(57)【要約】本発明は、操作されたβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）酵素、ＢＧＬ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明はまた、酵素を含む組成物、および操作されたＢＧＬ酵素を使用してβ−グルコース結合を有する生成物を作製するための方法を提供する。本発明は、配列番号１２、１４、１６、１８、および／または２０と少なくとも８０％配列同一性を有する天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントを提供する。
2019517801.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１２、１４、１６、１８、および／または２０と少なくとも８０％配列同一性を有する天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアント。
【請求項２】
３１、３２、３４、３６、３７、３８、５７／９１、５８、５９、６０、６１、６２、６２／４０３、６６、７０、８９、８９／１８７、９１／５９５、１２４／２９７、１２５、１２６／１８８、１３３、１３８／２９６、１４７、１５０、１８４、１８６、１８７、２３０、２３１、２３３、２６６、２９６、２９７、４０３、４０５、４４９、４５０、４９２、５９０、および６０１から選択される１つまたはそれを超える位置に少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号１２を参照して付番されている、請求項１に記載の天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアント。
【請求項３】
３１Ｃ／Ｇ、Ｖ３２Ｇ／Ｐ／Ｓ、３４Ｉ／Ｐ、３６Ｐ、３７Ｋ／Ｗ、３８Ｅ、５７Ｒ／９１Ｐ、５８Ｐ、５９Ｒ、６０Ｃ／Ｒ／Ｖ、６１Ｒ、６２Ｎ、６２Ｐ／４０３Ｒ、６６Ｇ／Ｎ、７０Ｗ、８９Ｌ、８９Ｓ／１８７Ｒ、９１Ｇ／５９５Ｖ、１２４Ｄ／２９７Ｐ、１２５Ｇ、１２６Ｖ／１８８Ｒ、１３３Ｇ／Ｒ、１３８Ｇ／２９６Ｓ、１４７Ｌ、１５０Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｔ、１８４Ａ／Ｒ、１８６Ｅ、１８７Ｇ／Ｎ／Ｙ、２３０Ｆ／Ｈ／Ｉ、２３１Ｇ／Ｒ、２３３Ｌ／Ｐ／Ｑ、２６６Ｆ／Ｇ、２９６Ｒ／Ｔ、２９７Ｒ、４０３Ｅ／Ｐ、４０５Ｒ、４４９Ｇ／Ｐ、４５０Ｇ、４９２Ｐ、５９０Ｗ、６０１Ａ／Ｅ／Ｌ、６０１Ｅ、および６０１Ｌから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号１２を参照して付番されている、請求項１に記載の天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアント。
【請求項４】
Ｐ３１Ｃ／Ｇ、Ｖ３２Ｇ／Ｐ／Ｓ、Ｇ３４Ｉ／Ｐ、Ｉ３６Ｐ、Ｔ３７Ｋ／Ｗ、Ｔ３８Ｅ、Ｇ５７Ｒ／Ｉ９１Ｐ、Ｌ５８Ｐ、Ｆ５９Ｒ、Ｎ６０Ｃ／Ｒ／Ｖ、Ｌ６１Ｒ、Ｋ６２Ｎ、Ｋ６２Ｐ／Ｗ４０３Ｒ、Ｒ６６Ｇ／Ｎ、Ｖ７０Ｗ、Ｄ８９Ｌ、Ｄ８９Ｓ／Ｈ１８７Ｒ、Ｉ９１Ｇ／Ｇ５９５Ｖ、Ａ１２４Ｄ／Ｖ２９７Ｐ、Ｓ１２５Ｇ、Ａ１２６Ｖ／Ｆ１８８Ｒ、Ｆ１３３Ｇ／Ｒ、Ｄ１３８Ｇ／Ｍ２９６Ｓ、Ｒ１４７Ｌ、Ｅ１５０Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｔ、Ｃ１８４Ａ／Ｒ、Ｋ１８６Ｅ、Ｈ１８７Ｇ／Ｎ／Ｙ、Ｍ２３０Ｆ／Ｈ／Ｉ、Ａ２３１Ｇ／Ｒ、Ｆ２３３Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｙ２６６Ｆ／Ｇ、Ｍ２９６Ｒ／Ｔ、Ｖ２９７Ｒ、Ｗ４０３Ｅ／Ｐ、Ｖ４０５Ｒ、Ｍ４４９Ｇ／Ｐ、Ｆ４５０Ｇ、Ｓ４９２Ｐ、Ｒ５９０Ｗ、およびＦ６０１Ａ／Ｅ／Ｌから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号１２を参照して付番されている、請求項１に記載の天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアント。
【請求項５】
３２、３４、３６、５７／９１、５８、５９、６０、６２、６２／４０３、６６、８９、８９／１８７、９１／５９５、１２４／２９７、１２６／１８８、１３３、１３８／２９６、１４７、１５０、１８４、１８６、１８７、２３０、２３１、２３３、２６６、２９６、２９７、４０３、４０５、４４９、４９２、５９０、および６０１から選択される１つまたはそれを超える位置に少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号１２を参照して付番されている、請求項１に記載の天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアント。
【請求項６】
３２Ｇ／Ｐ／Ｓ、３４Ｉ／Ｐ、３６Ｐ、５７Ｒ／９１Ｐ、５８Ｐ、５９Ｒ、６０Ｃ／Ｒ／Ｖ、６２Ｎ、６２Ｐ／４０３Ｒ、６６Ｎ、８９Ｌ、８９Ｓ／１８７Ｒ、９１Ｇ／５９５Ｖ、１２４Ｄ／２９７Ｐ、１２６Ｖ／１８８Ｒ、１３３Ｇ／Ｒ、１３８Ｇ／，２９６Ｓ、１４７Ｌ、１５０Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｔ、１８４Ｒ、１８６Ｅ、１８７Ｇ、１８７Ｎ／Ｙ、２３０Ｆ／Ｈ／Ｉ、２３１Ｇ／Ｒ、２３３Ｐ／Ｑ、２６６Ｆ／Ｇ、２９６Ｒ／Ｔ、２９７Ｒ、４０３Ｅ／Ｐ、４０５Ｒ、Ｍ４４９Ｇ／Ｐ、４９２Ｐ、５９０Ｗ、および６０１Ａ／Ｅ／Ｌから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号１２を参照して付番されている、請求項１に記載の天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアント。
【請求項７】
Ｖ３２Ｇ／Ｐ／Ｓ、Ｇ３４Ｉ／Ｐ、Ｉ３６Ｐ、Ｇ５７Ｒ／Ｉ９１Ｐ、Ｌ５８Ｐ、Ｆ５９Ｒ、Ｎ６０Ｃ／Ｒ／Ｖ、Ｋ６２Ｎ、Ｋ６２Ｐ／Ｗ４０３Ｒ、Ｒ６６Ｎ、Ｄ８９Ｌ、Ｄ８９Ｓ／Ｈ１８７Ｒ、Ｉ９１Ｇ／Ｇ５９５Ｖ、Ａ１２４Ｄ／Ｖ２９７Ｐ、Ａ１２６Ｖ／Ｆ１８８Ｒ、Ｆ１３３Ｇ／Ｒ、Ｄ１３８Ｇ／Ｍ２９６Ｓ、Ｒ１４７Ｌ、Ｅ１５０Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｔ、Ｃ１８４Ｒ、Ｋ１８６Ｅ、Ｈ１８７Ｇ／Ｎ／Ｙ、Ｍ２３０Ｆ／Ｈ／Ｉ、Ａ２３１Ｇ／Ｒ、Ｆ２３３Ｐ／Ｑ、Ｙ２６６Ｆ／Ｇ、Ｍ２９６Ｒ／Ｙ、Ｖ２９７Ｒ、Ｗ４０３Ｅ／Ｐ、Ｖ４０５Ｒ、Ｍ４４９Ｇ／Ｐ、Ｓ４９２Ｐ、Ｒ５９０Ｗ、およびＦ６０１Ａ／Ｅ／Ｌから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号１２を参照して付番されている、請求項１に記載の天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアント。
【請求項８】
１５、１６、１６／８４、１７、１９、２１、３５、４５、５５、７６、７９、１２１、１６４、１６８、１６８／２５６、１７０、１７９、２１５／４１３、２２１、２２１／３１１、２２５、２４７、３１３、３５１、３５６、４０２、４０４、４０５、４０９、４１１、４１２、４１３、および４１４から選択される１つまたはそれを超える位置に少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号１４を参照して付番されている、請求項１に記載の天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアント。
【請求項９】
１５Ｓ、１６Ａ／Ｇ、１６Ｓ／８４Ｈ、１７Ｇ、１９Ｇ、２１Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｓ、３５Ａ／Ｇ、４５Ｌ、５５Ｐ、７６Ｇ／Ｌ、７６Ｌ、７９Ｔ、１２１Ｓ、１６４Ｙ、１６８Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｌ／Ｓ、１６８Ｑ／２５６Ｖ、１７０Ｈ、１７９Ｈ／Ｒ、２１５Ｓ／４１３Ｐ、２２１Ｃ／Ｇ／Ｔ、２２１Ｐ／３１１Ｖ、２２５Ｈ／Ｎ／Ｙ、Ｖ２４７Ｇ／Ｉ／Ｌ、３１３Ｖ、３５１Ａ／Ｌ、３５６、４０２Ｋ、４０４Ｐ／Ｓ、４０５Ｈ／Ｗ、４０９Ｔ、４１１Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｒ／Ｔ、４１２Ｌ、４１３Ａ／Ｈ／Ｐ、および４１４Ｄから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号１４を参照して付番されている、請求項１に記載の天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアント。
【請求項１０】
Ａ１５Ｓ、Ｔ１６Ａ／Ｇ、Ｔ１６Ｓ／Ｒ８４Ｈ、Ａ１７Ｇ、Ｙ１９Ｇ、Ｉ２１Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｓ、Ｗ３５Ａ／Ｇ、Ｉ４５Ｌ、Ｃ５５Ｐ、Ｙ７６Ｇ／Ｌ、Ｓ７９Ｔ、Ｈ１２１Ｓ、Ｌ１６４Ｙ、Ｗ１６８Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｌ／Ｓ、Ｗ１６８Ｑ／Ａ２５６Ｖ、Ｓ１７０Ｈ、Ｖ１７９Ｈ／Ｒ、Ｐ２１５Ｓ／Ｍ４１３Ｐ、Ｖ２２１Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｖ２２１Ｐ／Ａ３１１Ｖ、Ｔ２２５Ｈ／Ｎ／Ｙ、Ｖ２４７Ｇ／Ｉ／Ｌ、Ｒ３１３Ｖ、Ｔ３５１Ａ／Ｌ、Ａ３５６Ｇ、Ｌ４０２Ｋ、Ｎ４０４Ｐ／Ｓ、Ｆ４０５Ｈ／Ｗ、Ｍ４０９Ｔ、Ｌ４１１Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｒ／Ｔ、Ｓ４１２Ｌ、Ｍ４１３Ａ／Ｈ、Ｍ４１３Ｐ、およびＲ４１４Ｄから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号１４を参照して付番されている、請求項１に記載の天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアント。
【請求項１１】
配列番号２２〜配列番号２９４に提供された偶数番号の配列を含む、請求項１に記載の天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアント。
【請求項１２】
少なくとも１つの、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントをコードする組換えポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号２１〜配列番号２９３または配列番号３４３〜配列番号３５９に提供された奇数番号の配列を含む、請求項１２に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号２２〜配列番号２９４または配列番号３４４〜配列番号３６０に提供された偶数番号の配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１２に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１２〜１４に記載の少なくとも１つの組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１６】
少なくとも１つの調節配列をさらに含む、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
少なくとも１つの、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチドおよび／または請求項１５および／または１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
真核生物および原核生物から選択される、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
大腸菌である、請求項１７および／または１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
少なくとも１つの、請求項１〜１１に記載の天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントを生成するための方法であって、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の宿主細胞を、前記天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントが前記宿主細胞によって生成されるような条件下で培養する工程を含む、方法。
【請求項２１】
前記天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントを回収する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントを含む組成物。
【請求項２３】
グリコシル基アクセプター基質をβ−グルコシル化生成物に変換するための方法であって、少なくとも１つのグリコシル基アクセプター基質、少なくとも１つのグリコシル基ドナー補基質、および少なくとも１つの、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の偶数番号の配列番号２〜３６０を含むβ−グルコシダーゼ、および／または請求項２２に記載の組成物を提供する工程；前記グリコシル基アクセプター基質、前記グリコシル基ドナー補基質、および前記β−グルコシダーゼを、前記基質が前記β−グルコシダーゼによってグルコシル化されるような条件下で接触させてβ−グルコシル化生成物を得る工程を含む、方法。
【請求項２４】
前記グリコシル基ドナー補基質が、ジサッカリド、トリサッカリド、オリゴサッカリド、セロビオース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース、およびセルロースから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記グリコシル基アクセプター基質がグリコシル化される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記グリコシル基アクセプター基質が天然に存在するグリコシル化基質である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記天然に存在するグリコシル化グリコシル基アクセプター基質が、ステビオシド、レバウジオシドＡ、またはレバウジオシドＤから選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記グリコシル基アクセプター基質が天然に存在しないグリコシル化基質である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記グリコシル基アクセプター基質が非グリコシル化天然物質である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記グリコシル基アクセプター基質が天然に存在しない非グリコシル化物質である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
基質をトランスグリコシル化するための方法であって、少なくとも１つの基質、少なくとも１つの、配列番号２９６〜配列番号３４２の偶数番号の配列から選択されるグリコシドヒドロラーゼを提供する工程；前記基質を、前記基質がトランスグリコシル化されるような条件下で前記グリコシドヒドロラーゼと接触させて少なくとも１つのトランスグリコシル化生成物を得る工程を含む、方法。
【請求項３２】
前記基質が少なくとも１つのステビオシドを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記トランスグリコシル化生成物が、モノグリコシル化生成物および／またはジグリコシル化生成物を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記グリコシドヒドロラーゼが、配列番号２９５および／または配列番号２９９を含む、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１６年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３５０，６２５号（これは、全ての目的のためにその全体が参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、操作されたβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）酵素、ＢＧＬ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明はまた、酵素を含む組成物、および操作されたＢＧＬ酵素を使用してβ−グルコース結合を有する生成物を作製するための方法を提供する。
【０００３】
ＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出される「配列表」、表、またはコンピュータ・プログラム一覧付属物の参照
配列表の写しを、ファイル名「ＣＸ８−１５７ＵＳＰ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日２０１６年６月１５日、およびサイズ１，１１０，０１６バイトのＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂから明細書と同時に提出している。ＥＦＳ−Ｗｅｂから提出した配列表は、本明細書の一部を構成し、その全体が本明細書中で参照によって組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
グリコシドヒドロラーゼ（グリコシダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ）は、複合糖類のグリコシド結合の加水分解において機能する。グリコシドヒドロラーゼは、自然界で種々の役割を有する一般的な酵素である。グリコシドヒドロラーゼは、典型的には、その基質に基づいて命名されている。β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）（ＥＣ３．２．１．２１；β−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ）は、多数の生物学的に異なり、且つ重要な役割（真菌および細菌によるセルロース性バイオマスの分解、哺乳動物リソソームにおける糖脂質の分解、および植物におけるグルコシル化フラボノイドの切断が含まれる）を果たす。
【０００５】
グリコシダーゼは、配列類似性に基づいたファミリーに割り当てられている。現在、１３５ファミリーが存在し、ＣＡＺｙ（ＣＡｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ＥｎＺｙｍｅ）サイトに列挙されている。まれに例外はあるが、全ての単純なβ−グルコシダーゼは、ファミリー１またはファミリー３のいずれかに属する。ファミリー１は、細菌、植物、および哺乳動物の酵素（例えば、６−ホスホ−グルコシダーゼ）を含む。ほとんどのファミリー１酵素はまた、有意なガラクトシダーゼ活性を有する。ファミリー３は、真菌、細菌、および植物のβ−グルコシダーゼおよびヘキソサミニダーゼを含む。両ファミリーの酵素は、その基質を、アノマー配置を正味で保持しながら、２つの重要な活性部位のカルボン酸残基が関与する２工程の二重置換機構を介して加水分解する。第１の工程では、一方のカルボン酸（すなわち、求核剤）が基質のアノマー中心を攻撃する一方で、他方（すなわち、酸／塩基触媒）がグリコシドの酸素をプロトン化し、それにより、アグリコンの脱離が促進される。これにより、共有結合性α−グリコシル−酵素中間体が形成される。第２の工程では、この中間体は、グリコシル−酵素のアノマー中心での水の一般的な塩基触媒攻撃によって加水分解されてβ−グルコース生成物を放出し、酵素が再生される。この中間体の形成および加水分解の両方は、オキソカルベニウムイオンの特徴を実質的に有する遷移状態を介して進行する。
【０００６】
トランスグリコシル化は、生物学において別の重要な反応である。この反応では、糖残基が一方のグリコシドから他方へ転移する。トランスグリコシル化は、特にポリサッカリド合成中のグリコシド結合の形成機構である。ヌクレオシドリン酸誘導体は、典型的には、そのグリコシド結合のエネルギーが反応生成物中で部分的に保存される活性化ドナー化合物としての機能を果たす。トランスグリコシル化により、基質とドナーとの間でグリコシル残基を直接転移することによってヌクレオシドリン酸の糖が不要になる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、操作されたβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）酵素、ＢＧＬ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明はまた、酵素を含む組成物、および操作されたＢＧＬ酵素を使用してβ−グルコース結合を有する生成物を作製するための方法を提供する。
【０００８】
本発明は、配列番号１２、１４、１６、１８、および／または２０と少なくとも８０％配列同一性を有する天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントを提供する。いくつかの実施形態では、天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントは、３１、３２、３４、３６、３７、３８、５７／９１、５８、５９、６０、６１、６２、６２／４０３、６６、７０、８９、８９／１８７、９１／５９５、１２４／２９７、１２５、１２６／１８８、１３３、１３８／２９６、１４７、１５０、１８４、１８６、１８７、２３０、２３１、２３３、２６６、２９６、２９７、４０３、４０５、４４９、４５０、４９２、５９０、および６０１から選択される１つまたはそれを超える位置に少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号１２を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態では、天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントは、３１Ｃ／Ｇ、Ｖ３２Ｇ／Ｐ／Ｓ、３４Ｉ／Ｐ、３６Ｐ、３７Ｋ／Ｗ、３８Ｅ、５７Ｒ／９１Ｐ、５８Ｐ、５９Ｒ、６０Ｃ／Ｒ／Ｖ、６１Ｒ、６２Ｎ、６２Ｐ／４０３Ｒ、６６Ｇ／Ｎ、７０Ｗ、８９Ｌ、８９Ｓ／１８７Ｒ、９１Ｇ／５９５Ｖ、１２４Ｄ／２９７Ｐ、１２５Ｇ、１２６Ｖ／１８８Ｒ、１３３Ｇ／Ｒ、１３８Ｇ／２９６Ｓ、１４７Ｌ、１５０Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｔ、１８４Ａ／Ｒ、１８６Ｅ、１８７Ｇ／Ｎ／Ｙ、２３０Ｆ／Ｈ／Ｉ、２３１Ｇ／Ｒ、２３３Ｌ／Ｐ／Ｑ、２６６Ｆ／Ｇ、２９６Ｒ／Ｔ、２９７Ｒ、４０３Ｅ／Ｐ、４０５Ｒ、４４９Ｇ／Ｐ、４５０Ｇ、４９２Ｐ、５９０Ｗ、６０１Ａ／Ｅ／Ｌ、６０１Ｅ、および６０１Ｌから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号１２を参照して付番されている。いくつかの追加の実施形態では、天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントは、Ｐ３１Ｃ／Ｇ、Ｖ３２Ｇ／Ｐ／Ｓ、Ｇ３４Ｉ／Ｐ、Ｉ３６Ｐ、Ｔ３７Ｋ／Ｗ、Ｔ３８Ｅ、Ｇ５７Ｒ／Ｉ９１Ｐ、Ｌ５８Ｐ、Ｆ５９Ｒ、Ｎ６０Ｃ／Ｒ／Ｖ、Ｌ６１Ｒ、Ｋ６２Ｎ、Ｋ６２Ｐ／Ｗ４０３Ｒ、Ｒ６６Ｇ／Ｎ、Ｖ７０Ｗ、Ｄ８９Ｌ、Ｄ８９Ｓ／Ｈ１８７Ｒ、Ｉ９１Ｇ／Ｇ５９５Ｖ、Ａ１２４Ｄ／Ｖ２９７Ｐ、Ｓ１２５Ｇ、Ａ１２６Ｖ／Ｆ１８８Ｒ、Ｆ１３３Ｇ／Ｒ、Ｄ１３８Ｇ／Ｍ２９６Ｓ、Ｒ１４７Ｌ、Ｅ１５０Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｔ、Ｃ１８４Ａ／Ｒ、Ｋ１８６Ｅ、Ｈ１８７Ｇ／Ｎ／Ｙ、Ｍ２３０Ｆ／Ｈ／Ｉ、Ａ２３１Ｇ／Ｒ、Ｆ２３３Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｙ２６６Ｆ／Ｇ、Ｍ２９６Ｒ／Ｔ、Ｖ２９７Ｒ、Ｗ４０３Ｅ／Ｐ、Ｖ４０５Ｒ、Ｍ４４９Ｇ／Ｐ、Ｆ４５０Ｇ、Ｓ４９２Ｐ、Ｒ５９０Ｗ、およびＦ６０１Ａ／Ｅ／Ｌから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号１２を参照して付番されている。なおいくつかの追加の実施形態では、天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントは、３２、３４、３６、５７／９１、５８、５９、６０、６２、６２／４０３、６６、８９、８９／１８７、９１／５９５、１２４／２９７、１２６／１８８、１３３、１３８／２９６、１４７、１５０、１８４、１８６、１８７、２３０、２３１、２３３、２６６、２９６、２９７、４０３、４０５、４４９、４９２、５９０、および６０１から選択される１つまたはそれを超える位置に少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配��番号１２を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態では、天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントは、３２Ｇ／Ｐ／Ｓ、３４Ｉ／Ｐ、３６Ｐ、５７Ｒ／９１Ｐ、５８Ｐ、５９Ｒ、６０Ｃ／Ｒ／Ｖ、６２Ｎ、６２Ｐ／４０３Ｒ、６６Ｎ、８９Ｌ、８９Ｓ／１８７Ｒ、９１Ｇ／５９５Ｖ、１２４Ｄ／２９７Ｐ、１２６Ｖ／１８８Ｒ、１３３Ｇ／Ｒ、１３８Ｇ／，２９６Ｓ、１４７Ｌ、１５０Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｔ、１８４Ｒ、１８６Ｅ、１８７Ｇ、１８７Ｎ／Ｙ、２３０Ｆ／Ｈ／Ｉ、２３１Ｇ／Ｒ、２３３Ｐ／Ｑ、２６６Ｆ／Ｇ、２９６Ｒ／Ｔ、２９７Ｒ、４０３Ｅ／Ｐ、４０５Ｒ、Ｍ４４９Ｇ／Ｐ、４９２Ｐ、５９０Ｗ、および６０１Ａ／Ｅ／Ｌから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号１２を参照して付番されている。いくつかの追加の実施形態では、天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントは、Ｖ３２Ｇ／Ｐ／Ｓ、Ｇ３４Ｉ／Ｐ、Ｉ３６Ｐ、Ｇ５７Ｒ／Ｉ９１Ｐ、Ｌ５８Ｐ、Ｆ５９Ｒ、Ｎ６０Ｃ／Ｒ／Ｖ、Ｋ６２Ｎ、Ｋ６２Ｐ／Ｗ４０３Ｒ、Ｒ６６Ｎ、Ｄ８９Ｌ、Ｄ８９Ｓ／Ｈ１８７Ｒ、Ｉ９１Ｇ／Ｇ５９５Ｖ、Ａ１２４Ｄ／Ｖ２９７Ｐ、Ａ１２６Ｖ／Ｆ１８８Ｒ、Ｆ１３３Ｇ／Ｒ、Ｄ１３８Ｇ／Ｍ２９６Ｓ、Ｒ１４７Ｌ、Ｅ１５０Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｔ、Ｃ１８４Ｒ、Ｋ１８６Ｅ、Ｈ１８７Ｇ／Ｎ／Ｙ、Ｍ２３０Ｆ／Ｈ／Ｉ、Ａ２３１Ｇ／Ｒ、Ｆ２３３Ｐ／Ｑ、Ｙ２６６Ｆ／Ｇ、Ｍ２９６Ｒ／Ｙ、Ｖ２９７Ｒ、Ｗ４０３Ｅ／Ｐ、Ｖ４０５Ｒ、Ｍ４４９Ｇ／Ｐ、Ｓ４９２Ｐ、Ｒ５９０Ｗ、およびＦ６０１Ａ／Ｅ／Ｌから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号１２を参照して付番されている。
【０００９】
本開示は、１５、１６、１６／８４、１７、１９、２１、３５、４５、５５、７６、７９、１２１、１６４、１６８、１６８／２５６、１７０、１７９、２１５／４１３、２２１、２２１／３１１、２２５、２４７、３１３、３５１、３５６、４０２、４０４、４０５、４０９、４１１、４１２、４１３、および４１４から選択される１つまたはそれを超える位置に少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号１４を参照して付番されている、天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントも提供する。いくつかの追加の実施形態では、天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントは、１５Ｓ、１６Ａ／Ｇ、１６Ｓ／８４Ｈ、１７Ｇ、１９Ｇ、２１Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｓ、３５Ａ／Ｇ、４５Ｌ、５５Ｐ、７６Ｇ／Ｌ、７６Ｌ、７９Ｔ、１２１Ｓ、１６４Ｙ、１６８Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｌ／Ｓ、１６８Ｑ／２５６Ｖ、１７０Ｈ、１７９Ｈ／Ｒ、２１５Ｓ／４１３Ｐ、２２１Ｃ／Ｇ／Ｔ、２２１Ｐ／３１１Ｖ、２２５Ｈ／Ｎ／Ｙ、Ｖ２４７Ｇ／Ｉ／Ｌ、３１３Ｖ、３５１Ａ／Ｌ、３５６、４０２Ｋ、４０４Ｐ／Ｓ、４０５Ｈ／Ｗ、４０９Ｔ、４１１Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｒ／Ｔ、４１２Ｌ、４１３Ａ／Ｈ／Ｐ、および４１４Ｄから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号１４を参照して付番されている。いくつかのさらなる実施形態では、天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントは、Ａ１５Ｓ、Ｔ１６Ａ／Ｇ、Ｔ１６Ｓ／Ｒ８４Ｈ、Ａ１７Ｇ、Ｙ１９Ｇ、Ｉ２１Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｓ、Ｗ３５Ａ／Ｇ、Ｉ４５Ｌ、Ｃ５５Ｐ、Ｙ７６Ｇ／Ｌ、Ｓ７９Ｔ、Ｈ１２１Ｓ、Ｌ１６４Ｙ、Ｗ１６８Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｌ／Ｓ、Ｗ１６８Ｑ／Ａ２５６Ｖ、Ｓ１７０Ｈ、Ｖ１７９Ｈ／Ｒ、Ｐ２１５Ｓ／Ｍ４１３Ｐ、Ｖ２２１Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｖ２２１Ｐ／Ａ３１１Ｖ、Ｔ２２５Ｈ／Ｎ／Ｙ、Ｖ２４７Ｇ／Ｉ／Ｌ、Ｒ３１３Ｖ、Ｔ３５１Ａ／Ｌ、Ａ３５６Ｇ、Ｌ４０２Ｋ、Ｎ４０４Ｐ／Ｓ、Ｆ４０５Ｈ／Ｗ、Ｍ４０９Ｔ、Ｌ４１１Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｒ／Ｔ、Ｓ４１２Ｌ、Ｍ４１３Ａ／Ｈ、Ｍ４１３Ｐ、およびＲ４１４Ｄから選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置は、配列番号１４を参照して付番されている、請求項１に記載の。
【００１０】
本発明は、配列番号２２〜配列番号２９４または配列番号３４４〜配列番号３６０に提供された偶数番号の配列を含む、天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントも提供する。
【００１１】
本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つの天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントをコードする組換えポリヌクレオチドも提供する。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号２１〜配列番号２９３または配列番号３４３〜配列番号３５９に提供された奇数番号の配列を含む。いくつかの追加の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号２２〜配列番号２９４または配列番号３４４〜配列番号３６０に提供された偶数番号の配列を含むポリペプチドをコードする。
【００１２】
本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つの組換えポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの調節配列をさらに含む。いくつかの追加の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの本明細書に提供される組換えポリヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの本明細書に提供されるベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核生物および原核生物から選択される。いくつかのさらなる実施形態では、宿主細胞は、大腸菌である。
【００１３】
本発明は、少なくとも１つの本明細書に提供される天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントを生成するための方法であって、本明細書に提供される宿主細胞を、天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントが宿主細胞によって生成されるような条件下で培養する工程を含む、方法も提供する。いくつかの実施形態では、方法は、天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントを回収する工程をさらに含む。
【００１４】
本発明は、少なくとも１つの本明細書に提供される天然に存在しないβ−グルコシダーゼバリアントを含む組成物も提供する。
【００１５】
本発明は、グリコシル基アクセプター基質をβ−グルコシル化生成物に変換するための方法であって、少なくとも１つのグリコシル基アクセプター基質、少なくとも１つのグリコシル基ドナー補基質、および少なくとも１つの本明細書に提供される偶数番号の配列番号１〜３６０に含まれるβ−グルコシダーゼ、および／または少なくとも１つのβ−グルコシダーゼを含む本明細書に提供される組成物を提供する工程；グリコシル基アクセプター基質、グリコシル基ドナー補基質、およびβ−グルコシダーゼを、基質がβ−グルコシダーゼによってグルコシル化されるような条件下で接触させてβ−グルコシル化生成物を得る工程を含む、方法も提供する。いくつかの方法の実施形態では、グリコシル基ドナー補基質は、ジサッカリド、トリサッカリド、オリゴサッカリド、セロビオース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース、およびセルロースから選択される。いくつかの追加の方法の実施形態では、グリコシル基アクセプター基質はグリコシル化される。さらにいくつかのさらなる方法の実施形態では、グリコシル基アクセプター基質は天然に存在するグリコシル化基質である。いくつかのなお追加の方法の実施形態では、天然に存在するグリコシル化グリコシル基アクセプター基質は、ステビオシド、レバウジオシドＡ、またはレバウジオシドＤから選択される。さらにいくつかのさらなる方法の実施形態では、グリコシル基アクセプター基質は、天然に存在しないグリコシル化基質である。本方法のいくつかのさらなる実施形態では、天然に存在しないグリコシル化基質は、４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを含む。さらなるいくつかの実施形態では、グリコシル基アクセプター基質は非グリコシル化天然物質である。本方法のなおさらなるいくつかの実施形態では、非グリコシル化天然基質はレスベラトロールである。追加のいくつかの実施形態では、グリコシル基アクセプター基質は天然に存在しない非グリコシル化物質である。
【００１６】
本発明は、基質をトランスグリコシル化するための方法であって、少なくとも１つの基質、少なくとも１つの、配列番号２９６〜配列番号３４２の偶数番号の配列から選択されるグリコシドヒドロラーゼを提供する工程；基質を、基質がトランスグリコシル化されるような条件下でグリコシドヒドロラーゼと接触させて少なくとも１つのトランスグリコシル化生成物を得る工程を含む、方法も提供する。本方法のいくつかの実施形態では、基質は少なくとも１つのステビオシドを含む。本方法のなお追加のいくつかの実施形態では、トランスグリコシル化生成物は、モノグリコシル化生成物および／またはジグリコシル化生成物を含む。本方法のなおさらなるいくつかの実施形態では、グリコシドヒドロラーゼは、配列番号２９５および／または配列番号２９９を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、分子のヒドロキシル基が水の代わりに切断された糖のアクセプターとして作用することができる、いくつかのグリコシルトランスフェラーゼによって示されるトランスグリコシル化活性を示す略図を提供する。
【００１８】
【図２】図２は、炭素に番号を付けた、レバウジオシドＡの構造を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の説明
本発明は、操作されたβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）酵素、ＢＧＬ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明はまた、酵素を含む組成物、および操作されたＢＧＬ酵素を使用してβ−グルコース結合を有する生成物を作製するための方法を提供する。
【００２０】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、一般に、本発明に属する当業者が一般的に理解している意味と同じ意味を有する。一般に、本明細書中で使用した命名法ならびに下記の細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学、および核酸化学の実験手順は、当該分野で周知であり、且つ一般的に使用されている。かかる技術は周知であり、当業者に周知の多数のテキストおよび参考文献に記載されている。標準的な技術またはその修正形態を、化学合成および化学分析のために使用する。前出および下記の本明細書中で言及した全ての特許、特許出願、論文、および刊行物は、本明細書中で参考として明確に援用される。
【００２１】
本明細書中に記載の方法および材料に類似するか等価な任意の適切な方法および材料が本発明の実施で使用されるが、いくつかの方法および材料を本明細書中に記載する。記載の特定の方法論、プロトコール、および試薬は、当業者が使用する状況に応じて変動し得るので、本発明はこれらに限定されないと理解すべきである。したがって、直後に定義した用語は、本発明全体を参照することによってより完全に説明される。
【００２２】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は例示および説明のみを目的とし、本発明を制限しないと理解すべきである。本明細書中で使用した節の表題は、まとめのみを目的とし、記載の主題を制限すると解釈されない。数値範囲は、範囲を規定する数を含む。したがって、本明細書中に開示のあらゆる数値範囲は、より狭い数値範囲が全て本明細書中に明示されているかのように、より広い数値範囲に含まれるあらゆるかかるより狭い数値範囲を含むことが意図される。本明細書中に開示のあらゆる最大（または最小）の数値の限度が、より低い（またはより高い）数値の限度が本明細書中に明示されているかのように、あらゆるかかるより低い（またはより高い）数値の限度を含むことも意図される。
【００２３】
略語：
遺伝的にコードされたアミノ酸のために使用した略語は慣習的な略語であり、これらを以下に示す。
【表Ａ】
2019517801.tif 000003
【００２４】
三文字略語を使用する場合、「Ｌ」または「Ｄ」が明確に前置されないか、略語を使用した文脈から明確で無い限り、アミノ酸は、α−炭素（Ｃα）についてＬ型またはＤ型の立体配置のいずれかであり得る。例えば、「Ａｌａ」がα−炭素についての立体配置を特定しないでアラニンを示すのに対して、「Ｄ−Ａｌａ」および「Ｌ−Ａｌａ」は、Ｄ−アラニンおよびＬ−アラニンをそれぞれ示す。一文字略語を使用する場合、大文字はα−炭素についてＬ−立体配置のアミノ酸を示し、小文字はα−炭素についてＤ−立体配置のアミノ酸を示す。例えば、「Ａ」はＬ−アラニンを示し、「ａ」はＤ−アラニンを示す。ポリペプチド配列を一連の一文字略語または三文字略語（またはその混合）として示す場合、配列を、慣習にしたがってアミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）への方向で示す。
【００２５】
遺伝的にコードするヌクレオシドのために使用される略語は慣習的な略語であり、以下に示す：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）；およびウリジン（Ｕ）。特に記載しないかぎり、省略したヌクレオシドは、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのいずれかであり得る。ヌクレオシドを、個別または凝集体に基づいてリボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのいずれかであると特定することができる。核酸配列を一連の一文字略語として示す場合、配列を、慣習にしたがって５’から３’への方向で示し、リン酸塩は示さない。
【００２６】
定義：
本発明に関して、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、他で具体的に定義しないかぎり、当業者によって一般的に理解される意味を有するであろう。したがって、以下の用語は以下の意味を有することを意図する。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、文脈上明らかに他の意味を示さない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」という表記には１つを超えるポリペプチドが含まれる。
【００２８】
同様に、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」「ｉｎｃｌｕｄｅ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」は、相互に交換可能であり、本発明を制限することを意図しない。したがって、本明細書中で使用する場合、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」およびその同語源語を、包含の意味（すなわち、用語「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」およびその対応する同語源語と等価）で使用する。
【００２９】
種々の実施形態の説明で用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の例では、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ」という用語を使用して実施形態を代わりに説明することができるとさらに理解すべきである。
【００３０】
用語「約」は、特定の値の許容可能な誤差を意味する。いくつかの例では、「約」は、所与の値の範囲の０．０５％、０．５％、１．０％、または２．０％以内を意味する。いくつかの例では、「約」は、所与の値の１、２、３、または４標準偏差以内を意味する。
【００３１】
「ＥＣ」番号は、国際生化学・分子生物学連合の命名法委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法をいう。ＩＵＢＭＢ生化学分類は、酵素が触媒する化学反応に基づいた酵素についての数値による分類システムである。
【００３２】
「ＡＴＣＣ」は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）をいい、その生物所蔵物は遺伝子および株を含む。
【００３３】
「ＮＣＢＩ」は、米国国立生物学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および同センターが提供する配列データベースをいう。
【００３４】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」を、長さや翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、またはリン酸）と無関係にアミド結合によって共有結合した少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すために本明細書中で互換的に使用する。Ｄ型およびＬ型アミノ酸、およびＤ型およびＬ型アミノ酸の混合物、ならびにＤ型およびＬ型アミノ酸、およびＤ型およびＬ型アミノ酸の混合物を含むポリマー、が本定義の範囲内に含まれる。
【００３５】
「アミノ酸」は、本明細書中で、アミノ酸の一般的に知られている三文字表記またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨されている一文字表記によって言及される。クレオチドを、同様に、その一般的に許容されている一文字コードによって言及し得る。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、相互に共有結合した２つまたはそれを超えるヌクレオシドをいう。ポリヌクレオチドを、リボヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ）から完全に構成することができ、２’デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ）またはリボヌクレオシドおよび２’デオキシリボヌクレオチドの混合物から完全に構成することができる。典型的にはヌクレオシドが標準的なホスホジエステル結合を介して相互に連結する一方で、ポリヌクレオチドは、１つまたはそれを超える非標準的な連結を含み得る。ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であり得るか、一本鎖領域および二本鎖領域の両方を含み得る。さらに、ポリヌクレオチドは典型的には天然に存在するコードヌクレオベース（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、およびシトシン）から構成される一方で、ポリヌクレオチドは１つまたはそれを超える改変および／または合成ヌクレオベース（例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなど）を含み得る。いくつかの実施形態では、かかる改変または合成ヌクレオベースは、アミノ酸配列をコードするヌクレオベースである。
【００３７】
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の部分をいう。
【００３８】
用語「セルラーゼ」は、セルロース（β−１，４−グルカンまたはβ−Ｄ−グルコシド結合）をより短いオリゴサッカリドであるセロビオースおよび／またはグルコースに加水分解することができる酵素のカテゴリーをいう。セルラーゼには、１，４−β−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ（「エンドグルカナーゼ」または「ＥＧ」）；１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ（「エキソグルカナーゼ」、「セロビオヒドロラーゼ」、または「ＣＢＨ」）；およびβ−Ｄ−グルコシド−グルコヒドロラーゼ（「β−グルコシダーゼ」、「セロビアーゼ」、または「ＢＧ」）が含まれる。
【００３９】
本明細書中で使用する場合、用語「生物触媒作用」、「生物触媒作用の」、「生体内変化」、および「生合成」は、有機化合物に対して化学反応を引き起こすための酵素の使用をいう。
【００４０】
本明細書中で互換的に使用する用語「β−グルコシダーゼ」または「セロビアーゼ」は、糖二量体（セロビオースが含まれるが、これに限定されない）の加水分解を触媒し、それにより、対応する糖単量体を放出させるβ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼを意味する。１つの実施形態では、β−グルコシダーゼは、セロビオースのグルコースへの加水分解を触媒する分類Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１のβ−グルコシドグルコヒドロラーゼである。いくつかのβ−グルコシダーゼは、β−Ｄ−ガラクトシド、β−Ｌ−アラビノシド、および／またはβ−Ｄ−フコシドも加水分解する能力を有し、さらに、いくつかのβ−グルコシダーゼは、デンプンなどのα−１，４−基質に作用し得る。β−グルコシダーゼ活性を、当該分野で周知の方法（本明細書中に記載のアッセイが含まれる）によって測定することができる。β−グルコシダーゼには、ＧＨ１、ＧＨ３、ＧＨ９、およびＧＨ３０というＧＨファミリーに分類される酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
用語「β−グルコシダーゼポリペプチド」は、本明細書中で、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをいう。
【００４２】
本明細書中で「グリコヒドロラーゼ」（ＥＣ３．２．１．）とも呼ばれる「グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）は、２つまたはそれを超える炭水化物の間または炭水化物部分と非炭水化物部分との間のグリコシド結合を加水分解する。炭水化物活性酵素データベース（ＣＡＺｙ）は、グリコシドヒドロラーゼファミリーのリストを提供しており、このリストは更新し続けている。
【００４３】
「グリコシルトランスフェラーゼ」は、グリコシル残基を活性化したヌクレオチド糖から単量体および重合体のアクセプター分子に転移させる酵素の能力を有するポリペプチドをいう。
【００４４】
本明細書中で使用する場合、「トランスグリコシル化」は、グリコシル残基を、ジサッカリドドナー、トリサッカリドドナー、またはオリゴサッカリドドナーから非グリコシル化アクセプター分子またはグリコシル化アクセプター分子へ転移する反応をいう。
【００４５】
本明細書中で使用する場合、「トランスグルコシル化」は、転移されるグリコシル残基がグルコースであり、ジサッカリドドナー、トリサッカリドドナー、またはオリゴサッカリドドナーがグルコースを含むトランスグリコシル化反応をいう。
【００４６】
本明細書中で使用する場合、「トランスガラクトシル化」は、転移されるグリコシル残基がガラクトースであり、ジサッカリドドナー、トリサッカリドドナー、またはオリゴサッカリドドナーがガラクトースを含むトランスグリコシル化反応をいう。
【００４７】
「ホスホリラーゼ」は、無機ホスフェートを使用してグリコシド結合を切断し、それにより、ホスホグリコシドおよび単量体または重合体の生成物を放出する酵素の能力を有するポリペプチドをいう。逆方向では、ホスホリラーゼは、グリコシル残基をホスホグリコシド（例えば、グルコース−１−リン酸）から単量体および重合体のアクセプターに転移させることによってグリコシルトランスフェラーゼとして作用し得る。
【００４８】
本明細書中で使用する場合、「グリコシル化」は、グリコシル残基とアクセプター分子との間のグリコシド結合の形成をいう。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、「グルコシル化」は、グルコース残基とアクセプター分子との間のグリコシド結合の形成をいう。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、「グリコシル」は、モノサッカリド、低級オリゴサッカリド、またはオリゴサッカリド誘導体の環状形態からヘミアセタールのヒドロキシル基を除去することによって得られる一価のフリーラジカルまたは置換基構造である有機基をいう。グリコシル基は、無機酸（例えば、リン酸）と反応してエステル（例えば、グルコース１−リン酸）を形成する。
【００５１】
本明細書中で使用する場合、「グリコシド」は、グリコシド結合によって炭水化物（例えば、糖）が別の官能基に結合した分子をいう。グリコシドを加水分解して糖および非糖（すなわち、アグリコン）成分を生成することができる。
【００５２】
本明細書中で使用する場合、用語「ステビオールグリコシド」は、ステビオールのグリコシド（天然に存在するステビオールグリコシド（例えば、ステビオシド、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＢ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＭ（レバウジオシドＸともいう）、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ）、および合成ステビオールグリコシド（例えば、酵素的にグルコシル化されたステビオールグリコシド）、ならびにその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない）をいう。ステビオールおよびそのグリコシドの化学構造を以下に示す（ＷＯ２０１３／１７６７３８号を参照のこと）。
【表Ｂ−１】
2019517801.tif 000004
【表Ｂ−２】
2019517801.tif 000005
【００５３】
本明細書中で使用する場合、「野生型」および「天然に存在する」は、天然に見出される形態をいう。例えば、野生型のポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然供給源から単離することができ、且つ人為的に意図的に改変されていない生物中に存在する配列である。
【００５４】
本明細書中で使用する場合、「組換え」、「操作された」および「天然に存在しない」は、細胞、核酸、またはポリペプチドに関して使用する場合、材料、すなわち、他の点では天然に存在しないと考えられる様式で改変された材料の天然または未変性の形態に対応する材料をいう。いくつかの実施形態では、細胞、核酸、またはポリペプチドは、天然に存在する細胞、核酸、またはポリペプチドと同一であるが、合成材料および／または組換え技術を使用した操作によって産生または誘導されている。非限定的な例には、とりわけ、細胞の未変性（非組換え）形態内に見出されない遺伝子を発現するか、他の方法で異なるレベルで発現される未変性遺伝子を発現する組換え細胞が含まれる。
【００５５】
用語「配列同一率（％）」を、ポリヌクレオチド間またはポリペプチド間の比較をいうために本明細書中で使用し、比較ウィンドウにわたる２つの最適にアラインメントした配列の比較によって決定し、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列部分またはポリペプチド配列部分は、２配列の最適なアラインメントのために参照配列と比較した場合に付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一率を得ることによって百分率を計算することができる。あるいは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に生じるか、核酸塩基またはアミノ酸残基をギャップを用いてアラインメントした位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一率を得ることによって百分率を計算することができる。当業者は、２つの配列をアラインメントするために利用可能な確立されたアルゴリズムが多数存在すると認識する。比較のための配列の最適アラインメントを、これらに限定されないがＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，  ２：４８２［１９８１］）の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：４４３［１９７０］）の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４［１９８８］）の類似性検索法、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実行（例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査を含む任意の適切な方法によって、当該技術分野において知られているように行うことができる。配列同一率および配列類似率の決定に適切なアルゴリズムの例は、これらに限定されないがＡｌｔｓｃｈｕｌらによって記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム（それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５：  ４０３−４１０［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３３８９−３４０２［１９７７］を参照のこと）を含む。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターウェブサイトから公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードとアラインメントした場合にいくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するか満たすクエリー配列中の長さＷのショートワードの同定による高スコア配列対（ｈｉｇｈ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐａｉｒ）（ＨＳＰ）の第１の同定を含む。Ｔを、隣接ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）という（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出を参照のこと）。これらの最初の隣接ワードヒットは、これらのワードヒットを含むより長いＨＳＰを見出すための検索開始のためのシードとして働く。次いで、ワードヒットを、累積アラインメントスコアを増加させることができるかぎり、各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアを、ヌクレオチド配列についてはパラメーターＭ（一致する残基対のための報酬スコア；常に０超）およびＮ（ミスマッチ残基のためのペナルティスコア；常に０未満）を使用して計算する。アミノ酸配列について、スコア行列を使用して、累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；１つまたはそれを超える負スコアの残基アラインメントの蓄積によって累積スコアが０またはそれ未満に進行した場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワードレングス（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワードレングス（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５［１９８９］を参照のこと）を使用する。例示的な配列アラインメントおよび配列同一率の決定には、提供されたデフォルトパラメーターを使用したＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）中のＢＥＳＴＦＩＴプログラムまたはＧＡＰプログラムを使用することができる。
【００５６】
「参照配列」は、配列および／または活性比較の基本として使用される定義された配列をいう。参照配列は、より大きな配列のサブセット（例えば、全長の遺伝子配列またはポリペプチド配列のセグメント）であり得る。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長またはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、少なくとも１００残基長または核酸もしくはポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、それぞれ、（１）２配列間で類似する配列（すなわち、完全配列の一部）を含むことができ、（２）２配列間で異なる配列をさらに含むことができるので、２つ（またはそれを超える）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較を、典型的には、配列が類似する局所領域を同定および比較するための「比較ウィンドウ」にわたる２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列の比較によって行う。いくつかの実施形態では、「参照配列」は一次アミノ酸配列に基づくことができ、ここで、参照配列は一次配列中に１つまたはそれを超える変化を有し得る配列である。
【００５７】
本明細書中で使用する場合、「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個の連続するヌクレオチドの位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントをいい、ここで、ある配列を少なくとも２０個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウィンドウ中の配列の一部が２配列の最適なアラインメントのために参照配列（付加や欠失を含まない）と比較した場合に２０％またはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較ウィンドウは、２０個の連続残基よりも長いことが可能であり、任意選択的に、３０、４０、５０、１００、またはそれより長いウィンドウが含まれる。
【００５８】
本明細書中で使用する場合、「〜に相当する」、「〜に関する」、または「〜に関連する」は、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の付番の文脈で使用する場合、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較した場合に指定した参照配列の残基の付番をいう。換言すれば、所与のポリマーの残基番号または残基の位置を、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の番号の位置によるよりもむしろ参照配列に関して命名する。例えば、所与のアミノ酸配列（操作されたグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列など）を、２配列間の残基マッチを最適にするためのギャップの導入によって参照配列とアラインメントすることができる。これらの場合、ギャップが存在するにもかかわらず、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列中の残基を、アラインメントした参照配列に関して付番する。
【００５９】
本明細書中で使用する場合、「実質的な同一性」は、少なくとも２０残基の位置の比較ウィンドウにわたって、頻繁には、少なくとも３０〜５０残基のウィンドウにわたって参照配列と比較した場合に、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％同一性、および少なくとも８９〜９５％配列同一性、またはより通常には少なくとも９９％配列同一性を有するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列をいい、ここで、配列同一率を、比較ウィンドウにわたって合計で２０％またはそれ未満の参照配列が付加または欠失した配列との参照配列の比較によって計算する。ポリペプチドに適用したいくつかの特定の実施形態では、用語「実質的な同一性」は、２つのポリペプチド配列が、デフォルトギャップウェイトを使用したプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインメントした場合、少なくとも８０％配列同一性、好ましくは少なくとも８９％配列同一性、少なくとも９５％配列同一性、またはそれを超える配列同一性（例えば、９９％配列同一性）を共有することを意味する。いくつかの実施形態では、比較されている配列において同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【００６０】
本明細書中で使用する場合、「アミノ酸の相違」および「残基の相違」は、参照配列中の対応する位置のアミノ酸残基と比較したポリペプチド配列の位置のアミノ酸残基の相違をいう。アミノ酸の相違の位置を、一般に、本明細書中で「Ｘｎ」といい、ここで、ｎは残基の相違に基づいた参照配列中の対応する位置をいう。例えば、「配列番号４と比較した場合のＸ９３位の残基の相違」は、配列番号４の９３位に対応するポリペプチドの位置でのアミノ酸残基の相違をいう。したがって、配列番号４の参照ポリペプチドが９３位にセリンを有する場合、「配列番号４と比較した場合のＸ９３位の残基の相違」は、配列番号４の９３位に対応するポリペプチドの位置でのセリン以外の任意の残基のアミノ酸置換をいう。本明細書中のほとんどの例では、ある位置での特異的なアミノ酸残基の相違を「ＸｎＹ」として示し、ここで、「Ｘｎ」は上記の対応する位置を指定し、「Ｙ」は操作されたポリペプチド中に見出されるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチド中の残基と異なる残基）の一文字識別子である。いくつかの場合（例えば、表２．１、３．１および５．１において）、本発明はまた、従来の表示法「ＡｎＢ」で示す特異的なアミノ酸の相違を提供し、ここで、Ａは参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は参照配列中の残基の位置の番号であり、Ｂは操作されたポリペプチド配列中の残基置換の一文字識別子である。いくつかの例では、本発明のポリペプチドは、参照配列と比較した１つまたはそれを超えるアミノ酸残基の相違を含むことができ、この相違は、参照配列と比較した場合に残基の相違が存在する特定の位置のリストによって示される。いくつかの実施形態では、１つを超えるアミノ酸をポリペプチドの特定の残基の位置で使用することができる場合、使用することができる種々のアミノ酸残基を、「／」によって分ける（例えば、Ｘ３０７Ｈ／Ｘ３０７ＰまたはＸ３０７Ｈ／Ｐ）。所与のバリアント内に複数の置換を示すためにスラッシュを使用することもできる（すなわち、（例えば、コンビナトリアルバリアントにおける）所与の配列内に１つを超える置換が存在する）。いくつかの実施形態では、本発明は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換を含む１つまたはそれを超えるアミノ酸の相違を含む操作されたポリペプチド配列を含む。いくつかのさらなる実施形態では、本発明は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換の両方を含む操作されたポリペプチド配列を提供する。
【００６１】
本明細書中で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」は、ある残基の類似の側鎖を有する異なる残基との置換をいい、したがって、典型的には、ポリペプチド中のアミノ酸の同一または類似と定義されたアミノ酸クラス内のアミノ酸との置換を含む。いくつかの実施形態では、制限されない例として、それぞれ、脂肪族側鎖を有するあるアミノ酸を、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）と置換し；ヒドロキシル側鎖を有するあるアミノ酸を、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）と置換し；芳香族側鎖を有するあるアミノ酸を、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン）と置換し；塩基性側鎖を有するあるアミノ酸を、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リジンおよびアルギニン）と置換し；酸性側鎖を有するあるアミノ酸を、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）と置換し；かつ／またはある疎水性または親水性のアミノ酸を、別の疎水性または親水性のアミノ酸と置換する。
【００６２】
本明細書中で使用する場合、「非保存的置換」は、ポリペプチド中のアミノ酸の有意に特性が異なる側鎖を有するアミノ酸との置換をいう。非保存的置換は、定義した群内よりもむしろ群間のアミノ酸を使用することができ、（ａ）置換領域中のペプチド骨格の構造（例えば、グリシンのプロリンへの置換）、（ｂ）電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さに影響を及ぼす。制限されない例として、例示的な非保存的置換は、塩基性アミノ酸または脂肪族アミノ酸に置換された酸性アミノ酸；小アミノ酸に置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸に置換された親水性アミノ酸であり得る。
【００６３】
本明細書中で使用する場合、「欠失」は、参照ポリペプチドからの１つまたはそれを超えるアミノ酸の除去によるポリペプチドの改変をいう。欠失は、操作されたグリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を保持し、そして／またはその改良された特性を保持しながら、参照酵素を構成する１またはそれを超えるアミノ酸、２またはそれを超えるアミノ酸、５またはそれを超えるアミノ酸、１０またはそれを超えるアミノ酸、１５またはそれを超えるアミノ酸、または２０またはそれを超えるアミノ酸、全アミノ酸数の１０％まで、または全アミノ酸数の２０％までを除去することができる。欠失は、ポリペプチドの内部および／または末端部が対象であり得る。種々の実施形態では、欠失は、連続的なセグメントを含むことができるか、不連続であり得る。
【００６４】
本明細書中で使用する場合、「挿入」は、参照ポリペプチドに対する１つまたはそれを超えるアミノ酸の付加によるポリペプチドの改変をいう。ポリペプチドの内部またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端に挿入することができる。本明細書中で使用される挿入には、当該分野で公知の融合タンパク質が含まれる。挿入は、アミノ酸の連続セグメントであり得るか、天然に存在するポリペプチド中で１つまたはそれを超えるアミノ酸によって分離され得る。
【００６５】
「機能的フラグメント」および「生物学的に活性なフラグメント」を、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失および／または内部欠失を有するが、残存するアミノ酸配列が、このアミノ酸配列と比較される配列（例えば、本発明の操作された全長グリコシルトランスフェラーゼ）内の対応する位置と同一であり、かつ全長ポリペプチドの活性の実質的に全てを保持するポリペプチドをいうために本明細書中で互換的に使用する。
【００６６】
本明細書中で使用する場合、「単離されたポリペプチド」は、ポリペプチドに天然に付随している他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されたポリペプチドをいう。この用語は、その天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞内で、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成を介して）から除去または精製されているポリペプチドを含む。組換えグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、細胞内に存在することができるか、細胞培地中に存在することができるか、種々の形態（溶解物または単離された調製物など）で調製することができる。そのようなものとして、いくつかの実施形態では、組換えグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
【００６７】
本明細書中で使用する場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が主に存在する種である（すなわち、モルベースまたは重量ベースで、組成物中の任意の他の個別の高分子種よりも豊富に存在する）組成物をいい、一般に、モルまたは重量％で存在する高分子種の少なくとも約５０％を対象種が占める場合、実質的に精製された組成物である。しかし、いくつかの実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼを含む組成物は、５０％未満純粋（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％）であるグリコシルトランスフェラーゼを含む。一般に、実質的に純粋なグリコシルトランスフェラーゼ組成物は、モルまたは重量％で組成物に存在する全高分子種の約６０％またはそれを超えて、約７０％またはそれを超えて、約８０％またはそれを超えて、約９０％またはそれを超えて、約９５％またはそれを超えて、および約９８％またはそれを超えて含まれる。いくつかの実施形態では、対象種を、本質的に均一（すなわち、従来の検出方法によって組成物中の夾雑種を検出できない）まで精製し、ここで、組成物は、本質的に単一の高分子種からなる。溶媒種、小分子（５００ダルトン未満）、および元素イオン種は、高分子種と見なさない。いくつかの実施形態では、単離された組換えグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【００６８】
本明細書中で使用する場合、「改良された酵素の特性」は、少なくとも１つの改良された酵素の特性をいう。いくつかの実施形態では、本発明は、基準グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドおよび／または野生型グリコシルトランスフェラーゼポリペプチド、および／または別の操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドと比較して任意の酵素の特性の改良を示す操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。したがって、「改良」レベルを決定し、種々のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド（野生型および操作されたグリコシルトランスフェラーゼを含む）の間で比較することができる。改良された特性には、タンパク質発現の増加、熱活性の増加、熱安定性の増加、ｐＨ活性の増加、安定性の増加、酵素活性の増加、基質特異性または基質親和性の増加、比活性の増加、基質または最終産物阻害に対する耐性の増加、化学安定性の増加、化学選択性の改良、溶媒安定性の改良、酸性ｐＨに対する耐性の増加、タンパク質分解活性に対する耐性の増加（すなわち、タンパク質分解に対する感受性の低下）、凝集の低下、溶解度の増加、および温度プロフィールの変化などの特性が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書中で使用する場合、「酵素活性の増加」および「酵素活性の増強」は、操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの特性の改良をいい、この酵素活性の増加を、参照グリコシルトランスフェラーゼ酵素と比較した場合の比活性（例えば、生成された生成物／時間／タンパク質重量）の増加または基質の生成物への変換率（例えば、特定の量のグリコシルトランスフェラーゼを使用した特定の時間における出発量の基質の生成物への変換率）の増加によって示すことができる。例示的な酵素活性の決定方法を、実施例に示す。酵素活性に関する任意の特性（その変化によって酵素活性が増加し得るＫｍ、Ｖｍａｘ、またはｋｃａｔの古典的な酵素の特性が含まれる）が影響を受け得る。酵素活性の改良は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．１倍から、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドが由来する天然に存在するグリコシルトランスフェラーゼまたは別の操作されたグリコシルトランスフェラーゼよりも酵素活性が２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、またはそれを超えるまでであり得る。
【００７０】
本明細書中で使用する場合、「変換」は、基質の対応する生成物への酵素変化（または生体内変化）をいう。「変換率」は、特定の条件下での時間内の生成物に変換した基質の百分率をいう。したがって、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」を、特定の期間における基質の生成物への「変換率」として示すことができる。
【００７１】
「ゼネラリスト特性」を有する酵素（または「ゼネラリスト酵素」）は、親配列と比較して広範囲の基質に対して改良された活性を示す酵素をいう。ゼネラリスト酵素は、必ずしもあらゆる可能性のある基質に対して改良された活性を示すわけではない。いくつかの実施形態では、本発明は、ゼネラリスト特性を有するグリコシルトランスフェラーゼバリアントであって、このバリアントが広範囲の立体的および電子的に多様な基質について親遺伝子と比較して類似するか改良された活性を示すという点で、ゼネラリスト特性を有するグリコシルトランスフェラーゼバリアントを提供する。さらに、本明細書中に提供するゼネラリスト酵素を、広範囲の多様な分子にわたって代謝産物／生成物の生成が増加するように改良されるように操作した。
【００７２】
用語「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」は、本明細書中で、核酸ハイブリッドが安定な条件をいう。当業者に公知のように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融点（Ｔｍ）に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含量、およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのＴｍ値を、公知の融点の予測方法を使用して計算することができる（例えば、Ｂａｌｄｉｎｏら、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １６８：７６１−７７７［１９８９］；Ｂｏｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ４８：１３９０［１９６２］；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：８８９３−８８９７［１９８６］；Ｆｒｅｉｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７［１９８６］；Ｋｉｅｒｚｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５：７８４０−７８４６［１９８６］；Ｒｙｃｈｌｉｋら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８：６４０９−６４１２［１９９０］（ｅｒｒａｔｕｍ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９：６９８［１９９１］）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）；Ｓｕｇｇｓら、１９８１，  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、Ｂｒｏｗｎら（編）ｐｐ．  ６８３−６９３，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ［１９８１］；およびＷｅｔｍｕｒ，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２６：２２７−２５９［１９９１］を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に開示のポリペプチドをコードし、定義した条件下で（中程度にストリンジェントな条件または高ストリンジェントな条件など）、本発明の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする配列の相補物とハイブリッド形成する。
【００７３】
本明細書中で使用する場合、「ハイブリッド形成ストリンジェンシー」は、核酸のハイブリッド形成における洗浄条件などのハイブリッド形成条件をいう。一般に、ハイブリッド形成反応を、低い方のストリンジェンシーの条件下で実施後、多様であるが高い方のストリンジェンシーで洗浄する。用語「中程度のストリンジェントなハイブリッド形成」は、標的−ＤＮＡが標的ＤＮＡに対して約６０％同一、好ましくは約７５％同一、約８５％同一、標的−ポリヌクレオチドに対して約９０％を超える同一性で相補核酸に結合可能な条件をいう。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、４２℃での５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳでのハイブリッド形成後、４２℃での０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳでの洗浄に等価な条件である。「高ストリンジェンシーハイブリッド形成」は、一般に、定義されたポリヌクレオチド配列についての溶液条件下で決定した熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれ未満低い温度の条件をいう。いくつかの実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、６５℃で０．０１８Ｍ  ＮａＣｌにて安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみがハイブリッド形成することが可能な条件をいう（すなわち、ハイブリッドが６５℃の０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中で安定ではない場合、本明細書中で意図するように、高ストリンジェンシー条件下で安定でないであろう）。高ストリンジェンシー条件を、例えば、４２℃の５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ後、６５℃で０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳでの洗浄に等価な条件でのハイブリッド形成によって提供することができる。別の高ストリンジェンシー条件は、６５℃の０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む５×ＳＳＣでのハイブリッド形成および６５℃の０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣの洗浄に等価な条件でのハイブリッド形成である。他の高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件および中程度にストリンジェントな条件は、上記で引用した文献に記載されている。
【００７４】
本明細書中で使用する場合、「コドン最適化」は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、コードされたタンパク質が目的の生物中で効率的に発現されるように特定の生物中で優先的に使用されるコドンへの変化をいう。ほとんどのアミノ酸がいくつかのコドンによって示されるという点で遺伝暗号が縮重している（「同義語」または「同義」コドンと呼ばれる）にもかかわらず、特定の生物によるコドン使用頻度が非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏っていることが周知である。このコドン使用頻度の偏りは、所与の遺伝子、共通の機能または起源となる祖先の遺伝子、低コピー数タンパク質に対する高発現タンパク質、および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域に関して高い可能性がある。いくつかの実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを、発現のために選択された宿主生物における最適な産生のためにコドン最適化することができる。
【００７５】
本明細書中で使用する場合、「好ましい」コドン、「最適な」コドン、および「高コドン使用頻度バイアス」コドンは、単独または組み合わせて使用される場合、同一アミノ酸をコードする他のコドンよりもタンパク質コード領域中でより高い頻度で使用されるコドンを互換的にいう。好ましいコドンを、単一の遺伝子、共通の機能または起源の遺伝子組、高発現遺伝子におけるコドン使用頻度、全生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、関連する生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはその組み合わせに関して決定することができる。遺伝子発現レベルに伴って頻度が増加するコドンは、典型的には、発現に最適なコドンである。特定の生物におけるコドン頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的な同義語コドン使用頻度）およびコドン優先度（例えば、クラスター分析またはコレスポンデンス分析を使用した多変量解析が含まれる）ならびに遺伝子中で使用された有効コドン数を決定するための種々の方法が公知である（例えば、ＧＣＧ  ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ；ＣｏｄｏｎＷ，Ｐｅｄｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ  １４：３７２−７３［１９９８］；Ｓｔｅｎｉｃｏら，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２２４３７−４６［１９９４］；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇｅｎｅ  ８７：２３−２９［１９９０］を参照のこと）。コドン使用頻度表は、多くの異なる生物に利用可能である（例えば、Ｗａｄａら，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８［１９９２］；Ｎａｋａｍｕｒａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２  ［２０００］；Ｄｕｒｅｔら，ｓｕｐｒａ；Ｈｅｎａｕｔ  ａｎｄ  Ｄａｎｃｈｉｎ，“Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，”Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら，（Ｅｄｓ．），ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ｐ．２０４７−２０６６［１９９６］を参照のこと）。コドン使用頻度を得るためのデータソースは、タンパク質をコードすることができる任意の利用可能なヌクレオチド配列に依存し得る。これらのデータ・セットは、発現したタンパク質をコードすることが実際に公知の核酸配列（例えば、完全タンパク質コード配列−ＣＤＳ）、発現配列タグ（ＥＳＴＳ）、またはゲノム配列の推定コード領域）を含む（例えば、Ｍｏｕｎｔ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，［２００１］；Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２５９−２８１［１９９６］；およびＴｉｗａｒｉら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：２６３−２７０［１９９７］を参照のこと）。
【００７６】
本明細書中で使用する場合、「調節配列」は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要であるか有利な全ての成分を含む。各調節配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して未変性または外来であり得る。かかる調節配列には、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターが含まれるが、これらに限定されない。最小限でも、調節配列は、プロモーター、転写停止シグナル、および翻訳停止シグナルを含む。調節配列に、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域内の調節配列のライゲーションを容易にする特異的な制限部位を導入するためのリンカーを提供することができる。
【００７７】
「作動可能に連結された」は、本明細書中で、調節配列が目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指示または制御するように目的のポリヌクレオチドに関連する位置に調節配列が適切に（すなわち、機能的関係において）配置された構成と定義する。
【００７８】
「プロモーター配列」は、目的のポリヌクレオチド（コード配列など）の発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列をいう。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、最適な宿主細胞中で転写活性を示す任意の核酸配列であってよく（変異プロモーター、短縮プロモーター、およびハイブリッドプロモーターが含まれる）、宿主細胞と同種または異種のいずれかの細胞外または細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【００７９】
「適切な反応条件」という語句は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドが基質を所望の生成物化合物に変換することができる酵素変換反応溶液中の条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒の範囲など）をいう。いくつかの例示的な「適切な反応条件」が、本明細書中に提供される。
【００８０】
本明細書中で使用する場合、「化合物負荷」、または「酵素負荷」などにおける「負荷」は、反応開始時の反応混合物中の成分の濃度または量をいう。
【００８１】
本明細書中で使用する場合、酵素変換反応プロセスの文脈における「基質」は、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドが作用する化合物または分子をいう。  
【００８２】
本明細書中で使用する場合、用語「バイオマス」、「バイオマス基質」「セルロース性バイオマス」、「セルロース性供給材料」、および「セルロース性基質」は、セルロースを含む任意の材料をいう。バイオマスは、植物、動物、または微生物に由来することができ、農業、産業、および森林由来の残渣物、産業廃棄物および都市廃棄物、ならびにエネルギーの目的のために栽培される陸生作物および水性作物が含まれ得るが、これらに限定されない。セルロース性基質の例には、木材、木材パルプ、製紙用パルプ、トウモロコシ繊維、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、作物残渣物（トウモロコシの穀皮、トウモロコシ茎葉、イネ科植物、コムギ、コムギ藁、オオムギ、オオムギ藁、干し草、イネ、稲藁、スイッチグラス、古紙、紙およびパルプの加工廃棄物、木本（ｗｏｏｄｙ  ｐｌａｎｔ）または草本（ｈｅｒｂａｃｅｏｕｓ  ｐｌａｎｔ）、果実または野菜のパルプ、トウモロコシ穂軸、蒸留酒用穀粒、イネ科植物、外皮、ワタ、アサ、アマ、サイザル、サトウキビバガス、ソルガム、ダイズ、スイッチグラスなど）、穀粒、樹木、枝、根、葉、木材チップ、おが屑、灌木および低木、野菜、果物、および花のミリングから得られる成分、ならびにこれらの任意の混合物が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、セルロース性バイオマスは、栽培作物（例えば、Ｃ４イネ科植物（スイッチグラス、スパルティナ（ｃｏｒｄ  ｇｒａｓｓ）、ドクムギ（ｒｙｅ  ｇｒａｓｓ）、ススキ（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、クサヨシ（ｒｅｅｄ  ｃａｎａｒｙ  ｇｒａｓｓ）、またはその任意の組み合わせなど）が含まれるイネ科植物）、製糖残渣物（例えば、バガス（例えば、サトウキビバガス、ビートパルプ（例えば、サトウダイコン）、またはその組み合わせ）であるがこれらに限定されない）、農業残渣物（例えば、ダイズ茎葉、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、稲藁、サトウキビ藁、イネ、イネ外皮、オオムギ藁、トウモロコシ穂軸、コムギ藁、アブラナ藁、オートムギ藁、オートムギ外皮、トウモロコシ繊維、アサ、アマ、サイザル、ワタ、またはその任意の組み合わせ）、果実パルプ、野菜パルプ、蒸留酒用穀粒（ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ’  ｇｒａｉｎ）、森林バイオマス（例えば、木材、木材パルプ、製紙用パルプ、再利用した木材パルプ繊維、おが屑、硬材（ポプラ材など）、軟材、またはその組み合わせ）を含むが、これらに限定されない。さらに、いくつかの実施形態では、セルロース性バイオマスは、セルロース性廃棄材料および／または森林廃棄材料（紙およびパルプの加工廃棄物、新聞用紙、および厚紙などが含まれるが、これらに限定されない）を含む。いくつかの実施形態では、セルロース性バイオマスは、一種類の繊維を含む一方で、いくつかの代替的な実施形態では、セルロース性バイオマスは、異なるセルロース性バイオマス由来の繊維の混合物を含む。いくつかの実施形態では、バイオマスはまた、リグニナーゼおよび／またはセルラーゼ酵素を発現するトランスジェニック植物を含み得る（米国特許出願公開第２００８／０１０４７２４Ａ１号）。
【００８３】
用語「リグノセルロース性バイオマス」および「リグノセルロース性供給材料」は、リグニンに結合したセルロースおよびヘミセルロースから構成される植物バイオマスをいう。バイオマスを、任意選択的に、化学的、物理的、および生物学的な前処理（蒸気爆発、パルプ化、粉砕、酸加水分解、および溶媒曝露など、ならびにその組み合わせなど）によってセルロースの加水分解に対する感受性を増加させるために前処理することができる。種々のリグノセルロース性供給材料（新鮮なリグノセルロース性供給材料、部分的に乾燥したリグノセルロース性供給材料、完全に乾燥したリグノセルロース性供給材料、および／またはその任意の組み合わせを含むリグノセルロース性供給材料が含まれる）を使用する。いくつかの実施形態では、リグノセルロース性供給材料は、約２０％超、より好ましくは約３０％超、より好ましくは約４０％超（ｗ／ｗ）の量のセルロースを含む。例えば、いくつかの実施形態では、リグノセルロース性材料は、約２０％〜約９０％（ｗ／ｗ）のセルロース、またはその間の任意の量のセルロースを含むが、いくつかの実施形態では、リグノセルロース性材料は、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満，約７％未満、約６％未満、または約５％未満のセルロース（ｗ／ｗ）を含む。さらに、いくつかの実施形態では、リグノセルロース性供給材料は、約１０％超の量、より典型的には約１５％超の量（ｗ／ｗ）のリグニンを含む。いくつかの実施形態では、リグノセルロース性供給材料は、少量のスクロース、フルクトース、および／またはデンプンを含む。一般にリグノセルロース性供給材料は、最初にミリング、粉砕、撹拌、断片化、圧縮／膨張、または他のタイプの機械的作用が含まれるが、これらに限定されない方法によってサイズを小さくする。目的に適合した任意のタイプの装置（例えば、ハンマーミル、タブグラインダー、ロールプレス、リファイナー（ｒｅｆｉｎｅｒ）、およびハイドラパルパ（ｈｙｄｒａｐｕｌｐｅｒ）が含まれるが、これらに限定されない）によって機械的作用によりサイズを小さくすることができる。いくつかの実施形態では、サイズを小さくすることで生成された粒子の少なくとも９０重量％が、約１／１６インチと約４インチとの間未満の長さである（測定値は、体積平均または重量平均の長さであってよい）。いくつかの実施形態では、粒径を小さくするために使用する装置は、ハンマーミルまたはシュレッダである。サイズを小さくした後、供給材料は、供給材料のポンプでの汲み上げが容易になるので、典型的には、水中でスラリーにされる。いくつかの実施形態では、粒径が約６インチ未満のリグノセルロース性供給材料は、サイズを小さくする必要はない。
【００８４】
本明細書中で使用する場合、用語「前処理したリグノセルロース性供給材料」は、上記のように、繊維をセルロース分解酵素により近づきやすくし、そして／またはその作用をより受けやすくするための物理的および／または化学的プロセスに供されたリグノセルロース性供給材料をいう。
【００８５】
セルロース性基質またはリグノセルロース性基質は、糖化を容易にするいくつかの物理的および／または化学的手段によって基質が加工されているとき、「前処理された」という。本明細書中にさらに記載のように、いくつかの実施形態では、バイオマス基質を、セルロースの加水分解に対する感受性を増大させるための当該分野で公知の方法（化学的前処理（例えば、アンモニア前処理、希酸前処理、希アルカリ前処理、または溶媒曝露）、物理的前処理（例えば、蒸気爆発または照射）、機械的前処理（例えば、粉砕またはミリング）、および生物学的前処理（例えば、リグニン可溶化微生物の適用）、ならびにその組み合わせなど）を使用して「前処理」または処理する。したがって、用語「セルロース性バイオマス」は、ポリサッカリド基質（セルロース、デンプン、長鎖炭水化物ポリマーの他の形態、およびかかる供給源の混合物が含まれるが、これらに限定されない）を含む任意の生存している、または死んでいる生物材料を含む。セルロース性バイオマスは、グルコースまたはキシロースから完全にまたは主にアセンブリされていても、そうでなくともよく、任意選択的に、種々の他のペントースまたはヘキソースの単量体も含み得る。キシロースは、５つの炭素原子および１つのアルデヒド基を含むアルドペントースである。キシロースは、ヘミセルロースの前駆体であり、バイオマスの主構成成分であることが多い。いくつかの実施形態では、基質を前処理前にスラリーにする。いくつかの実施形態では、スラリーの粘稠度は、約２％と約３０％との間、より典型的には、約４％と約１５％との間である。いくつかの実施形態では、スラリーを、前処理の前に水および／または酸への浸漬操作に供する。いくつかの実施形態では、スラリーを、蒸気および化学物質の使用量を減少させるために前処理の前に任意の適切な方法を使用して脱水する。脱水デバイスの例には、加圧スクリュープレス（例えば、ＷＯ２０１０／０２２５１１号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）、加圧フィルタ、および押出機が含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ヘミセルロースおよび／またはセルロース性基質中に存在するその一部を単量体のペントースおよびヘキソース類（例えば、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、および／またはその任意の組み合わせ）に加水分解するための前処理を行う。いくつかの実施形態では、ヘミセルロースがほぼ完全に加水分解され、少量のセルロースのグルコースへの変換が起こるように前処理する。いくつかの実施形態では、約０．０２％（ｗ／ｗ）〜約２％（ｗ／ｗ）またはその間の任意の量の水性スラリー中の酸濃度を、典型的には、セルロース性基質の処理のために使用する。任意の適切な酸（塩酸、硝酸、および／または硫酸が含まれるが、これらに限定されない）を、これらの方法で使用する。いくつかの実施形態では、前処理中に使用される酸は硫酸である。蒸気爆発は、バイオマス基質の酸前処理方法の１つである（例えば、米国特許第４，４６１，６４８号を参照のこと）。スラリーの別の前処理方法は、連続的前処理を含む（すなわち、セルロース性バイオマスを、反応器を使用して連続的に汲み上げる）。この方法は当業者に周知である（例えば、米国特許第７，７５４，４５７号を参照のこと）。
【００８７】
いくつかの実施形態では、アルカリを前処理で使用する。酸前処理と対照的に、アルカリでの前処理は、バイオマスのヘミセルロース成分を加水分解しないことがある。むしろ、アルカリは、ヘミセルロース上に存在する酸性基と反応して基質表面を開裂する。いくつかの実施形態では、アルカリの添加によってセルロースの結晶構造が変化し、セルロースがより加水分解しやすくなる。前処理に使用するアルカリの例には、アンモニア、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、および水酸化ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。１つのアルカリ前処理方法は、アンモニア凍結爆砕（Ａｍｍｏｎｉａ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ）、アンモニア繊維爆砕（Ａｍｍｏｎｉａ  Ｆｉｂｅｒ  Ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ）、またはアンモニア繊維膨張である（「ＡＦＥＸ」プロセス；例えば、米国特許第５，１７１，５９２号；同第５，０３７，６６３号；同第４，６００，５９０号；同第６，１０６，８８８号；同第４，３５６，１９６号；同第５，９３９，５４４号；同第６，１７６，１７６号；同第５，０３７，６６３号、および同第５，１７１，５９２号を参照のこと）。このプロセス中、セルロース性基質を、圧力容器内でアンモニアまたは水酸化アンモニウムがセルロース繊維の結晶構造を変化させることができるのに十分な時間、アンモニアまたは水酸化アンモニウムと接触させる。次いで、圧力を迅速に下げ、それにより、アンモニアがフラッシングまたは沸騰して、セルロース繊維構造が爆砕される。いくつかの実施形態では、次いで、フラッシングしたアンモニアを、当該分野で公知の方法を使用して回収する。いくつかの代替的な方法では、希アンモニア前処理を利用する。希アンモニア前処理法は、ＡＦＥＸよりも多くのアンモニアまたは水酸化アンモニウムの希釈溶液を利用する（例えば、ＷＯ２００９／０４５６５１号および米国特許出願公開第２００７／００３１９５３号を参照のこと）。この前処理プロセスにより、任意のモノサッカリドが生成されてもされなくてもよい。
【００８８】
本発明で用いるさらなる前処理方法には、前処理系で有機液体を利用する方法などの方法における有機溶媒でのセルロース性基質の化学的処理が含まれる（例えば、米国特許第４，５５６，４３０号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。これらの方法は、低沸点の液体を容易に回収して再使用することができるという利点がある。他の前処理（Ｏｒｇａｎｏｓｏｌｖ（商標）プロセスなど）も有機液体を使用する（例えば、米国特許第７，４６５，７９１号（これも本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。基質を加圧水に供することも、適切な前処理方法であり得る（例えば、Ｗｅｉｌら，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６８（１−２）：２１−４０［１９９７］（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、前処理したセルロース性バイオマスを、当業者によく知られているように、前処理後にいくつかの工程のうちのいずれか（酵素加水分解前の水での希釈、水での洗浄、緩衝化、濾過、もしくは遠心分離、またはこれらのプロセスの任意の組み合わせなど）によって加工する。前処理により、可溶性成分（ヘミセルロースの加水分解に起因する糖、任意選択的に、酢酸および他のインヒビターが含まれる）および固体（加水分解されていない供給材料およびリグニンが含まれる）を含む前処理された供給材料組成物（例えば、「前処理された供給材料スラリー」）が生成される。いくつかの実施形態では、前処理された供給材料組成物の可溶性成分を固体から分離して可溶性画分を生成する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、次いで、可溶性画分（前処理中に放出された糖および他の可溶性成分（例えば、インヒビター）が含まれる）を発酵に進める。しかし、前処理中にヘミセルロースが効率的に加水分解されないいくつかの実施形態では、発酵性糖を生成するための１つまたはそれを超えるさらなる工程（例えば、さらなる加水分解工程および／または酵素処理工程および／またはさらなるアルカリおよび／または酸処理）が含まれる。いくつかの実施形態では、前処理された供給材料組成物を水溶液で洗浄することによって分離して、洗浄流および加水分解されていない前処理された供給材料を含む固体流を得る。あるいは、可溶性成分を、前処理された供給材料組成物を任意の適切な方法（例えば、遠心分離、微量濾過、プレートおよびフレームでの濾過、クロスフロー濾過、圧力濾過、真空濾過など）を使用した固液分離に供することによって固体から分離する。任意選択的に、いくつかの実施形態では、洗浄工程を固液分離に組み込む。いくつかの実施形態では、次いで、セルロースを含む分離された固体を、セルロースをグルコースに変換するためのセルラーゼ酵素での酵素加水分解に供する。いくつかの実施形態では、前処理された供給材料組成物を、この組成物中に含まれる固体を分離せずに発酵プロセスに送る。いくつかの実施形態では、加水分解されていない固体を、発酵プロセス後に、セルロースをグルコースに変換するためのセルラーゼ酵素での酵素加水分解に供する。いくつかの実施形態では、前処理したセルロース性供給材料を、セルラーゼ酵素での酵素加水分解に供する。
【００９０】
本明細書中で使用する場合、用語「スラリー」は、１つまたはそれを超える固体成分（セルロース性基質など）が分散された水溶液をいう。
【００９１】
反応中に存在する特定の成分（例えば、ＧＨ酵素）によって、同一の基質および他の置換基を使用する同一条件下であるが、目的の成分の非存在下で行った反応と比較してより多くの生成物が生成されるとき、反応物由来の生成物（例えば、ステビオールグリコシド）の収量が「増加」する。
【００９２】
基質中に存在する２つのモノサッカリド間の少なくともいくつかのグリコシド結合が加水分解され、それにより、その前に結合していた２つの単量体が相互に引き離されたとき、セルロースまたは他のポリサッカリドは「加水分解」する。
【００９３】
特定の酵素の量が反応の触媒に関与する他の酵素の量と比較して約２％、約１％、または約０．１％（ｗｔ／ｗｔ）未満である場合、反応は、前述の特定の酵素を「実質的に含まない」という。
【００９４】
液体（例えば、培養ブロス）の「分画」は、溶液中の所望のタンパク質（例えば、ＧＨ６１タンパク質、セルラーゼ酵素、またはその組み合わせ）の総タンパク質に対する比率が最初の液体生成物中のタンパク質よりも高い溶液を得るために分離プロセス（例えば、塩析、カラムクロマトグラフィ、サイズ排除、および濾過）またはかかるプロセスの組み合わせを適用することを意味する。
【００９５】
本明細書中で使用する場合、「出発組成物」は、少なくとも１つの基質を含む任意の組成物をいう。いくつかの実施形態では、出発組成物は、任意のセルロース性基質を含む。
【００９６】
いくつかの別の実施形態では、用語「出発組成物」は、少なくとも１つのステビオールグリコシドを含む任意の組成物であって、ステビオールグリコシドのうちの１つまたはそれより多くが生体内変換のための基質として作用する組成物をいう。いくつかの実施形態では、出発組成物を水溶液として提供する。いくつかの実施形態では、出発材料は、ステビオシド、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＢ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＭ（レバウジオシドＸともいう）、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、および合成ステビオールグリコシド（例えば、酵素的にグルコシル化されたステビオールグリコシド）から選択される少なくとも１つのステビオールグリコシドを含む。いくつかの実施形態では、出発組成物は、２つまたはそれを超えるステビオールグリコシドを含む。いくつかの実施形態では、出発組成物は、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ植物材料（例えば、葉）の精製から得た抽出物を含む。いくつかの代替的な実施形態では、出発組成物は、市販のステビア抽出物を含む。さらなる出発組成物は、ステビオールグリコシドを単離および精製するために使用したプロセスの副生成物を含む。いくつかの実施形態では、出発組成物は、精製または部分精製されたステビオールグリコシド基質を含む。いくつかの実施形態では、出発組成物は、約９９重量％を超える特定のステビオールグリコシドを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、出発組成物は、少なくとも１つのステビオールグリコシド（例えば、レバウジオシドＡ、Ｄなど）を生成するための基質としての少なくとも１つのグリコシドおよびセルロース成分を含む。
【００９８】
本明細書中で使用する場合、酵素変換プロセスの文脈中の「生成物」は、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの気質に対する作用に起因する化合物または分子をいう。いくつかの実施形態では、本発明によって提供される生成物は、ステビオールグリコシドである。いくつかの実施形態では、生成物は、ステビオシド、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＢ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＭ（レバウジオシドＸともいう）、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、および合成ステビオールグリコシド（例えば、酵素的にグルコシル化されたステビオールグリコシド）から選択される少なくとも１つのステビオールグリコシドを含む。
【００９９】
本明細書中で使用する場合、用語「培養」は、任意の適切な条件下での（例えば、液体培地、ゲル培地、または固体培地を使用した）微生物細胞集団の成長をいう。
【０１００】
組換えポリペプチドを、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して産生することができる。目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子を、プラスミドなどのベクター内でクローン化し、大腸菌などの所望の宿主内で発現させることができる。組換えポリペプチドのバリアントを、当該分野で公知の種々の方法によって生成することができる。実際に、多種多様な当業者に周知の異なる変異誘発技術が存在する。さらに、変異誘発キットはまた、多数の、分子生物学の商業的供給業者から入手可能である。規定のアミノ酸での特異的置換（部位指定）、遺伝子の局在化領域内での特異的変異もしくはランダム変異（領域特異的）、または全遺伝子にわたるランダム変異誘発（例えば、飽和変異誘発）を行うための方法が利用可能である。酵素バリアントを生成するための多数の適切な方法（ＰＣＲを使用した一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの部位指定変異誘発、カセット式変異誘発、遺伝子合成、誤りがちのＰＣＲ、シャフリング、および化学飽和変異誘発、または当該分野で公知の任意の他の適切な方法が含まれるが、これらに限定されない）が当業者に公知である。ＤＮＡ工学およびタンパク質工学のために使用される方法の非限定的な例は、以下の特許に提供されている：米国特許第６，１１７，６７９号；米国特許第６，４２０，１７５号；米国特許第６，３７６，２４６号；米国特許第６，５８６，１８２号；米国特許第７，７４７，３９１号；米国特許第７，７４７，３９３号；米国特許第７，７８３，４２８号；および米国特許第８，３８３，３４６号。バリアントが産生された後、これらを任意の所望の特性（例えば、高活性もしくは活性の増加、または低活性もしくは活性の低下、熱活性の増加、熱安定性の増加、および／または酸性ｐＨ安定性など）についてスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、「組換えグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド」（本明細書中で「操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド」、「バリアントグリコシルトランスフェラーゼ酵素」、および「グリコシルトランスフェラーゼバリアント」とも呼ばれる）を使用する。
【０１０１】
本明細書中で使用する場合、「ベクター」は、細胞内にＤＮＡ配列を導入するためのＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ配列にコードされたポリペプチドを適切な宿主内で発現させることができる適切な調節配列に作動可能に連結された発現ベクターである。いくつかの実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞内での発現を駆動するため、ＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子）に作動可能に連結されたプロモーター配列を有し、いくつかの実施形態では、転写ターミネーター配列も含む。
【０１０２】
本明細書中で使用する場合、用語「発現」には、ポリペプチド産生に関与する任意の工程（転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。いくつかの実施形態では、この用語はまた、細胞からのポリペプチドの分泌を含む。
【０１０３】
本明細書中で使用する場合、用語「産生する」は、細胞によるタンパク質および／または他の化合物の産生をいう。この用語は、ポリペプチド産生に関与する任意の工程（転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾が含まれるが、これらに限定されない）を含むことが意図される。いくつかの実施形態では、この用語はまた、細胞からのポリペプチドの分泌を含む。
【０１０４】
本明細書中で使用する場合、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列など）は、この配列および別の配列の２つが天然では関連しない場合に、作動可能に連結された別の配列に対して、「異種である」。例えば、「異種ポリヌクレオチド」は、実験技術によって宿主細胞に導入された任意のポリヌクレオチドであり、宿主細胞から取り出し、実験操作に供し、次いで、宿主細胞に再導入されるポリヌクレオチドが含まれる。
【０１０５】
本明細書中で使用する場合、用語「宿主細胞」および「宿主株」は、本明細書中に提供したＤＮＡ（例えば、グリコシルトランスフェラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド）を含む発現ベクターに適切な宿主をいう。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築されたベクターを使用して形質転換されているかトランスフェクトされている原核細胞または真核細胞である。
【０１０６】
用語「アナログ」は、基準ポリペプチドと７０％を超える配列同一性を有するが、１００％未満の配列同一性（例えば、７５％、７８％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超える配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、アナログは、１つまたはそれを超える天然に存在しないアミノ酸残基（ホモアルギニン、オルニチン、およびノルバリンが含まれるが、これらに限定されない）および天然に存在するアミノ酸を含むポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、アナログはまた、１つまたはそれを超えるＤ−アミノ酸残基および２つまたはそれを超えるアミノ酸残基の間の非ペプチド結合を含む。
【０１０７】
用語「有効量」は、所望の結果を得るために十分な量を意味する。当業者は、日常的な実験を使用することによって有効量を決定し得る。
【０１０８】
用語「単離された」および「精製された」を、天然で関連している少なくとも１つの他の成分から取り出された分子（例えば、単離された核酸、単離されたポリペプチドなど）または他の成分をいうために使用する。用語「精製された」は、完全に純粋である必要はなく、むしろ、相対的な定義であることが意図される。
【０１０９】
「立体選択性」は、化学反応または酵素反応における、一方の立体異性体の他方の立体異性体を超える優先的形成をいう。立体選択性は、一方の立体異性体の形成が他方よりも好まれる場合は部分的であり得、一方の立体異性体のみが形成される場合は完全であり得る。立体異性体が鏡像異性体である場合、立体選択性は、エナンチオ選択性（両方の合計中の１つの鏡像異性体の分率（典型的には、百分率として報告される））をいう。エナンチオ選択性は、代わりとして、式［主な鏡像異性体−少数の鏡像異性体］／［主な鏡像異性体＋少数の鏡像異性体］にしたがって鏡像異性体から計算した鏡像体過剰率（ｅ．ｅ．）（典型的には百分率として）として当該分野で一般的に報告されている。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性をジアステレオ選択性（２つのジアステレオマーの混合物のうちの一方のジアステレオマーの分率（典型的には、百分率として報告される））といい、一般に、代わりとして、ジアステレオマー過剰率（ｄ．ｅ．）として報告される。鏡像体過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃ  ｅｘｃｅｓｓ）の一形態である。
【０１１０】
「位置選択性」および「位置選択的反応」は、結合の１つの作製方向または破壊方向が全ての他の可能性のある方向より優先されて起こる反応をいう。反応は、この区別が完全である場合は完全に（１００％）位置選択性であり得、一方の部位での反応生成物が他方の部位での反応生成物より優位である場合、実質的に位置選択性（少なくとも７５％）であり得るか、部分的に位置選択性（ｘ％、百分率は目的の反応に応じて設定される）であり得る。
【０１１１】
本明細書で使用されるとき、「熱安定性」は、同じ高温に暴露された野生型酵素と比較して一定期間（例えば、０．５〜２４時間）高温（例えば、４０〜８０℃）に暴露後に類似の活性（例えば、６０％〜８０％を超える）を維持するグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをいう。
【０１１２】
本明細書で使用されるとき、「溶媒安定性」は、同じ濃度の同じ溶媒に暴露された野生型酵素と比較して一定期間（例えば、０．５〜２４時間）種々の濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒（エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）に曝露後に類似の活性（例えば、６０％〜８０％を超える）を維持するグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをいう。
【０１１３】
本明細書で使用されるとき、「熱および溶媒安定性」は、熱安定性および溶媒安定性の両方を示すグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをいう。
【０１１４】
本明細書中で使用する場合、「還元剤」は、Ｆｅ＋３をＦｅ＋２に変換することができる化合物または薬剤をいう。例示的な還元剤は、一般にＬ−アスコルビン酸の形態のアスコルビン酸である。
【０１１５】
本明細書中で使用する場合、「任意選択的な」および「任意選択的に」は、その後に記載される事象または状況が生じても生じなくてもよく、この記載には事象または状況が生じる場合および生じない場合が含まれることを意味する。当業者は、１つまたはそれを超える任意選択の置換基を含む任意の分子に関して、立体的に実用的および／または合成的に実行可能な化合物のみが含まれることを意味すると理解するであろう。「任意選択的に置換された」は、その後に来る１つの用語または一連の化学基の全てを修飾することをいう。
【０１１６】
グリコシル化
グリコシル化は、天然生成物および合成生成物の多数の特性（安定性、薬力学、溶解度、および膜輸送が含まれる）を変化させることができる。本発明は、種々のアグリコンおよびグリコシル化基質から新規のグリコシル化化合物を生成するのに適切な組成物、方法、および酵素を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、容易に得られる前駆体から公知のグリコシル化化合物を効率的に生成する手段を提供する。いくつかの場合、化学合成法によってグリコシル化を達成する。しかし、これらの方法は、典型的には、望ましくない化学物質およびプロセスを必要とし、混合生成物（例えば、結合の位置が不正確であり、そして／または望ましくないアノマー配置を有する）を生じ得る。さらに、炭水化物化学は、複数の保護および脱保護工程を必要とする。
【０１１７】
対照的に、グリコシル化酵素は、穏やかな条件下で活性であり得、単一の工程で高い位置選択性および立体特異性を付与することができる。多数の天然に誘導されたグリコシル化代謝産物を、種々の糖ヌクレオチドから糖部分を転移するグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）酵素を使用してｉｎ  ｖｉｖｏで生成する。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセスで使用する場合、これらの酵素が必要とする糖ヌクレオチドドナーは法外に高価であり得、大規模で利用できないかもしれない。さらに、所与のグリコシル化反応のためのネイティブのＧＴ酵素は知られていないかもしれない。
【０１１８】
あるいは、いくつかのグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）酵素は、分子のヒドロキシル基が水の代わりに切断された糖のアクセプターとして作用することができるというトランスグリコシル化活性を有することが示されている（図１を参照のこと）。この場合、基質は、ドナーおよびアクセプターの両方として作用するか（例えば、ＬａｃＺβ−ガラクトシダーゼタンパク質によって触媒されるラクトースおよびアロラクトースの相互変換）、一方のグリコシル化基質由来の切断された糖が代わりとなるアクセプターに転移する。後者の場合は、グリコシドドナーとしてのそれぞれ安価なプルラン、マルトース、ラクトース、およびスクロースと共にトランスグリコシル化酵素として使用されてきた種々のヒドロラーゼ酵素（例えば、プルラナーゼ酵素、α−アミラーゼ酵素、β−ガラクトシダーゼ酵素、およびデキストランスクラーゼ酵素）について証明されている。
【０１１９】
多数の目的の分子（抗菌特性、抗腫瘍特性、天然甘味特性などを有し、分子間トランスグリコシル化を介した生成の良好な候補であろう多数の二次代謝産物が含まれる）を、β−グルコース結合で改変する。しかし、有意なトランスグリコシル化活性を有することが示されている酵素のほとんどは、一般に、それぞれα−グルコース結合およびβ−ガラクトース結合をもたらすα−グルコシダーゼ活性またはβ−ガラクトシダーゼ活性を有する。したがって、安価な糖ドナーを使用した分子間トランスグリコシル化を介したβ−グルコシル化分子を生成することができる酵素が必要である。β−グルコシル化化合物を生成するための公知の生体触媒経路は存在せず、当該分野で公知の既存の化学的方法は多段階合成を使用する。したがって、本発明は、産業的に許容され得る条件下で、β−グルコシル化化合物合成のために生体触媒および生体触媒を使用するためのプロセスについての当該分野の要求を満たす。
【０１２０】
本発明では、目的の基質（例えば、ステビオシド）と安価な糖ドナー（例えば、セロビオース）との間の分子間トランスグリコシル化反応（図１を参照のこと）を容易にして、β−グルコース結合した生成物（例えば、レバウジオシドＡ）を形成することができるβ−グルコシダーゼ酵素を提供する。さらに、ステビオシド基質のトランスグリコシル化を増加させ、そして／または加水分解を減少させるβ−グルコシダーゼバリアントを生成する。β結合グルコースドナーの他の非限定的な例は、ジサッカリドであるセロビオース、ゲンチオビオース、ソホロース、ラミナリビオース、β，β−トレハロース、またはβ−１，２、β−１，３、β−１，４、もしくはβ−１，６結合トリオースなど、またはさらなるオリゴサッカリド（セロトリオース、およびセロテトラオース（ｃｅｌｌａｔｅｔｒａｏｓｅ）など）である。したがって、本発明はまた、商業的に関連するステビオールグリコシドの生成方法を提供する。
【０１２１】
操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチド
本発明は、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ポリペプチドの調製方法、およびポリペプチドの使用方法を提供する。記述がポリペプチドに関する場合、本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを記載し得ると理解すべきである。
【０１２２】
上記の操作されたポリペプチドの改良された特性によってグリコシル化反応が行われる適切な反応条件を、以下および実施例にさらに記載するように、以下の濃度または量に関して決定することができる：ポリペプチド、基質、共基質、緩衝液、溶媒、ｐＨ、温度および反応時間を含む条件、および／または固体支持体上に固定したポリペプチドを使用した条件。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、特にグリコシドのさらにステビオールグリコシドへの変換において改良された特性を有するβ−グルコシダーゼ活性を有する例示的な操作されたポリペプチドは、表２．１および３．１に示される残基位置に、配列番号１２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、特にグリコシドのステビオールグリコシドへの変換において改良された特性を有するβ−グルコシダーゼ活性を有する例示的な操作されたポリペプチドは、配列番号１４と比較して表５．１に示す残基の位置に１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２５】
本発明の例示的な天然に存在しない（または操作された）ポリペプチドの構造および機能の情報は、グリコシドのステビオールグリコシドへの変換に基づいており、変換の結果を以下の表２．１、３．１、および５．１に示し、実施例でさらに説明している。これらの表における奇数番号の配列識別子（すなわち、配列番号）は、これらの表における偶数番号の配列番号によって提供されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をいう。例示的な配列を本発明に添付の配列表の電子ファイル中に提供し、この電子ファイルは本明細書中で参照によって組み込まれる。アミノ酸残基の相違は、配列番号１２および１４の基準配列との比較に基づく。
【０１２６】
本明細書で使用されるＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＧＨ３  β−グルコシダーゼの天然に存在するアミノ酸配列は、本明細書において配列番号２として提供される（対応するポリヌクレオチド配列は、本明細書に提供される配列番号１である）。このポリヌクレオチドのコドン最適化された配列は、配列番号１１として提供される（配列番号１２として対応するポリペプチド配列と共に）。本明細書で使用されるｔｄ２ｆ２  ＧＨ１  β−グルコシダーゼの天然に存在するアミノ酸配列は、本明細書において配列番号４として提供される（対応するポリヌクレオチド配列は、本明細書に提供される配列番号３である）。このポリヌクレオチドのコドン最適化された配列は、配列番号１３として提供される（配列番号１４として対応するポリペプチド配列と共に）。本明細書で使用されるＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ  ＧＨ１  β−グルコシダーゼの天然に存在するアミノ酸配列は、本明細書において配列番号６として提供される（対応するポリヌクレオチド配列は、本明細書に提供される配列番号５である）。このポリヌクレオチドのコドン最適化された配列は、配列番号１５として提供される（配列番号１６として対応するポリペプチド配列と共に）。本明細書で使用されるＴｈｅｒｍｏｂａｃｕｌｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ  ＧＨ１  β−グルコシダーゼの天然に存在するアミノ酸配列は、本明細書において配列番号８として提供される（対応するポリヌクレオチド配列は、本明細書に提供される配列番号７である）。このポリヌクレオチドのコドン最適化された配列は、配列番号１７として提供される（配列番号１８として対応するポリペプチド配列と共に）。本明細書で使用されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍの天然に存在するＧＨ１  β−グルコシダーゼは、配列番号２０として提供される（対応するポリヌクレオチド配列は、配列番号１９として提供される）。本明細書で使用されるＥ．ｃｏｌｉ（株Ｋ１２）のβ−ガラクトシダーゼ酵素は、本明細書において配列番号２９６として提供される（対応するポリヌクレオチド配列は、配列番号２９５として提供される）。本明細書で使用されるＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｓｕｂｓｐ．  ｊａｐｏｎｉｃａの天然に存在するβ−ガラクトシダーゼは、配列番号２９８として提供される（対応するポリヌクレオチド配列は、配列番号２９７として提供される）。このポリヌクレオチドのコドン最適化された配列は、配列番号２９９として提供される（配列番号３００として対応するポリペプチド配列と共に）。
【０１２７】
配列番号１２または１４の基準ポリペプチドと比較した各操作されたポリペプチドの活性を、本明細書中の実施例に記載の基質の変換として決定した。いくつかの実施形態では、振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を、操作されたβ−グルコシダーゼの特性を評価するための二次スクリーニングとして使用し、その結果を実施例に提供する。いくつかの実施形態では、ＳＦＰ形態は、操作されたポリペプチドのより精製された粉末調製物を提供し、総タンパク質の約３０％まで、操作されたポリペプチドを含むことができる。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、酵素の特異性は、配列番号１２および１４と比較して本明細書中に示した残基の位置での残基の相違に関連する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド発現に影響を及ぼす残基の相違を使用して、操作されたβ−グルコシダーゼの発現を増加させることができる。
【０１２９】
本明細書中に提供したガイダンスを考慮すると、例えば、表２．１、３．１および５．１中の他のポリペプチド由来の種々のアミノ酸の相違と本明細書中に記載の他の残基の位置との新規の組み合わせを組み込むその後の一連の進化によって、配列番号２２〜２９４のうち偶数番号の配列を含む任意の例示的な操作されたポリペプチドを、他の操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドの合成のための出発アミノ酸配列として使用することができることをさらに意図する。より初期の一連の進化を通して不変なままの残基の位置にアミノ酸の相違を含めることによってさらに改良することができる。
【０１３０】
一部の実施形態では、β−グルコシダーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列である配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列、および３１、３２、３４、３６、３７、３８、５７／９１、５８、５９、６０、６１、６２、６２／４０３、６６、７０、８９、８９／１８７、９１、９１／５９５、１２４、１２４／２９７、１２５、１２６／１８８、１３３、１３８／２９６、１４７、１５０、１８４、１８６、１８７、２３０、２３１、２３３、２６６、２９６、２９７、４０３、４０５、４４９、４５０、４９２、５９０、５９５、および６０１から選択される残基位置に、配列番号１２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を含む。
【０１３１】
一部の実施形態では、β−グルコシダーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列である配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列、および３１Ｃ／Ｇ、Ｖ３２Ｇ／Ｐ／Ｓ、３４Ｉ／Ｐ、３６Ｐ、３７Ｋ／Ｗ、３８Ｅ、５７Ｒ／９１Ｐ、５８Ｐ、５９Ｒ、６０Ｃ／Ｒ／Ｖ、６１Ｒ、６２Ｎ、６２Ｐ／４０３Ｒ、６６Ｇ／Ｎ、７０Ｗ、８９Ｌ、８９Ｓ／１８７Ｒ、９１Ｇ／５９５Ｖ、１２４Ｄ／２９７Ｐ、１２５Ｇ、１２６Ｖ／１８８Ｒ、１３３Ｇ／Ｒ、１３８Ｇ／２９６Ｓ、１４７Ｌ、１５０Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｔ、１８４Ａ／Ｒ、１８６Ｅ、１８７Ｇ／Ｎ／Ｙ、２３０Ｆ／Ｈ／Ｉ、２３１Ｇ／Ｒ、２３３Ｌ／Ｐ／Ｑ、２６６Ｆ／Ｇ、２９６Ｒ／Ｔ、２９７Ｒ、４０３Ｅ／Ｐ、４０５Ｒ、４４９Ｇ／Ｐ、４５０Ｇ、４９２Ｐ、５９０Ｗ、６０１Ａ／Ｅ／Ｌ、６０１Ｅ、および６０１Ｌから選択される、配列番号１２、と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を含む。
【０１３２】
一部の実施形態では、β−グルコシダーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列である配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列、および３２、３４、３６、５７／９１、５８、５９、６０、６２、６２／４０３、６６、８９、８９／１８７、９１／５９５、１２４／２９７、１２６／１８８、１３３、１３８、１３８／２９６、１４７、１５０、１８４、１８６、１８７、１８８、２３０、２３１、２３３、２６６、２９６、２９７、４０３、４０５、４４９、４９２、５９０、および６０１から選択される残基位置に、配列番号１２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を含む。
【０１３３】
一部の実施形態では、β−グルコシダーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列である配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列、およびＰ３１Ｃ／Ｇ、Ｖ３２Ｇ／Ｐ／Ｓ、Ｇ３４Ｉ／Ｐ、Ｉ３６Ｐ、Ｔ３７Ｋ／Ｗ、Ｔ３８Ｅ、Ｇ５７Ｒ／Ｉ９１Ｐ、Ｌ５８Ｐ、Ｆ５９Ｒ、Ｎ６０Ｃ／Ｒ／Ｖ、Ｌ６１Ｒ、Ｋ６２Ｎ、Ｋ６２Ｐ／Ｗ４０３Ｒ、Ｒ６６Ｇ／Ｎ、Ｖ７０Ｗ、Ｄ８９Ｌ、Ｄ８９Ｓ／Ｈ１８７Ｒ、Ｉ９１Ｇ／Ｇ５９５Ｖ、Ａ１２４Ｄ／Ｖ２９７Ｐ、Ｓ１２５Ｇ、Ａ１２６Ｖ／Ｆ１８８Ｒ、Ｆ１３３Ｇ／Ｒ、Ｄ１３８Ｇ／Ｍ２９６Ｓ、Ｒ１４７Ｌ、Ｅ１５０Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｔ、Ｃ１８４Ａ／Ｒ、Ｋ１８６Ｅ、Ｈ１８７Ｇ／Ｎ／Ｙ、Ｍ２３０Ｆ／Ｈ／Ｉ、Ａ２３１Ｇ／Ｒ、Ｆ２３３Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｙ２６６Ｆ／Ｇ、Ｍ２９６Ｒ／Ｔ、Ｖ２９７Ｒ、Ｗ４０３Ｅ／Ｐ、Ｖ４０５Ｒ、Ｍ４４９Ｇ／Ｐ、Ｆ４５０Ｇ、Ｓ４９２Ｐ、Ｒ５９０Ｗ、およびＦ６０１Ａ／Ｅ／Ｌから選択される、配列番号１２、と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を含む。
【０１３４】
一部の実施形態では、β−グルコシダーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列である配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列、および３２Ｇ／Ｐ／Ｓ、３４Ｉ／Ｐ、３６Ｐ、５７Ｒ／９１Ｐ、５８Ｐ、５９Ｒ、６０Ｃ／Ｒ／Ｖ、６２Ｎ、６２Ｐ／４０３Ｒ、６６Ｎ、８９Ｌ、８９Ｓ／１８７Ｒ、９１Ｇ／５９５Ｖ、１２４Ｄ／２９７Ｐ、１２６Ｖ／１８８Ｒ、１３３Ｇ／Ｒ、１３８Ｇ／，２９６Ｓ、１４７Ｌ、１５０Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｔ、１８４Ｒ、１８６Ｅ、１８７Ｇ、１８７Ｎ／Ｙ、２３０Ｆ／Ｈ／Ｉ、２３１Ｇ／Ｒ、２３３Ｐ／Ｑ、２６６Ｆ／Ｇ、２９６Ｒ／Ｔ、２９７Ｒ、４０３Ｅ／Ｐ、４０５Ｒ、Ｍ４４９Ｇ／Ｐ、４９２Ｐ、５９０Ｗ、および６０１Ａ／Ｅ／Ｌから選択される、配列番号１２、と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を含む。
【０１３５】
一部の実施形態では、β−グルコシダーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列である配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列、およびＶ３２Ｇ／Ｐ／Ｓ、Ｇ３４Ｉ／Ｐ、Ｉ３６Ｐ、Ｇ５７Ｒ／Ｉ９１Ｐ、Ｌ５８Ｐ、Ｆ５９Ｒ、Ｎ６０Ｃ／Ｒ／Ｖ、Ｋ６２Ｎ、Ｋ６２Ｐ／Ｗ４０３Ｒ、Ｒ６６Ｎ、Ｄ８９Ｌ、Ｄ８９Ｓ／Ｈ１８７Ｒ、Ｉ９１Ｇ／Ｇ５９５Ｖ、Ａ１２４Ｄ／Ｖ２９７Ｐ、Ａ１２６Ｖ／Ｆ１８８Ｒ、Ｆ１３３Ｇ／Ｒ、Ｄ１３８Ｇ／Ｍ２９６Ｓ、Ｒ１４７Ｌ、Ｅ１５０Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｔ、Ｃ１８４Ｒ、Ｋ１８６Ｅ、Ｈ１８７Ｇ／Ｎ／Ｙ、Ｍ２３０Ｆ／Ｈ／Ｉ、Ａ２３１Ｇ／Ｒ、Ｆ２３３Ｐ／Ｑ、Ｙ２６６Ｆ／Ｇ、Ｍ２９６Ｒ／Ｙ、Ｖ２９７Ｒ、Ｗ４０３Ｅ／Ｐ、Ｖ４０５Ｒ、Ｍ４４９Ｇ／Ｐ、Ｓ４９２Ｐ、Ｒ５９０Ｗ、およびＦ６０１Ａ／Ｅ／Ｌから選択される、配列番号１２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を含む。
【０１３６】
一部の実施形態では、β−グルコシダーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列である配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２２と１７２との間の偶数番号の配列を含む。
【０１３７】
一部の実施形態では、活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列である配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列、および１５、１６、１６／８４、１７、１９、２１、３５、４５、５５、７６、７９、１２１、１６４、１６８、１６８／２５６、１７０、１７９、２１５／４１３、２２１、２２１／３１１、２２５、２４７、３１３、３５１、３５６、４０２、４０４、４０５、４０９、４１１、４１２、４１３、および４１４から選択される残基位置に、配列番号１４と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列である配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列、および１５Ｓ、１６Ａ／Ｇ、１６Ｓ／８４Ｈ、１７Ｇ、１９Ｇ、２１Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｓ、３５Ａ／Ｇ、４５Ｌ、５５Ｐ、７６Ｇ／Ｌ、７６Ｌ、７９Ｔ、１２１Ｓ、１６４Ｙ、１６８Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｌ／Ｓ、１６８Ｑ／２５６Ｖ、１７０Ｈ、１７９Ｈ／Ｒ、２１５Ｓ／４１３Ｐ、２２１Ｃ／Ｇ／Ｔ、２２１Ｐ／３１１Ｖ、２２５Ｈ／Ｎ／Ｙ、Ｖ２４７Ｇ／Ｉ／Ｌ、３１３Ｖ、３５１Ａ／Ｌ、３５６、４０２Ｋ、４０４Ｐ／Ｓ、４０５Ｈ／Ｗ、４０９Ｔ、４１１Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｒ／Ｔ、４１２Ｌ、４１３Ａ／Ｈ／Ｐ、および４１４Ｄから選択される、配列番号１４、と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を含む。
【０１３９】
一部の実施形態では、活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列である配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列、およびＡ１５Ｓ、Ｔ１６Ａ／Ｇ、Ｔ１６Ｓ／Ｒ８４Ｈ、Ａ１７Ｇ、Ｙ１９Ｇ、Ｉ２１Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｓ、Ｗ３５Ａ／Ｇ、Ｉ４５Ｌ、Ｃ５５Ｐ、Ｙ７６Ｇ／Ｌ、Ｓ７９Ｔ、Ｈ１２１Ｓ、Ｌ１６４Ｙ、Ｗ１６８Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｌ／Ｓ、Ｗ１６８Ｑ／Ａ２５６Ｖ、Ｓ１７０Ｈ、Ｖ１７９Ｈ／Ｒ、Ｐ２１５Ｓ／Ｍ４１３Ｐ、Ｖ２２１Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｖ２２１Ｐ／Ａ３１１Ｖ、Ｔ２２５Ｈ／Ｎ／Ｙ、Ｖ２４７Ｇ／Ｉ／Ｌ、Ｒ３１３Ｖ、Ｔ３５１Ａ／Ｌ、Ａ３５６Ｇ、Ｌ４０２Ｋ、Ｎ４０４Ｐ／Ｓ、Ｆ４０５Ｈ／Ｗ、Ｍ４０９Ｔ、Ｌ４１１Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｒ／Ｔ、Ｓ４１２Ｌ、Ｍ４１３Ａ／Ｈ、Ｍ４１３Ｐ、およびＲ４１４Ｄから選択される、配列番号１４、と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を含む。
【０１４０】
一部の実施形態では、β−グルコシダーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列である配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１７４と２９４との間の偶数番号の配列を含む。
【０１４１】
当業者が認識するように、いくつかの実施形態では、選択された上記の残基の相違の１つまたは組み合わせを、コア特徴として操作されたβ−グルコシダーゼ中に一定に維持し（例えば、維持し）、他の残基の位置のさらなる残基の相違を配列に組み込むことにより特性が改良されたさらなる操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドを生成することができる。したがって、上記の残基の相違の１つまたはサブセットを含む任意の操作されたβ−グルコシダーゼについて、本発明が、残基の相違の１つまたはサブセット、さらに、本明細書中に開示の他の残基の位置に１つまたはそれを超える残基の相違を含む他の操作されたβ−グルコシダーゼを意図すると理解すべきである。
【０１４２】
上述の通り、β−グルコシダーゼ活性を有する操作されたポリペプチドはまた、基質（例えば、グリコシドおよびセロビオース）を生成物（例えば、ステビオールグリコシド）に変換することができる。いくつかの実施形態では、操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドは、配列番号１２、１４、２９６、または２９８の基準ポリペプチドの活性と比較して少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれを超える活性で、基質を生成化合物（ｐｒｏｄｕｃｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）に変換することができる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、配列番号１２および／または１４と比較して少なくとも２倍の活性で基質化合物を生成化合物に変換することができる操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドは、配列番号２２〜１９４内の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、操作されたβ−グルコシダーゼは、配列番号１２および／または１４と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を含むアミノ酸配列を有し、細菌宿主細胞、特に大腸菌における操作されたβ−グルコシダーゼ活性の発現を増加させる。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、特性が改良された操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドは、配列番号２２〜２９４の範囲の偶数番号の配列から選択される配列を含むアミノ酸配列を有する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２２〜２９４の範囲の偶数番号の配列のうちの１つと少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、配列番号１２および／または１４と比較した場合に、実施例に提供する配列番号２２〜２９４の範囲の偶数番号の配列のうちのいずれか１つに存在するアミノ酸残基の相違を有するアミノ酸配列を含む。
【０１４７】
上で特定した残基位置に加えて，本明細書中に開示の任意の操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドは、配列番号１２、１４、２９６、２９８および／または３００と比較して他の残基の位置（すなわち、本明細書に含まれるもの以外の残基の位置）に他の残基の相違をさらに含むことができる。これらの他の残基の位置での残基の相違により、ポリペプチドが基質の生成物への変換反応を実施する能力に悪影響を与えずにアミノ酸配列をさらに変動させることができる。したがって、いくつかの実施形態では、配列番号２２〜２９４の範囲の偶数番号の配列から選択される操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドのうちのいずれか１つに存在するアミノ酸残基の相違に加えて、配列は、配列番号１２、１４、２９６、２９８および／または３００と比較した場合に他のアミノ酸残基の位置に１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、または１〜５０個の残基の相違をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、参照配列と比較したアミノ酸残基の相違の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個の残基の位置にあり得る。いくつかの実施形態では、参照配列と比較したアミノ酸残基の相違の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の残基の位置にあり得る。これらの他の位置での残基の相違は、保存的変化または非保存的変化であり得る。いくつかの実施形態では、残基の相違は、配列番号１２、１４、２９６、２９８および／または３００の天然に存在するβ−グルコシダーゼポリペプチドと比較した場合に保存的置換および非保存的置換を含むことができる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本発明はまた、操作されたβ−グルコシダーゼの機能活性および／または改良された特性を保持する本明細書中に記載の任意の操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドのフラグメントを含む操作されたポリペプチドを提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、適切な反応条件下で基質を生成物に変換することができるポリペプチドフラグメントであって、このフラグメントが、本発明の操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチド（配列番号２２〜２９４の範囲の偶数番号の配列から選択される例示的な操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドなど）の全長アミノ酸配列の少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む、ポリペプチドフラグメントを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドは、本明細書中に記載の操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチド配列（配列番号２２〜２９４の範囲の偶数番号の配列の例示的な操作されたポリペプチドなど）のうちのいずれか１つの欠失を含むアミノ酸配列を有することができる。
【０１４９】
したがって、本発明の操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドの各実施形態およびあらゆる実施形態のために、アミノ酸配列は、β−グルコシダーゼポリペプチドの１つまたはそれを超えるアミノ酸、２またはそれを超えるアミノ酸、３またはそれを超えるアミノ酸、４またはそれを超えるアミノ酸、５またはそれを超えるアミノ酸、６またはそれを超えるアミノ酸、８またはそれを超えるアミノ酸、１０またはそれを超えるアミノ酸、１５またはそれを超えるアミノ酸、または２０またはそれを超えるアミノ酸、総アミノ酸数の１０％まで、総アミノ酸数の２０％まで、または総アミノ酸数の３０％までの欠失を含むことができ、本明細書中に記載の操作されたβ−グルコシダーゼの関連する機能活性および／または改良された特性が維持される。いくつかの実施形態では、欠失は、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、または１〜５０個のアミノ酸残基を含むことができる。いくつかの実施形態では、欠失数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸残基数であり得る。いくつかの実施形態では、欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸残基の欠失を含むことができる。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本明細書中の操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドは、本明細書中に記載の操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチド（配列番号２２〜２９４の範囲内の偶数番号の配列の例示的な操作されたポリペプチドなど）のうちのいずれか１つと比較した場合に挿入を含むアミノ酸配列を有することができる。したがって、本発明のβ−グルコシダーゼポリペプチドのそれぞれおよび全ての実施形態について、挿入は、１つまたはそれを超えるアミノ酸、２またはそれを超えるアミノ酸、３またはそれを超えるアミノ酸、４またはそれを超えるアミノ酸、５またはそれを超えるアミノ酸、６またはそれを超えるアミノ酸、８またはそれを超えるアミノ酸、１０またはそれを超えるアミノ酸、１５またはそれを超えるアミノ酸、２０またはそれを超えるアミノ酸、３０またはそれを超えるアミノ酸、４０またはそれを超えるアミノ酸、または５０またはそれを超えるアミノ酸を含むことができ、本明細書中に記載の操作されたβ−グルコシダーゼの関連する機能活性および／または改良された特性が維持される。挿入は、β−グルコシダーゼポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端または内部に存在し得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本明細書中の操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドは、配列番号２２〜２９４の範囲内の偶数番号の配列から選択される配列、および任意選択で、１つまたは複数の（例えば、最大３、４、５、または最大１０の）アミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を含むアミノ酸配列を有することができる。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、または１〜５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列数は、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
【０１５２】
上記の実施形態では、操作されたポリペプチドの適切な反応条件は、表２．１、３．１および／または５．１に提供され、実施例２、３および５ならびに他の実施例に記載される通りである。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、操作されたポリペプチドが他のポリペプチド（制限されない例として、抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープ）、精製配列（例えば、金属への結合のためのＨｉｓタグ）、および細胞局在化シグナル（例えば、分泌シグナル）など）に融合した融合ポリペプチドである。したがって、本明細書中に記載の操作されたポリペプチドを、他のポリペプチドに融合するか融合せずに使用することができる。
【０１５４】
本明細書中に記載のポリペプチドが遺伝的にコードされたアミノ酸に制限されないと理解すべきである。遺伝的にコードされたアミノ酸に加えて、本明細書中に記載のポリペプチドは、その全体または一部が、天然に存在し、そして／または合成によるコードされないアミノ酸から構成され得る。本明細書中に記載のポリペプチドを構成することができる一定の一般的に認められる非コードアミノ酸には、以下が含まれるが、これらに限定されない：遺伝的にコードされたアミノ酸のＤ−ステレオマー；２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ−ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２−クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３−フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２−ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３−ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４−ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２−メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３−メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４−メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２−ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３−ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２−シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４−アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４−ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４−アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド−２−イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド−３−イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド−４−イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフト−１−イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフト−２−イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルアラニン（ｓｔｙｒｙｌｋａｌａｎｉｎｅ）（ｓＡｌａ）；アントリルアラニン（ａｕｔｈｒｙｌａｌａｎｉｎｅ）（ａＡｌａ）；３，３−ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３−アミノ−５−フェニルペンタン酸（３−ａｍｉｎｏ−５−ｐｈｅｎｙｐｅｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）−ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリジン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（ｈｏｍｏｇｌｕｔａｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ｈＧｌｕ）；１−アミノシクロペント−（２または３）−エン−４  カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）、アゼチジン−３−カルボン酸（ＡＣＡ）；１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸；アリルグリシン（ａＧｌｙ）；プロパルギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）、ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）。本明細書中に記載のポリペプチドを構成することができるさらなるコードされないアミノ酸は、当業者に明らかであろう（例えば、Ｆａｓｍａｎ，ＣＲＣ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ｐｐ．３−７０［１９８９］、および引用文献（その全てが本明細書中で参照によって組み込まれる）に記載の種々のアミノ酸を参照のこと）。これらのアミノ酸は、Ｌ立体配置またはＤ立体配置のいずれかであり得る。
【０１５５】
当業者は、側鎖保護基を保有するアミノ酸または残基が本明細書中に記載のポリペプチドを構成することもできると認識するであろう。この場合に芳香族カテゴリーに属するかかる保護されたアミノ酸の非限定的な例には、以下が含まれるが、これらに限定されない（カッコ内に保護基を列挙する）：Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ−ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ−δ−キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ−ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ−ベンジル）、およびＴｙｒ（Ｏ−ベンジル）。
【０１５６】
本明細書中に記載のポリペプチドを構成することができるコンフォメーションが拘束された非コードアミノ酸には、Ｎ−メチルアミノ酸（Ｌ−立体配置）；１−アミノシクロペント−（２または３）−エン−４−カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン−３−カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、例えば、実質的に精製された酵素としての単離された調製物、酵素をコードする遺伝子を使用して形質転換されたホールセル、ならびに／またはかかる細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解物などの種々の形態であり得る。酵素は、以下でさらに考察するように、凍結乾燥形態、噴霧乾燥形態、沈殿形態、または粗ペースト形態であり得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドを、固体支持体（膜、樹脂、固体キャリア、または他の固相材料など）上に提供し得る。固体支持体は、有機ポリマー（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミドなど）、ならびにそのコポリマーおよびグラフトから構成され得る。固体支持体は、ガラス、シリカ、孔制御ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金属（金または白金など）などの無機固体支持体でもあり得る。固体支持体の構成は、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、膜、または面の形態であり得る。面は、平面、実質的平面、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であってよく、膨潤性または非膨潤性であり得る。固体支持体を、ウェル、窪み、または他の容器、管の形態、特徴、または位置で構成することができる。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、本発明のβ−グルコシダーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを、このポリペプチドが配列番号１２および／または１４の参照のポリペプチドと比較した場合に改良された活性、および／または他の改良された特性を保持するように固体支持体上に固定することができる。かかる実施形態では、固定されたポリペプチドは、基質化合物の生成物への生体触媒変換を容易にすることができ、反応完了後に容易に保持され（例えば、ポリペプチドが固定されたビーズの保持による）、次いで、その後の反応で再利用またはリサイクルされる。かかる酵素の固定化プロセスによりさらに効率が上がり、経費が抑えられる。したがって、本発明のβ−グルコシダーゼポリペプチドの任意の使用方法を、固体支持体に結合または固定された同一のグルコシルトランスフェラーゼポリペプチドを使用して実施することができることがさらに意図される。
【０１６０】
酵素の固定方法は、当該分野で周知である。操作されたポリペプチドを、非共有結合または共有結合することができる。固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）への酵素の種々のコンジュゲーションおよび固定方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｙｉら，Ｐｒｏｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４２（５）：８９５−８９８［２００７］；Ｍａｒｔｉｎら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７６（４）：８４３−８５１［２００７］；Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔ．Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，６３：３９−４４［２０１０］；Ｔｒｕｐｐｏら，Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｏｐ２００１５７ｃ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍ［２００８］；Ｍａｔｅｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１８（３）：６２９−３４［２００２］；およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｉｅｍｅｙｅｒ（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ［２００４］（それぞれの開示は、本明細書中で参照によって組み込まれる）を参照のこと）。本発明の操作されたβ−グルコシダーゼの固定に有用な固体支持体には、エポキシド官能基を有するポリメタクリラート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリラート、スチレン／ＤＶＢコポリマー、またはオクタデシル官能基を有するポリメタクリラートを含むビーズまたは樹脂が含まれるが、これらに限定されない。本発明の操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドの固定に有用な固体支持体の例には、キトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃ、およびＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）（以下の異なるタイプのＳＥＰＡＢＥＡＤが含まれる：ＥＣ−ＥＰ、ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９、およびＥＸＥ１２０）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のポリペプチドを、キットの形態で提供される。キット中の酵素は、個別に存在し得るか、複数の酵素として存在し得る。キットは、酵素反応を行うための試薬、酵素活性を評価するための基質、および生成物を検出するための試薬をさらに含むことができる。キットはまた、試薬用ディスペンサーおよびキットの使用説明書を含むことができる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本発明のキットは、異なるアドレス可能位置に複数の異なるβ−グルコシダーゼポリペプチドを含むアレイを含み、異なるポリペプチドが、それぞれが少なくとも１つの異なる改良された酵素の特性を有する参照配列の異なるバリアントである。いくつかの実施形態では、固体支持体上に固定した複数のポリペプチドは、ロボットによる試薬送達のためにアドレス可能であるか、検出方法および／または検出装置によってアレイの種々の位置に構成される。アレイを使用して、ポリペプチドによる変換について種々の基質化合物を試験することができる。複数の操作されたポリペプチドを含むかかるアレイおよびその使用方法は当該分野で公知である（例えば、ＷＯ２００９／００８９０８Ａ２号を参照のこと）。
【０１６３】
操作されたβ−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載の操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドを、遺伝子発現を調節する１つまたはそれを超える異種制御配列に作動可能に連結してポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作製することができる。操作されたβ−グルコシダーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応するβ−グルコシダーゼポリペプチドを発現させる。
【０１６４】
当業者に明らかなように、タンパク質配列の利用可能性および種々のアミノ酸に対応するコドンの知識により、対象ポリペプチドをコードすることができる全てのポリヌクレオチドが説明される。同一のアミノ酸が代替コドンまたは同義語コドンによってコードされる遺伝暗号の縮重により、非常に多数の核酸を作製することが可能であり、その核酸の全てが改良されたβ−グルコシダーゼ酵素をコードする。したがって、特定のアミノ酸配列の知識を有することにより、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変えない方法で１つまたはそれを超えるコドンの配列を改変するだけでいくつもの異なる核酸を作製することができる。これに関して、本発明は、可能なコドンの選択に基づいた組み合わせの選択による本明細書中に記載のポリペプチドをコードする作製可能なポリヌクレオチドのそれぞれおよびあらゆる可能なバリエーションを具体的に意図し、全てのかかるバリエーションは、本明細書中に記載の任意のポリペプチド（表２．１、３．１および５．１に表された、本明細書中で参照によって組み込まれた配列表に配列番号２２〜２９４の範囲のうち偶数番号の配列として開示したアミノ酸配列が含まれる）について具体的に開示されると見なされるものとする。
【０１６５】
種々の実施形態では、タンパク質が生成される宿主細胞に適合するようにコドンを選択することが好ましい。例えば、細菌中で遺伝子を発現するために細菌中で使用される好ましいコドンを使用し；酵母中での発現のために酵母中で使用される好ましいコドンを使用し；哺乳動物細胞中での発現のために哺乳動物中で使用される好ましいコドンを使用する。いくつかの実施形態では、天然の配列が好ましいコドンを含み、好ましいコドンの使用が全てのアミノ酸残基に必要でないかもしれないので、全てのコドンがβ−グルコシダーゼのコドン使用頻度を最適化するために置換される必要はない。したがって、β−グルコシダーゼ酵素をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、全長コード領域のコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を超える位置で好ましいコドンを含み得る。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１２、１４、２９６、および／または２９８によって示される天然に存在するβ−グルコシダーゼポリペプチドアミノ酸配列をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２２〜２９４の範囲中の偶数番号の配列をコードするコドン最適化された核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を含む核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２１〜２９３の範囲中の奇数番号、ならびに配列番号１１、１３、１５、１７および１９の配列におけるコドン最適化された核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を含む核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２１〜２９３の範囲中の奇数番号、ならびに配列番号１１、１３、１５、１７および１９の配列のコドン最適化された配列は、コードされた野生型β−グルコシダーゼの発現を増強し、それにより、基質を生成物に変換できる酵素が調製される。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシー条件下で配列番号３〜２９９の奇数番号の配列から選択される参照配列またはその相補物とハイブリッド形成することができ、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、上記のように、ポリヌクレオチドは、配列番号１２および／または１４と比較した場合に改良された特性を有するβ−グルコシダーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは、配列番号１２および／または１４から選択される参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性、配列番号１２および／または１４と比較した場合に１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を含み、ここで配列は、配列番号２２〜２９４の範囲中の偶数番号から選択される。いくつかの実施形態では、参照アミノ酸配列は配列番号２２〜２９４の範囲中の偶数番号の配列から選択される。いくつかの実施形態では、参照アミノ酸配列は配列番号１２であり、他方、いくつかの他の実施形態では、参照配列は配列番号１４である。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１２、１４、２９６および／または３００と比較した場合に改良された特性を有する基質を生成物に変換することが可能なβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドは、配列番号１２、１４、２９６および／または３００の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、操作されたβ−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２１〜２９３の範囲の奇数番号の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、高ストリンジェント条件下で配列番号２１〜２９３の範囲中の奇数番号の配列から選択される基準ポリヌクレオチド配列またはその相補物とハイブリッド形成することができ、本明細書中に記載の改良された特性のうちの１つまたはそれより多くを有するβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、高ストリンジェント条件下でハイブリッド形成することができるポリヌクレオチドは、配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含み、３１、３２、３４、３６、３７、３８、５７／９１、５８、５９、６０、６１、６２、６２／４０３、６６、７０、８９、８９／１８７、９１／５９５、１２４／２９７、１２５、１２６／１８８、１３３、１３８／２９６、１４７、１５０、１８４、１８６、１８７、２３０、２３１、２３３、２６６、２９６、２９７、４０３、４０５、４４９、４５０、４９２、５９０および６０１から選択される残基位置に、配列番号１２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を有するβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードする。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、高ストリンジェント条件下で配列番号２１〜２９３の範囲中の奇数番号の配列から選択される基準ポリヌクレオチド配列またはその相補物とハイブリッド形成することができ、本明細書中に記載の改良された特性のうちの１つまたはそれより多くを有するβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、高ストリンジェント条件下でハイブリッド形成することができるポリヌクレオチドは、配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含み、３２、３４、３６、５７／９１、５８、５９、６０、６２、６２／４０３、６６、８９、８９／１８７、９１／５９５、１２４／２９７、１２６／１８８、１３３、１３８／２９６、１４７、１５０、１８４、１８６、１８７、２３０、２３１、２３３、２６６、２９６、２９７、４０３、４０５、４４９、４９２、５９０および６０１から選択される残基位置に、配列番号１２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を有するβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードする。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、高ストリンジェント条件下でハイブリッド形成することができるポリヌクレオチドは、配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える同一性、および１５、１６、１６／８４、１７、１９、２１、３５、４５、５５、７６、７９、１２１、１６４、１６８、１６８／２５６、１７０、１７９、２１５／４１３、２２１、２２１／３１１、２２５、２４７、３１３、３５１、３５６、４０２、４０４、４０５、４０９、４１１、４１２、４１３および４１４から選択される残基位置に、配列番号１４と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するアミノ酸配列を含む、改良された特性を有するβ−グルコシダーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、高ストリンジェント条件下でハイブリッド形成することができるポリヌクレオチドは、配列番号２９６および／または２９８と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含む、改良された特性を有するβ−グルコシダーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載のポリペプチドをコードするが、操作されたβ−グルコシダーゼをコードする参照ポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれを超える配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号２１〜２９３から選択される。
【０１７５】
本明細書で提供される操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発現させる種々の方法で操作する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を制御するための１つまたはそれを超える調節配列が存在する発現ベクターとして提供する。発現ベクターに応じて単離されたポリヌクレオチドをベクターへの挿入前に操作することが望ましいか必要かもしれない。組換えＤＮＡ法を利用したポリヌクレオチドおよび核酸配列の改変技術は、当該分野で周知である。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、調節配列には、他の配列の中でも、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが含まれる。当該技術分野で公知のように、適切なプロモーターを、使用する宿主細胞に基づいて選択することができる。細菌宿主細胞のために、本出願の核酸構築物の転写の指示に適切なプロモーターには、これらに限定されないが、大腸菌ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、および原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子（例えば、Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１［１９７８］を参照のこと）から得たプロモーター、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５［１９８３］を参照のこと）が含まれる。糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターには、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（例えば、ＷＯ９６／００７８７号を参照のこと）の遺伝子から得たプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、その変異プロモーター、短縮プロモーター、およびハイブリッドプロモーターが含まれる。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来し得る遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは当該分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８［１９９２］を参照のこと）。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、調節配列は、適切な転写終結配列（転写を終結させるために宿主細胞によって認識される配列）である。終結配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞で機能する任意のターミネーターを、本発明で有用である。例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのα−グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターを、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロム  Ｃ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、当該分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら，前出を参照のこと）。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、調節配列は、適切なリーダー配列（宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞で機能する任意のリーダー配列を使用することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得る。酵母宿主細胞に適切なリーダーは、これらに限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られるものが挙げられる。調節配列はまた、ポリアデニル化配列（核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写時に転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞によって認識される配列）であり得る。最適な宿主細胞で機能する任意のポリアデニル化配列を、本発明で使用することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列として、これらに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  α−グルコシダーゼの遺伝子に由来するものが挙げられる。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、当該分野で公知である（例えば、Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．，１５：５９８３−５９９０［１９９５］を参照のこと）。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結したアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に方向づけるシグナルペプチドコード領域である。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと共に翻訳読み枠中に天然に連結したシグナルペプチドコード領域を固有に含むことができる。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来のシグナルペプチドコード領域を含むことができる。発現されたポリペプチドを最適な宿主細胞の分泌経路に方向づける任意のシグナルペプチドコード領域は、本明細書で提供される操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドの発現に有用である。細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域として、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣｌＢ  １１８３７マルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  α−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  β−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡの遺伝子から得たシグナルペプチドコード領域が挙げられる。さらなるシグナルペプチドは、当該分野で公知である（例えば、Ｓｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５７：１０９−１３７［１９９３］を参照のこと）。糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域として、これらに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得たシグナルペプチドコード領域が挙げられる。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドとして、これらに限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子に由来するものが挙げられる。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に配置されたアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域である。得られたポリペプチドは、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」またはいくつかの場合「酵素原」と称される。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的切断または自己触媒的切断によって活性な成熟ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域として、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子由来のものが挙げられる（例えば、ＷＯ９５／３３８３６号を参照のこと）。シグナルペプチド領域およびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端に隣接し、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端に隣接する。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、制御配列も使用される。これらの配列は、宿主細胞の成長に関連するポリペプチドの発現の制御を促進する。制御系の例は、化学的刺激または物理的刺激（制御化合物の存在が含まれる）に応答して遺伝子発現をオンまたはオフにする制御系である。原核生物宿主細胞では、適切な制御配列には、これらに限定されないが、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐのオペレーター系が含まれる。酵母宿主細胞では、適切な制御系には、これらに限定されないが、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が含まれる。糸状菌では、適切な制御配列には、これらに限定されないが、ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが含まれる。
【０１８２】
本発明はまた、操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および導入される宿主のタイプに応じて１つまたはそれを超える発現制御領域（プロモーターおよびターミネーターなど）、複製起点などを含む組換え発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、上記の種々の核酸および調節配列を共に組み合わせて組換え発現ベクターを産生し、この組換え発現ベクターは、１つまたはそれを超える都合の良い制限部位を含み、この制限部位は、かかる部位でのバリアントβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換が可能である。あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列を、ポリヌクレオチド配列または該ポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物を発現に適切なベクター内に挿入することによって発現する。発現ベクターの作製では、コード配列が発現に適切な調節配列と作動可能に連結されるようにコード配列をベクター中に配置する。
【０１８３】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に都合よく供することができ、且つバリアントβ−グルコシダーゼポリヌクレオチド配列を発現することができる任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターとベクターを導入すべき宿主細胞との適合性に依存するであろう。ベクターは、線状プラスミドまたは閉じた環状プラスミドであり得る。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、自己複製ベクター（すなわち、染色体外実体として存在するベクターであり、その複製は染色体複製、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体から独立している）である。ベクターは、自己複製を保証する任意の手段を含むことができる。いくつかの代替的な実施形態では、、ベクターは、宿主細胞に導入された場合にゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と共に複製されるベクターであり得る。さらに、単一のベクターまたはプラスミドまたは宿主細胞のゲノムに導入されるべきＤＮＡの全てを共に含む２つまたはそれを超えるベクターまたはプラスミド、またはトランスポゾンを使用することができる。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、形質転換した細胞を容易に選択することができる１つまたはそれを超える選択マーカーを含むことが好ましい。選択マーカーは、その産物が殺生物剤耐性またはウイルス耐性、重金属耐性、および栄養素要求体に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。細菌選択マーカーの例として、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、あるいは、抗生物質耐性（アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリンへの耐性など）を付与するマーカーが挙げられる。酵母宿主細胞に適切なマーカーには、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３が含まれるが、これらに限定されない。糸状菌宿主細胞で用いる選択マーカーには、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにその等価物が含まれるが、これらに限定されない。別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つの操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、このポリヌクレオチドが宿主細胞中で操作されたβ−グルコシダーゼ酵素の発現のための１つまたはそれを超える調節配列に作動可能に連結されている、宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによってコードされたポリペプチドの発現で用いる宿主細胞は、当該分野で周知であり、細菌細胞（大腸菌細胞、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞など）；真菌細胞（酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞［ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８］）など）；昆虫細胞（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞など）；動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞など）；および植物細胞が含まれるが、これらに限定されない。例示的な宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株（例えば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１）である。
【０１８６】
したがって、別の態様では、本発明は、操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドを生成する方法であって、ポリペプチドの発現に適切な条件下で操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書中に記載のように、β−グルコシダーゼポリペプチドを単離および／または精製する工程をさらに含む。
【０１８７】
上記宿主細胞の適切な培養培地および成長条件は当該分野で周知である。β−グルコシダーゼポリヌクレオチド発現のためのポリヌクレオチドを、当該分野で公知の種々の方法によって細胞に導入することができる。技術には、とりわけ、エレクトロポレーション、遺伝子銃粒子衝突、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が含まれる。
【０１８８】
本明細書中に開示の特性を有する操作されたβ−グルコシダーゼを、天然に存在するか操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当該分野で公知であり、且つ本明細書中に記載の変異誘発法および／または定向進化法（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）に供することによって得ることができる。例示的な定向進化技術は、変異誘発および／またはＤＮＡシャフリングである（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１［１９９４］；ＷＯ９５／２２６２５号；ＷＯ９７／００７８号；ＷＯ９７／３５９６６号；ＷＯ９８／２７２３０号；ＷＯ００／４２６５１号；ＷＯ０１／７５７６７号、および米国特許第６，５３７，７４６号を参照のこと）。使用することができる他の定向進化手順には、とりわけ、付着伸長プロセス（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳｔＥＰ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え（例えば、Ｚｈａｏら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：２５８−２６１［１９９８］を参照のこと）、変異誘発ＰＣＲ（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，３：Ｓ１３６−Ｓ１４０［１９９４］を参照のこと）、およびカセット式変異誘発（例えば、Ｂｌａｃｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：３５２５−３５２９［１９９６］を参照のこと）が含まれる。
【０１８９】
例えば、変異誘発法および定向進化法を、発現、スクリーニング、およびアッセイが可能なバリアントライブラリーを生成するために、ポリヌクレオチドに容易に適用することができる。変異誘発法および定向進化法は当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８３０，７２１号、同第６，１３２，９７０号、同第６，４２０，１７５号、同第６，２７７，６３８号、同第６，３６５，４０８号、同第６，６０２，９８６号、同第７，２８８，３７５号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２９７，０５３号、同第６，５７６，４６７号、同第６，４４４，４６８号、同第５，８１１２３８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２９１，２４２号、同第６，９９５，０１７号、同第６，３９５，５４７号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５０６，６０３号、同第６，４１３，７７４号、同第６，５７３，０９８号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３７２，４９７号、同第７，８６８，１３８号、同第５，８３４，２５２号、同第５，９２８，９０５号、同第６，４８９，１４６号、同第６，０９６，５４８号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３５８，７４２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，３３５，１６０号、同第６，６５３，０７２号、同第６，３５５，４８４号、同第６，３０３，３４４号、同第６，３１９，７１３号、同第６，６１３，５１４号、同第６，４５５，２５３号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，４０６，８５５号、同第６，９４６，２９６号、同第７，５３４，５６４号、同第７，７７６，５９８号、同第５，８３７，４５８号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３０９，８８３号、同第７，１０５，２９７号、同第７，７９５，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，２５１，６７４号、同第６，７１６，６３１号、同第６，５２８，３１１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３７９，９６４号、同第７，１４８，０５４号、同第７，６２９，１７０号、同第７，６２０，５００号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３５８，７４０号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４３６，６７５号、同第６，９６１，６６４号、同第６，５３７，７４６号、同第７，４３０，４７７号、同第７，８７３，４９９号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第６，３７６，２４６号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４７９，６５２号、同第６，３１９，７１４号、同第６，５２１，４５３号、同第６，３６８，８６１号、同第７，４２１，３４７号、同第７，０５８，５１５号、同第７，０２４，３１２号、同第７，６２０，５０２号、同第７，８５３，４１０号、同第７，９５７，９１２号、同第７，９０４，２４９号、同第８，３８３，３４６号、同第８，５０４，４９８号、同第８，７６８，８７１号、同第８，７６２，０６６号、同第８，８４９，５７５号および全ての関連非米国対応出願；Ｌｉｎｇら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５４：１５７−７８［１９９７］；Ｄａｌｅら、Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５７：３６９−７４［１９９６］；Ｓｍｉｔｈ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １９：４２３−４６２［１９８５］；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２９：１１９３−１２０１［１９８５］；  Ｃａｒｔｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ２３７：１−７［１９８６］；Ｋｒａｍｅｒら、Ｃｅｌｌ，  ３８：８７９−８８７  ［１９８４］；  Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ，  ３４：３１５−３２３［１９８５］；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら、  Ｃｕｒｒ．    Ｏｐ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ３：２８４−２９０［１９９９］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １７：２５９−２６４［１９９９］；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１：２８８−２９１［１９９８］；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １５：４３６−４３８［１９９７］；Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．    Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９４：４５０４−４５０９［１９９７］；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １４：３１５−３１９［１９９６］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３７０：３８９−３９１［１９９４］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９１：１０７４７−１０７５１［１９９４］；ＷＯ  ９５／２２６２５；ＷＯ  ９７／００７８；ＷＯ  ９７／３５９６６；ＷＯ  ９８／２７２３０；ＷＯ  ００／４２６５１；ＷＯ  ０１／７５７６７；ＷＯ  ２００９／１５２３３６、ＷＯ  ２００９／１０２９０１、ＷＯ  ２００９／１０２８９９、ＷＯ  ２０１１／０３５１０５、ＷＯ  ２０１３／１３８３３９、ＷＯ  ２０１３／００３２９０、ＷＯ  ２０１４／１２０８１９、ＷＯ  ２０１４／１２０８２１、ＷＯ  ２０１５／０１３４３１５、およびＷＯ  ２０１５／０４８５７３を参照のこと（その全てが、本明細書中で参照によって組み込まれる））。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、変異誘発処理後に得られた酵素クローンを、酵素を規定の温度（または広範な基質にわたる酵素活性の試験などの他のアッセイ条件）に供し、熱処理または他のアッセイ条件後の酵素活性の残存量を測定することによってスクリーニングする。次に、β−グルコシダーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むクローンを配列決定してヌクレオチド配列の変化（存在する場合）を同定し、これを使用して宿主細胞中で酵素を発現させる。発現ライブラリー由来の酵素活性の測定を、当該技術分野において公知の任意の適切な方法（例えば、標準的な生化学技術（ＨＰＬＣ分析など））を使用して行うことができる。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、変異誘発処理後に得られたクローンを、１つまたはそれを超える望ましい改良された酵素特性（例えば、改良された位置選択性）を有する操作されたβ−グルコシダーゼについてスクリーニングすることができる。発現ライブラリー由来の酵素活性の測定を、標準的な生化学技術（ＨＰＬＣ分析および／または生成物の誘導体化（分離前または分離後）（例えば、ダンシルクロリドまたはＯＰＡを使用（例えば、Ｙａｅｇａｋｉら、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  ３５６（１）：１６３−７０［１９８６］を参照のこと）など）を使用して行うことができる。
【０１９２】
操作されたポリペプチドの配列が既知の場合、酵素をコードするポリヌクレオチドを、公知の合成方法にしたがった標準的な固相法によって調製することができる。いくつかの実施形態では、約１００塩基までのフラグメントを、個別に合成し、次いで、接合して（例えば、酵素的もしくは化学的なライゲーション（ｌｉｔｉｇａｔｉｏｎ）法、またはポリメラーゼ媒介法による）、任意の所望の連続配列を形成することができる。例えば、β−グルコシダーゼの一部をコードするポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを、自動化合成法で典型的に実施されるように、当該技術分野で知られる通りに（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−６９［１９８１］の古典的なホスホルアミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，３：８０１−０５［１９８４］によって記載される方法）を使用した化学合成によって調製することができる。ホスホルアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドを、（例えば、自動ＤＮＡ合成機で）合成し、精製し、アニーリングし、適切なベクター中にライゲーションし、クローニングする。さらに、本質的に任意の核酸を、種々の販売者のうちのいずれかから得ることができる。いくつかの実施形態では、さらなるバリエーションを、欠失、挿入、および／または置換を含むオリゴヌクレオチドを合成し、種々の順序でオリゴヌクレオチドを組み合わせて特性が改良された操作されたβ−グルコシダーゼを作製することによって作製することができる。
【０１９３】
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたβ−グルコシダーゼのポリペプチドを調製する方法は、（ａ）配列番号２２〜２９４の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、３１、３２、３４、３６、３７、３８、５７／９１、５８、５９、６０、６１、６２、６２／４０３、６６、７０、８９、８９／１８７、９１／５９５、１２４／２９７、１２５、１２６／１８８、１３３、１３８／２９６、１４７、１５０、１８４、１８６、１８７、２３０、２３１、２３３、２６６、２９６、２９７、４０３、４０５、４４９、４５０、４９２、５９０および６０１から選択される位置に、配列番号１２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成する工程；および（ｂ）前述のポリヌクレオチドによってコードされるβ−グルコシダーゼポリペプチドを発現させる工程を含む。
【０１９４】
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたβ−グルコシダーゼのポリペプチドを調製する方法は、（ａ）配列番号２２〜２９４の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、３１Ｃ／Ｇ、Ｖ３２Ｇ／Ｐ／Ｓ、３４Ｉ／Ｐ、３６Ｐ、３７Ｋ／Ｗ、３８Ｅ、５７Ｒ／９１Ｐ、５８Ｐ、５９Ｒ、６０Ｃ／Ｒ／Ｖ、６１Ｒ、６２Ｎ、６２Ｐ／４０３Ｒ、６６Ｇ／Ｎ、７０Ｗ、８９Ｌ、８９Ｓ／１８７Ｒ、９１Ｇ／５９５Ｖ、１２４Ｄ／２９７Ｐ、１２５Ｇ、１２６Ｖ／１８８Ｒ、１３３Ｇ／Ｒ、１３８Ｇ／２９６Ｓ、１４７Ｌ、１５０Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｔ、１８４Ａ／Ｒ、１８６Ｅ、１８７Ｇ／Ｎ／Ｙ、２３０Ｆ／Ｈ／Ｉ、２３１Ｇ／Ｒ、２３３Ｌ／Ｐ／Ｑ、２６６Ｆ／Ｇ、２９６Ｒ／Ｔ、２９７Ｒ、４０３Ｅ／Ｐ、４０５Ｒ、４４９Ｇ／Ｐ、４５０Ｇ、４９２Ｐ、５９０Ｗ、６０１Ａ／Ｅ／Ｌ、６０１Ｅ、および６０１Ｌから選択される、配列番号１２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成する工程；および（ｂ）前述のポリヌクレオチドによってコードされるβ−グルコシダーゼポリペプチドを発現させる工程を含む。
【０１９５】
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたβ−グルコシダーゼのポリペプチドを調製する方法は、（ａ）配列番号２２〜２９４の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｐ３１Ｃ／Ｇ、Ｖ３２Ｇ／Ｐ／Ｓ、Ｇ３４Ｉ／Ｐ、Ｉ３６Ｐ、Ｔ３７Ｋ／Ｗ、Ｔ３８Ｅ、Ｇ５７Ｒ／Ｉ９１Ｐ、Ｌ５８Ｐ、Ｆ５９Ｒ、Ｎ６０Ｃ／Ｒ／Ｖ、Ｌ６１Ｒ、Ｋ６２Ｎ、Ｋ６２Ｐ／Ｗ４０３Ｒ、Ｒ６６Ｇ／Ｎ、Ｖ７０Ｗ、Ｄ８９Ｌ、Ｄ８９Ｓ／Ｈ１８７Ｒ、Ｉ９１Ｇ／Ｇ５９５Ｖ、Ａ１２４Ｄ／Ｖ２９７Ｐ、Ｓ１２５Ｇ、Ａ１２６Ｖ／Ｆ１８８Ｒ、Ｆ１３３Ｇ／Ｒ、Ｄ１３８Ｇ／Ｍ２９６Ｓ、Ｒ１４７Ｌ、Ｅ１５０Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｔ、Ｃ１８４Ａ／Ｒ、Ｋ１８６Ｅ、Ｈ１８７Ｇ／Ｎ／Ｙ、Ｍ２３０Ｆ／Ｈ／Ｉ、Ａ２３１Ｇ／Ｒ、Ｆ２３３Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｙ２６６Ｆ／Ｇ、Ｍ２９６Ｒ／Ｔ、Ｖ２９７Ｒ、Ｗ４０３Ｅ／Ｐ、Ｖ４０５Ｒ、Ｍ４４９Ｇ／Ｐ、Ｆ４５０Ｇ、Ｓ４９２Ｐ、Ｒ５９０Ｗ、およびＦ６０１Ａ／Ｅ／Ｌから選択される、配列番号１２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成する工程；および（ｂ）前述のポリヌクレオチドによってコードされるβ−グルコシダーゼポリペプチドを発現させる工程を含む。
【０１９６】
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたβ−グルコシダーゼのポリペプチドを調製する方法は、（ａ）配列番号２２〜２９４の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、３２、３４、３６、５７／９１、５８、５９、６０、６２、６２／４０３、６６、８９、８９／１８７、９１／５９５、１２４／２９７、１２６／１８８、１３３、１３８／２９６、１４７、１５０、１８４、１８６、１８７、２３０、２３１、２３３、２６６、２９６、２９７、４０３、４０５、４４９、４９２、５９０および６０１から選択される位置に、配列番号１２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成する工程；および（ｂ）前述のポリヌクレオチドによってコードされるβ−グルコシダーゼポリペプチドを発現させる工程を含む。
【０１９７】
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたβ−グルコシダーゼのポリペプチドを調製する方法は、（ａ）配列番号２２〜２９４の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、３２Ｇ／Ｐ／Ｓ、３４Ｉ／Ｐ、３６Ｐ、５７Ｒ／９１Ｐ、５８Ｐ、５９Ｒ、６０Ｃ／Ｒ／Ｖ、６２Ｎ、６２Ｐ／４０３Ｒ、６６Ｎ、８９Ｌ、８９Ｓ／１８７Ｒ、９１Ｇ／５９５Ｖ、１２４Ｄ／２９７Ｐ、１２６Ｖ／１８８Ｒ、１３３Ｇ／Ｒ、１３８Ｇ／，２９６Ｓ、１４７Ｌ、１５０Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｔ、１８４Ｒ、１８６Ｅ、１８７Ｇ、１８７Ｎ／Ｙ、２３０Ｆ／Ｈ／Ｉ、２３１Ｇ／Ｒ、２３３Ｐ／Ｑ、２６６Ｆ／Ｇ、２９６Ｒ／Ｔ、２９７Ｒ、４０３Ｅ／Ｐ、４０５Ｒ、Ｍ４４９Ｇ／Ｐ、４９２Ｐ、５９０Ｗ、および６０１Ａ／Ｅ／Ｌから選択される、配列番号１２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成する工程；および（ｂ）前述のポリヌクレオチドによってコードされるβ−グルコシダーゼポリペプチドを発現させる工程を含む。
【０１９８】
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたβ−グルコシダーゼのポリペプチドを調製する方法は、（ａ）配列番号２２〜２９４の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｖ３２Ｇ／Ｐ／Ｓ、Ｇ３４Ｉ／Ｐ、Ｉ３６Ｐ、Ｇ５７Ｒ／Ｉ９１Ｐ、Ｌ５８Ｐ、Ｆ５９Ｒ、Ｎ６０Ｃ／Ｒ／Ｖ、Ｋ６２Ｎ、Ｋ６２Ｐ／Ｗ４０３Ｒ、Ｒ６６Ｎ、Ｄ８９Ｌ、Ｄ８９Ｓ／Ｈ１８７Ｒ、Ｉ９１Ｇ／Ｇ５９５Ｖ、Ａ１２４Ｄ／Ｖ２９７Ｐ、Ａ１２６Ｖ／Ｆ１８８Ｒ、Ｆ１３３Ｇ／Ｒ、Ｄ１３８Ｇ／Ｍ２９６Ｓ、Ｒ１４７Ｌ、Ｅ１５０Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｔ、Ｃ１８４Ｒ、Ｋ１８６Ｅ、Ｈ１８７Ｇ／Ｎ／Ｙ、Ｍ２３０Ｆ／Ｈ／Ｉ、Ａ２３１Ｇ／Ｒ、Ｆ２３３Ｐ／Ｑ、Ｙ２６６Ｆ／Ｇ、Ｍ２９６Ｒ／Ｙ、Ｖ２９７Ｒ、Ｗ４０３Ｅ／Ｐ、Ｖ４０５Ｒ、Ｍ４４９Ｇ／Ｐ、Ｓ４９２Ｐ、Ｒ５９０Ｗ、およびＦ６０１Ａ／Ｅ／Ｌから選択される、配列番号１２と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成する工程；および（ｂ）前述のポリヌクレオチドによってコードされるβ−グルコシダーゼポリペプチドを発現させる工程を含む。
【０１９９】
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたβ−グルコシダーゼのポリペプチドを調製する方法は、（ａ）配列番号１７４〜２９４の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、１５、１６、１６／８４、１７、１９、２１、３５、４５、５５、７６、７９、１２１、１６４、１６８、１６８／２５６、１７０、１７９、２１５／４１３、２２１、２２１／３１１、２２５、２４７、３１３、３５１、３５６、４０２、４０４、４０５、４０９、４１１、４１２、４１３、および４１４から選択される位置に、配列番号１４と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成する工程；および（ｂ）前述のポリヌクレオチドによってコードされるβ−グルコシダーゼポリペプチドを発現させる工程を含む。
【０２００】
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたβ−グルコシダーゼのポリペプチドを調製する方法は、（ａ）配列番号１７４〜２９４の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、１５Ｓ、１６Ａ／Ｇ、１６Ｓ／８４Ｈ、１７Ｇ、１９Ｇ、２１Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｓ、３５Ａ／Ｇ、４５Ｌ、５５Ｐ、７６Ｇ／Ｌ、７６Ｌ、７９Ｔ、１２１Ｓ、１６４Ｙ、１６８Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｌ／Ｓ、１６８Ｑ／２５６Ｖ、１７０Ｈ、１７９Ｈ／Ｒ、２１５Ｓ／４１３Ｐ、２２１Ｃ／Ｇ／Ｔ、２２１Ｐ／３１１Ｖ、２２５Ｈ／Ｎ／Ｙ、Ｖ２４７Ｇ／Ｉ／Ｌ、３１３Ｖ、３５１Ａ／Ｌ、３５６、４０２Ｋ、４０４Ｐ／Ｓ、４０５Ｈ／Ｗ、４０９Ｔ、４１１Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｒ／Ｔ、４１２Ｌ、４１３Ａ／Ｈ／Ｐ、および４１４Ｄから選択される、配列番号１４と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成する工程；および（ｂ）前述のポリヌクレオチドによってコードされるβ−グルコシダーゼポリペプチドを発現させる工程を含む。
【０２０１】
したがって、いくつかの実施形態では、操作されたβ−グルコシダーゼのポリペプチドを調製する方法は、（ａ）配列番号１７４〜２９４の偶数番号の配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ａ１５Ｓ、Ｔ１６Ａ／Ｇ、Ｔ１６Ｓ／Ｒ８４Ｈ、Ａ１７Ｇ、Ｙ１９Ｇ、Ｉ２１Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｓ、Ｗ３５Ａ／Ｇ、Ｉ４５Ｌ、Ｃ５５Ｐ、Ｙ７６Ｇ／Ｌ、Ｓ７９Ｔ、Ｈ１２１Ｓ、Ｌ１６４Ｙ、Ｗ１６８Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｌ／Ｓ、Ｗ１６８Ｑ／Ａ２５６Ｖ、Ｓ１７０Ｈ、Ｖ１７９Ｈ／Ｒ、Ｐ２１５Ｓ／Ｍ４１３Ｐ、Ｖ２２１Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｖ２２１Ｐ／Ａ３１１Ｖ、Ｔ２２５Ｈ／Ｎ／Ｙ、Ｖ２４７Ｇ／Ｉ／Ｌ、Ｒ３１３Ｖ、Ｔ３５１Ａ／Ｌ、Ａ３５６Ｇ、Ｌ４０２Ｋ、Ｎ４０４Ｐ／Ｓ、Ｆ４０５Ｈ／Ｗ、Ｍ４０９Ｔ、Ｌ４１１Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｒ／Ｔ、Ｓ４１２Ｌ、Ｍ４１３Ａ／Ｈ、Ｍ４１３Ｐ、およびＲ４１４Ｄから選択される、配列番号１４と比較して１つまたはそれを超える残基の相違を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成する工程；および（ｂ）前述のポリヌクレオチドによってコードされるβ−グルコシダーゼポリペプチドを発現させる工程を含む。
【０２０２】
方法のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、任意選択的に１つまたは数個の（例えば、３、４、５まで、または１０までの）アミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する操作されたβ−グルコシダーゼをコードする。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、または１〜５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、任意選択的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、宿主細胞で発現された任意の操作されたβ−グルコシダーゼ酵素は、タンパク質精製のための周知の技術（とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心、およびクロマトグラフィが含まれる）のうちの任意の１つまたは複数を使用して細胞および／または培養培地から回収することができる。大腸菌などの細菌の溶解および高効率のタンパク質抽出に適切な溶液は、市販されている（例えば、ＣｅｌＬｙｔｉｃ  ＢＴＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）。
【０２０４】
β−グルコシダーゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィ技術には、とりわけ、逆相クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、およびアフィニティクロマトグラフィが含まれる。特定の酵素の精製条件は、その一部が、正味荷電、疎水性、親水性、分子量、分子の形状などの要因に依存し、その条件は当業者に明らかであろう。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、親和性技術を使用して、改良されたβ−グルコシダーゼ酵素を単離することができる。アフィニティクロマトグラフィ精製のために、β−グルコシダーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用することができる。抗体生成のために、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどが含まれるが、これらに限定されない）を、β−グルコシダーゼポリペプチドまたはそのフラグメントを使用した注射によって免疫化することができる。β−グルコシダーゼポリペプチドまたはフラグメントを、側鎖官能基または側鎖官能基に取り付けたリンカーによって適切なキャリア（ＢＳＡなど）に取り付けることができる。いくつかの実施形態では、親和性精製は、β−グルコシダーゼによって結合した特異的リガンドまたは色素アフィニティカラム（例えば、欧州特許第０６４１８６２号；およびＳｔｅｌｌｗａｇｅｎ，“Ｄｙｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，”Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｕｎｉｔ  ９．２−９．２．１６［２００１］を参照のこと）を使用することができる。
【０２０６】
操作されたβ−グルコシダーゼ酵素の使用方法
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のβ−グルコシダーゼを、適切な基質をそのβ−グルコシル化生成物に変換するプロセスで使用する。一般に、トランスグルコシル化反応を実施するためのプロセスは、図１に示すように、基質化合物を、β結合したジサッカリド、トリサッカリド、もしくはオリゴサッカリド、またはその混合物（例えば、セロビオース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース、ソホロース、β，β−トレハロース、セロトリオース、セルロースなど）などのグリコシルドナー補基質の存在下で、本発明のβ−グルコシダーゼポリペプチドと、β−グルコシル化生成物の形成に適切な反応条件下にて接触させるかインキュベートする工程を含む。
【０２０７】
本明細書に提供されるおよび実施例に例示の実施形態では、プロセスで使用することができる種々の範囲の適切な反応条件には、基質負荷、共基質負荷、ｐＨ、温度、緩衝液、溶媒系、ポリペプチド負荷、および反応時間に伴う条件が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中に記載の操作されたβ−グルコシダーゼを使用した基質化合物の生成物化合物への生体触媒変換プロセスの実施のためのさらに適切な反応条件を、本明細書中に提供したガイダンスを考慮して、日常的な実験（濃度、ｐＨ、温度、および溶媒条件の実験反応条件下での目的の操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドと基質化合物との接触、ならびに生成物化合物の検出が含まれるが、これらに限定されない）によって容易に最適化することができる。
【０２０８】
操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドを使用した適切な反応条件は、典型的には、ヒドロキシル化反応で化学量論的に使用される補基質を含む。一般に、トランスグルコシル化反応におけるβ−グルコシダーゼのための補基質は、β結合したジサッカリド、トリサッカリド、もしくはオリゴサッカリド、またはその混合物（例えば、セロビオース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース、ソホロース、β，β−トレハロース、セロトリオース、セルロースなど）であり、バイオマス由来のグルコースドナー補基質の混合物であり得る。ジサッカリド補基質を化学量論的に使用するので、補基質は、基質化合物の量と比較して等モルまたはより多い量で存在する（すなわち、補基質のモル濃度は、基質化合物のモル濃度と比較して等しいかより高い）。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、基質化合物のモル濃度の少なくとも１倍、１．５倍、２倍、３倍  ４倍、もしくは５倍またはそれを超えるモル濃度のジサッカリド補基質を含むことができる。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約０．００１Ｍ〜約０．３５Ｍ、０．０１Ｍ〜約０．３５Ｍ、０．１Ｍ〜約０．３５Ｍ、または０．２Ｍ〜約０．３５Ｍの濃度の補基質、特に、セロビオースを含むことができる。いくつかの実施形態では、反応条件は、約０．００１、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４Ｍの濃度の補基質を含む。いくつかの実施形態では、反応中にさらなる補基質を添加することができる。
【０２０９】
反応混合物中の基質化合物を、例えば、生成物化合物の望ましい量、酵素活性に及ぼす基質濃度の影響、反応条件下での酵素の安定性、および生成物に対する基質の変換率を考慮して変更することができる。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約０．５〜約２５ｇ／Ｌ、１〜約２５ｇ／Ｌ、５〜約２５ｇ／Ｌ、約１０〜約２５ｇ／Ｌ、または２０〜約２５ｇ／Ｌの基質化合物負荷を含む。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、または少なくとも約３０ｇ／Ｌ、またはさらに超える基質化合物負荷を含む。本明細書中に提供した基質負荷の値はレバウジオシドＤの分子量に基づくが、等モル量のレバウジオシドＤ、レバウジオシドＡ、ステビオシド、または他の基質の種々の水和物および塩もプロセスで使用することができることも意図する。
【０２１０】
本明細書中に記載のβ−グルコシダーゼ媒介プロセスの実施では、操作されたポリペプチドを、精製酵素、部分精製酵素、酵素をコードする遺伝子で形質転換したホールセルの形態で、かかる細胞の細胞抽出物および／または溶解物として、および／または固体支持体上に固定した酵素として反応混合物に添加することができる。操作されたβ−グルコシダーゼ酵素をコードする遺伝子で形質転換したホールセルまたはその細胞抽出物、溶解物、および単離された酵素を、種々の異なる形態（固体（例えば、凍結乾燥形態、および噴霧乾燥形態など）または半固体（例えば、粗ペースト）が含まれる）で使用することができる。細胞抽出物または細胞溶解物を、沈殿（硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、または熱処理など、およびその後の凍結乾燥前の脱塩手順（例えば、限外濾過および透析など）によって部分精製することができる。任意の酵素調製物（ホールセル調製物が含まれる）を、公知の架橋剤（例えば、グルタルアルデヒドなど）を使用した架橋または固相（例えば、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃなど）への固定によって安定化することができる。
【０２１１】
操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードする遺伝子を、宿主細胞に個別に形質転換するか、同一宿主細胞に共に形質転換することができる。例えば、いくつかの実施形態では、一方の宿主細胞組を、一方の操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換することができ、他方の組を他方の操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換することができる。両方の形質転換された細胞の組を、ホールセルの形態またはホールセル由来の溶解物もしくは抽出物の形態にて反応混合物中で共に利用することができる。他の実施形態では、宿主細胞を、複数の操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換することができる。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドを、分泌されたポリペプチドの形態で発現することができ、分泌されたポリペプチドを含む培養培地を、β−グルコシダーゼ反応のために使用することができる。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドの改良された活性および／または位置選択性および／または立体選択性により、より低い濃度の操作されたポリペプチドを使用してより高い変換率を得ることができるプロセスが得られる。プロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、７５％（ｗ／ｗ）、１００％（ｗ／ｗ）、またはそれを超える量の基質化合物負荷の操作されたポリペプチドを含む。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、約０．０１ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌ；約０．０５ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌ；約０．１ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ；約１ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ；約２ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ；約５ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ；約５ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌ；約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ；約０．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ；約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ；約０．１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ；約０．５ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ；または約０．１ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌで存在する。いくつかの実施形態では、β−グルコシダーゼポリペプチドは、約０．０１ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、または５０ｇ／Ｌで存在する。
【０２１４】
一連の反応中、反応混合物のｐＨは変化し得る。反応混合物のｐＨを、所望のｐＨまたは所望のｐＨ範囲内に維持することができる。一連の反応前および／または反応中の酸または塩基の添加によってこれを行うことができる。あるいは、緩衝液の使用によってｐＨを調節することができる。したがって、いくつかの実施形態では、反応条件には、緩衝液が含まれる。所望のｐＨ範囲を維持するための適切な緩衝液が当該分野で公知であり、制限されない例として、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、酢酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、および２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（Ｔｒｉｓ）緩衝液などが含まれる。いくつかの実施形態では、緩衝液は酢酸緩衝液である。プロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約０．０１〜約０．４Ｍ、０．０５〜約０．４Ｍ、０．１〜約０．３Ｍ、または約０．１〜約０．２Ｍの濃度の緩衝液（例えば、酢酸緩衝液）を含む。いくつかの実施形態では、反応条件は、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０７、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．３、または０．４Ｍの濃度の緩衝液（例えば、酢酸緩衝液）を含む。いくつかの実施形態では、反応条件は、適切な溶媒として緩衝液が存在しない水を含む。
【０２１５】
プロセスの実施形態では、反応条件は、適切なｐＨを含む。望ましいｐＨまたは望ましいｐＨ範囲を、酸または塩基、適切な緩衝液の使用、または緩衝化と酸もしくは塩基の添加との組み合わせによって維持することができる。反応混合物のｐＨを、一連の反応前および／または反応中に調節することができる。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、ｐＨが約４〜約１０、約５〜約１０、約５〜約９、約６〜約９、約６〜約８の溶液を含む。いくつかの実施形態では、反応条件は、ｐＨが約４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０の溶液を含む。
【０２１６】
本明細書中のプロセスの実施形態では、例えば、より高い温度での反応速度の増加および反応期間中の酵素活性を考慮して、反応条件に適切な温度を使用する。したがって、いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約１０℃〜約６０℃、約１０℃〜約５５℃、約１５℃〜約６０℃、約２０℃〜約６０℃、約２０℃〜約５５℃、約２５℃〜約５５℃、または約３０℃〜約５０℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、または６０℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、酵素反応中の温度を、一連の反応を通して特定の温度に維持することができる。いくつかの実施形態では、酵素反応中の温度を、一連の反応中の温度プロフィールに対して調整することができる。
【０２１７】
本発明のプロセスを、一般に溶媒中で行う。適切な溶媒には、水、水性緩衝液、有機溶媒、ポリマー溶媒、および／または共溶媒系（一般に、水性溶媒、有機溶媒、および／またはポリマー溶媒を含む）が含まれる。水性溶媒（水または水性共溶媒系）を、ｐＨ緩衝化しても緩衝化しなくてもよい。いくつかの実施形態では、操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドを使用するプロセスを、有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール（ＩＰＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、酢酸エチル、酢酸ブチル、１−オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、およびトルエンなど）、イオン性溶媒または極性溶媒（例えば、１−エチル−４−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボラート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボラート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、グリセロール、およびポリエチレングリコールなど）を含む水性共溶媒系中で行うことができる。いくつかの実施形態では、共溶媒は、極性溶媒（ポリオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、または低級アルコールなど）であり得る。水性共溶媒系の非水性共溶媒成分は、水性成分と混和性を示して単一の液相を得ることができるか、水性成分と部分的混和性または不混和性を示して２種の液相を得ることができる。例示的な水性共溶媒系は、水ならびに有機溶媒、極性溶媒、およびポリオール溶媒から選択される１つまたはそれを超える共溶媒を含むことができる。一般に、水性共溶媒系の共溶媒成分を、反応条件下でβ−グルコシダーゼ酵素を不利に不活化しないように選択する。適切な共溶媒系を、酵素活性アッセイ（本明細書中に記載のアッセイなど）を利用した候補溶媒系における目的の定義した基質を使用した指定の操作されたβ−グルコシダーゼ酵素の酵素活性の測定によって容易に同定することができる。
【０２１８】
プロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、水性共溶媒を含み、この共溶媒は、約１％〜約５０％（ｖ／ｖ）、約１〜約４０％（ｖ／ｖ）、約２％〜約４０％（ｖ／ｖ）、約５％〜約３０％（ｖ／ｖ）、約１０％〜約３０％（ｖ／ｖ）、または約１０％〜約２０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含む。プロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約１％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）、約２０％（ｖ／ｖ）、約２５％（ｖ／ｖ）、約３０％（ｖ／ｖ）、約３５％（ｖ／ｖ）、約４０％（ｖ／ｖ）、約４５％（ｖ／ｖ）、または約５０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含む水性共溶媒を含むことができる。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、反応条件は、反応の安定化または増強のための界面活性剤を含む。界面活性剤は、非イオン性、陽イオン性、陰イオン性、および両親媒性の界面活性剤を含むことができる。例示的な界面活性剤には、制限されない例として、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ４０）、ＴＲＩＴＯＮＴＭ  Ｘ−１００、ポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン−ステアリルアミン、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、オレイルアミド硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｏｌｅｙｌａｍｉｄｏｓｕｌｆａｔｅ）、ポリオキシエチレン−ソルビタンモノステアラート、ヘキサデシルジメチルアミンなどが含まれる。反応を安定化または増強することができる任意の界面活性剤を使用することができる。反応における界面活性剤の使用濃度は、一般に、０．１〜５０ｍｇ／ｍｌ、特に１〜２０ｍｇ／ｍｌであり得る。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、反応条件には、反応溶液を混合またはスパージングする場合などに反応溶液中の起泡を軽減または防止するのを補助する消泡剤を含める。消泡剤には、非極性油（例えば、鉱物、シリコーンなど）、極性油（例えば、脂肪酸、アルキルアミン、アルキルアミド、アルキルスルファートなど）、および疎水性消泡剤（例えば、処理済みシリカ、ポリプロピレンなど）が含まれ、これらのうちのいくつかは界面活性剤としても機能する。例示的な消泡剤には、Ｙ−３０（登録商標）（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ポリ−グリコールコポリマー、オキシ／エトキシル化アルコール、およびポリジメチルシロキサンが含まれる。いくつかの実施形態では、消泡剤は、約０．００１％（ｖ／ｖ）〜約５％（ｖ／ｖ）、約０．０１％（ｖ／ｖ）〜約５％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約５％（ｖ／ｖ）、または約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２％（ｖ／ｖ）で存在し得る。いくつかの実施形態では、消泡剤は、反応を促進することが望ましい場合、約０．００１％（ｖ／ｖ）、約０．０１％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、または約５％（ｖ／ｖ）、またはそれを超えて存在し得る。
【０２２１】
トランスグリコシル化反応で使用される反応物の量は、一般に、望ましい生成物の量、同時にβ−グルコシダーゼ基質の使用量に応じて変化するであろう。当業者は、所望の生成レベルおよび生成規模に合わせてこれらの量を変化させる方法を容易に理解するであろう。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、反応物の添加順序は重要ではない。反応物を、溶媒（例えば、単相溶媒および二相水性共溶媒系など）と同時に共に添加することができ、あるいは、いくつかの反応物を、個別に添加することができ、いくつかの反応物を異なる時点で一緒に添加することができる。例えば、補因子、補基質、β−グルコシダーゼ、および基質を、最初に溶媒に添加することができる。
【０２２３】
固体反応物（例えば、酵素、塩など）を、種々の異なる形態（粉末（例えば、凍結乾燥粉末および噴霧乾燥粉末など）、溶液、乳濁液、および懸濁液などが含まれる）で反応物に提供することができる。反応物を、当業者に公知の方法および装置を使用して容易に凍結乾燥または噴霧乾燥させることができる。例えば、タンパク質溶液を、少量ずつ等分して−８０℃で凍結し、次いで、予め冷却した凍結乾燥室に添加し、その後に真空を適用することができる
【０２２４】
水性共溶媒系を使用する場合の混合効率を改良するために、β−グルコシダーゼおよび共基質を水相に最初に添加し、混合することができる。β−グルコシダーゼ基質を添加し、混合し、その後に有機相または基質は有機相に溶解されて、混合されてもよい。あるいは、β−グルコシダーゼ基質を、有機相に予め混合後、水相に添加することができる。
【０２２５】
トランスグリコシル化プロセスは、一般に、基質のグリコシル化生成物へのさらなる変換が反応時間とともに有意に変化しなくなるまで（例えば、１０％未満の基質が変換されるか、５％未満の基質が変換されるまで）進行させる。いくつかの実施形態では、基質が生成物に完全またはほぼ完全に変換されるまで、反応を進行させる。基質の生成物への成分変換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を、公知の方法を使用して、誘導体化するか誘導体化しない基質および／または生成物の検出によってモニタリングすることができる。適切な分析方法には、ガスクロマトグラフィおよびＨＰＬＣ、ＭＳなどが含まれる。
【０２２６】
プロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌまたはそれを超える基質負荷を含み、本方法により、約２４時間またはそれ未満、約１２時間またはそれ未満、約６時間またはそれ未満、または約４時間またはそれ未満で少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれを超えて基質化合物が生成物化合物に変換される。
【０２２７】
適切な反応条件下にてプロセスで使用した場合、本発明の操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドは、α−グルコシル化生成物に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えるジアステレオマー過剰率のβ−グルコシル化生成物の過剰率をもたらす。いくつかの実施形態では、検出可能な量の化合物α−グルコシル化生成物は形成されない。
【０２２８】
操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドを使用した基質化合物のグルコシル化生成物化合物への変換のためのプロセスのさらなる実施形態では、適切な反応条件は、反応溶液への最初の基質負荷を含み得、これは、その後、ポリペプチドによって接触される。次に、この反応溶液に、少なくとも約１ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約２ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約４ｇ／Ｌ／ｈ、少なくとも約６ｇ／Ｌ／ｈ、またはそれを超える速度での長時間にわたる連続的添加またはバッチ式添加としてさらなる基質化合物をさらに補足する。したがって、これらの適切な反応条件によれば、ポリペプチドを、少なくとも約１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、または１０ｇ／Ｌの最初の基質を負荷した溶液に添加する。このポリペプチドの添加後、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、またはそれを超える遥かに高い最終基質負荷に到達するまで約２ｇ／Ｌ／ｈ、４ｇ／Ｌ／ｈ、または６ｇ／Ｌ／ｈの速度で溶液にさらなるケトン基質およびアミン基質を連続的に添加する。したがって、プロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、または１０ｇ／Ｌの基質を最初に負荷した溶液へのポリペプチドの添加、その後の少なくとも約３０ｇ／Ｌまたはそれを超える最終基質負荷に到達するまでの約２ｇ／Ｌ／ｈ、４ｇ／Ｌ／ｈ、または６ｇ／Ｌ／ｈの速度での溶液へのさらなる基質の添加を含む。この基質補足反応条件により、少なくとも約５％、２５％、５０％、７５％、９０％、またはそれを超える基質のグルコシル化生成物への高変換率を維持しながらより高い基質負荷を達成可能である。このプロセスのいくつかの実施形態では、添加した基質は、さらに添加した基質と比較して等モルまたはそれを超える量でセロビオースを含む溶液中に存在する。
【０２２９】
プロセスのいくつかの実施形態では、操作されたβ−グルコシダーゼポリペプチドを使用する反応は、以下の適切な反応条件を含む：（ａ）約１ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌでの基質負荷；（ｂ）約１ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約１５０〜３００モル当量の基質化合物でのセロビオース；（ｄ）約ｐＨ４．５〜６．５；（ｅ）約３０℃〜６０℃の温度；および（ｆ）１〜１８時間の反応時間。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、反応条件を補足するために、さらなる反応成分またはさらなる技術を実施した。これらは、酵素の安定化またはその不活化の阻害、生成物の阻害の軽減、グルコシル化生成物形成への反応平衡のシフトのための手段を講じることを含むことができる。
【０２３１】
さらなる実施形態では、基質化合物の生成物化合物への変換のための上記の任意のプロセスは、以下：生成物化合物の抽出；単離；精製；および結晶化から選択される１つまたはそれを超える工程をさらに含むことができる。上で開示のプロセスによって生成された生体触媒反応混合物からのグルコシル化生成物の抽出、単離、精製、および／または結晶化のための方法、技術、およびプロトコールは、当業者に公知であり、そして／または日常的な実験によって評価される。さらに、例示的な方法を、以下の実施例に示す。
【０２３２】
本発明の種々の特徴および実施形態を、以下の代表例で例示しており、これは、例示を意図し、本発明の制限を意図しない。
【０２３３】
実験
以下の実施例（達成された実験および結果が含まれる）を、例示のみを目的として提供し、この実施例は、本発明を制限すると解釈されない。
【０２３４】
以下に開示の実験では、以下の略語を適用する：Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時間）；Ｕ（ユニット）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ｐｓｉおよびＰＳＩ（ポンド／平方インチ）；℃（摂氏）；ＲＴおよびｒｔ（室温）；ＣＶ（変動係数）；ＣＡＭおよびｃａｍ（クロラムフェニコール）；ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシンＢ）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）；ＬＢ（Ｌｕｒｉａブロス）；ＴＢ（ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス）；ＳＦＰ（振盪フラスコ粉末）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；大腸菌Ｗ３１１０（一般的に使用される研究用大腸菌株，ｔｈｅ  Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴから利用可能）；ＧＨ１（グリコシドヒドロラーゼファミリー１）；ＧＨ３（グリコシドヒドロラーゼファミリー３）；ＨＴＰ（高処理）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィ）；ＨＰＬＣ−ＲＩＤ（ＨＰＬＣ−屈折率検出器）；１Ｈ  ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴分光法）；ＴＯＣＳＹ  ＮＭＲ（総相関分光法（ｔｏｔａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）ＮＭＲ）；ＤＥＰＴ  ＮＭＲ（分極移動による無歪増強（ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎｌｅｓｓ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）ＮＭＲ）；ＨＳＱＣ  ＮＭＲ（異種核一量子コヒーレンス分光法ＮＭＲ）；ＨＭＢＣ  ＮＭＲ（異種核多量子相関（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｂｏｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）ＮＭＲ）；Ａｃｏｒｎ（Ａｃｏｒｎ  ＮＭＲ、Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ、ＣＡ）；ＦＩＯＰＣ（ポジティブコントロールに対する改良の倍数）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，  Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，  ＭＡ）；ＣｈｒｏｍａＤｅｘ（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ，  Ｉｎｃ．，  Ｉｒｖｉｎｅ，  ＣＡ）；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，  Ｉｎｃ．，  Ｅｎｆｉｅｌｄ，  ＣＴ）；およびＴｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ，  Ｈｏｌｌａｎｄ，  ＭＩ）。
【０２３５】
実施例１
β−グルコシダーゼ酵素の合成、最適化、およびスクリーニング
この実施例では、グルコシル化活性を有するβ−グルコシダーゼ酵素を合成、最適化、およびおよびスクリーニングするために行った実験を記載する。
【０２３６】
遺伝子合成および最適化
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．（配列番号３４３、配列番号３４４のポリペプチドをコードする）、Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．（配列番号３４５、配列番号３４６のポリペプチドをコードする）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｐ．（配列番号３４７、配列番号３４８のポリペプチドをコードする）、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．（配列番号３４９、配列番号３５０のポリペプチドをコードする；および配列番号３５３、配列番号３５４のポリペプチドをコードする）、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐ．（配列番号３５１、配列番号３５２のポリペプチドをコードする）、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．（配列番号３５５、配列番号３５６のポリペプチドをコードする）、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．（配列番号３５７、配列番号３５８のポリペプチドをコードする）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．（配列番号１、配列番号２のポリペプチドをコードする）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．（配列番号３６１、配列番号３６２のポリペプチドをコードする）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．（配列番号３６３、配列番号３６４のポリペプチドをコードする）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐ．（配列番号３６５、配列番号３６６のポリペプチドをコードする；配列番号３６７、配列番号３６８のポリペプチドをコードする）、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．（配列番号３６９、配列番号３７０のポリペプチドをコードする；および配列番号３７３、配列番号３７４のポリペプチドをコードする）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．（配列番号３７５、配列番号３７６のポリペプチドをコードする）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（配列番号３７１、配列番号３７２のポリペプチドをコードする）、および非培養生物（配列番号３５９、配列番号３６０のポリペプチドをコードする）由来の１８の野生型ＧＨ１およびＧＨ３β−グルコシダーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、コドン最適化し、合成し、ｐＣＫ１１０９００ベクター系にクローン化し（例えば、米国特許出願公開第２００６０１９５９４７号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）、その後に大腸菌Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）内で発現させた。大腸菌Ｗ３１１０株に、ｌａｃプロモーターの調節下でＧＨ１およびＧＨ３酵素を発現させた。
【０２３７】
高処理（ＨＴＰ）ライセートの生成：
目的のポリペプチド遺伝子を発現する大腸菌細胞を成長させ、９６ウェルプレート中に誘導し、ペレット化し、低速振盪のタイタープレートシェーカー（ｔｉｔｒｅ−ｐｌａｔｅ  ｓｈａｋｅｒ）上で２５０μＬ溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５中、０．５ｇ／Ｌリゾチームおよび０．５ｇ／Ｌ  ＰＭＢＳ）中にて室温で２時間溶解させた。次いで、プレートを４０００ｒｐｍにて４℃で２０分間遠心分離し、清澄化したライセート上清を下記のアッセイ反応で使用した。
【０２３８】
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）の生成：
振盪フラスコ手順を使用して、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を生成し、特徴付けアッセイを、本明細書に記載の生体触媒プロセスを実施するために使用した。酵素の振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）調製により、ＨＴＰアッセイで使用した細胞溶解物と比較した場合に、より精製された酵素の調製物（例えば、総タンパク質の３０％まで）が得られる。さらに、より濃縮した酵素溶液の使用が可能である。目的の操作されたポリペプチドをコードするプラスミドを含む大腸菌の単一コロニーを、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１％グルコースを含む５ｍＬ  Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉブロスに播種した。細胞を、２５０ｒｐｍで振盪したインキュベーター中にて３０℃で一晩（少なくとも１６時間）成長させた。培養物を、１Ｌフラスコ中にて３０μｇ／ｍｌ  ＣＡＭを含む２５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（１２ｇ／Ｌバクト−トリプトン、２４ｇ／Ｌ酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌグリセロール、６５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４）で６００ｎｍ（ＯＤ６００）の光学密度０．２に希釈し、３０℃で成長させた。培養物のＯＤ６００が０．６〜０．８である場合に最終濃度１ｍＭまでのＩＰＴＧの添加によってグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を誘導した。次いで、インキュベーションを一晩（少なくとも１６時間）継続した。細胞を、遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）によって回収し、上清を破棄した。細胞ペレットを、２体積の２５ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁し、標準的な大腸菌の溶解設定を使用し、４℃に維持したＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ（登録商標）高圧ホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）に通した。細胞デブリを遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、４５分間、４℃）によって除去した。清澄なライセート上清を回収し、−８０℃で凍結し、次いで、凍結乾燥させて粗ポリペプチドの乾燥振盪フラスコ粉末を生成した。
【０２３９】
セロビオース合成についてのアッセイ：
このアッセイでは、５０μＬのＨＴＰライセートを、総反応体積が２００μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）および１００ｇ／Ｌグルコースで希釈した。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎタイタープレートシェーカー中、３００ＲＰＭで振盪させながら４０℃で１６〜１８時間反応させた。
【０２４０】
セロビオース合成アッセイのＨＰＬＣ分析：
上記のセロビオース合成反応を、０．５体積／体積の２％ギ酸を含むアセトニトリルでクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のセロビオースを、以下に示す装置およびパラメーターを使用したＨＰＬＣ−ＲＩＤによって検出した：
【表１−１】
2019517801.tif 000006
【０２４１】
最大のセロビオース形成を触媒したβ−グルコシダーゼをコードする３つの配列を含むプラスミドを含む大腸菌の単一コロニーを使用してＳＦＰを調製した。
【０２４２】
ステビオールグリコシドのグルコシル化についてのアッセイ：
ＳＦＰを再構成して２０ｇ／Ｌ粉末を得た。次いで、１０μＬのこれらのストックを、０．５ｍＭステビオシド（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ、純度９４％超）またはレバウジオシドＡ（Ｓｉｇｍａ、純度９６％超）を含み、５０μＭ〜５ｍＭ  グルコースまたはセロビオースを含む、総反応体積が２００μＬの５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）で希釈した。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎタイタープレートシェーカー中、３００ＲＰＭで振盪させながら３０℃で２時間反応させた。
【０２４３】
ステビオールグリコシドのグルコシル化アッセイのＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
ステビオールグリコシドのグルコシル化反応を、２％ギ酸を含む０．５体積／体積アセトニトリルでクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化ステビオシド生成物を、以下に示す装置およびパラメーターを使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって検出した：
【表１−２】
2019517801.tif 000007
【０２４４】
３つ全てのβ−グルコシダーゼについて検出されたステビオシドに対する主な活性は、ステビオシドのルブソシドへの加水分解であったが、配列番号１１によってコードされたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ由来の１つのＧＨ３酵素は、レバウジオシドＡと同一の保持時間を有するネガティブコントロールを超える有意なピークを生じた。生体触媒試薬としてこの酵素を使用することで、ステビオシドのβ−グルコシル化についての新規方法が得られる。活性は、ｐＨおよびグルコースドナーに非依存性であった。基質としてのレバウジオシドＡは加水分解されなかった。
【０２４５】
実施例２
操作されたＧＨ３ポリペプチドの進化およびスクリーニング
この実施例では、β−グルコシル化生成物を形成する改良されたトランスグルコシル化活性についての配列番号１１由来の操作されたＧＨ３ポリペプチドの進化およびスクリーニングを記載する。配列番号１１によってコードされるβ−グルコシダーゼ遺伝子の定向進化を、ステビオシド基質にドッキングした酵素構造のコンピュータモデリングに関連する位置ならびに活性部位および他の構造の特徴に関連する残基の位置を変異誘発に供したバリアント遺伝子ライブラリーの構築によって行った。次いで、これらのライブラリーをプレートし、成長させ、下記のＨＴＰアッセイを使用してスクリーニングして、第１ラウンド（「ラウンド１」）の、ステビオシドに対するグルコシル化／トランスグルコシル化活性を有する６８種の操作されたβ−グルコシダーゼＧＨ３バリアントポリペプチドを得た。
ＨＴＰの成長、発現、およびライセートの調製：
【０２４６】
細胞を９６ウェルプレートに選んで入れ、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬ  ＣＡＭを含むＬＢ培地中にて、３０℃、２００ｒｐｍ、湿度８５％で一晩成長させた。次いで、２０μＬの一晩成長させた細胞を、３０μｇ／ｍＬ  ＣＡＭ、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む３８０μＬのＴＢ成長培地を含むディープウェルプレートに移し、３０℃、２００ｒｐｍ、湿度８５％で１８時間インキュベートした。細胞培養物を、４０００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠心分離し、培地を破棄した。このようにして得られた細胞ペレットを−８０℃で凍結し、実施例１に記載のようにこれを使用してＨＴＰ反応のためのライセートを調製した。
【０２４７】
ステビオシドのトランスグルコシル化についてのＨＴＰアッセイ：
２００μＬ反応物中５〜５０μＬライセートのライセート負荷、および５０％メタノール中の２０ｍＭストック溶液からの０．５〜５ｍＭステビオシドの基質負荷で、配列番号１１を発現する大腸菌培養物の９６ウェルコントロールプレートに対してアッセイを行った。アッセイ変動係数を最小にし、且つ活性ヒットの可能性を最大にするために、以下の反応条件を選択した：２０μＬのＨＴＰライセートを、２ｍＭステビオシド（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ、純度９４％超）を用い、且つ１００ｇ／Ｌセロビオースを用いて、総反応体積が２００μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で希釈した。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎタイタープレートシェーカー中、３００ＲＰＭで振盪させながら４５℃で１時間時間反応させた。
【０２４８】
ステビオシドのトランスグルコシル化アッセイのＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
上記のステビオシドのトランスグルコシル化反応を、２％ギ酸を含む０．５体積／体積のアセトニトリルでクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化ステビオシド生成物を、実施例１の表１．２に記載の装置およびパラメーターを使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって検出した。
【０２４９】
レバウジオシドＡならびに生成物１８０および生成物２２０（質量のトランジションがステビオシドのグルコシル化と一致するネガティブコントロール中に存在しない生成物）を生成したβ−グルコシダーゼＧＨ３バリアントポリペプチドを同定し、これらの生成物の全てがこの酵素に対して新規の活性を示した。操作されたポリペプチドを、表２．１に列挙する。配列番号１２と比較して以下のアミノ酸変異を有するバリアントについて、実施例１に記載のようにＳＦＰを生成した：Ｖ７０Ｗ、Ｙ２６６Ｇ、Ｖ３２Ｓ、Ｔ３８Ｅ、Ｆ２３３Ｌ、Ｓ１２５Ｇ、およびＴ３７Ｗ。
【表２−１Ａ】
2019517801.tif 000008
【表２−１Ｂ】
2019517801.tif 000009
【表２−１Ｃ】
2019517801.tif 000010
【０２５０】
ステビオールグリコシドトランスグルコシル化についてのＳＦＰ特徴付けアッセイ：
ＳＦＰを再構成して２０ｇ／Ｌ粉末を得た。次いで、１０μＬのこれらのストックを、２ｍＭステビオシド（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ、純度９４％超）、レバウジオシドＡ（Ｓｉｇｍａ、純度９６％超）、またはレバウジオシドＤ（Ｓｉｇｍａ、純度９３％超）を用い、且つ１００ｇ／Ｌセロビオースを用いるか用いないで、総反応体積が２００μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で希釈した。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎタイタープレートシェーカー中、３００ＲＰＭで振盪させながら４５℃で１時間反応させた。
【０２５１】
ステビオールグリコシドのトランスグルコシル化のＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
上記のステビオールグリコシドのトランスグルコシル化反応を、２％ギ酸を含む０．５体積／体積のアセトニトリルでクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化ステビオシド生成物を、実施例１の表１．２に記載の装置およびパラメーターを使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって検出した。変異Ｖ７０Ｗ、Ｖ３２Ｓ、Ｔ３８Ｅ、Ｆ２３３Ｌ、Ｓ１２５Ｇ、およびＴ３７Ｗを有するバリアント（配列番号２２、１２０、２８、３２、４２、２６）は、セロビオースを用いた場合および用いない場合の両方においてステビオシドからレバウジオシドＡを生成した。変異Ｙ２６６Ｇを有するバリアント（配列番号６４）は、セロビオースの存在下でほぼ排他的に生成物１８０および生成物２２０を生成し、セロビオース要求性は、トランスグルコシル化によって活性が生じることを確認する。変異Ｖ７０Ｗ、Ｖ３２Ｓ、Ｔ３８Ｅ、Ｆ２３３Ｌ、Ｓ１２５Ｇ、およびＴ３７Ｗを有するバリアント（配列番号２２、１２０、２８、３２、４２、２６）において、基質としてのレバウジオシドＡに対する活性は認められなかった。基質としてレバウジオシドＤを用いた場合、レバウジオシドＡへの加水分解物が主な生成物であり、レバウジオシドＭへのグリコシル化が、野生型およびバリアントであるＦ２３３Ｌ、Ｖ７０Ｗ、Ｓ１２５Ｇ、およびＴ３７Ｗ（配列番号１２、３２、２２、４２、２６）において検出された。これらの操作された酵素により、ステビオシドのレバウジオシドＡおよび他の生成物へのβ−グルコシル化ならびにレバウジオシドＤのレバウジオシドＭへのβ−グルコシル化のための新規の方法における新規の生体触媒試薬が得られる。
【０２５２】
反応のスケールアップ、化合物の精製、およびＮＭＲによる特徴付け：
配列番号１１を発現する大腸菌由来のＳＦＰを、実施例１に記載のように生成した。ＳＦＰを再構成して２０ｇ／Ｌ粉末を得た。次いで、１１ｍＬのこのストックを、８ｇ／Ｌステビオシド（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ、純度９１％超）を用いて、４つの各１Ｌ振盪フラスコ中の総反応体積が２５０ｍＬの１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で希釈した。２５０ＲＰＭで振盪したＩｎｎｏｖａ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）振盪インキュベーター中にて４５℃で３時間４０分間反応させ、０．５ｍＬギ酸でｐＨ４未満にして反応をクエンチした。反応物を、１０，０００ＲＰＭにて４℃で１０分間の遠心分離によって沈殿させた。７．５ｇのＸＡＤ−４樹脂（Ｓｉｇｍａ）を各上清に添加し、振盪フラスコ中で１６〜２４時間インキュベートした。樹脂を濾過し、水で洗浄し、２５〜５０ｍＬの８０：２０アセトニトリル：水で数時間インキュベートすることによって溶離し、再度濾過した。溶離液を回転蒸発によって約２ｍＬまで濃縮し、ＷＨＡＴＭＡＮ（登録商標）ＵＮＩＰＲＥＰ（登録商標）シリンジレスフィルター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で濾過し、以下の装置およびパラメーターを使用したＨＰＬＣによって分画した：
【表２−２】
2019517801.tif 000011
【０２５３】
保持時間２．５〜４．７、４．７〜７．９、７．９〜１０、および１０．４〜１１．５分の画分を手作業で回収した。３番目の７．９〜１０分の画分をプールし、回転蒸発によって濃縮し、ＷＨＡＴＭＡＮ（登録商標）ＵＮＩＰＲＥＰ（登録商標）シリンジレスフィルター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で濾過し、以下の装置およびパラメーターを使用したＨＰＬＣによって分画した：
【表２−３】
2019517801.tif 000012
【０２５４】
保持時間６〜６．７分の画分を手作業で回収し、プールし、凍結乾燥させた。凍結乾燥させた試料を、メタノール−ｄ４で再懸濁し、次いで、再度凍結乾燥させた。この試料を、ピリジン−ｄ５で再懸濁し、１Ｈ  ＮＭＲスペクトル取得のために使用した。アミノカラムおよびＣ１８カラム上の試料の保持時間および１Ｈスペクトルは全て、レバウジオシドＡ標準（Ｓｉｇｍａ、９６％超）と一致する。炭素に番号を付けたレバウジオシドＡの構造を図２に示し、シフトの帰属を表２．４に示す。
【表２−４Ａ】
2019517801.tif 000013
【表２−４Ｂ】
2019517801.tif 000014
【表２−４Ｃ】
2019517801.tif 000015
【０２５５】
実施例３
操作されたＧＨ３ポリペプチドの進化およびスクリーニング
この実施例では、ステビオシドの加水分解の減少についての配列番号１２由来の操作されたＧＨ３ポリペプチドの進化およびスクリーニングを記載する。
【０２５６】
ステビオシドのトランスグルコシル化について実施例２に記載のアッセイを使用して、ステビオシド基質の加水分解の減少を示したβ−グルコシダーゼＧＨ３バリアントポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを、表３．１に列挙する。トランスグルコシル化活性を維持または増加させながら加水分解を減少させることは、ステビオールグリコシドのトランスグルコシル化のために使用される新規の操作されたβ−グルコシダーゼに有用である。
【表３−１Ａ】
2019517801.tif 000016
【表３−１Ｂ】
2019517801.tif 000017
【表３−１Ｃ】
2019517801.tif 000018
【０２５７】
実施例４
ＧＨ１酵素の合成、最適化、およびスクリーニング
この実施例では、グルコシル化活性を有するＧＨ１酵素を合成、最適化、およびおよびスクリーニングするために行った実験を記載する。
【０２５８】
遺伝子合成および最適化
ｔｄ２ｆ２と命名される未知の種（Ｕｃｈｉｙａｍａ，  ＭｉｙａｚａｋｉおよびＹａｏｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８８：１８３２５  ［２０１３］を参照のこと）由来の４つの野生型ＧＨ１  β−グルコシダーゼポリペプチド、すなわち、それぞれ、配列番号５、７、９および３をコードするポリヌクレオチド配列を、コドン最適化し、合成し、配列番号１５、１７、１９および１３としてｐＣＫ１１０９００ベクター系にクローン化し（例えば、米国特許出願公開第２００６０１９５９４７号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）、その後に大腸菌Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）内で発現させた。大腸菌Ｗ３１１０株に、ｌａｃプロモーターの調節下でＧＨ１酵素を発現させた。振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を実施例１に記載されるように産生した。
【０２５９】
ステビオシドのトランスグリコシル化についてのＳＦＰのアッセイ：
ＳＦＰを再構成して２０ｇ／Ｌの粉末を得た。次に、これらのストックの１〜５０μＬを、１〜２ｍＭステビオシド（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ、純度９４％超）を用い、且つ１００ｇ／Ｌセロビオースを用いて、総反応体積が２００μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で希釈した。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎタイタープレートシェーカー中、３００ＲＰＭで振盪させながら４５℃〜６０℃で０〜２時間、一部の場合には１８時間の時点で反応させた。
【０２６０】
ステビオシドのトランスグリコシル化のＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
上記のステビオシドのトランスグリコシル化反応を、２％ギ酸を含む０．５体積／体積のアセトニトリルでクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化ステビオシド生成物を、実施例１の表１．２に記載の装置およびパラメーターを使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって検出した。
【０２６１】
配列番号１３から発現されるｔｄ２ｆ２酵素について、モノグルコシル化ステビオシド生成物を、１．７１分、１．８２分、２．０５分、および２．２１分の保持時間に観察し、ジグルコシル化生成物を、１．２５分、１．３３分、１．３９分、１．５８分、および１．６７分の保持時間に観察した。生成物の形成は、２時間以内にプラトーに達することはなく、わずかな加水分解がルブソシドの形成として検出された。
【０２６２】
配列番号１５から発現されるＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ酵素について、モノグルコシル化ステビオシド生成物を、１．８４分、２．０８分、２．２３分、および２．２９分の保持時間に観察し、ジグルコシル化生成物を、１．４０分および１．７７分の保持時間に観察した。生成物の加水分解およびルブソシドの形成として検出されたステビオシドに起因して、生成物の形成は、２時間にわたって増大したが、１８時間までに減少した。
【０２６３】
配列番号１７から発現されるＴｈｅｒｍｏｂａｃｕｌｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ酵素について、モノグルコシル化ステビオシド生成物を、１．８０分および２．２７分の保持時間に観察した。生成物の加水分解およびおよびルブソシドの形成として検出されたステビオシド基質に起因して、生成物の形成は、１時間にわたって増大したが、その後減少した。
【０２６４】
配列番号１９から発現されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ酵素について、モノグルコシル化ステビオシド生成物を、１．７９分、２．０４分、２．２０分、および２．２５分の保持時間に観察した。生成物の加水分解およびおよびルブソシドの形成として検出されたステビオシド基質に起因して、生成物の形成は、２時間にわたって増大したが、１８時間までに減少した。
【０２６５】
アッセイした４つのＧＨ１酵素のうちで、ｔｄ２ｆ２由来の１つのＧＨ１酵素（配列番号１３）は、最高濃度のモノ−およびジ−グルコシル化ステビオシド生成物を生成した。
【０２６６】
ステビオールグリコシドのトランスグリコシル化についてのＳＦＰのアッセイ：
配列番号１３由来のＳＦＰを再構成して２０ｇ／Ｌ粉末を得た。次いで、１０μＬのこのストックを、２ｍＭ  ステビオシド（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ、純度９４％超）、レバウジオシドＡ（Ｓｉｇｍａ、純度９６％超）、またはレバウジオシドＤ（Ｓｉｇｍａ、純度９３％超）を用い、且つ１００ｇ／Ｌセロビオースを用いるか用いないで、総反応体積が２００μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で希釈した。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎタイタープレートシェーカー中、３００ＲＰＭで振盪させながら４５℃で１時間反応させた。
【０２６７】
ステビオールグリコシドのトランスグリコシル化のＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
上記のステビオールグリコシドのトランスグリコシル化反応を、２％ギ酸を含む０．５体積／体積のアセトニトリルでクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化ステビオシド生成物を、実施例１の表１．２に記載の装置およびパラメーターを使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって検出した。基質としてのステビオシドについて、同一のモノ−グルコシル化生成物が認められた。基質としてのレバウジオシドＡについて、保持時間１．４５分および１．６６分でモノ−グルコシル化生成物が認められた。基質としてのレバウジオシドＤについて、保持時間１．２５分、１．３３分、および１．７４分でモノ−グルコシル化生成物が認められた。３つ全ての基質由来の生成物は、セロビオースの存在下でほぼ排他的に認められ、セロビオース要求性は、トランスグルコシル化によって活性が生じることを確認する。これらの酵素は、ステビオールグリコシドのβ−グルコシル化のための新規の方法における生体触媒試薬として使用される。
【０２６８】
実施例５
ＧＨ１ポリペプチドの進化およびスクリーニング
この実施例では、β−グルコシル化生成物を形成する改良されたトランスグルコシル化活性についての配列番号１４由来のＧＨ１ポリペプチドの進化およびスクリーニングについての実験を記載する。
【０２６９】
配列番号１３によってコードされるβ−グルコシダーゼ遺伝子の定向進化を、ステビオシド基質にドッキングした酵素構造のコンピュータモデリングに関連する位置ならびに活性部位および他の構造の特徴に関連する残基の位置を変異誘発に供したバリアント遺伝子ライブラリーの構築によって行った。次いで、これらのライブラリーをプレートし、成長させ、下記のＨＴＰアッセイを使用してスクリーニングして、第１ラウンド（「ラウンド１」）の、ステビオシドに対するグルコシル化／トランスグルコシル化活性を有する６１種の操作されたβ−グルコシダーゼＧＨ１バリアントポリペプチドを得た。ＨＴＰの成長、発現、およびライセートの調製を、実施例２に記載される通りに行った。
【０２７０】
ステビオシドのトランスグルコシル化についてのＨＴＰアッセイ：
２００μＬ反応物中５〜５０μＬライセートのライセート負荷および０．５〜５ｍＭステビオシドおよび１００ｇ／Ｌセロビオースを用いて、配列番号１３を発現する大腸菌培養物の９６ウェルコントロールプレートに対してアッセイを行った。アッセイ変動係数を最小にし、且つ活性ヒットの可能性を最大にするために、以下の反応条件を選択した：２０μＬまたは５０μＬのＨＴＰライセートを、１ｍＭステビオシド（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ、純度９４％超）を用い、且つ１００ｇ／Ｌセロビオースを用いて、総反応体積が２００μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で希釈した。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎタイタープレートシェーカー中、３００ＲＰＭで振盪させながら６０℃で１時間または２時間反応させた。
【０２７１】
ステビオシドのトランスグルコシル化のＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
上記のステビオシドのトランスグルコシル化反応を、２％ギ酸を含む０．５体積／体積のアセトニトリルでクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化ステビオシド生成物を、実施例１の表１．２に記載の装置およびパラメーターを使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって検出した。保持時間１．７１、１．８２、２．０５、および２．２１に野生型酵素より高いレベルでモノ−グルコシル化ステビオシド生成物の生成が増加し、保持時間２．２７分に新規のモノ−グルコシル化生成物を生成したβ−グルコシダーゼＧＨ１バリアントポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを、表５．１に列挙する。全体的により高いレベルのモノ−グルコシル化ステビオシドを生成した操作されたポリペプチドもあれば、個別のモノ−グルコシル化生成物をより高いレベルで生成したものもあった。例えば、変異Ｗ１６８ＬおよびＷ１６８Ｇを有するバリアント（配列番号１７３、１７５）は、実質的に、保持時間１．８２および２．０５の生成物を増加させたが、保持時間２．２１分の生成物に影響を及ぼさなかった。例えば、変異Ｖ２４７ＩおよびＶ２４７Ｌを有するバリアント（配列番号１８９、１９１）は、３つ全ての生成物を増加させた。さらに別の例では、変異Ｎ４０４ＰおよびＮ４０４Ｓを有するバリアント（配列番号２７９、２８１）は、保持時間２．２１分および２．０６分の生成物を増加させたが、保持時間１．８０分の生成物を増加させなかった。
【表５−１Ａ】
2019517801.tif 000019
【表５−１Ｂ】
2019517801.tif 000020
【表５−１Ｃ】
2019517801.tif 000021
【０２７２】
反応のスケールアップ、化合物の精製、およびＮＭＲによる特徴付け：
配列番号１７３を発現して配列番号１７４のポリペプチドを生産する大腸菌由来のＳＦＰを、実施例１に記載のように生成した。ＳＦＰを再構成して２０ｇ／Ｌ粉末を得た。次いで、１２．５ｍＬのこのストックを、１．６ｇ／Ｌステビオシド（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ、純度９１％超）を用いて、４つの各１Ｌ振盪フラスコ中の総反応体積が２５０ｍＬの１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で希釈した。２５０ＲＰＭで振盪したＩｎｎｏｖａ（登録商標）振盪インキュベーター中にて４５〜６０℃で２〜２４時間反応させ、０．５ｍＬギ酸でｐＨ４未満にして反応をクエンチした。反応物を、１０，０００ＲＰＭにて４℃で１０分間の遠心分離によって沈殿させた。７．５ｇのＸＡＤ−４樹脂（Ｓｉｇｍａ）を各上清に添加し、振盪フラスコ中で１６〜２４時間インキュベートした。樹脂を濾過し、水で洗浄し、２５〜５０ｍＬの６８：３２アセトニトリル：水で１６〜２４時間インキュベートすることによって溶離し、再度濾過した。溶離液を回転蒸発によって約２ｍＬまで濃縮し、ＷＨＡＴＭＡＮ（登録商標）ＵＮＩＰＲＥＰ（登録商標）シリンジレスフィルターで濾過し、実施例１、表１．２に記載される装置およびパラメーターを使用したＨＰＬＣによって分画した。Ｃ１８カラムから、保持時間２．２〜２．８、２．８〜３．３、３．３〜３．９、３．９〜４．５、４．５〜５．５、５．５〜６．２、および６．２〜８分の画分を手作業で回収した。画分をプールし、凍結乾燥させた。４．５〜５．５分の画分を、実施例１の表１．２に記載の装置およびパラメーターを使用してＮＨ２カラムにて再度分画した。保持時間９．７〜１０．７分の画分を回収し、プールし、凍結乾燥させた。試料をピリジン−ｄ５に再懸濁し、１Ｈ、ＴＯＣＳＹ、ＤＥＰＴ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣのＮＭＲスペクトル取得のために使用した。Ｃ−６’ピークおよび１つのＨ−６’ピークが低磁場にシフトしたという観察に基づいて、保持時間１．７１で溶離したモノ−グルコシル化ステビオシドピークを、６’位でβグルコシル化したステビオシドであると決定した。この環を、Ｈ−１’が最も遠い低磁場に存在することに基づいて、ＴＯＣＳＹデータ由来の第１の糖と同定した。Ｈ−１’’’からＣ−６’までＨＭＢＣ相関もあった。Ｃ−６’’ピークおよび１つのＨ−６’’ピークが低磁場にシフトしたという観察に基づいて、保持時間１．８２で溶出したモノ−グルコシル化ステビオシドピークを、６’’位でβグルコシル化したステビオシドであると決定した。Ｈ−２’’からＣ−１’’およびＣ−１’’’までおよびＨ−６’’から１’’’’までＨＭＢＣ相関もあった。ＡｃｏｒｎによってＮＭＲ特徴付けを行った。
【０２７３】
実施例６
ＧＨ１ポリペプチドおよびＧＨ３ポリペプチドのスクリーニング
この実施例では、β−グルコシル化生成物を形成するための多様な基質のトランスグルコシル化について野生型および操作されたＧＨ１ポリペプチドおよびＧＨ３ポリペプチドをスクリーニングするために行った実験を記載する。配列番号１７、１９、１１、１３、１９１、および１７３を発現する大腸菌について、配列番号１８、２０、１２、１４、１９２、および１７４のポリペプチドを生成するために実施例１に記載のようにＳＦＰを生成した。
【０２７４】
２−ナフチルメタノールのトランスグルコシル化についてのＳＦＰ特徴付けアッセイ：
配列番号１３、１９１、および１７３によってコードされる酵素およびネガティブコントロールのＳＦＰを再構成して２０ｇ／Ｌ粉末を得た。次に、これらのストックの５０μＬを、１ｍＭナフチルメタノール（Ｓｉｇｍａ、純度９８％）を用い、且つ１００ｇ／Ｌセロビオースを用いて、総反応体積が２００μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で希釈した。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎタイタープレートシェーカー中、３００ＲＰＭで振盪させながら６０℃で１時間反応させた。
【０２７５】
ナフチルメタノールのトランスグルコシル化アッセイのＨＰＬＣ−ＵＶ分析：
上記の２−ナフチルメタノールのトランスグルコシル化反応を、２％ギ酸を含む０．５体積／体積のアセトニトリルでクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化２−ナフチルメタノールを、装置およびパラメーターに従ってＬＣ−ＵＶによって検出した。
【表６−１】
2019517801.tif 000022
【０２７６】
この実験で試験した３つの酵素は、２−ナフチルメタノールからグルコシル化生成物への４〜２０％の変換を示し、配列番号１３が最高の活性を有し、配列番号１９１が続き、次いで配列番号１７３が続いた。したがって、本発明は、アグリコン非天然生成物をβグルコシル化するための新規の方法で使用される野生型および操作されたβ−グルコシダーゼを提供する。
【０２７７】
４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニジンのトランスグルコシル化についてのＳＦＰ特徴付けアッセイ：
配列番号１７、１９、１１、および１３によってコードされる酵素ポリペプチド（すなわち、配列番号１８、２０、１２、および１４）のＳＦＰを再構成して、２０ｇ／Ｌ粉末を得た。次いで、１０〜５０μＬのこれらのストックを、２ｍＭ  ４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニジン（Ｓｉｇｍａ、９８％超）を用い、１００ｇ／Ｌセロビオースを用いて、総反応体積が２００μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で希釈した。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎタイタープレートシェーカー中、３００ＲＰＭで振盪させながら４５℃で０〜１８時間反応させた。
【０２７８】
４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニジンのトランスグルコシル化アッセイのＨＰＬＣ−ＵＶ分析：
上記の４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニジンのトランスグルコシル化反応を、２％ギ酸を含む０．５体積／体積のアセトニトリルでクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニジンを、以下に示す装置およびパラメーターを使用したＬＣ−ＵＶによって検出した：
【表６−２】
2019517801.tif 000023
【０２７９】
この実験で試験した３つの酵素は、４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニジンからグルコシル化生成物への５％未満の変換を示し、配列番号１９によってコードされる酵素ポリペプチドが最高の活性を有し、配列番号１７および配列番号１１によってコードされる酵素ポリペプチドが続いた。配列番号１３によってコードされる酵素ポリペプチドは、ほとんど活性を示さなかった。したがって、野生型および操作されたβ−グルコシダーゼは、グリコシル化された非天然生成物をβグルコシル化するための新規の方法で使用される。
【０２８０】
実施例７
ＧＨ２の合成、最適化、およびスクリーニング
この実施例では、トランスグリコシル化活性を有するＧＨ２の合成、最適化、およびおよびスクリーニングについての実験を記載する。
【０２８１】
遺伝子合成および最適化
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．（配列番号２９５、配列番号２９６をコードする）、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｓｐ．（配列番号２９７、配列番号２９８をコードする；配列番号２９９、配列番号３００をコードする；配列番号３０３、配列番号３０４をコードする；配列番号３１３、配列番号３１４をコードする；配列番号３１５、配列番号３１６をコードする；配列番号３１７、配列番号３１８をコードする；および配列番号３２７、配列番号３２８をコードする）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｐ．（配列番号３０１、配列番号３０２をコードする）、Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｓｐ．（配列番号３０５、配列番号３０６をコードする）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｓｐ．（配列番号３０７、配列番号３０８または配列番号３１９をコードする、配列番号３２０をコードする）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．（配列番号３０９、配列番号３１０をコードする）、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｓｐ．（配列番号３１１、配列番号３０１２をコードする）、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｓｐ．（配列番号３２１、配列番号３２２をコードする）、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｓｐ．（配列番号３２３、配列番号３２４をコードする）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．（配列番号３２５、配列番号３２６をコードする），、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（配列番号３２９、配列番号３３０をコードする）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．（配列番号３３１、配列番号３３２をコードする）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．（配列番号３３３、配列番号３３４をコードする）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．（配列番号３３５、配列番号３３６をコードする）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．（配列番号３３７、配列番号３３８をコードする）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．（配列番号３３９、配列番号３４０をコードする）、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（配列番号３４１、配列番号３４２をコードする）由来の２３の野生型ＧＨ２  β−ガラクトシダーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、コドン最適化し、合成し、ｐＣＫ１１０９００ベクター系にクローン化し（例えば、米国特許出願公開第２００６０１９５９４７号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）、その後に大腸菌Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）内で発現させた。大腸菌Ｗ３１１０株に、ｌａｃプロモーターの調節下でＧＨ２酵素を発現させた。高処理（ＨＴＰ）ライセートを、実施例１に記載される通りに調製した。
【０２８２】
ステビオシドのトランスガラクトシル化についてのアッセイ：
最初に、５０μＬのＨＴＰライセートを、０．５ｍＭステビオシド（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ、純度９４％超）、および１５０ｇ／Ｌラクトースで、総反応体積が２００μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で希釈した。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎタイタープレートシェーカー中、３００ＲＰＭで振盪させながら６０℃で１６〜１８時間反応させた。
【０２８３】
ステビオシドのトランスガラクトシル化のＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
上記のステビオシドのトランスガラクトシル化反応を、２％ギ酸を含む０．５体積／体積のアセトニトリルでクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のガラクトシル化ステビオシド生成物を、実施例１の表１．２に記載の装置およびパラメーターを使用したＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって検出した。モノ−ガラクトシル化生成物は、いくつかの酵素において保持時間１．６７分、１．８０分、１．９７分、および２．１４分で検出され、ジ−ガラクトシル化生成物は、保持時間１．３５分、１．４５分、および１．５７分で検出された。大腸菌由来の酵素（配列番号２９５）で最高の活性が認められた。
【０２８４】
ステビオシドのトランスグルコシル化についてのアッセイ：
最初に、５０μＬのＨＴＰライセートを、０．５ｍＭステビオシド（Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ、純度９４％超）および１５０ｇ／Ｌセロビオースを用いて、総反応体積が２００μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で希釈した。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎタイタープレートシェーカー中、３００ＲＰＭで振盪させながら６０℃で１６〜１８時間反応させた。
【０２８５】
ステビオシドのトランスグルコシル化のＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
上記のステビオシドのトランスグルコシル化反応を、２％ギ酸を含む０．５体積／体積のアセトニトリルでクエンチし、遠心分離によって沈殿させた。上清中のグリコシル化ステビオシド生成物を、実施例１の表１．２に記載の装置およびパラメーターを使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって検出した。モノ−グリコシル化生成物は、いくつかの酵素において保持時間１．８４分、１．９７分、２．０８分、２．２３分、および２．２９分で検出された。大腸菌由来の酵素（配列番号２９５）で最高の活性が認められ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（配列番号２９９）がそれに続いた。
【図１】
2019517801.tif 000024
【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019517801.tif 000027
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