(57)【要約】本発明は、血管形成を抑制する癌治療用組成物及びその製造方法に関する。本発明による血管形成抑制剤は、血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）の血管内皮増殖因子結合ドメインとニューロピリン１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１、ＮＲＰ１）のｂ１ドメインを含むことを特徴とする融合タンパク質を含む癌治療用組成物である。前記新規な融合タンパク質は、血管内皮増殖因子が細胞膜でその受容体と結合することをブロッキングする血管形成抑制剤であって、癌細胞の増殖、癌の成長及び転移を抑制する効果がある。また、前記融合タンパク質は、抗癌剤として有効に利用することができるほか、従来の血管形成抑制剤と比較してより少ない容量で効率的な抗癌作用を示す。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）のＩｇ２ドメイン及びニューロピリン１（ＮＲＰ１）のｂ１ドメインを含むことを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３を含む請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記融合タンパク質は、配列番号４をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記融合タンパク質は、配列番号５であることを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１ないし４の何れか一項による融合タンパク質を含む癌治療用組成物。
【請求項６】
請求項１ないし４の何れか一項による融合タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント。
【請求項７】
請求項６によるＤＮＡフラグメントを含むことを特徴とする組み換えベクター。
【請求項８】
請求項７による組み換えベクターに形質転換された細胞。
【請求項９】
前記細胞は、ＨＥＫ２９３Ｅであることを特徴とする請求項６に記載の細胞。
【請求項１０】
（ａ）請求項８による形質転換された細胞を培養する段階；及び（ｂ）前記細胞の培養液から融合タンパク質を分離することを特徴とする癌治療用タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の成長及び転移を抑制する新規な血管形成抑制融合タンパク質及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、適切な器官（ｏｒｇａｎ）の成長及び損傷回復において必須であり、非常に精巧に調節される過程である。このような過程の調節不均衡は、炎症性、心血管性、免疫性または悪性疾患を招く。血管内皮増殖因子Ａ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ；ＶＥＧＦＡ）は、血管形成の主要誘導体であり、癌の成長及び進行に関与すると知られている。８個のエキソン（ｅｘｏｎ）からなるＶＥＧＦＡ遺伝子は、少なくとも６種類の主要ＶＥＧＦＡ同型タンパク質（ｉｓｏｆｏｒｍ）であるＶＥＧＦＡ−１２１、ＶＥＧＦＡ−１４５、ＶＥＧＦＡ−１６５、ＶＥＧＦＡ−１８３、ＶＥＧＦＡ−１８９及びＶＥＧＦＡ−２０６を生産する。主な３個の同型タンパク質は、ＶＥＧＦＡ−１２１、ＶＥＧＦＡ−１６５、及びＶＥＧＦＡ−１８９であり、細胞で分泌されるが、これらの特性、生物学的利用の可能性及び分布は互いに異なる。しかし、これらのうち大部分の血管形成機能は、ＶＥＧＦＡ−１６５によって調節されると思われる。
【０００３】
ＶＥＧＦＡは、２個のチロシンキナーゼ受容体（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であるＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＶＥＧＦＲ）１及びＶＥＧＦＲ２に結合することによって、新生血管の発達に関与するだけでなく、内皮細胞生存（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）できるように細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）から保護する。血管形成信号伝達は、ＶＥＧＦＡがＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）及び共受容体（ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）であるニューロピリン１（Ｎｅｕｒｏｐｈｉｌｉｎ−１；ＮＲＰ１）に結合することによって媒介される。たとえＶＥＧＦＲ２が血管形成及び脈管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関与する主要受容体であるとしても、ＶＥＧＦＲ１がＶＥＧＦＲ２に比べてＶＥＧＦＡに対する親和度がはるかに高い。
【０００４】
ＶＥＧＦＡ発現量は、傷治癒や低酸素環境のような生理的な必要によって増加することもあるが、増殖網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、関節炎、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）及び癌のような病理学的状態でも増加する。さらに、ＶＥＧＦＡは、周辺血管から新たな血管の成長を誘導して癌細胞が酸素と栄養分とを得て癌転移を容易にするため、腫瘍脈管形成の重要な媒介体である。
【０００５】
現在まで抗体製剤、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）及びチロシンキナーゼ抑制剤のような抗ＶＥＧＦ薬剤が多く開発されてきたが、最近、ＶＥＧＦＡに親和度が高い融合タンパク質のアフリバーセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ；ＶＥＧＦ−ｔｒａｐ）が次世代の医薬品として脚光を浴びている。この薬剤は、ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２との結合部位からなっている。
【０００６】
関連する先行技術としては２０１４年韓国公開特許登録番号第１３９７０８８号「癌細胞増殖抑制と血管形成抑制のための融合タンパク質及びこれを含む坑癌組成物」において胃癌または乳癌治療に効果がある癌特異な抗体と血管形成抑制剤を結合した融合タンパク質が開示されている。
【０００７】
関連する先行文献として黄斑変性に対するＶＥＧＦＴｒａｐ−Ｅｙｅ（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ；商品名、Ｅｙｌｅａ(R)）の３相臨床試験分析結果をジェネロン社がバイエルヘルスケア社とともに発表したが、ラニビズマブ投与群と比較してより少ない投与回数で治療効果が現れた。
【０００８】
Ｆｉｎｅｌｙなどは癌の成長速度とＶＥＧＦ分泌とを含んで癌の特性を研究するために人間の癌を移植したネズミモデルを開発し、ＶＥＧＦ−ｔｒａｐを用いたＶＥＧＦ分泌速度を予測して全臨床段階においてｉｎ  ｖｉｖｏ癌モデルとして用いることができることを示唆している。
【０００９】
本発明者らは、ＶＥＧＦ−ｔｒａｐより高い親和度でＶＥＧＦＡに結合してＶＥＧＦＡ信号伝達をブロッキングできるようにＶＥＧＦＲ１のＩｇ２ドメインとＮＲＰ１のｂ１ドメインとを有するデコイ受容体（ｄｅｃｏｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）である血管形成抑制剤（ＶＥＧＦ  Ｄｅｅｐ  Ｂｌｏｃｋｅｒ；ＶＥＥＰ）融合タンパク質を製造して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、癌の成長及び転移を抑制する新規な血管形成抑制融合タンパク質及びその製造方法を提供することを目的とする。
【００１１】
本発明は、癌の成長及び転移を抑制する新規な血管形成抑制融合タンパク質をコードする組み換えＤＮＡを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的のために本発明の第１の形態は、血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）のＩｇ２ドメイン及びニューロピリン１（ＮＲＰ１）のｂ１ドメインを含むことを特徴とする融合タンパク質を提供する。前記タンパク質を含む組成物は、癌の成長及び転移を抑制する癌治療用に利用できる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明による新規な融合タンパク質は、血管内皮増殖因子が細胞膜でその受容体と結合することをブロッキングする血管形成抑制剤であって、癌細胞増殖、癌の成長及び転移を抑制する効果がある。前記融合タンパク質を含む組成物は、抗癌剤に有用に用いられるだけでなく、従来の血管形成抑制剤と比較してより少ない容量で効率的な坑癌作用効果を現す。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＶＥＧＦＲ１−ＮＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の模式図を示す図である。
【図２】ＶＥＥＰ融合タンパク質の発現を示す。
【図３】ＬＬＣネズミモデルにおけるＶＥＥＰの坑癌効果を対照群ＶＥＧＦ−ｔｒａｐと比較分析したものである。
【図４】ＬＬＣネズミモデルにＶＥＥＰを処理して３０日後にエンドポイント分析（ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を行ったものである。
【００１５】
［発明を実施するための最良の形態］
以下、実施例により本発明についてさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者に自明であろう。
【００１６】
本発明の第１の形態は、血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）のＩｇ２ドメイン及びニューロピリン１（ＮＲＰ１）のｂ１ドメインを含むことを特徴とする融合タンパク質である。より具体的に前記血管内皮増殖因子受容体１は、これに制限されないが、配列番号１であり得、前記Ｉｇ２ドメイン及びニューロピリン１（ＮＲＰ１）のｂ１ドメインは、多様な形態であり得るが、好ましくは配列番号２のＩｇ２ドメイン及びニューロピリン１（ＮＲＰ１）のｂ１ドメインである。前記融合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃドメインをさらに含み得、多様なＦｃドメインが用いられるが、好ましくは配列番号３のＦｃドメインを用い得る。前記融合タンパク質は、発現のためにリーダータンパク質をさらに含み得、多様なリーダータンパク質が用いられるが、好ましくは配列番号４のリーダータンパク質が用いられ得る。本発明による融合タンパク質は、最も好ましくは配列番号５のタンパク質である。
【００１７】
本発明の第２の形態は、前記融合タンパク質を含む癌治療用組成物である。本発明の技術分野に属する当業者は、多様な形態の薬物伝達物質、賦形剤、安定化剤などをさらに含み得、このような多様な剤形は本発明の要旨範囲に属する。
【００１８】
本発明の第３の形態は、前記タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントである。本発明が属する技術分野に属する当業者は、遺伝子コードの退化によって本発明の融合タンパク質をコードする多様な配列のＤＮＡ配列を製造でき、最終的に本発明のタンパク質をコードするいかなる形態のＤＮＡ配列も本発明の要旨の範囲に含まれる。
【００１９】
本発明の第４の形態は、前記組み換えベクターを形質転換した形質転換体である。前記形質転換体は、多様な細胞を用い得、人間由来細胞を使用することが好ましく、最も好ましくはＨＥＫ２９３Ｅ細胞である。
【００２０】
本発明の第５の形態は、前記本発明による形質転換された細胞を培養する段階；及び前記細胞の培養液から融合タンパク質を分離することを特徴とするタンパク質の製造方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
実験方法
１．ＶＥＧＦＲ１−ＮＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の製造
ＶＥＧＦＲ１遺伝子のＩｇ２ドメインは、合成したＤＮＡ（ＥＺｂｉｏ）をＰＣＲして得、ＮＲＰ１のｂ１ドメインはｃＤＮＡを韓国生命工学研究院人間遺伝子銀行から購入した。前記２つのＤＮＡのカケラをｈｕｍａｎ  Ｆｃ  ＤＮＡのカケラに付けて融合タンパク質を得た。クローニングしたＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞で発現し、その培養液をプロテイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ）Ａ樹脂（ｒｅｓｉｎ）で精製した。精製したタンパク質の濃度は、Ａ２８０吸光度を測定することによって計算した。
【００２２】
２．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和度のテスト（ＥＬＩＳＡ）
ＶＥＥＰ及びＶＥＧＦ−ｔｒａｐをＶＥＧＦがコートした９６−ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に添加する。数回洗浄した後、ＨＲＰが接合された抗ヒトＦｃ（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ）を入れて安定化したＴＭＢを添加した後、４５０ｎｍで吸光度を測定する。
【００２３】
３．ＶＥＥＰ動物実験の結果と導出方法
対象疾患及び固形癌動物モデル
薬物の坑癌効果の確認のための動物モデルとして、６週令の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＫＯＡＴＥＣＨ社（平沢市、韓国）から購入して用いた。動物は、動物実験倫理規定に従い１週間の適応期間を経た後に用いた。マウスの固形癌誘導にはＬＬＣ（Ｌｅｗｉｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株をＡＴＣＣ社から購入して用いた。
【００２４】
動物生体内ＶＥＥＰの坑癌効果及びエンドポイントの分析
６週令Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側面の背中側（Ｒｉｇｈｔ  ｆｌａｎｋ  ｒｅｇｉｏｎ）に１ｘ１０６個のＬＬＣ  ｃｅｌｌを皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ、ｓ．ｃ）注入した。その後、９日目から３日間隔で総８回のＶＥＥＰとＶＥＧＦ−ｔｒａｐとを各２５ｍｇ／ｋｇ皮下投与した。３０日にわたって３〜４日間隔で固形癌の増殖を測定して生存を観察した。固形癌の大きさの測定は、電子デジタルカリパス（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて直交で横（長い直径）と縦（短い直径）の長さを測定し、固形癌の体積は、Π／６ｘ（横）２ｘ縦で計算して算出した。３０日目にマウスを犠牲にして固形癌を摘出した後、マイクロバランスを用いて重量を測定した。
【００２５】
＜実施例１＞融合タンパク質
精製したＶＥＧＦＲ１−ＮＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を還元（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ）＆非還元（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ）の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）と二量体（ｄｉｍｅｒ）とが予想大きさの位置に現れることを確認した（図２）。
【００２６】
＜実施例２＞親和度の分析
製造した融合タンパク質のＶＥＥＰのＶＥＧＦＡに対する親和度を特定するために、ＥＬＩＳＡ分析によりＶＥＧＦの受容体またはブロッカーに対する親和度を分析した。親和度テストのためにＶＥＧＦＡ同型タンパク質中のＶＥＧＦ１６５を使用した。対照群には細胞で自然に発現するＶＥＧＦＡ受容体のＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＮＲＰ１及びＮＲＰ２を含んで市販のブロッカーであるＶＥＧＦ−ｔｒａｐ、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）及びラニビズマブ（ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）を使用して比較分析した。テストの結果、対照群の中ではＶＥＧＦ−ｔｒａｐが結合親和度が最も高く示された。それに比べて本発明者らが製造した融合タンパク質であるＶＥＥＰは全ての対照群と比較してＶＥＧＦ１６５に対して結合親和度が最も高く示され、ＶＥＧＦ−ｔｒａｐより１０倍程度高い結合親和度を示した（表１）。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
＜実施例３＞坑癌効果の分析
本発明により製造して精製したＶＥＥＰ融合タンパク質の坑癌効果を測定するためにＬＬＣネズミモデルを用いて固形癌の増殖を測定して生存を観察した。ＬＬＣネズミの固形癌の増殖を測定した結果、ブロッカーを処理しない対照群は、癌の大きさが１３１０５ｍｍ３で測定された。ＶＥＧＦ−ｔｒａｐを処理した場合、大きさが９４７９ｍｍ３に減少したが、ネズミモデル個体間にその効果の偏差が大きく示された。これに対し、ＶＥＥＰを処理したネズミの固形癌の大きさは、５８７２ｍｍ３で測定され、これはブロッカーを処理しない対照群と比較して坑癌効果が有意に減少したことが観察された（図３）。また、ＶＥＧＦ−ｔｒａｐの坑癌効果より優れた結果を示した。生存率においてもＶＥＥＰ融合タンパク質は８０％で測定されたが、これはＶＥＧＦ−ｔｒａｐ処理した対照群（８０％）やブロッカーを処理しない対照群（０％）に比べて優れた結果である。したがって、本発明で製造したＶＥＥＰ融合タンパク質をＶＥＧＦ−ｔｒａｐで治療できない患者の場合に用いられると思われる。
【００２９】
＜実施例４＞エンドポイントの分析
ＬＬＣネズミモデルにおいてＬＬＣネズミにＶＥＥＰを処理してから３０日目の癌の重量と大きさとを測定した結果、固形癌の重量は、ＶＥＧＦ−ｔｒａｐを処理した対照群（７．４９ｇ）に比べてＶＥＥＰ融合タンパク質を処理したネズミ（５．１５ｇ）で有意に減少したことが確認された（図３）。腫瘍の大きさを見れば、ＶＥＧＦ−ｔｒａｐを処理したネズミの場合、個体別に大きさの偏差が大きいことが確認されたが、ＶＥＥＰを処理したネズミは、癌大きさが平均的により小さく、個体間に類似の水準に減少したことが確認できた（図４）。したがって、前記坑癌効果分析の結果と同様に、本発明のＶＥＥＰブロッカーは、ＶＥＧＦ−ｔｒａｐで治療効果がなかった患者の場合に用いることができると思われる。
【００３０】
参考文献
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14. Finley, S.D., Dhar, M., and Popel, A.S. (2013). Compartment model predicts VEGF secretion and investigates the effects of VEGF trap in tumor-bearing mice. Front Oncol 3, 196.
【００３１】
［配列表フリーテキスト］
配列表１  ＶＥＧＦＲ１部分配列
VSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNT (VEGFR1)
配列表２  Ｎｒｐ１部分配列
SaiakegfSanysvLQSsvsedfkcmealgmesgeihsdqitassqystnwsaersrlnypengwtpgedsyrewiqvdlgllrfvtavgtqgaisketkkkyyvktykidvssngedwitikegnkpvlfqgntnptdvvvavfpkplitrfvrikpatwetgismrfevygckit
配列表３  免疫グロブリンＦｃドメイン
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列表４  リーダー配列
MYLGLNYVFIVFLLNGVQS
配列表５  全長配列
MYLGLNYVFIVFLLNGVQSVSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTSaiakegfSanysvLQSsvsedfkcmealgmesgeihsdqitassqystnwsaersrlnypengwtpgedsyrewiqvdlgllrfvtavgtqgaisketkkkyyvktykidvssngedwitikegnkpvlfqgntnptdvvvavfpkplitrfvrikpatwetgismrfevygckitDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月1日(2019.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）のＩｇ２ドメイン及びニューロピリン１（ＮＲＰ１）のｂ１ドメインを含む、融合タンパク質。
【請求項２】
配列番号１、配列番号２、及び配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
配列番号４のアミノ酸配列をさらに含む、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか一項記載の融合タンパク質を含む、癌治療用組成物。
【請求項６】
請求項１〜４の何れか一項記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント。
【請求項７】
請求項６記載のＤＮＡフラグメントを含む、組み換えベクター。
【請求項８】
宿主細胞を請求項７記載の組み換えベクターで形質転換することにより得られる、形質転換された細胞。
【請求項９】
宿主細胞が、ＨＥＫ２９３Ｅである、請求項８記載の細胞。
【請求項１０】
（ａ）請求項８記載の形質転換された細胞を培養して、融合タンパク質を製造すること；及び
（ｂ）前記細胞の培養液から融合タンパク質を分離すること
を含む、癌治療用タンパク質の製造方法。
【国際調査報告】
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