(57)【要約】  本発明は、光遺伝学的阻害剤をコードする異種核酸を含む光受容体前駆細胞に関する。また、本発明は、本発明の光受容体前駆細胞と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物にも関する。本発明は、網膜変性疾患、好ましくは光受容体の機能喪失又は死に関連する網膜変性疾患の処置に使用するための本発明の光受容体前駆細胞又は医薬組成物に関する。最後に、本発明は、ｉ）光受容体前駆細胞を提供するステップと、ｉｉ）該前駆細胞に光遺伝学的阻害剤をコードする核酸を導入するステップとを含む、本発明の光受容体前駆細胞を作製する方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光遺伝学的阻害剤をコードする異種核酸を含む単離した光受容体前駆細胞。
【請求項２】
前記光遺伝学的阻害剤は、光に暴露すると細胞を過分極させ、好ましくは光ゲート式イオンポンプである、請求項１に記載の光受容体前駆細胞。
【請求項３】
前記異種核酸は、特異的光受容体プロモーターと操作可能に連結される、請求項１又は２に記載の光受容体前駆細胞。
【請求項４】
前記異種核酸は、組換えウイルスベクター、より好ましくはアデノ随伴ウイルスに含まれる、請求項１〜３のいずれかに記載の光受容体前駆細胞。
【請求項５】
前記光遺伝学的阻害剤は、ハロロドプシン、アーキロドプシン−３（ＡＲ−３）、アーキロドプシン（Ａｒｃｈ）、バクテリオロドプシン、プロテオロドプシン、キサントロドプシン、レプトスフェリアマクランス真菌オプシン（Ｍａｃ）、及びＪａｗｓからなる群から選択され、好ましくはハロロドプシン及びＪａｗｓから選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の光受容体前駆細胞。
【請求項６】
前記光受容体前駆細胞は、幹細胞、より好ましくは誘導多能性幹細胞の分化によって得られる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の光受容体前駆細胞。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の光受容体前駆細胞と薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項８】
前記組成物は眼内注入用に製剤化される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
網膜変性疾患、好ましくは光受容体の機能喪失又は死に関連する網膜変性疾患の処置に使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の光受容体前駆細胞又は請求項７若しくは８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記細胞又は前記組成物は、眼内注入、より好ましくは目の網膜下腔に注入することで、投与を必要とする対象に投与される、請求項９に記載の使用のための光受容体前駆細胞又は医薬組成物。
【請求項１１】
前記網膜変性疾患は、黄斑変性、網膜色素変性、錐体ジストロフィー、アッシャー症候群、桿体ジストロフィー、桿体−錐体ジストロフィー、全色盲、及びバルデー・ビードル症候群からなる群より選択される、請求項９又は１０に記載の使用のための光受容体前駆細胞又は医薬組成物。
【請求項１２】
前記疾患は網膜色素変性である、請求項９〜１１のいずれかに記載の使用のための光受容体前駆細胞又は医薬組成物。
【請求項１３】
光受容体変性の進行期にある患者における、請求項９〜１２のいずれかに記載の使用のための光受容体前駆細胞又は医薬組成物。
【請求項１４】
ｉ）光受容体前駆細胞を提供するステップと、ｉｉ）前記前駆細胞に光遺伝学的阻害剤をコードする核酸を導入するステップとを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の光受容体前駆細胞を作製するインビトロの方法。
【請求項１５】
ステップｉ）で提供される前記光受容体前駆細胞は、幹細胞の分化、好ましくは網膜変性疾患に罹患する患者の体細胞から得た成体幹細胞又は誘導多能性幹細胞の分化によって得られる、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野、特に網膜変性疾患の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
光受容体の減少につながる網膜変性疾患は、先進国における治療不能な失明の主要な原因である。後期段階の網膜回復に対して考えられる方法は、電気的網膜インプラント、及び細胞置換療法（幹細胞による方法）又は光遺伝学などの新しい取り組みを含むものである。
【０００３】
光受容体前駆細胞を使用する細胞置換療法は、網膜色素変性又は加齢黄斑変性などの失明する疾患における変性光受容体の置換を可能にする。しかしながら、細胞置換療法の主要な問題は、移植した光受容体が光感受性外節の健康な光受容体に成長する必要があるということである。Ｂａｒｂｅｒ等は、緩徐な網膜変性（Gnat1-/-）の野生型マウスモデルにおいて、光受容体移植後に視機能回復を示したが、急激で重篤な変性モデル（例えばPDE6βrd1/rd1）では細胞置換方法はより困難であることを示した(Barber AC等、Proc Natl AcadSci USA. 2013 Jan 2;110(1):354-9)。これらの動物モデルにおいて、移植前駆細胞は、既存の病気の網膜に良好に取り込まれることができず、光感受性外節の正常で健康な光受容体に成長せず、つまり、機能しているとは考えられない。
【０００４】
未熟な光受容体前駆体が機能的外節を作り出す能力は、生理学的状態、特にグリア性瘢痕及び受容者の病気の網膜の外層膜（outer layer membrane、OLM）における変化に多くを依存している（Barber AC等、 Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Jan 2;110(1):354-9）。光感受性外節の成長及び維持は、光受容体外節と網膜色素上皮（ＲＰＥ）との密接な接触を要求する非常に複雑なプロセスである。重要なことは、ＲＰＥは光受容体に栄養分を供給し、これが外節の更新（ディスクシェディング）に重要であるということである。最後に、ＲＰＥは、オールトランスレチノールから視物質の発色団である１１−シスレチナールへの変換に必須であるので、視サイクル（発色団再生）にとって重要なものである。
【０００５】
あるいはまた、網膜内層細胞に光感受性を与えることで視機能を回復するために、光遺伝学的ツールが使用される。遺伝子的にコードした光感受性タンパク質を、ウイルスベクターを介して、双極細胞若しくは網膜神経節細胞、又は「休止状態の」錐体に導入する。この方法は、残りの細胞の機能を回復できるのみであって変性神経構造を再生できないことから、いずれにしても限定的である。
ゆえに、特に疾患の進行期にある患者において、光受容体の減少につながる網膜変性疾患を処置する改善された方法が大きく求められている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、細胞置換方法を光遺伝学的方法と組み合わせることで、網膜変性疾患の処置が、特に疾患の進行期にある患者において著しく改善できることを示した。その方法は、移植前に、光受容体前駆体に光遺伝学的阻害剤（例えばハロロドプシン又はＪａｗｓ）を導入することである。この光遺伝学的ツールを発現する細胞を照射することで過分極させて、光に対する健康な光受容体の機能を再現する。この方法の主な利点は、取り込まれた光受容体が、正常に成長した外節も有さずに光遺伝的阻害剤によって視機能を回復するだけでなく、神経変性構造の再生も行うということである。さらに、これらの光遺伝学的に形質転換した光受容体は、ＲＰＥと光受容体細胞との間のレチノイド類似体のサイクルを必要としない。
【０００７】
したがって、第１の態様において、本発明は、光遺伝学的阻害剤をコードするとともに、好ましくは特異的光受容体プロモーターに操作可能に連結する異種核酸を含む、光受容体前駆細胞、好ましくは単離光受容体前駆細胞に関する。
【０００８】
好ましくは、該異種核酸は、組換えウイルスベクター、より好ましくはアデノ随伴ウイルスに含まれる。
【０００９】
好ましくは、該光遺伝学的阻害剤は、ハロロドプシン、アーキロドプシン−３（AR-3）、アーキロドプシン（Arch）、バクテリオロドプシン、プロテオロドプシン、キサントロドプシン、レプトスフェリアマクランス真菌オプシン（Mac）、及びＪａｗｓからなる群から選択され、より好ましくはハロロドプシン及びＪａｗｓから選択される。
【００１０】
好ましくは、該光受容体前駆細胞は、幹細胞、より好ましくは誘導多能性幹細胞の分化によって得られる。
【００１１】
第２の態様において、本発明は、本発明の光受容体前駆細胞と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。好ましくは、該組成物は眼内注入用に製剤化される。
【００１２】
第３の態様において、本発明は、網膜変性疾患、好ましくは光受容体の機能喪失又は死に関連する網膜変性疾患の処置に使用するための本発明の光受容体前駆細胞又は医薬組成物に関する。
【００１３】
好ましくは、該細胞又は組成物は、眼内注入、より好ましくは目の網膜下腔に注入することで、それを必要とする対象に投与される。
【００１４】
好ましくは、網膜変性疾患は、黄斑変性、網膜色素変性、錐体ジストロフィー、アッシャー症候群、桿体ジストロフィー、桿体−錐体ジストロフィー、全色盲、及びバルデー・ビードル症候群からなる群から選択される。
【００１５】
好ましくは、本発明の光受容体前駆細胞又は医薬組成物で処置される患者は、光受容体変性の進行期にある患者である。
【００１６】
最後の態様において、本発明は、ｉ）光受容体前駆細胞を提供するステップと、ｉｉ）該前駆細胞に光遺伝学的阻害剤をコードする核酸を導入するステップとを含む、本発明の光受容体前駆細胞を作製する方法に関する。
【００１７】
好ましくは、ステップｉ）で提供される光受容体前駆細胞は、幹細胞の分化、より好ましくは成体幹細胞又は誘導多能性幹細胞の分化によって得られる。特に、光受容体前駆細胞は、網膜変性疾患に罹患した患者の体細胞、例えば線維芽細胞から得た誘導多能性幹細胞によって得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、マウス（上段）又はｈｉＰＳＣ（下段）由来の光遺伝学的に形質転換した光受容体の概略図である。上段では、新生仔野生型マウス（Ｐ２）の目に、ロドプシンプロモーターの制御下でＮｐＨＲをコードするウイルスベクター（AAV-hRho-NpHR-GFP）を注入した。Ｐ４に、網膜を切開し、光受容体特異的マーカーを使用して光受容体前駆体を選別した。そして、これらの採取した細胞を網膜下注入により失明マウスに移植した。下段では、ヒトｉＰＳＣを網膜オルガノイドに分化させた。錐体アレスチンプロモーターの制御下でＪａｗｓ遺伝子を有するウイルスベクター（AAV-mCar-Jaws-GFP）を網膜オルガノイドに感染させた。さらに成熟させた後、細胞を解離し、ｉＰＳＣ由来光受容体を網膜下注入により失明マウスに移植した。
【図２Ａ−Ｆ】図２は、ハロロドプシンを発現する取り込んだ移植光受容体前駆体は光に反応することを示す。Ａ〜ＤはＣｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−モデルであり、Ｅ〜Ｇはｒｄ１モデルである。Ａ、Ｅは、１×１０１６ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１の強度における５９０ｎｍの光による２回連続フラッシュで刺激したＮｐＨＲ発現光受容体前駆体の光誘発反応を示す（上部は電流反応、下部は電圧反応）。Ｂ、Ｆは、様々な波長で刺激したＮｐＨＲ発現細胞に対応する光電流作用スペクトルを示す。２５ｎｍのステップによって隔てられた４００ｎｍ〜６５０ｎｍの範囲の刺激を３．５×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１で使用した。５７５ｎｍで最大反応を得た。Ｃは、Ｂと同様だが、３５０ｎｍ〜６８０ｎｍの連続的な「虹」刺激で行った。Ｄ、Ｇは、刺激周波数の増大における（２Ｈｚ〜２５Ｈｚ、３．５×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）ＮｐＨＲ誘導光電流の変調によって時間特性を示し、２５Ｈｚについて拡大トレースを示す。Ｈは、ＮｐＨＲ光受容体前駆体を移植したＣｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−モデルとｒｄ１モデルとの光反応特性の比較を示す。Ｋは反応振幅の比較である。平均光電流ピークは電圧クランプ構成において−４０ｍＶで得られ（左上）、又は平均ピーク電圧反応は電流クランプ構成（電流ゼロ）において得られた（右上）。５９０ｎｍ及び１×１０１６ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１における、（電流クランプ「ゼロ」構成の）２つのモデルの移植細胞の立上り及び減衰時定数の比較を示す（下部）。
【図２Ｇ−Ｈ】図２は、ハロロドプシンを発現する取り込んだ移植光受容体前駆体は光に反応することを示す。Ａ〜ＤはＣｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−モデルであり、Ｅ〜Ｇはｒｄ１モデルである。Ａ、Ｅは、１×１０１６ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１の強度における５９０ｎｍの光による２回連続フラッシュで刺激したＮｐＨＲ発現光受容体前駆体の光誘発反応を示す（上部は電流反応、下部は電圧反応）。Ｂ、Ｆは、様々な波長で刺激したＮｐＨＲ発現細胞に対応する光電流作用スペクトルを示す。２５ｎｍのステップによって隔てられた４００ｎｍ〜６５０ｎｍの範囲の刺激を３．５×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１で使用した。５７５ｎｍで最大反応を得た。Ｃは、Ｂと同様だが、３５０ｎｍ〜６８０ｎｍの連続的な「虹」刺激で行った。Ｄ、Ｇは、刺激周波数の増大における（２Ｈｚ〜２５Ｈｚ、３．５×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）ＮｐＨＲ誘導光電流の変調によって時間特性を示し、２５Ｈｚについて拡大トレースを示す。Ｈは、ＮｐＨＲ光受容体前駆体を移植したＣｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−モデルとｒｄ１モデルとの光反応特性の比較を示す。Ｋは反応振幅の比較である。平均光電流ピークは電圧クランプ構成において−４０ｍＶで得られ（左上）、又は平均ピーク電圧反応は電流クランプ構成（電流ゼロ）において得られた（右上）。５９０ｎｍ及び１×１０１６ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１における、（電流クランプ「ゼロ」構成の）２つのモデルの移植細胞の立上り及び減衰時定数の比較を示す（下部）。
【図３】図３は、ＣＰＦＬマウスモデルの単離網膜におけるＧＦＰ陽性移植細胞のライブイメージングを示す。Ａは、全組織標本網膜に注入した２０日後の移植光受容体細胞の落射蛍光画像である（光受容体側が上）。白色矢印は小球とみなされる（シナプス出力）移植細胞を示す。Ｂは、移植細胞の密度を示し、光遺伝発現はＰＲ膜に限定されたことを示す２光子ライブ画像である。
【図４】図４において、移植光受容体のハロロドプシン誘発反応は、網膜神経節細胞に伝達される。Ａ〜Ｃは、移植したＣｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−マウスにおいて記録したＰＳＴＨ（刺激前後時間ヒストグラム）及びラスタープロットとして示される多電極アレイ（ＭＥＡ）記録から得た平均スパイク反応を表す（５８０ｎｍ、１．２４×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）。Ａは、オン反応（左）、オフ反応（中央）、又はオン・オフ反応（右）のいずれかで反応する３つのＲＧＣの代表的なトレースを示す。Ｂは、Ｌ−ＡＰ４での灌流前（左）及びＬ−ＡＰ４での灌流時のオン反応を示す細胞の代表的なＰＳＴＨ及びラスタープロットを示す。右に示すような洗浄後の反応と比較して、中央に示すようにＬ−ＡＰ４の適用によりオン型双極細胞反応を特異的に遮断する。ＰＳＴＨは、１０反復を超えて単一細胞に対して計算した平均として示され、同じ細胞のラスタープロットを下に示す。Ｃは、ＧＦＰのみを発現する光受容体前駆細胞を移植したコントロールの網膜の非反応細胞から記録した代表的なＰＳＴＨ及びラスタープロットを示す。Ｄは、移植したｒｄ１マウスにおいて記録したＰＳＴＨ（刺激前後時間ヒストグラム）及びラスタープロットとして示される多電極アレイ（ＭＥＡ）記録から得た平均スパイク反応を示し（５８０ｎｍ、１．２４×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）、オン反応（左）、オフ反応（中央）、又はオン・オフ反応（右）のいずれかで反応する３つのＲＧＣの代表的なトレースを表す。
【図５】図５において、移植光受容体のハロロドプシン誘発反応により、失明マウスの光回避挙動を引き起こす。Ａは、マウスの光回避挙動を測定するために使用した明暗ボックステストの概略図を示す。Ｂは、明るい区画で過ごした時間のパーセンテージを示す。コントロール群は、非注入Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−マウス、ＧＦＰ発現細胞を移植、Ｎ＝９であり、ハロロドプシン群は、ＮｐＨＲ−ＹＦＰ発現細胞を移植、Ｎ＝１２であり、野生型群は、非注入野生型マウスである。各群に対して平均±標準誤差を示す。２．１１×１０１５ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１の照度を使用した。
【図６】図６において、光遺伝学的刺激が失明ｒｄ１０マウスの移植光受容体においてハロロドプシン誘導光反応を誘発する。Ａは、５９０ｎｍの光及び１．３×１０１６ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１の強度の２回連続フラッシュで刺激したハロロドプシン発現細胞の膜電位過分極の代表的な例を示す。Ｂは、刺激波長の関数としてのハロロドプシン誘導光電流を示す。２５ｎｍのステップによって隔てられた４００ｎｍ〜６５０ｎｍの範囲の刺激を使用した（１．３×１０１６ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）。５５０〜５７５ｎｍで最大反応を得た。Ｃは、Ｂと同様だが、３５０ｎｍ〜６８０ｎｍの連続的な「虹」刺激で行った（電流クランプ）。Ｄは、刺激周波数の増大における（２Ｈｚ〜２５Ｈｚ、１．３×１０１６ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）ハロロドプシン誘導膜過分極の変調によって時間特性を示す。Ａ〜Ｄのすべてのトレースは、ホールセルパッチクランプ記録技術を使用して得た。
【図７】図７は、ｒｄ１０マウスモデルの単離網膜におけるＧＦＰ陽性移植細胞のライブイメージングを示す。Ａは、全組織標本網膜に注入した２０日後の移植光受容体細胞の落射蛍光画像である（光受容体側が上）。白色矢印（右）は小球とみなされる（シナプス出力）移植細胞を示す。Ｂは、移植細胞の密度を示し、光遺伝発現はＰＲ膜に限定されたことを示す２光子ライブ画像である（左、矢印）。一部の移植細胞は良好な延長性を示した（右、矢印）。
【図８】図８において、光遺伝学的刺激はドナー細胞においてハロロドプシン誘導光反応を誘発する。Ａは、５９０ｎｍの光及び１．３×１０１６ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１の強度の２回連続フラッシュで刺激したハロロドプシン発現細胞の膜電位過分極の代表的な例を示す。Ｂは、刺激波長の関数としてのハロロドプシン誘導光電流（上）又は膜過分極（下）を示す。２５ｎｍのステップによって隔てられた４００ｎｍ〜６５０ｎｍの範囲の刺激を使用した（１．３×１０１６ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）。５７５ｎｍで最大反応を得た。Ｃは、刺激周波数の増大における（２Ｈｚ〜２５Ｈｚ、１．３×１０１６ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）ハロロドプシン誘導光電流（上）及び膜過分極（下）の変調を示す。２５Ｈｚについて、拡大したトレースを示す。Ａ〜Ｃのすべてのトレースは、ホールセルパッチクランプ記録技術を使用して得た。
【図９】図９は、ドナーの単離網膜におけるＧＦＰ陽性細胞のライブイメージングを示す。Ａは、全組織標本網膜にＡＡＶ注入した２０日後の光受容体細胞の落射蛍光画像である（光受容体側が上）。蛍光は細胞膜に限定された。Ｂは、蛍光ドナー細胞の高密度を示し、光遺伝発現はＰＲ膜に限定されることを示す２光子ライブ画像である。
【図１０】図１０において、網膜オルガノイドにおけるＪａｗｓを発現するＡＡＶ形質導入ｈｉＰＳ細胞において光遺伝学的刺激が光反応を誘発する。Ａは、５９０ｎｍの光及び３．５×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１の強度の２回連続フラッシュで刺激したＪａｗｓ発現細胞の光電流の代表的な例である細胞の典型的な光反応を示す。Ｂは、刺激波長の関数としてのＪａｗｓ誘導光電流（上）及び過分極（下）を示す。２５ｎｍのステップによって隔てられた４００ｎｍ〜６５０ｎｍの範囲の刺激を使用した（１．３×１０１６ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）。５７５ｎｍで最大反応を得た。Ｃは、刺激周波数の増大における（２Ｈｚ〜２５Ｈｚ、３．５×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）Ｊａｗｓ誘発膜光電流（上）及び過分極（下）の変調によって時間特性を示し、２５Ｈｚについて拡大トレースを示す。Ｂ〜Ｄのすべてのトレースは、ホールセルパッチクランプ記録技術を使用して得た。
【図１１】図１１は、様々な倍率での網膜オルガノイドにおけるＧＦＰ陽性細胞のライブイメージングを示す。観察された蛍光は、Ｊａｗｓ発現がＰＲ膜に限定されることを示す（２光子ライブ画像）。
【図１２】図１２は、Ｊａｗｓ陽性光受容体単層の形成（Ａ〜Ｂ）、７０日目の網膜オルガノイドの解離から得たＤ１００単層培養物の明視野画像（Ｃ）、ＧＦＰ（Ｃ）、ＤＡＰＩ（Ｄ）、光受容体マーカーリカバリン（Ｅ）、３チャンネルの統合（Ｆ）に対して染色した７０日目の網膜オルガノイドの解離から得たＤ１００単層培養物の免疫蛍光を示す。スケールバーは、Ａ〜Ｂは１０μｍ、Ｃ〜Ｆは５０μｍである。
【図１３】図１３において、Ａは、Ｊａｗｓ（ＧＦＰ）及びＣＲＸ、Ｊａｗｓ及びＲＣＶＮ、Ｊａｗｓ及びＰＤＥ６Ｃ、並びにＪａｗｓ及びＲ／Ｇオプシンを標識する感染網膜オルガノイドを移植した１００日齢のｒｄ１０マウスの網膜切片への免疫染色、Ｂは、Ｊａｗｓ（ＧＦＰ）及びＰＫＣＡ、Ｊａｗｓ及びＲＩＢＥＹＥを標識する移植した１００日齢のｒｄ１０マウスの網膜切片への免疫染色を示す。
【図１４】図１４は、９０日齢ｒｄ１０マウスの明暗ボックス挙動テストを示す。Ａは、非移植ｒｄ１０マウス（ｎ＝１２）、単眼移植ｒｄ１０マウス（ｎ＝１０）、両眼移植ｒｄ１０マウス（ｎ＝３）における（Ｂ）、光条件の明るいボックスで過ごした時間（％）を表す。*：ｐ＜０．００７０及び**：ｐ＜０．００９１。
【図１５】図１５は、ｈｉＰＳＣ由来の取り込まれた移植Ｊａｗｓ陽性光受容体は光に反応することを示す。Ａ〜ＤはＣｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−モデルであり、Ｅ〜Ｇはｒｄ１モデルである。Ａ、Ｄは、Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−モデル（図１５Ａ）及び又はｒｄ１モデル（図１５Ｄ）において、３．５×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１の強度における５９０ｎｍの光による２回連続フラッシュで刺激した、Ｊａｗｓ発現細胞の代表的な光電流（上）及び電圧過分極（下）を示す。Ｂ、Ｆは、様々な波長で刺激したＪａｗｓ発現細胞に対応するＪａｗｓ誘導過分極作用スペクトルを示す。２５ｎｍのステップによって隔てられた４００ｎｍ〜６５０ｎｍの範囲の刺激を３．５×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１で使用した。５７５ｎｍで最大反応を得た。Ｃ、Ｇは、移植失明マウスにおいて刺激周波数を増大させた（２Ｈｚ〜３０Ｈｚ、３．５×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）Ｊａｗｓ誘導過分極の変調によって時間特性を示し、Ｃにおいて２５Ｈｚの拡大トレースを示す。Ｅは、光刺激強度の関数としてのＪａｗｓ電圧反応を示す（１０１４〜１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）。
【図１６】図１６は、介在ニューロンを介したｈｉＰＳから神経節細胞への信号伝達の概略図を示す。Ａ〜Ｃは、１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１の５９０ｎｍ光刺激に反応する３つの異なる細胞タイプの、ｈｉＰＳ細胞を移植したｒｄ１マウスにおける連続する電気生理学的記録を示し、この実施例では、移植細胞からの入力信号がどのようにオフＩＮＬ細胞に、最終的にはオフ神経節細胞に伝達され得るかを示している。Ａは、２回連続フラッシュで刺激したＪａｗｓ発現細胞の代表的な光電流を示す。Ｂは、Ｊａｗｓを発現しないが周囲のＪａｗｓ−ｈｉＰＳ移植細胞に接続すると考えられる（左側画像）ＩＮＬ層における２次細胞（オフ細胞）からの代表的な電流（下部）及び電圧（上部）反応を示す。Ｃは、Ｂに示す２次ニューロンから仮説上は入力を受けているとされるオフ神経節細胞（３次ニューロン）反応（スパイク活性）記録の例を示す。
【図１７】図１７は、Ｊａｗｓによって媒介される光反応が網膜神経節細胞に伝達されることを示す。Ａ〜Ｄは、移植した失明Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−マウスのＰＳＴＨ及びラスタープロットとして示されるＭＥＡ記録から得た平均スパイク反応を示す。Ａは、Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−マウスにおいてオフ反応（左）又はオン・オフ反応（右）のいずれかで反応する２つのＲＧＣの代表的な例を示す（５８０ｎｍ、１．２４×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）。Ｂは、４５０〜６５０ｎｍの範囲の波長に対して構成された代表的なＰＳＴＨ及びラスタープロットを示す（１．２４×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）。Ｃは、より低い光強度（それぞれ、５８０ｎｍ、１０１６ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１及び１０１５ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）、Ｄは、１秒〜１ミリ秒の範囲のより短い光パルス（５８０ｎｍ、１．２４×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）における代表的な細胞の平均スパイク反応及びラスタープロットを示す。Ｅは、ＧＦＰのみを発現するｉＰＳＣ由来光受容体を移植したコントロールの網膜の非反応細胞から記録した代表的なＰＳＴＨ及びラスタープロットを示す。Ｆは、移植したｒｄ１マウスにおいて記録したＰＳＴＨ（刺激前後時間ヒストグラム）及びラスタープロットとして示される多電極アレイ（ＭＥＡ）記録から得た平均スパイク反応を示し（５８０ｎｍ、１．２４×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）、オン反応（左）、又はオフ反応（右）のいずれかで反応する２つのＲＧＣの代表的なトレースを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明者らは、本明細書において、細胞置換方法を移植前の光受容体前駆細胞における光遺伝学的阻害剤の導入と組み合わせることからなる新規の治療方法を使用して網膜変性疾患の処置が大きく改善可能であること示した。この手法は、光受容体過分極におけるこれらの細胞の移植の利益を向上させる。
【００２０】
発明者らは、重度の網膜変性のマウスモデルにおいて微生物オプシンを発現する光受容体前駆体の移植により、これらの処置マウスにおいて視覚的に誘導された挙動を回復可能であることを示した。また、発明者らは、これらの移植光受容体がホスト動物の網膜に良好に取り込まれることができ、残りの網膜内層回路にシナプス結合を形成することができること、及び、微生物オプシンによって誘導される信号が失明マウスの出力ニューロンに伝達されることを観察した。
【００２１】
［定義］
本明細書において使用するとき、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドである、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指す。つまり、この用語は、一本鎖、二本鎖、若しくは多重鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又はプリン塩基及びピリミジン塩基を含む、若しくは他の天然、化学的、若しくは生化学的に修飾した、非天然の、若しくは生成したヌクレオチド塩基を含む重合体を包含するが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの骨格は、（ＲＮＡ又はＤＮＡに通常見受けられ得るように）糖とリン酸基、又は修飾若しくは置換された糖若しくはリン酸基を含むことができる。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホロアミダイトなどの合成サブユニットの重合体を含むことができ、つまり、オリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミダイト（P-NH2）又は混合ホスホロアミダイトホスホジエステルオリゴマーであり得る。本発明の核酸は、化学合成、組換え、突然変異誘発を含む、当業者に既知の任意の方法によって作製することができる。好ましい実施形態において、本発明の核酸はＤＮＡ分子、好ましくは二本鎖ＤＮＡ分子であり、好ましくは当業者に既知の組換え方法によって合成される。
【００２２】
本明細書において使用するとき、「プロモーター」という用語は、プロモーターが操作可能に連結する核酸の転写を行わせる調節因子を指す。プロモーターは、操作可能に連結した核酸の転写の速度と効率との両方を調節可能である。プロモーターは、核酸のプロモーター依存性転写を促進（「促進因子」）又は制御（「制御因子」）する他の調節因子に操作可能に連結することもできる。本明細書において使用するとき、「特異的プロモーター」という用語は、主に特定の組織又は細胞タイプに活性であるプロモーターを指すと理解される。他の組織又は細胞における、一般には低い残存発現は完全には除外できないことが理解される。本明細書において使用するとき、「特異的光受容体プロモーター」という用語は、光受容体細胞又はその前駆体に特異的な転写プロモーター活性を有するプロモーターを指すと理解される。
【００２３】
「対象」又は「患者」という用語は、網膜を有する動物、好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくは、成人、子供、出生前段階のヒトを含むヒトを指す。
【００２４】
本明細書において使用するとき、「処置」、「処置する」、又は「処置すること」という用語は、疾患の治療、防止、予防、及び遅延などの患者の健康状態を改善することを意図する任意の行為を指す。所定の実施形態において、そうした用語は、疾患の又は疾患に関連した症状の緩和又は根絶を指す。他の実施形態において、この用語は、そうした疾患を有する対象に１つ以上の治療剤を投与することでもたらされた疾患の広がり又は悪化の最小化を指す。
【００２５】
特に、「網膜変性疾患の処置」という用語は、光受容体の光検知能力の維持又は改善を指し得る。特に、この用語は、視力の回復、改善、又は維持を指し得る。
【００２６】
「治療有効量」によって、上述で規定するような処置、特に網膜変性疾患の処置をなすのに十分であり、対象に投与される、例えば本発明の光受容体前駆細胞などの治療剤の量を意図する。網膜変性疾患を処置するための本発明の方法において、本発明の医薬組成物又は光受容体前駆細胞は、好ましくは眼球内に、より好ましくは目の網膜下腔に注入することで、投与する。特に、光受容体前駆細胞又は医薬組成物は、好ましくは、神経網膜と、重なっているＲＰＥとの間に注入される。
【００２７】
第１の態様において、本発明は、光遺伝学的阻害剤をコードする異種核酸を含む、光受容体前駆細胞、好ましくは単離光受容体前駆細胞に関する。
【００２８】
本明細書において使用するとき、「単離」という用語は、光受容体前駆細胞に関して、その自然環境にない、すなわち対象又は患者にはない光受容体前駆細胞を指す。単離光受容体前駆細胞は、例えば、細胞培養物、細胞懸濁液、又は医薬組成物内に配することができる。単離光受容体前駆細胞は、他の細胞又は細胞タイプと相互作用し得る。特に、オルガノイド又は組織などのエクスビボ又はインビトロ細胞系に含むことができる。
【００２９】
光受容体前駆細胞は、光受容体細胞への分化に関与する十分に分化されていない、非分裂細胞である。本明細書において使用するとき、「光受容体細胞」という用語は、錐体光受容体細胞又は桿体光受容体細胞を指す。このように、本明細書において使用するとき、「光受容体前駆細胞」という用語は、桿体光受容体前駆細胞又は錐体光受容体前駆細胞を指し得る。光受容体前駆細胞は、好ましくは、有糸分裂後の光受容体前駆体、すなわち、桿体光受容体への分化に特異的である細胞である。好ましくは、光受容体前駆細胞はＣＤ７３を発現する。好ましくは、光受容体前駆細胞はＣＤ７３及びＣＤ２４を発現する。
【００３０】
実施形態において、光受容体前駆細胞は、ドナー（例えば死体ドナーの目）又は処置される対象の、好ましくは処置される対象からの網膜から得られる。
【００３１】
他の実施形態において、光受容体前駆細胞は、幹細胞、特に胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞（iPS細胞）、成体幹細胞、又は胎児幹細胞から得られる。他の実施形態において、光受容体前駆細胞は分化胚性幹細胞から得られる。
【００３２】
ヒト胚性幹細胞からの光受容体前駆細胞の作製は、倫理的問題に見合うものである。一実施形態において、胚性幹細胞は非ヒト胚性幹細胞である。他の実施形態において、ヒト胚性幹細胞は、方法自体又は任意の関連行為にはヒト胚の破壊を含まないという条件で用いられ得る。
【００３３】
胚性幹細胞は、着床前胚盤胞の内部細胞塊に由来する。胚性幹細胞は、未分化状態を維持可能である、又は外胚葉、内胚葉、及び中胚葉の３つすべての胚葉由来の系統に沿って成熟させることができる。本発明において、胚性幹細胞は、主要な発生シグナル経路の操作によって、例えばアクチビン−Ａ及び血清に加えノーダル及びｗｎｔ経路のアンタゴニストを使用して(Watanabe K等、Nat Neurosci. 2005 Mar;8(3):288-96.)、ノッチシグナル経路を阻害して(Osakada F等、Nat Protoc. 200;4(6):811-24)、光受容体へ分化することができる。光受容体前駆細胞は、当業者に既知の任意のプロトコルを使用して胚性幹細胞から得ることができる(Osakada F等、Nat Biotechnol. 2008 Feb;26(2):215-24; Amirpour N等、Stem Cells Dev. 2012 Jan;21(1):42-53; Nakano T等、Cell Stem Cell. 2012 Jun 14;10(6):771-85; Zhu Y等、Plos One. 2013;8(1):e54552; Yanai A等、Tissue Eng Part C Methods. 2013 Oct;19(10):755-64; Kuwahara A等、Nat Commun. 2015 Feb 19;6:6286; Mellough CB等、Stem Cells. 2015 Aug;33(8):2416-30; Singh RK等、Stem Cells Dev. 2015 Dec 1;24(23):2778-95)。
【００３４】
好ましくは、光受容体前駆細胞は、ｉＰＳ細胞又は成体幹細胞、より好ましくはｉＰＳ細胞から得られる。
【００３５】
誘導多能性幹（iPS）細胞は、いくつかの特定遺伝子のみの導入が細胞を多能性にするのに必要とされるリプログラミングとして既知のプロセスを介して、非多能性細胞、通常は成体体細胞に由来するものである（例えば、ヒト細胞のOCT4、SOX2、KLF4、及びC-MYC）。ｉＰＳ細胞使用の一利益は、胚性細胞の使用を全体的に回避して、ゆえにその倫理的問題を退けることである。
【００３６】
つまり、好ましい実施形態において、光受容体前駆細胞は、ｉＰＳ細胞由来光受容体前駆細胞である。ｉＰＳ細胞は、処置される対象又は他の対象から得ることができる。好ましくは、ｉＰＳ細胞は、処置される対象の細胞に、特にこの対象の線維芽細胞に由来するものである。
【００３７】
光受容体前駆細胞は、当業者に既知の任意の分化方法を使用してｉＰＳ細胞から得ることができる。特に、光受容体前駆細胞は、ｉＰＳ培地においてコンフルエントに広がったヒトｉＰＳ細胞から得ることができる。（例えば、Essential 8培地、GIBCO、Life Technologies）。コンフルエント後、培地を前神経用培地（例えば、１％のＮ２サプリメントを添加したEssential 6培地、GIBCO、Life Technologies）に２８日間換えた。２８日目に、ニードルを用いて、同定した神経網膜様構造を単離し、ＦＧＦ２を添加した成熟培地（例えば、ＤＭＥＭ／栄養混合物Ｆ−１２、１％のＭＥＭ非必須アミノ酸、２％のＢ２７サプリメント（Life Technologies））にプレーティングした。３５日目に、ＦＧＦ２を取り除き、網膜オルガノイドを、分化の４２日目から４９日目に添加したγセクレターゼ阻害剤のＮ−［Ｎ−（３、５−ジフルオロフェナセチル）−ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（DAPT）とともにさらに成熟培地にて培養した。７０日目に、ヒト由来の移植可能な光受容体前駆体を得る。
【００３８】
また、光受容体前駆細胞は、当業者に既知の任意の他のプロトコル（Lamba, Osakada and colleagues (Lamba等、Proc Natl Acad Sci USA. 2006 Aug 22;103(34):12769-74;, Lamba等、Plos one. 2010 Jan 20;5(1):e8763; Osakada等、Nat. Protoc. 2009;4(6):811-24; Meyer JS等、Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Sep 29; 106(39):16698-703 ;Meyer JS等、Stem Cells. 2011 Aug ;29(8) :1206-18; Mellough CB等、Stem Cells. 2012 Apr;30(4):673-86; Boucherie C等、Stem Cells. 2013 Feb ;31(2) :408-14 ; Sridhar A等、Stem Cells Transl Med. 2013 ;2(4) :255-64 ;Tucker BA等、Elife. 2013 Aug 27,2:e00824 ; Tucker BA等、Stem Cells Transl Med. 2013 Jan ;2(1) :16-24 ;Reichman S等、Proc Natl Acad Sci USA. 2014 Jun10 ;111(23) :8518-23 ; Zhong X等、Nat Commin. 2014 Jun 10 ;5 :4047 ; Wang X等、Biomaterials. 2015 Jun ;53 :40-9）を使用してヒトｉＰＳ細胞から得ることができる。
【００３９】
本発明の光受容体前駆細胞は、光遺伝学的阻害剤をコードする異種核酸を含む。
【００４０】
本明細書において使用するとき、「異種核酸」という用語は、その自然環境には存在しない遺伝子、ポリヌクレオチド、又は核酸配列を指す。特に、この用語は、光受容体細胞又は光受容体前駆に自然には存在しない核酸分子を指す。換言すると、この用語は、外来の由来物若しくは種に由来する、又は同じ由来物の場合その元の形態から改変した核酸を指す。
【００４１】
異種核酸は、光遺伝学的阻害剤をコードする任意の核酸配列であってもよい。
【００４２】
本明細書において使用するとき、「光遺伝学的ツール」という用語は、光強度の増大後に標的細胞の膜電位を変化させる分子を指す。分子は、標的細胞を過分極又は脱分極させることができる。本明細書において使用するとき、「光遺伝学的阻害剤」という用語は、光遺伝学的ツールを発現するニューロンを過分極させて、不活性化させる光遺伝学的ツールを指す。
【００４３】
光遺伝学的阻害剤は、光に暴露すると細胞を過分極させる。細胞を過分極させると、細胞の内部負電荷が短期間、さらに負になる。さらに負に変化させることで、膜電位を活動電位しきい値にするのに必要な刺激を増大させて活動電位を阻害する。特定の実施形態において、光遺伝学的阻害剤は、フォトンの吸収により、クロライドイオンを内側に輸送する、及び／又はカチオンを外側に輸送する光ゲート式イオンポンプである。特定の実施形態において、フォトンの吸収により、クロライドイオンを内側に又はカチオンを外側に輸送する、任意の適切な光ゲート式網膜依存イオンポンプは、光遺伝学的阻害剤として使用することができる。光遺伝学的阻害剤の例は、古細菌ナトロノモナス・パラオニス（NpHR）のハロロドプシン、改良ハロロドプシン（eNpHR2.0及びeNpHR3.0）、及びレッドシフトハロロドプシンのハロ５７などのハロロドプシン、アーキロドプシン−３（AR-3）、アーキロドプシン（Arch）、改良バクテリオロドプシン（eBR）などのバクテリオロドプシン、プロテオロドプシン、キサントロドプシン、レプトスフェリア・マキュランス（Leptosphaeria maculans）真菌オプシン（Ｍａｃ）、Ｊａｗｓとも呼称されるクラックスハロロドプシン（cruxhalorhodopsin）のＪａｗｓ、並びにそれらの変異体を含むが、これらに限定されない。好ましくは、光遺伝学的阻害剤は、ハロロドプシン、並びに改良ハロロドプシン（eNpHR2.0及びeNpHR3.0）及びレッドシフトハロロドプシンのハロ５７などのその誘導体、並びにＪａｗｓ、より好ましくは改良ハロロドプシン及びＪａｗｓから選択される。
【００４４】
本明細書に記載の光遺伝学的阻害剤の一部は、改変のない天然のタンパク質である。
【００４５】
特定の実施形態において、光受容体前駆細胞は、一般に、光遺伝学的阻害剤をコードする異種核酸配列を含む発現カセット又は発現ベクターを該細胞に導入して遺伝子学的に改変される。本明細書において使用するとき、「発現カセット」という用語は、コード配列及び該コード配列の発現に必要とされる１つ以上の制御配列を含む核酸構築物を指す。特に、これらの制御配列の１つは、コード配列の発現を促進するプロモーターである。
【００４６】
好ましくは、光遺伝学的阻害剤をコードする核酸配列は、光受容体前駆細胞が認識するプロモーターに操作可能に連結される。プロモーターは、光遺伝学的阻害剤の発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモーターは、突然変異体の、トランケートした、及びハイブリッドのプロモーターを含む、光受容体前駆細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであってもよい。プロモーターは、構成的プロモーター又は誘導的プロモーター、好ましくは構成的プロモーターであってもよい。
【００４７】
適切なプロモーターの例は、ロドプシンプロモーター、錐体アレスチンプロモーター、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ（PDE）プロモーター、光受容体間レチノイド結合タンパク質（IRBP）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、ＲＰＥ−６５プロモーター、組織メタロプロテアーゼ阻害物質３（Timp3）プロモーター、及びチロシナーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００４８】
特定の実施形態において、プロモーターは組織特異的、特に光受容体細胞又は光受容体前駆細胞に特異的である。好ましくは、該特異的プロモーターは、ロドプシンプロモーター、錐体アレスチンプロモーター、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ（PDE）プロモーター、光受容体間レチノイド結合タンパク質（IRBP）プロモーターからなる群から選択される。
【００４９】
好ましい実施形態において、プロモーターは、ロドプシンプロモーター及び錐体アレスチンプロモーターからなる群から選択される。特定の実施形態において、光受容体前駆細胞は桿体光受容体前駆細胞であり、プロモーターはロドプシンプロモーターである。他の特定の実施形態において、光受容体前駆細胞は錐体光受容体前駆細胞であり、プロモーターは錐体アレスチンプロモーターである。
【００５０】
また、発現カセットは、適切な転写開始、終了、及び促進因子配列、スプライス信号及びポリアデニル化信号などの効果的なＲＮＡプロセシング信号、細胞質のｍＲＮＡを安定化する配列、転写効率を向上する配列（すなわちコザックコンセンサス配列）、及び／又はタンパク質の安定性を向上させる配列も含むことができる。例えば、天然の、構成的、誘導的、及び／又は組織特異的な多くの発現制御配列が当該分野において知られており、光遺伝学的阻害剤をコードする核酸配列の発現を促進するために使用することができる。
【００５１】
核酸配列又は発現カセットは発現ベクターに含まれてもよい。本明細書において使用するとき、「ベクター」という用語は、インビトロ又はインビボで、遺伝物質を伝達する、特に核酸を宿主細胞に送達する媒体として使用される核酸分子を指す。ベクターは、例えば、プラスミド、染色体外因子、小染色体、又は人工染色体などの、自己複製ベクター、すなわち染色体外成分として存在しその複製は染色体複製から独立するベクターであってもよい。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含んでもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されるとゲノムに組み込まれ、ベクターが組み込まれた染色体と共に複製されるものであってよい。
【００５２】
好ましくは、異種核酸、発現カセット、又はベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製される。
【００５３】
適切なベクターの例は、組換えの組込み又は非組込みウイルスベクター、並びに組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ由来のベクターを含むが、これらに限定されない。好ましくは、ベクターは組換えの組込み又は非組込みウイルスベクターである。組換えウイルスベクターの例は、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（Adeno-associatedvirus）、又はウシパピローマウイルス由来のベクターを含むが、これらに限定されない。
【００５４】
好ましくは、光遺伝学的阻害剤をコードする異種核酸又は発現カセットは、組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、又はレンチウイルスベクターに含まれる。
【００５５】
好ましい実施形態において、ベクターは組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、すなわち本発明の光受容体前駆細胞は、光遺伝学的阻害剤を発現するＡＡＶ形質導入光受容体前駆細胞である。
【００５６】
ヒトパルボウイルスのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、自然には複製できないディペンドウイルスであり、感染細胞のゲノムに組み込んで潜伏感染を行うことができる。最後の特性は、染色体１９（19ql3.3-qter）に位置する、ＡＡＶＳＩと呼称されるヒトゲノムの特定の部位で組込みが起こることから、哺乳動物のウイルスのなかでも特有であると考えられる。ゆえに、ＡＡＶは、ヒト遺伝子治療用の使用可能なベクターとして考慮されるべき対象となっている。ウイルスの好ましい特性には、任意のヒト疾患との関連がないこと、分裂細胞と非分裂細胞との両方に感染できること、感染可能な種々の組織由来の広範囲の細胞株がある。
【００５７】
本明細書において使用するとき、「ＡＡＶベクター」という用語は、少なくとも１つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ITR）、好ましくは２つのＩＴＲが側部に位置する、１つ以上の異種配列（すなわち、例えば光遺伝学的阻害剤をコードする配列などＡＡＶ由来ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。そうしたＡＡＶベクターは、適切なヘルパーウイルスに感染させる（又は適切なヘルパー機能を発現する）とともにＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物（すなわちＡＡＶのＲｅｐ及びＣａｐタンパク質）を発現する宿主細胞に存在するとき、複製して、感染性ウイルス粒子にパッケージングすることができる。「末端逆位反復」又は「ＩＴＲ」配列は、当該技術分野において十分に理解されている用語であり、反対の位置にあるウイルスゲノムの末端に見受けられる比較的短い配列を指す。「ＡＡＶ末端逆位反復（ITR）」配列は、天然の一本鎖ＡＡＶゲノムの両末端に存在する約１４５のヌクレオチドの配列である。ＩＴＲにおける最外の１２５のヌクレオチドは、２つの別の位置のいずれかに存在して、種々のＡＡＶゲノム同士の間及び単一のＡＡＶゲノムの２つの端部の間で不均質性をもたらし得る。また、最外の１２５のヌクレオチドは、いくつかのより短い自己相補領域（指定したＡ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’及びＤ領域）を含んで、鎖内塩基対形成をこのＩＴＲ部分内で行うことができる。ＡＡＶのＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有してもよく、又は挿入、削除、又は置換によって変化させることができる。ＡＡＶベクターの末端逆位反復（ITR）の血清型は、任意の既知のヒト又は非ヒトＡＡＶ血清型から選択することができる。
【００５８】
ベクターは、栄養要求性マーカー（例えば、LEU2、URA3、TRP1、又はHIS3）などの選択マーカーをコードする１つ以上の核酸配列、蛍光若しくは発光タンパク質などの検出可能な標識（例えば、GFP、eGFP、DsRed、CFP、YFP）、又は化学的・毒性化合物に対する耐性を与えるタンパク質（例えば、テモゾロミドに対する耐性を与えるＭＧＭＴ遺伝子）をさらに含むことができる。これらのマーカーは、ベクターを含む宿主細胞を選択又は検出するために使用可能であり、宿主細胞に対応して当業者が容易に選択可能である。
【００５９】
ベクターは、ウイルスカプシドにパッケージングして「ウイルス粒子」を作製することができる。特に、ベクターは、ＡＡＶ由来カプシドにパッケージングして少なくともの１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド形成したＡＡＶベクターゲノムから構成された「アデノ随伴ウイルス粒子」又は「ＡＡＶ粒子」を作製した、ＡＡＶベクターであってもよい。
【００６０】
カプシド血清型は、ＡＡＶ粒子の指向性範囲を決定する。１２のヒト血清型及び非ヒト霊長動物の１００を超える血清型を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の複数の血清型が現在特定されている（Howarth等、2010, Cell BiolToxicol 26: 1-10）。これらの血清型のなかでも、ヒト血清型２は、遺伝子伝達ベクターとして開発された最初のＡＡＶであった。現在使用される他のＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ７４、及びＡＡＶｄｊ等を含むが、これらに限定されない。
【００６１】
特定の実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９−２ＹＦ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ２−７ｍ８（Dalkara D等、Gene Ther. 2012Feb;19(2):176-81; Dalkara D等、Sci Transl Mes. 2013 Jun 12;5(189):189ra76）又はＡＡＶ８カプシドからなる群より選択されるＡＡＶ由来カプシドを含む。
【００６２】
さらに、非天然の改変変異体及びキメラＡＡＶも有用であり得る。特に、カプシドタンパク質は、効果的に分解するため及び／又は核へと正確に伝達するため、形質導入効果を向上させ、免疫原性を最小化し、安定性及び粒子生存期間を調整するように、１つ以上のアミノ酸置換を含む変異体であってもよい。突然変異ＡＡＶカプシドは、エラープローンＰＣＲによって挿入したカプシド改変及び／若しくはペプチド挿入、又は１又は複数のアミノ酸置換を含むことで、得られる。特に、突然変異は、天然又は非天然カプシドタンパク質の任意の１つ以上のチロシン残基に行ってもよい（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ３）。好ましくは、突然変異残基は表面露出チロシン残基である。例示の突然変異は、Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、Ｙ２７５Ｆ、Ｙ２８１Ｆ、Ｙ５０８Ｆ、Ｙ５７６Ｆ、Ｙ６１２Ｇ、Ｙ６７３Ｆ、及びＹ７２０Ｆなどのチロシンからフェニルアラニンへの置換を含むが、これらに限定されない。
【００６３】
ＡＡＶ天然血清型を使用する代わりに、非天然発生カプシドタンパク質を有するＡＡＶを非限定的に含む、人工ＡＡＶ血清型も使用することができる。そうした人工カプシドは、異なる選択ＡＡＶ血清型、同じＡＡＶ血清型の非隣接部分、非ＡＡＶウイルス源、又は非ウイルス源から得たものであり得る異種配列と組み合わせた選択ＡＡＶ配列（例えば、ＶＰＩカプシドタンパク質のフラグメント）を使用して、任意の適切な技術で作製することができる。人工ＡＡＶ血清型は、非限定的に、キメラＡＡＶカプシド又は突然変異ＡＡＶカプシドであり得る。キメラカプシドは、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型由来のＶＰカプシドタンパク質を含む、又は、少なくとも２つのＡＡＶ血清型由来のＶＰタンパク質領域若しくはドメインを組み合わせた少なくとも１つのキメラＶＰタンパク質を含む。ＡＡＶ粒子は、同じ血清型又は混合血清型（すなわち偽型ＡＡＶ）のウイルスタンパク質及びウイルス核酸を含むことができる。例として、組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ゲノム及びＡＡＶ１カプシドタンパク質を含む、ＡＡＶ血清型２／１ハイブリッド組換え遺伝子伝達システムであってもよい。当業者は、そうしたベクター並びにそれらの構築方法及び使用方法を熟知しており、例えば国際公開第０１／８３６９２号が参照される。
【００６４】
本発明に使用するＡＡＶベクターは、当業者によって容易に選択されることができる。
【００６５】
好ましい実施形態において、光遺伝学的阻害剤をコードする異種核酸又は発現カセットを含むＡＡＶベクターは、血清型２若しくは９のＡＡＶベクター、又は例えばＡＡＶ９−２ＹＦ又はＡＡＶ２−７ｍ８などのＡＡＶ−２若しくはＡＡＶ−９由来ＡＡＶベクター（Dalkara D等、Gene Ther. 2012Feb;19(2):176-81; Dalkara D等、Sci Transl Mes. 2013 Jun 12;5(189):189ra76）である。
【００６６】
核酸構築物、発現カセット、又はベクターは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン遺伝子導入法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法、リポフェクション法、ウイルス感染法を含むがこれらに限定されない任意の既知の技術を使用して、光受容体前駆細胞に運搬することができる。
【００６７】
さらなる態様において、本発明はまた、本発明の光受容体前駆細胞と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００６８】
また、上述のすべての実施形態はこの態様においても考慮される。薬学的に許容される賦形剤は、投与経路に対応して選択される。本明細書において使用するとき、「薬学的に許容される」という用語は、動物及び／又はヒトにおける使用について、規制機関又は欧州薬局方などの指定薬局方によって承認されたことを意味する。「賦形剤」という用語は、それとともに治療剤が投与される希釈剤、アジュバント、担体、又はビヒクルを指す。当該技術分野では既知であるように、薬学的に許容される賦形剤は、薬理的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性の物質であり、液剤又は懸濁剤として、乳剤として、又は使用前に液体に溶解又は懸濁することに適した固体剤形として提供することができる。例として、賦形剤は、剤形若しくは硬度を与える、又は希釈剤として機能することができる。適切な賦形剤は、安定化剤、湿潤及び乳化剤、異なる重量モル浸透圧濃度のための塩、内包剤、ｐＨ緩衝物質、及び緩衝剤を含むが、これらに限定されない。そうした賦形剤は、不適当な毒性なく投与できる、目に直接的に送達することに適する任意の医薬剤を含む。
【００６９】
好ましくは、組成物は、特に目の網膜下腔に、好ましくは網膜と、重なっているＲＰＥとの間に、眼球内注入によって投与するように製剤化される。そうした投与に適する医薬組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、溶質、又は懸濁化剤若しくは増粘剤を含み得る、１つ以上の薬学的に許容される滅菌等張水性溶液（例えば等張性の０．９％ＮａＣｌ）若しくは非水性溶液（例えば平衡塩溶液（ＢＳＳ））、分散剤、懸濁剤、若しくは乳剤、又は使用直前に滅菌注射液剤又は懸濁剤にすることができ得る滅菌粉末、と組み合わせた光受容体前駆細胞を含むことができる。薬学的に許容される賦形剤の適切な記載は、Remington'sPharmaceutical Sciencesの１５版にて入手可能である。
【００７０】
任意的に、本発明の光受容体前駆細胞を含む医薬組成物は、細胞保存に適する任意の温度で、保存のために凍結することができる。例として、細胞は約−２０℃、−８０℃、又は任意の他の適切な温度で凍結することができる。低温で凍結した細胞は、細胞損傷のリスクを下げるとともに細胞が解凍において生存する可能性を最大化するように、適切な容器にて保存して保管に備えることができる。あるいは、細胞はまた、例えば約４℃の冷蔵室温で維持することもできる。
【００７１】
投与される光受容体前駆細胞の量は、当業者に既知の標準的な方法によって決定することができる。適切な投与量を決定するために、患者の生理学的データ（例えば、年齢、大きさ、及び体重）並びに処置する疾患のタイプ及び重症度を考慮に入れる必要がある。
【００７２】
本発明の医薬組成物は単一用量として又は複数用量で投与することができる。特に、各単位用量は、１μｌあたり１００，０００〜３００，０００の光受容体前駆細胞、好ましくは１μｌあたり２００，０００〜３００，０００の光受容体前駆細胞を含むことができる。
【００７３】
医薬組成物は、副腎皮質ステロイド、抗生物質、鎮痛剤、免疫抑制剤、栄養因子、又は任意のそれらの組合せなどの１又は複数のさらなる活性化合物をさらに含むことができる。
【００７４】
他の態様において、本発明はまた、光受容体前駆細胞を提供するステップと、該細胞に、光遺伝学的阻害剤をコードする核酸、又は該核酸を含む発現カセット若しくはベクターを導入するステップとを含む、本発明の光受容体前駆細胞を作製する方法にも関する。
【００７５】
該方法は、インビボ、インビトロ、又はエクスビボ方法であってもよい。好ましくは、本発明の光受容体前駆細胞を作製する方法はエクスビボ又はインビトロ方法である。特に、作製した光受容体前駆細胞は、移植を必要とする患者に移植するために使用することができる。
【００７６】
実施形態において、核酸を導入することによって改変される光受容体前駆細胞は、特にドナー又は処置される患者の、網膜から得られる。
【００７７】
他の実施形態において、改変される光受容体前駆細胞は、幹細胞の分化、好ましくは成体幹細胞又は誘導多能性幹細胞の分化、より好ましくは処置される対象の例えば線維芽細胞などの体細胞から得た誘導多能性幹細胞の分化によって得られる。
【００７８】
該光受容体前駆細胞は、当業者には既知の任意の方法によって、例えば、特に抗ＣＤ７３抗体を使用して網膜細胞又は網膜オルガノイドからＣＤ７３陽性細胞を単離することによって、精製又は単離することができる。
【００７９】
特定の実施形態において、本発明の光受容体前駆細胞を作製する方法は、上述のように、（ｉ）幹細胞の分化、好ましくは処置される患者の例えば線維芽細胞などの体細胞から得た成体幹細胞又は誘導多能性幹細胞の分化によって得た光受容体前駆細胞を提供するステップと、（ｉｉ）該受容体前駆細胞に、光遺伝学的阻害剤をコードする異種核酸、又は該核酸を含む発現カセット若しくはベクターを導入するステップとを含む。
【００８０】
方法には、上述のような薬学的に許容される賦形剤を該遺伝子学的に改変した光受容体前駆細胞に添加することで本発明の医薬組成物を調製することをさらに含むことができる。
【００８１】
また、方法には、処置される患者から誘導多能性幹細胞を提供することと、該細胞を光受容体前駆細胞に分化することも含むことができる。
【００８２】
また、方法には、誘導多能性幹細胞を得るために、処置される患者の成体体細胞、好ましくは線維芽細胞を提供することもさらに含むことができる。
【００８３】
特定の実施形態において、光遺伝学的阻害剤をコードする異種核酸又は発現カセットは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれる。
【００８４】
核酸構築物、発現カセット、又はベクターは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン遺伝子導入法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法、リポフェクション法、ウイルス感染法を含むがこれらに限定されない任意の既知の技術を使用して、光受容体前駆細胞に運搬することができる。
【００８５】
また、光受容体前駆細胞及び医薬組成物のすべての実施形態はこの方法においても考慮される。
【００８６】
他の態様において、本発明は、
−網膜変性疾患の処置に使用するための本発明の光受容体前駆細胞又は本発明の医薬組成物と、
−投与を必要とする対象に本発明の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む網膜変性疾患を処置する方法と、
−網膜変性疾患の処置のための薬剤を製造するための本発明の光受容体前駆細胞又は本発明の医薬組成物の使用と、にさらに関する。
【００８７】
また、本発明の光受容体前駆細胞、本発明の医薬組成物、及び本発明の光受容体前駆細胞を作製する方法について上述したすべての実施形態は、この態様においても考慮される。
【００８８】
網膜変性疾患は、好ましくは光受容体の機能喪失又はその死に関し、より好ましくは光受容体の機能喪失に関する。
【００８９】
網膜変性疾患は、黄斑変性、網膜色素変性（症候性及び非症候性）、錐体ジスロフィー、アッシャー症候群、桿体ジストロフィー、桿体−錐体ジストロフィー、全色盲、及びバルデー・ビードル症候群を含むが、これらに限定されない。好ましくは、網膜変性疾患は、網膜色素変性又は加齢黄斑変性である。
【００９０】
実施形態において、上述の光受容体前駆体又は医薬組成物は、光受容体変性の進行期にある患者における網膜変性疾患の処置に使用することに特に適する。光受容体変性の進行期は、主に、実質的な光受容体細胞喪失だけでなく、網膜グリア性瘢痕の存在及び外層膜における実質的な変化によって、特徴づけることができる。光受容体変性の進行期にある患者は、視力の著しい障害、又はさらに視力の完全な喪失を示し得る。
【００９１】
特定の実施形態において、網膜変性疾患の処置に使用される本発明の光受容体前駆細胞は、処置される患者の細胞から得られる。光受容体前駆細胞は、上述のように患者から、該患者の網膜サンプル又は幹細胞から得ることができる。好ましくは、本発明に使用される光受容体前駆細胞は、処置される患者の幹細胞から、より好ましくは線維芽細胞などの患者の成体体細胞由来の成体幹細胞から又は誘導多能性幹細胞から得られる。
【００９２】
ゆえに、特定の実施形態において、処置を必要とする対象における網膜変性疾患を処置する方法は、上述のように、（ｉ）幹細胞の分化、好ましくは処置される患者の例えば線維芽細胞などの体細胞から得た成体幹細胞又は誘導多能性幹細胞の分化によって得た光受容体前駆細胞を提供するステップと、（ｉｉ）該受容体前駆細胞に、光遺伝学的阻害剤をコードする異種核酸、又は該核酸を含む発現カセット若しくはベクターを導入するステップとを含む。
【００９３】
また、方法には、処置される患者から誘導多能性幹細胞を提供することと、該細胞を光受容体前駆細胞に分化することも含むことができる。
【００９４】
また、方法には、誘導多能性幹細胞を得るために、処置される患者の成体体細胞、好ましくは線維芽細胞を提供することもさらに含むことができる。患者から得た成体体細胞、好ましくは線維芽細胞は、当業者に既知の任意の方法によって、好ましくは該細胞に特定の遺伝子（例えば、OCT4、SOX2、C-MYC、及びKLF4）を発現することによって、多能性幹細胞にリプログラミングすることができる。
【００９５】
方法には、投与を必要とする対象に、光遺伝学的阻害剤をコードする異種核酸を含む光受容体前駆細胞を投与することをさらに含むことができる。前述の好ましくは、該光受容体前駆細胞は眼球内に投与される。
【００９６】
特定の実施形態において、網膜変性疾患は、遺伝性網膜色素変性又は遺伝性加齢黄斑変性などの遺伝性網膜変性疾患である。特に、遺伝性網膜変性疾患は、ＡＢＣＡ４、ＥＹＳ、ＰＤＥ６Ｂ、ＲＰＥ６５、ＲＨＯ、ＵＳＨ６５、ＲＰＧＲ、ＷＦＳ１、ＣＲＢ１を含むがこれらに限定されない遺伝子内の突然変異によるものであり得る。この特定の実施形態において、光受容体前駆細胞は処置される遺伝性網膜変性疾患の患者から得られ、疾患の原因の突然変異を修正するように遺伝子学的に改変することができる。光受容体前駆細胞は、当業者に既知の任意の方法によって、好ましくは修正遺伝子を含む核酸の相同組換えを使用して、遺伝子学的に改変することができる。遺伝子修正方法は、内在性遺伝子と核酸との間に相同組換えが起こるように、少なくとも修正遺伝子をコードする配列と内在性遺伝子の部分とを含む核酸を細胞に導入するステップを含むことができる。特定の実施形態において、方法には、内在性遺伝子内の標的配列を切断可能なレアカッティングエンドヌクレアーゼ（rare-cutting endonuclease）を細胞に発現させるステップをさらに含むことができる。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり得る。好ましい実施形態において、遺伝子学的に改変された光受容体前駆細胞は、患者の成体体細胞、好ましくは線維芽細胞由来の誘導多能性幹細胞から得られる。他の実施形態において、遺伝子学的に改変された光受容体前駆細胞はドナーから得られる。
【００９７】
他の好ましい実施形態において、本発明は、ｉ）患者の網膜サンプル又は幹細胞から、上述のように処置される患者より得た光受容体前駆細胞を提供するステップと、ｉｉ）該光受容体前駆細胞に光遺伝学的阻害剤をコードする異種核酸を導入するステップと、ｉｉｉ）疾患の原因の突然変異を修正するように光受容体前駆細胞を遺伝子学的に改変するステップとを含む、遺伝性網膜変性疾患を処置する方法に関する。ステップ（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、連続的に又は共に、任意の順番で行ってもよい。
【００９８】
好ましくは、処置される患者から得た光受容体前駆細胞は、幹細胞の分化、好ましくは処置される患者の例えば線維芽細胞などの体細胞から得た成体幹細胞又は誘導多能性幹細胞の分化によるものである。
【００９９】
方法には、投与を必要とする対象に、疾患の原因の突然変異を修正するように遺伝子学的に改変されるとともに光遺伝学的阻害剤をコードする異種核酸を含む、光受容体前駆細胞の治療有効量を投与することをさらに含むことができる。
【０１００】
他の実施形態において、遺伝性網膜変性疾患を処置するために使用される、光遺伝学的阻害剤をコードする異種核酸を含む光受容体前駆細胞は、健康なドナー、すなわち遺伝性網膜変性疾患の原因となる突然変異を有しないドナーから得られる。そうした実施形態において、方法には、ｉ）健康なドナーから、すなわち該ドナーの網膜サンプル又は幹細胞からから得た光受容体前駆細胞を提供するステップと、ｉｉ）該光受容体前駆細胞に光遺伝学的阻害剤をコードする異種核酸を導入するステップと、を含むことができる。
【０１０１】
また、本発明の方法は、少なくとも１つのさらなる治療剤を対象に投与することをさらに含むことができる。特に、該治療剤は、副腎皮質ステロイド、抗生物質、鎮痛剤、免疫抑制剤、若しくは栄養因子、又はそれらの任意の組合せからなる群より選択することができる。該さらなる治療剤及び本発明の光受容体前駆細胞は、連続的に又は共に投与することができる。さらなる治療剤及び本発明の光受容体前駆細胞は、共に投与する場合、同じ医薬組成物に製剤化することができる。
【０１０２】
好ましくは、本発明の光受容体前駆細胞又は医薬組成物は、眼球内の注入、好ましくは網膜下腔注入、より好ましくは神経網膜と、重なっているＲＰＥとの間に投与される。
【０１０３】
投与される本発明の光受容体前駆細胞の量は、当業者に既知の標準的な方法によって決定することができる。適切な投与量を決定するために、患者の生理学的データ（例えば、年齢、大きさ、及び体重）並びに処置する疾患のタイプ及び重症度を考慮に入れる必要がある。
【０１０４】
本発明の改変光受容体前駆細胞は単一用量として又は複数用量で投与することができる。特に、各単位用量は、１μｌあたり１００，０００〜３００，０００の光受容体前駆細胞、好ましくは１μｌあたり２００，０００〜３００，０００の光受容体前駆細胞を含むことができる。
【０１０５】
本明細書にて言及される又は引用されるすべての特許、特許出願、仮特許出願、及び公報は、この明細書の明確な教示と整合しない範囲まで、すべての図面及び表を含む、その全体が言及することで援用される。
【０１０６】
以下の実施例は例示の目的で提供され、限定するものではない。
【実施例】
【０１０７】
〔Ａ．失明ＣＰＦＬ（錐体光受容体機能喪失、Cone Photoreceptor Function Loss）マウス及びｒｄ１マウスの移植光受容体において、光遺伝学的刺激がハロロドプシン誘導光反応を誘発する〕
＜１．ドナー（光受容体前駆体）細胞の光遺伝学的形質転換＞
出生後日Ｐ２に、ジャンヴィエ研究所（JanvierLaboratories、Le Genest SaintIsle、仏国）より入手したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（野生型）を氷上で麻痺させて、まぶたに切り口をつけ、ヒトロドプシンプロモーターのもとでハロロドプシンをコードするＡＡＶ（AAV92YF-hRho-eNpHR-EYFP）の３．０×１０１３〜３．３×１０１４粒子を含有する１μｌストックを、超微細３４ゲージシリンジ（Hamilton）を使用して各目の硝子体腔に注入した（図１、上段）。
【０１０８】
＜２．ドナー細胞（光受容体前駆体）の単離−ＭＡＣＳによる細胞濃縮＞
出生後日Ｐ４に、以前に注入したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから網膜を単離した。パパイン解離系（Worthington Biochemical Corporation）を使用して、網膜を消化させた。細胞（約１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を、遠心分離によって（３００ｇで５分）採取し、５００μＬのＭＡＣＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩液［ＰＢＳ、ｐＨ７．２］、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、１０μｇ／ｍｌのラット抗マウスＣＤ７３抗体（BD Biosciences）とともに５分間４℃でインキュベートした。ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄後、細胞を５分間３００ｇで遠心分離した。細胞のペレットを、４８０μＬのＭＡＣＳ緩衝液及び１２０μＬのヤギ抗ラットＩｇＧ磁気ビーズ（Miltenyi Biotec）に再懸濁した。懸濁液を１５分間４℃でインキュベートし、その後ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄して遠心分離した。磁気分離前に、細胞をＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、３０μｍの前分離フィルターでろ過した。ＭＡＣＳ分離器に固定した平衡化前ＬＳカラムに、細胞懸濁液を付加した。カラムを３×３ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液でリンスし、その通過画分を採取した（ＣＤ７３陰性細胞）。カラムを磁石から取り外して、新しい採取チューブに配置した。５ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液をロードして、カラムのプランジャーを直ちに適用することで、ＣＤ７３陽性の断片を溶出した。
【０１０９】
＜３．失明Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−マウス及びｒｄ１マウスへの移植＞
細胞懸濁液を網膜下腔に移植するために、成体のＣｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−失明マウス又は早期発症の重度網膜変性を示すｒｄ１マウスを、ケタミン（50mg/kg）及びキシラジン（10mg/kg）の腹腔内注入により麻酔した。瞳孔をトロピカミド（Mydriaticum Dispersa）の液滴で拡張させ、鈍い３４ゲージニードルを備えたシリンジ（Hamilton）を使用して、約２００，０００細胞を含有する１マイクロリットルの懸濁液を網膜下腔に注入した（図１、上段）。
【０１１０】
＜３．パッチクランプ記録＞
実験全体で、３６℃の顕微鏡記録チャンバに、酸素を添加した（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）エイムス培地（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州）において、単離した網膜を配置した。ＹＦＰ陽性細胞のパッチクランプ記録のために、２５×水浸対物レンズ(XLPlanN-25x-W-MP/NA1.05、Olympus、東京、日本）とパルスフェムト秒レーザー（InSight DeepSee - Newport Corporation、アーバイン、カリフォルニア州）とを備えた特注の２光子顕微鏡を使用した。
【０１１１】
ＡＡＶ形質導入蛍光性細胞をパッチ電極で標的とした。Ａｘｏｎ  Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ７００Ｂ増幅器（Molecular Device Cellular Neurosciences、サニーベール、カリフォルニア州）を使用してホールセル記録をした。パッチ電極は、ホウケイ酸ガラスから作製し（BF100-50-10, Sutter Instrument、ノバト、カリフォルニア州）、８〜１０ＭΩにし、１１５ｍＭのグルコン酸カリウム、１０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、１．５ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び４ｍＭのＡＴＰ-Ｎａ２（ｐＨ７．２）で充填した。細胞は、光電流を測定するために電圧クランプ構成において（−４０ｍＶ）記録され、又は光刺激時の膜電位変化をモニターするために電流クランプ構成において（ゼロ）記録された。
【０１１２】
＜５．光刺激＞
移植の後、一連の電気生理学的実験によって機能性をテストした。
【０１１３】
ＹＦＰ陽性細胞の光反応を測定するため、単色光源（Polychrome V,TILL photonics(FEI)、ヒルズボロ、オレゴン州）を使用した。細胞をパッチした後、まず、対の５９０ｎｍのフルフィールド光パルスで細胞を刺激した。
【０１１４】
そして、（２５ｎｍのステップで隔てられた）４００ｎｍ〜６５０ｎｍの範囲の光フラッシュを使用して、活性スペクトルを測定し、３５０ｎｍ〜６８０ｎｍの連続的な「虹」スペクトルも使用した。
【０１１５】
最後に、２Ｈｚ〜２５Ｈｚの範囲の様々な周波数の光パルスを生成して、記録した細胞の時間反応特性を測定した。マトラボ（Matlab、Mathworks、ネイティック、マサチューセッツ州）及びラボビュー（Labview、National Instruments、オースティン、テキサス州）の特注のソフトウエアを使用して、刺激を生成した。１．３×１０１６〜３．２×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１の範囲の光強度を使用した。
【０１１６】
図２Ａ及び図２Ｄは、それぞれＣｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−モデル及びｒｄ１モデルに取り込まれ、５９０ｎｍでの光による２回連続フラッシュで刺激したＮｐＨＲ発現光受容体前駆体の典型的な光誘起反応を示し、これらの細胞は、最大反応が５７５ｎｍで得られるスペクトルチューニングでの光電圧を示す（図２Ｂ（Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−モデル）、図２Ｅ（ｒｄ１モデル））。図２Ｃ（Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−モデル）及び図２Ｆ（ｒｄ１モデル）では、刺激周波数の増大における（２Ｈｚ〜２５Ｈｚ、１．３×１０１６ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）ハロロドプシン誘導膜過分極の変調を示す。
【０１１７】
図２Ｇは、ＮｐＨＲ光受容体前駆体を移植したＣｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−モデルとｒｄ１モデルとの光反応特性の比較を示す。図２Ｇの左側は、電圧クランプ構成において−４０ｍＶ又は０ｍＶで移植細胞にて得た、平均光電流ピークを表し、図２Ｇの右側は、電流クランプ構成（電流ゼロ）において得た平均ピーク電圧反応を表す。
【０１１８】
図２Ｈは、５９０ｎｍ及び１×１０１６ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１における、（電流クランプ「ゼロ」構成の）２つのモデルの移植細胞の立上り及び減衰時定数の比較を示す（下部）。
【０１１９】
このように、失明ＣＰＦＬマウス及びｒｄ１マウスの移植光受容体において、光遺伝学的刺激がハロロドプシン誘導光反応を誘発し、この反応は５７５ｎｍの光強度で最大になり、速い動態を示し、ドナー細胞から得た反応と有意に異なることはない。
【０１２０】
＜６．２光子ライブイメージング＞
実験全体で、３６℃の顕微鏡記録チャンバに、酸素を添加した（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）エイムス培地（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州）において、単離した網膜又は網膜オルガノイドを配置した。ＹＦＰ陽性細胞のイメージング記録のために、２５×水浸対物レンズ(XLPlanN-25x-W-MP/NA1.05、Olympus、東京、日本）とパルスフェムト秒レーザー（InSight DeepSee - Newport Corporation、アーバイン、カリフォルニア州）とを備えた特注の２光子顕微鏡を使用した。９３０ｎｍの波長の励起レーザーを使用して２光子画像を取得した。ＩｍａｇｅＪ（NIH、ベセスダ、メリーランド州）を使用して画像をオフラインで処理した。
【０１２１】
（落射蛍光光による）図３Ａ及び（２光子イメージングによる）図３Ｂに示すように、ハロロドプシン形質導入前駆細胞はホストに移植後２０日生存し、蛍光は細胞膜に限定された。
【０１２２】
＜７．多電極アレイ記録及びデータ分析＞
すべての多電極アレイ記録を、２５２チャンネルの多電極アレイシステム（USB-MEA256-System、MultiChannel Systems、ロイトリンゲン、ドイツ）で行い、ＭＣ＿Ｒａｃｋソフトウエア（MC_Rackv4.5、Multi ChannelSystems）を使用してデータを取得した。１０週齢以上の移植したＣｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−マウス及びＲｄ１マウスにおけるエクスビボで単離して平坦に載置した網膜をテストした。マウスを安楽死させ、網膜は、ポリ‐ｌ‐リジン（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州）に一晩浸漬したセルロース膜に配置して、３４℃で重炭酸ナトリウム（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州）を含有する酸素を添加したエイムス培地（A1420、Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州）で灌流し、ＲＧＣ側を、電極間隔が６０μｍである多電極アレイチップ（256MEA60/10iR, Multi Channel Systems）に対して軽く押し付けた。所定の実験では、光受容体からのオン型双極細胞への入力を遮断するため、記録前に組織をＬ−ＡＰ４（５０μＭ）で少なくとも２０分間灌流した。フルフィールド光刺激をポリクロームＶモノクロメーター（TILL Photonics、ミュンヘン、ドイツ）を使用して行い、MC_Stimulus II（MC_Stimulus II Version 3.4.4、Multi Channel Systems）における特注の刺激を使用してＳＴＧ２００８刺激生成器（Multichannel Systems）によって発生させた。出力光強度を分光光度計（USB2000+、Oceanoptics、ダニーデン、フロリダ州）を使用してキャリブレーションした。網膜を約１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１において実行毎に２秒の期間で５８０ｎｍの光波長で刺激した。そして、ＲＧＣ活性を増幅して２０ｋＨｚでサンプリングした。信号をＭＣ＿Ｒａｃｋにおいて２００Ｈｚのハイパスフィルターでフィルターして、Ｓｐｉｋｅ２ソフトウエアｖ．７（Cambridge Electronic Design Ltd.、ケンブリッジ、ＵＫ）を使用して波長の主成分分析プロットを視覚化することによって各チャンネルをスパイクソーティングした。反応をプロットするために特注のマトラボスクリプトを使用した。
【０１２３】
光刺激後にＲＧＣからの反応を得ることで、移植光受容体からのハロロドプシン誘発反応がＲＧＣ層に伝達されることを示す。図４は、ＮｐＨＲ移植Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−マウス（Ａ、Ｂ）、コントロールのＧＦＰのみ移植Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−マウス（Ｃ）、及びｒｄ１マウス（Ｄ）において記録したＰＳＴＨ（刺激前後時間ヒストグラム）及びラスタープロットとして示されるＭＥＡ記録から得た平均スパイク反応を表す。網膜を５８０ｎｍの光波長及び１．２４×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１の強度で刺激した。図４Ａ（Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−マウス）及び図４Ｄ（ｒｄ１マウス）は、オン反応（左）、オフ反応（中央）、又はオン・オフ反応（右）のいずれかで反応する３つのＲＧＣの代表的なトレースを示す。ＲＧＣに通常見受けられる３つの主なタイプの反応が得られた。その後、オン型双極細胞反応の遮断剤であるＬ−ＡＰ４で網膜を灌流した。これはＲＧＣ反応を遮断し、反応がまさに光受容体層に由来するものであることを示した（図４Ｂ）。この反応は、洗浄後に再度出現する。コントロールとして、失明Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−マウスにＧＦＰのみを発現する光受容体前駆体を移植した（図４Ｃ）。移植される細胞を、ＮｐＨＲ発現細胞と同様の方法で準備して単離し、その唯一の違いは、ＡＡＶ−Ｒｈｏ−ＮｐＨＲ−ＹＦＰの代わりにＡＡＶ−Ｒｈｏ−ＧＦＰをＰ２野生型マウスへの注入に使用したことである。これらのマウスにて反応が検出されなかったということは、光遺伝学的タンパク質を発現しない光受容体前駆体単独では機能しない又は信号を網膜出力ニューロンに伝達できないということを示している。
【０１２４】
＜８．光が誘導する挙動＞
明暗ボックス実験のために、特注の明暗ボックス（Bourin M, Hascoet M, Eur J Pharmacol. 2003 Feb 28;463(1-3):55-65に類似するが、５９０ｎｍで光遺伝学的刺激を行うように構成される）を作製した。図５Ａに示すように、３６ｃｍ（ｌ）×２０ｃｍ（ｂ）×１８ｃｍ（ｈ）の寸法の箱を、中央に７ｃｍ（ｂ）×５ｃｍ（ｈ）の穴のある不透明壁を使用して２つの等しいサイズの区画に長さ方向に分けた。明るい区画には、ケージ床から３ｃｍの高さで、アルミニウムヒートシンクに、８個の５９０ｎｍのＬＥＤ（Cree XP-E, amber, Lumitronix）を取り付けた。マウスはすべて同年齢であり、その年齢はテスト時に１０〜１３週の範囲であった。非移植Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−（ｎ＝１０）、ＧＦＰのみを発現する細胞を移植したＣｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−（ｎ＝９）、ＮｐＨＲ発現細胞を移植したＣｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−（ｎ＝１２）、及び非移植野生型Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウス（ｎ＝１０）に、オレンジ色（５９０ｎｍ）光で区画を照明する４分間のトライアルを行った。テスト前に、マウスを暗いテスト室に２時間馴化させた。マウスの挙動を２．１１×１０１５ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１の光強度においてテストした。明るい区画の光強度は、可変電圧供給源（VLP-1303 PRO, Voltcraft）を使用して調節され、分光光度計（OceanOptics）を用いて測定した。光強度測定値は、ＬＥＤから１ｃｍにおいて、ケージ中央において、及び照明側の穴に隣接して、明るい区画の３つの位置より平均した。実験手順及び処置群については伏せてある観察者が、マウスの挙動を手作業で分析した。マウスを明るい区画に個別に誘導して、４分間自由にボックスにおいて移動させた。マウスが位置する区画を判定するためにマウス頭部の位置を使用した。各区画で過ごした時間をビデオカメラ（Handycam、Sony Corporation、東京、日本）で記録した。動物が暗所において最初の３分に境界を超えない場合、トライアルから除外した。統計的有意性を通常の一元配置分散分析によって評価するとともに、群平均を比較するためにテューキーの多重比較検定を使用し、Ｐ＜０．０５のレベルを有意であるとした。データをＰｒｉｓｍ６（Graphpad Software、ラホヤ、カリフォルニア州）で分析及びプロットした。
【０１２５】
図５Ｂに示すように、野生型とＮｐＨＲ発現細胞を移植したＣｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−マウスとは、非移植Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−マウス又はＧＦＰのみを発現する細胞を移植したＣｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−マウスと比較して、明るい区画において有意に少ない時間を過ごした（Ｐ＜０．０００１、通常の一元配置分散分析）。野生型マウスとＮｐＨＲ処置Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−マウスとの挙動の違いは有意ではなく、非移植マウスとＧＦＰのみで処置したＣｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−マウスとの挙動の違いも有意ではなかった。明暗ボックス実験は、ＮｐＨＲ細胞移植マウスにおける有意な光回避挙動を示すことから、網膜に由来するハロロドプシン誘導信号が脳に伝達されているとともに失明マウスの挙動を変化させるのに十分であるということが示される。移植細胞単独（ＧＦＰのみ、ＮｐＨＲを発現しない）では挙動の変化を誘発するには十分でない。
【０１２６】
〔Ｂ．失明ｒｄ１０マウスの移植光受容体において、光遺伝学的刺激がハロロドプシン誘導光反応を誘発する〕
ドナー（光受容体前駆体）細胞の光遺伝学的形質転換、単離及び失明ｒｄ１０マウスへの移植を、パッチクランプ記録及び光刺激分析として上記に記載されるように行う。
【０１２７】
ハロロドプシン発現細胞は、５９０ｎｍの光による２回連続フラッシュに対する典型的な光反応を示し（図６Ａ）、最大反応が５５０ｎｍ〜５７５ｎｍで得られるスペクトルチューニングでの光電流を示し（図６Ｂ及び図６Ｃ）、速い動態を示す典型的なフリッカー刺激反応を示す（図６Ｄ）。
【０１２８】
ＧＦＰ陽性細胞のライブイメージングを上述のように行う。ハロロドプシン形質導入前駆細胞はホストに移植後生存し、蛍光性は細胞膜に限定された（図７Ａは落射蛍光画像、図７Ｂは２光子イメージング）。一部の移植細胞は良好な延長性を示した（図７Ａ及び図７Ｂ、右側、矢印）。
【０１２９】
〔Ｃ．全組織標本網膜のドナー細胞において光遺伝学的刺激がハロロドプシン誘導光反応を誘発する〕
出生後日Ｐ２に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを氷上で麻痺させて、まぶたに切り口をつけ、ヒトロドプシンプロモーターのもとでハロロドプシンをコードするＡＡＶ（AAV92YF-hRho-eNpHR-EYFP）の３．０×１０１３〜３．３×１０１４粒子を含有する１μｌストックを、超微細３４ゲージシリンジ（Hamilton）を使用して各目の硝子体腔に注入した。出生後日Ｐ４に、以前に注入したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから網膜を単離した。網膜におけるパッチクランプ記録及び光刺激分析を上記に記載されるように行う。
【０１３０】
ハロロドプシン発現細胞は、５９０ｎｍの光による２回連続フラッシュに対する典型的な光反応を示し（図８Ａ）、最大反応が５７５ｎｍで得られるスペクトルチューニングでの光電流及び膜過分極を示し（図８Ｂ）、速い動態の典型的なフリッカー刺激反応を示す（図８Ｃ）。
【０１３１】
ＧＦＰ陽性細胞のライブイメージングを上述のように行う。ハロロドプシン形質導入前駆細胞は全組織標本網膜に注入後２０日存在し、蛍光性は細胞膜に限定された（図９Ａ及び図９Ｂ）。
【０１３２】
〔Ｄ．網膜オルガノイドにおけるＪａｗｓを発現するＡＡＶ形質導入ｈｉＰＳ細胞において光遺伝学的刺激が光反応を誘発する〕
＜１．Ｊａｗｓ陽性光受容体の生成＞
ｈｉＰＳ細胞を、成体ヒト皮膚線維芽細胞初代細胞株に、転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＣ−ＭＹＣをコードする３つのプラスミドで遺伝子導入することによって作製し、フィーダー上で培養する（Yu J等、Science, 2009）。ｈｉＰＳ細胞は、ｉＰＳ培地においてコンフルエントに広がる。（Essential8培地、GIBCO、Life Technologies）。コンフルエントにおいて、時間の状態を０日目とする。０日目に、ｈｉＰＳ細胞をＦＧＦ−２不含ｉＰＳ培地に配置する。３日目に、培地を取り除き、新しいＰｒｏＮ２培地（１％のＮ２サプリメントを添加したEssential6培地、（GIBCO、Life Technologies）を添加する。２８日目に、同定した神経網膜（ＮＲ）様構造をニードルで単離し、移動して、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を添加したＤＭＥＭ／栄養素混合物Ｆ−１２、１％のＭＥＭ非必須アミノ酸、２％のＢ２７サプリメント（すべてLife Technologiesより）（ＰｒｏＢ２７培地とも呼称される）を含む成熟培地において浮遊構造として培養して、神経網膜を形成させる。３５日目に、ＦＧＦ２を取り除いた。ＤＡＰＴを分化の４２日〜４９日に添加した。
【０１３３】
＜２．感染網膜オルガノイドの光刺激＞
７０日目に、ｍＣＡＲ（錐体アレスチン）プロモーターのもとでＪａｗｓをコードするＡＡＶの５．０×１０１０粒子（AAV2-7m8-mCAR-Jaws-GFP）に網膜オルガノイドを感染させた（図１、下段）。感染網膜オルガノイドにおけるパッチクランプ記録及び光刺激分析を上記に記載されるように行う。
【０１３４】
Ｊａｗｓ発現細胞は、５９０ｎｍの光による２回連続フラッシュで刺激するとき典型的な光反応を示し（図１０Ａ）、最大反応が５７５ｎｍで得られるスペクトルチューニングでの過分極及び光電流を示し（図１０Ｂ）、速い動態の典型的なフリッカー刺激反応を示す（図１０Ｃ）。
【０１３５】
＜３．感染網膜オルガノイドの２光子ライブイメージング＞
ＧＦＰ陽性細胞のライブイメージングを上述のように行う。様々な倍率での網膜オルガノイドにおけるＧＦＰ陽性細胞のライブイメージングにより、Ｊａｗｓ発現がＰＲ膜に限定されることが示される（図１１）。
【０１３６】
＜４．７０日目の網膜オルガノイドの解離から得たＤ１００単層培養物の免疫蛍光＞
−網膜オルガノイドの解離
任意の色素組織を取り除いた後、７０日目の網膜オルガノイドを採取し、リンゲル液（155mMのNaCl、5mMのKCl、2mMのCaCl2、1mMのMgCl2、2mMのNaH2PO4、10mMのHEPES、及び10mMのグルコース）にて３回洗浄してから、リンゲル液にて２５分間３７℃で、２８．７μ／ｍｇの２単位の前活性化したパパイン（Worthington）で解離した。ピペットに通した後に均質な細胞懸濁液を得ると、パパインをＰｒｏＢ２７培地で非活性化した。細胞を遠心分離して予備加温したＰｒｏＢ２７培地に再懸濁した。
【０１３７】
−ヒトｉＰＳＣ由来の光受容体の単層培養
解離した網膜細胞を、２４ウェルのプレートにおいて３０μｇ／ｃｍ２ヒト組換えラミニン（Sigma-Aldrich）及び１５０μｇ／ｃｍ２のポリ−Ｌ−オルニチンでコーティングしたカバーガラスにプレーティングした。単層物を標準的な５％ＣＯ２／９５％空気のインキュベータ−において３７℃でインキュベートして、免疫染色前、培地を続く１５〜２０日間で２日毎に変えた。
【０１３８】
細胞をＰＢＳで洗浄して（５分、室温）、０．５％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含むＰＢＳにて１時間室温で透過処理した。遮断を０．２％のゼラチン、０．２５％のＴＲＩＴＯＮ、Ｘ−１００を含むＰＢＳで３０分間室温にて行い、一次抗体とともにインキュベートを一晩４℃で行った。使用した一次抗体は、光受容体マーカーとして１／２０００希釈の抗リカバリンウサギポリクローナル抗体（Millipore）と１／５００希釈の抗ＧＦＰニワトリポリクローナル抗体（abcam）である。
【０１３９】
一次抗体とともにインキュベート後、切片を０．２５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄して、蛍光色素コンジュゲート２次抗体（１／５００希釈）とともに１時間室温でインキュベートした。その後のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０での洗浄後、核を１／２０００希釈のＤＡＰＩ（４´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ジラクテート、Invitrogen-MolecularProbe、ユージーン、オレゴン州）で対比染色した。
【０１４０】
図１２に示すように、７０日目のＪａｗｓ感染網膜オルガノイドの解離から得た１００日目の単層培養物はＪａｗｓ陽性光受容体（RCVN）細胞を示す。
【０１４１】
＜５．Ｊａｗｓ陽性光受容体の網膜下移植＞
感染網膜オルガノイドを移植前に解離する。  細胞懸濁液を網膜下腔に移植するために、成体のｒｄ１０、Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−又はｒｄ１−／−マウスを、ケタミン（50mg/Kg）及びキシラジン（10mg/kg）の腹腔内注入により麻酔した。瞳孔をトロピカミド（MydriaticumDispersa）の液滴で拡張させ、鈍い３４ゲージニードルを備えたシリンジ（Hamilton）を使用して、約２００，０００細胞を含有する１マイクロリットルの懸濁液を網膜下腔に注入した（図１、下段）。
【０１４２】
＜６.Ｒｄ１０マウスにおける移植Ｊａｗｓ陽性細胞（GFP）は外顆粒層に取り込まれて光受容体特異的マーカーを発現する＞
組織の準備
１００日齢の移植ｒｄ１０マウスの目を摘出して、新しく準備した４％のパラホルムアルデヒド溶液にて一晩４℃で直ちに固定した。目をＰＢＳにて洗浄して、ＰＢＳ溶液内の３０％ショ糖にて一晩インキュベートして、ＯＣＴに含ませた。
【０１４３】
クリオスタットミクロトームを使用して眼杯の１８μｍ厚の切片を得て、スーパーフロストウルトラプラススライド（MENZEL-GLASER、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）に封入した。凍結切片をＰＢＳで洗浄して（５分、室温）残りのＯＣＴを取り除き、０．５％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含むＰＢＳにて１時間室温で透過処理した。遮断を０．２％のゼラチン、０．２５％のＴＲＩＴＯＮ、Ｘ−１００を含むＰＢＳで３０分間室温にて行い、一次抗体とともにインキュベートを一晩４℃で行った。使用した一次抗体は、１／５０００希釈の抗ＣＲＸマウスモノクローナル抗体（Abnova）と、光受容体マーカーとしての１／２０００希釈の抗ＲＣＶＮウサギポリクローナル抗体（Millipore）と、錐体特異的マーカーとしての１／２００希釈の抗Ｒ／Ｇオプシンウサギポリクローナル抗体（Millipore）と、１／２００希釈の抗ＰＤＥ６Ｃウサギポリクローナル抗体（Millipore）と、１／５００希釈の抗ＧＦＰニワトリポリクローナル抗体（abcam）と、１／５００希釈の抗ＲＩＢＥＹＥマウスモノクローナル抗体（BD Biosciences）である。
【０１４４】
一次抗体とともにインキュベート後、切片を０．２５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄して、蛍光色素コンジュゲート２次抗体（１／５００希釈）とともに１時間室温でインキュベートした。その後のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０での洗浄後、核を１／２０００希釈のＤＡＰＩ（４´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ジラクテート、Invitrogen-MolecularProbe、ユージーン、オレゴン州）で対比染色した。サンプルをさらにＰＢＳで洗浄し、１００％エタノールで脱水してから、フルオロマウント、ベクタシールド（VectorLaboratories）を使用して封入した。
【０１４５】
１００日齢の移植ｒｄ１０マウスの網膜切片における免疫蛍光分析は、ＯＮＬに取り込まれて光受容体特異的マーカーを発現するＪａｗｓ陽性細胞（GFP）を示す。Ｊａｗｓ及びＣＲＸ及びＲＣＶＮ並びに錐体特異的マーカーＲ／Ｇオプシン、ＮｏＰＤＥ６Ｃ（錐体特異的）の陽性細胞をドナー又はホスト細胞において観察した（図１３Ａ）。Ｊａｗｓ陽性光受容体細胞は双極細胞と接続し、シナプス結合を形成する（図１３Ｂ）。
【０１４６】
このように、Ｊａｗｓ陽性細胞（GFP）は、ＯＮＬに取り込まれて光受容体特異的マーカーを発現した。Ｊａｗｓ陽性細胞は下方の双極細胞とシナプス結合を形成した。
【０１４７】
＜７．Ｒｄマウスにおける移植Ｊａｗｓ陽性細胞による光が誘導する挙動＞
図１４に示すように、９０日齢ｒｄ１０マウスにおいて明暗ボックステストを使用して光挙動分析を行った。図１４は、非移植失明ｒｄ１０マウス（ｎ＝１２）、単眼移植ｒｄ１０マウス（ｎ＝１０）、両眼移植ｒｄ１０マウス（ｎ＝３）における、光条件の明るいボックスで過ごした時間（％）を表す。統計的有意性をマン・ホイットニーのＵ検定を行って評価して、群平均を比較した。ｐ＜０．０５のｐ値を有意であるとした。データをＰｒｉｓｍ６（Graphpad Software、ラホヤ、カリフォルニア州）で分析及びプロットした。＊：ｐ＝０．００７０であり、＊＊：ｐ＝０．００９１である。
【０１４８】
このように、これらの結果は、両眼に注入したとき移植マウスがｒｄ１０失明マウスのコントロールと比較して光回避挙動を示すことを表す。
【０１４９】
＜Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−モデル及びＲｄ１モデルにおける移植Ｊａｗｓ陽性細胞の光刺激＞
パッチクランプ記録及び光刺激分析を上記に記載されるように行った。
【０１５０】
光電流（上部）及び電圧過分極（下部）を、Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−モデル（図１５Ａ）及び又はｒｄ１モデル（図１５Ｄ）において、３．５×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１の強度における５９０ｎｍの光による２回連続フラッシュで刺激した、Ｊａｗｓ発現細胞より分析した。図１５Ｂ及び図１５Ｆは、様々な波長で刺激したＪａｗｓ発現細胞に対応するＪａｗｓ誘導過分極作用スペクトルを示す。２５ｎｍのステップによって隔てられた４００ｎｍ〜６５０ｎｍの範囲の刺激を３．５×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１で使用した。Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−モデル（図１５Ｂ）及びｒｄ１モデル（図１５Ｆ）の両方において、最大反応を５７５ｎｍで取得し、これはＪａｗｓの作用スペクトル最大値に対応するものである。そして、時間特性を、移植Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−マウス（図１５Ｃ）及びｒｄ１マウス（図１５Ｇ）において、２Ｈｚから３０Ｈｚまでの（３．５×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）刺激周波数の増大におけるＪａｗｓ誘導過分極の変調によって分析した。Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−モデルの２５Ｈｚについて、拡大したトレースを示す（図１５Ｃ）。これは人の視力にとって十分な時間分解能である。図１５Ｅは、光刺激強度（１０１４〜１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１）の関数としてのＪａｗｓ電圧反応を示し、より低い光強度もまた、移植細胞に反応を、程度はより低いものではあるが、誘発するのに十分であることを示す。
【０１５１】
＜９．介在ニューロンを介したｈｉＰＳから神経節細胞への信号伝達＞
移植したｈｉＰＳＣ由来細胞（網膜の入力）から神経節細胞（網膜の出力）への信号伝達の例を示すため、３つの移植蛍光性細胞に直接的に接続する可能性が高いことから３つの移植蛍光細胞の直下に位置する介在ニューロン（Ｊａｗｓを発現しない２次ニューロン）を記録することができた。この信号伝達の概略図が図１６に示される。２回連続フラッシュで刺激したＪａｗｓ発現細胞の代表的な光電流を図１６Ａに示し、次に、Ｊａｗｓを発現しないが周囲のＪａｗｓ−ｈｉＰＳ移植細胞に接続すると考えられるＩＮＬ層における２次細胞（オフ細胞）からの代表的な電流（下部）及び電圧（上部）反応（図１６Ｂ）、最後に、図１６Ｂに示す２次ニューロンから仮説上は入力を受けているオフ神経節細胞（３次ニューロン）反応（スパイク活性）記録の例である（図１６Ｃ）。
【０１５２】
＜１０．多電極アレイ記録及びデータ分析＞
多電極アレイ記録、光刺激、及びデータ分析を上記に記載されるように行った。
【０１５３】
図１７Ａは、移植した失明Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−マウスのＰＳＴＨ及びラスタープロットとして示されるＭＥＡ記録からの平均スパイク反応を示す。反応は、１．２４×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１の強度の５８０ｎｍの光による２秒の光パルスで誘発される。オフ（左）又はオン・オフ（右）反応のいずれかで反応するＲＧＣを検出している。また、移植したｒｄ１マウスにおけるオン及びオフ反応も記録しており、代表的な例を図１７Ｆに示す。さらに、４５０ｎｍ〜６５０ｎｍの範囲の波長で（１．２４×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１の強度）移植Ｃｐｆｌ１／Ｒｈｏ−／−網膜を刺激した。ＲＧＣは、４５０ｎｍ刺激に暴露したとき反応を示さず、Ｊａｗｓの作用スペクトルがレッドシフトしているということと対応する（図１７Ｂ）。また、刺激により低い光強度を使用して、１０１６ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−１の強度の刺激（５８０ｎｍ）がＲＧＣにおける反応を、程度はより低いものではあるが、誘発するために十分なものであるということを示した（図１７Ｃ）。図１７Ｄは、１秒（左）、１００ミリ秒（中央）、１ミリ秒（右）の刺激の結果である（５８０ｎｍ、１．２４×１０１７ｐｈｏｔｏｎｓ・ｃｍ−２ｓ−）代表的なＲＧＣからの平均スパイク反応及びラスタープロットを表す。適切な反応を誘発するために、１ミリ秒ほども短い刺激でも十分である。図１７Ｅは、ＧＦＰのみを発現するｉＰＳＣ由来光受容体で処置した網膜から記録した代表例を示す。これらの細胞の準備及び単離は、Ｊａｗｓ発現細胞のものと同じ方法で行われ、その唯一の違いは、ＡＡＶ−ｍＣａｒ−Ｊａｗｓ−ＧＦＰウイルスの代わりにＡＡＶ−ｍＣａｒ−ＧＦＰウイルスを培地に添加したことである。結果は、Ｊａｗｓを発現しないｉＰＳＣ由来光受容体単独はＲＧＣの反応を回復するために十分なものではないことを示す。
【図１】
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【図２Ａ−Ｆ】
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【図２Ｇ−Ｈ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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2019532636.tif 000022
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