(57)【要約】  本発明は、粒子内に含まれる生物学的活性カーゴと前記粒子が存在する水性環境の成分との間の相互作用を阻止することができる薬物送達粒子に関する。粒子は、閾値pHレベルを超えると、生物学的活性カーゴが、周囲環境に到達可能になるように、pHに感受性を示す。したがって、そのような粒子は、生物学的活性カーゴを、普通ならカーゴと有害な相互作用をするはずである成分を含有し、組成物が投与される動物、例えばヒトの身体においてカーゴを放出して、生物学的効果を媒介する水性組成物中で、安定に保存するのに有用である。また、そのような粒子を含む組成物、並びにそのような粒子及び組成物を作製及び使用する方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数のpH感受性の薬物送達粒子であって、前記粒子がトリガーされる前に製剤化及び維持される水性環境のpHに比べて高いpHを有する水性環境中に存在することによって、前記粒子がトリガーされて、前記カーゴを放出する、複数の粒子。
【請求項２】
前記マトリックスが、準生理学的pHにおける水性環境中で不溶性であり、前記マトリックスが、トリガー生理学的pHにおける水性環境中で可溶性である、請求項1に記載の複数の粒子。
【請求項３】
前記粒子が、準生理学的pHで無傷であり、前記粒子をトリガー生理学的pHに晒すと、前記粒子が、24時間又はそれ未満以内で実質的に又は完全に溶解又は分解する、請求項1又は2に記載の複数の粒子。
【請求項４】
生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数のpH感受性の薬物送達粒子であって、準生理学的pHにおける水性環境中に少なくとも6か月間存在するとき前記複数の粒子から放出されるカーゴの量が、カーゴの全量の30重量%以下であり、前記粒子をトリガー生理学的pHに晒すと、24時間又はそれ未満以内で放出されるカーゴの量が、カーゴの全量の50重量%以上である、複数の粒子。
【請求項５】
前記粒子が、請求項1又は3にさらに記載される通りであり、且つ/又は前記マトリックスが、請求項2にさらに記載される通りである、請求項4に記載の複数の粒子。
【請求項６】
前記準生理学的pH及び生理学的pHが、ヒト、特に乳児の筋組織のpHに関連している、請求項2から5のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項７】
前記準生理学的pH及び生理学的pHが、互いに少なくとも0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4又は1.5pH単位で異なる、請求項2から6のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項８】
前記準生理学的pHが、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1又は6.0以下である、請求項2から7のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項９】
前記生理学的pHが、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6又は7.7以上である、請求項2から8のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項１０】
カーゴの全量の前記30重量%以下が、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1重量%以下である、請求項4から9のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項１１】
カーゴの全量の前記50重量%以上が、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99又は100重量%以上である、請求項4から10のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項１２】
前記少なくとも6か月が、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34又は36か月である、請求項4から11のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項１３】
前記24時間又はそれ未満以内が、20、16、12、10、8、6、4、2若しくは1時間又は45、30、15、10若しくは5分以内である、請求項4から12のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項１４】
カーゴの放出が、インビトロで、例えばHPAEC-PAD又はELISAによって決定される、請求項4から13のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項１５】
準生理学的pHで前記少なくとも6か月の間に、前記水性環境が、2〜8℃の間で、例えば約4℃で維持される、請求項4から14のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項１６】
準生理学的pHで前記少なくとも6か月の間に、前記水性環境が、2、3、4、5、6、7、8℃、又は好ましくは4℃を超えず、約37℃、好ましくは約25℃を超えない逸脱は、1日〜12週間の期間より長い、請求項4から14のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項１７】
前記準生理学的pH水性環境が、バッファー、例えば生理食塩水、リン酸、Tris、ホウ酸、コハク酸、ヒスチジン、クエン酸又はマレイン酸バッファーを含む、請求項4から16のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項１８】
粒子が無傷であるか、又は実質的に若しくは完全に溶解若しくは分解するかどうかは、インビトロで光学顕微鏡法により決定される、請求項3及び5から17のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項１９】
前記マトリックスが高分子である、請求項1から18のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項２０】
前記高分子マトリックスが、人体において生体適合性若しくは生分解性若しくは生体吸収性であるか、又は人体から排泄可能である、請求項19に記載の複数の粒子。
【請求項２１】
前記高分子マトリックスが、前記トリガー生理学的pH未満のpKaを有するポリマーを含む、請求項19又は20に記載の複数の粒子。
【請求項２２】
前記高分子マトリックスが、準生理学的pHにおける前記水性環境にあるとき、少なくとも部分的にプロトン化状態であり、且つ/又はほぼ若しくは厳密に中性の電荷を有し、不溶性であるポリマーを含む、請求項19から21のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項２３】
前記高分子マトリックスが、(ポリ(メチルメタクリレート)-co-ポリ(メタクリル酸)コポリマー(PMMA-co-PMAAコポリマー)、ポリ(グルタミン酸)-co-ポリ(リシン)、双性イオン型ヘテロ若しくはホモ(ポリアミノ酸)、カルボキシメチルキトサン、ヒプロメロースフタル酸エステル、ヒプロメロース酢酸エステルコハク酸エステル、又は一般式(1):
【化１】
2019513128.tif 000022
(式中、R1は、水素又はメチルを表し、R2は、水素又はメチルを表し、R3は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、sec-ブチル、フェニル、又はベンジルを表す)で表されるアクリラートコポリマーを含む、請求項19から22のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項２４】
前記高分子マトリックスが、PMMA-co-PMAAコポリマーを含み、コポリマー中のメチルメタクリレート(MMA)モノマーとメタクリル酸(MAA)モノマーのモル比が、1:1〜4:1、特に1.5〜2:1の範囲である、請求項19から23のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項２５】
前記PMMA-co-PMAAコポリマーが、1〜200kDaの範囲の重量平均分子量(Mw)、例えば50〜60kDa又は35〜45kDa又は22〜28kDa又は8〜12kDaの範囲、例えば10、25、40、55又は125kDaの重量平均分子量(Mw)を有する、請求項19から24のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項２６】
前記高分子マトリックスが、ポリ(グルタミン酸)-co-ポリ(リシン)を含み、グルタミン酸モノマーとリシンモノマーのモル比が、ほぼ又は厳密に1:1である、請求項19から23のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項２７】
前記カーゴが、薬物又は抗原である、請求項1から26のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項２８】
前記カーゴが、キャリアタンパク質、例えば破傷風トキソイド、破傷風トキソイドの断片C、ジフテリアトキソイド、ジフテリア毒素のCRM197若しくは別の無毒変異体、分類不可能なインフルエンザ菌のプロテインD、髄膜炎菌の外膜タンパク質複合体(OMPC)、肺炎球菌PhtD、肺炎球菌ニューモリシン、緑膿菌のエキソトキシンA(EPA)、黄色ブドウ球菌の無毒化溶血素、ボルデテラ属菌種の無毒化アデニル酸シクラーゼ、無毒化大腸菌易熱性エンテロトキシン、又はコレラ毒素サブユニットB(CTB)若しくは無毒化コレラ毒素に場合によってコンジュゲートしたオリゴ糖/多糖抗原を含む、請求項1から27のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項２９】
前記カーゴが加水分解に感受性がある、請求項1から28のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項３０】
前記カーゴが、低い等電点(pI)、例えば4以下、特に3又は2又はそれ未満のpIを有する、請求項1から29のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項３１】
前記カーゴが、オリゴ糖/多糖-タンパク質コンジュゲート抗原であり、コンジュゲーション前の前記オリゴ糖/多糖部分が、低い等電点(pI)、例えば4以下、特に3又は2又はそれ未満のpIを有する、請求項1から29のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項３２】
前記抗原が、インフルエンザ菌b型(Hib)、髄膜炎菌(特に、血清型A、C、W及び/又はY)、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、百日咳菌、及びチフス菌からなる群から選択される病原体に由来するオリゴ糖/多糖を含む、請求項27から31のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項３３】
前記抗原が、細菌莢膜糖又はリポオリゴ糖(LOS)若しくはリポ多糖(LPS)に由来するオリゴ糖/多糖を含む、請求項27から32のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項３４】
前記抗原が、破傷風トキソイド(TT)又はCRM197にコンジュゲートしたHib莢膜オリゴ糖/多糖抗原(PRP)である、請求項27から33のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項３５】
前記抗原が、CRM197にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型A(MenA)莢膜オリゴ糖/多糖である、請求項27から33のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項３６】
前記カーゴが、リン酸基又はホスホジエステル結合を含む、請求項1から35のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項３７】
前記カーゴが、マトリックス全体にわたって実質的に均質に分散されている、請求項1から36のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項３８】
前記カーゴが、マトリックス内に被包されている、請求項1から36のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項３９】
前記抗原が、キャリアタンパク質にコンジュゲートしたオリゴ糖/多糖であり、準生理学的pHにおける水性環境中に前記少なくとも6か月の間、粒子及び水性環境中に集合的に存在する、前記オリゴ糖/多糖コンジュゲートに由来する遊離型(非コンジュゲート型)糖の量が、粒子及び水性環境中に集合的に存在するコンジュゲート型及び遊離型の糖の全量の30又は25又は20又は15又は10重量%以下である、請求項27から38のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項４０】
前記粒子が、正確に所定のサイズ及び形状に、特にドーナツ形に成形されている、請求項1から39のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項４１】
前記粒子の最長軸が、約1〜10μmの間、特に5〜7μmの間、例えば6μmである、請求項1から40のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項４２】
少なくとも1つの軸が、200nm未満、例えば100nm未満であり、前記粒子が無菌ろ過できる、請求項1から41のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項４３】
前記粒子が、非経口投与、例えば皮内又は皮下投与、特に筋肉内投与用である、請求項1から42のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項４４】
請求項1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子を水性環境中に含む組成物であって、場合によって前記環境が無菌環境である、組成物。
【請求項４５】
粒子の閾値生理学的pH未満のpHを有し、且つ/又は準生理学的pHのものである、請求項44に記載の組成物。
【請求項４６】
6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1又は6.0以下のpHを有する、請求項44又は45に記載の組成物。
【請求項４７】
前記粒子が、前記組成物中に0.1〜15、0.5〜12.5、1〜10又は2〜5mg/ml、例えば、0.5〜3mg/mlの濃度で存在し、場合によって、前記粒子が、請求項25に記載の通りである、請求項44から46のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
請求項1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子を含む組成物であって、前記複数の粒子が、第1の複数の粒子とそれに対する別の第2の複数の粒子であり、前記第2の複数の粒子が、第1の複数の粒子のカーゴ以外のカーゴを含む、組成物。
【請求項４９】
前記水性環境が、1種以上の生理学的に許容される賦形剤を含む、請求項44から48のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記水性環境が、バッファー、例えば生理食塩水、リン酸、Tris、ホウ酸、コハク酸、ヒスチジン、クエン酸又はマレイン酸バッファーを含む、請求項44から49のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記カーゴと水性環境の成分との相互作用が、粒子のマトリックスにより阻止又は低減される、請求項44から50のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記相互作用が、少なくとも6か月間、例えば、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34又は36か月阻止又は低減され、場合によって、前記組成物が、約4℃で維持される、請求項51に記載の組成物。
【請求項５３】
免疫原性組成物である、請求項44から52のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
前記水性環境がアジュバントを含む、請求項44から53のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５５】
前記アジュバントが、高いpI、例えば8以上、例えば9又は10又はそれより高い、特に11以上のpIを有する、請求項54に記載の免疫原性組成物。
【請求項５６】
前記アジュバントが水酸化アルミニウムである、請求項54又は55に記載の免疫原性組成物。
【請求項５７】
前記水性環境が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原(例えば、百日咳トキソイド、線維状赤血球凝集素、パータクチン)、B型肝炎表面抗原(HBsAg)、不活性化ポリオワクチン(IPV)、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型A(MenA)莢膜オリゴ糖/多糖、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型C(MenC)莢膜オリゴ糖/多糖、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型W(MenW)莢膜オリゴ糖/多糖、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型Y(MenY)莢膜オリゴ糖/多糖、及び髄膜炎菌血清型B(MenB)に由来する抗原からなる群から選択される1種以上の抗原、特に以下の組合せ:
i.  ジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイド、
ii.  ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原、
iii.  ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原及びHBsAg、
iv.  ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原及びIPV、
v.  ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原、HBsAg及びIPV、
vi.  キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型C(MenC)莢膜オリゴ糖/多糖、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型W(MenW)莢膜オリゴ糖/多糖、及びキャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型Y(MenY)莢膜オリゴ糖/多糖、
vii.  キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型C(MenC)莢膜オリゴ糖/多糖、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型W(MenW)莢膜オリゴ糖/多糖、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型Y(MenY)莢膜オリゴ糖/多糖及び髄膜炎菌血清型B(MenB)に由来する抗原
の1つを含む、請求項44から56のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５８】
前記ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド及び無細胞百日咳抗原が、水酸化アルミニウム上に吸着され、場合によって、前記HBsAgが存在する場合それが、リン酸アルミニウム上に吸着される、請求項57に記載の免疫原性組成物。
【請求項５９】
請求項1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子を水性環境中に含む免疫原性組成物であって、
i.  前記粒子が、PMMA-co-PMAAを含むマトリックス内に均質に分散されているHib-TT又はHib-CRM197カーゴを含み、
ii.  前記水性環境が、水酸化アルミニウム上に吸着されたジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド及び無細胞百日咳抗原、並びに場合によってHBsAg及びIPVを含む、免疫原性組成物。
【請求項６０】
請求項1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子を水性環境中に含む免疫原性組成物であって、
i.  前記粒子が、PMMA-co-PMAAを含むマトリックス内に均質に分散されているMenA-CRMカーゴを含み、
ii.  前記水性環境が、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型C(MenC)莢膜オリゴ糖/多糖、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型W(MenW)莢膜オリゴ糖/多糖、及びキャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型Y(MenY)莢膜オリゴ糖/多糖、並びに場合によって髄膜炎菌血清型B(MenB)に由来する抗原を含む、免疫原性組成物。
【請求項６１】
粒子のマトリックスが、Hib-TT若しくはHib-CRM197若しくはMenA-CRM197の凝集若しくはフロキュレーションを阻止若しくは低減し、且つ/又はHib-TT若しくはHib-CRM197若しくはMenA-CRM197に対する免疫干渉を阻止若しくは低減する、請求項59又は60に記載の免疫原性組成物。
【請求項６２】
前記凝集若しくはフロキュレーション及び/又は前記免疫干渉が、少なくとも6か月間、例えば、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34又は36か月阻止又は低減され、場合によって、前記組成物が約4℃で保持される、請求項61に記載の免疫原性組成物。
【請求項６３】
粒子のマトリックスが、水性環境内に含まれる前記1種以上の抗原の免疫原性に干渉しない、請求項53から61のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６４】
請求項1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子又は請求項44から63のいずれか一項に記載の組成物を含有するバイアル。
【請求項６５】
請求項1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子又は請求項44から63のいずれか一項に記載の組成物を含有する、注射器などの非経口投与用のデバイス。
【請求項６６】
一方のチャンバーに、請求項1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子を、他方のチャンバーに、請求項45、46、49、50及び54から58のいずれか一項に記載の水性環境を含有するデュアルチャンバー注射器である、請求項65に記載のデバイス。
【請求項６７】
医薬、特にヒト用医薬における使用のための、請求項1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子又は請求項44から63のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６８】
特にヒトにおける(i)病原体によって直接的若しくは間接的に引き起こされる感染症若しくは病状、又は(ii)免疫学的に異なる宿主細胞、例えばがんに関連する病状の処置又は予防における使用のための、請求項1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子又は請求項44から63のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６９】
請求項1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子又は請求項44から63のいずれか一項に記載の組成物の、特にヒトにおける(i)病原体によって直接的若しくは間接的に引き起こされる感染症若しくは病状、又は(ii)免疫学的に異なる宿主細胞、例えばがんに関連する病状の処置又は予防における使用のための医薬品の製造における使用。
【請求項７０】
前記複数の粒子又は前記組成物が非経口投与用である、請求項68に記載の複数の粒子若しくは組成物又は請求項69に記載の使用。
【請求項７１】
(i)感染症若しくは病状を引き起こす病原体若しくはアレルゲン、又は(ii)病状、例えばがんの原因となる免疫学的に異なる宿主細胞に対する免疫応答を誘発する方法であって、対象、特にヒトに、有効量の請求項1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子又は請求項44から63のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項７２】
(i)病原体によって直接的若しくは間接的に引き起こされる感染症若しくは病状、又は(ii)免疫学的に異なる宿主細胞によって起こる病状、例えばがんに対する処置又は予防の方法であって、対象、特にヒトに、有効量の請求項1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子又は請求項44から63のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項７３】
前記投与するステップが非経口経路で行われる、請求項71又は72に記載の方法。
【請求項７４】
前記病原体が、インフルエンザ菌b型(Hib)、髄膜炎菌(特に、血清型A、C、W及び/又はY)、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、ボルデテラ属菌種、及びチフス菌からなるリストから選択される、請求項68若しくは70に記載の複数の粒子若しくは組成物、又は請求項69若しくは70に記載の使用、又は請求項71から73のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
ワクチンである、請求項44から63のいずれか一項に記載の組成物又は免疫原性組成物。
【請求項７６】
請求項44から63のいずれか一項に記載の組成物又は免疫原性組成物を含むワクチン。
【請求項７７】
生物学的活性カーゴと前記カーゴが存在する水性環境の成分との間の相互作用を阻止又は低減する方法であって、
i.  前記カーゴを含む、請求項1から43のいずれか一項に記載のpH感受性の複数の粒子を形成するステップ、及び
ii.  前記複数の粒子を前記水性環境中で製剤化するステップであって、準生理学的pHの前記環境がもたらされるように任意の必要な調整を含む、ステップ
を含む方法。
【請求項７８】
生物学的活性カーゴと前記カーゴが存在する準生理学的pHの水性環境の成分との相互作用を阻止又は低減する方法であって、
i.  前記カーゴを含む、請求項1から43のいずれか一項に記載の複数のpH感受性の粒子を形成するステップ、及び
ii.  前記複数の粒子を前記水性環境中で製剤化するステップ
を含む方法。
【請求項７９】
前記水性環境中で製剤化された前記複数の粒子が、請求項44から63のいずれか一項に記載の組成物である、請求項77又は78に記載の方法。
【請求項８０】
前記相互作用の阻止又は低減が、
i.  前記カーゴを前記水性環境中で保存するため、又は
ii.  前記水性環境中における前記カーゴの分解、例えば加水分解を阻止若しくは低減するため
のものである、請求項77又は78に記載の方法。
【請求項８１】
前記生物学的活性カーゴと前記水性環境中の水分子との間の、又は前記生物学的活性カーゴと水以外の水性環境の成分、例えばアジュバントとの間の相互作用を阻止又は低減するためのものである、請求項77又は78に記載の方法。
【請求項８２】
前記アジュバントが水酸化アルミニウムであり、場合によって、前記カーゴが、Hib-TT又はHib-CRM197又はMenA-CRM197である、請求項81に記載の方法。
【請求項８３】
前記生物学的活性カーゴと前記水性環境中に存在する第2のカーゴとの間の相互作用を阻止又は低減するためのものであり、
iii.  前記第2のカーゴをマトリックス内に含む第2の複数の粒子を形成するステップであって、前記第2の複数の粒子が、請求項1から43のいずれか一項に記載される通りであり、ただし、前記第2のカーゴが前記生物学的活性カーゴと同じでない、ステップ
をさらに含む、請求項77又は78に記載の方法。
【請求項８４】
生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数の薬物送達粒子を作製する方法であって、前記カーゴ及びマトリックスポリマーの溶液を作製するステップであって、場合によって、前記ポリマーが、請求項20から26のいずれか一項に記載の高分子マトリックス又はポリマーを参照して定義される通りである、ステップを含む方法。
【請求項８５】
生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数の薬物送達粒子を作製する方法であって、請求項20から26のいずれか一項に記載の高分子マトリックス又はポリマーを参照して定義されるポリマー、及びカーゴを含む溶液の使用を含み、前記カーゴは、場合によって請求項27から36のいずれか一項に記載の通りである、方法。
【請求項８６】
前記溶液が、30重量%を超えない量の前記カーゴを含み、その残部が、PMMA-co-PMAAコポリマーである、請求項84又は85に記載の方法。
【請求項８７】
前記溶液が、0.1〜5重量%、例えば0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5又は5重量%の量の前記カーゴを含む、請求項86に記載の方法。
【請求項８８】
前記カーゴが、Hib-TT又はHib-CRM197又はMenA-CRM197である、請求項84から87のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記溶液がPVPをさらに含み、PVP:PMMA-co-PMAAの重量%比が1:1を超えない、請求項84から88のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
PVP:PMMA-co-PMAAの重量%比が、0.1〜1:1の範囲、例えば0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1又は0.9:1である、請求項89に記載の方法。
【請求項９１】
前記PVPが、約2.5kDaの分子量及び約1.9の多分散性を有する、請求項89又は90に記載の方法。
【請求項９２】
前記溶液が、30重量%を超えない量の前記カーゴを含み、その残部が、ポリ(グルタミン酸)-co-ポリ(リシン)コポリマーである、請求項84又は85に記載の方法。
【請求項９３】
前記カーゴが、Hib-TT又はHib-CRM197又はMenA-CRM197である、請求項92に記載の方法。
【請求項９４】
前記溶液がグリセロールをさらに含み、グリセロール:ポリ(グルタミン酸)-co-ポリ(リシン)の重量%比が1:1を超えない、請求項92又は93に記載の方法。
【請求項９５】
前記溶液が、0.2〜1.2、より特定には0.4〜1重量%のHib-TT又はHib-CRM197又はMenA-CRM197を含み、その残部が、場合によって1:1重量%比のPMMA-co-PMAA及びPVPである、請求項84から91のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記溶液が、0.2〜1.2、より特定には0.4〜1重量%のHib-TT又はHib-CRM197又はMenA-CRM197を含み、その残部が、ポリ(グルタミン酸)-co-ポリ(リシン)及びグリセロールであり、グリセロールが30重量%で存在する、請求項84、85、及び92から94のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記溶液を成形することによって、前記複数の粒子を形成するステップをさらに含む、請求項84から96のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記溶液が、PVP以外の可塑剤をさらに含み、場合によって、前記可塑剤がポロゲンである、請求項84から97のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記溶液が、PVP、別の可塑剤及び/又はポロゲンを含む場合、前記方法が、前記PVP、他の可塑剤及び/又はポロゲンの実質的に全部を前記粒子から除去するステップをさらに含む、請求項84から98のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数の薬物送達粒子を作製する方法であって、
i.  プロトン化状態で不溶性であるポリマーを、水性環境中で少なくとも部分的に脱プロトン化するステップであって、それにより前記水性環境中でポリマーが正味の負電荷を有し、可溶性になる、ステップ、
ii.  前記ポリマーを前記カーゴと組み合わせて、溶液を生成するステップ、
iii.  前記溶液を成形し、水性環境を除去することによって、粒子を形成するステップ
を含む方法。
【請求項１０１】
粒子を乾燥状態で、又は有機若しくは水性液体回収環境で回収するステップをさらに含む、請求項100に記載の方法。
【請求項１０２】
水性液体が酸性である、請求項101に記載の方法。
【請求項１０３】
水性液体が、5未満のpHを有する、請求項101又は102に記載の方法。
【請求項１０４】
粒子のポリマーが不溶性状態に戻るように、粒子のポリマーをプロトン化するステップをさらに含む、請求項100に記載の方法。
【請求項１０５】
非経口送達に許容される準生理学的pHで粒子を保存するステップをさらに含む、請求項104に記載の方法。
【請求項１０６】
前記保存が、水性環境中で行われる、請求項105に記載の方法。
【請求項１０７】
請求項84から106のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる又は得られた複数の薬物送達粒子。
【請求項１０８】
組成物、例えば免疫原性組成物を作製する方法であって、請求項84から106のいずれか一項に記載の方法に従って、複数の粒子を作製するステップ、及び前記粒子を水性環境中で製剤化するステップを含み、前記環境が、場合によって抗原及び/又はアジュバントを含み、前記抗原及び/又はアジュバントが、場合によって請求項55から58のいずれか一項に記載の通りである、方法。
【請求項１０９】
生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数の薬物送達粒子を含む組成物、例えば免疫原性組成物を作製する方法であって、マトリックスがポリマーを含み、方法が、
i.  請求項84から101のいずれか一項に記載の方法に従って作製された複数の粒子を、酸性の水性環境に導入し、酸性環境により、マトリックスポリマーがプロトン化され、ポリマーが前記環境中で不溶性になるステップ、
ii.  マトリックスポリマーが前記環境中で不溶性である状態を保持しながら、酸性の水性環境のpHを、非経口投与に許容される準生理学的pHに上げるステップ、及び場合によって
iii.  前記粒子を準生理学的pHの水性環境中で製剤化するステップであって、場合によって、前記水性環境が、請求項45、46、49、50及び54から58のいずれか一項に記載の通りである、ステップ
を含む方法。
【請求項１１０】
ステップ(i)において、前記複数の粒子を酸性環境に導入するステップが、前記粒子を、1〜5の範囲のpH、例えばpH3.5又は4.5における安定化溶液に導入するステップを含み、粒子が安定化溶液に最大で60、50、40、30、20、10又は5分間導入される、請求項109に記載の方法。
【請求項１１１】
ステップ(ii)において、前記酸性の水性環境のpHを上げるステップが、前記環境のpHを前記準生理学的pHに向けて段階的に上げるステップを含む、請求項109又は110に記載の方法。
【請求項１１２】
ステップ(ii)において、溶液のpHが、1分当たり0.1〜10pH単位、例えば1分当たり0.5、1、2又は5pH単位、特に1分当たり0.5pH単位上げられる、請求項109から111のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
請求項108から112のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる又は得られた組成物、例えば免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的活性カーゴを含む(マイクロ又はナノ)粒子であって、カーゴが、そのような粒子内に存在している結果として、例えば非経口製剤中において粒子と共に配合された物質との望ましくない相互作用から保護される、粒子に関する。それによって、カーゴ、例えば薬物又は他の治療上関連する薬剤を非経口製剤に安定に保存することができ、粒子からのカーゴ放出が投与後になって初めて起こる。これらの粒子は、ワクチン組成物において特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
多くの医薬組成物、例えば(治療)薬又は(予防)ワクチンは、2種以上の生物学的活性構成要素、例えば医薬品有効成分又は抗原を含有する組合せ製品である。そのような組成物は、相乗効果を示すことができ、又は特に小児免疫化スケジュールの場合に、例えば総投与回数の低減により、利点、例えば処置レジメンの遵守の向上を与えることができる。
【０００３】
それぞれの生物学的活性構成要素は、他の構成要素、例えばワクチンの場合はアジュバントをそれらと結合させることができ、組成物全体は、薬学的に許容される製剤賦形剤を多くの場合水性製剤中に含有する。共に配合される(すなわち、一緒に単一組成物、例えば非経口製剤に製剤化される)とき、1種の生物学的活性構成要素が、別の生物学的活性構成要素、或いは関連構成要素、例えばアジュバント若しくは賦形剤又は製剤中に存在している水とも相互作用することができることは公知である。そのような相互作用は、相互作用している生物学的活性構成要素の少なくとも1種によって媒介される生物学的効果への有害な影響(そのような生物学的活性構成要素が、単独で、すなわち単独の生物学的活性構成要素として製剤化される場合に媒介する、生物学的効果に対して「有害」な影響)を及ぼす可能性がある。
【０００４】
ワクチンの場合、そのような有害な相互作用は、物理的若しくは生化学的不相溶性、例えば生物学的活性構成要素の安定性に対する効果として、及び/又は構成要素によって誘発される免疫応答に悪影響を与えるインビボ現象(「免疫干渉」)として現れることがある。例えば、水酸化アルミニウムアジュバント上に吸着された他の抗原と共に、キャリアタンパク質(例えば、破傷風トキソイド、「TT」)にコンジュゲートしたインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)b型(「Hib」)多糖を含有する小児用混合ワクチン(例えば、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド及び無細胞百日咳抗原、「DTPa」)の場合、Hib抗原は凍結乾燥され、水性DTPa/水酸化アルミニウム含有液体製剤と別に包装される。これは、例えばInfanrix(商標)Hexa(GSK Vaccines)において当てはまる。これには2つの理由がある。第一に、Hibコンジュゲート抗原のHib由来多糖部分(ポリリボシルリビトール、「PRP」)は、水性製剤中のとき加水分解を受けやすい(すなわち、Hibは、水分子との物理的/生化学的相互作用を受け、その安定性が低減する)からであり、第二に、PRPは、水酸化アルミニウムと相互作用して、PRPエピトープをレシピエントの免疫システムからマスキングすると考えられる粒子のネットワークを形成すること(「フロキュレーション」)ができる(すなわち、Hibは、水酸化アルミニウムの存在下で製剤化されるとき免疫干渉を示す)からである。ワクチン、例えばInfanrix(商標)Hexaの場合、ワクチン成分を液体水性成分と凍結乾燥成分に分割し、投与時に即時に再構成することにより、上記の問題が解決される。しかし、それは、再構成ステップがワクチンを投与する医療関係者によって実施されるよう求められる二成分ワクチンということになる。単一の容器中にすべての成分を含む一体型（one-part）液体ワクチンであれば、利点、例えば充填/包装、輸送/保存、及び投与の簡易化を与える。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、いかに組合せの(「多価」)医薬組成物の物理的、生化学的及び/又は免疫学的に不相溶性の構成要素を組み合わせて、そのような不相溶性の有害な結果を回避しながら単一の容器に包装及び保存することができる一体型液体水性組成物にするかという問題の解決方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、「カーゴ」(例えば、医薬組成物の生物学的活性構成要素)を含有することができる薬物送達粒子が作製され得るという本発明者らの発見に基づいている。そのような粒子を含む組成物という文脈において、粒子は、それらの中に含有されるカーゴを、保存中に粒子の外にある組成物の構成要素物質との潜在的に有害な相互作用から保護することができる。さらに、粒子は、投与に応答して、次いで、カーゴがその効果をレシピエント対象の体内において自由に及ぼすように前記カーゴを「放出する」ことができる。特に、粒子は、粒子マトリックスが、粒子をその中に保存している最終医薬組成物のpHで不溶性であるが、対象の注射部位組織の比較的より高いpHで可溶性になるように、pHに応答するように設計されている。
【０００７】
したがって、一態様において、本発明は、生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数のpH感受性の薬物送達粒子であって、前記粒子がトリガー（trigger）される前に存在する(すなわち、保存されている)水性環境のpHに比べて高いpHを有する水性環境中に存在することによって、前記粒子がトリガーされて、前記カーゴを放出する、複数の粒子を提供する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数のpH感受性の薬物送達粒子であって、準生理学的pHにおける水性環境中に少なくとも6か月間存在するとき前記複数の粒子から放出されるカーゴの量が、カーゴの全量の30重量%以下であり、前記粒子を(閾値pHを超える)トリガー生理学的pHに晒すと、24時間又はそれ未満以内で放出されるカーゴの量が、カーゴの全量の50重量%以上である、複数の粒子を提供する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、そのような複数のpH感受性の薬物送達粒子を含む組成物、免疫原性組成物又はワクチンを提供する。別の態様において、本発明は、そのような(免疫原性)組成物若しくはワクチン又は複数のpH感受性の薬物送達粒子を含有する、バイアル又は非経口投与デバイスを提供する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、そのような組成物、免疫原性組成物若しくはワクチン又は複数のpH感受性の薬物送達粒子の、特に病原体によって直接的若しくは間接的に引き起こされる感染症又は免疫学的に異なる宿主細胞、例えばがんに関連している病状の処置又は予防のための医薬における使用を提供する。別の態様において、本発明は、感染症若しくは病状を引き起こす病原体若しくはアレルゲン、又は病状、例えばがんの原因となる免疫学的に異なる宿主細胞に対する免疫応答を誘発する方法であって、対象に、有効量のそのような複数の粒子又は組成物、免疫原性組成物若しくはワクチンを投与するステップを含む方法を提供する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、生物学的活性カーゴと前記カーゴが存在する水性環境の成分との間の相互作用を阻止又は低減する方法であって、前記カーゴを含むそのような複数のpH感受性の薬物送達粒子を形成するステップ、及び前記複数の粒子を前記水性環境中で製剤化するステップであって、準生理学的pHの前記環境がもたらされるように任意の必要な調整を含む、ステップを含む方法を提供する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、生物学的活性カーゴと前記カーゴが存在する準生理学的pHの水性環境の成分との間の相互作用を阻止又は低減する方法であって、前記カーゴを含むそのような複数のpH感受性の薬物送達粒子を形成するステップ、及び前記複数の粒子を前記水性環境中で製剤化するステップを含む方法を提供する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数の薬物送達粒子を作製する方法であって、前記カーゴ及びマトリックスポリマーの溶液を作製するステップを含む方法並びに/又はポリマー及びカーゴを含む溶液の使用を提供する。別の態様において、本発明は、生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数の薬物送達粒子を作製する方法であって、プロトン化状態で不溶性であるポリマーを、水性環境中で少なくとも部分的に脱プロトン化するステップであって、それにより前記水性環境中でポリマーが正味の負電荷を有し、可溶性になる、ステップ、前記ポリマーを前記カーゴと組み合わせて、保存液を生成するステップ、及び前記保存液を成形し、水性環境を除去することによって、粒子を形成するステップを含む方法を提供する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、複数の薬物送達粒子を作製するそのような方法によって得ることができる又は得られた複数の薬物送達粒子を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、組成物を作製する方法であって、複数の薬物送達粒子を作製し、前記粒子を水性環境中で製剤化するそのような方法を含む方法を提供する。別の態様において、本発明は、生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数の薬物送達粒子を含む組成物を作製する方法であって、マトリックスがポリマーを含み、方法が、複数の薬物送達粒子を作製するそのような方法に従って作製された複数の粒子を酸性の水性環境に導入し、酸性環境により、マトリックスポリマーがプロトン化され、ポリマーが前記環境中において不溶性になるステップ、マトリックスポリマーが前記環境中で不溶性である状態を保持しながら、酸性の水性環境のpHを、非経口投与に許容される準生理学的pHに上げるステップ、及び場合によって、前記粒子を準生理学的pHの水性環境中で製剤化するステップを含む方法を提供する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、組成物を作製するそのような方法によって得ることができる又は得られた組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】HPAEC-PADで検出した、4℃での保存中に粒子含有試料700-65中に存在するすべてのHib(上澄み+ペレット)に対する百分率(重量%)として、上澄み画分中の全Hib(非コンジュゲート型及びTTコンジュゲート型)の割合を示す図である。
【図２】HPAEC-PADで検出した、4℃での保存中に粒子含有試料700-65(ペレット+上澄み)中に存在する全(すなわち、TTコンジュゲート型+遊離型)Hibに対する百分率(重量%)として、「遊離型」(非コンジュゲート型)Hibの割合を示す図である。
【図３】HPAEC-PADで検出した、4℃での保存中に粒子含有試料841-57-1中に存在するすべてのHib(上澄み+ペレット)に対する百分率(重量%)として、上澄み画分中の全Hib(非コンジュゲート型及びTTコンジュゲート型)の割合を示す図である。
【図４】HPAEC-PADで検出した、4℃での保存中に粒子含有試料841-57-1(ペレット+上澄み)中に存在する全(すなわち、TTコンジュゲート型+遊離型)Hibに対する百分率(重量%)として、「遊離型」(非コンジュゲート型)Hibの割合を示す図である。
【図５】4℃での保存中に粒子含有試料841-57-2及び841-57-2S(ペレット+上澄み)において、HPAEC-PADで検出可能な全Hib(非コンジュゲート型及びTTコンジュゲート型)(単位μg/ml)を示す図である。
【図６】HPAEC-PADで検出した、粒子含有試料855-118-AのpH6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.2、及び7.4で約4時間それぞれ保存されたアリコート中に存在するすべてのHib(上澄み+ペレット)に対する百分率(重量%)として、上澄み画分中の全Hib(非コンジュゲート型及びTTコンジュゲート型)の割合を示す図である。
【図７】HPAEC-PADで検出した、粒子含有試料855-14のpH6.8、7.4及び8.0で約4時間それぞれ保存された様々な粒子濃度(2mg/ml、1mg/ml及び0.5mg/ml)で存在するすべてのHib(上澄み+ペレット)に対する百分率(重量%)として、上澄み画分中の全Hib(非コンジュゲート型及びTTコンジュゲート型)の割合を示す図である。
【図８Ａ】(A)pHが閾値pH辺りに徐々に増加するにつれて、約1年齢の試料700-65粒子、及び約1週間齢の試料817-83-1粒子の溶解を示す光学顕微鏡法を示す図である。
【図８Ｂ】(B)試料pHの突然の増加後10分間にわたって試料841-12-1及び試料841-12-3粒子の溶解を示す光学顕微鏡法を示す図である。
【図９Ａ】14、68及び86日目にHPAEC-PADで検出した、25、37及び45℃での保存中に粒子含有試料855-72-2及び855-72-4中に存在する全(すなわち、TTコンジュゲート型+遊離型)Hib(ペレット+上澄み)に対する百分率(重量%)として、「遊離型」(非コンジュゲート型)Hibの割合(いずれの場合にもT=0値が差し引かれる)を示す図である。対照試料855-72-5はHib-TTを含有したが、粒子を含有しなかった。
【図９Ｂ】14、68及び86日目にHPAEC-PADで検出した、25、37及び45℃での保存中に粒子含有試料855-72-2及び855-72-4中に存在する全(すなわち、TTコンジュゲート型+遊離型)Hib(ペレット+上澄み)に対する百分率(重量%)として、「遊離型」(非コンジュゲート型)Hibの割合(いずれの場合にもT=0値が差し引かれる)を示す図である。対照試料855-72-5はHib-TTを含有したが、粒子を含有しなかった。
【図９Ｃ】14、68及び86日目にHPAEC-PADで検出した、25、37及び45℃での保存中に粒子含有試料855-72-2及び855-72-4中に存在する全(すなわち、TTコンジュゲート型+遊離型)Hib(ペレット+上澄み)に対する百分率(重量%)として、「遊離型」(非コンジュゲート型)Hibの割合(いずれの場合にもT=0値が差し引かれる)を示す図である。対照試料855-72-5はHib-TTを含有したが、粒子を含有しなかった。
【図１０】成体ラットの初回免疫化後21(「PII」)及び35(「PIII」)日目における平均抗Hib抗体価を示す図である。図10において、左から右に向かって、動物の投与群:第1群(対照)-Infanrix Hexa(凍結乾燥Hib-TTを即時に再構成するのにInfanrix Pentaを使用した)、第2群(対照)-Infanrix Penta及びHiberix(凍結乾燥Hib-TTを生理食塩水で再構築)を異なる部位で共投与した、第3群-Hib-TT含有粒子試料841-57-1をInfanrix Pentaと異なる部位で共投与した、第4群-Hib-TT含有粒子試料841-57-2をInfanrix Pentaと混合し、4℃で4週間保存した後投与した、第5群-Hib-TTを含有する粒子試料700-66をInfanrix Pentaと混合し、4℃で16か月間保存した後投与した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
略語
Hib-CRM:ジフテリアCRM197タンパク質にコンジュゲートしたインフルエンザ菌b型多糖、Hib-TT:破傷風トキソイドにコンジュゲートしたインフルエンザ菌b型多糖、HPAEC-PAD:パルスアンペロメトリック検出を用いる高圧陰イオン交換クロマトグラフィー、kDa:キロダルトン、NaCl:塩化ナトリウム、NaOH:水酸化ナトリウム、PBS:リン酸緩衝食塩水、PEG:ポリエチレングリコール、PET:ポリエチレンテレフタレート、PLGA:ポリ(ラクチド-co-グリコリド)ポリマー、PMAA:ポリ(メタクリル酸)、PMMA:ポリ(メチルメタクリレート)、PMMA-co-PMAA:ポリ(メチルメタクリレート)-co-ポリ(メタクリル酸)ポリマー、PRP:ポリリボシルリビトール、PVOH:ポリ(ビニルアルコール)、PVP:ポリ(ビニルピロリドン)、T:時間、THF:テトラヒドロフラン、TT:破傷風トキソイド、WFI:注射用水。
【００１９】
本発明は、一体型水性液体組成物中に、不相溶性である、例えば相互に物理的若しくは生化学的に反応性の、又は組成物が免疫原性組成物若しくはワクチンである場合に免疫学的に干渉を起こしやすい、物質(構成要素)を含有する薬物組成物の安定な保存及び送達に関する。これは、不相溶性物質の少なくとも1種が、それと不溶性の物質を含有する周囲環境(すなわち、水性組成物)に曝露されないようにマイクロ又はナノ粒子内に隔離されることによって達成される。そのような粒子内に隔離された物質は、本明細書で「生物学的活性カーゴ」と呼ばれる。粒子は、pH感受性となるように設計されている。これは、本明細書で言及されるように、pH「トリガー」に応答するということを意味し、所定の「閾値pH」未満では、カーゴは粒子内に隔離されたままであるが、閾値pHを超えると、カーゴはもはや隔離されておらず、周囲環境に到達可能になる。粒子マトリックスが所期対象の標的投与部位の局所pHに対して適切な閾値pHを有するように調節することによって、「送達」(粒子からの「放出」後に、カーゴが到達可能)は投与後に初めて行われる。
【００２０】
粒子
したがって、一態様において、本発明は、生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数のpH感受性の薬物送達粒子であって、前記粒子がトリガーされる前に存在する水性環境のpHに比べて高いpHを有する水性環境中に存在することによって、前記粒子がトリガーされて、前記カーゴを放出する、複数の粒子を提供する。言い換えれば、粒子は、局所環境のpHのある特定の閾値pHを超える増加により、それらのカーゴを「放棄する」ように誘導される。例えば、保存中に準生理学的pHレベルを維持する最終的に製剤化された非経口組成物の成分として存在している粒子は、組成物がヒト対象の筋組織に注射されるとき遭遇する高pHレベルによりトリガーされて、それらのカーゴを放出する。
【００２１】
一部の実施形態において、生物学的活性カーゴが含まれている粒子のマトリックスは、準生理学的pHにおける水性環境中で不溶性であるが、「トリガー」生理学的pH(すなわち、閾値pHを超えるpH)における水性環境中で可溶性である。したがって、一部の実施形態において、粒子は準生理学的pHで無傷であるが、前記粒子をトリガー生理学的pHに晒すと、前記粒子は、24時間又はそれ未満以内で実質的に又は完全に分解/溶解し、例えば少なくとも80、85、90、95、99又は100%分解/溶解する。粒子が無傷である又は分解/溶解する程度は、インビトロで光学顕微鏡法により決定することができる。
【００２２】
別の態様において、本発明は、より特定には、生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数のpH感受性の薬物送達粒子であって、準生理学的pHにおける水性環境中に少なくとも6か月間存在するとき前記複数の粒子から放出されるカーゴの量が、カーゴの全量の30重量%以下であり、前記粒子を(閾値pH又はそれを超える)トリガー生理学的pHに晒すと、24時間又はそれ未満以内で放出されるカーゴの量が、カーゴの全量の50重量%以上である、複数の粒子を提供する。
【００２３】
上記の態様の文脈における「放出された」とは、カーゴが、薬物送達粒子の例えば遠心による分離後における粒子含有試料の、ペレットではなく上澄み中で検出可能であるということを意味する(本明細書では、粒子がそれから分離されるとき残存する粒子含有組成物の水性部分は、「水性環境」又は「保存バッファー」と呼ばれる。これは、1種以上の生物学的活性構成要素を含有してもしなくてもよい)。それは、上澄み中に存在しているものとして測定されたカーゴの、同時点で検出された「全」量(すなわち、上澄み量に、粒子含有画分、例えば遠心ペレットと結合しているものとして検出された量を加えた量)に対する割合として表される。放出されたカーゴの量は、インビトロで、例えばHPAEC-PADによって決定することができる。しかし、より広義には、本明細書で用いるカーゴを「放出する」粒子という概念とは、カーゴが水性環境に曝露される又は水性環境に到達可能であるという意味で、カーゴがもはや粒子によって「隔離されて」いないということを意味することに留意されたい。したがって、カーゴと粒子との結合を定量するという特定の文脈において前述したことを除いて、「放出された」は、カーゴの粒子マトリックスからの物理的解離又は分離を必ずしも含意するものではなく、むしろカーゴが局所水性環境に到達可能になるようにpHの変化によって、粒子の構造又は完全性が変更されているということを意味する。
【００２４】
本明細書で用いる「生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む」粒子への言及は、そのようなカーゴ及びマトリックス材料が一緒になって粒子を形成することができる様々な方式を包含するものである。この意味で「マトリックス内に含まれている」とき、カーゴは、隔離されていると言うことができるが、組成物の外部環境、例えば水性環境に概ね又は完全に到達しがたいということを意味する。一部の実施形態において、カーゴは、マトリックス内に被包されている。好ましい実施形態において、カーゴは、粒子のマトリックスの全体にわたって実質的に均質に分散されている又は粒子のマトリックスと絡み合っている。
【００２５】
一部の実施形態において、準生理学的pHにおける水性環境は、バッファー、例えば生理食塩水、リン酸、Tris、ホウ酸、コハク酸、ヒスチジン、クエン酸又はマレイン酸バッファーを含む。
【００２６】
本明細書で用いる「準生理学的pH」及び「生理学的pH」の意味は、(投与可能な組成物に製剤化された)粒子の所期のレシピエント対象の局所生理、すなわち対象の注射部位の組織のpHに関連している。好ましい実施形態において、「準生理学的pH」及び「生理学的pH」はそれぞれ、ヒト組織、特にヒト筋肉及び/又は乳児組織のpHに関して準生理的及び生理的であるということを意味する。一部の実施形態において、準生理学的pHは、生理学的pHと少なくとも0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4又は1.5のpH単位で異なる。すなわち、生理学的pHは、準生理学的pHより少なくとも0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9又は1.0、1.1、1.2、1.3、1.4又は1.5のpH単位高い。これらの値は、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2.0又は3.0から選択される値が上端における境界線になっている範囲の下限を表すことができる。一部の実施形態において、準生理学的pHは、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1若しくは6.0以下であり、又はこれらのそれぞれの値を上限及び6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1若しくは5.0から選択される下限とする範囲を含む。一部の実施形態において、生理学的pHは、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6若しくは7.7以上であり、又はこれらのそれぞれの値を下限及び6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4若しくは8.5から選択される上限とする範囲を含む。
【００２７】
一部の実施形態において、準生理学的pHにおける水性環境中に少なくとも6か月間存在するとき前記複数の粒子から放出されるカーゴの量が、カーゴの全量の30重量%以下、例えば30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1重量%以下である。これらの値は、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1から選択される値が下端における境界線になっている範囲の上限を表すことができる。準生理学的pHにおける水性環境中に存在するとき、そのようなカーゴ放出レベル(逆に言えば、そのような粒子内における隔離レベル)は、一部の実施形態において、より長い時間、例えば少なくとも7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34又は36か月にわたって達成可能である。これらの値は、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、48又は60か月から選択される値が上端における境界線になっている範囲の下限を表すことができる。
【００２８】
前記粒子をトリガー生理学的pHに晒して、24時間又はそれ未満以内で前記粒子から放出されたカーゴの量は、一部の実施形態において、カーゴの全量の50重量%以上、例えば50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99又は100重量%以上である。これらの値は、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99又は100から選択される値が上端における境界線になっている範囲の下限を表すことができる。トリガー生理学的pHに応答するそのようなカーゴ放出レベルは、一部の実施形態において、より短い時間、例えば20、16、12、10、8、6、4、2若しくは1時間又は45、30、15、10若しくは5分間にわたって達成可能である。これらの値は、16、12、10、8、6、4、2若しくは1時間又は45、30、15、10、5若しくは1分間から選択される値が下端における境界線になっている範囲の上限を表すことができる。
【００２９】
一部の実施形態において、粒子が少なくとも6か月間存在する準生理学的pHの水性環境は、2〜8℃の間で、例えば約4℃で維持される。しかし、一部の実施形態において、本発明の粒子は熱安定性を示す。これは、粒子が、2〜8℃の範囲(すなわち、2、3、5、6、7、8℃を超えず、又は好ましくは4℃)の温度で準生理学的pHの水性環境中に存在しているが、約25℃又は37℃を超えない温度逸脱(すなわち、2、3、4、5、6、7又は8℃を超える温度)に最大で12週間、例えば1日〜2、4、6、8、10、12週間の期間供されてもよいことを意味する。
【００３０】
一部の実施形態において、粒子をトリガー生理学的pHに晒すことは、レシピエントの体温辺りの温度、特にレシピエントの注射部位組織の温度辺り、例えばヒトの場合は、37℃又は37℃辺りで行われる。
【００３１】
一部の実施形態において、粒子は、例えば成形された結果として形状、サイズ及び/又は組成に関して非常に均一である。そのような粒子を製作することができる一方式では、PRINT(商標)技術(Liquidia Technologies, Inc.)が使用されている。これは、(i)サイズ及び均一な形状において単分散であり、(ii)どんな形状にも成形することができ、(iii)本質的にどんなマトリックス材料からでも構成することができ、(iv)(繊細なカーゴと適合性がある)穏やかな条件下で形成することができ、(v)ポスト機能化化学(例えば、活性剤及び/又は標的成分のバイオコンジュゲーション)に適しており、並びに(vi)(粒子に「バーコードを付ける」ことができるのでコンビナトリアル手法を利用可能にする)アドレス可能な2D配列で、粒子を最初に製作する、(マイクロ及び/又はナノ)粒子を形成することができる方法である。本発明の粒子を製作する方法及び材料は、共同出願人の発行特許及び同時係属中の特許出願にさらに記載及び開示され、これらのそれぞれが全体として参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第8,518,316号、同第8,444,907号、同第8,420,124号、同第8,268,446号、同第8,263,129号、同第8,158,728号、同第8,128,393号、同第7,976,759号、米国特許出願公開第2013-209564号、同第2013-0249138号、同第2013-0241107号、同第2013-0228950号、同第2013-0202729号、同第2013-0011618号、同第2013-0256354号、同第2012-0189728号、同第2011-151015号、同第2010-0003291号、同第2009-0165320号、同第2008-0131692号、国際公開第2015/073831号、並びに2013年3月28日出願の係属中の米国特許出願第13/852,683号及び2013年7月25日出願の同第13/950,447号。
【００３２】
PRINT(商標)技術を使用して製造される粒子は、粒子を作製することを意図した材料をモールドキャビティで成形することによって作製される。PRINT(商標)技術は、一般に材料、例えばシリコーン、ペルフルオロポリエーテルベースのエラストマー(PFPE)又は他の炭化水素ベースの材料から作製された低表面エネルギーモールドを利用して、マイクロ又はナノサイズの構造体をマスターテンプレート上に複製する。モールドにおいて利用されたポリマーは、室温において液体である場合が多く、光化学架橋して、マイクロ又はナノサイズの構造体の高分解能複製を可能にするエラストマー固体になることができる。液体ポリマーは、マスターテンプレートと接触していながら「固化」し、それによって構造体のレプリカ像がマスターテンプレート上に形成される。マスターテンプレートと接触しているモールドの固化は、(熱又は光化学)硬化によって、透化による冷却によって、及び/又は結晶化によって起こり得る。ポリマーモールドをマスターテンプレートから取り外すと、ポリマーは、マスターテンプレートのマイクロ又はナノサイズの特徴のキャビティ又は凹部レプリカを含むパターン付きテンプレートを形成する。パターン付きテンプレートのマイクロ又はナノサイズのキャビティを、高分解能粒子製作に使用することができる。PRINT(商標)技術により、構造(例えば、形状、サイズ及び組成)及び機能(例えば、表面構造)を同時に制御しながら、単分散の有機及び無機粒子を製作することが可能になる。粒子の物理的及び組成的構成の点からの単分散性は、非常に均一で、予め決定可能な粒子特性、例えば粒子分解/溶解速度、それによってカーゴ放出速度及び投与範囲をもたらす。
【００３３】
PRINT(商標)技術を使用して粒子担体システムを設計するとき考慮すべき技術的態様としては、とりわけ(i)粒子カーゴ又はマトリックス材料とポリマーPRINT(商標)モールド材料との相溶性、(ii)カーゴ放出のために望ましい粒子分解/溶解プロファイル、(iii)粒子標的化又は粒子相溶性のための表面機能化、(iv)粒子の係数（modulus）、及び(v)成形方法に適している、粒子前駆体溶液の形成におけるポイント(i)〜(iv)の組合せが挙げられる。例えば、マトリックス材料の賢明な選択によりマトリックスの親水性がカーゴの親水性と適合するように調節することによって、粒子マトリックス内のカーゴ相溶性に対処することができる。粒子分解/溶解を本明細書で述べる。粒子の係数は、例えば、粒子の構成要素を変更することによって調整することができる。最後に、粒子前駆体は、コモノマー又は共溶媒を添加して、粒子前駆体溶液の物理的特性を変更することによって、粒子製作のために必要なら最適化することができる。
【００３４】
粒子が成形されている本発明の実施形態において、それによって製造された粒子は、各粒子が形成されたモールドのキャビティのサイズ及び形状に実質的に似ているサイズ及び形状を有する。モールドキャビティの寸法に応じて、粒子はマイクロ粒子又はナノ粒子となり得る。適切な寸法のモールドを選択することによって、粒子のサイズ及び形状は、例えばカーゴ充填、分解/溶解速度などの特定の送達ニーズを満たすように調節することができる。一部の実施形態において、本発明によるマイクロ粒子は、約1000μm未満、約900μm未満、約800μm未満、約700μm未満、約600μm未満、約500μm未満、約400μm未満、約300μm未満、約200μm未満、約100μm未満、約50μm未満、約10μm未満、約5μm未満、又は約1μmの最大寸法を有することができる。他の実施形態において、粒子はナノ粒子であり、約1000nm未満、約900nm未満、約800nm未満、約700nm未満、約600nm未満、約500nm未満、約400nm未満、約300nm未満、約200nm未満、約100nm未満、又は約50nm未満の最大寸法を有することができる。モールドキャビティ及びそれらのモールドから製造された対応する粒子は、上に明記されたサイズ間に収まる寸法を有することができると当業者に認識されている。さらに、寸法は、粒子の長さ、幅、又は直径であり得る。
【００３５】
一部の実施形態において、粒子の最長軸は、約1〜10μmの間、特に5〜7μmの間、例えば6μmである。一部の実施形態において、粒子は、少なくとも1つの軸が200nm未満であり、場合によって無菌ろ過できるものであり得る。
【００３６】
粒子を、選択されたアスペクト比を有するのに必要な寸法にすることができることも当業者に認識されている。本明細書に定義するように、「アスペクト比」は、粒子の最長軸と最短軸の比を示す。一部の実施形態において、アスペクト比は、少なくとも1:1、少なくとも2:1、少なくとも5:1、少なくとも10:1、少なくとも50:1、又は少なくとも100:1である。特定の実施形態において、アスペクト比は、約1:1〜約5:1の間、約5:1〜約10:1の間、又は約10:1〜100:1の間である。粒子を任意の所望の形状に成形することができる。一部の実施形態において、粒子は、ドーナツ形又はロッド形である。一部の実施形態において、粒子は、非経口投与、例えば皮内若しくは皮下投与、又は好ましくは筋肉内投与用である。
【００３７】
粒子マトリックス
本発明の粒子は、生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む。マトリックスは、粒子を形成するための構造基材をもたらし、粒子安定性及びpHトリガーに応答するそれらの分解/溶解の動態に影響を及ぼす。したがって、本発明の粒子は、部分的に、マトリックス材料及びそれらの相対的割合などの選択によって、調節可能なカーゴ放出プロファイルを有する。粒子のマトリックスは、合成タンパク質、天然タンパク質、組換えタンパク質、ペプチド、合成ポリマー、生体吸収性ポリマー、多糖、核酸、低分子、又はそれらの任意の組合せを含めて様々な材料を使用して製造することができる。適当な生体吸収性ポリマーとしては、ポリ(ビニルアルコール)(PVOH)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、合成又は天然ポリアミノ酸、及びPMMA-co-PMAAが挙げられる。適当な多糖としては、デキストラン、デキストラン誘導体、キトサン、キトサン誘導体、ヒアルロン酸、アルギン酸、アガロース、ペクチン、セルロース類、セルロース誘導体、セルロースエーテル、キサンタンガム、カラギナン、グアーガム、デンプン、及びイヌリンが挙げられる。ゼラチンも、粒子のマトリックスに適している。
【００３８】
したがって、一部の実施形態において、マトリックスは高分子であり、すなわち1種以上のポリマーから構成される。ポリマーは、ホモポリマー、又はヘテロポリマー若しくはコポリマー、例えば交互コポリマー若しくはブロックコポリマーであり得る。好ましくは、そのような高分子マトリックスは、人体において生体適合性、生分解性、生体吸収性であり、且つ/又は人体から排泄可能である。一部の実施形態において、高分子マトリックスのポリマーは、準生理学的pHにおける水性環境にあるとき、少なくとも部分的にプロトン化状態であり、且つ/又はほぼ若しくは厳密に中性の電荷を有し、不溶性であり得る。
【００３９】
一部の実施形態において、高分子マトリックスは、閾値生理学的pHを下回るpKaを有するポリマーを含む。
【００４０】
一部の実施形態において、高分子マトリックスは、(ポリ(メチルメタクリレート)-co-ポリ(メタクリル酸)コポリマー(PMMA-co-PMAAコポリマー)、ポリ(グルタミン酸)-co-ポリ(リシン)、双性イオン型ヘテロ若しくはホモ(ポリアミノ酸)、カルボキシメチルキトサン、ヒプロメロースフタル酸エステル、ヒプロメロース酢酸エステルコハク酸エステル、又は一般式(1):
【化１】
2019513128.tif 000002
(式中、R1は、水素又はメチルを表し、R2は、水素又はメチルを表し、R3は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、sec-ブチル、フェニル、又はベンジルを表す)で表されるアクリラートコポリマーを含む。PMMA-co-PMAAコポリマーは、1〜200kDaの範囲の重量平均分子量(Mw)、例えば50〜60kDa又は35〜45kDa又は22〜28kDa又は8〜12kDaの範囲、例えば10、25、40、55又は125kDaの重量平均分子量(Mw)を有することができる。
【００４１】
一部の実施形態において、高分子マトリックスは、PMMA-co-PMAAコポリマーを含み、コポリマー中のメチルメタクリレート(MMA)モノマーとメタクリル酸(MAA)モノマーのモル比が1:1〜4:1の範囲、例えば1.5〜2:1の範囲である。他の実施形態において、高分子マトリックスは、ポリ(グルタミン酸)-co-ポリ(リシン)を含み、グルタミン酸モノマーとリシンモノマーのモル比がほぼ又は厳密に1:1である。
【００４２】
カーゴ
本発明のpH感受性の薬物送達粒子は、上述のマトリックスに加えて、生物学的活性カーゴを含む。そのようなカーゴは、粒子内に隔離され、水性環境内における保存が可能になり、水性環境のカーゴと成分との望ましくないどんな相互作用も阻止される。カーゴに関連して本明細書で用いる「生物学的活性」とは、粒子が投与されるレシピエントの身体の生物学的(例えば、生理学的、免疫学的など)機能に対してカーゴが不活性でないということを意味する。言い換えれば、そのような生物学的活性カーゴは、レシピエントの身体と相互作用して、生物学的効果の何らかの様式を媒介することができる。生物学的効果は、治療又は予防効果とすることができ、したがってカーゴは、本発明の粒子と関連して、本明細書でその最も広い意味で用いられる「薬物」とすることができる。したがって、カーゴは、活性剤、薬剤、治療剤、又はワクチン剤とすることができる。一部の実施形態において、粒子はそれぞれ、1種より多い生物学的活性カーゴ、例えば異なる1、2、3若しくは4種又はそれより多いカーゴを含むことができる。一部の実施形態において、粒子はそれぞれ、1種より多い同タイプの生物学的活性カーゴ、例えば2、3、4種若しくはそれより多い薬物又は2、3、4種若しくはそれより多い治療剤を含むことができる。一部の実施形態において、粒子はそれぞれ、異なるタイプの1種より多い生物学的活性カーゴ、例えば1、2、3、4種又はそれより多い薬物及び1、2、3、又は4種又はそれより多いワクチン剤を含むことができる。
【００４３】
生物学的活性カーゴは、より特定には抗原、抗体、低分子薬物化合物、免疫グロブリン、タンパク質、多糖、タンパク質-多糖コンジュゲート、核酸又はアジュバント(非特異的免疫調節剤)を含むことができる。生物学的活性カーゴは、一部の実施形態において、加水分解に感受性を示すことがあり、これは、一般的なパラメータ、例えばpH、温度、イオン強度などを条件として、カーゴが、水性環境と接触しているとき重大な程度の加水分解の影響を受けやすいということを意味する。例えば、「重大な」程度の加水分解は、抗原カーゴの文脈において、免疫原性又は抗原性の検出可能な低下を引き起こす程度の分解とすることができる。一部の実施形態において、生物学的活性カーゴは、低い等電点(pI)、例えば4以下、特に3又は2又はそれ未満のpIを有する。一部の実施形態において、生物学的活性カーゴは、リン酸基を例えばホスホジエステル結合中に含む。
【００４４】
特定の実施形態において、生物学的活性カーゴは抗原を含む。用語「抗原」がヒト又は動物の身体において免疫応答を誘発することができる作用剤を意味することは、当業者によく理解されている。したがって、抗原は、免疫原性の組成物/ワクチンにおける「活性成分」である。抗原は、例えば、タンパク質若しくはポリペプチド、糖、例えばオリゴ糖若しくは多糖、タンパク質と糖のコンジュゲート、又は核酸を含む又はそれらからなる。抗原は、様々な形、例えば精製若しくは組換えタンパク質、多糖、そのようなタンパク質と多糖のコンジュゲート、インビボ抗原産生用の核酸ベクター、不活性化全細菌若しくはウイルス、ウイルス断片、ウイルス様粒子、弱毒生細菌、弱毒複製型ウイルス又は細菌外膜複合体で提示することができる。本発明によるカーゴである抗原は、上記のようなどんなタイプの抗原でもよく、病原体(例えば、細菌、ウイルス又は他の病原体)、がん/腫瘍、アレルギー性若しくは自己免疫性状態、非感染性疾患状態、嗜癖状態、又は免疫化を介した予防的若しくは治療的介入に潜在的に適している他の任意の生理的状態に由来する又は関連する抗原とすることができる。
【００４５】
生物学的活性カーゴが抗原である一部の実施形態において、前記カーゴは、糖、例えばオリゴ糖又は多糖を含む。表現「オリゴ糖/多糖」は、病原体から単離されたオリゴ糖又は多糖を意味するために本明細書で用いられる。そのような一部の実施形態において、オリゴ糖/多糖は、低い等電点(pI)、例えば4以下、特に3又は2又はそれ未満のpIを有する。オリゴ糖/多糖は、病原体から単離されたようなその天然の形で使用されてもよく、又は加工されてもよい。そのような加工は、例えば天然の糖の、例えば顕微溶液化(他の技法については、EP0497524に記載されている)によるサイズ分類であってもよい。
【００４６】
一部の実施形態において、オリゴ糖/多糖は細菌性病原体に由来し、特に細菌莢膜糖又はリポオリゴ糖(LOS)若しくはリポ多糖(LPS)に由来することがある。例えば、オリゴ糖/多糖は、インフルエンザ菌b型(「Hib」)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)(特に、血清型A、C、W及び/又はY)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)(特に、血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、15C、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及び/又は33F)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、及びチフス菌(Salmonella typhi)からなる群から選択される細菌性病原体に由来することができる。
【００４７】
特定の実施形態において、前記の糖を含む抗原カーゴ中の糖は、キャリアタンパク質にコンジュゲートしたオリゴ糖/多糖であり、すなわち、前記カーゴは、オリゴ糖/多糖-タンパク質コンジュゲート抗原である。そのようなコンジュゲートは、キャリアタンパク質によって誘発される免疫応答のT細胞依存性をオリゴ糖/多糖抗原に与える手段として当技術分野において周知である。したがって、キャリアタンパク質は、ヘルパーT細胞エピトープの源を提供する能力のために選択される。所与のオリゴ糖/多糖-タンパク質コンジュゲートにおいて、キャリアタンパク質は、オリゴ糖/多糖と同じ病原体又は異なる病原体に由来することができる。本発明のオリゴ糖/多糖-タンパク質コンジュゲート抗原カーゴにおける使用に適したキャリアタンパク質は、当技術分野において周知であり、破傷風トキソイド、破傷風トキソイドの断片C、ジフテリアトキソイド、ジフテリア毒素のCRM197若しくは別の無毒変異体、分類不可能なインフルエンザ菌のプロテインD、髄膜炎菌の外膜タンパク質複合体(OMPC)、肺炎球菌PhtD、肺炎球菌ニューモリシン(pneumococcal pneumolysin)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)のエキソトキシンA(EPA)、黄色ブドウ球菌の無毒化溶血素、ボルデテラ属菌種(Bordetella sp)の無毒化アデニル酸シクラーゼ、無毒化大腸菌(Escherichia coli)易熱性エンテロトキシン、又はコレラ毒素サブユニットB(CTB)若しくは無毒化コレラ毒素が挙げられる。
【００４８】
上述のように、本発明の粒子の生物学的活性カーゴは、加水分解に感受性があり得る。オリゴ糖/多糖-タンパク質コンジュゲート抗原の場合、加水分解感受性は、糖鎖内又は糖とキャリアタンパク質の間の加水分解的開裂として顕在化することができ、どちらの場合も「遊離型」(非コンジュゲート型)糖、すなわちタンパク質にコンジュゲートしていない糖が生成され、望ましいことではない。オリゴ糖/多糖-タンパク質コンジュゲート抗原を本発明の粒子内に隔離すると、粒子が存在することがある(準生理学的pH)水性環境との加水分解による相互作用を起こす可能性からコンジュゲート抗原を保護する働きをするので、粒子の水性環境での保存中におけるコンジュゲート完全性の損失が最小限に抑えられる。したがって、生物学的活性カーゴがオリゴ糖/多糖-タンパク質コンジュゲート抗原である一部の実施形態において、薬物送達粒子及び水性環境中に集合的に存在する、前記オリゴ糖/多糖コンジュゲートに由来する遊離型(非コンジュゲート型)糖の量は、準生理学的pHにおける水性環境中で少なくとも6か月の間に粒子及び水性環境中に集合的に存在するコンジュゲート型及び遊離型の糖の全量の30又は25又は20又は15又は10重量%以下である。これらの値はそれぞれ、25、20、15、10又は5重量%から選択される値が下端における境界線になっている範囲の上端を表すことができる。そのような一部の実施形態において、遊離型糖の増加のそのような最大レベルは、6か月より長い期間、例えば少なくとも7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34又は36か月の間当てはまる。これらの値は、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、48又は60か月から選択される値が上端における境界線になっている範囲の下限を表すことができる。そのような一部の実施形態において、粒子が少なくとも6か月間存在する準生理学的pHの水性環境は、2〜8℃の間で維持される。特定の実施形態において、粒子を、この範囲を超えるが約37℃を超えない温度への1回の逸脱に約2週間以内供することができる。好ましくは、逸脱は約25℃を超えない。
【００４９】
好ましい実施形態において、生物学的活性カーゴは、場合によって、CRM197、又はより好ましくは破傷風トキソイドにコンジュゲートした全長天然の形のインフルエンザ菌b型(「Hib」、ポリリボシルリビトールホスフェート又は「PRP」)の莢膜糖に由来するオリゴ糖/多糖を含む。他の好ましい実施形態において、オリゴ糖/多糖は、髄膜炎菌、特に血清型Aからの莢膜糖に由来する。これらの好ましい実施形態において、コンジュゲート抗原は、好ましくは粒子のマトリックス全体にわたって実質的に均質に分散されている。
【００５０】
組成物
本発明のpH感受性の薬物送達粒子を保存し、動物、特に哺乳動物、より特定にはヒトである対象に、非経口的に許容される組成物で送達することができる。したがって、本発明の一態様において、本発明の複数のpH感受性の薬物送達粒子を水性、好ましくは無菌の環境中に含む組成物が提供される。本発明のそのような組成物は、免疫原性組成物、すなわち、対象において特異的に組成物中に存在する1種以上の抗原成分に対する免疫応答を誘発することができる組成物とすることができる。そのような免疫原性組成物はワクチンとすることができる。言い換えれば、本発明は、本明細書に記載される本発明の(免疫原性)組成物を含むワクチンを提供する。
【００５１】
好ましくは、そのような組成物は、粒子の閾値生理学的pH未満のpHを維持し、又は言い換えれば、準生理学的pHを有する。組成物又はその水性環境のそのような準生理学的pHは、組成物を直接投与することが意図された特定の対象タイプ(例えば、動物、哺乳動物、ヒト、成人、乳児)の特定の組織タイプ/解剖学的領域(例えば、筋肉内、静脈内)の局所生理学的pHに比べて決定される。一部の実施形態において、組成物/水性環境は、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1又は6.0以下のpHを有するように調整される。値はそれぞれ、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1又は5.0から選択される値が下端において画定する範囲の上端を画定することができる。水性環境は、1種以上の生理学的に許容される賦形剤及び/又はバッファー、例えば生理食塩水、リン酸、Tris、ホウ酸、コハク酸、ヒスチジン、クエン酸又はマレイン酸バッファーを含有することができる。
【００５２】
組成物は、1つより多いpH感受性粒子集団を含むことができ、各集団は異なるカーゴを含有し、同じか又は異なる粒子マトリックスを含む。したがって、一部の実施形態において、組成物は、第1の複数の粒子及び第2の複数の粒子を含み、前記第2の複数の粒子は、第1の複数の粒子のカーゴ以外のカーゴを含む。或いは、組成物は、物理的特徴、例えばマトリックスポリマー、サイズ、及び形状が異なる複数の粒子集団を含有してもよい。そのような集団はそれぞれ、同じか又は異なるカーゴを含むことができる。
【００５３】
一部の実施形態において、例えば粒子の高分子マトリックスがPMMA-co-PMAAコポリマーを含む場合、粒子は、組成物中に0.1〜15、0.5〜12.5、1〜10又は2〜5mg/ml、例えば0.5〜3mg/ml、特に1.0〜2.5mg/mlの濃度で存在する。そのような実施形態において、PMMA-co-PMAAコポリマーは、例えばメチルメタクリレート(MMA)モノマーとメタクリル酸(MAA)モノマーのモル比が1:1〜4:1の範囲(例えば、1.5〜2:1の範囲)とすることができ、重量平均分子量(Mw)が、1〜200kDaの範囲、例えば50〜60kDa又は35〜45kDa又は22〜28kDa又は8〜12kDaの範囲、例えば重量平均分子量(Mw)が8.5、10、23.9、25、37、40、51、55又は125kDaとすることができる。
【００５４】
カーゴが粒子のマトリックス内に隔離されている結果として、カーゴの水性環境への到達可能性は損なわれる又は実質的に阻止される。したがって、カーゴは、水性環境の成分と相互作用するのをマトリックスによって実質的に阻止され、又はそのような相互作用は、粒子マトリックスの非存在下における状況に比べて少なくとも低減される。一部の実施形態において、前記相互作用は、少なくとも6か月間、例えば7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34又は36か月(これらの値は、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、48又は60か月から選択される値が上端における境界線になっている範囲の下限を表すことができる)阻止又は低減される。そのような一部の実施形態において、組成物は約4℃で維持される。
【００５５】
組成物が免疫原性組成物である一部の実施形態において、水性環境(すなわち、その中に存在する粒子を含まない)は、1種以上の抗原、及び場合によって関連成分、例えば1種以上のアジュバントを含む。そのようなアジュバントは、高いpI、例えば8以上、例えば9又は10又はそれより高い、特に11以上のpIを有することができる。好ましい実施形態において、アジュバントは水酸化アルミニウムである。
【００５６】
免疫原性組成物の一部の実施形態において水性環境に含まれる1種以上の抗原は、一部の実施形態において、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原(例えば、百日咳トキソイド、線維状赤血球凝集素、パータクチン)、B型肝炎表面抗原(HBsAg)、並びに不活性化ポリオワクチン(IPV)、インフルエンザ菌b型オリゴ糖/多糖コンジュゲート抗原、髄膜炎菌血清型Cオリゴ糖/多糖コンジュゲート抗原、髄膜炎菌血清型Aオリゴ糖/多糖コンジュゲート抗原、髄膜炎菌血清型Wオリゴ糖/多糖コンジュゲート抗原、髄膜炎菌血清型Yオリゴ糖/多糖コンジュゲート抗原及び髄膜炎菌血清型B抗原から選択することができる。特に、抗原の以下の組合せは、本発明の免疫原性組成物の水性環境内に含めることができる。
i.  ジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイド、
ii.  ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原、
iii.  ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原及びHBsAg、
iv.  ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原及びIPV、
v.  ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原、HBsAg及びIPV、
vi.  キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型C(MenC)莢膜オリゴ糖/多糖、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型W(MenW)莢膜オリゴ糖/多糖、及びキャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型Y(MenY)莢膜オリゴ糖/多糖、
vii.  キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型C(MenC)莢膜オリゴ糖/多糖、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型W(MenW)莢膜オリゴ糖/多糖、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型Y(MenY)莢膜オリゴ糖/多糖及び髄膜炎菌血清型B(MenB)に由来する抗原。
【００５７】
好ましくは、免疫原性組成物の水性環境が上記の組合せ(i)〜(v)の1つを含む場合、カーゴはHibオリゴ糖/多糖コンジュゲート抗原である。また、好ましくは、免疫原性組成物の水性環境が、上記の組合せ(vi)〜(vii)の1つを含む場合、カーゴはMenAオリゴ糖/多糖コンジュゲート抗原である。ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原及び/又はHBsAgが水性環境中に存在するそのような一部の実施形態において、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原は水酸化アルミニウム上に吸着され、HBsAgはリン酸アルミニウム上に吸着される。そのような一部の実施形態において、ジフテリアトキソイドは、1〜10国際単位(IU)(例えば、厳密に又はおよそ2IU)若しくは10〜40IU(例えば、厳密に又はおよそ20又は30IU)又は1〜10限界フロキュレーション(Lf)単位(例えば、厳密に又はおよそ2又は2.5又は9Lf)若しくは10〜30Lf(例えば、厳密に又はおよそ15又は25Lf)の1用量当たりの量で存在し、破傷風トキソイドは、10〜30IU(例えば、厳密に又はおよそ20IU)若しくは30〜50IU(例えば、厳密に又はおよそ40IU)又は1-15Lf(例えば、厳密に又はおよそ5又は10Lf)の1用量当たりの量で存在する。
【００５８】
一部の実施形態において、粒子結合Hibオリゴ糖/多糖コンジュゲート抗原に加えて、免疫原性組成物は、その水性環境中に、ジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイドをそれぞれの1用量当たりの厳密な又はおよその量: 30:40IU、25:10Lf、20:40IU、15:5Lf、2:20IU、2.5:5Lf、2:5Lf、25:10Lf、9:5Lfで含む。百日咳トキソイド(PT)、線維状赤血球凝集素(FHA)及びパータクチン(PRN)を含めて無細胞百日咳(Pa)抗原も、水性環境がDTPa抗原を以下の量で含むように存在してもよい。
20〜30μg、例えば、厳密に又はおよそ25μgのPT、
20〜30μg、例えば、厳密に又はおよそ25μgのFHA、
1〜10μg、例えば、厳密に又はおよそ3又は8μgのPRN、
10〜30Lf、例えば、厳密に又はおよそ15又は25LfのD、及び
1〜15Lf、例えば、厳密に又はおよそ5又は10LfのT、或いは
2〜10μg、例えば、厳密に又はおよそ2.5又は8μgのPT、
2〜10μg、例えば、厳密に又はおよそ5又は8μgのFHA、
0.5〜4μg、例えば2-3μg、例えば、厳密に又はおよそ2.5又は3μgのPRN、
1〜10Lf、例えば、厳密に又はおよそ2又は2.5又は9LfのD、及び
1〜15Lf、例えば、厳密に又はおよそ5又は10LfのT。
【００５９】
前述のように、カーゴと水性環境の成分の間の相互作用は、粒子マトリックスによって低減又は実質的に阻止される。このように、本発明の免疫原性組成物の実施形態において、粒子マトリックスは、カーゴが粒子内に隔離されておらず、水性環境に到達可能である等価な組成物に比べて、凝集若しくはフロキュレーションを阻止若しくは低減し、且つ/又は免疫干渉を阻止若しくは低減し、且つ/又はカーゴの加水分解を阻止する。一部の実施形態において、前記相互作用、特に前記凝集/フロキュレーション及び/又は免疫干渉及び/又は加水分解は、少なくとも6か月間、例えば7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34又は36か月(これらの値は、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、48又は60か月から選択される値が上端における境界線になっている範囲の下限を表すことができる)阻止又は低減され、場合によって前記組成物は約4℃で維持される。
【００６０】
目視又は光学顕微鏡法によって観察することができる凝集又はフロキュレーション（flocculation）の現象は、ある特定のカーゴが水性環境のある特定の成分と相互作用するとき起こり、粒子のネットワークが形成される。抗原カーゴを含有する免疫原性組成物の場合、そのような粒子のネットワークは、エピトープをマスキングし、誘発された免疫応答に負に「干渉する」ことがある。場合によっては、凝集/フロキュレーション及び結果として生じる干渉は、それぞれ低い及び高い(又はその逆の)等電点(pI)を有するカーゴ及び水性環境成分が引き寄せられて、互いに相互作用するようなそれらの結果とすることができる。これは、Hibコンジュゲートワクチン(低pI)のPRP糖といくつかのHibコンジュゲート含有混合ワクチン中の他の抗原を吸着するために使用される水酸化アルミニウムアジュバント(高pI)との間の、観察された凝集/フロキュレーション/干渉の理由と考えられる。したがって、一部の実施形態において、前記カーゴは低pI、例えば4以下、特に3若しくは2若しくはそれ未満のpIを有し、且つ/又は水性環境は、高pI、例えば8以上、例えば9若しくは10若しくは11のpIを有する成分を含む。そのような低pIカーゴは、リン酸基を例えばホスホジエステル結合の文脈において含むことができる。しかし、本明細書に記載された免疫原性組成物によって低減又は阻止される免疫干渉は、フロキュレーション又は凝集を必ずしも伴うものではない。水性環境が1種以上の抗原を含む実施形態において、好ましくは、粒子マトリックスは、前記1種以上の抗原の免疫原性に干渉しない。
【００６１】
本発明の免疫原性組成物の特定の実施形態において、粒子のマトリックスは、Hib-TT若しくはHib-CRM197若しくはMenA-CRM197の凝集若しくはフロキュレーションを阻止若しくは低減し、且つ/又はHib-TT若しくはHib-CRM197若しくはMenA-CRM197に対する免疫干渉を阻止若しくは低減する。
【００６２】
加水分解に感受性があるカーゴの加水分解、例えば開裂は上述され、前記カーゴと水性組成物中の水分子との相互作用により起こり得る。したがって、カーゴの水分子への曝露を阻止又は最小限に抑えることによって、加水分解の発生を低減又は阻止することができる。したがって、本免疫原性組成物は、抗原カーゴを粒子内に隔離することによってこのことを達成する。いくつかの糖ベースの抗原、例えばHib及びMenAは、特に加水分解、例えば解重合を起こしやすい恐れがある。本発明の免疫原性組成物の特定の実施形態において、粒子のマトリックスは、Hib-TT又はHib-CRM197又はMenA-CRM197の加水分解を阻止又は低減する。
【００６３】
本発明の免疫原性組成物は、一部の実施形態において、非経口投与に適している。当業者は、所与の非経口投与経路、例えば筋肉内投与経路と適合した治療組成物をいかに製剤化するかを認識している。特に、当業者は、そのような組成物を特定のpHのものにいかに製剤化するかを理解しており、これは、粒子が投与される(場合によって保存される)水性環境が準生理学的pHのものである、本発明の少なくとも一部の実施形態の免疫原性組成物の重要な特徴である。
【００６４】
本発明は、治療上適した容器に包装された本発明の複数の粒子又は組成物をさらに提供する。粒子又は組成物は、例えば針及び注射器を使用して、必要に応じて内容物を抜き出すことができるバイアルで提示することができる。或いは、粒子又は組成物を、非経口投与デバイス、例えば注射器に事前に充填することができる。そのような注射器は、通常のシングルチャンバー注射器とすることができ、又はデュアルチャンバー注射器とすることができる。デュアルチャンバー注射器は、注射器内で即時に混合した後、チャンバーのそれぞれの内容物を逐次、又は同時に送達するように設計することができる。
【００６５】
薬物送達粒子の使用及び投与
本発明の態様において、生物学的活性カーゴと前記カーゴが存在する水性環境の成分との間の相互作用を阻止又は低減する方法であって、(i)前記カーゴを含む、本明細書に定義する複数のpH感受性の薬物送達粒子を形成するステップ、及び(ii)前記複数の粒子を前記水性環境中で製剤化するステップであって、準生理学的pHの前記環境がもたらされるように任意の必要な調整を含む、ステップを含む方法が提供される(上記のステップ(ii)において、前記調整は、水性環境が既に準生理学的pHである場合、必要でない可能性がある)。したがって、本発明のこの態様の一実施形態において、生物学的活性カーゴと前記カーゴが存在する準生理学的pHの水性環境の成分との間の相互作用を阻止又は低減する方法であって、(i)前記カーゴを含む、本明細書に定義する複数のpH感受性の薬物送達粒子を形成するステップ、及び(ii)前記複数の粒子を前記水性環境中で製剤化するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態において、上記のステップ(ii)に従った製剤化の結果は、本明細書に定義する組成物、免疫原性組成物、又はワクチンの製造である。
【００６６】
上述のように、前記相互作用のそのような阻止又は低減は様々な状況において有利である。したがって、一部の実施形態において、上記の方法は、生物学的活性カーゴを水性環境中で保存する(保存は、生物学的活性カーゴと水性環境の成分の間の相互作用の阻止又は低減によって達成される)方法である。同様に、そのような一部の実施形態及び他の実施形態において、上記の方法は、前記生物学的活性カーゴと前記水性環境中の水分子の間又は前記生物学的活性カーゴと水性環境の水以外の成分の間の相互作用を阻止又は低減する方法である。そのような成分は、例えばアジュバント又は抗原又は生物学的若しくは医薬活性成分、又は製剤賦形剤とすることができる。特に、前記方法は、前記カーゴの前記水性環境中における分解、例えば加水分解(すなわち、水分子との相互作用による)を阻止又は低減するためのものとすることができる。
【００６７】
上記の方法が生物学的活性カーゴを水性環境中で保存するためのものである場合、前記保存は、少なくとも6か月、例えば7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34又は36か月間とすることができる。これらの値は、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、48又は60か月から選択される値が上端における境界線になっている範囲の下限を表すことができる。
【００６８】
上記の方法が前記生物学的活性カーゴと水性環境のアジュバント成分の間の相互作用を阻止又は低減するためのものある場合、一部の実施形態において、前記アジュバントは水酸化アルミニウムである。一部の実施形態において、カーゴは、リン酸基を例えばホスホジエステル部分中に含有し、且つ/又は低pIを有する。一部の実施形態において、カーゴは、Hib-TT又はHib-CRM197又はMenA-CRM197である。
【００６９】
或いは、上記の方法は、前記生物学的活性カーゴと第2のカーゴの間の相互作用を阻止又は低減するためのものとすることができる。そのような実施形態は、上記ステップ(i)及び(ii)に加えて、(iii)前記第2のカーゴをマトリックス内に含む第2の複数の粒子を形成するステップを含み、この場合、前記第2の複数の粒子は、複数の粒子について本明細書に定義した通りであり、ただし、カーゴは前記生物学的活性カーゴと同じでなく、すなわち、2種の複数の粒子(集団)を含むそのような実施形態において、2種の群が異なるカーゴを含むという意味で、第2の複数の粒子が、カーゴを除いて、複数の粒子について本明細書に定義した通りである。いくつかの代替実施形態において、2つの群は、異なるポリマーマトリックス中に同じカーゴを含むことができる。
【００７０】
本発明の複数の粒子並びに(免疫原性)組成物及びワクチンは、医薬として、例えば予防上又は治療上使用することができる。それらは、それらを必要とする対象に投与することができる。典型的には、対象は動物、例えば哺乳動物であり、好ましくはヒト対象である。一部の実施形態において、対象は、乳児又は小児又は青年又は成人又は高齢者である。対象は、妊婦とすることができ、場合によって在胎期の乳児が、必要とする対象である。対象は、免疫低下状態の個体とすることができる。特定の実施形態において、複数の粒子並びに免疫原性組成物及びワクチンは、免疫化、例えば小児免疫化における使用のためのものである。
【００７１】
一態様において、本発明は、医薬、特にヒト用医薬における使用のための、本明細書に開示される複数の粒子又は組成物/免疫原性組成物/ワクチンを提供する。より特定には、本発明は、特にヒトにおける(i)病原体若しくはアレルゲンによって直接的若しくは間接的に引き起こされる感染症若しくは病状、又は(ii)免疫学的に異なる宿主細胞、例えばがんに関連する病状の処置又は予防における使用のための、本明細書に定義する複数の粒子、又は本明細書に定義する組成物/免疫原性組成物/ワクチンを提供する。
【００７２】
本発明は、本明細書に定義する複数の粒子、又は本明細書に定義する組成物/免疫原性組成物/ワクチンの、動物、特にヒトにおける(i)病原体若しくはアレルゲンによって直接的若しくは間接的に引き起こされる感染症若しくは病状、又は(ii)免疫学的に異なる宿主細胞、例えばがんに関連する病状の処置又は予防における使用のための医薬品の製造における使用をさらに提供する。
【００７３】
別の態様において、(i)病原体若しくはアレルゲンによって直接的若しくは間接的に引き起こされる感染症若しくは病状、又は(ii)免疫学的に異なる宿主細胞、例えばがんによって起こる病状に対する処置又は予防の方法であって、対象、特にヒトに、有効量の本明細書に開示される複数の粒子又は組成物/免疫原性組成物/ワクチンを投与するステップを含む方法が提供される。同じ投与するステップを含む方法も、そのような病原体若しくはアレルゲン又は免疫学的に異なる宿主細胞に対する免疫応答を誘発するために提供される。
【００７４】
本発明の複数の粒子又は組成物/免疫原性組成物/ワクチンは、液体の形で、すなわち粒子を含有する懸濁液として投与することができる。投与する前に、粒子は、最終的に製剤化された投与可能な液体組成物、例えば、粒子が本明細書に定義する水性環境中にある本発明の組成物/免疫原性組成物/ワクチンに保存することができる。しかし、粒子は、凍結乾燥した、例えばフリーズドライした形、又は粉末にした形で保存して、(本明細書に定義する)水性環境と混合することによって液体の形に即時に再構成することができ、対象に投与される。或いは、粒子は、前記水性環境と混合して、本発明の組成物/免疫原性組成物/ワクチンを生じることが即時に行われ、投与されるように、前記水性環境以外の液体媒体に保存することができる。本発明の粒子又は組成物/免疫原性組成物/ワクチンは、単位用量若しくは複数回用量密閉容器、例えばバイアルで提示することができ、又は投与デバイス、例えば注射器に事前に充填することができる。
【００７５】
本発明の複数の粒子又は組成物/免疫原性組成物/ワクチンは、様々な経路、例えば筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内又は経皮、皮下、肺内(例えば、吸入)、経粘膜又は粘膜下経路により対象に送達することができる。したがって、一部の実施形態において、投与は非経口経路により行われる。
【００７６】
生物学的活性カーゴ、例えば抗原(したがって、それらが存在する粒子及び組成物)の適切な有効用量は、当業者が容易に決定することができる。そのような用量は、指定された質量の粒子の送達に基づいて算出することができる。その場合、特定の質量の粒子含有組成物は、重量又は体積により測定される。或いは、用量は、指定された質量のカーゴの送達に基づくことができ、その場合、カーゴが粒子中に充填されていることを考慮しなければならない。
【００７７】
上記の複数の粒子、組成物/免疫原性組成物/ワクチン、そのようなものの使用、又は処置方法若しくは免疫応答を誘発する方法の特定の実施形態において、病原体は、インフルエンザ菌b型(Hib)、髄膜炎菌(特に、血清型A、C、W及び/又はY)、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、ボルデテラ属菌種、及びチフス菌からなるリストから選択される。好ましい実施形態において、病原体は、インフルエンザ菌b型(Hib)又は髄膜炎菌血清型A(MenA)である。
【００７８】
粒子の製作及び製剤化
本発明の粒子は、生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む。カーゴは、「マトリックス内に含まれている」ような様々な方式で粒子マトリックスと結合することができる。例えば、カーゴをマトリックス内に被包することができ、又はカーゴをマトリックス内に分散させる、若しくはマトリックスと物理的にブレンドすることができる。カーゴとマトリックスの組合せは、物理的結合、例えば非共有結合として説明することができる。
【００７９】
特定の実施形態において、カーゴは、粒子のマトリックス全体にわたって実質的に均質に分散されている。これは、カーゴ及びマトリックスポリマー(複数可)を含む均質な混合物(溶液)から粒子を製作することによって達成することができる。
【００８０】
したがって、一態様において、生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数の薬物送達粒子を作製する方法であって、前記カーゴ及びマトリックスポリマーを含む溶液(すなわち、均質な混合物)を作製するステップであって、場合によって前記ポリマーが、高分子マトリックスについて本明細書に定義した通りである、ステップを含む方法が提供される。また、生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数の薬物送達粒子を作製する方法であって、高分子マトリックスについて本明細書に定義するポリマー、及びカーゴを含む溶液の使用を含み、前記カーゴが場合によって本明細書に定義した通りである、方法も提供される。
【００８１】
上記の方法の一部の実施形態において、前記溶液は、30重量%を超えない量の前記カーゴを含み、その残部は、PMMA-co-PMAAコポリマーである。例えば、溶液は、0.1〜5重量%、例えば、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5又は5重量%の量のカーゴを含むことができる。一部の実施形態において、溶液は可塑剤をさらに含む。一部の実施形態において、可塑剤はポリビニルピロリドン(PVP)である。特定の実施形態において、マトリックスポリマーはPMMA-co-PMAAであり、溶液はPVPをさらに含み、PVP:PMMA-co-PMAAの重量%比が1:1を超えず、例えばPVP:PMMA-co-PMAAの重量%比が0.1〜1:1の範囲、例えば0.15:1、0.2:1、0.25:1、0.3:1、0.35:1、0.4:1、0.45:1、0.5:1、0.55:1、0.6:1、0.65:1、0.7:1、0.75:1、0.8:1、0.85:1、0.9:1、又は0.95:1である。PVPは、例えば約2.5kDaの分子量(Mw)及び約1.9の多分散性を有することができる。そのような方法の他の実施形態において、溶液は、PMMA-co-PMAAコポリマーの代わりにポリ(グルタミン酸)-co-ポリ(リシン)コポリマーを含み、且つ/又はPVPの代わりにグリセロールを含む。
【００８２】
カーゴは、例えばHib-TT、Hib-CRM197及びMenA-CRM197から選択することができる。特定の実施形態において、前記溶液は、0.2〜1.2、より特定には0.4〜1重量%のHib-TT又はHib-CRM197又はMenA-CRM197を含み、その残部は、場合によって1:1重量%比のPVP:PMMA-co-PMAA又はポリ(グルタミン酸)-co-ポリ(リシン):グリセロールである。
【００８３】
本発明の粒子は、そのような溶液から、マイクロ又はナノ粒子を製作する公知の技法、例えば均質化(乳化)、押出及び乾燥、例えば噴霧乾燥により製作することができる。特に、粒子は成形により形成される。したがって、一部の実施形態において、上記の方法は、前記溶液を成形して、複数の粒子を形成する別のステップを含む。溶液は、PVP以外の可塑剤を(場合によって、PVPに加えて)含むことができ、そのような可塑剤はポロゲンとすることができる。一部の実施形態において、方法は、前記PVP又は他の可塑剤及び/若しくはポロゲンの実質的にすべてを前記粒子から除去するステップを含む。この意味において「前記粒子から除去する」とは、可塑剤及び/又はポロゲンが、方法の結果として前記の(可塑剤及び/又はポロゲン含有)溶液から形成された粒子に実質的に存在しないことがあり得ること、すなわち、得られる粒子は、可塑剤及び/又はポロゲンをいずれも実質的に含まないことがあり得ることを意味する。それは、形成された粒子がそのような可塑剤及び/又はポロゲンを一時的に含有する(可塑剤及び/又はポロゲンは、粒子製作方法の結果として失われることがある)ということを意味するとは限らないが、これは、乾燥状態で回収された粒子について当てはまる可能性があり、可塑剤及び/又はポロゲンが、粒子を非経口投与に許容される準生理学的pHに「移行させる」後続のステップ中に粒子から失われる。必然的に、可塑剤及び/又はポロゲンのいずれかが損失又は除去した後の粒子の組成は、それらの製作において使用される溶液の組成と異なる。
【００８４】
別の態様において、本発明は、生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数の薬物送達粒子を作製する方法であって、
i.  プロトン化状態で不溶性であるポリマーを、水性環境中で少なくとも部分的に脱プロトン化するステップであって、それにより前記水性環境中でポリマーが正味の負電荷を有し、可溶性になる、ステップ、
ii.  前記ポリマーを前記カーゴと組み合わせて、溶液を生成するステップ、
iii.  前記溶液を成形し、水性環境を除去することによって、粒子を形成するステップ
を含む方法を提供する。
【００８５】
明確にするために、上記の段落で使用される「水性環境」は、トリガーpH未満の水性環境中に存在するときの本発明の組成物又は本発明の粒子の特性に関して、本明細書の他の場所におけるこの用語の使用と混同されるべきでないことに留意すべきである。
【００８６】
上記のステップ(i)において、ポリマーは、(少なくとも部分的に)脱プロトン化により、例えばポリマーをアルカリ性又は塩基性pHの水性環境に添加することによって可溶化される。次いで、溶解したポリマーをカーゴと組み合わせて、しばしば「保存液」と呼ばれる溶液を生成する。次いで、溶液を、共同出願人Liquidia TechnologiesのPRINT(商標)技術に関連して上に説明され、本明細書の実施例で例示されるように成形し、その結果として、水性環境が除去される。上記の方法のこのステップ(iii)によって、ポリマー鎖がカーゴと非共有結合する又は物理的に絡み合うことになる。代替実施形態において、粒子は、成形によってではなく、他の公知のマイクロ又はナノ粒子製作技法、例えば噴霧乾燥によって形成することができる。
【００８７】
粒子を形成した後、それらは、乾燥状態で、又は有機若しくは水性液体回収環境中で回収することができる。そのような回収環境は、酸性、例えば5未満のpHとすることができる。一部の実施形態において、上記の方法は、回収された粒子のマトリックスポリマーをプロトン化し、ポリマーが不溶性状態に戻るステップをさらに含むことができる。次いで、粒子は、非経口送達に許容される準生理学的pHにおいて、例えば水性環境中で保存することができる。
【００８８】
別の態様において、本発明は、前述の方法によって得ることができる又は得られた複数の薬物送達粒子を提供する。
【００８９】
別の態様において、組成物を作製する方法であって、本明細書に定義する方法に従って複数の粒子を作製するステップ、及び前記粒子を水性環境中で製剤化するステップを含む方法が提供される。組成物が免疫原性組成物である一部の実施形態において、前記環境は、抗原及び/又はアジュバントを含む。前記抗原及び/又はアジュバントは、例えば、本発明の免疫原性組成物と関連して本明細書に定義した通りとすることができる。本発明は、別の態様において、生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数の薬物送達粒子を含む組成物、例えば免疫原性組成物を作製する方法であって、マトリックスがポリマーを含み、方法が、
i.  本明細書に定義する方法に従って作製された複数の粒子を酸性の水性環境に導入し、酸性環境により、マトリックスポリマーがプロトン化され、ポリマーが前記環境中で不溶性になるステップ、
ii.  マトリックスポリマーが前記環境中で不溶性である状態を保持しながら、酸性の水性環境のpHを、非経口投与に許容される準生理学的pHに上げるステップ、及び場合によって
iii.  前記粒子を準生理学的pHの水性環境中で製剤化するステップ
を含む方法をさらに提供する。
【００９０】
本明細書で「安定化」と呼ばれるこの方法のステップ(i)において、粒子を酸性pHにおける「安定化溶液」と接触させ、マトリックスポリマーがプロトン化され、ポリマーが不溶性になる。例えば、最初にCOOH基を主にイオン化された負に帯電した(すなわち、COO-)の形で含有するマトリックスポリマーを含む粒子では、そのようなプロトン化によって、均衡が電荷中性COOHの形に有利に変化する。マトリックスポリマーのプロトン化によって、粒子が安定化溶液中で不溶性になることになる。安定化溶液のpHは、粒子を安定化溶液と接触させると、プロトン化速度が溶解速度を超えるようにすべきである。一部の実施形態において、安定化溶液は、1〜5の範囲のpHを有し、例えばおよそ又は厳密にpH3.5又は4.5である。そのような「接触させること」は、例えば、安定化溶液を連続的に撹拌しながら、乾燥粒子を安定化溶液に振り入れることによって行うことができる。そのような接触(すなわち、ステップ(ii)が始まる前)の時間は、最大で60、50、40、30、20、10若しくは5分とすることができ、又はこれらの値はそれぞれ、1分が下端における境界線になっている時間範囲の上端を示すことができる。
【００９１】
本明細書で「中和」として知られるステップ(ii)において、不溶性粒子を含有する環境は、非経口投与と適合性があるpHに調整される。そのようなpHは、明確に閾値pH未満でなければならず、それを超えると、粒子はそれらのカーゴを放出する。すなわち、pHは準生理的pHでなければならない。この意味における「準生理的」と「非経口投与に許容される」は両方とも、特定の所期対象の特定の標的投与部位/特定の所期対象への経路に関連していなければならない。例えば、より高いpHの溶液の連続的又は段階的な添加(例えば、安定化溶液より酸性が低いバッファーの添加)によるこのpHの調整は、マトリックスポリマーの不溶性状態を維持する適切な速度で行われなければならない。したがって、一部の実施形態において、ステップ(ii)は、水性環境のpHを準生理学的pHに向けて段階的に上げるステップを含む。一部の実施形態において、水性環境のpHは、1分当たり0.1〜10pH単位、例えば1分当たり0.5、1、2又は5pH単位、特に1分当たり0.5pH単位上げられる。明確にするために、これは、第1の調整と最終的に調整された準生理的で非経口的に許容されるpHの達成の間に経過する1分ごとに、溶液pHの上昇が0.1〜10pH単位の範囲であるということを意味する。安定化及び中和のステップを合わせて、本明細書で「移行」と呼ぶ。
【００９２】
任意選択のステップ(iii)において、粒子は、準生理学的pHの水性環境中で製剤化される。すなわち、準生理学的pHの粒子含有溶液を他の成分と組み合わせて、組成物を生成する。その組成物も、粒子が保存中にカーゴを保持するために準生理学的pHでなければならない。ステップ(iii)の水性組成物内に存在するそのような「他の成分」としては、製剤賦形剤、例えばバッファー、浸透圧調節剤、保存剤、アジュバントなど、及び活性成分、例えば薬物化合物又は抗原を挙げることができる。特に、ステップ(iii)の水性環境は、本発明の組成物について本明細書に定義した通りとすることができる。別の態様において、本発明は、前述の方法によって得ることができる又は得られた組成物、例えば免疫原性組成物を提供する。
【００９３】
以下の実施例は、ある特定の特徴及び/又は実施形態を例示するために提供される。これらの実施例は、本発明を記載された特定の特徴又は実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９４】
[実施例1]
粒子及び粒子含有製剤の調製
粒子製作:薬物送達粒子を製造した。第一に、一連の保存液を調製した。約10重量% PMMA-co-PMAA(Mw  約125kDa、MMA:MAA=2:1モル比、Eudragit(登録商標)S100、Evonik Industries)の均質水溶液を、ポリマーを約8のpHにおいて溶解することによって作製した。約15重量% PVP(2.5kDa、Polysciences, Inc.)の均質水溶液を調製した。インフルエンザ菌b型多糖-破傷風トキソイドコンジュゲート(「Hib-TT」)溶液の濃度は、水中で0.0946重量%であった。
【００９５】
以下の分量を組み合わせて、粒子保存液を生成した。19.000mLのPMMA-co-PMAA、12.667mLのPVP、26.540mLのHib-TT、及び2.111mLのWFI水。固体成分に基づいて、粒子保存液は、以下の重量パーセント比を有した。49.67重量%のPMMA-co-PMAA、49.67重量%のPVP、及び0.66重量%のHib-TT。得られた保存液を、10番のマイヤーロッドを使用して厚さ0.005インチ(0.127mm)のPETフィルム上に室温で流延した。薬物送達粒子を形成するために、フィルムを6μmのドーナツ形PRINT(登録商標)(Liquidia Technologies, Inc.、Morrisville、NC)モールドに対してプレ積層した。次いで、モールドを、290°Fの積層装置を1分当たり2フィートで通過させることによって充填した。ドクターブレードを使用して、乾燥条件(すなわち、相対湿度30%未満)下で機械的掻き取りを行うことによって、薬物送達粒子をフィルムから除去した。
【００９６】
粒子の移行:乾燥条件(相対湿度10〜30%)下で、約1.000gの薬物送達粒子を、急速に撹拌している0.2Mコハク酸ナトリウム(pH3.5)/PEG400の50/50(体積)の40mLに振りかけた。粒子を約10分間撹拌した。10分後、4×20mLの200mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)のアリコートを懸濁液に添加し、アリコートを添加するごとに1〜2分間撹拌した。
【００９７】
懸濁液を、4本のポリカーボネートチューブにチューブ1本当たり約30mLで分けた。懸濁液を18,000×gで約10分間4℃にて回転させることによってペレットにした。上澄みを除去し、廃棄した。各ペレットを15mLの200mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)に再懸濁し、2本のチューブを1本のチューブにまとめた。懸濁液を18,000×gで約10分間4℃にて回転させることによってペレットにした。上澄みを除去し、廃棄した。ペレットを30mLの200mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)に再懸濁した。懸濁液を18,000×gで約10分間4℃にて回転させることによってペレットにした。上澄みを除去し、廃棄した。ペレットを30mLの10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)に再懸濁した。粒子懸濁液は、15mLの懸濁液を30mLの10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)と組み合わせることによって希釈した。
【００９８】
粒子懸濁液を、10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)で41μmのナイロン網に通してろ過した。ろ液は、懸濁液を19,000×gで約20分間4℃にて回転させることによって濃縮した。濃縮したろ液を19,000×gで約20分間4℃にて回転させることによってペレットにした。上澄みを除去し、廃棄した。ペレットを40mLの10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)に再懸濁して、洗浄した。粒子をもう2回洗浄して、合計3回洗浄した。粒子を再びペレットにし、少量(チューブ1本当たり約3mL)の10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)に再懸濁した。
【００９９】
粒子含有量を、重量測定により25.925mg/mLであると決定した。全(コンジュゲート型+遊離型)Hib含有量を、HPAEC-PADにより37.750μg/mLであると決定した。
【０１００】
粒子の製剤化:上記の粒子懸濁液を以下の通り製剤化した。
【０１０１】
Infanrix(商標)Penta(GSK Vaccines)700-65と共投与するための試料を生成するために、8mLの10mMマレイン酸ナトリウム/300mM NaCl/0.02%  チメロサール(pH6.1)を容器に分注した。8mLの上記の粒子懸濁液を添加した。62.297mLの10mMマレイン酸ナトリウム/150mM NaCl/0.01%  チメロサール(pH6.1)を添加し、約2.649mg/mLの粒子濃度が得られた。
【０１０２】
Infanrix(商標)Penta 700-66含有試料を生成するために、6mLの上記の粒子懸濁液をペレットにした。ペレットを、1.021mLの10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)及び2.669mLの210mMマレイン酸ナトリウム/0.22%  チメロサール(pH6.1)に再懸濁した。5mLの再懸濁した粒子を除去し、その5mLに50mLのInfanrix(商標)Pentaを添加した。
【０１０３】
第2のInfanrix(商標)Penta含有試料[700-83-02]を生成するために、5.0mLの上記の粒子懸濁液をペレットにした。ペレットを、0.787mLの10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)及び2.224mLの210mMマレイン酸ナトリウム/0.22%  チメロサール(pH6.1)に再懸濁した。3mLの再懸濁した粒子を除去し、その3mLに30mLのInfanrix(商標)Pentaを添加した。
【０１０４】
製剤をバイアルに分注し、使用するまで4℃で保存した。これらの実施例で使用されるように、それぞれの試料の粒子を再懸濁した液体媒体は、「保存バッファー」と呼ばれるものとする。
【０１０５】
[実施例2]
実施例1製剤化粒子の安定性
HPAEC-PAD:実施例1のように保存バッファー中で製剤化された薬物送達粒子を含有する試料について、HPAEC-PAD定量を実施した。試料を、コンジュゲート型(Hib-TT又はHib-CRM)と非コンジュゲート型(「遊離型」)オリゴ糖/多糖(「Hib」)の両方を包含する全オリゴ糖/多糖について分析した。一部の試料は、遊離型Hibについても分析した。
【０１０６】
粒子含有試料、特にアルミニウムアジュバントを含有しないものの分析において、薬物送達粒子と保存バッファーの両方を、全Hib(コンジュゲート型+遊離型)について分析した。これらの場合、薬物送達粒子は、遠心を用いて保存バッファーから回収した。保存バッファー(上澄み)を除去し、分析のために保持した。薬物送達粒子(ペレット)を、上澄み中で回収した同量の保存バッファーに再懸濁した。次いで、塩基を添加して、トリガーされた薬物粒子懸濁液を生成することによって、再懸濁した薬物送達粒子をトリガーして、カーゴを「放出」させた。分析する前に、肉眼では、試料はクリアであった。これらの試料を、ペレットと上澄みの両方の全Hibと遊離型Hibの両方について分析した。
【０１０７】
例えば、約2mg/mLの粒子濃度を有する試料500μLを遠心して、薬物送達粒子を保存バッファーから分離した。上澄みを測定し、除去し、分析のために保持した。上澄みの除去された量と等しい量の10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)をペレットに添加して、薬物送達粒子を再懸濁した。薬物送達粒子をトリガー/溶解するために、4〜7μLの0.5N  水酸化ナトリウムを再懸濁した粒子に添加して、pHを、約7.2を標的にして、約7.0〜7.5に上げた。この実施例に規定される塩基と粒子の比を維持するように、塩基の添加量を必要に応じて調整した。一部の試料、特にアルミニウムアジュバントを含有するものについては、全Hibを決定した。これらの場合、薬物送達粒子は、遠心を用いて保存バッファーから回収しなかった。塩基を添加して、トリガーされた薬物粒子懸濁液を生成することによって、試料をトリガーした。分析する前に、肉眼では、試料はクリアであった。これらの試料を全Hibについて分析した。全Hibのこの尺度は、試料中に含有されている全Hib(薬物送達粒子と保存バッファーの両方)を反映するものであった。
【０１０８】
例えば、塩基を添加することによって、約2mg/mLの粒子濃度を有する試料500μLをトリガーした。試料に、4〜7μLの0.5N  水酸化ナトリウムを添加して、試料のpHを、約7.2を標的にして、約7.0〜7.5に上げた。この実施例に規定される塩基と粒子の比を維持するように、塩基の添加量を必要に応じて調整した。
【０１０９】
標準品/対照調製:標準品:Hib標準品を目的の濃度範囲で調製した。例えば、10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)を使用して、既知濃度のHibを希釈することによって、0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.50μg/mL、5.00μg/mL、10.0μg/mL、15.0μg/mL、20.0μg/mL、及び25.0μg/mLの標準品を調製した。
【０１１０】
対照:場合によって、分析において対照試料を含めることができる。例えば、既知濃度を有するHIBERIX(商標)[ヘモフィルスbコンジュゲートワクチン(破傷風トキソイドコンジュゲート)]を、対照試料として含めることができる。HIBERIX(商標)を使用する場合、添付文書（Prescribing Information）に記載されているように0.9% NaClを使用して、凍結乾燥ワクチンを再構成することによって、第1の対照試料を生成することができる。第2の対照試料を生成するために、次いで、再構成したワクチンの一部分を、0.9% NaClをさらに使用して10倍希釈する。対照試料を両方とも分析することができる。
【０１１１】
遊離型多糖の分析:遊離型オリゴ糖/多糖を分析するために、デオキシコレートを使用して、コンジュゲート型多糖を目的の試料から沈澱及び除去した。
【０１１２】
1%(m/v)のデオキシコレート(DOC)の脱イオン水溶液を予め調製し、アリコートで-20℃で6か月以下保存した。約1gのデオキシコレートを、撹拌しながら90mLの脱イオン水に添加した。デオキシコレートが完全に溶解した後、1M水酸化ナトリウムを滴下添加することによって、溶液のpHをゆっくりと6.8に上げた。塩基を1滴加えるごとに形成される沈澱物は、塩基をもう1滴添加する前に溶解させた。pHを調整した後、脱イオン水を添加して、最終量を100mLにした。分析用の試料を調製するために、(再懸濁したペレットからの)100μLの上澄み又はトリガーされた薬物粒子懸濁液を1.5mLのLoBind微小遠心管(Eppendorf)に入れ、100μLの1% DOC溶液を添加し、チューブをボルテックスして、確実に均一な混合を行った。試料を氷上で約30分間冷却した。30分後、10μLの1N HClを添加し、試料をボルテックスした。コンジュゲート型オリゴ糖/多糖、Hib-TT又はHib-CRMは、DOCに結合し、沈澱物が生じた。19,500×gで15分間約4℃及び室温にて遠心を用いて、沈澱物を除去した。ペレットを廃棄し、上澄みを、遊離型Hibの分析のために保持した。
【０１１３】
試料調製:リビトールリボース5-ホスフェートへの加水分解:試料を加水分解し、リビトールリボース5-ホスフェートを目的の分析物として生成した。
【０１１４】
標準品/対照:100μLの標準品又は対照に、150μLの1N  水酸化ナトリウムを添加した。試料をボルテックスして、試料に塩基を均一に混合した。試料を室温で約12時間加水分解した。
【０１１５】
目的の試料:100μLの試料(全試料オリゴ糖/多糖、全ペレット多糖、全上澄み多糖、遊離型ペレット多糖、又は遊離型上澄み多糖)に、150μLの1N  水酸化ナトリウムを添加した。試料をボルテックスして、試料に塩基を均一に混合した。試料を室温で約12時間加水分解した。
【０１１６】
装置パラメータ
【０１１７】
【表１】
2019513128.tif 000003
【０１１８】
試料濃度は、目的の試料中のリビトールリボース5-ホスフェートのピーク面積を標準品の最小二乗法線形回帰適合と比較することによって算出した。濃度をμg/mLとして報告した。試料700-65を含有するバイアルを4℃で保存し、Hib-TTコンジュゲート及び非コンジュゲート型(「遊離型」)Hibの分布(すなわち、粒子結合又は非結合)を、HPAEC-PADを使用して経時的に(T=0、1、8、15、18、28、49、64、84、242、593、649、及び663日)評価した。表1は、各時点で測定して、ペレット画分(すなわち、粒子結合)及び上澄み画分(すなわち、粒子非結合)で認められた全(すなわち、コンジュゲート型+遊離型)Hibの割合を(重量%単位で)示す。図1は、上澄み画分(すなわち、粒子非結合)で認められた全(コンジュゲート型+遊離型)Hibの部分を示す。
【０１１９】
【表２】
2019513128.tif 000004
【０１２０】
表2及び図2は、各時点で測定して、遊離型(非コンジュゲート型)Hibの割合を、(まとめて、ペレット及び上澄みにおける)試料中に含有されている全(すなわち、コンジュゲート型+遊離型)Hibの百分率として(重量%単位で)示す。各時点で、全(コンジュゲート型及び非コンジュゲート型)Hibと遊離型Hib(非コンジュゲート型)の両方をペレット(粒子)及び上澄みについて決定した。
【０１２１】
【表３】
2019513128.tif 000005
【０１２２】
pH:試料700-65及び700-66のpHも経時的にモニターした。試験試料のアリコート200〜300μLを1.5mLのチューブに分注し、ISFETプローブ(Hach Corporation、pH17.SS)を備えたpH計(Hach Corporation、Model IQ 150)を使用して、pHを決定した。pHを決定する前に、pH4.01(Orion 910104)及びpH7.00(Orion 910107)標準品を使用して、pH計を較正した。表3は、いくつかの時間間隔をおいて収集されたpH値を示す(NA=試料は分析せず)。
【０１２３】
【表４】
2019513128.tif 000006
【０１２４】
[実施例3]
別の粒子及び粒子含有製剤の調製
粒子製作:Hib-TT保存液の濃度が水中で0.0957重量%であった点以外は実施例1と同様にして、薬物送達粒子を製造した。
【０１２５】
粒子の移行:乾燥条件(相対湿度20〜30%)下で、約800mgの薬物送達粒子を、急速に撹拌している0.1Mコハク酸ナトリウム(pH4.5)バッファー/PEG400、50/50(体積)の40mLに振りかけた。粒子を約5〜10分間撹拌した。5〜10分後、4×20mLの0.2Mマレイン酸ナトリウム(pH6.1)のアリコートを懸濁液に添加し、アリコートを添加するごとに1〜2分間撹拌した。
【０１２６】
わずかな変更を伴うが、実施例1と同様にして、移行を継続した。懸濁液を4本のポリカーボネートチューブに分けた後、18,000×gで少なくとも15分間4℃にて回転させることによってペレットにし、その後、18,000×gで5分間遠心を行った。
【０１２７】
粒子含有量を、重量測定により14.12mg/mLであると決定した。HPAEC-PADを使用して、全Hib(コンジュゲート型+遊離型)含有量を39.595μg/mLであると決定した。
【０１２８】
粒子の製剤化:上記の粒子懸濁液を以下の通り製剤化した。
【０１２９】
試料841-57-1を、Infanrix(商標)Pentaと共投与するために生成した。試料841-57-1を生成するために、7mLの量の上記の粒子懸濁液を、7mLの10mMマレイン酸ナトリウム/300mM塩化ナトリウム/0.01%  チメロサール(pH6.1)及び25.136mLの10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)を使用して希釈し、2.526mg/mLの粒子濃度が得られた。
【０１３０】
試料841-57-2を生成した。試料841-57-2を生成するために、11mLの上記の粒子懸濁液をペレットにした。ペレットを、0.878mLの10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)及び2.795mLの210mMマレイン酸ナトリウム/0.21%  チメロサール(pH6.1)に再懸濁した。5mLの再懸濁した粒子を除去し、その5mLに50mLのInfanrix(商標)Pentaを添加した。
【０１３１】
粒子含有試料を、様々なインビボ研究及び安定性研究のためにバイアルに分注した。安定性研究のために、試料841-57-2を注射器に分注することによって、試料841-57-2Sを生成した。製剤を、使用するまで4℃で保存した。
【０１３２】
[実施例4]
実施例3製剤化粒子の安定性
HPAEC-PAD:実施例3試料を含有するバイアルを4℃で保存し、Hib-TTコンジュゲート及び非コンジュゲート型(「遊離型」)Hibの分布(すなわち、粒子結合又は非結合)を、実施例2について記載するようにHPAEC-PADを使用して経時的に(T=0、14、34、67、94、124及び199日)評価した。試料841-57-1(バッファー中にpH6.1で保存されたHib-TT含有粒子)について、表4は、各時点で測定して、ペレット画分(すなわち、粒子結合)及び上澄み画分(すなわち、粒子非結合)で認められる全(すなわち、コンジュゲート型+遊離型)Hibの割合を(重量%単位で)示す。図3は、上澄み画分(すなわち、粒子非結合)で認められた全(コンジュゲート型+遊離型)Hibの部分を示す。
【０１３３】
【表５】
2019513128.tif 000007
【０１３４】
表5及び図4は、各時点で測定して、遊離型(非コンジュゲート型)Hibの割合を、(まとめて、ペレット及び上澄みにおける)試料中に含有されている全(すなわち、コンジュゲート型+遊離型)Hibの百分率として(重量%単位で)示す。各時点で、全(コンジュゲート型及び非コンジュゲート型)Hibと遊離型Hib(非コンジュゲート型)の両方をペレット(粒子)及び上澄みについて決定した。
【０１３５】
【表６】
2019513128.tif 000008
【０１３６】
試料841-57-2及び841-57-2S(Infanrix(商標)Penta中で保存され、後者は注射器中で保存された、Hib-TT含有粒子)、並びに上記の841-57-1について、表6及び図5は、HPAEC-PADを使用して同時点で測定された全(すなわち、コンジュゲート型+遊離型)Hibの濃度(μg/mL)を示す。報告した濃度は、試料(粒子及び水性環境)中の全Hibを反映している。
【０１３７】
【表７】
2019513128.tif 000009
【０１３８】
[実施例5]
pHトリガーへの粒子応答性
閾値pH辺りにおけるカーゴ放出
粒子製作:薬物送達粒子を製造した。第一に、一連の保存液を調製した。10重量% PMMA-co-PMAA(Mw  約125kDa、MMA:MAA=2:1モル比、Eudragit(登録商標)S100、Evonik Industries)の均質水溶液を、ポリマーを約8.0のpHにおいて溶解することによって作製した。15重量% PVP(2.5kDa、Polysciences, Inc.)の均質水溶液を調製した。Hib-TT溶液の濃度は水中で0.0902重量%であった。
【０１３９】
以下の分量を組み合わせて、粒子保存液を生成した。17.325mLのPMMA-co-PMAA、11.550mLのPVP、25.575mLのHib-TT、及び0.550mLのWFI水。固体成分に基づいて、粒子保存液は、以下の重量パーセント比を有した。49.67重量%のPMMA-co-PMAA、49.67重量%のPVP、及び0.66重量%のHib-TT。得られた保存液を、10番のマイヤーロッドを使用して厚さ0.004インチ(0.102mm)のPETフィルム上に室温で流延した。薬物送達粒子を形成するために、フィルムを6μmのドーナツ形PRINT(登録商標)(Liquidia Technologies, Inc.、Morrisville、NC)モールドに対して積層した。フィルム/モールドを、290°Fの積層装置に2フィート/分で通過させた。積層物を空気中でゆっくり冷却した。ドクターブレードを使用して、乾燥条件(相対湿度20%)下で粒子855-51を回収した。薬物送達粒子855-51を様々なビヒクル中に移行して、以下の手順を使用して一連の製剤を生成した。
【０１４０】
粒子の移行:試料855-61-1を生成した。撹拌している0.2Mコハク酸ナトリウム(pH3.5)/PEG400の50/50(体積)の40mLを含有するチューブに、約0.95gの855-51を添加した。約10分間撹拌した後、4×20mLの200mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)のアリコートを添加し、添加するごとに約1分間撹拌した。懸濁液を4本のチューブに(チューブ1本当たり約30mL)分け、粒子を18,000×gで約20分間4℃にて回転させることによってペレットにした。上澄みを廃棄し、チューブ1本当たり15mLの200mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)を使用して、粒子を再懸濁した。4本のチューブを2本のチューブにまとめ、粒子をペレットにした。上澄みを除去し、廃棄した。各ペレットを30mLの200mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)に再懸濁した。懸濁液を19,000×gで約10分間4℃にて回転させることによってペレットにした。上澄みを除去し、廃棄した。各ペレットを15mLの10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)に再懸濁し、チューブ1本当たり30mLの10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)を添加して、懸濁液を3倍希釈した。
【０１４１】
粒子懸濁液を、10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)で41μmのナイロン網に通してろ過した。ろ液は、懸濁液を19,000×gで約15分間4℃にて回転させることによって濃縮した。濃縮したろ液を20,000×gで約20分間4℃にて回転させることによってペレットにした。上澄みを除去し、廃棄した。ペレットを40mLの10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)に再懸濁して、洗浄した。粒子をもう3回洗浄して、合計4回洗浄した。粒子を再びペレットにし、少量(チューブ1本当たり約3mL)の10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)に再懸濁した。HPAEC-PADによって、懸濁液を粒子濃度及び多糖含有量について分析した。855-61-1は、粒子濃度が28.26mg/mLであり、16.802μg/mLの全(コンジュゲート型+遊離型)Hibを含有した。
【０１４２】
様々なpHにおけるインキュベーション: 10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)中で28.26 mg/mLの粒子濃度の試料855-61-1のアリコートを、10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)を使用して約2mg/mLに希釈して、855-118-Aを生成した。
【０１４３】
1.5mLのチューブ14本に、それぞれ0.5mLのアリコートにし、次いで17,000×gで約20分間4℃にて回転させて、薬物送達粒子をペレットにした。上澄みを除去し、廃棄した。pHを増加させながら一連のバッファーに、ペレットを再懸濁した。バッファーは、以下のpH値:6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.2、及び7.4で1×PBSを使用して生成した。粒子を、それぞれのバッファー中で周囲温度にて、撹拌することなく約4時間維持した。4時間後、粒子試料を17,000×gで約20分間4℃にてペレットにした。上澄みは、分析のために回収し、ペレットは1×PBS(pH7.4)に再懸濁し、クリアな懸濁液を得た。HPAEC-PADによって、試料(上澄み及びペレット)を全Hib(コンジュゲート型+遊離型)について分析した。表7及び図6に結果を示し、pHが6.5から7.4に上がるにつれて、カーゴ放出の顕著な増加(上澄みにおける全Hib)が明らかである。
【０１４４】
【表８】
2019513128.tif 000010
【０１４５】
様々な粒子濃度におけるpHによってトリガーされるカーゴ放出
【０１４６】
【化２】
2019513128.tif 000011
【０１４７】
一連のPMMA-co-PMAAポリマーを上記の反応スキームにより合成した。モル比の目標である2:1(MMA:MAA)は維持された。表8に、使用した原材料を詳述する。
【０１４８】
【表９】
2019513128.tif 000012
【０１４９】
合成方法:抑制剤除去ビーズ(Aldrich 306312)を詰めたカラムに反応性モノマーのメチルメタクリレート(Aldrich M55909)を通すことによって、抑制剤をモノマーから除去した。メチルアクリル酸(Aldrich 155721)について、新鮮なビーズを詰めたカラムを使用して、手順を繰り返した。抑制剤を除去したモノマーは、使用する前に暗所に保存した。
【０１５０】
様々な試薬及び溶媒の量を算出し、表9に列挙した。材料を25又は50mLの丸底フラスコに添加した。試薬を添加した後、フラスコを密封し、再度乾燥窒素を少なくとも5分間スパージした。還流冷却器を加え、システムを窒素でフラッシュした。フラスコを80℃に加熱した。反応は、窒素を用いて、撹拌しながら還流条件下に80℃で終夜進行した。
【０１５１】
翌朝、反応液を熱源から外し、冷却した。ゼラチン質の生成物を15mLのACSグレードのTHFに溶解した。ポリマーを、300mLの撹拌している氷冷エチルエーテル(無水、ACSグレード)中に滴らせることによって沈澱させた。沈澱したポリマーは、遠心(3,000×g、3分間)を用いて回収した。沈澱物を50mLの三角フラスコに移し、20mLのACSグレードのTHFに溶解した。ポリマーを、撹拌している氷冷エチルエーテル(無水、ACSグレード)中で再度沈澱させた。沈澱したポリマーは、遠心(3,000×g、3分間)を用いて回収し、室温のエチルエーテル(無水、ACSグレード)(4×50mL)で洗浄した。次いで、ポリマーペレットを時計皿に移し、真空下で20分間乾燥させた。
【０１５２】
真空乾燥した後、乳鉢及び乳棒を使用して、ポリマーを手で粉砕して、微細粉末にした。ポリマーを予備秤量したバイアルに移し、60℃の真空オーブンに入れて、終夜乾燥した。翌朝、真空を維持しながら、オーブンを室温まで冷却した。得られたポリマーを秤量して、収量を決定し、GPCによりアッセイして、分子量を決定し、NMRにより分析して、MMA含有量を決定した。
【０１５３】
【表１０】
2019513128.tif 000013
【０１５４】
ポリマー分析:GPC及びNMR:得られたポリマーを、GPCを使用して分子量について分析し、NMRを使用してPMMA含有量について分析した。NMR分析では、メタクリレートのメチル基に起因するプロトンのシグナルの積分値をメタクリル酸の酸プロトンに起因するプロトンのシグナルの積分値と比較することによって、PMMA(%)を決定した。表10に、分析の結果をまとめる。全収率も、表10に含める。連鎖移動剤を使用すると、得られたポリマーの分子量が低下した。連鎖移動剤の量を増加すると、得られたポリマーの分子量がさらに低下した。
【０１５５】
【表１１】
2019513128.tif 000014
【０１５６】
粒子製作:薬物送達粒子を製造した。第一に、一連の保存液を調製した。6重量%のPMMA-co-PMAA(ロット852-2-2、852-4-3、852-4-4、852-9-6、852-13-7、及び852-13-8)の均質水溶液は、ポリマーを約8〜12のpHで溶解することによって作製した。15重量% PVP(2.5kDa、Polysciences, Inc.)の均質水溶液を調製した。Hib-TT溶液の濃度は水中で0.0902重量%であった。
【０１５７】
以下の分量を組み合わせて、粒子保存液を生成した。52.560mLのPMMA-co-PMAA、21.024mLのPVP、46.200 Hib-TT、及び0.216mLのWFI水。固体成分に基づいて、粒子保存液は、以下の重量パーセント比を有した。49.67重量%のPMMA-co-PMAA、49.67重量%のPVP、及び0.66重量%のHib-TT。得られた保存液を、12番のマイヤーロッドを使用して厚さ0.005インチ(0.127mm)の生PETフィルム上に室温で流延した。薬物送達粒子を形成するために、フィルムを6μmのドーナツ形PRINT(登録商標)(Liquidia Technologies, Inc.、Morrisville、NC)モールドに対して積層した。フィルム/モールドを、290°Fの積層装置に2フィート/分のライン速度で通過させた。積層物を空気中でゆっくり冷却した。ドクターブレードを使用して、乾燥条件(相対湿度5〜15%)下で粒子を回収した。粒子のロット番号は855-12であった。
【０１５８】
粒子の移行:採取した粒子を、4つの試料に分けた。乾燥条件(相対湿度10〜20%)下で、約900mgの薬物送達粒子を、40mLの急速に撹拌している安定化溶液(0.2Mコハク酸ナトリウム(pH3.5)バッファー/PEG400、50/50(体積))に振りかけた。粒子を約10分間撹拌した。10分間撹拌した後、試料を無菌フードに移動し、懸濁液に、8×10mLの400mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)のアリコートを添加し、アリコートを添加するごとに1分間撹拌した。懸濁液を、4本のポリカーボネートチューブにチューブ1本当たり約30mLで分けた。懸濁液を18,000×gで約25分間4℃にて回転させることによってペレットにした。上澄みを除去し、廃棄した。各ペレットを15mLの400mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)に再懸濁し、4本のチューブを2本のチューブにまとめた。懸濁液を18,000×gで約25分間4℃にて回転させることによってペレットにした。上澄みを除去し、廃棄した。各ペレットを30mLの200mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)に再懸濁した。懸濁液を19,000×gで約10分間4℃にて回転させることによってペレットにした。上澄みを除去し、廃棄した。各ペレットを15mLの10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)に再懸濁し、さらに30mLの10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)で希釈した。粒子懸濁液を、10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)で41μmのナイロン網に通してろ過した。ナイロン網をさらに10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)バッファーですすいだ。ろ液は、材料を2本のチューブに分け、懸濁液を19,000×gで約10分間4℃にて回転させることによって濃縮した。濃縮したろ液を19,000×gで約10分間4℃にて回転させることによってペレットにした。上澄みを除去し、廃棄した。各ペレットを40mLの10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)に再懸濁して、洗浄した。粒子をもう2回洗浄して、合計3回洗浄した。粒子を、チューブ1本当たり約3mLの10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)に再懸濁した。懸濁液の粒子濃度は12.5mg/mLであると決定した。HPAEC-PADを使用して、懸濁液のアリコートを全Hib濃度について試験した。結果は17.52μg/mLであった。懸濁液の粒子濃度は12.50mg/mLであった。粒子懸濁液のロット番号は855-14であった。試料は、その後使用するまで4℃で保存した。
【０１５９】
様々なpH及び粒子濃度におけるインキュベーション:10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)中で12.5mg/mLの粒子濃度を有する粒子製剤855-14をバイアルに分注した。2mg/mLの粒子濃度を有する試料では、80μLをバイアルに分注し、1mg/mLの試料では、40μLを分注し、0.5mg/mLの試料では、20μLを分注した。分注したアリコートを17,000×gで約20分間4℃にてペレットにして、薬物送達粒子を目的の各粒子濃度で再構成した。pH6.8及びpH8.0の1×PBSを調製した。1×PBSも、pH7.4を有するもののように使用した。2mg/mLのペレットにした試料を、pH6.8、7.4、及び8.0の1×PBSに再懸濁した。1mg/mL及び0.5mg/mLの試料についても同様に、方法を繰り返した。撹拌することなく周囲条件で4時間インキュベーションした後、試料を17,000×gで約20分間4℃にてペレットにした。上澄みは、分析のために回収し、ペレットは1×PBS(pH7.4)に再懸濁した。HPAEC-PADによって、試料(上澄み及びペレット)を全Hibについて分析した。表11及び図7は、様々な粒子濃度及びpH値における試料について得られた結果を示す。
【０１６０】
【表１２】
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【０１６１】
試料は、粒子濃度とpHの両方に依存性の全Hib放出を示した。所与の粒子濃度では、pHレベルが高いほど、上澄み中のHibの百分率が高くなった。所与のpH値では、粒子濃度が低いほど、上澄み中のHibの百分率が高くなった。
【０１６２】
光学顕微鏡法による閾値pHにおける粒子溶解:4℃で約1年間保存した後、700μLの試料700-65を、1ドラムのバイアルに分注した。27ゲージ針を装着した250μLのHamilton注射器を使用して、0.01N NaOHを徐々に増やしながら添加した。pH計を使用して、pHをモニターした。少量のアリコートを定期的に除去し、光学顕微鏡を使用して分析した。表12に、研究で収集したデータを詳述する。図8Aは光学像を示す。
【０１６３】
【表１３】
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【０１６４】
図8Aにおいて、光学像から、pH6.40で、薬物送達粒子は不溶性のままであったことが明らかである。pH6.64で、薬物送達粒子は膨潤と溶解を始めていた。pH6.72で、光学イメージングは、粒子の大部分は溶解し、膨潤した粒子のごく一部が残存していたことを示した。pH6.80で、光学イメージングは、ほとんど溶解した粒子、及び膨潤した、形状のない粒子からなる大凝集体2個を示した。凝集体は、pH6.80で約20分後、経時的に溶解するように見えた。新しく製造した薬物送達粒子を使用して、研究を繰り返した。4℃で約1週間保存した後、700μLの試料817-83-1を、1ドラムのバイアルに分注した。27ゲージ針を装着した250μLのHamilton注射器を使用して、0.02N NaOHを徐々に増やしながら添加した。NaOHの添加は、少なくとも2分間あけて行った。この研究では、0.02N NaOHを使用して、いずれの潜在的な希釈効果も最小限に抑えた。表13に、研究で収集したデータを詳述する。図8Aは光学像を示す。
【０１６５】
【表１４】
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【０１６６】
図8Aにおいて、光学像から、pH6.41で、薬物送達粒子は不溶性のままであったことが明らかである。pH6.56で、薬物送達粒子は膨潤中であった。pH6.74で、光学イメージングは、粒子の大部分は溶解していたことを示した。pH6.85で、光学イメージングは、ほとんど溶解した粒子及び少量の粒子残骸を示した。実験データに基づいて、製造後、約1週間保存した薬物送達粒子と製造後、約1年間保存した薬物送達粒子にはわずかな差があった。薬物送達粒子は、pH6.50〜6.55に曝露されると膨潤し始めた。薬物送達粒子の大部分は、pH6.65〜6.74に曝露されると溶解した。薬物送達粒子は、pH6.85以上に曝露されるとほとんど完全に溶解した。
【０１６７】
光学顕微鏡法による粒子溶解の速度論
粒子製作:薬物送達粒子を製造した。第一に、一連の保存液を調製した。5重量%のPMMA-co-PMAA(約125kDa、MMA:MAA=2:1モル比。Eudragit(登録商標)S100、Evonik Industries)の均質水溶液を、ポリマーを約8のpHにおいて溶解することによって作製した。5重量%のPMMA-co-PMAA(ロット831-30、実施例5)の第2の均質水溶液を同様に作製した。15重量%のPVP(2.5kDa、Polysciences, Inc.)の均質水溶液を調製した。Hib-TT溶液の濃度は897μg/mLであった。以下の分量を組み合わせて、粒子保存液を生成した。1.932mLのPMMA-co-PMAA、0.644mLのPVP、及び1.424mLのHib-TT。固体成分に基づいて、粒子保存液は、以下の重量パーセント比を有した。49.67重量%のPMMA-co-PMAA、49.67重量%のPVP、及び0.66重量%のHib-TT。Eudragit(登録商標)S100及び[831-30]のそれぞれを用いて、粒子保存液を生成した。得られた保存液を、13番のマイヤーロッドを使用して生PETフィルム上に室温で流延した。薬物送達粒子を形成するために、ベンチ型積層装置を使用して、フィルムを6μmのドーナツ状PRINT(登録商標)(Liquidia Technologies, Inc.、Morrisville、NC)モールドに対して積層した。乾燥条件(すなわち、相対湿度30%未満)下で機械的掻き取りを行うことによって、薬物送達粒子をフィルムから除去した。両保存液を用いて、方法を繰り返した。
【０１６８】
粒子の移行:各粒子セットについて、乾燥条件(相対湿度10〜30%)下で、約90〜100mgの薬物送達粒子を急速に撹拌している0.2Mコハク酸ナトリウム(pH3.5)/PEG400の50/50(体積)の4mLに振りかけた。粒子を約5分間撹拌した。約5分後、4×2mLの200mMマレイン酸ナトリウム(pH)のアリコートを懸濁液に添加し、アリコートを添加するごとに約1分間撹拌した。懸濁液を、6本のチューブにチューブ1本当たり約2mLで分けた。懸濁液を17,000×gで少なくとも5分間4℃にて回転させることによってペレットにした。上澄みを除去し、廃棄した。各ペレットを1mLの200mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)に再懸濁し、2本のチューブを1本のチューブにまとめた。懸濁液を17,000×gで少なくとも5分間4℃にて回転させることによってペレットにした。上澄みを除去し、廃棄した。ペレットを2mLの200mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)に再懸濁した。懸濁液を12,000×gで約5分間4℃にて回転させることによってペレットにした。上澄みを除去し、廃棄した。ペレットを2mLの10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)に再懸濁した。粒子懸濁液は、1mLの懸濁液を1mLのマレイン酸ナトリウム(pH6.1)と組み合わせることによって希釈した。
【０１６９】
粒子懸濁液を、10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)で41μmのナイロン網に通してろ過した。ろ液は、懸濁液を12,000×gで少なくとも3分間4℃にて回転させることによって濃縮した。濃縮したろ液を12,000×gで約3分間4℃にて回転させることによってペレットにした。上澄みを除去し、廃棄した。ペレットを2mLの10mMマレイン酸ナトリウム(pH6.1)に再懸濁して、洗浄した。粒子をもう2回洗浄して、合計3回洗浄した。粒子を12,000×gで約3分間4℃にてペレットにした。上澄みを除去し、廃棄した。ペレットを2mLの10mMマレイン酸ナトリウム/150mM NaCl(pH6.1)に再懸濁した。粒子を12,000×gで約3分間4℃にてペレットにした。上澄みを除去し、廃棄した。ペレットを1mLの10mMマレイン酸ナトリウム/150mM NaCl(pH6.1)に再懸濁した。
【０１７０】
懸濁液を、重量測定により粒子濃度について分析した。試料841-12-1(Eudragit(登録商標)S100を含有する粒子)の濃度は7.75mg/mLであった。試料841-12-3(ロット[831-30]を含有する粒子)の濃度は1.725mg/mLであった。懸濁液を希釈又は濃縮して、約2mg/mLの粒子濃度にした。
【０１７１】
50μLの試料841-12-1及び試料841-12-3を個々のバイアルに入れ、室温において約300rpmで撹拌した。0.02N NaOHをそれぞれ試料841-12-1に10μL、試料841-12-3に18μL添加し、時間測定を開始した。T=2、4、6、8、及び10分で、2μLの試料を除去し、光学顕微鏡法を用いて評価した。図8Bは像を示す。表14に、顕微鏡法を用いて粒子の観察結果をまとめる。
【０１７２】
【表１５】
2019513128.tif 000018
【０１７３】
[実施例6]
pH感受性粒子の熱安定性
様々な温度(25、37、45℃)で保存された薬物送達粒子について、(HPAEC-PADを用いて)遊離型Hibによって経時的(T=0、14、68、及び86日)に測定して、熱安定性を評価する研究を実施した。
【０１７４】
試料855-72-2:1.1mLの855-61-1を1.1mLの10mMマレイン酸ナトリウム/300mM NaCl/0.02%  チメロサール(pH6.1)及び10.857mLの10mMマレイン酸ナトリウム/150mM NaCl/0.01%  チメロサール(pH6.1)と組み合わせると、全Hib含有量の計算値が20μg/mLで、約2.381mg/mLの最終粒子濃度が実現した。855-61-1の生成を実施例5に記載した。
【０１７５】
試料855-72-4:2.4mLの855-14を、2.4mLの10mMマレイン酸ナトリウム/300mM NaCl/0.02%  チメロサール(pH6.1)及び8.340mLの10mMマレイン酸ナトリウム/150mM NaCl/0.01%  チメロサール(pH6.1)と組み合わせると、全Hib含有量の計算値が20μg/mLで、約2.283mg/mLの最終粒子濃度が実現した。855-14の生成を実施例5に記載した。上記の855-72-2に比べて、855-72-4は、異なる起源のPMMA-co-PMAAポリマーマトリックスから作製され、0.2Mとは対照的に、0.4Mマレイン酸ナトリウム(pH6.1)中において移行された粒子を含有する。
【０１７６】
855-72-5:対照として、0.27mLのHib-TT(902μg/mL)を11.910mLの10mMマレイン酸ナトリウム/150mM NaCl/0.01%  チメロサール(pH6.1)と組み合わせることによって、可溶性のHibを含有する(すなわち、粒子を含まない)試料を生成した。
【０１７７】
試料を、0.65mLのアリコートをバイアルに分注し、3つの温度:25℃、37℃、及び45℃で保存スペースに置いた。それらを0、14、68、及び86日目(約0、2、10、12週間)に保存スペースから取り出し、HPAEC-PADを使用して、粒子(ペレット)と水性環境(上澄み)の両方における全Hib及び遊離型Hibについて分析した。表15〜17は、これらの時点における遊離型(非コンジュゲート型)の形(粒子を含有する試料について、ペレット+上澄み)のHibの、T=0において存在するそれぞれの遊離型Hib量を差し引いた後の割合を示す。図9は、25、37及び45℃における14、68及び86日時点の情報をグラフで示す。粒子は、37及び45℃におけるHib-TTコンジュゲート完全性に対して保護効果を有するようである。
【０１７８】
【表１６】
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【０１７９】
【表１７】
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【０１８０】
【表１８】
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【０１８１】
[実施例7]
インビボ研究
保存中はHib-TTカーゴをInfanrix Penta製剤との有害な相互作用から保護するが、投与後にはカーゴの免疫応答誘発を可能にする、pH感受性粒子の能力を実証するためのインビボ研究を行った。成体ラットモデルを使用した。
【０１８２】
材料及び方法:Hib-TT含有粒子をInfanrix Pentaに添加して、6価のDTPa-HepB-IPV-Hib組成物を作製した。4℃で最低限4週間保存した後、これらの組成物を後述する第4群及び5群のラットに投与した。6週齢の成体Sprague-Dawley系雌性ラット(Ico:OFA-SD)を5群に分けた(下記を参照のこと;1群当たりn=20匹)。1/10のヒト用量で筋肉内投与による免疫化は、0、14、及び28日目に行われた。血清分析のために、動物の採血を21日目(「7PII」)及び35日目(「7PIII」)に行った。
【０１８３】
第1群:(リン酸アルミニウム上に吸着させた)凍結乾燥Hib-TTをInfanrix Penta(=Infanrix Hexa)で最終量を約625μLとして再構成した。50μL(1μg/ml Hib用量)を即時(すなわち、再構成後1時間以内)に投与した。
【０１８４】
第2群:凍結乾燥Hib-TT(Hiberix)を625μLのNaCl 150mM(50μL中、1μg/mL Hib用量)で再構成し、Infanrix Penta(50μL)と(異なる部位で)共投与した。
【０１８５】
第3群:Hib-TT含有粒子841-57-1を、150mM NaCl/10mMマレイン酸バッファー(pH6.1)中で20μg/mLのHib-TT濃度に希釈した。希釈した試料55μLを投与し、Infanrix Penta(50μL)を(異なる部位で)共投与した。
【０１８６】
第4群:Infanrix Penta 841-57-2中のHib-TT含有粒子55μLを、4℃で4週間保存した後投与した。
【０１８７】
第5群:Infanrix Penta 700-66中のHib-TT含有粒子55μLを、4℃で16か月間保存した後投与した。
【０１８８】
Hib抗原(PRP)の血清分析:すべてのラットからの血清を、2回目(7PII)又は3回目(7PIII)の免疫化から7日後に個々に回収し、以下のプロトコールに従って、インフルエンザ菌b型ポリリボシル-リビトール-ホスフェート(PRP)特異的IgG抗体の存在を試験した。96ウェルプレートに、炭酸-重炭酸バッファー(50mM)中のチラミン化PRP(1μg/ml)をコーティングし、4℃で終夜インキュベーションした。ラット血清をPBS-Tween 0.05%で1/10に希釈し、プレートのウェル中で段階稀釈した(12希釈液、ステップ1/2)。ペルオキシダーゼとカップリングした抗ラットIgG(H+L)ポリクロナール抗体を添加した(1/5000希釈)。ペルオキシダーゼ基質(OPDA)を添加した後、比色反応を観察し、HCL(1M)を用いて止めた後、分光測定法による読取(波長:490〜620nm)を行った。試験血清及び各プレートに添加された標準物のそれぞれについて、4-パラメータロジスティック曲線は、ODと希釈液の間の関係に適合した(Softmaxpro)。これによって、STD力価で表される各試料力価を導き出すことが可能になった。用いられた統計方法は、異種分散モデルを使用する、2つの因子(群及びTP)によるlog10値の分散分析(ANOVA)であり、すなわち、同一の分散は、因子の異なるレベルのために想定されなかった。2つの因子間の相互作用を試験した。結果は、相互作用が本質的に定性的であるように見えるので、第2の因子のレベルによって示す。群とそれらの95%信頼区間(CI)の幾何平均値比の推定値は、log10値に対して逆変換を用いて得た。多重性に対する調整は、テューキー法を用いて行った。多重性調整95%信頼区間が得られた。
【０１８９】
Hib血清分析の結果:Hib血清分析の結果を図10に示す。7PIIと7PIIIの両方において、第1群と第2群には統計学的に有意な差があり、実験はHib-TTとInfanrix Pentaの間の干渉の出現(抗Hib免疫応答の低下として明らか)を実証することができることが確認された。
【０１９０】
7PIIIにおいて、第1群(Infanrix Penta=Infanrix Hexaを用いた凍結乾燥Hib-TTの即時再構成)は、統計学的に第2〜5群と有意な差があった。Hib-TTは、Infanrix Pentaと(すなわち、別個の部位で、混合せずに、第2群及び第3群)共投与され、且つ/又は薬物送達粒子内に存在していた(第3〜5群)。したがって、Hib-TT含有粒子をInfanrix Pentaと混合することによって、干渉の低減が観察された。第1群における抗Hib免疫応答の低下は、即時混合時に、すなわち混合物の長期保存が行われていない場合でさえ起こることに留意されたい。
【０１９１】
7PIIIにおいて、Hib-TT含有粒子とInfanrix Pentaと(混合しない)共投与(第3群)と、Infanrix Pentaと4週間混合させておいた粒子の投与(第4群)の間には有意差が検出されなかった。これによって、粒子が、保存中においてHib-TTとInfanrix Pentaの間の有害な相互作用を阻止又は最小限に抑え、投与されると、免疫システムへのHib-TTの到達を可能にすることが実証される。
【０１９２】
7PIIIにおいて、第2群と第3群の間に統計的同等性が検出され、粒子内のHib-TTの製剤は、投与されると免疫応答を誘導するその能力を損なわないことが示された。7PIIIにおいて、第4群及び第5群も同等であることが示され、4週間から1年超までの保存期間に、Hib-TT免疫原性の損失が全くなく又は最小限であり、粒子からのHib-TTの損失が全くなく又は最小限である、すなわち粒子中のHib-TTが水性製剤中で安定であることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2019513128.tif 000026
【図５】
2019513128.tif 000027
【図６】
2019513128.tif 000028
【図７】
2019513128.tif 000029
【図８Ａ】
2019513128.tif 000030
【図８Ｂ】
2019513128.tif 000031
【図９Ａ】
2019513128.tif 000032
【図９Ｂ】
2019513128.tif 000033
【図９Ｃ】
2019513128.tif 000034
【図１０】
2019513128.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月2日(2018.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数のpH感受性の薬物送達粒子であって、前記粒子がトリガーされる前に製剤化及び維持される水性環境のpHに比べて高いpHを有する水性環境中に存在することによって、前記粒子がトリガーされて、前記カーゴを放出する、複数の粒子。
【請求項２】
前記マトリックスが、準生理学的pHにおける水性環境中で不溶性であり、前記マトリックスが、トリガー生理学的pHにおける水性環境中で可溶性である、請求項1に記載の複数の粒子。
【請求項３】
前記粒子が、準生理学的pHで無傷であり、前記粒子をトリガー生理学的pHに晒すと、前記粒子が、24時間又はそれ未満以内で実質的に又は完全に溶解又は分解する、請求項1又は2に記載の複数の粒子。
【請求項４】
前記準生理学的pHが、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1又は6.0以下である、請求項2又は3に記載の複数の粒子。
【請求項５】
前記マトリックスが高分子である、請求項1から4のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項６】
前記高分子マトリックスが、人体において生体適合性若しくは生分解性若しくは生体吸収性であるか、又は人体から排泄可能である、請求項5に記載の複数の粒子。
【請求項７】
前記高分子マトリックスが、(ポリ(メチルメタクリレート)-co-ポリ(メタクリル酸)コポリマー(PMMA-co-PMAAコポリマー)、ポリ(グルタミン酸)-co-ポリ(リシン)、双性イオン型ヘテロ若しくはホモ(ポリアミノ酸)、カルボキシメチルキトサン、ヒプロメロースフタル酸エステル、ヒプロメロース酢酸エステルコハク酸エステル、又は一般式(1):
【化１】
2019513128.tif 000036
(式中、R1は、水素又はメチルを表し、R2は、水素又はメチルを表し、R3は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、sec-ブチル、フェニル、又はベンジルを表す)で表されるアクリラートコポリマーを含む、請求項5又は6に記載の複数の粒子。
【請求項８】
前記高分子マトリックスが、PMMA-co-PMAAコポリマーを含み、コポリマー中のメチルメタクリレート(MMA)モノマーとメタクリル酸(MAA)モノマーのモル比が、1:1〜4:1、特に1.5〜2:1の範囲である、請求項5から7のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項９】
前記PMMA-co-PMAAコポリマーが、1〜200kDaの範囲の重量平均分子量(Mw)、例えば50〜60kDa又は35〜45kDa又は22〜28kDa又は8〜12kDaの範囲、例えば10、25、40、55又は125kDaの重量平均分子量(Mw)を有する、請求項7又は8に記載の複数の粒子。
【請求項１０】
前記カーゴが、キャリアタンパク質、例えば破傷風トキソイド、破傷風トキソイドの断片C、ジフテリアトキソイド、ジフテリア毒素のCRM197若しくは別の無毒変異体、分類不可能なインフルエンザ菌のプロテインD、髄膜炎菌の外膜タンパク質複合体(OMPC)、肺炎球菌PhtD、肺炎球菌ニューモリシン、緑膿菌のエキソトキシンA(EPA)、黄色ブドウ球菌の無毒化溶血素、ボルデテラ属菌種の無毒化アデニル酸シクラーゼ、無毒化大腸菌易熱性エンテロトキシン、又はコレラ毒素サブユニットB(CTB)若しくは無毒化コレラ毒素に場合によってコンジュゲートしたオリゴ糖/多糖抗原を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項１１】
前記粒子が、正確に所定のサイズ及び形状に、特にドーナツ形に成形されている、請求項1から10のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項１２】
前記粒子の最長軸が、約1〜10μmの間、特に5〜7μmの間、例えば6μmである、請求項1から11のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項１３】
少なくとも1つの軸が、200nm未満、例えば100nm未満であり、前記粒子が無菌ろ過できる、請求項1から12のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項１４】
前記粒子が、非経口投与、例えば皮内又は皮下投与、特に筋肉内投与用である、請求項1から13のいずれか一項に記載の複数の粒子。
【請求項１５】
請求項1から14のいずれか一項に記載の複数の粒子を水性環境中に含む組成物、特に免疫原性組成物であって、場合によって前記環境が無菌環境である、組成物、特に免疫原性組成物。
【請求項１６】
請求項1から14のいずれか一項に記載の複数の粒子を水性環境中に含む免疫原性組成物であって、
i.  前記粒子が、PMMA-co-PMAAを含むマトリックス内に均質に分散されているHib-TT又はHib-CRM197カーゴを含み、
ii.  前記水性環境が、水酸化アルミニウム上に吸着されたジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド及び無細胞百日咳抗原、並びに場合によってHBsAg及びIPVを含む、免疫原性組成物。
【請求項１７】
医薬、特にヒト用医薬における使用のための、請求項1から14のいずれか一項に記載の複数の粒子又は請求項15若しくは16に記載の組成物。
【請求項１８】
ワクチンである、請求項15から17のいずれか一項に記載の組成物又は免疫原性組成物。
【請求項１９】
生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数の薬物送達粒子を作製する方法であって、
i.  プロトン化状態で不溶性であるポリマーを、水性環境中で少なくとも部分的に脱プロトン化するステップであって、それにより前記水性環境中でポリマーが正味の負電荷を有し、可溶性になる、ステップ、
ii.  前記ポリマーを前記カーゴと組み合わせて、溶液を生成するステップ、
iii.  前記溶液を成形し、水性環境を除去することによって、粒子を形成するステップ
を含む方法。
【請求項２０】
請求項19に記載の方法によって得ることができる又は得られた複数の薬物送達粒子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９２】
7PIIIにおいて、第2群と第3群の間に統計的同等性が検出され、粒子内のHib-TTの製剤は、投与されると免疫応答を誘導するその能力を損なわないことが示された。7PIIIにおいて、第4群及び第5群も同等であることが示され、4週間から1年超までの保存期間に、Hib-TT免疫原性の損失が全くなく又は最小限であり、粒子からのHib-TTの損失が全くなく又は最小限である、すなわち粒子中のHib-TTが水性製剤中で安定であることが示唆された。
本発明は、以下の態様及び実施形態を包含する。
（実施形態１）
生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数のpH感受性の薬物送達粒子であって、前記粒子がトリガーされる前に製剤化及び維持される水性環境のpHに比べて高いpHを有する水性環境中に存在することによって、前記粒子がトリガーされて、前記カーゴを放出する、複数の粒子。
（実施形態２）
前記マトリックスが、準生理学的pHにおける水性環境中で不溶性であり、前記マトリックスが、トリガー生理学的pHにおける水性環境中で可溶性である、前記実施形態1に記載の複数の粒子。
（実施形態３）
前記粒子が、準生理学的pHで無傷であり、前記粒子をトリガー生理学的pHに晒すと、前記粒子が、24時間又はそれ未満以内で実質的に又は完全に溶解又は分解する、前記実施形態1又は2に記載の複数の粒子。
（実施形態４）
生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数のpH感受性の薬物送達粒子であって、準生理学的pHにおける水性環境中に少なくとも6か月間存在するとき前記複数の粒子から放出されるカーゴの量が、カーゴの全量の30重量%以下であり、前記粒子をトリガー生理学的pHに晒すと、24時間又はそれ未満以内で放出されるカーゴの量が、カーゴの全量の50重量%以上である、複数の粒子。
（実施形態５）
前記粒子が、前記実施形態1又は3にさらに記載される通りであり、且つ/又は前記マトリックスが、前記実施形態2にさらに記載される通りである、前記実施形態4に記載の複数の粒子。
（実施形態６）
前記準生理学的pH及び生理学的pHが、ヒト、特に乳児の筋組織のpHに関連している、前記実施形態2から5のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態７）
前記準生理学的pH及び生理学的pHが、互いに少なくとも0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4又は1.5pH単位で異なる、前記実施形態2から6のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態８）
前記準生理学的pHが、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1又は6.0以下である、前記実施形態2から7のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態９）
前記生理学的pHが、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6又は7.7以上である、前記実施形態2から8のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態１０）
カーゴの全量の前記30重量%以下が、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1重量%以下である、前記実施形態4から9のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態１１）
カーゴの全量の前記50重量%以上が、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99又は100重量%以上である、前記実施形態4から10のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態１２）
前記少なくとも6か月が、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34又は36か月である、前記実施形態4から11のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態１３）
前記24時間又はそれ未満以内が、20、16、12、10、8、6、4、2若しくは1時間又は45、30、15、10若しくは5分以内である、前記実施形態4から12のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態１４）
カーゴの放出が、インビトロで、例えばHPAEC-PAD又はELISAによって決定される、前記実施形態4から13のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態１５）
準生理学的pHで前記少なくとも6か月の間に、前記水性環境が、2〜8℃の間で、例えば約4℃で維持される、前記実施形態4から14のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態１６）
準生理学的pHで前記少なくとも6か月の間に、前記水性環境が、2、3、4、5、6、7、8℃、又は好ましくは4℃を超えず、約37℃、好ましくは約25℃を超えない逸脱は、1日〜12週間の期間より長い、前記実施形態4から14のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態１７）
前記準生理学的pH水性環境が、バッファー、例えば生理食塩水、リン酸、Tris、ホウ酸、コハク酸、ヒスチジン、クエン酸又はマレイン酸バッファーを含む、前記実施形態4から16のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態１８）
粒子が無傷であるか、又は実質的に若しくは完全に溶解若しくは分解するかどうかは、インビトロで光学顕微鏡法により決定される、前記実施形態3及び5から17のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態１９）
前記マトリックスが高分子である、前記実施形態1から18のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態２０）
前記高分子マトリックスが、人体において生体適合性若しくは生分解性若しくは生体吸収性であるか、又は人体から排泄可能である、前記実施形態19に記載の複数の粒子。
（実施形態２１）
前記高分子マトリックスが、前記トリガー生理学的pH未満のpKaを有するポリマーを含む、前記実施形態19又は20に記載の複数の粒子。
（実施形態２２）
前記高分子マトリックスが、準生理学的pHにおける前記水性環境にあるとき、少なくとも部分的にプロトン化状態であり、且つ/又はほぼ若しくは厳密に中性の電荷を有し、不溶性であるポリマーを含む、前記実施形態19から21のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態２３）
前記高分子マトリックスが、(ポリ(メチルメタクリレート)-co-ポリ(メタクリル酸)コポリマー(PMMA-co-PMAAコポリマー)、ポリ(グルタミン酸)-co-ポリ(リシン)、双性イオン型ヘテロ若しくはホモ(ポリアミノ酸)、カルボキシメチルキトサン、ヒプロメロースフタル酸エステル、ヒプロメロース酢酸エステルコハク酸エステル、又は一般式(1):
【化３】
2019513128.tif 000037
(式中、R1は、水素又はメチルを表し、R2は、水素又はメチルを表し、R3は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、sec-ブチル、フェニル、又はベンジルを表す)で表されるアクリラートコポリマーを含む、前記実施形態19から22のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態２４）
前記高分子マトリックスが、PMMA-co-PMAAコポリマーを含み、コポリマー中のメチルメタクリレート(MMA)モノマーとメタクリル酸(MAA)モノマーのモル比が、1:1〜4:1、特に1.5〜2:1の範囲である、前記実施形態19から23のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態２５）
前記PMMA-co-PMAAコポリマーが、1〜200kDaの範囲の重量平均分子量(Mw)、例えば50〜60kDa又は35〜45kDa又は22〜28kDa又は8〜12kDaの範囲、例えば10、25、40、55又は125kDaの重量平均分子量(Mw)を有する、前記実施形態19から24のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態２６）
前記高分子マトリックスが、ポリ(グルタミン酸)-co-ポリ(リシン)を含み、グルタミン酸モノマーとリシンモノマーのモル比が、ほぼ又は厳密に1:1である、前記実施形態19から23のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態２７）
前記カーゴが、薬物又は抗原である、前記実施形態1から26のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態２８）
前記カーゴが、キャリアタンパク質、例えば破傷風トキソイド、破傷風トキソイドの断片C、ジフテリアトキソイド、ジフテリア毒素のCRM197若しくは別の無毒変異体、分類不可能なインフルエンザ菌のプロテインD、髄膜炎菌の外膜タンパク質複合体(OMPC)、肺炎球菌PhtD、肺炎球菌ニューモリシン、緑膿菌のエキソトキシンA(EPA)、黄色ブドウ球菌の無毒化溶血素、ボルデテラ属菌種の無毒化アデニル酸シクラーゼ、無毒化大腸菌易熱性エンテロトキシン、又はコレラ毒素サブユニットB(CTB)若しくは無毒化コレラ毒素に場合によってコンジュゲートしたオリゴ糖/多糖抗原を含む、前記実施形態1から27のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態２９）
前記カーゴが加水分解に感受性がある、前記実施形態1から28のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態３０）
前記カーゴが、低い等電点(pI)、例えば4以下、特に3又は2又はそれ未満のpIを有する、前記実施形態1から29のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態３１）
前記カーゴが、オリゴ糖/多糖-タンパク質コンジュゲート抗原であり、コンジュゲーション前の前記オリゴ糖/多糖部分が、低い等電点(pI)、例えば4以下、特に3又は2又はそれ未満のpIを有する、前記実施形態1から29のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態３２）
前記抗原が、インフルエンザ菌b型(Hib)、髄膜炎菌(特に、血清型A、C、W及び/又はY)、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、百日咳菌、及びチフス菌からなる群から選択される病原体に由来するオリゴ糖/多糖を含む、前記実施形態27から31のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態３３）
前記抗原が、細菌莢膜糖又はリポオリゴ糖(LOS)若しくはリポ多糖(LPS)に由来するオリゴ糖/多糖を含む、前記実施形態27から32のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態３４）
前記抗原が、破傷風トキソイド(TT)又はCRM197にコンジュゲートしたHib莢膜オリゴ糖/多糖抗原(PRP)である、前記実施形態27から33のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態３５）
前記抗原が、CRM197にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型A(MenA)莢膜オリゴ糖/多糖である、前記実施形態27から33のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態３６）
前記カーゴが、リン酸基又はホスホジエステル結合を含む、前記実施形態1から35のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態３７）
前記カーゴが、マトリックス全体にわたって実質的に均質に分散されている、前記実施形態1から36のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態３８）
前記カーゴが、マトリックス内に被包されている、前記実施形態1から36のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態３９）
前記抗原が、キャリアタンパク質にコンジュゲートしたオリゴ糖/多糖であり、準生理学的pHにおける水性環境中に前記少なくとも6か月の間、粒子及び水性環境中に集合的に存在する、前記オリゴ糖/多糖コンジュゲートに由来する遊離型(非コンジュゲート型)糖の量が、粒子及び水性環境中に集合的に存在するコンジュゲート型及び遊離型の糖の全量の30又は25又は20又は15又は10重量%以下である、前記実施形態27から38のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態４０）
前記粒子が、正確に所定のサイズ及び形状に、特にドーナツ形に成形されている、前記実施形態1から39のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態４１）
前記粒子の最長軸が、約1〜10μmの間、特に5〜7μmの間、例えば6μmである、前記実施形態1から40のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態４２）
少なくとも1つの軸が、200nm未満、例えば100nm未満であり、前記粒子が無菌ろ過できる、前記実施形態1から41のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態４３）
前記粒子が、非経口投与、例えば皮内又は皮下投与、特に筋肉内投与用である、前記実施形態1から42のいずれか一項に記載の複数の粒子。
（実施形態４４）
前記実施形態1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子を水性環境中に含む組成物であって、場合によって前記環境が無菌環境である、組成物。
（実施形態４５）
粒子の閾値生理学的pH未満のpHを有し、且つ/又は準生理学的pHのものである、前記実施形態44に記載の組成物。
（実施形態４６）
6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1又は6.0以下のpHを有する、前記実施形態44又は45に記載の組成物。
（実施形態４７）
前記粒子が、前記組成物中に0.1〜15、0.5〜12.5、1〜10又は2〜5mg/ml、例えば、0.5〜3mg/mlの濃度で存在し、場合によって、前記粒子が、前記実施形態25に記載の通りである、前記実施形態44から46のいずれか一項に記載の組成物。
（実施形態４８）
前記実施形態1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子を含む組成物であって、前記複数の粒子が、第1の複数の粒子とそれに対する別の第2の複数の粒子であり、前記第2の複数の粒子が、第1の複数の粒子のカーゴ以外のカーゴを含む、組成物。
（実施形態４９）
前記水性環境が、1種以上の生理学的に許容される賦形剤を含む、前記実施形態44から48のいずれか一項に記載の組成物。
（実施形態５０）
前記水性環境が、バッファー、例えば生理食塩水、リン酸、Tris、ホウ酸、コハク酸、ヒスチジン、クエン酸又はマレイン酸バッファーを含む、前記実施形態44から49のいずれか一項に記載の組成物。
（実施形態５１）
前記カーゴと水性環境の成分との相互作用が、粒子のマトリックスにより阻止又は低減される、前記実施形態44から50のいずれか一項に記載の組成物。
（実施形態５２）
前記相互作用が、少なくとも6か月間、例えば、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34又は36か月阻止又は低減され、場合によって、前記組成物が、約4℃で維持される、前記実施形態51に記載の組成物。
（実施形態５３）
免疫原性組成物である、前記実施形態44から52のいずれか一項に記載の組成物。
（実施形態５４）
前記水性環境がアジュバントを含む、前記実施形態44から53のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（実施形態５５）
前記アジュバントが、高いpI、例えば8以上、例えば9又は10又はそれより高い、特に11以上のpIを有する、前記実施形態54に記載の免疫原性組成物。
（実施形態５６）
前記アジュバントが水酸化アルミニウムである、前記実施形態54又は55に記載の免疫原性組成物。
（実施形態５７）
前記水性環境が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原(例えば、百日咳トキソイド、線維状赤血球凝集素、パータクチン)、B型肝炎表面抗原(HBsAg)、不活性化ポリオワクチン(IPV)、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型A(MenA)莢膜オリゴ糖/多糖、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型C(MenC)莢膜オリゴ糖/多糖、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型W(MenW)莢膜オリゴ糖/多糖、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型Y(MenY)莢膜オリゴ糖/多糖、及び髄膜炎菌血清型B(MenB)に由来する抗原からなる群から選択される1種以上の抗原、特に以下の組合せ:
i.  ジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイド、
ii.  ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原、
iii.  ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原及びHBsAg、
iv.  ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原及びIPV、
v.  ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞百日咳抗原、HBsAg及びIPV、
vi.  キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型C(MenC)莢膜オリゴ糖/多糖、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型W(MenW)莢膜オリゴ糖/多糖、及びキャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型Y(MenY)莢膜オリゴ糖/多糖、
vii.  キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型C(MenC)莢膜オリゴ糖/多糖、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型W(MenW)莢膜オリゴ糖/多糖、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型Y(MenY)莢膜オリゴ糖/多糖及び髄膜炎菌血清型B(MenB)に由来する抗原
の1つを含む、前記実施形態44から56のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（実施形態５８）
前記ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド及び無細胞百日咳抗原が、水酸化アルミニウム上に吸着され、場合によって、前記HBsAgが存在する場合それが、リン酸アルミニウム上に吸着される、前記実施形態57に記載の免疫原性組成物。
（実施形態５９）
前記実施形態1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子を水性環境中に含む免疫原性組成物であって、
i.  前記粒子が、PMMA-co-PMAAを含むマトリックス内に均質に分散されているHib-TT又はHib-CRM197カーゴを含み、
ii.  前記水性環境が、水酸化アルミニウム上に吸着されたジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド及び無細胞百日咳抗原、並びに場合によってHBsAg及びIPVを含む、免疫原性組成物。
（実施形態６０）
前記実施形態1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子を水性環境中に含む免疫原性組成物であって、
i.  前記粒子が、PMMA-co-PMAAを含むマトリックス内に均質に分散されているMenA-CRMカーゴを含み、
ii.  前記水性環境が、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型C(MenC)莢膜オリゴ糖/多糖、キャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型W(MenW)莢膜オリゴ糖/多糖、及びキャリアタンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清型Y(MenY)莢膜オリゴ糖/多糖、並びに場合によって髄膜炎菌血清型B(MenB)に由来する抗原を含む、免疫原性組成物。
（実施形態６１）
粒子のマトリックスが、Hib-TT若しくはHib-CRM197若しくはMenA-CRM197の凝集若しくはフロキュレーションを阻止若しくは低減し、且つ/又はHib-TT若しくはHib-CRM197若しくはMenA-CRM197に対する免疫干渉を阻止若しくは低減する、前記実施形態59又は60に記載の免疫原性組成物。
（実施形態６２）
前記凝集若しくはフロキュレーション及び/又は前記免疫干渉が、少なくとも6か月間、例えば、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34又は36か月阻止又は低減され、場合によって、前記組成物が約4℃で保持される、前記実施形態61に記載の免疫原性組成物。
（実施形態６３）
粒子のマトリックスが、水性環境内に含まれる前記1種以上の抗原の免疫原性に干渉しない、前記実施形態53から61のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
（実施形態６４）
前記実施形態1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子又は前記実施形態44から63のいずれか一項に記載の組成物を含有するバイアル。
（実施形態６５）
前記実施形態1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子又は前記実施形態44から63のいずれか一項に記載の組成物を含有する、注射器などの非経口投与用のデバイス。
（実施形態６６）
一方のチャンバーに、前記実施形態1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子を、他方のチャンバーに、前記実施形態45、46、49、50及び54から58のいずれか一項に記載の水性環境を含有するデュアルチャンバー注射器である、前記実施形態65に記載のデバイス。
（実施形態６７）
医薬、特にヒト用医薬における使用のための、前記実施形態1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子又は前記実施形態44から63のいずれか一項に記載の組成物。
（実施形態６８）
特にヒトにおける(i)病原体によって直接的若しくは間接的に引き起こされる感染症若しくは病状、又は(ii)免疫学的に異なる宿主細胞、例えばがんに関連する病状の処置又は予防における使用のための、前記実施形態1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子又は前記実施形態44から63のいずれか一項に記載の組成物。
（実施形態６９）
前記実施形態1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子又は前記実施形態44から63のいずれか一項に記載の組成物の、特にヒトにおける(i)病原体によって直接的若しくは間接的に引き起こされる感染症若しくは病状、又は(ii)免疫学的に異なる宿主細胞、例えばがんに関連する病状の処置又は予防における使用のための医薬品の製造における使用。
（実施形態７０）
前記複数の粒子又は前記組成物が非経口投与用である、前記実施形態68に記載の複数の粒子若しくは組成物又は前記実施形態69に記載の使用。
（実施形態７１）
(i)感染症若しくは病状を引き起こす病原体若しくはアレルゲン、又は(ii)病状、例えばがんの原因となる免疫学的に異なる宿主細胞に対する免疫応答を誘発する方法であって、対象、特にヒトに、有効量の前記実施形態1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子又は前記実施形態44から63のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
（実施形態７２）
(i)病原体によって直接的若しくは間接的に引き起こされる感染症若しくは病状、又は(ii)免疫学的に異なる宿主細胞によって起こる病状、例えばがんに対する処置又は予防の方法であって、対象、特にヒトに、有効量の前記実施形態1から43のいずれか一項に記載の複数の粒子又は前記実施形態44から63のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
（実施形態７３）
前記投与するステップが非経口経路で行われる、前記実施形態71又は72に記載の方法。
（実施形態７４）
前記病原体が、インフルエンザ菌b型(Hib)、髄膜炎菌(特に、血清型A、C、W及び/又はY)、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、ボルデテラ属菌種、及びチフス菌からなるリストから選択される、前記実施形態68若しくは70に記載の複数の粒子若しくは組成物、又は前記実施形態69若しくは70に記載の使用、又は前記実施形態71から73のいずれか一項に記載の方法。
（実施形態７５）
ワクチンである、前記実施形態44から63のいずれか一項に記載の組成物又は免疫原性組成物。
（実施形態７６）
前記実施形態44から63のいずれか一項に記載の組成物又は免疫原性組成物を含むワクチン。
（実施形態７７）
生物学的活性カーゴと前記カーゴが存在する水性環境の成分との間の相互作用を阻止又は低減する方法であって、
i. 前記カーゴを含む、前記実施形態1から43のいずれか一項に記載のpH感受性の複数の粒子を形成するステップ、及び
ii. 前記複数の粒子を前記水性環境中で製剤化するステップであって、準生理学的pHの前記環境がもたらされるように任意の必要な調整を含む、ステップ
を含む方法。
（実施形態７８）
生物学的活性カーゴと前記カーゴが存在する準生理学的pHの水性環境の成分との相互作用を阻止又は低減する方法であって、
i.  前記カーゴを含む、前記実施形態1から43のいずれか一項に記載の複数のpH感受性の粒子を形成するステップ、及び
ii.  前記複数の粒子を前記水性環境中で製剤化するステップ
を含む方法。
（実施形態７９）
前記水性環境中で製剤化された前記複数の粒子が、前記実施形態44から63のいずれか一項に記載の組成物である、前記実施形態77又は78に記載の方法。
（実施形態８０）
前記相互作用の阻止又は低減が、
i.  前記カーゴを前記水性環境中で保存するため、又は
ii.  前記水性環境中における前記カーゴの分解、例えば加水分解を阻止若しくは低減するため
のものである、前記実施形態77又は78に記載の方法。
（実施形態８１）
前記生物学的活性カーゴと前記水性環境中の水分子との間の、又は前記生物学的活性カーゴと水以外の水性環境の成分、例えばアジュバントとの間の相互作用を阻止又は低減するためのものである、前記実施形態77又は78に記載の方法。
（実施形態８２）
前記アジュバントが水酸化アルミニウムであり、場合によって、前記カーゴが、Hib-TT又はHib-CRM197又はMenA-CRM197である、前記実施形態81に記載の方法。
（実施形態８３）
前記生物学的活性カーゴと前記水性環境中に存在する第2のカーゴとの間の相互作用を阻止又は低減するためのものであり、
iii.  前記第2のカーゴをマトリックス内に含む第2の複数の粒子を形成するステップであって、前記第2の複数の粒子が、前記実施形態1から43のいずれか一項に記載される通りであり、ただし、前記第2のカーゴが前記生物学的活性カーゴと同じでない、ステップ
をさらに含む、前記実施形態77又は78に記載の方法。
（実施形態８４）
生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数の薬物送達粒子を作製する方法であって、前記カーゴ及びマトリックスポリマーの溶液を作製するステップであって、場合によって、前記ポリマーが、前記実施形態20から26のいずれか一項に記載の高分子マトリックス又はポリマーを参照して定義される通りである、ステップを含む方法。
（実施形態８５）
生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数の薬物送達粒子を作製する方法であって、前記実施形態20から26のいずれか一項に記載の高分子マトリックス又はポリマーを参照して定義されるポリマー、及びカーゴを含む溶液の使用を含み、前記カーゴは、場合によって前記実施形態27から36のいずれか一項に記載の通りである、方法。
（実施形態８６）
前記溶液が、30重量%を超えない量の前記カーゴを含み、その残部が、PMMA-co-PMAAコポリマーである、前記実施形態84又は85に記載の方法。
（実施形態８７）
前記溶液が、0.1〜5重量%、例えば0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5又は5重量%の量の前記カーゴを含む、前記実施形態86に記載の方法。
（実施形態８８）
前記カーゴが、Hib-TT又はHib-CRM197又はMenA-CRM197である、前記実施形態84から87のいずれか一項に記載の方法。
（実施形態８９）
前記溶液がPVPをさらに含み、PVP:PMMA-co-PMAAの重量%比が1:1を超えない、前記実施形態84から88のいずれか一項に記載の方法。
（実施形態９０）
PVP:PMMA-co-PMAAの重量%比が、0.1〜1:1の範囲、例えば0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1又は0.9:1である、前記実施形態89に記載の方法。
（実施形態９１）
前記PVPが、約2.5kDaの分子量及び約1.9の多分散性を有する、前記実施形態89又は90に記載の方法。
（実施形態９２）
前記溶液が、30重量%を超えない量の前記カーゴを含み、その残部が、ポリ(グルタミン酸)-co-ポリ(リシン)コポリマーである、前記実施形態84又は85に記載の方法。
（実施形態９３）
前記カーゴが、Hib-TT又はHib-CRM197又はMenA-CRM197である、前記実施形態92に記載の方法。
（実施形態９４）
前記溶液がグリセロールをさらに含み、グリセロール:ポリ(グルタミン酸)-co-ポリ(リシン)の重量%比が1:1を超えない、前記実施形態92又は93に記載の方法。
（実施形態９５）
前記溶液が、0.2〜1.2、より特定には0.4〜1重量%のHib-TT又はHib-CRM197又はMenA-CRM197を含み、その残部が、場合によって1:1重量%比のPMMA-co-PMAA及びPVPである、前記実施形態84から91のいずれか一項に記載の方法。
（実施形態９６）
前記溶液が、0.2〜1.2、より特定には0.4〜1重量%のHib-TT又はHib-CRM197又はMenA-CRM197を含み、その残部が、ポリ(グルタミン酸)-co-ポリ(リシン)及びグリセロールであり、グリセロールが30重量%で存在する、前記実施形態84、85、及び92から94のいずれか一項に記載の方法。
（実施形態９７）
前記溶液を成形することによって、前記複数の粒子を形成するステップをさらに含む、前記実施形態84から96のいずれか一項に記載の方法。
（実施形態９８）
前記溶液が、PVP以外の可塑剤をさらに含み、場合によって、前記可塑剤がポロゲンである、前記実施形態84から97のいずれか一項に記載の方法。
（実施形態９９）
前記溶液が、PVP、別の可塑剤及び/又はポロゲンを含む場合、前記方法が、前記PVP、他の可塑剤及び/又はポロゲンの実質的に全部を前記粒子から除去するステップをさらに含む、前記実施形態84から98のいずれか一項に記載の方法。
（実施形態１００）
生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数の薬物送達粒子を作製する方法であって、
i.  プロトン化状態で不溶性であるポリマーを、水性環境中で少なくとも部分的に脱プロトン化するステップであって、それにより前記水性環境中でポリマーが正味の負電荷を有し、可溶性になる、ステップ、
ii.  前記ポリマーを前記カーゴと組み合わせて、溶液を生成するステップ、
iii.  前記溶液を成形し、水性環境を除去することによって、粒子を形成するステップ
を含む方法。
（実施形態１０１）
粒子を乾燥状態で、又は有機若しくは水性液体回収環境で回収するステップをさらに含む、前記実施形態100に記載の方法。
（実施形態１０２）
水性液体が酸性である、前記実施形態101に記載の方法。
（実施形態１０３）
水性液体が、5未満のpHを有する、前記実施形態101又は102に記載の方法。
（実施形態１０４）
粒子のポリマーが不溶性状態に戻るように、粒子のポリマーをプロトン化するステップをさらに含む、前記実施形態100に記載の方法。
（実施形態１０５）
非経口送達に許容される準生理学的pHで粒子を保存するステップをさらに含む、前記実施形態104に記載の方法。
（実施形態１０６）
前記保存が、水性環境中で行われる、前記実施形態105に記載の方法。
（実施形態１０７）
前記実施形態84から106のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる又は得られた複数の薬物送達粒子。
（実施形態１０８）
組成物、例えば免疫原性組成物を作製する方法であって、前記実施形態84から106のいずれか一項に記載の方法に従って、複数の粒子を作製するステップ、及び前記粒子を水性環境中で製剤化するステップを含み、前記環境が、場合によって抗原及び/又はアジュバントを含み、前記抗原及び/又はアジュバントが、場合によって前記実施形態55から58のいずれか一項に記載の通りである、方法。
（実施形態１０９）
生物学的活性カーゴをマトリックス内に含む複数の薬物送達粒子を含む組成物、例えば免疫原性組成物を作製する方法であって、マトリックスがポリマーを含み、方法が、
i.  前記実施形態84から101のいずれか一項に記載の方法に従って作製された複数の粒子を、酸性の水性環境に導入し、酸性環境により、マトリックスポリマーがプロトン化され、ポリマーが前記環境中で不溶性になるステップ、
ii.  マトリックスポリマーが前記環境中で不溶性である状態を保持しながら、酸性の水性環境のpHを、非経口投与に許容される準生理学的pHに上げるステップ、及び場合によって
iii.  前記粒子を準生理学的pHの水性環境中で製剤化するステップであって、場合によって、前記水性環境が、前記実施形態45、46、49、50及び54から58のいずれか一項に記載の通りである、ステップ
を含む方法。
（実施形態１１０）
ステップ(i)において、前記複数の粒子を酸性環境に導入するステップが、前記粒子を、1〜5の範囲のpH、例えばpH3.5又は4.5における安定化溶液に導入するステップを含み、粒子が安定化溶液に最大で60、50、40、30、20、10又は5分間導入される、前記実施形態109に記載の方法。
（実施形態１１１）
ステップ(ii)において、前記酸性の水性環境のpHを上げるステップが、前記環境のpHを前記準生理学的pHに向けて段階的に上げるステップを含む、前記実施形態109又は110に記載の方法。
（実施形態１１２）
ステップ(ii)において、溶液のpHが、1分当たり0.1〜10pH単位、例えば1分当たり0.5、1、2又は5pH単位、特に1分当たり0.5pH単位上げられる、前記実施形態109から111のいずれか一項に記載の方法。
（実施形態１１３）
前記実施形態108から112のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる又は得られた組成物、例えば免疫原性組成物。
【国際調査報告】
2019513128.tif 000038
2019513128.tif 000039