーフを下線で示し、Ｆｌａｇタグモチーフをイタリックで示し、ＬＡＭＰ１ＴＭモチーフを太字／下線タイプのフォントで示し、ＣＤ１ａ標的化モチーフを下線／斜体で示す配置のペプチド構造を例示的に示す。図６Ｂのヌクレオチド配列は配列番号１６であり、図６Ｂのポリペプチド配列は配列番号１９である。
【０１０８】
Ｋｂエピトープペプチドのソーティングエンドソームの標的化：（ＣＤ１ｂリーダーペプチド)-20aa-Am-20aa-GPGPG-20aa Bm-20aa-GPGPG-(20aa-Xm-20aa-GPGPG-)n-Esat6-FlagTag-LAMP1TM/CD1cテール。図６Ｃは、ＣＤ１ｂリーダーペプチド部分を太字で示し、Ｅｓａｔ６モチーフを下線で示し、Ｆｌａｇタグモチーフをイタリックで示し、ＬＡＭＰ１ＴＭモチーフを太字／下線タイプのフォントで示し、ＣＤ１ｃ標的化モチーフを下線／斜体で示す配置のペプチド構造を例示的に示す。図６Ｃのヌクレオチド配列は配列番号１７であり、図６Ｃのポリペプチド配列は配列番号２０である。
ＭＨＣ−ＩＩ提示（細胞質からの搬出、エンド／リソソームによる輸送）に向けられたＭＨＣ−ＩＩエピトープのための例示的構築物：
【０１０９】
ＩＡｂエピトープペプチドのリソソーム標的化：（ＣＤ１ｂリーダーペプチド)-20aa-Am-20aa-GPGPG-20aa Bm-20aa-GPGPG-(20aa-Xm-20aa-GPGPG-)n-Esat6-FlagTag-LAMP1TM/細胞質テール。図７Ａは、ＣＤ１ｂリーダーペプチド部分を太字で示し、ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびＥｓａｔ６モチーフを下線で示し、Ｆｌａｇタグモチーフをイタリックで示し、ＬＡＭＰ１ＴＭ／細胞質テールが太字／下線のフォントである配置のポリペプチド構造を例示的に示す。図７Ａのヌクレオチド配列は配列番号２１であり、図７Ａのポリペプチド配列は配列番号２４である。
【０１１０】
ＩＡｂエピトープペプチドのリサイクリングリソソームの標的化：（ＣＤ１ｂリーダーペプチド)-20aa-Am-20aa-GPGPG-20aa Bm-20aa-GPGPG-(20aa-Xm-20aa-GPGPG-)n-Esat6-FlagTag-LAMP1TM/CD1aテール。図７Ｂは、ＣＤ１ｂリーダーペプチド部分を太字で示し、ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびＥｓａｔ６モチーフを下線で示し、Ｆｌａｇタグモチーフをイタリックで示し、ＬＡＭＰ１ＴＭモチーフを太字／下線タイプのフォントで示し、ＣＤ１ａテールは太字／イタリックで示す配置のポリペプチド構造を例示的に示す。図７Ｂのヌクレオチド配列は配列番号２２であり、図７Ｂのポリペプチド配列は配列番号２５である。
【０１１１】
ＩＡｂエピトープペプチドのソーティングエンドソームの標的化：（ＣＤ１ｂリーダーペプチド)-20aa-Am-20aa-GPGPG-20aa Bm-20aa-GPGPG-(20aa-Xm-20aa-GPGPG-)n-Esat6-FlagTag-LAMP1TM/CD1cテール。図７Ｃは、ＣＤ１ｂリーダーペプチド部分を太字で示し、ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびＥｓａｔ６モチーフを下線で示し、Ｆｌａｇタグモチーフをイタリックで示し、ＬＡＭＰ１ＴＭモチーフを太字／下線タイプのフォントで示し、ＣＤ１ｃテールは太字／イタリックで示す配置のポリペプチド構造を例示的に示す。図７Ｃのヌクレオチド配列は配列番号２３であり、図７Ｃのポリペプチド配列は配列番号２６である。
インビボワクチン接種
【０１１２】
図８は、９つの群のＣ５７ｂｌ／６マウスを、実質的に上記の配列配置を含む９つの異なる組換えＡｄ５ウイルスで免疫化した例示的なインビボワクチン接種実験を描写する。免疫化は、図８に概略的に示される、別々の動物群の異なる経路（皮下および静脈内）による隔週の投与スケジュールに従って行った。Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞による腫瘍チャレンジは４２日目に行い、続いてＭ２マクロファージ抑制薬（ＲＰ１８２）およびＩＬ−１５スーパーアゴニスト（Ａｌｔ−８０３）を投与した。図９Ａ〜９Ｃは皮下投与の例示的結果を描写し、図１０Ａ〜１０Ｃは静脈内投与の例示的結果を描写する。
【０１１３】
特に、細胞質およびＭＨＣ−Ｉ提示に向けられたクラスＩポリトープをコードするアデノウイルスの皮下注射は、ユビキチン化の有無にかかわらず（図９Ａから取り除くことができる）、有意な免疫防御をもたらすことはなかった。その一方で、クラスＩポリトープがＭＨＣ−ＩＩによるプロセシングおよび提示のために、エンドソームおよびリソソーム区画に向けられた場合、図９Ｂから明らかなように、リサイクリングエンドソーム区画およびリソソーム区画へ方向に向かっていくらかの防御免疫が観察された。ＭＨＣ−ＩＩによるプロセシングおよび提示のために、クラスＩＩポリトープがエンドソームおよびリソソーム区画に向けられた場合、さらに強力な免疫保護が観察された。ここでは、図９Ｃに示すように、リソソームおよびソーティングエンドソーム区画について最も強い保護が観察された。
【０１１４】
静脈注射を介してではあるが、同じウイルス構築物により免疫化を行った場合、図１０Ａから分かるように、ポリトープが切断可能なユビキチンを含む細胞質に向けられたクラスＩネオエピトープについてネオエピトープワクチン接種の保護効果が観察され、ポリトープが切断不能ユビキチンを含む場合、若干の保護効果が観察された。注目すべきことに、クラスＩポリトープがエンドソームおよびリソソーム区画に向けられた場合、図１０Ｂに示すように、すべてのワクチン接種においてより強い保護効果が観察された。さらに、ＭＨＣ−ＩＩによるプロセシングおよび提示のために、クラスＩＩポリトープがエンドソームおよびリソソーム区画に向けられた場合、さらに強力な保護効果が観察された。ここでは、図１０Ｃのグラフに示すように、リサイクリングおよびソーティングエンドソーム区画では最も強い保護が観察された。
【０１１５】
本明細書における値の範囲の列挙は、範囲内に入る個々の値ごとに個々に言及する簡略な方法として役立つことを意図するに過ぎない。本明細書中で他に示されない限り、個々の各値は、本明細書中に個別に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書中で他に指示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書の特定の実施形態に関して提供される任意のおよびすべての実施例、または例示的言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図するものであり、他に請求される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に不可欠な任意の請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【０１１６】
本明細書の発明概念から逸脱することなく、既に記述した以外の多くのさらなる変更が可能であることは、当業者には明らかであるものとする。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲を除いて限定されるものではない。さらに、明細書および特許請求の範囲の両方を解釈するにあたり、すべての用語は、文脈と一致する最も広い可能な様式で解釈されるべきである。特に、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、要素、構成成分またはステップを非排他的な様式で参照するものと解釈され、参照された要素、構成成分またはステップが存在するか、利用されているか、または明示的に参照されていない他の要素、構成成分、またはステップと組み合わせたものであってもよいことを示す。明細書の請求項が、Ａ、Ｂ、Ｃ．．．Ｎからなる群から選択されたもののうちの少なくとも１つを指す場合、Ａ＋Ｎ、Ｂ＋Ｎなどではなく、その群の要素を１つのみ必要としていると解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年12月7日(2018.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫療法のための組換え発現ベクターであって、
ポリトープを発現させるためにプロモーターに作動可能に連結された前記ポリトープをコードする配列を含み、
前記ポリトープは、細胞質、リサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、リソソームおよび細胞外膜からなる群から選択される細胞内の位置に前記ポリトープを向ける輸送エレメントを含むか、または前記輸送エレメントにより前記ポリトープが細胞外空間に向けられており、
前記ポリトープが、複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列を含む、
ベクター。
【請求項２】
前記組換え発現ベクターが、Ｅ１およびＥ２ｂ遺伝子が欠失しているアデノウイルス発現ベクターである、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記プロモーターが、構成的プロモーターであるか、または低酸素、ＩＦＮ−ガンマもしくはＩＬ−８によって誘導可能である誘導性プロモーターである、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
前記輸送エレメントが、切断可能なユビキチン、切断不能なユビキチン、ＣＤ１ｂリーダー配列、ＣＤ１ａテール、ＣＤ１ｃテール、およびＬＡＭＰ１膜貫通配列からなる群から選択される、または
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列は、同じ患者の腫瘍と適合する正常とを比較することによってフィルタ処理される、または
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列が、２００ｎＭ以下のＭＨＣ複合体に対する結合親和性を有するようにフィルタ処理される、または
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列が、既知のヒトＳＮＰおよび体細胞多様体に対してフィルタ処理される、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項５】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列は、前記ポリトープが、所定の閾値未満である疎水性配列またはシグナルペプチドの存在の可能性および／または強度を有するように前記ポリトープ内に配置を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項６】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列がＭＨＣ−Ｉに結合し、前記輸送エレメントが前記ポリトープを細胞質またはプロテアソームに向ける、請求項１〜５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項７】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列がＭＨＣ−Ｉに結合し、前記輸送エレメントが前記ポリトープをリサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソームまたはリソソームに向ける、請求項１〜５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８】
前記フィルタ処理されたネオエピトープ配列がＭＨＣ−ＩＩに結合し、前記輸送エレメントが前記ポリトープをリサイクリングエンドソーム、ソーティングエンドソーム、またはリソソームに向ける、請求項１〜５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９】
組換え核酸が、第２のポリトープをコードする配列をさらに含み、前記第２のポリトープが、前記第２のポリトープを異なる細胞内位置に向ける第２の輸送エレメントを含み、前記第２のポリトープが、第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１０】
前記複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちの少なくともいくつかと前記第２の複数のフィルタ処理されたネオエピトープ配列のうちのいくつかが同一である、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
組換え核酸が、共刺激分子、免疫刺激性サイトカイン、およびチェックポイント阻害に干渉するかチェックポイント阻害を下方制御するタンパク質、のうちの少なくとも１つをコードする配列をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２】
前記共刺激分子が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ−Ｌ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＴＬ１Ａ、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３からなる群から選択される、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
前記免疫刺激性サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＡＬＴ８０３）、ＩＬ−２１、ＩＰＳ１、およびＬＭＰ１からなる群から選択される、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１４】
前記チェックポイント阻害に干渉するタンパク質が、抗体またはＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ１受容体、２Ｂ４またはＣＤ１６０のアンタゴニストである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のベクターを含む、組換えウイルス。
【請求項１６】
前記ウイルスが複製欠損ウイルスである、請求項１５に記載の組換えウイルス。
【請求項１７】
前記ウイルスがアデノウイルスである、請求項１５または１６に記載の組換えウイルス。
【請求項１８】
前記アデノウイルスが欠失Ｅ１およびＥ２ｂ遺伝子を有する、請求項１７に記載の組換えウイルス。
【請求項１９】
請求項１５に記載の組換えウイルスを含む、医薬組成物。
【請求項２０】
注射用または鼻腔内投与用に製剤化された、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
癌の治療のための医薬品の製造における、請求項１５に記載の組換えウイルスの使用。
【請求項２２】
免疫療法のためのポリトープを生成する方法であって、
複数のネオエピトープ配列を得ることと、
それぞれが前記複数のネオエピトープ配列の別の線状配置を有する、ポリトープ配列のセットを生成することと、
前記ポリトープ配列の各々について、疎水性配列またはシグナルペプチドの存在の可能性および／または強度を表すスコアを計算することと、
前記スコアを使用して前記ポリトープ配列をランク付けし、前記ランクを基準にして、前記複数のネオエピトープ配列の前記線状配置を選択することと、
を含む方法。
【請求項２３】
前記スコアは、ウェイトマトリックス行列およびニューラルネットワーク予測のうちの少なくとも１つを使用して計算される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ネオエピトープ配列が、ＭＨＣ結合強度、既知のヒトＳＮＰおよび体細胞多様体、ならびに同じ患者の腫瘍と適合する正常との比較、のうちの少なくとも１つによってフィルタ処理される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリトープ配列の各々が、少なくとも５つのネオエピトープ配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019513021000001.app
【国際調査報告】
2019513021.tif 000022
2019513021.tif 000023
2019513021.tif 000024
2019513021.tif 000025