(57)【要約】ある特定の態様では、本発明は、赤血球または骨、軟骨、筋肉、脂肪および／もしくは神経組織などの組織の成長をモジュレート（促進または阻害）するための組成物および方法を提供する。本発明はまた、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質および／またはＡｃｔＲＩＩＢリガンドの活性をモジュレートする化合物をスクリーニングする方法を提供する。本明細書に提供される組成物および方法は、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質および／またはＡｃｔＲＩＩＢリガンドの異常な活性に関連する疾患の処置において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸２０〜２９（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９）のいずれか１つで始まり、配列番号２のアミノ酸１０９〜１３４（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドであって、Ｋ５５、Ｆ８２、Ｌ７９、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２からなる群から選択される配列番号２の位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸２９〜１０９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸２５〜１３１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸２０〜１３４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項５】
配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項６】
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインおよび１つまたは複数の異種ドメインを含む融合タンパク質である、請求項１から５までのいずれか一項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項７】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項６に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項８】
前記融合タンパク質が、前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインおよび前記１つまたは複数の異種ドメインまたはＦｃドメインの間に位置するリンカードメインをさらに含む、請求項６または７に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項９】
前記リンカードメインが、ＴＧＧＧ、ＴＧＧＧＧ、ＳＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＳＧＧＧおよびＧＧＧＧＳから選択される、請求項８に記載のバリアント。
【請求項１０】
配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項１２】
Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｋ５５Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される配列番号２のアミノ酸配列に関する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号２のＫ５５に対応する位置におけるＡ置換を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号２のＫ５５に対応する位置におけるＥ置換を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号２のＦ８２に対応する位置におけるＩ置換を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号２のＦ８２に対応する位置におけるＫ置換を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号２のＬ７９に対応する位置におけるＥ置換を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号２のＫ５５に対応する位置におけるＡ置換を含む、請求項１８または１９に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号２のＫ５５に対応する位置におけるＥ置換を含む、請求項２１または２２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号２のＦ８２に対応する位置におけるＩ置換を含む、請求項２４または２５に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号２のＦ８２に対応する位置におけるＫ置換を含む、請求項２７または２８に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項３２】
配列番号２のＬ７９に対応する位置におけるＥ置換を含む、請求項３０または３１に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項３３】
配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号２のＬ７９に対応する位置におけるＥ置換を含む、請求項３３または３４に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項３６】
配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項３７】
配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項３８】
配列番号２のＬ７９に対応する位置におけるＥ置換を含む、請求項３６または３７に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項３９】
配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項４０】
配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項４１】
配列番号２のＬ７９に対応する位置におけるＥ置換を含む、請求項３９または４０に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項４２】
前記Ｆｃドメインが、配列番号１３〜３０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８または９に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項４３】
ホモ二量体タンパク質である、請求項１から４２までのいずれか一項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項４４】
第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体タンパク質であって、前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２０〜２９（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９）のいずれか１つで始まり、配列番号２のアミノ酸１０９〜１３４（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列、ならびにＡ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２からなる群から選択される配列番号２の位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２０〜２９（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９）のいずれか１つで始まり、配列番号２のアミノ酸１０９〜１３４（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと比較して異なるアミノ酸配列を含む、ヘテロ多量体タンパク質。
【請求項４５】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載のヘテロ多量体。
【請求項４６】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２５〜１３１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載のヘテロ多量体。
【請求項４７】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２０〜１３４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載のヘテロ多量体。
【請求項４８】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載のヘテロ多量体。
【請求項４９】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｋ５５Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される配列番号２のアミノ酸配列に関する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項４４から４８までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項５０】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２からなる群から選択される配列番号２の位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項４４から４９までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項５１】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｋ５５Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される配列番号２のアミノ酸配列に関する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項４９に記載のヘテロ多量体。
【請求項５２】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインおよび１つまたは複数の異種ドメインを含む融合タンパク質である、請求項４４から５１までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項５３】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項５２に記載のヘテロ多量体。
【請求項５４】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および／または第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインおよび前記１つまたは複数の異種ドメインまたはＦｃドメインの間に位置するリンカードメインをさらに含む、請求項５２または５３に記載のヘテロ多量体。
【請求項５５】
前記リンカードメインが、ＴＧＧＧ、ＴＧＧＧＧ、ＳＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＳＧＧＧおよびＧＧＧＧＳから選択される、請求項５４に記載のヘテロ多量体。
【請求項５６】
ａ．前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む；
ｂ．前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む；
ｃ．前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む；
ｄ．前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む；および
ｅ．前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む
から選択されるＦｃドメインを含む、請求項５３から５５までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項５７】
ａ．前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む；
ｂ．前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む
から選択されるＦｃドメインを含む、請求項５３から５５までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項５８】
ａ．前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む；
ｂ．前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む
から選択されるＦｃドメインを含む、請求項５３から５５までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項５９】
ａ．前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む；
ｂ．前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む
から選択されるＦｃドメインを含む、請求項５３から５５までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項６０】
ａ．前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む；
ｂ．前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む
から選択されるＦｃドメインを含む、請求項５３から５５までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項６１】
ａ．前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む；
ｂ．前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む
から選択されるＦｃドメインを含む、請求項５３から５５までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項６２】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む、請求項５３から５５までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項６３】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、アミノ酸位置１３２におけるシステイン、アミノ酸位置１３８におけるグルタミン酸、アミノ酸位置１４４におけるトリプトファンおよびアミノ酸位置２１７におけるアスパラギン酸を含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、アミノ酸位置１２７におけるシステイン、アミノ酸位置１４４におけるセリン、位置１４６におけるアラニン、アミノ酸位置１６２におけるアルギニン、アミノ酸位置１７９におけるアルギニンおよびアミノ酸位置１８５におけるバリンを含む、請求項６２に記載のヘテロ多量体。
【請求項６４】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む、請求項５３から５５までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項６５】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、アミノ酸位置１３２におけるシステイン、アミノ酸位置１３８におけるグルタミン酸、アミノ酸位置１４４におけるトリプトファンおよびアミノ酸位置２１７におけるアスパラギン酸を含み、前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、アミノ酸位置１２７におけるシステイン、アミノ酸位置１４４におけるセリン、位置１４６におけるアラニン、アミノ酸位置１６２におけるアルギニン、アミノ酸位置１７９におけるアルギニンおよびアミノ酸位置１８５におけるバリンを含む、請求項６２に記載のヘテロ多量体。
【請求項６６】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む、請求項５３から５５までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項６７】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、アミノ酸位置１３２におけるシステイン、アミノ酸位置１４４におけるトリプトファンおよびアミノ酸位置４３５におけるアルギニンを含み、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、アミノ酸位置１２７におけるシステイン、アミノ酸位置１４４におけるセリン、アミノ酸位置１４６におけるアラニンおよびアミノ酸位置１８５におけるバリンを含む、請求項６６に記載のヘテロ多量体。
【請求項６８】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む、請求項５３から５５までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項６９】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、アミノ酸位置１３２におけるシステイン、アミノ酸位置１４４におけるトリプトファンおよびアミノ酸位置４３５におけるアルギニンを含み、前記第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインが、アミノ酸位置１２７におけるシステイン、アミノ酸位置１４４におけるセリン、アミノ酸位置１４６におけるアラニンおよびアミノ酸位置１８５におけるバリンを含む、請求項６６に記載のヘテロ多量体。
【請求項７０】
ヘテロ二量体である、請求項４４から６９までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項７１】
配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列を含まない、ヘテロ多量体。
【請求項７２】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２の５５に対応するアミノ酸位置におけるアラニンを含む、請求項７１に記載のヘテロ多量体。
【請求項７３】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２の５５に対応するアミノ酸位置におけるアラニンを含まない、請求項７１または７２に記載のヘテロ多量体。
【請求項７４】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２の５５に対応するアミノ酸位置におけるリシンを含む、請求項７３に記載のヘテロ多量体。
【請求項７５】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のＦ８２、Ｌ７９、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項７１から７４までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項７６】
前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される、請求項７５に記載のヘテロ多量体。
【請求項７７】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のＦ８２、Ｌ７９、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項７１から７６までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項７８】
前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される、請求項７７に記載のヘテロ多量体。
【請求項７９】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項７１から７８までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項８０】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ヘテロ多量体形成を阻害する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項７１から７９までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項８１】
ヘテロ二量体である、請求項７１から８０までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項８２】
配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列を含まない、ヘテロ多量体。
【請求項８３】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２の５５に対応するアミノ酸位置におけるグルタミン酸を含む、請求項８２に記載のヘテロ多量体。
【請求項８４】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２の５５に対応するアミノ酸位置におけるグルタミン酸を含まない、請求項８２または８３に記載のヘテロ多量体。
【請求項８５】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２の５５に対応するアミノ酸位置におけるリシンを含む、請求項８４に記載のヘテロ多量体。
【請求項８６】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のＦ８２、Ｌ７９、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項８２から８５までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項８７】
前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される、請求項８６に記載のヘテロ多量体。
【請求項８８】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のＦ８２、Ｌ７９、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項８２から８７までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項８９】
前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される、請求項８８に記載のヘテロ多量体。
【請求項９０】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項８２から８９までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項９１】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ヘテロ多量体形成を阻害する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項８２から９０までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項９２】
ヘテロ二量体である、請求項８２から９１までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項９３】
配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列を含まない、ヘテロ多量体。
【請求項９４】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２の８２に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシンを含む、請求項９３に記載のヘテロ多量体。
【請求項９５】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２の８２に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシンを含まない、請求項９３または９４に記載のヘテロ多量体。
【請求項９６】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２の８２に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンを含む、請求項９５に記載のヘテロ多量体。
【請求項９７】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のＬ７９、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８およびＤ８０のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項９３から９６までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項９８】
前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０ＮおよびＤ８０Ｒからなる群から選択される、請求項９７に記載のヘテロ多量体。
【請求項９９】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のＬ７９、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８およびＤ８０のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項９３から９８までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１００】
前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０ＮおよびＤ８０Ｒからなる群から選択される、請求項９９に記載のヘテロ多量体。
【請求項１０１】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項９３から１００までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１０２】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ヘテロ多量体形成を阻害する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項９３から１０１までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１０３】
ヘテロ二量体である、請求項９３から１０２までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１０４】
配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列を含まない、ヘテロ多量体。
【請求項１０５】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２の８２に対応するアミノ酸位置におけるリシンを含む、請求項１０４に記載のヘテロ多量体。
【請求項１０６】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２の８２に対応するアミノ酸位置におけるリシンを含まない、請求項１０３または１０４に記載のヘテロ多量体。
【請求項１０７】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２の８２に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンを含む、請求項１０６に記載のヘテロ多量体。
【請求項１０８】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のＬ７９、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８およびＤ８０のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１０４から１０７までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１０９】
前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０ＮおよびＤ８０Ｒからなる群から選択される、請求項１０８に記載のヘテロ多量体。
【請求項１１０】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のＬ７９、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８およびＤ８０のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１０４から１０９までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１１１】
前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０ＮおよびＤ８０Ｒからなる群から選択される、請求項１１０に記載のヘテロ多量体。
【請求項１１２】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項１０４から１１１までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１１３】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ヘテロ多量体形成を阻害する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項１０４から１１２までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１１４】
ヘテロ二量体である、請求項１０４から１１３までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１１５】
配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、および配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列を含まない、ヘテロ多量体。
【請求項１１６】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２の７９に対応する酸性アミノ酸位置を含む、請求項１１５に記載のヘテロ多量体。
【請求項１１７】
前記酸性アミノ酸が、アスパラギン酸である、請求項１１６に記載のヘテロ多量体。
【請求項１１８】
前記酸性アミノ酸が、グルタミン酸である、請求項１１６に記載のヘテロ多量体。
【請求項１１９】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２の７９に対応するアミノ酸位置における酸性アミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）を含まない、請求項１１５から１１７までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１２０】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２の７９に対応するアミノ酸位置におけるロイシンを含む、請求項１１９に記載のヘテロ多量体。
【請求項１２１】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のＦ８２、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１１５から１２０までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１２２】
前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される、請求項１２１に記載のヘテロ多量体。
【請求項１２３】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のＦ８２、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１１５から１２２までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１２４】
前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される、請求項１２３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１２５】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項１１５から１２４までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１２６】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ヘテロ多量体形成を阻害する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項１１５から１２５までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１２７】
ヘテロ二量体である、請求項１１５から１２６までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１２８】
配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、および配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列を含まない、ヘテロ多量体。
【請求項１２９】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２の７９に対応する酸性アミノ酸位置を含む、請求項１２８に記載のヘテロ多量体。
【請求項１３０】
前記酸性アミノ酸が、アスパラギン酸である、請求項１２９に記載のヘテロ多量体。
【請求項１３１】
前記酸性アミノ酸が、グルタミン酸である、請求項１２９に記載のヘテロ多量体。
【請求項１３２】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２の７９に対応するアミノ酸位置における酸性アミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）を含まない、請求項１２８から１３１までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１３３】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２の７９に対応するアミノ酸位置におけるロイシンを含む、請求項１３２に記載のヘテロ多量体。
【請求項１３４】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のＦ８２、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１２８から１３３までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１３５】
前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される、請求項１３４に記載のヘテロ多量体。
【請求項１３６】
前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号２のＦ８２、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１２８から１３５までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１３７】
前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される、請求項１３６に記載のヘテロ多量体。
【請求項１３８】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項１２８から１３７までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１３９】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ヘテロ多量体形成を阻害する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項１２８から１３８までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１４０】
ヘテロ二量体である、請求項１２８から１３９までのいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１４１】
グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸および脂質部分とコンジュゲートしたアミノ酸からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、前記請求項のいずれかに記載のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項１４２】
グリコシル化されており、ＣＨＯ細胞における前記ポリペプチドから入手可能なグリコシル化パターンを有する、請求項１４１に記載のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド。
【請求項１４３】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸および脂質部分とコンジュゲートしたアミノ酸からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体。
【請求項１４４】
前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、グリコシル化されており、ＣＨＯ細胞における前記ポリペプチドから入手可能なグリコシル化パターンを有する、請求項１４３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１４５】
１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドまたはヘテロ多量体。
【請求項１４６】
少なくとも１×１０−７ＭのＫＤで、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する、請求項１４５に記載のポリペプチドまたはヘテロ多量体。
【請求項１４７】
前記１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドが、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣおよびアクチビンＢＥからなる群から選択される、請求項１４５または１４６に記載のポリペプチドまたはヘテロ多量体。
【請求項１４８】
１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドを阻害する、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドまたはヘテロ多量体。
【請求項１４９】
１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する、請求項１４８に記載のポリペプチドまたはヘテロ多量体。
【請求項１５０】
１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのＳｍａｄシグナル伝達を阻害する、請求項１４９に記載のポリペプチドまたはヘテロ多量体。
【請求項１５１】
細胞に基づくアッセイにおいて、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する、請求項１４８から１５０までのいずれか一項に記載のポリペプチドまたはヘテロ多量体。
【請求項１５２】
ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣおよびアクチビンＢＥからなる群から選択される１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドを阻害する、請求項１４８から１５１までのいずれか一項に記載のポリペプチドまたはヘテロ多量体。
【請求項１５３】
請求項１から４２までのいずれか一項に記載のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ならびにＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩおよびＭＩＳＲＩＩポリペプチドからなる群から選択される第２のポリペプチドまたはその機能的断片を含むヘテロ多量体タンパク質。
【請求項１５４】
前記第２のポリペプチドが、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはその機能的断片である、請求項１５３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１５５】
前記ＡＬＫ１ポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号５４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１５４に記載のヘテロ多量体。
【請求項１５６】
前記ＡＬＫ１ポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２および６３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１５４に記載のヘテロ多量体。
【請求項１５７】
前記第２のポリペプチドが、ＡＬＫ２ポリペプチドまたはその機能的断片である、請求項１５３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１５８】
前記ＡＬＫ２ポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号６４もしくは６５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１５７に記載のヘテロ多量体。
【請求項１５９】
前記ＡＬＫ２ポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２および７３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１５７に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６０】
前記第２のポリペプチドが、ＡＬＫ３ポリペプチドまたはその機能的断片である、請求項１５３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６１】
前記ＡＬＫ３ポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号７４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１６０に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６２】
前記ＡＬＫ３ポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号７４、７５、７６、７７、８０もしくは８１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１６０に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６３】
前記第２のポリペプチドが、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはその機能的断片である、請求項１５３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６４】
前記ＡＬＫ４ポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号８４もしくは８５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１６３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６５】
前記ＡＬＫ４ポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号８４、８６、８５、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４および９５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１６３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６６】
前記第２のポリペプチドが、ＡＬＫ５ポリペプチドまたはその機能的断片である、請求項１５３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６７】
前記ＡＬＫ５ポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号９６もしくは９７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１６６に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６８】
前記ＡＬＫ５ポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号９６、９８、９７、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６および１０７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１６６に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６９】
前記第２のポリペプチドが、ＡＬＫ６ポリペプチドまたはその機能的断片である、請求項１５３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７０】
前記ＡＬＫ６ポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号１０８もしくは１１０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１６９に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７１】
前記ＡＬＫ６ポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８および１１９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１６９に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７２】
前記第２のポリペプチドが、ＡＬＫ７ポリペプチドまたはその機能的断片である、請求項１５３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７３】
前記ＡＬＫ７ポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号１２０、１２１もしくは１２２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１７２に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７４】
前記ＡＬＫ７ポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号１２０、１２３、１２４、１２５、１２１、１２６、１２２、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５および１３６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１７２に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７５】
前記第２のポリペプチドが、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはその機能的断片である、請求項１５３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７６】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号１３７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１７５に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７７】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６および１４７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１７５に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７８】
前記第２のポリペプチドが、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片である、請求項１５３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７９】
前記ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号２０４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１７８に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８０】
前記ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号１６１、１６２、１６０、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８および１７９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１７８に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８１】
前記第２のポリペプチドが、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片である、請求項１５３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８２】
前記ＢＭＰＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号１４８もしくは１４９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１８１に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８３】
前記ＢＭＰＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号１４８、１５０、１４９、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８および１５９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１８１に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８４】
前記第２のポリペプチドが、ＭＩＳＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片である、請求項１５３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８５】
前記ＭＩＳＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号１８０、１８１もしくは１８２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１８４に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８６】
前記ＭＩＳＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片が、配列番号１８０、１８３、１８１、１８４、１８２、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２および１９３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、請求項１８４に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８７】
前記請求項のいずれかに記載のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬調製物。
【請求項１８８】
前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体および薬学的に許容される担体を含む医薬調製物。
【請求項１８９】
約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満または約１％未満のホモ多量体を含む、請求項１８８に記載の医薬調製物。
【請求項１９０】
前記請求項のいずれかに記載のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（複数可）の１つまたは複数のコード配列を含む、単離されたおよび／または組換え核酸。
【請求項１９１】
配列番号３、１０、３１、３５、３８、４１、４４または４７のいずれか１つに対応する核酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、請求項１９０に記載の単離されたおよび／または組換え核酸。
【請求項１９２】
請求項１９０または１９１に記載のコード配列に作動可能に連結したプロモーター配列を含む、単離されたおよび／または組換えポリヌクレオチド配列。
【請求項１９３】
請求項１９０から１９２までのいずれか一項に記載の単離されたおよび／または組換え核酸を含むベクター。
【請求項１９４】
請求項１９０から１９２までのいずれか一項に記載の単離されたおよび／または組換えポリヌクレオチド配列、または請求項１９３に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１９５】
前記請求項のいずれかに記載のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを作製するための方法であって、前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養するステップを含み、前記細胞が、請求項１９０から１９２までのいずれか一項に記載の核酸またはベクターを含む、方法。
【請求項１９６】
発現されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを回収するステップをさらに含む、請求項１９５に記載の方法。
【請求項１９７】
前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体を作製するための方法であって、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養するステップを含み、前記細胞が、請求項１９０から１９２までのいずれか一項に記載の第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列を含む核酸またはベクター、および請求項１９０から１９２までのいずれか一項に記載の第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列を含む第２の核酸またはベクターを含む、方法。
【請求項１９８】
発現されたヘテロ多量体ポリペプチドを回収するステップをさらに含む、請求項１９７に記載の方法。
【請求項１９９】
前記請求項のいずれかに記載のヘテロ多量体を作製するための方法であって、
ａ．第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現に適した条件下で第１の細胞を培養するステップであって、前記細胞が、請求項１９０から１９２までのいずれか一項に記載の第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列を含む核酸またはベクターを含む、ステップと；
ｂ．前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを回収するステップと；
ｃ．前記第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現に適した条件下で第２の細胞を培養するステップであって、前記細胞が、請求項１９０から１９２までのいずれか一項に記載の第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列を含む核酸またはベクターを含む、ステップと；
ｄ．前記第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを回収するステップと；
ｅ．ヘテロ多量体形成に適した条件下で前記第１および第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを組み合わせるステップと
を含む方法。
【請求項２００】
発現されたヘテロ多量体ポリペプチドを回収するステップをさらに含む、請求項１９９に記載の方法。
【請求項２０１】
患者における赤血球レベルまたはヘモグロビンレベルを増大させるための方法であって、前記請求項のいずれかに記載のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはヘテロ多量体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法。
【請求項２０２】
患者における貧血または貧血に関連する障害を処置するための方法であって、前記請求項のいずれかに記載のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはヘテロ多量体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法。
【請求項２０３】
患者における筋量および／または筋力を増大させるための方法であって、前記請求項のいずれかに記載のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはヘテロ多量体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法。
【請求項２０４】
患者における筋肉関連障害を処置するための方法であって、前記請求項のいずれかに記載のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはヘテロ多量体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法。
【請求項２０５】
前記障害が、望ましくなく低い筋肉成長および／または筋衰弱に関連する、請求項２０４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年１０月５日に出願された米国仮出願第６２／４０４，７１８号からの優先権の利益を主張する。前記出願の明細書は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）スーパーファミリーは、共通の配列エレメントおよび構造モチーフを共有する種々の増殖因子を含有する。これらのタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物どちらにおいても多種多様な細胞型に対して生物学的効果を発揮することが公知である。当該スーパーファミリーのメンバーは、胚発生中にパターン形成および組織特定化において重要な機能を果たし、脂肪生成、筋形成、軟骨形成、心臓発生、造血、神経発生、および上皮細胞分化を含めた種々の分化プロセスに影響を及ぼし得る。ファミリーは、２つの一般的な分枝：ＢＭＰ／ＧＤＦおよびＴＧＦ−ベータ／アクチビン／ＢＭＰ１０分枝に分けられ、これらのメンバーは、多様な、多くの場合補完的な効果を有する。ＴＧＦ−ベータファミリーのメンバーの活性を操作することにより、多くの場合、生物体において有意な生理的変化を引き起こすことが可能である。例えば、ピエモンテおよびベルジャンブルーウシ品種は、ＧＤＦ８（ミオスタチンとも称される）遺伝子に、筋肉量の顕著な増加を引き起こす機能喪失型突然変異を有する。Ｇｒｏｂｅｔら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．、（１９９７年）１７巻（１号）：７１〜４頁。さらに、ヒトでは、ＧＤＦ８の不活性対立遺伝子が筋肉量の増加、および報告によれば、例外的な強度に関連付けられている。Ｓｃｈｕｅｌｋｅら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（２００４年）、３５０巻：２６８２〜８頁。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｇｒｏｂｅｔら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．、（１９９７年）１７巻（１号）：７１〜４頁
【非特許文献２】Ｓｃｈｕｅｌｋｅら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（２００４年）、３５０巻：２６８２〜８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
赤血球レベル、骨、軟骨および他の組織の変化は、適切なＴＧＦ−ベータファミリーメンバーによって媒介されるシグナル伝達を作動させるまたは拮抗することにより達成することができる。よって、ＴＧＦ−ベータシグナル伝達の強力な制御因子として機能する作用剤が必要とされている。
ある特定の態様では、本開示は、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、特に、バリアントＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体タンパク質およびバリアントＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質を提供する。例によって実証される通り、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンドに対する結合親和性の変更を呈する、いくつかのバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが同定された。リガンド結合活性を低下および増大させるＡｃｔＲＩＩＢバリアントが同定された。そのようなバリアントは、種々の適用における、対応する未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと比較したリガンド選択性（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）の増大または低下に特に有用となり得る。例えば、例は、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの一部が、例えば、体重量（例えば、筋量）を増大させる能力、ならびに赤血球およびヘモグロビンレベルの増大を含む、様々なｉｎ  ｖｉｖｏ効果を有することをさらに実証する。したがって、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されている適用を含む種々の治療適用において有用となるはずである。
【０００５】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号２のアミノ酸２０〜２９（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９）のいずれか１つで始まり、配列番号２のアミノ酸１０９〜１３４（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドであって、Ｋ５５、Ｆ８２、Ｌ７９、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２からなる群から選択される配列番号２の位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ならびに１つまたは複数のそのようなＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体複合体に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２５〜１３１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２０〜１３４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＫ５５に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｋ５５Ａである。一部の実施形態では、置換は、Ｋ５５Ｅである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＬ７９に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｌ７９Ｄである。一部の実施形態では、置換は、Ｌ７９Ｅである。一部の実施形態では、置換は、Ｌ７９Ｐである。一部の実施形態では、置換は、Ｌ７９Ａである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＦ８２に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｆ８２Ｉである。一部の実施形態では、置換は、Ｆ８２Ｋである。一部の実施形態では、置換は、Ｆ８２Ａである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＡ２４に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ａ２４Ｎである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＫ７４に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｋ７４Ａである。一部の実施形態では、置換は、Ｋ７４Ａである。一部の実施形態では、置換は、Ｋ７４Ｆである。一部の実施形態では、置換は、Ｋ７４Ａである。一部の実施形態では、置換は、Ｋ７４Ｉである。一部の実施形態では、置換は、Ｋ７４Ａである。一部の実施形態では、置換は、Ｋ７４Ｙである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＤ８０に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｄ８０Ａである。一部の実施形態では、置換は、Ｄ８０Ｆである。一部の実施形態では、置換は、Ｄ８０Ｋである。一部の実施形態では、置換は、Ｄ８０Ｇである。一部の実施形態では、置換は、Ｄ８０Ｍである。一部の実施形態では、置換は、Ｄ８０Ｉである。一部の実施形態では、置換は、Ｄ８０Ｎである。一部の実施形態では、置換は、Ｄ８０Ｒである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＲ６４に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｒ６４Ｋである。一部の実施形態では、置換は、Ｒ６４Ｎである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＰ１２９に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｐ１２９Ｓである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＰ１３０に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｐ１３０Ａである。一部の実施形態では、置換は、Ｐ１３０Ｒである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＥ３７に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｅ３７Ａである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＲ４０に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｒ４０Ａである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＤ５４に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｄ５４Ａである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＲ５６に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｒ５６Ａである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＷ７８に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｗ７８Ａである。
【０００６】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＫ５５に対応する位置におけるアラニンを含む。
【０００７】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＫ５５に対応する位置におけるアラニンを含む。
【０００８】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＫ５５に対応する位置におけるグルタミン酸を含む。
【０００９】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＫ５５に対応する位置におけるグルタミン酸を含む。
【００１０】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＦ８２に対応する位置におけるイソロイシンを含む。
【００１１】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＦ８２に対応する位置におけるイソロイシンを含む。
【００１２】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＦ８２に対応する位置におけるリシンを含む。
【００１３】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＦ８２に対応する位置におけるリシンを含む。
【００１４】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＬ７９に対応する位置におけるグルタミン酸を含む。
【００１５】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＬ７９に対応する位置におけるグルタミン酸を含む。
【００１６】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＬ７９に対応する位置におけるグルタミン酸を含む。
【００１７】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＬ７９に対応する位置におけるグルタミン酸を含む。
【００１８】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＬ７９に対応する位置におけるグルタミン酸を含む。
【００１９】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＬ７９に対応する位置におけるグルタミン酸を含む。
【００２０】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＬ７９に対応する位置におけるグルタミン酸を含む。
【００２１】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＬ７９に対応する位置におけるグルタミン酸を含む。
【００２２】
ある特定の態様では、本開示のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ホモ二量体を形成する。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、共有結合性相互作用によりヘテロ二量体を形成することができる。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、非共有結合性相互作用によりヘテロ二量体を形成することができる。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、共有結合および非共有結合性相互作用の両方によりヘテロ二量体を形成することができる。
【００２３】
ある特定の態様では、そのホモ多量体（例えば、ホモ二量体）を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、そのホモ多量体を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、少なくとも１×１０−７ＭのＫＤで、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドは、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣおよびアクチビンＢＥからなる群から選択される。
【００２４】
ある特定の態様では、そのホモ多量体（例えば、ホモ二量体）を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドを阻害する。一部の実施形態では、そのホモ多量体を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、そのホモ多量体を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのＳｍａｄシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、そのホモ多量体を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、細胞に基づくアッセイにおいて、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、そのホモ多量体を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣおよびアクチビンＢＥからなる群から選択される１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドを阻害する。
【００２５】
ある特定の態様では、本開示は、少なくとも１つのバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、本明細書に記載されている１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を含むヘテロ多量体に関する。例えば、一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体タンパク質は、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含み、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２０〜２９（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９）のいずれか１つで始まり、配列番号２のアミノ酸１０９〜１３４（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２からなる群から選択される配列番号２アミノ酸に対応する位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２０〜２９（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９）のいずれか１つで始まり、配列番号２のアミノ酸１０９〜１３４（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと比較して異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２５〜１３１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２５〜１３１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２０〜１３４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２５〜１３１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号２のＫ５５に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｋ５５Ａである。一部の実施形態では、置換は、Ｋ５５Ｅである。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号２のＬ７９に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｌ７９Ｄである。一部の実施形態では、置換は、Ｌ７９Ｅである。一部の実施形態では、置換は、Ｌ７９Ｐである。一部の実施形態では、置換は、Ｌ７９Ａである。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号２のＦ８２に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｆ８２Ｉである。一部の実施形態では、置換は、Ｆ８２Ｋである。一部の実施形態では、置換は、Ｆ８２Ａである。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号２のＡ２４に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ａ２４Ｎである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のＫ７４に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｋ７４Ａである。一部の実施形態では、置換は、Ｋ７４Ａである。一部の実施形態では、置換は、Ｋ７４Ｆである。一部の実施形態では、置換は、Ｋ７４Ａである。一部の実施形態では、置換は、Ｋ７４Ｉである。一部の実施形態では、置換は、Ｋ７４Ａである。一部の実施形態では、置換は、Ｋ７４Ｙである。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号２のＤ８０に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｄ８０Ａである。一部の実施形態では、置換は、Ｄ８０Ｆである。一部の実施形態では、置換は、Ｄ８０Ｋである。一部の実施形態では、置換は、Ｄ８０Ｇである。一部の実施形態では、置換は、Ｄ８０Ｍである。一部の実施形態では、置換は、Ｄ８０Ｉである。一部の実施形態では、置換は、Ｄ８０Ｎである。一部の実施形態では、置換は、Ｄ８０Ｒである。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号２のＲ６４に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｒ６４Ｋである。一部の実施形態では、置換は、Ｒ６４Ｎである。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号２のＰ１２９に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｐ１２９Ｓである。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号２のＰ１３０に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｐ１３０Ａである。一部の実施形態では、置換は、Ｐ１３０Ｒである。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号２のＥ３７に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｅ３７Ａである。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号２のＲ４０に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｒ４０Ａである。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号２のＤ５４に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｄ５４Ａである。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号２のＲ５６に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｒ５６Ａである。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号２のＷ７８に対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｗ７８Ａである。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２からなる群から選択される配列番号２の位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えば、一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｋ５５Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される配列番号２のアミノ酸配列に関する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ヘテロ多量体形成を阻害する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾およびヘテロ多量体形成を阻害する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００２６】
ある特定の態様では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインおよび１つまたは複数の異種ドメインを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインおよび１つまたは複数の異種ドメインまたはＦｃドメインの間に位置するリンカードメインをさらに含む。一部の実施形態では、リンカードメインは、ＴＧＧＧ、ＴＧＧＧＧ、ＳＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＳＧＧＧおよびＧＧＧＧＳから選択される。
【００２７】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。
【００２８】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。
【００２９】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。
【００３０】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。
【００３１】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。
【００３２】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。
【００３３】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。
【００３４】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。
【００３５】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。
【００３６】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。
【００３７】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。
【００３８】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。
【００３９】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。
【００４０】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。
【００４１】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。
【００４２】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、アミノ酸位置１３２におけるシステイン、アミノ酸位置１３８におけるグルタミン酸、アミノ酸位置１４４におけるトリプトファンおよびアミノ酸位置２１７におけるアスパラギン酸を含む。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、アミノ酸位置１２７におけるシステイン、アミノ酸位置１４４におけるセリン、位置１４６におけるアラニン、アミノ酸位置１６２におけるアルギニン、アミノ酸位置１７９におけるアルギニンおよびアミノ酸位置１８５におけるバリンを含む。
【００４３】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、アミノ酸位置１３２におけるシステイン、アミノ酸位置１３８におけるグルタミン酸、アミノ酸位置１４４におけるトリプトファンおよびアミノ酸位置２１７におけるアスパラギン酸を含む。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、アミノ酸位置１２７におけるシステイン、アミノ酸位置１４４におけるセリン、位置１４６におけるアラニン、アミノ酸位置１６２におけるアルギニン、アミノ酸位置１７９におけるアルギニンおよびアミノ酸位置１８５におけるバリンを含む。
【００４４】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、アミノ酸位置１３２におけるシステイン、アミノ酸位置１４４におけるトリプトファンおよびアミノ酸位置４３５におけるアルギニンを含む。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、アミノ酸位置１２７におけるシステイン、アミノ酸位置１４４におけるセリン、アミノ酸位置１４６におけるアラニンおよびアミノ酸位置１８５におけるバリンを含む。
【００４５】
ある特定の態様では、本開示は、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体タンパク質に関し、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含み、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、アミノ酸位置１３２におけるシステイン、アミノ酸位置１４４におけるトリプトファンおよびアミノ酸位置４３５におけるアルギニンを含む。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質Ｆｃドメインは、アミノ酸位置１２７におけるシステイン、アミノ酸位置１４４におけるセリン、アミノ酸位置１４６におけるアラニンおよびアミノ酸位置１８５におけるバリンを含む。
【００４６】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列を含まない。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の５５に対応するアミノ酸位置におけるアラニンを含む。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の５５に対応するアミノ酸位置におけるアラニンを含まない。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の５５に対応するアミノ酸位置におけるリシンを含む。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＦ８２、Ｌ７９、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＦ８２、Ｌ７９、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ヘテロ多量体形成を阻害する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、ヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００４７】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列を含まない。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の５５に対応するアミノ酸位置におけるグルタミン酸を含む。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の５５に対応するアミノ酸位置におけるグルタミン酸を含まない。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の５５に対応するアミノ酸位置におけるリシンを含む。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＦ８２、Ｌ７９、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＦ８２、Ｌ７９、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ヘテロ多量体形成を阻害する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、ヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００４８】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列を含まない。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の８２に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシンを含む。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の８２に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ  ａｃｉｄ）を含まない。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の８２に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンを含む。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＬ７９、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８およびＤ８０のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０ＮおよびＤ８０Ｒからなる群から選択される。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＬ７９、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８およびＤ８０のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０ＮおよびＤ８０Ｒからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ヘテロ多量体形成を阻害する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、ヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００４９】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列を含まない。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の８２に対応するアミノ酸位置におけるリシンを含む。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の８２に対応するアミノ酸位置におけるリシンを含まない。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の８２に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンを含む。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＬ７９、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８およびＤ８０のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０ＮおよびＤ８０Ｒからなる群から選択される。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＬ７９、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８およびＤ８０のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ａ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０ＮおよびＤ８０Ｒからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ヘテロ多量体形成を阻害する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、ヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００５０】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、および配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列を含まない。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の７９に対応する酸性アミノ酸位置を含む。一部の実施形態では、酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の７９に対応するアミノ酸位置における酸性アミノ酸（ａｃｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）を含まない。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の７９に対応するアミノ酸位置におけるロイシンを含む。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＦ８２、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＦ８２、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／または第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ヘテロ多量体形成を阻害する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、ヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【００５１】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、および配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列を含まない。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の７９に対応する酸性アミノ酸位置を含む。一部の実施形態では、酸性アミノ酸は、アスパラギン酸である。一部の実施形態では、酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の７９に対応するアミノ酸位置における酸性アミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）を含まない。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２の７９に対応するアミノ酸位置におけるロイシンを含む。一部の実施形態では、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＦ８２、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｌ７９Ｐ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される。一部の実施形態では、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のＦ８２、Ａ２４、Ｋ７４、Ｒ６４、Ｐ１２９、Ｐ１３０、Ｅ３７、Ｒ４０、Ｄ５４、Ｒ５６、Ｗ７８、Ｄ８０およびＦ８２のいずれか１つに対応するアミノ酸位置における１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ａ２４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｎ、Ｋ７４Ａ、Ｐ１２９Ｓ、Ｐ１３０Ａ、Ｐ１３０Ｒ、Ｅ３７Ａ、Ｒ４０Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｋ７４Ｙ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｉ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｍ、Ｄ８０Ｎ、Ｄ８０ＲおよびＦ８２Ａからなる群から選択される。
【００５２】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されているＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのいずれか、ならびにＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩおよびＭＩＳＲＩＩポリペプチドからなる群から選択される第２のポリペプチドまたはその機能的断片を含むヘテロ多量体タンパク質を提供する。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号５４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号５４、５５、５６、５７、６０および６１のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＡＬＫ２ポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＡＬＫ２ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号６４もしくは６５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ２ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号６４、６５、６６、６７、７０および７１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＡＬＫ３ポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＡＬＫ３ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号７４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ３ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号７４、７５、７６、７７、８０もしくは８１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号８４もしくは８５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号８４、８６、８５、８７、８８、８９、９２および９３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＡＬＫ５ポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＡＬＫ５ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号９６もしくは９７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ５ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号９６、９８、９７、９９、１００、１０１、１０４および１０５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＡＬＫ６ポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＡＬＫ６ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１０８もしくは１１０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ６ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１６および１１７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＡＬＫ７ポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＡＬＫ７ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１２０、１２１もしくは１２２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ７ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１２０、１２３、１２４、１２５、１２１、１２６、１２２、１２７、１２８、１２９、１３０、１３３および１３４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１３７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４４および１４５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号２０４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１６１、１６２、１６０、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１７２、１７３、１７４および１７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１４８もしくは１４９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１４８、１５０、１４９、１５１、１５２、１５３、１５６および１５７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＭＩＳＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＭＩＳＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１８０、１８１もしくは１８２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＭＩＳＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１８０、１８３、１８１、１８４、１８２および１８５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。
【００５３】
ある特定の態様では、本開示のヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、少なくとも１×１０−７ＭのＫＤで、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドは、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣおよびアクチビンＢＥからなる群から選択される。
【００５４】
ある特定の態様では、本開示のヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドを阻害する。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのＳｍａｄシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、細胞に基づくアッセイにおいて、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣおよびアクチビンＢＥからなる群から選択される１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドを阻害する。
【００５５】
ある特定の態様では、本開示は、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸および脂質部分とコンジュゲートしたアミノ酸からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにこれを含むホモ多量体およびヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、グリコシル化されており、ＣＨＯ細胞におけるポリペプチドから入手可能なグリコシル化パターンを有する。
【００５６】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されているＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのいずれか、ならびにＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩおよびＭＩＳＲＩＩポリペプチドからなる群から選択される第２のポリペプチドまたはその機能的断片を含むヘテロ多量体タンパク質を提供する。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号５４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２および６３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＡＬＫ２ポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＡＬＫ２ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号６４もしくは６５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ２ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２および７３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＡＬＫ３ポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＡＬＫ３ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号７４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ３ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号７４、７５、７６、７７、８０もしくは８１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号８４もしくは８５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号８４、８６、８５、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４および９５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＡＬＫ５ポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＡＬＫ５ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号９６もしくは９７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ５ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号９６、９８、９７、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６および１０７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＡＬＫ６ポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＡＬＫ６ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１０８もしくは１１０のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ６ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８および１１９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＡＬＫ７ポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＡＬＫ７ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１２０、１２１もしくは１２２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ７ポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１２０、１２３、１２４、１２５、１２１、１２６、１２２、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５および１３６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１３７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６および１４７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号２０４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１６１、１６２、１６０、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８および１７９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１４８もしくは１４９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１４８、１５０、１４９、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８および１５９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＭＩＳＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片である。一部の実施形態では、ＭＩＳＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１８０、１８１もしくは１８２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、ＭＩＳＲＩＩポリペプチドまたはその機能的断片は、配列番号１８０、１８３、１８１、１８４、１８２、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２および１９３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列またはその機能的断片を含む。
【００５７】
ある特定の態様では、本開示は、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにこれを含むホモ多量体およびヘテロ多量体、薬学的に許容される担体を含む医薬調製物に関する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体（ｈｅｔｅｒｏｍｕｌｉｔｍｅｒ）を含む医薬調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満または約１％未満のホモ多量体を含む。
【００５８】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載されているＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（複数可）の１つまたは複数のコード配列を含む単離されたおよび／または組換え核酸に関する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、配列番号３、１０、３１、３５、３８、４１、４４または４７のいずれか１つに対応する核酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である単離されたおよび／または組換え核酸に関する。一部の実施形態では、本開示の単離されたおよび／または組換えポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載されているコード配列（例えば、配列番号３、１０、３１、３５、３８、４１、４４または４７のいずれか１つに対応する核酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸）に作動可能に連結したプロモーター配列を含む。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている単離されたおよび／または組換え核酸（例えば、配列番号３、１０、３１、３５、３８、４１、４４または４７のいずれか１つに対応する核酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸）を含むベクターに関する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている単離されたおよび／または組換えポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号３、１０、３１、３５、３８、４１、４４または４７のいずれか１つに対応する核酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸）を含む細胞に関する。一部の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＯＳ細胞である。
【００５９】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載されているバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにこれを含むホモ多量体およびヘテロ多量体を作製する方法に関する。そのような方法は、適した細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞）において本明細書に開示されている核酸のいずれかを発現させるステップを含むことができる。そのような方法は、ａ）可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養するステップを含むことができ、前記細胞は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド発現構築物を含む。一部の実施形態では、本方法は、発現されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを回収するステップをさらに含む。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、細胞培養物からタンパク質を得るための周知技法のいずれかを使用して、粗製画分、部分的に精製された画分または高度に精製された画分として回収され得る。
【００６０】
一部の実施形態では、本開示は、患者における赤血球レベルまたはヘモグロビンレベルを増大させるための方法であって、本明細書に記載されているバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにこれを含むホモ多量体およびヘテロ多量体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法に関する。
【００６１】
一部の実施形態では、本開示は、患者における貧血または貧血に関連する障害（例えば、本明細書に記載されている障害）を処置するための方法であって、本明細書に記載されているバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにこれを含むホモ多量体およびヘテロ多量体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法に関する。
【００６２】
一部の実施形態では、本開示は、患者における筋量および／または筋力を増大させるための方法であって、本明細書に記載されているバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにこれを含むホモ多量体およびヘテロ多量体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法に関する。
【００６３】
一部の実施形態では、本開示は、患者における筋肉関連障害を処置するための方法であって、本明細書に記載されているバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むＡｃｔＲＩＩＢならびにこれを含むホモ多量体およびヘテロ多量体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、障害は、望ましくなく低い筋肉成長および／または筋衰弱に関連する。そのような障害は、筋萎縮、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および筋消耗障害（例えば、カヘキシー、食欲不振、ＤＭＤ症候群、ＢＭＤ症候群、ＡＩＤＳ消耗症候群、筋ジストロフィー、神経筋疾患、運動ニューロン疾患、神経筋接合部の疾患、および炎症性ミオパチー）を含む。
【００６４】
一部の実施形態では、本開示は、体脂肪含量を低下または体脂肪含量の増大速度を減少させ、肥満、インスリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、心血管疾患、がん、高血圧、変形性関節症、脳卒中、呼吸器問題および胆嚢疾患など、望ましくない体重増加に関連する障害を処置するための方法であって、本明細書に記載されているバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むＡｃｔＲＩＩＢならびにこれを含むホモ多量体およびヘテロ多量体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１−１】図１は、第１のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（「Ｘ」と示される）と、第２のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（「Ｙ」と示される）または未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（「Ｙ」と示される）のいずれかとを含むヘテロマータンパク質複合体の概略図例を示す。例示された実施形態では、第１のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用対の第１のメンバー（「Ｃ１」）を含む融合ポリペプチドの一部であり、第２のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのいずれかは、相互作用対の第２のメンバー（「Ｃ２」）を含む融合ポリペプチドの一部である。好適な相互作用対としては、例えば、重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用対、短縮、および本明細書に記載のものなどのそのバリアントが挙げられる［例えば、Ｓｐｉｅｓｓら（２０１５年）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７巻（２Ａ号）：９５〜１０６頁］。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、第１のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、第２のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、または未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと、相互作用対の対応するメンバーとの間に配置してもよい。相互作用対の第１および第２のメンバーは、無誘導であってよく、これは、対のメンバーが互いに会合するか、または実質的な優先性なしに自己会合してもよく、それらが同じまたは異なるアミノ酸配列を有してもよいことを意味する。図１Ａを参照されたい。あるいは、相互作用対は、誘導（非対称）対であってよく、これは、対のメンバーが自己会合ではなく、互いに優先的に会合することを意味する。図１Ｂを参照されたい。
【図１−２】図１は、第１のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（「Ｘ」と示される）と、第２のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（「Ｙ」と示される）または未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（「Ｙ」と示される）のいずれかとを含むヘテロマータンパク質複合体の概略図例を示す。例示された実施形態では、第１のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用対の第１のメンバー（「Ｃ１」）を含む融合ポリペプチドの一部であり、第２のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのいずれかは、相互作用対の第２のメンバー（「Ｃ２」）を含む融合ポリペプチドの一部である。好適な相互作用対としては、例えば、重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用対、短縮、および本明細書に記載のものなどのそのバリアントが挙げられる［例えば、Ｓｐｉｅｓｓら（２０１５年）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７巻（２Ａ号）：９５〜１０６頁］。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、第１のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、第２のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、または未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと、相互作用対の対応するメンバーとの間に配置してもよい。相互作用対の第１および第２のメンバーは、無誘導であってよく、これは、対のメンバーが互いに会合するか、または実質的な優先性なしに自己会合してもよく、それらが同じまたは異なるアミノ酸配列を有してもよいことを意味する。図１Ａを参照されたい。あるいは、相互作用対は、誘導（非対称）対であってよく、これは、対のメンバーが自己会合ではなく、互いに優先的に会合することを意味する。図１Ｂを参照されたい。
【００６６】
【図２】図２は、複数のＡｃｔＲＩＩＢおよびＡｃｔＲＩＩＡ結晶構造の合成分析に基づいてリガンドと直接接触すると本明細書で推定される残基を有する（囲みで示される）、ヒトＡｃｔＲＩＩＡおよびヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのアラインメントを示す。
【００６７】
【図３】図３は、その細胞内ドメインを含まない様々な脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質、その細胞内ドメインを含まないヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質、およびコンセンサスＡｃｔＲＩＩ前駆体タンパク質の複数の配列アラインメントを示す。
【００６８】
【図４】図４は、Ｃｌｕｓｔａｌ  ２．１を使用したヒトＩｇＧアイソタイプに由来するＦｃドメインの複数の配列アラインメントを示す。ヒンジ領域は、点線の下線で示される。二重下線は、非対称鎖対合を促進するためのＩｇＧ１（配列番号１３）Ｆｃ中で工学的に作製された位置ならびに他のアイソタイプＩｇＧ４（配列番号１７）、ＩｇＧ２（配列番号１４）、およびＩｇＧ３（配列番号１５）に関する対応する位置の例を示す。
【００６９】
【図５】図５は、番号付けが天然のヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体配列（配列番号２を参照されたい）に基づく、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【００７０】
【図６】図６は、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２；ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１０９７．２）を示す。シグナルペプチドは下線付きであり、細胞外ドメインは太字であり（配列番号１とも呼ばれる）、潜在的なＮ結合型グリコシル化部位は囲まれている。
【００７１】
【図７】図７は、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）細胞外ドメインポリペプチドをコードする核酸配列を示す。
【００７２】
【図８】図８は、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質をコードする核酸配列を示す。配列番号４は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１０６のヌクレオチド２５〜１５６０からなる。
【００７３】
【図９】図９は、３７℃での表面プラズモン共鳴によって決定された、ＡｃｔＲＩＩＢバリアントドメインまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢドメインを含むホモ二量体Ｆｃ融合タンパク質のリガンド結合動態の値を示す。アミノ酸の番号付けは、配列番号２に基づく。
【００７４】
【図１０】図１０は、２５℃での表面プラズモン共鳴によって決定された、ＡｃｔＲＩＩＢバリアントドメインまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢドメインを含むホモ二量体Ｆｃ融合タンパク質のリガンド結合動態の値を示す。アミノ酸の番号付けは、配列番号２に基づく。
【００７５】
【図１１】図１１は、ビヒクルまたはＡｃｔＲＩＩＢバリアントドメインもしくは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢドメインを含むホモ二量体Ｆｃ融合タンパク質で処置された野生型マウスに関するベースラインからの体重の変化を示す。
【００７６】
【図１２】図１２は、ビヒクルまたはＡｃｔＲＩＩＢバリアントドメインもしくは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢドメインを含むホモ二量体Ｆｃ融合タンパク質で処置された野生型マウスにおけるヘモグロビン濃度を示す。
【００７７】
【図１３】図１３は、１および１５日目に９ｍｇ／ｋｇ（ｓ．ｃ．）のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ、またはＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｆｃで処置されたカニクイザルにおける赤血球計数を示す。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｆｃ処置は、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ（陽性対照）のものと同様の量により、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（陰性対照）と比較してＲＢＣ計数を増加させた。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
１．概要
ある特定の態様では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。本明細書で使用される場合、用語「ＡｃｔＲＩＩＢ」は、いずれかの種に由来する、アクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）タンパク質およびＡｃｔＲＩＩＢ関連タンパク質のファミリーを指す。ＡｃｔＲＩＩＢファミリーのメンバーは一般に全て、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／トレオニンキナーゼ特異性を有する細胞質ドメインで構成された膜貫通タンパク質である。ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質のアミノ酸配列を図６に示す（配列番号２）。
【００７９】
用語「ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＢファミリーメンバーのいずれかの天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチド、および有用な活性を保持するそのいずれかのバリアント（突然変異体、断片、融合体およびペプチド模倣形態を含む）を指すように使用されている。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの配列と少なくとも約８０％同一である配列、好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれを超える同一性を有するいずれか公知のＡｃｔＲＩＩＢの配列に由来するポリペプチドを含む。
【００８０】
特異的な実施形態では、本発明は、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。本明細書に記載されている通り、用語「可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」は一般に、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチドを指す。用語「可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質のいずれかの天然に存在する細胞外ドメイン、および有用な活性を保持するそのいずれかのバリアント（突然変異体、断片およびペプチド模倣形態を含む）を含む。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインは、リガンドに結合し、一般に可溶性である。可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例として、図５に示すＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１）、および配列番号５３が挙げられる。可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの他の例は、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインに加えてシグナル配列を含む（実施例１を参照）。シグナル配列は、ＡｃｔＲＩＩＢのネイティブシグナル配列、または組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）シグナル配列もしくはミツバチメリチン（ｈｏｎｅｙ  ｂｅｅ  ｍｅｌａｔｉｎ）シグナル配列など、別のタンパク質由来のシグナル配列となり得る。
【００８１】
ＴＧＦ−βシグナルは、リガンド刺激後に下流Ｓｍａｄタンパク質をリン酸化および活性化する、Ｉ型およびＩＩ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体のヘテロマー複合体によって媒介される（Ｍａｓｓａｇｕｅ、２０００年、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１巻：１６９〜１７８頁）。このようなＩ型およびＩＩ型受容体は全て、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／トレオニン特異性を有する細胞質ドメインで構成された膜貫通タンパク質である。Ｉ型受容体は、シグナル伝達に必須であり、ＩＩ型受容体は、リガンドの結合に要求される。Ｉ型およびＩＩ型アクチビン受容体は、リガンド結合後に安定な複合体を形成し、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化をもたらす。
【００８２】
２種の関連するＩＩ型受容体であるＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢが、アクチビンのＩＩ型受容体として同定された（ＭａｔｈｅｗｓおよびＶａｌｅ、１９９１年、Ｃｅｌｌ  ６５巻：９７３〜９８２頁；Ａｔｔｉｓａｎｏら、１９９２年、Ｃｅｌｌ  ６８巻：９７〜１０８頁）。アクチビンに加えて、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢは、ＢＭＰ７、ノーダル、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１を含む、いくつかの他のＴＧＦ−βファミリータンパク質と生化学的に相互作用することができる（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、１９９５年、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３０巻：２１７〜２２６頁；ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ、２００１年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．９８巻：９３０６〜９３１１頁；ＹｅｏおよびＷｈｉｔｍａｎ、２００１年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ７巻：９４９〜９５７頁；Ｏｈら、２００２年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６巻：２７４９〜５４頁）。出願人らは、可溶性ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質およびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、ｉｎ  ｖｉｖｏで実質的に異なる効果を有し、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃが、骨に主要効果を有し、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃが、骨格筋に主要効果を有することを見出した。
【００８３】
ある特定の実施形態では、本発明は、対象ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）による、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンド（ＡｃｔＲＩＩＢリガンドとも称される）の拮抗に関する。よって、本発明の組成物および方法は、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の１つまたは複数のリガンドの異常な活性に関連する障害の処置に有用である。ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の例示的なリガンドは、アクチビン、ノーダル、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１およびＢＭＰ７など、いくつかのＴＧＦ−βファミリーメンバーを含む。
【００８４】
アクチビンは、二量体ポリペプチド増殖因子であり、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーに属する。２種の近縁のβサブユニットのホモ／ヘテロ二量体（βＡβＡ、βＢβＢおよびβＡβＢ）である、３種のアクチビン（Ａ、ＢおよびＡＢ）が存在する。ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーにおいて、アクチビンは、卵巣および胎盤細胞におけるホルモン産生を刺激し、神経細胞生存を支持し、細胞型に応じて正にまたは負に細胞周期進行に影響し、少なくとも両生類胚における中胚葉分化を誘導することができる、特有かつ多機能性の因子である（ＤｅＰａｏｌｏら、１９９１年、Ｐｒｏｃ  ＳｏｃＥｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．１９８巻：５００〜５１２頁；Ｄｙｓｏｎら、１９９７年、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．７巻：８１〜８４頁；Ｗｏｏｄｒｕｆｆ、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５巻：９５３〜９６３頁）。さらに、刺激されたヒト単球性白血病性細胞から単離された赤血球系分化因子（ＥＤＦ）は、アクチビンＡと同一であることが判明した（Ｍｕｒａｔａら、１９８８年、ＰＮＡＳ、８５巻：２４３４頁）。アクチビンＡが、骨髄における赤血球生成の天然の制御因子として作用することが示唆された。いくつかの組織において、アクチビンシグナル伝達は、その関連するヘテロ二量体のインヒビンによって拮抗される。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出の際に、アクチビンは、ＦＳＨ分泌および合成を促進する一方、インヒビンは、ＦＳＨ分泌および合成を防止する。アクチビン生物活性を制御することおよび／またはアクチビンに結合することができる他のタンパク質は、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ）、α２−マクログロブリン、ケルベロスおよびエンドグリンを含む。
【００８５】
ノーダルタンパク質は、中胚葉および内胚葉誘導および形成、ならびに初期胚発生における心臓および胃などの軸構造のその後の組織化における機能を有する。発生中の脊椎動物胚における背側組織が、脊索および脊索前板の軸構造に主に寄与する一方、これが、周囲の細胞を動員して、非軸胚性構造を形成することが実証された。ノーダルは、Ｉ型およびＩＩ型受容体の両方ならびにＳｍａｄタンパク質として公知の細胞内エフェクターを介してシグナル伝達すると思われる。近年の研究は、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢが、ノーダルのＩＩ型受容体として機能するという考えを支持する（Ｓａｋｕｍａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．２００２年、７巻：４０１〜１２頁）。ノーダルリガンドが、その補因子（例えば、ｃｒｉｐｔｏ）と相互作用して、Ｓｍａｄ２をリン酸化するアクチビンＩ型およびＩＩ型受容体を活性化することが示唆される。ノーダルタンパク質は、中胚葉形成、前側パターン形成および左右軸指定を含む、初期脊椎動物胚に決定的な多くの事象に関係付けられる。実験的証拠は、ノーダルシグナル伝達が、アクチビンおよびＴＧＦ−ベータに特異的に応答することが以前に示されたルシフェラーゼレポーターであるｐＡＲ３−Ｌｕｘを活性化することを実証した。しかし、ノーダルは、骨形成タンパク質に特異的に応答性であるレポーターであるｐＴｌｘ２−Ｌｕｘを誘導することができない。近年の結果は、ノーダルシグナル伝達が、アクチビン−ＴＧＦ−ベータ経路ＳｍａｄのＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３の両方によって媒介されることの直接的な生化学的証拠を提供する。さらなる証拠は、細胞外ｃｒｉｐｔｏタンパク質が、ノーダルシグナル伝達に要求されることを示し、これを、アクチビンまたはＴＧＦ−ベータシグナル伝達とは別個のものとする。
【００８６】
増殖分化因子−８（ＧＤＦ８）は、ミオスタチンとしても公知である。ＧＤＦ８は、骨格筋量の負の制御因子である。ＧＤＦ８は、発生中および成体の骨格筋において高度に発現される。トランスジェニックマウスにおけるＧＤＦ８ヌル突然変異は、骨格筋の顕著な肥大および過形成によって特徴付けられる（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年、３８７巻：８３〜９０頁）。骨格筋量の同様の増大は、ウシ（Ａｓｈｍｏｒｅら、１９７４年、Ｇｒｏｗｔｈ、３８巻：５０１〜５０７頁；ＳｗａｔｌａｎｄおよびＫｉｅｆｆｅｒ、Ｊ．  Ａｎｉｍ．  Ｓｃｉ．、１９９４年、３８巻：７５２〜７５７頁；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１９９７年、９４巻：１２４５７〜１２４６１頁；ならびにＫａｍｂａｄｕｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１９９７年、７巻：９１０〜９１５頁）および際だったことにヒト（Ｓｃｈｕｅｌｋｅら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００４年；３５０巻：２６８２〜８頁）におけるＧＤＦ８の天然に存在する突然変異において明らかである。研究は、ヒトにおけるＨＩＶ感染に関連する筋消耗が、ＧＤＦ８タンパク質発現の増大を伴うことも示した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら、ＰＮＡＳ、１９９８年、９５巻：１４９３８〜４３頁）。加えて、ＧＤＦ８は、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の産生をモジュレートし、筋芽細胞の細胞増殖をモジュレートすることができる（ＷＯ００／４３７８１）。ＧＤＦ８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ８ドメイン二量体に非共有結合で結合し、その生物活性を不活性化することができる（Ｍｉｙａｚｏｎｏら（１９８８年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻：６４０７〜６４１５頁；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９８８年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻；７６４６〜７６５４頁；およびＢｒｏｗｎら（１９９０年）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、３巻：３５〜４３頁）。ＧＤＦ８または構造的に関連するタンパク質に結合し、その生物活性を阻害する他のタンパク質は、フォリスタチンおよび潜在的にフォリスタチン関連タンパク質を含む（Ｇａｍｅｒら（１９９９年）Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２〜２３２頁）。
【００８７】
ＢＭＰ１１としても公知の増殖分化因子−１１（ＧＤＦ１１）は、分泌タンパク質である（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、１９９９年、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．２２巻：２６０〜２６４頁）。ＧＤＦ１１は、マウス発生の際に尾芽、肢芽、上顎および下顎弓、ならびに後根神経節において発現される（Ｎａｋａｓｈｉｍａら、１９９９年、Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．８０巻：１８５〜１８９頁）。ＧＤＦ１１は、中胚葉および神経組織の両方のパターン形成における特有の役割を果たす（Ｇａｍｅｒら、１９９９年、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２〜３２頁）。ＧＤＦ１１は、発生中のニワトリ肢における軟骨形成および筋形成の負の制御因子であることが示された（Ｇａｍｅｒら、２００１年、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２２９巻：４０７〜２０頁）。筋肉におけるＧＤＦ１１の発現は、ＧＤＦ８と同様の仕方での筋肉成長の制御におけるその役割も示唆する。加えて、脳におけるＧＤＦ１１の発現は、ＧＤＦ１１が、神経系の機能に関する活性を保有することもできることを示唆する。興味深いことに、ＧＤＦ１１は、嗅上皮における神経発生を阻害することが判明した（Ｗｕら、２００３年、Ｎｅｕｒｏｎ．３７巻：１９７〜２０７頁）。したがって、ＧＤＦ１１は、筋肉疾患および神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症）など、疾患の処置におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ適用を有することができる。
【００８８】
骨原性タンパク質−１（ＯＰ−１）とも呼ばれる骨形成タンパク質（ＢＭＰ７）は、軟骨および骨の形成を誘導することが周知である。加えて、ＢＭＰ７は、多種多様な生理学的過程を制御する。例えば、ＢＭＰ７は、上皮骨形成の現象の原因となる骨誘導因子となり得る。ＢＭＰ７が、カルシウム制御および骨恒常性における役割を果たすことも判明した。アクチビンと同様に、ＢＭＰ７は、ＩＩ型受容体、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＩＩＢに結合する。しかし、ＢＭＰ７およびアクチビンは、別個のＩ型受容体をヘテロマー受容体複合体へと動員する。観察される主要なＢＭＰ７  Ｉ型受容体がＡＬＫ２であった一方、アクチビンは、ＡＬＫ４（ＡｃｔＲＩＩＢ）に排他的に結合した。ＢＭＰ７およびアクチビンは、別個の生物学的応答を誘発し、異なるＳｍａｄ経路を活性化した（Ｍａｃｉａｓ−Ｓｉｌｖａら、１９９８年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７３巻：２５６２８〜３６頁）。
【００８９】
ある特定の態様では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢ活性に関連するいずれかの過程において、一般にＡｃｔＲＩＩＢリガンドのシグナル伝達に拮抗するための、ある特定のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の使用に関する。任意選択で、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、アクチビン、ノーダル、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１など、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の１つまたは複数のリガンドに拮抗することができ、したがって、追加的な障害の処置において有用となり得る。
【００９０】
したがって、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドの異常な活性に関連する疾患または状態の処置または予防におけるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの使用を企図する。ＡｃｔＲＩＩＢまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドは、多くの決定的な生物学的過程の制御に関与する。このような過程におけるそれらの重要な機能のため、ＡｃｔＲＩＩＢまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドは、治療介入のための望ましい標的となり得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を使用して、ヒトまたは動物の障害または状態を処置することができる。そのような障害または状態の例として、２型糖尿病、耐糖能障害、メタボリックシンドローム（例えば、シンドロームＸ）および外傷（例えば、熱傷または窒素不均衡）によって誘導されるインスリン抵抗性などの代謝性障害；脂肪組織障害（例えば、肥満）；筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む）などの筋肉および神経筋障害；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；筋萎縮；臓器萎縮；フレイルティ；手根管症候群；うっ血性閉塞性肺疾患；ならびにサルコペニア、カヘキシーおよび他の筋消耗症候群が挙げられるがこれらに限定されない。他の例として、特に、高齢者および／または閉経後女性における骨粗鬆症；グルココルチコイド誘導性骨粗鬆症；オステオペニア；変形性関節症；ならびに骨粗鬆症関連骨折が挙げられる。さらにまた別の例として、慢性グルココルチコイド療法による低い骨量、早発性性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏、続発性副甲状腺機能亢進、栄養的欠乏および神経性食欲不振症が挙げられる。これらの障害および状態は、下の「例示的な治療使用」にて記述されている。
【００９１】
本明細書で使用されている用語は一般に、本発明の文脈内で、また、各用語が使用されている特異的な文脈において、当技術分野におけるその通常の意義を有する。ある特定の用語は、下にまたは本明細書の他の箇所に記述されて、実務担当者に、本発明の組成物および方法ならびにこれらを作製および使用する仕方の説明に関する追加的なガイダンスを提供する。用語のいずれかの使用の範囲または意義は、当該用語が使用されている特異的な文脈から明らかとなるであろう。
【００９２】
「約」および「およそ」は一般に、測定の性質または精度を考慮して、測定される含量に関する許容される程度の誤差を意味するものとする。典型的には、例示的な程度の誤差は、所与の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは、１０％以内、より好ましくは、５％以内である。
【００９３】
あるいは、そして特に生物システムにおいて、用語「約」および「およそ」は、所与の値の１桁以内、好ましくは、５倍以内、より好ましくは、２倍以内の値を意味することができる。本明細書に示されている数的含量は、他に断りがなければ近似値であり、明確に記述されていない場合に、用語「約」または「およそ」が推測され得ることを意味する。
【００９４】
本発明の方法は、１つまたは複数の突然変異体（配列バリアント）に対する未修飾（野生型）配列を含む配列を互いに比較するステップを含むことができる。そのような比較は典型的に、例えば、当技術分野で周知の配列アラインメントプログラムおよび／またはアルゴリズム（例えば、数例を挙げると、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＭＥＧＡＬＩＧＮ）を使用した、ポリマー配列のアラインメントを含む。当業者であれば、突然変異が残基挿入または欠失を含有するそのようなアラインメントにおいて、配列アラインメントが、挿入または欠失された残基を含有しないポリマー配列において「ギャップ」（ダッシュ記号または「Ａ」によって典型的に表される）を導入するであろうことを容易に認めることができる。
【００９５】
「相同」は、そのあらゆる文法上の形態およびスペル上の変形形態において、同じ種の生物におけるスーパーファミリー由来のタンパク質、および異なる種の生物由来の相同タンパク質を含む、「共通の進化的起源」を保有する２種のタンパク質の間の関係性を指す。そのようなタンパク質（およびそのコード核酸）は、パーセント同一性の観点からであれ、特異的残基またはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、その配列類似性によって反映される配列相同性を有する。
【００９６】
用語「配列類似性」は、そのあらゆる文法上の形態において、共通の進化的起源を共有しても共有しなくてもよい、核酸またはアミノ酸配列の間の同一性または一致の程度を指す。
【００９７】
しかし、一般的な用法および本願において、用語「相同」は、「高度に」などの副詞で修飾される場合、配列類似性を指すことができ、共通の進化的起源に関係しても関係しなくてもよい。
【００９８】
「作動させる」は、そのあらゆる文法上の形態において、タンパク質および／または遺伝子を活性化する（例えば、当該タンパク質の遺伝子発現を活性化もしくは増幅することにより、または活性状態に進むように不活性タンパク質を誘導することにより）、またはタンパク質および／または遺伝子の活性を増大させる過程を指す。
【００９９】
「拮抗する」は、そのあらゆる文法上の形態において、タンパク質および／または遺伝子を阻害する（例えば、当該タンパク質の遺伝子発現を阻害もしくは低下させることにより、または不活性状態に進むように活性タンパク質を誘導することにより）、またはタンパク質および／または遺伝子の活性を低下させる過程を指す。
【０１００】
用語「約」および「およそ」は、本明細書および特許請求の範囲を通して、数値に関連して使用される場合、当業者にとって馴染みがあり許容される、正確性の区間を表示する。一般に、そのような正確性の区間は、±１０％であり、あるいは、そして特に生物システムにおいて、用語「約」および「およそ」は、所与の値の１桁以内、好ましくは≦５倍、より好ましくは≦２倍の値を意味することができる。
【０１０１】
本明細書に開示されている数的範囲は、その範囲を定義する数を包括する。
【０１０２】
当該用語が使用されている文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、複数形の指示対象を含む。用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）ならびに用語「１つまたは複数の」および「少なくとも１つの」は、本明細書において互換的に使用することができる。さらに、「および／または」は、本明細書で使用される場合、それ以外を伴うまたは伴わない、２つまたはそれよりも多い指定の特色または構成成分のそれぞれの特異的開示として解釈されるべきである。よって、用語「および／または」は、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される場合、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）ならびに「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、用語「および／または」は、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの語句において使用される場合、次の態様のそれぞれを包含することが意図される：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
２．ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド
【０１０３】
ある特定の態様では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢバリアントポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）に関する。任意選択で、断片、機能的バリアントおよび修飾形態は、それらの対応する野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと同様または同じ生物活性を有する。例えば、本発明のＡｃｔＲＩＩＢバリアントは、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、ノーダル、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１またはＢＭＰ７）に結合し、その機能を阻害することができる。任意選択で、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、骨、軟骨、筋肉または脂肪などの組織の成長をモジュレートする。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例として、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体ポリペプチド（配列番号２）および可溶性ヒトＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、配列番号１、５、６および１２）が挙げられる。
【０１０４】
本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢの機能的に活性な部分およびバリアントを同定する。出願人らは、配列番号２のアミノ酸６４に対応する位置におけるアラニン（Ａ６４）を有する、Ｈｉｌｄｅｎら（Ｂｌｏｏｄ．、１９９４年４月１５日；８３巻（８号）：２１６３〜７０頁）によって開示されている配列を有するＦｃ融合タンパク質が、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対し相対的に低い親和性を有することを確認した。対照的に、位置６４におけるアルギニン（Ｒ６４）を有する同じＦｃ融合タンパク質は、低ナノモル濃度〜高ピコモル濃度範囲内でアクチビンおよびＧＤＦ−１１に対する親和性を有する。したがって、Ｒ６４を有する配列は、本開示におけるヒトＡｃｔＲＩＩＢの野生型参照配列として使用される。
【０１０５】
Ａｔｔｉｓａｎｏら（Ｃｅｌｌ．、１９９２年１月１０日；６８巻（１号）：９７〜１０８頁）は、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端におけるプロリンノットの欠失が、アクチビンに対する受容体の親和性を減少させたことを示した。ＷＯ２００８０９７５４１に開示されているデータは、配列番号２のアミノ酸２０〜１１９を含有するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質「ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１１９）−Ｆｃ」が、プロリンノット領域および完全膜近傍ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−Ｆｃと比べて、ＧＤＦ１１およびアクチビンへの結合を減少させたことを示す。しかし、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１２９）−Ｆｃタンパク質は、プロリンノット領域が破壊されているとしても、野生型と比べて同様の、ただし若干減少した活性を保持する。よって、アミノ酸１３４、１３３、１３２、１３１、１３０および１２９で停止するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは全て、活性があると予想されるが、１３４または１３３で停止する構築物が、最も活性となり得る。同様に、残基１２９〜１３４のいずれかにおける突然変異は、リガンド結合親和性を大幅に変更するとは予想されない。これを支持して、Ｐ１２９およびＰ１３０の突然変異は、リガンド結合を実質的に低下させない。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、アミノ酸１０９（最終システイン）もの早さで終わることができるが、１０９および１１９でまたはその間で終わる形態は、減少したリガンド結合を有することが予想される。アミノ酸１１９は不十分に保存されているため、容易に変更または短縮される。１２８またはそれ以後で終わる形態は、リガンド結合活性を保持する。１１９および１２７でまたはその間で終わる形態は、中等度結合能力を有するであろう。これらの形態のいずれかが、臨床または実験設定に応じて、使用に望ましくなり得る。
【０１０６】
ＡｃｔＲＩＩＢのＮ末端において、アミノ酸２９またはそれ以前から始まるタンパク質が、リガンド結合活性を保持することが予想される。アミノ酸２９は、最初のシステインを表す。位置２４におけるアラニンからアスパラギンへの突然変異は、リガンド結合に実質的に影響を与えることなく、Ｎ結合型グリコシル化配列を導入する。このことから、アミノ酸２０〜２９に対応するシグナル切断ペプチドおよびシステイン架橋領域の間の領域における突然変異がよく許容されることが確認される。特に、位置２０、２１、２２、２３および２４から始まる構築物が活性を保持し、位置２５、２６、２７、２８および２９から始まる構築物も活性を保持することが予想される。ＷＯ２００８０９７５４１にデータが示されており、驚いたことに、２２、２３、２４または２５から始まる構築物が、最も活性を有するであろうことを実証する。
【０１０７】
まとめると、ＡｃｔＲＩＩＢの活性部分は、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９を含み、構築物は、例えば、アミノ酸２０〜２９に対応する残基から始まり、アミノ酸１０９〜１３４に対応する位置で終わることができる。他の例として、２０〜２９または２１〜２９の位置から始まり、１１９〜１３４、１１９〜１３３または１２９〜１３４、１２９〜１３３の位置で終わる構築物が挙げられる。他の例として、２０〜２４（または２１〜２４もしくは２２〜２５）の位置から始まり、１０９〜１３４（または１０９〜１３３）、１１９〜１３４（または１１９〜１３３）または１２９〜１３４（または１２９〜１３３）の位置で終わる構築物が挙げられる。これらの範囲内のバリアント、特に、配列番号４の対応する部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一性を有するバリアントも企図される。
【０１０８】
本開示は、図２に示す複合性ＡｃｔＲＩＩＢ構造の解析結果を含み、これは、リガンド結合ポケットが、残基Ｙ３１、Ｎ３３、Ｎ３５、Ｌ３８からＴ４１、Ｅ４７、Ｅ５０、Ｑ５３からＫ５５、Ｌ５７、Ｈ５８、Ｙ６０、Ｓ６２、Ｋ７４、Ｗ７８からＮ８３、Ｙ８５、Ｒ８７、Ａ９２およびＥ９４からＦ１０１によって定義されることを実証する。これらの位置において、保存的突然変異が許容されるであろうが、Ｒ４０Ａ、Ｋ５５Ａ、Ｆ８２Ａおよび位置Ｌ７９における突然変異と同様に、Ｋ７４Ａ突然変異がよく許容されることが予想される。Ｒ４０は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、この位置における塩基性アミノ酸が許容されるであろうことを示す。Ｑ５３は、ウシＡｃｔＲＩＩＢではＲであり、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ＡｃｔＲＩＩＢではＫであり、したがって、Ｒ、Ｋ、Ｑ、ＮおよびＨを含むアミノ酸は、この位置において許容されるであろう。よって、活性ＡｃｔＲＩＩＢバリアントタンパク質の一般式は、アミノ酸２９〜１０９を含むが、任意選択で、２０〜２４または２２〜２５に及ぶ位置から始まり、１２９〜１３４に及ぶ位置で終わり、リガンド結合ポケットにおける１、２、５、１０または１５個以下の保存的アミノ酸変化、ならびにリガンド結合ポケットにおける位置４０、５３、５５、７４、７９および／または８２におけるゼロ個、１個または複数の非保存的変更を含む、一般式である。そのようなタンパク質は、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と８０％、９０％、９５％または９９％を超える配列同一性を保持することができる。可変性が特に許容され得る、結合ポケットの外側の部位は、細胞外ドメイン（上に記す通り）のアミノおよびカルボキシ末端、ならびに位置４２〜４６および６５〜７３を含む。位置６５におけるアスパラギンからアラニンへの変更（Ｎ６５Ａ）は、Ａ６４バックグラウンドにおけるリガンド結合を実際に改善するため、Ｒ６４バックグラウンドにおけるリガンド結合に有害効果がないことが予想される。この変化はおそらく、Ａ６４バックグラウンドのＮ６５におけるグリコシル化を排除し、これにより、この領域における有意な変化が許容され得る可能性が高いことを実証する。Ｒ６４Ａ変化は許容されにくいが、Ｒ６４Ｋはよく許容されるため、Ｈなどの別の塩基性残基が位置６４において許容され得る。
【０１０９】
ＡｃｔＲＩＩＢは、ほぼ全ての脊椎動物にわたって十分に保存されており、大型のひと続きの細胞外ドメインが、完全に保存されている。図３を参照されたい。ＡｃｔＲＩＩＢに結合するリガンドの多くも高度に保存されている。したがって、様々な脊椎動物生物由来のＡｃｔＲＩＩＢ配列の比較は、変更され得る残基への洞察を提供する。したがって、活性ヒトＡｃｔＲＩＩＢバリアントは、別の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢの配列に由来する対応する位置における１個または複数のアミノ酸を含むことができる、またはヒトまたは他の脊椎動物配列におけるものと同様の残基を含むことができる。次の例は、活性ＡｃｔＲＩＩＢバリアントを定義するこのアプローチを例証する。Ｌ４６は、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ＡｃｔＲＩＩＢではバリンであるため、この位置は変更することができ、任意選択で、Ｖ、ＩもしくはＦなどの別の疎水性残基、またはＡなどの非極性残基へと変更することができる。Ｅ５２は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、この部位は、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、ＹおよびおそらくＡなど、極性残基を含む、多種多様な変化に寛容性となり得ることを示す。Ｔ９３は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、広い構造的変形形態がこの位置において許容され、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、ＧおよびＹなど、極性残基が好ましいことを示す。Ｆ１０８は、ＸｅｎｏｐｕｓではＹであり、したがって、Ｙ、またはＩ、ＶもしくはＬなどの他の疎水性基が許容されるはずである。Ｅ１１１は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、Ｄ、Ｒ、ＫおよびＨならびにＱおよびＮを含む荷電残基が、この位置において許容されるであろうことを示す。Ｒ１１２は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、ＲおよびＨを含む塩基性残基が、この位置において許容されることを示す。位置１１９におけるＡは、相対的に不十分に保存されており、齧歯類ではＰとして、ＸｅｎｏｐｕｓではＶとして出現するため、本質的にいかなるアミノ酸もこの位置において許容されるはずである。
【０１１０】
ＷＯ２００８０９７５４１に開示されているデータは、さらなるＮ結合型グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）の付加が、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４）−Ｆｃ形態と比べて、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質の活性に影響を与えないことを実証する。他のＮＸ（Ｔ／Ｓ）配列は、４２〜４４（ＮＱＳ）および６５〜６７（ＮＳＳ）において見出されるが、後者は、位置６４におけるＲにより効率的にグリコシル化されない場合がある。Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列は一般に、図２に定義されるリガンド結合ポケットの外側の位置に導入され得る。非内在性Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列の導入に特に適した部位は、アミノ酸２０〜２９、２０〜２４、２２〜２５、１０９〜１３４、１２０〜１３４または１２９〜１３４を含む。ＡｃｔＲＩＩＢ配列およびＦｃまたは他の融合構成成分の間のリンカーに、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を導入することもできる。既存のＳもしくはＴに関して正しい位置にＮを導入することにより、または既存のＮに対応する位置にＳもしくはＴを導入することにより、そのような部位を最小の労力で導入することができる。よって、Ｎ結合型グリコシル化部位を作出するであろう望ましい変更を次に示す：Ａ２４Ｎ、Ｒ６４Ｎ、Ｓ６７Ｎ（おそらくＮ６５Ａ変更と組み合わせた）、Ｅ１０６Ｎ、Ｒ１１２Ｎ、Ｇ１２０Ｎ、Ｅ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｎ、Ａ１３２Ｎ、Ｒ１１２ＳおよびＲ１１２Ｔ。グリコシル化されることが予測されるいずれかのＳは、グリコシル化によって提供される保護のため、免疫原性部位を作製することなく、Ｔに変更することができる。同様に、グリコシル化されることが予測されるいずれかのＴは、Ｓに変更することができる。よって、変更Ｓ６７ＴおよびＳ４４Ｔが企図される。同様に、Ａ２４Ｎバリアントにおいて、Ｓ２６Ｔ変更を使用することができる。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢバリアントは、１つまたは複数の追加的な非内在性Ｎ結合型グリコシル化コンセンサス配列を含むことができる。
【０１１１】
位置Ｌ７９は、変更されたアクチビン−ミオスタチン（ＧＤＦ−１１）結合特性を付与するように変更することができる。Ｌ７９ＡまたはＬ７９Ｐは、アクチビン結合よりも大きい程度までＧＤＦ−１１結合を減少させる。Ｌ７９ＥまたはＬ７９Ｄは、ＧＤＦ−１１結合を保持する。注目すべきことに、Ｌ７９ＥおよびＬ７９Ｄバリアントは、大幅に減少されたアクチビン結合を有する。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験は、これらの非アクチビン受容体が、筋量を増大させる有意な能力を保持するが、他の組織における効果低下を示すことを示す。これらのデータは、アクチビンにおける効果が減少したポリペプチドを得るための望ましさおよび実現可能性を実証する。
【０１１２】
記載されている変形形態は、様々な仕方で組み合わせることができる。その上、本明細書に記載されている突然変異誘発プログラムの結果は、保存することが有益な場合が多いＡｃｔＲＩＩＢにおけるアミノ酸位置が存在することを示す。これらには、位置６４（塩基性アミノ酸）、位置８０（酸性または疎水性アミノ酸）、位置７８（疎水性、特にトリプトファン）、位置３７（酸性、特にアスパラギン酸またはグルタミン酸）、位置５６（塩基性アミノ酸）、位置６０（疎水性アミノ酸、特にフェニルアラニンまたはチロシン）が挙げられる。よって、本明細書に開示されているバリアントのそれぞれにおいて、本開示は、保存され得るアミノ酸のフレームワークを提供する。保存が望ましくなり得る他の位置を次に示す：位置５２（酸性アミノ酸）、位置５５（塩基性アミノ酸）、位置８１（酸性）、９８（極性または荷電、特にＥ、Ｄ、ＲまたはＫ）。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの単離された断片は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号３および４）の対応する断片から組換えにより産生されたポリペプチドをスクリーニングすることにより得ることができる。加えて、断片は、従来のメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学など、当技術分野で公知の技法を使用して化学合成することができる。断片を産生（組換えによりまたは化学合成によって）し、検査して、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質またはＡｃｔＲＩＩＢリガンドのアンタゴニスト（阻害剤）またはアゴニスト（活性化剤）として機能することができるペプチジル断片を同定することができる。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの機能的バリアントは、配列番号１、２および５３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の事例では、機能的バリアントは、配列番号１、２および５３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、本発明は、治療有効性または安定性（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏ有効期間およびｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質分解性の分解に対する抵抗性）の増強などの目的で、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの構造を修飾することによる、機能的バリアントの作製を企図する。修飾されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加によって産生することもできる。例えば、イソロイシンもしくはバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、セリンによるトレオニンの単離された置き換え、または構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の同様の置き換え（例えば、保存的突然変異）が、その結果得られる分子の生物活性に主要な効果がないことを予想することは合理的である。保存的置き換えは、その側鎖が関連するアミノ酸ファミリー内で起こる置き換えである。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列の変化が、機能的ホモログをもたらすか否かは、野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと同様の様式で細胞における応答を産生する、または野生型と同様の様式でアクチビン、ＧＤＦ１１もしくはＧＤＦ８などの１つもしくは複数のリガンドに結合する、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの能力を評価することにより容易に決定することができる。
【０１１６】
ある特定の特異的な実施形態では、本発明は、バリアント（または突然変異体）ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、変更されたリガンド結合活性（例えば、結合親和性または結合選択性）を有するような、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの細胞外ドメイン（リガンド結合ドメインとも称される）における突然変異の作製を企図する。ある特定の事例では、そのようなバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、特異的なリガンドに対して変更された（上昇または減少された）結合親和性を有する。他の事例では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、そのリガンドに対して変更された結合選択性を有する。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、本発明は、ポリペプチドのグリコシル化を変更することができるような、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの特異的な突然変異を企図する。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドにおける例示的なグリコシル化部位は、図６に例証されている。そのような突然変異は、Ｏ結合型またはＮ結合型グリコシル化部位など、１個または複数のグリコシル化部位を導入または排除することができるように選択することができる。アスパラギン結合型グリコシル化認識部位は一般に、適切な細胞グリコシル化酵素によって特異的に認識される、トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、「Ｘ」はいずれかのアミノ酸である）を含む。変更は、野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの配列に対する１個または複数のセリンまたはトレオニン残基の付加またはこれによる置換によって為すこともできる（Ｏ結合型グリコシル化部位のための）。グリコシル化認識部位の第１または第３のアミノ酸位置の一方または両方における種々のアミノ酸置換または欠失（および／または第２の位置におけるアミノ酸欠失）は、修飾されたトリペプチド配列における非グリコシル化をもたらす。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドにおける炭水化物部分の数を増大させる別の手段は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。使用したカップリングモードに応じて、糖（複数可）は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）システイン内などの遊離スルフヒドリル基；（ｄ）セリン、トレオニンもしくはヒドロキシプロリン内などの遊離ヒドロキシル基；（ｅ）フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファン内などの芳香族残基；または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれる、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ（１９８１年）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９〜３０６頁に記載されている。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに存在する１個または複数の炭水化物部分の除去は、化学的におよび／または酵素的に達成することができる。化学的脱グリコシルは、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物へのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの曝露が関与することができる。この処置は、アミノ酸配列をインタクトに保ちつつ、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除いた大部分のまたは全ての糖の切断をもたらす。化学的脱グリコシルは、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら（１９８７年）Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５９巻：５２頁およびＥｄｇｅら（１９８１年）Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８巻：１３１頁によってさらに記載されている。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドにおける炭水化物部分の酵素による切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７年）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８巻：３５０頁によって記載されている種々のエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。哺乳動物、酵母、昆虫および植物細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異な���グリコシル化パターンを導入することができるため、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの配列は、使用される発現系の種類に応じて適宜調整することができる。一般に、ヒトにおける使用のためのＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞系など、適正なグリコシル化をもたらす哺乳動物細胞系において発現されるであろうが、他の哺乳動物発現細胞系も同様に有用であることが予想される。
【０１１８】
本開示は、任意選択で短縮バリアントを含む、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのバリアント、特に、コンビナトリアルバリアントのセットを生成する方法をさらに企図する；コンビナトリアル突然変異体のプールが、機能的バリアント配列を同定するために特に有用である。そのようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、変更された薬物動態または変更されたリガンド結合など、変更された特性を有するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドバリアントを生成することとなり得る。種々のスクリーニングアッセイが下に提示されており、そのようなアッセイを使用して、バリアントを評価することができる。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドバリアントは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに結合して、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドへのＡｃｔＲＩＩＢリガンドの結合を防止する能力に関してスクリーニングすることができる。
【０１１９】
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそのバリアントの活性は、細胞に基づくまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて検査することもできる。例えば、骨芽細胞または前駆体における骨産生に関与する遺伝子の発現におけるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドバリアントの効果を評価することができる。これは、必要に応じて、１つまたは複数の組換えＡｃｔＲＩＩＢリガンドタンパク質（例えば、ＢＭＰ７）の存在下で行うことができ、細胞は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／またはそのバリアント、ならびに任意選択でＡｃｔＲＩＩＢリガンドを産生することができるようにトランスフェクトすることができる。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、マウスまたは他の動物に投与することができ、密度または体積などの１つまたは複数の骨特性を評価することができる。骨折の治癒速度を評価することもできる。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそのバリアントの活性は、例えば、後述する通りのアッセイによって、筋肉細胞、脂肪細胞および神経細胞において、これらの細胞の成長におけるいずれかの効果に関して検査することができる。そのようなアッセイは、当技術分野で周知かつルーチンである。そのような細胞系においてＳＭＡＤ応答性レポーター遺伝子を使用して、下流シグナル伝達における効果をモニターすることができる。
【０１２０】
天然に存在するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと比べて選択的な効力を有する、コンビナトリアル手法に由来するバリアントを生成することができる。そのようなバリアントタンパク質は、組換えＤＮＡ構築物から発現されると、遺伝子療法プロトコールにおいて使用することができる。同様に、突然変異誘発は、対応する野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有するバリアントを生じることができる。例えば、変更されたタンパク質は、タンパク質分解性の分解、またはネイティブＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの破壊さもなければ不活性化をもたらす他の過程に対してより高い安定性またはより低い安定性のいずれかになり得る。そのようなバリアントおよびこれをコードする遺伝子を利用して、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの半減期をモジュレートすることにより、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドレベルを変更することができる。例えば、短い半減期は、より一過性の生物学的効果を生じることができ、誘導性発現系の一部の場合、細胞内における組換えＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドレベルのより厳格な調節を可能にし得る。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに天然に存在するいずれかに加えて、翻訳後修飾をさらに含むことができる。そのような修飾として、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられるがこれらに限定されない。結果として、修飾されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ポリエチレングリコール、脂質、多糖または単糖およびリン酸塩など、非アミノ酸エレメントを含有することができる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの機能性におけるそのような非アミノ酸エレメントの効果は、他のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドバリアントに関して本明細書に記載されている通りに検査することができる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、新生形態のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの切断によって細胞において産生される場合、翻訳後プロセシングも、タンパク質の正しいフォールディングおよび／または機能に重要となり得る。異なる細胞（ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３など）は、そのような翻訳後活性のための特異的な細胞機構および特徴的な機序を有し、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの正しい修飾およびプロセシングを確実にするように選択することができる。
【０１２２】
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの機能的バリアントまたは修飾形態は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの少なくとも部分および１つまたは複数の融合ドメインを有する融合タンパク質を含む。そのような融合ドメインの周知の例として、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（例えば、Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはヒト血清アルブミンが挙げられるがこれらに限定されない。融合ドメインは、所望の特性を付与することができるように選択することができる。例えば、一部の融合ドメインは、親和性クロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。親和性精製の目的のため、グルタチオン、アミラーゼおよびニッケルまたはコバルトコンジュゲートされた樹脂など、親和性クロマトグラフィーのための関連するマトリックスが使用される。そのようなマトリックスの多くは、（ＨＩＳ６）融合パートナーと共に有用なＰｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システムおよびＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）など、「キット」形態で利用することができる。別の例として、融合ドメインは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの検出を容易にすることができるように選択することができる。そのような検出ドメインの例として、様々な蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）と共に、通常、特異的抗体を利用できる短いペプチド配列である「エピトープタグ」が挙げられる。特異的モノクローナル抗体を容易に利用できる周知エピトープタグは、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）およびｃ−ｍｙｃタグを含む。一部の事例では、融合ドメインは、第Ｘａ因子またはトロンビンに対するものなど、プロテアーゼ切断部位を有し、これにより、関連するプロテアーゼが、融合タンパク質を部分的に消化し、これにより、そこから組換えタンパク質を遊離させることを可能にする。次いで、遊離されたタンパク質は、その後のクロマトグラフィー分離によって、融合ドメインから単離することができる。ある特定の好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを安定化するドメイン（「安定剤」ドメイン）と融合される。「安定化」とは、それが、低下した破壊、低下した腎臓クリアランスまたは他の薬物動態効果によるものであるか否かに関係なく、血清半減期を増大させる何らかのことを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合は、広範囲のタンパク質に望ましい薬物動態特性を付与することが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、望ましい特性を付与することができる。選択され得る他の種類の融合ドメインは、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメインおよび機能的ドメイン（筋肉成長のさらなる刺激など、追加的な生物学的機能を付与する）を含む。
【０１２３】
ある特定の態様では、本明細書に開示されているポリペプチドは、タンパク質複合体における各融合ポリペプチド鎖が、複合体における他のいずれかのそのような鎖と同じＡｃｔＲＩＩＢバリアントを含むことを意味する、ホモマーバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを形成することができる。ある特定の態様では、本明細書に開示されているポリペプチドは、少なくとも１つの未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは第１のＡｃｔＲＩＩＢバリアントとは異なる少なくとも１つのバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと共有結合または非共有結合で会合した少なくとも１つのバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む、ヘテロ多量体を形成することができる。ある特定の態様では、本明細書に開示されているポリペプチドは、その断片およびバリアントを含む少なくとも１つのＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６およびＡＬＫ７ポリペプチド）と共有結合または非共有結合で会合した少なくとも１つのバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む、ヘテロ多量体を形成することができる。ある特定の態様では、本明細書に開示されているポリペプチドは、その断片およびバリアントを含む少なくとも１つのＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体ポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩおよびＭＩＳＲＩＩ）と共有結合または非共有結合で会合した少なくとも１つのバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む、ヘテロ多量体を形成することができる。好ましくは、本明細書に開示されているヘテロマーポリペプチドは、ヘテロ二量体を形成するが、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体およびさらなるオリゴマー構造などが挙げられるがこれらに限定されない、より高次のヘテロ多量体も含まれている。一部の実施形態では、本開示のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、少なくとも１つの多量体化ドメインを含む。本明細書に開示されている通り、用語「多量体化ドメイン」は、少なくとも第１のポリペプチドおよび少なくとも第２のポリペプチドの間の共有結合または非共有結合性相互作用を促進するアミノ酸またはアミノ酸の配列を指す。本明細書に開示されているバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、多量体化ドメインへと共有結合または非共有結合で連接することができる。好ましくは、多量体化ドメインは、第１のポリペプチド（例えば、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）および第２のポリペプチド（例えば、未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは第１のポリペプチドに存在するものとは異なるバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の間の相互作用を促進して、ヘテロ多量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）を促進し、任意選択で、ホモ多量体形成（例えば、ホモ二量体形成）を邪魔する、さもなければこれを支持せず、これにより、所望のヘテロ多量体の収量を増大させる（例えば、図１を参照）。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載されているものなど、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載されているものなど、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載されているものなど、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載されているものなど、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載されているものなど、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載されているものなど、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質および少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載されているものなど、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、本明細書に記載されているものなど、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。
【０１３５】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号５４のアミノ酸２２〜３４（例えば、アミノ酸残基２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、および３４）のいずれか１つで始まり、配列番号５４のアミノ酸９５〜１１８（例えば、アミノ酸残基９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、および１１８）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ１ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号５４のアミノ酸２２〜１１８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ１ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号５４のアミノ酸３４〜９５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ１ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２および６３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ１ドメインを含む。
代表的ＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号６０）を次に示す：
【化１】
2019536440.tif 000002
【化２】
2019536440.tif 000003
【０１３６】
リーダー配列およびリンカー配列に下線が引かれている。
【０１３７】
成熟ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号６１）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化３】
2019536440.tif 000004
一部の実施形態では、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号５６）を次に示す：
【化４】
2019536440.tif 000005
【０１３８】
リーダー配列およびリンカー配列に下線が引かれている。本明細書に開示されているある特定のＦｃ融合ポリペプチドによるヘテロ二量体形成を誘導するために、上に二重下線で示す通り、２個のアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、ＡＬＫ１−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入することができる。配列番号５６のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
このＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質は、次の核酸（配列番号２５８）によってコードされる：
【化５】
2019536440.tif 000006
【化６】
2019536440.tif 000007
【０１３９】
成熟ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号５７）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【化７】
2019536440.tif 000008
【０１４０】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ２ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、用語「ＡＬＫ２」は、いずれかの種由来のアクチビン受容体様キナーゼ−２タンパク質、および突然変異誘発または他の修飾によるそのようなＡＬＫ２タンパク質に由来するバリアントのファミリーを指す。本明細書におけるＡＬＫ２の参照は、現在同定されている形態のいずれか１つの参照であることが理解されている。ＡＬＫ２ファミリーのメンバーは一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成された膜貫通タンパク質である。
【０１４１】
「ＡＬＫ２ポリペプチド」という用語は、ＡＬＫ２ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＡＬＫ２前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１０９６．１）は、次の通りである：
【化８】
2019536440.tif 000009
【０１４２】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ２ポリペプチド配列を次に示す：
【化９】
2019536440.tif 000010
【０１４３】
ヒトＡＬＫ２前駆体タンパク質をコードする核酸配列を配列番号２１７に示し、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１０５．４のヌクレオチド４３１〜１９５７に対応する。細胞外ＡＬＫ２ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２１８に示す通りである。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、本開示は、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む少なくとも１つのＡＬＫ２ポリペプチドを含むヘテロ多量体に関する。好ましくは、本開示の発明に従った使用のためのＡＬＫ２ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ２ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびその使用）は、可溶性である（例えば、ＡＬＫ２の細胞外ドメイン）。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従った使用のためのＡＬＫ２ポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する、および／またはその活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号６４または６５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ２ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、配列番号６４または６５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ２ポリペプチドからなるまたはそれから本質的になる。
【０１４５】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号６４のアミノ酸２１〜３５（例えば、アミノ酸残基２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５）のいずれか１つで始まり、配列番号６４のアミノ酸９９〜１２３（例えば、アミノ酸残基９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２および１２３）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ２ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号６４のアミノ酸３５〜９９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ２ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号６４のアミノ酸２１〜１２３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ２ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２および７３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ２ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＰＡリーダーを用い、これを次に示す（配列番号６６）：
【化１０】
2019536440.tif 000011
【化１１】
2019536440.tif 000012
【０１４６】
シグナル配列およびリンカー配列に下線が引かれている。本明細書に開示されているある特定の他のＦｃ融合体によるヘテロ二量体の形成を促進するために、上に二重下線で示す通り、２個のアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、融合タンパク質のＦｃドメインに導入することができる。配列番号６６のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
このＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質は、次の核酸（配列番号２４４）によってコードされる：
【化１２】
2019536440.tif 000013
【０１４７】
成熟ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号６７）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【化１３】
2019536440.tif 000014
【化１４】
2019536440.tif 000015
【０１４８】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用してヘテロ多量体複合体の形成を促進する別のアプローチにおいて、Ｆｃドメインは、相補的な疎水性相互作用および追加的な分子間ジスルフィド結合を導入するように変更される。
一部の実施形態では、ＡＬＫ２−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号７０）を次に示す：
【化１５】
2019536440.tif 000016
【０１４９】
リーダー配列およびリンカー配列に下線が引かれている。本明細書に開示されているある特定のＦｃ融合ポリペプチドによるヘテロ二量体形成を誘導するために、上に二重下線で示す通り、４個のアミノ酸置換を、ＡＬＫ２融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入することができる。さらに、ＦｃドメインのＣ末端リシン残基は、欠失される場合がある。配列番号７０のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０１５０】
成熟ＡＬＫ２−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号７１）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１６】
2019536440.tif 000017
【化１７】
2019536440.tif 000018
【０１５１】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ２ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＡＬＫ２」という用語は、任意の種からのアクチビン受容体様キナーゼ−２タンパク質のファミリー、およびそのようなＡＬＫ２タンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＡＬＫ２への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＡＬＫ２ファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０１５２】
用語「ＡＬＫ２ポリペプチド」は、ＡＬＫ２ファミリーメンバーのいずれかの天然に存在するポリペプチド、および有用な活性を保持するそのいずれかのバリアント（突然変異体、断片、融合体およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを含む。
代表的ヒトＡＬＫ２前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＰ＿００１０９６．１）を次に示す：
【化１８】
2019536440.tif 000019
【０１５３】
シグナルペプチドは、１本の下線で示し、細胞外ドメインは、太字フォントで示す。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ２ポリペプチド配列を次に示す：
【化１９】
2019536440.tif 000020
【０１５４】
ヒトＡＬＫ２前駆体タンパク質をコードする核酸配列を配列番号２１７に示し、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１０５．４のヌクレオチド４３１〜１９５７に対応する。細胞外ＡＬＫ２ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２１８に示す通りである。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ２ポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＡＬＫ２ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＡＬＫ２ポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡＬＫ２の細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ２ポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号６４または６５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、少なくとも１つのＡＬＫ２ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、配列番号６４または６５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、少なくとも１つのＡＬＫ２ポリペプチドからなるまたはそれから本質的になる。
【０１５６】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ３ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＡＬＫ３」という用語は、任意の種からのアクチビン受容体様キナーゼ−３タンパク質のファミリー、およびそのようなＡＬＫ３タンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＡＬＫ３への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＡＬＫ３ファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０１５７】
「ＡＬＫ３ポリペプチド」という用語は、ＡＬＫ３ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＡＬＫ３前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４３２０．２）は、次の通りである：
【化２０】
2019536440.tif 000021
【化２１】
2019536440.tif 000022
【０１５８】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ３ポリペプチド配列は、次の通りである：
【化２２】
2019536440.tif 000023
【０１５９】
ヒトＡＬＫ３前駆体タンパク質をコードする核酸配列を配列番号２１９に示し、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００４３２９．２のヌクレオチド５４９〜２１４４に対応する。シグナル配列に下線が引かれ、細胞外ドメインは、太字フォントで示す。細胞外ヒトＡＬＫ３ポリペプチドをコードする核酸配列を配列番号２２０に示す。
【０１６０】
活性（例えば、リガンド結合性）ＡＬＫ３ポリペプチドの一般式は、配列番号７４のいずれかのアミノ酸位置２５〜３１（すなわち、位置２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１）から始まり、配列番号７４のいずれかのアミノ酸位置１４０〜１５２（すなわち、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１または１５２）で終わるポリペプチドを含む一般式である。その教示全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３３８，３７７号を参照されたい。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ３ポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＡＬＫ３ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＡＬＫ３ポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡＬＫ３の細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ３ポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号７４のいずれかのアミノ酸位置２５〜３１（すなわち、位置２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１）から始まり、配列番号７４のいずれかのアミノ酸位置１４０〜１５３（すなわち、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１または１５２）で終わるアミノ酸を含む少なくとも１つのＡＬＫ３ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、配列番号７４、７５、７６、７７、８０または８１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ３ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、配列番号７４、７５、７６、７７、８０または８１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一である少なくとも１つのＡＬＫ３ポリペプチドからなるまたはそれから本質的になる。
【０１６２】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号７４のアミノ酸２４〜６１（例えば、アミノ酸残基２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０および６１）のいずれか１つで始まり、配列番号７４のアミノ酸１３０〜１５２（例えば、アミノ酸残基１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１および１５２）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ３ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号７４のアミノ酸６１〜１３０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ３ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号７４のアミノ酸２４〜１５２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ３ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２および８３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ３ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＰＡリーダーを用い、次の通りである：
【化２３】
2019536440.tif 000024
【化２４】
2019536440.tif 000025
【０１６３】
リーダーおよびリンカー配列は下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ３−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号７６のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【０１６４】
このＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質は、次の核酸（配列番号２４５）によってコードされる。
【化２５】
2019536440.tif 000026
【０１６５】
成熟ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質配列を次に示し（配列番号７７）、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【化２６】
2019536440.tif 000027
ＡＬＫ３−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号８０）の相補的形態を次に示す：
【化２７】
2019536440.tif 000028
【０１６６】
リーダー配列およびリンカーに下線が引かれている。本明細書に開示されているある特定のＦｃ融合ポリペプチドによるヘテロ二量体形成を誘導するために、上に二重下線で示す通り、４個のアミノ酸置換を、ＡＬＫ３融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入することができる。配列番号８０のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０１６７】
成熟ＡＬＫ３−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号８１）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）を除去して提供することができる。
【化２８】
2019536440.tif 000029
【化２９】
2019536440.tif 000030
【０１６８】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ４ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＡＬＫ４」という用語は、任意の種からのアクチビン受容体様キナーゼ−４タンパク質のファミリー、およびそのようなＡＬＫ４タンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＡＬＫ４への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＡＬＫ４ファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０１６９】
「ＡＬＫ４ポリペプチド」という用語は、ＡＬＫ４ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＡＬＫ４前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４２９３）は、次の通りである：
【化３０】
2019536440.tif 000031
【０１７０】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ヒトＡＬＫ４ポリペプチド配列は、次の通りである：
【化３１】
2019536440.tif 000032
【０１７１】
ＡＬＫ４前駆体タンパク質をコードする核酸配列を配列番号２２１に示し、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００４３０２．４のヌクレオチド７８〜１５９２に対応する。細胞外ＡＬＫ４ポリペプチドをコードする核酸配列を配列番号２２２に示す。
ヒトＡＬＫ４前駆体タンパク質配列の代替アイソフォームである、アイソフォームＣ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＰ＿０６４７３３．３）を次に示す：
【化３２】
2019536440.tif 000033
【０１７２】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ４ポリペプチド配列（アイソフォームＣ）は、次の通りである：
【化３３】
2019536440.tif 000034
【０１７３】
ＡＬＫ４前駆体タンパク質（アイソフォームＣ）をコードする核酸配列を配列番号２２３に示し、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿０２０３２８．３のヌクレオチド７８〜１７１５に対応する。細胞外ＡＬＫ４ポリペプチド（アイソフォームＣ）をコードする核酸配列を配列番号２２４に示す。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＡＬＫ４ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＡＬＫ４ポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡＬＫ４の細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ４ポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号８４、８６、８５、８７、８８、８９、９２または９３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号８４、８６、８５、８７、８８、８９、９２または９３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドからなるまたはそれから本質的になる。
【０１７５】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号８４または８５のアミノ酸２３〜３４（例えば、アミノ酸残基２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４）のいずれか１つで始まり、配列番号８４または８５のアミノ酸１０１〜１２６（例えば、アミノ酸残基１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５および１２６）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ４ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号８４または８５のアミノ酸３４〜１０１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ４ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号８４または８５のアミノ酸２３〜１２６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ４ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号８４、８６、８５、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４および９５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ４ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、次のＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号８８）を含む：
【化３４】
2019536440.tif 000035
【０１７６】
リーダー配列およびリンカー配列に下線が引かれている。本開示のある特定のＦｃ融合ポリペプチドによるヘテロ二量体形成を誘導するために、上に二重下線で示す通り、２個のアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入することができる。配列番号８８のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
このＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質は、次の核酸（配列番号２４３）によってコードされる：
【化３５】
2019536440.tif 000036
【０１７７】
成熟ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号８９）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【化３６】
2019536440.tif 000037
【０１７８】
一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド（または本明細書に開示されているいずれかのＦｃ融合ポリペプチド）は、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダーを用いる：
【化３７】
2019536440.tif 000038
【０１７９】
一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号９２）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化３８】
2019536440.tif 000039
【０１８０】
リーダー配列およびリンカーに下線が引かれている。本明細書に開示されているある特定のＦｃ融合ポリペプチドによるヘテロ二量体形成を誘導するために、上に二重下線で示す通り、４個のアミノ酸置換を、ＡＬＫ４融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入することができる。配列番号９２のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０１８１】
成熟ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質配列は以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化３９】
2019536440.tif 000040
【０１８２】
様々なＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃ複合体の精製は、例えば、次のうち３種またはそれよりも多くをいずれかの順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了することができる。
【０１８３】
一部の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号２４７）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化４０】
2019536440.tif 000041
【０１８４】
リーダー配列およびリンカーに下線が引かれている。本明細書に開示されているある特定のＦｃ融合ポリペプチドによるヘテロ二量体形成を誘導するために、上に二重下線で示す通り、４個のアミノ酸置換（チロシンをシステインで、トレオニンをセリンで、ロイシンをアラニンで、チロシンをバリンで置き換える）を、ＡＬＫ４融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入することができる。ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の精製を容易にするために、２つのアミノ酸置換（アスパラギンをアルギニンで、アスパラギン酸をアルギニンで置き換える）を、上に二重下線により示されたＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することもできる。配列番号２４７のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、次の核酸（配列番号２４８）によってコードされる：
【化４１】
2019536440.tif 000042
【化４２】
2019536440.tif 000043
【０１８５】
成熟ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド配列を次に示し（配列番号２４９）、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化４３】
2019536440.tif 000044
このＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、次の核酸（配列番号２５０）によってコードされる：
【化４４】
2019536440.tif 000045
【化４５】
2019536440.tif 000046
【０１８６】
ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、本明細書に開示されているある特定のＦｃ融合ポリペプチドのヘテロ二量体形成を誘導するための、４個のアミノ酸置換を含有する配列番号９２（上に示す）であり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、次の核酸（配列番号２５１）によってコードされる：
【化４６】
2019536440.tif 000047
【化４７】
2019536440.tif 000048
【０１８７】
成熟ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、配列番号９３（上に示す）であり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、次の核酸（配列番号２５２）によってコードされる：
【化４８】
2019536440.tif 000049
【０１８８】
様々なＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびエピトープに基づく親和性クロマトグラフィー（例えば、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢ上のエピトープに対する抗体または機能的に等価なリガンドを用いる）、ならびにマルチモーダルクロマトグラフィー（静電気的および疎水性リガンドの両方を含有する樹脂を用いる）のうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
【０１８９】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ５ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＡＬＫ５」という用語は、任意の種からのアクチビン受容体様キナーゼ−５タンパク質のファミリー、およびそのようなＡＬＫ４タンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＡＬＫ５への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＡＬＫ５ファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０１９０】
「ＡＬＫ５ポリペプチド」という用語は、ＡＬＫ５ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＡＬＫ５前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４６０３．１）は、次の通りである：
【化４９】
2019536440.tif 000050
【０１９１】
シグナルペプチドは、１本の下線で示し、細胞外ドメインは、太字フォントで示す。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ５ポリペプチド配列を次に示す：
【化５０】
2019536440.tif 000051
【０１９２】
ＡＬＫ５前駆体タンパク質をコードする核酸配列を配列番号２２５に示し、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００４６１２．２のヌクレオチド７７〜１５８５に対応する。細胞外ヒトＡＬＫ５ポリペプチドをコードする核酸配列を配列番号２２６に示す。
ヒトＡＬＫ５前駆体タンパク質配列の代替アイソフォームであるアイソフォーム２（ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿００５２５２２０７．１）は、次の通りである：
【化５１】
2019536440.tif 000052
【０１９３】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ５ポリペプチド配列（アイソフォーム２）を次に示す：
【化５２】
2019536440.tif 000053
【０１９４】
ヒトＡＬＫ５前駆体タンパク質（アイソフォーム２）をコードする核酸配列を配列番号２２７に示し、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＸＭ＿００５２５２１５０．１のヌクレオチド７７〜１５９７に対応する。プロセシングされた細胞外ＡＬＫ５ポリペプチドをコードする核酸配列を配列番号２２８に示す。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＡＬＫ５ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＡＬＫ５ポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡＬＫ５の細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ５ポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号９６、９８、９７または９９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、配列番号９６、９８、９７または９９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ５ポリペプチドからなるまたはそれから本質的になる。
【０１９６】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号９６または９７のアミノ酸２５〜３６（例えば、アミノ酸残基２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５および３６）のいずれか１つで始まり、配列番号９６または９７のアミノ酸１０６〜１２６（例えば、アミノ酸残基１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５および１２６）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ５ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号９６または９７のアミノ酸３６〜１０６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ５ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号９６または９７のアミノ酸２５〜１２６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ５ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５および１０６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ５ドメインを含む。
相補的ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＰＡリーダーを用い、これを次に示す（配列番号１００）：
【化５３】
2019536440.tif 000054
【０１９７】
シグナル配列およびリンカー配列は下線付きである。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ５−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号１００のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
このＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質は、次の核酸（配列番号２５３）によってコードされる：
【化５４】
2019536440.tif 000055
【０１９８】
成熟ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号１０１）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【化５５】
2019536440.tif 000056
【化５６】
2019536440.tif 000057
【０１９９】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用してヘテロ多量体複合体の形成を促進する別のアプローチにおいて、Ｆｃドメインは、相補的な疎水性相互作用および追加的な分子間ジスルフィド結合を導入するように変更される。
一部の実施形態では、ＡＬＫ５−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１０４）を次に示す：
【化５７】
2019536440.tif 000058
【０２００】
リーダー配列およびリンカー配列に下線が引かれている。本明細書に開示されているある特定のＦｃ融合ポリペプチドによるヘテロ二量体形成を誘導するために、上に二重下線で示す通り、４個のアミノ酸置換を、ＡＬＫ５融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入することができる。さらに、ＦｃドメインのＣ末端リシン残基は、欠失される場合がある。配列番号１０４のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０２０１】
成熟ＡＬＫ５−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号１０５）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化５８】
2019536440.tif 000059
【化５９】
2019536440.tif 000060
【０２０２】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ６ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＡＬＫ６」という用語は、任意の種からのアクチビン受容体様キナーゼ−６タンパク質のファミリー、およびそのようなＡＬＫ６タンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＡＬＫ６への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＡＬＫ６ファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０２０３】
「ＡＬＫ６ポリペプチド」という用語は、ＡＬＫ６ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＡＬＫ６前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１９４．１）は、次の通りである：
【化６０】
2019536440.tif 000061
【０２０４】
シグナルペプチドは、一重下線により示されており、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ６ポリペプチド配列を次に示す：
【化６１】
2019536440.tif 000062
【０２０５】
ＡＬＫ６前駆体タンパク質をコードする核酸配列を配列番号２２９に示し、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１２０３．２のヌクレオチド２７５〜１７８０に対応する。プロセシングされた細胞外ＡＬＫ６ポリペプチドをコードする核酸配列を配列番号２３０に示す。
ヒトＡＬＫ６前駆体タンパク質配列の代替アイソフォームであるアイソフォーム２（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１２４３７２２．１）は、次の通りである：
【化６２】
2019536440.tif 000063
【０２０６】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ６ポリペプチド配列（アイソフォーム２）を次に示す：
【化６３】
2019536440.tif 000064
【０２０７】
ヒトＡＬＫ６前駆体タンパク質（アイソフォーム２）をコードする核酸配列を配列番号２３１に示し、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１２５６７９３．１のヌクレオチド２２〜１６１７に対応する。プロセシングされた細胞外ＡＬＫ６ポリペプチドをコードする核酸配列を配列番号２３２に示す。
【０２０８】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ６ポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＡＬＫ６ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＡＬＫ６ポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡＬＫ６の細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ６ポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１０８、１０９、１１０または１１１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ６ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１０８、１０９、１１０または１１１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ６ポリペプチドからなるまたはそれから本質的になる。
【０２０９】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１０８のアミノ酸１４〜３２（例えば、アミノ酸残基１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２）のいずれか１つで始まり、配列番号１０８のアミノ酸１０２〜１２６（例えば、アミノ酸残基１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、および１２６）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ６ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１０８のアミノ酸３２〜１０２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ６ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１０８のアミノ酸１４〜１２６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ６ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８および１１９のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ６ドメインを含む。
【０２１０】
一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１１０のアミノ酸２６〜６２（例えば、アミノ酸残基２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、および６２）のいずれか１つで始まり、配列番号１１０のアミノ酸１３２〜１５６（例えば、アミノ酸残基１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、および１５６）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ６ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１１０のアミノ酸６２〜１３２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ６ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１１０のアミノ酸２６〜１５６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ６ドメインを含む。
相補的ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＰＡリーダーを用い、これを次に示す（配列番号１１２）：
【化６４】
2019536440.tif 000065
【０２１１】
シグナル配列およびリンカー配列に下線が引かれている。可能なホモ二量体複合体のいずれかではなく、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ６−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、上に二重下線で示す通り、２個のアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、融合タンパク質のＦｃドメインに導入することができる。配列番号１１２のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
このＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質は、次の核酸（配列番号２５４）によってコードされる：
【化６５】
2019536440.tif 000066
【化６６】
2019536440.tif 000067
【０２１２】
成熟ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号１１３）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【化６７】
2019536440.tif 000068
【０２１３】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用してヘテロ多量体複合体の形成を促進する別のアプローチにおいて、Ｆｃドメインは、相補的な疎水性相互作用および追加的な分子間ジスルフィド結合を導入するように変更することができる。
相補的形態のＡＬＫ６−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１１６）を次に示す：
【化６８】
2019536440.tif 000069
【化６９】
2019536440.tif 000070
【０２１４】
リーダー配列およびリンカー配列に下線が引かれている。本明細書に開示されているある特定のＦｃ融合ポリペプチドによるヘテロ二量体形成を誘導するために、上に二重下線で示す通り、４個のアミノ酸置換を、ＡＬＫ６融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入することができる。さらに、ＦｃドメインのＣ末端リシン残基は、欠失される場合がある。配列番号１１６のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０２１５】
成熟ＡＬＫ６−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号１１７）は、次の通りになり得、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化７０】
2019536440.tif 000071
【０２１６】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ６ポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＡＬＫ６ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＡＬＫ６ポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡＬＫ６の細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ６ポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号３４、３５、９１または９２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ６ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号３４、３５、９１もしくは９２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ６ポリペプチドからなるか、またはそのようなポリペプチドから本質的になる。
【０２１７】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ７ポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＡＬＫ７」という用語は、任意の種からのアクチビン受容体様キナーゼ−７タンパク質のファミリー、およびそのようなＡＬＫ７タンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＡＬＫ７への言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＡＬＫ７ファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０２１８】
「ＡＬＫ７ポリペプチド」という用語は、ＡＬＫ７ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＡＬＫ７についての４つの天然に存在するアイソフォームが記載されている。ヒトＡＬＫ７アイソフォーム１前駆体タンパク質の配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６６０３０２．２）は、次の通りである：
【化７１】
2019536440.tif 000072
シグナルペプチドは、１本の下線で示し、細胞外ドメインは、太字フォントで示す。
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ７アイソフォーム１ポリペプチド配列を次に示す：
【化７２】
2019536440.tif 000073
【０２１９】
ヒトＡＬＫ７アイソフォーム１前駆体タンパク質をコードする核酸配列を下の配列番号２３３に示し、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿１４５２５９．２のヌクレオチド２４４〜１７２２に対応する。プロセシングされた細胞外ＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム１）をコードする核酸配列を配列番号２３４に示す。
【０２２０】
ヒトＡＬＫ７、アイソフォーム２の代替アイソフォームのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＰ＿００１１０４５０１．１）は、次の通りにそのプロセシング形態で示し（配列番号１２４）、配列中、細胞外ドメインは、太字フォントで示す。
【化７３】
2019536440.tif 000074
細胞外ＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム２）のアミノ酸配列を次に示す：
【０２２１】
【化７４】
2019536440.tif 000075
【０２２２】
プロセシングされたＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム２）をコードする核酸配列を下の配列番号２３５に示し、これは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１１１０３１．１のヌクレオチド２７９〜１６０７に対応する。
【０２２３】
細胞外ＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム２）をコードする核酸配列を配列番号２３６に示す。
【０２２４】
代替ヒトＡＬＫ７前駆体タンパク質、アイソフォーム３（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＰ＿００１１０４５０２．１）のアミノ酸配列を次に示し（配列番号１２１）、配列中、シグナルペプチドは、１本の下線で示す。
【化７５】
2019536440.tif 000076
【０２２５】
プロセシングされたＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム３）のアミノ酸配列を次に示す（配列番号１２６）。このアイソフォームは、膜貫通ドメインを欠き、したがって、その全体が可溶性であることが提案される（Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００３年、Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ６８巻：１７１９〜１７２６頁）。配列番号１２６のＮ末端バリアントは、後述する通りに予測される。
【化７６】
2019536440.tif 000077
【０２２６】
プロセシングされていないＡＬＫ７ポリペプチド前駆体タンパク質（アイソフォーム３）をコードする核酸配列を配列番号２３７に示し、これは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１１１０３２．１のヌクレオチド２４４〜１４８２に対応する。プロセシングされたＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム３）をコードする核酸配列は、配列番号２３８に示す。
【０２２７】
代替ヒトＡＬＫ７前駆体タンパク質、アイソフォーム４のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＰ＿００１１０４５０３．１）を次に示し（配列番号１２２）、配列中、シグナルペプチドは、１本の下線で示す。
【化７７】
2019536440.tif 000078
【０２２８】
プロセシングされたＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム４）のアミノ酸配列を次に示す（配列番号１２７）。ＡＬＫ７アイソフォーム３と同様に、アイソフォーム４は、膜貫通ドメインを欠き、したがって、その全体が可溶性であることが提案される（Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００３年、Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ６８巻：１７１９〜１７２６頁）。配列番号１２７のＮ末端バリアントは、後述する通りに予測される。
【化７８】
2019536440.tif 000079
【０２２９】
プロセシングされていないＡＬＫ７ポリペプチド前駆体タンパク質（アイソフォーム４）をコードする核酸配列を配列番号２３９に示し、これは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１１１０３３．１のヌクレオチド２４４〜１２４４に対応する。プロセシングされたＡＬＫ７ポリペプチド（アイソフォーム４）をコードする核酸配列は、配列番号２４０に示す。
【０２３０】
ラットにおける全長ＡＬＫ７（アイソフォーム１）のシグナル配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６２０７９０．１を参照）、ならびにヒトおよびラットＡＬＫ７の間の高い程度の配列同一性に基づき、プロセシング形態のヒトＡＬＫ７アイソフォーム１が次の通りであることが予測される（配列番号１２８）。
【化７９】
2019536440.tif 000080
【０２３１】
配列番号１２３が、Ｎ末端において１、２、３、４、５、６または７アミノ酸が短縮された、また、配列番号１２８が、Ｎ末端において１または２アミノ酸が短縮された、プロセシングされたＡＬＫ７アイソフォーム１の活性バリアントが予測される。配列番号１２８と一貫して、ロイシンが、プロセシング形態のヒトＡＬＫ７アイソフォーム３（配列番号１２６）およびヒトＡＬＫ７アイソフォーム４（配列番号１２７）におけるＮ末端アミノ酸であることがさらに予想される。
【０２３２】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ７ポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＡＬＫ７ポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＡＬＫ７ポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡＬＫ７の細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＡＬＫ７ポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１２０、１２３、１２９、１３０、１２４、１２５、１２１、１２６、１２２、１２７、１２８、１３３または１３４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ７ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１２０、１２３、１２９、１３０、１２４、１２５、１２１、１２６、１２２、１２７、１２８、１３３または１３４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ７ポリペプチドからなるまたはそれから本質的になる。
【０２３３】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１２０、１２１または１２２のアミノ酸２１〜２８（例えば、アミノ酸残基２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７および２８）のいずれか１つで始まり、配列番号１２０、１２１または１２２のアミノ酸９２〜１１３（例えば、アミノ酸残基９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２および１１３）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ７ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１２０、１２１または１２２のアミノ酸２８〜９２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ７ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１２０、１２１または１２２のアミノ酸２１〜１１３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ７ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１２０、１２３、１２４、１２５、１２１、１２６、１２２、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５および１３６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡＬＫ７ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＰＡリーダーを用い、これを次に示す（配列番号１２９）：
【化８０】
2019536440.tif 000081
【０２３４】
シグナル配列およびリンカー配列に下線が引かれている。可能なホモ二量体複合体のいずれかではなく、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ７−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、上に二重下線で示す通り、２個のアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸で置き換える）を、融合タンパク質のＦｃドメインに導入することができる。配列番号１２９のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
このＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質は、次の核酸（配列番号２５５）によってコードされる：
【化８１】
2019536440.tif 000082
【化８２】
2019536440.tif 000083
【０２３５】
成熟ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号１３０）は、次の通りであることが予想され、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【化８３】
2019536440.tif 000084
相補的形態のＡＬＫ７−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１３３）を次に示す：
【化８４】
2019536440.tif 000085
【０２３６】
リーダー配列およびリンカー配列に下線が引かれている。本明細書に開示されているある特定のＦｃ融合ポリペプチドによるヘテロ二量体形成を誘導するために、上に二重下線で示す通り、４個のアミノ酸置換を、ＡＬＫ７融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入することができる。さらに、ＦｃドメインのＣ末端リシン残基は、欠失される場合がある。配列番号１３３のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０２３７】
成熟ＡＬＫ７−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号１３４）は、次の通りであることが予想され、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化８５】
2019536440.tif 000086
【０２３８】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＡｃｔＲＩＩＡ」という用語は、任意の種からのアクチビン受容体ＩＩＡ型（ＡｃｔＲＩＩＡ）タンパク質のファミリー、およびそのようなＡｃｔＲＩＩＡタンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＡｃｔＲＩＩＡへの言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＡｃｔＲＩＩＡファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０２３９】
「ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド」という用語は、ＡｃｔＲＩＩＡファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。そのようなバリアントＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの例は、本開示の至る所で、ならびに国際特許出願公開番号ＷＯ２００６／０１２６２７に提供されており、この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質配列は、次の通りである：
【化８６】
2019536440.tif 000087
【化８７】
2019536440.tif 000088
【０２４０】
シグナルペプチドは、一重下線により示され；細胞外ドメインは、太字フォントで示され；可能性のある内在性Ｎ連結グリコシル化部位は、二重下線により示されている。
プロセシングされた細胞外ヒトＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド配列を次に示す：
【化８８】
2019536440.tif 000089
細胞外ドメインのＣ末端「テイル」は、１本の下線で示す。「テイル」が欠失された配列（Δ１５配列）を次に示す：
【化８９】
2019536440.tif 000090
【０２４１】
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質をコードする核酸配列を配列番号２４１に示し、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１６１６．４のヌクレオチド１５９〜１７００に対応する。プロセシングされた細胞外ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドをコードする核酸配列を配列番号２４２に示す。
【０２４２】
活性（例えば、リガンド結合性）ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの一般式は、配列番号１３７のアミノ酸３０から始まり、アミノ酸１１０で終わるポリペプチドを含む一般式である。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号１３７のアミノ酸３０〜１１０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチドを含むことができる。任意選択で、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、任意選択で、それぞれ１〜５（例えば、１、２、３、４または５）または３〜５（例えば、３、４または５）に及ぶ位置から始まり、１１０〜１１６（例えば、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５または１１６）または１１０〜１１５（例えば、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４または１１５）に及ぶ位置で終わり、配列番号１３７に関して、リガンド結合ポケットにおける１、２、５、１０または１５個以下の保存的アミノ酸変化、ならびにリガンド結合ポケットにおける位置４０、５３、５５、７４、７９および／または８２におけるゼロ個、１個または複数の非保存的変更を含む、配列番号１３７のアミノ酸１２〜８２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチドを含む。
【０２４３】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４４または１４５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４４または１４５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含む。
【０２４４】
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１３７のアミノ酸２１〜３０（例えば、アミノ酸残基２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）のいずれか１つで始まり、配列番号１３７のアミノ酸１１０〜１３５（例えば、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＡドメインを含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１３７のアミノ酸３０〜１１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＡドメインを含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１３７のアミノ酸２１〜１３５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＡドメインを含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６および１４７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＡドメインを含む。
ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１４０）を下に示す：
【化９０】
2019536440.tif 000091
【０２４５】
リーダー配列およびリンカー配列に下線が引かれている。可能なホモ二量体複合体のいずれかではなく、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、上に二重下線で示す通り、２個のアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンで置き換える）を、ＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質のＦｃドメインに導入することができる。配列番号１４０のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質は、次の核酸配列（配列番号２５６）によってコードされる：
【化９１】
2019536440.tif 000092
【化９２】
2019536440.tif 000093
【０２４６】
成熟ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１４１）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化９３】
2019536440.tif 000094
ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１４４）を下に示す：
【化９４】
2019536440.tif 000095
【０２４７】
リーダー配列およびリンカー配列に下線が引かれている。可能なホモ二量体複合体のいずれかではなく、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、上に二重下線で示す通り、２個のアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファン（ｔｒｙｔｏｐｈａｎ）で置き換える）を、融合タンパク質のＦｃドメインに導入することができる。配列番号１４４のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０２４８】
成熟ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１４５）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化９５】
2019536440.tif 000096
【０２４９】
ある特定の態様では、本開示は、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、用語「ＢＭＰＲＩＩ」は、いずれかの種由来の骨形成タンパク質受容体ＩＩ型（ＢＭＰＲＩＩ）タンパク質、および突然変異誘発または他の修飾によるそのようなＢＭＰＲＩＩタンパク質に由来するバリアントのファミリーを指す。本明細書におけるＢＭＰＲＩＩの参照は、現在同定されている形態のいずれか１つの参照であることが理解されている。ＢＭＰＲＩＩファミリーのメンバーは一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成された膜貫通タンパク質である。
【０２５０】
「ＢＭＰＲＩＩポリペプチド」という用語は、ＢＭＰＲＩＩファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＢＭＰＲＩＩ前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１９５．２）は、次の通りである：
【化９６】
2019536440.tif 000097
【化９７】
2019536440.tif 000098
【０２５１】
シグナルペプチドは、１本の下線で示し、細胞外ドメインは、太字フォントで示す。
プロセシングされた細胞外ＢＭＰＲＩＩポリペプチド配列を次に示す：
【化９８】
2019536440.tif 000099
【０２５２】
ＢＭＰＲＩＩ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１２０４．６のヌクレオチド１１４９〜４２６２に従った、配列番号２０５に示す。細胞外ＢＭＰＲＩＩポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２０６に示す。
ＢＭＰＲＩＩ、アイソフォーム２の代替アイソフォーム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ８６５１９．１）を次に示す：
【化９９】
2019536440.tif 000100
【化１００】
2019536440.tif 000101
【０２５３】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＢＭＰＲＩＩポリペプチド配列（アイソフォーム２）を次に示す：
【化１０１】
2019536440.tif 000102
【０２５４】
ヒトＢＭＰＲＩＩ前駆体タンパク質（アイソフォーム２）をコードする核酸配列を配列番号２０７に示し、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列Ｕ２５１１０．１のヌクレオチド１６３〜１７５２に対応する。シグナル配列に下線が引かれている。細胞外ＢＭＰＲＩＩポリペプチド（アイソフォーム２）をコードする核酸配列を配列番号２０８に示す。
【０２５５】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、可溶性（例えば、ＢＭＰＲＩＩの細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従った使用のためのＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する、および／またはその活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１４８、１５０、１４９、１５１、１５２、１５３、１５６または１５７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、配列番号１４８、１５０、１４９、１５１、１５２、１５３、１５６または１５７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である少なくとも１つのＢＭＰＲＩＩポリペプチドからなるまたはそれから本質的になる。
【０２５６】
ある特定の態様では、本開示は、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１４８または１４９のアミノ酸２７〜３４（例えば、アミノ酸残基２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、および３４）のいずれか１つで始まり、配列番号１４８または１４９のアミノ酸１２３〜１５０（例えば、アミノ酸残基１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、および１５０）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＢＭＰＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１４８または１４９のアミノ酸３４〜１２３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＢＭＰＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１４８または１４９のアミノ酸２７〜１５０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＢＭＰＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１４８、１５０、１４９、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８および１５９のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＢＭＰＲＩＩドメインを含む。
ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１５２）を下に示す：
【化１０２】
2019536440.tif 000103
【０２５７】
リーダー配列およびリンカー配列に下線が引かれている。可能なホモ二量体複合体のいずれかではなく、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、上に二重下線で示す通り、２個のアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンで置き換える）を、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃドメインに導入することができる。配列番号１５２のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、次の核酸配列（配列番号２５７）によってコードされる：
【化１０３】
2019536440.tif 000104
【０２５８】
成熟ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１５３）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１０４】
2019536440.tif 000105
【化１０５】
2019536440.tif 000106
ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１５６）を下に示す：
【化１０６】
2019536440.tif 000107
【０２５９】
リーダー配列およびリンカー配列に下線が引かれている。可能なホモ二量体複合体のいずれかではなく、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、上に二重下線で示す通り、２個のアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、融合タンパク質のＦｃドメインに導入することができる。配列番号１５６のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０２６０】
成熟ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１５７）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）を除去して提供することができる。
【化１０７】
2019536440.tif 000108
【０２６１】
ある特定の態様では、本開示は、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＴＧＦＢＲＩＩ」という用語は、任意の種からの形質転換増殖因子−ベータ受容体ＩＩ（ＴＧＦＢＲＩＩ）タンパク質のファミリー、およびそのようなタンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＴＧＦＢＲＩＩへの言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＴＧＦＢＲＩＩファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０２６２】
「ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド」という用語は、ＴＧＦＢＲＩＩファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＴＧＦＢＲＩＩ前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３２３３．４）は、以下の通りである：
【化１０８】
2019536440.tif 000109
【０２６３】
シグナルペプチドは、１本の下線で示し、細胞外ドメインは、太字フォントで示す。
プロセシングされた細胞外ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド配列は、次の通りである：
【化１０９】
2019536440.tif 000110
【０２６４】
ヒトＴＧＦＢＲＩＩ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１９６で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００３２４２．５のヌクレオチド３８３〜２０８３に対応する。プロセシングされた細胞外ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１９７で示される。
ＴＧＦＢＲＩＩの代替アイソフォームであるアイソフォームＡ（ＮＰ＿００１０２００１８．１）は、次の通りである：
【化１１０】
2019536440.tif 000111
【０２６５】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド配列（アイソフォームＡ）は、次の通りである：
【化１１１】
2019536440.tif 000112
【０２６６】
ＴＧＦＢＲＩＩ前駆体タンパク質（アイソフォームＡ）をコードする核酸配列は、配列番号２０２で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１０２４８４７．２のヌクレオチド３８３〜２１５８に対応する。プロセシングされた細胞外ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド（アイソフォームＡ）をコードする核酸配列は、配列番号２０３で示される。
【０２６７】
上述のＴＧＦβＲＩＩアイソフォーム（配列番号１９４、１９５、１９８および１９９）のいずれも、ＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＣにおいて天然に起こる（Ｋｏｎｒａｄら、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８巻：３１８頁、２００７年）ように、３６アミノ酸（配列番号２０４）の挿入物を、ＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤのＣ末端付近に位置するグルタミン酸残基対（配列番号１９４の１５１位と１５２位；配列番号１９５の１２９位と１３０位；配列番号１９８の１７６位と１７７位；または配列番号１９９の１５４位と１５５位）の間に組み込むことができるだろう。
【化１１２】
2019536440.tif 000113
【０２６８】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドは、可溶性（例えば、ＴＧＦＢＲＩＩの細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、上記のような配列番号２０４の挿入を伴うまたは伴わない、配列番号１９４、１９５、１９８もしくは１９９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、配列番号２０４の挿入を伴うまたは伴わない、配列番号１９４、１９５、１９８もしくは１９９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である少なくとも１つのＴＧＦＢＲＩＩポリペプチドからなるか、またはそのようなポリペプチドから本質的になる。
【０２６９】
ある特定の態様では、本開示は、ＴＧＦＢＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１６０のアミノ酸２３〜４４（例えば、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４）のいずれか１つで始まり、配列番号１６０のアミノ酸１６８〜１９１（例えば、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０または１９１）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦＢＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１６０のアミノ酸４４〜１６８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦＢＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１６０のアミノ酸２３〜１９１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦＢＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１６１、１６２、１６０、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８および１７９のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦＢＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１６１のアミノ酸２３〜５１（例えば、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０および５１）のいずれか１つで始まり、配列番号１６１のアミノ酸１４３〜１６６（例えば、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５および１６６）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦＢＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１６１のアミノ酸５１〜１４３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦＢＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１６１のアミノ酸２３〜１６６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦＢＲＩＩドメインを含む。
ヒトＴＧＦＢＲＩＩ前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＰ＿００３２３３．４）を次に示す：
【化１１３】
2019536440.tif 000114
【０２７０】
シグナルペプチドは、１本の下線で示し、細胞外ドメインは、太字フォントで示す。
プロセシングされた細胞外ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド配列を次に示す：
【化１１４】
2019536440.tif 000115
ＴＧＦＢＲＩＩの代替アイソフォーム、アイソフォームＡ（ＮＰ＿００１０２００１８．１）を次に示す：
【化１１５】
2019536440.tif 000116
【０２７１】
シグナルペプチドは、１本の下線で示し、細胞外ドメインは、太字フォントで示す。
プロセシングされた細胞外ＴＧＦＢＲＩＩポリペプチド配列（アイソフォームＡ）を次に示す：
【化１１６】
2019536440.tif 000117
ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１６４）を下に示す：
【化１１７】
2019536440.tif 000118
【０２７２】
リーダー配列およびリンカー配列に下線が引かれている。可能なホモ二量体複合体のいずれかではなく、ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、上に二重下線で示す通り、２個のアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンで置き換える）を、ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃドメインに導入することができる。配列番号１６４のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ融合タンパク質は、次の核酸配列（配列番号２５９）によってコードされる：
【化１１８】
2019536440.tif 000119
【０２７３】
成熟ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１６５）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１１９】
2019536440.tif 000120
ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１６６）を下に示す：
【化１２０】
2019536440.tif 000121
【０２７４】
リーダー配列およびリンカー配列に下線が引かれている。可能なホモ二量体複合体のいずれかではなく、ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、上に二重下線で示す通り、２個のアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンで置き換える）を、ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃドメインに導入することができる。配列番号１６６のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ融合タンパク質は、次の核酸配列（配列番号２６０）によってコードされる：
【化１２１】
2019536440.tif 000122
【化１２２】
2019536440.tif 000123
【０２７５】
成熟ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１６７）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１２３】
2019536440.tif 000124
【０２７６】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用してヘテロ多量体複合体の形成を促進する第２のアプローチにおいて、Ｆｃドメインは、相補的な疎水性相互作用および追加的な分子間ジスルフィド結合を導入するように変更される。
ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１７２）を下に示す：
【化１２４】
2019536440.tif 000125
【０２７７】
リーダー配列およびリンカー配列に下線が引かれている。可能なホモ二量体複合体のいずれかではなく、ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、上に二重下線で示す通り、２個のアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、融合タンパク質のＦｃドメインに導入することができる。配列番号１７２のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０２７８】
成熟ＴＧＦβＲＩＩＳＨＯＲＴ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１７３）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１２５】
2019536440.tif 000126
【０２７９】
本明細書に開示されているある特定のＦｃ融合ポリペプチドによるヘテロ二量体形成を誘導するために、４個のアミノ酸置換を、ＡＬＫ１融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入することができる。
一部の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１７４）は下に示す通りである：
【化１２６】
2019536440.tif 000127
【０２８０】
リーダー配列およびリンカー配列に下線が引かれている。可能なホモ二量体複合体のいずれかではなく、ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、上に二重下線で示す通り、２個のアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、融合タンパク質のＦｃドメインに導入することができる。配列番号１７４のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０２８１】
成熟ＴＧＦβＲＩＩＬＯＮＧ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１７５）を次に示し、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１２７】
2019536440.tif 000128
【０２８２】
ある特定の態様では、本開示は、ＭＩＳＲＩＩポリペプチドを含むタンパク質複合体に関する。本明細書で使用される場合、「ＭＩＳＲＩＩ」という用語は、任意の種からのミュラー管阻害因子受容体ＩＩ型（ＭＩＳＲＩＩ）タンパク質のファミリー、およびそのようなＭＩＳＲＩＩタンパク質から突然変異誘発または他の修飾により誘導されたバリアントを指す。本明細書でのＭＩＳＲＩＩへの言及は、現在同定されている形態のいずれか１つへの言及であると解される。ＭＩＳＲＩＩファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成されている膜貫通タンパク質である。
【０２８３】
「ＭＩＳＲＩＩポリペプチド」という用語は、ＭＩＳＲＩＩファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドを含むポリペプチドはもちろん、有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）も含む。
ヒトＭＩＳＲＩＩ前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６５４３４．１）は、次の通りである：
【化１２８】
2019536440.tif 000129
【０２８４】
シグナルペプチドは、一重下線により示され、細胞外ドメインは、太字フォントで示されている。
プロセシングされた細胞外ＭＩＳＲＩＩポリペプチド配列は、次の通りである：
【化１２９】
2019536440.tif 000130
【０２８５】
ＭＩＳＲＩＩ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２０９で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿０２０５４７．２のヌクレオチド８１〜１７９９に対応する。細胞外ヒトＭＩＳＲＩＩポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２１０で示される。
ヒトＭＩＳＲＩＩ前駆体タンパク質配列の代替アイソフォームであるアイソフォーム２（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１５８１６２．１）は、次の通りである：
【化１３０】
2019536440.tif 000131
【０２８６】
シグナルペプチドは、１本の下線で示し、細胞外ドメインは、太字フォントで示す。
プロセシングされた細胞外ＭＩＳＲＩＩポリペプチド配列（アイソフォーム２）は、次の通りである：
【化１３１】
2019536440.tif 000132
【０２８７】
ＭＩＳＲＩＩ前駆体タンパク質（アイソフォーム２）をコードする核酸配列は、配列番号２１１で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１６４６９０．１のヌクレオチド８１〜１５１４に対応する。プロセシングされた可溶性（細胞外）ヒトＭＩＳＲＩＩポリペプチド（アイソフォーム２）をコードする核酸配列は、配列番号２１２で示される。
ヒトＭＩＳＲＩＩ前駆体タンパク質配列の代替アイソフォームであるアイソフォーム３（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１５８１６３．１）は、次の通りである：
【化１３２】
2019536440.tif 000133
【０２８８】
シグナルペプチドは、１本の下線で示し、細胞外ドメインは、太字フォントで示す。
プロセシングされた細胞外ＭＩＳＲＩＩポリペプチド配列（アイソフォーム３）を次に示す：
【化１３３】
2019536440.tif 000134
【０２８９】
ヒトＭＩＳＲＩＩ前駆体タンパク質（アイソフォーム３）をコードする核酸配列は、配列番号２１３で示され、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１６４６９１．１のヌクレオチド８１〜１５１４に対応する。プロセシングされた可溶性（細胞外）ヒトＭＩＳＲＩＩポリペプチド（アイソフォーム３）をコードする核酸配列は、配列番号２１４で示される。
【０２９０】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩポリペプチドを含むヘテロ多量体に関し、ポリペプチドは、その断片、機能的バリアントおよび修飾形態を含む。好ましくは、本開示の発明（例えば、ＭＩＳＲＩＩポリペプチドを含むヘテロ多量体およびそれらの使用）に従って使用するためのＭＩＳＲＩＩポリペプチドは、可溶性（例えば、ＭＩＳＲＩＩの細胞外ドメイン）である。他の好ましい実施形態では、本開示の発明に従って使用するためのＭＩＳＲＩＩポリペプチドは、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合し、および／またはそのようなリガンドの活性（例えば、Ｓｍａｄ２／３および／またはＳｍａｄ１／５／８シグナル伝達の誘導）を阻害する（そのような活性に拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１８０、１８３、１８４、１８２もしくは１８５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のヘテロ多量体は、配列番号１８０、１８３、１８４、１８２もしくは１８５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である少なくとも１つのＭＩＳＲＩＩポリペプチドからなるか、またはそのようなポリペプチドから本質的になる。
【０２９１】
ある特定の態様では、本開示は、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含むヘテロ多量体に関する。一部の実施形態では、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１８０、１８１または１８２のアミノ酸１７〜２４（例えば、アミノ酸残基１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４）のいずれか１つで始まり、配列番号１８０、１８１または１８２のアミノ酸１１６〜１４９（例えば、アミノ酸残基１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８および１４９）のいずれか１つで終わるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＭＩＳＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１８０、１８１または１８２のアミノ酸２４〜１１６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＭＩＳＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１８０、１８１または１８２のアミノ酸１７〜１４９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＭＩＳＲＩＩドメインを含む。一部の実施形態では、ＭＩＳＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１８０、１８３、１８１、１８４、１８２、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２および１９３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＭＩＳＲＩＩドメインを含む。
【０２９２】
一部の実施形態では、本開示は、治療有効性または安定性（例えば、有効期間およびｉｎ  ｖｉｖｏでの耐タンパク質分解性）を増強するというような目的で、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、およびＡＬＫ７）および／またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩ）の構造を修飾することにより機能的バリアントを作製することを企図している。バリアントを、アミノ酸置換、欠失、付加、またはこれらの組合せにより産生することができる。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの、アスパラギン酸塩のグルタミン酸塩での、トレオニンのセリンでの孤立した置き換え、またはアミノ酸の構造的に関連性があるアミノ酸での同様の置き換え（例えば、保存的突然変異）が、結果として得られる分子の生物活性に大きな影響を与えないと予想することは理にかなっている。保存的置き換えは、側鎖に関連性があるアミノ酸のファミリー内で起こるものである。本開示のポリペプチドのアミノ酸配列の変化が、機能的ホモログを生じさせるかどうかは、細胞において野生型ポリペプチドと同様の方法で応答を生じさせるバリアントポリペプチドの能力、または例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ノーダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティーを含む、１つもしくは複数のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合する、バリアントポリペプチドの能力を評定することによって、容易に判定することができる。
【０２９３】
一部の実施形態では、本開示は、治療有効性または安定性を増強する（例えば、有効期間延長、および／または耐タンパク質分解性増大）というような目的で、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチドおよび／またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチドの構造を修飾することにより機能的バリアントを作製することを企図している。
【０２９４】
ある特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を変化させるための、本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、およびＡＬＫ７）および／またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩ）受容体の特異的突然変異を企図している。そのような突然変異は、Ｏ連結またはＮ連結グリコシル化部位などの、１つまたは複数のグリコシル化部位を導入するために、または消失させるために、選択され得る。アスパラギン連結グリコシル化認識部位は、適切な細胞グリコシル化酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列である、アスパラギン−Ｘ−トレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリン（ここでの「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を、一般に含む。ポリペプチドの配列への（Ｏ連結グリコシル化部位に対する）１つもしくは複数のセリンもしくはトレオニン残基の付加により、またはそのような残基による置換により、変更を加えることもできる。グリコシル化認識部位の第１もしくは第３のアミノ酸位置の一方もしくは両方における様々なアミノ酸の置換もしくは欠失（および／または第２位におけるアミノ酸欠失）は、修飾トリペプチド配列における非グリコシル化をもたらす。ポリペプチド上の糖鎖部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドとポリペプチドとの化学的または酵素的カップリングによるものである。使用されるカップリング方法に依存して、糖を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基；（ｄ）セリン、トレオニンもしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基；（ｅ）フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基；または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。ポリペプチド上に存在する１つまたは複数の糖鎖部分の除去は、化学的におよび／または酵素的に遂行することができる。化学的脱グリコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物へのポリペプチドの曝露を含み得る。この処置は、アミノ酸配列を原形のまま残しつつ、連結している糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除いてほとんどのまたはすべての糖を切断する結果となる。ポリペプチド上の糖鎖部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら［Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７年）１３８巻：３５０頁］によって記載されたような様々なエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用により果すことができる。哺乳動物、酵母、昆虫および植物細胞は、すべて、ペプチドのアミノ酸配列による影響を受け得る異なるグリコシル化パターンを導入することができるので、使用する発現系のタイプに依存して、必要に応じてポリペプチドの配列を調整することができる。一般に、ヒトにおける使用のための本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型およびＩＩ型受容体複合体は、適切なグリコシル化をもたらす哺乳動物細胞系、例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ���胞系において発現させることができるが、他の哺乳動物発現細胞系も有用であると予想される。
【０２９５】
本開示は、突然変異体、特に、本明細書で開示されるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、およびＡＬＫ７）および／またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体ポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＭＩＳＲＩＩ）のコンビナトリアル突然変異体のセット、ならびに短縮突然変異体を作製する方法をさらに企図している。コンビナトリアル突然変異体のプールは、機能的に活性な（例えば、リガンド結合）ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩ型および／またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩＩ型受容体配列の同定に、特に有用である。そのようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、薬物動態の変化またはリガンド結合の変化などの特性の変化を有するポリペプチドバリアントを生成することであり得る。様々なスクリーニングアッセイが下記で提供され、そのようなアッセイを使用してバリアントを評価することができる。例えば、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩおよびＩＩ型受容体複合体バリアントを、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ノーダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティー）に結合する能力、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドのＴＧＦ−ベータスーパーファミリー受容体への結合を防止する能力、および／またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドによって引き起こされるシグナル伝達に干渉する能力について、スクリーニングすることができる。
【０２９６】
本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の活性を、例えば、細胞に基づくｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで、試験することもできる。例えば、遺伝子の発現、または筋肉細胞での筋肉産生に関与するタンパク質の活性に対する、ヘテロ多量体複合体の効果を評定することができる。これを、必要に応じて、１つまたは複数の組換えＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドタンパク質（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＣ、アクチビンＢＥ、ノーダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティー）の存在下で行うことができ、細胞に、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーＩおよびＩＩ型受容体複合体ならびに任意選択でＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドを産生するように、トランスフェクトすることができる。同様に、本開示のヘテロ多量体複合体をマウスまたは他の動物に投与することができ、当技術分野で認知されている方法を使用して、筋肉形成および強度などの１つまたは複数の測定値を評定することができる。同様に、ヘテロ多量体またはそのバリアントの活性を、骨芽細胞、脂肪細胞および／または神経細胞において、これらの細胞の増殖に対する任意の効果について、例えば、本明細書に記載のアッセイおよび当技術分野において常識のアッセイにより、試験することができる。ＳＭＡＤ反応性レポーター遺伝子をそのような細胞系において使用して、下流のシグナル伝達に対する効果をモニターすることができる。
【０２９７】
参照ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体と比較して選択性の増加または一般に効力の増大を有する、コンビナトリアル由来バリアントを生成することができる。そのようなバリアントは、組換えＤＮＡ構築物から発現された場合、遺伝子療法プロトコールで使用することができる。同様に、突然変異誘発は、対応する未修飾ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体とは劇的に異なる細胞内半減期を有するバリアントを生じさせることができる。例えば、変化したタンパク質を、タンパク質分解に対して、または未修飾ポリペプチドの崩壊もしくは別様の不活性化を生じさせる他の細胞過程に対して、より安定にまたはより不安定にさせることができる。そのようなバリアント、およびそれらをコードする遺伝子を利用して、ポリペプチドの半減期をモジュレートすることによりポリペプチド複合体レベルを変更することができる。例えば、短い半減期は、より短期的な生物学的効果を生じさせることができ、誘導性発現系の部分の場合、細胞内の組換えポリペプチド複合体レベルのより厳格な調節を可能にすることができる。Ｆｃ融合タンパク質では、リンカー（存在する場合）および／またはＦｃ部分において突然変異を生じさせて、例えば免疫原性、半減期および可溶性を含む、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体複合体の１つまたは複数の活性を変化させることができる。
【０２９８】
当技術分野で公知の多くの方法を使用して、本開示のヘテロ多量体を生成することができる。例えば、第１および第２のポリペプチドの間にジスルフィド結合が形成されるように、遊離チオールが、第２のポリペプチド（例えば、未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは第１のポリペプチドに存在するものとは異なるバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）における別の遊離チオール含有残基と相互作用するように、第１のポリペプチド（例えば、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）において、天然に存在するアミノ酸を、システインなどの遊離チオール含有残基で置き換えることにより、天然に存在しないジスルフィド結合を構築することができる。ヘテロ多量体形成を促進するための相互作用のさらなる例は、Ｋｊａｅｒｇａａｒｄら、ＷＯ２００７１４７９０１に記載されているものなどのイオン性相互作用；Ｋａｎｎａｎら、Ｕ．Ｓ．８，５９２，５６２に記載されているものなどの静電ステアリング効果；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｕ．Ｓ．２０１２０３０２７３７に記載されているものなどのコイルドコイル相互作用；ＰａｃｋおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、（１９９２年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１巻：１５７９〜１５８４頁に記載されているものなどのロイシンジッパー；およびＰａｃｋら（１９９３年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１巻：１２７１〜１２７７頁に記載されているものなどのヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフを含むが、これらに限定されない。様々なセグメントの連結は、例えば、化学的架橋、ペプチドリンカー、ジスルフィドブリッジなどによるような共有結合によって、またはアビジン−ビオチンもしくはロイシンジッパー技術によるような親和性相互作用によって、達成することができる。
【０２９９】
ある特定の態様では、多量体化ドメインは、相互作用対の一方の構成成分を含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されているポリペプチドは、第２のポリペプチドと共有結合または非共有結合により会合された第１のポリペプチドを含むタンパク質複合体を形成することができ、第１のポリペプチドは、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用対の第１のメンバーのアミノ酸配列を含み；第２のポリペプチドは、未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは第１のポリペプチドに存在するものとは異なるバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列、および相互作用対の第２のメンバーのアミノ酸配列を含む。相互作用対は、相互作用して、複合体、特にヘテロ二量体複合体を形成する、いずれか２つのポリペプチド配列となり得るが、効力のある実施形態は、ホモ二量体複合体を形成することができる相互作用対を用いることもできる。相互作用対を、血清半減期の延長などの特性／活性の向上を付与するように選択してもよく、または特性／活性の向上をもたらすために別の部分を結合させるアダプターとして作用するように選択してもよい。例えば、ポリエチレングリコール部分を、血清半減期の延長などの特性／活性の向上をもたらすために相互作用対の一方または両方の成分に結合させてもよい。
【０３００】
相互作用対の第１および第２のメンバーは、非対称対であってもよく、これは、対のメンバーが、自己会合するのではなく優先的に互いに会合することを意味する。したがって、非対称の相互作用対の第１および第２のメンバーは、ヘテロ二量体複合体（例えば、図１Ｂを参照されたい）を形成するように会合し得る。あるいは、相互作用対は、無誘導であってもよく、これは、対のメンバーが、実質的な優先性なく、互いに会合することもあり、または自己会合することもあり、したがって、同じアミノ酸配列を有することもあり、または異なるアミノ酸配列を有することもあることを意味する（例えば、図１Ａを参照されたい）。したがって、無誘導相互作用対の第１および第２のメンバーは、ホモ二量体複合体を形成するように会合することもあり、またはヘテロ二量体複合体を形成するように会合することもある。任意選択で、相互作用対（例えば、非対称対または無誘導相互作用対）の第１のメンバーは、相互作用対の第２のメンバーと共有結合で会合する。任意選択で、相互作用対（例えば、非対称対または無誘導相互作用対）の第１のメンバーは、相互作用対の第２のメンバーと非共有結合で会合する。
【０３０１】
具体例として、本開示は、免疫グロブリンまたはＦｃドメインのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインなど、免疫グロブリンの定常ドメインを含むポリペプチドに融合された、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に由来するＦｃドメインは、本明細書で提供される。ＣＤＣまたはＡＤＣＣ活性のどちらかを低下させる他の突然変異は公知であり、まとめて、これらのバリアントのいずれもが本開示に含まれ、本開示のヘテロ多量体の有利な成分として使用され得る。任意選択で、配列番号１３のＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、Ｌｙｓ−３２２およびＡｓｎ−４３４（対応する完全長ＩｇＧ１に従って番号付けされた）などの残基における１つまたは複数の突然変異を有する。ある特定の場合、これらの突然変異の１つまたは複数（例えば、Ａｓｐ−２６５突然変異）を有するバリアントＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較してＦｃγ受容体に結合する能力が低下している。他の場合、これらの突然変異の１つまたは複数（例えば、Ａｓｎ−４３４突然変異）を有するバリアントＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較してＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）に結合する能力が増大している。
【０３０２】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｇ１Ｆｃ）に使用され得る天然アミノ酸配列の例は、下記で示される（配列番号１３）。点線下線は、ヒンジ領域を示し、実線下線は、天然に存在するバリアントを有する位置を示す。一部には、本開示は、配列番号１３に対して７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるか、またはそのようなアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドを提供する。Ｇ１Ｆｃにおける天然に存在するバリアントは、配列番号１３で使用された番号付けシステム（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５７を参照されたい）に従ってＥ１３４ＤおよびＭ１３６Ｌを含むであろう。
【化１３４】
2019536440.tif 000135
【０３０３】
ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分（Ｇ２Ｆｃ）に使用され得る天然アミノ酸配列の例は、下記で示される（配列番号１４）。点線下線は、ヒンジ領域を示し、二重下線は、配列にデータベースコンフリクトがある位置を示す（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９に従う）。一部には、本開示は、配列番号１４に対して７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるか、またはそのようなアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドを提供する。
【化１３５】
2019536440.tif 000136
【０３０４】
ヒトＩｇＧ３のＦｃ部分（Ｇ３Ｆｃ）に使用され得るアミノ酸配列の２つの例は、下記で示される。Ｇ３Ｆｃにおけるヒンジ領域は、他のＦｃ鎖における場合の４倍以下の長さであることができ、３つの同一の１５残基セグメントを含有し、その前に同様の１７残基セグメントがある。下記で示される第１のＧ３Ｆｃ配列（配列番号１５）は、単一の１５残基セグメントからなる短いヒンジ領域を含有するが、第２のＧ３Ｆｃ配列（配列番号１６）は、完全長ヒンジ領域を含有する。各々の場合、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９に従って、点線下線は、ヒンジ領域を示し、実線下線は、天然に存在するバリアントを有する位置を示す。一部には、本開示は、配列番号１５および１６に対して７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるか、またはそのようなアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドを提供する。
【化１３６】
2019536440.tif 000137
【０３０５】
Ｇ３Ｆｃにおける天然に存在するバリアント（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８６０を参照されたい）は、配列番号１５に使用された番号付けシステムに変換した場合、Ｅ６８Ｑ、Ｐ７６Ｌ、Ｅ７９Ｑ、Ｙ８１Ｆ、Ｄ９７Ｎ、Ｎ１００Ｄ、Ｔ１２４Ａ、Ｓ１６９Ｎ、Ｓ１６９ｄｅｌ、Ｆ２２１Ｙを含み、本開示は、これらの変異の１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む融合タンパク質を提供する。加えて、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ３遺伝子（ＩＧＨＧ３）は、異なるヒンジ長を特徴とする構造的多型を示す［Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５９を参照されたい］。具体的には、バリアントＷＩＳは、Ｖ領域の大部分およびＣＨ１領域のすべてを欠いている。バリアントＷＩＳは、ヒンジ領域に通常は存在する１１個に加えて７位に追加の鎖間ジスルフィド結合を有する。バリアントＺＵＣは、Ｖ領域の大部分、ＣＨ１領域のすべて、およびヒンジの一部を欠く。バリアントＯＭＭは、対立遺伝子形を表すこともあり、または別のガンマ鎖サブクラスを表すこともある。本開示は、これらのバリアントの１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含むさらなる融合タンパク質を提供する。
【０３０６】
ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分（Ｇ４Ｆｃ）に使用され得る天然アミノ酸配列の例は、下記で示される（配列番号１７）。点線下線は、ヒンジ領域を示す。一部には、本開示は、配列番号１７に対して７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるか、またはそのようなアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドを提供する。
【化１３７】
2019536440.tif 000138
【０３０７】
Ｆｃドメインにおける種々の工学的に作製された突然変異が、Ｇ１Ｆｃ配列（配列番号１３）に関して本明細書で提示され、Ｇ２Ｆｃ、Ｇ３ＦｃおよびＧ４Ｆｃにおける類似の突然変異を図４におけるＧ１Ｆｃとのそれらのアラインメントから導出することができる。等しくないヒンジ長のため、アイソタイプアラインメント（図４）に基づく類似のＦｃ位置は、配列番号１３、１４、１５および１７において異なるアミノ酸番号を有する。ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる免疫グロブリン配列（例えば、配列番号１３、１４、１５または１７）における所与のアミノ酸位置が、番号付けが、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの場合のように（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる）ＩｇＧ１重鎖定常ドメイン全体を包含するときの同じ位置とは異なる番号によって特定されることになることも理解され得る。例えば、ヒトＧ１Ｆｃ配列（配列番号１３）、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５７）およびヒトＩｇＧ１重鎖における選択されたＣＨ３位置間の対応は、次の通りである。
【表１−１】
2019536440.tif 000139
【表１−２】
2019536440.tif 000140
【０３０８】
単一の細胞系からの非対称の免疫グロブリンに基づくタンパク質の大規模産生の際に生じる問題は、「鎖会合課題」として公知である。二特異性抗体の産生の際に主として直面するように、鎖会合問題は、異なる重鎖および／または軽鎖が単一の細胞系において産生される場合に本質的に生じる複数の組合せの中から所望の多鎖タンパク質を効率的に産生させるという難題に関する［例えば、Ｋｌｅｉｎら（２０１２年）ｍＡｂｓ  ４巻：６５３〜６６３頁を参照されたい］。この問題は、２つの異なる重鎖および２つの異なる軽鎖が同じ細胞において産生される場合、最も深刻であり、この場合、１つだけが概して所望されるときに可能性のある鎖の組合せが（これらの一部は同一であるが）合計１６存在する。それにもかかわらず、同じ原理により、異なる（非対称）重鎖を２つだけ組み込む所望の多鎖融合タンパク質の収量減少が説明される。
【０３０９】
好ましい非対称の融合タンパク質を許容可能な収量で産生するために単一の細胞系においてＦｃ含有融合ポリペプチド鎖の所望の対合を増加させる様々な方法が、当技術分野において公知である［例えば、Ｋｌｅｉｎら（２０１２年）ｍＡｂｓ  ４巻：６５３〜６６３頁；およびＳｐｉｅｓｓら（２０１５年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７巻（２Ａ号）：９５〜１０６頁を参照されたい］。Ｆｃ含有鎖の所望の対合を達成するための方法は、電荷に基づく対合（静電ステアリング）、「ノブ−イントゥ−ホール」立体的対合、ＳＥＥＤｂｏｄｙ対合、およびロイシンジッパーに基づく対合を含むが、これらに限定されない。例えば、Ｒｉｄｇｗａｙら（１９９６年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ９巻：６１７〜６２１頁；Ｍｅｒｃｈａｎｔら（１９９８年）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １６巻：６７７〜６８１頁；Ｄａｖｉｓら（２０１０年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２３巻：１９５〜２０２頁；Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら（２０１０年）；２８５巻：１９６３７〜１９６４６頁；Ｗｒａｎｉｋら（２０１２年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８７巻：４３３３１〜４３３３９頁；ＵＳ５９３２４４８；ＷＯ１９９３／０１１１６２；ＷＯ２００９／０８９００４、およびＷＯ２０１１／０３４６０５を参照されたい。本明細書に記載されている通り、これらの方法を使用して、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、および別の、任意選択で異なる、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ二量体を生成することができる。
【０３１０】
例えば、特定のポリペプチド間の相互作用を促進することができる１つの手段は、Ａｒａｔｈｏｏｎら、Ｕ．Ｓ．７，１８３，０７６およびＣａｒｔｅｒら、Ｕ．Ｓ．５，７３１，１６８に記載されているものなどの、突出−イントゥ−空洞（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ）（ノブ−イントゥ−ホール）相補領域を工学的に作製することによるものである。「突出」は、第１のポリペプチド（例えば、第１の相互作用対）の境界面からの小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築される。突出と同一のまたは同様のサイズの相補的「空洞」が、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることによって、第２のポリペプチド（例えば、第２の相互作用対）の境界面に任意選択で作出される。適切な位置にあり、適切な寸法を有する突出または空洞が、第１または第２のポリペプチドのどちらかの境界面に存在する場合、対応する空洞または突出を、それぞれ、隣接する境界面に工学的に作製するだけでよい。
【０３１１】
中性ｐＨ（７．０）では、アスパラギン酸およびグルタミン酸は、負に荷電しており、リシン、アルギニンおよびヒスチジンは、正に荷電している。これらの荷電残基を使用して、ヘテロ二量体形成を促進すること、および同時にホモ二量体形成を妨げることができる。引力相互作用が、反対の電荷間で起こり、反発相互作用が、同じ電荷間で起こる。一部には、本明細書で開示されるタンパク質複合体は、荷電境界面残基の部位特異的突然変異誘発を行うことにより、ヘテロ多量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）を促進するために引力相互作用を、および任意選択で、ホモ二量体形成（例えば、ホモ二量体形成）を妨げるために反発相互作用を使用する。
【０３１２】
例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン境界面は、ドメイン−ドメイン相互作用に関与する４種の特有の荷電残基（ｃｈａｒｇｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ）対：Ａｓｐ３５６−Ｌｙｓ４３９’、Ｇｌｕ３５７−Ｌｙｓ３７０’、Ｌｙｓ３９２−Ａｓｐ３９９’、およびＡｓｐ３９９−Ｌｙｓ４０９’［第２の鎖における残基番号付けが（’）により示されている］を含む。ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインにおける残基を指定するためにここで使用される番号付けスキームが、ＫａｂａｔのＥＵ番号付けスキームに準拠することに留意されたい。ＣＨ３−ＣＨ３ドメイン相互作用に存在する２回対称性のため、各々の特有の相互作用は、構造に２回示されることになる（例えば、Ａｓｐ−３９９−Ｌｙｓ４０９’およびＬｙｓ４０９−Ａｓｐ３９９’）。野生型配列では、Ｋ４０９−Ｄ３９９’は、ヘテロ二量体形成とホモ二量体形成の両方に有利である。第１の鎖における電荷極性を切り替える単一の突然変異（例えば、Ｋ４０９Ｅ；正電荷から負電荷へ）は、第１の鎖のホモ二量体の形成に不利な相互作用をもたらす。不利な相互作用は、同じ電荷（負−負；Ｋ４０９Ｅ−Ｄ３９９’およびＤ３９９−Ｋ４０９Ｅ’）間で起こる反発相互作用に起因して生じる。第２の鎖における電荷極性を切り替える同様の突然変異（Ｄ３９９Ｋ’；負から正へ）は、第２の鎖のホモ二量体形成に不利な相互作用（Ｋ４０９’−Ｄ３９９Ｋ’およびＤ３９９Ｋ−Ｋ４０９’）をもたらす。しかし、同時に、これら２つの突然変異（Ｋ４０９ＥおよびＤ３９９Ｋ’）は、ヘテロ二量体形成に有利な相互作用（Ｋ４０９Ｅ−Ｄ３９９Ｋ’およびＤ３９９−Ｋ４０９’）をもたらす。
【０３１３】
ヘテロ二量体形成およびホモ二量体防止に対する静電ステアリング効果を、例えばＡｒｇ３５５およびＬｙｓ３６０を含む第２の鎖における反対荷電残基と対合することもあり、またはしないこともある、さらなる荷電残基の突然変異によって、さらに増強することができる。下記の表は、本明細書で開示されるヘテロ多量体のヘテロ多量体形成を増進するために単独でまたは組み合わせて使用することができる、可能性のある電荷変化突然変異を収載する。
【表２】
2019536440.tif 000141
【０３１４】
一部の実施形態では、本願の融合タンパク質におけるＣＨ３−ＣＨ３境界面を構成する１つまたは複数の残基は、相互作用が静電的に不利になるような荷電アミノ酸で置き換えられる。例えば、境界面における正荷電アミノ酸（例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジン）は、負荷電アミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置き換えられる。あるいは、または前述の置換と組み合わせて、境界面における負荷電アミノ酸は、正荷電アミノ酸で置き換えられる。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、所望の電荷特性を有する天然に存在しないアミノ酸で置き換えられる。負荷電残基（ＡｓｐまたはＧｌｕ）のＨｉｓへの突然変異が、立体的課題の原因になり得る、側鎖体積の増加につながることになることに留意されたい。さらに、Ｈｉｓプロトン供与体および受容体形態は、局在環境に依存する。これらの課題を設計戦略とともに考慮するべきである。境界面残基は、ヒトおよびマウスＩｇＧサブクラスにおいて高度に保存されるため、本明細書で開示される静電ステアリング効果をヒトおよびマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に適用することができる。この戦略をＣＨ３ドメイン境界面における非荷電残基の荷電残基への修飾に拡大することもできる。
【０３１５】
一部には、本開示は、電荷対合（静電ステアリング）に基づいて相補性になるように工学的に作製されたＦｃ配列を使用する、非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対合を提供する。静電相補性によるＦｃ配列の対の一方を、任意選択のリンカーありまたはなしで、構築物の第１のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、第２のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに任意で融合して、バリアントＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖を、最適な細胞内で第１のＦｃ配列と相補的なＦｃ配列と共に同時発現させて、所望の多重鎖構築物（例えば、バリアントＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体）の生成を支持することができる。静電ステアリングに基づくこの例において、配列番号２００［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｅ１３４Ｋ／Ｄ１７７Ｋ）］および配列番号２０１［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｋ１７０Ｄ／Ｋ１８７Ｄ）］は、工学的に作製されたアミノ酸置換に二重下線が引かれている相補的Ｆｃ配列の例であり、構築物の第１のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、第２のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１８または配列番号１９のいずれかに融合することができるが、その両方には融合できない。ネイティブｈＧ１Ｆｃ、ネイティブｈＧ２Ｆｃ、ネイティブｈＧ３ＦｃおよびネイティブｈＧ４Ｆｃの間の高い程度のアミノ酸配列同一性を仮定すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃの対応する位置におけるアミノ酸置換（図４を参照）が、下の相補的ｈＧ１Ｆｃ対（配列番号１８および１９）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃ対を生成するであろうことを認めることができる。
【化１３８】
2019536440.tif 000142
【０３１６】
一部には、本開示は、立体的相補性のために工学的に作製されたＦｃ配列を使用する、非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対合を提供する。一部には、本開示は、ノブ−イントゥ−ホール対合を立体的相補性の例として提供する。立体的相補性によるＦｃ配列の対の一方を、任意選択のリンカーありまたはなしで、構築物の第１のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、第２のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに任意で融合して、バリアントＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖を、最適な細胞内で第１のＦｃ配列と相補的なＦｃ配列と共に同時発現させて、所望の多重鎖構築物の生成を支持することができる。ノブ・イントゥ・ホール対合に基づくこの例において、配列番号２０［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｔ１４４Ｙ）］および配列番号２１［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｙ１８５Ｔ）］は、工学的に作製されたアミノ酸置換に二重下線が引かれている相補的Ｆｃ配列の例であり、構築物の第１のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、第２のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２０または配列番号２１のいずれかに融合することができるが、その両方には融合できない。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一性度を考えると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図４を参照されたい）における対応する位置でのアミノ酸置換が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃ対（配列番号２０および２１）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃ対を生成することになることは理解され得る。
【化１３９】
2019536440.tif 000143
【化１４０】
2019536440.tif 000144
【０３１７】
工学的に作製されたジスルフィド結合と組み合わせたノブ・イントゥ・ホール対合に基づくＦｃ相補性の例は、配列番号２２［ｈＧ１Ｆｃ（Ｓ１３２Ｃ／Ｔ１４４Ｗ）］および配列番号２３［ｈＧ１Ｆｃ（Ｙ１２７Ｃ／Ｔ１４４Ｓ／Ｌ１４６Ａ／Ｙ１８５Ｖ）］に開示されている。これらの配列における工学的に作製されたアミノ酸置換には二重下線が引かれており、構築物の第１のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、第２のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２２または配列番号２３のいずれかに融合することができるが、その両方には融合できない。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一性度を考えると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図４を参照されたい）における対応する位置でのアミノ酸置換が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃ対（配列番号２２および２３）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃ対を生成することになることは理解され得る。
【化１４１】
2019536440.tif 000145
【０３１８】
一部には、本開示は、ヒトＩｇＧおよびＩｇＡ  ＣＨ３ドメインの指状嵌入β鎖セグメントを生成するように工学的に作製されたＦｃ配列を使用する、非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対合を提供する。このような方法は、ＳＥＥＤｂｏｄｙ融合タンパク質の形成を可能にする鎖交換工学的作製ドメイン（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ヘテロ二量体の使用を含む［例えば、Ｄａｖｉｓら（２０１０年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｅｌ  ２３巻：１９５〜２０２頁を参照されたい］。ＳＥＥＤｂｏｄｙ相補性によるＦｃ配列の対の一方を、任意選択のリンカーありまたはなしで、構築物の第１のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、第２のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに任意で融合して、バリアントＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖を、最適な細胞内で第１のＦｃ配列と相補的なＦｃ配列と共に同時発現させて、所望の多重鎖構築物の生成を支持することができる。ＳＥＥＤｂｏｄｙ（Ｓｂ）対合に基づくこの例において、配列番号２４［ｈＧ１Ｆｃ（ＳｂＡＧ）］および配列番号２５［ｈＧ１Ｆｃ（ＳｂＧＡ）］は、ＩｇＡ  Ｆｃ由来の工学的に作製されたアミノ酸置換に二重下線が引かれている相補的ＩｇＧ  Ｆｃ配列の例であり、構築物の第１のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、第２のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２４または配列番号２５のいずれかに融合することができるが、その両方には融合できない。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一性度を考えると、ｈＧ１Ｆｃ、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図４を参照されたい）における対応する位置でのアミノ酸置換が、下記の相補的ＩｇＧ−ＩｇＡ対（配列番号２４および２５）において使用することができるＦｃ単量体を生成することになることは理解され得る。
【化１４２】
2019536440.tif 000146
【０３１９】
一部には、本開示は、Ｆｃ  ＣＨ３ドメインのＣ末端に結合された切断可能ロイシンジッパードメインを用いる非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対合を提供する。ロイシンジッパーの結合は、ヘテロ二量体抗体重鎖の優先的構築を生じさせるのに十分である。例えば、Ｗｒａｎｉｋら（２０１２年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８７巻：４３３３１〜４３３３９頁を参照されたい。本明細書に開示されている通り、ロイシンジッパー形成鎖に結合したＦｃ配列の対の一方を、任意選択のリンカーありまたはなしで、構築物の第１のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、第２のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに任意で融合して、バリアントＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖を、選ばれた細胞において、所望の多鎖構築物の生成に有利であるように、相補的ロイシンジッパー形成鎖に結合されたＦｃ配列とともに共発現させることができる。精製後の細菌エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃでの構築物のタンパク質消化は、ロイシンジッパードメインを放出して、構造が天然Ｆｃの構造と同一であるＦｃ構築物をもたらすことができる。ロイシンジッパー対合に基づくこの例において、配列番号２６［ｈＧ１Ｆｃ−Ａｐ１（酸性）］および配列番号２７［ｈＧ１Ｆｃ−Ｂｐ１（塩基性）］は、工学的に作製された相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ロイシンジッパー配列に下線が引かれている相補的ＩｇＧ  Ｆｃ配列の例であり、構築物の第１のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、第２のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２６または配列番号２７のいずれかに融合することができるが、その両方には融合できない。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一性度を考えると、任意選択のリンカーを用いてまたは用いずにｈＧ１Ｆｃ、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図４を参照されたい）に結合されたロイシンジッパー形成配列が、下記の相補的ロイシンジッパー形成対（配列番号２６および２７）において使用することができるＦｃ単量体を生成することになることは理解され得る。
【化１４３】
2019536440.tif 000147
【０３２０】
一部には、本開示は、所望のヘテロマー種の精製を助長するＦｃドメインにおけるさらなる突然変異と組み合わせての上記の方法により、非対称のＦｃ含有ポリペプチド鎖の所望の対合を提供する。例は、一方のＦｃ含有ポリペプチド鎖中の２つの負荷電アミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸）および相補的Ｆｃ含有ポリペプチド鎖中の２つの正荷電アミノ酸（例えば、アルギニン）（配列番号２８〜２９）のさらなる置換を加えた、配列番号２２および２３で開示されているような、工学的に作製されたジスルフィド結合と組み合わされたノブ−イントゥ−ホール対合に基づくＦｃドメインの相補性を用いる。これら４個のアミノ酸置換は、等電点または正味の分子電荷における差に基づく、不均一ポリペプチド混合物からの所望のヘテロマー融合タンパク質の選択的精製を容易にする。これらの配列における工学的に作製されたアミノ酸置換には、下に二重下線が引かれており、構築物の第１のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、第２のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２８または配列番号２９のいずれかに融合することができるが、その両方には融合できない。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一性度を考えると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図４を参照されたい）における対応する位置でのアミノ酸置換が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃ対（配列番号２８および２９）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃ対を生成することになることは理解され得る。
【化１４４】
2019536440.tif 000148
【０３２１】
別の例は、一方のＦｃ含有ポリペプチド鎖（配列番号３０）の２１３位におけるヒスチジンのアルギニンへの置換を加えた、配列番号２２〜２３で開示されているような、工学的に作製されたジスルフィド結合と組み合わされたノブ−イントゥ−ホール対合に基づくＦｃドメインの相補性を含む。この置換（Ｋａｂａｔらの番号付けシステムでＨ４３５Ｒと表示）は、プロテインＡに対する親和性における差に基づき、望ましくないホモ二量体からの所望のヘテロマーの分離を容易にする。工学的に作製されたアミノ酸置換は、二重下線で示し、構築物の第１のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、第２のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号３０または配列番号２３のいずれかに融合することができるが、その両方には融合できない。天然ｈＧ１Ｆｃと天然ｈＧ２Ｆｃと天然ｈＧ３Ｆｃと天然ｈＧ４Ｆｃの間の高いアミノ酸配列同一性度を考えると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃ（図４を参照されたい）における対応する位置でのアミノ酸置換が、配列番号３０（下記）および配列番号２３の相補的ｈＧ１Ｆｃ対の代わりに使用することができる相補的Ｆｃ対を生成することになることは理解され得る。
【化１４５】
2019536440.tif 000149
【０３２２】
Ｆｃドメインにおける種々の工学的に作製された突然変異が、Ｇ１Ｆｃ配列（配列番号１３）に関して上記で提示されている。Ｇ２Ｆｃ、Ｇ３ＦｃおよびＧ４Ｆｃにおける類似の突然変異を、図４中のＧ１Ｆｃとのそれらのアラインメントから導出することができる。等しくないヒンジ長のため、アイソタイプアラインメント（図４）に基づく類似のＦｃ位置は、次の表で要約される通り、配列番号１３、１４、１５、１６および１７において異なるアミノ酸番号を有する。
【表３】
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【０３２３】
融合タンパク質（例えば、免疫グロブリンＦｃ融合タンパク質）の異なるエレメントを、所望の機能性と一貫したいずれかの様式で配置することができることが理解される。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインは、異種ドメインに対してＣ末端に設置することができる、あるいは、異種ドメインは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインに対してＣ末端に設置することができる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインおよび異種ドメインは、融合タンパク質において隣接している必要はなく、追加的なドメインまたはアミノ酸配列が、いずれかのドメインに対してＣもしくはＮ末端に、またはドメインの間に含まれていてよい。
【０３２４】
例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、式Ａ−Ｂ−Ｃに表示されるアミノ酸配列を含むことができる。Ｂ部分は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインに対応する。ＡおよびＣ部分は、独立して、０、１、または１より多くのアミノ酸であってもよく、Ａ部分とＣ部分の両方は、存在する場合、Ｂに対して異種である。Ａおよび／またはＣ部分は、リンカー配列を介してＢ部分に結合されていてもよい。リンカーは、グリシン残基を多く含むことがあり（例えば、２〜１０、２〜５、２〜４、２〜３個のグリシン残基）、またはグリシンおよびプロリン残基を多く含むこともあり、例えば、トレオニン／セリンおよびグリシンの単一の配列、またはトレオニン／セリンおよび／もしくはグリシンの反復配列、例えば、ＧＧＧ（配列番号２６１）、ＧＧＧＧ（配列番号２６２））、ＴＧＧＧＧ（配列番号２６３）、ＳＧＧＧＧ（配列番号２６４）、ＴＧＧＧ（配列番号２６５）またはＳＧＧＧ（配列番号２６６）シングレットまたはリピートを含有することもある。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃに表示されるアミノ酸配列を含み、式中、Ａは、リーダー（シグナル）配列であり、Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインからなり、Ｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、取り込み／投与、組織局在性もしくは分布、タンパク質複合体の形成、および／または精製のうち１つまたは複数を増強するポリペプチド部分である。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃに表示されるアミノ酸配列を含み、式中、Ａは、ＴＰＡリーダー配列であり、Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインからなり、Ｃは、免疫グロブリンＦｃドメインである。
【０３２５】
ある特定の実施形態では、本発明のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを安定化することができる１個または複数の修飾を含有する。例えば、そのような修飾は、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期を増強する、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの循環半減期を増強する、またはバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのタンパク質分解性の分解を減少させる。そのような安定化修飾として、融合タンパク質（例えば、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび安定剤ドメインを含む融合タンパク質を含む）、グリコシル化部位の修飾（例えば、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドへのグリコシル化部位の付加を含む）および炭水化物部分の修飾（例えば、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドからの炭水化物部分の除去を含む）が挙げられるがこれらに限定されない。融合タンパク質の場合、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＩｇＧ分子（例えば、Ｆｃドメイン）などの安定剤ドメインに融合される。本明細書で使用される場合、用語「安定剤ドメイン」は、融合タンパク質の場合と同様に融合ドメイン（例えば、Ｆｃ）を指すだけではなく、炭水化物部分などの非タンパク質性修飾、またはポリエチレングリコールなどの非タンパク質性ポリマーも含む。
【０３２６】
ある特定の実施形態では、本発明は、他のタンパク質から単離された、さもなければそれを実質的に含まない、単離および／または精製形態のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを利用できるようにする。
【０３２７】
ある特定の実施形態では、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（未修飾または修飾）は、種々の当技術分野で公知の技法によって産生することができる。例えば、そのようなＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，  Ｍ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３年）およびＧｒａｎｔ  Ｇ．  Ａ．（編）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２年）に記載されている技法など、標準タンパク質化学技法を使用して合成することができる。加えて、自動ペプチド合成機が市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ９６００）。あるいは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、その断片またはバリアントは、当技術分野で周知の通り（後述も参照）、様々な発現系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス）を使用して組換えにより産生することができる。さらなる実施形態では、修飾または未修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、例えば、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシンまたは対合塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ）を使用することにより、天然に存在するまたは組換えにより産生された全長ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの消化によって産生することができる。コンピュータ解析（市販のソフトウェア、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ、Ｉｎｃ．を使用）を使用して、タンパク質分解性切断部位を同定することができる。あるいは、そのようなＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、化学的切断（例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミン）など、当技術分野で公知の標準技法により、天然に存在するまたは組換えにより産生された全長ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドから産生することができる。
３．ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸
【０３２８】
ある特定の態様では、本発明は、本明細書に開示されているバリアントのいずれかを含む、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）のいずれかをコードする単離されたおよび／または組換え核酸を提供する。例えば、配列番号４は、天然に存在するＡｃｔＲＩＩＢ前駆体ポリペプチドをコードする一方、配列番号３は、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする。対象核酸は、一本鎖または二本鎖となり得る。そのような核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子となり得る。このような核酸は、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを作製するための方法において、または直接的治療剤として（例えば、遺伝子療法アプローチにおいて）使用することができる。
【０３２９】
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする対象核酸は、配列番号３のバリアントである核酸を含むことがさらに理解される。バリアントヌクレオチド配列は、対立遺伝子バリアントなど、１個または複数のヌクレオチド置換、付加または欠失によって異なる配列を含み；したがって、配列番号４に指定されるコード配列のヌクレオチド配列とは異なるコード配列を含むであろう。
【０３３０】
ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である単離されたまたは組換え核酸配列を提供する。当業者であれば、配列番号３と相補的な核酸配列および配列番号３のバリアントも本発明の範囲内にあることを認めるであろう。さらなる実施形態では、本発明の核酸配列は、単離することができる、組換えとなり得る、および／または異種ヌクレオチド配列ともしくはＤＮＡライブラリーにおいて融合することができる。
【０３３１】
他の実施形態では、本発明の核酸は、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号３に指定されたヌクレオチド配列、配列番号３の相補体配列、またはそれらの断片にハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。上に記述される通り、当業者であれば、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変動し得ることを容易に理解するであろう。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件を変えることができることを容易に理解するであろう。例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーション、続いて５０℃での２．０×ＳＳＣの洗浄を行うことができるだろう。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度を、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃で約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーより選択することができる。加えて、洗浄ステップにおける温度を、室温、約２２℃での低ストリンジェンシー条件から、約６５℃での高ストリンジェンシー条件へと増大させることができる。温度と塩の両方を変えてもよく、または温度もしくは塩濃度を、他方の変数は変化させて、一定に保持してもよい。一実施形態では、本発明は、室温で６×ＳＳＣ、続いて室温で２×ＳＳＣでの洗浄という、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
【０３３２】
遺伝暗号における縮重のために、配列番号３に表示されている核酸とは異なる単離された核酸も、本発明の範囲内にある。例えば、いくつかのアミノ酸が、１つより多くのトリップレットにより指定される。同じアミノ酸を規定するコドン、または同義コドン（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣは、ヒスチジンの同義コドンである）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を与えない「サイレント」突然変異をもたらし得る。しかし、対象タンパク質のアミノ酸配列の変化につながるＤＮＡ配列多型が、哺乳動物細胞間に存在すると予想される。特定のタンパク質をコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチド（ヌクレオチドの約３〜５％以下）におけるこれらのバリエーションが、自然の対立遺伝子のバリエーションのために所与の種の個体間に存在し得ることを、当業者は理解するであろう。任意のおよびすべてのそのようなヌクレオチドのバリエーションならびに結果として生じるアミノ酸多型は、本発明の範囲内である。
【０３３３】
ある特定の実施形態では、本発明の組換え核酸を、発現構築物中の１つまたは複数の制御ヌクレオチド配列に作動可能に連結させることができる。制御ヌクレオチド配列は、一般に、発現に使用される宿主細胞に適しているであろう。非常に多くのタイプの適切な発現ベクターおよび好適な制御配列が、様々な宿主細胞について当技術分野では公知である。典型的には、前記１つまたは複数の制御ヌクレオチド配列は、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含み得るが、これらに限定されない。当技術分野において公知であるような構成的または誘導性プロモーターが、本発明により企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーターであってもよく、または１つより多くのプロモーターのエレメントを併せ持つハイブリッドプロモーターであってもよい。発現構築物は、細胞内のプラスミドなどのエピソーム上に存在することもあり、または発現構築物は染色体内に挿入されることもある。好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子は、当技術分野において周知であり、使用される宿主細胞によって変わることになる。
【０３３４】
本発明のある特定の態様では、対象核酸は、少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結した、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター中に提供される。制御配列は、当技術分野で認識されており、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現を方向付けるように選択される。したがって、制御配列という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメントを含む。例示的な制御配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ（１９９０年）に記載されている。例えば、それに作動的に連結されるとＤＮＡ配列の発現を調節する多種多様な発現調節配列のいずれかを、このようなベクターにおいて使用して、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現することができる。そのような有用な発現調節配列は、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、発現がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼにより指示されるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏ５、酵母α−接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、ならびに原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を調節することが公知の他の配列、ならびにそれらの様々な組合せを含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されることが所望されるタンパク質のタイプなどの因子に依存し得ることは理解されるはずである。さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数を調節する能力、およびベクターによりコードされている任意の他のタンパク質、例えば抗生物質マーカーの発現も考慮するべきである。
【０３３５】
本発明の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部分を、原核細胞、真核細胞（酵母、トリ、昆虫または哺乳動物細胞）のどちらかまたは両方における発現に好適なベクターにライゲーションすることにより、産生させることができる。組換えバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの産生のための発現ビヒクルは、プラスミドおよび他のベクターを含む。例えば、好適なベクターは、次のタイプのプラスミドを含む：Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における発現のための、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミド。
【０３３６】
一部の哺乳動物発現ベクターは、細菌におけるベクターの伝播を助長するための原核生物配列と、真核細胞において発現される１つまたは複数の真核生物転写ユニットの両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの一部は、原核細胞と真核細胞の両方における複製および薬物耐性選択を助長するために、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミドからの配列で修飾される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）などのウイルスの誘導体を、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現に使用することができる。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、下記の遺伝子療法送達系の説明の中で見つけることができる。プラスミドの調製の際および宿主生物の形質転換の際に利用される様々な方法が、当技術分野において周知である。原核細胞および真核細胞の両方についての他の好適な発現系、ならびに一般的な組換え手順については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）、１６章および１７章を参照されたい。一部の事例では、バキュロウイルス発現系の使用により組換えポリペプチドを発現させることが望ましいことがある。そのようなバキュロウイルス発現系の例は、ｐＶＬ由来ベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（例えば、ｐＡｃＵＷ１）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（例えば、β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩ）を含む。
【０３３７】
好ましい実施形態では、ベクター、例えば、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．）は、ＣＨＯ細胞における対象バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの産生用に設計されることになる。明らかであろうが、対象遺伝子構築物を使用して、精製のために、培養で繁殖された細胞において対象バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現を生じさせて、例えば、融合タンパク質またはバリアントタンパク質を含む、タンパク質を産生させることができる。
【０３３８】
本発明はまた、対象バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのうち１つまたは複数のコード配列（例えば、配列番号４）を含む組換え遺伝子をトランスフェクトした宿主細胞に関係する。宿主細胞は、いずれかの原核または真核細胞となり得る。例えば、本発明のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用）、酵母または哺乳動物細胞において発現させることができる。他の適した宿主細胞は、当業者にとって公知である。
【０３３９】
したがって、本発明はさらに、対象バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを産生する方法に関係する。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現が起こることを可能にする適切な条件下で培養することができる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを分泌させ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含有する細胞および培地の混合物から単離することができる。あるいは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、細胞質にまたは膜画分に保持され得、細胞を収集し、溶解し、タンパク質を単離することができる。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適した培地は、当技術分野で周知である。対象ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体による免疫親和性精製を含む、タンパク質を精製するための当技術分野で公知の技法を使用して、細胞培養培地、宿主細胞またはその両方から単離することができる。好ましい実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含有する融合タンパク質である。
【０３４０】
別の実施形態では、組換バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの所望の部分のＮ末端におけるポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列などの精製リーダー配列をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を使用する親和性クロマトグラフィーによる発現された融合タンパク質の精製を可能にし得る。その場合、精製リーダー配列を、その後、エンテロキナーゼでの処置により除去して、精製されたバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを得ることができる。例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら（１９８７年）Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１巻：１７７頁；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔらＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８巻：８９７２頁を参照されたい。
【０３４１】
融合遺伝子を作製する技術は、周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結は、従来の技術に従って、ライゲーションのために平滑末端または付着末端を利用して、適切な末端をもたらすために制限酵素消化を利用して、付着末端の埋め込みを適宜利用して、望ましくない連結を回避するためにアルカリホスファターゼ処置を利用して、および酵素的ライゲーションを利用して行われる。別の実施形態では、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術により、融合遺伝子を合成することができる。あるいは、２つの連続した遺伝子断片間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができ、その後、２つの連続した遺伝子断片をアニールして、キメラ遺伝子配列を生成することができる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２年を参照されたい。
４．スクリーニングアッセイ
【０３４２】
ある特定の態様では、本発明は、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである化合物（薬剤）を同定するための対象バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の使用に関する。このスクリーニングにより同定された化合物は、骨、軟骨、筋肉、脂肪および／またはニューロンなどの組織において検査して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで組織成長をモジュレートするその能力を評価することができる。任意選択で、これらの化合物は、動物モデルにおいてさらに検査して、ｉｎ  ｖｉｖｏで組織成長をモジュレートするその能力を評価することができる。
【０３４３】
バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを標的化することにより組織成長をモジュレートするための治療剤に関するスクリーニングのための多数のアプローチが存在する。ある特定の実施形態では、化合物のハイスループットスクリーニングを実行して、骨、軟骨、筋肉、脂肪および／またはニューロンの成長におけるＡｃｔＲＩＩＢ媒介性効果を撹乱する薬剤を同定することができる。ある特定の実施形態では、アッセイが実行されて、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、アクチビン、ノーダル、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１またはＢＭＰ７）など、その結合パートナーへのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの結合を特異的に阻害または減少させる化合物をスクリーニングおよび同定する。あるいは、アッセイを使用して、ＡｃｔＲＩＩＢリガンドなどのその結合タンパク質へのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの結合を増強する化合物を同定することができる。さらなる実施形態では、化合物は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと相互作用するその能力によって同定することができる。
【０３４４】
種々のアッセイ形式は十分であり、本開示を踏まえて、本明細書に明確に記載されていないアッセイ形式は、そうであるにもかかわらず、当業者によって理解されるであろう。本明細書に記載されている通り、本発明の被験化合物（薬剤）は、いずれかのコンビナトリアル化学的方法によって作出することができる。あるいは、対象化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成された天然に存在する生体分子となり得る。組織成長のモジュレーターとして作用するその能力に関して検査されるべき化合物（薬剤）は、例えば、細菌、酵母、植物または他の生物によって産生することができる（例えば、天然産物）、化学的に産生することができる（例えば、ペプチド模倣物を含む小分子）、または組換えにより産生することができる。本発明によって企図される被験化合物は、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖、ホルモンおよび核酸分子を含む。特異的な実施形態では、被験薬剤は、約２，０００ダルトン未満の分子量を有する有機小分子である。
【０３４５】
本発明の試験化合物を、単一の、個別の実体として提供することができ、またはコンビナトリアルケミストリーにより作製されたものなどの、複雑度がより大きいライブラリーで提供することができる。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび他のクラスの有機化合物を含むことができる。試験系に対する試験化合物の提示は、単離された形態での提示であってもよく、または特に初期スクリーニングステップでは、化合物の混合物としての提示であってもよい。任意選択で、化合物は、他の化合物と任意選択で誘導体化されることがあり、化合物の単離を助長する誘導体化基を有することがある。誘導体化基の非限定的な例は、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁気ビーズ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化可能な架橋剤、またはこれらの任意の組合せを含む。
【０３４６】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、ハイスループットアッセイは、所与の期間内に調査される化合物の数を最大化するために望ましい。精製または半精製タンパク質を用いて誘導され得るものなどの、無細胞系において行われるアッセイは、試験化合物により媒介される分子標的の変化の迅速な発生および比較的容易な検出を可能にするようにそれらを生成することができるという点で、「一次」スクリーンとして好ましいことが多い。さらに、被験化合物の細胞毒性またはバイオアベイラビリティの効果は一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系では無視することができ、アッセイは、その代わりに、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびその結合タンパク質（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド）の間の結合親和性の変更において顕在化され得る、分子標的における薬物の効果に主に焦点を合わされる。
【０３４７】
単に例証するために、本発明の例示的なスクリーニングアッセイにおいて、アッセイの意図の必要に応じて、目的の化合物は、通常、ＡｃｔＲＩＩＢリガンドに結合することができる、単離および精製されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと接触される。次に、化合物およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの混合物に、ＡｃｔＲＩＩＢリガンドを含有する組成物が添加される。ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢリガンド複合体の検出および定量化は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびその結合タンパク質の間の複合体形成の阻害（または強化）における化合物の有効性を決定するための手段を提供する。化合物の有効性は、様々な濃度の被験化合物を使用して得られるデータから用量応答曲線を作成することにより評価することができる。さらに、対照アッセイを行って、比較のためのベースラインを提供することもできる。例えば、対照アッセイにおいて、単離および精製されたＡｃｔＲＩＩＢリガンドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含有する組成物に添加され、ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢリガンド複合体の形成が、被験化合物の非存在下で定量化される。一般に、反応物が混合され得る順序が変動し得ること、また、同時に混合してよいことが理解されるであろう。さらに、精製されたタンパク質の代わりに、細胞抽出物およびライセートを使用して、適した無細胞アッセイ系を用意することができる。
【０３４８】
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびその結合タンパク質の間の複合体形成は、種々の技法によって検出することができる。例えば、複合体の形成のモジュレーションは、例えば、放射標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ）または酵素標識されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはその結合タンパク質など、検出可能に標識されたタンパク質を使用して、イムノアッセイまたはクロマトグラフィー検出により定量化することができる。
【０３４９】
ある特定の実施形態では、本発明は、直接的または間接的のいずれかでの、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびその結合タンパク質の間の相互作用の程度の測定において、蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を企図する。さらに、光導波路（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサーおよび面積力センサーに基づく検出モードなど、他の検出モードが、本発明の多くの実施形態と適合性である。
【０３５０】
さらに、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびその結合タンパク質の間の相互作用を破壊または強化する薬剤を同定するために、「ツーハイブリッドアッセイ」としても公知の相互作用トラップアッセイの使用を企図する。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３年）Ｃｅｌｌ  ７２巻：２２３〜２３２頁；Ｍａｄｕｒａら（１９９３年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８巻：１２０４６〜１２０５４頁；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４巻：９２０〜９２４頁；およびＩｗａｂｕｃｈｉら（１９９３年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８巻：１６９３〜１６９６頁）を参照されたい。特異的な実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびその結合タンパク質の間の相互作用を解離する化合物（例えば、小分子またはペプチド）を同定するためのリバースツーハイブリッド系の使用を企図する。例えば、ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９９９年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７巻：９１９〜２９頁；ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９９９年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７巻：３７４〜８１頁；ならびに米国特許第５，５２５，４９０号；同第５，９５５，２８０号；および同第５，９６５，３６８号を参照されたい。
【０３５１】
ある特定の実施形態では、対象化合物は、本発明のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと相互作用するその能力によって同定される。化合物およびバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの間の相互作用は、共有結合または非共有結合となり得る。例えば、そのような相互作用は、光架橋、放射標識リガンド結合および親和性クロマトグラフィーを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ生化学的方法を使用して、タンパク質レベルで同定することができる（Ｊａｋｏｂｙ  ＷＢら、１９７４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４６巻：１頁）。ある特定の事例では、化合物は、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに結合する化合物を検出するためのアッセイなど、機序に基づくアッセイにおいてスクリーニングすることができる。これは、固相または流動相結合事象を含むことができる。あるいは、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする遺伝子を、レポーター系（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質）と共に、細胞へとトランスフェクトし、好ましくは、ハイスループットスクリーニングによって、またはライブラリーの個々のメンバーにより、ライブラリーに対してスクリーニングすることができる。他の機序に基づく結合アッセイ、例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイを使用することができる。結合アッセイは、ウェル、ビーズもしくはチップに固定された、または固定化抗体によって捕捉された、またはキャピラリー電気泳動によって分離された標的により行うことができる。結合された化合物は、通常、比色分析または蛍光または表面プラズモン共鳴を使用して検出することができる。
【０３５２】
ある特定の態様では、本発明は、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢリガンドの機能をアンタゴナイズすることにより、筋肉成長を刺激し、筋量を増大させるための方法および薬剤を提供する。したがって、同定されたいずれかの化合物を、細胞全体または組織において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで検査して、筋肉成長をモジュレートするその能力を確認することができる。この目的のため、当技術分野で公知の様々な方法を利用することができる。例えば、本発明の方法は、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、ＧＤＦ８）への結合によって活性化されたＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を介したシグナルトランスダクションが、減少または阻害されるように行われる。ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を介したシグナルトランスダクションがこのように起こらなかった対応する生物（または生物集団）の筋量と比較して、生物における筋肉組織の成長が、生物における筋量増大をもたらすことが認識されるであろう。
【０３５３】
例えば、筋肉細胞成長／増殖におけるバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは被験化合物の効果は、筋原細胞の増殖に関連するＰａｘ−３およびＭｙｆ−５の遺伝子発現、ならびに筋肉分化に関連するＭｙｏＤの遺伝子発現を測定することにより決定することができる（例えば、Ａｍｔｈｏｒら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２００２年、２５１巻：２４１〜５７頁）。ＧＤＦ８が、Ｐａｘ−３およびＭｙｆ−５の遺伝子発現を下方制御し、ＭｙｏＤの遺伝子発現を防止することが公知である。バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは被験化合物は、ＧＤＦ８のこの活性をアンタゴナイズすることが予想される。細胞に基づくアッセイの別の例として、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは被験化合物の存在下でのＣ（２）Ｃ（１２）筋芽細胞などの筋芽細胞の増殖の測定が挙げられる（例えば、Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０００年、２７５巻：４０２３５〜４３頁）。
【０３５４】
本発明はまた、筋量および筋力を測定するためのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを企図する。例えば、Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００３年、３００巻：９６５〜７１頁）は、マウスにおける骨格筋量増大および握力増大を測定する方法を開示する。任意選択で、この方法を使用して、筋肉疾患または状態、例えば、筋量が制限的な疾患における被験化合物（例えば、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の治療効果を決定することができる。
【０３５５】
ある特定の態様では、本発明は、骨形成をモジュレート（刺激または阻害）し、骨量を増大させるための方法および薬剤を提供する。したがって、同定されたいずれかの化合物を、細胞全体または組織において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで検査して、骨または軟骨成長をモジュレートするその能力を確認することができる。この目的のため、当技術分野で公知の様々な方法を利用することができる。
【０３５６】
例えば、骨または軟骨成長におけるバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは被験化合物の効果は、細胞に基づくアッセイにおいてＭｓｘ２の誘導または骨細胞前駆細胞から骨芽細胞への分化を測定することにより決定することができる（例えば、Ｄａｌｕｉｓｋｉら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００１年、２７巻（１号）：８４〜８頁；Ｈｉｎｏら、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．２００４年、９巻：１５２０〜９頁を参照）。細胞に基づくアッセイの別の例として、間葉系前駆細胞および造骨性細胞における対象ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび被験化合物の骨原性活性の分析が挙げられる。例証するために、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを発現する組換えアデノウイルスを構築して、多能性間葉系前駆細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、前造骨性Ｃ２Ｃ１２細胞および造骨性ＴＥ−８５細胞に感染させた。次に、アルカリホスファターゼ、オステオカルシンおよびマトリックスミネラル化の誘導を測定することにより、骨原性活性が決定される（例えば、Ｃｈｅｎｇら、Ｊ  ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ．２００３年、８５−Ａ巻（８号）：１５４４〜５２頁を参照）。
【０３５７】
本発明はまた、骨または軟骨成長を測定するためのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを企図する。例えば、Ｎａｍｋｕｎｇ−Ｍａｔｔｈａｉら、Ｂｏｎｅ、２８巻：８０〜８６頁（２００１年）は、骨折後初期期間における骨修復が研究されるラット骨粗鬆症モデルを開示する。Ｋｕｂｏら、Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６８巻：１９７〜２０２頁（１９９９年）も、骨折後後期期間における骨修復が研究されるラット骨粗鬆症モデルを開示する。これらの参考文献は、骨粗鬆症性骨折に関する研究のためのラットモデルのそれらの開示に関して、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の態様では、本発明は、当技術分野で公知の骨折治癒アッセイを活用する。これらのアッセイは、骨折技法、組織学的分析および生体力学分析を含み、これらは、例えば、骨折を引き起こし、骨折の程度および修復過程を測定するための実験プロトコールのその開示に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５２１，７５０号に記載されている。
【０３５８】
ある特定の態様では、本発明は、体重増加および肥満を調節するための方法および薬剤を提供する。細胞レベルでは、肥満の発症において脂肪細胞増殖および分化が決定的であり、これは、追加的な脂肪性細胞（脂肪細胞）の生成をもたらす。したがって、同定されたいずれかの化合物を、細胞全体または組織において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで検査して、脂肪細胞増殖または分化を測定することにより、脂肪生成をモジュレートするその能力を確認することができる。この目的のため、当技術分野で公知の様々な方法を利用することができる。例えば、脂肪生成におけるバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）または被験化合物の効果は、オイルレッドＯ染色小胞におけるトリアシルグリセロールの蓄積の観察による、ならびにＦＡＢＰ（ａＰ２／４２２）およびＰＰＡＲγ２などのある特定の脂肪細胞マーカーの出現によるなど、細胞に基づくアッセイにおいて３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化を測定することにより決定することができる。例えば、Ｒｅｕｓｃｈら、２０００年、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０巻：１００８〜２０頁；Ｄｅｎｇら、２０００年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１４１巻：２３７０〜６頁；Ｂｅｌｌら、２０００年、Ｏｂｅｓ  Ｒｅｓ．８巻：２４９〜５４頁を参照されたい。細胞に基づくアッセイの別の例として、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）陽性細胞のモニタリングによるなど、脂肪細胞または脂肪細胞前駆体細胞（例えば、３Ｔ３−Ｌ１細胞）の増殖におけるバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび被験化合物の役割の分析が挙げられる。例えば、Ｐｉｃｏら、１９９８年、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９巻：１〜７頁；Ｍａｓｕｎｏら、２００３年、Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ．７５巻：３１４〜２０頁を参照されたい。
【０３５９】
本発明のスクリーニングアッセイが、対象ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのバリアントのみならず、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを含むいずれかの被験化合物にも適用されることが理解される。さらに、このようなスクリーニングアッセイは、薬物標的検証および品質管理目的に有用である。
６．例示的な治療使用
【０３６０】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物（例えば、ホモマーまたはヘテロマー形態のいずれかにおけるバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質）は、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、ＧＤＦ８またはＧＤＦ１１）の異常な活性に関連する疾患または状態を処置または予防するために使用することができる。このような疾患、障害または状態は、本明細書において概して、「ＡｃｔＲＩＩＢ関連状態」と称される。ある特定の実施形態では、本発明は、上述の治療有効量のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の個体への投与により、それを必要とする個体を処置または予防する方法を提供する。このような方法は特に、動物、より具体的には、ヒトの治療的および予防的処置を目標とする。用語「対象」、「個体」または「患者」は、本明細書を通して互換的であり、一般に哺乳動物を指す。哺乳動物として、飼い慣らされた動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギおよび齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３６１】
本明細書で使用される場合、障害または状態を「予防」する治療薬は、統計学的試料において、無処置対照試料と比べて処置された試料における障害もしくは状態の発生率を減少させる、または無処置対照試料と比べて障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状の開始を遅延もしくはその重症度を減少させる化合物を指す。用語「処置する」は、本明細書で使用される場合、指名された状態の予防法、または確立された後の状態の寛解もしくは排除を含む。
【０３６２】
ＡｃｔＲＩＩＢおよびＡｃｔＲＩＩＢリガンドの間の内在性複合体は、組織成長と共に、様々な構造の正しい形成などの初期発生過程、または性発達、下垂体ホルモン産生ならびに骨および軟骨の作出を含む１つもしくは複数の発生後能力における必須の役割を果たす。よって、ＡｃｔＲＩＩＢ関連状態は、異常な組織成長および発生欠損を含む。加えて、ＡｃｔＲＩＩＢ関連状態として、炎症、アレルギー、自己免疫性疾患、感染性疾患および腫瘍など、細胞成長および分化の障害が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３６３】
例示的なＡｃｔＲＩＩＢ関連状態は、神経筋障害（例えば、筋ジストロフィーおよび筋萎縮）、うっ血性閉塞性肺疾患（およびＣＯＰＤを伴う筋消耗）、筋消耗症候群、サルコペニア、カヘキシー、脂肪組織障害（例えば、肥満）、２型糖尿病および骨変性疾患（例えば、骨粗鬆症）を含む。他の例示的なＡｃｔＲＩＩＢ関連状態は、貧血、筋変性および神経筋障害、組織修復（例えば、創傷治癒）、神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症）、免疫性障害（例えば、リンパ球の異常増殖または機能に関する障害）、ならびに肥満または脂肪細胞の異常増殖に関する障害を含む。
【０３６４】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物（例えば、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質）は、筋ジストロフィーの処置の一部として使用される。「筋ジストロフィー」という用語は、骨格筋ならびに時には心筋および呼吸筋の漸進的衰弱および低下を特徴とする変性筋疾患群を指す。筋ジストロフィーは、筋肉の微視的変化で始まる進行性筋消耗および筋力低下を特徴とする遺伝性障害である。筋肉が徐々に変性するにつれて、その人の筋力が低下する。対象ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体複合体を含むレジメンで処置することができる例示的な筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エミリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ）（ランドゥジー・デジュリン型としても公知）、筋強直性ジストロフィー（ＭＭＤ；スタイナート病としても公知）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）を含む。
【０３６５】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、１８６０年代にフランス人神経学者Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ａｍａｎｄ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅによって最初に記載された。ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、１９５０年代にＤＭＤのこのバリアントを最初に記載したドイツ人医師Ｐｅｔｅｒ  Ｅｍｉｌ  Ｂｅｃｋｅｒにちなんで名付けられたものである。ＤＭＤは、男性における最も頻度の高い遺伝性疾患の１つであり、男児３，５００名に１名が発症する。ＤＭＤは、Ｘ染色体の短腕上に位置するジストロフィン遺伝子が壊れている場合に起こる。男性は、Ｘ染色体のコピーを１つしか保有しないので、ジストロフィンのコピーを１つしか有さない。ジストロフィンタンパク質がないと、筋肉は、収縮および弛緩のサイクル中に容易に損傷される。この疾患の早期の間は、筋肉は再生により代償するが、後になると、筋肉前駆細胞は進行中の損傷についていくことができず、健常な筋肉は非機能性線維脂肪組織に置き換えられる。
【０３６６】
ＢＭＤは、ジストロフィン遺伝子における異なる突然変異に起因する。ＢＭＤ患者は、ある程度のジストロフィンを有するが、これは、含量が不十分または品質が不良のいずれかである。ある程度のジストロフィンを有することは、ＤＭＤ患者と同じほど悪いまたは速い変性からＢＭＤ患者の筋肉を保護する。
【０３６７】
例えば、研究は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＤＦ８の機能の遮断または排除が、ＤＭＤおよびＢＭＤ患者における少なくともある特定の症状を有効に処置することができることを実証する。よって、対象バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、ＧＤＦ８阻害剤（アンタゴニスト）として作用することができ、ＤＭＤおよびＢＭＤ患者におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＤＦ８および／またはＡｃｔＲＩＩＢの機能の遮断の代替手段を構成する。
【０３６８】
同様に、対象バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、筋肉成長を必要とする他の疾患状態における筋量を増大させるための有効な手段を提供する。例えば、ルー・ゲーリック病（運動ニューロン疾患）とも呼ばれるＡＬＳは、脳を骨格筋に接続するＣＮＳの構成成分である運動ニューロンを攻撃する、慢性で不治の止められないＣＮＳ障害である。ＡＬＳにおいて、運動ニューロンは増悪し、最終的に死に、その者の脳は通常、十分に機能を保ち覚醒しているが、運動指令は筋肉に到達しない。ＡＬＳの罹患年齢は、大部分が４０〜７０歳の間である。衰弱する最初の運動ニューロンは、腕または脚に繋がる運動ニューロンである。ＡＬＳ患者は、歩行に困難を抱える場合があり、物を落とし、転倒し、不明瞭発語となり、こらえきれずに笑うまたは泣く場合がある。最終的に、肢における筋肉は、廃用性により萎縮し始める。この筋衰弱は、衰弱となり、患者は、車椅子を必要とする、またはベッドから起き上がって機能することができなくなるであろう。大部分のＡＬＳ患者は、疾患開始から３〜５年間に、呼吸器不全または肺炎のような換気補助の合併症により死ぬ。
【０３６９】
バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質誘導性筋量増大は、筋消耗疾患患者に利益をもたらすこともできる。Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら（上記参照）は、ＧＤＦ８発現が、ヒトにおける除脂肪体重と逆相関すること、ＧＤＦ８遺伝子の発現増大が、ＡＩＤＳ消耗症候群の男性における体重減少に関連することを報告した。ＡＩＤＳ患者におけるＧＤＦ８の機能を阻害することにより、ＡＩＤＳの少なくともある特定の症状が、完全には排除されないとしても軽減され得るため、ＡＩＤＳ患者における生活の質を有意に改善する。
【０３７０】
ＧＤＦ８機能の損失は、栄養摂取の低減を伴わない脂肪損失にも関連するため（Ｚｉｍｍｅｒｓら、上記参照；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、上記参照）、対象バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、肥満および２型糖尿病の発症を減速または予防するための治療剤としてさらに使用することができる。
【０３７１】
がん食欲不振−カヘキシー症候群は、最も衰弱性かつ生命を脅かす態様のがんの１つである。がん食欲不振−カヘキシー症候群における進行性体重減少は、多くの種類のがんの共通の特色であり、生活の質の不良および化学療法に対する応答不良のみならず、体重減少がない匹敵する腫瘍を有する患者に見られるものよりも短い生存時間の原因ともなる。食欲不振、脂肪および筋肉組織消耗、心理的窮迫、ならびにより低い生活の質に関連して、カヘキシーが、がんおよび宿主の間の複雑な相互作用から生じる。これは、がん患者の間で最も一般的な死亡原因の１つであり、死亡時に８０％で見られる。これは、タンパク質、炭水化物および脂肪代謝をもたらす代謝性カオスの複雑な例である。腫瘍は、食欲不振および体重減少をもたらす直接的および間接的異常の両方を産生する。現在、この過程を制御または反転する処置はない。がん食欲不振−カヘキシー症候群は、サイトカイン産生、脂質動員およびタンパク質分解誘導因子の放出、ならびに中間代謝の変更に影響を与える。食欲不振が一般的であるが、食物摂取低下単独は、がん患者に見られる体組成の変化を説明することができず、栄養摂取の増大は、消耗症候群を反転することができない。発病前体重の５パーセントを超える不随意性体重減少が、６カ月間の期間内に起こる場合、カヘキシーが、がん患者において疑われるべきである。
【０３７２】
成体マウスにおけるＧＤＦ８の全身性過剰発現は、ヒトカヘキシー症候群に見られるにものに類似して著明な筋肉および脂肪損失を誘導することが見出されたため（Ｚｉｍｍｅｒｓら、上記参照）、医薬組成物としての対象バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を有益に使用して、筋肉成長が所望されるカヘキシー症候群の症状を予防、処置または軽減することができる。
【０３７３】
他の実施形態では、本発明は、骨および／または軟骨形成を誘導する、骨損失を予防する、骨ミネラル化を増大させる、または骨の脱ミネラル化を予防する方法を提供する。例えば、対象バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、ヒトおよび他の動物における骨粗鬆症の処置ならびに骨折および軟骨欠損の治癒における適用を有する。バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、骨粗鬆症の発症に対する保護的方策として、無症状性低骨密度と診断された患者において有用となり得る。
【０３７４】
特異的な一実施形態では、本発明の方法および組成物は、ヒトおよび他の動物における骨折および軟骨欠損の治癒における医学的有用性を見出すことができる。対象方法および組成物は、閉鎖性および開放性骨折減少ならびに同様に人工関節の固定改善における予防的使用を有することもできる。骨原性薬剤によって誘導されたｄｅ  ｎｏｖｏ骨形成は、先天性、外傷誘導性または腫瘍学切除誘導性頭蓋顔面欠損の修復に寄与し、また、美容整形外科において有用である。さらに、本発明の方法および組成物は、歯周疾患の処置および他の歯修復過程において使用することができる。ある特定の事例では、対象バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、骨形成細胞を誘引する、骨形成細胞の成長を刺激する、または骨形成細胞の前駆細胞の分化を誘導する環境を提供することができる。本発明のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、骨粗鬆症の処置において有用となることもできる。さらに、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、軟骨欠損修復および変形性関節症の予防／反転において使用することができる。
【０３７５】
別の特定の実施形態では、本発明は、骨折あるいは軟骨および／もしくは骨欠損または歯周病に関連する他の状態を修復するための治療方法および組成物を提供する。本発明は、さらに、創傷治癒および組織修復のための治療方法および組成物を提供する。創傷のタイプは、熱傷、切創および潰瘍を含むが、これらに限定されない。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８４／０１１０６を参照されたい。そのような組成物は、薬学的に許容される媒体、担体またはマトリックスとの混合物における、本発明のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質のうち少なくとも１つの治療有効量を含む。
【０３７６】
別の特異的な実施形態では、本発明の方法およびバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、骨粗鬆症、副甲状腺機能亢進、クッシング病、甲状腺中毒症、慢性下痢性状態または吸収障害、腎尿細管性アシドーシス、または神経性食欲不振症など、骨損失を引き起こす状態に適用することができる。多くの人々は、女性であること、低体重であること、およびセデンタリー・ライフスタイルを送ることが、骨粗鬆症（骨折リスクをもたらす骨塩密度の損失）のリスク因子であることを知っている。しかし、骨粗鬆症は、ある特定の薬物療法の長期使用に起因する場合もある。薬物または別の医学的状態に起因する骨粗鬆症は、続発性骨粗鬆症として公知である。クッシング病として公知の状態において、身体によって産生された過剰量のコルチゾールは、骨粗鬆症および骨折をもたらす。続発性骨粗鬆症に関連する最も一般的な薬物療法は、副腎によって天然に産生されるホルモンであるコルチゾールのように作用する薬物クラスの、コルチコステロイドである。適切なレベルの甲状腺ホルモン（甲状腺によって産生される）が、骨格の発達に必要とされるが、過剰な甲状腺ホルモンは、経時的に骨量を低下し得る。アルミニウムを含有する制酸薬は、腎臓の問題を有する人々、特に、透析を受けている人々が高用量で摂取すると、骨量減少につながり得る。二次性骨粗鬆症を引き起こすことがある他の医薬は、てんかん発作を予防するために使用される、フェニトイン（Ｄｉｌａｎｔｉｎ）およびバルビツレート；一部の型の関節炎、がんおよび免疫障害のための薬物であるメトトレキサート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ、Ｉｍｍｕｎｅｘ、Ｆｏｌｅｘ  ＰＦＳ）；一部の自己免疫疾患を処置するために、および臓器移植患者において免疫系を抑制するために使用される薬物であるシクロスポリン（Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ、Ｎｅｏｒａｌ）；前立腺がんおよび子宮内膜症を処置するために使用される黄体ホルモン放出ホルモンアゴニスト（Ｌｕｐｒｏｎ、Ｚｏｌａｄｅｘ）；抗凝固薬であるヘパリン（Ｃａｌｃｉｐａｒｉｎｅ、Ｌｉｑｕａｅｍｉｎ）；ならびに高コレステロールを処置するために使用される、コレスチラミン（Ｑｕｅｓｔｒａｎ）およびコレスチポール（Ｃｏｌｅｓｔｉｄ）を含む。我々の口内のこのような有害細菌は、我々の身体に、有害細菌から防御させるため、歯肉疾患は、骨損失を引き起こす。細菌は、歯肉線下で毒素および酵素を産生し、慢性感染を引き起こす。
【０３７７】
さらなる実施形態では、本発明のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、異常なまたは望まれない骨成長に関連する疾患または障害を処置するための方法および治療剤を提供する。例えば、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）として公知の疾患を有する患者は、いかなる運動も防止する異常な「第２の骨格」を成長させる。加えて、異常な骨成長は、人工股関節置換術後に起こることがあり、したがって、手術結果を損なわせ得る。これは、病的骨成長、ならびに対象方法および組成物が治療的に有用であり得る状況の、より一般的な例である。同方法および組成物は、他の形態の異常な骨成長（例えば、外傷、熱傷または脊髄傷害後の骨の病的成長）を処置するのに、および転移性前立腺がんまたは骨肉腫に関連して見られる異常な骨成長に関連する望ましくない状態を処置または予防するのにも有用であり得る。
【０３７８】
他の実施形態では、本発明のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、動物における体脂肪含量を制御するため、およびそれに関係する状態、特に、それに関係する健康を損なう状態を処置または予防するための組成物および方法を提供する。本発明において、体重を制御（調節）することは、体重の減少もしくは増大、体重増加速度の減少もしくは増大、または体重減少速度の増大もしくは減少を指すことができ、体重を能動的に維持すること、または有意に変化させないことも含む（例えば、さもなければ体重を増大または低下し得る外部または内部影響に対して）。本発明の一実施形態は、それを必要とする動物（例えば、ヒト）にバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を投与することによる体重の制御に関する。
【０３７９】
特異的な一実施形態では、本発明は、動物における体重を減少および／または体重増加を減少させるため、より具体的には、肥満のリスクがあるまたは肥満を患う患者における肥満を処置または寛解するための方法および化合物に関する。別の特異的な実施形態では、本発明は、体重を増加または保持することができない動物（例えば、消耗症候群を有する動物）を処置するための方法および化合物を対象にする。そのような方法は、体重および／または質量の増大、または体重および／または質量損失の減少、または望ましくなく低い（例えば、不健康な）体重および／または質量に関連するまたはこれに起因する状態の改善に有効である。
【０３８０】
ある特定の態様では、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を使用して、それを必要とする対象における赤血球レベルを増大させる、貧血を処置もしくは予防する、および／または無効赤血球生成を処置もしくは予防することができる。ある特定の態様では、本開示のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、赤血球レベルを増大させるための従来の治療アプローチ、特に、多因子起源の貧血の処置に使用されるアプローチと組み合わせて使用することができる。赤血球レベルを増大させるための従来の治療アプローチは、例えば、赤血球輸血、１つまたは複数のＥＰＯ受容体活性化剤の投与、造血幹細胞移植、免疫抑制性生物製剤および薬物（例えば、コルチコステロイド）を含む。ある特定の実施形態では、本開示のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を使用して、それを必要とする対象における貧血を処置または予防することができる。ある特定の実施形態では、本開示のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を使用して、それを必要とする対象における無効赤血球生成および／または無効赤血球生成に関連する障害を処置または予防することができる。ある特定の態様では、本開示のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、貧血または無効赤血球生成障害を処置または予防するための従来の治療アプローチ、特に、多因子起源の貧血の処置に使用されるアプローチと組み合わせて使用することができる。
【０３８１】
本明細書で使用される場合、障害または状態を「予防する」治療薬は、統計学的試料において、未処置対照試料と比較して処置試料において障害または状態の発生率を低下させる、あるいは未処置対照試料と比較して障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状の発症を遅延させるか、または症状の重症度を低下させる化合物を指す。
【０３８２】
用語「処置」は、本明細書で使用される場合、確立された後の状態の寛解または排除を含む。
【０３８３】
いずれにせよ、予防または処置は、医師または他の医療提供者により提供される診断、および治療剤の投与についての意図した結果で識別され得る。
【０３８４】
一般に、本開示に記載されている疾患または状態の処置または予防は、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を「有効量」で投与することにより達成される。薬剤の有効量は、必要な投薬量で必要な期間にわたって所望の治療または予防結果を達成するのに有効な量を指す。本開示の薬剤の「治療有効量」は、個体の病状、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を惹起するその薬剤の能力によって変わり得る。「予防有効量」は、必要な投薬量で必要な期間にわたって所望の予防結果を達成するのに有効な量を指す。
【０３８５】
ある特定の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わせた、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を使用して、健康個体および選択された患者集団における赤血球、ヘモグロビンまたは網状赤血球レベルを増大させることができる。適切な患者集団の例として、貧血を有する患者など、望ましくなく低い赤血球またはヘモグロビンレベルを有する患者集団、および大規模失血を生じ得る大手術または他の手技を受けようとしている患者など、望ましくなく低い赤血球またはヘモグロビンレベルの発症リスクがある患者集団が挙げられる。一実施形態では、適切な赤血球レベルを有する患者は、１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質で処置されて、赤血球レベルを増大させ、次いで輸血における後の使用のために血液が採取および貯蔵される。
【０３８６】
ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、貧血を有する患者における赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、および／またはヘマトクリットレベルを増加させるために使用され得る。ヒトにおけるヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットレベルを観察する場合、個体のバリエーションを考慮に入れるとはいえ、ふさわしい年齢および性別カテゴリーについての正常未満のレベルは、貧血を示し得る。例えば、１０〜１２．５ｇ／ｄｌ、および典型的には約１１．０ｇ／ｄｌのヘモグロビンレベルは、健常成人における正常範囲内であると見なされるが、治療の観点から見ると、標的レベルが低いほど、引き起こされる心血管系副作用は少ないだろう［例えば、Ｊａｃｏｂｓら（２０００年）Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １５巻、１５〜１９頁を参照されたい］。あるいは、ヘマトクリットレベル（細胞により占有される血液試料の体積のパーセンテージ）を貧血の尺度として使用することができる。健常個体のヘマトクリットレベルは、成人男性については約４１〜５１％、成人女性については３５〜４５％の範囲である。ある特定の実施形態では、患者は、赤血球、ヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットの標的レベルに患者を回復させることを目的とする投薬レジメンで処置され得る。ヘモグロビンおよびヘマトクリットレベルは、人によって異なるので、最適には、標的ヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットレベルは、患者ごとに個別化され得る。
【０３８７】
貧血は、組織傷害、感染症および／または慢性疾患、特にがんを有する患者において観察されることが多い。一部の対象では、貧血は、骨髄における低いエリスロポエチンレベルおよび／またはエリスロポエチンに対する不十分な応答により識別される［例えば、Ａｄａｍｓｏｎ（２００８年）Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１７版；ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、６２８〜６３４頁を参照されたい］。貧血の潜在的原因は、例えば、失血、栄養不良（例えば、タンパク質の食事摂取量の低減）、投薬反応、骨髄に関連する様々な問題、および多くの疾患を含む。より詳細には、貧血は、例えば、骨髄移植；固形腫瘍（例えば、乳がん、肺がん、および結腸がん）；リンパ系の腫瘍（例えば、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、およびホジキンリンパ腫）；造血系の腫瘍（例えば、白血病、骨髄異形成症候群および多発性骨髄腫）；放射線療法；化学療法（例えば、白金含有レジメン）；これらに限定されないが、関節リウマチ、他の炎症性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、急性または慢性皮膚疾患（例えば、乾癬）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）を含む、炎症性および自己免疫疾患；特発性または先天性の状態を含む急性または慢性腎疾患または不全；急性または慢性肝疾患；急性または慢性出血；患者非自己もしくは自己抗体に起因しておよび／または宗教的理由（例えば、一部のエホバの証人）のために赤血球の輸血が不可能である状況；感染症（例えば、マラリアおよび骨髄炎）；例えば、鎌状赤血球症（貧血）、サラセミアを含む、ヘモグロビン異常症；薬物使用または乱用（例えば、アルコール誤用）；輸血を避ける何らかの理由から貧血を有する小児患者；ならびに循環過負荷への懸念のために輸血を受けることができない、高齢患者または貧血を伴う基礎心肺疾患を有する患者を含む、様々な障害および状態に関連付けられている［例えば、Ａｄａｍｓｏｎ（２００８年）Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１７版；ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、６２８〜６３４頁を参照されたい］。一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質体は、本明細書で開示される障害または状態の１つまたは複数に関連する貧血を処置または予防するために使用することができるだろう。
【０３８８】
多くの因子が、がん関連貧血の一因となり得る。一部は、疾患過程自体に、ならびにインターロイキン−１、インターフェロン−ガンマおよび腫瘍壊死因子などの炎症性サイトカインに関連する［Ｂｒｏｎら（２００１年）Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２８巻（補遺８号）：１〜６頁］。その効果の中でも、炎症は、肝要な鉄制御ペプチドであるヘプシジンを誘導することによって、マクロファージからの鉄排出を阻害し、一般に、赤血球生成への鉄利用能を制限する［例えば、Ｇａｎｚ（２００７年）Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １８巻：３９４〜４００頁を参照されたい］。様々な経路による失血も、がん関連貧血の一因となり得る。がん進行に起因する貧血の有病率は、がんのタイプによって変わり、前立腺がんにおける５％から多発性骨髄腫における９０％まで様々である。がん関連貧血は、疲労、および生活の質の低下、処置有効性の低下、および死亡率の増加を含む、患者にとって深刻な結果をもたらす。一部の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質体は、がん関連貧血を処置するために使用することができるだろう。
【０３８９】
低増殖性貧血は、骨髄の原発性機能不全または不全の結果として生じ得る。低増殖性貧血は、慢性疾患の貧血、腎臓疾患の貧血、低代謝状態に関連する貧血、およびがんに関連する貧血を含む。これらのタイプの各々において、内因性エリスロポエチンレベルは、観察される貧血の程度に対して不相応に低い。他の低増殖性貧血は、早期鉄欠乏性貧血、および骨髄の損傷により引き起こされる貧血を含む。これらのタイプでは、内因性エリスロポエチンレベルは、観察される貧血の程度に対して相応に上昇する。顕著な例は、抗がん薬および／または化学療法薬またはがん放射線療法により引き起こされる骨髄抑制であろう。臨床試験の広範な再調査により、軽度貧血が化学療法後の患者の１００％に起こり得る一方で、より重度の貧血がそのような患者の８０％以下に起こり得ることが判明した［例えば、Ｇｒｏｏｐｍａｎら（１９９９年）Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９１巻：１６１６〜１６３４頁を参照されたい］。骨髄抑制薬は、例えば、１）アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、メルファラン）およびニトロソウレア（例えば、ストレプトゾシン）；２）代謝拮抗薬、例えば、葉酸アンタゴニスト（例えば、メトトレキサート）、プリンアナログ（例えば、チオグアニン）、およびピリミジンアナログ（例えば、ゲムシタビン）；３）細胞傷害性抗生物質、例えば、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン）；４）キナーゼ阻害剤（例えば、ゲフィチニブ）；５）有糸分裂阻害剤、例えば、タキサン（例えば、パクリタキセル）およびビンカアルカロイド（例えば、ビノレルビン）；６）モノクローナル抗体（例えば、リツキシマブ）；および７）トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、トポテカンおよびエトポシド）を含む。加えて、低代謝率をもたらす状態は、軽度から中等度の低増殖性貧血を生じさせ得る。そのような状態には、内分泌不全状態がある。例えば、貧血は、アジソン病、甲状腺機能低下症、副甲状腺機能亢進症、または去勢されているもしくはエストロゲンで処置されている男性において起こり得る。一部の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、過剰増殖性貧血を処置するために使用することができるだろう。
【０３９０】
慢性腎臓疾患が低増殖性貧血と関連することがあり、貧血の程度は、腎機能低下レベルによって重症度が変わる。そのような貧血は、エリスロポエチンの不十分な産生および赤血球の生存率低下に主として起因する。慢性腎臓疾患は、通常は、何年もまたは何十年もの期間をかけて末期（ステージ５）疾患へと徐々に進行し、進行した時点で、患者生存のために透析または腎臓移植が必要とされる。貧血は、多く場合、この過程の早期に発症し、疾患が進行するにつれて悪化する。腎臓疾患の貧血の臨床的帰結は、十分に文書で裏付けられており、左室肥大、認知機能の障害、生活の質の低下、および免疫機能の変化の発生を含む［例えば、Ｌｅｖｉｎら（１９９９年）Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ  ２７巻：３４７〜３５４頁；Ｎｉｓｓｅｎｓｏｎ（１９９２年）Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ  ２０巻（補遺１号）：２１〜２４頁；Ｒｅｖｉｃｋｉら（１９９５年）Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ  ２５巻：５４８〜５５４頁；Ｇａｆｔｅｒら（１９９４年）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ４５巻：２２４〜２３１頁を参照されたい］。一部の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、急性または慢性腎疾患または不全を処置するために使用することができるだろう。
【０３９１】
外傷または分娩後出血からなどの、十分な体積の急性失血の結果として生じる貧血は、急性出血後貧血として公知である。ＲＢＣが他の血液成分とともに比例的に枯渇するので、急性失血は、最初は、貧血を伴わない血液量減少を引き起こす。しかし、血液量減少が流体を血管外コンパートメントから血管コンパートメントに移す生理的メカニズムを迅速に作動させることになり、その結果として、血液希釈が生じ、貧血になる。慢性の場合、失血は、体内鉄貯蔵量を徐々に枯渇させ、最終的に鉄欠乏症に至る。一部の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、急性失血の結果として生じる貧血を処置するために使用することができるだろう。
【０３９２】
鉄欠乏性貧血は、中間段階として負の鉄バランスおよび鉄欠乏性赤血球生成を含む、鉄欠乏増加の段階的進行の最終段階である。鉄欠乏症は、妊娠、不十分な食事、腸管吸収不良、急性または慢性炎症および急性または慢性失血などの状態において例示されるように、鉄要求量増加、鉄摂取量減少、または鉄喪失量増加の結果として生じ得る。このタイプの軽度から中等度の貧血に関して、骨髄は、低増殖性のままであり、ＲＢＣ形態は、概して正常であるが、軽度の貧血であっても、多少の小球性低色素性ＲＢＣをもたらすことがあり、重度鉄欠乏性貧血への移行に不随して、骨髄の過剰増殖が起こり、小球性および低色素性ＲＢＣの出現頻度が次第に高くなる［例えば、Ａｄａｍｓｏｎ（２００８年）Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１７版；ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、６２８〜６３４頁を参照されたい］。鉄欠乏性貧血の適切な治療は、その原因および重症度に依存し、主な従来の選択肢として経口鉄剤、非経口鉄製剤、およびＲＢＣ輸血がある。一部の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、慢性鉄欠乏症を処置するために使用することができるだろう。
【０３９３】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、骨髄血球の無効な産生、および急性骨髄性白血病への転換のリスクを特徴とする、多様な一連の血液学液状態である。ＭＤＳ患者では、血液幹細胞が成熟して健常な赤血球、白血球または血小板にならない。ＭＤＳ障害は、例えば、不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、過剰芽球を伴う不応性貧血、移行期の過剰芽球を伴う不応性貧血、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症、および５ｑ単独の染色体異常を伴う骨髄異形成症候群を含む。これらの障害は、造血細胞の量と質の両方の不可逆的異常として顕在化するので、ほとんどのＭＤＳ患者が慢性貧血に罹患している。したがって、ＭＤＳ患者は、赤血球レベルを増大させるために、輸血、および／または増殖因子（例えば、エリスロポエチンもしくはＧ−ＣＳＦ）での処置を、最終的に必要とする。しかし、多くのＭＤＳ患者は、そのような治療の頻度に起因して副作用を発症する。例えば、頻繁に赤血球輸血を受ける患者は、余分な鉄の蓄積から組織および臓器損傷を示し得る。したがって、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、ＭＤＳを有する患者を処置するために使用され得る。ある特定の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わせて、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を使用して、ＭＤＳに罹患している患者を処置することができる。他の実施形態では、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質と、例えば、サリドマイド、レナリドミド、アザシチジン（ａｚａｃｉｔａｄｉｎｅ）、デシタビン、エリスロポエチン、デフェロキサミン、抗胸腺細胞グロブリンおよびフィルグラスチム（ｆｉｌｇｒａｓｔｒｉｍ）（Ｇ−ＣＳＦ）を含む、ＭＤＳを処置するための１つまたは複数のさらなる治療剤との組合せを使用して、ＭＤＳに罹患している患者を処置することができる。
【０３９４】
鉄動態研究に基づいて再生不良性貧血、出血、または末梢溶血とは元来区別され［例えば、Ｒｉｃｋｅｔｔｓら（１９７８年）Ｃｌｉｎ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ３巻：１５９〜１６４頁を参照されたい］、無効赤血球生成によって、成熟ＲＢＣの産生が、骨髄中に存在する赤血球前駆体（赤芽球）の数を前提として予想されるものより少ない、多様な貧血群が説明される［Ｔａｎｎｏら（２０１０年）Ａｄｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１０：３５８２８３］。そのような貧血では、エリスロポエチンレベルを上昇させたとしても、成熟ＲＢＣの無効な産生に起因して組織低酸素状態が続く。エリスロポエチンレベル上昇が赤芽球の大規模な拡大増殖を駆動し、その結果、髄外赤血球生成に起因して脾腫（脾臓の腫大）に至る［例えば、Ａｉｚａｗａら（２００３年）Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ７４巻：６８〜７２頁を参照されたい］、赤芽球誘導性骨病態に至る［例えば、Ｄｉ  Ｍａｔｔｅｏら（２００８年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｈｏｍｅｏｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ  ２２巻：２１１〜２１６頁を参照されたい］、および治療的ＲＢＣ輸血の非存在下であっても組織鉄過剰に至る［例えば、Ｐｉｐｐａｒｄら（１９７９年）Ｌａｎｃｅｔ  ２巻：８１９〜８２１頁を参照されたい］可能性がある悪循環が、最終的には発生する。したがって、赤血球生成の有効性を後押しすることにより、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、前述の循環を打破し、こうして、根底にある貧血ばかりでなく、エリスロポエチンレベル上昇、脾腫、骨病態、および組織鉄過剰といった関連する合併症も緩和することができる。一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、貧血およびＥＰＯレベル上昇はもちろん、合併症、例えば、脾腫、赤芽球誘導性骨病態、鉄過剰、およびそれらに付随する病態も含む、無効赤血球生成を処置または予防するために使用することができる。脾腫に関して、そのような病態は、胸痛または腹痛および網内系過形成を含む。髄外造血は、脾臓内ばかりでなく、ことによると他の組織内でも、髄外造血性偽腫瘍の形態で生じ得る［例えば、Ｍｕｓａｌｌａｍら（２０１２年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｍｅｄ  ２巻：ａ０１３４８２頁を参照されたい］。赤芽球誘導性骨病態に関して、付随する病態は、低骨塩密度、骨粗鬆症、および骨痛を含む［例えば、Ｈａｉｄａｒら（２０１１年）Ｂｏｎｅ  ４８巻：４２５〜４３２頁を参照されたい］。鉄過剰に関して、付随する病態は、ヘプシジン抑制および食事に含まれる鉄の過剰吸収［例えば、Ｍｕｓａｌｌａｍら（２０１２年）Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ  ２６巻（補遺１号）：Ｓ１６〜Ｓ１９頁を参照されたい］、複数の内分泌疾患および肝線維症／肝硬変［例えば、Ｇａｌａｎｅｌｌｏら（２０１０年）Ｏｒｐｈａｎｅｔ  Ｊ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓ  ５巻：１１頁を参照されたい］、ならびに鉄過剰性心筋症［Ｌｅｋａｗａｎｖｉｊｉｔら、２００９年、Ｃａｎ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２５巻：２１３〜２１８頁］を含む。
【０３９５】
無効赤血球生成の最も一般的な原因は、無傷のアルファ−およびベータ−ヘモグロビン鎖の産生の不均衡が赤芽球成熟中にアポトーシス増加をもたらす遺伝性ヘモグロビン異常症である、サラセミア症候群である［例えば、Ｓｃｈｒｉｅｒ（２００２年）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ９巻：１２３〜１２６頁を参照されたい］。集合的にサラセミアは、世界中で最も出現頻度が高い遺伝子障害の１つであり、米国においても全世界においても深刻さを増す公衆衛生問題の一因となると予測される疫学的パターンの変化を伴う［Ｖｉｃｈｉｎｓｋｙ（２００５年）Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０５４巻：１８〜２４頁］。サラセミア症候群は、それらの重症度に応じて命名される。したがって、α−サラセミアは、軽症型α−サラセミア（α−サラセミア形質としても公知；罹患α−グロビン遺伝子２個）、ヘモグロビンＨ症（罹患α−グロビン遺伝子３個）、および重症型α−サラセミア（胎児水腫としても公知；罹患α−グロビン遺伝子４個）を含む。β−サラセミアは、軽症型β−サラセミア（β−サラセミア形質としても公知；罹患β−グロビン遺伝子１個）、中間型β−サラセミア（罹患β−グロビン遺伝子２個）、ヘモグロビンＥサラセミア（罹患β−グロビン遺伝子２個）、および重症型β−サラセミア（クーリー貧血としても公知；罹患β−グロビン遺伝子２個、その結果、β−グロビンタンパク質が完全に非存在となる）を含む。β−サラセミアは、複数の臓器に影響を及ぼし、相当高い罹患率および死亡率を伴い、現在のところ生涯にわたるケアを必要とする。β−サラセミアを有する患者の平均余命は、近年、鉄キレート化と組み合わせて定期的に輸血を使用することから延びてきたが、輸血および消化管による鉄の過剰吸収の両方の結果として生じる鉄過剰は、心疾患、血栓症、性腺機能低下症、甲状腺機能低下症、糖尿病、骨粗鬆症および骨減少など、重篤な合併症を引き起こし得る［例えば、Ｒｕｎｄら（２００５年）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５３巻：１１３５〜１１４６頁を参照されたい］。ある特定の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、サラセミア症候群を処置または予防するために使用することができる。
【０３９６】
一部の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、サラセミア症候群に加えて無効赤血球生成の障害を処置するために使用することができる。そのような障害は、鉄芽球性（ｓｉｄｅｒｂｌａｓｔｉｃ）貧血（遺伝性または後天性）；赤血球異形成貧血（Ｉ型およびＩＩ型）；鎌状赤血球貧血；遺伝性球状赤血球症；ピルビン酸キナーゼ欠損症；葉酸欠損症（先天性疾患、摂取量の減少、または要求量の増加に起因する）、コバラミン欠損症（先天性疾患、悪性貧血、吸収障害、膵臓機能不全、または摂取量の減少に起因する）などの状態、ある特定の薬物、または未解明の原因により引き起こされる可能性がある、巨赤芽球性貧血（先天性赤血球形成異常性貧血、不応性巨赤芽球性貧血、または赤白血病）；例えば骨髄線維症（骨髄化生）および骨髄癆を含む骨髄癆性貧血；先天性赤血球生成性ポルフィリン症；ならびに鉛中毒を含む。
【０３９７】
ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、無効赤血球生成のための支持療法と組み合わせて使用され得る。そのような療法は、貧血を処置するための、赤血球または全血どちらかの輸血を含む。慢性または遺伝性貧血では、鉄恒常性の正常なメカニズムが、繰り返される輸血により圧倒され、最終的には、心臓、肝臓および内分泌腺などの主要組織内への鉄の毒性であり、ことによると致死性である蓄積に至る。したがって、無効赤血球生成を慢性的に患っている患者のための支持療法は、１つまたは複数の鉄キレート化分子での処置であって、尿および／または糞便での鉄排泄を促進し、それによって組織鉄過剰を予防するかまたは好転させるための処置も含む［例えば、Ｈｅｒｓｈｋｏ（２００６年）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９１巻：１３０７〜１３１２頁；Ｃａｏら（２０１１年）Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｐ  ３巻（２号）：ｅ１７頁を参照されたい］。有効な鉄キレート剤は、ヒドロキシルラジカルおよび酸化生成物の触媒生成による、大部分の鉄毒性の主要因である可能性が高い、酸化形態の非トランスフェリン結合鉄である第二鉄に、選択的に結合し、それを中和することができなければならない［例えば、Ｅｓｐｏｓｉｔｏら（２００３年）Ｂｌｏｏｄ、１０２巻：２６７０〜２６７７頁を参照されたい］。これらの薬剤は、構造的に多様であるが、すべてが、１：１（六座の薬剤）、２：１（三座）、または３：１（二座）の化学量論比で個々の鉄原子と中和八面体配位錯体を形成することができる、酸素または窒素供与原子を保有する［Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉら（２００５年）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ、５７巻：５４７〜５８３頁］。一般に、有効な鉄キレート剤はまた、比較的低分子量（例えば、７００ダルトン未満）であり、罹患組織への接近を可能にするために水溶性でもあり脂溶性でもある。鉄キレート分子の具体的な例は、連日非経口投与を必要とする細菌由来の六座の薬剤であるデフェロキサミン、ならびに経口活性の合成薬剤であるデフェリプロン（二座）およびデフェラシロクス（三座）を含む。２つの鉄キレート剤の同日投与からなる併用療法は、キレート剤単剤療法に応答しない患者において有望であり、単独でのデフェロキサミン（ｄｅｒｅｒｏｘａｍｉｎｅ）に関する患者コンプライアンス不良の課題を克服する上でも有望である［Ｃａｏら（２０１１年）Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｐ  ３巻（２号）：ｅ１７頁；Ｇａｌａｎｅｌｌｏら（２０１０年）Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１２０２巻：７９〜８６頁］。
【０３９８】
本明細書で使用される場合、「〜と組み合わせて」または「併せての投与」は、第２の治療が、体内でまだ有効である（例えば、２つの化合物が患者において同時に有効であり、これは、２つの化合物の相乗効果を含み得る）ような、任意の投与形態を指す。有効性は、血液、血清または血漿中の薬剤の測定可能な濃度と相関しないことがある。例えば、異なる治療用化合物を、同じ製剤でまたは別々の製剤で、同時にまたは逐次的に、および異なるスケジュールで投与することができる。したがって、そのような処置を受ける個体は、異なる治療の組み合わされた効果からの恩恵を受けることができる。本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を、１つもしくは複数の他のさらなる薬剤もしくは支持療法と同時に、その前に、またはその後に投与することができる。一般に、各治療剤は、その個々の薬剤について決められた用量および／またはタイムスケジュールで投与されることになる。レジメンに用いられる特定の組合せは、本開示のアンタゴニストと治療の適合性、および／または達成すべき所望の治療効果を考慮に入れることになる。
【０３９９】
ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、無効赤血球生成のためのヘプシジンまたはヘプシジンアゴニストと組み合わせて使用され得る。主として肝臓で産生される循環ポリペプチドであるヘプシジンは、吸収腸細胞、肝細胞およびマクロファージ上に局在する鉄排出タンパク質であるフェロポルチンの分解を誘導するその能力のため、鉄代謝の主要制御因子と考えられる。大まかに言うと、ヘプシジンは、細胞外鉄の利用能を低下させるため、ヘプシジンアゴニストは、無効赤血球生成の処置に有益であり得る［例えば、Ｎｅｍｅｔｈ（２０１０年）Ａｄｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ、２０１０：７５０６４３を参照されたい］。この見解は、β−サラセミアのマウスモデルにおけるヘプシジン発現増加という有益な効果により裏付けられる［Ｇａｒｄｅｎｇｈｉら（２０１０年）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２０巻：４４６６〜４４７７頁］。
【０４００】
ＥＰＯ受容体活性化剤と任意選択で組み合わされた、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、小型の（小球性）、特大の（大球性）、奇形の、または異常な色の（低色素性）ＲＢＣを一部には特徴とする、ＲＢＣ成熟異常の貧血を処置するのにも適しているであろう。
【０４０１】
ある特定の実施形態では、本開示は、個体に治療有効量の本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質およびＥＰＯ受容体活性化剤を投与することにより、それを必要とする個体における貧血を処置または予防する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を、ＥＰＯ受容体活性化剤と組み合わせて使用して、ＥＰＯの有害効果を受けやすい患者におけるこれらの活性化剤の必要用量を低減させることができる。これらの方法を患者の治療的および予防的処置に使用することができる。
【０４０２】
本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質をＥＰＯ受容体活性化剤と組み合わせて使用して、赤血球の増加を、特に、ＥＰＯ受容体活性化剤のより低い用量範囲で達成することができる。これは、高用量のＥＰＯ受容体活性化剤に関連する公知のオフターゲット効果およびリスクを低減させる点で有益であり得る。ＥＰＯの主要な有害効果は、例えば、ヘマトクリットまたはヘモグロビンレベルの過剰な増大、および赤血球増加症を含む。ヘマトクリットレベル上昇は、高血圧症（より詳細には、高血圧症の増悪）および血管血栓症に至ることがある。一部は高血圧症に関連する、報告されているＥＰＯの他の有害効果は、頭痛、インフルエンザ様症候群、シャントの閉塞、心筋梗塞、ならびに血栓症、高血圧性脳症および赤血球無形成（ｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ａｐｌａｓｉａ）に起因する脳性痙攣である。例えば、Ｓｉｎｇｉｂａｒｔｉ（１９９４年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  ７２巻（補遺６号）、Ｓ３６〜Ｓ４３頁；Ｈｏｒｌら（２０００年）Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １５巻（補遺４号）、５１〜５６頁；Ｄｅｌａｎｔｙら（１９９７年）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４９巻、６８６〜６８９頁；およびＢｕｎｎ（２００２年）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４６巻（７号）、５２２〜５２３頁を参照されたい。
【０４０３】
本開示のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質が、ＥＰＯとは異なるメカニズムにより作用するという条件で、これらのアンタゴニストは、ＥＰＯに対してあまり応答しない患者において赤血球およびヘモグロビンレベルを増大させるのに有用であり得る。例えば、本開示のアンタゴニストは、ＥＰＯの通常用量から増加用量（＞３００ＩＵ／ｋｇ／週）の投与がヘモグロビンレベルを標的のレベルまで増大させる結果とならない患者に有益であり得る。ＥＰＯ応答が不十分である患者はすべてのタイプの貧血に見られるが、がんを有する患者および末期腎疾患を有する患者において、より多くの非応答者数が特に頻繁に観察されている。ＥＰＯに対する不十分な応答は、構成的である（ＥＰＯでの初回処置時に観察される）こともあり、または後天的である（ＥＰＯでの反復処置時に観察される）こともある。
【０４０４】
ある特定の実施形態では、本開示は、本開示の１つもしくは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質で処置されている患者、または処置される候補者である患者を、患者における１つまたは複数の血液学的パラメーターを測定することにより管理するための方法を提供する。血液学的パラメーターは、本開示のアンタゴニストで処置される候補者である患者に対する適切な投薬を評価するために、処置中に血液学的パラメーターをモニターするために、本開示の１つもしくは複数のアンタゴニストでの処置中に投薬量を調整するかどうかを評価するために、および／または本開示の１つもしくは複数のアンタゴニストの適切な維持用量を評価するために使用することができる。血液学的パラメーターの１つまたは複数が正常レベル外である場合、本開示の１つもしくは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の投薬を低減させてもよく、遅らせてもよく、または終了してもよい。
【０４０５】
本明細書で提供される方法に従って測定することができる血液学的パラメーターは、例えば、赤血球レベル、血圧、鉄貯蔵量、および当技術分野で認知されている方法を使用して、赤血球レベル増大と相関する、体液中で見出される他の作用因子を含む。そのようなパラメーターを、患者からの血液試料を使用して判定することができる。赤血球レベル、ヘモグロビンレベルおよび／またはヘマトクリットレベルの増大は、血圧の増大を引き起こし得る。
【０４０６】
一実施形態では、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質で処置される候補者である患者において、１つまたは複数の血液学的パラメーターが、正常範囲外であるか、または高めの正常値である場合には、血液学的パラメーターが自然にまたは治療的介入によって正常または許容されるレベルに戻るまで、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の投与の開始を遅らせることができる。例えば、候補患者が高血圧または前高血圧である場合には、患者の血圧を下げるために患者を降圧剤で処置することができる。例えば、利尿薬、アドレナリン阻害剤（アルファブロッカーおよびベータブロッカーを含む）、血管拡張薬、カルシウムチャネル遮断薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬を含む、個々の患者の状態に適する任意の降圧剤を使用することができる。あるいは、食事および運動レジメンを使用して、血圧を処置することができる。同様に、候補患者が、正常よりも低いか、または低めの正常値である鉄貯蔵量を有する場合には、患者の鉄貯蔵量が正常または許容されるレベルに戻るまで、食事および／または鉄サプリメントの適切なレジメンで患者を処置することができる。正常より高い赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルを有する高い患者については、レベルが正常または許容されるレベルに戻るまで、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の投与を遅らせることができる。
【０４０７】
ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質で処置される候補者である患者において、１つまたは複数の血液学的パラメーターが、正常範囲外であるか、または高めの正常値である場合には、投与の開始を遅らせないことがある。しかし、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の投薬の投薬量または頻度を、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の投与時に生じる血液学的パラメーターの許容され難い増大のリスクを低下させることになる量に設定することができる。あるいは、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質と、血液学的パラメーターの望ましくないレベルに対処する治療剤とを組み合わせる治療レジメンを、患者のために開発することができる。例えば、患者が高血圧を有する場合には、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質および降圧剤の投与を含む治療レジメンを設計することができる。所望の鉄貯蔵量より低い鉄貯蔵量を有する患者については、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質および鉄補充の治療レジメンを開発することができる。
【０４０８】
一実施形態では、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質で処置される候補者である患者のために、１つまたは複数の血液学的パラメーターについてのベースラインパラメーターを確立することができ、ベースライン値に基づいて、その患者に適した投薬レジメンを確立することができる。あるいは、患者の病歴に基づいて確立されたベースラインパラメーターを使用して、患者に適したアンタゴニスト投薬レジメンの情報を得ることができる。例えば、健常患者が被定義正常範囲より高い確立されたベースライン血圧測定値を有する場合、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストでの処置の前に、患者の血圧を、一般集団について正常と見なされる範囲内に至らせる必要がないことがある。本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質での処置前の１つまたは複数の血液学的パラメーターについての患者のベースライン値は、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストでの処置中の血液学的パラメーターに対する何らかの変化をモニターするための関連比較値として使用することもできる。
【０４０９】
ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質で処置されている患者において、１つまたは複数の血液学的パラメーターが測定される。血液学的パラメーターを使用して、処置中に患者をモニターし、本開示の１つもしくは複数のアンタゴニストの投薬または別の治療剤のさらなる投薬の調整または終了を可能にすることができる。例えば、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の投与が、血圧、赤血球レベルもしくはヘモグロビンレベルの増大、または鉄貯蔵量の低減をもたらす場合には、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の投薬は、１つまたは複数の血液学的パラメーターに対する本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の影響を低下させるために、量または頻度が低減され得る。本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の投与が、患者に有害である１つまたは複数の血液学的パラメーターの変化をもたらす場合には、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の投薬を、血液学的パラメーターが許容されるレベルに戻るまで一時的に終了してもよく、または永久に終了してもよい。同様に、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の投与の用量または頻度を低減させた後に１つまたは複数の血液学的パラメーターが許容される範囲内に至らない場合には、投薬を終了することができる。本開示の１つもしく複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の投薬の低減もしくは終了の代替として、またはそれに加えて、血液学的パラメーターの望ましくないレベルに対処するさらなる治療剤、例えば、降圧剤または鉄サプリメントを、患者に投薬することができる。例えば、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質で処置されている患者が高血圧を有する場合には、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の投薬を同じレベルで継続することができ、降圧剤が処置レジメンに追加されるか、本開示の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の投薬を（例えば、量および／または頻度に関して）低減させることができ、降圧剤が処置レジメンに追加されるか、または本開示の１つもしくは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の投薬を終了することができ、そして患者を降圧剤で処置することができる。
７．医薬組成物
【０４１０】
ある特定の実施形態では、本発明の化合物（例えば、ホモマーまたはヘテロマー形態のいずれかにおけるバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質）は、薬学的に許容される担体と共に製剤化される。例えば、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、単独で、または医薬製剤（治療組成物）の構成成分として投与することができる。対象化合物は、ヒトの医学または獣医学における使用のためのいずれか簡便な仕方で投与のために製剤化することができる。
【０４１１】
ある特定の実施形態では、本発明の治療方法は、インプラントまたはデバイスとして、外用に、全身性にまたは局所的に組成物を投与するステップを含む。投与される場合、本発明における使用のための治療組成物は、当然ながら、パイロジェン不含の生理学的に許容される形態である。さらに、組成物は、望ましくは、標的組織部位（例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪またはニューロン）、例えば、組織損傷を有する部位への送達のために被包または粘稠性形態で注射され得る。外用投与は、創傷治癒および組織修復に適する場合がある。上述の組成物中に同様に任意選択で含まれ得るバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質以外の治療上有用な薬剤は、それに代えてまたはその上、本発明の方法において対象化合物（例えば、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質）と同時にまたは逐次に投与することができる。
【０４１２】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、標的組織部位に１つまたは複数の治療化合物（例えば、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質）を送達し、発達中の組織のための構造を提供することができ、最適には、身体内に再吸収され得る、マトリックスを含むことができる。例えば、マトリックスは、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の緩徐放出を提供することができる。そのようなマトリックスは、他の植え込み型の医学的適用のために現在使用されている材料でできていてよい。
【０４１３】
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容上の外観および界面特性に基づく。対象組成物の特定の適用は、適切な製剤を定義するであろう。組成物のための潜在的マトリックスは、生分解性および化学的に定義された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ酸無水物となり得る。他の潜在的材料は、骨または真皮コラーゲンなど、生分解性であり、生物学的に十分に定義されている。さらなるマトリックスは、純粋タンパク質または細胞外基質構成成分で構成されている。他の潜在的マトリックスは、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩または他のセラミックスなど、非生分解性であり、化学的に定義されている。マトリックスは、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムなど、前述の種類の材料のいずれかの組合せで構成されていてよい。バイオセラミックスは、アルミン酸リン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ−ａｌｕｍｉｎａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）など、組成が変更されていてよく、ポアサイズ、粒子径、粒子形状および生分解性を変更するように加工する。
【０４１４】
ある特定の実施形態では、本発明のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、経口で、例えば、活性成分として所定量の薬剤をそれぞれ含有する、カプセル、カシェー、丸剤、錠剤、薬用キャンディー（風味付け基剤、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガントを使用）、粉末、顆粒の形態で、または水性もしくは非水性液体における溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型液体エマルションとして、またはエリキシル剤もしくはシロップとして、または芳香錠（ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤を使用）として、および／または口腔洗浄薬その他として投与することができる。薬剤は、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与することもできる。
【０４１５】
経口投与のための固体剤形（カプセル、錠剤、丸剤、ドラジェ、粉末、顆粒、その他）において、本発明の１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムおよび／または次のうちいずれかなど、１つまたは複数の薬学的に許容される担体と混合することができる：（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸など、フィラーまたは増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシアなど、結合剤；（３）グリセロールなど、保水剤；（４）寒天−寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩および炭酸ナトリウムなど、崩壊剤；（５）パラフィンなど、溶解遅延剤；（６）四級アンモニウム化合物など、吸収促進物質；（７）例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなど、湿潤剤；（８）カオリンおよびベントナイト粘土など、吸収剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物など、潤滑剤；ならびに（１０）着色剤。カプセル、錠剤および丸剤の場合、医薬組成物は、緩衝剤を含むこともできる。同様の種類の固体組成物が、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールその他などの賦形剤を使用して、軟および硬充填ゼラチンカプセルにおけるフィラーとして用いられてもよい。
【０４１６】
経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤を含む。活性成分に加えて、液体剤形は、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実、ラッカセイ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシおよびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物など、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤など、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含有することができる。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味料、調味料、着色料、香料および保存剤など、アジュバントを含むこともできる。
【０４１７】
懸濁液は、活性化合物に加えて、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｍｅｔａｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、ベントナイト、寒天−寒天およびトラガント、ならびにこれらの混合物など、懸濁剤を含有することができる。
【０４１８】
本明細書に開示されているある特定の組成物は、皮膚または粘膜のいずれかに、外用投与することができる。外用製剤は、皮膚または角質層浸透エンハンサーとして有効であることが公知の多種多様な薬剤のうち１つまたは複数をさらに含むことができる。それらの例は、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルまたはイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシドおよびアゾンである。追加的な薬剤がさらに含まれて、製剤を化粧品的に許容されるようにすることができる。それらの例は、脂肪、ワックス、油、色素、芳香剤、保存剤、安定剤および界面活性剤である。当技術分野で公知のものなど、角質溶解剤が含まれてもよい。その例は、サリチル酸および硫黄である。
【０４１９】
外用または経皮投与のための剤形は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入薬を含む。活性化合物は、無菌条件下で、薬学的に許容される担体と、また、要求され得るいずれかの保存剤、緩衝剤または噴霧剤と混合されてよい。軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の対象化合物（例えば、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質）に加えて、動物および植物脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはこれらの混合物などの賦形剤を含有することができる。
【０４２０】
粉末およびスプレーは、対象化合物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有することができる。スプレーはその上、クロロフルオロヒドロカーボンなどの習慣的な噴霧剤、ならびにブタンおよびプロパンなどの揮発性未置換炭化水素を含有することができる。
【０４２１】
ある特定の実施形態では、非経口的投与に適した医薬組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質、または懸濁もしくは増粘剤を含有することができる、１つまたは複数の薬学的に許容される無菌等張性水性または非水性溶液、分散、懸濁液またはエマルション、または使用直前に無菌注射用溶液もしくは分散へと再構成され得る無菌粉末と組み合わせて、１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を含むことができる。本発明の医薬組成物中に用いられてよい適した水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、その他など）およびこれらの適した混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散の場合は要求される粒子径の維持によって、また、界面活性物質の使用によって維持することができる。
【０４２２】
本発明の組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤など、アジュバントを含有することもできる。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸、その他の包含によって確実となり得る。糖、塩化ナトリウム、その他など、等張性薬剤を組成物中に含むことが望ましい場合もある。加えて、注射用医薬品形態の延長された吸収が、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど、吸収を遅延させる薬剤の包含によってもたらされてもよい。
【０４２３】
投薬量レジメンが、本発明の対象化合物（例えば、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質）の作用を修飾する様々な因子を考慮して、担当医によって決定されるであろうことが理解される。様々な因子は、処置されるべき疾患に依存するであろう。筋肉障害の場合、因子として、形成されることが望まれる筋量の量、疾患によって最も影響を受ける筋肉、増悪した筋肉の状態、患者の年齢、性別および食事、投与の時間、ならびに他の臨床因子を挙げることができるがこれらに限定されない。最終組成物への他の公知増殖因子の添加も、投薬量に影響を与え得る。進行は、筋肉成長および／または修復の定期的評価によって、例えば、筋力検査、筋肉サイズのＭＲＩ評価、および筋肉生検の分析によってモニターすることができる。
【０４２４】
本発明のある特定の実施形態では、１つまたは複数のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、一緒に（同時に）、または異なる時点で（逐次または重複して）投与することができる。加えて、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、別の種類の治療剤、例えば、軟骨誘導剤、骨誘導剤、筋肉誘導剤、脂肪減少またはニューロン誘導剤と共に投与することができる。２種類の化合物を、同時にまたは異なる時点で投与することができる。本発明のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質が、別の治療剤と協調してまたはおそらく相乗的に作用し得ることが予想される。
【０４２５】
具体例では、種々の骨原性、軟骨誘導および骨誘導因子、特に、ビスホスホネートについて記載されている。例えば、欧州特許出願第１４８，１５５号および同第１６９，０１６号を参照されたい。例えば、対象バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質と組み合わせることができる他の因子は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）など、様々な増殖因子を含む。
【０４２６】
ある特定の実施形態では、本発明はまた、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ産生のための遺伝子療法を提供する。そのような治療法は、上に収載されている障害を有する細胞または組織へのバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチド配列の導入によってその治療効果を達成するであろう。バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチド配列の送達は、キメラウイルスなどの組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を使用して達成することができる。バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチド配列の治療送達に好ましいのは、標的化リポソームの使用である。
【０４２７】
本明細書に教示されている遺伝子療法に利用することができる様々なウイルスベクターは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアまたは好ましくは、レトロウイルスなどのＲＮＡウイルスを含む。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリレトロウイルスの誘導体である。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例として、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられるがこれらに限定されない。多数の追加的なレトロウイルスベクターは、複数の遺伝子を取り込むことができる。これらのベクターは全て、形質導入された細胞を同定および生成することができるように、選択可能マーカーのための遺伝子を移入または取り込むことができる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を結合させることにより、標的特異的とすることができる。好ましい標的化は、抗体を使用することにより達成される。当業者であれば、特異的ポリヌクレオチド配列をレトロウイルスゲノム内に挿入して、またはウイルスエンベロープに結合させて、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にすることができることを認識するであろう。好ましい一実施形態では、ベクターは、骨、軟骨、筋肉または神経細胞／組織に標的化される。
【０４２８】
あるいは、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションにより、レトロウイルス構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）をコードするプラスミドを組織培養細胞に直接トランスフェクトすることができる。次いで、これらの細胞に、目的の遺伝子を含有するベクタープラスミドがトランスフェクトされる。得られた細胞は、レトロウイルスベクターを培養培地に放出する。
【０４２９】
バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドのための別の標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合型ミセルおよびリポソームを含む脂質に基づく系を含む。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの送達媒体として有用な人工膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトビリオンは、水性内部の内に被包され、生物学的活性形態で細胞に送達され得る（例えば、Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．、６巻：７７頁、１９８１年を参照）。リポソーム媒体を使用した効率的遺伝子移入のための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６８２頁、１９８８年を参照されたい。通常、リポソームの組成は、通常、ステロイド、特にコレステロールと組み合わせた、リン脂質の組合せである。他のリン脂質または他の脂質を使用することもできる。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。
【０４３０】
リポソーム産生において有用な脂質の例として、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドなどのホスファチジル化合物が挙げられる。例証的なリン脂質は、例えば、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンを含む。例えば、臓器特異性、細胞特異性およびオルガネラ特異性に基づくリポソームの標的化も可能であり、当技術分野で公知である。
【実施例】
【０４３１】
ここで、本発明を一般的に記載し、単に、ある特定の実施形態および本発明の実施形態の例示のために含まれ、本発明を限定することを意図するものではない、以下の実施例を参照することによって、本発明はより容易に理解されるであろう。
（実施例１）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質の生成
【０４３２】
出願人は、最小リンカー（３個のグリシンアミノ酸）を間に有するヒトＧ１Ｆｃドメインに融合されたヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質を構築した。構築物は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｇ１Ｆｃと呼ばれる。
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｇ１Ｆｃは、ＣＨＯ細胞系から精製された、以下の配列番号５中に示される（リンカーは下線付きである）：
【０４３３】
【化１４６】
2019536440.tif 000151
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｇ１Ｆｃタンパク質を、ＣＨＯ細胞系中で発現させた。３つの異なるリーダー配列を考慮した：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号７）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号８）
【０４３４】
（ｉｉｉ）天然：ＭＴＡＰＷＶＡＬＡＬＬＷＧＳＬＣＡＧ（配列番号９）
選択された形態は、ＴＰＡリーダーを用い、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列を有する：
【０４３５】
【化１４７】
2019536440.tif 000152
【化１４８】
2019536440.tif 000153
（配列番号６）
このポリペプチドは、以下の核酸配列（配列番号１０）によってコードされる：
【０４３６】
【化１４９】
2019536440.tif 000154
【０４３７】
ＣＨＯ細胞により産生された材料のＮ末端配列決定により、−ＧＲＧＥＡＥ（配列番号１１）の主要な配列が明らかになった。注目すべきことに、文献中で報告された他の構築物は、−ＳＧＲ．．．配列で始まる。
【０４３８】
精製を、例えば、任意の順序の、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
【０４３９】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質も、ＨＥＫ２９３細胞およびＣＯＳ細胞中で発現させた。全ての細胞系に由来する材料および合理的な培養条件は、タンパク質に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの筋肉構築活性を提供したが、おそらく、細胞系の選択および／または培養条件と関連する効力の変動性が観察された。
（実施例２）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃバリアントタンパク質の生成
【０４４０】
出願人は、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン中に一連の突然変異（配列変形形態）を生成し、任意選択のリンカーによって接合されたＡｃｔＲＩＩＢバリアント細胞外ドメインとＦｃドメインとを含む可溶性ホモ二量体融合タンパク質としてこれらのバリアントポリペプチドを産生した。バックグラウンドＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合物は、配列番号５に示されるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｇ１Ｆｃであった。
【０４４１】
様々な置換突然変異を、バックグラウンドＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質中に導入した。実施例１に提示されたデータに基づくと、これらの構築物が、ＴＰＡリーダーと共に発現された場合、Ｎ末端セリンを欠くであろうことが予想される。突然変異は、ＰＣＲ突然変異誘発によってＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン中で生成した。ＰＣＲ後、Ｑｉａｇｅｎカラムを介して断片を精製し、ＳｆｏＩおよびＡｇｅＩで消化し、ゲル精製した。これらの断片を、ライゲーションの際に、それがヒトＩｇＧ１との融合キメラを作出するように、発現ベクターｐＡＩＤ４（ＷＯ２００６／０１２６２７を参照されたい）中にライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５アルファ中への形質転換の際に、コロニーを選び取り、ＤＮＡを単離した。マウス構築物（ｍＦｃ）については、マウスＩｇＧ２ａをヒトＩｇＧ１に置換した。全ての突然変異体を、配列検証した。
【０４４２】
プロセシングされていないＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ５５Ａ）−Ｇ１Ｆｃのアミノ酸配列を、以下に示す（配列番号３１）。シグナル配列およびリンカー配列は、実線の下線により示され、Ｋ５５Ａ置換は、二重下線により示される。配列番号３１のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１５０】
2019536440.tif 000155
このＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ５５Ａ）−Ｇ１Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸配列（配列番号３２）によってコードされる：
【化１５１】
2019536440.tif 000156
【化１５２】
2019536440.tif 000157
【０４４３】
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ５５Ａ）−Ｇ１Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号３３）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１５３】
2019536440.tif 000158
【０４４４】
プロセシングされていないＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ５５Ｅ）−Ｇ１Ｆｃのアミノ酸配列を、以下に示す（配列番号３４）。シグナル配列およびリンカー配列は、実線の下線により示され、Ｋ５５Ｅ置換は二重下線により示される。配列番号３４のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１５４】
2019536440.tif 000159
【化１５５】
2019536440.tif 000160
このＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ５５Ｅ）−Ｇ１Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸配列（配列番号３５）によってコードされる：
【化１５６】
2019536440.tif 000161
【０４４５】
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ５５Ｅ）−Ｇ１Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号３６）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１５７】
2019536440.tif 000162
【化１５８】
2019536440.tif 000163
【０４４６】
プロセシングされていないＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｇ１Ｆｃのアミノ酸配列を、以下に示す（配列番号３７）。シグナル配列およびリンカー配列は、実線の下線により示され、Ｆ８２Ｉ置換は二重下線により示される。配列番号３７のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１５９】
2019536440.tif 000164
このＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｇ１Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸配列（配列番号３８）によってコードされる：
【化１６０】
2019536440.tif 000165
【化１６１】
2019536440.tif 000166
【０４４７】
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｇ１Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号３９）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１６２】
2019536440.tif 000167
【０４４８】
プロセシングされていないＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｋ）−Ｇ１Ｆｃのアミノ酸配列を、以下に示す（配列番号４０）。シグナル配列およびリンカー配列は、実線の下線により示され、Ｆ８２Ｋ置換は二重下線により示される。配列番号４０のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１６３】
2019536440.tif 000168
このＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｋ）−Ｇ１Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸配列（配列番号４１）によってコードされる：
【化１６４】
2019536440.tif 000169
【化１６５】
2019536440.tif 000170
【０４４９】
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｋ）−Ｇ１Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４２）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１６６】
2019536440.tif 000171
【０４５０】
構築物を、ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞中で発現させ、濾過およびプロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。一部の例では、アッセイを、精製タンパク質ではなく馴化培地を用いて実施した。レポーター遺伝子アッセイのための試料の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット解析によって評価した。
【０４５１】
突然変異体を、以下に記載される結合アッセイおよび／またはバイオアッセイにおいて試験した。
【０４５２】
あるいは、同様の突然変異を、以下に示されるように、５個のアミノ酸のＮ末端短縮および３個のアミノ酸のＣ末端短縮を有するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン中に導入することができる（配列番号５３）。この短縮されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは、配列番号２中の番号付けに基づいてＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）と命名される。
【化１６７】
2019536440.tif 000172
【０４５３】
対応するバックグラウンド融合ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−Ｇ１Ｆｃを、以下に示す（配列番号１２）。
【化１６８】
2019536440.tif 000173
（実施例３）
細胞に基づくアッセイにおけるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃバリアントタンパク質の活性
【０４５４】
Ａ２０４細胞に基づくアッセイを使用して、アクチビンＡ、ＧＤＦ１１、およびＢＭＰ９によるシグナル伝達に対するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃバリアントタンパク質間の効果を比較した。簡単に述べると、このアッセイは、筋肉に由来するヒトＡ２０４横紋筋肉腫細胞系（ＡＴＣＣ（登録商標）：ＨＴＢ−８２（商標））およびレポーターベクターｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８年、ＥＭＢＯ  １７巻：３０９１〜３１００頁）ならびにトランスフェクション効率について制御するためのウミシイタケレポータープラスミド（ｐＲＬＣＭＶ）を使用する。ＣＡＧＡ１２モチーフは、ＴＧＦ−β応答遺伝子（例えば、ＰＡＩ−１遺伝子）中に存在し、したがって、このベクターは、アクチビンＡ、ＧＤＦ１１、およびＢＭＰ９を含む、Ｓｍａｄ２／３を介してシグナルを発することができるリガンドに対して一般に使用されているものである。
【０４５５】
１日目に、Ａ−２０４細胞を、１つまたは複数の４８ウェルプレート中に移した。２日目に、これらの細胞に、１０μｇのｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２またはｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（１０μｇ）＋ｐＲＬＣＭＶ（１μｇ）およびＦｕｇｅｎｅをトランスフェクトした。３日目に、０．１％ＢＳＡを含有する培地中に希釈したリガンドを、細胞への添加前に１時間、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質と共に予備インキュベートした。約６時間後、細胞をＰＢＳですすぎ、溶解した。細胞溶解物をルシフェラーゼアッセイにおいて分析して、Ｓｍａｄ活性化の程度を決定した。
【０４５６】
このアッセイを使用して、アクチビンＡ、ＧＤＦ１１、およびＢＭＰ９による細胞シグナル伝達に対する阻害効果についてＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃバリアントタンパク質をスクリーニングした。ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン中にアミノ酸置換を組み入れたホモ二量体Ｆｃ融合タンパク質の効力を、未修飾ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを含むＦｃ融合タンパク質のものと比較した。
【表４−１】
2019536440.tif 000174
【表４−２】
2019536440.tif 000175
【０４５７】
上記の表に示されたように、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン中の単一のアミノ酸置換は、細胞に基づくレポーター遺伝子アッセイにおいて、アクチビンＡまたはＧＤＦ１１の阻害と、ＢＭＰ９の阻害との間の均衡を変更し得る。未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを含有する融合タンパク質と比較して、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ５５Ａ）−Ｆｃ、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ５５Ｅ）−Ｆｃ、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｆｃ、およびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｋ）−Ｆｃバリアントは、アクチビンＡおよびＧＤＦ１１の本質的に減少していない阻害を維持しながら、ＢＭＰ９のあまり強力でない阻害（ＩＣ５０値の増大）を示した。
【０４５８】
これらの結果は、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ５５Ａ）−Ｆｃ、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ５５Ｅ）−Ｆｃ、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｆｃ、およびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｋ）−ＦｃなどのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃバリアントタンパク質が、未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを含むＦｃ融合タンパク質と比較して、アクチビンＡおよびＧＤＦ１１のより選択的なアンタゴニストであることを示している。したがって、これらのバリアントは、そのような拮抗作用が有利である、ある特定の適用では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃよりも有用であり得る。例としては、ＢＭＰ９、潜在的には、ＢＭＰ１０の拮抗作用を低下させながら、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のうちの１つまたは複数の拮抗作用を保持することが望ましい治療適用が挙げられる。
（実施例４）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃバリアントホモ二量体のリガンド結合プロファイル
【０４５９】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）に基づく結合アッセイを使用して、実施例３でスクリーニングされたある特定のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃバリアントタンパク質ならびに以前に評価されていない他のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃバリアントタンパク質のリガンド結合動態を比較した。試験しようとするＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質を、抗Ｆｃ抗体を使用するシステム上に独立に捕捉した。次いで、リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流動させた。３７℃で分析されたＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃバリアントタンパク質の結果を、図８に示す。未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを含むＦｃ融合タンパク質と比較して、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ５５Ａ）−Ｆｃ、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ５５Ｅ）−Ｆｃ、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｆｃ、およびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｋ）−Ｆｃバリアントタンパク質は、ＧＤＦ１１に対するよりもＢＭＰ９に対するその親和性のより大きな減少を示した。２５℃で分析されたさらなるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃバリアントタンパク質の結果を、図９に示す。
【０４６０】
これらの結果により、Ｋ５５Ａ、Ｋ５５Ｅ、Ｆ８２Ｉ、およびＦ８２Ｋが、アクチビンＡまたはＧＤＦ１１に対するＡｃｔＲＩＩＢの親和性を低下させるよりも、ＢＭＰ９に対するＡｃｔＲＩＩＢの結合親和性を低下させる置換として、確認される。したがって、これらのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃバリアントタンパク質は、そのような選択的拮抗作用が有利である、ある特定の適用では未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質よりも有用であり得る。例としては、ＢＭＰ９の拮抗作用を低下させながら、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のうちの１つまたは複数の拮抗作用を保持することが望ましい治療適用が挙げられる。
（実施例５）
マウスにおけるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃバリアントホモ二量体の活性
【０４６１】
選択されたＡｃｔＲＩＩＢ−Ｇ１Ｆｃバリアントホモ二量体をマウスにおいて試験して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその活性プロファイルの差異を調査した。成体野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）のＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ５５Ａ）−Ｆｃ、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ５５Ｅ）−Ｆｃ、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｆｃ、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｋ）−Ｆｃ、未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ、またはビヒクルを、週２回、４週間投薬した（ｎ＝群あたり８匹のマウス）。研究評価項目は、ベースラインおよび研究完了時に核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって決定された、体重、ＣＢＣ、および全身除脂肪量および全身脂肪量を含んでいた。
【０４６２】
未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃによるマウスの処置は、ビヒクル処置対照と比較して、研究の経過にわたって体重増加を３倍よりも多くした。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｆｃにより引き起こされた体重増加（２５％）は、未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃにより引き起こされたもの（２９％）とほぼ同じ大きさであったが、他のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃバリアントタンパク質は、１２〜１７％の範囲の体重増加をもたらした（図１０）。ＮＭＲ分析により、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｆｃ処置が、以下の表に示されるように、ビヒクルと比較して、大幅に全身除脂肪量を増加させ全身体脂肪量を減少させたことが明らかになった。
【表５】
2019536440.tif 000176
【０４６３】
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｆｃは、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃによってもたらされたもののおよそ半分の規模の除脂肪量および体脂肪量の変化をもたらした。除脂肪組織および脂肪組織の正規化された（パーセンテージに基づく）変化は、除脂肪量（典型的には、マウスでは体重の約７０％）は脂肪量（典型的には、体重の約１０％）よりもはるかに大きいため、絶対的な変化に対するその一致において異なることが認識されるべきである。腓腹筋、大腿直筋、および胸筋を含む、検査した個々の骨格筋は、全てビヒクルと比較してＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｆｃによる処置の経過にわたって重量を大幅に増加させた。
【０４６４】
評価した５つ全てのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、ビヒクルがもたらすよりも大幅に高い赤血球パラメーター（ＲＢＣ計数、ヘマトクリット、およびヘモグロビン濃度）の値をもたらし、これらのパラメーターに対するＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｆｃの刺激効果は、未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃのものを超えていた（図１１）。
【０４６５】
したがって、ＡｃｔＲＩＩＢバリアント細胞外ドメインを含むＦｃ融合タンパク質ホモ二量体は、赤血球および骨格筋に対する有益な同化効果ならびに未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体のものと類似する脂肪組織に対する異化効果を発揮することができる。しかしながら、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃバリアントホモ二量体は、未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃと比較してＢＭＰ９に対して低い親和性で結合し、したがって、血管新生などの、そのリガンドによって媒介されるプロセスの減少した阻害を発揮する。この新規の選択性は、例えば、赤血球および筋肉に対する刺激効果ならびに脂肪に対する阻害効果を必要とするが、血管新生の変更を必要としない患者の処置において有用である。
（実施例６）
非ヒト霊長類におけるＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｆｃホモ二量体の活性
【０４６６】
次いで、出願人は、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｆｃホモ二量体が非ヒト霊長類におけるＲＢＣパラメーターを変更するかどうかを調査した。カニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を、２９日の研究の１および１５日目に、９ｍｇ／ｋｇ（ｓ．ｃ．）のＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｇ１Ｆｃ、未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｇ１Ｆｃ、または未修飾ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｇ１Ｆｃで処置した（ｎ＝群あたり４匹のサル）。図１２に示されるように、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｆｃ処置は、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ（陽性対照）のものと同様の量によりＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（霊長類における陰性対照）と比較してＲＢＣ計数を増加させた。同等の結果が、ヘモグロビン濃度およびヘマトクリットについて得られた（データは示さない）。これらのデータにより、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｆ８２Ｉ）−Ｆｃホモ二量体が、未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体のものとは異なるｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を有することが確認される。
（実施例７）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃヘテロ二量体の生成
【０４６７】
出願人は、それぞれ、細胞外ドメインとＧ１Ｆｃドメインとの間に配置されたリンカーを用いてＧ１Ｆｃドメインに別々に融合された、未修飾ヒトＡｃｔＲＩＩＢおよび７９位にロイシンからグルタミン酸への置換を有するヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを含む可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃヘテロマー複合体の生成を想定する。個々の構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃ融合ポリペプチドと呼ばれ、それぞれの配列は以下に提供される。
【０４６８】
ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃまたはＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃホモ二量体複合体とは反対に、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃヘテロマー複合体の形成を促進するための方法論は、Ｆｃドメインのアミノ酸配列中に変更を導入して、非対称ヘテロマー複合体の形成を誘導することである。Ｆｃドメインを使用して非対称相互作用対を作製するための多くの異なる手法が、本開示に記載される。
【０４６９】
それぞれ、配列番号４３〜４５および４６〜４８のＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−ＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチド配列に例示される、１つの手法では、一方のＦｃドメインを変更して、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入することができるが、他方のＦｃドメインを変更して、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入することができる。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドはそれぞれ、ＴＰＡリーダーを用いることができる（配列番号８）。
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号４３）を、以下に示す：
【化１６９】
2019536440.tif 000177
【０４７０】
リーダー（シグナル）配列およびリンカーは下線付きであり、Ｌ７９Ｅ置換は二重下線により示される。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（リシンを酸性アミノ酸で置き換える）を、上に二重下線により示されたようにＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４３のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
このＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号４４）によってコードされ得る：
【化１７０】
2019536440.tif 000178
【化１７１】
2019536440.tif 000179
【０４７１】
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号４５）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
【化１７２】
2019536440.tif 000180
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドの相補形態（配列番号４６）は、以下の通りである：
【化１７３】
2019536440.tif 000181
【０４７２】
リーダー配列およびリンカー配列は下線付きである。上記の配列番号４３および４５のＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、２つのアミノ酸置換（グルタミン酸およびアスパラギン酸をリシンで置き換える）を、上に二重下線により示されたＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４６のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
このＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号４７）によってコードされ得る：
【化１７４】
2019536440.tif 000182
【０４７３】
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号４８）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１７５】
2019536440.tif 000183
【０４７４】
それぞれ、配列番号４５および配列番号４８のＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−ＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチドを同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃを含むヘテロマータンパク質複合体を生じさせることができる。
【０４７５】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用してヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別の手法では、Ｆｃドメインを変更して、それぞれ、配列番号４９〜５０および５１〜５２のＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−ＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチド配列に示されるような相補的疎水性相互作用およびさらなる分子間ジスルフィド結合を導入することができる。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドはそれぞれ、ＴＰＡリーダー（配列番号８）を用いることができる。
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号４９）を、以下に示す：
【化１７６】
2019536440.tif 000184
【０４７６】
シグナル配列およびリンカー配列は下線付きであり、Ｌ７９Ｅ置換は二重下線により示される。考えられるホモ二量体複合体のいずれかではなくＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインで、トレオニンをトリプトファンで置き換える）を、上に二重下線により示された融合タンパク質のＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号４９のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端にリシンを付加して提供することができる。
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号５０）は、以下の通りである：
【化１７７】
2019536440.tif 000185
【０４７７】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドの相補形態（配列番号５１）は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１７８】
2019536440.tif 000186
【０４７８】
リーダー配列およびリンカーは下線付きである。上記の配列番号４９〜５０のＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換（チロシンをシステインで、トレオニンをセリンで、ロイシンをアラニンで、チロシンをバリンで置き換える）を、上に二重下線により示されたＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメイン中に導入することができる。配列番号５１のアミノ酸配列を、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【０４７９】
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質配列は、以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシンを除去して提供することができる。
【化１７９】
2019536440.tif 000187
【０４８０】
それぞれ、配列番号５０および配列番号５２のＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−ＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチドを同時発現させ、ＣＨＯ細胞系から精製して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃを含むヘテロマータンパク質複合体を生じさせることができる。
【０４８１】
様々なＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃ複合体の精製を、例えば、任意の順序の、以下のもの：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー（例えば、静電気的および疎水性リガンドの両方を含有する樹脂を用いる）、およびエピトープに基づく親和性クロマトグラフィー（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢのエピトープに対する抗体または機能的に等価なリガンドを用いる）のうちの３つまたはそれより多くを含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる。精製を、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了させることができる。
（実施例８）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃヘテロマーのリガンド結合プロファイル
【０４８２】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）に基づく結合アッセイを使用して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃヘテロ二量体のリガンド結合動態を、未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体のリガンド結合動態と比較した。融合タンパク質を、抗Ｆｃ抗体を使用するシステム上で捕捉した。次いで、リガンドを注入し、３７℃で捕捉された受容体タンパク質上に流動させた。結果を以下の表にまとめるが、有効なリガンドトラップを最も示すリガンド解離速度（ｋｄ）は、灰色の影付きで示す。
【表６】
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【０４８３】
本実施例では、２つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド鎖のうちの一方における単一のアミノ酸置換は、未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と比べてＦｃ融合タンパク質のリガンド結合選択性を変更させた。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と比較して、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ）−Ｆｃヘテロ二量体は、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、およびＢＭＰ６に対する高親和性結合を大きく保持していたが、アクチビンＡおよびＢＭＰ１０については約１０倍速い解離速度を示し、ＢＭＰ９への結合強度のさらにより大きな低下を示した。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃバリアントヘテロマーは、そのような選択的拮抗作用が有利である、ある特定の適用では未修飾ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体よりも有用であり得る。例としては、アクチビンＡ、ＢＭＰ９、またはＢＭＰ１０の拮抗作用を減少させながら、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、およびＢＭＰ６のうちの１つまたは複数の拮抗作用を保持することが望ましい治療適用が挙げられる。
参照による組込み
【０４８４】
本明細書に記載の全ての刊行物および特許は、あたかもそれぞれ個々の刊行物または特許が具体的かつ個別的に参照により組み込まれると示されたかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４８５】
主題の具体的な実施形態が考察されてきたが、上記明細書は、例示的であり、制限的ではない。多くの変形形態が、本明細書および以下の特許請求の範囲を見る際に当業者には明らかとなるであろう。本発明の完全な範囲は、特許請求の範囲を、その等価物の完全な範囲と共に、また、本明細書を、そのような変形形態と共に参照することにより決定されるべきである。
【０４８６】
【化１８０】
2019536440.tif 000189
【０４８７】
【化１８１】
2019536440.tif 000190
【０４８８】
【化１８２】
2019536440.tif 000191
【０４８９】
【化１８３】
2019536440.tif 000192
【０４９０】
【化１８４】
2019536440.tif 000193
【化１８５】
2019536440.tif 000194
【０４９１】
【化１８６】
2019536440.tif 000195
【０４９２】
【化１８７】
2019536440.tif 000196
【０４９３】
【化１８８】
2019536440.tif 000197
【０４９４】
【化１８９】
2019536440.tif 000198
【０４９５】
【化１９０】
2019536440.tif 000199
【０４９６】
【化１９１】
2019536440.tif 000200
【０４９７】
【化１９２】
2019536440.tif 000201
【０４９８】
【化１９３】
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【０４９９】
【化１９４】
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【０５００】
【化１９５】
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【０５０１】
【化１９６】
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【０５０２】
【化１９７】
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【０５０３】
【化１９８】
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【化１９９】
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【化２００】
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【０５０４】
【化２０１】
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【０５０５】
【化２０２】
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【０５０６】
【化２０３】
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【０５０７】
【化２０４】
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【０５０８】
【化２０５】
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【０５０９】
【化２０６】
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【０５１０】
【化２０７】
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【０５１１】
【化２０８】
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【０５１２】
【化２０９】
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【０５１３】
【化２１０】
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【０５１４】
【化２１１】
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【０５１５】
【化２１２】
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【０５１６】
【化２１３】
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【０５１７】
【化２１４】
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【０５１８】
【化２１５】
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【０５１９】
【化２１６】
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【０５２０】
【化２１７】
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【０５２１】
【化２１８】
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【０５２２】
【化２１９】
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【０５２３】
【化２２０】
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【化２２１】
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【化２２２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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