(57)【要約】  治療的有効量のクロモリンまたはクロモリン誘導体化合物を投与することを含む、ニューロン炎症状態、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、虚血性脳卒中およびプリオン病を処置する方法を本明細書中で記載する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューロン炎症状態の処置を必要とする患者において前記ニューロン炎症状態を処置する方法であって、
以下の式：
【化１】
2019524865.tif 000022
を有する化合物のうち少なくとも１つの前記化合物の治療的有効量を前記患者に投与することを含み、
ただし、前記ニューロン炎症状態がＡＤの場合は、前記化合物がクロモリン二ナトリウム、Ｆ−クロモリン二ナトリウム、ＥＴ−クロモリンまたはＦ−ＥＴ−クロモリンではない、方法。
【請求項２】
前記化合物が下記の式：
【化２】
2019524865.tif 000023
2019524865.tif 000024
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ニューロン炎症状態がＡＬＳである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ニューロン炎症状態がＡＤである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ニューロン炎症がハンチントン病である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ニューロン炎症がパーキンソン病である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ニューロン炎症状態が虚血性脳卒中である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ニューロン炎症状態がプリオン病と関連がある、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物がＩＰおよび／またはＩＶを介して投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が経皮投与される、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が吸入により投与される、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が、１日あたり約１ｍｇ〜約１０００ｍｇの用量で投与される、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が１日あたり約１０、約２０、約３０、約５０、約１００または約５００ｍｇの用量で投与される、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＤ４＋；ｓｉＲＮＡ；ＡＬＳを寛解させるｍｉＲＮＡ；グリア形態修飾剤；ＳＯＤ１制御薬；およびリルゾールから選択される第２の化合物を同時投与することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
抗凝固薬およびＡＤに対する標的薬から選択される第２の化合物を同時投与することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ニューロン炎症状態がＡＤであり、ＡＤを寛解させる抗体標的薬から選択される第２の化合物を同時投与することをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ニューロン炎症状態がＡＤであり、ＡＤを寛解させる抗炎症標的薬から選択される第２の化合物を同時投与することをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記ニューロン炎症状態がＡＤであり、ＡＤを寛解させるタウ標的薬から選択される第２の化合物を同時投与することをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
ＡＬＳを寛解させる抗体標的薬から選択される第２の化合物を同時投与することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
ＡＬＳを寛解させる抗炎症標的薬から選択される第２の化合物を同時投与することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
アミロイドーシスまたはタウオパチーに関連する神経変性を寛解させる標的薬から選択される第２の化合物を同時投与することをさらに含む、請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ＰＤを寛解させるαシヌクレイン標的薬およびＰＤを寛解させるパーキンソンの標的薬から選択される第２の化合物を同時投与することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、その全体において本明細書によって参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年８月３１日出願の米国仮特許出願第６２／３８２，１９２号に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、次の式：
【化１】
2019524865.tif 000002
を有する少なくとも１つの化合物を治療的有効量で、ニューロン炎症状態の処置を必要とする患者に投与することを含む、ニューロン炎症状態を処置する方法を包含する。
【背景技術】
【０００３】
単球およびミクログリア活性を調整するためのストラテジー、特にミクログリアが介在する神経毒性から保護し得るストラテジーが研究されてきた。（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４，ｏｎ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ，”Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ２００６，  ９９：１１７６−１１８７；Ｈｅｎｅｋａ  ｅｔ  ａｌ．，“ＮＬＲＰ３  ｉｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ＡＰＰ／ＰＳ１  ｍｉｃｅ，”Ｎａｔｕｒｅ，２０１３，４９３（７４３４）：６７４−８；Ｔｈｅｅｒｉａｕｌｔ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，”Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．，２０１５，７：４１；Ｎａｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ａｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，”Ｆｒｏｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０１４，８：１３８．を参照のこと）全般的に見て、各炎症状態がアルツハイマー病（ＡＤ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患の病態をどのように調整し得るかをより明確にするためには、より集中的な研究が必要であることは明らかである。単球およびミクログリアの早期活性化は、神経変性を悪化させ得る炎症促進性サイトカインの分泌を誘発することなく、単球およびミクログリアの固有の食作用能を増大させるために免疫反応を調整することによって神経変性進行を減速させる可能性がある。
【０００４】
脳内のアミロイド斑および神経原線維変化の存在下での神経炎症反応の役割およびＡＤの病態におけるその関連するニューロン喪失は、十分に確立されており、広く研究されている。Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎｓ，”Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．，２０１５，７：５６；Ｔｈｅｅｒｉａｌｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｗｉｌｃｏｃｋ，ＤＭ，“Ａ  Ｃｈａｎｇｉｎｇ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１２，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４９５２４３；  ＭｃＧｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ，２０１５，１９（４）：４９７−５０６を参照のこと。ミクログリア介在性の炎症がＡＤの進行に寄与すること、およびミクログリア細胞がアミロイド−β（Ａβ）沈着と密接に関連して見出されることが、多数の研究により示されている。（Ｍａｎｄｒｅｋａｒ，  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，”ＣＮＳ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，２０１０，９（２）：１５６−１６７を参照のこと）。
【０００５】
脳に常在するマクロファージであるミクログリアの特性の変化は、それらの微小環境における異なる刺激（例えばサイトカイン）に対するそれらの反応に依存し、その結果、様々な表現型が生じることが知られている。サイトカイン、受容体および他のマーカーの発現の変化に基づいて、単球およびマクロファージの状態は、古典的活性化（Ｍ１）、選択的活性化（Ｍ２ａ）、タイプＩＩ選択的活性化（Ｍ２ｂ）および後天的非活性化（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）（Ｍ２ｃ）として定義されている。（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９，２７：４５１−８３；Ｍａｎｔｏｖａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，”Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００４，２５：６７７−６８６；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，ＥＭ．，“Ｎｅｕｒａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ：ａ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｏｓｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，”Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００６，６（４）：３１８−２８を参照のこと）。最近、多くの研究が、ＡＤ脳におけるこれらの表現型の役割を解明し、これらの細胞がＡＤ関連神経炎症に寄与する機序を決定しようとしている。（Ｍａｎｄｒｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１２；ＭｃＧｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；ａｎｄ  Ｗｉｌｃｏｃｋ，２０１２を参照のこと）。
【０００６】
ミクログリアと原線維Ａβとの相互作用は、それらの表現型活性化につながるが、最近これが神経保護に関与することが示唆された。（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｅｕｒｏｎ−ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ｃｒｏｓｓｔａｌｋ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ＦＧＦ−２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｈｉｃｈ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｖｉａ  ＪＮＫ１／２，”Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，２００８  Ｏｃｔ．，１０７（１）：７３−８５を参照のこと）。マウスおよびヒトの両方において、グリア細胞が、それらの形態学的特徴を変化させ、多数の細胞表面受容体を発現し、病変を取り囲むことにより、ＡＤ病理学的病変（プラークおよびもつれ）の存在に反応することが多くの研究で示されている。（Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ａｎｄ  ｓｅｎｉｌｅ  ｐｌａｑｕｅ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，１１９：１，３２−３６；Ｃｏｍｂｓ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ａ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  β−ａｍｙｌｏｉｄ  ａｎｄ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９９９，１９：３，９２８−９３９を参照のこと）。一方で、ＡＤ脳内の細胞細片に反応したマクロファージおよびミクログリアの活性化および続く炎症促進性サイトカインの放出によって、神経変性が加速される。次に、これによって、より多くの細胞細片が生じ、病気の進行が加速する。（Ｒｕｂｉｏ−Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ：  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１２，７５６３５７；ＭｃＧｅｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．１９９８，３３：５，３７１−３７８；Ａｋｉｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ，２０００，２１（３），３８３−４２１；Ｌｉｕ，  ｅｔ  ａｌ．，“ＴＬＲ２  ｉｓ  ａ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｍｙｌｏｉｄ  β  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｏ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，”Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１２，１８８（３）：１０９８−１０７を参照のこと）。
【０００７】
いくつかの研究は、ミクログリア活性化および、脳内でのアミロイド沈着物減少につながるＡＤ病変の排除におけるその役割に焦点を合わせている。（ＤｉＣａｒｌｏ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｔｒａｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ＬＰＳ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ  ｒｅｄｕｃｅ  Ａβ  ｌｏａｄ  ｉｎ  ＡＰＰ＋ＰＳ１  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ，”Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ，２００１，２２：６，１００７−１０１２；Ｈｅｒｂｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａβ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ＬＰＳ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＡＰＰ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ，”Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２００４，１９０（１）：２４５−５３；Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２を参照のこと）。Ａβ斑を取り囲む常在性ミクログリア細胞が、新たに浸潤したマクロファージまたは単球ほどＡβ分解に有効ではない（Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ，ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｖａｒｎｕｍ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｎ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｒａｉｎ，”Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．  （Ｗａｒｓｚ），２０１２，６０（４）：２５１−６６を参照のこと）一方で、ミクログリアは実際に原線維性および可溶性Ａβを内部に移行させることが可能であるが、これらのペプチドを処理できないことが示されている。（Ｃｈｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｕｐｔａｋｅ，  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４：３２３０１−８を参照のこと）。
【０００８】
さらに、ミクログリアは老化の間にＭ２からＭ１に偏った活性化表現型に切り替わると推論されている。（Ｈｅｎｅｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｖａｒｎｕｍ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｇｒａｔｃｈｅｖ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｐｈｉ１  ａｎｄ  Ｍｐｈｉ２  ｃａｎ  ｂｅ  ｒｅ−ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｂｙ  Ｔｈ２  ｏｒ  Ｔｈ１  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｔｏ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｄａｎｇｅｒ  ｓｉｇｎａｌｓ，”Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，２１１（６−８）：４７３−４８６；Ｃｏｌｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ＡＤ  ａｎｄ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ＡＤ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，２００６，３：２７を参照のこと）。しかし、脳内の免疫反応がＡＤにおいてどのようにして引き起こされるのか、特に神経炎症が老化に関連する全身性炎症によって引き起こされ得るか否かについては、依然として論争の的となっている。（Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ，ｅｔ  ａｌ．，２０１５を参照のこと）。ミクログリアの刺激によって、Ａβをより効果的に分解するためにそれらの固有の食作用能が増強され得ることが示されており；ミクログリア反応を調整するためのいくつかのストラテジーが提案されている。（Ｍａｎｄｒｅｋａｒ，２０１０；Ｋｉｙｏｔａ，ｅｔ  ａｌ．，“ＣＮＳ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ＡＰＰ  ＋ＰＳ１  ｂｉｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ，”ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２０１０，２４：３０９３−３１０２；Ｈｅ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｍｉｃｅ，”Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００７，１７８：８２９−８４１；Ｖａｒｎｕｍ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２を参照のこと）。
【０００９】
ミクログリアは細胞外に沈着したＡβペプチドによって活性化されることが示されている（Ｌｏｔｚ，  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １−４０  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２  ａｎｄ  −４  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｂｕｔ  ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−９−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｕｓｅ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，２００５，９４：２８９−２９８；Ｒｅｅｄ−Ｇｅａｇｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．，“ＣＤ１４  ａｎｄ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ２  ａｎｄ  ４  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  Ａβ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００９，２９：１１９８２−１１９９２）。これは、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、Ｔ細胞由来の腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）または抗原提示細胞の存在に反応したミクログリア活性化と類似している。Ｍ１活性化ミクログリアは活性酸素種を産生し得、その結果、ＴＮＦαおよびインターロイキン（ＩＬ）−１βなどの炎症促進性サイトカインの産生が増加し得る。
【００１０】
ミクログリア細胞のＭ１型反応は、アミロイド負荷量を減少させるが神経原線維変化の病態を悪化させることが示されている。Ｓｈａｆｔｅｌら（Ｓｈａｆｔｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ＩＬ−１β  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｐｌａｑｕｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００７，１１７（６）：１５９５−６０４）は、ＩＬ−１β発現が、ＡＤにおける有益な神経炎症反応の根底にあり得、ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスの海馬におけるＩＬ−１β過剰発現の結果、アミロイド負荷量が減少することを示した。著者らは、ＩＬ−１βが介在するミクログリアの活性化がアミロイド沈着の減少に対する機序であることを示唆する。さらに、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＮＦ−ＲＩ／ＲＩＩ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｉｃｅ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａｎ  ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐａｎ−ＴＮＦ−α  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ，”Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０１１，１７９（４）：２０５３−７０）は、インタクトなＴＮＦ受容体シグナル伝達が細胞外アミロイド−ペプチドのミクログリア介在性取り込みに重要であることを示した。Ｍ１炎症表現型は、多くの研究においてアミロイド病態を改善するように見える一方、タウトランスジェニックマウスまたは細胞培養におけるＭ１表現型の誘導の結果、タウ病態が悪化する。（Ｋｉｔａｚａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ  ｔａｕ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｂｙ  ａ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ５−  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００５，２８；２５（３９）：８８４３−５３．；Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ｏｎ  ｔａｕ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｎ  ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｐ３８−ＭＡＰＫ  ｐａｔｈｗａｙ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００３，１；２３（５）：１６０５−１１を参照のこと）。
【００１１】
マクロファージＭ２活性化は、抗炎症作用および細胞外マトリクスの再編成に寄与することが知られているメディエーターと関連がある（Ｚｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｃｉｄｉｃ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｈｉｔｉｎａｓｅ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａｔｉｃ  Ｔｈ２  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＩＬ−１３  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０４（５６７７）：１６７８−８２；Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｗｉｌｃｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。Ｍ２ａ表現型を有するミクログリアは、食作用が向上しており、インスリン様増殖因子−１などの増殖因子およびＩＬ−１０などの抗炎症性サイトカインを産生する。ＩＬ−４および／またはＩＬ−１３によるマクロファージの刺激の結果、創傷治癒マクロファージと呼ばれることがあるＭ２ａ状態となり（Ｅｄｗａｒｄｓ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ，”Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．，２００６，８０（６）：１２９８−３０７）、これは一般的に、炎症促進性サイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦおよびＩＬ−６）の産生が少ないことを特徴とする。Ｍ２ａ反応は主にアレルギー反応、細胞外マトリクス沈着およびリモデリングにおいて観察される。
【００１２】
Ｍ２ｂマクロファージは、それらが、Ｍ１活性化の特徴である、高レベルの炎症促進性サイトカインを発現するが、高レベルの抗炎症性サイトカインＩＬ−１０も発現するという点で独特である。（Ｍｏｓｅｒ  ＤＭ．，“Ｔｈｅ  ｍａｎｙ  ｆａｃｅｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．，２００３，７３（２）：２０９−１２を参照のこと）。
【００１３】
最後に、Ｍ２ｃマクロファージ状態はＩＬ−１０によって刺激され、これは制御性マクロファージと呼ばれることがある。Ｍ２ｃマクロファージは、古典的な炎症促進性反応なく、細胞細片の食作用に寄与する抗炎症活性を有する（Ｍｏｓｅｒ  ＤＭ．，２００３を参照のこと）。これらの細胞はＴＧＦβおよび高ＩＬ−１０ならびにマトリクスタンパク質を発現する。（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，”Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００４，２５：６７７−６８６；Ｗｉｌｃｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２を参照のこと）。Ｐｌｕｎｋｅｔｔら（Ｐｌｕｎｋｅｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０（ＩＬ−１０）ｏｎ  ｐａｉｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ，”Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２００１；１６８：１４４−１５４）は、ＩＬ−１０が、グリア活性化および炎症促進性サイトカイン産生の減少を含む抗炎症反応に介在することを報告した。
【００１４】
しかし、Ｍ２ミクログリア活性化の機序およびそれがＡＤおよび斑の病態で果たす役割は依然としてよく分かっていない。（Ｍａｎｄｒｅｋａｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０を参照のこと）。さらに、いくつかの研究から、疾患進行に反応してミクログリア活性化状態の切り替えがあることが示唆された（Ｃｏｌｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｊｉｍｅｎｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ｏｆ  ＰＳ１Ｍ１４６Ｌ／  ＡＰＰ７５１ＳＬ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｆｒｏｍ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ｃｌａｓｓｉｃ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００８，２８：１１６５０−１１６６１）。ミクログリア活性化表現型が疾患進行中にＭ２からＭ１に切り替わることが動物実験で報告されており（Ｊｉｍｅｎｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｎｏｌａｎ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００５；２８０：９３５４−９３６２；Ｍａｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−４−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎ  ＬＴＰ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｇｅｄ  ｒａｔ，”Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，２００５，２６：７１７−７２８）、このことから、年齢とともに選択的表現型よりも古典的活性化表現型が増加することが示唆される。細胞外に沈着したＡβによって活性化されたミクログリアが、抗炎症性／神経栄養性Ｍ２活性化を誘発することによって、および食作用を介してＡβを除去することによってニューロンを保護することは、概ね意見が一致している。これは新しい治療標的に対する道筋となる可能性がある。（Ｈｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｐｌａｑｕｅ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｅｔａ−  ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｗｅｄｉｓｈ  ｍｕｔａｎｔ  ＡＰＰ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ，”Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２００７，１７０：６８０−６９２；Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００８，１８１：３８７７−３８８６を参照のこと）。
【００１５】
Ｍａｎｔｏｖａｎｉら（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００４）は、Ｍ２ａミクログリア活性化の重要な修飾因子としてのＩＬ−４の効果を研究した。ＡＰＰ＋ＰＳ１マウスへのＩＬ−４の遺伝子送達によって、海馬におけるグリア蓄積が一部抑制され、神経発生が直接増強され、空間学習障害が回復し、またＡβ沈着も減少したことが示された（Ｋｉｙｏｔａ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００１６】
Ｙａｍａｍｏｔｏら（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，２００７，２００８）は、初代培養ヒト単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）およびミクログリアにおいて炎症促進性および抗炎症性サイトカインを用いてマクロファージ介在性Ａβ分解を調べた。これらの研究は、抗炎症性および制御性サイトカインがＭ２ａまたはＭ２ｃ活性化の上昇およびＡβ排除促進につながることを示した。Ｋｉｙｏｔａら（Ｋｉｙｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）は、ＩＬ−４の持続的発現により、アストロ／ミクログリオーシス、アミロイド−βペプチド（Ａβ）のオリゴマー化および沈着が減少し、神経新生が促進されることを示した。
【００１７】
ミクログリア活性化を調整するためのいくつかのアプローチが、ＡＤ処置に対する標的となる可能性があるものとして提案されている。（Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ，  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｃｈｅｒｒｙ，  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍ２  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ：  ｔｈｅ  ｇｏｏｄ，ｔｈｅ  ｂａｄ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｅｄ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，２０１４，１１：９８；Ｍａｎｄｒｅｋａｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｖｅｒｎｕｍ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２を参照のこと）。非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）のような抗炎症薬を使用してＡＤの進行を止めることは、内在性分子による炎症促進性および抗炎症性活性化の両方を抑制し得、Ｍ２ミクログリア機能および斑排除の内因性機序の有益な効果を不活性化し得ることが示唆されている。（Ｗｉｌｃｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃｈｅｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｔｈｅｅｒｉａｕｌｔ，ｅｔ  ａｌ．，２０１５を参照のこと）。
【００１８】
研究は主に２つの分野：炎症促進性サイトカインの毒性作用を和らげるための抗炎症薬；および、このＭ１状態から、毒性効果が低下し、Ａβに対するそれらの食作用活性が促進されるＭ２状態へのミクログリアの変換に焦点を当てている。疾患進行の早い時期に可能性のある処置を行うべきであることが示唆された（ＭｃＧｒｅｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【００１９】
単球およびミクログリア活性を調整するストラテジー、特にミクログリア介在性の神経毒性から保護し得るストラテジーが研究されてきた（Ｚｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｈｅｎｅｋａ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｔｈｅｒｌａｕｔ，ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｎａｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。全体として、各炎症状態がどのようにしてＡＤの病態を調整し得るかをより明確に確立するために、より集中的な研究を実施する必要があることは明らかである。単球およびミクログリアの早期活性化が、ＡＤを悪化させ得る炎症促進性サイトカインの分泌を誘発することなく、単球およびミクログリアの固有の食作用能を増大させるために免疫反応を調整することによってＡＤ進行を減速させる可能性があることは、一般的に受け入れられている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
ある一定の実施形態において、本発明は、以下の式：
【化２】
2019524865.tif 000003
を有する少なくとも１つの化合物を治療的有効量で、ニューロン炎症状態の処置を必要とする患者に投与することを含む、ニューロン炎症状態を処置する方法を包含する。
【００２１】
他の実施形態において、本方法は以下の化合物を使用する：
【化３】
2019524865.tif 000004
2019524865.tif 000005
【００２２】
また他の実施形態において、ニューロン炎症状態は、ＡＬＳ、ＡＤ、虚血性脳卒中またはプリオン病のうち少なくとも１つである。一実施形態において、本化合物を腹腔内（ＩＰ）および／または静脈内（ＩＶ）投与し得る。本化合物は、１日あたり約１ｍｇ〜約１０００ｍｇの用量で投与し得る。投与方法は、経皮的なものまたは吸入によるものであり得る。
【００２３】
別の実施形態において、本方法は、ＣＤ４＋；ｓｉＲＮＡ；ＡＬＳを寛解させるｍｉＲＮＡ；グリア形態修飾剤；ＳＯＤ１制御薬；リルゾール；または神経炎症を制御する、別のＭ１；Ｍ２変換活性薬を同時投与することをさらに含む、ＡＬＳ処置方法である。
【００２４】
ある一定の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載の方法の何れかに関するが、ただし本化合物はクロモリン二ナトリウムではない。ある一定の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載の方法の何れかに関するが、ただし、ニューロン炎症状態がＡＤである場合、本化合物がクロモリン二ナトリウム、Ｆ−クロモリン二ナトリウム、ＥＴ−クロモリンまたはＦ−ＥＴ−クロモリンではないものとする。
【００２５】
ある一定の実施形態において、本発明は次の化合物の何れか１つに関する：
【化４】
2019524865.tif 000006
2019524865.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａは、ＰＢＳまたは漸増用量のクロモリンナトリウムでの処置の１週間後のＡβｘ−４０およびＡβｘ−４２の血漿レベルの定量を示す（ｎ＝マウス３〜５匹／群）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、７日間毎日クロモリンナトリウム（３．１５ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳで処置したマウスにおけるアミロイド沈着物（６Ｅ１０）およびミクログリア（Ｉｂａ１）の局在化の代表的画像を示す。棒グラフは、各動物に対する斑の分析からの結果を示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図１Ｃ】図１Ｃは、インビトロでのミクログリアＡβ取り込みに対するクロモリンナトリウムの効果を示し、温置後にＡβＥＬＩＳＡを用いて培地中のＡβｘ−４０（図１Ｃ左）、Ａβｘ−４２（図１Ｃ右）の濃度を測定した。
【図２】図２は、実施例２の研究のＴｇ−２５７６マウスにおける斑およびそれらの沈着物を取り囲むミクログリア細胞を示す。この図は、アミロイド沈着物およびＩｂａ−１陽性ミクログリアの代表的な写真を示す。
【図３】図３は、クロモリンで処理したＢＶ２ミクログリア細胞の結果を示し、クロモリンおよびイブプロフェンで、ビヒクルで処理したＢＶ２ミクログリアと比較してＡβ４２取り込みレベルが上昇したことを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、本明細書中に記載の様々な化合物を用いたＡβ凝集阻害アッセイの結果を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本明細書中に記載の様々な化合物を用いたＡβ凝集阻害アッセイの結果を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、本明細書中に記載の様々な化合物を用いたＡβ凝集阻害アッセイの結果を示す。
【図５】図５は、クロモリンが脳のＴＢＳ可溶性ＡβのレベルおよびＡβ（４２：４０）の比率に有意に影響を及ぼすことを示す。
【図６Ａ−Ｄ】図６Ａは、ＤＭＳＯ（対照）で１６時間処理したナイーブＢＶ２ミクログリア細胞を示す。その後、細胞を蛍光標識したＡβ４２およびＤＭＳＯまたはクロモリンナトリウムとともに２時間温置した。温置後、細胞を原形質膜色素（ＰＭ）で標識し、画像化した。図６Ｂは、ＤＭＳＯ（対照）で１６時間処理したナイーブＢＶ２ミクログリア細胞を示す。その後、細胞を蛍光標識したＡβ４２およびＤＭＳＯまたはクロモリンナトリウムとともに２時間温置した。図６Ｃは、クロモリンナトリウム（５００μＭ）で１６時間処理したナイーブＢＶ２ミクログリア細胞を示す。その後、細胞を蛍光標識したＡβ４２およびＤＭＳＯまたはクロモリンナトリウムとともに２時間温置した。温置後、細胞を原形質膜色素（ＰＭ）で標識し、画像化した。図６Ｄは、クロモリンナトリウム（５００μＭ）で１６時間処理したナイーブＢＶ２ミクログリア細胞を示す。その後、細胞を蛍光標識したＡβ４２およびＤＭＳＯまたはクロモリンナトリウムとともに２時間温置した。
【図７Ａ】図７Ａは、クロモリンナトリウムがミクログリアのＡβ４２取り込みを促進することをグラフで示す。ＢＶ２ミクログリア細胞をＤＭＳＯまたは様々な濃度のクロモリンナトリウムで１６時間処理した。次に、細胞を可溶性のタグなしＡβ４２およびＤＭＳＯまたはクロモリンナトリウムとともに２時間温置し、ＥＬＩＳＡ分析のために回収した。クロモリンナトリウムで処理したナイーブＢＶ２およびＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴミクログリア細胞は両方とも、ビヒクル（ＤＭＳＯ）で処理した細胞と比較してＡβ４２取り込みレベルの上昇を示した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、クロモリンナトリウムがミクログリアのＡβ４２取り込みを促進することをグラフで示す。ＣＤ３３を安定的に発現するＢＶ２細胞（ＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴ）をＤＭＳＯまたは様々な濃度のクロモリンナトリウムで１６時間処理した。次に、細胞を可溶性のタグなしＡβ４２およびＤＭＳＯまたはクロモリンナトリウムとともに２時間温置し、ＥＬＩＳＡ分析のために回収した。クロモリンナトリウムで処理したナイーブＢＶ２およびＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴミクログリア細胞は両方とも、ビヒクル（ＤＭＳＯ）で処理した細胞と比較してＡβ４２取り込みレベルの上昇を示した。
【図８】図８は、ＬＤＨアッセイにおいて１００μＭ以上の濃度で試験した場合に化合物Ｃ８が毒性を示すことをグラフで示す。ナイーブＢＶ２ミクログリア細胞をＤＭＳＯまたはクロモリン誘導体で様々な濃度で３時間処理した。Ｃ１、Ｃ２、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７およびＣ８を１０、５０、１００および１５０μＭで試験し、一方でＣ３およびＣ４は、ＤＭＳＯ中の溶解度限界により５、２５、５０および７５μＭで評価した。その後、細胞を可溶性のタグなしＡβ４２ペプチドおよびＤＭＳＯまたはクロモリン誘導体とともに２時間温置した。処理終了時に、細胞培地を回収し、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイで化合物毒性を評価した。クロモリン誘導体Ｃ８で処理したＢＶ２ミクログリア細胞は、ビヒクル（ＤＭＳＯ）で処理した細胞と比較して１００および１５０μＭで毒性上昇を示した。
【図９】図９は、化合物Ｃ４がナイーブＢＶ２ミクログリア細胞におけるＡβ４２取り込みを促進することをグラフで示す。ＤＭＳＯ（ビヒクル）または５〜１５０μＭの範囲の様々な濃度のクロモリン誘導体でＢＶ２細胞を３時間処理した。次に、細胞を可溶性のタグなしＡβ４２およびＤＭＳＯまたはクロモリン誘導体とともにさらに２時間温置し、ＥＬＩＳＡ分析のために回収した。７５μＭのクロモリン誘導体Ｃ４で処理したＢＶ２ミクログリア細胞は、ビヒクルで処理した細胞と比較して有意に高いＡβ４２取り込みレベルを示した。
【図１０】図１０は、化合物Ｃ４がミクログリアＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴ細胞においてＡβ４２取り込みを促進することをグラフで示す。ＣＤ３３ＷＴを安定して発現するミクログリア細胞を、対照としてのＤＭＳＯ、または様々な濃度のクロモリン誘導体（Ｃ１、Ｃ３−８）で３時間処理した。その後、細胞をＡβ４２ペプチドの存在下でＤＭＳＯまたはクロモリン誘導体とともにさらに２時間温置した。Ａβ４２特異的ＥＬＩＳＡキットを用いて、Ａβ４２の細胞内レベルについて細胞溶解物を分析した。７５μＭのクロモリン誘導体Ｃ４での処理により、ＤＭＳＯ処理と比較して、ＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴ細胞におけるＡβ４２の取り込みが増加し、５０μＭで用量依存的効果を示した。
【図１１】図１１は、化合物Ｃ４がＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴ細胞においてＡβ４２取り込みを促進することをグラフで示す。ＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴ細胞をＤＭＳＯ（ビヒクル）または様々な濃度のクロモリン誘導体（Ｃ１、Ｃ２およびＣ４−７）で３時間処理した。その後、細胞をＤＭＳＯまたはクロモリン誘導体および可溶性Ａβ４２ペプチドで２時間処理した。Ａβ４２特異的ＥＬＩＳＡキットを用いて細胞溶解物を分析し、細胞内Ａβ４２レベルを定量した。クロモリン誘導体Ｃ４は、ＤＭＳＯで処理した細胞と比較して、ＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴ細胞において５０および７５μＭでＡβ４２取り込みを効果的に誘導した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
虚血性脳卒中、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリック病）、プリオンおよび他の神経変性障害は、ミクログリア活性化および肥満細胞遊走と、ならびに単球および毒性サイトカインの連発を生じさせる他の細胞タイプおよび炎症を促進する細片と関連がある。一定の実施形態において、本発明は、炎症促進性Ｍ１状態から、毒性効果が低下し、アミロイドーシス、タウオパチーおよび他の細胞毒性事象に対するそれらの食作用活性が促進されるＭ２状態にミクログリアを変換させることによって、炎症促進性サイトカインの毒性効果を低下させるための抗炎症性化合物を包含する。ある一定の実施形態において、本発明はまた、疾患過程の早期に治療に影響を与えるための化合物の使用も包含する。
【００２８】
抗炎症薬として使用される多くの薬物は、Ｍ１からＭ２へのミクログリアの変換に有効性を示さず、またそれらはＭ１からＭ２へのミクログリアの調整も促進しない。出願人の知る限りでは、本明細書に記載の化合物は、Ｍ１からＭ２活性を示す唯一の有効な非サイトカイン（例えばＩＬ−１０）化合物である。したがって、ある一定の実施形態において、本発明は、治療的有効量の少なくとも１つの本化合物を投与することによってニューロン炎症状態を処置する化合物および方法を包含する。
【００２９】
ある一定の実施形態において、本発明の化合物は、以下の式を有するものおよびそれらの類似体および異性体を含む：
【化５】
2019524865.tif 000008
【００３０】
さらに、Ｘは、ハロゲン化物およびＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ８アルキル）を含み得るが限定されない。アルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルおよびペンチルが挙げられるが限定されない。ハロゲン化物としては、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードが挙げられる。Ｙは、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＯＡｃまたは−ＣＨ２ＯＭｅを含み得るが限定されない。好ましくは、本発明の化合物は５位で結合したそれらの化合物を含む。
【００３１】
本発明の範囲を有する具体的な化合物としては次のものが挙げられる：
【化６】
2019524865.tif 000009
2019524865.tif 000010
【００３２】
ある一定の実施形態において、化合物はまた、５−［３−（２−カルボキシ−４−オキソクロメン−５−イル）オキシ−２−ヒドロキシプロポキシ］−４−オキソクロメン−２−カルボン酸誘導体および異性体形態も含む。
【００３３】
ある一定の実施形態において、本発明は、様々なニューロン炎症状態を処置する方法を包含する。ニューロン炎症状態としては、ＡＬＳ、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、虚血性脳卒中およびプリオン病などの疾患が挙げられるが限定されない。ある一定の実施形態において、本化合物はＡＬＳを処置するために使用され得、疾患の進行を減速または停止させることを含むが限定されない。ある一定の実施形態において、本化合物を他の抗炎症剤と組み合わせて投与して、ＡＬＳの進行性で致命的な影響の広がりを制御し得る。
【００３４】
ある一定の実施形態において、本発明は、ＣＤ４＋、ｓｉＲＮＡ、ＡＬＳを寛解させるｍｉＲＮＡ、グリア形態修飾剤、ＳＯＤ１制御薬またはＡＬＳに対する唯一の承認薬であるリルゾールなどの他の免疫標的治療との、上記の式における薬物などの神経炎症を制御するＭ１、Ｍ２変換活性薬物のＡＬＳに対する併用処置を包含する。
【００３５】
他の実施形態において、本化合物は、脳幹および／または脊髄に位置するニューロン、ニューロン、または身体の随意筋に影響を与える運動ニューロンに対するニューロン損傷を減速または停止させる。
【００３６】
ある一定の実施形態において、本化合物は、薬物の投与のための既知の方法、例えばＩＰ、ＩＶ、経皮的、吸入による投与を用いて投与し得る。ある一定の実施形態において、本発明は、ＡＤ、虚血性脳卒中、ＡＬＳまたはプリオンなどの神経疾患の侵襲性の進行を処置するかまたは減速させる方法に関し、本化合物は点滴または腹腔内投与によって投与される。
【００３７】
ある一定の実施形態において、本発明はまた、薬学的に許容可能な担体とともに本明細書中に記載の１つ以上の化合物を含む医薬組成物も提供する。好ましくは、これらの組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、滅菌非経口液剤または懸濁液、定量エアゾール剤または液体スプレー剤、滴剤、アンプル剤、自動注入装置または坐剤などの単位剤型で；経口、非経口、鼻腔内、舌下または直腸投与のため、または吸入もしくは吹送による投与のためのものである。本化合物は、適切な量の薬物を連続的に送達するように設計された経皮パッチに組み込まれ得ることも想定される。
【００３８】
散剤および錠剤などの固体組成物を調製するために、主な活性成分を薬学的に許容可能な担体、例えば従来の錠剤化成分、例えばコーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガムなど、および他の薬学的希釈剤、例えば水と混合して、均一な混合物を含有する固体予備処方組成物を形成させる。これらの予備処方組成物を均一という場合、活性成分が本組成物全体に均一に分散されているので、本組成物を等しく有効な単位剤型に容易に細分し得る。
【００３９】
いくつかの実施形態において、乾燥粉末組成物は、肺への吸入のために微粉化される。例えば、その全体において参照により本明細書中に明示的に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／０２６３２５７号明細書を、特にその中に記載される乾燥粉末クロモリン処方物に関して、参照のこと。他の実施形態において、乾燥粉末組成物は少なくとも１つの賦形剤をさらに含む。ある一定の実施形態において、少なくとも１つの賦形剤は、ラクトース一水和物および／またはステアリン酸マグネシウムを含む。
【００４０】
ある一定の実施形態において、本化合物は特定の適応症を処置する用量で投与され得る。特に、用量は、薬物がＭ１からＭ２への修飾因子として作用することを可能にする血中、脳およびＣＳＦ濃度をもたらすように具体的に調整される。このような用量は、１日あたり約１ｍｇ〜約１０００ｍｇを含み得る。
【００４１】
活性剤の投与量は、一般的に、化合物の薬力学的特徴、化合物の投与方式および経路、処置されている患者の健康状態、所望される処置の程度、あれば併用療法の性質および種類および処置頻度および所望される効果の性質を含む多くの要因に依存する。一般に、本化合物の投与量範囲は、１日あたり約０．００１〜約２５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であることが多い。体重が約７０ｋｇの正常な成人の場合、投与量は約０．１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。しかし、処置されている対象の年齢および体重、意図される投与経路、投与されている特定の薬剤などに依存して、この一般的な投与量範囲における幾分かの変動が必要とされ得る。重要なこととして、特定の哺乳動物についての投与量範囲および最適投与量の決定もまた、十分に、本開示の恩恵を受ける当業者の能力の範囲内である。
【００４２】
化合物に対する投与量は、５ｎｇ／ｄ程度に低いものであり得る。ある一定の実施形態において、約１０ｎｇ／日、約１５ｎｇ／日、約２０ｎｇ／日、約２５ｎｇ／日、約３０ｎｇ／日、約３５ｎｇ／日、約４０ｎｇ／日、約４５ｎｇ／日、約５０ｎｇ／日、約６０ｎｇ／日、約７０ｎｇ／日、約８０ｎｇ／日、約９０ｎｇ／日、約１００ｎｇ／日、約２００ｎｇ／日、約３００ｎｇ／日、約４００ｎｇ／日、約５００ｎｇ／日、約６００ｎｇ／日、約７００ｎｇ／日、約８００ｎｇ／日、約９００ｎｇ／日、約１μｇ／日、約２μｇ／日、約３μｇ／日、約４μｇ／日、約５μｇ／日、約１０μｇ／日、約１５μｇ／日、約２０μｇ／日、約３０μｇ／日、約４０μｇ／日、約５０μｇ／日、約６０μｇ／日、約７０μｇ／日、約８０μｇ／日、約９０μｇ／日、約１００μｇ／日、約２００μｇ／日、約３００μｇ／日、約４００μｇ／日、約５００μｇ／日、約６００μｇ／日、約７００μｇ／日、約８００μｇ／日、約９００μｇ／日、約１ｍｇ／日、約２ｍｇ／日、約３ｍｇ／日、約４ｍｇ／日、約５ｍｇ／日、約１０ｍｇ／日、約１５ｍｇ／日、約２０ｍｇ／日、約３０ｍｇ／日、約４０ｍｇ／日または約５０ｍｇ／日の化合物が投与される。
【００４３】
活性剤に対する投与量範囲は、５ｎｇ／ｄ〜１００ｍｇ／日であり得る。ある一定の実施形態において、活性剤に対する投与量範囲は、約５ｎｇ／日〜約１０ｎｇ／日、約１５ｎｇ／日、約２０ｎｇ／日、約２５ｎｇ／日、約３０ｎｇ／日、約３５ｎｇ、約４０ｎｇ／日、約４５ｎｇ／日、約５０ｎｇ／日、約６０ｎｇ／日、約７０ｎｇ／日、約８０ｎｇ／日、約９０ｎｇ／日、約１００ｎｇ／日、約２００ｎｇ／日、約３００ｎｇ／日、約４００ｎｇ／日、約５００ｎｇ／日、約６００ｎｇ／日、約７００ｎｇ／日、約８００ｎｇ／日または約９００ｎｇ／日であり得る。ある一定の実施形態において、化合物に対する投与量範囲は、約１μｇ／日〜約２μｇ／日、約３μｇ／日、約４μｇ／日、約５μｇ／日、約１０μｇ／日、約１５μｇ／日、約２０μｇ／日、約３０μｇ／日、約４０μｇ／日、約５０μｇ／日、約６０μｇ／日、約７０μｇ／日、約８０μｇ／日、約９０μｇ／日、１００μｇ／日、約２００μｇ／日、約３００μｇ／日、約４００μｇ／日、約５００μｇ／日、約６００μｇ／日、約７００μｇ／日、約８００μｇ／日または約９００μｇ／日であり得る。ある一定の実施形態において、活性剤に対する投与量範囲は、約１ｍｇ／日〜約２ｍｇ／日、約３ｍｇ／日、約４ｍｇ／日、約５ｍｇ／日、約１０ｍｇ／日、約１５ｍｇ／日、約２０ｍｇ／日、約３０ｍｇ／日、約４０ｍｇ／日、約５０ｍｇ／日、約６０ｍｇ／日、約７０ｍｇ／日、約８０ｍｇ／日、約９０ｍｇ／日、約１００ｍｇ／日、約２００ｍｇ／日、約３００ｍｇ／日、約４００ｍｇ／日、約５００ｍｇ／日、約６００ｍｇ／日、約７００ｍｇ／日、約８００ｍｇ／日または約９００ｍｇ／日であり得る。
【００４４】
ある一定の実施形態において、本化合物は、ｐＭまたはｎＭ濃度で投与される。ある一定の実施形態において、本化合物は、約１ｐＭ、約２ｐＭ、約３ｐＭ、約４ｐＭ、約５ｐＭ、約６ｐＭ、約７ｐＭ、約８ｐＭ、約９ｐＭ、約１０ｐＭ、約２０ｐＭ、約３０ｐＭ、約４０ｐＭ、約５０ｐＭ、約６０ｐＭ、約７０ｐＭ、約８０ｐＭ、約９０ｐＭ、約１００ｐＭ、約２００ｐＭ、約３００ｐＭ、約４００ｐＭ、約５００ｐＭ、約６００ｐＭ、約７００ｐＭ、約８００ｐＭ、約９００ｐＭ、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、約９ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約３００ｎＭ、約４００ｎＭ、約５００ｎＭ、約６００ｎＭ、約７００ｎＭ、約８００ｎＭまたは約９００ｎＭの濃度で投与される。
【００４５】
ある一定の実施形態において、剤型は固体剤型であり、この剤型の化合物の大きさは重要である。ある一定の実施形態において、本化合物は、直径が約３μｍ未満、約２μｍ未満または約１μｍ未満である。ある一定の実施形態において、活性剤は、直径約０．１μｍ〜約３．０μｍである。ある一定の実施形態において、活性剤は、直径約０．５μｍ〜約１．５μｍである。ある一定の実施形態において、活性剤は、直径約０．２μｍ、約０．３μｍ、約０．４μｍ、約０．５μｍ、約０．６μｍ、約０．７μｍ、約０．８μｍ、約０．９μｍ、約１．０μｍ、約１．１μｍ、約１．２μｍ、約１．３μｍ、約１．４μｍまたは約１．５μｍである。
【００４６】
例えば、ヒトへの経口投与を意図した処方物は、組成物全体の約５％〜約９５％まで変動する適切で都合の良い担体材料と混ぜ合わせて約０．１ｍｇ〜約５ｇの活性剤（または化合物）を含有し得る。単位投与量は一般的に約０．５ｍｇ〜約１５００ｍｇの活性剤を含有する。投与量は、約１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、２１ｍｇ、２２ｍｇ、２３ｍｇ、２４ｍｇ、２５ｍｇ、２６ｍｇ、２７ｍｇ、２８ｍｇ、２９ｍｇ、３０ｍｇ、３１ｍｇ、３２ｍｇ、３３ｍｇ、３４ｍｇ、３５ｍｇ、３６ｍｇ、３７ｍｇ、３８ｍｇ、３９ｍｇ、４０ｍｇ、４１ｍｇ、４２ｍｇ、４３ｍｇ、４４ｍｇ、４５ｍｇ、４６ｍｇ、４７ｍｇ、４８ｍｇ、４９ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、６５ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、８５ｍｇ、９０ｍｇ、９５ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇまたは１００ｍｇなど、最大約１５００ｍｇの化合物であり得る。
【００４７】
ある一定の実施形態において、本発明は２つの活性剤の組み合わせに関する。ある一定の実施形態において、医薬の組み合わせが、第２の成分と比較して比較的大量の第１の成分からなることが有利であり得る。ある一定の例において、第１の活性剤の第２の活性剤に対する比率は、約２００：１、１９０：１、１８０：１、１７０：１、１６０：１、１５０：１、１４０：１、１３０：１、１２０：１、１１０：１、１００：１、９０：１、８０：１、７０：１、６０：１、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１５：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１または５：１である。さらに、より均等な医薬品の分布を有することが好ましいものであり得る。ある一定の例において、第１の活性剤の第２の活性剤に対する比率は、約４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３または１：４である。医薬の組み合わせが第１の成分と比較して比較的大量の第２の成分を有することも有利であり得る。ある一定の例において、第２の活性剤の第１の活性剤に対する比率は、約２００：１、１９０：１、１８０：１、１７０：１、１６０：１、１５０：１、１４０：１、１３０：１、１２０：１、１１０：１、１００：１、９０：１、８０：１、７０：１、６０：１、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１５：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１または５：１である。第１の治療薬および第２の治療薬の上記の同定された組み合わせの何れかを含む組成物は、１日あたり約１、２、３、４、５、６回またはそれ以上、分割用量で投与し得るか、または所望の結果を達成するのに有効な放出速度をもたらす形態で投与し得る。剤型は、第１および第２の活性剤の両方を含有し得る。剤型は、それが第１および第２の活性剤の両方を含有する場合、１日に１回投与し得る。
【００４８】
例えば、ヒトへの経口投与を意図した処方物は、約０．１ｍｇ〜約５ｇの第１の治療薬および約０．１ｇ〜約５ｇの第２の治療薬を含有し得、これらの両者とも、組成物全体の約５％〜約９５％まで変動する担体材料の適切で都合の良い量（ａｂｏｕｔ）とともに混ぜ合わせられる。単位投与量は、一般的に、約０．５ｍｇ〜約１５００ｍｇの第１の治療薬および０．５ｍｇ〜１５００ｍｇの第２の治療薬を含有する。投与量は、約２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇまたは１００ｍｇなど、最大約１５００ｍｇの第１の治療薬であり得る。投与量は、約２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇまたは１００ｍｇなど、最大約１５００ｍｇの第２の治療薬であり得る。
【００４９】
ある一定の実施形態において、本発明は、アルツハイマー病の処置を必要とする患者に、１日あたり約１ｍｇ〜１００ｍｇのクロモリン二ナトリウムを含む微粉化した乾燥粉末を吸入により投与することを含む、アルツハイマー病を処置する方法に関する。
【実施例】
【００５０】
実施例１
ＰＳ１／ＰＳＳ動物モデルにおける発明者らの研究から、クロモリンナトリウムがミクログリア細胞とアミロイド沈着物との相互作用に影響を及ぼし、最終的にミクログリアによるＡβ排除に影響を及ぼしたことが示された。発明者らは、最初に、ＰＢＳまたは最大用量のクロモリンナトリウム（３．１５ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスの脳切片において、ＡβとミクログリアマーカーＩｂａ１との間の二重免疫染色を行った。両染色間の重複の系統的解析から、クロモリンナトリウムを与えられた動物がアミロイドと重複するより高いパーセンテージのＩｂａ１免疫反応性を示したことが明らかになり（図１Ｂ）、このことから、本化合物により誘導される斑の周囲のミクログリアの動員が穏やかに増加することが示され得る。
【００５１】
発明者らのこれらの機序の理解をさらに深めるために、およびミクログリア機能変化の評価がインビボでは困難であることを考慮して、発明者らはＡβミクログリア取り込みのさらなるインビトロ系を使用した。合成Ａβ４０およびＡβ４２ペプチドをクロモリンナトリウムの存在下または非存在下で培養中のミクログリアに適用した。
【００５２】
１６時間の温置後、発明者らは、クロモリンナトリウムの存在下で用量依存的なＡβ４０およびＡβ４２レベルの低下を観察し、このことから、Ａβ凝集機序に対するクロモリンナトリウムの影響により、ミクログリア取り込みによるＡβ排除が促進され得ることが示される（図１Ｃ）。これらのインビボおよびインビトロの結果の組み合わせから、Ａβ線維形成を阻害することに加えて、クロモリンナトリウムがミクログリア活性化およびＡβ排除に影響を及ぼしたことが示唆され得る。
【００５３】
クロモリンナトリウムは血漿中のＡβレベルに影響を与えないが、ミクログリアＡβ排除を促進する。図１Ａは、ＰＢＳまたは漸増用量のクロモリンナトリウム（ｎ＝マウス３〜５匹／群）での処置の１週間後のＡβｘ−４０およびＡβｘ−４２の血漿レベルの定量を示す。図１Ｂは、７日間毎日クロモリンナトリウム（３．１５ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳで処置したマウスにおけるアミロイド沈着物（６Ｅ１０）およびミクログリア（Ｉｂａ１）の局在化の代表的画像を示す。Ｉｂａ１陽性突起によって占有されるアミロイドのパーセンテージを各沈着物について計算し、クロモリンナトリウムでの処理後にＡβとＩｂａ１との間の重複増加が示された（ＰＢＳについてはｎ＝３匹のマウス、クロモリンナトリウムについてはｎ＝５匹のマウス）。各動物について２０〜２０個の斑を評価した。スケールバー＝１０μｍ。図１Ｃは、インビトロでのミクログリアＡβ取り込みに対するクロモリンナトリウムの効果を示す。ミクログリア細胞を培養し、５０ｎＭの合成Ａβ４０またはＡβ４２および０、１０ｎＭ、１０μＭまたは１ｍＭのクロモリンナトリウムとともに１６時間温置した。温置後、ＡβＥＬＩＳＡを使用して培地中のＡβｘ−４０（図１Ｃ左）、Ａβｘ−４２（図１Ｃ右）の濃度を測定し、ミクログリア細胞数を用いて、ＰＢＳ対照条件に従って正規化した。（ｎ＝３回の実験；＊、Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１）
【００５４】
実施例２
ミクログリア活性化およびＭ１、Ｍ２変換の他の動物試験において、クロモリンが、多くの被験薬物のうち、この変化をもたらし、食作用活性を示した唯一のものであることが示された。図２は、本研究のＴｇ−２５７６マウスにおける全ての斑のうち代表的な斑およびそれらの沈着物を取り囲むミクログリア細胞を示す。斑を取り囲むＩｂａ−１シグナルの総量に対するアミロイド染色と共局在するＩｂａ−１陽性突起のパーセンテージに着目した画像解析から、クロモリンナトリウムでマウスを処置した場合、他の何れの群とも対照的に、より多くのＩｂａ−１／アミロイド共局在があることが示された。この結果は、実施例１における発明者らの結果および発明者らのインビトロデータと相関する。
【００５５】
イブプロフェンではなくクロモリンがミクログリアＡβ４２取り込みを促進し、それらの組み合わせによって、イブプロフェンまたはクロモリン単独の何れよりも取り込みが改善した。ＢＶ２ミクログリア細胞培養物をクロモリンおよび／またはイブプロフェン（１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ）で１６時間処理した。その後、細胞を可溶性Ａβ４２および本化合物とともに３時間温置した。温置後、細胞をＥＬＩＳＡ分析のために回収した。クロモリン（１００μＭ、１ｍＭ）およびクロモリンおよびイブプロフェン（各化合物に対して１００μＭ、１ｍＭ）で処理したＢＶ２ミクログリア細胞は、ビヒクルで処理したＢＶ２ミクログリアと比較して、Ａβ４２取り込みレベル上昇を示す。結果は３つの独立した実験に由来した；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元ＡＮＯＶＡ、テューキー検定）。データは、平均±ＳＥＭとして表す。図３は、クロモリンで処理したＢＶ２ミクログリア細胞の結果をグラフで示し、クロモリンおよびイブプロフェンは、ビヒクルで処理したＢＶ２ミクログリアと比較してＡβ４２取り込みレベルの上昇を示す。
【００５６】
実施例３：化合物合成
５，５’−［（２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジイル）ビス（オキシ）］ビス［４−オキソ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−カルボン酸ジエチルエステル
【化７】
2019524865.tif 000011
ＥｔＯＨ（１００ｍＬ）および濃ＨＣｌ（１ｍＬ）中のクロモリンナトリウム塩（１．０ｇ、２ｍｍｏｌ）の懸濁液を１００℃で２４時間密閉反応管中で加熱した。白色固形物を溶解させ、熱いうちに無色透明の溶液を得た。それを室温まで冷まし、ＮａＨＣＯ３（１．０ｇ）を添加した。２５℃で３０分間撹拌した後、溶媒を回転蒸発により除去した。５：９５メタノール／塩化メチレンを使用する粗製物質のシリカゲル上でのクロマトグラフィーによりジエチルエステル（０．８ｇ、７６％収率）が得られた；ｍｐ１５４〜１５６℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）δ１．４２（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，ＣＨ３），２．７３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＯＨ），４．４４（ｑ，４Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２ＯＣＨ２ＣＨ３），４．３２−４．５９（ｍ，５Ｈ，ＣＨＯＨ，２ＯＣＨ２），６．８０（ｓ，２Ｈ，２ビニル−Ｈ），６．９９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２４Ｈｚ，２Ａｒｏ−Ｈ），７．１２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２４Ｈｚ，２Ａｒｏ−Ｈ），７．１７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２４Ｈｚ，２Ａｒｏ−Ｈ），７．７１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．２４  ２Ａｒｏ−Ｈ）。
【００５７】
５，５’−［（２−フルオロ−１，３−プロパンジイル）ビス（オキシ）］ビス［４−オキソ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−カルボン酸ジエチルエステル
【化８】
2019524865.tif 000012
３−ビス（４−メチルベンゼンスルホネート）−２−フルオロプロパンジオール
０〜５℃の塩化メチレン（２０ｍＬ）中の１，３−ビス（４−メチルベンゼンスルホネートプロパントリオール（２．７ｇ、６．７８ｍｍｏｌ）の溶液をＤＡＳＴ（２．１８ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を０〜５℃で３０分間撹拌し、次いで２５℃に温め、１６時間撹拌した。混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液（３０ｍＬ）に注ぎ入れ、層を分離させた。塩化メチレン層を乾燥させた（硫酸ナトリウム）。溶媒を除去した後、粗製物質をシリカゲル上でのクロマトグラフィー（塩化メチレン）にかけ、０．８２ｇ（３０％）の固形物を得た；ｍｐ９９−１０２℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ２．５（ｓ，６Ｈ，ＣＨ３），４．１５（ｄｄ，４Ｈ，Ｊ＝１２．３，４．６Ｈｚ，ＣＨ２，４．８（ｄｑ，１Ｈ，Ｊ＝４７，４．６，ＣＨＦ），７．４５（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，Ａｒｏ−Ｈ），７．７５（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ａｒｏ−Ｈ）．
【００５８】
５，５’−（２−フルオロプロパン−１，３−ジイル）ビス（オキシ）ビス（４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−カルボン酸）
【化９】
2019524865.tif 000013
１，３−ビス（２−アセチル−３−ヒドロキシフェノキシ）−２−フルオロプロパン
アセトニトリル（４０ｍＬ）中の３−ビス（４−メチルベンゼンスルホネート）−２−フルオロプロパンジオール（１．０、２．５ｍｍｏｌ）、２，６−ジヒドロキシアセトフェノン（０．７６ｇ、５．０ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（０．６９ｇ）の混合物を還流下で１６時間加熱した。混合物をろ過し、ろ液を蒸発させた。粗製物質をシリカゲル上でのクロマトグラフィー（アセトニトリル／塩化メチレン５：９５）にかけて、０．５７ｇ（４０％）の生成物を得た；ｍｐ１６２−１６５℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ），δ２．５（ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３），４．３８（ｍ，４Ｈ，２ＣＨ２），５．２２（ｂｒ  ｄ  １Ｈ，Ｊ＝４９Ｈｚ，ＣＨＦ），６．４５（ｍ，４Ｈ，４Ａｒｏ−Ｈ），７．２８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．５５Ｈｚ，２Ａｒｏ−Ｈ）．
【００５９】
５，５’−［（２−フルオロ−１，３−プロパンジイル）ビス（オキシ）］ビス［４−オキソ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−カルボン酸ジエチルエステル
【化１０】
2019524865.tif 000014
エタノール（１０ｍＬ）およびベンゼン（１０ｍＬ）中のナトリウムエトキシド（８７ｍｇ  Ｎａ）の溶液に、１，３−ビス（２−アセチル−３−ヒドロキシフェノキシ）−２−フルオロプロパン（２００ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）およびシュウ酸エチル（２ｍＬ）の混合物を添加した。混合物を１６時間還流温度で加熱し、冷却し、エーテル（５０ｍＬ）で希釈した。沈殿したナトリウム塩をろ過し、エーテルで洗浄し、乾燥させた。次に、それを水中で溶解させ、１０％ＨＣｌで酸性化して粘着性の固形物を得た。その固形物を、触媒量の３６％ＨＣｌとともにエタノール（２０ｍＬ）中で１時間還流させた。混合物を５０ｍＬの水中に注ぎ入れ、塩化メチレン（５０ｍＬ）で２回抽出した。抽出物を合わせ、乾燥させた。溶媒除去後、粗製物質をシリカゲル上でのクロマトグラフィー（アセトニトリル／塩化メチレン１０：９０）にかけて、０．１２ｇ（４５％）の生成物を得た；ｍｐ１６６〜１７０℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ１．４２（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝７．１４Ｈｚ，２ＣＨ３），４．５８（ｑ，４Ｈ，Ｊ＝７．１４Ｈｚ  ２ＣＨ２），４．６５（ｍ，４Ｈ，２ＣＨ２），５．３５（ｄｑ，１Ｈ，Ｊ＝４６Ｈｚ，Ｊ＝４．４ＨＺ，ＣＨＦ），６．９０（ｓ，２Ｈ，ビニル−Ｈ），６．９５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２４Ｈｚ，２Ａｒｏ−Ｈ），７．１３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２４Ｈｚ，２Ａｒｏ−Ｈ），７．１７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２４Ｈｚ，２Ａｒｏ−Ｈ）７．６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．２４  ２Ａｒｏ−Ｈ）．
【００６０】
５，５’−［（２−フルオロ−１，３−プロパンジイル）ビス（オキシ）］ビス［４−オキソ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−カルボン酸
【化１１】
2019524865.tif 000015
メタノール（２０ｍＬ）および１Ｍ水酸化ナトリウム（２ｍＬ）中の５，５’−［（２−フルオロ−１，３−プロパンジイル）ビス（オキシ）］ビス［４−オキソ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−カルボン酸ジエチルエステル（１００ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の懸濁液を８０℃で１時間加熱した。溶液を１０％ＨＣｌで酸性化し、揮発物を除去した。メタノール／塩化メチレン（５０：５０）の溶液を固形物に添加し、混合物をろ過した。蒸発により７６ｍｇ（８５％）の生成物を得た；１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ），δ４．６５（ｍ，４Ｈ，２ＣＨ２），５．３２（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４６Ｈｚ，ＣＨＦ），６．８０（ｓ，２Ｈ，２ビニル−Ｈ），７．２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２４Ｈｚ，２Ａｒｏ−Ｈ），７．７１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．２４  ２Ａｒｏ−Ｈ）．
【００６１】
５，５’−［（２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジイル）ビス（オキシ）］ビス［４−オキソ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−エタノール
【化１２】
2019524865.tif 000016
メタノール（６０ｍＬ）および塩化メチレン（４０ｍＬ）中の５，５’−（２−ヒドロキシトリメチレンジオキシ）ビス（４−オキソクロメン−２−カルボン酸）ジエチルエステル（１．０ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ＮａＢＨ４（０．１４ｇ、３．７２ｍｍｏｌ）を１時間かけてを少量ずつ添加した。混合物を透明になるまで（約５時間）２５℃で撹拌し、その時点で、酸性になるまで１Ｍ  ＨＣｌを滴下することにより溶液を不活性化した。溶媒を蒸発させ、残渣を塩化メチレンで抽出した。合わせた有機抽出物を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。蒸発後、残渣をカラムクロマトグラフィー（５：９５メタノール／塩化メチレン）により精製して０．５ｇ（５０％）のトリオールを得た；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）δ２．７３（ｓ，３Ｈ，ＯＨ），４．２５−４．３６（ｍ，９Ｈ，２ＯＣＨ２，ＣＨ−Ｏ），６．１３（ｓ，２Ｈ，２ビニルＨ），７．０４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，芳香族Ｈ），７．０７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，芳香族Ｈ），７．６３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，芳香族Ｈ）．
【００６２】
５，５’−［（２−フルオロ−１，３−プロパンジイル）ビス（オキシ）］ビス［４−オキソ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−エタノール
【化１３】
2019524865.tif 000017
５，５’−（２−ヒドロキシトリメチレンジオキシ）ビス（４−オキソクロメン−２−エタノール）に対する上記手順を使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）δ２．７３（ｓ，３Ｈ，ＯＨ），４．２５−４．３６（ｍ，８Ｈ，２ＯＣＨ２，ＣＨ−Ｏ），５．３５（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４６Ｈｚ，ＣＨＦ），６．１３（ｓ，２Ｈ，２ビニルＨ），７．０４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，芳香族Ｈ），７．０７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，芳香族Ｈ），７．６３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，芳香族Ｈ）．
【００６３】
５，５’−［（２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジイル）ビス（オキシ）］ビス［４−オキソ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−カルボン酸ビス［（２，２−ジメチル−１−オキソプロポキシ）メチル］エステル
【化１４】
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２０ｍＬのＤＭＦ中のクロモリン二酸（１．０ｇ、２．７ｍｍ）の撹拌溶液に、ジイソプロピルアミン（０．７ｍＬ）および１．０ｇ（６．５ｍｍｏｌ）のクロロメチルピバレートを添加した。反応混合物を６０℃で４時間撹拌し、水を添加し、混合物を抽出し、分離し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を真空下で除去した。溶媒を除去し、残渣を塩化メチレン中のシリカ４％メタノール上でクロマトグラフィーにかけて、１．２ｇ（６５％）のピバレート化合物を得た；ｍｐ１３５〜１４０℃；Ｈ１  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ），δ１．２４（ｓ，１８Ｈ，ＣＨ３），４．３６（ｍ，２Ｈ，ＯＣＨ２），４．４９（ｍ，１Ｈ，ＣＨＯＨ），４．５１（ｍ，２Ｈ，ＯＣＨ２），），６．００（ｓ，４Ｈ，ＣＨ−Ｏ−ＣＯ），６．９８（ｍ，４Ｈ，２ビニル−Ｈ，２Ａｒｏ−Ｈ），７．１３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２４Ｈｚ，２Ａｒｏ−Ｈ），７．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．２４  ２Ａｒｏ−Ｈ）．
【００６４】
５，５’−［（２−フルオロ−１，３−プロパンジイル）ビス（オキシ）］ビス［４−オキソ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−カルボン酸ビス［（２，２−ジメチル−１−オキソプロポキシ）メチル］エステル
【化１５】
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２０ｍＬのＤＭＦ中の５，５’−［（２−フルオロ−１，３−プロパンジイル）ビス（オキシ）］ビス［４−オキソ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−カルボン酸（１．０ｇ、２．１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、イイソプロピルアミン（ｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）（０．７ｍＬ）および１．０ｇ（６．５ｍｍｏｌ）のクロロメチルピバレートを添加した。反応混合物を６０℃で４時間撹拌し、水を添加し、混合物を抽出し、分離し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を真空下で除去した。溶媒を除去し、残渣を塩化メチレン中の２％メタノールを使用してシリカ上でクロマトグラフィーにかけて、１．０ｇ（７０％）のピバレート化合物を得た；ｍｐ１３０−１３３℃；δ１．２１（ｓ，１８Ｈ，ＣＨ３），４．３６（ｍ，４ｍ，２ＯＣＨ２），４．４９（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４６Ｈｚ，ＣＨＦ），６．００（ｓ，４Ｈ，ＣＨ−Ｏ−ＣＯ），６．９８（ｍ，４Ｈ，２ビニル−Ｈ，２Ａｒｏ−Ｈ），７．１３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２４Ｈｚ，２Ａｒｏ−Ｈ），７．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．２４  ２Ａｒｏ−Ｈ）．
【００６５】
５，５’−［（２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジイル）ビス（オキシ）］ビス［４−オキソ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−エタノールのトリアセテート
【化１６】
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０〜５℃に冷却したピリジン（２０ｍＬ）中の５，５’−［（２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジイル）ビス（オキシ）］ビス［４−オキソ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−エタノール（０．５ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）の混合物に無水酢酸（０．５ｇ、４．６ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。混合物を０〜５℃で３時間撹拌し、次いで室温に温めた。ＴＬＣは反応が完了したことを示した。塩化メチレンを添加し、水相が酸性になるまで混合物を１０％ＨＣｌで洗浄した。塩化メチレン層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を蒸発させた。塩化メチレン中３％メタノールを用いるシリカ上のクロマトグラフィーにより０．４５ｇ（７２％）のトリアセテート化合物を得た；ｍｐ１２２−１２５℃；Ｈ１  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），δ２．１６（ｓ，９Ｈ，ＣＨ３），４．５８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＯＨ），４．６６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＯＨ），４．９４（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２ＯＨ），５．６６（ｍ，１Ｈ，ＣＨＯＨ），６．１５（ｓ，２Ｈ，２ビニル−Ｈ），６．９４（ｄ，２Ｈ，２Ａｒｏ−Ｈ），６．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２４Ｈｚ，２Ａｒｏ−Ｈ），７．５２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．２４，２Ａｒｏ−Ｈ）．
【００６６】
実施例４：Ａβ凝集阻害アッセイ
実験計画。３ヶ月齢のＴｇ２５７６マウスを２ヶ月間順応させ、次いで異なる処置群に無作為に割り当てた。それらには、ビヒクル処置による対照群（ｎ＝１０）、クロモリン低用量群およびクロモリン高用量群が含まれた。この処置は、０．１ｍＬ／３０ｇ体重に基づいて、週に３回、さらに３ヶ月間、ＰＢＳでのＩＰ注射を通じて行った。全マウスを８ヶ月齢で屠殺した。組織を採取し、死後分析のために処理した。
【００６７】
最終５μＭの合成Ａａβ４２を１０、１００、１，０００ｎＭの試験化合物とともに１時間温置した。最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬのヘパリンを用いて凝集を開始させた。アッセイ緩衝液は、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２５ｍＭ  Ｎａ２Ｈ２ＰＯ４、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２５ｍＭグルコースおよびｐＨを７．４に調整するためのＮａＨＣＯ３から構成された。アッセイ緩衝液を対照として使用した。チオフラビンＴ結合の強度によって凝集を測定し、これを動的モードで４５０ｎｍ／４８０ｎｍの蛍光励起／発光（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｍ３プレートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって検出した。プレートリーダーのソフトウェアによりＶｍａｘとして速度を計算したときに、凝集を記録した。アッセイは３回行い、標準平均±ＳＤとして表した。青い点線はアッセイ緩衝液対照を示す。図４はアッセイの結果を示す。
【００６８】
実施例５
クロモリンは、脳のＴＢＳ可溶性ＡβのレベルおよびＡβ（４２：４０）比率に顕著に影響を及ぼした。Ａ−Ｂ．ＭＳＤ（Ａβ４２、４０および３８を測定するためのメススケール（ｍｅｓｓ  ｓｃａｌｅ））Ａβ分析を脳ＴＢＳ可溶性試料に適用した。様々な処置群を比較してＡβレベルおよびＡβ（４２：４０）比率の差異を分析した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）、テューキー検定；平均±ＳＥＭから、低用量および高用量についてのクロモリンおよびイブプロフェンの組み合わせは、Ａβ４２／４０の相対レベルを高め、斑形成に関与しないＡβ３８を高めることが示される。図５は、ＡβレベルおよびＡβ（４２：４０）比率の差異の一元（ｏｎｅ−ｗａｙ）の結果をグラフで示す。
【００６９】
実施例６−ミクログリア細胞におけるＡβ４２取り込みに対するクロモリンナトリウムの効果
共焦点顕微鏡およびＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ミクログリア細胞におけるＡβ４２取り込みに対するクロモリンおよびその誘導体化合物の効果を評価した。外部から添加されたＡβ４２を効率的に取り込み、分解することが以前に見出されたＢＶ２ミクログリア細胞株を使用した（Ｊｉａｎｇ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎｅｕｒｏｎ  ５８，６８１−６９３；Ｍａｎｄｒｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２９，４２５２−４２６２）。本化合物をナイーブＢＶ２ミクログリア細胞において試験して、それらがＡβ取り込みを調整するか否かを調べた。完全長ヒトＣＤ３３を安定的に発現するＢＶ２細胞（ＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴ）における化合物の効果を評価して、それらがＡβ取り込みのＣＤ３３介在性阻害を逆転させるか否かを調べた（Ｇｒｉｃｉｕｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  Ｎｅｕｒｏｎ  ７８，６３１−６４３）。
【００７０】
保存溶液の化合物番号、分子量および濃度を表１でまとめる。クロモリン誘導体、Ｃ３およびＣ４は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７およびＣ８と比較してＤＭＳＯ中での溶解度がより低いことが示された。したがって、Ｃ３およびＣ４を除く全化合物について２５ｍＭの保存溶液を調製した。Ｃ３およびＣ４に対する保存溶液は、それぞれ５ｍＭおよび７．５ｍＭで調製した。Ｃ１は親化合物−クロモリン二ナトリウムである。
【００７１】
【表１】
2019524865.tif 000021
【００７２】
ミクログリア細胞におけるＡβ４２取り込みに対するクロモリンナトリウムの効果を調べるために、ナイーブＢＶ２細胞をＤＭＳＯ（対照）または５００μＭのクロモリンで１６時間処理した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、蛍光タグ付加Ａβ４２ペプチド（４００ｎＭ、赤）の存在下でＤＭＳＯまたはクロモリンで２時間処理した。処理の終了時に、細胞を洗浄し、それらを原形質膜色素（緑色）で標識した。共焦点顕微鏡および赤色チャンネルにおける蛍光シグナルを用いて、細胞内Ａβ４２ペプチドのレベルを定量した。定量化は全て、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて盲検の観察者が行った。注目すべきことに、クロモリンナトリウムは、ナイーブＢＶ２ミクログリア細胞においてＡβ４２の取り込み増加をもたらした（図６Ａ〜図６Ｄ）。
【００７３】
さらに、ＥＬＩＳＡアッセイを使用することによって、クロモリンナトリウムがナイーブＢＶ２ミクログリア細胞におけるＡβ４２取り込みを調整するか否かを決定した。さらに、クロモリンナトリウムが、完全長ヒトＣＤ３３を安定的に発現するＢＶ２細胞（ＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴ）においてＡβ４２取り込みレベル上昇をもたらすか否かを決定した。この目的のために、ナイーブＢＶ２細胞株およびＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴ細胞株の両方を、ＤＭＳＯ（対照）または様々な濃度のクロモリンで１６時間処理した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＤＭＳＯまたはクロモリンおよび可溶性のタグなしＡβ４２ペプチド（４００ｎＭ）で２時間処理した。ＷａｋｏからのＡβ４２特異的ＥＬＩＳＡキットを用いて、Ａβ４２取り込みレベルについて回収した細胞溶解物を分析した。ＢＣＡアッセイを用いて以前に定量されたタンパク質濃度レベルに対してＥＬＩＳＡの結果を正規化した。
【００７４】
クロモリンナトリウムは、ナイーブＢＶ２ミクログリア細胞において１００μＭおよび１ｍＭでＡβ４２取り込みの増加をもたらし（図７Ａ）、したがってＥＬＩＳＡアッセイによる免疫蛍光の結果が確認された。クロモリンナトリウムはまた、ＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴ細胞において１０μＭおよび５００μＭで内部移行Ａβ４２レベル上昇ももたらし（図７Ｂ、ＥＬＩＳＡアッセイ）、ミクログリア細胞におけるＡβ４２取り込みのＣＤ３３介在性阻害を逆転させた。結論として、クロモリンナトリウムでの処理は、ナイーブＢＶ２およびＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴ細胞株におけるＡβ４２取り込みレベルの調整において用量依存的効果を示した。
【００７５】
実施例７−ミクログリア細胞におけるＡβ４２取り込みに対するクロモリン誘導体の効果
ミクログリアにおけるＡβ４２取り込みに対するクロモリン誘導体の効果を調べるために、ナイーブＢＶ２細胞またはＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴ細胞を増殖培地に播種した。翌日、増殖培地中で３時間、ＤＭＳＯ（対照）または様々な濃度の化合物で細胞を処理した。Ｃ１、Ｃ２、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７およびＣ８を１０、５０、１００および１５０μＭで試験し、一方でＣ３およびＣ４は、ＤＭＳＯ中の溶解度限界により５、２５、５０および７５μＭで評価した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ培地中、タグなしのＡβ４２ペプチド（４００ｎＭ）の存在下でＤＭＳＯまたは化合物で２時間処理した。化合物の毒性は、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイによって処理終了時に回収した培地中で評価した。プレート中の残留細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を補給したＲＩＰＡ緩衝液で溶解させた。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて溶解物上清中のタンパク質濃度を決定し、ＷａｋｏからのＡβ４２ＥＬＩＳＡキットを用いてＡβ４２取り込みについて各溶解物からの２〜３μｇ／ウェルの総タンパク質を分析した。毒性化合物濃度はさらなる研究から除外した。
【００７６】
クロモリン誘導体がより高用量で細胞傷害性を誘導するか否かを調べるために、ナイーブＢＶ２ミクログリア細胞をＤＭＳＯ（ビヒクル）または様々な濃度のクロモリン誘導体とともに３時間温置した。次いで細胞を洗浄し、ＤＭＳＯまたは化合物および可溶性のタグなしＡβ４２とさらに２時間温置した。その後、細胞培地を回収し、損傷細胞によって放出されたＬＤＨを測定して、細胞溶解を誘導する化合物を同定した。ＬＤＨアッセイから、クロモリン誘導体Ｃ８が１００および１５０μＭで試験した場合に毒性を示す唯一の化合物であることが示された（図８）。したがって、Ｃ８に対する１００および１５０μＭ濃度をＡβ４２取り込みアッセイから除外した。
【００７７】
実施例８−クロモリン誘導体による、ミクログリア細胞におけるＡβ４２取り込みの調整
クロモリン誘導体がＡβ４２の取り込みを調整するか否かを試験するために、ナイーブＢＶ２ミクログリア細胞をＤＭＳＯ（対照）または様々な濃度のクロモリン誘導体化合物で３時間処理した。その後、細胞を洗浄し、タグなしＡβ４２の存在下でＤＭＳＯまたは化合物で２時間処理した。処理終了時に、細胞溶解物を回収した。Ａβ４２特異的ＥＬＩＳＡキットを用いて、細胞内Ａβ４２レベルについての分析を行った。親化合物Ｃ１（クロモリンナトリウム）は、ＢＶ２細胞において１００および１５０μＭでＡβ４２取り込みの中程度の増加をもたらした。他のクロモリン誘導体とともに受領したＣ１アリコートは、（クロモリン誘導体なしで）初めて発明者らに送られたＣ１アリコートよりもＤＭＳＯ中での溶解度が低かった。興味深いことに、化合物Ｃ６はＢＶ２ミクログリア細胞においてＡβ４２取り込みの強力な阻害をもたらした。注目すべきことに、クロモリン誘導体Ｃ４は、ナイーブＢＶ２ミクログリア細胞において７５μＭでＡβ４２ペプチドの取り込み増加をもたらした（図９）。
【００７８】
さらに、２組の独立した実験によって、クロモリン誘導体がＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴ細胞におけるＡβ４２の取り込みおよび排除に影響を与えるか否かを決定した。ＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴ細胞をＤＭＳＯ（対照）または５〜１５０μＭの範囲の様々な濃度のクロモリン誘導体で処理した。
【００７９】
第１組の実験において、クロモリン誘導体Ｃ１およびＣ３〜８を試験した。第２組の実験において、他のクロモリン誘導体とともに化合物Ｃ２を試験した。７５μＭの化合物Ｃ４での処理の結果、ＤＭＳＯ処理と比較してＡβ４２取り込みが２倍増加し、５０μＭで用量依存的効果を示した（図１０）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７ソフトウェアを使用したところ、Ｃ４に対するＩＣ５０は、ＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴ細胞において５４．７μＭであった。化合物Ｃ６は、ＤＭＳＯ処理と比較した場合に、ＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴ細胞におけるＡβ４２取り込みの阻害への介在において用量依存的効果を示す。
【００８０】
第２組の実験では、ＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴ細胞におけるクロモリン誘導体Ｃ１、Ｃ２およびＣ４〜７を試験した。これらの結果により、化合物Ｃ４が７５μＭでＡβ４２取り込みを増加させるのに最も効果的であり、ＤＭＳＯ処理と比較した場合、より低濃度で用量依存的効果を示したという以前の結果が確認された（図１１）。したがって、これらの結果から、化合物Ｃ４がＢＶ２−ＣＤ３３ＷＴ細胞におけるＡβ４２取り込みレベルの増加をもたらし、Ａβ取り込みおよび排除のＣＤ３３介在性阻害を逆転させたことが示唆される（図１０および１１）。
【００８１】
これらの結果から、クロモリン誘導体Ｃ４がミクログリア取り込みおよびＡβ４２の排除を誘導し、神経毒性／炎症促進性から神経保護性／食作用促進性活性化表現型へのミクログリア細胞の偏りを促進したことが示唆される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2019524865.tif 000031
【図４Ｃ】
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【図５】
2019524865.tif 000033
【図６Ａ−Ｄ】
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【図７Ａ】
2019524865.tif 000035
【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019524865.tif 000039
【図１１】
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【国際調査報告】
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2019524865.tif 000042
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