(57)【要約】  いくつかの態様では、単一ＳＭＡＤ阻害、又は唯１つのＳＭＡＤ阻害剤によるＳＭＡＤシグナル伝達の阻害を使用して多能性細胞を中脳ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンに分化させるための方法が提供される。いくつかの実施形態では、単一ＳＭＡＤ阻害は、多能性細胞を中脳ＤＡニューロンに分化させるために骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の単一の阻害剤を利用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）及びＬＩＭホメオボックス転写因子１（ＬＭＸｌ）の両方を発現するヒト細胞（ＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸｌ＋細胞）を含む細胞組成物を調製するためのインビトロ方法であって、以下のシグナル伝達モジュレーター：
（ａ）Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達の単一の阻害剤、
（ｂ）ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子、及び
（ｃ）ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子、の存在下でヒト多能性細胞を培養すること；並びに
前記ＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸｌ＋細胞を含む細胞組成物を提供するのに十分な期間にわたって前記細胞を前記モジュレーターの存在下で培養することを含む、方法。
【請求項２】
前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤がＢＭＰ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＢＭＰ阻害剤が、ＬＤＮ−１９３１８９、ドルソモルフィン、ＤＭＨ−１、又はノギンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＢＭＰ阻害剤がＬＤＮ−１９３１８９である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＬＤＮ−１９３１８９が、約０．２μＭ〜約４μＭの濃度で存在する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＬＤＮ−１９３１８９が、約１μＭ〜約３μＭの濃度で存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤がＴＧＦβ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＧＦΒβ阻害剤がＳＢ４３１５４２である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記多能性細胞を、培養の１〜１５日目、１〜１６日目、又は１〜１７日目に前記ＳＭＡＤの阻害剤と共に培養する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記多能性細胞を、培養の１〜１７日目に前記ＳＭＡＤ阻害剤と共に培養する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記多能性細胞を、１５日間、１６日間、又は１７日間にわたって前記ＳＭＡＤの阻害剤と共に実質的に連続的に又は毎日培養する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記多能性細胞を、１７日間にわたって前記ＳＭＡＤの阻害剤と共に実質的に連続的に又は毎日培養する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＳＭＡＤの阻害剤が約５０〜２０００ｎＭ又は５０〜５００ｎＭの濃度で存在する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＳＭＡＤの阻害剤が、約１８０〜２４０ｎＭの濃度で存在する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記多能性細胞をＭＥＫ阻害剤に接触させることをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＤ０３２５９０１が、約０．２５〜２．５μＭの濃度で存在する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＭＥＫ阻害剤を、前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後約１〜３日間、又は１〜３日目、２〜４日目、３〜５日目、又は１日目、２日目、３日目、４日目、若しくは５日目に前記多能性細胞に接触させる、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＭＥＫ阻害剤を、前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後約２４〜約４８時間、前記多能性細胞に接触させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＭＥＫ阻害剤を、前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始の約１〜２日後から約３〜４日間にわたって毎日又は実質的に連続的に前記多能性細胞に接触させる、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＭＥＫ阻害剤を、１日目の前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後２〜５日目又は３〜６日目に前記多能性細胞に接触させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子がＧＳＫ３阻害剤である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＨＩＲ９９０２１が約０．５〜３μＭの濃度で存在する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＨＩＲ９９０２１が約１．２５μＭ超〜約２μＭの濃度で存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＨＩＲ９９０２１が、前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後９〜１７日目に約４〜７μＭの濃度で存在する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子を、前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後１〜３日目に前記多能性細胞に接触させる、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子を、前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後２４〜４８時間以内に前記多能性細胞に接触させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記多能性細胞を、１４日間、１５日間、又は約１６日間にわたって実質的に連続的に又は毎日、前記Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子と共に培養する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子を、前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後２〜１７日目に前記多能性細胞に接触させる、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＳＨＨシグナル伝達の活性化因子がプルモルファミン又はＣ２５ＩＩ  Ｓｈｈである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記多能性細胞を２つのＳＨＨシグナル伝達の活性化因子に接触させることをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記２つのＳＨＨシグナル伝達の活性化因子がプルモルファミン及びＣ２５ＩＩ  Ｓｈｈである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＳＨＨシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子を、前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始と同じ日に、又は前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後２４〜４８時間以内に前記多能性細胞に接触させる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＳＨＡシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子を、前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始と同時又は接触開始後１〜７日目に前記多能性細胞に接触させる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記多能性細胞をＦＧＦ−８に接触させることをさらに含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＦＧＦ−８を、前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始と同じ日に前記多能性細胞に接触させない、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＦＧＦ−８を、前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後９〜１７日目又は１１〜１７日目に前記多能性細胞に接触させる、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＦＧＦ−８が、約５０〜２００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記多能性細胞が、ニューロンプロモーターの制御下にある抗生物質耐性導入遺伝子を含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記多能性細胞由来の神経細胞又は中脳ＤＡニューロンを、細胞を抗生物質、化学療法剤、ＤＮＡ架橋剤、ＤＮＡ合成阻害剤、又は有糸分裂阻害剤に接触させることによって選択することをさらに含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記多能性細胞を抗生物質又は化学療法剤に接触させることをさらに含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記化学療法剤がマイトマイシンＣである、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記マイトマイシンＣを、前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後２７日目、２８日目、２８日目、及び／又は２９日目に前記多能性細胞に接触させる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗生物質がＧ４１８（ジェネティシン）である、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始前に、前記多能性細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養又はインキュベートすることをさらに含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記多能性細胞をブレビスタチンに接触させることをさらに含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ブレビスタチンを、分化の５日目及び１７日目に前記細胞に接触させる、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
細胞の少なくとも４０％が分化し、ＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１の両方を発現する、請求項１〜６又は９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
細胞の少なくとも６０％が分化し、ＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１の両方を発現する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
細胞の少なくとも８０％が分化し、ＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１の両方を発現する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
細胞の少なくとも８５％が分化し、ＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１の両方を発現する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
細胞の少なくとも５０％が分化し、ＦＯＸＡ２及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の両方を発現する、請求項１〜６又は９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
細胞の少なくとも７０％が分化し、ＦＯＸＡ２及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の両方を発現する、請求項５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記多能性細胞がヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＬＭＸ１が、ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）である、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
ＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１、又はＦＯＸＡ２及びＴＨを発現する前記分化細胞が、オルソデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ２）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＵＲＲ１）、ニューロン特異的クラスＩＩＩβ−チューブリン（Ｔｕｊ１）、ＴＴＦ３、対様ホメオドメイン３（ＰＩＴＸ３）、ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ複合体（ＡＳＣＬ）、初期Ｂ細胞因子１（ＥＢＦ−１）、初期Ｂ細胞因子３（ＥＢＦ−３）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、シナプシン、ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）、及びＧタンパク質共役型の内向き整流カリウムチャネル（Ｋｉｒ３．２／ＧＩＲＫ２）、ＣＤ１４２、ＤＣＳＭ１、ＣＤ６３、及びＣＤ９９からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーをさらに発現する、請求項４９〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
ヒト多能性細胞を、ＤＮａｓｅ又はエンドヌクレアーゼの存在下でインキュベートすることをさらに含む、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記エンドヌクレアーゼがＤＮａｓｅ  Ｉ又はＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＤＮａｓｅ  Ｉ又はＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）が約１００Ｕ／ｍＬの濃度で存在する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ヒト多能性細胞を、前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後４〜６日目の少なくとも１日、エンドヌクレアーゼの存在下で培養する、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ヒト多能性細胞を、前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後５日目にエンドヌクレアーゼの存在下で培養する、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法によって生成された中脳ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンの培養物。
【請求項６４】
前記培養物が容器手段に含まれる、請求項６３に記載の培養物。
【請求項６５】
前記ニューロンが医薬品中に含まれる、請求項６３又は６４に記載の培養物。
【請求項６６】
前記医薬品が注射用に製剤化されている、請求項６５に記載の培養物。
【請求項６７】
哺乳動物対象の疾患を処置する方法であって、治療有効量の請求項６３〜６６のいずれか一項に記載の培養物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６８】
前記哺乳動物対象がヒトである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記疾患が中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記疾患がパーキンソン病（ＰＤ）又はパーキンソンプラス症候群（ＰＰＳ）である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記培養物が、完全には分化していない、又は分化の１６日目、１７日目、１８日目、１９日目、２０日目、２１日目、２２日目、２３日目、２４日目、２５日目、若しくは１７〜２４日目であるドーパミン作動性ニューロンを含む、請求項６７〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記培養物がヒアルロン酸マトリックスを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
試験化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験対象を、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法によって分化したＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋細胞に接触させること、及び
（ｂ）前記細胞の機能、生理、又は生存率を測定することを含む、方法。
【請求項７４】
前記測定することが、前記細胞の毒物学的反応又は変化した電気生理学的反応について試験することを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞が、中脳ドーパミン作動性（ＤＡ）細胞である、請求項７３又は７４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年８月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／３７５，５９０号の利益を主張する。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、一般に、分子生物学及び医薬の分野に関する。より詳細には、本発明は、多能性細胞からドーパミン作動性ニューロンを生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
多数の特殊化した細胞型に分化する能力を保持している細胞集団は、多数の系統特異的分化細胞集団を生成するのに有用である。これらの系統特異的分化細胞集団は、定義された細胞集団の機能喪失をもたらす疾患を有する患者の細胞補充療法において用途を見出すことが企図される。これらの直接的な治療的価値に加えて、系統特異的分化細胞はまた、細胞系統特異的疾患を処置するための治療用分子の機能の詳細又は試験送達について同定し、確認し、かつ試験するためのインビトロスクリーニングアッセイを含む様々な目的のための貴重な研究ツールである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
例えば、パーキンソン病の場合、中脳ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンの喪失により、疾患症状が出現する。従って、例えばパーキンソン病の処置のための新しい治療薬を同定するために、このような細胞を治療にも疾患モデルにも使用することができるため、多能性細胞からＤＡニューロン細胞を産生させる方法が必要である。
【０００５】
多能性細胞から中脳ＤＡニューロンを生成するために様々な努力がなされてきた。例えば、多能性細胞から中脳ＤＡニューロンを生成するための方法論は、典型的には、例えば国際公開第２０１３／０６７３６２号パンフレットに記載されている、（ＡＬＫ  １／２／３／６を阻害し、ＳＭＡＤ  １／５／８をブロックする）ＢＭＰシグナル伝達阻害剤であるＬＤＮ−１９３１８９、及び（ＡＬＫ  ４／５／７を阻害し、ＳＭＡＤ２／３をブロックする）ＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤であるＳＢ−４３１５４２の両方を必要とする。これらの方法は、２つのＳｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達阻害剤の組み合わせを利用するため、これらの方法は、典型的には「二重ＳＭＡＤ阻害」又は「二重ＳＭＡＤｉ」と呼ばれる。単一のＳＭＡＤ阻害剤のみを使用して人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から中脳ドーパミン作動性（ｍＤＡ）ニューロンを生成するための方法を考案することが望ましいであろうが、このような努力はこれまでのところ失敗している。明らかに、単一のＳＭＡＤ阻害剤のみを用いてｉＰＳ細胞からｍＤＡニューロンを生成する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、いくつかの態様では、単一ＳＭＡＤ阻害（単一ＳＭＡＤｉ）を用いて多能性細胞からニューロンを生成するための方法を提供することによって、先行技術における制限を克服する。単一ＳＭＡＤｉ法の使用は、２つ以上のＳＭＡＤ阻害剤を用いたＳＭＡＤシグナル伝達の阻害を必要とする方法よりも優れた利点を提供することができる。以下の実施例に記載されるように、ヒト人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性細胞からドーパミン作動性ニューロンなどの神経細胞株を生成するための方法が提供される。本明細書に示すように、以下を含むいくつかの態様がこれらの方法に含まれ得る：（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）の添加を２日目又は３日目にシフトすること、（ｉｉ）ＣＨＩＲ濃度を再最適化すること（例えば、約０．５〜３．０μＭ、０．７〜３μＭ、１〜２．５μＭ、１．２５〜２．２５μＭ、約１．２５μＭ超〜約２μＭ、又は約１．５５μＭ、１．６５μＭ、１．７５μＭ、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲を用いる）、及び／又は（ｉｉｉ）３〜５日目の分化培地中にＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ０３２５９０１）を含めること。この方法は、例えば、上記の態様（ｉ及びｉｉ）、（ｉｉ及びｉｉｉ）、（ｉ及びｉｉｉ）、又は（ｉ、ｉｉ、及びｉｉｉ）を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞をＢＭＰ阻害剤（例えば、ドルソモルフィン（ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）又はＬＤＮ−１９３１８９）に曝露し、かつこの細胞を、ＳＢ４３１５４２などのＴＧＦ−β阻害剤に曝露せずに、細胞の中脳ＤＡニューロン又はＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋細胞への分化を促進する。以下の実施例に示すように、これらの方法は、単一のＳＭＡＤ阻害剤のみ（例えば、ドルソモルフィンのみ又はＬＤＮ−１９３１８９のみ）を含む培地を用いたｉＰＳ細胞株からの非常に効率的なｍＤＡ前駆細胞の形成に使用することができる。
【０００７】
本発明の一態様は、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）及びＬＩＭホメオボックス転写因子１（ＬＭＸ１）の両方を発現するヒト細胞（ＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１＋細胞）を含む細胞組成物を調製するためのインビトロ方法に関し、この方法は、次のシグナル伝達モジュレーター：（ａ）Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達の単一阻害剤、（ｂ）ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子、及び（ｃ）ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子の存在下でヒト多能性細胞を培養すること；及び前記ＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１＋細胞を含む細胞組成物を提供するのに十分な期間にわたって前記モジュレーターの存在下で細胞を培養することを含む。いくつかの好ましい実施形態では、ＬＭＸ１は、ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）である。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤は、例えばＬＤＮ−１９３１８９（例えば、約０．２μＭ〜約４μＭ、より好ましくは０．２μＭ超〜約４μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲の濃度の）、ドルソモルフィン、ＤＭＨ−１、又はノギン（ｎｏｇｇｉｎ）などのＢＭＰ阻害剤である。以下の実施例に示すように、ＬＤＮ−１９３１８９の濃度の上昇（例えば、０．２μＭと比較して２μＭ）は、ｉＰＳ細胞のＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１＋細胞又はドーパミン作動性ニューロンへの改善された分化をもたらした。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ阻害剤はＬＤＮ−１９３１８９である。ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤は、例えば、ＳＢ４３１５４２（例えば、約５〜１００μＭ、約２０〜６０μＭ、約３０〜５０μＭ、又は約４０μＭの濃度で存在するＳＢ４３１５４２）などのＴＧＦβ阻害剤（ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤）であり得る。いくつかの実施形態では、多能性細胞は、培養の１〜１５日目、１〜１６日目、又は１〜１７日目にＳＭＡＤの阻害剤と共に培養される。多能性細胞は、１５日間、１６日間、又は１７日間、実質的に連続的に又は毎日、ＳＭＡＤの阻害剤と共に培養される。ＳＭＡＤの阻害剤は、約５０〜２０００ｎＭ、約５０〜５００ｎＭ、約５００〜２５００ｎＭ、又は約５００〜２０００ｎＭ、又は約１８０〜２４０ｎＭの濃度で存在し得る。いくつかの実施形態では、この方法は、多能性細胞をＭＥＫ阻害剤に接触させることをさらに含む。ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ０３２５９０１は、約０．２５〜２．５μＭ又は約０．５〜１．５μＭの濃度で存在する。いくつかの態様では、ＭＥＫ阻害剤は、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後約１〜３日目、又は１〜３日目、２〜４日目、３〜５日目、又は１日目、２日目、３日目、４日目、若しくは５日目に多能性細胞に接触させる（例えば、分化の２日目又は３日目から約７２時間後に接触させることができる）。ＭＥＫ阻害剤は、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後約４８〜約７２時間、約２４〜約９６時間、又は約２４〜約４８時間で多能性細胞に接触させることができる。いくつかの実施形態では、ＭＥ���阻害剤は、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始の約１〜２日後から約３〜４日間、毎日又は実質的に連続的に多能性細胞に接触させる。いくつかの実施形態では、ＭＥＫ阻害剤は、１日目のＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後２〜５日目、３〜６日目、又は３〜５日目に多能性細胞に接触させる。Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子は、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１などのＧＳＫ３阻害剤であり得る。ＣＨＩＲ９９０２１は、約０．５〜３μＭの濃度、又は約１．２５μＭ超〜約２μＭの濃度（例えば、約１．５〜２．０μＭ、約１．５５〜１．７５μＭ、又は約１．５５μＭ、１．６５μＭ、１．７５μＭ、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲；そしていくつかの実施形態では、より高い濃度、例えば、１日目のＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後９〜１７日目又は１１〜１７日目に４〜７μＭ又は６μＭを使用してもよい）で存在し得る。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子は、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始の１〜３日後に多能性細胞に接触させる。Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子は、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始の１２〜４８時間後又は２４〜４８時間後に多能性細胞に接触させてもよい。多能性細胞は、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、又は約１６日間、実質的に連続的に又は毎日、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子と共に培養される。Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子は、１日目のＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後２〜１７日目に多能性細胞に接触させてもよい。いくつかの実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の活性化因子は、プルモルファミン（ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）、Ｃ２５ＩＩ  Ｓｈｈ、又はＣ２４ＩＩ  Ｓｈｈである。いくつかの実施形態では、Ｃ２５ＩＩ  Ｓｈｈは、Ｃ２４ＩＩ  Ｓｈｈの代わりに、又はこれと組み合わせて使用することができる。この方法は、多能性細胞を、例えば、プルモルファミン及びＣ２５ＩＩ  Ｓｈｈなどの２つのＳＨＨシグナル伝達の活性化因子に接触させることをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子は、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始と同じ日に、又はＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後２４〜４８時間以内に多能性細胞に接触させる。いくつかの実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の少なくとも１つの活性化因子は、１日目のＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始と同時又は接触開始後１〜７日目に多能性細胞に接触させる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、この方法は、多能性細胞をＦＧＦ−８に接触させることをさらに含む。ＦＧＦ−８は、ＦＧＦ−８ａ又はＦＧＦ−８ｂであり得；好ましくは、ＦＧＦ−８は、ＦＧＦ−８ｆではない。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ−８は、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始と同じ日に多能性細胞に接触されない。ＦＧＦ−８は、１日目のＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後９〜１７日目又は１１〜１７日目に多能性細胞に接触させてもよい。ＦＧＦ−８は、約２５〜５００ｎｇ／ｍＬ、約２５〜２５０ｎｇ／ｍＬ、５０〜１５０、５０〜２００ｎｇ／ｍＬ、又は２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２２５ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、若しくは２７５ｎｇ／ｍＬ、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲の濃度で存在し得る。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ−８を含むことは、細胞の生存率を改善し、そして所望のマーカーＥｎｇｒａｉｌｅｄ−１（Ｅｎ−１）の発現を促進することができる。多能性細胞は、ニューロンプロモーターの制御下の抗生物質耐性導入遺伝子を含み得る。この方法は、細胞を抗生物質、化学療法剤、ＤＮＡ架橋剤、ＤＮＡ合成阻害剤、又は有糸分裂阻害剤に接触させて、例えば、神経細胞又は中脳ＤＡニューロンを含む細胞の培養物中に存在し得る分裂細胞を殺すことによって多能性細胞由来の神経細胞又は中脳ＤＡニューロンを選択することをさらに含み得る。この方法は、多能性細胞を抗生物質（例えば、Ｇ４１８（ジェネティシン））又は化学療法剤（例えば、マイトマイシンＣ）に接触させることをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、マイトマイシンＣは、１日目のＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後２７日目、２８日目、２８日目、及び／又は２９日目に多能性細胞に接触させられる。この方法は、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始前に、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で多能性細胞を培養又はインキュベートすることをさらに含み得る。この方法は、多能性細胞をブレビスタチンに接触させることをさらに含み得る。例えば、ブレビスタチンは、分化の５日目及び１７日目に細胞に接触させられる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、細胞の少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％が分化し、そしてＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１（例えば、ＬＭＸ１Ａ）の両方を発現する。いくつかの実施形態では、細胞の少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％が分化し、そしてＦＯＸＡ２及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の両方を発現する。ＦＯＸＡ２及びＬＭＸ１（例えば、ＬＭＸ１Ａ）、又はＦＯＸＡ２及びＴＨを発現する分化細胞は、オルソデンティクルホメオボックス２（ｏｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ２）（ＯＴＸ２）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＵＲＲ１）、ニューロン特異的クラスＩＩＩβ−チューブリン（Ｔｕｊ１）、ＴＴＦ３、対様ホメオドメイン３（ＰＩＴＸ３）、ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ複合体（ＡＳＣＬ）、初期Ｂ細胞因子１（ＥＢＦ−１）、初期Ｂ細胞因子３（ＥＢＦ−３）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、シナプシン、ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）、及びＧタンパク質共役型の内向き整流カリウムチャネル（Ｋｉｒ３．２／ＧＩＲＫ２）、ＣＤ１４２、ＤＣＳＭ１、ＣＤ６３、及びＣＤ９９からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーをさらに発現し得る。いくつかの実施形態では、この方法は、例えばＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）又はＤＮａｓｅ  Ｉなどのエンドヌクレアーゼの存在下でヒト多能性細胞をインキュベートすることをさらに含む。いくつかの好ましい実施形態では、エンドヌクレアーゼはヒトエンドヌクレアーゼである。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）又はＤＮａｓｅ  Ｉは１００Ｕ／ｍＬで存在し得る。いくつかの実施形態では、ヒト多能性細胞は、１日目のＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後４〜６日目の少なくとも１日にエンドヌクレアーゼ又はＤＮａｓｅの存在下でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、ヒト多能性細胞は、１日目のＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との接触開始後５日目にエンドヌクレアーゼ又はＤＮａｓｅの存在下でインキュベートされる。
【００１０】
本発明の別の態様は、本発明又は上記の方法によって生成される中脳ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンの培養物に関する。培養物は、容器手段に含めてもよい。ニューロンは、例えば注射用に製剤化された医薬品などの医薬品に含めてもよい。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は、治療有効量の本発明又は上記の培養物を哺乳動物対象に投与することを含む、哺乳動物対象の疾患を処置する方法に関する。哺乳動物対象はヒトであり得る。この疾患は、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患であり得る。いくつかの実施形態では、この疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）又はパーキンソンプラス症候群（ＰＰＳ）である。培養物は、完全には分化していないか、又は分化の１６日目、１７日目、１８日目、１９日目、２０日目、２１日目、２２日目、２３日目、２４日目、若しくは２５日目（例えば、分化の１７〜２４日目）であるドーパミン作動性ニューロンを含み得る。いくつかの実施形態では、培養物はヒアルロン酸マトリックスを含む。実施例に示すように、哺乳動物対象に投与される分化の中間段階にある細胞（例えば、完全には分化していないドーパミン作動性ニューロン）の投与についての利点が観察されている。
【００１２】
本発明の別の態様は、（ａ）試験対象に本発明又は上記の方法によって分化した細胞に接触させること、及び（ｂ）細胞の機能、生理、又は生存率を測定することを含む、試験化合物をスクリーニングする方法に関する。いくつかの実施形態では、前記測定は、細胞の毒物学的応答又は変更された電気生理学的応答について試験することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、中脳ドーパミン作動性（ＤＡ）細胞である。
【００１３】
本発明と組み合わせて使用することができるさらなる条件及び方法は、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１５／０２６５６５２号明細書、同第２０１５／００１０５１４号明細書、及び国際公開第２０１３／０６７３６２号パンフレットで見ることができる。多能性細胞を精製するため、又は多能性細胞の、本発明と組み合わせて使用することができるニューロン若しくは中脳ＤＡニューロンへの分化を促進するためのさらなる方法には、例えば、Ｋｉｒｋｅｂｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），Ｋｒｉｋｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）；Ｃｈｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｘｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）；Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）；Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）、及び米国特許出願公開第２０１６／０１７７２６０号明細書が含まれる。
【００１４】
本明細書で使用される「分化日」は、多能性細胞の分化培地への曝露の開始の１日目である、培地中の細胞のインキュベーションの日を指す。いくつかの好ましい実施形態では、１日目の分化培地は、単一のＳＭＡＤ阻害剤を含む。分化培地中でのインキュベーション又は培養の前、例えば分化培地中でのインキュベーションの１日前、２日前、又は３日前（すなわち、０日目、１日前、及び／又は２日前）に、細胞を培地でインキュベートすることができ、この培地は、任意選択によりＲＯＣＫ阻害剤（例えば、約０．２５〜５μＭ、０．５μＭ、０．７５μＭ、１μＭ、１．２５μＭ、１．５μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲のＨ１１５２を含む、例えば、２日前に）が添加されたＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）基礎培地及びＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、及び／又はブレブスタチン（例えば、約０．１〜２０μＭ、より好ましくは約１．２５〜５μＭ、又は約２．５μＭの濃度で）を含むか、又はこれらからなる。
【００１５】
本明細書で使用される、特定の成分に関して「本質的に含まない」は、本明細書では、いずれの特定の成分も意図的に組成物に配合されていないこと、及び／又は汚染物質としてのみ若しくは微量で存在することを示すために使用される。従って、組成物の意図しないあらゆる汚染から生じる特定の成分の合計量は、０．０５％、好ましくは０．０１％よりも十分に低い。最も好ましいのは、特定の成分を標準的な分析方法では全く検出できない組成物である。
【００１６】
本明細書で使用される「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は１つ以上を意味し得る。本明細書において請求項で使用され、単語「含む」と一緒に使用される場合、単語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ又は複数を意味し得る。
【００１７】
請求項における用語「又は」の使用では、本開示は代替物のみ及び「及び／又は」を意味する定義を支持するが、代替物のみを意味する又は代替物が相互に排他的であると明示的に示されない限り、「及び／又は」を意味する。本明細書で使用される「別の」は、少なくとも第２の又はそれ以上を意味し得る。
【００１８】
本出願を通して、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために使用される装置、方法の誤差の固有の変動、又は研究対象の間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００１９】
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の精神及び範囲内の様々な変更及び修正が当業者にはこの詳細な説明から明らかであるため、例示としてのみ示されていることを理解するべきである。
【００２０】
図面の簡単な説明
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含められる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面のうちの１つ又は複数を参照することによってよりよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１−１】３つの異なるｉＰＳＣ株由来の中脳ドーパミン作動性（ｍＤＡ）前駆細胞のパターン形成を、プロセスの１７日目に、ＦｏｘＡ２を発現する（フローサイトメトリーにより）又はＦｏｘＡ２及びＬｍｘ１を共発現する（ＩＣＣにより）全細胞の割合を測定することによって評価した。
【図１−２】３つの異なるｉＰＳＣ株由来の中脳ドーパミン作動性（ｍＤＡ）前駆細胞のパターン形成を、プロセスの１７日目に、ＦｏｘＡ２を発現する（フローサイトメトリーにより）又はＦｏｘＡ２及びＬｍｘ１を共発現する（ＩＣＣにより）全細胞の割合を測定することによって評価した。
【００２２】
【図２】１７日目（Ｄ１７）及び２４日目（Ｄ２４）のドーパミン作動性前駆細胞（未成熟ｍＤＡニューロン）による発現されるマーカー。
【００２３】
【図３−１】プロセスの１７日目の異なるヒトｉＰＳ細胞株から産生されたｍＤＡ前駆細胞のパターン形成。ＦｏｘＡ２を発現する、又はＦｏｘＡ２及びＬｍｘ１を共発現する全細胞の割合が示されている。
【図３−２】プロセスの１７日目の異なるヒトｉＰＳ細胞株から産生されたｍＤＡ前駆細胞のパターン形成。ＦｏｘＡ２を発現する、又はＦｏｘＡ２及びＬｍｘ１を共発現する全細胞の割合が示されている。
【００２４】
【図４Ａ】図４Ａ、非増殖細胞を選択することによるニューロンの精製。図４Ｂ、ＭＭＣ選択後にｍＤＡニューロンのドーパミンを分泌する機能。図４Ｃ、増殖細胞の増殖は、長期解凍後の培養後でさえもＭＭＣ選択後に観察されなかった。
【図４Ｂ】図４Ａ、非増殖細胞を選択することによるニューロンの精製。図４Ｂ、ＭＭＣ選択後にｍＤＡニューロンのドーパミンを分泌する機能。図４Ｃ、増殖細胞の増殖は、長期解凍後の培養後でさえもＭＭＣ選択後に観察されなかった。
【図４Ｃ】図４Ａ、非増殖細胞を選択することによるニューロンの精製。図４Ｂ、ＭＭＣ選択後にｍＤＡニューロンのドーパミンを分泌する機能。図４Ｃ、増殖細胞の増殖は、長期解凍後の培養後でさえもＭＭＣ選択後に観察されなかった。
【００２５】
【図５】ヒトｉＰＳ細胞株から産生された細胞でのマーカーの発現。
【００２６】
【図６】凍結保存及び解凍後に株Ｋ（ｉＰＳ細胞株２１５３４．１０１）から生成された解凍後の特徴付けｍＤＡニューロン。
【００２７】
【図７Ａ】単一ＳＭＡＤｉ分化プロセスのＣｒｏｓｓ−ｉＰＳＣ株試験。健康なドナー由来の３つのｉＰＳＣ株及びパーキンソン病患者由来の９つのｉＰＳＣ株を、最適化単一ＳＭＡＤｉプロセスを用いて分化させた。全てのｉＰＳＣ株は、プロセスの１７日目までにＤＡ前駆細胞に効率的に変換され、１２株のうちの１１株で＞８０％のＦｏｘＡ２／Ｌｍｘ１が共発現された（図７Ａ）。プロセスの完了（３７日目）までに、全てのｉＰＳＣ株由来の細胞は、高レベルのニューロン純度（＞９０％のＭＡＰ２＋／ネスティン−）、中脳特異化（ｍｉｄｂｒａｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（＞８０％のＦｏｘＡ２＋）、及び中脳ドーパミンニューロン成熟（＞４０％のＴＨ＋）を達成した（図７Ｂ）。
【図７Ｂ】単一ＳＭＡＤｉ分化プロセスのＣｒｏｓｓ−ｉＰＳＣ株試験。健康なドナー由来の３つのｉＰＳＣ株及びパーキンソン病患者由来の９つのｉＰＳＣ株を、最適化単一ＳＭＡＤｉプロセスを用いて分化させた。全てのｉＰＳＣ株は、プロセスの１７日目までにＤＡ前駆細胞に効率的に変換され、１２株のうちの１１株で＞８０％のＦｏｘＡ２／Ｌｍｘ１が共発現された（図７Ａ）。プロセスの完了（３７日目）までに、全てのｉＰＳＣ株由来の細胞は、高レベルのニューロン純度（＞９０％のＭＡＰ２＋／ネスティン−）、中脳特異化（ｍｉｄｂｒａｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（＞８０％のＦｏｘＡ２＋）、及び中脳ドーパミンニューロン成熟（＞４０％のＴＨ＋）を達成した（図７Ｂ）。
【００２８】
【図８−１】ＦｏｘＡ２／Ｌｍｘ１共発現についてのフローサイトメトリーアッセイ。細胞が１７日目に＞８０％のＦｏｘＡ２＋／Ｌｍｘ１＋である場合（図８の上）、前駆細胞のパターン形成は成功したと見なされる。準標以下の前駆細胞のパターン形成の例が示され（図８の下）、６０％のＦｏｘＡ２＋／Ｌｍｘ１＋細胞及びＦｏｘＡ２＋／Ｌｍｘ１陰性細胞の有意な集団を伴っている。
【図８−２】ＦｏｘＡ２／Ｌｍｘ１共発現についてのフローサイトメトリーアッセイ。細胞が１７日目に＞８０％のＦｏｘＡ２＋／Ｌｍｘ１＋である場合（図８の上）、前駆細胞のパターン形成は成功したと見なされる。準標以下の前駆細胞のパターン形成の例が示され（図８の下）、６０％のＦｏｘＡ２＋／Ｌｍｘ１＋細胞及びＦｏｘＡ２＋／Ｌｍｘ１陰性細胞の有意な集団を伴っている。
【００２９】
【図９】ｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンからのドーパミンの放出。ｉＰＳＣ株「Ｋ」を、最適化単一ＳＭＡＤｉプロトコル（「条件９」）を使用してプロセスの完了（３７日目）までに分化させ、そして凍結保存した。ドーパミンの放出は、ｉＰＳＣ由来前脳ニューロン（ｉＣｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｎｓ）からは検出されなかった。逆に、最適化単一ＳＭＡＤｉプロセス（ＤＡ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｅｕｒｏｎｓ）を使用して誘導されたｉＰＳＣ−ｍＤＡ細胞は、最適化二重ＳＭＡＤプロセス（ｉＣｅｌｌ  ＤｏｐａＮｅｕｒｏｎｓ）を使用して誘導された細胞と少なくとも同量のドーパミンを分泌した。
【００３０】
【図１０−１】ｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンの電気的活動。凍結保存ｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンを解凍し、そしてＰＥＩ被覆４８ウェル多電極アレイ（ＭＥＡ）プレートに播種した。最適化単一ＳＭＡＤｉプロトコル（ＤＡ療法）を用いて生成したニューロンは、平均発火率（ｍＦＲ）、バースト（ｍａｃｒｏ  ＢＰＭ）、及び接続性（図１０の上のグラフ）を含む、最適化二重ＳＭＡＤｉプロトコル（ｉＣｅｌｌ  Ｄｏｐａ  Ｇ１００）を用いて産生させた細胞と比較して同様の電気活性を示した。ｍＦＲ、頻度、及び接続性バースト強度（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｕｒｓｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は時間と共に増加し、解凍後約１６日までに横ばいになった。Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｒａｓｔｅｒプロットは、きれいなスパイク間の間隔、高いバースト強度、及びウェル内の全ての電極についてのバーストを示し、高度の電気的活動を実証した。
【図１０−２】ｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンの電気的活動。凍結保存ｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンを解凍し、そしてＰＥＩ被覆４８ウェル多電極アレイ（ＭＥＡ）プレートに播種した。最適化単一ＳＭＡＤｉプロトコル（ＤＡ療法）を用いて生成したニューロンは、平均発火率（ｍＦＲ）、バースト（ｍａｃｒｏ  ＢＰＭ）、及び接続性（図１０の上のグラフ）を含む、最適化二重ＳＭＡＤｉプロトコル（ｉＣｅｌｌ  Ｄｏｐａ  Ｇ１００）を用いて産生させた細胞と比較して同様の電気活性を示した。ｍＦＲ、頻度、及び接続性バースト強度（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｕｒｓｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は時間と共に増加し、解凍後約１６日までに横ばいになった。Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｒａｓｔｅｒプロットは、きれいなスパイク間の間隔、高いバースト強度、及びウェル内の全ての電極についてのバーストを示し、高度の電気的活動を実証した。
【図１０−３】ｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンの電気的活動。凍結保存ｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンを解凍し、そしてＰＥＩ被覆４８ウェル多電極アレイ（ＭＥＡ）プレートに播種した。最適化単一ＳＭＡＤｉプロトコル（ＤＡ療法）を用いて生成したニューロンは、平均発火率（ｍＦＲ）、バースト（ｍａｃｒｏ  ＢＰＭ）、及び接続性（図１０の上のグラフ）を含む、最適化二重ＳＭＡＤｉプロトコル（ｉＣｅｌｌ  Ｄｏｐａ  Ｇ１００）を用いて産生させた細胞と比較して同様の電気活性を示した。ｍＦＲ、頻度、及び接続性バースト強度（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｕｒｓｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は時間と共に増加し、解凍後約１６日までに横ばいになった。Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｒａｓｔｅｒプロットは、きれいなスパイク間の間隔、高いバースト強度、及びウェル内の全ての電極についてのバーストを示し、高度の電気的活動を実証した。
【００３１】
【図１１】ｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンの定量的遺伝子発現プロファイル。最適化単一ＳＭＡＤｉプロセス（バッチ１〜４）を使用して誘導された４つのバッチのｉＰＳＣ−ｍＤＡ細胞及びプロセスの３７日目に最適化二重ＳＭＡＤｉプロトコル（ｉＣｅｌｌ  ＤｏｐａＮｅｕｒｏｎｓ）を使用して誘導された１つのバッチのｉＰＳＣ−ｍＤＡ細胞からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの単離後、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、結果をＧＡＰＤＨ対照に対する相対発現として表した。＜１０−４の値はバックグラウンドと見なされる（影付きボックス）。中脳及びｍＤＡニューロンマーカーの発現は、バッチ間及び異なるプロトコルを用いて産生させた細胞間で同様であった。非中脳領域又は非ｍＤＡ細胞型のマーカーは低く、単一ＳＭＡＤｉ由来細胞と二重ＳＭＡＤｉ由来細胞との間で同様であった。
【００３２】
【図１２−１】ｃＧＭＰ適合性試薬への変換。ｉＰＳＣ−ｍＤＡ細胞を、標準試薬又はｃＧＭＰ適合性試薬を使用した単一ＳＭＡＤｉプロセスで分化させ、この結果、同等の前駆細胞のパターン形成（１７日目）及び３７日目のｍＤＡニューロン純度が得られた。
【図１２−２】ｃＧＭＰ適合性試薬への変換。ｉＰＳＣ−ｍＤＡ細胞を、標準試薬又はｃＧＭＰ適合性試薬を使用した単一ＳＭＡＤｉプロセスで分化させ、この結果、同等の前駆細胞のパターン形成（１７日目）及び３７日目のｍＤＡニューロン純度が得られた。
【００３３】
【図１３】非ヒト霊長類におけるｉＰＳＣ−ＤＡニューロンの生着。ヒト細胞質の染色（ＳＴＥＭ１２１）は、良好なヒト細胞の生着及び全ての動物における神経支配を明らかにする。移植片中にドーパミンニューロン（ＴＨ＋）が観察され、これらの細胞が、長期間生存し、そして脳内のｍＤＡニューロン標的構造を神経支配する能力を証明している。これらの動物では、腫瘍、神経成長、又は他の有害作用は観察されなかった。
【００３４】
【図１４】ラットＰＤモデル系におけるｉＰＳＣ−ＤＡ前駆細胞及びニューロンの生着。これらの動物のいずれでも、腫瘍、神経成長、又は他の有害作用が観察されなかった。これらの結果は、最適化単一ＳＭＡＤｉ分化プロセスの早期（１７〜２４日目）に採取された細胞が、より成熟した細胞と比較して、よりよく生着及び神経支配することができるという考えを支持する。
【００３５】
【図１５】２μＭのＬＤＮ−１９３１８９を使用した分化の改善。複数の実験（ｎ＝５）において、２μＭのＬＤＮを使用したときに分化の質に改善が見られた。１７日目の前駆細胞におけるより高いＦｏｘＡ２及びＬｍｘ１の発現レベル（図１５の上）、及びプロセス３７日目のより高い割合の底板由来ニューロン（ＦｏｘＡ２＋）（図１５の下）が、プロトコルでの２μＭのＬＤＮの使用の結果として観察された。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
いくつかの態様では、本発明は、人工多能性幹細胞などの多能性細胞を、中脳ドーパミン作動性細胞などのニューロン前駆細胞又はニューロンに分化させるための組成物及び方法を提供することによって、先行技術における制限を克服する。この方法は、単一のＳＭＡＤ阻害剤（「単一ＳＭＡＤ阻害」）の存在下で多能性細胞を分化させることを含み得る。このような方法は、２つ以上のＳＭＡＤ阻害剤の使用を必要とする以前の方法と比較して、単一のＳＭＡＤ阻害剤を使用する利点（例えば、コスト低減、単純化された又はより最小限の方法論など）から利益を得ることができる。
【００３７】
Ｉ．定義
「多能性」又は「多能性の」は、１つ以上の組織又は器官を構成する全ての細胞、例えば、３つの胚葉：内胚葉（内胃内層、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、尿生殖器）、又は外胚葉（表皮組織及び神経系）のいずれかに分化する可能性を有する幹細胞又は未分化細胞を指す。
【００３８】
一般にｉＰＳ細胞又はｉＰＳＣと省略される「人工多能性幹細胞」は、リプログラミング因子を導入するか、又はこれに接触させることによって、非多能性細胞、典型的には成体体細胞、又は線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、若しくは表皮細胞などの最終分化細胞から人工的に作製されたある種の多能性幹細胞を指す。
【００３９】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、初期胚由来の多能性幹細胞である。
【００４０】
「付着培養」は、細胞又は細胞の凝集体が表面に付着される培養を指す。
【００４１】
「懸濁培養」は、液体培地中に懸濁されている間に細胞又は細胞の凝集体が増殖する培養を指す。
【００４２】
外部から添加された成分を「本質的に含まない」は、培地中の細胞以外の供給源からの特定の成分を含まないか、又は本質的に含まない培地を指す。外部から添加された成長因子又はシグナル伝達阻害剤、例えばＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤などを「本質的に含まない」は、外部から添加された成分が最小限の量又は検出不能な量であることを意味し得る。例えば、ＴＧＦβ又はｂＦＧＦを本質的に含まない培地又は環境は、５ｎｇ／ｍｌ未満、４ｎｇ／ｍｌ未満、３ｎｇ／ｍｌ未満、２ｎｇ／ｍｌ未満、１ｎｇ／ｍｌ未満、０．９ｎｇ／ｍｌ未満、０．８ｎｇ／ｍｌ未満、０．７ｎｇ／ｍｌ未満、０．６ｎｇ／ｍｌ未満、０．５ｎｇ／ｍｌ未満、０．４ｎｇ／ｍｌ未満、０．３ｎｇ／ｍｌ未満、０．２ｎｇ／ｍｌ未満、０．１ｎｇ／ｍｌ未満、０．０１ｎｇ／ｍｌ未満、０．００１ｎｇ／ｍｌ未満、又はその中で導出可能な任意の範囲を含み得る。例えば、シグナル伝達阻害剤を本質的に含まない培地又は環境は、０．２μＭ未満、０．１μＭ未満、０．０９μＭ未満、０．０８μＭ未満、０．０７μＭ未満、０．０６μＭ未満、０．０５μＭ未満、０．０４μＭ未満、０．０３μＭ未満、０．０２μＭ未満、０．０１μＭ未満、０．００５μＭ未満、０．００１μＭ未満、又はその中で導出可能な任意の範囲を含み得る。
【００４３】
「分化」は、それほど特殊化されていない細胞が、より特殊化された少なくとも新しい細胞型の子孫を形成するプロセスである。
【００４４】
用語「凝集促進培地」は、作用機序に関する一切の制限なしに細胞の凝集体形成を増強するあらゆる培地を意味する。
【００４５】
用語「凝集体」、すなわち胚様体は、懸濁培養された分化細胞、部分的に分化した細胞、及び／又は多能性幹細胞を含む均質又は不均質の細胞クラスターを指す。
【００４６】
「ニューロン」又は「神経細胞」又は「神経細胞型」又は「神経系統」は、特段の記載がない限り、いかなる制限もなく、あらゆる神経系統細胞を含み得、かつあらゆる段階のニューロン発生（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｏｎｔｏｇｅｎｙ）における細胞を指すと見なすことができる。例えば、ニューロンは、ニューロン前駆細胞、成熟ニューロン、及び星状細胞などの神経細胞型の両方を含み得る。
【００４７】
特定のタンパク質を「コードする」「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、又は「断片」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、インビボ又はインビトロで転写され、任意選択により遺伝子産物、例えばポリペプチドに翻訳される核酸分子である。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＲＮＡ形態のいずれかで存在し得る。ＤＮＡ形態で存在する場合、核酸分子は、一本鎖（すなわち、センス鎖）又は二本鎖であり得る。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子は、限定されるものではないが、原核生物又は真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物又は真核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列を含み得る。転写終結配列は、通常は遺伝子配列の３’に位置する。
【００４８】
用語「導入遺伝子」は、人工又は天然の手段、例えば外因性核酸によって細胞又は生物に導入された遺伝子、核酸、又はポリヌクレオチドを指す。外因性核酸は、異なる生物又は細胞に由来してもよいし、又は外因性核酸は、生物又は細胞内に天然に存在する核酸の１つ以上のさらなるコピーであってもよい。非限定的な例として、外因性核酸は、天然細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にあるか、あるいは天然に見られる核酸配列とは異なる核酸配列に隣接している。
【００４９】
用語「プロモーター」は、本明細書では、その通常の意味で使用されるとＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指し、この調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合して下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができる遺伝子に由来する。
【００５０】
ＩＩ．単一ＳＭＡＤ阻害のためのＳＭＡＤ阻害剤
いくつかの態様では、多能性細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞）を中脳ドーパミン作動性細胞などのニューロン細胞に変換する方法において、単一のＢＭＰシグナル伝達阻害剤又は単一のＴＧＦ−βシグナル伝達阻害剤のいずれかを用いてＳＭＡＤシグナル伝達を阻害する。例えば、いくつかの態様では、多能性細胞は、中脳ＤＡニューロンを含むニューロン細胞の集団に変換され、分化が、単一のＢＭＰシグナル伝達阻害剤を含む培地中で起こる。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ−１９３１８９、ドルソモルフィン、又はＤＭＨ−１である。ＢＭＰシグナル伝達阻害剤の非限定的な例としては、ドルソモルフィン、ドミナントネガティブＢＭＰ、切断型ＢＭＰ受容体、可溶性ＢＭＰ受容体、ＢＭＰ受容体−Ｆｃキメラ、ノギン、ＬＤＮ−１９３１８９、フォリスタチン、コーディン、グレムリン、ケルベロス／ＤＡＮファミリータンパク質、ベントロピン（ｖｅｎｔｒｏｐｉｎ）、高用量アクチビン、及び無羊膜が挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸、アンチセンス、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、又は他の遺伝的方法を、ＢＭＰシグナル伝達を阻害するために使用することができる。本明細書で使用される場合、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤は、単に「ＢＭＰ阻害剤」と呼ばれることもある。ＢＭＰ阻害剤は、分化の１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、及び／若しくは１７日目に、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲の日（例えば、１〜１７日目、１〜１６日目、１〜１５日目、２〜１５日目など）の分化培地に含めることができる。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、分化の１〜１７日目の全ての日に分化培地に含められる。それにもかかわらず、特定の時期、例えば上記の日の１日、２日、又は３日に、ＢＭＰ阻害剤を分化培地から排除することが可能であり得ることが予想される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、任意選択により１１〜１７日目の分化培地には含められず、いくつかの好ましい実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、１〜１０日目の分化培地に含められる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ−１９３１８９、ドルソモルフィン、ＤＭＨ−１、又はノギンである。例えば、細胞は、約１〜２５００ｎＭ、約１〜２０００ｎＭ、又は約１〜１０００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９（例えば、約１０〜５００ｎＭ、約５０〜５００ｎＭ、約５０〜３００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約３００ｎＭ、約５００ｎＭ、約７５０ｎＭ、約１０００ｎＭ、約１２５０ｎＭ、約１５００ｎＭ、約１７５０ｎＭ、約２０００ｎＭ、約２２５０ｎＭ、若しくは約２５００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲）を含む培地中で培養することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、約０．１〜１０μＭのドルソモルフィン（例えば、約０．１〜１０μＭ、約０．５〜７．５μＭ、約０．７５〜５μＭ、約０．５〜３μＭ、約１〜３μＭ、約０．２５μＭ、約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１μＭ、約１．２５μＭ、約１．５μＭ、約１．５５μＭ、約１．６μＭ、約１．６５μＭ、約１．７μＭ、約１．７５μＭ、約２μＭ、約２．２５μＭ、約２．５μＭ、約２．７５μＭ、約３μＭ、若しくは約２μＭのドルソモルフィン、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲）を含む培地中で培養することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、約１μＭのＤＭＨ−１（例えば、約０．２〜８μＭ、約０．５〜２μＭ、若しくは約１μＭのＤＭＨ−１、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲）を含む培地中で培養することができる。以下の実施例に示されているように、ＬＤＮ−１９３１８９、ドルソモルフィン、及びＤＭＨ−１は全て、ｉＰＳ細胞から中脳ドーパミン作動性ニューロンを生成するための単一ＳＭＡＤ阻害方法での使用に成功した。
【００５２】
いくつかの態様では、ＴＧＦβ阻害剤を使用して単一ＳＭＡＤ阻害剤としてＳＭＡＤを阻害し、ｉＰＳ細胞などの多能性細胞から中脳ドーパミン作動性ニューロンを生成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、分化培地は、少なくとも第１のＴＧＦβシグナル伝達阻害剤を含む。ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤の非限定的な例としては、Ａ−８３−０１、ＧＷ６６０４、ＩＮ−１１３０、Κｉ２６８９４、ＬＹ２１５７２９９、ＬＹ３６４９４７（ＨＴＳ−４６６２８４）、Ａ−８３−０１、ＬＹ５５０４１０、ＬＹ５７３６３６、ＬＹ５８０２７６、ＮＰＣ−３０３４５、ＳＢ−４３１５４２、ＳＢ−５０５１２４、ＳＤ−０９３、Ｓｍｌ６、ＳＭ３０５、ＳＸ−００７、Ａｎｔｐ−Ｓｍ２Ａ、及びＬＹ２１０９７６１が挙げられる。例えば、分化培地中のＴＧＦβ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２であり得る。いくつかの態様では、細胞は、約０．１〜１００μＭのＳＢ４３１５４２（例えば、約１〜１００μＭ、約１０〜８０μＭ、約１５〜６０μＭ、約２０〜５０μＭ、又は約４０μＭのＳＢ４３１５４２）を含む培地で培養される。本明細書で使用される場合、ＴＧＦβ受容体阻害剤を含むＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、単に「ＴＧＦβ阻害剤」と呼ぶこともある。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ阻害剤は分化培地に含まれない。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）は、単一ＳＭＡＤ阻害剤として、１〜３日目、又は１日目、２日目、３日目、及び／又は４日目の分化培地に含まれる。以下の実施例に示すように、いくつかの実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、ＴＧＦβ阻害剤の使用と比較して、これらの化合物が多能性細胞の中脳ＤＡニューロンへの優れた分化をもたらすことが観察されたため、単一ＳＭＡＤ阻害剤として使用される。
【００５３】
ＩＩＩ．ＭＥＫ阻害剤の含有
いくつかの態様では、ＭＥＫ阻害剤を、例えばＢＭＰ阻害剤又は単一ＳＭＡＤ阻害剤と組み合わせて分化培地に含めて、ｉＰＳ細胞などの多能性細胞からの中脳ドーパミン作動性ニューロンを生成する。いくつかの実施形態では、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１である。実施形態に従って使用することができるＭＥＫ阻害剤の非限定的な例としては、ＰＤ０３２５９０１、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、ピマセルチブ（ｐｉｍａｓｅｒｔｉｂ）（ＡＳ−７０３０２６）、ＭＥＫ１６２、コビメチニブ（ｃｏｂｉｍｅｔｉｎｉｂ）、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ１７３０７４、ＢＩＸ０２１８９、ＡＺＤ８３３０、及びＰＤ９８０５９が挙げられる。例えば、いくつかの実施形態では、この方法は、約０．１〜１０μＭ（例えば、約０．１〜５μＭ；約０．５〜３μＭ、又は約０．５〜１．５μＭ）のＰＤ０３２５９０１などのＭＥＫ阻害剤の存在下で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、分化の３日目、４日目、５日目、又は３〜５日目に細胞をＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ０３２５９０１）に接触させる。
【００５４】
従って、特定の態様では、細胞を分化させることは、多能性細胞の集団を、ＢＭＰ阻害剤；ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の活性化因子；Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子、ＭＥＫ阻害剤、又はこれらの組み合わせを含む培地で培養することを含み、この培地は、外部から添加されるＦＧＦ８ｂを含まない。場合によっては、ＴＧＦβ阻害剤を、ＢＭＰ阻害剤の代わりに使用することができる。なおさらなる態様では、実施形態の方法は、ＤＡ特異的マーカーを用いた細胞の精製を含まない。いくつかの態様では、多能性細胞は、ニューロン細胞の精製に使用することができるニューロンプロモーターの制御下にある耐性遺伝子を含む（例えば、抗生物質耐性遺伝子を発現するニューロン細胞は、抗生物質に曝露されても生存するが、非ニューロン細胞は死ぬ）。
【００５５】
いくつかの実施形態では、中脳ＤＡニューロンの濃縮集団は、以下を含む方法によって生成することができる：多能性細胞の集団を得ること；ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ０３２５９０１）を含む培地中で細胞を神経系統細胞集団に分化させること（この培地は、分化の１日目に外部から添加されるＦＧＦ８ｂを含まない）；及び神経系統細胞集団の細胞をさらに分化させて、中脳ＤＡニューロンの濃縮集団を提供すること。本明細書に記載されるように、本発明者らは、場合によっては、１日目にＦＧＦ８（例えば、ＦＧＦ８ｂ）を分化培地中に含めることは、場合により、細胞の中脳ＤＡニューロンへの分化を妨げる又は防止することができることを観察した。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ８は、任意選択により、例えば９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲の日などの分化の後半の日に分化培地に含めてもよく、例えば、好ましくは、多能性細胞の接触は、１日目に分化培地において単一のＳＭＡＤ阻害剤で開始される。
【００５６】
ＩＶ．Ｗｎｔ活性化因子又はＧＳＫ阻害剤の含有
いくつかの態様では、Ｗｎｔ活性化因子（例えば、ＧＳＫ３阻害剤）は、ｉＰＳ細胞などの多能性細胞から中脳ドーパミン作動性ニューロンを生成するために、例えばＢＭＰ阻害剤又は単一ＳＭＡＤ阻害剤と組み合わせて分化培地に含められる。いくつかの実施形態では、多能性細胞を、中脳ＤＡニューロンを含むニューロン細胞の集団に分化させ、この分化は、Ｗｎｔシグナル伝達の少なくとも第１の活性化因子を含む培地中である。
【００５７】
様々なＷｎｔ活性化因子又はＧＳＫ３阻害剤を、本発明の様々な態様に使用することができる。例えば、ＷＮＴシグナル伝達の活性化因子は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤であり得る。ＧＳＫ３阻害剤の非限定的な例としては、ＮＰ０３１１１２、ＴＷＳ１１９、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、ＳＢ４１５２８６、ＬＹ２０９０３１４、及びＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。いくつかの実施形態では、多能性細胞を、ＳＢ４１５２８６ではない単一のＳＭＡＤ阻害剤に接触させる。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子はＣＨＩＲ９９０２１である。従って、いくつかの態様では、実施形態に従って使用するための培養培地は、約０．１〜約１０μＭのＣＨＩＲ９９０２１（例えば、約０．１〜５μＭ、約０．５〜５μＭ、約０．５〜３μＭ、約１．２５超〜２．２５μＭ、約１．２５μＭ、約１．５μＭ、約１．５５μＭ、約１．６５μＭ、約１．７μＭ、約１．７５μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２．０μＭ、若しくは約１．７５μＭのＣＨＩＲ９９０２１、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲）を含む。
【００５８】
いくつかの好ましい実施形態では、Ｗｎｔ活性化因子（例えば、ＧＳＫ３阻害剤）は、任意選択により、分化の１日目に分化培地に含められない。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ活性化因子又はＧＳＫ阻害剤（例えば、ＣＨＲ９９０２１）は、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、及び／若しくは１７日目、又はこれらの日の任意の組み合わせの日又は全ての日に分化培地に含められる。例えば、いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ活性化因子又はＧＳＫ阻害剤は、２〜１７日目又は３〜１７日目に分化培地に含められる。
【００５９】
Ｖ．ソニックヘッジホッグ活性化因子
一部の態様では、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の活性化因子は、ｉＰＳ細胞などの多能性細胞から中脳ドーパミン作動性ニューロンを生成するために、例えばＢＭＰ阻害剤又は単一ＳＭＡＤ阻害剤と組み合わせて分化培地に含められる。いくつかの実施形態では、ソニックヘッジホッグ活性化因子は、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）又は変異体Ｓｈｈである。Ｓｈｈは、例えば、ヒト若しくはマウスタンパク質であってもよいし、又はヒト若しくはマウスＳｈｈに由来してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、Ｓｈｈは、マウスＣ２５ＩＩ  Ｓｈｈ又はヒトＣ２４ＩＩ  Ｓｈｈなどの変異体マウスＳｈｈタンパク質である。いくつかの実施形態では、分化培地は、Ｓｈｈ（例えば、Ｃ２５ＩＩ  Ｓｈｈ）及びＳＨＨの小分子活性化因子、例えば、プルモルファミンの両方を含む。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、Ｓｈｈ及び／又はソニックヘッジホッグの活性化因子の両方は、神経底板（ｎｅｕｒａｌ  ｆｌｏｏｒ  ｐｌａｔｅ）の分化を促進し得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、中脳ＤＡニューロンは、少なくともＳＨＨシグナル伝達の第一の活性化因子を含む培地中で多能性細胞を培養することを含む方法によって多能性細胞から生成される。例えば、ＳＨＨシグナル伝達の活性化因子は、組換えＳＨＨポリペプチド（又はその一部）又は小分子活性化因子であり得る。特定の態様では、ＳＨＨの活性化因子は、Ｓｈｈ  Ｃ２５ＩＩ、プルモルファミン、又はプルモルファミン類似体（例えば、ＳＡＧ−１又は３−クロロ−Ｎ−［（１ｒ，４ｒ）−４−（メチルアミノ）シクロヘキシル］−Ｎ−［３−（ピリジン−４−イル）ベンジル］ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボキサミドなどのスムーズンドアゴニスト）であり得る。従って、特定の態様では、実施形態に従って使用するための培養培地は、約０．１〜１０μＭのプルモルファミン（例えば、約０．１〜２０μＭ、約０．５〜１０μＭ、約０．５〜５μＭ、又は約２μＭのプルモルファミン）を含む。さらなる態様では、培養培地は、約１〜１，０００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ  Ｃ２５ＩＩ（例えば、約１０〜１，０００ｎｇ／ｍｌ、約１０〜５００ｎｇ／ｍｌ、約５０〜５００ｎｇ／ｍｌ、又は約１００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ  Ｃ２５ＩＩ）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の活性化因子は、Ｓｈｈ  Ｃ２５ＩＩ及びプルモルファミンの両方を含む。例えば、細胞は、約０．１〜１０μＭのプルモルファミン及び約１〜１，０００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ  Ｃ２５ＩＩを含む培地中で培養することができる。ＳＨＨ活性化因子（例えば、Ｓｈｈ  Ｃ２５ＩＩ及びプルモルファミン）は、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、及び／又は７日目に分化培地に含めてもよい。いくつかの実施形態では、ＳＨＨ活性化因子は、１日目の分化培地から除外される。例えば、様々な実施形態では、ＳＨＨ活性化因子は、１〜６日目又は２〜７日目の分化培地に含められる。
【００６１】
従って、特定の態様では、多能性細胞は、Ｂ２７Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１〜３０００ｎＭ又は１〜１０００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９（又は０．１〜１００μＭのＳＢ４３１５４２）、０．１〜５０μＭのプルモルファミン、１〜１，０００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ  Ｃ２５ＩＩ、及び０．１〜１０μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含む接着培養系において１〜６日間培養して分化させることができる。一態様では、この培地は、Ｂ２７Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９（又は１０μＭのＳＢ４３１５４２）、２μＭのプルモルファミン、１００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ  Ｃ２５ＩＩ、及び１．２５μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含み得る。いくつかの実施形態では、ＭＥＫ阻害剤は、１〜２日後に培地に含められる（例えば、ＭＥＫ阻害剤は、分化の２〜４日目、又は２日目、３日目、及び／又は４日目に含められる）。
【００６２】
ＶＩ．多能性幹細胞の供給源
多能性幹細胞は、多能性幹細胞の神経誘導のために本方法で使用することができる。例えば、培地成分の最適化及び／又は分化プロトコルによって生成される所望の中脳ＤＡニューロンの選択によって神経分化効率を改善するために使用することができる方法及び組成物が本明細書に開示される。
【００６３】
用語「多能性幹細胞」又は「多能性細胞」は、３つの胚層、すなわち内胚葉、中胚葉、及び外胚葉の全ての細胞を生じさせることができる細胞を指す。理論的には多能性幹細胞は身体のあらゆる細胞に分化することができるが、多能性の実験的決定は、典型的には多能性細胞の各胚層のいくつかの細胞型への分化に基づく。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚性幹（ＥＳ）細胞である。他の実施形態では、多能性幹細胞は、体細胞のリプログラミングによって誘導される人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、体細胞核移植によって誘導される胚性幹細胞である。多能性幹細胞は、健康な対象（例えば、健康なヒト）又は疾患（例えば、神経変性疾患、パーキンソン病など）を有する対象から得られるか又はこれらに由来し得る。
【００６４】
Ａ．胚性幹細胞
胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性細胞である。ＥＳ細胞は、発生中の胚の外側栄養外胚葉層を除去し、次いで非増殖細胞の支持細胞層上で内部細胞塊を培養することによって単離することができる。適切な条件下で、増殖している未分化のＥＳ細胞のコロニーが形成される。コロニーを除去し、個々の細胞に解離させ、次いで新鮮な支持細胞層に再播種することができる。再播種した細胞は、増殖し続けることができ、未分化ＥＳ細胞の新しいコロニーを形成する。次いで、新しいコロニーを取り出し、解離させ、もう一度再播種して成長させることができる。未分化ＥＳ細胞を「継代培養する」又は「継代する」このプロセスを何度も繰り返して、未分化ＥＳ細胞を含む細胞株を生成することができる（例えば、米国特許第５，８４３，７８０号明細書；同第６，２００，８０６号明細書；同第７，０２９，９１３号明細書に記載されている）。「初代細胞培養物」は、例えば胚盤胞の内部細胞塊などの組織から直接得られる細胞の培養物である。「継代培養物」は、初代細胞培養物に由来するあらゆる培養物である。
【００６５】
マウスＥＳ細胞を得るための方法は周知である。一方法では、１２９系統のマウス由来の着床前胚盤胞をマウス抗血清で処理して栄養外胚葉を除去し、そして内部細胞塊を、ウシ胎児血清を含む培地中で化学的に不活性化されたマウス胚性線維芽細胞の支持細胞層上で培養する。発生する未分化ＥＳ細胞のコロニーを、ウシ胎児血清の存在下でマウス胚性線維芽細胞支持細胞層上で継代培養してＥＳ細胞の集団を生成する。いくつかの方法では、マウスＥＳ細胞を、サイトカインである白血病抑制因子（ＬＩＦ）を血清含有培地に添加することによって支持細胞層の非存在下で増殖させることができる（Ｓｍｉｔｈ，２０００）。他の方法では、マウスＥＳ細胞を、骨形成タンパク質及びＬＩＦの存在下で無血清培地で増殖させることができる（Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。
【００６６】
ヒトＥＳ細胞は、既に記載された方法（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９８；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，２０００）を用いて胚盤胞から得ることができる。一方法では、５日目のヒト胚盤胞を、ウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に曝露し、次いで１：５希釈のモルモット補体に曝露して栄養外胚葉細胞を溶解する。溶解した栄養外胚葉細胞を無傷の内部細胞塊から取り出した後、この内部細胞塊を、ウシ胎児血清の存在下でγ不活性化マウス胚性線維芽細胞の支持細胞層上で培養する。９〜１５日後、内部細胞塊由来の細胞塊を化学的に（すなわち、トリプシンに曝露する）又は機械的に解離させて、ウシ胎児血清及びマウス胚性線維芽細胞の支持細胞層を含む新鮮な培地に再播種することができる。さらに増殖したら、未分化形態を有するコロニーをマイクロピペットで選択し、機械的に解離させて凝集塊にし、そして再播種する（米国特許第６，８３３，２６９号参照）。ＥＳ様形態は、明らかに高い核の細胞質に対する比率及び顕著な核小体を有するコンパクトなコロニーとして特徴付けられる。得られたＥＳ細胞は、短時間のトリプシン処理又はマイクロピペットによる個々のコロニーの選択によってルーチン的に継代することができる。いくつかの方法では、ヒトＥＳ細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下で線維芽細胞の支持細胞層上でＥＳ細胞を培養することによって無血清で増殖させることができる（Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。他の方法では、ヒトＥＳ細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子を含む「馴化」培地の存在下でＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）又はラミニンなどのタンパク質マトリックス上で細胞を培養することによって支持細胞層なしで増殖させることができる（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。この培地は、線維芽細胞と共培養することによって予め馴化させることができる。
【００６７】
アカゲザル及びコモンマーモセットＥＳ細胞の単離方法も公知である（Ｔｈｏｍｓｏｎ，ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９８；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｄｏｒｉｃｏ，２０００）。
【００６８】
ＥＳ細胞の別の供給源は樹立ＥＳ細胞株である。様々なマウス細胞株及びヒトＥＳ細胞株が知られており、これらの成長及び増殖のための条件が定義されている。例えば、マウスＣＧＲ８細胞株は、マウス系統１２９胚の内部細胞塊から樹立され、そしてＣＧＲ８細胞の培養物を、支持細胞層なしでＬＩＦの存在下で増殖させることができる。さらなる例として、ヒトＥＳ細胞株Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、及びＨ１４は、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）によって樹立された。さらに、Ｈ９株のサブクローンＨ９．１及びＨ９．２が開発された。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ｙｕ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｓｏｎ，２００８に記載されているものなどの、当技術分野で公知の事実上あらゆるＥＳ細胞株又は幹細胞株を本発明と共に使用できることが予想される。
【００６９】
本発明の態様で使用するためのＥＳ細胞の供給源には、胚盤胞、胚盤胞の内部細胞塊の培養から得られる細胞、及び樹立細胞株の培養から得られる細胞が含まれる。従って、本明細書で使用される場合、用語「ＥＳ細胞」は、胚盤胞の内部細胞塊の細胞、内部細胞塊の培養から得られるＥＳ細胞、及びＥＳ細胞株の培養から得られるＥＳ細胞を指し得る。
【００７０】
Ｂ．人工多能性幹細胞
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、ＥＳ細胞の特徴を有するが、分化した体細胞のリプログラミングによって得られる細胞である。人工多能性幹細胞は、様々な方法で得られてきた。一方法では、成人ヒト皮膚線維芽細胞に、レトロウイルス形質導入を用いて転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、及びＫｌｆ４をトランスフェクトする（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，２００７）。トランスフェクト細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加した培地中のＳＮＬ支持細胞（ＬＩＦを産生するマウス細胞線維芽細胞株）上に播種する。約２５日後、ヒトＥＳ細胞コロニーに似たコロニーが培養中に出現する。ＥＳ細胞様コロニーをピックアップし、そしてｂＦＧＦの存在下で支持細胞上で増殖させる。いくつかの好ましい態様では、ｉＰＳ細胞はヒトｉＰＳ細胞である。
【００７１】
細胞の特徴に基づくと、ＥＳ細胞様コロニーの細胞は、人工多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞は、ヒトＥＳ細胞に形態学的に類似し、様々なヒトＥＳ細胞マーカーを発現する。また、ヒトＥＳ細胞の分化をもたらすことが公知である条件下で増殖する場合、人工多能性幹細胞が適切に分化する。例えば、人工多能性幹細胞は、ニューロン構造及びニューロンマーカーを有する細胞に分化し得る。例えば、Ｙｕ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｓｏｎ，２００８に記載されているものを含む、実質的にあらゆるｉＰＳ細胞又は細胞株を本発明と共に使用できることが予想される。
【００７２】
別の方法では、レンチウイルス形質導入を用いて、ヒト胎児又は新生児線維芽細胞に、４つの遺伝子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８をトランスフェクトする（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。感染後１２〜２０日目に、ヒトＥＳ細胞形態を有するコロニーが見えるようになる。コロニーをピックアップし、増殖させる。コロニーを構成する人工多能性幹細胞は、ヒトＥＳ細胞に形態学的に類似しており、種々のヒトＥＳ細胞マーカーを発現し、そしてマウスへの注射後に神経組織、軟骨、及び腸上皮を有する奇形腫を形成する。
【００７３】
マウス細胞から人工多能性幹細胞を調製する方法も公知である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，２００６）。ｉＰＳ細胞の誘導は、典型的には、Ｓｏｘファミリーからの少なくとも１つのメンバー及びＯｃｔファミリーからの少なくとも１つのメンバーの発現又はそれらへの曝露を必要とする。Ｓｏｘ及びＯｃｔは、ＥＳ細胞同一性を特定する転写調節階層の中心的存在であると考えられている。例えば、Ｓｏｘは、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、Ｓｏｘ−１５、又はＳｏｘ−１８であり得；ＯｃｔはＯｃｔ−４であり得る。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、又はｃ−Ｍｙｃのような追加の因子がリプログラミングの効率を上げることができ；リプログラミング因子の特定のセットは、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、及び任意選択によるＬｉｎ−２８を含むセット；又はＳｏｘ−２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ、及び任意選択によるｃ−Ｍｙｃを含むセットであり得る。
【００７４】
ＩＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と同様に、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、及びＳＳＥＡ−４（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ）、並びにＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１（Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）に対する抗体を用いて，免疫組織化学又はフローサイトメトリーによって同定又は確認することができる特徴的な抗原を有する。胚性幹細胞の多能性は、例えば、８〜１２週齢の雄ＳＣＩＤマウスの後肢筋肉に約０．５〜１０×１０６の細胞を注射することによって確認することができる。３つの胚葉のそれぞれの少なくとも１つの細胞型を示す奇形腫が発生する。
【００７５】
本発明の特定の態様では、ｉＰＳ細胞は、例えば上記のＫｌｆ又はＮａｎｏｇと組み合わせて、Ｏｃｔファミリーメンバー及びＳｏｘファミリーメンバー、例えばＯｃｔ４及びＳｏｘ２を含むリプログラミング因子を用いてリプログラミング体細胞から作製される。この体細胞は、例えば、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉系細胞、肝細胞、胃細胞、又はβ細胞などの、多能性に誘導され得る任意の体細胞であり得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はまた、リプログラミングのための体細胞の供給源としても使用することができる（例えば、参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１０／１４１８０１号パンフレットを参照）。
【００７６】
リプログラミング因子は、１つ以上のベクター、例えば組み込みベクター、染色体非組み込みＲＮＡウイルスベクター（参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第１３／０５４，０２２号明細書を参照）、又はエピソームベクター、例えばＥＢＶ要素ベースの系（例えば、参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２００９／１４９２３３号パンフレット；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９を参照）に含まれる発現カセットから発現させることができる。さらなる態様では、リプログラミングタンパク質又はＲＮＡ（ｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡなど）は、タンパク質又はＲＮＡのトランスフェクションによって体細胞に直接導入することができる（Ｙａｋｕｂｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００７７】
Ｃ．体細胞核移植により誘導される胚性幹細胞
多能性幹細胞は、体細胞核移植によって作製することができ、この核移植では、ドナー核が紡錘体のない卵母細胞に導入される。核移植によって作製される幹細胞は、ドナー核と遺伝的に同一である。一方法では、皮膚線維芽細胞由来のドナー線維芽細胞核が、電気融合によって紡錘体のない成熟中期ＩＩ卵母細胞の細胞質に導入される（Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。融合卵母細胞は、イオノマイシンへの曝露によって活性化され、次いで胚盤胞期までインキュベートされる。次いで、選択された胚盤胞の内部細胞塊が、胚性幹細胞株が作製されるように培養される。胚性幹細胞株は、正常なＥＳ細胞形態を示し、様々なＥＳ細胞マーカーを発現し、そしてインビトロ及びインビボの両方で複数の細胞型に分化し得る。本明細書で使用される用語「ＥＳ細胞」は、受精核を含む胚に由来する胚性幹細胞を指す。ＥＳ細胞は、「体細胞核移植によって誘導される胚性幹細胞」と呼ばれる、核移植によって作製される胚性幹細胞とは区別される。
【００７８】
ＶＩＩ．分化用の培地
本発明の特定の態様による分化培地は、その基本培地として動物細胞の培養に使用されるべき培地を使用して調製することができる。いくつかの実施形態では、分化培地を用いて、単一のＢＭＰ阻害剤又は単一のＴＧＦ−β阻害剤のみを使用して多能性細胞を中脳ドーパミン作動性ニューロンに分化させる。例えば、多能性細胞の分化（例えば、中脳ドーパミン作動性細胞への分化）を促進するために使用される分化培地は、単一のＢＭＰ阻害剤（ＬＤＮ−１９３１８９又はドルソモルフィンなど；例えば、分化の１〜１７日目；ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の活性化因子（プルモルファミン、ヒトＣ２５ＩＩ  ＳＨＨ、又はマウスＣ２４ＩＩ  ＳＨＨなど；例えば、１〜６日目、２〜７日目、又は１〜７日目）；Ｗｎｔシグナル伝達の活性化因子（ＧＳＫ阻害剤など、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１；例えば、２〜１７日目又は３〜１７日目）、及び／又はＭＥＫ阻害剤（ＰＤ０３２５９０１など；例えば、２〜４日目又は３〜５日目）を含み得る。いくつかの実施形態では、単一のＴＧＦβ阻害剤（ＳＢ−４３１５４２など；例えば、１〜４日目）を単一のＢＭＰ阻害剤の代わりに使用することができる；しかしながら、以下の実施例に示すように、単一のＢＭＰ阻害剤の使用は、単一のＴＧＦ−β阻害剤の使用と比較して、細胞のＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋細胞への優れた分化をもたらすことが観察された。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ−８（例えば、ＦＧＦ−８ｂ）は、初日又は１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、若しくは１０日目、又はこれらの任意の組み合わせの日（例えば、１〜８日目）の分化培地に含められない；例えば、いくつかの実施形態では、ＦＧＦ−８は、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、及び１７日目、又はこれらの任意の組み合わせの日の分化培地に含められる。様々な実施形態では、分化培地は、ＴＧＦβ及びｂＦＧＦを含んでもよいし、あるいは、分化培地は、本質的にＴＧＦβ及びｂＦＧＦを含まなくてもよい。
【００７９】
特定の態様では、実施形態による分化方法は、様々な培地条件による細胞の継代を含み、例えば、細胞は、
・単一のＢＭＰ阻害剤（又はＴＧＦβ阻害剤）；ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の活性化因子；及びＷｎｔシグナル伝達の活性化因子を含む培地での接着培養で；
・細胞凝集体を形成するための、単一のＢＭＰ阻害剤（又はＴＧＦβ阻害剤）；ＳＨＨシグナル伝達の活性化因子；及びＷｎｔシグナル伝達の活性化因子を含む培地に懸濁して；
・成熟のための、Ｂ２７Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｌ−グルタミン、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦβ、アスコルビン酸、ジブチリルｃＡＭＰ、及びＤＡＰＴ、（及び任意選択による、外部から添加されるレチノール又はレチノイン酸を欠く）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中での接着培養で培養される。
【００８０】
基礎培地としては、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ  １０６６、グラスゴーＭＥＭ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、培地１９９、イーグルＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ  １６４０、及びＦｉｓｃｈｅｒ培地、これらのバリエーション又は組み合わせなどの任意の化学的に定義された培地を使用することができ、ＴＧＦβ及びｂＦＧＦは含まれても含まれなくてもよい。
【００８１】
さらなる実施形態では、細胞分化環境は、Ｂ−２７Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、インスリン、トランスフェリン、及びセレン（ＩＴＳ）添加剤、Ｌ−グルタミン、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、Ｐ／Ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン）、Ｎ２Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５μｇ／ｍＬのインスリン、１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、２０ｎＭのプロゲステロン、３０ｎＭのセレン、１００μＭのプトレシン（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ，ａｎｄ  Ｓａｔｏ，１９７９  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７６，５１４−５１７）、及び／又はβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）などの添加剤も含み得る。限定されるものではないが、フィブロネクチン、ラミニン、ヘパリン、硫酸ヘパリン、レチノイン酸を含む追加の因子を添加してもしなくてもよいと考えられる。
【００８２】
増殖因子は、分化培地に添加してもしなくてもよい。上記に概説した因子に加えて、又はその代わりに、増殖因子、例えば、上皮増殖因子ファミリー（ＥＧＦ）のメンバー、ＦＧＦ２及び／又はＦＧＦ８を含む線維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦ）のメンバー、血小板由来増殖因子ファミリー（ＰＤＧＦ）のメンバー、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）／骨形成タンパク質（ＢＭＰ）／増殖及び分化因子（ＧＤＦ）因子ファミリーのアンタゴニストを、プロセスの様々な段階で利用することができる。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ−８は、本明細書に記載の分化培地に含められる。分化培地に添加されてもされなくてもよい他の因子には、限定されるものではないが、Ｄｅｌｔａ様及びＪａｇｇｅｄファミリータンパク質、並びにγセクレターゼ阻害剤及びＤＡＰＴなどのＮｏｔｃｈプロセシング又は切断の他の阻害剤を含む、Ｎｏｔｃｈ受容体ファミリーを介してシグナル伝達を活性化又は不活性化することができる分子が含まれる。他の増殖因子には、インスリン様増殖因子ファミリー（ＩＧＦ）、ウィングレス関連（ＷＮＴ）因子ファミリー、及びヘッジホッグ因子ファミリーのメンバーが含まれ得る。
【００８３】
神経幹／前駆細胞の増殖及び生存並びにニューロンの生存及び分化を促進するために、追加の因子を凝集体形成及び／又は分化培地に添加することができる。これらの神経栄養因子には、限定されるものではないが、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、カルジオトロフィン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）／骨形成タンパク質（ＢＭＰ）／増殖及び分化因子（ＧＤＦ）ファミリー、限定されるものではないがニュールツリン、ニューブラスチン／アルテミン、及びペルセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）を含むグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーのメンバー、並びに肝細胞増殖因子に関連する因子及びこれを含む因子が含まれる。最終分化して有糸分裂後ニューロンを形成する神経培養物は、限定されるものではないが、５−フルオロ２’−デオキシウリジン、マイトマイシンＣ、及び／又はシトシンβ−Ｄ−アラビノ−フラノシド（Ａｒａ−Ｃ）を含む、有糸分裂阻害剤又は有糸分裂阻害剤の混合物も含み得る。
【００８４】
培地は、血清含有培地又は無血清培地であり得る。無血清培地は、未処理又は未精製の血清を含まない培地を指すことがあり、従って、精製された血液由来の成分又は動物組織由来の成分（増殖因子など）を有する培地を含み得る。異種動物由来成分による汚染防止の観点から、血清は、幹細胞の場合と同様に同じ動物に由来し得る。いくつかの実施形態では、培地は合成培地であり、培地は、血清又は他の動物組織由来成分（照射マウス線維芽細胞又は照射線維芽細胞支持細胞で馴化された培地など）を含まない。
【００８５】
培地は、任意の血清代替物を含んでも含まなくてもよい。血清代替物には、アルブミン（脂質に富むアルブミン、組換えアルブミンなどのアルブミン代用物、植物デンプン、デキストラン、及びタンパク質加水分解物など）、トランスフェリン（又は他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール、又はこれらの等価物を適切に含む材料が含まれ得る。例えば、血清代替物は、国際公開第９８／３０６７９号パンフレットに開示されている方法によって調製することができる。あるいは、市販の材料をより便利に使用することができる。市販の材料には、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）及び化学的に定義された脂質濃縮物（Ｇｉｂｃｏ）が含まれる。
【００８６】
培地はまた、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（非必須アミノ酸など）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化物質、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、及び無機塩も含み得る。２−メルカプトエタノールの濃度は、例えば、約０．０５〜１．０ｍＭ、特に約０．１〜０．５ｍＭ、又は０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、０．８ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、又は任意の中間値であり得るが、幹細胞を培養するのに適切であれば、濃度は特にこれらに限定されない。
【００８７】
特定の実施形態では、多能性幹細胞は、神経誘導及び底板パターン形成を改善するために凝集体形成の前に（例えば、凝集体形成を誘導するために単一細胞又は小さい凝集体に解離される前に）培地で培養される。本発明の特定の実施形態では、幹細胞は、支持細胞、支持細胞抽出物、及び／又は血清の非存在下で培養することができる。
【００８８】
Ｂ．培養条件
細胞を培養するために使用される培養容器としては、特に限定されるものではないが、内部で細胞を培養できるのであれば、フラスコ、組織培養用フラスコ、スピナーフラスコ、皿、ペトリ皿、組織培養用皿、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、培養バッグ、及びローラーボトルなどを挙げることができる。細胞は、培養の必要性に応じて、少なくとも又は約０．２ｍＬ、約０．５ｍＬ、約１ｍＬ、約２ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約２０ｍＬ、約３０ｍＬ、約４０ｍＬ、約５０ｍＬ、約１００ｍＬ、約１５０ｍＬ、約２００ｍＬ、約２５０ｍＬ、約３００ｍＬ、約３５０ｍＬ、約４００ｍＬ、約４５０ｍＬ、約５００ｍＬ、約５５０ｍＬ、約６００ｍＬ、約８００ｍＬ、約１０００ｍＬ、約１５００ｍＬ、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲の体積で培養することができる。特定の実施形態では、培養容器は、バイオリアクターであり得、このバイオリアクターは、生物学的に活性な環境を支持する任意の装置又はシステムを指し得る。バイオリアクターは、少なくとも又は約２リットル、約４リットル、約５リットル、約６リットル、約８リットル、約１０リットル、約１５リットル、約２０リットル、約２５リットル、約５０リットル、約７５リットル、約１００リットル、約１５０リットル、約２００リットル、約５００リットル、約１立方メートル、約２立方メートル、約４立方メートル、約６立方メートル、約８立方メートル、約１０立方メートル、約１５立方メートル、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲の体積を有し得る。
【００８９】
培養容器の表面は、目的に応じて細胞接着剤を用いて調製して又は用いずに調製することができる。細胞接着性培養容器は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）などの細胞接着用の任意の基材で被覆して細胞の容器表面への接着性を改善することができる。細胞接着に使用される基材は、幹細胞又は支持細胞（使用される場合）を付着させるための任意の材料であり得る。細胞接着のための非限定的な基材には、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ラミニン、ビトロネクチン、及びフィブロネクチン、並びにそれらの混合物、例えばＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス肉腫細胞（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）又はＧｅｌｔｒｅｘなど）及び溶解細胞膜調製物（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ，２００５）からのタンパク質混合物が含まれる。
【００９０】
他の培養条件は適切に定義することができる。例えば、培養温度は、約３０〜４０℃、例えば、少なくとも又は約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃であり得るが、特にこれらに限定されるものではない。ＣＯ２濃度は、約１〜１０％、例えば、約２〜７％、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲であり得る。酸素圧は、少なくとも又は約１％、約５％、約８％、約１０％、約２０％、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲であり得る。
【００９１】
接着培養は、特定の態様で使用することができる。この場合、細胞は、支持細胞の存在下で培養することができる。支持細胞が本発明の方法で使用される場合、胎児線維芽細胞などの間質細胞を支持細胞として使用することができる（例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９４）；Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９３）；Ｍａｒｔｉｎ（１９８１）；Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）；Ｊａｉｎｃｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９６９）；Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）；Ｋｏｄａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）；及び国際公開第０１／０８８１００号パンフレット及び米国特許出願公開第２００５／０８０５５４号明細書を参照）。
【００９２】
他の態様では、懸濁培養を使用することができる。懸濁培養は、担体上の懸濁培養（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）又はゲル／バイオポリマーカプセル化（米国特許出願公開第２００７／０１１６６８０号明細書）を含み得る。幹細胞の懸濁培養は、幹細胞が、培養容器又は培地中の支持細胞（使用される場合）に対して非接着条件下で培養されることを意味する。幹細胞の懸濁培養は、一般に、幹細胞の解離培養及び幹細胞の凝集懸濁培養を含む。幹細胞の解離培養（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）は、懸濁幹細胞を培養することを意味し、幹細胞の解離培養には、単一の幹細胞の解離培養、又は複数の幹細胞からなる小細胞凝集塊（例えば、約２〜４００の細胞）の解離培養が含まれる。上述の解離培養が続けられると、培養されて解離した細胞がより大きな幹細胞の凝集塊を形成し、その後、凝集懸濁培養（ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を行うことができる。凝集懸濁培養は、胚様体培養法（Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５を参照）及びＳＦＥＢ（無血清胚様体）法（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）；米国特許出願公開第２００５／１２３９０２号明細書）を含む。
【００９３】
Ｃ．多能性幹細胞の培養
ＥＳ細胞などの多能性幹細胞を調製及び培養するための方法は、細胞生物学、組織培養、並びに奇形癌腫及び胚性幹細胞を含む発生学の標準的な教科書及び概説で確認することができる：全て参照により本明細書に組み入れられる、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（１９９３）；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９８）。組織培養で使用される標準的な方法は概ね、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（１９８７）；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７  ＆  １９９５）に記載されている。
【００９４】
体細胞にリプログラミング因子を導入又は接触させた後、これらの細胞を、多能性及び未分化状態を維持するのに十分な培地で培養することができる。人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の培養は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２００７／０２３８１７０号明細書及び同第２００３／０２１１６０３号明細書、及び同第２００８／０１７１３８５号明細書に記載されるように、霊長類多能性幹細胞、胚性幹細胞、又はｉＰＳ細胞を培養するために開発された様々な培地及び技術を使用することができる。当業者に公知である、多能性幹細胞の培養及び維持のためのさらなる方法を本発明と共に使用できることを理解されたい。
【００９５】
特定の実施形態では、未定義の条件が使用することができる；例えば、多能性細胞は、幹細胞を未分化状態に維持するために、線維芽細胞支持細胞上で、又は線維芽細胞支持細胞に曝露された培地で培養することができる。あるいは、多能性細胞は、ＴｅＳＲ培地（Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ａ；Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ｂ）又はＥ８培地（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４６７９６）などの定義された支持細胞非依存性培養系を用いて培養して、本質的に未分化状態に維持することができる。支持細胞非依存性培養系及び培地を使用して、多能性細胞を培養し、維持することができる。これらのアプローチは、ヒト多能性幹細胞を、マウス線維芽細胞の「支持細胞層」を必要とすることなく、本質的に未分化の状態に維持することを可能にする。本明細書に記載されるように、所望に応じてコストを削減するために、これらの方法に様々な変更を行うことができる。
【００９６】
ヒト多能性幹細胞の培養、維持、又は分化に様々なマトリックス成分を使用することができる。例えば、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、及びビトロネクチンを組み合わせて使用して、参照によりその全容が本明細書に組み入れられるＬｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６ａ；２００６ｂ）に記載されているように、多能性細胞の増殖のための固体支持体を提供する手段として培養表面をコーティングすることができる。
【００９７】
また、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を使用して、ヒト多能性幹細胞の細胞培養及び維持のための基材を提供することができる。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、マウス腫瘍細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物であり、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）によって市販されている。この混合物は、多くの組織に見られる複雑な細胞外環境に類似し、細胞生物学者によって細胞培養の基材として使用されている。
【００９８】
Ｄ．単一細胞継代
多能性幹細胞培養のいくつかの実施形態では、培養容器が満たされたら、コロニーが、解離に適した任意の方法によって凝集細胞又は単一細胞にさえも分割され、次いでこの細胞は、継代のために新しい培養容器に入れられる。細胞継代又は細胞分裂は、細胞が長期間にわたって培養条件下で生存して増殖することを可能にする技術である。細胞は、典型的には、これらが約７０％〜１００％コンフルエントであるときに継代されることになる。
【００９９】
多能性幹細胞の単一細胞の解離の後の単一細胞継代は、細胞増殖の促進、細胞選別、及び分化のための既定の播種（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｅｅｄｉｎｇ）、及び培養手順の自動化とクローン増殖を可能にするなどのいくつかの利点を有する本方法に使用することができる。例えば、単一の細胞にクローン的に由来する子孫細胞は、遺伝的構造が均質であり得、かつ／又は細胞周期を同期させることができ、これにより標的分化が増加し得る。単一細胞継代のための例示的な方法は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００８／０１７１３８５号明細書に記載されている通りであり得る。
【０１００】
特定の実施形態では、多能性幹細胞は、単一の個々の細胞、又は単一の個々の細胞の組み合わせ、及び２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上の細胞を含む小細胞クラスターに解離させることができる。解離は、機械的な力によって、又は細胞解離剤、例えばキレート剤、クエン酸ナトリウム（ＮａＣｉｔｒａｔｅ）、又は酵素、例えばトリプシン、トリプシン−ＥＤＴＡ、Ａｃｃｕｔａｓｅ、又はＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔなどによって達成することができる。細胞の解離は、化学的分離（例えば、キレート剤又は酵素を用いる）及び／又は細胞を解離させるための機械的撹拌を使用して達成することができる。
【０１０１】
多能性幹細胞の供給源及び増殖の必要性に基づいて、解離した細胞を、少なくとも又は約１：２、約１：４、約１：５、約１：６、約１：８、約１：１０、約１：２０、約１：４０、約１：５０、約１：１００、約１：１５０、約１：２００、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲などの分割比で個々に又は小さなクラスターで新しい培養容器に移すことができる。懸濁細胞株の分割比は、培養細胞懸濁液の容量に対して決定することができる。継代間隔は、少なくとも又は約１日おき、約２日おき、約３日おき、約４日おき、約５日おき、約６日おき、約７日おき、約８日おき、約９日おき、約１０日おき、約１１日おき、約１２日おき、約１３日おき、約１４日おき、約１５日おき、約１６日おき、約１７日おき、約１８日おき、約１９日おき、約２０日おき、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲であり得る。例えば、異なる酵素的継代プロトコルで達成可能な分割比は、３〜７日おきでは１：２、４〜７日おきでは１：３、及び約７日おきでは１：５〜１：１０、７日おきでは１：５０〜１：１００であり得る。高い分割比が使用される場合、継代間隔は、過剰な自発的分化又は細胞死による細胞損失なしに、少なくとも１２〜１４日又は任意の期間に延長することができる。
【０１０２】
特定の態様では、単一細胞継代は、クローニング効率及び細胞生存率を高めるのに有効な小分子、例えば上記のＲＯＣＫ阻害剤又はミオシンＩＩ阻害剤の存在下であり得る。このようなＲＯＣＫ阻害剤又はミオシンＩＩ阻害剤、例えば、Ｙ−２７６３２、ＨＡ−１０７７、Ｈ−１１５２、又はブレビスタチンは、有効濃度、例えば、少なくとも又は約０．０２μＭ、約０．０５μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約４５μＭ、約５０〜約１００μＭ、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲で使用することができる。
【０１０３】
Ｅ．幹細胞の分化
多能性幹細胞の神経分化効率（特に中脳ＤＡ分化効率）を改善する方法を提供することができる。多能性幹細胞の分化は、様々な方法で、例えば、付着コロニーで、又は、例えば低付着環境において胚様体（ＥＢ）と呼ばれる細胞凝集塊を形成することによって誘導することができる。ＥＢ内の分子及び細胞形態形成シグナル及び事象は、発生中の胚におけるこのような細胞の天然の個体発生の多くの状況を模倣する。細胞を神経分化に誘導するための方法は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１２／０２７６０６３号明細書に示されている。ＤＡニューロン分化のためのより詳細かつ明確なプロトコルは、参照により本明細書に組み入れられるＰＣＴ国際公開第２０１３／０６７３６２号パンフレットに示されている。
【０１０４】
胚様体（ＥＢ）は、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞に由来する細胞の凝集体であり、マウス胚性幹細胞を用いて長年にわたって研究されてきた。インビボ分化に固有のいくつかの手がかりを再現するために、三次元凝集体（すなわち、胚様体）を中間段階として生成することができる。細胞凝集の開始時に、分化が開始され得、そして細胞が、限られた程度に胚発生の再現を開始することができる。これらの細胞は、栄養外胚葉性組織（胎盤を含む）を形成することはできないが、生物中に存在する事実上あらゆる他の種類の細胞が発生し得る。本発明は、凝集体形成後の神経分化をさらに促進することができる。
【０１０５】
細胞凝集は、懸滴、非組織培養処理プレート又はスピナーフラスコへの播種を行うことができ；いずれの方法も、細胞が表面に付着して典型的なコロニーの成長が起こるのを防止する。ＲＯＣＫ阻害剤又はミオシンＩＩ阻害剤を凝集体形成の前、最中、又は後に使用して多能性幹細胞を培養することができる。
【０１０６】
多能性幹細胞は、細胞培養の分野で公知の任意の方法を用いて凝集促進培地に播種することができる。例えば、多能性幹細胞は、単一のコロニー又はクローン群として凝集促進培地に播種することができ、多能性幹細胞はまた、本質的に個々の細胞としても播種することもできる。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、当技術分野で公知の機械的又は酵素的方法を用いて本質的に個々の細胞に解離される。非限定的な例として、多能性幹細胞は、細胞と培養表面との間の結合及び細胞自体間の結合を破壊するタンパク質分解酵素に曝露することができる。凝集体の形成及び分化のために多能性幹細胞を個別化するために使用することができる酵素としては、限定されるものではないが、ＴｒｙｐＬＥなどの様々な市販の製剤のトリプシン、又はＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）などの酵素の混合物を挙げることができる。特定の実施形態では、多能性細胞は、培養表面上での培養物形成のために、本質的に個々の（又は分散した）細胞として培養培地に添加又は播種することができる。
【０１０７】
例えば、分散した多能性細胞を培養培地に播種することができる。これらの実施形態では、培養表面は、当技術分野における標準的な無菌細胞培養方法に適合する本質的にあらゆる材料、例えば、非接着性表面から構成することができる。培養表面は、本明細書に記載されるマトリックス成分をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、マトリックス成分は、培養表面が細胞及び培地に接触する前にこの表面に適用することができる。
【０１０８】
コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、及びマトリゲルなどの基材を使用して、分化を誘導することができる。分化はまた、増殖誘導増殖因子の存在下で細胞を懸濁状態に維持することによって、増殖を再開させることなく（すなわち、ニューロスフェアを解離させることなく）誘導することができる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、細胞は、培養培地中の固定基材上で培養される。次いで、増殖誘導増殖因子を細胞に投与することができる。増殖誘導増殖因子は、細胞を基材（例えば、ポリオルニチン処理プラスチック又はガラス）に付着させ、平らにし、そして異なる細胞型への分化を開始させることができる。
【０１１０】
Ｖ．非静置培養
特定の態様では、非静置培養を、多能性幹細胞の培養及び分化に使用することができる。非静置培養は、例えば、振盪、回転、又は攪拌プラットフォーム又は培養容器、特に大容量回転バイオリアクターを使用することによって細胞を制御された移動速度に維持するあらゆる培養であり得る。いくつかの実施形態では、ロッカーテーブルを使用することができる。撹拌は、栄養素及び細胞老廃物の循環を改善することができ、また撹拌を行って、より均一な環境を提供することにより細胞凝集を制御することができる。例えば、回転速度は、少なくとも又は最大でも約１０ｒｐｍ、約１５ｒｐｍ、約２０ｒｐｍ、約２５ｒｐｍ、約３０ｒｐｍ、約３５ｒｐｍ、約４０ｒｐｍ、約４５ｒｐｍ、約５０ｒｐｍ、約７５ｒｐｍ、約１００ｒｐｍ、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲に設定することができる。多能性幹細胞、細胞凝集体、分化幹細胞、又はこれらに由来する子孫細胞のための非静置培養のインキュベーション期間は、少なくとも又は約４時間、約８時間、約１６時間、又は約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、又は約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、又はこれらの中で導出可能な任意の範囲であり得る。
【０１１１】
ＶＩ．細胞の遺伝子改変及び精製
いくつかの実施形態では、多能性細胞（例えば、多能性細胞又はＤＡニューロン）は、遺伝子操作されている。ポリヌクレオチドが任意の適切な人工操作の手段によって細胞内に移入された場合、又は細胞がポリヌクレオチドの遺伝子を受け継いだ最初に改変された細胞の子孫である場合に、細胞は、「遺伝子改変」されている又は「トランスジェニック」であると言われる。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、ＭＡＰ２プロモーターなどのニューロンプロモーターの制御下にある抗生物質耐性遺伝子を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子であり、そしてニューロン細胞は、細胞培養物を抗生物質に曝露することによって精製することができ、従ってニューロン細胞に分化しなかった細胞を殺す。例えば、ＭＡＰ２プロモーターの制御下にあるネオマイシン遺伝子を発現する細胞をＧ４１８に曝露して、非ニューロン細胞を殺すことができる。本発明と共に使用することができるさらなる方法は、参照により排除されずにその全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願第１４／６６４，２４５号明細書に記載されている。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ドーパミン作動性ニューロンを含む細胞の集団は、分裂中の細胞を殺すために細胞を有糸分裂阻害剤又は化学療法剤に曝露することによって精製することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の方法によって生成された中脳ＤＡ細胞を含む細胞の集団は、分裂中の細胞を殺すためにマイトマイシンＣと細胞を接触させることによって精製することができる。
【０１１３】
ＶＩＩ．ドーパミン作動性ニューロンの使用
本発明の特定の態様の方法及び組成物によって提供されるＤＡニューロンは、様々な用途に使用することができる。これらには、ほんの数例を挙げると、限定されるものではないが、インビボでのＤＡニューロンの移植又は植え込み；インビトロでの細胞毒性化合物、発癌物質、変異原性増殖（ｍｕｔａｇｅｎｓ  ｇｒｏｗｔｈ）／調節因子、医薬化合物などのスクリーニング；神経変性のメカニズムの解明；薬物及び／又は増殖因子が作用する機序の研究、遺伝子治療；並びに生物学的に活性な産物の生産が含まれる。
【０１１４】
Ａ．試験化合物のスクリーニング
本発明の中脳ＤＡニューロンを使用して、本明細書で提供されるＤＡニューロンの特性に影響を与える因子（溶媒、小分子薬、ペプチド、及びポリヌクレオチドなど）又は環境条件（培養条件又は操作など）をスクリーニングすることができる。
【０１１５】
いくつかの用途では、（分化又は未分化）幹細胞を使用して、神経系列に沿った細胞の成熟を促進する因子、又は長期培養におけるこのような細胞の増殖及び維持を促進する因子をスクリーニングする。例えば、候補神経成熟因子又は成長因子は、これらを異なるウェルの幹細胞に添加し、次いでさらなる培養及び細胞の使用のための望ましい基準に従って、生じるあらゆる表現型の変化を決定することによって試験される。
【０１１６】
本発明の特定のスクリーニング用途は、薬物研究における医薬化合物の試験に関連する。標準的な試験方法は、例えば、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）に記載されている。実施形態の特定の態様では、本明細書に詳述される方法によって産生された細胞を、短期間の培養において初代ニューロンに対して以前に行われたように、（例えば、細胞系統特異的疾患を処置するために治療用分子の機能の詳細又は送達試験について同定し、確認し、かつ試験するために）標準的な薬物スクリーニング及び毒性アッセイのための試験細胞として使用することができる。候補医薬化合物の活性の評価は、一般に、本発明の特定の態様で提供されるニューロンを候補化合物と組み合わせること、（未処理細胞又は不活性化合物で処理された細胞と比較して）化合物に起因する細胞の電気生理学、形態、マーカー表現型、又は代謝活性の変化を決定すること、次いで化合物の効果を観察された変化と相関させることを含む。化合物がニューロン細胞に対して薬理学的効果を有するように設計されているため、又は他のどこかで効果を有するように設計された化合物が意図しない神経性副作用を有し得るため、スクリーニングが行われ得る。可能性のある薬物−薬物相互作用効果を検出するために、（同時に又は連続して細胞と組み合わせることによって）２つ以上の薬物を組み合わせて試験することができる。
【０１１７】
いくつかの用途では、化合物は、潜在的な神経毒性について最初にスクリーニングされる。細胞毒性は、第一に、細胞の生存率、生存、形態、又は培養培地への酵素の漏出に対する効果によって決定することができる。化合物が毒性を引き起こさずに細胞機能（神経伝達など）に影響を与えるか否かを決定するために、より詳細な分析が行われる。
【０１１８】
Ｂ．中枢神経系の疾患の処置
１．中枢神経系の疾患
有糸分裂後中脳ＤＡニューロンなどのドーパミン作動性ニューロンを、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患を有する個体の神経細胞を再生するために移植することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って生成される中脳ＤＡニューロンを、ＣＮＳ疾患を処置するために対象に投与することができる（例えば、パーキンソン病を処置するために脳又は中脳、例えば、尾状核、被殻、又は黒質に投与する）。このような疾患には、限定されるものではないが、パーキンソニズムなどの神経変性疾患が含まれ得る。
【０１１９】
本明細書で使用される用語「パーキンソニズム」は、運動を制御する脳の部分である大脳基底核におけるドーパミンの不足に全て関連している一群の疾患を指す。症状には、振戦、運動緩慢（極端な動作の遅さ）、屈曲姿勢、姿勢の不安定性、及び硬直が含まれる。パーキンソニズムの診断には、これらの症状のうち少なくとも２つの存在が必要であり、そのうちの１つは、振戦又は運動緩慢でなければならない。パーキンソニズムの最も一般的な形態は、特発性又は古典的なパーキンソン病（ＰＤ）であるが、全体のうちの約１５パーセントとかなり少数の診断であり、パーキンソン病プラス症候群（ＰＰＳ）の１つが存在し得る。非定型パーキンソニズムとしても知られるこれらの症候群には、大脳皮質基底核変性症、レビー小体型認知症、多発性全身性萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍａｔｒｏｐｈｙ）、及び進行性核上麻痺が含まれる。一般に、パーキンソン病は、主として黒質と呼ばれる脳の領域における脳の活力神経細胞の機能不全及び死を伴う。これらの活力神経細胞の多くはドーパミンを産生する。これらのニューロンが死ぬと、ドーパミンの量が減少し、人間は、正常に運動を制御できなくなる。腸はまた、パーキンソン病患者において変性するドーパミン細胞を有し、これは、この疾患の一部である胃腸症状における重要な原因因子であり得る。個人が経験する特定の症状は、人によって異なり得る。パーキンソン病の主な運動徴候には以下が含まれる：手、腕、脚、顎、及び顔の振戦、運動緩慢又は動きの遅さ、四肢及び体幹の固縮又は硬直、並びに姿勢の不安定性、又はバランスと協調運動の低下。
【０１２０】
２．細胞を投与するための方法
幹細胞又は分化細胞は、局所的又は全身的のいずれかで対象に投与することができる。対象にＤＡニューロンを投与するための方法は当技術分野で公知である。患者に自身の細胞由来の細胞が投与される場合、これは自家移植と呼ばれ；このような移植は、拒絶の可能性が殆どない。
【０１２１】
幹細胞又は分化ニューロン細胞を対象、特にヒト対象に投与する例示的な方法は、対象の標的部位（例えば、線条体及び／又は黒質）への細胞の注射又は移植を含む。幹細胞及び／又はＤＡニューロンは、注射又は移植による細胞の対象への導入を容易にする送達装置に挿入することができる。このような送達装置には、レシピエント対象の体内に細胞及び流体を注入するための管、例えばカテーテルが含まれる。好ましい実施形態では、管は、本発明の細胞を対象の所望の位置に導入することができる針、例えばシリンジをさらに有する。幹細胞は、このような送達装置、例えばシリンジに様々な形態で挿入することができる。例えば、細胞は、溶液中に懸濁させること、細胞凝集体中に存在させること、あるいはこのような送達装置に含められるときに支持マトリックスに埋め込むことができる。
【０１２２】
幹細胞又はニューロンを組み込む又は包埋することができる支持マトリックスには、レシピエント適合性であり、かつレシピエントにとって有害ではない産物に分解するマトリックスが含まれる。支持マトリックスは、天然（例えば、ヒアルロン酸、コラーゲンなど）及び／又は合成生分解性マトリックスであり得る。使用することができる合成生分解性マトリックスには、ポリ無水物、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの合成ポリマーが含まれる。いくつかの実施形態では、ドーパミン作動性ニューロン（例えば、完全には分化していないドーパミン作動性ニューロン）をヒアルロン酸マトリックスに包埋し、そして神経変性疾患（例えば、パーキンソン病）を処置するために対象に投与する。
【０１２３】
本明細書で使用される用語「溶液」は、本発明の細胞が生存を維持する薬学的に許容され得る担体又は希釈剤を含む。薬学的に許容される担体及び希釈剤には、食塩水、緩衝水溶液、溶媒、及び／又は分散媒が含まれる。このような担体及び希釈剤の使用は当技術分野で公知である。溶液は、好ましくは、無菌であり、かつ容易に注射可能である程度に流動性である。
【０１２４】
好ましくは、溶液は、生産及び保存の条件下で安定であり、かつ細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されている。いくつかの実施形態では、ＤＡニューロン又は中脳ＤＡニューロンを含有する溶液が、ＢＳＳ  ＰＬＵＳ（Ａｌｃｏｎ，Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）の無菌溶液中で患者に投与される。所望であれば、保存剤又は抗生物質を、投与用の医薬組成物に含めることができる。本発明の溶液は、本明細書に記載のニューロンを薬学的に許容され得る担体又は希釈剤、及び必要に応じて他の成分に組み込むことによって調製することができる。
【０１２５】
３．投与量及び投与
一態様では、本明細書に記載の方法は、前駆細胞又はＤＡニューロンの対象での生着を高めるための方法を提供する。一実施形態では、対象は哺乳動物であり得る。別の実施形態では、哺乳動物はヒトであり得るが、本発明は、全ての哺乳動物に対して有効である。
【０１２６】
組成物は、剤形に適合する方式で、治療有効量で投与される。投与される量及びタイミングは、処置されるべき対象、有効成分を利用する対象の系の能力、及び望まれる治療効果の程度に依存する。投与に必要とされる各活性成分の正確な量は、開業医の判断に依存し、そして各個体に特有である。しかしながら、適切な投与量範囲は、投与経路に依存する。投与に適した投与計画も様々である。
【０１２７】
４．有効性
ＤＡニューロンの生着を高めるための所与の処置の有効性は、当業者によって決定することができる。しかしながら、例えば不十分なＤＡニューロンの生着の徴候又は症状のいずれか１つ又は全てが有益な方法で変更され、他の臨床的に許容されている症状が、例えば、本明細書に記載の細胞集団での処置後に少なくとも１０％改善された、又はさらに寛解された場合に、処置は、本明細書で使用される用語である「有効な処置」と見なされる。有効性はまた、入院、医学的介入の必要性（すなわち、疾患の進行が停止している）、又は生着不全の発生率によって評価される、個体の悪化がなかったことによっても測定することができる。これらの指標を測定する方法は当業者に公知であり、かつ／又は本明細書に記載されている。処置には、個体又は動物（いくつかの非限定的な例にはヒト又は哺乳動物が含まれる）における疾患のあらゆる処置が含まれ、かつ以下を含む：（１）疾患を抑制すること、例えば生着不全を防止すること；又は（２）病気を緩和すること、例えば症状を緩解させること。疾患の処置に有効な量は、それを必要とする哺乳動物に投与したときに、その疾患の処置又は治療上の利益をもたらすのに十分な量を意味する。剤の有効性は、例えば、振戦、運動緩慢、屈曲姿勢、バランスと協調運動などのようなＤＡニューロン生着の物理的指標を評価することによって決定することができる。いくつかの実施形態では、生着又は神経機能を、代謝又は活性又はドーパミン作動系を測定するためにＰＥＴスキャンを使用して（例えば、ドーパミン作動系のイメージングのためのＰＥＴトレーサーを使用して）インビボ（例えば、ヒトの体内）で測定することができる。有効性は、パーキンソン病の動物モデルにおいて、例えば段階試験や円筒試験などの行動試験を行うことによって評価することができる。
【０１２８】
Ｃ．商業目的、治療目的、及び研究目的での配布
生産、配布、及び使用の目的のために、本明細書に記載される中脳ＤＡニューロンなどの神経細胞は、細胞培養物の形態で供給してもよいし、又は等張賦形剤若しくは培養培地に懸濁し、任意選択により輸送又は保存を容易にするために凍結してもよい。
【０１２９】
本明細書に記載の神経細胞は、例えば、生産、配布、又は使用中のあらゆる時点で存在する細胞のセット又は組み合わせを含む、異なる試薬系を用いて提供することができる。細胞セットは、未分化幹細胞又は他の分化細胞型と組み合わせた、例示であってプログラミング由来細胞（神経系統細胞、それらの前駆細胞及びサブタイプ）に限定されない、本開示に記載の２つ以上の細胞集団の任意の組み合わせを含み得る。セット内の細胞集団は、同じゲノム又はその遺伝子改変型を共有してもよい。セット内の各細胞型は、同じ事業体又は取引関係を共有する異なる事業体の管理下で、同じ又は異なる時点で、同じ施設内で一緒に、又は異なる場所で別々の容器に包装することができる。
【実施例】
【０１３０】
ＶＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含められる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能する、発明者によって発見された技術を表しており、従ってその実施での好ましい様式を構成すると見なすことができることが当業者には理解されよう。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、開示された特定の実施形態に多くの変更を加えることができ、それでも本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を得ることができることが明らかであろう。
【０１３１】
実施例１
材料及び方法
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地中のＶＴＮ−ＴＮ上で増殖させたヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞株の中脳神経分化を、表１〜表５に詳述するように様々な分化培地の組成及びスケジュールを使用して小分子及び増殖因子誘導を用いて行った。一般に、ｉＰＳ細胞は、１日目にＤ１  ＤＡニューロン誘導培地で、２日目にＤ２ニューロン誘導培地で、そして３日目及び４日目にＤ３−Ｄ４  ＤＡ誘導培地で培養した。５日目に、細胞をＴｒｙｐＬＥを用いて１５分間解離させてＤＡ  Ｑｕｅｎｃｈ培地で収集してから、細胞をスピナーフラスコ懸濁培養に移して、Ｄ５  ＤＡニューロン凝集体形成培地で凝集体を形成させた。
【０１３２】
６日目に、凝集体を沈降させ、培地の約６６％を除去し、そして凝集体にＤＡニューロン誘導培地を供給した。７〜１６日目では、凝集体にＤＡニューロン凝集体維持培地を毎日供給し、１１〜１６日目では培地を交換した。１７日目に、凝集体をＴｒｙｐＬＥを用いて単一細胞懸濁液に解離させ、Ｄ１７  ＤＡニューロン凝集体播種培地中のＭａｔｒｉｇｅｌに播種した。１８日目、２０日目、２２日目に、培地をドーパニューロン成熟培地と交換した。２４日目に、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅを用いて解離させ、ＤＡニューロン成熟播種培地に播種した。翌日、培地をドーパニューロン成熟培地に交換した。
【０１３３】
２７日目と２９日目に、培地をＤＡニューロン成熟培地＋マイトマイシンＣと交換した。３１日目に、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅを用いて解離させ、ＤＡニューロン成熟播種培地中、ポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）／ラミニン被覆フラスコに再播種した。次に、３２日目、３４日目、及び３６日目に、細胞にドーパニューロン成熟培地を供給した。３７日目又は３８日目に、細胞を再びＡｃｃｕｔａｓｅを用いて解離させ、分析に供するか、又は後で使用するために凍結保存した。
【表１】
2019531062.tif 000002
2019531062.tif 000003
2019531062.tif 000004
2019531062.tif 000005
【表２】
2019531062.tif 000006
2019531062.tif 000007
2019531062.tif 000008
2019531062.tif 000009
【表３】
2019531062.tif 000010
2019531062.tif 000011
2019531062.tif 000012
2019531062.tif 000013
【表４】
2019531062.tif 000014
2019531062.tif 000015
2019531062.tif 000016
2019531062.tif 000017
【表５】
2019531062.tif 000018
2019531062.tif 000019
2019531062.tif 000020
2019531062.tif 000021
【表６】
2019531062.tif 000022
2019531062.tif 000023
2019531062.tif 000024
2019531062.tif 000025
【０１３４】
実施例２
単一ＳＭＡＤｉを用いた効率的なｍＤＡ前駆細胞のパターン形成
プロセスの１７日目にＦｏｘＡ２及びＬｍｘ１を共発現する細胞の割合によって測定される、ｍＤＡ前駆細胞の効率的なパターン形成は、一般に、生産プロセスの終了時にｍＤＡニューロンの高度に濃縮された集団を得るために必要である。１７日目の細胞の大部分がｍＤＡ前駆細胞ではない場合、得られるニューロンは、非中脳表現型ニューロンの大集団を有するか、又は典型的にはニューロンの剥離若しくは障害又は有糸分裂後のニューロンの精製不能をもたらす増殖細胞の増殖を有することになる。
【０１３５】
ｉＣｅｌドーパニューロンプロセスは、１日目から追加が開始される大部分の前駆細胞のパターン形成因子を用いて最適化した。これには、神経化（二重ＳＭＡＤｉ）、ソニックヘッジホッグシグナル伝達（Ｓｈｈ、ＰＭＮ）、及びＷｎｔシグナル伝達（ＣＨＩＲ）のための因子が含まれる。しかしながら、本発明者らは、このアプローチが、単一ＳＭＡＤ阻害を用いた神経化の状況において試験された殆ど全てのｉＰＳＣ株でうまく機能しないことを見出した。多数の最適化実験をいくつかのｉＰＳＣ株で行って、効率的な単一ＳＭＡＤｉ  ｍＤＡ前駆細胞のパターン形成の条件を定義し、全てのパターン形成因子のタイミングと用量を様々にした。図１に示すように、単一ＳＭＡＤｉ  ｍＤＡ前駆細胞のパターン形成が、以前に最適化標準条件（「ＤＵＡＬ／ＳＴＤ」）を用いた二重ＳＭＡＤｉパターン形成と同程度に良好であるという条件（「ＭＯＮＯ／ＡＬＴ」）が見出され、そして、標準的な条件（「ＭＯＮＯ／ＳＴＤ」）を使用すると、パターン形成は、単一ＳＭＡＤｉ  ｍＤＡ前駆細胞のパターン形成よりも著しく効率的であった。代替（ＡＬＴ）法では、ＳＨＨ／プルモルファミンの添加を１日目から２日目にずらした。この改善に利用した変更は、以下を含んでいた：（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト（ＣＨＩＲ）の添加を２日目又は３日目にずらすこと、（ｉｉ）ＣＨＩＲ濃度が最初に添加される時間に依存するため、ＣＨＩＲ濃度を再最適化すること、及び（ｉｉｉ）最適ウィンドウがＣＨＩＲがいつ添加されるかに依存するため、ＰＤ０３が添加されるウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ）を移動させること。最終的な結果は、複数のｉＰＳ細胞株において非常に効率的なｍＤＡ前駆細胞の形成をもたらした一連の狭い条件であった。試験したｉＰＳＣ株の約半数は、単一ＳＭＡＤｉ条件を使用してｍＤＡ前駆細胞を産生させることができた。図２は、最適化パターン形成条件を定義するために使用されたマトリックス最適化実験の例を示す。
【０１３６】
図１に示すように、３つの異なるｉＰＳＣ株由来のｍＤＡ前駆細胞のパターン形成を、プロセスフローの１７日目に、ＦｏｘＡ２を発現する（フローサイトメトリーにより）又はＦｏｘＡ２及びＬｍｘ１を共発現する（ＩＣＣにより）全細胞の割合を測定することにより評価した。ＦｏｘＡ２／Ｌｍｘ１共発現は、ｍＤＡ前駆細胞の最も正確なマーカーである。代替のパターン形成条件の使用により、単一ＳＭＡＤ阻害の状況において効率的なｍＤＡ前駆細胞のパターン形成が可能となり（「単一／代替」）、一方、標準のパターン形成条件は、単一ＳＭＡＤ阻害の状況において不十分なｍＤＡ前駆細胞のパターン形成を有する（「単一／標準」）。比較のために、二重ＳＭＡＤｉ及び標準パターン形成条件（「二重／標準」）を用いた対照の分化を示す。
【０１３７】
図１のデータは、全ての二重標準条件について表１に記載の条件を用いて得られたデータを表す。細胞株Ｃのデータは、単一代替条件については表４に記載の条件、単一標準条件については表３に記載の条件を使用して得た。細胞株Ｄ及びＫは、単一標準及び単一代替について表２及び表５に従った。すなわち、細胞株Ｃからのデータは、ＬＤＮの試験から得られ、他の細胞株は、ドルソモルフィンを用いて試験した。
【０１３８】
単一ＳＭＡＤ阻害を使用して分化に成功することを可能にする代替のパターン形成条件を同定したら（条件１、すなわち表４：代替、２００ｎＭでのＬＤＮ）、ＣＨＩＲの濃度、並びにＳｈｈシグナル伝達、Ｗｎｔシグナル伝達、及びＭＥＫ阻害のための処置ウィンドウ（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｎｄｏｗ）を含む条件のマトリックスを使用して方法を改善した。図２に示すように、以下の条件を、以下の表６に示すように単一ＳＭＡＤ阻害について試験した。表６は、特定の化合物とのインキュベーションの開始日（例えば、「Ｄ２」は２日目のインキュベーションの開始を示す）及び使用したＣＨＩＲ９９０２１の濃度を示す。図２に示すのは、ｉＰＳＣ株Ｋについての１つのマトリックス実験の例である。条件３、５、７、及び９は、１７日目までにＦｏｘＡ２＋／Ｌｍｘ１＋ｍＤＡ前駆細胞の最高の割合をもたらし、ＦｏｘＡ２＋集団は２４日目まで維持された。チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）発現は、未成熟ｍＤＡニューロンでは低い。これらの実験を、１．７５μＭの代わりに１．６５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１を用いて繰り返し、ｍＤＡ前駆細胞の産生について同様の結果が、より低い１．６５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１を用いても得られ得ることが観察された。
【０１３９】
ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（エンドヌクレアーゼ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１００Ｕ／ｍＬの濃度で５日目のインキュベーションに含める変更を行って、これらの単一ＳＭＡＤ実験を繰り返した。５日目のインキュベーションにｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を含めることにより、凝集体形成における過度の凝集が軽減又は防止されることが観察された。
【表７】
2019531062.tif 000026
【０１４０】
実施例３
単一ＳＭＡＤ阻害のための阻害剤の決定
以下のように、様々な阻害剤を、単一ＳＭＡＤｉ法で機能について試験した。ｉＣｅｌｌ  ＤｏｐａＮｅｕｒｏｎｓプロセスは、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤であるＬＤＮ−１９３１８９（ＡＬＫ  １／２／３／６を阻害し、ＳＭＡＤ  １／５／８をブロックする）、及びＴＧＦ−ｂシグナル伝達の阻害剤であるＳＢ−４３１５４２（ＡＬＫ  ４／５／７を阻害し、ＳＭＡＤ  ２／３をブロックする）を用いて神経化を誘導する。合わせて、これは、「二重ＳＭＡＤ阻害」又は「二重ＳＭＡＤｉ」と呼ばれる。ｍＤＡプロセスにおいて単一のＳＭＡＤ阻害剤のみを使用する神経化のための最適条件を定義するために、ＬＤＮ−１９３１８９及びＳＢ−４３１５４２の様々な類似体を、上記の代替のパターン形成条件を使用して複数のｉＰＳ細胞株についてスクリーニングした。図３に示すように、ＬＤＮ−１９３１８９は、異なるｉＰＳＣ株について試験した場合に、最高の割合のｍＤＡ前駆細胞の誘導において全体的に最良の阻害剤であることが観察された。１つのＳＭＡＤ阻害剤を用いて示されたデータでは、ＬＤＮ−１９３１８９、ドルソモルフィン、及びＤＭＨ−１は、１〜１７日目に培地に添加し、ＳＢ４３１５４２は、１〜４日目に培地に２０μＭで添加した。
【０１４１】
ｍＤＡ前駆細胞のパターン形成は、プロセスの１７日に、ＦｏｘＡ２を発現する（フローサイトメトリーにより）又はＦｏｘＡ２及びＬｍｘ１を共発現する（ＩＣＣにより）全細胞の割合を測定することによって評価し、結果を図３に示す。ＦｏｘＡ２／Ｌｍｘ１共発現は、ｍＤＡ前駆細胞の最も正確なマーカーであることが観察された。ＬＤＮ−１９３１８９は、複数のｉＰＳＣ株についてｍＤＡ前駆細胞を神経化するのに最も効率的であることが観察された。示されている全ての単一ＳＭＡＤｉ試験では、代替のパターン形成条件を使用し；標準パターン形成を用いた二重ＳＭＡＤｉ条件を対照として示す。また、ＳＢ−４３１５４２の類似体ＬＹ３６４９４７及びＡ−８３−０１も試験したが、これらはＬＤ−Ｎを上回らなかった。
【０１４２】
実施例４
単一ＳＭＡＤｉにより生成されたドーパミン作動性ニューロンの精製及び特徴付け
ｍＤＡニューロンのインプロセス精製：たとえ効率的なｍＤＡ前駆細胞のパターン形成を用いても、成熟ｍＤＡニューロンが細胞周期を出た後（およそ２５日目）でさえも増殖し続ける細胞の集団が存在する。これらの不要な細胞を除去するために、ｍＤＡニューロンが細胞周期を出た直後に、ＤＮＡ架橋剤マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）を低用量（５０〜５００ｎｇ／ｍＬ）で４日間（２７〜３１日目）添加した。Ｓｉｇｍａ又はＴｏｃｒｉｓから得たＭＭＣを実験に使用した。使用した用量及び期間は、有糸分裂後のｍＤＡニューロンに殆ど又は全く悪影響を及ぼさないが、分裂中の細胞を殺す。このアプローチは、分裂中の細胞に毒性のある様々な化合物を試験し、そして用量、期間、及びＭＭＣ処置の開始日を変更することによって最適化した。はるかに短い時間に与えられたはるかに高いＭＭＣの用量、例えば１時間に５μｇ／ｍＬは、同じ効果（分裂細胞を殺す）を達成することができることにも留意されたい。中間の時間に与えられた中間用量を使用しても、同様の効果を達成することができる。しかしながら、約１００ｎｇ／ｍＬのより低い濃度を４日間にわたって使用し、そして有糸分裂後のニューロンに対する毒性は観察されずに分裂細胞が除去されることが観察された。
【０１４３】
図４Ａに示すように、精製なしで、増殖細胞（ネスティン＋）の有意な集団が３７日目までに増殖し、有糸分裂後のニューロン純度（ＭＡＰ２＋／ネスティン−）が４４％となった（「選択なし」）。ｉＣｅｌｌ  ＤｏｐａＮｅｕｒｏｎｓ産物は、ＭＡＰ２プロモーターによって駆動されるｎｅｏＲ遺伝子を有する遺伝子構築物を利用して、有糸分裂後のニューロンの効率的な選択（「Ｇ４１８薬物選択」）を可能にするが、このアプローチは、典型的には臨床用途には適切ではないであろう。しかしながら、化学療法薬ＭＭＣを使用して有糸分裂後のニューロンを精製し、一貫して＞９０％の最終ニューロン純度が得られた（「化学療法薬選択」）。図４Ｂに示すように、ｍＤＡニューロンの機能は、ドーパミンを分泌する能力によって例示されるようにＭＭＣ選択後も保持され、そして他の試験では、遺伝的に選択された細胞である、広く特徴付けられたｉＣｅｌｌ  ＤｏｐａＮｅｕｒｏｎｓとの違いは明らかにされなかった。重要なことに、長期の解凍後培養の後でさえも、ＭＭＣ選択後に増殖細胞が増殖しない（図４Ｃ）。
【０１４４】
中脳ドーパミン作動性（ｍＤＡ）ニューロンの最終純度及び凍結保存：記載の方法：単一ＳＭＡＤ阻害、代替ｍＤＡ前駆細胞のパターン形成、及びＭＭＣ精製を用いて、複数のｉＰＳＣ株を分化させてプロセスを完了させた。結果を図５に示す。３つのｉＰＳＣ株（Ｃ、Ｋ、及びＨ）が、プロセスの完了（３７日目）までに成功した分化の例として示されている（図５）。ｉＰＳＣ株Ｃ、Ｋ、及びＨは、ｉＰＳＣ株（それぞれ２１５２６．１０１、２１５３４．１０１、及び２１５３１．１０１）である。データは、代替ＬＤＮについては表４、標準二重対照については表１のアプローチを用いて得た。これらの実験では、単一ＳＭＡＤｉ用のＬＤＮ−１９３１８９、及び図２に示す代替のパターン形成のバリエーションの１つを利用した。比較のために、二重ＳＭＡＤｉ及び最適化標準パターン形成を用いたＨ株の分化を示す。各場合において、高レベルのニューロン純度（＞９０％ＭＡＰ２＋／ネスティン−）が観察され、そして本質的に全てのニューロンがＦｏｘＡ２を共発現した。本発明者らは、この段階で大部分のＭＡＰ２＋／ＦｏｘＡ２＋細胞もまたＬｍｘ１を発現し、従ってｍＤＡニューロンであることを観察した。ＤＡニューロンの表現型は、より成熟したＤＡニューロンのマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のニューロンの大部分における発現によって確認された。
【０１４５】
図６に示すように、株Ｋから生成されたｍＤＡニューロンを凍結保存し、解凍後の特徴付けのために解凍した。図６に示すデータは、表６に示されているアプローチを用いて得た。細胞生存率は、融解時に高いことが観察され、そして生細胞の大部分は、ＰＬＯラミニン表面に播種することができた（播種効率、図６）。さらに、解凍後細胞は、解凍の３日後の測定により、ＭＡＰ２＋／ＦｏｘＡ２＋／ＴＨ＋のｍＤＡニューロン表現型を保持している。細胞は、健康な神経突起伸長を示し、そして増殖細胞は存在しないことが観察された。これらの表現型の特徴は、解凍後のｉＣｅｌｌ  ＤｏｐａＮｅｕｒｏｎｓに見られた特徴とよく一致している。
【０１４６】
実施例５
単一ＳＭＡＤｉ分化プロセスの交差ｉＰＳＣ株試験
健康なドナー（ドナーＩＤ  １１３７８及び１１３７９）由来の３つのｉＰＳＣ株及びパーキンソン病患者由来の９つのｉＰＳＣ株（ドナーＩＤ  １１２４９、１１２５０、及び１１２５１）を、最適化単一ＳＭＡＤｉプロセス（図２の「条件９」）を用いて分化させた。全てのｉＰＳＣ株は、プロセスの１７日目までにＤＡ前駆細胞に効率的に変換され、１２株のうちの１１株で＞８０％のＦｏｘＡ２／Ｌｍｘ１が共発現された（図７Ａ）。プロセスの完了（３７日目）までに、全てのｉＰＳＣ株由来の細胞は、高レベルのニューロン純度（＞９０％のＭＡＰ２＋／ネスティン−）、中脳特異化（＞８０  ％ＦｏｘＡ２＋）、及び中脳ドーパミンニューロン成熟（＞４０％のＴＨ＋）を達成した（図７Ｂ）。これらの結果は、パーキンソン病患者由来のｉＰＳＣ株を含む、ｉＰＳＣ株について最適化単一ＳＭＡＤｉ分化プロトコルのロバスト性を実証している。
【０１４７】
実施例６
ＦｏｘＡ２／Ｌｍｘｌ共発現についてのフローサイトメトリーアッセイ
ＦｏｘＡ２／Ｌｍｘ１共発現は、成功したドーパミンニューロン前駆細胞のパターン形成の重要な読み出しであり、従って、免疫細胞化学画像で実行される細胞計数ソフトウェアを用いて得られる結果よりも主観的でなく変動が少ない細胞内フローサイトメトリーアッセイが開発された。このアッセイは、プロセスの１７日目〜２４日目にＦｏｘＡ２及びＬｍｘ１を共発現する細胞の割合を正確に定量することができ、結果は、分析したＩＣＣ画像からのカウントに相関する。細胞が１７日目に＞８０％のＦｏｘＡ２＋／Ｌｍｘ１＋である場合、前駆細胞のパターン形成は成功したと見なされる（図８の上）。準標以下の前駆細胞のパターン形成の例が示され（図８の下）、６０％のＦｏｘＡ２＋／Ｌｍｘ１＋細胞及びＦｏｘＡ２＋／Ｌｍｘ１陰性細胞の有意な集団を伴っている。
【０１４８】
実施例７
ｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンからのドーパミンの放出
ｉＰＳＣ株「Ｋ」を、最適化単一ＳＭＡＤｉプロトコル（「条件９」）を使用してプロセスの完了（３７日目）までに分化させ、そして凍結保存した。細胞を解凍し、高密度（８．８×１０５／ｃｍ２）で播種した。細胞に、ＤＡＰＴを含まない成熟培地を３日ごとに合計１４日間供給した。アッセイの日に、細胞を洗浄し、そしてＨＢＳＳ（５６ｍＭのＫＣｌを含む又は含まない）と共に３０分間インキュベートした。放出溶液中のドーパミン濃度は、競合ドーパミンＥＬＩＳＡキット（Ｅａｇｌｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて決定した。ドーパミンの放出は、ｉＰＳＣ由来前脳ニューロン（ｉＣｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｎｓ）からは検出されなかった。逆に、最適化単一ＳＭＡＤｉプロセス（ＤＡ  Ｔｈｅｒａｐｙニューロン）を使用して誘導されたｉＰＳＣ−ｍＤＡ細胞は、最適化二重ＳＭＡＤプロセス（ｉＣｅｌｌ  ＤｏｐａＮｅｕｒｏｎｓ）を使用して誘導された細胞と少なくとも同量のドーパミンを分泌した。従って、細胞は、成熟ドーパミンニューロンの重要な機能的属性を果たすことができる。結果を図９に示す。
【０１４９】
実施例８
ｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンの電気的活動
凍結保存ｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンを解凍し、そしてＰＥＩ被覆４８ウェル多電極アレイ（ＭＥＡ）プレートに播種した。細胞を、米国特許出願第１４／８３０，１６２号明細書のＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｌ適用プロトコル「Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｍａｅｓｔｒｏ  ｍｕｌｔｉｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ａｒｒａｙ」に従って培養した。最適化単一ＳＭＡＤｉプロトコル「条件９」（ＤＡ  Ｔｈｅｒａｐｙ）を用いて生成したニューロンは、平均発火率（ｍＦＲ）、バースト（ｍａｃｒｏ  ＢＰＭ）、及び接続性（図１０の上のグラフ）を含む、最適化二重ＳＭＡＤｉプロトコル（ｉＣｅｌｌ  Ｄｏｐａ  Ｇ１００）を用いて産生させた細胞と比較して同様の電気活性を示した。平均発火率（ｍＦＲ）、頻度、及び接続性バースト強度は時間と共に増加し、解凍後約１６日までに横ばいになった。Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｒａｓｔｅｒプロットは、きれいなスパイク間の間隔、高いバースト強度、及びウェル内の全ての電極についてのバーストを示し、高度の電気的活動を実証した。結果を図１０に示す。
【０１５０】
実施例９
ｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンの定量的遺伝子発現プロファイル
最適化単一ＳＭＡＤｉプロセス（バッチ１〜４）を使用して誘導された４つのバッチのｉＰＳＣ−ｍＤＡ細胞及びプロセスの３７日目に最適化二重ＳＭＡＤｉプロトコル（ｉＣｅｌｌ  ＤｏｐａＮｅｕｒｏｎｓ）を使用して誘導された１つのバッチのｉＰＳＣ−ｍＤＡ細胞からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの単離後、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙ  ｓｔｅｍｓ）を用いて行い、結果をＧＡＰＤＨ対照に対する相対発現として表した。＜１０−４の値はバックグラウンドと見なされる（影付きボックス）。中脳及びｍＤＡニューロンマーカーの発現は、バッチ間及び異なるプロトコルを用いて産生させた細胞間で同様であった。非中脳領域又は非ｍＤＡ細胞型のマーカーは低く、単一ＳＭＡＤｉ由来細胞と二重ＳＭＡＤｉ由来細胞との間でも同様であった。結果を図１１に示す。
【０１５１】
実施例１０
ｃＧＭＰ適合性試薬への変換
単一ＳＭＡＤｉ  ｉＰＳＣ−ｍＤＡ分化プロトコルを細胞療法のｃＧＭＰ適合性プロセスに変換するためには、動物由来成分を含有する、許容できないレベルのエンドトキシンを含有する、又はそうでなければ治療用のｃＧＭＰ細胞の産生に不適合である複数の試薬を交換することが好ましい又は必要であった。ｉＰＳＣ−ｍＤＡ細胞を、最適化単一ＳＭＡＤｉプロセス（「条件９」）を用いて分化させ、さらに次のゼノフリーｃＧＭＰ適合性試薬を使用した：組換えヒトビトロネクチン、ラミニン、ソニックヘッジホッグ、ＦＧＦ−８、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、及びＴＧＦ−ｂ３；エンドトキシンフリーｄｂｃＡＭＰ。Ｂ２７及びＢ２７（−Ｖｉｔ．Ａ）が、動物成分を含むこのプロセスで使用される唯一の試薬である。標準試薬又はｃＧＭＰ適合試薬を用いて、「条件９」プロセスにより分化させたＫ系統ｉＰＳＣ細胞は、同等の前駆細胞のパターン形成（１７日目）及び３７日目のｍＤＡニューロン純度を有していた。結果を図１２に示す。
【０１５２】
実施例１１
非ヒト霊長類におけるｉＰＳＣ−ＤＡニューロンの生着
ｉＰＳＣ株「Ｋ」を、最適化プロトコル（「条件９」）を使用してプロセスの完了（３７日目）までに分化させ、そして凍結保存した。細胞を解凍し、そしてＭＰＴＰ処理及び免疫抑制したアフリカミドリザル（ｎ＝３）の尾状核及び被殻の両側に移植した（１．５×１０６細胞／注射）。３ヶ月後、ニューロンの生着及び神経支配を冠状切片の組織学によって評価した。ヒト細胞質の染色（ＳＴＥＭ１２１）は、良好なヒト細胞の生着及び全ての動物における神経支配を明らかにする。ドーパミンニューロン（ＴＨ＋）が移植片中に観察され、これらの細胞が、長期間生存し、そして脳内のｍＤＡニューロン標的構造を神経支配する能力を実証している。これらの動物では、腫瘍、神経成長、又は他の有害作用は観察されなかった。結果を図１３に示す。
【０１５３】
実施例１２
ラットパーキンソン病モデル系におけるｉＰＳＣ−ＤＡ前駆細胞及びニューロンの生着
ｉＰＳＣ株「Ｋ」を、最適化単一ＳＭＡＤｉプロトコル（「条件９」）を用いて分化させ、そして分化プロセスの異なる段階（１７日目、２４日目、及び３７日目）で凍結保存した。さらに、最適化二重ＳＭＡＤｉプロトコル（ｉＣｅｌｌ  Ｄｏｐａ）を使用して誘導されたｉＰＳＣ−ｍＤＡ細胞をプロセスの３７日目に凍結保存した。細胞を解凍し、そして６−ＯＨＤＡ処理したが無症状のヌード（ＲＮＵ）ラットの（１群あたりｎ＝３）の線条体（４．５×１０５の細胞／注射）の両側に移植した。３ヶ月後、細胞の生着及び神経支配を、冠状切片の組織学によって評価した。ニューロンの生着及び神経支配は４つの群全てで観察されたが（ヒトＮＣＡＭ染色）、ｉＰＳＣ−ＤＡ前駆細胞（１７日目）及び未成熟ｍＤＡニューロン（２４日目）は、より成熟した単一ＳＭＡＤｉ及び二重ＳＭＡＤｉ由来ｍＤＡニューロン（それぞれ３７日目及び３７日目のｉＣｅｌｌ  Ｄｏｐａ）と比較してはるかに大きい移植片及びより大きい神経支配を有していた。さらに、より多数のＤＡニューロン（ＴＨ＋）が、前駆細胞及び未成熟ＤＡニューロン移植片で観察された。Ｋｉ６７染色では、３７日目の細胞からの移植片では増殖細胞が殆ど示されず、そして１７日目及び２４日目の細胞からの移植片ではＫｉ６７＋細胞が殆ど示されなかった。これらの動物のいずれでも、腫瘍、神経成長、又は他の有害作用が観察されなかった。これらの結果は、最適化単一ＳＭＡＤｉ分化プロセスの早期（１７〜２４日目）に採取された細胞が、より成熟した細胞と比較して、よりよく生着して神経支配できることを示唆している。結果を図１４に示す。
【０１５４】
実施例１３
２μＭのＬＤＮ−１９３１８９を使用した分化の改善
ｉＰＳＣ株「Ｋ」を、標準濃度のＬＤＮ−１９３１８９（２００ｎＭ）、又は１０倍高い濃度（２μＭのＬＤＮ）のいずれかを用いて、単一ＳＭＡＤｉプロトコル「条件７」又は「条件９」（上記の通り）により分化させた。複数の実験（ｎ＝５）において、２μＭのＬＤＮを使用したときに分化の質に改善が見られた。例えば、「条件７」プロトコルに対する２μＭのＬＤＮの改善には、１７日目の前駆細胞におけるより高いＦｏｘＡ２及びＬｍｘ１発現レベル（上部）、並びにプロセス３７日目におけるより高い割合の底板由来ニューロン（ＦｏｘＡ２＋）（底部）が含まれる。これは、恐らくは、高濃度（ＩＣ５０＞５００ｎＭ、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．２００８）でＴＧＦ−β１型（ＡＬＫ４／５／７）受容体シグナル伝達を阻害するＬＤＮの能力により、２μＭのＬＤＮが分化プロセスのロバスト性を改善することを示唆する。結果を図１５に示す。
【０１５５】
本明細書に開示され請求されている全ての方法は、本開示に照らして、過度の実験なしに実施及び実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、当業者には、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱することなく、変更形態を、方法並びに本明細書に記載の方法の工程又は一連の工程に適用できることが明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連するある種の剤を本明細書に記載の剤の代わりに用いることができ、同じ又は同様の結果が達成され得ることは明らかであろう。当業者に明らかなこのような類似の代替物及び変更は全て、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲、及び概念に包含されると見なされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載の手順又は他の詳細を補足する例示的な手順又は他の詳細を提供する限りにおいて、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
米国特許第５，８４３，７８０号明細書
米国特許第６，２００，８０６号明細書
米国特許第６，８３３，２６９号明細書
米国特許第７，０２９，９１３号明細書
米国特許出願公開第２００２／０１６８７６６号明細書
米国特許出願公開第２００３／００２２３６７号明細書
米国特許出願公開第２００３／０２１１６０３号明細書
米国特許出願公開第２００３／００８７９１９号明細書
米国特許出願公開第２００３／０１２５３４４号明細書
米国特許出願公開第２００４／０００２５０７号明細書
米国特許出願公開第２００４／０００２５０８号明細書
米国特許出願公開第２００４／００１４７５５号明細書
米国特許出願公開第２００５／０１９２３０４号明細書
米国特許出願公開第２００５／０２０９２６１号明細書
米国特許出願公開第２００７／０１１６６８０号明細書
米国特許出願公開第２００７／０２３８１７０号明細書
米国特許出願公開第２００８／０１７１３８５号明細書
米国特許出願公開第２０１１／０２２９４４１号明細書
米国特許出願公開第２０１２／０２７６０６３号明細書
米国特許出願公開第２０１５／００１０５１４号明細書
米国特許出願公開第２０１５／０２６５６５２号明細書
米国特許出願公開第２０１６／０１７７２６０号明細書
米国特許出願第１３／０５４，０２２号明細書
米国特許出願第１４／６６４，２４５号明細書
米国特許出願第１４／８３０，１６２号明細書
国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２４４８７号明細書
国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４６７９６号明細書
国際公開第２００９／１４９２３３パンフレット
国際公開第２０１０／１４１８０１パンフレット
国際公開第２０１３／０６７３６２パンフレット
国際特許公開第１９９８／３０６７９号明細書
国際特許公開第２００１／０８８１００号明細書
国際特許公開第２００２／０７６９７６号明細書
国際特許公開第２００３／０５９９１３号明細書
国際特許公開第２００３／０６２２２５号明細書
国際特許公開第２００３／０６２２２７号明細書
国際特許公開第２００４／０３９７９６号明細書
国際特許公開第２００５／０８０５５４号明細書
国際特許公開第２００５／１２３９０２号明細書
国際特許公開第２０１３／０６７３６２号明細書
Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００．
Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（Ｅｄ．），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，２０７−２４６，１９８７．
Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９８７．
Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｓａｔｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５１４−５１７，１９７９．
Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４５０（７１６９）：４９７−５０２，２００７．
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３３：１１０６−１１１７，２００８．
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８：４２４−４２９，２０１１．
Ｃｈｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＳ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｉｄｂｒａｉｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０８（２３）：９７０３−８，２０１１．
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７  ａｎｄ  １９９５．
Ｄｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，３２：８９−９８，２００７．
Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，１９９３．
Ｅｖａｎｓ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１５４，１９８１．
Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３２（２）：２２７−２３６，２００７．
Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３．
Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，１９８７．
Ｇｒｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２５：４５５−４６４，２００７．
Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９３．
Ｈａｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０；３（８）：ｅ３００１，２００８．
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７．
Ｉｓｈｉｚａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５７：９７６−９８３，２０００．
Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３８（２０）：４３６３−７４，Ｏｃｔ．２０１１
Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２．
Ｊａｉｎｃｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４：５４９，１９６９．
Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７：８６２−８６９，１９９５．
Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４１８：５０−５６，２００２．
Ｋｉｒｋｅｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｇｉｏｎａｌｌｙ  Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｕｎｄｅｒ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１（６）：７０３−１４，２０１２．
Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．，３６５：Ｐ１６３６−１６４１，２００５．
Ｋｏｄａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２：８９，１９８２．
Ｋｒｅｎｃｉｋ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ６（１１）：１７１０−１７１７，２０１１．
Ｋｒｅｎｃｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９：５２８−５３４，２０１１．
Ｋｒｉｋｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｏｐａｍｉｎｅ  Ｎｅｕｒｏｎｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｅｎｇｒａｆｔ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ．４８０（７３７８）：５４７−５１，２０１１．
Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４（２）：１８５−１８７，２００６ｂ．
Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３（８）：６３７−４６，２００６ａ．
Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４．
Ｍａｒｔｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：７６３４，１９８１．
Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９３．
Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５２：３１９−３２４，２００３．
Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，７２２，１９９６．
Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１２０：５５−６５，２００７．
Ｐａｒｋｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｄｂｒａｉｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ”  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．，３：６６８，２０１２．
Ｐｅｒｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１（３４）：１２５４３−８，２００４．
Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９８．
Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：３９９−４０４，２０００．
Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，９３：２２５−２３２，２００２．
Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４５（２）：１４２−１５８，２００８．
Ｓｍｉｔｈ，Ｉｎ：Ｏｒｉｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２０００．
Ｓｔｅｒｎｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２８：１７７２−１７８１，２０１０．
Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：１０２９４−１０２９９．，２００６．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ，１２６：６６３−６７６，２００６．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２６（４）：６６３−７６，２００６．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２，２００７．
Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３８：１３３−１６５，１９９８．
Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｄｏｒｉｃｏ，Ｊ．Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：５３Ｂ５７，２０００．
Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．ＵＳＡ，９２：７８４４−７８４８，１９９５．
Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：１１４５，１９９８．
Ｗａｔａｂｅ  ａｎｄ  Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１９：１０３−１１５，２００９．
Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，８：２８８−２９６，２００５．
Ｘｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．３０（８）：１６５５−６３．，２０１２．
Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，３：１９６−２０６．，２００８．
Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９：９７１−９７４，２００１．
Ｙａｋｕｂｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３９４：１８９−１９３，２０１０．
Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１５：２８１−２９２，２００３．
Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２２（８）：１５３０−４３，２０１４．
Ｙｕ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２２（１５）：１９８７−９７，２００８．
Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７−１９２０，２００７．
Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４：１３６３，２００８．
Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２４（５９２８）：７９７−８０１，２００９．
【図１−１】
2019531062.tif 000027
【図１−２】
2019531062.tif 000028
【図２】
2019531062.tif 000029
【図３−１】
2019531062.tif 000030
【図３−２】
2019531062.tif 000031
【図４Ａ】
2019531062.tif 000032
【図４Ｂ】
2019531062.tif 000033
【図４Ｃ】
2019531062.tif 000034
【図５】
2019531062.tif 000035
【図６】
2019531062.tif 000036
【図７Ａ】
2019531062.tif 000037
【図７Ｂ】
2019531062.tif 000038
【図８−１】
2019531062.tif 000039
【図８−２】
2019531062.tif 000040
【図９】
2019531062.tif 000041
【図１０−１】
2019531062.tif 000042
【図１０−２】
2019531062.tif 000043
【図１０−３】
2019531062.tif 000044
【図１１】
2019531062.tif 000045
【図１２−１】
2019531062.tif 000046
【図１２−２】
2019531062.tif 000047
【図１３】
2019531062.tif 000048
【図１４】
2019531062.tif 000049
【図１５】
2019531062.tif 000050
【国際調査報告】
2019531062.tif 000051
2019531062.tif 000052
2019531062.tif 000053