(57)【要約】  本発明は、患者の血液試料、尿試料、又は唾液試料などの体液から、前記患者がＰＤＥ８Ａ転写物上でのＡ−ｔｏ−Ｉ編集の変化に付随する病態、例えば精神疾患を発現するリスクをインビトロで予測するための方法、又は前記患者に前記病態を発症するリスクがあるか判定するための方法に関する。本発明は前記方法を実施するためのキットにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者がＰＤＥ８Ａ転写物上でのＡ−ｔｏ−Ｉ編集の変化に付随する精神疾患又は神経学的症候群、免疫学的症候群、及び変性症候群からなる群より選択される病態を発現している（present）リスクを予測するための、又は患者に前記病態を発症する（develop）リスクがあるか判定するための、インビトロ方法であって、
編集酵素であるＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ、及びＡＤＡＲ２のうちの少なくとも１つとＰＤＥ８Ａとを発現する細胞を含有する前記患者の体液試料から
（ａ）前記細胞含有血液試料から得られた同じ細胞内ＲＮＡ抽出物における
（ｉ）ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡの発現レベル、及び
（ｉｉ）ＰＤＥ８Ａ遺伝子上の編集可能な部位であって、好ましくは前記病態と関連する部位のうち、少なくとも１つ又はその組み合わせにおける、ＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡ編集のレベル、及び／又は、
発現可能であり、好ましくは前記病態と関連する少なくとも１つのＰＤＥ８Ａアイソフォーム又はＰＤＥ８Ａアイソフォームの組み合わせの、発現レベル
を決定する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた結果から、前記ＲＮＡ編集部位の相対割合及び／又は前記ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ発現レベルに対する前記ＰＤＥ８Ａアイソフォームレベルの相対割合を決定する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られた前記ＲＮＡ編集部位及び／又は前記アイソフォームの相対的な割合を、（ｉ）前記病態を示すこと若しくは示さないことが既知の患者、又は前記病態を発症するリスクがあること若しくは無いことが既知の患者の対照体液試料から得られた前記部位におけるＲＮＡ編集及び／又は前記アイソフォームの相対的な割合と比較すること、及び／又は
（ｉｉ）工程（ｂ）において選択された前記編集部位及び／又は前記アイソフォーム、又はそれらの組み合わせを用いて、識別能力を示すアルゴリズム又は統計モデルを適用すること
によって、前記患者が前記病態を発現しているかどうか、又は前記病態を発症するリスクを有するかどうかを識別する工程、並びに、
工程（ｃ）の（ｉ）又は（ｉｉ）において得られた結果又は終値を用いて、前記患者が前記病態を発現しているかどうか、又は前記病態を発症するリスクを有するかどうかを決定する工程
を含む前記方法。
【請求項２】
前記病態が精神疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記病態が抑うつ障害、精神障害、双極性障害、精神分裂病、パニック障害、社交不安症、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、薬物依存／乱用、異常摂食行動、強迫性障害（ＯＣＤ）、早期アルツハイマー病、及びパーキンソン病からなる群より選択される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記患者が精神疾患を発現すしていることが既に確認されており、且つ自殺未遂歴が有るか又は無い患者の中から選択され、工程（ｃ）においては前記患者が自殺行動を発現しているかどうか、又は自殺行動を発症するリスクを有するかどうかが識別される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記患者が非精神疾患の治療を既に受けた患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
患者が自殺を試みるリスクを予測するための方法であって、工程（ｃ）の（ｉ）においては情動障害対照群の患者から対照体液試料を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
患者がうつ病を示すかどうか判定するための方法であって、工程（ｃ）の（ｉ）においては健常群の患者から対照体液試料を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
患者をモニターし、及び／又は、患者を治療応答者と治療非応答者に分けることを可能とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）が、同じ細胞抽出物中の編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ及び／又はＡＤＡＲ２の発現量を決定することを含み、
工程（ｃ）において、前記患者が前記病態を発現しているかどうか、又は前記病態を発症するリスクを有するかどうかが
（ｉ）さらに、工程（ｂ）で得られた編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ及び／又はＡＤＡＲ２の発現量を、正常な患者について得られた発現量、及び所望によりさらにＰＤＥ８Ａ転写物上におけるＡ−ｔｏ−Ｉ編集の変化に付随する病態を呈する患者について得られた発現量と、比較すること、及び／又は
（ｉｉ）工程（ａ）及び（ｂ）において選択された前記編集部位及び／又は前記アイソフォーム、及びＡＤＡＲ類の発現量、又はそれらの組み合わせを用いて、識別能力を示すアルゴリズム又は統計モデルを適用すること
によって判定される、請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記体液試料が血液試料、尿試料、及び唾液試料から選択され、好ましくはＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を含む試料であり、より好ましくは血液試料である、請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）において、部位毎のＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡ編集の決定が、表ＩＩＩに記載される編集部位から選択される少なくとも１つの部位について行われ、好ましくは表ＩＩＩの部位Ｏ〜ＺＺのうち少なくとも１つの部位を含む複数の部位について行われ、より好ましくは部位Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｚ、及びＺＺからなる群より選択される部位について行われる、請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ａ）において、前記ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ発現レベルに対しての前記１つの編集部位又は複数の編集部位を含むＰＤＥ８Ａアイソフォームレベルの相対的な割合を決定する、請求項１〜請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ａ）において、アイソフォームＢ、ＢＣ、Ｄ、Ｅ、Ｎｅ（非編集型）、ＢＥ、Ｇ、ＢＧ、ＢＦ、Ａ、Ｚ、Ｃ、Ｆ、ＢＺ、及びＢＤからなる群より選択される前記ＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡアイソフォームの相対的割合が決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）において、前記アルゴリズムが表ＶＩに記載される組み合わせからなるｍＲＯＣの組み合わせの群より選択される、請求項１〜請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ａ）及び工程（ｂ）において、ｑＰＣＲによってＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ発現レベルが決定される、及び／又は、ＮＧＳ（次世代シーケンシング）法によって部位毎のＲＮＡ編集レベルが決定される、請求項１〜請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
フォワードプライマーとしてのＳｅｑ１−フォワード（配列番号２）又はＳｅｑ２−フォワード（配列番号３）；
リバースプライマーとしてのＳｅｑ１−リバース（配列番号４）、Ｓｅｑ２−リバース（配列番号５）又はＳｅｑ３−リバース（配列番号６）；並びに
次の選択基準、すなわち
（ｉ）１８ヌクレオチド長〜２７ヌクレオチド長の間のオリゴである
（ｉｉ）好ましくは６０℃近辺（５７℃〜６３℃）の融点を有する
（ｉｉｉ）５０％（±５％）近辺の最適なＧＣ含量を有する
（ｉｉｉｉ）許容可能な最大反復長が５モノヌクレオチドである、及び
（ｖｉ）図１に示される目的領域を特異的に増幅する
に合致する、フォワードプライマーとリバースプライマーとのセット
からなる群より選択されるプライマーのセットにより、ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡの部位毎のＲＮＡ編集レベルが決定される、請求項１〜請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
患者がＰＤＥ８Ａ転写物上でのＡ−ｔｏ−Ｉ編集の変化に付随する精神疾患又は神経学的症候群、免疫学的症候群、及び変性症候群からなる群より選択される病態を発現しているリスクを有するかどうかを判定するための、又は患者が前記病態を発症するリスクを有するかどうかを判定するための、キットであって、
（１）分析することで前記病態を引き起こすリスクが判定できる終値を得るために請求項１〜請求項１６のいずれか一項に記載の方法を適用するための、ＲＯＣ曲線を含むか又は含まない指示書と、
（２）フォワードプライマーとしてのＳｅｑ１−フォワード（配列番号２）又はＳｅｑ２−フォワード（配列番号３）；
リバースプライマーとしてのＳｅｑ１−リバース（配列番号４）、Ｓｅｑ２−リバース（配列番号５）又はＳｅｑ３−リバース（配列番号６）；並びに
次の選択基準、すなわち
（ｉ）１８ヌクレオチド長〜２７ヌクレオチド長の間のオリゴである
（ｉｉ）好ましくは６０℃近辺（５７℃〜６３℃）の融点を有する
（ｉｉｉ）５０％（±５％）近辺の最適なＧＣ含量を有する
（ｉｉｉｉ）許容可能な最大反復長が５モノヌクレオチドである、及び
（ｖｉ）図１に示される目的領域を特異的に増幅する
に合致する、フォワードプライマーとリバースプライマーとのセット
からなる群より選択されるプライマーのセットと、
を含む、前記キット。
【請求項１８】
前記プライマーのセットがＳｅｑ２−フォワード（配列番号３）とＳｅｑ３−リバース（配列番号６）とからなるセットである、請求項１６に記載の方法又は請求項１７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は患者がＰＤＥ８Ａ転写物上でのＡ−ｔｏ−Ｉ編集の変化に付随する病態、例えば精神疾患を発現するリスクをインビトロで予測するための方法、又は患者に前記病態を発症するリスクがあるか判定するための方法であって前記患者の血液試料、尿試料、又は唾液試料などの体液から予測又は識別する方法に関する。本発明は前記方法を実施するためのキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
大半の西洋諸国で１００万件の自殺が報告されており、これは２０２０年までに１５０万件にまで増加することが予測されていることから自殺と自殺行動は世界的な公衆衛生上の大問題である。今日、生物学的手段を用いた自殺リスクの防止は効果を確認されておらず、且つ、臨床評価では所与の患者における自殺行動の発生が的確に予測されない。さらに、精神疾患の薬物治療は自殺未遂及び完遂率の低下に対して限定的な効果しか示していない。自殺リスクが最も高い人々向けに新しい戦略を開発し、予防措置を促進することが公衆衛生上、緊急に必要である。この目的を達成するためにはリスクを有する個人の特定が自殺防止戦略に必要となる。
【０００３】
自殺行動の決定に関わる多数の因子の中で多数の因子が自殺行動の感受性に寄与し得ることが幾つかの最近の分子遺伝学及びゲノム研究の進展によって明らかになった。生存期間を通して環境的及びエピジェネティクス的因子と相互作用して神経回路の機能を改変する潜在的な遺伝的素因がおそらくこの感受性を媒介する［１〜３］。シナプス間隙に発現する受容体と他の関連タンパク質のＲＮＡ編集が様々な精神疾患の病因に関与し、且つ、自殺行動と関連することが示されている［４〜７］。近年、Ｓｉｍｍｏｎｓと同僚はうつ病による自殺者の大脳皮質においてＲＮＡ−ｅｄｉｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  １であるＡｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ｄｅａｍｉｎａｓｅ  Ａｃｔｉｎｇ  ｏｎ  ＲＮＡ（ＡＤＡＲ１）のｍＲＮＡ発現が上昇することを報告した［８］。ＡＤＡＲ類の標的であるホスホジエステラーゼ８Ａ（ＰＤＥ８Ａ）は脳組織でも血液組織でも発現しており、ヒトではＡＤＡＲ類によって編集される［９〜１１］。ＰＤＥ８ＡプレｍＲＮＡの編集プロファイルの変化は脳を含むヒト組織の総ＲＮＡ抽出物から定量的に評価することができるが、実際には血液試料中のＲＮＡで評価する方が簡便であり、患者状態のモニターに使用可能である。これらの観察結果に基づき、疾患特異的分子シグネチャを判定する体液バイオマーカーを特定することが目的となる。この体液検査の適用により新しい可能性が重篤な精神医学的副作用の一次的リスク又は副次的リスクの評価に開くだろう。
【０００４】
患者が精神疾患、例えば抑うつ障害又は自殺行動を発現又は発症するリスクを予測するための効果的な検査として米国食品医薬品局（ＦＤＡ）又は他の医薬品規制当局によって具体的に認可された検査はこれまで存在しない。
【０００５】
患者の自殺行動又は抑うつ障害のリスクを判定するための効力を示す可能性があるあらゆる検査を再吟味することに大きな関心が寄せられている。
【０００６】
現時点ではそのような患者を特定するための認可済み生物学的検査は存在しない。
【発明の概要】
【０００７】
したがって、患者が精神疾患、例えば抑うつ障害又は自殺行動を発現又は発症するリスクを高い精度及び高い識別力で判定することができるインビトロ検査であって、例えば検査を受ける患者の血液試料から判定できる特に使いやすいインビトロ検査を提供する必要性が存在する。
このことが本発明の目的である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
第１の態様では、本発明は、患者がＰＤＥ８Ａ転写物上でのＡ−ｔｏ−Ｉ編集の変化に付随する精神疾患又は神経学的症候群、免疫学的症候群、及び変性症候群からなる群より選択される病態を発現している（present）リスクを予測するための、又は患者に前記病態を発症する（develop）リスクがあるか判定するための、インビトロ方法であって、
編集酵素であるＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ、及びＡＤＡＲ２のうちの少なくとも１つとＰＤＥ８Ａとを発現する細胞を含有する前記患者の体液試料から
（ａ）前記細胞含有血液試料から得られた同じ細胞内ＲＮＡ抽出物における
（ｉ）ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡの発現レベル、及び
（ｉｉ）ＰＤＥ８Ａ遺伝子上の編集可能な部位であって、好ましくは前記病態と関連する部位のうち、少なくとも１つ又はその組み合わせにおける、ＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡ編集のレベル、及び／又は、
発現可能であり好ましくは前記病態と関連する少なくとも１つのＰＤＥ８Ａアイソフォーム若しくはＰＤＥ８Ａアイソフォームの組み合わせ又は非編集転写物（Ｎｅ）の、発現レベル
を決定する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた結果から、前記ＲＮＡ編集部位の相対割合及び／又は前記ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ発現レベルに対する前記ＰＤＥ８Ａアイソフォームレベルの相対割合を決定する工程；及び
（ｃ）前記患者が前記病態を発現しているかどうか、又は前記病態を発症するリスクを有するかどうかを識別する工程であって、
（ｉ）工程（ｂ）で得られた前記ＲＮＡ編集部位及び／又は前記アイソフォームの相対的な割合を、前記病態を示すこと若しくは示さないことが既知の患者、又は前記病態を発症するリスクがあること若しくは無いことが既知の患者の対照体液試料から得られた前記部位におけるＲＮＡ編集及び／又は前記アイソフォームの相対的な割合と比較し、且つ／又は
（ｉｉ）工程（ｂ）において選択された前記編集部位及び／又は前記アイソフォーム、又はそれらの組み合わせを用いて、識別能力を示すアルゴリズム又は統計モデルを適用し、且つ、
工程（ｃ）の（ｉ）又は（ｉｉ）において得られた結果又は終値を用いて、前記患者が前記病態を発現しているかどうか、又は前記病態を発症するリスクを有するかどうかを判定する工程
を含む前記方法に関する。
【０００９】
工程（ｃ）−（ｉ）の対照試料について決定される閾値、又は工程（ｃ）−（ｉｉ）において使用されるアルゴリズムは以下の工程、すなわち
（ａ）ある比率の精神疾患を発症するリスクを有すると注釈付けられた患者、又はそのリスクを有しないと注釈付けられた患者からなる患者コレクション、又は患者が精神疾患を発現することを確認するための患者コレクションを選択し、
１つ又は幾つかのＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡ編集部位及び／又はアイソフォーム、又はそれらの組み合わせを選択する工程、
（ｂ）その標的ＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡ編集部位又は標的アイソフォームを分析して前記標的部位のＲＮＡ編集レベル及び／又は前記標的アイソフォームの割合を前記コレクションの患者の各々について得る工程、
（ｃ）−（ｉ）各ＲＮＡ編集部位及び／又は各アイソフォームについて精神疾患などの前記病態を発症するリスクを識別するための、又は患者が前記病態を発現していることを確認するためのその閾値及び／又はその精度と能力を単変量統計分析方法によって評価する工程、及び／又は
（ｃ）−（ｉｉ）ＲＮＡ編集部位及び／又はアイソフォームのそれぞれの組み合わせについて前記病態、特に精神疾患を発症するリスクを識別するための、又は患者が前記病態を発現していることを確認するためのその精度及びその能力を多変量統計分析方法によって評価する工程、及び
（ｃ）−（ｉｉｉ）許容可能な識別能力を示す編集部位及び／又はアイソフォーム、又はそれらの組み合わせを選択する工程、及び
（ｅ）選択した編集部位及び／又はアイソフォームの前記組み合わせを使用してアルゴリズムを構築し、所与の患者が前記病態、特に精神疾患を発症するリスクを予測するために、又は前記患者が前記病態を発現していることを確認するためにそのようにして得られた前記アルゴリズムを使用する工程
を含む方法によって獲得可能である。
【００１０】
好ましい実施形態では本発明の方法に使用可能である前記アルゴリズムは、
ＲＯＣのＡＵＣ（曲線下面積）を最大にするｍＲＯＣプログラム、特に一次結合を特定するためのプログラムであって、個々の結合の方程式が、ａｉが算出された係数であり、且つ、（バイオマーカーｉ）がＲＮＡ編集部位又はアイソフォーム標的の個々のレベルの相対的な割合である次の式
Ｚ＝ａ１・（バイオマーカー１）＋ａ２・（バイオマーカー２）＋．．．ａｉ・（バイオマーカーｉ）＋．．．．ａｎ・（バイオマーカーｎ）
として提供され、且つ、新しい仮想マーカーＺとして使用可能である前記プログラム、及び／又は
様々なＲＮＡ編集部位レベル又はアイソフォーム値における患者の相対的なリスクを見積もるための単変量分析及び多変量分析に適用されるロジスティック回帰モデル、及び／又は
ＲＮＡ編集部位及び／又はアイソフォームの組み合わせを評価するために適用されるＣＡＲＴ（分類回帰木）アプローチ、及び／又は
ＲＮＡ編集部位及び／又はアイソフォームの組み合わせを評価するために適用されるランダムフォレスト（ＲＦ）アプローチ、具体的にはそれらのＲＮＡ編集部位及び／又はアイソフォームの重要性を等級付けし、且つ、「相対的なリスク」を分類するために最良のＲＮＡ編集部位及び／又はアイソフォームを組み合わせるためのアプローチ、及び／又は所望により
「相対的なリスク」についてＲＮＡ編集部位及び／又はアイソフォームの組み合わせを評価するために適用される多変量分析であって、例えば
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アプローチ、
人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）アプローチ、
ベイジアンネットワークアプローチ、
ＷＫＮＮ（加重ｋ最近傍）アプローチ、
部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）、
一次及び二次判別分析（ＬＤＡ／ＱＤＡ）、及び
バイオマーカーを組み合わせる他のあらゆる数理的方法
からなる群より選択される前記多変量分析
をはじめとする多変量方法によって実施される。
【００１１】
好ましい実施形態では、前記体液試料は血液試料、尿試料、及び唾液試料から選択され、血液試料が最も好ましい。
【００１２】
好ましい実施形態では、前記病態は精神疾患である。
【００１３】
別の好ましい実施形態では、前記病態は精神障害、双極性障害、抑うつ障害、精神分裂病、パニック障害、社交不安症、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、薬物依存／乱用、好ましくは拒食症又は肥満である異常摂食行動、強迫性障害（ＯＣＤ）、早期アルツハイマー病、及びパーキンソン病からなる群より選択される。
【００１４】
より好ましい実施形態では、前記病態は抑うつ障害であり、さらに具体的には自殺行動である。
【００１５】
本発明の方法のより好ましい実施形態では、前記方法は患者が自殺を試みるリスクを予測するための方法であって、工程（ｃ）−（ｉ）において情動障害対照群の患者から対照体液試料を得る方法である。
【００１６】
本発明の方法のさらにより好ましい実施形態では、前記方法は患者がうつ病を示すかどうか判定するための方法であって、工程（ｃ）−（ｉ）において健常群の患者から対照体液試料を得る方法である。
【００１７】
本発明の方法の特定の実施形態では、前記患者は自殺行動を発症するリスクと関連付けることができる精神疾患、特に抑うつ障害を発現していることが既に確認されており、自殺未遂歴が有るか又は無い患者の中から選択され、前記患者が自殺行動を発現しているかどうか、又は自殺行動を発症するリスクを有するかどうかが工程（ｃ）において識別される。
【００１８】
別の実施形態では、本発明の方法によって患者をモニターし、且つ／又は患者を治療応答者と治療非応答者に分けることが可能になる。
【００１９】
精神疾患などの多くの疾患が自殺傾向と関連するときがあることが知られている。幾つかの実施形態では、前記患者は精神障害、双極性障害、精神分裂病、パニック障害、社交不安症、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、薬物依存／乱用、摂食障害（拒食症、肥満のような異常摂食行動）、強迫性障害（ＯＣＤ）、早期アルツハイマー病、又はパーキンソン病を患っている。
【００２０】
別の実施形態では、前記患者は精神疾患を発現していないと確認されており、且つ、非精神疾患について治療されている患者、特に肝炎について治療されている患者であり得る。
【００２１】
本発明の別の態様は、
工程（ａ）が、同じ細胞抽出物中の編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ及び／又はＡＤＡＲ２の発現量を決定することを含み、
工程（ｃ）において、前記患者が前記病態を発現しているかどうか、又は前記病態を発症するリスクを有するかどうかが
（ｉ）さらに、工程（ｂ）で得られた編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ及び／又はＡＤＡＲ２の発現量を、正常な患者について得られた発現量、及び所望によりさらにＰＤＥ８Ａ転写物上におけるＡ−ｔｏ−Ｉ編集の変化に付随する病態を呈する患者について得られた発現量と、比較すること、及び／又は
（ｉｉ）工程（ａ）及び（ｂ）において選択された前記編集部位及び／又は前記アイソフォーム、及びＡＤＡＲ類の発現量、又はそれらの組み合わせを用いて、識別能力を示すアルゴリズム又は統計モデルを適用すること
によって判定される前記方法に関する。
【００２２】
本発明の方法の好ましい実施形態では、前記血液試料はＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を含む。
【００２３】
本発明の方法では、工程（ａ）において、表ＩＩＩに記載される編集部位から選択される少なくとも１つの部位について部位毎のＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡの編集を決定することが好ましく、表ＩＩＩのＯ〜ＺＺのうち少なくとも１部位を含む複数の部位について決定することがより好ましい。
【００２４】
本発明の方法では、工程（ａ）において、少なくとも部位Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｚ、及びＺＺからなる群より選択される部位についてＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡの１つの部位又は複数の部位の編集を判定することが好ましい。
【００２５】
本発明の方法では、工程（ａ）において、少なくとも部位ＢについてＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡの１つの部位又は複数の部位の編集を判定することがより好ましい。
【００２６】
本発明の方法では、工程（ａ）において、ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ発現レベルに対しての、前記１つの編集部位又は前記複数の編集部位のうちの幾つかからなる組み合わせを含むＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡアイソフォームのレベルの相対的割合を決定することが好ましい。
【００２７】
本発明の方法では、工程（ａ）において、アイソフォームＢ、ＢＣ、Ｄ、Ｅ、Ｎｅ（非編集型）、ＢＥ、Ｇ、ＢＧ、ＢＦ、Ａ、Ｚ、Ｃ、Ｆ、ＢＺ、及びＢＤからなる群より選択されるＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡアイソフォームの相対的な割合を決定することが好ましい。
【００２８】
本発明の方法では、工程（ａ）において少なくともＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡアイソフォームＢの相対的な割合を決定することがより好ましい。
【００２９】
本発明の方法の好ましい実施形態では、前記アルゴリズム又は統計方法は、工程（ｃ）にＲＯＣのＡＵＣ（曲線下面積）を最大にするｍＲＯＣプログラム、特に一次結合を特定するためのプログラムであって、個々の結合の方程式が、ａｉが算出された係数であり、且つ、（バイオマーカーｉ）が１つの部位又は１つのアイソフォーム標的の個々のＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡ編集レベルの相対的な割合、又はＡＤＡＲ１ａ、１ｂ、若しくはＡＤＡＲ２の発現レベルである次の式
Ｚ＝ａ１・（バイオマーカー１）＋ａ２・（バイオマーカー２）＋．．．ａｉ・（バイオマーカーｉ）＋．．．．ａｎ・（バイオマーカーｎ）
として提供され、且つ、新しい仮想マーカーＺとして使用可能である前記プログラム、及び／又は
様々な編集部位値及び／又はアイソフォーム値及び／又はＡＤＡＲ類値における所与の患者の相対的なリスクを見積もるための単変量分析及び多変量分析に適用されるロジスティック回帰モデル、又は
バイオマーカーを組み合わせる他のあらゆる数理的方法
を含む。
【００３０】
本発明の方法では、工程（ｃ）において、前記アルゴリズムが表ＶＩに記載される組み合わせからなるｍＲＯＣの組み合わせの群より選択することが好ましい。
【００３１】
本発明の方法では、工程（ａ）及び工程（ｂ）において、ｑＰＣＲによってＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ発現レベルを決定すること、及び／又は、ＮＧＳ（次世代シーケンシング）法によって部位毎のＲＮＡ編集レベルを決定することが好ましい。
【００３２】
好ましい実施形態では、
フォワードプライマーとしてのＳｅｑ１−フォワード（配列番号２）又はＳｅｑ２−フォワード（配列番号３）；
リバースプライマーとしてのＳｅｑ１−リバース（配列番号４）、Ｓｅｑ２−リバース（配列番号５）又はＳｅｑ３−リバース（配列番号６）；並びに
次の選択基準、すなわち
（ｉ）１８ヌクレオチド長〜２７ヌクレオチド長の間のオリゴである
（ｉｉ）好ましくは６０℃近辺（５７℃〜６３℃）の融点を有する
（ｉｉｉ）５０％（±５％）近辺の最適なＧＣ含量を有する
（ｉｉｉｉ）許容可能な最大反復長が５モノヌクレオチドである、及び
（ｖｉ）図１に示される目的領域を特異的に増幅する
に合致する、フォワードプライマーとリバースプライマーとのセット
から選択されるフォワードプライマーとリバースプライマーとのセットにより、ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡの発現レベル及び／又は部位毎のＲＮＡ編集レベルがｑＰＣＲにより決定される。
【００３３】
より好ましい実施形態では、本発明の方法において次のプライマーセット、すなわちＳｅｑ２−フォワードとＳｅｑ−３リバースを使用して部位毎のＰＤＥ８ＡのＲＮＡ編集レベルが決定される。
【００３４】
別の態様では、本発明は、患者がＰＤＥ８Ａ転写物上でのＡ−ｔｏ−Ｉ編集の変化に付随する精神疾患又は神経学的症候群、免疫学的症候群、及び変性症候群からなる群より選択される病態を発現しているリスクを有するかどうかを判定するための、又は患者が前記病態を発症するリスクを有するかどうかを判定するための、キットであって、
（１）分析することで前記病態を引き起こすリスクが判定できる終値を得るために本発明の方法を適用するための指示書であって、ＲＯＣ曲線を含むか又は含まない前記指示書、及び
（２）フォワードプライマーとしてのＳｅｑ１−フォワード（配列番号２）又はＳｅｑ２−フォワード（配列番号３）；
リバースプライマーとしてのＳｅｑ１−リバース（配列番号４）、Ｓｅｑ２−リバース（配列番号５）又はＳｅｑ３−リバース（配列番号６）；並びに
次の選択基準、すなわち
（ｉ）１８ヌクレオチド長〜２７ヌクレオチド長の間のオリゴである
（ｉｉ）好ましくは６０℃近辺（５７℃〜６３℃）の融点を有する
（ｉｉｉ）５０％（±５％）近辺の最適なＧＣ含量を有する
（ｉｉｉｉ）許容可能な最大反復長が５モノヌクレオチドである、及び
（ｖｉ）図１に示される目的領域を特異的に増幅する
に合致するフォワードプライマーとリバースプライマーのセット
からなる群より選択される、フォワードプライマーとリバースプライマーとのセット
を含む前記キットに関する。
【００３５】
より好ましい実施形態では、前記キットは次のプライマーセット、すなわちＳｅｑ２−フォワード（配列番号３）とＳｅｑ−３リバース（配列番号６）を含む。
【００３６】
本明細書中以下の実施例と図面及び図の説明は、当業者が本発明を実施し、使用することができるように完全に説明するために選択されている。これらの実施例は、発明者が考えている発明の範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験だけが実施されたと示すことを意図するものでもない。
【００３７】
実施例と図についての本明細書の残りの部分において、本発明の他の特徴と利点が明らかになる。図の説明を以下に提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ヒトＰＤＥ８Ａ遺伝子の第９イントロン内に位置する目的の配列を示す図である。第９イントロンの内部配列（２２５ｂｐ）（塩基位置８５，０９６，６０６〜８５，０９６，８３０、配列番号１）が示されている。Ｓｅｑ２フォワード及びＳｅｑ３リバースというプライマーの組み合わせを使用してこの配列を増幅する。Ｏｒｌｏｗｓｋｉと共同研究者によってこれまでに記載された編集部位（ＡからＨまで）［１０］及びＷｅｉｓｓｍａｎｎら（国際公開２０１１／１６１２５３号パンフレット）によってこれまでに記載された編集部位が配列上に灰色太字の大文字で示されている。新しい編集部位ＯからＺＺは配列上に黒色下線付きの大文字で示されている。
【図２】様々なプライマーペアを使用する増幅によって得られる非特異的副産物を示す典型的な電気泳動図である。検出可能な非特異的産物を作製しないＳｅｑ２−フォワードとＳｅｑ３−リバースからなるプライマーペアをＰＤＥ８Ａの標的領域の増幅とウルトラディープシーケンシングに使用した。
【図３】ウルトラディープシーケンシングによってヒト白血球中に特定されたＲＮＡ編集部位を示す図である。情動障害対照群のＰＤＥ８Ａ遺伝子の複数の部位（Ａ〜Ｇ、Ｚ、及びＺＺ）について評価されたＲＮＡ編集の相対的な割合（平均値±ＳＥＭ）を報告する図である。
【図４】情動障害対照（ＡＣ）集団及び自殺企図者（ＳＡ）集団の白血球においてｑＰＣＲ分析によって測定された関連遺伝子の発現レベルを示す図である。情動障害対照（ＡＣ）におけるＡＤＡＲ１ａ（Ａ）、ＡＤＡＲ１ｂ（Ｂ）、ＡＤＡＲ２（Ｃ）、及びＰＤＥ８Ａ（Ｄ）のｍＲＮＡ発現レベルを自殺企図者（ＳＡ）と比較した。ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ、ＡＤＡＲ２、及びＰＤＥ８ＡのｍＲＮＡ発現レベルを３８人の患者（ｎ＝１８の情動障害対照とｎ＝２０の自殺企図者）において定量した。様々な転写物の発現をＧＡＰＤＨ及びβ２Μの遺伝子発現に対して正規化した。三回の複製実験で測定を行った。ＡＤＡＲ１ａ、１ｂ、及びＰＤＥ８ＡのｍＲＮＡ発現は自殺企図者において有意に高い。マン・ホイットニー検定を用いてｐ値を算出した。
【図５】ＰＤＥ８Ａ遺伝子の部位ＢのＲＮＡ編集の相対的な割合を示す図である。（Ａ）情動障害対照（ＡＣ）及び自殺企図者（ＳＡ）において測定されたＰＤＥ８Ａの部位ＢのｍＲＮＡ編集のボックスプロットである。（Ｂ）相対的な転写物レベルに対して調整されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ編集の測定値である。データは５回の独立した実験の平均値を表す。マン・ホイットニー検定を用いてｐ値を算出した。
【図６】ｍＲＯＣアプローチを使用するバイオマーカーの組み合わせの診断成績を示す図である。この図は情動障害対照を自殺企図者に対して比較する多変量ＲＯＣ曲線の例を示している。ＡＤＡＲ１ａ＋ＡＤＡＲ２＋ＰＤＥ８Ａ＿部位Ａ＊＋ＰＤＥ８Ａ＿部位Ｂ＊のｍＲＯＣ組み合わせで得られたＲＯＣ曲線である。
【図７】ロジスティック回帰を使用するバイオマーカーの組み合わせの診断成績を示す図である。この図は情動障害対照を自殺企図者に対して比較する多変量ＲＯＣ曲線の例を示している。ＡＤＡＲ１ａ＋ＰＤＥ８Ａ＿部位Ｂ＊ロジスティック回帰モデルで得られたＲＯＣ曲線である。
【図８】ＩＦＮ−αとリバビリンで治療された患者のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の縦断的調査を示す図である。抗ウイルス剤治療の４週間前（−４）及び治療開始から２週間毎（第０週、第２週、第４週、第６週、第８週、第１０週、及び第１２週）に１０人のＨＣＶ感染患者からＰＡＸｇｅｎｅ血液ＲＮＡチューブに試料採取した。その治療には毎週のＰＥＧ化ＩＦＮ−α皮下注射（１８０μｇ）と毎日のリバビリン錠剤（１０００〜１２００ｍｇ）が含まれた。
【図９】ＩＦＮ−αとリバビリンで治療された２人のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染患者における関連遺伝子の発現レベル（Ａ−Ｂ）及びＰＤＥ８Ａ遺伝子の部位ＢのＲＮＡ編集（Ｃ−Ｄ）の相対的な割合の縦断的分析を示す図である。示されているデータは各時点において各患者について測定された５回の独立した実験（ｎ＝５）の平均値±ＳＤ（エラーバー）である。
【図１０】ＩＦＮ試験に含まれる６人のＨＣＶ感染患者のクラスタリング分析を示す図である。ＭＥＶソフトウェアｖ４．９を使用してＫ−メジアン・クラスターを出力し、距離についてピアソン相関を使用し、１０００回の反復と２つのクラスターをパラメーターとして選択する。このアプローチによって患者について２つの異なるクラスターが生じた。ＩＦＮの増加に対して急速で力強い応答を示す４人の患者を含む１つ目のクラスターが処置の最初の４週間の期間での急な傾きによって認められた。鈍いＩＦＮ応答を有する２人の患者を含む２つ目のクラスターも認めることができた。
【図１１】（Ａ〜Ｂ）６か月の期間にわたる追跡調査における非反復性自殺企図者（ＮＲＳＡ）群と反復性自殺企図者（ＲＳＡ）の臨床評価を示す図である。ハミルトン（ＨＡＭＤ）スコア、ＭＡＤＲＳ（モントゴメリー・アスベルグうつ病評価尺度）スコア及びＢＤＩ（ベックうつ病自己評価）スコアが最初の摂取時である０か月の時点と６か月の時点において両群について提示されている。（Ｃ〜Ｄ）ＰＤＥ８Ａ遺伝子の全ての部位における対応するＲＮＡ編集の量を示す図である。データは５回の複製実験の平均値を表しており、エラーバーはそれらの平均値の標準誤差を表している。ウィルコクソン検定を用いてｐ値を算出した。
【図１２】（Ａ）１６週間にわたる全てのＨＣＶ患者（ｎ＝１０）のＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ、ＡＤＡＲ２、及びＰＤＥ８Ａ遺伝子発現の縦断的分析を示す図である。（Ｂ）相対的なＰＤＥ８Ａ転写物レベル（ｎ＝１０）に対して調整された全てのＨＣＶ患者のＰＤＥ８Ａ遺伝子の部位ＢにおけるＲＮＡ編集の縦断的分析を示す図である。（Ｃ）相対的なＰＤＥ８Ａ転写物レベル（ｎ＝１０）に対して調整された全てのＨＣＶ患者のＰＤＥ８Ａ遺伝子の他の特定の部位におけるＲＮＡ編集の縦断的分析を示す図である。平均値は±ＳＥＭ（ｎ＝１０）で示されている。
【００３９】
【図１３】（Ａ）抑うつエピソードを有する患者の群（ｎ＝３）と有しない患者の群（ｎ＝７）におけるＡＤＡＲ遺伝子発現から構成されるバイオマーカーの組み合わせの縦断的分析を示す図である。（Ｂ）抑うつエピソードを有する患者の群（ｎ＝３）と有しない患者の群（ｎ＝７）におけるＲＮＡ編集から構成されるバイオマーカーの組み合わせの縦断的分析を示す図である。（Ｃ）抑うつエピソードを有する集団と有しない集団を分けるためのバイオマーカーの組み合わせのＲＯＣ曲線を示す図である。
【００４０】
【図１４】ＩＦＮ治療期間にわたって得られる全てのデータポイントに対して特定の組み合わせのバイオマーカーが適用されたことを示す図である。
【実施例】
【００４１】
実施例１：材料と方法
１）ヒト参加者
２つの異なるコホートに由来するデータを提示する。１つのコホートは自殺未遂歴を有する、又は有しないうつ病患者を含み（自殺企図者調査及び追跡調査と呼ぶ）、１つはＣ型肝炎ウイルスに感染しており、且つ、インターフェロンαで治療された患者を分析する縦断的調査である（インターフェロン調査と呼ぶ）。調査の目的と必要事項についての詳しい議論の後に全ての対象から書面によるインフォームドコンセントを得た。全ての対象が研究の目標と手段について詳細に説明しているインフォームドコンセントを理解することができた。本研究は認可要件及び医薬品臨床試験実施基準に従って地域の治験審査委員会により認可された。
【００４２】
２）自殺企図者調査及び自殺企図者追跡調査
２．１  自殺企図者調査
本調査にはフランス、モンペリエのＣＨＵの緊急及び緊急後精神科（ｎ＝１７）又はスペイン、オビエドの精神療養センター（ｎ＝２１）で診察を受けている３８人のうつ病患者が登録した。本精神科診断は構造的臨床面接基準によって確立されたものである。精神科診断法を精神障害の診断と統計マニュアルＩＶ（ＤＳＭ−ＩＶ）に従って判定した。標本には２０人の自殺企図者（ＳＡ）（５２．６３％）と１８人の非自殺企図者（情動障害対照、ＡＣ）（４７．３７％）が含まれた（表Ｉ（Ａ）参照）。
【００４３】
対象は民俗学的に同質であり、全員が西ヨーロッパ出身の白色人種であった。連例と性別に関する人口統計学的データ、並びに患者の精神科診断、アルコール又は物質消費、及び自殺未遂回数を記録した。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
比較のために２群が含まれた。第１群は情動障害対照（ＡＣ）と呼ばれ、自殺未遂歴の無いうつ病患者を含んだ。第２群は自殺企図者（ＳＡ）と呼ばれ、自殺未遂歴の有るうつ病患者を含んだ。
【００４６】
２．２  自殺企図者追跡調査
この追跡調査にはフランス、モンペリエのＣＨＵの救急精神科及び救急後精神科で診察を受けている２８人のうつ病自殺未遂患者が登録した。これらの患者は６か月の期間にわたって追跡調査を受けた（表Ｉ（Ｂ）参照）。追跡調査中に２８人のうちの８人の患者（２８．６％）が自殺を新たに１回又は数回試みたが（「反復自殺企図者」、ＲＳＡ）、２０人の患者（７１．４％）は自殺を新たに試みなかった（「非反復自殺企図者」、ＮＲＳＡ）。自殺企図者調査についてこれまでに言及したように患者の精神医学的評価を行った。３種類の尺度、すなわちハミルトンうつ病尺度（ＨＡＭＤ）、モントゴメリー・アスベルグうつ病評価尺度（ＭＡＤＲＳ）、及びベックうつ病自己評価（ＢＤＩ）尺度を用いてベースライン評価時及び追跡評価時のうつ病の重症度を評価した。
【００４７】
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【００４８】
３）インターフェロン調査
本調査にはマルセイユ、ナンシー、及びストラスブール（フランス）の３か所のＣＨＵ（大学付属中央病院）の診療科の１０人の患者が登録した。精神疾患のどの基準にも合致しないＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染患者が抗ウイルス剤治療の開始前に登録し、抗ウイルス剤治療の開始から最大で１２週間にわたって追跡調査された。初期血液試料を治療の４週間前（−４）に得た。治療開始時にＰＡＸｇｅｎｅチューブ中に採血し、最大で１２週間にわたって２週間毎に採血した（図８）。
【００４９】
４）血液採取及びＲＮＡ抽出及び適格性評価
各患者から２．５ｍｌの体積の全血試料をＰＡＸｇｅｎｅ血液ＲＮＡチューブ中に採取し、２か月にわたって−２０℃で貯蔵し、その後で−８０℃に移した。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ社）はＲＮＡ分子をリボヌクレアーゼによる分解と遺伝子発現の生体外での変化から守る試薬を含む。異なる回の抽出の中で試料を無作為に配分した。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡキット（参照番号２８７０４、ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ社）を使用して２．５ｍｌの全血に由来する総ＲＮＡを抽出した。ＰＡＸｇｅｎｅ血液ＲＮＡパート１、自動化プロトコルについての製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡｃｕｂｅシステムを使用して抽出したＲＮＡを単離した。試料調製とＲＮＡ抽出の間に標準的な注意事項を採用してリボヌクレアーゼによるＲＮＡ分解を回避した。Ｑｕｂｉｔフルオロメーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びＱｕａｎｔ−ＩＴ  ＲＮＡ  ＢＲアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて総ＲＮＡ濃度を決定した。
【００５０】
５）ＮＧＳライブラリーの調製
ＰＤＥ８Ａ遺伝子の第９イントロン内の目的領域を選択的にシーケンシングするために２ステップＰＣＲ法を用いてＮＧＳライブラリーを調製した。図１に示されているように、これまでに記載された編集部位とは別に新しい編集部位がその目的領域内に特定された。検証済みのＰＣＲプライマー（Ｓｅｑ２フォワード及びＳｅｑ３リバース）を使用してＰＣＲにより目的領域を増幅した（表ＩＩ及び図１）。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
２ステップＰＣＲライブラリー調製プロトコルを用いて複数の試料を含むシーケンシングライブラリーを作製した。ＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）などの次世代シーケンシングシステム上で本ライブラリーをシーケンシングした。
【００５３】
ＰＣＲ増幅のために製造業者のガイドライン（参照番号Ｍ０４９４Ｓ）に従ってＱ５ホットスタート・ハイフィデリティ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を使用した。最適化されたＰＣＲプロトコルを用いてＰｅｑｓｔａｒ  ９６ｘ  サーモサイクラー上でＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ後、ＬａｂＣｈｉｐＧｘ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）により全ての試料を分析し、ＰＣＲ産物の量と品質の両方を評価した。蛍光ベースＱｕｂｉｔ法を用いてアンプリコンの純度を決定し、且つ、定量を行った。品質管理の後に磁性ビーズ（Ｍｏｋａｓｃｉｅｎｃｅ社のＨｉｇｈ  Ｐｒｅｐ  ＰＣＲ  ＭＡＧｂｉｏシステム）を使用して９６種類のＰＣＲ反応物（マイクロプレート）を精製した。精製後にＱｕｂｉｔシステムを使用してＤＮＡを定量し、精製の収率を計算した。次にＱ５ホットスタート・ハイフィデリティＰＣＲ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）とＩｌｌｕｍｉｎａ  ９６インデックスキット（Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴインデックスキット；Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を使用するＰＣＲ増幅により個々にインデックスを試料に付した。ＰＣＲ後に試料をライブラリーにまとめ、Ｍａｇｂｉｏ  ＰＣＲクリーンアップシステムを使用して精製した。そのライブラリーを変性し、ＭｉＳｅｑプラットフォーム上だけでのＦＡＳＴＱのシーケンシング向けのＩｌｌｕｍｉｎａ社のガイドラインに従ってシーケンシングカートリッジにそのライブラリーを負荷した。市販のヒト血液末梢白血球由来総ＲＮＡプール（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、参照番号６３６５９２）を前記ライブラリーに組み入れることで実験期間中の異なるシーケンシングフローセル間の変動度を決定した。標準的な濃度でＮＧＳライブラリーをシーケンシングし、ＰｈｉＸ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を使用してライブラリー多様性をこれらのライブラリーに導入した。実験を独立して５回実施した。
【００５４】
６）シーケンシングデータのバイオインフォマティクス分析
Ｍｉｓｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）からシーケンシングデータをｆａｓｔｑファイルとしてダウンロードした。シーケンシングの品質を評価するためにＦａｓｔＱＣソフトウェア（バージョン０．１１．３）を使用してそれぞれの生ｆａｓｔｑファイルの初期品質調査を実施した。アダプター配列の除去及び配列サイズと品質スコアに応じた配列のフィルタリングからなる前処理工程を実施した（全てのショートリード（５０ｎｔ未満）と３０未満の平均ＱＣを有するリードを除去した）。次に配列アラインメントを容易にし、その質を向上させるためにＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮＧＳデータ向けのリードトリミング及びフィルタリングツール（ｆａｓｔｘツールキットｖＯ．０．１４及びｐｒｉｎｓｅｑバージョン０．２０．４）を使用した。前処理工程を実施した後にさらに配列処理を実施する前に追加の品質管理をそれぞれのクリーンアップしたｆａｓｔｑファイルについて実施した。
【００５５】
エンドツーエンド高感度モードでｂｏｗｔｉｅ２（バージョン２．２．５）を使用して処理済みリードのアラインメントを実施した。最新のヒトゲノム配列アノテーション（ＧＲＣｈ３８）に対してアラインメントを実施し、複数のアラインメント領域を有するリード、低いアラインメント品質（４０未満のＱ）を有するリード、又は挿入／欠失（ＩＮＤＥＬ）を含有するリードを以降の分析から除外した。ＳＡＭフォーマットのアラインメントを処理するためのソーティング、マージ、インデックス付与、及びプレポジションフォーマットのアラインメントの作製をはじめとする様々なユーティリティーを提供するＳＡＭｔｏｏｌｓソフトウェア（バージョン１．３．１）を使用してファイルアラインメントのフィルタリングを実施した。
【００５６】
次にＳＡＭｔｏｏｌｓ  ｍｐｉｌｅｕｐを使用して複数の試料から同時に得られたアラインメントの結果のデータを重層した。自製のスクリプトを実行して各ゲノム位置における異なるＡＴＧＣヌクレオチドの数を数えた（「ベースカウント」）。その自製のスクリプトは各ゲノム位置について「Ｇ」を有するリードのパーセンテージ（「Ｇ」リード数／（「Ｇ」リード数＋「Ａ」リード数）×１００）を計算する。「Ａ」基準に対する「Ｇ」リード中で０．１を超えるパーセンテージを有するゲノム位置がそのスクリプトによって自動的に検出され、「Ａ−ｔｏ−Ｉ編集部位」として見なされる。最後の段階でＰＤＥ８Ａ転写物の全ての可能なアイソフォームのパーセンテージを計算した。定義によると所与の編集「部位」におけるＲＮＡ編集の相対的な割合はこの唯一のゲノム座標において評価された編集修飾の合計を表す。逆にｍＲＮＡアイソフォームは同じ転写物上に複数の編集修飾を含んでも含まなくてもよいユニークな分子である。例えば、ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡアイソフォームＢＣは同じ転写物内の部位Ｂと部位Ｃの両方において修飾を含む。
【００５７】
７）逆転写及び定量的リアルタイムＰＣＲ
Ｔａｋａｒａ社のキット（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ、Ｔａｋａｒａ社、参照番号ＲＲ０３７Ａ）を使用して逆転写を実施した。それにより生じたｃＤＮＡを２０μｌの最終体積中にＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、参照番号４３６９０１６）及び次の特定の遺伝子プローブ、すなわちＡＤＡＲ１ａ（Ｈｓ０１０２０７８０）、ＡＤＡＲ１ｂ（Ｈｓ０１０１７５９６）、ＡＤＡＲ２（Ｈｓ００２１０５６２）、ＰＤＥ８Ａ（Ｈｓ００４００１７４）、ＧＡＰＤＨ（Ｈｓ０２７５８９９１）、β２Μ（Ｈｓ００９８４２３０）、ＨＰＲＴ１（Ｈｓ０２８００６９５）、ＰＧＫ（Ｈｓ９９９９９９０６）及びＴＢＰ（Ｈｓ００４２７６２０）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）と混合した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲ機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）上の９６ウェルプレート中で、又はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０リアルタイムＰＣＲ機（Ｒｏｃｈｅ社）上の３８４ウェルプレート中で定量的ＰＣＲを実施した。うつ病患者及び自殺企図者について実施される前記調査のために全ての患者における標的遺伝子発現の定量をＧＡＰＤＨ及びβ２Μの発現に対して正規化し、各試料における標的遺伝子の発現変化を２−ΔΔＣｔによって計算した。慢性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）患者について実施される前記調査のために二次導関数絶対的定量を用い、４種類のハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、ＰＧＫ、及びＴＢＰ）の幾何平均により正規化して分析を実施した。
【００５８】
８．データの統計分析
「Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ」統計オープンソースソフトウェアとＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン７．０）［１２、１３］を使用して全ての統計学と数字を計算した。通常、バイオマーカー（すなわちＰＤＥ８ＡのＲＮＡ編集部位とアイソフォーム及びＡＤＡＲ類のｍＲＮＡ発現）の値は平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として提示される。マン・ホイットニー検定を用いて差の分析を実施し、０．０５未満のｐ値を統計学的に有意であると見なした。全てのデータ分布はそれぞれのバイオマーカーの有意性について中央値と棒グラフ又は箱ひげ図として示されている。
【００５９】
部位とアイソフォームの両方について、ＰＤＥ８Ａ遺伝子の相対的な転写物レベルに対して調整することによりＲＮＡ編集の相対的な割合を分析した。調整されたＲＮＡ編集値は次のように計算された。
調整された編集値＊＝（ＲＮＡ編集値×相対的な転写物レベル）／１００
【００６０】
「自殺企図者」群を検出する能力を表す感度と「情動障害対照」群を検出する能力を表す特異度によってバイオマーカーの診断成績を特徴づけることができた。診断検査の評価結果はこれらの明確に規定された２群を比較する２×２分割表に要約可能である。カットオフ値を固定するとその検査の結果に応じた陽性又は陰性のどちらかに類別される区分にそれらの２群を分類することが可能になる。特定のバイオマーカーが提供されると我々は多数の（ａ）自殺企図者群の中の陽性の検査結果を有する患者（「真陽性」：ＴＰ）と（ｂ）「情動障害対照」群の中の陰性の検査結果を有する患者（「真陰性」：ＴＮ）を特定することができる。同様に（ｃ）「自殺企図者」群の中の陰性の検査結果を有する患者（「偽陰性」：ＦＮ）と（ｄ）「情動障害対照」群の中の陽性の検査結果を有する患者（「偽陽性」：ＦＰ）も認められる。感度はＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）として定義され、それは本明細書において「真陽性率」と呼ばれる。特異度はＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）として定義され、それは本明細書において「真陰性率」と呼ばれる。
【００６１】
受信者操作特性（ＲＯＣ）分析を用いて各バイオマーカーの精度及びその判別能力を評価した。ＲＯＣ曲線は検査の感度（Ｓｅ）と特異度（Ｓｐ）との間の相互関係を様々な値についてグラフによって視覚化したものである。
【００６２】
さらに、多変量アプローチを例えばｍＲＯＣプログラム又はロジスティック回帰［１４］として用いて全てのバイオマーカーを互いに組み合わせて感度と特異度の上昇の可能性を評価した。ｍＲＯＣは一次結合を特定するための専用プログラム［１５、１６］であり、ＲＯＣのＡＵＣ（曲線下面積）を最大化する［１７］。それぞれの組み合わせについての方程式が次として提供され、新しい仮想マーカーＺとして使用可能である。
Ｚ＝ａ×バイオマーカー１＋ｂ×バイオマーカー２＋ｃ×バイオマーカー３、
式中、ａ、ｂ、ｃは算出された係数であり、バイオマーカー１、２、３はバイオマーカーのレベルである。
【００６３】
相対的な気分障害リスクを見積もるために異なる組み合わせの編集部位及び／又はアイソフォーム及び／又はＡＤＡＲ類遺伝子発現値を患者に対して使用してロジスティック回帰モデルを適用する。
【００６４】
Ｋ−メジアンアプローチ又はＫ−平均値アプローチ［１８］を使用してインターフェロン調査から患者クラスターを確認した。例えば、ＭＥＶ  ｖ４．９ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｍ４．ｏｒｇ／ｍｅｖ／）を使用し、距離についてピアソン相関又はユークリッド相関を使用してＫ−メジアン分析を計算した。同じクラスター内に存在する全ての患者は他のクラスターの患者とは異なると考えられた。
【００６５】
実施例２：自殺企図者調査
本臨床調査に含まれた患者の特徴が表Ｉに示されている。この有望な調査には精神疾患を有すると診断された３８人の患者が登録し、自殺を試みることが無かった１８人の患者からなる群（情動障害対照、ＡＣ）に対して全員が自殺を少なくとも一回試みている２０人の患者からなる群（ＳＡ）を比較した。患者の年齢は２０歳から７７歳の範囲であった（平均値±ＳＤ：５０．１６±１３．５）。そのコホートは９人の男性（２３．６８％）と２９人の女性（７６．３２％）によって構成された。全ての患者が抑うつ障害を発現した。自殺未遂回数は１回から２０回の範囲であり、３．４±４．５２の平均値±ＳＤであった。
【００６６】
実施例３：次世代シーケンシング（ＮＧＳ）法を用いるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ編集の分析
我々はキャピラリー電気泳動一本鎖高次構造多型（ＣＥ−ＳＳＣＰ）法（２０１１年６月２４日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０６０４４４号明細書）を用いてＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡの編集プロファイルを決定するために使用される方法を以前に説明した。本発明において我々は、試験される全ての部位について確実な定量を可能にする充分な塩基当たりの深度を提供する次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に基づいたＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡの編集レベルを定量する新しい実験系を開発した。この方法はＰＣＲベースであるので我々は最初に目的のＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ領域を増幅するために幾つかのプライマーペア（表ＩＩ）を選択した。その領域を特異的に増幅するために次の選択基準に合致する異なるプライマーの組み合わせを試験した。すなわち、１）１８〜２７ヌクレオチド長の間のオリゴであり、２）好ましくは６０℃近辺（５７〜６３℃）の融点を有し、３）５０％近辺の最適なＧＣ含量を有し、４）許容可能な最大反復長が５モノヌクレオチドであり、且つ、５）図１に示されている目的の領域を特異的に増幅すること。ＲＮＡ編集の正確な定量に干渉する非特異的増幅産物を生成するプライマーペアもあったため、Ｓｅｑ２−フォワード及びＳｅｑ−３リバースを含む最適なプライマーペアを提供する（表ＩＩ参照）。
【００６７】
実施例４：ウルトラディープシーケンシングによるヒトＰＤＥ８Ａ遺伝子の第９イントロン内の新しい編集部位の特定
Ｏｒｌｏｗｓｋｉと共同研究者はこれまでにヒトＰＤＥ８Ａ遺伝子の第９イントロン内に８か所の編集部位（ＡからＨまで）を特定している（表ＩＩＩ参照）［１０］。その後、我々はこの同じ領域内にさらに６か所の編集部位（ＩからＮまで）を特定した（２０１１年６月２４日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０６０４４４号明細書）。大半のＡＤＡＲ活性はまとまって生じることが幾つかの研究から指摘された［１９、２０］。当然のことながら我々はＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞株に対してＮＧＳベースシーケンシングを使用してヒトＰＤＥ８Ａ遺伝子の第９イントロン内に以前に特定された編集部位を確認し、且つ、新しいＡ−ｔｏ−Ｉ編集部位を特定した。これらの新しい編集部位はＯ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、及びＺＺと名付けられた（表ＩＩＩ、図１参照）。うつ病患者及び自殺企図者を用いる本研究の幾人かの患者に由来する血液試料中にこれらの編集部位の大半（Ａ〜Ｈ、Ｊ〜Ｍ、Ｏ、Ｐ、Ｒ〜Ｕ、及びＸ〜ＺＺ）が存在することも確認された。
【００６８】
【表３】
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【００６９】
実用上の理由からＰＤＥ８Ａ転写物内の目的の座位のディープシーケンシング向けの標準的条件の最適化をＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞株から得られたヒト試料に対して実施した。これによりヒトＰＤＥ８Ａ遺伝子の第９イントロン内にこれまでに報告されていない新しい編集部位が特定された（下線付きの太字、番号１５〜２７）。それらの新しい編集部位はＯ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、及びＺＺと名付けられている。ゲノム座標はヒトゲノムの１５番染色体上のＰＤＥ８Ａ（ＧＲＣｈ３８：８４，９８０，４４０）に対して比較されている。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株の列はその特定のヒト神経芽細胞腫細胞株において編集部位が特定されたことを指す。血液の列は白血球がＰＡＸｇｅｎｅ血液ＲＮＡチューブに採取されたことを指す。Ｘはその編集部位が０．１％超のカットオフ値で少なくとも１人の患者において評価されている場合を表す。
【００７０】
実施例５：ウルトラディープシーケンシングによりヒト白血球において特定されたＲＮＡ編集部位
情動障害対照群から０．１％超のカットオフ値で評価されたＲＮＡ編集部位（平均値±ＳＥＭ）だけが表ＩＶ及び図３に報告されている（表ＩＶ及び図３参照）。
【００７１】
【表４】
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【００７２】
定義によると所与の編集「部位」におけるＲＮＡ編集の相対的な割合はこの唯一のゲノム座標において評価された編集修飾の合計を表す。逆にｍＲＮＡアイソフォームは同じ転写物上に複数の編集修飾を含んでも含まなくてもよいユニークな分子である。例えば、ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡアイソフォームＢＣは同じ転写物内の部位Ｂと部位Ｃの両方において修飾を含む。
【００７３】
実施例６：ＡＤＡＲ１ａ、１ｂ、及び２のｍＲＮＡ発現は自殺企図者の血液において増加する
我々はＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲアッセイを用いていわゆるデルタデルタＣＴ法によりＡＤＡＲ１ａ遺伝子、ＡＤＡＲ１ｂ遺伝子、及びＡＤＡＲ２遺伝子のｍＲＮＡ発現を分析した（それぞれ図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｃ）。ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ、及びＡＤＡＲ２の発現レベルはＡＣにおいてそれぞれ２．６から２５まで（平均値±ＳＤ：１０．２±６）、２．０４から１４．０９まで（平均値±ＳＤ：５．９±３．３）、及び１．２５から５０．５まで（平均値±ＳＤ：１２．４±１３．１）変化した。ＳＡ（ｎ＝２０）ではＡＤＡＲ１ａ、１ｂ、及びＡＤＡＲ２のｍＲＮＡ発現レベルはそれぞれ４．２と４９．５の間（平均値±ＳＤ：１７．８±１１．７）、３と３３．８の間（平均値±ＳＤ：１０．６±７）、及び３．８と６２の間（平均値±ＳＤ：１７．８±１６．１）で構成された。ＡＤＡＲ１ａ遺伝子とＡＤＡＲ１ｂ遺伝子の発現はＡＣと比較してＳＡにおいて有意に高く、平均値がそれぞれ１０．２及び５．９に対して１７．８及び１０．６であった（ｐ＝０．０４３５及び０．００４７）。
【００７４】
実施例７：ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡの発現は自殺企図者において高い
同様にＡＣ群と比較してＳＡ群においてＰＤＥ８Ａ発現レベルの変化が観察された（図４Ｄ）。実際、ＰＤＥ８Ａ発現はＡＣにおいて４．７から１９．９まで（平均値±ＳＤ：９．２±３．３）変化し、一方でそのレベルはＳＡにおいて７．５と３２．８の間（平均値±ＳＤ：１５．７±７．１）の範囲であった。ＡＤＡＲ類と同様にＰＤＥ８Ａ発現も情動障害群よりもＳＡ群において有意に高かった（ｐ＝０．００１３）（図４Ｄ）。このことは自殺行動についての追加のバイオマーカーがＰＤＥ８Ａによって提供される可能性もあることを示唆する。
【００７５】
実施例８：自殺企図者ではＰＤＥ８Ａの部位ＢにおけるｍＲＮＡ編集が増加し、非編集型（Ｎｅ）ＰＤＥ８Ａ転写物が減少する
Ａ）ＰＤＥ８Ａの部位ＢにおけるｍＲＮＡ編集
我々はＮＧＳアッセイを用いてＡＣ患者とＳＡ患者の間でＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ編集プロファイルを分析した。図５Ａに示されているように、我々は部位Ｂにおいて編集されたＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡの相対的な割合がＡＣと比較してＳＡにおいて高いことを発見した。ＡＣ（ｎ＝１８）ではＰＤＥ８Ａ編集転写物は１１．２〜２１．８％の範囲内にあり、平均値は１７．４％（ＳＤ±２．８％）であった。ＳＡ（ｎ＝２０）では編集変異体のレベルは１２．３〜２６．７％の範囲内にあり、平均値は２０．２％（ＳＤ±３．７％）であった。ＡＣの値とＳＡの値の間には有意差があった（ｐ＝０．０１）。さらに、我々はＰＤＥ８Ａ遺伝子の部位ＢにおけるＲＮＡ編集の相対的な割合をＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ（部位Ｂ＊）の相対的な発現レベルに対して調整した。図５Ｂに結果が提示されている。部位ＢにおけるＲＮＡ編集を調整することでｐ値によって示されるＡＣ群とＳＡ群との間の差がさらに強調された（ｐ＜０．０００１）。
【００７６】
Ｂ）非編集型ＰＤＥ８Ａ転写物
我々は情動障害対照（ＡＣ）及び自殺企図者（ＳＡ）における非編集型ＰＤＥ８Ａ転写物の相対的な割合を分析した。非編集型ＰＤＥ８Ａ転写物の相対的な割合はＳＡと比較してＡＣにおいて高い。ＡＣではＰＤＥ８Ａ非編集型転写物の相対的な割合は７７．１〜８７．９％の範囲内であり、平均値は８１．７％（ＳＤ±２．９％）であった。ＳＡでは非編集型転写物のレベルは７１．５〜８７．２％の範囲内であり、平均値は７８．９％（ＳＤ±３．８％）であった。ＡＣの値とＳＡの値の間には有意差があった（ｐ＝０．００９４）。
【００７７】
実施例９：自殺傾向の血液中バイオマーカーとしてのＡＤＡＲ１ａ及びＡＤＡＲ２のｍＲＮＡ発現によって調整済みのＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ編集
我々は自殺傾向のバイオマーカーとしてＡＤＡＲ類及びＰＤＥ８Ａの発現（表Ｖ（Ａ）参照）、調整済みの様々な部位におけるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ編集（部位Ａ＊〜Ｇ＊、Ｚ＊、及びＺＺ＊、表Ｖ（Ｂ））、及び様々なアイソフォーム（表Ｖ（Ｃ））を使用する本診断の成績を、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて評価した。表Ｖは個々のバイオマーカーについての結果を示している。我々は０．８７８という値を有する最大の曲線下面積（ＡＵＣ）をＰＤＥ８Ａの部位Ｂ＊におけるｍＲＮＡ編集に見出した（表ＶＢ）。ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡアイソフォームＢを用いて同じ結果が得られた（表Ｖ（Ｃ））。
【００７８】
【表５】
2019524115.tif 000007
【００７９】
2019524115.tif 000008
【００８０】
2019524115.tif 000009
【００８１】
表Ｖ（Ａ）はＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ、ＡＤＡＲ２、及びＰＤＥ８Ａの相対的な発現の診断成績を表す。表Ｖ（Ｂ）はＰＤＥ８Ａの個々の編集部位の診断成績を表す。表Ｖ（Ｃ）はＰＤＥ８Ａの個々の編集アイソフォーム又は非編集転写物（Ｎｅ）の診断成績を表す。０．１未満のｐ値を有するものとして規定される最も適切な編集アイソフォームと編集部位のみが提示されている。マン・ホイットニー検定を用いてｐ値を計算した。記号「＊」はＰＤＥ８Ａの編集部位又は編集アイソフォームがそのｍＲＮＡの相対的な発現に対して調整されていることを表す。
【００８２】
ＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ編集を他のＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ編集部位又はアイソフォーム及びＡＤＡＲ類のｍＲＮＡ発現などの他のバイオマーカーと共に含む複合アプローチによって、将来の自殺を予測する我々の能力が強化可能であるか、我々はさらに調査した。
【００８３】
例えば、ｍＲＯＣ曲線がＰＤＥ８Ａの部位Ｂ＊における編集のみを用いることによる０．８７８というＡＵＣからＰＤＥ８Ａの部位Ａ＊におけるｍＲＮＡ編集をＡＤＡＲ１ａ及びＡＤＡＲ２のｍＲＮＡ発現と共に付け加えることによる０．９５６というＡＵＣに向上することを我々は見出した（表ＶＩ、表ＶＩＩ第６行、及び図６参照）。表ＶＩＩに記載される他の組み合わせによって０．８７８（ＡＤＡＲ１ｂのｍＲＮＡ発現とＰＤＥ８Ａの部位Ｂ＊、第３０行）と０．９６４（ＡＤＡＲ１ａ及びＡＤＡＲ２のｍＲＮＡとＰＤＥ８ＡアイソフォームＢ、アイソフォームＢＣ、及びアイソフォームＤのｍＲＮＡ編集、第１行）の間のＡＵＣを有する好適な診断成績が得られた。
【００８４】
【表６】
2019524115.tif 000010
【００８５】
ＡＤＡＲ１ａ＋ＡＤＡＲ２＋ＰＤＥ８Ａ＿部位Ａ＊＋ＰＤＥ８Ａ＿部位Ｂ＊という組み合わせによって得られる情動障害対照を自殺企図者に対して比較する多変量ＲＯＣ曲線の複合診断成績の表である。
【００８６】
ロジスティック回帰モデル又はｍＲＯＣアプローチを用いる統計分析によって類似の結果が生じた（表ＶＩＩＩ、図７）。両方の方法がＡＤＡＲ１ａのｍＲＮＡ発現＋ＰＤＥ８Ａ部位Ｂ＊のｍＲＮＡ編集について同一の精度を示した（表ＶＩＩ第２９行及び表ＶＩＩＩ第３行、及び／又は図７）。
【００８７】
【表７】
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【００８８】
2019524115.tif 000012
【００８９】
ｍＲＯＣアプローチによりバイオマーカーの全ての組み合わせを実施した。組み合わせは、例えば、ＡＤＡＲ類のｍＲＮＡ発現とＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡ部位編集（調整＊又は非調整）の組み合わせ、ＡＤＡＲ類のｍＲＮＡ発現とＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡアイソフォーム編集（調整＊又は非調整）の組み合わせ、ＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡ部位編集（調整＊又は非調整）の組み合わせ、ＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡアイソフォーム編集（調整＊又は非調整）の組み合わせであり得た。例えば、ｍＲＯＣプログラムによって計算されるＡＤＡＲ１ａ＋ＡＤＡＲ２＋ＰＤＥ８Ａ＿部位Ａ＊＋ＰＤＥ８Ａ＿部位Ｂ＊というバイオマーカーの組み合わせについての方程式は（ａ）Ｚ＝０．０２３２７×［ＡＤＡＲ１ａ］−０．０２６４７４×［ＡＤＡＲ２］−１６．６９０３×ＰＤＥ８Ａ＿部位Ａ＊＋０．９９３１１×［ＰＤＥ８Ａ＿部位Ｂ＊］であり得た。これらの方程式を使用して新しい仮想マーカー（Ｚ）を計算して患者の診断を実施した。記号「＊」はＰＤＥ８Ａの編集部位又は編集アイソフォームがそのｍＲＮＡの相対的な発現に対して調整されていることを表す。
【００９０】
【表８】
2019524115.tif 000013
【００９１】
ロジスティック回帰を用いてバイオマーカーの組み合わせの精度及びその判別能力を評価した。組み合わせとしては、例えば、ＡＤＡＲ類の発現とＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡ部位編集（調整＊又は非調整）の組み合わせ、ＡＤＡＲ類のｍＲＮＡ発現とＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡアイソフォーム編集（調整＊又は非調整）の組み合わせ、ＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡ部位編集（調整＊又は非調整）の組み合わせ、ＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡアイソフォーム編集（調整＊又は非調整）の組み合わせが考えられた。例えば、ロジスティック回帰によって計算されるＡＤＡＲ１ａ＋ＰＤＥ８Ａ＿部位Ｂ＊というバイオマーカーの組み合わせについての方程式はＰ＝Ｌｏｇｉｔ−１（０．０５６４×［ＡＤＡＲ１ａ］＋１．９０１２×［ＰＤＥ８Ａ＿部位Ｂ＊−４．６８８４９］であり得た。これらの方程式を使用して確率Ｐを計算して患者の診断を実施した。Ｐ（ｌｏｇｉｔ）は患者が「自殺企図者」の区分に属する確率である。記号「＊」はＰＤＥ８Ａの編集部位又は編集アイソフォームがそのｍＲＮＡの相対的な発現に対して調整されていることを表す。
【００９２】
実施例１０：ＩＦＮ−α療法時のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染患者におけるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ編集の増加
慢性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症のＩＦＮ−α療法時の大うつ病は一般的であり、発生率は最大４５％である［２１］。このモデルは短い期間（数週間）内でうつ病及び／又は薬原性精神的副作用について個人を評価するユニークな機会である。縦断的調査は各患者が自身の基準対照として作用し、遺伝的変異性及び環境的影響を除外するという大きな利点を有する。さらに、ＡＤＡＲ１ａはインターフェロンによる刺激によって誘導可能である［２２］。本調査では我々はＨＣＶ患者のＩＦＮ−α治療中にＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ編集が変化するか調査する。６人のＨＣＶ患者を事前に治療４週間前に評価し、１２週間のＩＦＮ−αとリバビリンによる治療期間にわたって２週間毎に評価した（図８）。概して我々は、ＩＦＮ−α治療後に全ての患者で部位ＢにおけるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ編集が増加することを観察した。例えば、２人の代表的な患者においてＰＤＥ８Ａの個々の部位におけるＲＮＡ編集の相対的な割合及びＡＤＡＲ類の遺伝子発現をさらに分析することで、我々はＩＦＮ−α治療に対する応答についての個人間の明確な差を観察することができた。患者１では、ＩＦＮ−αに応答したＡＤＡＲ類遺伝子発現の誘導を観察することができなかったがＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡ編集の緩やかな増加を観察することができた（図９Ａ、９Ｃ）。逆に患者２では、ＡＤＡＲ類の発現の急速で力強い増加（図９Ｂ）、並びにＰＤＥ８Ａ  ＲＮＡ編集の急速で力強い増加を観察することができた（図９Ｄ）。概して、ｋ−メジアンアプローチを用いることで６人全ての患者のクラスター化により異なるＩＦＮ−α介在性応答が確認され、２つの異なる患者群が示唆された（図１０）。第１の患者群（クラスター１）は、曲線の急な傾きによって認められるように、ＡＤＡＲ１ａ転写物レベルと部位ＢにおけるＰＤＥ８Ａ編集の両方に対して顕著で急速なＩＦＮ−α介在性応答を有する（図１０）。第２の患者群（クラスター２）は、患者１について観察されたように、他の患者と比較して緩やかな応答を有する（図９Ａ〜９Ｃ）。ＭＡＤＲＳ（モントゴメリー・アスベルグうつ病尺度）検査、ＭＩＮＩ（精神疾患簡易構造化面接法）検査、ＭＡＴｈｙＳ（躁うつ病寛解状態多面的評価尺度）検査、及びＹＭＲＳ（ヤング躁病評価尺度）検査を用いて全ての患者を臨床的に評価した。上述の検査によって測定される過敏状態及び／又は抑うつ状態などの気分の変化が精神医学的評価によって明確に示された。
【００９３】
実施例１１：非反復自殺企図者における経時的なＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ編集の減少
自殺未遂は将来の自殺企図についての最も強力なリスク因子のうちの１つを構成する［２３、２４］。自殺から１年の間の自殺再企図率は１２〜１５％の範囲である［２５、２６］。２８人の患者を含む追跡調査（表１（Ｂ））において我々は初回の通院時と６か月後のこれらの患者の臨床評価を分析した。我々は自殺を再度試みなかった（ＮＲＳＡ）第１の群（ｎ＝２０）とその期間に少なくとも一回は自殺を試みた患者（ＲＳＡ）からなる第２の群（ｎ＝８）２つの異なる亜群に群全体を分割した。６か月の追跡調査期間におけるこの群の自殺未遂の平均回数は１．８７５回であった。３種類の独立した臨床評価スコア（ハミルトン、ＭＡＤＲＳ、及びＢＤＩ）を用いてそれらの患者をモニターし、ＮＲＳＡ群では追跡調査中に著しい改善がＢＤＩスコアに見られた（図１１Ａ）。他方、ＲＳＡ群の臨床評価には改善が見られず、ＭＡＤＲＳスコアの著しい悪化さえ見られた（図１１Ｂ）。それらの臨床評価を前記バイオマーカー（ＰＤＥ８Ａ遺伝子のＲＮＡ編集）に対して比較するために我々は追跡評価時のこれらの患者の白血球におけるＲＮＡ編集を分析した（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。我々はＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ編集が６か月の期間に非反復自殺企図者（ＮＲＳＡ）と反復自殺企図者（ＲＳＡ）との間で変調するか調査した。興味深いことに、ＲＳＡ群では部位Ｂだけが変化する一方でＮＲＳＡ群では全てのＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ編集部位が著しい変化を示しており、それらの患者の精神状態の改善を示唆的に示した。
【００９４】
実施例１２：ＩＦＮ−α療法中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染患者におけるＰＤＥ８Ａ  ｍＲＮＡ編集の変化
慢性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症のＩＦＮ−α療法時の大うつ病は一般的であり、発生率は最大４５％である［２１］。このモデルは短い期間（数週間）内でうつ病及び／又は薬原性精神的副作用について個人を評価するユニークな機会である。本調査では我々は充分な文献があり、且つ、充分に特徴解析された、ＩＦＮ及びリバビリンを使用する抗ウイルス剤治療を受けているＣ型肝炎ウイルス感染患者において観察される気分の変化を活用した。精神疾患の履歴が無いＣ型肝炎ウイルスを有する１０人の個人からなる小コホートをフランスの異なる病院で動員した。患者は調和のとれた精神医学的評価を動員時に受け、そして治療期間中に一定の間隔で繰り返し受けた。この特定の設定では各患者が自身の対照として作用し、その患者における進展を経時的にモニターすることができる。ＭＡＤＲＳ（モントゴメリー・アスベルグうつ病尺度）検査、ＭＩＮＩ（精神疾患簡易構造化面接法）検査、ＭＡＴｈｙＳ（躁うつ病寛解状態多面的評価尺度）検査、及びＹＭＲＳ（ヤング躁病評価尺度）検査を用いて全ての患者を臨床的に評価した。上述の検査によって測定される過敏状態及び／又は抑うつ状態などの気分の変化が精神医学的評価によって明確に示された。ＩＦＮを使用して治療される各患者に起こる事象をより詳細にさらに調査するため、我々は１２週間の治療期間のＭＡＤＲＳスコアを分析した。我々は情動反応性と共に高いＭＡＤＲＳスコアを有する各患者が気分を変化させる（うつ病になる）と考えた。１０人の患者のうち３人の患者が抑うつエピソードを有すると分類された。
【００９５】
縦断的調査は各患者が自身の基準対照として作用し、遺伝的変異性及び環境的影響を除外するという大きな利点を有する。さらに、ＡＤＡＲ１ａはインターフェロンによる刺激によって誘導可能である［２２］。ＡＤＡＲ２遺伝子発現は治療期間中に変化しなかったが、治療開始から２週間という早い時期にＡＤＡＲ１ａ及びＡＤＡＲ１ｂの転写物レベルの明らかな上方制御が認められた（図１２Ａ、表ＩＸ）。ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ、及びＰＤＥ８Ａの間で観察された同様の発現プロファイルは抗ウイルス治療によってこれらの遺伝子が特異的に変化することを示唆している。ウルトラディープシーケンシングアプローチを適用することで相対的なＰＤＥ８Ａ転写物レベルに対して調整されたＰＤＥ８Ａ遺伝子のＲＮＡ編集を分析し、コンピュータで解析した（図１２Ｂ）。治療期間中にＰＤＥ８Ａ遺伝子発現が著しく増加したので相対的なＰＤＥ８Ａ転写物レベルに対して調整することでＰＤＥ８Ａ遺伝子のＲＮＡ編集の分析を行った。顕著なことに、ＰＤＥ８Ａ転写物のＲＮＡ編集の増加は全調査集団において非常に均一であり、ＰＤＥ８Ａ転写物の部位Ｂにおける全編集が２週間以内に二倍になった。これらの部位におけるＲＮＡ編集の全体的な増加は治療開始から２週間と４週間の間にプラトーレベルに達した（図１２Ｃ）。ＳＨ−ＳＹ５Ｙにおいて得られた以前のデータと一致して、Ｃ型肝炎ウイルス感染患者におけるＩＦＮ注射によってそれらの患者の白血球においてＲＮＡ編集活性の急速で力強い上昇が誘導された。遺伝子発現のデータを組み合わせることで抑うつエピソードを有する群と有しない群との間で顕著な差が観察された（図１３Ａ）。興味深いことに、遺伝子発現データと組み合わせてＰＤＥ８Ａ転写物のＲＮＡ編集を特定的に分析することでも同様の分離が観察された（図１３Ｂ）。治療期間中に精神医学的事象を経験するリスクがあるＩＦＮ処置患者の特定においてＲＮＡ編集と特定の遺伝子発現バイオマーカーを組み合わせることで高い特異度と感度が示された（表Ｘ、図１３Ｄ）。最後に我々は特定のアルゴリズムを全ての時点の全ての患者に適用してリスクがある患者を特定するための混合バイオマーカーを検査した（図１４）。それらのバイオマーカーの組み合わせはうつ病を発症する３人の患者を検出するパイロット試験の全期間にわたって非常に堅調であり、偽陰性であったのは１８コールのうちの３コール（１６％）であった。他方、うつ病の臨床徴候を示さない患者からなる群における４２の結果のうちのわずかに３つの結果が偽陽性であった（７％）。まとめると、特定された血液バイオマーカーによってＩＦＮなどの薬物治療の背景でうつ病を発症するリスクを有する患者を正確且つ堅実に検出することが可能になる。
【００９６】
【表９】
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【００９７】
ウィルコクソン検定によって得られたｐ値、誘導倍率、及びＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）が表ＩＸによってまとめられている。ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂ、及びＰＤＥ８Ａが著しく増加したときにＡＤＡＲ２発現は調査期間中に変化しなかった。
【００９８】
【表１０】
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【００９９】
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【図１】
2019524115.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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