(57)【要約】本発明は、新たな形態のヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡＬ）ポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片、それをコードする核酸、および関連産物、ならびにファブリー病、シンドラー病または神崎病を処置する方法における使用を含む使用を提供する。本発明は、広く酵素補充治療（ＥＲＴ）の分野にあり、より正確には、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）の処置における使用のためのポリペプチド産物の分野にある。特に、本発明は、ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡＬ）ポリペプチド産物および関連産物、使用ならびに方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡＬ）ポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片であって、
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている；または
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている；または
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換され、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項２】
前記第１のアミノ酸が、１つ、２つもしくは３つのアミノ酸によって置換されている；または
前記第２のアミノ酸が、１つ、２つもしくは３つのアミノ酸によって置換されている；または
前記第１のアミノ酸が、１つ、２つもしくは３つのアミノ酸によって置換され、前記第２のアミノ酸が、１つ、２つもしくは３つのアミノ酸によって置換されている、請求項１に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項３】
前記第１のアミノ酸が、１つのアミノ酸によって置換されている；または
前記第２のアミノ酸が、１つのアミノ酸によって置換されている；または
前記第１のアミノ酸が、１つのアミノ酸によって置換され、前記第２のアミノ酸が、１つのアミノ酸によって置換されている、請求項１に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項４】
前記第１のアミノ酸がアスパラギンであり、
前記アスパラギンが、アスパラギン以外の１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている；または
前記アスパラギンが、アスパラギン以外の１つ、２つもしくは３つのアミノ酸によって置換されている；または
前記アスパラギンが、アスパラギン以外の１つのアミノ酸によって置換されている、請求項１から３のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項５】
前記第２のアミノ酸がシステインであり、
前記システインが、システイン以外の１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている；または
前記システインが、システイン以外の１つ、２つもしくは３つのアミノ酸によって置換されている；または
前記システインが、システイン以外の１つのアミノ酸によって置換されている、請求項１から４のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項６】
前記第１のアミノ酸を置換する１つまたは複数の前記アミノ酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から各々独立して選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項７】
前記第２のアミノ酸を置換する１つまたは複数の前記アミノ酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から各々独立して選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項８】
前記第１のアミノ酸が、そのうち少なくとも１つが負に荷電した側鎖基を含む１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている；または
前記第１のアミノ酸が、そのうち少なくとも１つが負に荷電した側鎖基を含む１つ、２つもしくは３つのアミノ酸によって置換されている；または
前記第１のアミノ酸が、負に荷電した側鎖基を含む１つのアミノ酸によって置換されている、請求項１から７のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項９】
負に荷電した側鎖基を含む少なくとも１つの前記アミノ酸が、アスパラギン酸またはグルタミン酸、好ましくはアスパラギン酸である、請求項８に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項１０】
前記第２のアミノ酸が、そのうち少なくとも１つが正に荷電した側鎖基もしくは極性非荷電側鎖基を含む１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている；または
前記第２のアミノ酸が、そのうち少なくとも１つが正に荷電した側鎖基もしくは極性非荷電側鎖基を含む１つ、２つもしくは３つのアミノ酸によって置換されている；または
前記第２のアミノ酸が、正に荷電した側鎖基もしくは極性非荷電側鎖基を含む１つのアミノ酸によって置換されている、請求項１から９のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項１１】
正に荷電した側鎖基を含む少なくとも１つの前記アミノ酸が、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシン、好ましくはアルギニンであり、または極性非荷電側鎖基を含む少なくとも１つの前記アミノ酸が、セリン、スレオニン、アスパラギンもしくはグルタミン、好ましくはセリンである、請求項１０に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項１２】
前記第１のアミノ酸が、アスパラギン酸によって置換され、前記第２のアミノ酸が、アルギニンによって置換されている；または
前記第２のアミノ酸が、アルギニンによって置換されている；または
前記第１のアミノ酸が、アスパラギン酸によって置換され、前記第２のアミノ酸が、セリンによって置換されている；または
前記第２のアミノ酸が、セリンによって置換されている、請求項１から１１のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項１３】
前記ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号２に示されるとおりであるか、もしくは前記機能的に活性なバリアントが、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す；または
前記ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号３に示されるとおりであるか、もしくは前記機能的に活性なバリアントが、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す；または
前記ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号４に示されるとおりであるか、もしくは前記機能的に活性なバリアントが、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す；または
前記ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号５に示されるとおりであるか、もしくは前記機能的に活性なバリアントが、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す、請求項１から１２のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項１４】
１つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも１つが、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、前記１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている；または
１つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも１つが、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、前記１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている；または
前記第１のアミノ酸を置換する前記１つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも１つが、前記第２のアミノ酸を置換する前記１つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも１つと直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換され、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項１５】
前記第１のアミノ酸が、１つ、２つもしくは３つのアミノ酸によって置換されている；または
前記第２のアミノ酸が、１つ、２つもしくは３つのアミノ酸によって置換されている；または
前記第１のアミノ酸が、１つ、２つもしくは３つのアミノ酸によって置換され、前記第２のアミノ酸が、１つ、２つもしくは３つのアミノ酸によって置換されている、請求項１４に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項１６】
前記第１のアミノ酸が、１つのアミノ酸によって置換されている；または
前記第２のアミノ酸が、１つのアミノ酸によって置換されている；または
前記第１のアミノ酸が、１つのアミノ酸によって置換され、前記第２のアミノ酸が、１つのアミノ酸によって置換されている、請求項１４に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項１７】
前記第１のアミノ酸がアスパラギンであり、
前記アスパラギンが、アスパラギン以外の１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている；または
前記アスパラギンが、アスパラギン以外の１つ、２つもしくは３つのアミノ酸によって置換されている；または
前記アスパラギンが、アスパラギン以外の１つのアミノ酸によって置換されている、請求項１４から１６のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項１８】
前記第２のアミノ酸がシステインであり、
前記システインが、システイン以外の１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている；または
前記システインが、システイン以外の１つ、２つもしくは３つのアミノ酸によって置換されている；または
前記システインが、システイン以外の１つのアミノ酸によって置換されている、請求項１４から１７のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項１９】
前記相互作用が、イオン性相互作用または水素結合相互作用またはファンデルワールス相互作用である、請求項１４から１８のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項２０】
前記イオン性相互作用が、少なくとも１つのイオン対の形成を含む、請求項１９に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのイオン対が、前記第１のアミノ酸を置換する前記１つまたは複数のアミノ酸に含まれるアミノ酸の負に荷電した側鎖基と、前記第２のアミノ酸を置換する前記１つまたは複数のアミノ酸に含まれるアミノ酸の正に荷電した側鎖基との間に形成される、請求項２０に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項２２】
前記水素結合相互作用が、直接的相互作用である、または前記水素結合相互作用が、１つもしくは複数の溶媒分子、好ましくは１つもしくは複数の水分子を含む、請求項１９に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項２３】
α−ガラクトシダーゼ活性を獲得するなどのためにさらに改変される、請求項１から２２のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項２４】
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸１７１の位置に対応するアミノ酸位置におけるＳからＥへの置換、および配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸１７４の位置に対応するアミノ酸位置におけるＡからＬへの置換を含む、請求項２３に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項２５】
前記ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号６に示されるとおりであるか、もしくは前記機能的に活性なバリアントが、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す；または
前記ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号７に示されるとおりであるか、もしくは前記機能的に活性なバリアントが、配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す；または
前記ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号８に示されるとおりであるか、もしくは前記機能的に活性なバリアントが、配列番号８に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す；または
前記ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号９に示されるとおりであるか、もしくは前記機能的に活性なバリアントが、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す、請求項２３または２４に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項２６】
前記ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のＣ末端もしくはＮ末端のいずれかまたは両方の末端に、任意選択で１つまたは複数のリンカーペプチドによって接続された１つまたは複数の異種アミノ酸配列などの１つまたは複数の異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項２７】
１つまたは複数のＮ−グリカンを含み、好ましくは、前記Ｎ−グリカンのうち１つまたは複数がリン酸化され、より好ましくは、前記Ｎ−グリカンの数で４０％またはそれよりも多くがリン酸化される、請求項１から２６のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項２８】
前記リン酸化されたＮ−グリカンのうち１つまたは複数が、脱キャップ化および脱マンノシル化され、好ましくは、前記リン酸化されたＮ−グリカンの数で４０％またはそれよりも多くが、脱キャップ化および脱マンノシル化される、請求項２７に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項２９】
治療における使用のための、請求項１から２８のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項３０】
ファブリー病を処置する方法における使用のための、請求項２３から２５のいずれか一項または請求項２３から２５のいずれか一項に従属する請求項２６から２８のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片、あるいはシンドラー病または神崎病を処置する方法における使用のための、請求項１から２２のいずれか一項または請求項１から２２のいずれか一項に従属する請求項２６から２８のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
【請求項３１】
かかる処置を必要とするヒト対象においてファブリー病を処置する方法であって、請求項２３から２５のいずれか一項または請求項２３から２５のいずれか一項に従属する請求項２６から２８のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法、あるいはかかる処置を必要とするヒト対象においてシンドラー病または神崎病を処置する方法であって、請求項１から２２のいずれか一項または請求項１から２２のいずれか一項に従属する請求項２６から２８のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項３２】
請求項１から２８のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を含む、医薬組成物。
【請求項３３】
請求項１から２８のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項３４】
請求項３３に記載の核酸分子と前記核酸分子に作動可能に連結したプロモーターとを含む発現カセットまたは発現ベクターであって、好ましくは、前記発現カセットまたは発現ベクターが、宿主細胞、好ましくは真菌細胞、より好ましくはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓにおいて、前記ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の発現をもたらすように構成される、発現カセットまたは発現ベクター。
【請求項３５】
治療における使用のための、請求項３３に記載の核酸分子または請求項３４に記載の発現カセットもしくは発現ベクター。
【請求項３６】
前記治療が、遺伝子治療またはｍＲＮＡ治療である、請求項３５に記載の使用のための、請求項３３に記載の核酸分子または請求項３４に記載の発現カセットもしくは発現ベクター。
【請求項３７】
ファブリー病を処置する方法における使用のための、請求項２３から２５のいずれか一項または請求項２３から２５のいずれか一項に従属する請求項２６から２８のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードし、好ましくは、前記方法が、遺伝子治療方法またはｍＲＮＡ治療方法である、請求項３３に記載の核酸分子または請求項３４に記載の発現カセットもしくは発現ベクター。
【請求項３８】
シンドラー病または神崎病を処置する方法における使用のための、請求項１から２２のいずれか一項または請求項１から２２のいずれか一項に従属する請求項２６から２８のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードし、好ましくは、前記方法が、遺伝子治療方法またはｍＲＮＡ治療方法である、請求項３３に記載の核酸分子または請求項３４に記載の発現カセットもしくは発現ベクター。
【請求項３９】
かかる処置を必要とするヒト対象においてファブリー病を処置する方法であって、請求項２３から２５のいずれか一項または請求項２３から２５のいずれか一項に従属する請求項２６から２８のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードする請求項３３に記載の核酸分子または請求項３４に記載の発現カセットもしくは発現ベクターの治療有効量を前記対象に投与するステップを含み、好ましくは、遺伝子治療方法またはｍＲＮＡ治療方法である、方法。
【請求項４０】
かかる処置を必要とするヒト対象においてシンドラー病または神崎病を処置する方法であって、請求項１から２２のいずれか一項または請求項１から２２のいずれか一項に従属する請求項２６から２８のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードする請求項３３に記載の核酸分子または請求項３４に記載の発現カセットもしくは発現ベクターの治療有効量を前記対象に投与するステップを含み、好ましくは、遺伝子治療方法またはｍＲＮＡ治療方法である、方法。
【請求項４１】
請求項３３に記載の核酸分子または請求項３４に記載の発現カセットもしくは発現ベクターを含む、医薬組成物。
【請求項４２】
請求項３３に記載の核酸分子または請求項３４に記載の発現カセットもしくは発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４３】
前記宿主細胞が、真菌細胞、好ましくはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓである、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
−  Ｎ−グリカン活性の外鎖伸長における欠損、例えば、ＯＣＨ１活性における欠損を含むように遺伝子操作される；および／あるいは
−  ＭＮＮ４、ＰＮＯ１、ＭＮＮ６またはそれらのいずれか１つの生物学的に活性なバリアントもしくは断片などの、Ｎ−グリカンのマンノシルリン酸化をもたらすことが可能なポリペプチドの発現を含むように遺伝子操作される、請求項４２または４３に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
請求項４２から４４のいずれか一項に記載の宿主細胞の実質的に純粋な培養物。
【請求項４６】
宿主細胞において請求項１から２８のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の発現を達成するための、請求項３３に記載の核酸分子または請求項３４に記載の発現カセットもしくは発現ベクターの使用であって、好ましくは、前記宿主細胞が、真菌細胞、より好ましくはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓである、使用。
【請求項４７】
請求項１から２８のいずれか一項に記載のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を産生するための方法であって、
ａ）宿主細胞が、前記ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を発現するように、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養するステップ、
ｂ）前記宿主細胞または宿主細胞培養培地から、前記ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を収集するステップであって、必要に応じて単離するステップ
を含む方法。
【請求項４８】
前記ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片に含まれるリン酸化されたＮ−グリカンの少なくとも一部の脱キャップ化および脱マンノシル化をさらに含み、例えば、前記脱キャップ化および脱マンノシル化が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または前記宿主細胞中で、または前記宿主細胞の溶解物中で起こる、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本発明は、広く酵素補充治療（ＥＲＴ）の分野にあり、より正確には、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）の処置における使用のためのポリペプチド産物の分野にある。特に、本発明は、ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡＬ）ポリペプチド産物および関連産物、使用ならびに方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、リソソームにおける貯蔵産物の分解に関与する異化酵素の活性が損なわれたことに起因する、そのような貯蔵産物の蓄積を特徴とする遺伝性代謝障害の多様な群である。貯蔵産物の蓄積は、細胞機能不全および進行性の臨床所見をもたらす。リソソーム酵素活性、特にリソソームヒドロラーゼ活性における欠損は、投与された酵素が、罹患細胞のリソソームに効果的に標的化され得ることを条件として、酵素補充治療（ＥＲＴ）によって修正され得る。現時点では、ＥＲＴは、ＬＳＤ、特に全身ＬＳＤを処置するための介入の好ましい方針である。
【０００３】
古典的ファブリー病は、糖脂質から末端α−Ｄ−ガラクトース残基を切断するリソソーム酵素α−ガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ  Ａ）における欠損によって引き起こされる稀なＸ連鎖代謝障害である（Bradyら、１９６７年、N.  Engl.  J.  Med.、２７６巻（２１号）：１１６３〜７頁）。酵素欠損は、血管内皮および他の組織における、スフィンゴ糖脂質、主にグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）の、全身性の生涯にわたるリソソーム蓄積を生じる。これは、腎臓、心臓および脳血管系に主に影響を与える多臓器病理をもたらす（Clarkeら、２００７年、Ann  Intern  Med.、１４６巻（６号）：４２５〜３３頁；ZarateおよびHopkin、２００８年、Lancet、３７２巻（９６４７号）：１４２７〜３５頁）。男性個体は、そのＸ連鎖性質に起因してファブリー病を発症する傾向がより高く、推定の発生率は、男性の新生児４０，０００人のうち１人の割合である（Spadaら、２００６年、Am  J  Hum  Genet.、７９巻（１号）：３１〜４０頁）。１つの変異体α−Ｇａｌ  Ａ対立遺伝子を保有するヘテロ接合性女性もまた罹患するが、α−Ｇａｌ  Ａの活性レベルならびにこの疾患の発病および進行速度は、より変わりやすい（MacDermotら、２００１年、J  Med  Genet、３８巻（１１号）：７６９〜７５頁）。
【０００４】
現在、２つの別個の組換えα−Ｇａｌ  Ａタンパク質：アガルシダーゼアルファ（Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）：Ｓｈｉｒｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ、Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）およびアガルシダーゼベータ（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）：Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ−ａ  Ｓａｎｏｆｉ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＳＡ）が、ファブリー患者のＥＲＴ処置に使用されている。アガルシダーゼアルファは、ヒト細胞株において産生され、１週間おきに０．２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与されるが、アガルシダーゼベータは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において組換え産生され、１週間おきに１ｍｇ／ｋｇ体重で投与される。
【０００５】
これらの哺乳動物発現系は、原材料の高いコストおよび発酵プラントの低い回転率に起因して、実行するのに費用がかかる。さらに、拡張可能性に関してかなりの課題が存在し、これらの産生プロセスの性質に起因して、ウイルス混入の機会が増加する。
【０００６】
また、哺乳動物グリコシル化系の複雑な性質は、かなりのＮ−グリカン不均一性を生じ、これは、バッチ毎の再現性を証明するのに大きな問題となり、下流の処理と関連する費用をさらに増加させる。グリカンの性質は、産物の有効性を決定する重要な因子であるので、グリコシル化を制御する能力の非存在は、大きな懸念である。より具体的には、これらの哺乳動物細胞発現系によって産生される分泌型糖タンパク質は、複雑な型および高マンノース型グリコシル化の不均一な混合物（３０種よりも多い異なるＮ−グリカン構造が、両方の形態の組換えα−ガラクトシダーゼＡ上で見出される）を示し、このことが、末端マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を有するＮ−グリカンの量を制限し（Leeら、２００３年、Glycobiology、１３巻（４号）：３０５〜１３頁）、したがって、リソソーム中へのこれらの酵素の取込みの効率を制限する。実際、近年、腎臓間質細胞、近位尿細管細胞およびポドサイトによるα−Ｇａｌ  Ａの取込みは、とりわけＭ６Ｐ受容体を介して起こることが示された（Christensenら、２００７年、J  Am  Soc  Nephrol.、１８巻（３号）：６９８〜７０６頁；Christensenら、２００９年、Pflugers  Arch.、４５８巻（６号）：１０３９〜４８頁；Prabakaranら、２０１１年、PLoS  One、６巻（９号））。
【０００７】
さらに、現行の哺乳動物発現される組換えα−ガラクトシダーゼ産物の循環半減期は短い。これは、それらの不十分なタンパク質安定性に一部起因する（Sakurabaら、２００６年、J  Hum  Genet.、５１巻（４号）：３４１〜５２頁；Tajimaら、２００９年、Am  J  Hum  Genet.、８５巻（５号）：５６９〜８０頁）。生理的ｐＨ（ｐＨ７）およびリソソームｐＨ（ｐＨ４．５）の両方において、酵素活性は、３７℃で２時間のインキュベーション後に、それぞれおよそ３０％または２０％に低下し、活性のほぼ完全な喪失が、ｐＨ４．５で１５時間の後に観察された。３７℃におけるヒト血清中でのインキュベーションは、ほんの３０分間後に活性の７５％喪失を既に生じ、わずか２時間後には活性はほとんど観察されなかった。
【０００８】
さらに、この疾患についてヘミ接合性の男性患者の多くは、α−Ｇａｌ  Ａを全く産生せず、したがって、この酵素は、これらの患者の免疫系によって自己と認識されない。これは、現行のファブリー病ＥＲＴによってかかる患者を処置する場合にさらなる問題を生じる、即ち、治療用酵素の反復される生涯にわたる高用量投与は、潜在的に生命を脅かすアナフィラキシー反応（Bodensteinerら、２００８年、Genet  Med.、１０巻（５号）：３５３〜８頁）を含む、アレルギー反応を頻繁に引き起こす（Engら、２００１年、N  Engl  J  Med.、３４５巻（１号）：９〜１６頁；Wilcoxら、２０１２年、Mol  Genet  Metab.、１０５巻（３号）：４４３〜９頁）。また、治療用タンパク質に対して惹起された抗体応答は、ファブリー患者のさらなる処置の間のＥＲＴの効果の減少を生じる（Ohashiら、２００７年、Mol  Genet  Metab.、９２巻（３号）：２７１〜３頁；Ohashiら、２００８年、Mol  Genet  Metab.、９４巻（３号）：３１３〜８頁；Vedderら、２００８年、Mol  Genet  Metab.、９４巻（３号）：３１９〜２５頁；Rombachら、２０１２年、PLoS  One、７巻（１０号））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Bradyら、１９６７年、N.  Engl.  J.  Med.、２７６巻（２１号）：１１６３〜７頁
【非特許文献２】Clarkeら、２００７年、Ann  Intern  Med.、１４６巻（６号）：４２５〜３３頁
【非特許文献３】ZarateおよびHopkin、２００８年、Lancet、３７２巻（９６４７号）：１４２７〜３５頁
【非特許文献４】Spadaら、２００６年、Am  J  Hum  Genet.、７９巻（１号）：３１〜４０頁
【非特許文献５】MacDermotら、２００１年、J  Med  Genet、３８巻（１１号）：７６９〜７５頁）
【非特許文献６】Leeら、２００３年、Glycobiology、１３巻（４号）：３０５〜１３頁
【非特許文献７】Christensenら、２００７年、J  Am  Soc  Nephrol.、１８巻（３号）：６９８〜７０６頁
【非特許文献８】Christensenら、２００９年、Pflugers  Arch.、４５８巻（６号）：１０３９〜４８頁
【非特許文献９】Prabakaranら、２０１１年、PLoS  One、６巻（９号）
【非特許文献１０】Sakurabaら、２００６年、J  Hum  Genet.、５１巻（４号）：３４１〜５２頁
【非特許文献１１】Tajimaら、２００９年、Am  J  Hum  Genet.、８５巻（５号）：５６９〜８０頁
【非特許文献１２】Bodensteinerら、２００８年、Genet  Med.、１０巻（５号）：３５３〜８頁
【非特許文献１３】Engら、２００１年、N  Engl  J  Med.、３４５巻（１号）：９〜１６頁
【非特許文献１４】Wilcoxら、２０１２年、Mol  Genet  Metab.、１０５巻（３号）：４４３〜９頁
【非特許文献１５】Ohashiら、２００７年、Mol  Genet  Metab.、９２巻（３号）：２７１〜３頁
【非特許文献１６】Ohashiら、２００８年、Mol  Genet  Metab.、９４巻（３号）：３１３〜８頁
【非特許文献１７】Vedderら、２００８年、Mol  Genet  Metab.、９４巻（３号）：３１９〜２５頁
【非特許文献１８】Rombachら、２０１２年、PLoS  One、７巻（１０号）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
それらを考慮すると、ファブリー病などのリソソーム蓄積症を処置する方法における使用のための、さらなる改善された産物を提供することが、当該分野でなおも必要とされている。
【００１１】
要旨
本発明者らは、真菌細胞において、ヒトα−Ｇａｌ  Ａ自体ではなく、増加したα−ガラクトシダーゼ（α−Ｇａｌ  Ａ）活性を有するヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡＬ）酵素を産生することによって、上述の問題に対処しようとした。ヒトＮＡＧＡＬ遺伝子は、ヒトα−Ｇａｌ  Ａをコードする遺伝子と密接に関連している。それらのコードされたタンパク質は、４６％の配列同一性を共有し、類似のフォールディングを有するが、異なる基質特異性を有する（Tomasicら、２０１０年、J.  Biol.  Chem.、２８５巻（２８号）：２１５６０〜６頁）。２つのアミノ酸置換（Ｓｅｒ１８８ＧｌｕおよびＡｌａ１９１Ｌｅｕ、ヒトＮＡＧＡＬの出発メチオニンから始まる番号付け）をヒトＮＡＧＡＬの活性部位中に導入することによって、増加したα−ガラクトシダーゼ活性を有する酵素が取得されたことが、他者によって以前に示されている（Tajimaら、２００９年、Am  J  Hum  Genet.、８５巻（５号）：５６９〜８０頁；Tomasicら、２０１０年、上記）。この変更されたＮＡＧＡＬは、α−Ｇａｌ  Ａよりも高い血漿安定性を示し、α−Ｇａｌ  Ａに対する抗体を含むファブリー患者の血清に対する免疫反応性を示さなかった。
【００１２】
実験のセクションに示されるように、本発明者らは、真菌細胞においてヒトＮＡＧＡＬを発現させることを目指したが、真菌細胞、特にＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおけるヒトＮＡＧＡＬの発現レベルが、ヒトα−Ｇａｌ  Ａについて得られた発現レベルと比較して不満足なものであったことに気づいた。しかし、本発明のある特定の代表的実施形態を例示する本明細書に記載される実験によってさらに裏付けられるように、本発明者らは、ＮＡＧＡＬ発現における顕著な増加が、本明細書に開示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの改変形態について得られたことに気づいた。
【００１３】
したがって、第１の態様では、本発明は、ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡＬ）ポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片であって、
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている；または
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている；または
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換され、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【００１４】
第２の態様では、本発明は、
１つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも１つが、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、前記１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている；または
１つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも１つが、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、前記１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている；または
第１のアミノ酸を置換する前記１つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも１つが、第２のアミノ酸を置換する前記１つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも１つと直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換され、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【００１５】
第３の態様では、本発明は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片が、第１のドメインが第２のドメインと少なくとも１つの（さらなる）イオン対を形成することが可能であるように、改変される、第１のドメインおよび第２のドメインを含むヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。前記イオン対は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの第１のドメインと第２のドメインとの間に形成される唯一のイオン対であり得る、または第１のドメインと第２のドメインとの間に形成される１つもしくは複数の他のイオン対に対して追加的であり得る。限定ではなく例として、本発明者らによるヒトＮＡＧＡＬの三次元構造の分析により、野性型ヒトＮＡＧＡＬにおいて、イオン対が、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン酸２２０とアルギニン２９８との間に形成され得ることが予測された。
【００１６】
有利なことに、第１から第３の態様のいずれか１つに教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、宿主細胞、例えば真菌細胞、特にＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて組換え発現された場合、満足のいく発現レベルを示す。限定なしに、本発明者らは、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、非改変型ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドと比較して、実質的に増加した安定性もまた示し得ると仮定する。
【００１７】
さらなる態様は、治療における使用のための、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片に関する。
【００１８】
さらなる態様は、シンドラー病または神崎病を処置する方法における使用のための、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片に関する。
【００１９】
さらなる態様は、ファブリー病を処置する方法における使用のための、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片に関する。有利なことに、ファブリー病を処置するために使用される場合、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、α−ガラクトシダーゼ活性を獲得するなどのためにさらに改変され得る。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、かかる処置を必要とするヒト対象においてシンドラー病または神崎病を処置する方法であって、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、かかる処置を必要とするヒト対象においてファブリー病を処置する方法であって、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。有利なことに、ファブリー病を処置するために使用される場合、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、α−ガラクトシダーゼ活性を獲得するなどのためにさらに改変され得る。
【００２２】
さらなる態様は、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を含む医薬組成物に関する。
【００２３】
なおさらなる態様は、以下に関する：
−  本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードする核酸配列を含む核酸分子。
−  本明細書に定義される核酸分子とこの核酸分子に作動可能に連結したプロモーターとを含む、発現カセットまたは発現ベクター。
治療における使用のための、本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクター。
ファブリー病を処置する方法における使用のための、またはシンドラー病もしくは神崎病を処置する方法における使用のための、本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクター。
かかる処置を必要とするヒト対象においてファブリー病を処置する方法またはシンドラー病もしくは神崎病を処置する方法であって、本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクターの治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法。
本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクターを含む医薬組成物。
本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクターを含む宿主細胞。
−  本明細書に定義される宿主細胞の実質的に純粋な培養物。
−  宿主細胞において本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の発現を達成するための、本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクターの使用。
−  本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を産生するための方法であって、
ａ）宿主細胞が、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を発現するように、本明細書に定義される宿主細胞を培養するステップ、
ｂ）宿主細胞または宿主細胞培養培地から、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を収集し、任意選択で単離するステップ
を含む方法。
【００２４】
本発明の上記およびさらなる態様ならびに好ましい実施形態は、以下のセクションおよび添付の特許請求の範囲において記載される。添付の特許請求の範囲の主題は、本明細書で具体的に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン（Ｎ）２１３；太字下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン（Ｃ）３２６。
【００２６】
【図２】図２は、本発明のある実施形態に従うヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸を置換するアスパラギン酸（Ｄ）；太字下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸を置換するアルギニン（Ｒ）。
【００２７】
【図３】図３は、本発明のある実施形態に従うヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３）を示す。下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸（アスパラギン、Ｎ）；太字下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸を置換するアルギニン（Ｒ）。
【００２８】
【図４】図４は、本発明のある実施形態に従うヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸を置換するアスパラギン酸（Ｄ）；太字下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸を置換するセリン（Ｓ）。
【００２９】
【図５】図５は、本発明のある実施形態に従うヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５）を示す。下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸（アスパラギン、Ｎ）；太字下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸を置換するセリン（Ｓ）。
【００３０】
【図６】図６は、本発明のある実施形態に従う、α−ガラクトシダーゼ活性を獲得するなどのためにさらに改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号６）を示す。下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸を置換するアスパラギン酸（Ｄ）；太字下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸を置換するアルギニン（Ｒ）；太字イタリック下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのセリン１７１に対応するアミノ酸を置換するグルタミン酸（Ｅ）；太字イタリック二重下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアラニン１７４に対応するアミノ酸を置換するロイシン（Ｌ）。
【００３１】
【図７】図７は、本発明のある実施形態に従う、α−ガラクトシダーゼ活性を獲得するなどのためにさらに改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号７）を示す。下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸（アスパラギン、Ｎ）；太字下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸を置換するアルギニン（Ｒ）；太字イタリック下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのセリン１７１に対応するアミノ酸を置換するグルタミン酸（Ｅ）；太字イタリック二重下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアラニン１７４に対応するアミノ酸を置換するロイシン（Ｌ）。
【００３２】
【図８】図８は、本発明のある実施形態に従う、α−ガラクトシダーゼ活性を獲得するなどのためにさらに改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号８）を示す。下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸を置換するアスパラギン酸（Ｄ）；太字下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸を置換するセリン（Ｓ）；太字イタリック下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのセリン１７１に対応するアミノ酸を置換するグルタミン酸（Ｅ）；太字イタリック二重下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアラニン１７４に対応するアミノ酸を置換するロイシン（Ｌ）。
【００３３】
【図９】図９は、本発明のある実施形態に従う、α−ガラクトシダーゼ活性を獲得するなどのためにさらに改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号９）を示す。下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸（アスパラギン、Ｎ）；太字下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸を置換するセリン（Ｓ）；太字イタリック下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのセリン１７１に対応するアミノ酸を置換するグルタミン酸（Ｅ）；太字イタリック二重下線：配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアラニン１７４に対応するアミノ酸を置換するロイシン（Ｌ）。
【００３４】
【図１０】図１０は、単一コピーまたは３コピーのいずれかのα−ＧａｌＡまたはＮＡＧＡＬ１発現カセットを含むＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ発現株の２４ウェルの培養に由来する還元（左）または非還元（右）培地試料に対するウエスタンブロット分析を示す。文脈が他を示さない限り、本実験では、単一コピー株とは、単一の発現カセットのランダム組込みから生じる株を指し、一方、３コピー株は、３つの異なる選択マーカーを使用する３つの発現カセットのランダム組込みから生じることに留意されたい。任意の発現カセットが、例えばタンデム挿入を介した形質転換の際にゲノム中に１回または１回よりも多く組み込まれ得る。したがって、例において単一コピー株として示される株のゲノム中に組み込まれた発現カセットの数は、１であってもよく、または１よりも多く（例えば、２、３または４）であってもよく、例において３コピー株として示される株のゲノム中に組み込まれた発現カセットの数は、３であってもよく、または３よりも多く（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２）であってもよい。任意の特定の株中のコピーの数は、所望に応じて、株のゲノム分析によって容易に決定され得る。４０ｎｇのＦａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）（アガルシダーゼベータ、組換えヒトａ−ガラクトシダーゼＡ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ａ  Ｓａｎｏｆｉ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＳＡ）または市販の組換えヒトＮＡＧＡＬ（カタログ番号６７１７−ＧＨ−０２０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を、参照としてロードした。抗Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）抗体（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）を使用するウサギの従来の免疫化によって産生されたポリクローナルウサギ抗体）（マーカーの左のレーン）および抗ＮＡＧＡＬ抗体（Ａｂｃａｍ；Ａｂ１３９５２６）（マーカーの右側のレーン）を使用して、検出を実施した。ここおよび他の例では、近赤外蛍光シグナルの検出（Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を使用する）のための二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩＲＤｙｅ  ６８０ＬＴ（Ｗｅｓｔｂｕｒｇ；９２６−６８０２４）であり；近赤外蛍光シグナルのウエスタンブロット検出を、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を使用して実施した。
【００３５】
【図１１】図１１は、ＥｎｄｏＨ（Ｂｉｏｋｅ；Ｐ０７０２Ｌ）を使用する脱グリコシル化の前（レーン１）および後（レーン２）のＮＡＧＡＬ１  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ発現株の培地試料に対するウエスタンブロット分析を示す。
【００３６】
【図１２】図１２は、３つの異なる培地ｐＨで実行した、３コピーＮＡＧＡＬ１発現株のバイオリアクター培養の異なる時点（ｔｐ）の試料に対するウエスタンブロット分析を示す。Ｔｐ２、５および７は、炭素制限の開始の３５時間後、１０６時間後および１７８時間後を示す。マーカー前の最後のレーンは、２０ｎｇの組換えヒトＮＡＧＡＬ（カタログ番号６７１７−ＧＨ−０２０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）である。
【００３７】
【図１３】図１３は、ＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）、ＮＡＧＡＬ１＃１、ＮＡＧＡＬ１＃２およびＮＡＧＡＬ１＃３についての異なる単一コピー発現株の２４ウェルの培養試料に対するウエスタンブロット分析を示す。
【００３８】
【図１４】図１４は、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ；Ｂｉｏｋｅ；Ｐ０７０４Ｌ）処理の前（右）または後（左）の、ＮＡＧＡＬ１＃２についての異なる単一コピー発現株の２４ウェル培地試料に対する還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【００３９】
【図１５】図１５は、ＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）、ＮＡＧＡＬ１＃２およびＮＡＧＡＬ１＃３の異なる単一コピー発現株の２４ウェル培地試料に対する、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後の抗ＮＡＧＡＬ抗体（Ａｂｃａｍ；Ａｂ１３９５２６）を使用するウエスタンブロット分析を示す。
【００４０】
【図１６】図１６は、蛍光定量的基質４ＭＵ−α−Ｇａｌ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ；ＥＭ０５１８２）との２４ウェル培養培地の２時間のインキュベーション後の放出された４−メチルウンベリフェリル（4-methylumberriferyl）（μＭ）を示す。数字は、測定された値の平均を示す。
【００４１】
【図１７】図１７は、異なるＮＡＧＡＬ１バリアントを発現するＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株のバイオリアクター培養の間の異なる時点のウエスタンブロット分析を示す。ブロットの上部の数字は、フィード期ＩＩにある培養時間の数を示す。
【００４２】
【図１８】図１８は、異なるＮＡＧＡＬ１バリアントを発現するＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株のバイオリアクター培養の間の異なる時点のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色を示す。ゲルの上部の数字は、フィード期ＩＩにある培養時間の数を示す。
【００４３】
【図１９】図１９は、単一コピーのＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）、ＮＡＧＡＬ１＃２およびＮＡＧＡＬ１＃３発現株の発酵試料との蛍光定量的基質４ＭＵ−α−Ｇａｌの１時間のインキュベーション後の放出された４−メチルウンベリフェリル（μＭ）を示す：１株当たりの活性レベルを、発酵実行の最後から２番目および最後の時点において評価した。数字は、測定された値の平均を示す。活性試験前のＮＡＧＡＬ（Ｍｕｔ）培地試料中のα−ガラクトシダーゼ活性の熱不活性化（９９℃で２０分間）は、未処理のＮＡＧＡＬ１＃３およびＮＡＧＡＬ（Ｍｕｔ）試料の場合に放出された４ＭＵの低いレベルが、背景測定値を明らかに上回り、したがって実際の酵素活性を表していることを示している。
【００４４】
【図２０】図２０は、ＮＡＧＡＬ１＃２を発現するＯＸＹＹ２１６３における暫定的な単一コピー形質転換体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシー染色（左）およびウエスタンブロット分析（右）を示す。
【００４５】
【図２１】図２１は、３コピーＮＡＧＡＬ１＃２発現株対いくつかの参照単一コピー株の２４ウェル培地試料に対するウエスタンブロット分析（上パネル）およびα−ガラクトシダーゼ活性アッセイ（下パネル）を示す。
【００４６】
【図２２】図２２は、１つの単一コピーＮＡＧＡＬ１＃２発現株および２つの３コピーＮＡＧＡＬ１＃２発現株のバイオリアクター培養間の異なる時点のウエスタンブロット分析を示す。ブロットの上部の数字は、フィード期ＩＩにある培養時間の数を示す。
【００４７】
【図２３】図２３は、１つの単一コピーＮＡＧＡＬ１＃２発現株および２つの３コピーＮＡＧＡＬ１＃２発現株のバイオリアクター培養間の異なる時点のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色を示す。ゲルの上部の数字は、フィード期ＩＩにある培養時間の数を示す。
【００４８】
【図２４】図２４は、単一および多コピーＮＡＧＡＬ１＃２発現株の発酵試料との蛍光定量的基質４ＭＵ−α−Ｇａｌの１時間のインキュベーション後の放出された４−メチルウンベリフェリル（μＭ）を示す：１株当たりの活性レベルを、発酵実行の最後から２番目および最後の時点において評価した。数字は、測定された値の平均を示す。
【００４９】
【図２５】図２５は、多コピーＮＡＧＡＬ１＃２発現クローンの１Ｌの発酵ブロス中の総タンパク質含量に由来する、ＡＰＴＳ標識されたＮ−グリカンに対するキャピラリー電気泳動を介したＮ−グリカンプロファイリングを示す。Ｍ５、Ｍ６、Ｍ８、Ｍ９：Ｍａｎ５−６−８−９ＧｌｃＮＡｃ２；ＭＰ−Ｍ８、（ＭＰ）２−Ｍ８：それぞれ、１つまたは２つのマンノースリン酸部分を保有する、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２。
【００５０】
【図２６】図２６は、ニワトリ（ｃｈ；明るい灰色）およびヒト（ｈｕ；暗い灰色）ＮＡＧＡＬの重ね合わせを示し、後者は、Ａｓｎ２１３（Ｎ２１３）のＡｓｐ（Ｄ２１３）への変換およびＣｙｓ３２６（Ｃ３２６）のＡｒｇ（Ｒ３２６）への変換後である。四角中：ニワトリＮＡＧＡＬとヒトＮＡＧＡＬとの間で保存されたイオン対。楕円中：ニワトリＮＡＧＡＬ（Ｒ３２８）とヒトＮＡＧＡＬ（Ｒ３２７）との間で保存されたＡｒｇ。変異されたヒトＮＡＧＡＬのアミノ酸部位鎖間の４Åおよび３Åの距離は、イオン対形成を可能にする範囲内である。
【００５１】
【図２７】図２７は、ニワトリ（ｃｈ；明るい灰色）およびヒト（ｈｕ；暗い灰色）ＮＡＧＡＬの重ね合わせを示し、後者は、Ａｓｎ２１３（Ｎ２１３）のＡｒｇ（Ｒ２１３）への変換およびＣｙｓ３２６（Ｃ３２６）のＡｓｐ（Ｄ３２６）への変換後である。楕円中：ニワトリＮＡＧＡＬ（Ｒ３２８）とヒトＮＡＧＡＬ（Ｒ３２７）との間で保存されたＡｒｇ。変異されたヒトＮＡＧＡＬのアミノ酸部位鎖間の５．２Åの距離は、イオン対形成を可能にする最適な範囲内ではない。
【００５２】
【図２８】図２８は、ＮＡＧＡＬ１＃７についての８つの異なる単一コピー発現株の２４ウェルの培養試料に対するウエスタンブロット分析を示す；単一コピーＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）発現クローンとの比較。
【００５３】
【図２９】図２９は、ＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）、ＮＡＧＡＬ１＃２、ＮＡＧＡＬ１＃３、ＮＡＧＡＬ１＃４、ＮＡＧＡＬ１＃５およびＮＡＧＡＬ１＃６についての異なる単一コピー発現株の２４ウェルの培養試料に対するウエスタンブロット分析を示す。
【００５４】
【図３０】図３０は、異なるＮＡＧＡＬ１バリアントを発現する株のバイオリアクター培養の間の異なる時点のウエスタンブロット分析を示す。ブロットの上部の数字は、フィード期ＩＩにある培養時間の数を示す。ＤＧ０７２、ユニット３：ＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）；ＤＧ１００、ユニット８：ＮＡＧＡＬ１＃２；ＤＧ０６９、ユニット６：ＮＡＧＡＬ１＃３；ＤＧ０９８、ユニット６〜８：ＮＡＧＡＬ１＃４  ｒｅｓｐ．＃５、ｒｅｓｐ．＃６。
【００５５】
【図３１−１】図３１は、異なるＮＡＧＡＬ１バリアントの単一コピー発現株の２４ウェルの培養（左）または小規模発酵（右）試料との蛍光定量的基質４ＭＵ−α−Ｇａｌの１時間のインキュベーション後の放出された４−メチルウンベリフェリルのμＭ量の概要を示す。各棒の上部の数字は、測定された値の平均を示す。ＤＧ０７２、ユニット３：ＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）；ＤＧ１００、ユニット８：ＮＡＧＡＬ１＃２；ＤＧ０９８、ユニット６：ＮＡＧＡＬ１＃４。
【図３１−２】図３１は、異なるＮＡＧＡＬ１バリアントの単一コピー発現株の２４ウェルの培養（左）または小規模発酵（右）試料との蛍光定量的基質４ＭＵ−α−Ｇａｌの１時間のインキュベーション後の放出された４−メチルウンベリフェリルのμＭ量の概要を示す。各棒の上部の数字は、測定された値の平均を示す。ＤＧ０７２、ユニット３：ＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）；ＤＧ１００、ユニット８：ＮＡＧＡＬ１＃２；ＤＧ０９８、ユニット６：ＮＡＧＡＬ１＃４。
【００５６】
【図３２−１】図３２および３３は、本明細書の実施例のセクションにおいて生成および使用したプラスミドの概要を提供する。
【図３２−２】図３２および３３は、本明細書の実施例のセクションにおいて生成および使用したプラスミドの概要を提供する。
【図３２−３】図３２および３３は、本明細書の実施例のセクションにおいて生成および使用したプラスミドの概要を提供する。
【図３２−４】図３２および３３は、本明細書の実施例のセクションにおいて生成および使用したプラスミドの概要を提供する。
【図３２−５】図３２および３３は、本明細書の実施例のセクションにおいて生成および使用したプラスミドの概要を提供する。
【図３３】図３２および３３は、本明細書の実施例のセクションにおいて生成および使用したプラスミドの概要を提供する。
【００５７】
【図３４Ａ】図３４Ａ〜Ｃは、本明細書の実施例のセクションにおいて生成および使用した株の概要を提供する。
【図３４Ｂ】図３４Ａ〜Ｃは、本明細書の実施例のセクションにおいて生成および使用した株の概要を提供する。
【図３４Ｃ】図３４Ａ〜Ｃは、本明細書の実施例のセクションにおいて生成および使用した株の概要を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
詳細な説明
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈が明らかに他を示さない限り、単数形および複数形の両方の指示対象を含む。
【００５９】
用語「含む（comprising）」、「含む（comprises）」および「〜から構成される」は、本明細書で使用する場合、「含む（including）」、「含む（includes）」または「含む（containing）」、「含む（contains）」と同義であり、包含的またはオープンエンドであり、さらなる列挙されていないメンバー、エレメントまたは方法ステップを排除しない。これらの用語は、特許の用語法において十分に確立された意味を享受する、「〜からなる」および「〜から本質的になる」もまた包含する。
【００６０】
端点による数値範囲の記述は、それぞれの範囲内に含められる全ての数および一部、ならびに列挙された端点を含む。
【００６１】
用語「約」または「およそ」は、測定可能な値、例えば、パラメーター、量、時間的持続などに言及して本明細書で使用する場合、特定された値のおよび特定された値からの変動、例えば、特定された値のおよび特定された値からの、＋／−１０％またはそれ未満、好ましくは＋／−５％またはそれ未満、より好ましくは＋／−１％またはそれ未満、なおより好ましくは＋／−０．１％またはそれ未満の変動を包含することを意味するが、それは、かかる変動が、開示された発明において機能するのに適切である限りにおいてである。修飾語「約」が言及する値自体もまた、具体的に、および好ましくは開示されることを理解すべきである。
【００６２】
用語「１つもしくは複数の」または「少なくとも１つの」、例えば、メンバーの群の１つもしくは複数のメンバーまたは少なくとも１つのメンバーは、それ自体明らかであるが、さらなる例示として、この用語はとりわけ、前記メンバーのいずれか１つ、または前記メンバーのいずれか２つもしくはそれよりも多く、例えば、前記メンバーの任意の３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上または７つ以上など、さらに、最大で全ての前記メンバーに対する言及を包含する。別の例では、「１つもしくは複数の」または「少なくとも１つの」とは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたはそれよりも多くを指し得る。
【００６３】
本明細書の発明の背景の議論が、本発明の文脈を説明するために含められる。これは、言及される材料のいずれかが、特許請求の範囲のうちいずれかの優先日当時に、任意の国において刊行された、公知であったまたは共通の一般知識の一部であったということの承認として解釈すべきではない。
【００６４】
本開示を通じて、種々の刊行物、特許および公開された特許明細書は、同定的な引用によって言及される。本明細書中で引用される全ての文書は、それらの全体が本明細書で参照によって組み込まれる。特に、具体的に言及される本明細書のかかる文書の教示またはセクションは、参照によって組み込まれる。
【００６５】
他に定義されない限り、技術および科学用語を含む、本発明を開示する際に使用される全ての用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。さらなるガイダンスによって、用語の定義が、本発明の教示をよりよく理解するために含められる。具体的な用語が本発明の特定の態様または本発明の特定の実施形態と併せて定義される場合、かかる含意は、他に定義されない限り、本明細書を通じて、即ち、本発明の他の態様または実施形態に関しても適用されることを意味する。
【００６６】
以下の節では、本発明の異なる態様または実施形態が、より詳細に定義される。そうして定義された各態様または実施形態は、明確に逆を示さない限り、任意の他の態様または実施形態と組み合わされ得る。特に、好ましいまたは有利であると示された任意の特色は、好ましいまたは有利であると示された任意の他の１つまたは複数の特色と組み合わされ得る。
【００６７】
「一実施形態」、「ある実施形態」に対する本明細書を通じた言及は、その実施形態と併せて記載された特定の特色、構造または特徴が、本発明の少なくとも１つの実施形態中に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通じた種々の場所における語句「一実施形態では」または「ある実施形態では」の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態に言及するわけではないが、言及してもよい。さらに、特定の特色、構造または特徴は、１つまたは複数の実施形態において、本開示から当業者に明らかな、任意の適切な様式で組み合わされ得る。さらに、本明細書に記載される一部の実施形態は、他の実施形態中に含まれる一部の特色を含み他の特色は含まないが、異なる実施形態の特色の組合せは、当業者に理解されるように、本発明の範囲内にあり、異なる実施形態を形成することを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲において、特許請求された実施形態のいずれかが、任意の組合せで使用され得る。
【００６８】
本発明者らは、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの組換え発現レベルにおける注目に値する増加が、本明細書に開示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの改変形態について得られたことに気づいた。
【００６９】
したがって、本発明の第１の態様は、
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡＬ）ポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片；あるいは
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片；あるいは
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換され、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片
を提供する。
【００７０】
本発明の第２の態様は、
１つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも１つが、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、前記１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片；あるいは
１つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも１つが、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、前記１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片；あるいは
第１のアミノ酸を置換する前記１つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも１つが、第２のアミノ酸を置換する前記１つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも１つと直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換され、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片
を提供する。
【００７１】
本発明の第３の態様は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片が、第１のドメインが第２のドメインと少なくとも１つの（さらなる）イオン対を形成することが可能であるように、改変される、第１のドメインおよび第２のドメインを含むヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【００７２】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、相互交換可能に使用され得、隣接アミノ酸残基間のペプチド結合によって一緒に繋がれたアミノ酸を含む任意の天然、合成または組換え分子に関する。「ペプチド結合」、「ペプチド連結」または「アミド結合」は、１つのアミノ酸のカルボキシル基が他のアミノ酸のアミノ基と反応し、それによって水の分子を放出する場合に２つのアミノ酸間で形成される共有結合である。ポリペプチドは、任意の供給源に由来し得、例えば、天然に存在するポリペプチド、化学合成されたポリペプチド、組換え分子遺伝学的技術によって産生されるポリペプチド、または細胞もしくは翻訳系由来のポリペプチドであり得る。好ましくは、ポリペプチドは、組換え分子遺伝学的技術によって産生されるポリペプチドである。ポリペプチドは、線状鎖であり得、または球状形態へとフォールディングされ得る。用語「アミノ酸」および「アミノ酸残基」は、本明細書で相互交換可能に使用され得る。
【００７３】
用語「組換え」は、材料（例えば、核酸、遺伝子構築物またはタンパク質）が、人の介入による技術的手段によって（即ち、非天然で）変更されたことを示すために一般に使用される。用語「組換え核酸」は、組換えＤＮＡ技術を使用して一緒に繋がれたセグメントから構成される核酸を一般に指し得る。本明細書で使用する場合、この用語は、好ましくは、変異誘発の技術的手段によって変更された材料（例えば、核酸、遺伝子構築物またはタンパク質）を示し得る。本明細書で使用する場合、用語「組換えタンパク質またはポリペプチド」とは、組換えＤＮＡなどの組換え核酸の発現から生じ得るタンパク質またはポリペプチドを指す。
【００７４】
「核酸」とは、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドから本質的に構成される、任意の長さのオリゴマーおよびポリマーを意味する。核酸は、プリンおよび／もしくはピリミジン塩基、ならびに／あるいは他の天然の（例えば、キサンチン、イノシン、ヒポキサンチン）、化学的にもしくは生化学的に改変された（例えば、メチル化された）、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含み得る。核酸の骨格は、ＲＮＡもしくはＤＮＡにおいて典型的に見出され得る糖およびリン酸基、ならびに／あるいは１つもしくは複数の改変されたもしくは置換された糖および／または１つもしくは複数の改変されたもしくは置換されたリン酸基を含み得る。リン酸基または糖の改変は、安定性、酵素分解に対する耐性、またはある他の有用な特性を改善するために導入され得る。「核酸」は、例えば、二本鎖、部分的に二本鎖、または一本鎖であり得る。一本鎖の場合、核酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。さらに、核酸は、環状または線状であり得る。用語「核酸」は、本明細書で使用する場合、好ましくは、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、プロウイルス、プレ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを具体的には含む、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。
【００７５】
ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４９）は、糖脂質および糖タンパク質から末端アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（α−ＧａｌＮＡｃ）単糖を除去するグリコシドヒドロラーゼである。ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、ヒト血液型ＡおよびＡＢのムチン糖タンパク質、Ｆｏｒｓｓｍａｎハプテンならびに血液型Ａラクトシリーズ（lacto  series）糖脂質からの非還元α−（１→３）−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基の切断を触媒する。ヒトα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼは、ClarkおよびGarman（２００９年、J.  Mol.  Biol.、３９３巻（２号）：４３５〜４４７頁）などの文献中に記載されている。
【００７６】
用語「アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ」、「α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ」、「α−ガラクトシダーゼＢ」、「α−アセチルガラクトサミニダーゼ」、「Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミニダーゼ」、「Ｎ−アセチル−α−ガラクトサミニダーゼ」、「アルファ−ＧａｌＮＡｃａｓｅ」、「α−ＮＡＧＡ」、「α−ＮＡＧＡＬ」および「ＮＡＧＡＬ」は、本明細書で相互交換可能に使用され得る。
【００７７】
例示的なヒトＮＡＧＡＬタンパク質配列は、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｇｅｎｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）受託番号ＮＰ＿０００２５３．１（配列バージョン１）またはＳｗｉｓｓｐｒｏｔ／Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）受託番号Ｐ１７０５０−２（配列バージョン２）の下にアノテートされるとおりであり得る。例示的なヒトＮＡＧＡＬ  ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）配列は、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００２６２．２（配列バージョン２）の下にアノテートされるとおりであり得る。
【００７８】
ＮＰ＿０００２５３．１の下にアノテートされたヒトＮＡＧＡＬアミノ酸配列は、以下に再現される：
【化１】
2019503171.tif 000002
【００７９】
上記の代表的なヒトＮＡＧＡＬポリペプチド配列は、Ｎ末端シグナルペプチドを含むＮＡＧＡＬ前駆体のものである。ヒトＮＡＧＡＬのプロセシングの間に、配列番号２１中のアミノ酸１〜１７に対応するシグナルペプチドは、配列番号２１のアミノ酸１８〜４１１に対応する、したがって３９４アミノ酸長である成熟ヒトＮＡＧＡＬタンパク質を形成するために、プロセシングで除かれる。
【００８０】
したがって、例示的な成熟ヒトＮＡＧＡＬのアミノ酸配列は、以下に再現される：
【化２】
2019503171.tif 000003
【００８１】
ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドに対する言及は、本明細書で使用する場合、文脈から明らかなように、ヒトＮＡＧＡＬ前駆体ポリペプチドおよび成熟ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの両方を包含する。さらに、ネイティブシグナルペプチドが、適切な宿主細胞において活性なシグナルペプチド（例えば、真菌細胞において活性なシグナルペプチド）によって置き換えられるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドもまた、文脈から明らかなように、包含される。
【００８２】
限定詞「ヒト」は、ＮＡＧＡＬポリペプチドと併せて本明細書で使用する場合、その起源または供給源ではなく、ＮＡＧＡＬポリペプチドの一次アミノ酸配列に関する。例えば、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドは、技術的手段、例えば、組換え発現、無細胞翻訳または非生物学的ペプチド合成によって取得され得る。
【００８３】
成熟ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドは、各モノマーが３９４残基（１７残基のシグナル配列を含まない）を含むホモダイマーを形成する。ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドは、２つのドメインを含む。第１のドメイン（即ち、ドメインＩまたはドメイン１）は、１つの（β／α）８バレルを形成し、第２のドメイン（即ち、ドメインＩＩまたはドメイン２）は、２つのβシート中に８個のアンチパラレルβ鎖を含む（ClarkおよびGarman、２００９年、J.  Mol.  Biol.、３９３巻（２号）：４３５〜４４７頁）。
【００８４】
ヒトＮＡＧＡＬの第１のドメインは、第２のドメインに対してＮ末端側に位置し、第２のドメインは、第１のドメインに対してＣ末端側に位置する、即ち、ヒトＮＡＧＡＬのドメインＩはＮ末端であり、ドメインＩＩはＣ末端である。ヒトＮＡＧＡＬの第１のドメインと第２のドメインとの間の概念的境界は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２９２とアミノ酸２９６との間の位置（例えば、アミノ酸２９２〜２９５、２９２〜２９４、２９２〜２９３、２９３〜２９６、２９３〜２９５、２９３〜２９４、２９４〜２９６、２９４〜２９５または２９５〜２９６の間の位置）に対応するアミノ酸位置に、簡便に配置され得る。したがって、限定ではなく例として、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのドメインＩは、配列番号１のアミノ酸１〜２９６または１〜２９５または１〜２９４または１〜２９３または１〜２９２、好ましくは１〜２９１に含まれ得る。配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのドメインＩＩは、配列番号１のアミノ酸２９２〜３９４または２９３〜３９４または２９４〜３９４または２９５〜３９４または２９６〜３９４、好ましくは２９７〜３９４に含まれ得る。
【００８５】
したがって、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの例示的な第１のドメイン（ドメインＩ）のアミノ酸配列は、以下に再現されるとおりであり得る：
【化３】
2019503171.tif 000004
【００８６】
ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの例示的な第２のドメイン（ドメインＩＩ）のアミノ酸配列は、以下に再現されるとおりであり得る：
【化４】
2019503171.tif 000005
【００８７】
ヒトＮＡＧＡＬの活性部位は、β鎖のＣ末端において、（β／α）８バレルドメイン（即ち、第１のドメイン）中に見出される。特に、ヒトＮＡＧＡＬの活性部位は、６つの連続するβ鎖、鎖β１〜β６に対してＣ末端側のループによって形成される。そのエキソグリコシダーゼ機能と一致して、活性部位は、分子の表面上に小さいポケットを形成する。活性部位を形成する残基には、Ｗ３３、Ｄ７８、Ｄ７９、Ｙ１１９、Ｃ１２７、Ｋ１５４、Ｄ１５６、Ｃ１５８、Ｓ１８８、Ａ１９１、Ｙ１９２、Ｒ２１３およびＤ２１７が含まれる（開始メチオニンから始まるアミノ酸番号付けを用いる、例えば、配列番号２１を参照のこと）。
【００８８】
成熟ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドは、５つのＮ−結合型グリコシル化部位（即ち、Ｎ１２４、Ｎ１７７、Ｎ２０１、Ｎ３５９およびＮ３８５）、４つのジスルフィド結合（Ｃ３８−Ｃ８０、Ｃ４２−Ｃ４９、Ｃ１２７−Ｃ１５８、Ｃ１８７−Ｃ２０９）、および１つの遊離システイン（Ｃ３４３）を含む（開始メチオニンから始まるアミノ酸番号付けを用いる、例えば、配列番号２１を参照のこと）。
【００８９】
本明細書に開示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、そのように変異されていないヒトＮＡＧＡＬのアミノ酸配列と比較して、例えば、特に、野性型ヒトＮＡＧＡＬのアミノ酸配列と比較して、「改変された」もしくは「変異された」もしくは「変異体」として、または１つもしくは複数の変異を含む、即ち、１つまたは複数のアミノ酸配列変化を含むとして、簡便に示され得る。
【００９０】
本明細書で使用する場合、用語「野性型」とは、核酸またはポリペプチドに適用する場合、その生物学的生物が自然界に存在する場合に、生物学的生物中に存在するまたは生物学的生物によって産生される核酸またはポリペプチドを指す。用語「野性型」は、ある程度までは「ネイティブ」と同義であり得、後者は、ネイティブ配列を有する核酸またはポリペプチド、即ち、一次配列が自然界において見出されるまたは自然界から誘導される核酸またはポリペプチドの一次配列と同じであるものを包含する。当業者は、ネイティブ配列が、所与の種内の通常の遺伝的多様性（バリエーション）に起因して、同じ種の異なる個体間または異なる個体内で異なり得ることを理解する。また、ネイティブ配列は、転写後または翻訳後改変に起因して、同じ種の異なる個体間または異なる個体内で異なり得る。核酸またはポリペプチドの任意のかかるバリアントまたはアイソフォームは、「ネイティブ」として本明細書で包含される。したがって、自然界において見出されるまたは自然界から誘導される核酸またはポリペプチドの全ての配列は、「ネイティブ」とみなされる。用語「ネイティブ」は、生きた生物、臓器、組織または細胞の一部を形成する場合、生物学的試料の一部を形成する場合、ならびにかかる供給源から少なくとも部分的に単離された場合の、核酸またはポリペプチドを包含する。この用語は、組換えまたは合成手段によって産生された場合の核酸またはポリペプチドもまた包含する。しかし、ほとんどのネイティブヒトＮＡＧＡＬ核酸またはポリペプチドが「野性型」とみなされ得るものの、シンドラー病もしくは神崎病などの疾患表現型と関連するまたはかかる疾患表現型を引き起こす天然に存在する変異（かかる変異は、ＮＡＧＡＬの発現および／または活性を減退させ得るまたは排除し得る）を保有するかかる核酸またはポリペプチドは一般に、用語「野性型」の範囲から排除される。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で意図するように改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、シンドラー病または神崎病などの疾患表現型と関連するものでもかかる疾患表現型を引き起こすものでもない。しかし、ヒトＮＡＧＡＬの発現および／または活性に干渉する天然に存在する変異が、ＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の潜在的α−Ｇａｌ  Ａ活性に干渉しない限りにおいて、前記α−Ｇａｌ  Ａ活性を獲得するためにさらに改変された場合、かかるＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、本明細書で有用であり得る。
【００９１】
ある特定の実施形態では、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、化学的ポリペプチド合成の間に（例えば、所望のアミノ酸を化学的に組み込むことによって）、または組換え分子遺伝学的技術もしくは無細胞翻訳によるポリペプチドの産生の間に、改変され得る。
【００９２】
本開示は、本明細書に開示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの「機能的に活性なバリアントまたは断片」にも関する。この表現は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの機能的に活性なバリアント、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの機能的に活性な断片、ならびにヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの断片の機能的に活性なバリアントを含む。
【００９３】
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの用語「断片」は一般に、前記タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのＮ末端および／またはＣ末端が欠失または短縮された形態を指す。この用語は、例えば限定なしに、前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の、選択的翻訳、エキソおよび／もしくはエンドタンパク質分解ならびに／または分解、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏなどの、例えば、物理的、化学的および／または酵素的タンパク質分解などによる任意の機構によって生じる断片を包含する。限定なしに、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの断片は、前記タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、例えば、対応するヒトＮＡＧＡＬポリペプチド、例えば、対応する成熟ヒトＮＡＧＡＬポリペプチド、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８または９に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列の、少なくとも約５％（アミノ酸数で）、または少なくとも約１０％、例えば、２０％もしくはそれよりも多く、３０％もしくはそれよりも多く、または４０％もしくはそれよりも多く、例えば、好ましくは５０％もしくはそれよりも多く、例えば、６０％もしくはそれよりも多く、７０％もしくはそれよりも多く、８０％もしくはそれよりも多く、９０％もしくはそれよりも多く、または９５％もしくはそれよりも多くを示し得る。
【００９４】
例えば、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの断片は、対応する全長タンパク質またはポリペプチド、例えば、対応するヒトＮＡＧＡＬポリペプチド、例えば、対応する成熟ヒトＮＡＧＡＬポリペプチド、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８または９に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの、５個もしくはそれよりも多く連続するアミノ酸、１０個もしくはそれよりも多く連続するアミノ酸、２０個もしくはそれよりも多く連続するアミノ酸、３０個もしくはそれよりも多く連続するアミノ酸、例えば、４０個もしくはそれよりも多く連続するアミノ酸、例えば、５０個もしくはそれよりも多く連続するアミノ酸、６０個もしくはそれよりも多く、７０個もしくはそれよりも多く、８０個もしくはそれよりも多く、９０個もしくはそれよりも多く、１００個もしくはそれよりも多く、２００個もしくはそれよりも多く、３００個もしくはそれよりも多く、３１０個もしくはそれよりも多く、３２０個もしくはそれよりも多く、３３０個もしくはそれよりも多く、３４０個もしくはそれよりも多く、３５０個もしくはそれよりも多く、３６０個もしくはそれよりも多く、３７０個もしくはそれよりも多く、３８０個もしくはそれよりも多く、または３９０個もしくはそれよりも多く連続するアミノ酸などの配列を含み得る。
【００９５】
ある実施形態では、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの断片は、対応する全長タンパク質またはポリペプチド、例えば、対応するヒトＮＡＧＡＬポリペプチド、例えば、対応する成熟ヒトＮＡＧＡＬポリペプチド、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８または９に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドと比較して、１〜約２０アミノ酸、例えば、１〜約１５アミノ酸、または１〜約１０アミノ酸、または１〜約５アミノ酸が、Ｎ末端および／またはＣ末端で短縮され得る。
【００９６】
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの用語「バリアント」は一般に、そのアミノ酸配列が、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの配列に対して実質的に同一である（即ち、大部分同一ではあるが完全に同一ではない）、例えば、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの配列に対して、例えば、対応するヒトＮＡＧＡＬポリペプチド、例えば、対応する成熟ヒトＮＡＧＡＬポリペプチド、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８または９に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの配列に対して、少なくとも約８０％同一または少なくとも約８５％同一、例えば、好ましくは少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９１％同一、９２％同一、より好ましくは少なくとも約９３％同一、例えば、少なくとも９４％同一、さらにより好ましくは少なくとも約９５％同一、例えば、少なくとも９６％同一、なおより好ましくは少なくとも約９７％同一、例えば、少なくとも９８％同一、最も好ましくは少なくとも９９％同一である、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを指す。好ましくは、バリアントは、列挙されたタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの配列全体が配列アラインメントにおいて問い合わせされる場合（即ち、全体的配列同一性）、列挙されたタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに対してかかる程度の同一性を示し得る。配列同一性は、それ自体公知の、配列アラインメントおよび配列同一性の決定を実施するための適切なアルゴリズムを使用して決定され得る。例示的ではあるが非限定的なアルゴリズムには、例えば、公開されたデフォルト設定または他の適切な設定（例えば、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムについて：ギャップを開けるためのコスト＝５、ギャップを拡張するためのコスト＝２、ミスマッチについてのペナルティ＝−２、マッチについての報酬＝１、ｇａｐ  ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ＝５０、期待値＝１０．０、ワードサイズ＝２８；またはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムについて：マトリックス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２（Henikoffら、１９９２年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.、８９巻：１０９１５〜１０９１９頁）、ギャップを開けるためのコスト＝１１、ギャップを拡張するためのコスト＝１、期待値＝１０．０、ワードサイズ＝３など）を使用する、Altschulら  １９９０年（J  Mol  Biol  ２１５巻：４０３〜１０頁）によって元々記載されたＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）に基づくもの、例えば、TatusovaおよびMadden  １９９９年（FEMS  Microbiol  Lett  １７４巻：２４７〜２５０頁）によって記載された「Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」アルゴリズムが含まれる。
【００９７】
特定のアミノ酸配列とクエリーポリペプチド（例えば、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチド、例えば、成熟ヒトＮＡＧＡＬポリペプチド、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８または９に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチド）のアミノ酸配列との間のパーセント同一性を決定するための一例の手順は、適切なアルゴリズムパラメーターを使用し、ＮＣＢＩウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）においてウェブアプリケーションとしてまたはスタンドアローンの実行可能なプログラム（ＢＬＡＳＴバージョン２．２．３１＋）として入手可能なＢｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｂｌ２ｓｅｑ）アルゴリズムを使用して、２つのアミノ酸配列をアラインさせることを伴う。適切なアルゴリズムパラメーターの一例には、マトリックス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップを開けるためのコスト＝１１、ギャップを拡張するためのコスト＝１、期待値＝１０．０、ワードサイズ＝３が含まれる。２つの比較された配列が相同性を共有する場合、アウトプットは、アラインされた配列として、それらの相同性の領域を示す。２つの比較された配列が相同性を共有しない場合、アウトプットは、アラインされた配列を示さない。アラインされると、マッチの数が、同一のアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を数えることによって決定される。パーセント同一性は、マッチの数をクエリーポリペプチドの長さによって除算し、その後得られた値に１００を乗算することによって決定される。パーセント同一性値は、最も近い小数第１位に丸められ得るが、丸めなくてもよい。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３および７８．１４は、７８．１に切り捨てて丸められ得るが、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８および７８．１９は、７８．２に切り上げて丸められ得る。Ｂｌ２ｓｅｑによってアウトプットされたアラインメントの各セグメントについての詳細な一覧は、既に同一性の百分率を簡便に含んでいることにさらに留意されたい。
【００９８】
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのバリアントは、前記タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのホモログ（例えば、オルソログまたはパラログ）であり得る。本明細書で使用する場合、用語「相同性」は一般に、２つの高分子間、特に、同じまたは異なる分類群由来の２つのタンパク質またはポリペプチド間の構造的類似性を示し、前記類似性は、共有された祖先に起因する。
【００９９】
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのバリアントは、対応するタンパク質またはポリペプチド、例えば、対応するヒトＮＡＧＡＬポリペプチド、例えば、対応する成熟ヒトＮＡＧＡＬポリペプチド、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８または９に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドに対して（即ち、これらと比較して）、１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失または置換を含み得る。
【０１００】
例えば、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのバリアント（置換バリアント）は、対応するタンパク質またはポリペプチド、例えば、対応するヒトＮＡＧＡＬポリペプチド、例えば、対応する成熟ヒトＮＡＧＡＬポリペプチド、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８または９に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドに対して（即ち、これらと比較して）、最大で５０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０個以下）の保存的アミノ酸置換を含み得る。
【０１０１】
保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸による、類似の特徴を有する別のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸置換には、以下の群内の置換が含まれる：バリン、アラニンおよびグリシン；ロイシン、バリンおよびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システインおよびスレオニン；リシンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。非極性疎水性アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に荷電した（即ち、塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（即ち、酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。上述の極性、塩基性または酸性群の１つのメンバーの、同じ群の別のメンバーによる任意の置換は、保存的置換とみなされ得る。対照的に、非保存的置換は、１つのアミノ酸による、異なる特徴を有する別のアミノ酸の置換である。
【０１０２】
あるいは、またはさらに、例えば、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのバリアント（欠失バリアント）は、対応するタンパク質またはポリペプチド、例えば、対応するヒトＮＡＧＡＬポリペプチド、例えば、対応する成熟ヒトＮＡＧＡＬポリペプチド、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８または９に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドに対して（即ち、これらと比較して）、最大で２０個のアミノ酸セグメント（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のセグメント）を欠如し得る。欠失セグメントは、各々独立して、１つのアミノ酸、２つ連続するアミノ酸または３つ連続するアミノ酸からからなり得る。欠失セグメントは、非連続であり得る、あるいは欠失セグメントのうち２つもしくはそれよりも多くまたは全てが連続であり得る。
【０１０３】
本明細書に開示されるように、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドはまた、１つまたは複数の内部および／または末端（即ち、Ｎ末端および／またはＣ末端）の無関係のまたは異種のアミノ酸配列と融合され得る（即ち、融合タンパク質）。異種配列は、例えば、組換えタンパク質の精製に使用される配列（例えば、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン（例えば、ヘキサヒスチジン）、ヘマグルチニン（hemagluttanin）（ＨＡ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））であり得る。異種配列はまた、診断マーカーまたは検出可能なマーカーとして有用なタンパク質、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）であり得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、別のタンパク質由来のシグナル配列を含み得る。ある特定の宿主細胞（例えば、酵母宿主細胞）では、標的タンパク質の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増加され得る。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、例えば、免疫応答を惹起する際に有用な担体（例えば、ＫＬＨ）（例えば、抗体生成のため；以下を参照のこと）、または小胞体もしくはゴルジ体保留シグナルを含み得る。異種配列は、変動する長さのものであり得、一部の場合には、異種配列が結合される全長タンパク質またはポリペプチドよりも長い配列であり得る。
【０１０４】
本明細書がタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのバリアントおよび／または断片に言及するまたはそれらを包含する場合、これは、機能的に活性なまたは機能的な、即ち、それぞれのまたは対応するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの生物学的活性または意図した機能性を少なくとも部分的に保持する、バリアントまたは断片を示す。限定ではなく例として、本明細書に開示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの機能的に活性なバリアントまたは断片は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの生物学的活性を少なくとも部分的に保持するものである。例えば、これは、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの生物学的活性、例えば、そのグリコシドヒドロラーゼ活性の１つまたは複数の態様を保持し得る。好ましくは、機能的に活性なバリアントまたは断片は、対応するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドと比較して、意図した生物学的活性または機能性の少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、もしくは少なくとも３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、例えば、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、例えば、少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも約８５％、なおより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％もしくはさらには約１００％またはそれよりも高くを保持し得る。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、例えば、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの「活性」に対する言及は、一般に、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの生物学的活性の任意の１つまたは複数の態様、例えば、限定なしに、例えば、細胞、組織、臓器または生物内の、その生化学的活性、酵素活性、シグナル伝達活性、相互作用活性、リガンド活性、および／または構造的活性の任意の１つまたは複数の態様を包含し得る。限定ではなく例として、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の活性に対する言及は、特に、グリコシドヒドロラーゼとしてのその活性、即ち、末端α−ＧａｌＮＡｃ単糖を除去するその能力を示し得る。所与のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、例えばヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの活性が、確立されたアッセイ、例えば、酵素アッセイ（例えば、蛍光定量的アッセイなどによる）において容易に測定できる場合、そのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの機能的に活性なバリアントまたは断片は、かかるアッセイにおいて、それぞれのまたは対応するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの活性の、少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、もしくは少なくとも３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、例えば、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、例えば、少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも約８５％、なおより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％もしくはさらには約１００％またはそれよりも高い活性を示し得る。
【０１０５】
例えば、ヒトＮＡＧＡＬまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ活性は、例えば、基質としてＭＵ−α−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（例えば、ＭＵ−２−アセトアミド−２−デオキシ−ａ−Ｄ−ガラクトピラノシド；Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｎｏｒｔｈ  Ｙｏｒｋ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）を用いる蛍光定量的アッセイによって、酵素アッセイで測定され得る。ＮＡＧＡＬ活性は、例えば、３５５ｎｍでの励起後に、４６０ｎｍでＷａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯ  ＭＸマルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて測定され得る。
【０１０６】
本明細書の他の箇所に詳述するように、ある特定の実施形態では、本明細書に教示されるように改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、α−ガラクトシダーゼ活性を獲得するためにさらに改変され得る。用語「獲得する」（取得する／得る（obtain）、得る（attain）、得る（gain））は、広く使用され、そのような活性がさらなる改変前には検出可能でなかった場合に、さらなる改変がポリペプチドにα−ガラクトシダーゼ活性を示させる状況、ならびにさらなる改変前に検出可能であった任意のα−ガラクトシダーゼ活性と比較して、さらなる改変がポリペプチドにさらなる（増加した、増強された）α−ガラクトシダーゼ活性を示させる状況を包含する。本明細書の他の箇所にも記載されるように、さらなる改変は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸１７１の位置に対応するアミノ酸位置におけるＳからＥへの置換、および配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸１７４の位置に対応するアミノ酸位置におけるＡからＬへの置換を伴い得る。
【０１０７】
かかる実施形態では、かかるさらに改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの機能的に活性なバリアントまたは断片は、さらに改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのα−ガラクトシダーゼ活性を少なくとも部分的に保持するものである。好ましくは、これらの実施形態では、機能的に活性なバリアントまたは断片は、さらに改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのα−ガラクトシダーゼ活性の、少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約２５％、もしくは少なくとも３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、例えば、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、例えば、少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも約８５％、なおより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％もしくはさらには約１００％またはそれよりも高くを保持し得る。
【０１０８】
例えば、さらに改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のα−ガラクトシダーゼ活性は、例えば、Tajimaら  ２００９年、Am.  J.  Hum.  Genet.、８５巻（５号）：５６９〜８０頁およびTomasicら、２０１０年、J.  Biol.  Chem.、２８５巻（２８号）：２１５６０〜６頁によって記載されるように、蛍光定量的アッセイなどによって、酵素アッセイで測定され得る。簡潔に述べると、蛍光定量的アッセイは、基質として４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（４ＭＵ−α−Ｇａｌ）を使用して、ｐＨ４．５および３７℃の温度で実施される。活性α−ガラクトシダーゼが（例えば、培養培地中に）存在する場合、４ＭＵ−α−Ｇａｌは加水分解され、それによって、４−メチルウンベリフェリルを放出する。後者は、３６５ｎｍでの励起後に、４５０ｎｍで測定され得る。
【０１０９】
ある特定の例では、ヒトＮＡＧＡＬの機能的に活性なバリアントまたは断片は、配列番号１、２、３、４または５に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのＮＡＧＡＬ酵素活性の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、またはさらには１００％よりも高く）を有し得る。機能的バリアントまたは断片は、常にではないが一般に、タンパク質の連続的領域から構成され得、この領域は、機能的活性を有する。ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの活性部位のアミノ酸配列は、文献中に記載されている（ClarkおよびGarman、２００９年、J.  Mol.  Biol.、３９３巻（２号）：４３５〜４４７頁）。活性部位を形成する残基は、第１のドメイン中に位置し、Ｗ３３、Ｄ７８、Ｄ７９、Ｙ１１９、Ｃ１２７、Ｋ１５４、Ｄ１５６、Ｃ１５８、Ｓ１８８、Ａ１９１、Ｙ１９２、Ｒ２１３およびＤ２１７（開始メチオニンから始まるとして与えられるアミノ酸番号付けを用いる）を含む。したがって、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの候補機能的バリアントまたは断片は、十分に確立された方法、例えば、相同性モデリングおよび計算工学を使用して、当業者によって産生され得、所望の酵素活性について試験され得る。
【０１１０】
ある特定の例では、本明細書に教示されるさらに改変されたヒトＮＡＧＡＬの機能的に活性なバリアントまたは断片は、配列番号６、７、８または９に示されるさらに改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのα−ガラクトシダーゼ酵素活性の少なくとも２５％（例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、またはさらには１００％よりも高く）を有し得る。本明細書の他の箇所に記載されるように、さらなる改変は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸１７１の位置に対応するアミノ酸位置におけるＳからＥへの置換、および配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸１７４の位置に対応するアミノ酸位置におけるＡからＬへの置換を伴い得る。機能的バリアントまたは断片は、常にではないが一般に、タンパク質の連続的領域から構成され得、この領域は、機能的活性を有する。さらに改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの候補機能的バリアントまたは断片は、十分に確立された方法、例えば、相同性モデリングおよび計算工学を使用して、当業者によって産生され得、所望の酵素活性について試験され得る。
【０１１１】
さらに、文脈から他のように明らかでない限り、任意の核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質およびそれらのバリアントまたは断片に対する本明細書の言及は、一般に、例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質化、メチル化、システイン化、スルホン化、グルタチオン化、アセチル化、メチオニンのメチオニンスルホキシドまたはメチオニンスルホンへの酸化などを含む発現後改変を保有するなど、前記核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質およびバリアントまたは断片の変更された形態もまた包含し得る。
【０１１２】
好都合に、本明細書に開示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のある特定のアミノ酸は、参照ヒトＮＡＧＡＬポリペプチド、通常は配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのある特定のアミノ酸「に対応する」と本明細書で呼ばれ得る。
【０１１３】
当業者は、２つの形態のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸間の対応関係を即座に理解する。例として、かかる対応するアミノ酸は、２つの形態のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの一次アミノ酸配列のアラインメント中の同じ位置に位置し得る。配列アラインメントは、配列同一性の程度の決定と併せて、本明細書の他の箇所に説明されるように生成され得る。かかる対応するアミノ酸はまた、２つの形態のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの二次および／または三次構造中に共に位置し得る。
【０１１４】
便宜上、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する、本明細書に開示される、特に、本発明の第１および第２の態様に従って開示される、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸は、「第１のアミノ酸（a  first  amino  acid）」または「第１のアミノ酸（the  first  amino  acid）」と本明細書で呼ばれ得る；一方で、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する、本明細書に開示される、特に、本発明の第１および第２の態様に従って開示される、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸は、「第２のアミノ酸（a  second  amino  acid）」または「第２のアミノ酸（the  second  amino  acid）」と本明細書で呼ばれ得る。
【０１１５】
疑いを回避するために、序数「第１の」および「第２の」は、この文脈では、それぞれ、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３およびシステイン３２６に対応する、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片中の特定のアミノ酸を示すように、より特には、前記アミノ酸間を識別するように機能する。結果として、用語「第１の」および「第２の」アミノ酸は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の一次アミノ酸配列中の、それぞれ１番目および２番目に来るアミノ酸を指すことを意図しない。
【０１１６】
「第１の」および「第２の」アミノ酸の位置は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸の対応する位置に言及することによって、簡便に定義され得る。配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸１（即ち、ロイシン）の位置は、１位を示す。
【０１１７】
用語「アミノ酸置換」または「アミノ酸交換」は、本明細書で相互交換可能に使用され得、別のアミノ酸による、アミノ酸配列中のあるアミノ酸の置き換え、または２つもしくはそれよりも多くのアミノ酸のセグメントによる、アミノ酸配列中のあるアミノ酸の置き換えを包含し得る。
【０１１８】
用語アミノ酸は、本明細書で使用する場合、アミン官能基およびカルボキシル官能基の両方を含む分子を一般に指す。生化学では、この用語は、特に、一般式Ｈ２ＮＣＨＲＣＯＯＨを有するアルファ−アミノ酸を指し、式中、Ｒは、有機置換基である。アルファ−アミノ酸では、アミノ基およびカルボン酸基は、同じ炭素、即ち、α−炭素に結合される。この用語は、２０種の天然に存在するアミノ酸；例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホスレオニンを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏで翻訳後改変される場合が多いアミノ酸；ならびに２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンが含まれるがこれらに限定されない、他の普通でないアミノ酸を含む。この用語は、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方を含む。Ｌ−アミノ酸が好ましい。
【０１１９】
したがって、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の第１のアミノ酸、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する前記第１のアミノ酸は、１つまたは複数のアミノ酸、例えば、１〜２０アミノ酸、好ましくは１〜１５アミノ酸、より好ましくは１〜１０アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸、さらにより好ましくは１〜５アミノ酸、例えば、１〜４アミノ酸、１〜３アミノ酸、または１〜２アミノ酸によって置換され得る。
【０１２０】
したがって、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の第２のアミノ酸、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する前記第２のアミノ酸は、１つまたは複数のアミノ酸、例えば、１〜２０アミノ酸、好ましくは１〜１５アミノ酸、より好ましくは１〜１０アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸、さらにより好ましくは１〜５アミノ酸、例えば、１〜４アミノ酸、１〜３アミノ酸、または１〜２アミノ酸によって置換され得る。
【０１２１】
したがって、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の第１のアミノ酸、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する前記第１のアミノ酸は、１つまたは複数のアミノ酸、例えば、１〜２０アミノ酸、好ましくは１〜１５アミノ酸、より好ましくは１〜１０アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸、さらにより好ましくは１〜５アミノ酸、例えば、１〜４アミノ酸、１〜３アミノ酸、または１〜２アミノ酸によって置換され得；ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の第２のアミノ酸、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する前記第２のアミノ酸は、１つまたは複数のアミノ酸、例えば、１〜２０アミノ酸、好ましくは１〜１５アミノ酸、より好ましくは１〜１０アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸、さらにより好ましくは１〜５アミノ酸、例えば、１〜４アミノ酸、１〜３アミノ酸、または１〜２アミノ酸によって置換され得る。
【０１２２】
ある特定の実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、１つ、２つまたは３つのアミノ酸によって、好ましくは、１つまたは２つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１２３】
ある特定の他の実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、１つ、２つまたは３つのアミノ酸によって、好ましくは、１つまたは２つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１２４】
ある特定のさらなる実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、１つ、２つまたは３つのアミノ酸によって、好ましくは、１つまたは２つのアミノ酸によって置換され；配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、１つ、２つまたは３つのアミノ酸によって、好ましくは、１つまたは２つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１２５】
したがって、ある特定の実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、１つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１２６】
ある特定の他の実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、１つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１２７】
ある特定のさらなる実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、１つのアミノ酸によって置換され；配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、１つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１２８】
ある特定の実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸がアスパラギンであり、このアスパラギンが、アスパラギン以外の１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１２９】
好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸がアスパラギンであり、このアスパラギンが、アスパラギン以外の１つ、２つまたは３つのアミノ酸によって、好ましくはアスパラギン以外の１つまたは２つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１３０】
より好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸がアスパラギンであり、このアスパラギンが、アスパラギン以外の１つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１３１】
したがって、ある特定の特に好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応するアミノ酸位置において、アルパラギン以外のアミノ酸（より特には１つのアミノ酸）を含む、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１３２】
ある特定の実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸がシステインであり、このシステインが、システイン以外の１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１３３】
好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸がシステインであり、このシステインが、システイン以外の１つ、２つまたは３つのアミノ酸によって、好ましくは、システイン以外の１つまたは２つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１３４】
より好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸がシステインであり、このシステインが、システイン以外の１つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１３５】
したがって、ある特定の特に好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応するアミノ酸位置において、システイン以外のアミノ酸（より特には１つのアミノ酸）を含む、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１３６】
ある特定の実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸がアスパラギンであり、このアスパラギンが、アスパラギン以外の１つまたは複数のアミノ酸によって置換され；配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸がシステインであり、このシステインが、システイン以外の１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１３７】
好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸がアスパラギンであり、このアスパラギンが、アスパラギン以外の１つ、２つまたは３つのアミノ酸によって、好ましくはアスパラギン以外の１つまたは２つのアミノ酸によって置換され；配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸がシステインであり、このシステインが、システイン以外の１つ、２つまたは３つのアミノ酸によって、好ましくは、システイン以外の１つまたは２つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１３８】
より好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸がアスパラギンであり、このアスパラギンが、アスパラギン以外の１つのアミノ酸によって置換され；配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸がシステインであり、このシステインが、システイン以外の１つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１３９】
したがって、ある特定の特に好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応するアミノ酸位置において、アルパラギン以外のアミノ酸（より特には１つのアミノ酸）を含み、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応するアミノ酸位置において、システイン以外のアミノ酸（より特には１つのアミノ酸）を含む、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１４０】
ある特定の実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸を置換する１つまたは複数のアミノ酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から各々独立して選択される、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。上述のように、Ｌ−アミノ酸が好ましくは想定される。
【０１４１】
したがって、ある特定の実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応するアミノ酸位置において、１つまたは複数のアミノ酸、好ましくは１つ、２つまたは３つのアミノ酸、より好ましくは１つまたは２つのアミノ酸、さらにより好ましくは１つのアミノ酸を含み、この１つまたは複数のアミノ酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から各々独立して選択される、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。上述のように、Ｌ−アミノ酸が好ましくは想定される。
【０１４２】
ある特定の実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸を置換する１つまたは複数のアミノ酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から各々独立して選択される、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。上述のように、Ｌ−アミノ酸が好ましくは想定される。
【０１４３】
したがって、ある特定の実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応するアミノ酸位置において、１つまたは複数のアミノ酸、好ましくは１つ、２つまたは３つのアミノ酸、より好ましくは１つまたは２つのアミノ酸、さらにより好ましくは１つのアミノ酸を含み、この１つまたは複数のアミノ酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から各々独立して選択される、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。上述のように、Ｌ−アミノ酸が好ましくは想定される。
【０１４４】
ある特定の実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸を置換する１つまたは複数のアミノ酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から各々独立して選択され；配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸を置換する１つまたは複数のアミノ酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から各々独立して選択される、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。上述のように、Ｌ−アミノ酸が好ましくは想定される。
【０１４５】
したがって、ある特定の実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応するアミノ酸位置において、１つまたは複数のアミノ酸、好ましくは１つ、２つまたは３つのアミノ酸、より好ましくは１つまたは２つのアミノ酸、さらにより好ましくは１つのアミノ酸を含み、この１つまたは複数のアミノ酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から各々独立して選択され；配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応するアミノ酸位置において、１つまたは複数のアミノ酸、好ましくは１つ、２つまたは３つのアミノ酸、より好ましくは１つまたは２つのアミノ酸、さらにより好ましくは１つのアミノ酸を含み、この１つまたは複数のアミノ酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から各々独立して選択される、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。上述のように、Ｌ−アミノ酸が好ましくは想定される。
【０１４６】
ある特定の好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、そのうち少なくとも１つが負に荷電した側鎖基を含む１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１４７】
ある特定のより好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、そのうち少なくとも１つが負に荷電した側鎖基を含む１つ、２つまたは３つのアミノ酸、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１４８】
ある特定のさらにより好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、負に荷電した側鎖基を含む１つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１４９】
したがって、ある特定の実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応するアミノ酸位置において、そのうち少なくとも１つが負に荷電した側鎖基を含む１つまたは複数のアミノ酸、好ましくは、そのうち少なくとも１つが負に荷電した側鎖基を含む１つ、２つまたは３つのアミノ酸、より好ましくは、そのうち少なくとも１つが負に荷電した側鎖基を含む１つまたは２つのアミノ酸、さらにより好ましくは、負に荷電した側鎖基を含む１つのアミノ酸を含む、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１５０】
好ましくは、負に荷電した側鎖基を含む少なくとも１つのアミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸、好ましくはアスパラギン酸である。
【０１５１】
したがって、ある特定の好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、そのうち少なくとも１つがアスパラギン酸またはグルタミン酸（好ましくはアスパラギン酸）である１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１５２】
ある特定のより好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、そのうち少なくとも１つがアスパラギン酸またはグルタミン酸（好ましくはアスパラギン酸）である１つ、２つまたは３つのアミノ酸、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１５３】
ある特定のより好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、アスパラギン酸またはグルタミン酸（好ましくはアスパラギン酸）によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１５４】
したがって、ある特定の実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応するアミノ酸位置において、そのうち少なくとも１つがアスパラギン酸またはグルタミン酸（好ましくはアスパラギン酸）である１つまたは複数のアミノ酸、好ましくは、そのうち少なくとも１つがアスパラギン酸またはグルタミン酸（好ましくはアスパラギン酸）である１つ、２つまたは３つのアミノ酸、より好ましくは、そのうち少なくとも１つがアスパラギン酸またはグルタミン酸（好ましくはアスパラギン酸）である１つまたは２つのアミノ酸、さらにより好ましくは、アスパラギン酸またはグルタミン酸（好ましくはアスパラギン酸）である１つのアミノ酸を含む、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１５５】
ある特定の好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、そのうち少なくとも１つが正に荷電した側鎖基または極性非荷電側鎖基を含む１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１５６】
ある特定のより好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、そのうち少なくとも１つが正に荷電した側鎖基または極性非荷電側鎖基を含む１つ、２つまたは３つのアミノ酸、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１５７】
ある特定のさらにより好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、正に荷電した側鎖基または極性非荷電側鎖基を含む１つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１５８】
したがって、ある特定の実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応するアミノ酸位置において、そのうち少なくとも１つが正に荷電した側鎖基または極性非荷電側鎖基を含む１つまたは複数のアミノ酸、好ましくは、そのうち少なくとも１つが正に荷電した側鎖基または極性非荷電側鎖基を含む１つ、２つまたは３つのアミノ酸、より好ましくは、そのうち少なくとも１つが正に荷電した側鎖基または極性非荷電側鎖基を含む１つまたは２つのアミノ酸、さらにより好ましくは、正に荷電した側鎖基または極性非荷電側鎖基を含む１つのアミノ酸を含む、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１５９】
好ましくは、正に荷電した側鎖基を含む少なくとも１つのアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシン、好ましくはアルギニンであり、または極性非荷電側鎖基を含む少なくとも１つのアミノ酸は、セリン、スレオニン、アスパラギンもしくはグルタミン、好ましくはセリンである。
【０１６０】
したがって、ある特定の好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、そのうち少なくとも１つがアルギニン、ヒスチジンまたはリシン（好ましくはアルギニン）である１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１６１】
ある特定のより好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、そのうち少なくとも１つがアルギニン、ヒスチジンまたはリシン（好ましくはアルギニン）である１つ、２つまたは３つのアミノ酸、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１６２】
ある特定のさらにより好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、アルギニン、ヒスチジンまたはリシン（好ましくはアルギニン）によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１６３】
したがって、ある特定の実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応するアミノ酸位置において、そのうち少なくとも１つがアルギニン、ヒスチジンまたはリシン（好ましくはアルギニン）である１つまたは複数のアミノ酸、好ましくは、そのうち少なくとも１つがアルギニン、ヒスチジンまたはリシン（好ましくはアルギニン）である１つ、２つまたは３つのアミノ酸、より好ましくは、そのうち少なくとも１つがアルギニン、ヒスチジンまたはリシン（好ましくはアルギニン）である１つまたは２つのアミノ酸、さらにより好ましくは、アルギニン、ヒスチジンまたはリシン（好ましくはアルギニン）である１つのアミノ酸を含む、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１６４】
したがって、ある特定の好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、そのうち少なくとも１つがセリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン（好ましくはセリン）である１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１６５】
ある特定のより好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、そのうち少なくとも１つがセリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン（好ましくはセリン）である１つ、２つまたは３つのアミノ酸、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１６６】
ある特定のさらにより好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、セリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン（好ましくはセリン）によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１６７】
したがって、ある特定の実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応するアミノ酸位置において、そのうち少なくとも１つがセリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン（好ましくはセリン）である１つまたは複数のアミノ酸、好ましくは、そのうち少なくとも１つがセリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン（好ましくはセリン）である１つ、２つまたは３つのアミノ酸、より好ましくは、そのうち少なくとも１つがセリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン（好ましくはセリン）である１つまたは２つのアミノ酸、さらにより好ましくは、セリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン（好ましくはセリン）である１つのアミノ酸を含む、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１６８】
ある特定の好ましい実施形態は、
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、そのうち少なくとも１つが負に荷電した側鎖基を含む、好ましくは、そのうち少なくとも１つがアスパラギン酸またはグルタミン酸（好ましくはアスパラギン酸）である１つまたは複数のアミノ酸によって置換され；
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、
そのうち少なくとも１つが正に荷電した側鎖基を含む、好ましくは、そのうち少なくとも１つがアルギニン、ヒスチジンもしくはリシン（好ましくはアルギニン）である１つまたは複数のアミノ酸；または
そのうち少なくとも１つが極性非荷電側鎖基を含む、好ましくは、そのうち少なくとも１つがセリン、スレオニン、アスパラギンもしくはグルタミン（好ましくはセリン）である１つまたは複数のアミノ酸
によって置換されている、
ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１６９】
ある特定のより好ましい実施形態は、
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、そのうち少なくとも１つが負に荷電した側鎖基を含む、好ましくは、そのうち少なくとも１つがアスパラギン酸またはグルタミン酸（好ましくはアスパラギン酸）である１つ、２つまたは３つのアミノ酸、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸によって置換され；
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、
そのうち少なくとも１つが正に荷電した側鎖基を含む、好ましくは、そのうち少なくとも１つがアルギニン、ヒスチジンもしくはリシン（好ましくはアルギニン）である１つ、２つもしくは３つのアミノ酸、好ましくは１つもしくは２つのアミノ酸；または
そのうち少なくとも１つが極性非荷電側鎖基を含む、好ましくは、そのうち少なくとも１つがセリン、スレオニン、アスパラギンもしくはグルタミン（好ましくはセリン）である１つ、２つもしくは３つのアミノ酸、好ましくは１つもしくは２つのアミノ酸
によって置換されている、
ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１７０】
ある特定のさらにより好ましい実施形態は、
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、負に荷電した側鎖基を含む１つのアミノ酸によって、好ましくは、アスパラギン酸またはグルタミン酸によって（好ましくはアスパラギン酸によって）置換され；
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、
正に荷電した側鎖基を含む１つのアミノ酸によって、好ましくは、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンによって（好ましくはアルギニンによって）；または
極性非荷電側鎖基を含む１つのアミノ酸によって、好ましくは、セリン、スレオニン、アスパラギンもしくはグルタミンによって（好ましくはセリンによって）
置換されている、
ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１７１】
したがって、ある特定の実施形態は、
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応するアミノ酸位置において、そのうち少なくとも１つが負に荷電した側鎖基を含む１つまたは複数のアミノ酸、好ましくは、そのうち少なくとも１つが負に荷電した側鎖基を含む１つ、２つまたは３つのアミノ酸、より好ましくは、そのうち少なくとも１つが負に荷電した側鎖基を含む１つまたは２つのアミノ酸、さらにより好ましくは、負に荷電した側鎖基を含む１つのアミノ酸；および
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応するアミノ酸位置において、そのうち少なくとも１つが正に荷電した側鎖基または極性非荷電側鎖基を含む１つまたは複数のアミノ酸、好ましくは、そのうち少なくとも１つが正に荷電した側鎖基または極性非荷電側鎖基を含む１つ、２つまたは３つのアミノ酸、より好ましくは、そのうち少なくとも１つが正に荷電した側鎖基または極性非荷電側鎖基を含む１つまたは２つのアミノ酸、さらにより好ましくは、正に荷電した側鎖基または極性非荷電側鎖基を含む１つのアミノ酸
を含む、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１７２】
したがって、ある特定の実施形態は、
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応するアミノ酸位置において、そのうち少なくとも１つがアスパラギン酸またはグルタミン酸（好ましくはアスパラギン酸）である１つまたは複数のアミノ酸、好ましくは、そのうち少なくとも１つがアスパラギン酸またはグルタミン酸（好ましくはアスパラギン酸）である１つ、２つまたは３つのアミノ酸、より好ましくは、そのうち少なくとも１つがアスパラギン酸またはグルタミン酸（好ましくはアスパラギン酸）である１つまたは２つのアミノ酸、さらにより好ましくは、アスパラギン酸またはグルタミン酸（好ましくはアスパラギン酸）である１つのアミノ酸；および
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応するアミノ酸位置において、そのうち少なくとも１つがアルギニン、ヒスチジンまたはリシン（好ましくはアルギニン）である１つまたは複数のアミノ酸、好ましくは、そのうち少なくとも１つがアルギニン、ヒスチジンまたはリシン（好ましくはアルギニン）である１つ、２つまたは３つのアミノ酸、より好ましくは、そのうち少なくとも１つがアルギニン、ヒスチジンまたはリシン（好ましくはアルギニン）である１つまたは２つのアミノ酸、さらにより好ましくは、アルギニン、ヒスチジンまたはリシン（好ましくはアルギニン）である１つのアミノ酸
を含む、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１７３】
したがって、ある特定の実施形態は、
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応するアミノ酸位置において、そのうち少なくとも１つがアスパラギン酸またはグルタミン酸（好ましくはアスパラギン酸）である１つまたは複数のアミノ酸、好ましくは、そのうち少なくとも１つがアスパラギン酸またはグルタミン酸（好ましくはアスパラギン酸）である１つ、２つまたは３つのアミノ酸、より好ましくは、そのうち少なくとも１つがアスパラギン酸またはグルタミン酸（好ましくはアスパラギン酸）である１つまたは２つのアミノ酸、さらにより好ましくは、アスパラギン酸またはグルタミン酸（好ましくはアスパラギン酸）である１つのアミノ酸；および
配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応するアミノ酸位置において、そのうち少なくとも１つがセリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン（好ましくはセリン）である１つまたは複数のアミノ酸、好ましくは、そのうち少なくとも１つがセリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン（好ましくはセリン）である１つ、２つまたは３つのアミノ酸、より好ましくは、そのうち少なくとも１つがセリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン（好ましくはセリン）である１つまたは２つのアミノ酸、さらにより好ましくは、セリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン（好ましくはセリン）である１つのアミノ酸
を含む、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１７４】
したがって、ある特定の好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、アスパラギン酸によって置換され、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、アルギニンによって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１７５】
したがって、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応するアミノ酸位置においてアスパラギン酸を含み、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応するアミノ酸位置においてアルギニンを含む、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片もまた提供される。
【０１７６】
ある特定のさらに好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、アルギニンによって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１７７】
したがって、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応するアミノ酸位置においてアルギニンを含む、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片もまた提供される。
【０１７８】
ある特定のさらに好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、アスパラギン酸によって置換され、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、セリンによって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１７９】
したがって、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応するアミノ酸位置においてアスパラギン酸を含み、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応するアミノ酸位置においてセリンを含む、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片もまた提供される。
【０１８０】
ある特定のさらに好ましい実施形態は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、セリンによって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１８１】
したがって、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応するアミノ酸位置においてセリンを含む、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片もまた提供される。
【０１８２】
好ましい実施形態は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号２（図２）に示されるとおりである、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１８３】
好ましい実施形態は、機能的に活性なバリアントが、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す、例えば、機能的に活性なバリアントが、配列番号２に対して、望ましさの低い順に、９０％、少なくとも９１％（例えば、９１％）、少なくとも９２％（例えば、９２％）、少なくとも９３％（例えば、９３％）、少なくとも９４％（例えば、９４％）、少なくとも９５％（例えば、９５％）、少なくとも９６％（例えば、９６％）、少なくとも９７％（例えば、９７％）、少なくとも９８％（例えば、９８％）または少なくとも９９％（例えば、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％）の配列同一性を示す、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１８４】
好ましい実施形態は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号３（図３）に示されるとおりである、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１８５】
好ましい実施形態は、機能的に活性なバリアントが、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す、例えば、機能的に活性なバリアントが、配列番号３に対して、望ましさの低い順に、９０％、少なくとも９１％（例えば、９１％）、少なくとも９２％（例えば、９２％）、少なくとも９３％（例えば、９３％）、少なくとも９４％（例えば、９４％）、少なくとも９５％（例えば、９５％）、少なくとも９６％（例えば、９６％）、少なくとも９７％（例えば、９７％）、少なくとも９８％（例えば、９８％）または少なくとも９９％（例えば、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％）の配列同一性を示す、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１８６】
好ましい実施形態は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号４（図４）に示されるとおりである、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１８７】
好ましい実施形態は、機能的に活性なバリアントが、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す、例えば、機能的に活性なバリアントが、配列番号４に対して、望ましさの低い順に、９０％、少なくとも９１％（例えば、９１％）、少なくとも９２％（例えば、９２％）、少なくとも９３％（例えば、９３％）、少なくとも９４％（例えば、９４％）、少なくとも９５％（例えば、９５％）、少なくとも９６％（例えば、９６％）、少なくとも９７％（例えば、９７％）、少なくとも９８％（例えば、９８％）または少なくとも９９％（例えば、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％）の配列同一性を示す、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１８８】
好ましい実施形態は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号５（図５）に示されるとおりである、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１８９】
好ましい実施形態は、機能的に活性なバリアントが、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す、例えば、機能的に活性なバリアントが、配列番号５に対して、望ましさの低い順に、９０％、少なくとも９１％（例えば、９１％）、少なくとも９２％（例えば、９２％）、少なくとも９３％（例えば、９３％）、少なくとも９４％（例えば、９４％）、少なくとも９５％（例えば、９５％）、少なくとも９６％（例えば、９６％）、少なくとも９７％（例えば、９７％）、少なくとも９８％（例えば、９８％）または少なくとも９９％（例えば、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％）の配列同一性を示す、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１９０】
本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３およびシステイン３２６に対応するアミノ酸位置に位置するアミノ酸間の直接的または間接的相互作用を、有利なことに含み得る。
【０１９１】
したがって、上述のように、第２の態様は、
１つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも１つが、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、前記１つまたは複数のアミノ酸によって本明細書に教示されるように置換されている；または
１つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも１つが、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、前記１つまたは複数のアミノ酸によって本明細書に教示されるように置換されている；または
第１のアミノ酸を置換する前記１つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも１つが、第２のアミノ酸を置換する前記１つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも１つと直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって本明細書に教示されるように置換され、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸が、１つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸は、１つ、２つまたは３つのアミノ酸によって置換され得る。
【０１９３】
ある特定のさらなる実施形態では、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸は、１つ、２つまたは３つのアミノ酸によって置換され得る。
【０１９４】
ある特定の他の実施形態では、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸は、１つ、２つまたは３つのアミノ酸によって置換され得、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸は、１つ、２つまたは３つのアミノ酸によって置換され得る。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸は、１つのアミノ酸によって置換され得る。
【０１９６】
ある特定のさらなる実施形態では、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸は、１つのアミノ酸によって置換され得る。
【０１９７】
ある特定の他の実施形態では、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸は、１つのアミノ酸によって置換され得、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸は、１つのアミノ酸によって置換され得る。
【０１９８】
ある特定の実施形態では、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸は、アスパラギン以外の１つまたは複数のアミノ酸によって、好ましくは、アスパラギン以外の１つ、２つまたは３つのアミノ酸によって、より好ましくは、アスパラギン以外の１つのアミノ酸によって置換されたアスパラギンであり得る。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸は、システイン以外の１つまたは複数のアミノ酸によって、好ましくは、システイン以外の１つ、２つまたは３つのアミノ酸によって、より好ましくは、システイン以外の１つのアミノ酸によって置換されたシステインであり得る。
【０２００】
ある特定の実施形態では、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸は、アスパラギン以外の１つまたは複数のアミノ酸によって、好ましくは、アスパラギン以外の１つ、２つまたは３つのアミノ酸によって、より好ましくは、アスパラギン以外の１つのアミノ酸によって置換されたアスパラギンであり得；配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸は、システイン以外の１つまたは複数のアミノ酸によって、好ましくは、システイン以外の１つ、２つまたは３つのアミノ酸によって、より好ましくは、システイン以外の１つのアミノ酸によって置換されたシステインであり得る。
【０２０１】
用語「相互作用」、「相互作用する」、「相互作用することが可能」または類似の語は、分子間または分子内に存在する非共有結合相互作用を広く指す。
【０２０２】
より特には、本明細書では、これらの用語は、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸間、より特には、アミノ酸の側鎖間、より典型的には２つのアミノ酸の側鎖間の非共有結合相互作用を指し得る。
【０２０３】
非共有結合相互作用に関与するために、アミノ酸、例えば２つのアミノ酸、より特にはアミノ酸の側鎖は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の三次元構造において空間的に接近し得る。例として、アミノ酸の側鎖間の距離、より特には、側鎖間の直接的相互作用の基礎をなす原子または官能基間の距離は、イオン性相互作用の場合、最大でも約５．０Å、好ましくは最大でも約４．５Å、より好ましくは最大でも約４．０Å（例えば、４．０Å、３．９Å、３．８Å、３．７Å、３．６Å、３．５Å、３．４Å、３．３Å、３．２Å、３．１Å、３．０Åまたはそれよりも短く）であり得る。例として、アミノ酸の側鎖間の距離、より特には、側鎖間の直接的相互作用の基礎をなす原子または官能基間の距離は、水素結合相互作用の場合、最大でも約４．０Å（ドナー−アクセプター距離）、例えば、２．２Å〜２．５Åまたは２．５Å〜３．２Åまたは３．２Å〜４．０Å（ドナー−アクセプター距離）であり得る。例として、アミノ酸の側鎖間の距離、より特には、側鎖間の直接的相互作用の基礎をなす原子または官能基間の距離は、ファンデルワールス相互作用の場合、それぞれの相互作用する原子または官能基のファンデルワールス半径の合計と実質的に等しいまたはそれ未満であり得る。
【０２０４】
アミノ酸間の直接的相互作用に対する言及は、アミノ酸、特にアミノ酸の側鎖、より特には側鎖のある特定の原子または官能基が、より特には、互いの間にイオン性相互作用または水素結合相互作用またはファンデルワールス相互作用を形成することによって、互いと相互作用することを示す。
【０２０５】
アミノ酸間の間接的相互作用に対する言及は、アミノ酸、特にアミノ酸の側鎖、より特には側鎖のある特定の原子または官能基が、それらの間に介在する１つまたは複数の分子と相互作用し得ることを示す。例として、２つのアミノ酸側鎖の各々は、水などの溶媒の同じ分子と水素結合を形成し、それによって間接的相互作用に関与し得る。
【０２０６】
したがって、ある特定の実施形態では、相互作用は、イオン性相互作用または水素結合相互作用またはファンデルワールス相互作用であり得、前記用語は、当該分野で十分理解されている。限定ではなく例として、イオン性相互作用とは、反対に荷電したイオン間の静電誘引が関与する非共有結合相互作用または非共有結合を指す；水素結合相互作用とは、高度に電気陰性の原子、例えば、Ｎ、ＯまたはＦに結合した水素原子が、その近位にある別の高度に電気陰性の原子（例えば、Ｎ、ＯまたはＦ）に誘引される場合に生じる、極性基間の静電誘引が関与する非共有結合相互作用または非共有結合を指す；ファンデルワールス相互作用は、ロンドン分散力および双極子−双極子力を含む。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、イオン性相互作用は、少なくとも１つのイオン対の形成を含む。
【０２０８】
用語「イオン対」とは一般に、それらの間の誘引の静電力によって一時的に一緒に結合した陽イオンおよび陰イオンからなる荷電粒子（普通に荷電した原子または分子）の二重体を指す。
【０２０９】
好ましくは、本明細書では、用語「イオン対」は、塩基性アミノ酸残基の窒素原子（Ｎ原子）と酸性アミノ酸残基のカルボン酸酸素原子（Ｏ原子）との間の静電相互作用を指す。塩基性アミノ酸残基は、アルギニン、ヒスチジンまたはリシンであり得る。酸性アミノ酸残基は、アスパラギン酸（もしくはアスパルテート）またはグルタミン酸（もしくはグルタメート）であり得る。
【０２１０】
塩基性アミノ酸残基について、ヒスチジンのＮＤ１原子および／もしくはＮＥ２原子、アルギニンのＮＨ１原子および／もしくはＮＨ２原子、ならびに／またはリシンのＮＺ原子が、イオン対の形成に関与し得る。酸性アミノ酸残基について、アスパルテートのＯＤ１原子および／もしくはＯＤ２原子、ならびに／またはグルタメートのＯＥ１原子および／もしくはＯＥ２原子が、イオン対の形成に関与し得る。
【０２１１】
ある特定の実施形態では、イオン対は、完全なイオン対または不完全なイオン対であり得る。
【０２１２】
用語「完全なイオン対」とは、１）各アミノ酸残基（即ち、酸性アミノ酸残基および塩基性アミノ酸残基）の両方の原子、または２）酸性アミノ酸残基由来の両方の原子（例えば、アスパラギン酸の２つのカルボン酸酸素原子）および塩基性アミノ酸残基由来の１つの原子（例えば、リシンの窒素原子）もしくは両方の原子（例えば、アルギニンの２つの窒素原子）、または３）塩基性アミノ酸残基由来の両方の原子（例えば、アルギニンの２つの窒素原子）および酸性アミノ酸残基由来の１つの原子（例えば、アスパラギン酸の１つのカルボン酸酸素原子）もしくは両方の原子（例えば、アスパラギン酸の２つのカルボン酸酸素原子）が、イオン対に関与（involved  in／participate  in）する、イオン対を指す。
【０２１３】
用語「不完全なイオン対」とは、各アミノ酸残基（即ち、酸性アミノ酸残基および塩基性アミノ酸残基）の１つの原子だけがイオン対に関与（involved  in／participate  in）するイオン対を指す。イオン対は、幾何学的基準に基づいて、塩橋、窒素−酸素（Ｎ−Ｏ）架橋、炭素−炭素（Ｃ−Ｃ）架橋またはより遠い（longer-range）イオン対として分類され得る（KumarおよびNussinov、２００２年、Biophys.  J.、８３巻（３号）：１５９５〜６１２頁）。
【０２１４】
イオン対の存在は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法またはＸ線結晶解析などの当該分野で公知の方法を使用して決定され得る。結晶構造可視化および分子デザインプログラムを使用するタンパク質構造の分析は、個々の原子間の接触に関する洞察を可能にする。イオン対のような接触の検出は、それらの原子間距離および幾何学的構成によって主に駆動される。
【０２１５】
用語「塩橋」とは、荷電アミノ酸残基の側鎖原子の重心が、２．５Åおよび４．０Åの距離以内であり、アスパラギン酸またはグルタミン酸の側鎖カルボン酸酸素原子およびアルギニン、ヒスチジンまたはリシンの側鎖窒素原子の少なくとも１つの対が、４．０Åの距離以内である、イオン対を指す。
【０２１６】
用語「Ｃ−Ｃ架橋」とは、荷電アミノ酸残基の側鎖原子の重心が、２．５Åおよび４．０Åの距離以内であるが、アスパラギン酸またはグルタミン酸の側鎖カルボン酸酸素原子とアルギニン、ヒスチジンまたはリシンの側鎖窒素原子との間の距離が、４．０Åよりも大きい、イオン対を指す。
【０２１７】
用語「Ｎ−Ｏ架橋」とは、アスパラギン酸またはグルタミン酸の側鎖カルボン酸酸素原子およびアルギニン、ヒスチジンまたはリシンの側鎖窒素原子の少なくとも１つの対が、４．０Åの距離以内であるが、荷電アミノ酸残基の側鎖原子の重心間の距離が、４．０Åよりも大きい、イオン対を指す。
【０２１８】
用語「より遠いイオン対」とは、荷電アミノ酸残基の側鎖原子の重心間の距離ならびに側鎖窒素原子と酸素原子との間の距離が、４．０Åよりも大きい、イオン対を指す。
【０２１９】
ある特定の実施形態では、イオン対は、塩橋、Ｎ−Ｏ架橋、Ｃ−Ｃ架橋またはより遠いイオン対であり得る。好ましくは、イオン対は、塩橋またはＮ−Ｏ架橋である。より好ましくは、イオン対は塩橋である。
【０２２０】
ある特定の実施形態では、荷電（即ち、塩基性および酸性）アミノ酸残基の側鎖原子の重心間の距離は、ＮＭＲ分光法によって測定した場合、最大でも５．０Å、好ましくは最大でも４．０Å、より好ましくは２．５Å〜４．０Åであり得る。
【０２２１】
ある特定の実施形態では、アスパラギン酸またはグルタミン酸の側鎖カルボン酸酸素原子およびアルギニン、ヒスチジンまたはリシンの側鎖窒素原子の少なくとも１つの対間の距離は、ＮＭＲ分光法によって測定した場合、最大でも４．０Å、好ましくは２．５Å〜４．０Åであり得る。
【０２２２】
ある特定の実施形態では、イオン対は、分子内または分子間イオン対であり得る。ClarkおよびGarman  ２００９年を参照して本明細書の他の箇所に記載されるように、成熟ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドは、ホモダイマーを形成する。したがって、分子内イオン対とは、同じＮＡＧＡＬポリペプチドの第１のドメインと第２のドメインとの間、即ち、１つの同じＮＡＧＡＬモノマーの第１のドメインと第２のドメインとの間に形成されるイオン対を指す。分子間イオン対とは、ＮＡＧＡＬホモダイマー中の一方のＮＡＧＡＬポリペプチドの第１のドメインとＮＡＧＡＬホモダイマー中の他方のＮＡＧＡＬポリペプチドの第２のドメインとの間、即ち、２つの別個のＮＡＧＡＬモノマーの第１のドメインと第２のドメインとの間に形成されるイオン対を指す。好ましくは、イオン対は、分子内イオン対であり得る。
【０２２３】
ある特定の好ましい実施形態では、少なくとも１つのイオン対は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸を置換する１つまたは複数の（好ましくは１つ、２つまたは３つの、より好ましくは１つまたは２つの、さらにより好ましくは１つの）アミノ酸に含まれるアミノ酸の負に荷電した側鎖基と、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸を置換する１つまたは複数の（好ましくは１つ、２つまたは３つの、より好ましくは１つまたは２つの、さらにより好ましくは１つの）アミノ酸に含まれるアミノ酸の正に荷電した側鎖基との間に形成され得る。
【０２２４】
ある特定の好ましい実施形態では、少なくとも１つのイオン対は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸を置換する１つまたは複数の（好ましくは１つ、２つまたは３つの、より好ましくは１つまたは２つの、さらにより好ましくは１つの）アミノ酸に含まれるアスパラギン酸またはグルタミン酸の負に荷電した側鎖基と、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸を置換する１つまたは複数の（好ましくは１つ、２つまたは３つの、より好ましくは１つまたは２つの、さらにより好ましくは１つの）アミノ酸に含まれるアルギニン、ヒスチジンまたはリシンの正に荷電した側鎖基との間に形成され得る。
【０２２５】
ある特定の好ましい実施形態では、少なくとも１つのイオン対は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応する第１のアミノ酸を置換する１つまたは複数の（好ましくは１つ、２つまたは３つの、より好ましくは１つまたは２つの、さらにより好ましくは１つの）アミノ酸に含まれるアスパラギン酸の負に荷電した側鎖基と、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応する第２のアミノ酸を置換する１つまたは複数の（好ましくは１つ、２つまたは３つの、より好ましくは１つまたは２つの、さらにより好ましくは１つの）アミノ酸に含まれるアルギニンの正に荷電した側鎖基との間に形成され得る。
【０２２６】
ある特定の実施形態では、水素結合相互作用は、直接的相互作用であり得る、または１つもしくは複数の溶媒分子、好ましくは１つもしくは複数の水分子を含み得る。
【０２２７】
以前に述べたように、第３の態様は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片が、第１のドメインが第２のドメインと少なくとも１つの（さらなる）イオン対を形成することが可能であるように、改変される、第１のドメインおよび第２のドメインを含むヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０２２８】
本明細書で意図する場合、用語「第１のドメインが第２のドメインと少なくとも１つのイオン対を形成することが可能であるように、改変される」は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の第１のドメインと第２のドメインとの間に少なくとも１つのイオン対が形成される能力を可能にする、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の任意の１つまたは複数の改変（変更、変化、適応）を広く包含する。限定ではなく例として、かかる改変は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の一次アミノ酸配列を変更すること、および／あるいはヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の１つまたは複数のアミノ酸側鎖を、例えば化学反応によって変更することを伴い得る。
【０２２９】
特に好ましくは、本明細書で意図する場合、「第１のドメインが第２のドメインと少なくとも１つのイオン対を形成することが可能であるように、改変される」とは、その第１のドメインと第２のドメインの間に少なくとも１つのイオン対が形成されるのを可能にするなどのためにその一次アミノ酸配列が改変された、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を指す。
【０２３０】
例として、改変は、第１のドメインのみに、または第２のドメインのみに、または第１のドメインおよび第２のドメインの両方にあり得る。
【０２３１】
例えば、用語「改変された」とは、本明細書で使用する場合、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸（残基）の、別のアミノ酸（残基）による置換；ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸配列への少なくとも１つのアミノ酸（残基）の付加；あるいはヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸（残基）の欠失；あるいはそれらの任意の組合せを指し得る。
【０２３２】
ある特定の実施形態では、本明細書で意図する改変は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る、本質的にそれらからなり得る、またはそれらからなり得る。
【０２３３】
ある特定の実施形態では、本明細書で意図する改変は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸置換、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸置換、より好ましくは２つのアミノ酸置換を含み得る、本質的にそれらからなり得る、またはそれらからなり得る。
【０２３４】
ある特定の実施形態では、本明細書で意図する改変は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の第１のドメインのアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸置換、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸置換、より好ましくは１つのアミノ酸置換を含み得る、本質的にそれらからなり得る、またはそれらからなり得る。
【０２３５】
ある特定の実施形態では、本明細書で意図する改変は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の第２のドメインのアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸置換、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸置換、より好ましくは１つのアミノ酸置換を含み得る、本質的にそれらからなり得る、またはそれらからなり得る。
【０２３６】
ある特定の実施形態では、本明細書で意図する改変は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの機能的に活性なバリアントもしくは断片の第１のドメインのアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸置換、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸置換、より好ましくは１つのアミノ酸置換；およびヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはヒトＮＡＧＡＬポリペプチドの機能的に活性なバリアントもしくは断片の第２のドメインのアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸置換、好ましくは１つまたは２つのアミノ酸置換、より好ましくは１つのアミノ酸置換を含み得る、本質的にそれらからなり得る、またはそれらからなり得る。
【０２３７】
本明細書で意図する場合、第１のドメインが第２のドメインと少なくとも１つのイオン対を形成することが可能であるような、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸配列の改変をもたらす変異は、典型的に、前記ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に含まれる核酸配列中に存在する。「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、本明細書で使用する場合、それ自体公知の翻訳開始コドンで始まり翻訳終結コドンで終わり、いずれの内部インフレーム翻訳終結コドンも含まず、タンパク質またはポリペプチドをコードすることが潜在的に可能な、コーディングヌクレオチド三つ組み（コドン）の連続を指す。
【０２３８】
意図した効果を達成する、例えば、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列を改変する任意の型の変異が、本明細書で企図される。例えば、適切な変異には、核酸の欠失、挿入および／または置換が含まれ得る。用語「核酸欠失」とは、核酸の１つまたは複数のヌクレオチド、典型的には連続するヌクレオチドが、核酸から除去、即ち欠失される変異を指す。用語「核酸挿入」とは、１つまたは複数のヌクレオチド、典型的には連続するヌクレオチドが、核酸中に付加、即ち挿入される変異を指す。用語「核酸置換」とは、核酸の１つまたは複数のヌクレオチドが、各々独立して、別のヌクレオチドによって置き換えられる、即ち置換される変異を指す。
【０２３９】
記述「第１のドメインが第２のドメインと少なくとも１つのイオン対を形成することが可能である」は、記述「第２のドメインが第１のドメインと少なくとも１つのイオン対を形成することが可能である」および「第１および第２のドメインが少なくとも１つのイオン対を形成することが可能である」と相互交換可能に使用され得、第１のドメインのアミノ酸と第２のドメインのアミノ酸とがイオン対に携わる能力、より特には、第１のドメインのアミノ酸側鎖と第２のドメインのアミノ酸側鎖とがイオン対に携わる能力を指す。
【０２４０】
ある特定の実施形態では、第１のドメインは、１つの（β／α）８バレルを含み、第２のドメインは、２つのβシート中に８つのアンチパラレルβ鎖を含む。
【０２４１】
ある特定の実施形態は、（β／α）８バレルが８つのアンチパラレルβ鎖と少なくとも１つのイオン対を形成することが可能であるように、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片が改変される、１つの（β／α）８バレルおよび８つのアンチパラレルβ鎖を含むヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片に関する。
【０２４２】
ある特定の実施形態では、イオン対は、第１のアミノ酸および第２のアミノ酸によって形成され得る。ある特定の実施形態では、イオン対は、第１のアミノ酸および第２のアミノ酸によって形成され得、第１のドメインは第１のアミノ酸を含み、第２のドメインは第２のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、イオン対は、第１のアミノ酸および第２のアミノ酸によって形成され得、第１のアミノ酸は、第１のドメインの一部であり、第２のアミノ酸は、第２のドメインの一部である。
【０２４３】
便宜上、イオン対の形成に関与する、本明細書に開示される、特に、本発明の第３の態様に従って開示される、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸は、「第１のアミノ酸（a  first  amino  acid）」または「第１のアミノ酸（the  first  amino  acid）」および「第２のアミノ酸（a  second  amino  acid）」または「第２のアミノ酸（the  second  amino  acid）」と本明細書で呼ばれ得る。
【０２４４】
疑いを回避するために、序数「第１の」および「第２の」は、この文脈では、イオン対の形成に関与する、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片中の特定のアミノ酸を示すために、およびより特には、前記アミノ酸間を識別するために機能する。結果として、用語「第１の」および「第２の」アミノ酸は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の一次アミノ酸配列中の、それぞれ１番目および２番目に来るアミノ酸を指すことを意図しない。
【０２４５】
イオン対が、第１のアミノ酸および第２のアミノ酸によって形成される場合、第１のアミノ酸および／または第２のアミノ酸の位置は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸の対応する位置に言及することによって、簡便に定義され得る。配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸１（即ち、ロイシン）の位置は、１位を示す。
【０２４６】
ある特定の実施形態では、イオン対の第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２０８とアミノ酸２１８との間の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る。
【０２４７】
ある特定の実施形態では、イオン対の第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２１とアミノ酸３３１との間の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る。
【０２４８】
例として、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の改変は、イオン対の第１のアミノ酸を導入することを伴い得るが、イオン対の第２のアミノ酸は、未改変のヒトＮＡＧＡＬ中に既に存在している；またはイオン対の第２のアミノ酸を導入することを伴い得るが、イオン対の第１のアミノ酸は、未改変のヒトＮＡＧＡＬ中に既に存在している；またはイオン対の第１のアミノ酸および第２のアミノ酸の両方を導入することを伴い得る。
【０２４９】
例として、第１のアミノ酸を導入することは、ヒトＮＡＧＡＬの１つもしくは複数（例えば、２、３、４もしくは５または最大で１０）個連続するアミノ酸を、前記第１のアミノ酸を含むもしくは前記第１のアミノ酸からなるアミノ酸配列によって置換することを伴い得、または第１のアミノ酸を導入することは、前記第１のアミノ酸を含むもしくは前記第１のアミノ酸からなるアミノ酸配列をヒトＮＡＧＡＬに付加することを伴い得る。第１のアミノ酸を含むアミノ酸配列は、例えば、２、３、４もしくは５または最大で１０アミノ酸長であり得る。独立して、例として、第２のアミノ酸を導入することは、ヒトＮＡＧＡＬの１つもしくは複数（例えば、２、３、４もしくは５または最大で１０）個連続するアミノ酸を、前記第２のアミノ酸を含むもしくは前記第２のアミノ酸からなるアミノ酸配列によって置換することを伴い得、または第２のアミノ酸を導入することは、前記第２のアミノ酸を含むもしくは前記第２のアミノ酸からなるアミノ酸配列をヒトＮＡＧＡＬに付加することを伴い得る。第２のアミノ酸を含むアミノ酸配列は、例えば、２、３、４もしくは５または最大で１０アミノ酸長であり得る。
【０２５０】
ある特定の実施形態では、イオン対は、第１のアミノ酸および第２のアミノ酸によって形成され得、
第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２０８とアミノ酸２１８との間の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；および／あるいは（好ましくは「および」）
第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２１とアミノ酸３３１との間の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る。
【０２５１】
記述「配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸ｘｘとアミノ酸ｘｘ＋ｎとの間の位置」において、本明細書で使用する場合、用語「との間」は、列挙されたアミノ酸ｘｘおよびｘｘ＋ｎの位置もまた含むことを意味する（ｘｘおよびｎは、正の整数である）。
【０２５２】
したがって、記述「配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸ｘｘとアミノ酸ｘｘ＋ｎとの間の位置」とは、本明細書で使用する場合、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸ｘｘ、アミノ酸ｘｘ＋１、アミノ酸ｘｘ＋２、アミノ酸ｘｘ＋３、アミノ酸ｘｘ＋４、…またはアミノ酸ｘｘ＋ｎの位置を指す。
【０２５３】
例えば、記述「配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２０８とアミノ酸２１８との間の位置」とは、本明細書で使用する場合、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２０８、アミノ酸２０９、アミノ酸２１０、アミノ酸２１１、アミノ酸２１２、アミノ酸２１３、アミノ酸２１４、アミノ酸２１５、アミノ酸２１６、アミノ酸２１７またはアミノ酸２１８の位置を指す。
【０２５４】
例えば、記述「配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２１とアミノ酸３３１との間の位置」とは、本明細書で使用する場合、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２１、アミノ酸３２２、アミノ酸３２３、アミノ酸３２４、アミノ酸３２５、アミノ酸３２６、アミノ酸３２７、アミノ酸３２８、アミノ酸３２９、アミノ酸３３０またはアミノ酸３３１の位置を指す。
【０２５５】
ある特定の実施形態では、
第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２０９とアミノ酸２１７との間の位置、好ましくは、アミノ酸２１０とアミノ酸２１６との間の位置、より好ましくは、アミノ酸２１１とアミノ酸２１５との間の位置、さらにより好ましくは、アミノ酸２１２とアミノ酸２１４との間の位置、最も好ましくは、アミノ酸２１３の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；および／あるいは（好ましくは「および」）
第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２２とアミノ酸３３０との間の位置、好ましくは、アミノ酸３２３とアミノ酸３２９との間の位置、より好ましくは、アミノ酸３２４とアミノ酸３２８との間の位置、さらにより好ましくは、アミノ酸３２５とアミノ酸３２７との間の位置、最も好ましくは、アミノ酸３２６の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る。
【０２５６】
ある特定の実施形態では、第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２０９とアミノ酸２１７との間の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；および／あるいは第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２２とアミノ酸３３０との間の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る。ある特定の実施形態では、第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２１０とアミノ酸２１６との間の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；および／あるいは第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２３とアミノ酸３２９との間の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る。ある特定の実施形態では、第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２１１とアミノ酸２１５との間の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；および／あるいは第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２４とアミノ酸３２８との間の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る。ある特定の実施形態では、第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２１２とアミノ酸２１４との間の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；および／あるいは第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２５とアミノ酸３２７との間の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る。
【０２５７】
ある特定の実施形態では、
第１のアミノ酸は、表１に記載される位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；および／あるいは（好ましくは「および」）
第２のアミノ酸は、表１に記載される位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る。
【０２５８】
ある特定の実施形態では、第１のアミノ酸は、表１に記載される、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸「ＡＡｘ」の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；および／あるいは（好ましくは「および」）第２のアミノ酸は、表１に記載される、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸「ＡＡｙ」の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る。
【０２５９】
ある特定の実施形態では、第１のアミノ酸は、表１に記載される、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸ＡＡ２０８、ＡＡ２０９、ＡＡ２１０、ＡＡ２１１、ＡＡ２１２、ＡＡ２１３、ＡＡ２１４、ＡＡ２１５、ＡＡ２１６、ＡＡ２０１７またはＡＡ２１８の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；および／あるいは（好ましくは「および」）第２のアミノ酸は、表１に記載される、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸ＡＡ３２１、ＡＡ３２２、ＡＡ３２３、ＡＡ３２４、ＡＡ３２５、ＡＡ３２６、ＡＡ３２７、ＡＡ３２８、ＡＡ３２９、ＡＡ３３０またはＡＡ３３１の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る。
【０２６０】
記述「第１のアミノ酸は、表１に記載される、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸「ＡＡｘ」の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；および第２のアミノ酸は、表１に記載される、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸「ＡＡｙ」の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る」とは、表１に記載される第１のアミノ酸および第２のアミノ酸のアミノ酸位置の任意の１つまたは複数の組合せ、例えば全ての組合せ、特に、表現「ＡＡｘ＋ＡＡｙ」によって表１の各欄において特定した組合せを指す。
【０２６１】
【表１−１】
2019503171.tif 000006
【表１−２】
2019503171.tif 000007
【０２６２】
ある特定の実施形態では、
第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２１３の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る（好ましくは、第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応し、それを置換する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る）；および／あるいは
第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２６の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る（好ましくは、第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応し、それを置換する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る）。
【０２６３】
ある特定の実施形態では、
第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２１３の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る（好ましくは、第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応し、それを置換する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る）；および
第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２６の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る（好ましくは、第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応し、それを置換する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る）。
【０２６４】
ある特定の実施形態では、
第１のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み得、好ましくは、第１のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であり、より好ましくは、第１のアミノ酸はアスパラギン酸であり、第２のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得、好ましくは、第２のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンであり、より好ましくは、第２のアミノ酸はアルギニンである；または
第１のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得、好ましくは、第１のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンであり、第２のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み得、好ましくは、第２のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸である。
【０２６５】
ある特定の実施形態では、第１のアミノ酸は、酸性アミノ酸残基であり得、第２のアミノ酸は、塩基性アミノ酸残基であり得る；または第１のアミノ酸は、塩基性アミノ酸残基であり得、第２のアミノ酸は、酸性アミノ酸残基であり得る。
【０２６６】
ある特定の実施形態では、第１のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であり得、第２のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンであり得る；または第１のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンであり得、第２のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であり得る。
【０２６７】
ある特定の実施形態では、第１のアミノ酸はアスパラギン酸であり得、第２のアミノ酸はアルギニンであり得る；または第１のアミノ酸はアルギニンであり得、第２のアミノ酸はアスパラギン酸であり得る。
【０２６８】
ある特定の実施形態では、
第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２０８とアミノ酸２１８との間の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；および／あるいは（好ましくは「および」）第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２１とアミノ酸３３１との間の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；ならびに
第１のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み得、第２のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得る；または第１のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得、第２のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み得る；好ましくは、第１のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み、第２のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得る。
【０２６９】
ある特定の実施形態では、
第１のアミノ酸は、表１に記載される、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸「ＡＡｘ」の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；および／あるいは（好ましくは「および」）第２のアミノ酸は、表１に記載される、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸「ＡＡｙ」の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；ならびに
第１のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み得、第２のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得る；または第１のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得、第２のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み得る；好ましくは、第１のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み、第２のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得る。
【０２７０】
ある特定の実施形態では、
第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２１３の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る（好ましくは、第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応し、それを置換する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る）；および第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２６の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る（好ましくは、第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応し、それを置換する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る）；ならびに
第１のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み得、第２のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得る；または第１のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得、第２のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み得る；好ましくは、第１のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み、第２のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得る。
【０２７１】
ある特定の実施形態では、
第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２０８とアミノ酸２１８との間の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；および／あるいは（好ましくは「および」）第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２１とアミノ酸３３１との間の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；ならびに
第１のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であり、第２のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンである；または第１のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンであり、第２のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸である；好ましくは、第１のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であり、第２のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンである。
【０２７２】
ある特定の実施形態では、
第１のアミノ酸は、表１に記載される、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸「ＡＡｘ」の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；および／あるいは（好ましくは「および」）第２のアミノ酸は、表１に記載される、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸「ＡＡｙ」の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；ならびに
第１のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であり、第２のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンである；または第１のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンであり、第２のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸である；好ましくは、第１のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であり、第２のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンである。
【０２７３】
ある特定の実施形態では、
第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２１３の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る（好ましくは、第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応し、それを置換する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る）；および第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２６の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る（好ましくは、第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応し、それを置換する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る）；ならびに
第１のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であり、第２のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンである；または第１のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンであり、第２のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸である；好ましくは、第１のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であり、第２のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンである。
【０２７４】
ある特定の実施形態では、
第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２０８とアミノ酸２１８との間の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；および／あるいは（好ましくは「および」）第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２１とアミノ酸３３１との間の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；ならびに
第１のアミノ酸はアスパラギン酸であり、第２のアミノ酸はアルギニンである；または第１のアミノ酸はアルギニンであり、第２のアミノ酸はアスパラギン酸である；好ましくは、第１のアミノ酸はアスパラギン酸であり、第２のアミノ酸はアルギニンである。
【０２７５】
ある特定の実施形態では、
第１のアミノ酸は、表１に記載される、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸「ＡＡｘ」の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；および／あるいは（好ましくは「および」）第２のアミノ酸は、表１に記載される、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸「ＡＡｙ」の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る；ならびに
第１のアミノ酸はアスパラギン酸であり、第２のアミノ酸はアルギニンである；または第１のアミノ酸はアルギニンであり、第２のアミノ酸はアスパラギン酸である；好ましくは、第１のアミノ酸はアスパラギン酸であり、第２のアミノ酸はアルギニンである。
【０２７６】
ある特定の実施形態では、
第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２１３の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る（好ましくは、第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応し、それを置換する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る）；および第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２６の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る（好ましくは、第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応し、それを置換する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る）；ならびに
第１のアミノ酸はアスパラギン酸であり、第２のアミノ酸はアルギニンである；または第１のアミノ酸はアルギニンであり、第２のアミノ酸はアスパラギン酸である；好ましくは、第１のアミノ酸はアスパラギン酸であり、第２のアミノ酸はアルギニンである。
【０２７７】
ある特定の実施形態では、
第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２１３の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置するアスパラギン酸であり得る；および
第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２６の位置に対応する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置するアルギニンであり得る。
ある特定の実施形態では、
第１のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアスパラギン２１３に対応し、それを置換する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置するアスパラギン酸であり得る；および
第２のアミノ酸は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのシステイン３２６に対応し、それを置換する、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置するアルギニンであり得る。
ある特定の実施形態は、
第１のアミノ酸が、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２１３の位置に対応する、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置するアスパラギン酸である；および
第２のアミノ酸が、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２６の位置に対応する、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置するアルギニンである、
第１のアミノ酸および第２のアミノ酸を含むヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。ある特定の実施形態では、第１のアミノ酸は、第１のドメインの一部であり、第２のアミノ酸は、第２のドメインの一部である。
【０２７８】
ある特定の実施形態では、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の安定性は、対応する未改変のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の安定性と比較して、少なくとも１％増加し得る。例えば、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の安定性は、対応する未改変のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の安定性と比較して、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％増加し得る。
【０２７９】
用語「対応するヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片」または「対応する未改変のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片」とは、本明細書で使用する場合、本明細書に教示されたように改変されていない、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を指す。しかし、対応する（未改変の）ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、例えばα−ガラクトシダーゼ活性を獲得するなどのために、他の方法で変更され得る。例えば、対応する（未改変の）ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸１７１の位置に対応するアミノ酸位置におけるＳからＥへの置換、および配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸１７４の位置に対応するアミノ酸位置におけるＡからＬへの置換を含み得る。
【０２８０】
ヒトＮＡＧＡＬタンパク質またはポリペプチドの安定性は、ある特定の期間（例えば、１６時間）にわたって、ある特定の温度（例えば、３７℃）で、ある特定の条件下（例えば、異なる組成およびｐＨを有する緩衝液（例えば、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５および５．０）、１０ｍＭクエン酸／リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５、６．０および６．５）または１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、７．５および８．０）中）で、異なるｐＨ値（例えば、４．５のｐＨおよび７．０のｐＨ）を有する緩衝液中、または血漿中）でタンパク質またはポリペプチドをインキュベートするステップ、および時間の関数としてＮＡＧＡＬ活性を（例えば、本明細書の他の箇所に記載されるように、基質としてＭＵ−α−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミンを用いる蛍光定量的アッセイによって）測定するステップを含む方法によって、決定され得る。対照として、対応する未改変のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたは機能的に活性なバリアントもしくは断片が使用され得る。時間ゼロにおける酵素活性（例えば、本明細書に記載されるように、基質としてＭＵ−α−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミンを用いる蛍光定量的アッセイによって測定される、２ｍｍｏｌ／ｈ／ｍｌのＮＡＧＡＬ活性）が、各条件下での１００％に設定され得る。各酵素の安定性は、特定のインキュベーション時点における酵素活性の、時間ゼロにおける値に対する比（例えば、パーセント）として計算および表現され得る。同様に、改変されたまたは未改変のヒトＮＡＧＡＬまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片がα−ガラクトシダーゼ活性を獲得するためにさらに改変された場合、安定性は、α−ガラクトシダーゼ活性の保存を測定することによって決定され得る。
【０２８１】
あるいは、またはさらに、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片などのタンパク質またはポリペプチドの安定性は、示差走査型蛍光定量（ＤＳＦ）とも呼ばれるサーマルシフトアッセイによって予測され得る。
【０２８２】
あるいは、またはさらに、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片などのタンパク質またはポリペプチドの安定性は、タンパク質またはポリペプチドの融解温度（Ｔｍ）を測定することによって予測され得る。
【０２８３】
改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片などのタンパク質またはポリペプチドの「融解温度（Ｔｍ）」は、タンパク質またはポリペプチドの５０％が可逆的熱変性の間に不活性化される温度を指す。
【０２８４】
タンパク質またはポリペプチドの融解温度は、円二色性（ＣＤ）分光法を使用して決定され得る。用語「円二色性分光法」とは一般に、タンパク質の二次構造またはタンパク質フォールディングを研究するためのツールを指す。円二色性分光法は、円偏光の吸収を測定する。タンパク質では、アルファヘリックスおよびベータシートなどの二次構造はキラルであり、したがってかかる光を吸収する。この光の吸収は、タンパク質のフォールディングの程度のマーカーとして機能する。ＣＤは、コンフォメーションにおける変化を示すための有用なツールである。この技術は、吸収の変化を温度の関数として測定することによって、タンパク質の二次構造がどのように変化するかを研究するために使用され得る。このように、ＣＤは、他の方法では容易に取得することができない、タンパク質についての重要な熱力学的情報（例えば、変性のエンタルピーおよびギブズ自由エネルギー）を明らかにできる。
【０２８５】
ある特定の実施形態では、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の融解温度は、対応する未改変のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の安定性と比較して、少なくとも２．０℃増加し得る。例えば、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の融解温度は、対応する未改変のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の融解温度と比較して、少なくとも２．０℃、少なくとも３．０℃、少なくとも４．０℃、少なくとも５．０℃、少なくとも１０．０℃、少なくとも１５．０℃、少なくとも２０．０℃、少なくとも２５．０℃または少なくとも３０．０℃増加し得る。
【０２８６】
ある特定の実施形態では、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の安定性は、円二色性などの適切な方法によって検出可能なように、タンパク質フォールディングを促進するまたはそれを生じさせるなどのために増加され得る。ある特定の実施形態では、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の安定性は、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット検出またはクーマシー染色などの適切な方法によって検出可能なように、組換えタンパク質発現を生じさせるなどのために増加され得る。
【０２８７】
したがって、第４の態様は、対応する未改変のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の安定性と比較して増加した安定性（例えば、上に説明したとおり）を示すなどのために改変された、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０２８８】
ある特定の実施形態では、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２に示されるとおり（図２に示されるとおり）である。配列番号２に示される改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸２１３（即ち、アスパラギン酸）の位置は、図２に示される（下線）。配列番号２に示される改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸３２６（即ち、アルギニン）の位置は、図２に示される（太字下線）。
【０２８９】
ある特定の実施形態では、機能的に活性なバリアントは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す。
【０２９０】
ある特定の実施形態では、機能的に活性なバリアントは、配列番号２に対して少なくとも９１％の配列同一性、例えば、配列番号２に対して少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％の配列同一性を示し得る。
【０２９１】
ある特定の実施形態では、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、第１のドメインが第２のドメインと少なくとも１つのイオン対を形成することが可能であるように、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたは配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に活性なバリアントのアミノ酸配列を改変することによって取得可能であり得る。ある特定の実施形態では、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、第１のドメインが第２のドメインと少なくとも１つのイオン対を形成することが可能であるように、配列番号１に対して少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％；少なくとも９９％または少なくとも９９．５％の配列同一性を有する機能的に活性なバリアントを改変することによって取得可能であり得る。
【０２９２】
本明細書の以下のセクションは、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片に関わる、それに関するまたはそれを使用する主題をさらに記載し発展させる。語句「本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片」または類似の語は、より特には、上に示した第１、第２、第３および第４の態様の任意の１つもしくは複数または全て、ならびにそれらの実施形態に従うヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を含む、本明細書に開示される任意のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を包含することを理解すべきである。
【０２９３】
ある特定の実施形態では、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、α−ガラクトシダーゼ活性を獲得するなどのためにさらに改変され得る。
【０２９４】
例えば、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸１７１の位置に対応するアミノ酸位置におけるＳからＥへの置換、および配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸１７４の位置に対応するアミノ酸位置におけるＡからＬへの置換をさらに含み得る。
【０２９５】
好ましい実施形態は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号６（図６）に示されるとおりである、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０２９６】
好ましい実施形態は、機能的に活性なバリアントが、配列番号６に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す、例えば、機能的に活性なバリアントが、配列番号６に対して、望ましさの低い順に、９０％、少なくとも９１％（例えば、９１％）、少なくとも９２％（例えば、９２％）、少なくとも９３％（例えば、９３％）、少なくとも９４％（例えば、９４％）、少なくとも９５％（例えば、９５％）、少なくとも９６％（例えば、９６％）、少なくとも９７％（例えば、９７％）、少なくとも９８％（例えば、９８％）または少なくとも９９％（例えば、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％）の配列同一性を示す、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０２９７】
好ましい実施形態は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号７（図７）に示されるとおりである、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０２９８】
好ましい実施形態は、機能的に活性なバリアントが、配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す、例えば、機能的に活性なバリアントが、配列番号７に対して、望ましさの低い順に、９０％、少なくとも９１％（例えば、９１％）、少なくとも９２％（例えば、９２％）、少なくとも９３％（例えば、９３％）、少なくとも９４％（例えば、９４％）、少なくとも９５％（例えば、９５％）、少なくとも９６％（例えば、９６％）、少なくとも９７％（例えば、９７％）、少なくとも９８％（例えば、９８％）または少なくとも９９％（例えば、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％）の配列同一性を示す、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０２９９】
好ましい実施形態は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号８（図８）に示されるとおりである、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０３００】
好ましい実施形態は、機能的に活性なバリアントが、配列番号８に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す、例えば、機能的に活性なバリアントが、配列番号８に対して、望ましさの低い順に、９０％、少なくとも９１％（例えば、９１％）、少なくとも９２％（例えば、９２％）、少なくとも９３％（例えば、９３％）、少なくとも９４％（例えば、９４％）、少なくとも９５％（例えば、９５％）、少なくとも９６％（例えば、９６％）、少なくとも９７％（例えば、９７％）、少なくとも９８％（例えば、９８％）または少なくとも９９％（例えば、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％）の配列同一性を示す、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０３０１】
好ましい実施形態は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号９（図９）に示されるとおりである、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０３０２】
好ましい実施形態は、機能的に活性なバリアントが、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を示す、例えば、機能的に活性なバリアントが、配列番号９に対して、望ましさの低い順に、９０％、少なくとも９１％（例えば、９１％）、少なくとも９２％（例えば、９２％）、少なくとも９３％（例えば、９３％）、少なくとも９４％（例えば、９４％）、少なくとも９５％（例えば、９５％）、少なくとも９６％（例えば、９６％）、少なくとも９７％（例えば、９７％）、少なくとも９８％（例えば、９８％）または少なくとも９９％（例えば、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％）の配列同一性を示す、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
【０３０３】
ある特定の実施形態では、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のＣ末端もしくはＮ末端のいずれかまたは両方の末端に、任意選択で１つまたは複数のリンカーペプチドによって接続された１つまたは複数の異種アミノ酸配列などの、１つまたは複数の異種（非ＮＡＧＡＬ）アミノ酸配列をさらに含み得る。
【０３０４】
ある特定の実施形態では、
異種アミノ酸配列は、マンノース−６−リン酸受容体を標的化するための配列からなる群から選択される受容体標的化アミノ酸配列などの、受容体標的化アミノ酸配列であり得る；あるいは
異種アミノ酸配列は、分泌シグナル配列、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐ２プレプロ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐ２プレ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−接合因子、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ＸＰＲ２プレプロもしくはＹａｒｒｏｗｉａ  ＸＰＲ２プレ配列であり得るまたはそれを含み得る；あるいは
異種アミノ酸配列は、分泌シグナル配列、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐ２プレプロ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐ２プレ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−接合因子、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ＸＰＲ２プレプロまたはＹａｒｒｏｗｉａ  ＸＰＲ２プレ配列を含み得、分泌シグナル配列のＣ末端側に２つのＸ−Ａｌａリピートをさらに含み得る；あるいは
異種アミノ酸配列は、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の精製を可能にし得る；あるいは
異種アミノ酸配列は、診断マーカーまたは検出可能なマーカーとしての使用のために構成され得る。
【０３０５】
一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、哺乳動物細胞中への改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の輸送の効率を増強するために使用される。例えば、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、細胞外受容体に対するリガンド、標的細胞の表面上の受容体の細胞外ドメインを結合する標的化ドメイン、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体、またはマンノース−６−リン酸受容体に結合するヒトインスリン様増殖因子ＩＩのドメイン（例えば、ヒトインスリン様増殖因子のアミノ酸１〜６７もしくは１〜８７；少なくともアミノ酸４８〜５５；少なくともアミノ酸８〜２８および４１〜６１；または少なくともアミノ酸８〜８７；ヒトインスリン様増殖因子ＩＩのその配列バリアント（例えば、Ｒ６８Ａ）あるいは短縮形態のヒトインスリン様増殖因子（例えば、位置６２からＣ末端短縮された））に融合され得る。異種アミノ酸配列は、ポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方において融合され得る。一実施形態では、ペプチドタグが、スペーサー（例えば、５〜３０アミノ酸または１０〜２５アミノ酸）によってポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合される。
【０３０６】
ある特定の実施形態では、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、１つまたは複数のＮ−結合型グリカン（Ｎ−グリカン）を含み得る。例として、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドは、５つのＮ−結合型グリコシル化部位（Ｎ１２４、Ｎ１７７、Ｎ２０１、Ｎ３５９およびＮ３８５；開始メチオニンから始まるアミノ酸番号付け）を含むことが、ClarkおよびGarman  ２００９年（上記）によって報告されている。したがって、ある特定の実施形態では、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、例えば、上述の部位に対応する１つまたは複数のＡｓｎ残基において、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのＮ−グリカンを保有し得る。ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片がホモダイマーを形成する場合、モノマーのうち少なくとも一方は、１つまたは複数のＮ−結合型グリカンを含み得る、例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのＮ−グリカンを保有し得る。
【０３０７】
ある特定の実施形態では、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、１つまたは複数のＮ−グリカンを含み得、前記Ｎ−グリカンのうち１つまたは複数は、リン酸化され得る。ある特定の実施形態では、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、１つまたは複数のＮ−グリカンを含み得、前記Ｎ−グリカンの数で４０％またはそれよりも多くが、リン酸化され得る。例えば、前記Ｎ−グリカンの数で５０％もしくはそれよりも多く、６０％もしくはそれよりも多く、７０％もしくはそれよりも多く、８０％もしくはそれよりも多く、９０％もしくはそれよりも多くまたは９５％もしくはそれよりも多くが、リン酸化され得る。Ｎ−グリカンは、典型的には、１つまたは２つのリン酸基を保有する。リン酸化されたＮ−グリカンに対する言及は、モノリン酸化されたＮ−グリカンおよびジリン酸化されたＮ−グリカンの両方を包含する。したがって、Ｎ−グリカンの数で４０％もしくはそれよりも多く（例えば、Ｎ−グリカンの数で５０％もしくはそれよりも多く、６０％もしくはそれよりも多く、７０％もしくはそれよりも多く、８０％もしくはそれよりも多く、９０％もしくはそれよりも多くまたは９５％もしくはそれよりも多く）は、少なくとも１つのリン酸基を保有し得る。ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片がホモダイマーを形成する場合、モノマーのうち少なくとも一方は、そのうち１つまたは複数がリン酸化され得る、１つまたは複数のＮ−結合型グリカンを含み得る。
【０３０８】
ある特定の実施形態では、前記リン酸化されたＮ−グリカンのうち１つまたは複数は、脱キャップ化され得る。ある特定の実施形態では、前記リン酸化されたＮ−グリカンの数で４０％またはそれよりも多くが、脱キャップ化され得る。例えば、前記リン酸化されたＮ−グリカンの数で５０％もしくはそれよりも多く、６０％もしくはそれよりも多く、７０％もしくはそれよりも多く、８０％もしくはそれよりも多く、９０％もしくはそれよりも多くまたは９５％もしくはそれよりも多くが、脱キャップ化され得る。
【０３０９】
これに関して、「脱キャップ化された」とは、特に、ホスホ−６−マンノース部分中のリン酸基が、別の部分、例えば、マンノース−１−イル部分に共有結合的に連結されないことを意味する。例として、真菌細胞などのある特定の生物は、リン酸部分がマンノース残基で「キャップ化」されてマンノース−１−ホスホ−６−マンノース基を形成する、リン酸化されたＮ−グリカンを合成し得る。かかる状況では、「脱キャップ化」とは、マンノース−１−イル残基を除去し、それによって、リン酸部分を曝露させることを指し得る。Ｎ−グリカンが１つよりも多いリン酸基を含む場合、前記リン酸基のうちの少なくとも１つが脱キャップ化されたとき、Ｎ−グリカンは、「脱キャップ化された」と示され得る。好ましくは、両方の前記リン酸基が脱キャップ化され得る。脱キャップ化されたリン酸基を含むＮ−グリカンは、キャップ化されたリン酸基を含むＮ−グリカンよりも実質的に良好に、哺乳動物細胞上のマンノース−６−リン酸受容体に結合し、それによって、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片が哺乳動物細胞の内側に輸送され、最終的にリソソームに輸送される効率を増加させる。
【０３１０】
ある特定の実施形態では、前記リン酸化されたＮ−グリカンのうち１つまたは複数は、脱マンノシル化され得る。ある特定の実施形態では、前記リン酸化されたＮ−グリカンの数で４０％またはそれよりも多くが、脱マンノシル化され得る。例えば、前記リン酸化されたＮ−グリカンの数で５０％もしくはそれよりも多く、６０％もしくはそれよりも多く、７０％もしくはそれよりも多く、８０％もしくはそれよりも多く、９０％もしくはそれよりも多くまたは９５％もしくはそれよりも多くが、脱マンノシル化され得る。これに関して、「脱マンノシル化された」とは、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合の末端アルファ−１，２−マンノースを含む、リン酸含有Ｎ−グリカンの末端アルファ−１，２マンノース部分の加水分解を少なくとも指し得る。したがって、これは、末端マンノースになる６位においてリン酸を含むマンノースを生じる。ある特定の実施形態では、「脱マンノシル化された」とは、リン酸含有Ｎ−グリカンの末端アルファ−１，２マンノース、アルファ−１，３マンノースおよび／または（好ましくは「および」）アルファ−１，６マンノース連結または部分の加水分解を指し得る。より特には、リン酸化された（モノリン酸化されたまたはジリン酸化された）Ｎ−グリカンでは、脱マンノシル化は、Ｎ−グリカンのリン酸化されていないアームの加水分解および基礎をなすマンノースがリン酸化される場合の末端アルファ−１，２−マンノースの加水分解を含み得る。かかる場合には、脱マンノシル化の最終加水分解産物は、ＭａｎＰＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２および（ＭａｎＰ）２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を示す）を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる群から選択され得る。脱キャップ化されたリン酸基を含む脱マンノシル化されたＮ−グリカンは、脱キャップ化されたリン酸基を含む脱マンノシル化されていないＮ−グリカンよりも実質的に良好に、哺乳動物細胞上のマンノース−６−リン酸受容体に結合し、それによって、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片が哺乳動物細胞の内側に輸送され、最終的にリソソームに輸送される効率を増加させる。
【０３１１】
ある特定の実施形態では、前記リン酸化されたＮ−グリカンのうち１つまたは複数は、脱キャップ化および脱マンノシル化され得る。ある特定の実施形態では、前記リン酸化されたＮ−グリカンの数で４０％またはそれよりも多くが、脱キャップ化および脱マンノシル化され得る。例えば、前記リン酸化されたＮ−グリカンの数で５０％もしくはそれよりも多く、６０％もしくはそれよりも多く、７０％もしくはそれよりも多く、８０％もしくはそれよりも多く、９０％もしくはそれよりも多くまたは９５％もしくはそれよりも多くが、脱キャップ化および脱マンノシル化され得る。脱マンノシル化および脱キャップ化の最終加水分解産物は、ＰＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＰ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍａｎはマンノース残基を示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン残基を示す）を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる群から選択され得る。
【０３１２】
したがって、ある特定の実施形態では、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、１つまたは複数のＮ−グリカン、例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのＮ−グリカンを含み得、前記Ｎ−グリカンの数で４０％もしくはそれよりも多く、例えば、前記Ｎ−グリカンの数で５０％もしくはそれよりも多く、６０％もしくはそれよりも多く、７０％もしくはそれよりも多く、８０％もしくはそれよりも多く、９０％もしくはそれよりも多くまたは９５％もしくはそれよりも多くが、リン酸化、脱キャップ化および脱マンノシル化される。例として、前記Ｎ−グリカンの数で４０％もしくはそれよりも多く、５０％もしくはそれよりも多く、６０％もしくはそれよりも多く、７０％もしくはそれよりも多く、８０％もしくはそれよりも多く、９０％もしくはそれよりも多くまたは９５％もしくはそれよりも多くが、ＰＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＰ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる群から選択され得る。
【０３１３】
リン酸化されたＮ−グリカンを含む糖タンパク質は、脱マンノシル化され得、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース連結または部分を含むリン酸化されたＮ−グリカンを含む糖タンパク質は、糖タンパク質を、（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース連結または部分をマンノース−６−リン酸へと加水分解することが可能であり、（ｉｉ）末端アルファ−１，２マンノース、アルファ−１，３マンノースおよび／またはアルファ−１，６マンノース連結または部分を加水分解することが可能なマンノシダーゼと接触させることによって、脱キャップ化および脱マンノシル化され得る。かかるマンノシダーゼの非限定的な例には、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）マンノシダーゼおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａマンノシダーゼ（例えば、ＡＭＳ１）が含まれる。タチナタマメマンノシダーゼおよびＡＭＳ１マンノシダーゼは共に、ファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼである。
【０３１４】
タチナタマメマンノシダーゼは、例えば、硫酸アンモニウム懸濁物（カタログ番号Ｍ７２５７）およびプロテオミクスグレードの調製物（カタログ番号Ｍ５５７３）として、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から市販されている。かかる市販の調製物は、ホスファターゼなどの混入物を除去するために、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーによってさらに精製され得る。
【０３１５】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＭＳ１マンノシダーゼは、組換え産生され得る。ＡＭＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＷＯ２０１３／１３６１８９中に配列番号５として示される。
【０３１６】
一部の実施形態では、脱キャップ化および脱マンノシル化のステップは、２種の異なる酵素によって触媒される。例えば、マンノース−１−ホスホ−６マンノース連結または部分の脱キャップ化は、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来のマンノシダーゼ（例えば、ＣｃＭａｎ５）を使用して実施され得る。ＣｃＭａｎ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＷＯ２０１３／１３６１８９中に配列番号２として示される。シグナル配列を含むＣｃＭａｎ５ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＷＯ２０１３／１３６１８９中に配列番号３として示される。シグナル配列を含まないＣｃＭａｎ５ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＷＯ２０１３／１３６１８９中に配列番号４として示される。一部の実施形態では、ＣｃＭａｎ５ポリペプチドの生物学的に活性な断片が使用される。例えば、生物学的に活性な断片は、ＷＯ２０１３／１３６１８９中に配列番号４として示されるアミノ酸配列の残基１〜７７４を含み得る。ＷＯ２０１１／０３９６３４もまた参照のこと。ＣｃＭａｎ５マンノシダーゼは、ファミリー９２のグリコシドヒドロラーゼである。
【０３１７】
脱キャップ化された糖タンパク質または糖タンパク質の分子複合体の脱マンノシル化は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｔｏｉ（Ａｓ）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｈｏｅｎｉｃｉｓとしても公知）由来のマンノシダーゼまたはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来のマンノシダーゼ（例えば、ＣｃＭａｎ４）を使用して触媒され得る。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｔｏｉマンノシダーゼは、ファミリー４７のグリコシドヒドロラーゼであり、ＣｃＭａｎ４マンノシダーゼは、ファミリー９２のグリコシドヒドロラーゼである。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｔｏｉマンノシダーゼのアミノ酸配列は、ＷＯ２０１３／１３６１８９中に配列番号６として示され、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＡＡ０８６３４．１で示される。ＣｃＭａｎ４ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＷＯ２０１３／１３６１８９の図８に示される。
【０３１８】
脱キャップ化された糖タンパク質または糖タンパク質の分子複合体の脱マンノシル化は、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）マンノシダーゼまたはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａマンノシダーゼ（例えば、ＡＭＳ１）などの、ファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼからのマンノシダーゼを使用しても触媒され得る。例えば、ＣｃＭａｎ５は、糖タンパク質（または糖タンパク質の分子複合体）上のマンノース−１−ホスホ−６マンノース部分を脱キャップ化するために使用され得、タチナタマメマンノシダーゼは、脱キャップ化された糖タンパク質（または糖タンパク質の分子複合体）を脱マンノシル化するために使用され得る。
【０３１９】
脱マンノシル化された糖タンパク質、または脱キャップ化および脱マンノシル化された糖タンパク質を産生するために、マンノース−１−ホスホ−６マンノース連結または部分を含む糖タンパク質は、適切なマンノシダーゼおよび／または適切なネイティブのもしくは組換え産生されたマンノシダーゼを含む細胞溶解物と、適切な条件下で接触させられる。適切なマンノシダーゼは上記される。細胞溶解物は、真菌細胞、植物細胞または動物細胞を含む、任意の遺伝子操作された細胞由来であり得る。動物細胞の非限定的な例には、線虫、昆虫、植物、鳥類、爬虫類および哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、スナネズミ、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、雌ウシ、ウマ、クジラ、サルまたはヒトが含まれる。
【０３２０】
糖タンパク質を精製されたマンノシダーゼおよび／または細胞溶解物と接触させると、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース連結または部分は、ホスホ−６−マンノースへと加水分解され得、かかるリン酸含有グリカンの末端アルファ−１，２マンノース、アルファ−１，３マンノースおよび／または（好ましくは「および」）アルファ−１，６マンノース連結または部分は、脱キャップ化および脱マンノシル化された糖タンパク質を産生するために加水分解され得る。一部の実施形態では、脱キャップ化ステップおよび脱マンノシル化ステップの両方を触媒する１つのマンノシダーゼが使用される。一部の実施形態では、１つのマンノシダーゼが脱キャップ化ステップを触媒するために使用され、異なるマンノシダーゼが脱マンノシル化ステップを触媒するために使用される。マンノシダーゼによるプロセシング後、糖タンパク質は単離され得る。
【０３２１】
溶解物中のマンノシダーゼ活性の活性または完全性を保存する細胞溶解物を取得するための適切な方法は、細胞溶解物中のＮ−グリコシル化活性を保存するまたはその変化を最小化する、適切な緩衝液ならびに／またはヌクレアーゼ、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む阻害剤の使用を含み得る。かかる阻害剤には、例えば、キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（Ｐ−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、プロテアーゼ阻害剤、例えば、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、アプロチニン、ロイペプチン、アンチパインなど、およびホスファターゼ阻害剤、例えば、ホスフェート、フッ化ナトリウム、バナデートなどが含まれる。酵素活性を含む溶解物を取得するのに適切な緩衝液および条件は、例えば、Ausubelら  Current  Protocols  in  Molecular  Biology（補遺４７）、John  Wiley  &  Sons、New  York（１９９９年）；HarlowおよびLane、Antibodies:  A  Laboratory  Manual  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press（１９８８年）；HarlowおよびLane、Using  Antibodies:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Press（１９９９年）；Tietz  Textbook  of  Clinical  Chemistry、第３版、BurtisおよびAshwood編、W.B.  Saunders、Philadelphia（１９９９年）に記載されている。
【０３２２】
細胞溶解物は、必要に応じて、干渉性の物質の存在を排除または最小化するために、さらに処理され得る。所望に応じて、細胞溶解物は、細胞下分画、ならびにクロマトグラフィー技術、例えば、イオン交換、疎水性および逆相、サイズ排除、アフィニティー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーなどを含む、当業者に周知の種々の方法によって分画され得る。
【０３２３】
一部の実施形態では、細胞オルガネラ全体がインタクトおよび／または機能的なままである細胞溶解物が調製され得る。例えば、溶解物は、インタクトな粗面小胞体、インタクトな滑面小胞体またはインタクトなゴルジ体のうち１つまたは複数を含み得る。インタクトな細胞オルガネラを含む溶解物を調製するためおよびオルガネラの機能性について試験するための適切な方法は、例えば、Moreauら、１９９１年、J.  Biol.  Chem.、２６６巻（７号）：４３２９〜４３３３頁；Moreauら、１９９１年、J.  Biol.  Chem.、２６６巻（７号）：４３２２〜４３２８頁；Rexachら、１９９１年、J.  Cell  Biol.、１１４巻（２号）：２１９〜２２９頁；およびPaulikら、１９９９年、Arch.  Biochem.  Biophys.  ３６７巻（２号）：２６５〜２７３頁に記載されている。
【０３２４】
哺乳動物細胞と、脱キャップ化および脱マンノシル化されたリン酸化されたＮ−グリカンを含む糖タンパク質との接触の際に、糖タンパク質は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）の内側に輸送され得る。脱キャップ化されているが脱マンノシル化されていないリン酸化されたＮ−グリカンを有する糖タンパク質は、哺乳動物細胞上のマンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合せず、したがって、細胞の内側に効率的に輸送されない。しかし、かかる糖タンパク質が、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合の末端アルファ−１，２マンノース連結または部分を加水分解することが可能なマンノシダーゼと接触させられる場合、哺乳動物細胞上のマンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合し、細胞の内側に効率的に輸送される脱マンノシル化された糖タンパク質が産生される。リン酸化されたＮ−グリカンを脱キャップ化するが脱マンノシル化しない酵素を含む調製物（例えば、組換え宿主細胞または無細胞調製物）には、リン酸化されたＮ−グリカンを脱マンノシル化する酵素が混入し得ることが理解される。糖タンパク質試料は、かかる調製物との接触後、一部のリン酸化されたＮ−グリカンが脱キャップ化だけされ、その他が脱キャップ化および脱マンノシル化されたタンパク質分子を含み得る。自然と、脱キャップ化および脱マンノシル化されたリン酸化されたＮ−グリカンを含むタンパク質分子は、マンノース−６−リン酸受容体に実質的に結合できる。
【０３２５】
したがって、本明細書は、糖タンパク質、特に、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を、哺乳動物細胞上のマンノース−６−リン酸受容体に結合しない第１の形態から、哺乳動物細胞上のマンノース−６−リン酸受容体に結合する第２の形態へと変換する方法を提供する。第１の形態では、この糖タンパク質は、６位においてリン酸残基を含むマンノース残基に１位において連結された１つまたは複数のマンノース残基を含む１つまたは複数のＮ−グリカンを含む。かかる方法では、糖タンパク質の第１の形態は、６位においてリン酸を含むマンノースを末端マンノースにするために、末端マンノース残基を脱マンノシル化するマンノシダーゼと接触させられる。一部の実施形態では、マンノシダーゼは、脱キャップ化活性および脱マンノシル化活性の両方を有する（例えば、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）またはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（ＡＭＳ１マンノシダーゼ））。一部の実施形態では、マンノシダーゼは、脱キャップ化活性を有さない（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｔｏｉ由来のマンノシダーゼまたはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来のマンノシダーゼ（例えば、ＣｃＭａｎ４））。
【０３２６】
細胞の内側への糖タンパク質の輸送は、細胞取込みアッセイを使用して評価され得る。例えば、哺乳動物細胞と、脱キャップ化および脱マンノシル化されたリン酸化されたＮ−グリカンを含む糖タンパク質とがインキュベートされ得、次いで、細胞が洗浄および溶解され得る。細胞溶解物は、例えば、ウエスタンブロッティングによって、または細胞溶解物中のＮＡＧＡＬの活性もしくはα−Ｇａｌ  Ａ活性によって、糖タンパク質、特に、改変されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の存在について評価され得る。例えば、取込みは、ＮＡＧＡＬまたはα−Ｇａｌ  Ａ活性が欠損した線維芽細胞において評価され得る。細胞内ＮＡＧＡＬ活性は、本明細書の他の箇所に記載されるように、基質としてＭＵ−α−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミンを使用してアッセイされ得る。細胞内α−Ｇａｌ  Ａ活性は、本明細書の他の箇所に記載されるように、基質として４ＭＵ−α−Ｇａｌを使用してアッセイされ得る。
【０３２７】
本発明者らは、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片が、例えば、他の処置選択肢が利用可能でないリソソーム蓄積症、例えばファブリー病、およびシンドラー病または神崎病の処置において、酵素補充治療などの治療において有利に使用できることに気づいた。用語「酵素補充治療」とは、特定の酵素が欠損しているまたは存在しない対象において酵素を補充する医学的処置を広く指す。
【０３２８】
したがって、さらなる態様は、治療における使用のための、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片に関する。
【０３２９】
さらなる態様は、特に、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片が、ファブリー病を処置する方法における使用のために、またはファブリー病の処置（本明細書を通じて、治療的および／または予防的手段を含む）における使用のために、α−ガラクトシダーゼ活性を獲得するなどのためにさらに改変される、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片に関する。かかる処置は、典型的には、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の非経口投与、好ましくは静脈内投与（例えば、注入）を含み得る。
【０３３０】
したがって、関連の態様は、特に、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片が、ファブリー病の処置のための医薬の製造のために、α−ガラクトシダーゼ活性を獲得するなどのためにさらに改変される、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の使用を提供する。かかる処置は、典型的には、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の非経口投与、好ましくは静脈内投与（例えば、注入）を含み得る。
【０３３１】
関連の態様は、かかる処置を必要とするヒト対象においてファブリー病を処置する方法であって、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の治療有効量を前記対象に投与するステップを含み、特に、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片が、α−ガラクトシダーゼ活性を獲得するなどのためにさらに改変される、方法を提供する。処置のかかる方法は、典型的には、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の非経口投与、好ましくは静脈内投与（例えば、注入）を含み得る。
【０３３２】
用語「ファブリー病（Fabry  disease）」、「ファブリー病（Fabry's  disease）」、「アンダーソン・ファブリー病」、「びまん性体部被角血管腫」および「アルファ−ガラクトシダーゼＡ欠損症」は、相互交換可能に使用され得、リソソーム酵素α−ガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ  Ａ）における欠損によって引き起こされる、Ｘ連鎖様式で遺伝する稀な遺伝性リソソーム蓄積症を指す。酵素α−Ｇａｌ  Ａは、糖脂質から末端α−Ｄ−ガラクトース残基を切断する。α−Ｇａｌ  Ａ欠損は、血管内皮および他の組織における、スフィンゴ糖脂質、主にグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）の全身性の生涯にわたるリソソーム蓄積を生じる。これは、腎臓、心臓および脳血管系に主に影響を与える多臓器病理をもたらす。ファブリー病を有する患者は、胃腸疾患、疼痛、脳卒中、ならびに心欠陥および腎欠陥を含む多数の症状を患い、脳卒中、心臓疾患または腎不全からの合併症によって早くに死亡する場合が多い。ファブリー病の推定的な診断を提供できる徴候および症状には、被角血管腫および渦巻き状角膜（corneal  verticillata）が含まれる。家族歴を考慮して、早期腎疾患、早期脳卒中および早期の心臓の問題などの症状を有する他の家族成員に注目することは、さらなる支持を提供し得る。男性では、確定診断は、生物学的試料、例えば、血漿、白血球、培養皮膚線維芽細胞、生検組織または乾燥血液において、欠損したα−ガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ  Ａ）酵素活性について試験することによって行われ得る。女性では、変異または連鎖分析で、ヘテロ接合性変異キャリアを同定できる。多くの女性キャリア（症状ありまたはなし）は、正常レベルを下回るα−Ｇａｌ  Ａ活性および／または特徴的角膜混濁を有する。
【０３３３】
別の態様は、シンドラー病もしくは神崎病を処置する方法における使用のための、またはシンドラー病もしくは神崎病の処置（本明細書を通じて、治療的および／または予防的手段を含む）における使用のための、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片に関する。かかる処置は、典型的には、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の非経口投与、好ましくは静脈内投与（例えば、注入）を含み得る。
【０３３４】
したがって、関連の態様は、シンドラー病または神崎病の処置のための医薬の製造のための、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の使用を提供する。かかる処置は、典型的には、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の非経口投与、好ましくは静脈内投与（例えば、注入）を含み得る。
【０３３５】
関連の態様は、かかる処置を必要とするヒト対象においてシンドラー病または神崎病を処置する方法であって、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。処置のかかる方法は、典型的には、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の非経口投与、好ましくは静脈内投与（例えば、注入）を含み得る。
【０３３６】
用語「シンドラー病」、「神崎病」および「アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ欠損症」は、相互交換可能に使用され得、酵素アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡＬ）における欠損によって引き起こされる稀な先天性リソソーム蓄積障害を指す。酵素アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼにおける欠損は、糖タンパク質の過剰なリソソーム蓄積をもたらす、第２２染色体上のＮＡＧＡ遺伝子中の変異に帰せられる。ＮＡＧＡＬ酵素の欠損は、身体の至る所でのスフィンゴ糖脂質の蓄積をもたらす。この疾患には、それ自身の弁別的症状を各々が有する、３つの主な型（即ち、Ｉ型乳児形態、ＩＩ型成人形態およびＩＩＩ型）が存在する。
【０３３７】
指摘した場合を除き、「対象」または「患者」は、相互交換可能に使用され、動物、好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物、なおより好ましくは霊長類を指し、具体的には、ヒト患者および非ヒト哺乳動物および霊長類が含まれる。好ましい患者はヒト対象である。
【０３３８】
用語「哺乳動物」には、ヒト、飼育動物および家畜、動物園動物、競技用動物、ペット動物、コンパニオンアニマルおよび実験動物が含まれるがこれらに限定されない、そのように分類される任意の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、スナネズミ、ウシ、雌ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタならびに霊長類、例えば、サルおよび類人猿（例えば、チンパンジー、ヒヒまたはサル）などが含まれる。両方の性別およびその全ての年齢カテゴリーを含むヒト対象が特に好ましい。
【０３３９】
用語「罹患対象」とは、本明細書で使用する場合、ファブリー病を有する（with／having）と診断された対象、またはシンドラー病もしくは神崎病を有する（with／having）と診断された対象を指す。本明細書で使用する場合、「処置を必要とする対象」などの語句は、所与の状態、特にファブリー病、またはシンドラー病もしくは神崎病の処置から利益を得る対象を含む。かかる対象には、限定なしに、前記状態を有すると診断された対象、（例えば、α−Ｇａｌ  Ａ（ファブリー病）またはＮＡＧＡＬ（シンドラー病もしくは神崎病）をコードする遺伝子中の変異に起因して）前記状態を発症する傾向がある対象、および／または前記状態が予防される対象が含まれ得る。
【０３４０】
用語「処置する」または「処置」は、すでに発症した疾患または状態の治療的処置、例えば、すでに発症したファブリー病、またはシンドラー病もしくは神崎病の治療、ならびに、その目的が、ファブリー病、またはシンドラー病もしくは神崎病の発生、発症および進行を予防することなど、望ましくない苦痛を予防するまたは望ましくない苦痛の発生率の確率を低下させることである予防的（prophylactic／preventive）手段の両方を包含する。有益なまたは所望の臨床結果には、限定なしに、１つもしくは複数の症状または１つもしくは複数の生物学的マーカーの軽減、疾患の程度の減退、安定化された（即ち、悪化していない）状態の疾患、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の緩解または緩和などが含まれ得る。「処置」は、処置を受けていない場合に予測される生存と比較して生存を延長させることもまた意味し得る。
【０３４１】
用語「予防有効量」とは、研究者、獣医師、医師または他の臨床医が求める、対象における障害の発病を阻害または遅延させる、活性化合物または医薬薬剤の量を指す。用語「治療有効量」とは、本明細書で使用する場合、とりわけ、処置されている疾患または状態の症状の軽減を含み得る、研究者、獣医師、医師または他の臨床医が求める、対象における生物学的または医薬的応答を惹起する、活性化合物または医薬薬剤の量を指す。本明細書に教示される医薬製剤についての治療有効用量および予防有効用量を決定するための方法は、当該分野で公知である。
【０３４２】
投与される１つまたは複数の他の活性化合物と任意選択で組み合わせた、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の投薬量または量は、個々の症例に依存し、慣習により、最適な効果を達成するために個々の状況に適応される。したがって、単位用量およびレジメンは、処置される障害の性質および重症度に依存し、対象の種、処置されるヒトもしくは動物の性別、年齢、体重、全体的な健康、食餌、投与の様式および時間、免疫状態ならびに個々の応答性、使用される化合物の有効性、代謝安定性および作用の持続時間、治療が急性であるか慢性であるか予防的であるか、または他の活性化合物が本発明の薬剤に加えて投与されるかどうかなどの因子にも依存する。治療有効性を最適化するために、本明細書に記載されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、異なる投薬レジメンで最初に投与され得る。典型的には、組織中のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のレベルは、例えば、所与の処置レジメンの有効性を決定するために、臨床試験手順の一部として、適切なスクリーニングアッセイを使用してモニタリングされ得る。投薬の頻度は、医療従事者（例えば、医師および看護師）の技術および臨床的判断の範囲内である。典型的には、投与レジメンは、最適な投与パラメーターを確立し得る臨床試験によって確立される。しかし、従事者は、上述の因子、例えば、対象の年齢、健康、体重、性別および医学的状態のうち１つまたは複数に従って、かかる投与レジメンを変動させ得る。投薬の頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかに依存して変動され得る。
【０３４３】
本明細書に記載されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片、あるいはそれを含む医薬組成物の毒性および治療有効性は、例えば、細胞培養物または実験動物において、公知の医薬手順よって決定され得る。これらの手順は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために使用され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表され得る。高い治療指数を示す医薬組成物が好ましい。毒性副作用を示す医薬組成物が使用され得るが、正常細胞（例えば、非標的細胞）に対する潜在的な損傷を最小化し、それによって副作用を低減させるために、影響を受けた組織の部位にかかる化合物を標的化する送達系を設計するように注意を払うべきである。
【０３４４】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、適切な対象（例えば、ヒト患者）における使用のために様々な投薬量を処方する際に使用され得る。かかる医薬組成物の投薬量は、一般に、毒性をほとんどまたは全く有さないＥＤ５０を含む様々な循環濃度の範囲内に入る。投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。本明細書に記載されるように使用される医薬組成物について、治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量は、細胞培養物中で決定されるように、ＩＣ５０（即ち、症状の最大半量阻害を達成する医薬組成物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて処方され得る。かかる情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０３４５】
限定なしに、疾患の型および重症度に依存して、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の典型的投薬量（例えば、典型的な一日投薬量または典型的な間欠的投薬量、例えば、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、１週間毎、１．５週間毎、２週間毎、３週間毎、１カ月毎などの典型的投薬量）は、上述の因子に依存して、１用量当たり、対象の体重１ｋｇ当たり約１０μｇ〜約１００ｍｇの範囲であり得、例えば、毎日もしくは間欠的に、好ましくは間欠的に、より好ましくは１週間毎、さらにより好ましくは１週間おきに、なおより好ましくは１カ月毎、またはさらに低い頻度で、１用量当たり、対象の体重１ｋｇ当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇ、または１用量当たり、対象の体重１ｋｇ当たり約２００μｇ〜約２ｍｇの範囲であり得、例えば、１用量当たり、対象の体重１ｋｇ当たり約１００μｇ、約２００μｇ、約３００μｇ、約４００μｇ、約５００μｇ、約６００μｇ、約７００μｇ、約８００μｇ、約９００μｇ、約１．０ｍｇ、約１．１ｍｇ、約１．２ｍｇ、約１．３ｍｇ、約１．４ｍｇ、約１．５ｍｇ、約１．６ｍｇ、約１．７ｍｇ、約１．８ｍｇ、約１．９ｍｇまたは約２．０ｍｇであり得る。限定ではなく例として、ヒトＮＡＧＡＬは、好ましくは隔週で（bi-weekly）約０．５ｍｇ／ｋｇ、または約０．６ｍｇ／ｋｇ、または約０．７ｍｇ／ｋｇ、または約０．８ｍｇ／ｋｇ、または約０．９ｍｇ／ｋｇ、または約１．０ｍｇ／ｋｇ、または約１．５ｍｇ／ｋｇ、または約２．０ｍｇ／ｋｇ、または約２．５ｍｇ／ｋｇ、または約３．０ｍｇ／ｋｇ、または約３．５ｍｇ／ｋｇ、または約４．０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．６〜０．８ｍｇ／ｋｇまたは約３〜４ｍｇ／ｋｇで投与され得る。
【０３４６】
さらなる態様は、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を含む医薬組成物に関する。さらなる態様は、本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクターを含む医薬組成物を提供する。
【０３４７】
用語「医薬組成物」および「医薬製剤」は、相互交換可能に使用され得る。本明細書に教示される医薬製剤は、本明細書で特に特定された構成要素に加えて、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。適切な医薬賦形剤は、投薬形態および活性成分の正体に依存し、当業者によって選択され得る（例えば、Handbook  of  Pharmaceutical  Excipients  第７版、２０１２年、Roweら編を参照することによる）。本明細書で使用する場合、「担体」または「賦形剤」には、あらゆる溶媒、希釈剤、緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水またはリン酸緩衝食塩水など）、可溶化剤、コロイド、分散媒、ビヒクル、フィラー、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなど）、アミノ酸（例えば、グリシンなど）、タンパク質、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色料、香味料、芳香剤、増粘剤、デポー効果を達成するための薬剤、コーティング、抗真菌剤、保存料、安定剤、抗酸化剤、浸透圧制御剤、吸収遅延剤などが含まれる。許容される希釈剤、担体および賦形剤は、典型的には、レシピエントの恒常性（例えば、電解質バランス）に悪影響を与えない。医薬的に活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。かかる材料は、非毒性でなければならず、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の活性を干渉してはならない。許容される担体には、生体適合性の、不活性なまたは生体吸収性の塩、緩衝剤、オリゴ糖または多糖、ポリマー、粘性改善剤、保存料などが含まれ得る。１つの例示的な担体は、生理的食塩水（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０〜７．４）である。別の例示的な担体は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムである。
【０３４８】
担体または他の材料の正確な性質は、投与経路に依存する。例えば、医薬組成物は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。
【０３４９】
医薬製剤は、生理的条件に近付けるのに必要とされる薬学的に許容される補助的物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、保存料、錯化剤、浸透圧調整剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、塩化水素、ベンジルアルコール、パラベン、ＥＤＴＡ、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなどを含み得る。好ましくは、医薬製剤のｐＨ値は、生理的ｐＨ範囲にある、例えば、特に、製剤のｐＨは、約５と約９．５との間、より好ましくは約６と約８．５との間、さらにより好ましくは約７と約７．５との間である。かかる医薬製剤の調製は、当業者の通常の技術範囲内である。
【０３５０】
医薬組成物の投与は、全身または局所であり得る。医薬組成物は、非経口および／または経口（non-parenteral）投与に適切であるように製剤化され得る。具体的な投与様式には、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、くも膜下腔内、口腔、直腸、頬側、外用、経鼻、眼、関節内、動脈内、くも膜下、気管支、リンパ管、腟および子宮内投与が含まれる。
【０３５１】
投与は、医薬組成物のボーラスの定期的注射によるものであり得る、または外部（例えば、ＩＶバッグ）もしくは内部（例えば、生体分解性インプラント、バイオ人工臓器、またはインプラントされた宿主細胞のコロニー）であるレザバからの静脈内もしくは腹腔内投与による中断されないもしくは継続的なものであり得る。医薬組成物の投与は、ポンプ、マイクロカプセル化、継続的放出ポリマーインプラント、マクロカプセル化、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内もしくは他の適切な部位へのいずれかの注射、またはカプセル剤、液剤、錠剤、丸剤もしくは長期放出製剤での経口投与などの適切な送達手段を使用して達成され得る。
【０３５２】
非経口送達系の例には、エチレン酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、インプラント可能な注入系、ポンプ送達、カプセル化細胞送達、リポソーム送達、針送達注射、針なし注射、ネブライザー、エアロゾリザー（aerosolizer）、エレクトロポレーションおよび経皮パッチが含まれる。
【０３５３】
非経口投与に適切な製剤は、簡便には、レシピエントの血液と好ましくは等張な、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の無菌水性調製物（例えば、生理的食塩水溶液）を含む。製剤は、単位用量または多用量形態で提供され得る。
【０３５４】
経口投与に適切な製剤は、別個の単位、例えば、各々が所定量のヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を含む、カプセル剤、サシェ剤、錠剤もしくはロゼンジ、または水性の液剤もしくは非水性液体中の懸濁物、例えば、シロップ剤、エリキシル剤、エマルジョンもしくは１回分量（draught）として提供され得る。
【０３５５】
外用投与に適切な製剤は、例えば、クリーム、スプレー、泡、ゲル、軟膏、膏薬またはドライラブ（dry  rub）として提供され得る。ドライラブは、投与の部位において再水和され得る。かかる製剤はまた、絆創膏、ガーゼまたはパッチ中に直接的に注入され得（例えば、中に染み込まされ乾燥される）、次いでこれらは外用適用され得る。かかる製剤はまた、外用投与のための絆創膏、ガーゼまたはパッチ中で半液体、ゲル化または完全液体状態で維持され得る。
【０３５６】
典型的には、ＥＲＴは、酵素を含む静脈内（ＩＶ）注射または注入を患者に与えることによって実施され得る。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に教示される医薬組成物は、非経口投与、例えば、非経口注入または注射のために構成され得る。好ましくは、本明細書に教示される医薬組成物は、静脈内投与、例えば、静脈内注入のために構成され得る。
【０３５７】
ある特定の実施形態では、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、凍結乾燥され得る。本明細書に記載される医薬組成物のいずれかは、投与のための指示書と共に、容器、パックまたはディスペンサー中に含まれ得る。一部の実施形態では、組成物は、単回使用バイアルとして包装される。
【０３５８】
さらに、動物細胞中に核酸を導入するいくつかの周知の方法が存在し、そのうちいずれかが本明細書で使用され得る。端的に言えば、核酸は、標的細胞／標的組織中に直接注射され得る。他の方法には、レシピエント細胞と核酸を含む細菌プロトプラストとの融合、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、塩化リチウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、カチオン性脂質もしくはリポソームのような組成物の使用、または受容体媒介性エンドサイトーシス、微粒子銃（biolistic  particle  bombardment）（「遺伝子銃」法）、例えば本明細書に教示されるようなウイルスベクターによる感染、エレクトロポレーションなどのような方法が含まれる。核酸分子を標的細胞に送達するのに適切な他の技術または方法には、乳酸−グリコール酸コポリマーのポリマー性ミクロスフェアからのＤＮＡ分子の継続的送達、または産物を送達するマイクロポンプ中への保護された（安定化された）ＤＮＡ分子の直接的注射が含まれる。別の可能性は、インプラント可能な薬物放出性生分解性ミクロスフェアの使用である。種々の型のリポソーム（イムノリポソーム、ＰＥＧ化（イムノ）リポソーム）、カチオン性脂質およびポリマー、ナノ粒子またはデンドリマー、乳酸−グリコール酸コポリマーのポリマー性ミクロスフェア、インプラント可能な薬物放出性生分解性ミクロスフェアなどでのＤＮＡのカプセル化；ならびにヌクレアーゼ阻害剤アウリントリカルボン酸のような保護剤とのＤＮＡの共注射もまた想定される。異なる上述の送達様式または方法の組合せもまた使用され得ることが明らかである。
【０３５９】
核酸の細胞内送達の好ましい方法は、本明細書に教示されるウイルスベクターによる感染を含み得る。かかる方法では、本明細書に教示される組換えウイルスベクターは、宿主生物に（例えば、局所または全身）導入されるなど、宿主細胞と接触させられ、ウイルス感染に好ましい条件でインキュベートされ、したがって、ウイルスが細胞に感染する天然の能力を使用する。例えば、レトロウイルスは、レトロウイルスタンパク質と、宿主細胞の表面上の受容体として作用する膜貫通タンパク質との相互作用を介して、宿主細胞に侵入する。核酸のウイルスベクター媒介性送達の別のアプローチは、ＷＯ２００６／１２９０８０に記載されるウイルスベクター媒介性送達と組み合わせた、物理的細胞侵入ベースの技術、例えば、超音波およびマイクロバブルの使用などを包含し得る。
【０３６０】
核酸の送達のさらなる方法は、以前に公開された方法を使用し得る。例えば、核酸の細胞内送達は、核酸分子と有効量のブロックコポリマーとの混合物を含む組成物を介してであり得る。この方法の一例は、ＵＳ２００４／０２４８８３３に記載されている。
【０３６１】
核への核酸の送達の他の方法は、Mannら  ２００１年（Proc  Natl  Acad  Science  ９８巻（１号）：４２〜４７頁）およびGebskiら  ２００３年（Human  Molecular  Genetics  １２巻（１５号）：１８０１〜１８１１頁）に記載されている。
【０３６２】
ネイキッドＤＮＡとしてのまたは脂質担体と複合体化した発現ベクターによって細胞中に核酸分子を導入するための方法は、ＵＳ６，８０６，０８４に記載されている。
【０３６３】
コロイド分散系中で核酸分子を送達することが望ましいことがある。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームまたはリポソーム製剤を含む脂質ベースの系が含まれる。リポソームは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで送達ビヒクルとして有用な人工膜小胞である。これらの製剤は、正味のカチオン性、アニオン性または中性の電荷特徴を有し得、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの送達方法に有用な特徴である。サイズが０．２〜４．０ＰＨＩ．ｍの範囲の大単層小胞（ＬＵＶ）は、大きい高分子を含む水性緩衝液のかなりの百分率をカプセル化できることが示されている。ＲＮＡおよびＤＮＡは、水性内側内にカプセル化され得、生物学的に活性な形態で細胞に送達され得る（Fraleyら  １９８１年（Trends  Biochem  ScL  ６巻：７７頁））。
【０３６４】
リポソームが効率的遺伝子移入ビヒクルになるためには、以下の特徴が存在すべきである：（１）それらの生物学的活性を損なうことなしの、高い効率での目的の核酸分子のカプセル化；（２）非標的細胞と比較した標的細胞への優先的かつ実質的な結合；（３）高い効率での標的細胞細胞質への小胞の水性内容物の送達；および（４）遺伝子情報の正確かつ有効な発現（Manninoら  １９８８年（Biotechniques  ６巻：６８２頁））。
【０３６５】
リポソームの組成は通常、通常はステロイド、特にコレステロールと組み合わせた、リン脂質、特に高相転移温度リン脂質の組合せである。他のリン脂質または他の脂質もまた使用され得る。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。
【０３６６】
あるいは、核酸分子は、医薬組成物を産生するために、他の薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わされ得る。適切な担体および希釈剤には、等張食塩水溶液、例えば、リン酸緩衝食塩水が含まれる。組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、経口または経皮投与のために製剤化され得る。
【０３６７】
当業者は、任意の特定の動物および状態のための最適な投与経路および任意の投薬量を容易に決定できるので、記載される投与経路はガイドとしてのみ意図される。機能的な新たな遺伝子材料をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で細胞中に導入するための複数のアプローチが試みられている（Friedmann  １９８９年（Science  ２４４巻：１２７５〜１２８０頁））。これらのアプローチには、改変されたレトロウイルス中への、発現される遺伝子の組込み（Friedmann  １９８９年、上記；Rosenberg  １９９１年（Cancer  Research  ５１巻（１８号）、補遺：５０７４Ｓ〜５０７９Ｓ））；非レトロウイルスベクター中への組込み（Rosenfeldら  １９９２年（Cell  ６８巻：１４３〜１５５頁）；Rosenfeldら  １９９１年（Science  ２５２巻：４３１〜４３４頁））；またはリポソームを介した、異種プロモーター−エンハンサーエレメントに連結された導入遺伝子の送達（Friedmann  １９８９年、上記；Brighamら  １９８９年（Am  J  Med  Sci  ２９８巻：２７８〜２８１頁）；Nabelら  １９９０年（Science  ２４９巻：１２８５〜１２８８頁）；Hazinskiら  １９９１年（Am  J  Resp  Cell  Molec  Biol  ４巻：２０６〜２０９頁）；ならびにWangおよびHuang  １９８７年（Proc  Natl  Acad  Sci  USA、８４巻：７８５１〜７８５５頁））；リガンド特異的なカチオンベースの輸送系へのカップリング（WuおよびWu  １９８８年（J  Biol  Chem  ２６３巻：１４６２１〜１４６２４頁））またはネイキッドＤＮＡ発現ベクターの使用（Nabelら  １９９０年、上記）；Wolffら  １９９０年（Science  ２４７巻：１４６５〜１４６８頁））が含まれる。組織中への導入遺伝子の直接的注射は、局在化した発現のみを生じる（Rosenfeld  １９９２年、上記；Rosenfeldら  １９９１年、上記；Brighamら  １９８９年、上記；Nabel  １９９０年、上記；およびHazinskiら  １９９１年、上記）。Brighamらのグループ（Am  J  Med  Sci  ２９８巻：２７８〜２８１頁（１９８９年）およびClinical  Research  ３９（要約）（１９９１年））は、ＤＮＡリポソーム複合体の静脈内または気管内のいずれかの投与後の、マウスの肺のみのｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクションを報告している。ヒト遺伝子治療手順の総説論文の一例は、Anderson  １９９２年（Science  ２５６巻：８０８〜８１３頁）である。
【０３６８】
ある特定の実施形態では、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、単独で、あるいは、ファブリー病の処置において、またはシンドラー病もしくは神崎病の処置において適切な１つまたは複数の活性化合物と組み合わせて（即ち、併用治療）使用され得る。１つまたは複数の活性化合物は、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の投与の前に、その後に、またはそれと同時に投与され得る。
【０３６９】
記述「活性化合物」または「活性医薬成分」とは、この文脈では、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片以外の物質または組成物を指す。記述「活性化合物」または「活性医薬成分」中の用語「活性」とは、「薬理学的に活性」を指す。
【０３７０】
例として、かかる他の治療は、別の酵素補充治療、例えば、ファブリー病の場合には、組換えα−Ｇａｌ  Ａタンパク質、例えば、アガルシダーゼアルファ（Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）：Ｓｈｉｒｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ、Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）またはアガルシダーゼベータ（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）：Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ−ａ  Ｓａｎｏｆｉ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＳＡ）であり得る。別の例として、かかる他の治療は、対症治療、例えば、疼痛を処置するための抗痙攣薬、例えば、フェニトインおよびカルバマゼピン、胃腸機能亢進を処置するためのメトクロプラミド、ならびに／または透析もしくは腎臓移植であり得る。
【０３７１】
さらなる態様は、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードする核酸配列を含む核酸分子に関する。
【０３７２】
「コードする」とは、特に、核酸配列またはその一部が、鋳型−転写産物（例えば、ＲＮＡまたはＲＮＡアナログ）関係にある別の核酸配列に対応すること、または問題の生物の遺伝コードのおかげで特定のアミノ酸配列、例えば、１つもしくは複数の所望のタンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸配列に対応することを意味する。
【０３７３】
ある特定の実施形態では、核酸分子は、宿主細胞、例えば、細菌細胞、酵母細胞を含む真菌細胞、動物細胞、またはヒト細胞および非ヒト哺乳動物細胞を含む哺乳動物細胞におけるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の発現のためにコドン最適化され得る。好ましくは、核酸分子は、真菌細胞、より好ましくはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓにおけるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の発現のためにコドン最適化される。
【０３７４】
ある特定の実施形態では、核酸分子は、ヒトＮＡＧＡＬヌクレオチド配列の開始コドンの前に、ＣＡＣＡヌクレオチド配列をさらに含み得る。
【０３７５】
さらなる態様は、本明細書に定義される核酸分子とこの核酸分子に作動可能に連結したプロモーターとを含む発現カセットまたは発現ベクターに関する。好ましくは、発現カセットまたは発現ベクターは、宿主細胞、例えば、細菌細胞、酵母細胞を含む真菌細胞、動物細胞、またはヒト細胞および非ヒト哺乳動物細胞を含む哺乳動物細胞におけるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の発現をもたらすために構成され得る。好ましくは、発現カセットまたは発現ベクターは、真菌細胞、より好ましくはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓにおけるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の発現をもたらすために構成される。
【０３７６】
用語「発現ベクター」または「ベクター」とは、本明細書で使用する場合、核酸断片、好ましくは本明細書に定義される組換え核酸分子が挿入およびクローニングされ得る、即ち、伝播され得る核酸分子、典型的にはＤＮＡを指す。したがって、ベクターは、典型的には、１つまたは複数の独自の制限部位を含み、クローニングされた配列が再現可能であるように、規定された宿主細胞またはビヒクル生物において自律複製が可能であり得る。ベクターは、好ましくは、ベクターを含むレシピエント細胞の選択を可能にするために、選択マーカー、例えば、抗生物質耐性遺伝子などもまた含み得る。ベクターには、必要に応じて、限定なしに、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ、バクテリオファージ由来ベクター、ＰＡＣ、ＢＡＣ、線状核酸、例えば、線状ＤＮＡ、ウイルスベクターなどが含まれ得る（例えば、Sambrookら、１９８９年；Ausubel  １９９２年を参照のこと）。発現ベクターは、一般に、所望の発現系における、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、宿主細胞、宿主臓器および／または宿主生物における、それらに導入された核酸もしくはＯＲＦの発現を可能にするためおよび／または核酸もしくはＯＲＦの発現をもたらすために構成される。例えば、発現ベクターは、適切な調節配列を有利には含み得る。
【０３７７】
特定のベクターを選択する際に重要な因子には、とりわけ、レシピエント宿主細胞の選択、ベクターを含むレシピエント細胞がベクターを含まないレシピエント細胞から認識および選択され得る容易さ；特定のレシピエント細胞において所望されるベクターのコピー数；ベクターがレシピエント細胞において染色体中に組み込まれることが所望されるか染色体外のままであることが所望されるか；ならびに異なる種のレシピエント細胞間でベクターを「往復させる」ことができることが望ましいかどうかが含まれる。
【０３７８】
発現ベクターは、自律的または組込みであり得る。組換え核酸は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミドまたはウイルス粒子などの発現ベクターの形態で、宿主細胞中に導入され得る。組換え核酸は、染色体外で維持され得る、または細胞染色体ＤＮＡ中に組み込まれ得る。発現ベクターは、所望の核酸で形質転換された細胞の検出および／または選択を可能にするために、選択された条件下での細胞の生存性に必要なタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子（例えば、ウラシル生合成に必要な酵素をコードするＵＲＡ３、またはトリプトファン生合成に必要な酵素をコードするＴＲＰ１）を含み得る。発現ベクターは、自律複製配列（ＡＲＳ）もまた含み得る。
【０３７９】
組込みベクターは、一般に、少なくとも、第１の挿入可能なＤＮＡ断片、選択可能なマーカー遺伝子、および第２の挿入可能なＤＮＡ断片の、連続的に整列された配列を含む。第１および第２の挿入可能なＤＮＡ断片は、各々、約２００（例えば、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００もしくは約１０００またはそれよりも多い）ヌクレオチド長であり、形質転換される宿主細胞種のゲノムＤＮＡの部分に対して相同なヌクレオチド配列を有する。発現のための目的の遺伝子を含むヌクレオチド配列は、マーカー遺伝子の前であれ後であれ、第１の挿入可能なＤＮＡ断片と第２の挿入可能なＤＮＡ断片との間で、このベクター中に挿入される。組込みベクターは、宿主細胞ゲノム中への目的のヌクレオチド配列の組込みを促進するために、形質転換前に線状化され得る。
【０３８０】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」とは、遺伝子が転写されるのを可能にするＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、次いで転写を開始するＲＮＡポリメラーゼによって認識される。したがって、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが直接的に結合する、またはＲＮＡポリメラーゼの動員に関与する、いずれかのＤＮＡ配列を含む。プロモーター配列は、遺伝子クラスター中の遺伝子の転写レベルを増強するためにタンパク質と結合し得るＤＮＡの１つまたは複数の領域（即ち、トランス作用性の因子）である、「エンハンサー領域」もまた含み得る。エンハンサーは、典型的にはコード領域の５’末端側にあるが、プロモーター配列から離れていてもよく、例えば、遺伝子のイントロン領域内、または遺伝子のコード領域に対して３’側であり得る。
【０３８１】
「作動可能な連結」は、調節配列および発現が求められる配列が、前記発現を可能にするような方法で接続される連結である。例えば、配列、例えば、プロモーターおよびＯＲＦなどは、前記配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入を生じない、（２）ＯＲＦの転写を指示するプロモーターの能力に干渉しない、（３）プロモーター配列からＯＲＦが転写される能力に干渉しない場合に、作動可能に連結したと言われ得る。したがって、「作動可能に連結した」とは、発現制御配列、例えばプロモーターが、本明細書に定義される核酸分子などの目的のコード配列の発現を効果的に制御するように、遺伝子構築物中に取り込まれることを意味し得る。
【０３８２】
プロモーターは、構成的または誘導性（条件的）プロモーターであり得る。構成的プロモーターは、その発現が標準的な培養条件下で一定であるプロモーターであると理解される。誘導性プロモーターは、１つまたは複数の誘導合図に対して応答性のプロモーターである。例えば、誘導性プロモーターは、化学的に調節され得る（例えば、その転写活性が、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属または他の小分子などの化学的誘導剤の存在または非存在によって調節されるプロモーター）または物理的に調節され得る（例えば、その転写活性が、光または高いもしくは低い温度などの物理的誘導因子の存在または非存在によって調節されるプロモーター）。誘導性プロモーターはまた、化学的または物理的合図によってそれ自身が直接的に調節される１つまたは複数の転写因子によって間接的に調節され得る。
【０３８３】
例えば、プロモーターは、真菌細胞、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞における発現のためのプロモーター、例えば、適切な真菌種、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたは他の適切な真菌種由来のプロモーターであり得る。適切な真菌または酵母のプロモーターには、例えば、ＡＤＣ１、ＴＰＩ１、ＡＤＨ２、ｈｐ４ｄ、ＴＥＦ１、ＰＯＸ２またはＧａｌ１０プロモーターが含まれる。好ましくは、プロモーターは、ｈｐ４ｄまたはＰＯＸ２である。より好ましくは、プロモーターはｈｐ４ｄである。例えば、Guarenteら、１９８２年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ７９巻（２３号）：７４１０頁；ZhuおよびZhang、１９９９年、Bioinformatics  １５巻（７〜８号）：６０８〜６１１頁；または米国特許第６，２６５，１８５号を参照のこと。
【０３８４】
組換え核酸は、スフェロプラスト技術または細胞全体塩化リチウム酵母形質転換法などの種々の方法を使用して、宿主細胞中に導入され得る。プラスミドまたは線状核酸ベクターの細胞中への形質転換に有用な他の方法は、例えば、米国特許第４，９２９，５５５号；Hinnenら、１９７８年、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA、７５巻：１９２９頁；Itoら、１９８３年、J.  Bacteriol.、１５３巻：１６３頁；米国特許第４，８７９，２３１号；およびSreekrishnaら、１９８７年、Gene、５９巻：１１５頁に記載されている。CreggおよびRussel、Methods  in  Molecular  Biology:  Pichia  Protocols、第３章、Humana  Press、Totowa、N.J.、２７〜３９頁（１９９８年）によって記載されるような、エレクトロポレーションおよびＰＥＧ１０００細胞全体形質転換手順もまた使用され得る。
【０３８５】
形質転換された真菌細胞は、必要な生化学的産物の非存在下で、形質転換後の栄養要求性細胞を培養すること（細胞の栄養要求性に起因する）、新たな表現型についての選択および新たな表現型の検出、または形質転換体中に含まれる耐性遺伝子の非存在下では酵母にとって毒性である抗生物質の存在下で培養することが含まれるがこれらに限定されない適切な技術を使用することによって、選択され得る。形質転換体は、例えば、サザンブロットまたはＰＣＲ分析によって評価され得る、ゲノム中への発現カセットの組込みによっても、選択および／または検証され得る。
【０３８６】
ベクターを目的の標的細胞中に導入する前に、ベクターは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞において増やされ（例えば、増幅され）得る。ベクターＤＮＡは、細菌環境からのベクターＤＮＡの精製を生じる、当該分野で公知の方法のいずれかによって細菌細胞から単離され得る。精製されたベクターＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質がプラスミドＤＮＡ調製物中に存在しないことを確実にするために、フェノール、クロロホルムおよびエーテルによって広範に抽出され得るが、それは、これらのタンパク質が、哺乳動物細胞にとって毒性であり得るからである。
【０３８７】
本明細書で意図する任意の遺伝子操作された改変は、条件的でもあり得ることが理解される。例えば、遺伝子は、例えば、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼ、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を使用して、条件的に欠失され得る（例えば、Gossenら、２００２年、Ann.  Rev.  Genetics、３６巻：１５３〜１７３頁およびＵ．Ｓ．２００６００１４２６４を参照のこと）。
【０３８８】
発現ベクターまたはカセットは、ロイシン（例えば、ＬＥＵ２）、ウラシル（例えば、ＵＲＡ３）、アデニン（例えば、ＡＤＥ２）、リシン（例えば、ＬＹＳ５）、アルギニン、トリプトファンの産生のため、またはグリセロール利用（Ｇｕｔ）のために必要な任意の１つまたは複数の遺伝子、およびハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）マーカーを含む、１つまたは複数の選択マーカーをさらに含み得る。
【０３８９】
発現ベクターまたは発現カセットは、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得る。例えば、発現ベクターまたは発現カセットは、レトロトランスポゾン、例えば、限定なしに、Ｙｌｔ１もしくはＴｙｌ６レトロトランスポゾンまたは当業者に公知の他のものの長い末端リピートなどのゼータエレメントを含み得る。本発明の一実施形態では、組込みは、標的化された組込みである。
【０３９０】
あるいは、発現ベクターまたは発現カセットは、組み込まれるのではなく複製的であり得る。例えば、複製的な発現ベクターまたは発現カセットは、１つまたは複数の常染色体複製配列（ＡＲＳ）を含み得る。ＡＲＳは、セントロメア（ＣＥＮ）および複製起点（ＯＲＩ）を含み得る。例えば、ＡＲＳは、ＡＲＳ１８またはＡＲＳ６８であり得る。
【０３９１】
さらなる態様は、治療における使用のための、上で定義した核酸分子または上で定義した発現カセットもしくは発現ベクターを提供する。
【０３９２】
好ましくは、治療は、遺伝子治療またはｍＲＮＡ治療であり得る。
【０３９３】
より特には、とりわけリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）の酵素補充処置（ＥＲＴ）に適用される、遺伝子治療およびｍＲＮＡ治療の一般的な原理は、当該分野で十分に展開されている。
【０３９４】
一般に、用語「遺伝子治療」とは、目的の治療的産物をコードする核酸分子または発現カセットもしくは発現ベクター、例えば、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードする核酸分子または発現カセットもしくは発現ベクターなどの遺伝子材料を含む組成物の、ウイルスまたは非ウイルスベクターを介したｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ送達による、ＬＳＤなどの状態の処置または予防を指す。
【０３９５】
ある特定の実施形態では、送達された組換え遺伝子材料は、目的の治療的産物をコードするＤＮＡを含み得、本質的にそれからなり得、またはそれからなり得、それによって、細胞の転写および翻訳機構が、標的細胞において目的の治療的産物を産生するために使用される。
【０３９６】
ある特定の他の実施形態では、送達された遺伝子材料は、目的の治療的産物をコードするＲＮＡ、より特にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み得、本質的にそれからなり得、またはそれからなり得、それによって、ｍＲＮＡは、目的の治療的産物を産生するために、標的細胞の翻訳機構によって直接的に翻訳され得る（「ｍＲＮＡ治療」）。
【０３９７】
用語「ｅｘ  ｖｉｖｏ」送達は、この文脈では、細胞、組織、オルガノイド、臓器など中への、遺伝子材料を含む組成物の、ヒトなどの対象の身体の外側での導入と、その後の、製剤、部位または投与経路に関して限定なしの、同じ（自家）または異なる（同種）対象の身体中への、かかる導入された組成物を含む細胞、組織、オルガノイド、臓器などの投与とを示す。
【０３９８】
有利なことに、本明細書で想定されるＥＲＴによるＬＳＤの処置のために、本明細書に教示される核酸分子（例えば、ＤＮＡもしくはｍＲＮＡ）または発現カセットもしくは発現ベクターは、対象の肝臓に、より特には対象の実質肝臓細胞に、さらにより特には対象の肝細胞に送達され得る。好ましくは、そうして送達された場合、目的の治療的産物、例えば、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、例えば、適切な分泌シグナルをポリペプチドの配列中に含めることによって、肝臓細胞による分泌のために標的化され得る。これによって、本明細書に教示される核酸分子または発現カセットもしくは発現ベクターを含む肝臓細胞は、目的の治療的産物を産生および分泌し、この治療的産物は、対象の血流中に放出され、したがって、肝臓以外の細胞、組織および臓器に送達されそれらによって取り込まれ、その場所で、予防または治療効果を発揮し得る。
【０３９９】
本明細書に教示される核酸分子（例えば、ＤＮＡもしくはｍＲＮＡ）または発現カセットもしくは発現ベクターの投与は、必要に応じて、例えば、対象の血流において検出される目的の治療的産物のレベルに基づいて、反復され得る。例として、ｍＲＮＡ治療のために、投与は、約２週間毎、または約３週間毎、または約４、５、６、７もしくは８週間毎に反復され得る。
【０４００】
限定なしに、遺伝子治療における使用に適切なベクターには、周知のウイルスベクターが含まれ得、例えば、限定なしに、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターが含まれる。かかるウイルスベクターは、本明細書に開示される核酸配列をそれに導入するために、自体公知の組換え技術によって操作され得る。
【０４０１】
例えば、レトロウイルスベクターが本明細書で使用され得る。一般に、レトロウイルスベクターは、宿主細胞ゲノム中への組換えウイルスゲノムの（ランダムな）組込みに必要な構成要素をコードするレトロウイルスゲノム配列と、目的の核酸配列とを含み得る。かかるレトロウイルスベクターは、例えば、Ｂ、ＣおよびＤ型レトロウイルスならびにスプーマウイルスおよびレンチウイルスを含む広範な種々のレトロウイルス（RNA  Tumor  Viruses、第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、１９８５年を参照のこと）から標準的な組換え技術（例えば、Sambrookら、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、１９８９年）を使用して容易に構築され得る。
【０４０２】
組換えアデノウイルスベクターは、宿主細胞における目的の核酸配列の送達および発現のためにも企図され得る。アデノウイルスベースのウイルスベクターは、非分裂宿主細胞に感染することが可能であるという利点を有するが、組換えウイルスゲノムは、宿主細胞ゲノム中に組み込まれない。例えば、適切なアデノウイルスベクター、その組換えアデノウイルスベクターを構築するための方法、および組換えベクターを宿主細胞中に送達するための方法は、Xia  Hら（２００２年）（Nat.  Biotech.  ２０巻：１００６〜１０１０頁）に記載されている。組換えＡＡＶ（ＲＡＡＶ）ベクターの使用もまた、本明細書で企図される。ＲＡＡＶベクターは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染でき、その組換えウイルスゲノムは、宿主細胞のゲノム中に取り込まれ得る。ＲＡＡＶベクターは、例えば、血清型１〜６を含む、種々のアデノ随伴ウイルスから生成され得る。一般に、ＲＡＡＶベクターは、５’アデノ随伴ウイルス逆位末端配列（ＩＴＲ）、宿主細胞または宿主生物におけるその発現を調節する配列に動作可能に連結した目的の核酸、および３’アデノ随伴ウイルスＩＴＲを、順番に含み得る。さらに、ｒＡＡＶベクターは、好ましくは、ポリアデニル化シグナルを有し得る。適切なＲＡＡＶベクターは、とりわけ、ＷＯ１９９４／１３７８８、ＷＯ１９９３／２４６４１およびGoyenvalleら  ２００４年（Science  ３０６巻：１７９６〜１７９９頁）に記載されている。
【０４０３】
本明細書での使用のための他の好ましいウイルスベクターは、ポックスウイルス、例えばワクシニアウイルス、例えば、弱毒化ワクシニアウイルス、例えば、改変ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣ、トリポックスウイルス、例えば、鶏痘ウイルスまたはカナリヤポックスウイルスに由来するベクターである。
【０４０４】
したがって、ファブリー病を処置する方法における使用のための、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードする本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクターもまた提供される。好ましくは、治療は、遺伝子治療またはｍＲＮＡ治療であり得る。
【０４０５】
シンドラー病または神崎病を処置する方法における使用のための、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードする本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクターがさらに提供される。好ましくは、治療は、遺伝子治療方法またはｍＲＮＡ治療であり得る。
【０４０６】
かかる処置を必要とするヒト対象においてファブリー病を処置する方法であって、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードする本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクターの治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法がさらに提供される。好ましくは、治療は、遺伝子治療方法またはｍＲＮＡ治療であり得る。
【０４０７】
かかる処置を必要とするヒト対象においてシンドラー病または神崎病を処置する方法であって、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードする本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクターの治療有効量を対象に投与するステップを含む方法もまた提供される。好ましくは、治療は、遺伝子治療方法またはｍＲＮＡ治療であり得る。
【０４０８】
さらなる態様は、本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【０４０９】
例として、宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞を含む真菌細胞、動物細胞、またはヒト細胞および非ヒト哺乳動物細胞を含む哺乳動物細胞であり得る。
【０４１０】
ポリペプチドの小規模産生または大規模産生に使用され得る発現系（宿主細胞）には、限定なしに、微生物、例えば、例えば、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｍｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；あるいは、例えば、組換え真菌発現ベクターで形質転換された真菌細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、メチロトローフ酵母（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｏｏｇａｔａｅａ属、Ｐｉｃｈｉａ属またはＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属のメチロトローフ酵母、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａまたはＰｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属もしくはＣｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ属の糸状菌、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属もしくはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅもしくはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）が含まれる。有用な発現系には、核酸分子を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに由来する細胞、例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２細胞、ヨトウムシＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａに由来する細胞株、例えば、Ｓｆ９およびＳｆ２１細胞、またはキャベツルーパー（cabbage  looper）Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉに由来する細胞、例えば、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞）、ならびに組換えウイルス発現ベクター（例えば、タバコモザイクウイルス）に感染したまたは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系もまた含まれる。哺乳動物発現系には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物細胞、例えば、げっ歯類細胞、霊長類細胞またはヒト細胞が含まれる。哺乳動物細胞、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物細胞には、初代細胞、二次、三次などの細胞が含まれ得る、またはクローン性細胞株を含む不死化細胞株が含まれ得る。好ましい動物細胞は、組織培養物中で容易に維持および形質転換され得る。ヒト細胞の非限定的な例には、ヒトＨｅＬａ（子宮頸がん）細胞株が含まれる。組織培養の実務において一般的な他のヒト細胞株には、とりわけ、ヒト胚腎臓２９３細胞（ＨＥＫ細胞）、ＤＵ１４５（前立腺がん）、Ｌｎｃａｐ（前立腺がん）、ＭＣＦ−７（乳がん）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８（乳がん）、ＰＣ３（前立腺がん）、Ｔ４７Ｄ（乳がん）、ＴＨＰ−１（急性骨髄性白血病）、Ｕ８７（神経膠芽腫）、ＳＨＳＹ５Ｙ（神経芽細胞腫）またはＳａｏｓ−２細胞（骨がん）が含まれる。霊長類細胞の非限定的な例は、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザルＣｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ腎臓上皮細胞株）細胞およびＣＯＳ細胞である。げっ歯類細胞の非限定的な例は、ラットＧＨ３（下垂体腫瘍）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＰＣ１２（褐色細胞腫）細胞株、またはマウスＭＣ３Ｔ３（胚頭蓋冠）細胞株である。かかる細胞は、本明細書で特定した遺伝子操作の前に、種々の商業的供給源および研究資源機関、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）などから取得され得る。メタロチオネインプロモーター、アデノウイルス後期プロモーターまたはサイトメガロウイルスプロモーターなどの種々のプロモーターが、哺乳動物細胞における発現に適切であり得る。
【０４１１】
好ましい実施形態では、宿主細胞は、真菌細胞であり得る。真菌細胞は、酵母細胞、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞、またはメチロトローフ酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅまたはＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の細胞であり得る。あるいは、真菌細胞は、糸状菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｅｓｉｅｌｌｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｎｄｉｄｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｒｎｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｄｅｆｌｅｃｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｇｌａｕｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｏｉｄｅｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔａｍａｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａまたはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ）の細胞であり得る。
【０４１２】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓであり得る。好ましくは、宿主細胞はＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。有利なことに、実施例に示されるように、真菌細胞、特にＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおけるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の産生は、満足のいく発現レベルの、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を生じる。
【０４１３】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、
−  Ｎ−グリカン活性の外鎖伸長における欠損、例えば、ＯＣＨ１活性における欠損を含むように遺伝子操作され得る；および／あるいは
−  ＭＮＮ４、ＰＮＯ１、ＭＮＮ６またはそれらのいずれか１つの生物学的に活性なバリアントもしくは断片などの、Ｎ−グリカンのマンノシルリン酸化をもたらすことが可能なポリペプチドの発現を含むように遺伝子操作され得る。
【０４１４】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、末端マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分を末端ホスホ−６−マンノースへと加水分解することが可能なマンノシダーゼまたはマンノシダーゼの機能的断片を発現するように遺伝子操作され得る。例えば、マンノシダーゼは、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来のＣｃＭａｎ５を含む、ファミリー９２のグリコシドヒドロラーゼであり得る。
【０４１５】
マンノシダーゼまたはマンノシダーゼの機能的断片は、マンノース−１−ホスホ−６−マンノースまたはホスホ−６−マンノース部分を含む基礎をなすマンノースにアルファ１，２連結によって結合したマンノース残基を除去することも可能であり得る。さらに、マンノシダーゼまたはマンノシダーゼの機能的断片は、マンノース−１−ホスホ−６−マンノースまたはホスホ−６−マンノース部分を含むグリカンの基礎をなすマンノースに末端アルファ−１，３マンノースおよび／またはアルファ−１，６マンノースおよび／またはアルファ−１，２マンノース連結によって結合したマンノース残基を加水分解することが可能であり得る。例えば、マンノシダーゼは、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）マンノシダーゼおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＭＳ１マンノシダーゼからなる群から選択される、ファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼであり得る。
【０４１６】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、末端マンノース−１−ホスホ−６−マンノースまたはホスホ−６−マンノース部分中の基礎をなすマンノースにアルファ１，２連結によって結合したマンノース残基を除去することが可能であるマンノシダーゼまたはその機能的断片もしくはバリアントを発現するように遺伝子操作され得る。例えば、マンノシダーゼは、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）マンノシダーゼおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＭＳ１マンノシダーゼを含むファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｔｏｉ（ＡＳ）マンノシダーゼを含むファミリー４７のグリコシドヒドロラーゼ；またはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ  ＣｃＭａｎ４マンノシダーゼを含むファミリー９２のグリコシドヒドロラーゼであり得る。
【０４１７】
マンノシダーゼまたはマンノシダーゼの機能的断片は、マンノース−１−ホスホ−６−マンノースまたはホスホ−６−マンノース部分を含むグリカン中の基礎をなすマンノースに末端アルファ−１，３マンノースおよび／またはアルファ−１，６マンノースおよび／またはアルファ−１，２マンノース連結によって結合したマンノース残基を加水分解することもまた可能であり得る。例えば、マンノシダーゼは、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）マンノシダーゼおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＭＳ１マンノシダーゼからなる群から選択されるがこれらに限定されない、ファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼであり得る。
【０４１８】
さらなる態様は、本明細書に定義される宿主細胞の実質的に純粋な培養物に関する。
【０４１９】
本明細書で使用する場合、宿主細胞の「実質的に純粋な培養物」は、培養物中の生存細胞の総数の約４０％未満（即ち、約３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％、０．５０％、０．２５％；０．１０％；０．０１％、０．００１％、０．０００１％未満、またはさらに低く）が宿主細胞以外の生存細胞である、細胞の培養物である。
【０４２０】
宿主細胞のかかる培養物は、細胞と、成長、貯蔵または輸送培地とを含む。培地は、液体、半固体（例えば、ゼラチン状培地）、固体または凍結であり得る。培養物は、液体中もしくは半固体培地中／上で成長している細胞、または凍結された貯蔵もしくは輸送培地を含む貯蔵もしくは輸送培地中で貯蔵もしくは輸送されている細胞を含む。培養物は、培養ベッセルまたは貯蔵ベッセルまたは基材（例えば、培養ディッシュ、フラスコ、あるいはチューブまたは貯蔵バイアルもしくはチューブ）中にある。本明細書に記載される宿主細胞は、例えば、グリセロールまたはスクロースなどの凍結保護物質を含む緩衝液中で凍結細胞懸濁物などとして、凍結乾燥された細胞として、貯蔵され得る。あるいは、これらは、例えば、流動床乾燥もしくはスプレー乾燥、または任意の他の適切な乾燥方法によって取得された、乾燥細胞調製物などとして貯蔵され得る。
【０４２１】
本発明のさらなる態様は、宿主細胞において本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の発現を達成するための、本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクターの使用を提供する。好ましくは、宿主細胞は、真菌細胞、より好ましくはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。
【０４２２】
さらなる態様は、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を産生するための方法であって、
ａ）宿主細胞が、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を発現するように、本明細書に定義される宿主細胞を培養するステップ、
ｂ）宿主細胞または宿主細胞培養培地から、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を収集し、任意選択で単離するステップ
を含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は真菌細胞である。好ましくは、宿主細胞はＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞である。
【０４２３】
ある特定の実施形態では、この方法は、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片に含まれるリン酸化されたＮ−グリカンの少なくとも一部の脱キャップ化および／または（好ましくは「および」）脱マンノシル化をさらに含み得、例えば、脱キャップ化および脱マンノシル化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または宿主細胞中で、または宿主細胞の溶解物中で起こる。
【０４２４】
したがって、本明細書に記載される遺伝子操作された宿主細胞は、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を産生するために使用され得る。本明細書に記載される遺伝子操作された宿主細胞は、脱キャップ化および脱マンノシル化された本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を産生するためにも使用され得る。
【０４２５】
脱キャップ化および脱マンノシル化された糖タンパク質を産生する細胞ベースの方法は、マンノース−１−ホスホ−６−マンノース連結または部分をホスホ−６−マンノースへと加水分解することが可能なマンノシダーゼをコードする核酸を含むように遺伝子操作された真菌宿主細胞中に、糖タンパク質、特に本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードする核酸を導入するステップを含み得、それによって、宿主細胞は、脱キャップ化されたリン酸化されたＮ−グリカンを含む糖タンパク質を産生する。かかるリン酸化されたＮ−グリカンは、本明細書の他の箇所に記載されるように、脱マンノシル化され得る。一部の実施形態では、マンノシダーゼおよび糖タンパク質をコードする核酸は、マンノシダーゼおよび糖タンパク質が共分泌されるように、分泌配列を含む。
【０４２６】
別の細胞ベースの方法は、（ｉ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース連結または部分をホスホ−６−マンノースへと加水分解することが可能であり、（ｉｉ）リン酸含有グリカンの末端アルファ−１，２マンノース、アルファ−１，３マンノースおよび／またはアルファ−１，６マンノース連結または部分を加水分解することが可能なマンノシダーゼをコードする核酸を含むように遺伝子操作された真菌宿主細胞中に、糖タンパク質、特に本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードする核酸を導入するステップを含み得、それによって、宿主細胞は、脱キャップ化および脱マンノシル化された糖タンパク質を産生する。一部の実施形態では、マンノシダーゼおよび糖タンパク質をコードする核酸は、マンノシダーゼおよび糖タンパク質が共分泌されるように、分泌配列を含む。
【０４２７】
糖タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ産生に適切な宿主細胞は、本明細書の他の箇所に教示される真菌起源、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、好ましくはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのものであり得る。
【０４２８】
糖タンパク質、特に、本明細書に教示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を組換え発現するように意図または構成された宿主細胞の遺伝子操作は、（ｉ）外鎖伸長（ＯＣＨ１）タンパク質をコードする内因性遺伝子の欠失；（ｉｉ）マンノース残基のリン酸化を増加させるための、マンノシルリン酸化を促進することが可能なポリペプチド（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓもしくはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＭＮＮ４ポリペプチド、またはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のＰＮＯ１ポリペプチド）をコードする組換え核酸の導入；（ｉｉｉ）ＯＣＨ１タンパク質の機能的発現に干渉するＲＮＡ分子の導入もしくは発現；（ｉｖ）Ｎ−グリコシル化活性を有する野性型（例えば、内因性または外因性）タンパク質をコードする（即ち、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質を発現させる）組換え核酸の導入；または（ｖ）Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする１つもしくは複数の内因性遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサーエレメントを変更し、したがって、それらのコードされたタンパク質の発現を変更することなどの１つまたは複数の遺伝子改変をさらに含み得る。ＲＮＡ分子には、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる。遺伝子操作は、付加（例えば、異種配列）、欠失または置換（例えば、変異、例えば、点変異；保存的または非保存的変異）を有するタンパク質を産生するように、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする内因性遺伝子を変更することもまた含む。変異は、（例えば、部位特異的変異誘発または相同組換えによって）特異的に導入され得、またはランダムに導入され得る（例えば、細胞は、例えば、NewmanおよびFerro-Novick、１９８７年、J.  Cell  Biol.、１０５巻（４号）：１５８７頁に記載されるように、化学的に変異誘発され得る）。
【０４２９】
本明細書に記載される遺伝子改変は、（ｉ）遺伝子改変された細胞における１つもしくは複数の活性における増加、（ｉｉ）遺伝子改変された細胞における１つもしくは複数の活性における減少、または（ｉｉｉ）遺伝子改変された細胞における１つもしくは複数の活性の局在化もしくは細胞内分布における変化のうち１つまたは複数を生じ得る。特定の活性の量における増加（例えば、マンノシルリン酸化を促進する）は、マンノシルリン酸化を促進することが可能な１つもしくは複数のタンパク質の過剰発現、内因性遺伝子のコピー数の増加（例えば、遺伝子重複）、または遺伝子によってコードされるタンパク質の発現における増加を刺激する内因性遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサーにおける変更に起因し得ることが理解される。１つまたは複数の特定の活性における減少は、変異体形態（例えば、ドミナントネガティブ形態）の過剰発現、特定の活性を有する１つもしくは複数のタンパク質の発現を低減させる１つもしくは複数の干渉ＲＮＡ分子の導入もしくは発現、または特定の活性を有するタンパク質をコードする１つもしくは複数の内因性遺伝子の欠失に起因し得る。
【０４３０】
相同組換えによって遺伝子を破壊するために、「遺伝子置換」ベクターが、選択可能なマーカー遺伝子を含むような方法で構築され得る。選択可能なマーカー遺伝子は、相同組換えを媒介するのに十分な長さの遺伝子の部分に対して５’末端側および３’末端側の両方で、作動可能に連結し得る。選択可能なマーカーは、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２およびＨＩＳ３遺伝子を含む、宿主細胞の栄養要求性を補完するまたは抗生物質耐性を提供する、任意の数の遺伝子のうち１つであり得る。他の適切な選択可能なマーカーには、酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を付与するＣＡＴ遺伝子、またはβ−ガラクトシダーゼの発現に起因する青いコロニーを生じるｌａｃＺ遺伝子が含まれる。次いで、遺伝子置換ベクターの線状化されたＤＮＡ断片が、当該分野で周知の方法を使用して、細胞中に導入される。ゲノム中への線状断片の組込みおよび遺伝子の破壊は、選択マーカーに基づいて決定され得、例えば、サザンブロット分析によって検証され得る。選択可能なマーカーは、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系によって、宿主細胞のゲノムから除去され得る。
【０４３１】
あるいは、遺伝子置換ベクターは、破壊される遺伝子の一部分を含むような方法で構築され得、この部分は、いずれの内因性遺伝子プロモーター配列も欠いており、遺伝子のコード配列をコードしないまたはその不活性断片をコードする。「不活性断片」は、遺伝子の全長コード配列から産生されるタンパク質の活性の、例えば、約１０％未満（例えば、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満または０％）を有するタンパク質をコードする遺伝子の断片である。遺伝子のかかる一部分は、公知のプロモーター配列が遺伝子配列に作動可能に連結しないが、終止コドンおよび転写終結配列が遺伝子配列のその部分に作動可能に連結するような方法で、ベクター中に挿入される。このベクターは、遺伝子配列の部分において引き続いて線状化され得、細胞中に形質転換され得る。次いで、単回の相同組換えによって、この線状化されたベクターは、遺伝子の内因性対応物中に組み込まれる。
【０４３２】
したがって、一部の実施形態では、宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、ＯＣＨ１遺伝子またはその遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）を欠き、ＯＣＨ１活性が欠損している。とりわけＷＯ２００８／１２０１０７で解明されたように、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞におけるＯＣＨ１欠損は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカン構造上にアルファ−１，２連結されたマンノース残基を有するグリコシル化されたタンパク質の実質的に均質な産生、例えば、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンの優勢な産生を生じ得る。
【０４３３】
ある特定の実施形態では、この方法は、ＭＮＮ４（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＭＮＮ４ポリペプチド）、ＰＮＯ１（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のＰＮＯ１）もしくはＭＮＮ６、またはかかるポリペプチドの機能的断片を含む、マンノシルリン酸化をもたらすことが可能なポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞中に導入するステップをさらに含み得る。例えば、真菌細胞は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来のＭＮＮ４ポリペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＸＭ＿５０３２１７．１）を発現できる。
【０４３４】
一部の実施形態では、遺伝子操作された細胞は、ＯＣＨ１活性が欠損しており、マンノシルリン酸化を促進することが可能なポリペプチドを発現する。
【０４３５】
ある特定の実施形態では、この方法は、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質の機能的発現に干渉するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の転写のための核酸を宿主細胞中に導入するステップをさらに含み得る。好ましくは、Ｎ−グリコシル化活性を有するタンパク質は、ＯＣＨ１である。例えば、ＲＮＡ分子には、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれ得る。
【０４３６】
ある特定の実施形態では、この方法は、末端マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分を末端ホスホ−６−マンノースへと加水分解することが可能なマンノシダーゼまたはマンノシダーゼの機能的断片もしくはバリアントをコードする核酸を宿主細胞中に導入するステップをさらに含み得る。例えば、マンノシダーゼは、例えばＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来のＣｃＭａｎ５であるがこれに限定されないファミリー９２のグリコシドヒドロラーゼ、またはＣａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）マンノシダーゼおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＭＳ１マンノシダーゼなどのファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼであり得る。
【０４３７】
マンノシダーゼまたはマンノシダーゼの機能的断片もしくはバリアントは、マンノース−１−ホスホ−６−マンノースまたはホスホ−６−マンノース部分を含む基礎をなすマンノースにアルファ１，２連結によって結合したマンノース残基を除去することも可能であり得る。例えば、マンノシダーゼは、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）マンノシダーゼおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＭＳ１マンノシダーゼからなる群から選択される、ファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼであり得る。
【０４３８】
マンノシダーゼまたはその機能的断片もしくはバリアントは、マンノース−１−ホスホ−６−マンノースまたはホスホ−６−マンノース部分を含むグリカン部分の末端アルファ−１，３マンノースおよび／またはアルファ−１，６マンノースおよび／またはアルファ−１，２マンノース連結または部分を加水分解することがさらに可能であり得る。例えば、かかるマンノシダーゼは、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）マンノシダーゼおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＭＳ１マンノシダーゼからなる群から選択される、ファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼであり得る。
【０４３９】
ある特定の実施形態では、この方法は、末端マンノース−１−ホスホ−６−マンノースまたはホスホ−６−マンノース部分中の基礎をなすマンノースにアルファ−１，２連結によって結合したマンノース残基を除去することが可能なマンノシダーゼまたはその機能的断片もしくはバリアントをコードする核酸を宿主細胞中に導入するステップをさらに含み得る。例えば、マンノシダーゼは、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）マンノシダーゼおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＭＳ１マンノシダーゼからなる群から選択されるがこれらに限定されないファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｔｏｉ（ＡＳ）マンノシダーゼが含まれるがこれに限定されないファミリー４７のグリコシドヒドロラーゼ、またはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ  ＣｃＭａｎ４マンノシダーゼを含むファミリー９２のグリコシドヒドロラーゼであり得る。
【０４４０】
あるいは、ある特定の実施形態では、この方法は、ステップ（ｂ）において収集されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を、末端マンノース−１−ホスホ−６−マンノース部分を末端ホスホ−６−マンノースへと加水分解することが可能なマンノシダーゼまたはマンノシダーゼの機能的断片と共にインキュベートするステップを含み得る。例えば、マンノシダーゼは、例えばＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来のＣｃＭａｎ５であるがこれに限定されないファミリー９２のグリコシドヒドロラーゼ、またはＣａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）マンノシダーゼおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＭＳ１マンノシダーゼなどのファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼであり得る。
【０４４１】
マンノシダーゼまたはマンノシダーゼの機能的断片は、マンノース−１−ホスホ−６−マンノースまたはホスホ−６−マンノース部分を含む基礎をなすマンノースにアルファ１，２連結によって結合したマンノース残基を除去することも可能であり得る。例えば、マンノシダーゼは、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）マンノシダーゼおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＭＳ１マンノシダーゼからなる群から選択される、ファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼであり得る。
【０４４２】
マンノシダーゼは、マンノース−１−ホスホ−６−マンノースまたはホスホ−６−マンノース部分を含むグリカン部分の末端アルファ−１，３マンノースおよび／またはアルファ−１，６マンノースおよび／またはアルファ−１，２マンノース連結または部分を加水分解することがさらに可能であり得る。例えば、かかるマンノシダーゼは、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）マンノシダーゼおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＭＳ１マンノシダーゼからなる群から選択される、ファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼであり得る。
【０４４３】
ある特定の実施形態では、この方法は、ステップ（ｂ）において収集されたヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を、末端マンノース−１−ホスホ−６−マンノースまたはホスホ−６−マンノース部分中の基礎をなすマンノースにアルファ１，２連結によって結合したマンノース残基を除去することが可能なマンノシダーゼと共にインキュベートするステップをさらに含み得る。例えば、マンノシダーゼは、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）マンノシダーゼおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＭＳ１マンノシダーゼからなる群から選択されるがこれらに限定されないファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｔｏｉ（ＡＳ）マンノシダーゼが含まれるがこれに限定されないファミリー４７のグリコシドヒドロラーゼ、またはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ  ＣｃＭａｎ４マンノシダーゼが含まれるファミリー９２のグリコシドヒドロラーゼであり得る。マンノシダーゼは、マンノース−１−ホスホ−６−マンノースまたはホスホ−６−マンノース部分を含むグリカン部分の末端アルファ−１，３マンノースおよび／またはアルファ−１，６マンノースおよび／またはアルファ−１，２マンノース連結または部分を加水分解することがさらに可能であり得る。例えば、マンノシダーゼは、Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）マンノシダーゼおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＡＭＳ１マンノシダーゼからなる群から選択されるがこれらに限定されないファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼであり得る。
【０４４４】
分子のグリコシル化を検出するための方法には、ＤＮＡシーケンサー補助（ＤＳＡ）、フルオロフォア補助炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）または表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）が含まれる。例えば、分析は、例えば、糖タンパク質が変性され、その後、例えばメンブレン上に固定化される、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを利用できる。次いで、糖タンパク質は、適切な還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはベータ−メルカプトエタノールを用いて還元され得る。タンパク質のスルフヒドリル基は、ヨード酢酸などの酸を使用してカルボキシル化され得る。次に、Ｎ−グリカンは、Ｎ−グリコシダーゼＦなどの酵素を使用してタンパク質から放出され得る。Ｎ−グリカンは、任意選択で再構成され得、還元的アミノ化によって誘導体化され得る。例えば、放出されたＮ−グリカンは、還元的アミノ化によって、還元末端においてＡＰＴＳ（８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸）などのフルオロフォアで標識され得る。標識化の化学量論は、１つのＡＰＴＳ分子だけがオリゴ糖の各分子に結合されるような化学量論である。次いで、誘導体化されたＮ−グリカンは、濃縮され得る。Ｎ−グリカン分析に適切な計測手段には、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７  ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が含まれる。データ分析は、例えば、ＧＥＮＥＳＣＡＮ（登録商標）３．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施され得る。単離されたＮ−グリカンは、それらのＮ−グリカン状態を確認するために、マンノシダーゼおよび／または仔牛腸ホスファターゼなどの１つまたは複数の酵素でさらに処理され得る。Ｎ−グリカン分析のさらなる方法には、例えば、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、順相、逆相およびイオン交換クロマトグラフィーでの高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、グリカンが標識されない場合にはアンペロメトリック電気化学検出を用い、グリカンが適切に標識される場合にはＵＶ吸光度または蛍光を用いる）が含まれる。Callewaertら、２００１年、Glycobiology、１１巻（４号）：２７５〜２８１頁およびFreireら、２００６年、Bioconjug.  Chem.、１７巻（２号）：５５９〜５６４頁もまた参照のこと。
【０４４５】
一部の実施形態では、脱キャップ化および脱マンノシル化され得る糖タンパク質、特に、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、真菌宿主細胞などの宿主細胞内で維持され得、細胞溶解の際に放出され得る。一部の実施形態では、糖タンパク質は、細胞からの糖タンパク質の分泌を指示するコード配列（外因性核酸に対してネイティブ、または発現ベクター中に操作されたのいずれか）によって提供される機構を介して、培養培地中に分泌され得る。細胞溶解物または培養培地中の糖タンパク質の存在は、種々の標準的な検出プロトコール、例えば、糖タンパク質に対して特異的な抗体を用いるイムノブロッティングもしくは放射性免疫沈降、または特定の酵素活性について試験することによって検証され得る。
【０４４６】
ある特定の実施形態では、単離または精製のステップは、遠心分離、濾過による培地清澄化、脱塩、濃縮、アンモニウム沈殿、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび／または疎水性電荷誘導クロマトグラフィー）、ポリペプチドタグ（例えば、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン（例えば、ヘキサヒスチジン）タグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグもしくはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ）を介した選択的精製、またはそれらの任意の組合せが含まれるがこれらに限定されない、当業者に公知の任意の１つまたは複数のステップを含み得る。例えば、Scopes、Protein  Purification:  Principles  and  Practice、第３版、Springer-Verlag、New  York（１９９３年）；BurtonおよびHarding、J.  Chromatogr.  A  ８１４巻：７１〜８１頁（１９９８年）を参照のこと。
【０４４７】
一部の実施形態では、単離後、脱キャップ化および脱マンノシル化され得る糖タンパク質、特に、ヒトＮＡＧＡＬポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片は、例えば、酵素的または化学的手段を使用して、異種部分に結合され得る。「異種部分」とは、糖タンパク質に（例えば、共有結合的または非共有結合的に）繋がれる任意の構成成分を指し、この構成成分は、糖タンパク質上に元々存在する構成成分とは異なる。異種部分には、例えば、ポリマー、担体、アジュバント、免疫毒素または検出可能な（例えば、蛍光、発光または放射活性）部分が含まれる。一部の実施形態では、さらなるＮ−グリカンが、変更された標的分子に付加され得る。
【０４４８】
それらの３文字コードおよび１文字コードによるアミノ酸を表２に列挙する。
【表２】
2019503171.tif 000008
【０４４９】
本発明は、その具体的な実施形態と併せて記載されてきたが、多くの代替法、改変およびバリエーションが、上述の記載に照らして当業者に明らかであることは明白である。したがって、全てのかかる代替法、改変およびバリエーションを、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲にあるとおり、包含することが意図される。
【０４５０】
本明細書に開示される本発明の態様および実施形態は、以下の非限定的な実施例によってさらに支持される。
【実施例】
【０４５１】
（実施例１）
増加したα−ガラクトシダーゼ活性を有するヒトＮＡＧＡＬ（ＮＡＧＡＬ１）を発現するＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株の生成
実験の目的は、増加したα−ガラクトシダーゼ活性を有するようにアミノ酸置換Ｓｅｒ１８８ＧｌｕおよびＡｌａ１９１Ｌｅｕ（開始メチオニンから始まるアミノ酸番号付け、ヒトＮＡＧＡＬの１７アミノ酸のシグナルペプチドを含む；配列番号１に示されるヒトＮＡＧＡＬポリペプチド中では、これは、置換Ｓｅｒ１７１ＧｌｕおよびＡｌａ１７４Ｌｅｕに対応する）によって改変されたヒトリソソームα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡＬ）酵素の分泌された発現のためのＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株を開発することであった。この目的のために、Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐ２ｐのシグナルペプチド（Ｌｉｐ２プレ配列）と成熟形態のＮＡＧＡＬ（哺乳動物分泌シグナルペプチドを除く、ヒトＮＡＧＡＬのアミノ酸１８から始まる）との間の融合物をコードするＹａｒｒｏｗｉａコドン最適化合成遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔに注文した。この合成遺伝子は、酵母小胞体（ＥＲ）内でのシグナルペプチドの効率的プロセシングを確実にするために、Ｌｉｐ２プレ配列と第１のＮＡＧＡＬ特異的アミノ酸との間に２つのＸ−Ａｌａリピートもまたコードした（Gasmiら、２０１２年、Appl.  Microbiol.  Biotechnol.、９６巻（１号）：８９〜１０１頁）。ＣＡＣＡヌクレオチド配列は、Ｙａｒｒｏｗｉａにおける翻訳開始にとって有益であることが見出されたので、これをＡＴＧ開始コドンの前に導入した（Gasmiら、２０１１年、Appl.  Microbiol.  Biotechnol.、８９巻（１号）：１０９〜１９頁）。今後、アミノ酸置換Ｓｅｒ１８８ＧｌｕおよびＡｌａ１９１Ｌｅｕ（開始メチオニンから始まるアミノ酸番号付け）を含むヒトＮＡＧＡＬを、簡便に「ＮＡＧＡＬ１」または「ＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）」と呼ぶ。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現のための合成ＮＡＧＡＬ１遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１０として与えられる（太字下線：開始ＡＴＧ；イタリック下線：終止コドン）：
【化５−１】
2019503171.tif 000009
【化５−２】
2019503171.tif 000010
【０４５２】
組換えＮＡＧＡＬ１（Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐ２プレシグナルペプチドおよび２つのＸ−Ａｌａリピートを含む）のアミノ酸配列は、配列番号１１として与えられる（太字下線：Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐ２プレシグナルペプチドおよび２つのＸ−Ａｌａリピート）：
【化６】
2019503171.tif 000011
【０４５３】
比較のために、ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ  Ａ）をコードし、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｉｔｙｃａにおける発現のためにコドン最適化された合成遺伝子も同様に、ＧｅｎｅＡｒｔに注文した。このタンパク質の分泌もまた、成熟ヒトα−ガラクトシダーゼＡの最初のアミノ酸をＹａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐ２ｐプレ配列に融合させることによって駆動した。この場合、Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐ２ｐプレ配列の後に１つのＸ−Ａｌａを続け、シグナルペプチダーゼ切断部位におけるより良いプロセシングを確実にした（Pignedeら、２０００年、J.  Bacteriol.、１８２巻（１０号）：２８０２〜１０頁）。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける発現のための合成α−ＧａｌＡ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１２として与えられる（太字下線：開始ＡＴＧ；イタリック下線：終止コドン）：
【化７】
2019503171.tif 000012
【０４５４】
組換えα−ＧａｌＡのアミノ酸配列（Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐ２プレシグナルペプチドおよび１つのＸ−Ａｌａを含む）は、配列番号１３として与えられる（太字下線：Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐ２プレシグナルペプチドおよび１つのＸ−Ａｌａリピート）：
【化８】
2019503171.tif 000013
【０４５５】
ＮＡＧＡＬ１およびα−Ｇａｌ  Ａをコードする合成配列を、半構成的増殖期依存的Ｈｐ４ｄプロモーターの後ろにクローニングした。ＵＲＡ３、ＬＥＵ２またはＡＤＥ２選択マーカーを保有するプラスミドバリアントを生成して、それぞれウラシル、ロイシンまたはアデニンを欠く最少培地上でのＹａｒｒｏｗｉａ形質転換体の選択を可能にした。発現プラスミドを、ランダム組込みを介して、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株ＯＸＹＹ２１６３中に形質転換した。親株ＯＸＹＹ２１６３は、高レベルのリン酸化されたＮ−グリカンを合成する高い能力を有し、以下の遺伝子型特色を含む：ＭａｔＡ、ｌｅｕ２−９５８、ｕｒａ３−３０２、ｘｐｒ２−３２２、ａｄｅ２−８４４、ΔＳｃｓｕｃ２、Δｏｃｈ１、ＵＲＡ３：：ＰＯＸ２−ＭＮＮ４、ＯＣＨ１：：Ｈｐ４ｄ−ＭＮＮ４。したがって、ＯＸＹＹ２１６３は、Ｎ−グリカンの過グリコシル化を低減させるためにα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＯＣＨ１を惹起するために、細胞外プロテアーゼ遺伝子ＸＰＲ２が欠失している。ＹｌＭＮＮ４遺伝子の過剰発現は、増加したＮ−グリカンのリン酸化を確実にし、ａｄｅ栄養素要求性、ｌｅｕ栄養素要求性およびｕｒａ栄養素要求性は、複数の形質転換事象を可能にする。
【０４５６】
単一コピーＮＡＧＡＬ１またはα−Ｇａｌ  Ａ株を、ＡＤＥ２選択マーカーを含む発現プラスミドの、ＯＸＹＹ２１６３ゲノム中への組込みを介して生成した。３コピー発現株を、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３含有発現構築物の共形質転換を介して、この背景から生成した。限定ミネラル培地中での単一コピー株の制御されたバイオリアクター培養を可能にするために、これをＵＲＡ３およびＬＥＵ２選択マーカーのみで形質転換して、原栄養性を再び得た。あるいは、ＯＸＹＹ２１６３のＵＲＡ３およびＬＥＵ２補完されたバリアントである株ＯＸＹＹ１３１５を、単一のＡＤＥ２含有発現プラスミドで形質転換した。選択された形質転換体のゲノム中への発現構築物の存在を、ＰＣＲによってチェックした。ここおよび以下では、Ｙａｒｒｏｗｉａ形質転換体のＰＣＲスクリーニングを、ＳａｐｐｈｉｒｅＡｍｐ  Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ、ＲＲ３５０Ａ）またはＥｍｅｒａｌｄＡｍｐＭａｘＨＳ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ、ＲＲ３３０Ａ）のいずれかを使用して実施した。ＰＣＲ反応を、製造業者の推奨に従って、細胞懸濁物または調製されたゲノムＤＮＡのいずれかに対して実施した。
【０４５７】
ＮＡＧＡＬ１およびα−Ｇａｌ  Ａの発現レベルを、２ｍｌのリッチ培地中での２４ウェルの培養を介して、ＰＣＲ陽性Ｙａｒｒｏｗｉａ形質転換体について評価した。簡潔に述べると、数個の形質転換体を、２ｍｌのＹＰＤ（ＹＰＤ：１％ｗ／ｖ酵母抽出物；２％ｗ／ｖペプトン（pepton）；２％ｗ／ｖグルコース／デキストロース）を含むウェル中に接種し、２８℃および１８０ｒｐｍで一晩培養した。次の日（＋／−２４時間後）、１〜２μｌのこの培養物を、新鮮なＹＰＤを含む新たなウェルに移し、２８℃および１８０ｒｐｍで一晩再培養した。次の日、２４ウェルプレートを遠心分離し、培地を細胞ペレットから除去した。細胞を、２ｍｌのＳｕｐｅｒＴ／グリセロールリッチ培地（０．５％ｗ／ｖ酵母抽出物；２％ｗ／ｖ麦芽抽出物；１％ｗ／ｖトリプトン（trypton）；１．５％ｖ／ｖグリセロール；２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．８）中に再懸濁し、２８℃で３日間増殖させた。培養の終了時に、培地を回収し、ＮＡＧＡＬ１またはα−Ｇａｌ  Ａの発現について分析した。
【０４５８】
培養培地中の組換えタンパク質の分泌を、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット検出を介して最初に分析した。Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）（アガルシダーゼベータ、組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ａ  Ｓａｎｏｆｉ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＳＡ）または市販のＣＨＯ産生されたヒトＮＡＧＡＬ（カタログ番号６７１７−ＧＨ−０２０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を、陽性対照として機能するようにロードした（図１０）。分析を、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件を使用して実施した。アミノ酸組成に基づき、潜在的に付加されたＮ−グリカン（α−Ｇａｌ  Ａについて３つのＮ−部位、およびＮＡＧＡＬ１について５つのＮ−部位）のサイズを考慮すると、モノマー形態の組換えタンパク質は、約５０ｋＤａで泳動すると予測された。
【０４５９】
分析により、ＮＡＧＡＬ１は、α−ガラクトシダーゼについて得られた発現レベルと比較した場合、Ｙａｒｒｏｗｉａによってあまり良好に発現されないことが示された。さらに、顕著な量のＮＡＧＡＬ１特異的タンパク質分解産物が観察された。非還元ウエスタンブロット分析では、完全サイズのモノマーＮＡＧＡＬ１産物は、さらに目に見えにくかった（対照組換えＮＡＧＡＬも同様）。さらに、酵母由来のＮＡＧＡＬ１について、ＮＡＧＡＬ関連材料の顕著なスメアが、より高い分子量（ＭＷ）範囲で観察されたが、低ＭＷの分解バンドはほとんど存在しなかった。これは、例えば、望ましくないジスルフィド架橋の形成を潜在的に介した、完全サイズのモノマーＮＡＧＡＬ１とその分解産物との間の凝集を示した。
【０４６０】
還元ウエスタンブロット分析により、完全サイズのモノマーα−Ｇａｌ  Ａが、モノマーＮＡＧＡＬ１よりもいくらか速く泳動されたこと、および後者が、事実上二重バンドとして泳動されたことが示された。これは、試料をエンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）（Ｂｉｏｋｅ；Ｐ０７０２Ｌ）で脱グリコシル化した後のＮＡＧＡＬ１二つ組について示されるように、Ｎ−グリコシル化部位の占有における差異に起因した（図１１）。Ｎ−グリカンの除去は、単一のバンドを生じ（図１１、レーン２）、これは、ＥｎｄｏＨ処理前に観察された二重ＮＡＧＡＬ１バンド（図１１、レーン１）が実際にグリコシル化関連であったことを示している。
【０４６１】
（実施例２）
増加したα−ガラクトシダーゼ活性を有するヒトＮＡＧＡＬ（ＮＡＧＡＬ１）を発現するＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株の、制御されたバイオリアクター培養
ＮＡＧＡＬ１発現株の最初の制御されたバイオリアクター培養のために、ＤＡＳＧＩＰによって開発された８−パラレル１Ｌ発酵系を使用した。この系は、培養の間の酸素取込み速度（ＯＵＲ）および二酸化炭素生成速度（ＣＥＲ）を評価するための、ｐＨ、温度、溶存酸素のオンラインモニタリング、ならびに排ガス分析に対応している。
【０４６２】
選択された株のシード培養物を、リッチ培地を含む振盪フラスコ中で２８℃で増殖させた。次いで、シード培養物を、唯一の炭素供給源としてグリセロールを含む限定ミネラル培地を含む発酵槽中に接種して、増殖が制限されない２８℃でのバッチ期を開始させた。この期を使用して、高いバイオマス濃度に容易に到達した。グリセロール枯渇後、プロセスを、２つの連続的指数関数的グリセロールフィードを適用することによる炭素制限下で実行した。第１のフィード期は、静止期の開始に達するまでの４４時間にわたる比較的速い指数関数的グリセロールフィードであった。続くフィード期は、およそもう１３０時間にわたる比較的遅い指数関数的グリセロールフィードであった。発酵プロセスを通じて、溶存酸素、ｐＨ、温度、泡レベルおよびフィード速度を、能動的に制御した。溶存酸素レベルを、撹拌し、純粋酸素を混ぜることによって維持した。ｐＨを、１４％ｖ／ｖの水酸化アンモニウムを添加することによって調整した。泡を、消泡プローブの活性化の際に消泡剤を添加することによって相殺した。プロセスの間、試料を定期的に採取して、以下のパラメーターを評価した：１）組換えタンパク質発現、２）活性アッセイを介した機能的酵素の発現、３）セクレトームのＮ−グリコシル化プロファイルの進化、４）バイオマス濃度、５）ｐＨ、６）細胞形態学、および７）総タンパク質濃度。
【０４６３】
ウエスタンブロット分析を実施して、３コピー株のバイオリアクター培養の間の異なる時点においてＮＡＧＡＬ１発現レベルを評価した（図１２）。この分析により、制御された培養の後であっても、顕著なＮＡＧＡＬ１分解がなおも観察されたことが示された。培養培地のｐＨを５．０〜５．５で維持した場合、酵母発現されたニワトリＮＡＧＡＬの低減された分解が観察されることが記載されている（Zhuら、１９９６年、Protein  Expr  Purif.、８巻（４号）：４５６〜６２頁）。しかし、本発明者らの事例では、６．８から５．５へのｐＨの低減は、ＮＡＧＡＬ１タンパク質分解を低減させなかった（図１２）。
【０４６４】
発酵試料からのウエスタンブロットシグナルと、２０ｎｇの共ロードされた組換えヒトＮＡＧＡＬ（ＨｕＮＡＧＡＬ）のウエスタンブロットシグナルとの比較は、発現株の制御されたバイオリアクター培養の後であっても、低レベルの分泌されたＮＡＧＡＬ１を明らかに示した（図１２）。
【０４６５】
第２の分析方法では、細胞外α−ガラクトシダーゼ活性（ＮＡＧＡＬ１またはα−Ｇａｌ  ＡのいずれかのＹａｒｒｏｗｉａ発現に由来する）の存在を、基質として４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（４ＭＵ−α−Ｇａｌ）を使用して、ｐＨ４．５および３７℃の温度での酵素アッセイを介してモニタリングした。この蛍光定量的アッセイは基本的に、Tajimaら  ２００９年（Am.  J.  Hum.  Genet.、８５巻（５号）：５６９〜８０頁）およびTomasicら、２０１０年（J.  Biol.  Chem.、２８５巻（２８号）：２１５６０〜６頁）によって記載されたように実施した。簡潔に述べると、活性α−ガラクトシダーゼが培養培地中に存在する場合、４ＭＵ−α−Ｇａｌは加水分解され、それによって４−メチルウンベリフェリルを放出する。後者は、３６５ｎｍでの励起後に、４５０ｎｍで測定され得る。
【０４６６】
単一コピーα−ＧａｌＡ発現株対３コピーＮＡＧＡＬ１株からの等体積の発酵培地（回収時に採取した）の４ＭＵ−α−Ｇａｌアッセイを介した評価により、放出された４−メチルウンベリフェリルの総μＭ量における、１００倍を超える差異が示された（示さず）。言い換えると、細胞外α−ガラクトシダーゼ活性レベルは、３コピーＮＡＧＡＬ１株よりも、単一コピーα−ＧａｌＡ株について１００倍よりも多く高かった。これは再び、低レベルのＹａｒｒｏｗｉａ産生されたＮＡＧＡＬ１を示した。
【０４６７】
シャペロン、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａカルネキシン、Ｙａｒｒｏｗｉａタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、Ｙａｒｒｏｗｉａ結合タンパク質（ＢｉＰ）、ヒトカルネキシン、ヒトＰＤＩまたはヒトＢｉＰの共発現を介して組換えＮＡＧＡＬ１の発現レベルを増加させるための試みがなされてきたが、いずれも成功しなかった。小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）感受性転写因子ＨＡＣ１のスプライスバリアントの共発現も、同様に成功しないことが証明された。Ｌｉｐ２プレリーダー配列をＬｉｐ２プレプロ配列に交換することも、ＮＡＧＡＬ１の増加した分泌を生じなかった。本発明者らは、多プロテアーゼノックアウト株において発現研究を実施することによって、ＮＡＧＡＬ１分解のレベルを制限することもまた試みた。ＰｒｏＴ０１のノックアウトは、分泌された完全サイズのＮＡＧＡＬ１の増加を生じるようであった（ウエスタンブロットを介して示される）。しかし、これらの結果とは対照的に、分泌された総α−ガラクトシダーゼ活性における増加は、これらのＮＡＧＡＬ１産生ＰｒｏＴ０１ノックアウト株の培地中では観察できなかった。
【０４６８】
（実施例３）
増加したα−ガラクトシダーゼ活性を有するヒトＮＡＧＡＬのバリアント（ＮＡＧＡＬ１）を発現するＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株の生成
α−ＧａｌＡとＮＡＧＡＬとの間の高い配列類似性（全体で４６％）および非常に類似したタンパク質フォールドに基づくと、Ｙａｒｒｏｗｉａ産生されたＮＡＧＡＬ１について、顕著により低い発現レベルは予測されなかった。
【０４６９】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいてＮＡＧＡＬ１の発現を増加させることを試みるために、異なる戦略を試験した：
（ｉ）第１の戦略では、ＮＡＧＡＬ１のドメインＩＩをヒトα−ＧａｌＡのドメインＩＩによって置き換えた、全ドメインＩＩスワッピングを実施した；
（ｉｉ）第２の戦略では、ＮＡＧＡＬ１のドメインＩとドメインＩＩとの間に（さらなる）イオン対を形成する可能性を導入できるという仮説に基づいて、ＮＡＧＡＬ１のドメインＩのアスパラギン２１３をアスパラギン酸によって置き換え、ＮＡＧＡＬ１のドメインＩＩのシステイン３２６をアルギニンによって置き換えたＮＡＧＡＬ１バリアントを発現させた（成熟ＮＡＧＡＬ１中の最初のアミノ酸から始まるアミノ酸の番号付け、即ち、哺乳動物分泌シグナルを除く）；ならびに
（ｉｉｉ）第３の戦略では、ＮＡＧＡＬ１のドメインＩＩの対になっていないシステイン３２６（成熟ＮＡＧＡＬ１中の最初のアミノ酸から始まるアミノ酸の番号付け、即ち、哺乳動物分泌シグナルを除く）が、望ましくないジスルフィド架橋スクランブルの扇動因子であり得るという仮説に基づいて、システイン３２６を、アミノ酸セリン（サイズおよび疎水性が類似している）によって置き換えた。
【０４７０】
したがって、ＮＡＧＡＬ１の３つの新たなバリアントを生成した：＃１：ドメインＩＩスワップから生じる；＃２：二重アミノ酸変化：Ａｓｎ２１３ＡｓｐおよびＣｙｓ３２６Ａｒｇから生じる；ならびに＃３：単一のアミノ酸変化：Ｃｙｓ３２６Ｓｅｒから生じる。Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのためにコドン最適化された合成ヌクレオチド配列を、ＮＡＧＡＬ１配列において、一方ではドメインＩＩスワップを可能にするため、または他方では単一もしくは二重アミノ酸置換の導入を可能にするために設計した。これらの配列のサブクローニングは、Ｎ末端Ｌｉｐ２プレ分泌シグナルとその後の２つのＸ−Ａｌａリピートを有する新たなＮＡＧＡＬ１バリアント、即ち、ＮＡＧＡＬ１＃１（配列番号１４）、ＮＡＧＡＬ１＃２（配列番号１５）およびＮＡＧＡＬ１＃３（配列番号１６）の各々をコードするプラスミドを生じた：
【０４７１】
配列番号１４（太字下線：Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐ２プレシグナルペプチドおよび２つのＸ−Ａｌａリピート、下線：ＮＡＧＡＬ１からの配列相違）
【化９】
2019503171.tif 000014
【０４７２】
配列番号１５（太字下線：Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐ２プレシグナルペプチドおよび２つのＸ−Ａｌａリピート、下線：ＮＡＧＡＬ１からの配列相違）
【化１０】
2019503171.tif 000015
【０４７３】
配列番号１６（太字下線：Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐ２プレシグナルペプチドおよび２つのＸ−Ａｌａリピート、下線：ＮＡＧＡＬ１からの配列相違）
【化１１】
2019503171.tif 000016
【０４７４】
ＮＡＧＡＬ１バリアントの発現を、半構成的増殖期関連Ｈｐ４ｄプロモーターによって駆動した。
【０４７５】
バリアントＮＡＧＡＬ１＃１、ＮＡＧＡＬ１＃２およびＮＡＧＡＬ１＃３の単一コピー発現株を、Ｙａｒｒｏｗｉａ株ＯＸＹＹ１３１５中への対応するＡＤＥ２含有発現プラスミドの形質転換を介して生成した。形質転換体を、アデニンが全く添加されていない最少培地プレート上で増殖するそれらの能力に基づいて選択した。比較のために、ＮＡＧＡＬ１のためのＡＤＥ２発現プラスミドもまた、同じ株背景に形質転換した。選択された形質転換体のゲノム中の発現構築物の存在を、ＰＣＲを介してチェックした。ＰＣＲ分析で陽性とスコアされたＹａｒｒｏｗｉａ形質転換体による異なるＮＡＧＡＬバリアントの発現レベルを、２ｍｌのリッチ培地中での２４ウェルの培養後に評価した。簡潔に述べると、いくつかの形質転換体を、２ｍｌの酵母抽出物−ペプトン−デキストロース（ＹＰＤ）を含むウェル中に接種し、２８℃および１８０ｒｐｍで一晩培養した。次の日、１〜２μｌのこの培養物を、新鮮なＹＰＤを含む新たなウェルに移し、２８℃および１８０ｒｐｍで一晩再培養した。次の日、２４ウェルプレートを遠心分離し、培地を細胞ペレットから除去した。細胞を、２ｍｌのＳｕｐｅｒＴ／グリセロールリッチ培地（０．５％ｗ／ｖ酵母抽出物；２％ｗ／ｖ麦芽抽出物；１％ｗ／ｖトリプトン；１．５％ｖ／ｖグリセロール；２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．８）中に再懸濁し、２８℃で３日間増殖させた。培養の終了時に、培地を回収し、異なる改変されたＮＡＧＡＬ１ポリペプチドの発現について分析した
【０４７６】
培養培地中の組換えタンパク質の分泌を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動とその後のウエスタンブロット分析を介して最初に分析した（図１３；バリアント１つ当たり３つのクローン）。アミノ酸組成に基づき、潜在的に付加されたＮ−グリカンのサイズを考慮すると、モノマー形態の４つのＮＡＧＡＬバリアントは、約５０ｋＤａで泳動すると予測された。発現は、元のＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）およびＣｙｓ３２６Ｓｅｒアミノ酸変換が起きたＮＡＧＡＬ１＃３について観察された。ＮＡＧＡＬ１＃１で形質転換されたクローンについては発現は観察されなかったが、ＮＡＧＡＬ１発現における実質的な増加が、２つのアミノ酸変化Ａｓｎ２１３ＡｓｐおよびＣｙｓ３２６Ａｒｇを含むＮＡＧＡＬ１＃２発現構築物の形質転換体について得られた。これらの結果は、ＮＡＧＡＬ１のドメインＩＩをヒトα−ＧａｌＡのドメインＩＩで置き換えることで、対応するハイブリッドタンパク質を安定に産生する能力がなくなったことを示した。潜在的な異常なジスルフィド架橋形成を低減させるための試みとしての、セリンによるＣｙｓ３２６の交換は、ＮＡＧＡＬ１発現レベルに対していくらか影響を有した。ＮＡＧＡＬ１のドメインＩとドメインＩＩとの間に安定化イオン対を導入するために企図される二重アミノ酸置換は、分泌されたＮＡＧＡＬ１のかなりより良い発現を生じた（図１３、ＮＡＧＡＬ１＃２）。改変されたＮＡＧＡＬ１＃２ポリペプチドは、本発明の原理を示すある実施形態を示す。
【０４７７】
改変されたＮＡＧＡＬ１＃２ポリペプチドは、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色後に非常に良好に検出可能であった（図１４）。試料を脱グリコシル化するためのペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）（Ｂｉｏｋｅ；Ｐ０７０４Ｌ）処理は、単一のより低いＭＷのＮＡＧＡＬ１バンドを生じ、これは、改変されたＮＡＧＡＬ１＃２ポリペプチドが、Ｎ−グリコシル化の程度のみが互いに異なる２つの形態として産生されたことを示している（図１４）。
【０４７８】
次に、Ｙａｒｒｏｗｉａ産生された改変されたＮＡＧＡＬ１＃２ポリペプチドが、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびウエスタンブロット分析後にどのように挙動したかを調査した。２つのＮＡＧＡＬ１＃２発現クローンについての粗製培地、ならびに１／５希釈（一方のクローンについて）および１／１０希釈（両方のクローンについて）を、ゲル上にロードした（図１５）。これらの試料を、２つのＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）発現クローンおよび２つのＮＡＧＡＬ１＃３（Ｃｙｓ３２６Ｓｅｒ）発現クローンの粗製（未希釈）培地と比較した。ＮＡＧＡＬ１＃２についての未希釈試料中には、凝集物を形成すると思われる画分がなおも存在した。しかし、希釈シリーズに基づいて、凝集物対非凝集産物（即ち、およそ５０ｋＤａで泳動するモノマーＮＡＧＡＬ１バンド）の比は、ＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）またはＮＡＧＡＬ１＃３の発現に対して、改変されたＮＡＧＡＬ１＃２ポリペプチドの発現にかなり好ましいものであったと結論付けることができる。後者２つのバリアントの未希釈試料と比較して、ＮＡＧＡＬ１＃２試料の１／１０希釈は、有意により多くの５０ｋＤａモノマー産物を示したが、凝集した材料はほとんど検出不能になった（図１５）。ＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）とＮＡＧＡＬ１＃３との比較により、後者について、非凝集材料対凝集材料との間の比におけるわずかな改善が示された。
【０４７９】
異なるＮＡＧＡＬ１バリアントの２４ウェルの培養に対する別の分析として、培地中への活性α−ガラクトシダーゼ酵素活性の放出を試験した。標準的な蛍光定量的アッセイを、以前に記載したように基質として４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（４ＭＵ−α−Ｇａｌ）を使用して、培地の希釈シリーズに対してｐＨ４．５で実施した。α−ガラクトシダーゼの細胞外存在を、３７℃で２時間のインキュベーションの間に放出された４−メチルウンベリフェリルの量として測定し（図１６）、ヒトα−ＧａｌＡについて単一コピーおよび３コピーのＹａｒｒｏｗｉａ発現株の２４ウェルの培養と比較した。同じバリアントを発現するクローン間で観察されたバリエーションは、培養条件（例えば、リッチ培地中でのディープウェルの培養の間の増殖条件は制御できない）またはクローン的差異（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ形質転換体は、クローン間のゲノム差異を生じる、発現カセットのランダム組込みによって生成される）に起因し得る。
【０４８０】
分析により、ＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）クローンと比較して、本発明の原理を示す改変されたＮＡＧＡＬ１＃２ポリペプチドを発現するＹａｒｒｏｗｉａ株について、α−ガラクトシダーゼ活性の最大で１００倍の増加が示された。改変されたＮＡＧＡＬ１＃２ポリペプチドを発現するＹａｒｒｏｗｉａ株について得られた活性レベルは、ヒトα−ＧａｌＡ発現株によって産生される活性レベルの範囲内であった。分析により、改変されたＮＡＧＡＬ１＃３ポリペプチドを発現するＹａｒｒｏｗｉａ株について、α−ガラクトシダーゼ活性の測定可能な増加もまた示された。
【０４８１】
（実施例４）
異なるヒトＮＡＧＡＬ１バリアントを発現するＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株の制御されたバイオリアクター培養
制御されたバイオリアクター培養を、１Ｌの発酵系（ＤＡＳＧＩＰ）において実施した。要するに、選択された株のシード培養物を、リッチ培地を含む振盪フラスコ中で２８℃で一晩増殖させた。次いで、シードを、唯一の炭素供給源としてグリセロールを含む限定ミネラル培地を含む発酵槽ベッセル中に接種して、増殖が制限されない２８℃でのバッチ期を開始させた。グリセロール枯渇後、プロセスを、２つの連続的指数関数的グリセロールフィードを適用することによる炭素制限下で実行した：４０時間にわたる比較的速い指数関数的グリセロールフィードを伴う第１の期、およびおよそもう１１５時間にわたるより遅い指数関数的フィードを伴う第２の期。発酵プロセスを通じて、溶存酸素（およそ２０％）、ｐＨ（６．８）、温度（２８℃）、泡レベルおよびフィード速度を、能動的に制御した。溶存酸素レベルを、撹拌し、純粋酸素を混ぜることによって維持し、ｐＨを、１４％水酸化アンモニウムを添加することによって調整し、泡を、消泡プローブの活性化の際に消泡剤を添加することによって相殺した。プロセスの間、試料を定期的に採取して、以下のパラメーターを評価した：１）組換えタンパク質発現、２）活性アッセイを介した機能的酵素の発現、３）セクレトームのＮ−グリコシル化プロファイルの進化、４）バイオマス濃度、５）外部ｐＨ、６）細胞形態学、および７）総タンパク質濃度。
【０４８２】
１Ｌバイオリアクター培養の間の異なるＮＡＧＡＬ１バリアントの経時的な発現を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシー染色およびウエスタンブロット検出を介して分析した（図１７および１８）。２４ウェルの培養と同様に、ＮＡＧＡＬ１＃１（ドメインＩＩスワップ）の発現は観察できなかった（示さず）。ＮＡＧＡＬ１＃３（Ｃｙｓ３２６Ｓｅｒ）は、元のＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）バリアントと比較して僅かに良好に産生されたが、両方のバリアントのいずれも、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色では検出できなかった（図１８）。対照的に、ＮＡＧＡＬ１＃２（Ａｓｎ２１３Ａｓｐ／Ｃｙｓ３２６Ａｒｇ）の発現は、クーマシー染色で明らかに目に見え、発酵の間の早期に既に十分検出された（図１８）。ウエスタンブロット分析により、ＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）またはＮＡＧＡＬ１＃３と比較して、ＮＡＧＡＬ１＃２の明らかに優れた発現レベルが示された（図１７）。
【０４８３】
次に、分泌されたα−ガラクトシダーゼ活性のレベルを、基質として４−ＭＵ−α−Ｇａｌを使用して、以前に記載したように測定した（図１９）。分泌された酵素におけるいくらかの増加が、ＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）ブロスの最後から２番目の時点に対して、ＮＡＧＡＬ１＃３発酵ブロスの最後から２番目の時点において観察されたが、最終的なレベルは、発酵の終了時に同等化するようであった。反復バイオリアクター培養は、ＮＡＧＡＬ１＃３発現クローンとＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）発現クローンとの間での、発酵の終了時における分泌されたα−ガラクトシダーゼ活性における統計的差異を決定し得る。分泌されたα−ガラクトシダーゼ活性における１００倍を超える増加が、ＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）株での同様の発酵における活性と比較して、ＮＡＧＡＬ１＃２発現株のバイオリアクター培養ブロスにおいて観察された。
【０４８４】
（実施例５）
ＮＡＧＡＬ１＃２の発現のための多コピーＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株
最初に、本発明の原理を示す改変されたＮＡＧＡＬポリペプチドをコードする、ＮＡＧＡＬ１＃２発現構築物のＡＤＥ２バリアントを、ＯＸＹＹ２１６３中に形質転換して、ｌｅｕ２栄養要求性およびｕｒａ３栄養要求性を有する単一コピー発現株を生成した。プラスミドのゲノム組込みを、形質転換体に対するＰＣＲスクリーニングによってチェックした。いくつかのＰＣＲ陽性クローンを、２４ディープウェルプレート中での培養後に組換えＮＡＧＡＬ１＃２の産生について試験した。簡潔に述べると、いくつかの形質転換体を、２ｍｌのＹＰＤを含むウェル中に接種し、２８℃および１８０ｒｐｍで一晩培養した。次の日、１〜２μｌのこの培養物を、新鮮なＹＰＤを含む新たなウェルに移し、２８℃および１８０ｒｐｍで一晩再培養した。次の日、２４ウェルプレートを遠心分離し、培地を細胞ペレットから除去した。細胞を、２ｍｌのＳｕｐｅｒＴ／グリセロールリッチ培地中に再懸濁し、２８℃で３〜４日間増殖させた。培養の終了時に、培地を回収し、ＮＡＧＡＬ１＃２発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシー染色およびウエスタンブロット分析を介して評価した（図２０）。
【０４８５】
それに基づいて、２つの単一コピー形質転換体を、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３含有ＮＡＧＡＬ１＃２発現構築物による共形質転換について選択し、クローンを、アデニン、ウラシルおよびロイシンが添加されていない最少培地上で増殖する能力に基づいて選択した。２つの余分な発現カセットの組込みを、ＰＣＲ分析を介して確認し、いくつかのＰＣＲ陽性クローンを、２４ウェルの培養後に組換えＮＡＧＡＬ１＃２の産生について試験した（上記のとおり）。
【０４８６】
粗製培地を、ウエスタンブロット分析を介して組換えタンパク質の発現について分析し、α−ガラクトシダーゼ酵素活性を、基質として４−ＭＵ−α−Ｇａｌを使用して以前に記載したように測定した（図２１）。ウエスタンブロット分析に基づいて、全体として、原栄養性３コピー株が、原栄養性単一コピー株と比較してより少ない組換えＮＡＧＡＬ１＃２を産生していると思われた。上述のように、あるクローン的バリエーションが、培養条件の制御されない性質、または発現プラスミドのランダム組込みの結果としての遺伝子型における差異のいずれかに起因して、観察できた。クローン的バリエーションは、分泌されたα−ガラクトシダーゼ活性のレベルの評価の際により明白であった：平均して、３コピー株について観察された活性レベルは、原栄養性単一コピー株の活性レベルと同じ範囲内である。この観察は、Ｙａｒｒｏｗｉａの翻訳および／またはフォールディング機構が、この実施例において適用した培養条件下では、多コピー株におけるＮＡＧＡＬ１＃２バリアントの発現について飽和し得るまたは律速になり得ることを示し得る。
【０４８７】
２つの選択された多コピーＮＡＧＡＬ１＃２株の制御されたバイオリアクター培養を、１Ｌの発酵系において実施した。要するに、選択された株のシード培養物を、リッチ培地を含む振盪フラスコ中で２８℃で一晩増殖させた。次いで、シードを、唯一の炭素供給源としてグリセロールを含む限定ミネラル培地を含む発酵槽ベッセル中に接種して、増殖が制限されない２８℃でのバッチ期を開始させた。グリセロール枯渇後、プロセスを、２つの連続的指数関数的グリセロールフィードを適用することによる炭素制限下で実行した：４４時間にわたる比較的速い指数関数的グリセロールフィードを伴う第１の期、およびおよそもう１１０時間にわたるより遅い指数関数的フィードを伴う第２の期。発酵プロセスを通じて、溶存酸素（およそ２０％）、ｐＨ（６．８）、温度（２８℃）、泡レベルおよびフィード速度を、能動的に制御し、必要に応じて調整した。プロセスの間、試料を定期的に採取して、本明細書に記載される異なる発酵パラメーターを評価した。
【０４８８】
２つの多コピー発現株のバイオリアクター培養後の改変されたＮＡＧＡＬ１＃２ポリペプチドの産生を、単一コピークローンのものと比較した。１Ｌ発酵の間の経時的な産生を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシー染色およびウエスタンブロット検出を介して分析した（図２２および２３）。タンパク質発現における明らかな増加が、単一コピーバリアントのＮＡＧＡＬ１発現レベルと比較した場合に、多コピー株クローン３について観察された。これにより、最少培地中での制御されたバイオリアクター培養の間に、本発明を示す改変されたＮＡＧＡＬ１＃２ポリペプチドのさらにより高いレベルを産生する株の能力がまだ飽和していなかったことが示された。
【０４８９】
機能的ＮＡＧＡＬ１＃２の増加した発現は、基質として４−ＭＵ−α−Ｇａｌを使用して、粗製発酵試料に対するα−ガラクトシダーゼ酵素活性アッセイを実施した場合にも観察された（図２４）。機能的酵素のレベルを、３７℃での１時間のインキュベーション後の加水分解された４−メチルウンベリフェリルのμＭ量として表した。同じ時点を互いに比較した場合、多コピー株におけるα−ガラクトシダーゼレベルは、単一コピー株におけるレベルよりもおよそ１．７〜２．１５倍高かった（図２４）。
【０４９０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシー染色により、発酵ブロス中の総タンパク質の大部分が、ＮＡＧＡＬ関連産物からなったことが示された。Ｎ−グリカンプロファイリングを、粗製回収培地試料に対して記載されたように実施して（Laroyら、２００６年、Nat  Protoc.、１巻（１号）：３９７〜４０５頁）、組換えタンパク質上に存在する主要なＮ−グリカンに関する最初の指標を得た。要するに、培地タンパク質を、メンブレン上で捕捉および変性させ、その後ＰＮＧａｓｅＦ処理して、Ｎ−結合型オリゴ糖を切り落とした。フルオロフォアＡＰＴＳ（８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸）による標識化後、Ｎ−グリカンを、キャピラリー電気泳動を介して分析し、それらの泳動挙動を、公知の標準的なオリゴ糖のものと比較した。結果は、改変されたＮＡＧＡＬ１＃２ポリペプチドを発現する多コピー株の発酵ブロス中の総タンパク質について、図２５に示される。モノリン酸化された（ＭＰ−Ｍ８）および二リン酸化された（（ＭＰ）２−Ｍ８）Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２に対応する２つの主要なピークが、Ｎ−グリカンプロファイルにおいて同定された（図２５、クローン３およびクローン８）。
【０４９１】
（実施例６）
ＮＡＧＡＬポリペプチドの３Ｄモデリング
ＰｙＭＯＬソフトウェア（DeLano、２００２年、The  PyMOL  Molecular  Graphics  System、ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）を、ヒトＮＡＧＡＬ（ＰＤＢ  ３Ｈ５４、暗い灰色）およびニワトリＮＡＧＡＬ（ＰＤＢ  １ＫＴＢ、明るい灰色）の構造的アラインメントおよび重ね合わせに使用した。これは、両方の酵素が非常に類似した三次フォールドを有することを示している（図２６を参照のこと）。ニワトリＮＡＧＡＬ中のドメインＩとドメインＩＩとの間の界面は、２つの安定化性イオン対Ａｓｐ２１４−Ａｒｇ３２７およびＡｓｐ２２１−Ａｒｇ２９９を明らかにしている（Garmanら、２００２年、Structure、１０巻（３号）：４２５〜３４頁に記載されるとおり）。後者（図２６の四角を参照のこと）は、ヒトＮＡＧＡＬでは位置が厳密に保存されるようであり、一方で前者は、ヒトオルソログには存在しないようである。Ａｓｎ２１３がＡｓｐ２１３に変換され、同時にＣｙｓ３２６がＡｒｇ３２６に変換されたヒトＮＡＧＡＬの３Ｄバリアントを、ＰｙＭＯＬ変異誘発ツールを使用してｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでモデリングし、特定の回転異性体を、近隣残基との立体衝突を回避するために選択した。本発明者らは、ＰｙＭＯＬ測定ツールを使用して、導入されたＡｓｐ２１３側鎖とＡｒｇ３２６側鎖との間の距離を評価し、これらが４Åと等しいまたはそれ未満であることを見出した。限定なしに、本発明者らは、この知見が、ＮＡＧＡＬポリペプチドのドメインＩとドメインＩＩとの間の相互作用を安定化させ得る、変異されたヒトＮＡＧＡＬ中の第２のＡｓｐ−Ａｒｇイオン対を形成する可能性を確認すると推論する。
【０４９２】
野性型ヒトＮＡＧＡＬでは、Ｃｙｓ３２６の後には、３２７位のＡｒｇが続く（図２６の楕円を参照のこと）。しかし、３Ｄ構造に基づいて、本発明者らは、Ａｒｇ３２７のアミノ酸側鎖が、変異体ＮＡＧＡＬ中の導入されたＡｓｐ２１３とイオン対を形成できないようなあり方で位置していると推論する。したがって、本発明者らは、Ａｓｎ２１３のＡｓｐへの変換だけでは、既に存在しているＡｒｇ３２７とのイオン対形成を生じないと予測した。
【０４９３】
２回目のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ演習において、本発明者らは、ＮＡＧＡＬ１＃２において導入された電荷の反転が、ヒトＮＡＧＡＬのドメインＩとドメインＩＩとの間の第２のイオン対形成を生じることができるかどうかを評価した。これのために、Ａｓｎ２１３がＡｒｇ２１３に変換され、同時にＣｙｓ３２６がＡｓｐ３２６に変換されたヒトＮＡＧＡＬのバリアントを、ＰｙＭＯＬ変異誘発ツールを使用してｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで３Ｄモデリングし、回転異性体を、近隣残基との立体衝突を回避するために選択した（図２７）。
【０４９４】
導入されたＡｒｇ２１３部位鎖とＡｓｐ３２６部位鎖との間の距離を、ＰｙＭＯＬ測定ツールを使用して評価したところ、そのうち１つ（５．２Å）は、４Åよりも有意に高かった。したがって、このモデルに基づいて、かかるヒトＮＡＧＡＬ内の変異されたアミノ酸の幾何学は、酵素のこの代替的バリアントにおける第２のＡｓｐ−Ａｒｇイオン対の形成にとって最適ではないことが予測できた。
【０４９５】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのためにコドン最適化された合成ヌクレオチド配列を、ＮＡＧＡＬ１配列中に上記二重アミノ酸置換を導入するために設計した。得られた新たなバリアントを、ＮＡＧＡＬ１＃７と命名する（配列番号１７）。元のＮＡＧＡＬ１発現ベクター中への合成断片のサブクローニングは、Ｎ末端Ｌｉｐ２プレ分泌シグナルとその後の２つのＸ−Ａｌａリピートを有するＮＡＧＡＬ１＃７バリアントをコードするＹａｒｒｏｗｉａ発現プラスミドを生じた。以前に発現されたＮＡＧＡＬ１バリアントと同様に、ＮＡＧＡＬ１＃７の発現は、半構成的増殖期関連Ｈｐ４ｄプロモーターによって駆動する。
【０４９６】
配列番号１７（太字下線：Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐ２プレシグナルペプチドおよび２つのＸ−Ａｌａリピート、下線：ＮＡＧＡＬ１からの配列相違）
【化１２】
2019503171.tif 000017
【０４９７】
ＮＡＧＡＬ１＃７の単一コピー発現株を、株ＯＸＹＹ１３１５中への対応するＡＤＥ２含有発現プラスミドの形質転換を介して生成した。形質転換体を、アデニンが全く添加されていない最少培地プレート上で増殖するそれらの能力に基づいて選択した。選択された形質転換体のゲノム中の発現構築物の存在を、ＰＣＲを介してチェックし、ＮＡＧＡＬ１＃７バリアントの発現レベルを、２ｍｌのリッチ培地中での２４ウェルの培養後に評価した。培養は、上記のように実施した。簡潔に述べると、いくつかの形質転換体を、２ｍｌのＹＰＤを含むウェル中に接種し、２８℃および１８０ｒｐｍで一晩培養した。次の日、１〜２μｌのこの培養物を、新鮮なＹＰＤを含む新たなウェルに移し、２８℃および１８０ｒｐｍで一晩再培養した。次の日、２４ウェルプレートを遠心分離し、培地を細胞ペレットから除去した。細胞を、２ｍｌのＳｕｐｅｒＴ／グリセロールリッチ培地中に再懸濁し、２８℃で３〜４日間増殖させた。培養の終了時に、培地を回収し、異なるＮＡＧＡＬバリアントの発現について分析した。
【０４９８】
培養培地中の組換えＮＡＧＡＬ１＃７の分泌を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動とその後のウエスタンブロット分析を介して分析し、元のＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）バリアントのものと比較した（図２８）。単一コピーＹａｒｒｏｗｉａ形質転換体からのＮＡＧＡＬ１＃７の発現レベルは、単一コピーＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）産生クローンについて得られた発現レベルと比較して、類似またはさらに低かった。したがって、ＮＡＧＡＬ１＃２と比較した導入された電荷の反転（即ち、ドメインＩ中のＡｓｐ２１３の代わりのＡｒｇ２１３、およびドメインＩＩ中のＡｒｇ３２６の代わりのＡｓｐ３２６）は、バリアントＮＡＧＡＬ１＃２について導入されたＡｓｎ２１３ＡｓｐおよびＣｙｓ３２６Ａｒｇ改変と同じ効果は有さない。これは、ＮＡＧＡＬ１＃７中の変異されたアミノ酸の幾何学が、ＮＡＧＡＬポリペプチドのドメインＩとドメインＩＩとの間の第２のＡｓｐ−Ａｒｇイオン対の形成にとって最適ではないという、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリングに基づく本発明者らの予測と一致した。
【０４９９】
（実施例７）
２１３位の残基と３２６位の残基との間の改善された相互作用を実証するさらなるヒトＮＡＧＡＬポリペプチド
本発明者らは、ＮＡＧＡＬ１の以下のさらなるバリアントをさらに調製した：＃４：単一のアミノ酸変化：Ｃｙｓ３２６Ａｒｇから生じる（配列番号１８）；＃５：単一のアミノ酸変化Ａｓｎ２１３Ａｓｐから生じる（配列番号１９）；ならびに＃６：二重アミノ酸変化Ｃｙｓ３２６ＳｅｒおよびＡｓｎ２１３Ａｓｐから生じる（配列番号２０）。
【０５００】
配列番号１８（太字下線：Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐ２プレシグナルペプチドおよび２つのＸ−Ａｌａリピート、下線：ＮＡＧＡＬ１からの配列相違）
【化１３】
2019503171.tif 000018
【０５０１】
配列番号１９（太字下線：Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐ２プレシグナルペプチドおよび２つのＸ−Ａｌａリピート、下線：ＮＡＧＡＬ１からの配列相違）
【化１４】
2019503171.tif 000019
【０５０２】
配列番号２０（太字下線：Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｌｉｐ２プレシグナルペプチドおよび２つのＸ−Ａｌａリピート、下線：ＮＡＧＡＬ１からの配列相違）
【化１５−１】
2019503171.tif 000020
【化１５−２】
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【０５０３】
３つ全てのバリアントＮＡＧＡＬ＃４、＃５および＃６は、アミノ酸位置２１３（高発現バリアントＮＡＧＡＬ１＃２ではＡｓｐに変異される）とアミノ酸位置３２６（高発現バリアントＮＡＧＡＬ１＃２ではＡｒｇに変異される）との間に余分な安定化イオン対形成を形成する能力を欠くと予測される：バリアントＮＡＧＡＬ１＃４は、３２６位において正に荷電したアミノ酸のみを含み、バリアントＮＡＧＡＬ１＃５およびＮＡＧＡＬ１＃６は、２１３位において負に荷電したアミノ酸のみを含む。ＮＡＧＡＬ１＃６の場合、バリアントＮＡＧＡＬ１＃３と同様に、遊離Ｃｙｓ３２６もまた、潜在的な異常なジスルフィド架橋形成を防止するためにＳｅｒに変異させた。
【０５０４】
上記ＮＡＧＡＬ１バリアント（Ｎ末端Ｌｉｐ２プレ分泌シグナルとその後の２つのＸ−Ａｌａリピートを有する）の各々をコードする発現プラスミドを、ＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）、ＮＡＧＡＬ１＃２およびＮＡＧＡＬ１＃３についての発現構築物を使用して、標準的なＤＮＡクローニング技術を介して生成した。これらのＮＡＧＡＬ１バリアントの発現もまた、半構成的増殖期依存的Ｈｐ４ｄプロモーターによって駆動した。ＮＡＧＡＬ１＃４、ＮＡＧＡＬ１＃５およびＮＡＧＡＬ１＃６バリアントの単一コピー発現株を、株ＯＸＹＹ１３１５中への対応するＡＤＥ２含有発現プラスミドの形質転換を介して生成した。形質転換体を、アデニンが全く添加されていない最少培地プレート上で増殖するそれらの能力に基づいて選択した。選択された形質転換体のゲノム中への発現構築物の組込みを、ＰＣＲを介してチェックした。Ｙａｒｒｏｗｉａ形質転換体が異なるＮＡＧＡＬバリアントを発現する能力を、上記のように、２ｍｌのリッチ培地中での２４ウェルの培養後に評価した。簡潔に述べると、いくつかの形質転換体を、２ｍｌのＹＰＤを含むウェル中に接種し、２８℃および１８０ｒｐｍで一晩培養した。次の日、１〜２μｌのこの培養物を、新鮮なＹＰＤを含む新たなウェルに移し、２８℃および１８０ｒｐｍで一晩再培養した。次の日、２４ウェルプレートを遠心分離し、培地を細胞ペレットから除去した。細胞を、２ｍｌのＳｕｐｅｒＴ／グリセロールリッチ培地中に再懸濁し、２８℃で３〜４日間増殖させた。培養の終了時に、培地を回収し、異なるＮＡＧＡＬバリアント発現について分析した。
【０５０５】
培養培地中の組換えタンパク質の分泌を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動とその後のウエスタンブロット分析を介して最初に分析した（図２９）。
【０５０６】
以前に示したように、低い発現レベルが、元のＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）について観察され、高いレベルが、ＮＡＧＡＬ１＃２（Ａｓｎ２１３ＡｓｐおよびＣｙｓ３２６Ａｒｇ）について観察された。Ａｓｎ２１３だけがＡｓｐに変換されたバリアントＮＡＧＡＬ１＃５は、ＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）と同様の低い発現レベルを示した。バリアントＮＡＧＡＬ１＃６は、ドメインＩＩ内の余分なアミノ酸改変（Ｃｙｓ３２６Ｓｅｒ）に潜在的に起因して、ＮＡＧＡＬ１＃５と比較して僅かにより高い発現レベルを示した。これは、ＮＡＧＡＬ１＃３（Ｃｙｓ３２６Ｓｅｒ改変のみ）もまた、ＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）（遊離Ｃｙｓ３２６を含む）と比較して、僅かにより高い発現レベルを有したという以前の観察と一致していた。
【０５０７】
ＮＡＧＡＬ１＃４について観察された有意により高い発現レベルは、ドメインＩＩ中の単一のアミノ酸改変Ｃｙｓ３２６Ａｒｇが、それだけで、ＮＡＧＡＬ１＃２バリアントについて観察された発現レベルにおける非常に高い増加における重要な因子を既に示していることを示唆している。ＮＡＧＡＬ１＃４の分泌されたレベルは、ＮＡＧＡＬ１＃２について観察されたレベルの約２．５分の１〜３分の１（Ｏｄｙｓｓｅｙソフトウェアを介して定量化した）であり、これは、Ａｒｇ３２６がＡｓｐ２１３とイオン対を形成する可能性が、ＮＡＧＡＬ１＃２の発現潜在力をさらに増加させるという本発明者らの仮説を支持すると思われる。
【０５０８】
小規模バイオリアクター培養を、バリアントＮＡＧＡＬ１＃４、ＮＡＧＡＬ１＃５およびＮＡＧＡＬ１＃６についてのＹａｒｒｏｗｉａ発現株に対して上記のように実施し、比較を、ＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）、ＮＡＧＡＬ１＃２およびＮＡＧＡＬ１＃３発現株の発酵を用いて行った。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット分析を介した発酵の異なる時点における培養ブロスの分析により、互いと比較した異なるバリアントの発現挙動がさらに確認された：ＮＡＧＡＬ１＃２＞ＮＡＧＡＬ１＃４＞＞全ての他のＮＡＧＡＬ１バリアント（図３０）。制御されたバイオリアクター培養後、ＮＡＧＡＬ１＃４発現レベルは、ＮＡＧＡＬ１＃２のおよそ５分の１であった。
【０５０９】
活性ＮＡＧＡＬ１タンパク質の分泌を、異なるＮＡＧＡＬ１バリアントを発現するＹａｒｒｏｗｉａ株の培養ブロス中のα−ガラクトシダーゼ活性を分析することによってチェックした。活性アッセイを、基質として４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（４ＭＵ−α−Ｇａｌ）を使用して、２４ウェルの培養または小規模発酵培地のいずれかの希釈シリーズに対してｐＨ４．５で実施した（Tajimaら  ２００９年；Tomasicら、２０１０年）。α−ガラクトシダーゼの細胞外存在を、３７℃で１時間のインキュベーションの間に放出された４−メチルウンベリフェリルの量として測定し、異なる試料間で比較した（図３１）。
【０５１０】
上記の結果は、選択されたＮＡＧＡＬ１＃２株が、２４ウェルの培養の間にＮＡＧＡＬ１＃４発現クローンよりも２．５〜３倍高いα−ガラクトシダーゼ活性を分泌していることを示した（図３１、左）。これは、細胞外タンパク質に対するウエスタンブロット分析後に行った分泌されたＮＡＧＡＬの定量化と類似であり、ウエスタンブロットを介して観察されたＮＡＧＡＬ１発現における増加が、余分なＡｓｎ２１３Ａｓｐ変異の導入の際に、活性タンパク質の余分な産生を主に示していることを示す。発酵培養ブロスに対する活性測定は、ＮＡＧＡＬ１＃４発現株と比較した、ＮＡＧＡＬ１＃２についての分泌されたα−ガラクトシダーゼ活性におけるおよそ６倍の増加、およびＮＡＧＡＬ１（Ｍｕｔ）株についての非常に低い量だけの活性産物を示している。
【０５１１】
（実施例８）
生成されたプラスミドおよび株の概要
上述の実験で使用したプラスミドは、図３２および３３にさらに記載される。
【０５１２】
上述の実験で使用した株は、図３４Ａ〜Ｃにさらに記載される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３２−３】
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【図３２−４】
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【図３２−５】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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