(57)【要約】  本発明の分野は、多光子吸収による三次元構造体の製造の分野である。本発明の目的は、生分解性および／または生体適合性および／または生体吸収性である三次元構造体の製造に用いることができる多光子吸収によって活性化することができる感光性組成物を提供することである。したがって、この構造体は、細胞培養のためのマトリックスとして使用することができる。感光性組成物は、−  ゼラチン、−  コラーゲン、−  いくつかの光子によって励起され、一重項酸素を生成することができる水溶性光開始剤、−  必要に応じて細胞接着促進剤、−  及び水を含む。また、本発明は、感光性組成物の製造方法、該感光性組成物から三次元構造体を製造する方法、該製造方法により得られた三次元構造体及び該構造体を含む細胞培養用マトリックスに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多光子吸収によって活性化され得る感光性組成物であって、
−  ゼラチン、
−  コラーゲン、
−  いくつかの光子によって励起され、一重項酸素を生成することができる水溶性光開始剤、
−  必要に応じて細胞接着促進剤、
−  及び水
を含む、感光性組成物。
【請求項２】
水に対して10〜50質量％、好ましくは10〜30質量％、より好ましくは15〜25質量％の量のゼラチンを含むことを特徴とする、請求項１に記載の感光性組成物。
【請求項３】
水に対して1〜5質量％、好ましくは2〜4質量％の量のコラーゲンを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の感光性組成物。
【請求項４】
水に対して0.5〜10質量％、好ましくは1〜5質量％、より好ましくは1〜5質量％，さらにより好ましくは1〜2質量％の量の光開始剤を含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の感光性組成物。
【請求項５】
光開始剤が、遷移金属錯体から、好ましくはルテニウム（II）、オスミウム（II）、イリジウム（III）、パラジウム（II）、白金（II）、クロム（III）錯体およびそれらの混合物から選択されることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の感光性組成物。
【請求項６】
前記光開始剤がジクロロトリス（1,10-フェナントロリン）ルテニウム（II）であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の感光性組成物。
【請求項７】
室温でゲルの形態で、40℃以上に加熱した際に液体の形態で存在することを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の感光性組成物。
【請求項８】
活性化合物をさらに含むことを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の感光性組成物。
【請求項９】
以下の主な工程：
−  ゼラチン、コラーゲン、光開始剤および水の混合物を調製する工程；
−  化合物が水に溶解するまで混合物を30〜60℃、好ましくは40〜50℃の温度に加熱する工程；
−  組成物を室温に冷却し、ゲルの形成をもたらす工程
を含むことを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の感光性組成物の製造方法。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか一項に記載の感光性組成物から生産されることを特徴とする三次元構造体。
【請求項１１】
1〜5μmの線幅を有することを特徴とする、請求項１０に記載の三次元構造体。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の三次元構造体を含むことを特徴とする、細胞培養用マトリックス。
【請求項１３】
以下の主な工程：
−  感光性組成物のアリコートをサンプリングする工程；
−  多光子吸収による架橋を誘発するのに十分な波長および十分な強度の光源にアリコートの一部を露光する工程；
−  架橋されていない部分をすすぐ工程
を含むことを特徴とする、請求項１０または１１に記載の三次元構造体の製造方法。
【請求項１４】
光源がレーザー、好ましくは532、780または1062nmの波長を有するレーザー、好ましくは1ナノ秒未満のパルス持続時間を有するパルスレーザーであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
非架橋部分のすすぎ工程は、10分〜1時間、好ましくは15〜5分、より好ましくは25〜35分の継続時間で、好ましくは30〜55℃、好ましくは35〜40℃の温度で二重蒸留水にアリコートを配置することによって実施されることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、多光子吸収による三次元構造体の製造の分野である。
【０００２】
特に、本発明は、三次元製造のための感光性組成物、この組成物から得られる三次元構造体、及び多光子吸収を活性化プロセスとして用いる製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物学において、三次元構造体の製造は、特に、組織工学の分野で使用される。
【０００４】
組織工学は、例えば、インビボで移植され得る皮膚、軟骨または骨のような機能的組織代替物を作製することからなる。これらの機能的組織代替物は、細胞によってコロニー形成されたマトリックス（または多孔性の三次元支持体）である。したがって、これらのマトリックスは、細胞の増殖を可能にし、続いて生体内に移植することができる適切な寸法および特性を持たなければならない。特に、これらのマトリックスは、無毒性、好ましくは生体適合性、生分解性または生体吸収性でなければならない。
【０００５】
このようなマトリックスを生産するために、例えばエレクトロスピニング（electrospinning）のような多くの技術を使用することができる。しかしながら、これらの技術は、一般に、制御された再現可能なアーキテクチャおよび／または時には求められる応用に必要な良好な製造分解能を有することを可能にしない。
【０００６】
これらの問題を克服するために、多光子吸収がこのようなマトリックスの三次元製造に適用されている。この技術は、適合した集束光学系を用いて感光材料上に光源（一般にレーザー）を集束させることからなる。これは、多光子吸収が有効である、言い換えると、光源の強度が最大となる光源の焦点のみ（非線形吸収事象）で、光化学反応（一般的に重合または架橋反応）を誘導する。したがって、コンピュータ支援設計ソフトウェアを使用することにより、感光材料を3軸x、yおよびzに沿って移動させることによって、制御された再現可能なアーキテクチャおよび良好な分解能を有する三次元構造体を製造することが可能になる。多光子吸収による三次元構造体の製造は、例えば、J.P. Fouassier, X. Allonas Editors, (2010) Research Signpost（第14章第199-220頁）の書籍で印刷された、P.L. Baldeck、O. Stephan及びC. Andraudによる”Tri-dimensional mocro-structuration of materials by two-photon induced photochemistry”の章に定義されている。 
【０００７】
多光子吸収により異なる感光材料を使用して三次元構造体を生産することができる。 これらは、例えば、有機−無機ハイブリッド樹脂またはアクリレート系樹脂である。
【０００８】
Ormocer（登録商標）材料は、シリカナノ粒子を含む有機−無機ハイブリッド樹脂である。これらの樹脂は、特に剛性で生体適合性であるため、骨組織代用品の生産に特に有用である。しかしながら、特定の用途では、マトリックスの剛性を調節することが有用であることが判明する可能性があり、このタイプの樹脂では適切ではない。
【０００９】
アクリレート系樹脂は、多くの文献に定義されている：
【００１０】
国際公開第2015/084735A2号は、二光子吸収による三次元構造体を生産するための組成物および方法を規定している。この組成物は、ラジカル重合可能な化合物と光開始剤とを含む感光性液体組成物である。ラジカル重合可能な化合物は、メタクリレート基を含む。
【００１１】
米国特許出願第2012/0098164号は、異なるメタクリレートおよび光開始剤を含む感光性組成物を規定している。この組成物は、2光子吸収により優れた分解能（数μm、さらには数百nm）を有する構造や胃の製造に使用される。
【００１２】
米国特許出願第US2013/0012612号は、二光子吸収によって生体適合性のある三次元構造体を生産する方法を規定している。使用される材料は、重合可能な有機基と、例えばコラーゲンのようなペプチドのような生体適合性、生物分解性または生体吸収性基の両方を有する少なくとも1つの化合物を含む。生体適合性基はそのままで使用することはできず、重合性有機基をそれにグラフトすることによって化学的に修飾することが必要である。重合性有機基は、好ましくは、メタクリレートまたはアクリレート基である。
【００１３】
これらのメタクリレートまたはアクリレート樹脂のベースを有する構造体の剛性はモジュール式であり、Ormocer（登録商標）ポリマーから得られる3D構造体の剛性よりも小さい。しかしならが、アクリレートまたはメタクリレート基を含む構造体の生体適合性に関して疑問が生じる。しかし、上記のように、組織工学の範囲内でこれらの構造体の細胞培養のためのマトリックスとしての使用、およびこれにより、これらの構造体の生体内移植は、生体適合性の増加を必要とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第2015/084735A2号
【特許文献２】米国特許出願第2012/0098164号
【特許文献３】米国特許出願第US2013/0012612号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
これに関連して、本発明は、以下の目的の少なくとも1つを満たすことを目的とする。
【００１６】
本発明の主な目的の1つは、多光子吸収を活性化プロセスとして使用することによって、三次元構造体を生産するために使用することができる感光性組成物を提供することである。
【００１７】
本発明の主要な目的の1つは、生分解性および／または生体適合性および／または生体吸収性である三次元構造体を生産するために使用できる感光性組成物を提供することである。
【００１８】
本発明の別の主な目的は、例えば1〜5μm（マイクロメートル）の線幅を有する優れた解像度を有する三次元構造体を生産するために使用することができる感光性組成物を提供することである。
【００１９】
本発明の別の主な目的は、室温でゲルの形態で提供される感光性組成物を提供することである。
【００２０】
本発明の別の主な目的は、制御された剛性を有する三次元構造体を生産するために使用することができる感光性組成物を提供することである。
【００２１】
本発明の別の主な目的は、自己支持された三次元構造体を生産するために使用することができる感光性組成物を提供することである。
【００２２】
本発明の別の主な目的は、細胞培養のためのマトリックスとして使用することができる三次元構造体を生産するために使用することができる感光性組成物を提供することである。
【００２３】
本発明の別の主な目的は、上で定義した特徴の全てまたは一部を有する感光性組成物から得られる三次元構造体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
これらの目的は、とりわけ、活性化プロセスとして多光子吸収を使用することによって三次元構造体を生産するために使用することができる感光性組成物に関する発明によって達成される。この組成物は、ゼラチン、コラーゲン、いくつかの光子によって励起され、水および場合によりフィブロネクチンなどの細胞接着促進剤から一重項酸素を生成することができる水溶性光開始剤を含む。
【００２５】
本発明はまた、この感光性組成物を用いて製造された三次元構造体およびそのような三次元構造体を製造する方法に関する。
【００２６】
驚くべきことに、このような組成物は、優れた解像度（1μmと5μmとの間の線幅）を有する三次元構造体を製造することを可能にすることが発見された。一重項酸素を生成することができる光開始剤の存在は、多光子吸収を活性化プロセスとして使用することによって、組成物に含まれるタンパク質の架橋を可能にする。光開始剤によって誘発される光化学反応は架橋反応であって重合反応ではないので、重合性基をそれらにグラフトすることによって化合物を化学的に修飾する必要はなく、そのまま使用することができる。
【００２７】
ゼラチンおよびコラーゲンがバイオマス由来の要素であるため、組成物は生体適合性である。さらに、ゼラチン／コラーゲン会合は、良好な機械的特性を有する構造体を生産することを可能にし、フィブロネクチンのような細胞接着促進剤を添加することにより、三次元構造体に対する細胞の親和性が改善される。
【００２８】
本明細書全体にわたって、「Z1とZ2との間」とは、限界Z1とZ2が区間[Z1、Z2]に含まれることを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、実施例３に従って製造された「チキンクープ」型構造体の顕微鏡下の画像を表す。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、実施例４に従って製造され、細胞培養のためのマトリックスとして使用される構造体の共焦点顕微鏡下の画像を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
したがって、本発明は、三次元構造体を生産するために使用され得る多光子吸収によって活性化され得る感光性組成物に関する。この組成物は、
−  ゼラチン、
−  コラーゲン、
−  いくつかの光子によって励起され、一重項酸素を生成することができる水溶性光開始剤、
−  必要に応じて細胞接着促進剤、
−  及び水
を含む。
【００３１】
「感光性組成物」とは、例えば、光照射に感受性である混合物を意味する。
【００３２】
「多光子吸収」とは、与えられた状態の分子による2つ以上の光子の同時吸収を意味し、この分子はより大きなエネルギーの電子状態に進む。この励起は、光源の焦点において光化学反応を誘発する。上記で定義した感光性組成物の場合、2つの光子を同時に吸収するのは光開始剤であり、それは光源の焦点で組成物のタンパク質の架橋を誘導する。ほとんどの場合、多光子吸収は2光子吸収に相当する。
【００３３】
ゼラチンは、グリシンおよびプロリン比の増加したタンパク質である。これは、主に動物の皮膚および骨に含まれるコラーゲンから、コラーゲンの部分加水分解によって得られる。コラーゲンは、Ａ型（コラーゲン酸で処理したものから由来する）、またはＢ型（塩基性コラーゲン処理から由来する）であり得る。酵素的コラーゲン処理によっても得ることもできる。使用されるゼラチンは、好ましくは化学修飾されていない。本発明の一実施形態によれば、使用されるゼラチンは、店舗で入手可能な食品ゼラチン、またはＢ型であり、フレーク、粉末または顆粒の形態であり得る。
【００３４】
本発明の一実施形態によれば、組成物中に含まれるゼラチンの量は、水に対して10〜50質量％、好ましくは10〜30質量％、より好ましくは15〜25質量％である。
【００３５】
コラーゲンは、らせん状に配置された3つのポリペプチド鎖から形成されるタンパク質である。グリシンは、コラーゲンに存在するアミノ酸のほぼ3分の1を占める。コラーゲンはまた、増加したプロリンおよびヒドロキシプロリン比を含む。異なるタイプのコラーゲン、例えばＩ型またはＩＩ型コラーゲンがある。Ｉ型コラーゲンが最も一般的であり、主に皮膚、骨および腱から由来する。ＩＩ型コラーゲンは、主に軟骨から由来する。使用されるコラーゲンは、いかなるタイプのものであってもよく、好ましくは化学修飾されていない。本発明の好ましい実施形態によれば、使用されるコラーゲンはＩ型コラーゲンである。
【００３６】
組成物中のコラーゲンの最小量は、水に対して1質量％である。例えば、使用されるコラーゲンの量は、1〜5質量％、好ましくは2〜4質量％である。一実施形態によれば、使用されるコラーゲンの量は、水溶性コラーゲンの最大量に等しい。
【００３７】
光開始剤は水溶性であり、2つの光子で励起され、一重項酸素を生成することができる。 「水溶性」とは、例えば、少なくとも1mg/mLの濃度で20℃で水溶性であることを意味する。例えば、光開始剤は、1〜100mg/mL、または1〜50mg/mL、または1〜10mg/mLの濃度で水溶性である。
【００３８】
「複数の光子によって励起することができる」とは、2つ以上の光子を同時に吸収できることを意味する。光開始剤は、使用される光源の波長を有する光子を吸収しない。言い換えれば、光開始剤は、使用される光源の波長で透明である。
【００３９】
本発明の一実施形態によれば、光開始剤は、遷移金属錯体の中から、好ましくはルテニウム（II）、オスミウム（II）、イリジウム（III）、パラジウム（II）、白金（II）、クロム（III）錯体およびそれらの混合物の中から選択される。好ましくは、光開始剤はルテニウム（II）錯体である。
【００４０】
遷移金属錯体は、1つ以上の配位子を含むことができる。錯体がいくつかの配位子を含む場合、これらは同一であっても異なっていてもよい。好ましくは、配位子は、ビピリジン、1,10-フェナントロリン、ビピラジン、ジフェニル-1,10-フェナントロリン、ジフェニル-1,10-フェナントロリン-4,7-ジスルホネート、1,10-フェナントロリン-5-オクタデカンアミドおよびそれらの混合物から選択される。
【００４１】
特に好ましくは、使用される光開始剤はジクロロトリス（1,10-フェナントロリン）ルテニウム（II）である。
【００４２】
光開始剤は、組成物中で水に対して0.5質量％の最小量で使用される。例えば、使用される光開始剤の量は、水に対して0.5〜10質量％、好ましくは1〜5質量％である。特に好ましくは、使用される光開始剤の量は1〜2質量％である。
【００４３】
細胞接着促進剤を組成物に添加することができる。好ましくは、添加された細胞接着促進剤はフィブロネクチンである。フィブロネクチンの場合、水に対して0.01〜0.2質量％の量を使用することができる。特に好ましくは、フィブロネクチンの量は0.05〜0.15％である。
【００４４】
感光性組成物は、少なくとも1つの活性化合物を含むこともできる。活性化合物とは、例えば、生物活性を有する化合物または医学的関心を有する化合物または医薬化合物を意味する。
【００４５】
好ましくは、使用される水は脱イオン水である。脱イオン水には、蒸留水または二重蒸留水を用いることができる。二重蒸留水は、例えば、水がカチオン交換樹脂およびアニオン交換樹脂の上を通過するようにして、もはやＨ＋イオンおよびＯＨ−イオンを含まないようにすることによって得られる。
【００４６】
また、本発明は、上記感光性組成物を得る方法に関する。このプロセスは、以下の主な工程で構成される：
−  ゼラチン、コラーゲン、光開始剤、必要に応じて細胞接着促進剤、および水の混合物を調製する工程；
−  化合物が水に溶解するまで混合物を30〜60℃、好ましくは40〜50℃の温度に加熱する工程；
−  組成物を室温に冷却し、ゲルの形成をもたらす工程。
【００４７】
この組成物は、室温でゲルの形態であり、40℃以上に加熱された際に液体の形態で提供される。ゲルの形態の組成物は、冷蔵庫中で数週間保存することができる。さらに、ゲルの形態の組成物は、多光子吸収による三次元構造体の製造に特に適している。実際に、それはレーザーによる短い架橋構造の動きを大きく制限し、したがって三次元モデルに沿って最終的な非変形構造を保証する。
【００４８】
本発明はまた、上記の感光性組成物を用いて生産された三次元構造体に関する。本発明の一実施形態によれば、三次元構造体は、約数μmのサイズを有する。別の実施形態によれば、三次元構造体は、約数mmのサイズを有する。
【００４９】
本発明の一実施形態によれば、三次元構造体は0.5〜6μm、好ましくは1〜5μmの線幅を有する。「線幅」とは、例えば、レーザービームが製剤中に集束されて線がトレースされた際に得られる線の幅を意味する。線幅が非常に薄いので、求められる三次元構造体は、最も小さい部分が線幅と等しい寸法を有する部分を含むことができる。
【００５０】
三次元構造体は、水中またはリン酸緩衝液型の生物学的緩衝液中で数週間保存することができる。
【００５１】
コラーゲンを添加することにより、三次元構造体を強化し、良好な機械的特性を付与することが可能になる。三次元構造体の剛性は、感光性組成物中に存在するコラーゲンの量を変更することによって制御することができる。
【００５２】
三次元構造体は、細胞の増殖に悪影響を及ぼさない。好ましくは、三次元構造体は、生体適合性および／または生分解性および／または生体吸収性であるため、細胞培養のためのマトリックスとして使用することができる。「生体適合性」とは、例えば、それが分解されず、使用される環境に干渉しないことを意味する。「生分解性」とは、例えば、それが使用される環境によって少なくとも部分的に分解可能であることを意味する。「生体吸収性」とは、例えば、使用される環境によって再吸収され、代謝されることを意味する。
【００５３】
本発明はまた、上で定義したような三次元構造体を含む細胞培養のためのマトリックスに関する。「細胞培養のためのマトリックス」とは、例えば、その生物の外にまたはその元の環境の外に細胞を増殖させるために使用することができる多孔性三次元構造体を意味する。
【００５４】
本発明はまた、以下の工程を含む三次元構造体を製造する方法に関する：
−  上記で定義した感光性組成物のアリコートをサンプリングする工程；
−  多光子吸収による架橋を誘発するのに十分な波長および十分な強度の光源にアリコートの一部を露光する工程；
−  35〜40℃の温度で水中で架橋されていない部分をすすぐ工程。
【００５５】
非架橋部分をすすぐと、製造された三次元構造体が膨潤する。したがって、最初に製造された構造体に対して構造体の寸法が増大する。
【００５６】
本発明の一実施形態によれば、感光性組成物のアリコートのサンプリングは以下のように行われる：
−  感光性組成物を30℃〜60℃、好ましくは40℃〜50℃の温度に10分〜1時間、好ましくは15分〜45分、さらにより好ましくは25〜35分の間、加熱する工程；
−  感光性組成物の1滴をサンプリングする工程；
−  プレート、好ましくはガラスプレート上に堆積させる工程；
−  ゲルが得られるまで冷却する工程。
【００５７】
多光子吸収による架橋を引き起こすのに十分な波長および十分な強度を有する全光源を使用することができる。光源は、光開始剤に適合した波長を有さなければならず、換言すれば、光開始剤は、光源の波長において2つ以上の光子を吸収しなければならない。光源の波長は、一般に300〜1500nmである。本発明の好ましい実施形態によれば、使用される光源はレーザーである。本発明の好ましい実施形態によれば、レーザーはパルスレーザーであり、1ナノ秒未満の持続時間のパルスを提供する。好ましくは、レーザーは532、780または1064nmの波長を有する。
【００５８】
光源に露光されたアリコートの一部が、30〜55℃の温度で10分間〜1時間の間、二重蒸留水に配置されて溶解しない場合、架橋が誘発される。
【００５９】
本発明の一実施形態によれば、三次元構造体の製造は、集束光学系及びレーザーを使用することによって行われる。好ましくは、集束光学系は顕微鏡、例えば倒立顕微鏡である。
【００６０】
架橋は、光源の焦点、換言すれば、サンプルの少量（ボクセル）にのみ局在する。したがって、コンピュータ支援設計ソフトウェアを使用し、試料を3つの軸x、y、zに沿って移動させることによって、求められる三次元構造体を製造することが可能である。したがって、この構造体は、制御された再現可能なアーキテクチャを有する。
【００６１】
本発明の一実施形態によれば、非架橋部分のすすぎは、試料を10分〜1時間、好ましくは15分〜45分、より好ましくは25〜35分の継続時間、30〜55℃の温度、好ましくは35〜40℃の温度の二重蒸留水中にサンプルを配置することによってなし得る。
【００６２】
本発明の一実施形態によれば、レーザー出力は1〜2.5mW、好ましくは1.5〜2mW、例えば1.5mWである。露光時間はボクセル当たり1〜10msであり、これは150〜15μm/sのレーザービームの走査速度に対応する。好ましくは、走査速度は100〜15μm/s、より好ましくは20〜40μm/sである。
【００６３】
本発明の一実施形態によれば、本発明の方法は、多光子吸収による架橋を誘発するのに十分な波長および十分な強度の光源にアリコートの同一部分のいくつかの露光を含む。したがって、既に架橋された部分にいくつかの連続通過、例えば2〜10通過または4〜6通過を達成することが可能である。これにより、架橋速度を増加させることが可能になり、すすぎ工程の間、構造体の膨潤を制限することが可能である。したがって、構造体は最もよく解かれ、線幅は減少する。例えば、水平ラインについて、すすぎの後、最初の通過後に線幅は5μmに近くなる。 3回目の通過後に4.5μmに減少し、5回目の通過後に4μm付近に位置する。通過の数を増やすことにより、最良の分解構造（細い線）を得ることが可能になるだけでなく、すすぎ工程中に最良に架橋され、したがって変形が少なくなる。
【００６４】
倒立型の顕微鏡を用いた場合には、ゲル状の固体組成物を有することにより、組成物内部のレーザーを基底方向に走査することが可能であり、言い換えると、構造体は、レーザーの先端で開始することによって形成される。これは、組成物の既に架橋された部分によるレーザーの焦点ぶれの危険性を回避することを可能にし、レーザーによる短い架橋構造の動きも制限する。
【実施例】
【００６５】
Teamphotonics社によって市販されているマイクロファブリケーションキットμFAB-3Dと結合されたレンズx100（1.25開口数）を使用する従来の倒立顕微鏡を使用することによって、三次元構造体が作製される。使用される光源は、532nmの波長を有するパルスレーザーである。
【００６６】
これを行うために、感光性組成物のサンプルを、構造体の接着を確実にするために、GE Healthcare社のPlusOne Bind Silaneで前処理した従来の顕微鏡スライド（25×25mmおよび170μm厚）上に置く。
【００６７】
線の線幅は、非架橋部分をすすいだ後に測定される。
【００６８】
感光性組成物は、Sigma-Aldrich社で購入したウシの皮膚から得たＢ型ゼラチン、Sigma-Aldrich社で購入したラットの尾から得られたＩ型コラーゲン、光開始剤としてジクロロトリ（1,10-フェナントロリン）ルテニウム（II）、場合によってはSigma-Aldrich社で購入したフィブロネクチンおよび二重蒸留水から得る。
【００６９】
1）     感光性組成物の調製
【００７０】
実施例１：接着促進剤を含まない感光性組成物
【００７１】
二重蒸留水10mLに、Ｂ型ゼラチン2g、Ｉ型コラーゲン300mgおよびジクロロトリス（1,10-フェナントロリン）ルテニウム（II）100mgを添加する。
【００７２】
この混合物を、完全に溶解するまで（約1時間）、40℃で湯煎しながら撹拌する。室温に戻した後、感光性組成物を固体ゲルの形態で提供する。
【００７３】
実施例２：接着促進剤を有する感光性組成物
【００７４】
混合物に10mgのフィブロネクチンを添加することにより、実施例１で定義した作業方法に従って、接着促進剤を有する感光性組成物を得る。
【００７５】
2）三次元構造体の製造
【００７６】
実施例３：接着促進剤を用いない三次元構造体
【００７７】
実施例１に従って得られた組成物のアリコートを採取し、湯煎しながら攪拌して30分間40℃に加熱する。次いで、感光性組成物は液体状態にある。
【００７８】
液体状態のこの感光性組成物の一滴をサンプリングし、顕微鏡スライド上に置く。室温に戻した後、組成物は再びゲルの形態であり、試料は準備ができている。
【００７９】
1.9mWに近いレーザー出力、30μm/ sに近い走査速度、5msの露光時間を使用して、架橋される部分にわたりレーザーを5回連続通過させることによって、11×11μmのメッシュを有する「チキン・コープ」型構造体が製造される。
【００８０】
三次元構造体の製造後、非架橋部分を溶解させるために、サンプルを37℃の二重蒸留水中に30分間置く。
【００８１】
図１は、顕微鏡下で得られた構造体を示す。構造体の膨張後、高さは100μm、辺の長さは115μmを有する。水平線の線幅は3.8〜4.2マイクロメータであり、垂直線の線幅は2〜2.5μmである。
【００８２】
この図は、この感光性組成物を用いて特定の三次元構造体を製造できることを示している。
【００８３】
実施例４：接着促進剤を用いた三次元構造体
【００８４】
実施例２に従って得られた組成物を使用することにより、実施例３で定義した作業方法に従って、15×15μmのメッシュを有する「チキン・コープ」型構造体を製造する。
【００８５】
3）細胞培養における試験
【００８６】
実施例４に従って得られた構造体は、細胞培養において試験されている。T24型癌細胞は、これらの構造体で48時間培養されている。培養条件は標準条件である。48時間後、細胞を2％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、核をHoeschtで着色した。
【００８７】
図２Ａおよび２Ｂは、共焦点顕微鏡下の三次元構造体および細胞を示す。図２Ａは、オフホワイトセルで囲まれたグリッドの外観を有する3つの三次元構造体を示し、図２Ｂは、オフホワイトセルで囲まれたグリッドの外観を有する4つの三次元構造体を示す。細胞および三次元構造体ははっきりと見え、培養48時間後の細胞の死亡率は正常である。従って、培養された細胞は、作製された三次元構造体に非常に良く耐え、これらの構造体の生体適合性を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【国際調査報告】
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