(57)【要約】  対象の神経変性疾患を治療する方法であって、前記対象に治療有効量のＴＤＰ−４３ミトコンドリア局在化阻害剤を投与することを含む、方法。
2019513752.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＤＰ−４３の少なくとも１つのミトコンドリア内部ターゲティングモチーフの約５〜約８個の連続したアミノ酸と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有する約５〜約１０個のアミノ酸からなる合成治療ペプチドと、前記治療ペプチドに連結され、細胞による前記治療ペプチドの取り込みを促進する輸送部分と、を含む治療剤を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記治療ペプチドが、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体１のＴＤＰ−４３によって媒介される分解を阻害する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＴＤＰ−４３の少なくとも１つのミトコンドリア内部ターゲティングモチーフが、配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記治療ペプチドが、配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記治療ペプチドが、配列番号３または配列番号８のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記治療ペプチドが、配列番号５または配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記輸送部分がＴＡＴペプチドを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項８】
前記治療剤が、配列番号１２〜１７からなる群から選択される酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
対象の神経変性疾患を治療する方法であって、前記対象に治療有効量のＴＤＰ−４３ミトコンドリア局在化阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項１０】
前記治療有効量の前記ＴＤＰ−４３の局在化阻害剤が、ＴＤＰ−４３により誘発されるミトコンドリア機能不全およびニューロン喪失を阻害するために必要な量である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化阻害剤が、前記ＴＤＰ−４３の少なくとも１つのミトコンドリア内部ターゲティングモチーフの約５〜約８個の連続したアミノ酸と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有する約５〜約１０個のアミノ酸からなる合成治療ペプチドを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記治療ペプチドが、前記ミトコンドリアの呼吸鎖複合体１のＴＤＰ−４３によって媒介される分解を阻害する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＤＰ−４３の少なくとも１つのミトコンドリア内部ターゲティングモチーフが、配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療ペプチドが、配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療ペプチドが、配列番号３または配列番号８のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療ペプチドが、配列番号５または配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＴＤＰ−４３の局在化阻害剤が、前記治療ペプチドに連結されて前記治療ペプチドの細胞による取り込みを促進する輸送部分を更に有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記輸送部分がＴＡＴペプチドを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＴＤＰ−４３の局在化阻害剤が、配列番号１２〜１７からなる群から選択される酸配列を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
前記神経変性疾患が、前頭側頭型認知症である、請求項９に記載の方法。
【請求項２２】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症である、請求項９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＴＤＰ−４３の局在化阻害剤が、連続的皮下注入によって前記対象に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項２４】
対象の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療する方法であって、
前記対象に、治療有効量のＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項２５】
前記治療有効量の前記ＴＤＰ−４３の局在化阻害剤が、ＴＤＰ−４３により誘発されるミトコンドリア機能不全およびニューロン喪失を阻害するために必要な量である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化阻害剤が、前記ＴＤＰ−４３の少なくとも１つのミトコンドリア内部ターゲティングモチーフの約５〜約８個の連続したアミノ酸と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有する約５〜約１０個のアミノ酸からなる合成治療ペプチドを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療ペプチドが、前記ミトコンドリアの呼吸鎖複合体１のＴＤＰ−４３によって媒介される分解を阻害する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＴＤＰ−４３の少なくとも１つのミトコンドリア内部ターゲティングモチーフが、配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記治療ペプチドが、配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記治療ペプチドが、配列番号３または配列番号８のアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療ペプチドが、配列番号５または配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＴＤＰ−４３の局在化阻害剤が、前記治療ペプチドに連結されて前記治療ペプチドの細胞による取り込みを促進する輸送部分を更に有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記輸送部分がＴＡＴペプチドを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＴＤＰ−４３の局在化阻害剤が、配列番号１２〜１７からなる群から選択される酸配列を有する、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願情報
本出願は、その主題を参照によりその全容にわたって本明細書に援用するところの２０１６年４月２７日出願の米国仮特許出願第６２／３２８，４８４号および２０１６年４月７日出願の同第６２／３１９，５８０号の優先権を請求する。
政府援助
【０００２】
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により与えられた助成番号第１Ｒ０１ＮＳ０８９６０４号の政府支援によってなされたものである。アメリカ合衆国政府は本発明に対して一定の権利を有するものである。
【背景技術】
【０００３】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、脳幹および脊髄の進行性運動ニューロン変性を特徴とする最も一般的な運動疾患であり、一方、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、前頭皮質および側頭皮質のニューロン喪失によって引き起こされる若年性認知症の２番目に一般的な形態である。孤発性ＡＬＳまたはＦＴＤと呼ばれるＡＬＳまたはＦＴＤの症例の大半は、遺伝的に伝播されず、それらの原因は明らかとなっていない。ＡＬＳおよびＦＴＤに対する効果的な治療は、現在のところ存在していない。
【０００４】
ＴＤＰ−４３は、２個のタンデムなＲＮＡ認識モチーフＲＲＭ１とＲＲＭ２３を有する遍在的に発現される小さなＲＮＡ／ＤＮＡ結合タンパク質である。従来の研究により、ＴＤＰ−４３は主としてｍＲＮＡに結合し、ＲＮＡのスプライシング、輸送、および翻訳といった、転写後のＲＮＡプロセシングを調節していることが解明されている。ＴＤＰ−４３の常染色体優性突然変異は孤発性および家族性ＡＬＳとの関連性が示されており、細胞核から細胞質へのＴＤＰ−４３の再分布がＡＬＳのほとんどの形態およびＦＴＤの最も高頻度のサブタイプの病理学的特徴として認識されている。実際、ＴＤＰ−４３の細胞質への誤った局在化は、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病をはじめとする他の主要な神経変性疾患の重要な病理学的特徴ともなっている。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書に述べられる実施形態は、神経細胞におけるＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）のミトコンドリア局在化を阻害する組成物および方法に一般的に関し、詳細には、神経変性疾患または障害の治療を要する対象の神経変性疾患または障害を治療するための組成物および方法に関する。かかる方法は、治療を要する神経細胞または対象に治療有効量のＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化を阻害する薬剤を投与することを含み得る。
【０００６】
特定の実施形態では、神経変性疾患または障害には、異常なＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化、ＴＤＰ−４３のニューロン毒性、および／またはＴＤＰ−４３の突然変異を特徴とするか、かつ／またはこれにともなう神経変性疾患または障害が含まれ得る。かかる神経変性疾患としては、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、アルツハイマー病；アルツハイマー病、パーキンソン病、老年認知症、ハンチントン病、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群、多発性硬化症、または遺伝性運動性感覚性ニューロパシーに関連する認知症を挙げることができる。
【０００７】
他の実施形態は、突然変異ＴＤＰ−４３の発現をともなう運動協調認知機能障害を治療する方法に関連する。かかる方法は、治療を要する神経細胞または対象に治療有効量のＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化を阻害する薬剤を投与することを含み得る。
【０００８】
特定の実施形態では、前記薬剤すなわちＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化阻害剤は、ＴＤＰ−４３のミトコンドリア内部ターゲティングシグナルの約５〜約８個の連続したアミノ酸と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有する約５〜約１０個のアミノ酸の治療ペプチドを含む。例えば、治療ペプチドは、Ｍ１（配列番号１）、Ｍ３（配列番号３）、またはＭ５（配列番号５）、またはＴＤＰ−４３の約５〜約７個の連続したアミノ酸と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有することができる。特定の実施形態では、治療ペプチドは、配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチドを含むか、これから基本的になるか、またはこれからなるものでよい。
【０００９】
他の実施形態では、前記薬剤は、治療ペプチドに連結され、細胞による治療ペプチドの取り込みを促進する輸送部分を含む。例えば、輸送部分は、ＨＩＶのＴａｔ輸送部分とすることができる。
【００１０】
更に他の実施形態では、前記細胞は、治療される対象の体内にあり、治療剤は治療される対象に局所的または全身的に投与される。
【００１１】
更に他の実施形態では、治療ペプチドは神経細胞で発現させられる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】（Ａ〜Ｉ）ＴＤＰ−４３がＡＬＳおよびＦＴＤ患者のミトコンドリアと共局在化し、ミトコンドリアに集積していることを示す。（Ａ、Ｂ）同年齢の正常な被験者（ｎ＝５）および孤発性ＡＬＳの症例（ｎ＝６）の腰部脊髄のヒト運動ニューロン（Ａ）、または同年齢の正常な被験者（ｎ＝３）および孤発性ＦＴＤの症例（ｎ＝４）の皮質のヒト皮質ニューロン（Ｂ）におけるＴｏｍ２０およびＴＤＰ−４３の代表的な共焦点画像およびラインスキャン解析。ニューロンは、Ｔｏｍ２０およびＴＤＰ−４３に対する特異的抗体をそれぞれ使用して共染色した。ａ、ｂにおいて幅「２」を有する白い実線で示されるＴｏｍ２０とＴＤＰ−４３との共局在化の代表的なラインスキャン解析を右パネルに示す。ラインスキャン解析は、方法において詳細に述べるように、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ＲＧＢ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｐｌｏｔプラグインにより行った。（ｃ、ｄ）Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ＲＧＢ  ３Ｄ  Ｖｉｅｗｅｒ  プラグインによる一連の薄い共焦点画像（光学厚さ２００ｎｍの約３０枚の連続画像）を使用した、それぞれａおよびｂのニューロンの代表的な再構成された３次元（３Ｄ）画像。（Ｅ、Ｆ）同年齢のコントロール（ｎ＝６）および孤発性ＡＬＳ（ｎ＝８）の脊髄（Ｅ）、または同年齢のコントロール（ｎ＝６）および孤発性ＦＴＤ（ｎ＝７）の皮質（Ｆ）から単離した精製ミトコンドリア（「ミトコンドリア」）におけるＴＤＰ−４３レベルの代表的な免疫ブロットおよび定量化。コントロールと比較して、全組織ライセート（「全ライセート」）中のＴＤＰ−４３（すなわち「全ＴＤＰ−４３」）はＡＬＳ又はＦＴＤ組織で変化していない。細胞質（ＧＡＰＤＨ）、ミトコンドリア（ＣＯＸＩＶおよびＴｏｍ２０）およびＥＲ（カルネキシン）に対するコンパートメント特異的なマーカーが含まれている。ミトコンドリアおよび全ＴＤＰ−４３レベルは、すべてＣＯＸＩＶおよびＧＡＰＤＨによりそれぞれ調整されている。（Ｇ， Ｈ）  同年齢のコントロールおよびＡＬＳの脊髄（Ｇ）、および同年齢のコントロールおよびＦＴＤの皮質（Ｈ）のミトコンドリアから調製した異なるミトコンドリアよりも細かい画分中のＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロット。ミトコンドリアよりも細かいコンパートメントのマーカーとしては、ＯＭＭに対するＴｏｍ２０、ＩＭＳに対するシトクロムｃ（Ｃｙｔｏ  ｃ）、ＩＭＭに対するＴｉｍ２３、およびマトリックスに対するＨｓｐ６０が挙げられる。（Ｉ）同年齢のコントロールおよび孤発性ＡＬＳの脊髄、または同年齢のコントロールおよび孤発性ＦＴＤの皮質から単離した精製ミトコンドリア中のＴＤＰ−４３の代表的な免疫電子顕微鏡（免疫ＥＭ）写真。右パネルの定量化は、薄いＥＭ切片（厚さ５０ｎｍ）中のミトコンドリアの１平方μｍ当たりのＴＤＰ−４３金粒子の平均の数を示す。矢印は、免疫金標識されたＴＤＰ−４３を指している。１０μｇの等量のタンパク質をすべての免疫ブロットにロードした。データは３重の独立した実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊Ｐ＜  ０．０５、＊＊Ｐ＜  ０．０１および＊＊＊Ｐ＜  ０．０１。
【図１−２】（Ａ〜Ｉ）ＴＤＰ−４３がＡＬＳおよびＦＴＤ患者のミトコンドリアと共局在化し、ミトコンドリアに集積していることを示す。（Ａ、Ｂ）同年齢の正常な被験者（ｎ＝５）および孤発性ＡＬＳの症例（ｎ＝６）の腰部脊髄のヒト運動ニューロン（Ａ）、または同年齢の正常な被験者（ｎ＝３）および孤発性ＦＴＤの症例（ｎ＝４）の皮質のヒト皮質ニューロン（Ｂ）におけるＴｏｍ２０およびＴＤＰ−４３の代表的な共焦点画像およびラインスキャン解析。ニューロンは、Ｔｏｍ２０およびＴＤＰ−４３に対する特異的抗体をそれぞれ使用して共染色した。ａ、ｂにおいて幅「２」を有する白い実線で示されるＴｏｍ２０とＴＤＰ−４３との共局在化の代表的なラインスキャン解析を右パネルに示す。ラインスキャン解析は、方法において詳細に述べるように、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ＲＧＢ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｐｌｏｔプラグインにより行った。（ｃ、ｄ）Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ＲＧＢ  ３Ｄ  Ｖｉｅｗｅｒ  プラグインによる一連の薄い共焦点画像（光学厚さ２００ｎｍの約３０枚の連続画像）を使用した、それぞれａおよびｂのニューロンの代表的な再構成された３次元（３Ｄ）画像。（Ｅ、Ｆ）同年齢のコントロール（ｎ＝６）および孤発性ＡＬＳ（ｎ＝８）の脊髄（Ｅ）、または同年齢のコントロール（ｎ＝６）および孤発性ＦＴＤ（ｎ＝７）の皮質（Ｆ）から単離した精製ミトコンドリア（「ミトコンドリア」）におけるＴＤＰ−４３レベルの代表的な免疫ブロットおよび定量化。コントロールと比較して、全組織ライセート（「全ライセート」）中のＴＤＰ−４３（すなわち「全ＴＤＰ−４３」）はＡＬＳ又はＦＴＤ組織で変化していない。細胞質（ＧＡＰＤＨ）、ミトコンドリア（ＣＯＸＩＶおよびＴｏｍ２０）およびＥＲ（カルネキシン）に対するコンパートメント特異的なマーカーが含まれている。ミトコンドリアおよび全ＴＤＰ−４３レベルは、すべてＣＯＸＩＶおよびＧＡＰＤＨによりそれぞれ調整されている。（Ｇ， Ｈ）  同年齢のコントロールおよびＡＬＳの脊髄（Ｇ）、および同年齢のコントロールおよびＦＴＤの皮質（Ｈ）のミトコンドリアから調製した異なるミトコンドリアよりも細かい画分中のＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロット。ミトコンドリアよりも細かいコンパートメントのマーカーとしては、ＯＭＭに対するＴｏｍ２０、ＩＭＳに対するシトクロムｃ（Ｃｙｔｏ  ｃ）、ＩＭＭに対するＴｉｍ２３、およびマトリックスに対するＨｓｐ６０が挙げられる。（Ｉ）同年齢のコントロールおよび孤発性ＡＬＳの脊髄、または同年齢のコントロールおよび孤発性ＦＴＤの皮質から単離した精製ミトコンドリア中のＴＤＰ−４３の代表的な免疫電子顕微鏡（免疫ＥＭ）写真。右パネルの定量化は、薄いＥＭ切片（厚さ５０ｎｍ）中のミトコンドリアの１平方μｍ当たりのＴＤＰ−４３金粒子の平均の数を示す。矢印は、免疫金標識されたＴＤＰ−４３を指している。１０μｇの等量のタンパク質をすべての免疫ブロットにロードした。データは３重の独立した実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊Ｐ＜  ０．０５、＊＊Ｐ＜  ０．０１および＊＊＊Ｐ＜  ０．０１。
【図１−３】（Ａ〜Ｉ）ＴＤＰ−４３がＡＬＳおよびＦＴＤ患者のミトコンドリアと共局在化し、ミトコンドリアに集積していることを示す。（Ａ、Ｂ）同年齢の正常な被験者（ｎ＝５）および孤発性ＡＬＳの症例（ｎ＝６）の腰部脊髄のヒト運動ニューロン（Ａ）、または同年齢の正常な被験者（ｎ＝３）および孤発性ＦＴＤの症例（ｎ＝４）の皮質のヒト皮質ニューロン（Ｂ）におけるＴｏｍ２０およびＴＤＰ−４３の代表的な共焦点画像およびラインスキャン解析。ニューロンは、Ｔｏｍ２０およびＴＤＰ−４３に対する特異的抗体をそれぞれ使用して共染色した。ａ、ｂにおいて幅「２」を有する白い実線で示されるＴｏｍ２０とＴＤＰ−４３との共局在化の代表的なラインスキャン解析を右パネルに示す。ラインスキャン解析は、方法において詳細に述べるように、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ＲＧＢ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｐｌｏｔプラグインにより行った。（ｃ、ｄ）Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ＲＧＢ  ３Ｄ  Ｖｉｅｗｅｒ  プラグインによる一連の薄い共焦点画像（光学厚さ２００ｎｍの約３０枚の連続画像）を使用した、それぞれａおよびｂのニューロンの代表的な再構成された３次元（３Ｄ）画像。（Ｅ、Ｆ）同年齢のコントロール（ｎ＝６）および孤発性ＡＬＳ（ｎ＝８）の脊髄（Ｅ）、または同年齢のコントロール（ｎ＝６）および孤発性ＦＴＤ（ｎ＝７）の皮質（Ｆ）から単離した精製ミトコンドリア（「ミトコンドリア」）におけるＴＤＰ−４３レベルの代表的な免疫ブロットおよび定量化。コントロールと比較して、全組織ライセート（「全ライセート」）中のＴＤＰ−４３（すなわち「全ＴＤＰ−４３」）はＡＬＳ又はＦＴＤ組織で変化していない。細胞質（ＧＡＰＤＨ）、ミトコンドリア（ＣＯＸＩＶおよびＴｏｍ２０）およびＥＲ（カルネキシン）に対するコンパートメント特異的なマーカーが含まれている。ミトコンドリアおよび全ＴＤＰ−４３レベルは、すべてＣＯＸＩＶおよびＧＡＰＤＨによりそれぞれ調整されている。（Ｇ， Ｈ）  同年齢のコントロールおよびＡＬＳの脊髄（Ｇ）、および同年齢のコントロールおよびＦＴＤの皮質（Ｈ）のミトコンドリアから調製した異なるミトコンドリアよりも細かい画分中のＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロット。ミトコンドリアよりも細かいコンパートメントのマーカーとしては、ＯＭＭに対するＴｏｍ２０、ＩＭＳに対するシトクロムｃ（Ｃｙｔｏ  ｃ）、ＩＭＭに対するＴｉｍ２３、およびマトリックスに対するＨｓｐ６０が挙げられる。（Ｉ）同年齢のコントロールおよび孤発性ＡＬＳの脊髄、または同年齢のコントロールおよび孤発性ＦＴＤの皮質から単離した精製ミトコンドリア中のＴＤＰ−４３の代表的な免疫電子顕微鏡（免疫ＥＭ）写真。右パネルの定量化は、薄いＥＭ切片（厚さ５０ｎｍ）中のミトコンドリアの１平方μｍ当たりのＴＤＰ−４３金粒子の平均の数を示す。矢印は、免疫金標識されたＴＤＰ−４３を指している。１０μｇの等量のタンパク質をすべての免疫ブロットにロードした。データは３重の独立した実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊Ｐ＜  ０．０５、＊＊Ｐ＜  ０．０１および＊＊＊Ｐ＜  ０．０１。
【図２−１】（Ａ〜Ｈ）ＴＤＰ−４３におけるＡＬＳ関連遺伝子突然変異がミトコンドリア内へのその移入を増大させることを示す。（Ａ〜Ｃ）ＴＤＰ−４３のＧ２９８ＳまたはＡ３８２Ｔを有するＡＬＳ患者由来の２系統の初代ヒト線維芽細胞（Ｇ２９８ＳまたはＡ３８２Ｔ線維芽細胞）および４系統の同年齢の初代正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＦ１〜４）（Ａ）から、ｐａｎＴＤＰ−４３抗体を使用して、Ｆｌａｇタグ化ヒトＷＴおよび突然変異体ＴＤＰ−４３  Ｇ２９８Ｓ、Ａ３１５ＴまたはＡ３８２Ｔを発現するＨＥＫ２９３細胞（Ｂ）から、または、ヒトＴＤＰ−４３（ｈＴＤＰ−４３）に特異的な抗体を使用して、ヒトＷＴ（ｎ＝６）または突然変異体ＴＤＰ−４３  Ａ３１５Ｔ（ｎ＝６）を発現する月齢１〜２ヶ月のトランスジェニック雄性マウスの脊髄および脳（Ｃ）から単離した精製ミトコンドリア（「ミトコンドリア」画分）中のＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。ＨＥＫ２９３細胞は、示されるＦｌａｇタグ化ＴＤＰ−４３を発現するコンストラクトを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を回収してミトコンドリア単離および更なる生化学的分析を行った。アスタリスクは内因性のＴＤＰ−４３を示し、矢印は外因性のＦｌａｇタグ化ＴＤＰ−４３を示す。全細胞ライセート（「全ライセート」）中のＴＤＰ−４３およびコンパートメント特異的マーカーの免疫ブロットも示されている。定量を行うため、ミトコンドリアＴＤＰ−４３を全ＴＤＰ−４３（すなわち、全細胞ライセート中のＴＤＰ−４３の発現量）およびＣＯＸＩＶ（ミトコンドリア画分中のＣＯＸＩＶの発現量）により調整している。（Ｄ、Ｅ）ＷＴまたは突然変異体ヒトＴＤＰ−４３を発現しているヒト線維芽細胞（Ｄ）またはトランスジェニックマウスの脊髄／脳組織（Ｅ）の精製ミトコンドリアから調製されたミトコンドリアよりも細かい画分中のＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロット。（Ｆ）ミトコンドリア移入アッセイ後に０．２５％トリプシンまたは０．２５％トリプシン／ジギトニン（５ｍｇ／１０ｍｇミトコンドリア）で処理した／しなかったマウスの脳から新しく単離されたミトコンドリア中のＦｌａｇタグ化ヒトｒＴＤＰ−４３  （左パネル）またはビオチン化Ｆ１β（右パネル）の代表的な免疫ブロット（１１４８）。（Ｇ）示された時間でｒＴＤＰ−４３とインキュベートした後、０．２５％トリプシン／ジギトニン（５ｍｇ／１０ｍｇミトコンドリア）による移入後処理を行った後のマウス脳から新しく単離されたミトコンドリア中のＦｌａｇタグ化ＷＴおよび突然変異体ヒトｒＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。注：ＷＴ／突然変異体ＴＤＰ−４３のＮ末端またはＣ末端のＦｌａｇタグは、その移入に有意な影響は及ぼさない（データは示さず）。（Ｈ）ミトコンドリア移入アッセイ（移入後処理は行わない）後の精製されたマウス脳ミトコンドリア中のＦｌａｇタグ化ヒトｒＴＤＰ−４３  ＷＴまたはＡ３１５Ｔの代表的な免疫ＥＭ分析。定量化は、薄いＥＭ切片（厚さ５０ｎｍ）中のミトコンドリアの１平方μｍ当たりのＴＤＰ−４３金粒子の平均の数を示す。矢印は、免疫金標識されたＴＤＰ−４３を指している。等量のタンパク質（１０μｇ）をすべての免疫ブロット分析にロードした。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１  パネルｇでは、ＷＴのＴＤＰ−４３と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊Ｐ＜０．０５。
【図２−２】（Ａ〜Ｈ）ＴＤＰ−４３におけるＡＬＳ関連遺伝子突然変異がミトコンドリア内へのその移入を増大させることを示す。（Ａ〜Ｃ）ＴＤＰ−４３のＧ２９８ＳまたはＡ３８２Ｔを有するＡＬＳ患者由来の２系統の初代ヒト線維芽細胞（Ｇ２９８ＳまたはＡ３８２Ｔ線維芽細胞）および４系統の同年齢の初代正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＦ１〜４）（Ａ）から、ｐａｎＴＤＰ−４３抗体を使用して、Ｆｌａｇタグ化ヒトＷＴおよび突然変異体ＴＤＰ−４３  Ｇ２９８Ｓ、Ａ３１５ＴまたはＡ３８２Ｔを発現するＨＥＫ２９３細胞（Ｂ）から、または、ヒトＴＤＰ−４３（ｈＴＤＰ−４３）に特異的な抗体を使用して、ヒトＷＴ（ｎ＝６）または突然変異体ＴＤＰ−４３  Ａ３１５Ｔ（ｎ＝６）を発現する月齢１〜２ヶ月のトランスジェニック雄性マウスの脊髄および脳（Ｃ）から単離した精製ミトコンドリア（「ミトコンドリア」画分）中のＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。ＨＥＫ２９３細胞は、示されるＦｌａｇタグ化ＴＤＰ−４３を発現するコンストラクトを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を回収してミトコンドリア単離および更なる生化学的分析を行った。アスタリスクは内因性のＴＤＰ−４３を示し、矢印は外因性のＦｌａｇタグ化ＴＤＰ−４３を示す。全細胞ライセート（「全ライセート」）中のＴＤＰ−４３およびコンパートメント特異的マーカーの免疫ブロットも示されている。定量を行うため、ミトコンドリアＴＤＰ−４３を全ＴＤＰ−４３（すなわち、全細胞ライセート中のＴＤＰ−４３の発現量）およびＣＯＸＩＶ（ミトコンドリア画分中のＣＯＸＩＶの発現量）により調整している。（Ｄ、Ｅ）ＷＴまたは突然変異体ヒトＴＤＰ−４３を発現しているヒト線維芽細胞（Ｄ）またはトランスジェニックマウスの脊髄／脳組織（Ｅ）の精製ミトコンドリアから調製されたミトコンドリアよりも細かい画分中のＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロット。（Ｆ）ミトコンドリア移入アッセイ後に０．２５％トリプシンまたは０．２５％トリプシン／ジギトニン（５ｍｇ／１０ｍｇミトコンドリア）で処理した／しなかったマウスの脳から新しく単離されたミトコンドリア中のＦｌａｇタグ化ヒトｒＴＤＰ−４３  （左パネル）またはビオチン化Ｆ１β（右パネル）の代表的な免疫ブロット（１１４８）。（Ｇ）示された時間でｒＴＤＰ−４３とインキュベートした後、０．２５％トリプシン／ジギトニン（５ｍｇ／１０ｍｇミトコンドリア）による移入後処理を行った後のマウス脳から新しく単離されたミトコンドリア中のＦｌａｇタグ化ＷＴおよび突然変異体ヒトｒＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。注：ＷＴ／突然変異体ＴＤＰ−４３のＮ末端またはＣ末端のＦｌａｇタグは、その移入に有意な影響は及ぼさない（データは示さず）。（Ｈ）ミトコンドリア移入アッセイ（移入後処理は行わない）後の精製されたマウス脳ミトコンドリア中のＦｌａｇタグ化ヒトｒＴＤＰ−４３  ＷＴまたはＡ３１５Ｔの代表的な免疫ＥＭ分析。定量化は、薄いＥＭ切片（厚さ５０ｎｍ）中のミトコンドリアの１平方μｍ当たりのＴＤＰ−４３金粒子の平均の数を示す。矢印は、免疫金標識されたＴＤＰ−４３を指している。等量のタンパク質（１０μｇ）をすべての免疫ブロット分析にロードした。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１  パネルｇでは、ＷＴのＴＤＰ−４３と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊Ｐ＜０．０５。
【図２−３】（Ａ〜Ｈ）ＴＤＰ−４３におけるＡＬＳ関連遺伝子突然変異がミトコンドリア内へのその移入を増大させることを示す。（Ａ〜Ｃ）ＴＤＰ−４３のＧ２９８ＳまたはＡ３８２Ｔを有するＡＬＳ患者由来の２系統の初代ヒト線維芽細胞（Ｇ２９８ＳまたはＡ３８２Ｔ線維芽細胞）および４系統の同年齢の初代正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＦ１〜４）（Ａ）から、ｐａｎＴＤＰ−４３抗体を使用して、Ｆｌａｇタグ化ヒトＷＴおよび突然変異体ＴＤＰ−４３  Ｇ２９８Ｓ、Ａ３１５ＴまたはＡ３８２Ｔを発現するＨＥＫ２９３細胞（Ｂ）から、または、ヒトＴＤＰ−４３（ｈＴＤＰ−４３）に特異的な抗体を使用して、ヒトＷＴ（ｎ＝６）または突然変異体ＴＤＰ−４３  Ａ３１５Ｔ（ｎ＝６）を発現する月齢１〜２ヶ月のトランスジェニック雄性マウスの脊髄および脳（Ｃ）から単離した精製ミトコンドリア（「ミトコンドリア」画分）中のＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。ＨＥＫ２９３細胞は、示されるＦｌａｇタグ化ＴＤＰ−４３を発現するコンストラクトを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を回収してミトコンドリア単離および更なる生化学的分析を行った。アスタリスクは内因性のＴＤＰ−４３を示し、矢印は外因性のＦｌａｇタグ化ＴＤＰ−４３を示す。全細胞ライセート（「全ライセート」）中のＴＤＰ−４３およびコンパートメント特異的マーカーの免疫ブロットも示されている。定量を行うため、ミトコンドリアＴＤＰ−４３を全ＴＤＰ−４３（すなわち、全細胞ライセート中のＴＤＰ−４３の発現量）およびＣＯＸＩＶ（ミトコンドリア画分中のＣＯＸＩＶの発現量）により調整している。（Ｄ、Ｅ）ＷＴまたは突然変異体ヒトＴＤＰ−４３を発現しているヒト線維芽細胞（Ｄ）またはトランスジェニックマウスの脊髄／脳組織（Ｅ）の精製ミトコンドリアから調製されたミトコンドリアよりも細かい画分中のＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロット。（Ｆ）ミトコンドリア移入アッセイ後に０．２５％トリプシンまたは０．２５％トリプシン／ジギトニン（５ｍｇ／１０ｍｇミトコンドリア）で処理した／しなかったマウスの脳から新しく単離されたミトコンドリア中のＦｌａｇタグ化ヒトｒＴＤＰ−４３  （左パネル）またはビオチン化Ｆ１β（右パネル）の代表的な免疫ブロット（１１４８）。（Ｇ）示された時間でｒＴＤＰ−４３とインキュベートした後、０．２５％トリプシン／ジギトニン（５ｍｇ／１０ｍｇミトコンドリア）による移入後処理を行った後のマウス脳から新しく単離されたミトコンドリア中のＦｌａｇタグ化ＷＴおよび突然変異体ヒトｒＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。注：ＷＴ／突然変異体ＴＤＰ−４３のＮ末端またはＣ末端のＦｌａｇタグは、その移入に有意な影響は及ぼさない（データは示さず）。（Ｈ）ミトコンドリア移入アッセイ（移入後処理は行わない）後の精製されたマウス脳ミトコンドリア中のＦｌａｇタグ化ヒトｒＴＤＰ−４３  ＷＴまたはＡ３１５Ｔの代表的な免疫ＥＭ分析。定量化は、薄いＥＭ切片（厚さ５０ｎｍ）中のミトコンドリアの１平方μｍ当たりのＴＤＰ−４３金粒子の平均の数を示す。矢印は、免疫金標識されたＴＤＰ−４３を指している。等量のタンパク質（１０μｇ）をすべての免疫ブロット分析にロードした。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１  パネルｇでは、ＷＴのＴＤＰ−４３と比較して＊Ｐ＜０．０５、＊Ｐ＜０．０５。
【図３−１】（Ａ〜Ｇ）ＴＤＰ−４３のミトコンドリアへの移入／局在化がＴＯＭ／ＴＩＭ２３複合体および内部Ｍ１／３／５モチーフに依存することを示す。（Ａ）ヒトＴＤＰ−４３の構造（上パネル）およびアミノ酸配列（下パネル）（配列番号１０）。ＲＲＭ１／２は、ＲＮＡ認識モチーフである。ＮＬＳ：核局在化配列、ＮＥＳ：核輸出配列。（Ｂ）示される組換えＦｌａｇタグ化ヒト野生型（ＷＴ）ＴＤＰ−４３、または推定上の内部ターゲティングシグナル（ΔＭ１〜６）の欠失を有する人工ＴＤＰ−４３突然変異体とインキュベーション後に０．２５％トリプシン／ジギトニン（５ｍｇ／１０ｍｇミトコンドリア）処理を行った後のマウス脳から新しく単離されたミトコンドリア（「脳ミトコンドリア」と示される）中のｒＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロットおよび定量結果（インビトロミトコンドリア移入アッセイ）。（Ｃ）Ｆｌａｇに対する特異的抗体を使用してＦｌａｇタグ化ＴＤＰ−４３（ΔＭ１〜６）を過剰発現しているＨＥＫ２９３から単離された純粋なミトコンドリア中のＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。細胞質画分（「細胞質」）、核画分（「核」）、および全ライセート（「全」）中のＴＤＰ−４３の発現も示されている。ＨＥＫ２９３細胞にはやはり示されたコンストラクトを一過性にトランスフェクトし、トランスフェクションの２日後にミトコンドリア単離に供した。（Ｄ）５μＭのコントロールペプチド（ｃＰＭ）、ＰＭ１またはＰＭ３で前／共処理した後、ｒＴＤＰ−４３またはｐＦ１βインキュベーションを用いてインビトロミトコンドリア移入アッセイを行ったミトコンドリア中のＦｌａｇタグ化ｒＴＤＰ−４３およびｐＦ１βの代表的な免疫ブロットおよび定量結果。（Ｅ、Ｆ）１μＭのｃＰＭ、ＰＭ１またはＰＭ３で２４時間処理した、ＨＥＫ２９３細胞（Ｅ）、またはラット初代皮質ニューロン（インビトロで１２日間：ＤＩＶ１２）（Ｆ）から単離された純粋なミトコンドリア中のＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。全細胞ライセート（「全」）中のＴＤＰ−４３およびコンパートメント特異的マーカーの免疫ブロットも示されている。（Ｇ）ＧＦＰまたはＭ１／３／５−ＧＦＰ（Ｎ末端タグ）を発現するＨＥＫ２９３細胞から単離された純粋ミトコンドリア中のＧＦＰの代表的な免疫ブロットおよび定量結果。ＨＥＫ２９３細胞は、示されたコンストラクトによる一過性のトランスフェクションの２日後に回収した。定量化は、トリプシン／ジギトニンで同時処理した試料に基づいている。全細胞ライセート（「全ライセート」）中のＧＦＰおよびＭ１／３／５タグ化ＧＦＰの免疫ブロットも示されている。１０μｇの等量のタンパク質をすべての免疫ブロットにロードした。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊＊ｐ＜０．０５。
【図３−２】（Ａ〜Ｇ）ＴＤＰ−４３のミトコンドリアへの移入／局在化がＴＯＭ／ＴＩＭ２３複合体および内部Ｍ１／３／５モチーフに依存することを示す。（Ａ）ヒトＴＤＰ−４３の構造（上パネル）およびアミノ酸配列（下パネル）（配列番号１０）。ＲＲＭ１／２は、ＲＮＡ認識モチーフである。ＮＬＳ：核局在化配列、ＮＥＳ：核輸出配列。（Ｂ）示される組換えＦｌａｇタグ化ヒト野生型（ＷＴ）ＴＤＰ−４３、または推定上の内部ターゲティングシグナル（ΔＭ１〜６）の欠失を有する人工ＴＤＰ−４３突然変異体とインキュベーション後に０．２５％トリプシン／ジギトニン（５ｍｇ／１０ｍｇミトコンドリア）処理を行った後のマウス脳から新しく単離されたミトコンドリア（「脳ミトコンドリア」と示される）中のｒＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロットおよび定量結果（インビトロミトコンドリア移入アッセイ）。（Ｃ）Ｆｌａｇに対する特異的抗体を使用してＦｌａｇタグ化ＴＤＰ−４３（ΔＭ１〜６）を過剰発現しているＨＥＫ２９３から単離された純粋なミトコンドリア中のＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。細胞質画分（「細胞質」）、核画分（「核」）、および全ライセート（「全」）中のＴＤＰ−４３の発現も示されている。ＨＥＫ２９３細胞にはやはり示されたコンストラクトを一過性にトランスフェクトし、トランスフェクションの２日後にミトコンドリア単離に供した。（Ｄ）５μＭのコントロールペプチド（ｃＰＭ）、ＰＭ１またはＰＭ３で前／共処理した後、ｒＴＤＰ−４３またはｐＦ１βインキュベーションを用いてインビトロミトコンドリア移入アッセイを行ったミトコンドリア中のＦｌａｇタグ化ｒＴＤＰ−４３およびｐＦ１βの代表的な免疫ブロットおよび定量結果。（Ｅ、Ｆ）１μＭのｃＰＭ、ＰＭ１またはＰＭ３で２４時間処理した、ＨＥＫ２９３細胞（Ｅ）、またはラット初代皮質ニューロン（インビトロで１２日間：ＤＩＶ１２）（Ｆ）から単離された純粋なミトコンドリア中のＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。全細胞ライセート（「全」）中のＴＤＰ−４３およびコンパートメント特異的マーカーの免疫ブロットも示されている。（Ｇ）ＧＦＰまたはＭ１／３／５−ＧＦＰ（Ｎ末端タグ）を発現するＨＥＫ２９３細胞から単離された純粋ミトコンドリア中のＧＦＰの代表的な免疫ブロットおよび定量結果。ＨＥＫ２９３細胞は、示されたコンストラクトによる一過性のトランスフェクションの２日後に回収した。定量化は、トリプシン／ジギトニンで同時処理した試料に基づいている。全細胞ライセート（「全ライセート」）中のＧＦＰおよびＭ１／３／５タグ化ＧＦＰの免疫ブロットも示されている。１０μｇの等量のタンパク質をすべての免疫ブロットにロードした。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊＊ｐ＜０．０５。
【図３−３】（Ａ〜Ｇ）ＴＤＰ−４３のミトコンドリアへの移入／局在化がＴＯＭ／ＴＩＭ２３複合体および内部Ｍ１／３／５モチーフに依存することを示す。（Ａ）ヒトＴＤＰ−４３の構造（上パネル）およびアミノ酸配列（下パネル）（配列番号１０）。ＲＲＭ１／２は、ＲＮＡ認識モチーフである。ＮＬＳ：核局在化配列、ＮＥＳ：核輸出配列。（Ｂ）示される組換えＦｌａｇタグ化ヒト野生型（ＷＴ）ＴＤＰ−４３、または推定上の内部ターゲティングシグナル（ΔＭ１〜６）の欠失を有する人工ＴＤＰ−４３突然変異体とインキュベーション後に０．２５％トリプシン／ジギトニン（５ｍｇ／１０ｍｇミトコンドリア）処理を行った後のマウス脳から新しく単離されたミトコンドリア（「脳ミトコンドリア」と示される）中のｒＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロットおよび定量結果（インビトロミトコンドリア移入アッセイ）。（Ｃ）Ｆｌａｇに対する特異的抗体を使用してＦｌａｇタグ化ＴＤＰ−４３（ΔＭ１〜６）を過剰発現しているＨＥＫ２９３から単離された純粋なミトコンドリア中のＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。細胞質画分（「細胞質」）、核画分（「核」）、および全ライセート（「全」）中のＴＤＰ−４３の発現も示されている。ＨＥＫ２９３細胞にはやはり示されたコンストラクトを一過性にトランスフェクトし、トランスフェクションの２日後にミトコンドリア単離に供した。（Ｄ）５μＭのコントロールペプチド（ｃＰＭ）、ＰＭ１またはＰＭ３で前／共処理した後、ｒＴＤＰ−４３またはｐＦ１βインキュベーションを用いてインビトロミトコンドリア移入アッセイを行ったミトコンドリア中のＦｌａｇタグ化ｒＴＤＰ−４３およびｐＦ１βの代表的な免疫ブロットおよび定量結果。（Ｅ、Ｆ）１μＭのｃＰＭ、ＰＭ１またはＰＭ３で２４時間処理した、ＨＥＫ２９３細胞（Ｅ）、またはラット初代皮質ニューロン（インビトロで１２日間：ＤＩＶ１２）（Ｆ）から単離された純粋なミトコンドリア中のＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。全細胞ライセート（「全」）中のＴＤＰ−４３およびコンパートメント特異的マーカーの免疫ブロットも示されている。（Ｇ）ＧＦＰまたはＭ１／３／５−ＧＦＰ（Ｎ末端タグ）を発現するＨＥＫ２９３細胞から単離された純粋ミトコンドリア中のＧＦＰの代表的な免疫ブロットおよび定量結果。ＨＥＫ２９３細胞は、示されたコンストラクトによる一過性のトランスフェクションの２日後に回収した。定量化は、トリプシン／ジギトニンで同時処理した試料に基づいている。全細胞ライセート（「全ライセート」）中のＧＦＰおよびＭ１／３／５タグ化ＧＦＰの免疫ブロットも示されている。１０μｇの等量のタンパク質をすべての免疫ブロットにロードした。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊＊ｐ＜０．０５。
【図４−１】（Ａ〜Ｈ）  ＴＤＰ−４３が、複合体ＩサブユニットＮＤ３／６をコードするミトコンドリアで転写されたｍＲＮＡに選択的に結合してその翻訳を阻害することを示す。（Ａ）ヒトミトコンドリアゲノムのマップ  軽鎖複製開始点（ＯＬ）／重鎖複製開始点（ＯＨ）、軽鎖および重鎖プロモーター（ＬＳＰおよびＨＳＰ）、およびＤＮＡ複製／転写の方向が矢印で示されている。ミトコンドリアのゲノムは、コーディング遺伝子の間に２個のｒＲＮＡおよび２２個のｔＲＮＡ、ならびに４つの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）複合体、すなわち複合体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶに不可欠な１３個のサブユニットをコードしている。これら１３個のミトコンドリアによってコードされたタンパク質には、複合体Ｉの７個のサブユニット（ＮＤ１、２、３、４、４Ｌ、５および６）、複合体ＩＩＩの１個のサブユニット（Ｃｙｔ  ｂ）、複合体ＩＶの３個のサブユニット（ＣＯＸＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）、および複合体Ｖの２個のサブユニット（Ａ６およびＡ８）が含まれる。（Ｂ〜Ｄ）  Ｆｌａｇタグ化ＷＴまたはヒト突然変異体ＴＤＰ−４３を過剰発現している、月齢３ヶ月のマウスから新しく採取したマウス脳（Ｂ）、培養した初代ヒト線維芽細胞（Ｃ）、またはＨＥＫ２９３細胞（Ｄ）から単離した精製ミトコンドリア中でＴＤＰ−４３またはＦｌａｇに特異的な抗体によって沈降された、ミトコンドリアによりコードされたｍＲＮＡの代表的な逆転写酵素共役定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析。ＨＥＫ２９３細胞からのミトコンドリアは、示されたコンストラクトによる一過性のトランスフェクションの２日後に単離した。すべての免疫沈降（ＩＰ）は、磁気ビーズに共有結合させた抗体に続いてＲＮＡ抽出および精製を行うことによって行った。（Ｅ）ＨＥＫ２９３細胞のミトコンドリアによりコードされたタンパク質の翻訳の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。ＨＥＫ２９３細胞に、ＴＤＰ−４３のＷＴまたはΔＭ１をコードしたコンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞をエメチン（０．１ｍｇ／ｍｌ）の存在下、ＡＨＡ（５０μＭ）で代謝的に標識した。ミトコンドリアの精製後、ＡＨＡで標識したタンパク質をビオチン−アルキンでタグ化し、最後にストレプトアビジン複合体を用いた免疫ブロットにより分析した。免疫ブロットのＮＤ３およびＮＤ６のバンドを特異的抗体により確認した（図示せず）。（Ｆ〜Ｈ）Ｆｌａｇタグ化ＷＴまたは突然変異体ヒトＴＤＰ−４３を発現するＨＥＫ２９３細胞（Ｆ）、１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１で４８時間処理した初代ヒト患者線維芽細胞（Ｇ）、ならびにＡＬＳの症例（ｎ＝８）および同年齢の正常被験者（ｎ＝６）からの脊髄のヒト組織試料（ｈ）中のミトコンドリアによりコードされたタンパク質の発現の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。ＨＥＫ２９３細胞は、やはり試料採取の２日前に一過性にトランスフェクトした。１０μｇの等量のタンパク質をロードした。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。パネルｆでは、＊Ｐ＜  ０．０５である。パネルａおよびｂでは、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【図４−２】（Ａ〜Ｈ）  ＴＤＰ−４３が、複合体ＩサブユニットＮＤ３／６をコードするミトコンドリアで転写されたｍＲＮＡに選択的に結合してその翻訳を阻害することを示す。（Ａ）ヒトミトコンドリアゲノムのマップ  軽鎖複製開始点（ＯＬ）／重鎖複製開始点（ＯＨ）、軽鎖および重鎖プロモーター（ＬＳＰおよびＨＳＰ）、およびＤＮＡ複製／転写の方向が矢印で示されている。ミトコンドリアのゲノムは、コーディング遺伝子の間に２個のｒＲＮＡおよび２２個のｔＲＮＡ、ならびに４つの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）複合体、すなわち複合体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶに不可欠な１３個のサブユニットをコードしている。これら１３個のミトコンドリアによってコードされたタンパク質には、複合体Ｉの７個のサブユニット（ＮＤ１、２、３、４、４Ｌ、５および６）、複合体ＩＩＩの１個のサブユニット（Ｃｙｔ  ｂ）、複合体ＩＶの３個のサブユニット（ＣＯＸＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）、および複合体Ｖの２個のサブユニット（Ａ６およびＡ８）が含まれる。（Ｂ〜Ｄ）  Ｆｌａｇタグ化ＷＴまたはヒト突然変異体ＴＤＰ−４３を過剰発現している、月齢３ヶ月のマウスから新しく採取したマウス脳（Ｂ）、培養した初代ヒト線維芽細胞（Ｃ）、またはＨＥＫ２９３細胞（Ｄ）から単離した精製ミトコンドリア中でＴＤＰ−４３またはＦｌａｇに特異的な抗体によって沈降された、ミトコンドリアによりコードされたｍＲＮＡの代表的な逆転写酵素共役定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析。ＨＥＫ２９３細胞からのミトコンドリアは、示されたコンストラクトによる一過性のトランスフェクションの２日後に単離した。すべての免疫沈降（ＩＰ）は、磁気ビーズに共有結合させた抗体に続いてＲＮＡ抽出および精製を行うことによって行った。（Ｅ）ＨＥＫ２９３細胞のミトコンドリアによりコードされたタンパク質の翻訳の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。ＨＥＫ２９３細胞に、ＴＤＰ−４３のＷＴまたはΔＭ１をコードしたコンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞をエメチン（０．１ｍｇ／ｍｌ）の存在下、ＡＨＡ（５０μＭ）で代謝的に標識した。ミトコンドリアの精製後、ＡＨＡで標識したタンパク質をビオチン−アルキンでタグ化し、最後にストレプトアビジン複合体を用いた免疫ブロットにより分析した。免疫ブロットのＮＤ３およびＮＤ６のバンドを特異的抗体により確認した（図示せず）。（Ｆ〜Ｈ）Ｆｌａｇタグ化ＷＴまたは突然変異体ヒトＴＤＰ−４３を発現するＨＥＫ２９３細胞（Ｆ）、１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１で４８時間処理した初代ヒト患者線維芽細胞（Ｇ）、ならびにＡＬＳの症例（ｎ＝８）および同年齢の正常被験者（ｎ＝６）からの脊髄のヒト組織試料（ｈ）中のミトコンドリアによりコードされたタンパク質の発現の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。ＨＥＫ２９３細胞は、やはり試料採取の２日前に一過性にトランスフェクトした。１０μｇの等量のタンパク質をロードした。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。パネルｆでは、＊Ｐ＜  ０．０５である。パネルａおよびｂでは、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【図４−３】（Ａ〜Ｈ）  ＴＤＰ−４３が、複合体ＩサブユニットＮＤ３／６をコードするミトコンドリアで転写されたｍＲＮＡに選択的に結合してその翻訳を阻害することを示す。（Ａ）ヒトミトコンドリアゲノムのマップ  軽鎖複製開始点（ＯＬ）／重鎖複製開始点（ＯＨ）、軽鎖および重鎖プロモーター（ＬＳＰおよびＨＳＰ）、およびＤＮＡ複製／転写の方向が矢印で示されている。ミトコンドリアのゲノムは、コーディング遺伝子の間に２個のｒＲＮＡおよび２２個のｔＲＮＡ、ならびに４つの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）複合体、すなわち複合体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶに不可欠な１３個のサブユニットをコードしている。これら１３個のミトコンドリアによってコードされたタンパク質には、複合体Ｉの７個のサブユニット（ＮＤ１、２、３、４、４Ｌ、５および６）、複合体ＩＩＩの１個のサブユニット（Ｃｙｔ  ｂ）、複合体ＩＶの３個のサブユニット（ＣＯＸＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）、および複合体Ｖの２個のサブユニット（Ａ６およびＡ８）が含まれる。（Ｂ〜Ｄ）  Ｆｌａｇタグ化ＷＴまたはヒト突然変異体ＴＤＰ−４３を過剰発現している、月齢３ヶ月のマウスから新しく採取したマウス脳（Ｂ）、培養した初代ヒト線維芽細胞（Ｃ）、またはＨＥＫ２９３細胞（Ｄ）から単離した精製ミトコンドリア中でＴＤＰ−４３またはＦｌａｇに特異的な抗体によって沈降された、ミトコンドリアによりコードされたｍＲＮＡの代表的な逆転写酵素共役定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析。ＨＥＫ２９３細胞からのミトコンドリアは、示されたコンストラクトによる一過性のトランスフェクションの２日後に単離した。すべての免疫沈降（ＩＰ）は、磁気ビーズに共有結合させた抗体に続いてＲＮＡ抽出および精製を行うことによって行った。（Ｅ）ＨＥＫ２９３細胞のミトコンドリアによりコードされたタンパク質の翻訳の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。ＨＥＫ２９３細胞に、ＴＤＰ−４３のＷＴまたはΔＭ１をコードしたコンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞をエメチン（０．１ｍｇ／ｍｌ）の存在下、ＡＨＡ（５０μＭ）で代謝的に標識した。ミトコンドリアの精製後、ＡＨＡで標識したタンパク質をビオチン−アルキンでタグ化し、最後にストレプトアビジン複合体を用いた免疫ブロットにより分析した。免疫ブロットのＮＤ３およびＮＤ６のバンドを特異的抗体により確認した（図示せず）。（Ｆ〜Ｈ）Ｆｌａｇタグ化ＷＴまたは突然変異体ヒトＴＤＰ−４３を発現するＨＥＫ２９３細胞（Ｆ）、１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１で４８時間処理した初代ヒト患者線維芽細胞（Ｇ）、ならびにＡＬＳの症例（ｎ＝８）および同年齢の正常被験者（ｎ＝６）からの脊髄のヒト組織試料（ｈ）中のミトコンドリアによりコードされたタンパク質の発現の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。ＨＥＫ２９３細胞は、やはり試料採取の２日前に一過性にトランスフェクトした。１０μｇの等量のタンパク質をロードした。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。パネルｆでは、＊Ｐ＜  ０．０５である。パネルａおよびｂでは、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【図４−４】（Ａ〜Ｈ）  ＴＤＰ−４３が、複合体ＩサブユニットＮＤ３／６をコードするミトコンドリアで転写されたｍＲＮＡに選択的に結合してその翻訳を阻害することを示す。（Ａ）ヒトミトコンドリアゲノムのマップ  軽鎖複製開始点（ＯＬ）／重鎖複製開始点（ＯＨ）、軽鎖および重鎖プロモーター（ＬＳＰおよびＨＳＰ）、およびＤＮＡ複製／転写の方向が矢印で示されている。ミトコンドリアのゲノムは、コーディング遺伝子の間に２個のｒＲＮＡおよび２２個のｔＲＮＡ、ならびに４つの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）複合体、すなわち複合体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶに不可欠な１３個のサブユニットをコードしている。これら１３個のミトコンドリアによってコードされたタンパク質には、複合体Ｉの７個のサブユニット（ＮＤ１、２、３、４、４Ｌ、５および６）、複合体ＩＩＩの１個のサブユニット（Ｃｙｔ  ｂ）、複合体ＩＶの３個のサブユニット（ＣＯＸＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）、および複合体Ｖの２個のサブユニット（Ａ６およびＡ８）が含まれる。（Ｂ〜Ｄ）  Ｆｌａｇタグ化ＷＴまたはヒト突然変異体ＴＤＰ−４３を過剰発現している、月齢３ヶ月のマウスから新しく採取したマウス脳（Ｂ）、培養した初代ヒト線維芽細胞（Ｃ）、またはＨＥＫ２９３細胞（Ｄ）から単離した精製ミトコンドリア中でＴＤＰ−４３またはＦｌａｇに特異的な抗体によって沈降された、ミトコンドリアによりコードされたｍＲＮＡの代表的な逆転写酵素共役定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析。ＨＥＫ２９３細胞からのミトコンドリアは、示されたコンストラクトによる一過性のトランスフェクションの２日後に単離した。すべての免疫沈降（ＩＰ）は、磁気ビーズに共有結合させた抗体に続いてＲＮＡ抽出および精製を行うことによって行った。（Ｅ）ＨＥＫ２９３細胞のミトコンドリアによりコードされたタンパク質の翻訳の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。ＨＥＫ２９３細胞に、ＴＤＰ−４３のＷＴまたはΔＭ１をコードしたコンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞をエメチン（０．１ｍｇ／ｍｌ）の存在下、ＡＨＡ（５０μＭ）で代謝的に標識した。ミトコンドリアの精製後、ＡＨＡで標識したタンパク質をビオチン−アルキンでタグ化し、最後にストレプトアビジン複合体を用いた免疫ブロットにより分析した。免疫ブロットのＮＤ３およびＮＤ６のバンドを特異的抗体により確認した（図示せず）。（Ｆ〜Ｈ）Ｆｌａｇタグ化ＷＴまたは突然変異体ヒトＴＤＰ−４３を発現するＨＥＫ２９３細胞（Ｆ）、１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１で４８時間処理した初代ヒト患者線維芽細胞（Ｇ）、ならびにＡＬＳの症例（ｎ＝８）および同年齢の正常被験者（ｎ＝６）からの脊髄のヒト組織試料（ｈ）中のミトコンドリアによりコードされたタンパク質の発現の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。ＨＥＫ２９３細胞は、やはり試料採取の２日前に一過性にトランスフェクトした。１０μｇの等量のタンパク質をロードした。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。パネルｆでは、＊Ｐ＜  ０．０５である。パネルａおよびｂでは、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【図４−５】（Ａ〜Ｈ）  ＴＤＰ−４３が、複合体ＩサブユニットＮＤ３／６をコードするミトコンドリアで転写されたｍＲＮＡに選択的に結合してその翻訳を阻害することを示す。（Ａ）ヒトミトコンドリアゲノムのマップ  軽鎖複製開始点（ＯＬ）／重鎖複製開始点（ＯＨ）、軽鎖および重鎖プロモーター（ＬＳＰおよびＨＳＰ）、およびＤＮＡ複製／転写の方向が矢印で示されている。ミトコンドリアのゲノムは、コーディング遺伝子の間に２個のｒＲＮＡおよび２２個のｔＲＮＡ、ならびに４つの酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）複合体、すなわち複合体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶに不可欠な１３個のサブユニットをコードしている。これら１３個のミトコンドリアによってコードされたタンパク質には、複合体Ｉの７個のサブユニット（ＮＤ１、２、３、４、４Ｌ、５および６）、複合体ＩＩＩの１個のサブユニット（Ｃｙｔ  ｂ）、複合体ＩＶの３個のサブユニット（ＣＯＸＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）、および複合体Ｖの２個のサブユニット（Ａ６およびＡ８）が含まれる。（Ｂ〜Ｄ）  Ｆｌａｇタグ化ＷＴまたはヒト突然変異体ＴＤＰ−４３を過剰発現している、月齢３ヶ月のマウスから新しく採取したマウス脳（Ｂ）、培養した初代ヒト線維芽細胞（Ｃ）、またはＨＥＫ２９３細胞（Ｄ）から単離した精製ミトコンドリア中でＴＤＰ−４３またはＦｌａｇに特異的な抗体によって沈降された、ミトコンドリアによりコードされたｍＲＮＡの代表的な逆転写酵素共役定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析。ＨＥＫ２９３細胞からのミトコンドリアは、示されたコンストラクトによる一過性のトランスフェクションの２日後に単離した。すべての免疫沈降（ＩＰ）は、磁気ビーズに共有結合させた抗体に続いてＲＮＡ抽出および精製を行うことによって行った。（Ｅ）ＨＥＫ２９３細胞のミトコンドリアによりコードされたタンパク質の翻訳の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。ＨＥＫ２９３細胞に、ＴＤＰ−４３のＷＴまたはΔＭ１をコードしたコンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞をエメチン（０．１ｍｇ／ｍｌ）の存在下、ＡＨＡ（５０μＭ）で代謝的に標識した。ミトコンドリアの精製後、ＡＨＡで標識したタンパク質をビオチン−アルキンでタグ化し、最後にストレプトアビジン複合体を用いた免疫ブロットにより分析した。免疫ブロットのＮＤ３およびＮＤ６のバンドを特異的抗体により確認した（図示せず）。（Ｆ〜Ｈ）Ｆｌａｇタグ化ＷＴまたは突然変異体ヒトＴＤＰ−４３を発現するＨＥＫ２９３細胞（Ｆ）、１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１で４８時間処理した初代ヒト患者線維芽細胞（Ｇ）、ならびにＡＬＳの症例（ｎ＝８）および同年齢の正常被験者（ｎ＝６）からの脊髄のヒト組織試料（ｈ）中のミトコンドリアによりコードされたタンパク質の発現の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。ＨＥＫ２９３細胞は、やはり試料採取の２日前に一過性にトランスフェクトした。１０μｇの等量のタンパク質をロードした。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。パネルｆでは、＊Ｐ＜  ０．０５である。パネルａおよびｂでは、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【図５−１】（Ａ〜Ｆ）ＴＤＰ−４３が複合体Ｉのアセンブリを特異的に低下させ、ミトコンドリア機能および形態を損なうことを示す。（Ａ、Ｃ）Ｆｌａｇタグ化ＷＴ／Ｍ１ドメインの欠失を有する／有さない突然変異体ＴＤＰ−４３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（Ａ）、および１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１処理の４８時間後の培養初代ヒト線維芽細胞（Ｃ）におけるＯＸＰＨＯＳ複合体ＩまたはＩ〜Ｖのアセンブリの代表的な画像および定量結果。ＨＥＫ２９３細胞は、一過性トランスフェクションの４８時間後に回収した。ミトコンドリアは細胞から単離し、溶解し、各ＯＸＰＨＯＳ複合体のサブユニットに対して特異的な抗体を用いたＢＮ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットにより分析した。矢印は複合体Ｉを指している。（Ｂ、Ｄ、Ｅ）Ｆｌａｇタグ化ＷＴ／Ｍ１ドメインの欠失を有する／有さない突然変異体ＴＤＰ−４３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（Ｂ）、１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１処理の４８時間後の初代ヒト線維芽細胞（Ｄ）、または、Ｆｌａｇタグ化ＷＴ  ＴＤＰ−４３、ＮＤ３、および／またはＮＤ６を同時過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞（Ｅ）から単離されたミトコンドリアにおけるＯＸＰＨＯＳ複合体ＩまたはＩＩ〜Ｖの活性の測定。ＨＥＫ２９３を、示されるコンストラクトで一過性にトランスフェクトし、ミトコンドリアをトランスフェクションの４８時間後に酵素活性について単離した。（Ｆ）１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１処理の４８時間後の初代ヒト線維芽細胞におけるｍΔψ、ＡＴＰ産生、および酸素消費速度（ＯＣＲ）を含むミトコンドリア機能のバルク測定値。ｍΔψについては、２４ウェルプレートで培養した線維芽細胞に２０ｎＭ  ＴＭＲＭを３０分間ロードし、蛍光マイクロプレートリーダーにより分析した。線維芽細胞のＡＴＰレベルは、ＡＴＰ比色／蛍光分析アッセイキットおよび吸光度マイクロプレートリーダーにより測定した。最適播種密度（１００，０００細胞／ウェル）の生きた培養線維芽細胞のＯＣＲは、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４  Ａｎａｌｙｚｅｒにより直接測定した。各試料のすべての測定値は全タンパク質により正規化した。（Ｇ）初代ヒト線維芽細胞中のミトコンドリアの長さの代表的な共焦点画像および定量結果。１μＭのｃＰＭまたはＰＭ１処理による４８時間の処理の１日前に、線維芽細胞に、ｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２（ミトコンドリアに特異的に局在化した赤色蛍光タンパク質）をコードしたコンストラクトをトランスフェクトしてミトコンドリアを標識した。核をＤＡＰＩにより青色に染色した。各群ｎ＝５０細胞とした。（Ｆ）酸化ストレスに対する初代ヒト線維芽細胞の感受性の測定。示された初代ヒト線維芽細胞を２４ウェルプレートで培養し、１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１による前処理を行うか、または行わなかった。前処理の４８時間後、線維芽細胞を５０μＭ  Ｈ２Ｏ２で１時間処理し、３時間の回復後（Ｈ２Ｏ２を含まない新鮮な培地に置き換えた後）に乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイにより調べた。１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の存在下でのＬＤＨの放出量を１００％細胞死（「１００」）とした。すべての条件下でＮＨＦにも患者線維芽細胞にも明らかな細胞剥離は認められず、各試料中のＬＤＨ放出量を全タンパク質により正規化した。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊ｐ＜０．０５。パネルＡおよびＢでは、コントロール細胞と比較して＊Ｐ＜０．０５であり、ＷＴ  ＴＤＰ−４３を発現する細胞と比較して＃ｐ＜０．０５である。
【図５−２】（Ａ〜Ｆ）ＴＤＰ−４３が複合体Ｉのアセンブリを特異的に低下させ、ミトコンドリア機能および形態を損なうことを示す。（Ａ、Ｃ）Ｆｌａｇタグ化ＷＴ／Ｍ１ドメインの欠失を有する／有さない突然変異体ＴＤＰ−４３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（Ａ）、および１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１処理の４８時間後の培養初代ヒト線維芽細胞（Ｃ）におけるＯＸＰＨＯＳ複合体ＩまたはＩ〜Ｖのアセンブリの代表的な画像および定量結果。ＨＥＫ２９３細胞は、一過性トランスフェクションの４８時間後に回収した。ミトコンドリアは細胞から単離し、溶解し、各ＯＸＰＨＯＳ複合体のサブユニットに対して特異的な抗体を用いたＢＮ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットにより分析した。矢印は複合体Ｉを指している。（Ｂ、Ｄ、Ｅ）Ｆｌａｇタグ化ＷＴ／Ｍ１ドメインの欠失を有する／有さない突然変異体ＴＤＰ−４３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（Ｂ）、１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１処理の４８時間後の初代ヒト線維芽細胞（Ｄ）、または、Ｆｌａｇタグ化ＷＴ  ＴＤＰ−４３、ＮＤ３、および／またはＮＤ６を同時過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞（Ｅ）から単離されたミトコンドリアにおけるＯＸＰＨＯＳ複合体ＩまたはＩＩ〜Ｖの活性の測定。ＨＥＫ２９３を、示されるコンストラクトで一過性にトランスフェクトし、ミトコンドリアをトランスフェクションの４８時間後に酵素活性について単離した。（Ｆ）１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１処理の４８時間後の初代ヒト線維芽細胞におけるｍΔψ、ＡＴＰ産生、および酸素消費速度（ＯＣＲ）を含むミトコンドリア機能のバルク測定値。ｍΔψについては、２４ウェルプレートで培養した線維芽細胞に２０ｎＭ  ＴＭＲＭを３０分間ロードし、蛍光マイクロプレートリーダーにより分析した。線維芽細胞のＡＴＰレベルは、ＡＴＰ比色／蛍光分析アッセイキットおよび吸光度マイクロプレートリーダーにより測定した。最適播種密度（１００，０００細胞／ウェル）の生きた培養線維芽細胞のＯＣＲは、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４  Ａｎａｌｙｚｅｒにより直接測定した。各試料のすべての測定値は全タンパク質により正規化した。（Ｇ）初代ヒト線維芽細胞中のミトコンドリアの長さの代表的な共焦点画像および定量結果。１μＭのｃＰＭまたはＰＭ１処理による４８時間の処理の１日前に、線維芽細胞に、ｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２（ミトコンドリアに特異的に局在化した赤色蛍光タンパク質）をコードしたコンストラクトをトランスフェクトしてミトコンドリアを標識した。核をＤＡＰＩにより青色に染色した。各群ｎ＝５０細胞とした。（Ｆ）酸化ストレスに対する初代ヒト線維芽細胞の感受性の測定。示された初代ヒト線維芽細胞を２４ウェルプレートで培養し、１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１による前処理を行うか、または行わなかった。前処理の４８時間後、線維芽細胞を５０μＭ  Ｈ２Ｏ２で１時間処理し、３時間の回復後（Ｈ２Ｏ２を含まない新鮮な培地に置き換えた後）に乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイにより調べた。１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の存在下でのＬＤＨの放出量を１００％細胞死（「１００」）とした。すべての条件下でＮＨＦにも患者線維芽細胞にも明らかな細胞剥離は認められず、各試料中のＬＤＨ放出量を全タンパク質により正規化した。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊ｐ＜０．０５。パネルＡおよびＢでは、コントロール細胞と比較して＊Ｐ＜０．０５であり、ＷＴ  ＴＤＰ−４３を発現する細胞と比較して＃ｐ＜０．０５である。
【図５−３】（Ａ〜Ｆ）ＴＤＰ−４３が複合体Ｉのアセンブリを特異的に低下させ、ミトコンドリア機能および形態を損なうことを示す。（Ａ、Ｃ）Ｆｌａｇタグ化ＷＴ／Ｍ１ドメインの欠失を有する／有さない突然変異体ＴＤＰ−４３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（Ａ）、および１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１処理の４８時間後の培養初代ヒト線維芽細胞（Ｃ）におけるＯＸＰＨＯＳ複合体ＩまたはＩ〜Ｖのアセンブリの代表的な画像および定量結果。ＨＥＫ２９３細胞は、一過性トランスフェクションの４８時間後に回収した。ミトコンドリアは細胞から単離し、溶解し、各ＯＸＰＨＯＳ複合体のサブユニットに対して特異的な抗体を用いたＢＮ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットにより分析した。矢印は複合体Ｉを指している。（Ｂ、Ｄ、Ｅ）Ｆｌａｇタグ化ＷＴ／Ｍ１ドメインの欠失を有する／有さない突然変異体ＴＤＰ−４３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（Ｂ）、１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１処理の４８時間後の初代ヒト線維芽細胞（Ｄ）、または、Ｆｌａｇタグ化ＷＴ  ＴＤＰ−４３、ＮＤ３、および／またはＮＤ６を同時過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞（Ｅ）から単離されたミトコンドリアにおけるＯＸＰＨＯＳ複合体ＩまたはＩＩ〜Ｖの活性の測定。ＨＥＫ２９３を、示されるコンストラクトで一過性にトランスフェクトし、ミトコンドリアをトランスフェクションの４８時間後に酵素活性について単離した。（Ｆ）１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１処理の４８時間後の初代ヒト線維芽細胞におけるｍΔψ、ＡＴＰ産生、および酸素消費速度（ＯＣＲ）を含むミトコンドリア機能のバルク測定値。ｍΔψについては、２４ウェルプレートで培養した線維芽細胞に２０ｎＭ  ＴＭＲＭを３０分間ロードし、蛍光マイクロプレートリーダーにより分析した。線維芽細胞のＡＴＰレベルは、ＡＴＰ比色／蛍光分析アッセイキットおよび吸光度マイクロプレートリーダーにより測定した。最適播種密度（１００，０００細胞／ウェル）の生きた培養線維芽細胞のＯＣＲは、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４  Ａｎａｌｙｚｅｒにより直接測定した。各試料のすべての測定値は全タンパク質により正規化した。（Ｇ）初代ヒト線維芽細胞中のミトコンドリアの長さの代表的な共焦点画像および定量結果。１μＭのｃＰＭまたはＰＭ１処理による４８時間の処理の１日前に、線維芽細胞に、ｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２（ミトコンドリアに特異的に局在化した赤色蛍光タンパク質）をコードしたコンストラクトをトランスフェクトしてミトコンドリアを標識した。核をＤＡＰＩにより青色に染色した。各群ｎ＝５０細胞とした。（Ｆ）酸化ストレスに対する初代ヒト線維芽細胞の感受性の測定。示された初代ヒト線維芽細胞を２４ウェルプレートで培養し、１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１による前処理を行うか、または行わなかった。前処理の４８時間後、線維芽細胞を５０μＭ  Ｈ２Ｏ２で１時間処理し、３時間の回復後（Ｈ２Ｏ２を含まない新鮮な培地に置き換えた後）に乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイにより調べた。１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の存在下でのＬＤＨの放出量を１００％細胞死（「１００」）とした。すべての条件下でＮＨＦにも患者線維芽細胞にも明らかな細胞剥離は認められず、各試料中のＬＤＨ放出量を全タンパク質により正規化した。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊ｐ＜０．０５。パネルＡおよびＢでは、コントロール細胞と比較して＊Ｐ＜０．０５であり、ＷＴ  ＴＤＰ−４３を発現する細胞と比較して＃ｐ＜０．０５である。
【図５−４】（Ａ〜Ｆ）ＴＤＰ−４３が複合体Ｉのアセンブリを特異的に低下させ、ミトコンドリア機能および形態を損なうことを示す。（Ａ、Ｃ）Ｆｌａｇタグ化ＷＴ／Ｍ１ドメインの欠失を有する／有さない突然変異体ＴＤＰ−４３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（Ａ）、および１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１処理の４８時間後の培養初代ヒト線維芽細胞（Ｃ）におけるＯＸＰＨＯＳ複合体ＩまたはＩ〜Ｖのアセンブリの代表的な画像および定量結果。ＨＥＫ２９３細胞は、一過性トランスフェクションの４８時間後に回収した。ミトコンドリアは細胞から単離し、溶解し、各ＯＸＰＨＯＳ複合体のサブユニットに対して特異的な抗体を用いたＢＮ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットにより分析した。矢印は複合体Ｉを指している。（Ｂ、Ｄ、Ｅ）Ｆｌａｇタグ化ＷＴ／Ｍ１ドメインの欠失を有する／有さない突然変異体ＴＤＰ−４３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（Ｂ）、１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１処理の４８時間後の初代ヒト線維芽細胞（Ｄ）、または、Ｆｌａｇタグ化ＷＴ  ＴＤＰ−４３、ＮＤ３、および／またはＮＤ６を同時過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞（Ｅ）から単離されたミトコンドリアにおけるＯＸＰＨＯＳ複合体ＩまたはＩＩ〜Ｖの活性の測定。ＨＥＫ２９３を、示されるコンストラクトで一過性にトランスフェクトし、ミトコンドリアをトランスフェクションの４８時間後に酵素活性について単離した。（Ｆ）１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１処理の４８時間後の初代ヒト線維芽細胞におけるｍΔψ、ＡＴＰ産生、および酸素消費速度（ＯＣＲ）を含むミトコンドリア機能のバルク測定値。ｍΔψについては、２４ウェルプレートで培養した線維芽細胞に２０ｎＭ  ＴＭＲＭを３０分間ロードし、蛍光マイクロプレートリーダーにより分析した。線維芽細胞のＡＴＰレベルは、ＡＴＰ比色／蛍光分析アッセイキットおよび吸光度マイクロプレートリーダーにより測定した。最適播種密度（１００，０００細胞／ウェル）の生きた培養線維芽細胞のＯＣＲは、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４  Ａｎａｌｙｚｅｒにより直接測定した。各試料のすべての測定値は全タンパク質により正規化した。（Ｇ）初代ヒト線維芽細胞中のミトコンドリアの長さの代表的な共焦点画像および定量結果。１μＭのｃＰＭまたはＰＭ１処理による４８時間の処理の１日前に、線維芽細胞に、ｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２（ミトコンドリアに特異的に局在化した赤色蛍光タンパク質）をコードしたコンストラクトをトランスフェクトしてミトコンドリアを標識した。核をＤＡＰＩにより青色に染色した。各群ｎ＝５０細胞とした。（Ｆ）酸化ストレスに対する初代ヒト線維芽細胞の感受性の測定。示された初代ヒト線維芽細胞を２４ウェルプレートで培養し、１μＭのｃＰＭ（スクランブルしたＭ１）またはＰＭ１による前処理を行うか、または行わなかった。前処理の４８時間後、線維芽細胞を５０μＭ  Ｈ２Ｏ２で１時間処理し、３時間の回復後（Ｈ２Ｏ２を含まない新鮮な培地に置き換えた後）に乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイにより調べた。１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の存在下でのＬＤＨの放出量を１００％細胞死（「１００」）とした。すべての条件下でＮＨＦにも患者線維芽細胞にも明らかな細胞剥離は認められず、各試料中のＬＤＨ放出量を全タンパク質により正規化した。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊ｐ＜０．０５。パネルＡおよびＢでは、コントロール細胞と比較して＊Ｐ＜０．０５であり、ＷＴ  ＴＤＰ−４３を発現する細胞と比較して＃ｐ＜０．０５である。
【図６−１】（Ａ〜Ｊ）インビボでのＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の阻害によるミトコンドリアおよび運動ニューロンに対するＴＤＰ−４３の毒性からの保護を示す。（Ａ）バイシストロニックレンチウイルス形質導入およびインビボでのｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２によるミトコンドリア標識を示す模式的かつ代表的なラージフィールド画像。月齢３ヶ月のマウスの運動皮質に１×１０９Ｔｕ／ｍｌの、ＴＤＰ−４３およびｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２の両方をコードしたバイシストロニックレンチウイルス２μｌを注射し、７日後に屠殺した。矢印は注射部位を指している。ＡＰ／前側後側方向：１ｍｍ；ＭＬ／内側外側方向：１ｍｍ、およびＤＶ／背側腹側方向：０．７ｍｍ。（Ｂ）ニューロン特異的マウスシナプシン１遺伝子プロモーターの制御下で、ｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２および示されるＴＤＰ−４３  ＷＴおよびＡ３１５Ｔをコードしたバイシストロニックレンチウイルスを感染させたニューロン内のミトコンドリアの長さの代表的な２Ｄ／３Ｄ（拡大）共焦点画像および定量結果。上側の各パネルは、ラージフィールド画像であり、下側の各パネルは、神経突起内のミトコンドリアの拡大図である。各群６匹の月齢３ヶ月のマウスから得たベクター、ＷＴ、ＷＴ／ΔＭ１、Ａ３１５ＴおよびＡ３１５Ｔ／ΔＭ１発現ニューロンについてそれぞれ、ｎ＝４５、５０、４０、３３および３５。（Ｃ）運動皮質中の切断カスパーゼ３陽性ニューロンの代表的な免疫染色および定量結果。核をＤＡＰＩにより染色し、感染した陽性ニューロンをｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２により同定した。各群６匹の月齢３ヶ月のマウスから得たベクター、ＷＴ、ＷＴ／ΔＭ１、Ａ３１５ＴおよびＡ３１５Ｔ／ΔＭ１発現ニューロンについてそれぞれ、ｎ＝３５、３７、３３、３３および３２。（Ｄ）示されるペプチドで処理された、生後７０日の非トランスジェニック（ＮＴＧ）マウスおよびＴＤＰ−４３  Ａ３１５Ｔを発現するトランスジェニックマウス（Ｔｇ）（ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄、ｃＰＭ：スクランブルしたＭ１）の脊髄から単離されたミトコンドリア内のミトコンドリアによりコードされたタンパク質の発現の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。（Ｅ、Ｆ）示されるペプチドで処理された、生後７０日の非トランスジェニック（ＮＴＧ）マウスおよびＴＤＰ−４３  Ａ３１５Ｔを発現するトランスジェニックマウス（ｎ＝４匹のマウス／群、すべて雄）のシナプス性ミトコンドリアにおけるＯＣＲ／ｍΔψ  （Ｅ）  およびＯＸＰＨＯＳ複合体のアセンブリの測定。シナプトソームをマウスの脳から単離し（脊髄組織からのシナプトソームは更なるミトコンドリア精製およびＯＸＰＨＯＳ複合体アセンブリの測定を行うには充分ではなかったため）、ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４マイクロプレートまたは２４ウェル細胞培養プレートに付着させた。シナプトソームのシナプス性ミトコンドリアのＯＣＲをｓｅａｈｏｒｓｅにより直接測定し、ｍΔψは、２０ｎＭ  ＴＭＲＭを３０分間ロードした後、蛍光マイクロプレートリーダーにより測定した。ＯＸＰＨＯＳ複合体のアセンブリは、各ＯＸＰＨＯＳ複合体のサブユニットに対する示された特異的抗体を使用したＢＮ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットによりシナプトソームから単離されたミ��コンドリアを用いて測定した。（Ｇ）示されたペプチドで処理した生後７０日のマウス（ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄）の腰部脊髄の運動ニューロンのカウント。（Ｈ）腓腹筋（脚のふくらはぎの最大の筋肉）の神経筋接合部（ＮＭＪ）の代表的な共焦点画像および定量結果。ＳＶ２（シナプス小胞タンパク質２、シナプス前マーカー）および（２Ｈ３、ニューロフィラメントに対する特異的抗体）；α−ブンガロトキシンは、シナプス後マーカーであるニコチン性アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）を染色する。ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄。（Ｉ）示されたペプチドで処理した生後７０日のマウス（ｎ＝６匹のマウス／群、雄）の歩行時の足跡パターンの代表的な画像および定量結果。矢印は歩行方向を指している。（Ｊ）示されたペプチドで処理した、加速するロータロッド（５分間で４〜４０ｒｐｍ）上の生後７０日のマウス（ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄）の運動協調性および平衡感覚。Ｄ〜Ｊでは、すべての処理を生後６０日から開始した。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６−２】（Ａ〜Ｊ）インビボでのＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の阻害によるミトコンドリアおよび運動ニューロンに対するＴＤＰ−４３の毒性からの保護を示す。（Ａ）バイシストロニックレンチウイルス形質導入およびインビボでのｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２によるミトコンドリア標識を示す模式的かつ代表的なラージフィールド画像。月齢３ヶ月のマウスの運動皮質に１×１０９Ｔｕ／ｍｌの、ＴＤＰ−４３およびｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２の両方をコードしたバイシストロニックレンチウイルス２μｌを注射し、７日後に屠殺した。矢印は注射部位を指している。ＡＰ／前側後側方向：１ｍｍ；ＭＬ／内側外側方向：１ｍｍ、およびＤＶ／背側腹側方向：０．７ｍｍ。（Ｂ）ニューロン特異的マウスシナプシン１遺伝子プロモーターの制御下で、ｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２および示されるＴＤＰ−４３  ＷＴおよびＡ３１５Ｔをコードしたバイシストロニックレンチウイルスを感染させたニューロン内のミトコンドリアの長さの代表的な２Ｄ／３Ｄ（拡大）共焦点画像および定量結果。上側の各パネルは、ラージフィールド画像であり、下側の各パネルは、神経突起内のミトコンドリアの拡大図である。各群６匹の月齢３ヶ月のマウスから得たベクター、ＷＴ、ＷＴ／ΔＭ１、Ａ３１５ＴおよびＡ３１５Ｔ／ΔＭ１発現ニューロンについてそれぞれ、ｎ＝４５、５０、４０、３３および３５。（Ｃ）運動皮質中の切断カスパーゼ３陽性ニューロンの代表的な免疫染色および定量結果。核をＤＡＰＩにより染色し、感染した陽性ニューロンをｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２により同定した。各群６匹の月齢３ヶ月のマウスから得たベクター、ＷＴ、ＷＴ／ΔＭ１、Ａ３１５ＴおよびＡ３１５Ｔ／ΔＭ１発現ニューロンについてそれぞれ、ｎ＝３５、３７、３３、３３および３２。（Ｄ）示されるペプチドで処理された、生後７０日の非トランスジェニック（ＮＴＧ）マウスおよびＴＤＰ−４３  Ａ３１５Ｔを発現するトランスジェニックマウス（Ｔｇ）（ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄、ｃＰＭ：スクランブルしたＭ１）の脊髄から単離されたミトコンドリア内のミトコンドリアによりコードされたタンパク質の発現の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。（Ｅ、Ｆ）示されるペプチドで処理された、生後７０日の非トランスジェニック（ＮＴＧ）マウスおよびＴＤＰ−４３  Ａ３１５Ｔを発現するトランスジェニックマウス（ｎ＝４匹のマウス／群、すべて雄）のシナプス性ミトコンドリアにおけるＯＣＲ／ｍΔψ  （Ｅ）  およびＯＸＰＨＯＳ複合体のアセンブリの測定。シナプトソームをマウスの脳から単離し（脊髄組織からのシナプトソームは更なるミトコンドリア精製およびＯＸＰＨＯＳ複合体アセンブリの測定を行うには充分ではなかったため）、ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４マイクロプレートまたは２４ウェル細胞培養プレートに付着させた。シナプトソームのシナプス性ミトコンドリアのＯＣＲをｓｅａｈｏｒｓｅにより直接測定し、ｍΔψは、２０ｎＭ  ＴＭＲＭを３０分間ロードした後、蛍光マイクロプレートリーダーにより測定した。ＯＸＰＨＯＳ複合体のアセンブリは、各ＯＸＰＨＯＳ複合体のサブユニットに対する示された特異的抗体を使用したＢＮ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットによりシナプトソームから単離されたミ��コンドリアを用いて測定した。（Ｇ）示されたペプチドで処理した生後７０日のマウス（ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄）の腰部脊髄の運動ニューロンのカウント。（Ｈ）腓腹筋（脚のふくらはぎの最大の筋肉）の神経筋接合部（ＮＭＪ）の代表的な共焦点画像および定量結果。ＳＶ２（シナプス小胞タンパク質２、シナプス前マーカー）および（２Ｈ３、ニューロフィラメントに対する特異的抗体）；α−ブンガロトキシンは、シナプス後マーカーであるニコチン性アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）を染色する。ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄。（Ｉ）示されたペプチドで処理した生後７０日のマウス（ｎ＝６匹のマウス／群、雄）の歩行時の足跡パターンの代表的な画像および定量結果。矢印は歩行方向を指している。（Ｊ）示されたペプチドで処理した、加速するロータロッド（５分間で４〜４０ｒｐｍ）上の生後７０日のマウス（ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄）の運動協調性および平衡感覚。Ｄ〜Ｊでは、すべての処理を生後６０日から開始した。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６−３】（Ａ〜Ｊ）インビボでのＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の阻害によるミトコンドリアおよび運動ニューロンに対するＴＤＰ−４３の毒性からの保護を示す。（Ａ）バイシストロニックレンチウイルス形質導入およびインビボでのｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２によるミトコンドリア標識を示す模式的かつ代表的なラージフィールド画像。月齢３ヶ月のマウスの運動皮質に１×１０９Ｔｕ／ｍｌの、ＴＤＰ−４３およびｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２の両方をコードしたバイシストロニックレンチウイルス２μｌを注射し、７日後に屠殺した。矢印は注射部位を指している。ＡＰ／前側後側方向：１ｍｍ；ＭＬ／内側外側方向：１ｍｍ、およびＤＶ／背側腹側方向：０．７ｍｍ。（Ｂ）ニューロン特異的マウスシナプシン１遺伝子プロモーターの制御下で、ｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２および示されるＴＤＰ−４３  ＷＴおよびＡ３１５Ｔをコードしたバイシストロニックレンチウイルスを感染させたニューロン内のミトコンドリアの長さの代表的な２Ｄ／３Ｄ（拡大）共焦点画像および定量結果。上側の各パネルは、ラージフィールド画像であり、下側の各パネルは、神経突起内のミトコンドリアの拡大図である。各群６匹の月齢３ヶ月のマウスから得たベクター、ＷＴ、ＷＴ／ΔＭ１、Ａ３１５ＴおよびＡ３１５Ｔ／ΔＭ１発現ニューロンについてそれぞれ、ｎ＝４５、５０、４０、３３および３５。（Ｃ）運動皮質中の切断カスパーゼ３陽性ニューロンの代表的な免疫染色および定量結果。核をＤＡＰＩにより染色し、感染した陽性ニューロンをｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２により同定した。各群６匹の月齢３ヶ月のマウスから得たベクター、ＷＴ、ＷＴ／ΔＭ１、Ａ３１５ＴおよびＡ３１５Ｔ／ΔＭ１発現ニューロンについてそれぞれ、ｎ＝３５、３７、３３、３３および３２。（Ｄ）示されるペプチドで処理された、生後７０日の非トランスジェニック（ＮＴＧ）マウスおよびＴＤＰ−４３  Ａ３１５Ｔを発現するトランスジェニックマウス（Ｔｇ）（ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄、ｃＰＭ：スクランブルしたＭ１）の脊髄から単離されたミトコンドリア内のミトコンドリアによりコードされたタンパク質の発現の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。（Ｅ、Ｆ）示されるペプチドで処理された、生後７０日の非トランスジェニック（ＮＴＧ）マウスおよびＴＤＰ−４３  Ａ３１５Ｔを発現するトランスジェニックマウス（ｎ＝４匹のマウス／群、すべて雄）のシナプス性ミトコンドリアにおけるＯＣＲ／ｍΔψ  （Ｅ）  およびＯＸＰＨＯＳ複合体のアセンブリの測定。シナプトソームをマウスの脳から単離し（脊髄組織からのシナプトソームは更なるミトコンドリア精製およびＯＸＰＨＯＳ複合体アセンブリの測定を行うには充分ではなかったため）、ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４マイクロプレートまたは２４ウェル細胞培養プレートに付着させた。シナプトソームのシナプス性ミトコンドリアのＯＣＲをｓｅａｈｏｒｓｅにより直接測定し、ｍΔψは、２０ｎＭ  ＴＭＲＭを３０分間ロードした後、蛍光マイクロプレートリーダーにより測定した。ＯＸＰＨＯＳ複合体のアセンブリは、各ＯＸＰＨＯＳ複合体のサブユニットに対する示された特異的抗体を使用したＢＮ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットによりシナプトソームから単離されたミ��コンドリアを用いて測定した。（Ｇ）示されたペプチドで処理した生後７０日のマウス（ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄）の腰部脊髄の運動ニューロンのカウント。（Ｈ）腓腹筋（脚のふくらはぎの最大の筋肉）の神経筋接合部（ＮＭＪ）の代表的な共焦点画像および定量結果。ＳＶ２（シナプス小胞タンパク質２、シナプス前マーカー）および（２Ｈ３、ニューロフィラメントに対する特異的抗体）；α−ブンガロトキシンは、シナプス後マーカーであるニコチン性アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）を染色する。ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄。（Ｉ）示されたペプチドで処理した生後７０日のマウス（ｎ＝６匹のマウス／群、雄）の歩行時の足跡パターンの代表的な画像および定量結果。矢印は歩行方向を指している。（Ｊ）示されたペプチドで処理した、加速するロータロッド（５分間で４〜４０ｒｐｍ）上の生後７０日のマウス（ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄）の運動協調性および平衡感覚。Ｄ〜Ｊでは、すべての処理を生後６０日から開始した。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６−４】（Ａ〜Ｊ）インビボでのＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の阻害によるミトコンドリアおよび運動ニューロンに対するＴＤＰ−４３の毒性からの保護を示す。（Ａ）バイシストロニックレンチウイルス形質導入およびインビボでのｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２によるミトコンドリア標識を示す模式的かつ代表的なラージフィールド画像。月齢３ヶ月のマウスの運動皮質に１×１０９Ｔｕ／ｍｌの、ＴＤＰ−４３およびｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２の両方をコードしたバイシストロニックレンチウイルス２μｌを注射し、７日後に屠殺した。矢印は注射部位を指している。ＡＰ／前側後側方向：１ｍｍ；ＭＬ／内側外側方向：１ｍｍ、およびＤＶ／背側腹側方向：０．７ｍｍ。（Ｂ）ニューロン特異的マウスシナプシン１遺伝子プロモーターの制御下で、ｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２および示されるＴＤＰ−４３  ＷＴおよびＡ３１５Ｔをコードしたバイシストロニックレンチウイルスを感染させたニューロン内のミトコンドリアの長さの代表的な２Ｄ／３Ｄ（拡大）共焦点画像および定量結果。上側の各パネルは、ラージフィールド画像であり、下側の各パネルは、神経突起内のミトコンドリアの拡大図である。各群６匹の月齢３ヶ月のマウスから得たベクター、ＷＴ、ＷＴ／ΔＭ１、Ａ３１５ＴおよびＡ３１５Ｔ／ΔＭ１発現ニューロンについてそれぞれ、ｎ＝４５、５０、４０、３３および３５。（Ｃ）運動皮質中の切断カスパーゼ３陽性ニューロンの代表的な免疫染色および定量結果。核をＤＡＰＩにより染色し、感染した陽性ニューロンをｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２により同定した。各群６匹の月齢３ヶ月のマウスから得たベクター、ＷＴ、ＷＴ／ΔＭ１、Ａ３１５ＴおよびＡ３１５Ｔ／ΔＭ１発現ニューロンについてそれぞれ、ｎ＝３５、３７、３３、３３および３２。（Ｄ）示されるペプチドで処理された、生後７０日の非トランスジェニック（ＮＴＧ）マウスおよびＴＤＰ−４３  Ａ３１５Ｔを発現するトランスジェニックマウス（Ｔｇ）（ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄、ｃＰＭ：スクランブルしたＭ１）の脊髄から単離されたミトコンドリア内のミトコンドリアによりコードされたタンパク質の発現の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。（Ｅ、Ｆ）示されるペプチドで処理された、生後７０日の非トランスジェニック（ＮＴＧ）マウスおよびＴＤＰ−４３  Ａ３１５Ｔを発現するトランスジェニックマウス（ｎ＝４匹のマウス／群、すべて雄）のシナプス性ミトコンドリアにおけるＯＣＲ／ｍΔψ  （Ｅ）  およびＯＸＰＨＯＳ複合体のアセンブリの測定。シナプトソームをマウスの脳から単離し（脊髄組織からのシナプトソームは更なるミトコンドリア精製およびＯＸＰＨＯＳ複合体アセンブリの測定を行うには充分ではなかったため）、ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４マイクロプレートまたは２４ウェル細胞培養プレートに付着させた。シナプトソームのシナプス性ミトコンドリアのＯＣＲをｓｅａｈｏｒｓｅにより直接測定し、ｍΔψは、２０ｎＭ  ＴＭＲＭを３０分間ロードした後、蛍光マイクロプレートリーダーにより測定した。ＯＸＰＨＯＳ複合体のアセンブリは、各ＯＸＰＨＯＳ複合体のサブユニットに対する示された特異的抗体を使用したＢＮ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットによりシナプトソームから単離されたミ��コンドリアを用いて測定した。（Ｇ）示されたペプチドで処理した生後７０日のマウス（ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄）の腰部脊髄の運動ニューロンのカウント。（Ｈ）腓腹筋（脚のふくらはぎの最大の筋肉）の神経筋接合部（ＮＭＪ）の代表的な共焦点画像および定量結果。ＳＶ２（シナプス小胞タンパク質２、シナプス前マーカー）および（２Ｈ３、ニューロフィラメントに対する特異的抗体）；α−ブンガロトキシンは、シナプス後マーカーであるニコチン性アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）を染色する。ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄。（Ｉ）示されたペプチドで処理した生後７０日のマウス（ｎ＝６匹のマウス／群、雄）の歩行時の足跡パターンの代表的な画像および定量結果。矢印は歩行方向を指している。（Ｊ）示されたペプチドで処理した、加速するロータロッド（５分間で４〜４０ｒｐｍ）上の生後７０日のマウス（ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄）の運動協調性および平衡感覚。Ｄ〜Ｊでは、すべての処理を生後６０日から開始した。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６−５】（Ａ〜Ｊ）インビボでのＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の阻害によるミトコンドリアおよび運動ニューロンに対するＴＤＰ−４３の毒性からの保護を示す。（Ａ）バイシストロニックレンチウイルス形質導入およびインビボでのｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２によるミトコンドリア標識を示す模式的かつ代表的なラージフィールド画像。月齢３ヶ月のマウスの運動皮質に１×１０９Ｔｕ／ｍｌの、ＴＤＰ−４３およびｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２の両方をコードしたバイシストロニックレンチウイルス２μｌを注射し、７日後に屠殺した。矢印は注射部位を指している。ＡＰ／前側後側方向：１ｍｍ；ＭＬ／内側外側方向：１ｍｍ、およびＤＶ／背側腹側方向：０．７ｍｍ。（Ｂ）ニューロン特異的マウスシナプシン１遺伝子プロモーターの制御下で、ｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２および示されるＴＤＰ−４３  ＷＴおよびＡ３１５Ｔをコードしたバイシストロニックレンチウイルスを感染させたニューロン内のミトコンドリアの長さの代表的な２Ｄ／３Ｄ（拡大）共焦点画像および定量結果。上側の各パネルは、ラージフィールド画像であり、下側の各パネルは、神経突起内のミトコンドリアの拡大図である。各群６匹の月齢３ヶ月のマウスから得たベクター、ＷＴ、ＷＴ／ΔＭ１、Ａ３１５ＴおよびＡ３１５Ｔ／ΔＭ１発現ニューロンについてそれぞれ、ｎ＝４５、５０、４０、３３および３５。（Ｃ）運動皮質中の切断カスパーゼ３陽性ニューロンの代表的な免疫染色および定量結果。核をＤＡＰＩにより染色し、感染した陽性ニューロンをｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２により同定した。各群６匹の月齢３ヶ月のマウスから得たベクター、ＷＴ、ＷＴ／ΔＭ１、Ａ３１５ＴおよびＡ３１５Ｔ／ΔＭ１発現ニューロンについてそれぞれ、ｎ＝３５、３７、３３、３３および３２。（Ｄ）示されるペプチドで処理された、生後７０日の非トランスジェニック（ＮＴＧ）マウスおよびＴＤＰ−４３  Ａ３１５Ｔを発現するトランスジェニックマウス（Ｔｇ）（ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄、ｃＰＭ：スクランブルしたＭ１）の脊髄から単離されたミトコンドリア内のミトコンドリアによりコードされたタンパク質の発現の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。（Ｅ、Ｆ）示されるペプチドで処理された、生後７０日の非トランスジェニック（ＮＴＧ）マウスおよびＴＤＰ−４３  Ａ３１５Ｔを発現するトランスジェニックマウス（ｎ＝４匹のマウス／群、すべて雄）のシナプス性ミトコンドリアにおけるＯＣＲ／ｍΔψ  （Ｅ）  およびＯＸＰＨＯＳ複合体のアセンブリの測定。シナプトソームをマウスの脳から単離し（脊髄組織からのシナプトソームは更なるミトコンドリア精製およびＯＸＰＨＯＳ複合体アセンブリの測定を行うには充分ではなかったため）、ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４マイクロプレートまたは２４ウェル細胞培養プレートに付着させた。シナプトソームのシナプス性ミトコンドリアのＯＣＲをｓｅａｈｏｒｓｅにより直接測定し、ｍΔψは、２０ｎＭ  ＴＭＲＭを３０分間ロードした後、蛍光マイクロプレートリーダーにより測定した。ＯＸＰＨＯＳ複合体のアセンブリは、各ＯＸＰＨＯＳ複合体のサブユニットに対する示された特異的抗体を使用したＢＮ−ＰＡＧＥ／免疫ブロットによりシナプトソームから単離されたミ��コンドリアを用いて測定した。（Ｇ）示されたペプチドで処理した生後７０日のマウス（ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄）の腰部脊髄の運動ニューロンのカウント。（Ｈ）腓腹筋（脚のふくらはぎの最大の筋肉）の神経筋接合部（ＮＭＪ）の代表的な共焦点画像および定量結果。ＳＶ２（シナプス小胞タンパク質２、シナプス前マーカー）および（２Ｈ３、ニューロフィラメントに対する特異的抗体）；α−ブンガロトキシンは、シナプス後マーカーであるニコチン性アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）を染色する。ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄。（Ｉ）示されたペプチドで処理した生後７０日のマウス（ｎ＝６匹のマウス／群、雄）の歩行時の足跡パターンの代表的な画像および定量結果。矢印は歩行方向を指している。（Ｊ）示されたペプチドで処理した、加速するロータロッド（５分間で４〜４０ｒｐｍ）上の生後７０日のマウス（ｎ＝６匹のマウス／群、すべて雄）の運動協調性および平衡感覚。Ｄ〜Ｊでは、すべての処理を生後６０日から開始した。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。統計：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７】（Ａ〜Ｅ）成体ヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスの感覚運動能力を示す。（Ａ）マウスが加速する回転ロッド上に留まることができる最大の時間として示される、ロータロッド上のＮＴＧおよびヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスにおける運動協調性および平衡感覚。（Ｂ）各ビームを伝うまでの待ち時間により評価したＮＴＧおよびヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスの運動協調性および平衡感覚。（Ｃ）ＮＴＧおよびヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスの前および後肢の強さ。（Ｄ）オープンフィールド試験で連続して１０分間記録した、非トランスジェニックな同年齢の同腹子コントロール（ＮＴＧ）およびトランスジェニック（ＴＧ）ヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスの移動距離（ｍ）および速度（ｍ／秒）。（Ｅ）後足から粘着テープを剥がすまでの待ち時間により測定したＮＴＧおよびヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスの感覚運動反応。マウスはすべて、月齢８〜９ヶ月のもの。ＮＴＧではｎ＝１１（８匹の雄／３匹の雌）、ＴＧでは１８（１０匹の雄／８匹の雌）。ビーム歩行試験のデータは、二元配置ＡＮＯＶＡ分析に続いてボンフェローニの多重比較検定を用いて分析し、他の試験のデータはスチューデントのｔ検定を用いて分析した。データはすべて、ドットで平均±ＳＥＭとして示した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；  ｎｓ：非有意。
【図８】（Ａ〜Ｄ）成体ヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスの認知機能の成績を示す。（Ａ、Ｂ）ＮＴＧおよびヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７ＶマウスのＹ字迷路試験における自然の交互移動比（Ａ）およびＴ字迷路試験における新しいものに対する嗜好（Ｂ）。（Ｃ）物体認識試験の３つの異なるセッションにおけるＮＴＧおよびヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスの馴染みのない物体に対する嗜好比。Ｔ１：最初の５分間のトレイルセッション；Ｔ２：遅延時間１．５時間後の５分間の異なる刺激セッション；Ｔ３：遅延時間２４時間後の５分間の第３のセッション。（Ｄ）恐怖条件付け試験における、トレイルセッション（刺激を与えない順応、および刺激間のインターバルを置いた４回の繰り返し）、文脈恐怖学習および手がかり依存恐怖学習におけるＮＴＧおよびヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスのすくみ行動。ＣＳ：条件刺激（ホワイトノイズ、８０ｄＢで３０秒）；ＵＳ：無条件刺激（０．５ｍＡで１秒の電気刺激）。マウスはすべて、月齢８〜９ヶ月のもの。ＮＴＧではｎ＝１１（８匹の雄／３匹の雌）、ＴＧでは１８（１０匹の雄／８匹の雌）。データは、スチューデントのｔ検定または二元配置ＡＮＯＶＡに続いてボンフェローニの多重比較検定を用いて分析した。データはすべて、ドットで平均±ＳＥＭとして示した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；  ｎｓ：非有意。
【図９】（Ａ〜Ｅ）ＰＭ１によるヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスの脳におけるＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化、ミトコンドリア機能不全、およびニューロン喪失の阻害を示す。月齢１１ヶ月のＮＴＧおよびヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスを１．５ｍｇ／ｋｇ／日のｃＰＭ（ＰＭ１のコントロールペプチド）またはＰＭ１で、連続して６週間、皮下注入により処理した。ＮＴＧ＋ｃＰＭ：ｃＰＭで処理したＮＴＧマウス；ＮＴＧ＋ＰＭ１：ＰＭ１で処理したＮＴＧマウス；ＴＧ＋ｃＰＭ：ｃＰＭで処理したヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウス；ＴＧ＋ＰＭ１：ＰＭ１で処理したヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウス。（Ａ）ｃＰＭまたはＰＭ１ペプチドで処理したＮＴＧおよびＴＧマウスの脳の全ライセートおよび精製ミトコンドリア画分中の外因性ヒトＴＤＰ−４３または全ＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロットおよび定量結果。１０μｇの等量のタンパク質をロードした。データは３重の実験の平均±ＳＥＭである。（Ｂ）Ｔｏｍ２０およびＴＤＰ−４３のそれぞれ対する特異的抗体を用いて共染色した皮質ニューロン中のＴｏｍ２０およびＴＤＰ−４３の代表的な共焦点画像。Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ＲＧＢ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｐｌｏｔプラグインによる、白い実線で表したＴｏｍ２０およびＴＤＰ−４３間の共局在化のラインスキャン分析。（Ｃ）示されたペプチドで処理したＮＴＧおよびＴＧマウス（ｎ＝４匹のマウス／群）のシナプス性ミトコンドリアにおけるＯＣＲ／ｍΔψの測定。マウスの脳から単離したシナプトソームをｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４マイクロプレートまたは２４ウェル細胞培養プレートに付着させた。シナプトソームのシナプス性ミトコンドリアのＯＣＲをｓｅａｈｏｒｓｅにより直接測定し、ｍΔψは、２０ｎＭ  ＴＭＲＭを３０分間ロードした後、蛍光マイクロプレートリーダーにより測定した。（Ｄ、Ｅ）ｃＰＭで処理したＴＧマウスのマウス皮質（２０）の層２および３におけるニューロン密度の低下を示す代表的なヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した切片および定量結果（ｃＰＭ処理をしないＴｇマウスは同様のパターンを示した（図示せず））。これに対して、ＰＭ１で処理したＴＧマウスは、ＮＴＧマウスまたはｃＰＭ１またはＰＭ１により処理したＮＴＧマウスと同様、同等のニューロン密度および形態を示す。マウスはすべて、月齢１２〜１３ヶ月のもの。ＮＴＧではｎ＝５、ＴＧ＋ｃＰＭでは４、ＴＧ＋ＰＭ１では３。データは、二元配置ＡＮＯＶＡに続いてボンフェローニの多重比較検定を用いて分析した。＊ｐ＜０．０５；ｎｓ：非有意。
【図１０】（Ａ〜Ｅ）ＰＭ１による成体ヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスの運動協調性の成績の改善を示す。月齢１１ヶ月のＮＴＧおよびヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスを１．５ｍｇ／ｋｇ／日のｃＰＭ（ＰＭ１のコントロールペプチド）またはＰＭ１で、連続して６週間、皮下注入により処理した。ＮＴＧ＋ｃＰＭ：ｃＰＭで処理したＮＴＧマウス；ＴＧ＋ｃＰＭ：ｃＰＭで処理したヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウス；ＴＧ＋ＰＭ１：ＰＭ１で処理したヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウス。（Ａ〜Ｅ）ロータロッド試験（Ａ）、ビーム歩行試験（Ｂ）、前／後肢強さ試験（Ｃ）、オープンフィールド試験（Ｄ）、および粘着紙試験（Ｅ）におけるＮＴＧ＋ｃＰＭ、ＴＧ＋ｃＰＭおよびＴＧ＋ＰＭ１マウスの感覚運動の成績。マウスはすべて、月齢１２〜１３ヶ月のもの。ＮＴＧ＋ｃＰＭではｎ＝７（４匹の雄／３匹の雌）、ＴＧ＋ｃＰＭでは８（４匹の雄／４匹の雌）、ＴＧ＋ＰＭ１では９（５匹の雄／４匹の雌）。データは、ＡＮＯＶＡに続いてボンフェローニの多重比較検定を用いて分析した。データはすべて、ドットで平均±ＳＥＭとして示した。＊ｐ＜０．０５；  ｎｓ：非有意。
【図１１】（Ａ〜Ｄ）ＰＭ１による成体ヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスの認知機能の成績の改善を示す。月齢１１ヶ月のＮＴＧおよびヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスを１．５ｍｇ／ｋｇ／日のｃＰＭ（ＰＭ１のコントロールペプチド）またはＰＭ１で、連続して６週間、皮下注入により処理した。ＮＴＧ＋ｃＰＭ：ｃＰＭで処理したＮＴＧマウス；ＴＧ＋ｃＰＭ：ｃＰＭで処理したヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウス；ＴＧ＋ＰＭ１：ＰＭ１で処理したヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウス。（Ａ〜Ｄ）Ｙ字迷路試験（Ａ）、Ｔ字迷路試験（Ｂ）、物体認識試験（Ｃ）および恐怖条件付け試験（Ｄ）におけるＮＴＧ＋ｃＰＭ、ＴＧ＋ｃＰＭおよびＴＧ＋ＰＭ１マウスの認知機能の成績。マウスはすべて、月齢１２〜１３ヶ月のもの。ＮＴＧ＋ｃＰＭではｎ＝７（４匹の雄／３匹の雌）、ＴＧ＋ｃＰＭでは８（４匹の雄／４匹の雌）、ＴＧ＋ＰＭ１では９（５匹の雄／４匹の雌）。データは、ＡＮＯＶＡに続いてボンフェローニの多重比較検定を用いて分析した。データはすべて、ドットで平均±ＳＥＭとして示した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；  ｎｓ：非有意。
【図１２】（Ａ〜Ｄ）ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の阻害が、５ｘＦＡＤトランスジェニックマウスの運動協調性および認知機能の成績を改善したことを示す。月齢１０ヶ月のＮＴｇおよびＴｇ雌マウスを０．５ｍｇ／ｋｇ／日のｃＰＭ（ＰＭ１のコントロールペプチド）またはＰＭ１で、連続して４週間、皮下注入により処理した。ＮＴｇ＋ｃＰＭ：ｃＰＭで処理したＮＴｇマウス；Ｔｇ＋ｃＰＭ：ｃＰＭで処理した５ｘＦＡＤマウス；Ｔｇ＋ＰＭ１：ＰＭ１で処理した５ｘＦＡＤマウス。（Ａ、Ｂ）ｃＰＭまたはＰＭ１ペプチドで処理したＴｇマウスの脳の精製ミトコンドリア画分中の内因性ＴＤＰ−４３の代表的な免疫ブロット（Ａ）および定量結果（Ｂ）。１０μｇの等量のタンパク質をロードした。（Ｂ）。（Ｃ）ロータロッドにおけるＮＴｇ＋ｃＰＭ、Ｔｇ＋ｃＰＭ、およびＴｇ＋ＰＭ１マウスの成績。（Ｄ）バーンズ迷路タスクにおけるＮＴｇ＋ｃＰＭ、Ｔｇ＋ｃＰＭ、およびＴｇ＋ＰＭ１マウスの成績。すべての雌マウスは月齢１０ヶ月のもの。ＮＴｇ＋ｃＰＭではｎ＝１１、Ｔｇ＋ｃＰＭでは９、Ｔｇ＋ＰＭ１では９。データは平均±ＳＥＭとして示す。＊ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に述べられる実施形態は、特定の方法、プロトコール、及び試薬などに限定されるのではなく、したがってさまざまに異なり得る。本明細書で使用される用語は、あくまで特定の実施形態を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定することを目的としたものではなく、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ定義されるものである。実施例以外において、または、そうでない旨が示されない限り、本明細書で用いる成分の量または反応条件を表すすべての数値は、すべての場合で「約」なる語によって修飾されているものとして理解されたい。
【００１４】
特定されるすべての特許文献および他の刊行物は、例えば本発明と関連して使用することが可能な、かかる刊行物に記載される方法を記載および開示する目的で、本明細書に参照によって明示的に援用するものである。これらの刊行物は、本出願の出願日よりも以前のそれらの開示内容についてのみ与えられるものである。この点に関し、本発明者らが先の発明によって、または他のいかなる理由によっても、そのような開示内容に先行する権利を有さないことを容認するものとして解釈されることがあってはならない。これらの文書の内容に関連する日付または表記に関するあらゆる記載は、出願人らに入手可能な情報に基づいたものであって、これらの文書の日付または内容の正確性に関してなんら容認するものではない。
【００１５】
別途定義がなされない限り、本明細書で使用される化学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈上必要とされない限りは、単数形の用語は、複数を含み、複数形の用語は単数を含むものとする。一般に、本明細書に述べられる細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法、およびそれらの方法は、当該技術分野では周知のものであり、広く用いられているものである。
【００１６】
本明細書においては、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、かかる冠詞の１つ、または複数（すなわち、少なくとも１つ）の文法上の目的語を指す。例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」（要素）とは、１つの要素または複数の要素を意味する。
【００１７】
本明細書で使用するところの「ａ、ｂ、およびｃのうちの１つ以上」とは、ａ、ｂ、ｃ、ａｂ、ａｃ、ｂｃ、またはａｂｃを意味する。本明細書における「ｏｒ」（または）の使用は、包含的な場合も除外的な場合もある。
【００１８】
「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、  「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」（〜を備える）、「ｉｎｃｌｕｄｅ」、  「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」（〜を含む）、  「ｈａｖｅ」、および「ｈａｖｉｎｇ」（〜を有する）なる用語は、包含的な、開いた意味合いで用いられ、追加的な要素が含まれ得ることを意味する。本明細書で使用するところの「ｓｕｃｈ  ａｓ」、「ｅ．ｇ．」（など）なる用語は、非限定的なものであり、あくまで例示を目的としたものにすぎない。「Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」（〜を含む）および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ」（〜を含むがそれらに限定されない）とは、互換的に用いられる。
【００１９】
本明細書で使用するところの「ｏｒ」（または）は、文脈上そうでないことが明らかに示されない限りは、「ａｎｄ／ｏｒ」（および／または）を意味するものとして理解されるべきである。
【００２０】
「ａｂｏｕｔ」（約）または「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ」（およそ）なる用語は、基準となる量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、割合（％）、寸法、大きさ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量、または長さに対して１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％程度異なる量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、割合（％）、寸法、大きさ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量、または長さを指す。一実施形態では、「ａｂｏｕｔ」（約）または「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ」（およそ）なる用語は、基準となる量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、割合（％）、寸法、大きさ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量、または長さから、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、割合（％）、寸法、大きさ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量、または長さの範囲のことを指す。
【００２１】
患者に「投与する」なる用語は、医薬製剤中の有効成分を対象に、脳脊髄液中へのまたは血液脳関門を通じた投与、非経口または経口経路による送達、筋肉内注射、皮下または皮内注射、静脈内注射、口腔内投与、経皮的送達、および直腸、結腸、膣内、鼻腔内、気道経路による投与を含む、対象の体内の所望の位置に有効成分を届けるための任意の適当な経路によって分注、送達、または適用する（これにより例えば、所望のニューロンなどの所望の細胞と接触させる）ことを含む。薬剤は、例えば、昏睡状態、麻酔状態、または麻痺状態の対象に静脈内注射によって投与するか、または妊娠中の対象に静脈内投与することで胎児のニューロンの機能障害を阻止することができる。具体的な投与経路としては、局所適用（例えば、点眼液、クリーム、または眼瞼の下に置かれる崩壊性製剤、水性または硝子体液中での眼内注射、結膜下注射またはサブテノン注射などによる眼の外側層内への注射、非経口投与または経口経路などによる）を挙げることができる。
【００２２】
「ニューロンと接触させる」または「ニューロンを処理する」なる用語は、薬剤がその薬理作用をニューロンで発揮することができるような、細胞または生物体全体への薬剤の送達または「投与」の任意の様式を指す。「ニューロンと接触させる」ことには、本発明の薬剤をニューロンに近接させるインビボおよびインビトロの方法の両方が含まれる。適当な投与様式は当業者が決定することができ、かかる投与様式は薬剤間で異なり得る。
【００２３】
薬剤または治療ペプチドの「有効量」なる用語は、所望の治療または薬理作用を実現する上で充分な量、例えば、ニューロンの生存率を高め、かつ／またはニューロン死を阻止することが可能な量のことを指す。本明細書で定義される薬剤の有効量は、疾患の状態、対象の年齢、体重、および対象に所望の反応を引き起こす薬剤の能力などの因子によって異なり得る。投与レジメンは、最適な治療応答が得られるように調節することができる。有効量とは、有効成分の毒性または有害作用を治療上の有用な作用が上回る量でもある。
【００２４】
「治療有効量」なる用語は、所望の治療結果を得る上で必要な用量および期間で効果的な量のことを指す。治療結果は、例えば、症状の緩和、生存期間の延長、運動能力の向上などであり得る。治療結果は「治癒」である必要はない。
【００２５】
「発現」なる用語は、核酸がペプチドに翻訳されるプロセス、または、例えば、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳され得るＲＮＡに転写されるプロセスのことを指す。核酸がゲノムＤＮＡ由来のものである場合、発現は、適当な真核宿主細胞または生物が選択される場合には、ｍＲＮＡのスプライシングを含む。異種核酸を宿主細胞で発現させるには、これを最初に細胞内に導入する必要があり、細胞内に導入されると、異種核酸は最終的に核内に位置する。
【００２６】
「遺伝子治療」なる用語は、治療または診断を行おうとする疾患または状態を有する哺乳動物、詳細にはヒトの細胞への異種ＤＮＡの移行をともなう。ＤＮＡは、選択された標的細胞に、異種ＤＮＡが発現されてコードされた治療産物が産生されるような方法で導入される。また、異種ＤＮＡは、治療産物をコードするＤＮＡの発現をなんらかの形で媒介してもよく、治療産物の発現をなんらかの形で直接的または間接的に媒介するペプチドまたはＲＮＡなどの産物をコードしてもよい。遺伝子治療は、欠陥遺伝子を置き換えるか、または核酸が導入された哺乳動物または細胞が産生する遺伝子産物を補うための遺伝子産物をコードした核酸を送達するために使用することもできる。導入される核酸は、哺乳動物宿主で通常は産生されない、または治療有効量でもしくは治療上有用な時間で産生されない増殖因子もしくはその阻害剤、または腫瘍壊死因子もしくはその阻害剤、例えば腫瘍壊死因子の受容体などの治療化合物をコードしてもよい。治療産物をコードした異種ＤＮＡは、罹患した宿主の細胞内への導入に先立って改変することによってその産物または発現を促進または他の形で変化させることができる。
【００２７】
「遺伝子」または「組換え遺伝子」なる用語は、エクソンおよび（場合により）イントロン配列を含む、ポリペプチドをコードしたオープンリーディングフレームを含む核酸のことを指す。
【００２８】
「異種核酸配列」なる用語は、一般的には、異種核酸配列が発現される細胞によって通常はインビボで産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードするか、または転写、翻訳、もしくは他の調節可能な生化学的プロセスに影響することにより内因性ＤＮＡの発現の変化を媒介するかまたはその媒介因子をコードするＤＮＡである。異種核酸配列は、外来ＤＮＡと呼ばれる場合もある。当業者が、そのＤＮＡが発現される細胞に対して異種または外来として認識するかまたはみなすであろうあらゆるＤＮＡは、本明細書では異種ＤＮＡに包含される。異種ＤＮＡの例としては、これらに限定されるものではないが、例えば薬剤耐性を付与するタンパク質などのトレーサブルなマーカータンパク質をコードしたＤＮＡ、抗癌剤、酵素およびホルモンなどの治療効果を有する物質をコードしたＤＮＡ、および抗体などの他の種類のタンパク質をコードしたＤＮＡが挙げられる。異種ＤＮＡによってコードされた抗体は、異種ＤＮＡが導入された細胞の表面に分泌されるかまたは発現され得る。
【００２９】
「相同性」および「同一性」なる用語は、全体を通じて同義的に用いられ、２個のペプチド間のまたは２個の核酸分子間の配列類似性のことを指す。相同性は、比較の目的でアラインすることができるそれぞれの配列中での位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中のある位置が、同じ塩基またはアミノ酸によって占められている場合、これらの分子はその位置において相同または同一である。配列間の相同性または同一性の程度は、各配列によって共有された一致した、すなわち相同位置の数の関数である。
【００３０】
「突然変異体」なる用語は、生物の遺伝物質の変化、詳細には野生型ポリヌクレオチド配列の変化（すなわち、欠失、置換、付加、または変更）、または野生型タンパク質の変化のことを指す。「変異体」なる用語は、「突然変異体」と互換可能に用いられる。遺伝物質の変化はタンパク質の機能の変化をもたらすものとしばしば仮定されるが、「突然変異体」および「変異体」なる用語は、その変化がタンパク質の機能を変化させる（例えば、増大させる、減少させる、または新たな機能を付与する）か、またはその変化がタンパク質の機能に影響を及ぼさない（例えば突然変異または変異がサイレントである）かとは無関係に、野生型タンパク質の配列の変化のことを指す。
【００３１】
本明細書で使用するところの「非経口投与」および「非経口で投与する」なる用語は、腸内および局所投与（通常、注射による）以外の投与様式を意味し、これらに限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、心室内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、および胸骨内への注射および注入が含まれる。
【００３２】
本明細書で使用するところの「全身投与」、「全身的に投与される」、「末梢投与」、および「末梢に投与される」なる用語は、化合物、薬剤、または他の物質の、標的組織（例えば中枢神経系）に直接投与する以外の投与を意味し、化合物、薬剤、または他の物質は、動物の系内に入るために代謝および他の同様のプロセスを受けることになる（例えば皮下投与）。
【００３３】
「患者」または「対象」または「動物」または「宿主」なる用語は、任意の動物を指す。対象は、ヒトであってもよいが、獣医学的治療を必要とする哺乳動物、例えばペット（例えばイヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、家禽、ブタ、ウマなど）、および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）であってもよい。
【００３４】
「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」なる用語も、本明細書では互換可能に用いられる。
【００３５】
「ペプチド」または「ポリペプチド」なる用語は、本明細書では互換可能に用いられ、約２〜約９０個のアミノ酸残基からなる化合物であって、１つのアミノ酸のアミノ基が別のアミノ酸のカルボキシル基にペプチド結合により結合されている化合物を指す。ペプチドは、例えば、酵素的または化学的切断によって天然のタンパク質から誘導または脱離することができるか、または従来のペプチド合成法（例えば固相合成）または分子生物学的手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：ＬＡＢ．ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）を参照）を用いて調製することができる。「ペプチド」は、任意の適当なＬ−および／またはＤ−アミノ酸、例えば一般的なα−アミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリンなど）、非α−アミノ酸（例えば、Ｐ−アラニン、４−アミノ酪酸、アミノカプロン酸、サルコシン、スタチンなど）、および異常アミノ酸（例えば、シトルリン、ホモシトルリン、ホモセリン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチンなど）を含み得る。ペプチドのアミノ基、カルボキシル基および／または他の官能基は遊離（例えば非修飾）であってもよく、または適当な保護基によって保護されていてもよい。アミノ基およびカルボキシル基に適した保護基、および保護基を付加または脱離するための手段は当該技術分野では周知のものである（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ＆ａｍｐ；Ｗｕｔｓ，ＰＲＯＴＥＣＴＩＮＧ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆ａｍｐ；Ｓｏｎｓ，１９９１を参照）。ペプチドの官能基は、当該技術分野では周知の方法によって誘導体化（例えばアルキル化）することもできる。
【００３６】
ペプチドは、数種〜多数種の個別の分子種からなるライブラリーとして合成およびアセンブルすることができる。かかるライブラリーはコンビナトリアルケミストリーの周知の方法を用いて作製することができ、本明細書に述べられるようにして、または他の適当な方法を用いてスクリーニングすることで、ライブラリーが、ＣＳＰＧ−ＰＴＰσ相互作用をアンタゴナイズすることができるペプチドを含んでいるか否かを判定することができる。かかるペプチドアンタゴニストはその後、適当な手段により単離することができる。
【００３７】
「ペプチドミメティック」なる用語は、ペプチドを模倣するように設計されたタンパク質様分子のことを指す。ペプチドミメティックは、既存のペプチドの改変により、またはペプトイドおよびβ−ペプチドのような、ペプチドを模倣した同様の系を設計することのいずれかにより通常は得られる。アプローチによらず、改変された化学構造は、安定性または生物活性といった分子特性を有利に調節するように設計される。これらの改変では、天然に存在しないペプチド（例えば、主鎖の改変、および非天然アミノ酸の組み込み）への改変が行われる。
【００３８】
あるポリヌクレオチド配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ）は、発現制御配列がそのポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を制御および調節する場合に発現制御配列と「機能的に連結されている」。「機能的に連結された」なる用語には、発現させようとするポリヌクレオチド配列の前に適当な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有すること、および発現制御配列の制御下でのポリヌクレオチド配列の発現を可能とする適正なリーディングフレームを維持すること、およびポリヌクレオチド配列によってコードされた所望のポリヌクレオチドの産生が含まれる。
【００３９】
本明細書で使用するところの「組換え」なる用語は、タンパク質が原核または真核発現系から誘導されることを意味する。
【００４０】
「組織特異的プロモーター」なる用語は、プロモーターとして機能し（すなわち、プロモーターに機能的に連結された選択された核酸配列の発現を調節する）、例えば上皮細胞の細胞などの組織の特定の細胞の選択された核酸配列の発現に影響する核酸配列を意味する。かかる用語には、主として１つの組織での選択された核酸の発現を調節するが、他の組織でも発現させる、いわゆる「リーキー」なプロモーターも含まれる。「トランスフェクション」なる用語は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指して用いられる。ある細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合に「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション法が当該技術分野で一般的に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６（１９７３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）；Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １３：１９７（１９８１）を参照されたい。これらの方法を使用して、ヌクレオチド組込みベクターおよび他の核酸分子のような１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適当な宿主細胞内に導入することができる。この用語には、化学的、電気的、およびウイルスにより媒介されるトランスフェクション手法が含まれる。
【００４１】
「転写調節配列」なる用語は、転写調節配列が機能的に連結されたタンパク質コーディング配列の転写を誘導または制御する、開始シグナル、エンハンサー、およびプロモーターなどの核酸配列を指して本明細書の全体を通じて用いられる総称である。特定の例では、組換え遺伝子の転写は、発現させようとする細胞型での組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（または他の転写調節配列）の制御下にある。組換え遺伝子は、タンパク質の天然に存在する形態の転写を制御する、それらの配列と同じかまたは異なる転写調節配列の制御下に置くことができる点も理解されよう。
【００４２】
「ベクター」なる用語は、その核酸分子に連結された別の核酸分子を輸送することが可能な核酸分子を指す。好ましいベクターは、自己複製およびベクターが連結された核酸の発現の１つ以上を行うことが可能なものである。ベクターが機能的に連結された遺伝子の発現を誘導することが可能なベクターのことを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。
【００４３】
「野生型」なる用語は、タンパク質またはその一部をコードした天然に存在するポリヌクレオチド配列、またはインビボで通常存在する状態のタンパク質配列またはその一部のことをそれぞれ指す。本明細書で使用するところの「核酸」なる用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および必要に応じてリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを指す。かかる用語は、ヌクレオチド類似体で構成されたＲＮＡまたはＤＮＡの類似体、および、記載される実施形態に当てはまる場合には、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを均等物として含む点も理解されるべきである。
【００４４】
本明細書に述べられる方法で使用される薬剤、化合物、組成物、抗体などは、それらの使用に先立って精製および／または単離されているものと考えられる。精製された材料は通常、「実質的に純粋」であり、これは、核酸、ポリヌクレオチド、またはそれらのフラグメント、または他の分子が、これらに天然にともなう成分から分離されていることを意味する。一般的に、ポリペプチドは、ポリペプチドに天然にともなうタンパク質および他の有機分子を、少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、または更には９９重量％が含まない場合に実質的に純粋である。例えば、実質的に純粋なポリペプチドは、天然の供給源からの抽出により、通常はそのタンパク質を発現しない細胞内での組換え核酸の発現により、または化学合成によって得ることができる。「単離された物質」は、それらの天然の場所および環境から取り出されたものである。単離または精製されたドメインまたはタンパク質フラグメントの場合、ドメインまたはフラグメントは、天然に存在する配列中でそのタンパク質に隣接するアミノ酸配列を実質的に含まない。「単離されたＤＮＡ」なる用語は、ＤＮＡが、天然に存在するゲノム内でその特定のＤＮＡに隣接する遺伝子を実質的に含まないことを意味する。したがって、「単離されたＤＮＡ」なる用語は、例えばｃＤＮＡ、クローニングされたゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを包含する。
【００４５】
本発明のポリペプチドについて言う場合、「部分」、「フラグメント」、「変異体」、および「類似体」なる用語には、少なくともある程度の本明細書で言うところの生物学的活性（例えば、結合などの相互作用の阻害）を維持しているあらゆるポリペプチドが含まれる。本明細書に述べられるポリペプチドは、ポリペプチドがその機能を果たす限り、部分、フラグメント、変異体、または誘導体分子を限定されることなく含み得る。本発明のポリペプチドまたはその部分は、タンパク質分解フラグメント、欠失フラグメント、詳細には動物に送達される際に作用部位により容易に到達するフラグメントを含み得る。
【００４６】
「治療する」なる用語は、当該技術分野で認識されているものであり、対象の疾患、障害、または状態を阻害すること、例えばその進行を遅らせること、および、疾患、障害、または状態を緩和すること、例えば疾患、障害、および／または状態の軽減をもたらすことが含まれる。病気または状態を治療することには、基礎となっている病態生理に影響しない場合であっても特定の疾患または状態の少なくとも１つの症状を緩和することが含まれる。
【００４７】
本明細書の全体を通じて、組成物が特定の成分を有する、含む、または特定の成分で構成されるものとして述べられる場合、組成物は記載される成分から基本的になるか、またはこれらの成分からなるものとも考えられる。同様に、方法またはプロセスが、特定の処理工程を有する、含む、または特定の処理工程で構成されるものとして述べられる場合、プロセスは、記載される処理工程から基本的になるか、またはこれらの工程からなる。更に、工程の順序、または特定の操作を行う順序は、本明細書に述べられる組成物および方法が機能する限りにおいて、重要ではないことが理解されるべきである。更に、２以上の工程または操作を同時に行うこともできる。
【００４８】
本明細書で使用されるすべての割合（％）および比は、特に断らない限りは、重量に基づくものである。
【００４９】
本明細書に述べられる実施形態は、神経細胞におけるＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）のミトコンドリア局在化を阻害する組成物および方法に一般的に関し、詳細には、神経変性疾患または障害の治療を要する対象の神経変性疾患または障害を治療するための組成物および方法に関する。ＴＤＰ−４３は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、およびアルツハイマー病などの神経変性疾患を有する患者のニューロンのミトコンドリアに蓄積することが判明した。ＴＤＰ−４３の神経変性疾患に関連した突然変異は、ニューロンにおけるＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化を更に増大させることが更に判明した。ミトコンドリアの内部では、野生型と突然変異体のＴＤＰ−４３が、ＯＸＰＨＯＳ呼吸鎖複合体１サブユニットＮＤ３およびＮＤ６をコードする、ミトコンドリアで転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合し、その発現を妨げ、複合体Ｉの分解、ひいてはニューロン細胞死をもたらす。ニューロンにおけるＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の抑制によって、野生型および突然変異体のＴＤＰ−４３によって誘発されるミトコンドリア機能不全およびニューロン死をいずれも阻止できることが判明した。
【００５０】
したがって、本明細書で述べられる特定の実施形態は、ニューロン、神経細胞、神経前駆細胞、または神経幹細胞などの細胞、詳細には、神経変性疾患または障害を有するかまたはそのリスクがある対象の神経細胞における野生型および／または突然変異体ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化を阻害、減少、低減、または抑制することによって神経変性疾患または障害を治療する方法に関する。かかる方法は、対象の神経細胞に治療有効量のＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化を阻害する薬剤を投与することを含み得る。
【００５１】
特定の実施形態では、神経変性疾患または障害には、異常なＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化、ＴＤＰ−４３のニューロン毒性を特徴とするか、かつ／またはこれに関連した神経変性疾患または障害、および／またはＴＤＰ−４３の突然変異に関連する疾患が含まれ得る。かかる神経変性疾患としては、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、アルツハイマー病；アルツハイマー病、パーキンソン病、老年認知症、ハンチントン病、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群、多発性硬化症、または遺伝性運動性感覚性ニューロパシーに関連する認知症を挙げることができる。
【００５２】
他の実施形態は、突然変異ＴＤＰ−４３の発現をともなう運動協調認知機能障害を治療する方法に関連する。かかる方法は、治療を要する神経細胞または対象に治療有効量のＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化を阻害する薬剤を投与することを含み得る。
【００５３】
特定の実施形態では、細胞または対象に投与される薬剤または治療剤は、対象のニューロン内のＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化を減少、阻害、低減、および／または抑制する任意の薬剤であってよい。ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の減少、阻害、低減、および／または抑制には、ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化；細胞核から細胞質へのＴＤＰ−４３の再分布；ミトコンドリアの呼吸鎖複合体１サブユニットＮＤ３およびＮＤ６をコードするｍＲＮＡに対するＴＤＰ−４３の結合；ミトコンドリアの呼吸鎖複合体１のＴＤＰ−４３により媒介される分解；ＴＤＰ−４３により誘発されるミトコンドリア機能不全およびニューロン喪失；および／または突然変異体および／または野生型ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化により媒介される疾患の症状のあらゆる測定可能な、再現可能な、かつ／または大幅な低減が含まれ得る。大幅な低減とは、「再現可能」な、すなわち一貫して観察される低減のことである。
【００５４】
ニューロン内のＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化は、これらに限定されるものではないが、ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の直接的阻害（例えば、干渉性または阻害性ペプチド、ドミナントネガティブポリペプチド；中和抗体、小分子、またはペプチドミメティクス）、ＴＤＰ−４３の局在化、活性、シグナル伝達、および／または機能のうちの１つ以上を促進する遺伝子および／またはタンパク質の阻害（例えば、Ｔｉｍ２２またはＴＯＭ／Ｔｉｍ２２複合体などの遺伝子および／またはタンパク質の発現または活性を減少させることにより）；ＴＤＰ−４３の局在化、活性、シグナル伝達、および／または機能のうちの１つ以上を阻害する遺伝子および／またはタンパク質の活性化（例えば、遺伝子および／またはタンパク質の発現または活性を増大させることにより）；ＴＤＰ−４３の下流の遺伝子および／またはタンパク質の阻害（例えば、メディエーター遺伝子および／またはタンパク質の発現および／または活性を遮断することにより）；ＴＤＰ−４３の活性、シグナル伝達、および／または機能のうちの１つ以上を負に調節する遺伝子および／またはタンパク質の導入（例えば、組換え遺伝子発現ベクター、組換えウイルスベクター、または組換えポリペプチドを用いることにより）；または例えばＴＤＰ−４３のハイポモルフィック突然変異体による遺伝子置換（例えば、組換え遺伝子発現またはウイルスベクターを用いた相同組換え、過剰発現、または突然変異導入により）を含む、いくつかの方法により、減少、阻害、低減、および／または抑制することができる。
【００５５】
対象のニューロン内のＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化を減少、阻害、低減、または抑制する治療剤は、細胞内に送達させることができ、細胞内に送達された後、ＴＤＰ−４３により誘導されるニューロン毒性、ＴＤＰ−４３の突然変異に関連する疾患、および／または異常なＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化を阻害する。
【００５６】
特定の実施形態では、対象のニューロン内のＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化を減少、阻害、低減、または抑制する治療剤は、ＴＤＰ−４３のミトコンドリア内部ターゲティングシグナルの約５〜約８個の連続したアミノ酸と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有する約５〜約１０個のアミノ酸の治療ペプチドを含む。ミトコンドリアのタンパク質は、切断されるプレ配列または切断されない内部シグナルのいずれかによってミトコンドリアに誘導される。ＴＤＰ−４３は、移入後に切断されない状態で維持されることが見出されており、ＴＤＰ−４３では切断されるプレ配列が同定されていないことから、ＴＤＰ−４３が内部シグナルを用いていることが示唆された。ミトコンドリアの内部シグナルは通常、連続した疎水性アミノ酸のストレッチで構成され、６個のこのようなストレッチがＴＤＰ−４３内に存在している（図３Ａ、Ｍ１〜６（配列番号１〜６））。Ｍ１／３／５  の欠失（ΔＭ１／３／５）（配列番号１、３、および５）により、インビトロでｒＴＤＰ−４３の移入が有意に阻害され、外因性に発現させたＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化が低減した（図３Ｂ、Ｃ）。Ｍ１（配列番号１）およびＭ３（配列番号３）を含む治療ペプチドは、ｒＴＤＰ−４３の移入を実質的に抑制し、ＨＥＫ２９３細胞および一次ニューロンのミトコンドリアＴＤＰ−４３を減少させた（図３Ｄ〜Ｆ）。有利な点として、ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化に不可欠な同定されたモチーフに基づいた治療ペプチドは、核、細胞質、および全ＴＤＰ−４３の発現に影響を及ぼすことなく、ＷＴまたは突然変異体ＴＤＰ−４３のミトコンドリア移入を特異的に抑制することができる。
【００５７】
特定の実施形態では、治療ペプチドは、ＴＤＰ−４３のＭ１（配列番号１）、Ｍ３（配列番号３）、またはＭ５（配列番号５）の約５〜約７個の連続したアミノ酸と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有することができる。
【００５８】
他の実施形態では、治療ペプチドは、ＴＤＰ−４３のＭ１内部モチーフの一部に相当し得る。ＴＤＰ−４３のＭ１内部モチーフの一部に相当する治療ペプチドは、ＦＰＧＡＣＧＬ（配列番号１）またはＡＱＦＰＧＡＣＧＬ  （配列番号７）のアミノ酸配列を有するペプチドを含むか、かかるペプチドから基本的になるか、またはかかるペプチドからなるものであり得る。
【００５９】
更なる他の実施形態では、治療ペプチドは、ＴＤＰ−４３のＭ３内部モチーフの一部に相当し得る。ＴＤＰ−４３のＭ１内部モチーフの一部に相当する治療ペプチドは、ＧＦＧＦＶ（配列番号３）またはＳＫＧＦＧＦＶＲＦ（配列番号８）のアミノ酸配列を有するペプチドを含むか、かかるペプチドから基本的になるか、またはかかるペプチドからなるものであり得る。
【００６０】
更なる他の実施形態では、治療ペプチドは、ＴＤＰ−４３のＭ５内部モチーフの一部に相当し得る。ＴＤＰ−４３のＭ１内部モチーフの一部に相当する治療ペプチドは、ＧＧＧＡＧＬＧ（配列番号５）またはＳＲＧＧＧＡＧＬＧ（配列番号９）のアミノ酸配列を有するペプチドを含むか、かかるペプチドから基本的になるか、またはかかるペプチドからなるものであり得る。
【００６１】
本明細書に述べられる治療ペプチドは、その使用に特定の利点をもたらすような他のさまざまな変更、置換、挿入、および欠失を行うことができる。この点に関し、ＴＤＰ−４３のミトコンドリア内部ターゲティングシグナルに相当する治療ペプチドは、記載されるポリペプチドの配列と同一であるというよりも、かかる配列に対応するかまたはかかる配列と実質的に相同なものであってよく、１つ以上の変更が行われ、ペプチドはＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化を阻害または低減する能力を維持しているものである。
【００６２】
治療ペプチドは、アミド、タンパク質との複合体、環化ポリペプチド、重合ポリペプチド、類似体、フラグメント、化学修飾されたポリペプチド、およびこれらに類する誘導体を含むさまざまな形態のポリペプチド誘導体のいずれであってもよい。
【００６３】
治療ペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによって、かつ／または当該技術分野では周知の化学修飾法によって改変されてもよい。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、ならびにアミノ末端およびカルボキシ末端を含むペプチド内のどこに生じてもよい。同じ種類の修飾が、特定のペプチドの同じ部位または複数の部位で異なる程度で存在し得る点は認識されるであろう。修飾には、これらに限定されるものではないが、例えば、アセチル化、アシル化、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）基の付加、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンとの共有結合、ヘム部分との共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化およびユビキチン化などのタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡを介した付加が含まれる（参考として、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ，１９９３を参照）。
【００６４】
他の種類のペプチド修飾としては、例えば、そのような改変がペプチドの全体的な阻害能を大きく変えず、更にその使用において特定の利点を与える場合もある、ポリペプチド配列における保存的または非保存的なアミノ酸の挿入（すなわち付加）、欠失および置換（すなわち置き換え）を挙げることができる。この点に関し、ＴＤＰ−４３局在化の阻害剤であるペプチドは、記載されるペプチドの配列と同一であるというよりは、かかる配列に対応したものであり、１つ以上の変更が行われ、ペプチドがＴＤＰ−４３局在化の阻害剤として機能する能力を維持しているものである。
【００６５】
本明細書に述べられる治療ペプチドには、例えば、生物活性を有する突然変異体、変異体、フラグメント、キメラ、および類似体も含まれてよく、かかるフラグメントは、アミノ末端（Ｎ末端）、カルボキシ末端（Ｃ末端）、またはタンパク質の内部から始まり得る１つ以上のアミノ酸の短縮化を有するアミノ酸を含む。類似体は、１つ以上のアミノ酸の挿入または置換をともなう。
【００６６】
本明細書に述べられる治療ペプチドは、当業者には周知の方法によって調製することができる。かかるペプチドおよび／またはタンパク質は、組換えＤＮＡを用いて調製することができる。例えば、１つの調製法では、細胞内でペプチドおよび／またはタンパク質の発現が得られる条件下で宿主細胞（細菌または真核細胞）を培養することができる。
【００６７】
ポリペプチドの精製は、アフィニティー法、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性、またはタンパク質精製に一般的に用いられている他の精製法により行うことができる。精製工程は、非変性条件下で行うことができる。これに対して、変性工程が必要とされる場合には、当該技術分野では周知の方法を用いてタンパク質を再生することができる。
【００６８】
特定の実施形態では、本明細書に述べられる治療ペプチドは、ポリペプチドを他のポリペプチド、タンパク質、検出可能な部分、標識、固体基質、または担体に便宜よく連結および／または結合することができる「リンカー」を与える目的でポリペプチドのいずれかの末端に付加することができる更なる残基を有することができる。
【００６９】
アミノ酸残基リンカーは、通常、少なくとも１個の残基であり、４０個以上の残基、より一般的には１〜１０個の残基とすることができる。連結に用いられる一般的なアミノ酸残基は、グリシン、チロシン、リシン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸などである。更に、対象ポリペプチドは、末端ＮＨ２アシル化（例えばアセチル化）、チオグリコール酸アミド化により、末端カルボキシルアミド化（例えばアンモニア、メチルアミンによる）、および同様の末端修飾により修飾された配列で異なり得る。末端修飾は、周知であるように、プロテアーゼによる消化を受けにくくする上で有用であり、そのため、溶液中、特にプロテアーゼが存在し得る生物学的液体中でのポリペプチドの半減期を延長する機能を有する。この点に関して、ポリペプチドの環化も有用な末端修飾であり、また、環化により形成される安定した構造によっても、また、本明細書に述べられるようなそのような環状ペプチドにみられる生物学的活性を考慮すると特に好ましい。
【００７０】
特定の実施形態では、リンカーは、治療ペプチドを他のポリペプチド、タンパク質、および／または分子、例えば検出可能な部分、標識、固体基質、または担体などと連結する柔軟なペプチドリンカーとすることができる。柔軟なペプチドリンカーの長さは、アミノ酸約２０個以下であってよい。例えば、ペプチドリンカーは、約１２個以下のアミノ酸残基（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個）を有することができる。特定の場合では、ペプチドリンカーは、以下のアミノ酸、すなわち、グリシン、セリン、アラニン、およびスレオニンのうちの２種以上を含む。
【００７１】
特定の実施形態では、本明細書に述べられる治療ペプチドを含む治療剤は、治療ペプチドに連結された、少なくとも細胞輸送サブドメインまたは部分（すなわち輸送部分）を含む、複合タンパク質または薬剤送達コンストラクトの形態で与えることができる。輸送部分は、哺乳動物（すなわちヒトまたは動物）組織または細胞（例えば神経細胞）内への治療ポリペプチドの取り込みを促進することができる。輸送部分は、治療ポリペプチドに共有結合により連結することができる。共有結合による連結には、ペプチド結合または不安定結合（例えば、標的細胞の内部環境で容易に切断されるかまたは化学変化を受けやすい結合）が含まれ得る。更に、輸送部分は治療ポリペプチドと架橋させる（例えば化学架橋、ＵＶ架橋させる）ことができる。輸送部分は、本明細書に述べられる連結ポリペプチドにより治療ポリペプチドに連結することもできる。
【００７２】
輸送部分は、治療剤中で複数回繰り返されてもよい。輸送部分の繰り返しは、所望の細胞によるペプチドおよび／またはタンパク質の取り込みに影響する（例えば増大させる）ことができる。輸送部分は、治療ペプチドのアミノ末端またはそのカルボキシ末端、または両方の領域に配置されてもよい。
【００７３】
一実施形態では、輸送部分は、いったん輸送部分に連結された治療ペプチドが、受容体とは独立した機構によって細胞内に浸透することを可能とする少なくとも１つの輸送ペプチド配列を含むことができる。１つの例では、輸送ペプチドは、Ｔａｔ媒介タンパク質送達配列（例えば、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１））を含む合成ペプチドである。輸送ペプチドは、配列番号１、３、５、７、８、または９の少なくとも１つを有する、記載される少なくとも１つの治療ペプチドに融合することができる。これらのペプチドは、配列番号１２〜１７のアミノ酸配列をそれぞれ有することができる。
【００７４】
既知の輸送部分、サブドメインなどの他の例が、例えば、カナダ特許文書第２，３０１，１５７号（アンテナペディアのホメオドメインを有する複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ））、ならびに米国特許第５，６５２，１２２号、同第５，６７０，６１７号、同５，６７４，９８０号、同５，７４７，６４１号、および同５，８０４，６０４号に記載されており、これらの文献をいずれもそれらの全容にわたって参照により本明細書に援用する（Ｔａｔ  ＨＩＶタンパク質のアミノ酸を含む複合体；単純ヘルペスウイルス１型ＤＮＡ結合タンパク質ＶＰ２２、４〜３０個の範囲の長さのヒスチジンリピートであるヒスチジンタグ、または、受容体独立プロセスによる活性カーゴ部分の取り込みを促進することが可能なその変異誘導体またはホモログ）。
【００７５】
アンテナペディアのホメオドメインの３番目のαヘリックスの１６個のアミノ酸からなる領域も、タンパク質（融合タンパク質として作製されたもの）が細胞膜を通過することを可能とすることが示されている（国際公開第ＷＯ９９／１１８０９号およびカナダ特許出願第２，３０１，１５７号）。同様に、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質も細胞膜を通過できることが示されていた。
【００７６】
更に、輸送部分には、活性剤部分（例えば、細胞内ドメインを含むフラグメント阻害ペプチド）に共有結合により連結された高塩基性アミノ酸含有領域を有するポリペプチドが含まれ得る。本明細書で使用するところの「高塩基性アミノ酸含有領域」なる用語は、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、リシンなどの塩基性アミノ酸を高含量で含むタンパク質の領域に関する。「高塩基性アミノ酸含有領域」は、例えば、１５％以上の塩基性アミノ酸を有し得る。特定の場合では、「高塩基性アミノ酸含有領域」は含まれる塩基性アミノ酸が１５％よりも低いが、なお輸送剤領域として機能することができる。他の場合では、塩基性アミノ酸領域は３０％以上の塩基性アミノ酸を有する。
【００７７】
輸送部分は、高プロリン含有領域を更に含むことができる。本明細書で使用するところの「高プロリン含有領域」なる用語は、その配列中に５％以上（１００％以下）のプロリンを含むポリペプチドの領域を指す。特定の場合では、高プロリン含有領域は、５％〜１５％のプロリンを有することができる。更に、高プロリン含有領域は、天然に存在するタンパク質（例えばヒトゲノムによりコードされるタンパク質）で一般的にみられるよりも多いプロリンを含むポリペプチドの領域のことを指す。本願の高プロリン含有領域は、輸送剤領域として機能することができる。
【００７８】
一実施形態では、本明細書に述べられる治療ペプチドは、トランスダクション剤に非共有結合的に連結することができる。非共有結合的に連結されたポリペプチドトランスダクション剤の１つの例として、Ｃｈａｒｉｏｔタンパク質送達システムがある（米国特許第６，８４１，５３５号；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（３５）：２４９４１−２４９４６；およびＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃ．１９：１１７３−１１７６、これらの文献をいずれもその全容にわたって参照により本明細書に援用する）。
【００７９】
他の実施形態では、治療ペプチドは、ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化を阻害するために、治療しようとする細胞で遺伝子治療を用いて発現させることができる。遺伝子治療では、治療ペプチドをコードしたヌクレオチドを含むベクターを使用することができる。「ベクター」（遺伝子送達または遺伝子移入「ビヒクル」と呼ばれる場合もある）とは、細胞に送達しようとするポリヌクレオチドを含む巨大分子または分子の複合体のことを指す。送達しようとするポリヌクレオチドは、遺伝子治療において対象となるコーディング配列を有することができる。ベクターとしては、例えば、ウイルスベクター（アデノウイルス（Ａｄ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、およびレトロウイルス）、リポソーム、および他の脂質含有複合体、ならびに標的細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介することが可能な他の巨大分子複合体が挙げられる。
【００８０】
ベクターは、遺伝子送達および／または遺伝子発現を更に調節するか、または他の形で標的細胞に有用な性質を与える他の要素または機能を有してもよい。かかる他の要素としては、例えば、細胞への結合またはターゲティングに影響する要素（細胞型または組織特異的結合を媒介する要素を含む）、細胞によるベクター核酸の取り込みに影響する要素、取り込み後の細胞内のポリヌクレオチドの局在化に影響する要素（例えば核局在化を媒介する薬剤）、およびポリヌクレオチドの発現に影響する要素などが挙げられる。かかる要素はまた、ベクターによって送達された核酸を取り込んで発現している細胞を検出または選択するために使用することができる検出可能および／または選択可能なマーカーなどのマーカーも含まれ得る。かかる要素はベクターの天然の特徴として与えられてもよく（例えば、結合および取り込みを媒介する要素または機能を有する特定のウイルスベクターの使用など）、またはベクターをそのような機能を与えるように改変することができる。
【００８１】
選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、または二機能性のものであってよい。ポジティブ選択マーカーがマーカーを有する細胞の選択を可能とするのに対して、ネガティブ選択マーカーはマーカーを有する細胞を選択的に除去することを可能とする。さまざまなかかるマーカー遺伝子がこれまでに述べられており、二機能性（すなわち（ポジティブ／ネガティブ）マーカー（例えば、１９９２年５月２９日公開のＬｕｐｔｏｎ，Ｓ．による国際公開第ＷＯ ９２／０８７９６号、および１９９４年１２月８日公開のＬｕｐｔｏｎ，Ｓ．による国際公開第ＷＯ  ９４／２８１４３号を参照）などが挙げられる。かかるマーカー遺伝子は、遺伝子治療の観点で有用となり得る更なる制御手段を与えることができる。広範なそのようなマーカーが当該技術分野で周知であり、広く入手可能である。
【００８２】
本明細書で使用されるベクターとしては、ウイルスベクター、脂質に基づくベクター、および、本明細書に述べられる治療ペプチドをコードしたヌクレオチドを標的細胞に送達することが可能な他の非ウイルスベクターが挙げられる。ベクターは、標的化ベクター、特にニューロンに選択的に結合する標的化ベクターとすることができる。本出願で使用されるウイルスベクターとしては、標的細胞に対して示す毒性が低く、治療上有用な量の治療ペプチドの細胞特異的な産生を誘導するものを挙げることができる。
【００８３】
ウイルスベクターの例としては、アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のものがある。ヒトおよび非ヒトウイルスをいずれも使用することができ、組換えウイルスベクターはヒトで複製できないものとすることができる。ベクターがアデノウイルスである場合、ベクターは、治療ペプチドをコードする遺伝子に機能的に連結されたプロモーターを有するポリヌクレオチドを含むことができ、ヒトで複製できない。
【００８４】
本明細書で使用することができる他のウイルスベクターとしては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に基づいたベクターが挙げられる。１以上の最初期遺伝子（ＩＥ）を欠失させたＨＳＶベクターは、一般に細胞毒性を有さず、標的細胞中で潜伏感染状態に似た状態で存在し、効率的な標的細胞のトランスダクションを行うことができることから有用である。組換えＨＳＶベクターは、およそ３０ｋｂの異種核酸を組み込むことができる。
【００８５】
Ｃ型レトロウイルスなどのレトロウイルスおよびレンチウイルスも本出願で使用することができる。例えば、レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づいたものとすることができる。例えば、Ｈｕ  ａｎｄ  Ｐａｔｈａｋ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５２：４９３−５１１，２０００、およびＦｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１７：１−６０，２０００を参照。ＭＬＶ系ベクターは、ウイルス遺伝子に代えて最大８ｋｂの異種（治療用）ＤＮＡを含むことができる。異種ＤＮＡは、組織特異的プロモーター、および治療ペプチドをコードした核酸を含むことができる。神経細胞への送達方法においては、異種ＤＮＡは、組織特異的受容体に対するリガンドをコードしてもよい。
【００８６】
使用可能な更なるレトロウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全（ＨＩＶ）ウイルスに基づいたベクターなどの複製欠損レンチウイルス系ベクターがある。例えばＶｉｇｎａ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｊ．  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．５：３０８−３１６，２０００およびＭｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８１５０−８１５７，１９９８を参照。レンチウイルスベクターは、活発に分裂している細胞および非分裂細胞のどちらにも感染できることから有用である。
【００８７】
本出願で使用されるレンチウイルスベクターは、ヒトおよび非ヒト（ＳＩＶを含む）レンチウイルス由来のものとすることができる。レンチウイルスベクターの例は、ベクター伝播に必要とされる核酸配列、および核酸をコードした治療ペプチドに機能的に連結された組織特異的プロモーターを含む。前者としては、ウイルスのＬＴＲ、プライマー結合部位、ポリプリントラクト、ａｔｔ部位、およびカプシド化部位が挙げられる。
【００８８】
特定の態様では、レンチウイルスベクターを使用することができる。レンチウイルスは、異なる種類のＣＮＳニューロンに形質導入可能であることが示されており（Ａｚｚｏｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：１０３０２−１２）、その大きなクローニング能力のため、特定の実施形態で使用することができる。
【００８９】
レンチウイルスベクターは、あらゆるレンチウイルスカプシドにパッケージングすることができる。１つの粒子タンパク質を異なるウイルスからの別の粒子タンパク質に置換することを「シュードタイピング」と呼ぶ。ベクターカプシドは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）または水泡口炎ウイルス（ＶＳＶ）などの他のウイルス由来のウイルスエンベロープタンパク質を含むことができる。ＶＳＶのＧタンパク質の使用により高いベクター力価が得られ、ベクターウイルス粒子の高い安定性が得られる。
【００９０】
セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）およびシンドビスウイルス（ＳＩＮ）から作製されたものなどのアルファウイルス系ベクターも本出願で使用することができる。アデノウイルスの使用については、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４３：２４７−２５７，２０００およびＰｅｒｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：９８０２−９８０７，２０００に記載されている。
【００９１】
組換え複製欠損アルファウイルスベクターは、高レベルの異種（治療用）遺伝子発現が可能であり、広範囲の標的細胞に感染できることから有用である。アルファウイルスのレプリコンは、そのビリオン表面に機能的異種リガンドまたは同族の結合パートナーを発現する標的細胞への選択的結合を可能とする結合ドメインを提示することにより、特定の細胞型を標的とすることができる。アルファウイルスのレプリコンは、標的細胞において潜伏感染状態、したがって、長期の異種核酸発現を確立することができる。かかるレプリコンは、標的細胞において一過性の異種核酸発現を行うこともできる。
【００９２】
本出願の方法に適合するウイルスベクターの多くでは、複数のプロモーターをベクターに含めることで複数の異種遺伝子をベクターによって発現させることができる。更に、ベクターは、標的細胞からの治療ペプチドの発現を促進するシグナルペプチドまたは他の部分をコードした配列を含むことができる。
【００９３】
２つのウイルスベクターシステムの有利な性質を組み合わせるには、治療ペプチドをコードした核酸を標的ニューロン、細胞、または組織に送達するためにハイブリッドウイルスベクターを使用することができる。ハイブリッドベクターを構築するための標準的な方法は、当該技術分野では周知のものである。かかる方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．または組換えＤＮＡ技術について述べた任意の数の実験マニュアルにみることができる。ＡＡＶとアデノウイルスＩＴＲの組み合わせを含むアデノウイルスカプシド内の二本鎖ＡＡＶゲノムを使用して細胞に形質導入することもできる。別の変例では、ＡＡＶベクターを「ガットレス」、「ヘルパー依存性」、または「大容量」アデノウイルスベクター内に組み込むこともできる。アデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドベクターについては、Ｌｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９３１４−９３２４，１９９９に記載されている。レトロウイルス／アデノウイルスハイブリッドベクターについては、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１７６−１８６，２０００に記載されている。アデノウイルス内に含まれるレトロウイルスゲノムは、標的細胞ゲノムに組み込まれて安定した遺伝子発現を行うことができる。
【００９４】
治療ペプチドの発現およびベクターのクローニングを促進する他のヌクレオチド配列のエレメントとしてについて更に検討する。例えば、プロモーターの上流のエンハンサーまたはコード領域の下流のターミネーターの存在によって発現を促進することができる。
【００９５】
別の実施形態によれば、組織特異的プロモーターを、本明細書に述べられる治療ペプチドをコードするヌクレオチドと融合することができる。かかる組織特異的プロモーターをアデノウイルスコンストラクト内に融合することにより、導入遺伝子の発現が特定の組織に限定される。組織特異的プロモーターによってもたらされる遺伝子発現の効率および特異性の程度は、本出願の組換えアデノウイルスシステムを用いて決定することができる。血小板由来増殖因子β鎖（ＰＤＧＦ−β）のようなニューロン特異的プロモーターおよびベクターは、当該技術分野では周知のものである。
【００９６】
ウイルスベクターに基づいた方法以外に、非ウイルス的な方法を用いて、治療ペプチドをコードした核酸を標的細胞に導入することもできる。遺伝子送達の非ウイルス的な方法の概論が、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：８６１−８７０，２００１に示されている。本出願に基づく非ウイルス的な遺伝子送達方法の１つの例は、治療ペプチドをコードした核酸を細胞内に導入するためのプラスミドＤＮＡを用いたものである。プラスミドに基づいた遺伝子送達方法は、当該技術分野で一般的に知られている。
【００９７】
プラスミドＤＮＡと多分子凝集体を形成する合成遺伝子導入分子を設計することができる。これらの凝集体は、標的細胞に結合するように設計することができる。リポポリアミンおよびカチオン性脂質を含むカチオン性両親媒性物質を用いて標的細胞内への受容体独立型核酸導入を行うことができる。
【００９８】
更に、予め形成されたカチオン性リボソームまたはカチオン性脂質をプラスミドＤＮＡと混合して細胞トランスフェクション複合体を作製することができる。カチオン性脂質配合物を用いた方法は、Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ７７２：１２６−１３９，１９９５およびＬａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．２０：２２１−２６６，１９９６に概説されている。遺伝子送達を行うには、ＤＮＡを両親媒性カチオン性ペプチドに結合させることもできる（Ｆｏｍｉｎａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．２：４５５−４６４，２０００）。
【００９９】
ウイルスおよび非ウイルス系構成要素を用いた方法を、本出願に基づいて用いることができる。例えば、治療遺伝子を送達するためのエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）に基づいたプラスミドについて、Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１５０８−１５１３，２００１に記載されている。更に、アデノウイルスに結合されたＤＮＡ／リガンド／ポリカチオン性補助剤を用いる方法について、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ．Ｔ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎ．１３：１４１−１６４，１９９４に記載されている。
【０１００】
更に、治療ペプチドをコードした核酸を、電気穿孔法を用いて標的細胞にトランスフェクトすることによって標的細胞に導入することができる。電気穿孔法は周知のものであり、この方法を用いることでプラスミドＤＮＡを用いた細胞のトランスフェクションを促進することができる。
【０１０１】
治療ペプチドの発現をコードしたベクターを、必要に応じて生理食塩水などの薬学的に許容される担体を含む注射製剤の形で標的細胞にインビボで送達することができる。他の医薬担体、製剤、および用量を本出願に基づいて使用することもできる。
【０１０２】
標的細胞が治療されるニューロンを含む場合、ベクターは、治療ペプチドが極めて効果的な治療を可能とする程度で発現されるのに充分な量で直接注入によって送達することができる。ベクターをニューロンに直接、またはその周辺に注入することにより、ベクターによるトランスフェクションをより効果的にターゲティングし、組換えベクターの損失を最小に留めることが可能である。この種の注入によって、特にＣＮＳ傷害部位において所望の数の細胞を局所的にトランスフェクトすることが可能であり、それにより、遺伝子導入の治療効果を最大に高め、ウイルスタンパク質に対する炎症反応の可能性を最小に留めることができる。標的細胞にベクターを投与する他の方法を用いることも可能であり、かかる方法は用いられる特定のベクターに応じて決まる。
【０１０３】
治療ペプチドは、一過性発現および安定した長期の発現など、標的細胞内で任意の適当な時間にわたって発現させることができる。本出願の一態様では、治療ペプチドをコードした核酸は、トランスフェクトした細胞の活性および増殖を誘導する上で効果的な規定の長さの時間にわたり、治療量で発現させられる。本出願の別の態様では、治療ペプチドをコードした核酸は、神経変性疾患または傷害を治療する上で効果的な規定の長さの時間にわたり、治療量で発現させられる。
【０１０４】
治療量とは、治療される動物またはヒトにおいて医学的に望ましい結果をもたらすことが可能な量である。医学分野では周知のこととして、任意の１匹の動物またはヒトに対する用量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の組成物、性別、投与の時間および経路、健康状態、ならびに同時に投与される他の薬剤などの多くの因子によって決まる。タンパク質および核酸の具体的な用量は、下記に述べる実験方法を用いることで当業者により容易に決定することができる。
【０１０５】
本明細書に述べられる治療剤には、更に修飾を行うことができる（例えば化学修飾）。かかる修飾は、分子の操作または精製を容易とし、分子の溶解度を高め、投与、所望の部位へのターゲティングを容易とし、半減期を増大または減少させるように設計することができる。かかる修飾は多くのものが当該技術分野では周知であり、当業者によって適用することができる。
【０１０６】
別の態様では、治療剤は、医薬組成物中に与えることができる。かかる医薬組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒質中に溶解または分散された有効量の薬剤を一般的に含む。複合治療薬も考えられ、同じ種類の基礎となる医薬組成物を単一の薬剤または併用薬剤に用いることができる。
【０１０７】
特定の実施形態では、治療剤は、非経口投与用に配合することができ、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、経皮、硝子体内、または、蠕動投与および標的部位内への直接注入を含む他のそのような経路を介して注入されるように配合することができる。かかる治療剤を有効成分として含む水性組成物の調製法は、本開示を考慮することで当業者の知るところとなろう。一般的には、かかる組成物は、液体溶液または懸濁液として注射可能な形態で調製することができるが、注射に先立って液体を加えることで溶液または懸濁液を調製するための使用に適した固形物を調製することもでき、かかる製剤は乳化させてもよい。
【０１０８】
注射用途で使用することが可能な医薬品の形態としては、滅菌水溶液または分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含む配合物；および、滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。いずれの場合も、かかる形態は滅菌状態かつ注射可能な程度の流動性を有さなければならない。組成物は、製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。
【０１０９】
治療剤の組成物は、中性または塩の形態の滅菌水性組成物として配合することができる。遊離塩基または薬学的に許容される塩としての溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適宜混合した水中で調製することができる。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸と、または酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基から、また、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。
【０１１０】
担体の例としては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適当な混合物、および植物油を含む溶媒および分散媒が挙げられる。多くの場合で、例えば、糖類または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合の必要な粒径の維持、および／または界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。
【０１１１】
通常の保存および使用条件下では、すべてのかかる製剤は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含む必要がある。例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどのさまざまな抗細菌および抗真菌剤によって微生物の活動を防止することができる。例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる剤を組成物中に使用することによって注射用組成物の吸収を遅延させることができる。
【０１１２】
配合に先立って、または配合に際して、治療剤を充分に透析することで望ましくない低分子量分子を除去し、かつ／または、凍結乾燥することで必要に応じて所望の溶媒中により容易に配合できるようにすることができる。必要な量の有効成分を適切な溶媒中に、必要に応じて上記に列挙した各種の他の成分とともに加えた後、滅菌濾過を行うことによって滅菌注射液が調製される。一般的に、分散液は、塩基性分散媒および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに各種の滅菌有効成分を添加することによって調製される。
【０１１３】
滅菌注射液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥およびフリーズドライ法であり、予め滅菌濾過したその溶液から有効成分および任意の更なる所望の成分の粉末が得られる。
【０１１４】
医薬組成物の例は、一般的に、目的とする用途に応じて広範囲の最終濃度を与えるために滅菌水溶液などの薬学的に許容される希釈剤または賦形剤と混合された所定量のＴＤＰ−４３ミトコンドリア局在化阻害ペプチドを含むことができる。
【０１１５】
上記に述べた投与様式（および他の投与様式）で使用される医薬化合物の配合は当該技術分野では周知のものであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ），ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．に記載されている（例えば、Ｍ．Ｊ．Ｒａｔｈｂｏｎｅ，ｅｄ．，Ｏｒａｌ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９６；Ｍ．Ｊ．Ｒａｔｈｂｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，２００３；Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｏｒａｌ  Ｃａｖｉｔｙ，Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，２００５；およびＭａｔｈｉｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９９も参照）。本発明の化合物は、薬学的に許容される非毒性賦形剤および担体を含む医薬組成物として配合することができる。賦形剤は、有効成分以外に医薬組成物中に存在するすべての成分である。本発明で有用な適当な賦形剤および担体は、安全かつ有効と考えられ、望ましくない生物学的副作用または他の薬剤との望ましくない相互作用を生じることなく個人に投与することが可能な材料で構成される。適当な賦形剤および担体は、薬剤のバイオアベイラビリティーおよび性能に影響しない材料で構成されるものである。本明細書で一般的に使用するところの「賦形剤」には、これらに限定されるものではないが、界面活性剤、乳化剤、エマルジョン安定化剤、皮膚軟化剤、緩衝剤、溶媒、色素、香料、結合剤、充填剤、潤滑剤、および防腐剤が含まれる。適当な賦形剤としては、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，２００３など、当該技術分野で一般的に知られるものが挙げられる。
【０１１６】
治療剤の配合物は、上記に述べた種類の注射溶液のようなさまざまな剤形で容易に投与されるが、他の薬学的に許容される形態も考えられ、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、または経口投与用の他の固形剤、坐剤、ペッサリー、点鼻液またはスプレー、エアロゾル、吸入剤、局所製剤、リポソーム形態などが挙げられる。投与形態の種類は、治療しようとする疾患または障害に合わせられる。
【０１１７】
薬学的な「徐放性」カプセルまたは「持続放出性」組成物または製剤を使用することができ、一般的に適用可能である。徐放製剤は長期にわたって一定の薬剤濃度を与えるように一般的に設計されており、本発明に基づくＴＤＰ−４３ミトコンドリア局在化阻害ペプチドを投与するために用いることができる。徐放製剤は、疾患部位に隣接して通常は埋め込まれる。
【０１１８】
持続放出製剤の例としては、ポリペプチドまたは免疫複合体を含んだ固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、例えばフィルムまたはマイクロカプセルのような成形粒子の形態であるマトリックスが挙げられる。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル；ヒドロゲル、例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）；ポリラクチド、例えば米国特許第３，７７３，９１９号；Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー；非分解性エチレン酢酸ビニル；Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔなどの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドとからなる注射可能なマイクロスフェア；およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０１１９】
エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーが１００日間にわたって分子の放出を可能とする一方で、特定のヒドロゲルはより短い時間にわたってタンパク質を放出する。カプセル化されたポリペプチドが体内に長時間残留すると、３７℃で水分に曝露される結果、変性または凝集する場合があり、生物活性が低下し、かつ／または免疫原性が変化する場合がある。関与する機構に応じて合理的な対処法が安定化のために存在している。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド相互変換による分子内Ｓ−Ｓ結合の形成をともなう場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水量の調節、適当な添加剤の使用、特定のポリマーマトリックス組成物の開発などによって安定化が実現される。
【０１２０】
特定の実施形態では、本明細書に述べられる治療剤および治療剤を含む医薬組成物を、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳのニューロンに送達することができる。かかるニューロンは、傷害または疾患を有しているものであってよい。また、かかるニューロンは健康な、傷害のないニューロンであってもよい。かかるニューロンは、傷害部位、または傷害に曝される部位に位置するものであってもよい。本明細書に述べられる薬剤および組成物を治療的投与、送達／接触させる標的とされるニューロンは、そのニューロンのニューロン変性またはニューロン死の阻害が対象にとって有用であると考えられるニューロンである。かかる判断は、通常以上の実験を行うことなく当業者の能力の範囲内にある。
【０１２１】
本明細書に述べられる治療剤および治療用医薬組成物は、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳの非ニューロン細胞、例えば、神経細胞に支持を与える非ニューロン細胞に送達してもよい。かかる細胞としては、これらに限定されるものではないが、グリア細胞（例えば、ＣＮＳの星状細胞、乏突起グリア細胞、上衣細胞、放射状グリア；および、ＰＮＳのシュウ酸細胞、サテライトグリア細胞、消化管グリア細胞など）が挙げられる。
【０１２２】
特定の実施形態では、１種以上の治療剤を含む医薬組成物を提供して対象に投与し、ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化をインビボで阻害することができる。医薬組成物は、治療剤の有用な効果を体験することが可能なあらゆる対象に投与することができる。かかる動物の中でも第一に挙げられるものはヒトであるが、本発明はそれに限定されるものではなく、神経変性疾患を有する動物および患者の治療に使用することができる。
【０１２３】
本明細書に述べられる方法に使用される医薬組成物は、治療有効量の薬剤を、対象の体重１ｋｇ当たり０．０１〜１０００ｍｇの範囲、より好ましくは対象の体重１ｋｇ当たり約１〜１００ｍｇの範囲の用量で有することができる。特定の実施形態では、本明細書に述べられる方法に使用される医薬組成物は、治療有効量の薬剤を、対象の体重１ｋｇ当たり１〜１０ｍｇの範囲の用量で有する。
【０１２４】
全体の用量は、使用される特定の薬剤、対象の全体的健康状態、対象の疾患状態、状態の重症度、改善の観察、ならびに選択された薬剤の配合および投与経路を含むいくつかの因子に応じた治療有効量とされる。治療有効量の決定は当業者の能力の範囲内である。正確な配合、投与経路、および用量は、対象の状態を考慮して個々の医師によって選択することができる。
【０１２５】
特定の実施形態では、治療剤は、神経系の中枢、体性、自律、交感、副交感要素を含む神経系の要素、目、耳、鼻、口、または他の器官内の神経感覚組織、ならびにニューロンの細胞および構造に関連したグリア組織に関連した疾患、障害、または状態を治療するために使用することができる。神経変性疾患または障害は、異常なＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化、ＴＤＰ−４３のニューロン毒性、および／またはＴＤＰ−４３の突然変異を特徴とするか、かつ／またはこれに関連する神経変性疾患または障害であってよい。かかる神経変性疾患としては、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、アルツハイマー病；アルツハイマー病、パーキンソン病、老年認知症、ハンチントン病、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群、多発性硬化症、または遺伝性運動性感覚性ニューロパシーに関連する認知症を挙げることができる。
【０１２６】
特定の一態様は、対象のＡＬＳの治療を想定したものである。かかる方法は、対象に、治療有効量の記載される１種以上の治療剤を投与することを含む。ＡＬＳは、表現型的には進行性の衰弱により、神経行理学的には運動ニューロンの喪失によって特徴付けられる。本発明の方法は、野生型および突然変異体ＴＤＰ−４３により誘発されるミトコンドリア機能不全および神経喪失を解消し、それによりＡＬＳを有する対象の疾患表現型を改善することができるものと考えられる。
【０１２７】
神経変性疾患または障害を罹患した対象を治療するための別の対処法は、治療有効量の本明細書に述べられるＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化阻害剤を、治療有効量の更なる抗神経変性疾患剤とともに投与することである。抗神経変性疾患剤の例としては、Ｌ−ドーパ、コリンエステラーゼ阻害剤、抗コリン作動薬、ドーパミンアゴニスト、ステロイド、ならびにインターフェロン、モノクローナル抗体、およびグラチラマー酢酸塩などの免疫調節剤が挙げられる。
【０１２８】
したがって、本発明の更なる態様では、本明細書に述べられる治療剤を、神経変性およびミエリン関連疾患を治療するための補助療法との併用療法の一環として投与することができる。
【０１２９】
「併用療法」なる語句には、これらの治療剤の同時作用から有用な効果を得ることを目的とした特定の治療レジメンの一環として本明細書に述べられる治療剤（例えば、ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化阻害剤）と更なる治療剤を投与することが含まれる。組み合わせとして投与される場合、ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化阻害剤と治療剤とは、別々の組成物として配合することができる。これらの治療剤の併用による投与は通常、規定の時間（選択される組み合わせに応じて、通常、分、時間、日、または週）にわたって行われる。
【０１３０】
「併用療法」とは、これらの薬剤の順次の投与、すなわち、それぞれの治療剤が異なる時間に投与される場合、および、これらの治療剤、またはこれらの治療剤のうちの少なくとも２つがほぼ同時に投与される場合を含むことを意図している。ほぼ同時の投与は、例えば、対象に、固定された比のそれぞれの治療剤を有する１個のカプセルを投与するか、またはそれぞれの治療剤について１個ずつの複数のカプセルを投与することにより実現することができる。それぞれの治療剤の順次、またはほぼ同時の投与は、これらに限定されるものではないが、皮下経路、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、および粘膜組織からの直接吸収を含む任意の適当な経路によって行うことができる。治療剤は、同じ経路または異なる経路によって投与することができる。例えば、選択された組み合わせの第１の治療剤を静脈内注射によって投与し、組み合わせの他の治療剤を経口投与することができる。また、例えば、すべての治療剤を経口投与してもよく、あるいはすべての治療剤を静脈内注射により投与してもよい。治療剤を投与する順序はまったく重要ではない。「併用療法」には、上記に述べた治療剤の、他の生物学的活性成分（例えばこれに限定されないが、第２の異なる治療剤）および非薬剤療法（例えば手術）と更に組み合わせた投与も含まれ得る。
【０１３１】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれるものである。当業者によれば、以下の実施例に開示される技術は、本発明者によって、発明を実施する上で効果的に機能することが発見された技術を代表するものであり、したがって、その実施の好ましい態様を構成するものとみなすことができる点は認識されるはずである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮することで、開示される具体的な実施形態に多くの変更を行うことが可能であり、それでもなお、発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または同等の結果を得ることができる点は認識されるはずである。
【０１３２】
実施例１
ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の阻害はそのニューロン毒性を遮断する  
細胞質のＴＤＰ−４３の悪影響による核枯渇または機能の獲得によるＴＤＰ−４３の機能の喪失が、ＡＬＳおよびＦＴＤにおけるニューロン喪失を引き起こすかについては未だに解明されていない。本実施例では、細胞質のＴＤＰ−４３がニューロン毒性および神経変性を引き起こすのに充分であり、ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の阻害がそのニューロン毒性を遮断することを示す。
材料および方法
クリーブランド大学病院より死後に得られたマウスおよびヒト脊髄組織の免疫細胞化学法および免疫蛍光法標本を固定し、本発明者らがこれまでに述べたようにして厚さ６μｍの連続切片を作製した（表１）。免疫細胞化学法は、ペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼプロトコールにより行った。免疫蛍光染色を行うため、脱パラフィン化し、再水和した組織切片を蒸留Ｈ２Ｏで３回簡単に洗い、１Ｘ抗原デクローカー（Ｂｉｏｃａｒｅ社、カリフォルニア州コンコード）中に入れた。次いで、Ｂｉｏｃａｒｅ社のＤｅｃｌｏａｋｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒを使用し、１２５℃に１０秒加熱し、９０℃に３０秒下げた後、２２ｐｓｉで１２８℃に加熱し、０ｐｓｉで９４℃に下げることにより、切片に加圧下で抗原賦活化を行った。温度を３０℃に下げた後、切片を蒸留Ｈ２Ｏで５回、徐々にすすいだ。次いで、切片を１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）により室温で３０分ブロッキングし、１％ＮＧＳを含むＰＢＳ中で一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、切片を１０％ＮＧＳ中で１０分間、次いで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒと結合させた二次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）（１：３００）と２時間、室温で暗状態でインキュベートした。最後に、切片をＰＢＳで３回すすぎ、ＤＡＰＩで染色し、ＰＢＳで再び３回洗い、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇマウンティングメディア（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、アラバマ州バーミングハム）とともにマウントした。
【０１３３】
発現ベクター、組換えタンパク質、ペプチド、抗体、および化学物質  
ＭｉｔｏＤｓＲｅｄ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州マウンテンビュー）及びレンチウイルスパッケージングプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社、マサチューセッツ州ケンブリッジより入手したＰＣＭＶ−ｄＲ８．２およびＰＣＭＶ−ＶＳＶＧ）を入手した。ＴＤＰ−４３をＰＣＭＶ−３Ｔａｇ−１ａ（Ａｇｉｌｅｎｔ社、カリフォルニア州サンタクララ）またはｐＣＭＶＴｎＴ  （Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）にクローニングすることによりＦｌａｇタグ化ＴＤＰ−４３コンストラクトを作製した。ＧＰＦをＭ１／３／５と融合させたコンストラクトを、ＰＣＭＶ−  ３Ｔａｇ−９ａ（Ａｇｉｌｅｎｔ社、カリフォルニア州サンタクララ）に基づいて作製した。ＴＤＰ−４３突然変異は、いずれもＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ社、カリフォルニア州サンタクララ）を使用して作製した。ＴＤＰ−４３およびｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２をｐＬＶＸ−Ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にクローニングし、ＰＣＭＶプロモーターをマウスシナプシン１プロモーターで置き換えることにより、ＭｉｔｏＤｓＲｅｄ２／ＴＤＰ−４３バイシストロニックレンチウイルスコンストラクトを作製した。ヒトチトクロームｃオキシダーゼのサブユニットＶＩＩＩ由来のミトコンドリアターゲティング配列を５’末端に付加した（更にｍｙｃタグを３’末端に付加した）ＮＤ３またはＮＤ６遺伝子を、直接合成し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）  （ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）にサブクローニングした。ＲＴ−ＰＣＲ／Ｒｅａｌｔｉｍｅ−ＰＣＲ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）に使用するプライマーおよびＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス、Ｔｉｍ２２  ｅｓｉＲＮＡｉ：ＥＨＵ１６０３６１−２０ＵＧおよびＴｉｍ２３  ｅｓｉＲＮＡｉ：ＥＨＵ１０６１４１−５１９  ２０ＵＧ）を入手した。Ｈｉｓタグ化組換えヒトＴＤＰ−４３をＡＴＧＥＮ社（京畿道、韓国）より入手し、Ｆｌａｇタグ化組換えヒトＴＤＰ−４３を、ｐＣＭＶＴｎＴコンストラクト（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）を使用し、ビオチン−リシル−ｔＲＮＡを用いた転写／翻訳カップリングによりウサギ網状赤血球システムで合成した。これまでに記載されているようにペプチド送達／透過性を高めるためにヒト免疫不全ウイルスＴＡＴタンパク質のタンパク質トランスダクションドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１））の５２４Ｃ末端にＭ１またはＭ３モチーフ、またはスクランブルしたＭ１またはＭ３モチーフを融合したｃＰＭ、ＰＭ１およびＰＭ３ペプチド５２３  （ＦＩＴＣ標識したものとしないもの）を、ＮｅｏＢｉｏｌａｂ社  （マサチューセッツ州ウーバン）またはＢｉｏｍａｔｉｋ社  （デラウェア州ウィルミントン）より入手した。化学物質はすべて入手した（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）。
【０１３４】
胚性初代皮質ニューロン、ＨＥＫ２９３細胞、および初代ヒト線維芽細胞培養５３０、およびトランスフェクション  
初代皮質ニューロンを、これまでに記載されているものに改変を行って、Ｅ１８  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ社、インディアナ州インディアナポリス）から単離した。簡単に述べると、ラットの脳をＨＢＳＳ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）中で切開し、２％  Ｂ２７  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）を添加したＨｉｂｅｒｎａｔｅ  Ｅ  （ＢｒａｉｎＢｉｔｓ社、イリノイ州スプリングフィールド）  中で保存した。解剖顕微鏡下で、精密ピンセットにより髄膜を完全に除去し、皮質を切り出した。次いで、皮質を０．２５％トリプシン中、室温（ＲＴ）で１５分消化した後、１０％ＦＢＳおよび５０単位／ｍｌのＤＮＡａｓｅＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ−ｂｉｏｃｈｅｍ社、ニュージャージー州レイクウッドタウンシップ）を添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）中で短時間インキュベートした。消化された皮質を、ピペットを使用して静かに破砕することにより、細胞懸濁液が均一となり、目視される大きな組織片がなくなるまで分解した。本発明者らがこれまでに述べているように、最終的に皮質ニューロンを採取し、ポリ−Ｌ−リシン／ラミニンをコートしたカバースリップ／チャンバースライド（ＢＤ社、ニュージャージー州フランクリンレイクス）、３５ｍｍのディッシュまたは２４ウェルプレートに播種し、培養した。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（バージニア州マナサス）より入手したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）中、５％ＣＯ２下、３７℃の湿度インキュベーター内で増殖させた。４人の同年齢の正常な被験者およびＴＤＰ−４３突然変異を有する２人のＡＬＳ患者（２系統のみが存在する）から得た初代ヒト線維芽細胞を、コリエル医学研究所（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ＮＩＮＤＳコレクション）から入手した。初代線維芽細胞を、本発明者らがこれまでに述べたように、非必須アミノ酸および２ｍＭグルタミンを含み、１０（ｖ／ｖ）％または１５（ｖ／ｖ）％のウシ胎児血清を添加した最小必須培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中、５％ＣＯ２下、３７℃の湿度インキュベーター内で増殖させた。ＨＥＫ２９３細胞および初代ヒト線維芽細胞は、マイコプラズマ汚染のないことを確認した。すべてのニューロンに製造者のプロトコールにしたがってＮｅｕｒｏＭａｇ（ＯＺ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ）をトランスフェクトし、一方、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞および初代線維芽細胞にはｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）をトランスフェクトした。同時トランスフェクションには、３：１の比（ｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２／ＴＤＰ−４３：ＧＦＰ）を用いた。
【０１３５】
ヒト線維芽細胞を使用したｉＰＳＣの作製、およびｉＰＳＣのヒトニューロンへの分化  
再プログラミングおよび分化を行うため、２系統のＮＨＦおよびＴＤＰ−４３  Ｇ２９８ＳまたはＡ３８２Ｔヒト線維芽細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）およびＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を添加したＤＭＥＭ中で培養した。線維芽細胞を、ＣｙｔｏＴｕｎｅ−ｉＰＳ  ２．０  Ｓｅｎｄａｉ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を製造者の指示にしたがって使用し、放射線照射ＭＥＦ（ｉＭＥＦ）をフィーダー細胞として使用して再プログラミングした。ｉＰＳＣを、ｈＥＳＣ培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１０％  ＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１×非不可欠アミノ酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、および１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ社）を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２））中、ｉＭＥＦ上で常法で培養した。分化を行うため、ｉＰＳＣを、ＴｅＳＲ１  Ｅ８培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中、マトリゲル上で無フィーダー条件で順応させて培養し、ＳｔｅｍＤｉｆｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ＭｅｄｉｕｍおよびＡｇｇｒｅＷｅｌｌ  ８００（いずれもＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社より入手）を指示にしたがって使用して誘導ニューロン前駆細胞（ｉＮＰＣ）に分化させた。Ｎｅｕｒａｌ  Ｒｏｓｅｔｔｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍを使用してｉＮＰＣを選択し、神経前駆細胞培地（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｍｅｄｉｕｍ）を使用して更に増殖させた（いずれもＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。ｉＰＳＣおよびｉＮＰＣの特性分析を行うため、  これまでに述べられているようにしてＴＲＡ−１−８１、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４に対する抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色にはＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）を使用した。ｉＮＰＣは、Ａｘｏｌ  ｉＮＰＣ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｘｏｌ社、ケンブリッジ、英国）を製造者のプロトコールにしたがって使用してヒトニューロンに分化させた。簡単に述べると、ｉＮＰＣ細胞を、最初に、Ａｘｏｌ  Ｐｌａｔｉｎｇ−ＸＦ培地中、Ａｘｏｌ  ＳｕｒｅＢｏｎｄＸＦをコートした２４または４８ウェルプレートまたは２４ウェルｓｅａｈｏｒｓｅプレートに播種した。播種２４時間後、細胞をニューロン分化培地（Ａｘｏｌ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ＸＦ培地）に移した。７２時間後、ニューロン分化培地の半分をニューロン成熟培地（Ａｘｏｌ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ−ＸＦ培地）に置き換えた後、４時間ごとに半分をニューロン成熟培地に交換した。実験に用いたｉＰＳＣおよびｉＮＰＣは、マイコプラズマ汚染がないことを確認した。ｉＰＳＣ由来のニューロンもＮｅｕｒｏＭａｇ（ＯＺ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ）によりトランスフェクトとした。
【０１３６】
細胞およびミトコンドリアの分画化  
ミトコンドリアを上記で述べたようにして単離した。簡単に述べると、細胞をＩＢ−１溶液（ＩＢ−１：２２５ｍＭ  マンニトール、７５  ｍＭ  スクロース、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；ｐＨ＝７．４）中でホモジナイズし、組織は０．５％ＢＳＡを加えたＩＢ−１中でホモジナイズした。全ホモジネート（Ｈ）を６００ｇ、４で５分間、２回遠心した（１７）。次いで、上清（Ｓ１）を回収し、７０００ｇ、４で１０分間遠心して濃縮ミトコンドリア画分を得て、上清（Ｓ２）を回収した。濃縮ミトコンドリア画分を細胞ミトコンドリアについてはＩＢ−２溶液（２２５ｍＭ  マンニトール、７５ｍＭ  スクロース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；ｐＨ＝７．４）で、組織ミトコンドリアについては０．５％  ＢＳＡを含むＩＢ−２で洗浄した後、９０００ｇで１０分間遠心した。ペレットをＭＲＢバッファー（２５０ｍＭ  Ｍａｎｎｉｔｏｌ、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７．４）に懸濁して粗ミトコンドリア画分（ｃＭ）を得た。粗ミトコンドリア画分を、更に８ｍｌ  パーコール培地（２２５ｍＭ  マンニトール、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＧＴＡおよび３０％  パーコール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）；ｐＨ＝７．４）上に置き、ＳＷ４０  Ｔｉローター中、９５０００ｇ、４で３０分間遠心した。ペレットを、ＭＲＢバッファーに懸濁した後、再び６３００ｇ、４で１０分間遠心して精製ミトコンドリア（ｐＭ）を得た。核画分を、核抽出試薬により単離／精製した（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）。ミトコンドリアコンパートメントよりも細かい分画化を行うため、単離した純粋なミトコンドリアを、０．１２ｍｇジギトニン／１ｍｇミトコンドリアのジギトニンを加えた単離培地（２２５ｍＭ  マンニトール、７５ｍＭ  スクロース、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；ｐＨ＝７．４）に懸濁し、氷上で１５分間静かに攪拌した。次いで、ジギトニンで処理した試料を３倍量の単離培地で希釈し、９０００ｇで１０分間遠心して上清Ａを得た後、ペレットを単離バッファーに再懸濁し、氷上で３０秒間超音波処理した。次いで、溶液を超音波処理し、６５００ｇで１０分間遠心した後、１４４０００ｇで６０分間遠心して内膜小胞を沈降させ、上清をマトリックス画分として回収した。上清Ａを１４４０００ｇで６０分間遠心して外膜小胞をペレットとして沈降させ、上清を内膜空間画分として回収した。
【０１３７】
シナプトソーム単離Ｓ
シナプトソームをこれまでに述べられているようにしてマウス皮質または脊髄から単離した。簡単に述べる特定の実施形態では、新鮮な皮質組織を氷冷した「Ｓｕｃｒｏｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍ」（３２０ｍＭ  スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５ｍＭ  ジチオトレイトール、ｐＨ７．４）中でホモジナイズした後、１０００ｇ、４で１０分間遠心した。上清を回収し、１５ｍＬの遠沈管中の不連続パーコール勾配（スクロース培地中、３、１０、および２３％パーコールの各３ｍＬの層）上に静かに置いてから、ＳＷ−４０Ｔｉ  ローター中、３２５００ｇ、４で１０分間遠心した。１０％と２３％パーコールの間のバンドを回収し、イオン性培地（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、１．２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５ｍＭ  ＫＣｌ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で希釈した後、１５０００ｇ、４で１５分間遠心してパーコールを除去した。ペレット（すなわち、シナプトソーム画分）を回収し、再びイオン性培地に再懸濁し、３０００ｇ、４で３０分間遠心することにより、ポリエチレンイミンをコートしたプレート上に播種した。シナプトソームの純度は、シナプスマーカーまたはＥＭによって確認した（データは示さず）。
【０１３８】
ミトコンドリアの機能および細胞生存率の測定
ＨＥＫ２９３細胞、ヒト線維芽細胞、初代ニューロン、またはシナプス性ミトコンドリアのｍΔψを、本発明者らが以前に述べているようにして、テトラメチルローダミン（ＴＭＲＭ）および／またはローダミン１２３（ｒｈｏｄ１２３）により測定した。簡単に述べると、３５ｍｍの６３０ディッシュまたは２４ウェルプレートで培養したＨＥＫ２９３細胞、ヒト線維芽細胞、初代ニューロン、または上記に述べたようにポリエチレンイミンを予めコートした２４ウェルプレートに結合させた単離シナプトソーム（５０％溶液（Ｓｉｇｍａ社）から１：１５０００の希釈）を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水  ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド；ＨＥＫ２９３細胞およびヒト線維芽細胞について）、ＨＥＰＥＳ緩衝Ｔｙｒｏｄｅ溶液（１１９ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、６ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７．４；初代ニューロンについて）、またはイオン性培地（シナプス性ミトコンドリアについて）中で、２０ｎＭ  ＴＭＲＭまたは２μＭ  ｒｈｏｄ１２３と、３０分間インキュベートした。ＴＭＲＭ／ｒｈｏｄ１２３を含む溶液を除去した。ＰＢＳ、Ｔｙｒｏｄｅ溶液、またはイオン性培地で３回洗った後、細胞／ニューロン／シナプトソームをＰＢＳまたはＴｙｒｏｄｅ溶液中、３７℃で、室内空気中で１０分間、インキュベートすることで蛍光顕微鏡によるイメージングに先立ってＴＭＲＭ／ｒｈｏｄ１２３シグナルを除去した。上記に述べたような細胞またはニューロンライセートを使用し、ＡＴＰ１８  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ／Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ社、カリフォルニア州ミルピタス）によりＡＴＰレベルを測定した。示される最適播種密度の生きた培養ＨＥＫ２９３細胞、ヒト線維芽細胞およびニューロン、またはシナプトソーム中のシナプス性ミトコンドリアにおける酸素消費速度（ＯＣＲ）のリアルタイム測定を、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、マサチューセッツ州ノースビレリカ）を製造者の指示にしたがって使用して行った。必要に応じて、ＡＴＰ合成酵素阻害剤であるオリゴマイシン（１μＭ）、脱共役剤であるＦＣＣＰ（４μＭ）、及び複合体Ｉ阻害剤であるアンチマイシンＡ（１μＭ）、およびロテノン（１μＭ）を順次注入した。測定後、細胞およびシナプトソームを溶解し、ＯＣＲデータを全タンパク質により正規化した。細胞の死亡率および生存率を、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＬＤＨ；  Ｒｏｃｈｅ社、ニュージャージー州ナットリー）、切断カスパーゼ３に対する特異的抗体による染色を用いた免疫蛍光染色またはＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）を用いて測定した。ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎによる死ニューロン染色では、ニューロンを３０ｎＭのＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎを含んだＰＢＳ中、２０分間、室温でインキュベートした後、ＰＢＳで３回洗った。ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ陽性の核および／または明らかなフラグメント化した核���神経突起を有するニューロンを、非生存ニューロンとしてカウントし、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ陽性の核および明瞭な核の輪郭／神経突起のないニューロンを生存ニューロンとしてカウントした。
【０１３９】
ミトコンドリア移入アッセイ
ミトコンドリアをマウスの脳から単離する一方で、単離したミトコンドリアをジギトニン（ミトコンドリアタンパク質１ｇ当たり０．１ｇ）と氷上で１５分間、インキュベートした後、１１０００ｇで１０分間遠心することによりミトプラストを調製した。使用した移入バッファーは、２５０ｍＭ  スクロース、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．２、８０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＮＡＤＨ、３％ＢＳＡからなるものとした。移入アッセイは、ミトコンドリアまたはミトプラストを示される組換えタンパク質と室温で４５分間インキュベートすることにより行った。移入反応はバリノマイシン（１μＭ）を添加することにより停止させた。等体積の移入反応液を必要に応じてトリプシンおよび／またはジギトニンにより、室温で５分間処理した後、１１０００ｇで１０分間遠心した。最後に、ミトコンドリアまたはミトプラストのペレットを、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社、ニュージャージー州ナットリー）およびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ、Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）を添加した細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、マサチューセッツ州ダンバース）に再懸濁した。ミトコンドリアタンパク質は、移入時にアンフォールドされる必要があり、このことは、網状赤血球ライセート中にインビトロでｒＴＤＰ−４３の移入を促進するシャペロンが存在することを示唆するものである。ｒＴＤＰ−４３の移入は尿素変性によって増大させることができたが（データは示さず）、網状赤血球ライセート中で生成された組換えタンパク質もインビトロでの効率的な移入を示した。したがって、この実験では、本発明者らは、組換えタンパク質を変性させずに使用した。
【０１４０】
呼吸鎖複合体Ｉ〜Ｖの活性の測定  
複合体Ｉ〜ＩＶの酵素活性を、これまでに述べられているようにして測定した。簡単に述べると、単離したミトコンドリアに、凍結と解凍を３サイクル行った後、総体積２００μｌの反応バッファー中に再懸濁した。複合体Ｉ（ＮＡＤＨ：ユビキノン酸化還元酵素）の活性は、２５ｍＭ  リン酸カリウム、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１３ｍＭ  ＮＡＤＨ、２μｇ／ｍｌ  アンチマイシンＡ、および６５μＭのユビキノン１を含む反応バッファー中、３４０ｎｍで５分間、ロテノン（２μｇ／ｍｌ）添加の前後で測定した。複合体ＩＩ（コハク酸：ユビキノン酸化還元酵素）の活性は、２５ｍＭ  リン酸カリウム、２．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２０ｍＭ  コハク酸ナトリウム、０．０５ｍＭ  ＤＣＰＩＰ、２ｍＭ  ＫＣＮ、および６５μＭユビキノン１を含む反応バッファー中、６００ｎｍで測定した。反応は、６５μＭのユビキノン１の添加により開始させた。複合体ＩＩＩ（ユビキノール２：シトクロムｃレダクターゼ）の活性は、２５ｍＭ  リン酸カリウム、２．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２ｍＭ  ＫＣＮ、２μｇ／ｍｌ  ロテノン、０．６ｍＭ  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、１５μＭ  シトクロムｃ、および３５μＭ  ユビキノール２を含む反応バッファー中、５５０ｎｍで測定した。複合体（シトクロムｃオキシダーゼ）の活性は、２５ｍＭ  リン酸カリウム、０．４５ｍＭ  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、および１５μＭ  シトクロムｃを含む反応バッファー中で５５０ｎｍで測定した。複合体Ｖ（Ｆ１−ＡＴＰ合成酵素）の活性は、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＯ３、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ  ｐＨ８．０、０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ、２．５ｍＭ  ＰＥＰ、２５μｇ／ｍｌ  アンチマイシンＡ、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＬＤＨ、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＰＫ、および２．５ｍＭ  ＡＴＰを含むアッセイバッファー中で測定した。複合体Ｖの活性は、ＮＡＤＨの酸化による３４０ｎｍの吸光度の変化にしたがって測定した。
【０１４１】
ＲＮＡ免疫沈降法およびＲＴ−ＰＣＲ／リアルタイムＰＣＲ  
単離したミトコンドリアを最初に、１Ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、マサチューセッツ州ダンバース）および１００Ｕ／ｍｌ  リボヌクレアーゼ阻害剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）を含む免疫沈降溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０（ＮＰ４０）および０．０２％  ＮａＮ３）により溶解した。次いで、このホモジネートを１８０００ｇ、４℃で３０分間遠心した。上清を回収し、ＴＤＰ４３抗体を結合させた磁気ビーズと４℃で一晩インキュベートした。この後、磁気ビーズを溶解バッファーで洗い、ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）により抽出した。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞およびヒト脊髄から得た全ＲＮＡも、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）により抽出した。ｍｔＤＮＡをＤＮａｓｅＩ処理により除去し、ＰＣＲにより確認した。ランダムオリゴマープライマーを使用してＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）により逆転写を行った。全ミトコンドリア転写産物のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）を用い、適当なプライマーペアを用いてＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓシステムで行った。使用したプライマーについては表１を参照されたい（Ａ８／ＮＤ４Ｌは、その短い配列のため、詳しく測定および増幅しなかった）。
【０１４２】
ＨＥＫ２９３細胞におけるミトコンドリア新生タンパク質の合成  
Ｆｌａｇタグ化ＴＤＰ−４３を発現しているＨＥＫ２９３細胞を、メチオニンを含まないＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）中で１時間培養した後、０．１ｍｇ／ｍｌ  エメチンで１０分間で予備処理し、更に０．１ｍｇ／ｍｌ  エメチンおよびＬ−アジドホモアラニン（ＡＨＡ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）で４時間、同時処理した。パルス標識後、細胞を収穫し、ミトコンドリア分画化を行った。単離したミトコンドリアを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中１％ＳＤＳで溶解した後、１００００ｇで１０分間遠心した。上清を、アビジン−ダイナビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）と室温で３０分間インキュベートした。ビーズを除去した後、上清にＣｌｉｃｋ−ｉｔアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）を行った。簡単に述べると、２００μｇのミトコンドリアタンパク質を体積１６０μＬのシステム中、ＰＥＧ４ーカルボキサミド−６−アジドヘキサニル−ビオチンで標識し、全タンパク質を沈降させメタノールおよびクロロホルムで抽出した。１８０００ｇで５分間遠心した後、全タンパク質のペレットを回収し、ウェスタンブロット用に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中１％ＳＤＳにより溶解した。
【０１４３】
ミトコンドリアリボソームの分画化及びＲＮＡへのローディング  
単離したミトコンドリアを溶解バッファー（２６０ｍＭ  スクロース、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭ  β−メルカプトエタノールおよびプロテアーゼ阻害剤）中、氷上で２０分間溶解した。ライセートを９４００ｇ、４℃で３０分間遠心した。次いで、上清を１１ｍＬの１０％〜３０％の連続的な線形スクロース勾配（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）にロードし、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４１−Ｔｉローター中、２０，４００ｒｐｍ、４℃で１５時間遠心した。遠心後、上から１３個の画分を回収し、更なる免疫ブロットおよび７３２  ｑＲＴ−ＰＣＲ分析に用いた。
【０１４４】
ブルーネイティブＰＡＧＥおよび免疫ブロット分析  
ブルーネイティブゲル電気泳動を、ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）を用いて行った。簡単に述べると、１０μｇのミトコンドリアタンパク質を含む単離したミトコンドリアを試料バッファーに再懸濁し、２％ジギトニン（Ｓｉｇｍａ社）により、３０分間、氷上で可溶化した。不溶化したペレットは、１８０００ｇで３０分間遠心して除去した。上清を回収し、５％Ｇ−２５０試料添加剤を添加した。試料を３〜１２％のプレキャストＢｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）にロードした後、ライトブルーの泳動バッファーを用いて、４℃、電圧４０Ｖで電気泳動を行った。通常の免疫ブロット分析を行うため、精製したミトコンドリア、細胞または組織を、細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、マサチューセッツ州ダンバース）に１ｍＭ  ＰＭＳＦおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社、ニュージャージー州ナットリー）を加えたもので溶解した。等量の全タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐに転写した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、マサチューセッツ州ビレリカ）。１０％スキムミルクでブロッキングした後、これまでに述べられているようにして一次および二次抗体を適用し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、マサチューセッツ州ビレリカ）によりブロットを現像した。６人の同年齢の正常な患者および８人のｓＡＬＳ患者からの凍結したヒト胸部脊髄組織を、ＮＩＣＨＤ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋより入手した（表１）。
【０１４５】
ＲＮＡ−タンパク質インビトロ結合アッセイ  
ＮＤ３  ＲＮＡおよび突然変異体ＮＤ３  ＲＮＡプローブをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（ニュージャージー州ピスカタウェイ）より購入した。ＲＮＡ−タンパク質結合を、１μＭ  ＲＮＡプローブを含む２０μＬの反応液中で行った。結合条件は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロールとした。室温で３０分間インキュベートした後、試料を、０．５×ＴＢＥを含むプレ電気泳動した６％ポリアクリルアミドゲルで氷水浴中、１００Ｖで１時間泳動した。ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）により、室温で２０分間染色した。次いで染色したゲルを水で３回すすぎ、ＥｐｉＣｈｅｍｉ  ＩＩ  Ｄａｒｋｒｏｏｍ（ＵＶＰ社、カリフォルニア州アップランド）により可視化した。
【０１４６】
レンチウイルス作製、定位注射、および凍結切片  
Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州マウンテンビュー）に、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、バイシストロニックレンチウイルスコンストラクト、および２種類のヘルパープラスミドＰＣＭＶ−ｄＲ８．２およびＰＣＭＶ−ＶＳＶＧを、１０ｃｍのプレート当たり、６μｇ、４．５μｇ、および１．５μｇのＤＮＡとなるようにしてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、培地を７８０ｇで３０分間遠心し、０．４５μｍの孔径のフィルターで濾過した。濾過した培地を２０％スクロースの上に更に置き、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ−２８ローター中、９００００ｇで２時間遠心した。ペレットを回収し、ＰＢＳまたは生理食塩水に再懸濁した。ウイルス注入を行うため、マウスをアバチン（２５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、定位フレームに配置した。小切開を行って頭蓋表面を露出させた。頭蓋の運動皮質領域に重なる位置に穴をドリルで穿孔した（ＡＰ／前後（Ａｎｔｅｒｉｏｒ−Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）方向：１  ｍｍ、ＭＬ／内外（Ｍｅｄｉａｌ−Ｌａｔｅｒａｌ）方向：１ｍｍ）。ウイルスを充填した針を０．７ｍｍ下降させ（ＤＶ／背腹（Ｄｏｒｓａｌ−Ｖｅｎｔｒａｌ）方向）、２μｌのウイルス（１０９個のウイルス粒子／ｍｌ）を５分間で注射した。針は５分間定置した後、ゆっくりと引き抜いた。皮膚を縫合し、暖かいパッドの上でマウスを回復させた。注射１週間後、マウスをアバチンで深麻酔し、冷ＰＢＳを経心的に灌流した。脳をパラホルムアルデヒド（４％）で２４時間、その後、３０％スクロース中で更に２４時間固定した。凍結保護処理の後、脳の冠状断面を免疫染色用に厚さ２０μｍに切片化した。
【０１４７】
ＴＡＴペプチドのインビボ投与
マウスの手術／手技は、ＮＩＨのガイドラインにしたがって実施したものであり、ケース・ウェスタン・リザーブ大学の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）により承認されたものである。Ｃ５７ＢＬ／６非トランスジェニック野生型マウス（ＮＴＧマウス）、Ｐｒｎｐ−ＴＡＲＤＢＰマウス（ＴＤＰ−４３  ＷＴ  Ｔｇマウス）、およびＰｒｎｐ−ＴＡＲＤＢＰ＊Ａ３１５Ｔマウス（ＴＤＰ−４３  Ａ３１５Ｔ  Ｔｇマウス）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州バーハーバー）より購入した。マウスに小型浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ  Ｍｏｄｅｌ  ２００４、カリフォルニア州クパチーノ；流速０．２５μｌ／時）で皮下に注入した。埋め込みの１日前に、小型浸透圧ポンプにｃＰＭまたはＰＭ１ペプチドを含んだ２００μｌのＰＢＳを満たし（０．５ｍｇ／ｋｇ／日）、製造者の指示にしたがってＰＢＳ中、３７で一晩ポンプインキュベーションした。手術を行うため、雄マウスをアバチンで麻酔した。マウスの背部に小切開を行って小型浸透圧ポンプを皮下に埋め込んだ。処置後、マウスをアバチンで深麻酔し、冷ＰＢＳを経心的に灌流し、脊髄および脳組織を採取した後、分画化、ウェスタンブロット、または免疫染色を行った。
【０１４８】
運動行動の評価  
Ｐａｎｌａｂ  ＲｏｔａＲｏｄ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社、マサチューセッツ州ホリストン）を使用してロータロッド試験を行って運動協調性および平衡感覚を評価した。簡単に述べると、最初にマウスに、１日３回、３日間トライアルを行わせる訓練を受けさせた（４〜１２ｒｐｍで３分未満の時間で行い、各トライアルの間に少なくとも１０分間のインターバルを置いた）。この実験で用いたマウスはすべて、訓練後に安定したＲｏｔａｒｏｄ動作を行うに到った（データは示さず）。訓練の３日後、マウスを週３回の加速モード（４〜４０ｒｐｍで５分以上）で評価した。ロータロッド試験はすべて、異なる遺伝子型で少なくとも５分間のインターバルで行い、慣れを防止するために分散させて行った。長さ５０ｃｍ、幅５ｃｍで両側に境界を設けた特別に設計したランウェイを用いて足跡分析を行った。最初にマウスの前足及び後足を赤色および青色の無害なペンキに浸した。その後、マウスを白い紙で覆ったランウェイの上に乗せ、周囲を囲った暗い箱の中に向かって走らせた。座っている状態のマウスの足跡は定量に含めなかった。ストライドの長さを一歩の間の前方への運動の平均距離とし、ベース長さを左右の前足または後足の間の平均距離とする。
【０１４９】
共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡および電子顕微鏡  
すべての共焦点顕微鏡像は、ＥＮＲＥＦ＿３７７１にこれまでに述べられているように、室温で、Ｃ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ４０Ｘ／１．２Ｗ水浸対物レンズまたはαＰｌａｎ−Ｆｌｕａｒ  １００ｘ／１．４５油浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０倒立型レーザー走査共焦点蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０共焦点ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ社）により制御されるもの）によって撮像した。遠赤色蛍光の共焦点像は、ＨｅＮｅレーザーからの６３３ｎｍの励起光および６５０ｎｍのロングパスフィルターを用いて収集し、赤色蛍光の像は、アルゴンレーザーからの５４３ｎｍの励起光および５６０ｎｍのロングパスフィルターを用いて収集し、緑色蛍光像は、アルゴンレーザーからの４８８ｎｍの励起光および５００〜５５０ｎｍのバンドパスバリアフィルターを用いて収集した。
【０１５０】
ＴＭＲＭ、Ｒｈｏｄ１２３およびＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎのタイムラプスイメージングまたは通常の蛍光イメージングを行うには、細胞またはニューロンを３５ｍｍディッシュまたは２４ウェルプレートに播き、ｍｉｔｏ−ＤｓＲｅｄ２または示されるプラスミドを感染／トランスフェクトした。細胞またはニューロンは、２０Ｘ／０．７ＮＡ  Ｐｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ乾式対物レンズを備え、ＣＯ２含量、湿度、温度（３７℃）が制御された環境チャンバを備えた倒立型Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ６０００蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社）（Ｌｅｉｃａ  ＬＡＳ  ＡＦ３  ソフトウェアにより制御されるもの）によってイメージングした。画像は、光退色またはシグナル過飽和を避けるため、最低強度で撮像した。タイムラプスイメージングでは、フレームは、１０秒ごとに少なくとも１時間、光毒性または光退色のないように撮像した。免疫ＥＭでは、生検で得たヒトの脳組織、細胞、および単離したミトコンドリアを、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファー（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペンシルベニア州ハットフィールド）中、０．１（ｗ／ｖ）％グルタルアルデヒドを含む４（ｗ／ｖ）％ホルムアルデヒド中、室温で４５分間固定した後、エタノール中で脱水し、ＬＲ  Ｗｈｉｔｅ樹脂（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．社、ペンシルベニア州ウォリントン）中に包埋した。免疫金標識法を、Ｆｕｊｉｏｋａらにより述べられる方法にしたがって行った。薄い切片を、１（ｗ／ｖ）％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１（ｖ／ｖ）％正常ヤギ血清、および０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ  ２０  （ＰＢＧＴ）を含むＰＢＳでブロッキングした。次いで、グリッドを抗体（抗Ｆｌａｇまたは抗ＴＤＰ−４３）とＰＢＧＴ中、１：１０〜１：３０の希釈率で１２時間、４℃でインキュベートした。ネガティブコントロールとして、一次抗体として正常ウサギ血清、正常マウス血清、およびＰＢＴに置き換えた。洗浄後、グリッドをＰＢＧＴ中に１：２０で希釈した１０ｎｍ金結合ヤギ抗ウサギＩｇＧまたはヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｒｉｔｉｓｈ  ＢｉｏＣｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．社、カリフォルニア州レディング）中で１．５時間インキュベートし、ＰＢＳですすぎ、グルタルアルデヒドで固定して金粒子を安定化した。金標識した薄い切片を最初に２％酸性化酢酸ウラニルで３８℃で３０分間、次いで、Ｈａｎａｉｃｈｉらにより改変された佐藤の三重鉛色素で染色した後、Ｇａｔａｎ  ＵＳ４０００  ４ｋｘ４ｋ  ＣＣＤを備えたＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｓｐｉｒｉｔ（Ｔ１２）で調べた。通常のＥＭでは、試料を新たに切除し、これまでに述べられているようにして、透過型電子顕微鏡用に処理した。すなわち、組織の小片または単離したミトコンドリアを三重アルデヒド−ＤＭＳＯ中に浸漬して固定した。蒸留水中ですすいだ後、これらをフェロシアン化物還元四酸化オスミウム中で後固定した。別の水でのすすぎの後に、酸性化酢酸ウラニル中に一晩浸漬した。再び蒸留水中ですすいだ後、組織ブロックを増大する濃度のエタノール中で脱水し、酸化プロピレンに通し、Ｐｏｌｙ／Ｂｅｄ樹脂中に包埋した。薄い切片を酸性化酢酸ウラニルで連続���て染色した後、佐藤の三重鉛染色の変法を行い、Ｇａｔａｎ  ＵＳ４０００  ４ｋｘ４ｋ  ＣＣＤを備えたＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｓｐｉｒｉｔ（Ｔ１２）で調べた。
【０１５１】
画像解析
オープンソースの画像解析プログラムであるＷＣＩＦ  ＩｍａｇｅＪ  （Ｗ．Ｒａｓｂａｎｄの開発によるもの）による画像解析も行った。「３Ｄ  Ｖｉｅｗｅｒ」プラグインを使用して３Ｄ画像を再構成した。「ＲＧＢ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ｐｌｏｔ」プラグインを使用してラインスキャン解析を行った。簡単に述べると、生の共焦点画像をバックグランド補正した。幅「２」を有する直線を対象とする領域内に引いた。次いで、この直線を、ＩｍａｇｅＪ  ｐｌｕｇｉｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓの「プラグイン」メニューの下の「ＲＧＢ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ｐｌｏｔ」を選択することによって直接分析した。「ＲＧＢ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ」の出力として、データをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌにエクスポートした。線の長さをＸ軸上にプロットし、強さをＹ軸上にプロットした。ミトコンドリア運動のキモグラフおよび定量を、これまでに述べられているようにして、「ＭｕｌｔｉｐｌｅＫｙｍｏｇｒａｐｈ」を使用して行った（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｄｅ／ｅａｍｎｅｔ／ｈｔｍｌ／ｂｏｄｙ＿ｋｙｍｏｇｒａｐｈ．ｈｔｍｌ）線維芽細胞およびＨＥＫ２９３細胞のミトコンドリアの形態を定量した。簡単に述べると、生画像の１つの平面またはｚ方向の一連のスタックをバックグランド補正し、直線的にコントラストを最適化し、７×７の「トップハット」フィルターを適用し、３×３のメジアンフィルターにかけた後、閾値処理を行ってバイナリー画像を生成した。大部分のミトコンドリアは、バイナリー画像内で明確に分離しており、ミトコンドリアの大きなクラスターは自動的に除外された。バイナリー画像はすべて、Ｉｍａｇｅ  Ｊによって更に分析した。ニューロンのミトコンドリアの形態またはＥＭ顕微鏡写真はすべてＩｍａｇｅ  Ｊ．によって直接分析した。
【０１５２】
統計学的分析  
統計学的分析を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてテューキーの多重比較検定またはスチューデントのＴ検定を行うことにより行った（８７０）。データは平均±ＳＥＭである。ｎは、実験当たりのニューロン、細胞、またはマウスの数を表す（８７１）。ｐ＜０．０５は、統計的に有意であるとみなした。ｎｓは、有意でない（ｎｏｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）を意味する。すべての統計的分析は盲検的に行った。
【０１５３】
結果  
ＴＤＰ−４３は、ＡＬＳおよびＦＴＤのミトコンドリアに蓄積する
本発明者らは、ＡＬＳの症例および同年齢の正常な個人から得た脊髄、ならびにＦＴＤの症例および同年齢の正常な個人から得た前頭皮質のヒト組織試料のニューロンの異なる細胞小器官とＴＤＰ−４３の共局在化について最初に検討した。コントロール例の脊髄運動ニューロンおよび皮質ニューロンはいずれも、主として核へのＴＤＰ−４３局在化を示したが、ＡＬＳの運動ニューロンおよびＦＴＤの皮質ニューロンはいずれも、特徴的な高い細胞質へのＴＤＰ−４３の蓄積を示した（図１Ａ〜Ｄ）。（４）注目すべき点として、ＡＬＳ患者の多くの脊髄運動ニューロンおよび／またはＦＴＤ患者の皮質ニューロンの細胞質のＴＤＰ−４３は、ミトコンドリアのマーカーと同様の分布パターンで顕著に共局在化していた（図１Ａ〜Ｄ）が、ゴルジ体、小胞体、リソソーム、オートファゴソーム、エンドソーム、またはペルオキシオームのマーカーとの重なり合いは最小であった。低い存在量ではあったが、コントロールのヒト運動ニューロンおよび皮質ニューロンの細胞質ＴＤＰ−４３はミトコンドリアとやはり顕著に共局在化していた（図１Ａ〜Ｄ）。
【０１５４】
本発明者らは、更に、ヒト脊髄および皮質組織から膜構造が保存された高度に精製されたミトコンドリアを更に単離し、すべての試料からミトコンドリアの存在するＴＤＰ−４３を見出した（図１Ｅ、Ｆ）。予想されたように、ＡＬＳまたはＦＴＤからのミトコンドリアでは、同年齢のコントロールと比較して顕著に高いＴＤＰ−４３の発現が認められた。
【０１５５】
これらの精製されたミトコンドリアに、ミトコンドリアよりも細かい分画化分析を続いて行ったところ、ミトコンドリアのＴＤＰ−４３は、ミトコンドリア内膜（ＩＭＭ）画分にもっぱら存在しており、ミトコンドリア外膜（ＯＭＭ）、膜間腔（ＩＭＳ）またはマトリックスには存在していないことが明らかとなった（図１Ｇ、Ｈ）。これと一致して、精製されたミトコンドリアおよび生検で得られたヒト皮質の更なる免疫電子顕微鏡（免疫ＥＭ）分析によって、ＴＤＰ−４３がＩＭＭのクリステに主に局在化していることが確認された（図１Ｉ）。ＡＬＳの脊髄またはＦＴＤの皮質から単離されたミトコンドリアは、同年齢のコントロールからのものと比較してより顕著なＴＤＰ−４３標識を示したが、これは予想されたとおりであった。避けられない死後遅延のため、ヒト組織の完全性が損なわれ、ＩＭＭのＴＤＰ−４３の更なる生化学的特性分析が困難となる。補完的なアプローチとして、本発明者らは、新しく採取したマウスの脊髄および皮質の組織試料からミトコンドリアを得て、これをトリプシンおよびジギトニンで処理してＯＭＭを透過化した（ただし、ＩＭＭは透過化されない）。ＯＭＭタンパク質Ｍｆｎ２／Ｍｆｆがトリプシン単独で消化され、ＩＭＳ側にあるＩＭＭタンパク質Ｔｉｍ２３／ＯＰＡ１がＯＭＭの透過化処理後にトリプシンによって消化されたのに対して、ＴＤＰ−４３またはマトリックス側にあるＩＭＭタンパク質ＣＯＸＩＶ／Ｆ１βはこれらのいずれの条件でも変化はみられなかった。ＣＯＸＩＶ／Ｆ１βと同様、ＴＤＰ−４３はＴｒｉｔｏｎＸ−１００による完全な膜透過化後にはトリプシンにより消化された。ＴＤＰ−４３は、マウスミトコンドリアのＩＭＭ画分にやはりもっぱら存在していることから、これらの結果は、ＴＤＰ−４３がＩＭＭのマトリックス側のひだ構造に位置していることを示唆するものである。
【０１５６】
ＡＬＳ関連突然変異はＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化を増大させる
本発明者らは次に、ＴＤＰ−４３における疾患関連突然変異がそのミトコンドリア局在化に影響するか否かを調べた。過剰発現に関連する潜在的な副作用を除外し、また本発明者らの知見を患者に直接関連したものとするため、本発明者らは、ＴＤＰ−４３突然変異Ｇ２９８ＳまたはＡ３８２Ｔを有するＡＬＳ患者由来の初代ヒト線維芽細胞（Ｇ２９８ＳまたはＡ３８２Ｔ線維芽細胞）、および同年齢の正常なヒト被験者由来の初代ヒト線維芽細胞（正常ヒト線維芽細胞、ＮＨＦ）から単離されたミトコンドリアにおけるＴＤＰ−４３の発現について最初に検討した。Ｇ２９８ＳおよびＡ３８２Ｔ線維芽細胞におけるＴＤＰ−４３突然変異を、ゲノムＤＮＡシークエンシングにより確認した。Ｇ２９８ＳおよびＡ３８２Ｔ線維芽細胞ではＴＤＰ−４３の誤った局在化は認められなかった。ＴＤＰ−４３突然変異を有するすべての線維芽細胞が全ＴＤＰ−４３の同等な発現を示したが、Ｇ２９８ＳおよびＡ３８２Ｔ線維芽細胞は、ＮＨＦよりも有意に高いレベルのミトコンドリアＴＤＰ−４３を示し（図２Ａ）、疾患関連突然変異によるＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の増大が示唆された。これらの研究結果を実証するため、本発明者らは、培養ＨＥＫ２９３細胞、またはＷＴまたは突然変異体ヒトＴＤＰ−４３を過剰発現するヘミ接合体トランスジェニックマウスからの脳および脊髄のマウス組織試料におけるＷＴと突然変異体ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の比較を行った。これに一致して、全ライセートで発現レベルが同様であったにもかかわらず、外因性に発現されたヒトＴＤＰ−４３のＧ２９８Ｓ、Ａ３１５Ｔ、およびＡ３８２Ｔでは、ヒトＷＴ  ＴＤＰ−４３と比較して一貫して高いミトコンドリアにおける発現を示した（図２Ｂ、Ｃ、ミトコンドリアにおけるＴＤＰ−４３の発現を全ＴＤＰ−４３およびミトコンドリアマーカーＣＯＸＩＶにより調節した）。外因性に発現させた、または内因性のヒトＷＴおよび突然変異体ＴＤＰ−４３は、ＩＭＭ画分中に依然存在しており（図２Ｄ、Ｅ）、ＩＭＭの透過化後にトリプシンにより消化されたが、ＯＭＭ透過化後では消化されず（データは示さず）、疾患関連突然変異体がＴＤＰ−４３のミトコンドリアよりも細かい部位への局在化に対しては影響を及ぼさないことが示された。
【０１５７】
核ＴＤＰ−４３の干渉の可能性を排除するため、本発明者らは更に、これらの研究結果を、Ｆｌａｇタグ化組換えＷＴ／突然変異体ヒトＴＤＰ−４３タンパク質（ｒＴＤＰ−４３）およびマウスの脳から単離されたミトコンドリアを使用した無細胞ミトコンドリア移入アッセイで確認しようと試みた。ヒトｒＴＤＰ−４３はいずれも可溶性であり、翻訳後に切断も修飾もされていなかった（データは示さず）。広く用いられているビオチン標識された組換えＦ１β前駆タンパク質（ｐＦ１β）をポジティブコントロールとして含め、組換えＧＦＰをネガティブコントロールとして用いた（データは示さず）。ｐＦ１βは、切断可能なシグナル配列を有しており、これは移入後に切断されてより短いｍＦ１βを生成し（図２Ｆ、右パネル）、単離されたミトコンドリアの完全な移入マシナリーを示した。ｍＦ１βと同様、ＷＴのｒＴＤＰ−４３は移入後にジギトニン／トリプシン共処理で消化されず（図２Ｆ、左パネル）、インビトロでＩＭＭの内部に支障なく移入されることを示している。予想されたように、ＷＴのｒＴＤＰ−４３と比較して、Ｇ２９８Ｓ、Ａ３１５ＴまたはＡ３８２Ｔを有するｒＴＤＰ−４３ｊは、高い移入効率を示した（図２Ｇ）。内部に移入されたＷＴ／突然変異体ｒＴＤＰ−４３は、ｔｒｉｔｏｎＸ−１００による透過化後にトリプシンにより完全に消化された（データは示さず）。
【０１５８】
更なる免疫ＥＭ分析により、移入されたＷＴ／突然変異体ｒＴＤＰ−４３の主としてＩＭＭクリステへの局在化、および疾患関連突然変異によるｒＴＤＰ−４３の移入の増大が確認された（図２Ｈ）。これらを合わせると、これらの観察結果はＡＬＳ突然変異がＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化を増大させることを示している。
【０１５９】
ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化は、内部モチーフに依存している
ミトコンドリアのタンパク質は、切断されるプレ配列または切断されない内部シグナルのいずれかによってミトコンドリアに誘導される。ＴＤＰ−４３は、移入後に切断されない状態で維持され、ＴａｒｇｅｔＰまたはＭｉｔｏｐｒｏｔによってＴＤＰ−４３では切断されるプレ配列は同定されていないため、ＴＤＰ−４３が内部配列を利用している可能性が示唆される。ミトコンドリアの内部シグナルは通常、連続した疎水性アミノ酸のストレッチで構成され、６個のこのようなストレッチがＴＤＰ−４３内に存在している（図３Ａ、Ｍ１〜６）。Ｍ１／３／５  の欠失（ΔＭ１／３／５）により、インビトロでｒＴＤＰ−４３の移入が有意に阻害され、外因性に発現させたＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化が低減した（図３Ｂ、Ｃ）。Ｍ１およびＭ３セグメントは種間で保存されていることから、本発明者らは、Ｍ１またはＭ３モチーフがＴＡＴペプチド（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１））と融合されることで透過性が高められた２種類のペプチドＰＭ１（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＡＱＦＰＧＡＣＧＬ（配列番号１５））とＰＭ３  （ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＳＫＧＦＧＦＶＲＦ  （配列番号１６））を合成した。ＰＭ１およびＰＭ３は、ＨＥＫ２９３細胞および初代ニューロンにおいてｒＴＤＰ−４３の移入を大幅に抑制し、ミトコンドリアＴＤＰ−４３を減少させたが、コントロールペプチドであるｃＰＭ（それぞれ、スクランブルされたＭ１およびＭ３をＴＡＴに融合したものであるＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＡＡＱＧＦＧＣＰＬ（配列番号１８）およびＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＲＦＦＫＳＦＧ（配列番号１９）の混合物）ではこのような抑制はみられなかった（図３Ｄ〜Ｆ）。Ｍ３およびＭ５、特にＭ１と、関連のない細胞質タンパク質ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）との融合は、ミトコンドリアへのターゲティングを促進するのに充分であった（図３Ｇ）。Ｍ１、Ｍ３、またはＭ５の欠失が核、細胞質、および全ＴＤＰ−４３の発現に影響しないこと（図３Ｃ）、Ｍ１、Ｍ３、またはＭ５の欠失がＴＤＰ−４３の凝集／誤った局在化／切断を引き起こさないこと（データは示さず）、および、ＰＭ１またはＰＭ３がｐＦ１βの移入に影響しないこと（図３Ｄ）の更なる事実に基づき、本発明者らは、Ｍ１、Ｍ３、およびＭ５はＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化にとって重要な内部モチーフであるとの結論にいたった。（２０８）
【０１６０】
ミトコンドリアのＷＴ／突然変異体ＴＤＰ−４３は、ミトコンドリアで転写されるＮＤ３／６のｍＲＮＡに選択的に結合し、それらの翻訳を阻害する  
ＴＤＰ−４３は主としてｍＲＮＡに結合する。ＴＤＰ−４３がＩＭＭに存在することから、本発明者らはＴＤＰ−４３がミトコンドリアで転写されるｍＲＮＡに結合するか否かを検討した（図４Ａ）。マウスの脳のミトコンドリアを使用した予め架橋を行うかまたは行わないＲＮＡ免疫沈降（ＩＰ）によって、ＴＤＰ−４３は、ＮＤ３、ＮＤ５、ＮＤ６、ＣＯＸＩ、ＣＯＸＩＩＩ、Ｃｙｔ  ｂ、およびＡ６のｍＲＮＡを沈降させた（ただし、ＲＮＡ結合ドメインを欠いたネガティブコントロールＣＯＸＩＶはこれらを沈降させなかった（図示せず））のに対して、他のｍＲＮＡはわずかに濃縮されたのみであり、１２ｓまたは１６ｓ  ｒＲＮＡと同等のレベルであった（図４Ｂ）。ＡＬＳ突然変異がＴＤＰ−４３のその標的に対する結合性を変化させるか否かを調べるため、本発明者らは、ヒトＴＤＰ−４３のＧ２９８Ｓ、Ａ３１５Ｔ、またはＡ３８２Ｔを発現するＧ２９８Ｓ／Ａ３８２Ｔ線維芽細胞またはＨＥＫ２９３細胞からミトコンドリアを単離した。驚くべきことに、いずれの突然変異体ＴＤＰ−４３も、ＷＴのＴＤＰ−４３と同等の存在量で同様のｍＲＮＡを沈降させた（図４Ｃ、Ｄ）。
【０１６１】
ミトコンドリアで転写されるｍＲＮＡのレベルは、ＴＤＰ−４３によって影響されないが、このことは、ミトコンドリアでの転写にＴＤＰ−４３が関与している可能性が低いことを示唆するものである。その高いトランスフェクション効率およびミトコンドリアの単離および下流の生化学的分析に適した培養のため、本発明者らは次に、細胞質での翻訳を阻害するためのエメチンの存在下でのアジドホモアラニン（ＡＨＡ）取り込みアッセイにより、ＨＥＫ２９３細胞におけるミトコンドリアでの翻訳に対するＴＤＰ−４３の効果について検討した。ＮＤ３およびＮＤ６の合成は、ＷＴのＴＤＰ−４３の過剰発現によって最も顕著に低減され（図４Ｅ）、これらのｍＲＮＡに対するＴＤＰ−４３の最も選択的な結合と一致する。ＮＤ３およびＮＤ６の安定状態のレベルは実際、ＷＴのＴＤＰ−４３によって低減され（図４Ｆ）（ただし、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）複合体のミトコンドリアでコードされたサブユニットの多くは低減されない）、ＮＤ３およびＮＤ６の合成または発現のＷＴのＴＤＰ−４３によって誘導される低下は、Ｍ１の欠失によって阻害された。ミトコンドリアのＴＤＰ−４３がＮＤ３およびＮＤ６の翻訳をどのように調節しているかを調べるため、本発明者らは、ミトコンドリアでのリボソームのアセンブリおよびＴＤＰ−４３のＷＴまたはΔＭ１を発現しているＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリアのスクロース勾配遠心によるＮＤ３およびＮＤ６のｍＲＮＡ上への結合について調べた。ＴＤＰ−４３は、すべてのミトコンドリアでコードされたタンパク質の翻訳に全体的な影響を示さなかった（図４Ｅ、Ｆ）。予想どおりのこととして、スクロース勾配中でのＭＲＰＳ１８ＢおよびＭＲＰＬ４４（ミトコンドリアのリボソーム２８Ｓ／３９Ｓサブユニットのマーカー）の沈降パターンはすべての試料で同様であり、全体的なミトコンドリアでのリボソームアッセンブリに変化がないことを示唆した。しかしながら、更なるＲＮＡ分布の分析により、コントロール細胞では大部分が５５Ｓリボソーム複合体の沈降であったのに対して、ＮＤ３およびＮＤ６のｍＲＮＡは、（ΔＭ１ではなく）ＴＤＰ−４３のＷＴの過剰発現後に２８Ｓと５５Ｓ複合体の間に更なるピークを示し（ＣＯＸＩのｍＲＮＡではこのピークを示さず）、ＮＤ３およびＮＤ６のｍＲＮＡへのリボソームの誤った結合を示唆した。
【０１６２】
ＮＤ３およびＮＤ６の発現に対する突然変異体ＴＤＰ−４３の影響を調べるため、本発明者らは、ＴＤＰ−４３のＧ２９８Ｓ、Ａ３１５ＴまたはＡ３８２Ｔを発現しているＨＥＫ２９３細胞、およびヒトＧ２９８ＳまたはＡ３８２Ｔ線維芽細胞について検討した。ＷＴのＴＤＰ−４３と比較して、すべての突然変異体ＴＤＰ−４３は、ＮＤ３およびＮＤ６の発現を更に低下させるかまたは低下させた（図４Ｆ、Ｇ）。特に、Ｍ１の欠失またはＰＭ１による処理は、ＮＤ３およびＮＤ６の発現をコントロール細胞またはＮＨＦと同程度のレベルにまで増大させた。この実験では、ＴＤＰ−４３のＲＮＡ結合モチーフへのＭ３の局在化（図３Ａ）および細胞に対するＰＭ３の穏やかな毒性作用（データは示さず）のため、ＰＭ３については試験を行わなかった。上記と一致して、同年齢の正常な被験者からのヒト組織試料と比較して、ＡＬＳの症例からの脊髄またはＦＴＤの症例からの前頭皮質のヒト組織試料では、ＮＤ３およびＮＤ６の発現は低く（図４Ｈ）、本発明者らの研究結果を更に疾患まで広げるものである。
【０１６３】
ミトコンドリア内のＷＴ／突然変異体ＴＤＰ−４３は、ＯＸＰＨＯＳ複合体Ｉおよびミトコンドリアによる生体エネルギー生成を妨げる  
複合体ＩのサブユニットＮＤ３およびＮＤ６の発現に対するＴＤＰ−４３の特異的な阻害作用と一致して、ＷＴのＴＤＰ−４３を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞は、ＯＸＰＨＯＳ複合体Ｉの最も顕著な喪失および機能不全、ならびに複合体Ｉで構成されたＯＸＰＨＯＳ超複合体のわずかな分解を示し、その影響は疾患関連突然変異Ｇ２９８Ｓ、Ａ３１５ＴまたはＡ３８２Ｔにより有意に悪化したが、Ｍ１の欠失により有意に防止された（図５Ａ、Ｂ）。予想されるように、ＯＸＰＨＯＳ複合体Ｉの分解および機能不全は患者由来のＧ２９８ＳまたはＡ３８２Ｔ線維芽細胞でみられ、ＰＭ１処理によって、ＯＸＰＨＯＳ複合体のアセンブリおよび機能がＮＨＦと同等のレベルにまで有意に回復した（図５Ｃ、Ｄ）。興味深い点として、ＴＤＰ−４３により誘発される複合体Ｉの分解および機能不全は、ＮＤ３およびＮＤ６の両方を同時に過剰発現させることによっても大きく軽減されるが、ＮＤ３またはＮＤ６単独では軽減されず（図５Ｅ）、ＮＤ３およびＮＤ６がミトコンドリアにおいてＴＤＰ−４３の特異的な標的となることを更に支持するものである。
【０１６４】
複合体ＩはＯＸＰＨＯＳ２７にとって重要である。予想されるように、ミトコンドリア膜電位（ｍΔψ）の低下、酸素消費速度（ＯＣＲ）の低下、およびミトコンドリアのフラグメント化にともなうＡＴＰレベルの低下を含む顕著なミトコンドリア機能不全が、ＷＴまたは突然変異体ＴＤＰ−４３を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞および患者のＧ２９８ＳまたはＡ３８２Ｔ線維芽細胞でいずれも観察された（図５Ｆ、Ｆ）。ＷＴのＴＤＰ−４３と比較して、突然変異体ＴＤＰ−４３はＨＥＫ２９３細胞でより深刻なミトコンドリア異常を引き起こした。予想どおりのこととして、ＨＥＫ２９３細胞およびヒト線維芽細胞においてＷＴおよび／または突然変異体ＴＤＰ−４３により誘発されるミトコンドリア機能不全およびフラグメント化は、Ｍ１の欠失またはＰＭ１処理におって完全に防止された。特に、基底細胞死は観察されなかったが、患者由来のＧ２９８ＳまたはＡ３８２Ｔ線維芽細胞は、ＮＨＦと比較して酸化ストレスに対して有意に高い脆弱性を示し、これもやはりＰＭ１処理によって解消された（図５Ｈ）。ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の抑制は、インビトロおよびインビボでＷＴ／突然変異体ＴＤＰ−４３のニューロン毒性を阻害する。最後に、本発明者らは、ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化がニューロンに対するその毒性に寄与しているか否かを調べた。ＷＴのＴＤＰ−４３の過剰発現は、インビトロで培養したラット初代ニューロンのニューロン死に先立ってミトコンドリアの断片化および機能不全（ｍΔψ／ＯＣＲ／ＡＴＰの低下）を引き起こし、これらはいずれも、Ｇ２９８Ｓ、Ａ３１５ＴまたはＡ３８２Ｔによって悪化したが、Ｍ１欠失またはＰＭ１処理により完全に防止された。これらの研究結果を実証するため、本発明者らは、ＮＨＦおよびヒトＡ３８２Ｔ線維芽細胞を、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に再プログラミングしてから、連続的に誘導ニューロン前駆細胞（ｉＮＰＣ）およびヒトニューロン（コントロールヒトニューロンおよびＡ３８２Ｔヒトニューロン）にそれぞれ分化させた。コントロールヒトニューロンとＡ３８２Ｔヒトニューロンとは、ＴＤＰ−４３の核局在化、ニューロンの形態、および生存率において区別できなかった。しかしながら、コントロールのヒトニューロンと比較して、Ａ３８２Ｔヒトニューロンは、顕著なミトコンドリア断片化／機能不全および酸化ストレスに対する高い脆弱性を示し、これらはＰＭ１処理によって軽減された。予想されたように、ラット初代ニューロンで観察された結果と同様、ｉＰＳＣ由来のコントロールヒトニューロンにおけるＴＤＰ−４３のＷＴまたはＡ３１５Ｔの過剰発現もまた、ミトコンドリアの異常およびニューロン死を引き起こし、Ｍ１の欠失は、ＴＤＰ−４３により誘発されるミトコンドリアおよびニューロン毒性を消失させるのに充分であった。
【０１６５】
本発明者らの研究結果をインビボで確認するため、本発明者らは、ＴＤＰ−４３およびｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２をコードするニューロン特異的なバイシストロニックレンチウイルスをマウスの皮質内に定位注射した（図６Ａ）。ＷＴのＴＤＰ−４３の過剰発現と比較して、ＴＤＰ−４３のＡ３１５Ｔの過剰発現は、ミトコンドリアの更なる断片化および切断カスパーゼ３陽性ニューロンの数の増大（ニューロン死を反映している）をもたらしたが、これらはＭ１欠失によって阻害された（図６Ｂ、Ｃ）。ＴＤＰ−４３  Ａ３１５ＴトランスジェニックマウスがＡＬＳ様の表現型を生じるかどうかについては議論がなされているが、神経変性および神経病理がＴＤＰ−４３  Ａ３１５Ｔヘミ接合体トランスジェニックマウスで一貫して報告されているのに対して、ＴＤＰ−４３のＷＴヘミ接合体トランスジェニックマウスでは、これらがヒトＴＤＰ−４３の同様の発現を示すことにもよらず報告されていない（図２Ｃ）。本発明者らは、ＴＤＰ−４３  Ａ３１５Ｔマウスを連続皮下注入によりＰＭ１で処理し、ＰＭ１が中枢神経系に達してミトコンドリア内の突然変異体ＴＤＰ−４３を大幅に低減させたことを確認した。ＴＡＴはペプチドがミトコンドリアの二重膜を通過することを可能とするため、ＰＭ１はすべてのミトコンドリアコンパートメントで検出されたが、これは予想されたことであった。ＴＤＰ−４３  Ａ３１５Ｔマウスは、ＮＤ３およびＮＤ６の発現、ミトコンドリアの断片化および機能不全（ｍΔψ／ＯＣＲおよび複合体Ｉの分解の低下）、運動ニューロンの喪失および軸索変性、神経病理（封入体および星状細胞活性化）、神経筋接合部（ＮＭＪ）の脱神経、歩行異常および協調運動／平衡感覚障害の有意な低下を示したが、これらはいずれも、ＰＭ１により軽減され、非トランスジェニック（ＮＴＧ）マウスと同等のレベルにまで回復した（図６Ｄ〜Ｊ）。Ｍ１の欠失は、ＴＤＰ−４３の半減期、二量体化、または非ミトコンドリアｍＲＮＡ標的に対するその結合に影響しない。また、Ｍ１は、いずれの既知の機能ドメイン内にも位置していない（図３Ａ）。更に、Ｍ１欠失またはＰＭ１処理は、細胞質、核または全ＴＤＰ−４３に大きな影響を及ぼさない（図３Ｃ〜Ｆ）。これらを合わせると、これらのデータはすべて、ミトコンドリア局在化が、ニューロンに対するＷＴおよび突然変異体ＴＤＰ−４３の毒性の重要な決定因子であることを示唆するものである。
【０１６６】
実施例２
本実施例では、本発明者ら成体のヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖ  Ｔｇマウスで一連の運動協調性および認知機能試験を行った。ＴＤＰ−４３誘発神経毒性の直接的な媒介因子としてミトコンドリアが特定された実施例１に基づき、本発明者らは、突然変異体ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の阻害が、疾患発症後の成体ヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖ  Ｔｇマウスの運動協調性および認知機能障害を回復させるかについて更に試験を行った。
【０１６７】
材料および方法
動物および処理
マウスの手術／手技は、ＮＩＨのガイドラインにしたがって実施したものであり、ケース・ウェスタン・リザーブ大学の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）により承認されたものである。Ｃ５７ＢＬ／６非トランスジェニック野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＮＴＧ  マウス）およびＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（Ｐｒｎｐ−ＴＡＲＤＢＰ＊Ｍ３３７Ｖ）４Ｐｔｒｃ／Ｊ  （ｈＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖトランスジェニックマウス、ストック番号＃０１７６０４）を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社  （メイン州バーハーバー）より購入し、ケース・ウエスタン・リザーブ大学で維持した。すべてのマウスを生後３０日目に離乳させ、パンチで穴をあけた耳から抽出したＤＮＡのＰＣＲ分析により遺伝子型を決定した。各実験の詳細なマウスの年齢および性別情報を具体的な図のレジェンドに示す。ペプチドの注入を行うため、小型浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ  Ｍｏｄｅｌ２００６，カリフォルニア州クパチーノ、流速０．１５μｌ／時）にＳＣまたはＰＭ１ペプチドを含んだ２００μｌのＰＢＳを満たし（０．５ｍｇ／ｋｇ／日）、製造者の指示にしたがってＰＢＳ中、３７℃で一晩ポンプインキュベーションした。マウスをアバチンで完全に麻酔した時点で小型浸透圧ポンプをマウスの背部の皮下に埋め込んだ。処理の６週間後、マウスに氷冷ＰＢＳを経心的に灌流し、脳および脊髄組織を採取した。
【０１６８】
行動試験
ペプチド注入で処理した、または処理しなかったマウスで、感覚運動および認知機能を調べるための一連の行動試験を行った。２群の独立した、同年齢のコホート群からの結果を合わせた。試験バッテリーは、運動タスク（オープンフィールド試験）、身体協調タスク（ロータロッドおよびビーム歩行試験）、筋強さ（把握力強さ試験）、触覚タスク（粘着紙試験）、および記憶タスク（作業記憶についてＹ字迷路、短期空間記憶についてＴ字迷路、短期および長期非空間記憶について物体認識、ならびに感情記憶について恐怖条件付け）からなるものとした。個々のマウスを、これらの行動タスクについて以下の順序で各試験日に試験した。すなわち、ロータロッドおよび把握力強さ試験は１日目、オープンフィールド試験およびビーム歩行試験は２日目、Ｙ字迷路は３日目、粘着紙試験および物体認識試験は４〜５日目、Ｔ字迷路は６日目、および恐怖条件付け試験は７〜８日目。試験はすべて、Ｃａｓｅ  Ｂｅｈａｖｉｏｒコアで行い、実験者はマウス遺伝子型および処理群の両方について盲検化した。
【０１６９】
ロータロッド試験
ロータロッド（Ｐａｎｌａｂ／Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社、マサチューセッツ州ホリストン）を使用して運動協調性および平衡感覚を測定した。最初に各マウスに１日３回、３日間にわたってトライアルを受けさせた。訓練期間の間、各マウスをロータロッド上に置き、毎回のトライアルでシリンダー速度を４ｒｐｍ〜１２ｒｐｍにまで徐々に上げた。試験日にロータロッド加速モード（５分間かけて４〜４０ｒｐｍ）に設定し、落下するまでの最大時間を収集して統計的分析を行った。
【０１７０】
把握力強さ試験
マウスの筋肉の強さをＧＲＩＰ  ＳＴＲＥＮＧＴＨ  ＴＥＳＴ  ｍｅｔｅｒ（Ｂｉｏｓｅｂ社、ビトロル、フランス）により測定した。前肢の試験では、マウスの両前足をバーに乗せ、マウスの尾を後方に引っ張った。後肢については、試験者が左手で押さえたグリッド上に両後肢を置き、マウスの両後足を器械に連結されたバーの上に置いた。単一の最良の記録の値を統計分析に使用した。
【０１７１】
オープンフィールド試験
オープンフィールドは、高さ５０ｃｍの壁で囲まれた一辺の長さ５０ｃｍの正方形のプラスチック製装置からなるものとし、ＡＮＹｍａｚｅビデオ追跡ソフトウェア（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ．社、イリノイ州ウッドデール）を使用して活動を記録した。フィールドを、ＡＮＹｍａｚｅソフトウェアを使用して内側領域（３０ｃｍ×３０ｃｍ）と周辺領域（幅１０ｃｍの通路）とにデジタル的に分割した。データを継続的に１０分間収集し、移動距離（ｍ）、速度（ｍ／秒）、動かなかった時間（２秒よりも長い非運動状態）、および内側領域にいた時間をすべて記録し、自動的にスコア付けした。
【０１７２】
ビーム歩行試験
マウスの運動協調性および平衡感覚を、囲われた安全なプラットフォームに達するために一連の段階的な幅狭のビームを伝っていく能力を測定することにより評価した。ビームは、１６ｍｍの丸い直径、または１６ｍｍもしくは９ｍｍ四方の正方形の断面を有する長い木材（５０ｃｍ）からなるものとした。訓練では、マウスを直径１６ｍｍの丸いビームの始点に置き、囲われた箱にまで伝って行くように訓練した。マウスの訓練が終了した（直径１６ｍｍの丸いビームを２０秒以内に伝った）時点で、各ビーム上で、それぞれの場合で１６ｍｍの丸いビームから、１６ｍｍの四角いビーム、９ｍｍの四角いビームへと進む２回の連続したトライアルを受けさせた。マウスに最大で６０秒かけて各ビームを伝わらせた。各ビームを伝うまでの待ち時間、および前後の足が各ビームから滑り落ちた回数を各トライアルについて記録した。
【０１７３】
Ｙ字迷路試験
マウスの短期間の特殊記憶を調べるため、マウスをプレキシグラス製のＴ字迷路（アームの長さ６０ｃｍ）の中に置き、アームの１つを塞いで迷路を８分間、自由に探索させた。塞いだアームは動物間で切り換えてアームの好みのバイアスをなくした（相殺した）。８分間の探索時間後、マウスをホームケージに２時間戻し、その後、今回は３本のアームをすべて開通させたＴ字迷路に５分間戻した。Ｔ字迷路に戻した後、ＡＮＹｍａｚｅ追跡システムを使用してマウスを記録し、前回塞いだアーム内にいた時間および頻度、ならびにアームに進入した合計回数をカウントした。
【０１７４】
Ｔ字迷路試験
マウスの短期間の特殊記憶を調べるため、マウスをプレキシグラス製のＴ字迷路（アームの長さ６０ｃｍ）の中に置き、一方のアームを塞いで迷路を１０分間、自由に探索させた。塞いだアームは動物間で切り換えてアームの好みのバイアスをなくした（相殺した）。１０分間の探索時間後、マウスをホームケージに２時間戻し、その後、今回は３本のアームをすべて開通させたＴ字迷路に戻した。Ｔ字迷路に戻した後、ＡＮＹｍａｚｅ追跡システム（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ社、イリノイ州ウッドデール）を使用してマウスを記録し、前回塞いだアーム内にいた時間および頻度、ならびにアームに進入した合計回数をカウントした。
【０１７５】
物体認識試験
この認識記憶のタスクは、動物が、見慣れた物体と比較して目新しい物体を探るのにより長い時間を費やすという事実を利用したものである。試験装置は、床材を置いた通常の収容ケージとした。各マウスを通常の収容ケージ内に３分間置いた。その後、２個の同じ物体を収容ケージの隅に置いた（Ｔ１）。マウスに５分間、これらの物体を調べさせた。このセッションの後、動物をホームケージにケージメートと一緒に戻す１．５時間の遅延時間を置いた。遅延時間の後、動物に５分間の異なる刺激セッションを行わせた（Ｔ２、短期記憶）。このセッションでは、Ｔ１で与えられた物体と、馴染みのない別の物体を試験ケージの中に入れた。次いで、マウスをホームケージに戻し、２４時間後に第３のセッションを行った（Ｔ３、長期記憶）。この５分間のセッションでは、Ｔ１およびＴ２で与えられた物体と、馴染みのない別の物体とを試験刑事の中に入れた。各物体は見かけの異なる形状を有する硬質プラスチックおよび／または金属で形成されたものとした。各物体の匂いを嗅いで接触した合計時間を記録し、完全自動のＡＮＹｍａｚｅ追跡ソフトウェアを用いてスコア付けした。５分間の間に移動した総距離およびケージの反対側に留まった時間（不動状態で）も測定した。
【０１７６】
恐怖条件付け試験
すべての動物を条件付けボックス（Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社、バーモント州バーリントン）の中に入れ、音（ホワイトノイズ、８０ｄＢで３０秒、条件刺激（ＣＳ））を電気ショック（０．５ｍＡで１秒、無条件刺激（ＵＳ））と関連付ける訓練を行った。この手順を、１２０秒の蓄積時間および６０秒の刺激間インターバルで４回繰り返した。音とショックを同時に中止した。トライアルの最後に動物を取り出し、２４時間後にボックスに戻して、ショックに関連付けられた環境に対する学習された嫌悪を評価した（文脈依存的恐怖）。この目的で、すべての動物を、訓練を行った同じボックスに６分間入れ、音または嫌悪刺激のない状態でのすくみ行動を測定した。この後、動物を取り出し、動物が訓練を受けたチャンバを認識できなくなるように文脈を変えた。動物を文脈恐怖条件付けについて試験した２時間後、その時点で文脈を変えたボックス（形状、照明、および匂い（バニラエッセンス））に動物を再び入れ、最初の２分間のすくみ行動を測定して動物が文脈を認識していないことを確認した。２分（キューなし時間）後、６０秒の刺激間インターバル（ＩＳＩ）でＵＳ曝露を行わず、音（３０秒、５ｋＨｚ、８０ｄＢ）を１０回聴かせ、すくみ行動を測定して手がかり依存性恐怖条件付けを判定した。
【０１７７】
ミトコンドリア単離
組織をＩＢ−１溶液（２２５ｍＭ  マンニトール、７５ｍＭ  スクロース、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中でホモジナイズした。次いで、ホモジネートを６００ｇで５分間遠心して核夾雑物および未破砕細胞を除去した。上清を再び６００ｇで５分間遠心した後、７０００ｇで１０分間遠心した。この上清を細胞質画分として回収した。ペレットをＩＢ−２溶液（２２５ｍＭ  マンニトール、７５ｍＭ  スクロース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中で洗い、７０００ｇで１０分間遠心し、ＩＢ−２溶液に再懸濁し、１００００ｇで１０分間遠心し、最後にＭＲＢバッファー（２５０ｍＭ  マンニトール、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。再懸濁した画分を、８ｍｌ  パーコール培地（２２５ｍＭ  マンニトール、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＧＴＡおよび３０（ｖ／ｖ）％  パーコール）上に置き、ＳＷ４０ローター中、９５０００ｇ、４℃で３０分間遠心した。精製されたミトコンドリア画分を回収し、１０倍体積のＭＲＢバッファーに再懸濁し、６３００ｇで１０分間遠心してペレットをミトコンドリア画分として回収した。
【０１７８】
シナプトソームの単離およびミトコンドリア呼吸アッセイ
これまでに報告されているようにしてシナプトソームをマウス皮質から単離した。簡単に述べると、皮質組織を速やかに摘出し、氷冷した「Ｓｕｃｒｏｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍ」（スクロース培地）（３２０ｍＭ  スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５ｍＭ  ジチオトレイトール、ｐＨ７．４）中でホモジナイズした。次いで、ホモジネートを１０００ｇ、４℃で１０分間遠心した。上清を遠沈管中の不連続パーコール勾配（スクロース培地中、３、１０、および２３％パーコールの各３ｍＬの層）の上に静かに置いてから、３２５００ｇ、４℃で１０分間遠心した。シナプトソームを１０％と２３％パーコールとの間のバンドとして回収した。回収した溶液を、「Ｉｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｕｍ」（イオン性培地）（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、１．２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５ｍＭ  ＫＣｌ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で希釈した。１５０００ｇ、４℃で１５分間遠心してパーコールを除去し、ペレットをイオン性培地に再懸濁した。細胞培養プレートをポリエチレンイミン（５０％応益からの希釈比１：１５０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で一晩コートし、蒸留水で洗った。３０００ｇ、４℃で３０分間遠心することにより、シナプトソームをプレートに付着させ、更なる測定を行うために氷上に置いた。ミトコンドリア呼吸アッセイのプロトコールは、３分間の混合、２分間の待機、および３分間の測定時間のサイクルの繰り返しからなるものとした。基底酸素消費速度（ＯＣＲ）をＳｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ−２４（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ビレリカ、米国）により３回測定した。各ウェルのタンパク質濃度を測定してシナプトソームが同程度の量であることを確認した。
【０１７９】
免疫ブロット、免疫細胞化学、および免疫蛍光分析
組織または細胞画分を、１Ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、マサチューセッツ州ダンバース）を含んだＲＩＰＡバッファー（Ａｂｃａｍ社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）中でホモジナイズまたは溶解した。タンパク質を１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。低温室内で一次抗体と一晩、室温で二次抗体と１時間インキュベートした後、免疫反応性をＥＣＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ社）により検出した。ウサギＴＤＰ−４３抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社、イリノイ州ローズモント）、マウスヒトＴＤＰ−４３抗体（Ａｂｎｏｖａ社、カリフォルニア州ウォルナット）、ＣＯＸ  ＶＩ  （Ａｂｃａｍ社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、およびＧＡＰＤＨ／カルネキシン（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、マサチューセッツ州ダンバース）。免疫細胞化学法は、ペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼプロトコールにより行った。免疫蛍光染色を行うため、脱パラフィン化し、再水和した、Ｈ２Ｏ２処理を行わない組織切片を蒸留Ｈ２Ｏで３回簡単に洗い、１Ｘ抗原デクローカー（Ｂｉｏｃａｒｅ社、カリフォルニア州コンコード）中に入れた。次いで、Ｂｉｏｃａｒｅ社のＤｅｃｌｏａｋｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒを使用し、１２５℃に１０秒加熱し、９０℃に３０秒下げた後、２２ｐｓｉで１２８℃に加熱し、０ｐｓｉで９４℃に下げることにより、切片に加圧下で抗原賦活化を行った。温度を３０℃に下げた後、切片を蒸留Ｈ２Ｏで５回、徐々にすすいだ。次いで、切片を１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）により室温で３０分ブロッキングし、１％ＮＧＳを含むＰＢＳ中で一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、切片を１０％ＮＧＳ中で１０分間、次いで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒと結合させた二次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）（１：３００）と２時間、室温で暗状態でインキュベートした。最後に、切片をＰＢＳで３回すすぎ、ＤＡＰＩで染色し、ＰＢＳで再び３回洗い、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇマウンティングメディア（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、アラバマ州バーミングハム）とともにマウントした。
【０１８０】
結果
成体ヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスにおける運動協調性には変化が認められたが歩行活動、筋肉の強さ、または感覚運動機能には変化は認められなかった。
【０１８１】
本発明者らは最初に、ヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスを体重別に監視し、運動および協調性機能に関連して一般的に用いられている行動試験であるロータロッドおよびビーム歩行試験を行った。ヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスは生育可能であり、出生時の表現型は正常であり、月齢１６ヶ月（現時点で入手可能な最高齢のマウス）までで食餌摂取、体重、生存率、および後肢クラスピングにおいて野生型（ＷＴ）の同腹子と差異は見られなかった。しかしながら、月齢８ヶ月では、マウスは、ロータロッド上に留まる能力の低下およびビームを伝うまでの待ち時間の増大によって示されるロータロッドおよびビーム歩行試験における能力の有意な低下を示した（ロータロッドについてＦ１，２７＝８．１２、Ｐ＜０．０１；  １２ｍｍ角形ビームについてＦ１，２７＝１１．８６、Ｐ＜０．０１；  １２ｍｍ丸形ビームについてＦ１，２７＝１．２１（非有意）；  ９ｍｍ角形ビームについてＦ１，２７＝５．４８、Ｐ＜０．０５；図７Ａ、Ｂ）。ロータロッドおよびビーム歩行試験では雄マウスと雌マウスとの間に差は認められなかった。ロータロッドおよびビーム歩行の成績の低下は、すべてのマウスが把握力強さ試験において前肢および後肢について同様の成績であった（前肢についてＦ１，２７＝０．６９、後肢について０．３８  （非有意）；図７Ｃ）ことから筋力の弱さによって引き起こされたとは考えにくかった。
【０１８２】
歩行活動が変化したかどうかを更に検討するため、本発明者らは、トランスジェニックマウスのオープンフィールド活動を評価した。ＷＴマウスと比較して月齢８〜９ヶ月のヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスは、オープンフィールド試験でより長い移動距離およびより速い移動速度を有する非有意な傾向を示した（距離についてＦ１，２７＝  ３．５５、Ｐ＜０．１０；速度について  Ｆ１，２７＝  ３．５０、Ｐ＜０．１０；図７Ｄ）。内側領域にいた時間に差は認められず（Ｆ１，２７＝０．０５，非有意、データは示さず）、不安関連行動に変化がないことを示した。本発明者らは、粘着紙試験によってヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスの触覚応答も測定した。ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖの発現は、マウスが粘着テープに触れてこれを剥がす時間に有意な影響を与えず（Ｆ１，２７＝０．０２、非有意；図７Ｅ）、足感覚運動機能が変化しなかったことを示唆するものである。
【０１８３】
成体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖ  Ｔｇマウスにおける認知機能障害
運動協調性を評価するために用いたビーム歩行試験および特にロータロッド試験は、脳機能障害にも特に感受性を有する可能性がある。そのため、歩行活動、筋力の強さまたは感覚運動機能の低下をともなわずにヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスのロータロッドおよびビーム歩行の成績が低下するという知見は、脳の認知機能障害から生じる行動の変化を反映している可能性がある。この仮説を検証するため、本発明者らは一連の行動試験を行って月齢８〜９ヶ月のヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスの認知能力を調べた。試験バッテリーは、空間作業記憶についてのＹ字迷路試験、短期空間記憶についてのＴ字迷路試験、短期および長期の非空間記憶についての物体認識試験、ならびに感情記憶についての恐怖条件付け試験からなるものとした。新しい環境を探索する際に各アームに交互に動くマウスの自然の傾向に基づいたＹ字迷路試験では、すべてのマウスが同様の探索速度を有する良好な歩行活動を示した（データは示さず）。しかしながら、トランスジェニックマウスは、ＷＴマウスと比較して有意に低い自然の交互移動比を示し（Ｆ１，２７＝８．９２、ｐ＜０．０１、図８Ａ）、空間作業記憶の低下を示した。ヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスの空間記憶障害を更に評価するため、本発明者らは、訪れたアームについて馴染みのない環境を探索しようとするマウスの生得的な好みにやはり基づいたＴ字迷路試験を行った。順応期間の後、Ｙ字迷路試験と一致して、トランスジェニックマウスは、同齢のＷＴマウスと比較して有意に低い成績であった（Ｆ１，２７＝４．４７、ｐ＜０．０５；図８Ｂ）。
【０１８４】
動物が馴染みのある物体と比較して目新しい物体の探索にはより多くの時間を費やすという事実を利用した物体認識試験では、各物体の匂いを嗅いで触れるのに費やした合計時間に、マウスのいずれの群でも第１のプローブトライアル（Ｔ１、５０％確度）で有意差は認められなかった（Ｆ１，２７＝０．９７、非有意、図８Ｃ）。しかしながら、第２の異なる刺激セッション（Ｔ２、短期記憶）およびＴ２の２４時間後の第３のセッション（Ｔ３、長期記憶）では、ヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスは、ＷＴマウスと比較して馴染みのない物体を調べる傾向は有意に低く（Ｔ２についてＦ１，２７＝２２．７３、ｐ＜０．０１；Ｔ３についてＦ１，２７＝１０．９８、ｐ＜０．０１；  図８Ｃ）、短期および長期の非空間記憶の両方の低下が明らかとなった。
【０１８５】
マウスがニュートラルな音の条件刺激（ＣＳ）を、軽い電気的な足への非条件刺激（ＵＳ）と関連付けて学習し、すくみ反応を示すことに基づいた恐怖条件付け試験では、本発明者らは、順応期間中と訓練セッション中の最初の３回のＵＳへの曝露時にすくみを示した時間の比率に、ＷＴとトランスジェニックマウスとの間で有意差を検出しなかった（順応セッションについてＦ１，２７＝０．０９；第１のＵＳについてＦ１，２７＝０．００３；第２のＵＳについてＦ１，２７＝２．８５；および第３のＵＳについてＦ１，２７＝１．８３；  いずれも非有意；図８Ｄ）。興味深い点として、第４のＵＳへの曝露において、ヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスは、ＷＴマウスと比較して有意に低いすくみ時間を示した（Ｆ１，２７＝６．９９、ｐ＜０．０５）。恐怖反応の低下を、実際、試験セッションで２４時間後に維持することでショックに関連付けられた環境に対する学習された嫌悪を評価した（文脈依存性恐怖；Ｆ１，２７＝４．９４、ｐ＜０．０５）。（６）更に、マウスのコホートを、文脈的に変化させたボックス（形状、照明、および匂い（バニラエッセンス））に再び導入して手がかり依存性恐怖条件付け試験を行った。ＷＴもトランスジェニックマウスもＣＳを加える前の文脈を認識することができた（Ｆ１，２７＝２．４４、非有意）。予想されたように、ＣＳにより誘発されるすくみ反応は、ＷＴマウスと比較してヘテロ接合型ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスで有意に低かった（Ｆ１，２７＝７．５９、ｐ＜０．０５）。１０回のＣＳへの曝露による消去訓練では、ＷＴおよびトランスジェニックマウスはいずれも同様の弱い消去を示した（データは示さず）。この実験では、雄マウスと雌マウスとの間に認知能力の有意差は認められなかった。以上まとめると、本発明者らの結果は、運動および協調性機能の低下に加えて、成体ヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスが記憶の障害も発現したことを示すものである。
【０１８６】
ＰＭ１によるＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の阻害は、ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖ  Ｔｇマウスの脳における細胞質へのＴＤＰ−４３の蓄積、ミトコンドリア機能不全、およびニューロン喪失を軽減する
本発明者らはこれまでに、ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化をもたらす特定のアミノ酸モチーフを特徴付けている。ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化に不可欠なモチーフＭ１（ＡＱＦＰＧＡＣＧＬ）（配列番号４）の欠失、またはＭ１モチーフに基づいた阻害ペプチドＰＭ１による処理のいずれかによるＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の抑制は、インビトロおよびマウスにおいてＷＴまたは突然変異体ＴＤＰ−４３によって誘導されるミトコンドリア機能不全およびニューロン死を阻止した。この際、月齢１１〜１２ヶ月のＷＴおよびトランスジェニックマウスにＰＭ１またはコントロールペプチド（ｃＰＭ）を６週間にわたって連続的に注入した（１．５ｍｇ／ｋｇ／日、皮下に埋め込んだＡＬＺＥＴポンプによる）。本発明者らによる過去の研究と一致して、マウスＴＤＰ−４３  （ｍＴＤＰ−４３、ＷＴマウスにおいてｐａｎ−ＴＤＰ−４３抗体により認識される）およびヒト突然変異体ＴＤＰ−４３（ｈＴＤＰ−４３、ＴＤＰ−４３Ｍ３３７ＶマウスにおいてヒトＴＤＰ−４３に特異的な抗体により認識される）は、マウスの脳組織から単離された高度に精製されたミトコンドリア中に存在していた（図９Ａ）。本発明者らは、ＰＭ１が中枢神経系に到達し、ＷＴマウスの脳のミトコンドリア内の内因性のｍＴＤＰ−４３のレベルを大幅に低下させたことを確認した（データは示さず）。全ライセート中におけるレベルは同様であるが、全ＴＤＰ−４３（ｍＴＤＰ−４３＋ｈＴＤＰ−４３）およびｈＴＤＰ−４３はいずれも、ＰＭ１処理後にヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスのミトコンドリア画分中で有意に低い発現を示した（図９Ａ）。ｐａｎ−ＴＤＰ−４３抗体を使用したＴＤＰ−４３の免疫組織化学分析により、ヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスにおいて層２および３の皮質ニューロンの細胞質中に選択的にＴＤＰ−４３の蓄積が見出された。更に、ミトコンドリアタンパク質ＴＯＭ２０に対する特異的抗体による二重標識により、誤って局在化したＴＤＰ−４３はミトコンドリアと高度に共局在化していることが示された（図９Ｂ）。興味深い点として、ＴＤＰ−４３Ｍ３３７ＶマウスにおけるＴＤＰ−４３の細胞質への蓄積は、ＰＭ１ペプチドの注入後に消失し、ＰＭ１によってＴＤＰ−４３の誤った局在化が防止されることを示唆した（図９Ｂ）。
【０１８７】
ミトコンドリア内のＴＤＰ−４３は、ミトコンドリアの成体エネルギー生成を妨げ、ＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の阻害は、ミトコンドリアの機能に対するその毒性を抑制する。予想されたとおり、ヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスの脳から単離されたシナプス性ミトコンドリアにみられるミトコンドリア膜電位（ｍΔψ）または酸素消費速度（ＯＣＲ）の有意な低下も、ＰＭ１によって大幅に軽減された（図９Ｃ）。ＰＭ１単独では、ｍΔψおよびＯＣＲの基底レベルのどちらも変化させず、本発明者らによる過去の研究結果と一致していた。興味深い点として、月齢１２ヶ月のヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスは、皮質層２および３においても皮質ニューロンの喪失を最も顕著に示し（月齢８ヶ月では示さず）（図９Ｄ、Ｅ、および補助図８、月齢８ヶ月のマウスは示さず）、これらの限定された皮質領域にみられるＴＤＰ−４３の誤った局在化と相関を示した。ＰＭ１による処理後、ヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスの皮質層２および３のニューロン密度は、ＷＴマウスまたはｃＰＭで処理したＷＴマウスと同等であり、突然変異体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖにより誘発されるニューロン喪失がＰＭ１によって完全に防止されることを示した。海馬、小脳、または脊髄では明らかなニューロン喪失はみられなかった（データは示さず）。
【０１８８】
ＰＭ１は、ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖ  Ｔｇマウスの運動協調性および認知機能障害を回復させる
ミトコンドリアおよびニューロンに対するＰＭ１ペプチド処理の保護作用を鑑み、本発明者らは最後に、ＰＭ１によるＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の抑制が、症状の発症後のヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスにおいて行動障害を回復させることができるかどうかについて検討した。月齢１１〜１２ヶ月のＷＴまたはトランスジェニックマウスを６週間にわたって継続的に皮下注入することによりＰＭ１またはｃＰＭで処理した。本発明者らは、処理前にはＰＭ１およびｃＰＭ注入についてトランスジェニックマウスの各コホート間でロータロッドおよびビーム歩行試験に有意差は認められないことを確認した（ロータロッドについてｐ＞０．１、データは示さず；１２ｍｍ角形／１２ｍｍ丸形／９ｍｍ角形ビーム上の歩行についてＦ１，１６＝１．５１／０．１８／０．０１、非有意、補助図１０）。ｃＰＭで処理したＷＴマウス（ＮＴＧ／ｃＰＭ群）と比較して、ｃＰＭ注入を行ったトランスジェニックマウス（Ｔｇ／ｃＰＭ群）は、有意に低いロータロッドおよびビーム歩行の成績を示し（ＰＭ１注入を行ったトランスジェニックマウス（Ｔｇ／ＰＭ１群）は有意に低くなかった）（ロータロッドについてＦ２，２１＝１１．９３、ｐ＜０．００１；１２ｍｍ角形ビームについてＦ２，２１＝３．３、ｐ＜０．１；１２ｍｍ丸形ビームについてＦ２，２１＝８．８、ｐ＜０．０１；  １２ｍｍ角形ビームについてＦ２，２１＝９．６１、ｐ＜０．０１；図１０Ａ、Ｂ））、ＰＭ１注入後の運動協調性および平衡感覚の改善を示した。把握力強さ、歩行活動、または触覚に３つすべての群の間で差は認められなかった（Ｆ２，２１＝１．８０３、オープンフィールド試験では非有意；Ｆ２，２１＝０．５３およびＦ２，２１＝０．３７、前／後肢把握力強さでは非有意；Ｆ２，２１＝１．３６８、粘着紙試験では非有意；図１０Ｃ〜Ｅ）。これに一致して、運動協調機能の障害以外に、Ｔｇ／ｃＰＭマウスでは有意な記憶の低下も認められた（Ｙ字迷路についてＦ２，２１＝３．９２、ｐ＜０．０５；Ｔ字迷路についてＦ２，２１＝４．９７、ｐ＜０．０５；新しい物体認識試験のＴ１〜Ｔ３のセッションのそれぞれについてＦ２，２１＝１．４３／７．２２／５．１６、ｐ＞０．１／＜０．０１／＜０．０５；恐怖条件付け試験において順応および訓練セッションの第１〜第４のＵＳへの８回の曝露のそれぞれについてＦ２，２１＝１．３１／４．３５／８．５５／３．０８／４．１９、ｐ＞０．１／＜０．０５／＜０．０１／＜０．１／＜０．０５；文脈依存性学習についてＦ２，２１＝７．９３、ｐ＜０．０１；手がかり依存性学習におけるキューなし時間について非有意、Ｆ２，２１＝０．６８；手がかり依存性学習におけるキュー時間についてＦ２，２１＝７．８４、ｐ＜０．０１、図１１Ａ〜Ｄ）。これに対して、Ｔｇ／ＰＭ１は、ＮＴＧ／ｃＰＭマウスのレベルにまで認知機能の大幅な回復を示し、ＰＭ１がヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスにおいて認知機能を改善することを示した。すべての群で恐怖条件付け試験において消去は認められなかったが、これは恐らくＣＳ刺激（ホワイトノイズ）がマウスにすくみを誘発し続けたためと考えられる（Ｆ８，８４＝１．０６５、ｐ＞０．１、���ータは示さず）。以上をまとめると、これらの結果は、ＰＭ１によるＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の阻害が、症状の発症後のヘミ接合体ＴＤＰ−４３Ｍ３３７Ｖマウスにおける運動協調性機能障害および認知機能障害を回復させる上で充分であることを示している。
【０１８９】
実施例３
本発明者らの上記の研究結果は、ＰＭ１ペプチドによるＴＤＰ−４３のミトコンドリア局在化の抑制が、ＡＬＳおよびＦＴＤ動物モデルにおいて運動および認知機能障害を完全に消失させるのに充分であることを示した。本実施例では、本発明者らは、運動および認知機能に対するＰＭ１ペプチドの保護作用を、多くのアルツハイマー病（ＡＤ）に関連した特徴を再現した広く使用されているマウスである５ｘＦＡＤトランスジェニックマウスにおいて試験した。月齢１０ヶ月の非トランスジェニック（ＮＴｇ）マウスまたは５ｘＦＡＤトランスジェニックマウス（Ｔｇ）にＰＭ１またはコントロールのｃＰＭペプチドを皮下注入した。本発明者らは、注入の４週間後、ミトコンドリア内のＴＤＰ−４３のレベルが、ＰＭ１で処理したＴｇマウスの脳で実際に低下したことを確認した（図１２Ａ、Ｂ）。月齢１１ヶ月において、ｃＰＭで処理したＴｇマウスは、それぞれ、ロータロッド上に留まる能力の低下（図１２Ｃ）および標的穴までの所要時間の増大（図１２Ｄ）によって示される、ロータロッド試験（運動機能試験）およびバーンズ迷路試験（空間学習および記憶試験）の成績の有意な低下を示した。興味深い点として、ｃＰＭ１で処理したＴｇマウスと比較して、ＰＭ１で処理したＴｇマウスは、ロータロッド試験の成績の有意な改善を示し（図１２Ｃ）、標的穴までの所要時間の大幅な短縮を示している（図１２Ｄ）。５ＸＦＡＤマウスにおける行動障害が月齢６ヶ月と早期に認められることから、これらの結果は、ＰＭ１が、症状の発症後の５ＸＦＡＤトランスジェニックマウスにおいて運動および認知機能を改善することも可能であることを示している。
【０１９０】
本発明の上記の説明より、当業者には改良、変更、および改変が認識されるであろう。当該技術分野の技能の範囲内であるかかる改良、変更、および改変は、付属の特許請求の範囲に含まれるものとする。本出願に引用されるすべての参照文献、公開公報、および特許を、それらの全容にわたって参照により本明細書に援用するものとする。
以上、本発明を説明したところで、以下に特許を請求する。
【図１−１】
2019513752.tif 000003
【図１−２】
2019513752.tif 000004
【図１−３】
2019513752.tif 000005
【図２−１】
2019513752.tif 000006
【図２−２】
2019513752.tif 000007
【図２−３】
2019513752.tif 000008
【図３−１】
2019513752.tif 000009
【図３−２】
2019513752.tif 000010
【図３−３】
2019513752.tif 000011
【図４−１】
2019513752.tif 000012
【図４−２】
2019513752.tif 000013
【図４−３】
2019513752.tif 000014
【図４−４】
2019513752.tif 000015
【図４−５】
2019513752.tif 000016
【図５−１】
2019513752.tif 000017
【図５−２】
2019513752.tif 000018
【図５−３】
2019513752.tif 000019
【図５−４】
2019513752.tif 000020
【図６−１】
2019513752.tif 000021
【図６−２】
2019513752.tif 000022
【図６−３】
2019513752.tif 000023
【図６−４】
2019513752.tif 000024
【図６−５】
2019513752.tif 000025
【図７】
2019513752.tif 000026
【図８】
2019513752.tif 000027
【図９】
2019513752.tif 000028
【図１０】
2019513752.tif 000029
【図１１】
2019513752.tif 000030
【図１２】
2019513752.tif 000031
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月7日(2018.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019513752000001.app
【国際調査報告】
2019513752.tif 000032
2019513752.tif 000033
2019513752.tif 000034
2019513752.tif 000035
2019513752.tif 000036