(57)【要約】  本発明は、ラムノリピドを産生し、かつその野生型と比較してＡＢＣグルコーストランスポーターの減少した活性を有するように、かつその野生型と比較して少なくとも１つの非ＡＢＣグルコーストランスポーターの増大した活性を有するように遺伝子改変された細胞、および本発明による細胞を用いたラムノリピドの製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラムノリピド産生細胞において、該細胞は、その野生型と比較して、ＡＢＣグルコーストランスポーターの減少した活性を有するように、かつその野生型と比較して、少なくとも１つの非ＡＢＣグルコーストランスポーターの増大した活性を有するように遺伝子改変されていることを特徴とする、細胞。
【請求項２】
前記非ＡＢＣグルコーストランスポーターは、次のもの：
ＥＣ２．７．３．９のホスホエノールピルベート・ホスホトランスフェラーゼ系、
ガラクトースパーミアーゼ、
グルコースファシリテーター、
ミオイノシトールトランスポーター、
グルコースパーミアーゼおよび
グルコース／ガラクトーストランスポーター
からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１記載の細胞。
【請求項３】
前記非ＡＢＣグルコーストランスポーターは、
ｇａｌＰ、ｇｌｆ、ｉｏｌＴ１、ｇｌｃＰ、ｇｌｕＰ、ＳｅｍｉＳＷＥＥＴもしくはｇｌｃＵ遺伝子によりコードされる酵素、ならびに
成分酵素Ｉ、ＨＰｒ、酵素ＩＩＡ、酵素ＩＩＢおよび酵素ＩＩＣからなるＰＴＳ系であって、ここで、酵素ＩＩＡ、ＩＩＢおよびＩＩＣは、融合タンパク質として存在できるものとするＰＴＳ系、または
ｇａｌＰ、ｇｌｆ、ｉｏｌＴ１、ｇｌｃＰ、ｇｌｕＰ、ＳｅｍｉＳＷＥＥＴもしくはｇｌｃＵ遺伝子がコードする酵素およびＰＴＳ系のアミノ酸残基の２５％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｇａｌＰ、ｇｌｆ、ｉｏｌＴ１、ｇｌｃＰ、ｇｌｕＰ、ＳｅｍｉＳＷＥＥＴもしくはｇｌｃＵ遺伝子がコードする酵素およびＰＴＳ系の酵素活性の少なくとも１０％をなおも有する酵素
からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２記載の細胞。
【請求項４】
バークホルデリア種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）、バークホルデリア・タイランデンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）、シュードモナス・レシノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、コマモナス・テストステローニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）、アルカリゲネス・レータス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）およびラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項５】
前記細胞は、その野生型と比較して、群Ｅ１、Ｅ２およびＥ３から選択される少なくとも１つの酵素の増大した活性を有するように遺伝子改変されており、ここで、
前記酵素Ｅ１は、３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸−ＡＣＰを経由してヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸への転化を触媒することができ、
前記酵素Ｅ２は、ラムノシルトランスフェラーゼＩであり、かつｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートからα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの転化を触媒することができ、かつ
前記酵素Ｅ３は、ラムノシルトランスフェラーゼＩＩであり、かつｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートからα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの転化を触媒することができることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項６】
Ｅ１、Ｅ２およびＥ３は、
それぞれｒｈｌＡ遺伝子、ｒｈｌＢ遺伝子およびｒｈｌＣ遺伝子によりコードされるか、または
ｒｈｌ遺伝子によりコードされる酵素に対してアミノ酸残基の２５％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｒｈｌ遺伝子によりコードされる酵素の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％をなおも有する酵素である
ことを特徴とする、請求項５記載の細胞。
【請求項７】
前記細胞は、その野生型と比較して、Ｄ−グルコースおよびキノンからＤ−グルコノ−１，５−ラクトンおよびキノールへの転化を触媒する少なくとも１つの酵素Ｅ４の減少した活性を有するように遺伝子改変されていることを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項８】
Ｅ４は、ＥＣ１．１．５．２のグルコース１−デヒドロゲナーゼであることを特徴とする、請求項７記載の細胞。
【請求項９】
以下の方法工程：
Ｉ）請求項１記載の細胞を、炭素源を含有する培地と接触させる工程、
ＩＩ）前記細胞が前記炭素源からラムノリピドを産生できるような条件下に前記細胞を培養する工程、および
ＩＩＩ）必要に応じて、産生されたラムノリピドを単離する工程
を含む、ラムノリピドの製造方法。
【請求項１０】
化粧品、皮膚用製剤または医薬製剤、作物保護剤ならびにケア製品および洗浄剤および界面活性剤濃縮物を製造するための、請求項９記載の方法を用いて得られたラムノリピドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ラムノリピドを産生し、かつその野生型と比較してＡＢＣグルコーストランスポーターの減少した活性を有するように、かつその野生型と比較して少なくとも１つの非ＡＢＣグルコーストランスポーターの増大した活性を有するように遺伝子改変された細胞、および本発明による細胞を用いたラムノリピドの製造方法に関する。
【０００２】
従来技術
ラムノリピドは、経済的に重要な物質クラスのうちの１つである。それというのも、ラムノリピドを通常の石油系界面活性剤と潜在的に置き替えることができ、ひいては相応する配合物の環境適合性を改善できるためである。目下、ラムノリピドは、様々なヒト病原性および動物病原性細菌、特にシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびバークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）の代表物の野生型分離株を使用して製造されている（Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０１０，  ３０３７〜５１頁参照）。
【０００３】
国際公開第２０１２０１３５５４号（ＷＯ  ２０１２０１３５５４）には、非病原性生物、例えばＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０におけるラムノリピドの産生が開示されており、その際、例えばシュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢおよびｒｈｌＣによりコードされる酵素が発現される。
【０００４】
最大限効率的な製法の開発および確立には、特に可能な限り高い空時収率の達成が必要である。
【０００５】
本発明の目的は、高い空時収率が達成される微生物細胞および該細胞を用いた方法を開発することである。
【０００６】
発明の説明
驚くべきことに、ラムノリピドを産生し、かつその野生型と比較してＡＢＣグルコーストランスポーターの減少した活性を有するように、かつその野生型と比較して少なくとも１つの非ＡＢＣグルコーストランスポーターの増大した活性を有するように遺伝子改変された細胞によって、基質投入量が同等の場合には、機能的ＡＢＣトランスポーターを有する同等の株よりも高いラムノリピド空時収率が得られることが判明した。
【０００７】
したがって本発明は、その野生型と比較して、ＡＢＣグルコーストランスポーターの減少した活性を有するように、かつその野生型と比較して少なくとも１つの非ＡＢＣグルコーストランスポーターの増大した活性を有するように遺伝子改変されていることを特徴とする、ラムノリピド産生細胞を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、上記細胞を生体触媒として使用するラムノリピドの製造方法を提供する。
【０００９】
本発明の利点の１つに、病原性ではなく、培養しやすい生物を使用することができるという点がある。
【００１０】
本発明のもう１つの利点は、広範な炭素源の選択肢を利用できるという点にある。
【００１１】
さらなる利点は、いかなる場合にも単独の基質としてまたは補助基質としての油を使用しなくてもよいことである。
【００１２】
もう１つの利点は、本発明を用いることで、所定のおよび調整可能な特性を有するラムノリピドを製造できるという点にある。
【００１３】
さらなる利点は、ラムノリピドを、その活性が変更されていない細胞を用いた場合よりも高い空時収率および高い炭素収率で製造できるという点にある。
【００１４】
したがって本発明は、ラムノリピド産生細胞、有利には単離されたラムノリピド産生細胞であって、該細胞は、その野生型と比較して、ＡＢＣグルコーストランスポーターの減少した活性を有するように、かつその野生型と比較して少なくとも１つの非ＡＢＣグルコーストランスポーターの増大した活性を有するように遺伝子改変されていることを特徴とする細胞を提供する。
【００１５】
本明細書において、細胞の「野生型」という用語は、そのゲノムが進化により自然に生じた状態で存在する細胞を意味する。この用語は、細胞全体と個々の遺伝子の双方に使用される。したがって「野生型」という用語には、その遺伝子配列がヒトにより組換え技法を用いて少なくとも部分的に改変された細胞または遺伝子は特に含まれない。「野生型」という用語は、特に生物の自然個体群の数で最も頻繁に生じる表現型、遺伝子型または遺伝子を意味する。
【００１６】
本発明において、「ラムノリピド」という用語は、一般式（Ｉ）
【化１】
2019532088.tif 000002
［式中、
ｍは、２、１または０、特に１または０であり、
ｎは、１または０、特に１であり、
Ｒ１は、２〜２４個、有利には５〜１３個の炭素原子を有し、特に場合により分岐状の、場合により置換された、特にヒドロキシで置換された、場合により不飽和の有機基、特に場合により一不飽和、二不飽和または三不飽和のアルキル基であり、有利にはペンテニル、ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニルおよびトリデセニルおよび（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ３（ここで、ｏは、１〜２３、有利には４〜１２である）からなる群から選択されるものであり、かつ
Ｒ２は、互いに独立して、２〜２４個、有利には５〜１３個の炭素原子を有する同一のまたは異なる有機基、特に場合により分岐状の、場合により置換された、特にヒドロキシで置換された、場合により不飽和の、特に場合により一不飽和、二不飽和または三不飽和のアルキル基であり、有利にはペンテニル、ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニルおよびトリデセニルおよび（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ３（ここで、ｏは、１〜２３、有利には４〜１２である）からなる群から選択されるものである］の化合物またはその塩を意味すると解釈される。
【００１７】
本発明による細胞が、ｍ＝１のラムノリピドを産生できる場合には、Ｒ１およびＲ２により決定される基
【化２】
2019532088.tif 000003
は、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシデセノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシドデセン酸、３−ヒドロキシドデセノイル−３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシデセノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデセノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシドデセン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシテトラデセン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシドデセノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシテトラデセン酸、３−ヒドロキシテトラデセノイル−３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデセノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシドデセン酸、３−ヒドロキシドデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシヘキサデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシヘキサデカン酸または３−ヒドロキシヘキサデカノイル−３−ヒドロキシヘキサデカン酸から誘導されることが有利である。
【００１８】
本発明による細胞が一般式（Ｉ）の種々のラムノリピドの混合物も産生し得ることは、当業者には自明である。
【００１９】
これに関連して、本発明による細胞は、産生されたラムノリピドの８０重量％超、有利には９０重量％超、特に有利には９５重量％超がｎ＝１であり、かつＲ１およびＲ２により決定される基に関して、産生されたラムノリピドの２０重量％未満、有利には１５重量％未満が３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシオクタン酸または３−ヒドロキシオクタノイル−３−ヒドロキシデカン酸に由来することを特徴とする一般式（Ｉ）のラムノリピドの混合物を産生できることが有利であり、ここで、表示された重量％は、産生された一般式（Ｉ）の全ラムノリピドの合計を基準とする。
【００２０】
本発明において列挙されたアクセッション番号は、２０１６年１月２６日付のＮＣＢＩのタンパク質構造データベースのエントリに相応し、総じてこの場合には、エントリのバージョン番号は、例えば「．１」のように「．数」により特定される。
【００２１】
別段の記載がない限り、所与のパーセンテージ（％）はいずれも、重量パーセントである。
【００２２】
したがって、使用される「酵素Ｅｘの減少した活性」という表現は、有利には少なくとも０．５倍、特に有利には少なくとも０．１倍、さらに有利には少なくとも０．０１倍、なおもさらに有利には０．００１倍、最も有利には少なくとも０．０００１倍に減少した活性を意味すると解釈される。「減少した活性」という表現には、検出不可能な活性も含まれる（「活性０」）。
【００２３】
微生物において酵素活性を減少させる方法は、当業者に公知である。ここでは、分子生物学的技法が特に有効である。例えば特定の酵素の活性を、標的突然変異により、または特定の酵素の活性を減少させる当業者に公知の他の方法により減少させることができる。特にシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびバークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）についての、特に特定の遺伝子を阻害するための、タンパク質発現を変更および減少させかつそれに付随して酵素活性を減少させる指示は、当業者により例えばＤｕｂｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９．  ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９：２６３；Ｓｉｎｇｈ  ＆  Ｒｏｅｈｍ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ２００８．  １５４：７９７−８０９またはＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２００９．  ２９７（１）：３８−４８において見ることができる。以下に記載するＡＢＣグルコーストランスポーターの酵素活性を減少させるための有利な方法を、本発明においてさらなる酵素活性を減少させるために同様に有利に使用することができる。
【００２４】
本発明による有利な細胞は、ＡＢＣグルコーストランスポーターをコードする遺伝子の遺伝子改変によって酵素活性の減少が達成されることを特徴とし、ここで、この改変は、遺伝子への外来ＤＮＡの挿入、遺伝子の少なくとも一部の欠失、遺伝子配列における点突然変異、特に例えばプロモーターやターミネーターといった制御配列中のもしくは該配列の遺伝子配列における点突然変異、またはリボソーム結合部位の遺伝子配列における点突然変異を含み、有利にはこれらからなる群から選択される。
【００２５】
これに関連して、外来ＤＮＡとは、（生物にとってではなく）遺伝子にとって「外来」である任意のＤＮＡ配列を意味すると解釈され、すなわちこれに関連して、内因性ＤＮＡ配列も「外来ＤＮＡ」として機能し得る。これに関連して、選択マーカー遺伝子の挿入により、遺伝子は特に有利に中断される。したがって、外来ＤＮＡは選択マーカー遺伝子であり、挿入は有利には遺伝子座への相同組換えにより行われている。
【００２６】
あるいは本発明による有利な細胞は、ＡＢＣグルコーストランスポーターをコードする遺伝子の目的の転写または転写後遺伝子サイレンシングにより、特にＡＢＣグルコーストランスポーターをコードする遺伝子のプロモーターへの少なくとも１つのリプレッサー結合を用いて、ナンセンスコドン介在的ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて酵素活性の減少が達成されることを特徴とし、その際、ＲＮＡｉでは、有利にはマイクロＲＮＡ方法論（ｍｉＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ法（ｓｉＲＮＡ）が利用され、これによって、ＡＢＣグルコーストランスポーターのｍＲＮＡが分解される。
【００２７】
本発明による細胞は、その野生型と比較してＡＢＣグルコーストランスポーターの減少した活性を有するように遺伝子改変されている。
【００２８】
本発明において「ＡＢＣグルコーストランスポーター」という用語は、共通の構造エレメントとしてＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）を有し、かつ細胞膜を通してグルコースのような特定の基質を能動的に輸送する膜タンパクを意味すると解釈されるべきである。ＡＣＢトランスポーターは、４つのコアドメイン、すなわち２つの内在性膜ドメインと、２つの細胞質ＡＴＰ結合ドメイン、いわゆるＡＴＰ結合カセットとからなる。前記カセット（タンパク質中の機能的ドメイン／領域）は、濃度勾配に対する基質のエネルギー共役輸送をベースとする。
【００２９】
本発明において、ＡＢＣグルコーストランスポーターの活性とは、細胞内に２−（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２−デオキシグルコース（２−ＮＢＤＧ）（グルコースの代わりであり、測定可能である）を取り込む能力と定義される。
【００３０】
ＡＢＣグルコーストランスポーターの活性は、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｕｐｔａｋｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（品番６００４７０）を用いて、具体的には２０１５年１０月９日付けの製造者の指示書にしたがって測定可能である。このために、ＡＢＣグルコーストランスポーターの活性が減少するように直接的に仕向けられた遺伝子改変の点でのみ異なっている細胞を互いに直接比較して、活性において相違があるか否かを調べることは、通常の当業者にとって自明である。
【００３１】
本発明による細胞は、野生型と比較して、少なくとも１つの非ＡＢＣグルコーストランスポーターの増大した活性を有するように遺伝子改変されている。
【００３２】
本発明における「非ＡＢＣグルコーストランスポーター」という用語は、上記で定義したＡＢＣグルコーストランスポーターではないグルコーストランスポーターと定義される。特に有利には、本発明においては、本発明による細胞にとって外来である非ＡＢＣグルコーストランスポーター、したがって野生型ゲノム中には存在しないものが利用される。
【００３３】
有利な非ＡＢＣグルコーストランスポーターは、特にＥＣ２．７．３．９のホスホエノールピルベート・ホスホトランスフェラーゼ系、ガラクトースパーミアーゼ、グルコースファシリテーター、ミオイノシトールトランスポーター、グルコースパーミアーゼおよびグルコース／ガラクトーストランスポーターからなる群から選択される。
【００３４】
トランスポーターは、当業者により、トランスポーター分類データベース（ｗｗｗ．ｔｃｄｂ．ｏｒｇ．）にしたがって分類される。本発明において、この分類に従う有利な非ＡＢＣグルコーストランスポーターは、ＴＣＤＢファミリーである、２．Ａ．１メジャーファシリテータースーパーファミリー、２．Ａ．１２３  Ｔｈｅ  Ｓｗｅｅｔスーパーファミリーおよび２．Ａ．７  ＤＭＴスーパーファミリーから選択されるものであり、ＴＣＤＢトランスポータークラス２．Ａ．１．１．１、２．Ａ．１．１．４、２．Ａ．１．１．５３、２．Ａ．１．７．３、２．Ａ．１．１．８１、２．Ａ．１２３．２および２．Ａ．７．５から選択されるものが特に有利である。
【００３５】
有利な非ＡＢＣグルコーストランスポーターは、特に
ｇａｌＰ、ｇｌｆ、ｉｏｌＴ１、ｇｌｃＰ、ｇｌｕＰ、ＳｅｍｉＳＷＥＥＴもしくはｇｌｃＵ遺伝子によりコードされる酵素、およびＰＴＳ系（これは、成分酵素Ｉ、ＨＰｒ、酵素ＩＩＡ、酵素ＩＩＢおよび酵素ＩＩＣからなり、ここで、酵素ＩＩＡ、ＩＩＢおよびＩＩＣは、融合タンパク質として存在できるものとする）、または
ｇａｌＰ、ｇｌｆ、ｉｏｌＴ１、ｇｌｃＰ、ｇｌｕＰ、ＳｅｍｉＳＷＥＥＴもしくはｇｌｃＵ遺伝子がコードする酵素およびＰＴＳ系のアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｇａｌＰ、ｇｌｆ、ｉｏｌＴ１、ｇｌｃＰ、ｇｌｕＰ、ＳｅｍｉＳＷＥＥＴもしくはｇｌｃＵ遺伝子がコードする酵素およびＰＴＳ系の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、とりわけ９０％超をなおも有する酵素
から選択され、ここで、非ＡＢＣグルコーストランスポーターの酵素活性とは、２−（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２−デオキシグルコース（２−ＮＢＤＧ）を細胞内に取り込む能力を意味すると解釈される。
【００３６】
上記ポリペプチド配列に関して、ｉｏｌＴ１遺伝子は特に、Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のものであり、ｇｌｃＰ遺伝子は特に、Ｍ．スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、Ｓ．フリジディマリナ（Ｓ．ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａ）またはＳ．アマゾネンシス（Ｓ．ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）由来のものであり、ｇｌｕＰ遺伝子は特に、Ｂ．アボルツス（Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ）由来のものであり、ＳｅｍｉＳＷＥＥＴ遺伝子は、Ｌ．ビフレクサ（Ｌ．ｂｉｆｌｅｘａ）由来のものであり、かつｇｌｃＵ遺伝子は特に、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはＳ．キシローサス（Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓ）由来のものである。
【００３７】
非ＡＢＣグルコーストランスポーターの活性は、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｕｐｔａｋｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（品番６００４７０）を用いて、具体的には２０１５年１０月９日付けの製造者の指示書にしたがって測定可能である。
【００３８】
本発明による細胞は、原核生物であっても真核生物であってもよい。これらは、哺乳類細胞（例えばヒトの細胞）、植物細胞または微生物、例えば酵母、真菌または細菌であることができ、微生物は特に有利であり、細菌および酵母が最も有利である。
【００３９】
さらに、本発明によれば、本発明による細胞が、野生型としてＣ６〜Ｃ１６のモノアルカノエートの鎖長を有するポリヒドロキシアルカノエートを産生し得る細胞である場合に有利である。このような細胞は、例えばバークホルデリア種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）、バークホルデリア・タイランデンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）、シュードモナス・レシノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、コマモナス・テストステローニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）、アルカリゲネス・レータス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）およびラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）である。これに関連して、有利な本発明の細胞は、該細胞がその野生型と比較してより少ないポリヒドロキシアルカノエートしか産生できないように遺伝子改変されている。
【００４０】
細菌の群のなかでは、特にシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、大腸菌およびバークホルデリア・タイランデンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）が特に有利である。
【００４１】
本発明による細胞の出発株は、天然のラムノリピド産生体であることができ、野生型として既にラムノリピドを産生する細胞であってもよいし、単に遺伝子工学によってラムノリピド産生が可能になったにすぎない細胞であってもよい。
【００４２】
どちらの場合にも、本発明による有利な細胞は、該細胞がその野生型と比較してＥ１、Ｅ２およびＥ３の群から選択される少なくとも１つの酵素の増大した活性を有するように遺伝子改変されているということから有益性を得ており、ここで、酵素Ｅ１は、３−ヒドロキシアルカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸−ＡＣＰを経由してヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカン酸への転化を触媒することができ、酵素Ｅ２は、ラムノシルトランスフェラーゼＩであり、かつｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートからα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの転化を触媒することができ、かつ酵素Ｅ３は、ラムノシルトランスフェラーゼＩＩであり、かつｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートからα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシアルカノイル−３−ヒドロキシアルカノエートへの転化を触媒することができる。
【００４３】
酵素Ｅ１は、有利には、
ｒｈｌＡ遺伝子によりコードされる酵素、ならびに
ｒｈｌＡ遺伝子によりコードされる酵素に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｒｈｌＡ遺伝子によりコードされる酵素の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する酵素
から選択される。
【００４４】
酵素Ｅ２は、有利には、
ｒｈｌＢ遺伝子によりコードされる酵素、ならびに
ｒｈｌＢ遺伝子によりコードされる酵素に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｒｈｌＢ遺伝子によりコードされる酵素の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する酵素
から選択される。
【００４５】
酵素Ｅ３は、有利には、
ｒｈｌＣ遺伝子によりコードされる酵素、ならびに
ｒｈｌＣ遺伝子によりコードされる酵素に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｒｈｌＣ遺伝子によりコードされる酵素の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する酵素
から選択される。
【００４６】
Ｅ１、Ｅ２およびＥ３に特に有利なもの：
酵素Ｅ１は、次のものからなる群から選択される：
少なくとも１つの酵素Ｅ１ａであって、
ポリペプチド配列ＡＤＰ０６３８７．１を有するか、または
参照配列ＡＤＰ０６３８７．１に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつ参照配列ＡＤＰ０６３８７．１を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する
酵素Ｅ１ａであり、ここで、酵素Ｅ１ａの酵素活性とは、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰから３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸−ＡＣＰを経由してヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと転化させる能力を意味すると解釈される；
少なくとも１つの酵素Ｅ１ｂであって、
ポリペプチド配列ＡＩＰ２９４７１．１、ＣＢＩ７１０２１．１、ＮＰ＿２５２１６９．１、ＡＢＲ８１１０６．１、ＹＰ＿４３９２７２．１、ＹＰ＿１１１３６２．１、ＹＰ＿１１０５５７．１、ＹＰ＿１０５２３１．１、ＺＰ＿０２４６１６８８．１、ＺＰ＿０２３５８９４９．１、ＺＰ＿０１７６９１９２．１、ＺＰ＿０４８９３１６５．１、ＺＰ＿０２２６５３８７．２、ＺＰ＿０２５１１７８１．１、ＺＰ＿０３４５６８３５．１、ＺＰ＿０３７９４６３３．１、ＹＰ＿９９０３２９．１、ＺＰ＿０２４０８７２７．１、ＹＰ＿００２９０８２４３．１、ＺＰ＿０４８８４０５６．１、ＹＰ＿００４３４８７０３．１、ＺＰ＿０４９０５３３４．１、ＺＰ＿０２３７６５４０．１、ＥＧＣ９９８７５．１、ＺＰ＿０２９０７６２１．１、ＹＰ＿００１８１１６９６．１、ＺＰ＿０２４６６６７８．１、ＺＰ＿０２８９１４７５．１、ＹＰ＿７７６３９３．１、ＹＰ＿００２２３４９３９．１、ＹＰ＿００１７７８８０４．１、ＹＰ＿３７１３１４．１、ＺＰ＿０４９４３３０５．１、ＹＰ＿６２３１３９．１、ＺＰ＿０２４１７２３５．１もしくはＺＰ＿０４８９２０５９．１を有するか、または
特定の前記アクセッション番号に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつ特定の前記アクセッション番号を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する
酵素Ｅ１ｂであり、ここで、酵素Ｅ１ｂの酵素活性とは、３−ヒドロキシテトラデカノイル−ＡＣＰを３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸−ＡＣＰを経由してヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸へと転化させる能力を意味すると解釈される。
【００４７】
酵素Ｅ２は、次のものからなる群から選択される：
少なくとも１つの酵素Ｅ２ａであって、
ポリペプチド配列ＡＤＰ０６３８８．１、ＹＰ＿００１３４７０３２．１、ＣＢＩ７１０２９．１、ＹＰ＿００２４３９１３８．１、ＣＢＩ７１０３１．１、ＮＰ＿２５２１６８．１、ＣＢＩ７１０３４．１、ＣＢＩ７１０２８．１、ＡＡＡ６２１２９．１もしくはＺＰ＿０４９２９７５０．１を有するか、または
特定の前記アクセッション番号に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつ特定の前記アクセッション番号を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する
酵素Ｅ２ａであり、ここで、酵素Ｅ２ａの酵素活性とは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸へと転化させる能力を意味すると解釈される；
少なくとも１つの酵素Ｅ２ｂであって、
ポリペプチド配列ＡＪＹ０１５９０．１、ＡＢＲ８４８８１．１、ＮＰ＿２５２１６８．１、ＦＮ６０１３６４．１、ＹＰ＿４４００７４．１、ＺＰ＿０５５９０６５７．１、ＺＰ＿０４５２０３７４．１、ＺＰ＿００４３８３６０．２、ＺＰ＿００４３８２０９．２、ＹＰ＿００１０７４７６１．１、ＺＰ＿０４８１１０８４．１、ＹＰ＿１１０５５８．１、ＹＰ＿１１１３６１．１、ＺＰ＿０２４９２８５７．１、ＹＰ＿３３７２４６．１、ＹＰ＿００１０６１８１１．１、ＹＰ＿１０５６０７．１、ＺＰ＿０２３７１５０３．１、ＺＰ＿０２５０３９６２．１、ＺＰ＿０３４５６８３９．１、ＺＰ＿０２４６１６９０．１、ＺＰ＿０３７９４６３４．１、ＺＰ＿０１７６９７３６．１、ＺＰ＿０１７６９３０８．１、ＺＰ＿０２３５８９４８．１、ＺＰ＿０２４８７７３６．１、ＺＰ＿０２４０８７５８．１、ＹＰ＿００２２３４９３７．１、ＺＰ＿０２８９１４７７．１、ＹＰ＿００１７７８８０６．１、ＹＰ＿６２３１４１．１、ＹＰ＿８３８７２１．１、ＺＰ＿０４９４３３０７．１、ＹＰ＿７７６３９１．１、ＹＰ＿００４３４８７０４．１、ＺＰ＿０２９０７６１９．１、ＹＰ＿３７１３１６．１、ＺＰ＿０２３８９９４８．１、ＹＰ＿００１８１１６９４．１、ＹＰ＿００２９０８２４４．１、ＺＰ＿０２５１１８０８．１、ＺＰ＿０２３７６５４２．１、ＥＧＣ９９８７７．１、ＺＰ＿０２４５１７６０．１もしくはＺＰ＿０２４１４４１４．１を有するか、または
特定の前記アクセッション番号に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつ特定の前記アクセッション番号を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する
酵素Ｅ２ｂであり、ここで、酵素Ｅ２ｂの酵素活性とは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよび３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸へと転化させる能力を意味すると解釈される。
【００４８】
酵素Ｅ３は、次のものからなる群から選択される：
少なくとも１つの酵素Ｅ３ａであって、
ポリペプチド配列ＮＰ＿２４９８２１．１を有するか、または
参照配列ＮＰ＿２４９８２１．１に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつ参照配列ＮＰ＿２４９８２１．１を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する
酵素Ｅ３ａであり、ここで、酵素Ｅ３ａの酵素活性とは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸に転化させる能力を意味すると解釈される；
１つの酵素Ｅ３ｂであって、
ポリペプチド配列ＡＪＹ０２９８１．１、ＦＮ６０１３８７．１、ＦＮ６０１３９１．１  ＹＰ＿４４００７１．１、ＺＰ＿０２３７５８９９．１、ＺＰ＿０２４６６６７６．１、ＹＰ＿００１０７５８６３．１、ＺＰ＿０２４０８７９６．１、ＹＰ＿３３５５３０．１、ＺＰ＿０１７６９１７６．１、ＹＰ＿１０５６０９．１、ＺＰ＿０１７７０８６７．１、ＺＰ＿０４５２０８７３．１、ＹＰ＿１１０５６０．１、ＹＰ＿００１０２４０１４．１、ＺＰ＿０３４５０１２５．１、ＹＰ＿００１０６１８１３．１、ＹＰ＿１１１３５９．１、ＺＰ＿００４４０９９４．２、ＺＰ＿０３４５６９２６．１、ＺＰ＿０２３５８９４６．１、ＺＰ＿００４３８００１．２、ＺＰ＿０２４６１４７８．１、ＺＰ＿０２５０３９２９．１、ＺＰ＿０２５１１８３２．１、ＹＰ＿００４３４８７０６．１、ＺＰ＿０４８９８７４２．１、ＹＰ＿００２９０８２４６．１、ＺＰ＿０２３８２８４４．１、ＥＧＤ０５１６７．１、ＹＰ＿００１７７８８０８．１、ＹＰ＿００１８１１６９２．１、ＹＰ＿００２２３４９３５．１、ＹＰ＿３７１３１８．１、ＹＰ＿６２３１４３．１、ＹＰ＿７７６３８９．１、ＺＰ＿０２８９１４７９．１、ＺＰ＿０２９０７６１７．１、ＺＰ＿０２４１７４２４．１もしくはＺＰ＿０４８９８７４３．１を有するか、または
特定の前記アクセッション番号に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつ特定の前記アクセッション番号を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する
酵素Ｅ３ｂであり、ここで、酵素Ｅ３ｂの酵素活性とは、ｄＴＤＰ−ラムノースおよびα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸をα−Ｌ−ラムノピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸に転化させる能力を意味すると解釈される。
【００４９】
酵素Ｅ１ａ〜Ｅ３ｂに関して具体的に挙げた活性が、上記酵素の広範な様々な活性の特定の例示的な選択肢にすぎないことは明らかであり、それぞれ挙げた活性は、所与の酵素について該活性に関して信頼性のある測定法が利用可能な活性である。したがって、非分岐状の飽和Ｃ１０−アルキル基を有する基質を転化させる酵素が、減少した活性を有する可能性があるにもかかわらず、Ｃ６−またはＣ１６−アルキル基（これらも分岐状または不飽和である可能性がある）を有する基質も同様に転化させることは明らかである。
【００５０】
本発明による有利な細胞は、野生型としては、ラムノリピドを産生することができないかまたは検出可能な量では産生することができず、さらに有利には野生型としては、酵素Ｅ１、Ｅ２およびＥ３の活性を有しないかまたは検出可能な活性を有しない。
【００５１】
本発明によれば、以下の酵素の組合せ：
Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ１Ｅ２、Ｅ１Ｅ３、Ｅ２Ｅ３およびＥ１Ｅ２Ｅ３
の増大した活性を有する細胞が好ましく、これらのうち、
Ｅ２、Ｅ２Ｅ３およびＥ１Ｅ２Ｅ３、特にＥ１Ｅ２Ｅ３
の組合せが特に有利である。
【００５２】
酵素の組合せＥ１Ｅ２Ｅ３の増大した活性を有する本発明による細胞の有利な実施態様では、ｎは有利には＝１である。
【００５３】
本発明において、「酵素の増大した活性」という用語は、有利には増大した細胞内活性を意味すると解釈されるべきである。
【００５４】
原則として、酵素をコードする遺伝子配列のコピー数を増大することにより、強力なプロモーターもしくは改善されたリボソーム結合部位を使用することにより、遺伝子発現の負の制御の減衰を例えば転写レギュレーターを使用して行うことにより、または遺伝子発現の正の制御の促進を例えば転写レギュレーターを使用して行うことにより、遺伝子のコドン使用頻度を変更することにより、様々な方法でｍＲＮＡもしくは酵素の半減期を増大することにより、遺伝子の発現の制御を変更することにより、または増大した活性を有する相応の酵素をコードする遺伝子もしくは対立遺伝子を使用することにより、およびこれらの方法を適切に組み合わせることにより、酵素活性の増大を達成することができる。活性の増大は有利には、本発明によれば、野生型と比較して酵素をコードする遺伝子配列のコピー数を増大することにより増大される。以前は野生型では存在しなかった遺伝子配列のコピーの取り込みは、自明ながら０から１のコピー数における増大に相応する。
【００５５】
本発明により遺伝子改変された細胞は、例えば形質転換、トランスダクション、コンジュゲーションまたはこれらの方法の組合せによって、所望の遺伝子と、該遺伝子の対立遺伝子またはその一部と、場合により遺伝子の発現を可能にするプロモーターとを含むベクターを用いて生成される。異種発現は、特に遺伝子もしくは対立遺伝子を細胞の染色体に組み込むか、または染色体外でベクターを複製することにより達成される。
【００５６】
細胞における酵素活性の増大に関する選択肢の概要は、一例として独国特許出願公開第１００３１９９９号明細書（ＤＥ−Ａ−１００３１９９９）にピルベートカルボキシラーゼに関して挙げられており、該刊行物の内容を本明細書において援用するものとし、その開示内容は、細胞における酵素活性の増大に関する選択肢に関して本発明の開示の一部を形成する。
【００５７】
上記の酵素または遺伝子および下記のすべての酵素または遺伝子の発現は、１次元および２次元タンパク質ゲル分離およびその後の適切な評価ソフトウェアを用いたゲル中でのタンパク質濃度の光学的同定を用いて検出可能である。酵素活性の増大が、相応する遺伝子の発現の増大のみに基づいている場合には、野生型と遺伝子改変細胞の間で１次元または２次元タンパク質分離を比較することにより前記酵素活性の増大を容易に定量化できる。コリネ型細菌の場合にタンパク質ゲルを製造して該タンパク質を同定する通常の方法は、Ｈｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．により記載されている手法である（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  ２２：１７１２．２３（２００１））。タンパク質濃度は、検出すべきタンパク質に特異的な抗体を使用したウエスタンブロットハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  ＵＳＡ，  １９８９）およびその後の濃度測定のための適切なソフトウェアを使用した光学的評価（Ｌｏｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ（１９８９）Ｂｉｏｓｐｅｋｔｒｕｍ，  ５：３２−３９；Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ（１９９９）Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  １１１：２６３０−２６４７）により同様に分析可能である。ＤＮＡ結合タンパク質の活性は、ＤＮＡバンドシフトアッセイを用いることにより測定可能である（ゲルリターデーションとも称される）（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  １８３：２１５１−２１５５）。その他の遺伝子の発現におけるＤＮＡ結合タンパク質の作用は、様々に十分に記載されているレポーター遺伝子アッセイ法により検出可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  ＵＳＡ，  １９８９）。細胞内酵素活性は、様々に記載されている方法により測定可能である（Ｄｏｎａｈｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８２（１９）：５６２４−５６２７；Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８２（８）：２２７７−２２８４；Ｆｒｅｅｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １１５（３）：８１６−８２３）。特定の酵素の活性を測定するための具体的な方法が以下の説明に記載されていない場合には、酵素活性の増大および酵素活性の減少は、好ましくは、Ｈｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｌｅｃｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  ２２：１７１２−２３（２００１）、Ｌｏｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｐｅｋｔｒｕｍ  ５  ３２−３９（１９９８）、Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  １１１：２６３０−２６４７（１９９９）およびＷｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ���，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８３：２１５１−２１５５（２００１）に記載の方法を用いて測定される。
【００５８】
酵素活性の増大が内部遺伝子の突然変異により達成される場合には、このような突然変異を、伝統的な方法により間接的に、例えばＵＶ照射または突然変異を引き起こす化学物質によって生じさせてもよいし、特に欠失、挿入および／またはヌクレオチド置換のような遺伝子工学法より生じさせてもよい。改変された細胞は、これらの突然変異により得られる。酵素の特に有利な突然変異体は、もはやフィードバック阻害、生産物阻害もしくは基質阻害下にはないか、または少なくとも野生型酵素と比較してそうしたものが少ない酵素である。
【００５９】
酵素活性の増大が酵素の合成の増大により達成される場合には、例えば関連遺伝子のコピー数が増大するか、またはプロモーターおよび制御領域もしくは構造遺伝子の上流に位置するリボソーム結合部位が突然変異される。構造遺伝子の上流に組み込まれた発現カセットは、類似の効果を示す。さらに、誘導性プロモーターにより、所望のどの時点でも発現を増大させることができる。しかしさらに、いわゆる「エンハンサー」を制御配列として酵素遺伝子に与えることもでき、これも同様に、ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡとの間での相互作用の改善によって増大した遺伝子発現を引き起こす。発現は、ｍＲＮＡの寿命を延長する措置によっても改善される。さらに、酵素活性は、酵素タンパク質の分解を阻害することによっても強化される。ここで、遺伝子または遺伝子構築物は、種々のコピー数のプラスミド中に存在するかまたは染色体に組み込まれて増幅される。あるいはさらに、関連遺伝子の過剰発現は、培地組成物および培養の変更により達成できる。これに関する指示は、当業者により特にＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５，  １３７−１４６（１９８７））、Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  １３８，  ３５−４１（１９９４））、Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｉｎａｇａ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，  ４２８−４３０（１９８８））、Ｅｉｋｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  １０２，  ９３−９８（１９９１））、欧州特許出願公開第０４７２８６９号明細書（ＥＰ−Ａ−０４７２８６９）、米国特許第４，６０１，８９３号明細書（ＵＳ  ４，６０１，８９３）、Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ  ａｎｄ  Ｐｕｅｈｌｅｒ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，  ８４−８７（１９９１））、Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６０，  １２６−１３２（１９９４））、ＬａＢａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７５，  １００１−１００７（１９９３））、国際公開第９６／１５２４６号（ＷＯ−Ａ−９６／１５２４６）、Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  １３４，  １５−２４（１９９３））、特開平１０−２２９８９１号公報（ＪＰ−Ａ−１０−２２９８９１）、Ｊｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｍｍｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ５８，  １９１−１９５（１９９８））、ならびに公知の遺伝子学および分子生物学的教書に見出すことができる。突然変異のような上記の手法によって、遺伝子改変された細胞が得られる。
【００６０】
特定の遺伝子の発現を増大するために、例えばエピソーマルプラスミドが使用される。原則として、プラスミドまたはベクターとして、このために当業者に入手可能なすべての実施態様が可能である。このようなプラスミドおよびベクターは、例えばＮｏｖａｇｅｎ，  Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ｏｒ  Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬのパンフレットから推論できる。さらに有利なプラスミドおよびベクターは、以下：Ｇｌｏｖｅｒ，  Ｄ．  Ｍ．（１９８５）ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｖｏｌ．  Ｉ−ＩＩＩ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，  Ｒ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，  Ｄ．  Ｔ（ｅｄｓ）（１９８８）Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，  １７９−２０４，  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，  Ｓｔｏｎｅｈａｍ；Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｄ．  Ｖ．（１９９０）Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８５，  ３−７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．；Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．（１９８９），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに見出すことができる。
【００６１】
次いで、増幅すべき遺伝子を含むプラスミドベクターは、コンジュゲーションまたは形質転換により所望の株に移される。コンジュゲーションの方法は、例えばＳｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６０：７５６−７５９（１９９４）に記載されている。形質転換の方法は，例えばＴｈｉｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９：３５６−３６２（１９８８），  Ｄｕｎｉｃａｎ  ａｎｄ  Ｓｈｉｖｎａｎ，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：１０６７−１０７０（１９８９）およびＴａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２３：３４３−３４７（１９９４）に記載されている。「交叉」事象による相同組換えの後に、得られた株は、該当する遺伝子の少なくとも２つのコピーを含む。
【００６２】
本発明において、酵素の活性の増大は、特に有利には、考慮する酵素をコードする領域のコピー数を、特に強力なプロモーターと共役して野生型細胞と比較して増加させることによって達成され、野生型において既に存在する酵素の場合には、野生型遺伝子中に存在するものと比較して、より強力なプロモーターを使用することによって達成される。
【００６３】
上記および以下の説明に使用される「酵素Ｅｘの、その野生型と比較して増大した活性」という表現は、特定の酵素Ｅｘの活性が有利には少なくとも２倍、特に有利には少なくとも１０倍、さらに有利には少なくとも１００倍、さらになお有利には少なくとも１０００倍および最も有利には少なくとも１００００倍増大することを意味すると常に解釈すべきである。さらに、「酵素Ｅｘの、その野生型と比較して増大した活性」を有する本発明による細胞には、特に、その野生型がこの酵素Ｅｘの活性を有しないかまたは少なくとも検出可能な活性を有しておらず、かつ例えば過剰発現により酵素活性が増大した後にのみ、この酵素Ｅｘの検出可能な酵素活性を示す細胞も含まれる。これに関連して、以下の説明で使用される「過剰発現」という用語または「発現を増大する」という表現には、出発細胞、例えば「野生型細胞」が発現を示さないかまたは少なくとも検出可能な発現を示さず、かつ組換え法によってのみ酵素Ｅｘの検出可能な合成が誘導される場合も含まれる。
【００６４】
所与のポリペプチドの特性および機能の著しい変化を導かない所与のポリペプチド配列のアミノ酸残基の変更は、当業者に周知である。したがって、例えば保存されたアミノ酸を交換することができる。このような適切なアミノ酸置換の例は、以下のものである：アラニンとセリン；アルギニンとリジン；アスパラギンとグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸とグルタミン酸；システインとセリン；グルタミンとアスパラギン；グルタミン酸とアスパラギン酸；グリシンとプロリン；ヒスチジンとアスパラギンまたはグルタミン；イソロイシンとロイシンまたはバリン；ロイシンとメチオニンまたはバリン；リジンとアルギニンまたはグルタミンまたはグルタミン酸；メチオニンとロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンとメチオニンまたはロイシンまたはチロシン；セリンとトレオニン；トレオニンとセリン；トリプトファンとチロシン；チロシンとトリプトファンまたはフェニルアラニン；バリンとイソロイシンまたはロイシン。特にポリペプチドのＮまたはＣ末端における例えばアミノ酸の挿入または欠失の形での変更は、ポリペプチドの機能に著しい影響を及ぼさないことが多いことも公知である。
【００６５】
本発明において使用される酵素と関連する「アミノ酸同一性」は、公知の方法を用いて決定される。一般的に、規定要求事項を考慮したアルゴリズムを用いた特別なコンピュータプログラムが利用される。
【００６６】
同一性を決定するための有利な方法では、最初に、比較すべき配列の間での最大のアライメントが生成される。同一性を決定するためのコンピュータプログラムには、次のものを含むＧＣＧプログラムパッケージが含まれるが、これらに限定されるわけではない：
ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｏｙ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１９８４），３８７頁），  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｗｉ）、ならびにＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１５（１９９０），  ４０３−４１０頁）。ＢＬＡＳＴプログラムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）およびその他の供給元から得ることができる（ＢＬＡＳＴ  Ｈａｎｄｂｕｃｈ，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＮＤ  ２２８９４；上記Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．）。
【００６７】
公知のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同様に、同一性の決定に使用することができる。
【００６８】
「アミノ酸同一性」を決定するための有利なパラメーターは、ＢＬＡＳＴＰプログラムを使用する場合は以下の通りである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１５（１９９０），  ４０３−４１０頁）：
期待閾値：                    １０
ワードサイズ：                ３
マトリックス：                ＢＬＯＳＵＭ６２
ギャップコスト：              存在：１１；伸長：１
構成調整：                    条件付きスコアマトリックス構成調整
上記のパラメーターは、アミノ酸配列比較用のデフォルトパラメーターである。ＧＡＰプログラムも同様に、上記パラメーターを用いた使用に適切である。本発明において、上記アルゴリズムによる６０％の同一性は、６０％同一性を意味する。より高い同一性についても、同一のことが該当する。
【００６９】
酵素の活性は、前記活性を含む細胞を、当業者に公知の方法で、例えばビーズミル、フレンチプレスまたは超音波粉砕機を使用して破砕し、次に無傷細胞、細胞破壊片および破砕助剤、例えばガラスビーズを１１０００×ｇおよび４℃で１０分間遠心分離して除去することにより測定可能である。次に、得られた細胞不含の粗抽出物を使用して酵素アッセイを行い、次いで産生物のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ検出を実施することができる。また、酵素を富化させるか、または当業者に公知の方法でクロマトグラフ法（例えばニッケル−ニトリロ三酢酸アフィニティークロマトグラフィー、ストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー）により精製して均質にすることができる。
【００７０】
些細なことであり万全を期すために述べるにすぎないが、細胞の野生型と比較して増大または減少した活性を測定するために、測定すべき試料と同一の条件に曝された野生型の参照培養物が使用される。
【００７１】
上記のように得られた細胞不含の粗抽出物を使用して、酵素Ｅ１の活性を以下のように決定する：標準のアッセイは、１００μＭの大腸菌ＡＣＰ、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、２００μＭのマロニル−コエンザイムＡ、４０μＭのオクタノイル−コエンザイムＡ（Ｅ１ａの場合）またはドデカノイル−コエンザイムＡ（Ｅ１ｂの場合）、１００μＭのＮＡＤＰＨ、２μｇの大腸菌ＦａｂＤ、２μｇの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＦａｂＨ、１μｇの大腸菌ＦａｂＧ、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）および５μｇの酵素Ｅ５を、最終体積１２０μＬで含有する。ＡＣＰ、β−メルカプトエタノールおよびリン酸ナトリウム緩衝剤を３７℃で３０分間プレインキュベートして、ＡＣＰを完全に減少させる。酵素Ｅ１の添加により反応を開始させる。ＨＣｌを使用してｐＨ２．０に酸性化しておいた２ｍｌの水を使用して反応を停止させ、かつ次に２ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１（ｖ：ｖ））を使用して２回抽出する。相分離を遠心分離（１６１００ｇ、５分、室温）により行う。下方の有機相を除去し、真空遠心分離で完全に蒸発させ、沈殿物を５０μｌのメタノール中にとる。不溶成分を遠心分離（１６１００ｇ、５分、ＲＴ）により沈殿させ、試料をＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにより分析する。相応する質量トレースおよびＭＳ２スペクトルの分析により生成物を同定する。
【００７２】
次に、上記のようにして得られた細胞不含の粗抽出物を使用して、酵素Ｅ２の活性を以下のように決定する：標準的なアッセイは、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１８５μｌ、１２５ｍＭのｄＴＤＰ−ラムノース１０μｌ、および溶解した粗タンパク質抽出物（全タンパク質約１ｍｇ）または精製タンパク質（精製タンパク質５μｇ）５０μｌからなることができる。３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸（Ｅ２ａの場合）または３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸（Ｅ２ｂの場合）の１０ｍＭのエタノール溶液１０μｌの添加により反応を開始し、振盪（６００ｒｐｍ）しながら３０℃で１時間インキュベートする。次に、この反応物を１ｍｌのアセトンと混合する。不溶成分を遠心分離（１６１００ｇ、５分、室温）により沈殿させ、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにより試料を分析する。相応する質量トレースおよびＭＳ２スペクトルの分析により生成物を同定する。
【００７３】
次に、上記のようにして得られた細胞不含の粗抽出物を使用して、酵素Ｅ３の活性を以下のように決定する：標準的なアッセイは、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１８５μｌ、１２５ｍＭのｄＴＤＰ−ラムノース１０μｌ、および溶解した粗タンパク質抽出物（全タンパク質約１ｍｇ）または精製タンパク質（精製タンパク質５μｇ）５０μｌからなることができる。α−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸（Ｅ３ａの場合）またはα−Ｌ−ラムノピラノシル−３−ヒドロキシテトラデカノイル−３−ヒドロキシテトラデカン酸（Ｅ３ｂの場合）の１０ｍＭエタノール溶液１０μｌの添加により反応を開始し、かつ振盪（６００ｒｐｍ）しながら３０℃で１時間インキュベートする。次に、この反応物をアセトン１ｍｌと混合する。不溶成分を遠心分離（１６１００ｇ、５分、室温）により沈殿させ、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにより試料を分析する。相応する質量トレースおよびＭＳ２スペクトルの分析により、生成物を同定する。
【００７４】
本発明による有利な細胞は、該細胞がその野生型と比較して、Ｄ−グルコースおよびキノンからＤ−グルコノ−１，５−ラクトンおよびキノールへの転化を触媒する少なくとも１つの酵素Ｅ４の減少した活性を有するように遺伝子改変されていることにより特徴付けられる。
【００７５】
本発明によれば、Ｅ４がＥＣ１．１．５．２のグルコース１−デヒドロゲナーゼであることが有利である。特に有利な酵素Ｅ４は、
ｇｃｄ遺伝子によりコードされる酵素、および
ｇｃｄ遺伝子によりコードされる酵素に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつｇｃｄ遺伝子によりコードされる酵素の参照配列を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、とりわけ９０％超をなおも有する酵素
から選択される。
【００７６】
特に、酵素Ｅ４は、
ポリペプチド配列ＡＡＮ６７０６６．１を有するか、または
ＡＡＮ６７０６６．１に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつ参照配列ＡＡＮ６７０６６．１を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、とりわけ９０％超をなおも有する
酵素Ｅ４から選択される。
【００７７】
酵素Ｅ１の活性は、Ａｂｃａｍ社製Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（品番ａｂ１０２５３２）を用いて、製造者の要求にしたがって細胞不含抽出物を使用して測定される。
【００７８】
本発明によれば、以下の酵素の組合せ：
Ｅ４、Ｅ１Ｅ４、Ｅ２Ｅ４、Ｅ３Ｅ４、Ｅ１Ｅ２Ｅ４、Ｅ１Ｅ３Ｅ４、Ｅ２Ｅ３Ｅ４およびＥ１Ｅ２Ｅ３Ｅ４の変更された活性を有する細胞が好ましく、このうち、Ｅ２Ｅ４、Ｅ２Ｅ３Ｅ４およびＥ１Ｅ２Ｅ３Ｅ４、特にＥ１Ｅ２Ｅ３Ｅ４の組合せが特に有利である。
【００７９】
本発明による細胞がその野生型と比較して、該細胞から周辺の培地への一般式（Ｉ）のラムノリピドの排出を触媒する少なくとも１つの酵素Ｅ５の増大した活性を有するように遺伝子改変されている場合にさらに有利であり、したがって好ましい。
【００８０】
本発明による有利な細胞の場合には、Ｅ５は、
次のポリペプチド配列：ＡＡＧ０４５２０．１、ＡＪＹ０２９９６．１、ＺＰ＿０５５９０６６１．１、ＹＰ＿４３９２７８．１、ＹＰ＿４４００６９．１、ＺＰ＿０４９６９３０１．１、ＺＰ＿０４５２０２３４．１、ＹＰ＿３３５５２８．１、ＹＰ＿００１０７５８５９．１、ＹＰ＿００１０６１８１７．１、ＺＰ＿０２４８７４９９．１、ＹＰ＿３３７２５１．１、ＺＰ＿０４８９７７１２．１、ＺＰ＿０４８１０１９０．１、ＹＰ＿９９０３２２．１、ＺＰ＿０２４７６９２４．１、ＺＰ＿０４８９９７３５．１、ＺＰ＿０４８９３８７３．１、ＺＰ＿０２３６５９８２．１、ＹＰ＿００１０６２９０９．１、ＹＰ＿１０５６１１．１、ＺＰ＿０３７９４０６１．１、ＺＰ＿０３４５７０１１．１、ＺＰ＿０２３８５４０１．１、ＺＰ＿０２３７０５５２．１、ＹＰ＿１０５２３６．１、ＺＰ＿０４９０５０９７．１、ＹＰ＿７７６３８７．１、ＹＰ＿００１８１１６９０．１、ＹＰ＿００４３４８７３０．１、ＹＰ＿００４３４８７０８．１、ＹＰ＿３７１３２０．１、ＹＰ＿６２３１４５．１、ＹＰ＿００１７７８８１０．１、ＹＰ＿００２２３４９３３．１、ＣＣＥ５２９０９．１、ＹＰ＿００２９０８２４８．１、ＺＰ＿０４９５４５５７．１、ＺＰ＿０４９５６０３８．１、ＺＰ＿０２４０８９５０．１、ＺＰ＿０２３７５８９７．１、ＺＰ＿０２３８９９０８．１、ＹＰ＿４３９２７４．１、ＹＰ＿００１０７４７６２．１、ＹＰ＿３３７２４７．１、ＹＰ＿１１０５５９．１、ＺＰ＿０２４９５９２７．１、ＹＰ＿１１１３６０．１、ＹＰ＿１０５６０８．１、ＺＰ＿０２４８７８２６．１、ＺＰ＿０２３５８９４７．１、ＹＰ＿００１０７８６０５．１、ＺＰ＿００４３８０００．１、ＺＰ＿００４４０９９３．１、ＺＰ＿０２４７７２６０．１、ＹＰ＿３７１３１７．１、ＹＰ＿００１７７８８０７．１、ＺＰ＿０２３８２８４３．１、ＹＰ＿００２２３４９３６．１、ＹＰ＿６２３１４２．１、ＺＰ＿０２９０７６１８．１、ＺＰ＿０２８９１４７８．１、ＹＰ＿７７６３９０．１、ＺＰ＿０４９４３３０８．１、ＹＰ＿００１８１１６９３．１、ＺＰ＿０２５０３９８５．１、ＹＰ＿００４３６２７４０．１、ＹＰ＿００２９０８２４５．１、ＹＰ＿００４３４８７０５．１、ＺＰ＿０２４０８７９８．１、ＺＰ＿０２４１７２５０．１、ＥＧＤ０５１６６．１、ＺＰ＿０２４５８６７７．１、ＺＰ＿０２４６５７９３．１、ＹＰ＿００１５７８２４０．１、ＺＰ＿０４９４４３４４．１、ＹＰ＿７７１９３２．１、ＺＰ＿０２８８９１６６．１、ＹＰ＿００２２３２６１４．１、ＺＰ＿０３５７４８０８．１、ＺＰ＿０２９０６１０５．１、ＹＰ＿００１８０６７６４．１、ＹＰ＿６１９９１２．１、ＹＰ＿００１１１７９１３．１、ＹＰ＿１０６６４７．１、ＹＰ＿００１７６３３６８．１、ＺＰ＿０２４７９５３５．１、ＺＰ＿０２４６１７４３．１、ＹＰ＿５６０９９８．１、ＹＰ＿３３１６５１．１、ＺＰ＿０４８９３０７０．１、ＹＰ＿００３６０６７１４．１、ＺＰ＿０２５０３９９５．１、ＺＰ＿０６８４０４２８．１、ＹＰ＿１０４２８８．１、ＺＰ＿０２４８７８４９．１、ＺＰ＿０２３５３８４８．１、ＹＰ＿３６７４７５．１、ＺＰ＿０２３７７３９９．１、ＺＰ＿０２３７２１４３．１、ＹＰ＿００１８９７５６２．１、ＺＰ＿０２３６１０６６．１、ＹＰ＿４４０５８２．１、ＺＰ＿０３２６８４５３．１、ＡＥＴ９０５４４．１、ＹＰ＿００３９０８７３８．１、ＹＰ＿００４２３００４９．１、ＺＰ＿０２８８５４１８．１、ＣＤＨ７２３１６．１、ＷＰ＿００１２９７０１３．１、ＷＰ＿０１０９５５７７５．１、ＷＰ＿０１０９５５６７１．１、ＷＰ＿０１０９５５６７２．１、ＷＰ＿０１０９５５６７３．１、ＷＰ＿０１０９５２４０１．１、ＷＰ＿０１０９５２４０２．１、ＷＰ＿０１０９５２４０３．１、ＷＰ＿０１０９５２８５５．１、ＷＰ＿０１０９５４５７３．１、ＷＰ＿０１０９５４６３１．１、ＷＰ＿０１０９５４６３２．１、ＷＰ＿０１０９５４４０４．１、ＷＰ＿００４５７５３１０．１もしくはＺＰ＿０２５１１８３１．１を有するか、または
特定の上記のアクセッション番号に対してアミノ酸残基の２５％まで、有利には２０％まで、特に有利には１５％まで、とりわけ１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％までが欠失、挿入、置換もしくはそれらの組合せにより改変されているポリペプチド配列を有し、かつ特に上記アクセッション番号を有する酵素の酵素活性の少なくとも１０％、有利には５０％、特に有利には８０％、特に９０％超をなおも有する
酵素Ｅ５からなる群から選択され、ここで、酵素Ｅ５の酵素活性とは、一般式（Ｉ）のラムノリピドを細胞から周辺培地に排出する能力を意味すると解釈される。
【００８１】
次いで、上記のように得られた細胞不含の粗抽出物を使用して、産生された酵素Ｅ５の量を測定することにより、酵素Ｅ５の活性を決定することができる。これは、バイオマス１単位当たりに、より多くの酵素Ｅ５によって、一般式（Ｉ）のより多くのラムノリピドが細胞から周辺培地に排出され得るという仮定に基づいている。このような定量化は、酵素Ｅ５に特異的な抗体を用いた免疫学的検出により（Ｋｕｒｉｅｎ，  Ｔ．  Ｂ．，  Ｓｃｏｆｉｅｌｄ，  Ｒ．  Ｈ  （Ｅｄｓ．）．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ５３６．  １ｓｔ  Ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ．  Ｎ．Ｙ．  ＵＳＡ，  ２００９参照）またはマススペクトロメトリー法により（Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ａ．，  Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ，  Ｊ．  ＆  Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，  Ｆ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｒｎｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｂｅｌｓ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５，  ４−１５（２００５）参照）実施することができる。
【００８２】
あるいは酵素Ｅ５の活性は、放射線によりラベルしたラムノリピドおよび本発明による細胞から産生された反転小胞を使用して取込みアッセイを実施することによっても決定できる。一般的な方法は、例えばＮｉｅｓ  ＤＨ，  Ｔｈｅ  ｃｏｂａｌｔ，  ｚｉｎｃ，  ａｎｄ  ｃａｄｍｉｕｍ  ｅｆｆｌｕｘ  ｓｙｓｔｅｍ  ＣｚｃＡＢＣ  ｆｒｏｍ  Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｃａｔｉｏｎ−ｐｒｏｔｏｎ  ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９５．  １７７（１０）：２７０７−１２、またはＬｅｗｉｎｓｏｎ  Ｏ，  Ａｄｌｅｒ  Ｊ，  Ｐｏｅｌａｒｅｎｄｓ  ＧＪ，  Ｍａｚｕｒｋｉｅｗｉｃｚ  Ｐ，  Ｄｒｉｅｓｓｅｎ  ＡＪ，  Ｂｉｂｉ  Ｅ．  Ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ＭｄｆＡ  ｃａｔａｌｙｚｅｓ  ｂｏｔｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｅｕｔｒａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００３  Ｆｅｂ  １８；１００（４）：１６６７−７２に記載されている。
【００８３】
本発明による細胞は、ラムノリピドの製造に有利に使用することができる。
【００８４】
したがって本発明は、一般式（Ｉ）の化合物を製造するための本発明による細胞の使用をさらに提供する。
【００８５】
本発明はさらに、ラムノリピド、特に一般式（Ｉ）
［式中、
ｍは、２、１または０、特に１または０であり、
ｎは、１または０、特に１であり、
Ｒ１およびＲ２は、２〜２４個、有利には５〜１３個の炭素原子を有する同一のまたは異なる有機基、特に場合により分岐状の、場合により置換された、特にヒドロキシで置換された、場合により不飽和の、特に場合により一不飽和、二不飽和または三不飽和のアルキル基であり、有利にはペンテニル、ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニルおよびトリデセニルおよび（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ３（ここで、ｏは、１〜２３、有利には４〜１２である）からなる群から選択されるものである］のラムノリピドの製造方法であって、以下の方法工程：
Ｉ）本発明による細胞を、炭素源を含有する培地と接触させる工程、
ＩＩ）前記細胞が前記炭素源からラムノリピドを産生できるような条件下に前記細胞を培養する工程、および
ＩＩＩ）必要に応じて、産生されたラムノリピドを単離する工程
を含む方法を提供する。
【００８６】
本発明による遺伝子改変された細胞を培養培地と接触させて、上記産生物を産生する目的で連続的または非連続的に回分法または流加法でまたは流加法を繰り返すことにより培養することができる。
【００８７】
また、英国特許出願公開第１００９３７０号明細書（ＧＢ−Ａ−１００９３７０）に記載されているような半連続的方法も考え得る。公知の培養法の概要は、Ｃｈｍｉｅｌによる教書（“Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ  １．  Ｅｉｎｆｕｅｈｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ”［Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １．  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］（Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，  １９９１））またはＳｔｏｒｈａｓによる教書（“Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ  ｕｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ  Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ”［Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ］（Ｖｉｅｗｅｇ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，  １９９４））に開示されている。
【００８８】
使用すべき培養培地は、特定の株の要求を適切に満たさねばならない。様々な酵母株の培養培地の説明は、例えば“Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｙｅａｓｔ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”（Ｅｄ．  Ｋｌａｕｓ  Ｗｏｌｆ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ，  １９９６）に含まれる。
【００８９】
使用される炭素源は、炭水化物、例えばグルコース、スクロース、アラビノース、キシロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロースおよびヘミセルロース、植物油および動物油ならびに脂肪、例えば大豆油、紅花油、落花生油、麻実油、ジャトロファ油、ココナッツ脂肪、パンプキンシード油、アマニ油、コーン油、ケシの実油、月見草油、オリーブ油、パーム核油、パーム油、菜種油、ゴマ油、ヒマワリ油、グレープシード油、クルミ油、小麦胚芽油およびココナッツ脂肪、脂肪酸、例えばカプリル酸、カプリン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトール酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、γ−リノレン酸およびそれらのメチルもしくはエチルエステルならびに脂肪酸混合物、前述の脂肪酸を含有するモノ−、ジ−およびトリグリセリド、アルコール、例えばグリセロール、エタノールおよびメタノール、炭化水素、例えばメタン、炭素質ガスおよびガス混合物、例えばＣＯ、ＣＯ２、合成ガスまたは燃焼排ガス、アミノ酸、例えばＬ−グルタメートまたはＬ−バリンまたは有機酸、例えば酢酸であってよい。これらの物質を、個別に使用してもよいし混合物として使用してもよい。特に有利であるのは、米国特許第６，０１，４９４号明細書（ＵＳ  ６，０１，４９４）および米国特許第６，１３６，５７６号明細書（ＵＳ  ６，１３６，５７６）に記載の炭素源としての、炭水化物、特に単糖類、オリゴ糖類または多糖類、ならびに炭化水素、特にアルカン、アルケンおよびアルキンおよびそれらから誘導されるモノカルボン酸および前記モノカルボン酸から誘導されるモノ−、ジ−およびトリグリセリドおよびグリセロールおよびアセテートの使用である。極めて特に有利であるのは、グリセロールと、カプリル酸、カプリン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトール酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸および／またはγ−リノレン酸とのエステル化生成物を含有するモノ−、ジ−およびトリグリセリドである。
【００９０】
本発明の主な利点は、本発明による細胞が、例えばグルコース、スクロースまたはグリセロールといった非常に単純な炭素源からラムノリピドを産生できることであり、このことは、本発明による方法の間に培地中に長鎖炭素源を提供しなくてもよいことを意味する。したがって、入手可能性が不十分である場合には、本発明による方法の工程Ｉ）での培地が、炭素原子６個よりも長い鎖長を有するカルボン酸またはそれらから誘導可能なエステルもしくはグリセリドを含有しないかまたは検出可能な量を含有しないことが有利である。
【００９１】
使用される窒素源は、含窒素有機化合物、例えばペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆粉末および尿素または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム、アンモニア、水酸化アンモニウムまたはアンモニア水であってもよい。窒素源を、個別に使用してもよいし混合物として使用してもよい。
【００９２】
使用されるリン源は、リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有塩であってもよい。さらに、培養培地は、増殖に必要な金属の塩、例えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄を含有すべきである。最後に、上記の物質に加えてアミノ酸およびビタミンのような必須増殖物質を使用してもよい。さらに、適切な前駆物質を培養培地に添加してもよい。上記の出発材料を、１回バッチの形で培養物に添加してもよいし、培養の間に適切に供給してもよい。培養物のｐＨを調整するために、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水、または酸性化合物、例えばリン酸もしくは硫酸が適切に使用される。発泡を調整するために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用することができる。プラスミドの安定性を保持するために、培地に適切な選択物質、例えば抗生物質を添加することができる。好気条件を保持するために、酸素または酸素性ガス混合物、例えば空気が培養物に導入される。
【００９３】
培養物の温度は、通常は２０℃よりも高く、有利には２５℃よりも高く、また４０℃よりも高いこともでき、９５℃の培養温度、とりわけ有利には９０℃および最も有利には８０℃を有利には超えない。
【００９４】
本発明による方法の工程ＩＩＩ）では、細胞により産生されるラムノリピドを、場合により細胞および／または培養培地から単離することができ、その際、単離の目的に使用するために、低分子量物質を複合的組成物から単離するための当業者に公知のあらゆる方法、例えばろ過、抽出、吸着（クロマトグラフィー）または結晶化を使用することができる。
【００９５】
さらに、生成物相は、バイオマスの残留物および様々な不純物、例えば油、脂肪酸およびその他の培養培地成分を含有する。不純物は、有利には無溶媒の方法で除去される。例えば生成物相は、水で希釈してｐＨ調節を容易に行うことができる。次に、酸またはアルカリを用いてｐＨを低下または上昇させてラムノリピドを水溶性の形態に移行させることにより、生成物相と水相とを均質化することができる。恐らく、水相へのラムノリピドの可溶化は、比較的に高温での、例えば６０〜９０℃でのインキュベーションおよび一定の混合により支持することができる。引き続きアルカリまたは酸を用いてｐＨを上昇または低下させることにより、ラムノリピドを再び水に不溶性の形態に移行させることができ、このようにして、これらを容易に水相から分離することができる。次に、生成物相はさらに水で１回以上洗浄して、水溶性の不純物を除去することができる。
【００９６】
油残留物は、例えば適切な溶媒を用いて、有利には有機溶媒を用いる抽出により除去できる。アルカン、例えばｎ−ヘキサンが溶媒として有利である。
【００９７】
上記の無溶媒の方法に代わるものとして、適切な溶媒、例えばエステル、例えば酢酸エチルまたは酢酸ブチルを使用して水相から生成物を除去することができる。記載された抽出工程は、所望の順番で実施することができる。ここでは、溶媒、特に有機溶媒が有利に使用される。有利な溶媒は、ｎ−ペンタノールである。溶媒は、例えば蒸留により除去される。その後、凍結乾燥生成物を例えばクロマトグラフ法によりさらに精製することができる。この点で挙げることができる例には、適切な溶媒を用いた沈殿、適切な溶媒を用いた抽出、例えばシクロデキストリンもしくはシクロデキストリン誘導体による錯体形成、結晶化、クロマトグラフ法による精製もしくは単離、またはラムノリピドを容易に除去可能な誘導体へと移行させることが含まれる。
【００９８】
方法工程ＩＩＩ）での特に適切なラムノリピド単離手法は、以下の部分工程：
Ａ）ラムノリピドを６未満のｐＨを有する水性培地に移す工程、
Ｂ）前記培地を少なくとも１つの有機溶媒と接触させて多相系を得て、そして水相を除去する工程、
Ｃ）ｐＨを６以上のｐＨに上昇させて、多相有機系を得る工程、
Ｄ）ラムノリピドが富化した有機相を除去する工程、および
Ｅ）場合によりラムノリピドをさらに精製する工程
の方法を含む。
【００９９】
方法工程ＩＩＩ）のこの有利な実施態様の実施方法の詳細な説明は、米国特許出願公開第２０１４０１４８５８８号明細書（ＵＳ  ２０１４０１４８５８８）に挙げられている。
【０１００】
本発明は、同様に本発明による方法を用いて得ることができるラムノリピド、特にまた本発明による方法を用いて得ることができる上記ラムノリピド混合物を提供する。
【０１０１】
有利にも、本発明による方法を用いて得ることができるラムノリピドおよび混合物を、洗浄剤において、化粧品または医薬製剤において、および作物保護剤において使用することができる。
【０１０２】
したがって、本発明はさらに、化粧品、皮膚用製剤または医薬製剤、作物保護剤ならびにケア製品および洗浄剤および界面活性剤濃縮物を製造するための、本発明による方法を用いて得られたラムノリピドの使用を提供する。
【０１０３】
以下に提示する例によって本発明を例示により説明するが、本発明は例に明示された実施態様に限定されるものではなく、その適用範囲は、本発明の明細書および特許請求の範囲の全体から明らかである。
【０１０４】
例：
例１（本発明によらない）：株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ＋ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を使用した。
【０１０５】
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ＋ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝の構築
遺伝子ｒｈｌＡ、ｒｈｌＢおよびｒｈｌＣならびに遺伝子ｒｍｌＢ、ｒｍｌＤ、ｒｍｌＡおよびｒｍｌＣ（双方ともＰ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）を異種発現するために、プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を構築した。このプラスミドは、第一に、Ｐ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＤＳＭ  １１２８（配列番号１）由来の遺伝子ｒｈｌＡおよびｒｈｌＢ（ラムノシルトランスフェラーゼ１をコード）ならびにｒｈｌＣ（ラムノシルトランスフェラーゼ２をコード）からなる合成オペロンを含み、第二に、Ｐ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＤＳＭ  １９８８０（配列番号２）由来の遺伝子ｒｍｌＢ（ｄＴＤＰ−Ｄ−グルコース４，６−デヒドラターゼをコード）、ｒｍｌＤ（ｄＴＤＰ−４−デヒドロラムノースレダクターゼをコード）、ｒｍｌＡ（グルコース−１−ホスフェートチミジリルトランスフェラーゼをコード）およびｒｍｌＣ（ｄＴＤＰ−４−デヒドロラムノース３，５−エピメラーゼをコード）からなるオペロンを含む。遺伝子ｒｈｌＡＢＣは、ラムノース誘導性ＰＲｈａプロモーターの制御下にあり、ｒｍｌＢＤＡＣ遺伝子は、アラビノース誘導性ＰＢＡＤプロモーターの制御下にある。２つのオペロン構造の下流には、ターミネーター配列（ｒｒｎＢ  Ｔ１Ｔ２）が位置している。ｒｍｌＢＤＡＣ遺伝子を、Ｐ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＤＳＭ  １９８８０由来のゲノムＤＮＡから増幅し、かつ合成ｒｈｌＡＢＣオペロンを遺伝子合成により得た。ＰＲｈａプロモーターカセット（配列番号３）およびＰＢＡＤプロモーターカセット（配列番号４）ならびにターミネーター配列（配列番号５）をゲノム大腸菌ＤＮＡから増幅した。ジラムノリピドの合成にはｒｈｌＡＢＣ遺伝子が必要であるのに対して、活性化されたｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノースの提供にはｒｍｌＢＤＡＣ遺伝子が必要である。
【０１０６】
ベクターは、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）をベースとし、かつ大腸菌内で複製するためのｐ１５Ａ複製起点とＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）内で複製するためのｐＶＳ１複製起点とを有する。ｐＶＳ１複製起点を、シュードモナスプラスミドｐＶＳ１から増幅させた（Ｉｔｏｈ  Ｙ，  Ｗａｔｓｏｎ  ＪＭ，  Ｈａａｓ  Ｄ，  Ｌｅｉｓｉｎｇｅｒ  Ｔ，  Ｐｌａｓｍｉｄ  １９８４，  １１（３），  ２０６−２０）。ベクター部分およびＤＮＡ断片を、市販のイン・ビトロＤＮＡアセンブリキットを（例えばＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを製造者（ＮＥＢ；フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）の指示書にしたがって）使用してクローニングした。大腸菌１０  ｂｅｔａケミカルコンピテントセル（ＮＥＢ；フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）を、当業者に公知の方法で形質転換した。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析によりチェックし、導入された相同領域の信頼性をＤＮＡシーケンシングにより確認した。得られたプラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝（配列番号６）のサイズは、１７３３７塩基対である。
【０１０７】
その後、このプラスミドを、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐに導入した。この株を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）内でマーカーレス遺伝子欠失を構築するための出発株として使用する（Ｇｒａｆ  ＆  Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ，  ２０１１，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ  ７７，  Ｎｏ．  １５，  ５５４９−５５５２，  ＤＯＩ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０５０５５−１１）。この方法は、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）に対するネガティブカウンターセレクション系に基づいており、これは、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの活性および代謝拮抗剤５−フルオロウラシルに対するＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）の感受性を利用する。ｕｐｐ遺伝子の欠失は、ラムノリピド生合成に影響を与えない。ベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を用いたＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐの形質転換を、Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｗａｓａｋｉ  Ｋ，  Ｕｃｈｉｙａｍａ  Ｈ，  Ｙａｇｉ  Ｏ，  Ｋｕｒａｂａｙａｓｈｉ，  Ｔ，  Ｉｓｈｉｚｕｋａ  Ｋ，  Ｔａｋａｍｕｒａ  Ｙ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９４．  ５８（５）：８５１−８５４）に記載の通りに実施した。１０クローンそれぞれからプラスミドＤＮＡを単離して分析した。このプラスミドを有する株を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝と称した。
【０１０８】
バイオテクノロジーによる界面活性剤の製造を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製の８重並行発酵系「ＤＡＳＧＩＰ」において実施した。
【０１０９】
発酵のために、１Ｌ反応器を使用した。ｐＨプローブを、ｐＨ４．０およびｐＨ７．０の測定溶液を用いた２点校正により校正した。反応器に３００ｍＬの水を充填し、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理して、確実に無菌状態となるようにした。翌朝、クリーンベンチ内で水を取り除き、無菌発酵培地と取り換えた（オートクレーブ処理済み：２．２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、別個に滅菌済み：２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｍＬ／Ｌの微量元素溶液Ｍ１２［滅菌ろ過済み：０．２ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／Ｌのクエン酸三ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ／ＬのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．００３ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、１ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ］）。引き続き、ｐＯ２プローブを１点校正により校正し（撹拌機：６００ｒｐｍ／通気：１０ｓＬ／ｈ空気）、フィード、校正剤および誘導剤のラインを定置洗浄により洗浄した。このために、チューブを７０％エタノールで洗い流し、次に１ＭのＮａＯＨで、次に滅菌した脱塩水で洗浄し、最後に特定の培地を充填した。
【０１１０】
凍結培養物から得た１００μＬを使用し、株（Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ＋ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝をまず、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンの入った２５０ｍＬバッフル付フラスコ内のＬＢ１培地（１０ｇ／Ｌのカゼイン加水分解物、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１ｇ／ＬのＮａＣｌ）２５ｍＬ中で、一晩３０℃、２００ｒｐｍで約１８時間増殖させた。この培養物の光学密度を測定した後に、５００ｍＬのバッフル付フラスコ内の滅菌シード培地５０ｍＬ（オートクレーブ処理済み：４．４ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、別個に滅菌済み：２０ｇ／Ｌのグルコース、０．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００６ｇ／ＬのＦｅＣｌ３、０．０１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２、１ｍＬ／Ｌの微量元素溶液ＳＬ６［滅菌ろ過済み：０．３ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、０．２ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／ＬのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ／ＬのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ］）を、０．２の開始ＯＤ６００を使用してＬＢ予備培養物から植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで約７時間インキュベートした。およそ８の光学密度ＯＤ６００で、主要な培養物を０．７の開始ＯＤ６００を使用して植菌した。
【０１１１】
０．７の光学密度を使用して反応器に植菌するために、約２６ｍＬを３０ｍＬシリンジ内に充填し、セプタムを通して針により反応器に植菌した。
【０１１２】
以下の標準プログラムを使用した：
【表１】
2019532088.tif 000004
【０１１３】
アンモニア（１２．５％）を使用して、ｐＨを一方的にｐＨ７．０に調節した。培養およびバイオトランスフォーメーションの間に、培養物中の溶存酸素を、撹拌機速度および通気速度により３０％で一定に保持した。発酵をフェドバッチとして実施し、その際、供給開始から、５００ｇ／Ｌのグルコース供給による２．５ｇ／Ｌｈグルコースの供給を、ＤＯピークをトリガとして行った。組換えにより導入された遺伝子の発現を、０．２％（ｗ／ｖ）ラムノースおよび０．２％（ｗ／ｖ）アラビノースの自動的な添加により供給開始の３時間後に誘導した。誘導糖の必要量は、発酵開始体積に基づく。双方の糖に、２２０ｇ／Ｌのストック溶液を使用した。誘導の時点から界面活性剤の生成が始まった。ｐＨ、ＤＯ、ＣＴＲ、ＯＴＲ、また基質、例えばｐＨ調節用のアンモニア溶液の流量および量、グルコース供給または誘導剤の流量といったすべてのオンライン測定データを、ＤＡＳＧＩＰ発酵系により記録した。
【０１１４】
発酵分析のために、１０ｍＬシリンジを使用して、２ｍＬを初留分として各容器から引き出し、かつ廃棄した。これに続いて、実際の分析用にもう一度６ｍＬを反応器から取り出した。ラムノリピド含有量を求めた。発酵を６５時間後に終了させた。
【０１１５】
ＨＰＬＣを用いてラムノリピド濃度を求めた。１００μＬの発酵試料をエッペンドルフチューブ内で９００μＬの７０％（ｖ／ｖ）ｎ−プロパノールと混合し、レッチェミル内で３０Ｈｚで１分間振盪させた。その後、この試料を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を新たなエッペンドルフチューブに移した。さらなる希釈が必要な場合には、これを５５％ｎ−プロパノールを使用して行った。すべてのチューブを即座に閉鎖して、蒸発を回避した。次に、この試料をＨＰＬＣバイアルに移し、測定するまで−２０℃で貯蔵した。
【０１１６】
容積式ピペット（Ｃｏｍｂｉｔｉｐ）を使用して２ｍｌ反応チューブに１ｍｌのアセトンを充填し、この反応チューブを即座に閉鎖して蒸発を最小限にした。これに続いて、１ｍｌの培養ブロスを添加した。この培養ブロス／アセトン混合物をボルテックス処理した後に、この混合物を１３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、８００μｌの上澄み液をＨＰＬＣバイアルに移した。蒸発光散乱検出器（Ｓｅｄｅｘ  ＬＴ−ＥＬＳＤ  Ｍｏｄｅｌ  ８５ＬＴ）をラムノリピドの検出および定量化に使用した。実際の測定は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２００  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ社、カルフォルニア）およびＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ８  Ｒａｐｉｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（４．６×１５０ｍｍ、３．５μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ社）を使用して実施した。注入体積は５μｌであり、本方法の実施時間は２０分であった。水性０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸、溶液Ａ）およびメタノール（溶液Ｂ）を移動相として使用した。カラム温度は４０℃であった。ＥＬＳＤ（検出器温度６０℃）およびＤＡＤ（ダイオードアレイ、２１０ｎｍ）を検出器として利用した。本方法で使用した勾配は、次の通りであった：
【表２】
2019532088.tif 000005
【０１１７】
３つの実験を、それぞれ例２と並行して行った。
【０１１８】
６５時間後に測定した全ＲＬ濃度：３４ｇ／Ｌ。
【０１１９】
算定空時収率：０．５３ｇ／Ｌ・ｈ。
【０１２０】
例２（本発明による）
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇａｌＰ＿Ｅｃ＋ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝｛ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ｝｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を使用した。
【０１２１】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ中にｇａｌＰ遺伝子を挿入するためのベクターの構築
ガラクトース−Ｈ＋シンポーターＧａｌＰをコードする大腸菌Ｋ１２由来のｇａｌＰ遺伝子を挿入するためのベクターを、遺伝子のＰＣＲ増幅により調製する。使用したテンプレートは、大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡである。ｇａｌＰ遺伝子を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ内で、ＡＢＣトランスポーターパーミアーゼ、ＡＢＣトランスポーター結合タンパク質およびＡＢＣトランスポーターＡＴＰ結合タンパク質をコードする遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８と交換することを目的とする。このために、遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８の上流および下流の約６８０塩基対をＰＣＲにより増幅する。
【０１２２】
以下のプライマーをｇａｌＰ遺伝子の増幅に使用した：
ＰＣＲ１：ｇａｌＰ
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０７  ５’−ＣＣＡＡＴＡＣＡＴＧＣＣＴＧＡＣＧＣＴＡＡＡＡＡＡＣＡ−３’（配列番号７）
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊１０  ５’−ＴＡＧＡＣＧＡＧＴＴＡＡＴＣＧＴＧＡＧＣＧＣＣＴＡＴＴＴ−３’（配列番号８）。
【０１２３】
以下のプライマーをＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８遺伝子の上流および下流の相同領域の増幅に使用した：
ＰＣＲ２：ＰＰ＿１０１６の上流領域
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０３  ５’−ＧＣＣＧＣＴＴＴＧＧＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＣＡＴＴＡＡＣ−３’（配列番号９）
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０８  ５’−ＴＣＡＧＧＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＴＡＧＴ−３’（配列番号１０）
ＰＣＲ３：ＰＰ＿１０１８の下流領域
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０２  ５’−ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１１）
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０９  ５’−ＣＧＡＴＴＡＡＣＴＣＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴＡＡ−３’（配列番号１２）。
【０１２４】
以下のパラメーターをＰＣＲに使用した：
変性：            ９８℃        ３０秒
変性：            ９８℃        １０秒            ３０ｘ
アニーリング：    ６２℃        １２秒            ３０ｘ
伸長：            ７２℃        ２２秒            ３０ｘ
最終伸長：        ７２℃        ５分。
【０１２５】
増幅には、ＮＥＢ社（フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）製Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを製造者の推奨にしたがって使用した。次に、ＰＣＲ反応物各５０μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲル上で溶解させた。ＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡの臭化エチジウム染色およびＰＣＲ断片サイズの決定を、当業者に公知の方法で実施する。予測されるサイズのＰＣＲ断片（ＰＣＲ１、１４１０塩基対、（配列番号１３）；ＰＣＲ２、６７５塩基対（配列番号１４）；ＰＣＲ３、６９７塩基対（配列番号１５））を増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ社製“ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ”を使用して製造者の規定通りに精製した。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを製造者（ＮＥＢ；フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）の指示書にしたがって使用し、精製したＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ−およびＳｂｆＩ−ｃｕｔ  ｐＫＯＰｐベクターにクローニングした（配列番号１６）。大腸菌１０  ｂｅｔａケミカルコンピテントセル（ＮＥＢ、フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）を、当業者に公知の方法で形質転換した。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析によりチェックし、導入された相同領域の信頼性をＤＮＡシーケンシングにより確認した。得られたノックアウトベクターを、ｐＫＯ＿ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８：：ｇａｌＰ（配列番号１７）と称した。
【０１２６】
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇａｌＰ＿Ｅｃの構築
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇａｌＰ＿Ｅｃの構築を、プラスミドｐＫＯ＿ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８：：ｇａｌＰおよびＧｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１（Ｇｒａｆ  Ｎ，  Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ  Ｊ，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，  ２０１１  ，  ７７（１５）：５５４９；ＤＯＩ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０５０５５−１１）に記載の方法を用いて実施した。遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８をｇａｌＰに交換した後のＤＮＡ配列は、配列番号１８に記載されている。ベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を用いたＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ΡΡ＿１０１６−１０１８］：：ｇａｌＰ＿Ｅｃの形質転換を、Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｗａｓａｋｉ  Ｋ，  Ｕｃｈｉｙａｍａ  Ｈ，  Ｙａｇｉ  Ｏ，  Ｋｕｒａｂａｙａｓｈｉ，  Ｔ，  Ｉｓｈｉｚｕｋａ  Ｋ，  Ｔａｋａｍｕｒａ  Ｙ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９４．  ５８（５）：８５１−８５４）に記載の通りに実施した。その後、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢアガープレートに細胞を播種した。プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝（配列番号６）は、既に例１に記載されている。１０クローンそれぞれからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析を用いて分析した。このプラスミドを有する株を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇａｌＰ＿Ｅｃ  ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝｛ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ｝｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝と称した。技術的な具現化を、例１に記載の通りに実施した。
【０１２７】
３つの実験を、それぞれ例１と並行して行った。
【０１２８】
６４時間後に測定した全ＲＬ濃度：４４．５ｇ／Ｌ。
【０１２９】
算定空時収率：０．７０ｇ／Ｌ・ｈ。
【０１３０】
例３（本発明による）
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｆ＿Ｚｍ（ｃｏ＿Ｐｐ）＋ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を使用する。
【０１３１】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐにｇｌｆ遺伝子を挿入するためのベクターの構築
グルコースファシリテーターＧｌｆをコードするザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）由来のｇｌｆ遺伝子を挿入するためのベクターを、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０に最適化された遺伝子コドンのＰＣＲ増幅により調製する。合成ＤＮＡ断片をテンプレートとして使用する。ｇｌｆ遺伝子を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ内で、ＡＢＣトランスポーターパーミアーゼ、ＡＢＣトランスポーター結合タンパク質およびＡＢＣトランスポーターＡＴＰ結合タンパク質をコードする遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８と交換することを目的とする。このために、遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８の上流および下流の約６９０塩基対をＰＣＲにより増幅する。
【０１３２】
以下のプライマーをｇｌｆ遺伝子の増幅に使用する：
ＰＣＲ４：ｇｌｆ
ＭＷ＿１８＿０２  ５’−ＴＡＣＣＴＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＴＡＣＡＴＧＴＣＣＡＧＣＧＡＧＴＣＧＴＣＣＣＡＧ−３’（配列番号１９）
ＭＷ＿１８＿０３  ５’−ＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＡＧＣＧＣＣＡＣＡＴＣ−３’（配列番号２０）。
【０１３３】
以下のプライマーをＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８遺伝子の上流および下流の相同領域の増幅に使用する：
ＰＣＲ５：ＰＰ＿１０１６の上流領域
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０３  ５’−ＧＣＣＧＣＴＴＴＧＧＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＣＡＴＴＡＡＣ−３’（配列番号９）
ＭＷ＿１８＿０１  ５’−ＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＴＡＧ−３’（配列番号２１）
ＰＣＲ６：ＰＰ＿１０１８の下流領域
ＭＷ＿１８＿０４  ５’−ＧＣＴＣＧＣＡＧＡＡＧＴＡＡＣＡＡＴＡＣＣＴＣＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号２２）
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０２  ５’−ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１１）。
【０１３４】
以下のパラメーターをＰＣＲに使用する：
変性：            ９８℃        ３０秒
変性：            ９８℃        １０秒            ３０ｘ
アニーリング：    ６２℃        １２秒            ３０ｘ
伸長：            ７２℃        ２２秒            ３０ｘ
最終伸長：        ７２℃        ５分。
【０１３５】
増幅には、ＮＥＢ社（フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）製Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを製造者の推奨にしたがって使用する。次に、ＰＣＲ反応物それぞれ５０μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲル上で溶解させる。ＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡの臭化エチジウム染色およびＰＣＲ断片サイズの決定を、当業者に公知の方法で実施する。予測されるサイズのＰＣＲ断片（ＰＣＲ４（配列番号２３）、１４４０塩基対；ＰＣＲ５（配列番号２４）、６７０塩基対；ＰＣＲ６（配列番号２５）、７１０塩基対）を増幅する。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ社製“ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ”を使用して製造者の規定通りに精製する。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを製造者（ＮＥＢ；フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）の指示書にしたがって使用し、精製したＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ−およびＳｂｆＩ−ｃｕｔ  ｐＫＯＰｐベクターにクローニングする（配列番号１６）。大腸菌１０  ｂｅｔａケミカルコンピテントセル（ＮＥＢ、フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）を、当業者に公知の方法で形質転換する。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析によりチェックし、導入された相同領域の信頼性をＤＮＡシーケンシングにより確認する。得られたノックアウトベクターを、ｐＫＯ＿ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８：：ｇｌｆ＿Ｚｍ（ｃｏ＿Ｐｐ）（配列番号２６）と称する。
【０１３６】
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｆ＿Ｚｍ（ｃｏ＿Ｐｐ）の構築
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｆ＿Ｚｍ（ｃｏ＿Ｐｐ）の構築を、プラスミドｐＫＯ＿ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８：：ｇｌｆ＿Ｚｍ（ｃｏ＿Ｐｐ）およびＧｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１（Ｇｒａｆ  Ｎ，  Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ  Ｊ，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，  ２０１１，７７（１５）：５５４９；ＤＯＩ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０５０５５−１１）に記載の方法を用いて行う。ｇｌｆで遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８を交換した後のＤＮＡ配列は、配列番号２７に記載されている。ベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を用いたＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ΡΡ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｆ＿Ｚｍ（ｃｏ＿Ｐｐ）の形質転換を、Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｗａｓａｋｉ  Ｋ，  Ｕｃｈｉｙａｍａ  Ｈ，  Ｙａｇｉ  Ｏ，  Ｋｕｒａｂａｙａｓｈｉ，  Ｔ，  Ｉｓｈｉｚｕｋａ  Ｋ，  Ｔａｋａｍｕｒａ  Ｙ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９４．  ５８（５）：８５１−８５４）に記載の通りに実施する。その後、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢアガープレートに細胞を播種する。プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝（配列番号６）は、既に例１に記載されている。１０クローンそれぞれからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析を用いて分析する。このプラスミドを有する株を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｆ＿Ｚｍ（ｃｏ＿Ｐｐ）ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝と称する。技術的な具現化を、例１に記載の通りに実施した。
【０１３７】
３つの実験を、それぞれ例１と並行して行う。
【０１３８】
例１と比較して、６４時間後の著しくより高い全ＲＬ濃度および著しくより高い算定空時収率が観察される。
【０１３９】
例４（本発明による）
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：［ｐｔｓＨ＿Ｅｃ  ｐｔｓｌ＿Ｅｃ  ｃｒｒ＿Ｅｃ  ｐｔｓＧ＿Ｅｃ］＋ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を使用する。
【０１４０】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ  ２４４０  Δｕｐｐ中にｐｔｓ遺伝子を挿入するためのベクターの構築
ホスホエノールピルベートホスホトランスフェラーゼ系ＰＥＰ−ＰＴＳをコードする大腸菌Ｋ１２由来のｐｔｓ遺伝子を挿入するためのベクターを、遺伝子ｐｔｓＨ、ｐｔｓｌ、ｃｒｒおよびｐｔｓＧのＰＣＲ増幅により調製する。ｐｔｓＨは、ホスホキャリアータンパク質ＨＰｒをコードし、ｐｔｓｌは、ＰＴＳ酵素Ｉをコードし、ｃｒｒは、酵素ＩＩＡＧｌｃをコードし、かつｐｔｓＧは、グルコース特異的ＰＴＳ酵素ＩＩＢＣをコードする。使用したテンプレートは、大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡである。ＰＴＳ系を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ内で、ＡＢＣトランスポーターパーミアーゼ、ＡＢＣトランスポーター結合タンパク質およびＡＢＣトランスポーターＡＴＰ結合タンパク質をコードする遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８と交換することを目的とする。このために、遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８の上流および下流の約６９０塩基対をＰＣＲにより増幅する。
【０１４１】
以下のプライマーをＰＴＳ遺伝子の増幅に使用する：
ＰＣＲ７：オペロンｐｔｓＨ／ｐｔｓｌ／ｃｒｒ
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊２３  ５’−ＴＣＣＡＡＴＡＣＡＴＧＴＴＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＡＣＣ−３’（配列番号２８）
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊２２  ５’−ＣＣＴＧＡＧＴＴＴＡＣＴＴＣＴＴＧＡＴＧＣＧＧＡＴＡＡＣＣ−３’（配列番号２９）
ＰＣＲ８：ｐｔｓＧ
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊２１  ５’−ＡＧＡＡＧＴＡＡＡＣＴＣＡＧＧＡＧＣＡＣＴＣＴＣＡＡＴＴ−３’（配列番号３０）
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊２６  ５’−ＡＧＡＣＧＡＧＴＴＡＧＴＧＧＴＴＡＣＧＧＡＴＧＴＡＣＴＣ−３’（配列番号３１）。
【０１４２】
以下のプライマーをＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８遺伝子の上流および下流の相同領域の増幅に使用する：
ＰＣＲ９：ＰＰ＿１０１６の上流領域
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０３  ５’−ＧＣＣＧＣＴＴＴＧＧＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＣＡＴＴＡＡＣ−３’（配列番号９）
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊２４  ５’−ＧＧＡＡＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＴＡＧＴＧ−３’（配列番号３２）
ＰＣＲ１０：ＰＰ＿１０１８の下流領域
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊２５  ５’−ＡＣＣＡＣＴＡＡＣＴＣＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴＡＡＧ−３’（配列番号３３）
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０２  ５’−ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１１）。
【０１４３】
以下のパラメーターをＰＣＲに使用する：
変性：            ９８℃        ３０秒
変性：            ９８℃        １０秒            ３０ｘ
アニーリング：    ６２℃        １２秒            ３０ｘ
伸長：            ７２℃        ２２秒            ３０ｘ
最終伸長：        ７２℃        ５分。
【０１４４】
増幅には、ＮＥＢ社（フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）製Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを製造者の推奨にしたがって使用する。次に、ＰＣＲ反応物それぞれ５０μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲル上で溶解させる。ＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡの臭化エチジウム染色およびＰＣＲ断片サイズの決定を、当業者に公知の方法で実施する。予測されるサイズのＰＣＲ断片（ＰＣＲ７（配列番号３４）、２５９５塩基対；ＰＣＲ８（配列番号３５）、１４６９塩基対；ＰＣＲ９（配列番号３６）、６７４塩基対；ＰＣＲ１０（配列番号３７）、６９８塩基対）を増幅する。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ社製“ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ”を使用して製造者の規定通りに精製する。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを製造者（ＮＥＢ；フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）の指示書にしたがって使用し、精製したＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ−およびＳｂｆＩ−ｃｕｔ  ｐＫＯＰｐベクターにクローニングする（配列番号１６）。大腸菌１０ｂｅｔａケミカルコンピテントセル（ＮＥＢ、フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）を、当業者に公知の方法で形質転換する。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析によりチェックし、導入された相同領域の信頼性をＤＮＡシーケンシングにより確認する。得られたノックアウトベクターを、ｐＫＯ＿ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８：：ｐｔｓＨ＿Ｅｃ  ｐｔｓｌ＿Ｅｃ  ｃｒｒ＿Ｅｃ  ｐｔｓＧ＿Ｅｃ）（配列番号３８）と称する。
【０１４５】
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｐｔｓＨ＿Ｅｃ  ｐｔｓｌ＿Ｅｃ  ｃｒｒ＿Ｅｃ  ｐｔｓＧ＿Ｅｃの構築
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｐｔｓＨ＿Ｅｃ  ｐｔｓｌ＿Ｅｃ  ｃｒｒ＿Ｅｃ  ｐｔｓＧ＿Ｅｃの構築を、プラスミドｐＫＯ＿ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８：：ｐｔｓＨ＿Ｅｃ  ｐｔｓｌ＿Ｅｃ  ｃｒｒ＿Ｅｃ  ｐｔｓＧ＿ＥｃおよびＧｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１（Ｇｒａｆ  Ｎ，  Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ  Ｊ，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，  ２０１１  ，  ７７（１５）：５５４９；ＤＯＩ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０５０５５−１１）に記載の方法を用いて実施する。遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８をｐｔｓＨ＿Ｅｃ  ｐｔｓｌ＿Ｅｃ  ｃｒｒ＿Ｅｃ  ｐｔｓＧ＿Ｅｃに交換した後のＤＮＡ配列は、配列番号３９に記載されている。ベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を用いたＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｐｔｓＨ＿Ｅｃ  ｐｔｓｌ＿Ｅｃ  ｃｒｒ＿Ｅｃ  ｐｔｓＧ＿Ｅｃの形質転換を、Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｗａｓａｋｉ  Ｋ，  Ｕｃｈｉｙａｍａ  Ｈ，  Ｙａｇｉ  Ｏ，  Ｋｕｒａｂａｙａｓｈｉ，  Ｔ，  Ｉｓｈｉｚｕｋａ  Ｋ，  Ｔａｋａｍｕｒａ  Ｙ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９４．  ５８（５）：８５１−８５４）に記載の通りに実施する。その後、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢアガープレートに細胞を播種する。プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝（配列番号６）は、既に例１に記載されている。１０クローンそれぞれからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析を用いて分析する。このプラスミドを有する株を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：［ｐｔｓＨ＿Ｅｃ  ｐｔｓｌ＿Ｅｃ  ｃｒｒ＿Ｅｃ  ｐｔｓＧ＿Ｅｃ］  ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝と称する。技術的な具現化を、例１に記載の通りに実施する。
【０１４６】
３つの実験を、それぞれ例１と並行して行う。
【０１４７】
例１と比較して、６４時間後の著しくより高い全ＲＬ濃度および著しくより高い算定空時収率が観察される。
【０１４８】
例５（本発明による）
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｕＰ＿Ｂａｂ＋ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を使用する。
【０１４９】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  ΔｕｐｐにｇｌｕＰ遺伝子を挿入するためのベクターの構築
グルコース／ガラクトーストランスポーターＧｌｕＰをコードするブルセラ・アボルツス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）由来のｇｌｕＰ遺伝子を挿入するためのベクターを、遺伝子のＰＣＲ増幅により調製する。使用したテンプレートは、合成ＤＮＡ断片である。ｇｕｌＰ遺伝子を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ内で、ＡＢＣトランスポーターパーミアーゼ、ＡＢＣトランスポーター結合タンパク質およびＡＢＣトランスポーターＡＴＰ結合タンパク質をコードする遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８と交換することを目的とする。このために、遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８の上流および下流の約６８０塩基対をＰＣＲにより増幅する。
【０１５０】
以下のプライマーをｇｌｕＰ遺伝子の増幅に使用する：
ＰＣＲ１１：ｇｌｕＰ
ＭＷ＿１８＿０５  ５’−ＴＡＣＣＴＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＴＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＴＴＣＣＡＴＣＣＣＡＡＣ−３’（配列番号４０）
ＭＷ＿１８＿０６  ５’−ＴＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＧＡＴＧＡＧ−３’（配列番号４１）。
【０１５１】
以下のプライマーをＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８遺伝子の上流および下流の相同領域の増幅に使用する：
ＰＣＲ５：ＰＰ＿１０１６の上流領域
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０３  ５’−ＧＣＣＧＣＴＴＴＧＧＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＣＡＴＴＡＡＣ−３’（配列番号９）
ＭＷ＿１８＿０１  ５’−ＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＴＡＧ−３’（配列番号２１）。
ＰＣＲ１２：ＰＰ＿１０１８の下流領域
ＭＷ＿１８＿０７  ５’−ＴＣＡＴＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号４２）
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０２  ５’−ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１１）。
【０１５２】
以下のパラメーターをＰＣＲに使用する：
変性：            ９８℃        ３０秒
変性：            ９８℃        １０秒            ３０ｘ
アニーリング：    ６２℃        １２秒            ３０ｘ
伸長：            ７２℃        ２２秒            ３０ｘ
最終伸長：        ７２℃        ５分。
【０１５３】
増幅には、ＮＥＢ社（フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）製Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを製造者の推奨にしたがって使用する。次に、ＰＣＲ反応物それぞれ５０μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲル上で溶解させる。ＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡの臭化エチジウム染色およびＰＣＲ断片サイズの決定を、当業者に公知の方法で実施する。予測されるサイズのＰＣＲ断片（ＰＣＲ１１（配列番号４３）、１２５７塩基対；ＰＣＲ５（配列番号２４）、６７０塩基対；ＰＣＲ１２（配列番号４４）、７１０塩基対）を増幅する。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ社製“ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ”を使用して製造者の規定通りに精製する。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを製造者（ＮＥＢ；フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）の指示書にしたがって使用し、精製したＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ−およびＳｂｆＩ−ｃｕｔ  ｐＫＯＰｐベクターにクローニングする（配列番号１６）。大腸菌１０  ｂｅｔａケミカルコンピテントセル（ＮＥＢ、フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）を、当業者に公知の方法で形質転換する。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析によりチェックし、導入された相同領域の信頼性をＤＮＡシーケンシングにより確認する。得られたノックアウトベクターを、ｐＫＯ＿ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８：：ｇｌｕＰ＿Ｂａｂ（配列番号４５）と称する。
【０１５４】
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｕＰ＿Ｂａｂの構築
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｕＰ＿Ｂａｂの構築を、プラスミドｐＫＯ＿ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８：：ｇｌｕＰ＿ＢａｂおよびＧｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１（Ｇｒａｆ  Ｎ，  Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ  Ｊ，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，  ２０１１，  ７７（１５）：５５４９；ＤＯＩ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０５０５５−１１）に記載の方法を用いて実施する。ｇｌｕＰで遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８を交換した後のＤＮＡ配列は、配列番号４６に記載されている。ベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を用いたＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｕＰ＿Ｂａｂの形質転換を、Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｗａｓａｋｉ  Ｋ，  Ｕｃｈｉｙａｍａ  Ｈ，  Ｙａｇｉ  Ｏ，  Ｋｕｒａｂａｙａｓｈｉ，  Ｔ，  Ｉｓｈｉｚｕｋａ  Ｋ，  Ｔａｋａｍｕｒａ  Ｙ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９４．  ５８（５）：８５１−８５４）に記載の通りに実施する。その後、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢアガープレートに細胞を播種する。プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝（配列番号６）は、既に例１に記載されている。１０クローンそれぞれからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析を用いて分析する。このプラスミドを有する株を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｕＰ＿Ｂａｂ  ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝と称する。技術的な具現化を、例１に記載の通りに実施する。
【０１５５】
３つの実験を、それぞれ例１と並行して行う。
【０１５６】
例１と比較して、６４時間後の著しくより高い全ＲＬ濃度および著しくより高い算定空時収率が観察される。
【０１５７】
例６（本発明による）
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｉｏｌＴ１＿Ｃｇ（ｃｏ＿Ｐｐ）＋ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を使用する。
【０１５８】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ中にｉｏｌＴ１遺伝子を挿入するためのベクターの構築
ミオイノシトールファシリテーターＩｏｌＴ１をコードするコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ  １３０３２由来のｉｏｌＴ１遺伝子を挿入するためのベクターを、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０にコドン最適化された遺伝子のＰＣＲ増幅により調製する。合成ＤＮＡ断片をテンプレートとして使用する。ｉｏｌＴ１遺伝子を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ内で、ＡＢＣトランスポーターパーミアーゼ、ＡＢＣトランスポーター結合タンパク質およびＡＢＣトランスポーターＡＴＰ結合タンパク質をコードする遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８と交換することを目的とする。このために、遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８の上流および下流の約６８０塩基対をＰＣＲにより増幅する。
【０１５９】
以下のプライマーをｉｏｌＴ１遺伝子の増幅に使用する：
ＰＣＲ１３：ｉｏｌＴ１
ＭＷ＿１８＿０８  ５’−ＴＡＣＣＴＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＴＡＣＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＣＧＡＣＡＧ−３’（配列番号４７）
ＭＷ＿１８＿０９  ５’−ＴＣＡＡＴＧＧＡＣＣＴＴＧＣＣＣＴＴＧＣＧＡＡＴＧ−３’（配列番号４８）。
【０１６０】
以下のプライマーをＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８遺伝子の上流および下流の相同領域の増幅に使用する：
ＰＣＲ５：ＰＰ＿１０１６の上流領域
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０３  ５’−ＧＣＣＧＣＴＴＴＧＧＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＣＡＴＴＡＡＣ−３’（配列番号９）
ＭＷ＿１８＿０１  ５’−ＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＴＡＧ−３’（配列番号２１）。
ＰＣＲ１４：ＰＰ＿１０１８の下流領域
ＭＷ＿１８＿１０  ５’−ＧＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＴＣＣＡＴＴＧＡＣＴＣＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号４９）
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０２  ５’−ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１１）。
【０１６１】
以下のパラメーターをＰＣＲに使用する：
変性：            ９８℃        ３０秒
変性：            ９８℃        １０秒            ３０ｘ
アニーリング：    ６２℃        １２秒            ３０ｘ
伸長：            ７２℃        ２２秒            ３０ｘ
最終伸長：        ７２℃        ５分。
【０１６２】
増幅には、ＮＥＢ社（フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）製Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを製造者の推奨にしたがって使用する。次に、ＰＣＲ反応物それぞれ５０μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲル上で溶解させる。ＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡの臭化エチジウム染色およびＰＣＲ断片サイズの決定を、当業者に公知の方法で実施する。予測されるサイズのＰＣＲ断片（ＰＣＲ１３（配列番号５０）、１４９４塩基対；ＰＣＲ５（配列番号２４）、６７０塩基対；ＰＣＲ１４（配列番号５１）、７１０塩基対）を増幅する。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ社製“ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ”を使用して製造者の規定通りに精製する。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを製造者（ＮＥＢ；フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）の指示書にしたがって使用し、精製したＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ−およびＳｂｆＩ−ｃｕｔ  ｐＫＯＰｐベクターにクローニングする（配列番号１６）。大腸菌１０ｂｅｔａケミカルコンピテントセル（ＮＥＢ、フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）を、当業者に公知の方法で形質転換する。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析によりチェックし、導入された相同領域の信頼性をＤＮＡシーケンシングにより確認する。得られたノックアウトベクターを、ｐＫＯ＿ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８：：ｉｏｌＴ１＿Ｃｇ（ｃｏ＿Ｐｐ）（配列番号５２）と称する。
【０１６３】
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ΡΡ＿１０１６−１０１８］：：ｉｏｌＴ１＿Ｃｇ（ｃｏ＿Ｐｐ）の構築
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ΡΡ＿１０１６−１０１８］：：ｉｏｌＴ１＿Ｃｇ（ｃｏ＿Ｐｐ）の構築を、プラスミドｐＫＯ＿ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８：：ｉｏｌＴ１＿Ｃｇ（ｃｏ＿Ｐｐ）およびＧｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１（Ｇｒａｆ  Ｎ，  Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ  Ｊ，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，  ２０１１，  ７７（１５）：５５４９；ＤＯＩ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０５０５５−１１）に記載の方法を用いて実施する。遺伝子ΡΡ＿１０１６−ＰＰ−１０１８をｉｏｌＴ１＿Ｃｇ（ｃｏ＿Ｐｐ）に交換した後のＤＮＡ配列は、配列番号５３に記載されている。ベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を用いたＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ΡΡ＿１０１６−１０１８］：：ｉｏｌＴ１＿Ｃｇ（ｃｏ＿Ｐｐ）の形質転換を、Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｗａｓａｋｉ  Ｋ，  Ｕｃｈｉｙａｍａ  Ｈ，  Ｙａｇｉ  Ｏ，  Ｋｕｒａｂａｙａｓｈｉ，  Ｔ，  Ｉｓｈｉｚｕｋａ  Ｋ，  Ｔａｋａｍｕｒａ  Ｙ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９４．  ５８（５）：８５１−８５４）に記載の通りに実施する。その後、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢアガープレートに細胞を播種する。プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝（配列番号６）は、既に例１に記載されている。１０クローンそれぞれからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析を用いて分析する。このプラスミドを有する株を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ΡΡ＿１０１６−１０１８］：：ｉｏｌＴ１＿Ｃｇ（ｃｏ＿Ｐｐ）ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝と称する。技術的な具現化を、例１に記載の通りに実施する。
【０１６４】
３つの実験を、それぞれ例１と並行して行う。
【０１６５】
例１と比較して、６４時間後の著しくより高い全ＲＬ濃度および著しくより高い算定空時収率が観察される。
【０１６６】
例７（本発明による）
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｃＰ＿Ｍｓ＋ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を使用する。
【０１６７】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ中にｇｌｃＰ遺伝子を挿入するためのベクターの構築
アラビノースプロトンシンポーターＧｌｃＰをコードするマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のｇｌｃＰ遺伝子を挿入するためのベクターを、遺伝子のＰＣＲ増幅により調製する。使用したテンプレートは、合成ＤＮＡ断片である。ｇｌｃＰ遺伝子を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ内で、ＡＢＣトランスポーターパーミアーゼ、ＡＢＣトランスポーター結合タンパク質およびＡＢＣトランスポーターＡＴＰ結合タンパク質をコードする遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８と交換することを目的とする。このために、遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８の上流および下流の約６８０塩基対をＰＣＲにより増幅する。
【０１６８】
以下のプライマーをｇｌｃＰ遺伝子の増幅に使用する：
ＰＣＲ１５：ｇｌｃＰ
ＭＷ＿１８＿１１  ５’−ＡＣＴＡＣＣＴＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＴＡＣＡＴＧＡＡＴＧＴＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＴＣ−３’（配列番号５４）
ＭＷ＿１８＿１２  ５’−ＴＣＡＧＴＧＣＣＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＧＧ−３’（配列番号５５）。
【０１６９】
以下のプライマーをＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８遺伝子の上流および下流の相同領域の増幅に使用する：
ＰＣＲ５：ＰＰ＿１０１６の上流領域
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０３  ５’−ＧＣＣＧＣＴＴＴＧＧＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＣＡＴＴＡＡＣ−３’（配列番号９）
ＭＷ＿１８＿０１  ５’−ＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＴＡＧ−３’（配列番号２１）
ＰＣＲ１６：ＰＰ＿１０１８の下流領域
ＭＷ＿１８＿１３  ５’−ＣＣＧＡＡＧＣＧＣＴＧＧＧＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号５６）
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０２  ５’−ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１１）。
【０１７０】
以下のパラメーターをＰＣＲに使用する：
変性：            ９８℃        ３０秒
変性：            ９８℃        １０秒            ３０ｘ
アニーリング：    ６２℃        １２秒            ３０ｘ
伸長：            ７２℃        ２２秒            ３０ｘ
最終伸長：        ７２℃        ５分。
【０１７１】
増幅には、ＮＥＢ社（フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）製Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを製造者の推奨にしたがって使用する。次に、ＰＣＲ反応物それぞれ５０μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲル上で溶解させる。ＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡの臭化エチジウム染色およびＰＣＲ断片サイズの決定を、当業者に公知の方法で実施する。予測されるサイズのＰＣＲ断片（ＰＣＲ１５（配列番号５７）、１５１７塩基対；ＰＣＲ５（配列番号２４）、６７０塩基対；ＰＣＲ１６（配列番号５８）、７１０塩基対）を増幅する。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ社製“ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ”を使用して製造者の規定通りに精製する。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを製造者（ＮＥＢ；フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）の指示書にしたがって使用し、精製したＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ−およびＳｂｆＩ−ｃｕｔ  ｐＫＯＰｐベクターにクローニングする（配列番号１６）。大腸菌１０  ｂｅｔａケミカルコンピテントセル（ＮＥＢ、フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）を、当業者に公知の方法で形質転換する。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析によりチェックし、導入された相同領域の信頼性をＤＮＡシーケンシングにより確認する。得られたノックアウトベクターを、ｐＫＯ＿ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８：：ｇｌｃＰ＿Ｍｓ（配列番号５９）と称する。
【０１７２】
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｃＰ＿Ｍｓの構築
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｃＰ＿Ｍｓの構築を、プラスミドｐＫＯ＿ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８：：ｇｌｃＰ＿ＭｓおよびＧｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１（Ｇｒａｆ  Ｎ，  Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ  Ｊ，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，  ２０１１  ，  ７７（１５）：５５４９；ＤＯＩ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０５０５５−１１）に記載の方法を用いて実施する。遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８をｇｌｃＰに交換した後のＤＮＡ配列は、配列番号６０に記載されている。ベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を用いたＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ΡΡ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｃＰ＿Ｍｓの形質転換を、Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｗａｓａｋｉ  Ｋ，  Ｕｃｈｉｙａｍａ  Ｈ，  Ｙａｇｉ  Ｏ，  Ｋｕｒａｂａｙａｓｈｉ，  Ｔ，  Ｉｓｈｉｚｕｋａ  Ｋ，  Ｔａｋａｍｕｒａ  Ｙ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９４．  ５８（５）：８５１−８５４）に記載の通りに実施する。その後、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢアガープレートに細胞を播種する。プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝（配列番号６）は、既に例１に記載されている。１０クローンそれぞれからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析を用いて分析する。このプラスミドを有する株を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｃＰ＿Ｍｓ  ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝｛ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ｝｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝と称する。技術的な具現化を、例１に記載の通りに実施する。
【０１７３】
３つの実験を、それぞれ例１と並行して行う。
【０１７４】
例１と比較して、６４時間後の著しくより高い全ＲＬ濃度および著しくより高い算定空時収率が観察される。
【０１７５】
例８（本発明による）
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｃＵ＿Ｂｓ（ｃｏ＿Ｐｐ）＋ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を使用する。
【０１７６】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ中にｇｌｃＵ遺伝子を挿入するためのベクターの構築
グルコース取り込みタンパク質ＧｌｃＵをコードするバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｇｌｃＵ遺伝子を挿入するためのベクターを、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０用にコドン最適化された遺伝子のＰＣＲ増幅により調製する。使用したテンプレートは、合成ＤＮＡ断片である。ｇｌｃＵ遺伝子を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ内で、ＡＢＣトランスポーターパーミアーゼ、ＡＢＣトランスポーター結合タンパク質およびＡＢＣトランスポーターＡＴＰ結合タンパク質をコードする遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８と交換することを目的とする。このために、遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８の上流および下流の約６８０塩基対をＰＣＲにより増幅する。
【０１７７】
以下のプライマーをｇｌｃＵ遺伝子の増幅に使用する：
ＰＣＲ１７：ｇｌｃＵ
ＭＷ＿１８＿１４  ５’−ＴＡＣＣＴＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＴＡＣＡＴＧＧＡＣＴＴＧＴＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧ−３’（配列番号６１）
ＭＷ＿１８＿１５  ５’−ＣＴＡＧＣＴＧＴＴＧＧＴＣＴＴＧＧＣＧＡＴＧ−３’（配列番号６２）。
【０１７８】
以下のプライマーを、ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８の上流および下流の相同領域の増幅に使用する：
ＰＣＲ５：ＰＰ＿１０１６の上流領域
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０３  ５’−ＧＣＣＧＣＴＴＴＧＧＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＣＡＴＴＡＡＣ−３’（配列番号９）
ＭＷ＿１８＿０１  ５’−ＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＴＡＧ−３’（配列番号２１）
ＰＣＲ１８：ＰＰ＿１０１８の下流領域
ＭＷ＿１８＿１６  ５’−ＴＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＡＧＣＴＡＧＣＴＣＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号６３）
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０２  ５’−ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１１）。
【０１７９】
以下のパラメーターをＰＣＲに使用する：
変性：            ９８℃        ３０秒
変性：            ９８℃        １０秒            ３０ｘ
アニーリング：    ６２℃        １２秒            ３０ｘ
伸長：            ７２℃        ２２秒            ３０ｘ
最終伸長：        ７２℃        ５分。
【０１８０】
増幅には、ＮＥＢ社（フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）製Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを製造者の推奨にしたがって使用する。次に、ＰＣＲ反応物それぞれ５０μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲル上で溶解させる。ＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡの臭化エチジウム染色およびＰＣＲ断片サイズの決定を、当業者に公知の方法で実施する。予測されるサイズのＰＣＲ断片（ＰＣＲ１７（配列番号６４）、８８２塩基対；ＰＣＲ５（配列番号２４）、６７０塩基対；ＰＣＲ１８（配列番号６５）、７１０塩基対）を増幅する。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ社製“ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ”を使用して製造者の規定通りに精製する。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを製造者（ＮＥＢ；フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）の指示書にしたがって使用し、精製したＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ−およびＳｂｆＩ−ｃｕｔ  ｐＫＯＰｐベクターにクローニングする（配列番号１６）。大腸菌１０ｂｅｔａケミカルコンピテントセル（ＮＥＢ、フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）を、当業者に公知の方法で形質転換する。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析によりチェックし、導入された相同領域の信頼性をＤＮＡシーケンシングにより確認する。得られたノックアウトベクターを、ｐＫＯ＿ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８：：ｇｌｃＵ＿Ｂｓ（配列番号６６）と称する。
【０１８１】
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｃＵ＿Ｂｓの構築
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｃＵ＿Ｂｓの構築を、プラスミドｐＫＯ＿ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８：：ｇｌｃＵ＿ＢｓおよびＧｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１（Ｇｒａｆ  Ｎ，  Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ  Ｊ，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，  ２０１１  ，  ７７（１５）：５５４９；ＤＯＩ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０５０５５−１１）に記載の方法を用いて実施する。遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８をｇｌｃＵに交換した後のＤＮＡ配列は、配列番号６７に記載されている。ベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を用いたＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｃＵ＿Ｂｓの形質転換を、Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｗａｓａｋｉ  Ｋ，  Ｕｃｈｉｙａｍａ  Ｈ，  Ｙａｇｉ  Ｏ，  Ｋｕｒａｂａｙａｓｈｉ，  Ｔ，  Ｉｓｈｉｚｕｋａ  Ｋ，  Ｔａｋａｍｕｒａ  Ｙ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９４．  ５８（５）：８５１−８５４）に記載の通りに実施する。その後、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢアガープレートに細胞を播種する。プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝（配列番号６）は、既に例１に記載されている。１０クローンそれぞれからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析を用いて分析する。このプラスミドを有する株を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｇｌｃＵ＿Ｂｓ  ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝と称する。技術的な具現化を、例１に記載の通りに実施する。
【０１８２】
３つの実験を、それぞれ例１と並行して行う。
【０１８３】
例１と比較して、６４時間後の著しくより高い全ＲＬ濃度および著しくより高い算定空時収率が観察される。
【０１８４】
例９（本発明による）
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ＳｅｍｉＳＷＥＥＴ＿Ｌｂ（ｃｏ＿Ｐｐ）＋ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を使用する。
【０１８５】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ中にＳｅｍｉＳＷＥＥＴ遺伝子を挿入するためのベクターの構築
糖トランスポーターｓｅｍｉｓｗｅｅｔをコードするレプトスピラ・ビフレクサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｂｉｆｌｅｘａ）由来のＳｅｍｉＳＷＥＥＴ遺伝子を挿入するためのベクターを、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０用にコドン最適化された遺伝子のＰＣＲ増幅により調製する。使用したテンプレートは、合成ＤＮＡ断片である。ｓｅｍｉＳＷＥＥＴ遺伝子を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ内で、ＡＢＣトランスポーターパーミアーゼ、ＡＢＣトランスポーター結合タンパク質およびＡＢＣトランスポーターＡＴＰ結合タンパク質をコードする遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８と交換することを目的とする。このために、遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８の上流および下流の約６８０塩基対をＰＣＲにより増幅する。
【０１８６】
以下のプライマーをｓｅｍｉＳＷＥＥＴ遺伝子の増幅に使用する：
ＰＣＲ１９：ｓｅｍｉＳＷＥＥＴ
ＭＷ＿１８＿１７  ５’−ＴＡＣＣＴＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＴＡＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＴＴＧＡＴＣＧＧＣＴＡＴＧＴＧ−３’（配列番号６８）
ＭＷ＿１８＿１８  ５’−ＴＣＡＧＧＴＴＴＧＧＴＴＧＣＣＣＴＣＧＧＴＣＡＧ−３’（配列番号６９）。
【０１８７】
以下のプライマーをＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８遺伝子の上流および下流の相同領域の増幅に使用する：
ＰＣＲ５：ＰＰ＿１０１６の上流領域
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０３  ５’−ＧＣＣＧＣＴＴＴＧＧＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＣＡＴＴＡＡＣ−３’（配列番号９）
ＭＷ＿１８＿０１  ５’−ＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＴＡＧ−３’（配列番号２１）
ＰＣＲ２０：ＰＰ＿１０１８の下流領域
ＭＷ＿１８＿１９  ５’−ＣＣＧＡＧＧＧＣＡＡＣＣＡＡＡＣＣＴＧＡＣＴＣＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号７０）
Ｏ．ＢＦ＿ＦＭ＿１＊０２  ５’−ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１１）。
【０１８８】
以下のパラメーターをＰＣＲに使用する：
変性：            ９８℃        ３０秒
変性：            ９８℃        １０秒            ３０ｘ
アニーリング：    ６２℃        １２秒            ３０ｘ
伸長：            ７２℃        ２２秒            ３０ｘ
最終伸長：        ７２℃        ５分。
【０１８９】
増幅には、ＮＥＢ社（フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）製Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを製造者の推奨にしたがって使用する。次に、ＰＣＲ反応物それぞれ５０μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲル上で溶解させる。ＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡの臭化エチジウム染色およびＰＣＲ断片サイズの決定を、当業者に公知の方法で実施する。予測されるサイズのＰＣＲ断片（ＰＣＲ１９（配列番号７１）、２７６塩基対；ＰＣＲ５（配列番号２４）、６７０塩基対；ＰＣＲ２０（配列番号７２）、７１０塩基対）を増幅する。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ社製“ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ”を使用して製造者の規定通りに精製する。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを製造者（ＮＥＢ；フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）の指示書にしたがって使用し、精製したＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ−およびＳｂｆＩ−ｃｕｔ  ｐＫＯＰｐベクターにクローニングする（配列番号１６）。大腸菌１０ｂｅｔａケミカルコンピテントセル（ＮＥＢ、フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）を、当業者に公知の方法で形質転換する。標的遺伝子の正確な挿入を制限分析によりチェックし、導入された相同領域の信頼性をＤＮＡシーケンシングにより確認する。得られたノックアウトベクターを、ｐＫＯ＿ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８］：：ＳｅｍｉＳＷＥＥＴ＿Ｌｂ（ｃｏ＿Ｐｐ）（配列番号７３）と称する。
【０１９０】
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｓｅｍｉＳＷＥＥＴ＿Ｌｂ（ｃｏ＿Ｐｐ）の構築
株Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｓｅｍｉＳＷＥＥＴ＿Ｌｂ（ｃｏ＿Ｐｐ）の構築を、プラスミドｐＫＯ＿ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８：：ｓｅｍｉＳＷＥＥＴ＿Ｌｂ（ｃｏ＿Ｐｐ）およびＧｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１（Ｇｒａｆ  Ｎ，  Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ  Ｊ，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，  ２０１１  ，  ７７（１５）：５５４９；ＤＯＩ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０５０５５−１１）に記載の方法を用いて実施する。遺伝子ＰＰ＿１０１６−ＰＰ＿１０１８をｓｅｍｉＳＷＥＥＴに交換した後のＤＮＡ配列は、配列番号７４に記載されている。ベクターｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝を用いたＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｓｅｍｉＳＷＥＥＴ＿Ｌｂ（ｃｏ＿Ｐｐ）の形質転換を、Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｗａｓａｋｉ  Ｋ，  Ｕｃｈｉｙａｍａ  Ｈ，  Ｙａｇｉ  Ｏ，  Ｋｕｒａｂａｙａｓｈｉ，  Ｔ，  Ｉｓｈｉｚｕｋａ  Ｋ，  Ｔａｋａｍｕｒａ  Ｙ，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９４．  ５８（５）：８５１−８５４）に記載の通りに実施する。その後、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢアガープレートに細胞を播種する。プラスミドｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝（配列番号６）は、既に例１に記載されている。１０クローンそれぞれからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析を用いて分析する。このプラスミドを有する株を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０  Δｕｐｐ  Δ［ＰＰ＿１０１６−１０１８］：：ｓｅｍｉｓｗｅｅｔ＿Ｌｂ（ｃｏ＿Ｐｐ）ｐＡＣＹＣＡＴｈ５−｛ＰｒｈａＳＲ｝［ｒｈａＳＲ＿Ｅｃ］｛ＰｒｈａＢＡＤ｝［ｒｈｌＡＢＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝［ａｒａＣ＿Ｅｃ］｛ＰａｒａＢＡＤ｝［ｒｍｌＢＤＡＣ＿Ｐａ］｛Ｔａｌｋ｝と称する。技術的な具現化を、例１に記載の通りに実施する。
【０１９１】
３つの実験を、それぞれ例１と並行して行う。
【０１９２】
例１と比較して、６４時間後の著しくより高い全ＲＬ濃度および著しくより高い算定空時収率が観察される。
【配列表】
2019532088000001.app
【国際調査報告】
2019532088.tif 000006
2019532088.tif 000007
2019532088.tif 000008