(57)【要約】  本発明は、ａ）緩衝剤を含む第１の水溶液（範囲２．０〜４．０中のｐＨを有する溶液）を提供することと；ｂ）前述の第１の水溶液中でパノビノスタットを溶解して、第２の水溶液を提供することと；ｃ）パノビノスタットを含む前述の第２の水溶液をシクロデキストリンを含む第３の水溶液と混合して、シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む第４の水溶液を形成することと、を含む、シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を産生する方法を提供する。シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む人工脳脊髄液（ＣＳＦ）溶液、およびシクロデキストリン−パノビノスタット付加物の医学的使用（脳腫瘍の治療におけるものが含まれる）も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）緩衝剤を含む第１の水溶液（範囲２．０〜４．０中のｐＨを有する溶液）を提供することと；
ｂ）前記第１の水溶液中でパノビノスタットを溶解して、第２の水溶液を提供することと；
ｃ）パノビノスタットを含む前記第２の水溶液をシクロデキストリンを含む第３の水溶液と混合して、シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む第４の水溶液を形成することと
を含む、シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を産生する方法。
【請求項２】
前記シクロデキストリンが２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記緩衝剤がクエン酸およびクエン酸塩を含む、請求項１または請求項２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の水溶液中でのパノビノスタットの濃度が、範囲１ｍＭ〜２０ｍＭ中である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第３の水溶液中でのシクロデキストリンの濃度が、範囲１０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ中である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ｄ）範囲６．０〜８．０中のｐＨを有する第５の水溶液を提供するために、シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む前記第４の水溶液へ十分な量の塩基を添加すること
をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第５の水溶液を乾燥して、前記シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む固体を形成することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第４の水溶液を乾燥して、前記シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む固体を形成することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記乾燥が、減圧下で冷凍乾燥して、前記シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む凍結乾燥固体を形成することを含む、請求項７または請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記固体が１０％ｗ／ｗ未満（随意に５％ｗ／ｗ未満）の水分含有量を有する、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
再構成溶液中で溶解することによって前記固体を再構成することをさらに含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記再構成溶液が、人工脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンガー溶液、注射用水（ＷＦＩ）、または緩衝塩溶液を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記再構成溶液が人工ＣＳＦを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
再構成の前、その間、またはその後に前記溶液のｐＨを調整することをさらに含む、請求項１２または請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む前記第５の水溶液を人工脳脊髄液（ＣＳＦ）溶液と混合して、人工ＣＳＦ中でシクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む第６の水溶液を提供することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記人工ＣＳＦ中のパノビノスタットの濃度が範囲１μＭ〜２０μＭ中である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む、前記溶液および／または前記固体のうちの少なくとも１つを濾過および／または滅菌するステップをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
人工ＣＳＦ中の前記シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を滅菌濾過することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
人工ＣＳＦ中の前記シクロデキストリン−パノビノスタット付加物の少なくとも一部を、少なくとも１つの対流強化送達（ＣＥＤ）カテーテルの中へ導入することをさらに含む、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれか一項において定義されるような方法によって産生されるかまたは産生可能なシクロデキストリン−パノビノスタット付加物。
【請求項２１】
前記シクロデキストリン−パノビノスタット付加物がナノ粒子またはナノチューブの形態である、請求項２０に記載のシクロデキストリン−パノビノスタット付加物。
【請求項２２】
前記シクロデキストリン−パノビノスタット付加物が、範囲１０ｎｍ〜１００ｎｍ中の直径を有するナノ粒子の形態である、請求項２１に記載のシクロデキストリン−パノビノスタット付加物。
【請求項２４】
シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む、人工脳脊髄液（ＣＳＦ）溶液。
【請求項２５】
前記シクロデキストリン−パノビノスタット付加物がナノ粒子またはナノチューブの形態である、請求項２４に記載の人工脳脊髄液（ＣＳＦ）溶液。
【請求項２６】
前記シクロデキストリン−パノビノスタット付加物が、範囲１０ｎｍ〜１００ｎｍ中の直径を有するナノ粒子の形態である、請求項２５に記載の人工脳脊髄液（ＣＳＦ）溶液。
【請求項２７】
前記溶液が、請求項１３〜１９のいずれか一項において定義されるような方法によって産生されるかまたは産生可能である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の人工ＣＳＦ溶液。
【請求項２８】
前記シクロデキストリン−パノビノスタット付加物が、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン−パノビノスタットである、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の人工ＣＳＦ溶液。
【請求項２９】
前記溶液が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が実質的にない、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の人工ＣＳＦ溶液。
【請求項３０】
前記溶液が、任意の有機溶媒が実質的にない、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の人工ＣＳＦ溶液。
【請求項３１】
ｍＭでのイオン濃度が、以下の通りの：Ｎａ＋１５０；Ｋ＋３．０；Ｃａ２＋１．４；Ｍｇ２＋０．８；ＰＯ４−１．０；およびＣｌ−１５５である、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の人工ＣＳＦ溶液。
【請求項３２】
請求項２４〜３１のいずれか一項の人工ＣＳＦ溶液を含む、対流強化送達（ＣＥＤ）カテーテル。
【請求項３３】
哺乳動物被験体における脳腫瘍の治療の方法における使用のための、請求項２４〜３１のいずれか一項において定義されるような人工脳脊髄液（ＣＳＦ）溶液。
【請求項３４】
前記脳腫瘍がグリオーマを含む、請求項３３に記載の使用のための溶液。
【請求項３５】
前記グリオーマがびまん性内在性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）を含む、請求項３４に記載の使用のための溶液。
【請求項３６】
対流強化送達（ＣＥＤ）経由の治療の前記方法が、前記哺乳動物被験体の脳への前記人工ＣＳＦ溶液の投与を含む、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の使用のための溶液。
【請求項３７】
請求項２４〜３１のいずれか一項において定義されるような人工脳脊髄液（ＣＳＦ）溶液の治療有効量を、それを必要とする哺乳動物被験体へ投与することを含む、哺乳動物被験体における脳腫瘍の治療の方法。
【請求項３８】
前記脳腫瘍がグリオーマを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記グリオーマがびまん性内在性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
対流強化送達（ＣＥＤ）経由の前記方法が、前記哺乳動物被験体の脳への前記人工ＣＳＦ溶液の投与を含む、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害物質の医薬製剤、かかる製剤を産生する方法、および脳腫瘍（特にグリオーマ）の治療における製剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、脳腫瘍（びまん性内在性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）等のグリオーマが含まれる）の治療における使用のための医薬組成物および製剤、ならびにかかる組成物および産物を製作および投与する方法に関する。
【０００３】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害物質は、様々ながんの治療について際立った能力を示す。パノビノスタット（Ｆａｒｙｄａｋ（登録商標）、ＬＢＨ−５８９、２−（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４［［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ］メチル］フェニル］−２−プロペンアミド）は、多発性骨髄腫の治療において使用される非選択的ＨＤＡＣ阻害物質である。パノビノスタットおよび放射線の組み合わせ療法は固形腫瘍の治療のために提案されている（ＷＯ２００７／０５０６５５）。しかしながら、ヒドロキサメート化合物（パノビノスタットが含まれる）は不良な水溶性および安定性を示す（ＷＯ２００９／０３９２２６）。少なくとも１つのアルコールを用いて酸化および加水分解を低減する、パノビノスタット製剤が提案された（ＷＯ２００８／０８６３３０）。
【０００４】
Ｗｅｈｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＬＯＳ  ＯＮＥ，２０１２，Ｖｏｌ．７，Ｉｓｓｕｅ  １０，ｅ４８５６１）は、ヴォリノスタット、パノビノスタット、βシクロデキストリンおよびその組み合わせによるニーマン・ピックＣ型の線維芽細胞における細胞内コレステロールレベルの低下を記載する。
【０００５】
Ｇｒａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６，ｐｐ．５５５−５５９）は、マルチヒストン脱アセチル化酵素阻害物質（パノビノスタット）がインビトロおよびＤＩＰＧの同所性異種移植モデルの両方において治療有効性を実証したことを報告する。しかしながら、パノビノスタットは、異種移植腫瘍を持つマウスへの対流強化送達（ＣＥＤ）のためにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で製剤化された。ＤＭＳＯは穏やかな酸化剤であり、ヒトにおける臨床用途については多くの欠点を有する。
【０００６】
ＷＯ２０１５／１９１９３１は、疎水性薬物（それはＨＤＡＣ阻害物質であり得る）、そのプロドラッグ、その塩、そのアイソフォーム、またはその組み合わせ；シクロデキストリン、そのプロドラッグ、その塩、またはその組み合わせ；ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、またはその組み合わせ；および薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物に加えて、その医学的使用（脳疾患の治療におけるものが含まれる）を記載する。
【０００７】
ＷＯ２００８／００２８６２は、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害物質およびビタミンＢを含有する医薬組成物ならびにその医学的使用（増殖性障害の治療におけるものが含まれる）を記載する。
【０００８】
Ｈｏｃｋｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ，２００３，Ｖｏｌ．１００（４），ｐｐ．２０４１−２０４６）は、経口で投与されるＨＤＡＣ阻害物質スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）を使用する、ハンチントン舞踏病のマウスモデルの治療を記載する。
【０００９】
ＵＳ２０１３１７７４９９は、脳腫瘍に対する活性薬剤のための送達ベヒクルとしての細菌由来のミニ細胞の使用を提案する。
【００１０】
ＷＯ２０１３／１３５７２７は、人工脳脊髄液（ＣＳＦ）中のカルボプラチンの組成物を使用する、対流強化送達（ＣＥＤ）によるグリオーマの治療のための方法を記載する。
【００１１】
脳腫瘍（グリオーマが含まれる）の治療のための中枢投与（例えばＣＥＤ経由で）への安定的かつ適した医薬製剤についての満たされていない必要性が依然として存在する。本発明は、これらおよび他の必要性に対処する。
【発明の概要】
【００１２】
おおまかには、本発明は、対流強化送達（ＣＥＤ）を経由して脳への投与のために好適な、ＨＤＡＣ阻害物質（パノビノスタット）の組成物および製剤に関する。本発明者は、「ｐＨブリッジング」方法が、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびパノビノスタットの水溶性で安定的な複合体または付加物を産生する好都合なルートを提供することを、意外にも見出した。そして、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン−パノビノスタット付加物が人工脳脊髄液（ＣＳＦ）中で可溶性であることを見出した。本明細書における実施例において記載されるように、シクロデキストリン−パノビノスタット付加物は、優れたＨＤＡＣ阻害活性、インビトロの腫瘍細胞殺傷活性、および予備的ヒト臨床試験におけるびまん性内在性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）に対する可能なインビボの治療活性を示す。本発明の産生の方法およびシクロデキストリン−パノビノスタット付加物の特定の利点は、これらが所望されない薬剤（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等）を避けるということである。ＤＭＳＯ（特に高濃度で）は、ヒト使用のための医薬品中で所望されず、パノビノスタットの安定性に負に影響し得る穏やかな酸化剤である。
【００１３】
したがって、第１の態様において、本発明は、
ａ）緩衝剤を含む第１の水溶液（範囲２．０〜４．０中のｐＨを有する溶液）を提供することと；
ｂ）前述の第１の水溶液中でパノビノスタットを溶解して、第２の水溶液を提供することと；
ｃ）パノビノスタットを含む前述の第２の水溶液をシクロデキストリンを含む第３の水溶液と混合して、シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む第４の水溶液を形成することと
を含む、シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を産生する方法を提供する。
【００１４】
シクロデキストリンは、薬学的使用のために好適な任意のシクロデキストリン（例えばα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンまたはγ−シクロデキストリン）であり得る。特定の事例において、シクロデキストリンはβ−シクロデキストリンである。好ましくは、シクロデキストリンは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。
【００１５】
緩衝剤は、任意の薬学的に許容される酸（およびその共役塩基）を含み得る。好ましくは、緩衝剤は、クエン酸およびクエン酸塩（例えばクエン酸およびクエン酸ナトリウム）を含む。緩衝剤の濃度は、範囲０．０１Ｍ〜１Ｍ（例えば０．１Ｍ）中であり得る。
【００１６】
第１の水溶液のｐＨは範囲２．０〜４．０（例えば２．５〜３．５）中である。好ましくは、第１の水溶液のｐＨは約３．０である。このｐＨで、パノビノスタット遊離塩基は良好な水溶性を示す。実際、第２の水溶液中でのパノビノスタットの濃度は範囲１ｍＭ〜２０ｍＭ中である。例えば、パノビノスタット遊離塩基は、ｐＨ３．０のクエン酸緩衝液中で１０ｍＭの濃度で可溶性である。第１の水溶液中でパノビノスタットを溶解するステップは、１分間〜２０分間の間（例えば１０分間）の期間で振盪および／または混合することを包含し得る。
【００１７】
いくつかの事例において、前述の第３の水溶液中でのシクロデキストリン（例えば２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）の濃度は、範囲１０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ中であり得る。例えば、第３の溶液は水中の１００ｍｇ／ｍＬの２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンであり得る。
【００１８】
いくつかの事例において、本発明の第１の態様の方法は、
ｄ）範囲６．０〜８．０中のｐＨを有する第５の水溶液を提供するために、シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む前述の第４の水溶液へ十分な量の塩基を添加すること
をさらに含む。
【００１９】
いくつかの事例において、本発明の第１の態様の方法は、前述の第５の水溶液を乾燥して、前述のシクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む固体を形成することをさらに含む。このような手法で、乾燥固体（例えば凍結乾燥ケーキ）は、中性ｐＨへのまたは中性ｐＨに接近した再構成のために、即応性の中性付近のｐＨを有する。
【００２０】
いくつかの事例において、本発明の第１の態様の方法は、前述の第４の水溶液を乾燥して、前述のシクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む固体を形成することをさらに含む。このような手法で、乾燥固体（例えば凍結乾燥ケーキ）は、比較的酸性のｐＨを有し、それは、任意の再構成ステップ、再水和ステップ、または溶解ステップの前、その間、またはその後に、例えば中性ｐＨ（約７）へまたはそれに向けて調整されるかまたは調整されなくてもよい。
【００２１】
いずれかの事例において（すなわち第５または第４の水溶液を乾燥する）、前述の乾燥は、減圧下で冷凍乾燥（凍結乾燥）して、前述のシクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む凍結乾燥固体を形成することを含み得る。好適な冷凍乾燥条件は、真空（０．０５３ｍｂａｒ）下での−５２℃への約２時間の冷却を含む。しかしながら、冷凍乾燥／凍結乾燥のための多様な技法および条件が公知であることが認識され、それらは本明細書において企図される乾燥ステップ（複数可）における即時使用を見出すだろう。一般的に言えば、凍結乾燥は、溶液中の構成要素がすべて凍結されるまで、溶液が冷却される冷凍ステップを含む。これは、−４０℃未満（−５０℃未満等）へ温度を低下させることを含み得る。冷凍に後続して、一次乾燥ステップがある。一次乾燥ステップにおいて、冷凍の間に形成された氷は昇華によって除去される。一次乾燥ステップは、減圧（＜１０ｍｂａｒ（１ｋＰａ）、または＜０．１ｍｂａｒ（１０Ｐａ）等）で実行され得る。一次乾燥ステップは、冷凍ステップのために使用された温度を超える温度で実行され得る。二次乾燥ステップは一次乾燥ステップに後続し得る。二次乾燥ステップの温度は、一次乾燥ステップの温度より高くてもよい。凍結乾燥は、いくつかの事例において、１時間より多く（例えば２時間もしくは３時間またはさらに長い）かかり得る。
【００２２】
いくつかの事例において、溶液は、１０％ｗ／ｗ未満（随意に５％ｗ／ｗ未満）の水分含有量を有する凍結乾燥固体（例えばケーキ、粉末または顆粒塊）へ乾燥される。凍結乾燥固体は、薬学的に許容される固体（例えば薬学的に許容されるケーキ）であり得る。
【００２３】
いくつかの事例において、本発明のこの態様の方法は、再構成溶液中で溶解することによってシクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む、乾燥固体（例えば凍結乾燥固体）を再構成することをさらに含む。再構成溶液は、好ましくは、シクロデキストリン−パノビノスタット付加物が可溶性である、薬学的に許容される溶液である。特に、再構成溶液は、人工脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンガー溶液、注射用水（ＷＦＩ）、および緩衝塩溶液からなる群から選択され得る。ある特定の事例において、例えば中枢神経系（ＣＮＳ）への投与が意図される場合に、再構成溶液は人工ＣＳＦを含み得る。
【００２４】
いくつかの事例において、冷凍乾燥ステップと続いて行われる再構成ステップとの間に、かなりの遅延があり得る。シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む凍結乾燥固体は、有意なシェルフライフを導く良好な安定性を示し得る。対応する水溶液への比較における凍結乾燥固体の安定性および／または相対的稠密度は、凍結乾燥固体を貯蔵および／または出荷のために魅力的にする。再構成ステップは患者への投与の直前に実行され得る。いくつかの事例において、再構成は、患者への投与の２４、４８または最大７２時間の前に実行され得る。投与の時間に近い再構成の実行によって、人工ＣＳＦ溶液を形成する塩のうちの１つまたは複数が、シクロデキストリンにより達成される核形成または他の核形成事象の結果として結晶する機会は、より少ない。
【００２５】
いくつかの事例において、方法は再構成の前、その間、またはその後に溶液のｐＨを調整することをさらに含む。特に、シクロデキストリン−パノビノスタット付加物が最初にｐＨを中和することなしに凍結乾燥される場合に（すなわち第４の水溶液が乾燥される場合に）、例えば塩基の十分な量の添加によってｐＨをさらに調整して、ｐＨを範囲６．０〜８．０へと導くことを必要とし得る。
【００２６】
いくつかの事例において、本発明のこの態様の方法は、シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む第５の水溶液を人工脳脊髄液（ＣＳＦ）溶液と混合して、人工ＣＳＦ中でシクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む第６の水溶液を提供することをさらに含む。
【００２７】
いくつかの事例において、人工ＣＳＦ中のパノビノスタットの濃度（第６の水溶液であるかまたは人工ＣＳＦの中へ再構成された固体であるかにかかわらず）は、範囲１μＭ〜１００μＭ（例えば１μＭ〜２０μＭ）中である。この濃度範囲は、薬物の効果的な抗腫瘍濃度に対応すると考えられる。シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む、第６の水溶液または人工ＣＳＦ中で再構成された凍結乾燥された固体は、好都合には、治療される患者（例えばグリオーマを患うかまたはグリオーマを有することが疑われる人物または他の哺乳動物）への投与のための溶液であり得る。
【００２８】
いくつかの事例において、本発明の第１の態様の方法は、シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む、前述の溶液および／または凍結乾燥された固体のうちの少なくとも１つを濾過および／または滅菌するステップをさらに含む。典型的には、方法は、シクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む、第６の水溶液または凍結乾燥された固体の人工ＣＳＦ中での再構成によって形成された溶液（例えば治療投与のために即応性で）を、滅菌濾過することを包含し得る。
【００２９】
いくつかの事例において、方法は、人工ＣＳＦ中のシクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む、第６の水溶液または凍結乾燥された固体の再構成によって形成された溶液の少なくとも一部を、少なくとも１つの対流強化送達（ＣＥＤ）カテーテルの中へ導入することをさらに含む。ＣＥＤカテーテル（複数可）は、治療される患者の頭部中の埋込みのための（または前埋込みされた）マイクロカテーテルであり得る。
【００３０】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様の方法によって産生されるかまたは産生可能なシクロデキストリン−パノビノスタット付加物を提供する。
【００３１】
シクロデキストリン複合体がナノ粒子の形態をとり得ることが報告されている（例えばＨｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｎ，２００８，Ｖｏｌ．３９，ｐｐ．４９５−５１６を参照）。実際、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）および電子顕微鏡の研究は、シクロデキストリン（β−シクロデキストリンが含まれる）が溶液中で濃度依存的凝集物を形成し、約６０ｎｍの流体力学的半径を有することを指摘する。したがって、本発明の第２の態様のシクロデキストリン−パノビノスタット付加物は、いくつかの事例において、ナノ粒子またはナノチューブの形態をとり得る。特に、シクロデキストリン−パノビノスタット付加物は、範囲１０ｎｍ〜５００ｎｍ（例えば１０ｎｍ〜１００ｎｍまたは場合によっては５０ｎｍ〜１００ｎｍ）中の直径を有するナノ粒子の形態であり得る。ナノ粒子および／またはナノチューブは自己組織化し得る（例えば溶液中で）。ナノ粒子および／またはナノチューブは可逆的であり得る（例えばモノマーのシクロデキストリン−パノビノスタット付加物を溶液中で形成する）。いくつかの事例において、ナノ粒子および／またはナノチューブの自己組織化および回復は、濃度および／または温度に依存的であり得る。
【００３２】
第３の態様において、本発明は、シクロデキストリン−パノビノスタット付加物（例えば本発明の第２の態様のシクロデキストリン−パノビノスタット付加物）を含む人工脳脊髄液（ＣＳＦ）溶液を提供する。人工ＣＳＦ溶液は、本発明の第１の態様の方法によって産生されるかまたは産生可能であり得る。いくつかの事例において、シクロデキストリン−パノビノスタット付加物は２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン−パノビノスタットである。
【００３３】
好ましくは、本発明の第２の態様のシクロデキストリン−パノビノスタット付加物、および／またはシクロデキストリン−パノビノスタット付加物を含む本発明の第３の態様の人工脳脊髄液（ＣＳＦ）溶液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が実質的にない。特に、溶液は、１０００百万分率（ｐｐｍ）未満（例えば１００ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満または１ｐｐｍ未満でさえ）のＤＭＳＯの濃度（ｖ／ｖ）を有し得る。
【００３４】
特に、本発明の第２の態様のシクロデキストリン−パノビノスタット付加物および／または本発明の第３の態様の人工脳脊髄液（ＣＳＦ）溶液は、有機溶媒（例えばアセトン、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミドおよびＤＭＳＯ）が、実質的になくてもよい。例えば、溶液は、１０００百万分率（ｐｐｍ）未満（例えば１００ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満または１ｐｐｍ未満でさえ）の有機溶媒の濃度または任意の有機溶媒の全濃度（ｖ／ｖ）を有し得る。
【００３５】
第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様の人工ＣＳＦ溶液を含む対流強化送達（ＣＥＤ）カテーテルを提供する。
【００３６】
第５の態様において、本発明は、医薬品における使用のための、本発明の第３の態様の人工脳脊髄液（ＣＳＦ）溶液または本発明の第２の態様のシクロデキストリン−パノビノスタット付加物を提供する。
【００３７】
第６の態様において、本発明は、哺乳動物被験体における脳腫瘍の治療の方法における使用のための、本発明の第３の態様の人工脳脊髄液（ＣＳＦ）溶液または本発明の第２の態様のシクロデキストリン−パノビノスタット付加物を提供する。
【００３８】
いくつかの事例において、脳腫瘍は、グリオーマ（脳幹グリオーマ、星細胞腫（例えば多形神経膠芽腫）、乏突起神経膠腫、乏突起星細胞腫またはびまん性内在性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）等）を含み得る。
【００３９】
いくつかの事例において、治療の方法は、人工ＣＳＦ溶液を対流強化送達（ＣＥＤ）を経由して前述の哺乳動物被験体の脳へ投与することを含む。
【００４０】
第７の態様において、本発明は、本発明の第３の態様の人工脳脊髄液（ＣＳＦ）溶液の治療有効量または本発明の第２の態様のシクロデキストリン−パノビノスタット付加物を、それを必要とする哺乳動物被験体へ投与することを含む、哺乳動物被験体における脳腫瘍の治療の方法を提供する。
【００４１】
いくつかの事例において、脳腫瘍は、神経膠腫（脳幹グリオーマ、星細胞腫（例えば多形神経膠芽腫）、乏突起神経膠腫、乏突起星細胞腫またはびまん性内在性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）等）を含み得る。
【００４２】
いくつかの事例において、方法は、人工ＣＳＦ溶液を対流強化送達（ＣＥＤ）を経由して前述の哺乳動物被験体の脳へ投与することを含む。
【００４３】
本発明によれば、被験体は、ヒト、ペット用動物（例えばイヌまたはネコ）、実験動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタまたは非ヒト霊長動物）、飼育動物または家畜（例えばブタ、ウシ、ウマまたはヒツジ）であり得る。好ましくは、被験体はヒトである。被験体は、ある特定の事例において（特に腫瘍がＤＩＰＧ腫瘍であるならば）、ヒト小児、例えば１０歳未満（１〜５歳等）であり得る。
【００４４】
本発明は態様および記載された好ましい特色の組み合わせを含むが、かかる組み合わせが、明らかに容認できないか、または明らかに避けられることが明言される場合は除く。本発明のこれらおよびさらなる態様および実施形態は、以下でおよび付随の実施例および図を参照してさらに詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】Ａ）Ｕ８７ＭＧ細胞へのＨＰ−β−ＣＤパノビノスタット（正方形）、シクロデキストリン（三角形）および人工ＣＳＦ（円）の７２時間の処理後の；Ｂ）Ｕ８７ＭＧ細胞へのＨＰ−β−ＣＤパノビノスタット（正方形）、シクロデキストリン（三角形）および人工ＣＳＦ（円）の４８時間の処理後の；Ｃ）ＨＥＰＧ２細胞へのＨＰ−β−ＣＤパノビノスタット（正方形）、シクロデキストリン（三角形）および人工ＣＳＦ（円）の７２時間の処理後の；Ｄ）Ｕ８７ＭＧ細胞（円）、ＨＥＰＧ２細胞（菱形）およびｈ１９細胞（三角形）へのＨＰ−β−ＣＤパノビノスタットの７２時間の処理後の、薬物濃度（μＭ）に対してプロットされた、ＭＴＴ査定細胞生存率（％）を示す。エラーバーは、三重サンプルの±標準偏差を示す。Ｎ＝１の実験的な反復。
【図２】Ａ）７２時間の処理後の、ＨＰ−β−ＣＤパノビノスタット濃度（μＭ）に対してプロットされた、ＳＦ８６２８  ＤＩＰＧ細胞の細胞生存率（％）；Ｂ）７２時間の処理（円）、６時間の処理（正方形）および３０分間の処理（菱形）後の、ＨＰ−β−ＣＤパノビノスタット濃度のｌｏｇ１０用量に対してプロットされた、細胞の細胞生存率（％生細胞）を示す。エラーバーは、三重サンプルの±標準偏差を示す。
【図３】１５℃〜２５℃で経時的な２４週間の貯蔵試験についてのパノビノスタット濃度（μＭ）を示す。貯蔵されたＨＰ−β−ＣＤパノビノスタット付加物の測定されたパノビノスタット濃度は、研究の完全な２４週間の期間の後でさえ著しく安定的であった。
【図４】１５℃〜２５℃で２４週間の貯蔵試験について、時間に対してプロットされたパーセンテージとしての全不純物（菱形）示す。相対的保持時間（ＲＲＴ）０．８６（正方形）およびＲＲＴ  １．１２（三角形）は、主要なパノビノスタット薬物ピークのいずれかの側のクロマトグラムピークを指す。プロットは、ＲＲＴピークおよび全％不純物が、研究期間を通して安定的で低いままであったことを示し、パノビノスタット分解産物の形成は無視できることを示唆する。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明の記載において、以下の用語が用いられ、以下で指摘されるように定義されることが意図される。
【００４７】
「パノビノスタット」（Ｆａｒｙｄａｋ（登録商標）、ＬＢＨ−５８９、２−（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４［［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ］メチル］フェニル］−２−プロペンアミド）は、以下で描写される化学構造：
【化１】
2019513139.tif 000002
を有する非選択的ＨＤＡＣ阻害物質である。
【００４８】
本明細書において使用される時、文脈が別に特別に規定しない限り（「遊離塩基パノビノスタット」として記載された場合等）、「パノビノスタット」としては塩形態（例えばパノビノスタットクエン酸塩、パノビノスタット乳酸塩、および同種のもの）が挙げられる。脱アセチル化酵素阻害物質（パノビノスタットが含まれる）として有用なヒドロキサメート誘導体を産生する方法は、ＷＯ２００２／０２２５７７中で詳述され、全体の内容は参照することによって本明細書において明示的に援用される。
【００４９】
「シクロデキストリン」は環式オリゴ糖であり、具体的には、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、およびγ−シクロデキストリンが挙げられる。シクロデキストリンは、典型的には薬学的に許容されるシクロデキストリンである。特定の事例において、シクロデキストリンは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。
【００５０】
「対流強化送達（ＣＥＤ）」は、脳腫瘍の中またはその周囲に外科的に置かれる１つまたは複数の非常に小さなカテーテルを介して、脳へ薬物を直接送達する方法である。カテーテルの留置を定位で方向付けて、例えば標的外の効果を最小限に抑えることができる。ＷＯ２０１３／１３５７２７（全体の内容は参照することによって本明細書において明示的に援用される）は、人工脳脊髄液（ＣＳＦ）中のカルボプラチンの組成物を使用する、対流強化送達（ＣＥＤ）によるグリオーマの治療のための方法を記載する。ＣＥＤは典型的にはインライン滅菌フィルターを用いる。多くの滅菌フィルターはＤＭＳＯと適合性がない（例えば酢酸セルロース；硝酸セルロース；ポリカーボネート；ポリエーテルスルホン；Ｓａｒｔｏｂｒａｎ  Ｐ；いくつかのＰＶＤＦ；ＰＶＣ；Ｍｅｔｒｉｃｅｔ；ナイロン；およびＰＥＳ）。したがって、ＣＥＤ送達のためのパノビノスタット人工ＣＳＦ製剤は、ある特定の有機溶媒（ＤＭＳＯ等）が実質的にないことが所望される。したがって、ＣＥＤ送達のための製剤中での本発明のシクロデキストリン−パノビノスタットの使用は、通常使用されるインライン滅菌フィルターの文脈において有利である。
【００５１】
「人工脳脊髄液（ＣＳＦ）」
人工脳脊髄液（ＣＳＦ）は、ＣＳＦの電解質濃度に一致することが意図される。好ましくは、人工ＣＳＦは、高純度水および分析用試薬から調製されるか、または医療および商業的な供給業者（例えばＳｏｕｔｈ  Ｄｅｖｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＮＨＳ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｔｒｕｓｔ、英国またはＴｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、英国）から得ることができる。人工ＣＳＦ中の最終的なイオン濃度は、以下の通りであり得る（ｍＭで）：
Ｎａ  １５０；
Ｋ  ３．０；
Ｃａ  １．４；
Ｍｇ  ０．８；
Ｐ  １．０；
Ｃｌ  １５５。
随意に、各々のイオン構成物は、上でリストされた濃度値から、濃度プラスまたはマイナス（±）１０％、±５％、±２％、±１％または±０．５％であり得る。さらに随意に、人工ＣＳＦは、ヒトＣＳＦにおいて典型的に見出される濃度で、グルコースおよび／または１つもしくは複数のタンパク質をさらに含み得る。好ましい事例において、人工ＣＳＦは、グルコースまたはタンパク質を含まない。
【００５２】
以下のものは、一例として提示され、請求項の範囲への限定として解釈されるべきではない。
【００５３】
実施例
実施例１  −  パノビノスタット−２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン付加物の産生のための手順
パノビノスタット遊離塩基は水中で低可溶性である。それは、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）（４５０ｍｇ／ｍｌ）の濃縮水溶液中で同様に不溶性である。しかしながら、パノビノスタットはｐＨ３．０のクエン酸緩衝液中で可溶性である。
【００５４】
溶液Ａ：０．１Ｍの水中のクエン酸
クエン酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ−０７５９；ロット番号２１Ｋ００４２）（２．１０１ｇ）を秤量し、１００ｍＬの超純水中で溶解した。
【００５５】
溶液Ｂ：０．１Ｍの水中のクエン酸ナトリウム
クエン酸ナトリウム（三塩基性）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ３４３４；ロット番号１３０４６４０／４１８０７２３０）（２．９４４ｇ）を秤量し、１００ｍＬの超純水中で溶解した。
【００５６】
溶液Ｃ：０．１Ｍのクエン酸緩衝液
溶液Ａ（８２ｍＬ）および溶液Ｂ（１８ｍＬ）を２５０ｍＬのＤｕｒａｎフラスコへ添加し、短時間混合して［Ｃ］を形成した。クエン酸緩衝液のｐＨを測定し、ｐＨ３．０であることが見出された。
【００５７】
溶液Ｄ：クエン酸緩衝液中の１０ｍＭのパノビノスタット溶液（２５ｍＬ）
濃度＝１０ｍＭ＝０．０１Ｍ
体積＝２５ｍＬ＝０．０２５Ｌ
したがって、要求されるモル数＝２．５×１０−４
パノビノスタットの分子量＝３４９．４３ｇ／ｍｏｌ
したがって、要求されるパノビノスタットの質量＝８２．３６ｍｇ
【００５８】
そして、パノビノスタット遊離塩基（８１．０ｍｇ）を秤量し、溶液Ｃ（２４．５９ｍＬ）中で溶解した。混合物を旋回振盪機上で１０分間振盪して、透明で無色の溶液［Ｄ］を得た。
【００５９】
溶液Ｅ：水中の１００ｍｇ／ｍＬの２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（２０ｍＬ）
２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンは１４６０ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。簡潔には、以下のように調製した。
濃度＝１００ｍｇ／ｍＬ。
２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｈ１０７；ロット番号０４８Ｋ０６７２）（２．００４ｇ）を秤量し、２０．０４ｍＬの超純水中で溶解した。混合物を旋回振盪機上で１０分間振盪して、透明で無色の溶液［Ｅ］を得た。
【００６０】
溶液Ｆ：パノビノスタット−２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン付加物（５ｍＭ）
等体積のＤ溶液（２ｍＬ）およびＥ溶液（２ｍＬ）溶液をＦａｌｃｏｎチューブ中で混合した。透明で無色の溶液をボルテックスで短時間撹拌して均質化した。
【００６１】
溶液Ｇ：パノビノスタット−２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン付加物（３．１２５ｍＭ）
注射のための中性溶液（約ｐＨ７）を産生するために、［Ｆ］のサンプル（１ｍＬ）をＮａＯＨ（水溶液）（０．６ｍＬ、０．２Ｍ）と混合して、透明で無色の溶液（体積で１．６ｍＬ）を得た。
【００６２】
溶液Ｈ：ａＣＳＦ（人工脳脊髄液）中のパノビノスタット−２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン付加物の滅菌された溶液（１０μＭ）
１容のａＣＳＦ溶液（Ｓｏｕｔｈ  Ｄｅｖｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ロット番号１４０７２９２）（１５５．５ｍＬ）を、２５０ｍＬのＤｕｒａｎのフラスコへ添加した。次いで溶液［Ｇ］（０．５ｍＬ）をピペットを経由して添加して、濃度１０μＭのａＣＳＦ中のパノビノスタットの最終溶液を得た。溶液を短時間混合し、次いでＳｔｅｒｉＦｌｉｐの滅菌されたフィルターカートリッジを使用して、ラミナーフローフード中でフィルター滅菌した。次いで透明で無色の溶液を４℃で貯蔵した。
【００６３】
実施例２  −  ＨＤＡＣ酵素アッセイ
ＤＭＳＯ中で溶解されたパノビノスタットの阻害活性、およびＨＰ−β−ＣＤパノビノスタット付加物（実施例１中で記載されたように調製される）の阻害活性を、ＨＤＡＣタイプ１〜１１に対して比較した。両者を、１１のＨＤＡＣに対して、１０μＭで開始する３倍の連続希釈による単一検体の１０用量のＩＣ５０モードで試験した。ＨＤＡＣ対照化合物（トリコスタチンＡ（（Ｒ，２Ｅ，４Ｅ）−６−（４−（ジメチルアミノ）ベンゾイル）−Ｎ−ヒドロキシ−４−メチルヘプタ−２，４−ジエンアミド）およびＴＭＰ  ２６９（Ｎ−（（４−（４−フェニルチアゾール−２−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル）−３−（５−（トリフルオロメチル）−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド））を、１０μＭで開始する３倍の連続希釈による１０用量のＩＣ５０で試験した。
【００６４】
基質は以下の通りであった。
ＨＤＡＣ  １、２、３、６、１０についての基質：ｐ５３残基３７９〜３８２からの蛍光発生性ペプチド（ＲＨＫＫ（Ａｃ）ＡＭＣ）
ＨＤＡＣ  ４、５、７、９および１１についての基質：蛍光発生性ＨＤＡＣクラス２ａ基質（トリフルオロアセチルリジン）
ＨＤＡＣ  ８についての基質：ｐ５３残基３７９〜３８２からの蛍光発生性ペプチド（ＲＨＫ（Ａｃ）Ｋ（Ａｃ）ＡＭＣ）
【００６５】
ＩＣ５０値は、シグモイドの用量応答等式に基づいて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４プログラムを使用して、計算した。ブランクの（ＤＭＳＯ）値は、曲線フィッティングのために１．００Ｅ−０１２の濃度として入力した。
【００６６】
各々のＨＤＡＣ酵素に対する各々の化合物についてのＩＣ５０値を以下で示す。
【表１】
2019513139.tif 000003
ＮＤは、酵素に対して試験されない化合物を示す。
【００６７】
これらの結果は、ＨＰ−β−ＣＤパノビノスタットがＨＤＡＣ酵素１〜１１の範囲にわたってＤＭＳＯ中のパノビノスタットに効力が等しいことを示す。
【００６８】
実施例３  −  インビトロ細胞毒性
ＨＰ−β−ＣＤパノビノスタットの細胞毒性を肝細胞癌および神経膠芽細胞腫において査定した。
【００６９】
Ｕ８７ＭＧ（神経膠芽細胞腫）およびＨＥＰＧ２（肝細胞癌）細胞株を、４８時間または７２時間のいずれかで、ＨＰ−β−ＣＤパノビノスタットの増加用量、シクロデキストリン単独、または人工脳脊髄液単独（人工ＣＳＦ）へ曝露した。次いで細胞生存率を、ＭＴＴ試薬を使用して査定した。ＨＰ−β−ＣＤパノビノスタットのＩＣ５０はおよそ０．０１μＭであると決定された（図１Ａ〜Ｄを参照）。シクロデキストリン単独および人工ＣＳＦ単独は、試験された条件下で本質的に毒性がなかった。
【００７０】
ＨＰ−β−ＣＤパノビノスタットの細胞毒性を、ヒトＳＦ８６２８  ＤＩＰＧ細胞（ＵＣＳＦ、米国のＧｕｐｔａグループからの寄贈）において査定した。
【００７１】
蛍光生−死細胞生存率アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。細胞を、三重検体で、人工ＣＳＦ中の１０μＭ、５μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭおよび０．０１μＭの用量のＨＰ−β−ＣＤパノビノスタットの存在下において、７２時間培養した。アッセイは、３つの異なる継代において３回反復した。細胞生存率を、対照（およびベヒクルのみの対照）の生死へ比較した。用量−応答カーブは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してプロットした（図２Ａを参照）。ＩＣ５０値は０．０１μＭであると計算された。
【００７２】
これらの結果は、ＨＰ−β−ＣＤパノビノスタット付加物として製剤化されたパノビノスタットが中性ｐＨの人工ＣＳＦ中で可溶性であること、および広範囲にわたる腫瘍細胞株（グリオーマおよび特にインビトロのＤＩＰＧ細胞が含まれる）に対して強力な癌細胞を殺傷する活性を提示することを実証する。
【００７３】
ＤＩＰＧ細胞に対するＨＰ−β−ＣＤパノビノスタット作用の時間経過を調査するために、細胞を、三重検体で、３つの分離した細胞継代で、５μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭの用量のＨＰ−β−ＣＤパノビノスタットの存在下において、７２時間、６時間および３０分間培養した。短いタイムポイントのインキュベーション（６時間および３０分間）は、投薬後７２時間でアッセイした。結果を図２Ｂ中で示す。ＩＣ５０値を各々のタイムポイントについて以下に示す。
【表２】
2019513139.tif 000004
【００７４】
これらの結果は、細胞毒性濃度への短い曝露でさえも抗腫瘍有効性のためには、十分であり得ることを指摘する。薬物動態データは、ＣＥＤベースの送達のために、人工ＣＳＦ中のＨＰ−β−ＣＤパノビノスタットがカテーテルチップから迅速に拡散することを示唆する。
【００７５】
実施例４  −  パノビノスタット製剤の可溶性および安定性
文献研究から、パノビノスタットがＤＭＳＯ／水混合相中で溶解され得ることが同定されている。ＣＥＤアプローチを経由して患者の脳へ薬物を直接投与するために、濾過された人工脳脊髄液（ＣＳＦ）を希釈剤として使用しなくてはならない。
【００７６】
ＣＥＤベースの送達の文脈において、薬物溶液は、典型的には、予定された投与の前日に調製される。患者が月曜日にＣＥＤ治療を受ける予定であるならば、薬物溶液は金曜日に調製され、月曜日まで冷蔵庫中で貯蔵されるだろう。したがって、人工ＣＳＦ中で調製されたパノビノスタットの溶液は、４℃で少なくとも４８時間実証可能に安定的でなくてはならない。
【００７７】
この研究は、ＤＭＳＯ／ａＣＳＦ混合物中で成功裡に到達され得るパノビノスタットの濃度、ならびに４℃および室温でのそれらの安定性を決定することを目的とした。
【００７８】
ＤＭＳＯ中のパノビノスタットのストック溶液を、７０ｍｇ／ｍＬ≡０．２Ｍ≡２００ｍＭで調製した。
【００７９】
この溶液から、いくつかのＤＭＳＯ作業溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を、ＤＭＳＯ中の希釈によって２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、２ｍＭおよび１ｍＭで調製した。
【００８０】
これらの溶液を人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ）により５０：５０で希釈し、以下の結果がもたらされた。
【表３】
2019513139.tif 000005
【００８１】
２０ｍＭ溶液をａＣＳＦによりさらに希釈して、以下の濃度を得た。ボルテックスによって混合した後に、サンプルを６０秒間遠心分離した。
【表４】
2019513139.tif 000006
【００８２】
１０ｍＭ溶液をａＣＳＦによりさらに希釈して、以下の濃度を得た。ボルテックスによって混合した後に、サンプルを６０秒間遠心分離した。
【表５】
2019513139.tif 000007
【００８３】
ＤＭＳＯ：ａＣＳＦ比が重要であることは明白である。有用な作業濃度は、５ｍＭと１ｍＭとの間で調製することができるが、ＤＭＳＯ比が約５０％ｖ／ｖである場合のみである。ヒトインビボの使用のために、ＤＭＳＯの存在（特に５０％ｖ／ｖほど高い濃度での）は所望されない。
【００８４】
比較すると、ＨＰ−β−ＣＤパノビノスタット付加物は、人工ＣＳＦ中で４℃で少なくとも４８時間溶解可能かつ安定的である。
【００８５】
パノビノスタット（１０ｍＭ）のストック溶液を作成し、ＤＭＳＯまたはクエン酸緩衝液（ｐＨ３）のいずれか中で溶解した。サンプルをＨＰＬＣによる分析を可能にするように希釈した（系のオーバーロードを避ける）。ピーク領域を、調整後０時間、１００時間および１５０時間で両方の溶液について測定した。サンプルを分析の経過にわたって室温で貯蔵した。パーセント変化をピーク領域に基づいて計算し、時間ゼロでの分析へ比較した。１つの重複検体を分析し、各々のサンプルについて７．２μｌを注入した（カラム上の０．２５μｇへ等価）。査定されたストック溶液の濃度は１０ｍＭであった。
【００８６】
カラム：Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ、ＥＳ−Ｃ１８、１０ｃｍ×４．６ｍｍ
移動相：アセトニトリル（有機）中の０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および水中の０．１％のトリフルオロ酢酸
ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ｉｎｆｉｎｉｔｙ
【００８７】
ＨＰＬＣ条件は以下のものを使用した。
【表６】
2019513139.tif 000008
【００８８】
結果：
１００時間で、ＤＭＳＯ溶液は、パノビノスタット濃度が２．８％まで減少したが、クエン酸溶液は０．４％まで減少したことを示す。同様に、１５０時間で、ＤＭＳＯ溶液中のパノビノスタットは４．４％まで減少したが、クエン酸溶液中のパノビノスタットは１％のみ減少した。
【表７】
2019513139.tif 000009
【００８９】
任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者は、クエン酸溶液と比較してＤＭＳＯ中でのパノビノスタットの比較的より低い安定性が、ＤＭＳＯの酸化的性質およびパノビノスタットに対するその作用によって引き起こされ得ると考える。この観点から、実質的にＤＭＳＯなしの溶液中でパノビノスタットを製剤化することが所望されるだろう。
【００９０】
人工ＣＳＦ中のＨＰ−β−ＣＤ−パノビノスタットの溶液を４０μＭのパノビノスタットの初期濃度で調製し、複数のアリコートを直立のシールバイアル中で５℃で保存した。サンプルを、様々なタイムポイント（ｔ＝０、１日目、８日目、１８日目および２２日目）で採取し、パノビノスタット濃度をＨＰＬＣによって測定した。残存するパノビノスタットを、ｔ＝０の開始濃度のパーセンテージで表現する。結果は以下のとおりであった。
【表８】
2019513139.tif 000010
【００９１】
測定されたタイムポイントのすべてで、２２日以下で、パノビノスタットの濃度は本質的に変わらず、初期濃度の９９％を超えていた。これらの結果は、人工ＣＳＦ中で製剤化されたＨＰ−β−ＣＤ−パノビノスタットが著しく安定的であることを実証する。
【００９２】
実施例５  −  ＣＥＤ経由のＨＰ−β−ＣＤパノビノスタットによるヒトＤＩＰＧ患者の治療
ＤＩＰＧに罹患する一人の患者（５歳の女児）を、人工ＣＳＦ中のＨＰ−β−ＣＤ−パノビノスタットの直接的なＣＥＤ注入によって治療した。
【００９３】
患者は、頭蓋骨にマウントされた経皮的なポートとして取り込まれた、前埋込み薬物送達系を有し、それはＣＥＤ経由の薬物の反復投与を可能にする。
【００９４】
人工ＣＳＦ中のＨＰ−β−ＣＤ−パノビノスタットを上記のように調製した。１０μＭの濃度のＨＰ−β−ＣＤ−パノビノスタットを、４つのカテーテルにわたって分布させた１２ｍＬの全体注入体積について、約８時間の期間にわたって注入／対流させた。コンサルタント主導の小児科の麻酔ケアが提供された。継続的な生理学的モニタリングは存在し、神経機能の一時間ごとの査定を得た。これは、肢および脳神経の機能の正確な記録を含んでいた。
【００９５】
ＣＥＤ経由の人工ＣＳＦ中のＨＰ−β−ＣＤ−パノビノスタットの投与は、良好な忍容性を示すことが見出され、有害事象は観察されなかった。
【００９６】
実施例６  −  ＨＰ−β−ＣＤ−パノビノスタット付加物の凍結乾燥
ＨＰ−β−ＣＤ−パノビノスタット付加物の２つのバッチを、実施例１中で設定された方法に従って産生した。
【００９７】
第１のバッチを放出し、長期安定性試験のために４℃に置いた。４２日目に、目視可能な粒子は産物の多くのバイアル中で観察された（しかし、すべてではない）。これらの粒子の分析は、それらが無機塩のみを含有することを示した（すなわち、それらはシクロデキストリン化合物またはパノビノスタット化合物のいずれかを含有していなかった）。エネルギー分散型Ｘ線分光法（ＥＤＸ）による分析は、マグネシウムおよびリンの存在を示し、したがって目視可能な粒子がリン酸マグネシウム結晶であることが結論された。
【００９８】
任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者は、人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ）中のシクロデキストリン付加物のナノ粒子形態の存在がａＣＳＦ中で存在する特定の塩の核形成を促進し得ると考える。人工ＣＳＦは、変動する濃度で塩の混合物を含有する。これらの塩のうちのいくつかには他のものよりも内因的に低可溶性であり、したがって経時的に核を形成する可能性がより高い。既に固体のナノ粒子形態であると考えられるシクロデキストリンの比較的大きな質量を溶液へ添加することは、この核形成をかなり加速するだろう。
【００９９】
本発明者は、凍結乾燥ステップの導入によって改善をもたらすことができるという理論を立てた。すなわち、本発明者は、これらのより低い可溶性の塩がＨＰ−β−ＣＤ−パノビノスタット付加物と共に溶液中で費やす時間を最小限にすることによって（すなわち投与直前に再構成することによって）、無機塩の漸進的結晶化の問題を回避することを期待する。
【０１００】
本実施例において、凍結乾燥プロセスは、ＨＰ−β−ＣＤ−パノビノスタット付加物を含有するサンプルを、約２時間真空（０．０５３ｍｂａｒ）下で、−５２℃へ冷却することを包含していた。しかしながら、実質的に乾燥した固体（例えば１０％ｗ／ｗ未満、５％ｗ／ｗ未満、または場合によっては２％ｗ／ｗ未満の水分含有量）をもたらすならば、他の凍結乾燥手順が企図される。当業者は、本発明に関する使用が見出される多数の冷凍乾燥プロセスを承知しているだろう。
【０１０１】
人工ＣＳＦ中のＨＰ−β−ＣＤ−パノビノスタット付加物の産生のための修飾プロセス（そこで、ＨＰ−β−ＣＤ−パノビノスタット付加物は貯蔵／出荷のために凍結乾燥され、その後に送達時にａＣＳＦ中で再構成されて即時注射溶液を与える）を、以下で説明する。
【０１０２】
溶液Ａ：０．１Ｍの水中のクエン酸
クエン酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ−０７５９；ロット番号２１Ｋ００４２）（２．１０１ｇ）を秤量し、１００ｍＬの超純水中で溶解した。
【０１０３】
溶液Ｂ：０．１Ｍの水中のクエン酸ナトリウム
クエン酸ナトリウム（三塩基性）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ３４３４；ロット番号１３０４６４０／４１８０７２３０）（２．９４４ｇ）を秤量し、１００ｍＬの超純水中で溶解した。
【０１０４】
溶液Ｃ：０．１Ｍのクエン酸緩衝液
溶液Ａ（８２ｍＬ）および溶液Ｂ（１８ｍＬ）を２５０ｍＬのＤｕｒａｎフラスコへ添加し、短時間混合して［Ｃ］を形成した。クエン酸緩衝液のｐＨを測定し、ｐＨ３．０であることが見出された。
【０１０５】
溶液Ｄ：クエン酸緩衝液中の１０ｍＭのパノビノスタット溶液（２５ｍＬ）
濃度＝１０ｍＭ＝０．０１Ｍ
体積＝２５ｍＬ＝０．０２５Ｌ
したがって、要求されるモル数＝２．５×１０−４
パノビノスタットの分子量＝３４９．４３ｇ／ｍｏｌ
したがって、要求されるパノビノスタットの質量＝８２．３６ｍｇ
【０１０６】
そして、パノビノスタット遊離塩基（８１．０ｍｇ）を秤量し、溶液Ｃ（２４．５９ｍＬ）中で溶解した。混合物を旋回振盪機上で１０分間振盪して、透明で無色の溶液［Ｄ］を得た。
【０１０７】
溶液Ｅ：水中の１００ｍｇ／ｍＬの２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（２０ｍＬ）
２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンは１４６０ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。簡潔には、以下のように調製した。濃度＝１００ｍｇ／ｍＬ。２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｈ１０７；ロット番号０４８Ｋ０６７２）（２．００４ｇ）を秤量し、２０．０４ｍＬの超純水中で溶解した。混合物を旋回振盪機上で１０分間振盪して、透明で無色の溶液［Ｅ］を得た。
【０１０８】
溶液Ｆ：パノビノスタット−２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン付加物（５ｍＭ）
等体積のＤ溶液（２ｍＬ）およびＥ溶液（２ｍＬ）溶液をＦａｌｃｏｎチューブ中で混合した。透明で無色の溶液をボルテックスで短時間撹拌して均質化した。
【０１０９】
溶液Ｇ：パノビノスタット−２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン付加物（３．１２５ｍＭ）
中性溶液（約ｐＨ７）を産生するために、［Ｆ］のサンプル（１ｍＬ）をＮａＯＨ（水溶液）（０．６ｍＬ、０．２Ｍ）と混合して、透明で無色の溶液（体積で１．６ｍＬ）を得た。
【０１１０】
凍結乾燥した溶液Ｇ：２ｍＬの付加物溶液Ｇを、真空（０．０５３ｍｂａｒ）下での−５２℃への約２時間の冷却によって凍結乾燥して、固体ケーキを産生した。次いで凍結乾燥固体は、例えば配達の場所への出荷のために必要に応じて貯蔵され得る。
【０１１１】
溶液Ｈ：ａＣＳＦ（人工脳脊髄液）中のパノビノスタット−２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン付加物の滅菌された溶液（４０μＭ）
２ｍＬの上記の溶液Ｇからの凍結乾燥固体ケーキを１０ｍＬのａＣＳＦの添加によって再構成して、ａＣＳＦ中のパノビノスタットの４０μＭの溶液を得た。この溶液は、治療のために要求される投薬量または体積に従ってさらに希釈され得る。
【０１１２】
実施例７  −  ＨＰ−β−ＣＤ−パノビノスタット付加物の長期貯蔵安定性
ＨＰ−β−ＣＤ−パノビノスタット付加物の長期安定性は、−２５℃〜−１５℃（データ不掲載）、２℃〜８℃（データ不掲載）、および１５℃〜２５℃（図３および４）でのｔ＝０から合計２４週間までの貯蔵の間隔で、パノビノスタット濃度およびパーセンテージ不純物を測定することによって査定した。
【０１１３】
図３中で示されるように、パノビノスタット濃度は、１５℃〜２５℃で２４週間の期間にわたって非常に安定的であることが見出された。−２５℃〜−１５℃および２℃〜８℃についての当量濃度プロットも、範囲３８μＭ〜４５μＭ内にとどまる測定濃度の類似するプロファイルを示した。
【０１１４】
１５℃〜２５℃での経時的なパノビノスタットの可能性のある分解を、ＨＰＬＣによる主要なパノビノスタット化合物ピークのいずれかの側のピークの測定によって、査定した（図４中のＲＲＴ  ０．８６およびＲＲＴ  １．１２を参照）。全不純物もパーセンテージとして図４上に示す。図４のプロットは、研究の２４週間の継続期間に非常に低いレベル（約１％以下）で不純物が残存したことを示す。非常に類似する結果が、同じ期間にわたって−２５℃〜−１５℃および２℃〜８℃での貯蔵について観察された。
【０１１５】
総合すると、パノビノスタット濃度および不純物の測定は、ＨＰ−β−ＣＤ−パノビノスタット付加物は、少なくとも２４週間までの期間にわたって室温ででさえ安定的であることを指摘する。
【０１１６】
本明細書において引用されたすべての参照文献は、あたかも各々の個別の出版物または特許または特許出願がその全体の参照によって援用されることが具体的かつ個別に指示されたかのように、それと同程度にその全体の参照によって、およびすべての目的のために、本明細書に援用される。
【０１１７】
本明細書において記載される具体的な実施形態は一例として提供され、限定ではない。任意のサブタイトルは利便性のためのみに含まれ、多少なりとも本発明を限定するとして解釈するべきできない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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