(57)【要約】本発明は、非構造タンパク質nsp-3における突然変異並びに/又はアクセサリータンパク質3a及び3bの欠失を含んでなる弱毒化生コロナウイルスを提供する。このコロナウイルスは、対象において、伝染性気管支炎などの疾患を治療及び/又は予防するためのワクチンとして使用し得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非構造タンパク質nsp-3における突然変異並びに/又はアクセサリータンパク質3a及び/若しくは3bの欠失を含んでなる、弱毒化生コロナウイルス。
【請求項２】
前記nsp-3における突然変異がアデノシン二リン酸-リボース-1'-ホスファターゼ(ADRP)領域にある、請求項1に記載のコロナウイルス。
【請求項３】
前記nsp-3遺伝子が、
a)配列番号6の373位でのAsn(N)からAla(A)、及び
b)配列番号6の379位でのGly(G)からSer(S)
のリストから選択される1以上のアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードする、請求項1又は2に記載のコロナウイルス。
【請求項４】
前記nsp-3遺伝子が、配列番号6の373位でのAsn(N)からAla(A)へのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項に記載のコロナウイルス。
【請求項５】
前記nsp-3遺伝子が配列番号6の379位でのGly(G)からSer(S)へのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項に記載のコロナウイルス。
【請求項６】
前記nsp-3遺伝子が、
a)配列番号5として示される配列と比較して、ヌクレオチド1116位でのAからG及びヌクレオチド1117位でのAからC、並びに
b)配列番号5として示される配列と比較して、ヌクレオチド1138位でのGからA
のリストから選択される1以上のヌクレオチド置換を含んでなる、請求項1〜5のいずれか一項に記載のコロナウイルス。
【請求項７】
配列番号2として示される配列のヌクレオチド37位から384位までの欠失を含んでなる、請求項1に記載のコロナウイルス。
【請求項８】
伝染性気管支炎ウイルス(IBV)である、請求項1〜7のいずれか一項に記載のコロナウイルス。
【請求項９】
IBV M41である、請求項1〜8のいずれか一項に記載のコロナウイルス。
【請求項１０】
その少なくとも一部はM41以外のIBV血清型由来のものであるSタンパク質を含んでなる、請求項9に記載のコロナウイルス。
【請求項１１】
前記S1サブユニットがM41以外のIBV血清型由来のものである、請求項10に記載のコロナウイルス。
【請求項１２】
ウイルスが発育卵に投与された際に、その胚に対して病原性を示さずにそれが複製可能であるように、野生型コロナウイルスと比較して病原性が低減されている、請求項1〜11のいずれか一項に記載のコロナウイルス。
【請求項１３】
請求項1〜6のいずれか一項に記載の改変nsp-3遺伝子。
【請求項１４】
請求項13に記載の改変nsp-3遺伝子によってコードされるタンパク質。
【請求項１５】
請求項13に記載の改変nsp-3遺伝子、又はアクセサリータンパク質3a及び/若しくは3bの欠失を有する改変遺伝子3を含んでなるプラスミド。
【請求項１６】
請求項1〜12のいずれか一項に記載のコロナウイルスを作製するための方法であって、次の工程、
(i)請求項15に記載のプラスミドを宿主細胞中にトランスフェクトする工程、
(ii)前記宿主細胞にnsp-3遺伝子及び/又は遺伝子3を有するコロナウイルス株のゲノムを含んでなる組換えウイルスを感染させる工程、
(iii)改変遺伝子を生成するために、前記プラスミド中の遺伝子配列と前記組換えウイルスゲノム中の対応する配列との間で相同組換えを起こさせる工程、及び
(iv)前記改変遺伝子を含んでなる組換えウイルスについて選択する工程
を含んでなる、前記方法。
【請求項１７】
前記組換えウイルスがワクシニアウイルスである、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
(v)工程(iv)からの組換えウイルスのDNAから前記改変遺伝子を含んでなる組換えコロナウイルスを回収する工程も含む、請求項16又は17に記載の方法。
【請求項１９】
請求項1〜12のいずれか一項に記載のコロナウイルスを産生可能な細胞。
【請求項２０】
請求項1〜12のいずれか一項に記載のコロナウイルス及び薬学上許容可能な担体を含んでなるワクチン。
【請求項２１】
対象における疾患を治療及び/又は予防するための方法であって、請求項20に記載のワクチンをその対象に投与する工程を含んでなる、前記方法。
【請求項２２】
対象における疾患の治療及び/又は予防における使用のための、請求項20に記載のワクチン。
【請求項２３】
対象における疾患を治療及び/又は予防するためのワクチンの製造における、請求項1〜12のいずれか一項に記載のコロナウイルスの使用。
【請求項２４】
前記疾患が伝染性気管支炎(IB)である、請求項21、22又は23に記載の方法、ワクチン又は使用。
【請求項２５】
前記投与方法が、点眼投与、鼻腔内投与、飲水投与、孵化後注射及び卵内注射からなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
【請求項２６】
前記ワクチン接種が卵内ワクチン接種である、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
請求項20に記載のワクチンを生産するための方法であって、請求項19に記載の細胞に請求項1〜12のいずれか一項に記載のコロナウイルスを感染させる工程を含んでなる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの病原性を低減させる突然変異を含んでなる弱毒化コロナウイルスに関する。本発明はまた、疾患を予防及び/又は治療するためのワクチンにおけるそのようなコロナウイルスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝染性気管支炎(infectious bronchitis)(IB)の病原体であるトリ伝染性気管支炎ウイルス(infectious bronchitis virus)(IBV)は、主に気道で複製するが消化管、腎臓及び卵管の上皮細胞でも複製する家禽の感染性の高い伝染性の病原体である。IBVは、ニドウイルス目(Nidovirales)、コロナウイルス科(Coronaviridae)、コロナウイルス亜科(Coronavirinae)及びガンマコロナウイルス属(Gammacoronavirus)のメンバーである。遺伝的に非常によく似たコロナウイルスは、シチメンチョウ、ホロホロチョウ及びキジの疾患を引き起こす。
【０００３】
IBの臨床徴候には、くしゃみ、気管ラ音、鼻汁及び喘鳴音が含まれる。肉用鳥類は体重増加の減少があり、一方、産卵鳥類は産卵数が少なくなり、低品質の卵を生産する。呼吸器感染症は、ヒヨコには致命的になる可能性がある二次的細菌感染症にニワトリを罹患しやすくする。このウイルスはまた、卵管(特に、ヒヨコでは、卵の生産及び品質の低下につながる)、及び腎臓(致命的になる可能性がある腎臓疾患につながることがある)への恒久的な損傷をもたらし得る。
【０００４】
IBVは、他の感染症よりも多くの、家禽産業にとっての経済的損失に関与することが報告されている。弱毒化生ワクチン及び不活化ワクチンはIBVの制御に広く使用されているが、ワクチン接種の使用によって得られる保護は、ワクチンの破壊又は使用したワクチンに関連していない新たなIBV血清型の導入のいずれかによって失われる可能性があり、家禽産業に対するリスクとなる。
【０００５】
さらに、当業界では、ワクチン接種プログラムの効率及び費用効果を改善するために、卵内での使用に好適なワクチンを開発する必要がある。卵内ワクチン接種に関連する主要な課題は、ウイルスが、胚に対して病原性を示さずに、ウイルスに対する母体由来抗体の存在下で複製可能でなければならないことである。現在のIBVワクチンは、発育卵で複数回継代した後に得られ、これは、ニワトリに対する病原性が低減しているウイルスを生じ、弱毒化生ワクチンとしてそれらを使用することができるようになっている。しかしながら、このようなウイルスは、ほとんどの場合、胚に対する病原性の増強を示し、したがって、それらは孵化率を減少させることから、卵内ワクチン接種に使用することができない。孵化率の70%減少は一部の場合に見られる。
【０００６】
発育卵での複数の継代後の弱毒化にはまた他の不都合な点もある。ウイルスの弱毒化はランダムであり、ウイルスが継代されるたびに異なるので経験的な方法であり、弱毒化目的で同じウイルスを異なる一連の卵で継代すると異なる一連の突然変異をもたらして弱毒に至る。また、そのプロセスに関連する有効性の問題もある。いくつかの突然変異はウイルスの複製に影響を与え、それらの突然変異のいくつかはウイルスを弱毒化しすぎる可能性がある。突然変異はまた、免疫原性にも影響を与え得るS遺伝子でも起こり得、その結果、所望の免疫応答が影響を受け、潜在的なワクチンが必要な血清型から保護し得なくなる。加えて、ワクチンの病原性復帰及び安定性に伴う問題もある。
【０００７】
IBVの制御のために新しいより安全なワクチンが開発されることが重要である。したがって、これらの問題点とは関連がないIBVワクチン、特に、卵内ワクチン接種に使用し得るワクチンが必要である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の態様の概要
本発明者らは、IBVを合理的に弱毒化するために、逆遺伝学アプローチを使用している。このアプローチは、発育卵での複数の継代後のランダムな弱毒化よりもはるかに制御可能であり、それは、各突然変異の位置がわかっており、ウイルスに及ぼすその効果、すなわち、弱毒化の理由を導出することができるためである。
【０００９】
その逆遺伝学アプローチを用いて、本発明者らは、ウイルスの病原性レベルを低減させる様々な突然変異を同定した。病原性レベルは、ウイルスが発育卵に投与されたときに、その胚に対して病原性を示さずにそれが複製可能であるように、低減され得る。このようなウイルスは、卵内ワクチン接種に好適であり得、発育卵での複数の継代後に産生された弱毒化IBVワクチンに対して重要な利点である。
【００１０】
したがって、第1の態様では、本発明は、非構造タンパク質nsp-3における突然変異並びに/又はアクセサリータンパク質3a及び/若しくは3bの欠失を含んでなる弱毒化生コロナウイルスを提供する。
【００１１】
前記nsp-3における突然変異は、アデノシン二リン酸-リボース-1'-ホスファターゼ(ADRP)領域中であり得る。
【００１２】
改変nsp-3遺伝子は、
a)配列番号6の373位でのAsn(N)からAla(A)、及び
b)配列番号6の379位でのGly(G)からSer(S)
のリストから選択される1以上のアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。
【００１３】
前記改変nsp-3遺伝子は、配列番号6の373位でのAsn(N)からAla(A)へのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。
【００１４】
前記改変nsp-3遺伝子は、配列番号6の379位でのGly(G)からSer(S)へのアミノ酸突然変異を含んでなるタンパク質をコードし得る。
【００１５】
前記改変nsp-3遺伝子は、
a)配列番号5として示された配列と比較して、ヌクレオチド1116位でのAからG及びヌクレオチド1117位でのAからC、並びに
b)配列番号5として示された配列と比較して、ヌクレオチド1138位でのGからA
のリストから選択される1以上のヌクレオチド置換を含んでなり得る。
【００１６】
前記弱毒化生コロナウイルスは、配列番号2として示された配列のヌクレオチド37位から384位までの欠失を含んでなり得る。
【００１７】
前記コロナウイルスは伝染性気管支炎ウイルス(IBV)であり得る。
【００１８】
前記コロナウイルスはIBV M41であり得る。
【００１９】
前記コロナウイルスは、その少なくとも一部はM41以外のIBV血清型のものであるSタンパク質を含んでなり得る。
【００２０】
例えば、S1サブユニット又はSタンパク質全体はM41以外のIBV血清型のものであり得る。
【００２１】
本発明の第1の態様によるコロナウイルスは、ウイルスが発育卵に投与された際に、胚に対して病原性を示さずにそれが複製可能であるように、野生型コロナウイルスと比較して病原性の低減がされ得ている。
【００２２】
第2の態様では、本発明は、本発明の第1の態様に関連して定義されている改変nsp-3遺伝子を提供する。
【００２３】
第3の態様では、本発明は、本発明の第2の態様による改変nsp-3遺伝子によってコードされるタンパク質を提供する。
【００２４】
第4の態様では、本発明は、本発明の第2の態様による改変nsp-3遺伝子又はアクセサリータンパク質3a及び/若しくは3bの欠失を有する改変遺伝子3を含んでなるプラスミドを提供する。
【００２５】
第5の態様では、本発明は、本発明の第1の態様によるコロナウイルスを作製するための方法であって、次の工程、
(i)本発明の第4の態様によるプラスミドを宿主細胞中にトランスフェクトする工程、
(ii)前記宿主細胞にnsp-3遺伝子及び/又は3遺伝子を有するコロナウイルス株のゲノムを含んでなる組換えウイルスを感染させる工程、
(iii)改変遺伝子を生成するために、前記プラスミド中の遺伝子配列と前記組換えウイルスゲノム中の対応する配列との間で相同組換えを起こさせる工程、及び
(iv)前記改変遺伝子を含んでなる組換えウイルスについて選択する工程
を含んでなる方法を提供する。
【００２６】
前記組換えウイルスはワクシニアウイルスであり得る。
【００２７】
前記方法はまた、
(v)工程(iv)からの組換えウイルスのDNAから前記改変遺伝子を含んでなる組換えコロナウイルスを回収する工程
も含み得る。
【００２８】
第6の態様では、本発明は、本発明の第1の態様によるコロナウイルスを産生可能な細胞を提供する。
【００２９】
第7の態様では、本発明は、本発明の第1の態様によるコロナウイルス及び薬学上許容可能な担体を含んでなるワクチンを提供する。
【００３０】
第8の態様では、本発明は、対象における疾患を治療及び/又は予防するための方法であって、本発明の第7の態様によるワクチンをその対象に投与する工程を含んでなる方法を提供する。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、
・対象における疾患の治療及び/又は予防における使用のための、本発明の第7の態様によるワクチン
・対象における疾患を治療及び/又は予防するためのワクチンの製造における、本発明の第1の態様によるコロナウイルスの使用
を提供する。
【００３２】
前記疾患は伝染性気管支炎(IB)であり得る。
【００３３】
前記ワクチンの投与方法は、点眼投与、鼻腔内投与、飲水投与、孵化後注射及び卵内注射からなる群から選択され得る。
【００３４】
ワクチン接種は卵内ワクチン接種のよるものであり得る。
【００３５】
本発明はまた、本発明の第7の態様によるワクチンを生産するための方法であって、本発明の第6の態様による細胞に本発明の第1の態様によるコロナウイルスを感染させる工程を含んでなる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】rIBV M41K-S-ADRPの生成に使用したプラスミド。
【図２】rIBV M41K-A-ADRPの生成に使用したプラスミド。
【図３】rIBV M41K-del3abの生成に使用したプラスミド。
【図４−１】M41-Kと比較した、rIBV M41K-S-ADRP、rIBV M41K-A-ADRP又はrIBV M41K-del3abで感染した鳥での、A)ラ音、B)複合した呼吸器症状(喘鳴音及びラ音)、C)スニッキング及びD)線毛運動(棒グラフは全て、左から右に、モック、rIBV M41K-A-ADRP、rIBV M41K-S-ADRP、rIBV M41K-del3ab、M41-Kとして示している)。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図４−３】図４−２の続きである。
【図４−４】図４−３の続きである。
【図５】感染4日後の臨床徴候、ウイルス検出及び単離の概要。
【図６】感染6日後の臨床徴候、ウイルス検出及び単離の概要。
【図７】CK細胞における、野生型M41-K6及びM41-CK EP4と比較した、突然変異体M41K-S-ADRP4、M41K-S-ADRP2(S-ADRP変異の複製)及びM41K-A-ADRPの増殖動態。
【図８】CK細胞における、野生型M41-CK及びM41-Kと比較した、突然変異体M41K-del3ab10及びM41K-del3ab1の増殖動態。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、対応する野生型コロナウイルスと比較して病原性を低減させる突然変異体コロナウイルスを提供する。
【００３８】
コロナウイルス
ガンマコロナウイルス属は、コロナウイルス科に属する動物ウイルスの属である。コロナウイルスは、ポジティブセンス一本鎖RNAゲノム及びらせん対称性を有するエンベロープウイルスである
【００３９】
コロナウイルスのゲノムサイズはおよそ27〜32キロベースの範囲であり、これは既知RNAウイルスの最長サイズである。
【００４０】
コロナウイルスは、主に、哺乳類及び鳥類の上気道又は消化管に感染する。5〜6の異なる現在知られているコロナウイルス株はヒトに感染する。最も多く報道されているヒトコロナウイルスである、重症急性呼吸器症候群(severe acute respiratory syndrome)(SARS)を引き起こすSARS-CoVは、上気道及び下気道両方の感染症を引き起こし、胃腸炎も引き起こし得ることから、独自の病因を有している。中東呼吸器症候群コロナウイルス(Middle East respiratory syndrome coronavirus)(MERS-CoV)もまた、ヒトにおいて下気道感染症を引き起こし得る。コロナウイルスは、ヒト成人における全風邪のかなりの割合の原因であると考えられている。
【００４１】
コロナウイルスはまた、家畜動物及び飼いならされたペットにおいて種々の疾患を引き起こし、その一部は重篤であることがあり、飼育産業にとっての脅威である。家畜動物の経済的に重要なコロナウイルスとしては、主にニワトリにおいて呼吸器疾患を引き起こし、世界的に家禽産業に深刻な影響を与える伝染性気管支炎ウイルス(IBV);ブタコロナウイルス(伝染性胃腸炎(transmissible gastroenteritis)、TGE)及びウシコロナウイルス(両ウイルスにより幼若動物において下痢を生じる)が挙げられる。ネココロナウイルスは2つの形態を有し、ネコ腸コロナウイルスは臨床上の重要性が低い病原体であるが、このウイルスの自然突然変異によりネコ感染性腹膜炎(feline infectious peritonitis)(FIP)、すなわち、高い死亡率と関連する疾患となり得る。
【００４２】
イヌコロナウイルス(canine coronavirus)(CCoV)には2種類あり、1つは軽度消化器疾患を引き起こし、1つは呼吸器疾患を引き起こすことが見出されている。マウス肝炎ウイルス(Mouse hepatitis virus)(MHV)は、特に実験用マウスのコロニーの間で、高死亡率の流行性のネズミの病気を引き起こすコロナウイルスである。
【００４３】
コロナウイルスは、以下に示すように4つのグループに分かれる。
アルファ
・イヌコロナウイルス(CCoV)
・ネココロナウイルス(Feline coronavirus)(FeCoV)
・ヒトコロナウイルス229E(Human coronavirus 229E)(HCoV-229E)
・ブタ流行性下痢ウイルス(Porcine epidemic diarrhoea virus)(PEDV)
・伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)
・ヒトコロナウイルスNL63(Human Coronavirus NL63)(NL又はNew Haven)
ベータ
・ウシコロナウイルス(Bovine coronavirus)(BCoV)
・イヌ呼吸器コロナウイルス(Canine respiratory coronavirus)(CRCoV)-東南アジア及びミクロネシアでよく見られる
・ヒトコロナウイルスOC43(Human coronavirus OC43)(HCoV-OC43)
・マウス肝炎ウイルス(MHV)
・ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス(Porcine haemagglutinating encephalomyelitis virus)(HEV)
・ラットコロナウイルス(Rat coronavirus)(RCV)。ラットコロナウイルスはオーストラリア東部でかなり流行しており、2008年3月/4月の時点で、それはネイティブ及び野生の齧歯類コロニーの間で発見された。
・(現在時点で一般名はない)(HCoV-HKU1)
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(Severe acute respiratory syndrome coronavirus)(SARS-CoV)
・中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS-CoV)
ガンマ
・伝染性気管支炎ウイルス(IBV)
・シチメンチョウコロナウイルス(Turkey coronavirus)(紫藍病ウイルス)
・キジコロナウイルス
・ホロホロチョウコロナウイルス
デルタ
・ヒヨドリコロナウイルス(Bulbul coronavirus)(BuCoV)
・ツグミコロナウイルス(Thrush coronavirus)(ThCoV)
・キンパラコロナウイルス(Munia coronavirus)(MuCoV)
・ブタコロナウイルス(Porcine coronavirus)(PorCov)HKU15
【００４４】
本発明の組換えコロナウイルスは、TGEVなどのアルファコロナウイルス、MHVなどのベータコロナウイルス、又はIBVなどのガンマコロナウイルスに由来し得る。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「由来の」は、組換えコロナウイルスが野生型コロナウイルスと実質的に同じヌクレオチド配列を含んでなることを意味する。例えば、本発明の組換えコロナウイルスは、野生型コロナウイルス配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%又は99%の同一性を有し得る。
【００４６】
IBV
トリ伝染性気管支炎(IB)は、重要な経済的損失を引き起こすニワトリの伝染性の高い急性呼吸器疾患である。この疾患は、あえぎ呼吸、咳、くしゃみ、気管ラ音、及び鼻汁を含む呼吸徴候を特徴とする。幼若なニワトリでは、重篤な呼吸困難が起こり得る。産卵系鶏では、呼吸困難、腎炎、卵生産の減少、並びに卵内部の質及び卵殻の質の低下がよく見られる。
【００４７】
ブロイラーでは、咳及びのど鳴りがよく見られる臨床徴候であり、敷地内の総ての鳥に急速に広がる。罹患率は、非ワクチン接種群では100%である。死亡率は、齢、ウイルス株、及び二次的感染症に依存して変化するが、非ワクチン接種群では最大60%であり得る。
【００４８】
同定されるべき最初のIBV血清型はマサチューセッツであったが、米国ではアーカンソー及びデラウェアを含むいくつかの血清型が、最初に同定されるマサチューセッツ型に加えて、現在循環している。
【００４９】
IBV株Beaudetteはニワトリ胚での少なくとも150代継代後に誘導された。IBV Beaudetteは、孵化したニワトリに対してもはや病原性はないが胚を急速に殺す。
【００５０】
H120は、有胚鶏卵でのおよそ120代継代により弱毒化した市販の弱毒化生IBVマサチューセッツ血清型ワクチン株である。H52は、別のマサチューセッツワクチンであり、H120の開発中のより早い段階のわずかに病原性を示す継代ウイルス(52代継代)を表す。H120に基づくワクチンが一般的に使用される。
【００５１】
IB QXは、IBVの毒性の強い野外分離株である。1990年代半ばに中国の青島地域で病気が発生した後に最初に単離されたことから、これは「Chinese QX」としても知られている。その時以来、ウイルスはヨーロッパに向かって広がっていった。2004年からは、非常によく似たウイルスに関して重大な卵の生産問題が西ヨーロッパの一部で、主にオランダで確認され、ドイツ、フランス、ベルギー、デンマークからも、英国でも報告されている。
【００５２】
オランダの症例から単離されたウイルスは、デーフェンテルのオランダ研究所(the Dutch Research Institute)によって、D388と呼ばれる新たな株として同定された。中国とのつながりは、このウイルスがChinese QXウイルスと99%類似していることを示すさらなる試験からきた。弱毒化生QX様IBVワクチン株は現在開発されている。
【００５３】
IBVは、細胞質内で複製し、非分離型の一本鎖ポジティブセンスRNAゲノムを含むエンベロープウイルスである。IBVは、27.6kbのRNAゲノムを有し、総てのコロナウイルスと同様に、4つの構造タンパク質;スパイク糖タンパク質(S)、小型膜タンパク質(E)、内在性膜タンパク質(M)及びゲノムRNAと相互作用するヌクレオキャプシドタンパク質(N)を含む。
【００５４】
ゲノムは以下のように構成されている:5'UTR-ポリメラーゼ(レプリカーゼ)遺伝子-構造タンパク質遺伝子(S-E-M-N)-UTR 3'、ここで、UTRは非翻訳領域である(それぞれIBV中約500ヌクレオチド)。
【００５５】
脂質エンベロープは、3つの膜タンパク質:S、M及びEを含む。IBV Sタンパク質は、小胞体内でオリゴマー化し、膜貫通ドメインを介してビリオン膜に挿入されるホモトリマーに組み立てられ、Mタンパク質と非共有結合性相互作用により会合されるI型糖タンパク質である。コロナウイルス粒子に組み込まれた後、Sタンパク質は標的細胞受容体との結合並びにウイルス膜と細胞膜との融合に関与する。S糖タンパク質は4つのドメインからなる。合成中に切断されるシグナル配列;ビリオン粒子の外側に存在するエクトドメイン;ビリオン粒子の脂質二重層中にSタンパク質を固定する役割を果たす膜貫通領域;及び細胞質尾部。
【００５６】
本発明の組換えコロナウイルスは、IBVに由来し得る。例えば、IBVはIBV Beaudette、H120、H52、IB QX、D388又はM41であり得る。
【００５７】
IBVはIBV M41であり得る。M41は、1941年にUSAで単離されたプロトタイプのマサチューセッツ血清型である。これは、病原性の実験室株(a pathogenic lab stain)として世界中の多くの研究室で使用されている分離株であり、ATCCから得ることができる(VR-21(商標))。弱毒化変異体はまた、この分野で問題を引き起こすマサチューセッツ血清型に対するIBVワクチンとしていくつかのワクチン生産者によって使用されている。本発明者らは、何年もこのウイルスに取り組んできたため、完全ウイルスゲノムの配列が入手可能であることから、この株を使用することを選択した。本発明者らが使用したM41分離株、M41-CKは、初代ニワトリ腎臓(chick kidney)(CK)細胞で増殖するように適合されており、そのため、完全ゲノムのcDNAからの感染性ウイルスとしての回収に適していると考えられた。それは病原性IBVの代表であり、したがって、病原性の喪失又は低減のいずれかを引き起こす突然変異について解析することができる。
【００５８】
IBV M41-CKのゲノム配列は配列番号1として示される。
【００５９】
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【００６０】
アクセサリータンパク質
総てのコロナウイルスは、in vitroでの複製に必要ではないが病因において役割を果たし得る機能不明のアクセサリータンパク質遺伝子セットをコードする。IBVは、2つのアクセサリー遺伝子、遺伝子3及び5をコードし、これら両方はそれぞれ2つのアクセサリータンパク質3a、3b及び5a、5bを発現する。
【００６１】
IBV MK41の遺伝子3のヌクレオチド配列並びにアクセサリータンパク質3a及び3bのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号2〜4として提供される。
【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
レプリカーゼ
構造遺伝子及びアクセサリー遺伝子に加えて、コロナウイルスゲノムの3分の2は、2つのポリタンパク質、pp1a及びpp1abとして発現されるレプリカーゼ遺伝子を(ゲノムの5'末端に)含んでなり、ここで、pp1abは-1リボゾームシフト機構の結果としてのpp1aの伸長産物である。2つのポリタンパク質は2種のウイルスコード化プロテイナーゼによって切断され、通常、16種類の非構造タンパク質(nsp1〜16)を生じる。IBVはnsp1を欠き、それによりnsp2〜16をコードする。
【００６６】
したがって、IBV中の遺伝子1は、RNA複製及び転写に関連する15種類の非構造タンパク質(他のコロナウイルスでは16種類)(nsp2〜16)をコードする。
【００６７】
用語「レプリカーゼタンパク質」は、本明細書では、ポリタンパク質pp1a及びpp1ab又は個々のnspサブユニットを意味するために使用される。
【００６８】
用語「レプリカーゼ遺伝子」は、本明細書では、レプリカーゼタンパク質をコードする核酸配列を意味するために使用される。
【００６９】
コロナウイルスnspタンパク質の機能の概要を表1に示す。
【００７０】
【表１】
2019503693.tif 000015
【００７１】
nsp-3は、不規則なリンカーによって隔てられている、ユビキチン様ドメイン、酸性ドメイン、パパイン様プロテアーゼ(PL pro)ドメイン、複数回膜貫通ドメイン及びマクロドメインを含む数多くの異なるドメインからなる大型のタンパク質である。マクロドメインは、nsp-3のN末端に位置する、ヘリックスに挟まれた中央にシートを有する球状ドメインである。これはADP-リボース-1-ホスファターゼ(ADRP)活性を含み、様々な形態のADP-リボースに結合する。このドメインは、コロナウイルスにおいて高度に保存されているが、他のウイルス科では僅かしかみられない。
【００７２】
IBV M41のnsp-3のヌクレオチド及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号5及び6として提供される。
【００７３】
2019503693.tif 000016
2019503693.tif 000017
【００７４】
2019503693.tif 000018
【００７５】
病原性の低減
本発明の弱毒化生コロナウイルスは、対応する野生型コロナウイルスと比較して該ウイルスの病原性を低減させる少なくとも1つの突然変異を含んでなる。
【００７６】
本明細書で使用される用語「弱毒化」は、前記病原性低減を示し、非毒性として分類され得るウイルスを意味する。弱毒化生ウイルスは、実際の病気を引き起こさないが免疫応答を刺激し、免疫をもたらすことがまだ可能である弱められた複製ウイルスである。
【００７７】
用語「病原性」は、本明細書において、その通常の意味に従って、対象において疾患を引き起こすウイルスの可能性を意味するために使用される。典型的には、コロナウイルスの病原性は、疾患に関連する症状、例えば、喘鳴音、スニッキング及び気管線毛運動低下をアッセイすることによって決定される。
【００７８】
用語「病原性の低減」は、コロナウイルスの病原性のレベルが対応する野生型コロナウイルスと比較して低下することを記載するために使用される。
【００７９】
1つの実施形態では、本発明のコロナウイルスは、それが由来する親M41-CKウイルス又は対照コロナウイルスと比較して病原性が低減されている。対照コロナウイルスは、既知の病原性を有するコロナウイルスであり得る。
【００８０】
コロナウイルスの病原性は、当技術分野で周知の方法を利用して評価し得る。典型的には、病原性は、ウイルスを投与した対象、例えば、ニワトリにおいて臨床症状をアッセイすることによって評価される。
【００８１】
例として、ニワトリは、8〜24日齢で鼻腔又は眼接種によりウイルス投与をすることができる。IBV感染に関連する臨床症状は、感染3〜10日後に評価し得る。コロナウイルス、例えば、IBVの病原性を決定するために一般的に評価される臨床症状には、あえぎ呼吸、咳、喘鳴音、スニッキング、抑鬱、羽の逆立て及び気管線毛運動低下が含まれる。
【００８２】
本発明の弱毒化コロナウイルスは、対応する野生型コロナウイルスと比較して臨床症状のレベルを低減させ得る。
【００８３】
例えば、弱毒化コロナウイルスは、野生型ウイルスによって引き起こされるスニックの数の90%未満、80%未満、70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満又は10%未満の、1羽当たり1分間当たりのスニックの数を引き起こし得る。
【００８４】
本発明による弱毒化コロナウイルスは、野生型ウイルスに感染した群の鳥の数の70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満又は10%未満に喘鳴音を引き起こし得る。
【００８５】
本発明による弱毒化コロナウイルスは、感染していない鳥での気管線毛運動のレベルの少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%である気管線毛運動をもたらし得る。
【００８６】
本発明による弱毒化コロナウイルスは、野生型コロナウイルスよりも低いレベルで、表2に定義される臨床症状を引き起こし得る。
【００８７】
【表２】
2019503693.tif 000019
【００８８】
本発明の弱毒化コロナウイルスは、卵内で非病原レベルで複製し得る。
【００８９】
卵内のニワトリ胚に投与するワクチンを開発する際には、ワクチンに対する母体抗体の影響と胚に対するワクチンの影響の2点に注意を払わなければならない。母体抗体は能動免疫に干渉することが知られている。例えば、弱毒系統を用いたワクチンは、母体抗体とともにブロイラー種のニワトリに投与すると、これらの株は母体抗体プールにより中和されるので、防護的抗体レベルを誘導しない。
【００９０】
したがって、ウイルス粒子は、それがウイルスに対する母体由来抗体のより中和されないように、複製及び増殖において十分に効率的でなければならない。母体由来抗体は有効抗体の有限プールであり、それはニワトリの齢とともに減少し、この様式でのウイルスの中和は、胚/ニワトリの長期免疫の確立には釣り合わない。ウイルスに対する長期免疫を発達させるためには、胚及び孵化したニワトリは、母体由来抗体の効果とは異なる適切な防御免疫応答を発達させなければならない。
【００９１】
卵内ワクチン接種に有用であるためには、ウイルスは、それを胚に対して病原性とするレベルで複製及び増殖してはならない。
【００９２】
胚に対する病原性の低減は、その弱毒化コロナウイルスが、対応する野生型対照コロナウイルスと比較して孵化率の低下を少なくすることを意味する。よって、用語「胚に対して病原性を示さずに」は、本発明に関して、対照コロナウイルスと比較した場合に「孵化率の低下を生じずに」を意味し得る。
【００９３】
好適な弱毒化コロナウイルスは、当技術分野で公知の方法を用いて同定され得る。例えば、母体由来抗体を伴った又は伴わない胚の卵内ワクチン接種の後に比較ウイルス投与試験を行ってもよい(すなわち、この場合、産卵鶏をIBVに対してワクチン接種したか、又はしなかった)。
【００９４】
高すぎるレベルで弱毒化コロナウイルスが増殖するとすれば、胚は孵化しないか、又は孵化後に存続しない(すなわち、ウイルスは胚に対して病原性を示す)。胚に対して病原性を示すウイルスは胚を殺す場合がある。
【００９５】
弱毒化コロナウイルスがウイルス複製及び増殖に大きすぎる低減を示せば、そのウイルスは母体由来抗体により中和される。したがって、ウイルスに対して効果的な免疫が惹起できなかったために、その後のニワトリのIBV投与の結果、臨床症状(例えば、喘鳴音、スニッキング、線毛運動の低下)が生じ、ウイルスを投与した鶏に疾患が発症する。
【００９６】
変異体
本明細書で使用する場合、用語「変異体」は、「突然変異体」と同義であり、対応する野生型配列と比較して異なる核酸配列又はアミノ酸配列を意味する。
【００９７】
変異型/突然変異型配列は、天然に生じ得るか、又は人為的に作出され得る(例えば、部位特異的突然変異誘発による)。突然変異体は、野生型配列の対応する部分と少なくとも70、80、90、95、98又は99%の配列同一性を持ち得る。突然変異体は、野生型配列の対応する部分に20、10、5、4、3、2又は1つの突然変異を持ち得る。
【００９８】
用語「野生型」は、それぞれ天然遺伝子又はタンパク質(すなわち、ウイルス遺伝子又はタンパク質)と同一のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を有する遺伝子又はタンパク質を意味するために使用される。
【００９９】
同一性の比較は目により、又はより通常には容易に入手可能な配列比較プログラムの助けで行うことができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、2以上の配列間の同一性%を計算することができる。このようなアラインメントを実行するため好適なコンピュータープログラムとしては、GCG Wisconsin Bestfitパッケージ(ウイスコンシン大学、U.S.A.;Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387)である。配列比較を実行することができる他のソフトウエアの例として、限定されるものではないが、BLASTパッケージ(Ausubel et al., 1999 ibid - Chapter 18参照)、FASTA(Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410)及び比較ツールClustalXのGENEWORKSスーツ(Larkin et al. (2007) Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23:2947-2948参照)が挙げられる。BLAST及びFASTAはいずれもオフライン及びオンライン検索で利用可能である(Ausubel et al., 1999同書, 7-58〜7-60参照)。しかしながら、適用によっては、GCG Bestfitプログラムを使用することが好ましい。BLAST2 Sequencesと呼ばれる新ツールもまたタンパク質及びヌクレオチド配列を比較するために利用可能である(FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 and tatiana@ncbi.nlm.nih.gov参照)。
【０１００】
配列はまた、サイレント変異を作出して機能的に同等の分子が得られるアミノ酸残基の1以上の欠失、挿入、又は置換を有してもよい。活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び/又は両親媒性の類似性に基づいて意図的なアミノ酸置換を行ってもよい。例えば、負電荷アミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正電荷アミノ酸にはリジン及びアルギンが含まれ、類似の親水性値を有する非荷電極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。
【０１０１】
保存的置換は、例えば、下記の表に従って行える。第2列の同じブロック内の、好ましくは、第3列の同列のアミノ酸は互いに置換可能である。
【０１０２】
2019503693.tif 000020
【０１０３】
Ammayappanら(Arch Virol (2009) 154:495-499)は、IBV株アーカンソーDPIの弱毒化に寄与する配列変化の同定を報告している。この研究では、発育卵でのウイルスの多回、およそ100回の継代の後の、様々なIBVタンパク質において17のアミノ酸変化が同定された。弱毒化ウイルス(Ark DPI 101)が卵内で、胚に対して病原性を示さずに、ウイルスに対する母体由来抗体の存在下で複製可能であるかどうかは検討されなかった。このウイルスが古典的IBVワクチンの方法論と同様にSPF発育卵での多回継代により生産されたことを考えれば、このウイルスは胚に対して病原性を示す可能性がある。このウイルスはまた、雌鳥が同じ血清型で接種を受けていれば、母体由来抗体に対して感受性であり得る。
【０１０４】
本発明のコロナウイルスは、野生型コロナウイルスと比較して突然変異がウイルスの病原性を低減させる、非構造タンパク質nsp-3における突然変異並びに/又はアクセサリータンパク質3a及び/若しくは3bの欠失を含んでなる。
【０１０５】
前記nsp-3における突然変異は、nsp-3のアデノシン二リン酸-リボース-1'-ホスファターゼ(ADRP)領域における突然変異を含んでなり得る。前記nsp-3のADRP領域は、配列番号6の残基332から491(例えば、配列番号5のヌクレオチド994から1473によりコードされる)を含んでなり得る又はからなり得る。したがって、前記nsp-3における突然変異は、配列番号6の332位から491位として示されたアミノ酸と比較して、1以上のアミノ酸突然変異を含んでなり得る。前記nsp-3における突然変異は、配列番号6の332位から491位、350位から470位、350位から450位、350位から425位、350位から400位、350位から380位、360位から380位又は370位から380位として示されたアミノ酸と比較して、1以上のアミノ酸突然変異を含んでなり得る。前記nsp-3における突然変異は、配列番号6の370位から380位として示されたアミノ酸と比較して、1以上のアミノ酸突然変異を含んでなり得る。
【０１０６】
前記nsp-3における突然変異は、
a)配列番号6の373位でのAsn(N)からAla(A)、及び
b)配列番号6の379位でのGly(G)からSer(S)
のリストから選択される1以上のアミノ酸突然変異を含んでなり得る。
【０１０７】
前記nsp-3における突然変異は、本明細書に記載のアミノ酸突然変異をコードする1以上のヌクレオチド置換を含んでなり得る。
【０１０８】
前記nsp-3における突然変異は、
a)配列番号5として示された配列と比較して、ヌクレオチド1116位でのAからG及びヌクレオチド1117位でのAからC、並びに
b)配列番号5として示された配列と比較して、ヌクレオチドでの1138位GからA
のリストから選択される1以上のヌクレオチド置換を含んでなり得る。
【０１０９】
本明細書で使用する場合、用語「置換」は、用語「突然変異」と同義であり、特定された位置のヌクレオチドが野生型ヌクレオチド配列のものと異なることを意味する。
【０１１０】
前記nsp-3における突然変異は、配列番号3の373位でのAsn(N)からAla(A)へのアミノ酸突然変異を含んでなり得る。
【０１１１】
前記nsp-3における突然変異は、配列番号3の379位でのGly(G)からSer(S)へのアミノ酸突然変異を含んでなり得る。
【０１１２】
前記nsp-3における突然変異は、配列番号3の373位でのAsn(N)からAla(A)及び配列番号3の379位でのGly(G)からSer(S)へのアミノ酸突然変異を含んでなり得る。
【０１１３】
前記弱毒化コロナウイルスはまた、ヌクレオチドのレベルで定義し得る。
【０１１４】
例えば、本発明の弱毒化コロナウイルスヌクレオチド配列は、
a)配列番号5として示される配列と比較して、ヌクレオチド1116位でのAからG及びヌクレオチド1117位でのAからC、並びに
b)配列番号5として示される配列と比較して、ヌクレオチド1138位でのGからA
のリストから選択される1以上の突然変異を含んでなり得る。
【０１１５】
前記nsp-3における突然変異は、配列番号5として示される配列と比較して、ヌクレオチド1116位でのAからG及びヌクレオチド1117位でのAからCへの突然変異を含んでなり得る。
【０１１６】
前記nsp-3における突然変異は、配列番号5として示される配列と比較して、ヌクレオチド1138位でのGからAへの突然変異を含んでなり得る。
【０１１７】
前記nsp-3における突然変異は、配列番号5として示される配列と比較して、ヌクレオチド1116位でのAからG、ヌクレオチド1117位でのAからC及びヌクレオチド1138位でのGからAへの突然変異を含んでなり得る。
【０１１８】
本発明の弱毒化生コロナウイルスは、アクセサリータンパク質3a及び/又は3bの欠失を含んでなり得る。この突然変異は、遺伝子3の部分的な又は完全な欠失によりなし得る。したがって、本発明の1つの態様では、アクセサリータンパク質3aの全部又は一部が欠失している。本発明の別の態様によると、アクセサリータンパク質3bの全部又は一部が欠失している。本発明のさらなる態様では、アクセサリータンパク質3a及び3b両方の全部又は一部が欠失している。本発明の1つの態様では、アクセサリータンパク質3aが欠失している。本発明の別の態様によると、アクセサリータンパク質3bが欠失している。本発明のさらなる態様では、アクセサリータンパク質3a及び3bがいずれも欠失している。
【０１１９】
アクセサリータンパク質3a及び3bの欠失は、配列番号2として示される遺伝子3配列のヌクレオチド約37位から約384位までの欠失を含んでなり得る。アクセサリータンパク質3a及び3bの欠失は、配列番号2として示される遺伝子3配列のヌクレオチド37位から384位までの欠失を含んでなり得る。
【０１２０】
アクセサリータンパク質3a及び3bの欠失は、配列番号1として示されるIBV M41-CK配列のヌクレオチド約23867位から約24214位までの欠失を含んでなり得る。アクセサリータンパク質3a及び3bの欠失は、配列番号1として示されるIBV M41-CK配列のヌクレオチド23867位から24214位までの欠失を含んでなり得る。
【０１２１】
ヌクレオチド配列は、上記のリストに挙げたヌクレオチド突然変異の任意の組合せを含んでなり得る。
【０１２２】
1つの実施形態では、本発明のコロナウイルスは、非構造タンパク質nsp-3における突然変異並びにアクセサリータンパク質3a及び/又は3bの欠失を含んでなり得る。
【０１２３】
さらなる実施形態では、本発明のコロナウイルスは、nsp-3のADRP領域における突然変異並びにアクセサリータンパク質3a及び3bの欠失を含んでなり得る。
【０１２４】
例えば、本発明の弱毒化コロナウイルスのヌクレオチド配列は、次の突然変異、
a)配列番号5として示される配列と比較して、ヌクレオチド1116位でのAからG及びヌクレオチド1117位でのAからC、並びに/又は
b)配列番号5として示される配列と比較して、ヌクレオチド1138位でのGからA、並びに
c)配列番号2として示される遺伝子3配列のヌクレオチド37位から384位までの欠失
を含んでなり得る。
【０１２５】
前記ヌクレオチド配列は、Ammayappanら(上記)により報告されているC12008T置換に相当する置換を含まなくてよい。
【０１２６】
ヌクレオチド配列は、天然、合成又は組換えであり得る。ヌクレオチド配列は、二本酸又は一本鎖であり得、DNA又はRNA又はそれらの組合せであり得る。ヌクレオチド配列は、例えば、cDNA、PCR産物、ゲノム配列又はmRNAであり得る。
【０１２７】
ヌクレオチド配列は、選択された宿主/宿主細胞での生産に関してコドンが最適化されていてもよい。
【０１２８】
ヌクレオチド配列は、単離されてもよいし、又はプラスミド、ウイルス又は宿主細胞の一部であってもよい。
【０１２９】
プラスミド
プラスミドは、染色体DNAとは別の染色体外DNA分子であり、染色体DNAとは独立に複製することができる。プラスミドは通常、環状で二本鎖である。
【０１３０】
プラスミド、又はベクター(それらが時に既知である場合)は、宿主細胞でタンパク質を発現させるために使用され得る。例えば、特定のタンパク質を発現させるために、細菌宿主細胞を、特定のタンパク質をコードし得るプラスミドでトランスフェクトすればよい。この用語にはまた、より長いDNA部分を収容することができる酵母人工染色体及び細菌人工染色体も含まれる。
【０１３１】
本発明のプラスミドは、弱毒化コロナウイルスの定義された領域をコードし得るヌクレオチド配列を含んでなる。本プラスミドはまた、1以上の付加的コロナウイルスヌクレオチド配列、又は1以上の他のコロナウイルスタンパク質、例えば、S遺伝子をコードし得るヌクレオチド配列も含んでなり得る。
【０１３２】
本プラスミドはまた、キサンチン及びヒポキサンチンの存在下でミコフェノール酸(MPA)耐性を付与し、かつ、ワクシニアウイルスP7.5前期/後期プロモーターによって制御される、大腸菌(Escherichia coli)由来グアニンキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(gpt)などの耐性マーカーも含んでなる。
【０１３３】
組換えワクシニアウイルス
本発明はまた、本明細書で定義される変異型遺伝子を含んでなる組換えワクシニアウイルス(rVV)に関する。
【０１３４】
組換えワクシニアウイルス(rVV)は、逆遺伝学系に基づきワクシニアウイルスを用いて作製してもよい。
【０１３５】
この点に関して、本発明はまた、
(i)前の項に記載のプラスミドを宿主細胞中にトランスフェクトする工程、
(ii)前記宿主細胞にnsp-3遺伝子又は遺伝子3を有するコロナウイルス株のゲノムを含んでなる組換えウイルスを感染させる工程、
(iii)改変遺伝子を生成するために、前記プラスミド中の遺伝子配列と前記組換えウイルスゲノム中の対応する配列との間で相同組換えを起こさせる工程、
(iv)前記改変遺伝子を含んでなる組換えウイルスについて選択する工程
によりウイルス粒子を作製するための方法を提供する。
【０１３６】
用語「改変遺伝子」は、本発明の第1の態様に関して記載されているように突然変異を含んでなるnsp-3遺伝子又は遺伝子3を意味する。具体的には、この用語は、野生型遺伝子に由来するが、それに本明細書で定義される変異型タンパク質をコードさせるか、又は遺伝子3の場合はタンパク質3a及び3bの一部若しくは全部をコードさせるわけではないヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子を意味する。
【０１３７】
前記組換えは、改変遺伝子の全部を含んでも、又は一部を含んでもよい。組換えは、上記で定義されるように、アミノ酸突然変異をコードするか又はヌクレオチド置換を含んでなるヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１３８】
コロナウイルス株のゲノムは、プラスミドにより提供される部分に相当するタンパク質の部分を欠いていてもよく、これにより、プラスミドにより提供されるヌクレオチド配列の挿入を介して改変タンパク質が形成される。
【０１３９】
組換えウイルスは、そのゲノムとプラスミドの間の相同組換えを可能とするのに好適なものである。ワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルスゲノムの配列の挿入及び欠失に相同組換えが通常用いられるので、特に好適である。
【０１４０】
上記方法は、所望により、
(v)工程(iv)からの組換えウイルスのDNAから前記改変遺伝子を含んでなる組換えコロナウイルスを回収する工程を含む。
【０１４１】
組換えIBVなどの組換えコロナウイルスを回収するための方法は当技術分野で公知である(Britton et al (2005)24参照;及びPCT/GB2010/001293参照)。
【０１４２】
例えば、工程(iv)からの組換えウイルスに由来するDNAをプラスミドに挿入し、細胞質T7 RNAポリメラーゼを発現する細胞をトランスフェクトするために使用することができる。これらの細胞に、例えば、T7 RNAポリメラーゼを発現する鶏痘ウイルスを予め感染させてもよい。次に、組換えコロナウイルスは、例えば増殖培地から単離され得る。
【０１４３】
プラスミドがワクシニアウイルスゲノムに挿入される場合には、不安定な中間体が形成される。プラスミドを含んでなる組換え体は、例えばプラスミド上の耐性マーカーを用いて選択され得る。
【０１４４】
次に、陽性組換え体は、例えばPCR及びシーケンシングにより改変遺伝子を含有することが確認され得る。
【０１４５】
工程(v)を行うために、改変遺伝子を含む組換えウイルス(例えば、組換えワクシニアウイルス(rVV))の多量の原株を増殖させ、DNAを抽出することができる。
【０１４６】
好適な逆遺伝学系は当技術分野で公知である(Casais et al (2001) J. Virol 75:12359-12369; Casais et al (2003) J. Virol. 77:9084-9089; Britton et al (2005) J. Virological Methods 123:203-211; Armesto et al (2008) Methods in Molecular Biology 454:255-273)。
【０１４７】
細胞
コロナウイルスは、細胞に感染させるために使用可能である。
【０１４８】
コロナウイルス粒子は、例えば、上清から、当技術分野で公知の方法により採取し、場合により精製することができる。
【０１４９】
この細胞をコロナウイルス粒子を生産するために使用することができる。
【０１５０】
よって、本発明はまた、次の工程:
(i)細胞に本発明によるコロナウイルスを感染させる工程、
(ii)前記細胞での前記ウイルスの複製を可能にする工程、及び
(iii)後代ウイルスを採取する工程
を含んでなる、コロナウイルスの生産方法を提供する。
【０１５１】
本発明はまた、逆遺伝学系を用いて本発明によるコロナウイルスを産生可能な細胞を提供する。例えば、これらの細胞は、本発明の改変遺伝子をコードし得るヌクレオチド配列を含んでなる組換えウイルスゲノムを含んでなり得る。
【０１５２】
この細胞は、突然変異を含有する組換えウイルス(例えば、ワクシニアウイルス)を産生可能であり得る。
【０１５３】
あるいは、この細胞は、逆遺伝学系により組換えコロナウイルスを産生可能であり得る。この細胞は、組換えウイルス粒子を救済するためにT7ポリメラーゼを発現し得るか、又は発現が誘導され得る。
【０１５４】
ワクチン
コロナウイルスは、ワクチンを生産するために使用可能である。ワクチンは、本発明のコロナウイルスの生きた弱毒化型であり得、薬学上許容可能な担体をさらに含んでなり得る。本明細書で定義される本発明での使用に好適な「薬学上許容可能な担体」は当業者に周知である。このような担体としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水、緩衝生理食塩水、リン酸バッファー、アルコール/水溶液、エマルション又は懸濁液が含まれる。他の慣用されている希釈剤及び賦形剤は、従来の技術に従って添加可能である。このような担体としては、エタノール、ポリオール、及びそれらの好適な混合物、植物油、並びに注射可能な有機エステルを含み得る。バッファー及びpH調整剤もまた使用可能である。バッファーとしては、限定されるものではないが、有機酸又は塩基から調製される塩が含まれる。代表的なバッファーとしては、限定されるものではないが、有機酸塩、例えば、クエン酸の塩、例えば、クエン酸バッファー、アスコルビン酸バッファー、グルコン酸バッファー、ヒスチジン-Helバッファー、炭酸バッファー、酒石酸バッファー、コハク酸バッファー、酢酸バッファー、又はフタル酸バッファー、Trisバッファー、塩酸トリメタンミン(trimethanmine)バッファー、又はリン酸バッファーが含まれる。非経口担体としては、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖加リンゲル液、デキストロース、トレハロース、スクロース、及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液又は硬化油を含み得る。静脈内担体としては、体液及び栄養補給液、電解質補給液、例えば、ブドウ糖加リンゲル液に基づくものなどを含み得る。保存剤及びその他の添加剤、例えば、抗微生物剤、酸化防止剤、キレート剤(例えばEDTA)、不活性ガスなども医薬担体中に提供され得る。本発明は、担体の選択により限定されない。上記成分からの、適当なpH、等張性(appropriate pH isotonicity)、安定性及び他の慣例の特徴を有する、これらの薬学上許容可能な組成物の調製は当技術分野の技術の範囲内である。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy,  第20版, Lippincott Williams & Wilkins, pub!., 2000; and The Handbook of Pharmaceutical Excipients,  第4版, R. C. Rowe et al編, APhA Publications, 2003などの教本を参照。
【０１５５】
本発明のワクチンは、「治療上有効な量」で投与され、これは、対象又は患者に投与された際に有益な又は所望の結果を果たすのに十分な有効成分、例えば、本発明による薬剤の量を意味する。有効量は、1回以上の投与、適用又は用量で投与され得る。本発明による組成物の治療上有効な量は、当業者により容易に決定され得る。本発明に関して「治療上有効な量」は、伝染性気管支炎の病態に関連する1以上のパラメーターにおいて、客観的に測定される有益な又は所望の結果を果たすのに十分な変化を生じる量である。有効量は1回以上の投与で投与することができる。本発明の目的では、有効量の薬物、化合物、又は医薬組成物は、伝染性気管支炎の罹患率を低減するのに十分な量である。本明細書で使用する場合、用語「治療上」とは、疾患、病態又は障害に対する処置の全域を包含する。本発明の「治療」薬は、リスクがあると特定され得る動物を標的とするように設計された手順(薬理遺伝学)を組み込んだものを含む、防止又は予防的な様式で、又は本質的に改善的若しくは治癒的である様式で働き得るか、あるいは処置される疾患若しくは障害の少なくとも1つの症状の進行の速度若しくは程度緩徐化するために働き得る。
【０１５６】
本発明はまた、細胞、例えば、Vero細胞に、本発明の第1の態様に関連して定義されている改変タンパク質を含んでなるウイルス粒子を感染させる工程を含んでなる、このようなワクチンの生産方法に関する。
【０１５７】
ワクチン接種法
本発明のコロナウイルスは、疾患を治療及び/又は予防するために使用され得る。
【０１５８】
「治療する」ことは、疾患に関連する少なくとも1つの症状を減らす、軽減する若しくは改善するため、及び/又は疾患の進行を緩徐化、低減若しくは遮断するために、既存の疾患を有する対象にワクチンを投与することを意味する。
【０１５９】
「予防する」ことは、まだ疾患に罹っていない対象及び/又は疾患のいずれの症状も示していない対象に、疾患の過程(例えば感染)を予防する若しくは傷害するため、又は疾患に関連する少なくとも1つの症状の発生を軽減若しくは予防するためにワクチンを投与することを意味する。
【０１６０】
疾患は、コロナウイルスにより引き起こされる任意の疾患、例えば、ヒトにおける呼吸器疾患及び/又は胃腸炎、並びに他の動物における肝炎、胃腸炎、脳炎、若しくは呼吸器疾患であり得る。
【０１６１】
疾患は、伝染性気管支炎(IB);ブタ伝染性下痢症;伝染性胃腸炎;マウス肝炎ウイルス;ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎;重症急性呼吸器症候群(SARS);又は紫藍病であり得る。
【０１６２】
疾患は伝染性気管支炎であり得る。
【０１６３】
ワクチンは、孵化したヒヨコ又は親鳥に、例えば、点眼剤又は鼻腔内投与に投与され得る。厳密ではあるが、これらの方法は、例えば大きなブロイラー群にはコストがかかり得る。別法としては、噴霧接種又は飲料水への投与を含むが、このような方法を用いて均一なワクチン適用を保証するのは困難であり得る。
【０１６４】
ワクチンは、眼内用の点眼剤などのその投与に好適な形態で提供してもよい。
【０１６５】
ワクチンは、卵内接種、例えば、発育卵への注射によって投与してもよい。卵内ワクチン接種は、疾患に早期耐性を提供するという利点を持つ。卵内接種はまた、噴霧接種及び飲料水を介した投与とは異なり、各対象に均一な用量の投与を助長する。
【０１６６】
ワクチンは、尿膜腔液、卵黄嚢、羊膜、気室又は胚を含む、卵の任意の好適な区画に投与してよい。ワクチンは卵殻(気室)膜下及び漿尿膜下に投与してよい。
【０１６７】
通常、ワクチンは、胚発生の後期、一般に、孵卵期間の最後の4分の1の間、例えば、孵化前3〜4日に発育卵に注入する。ニワトリでは、ワクチンは、21日の孵卵期間の15〜19日の間、例えば、17日目又は18日目に投与され得る。
【０１６８】
この工程は、WO2004/078203に記載されているものなどのロボット注入法を用いて自動化することができる。
【０１６９】
ワクチンは、1以上の他のワクチン、例えば、ニューカッスル病ウイルス(NDV)などの他の疾患のワクチンとともに投与してよい。本発明はまた、本発明によるワクチンを1以上の他のワクチンとともに含んでなるワクチン組成物を提供する。本発明はまた、本発明によるワクチンを、個別、逐次又は同時投与のための1以上の他のワクチンとともに含んでなるキットも提供する。
【０１７０】
本発明のワクチン又はワクチン組成物は、ヒト、動物又は鳥類対象を処置するために使用可能である。例えば、対象はヒヨコ、ニワトリ又はマウス(例えば、実験用マウス、例えば、トランスジェニックマウス)であり得る。
【０１７１】
一般に、医師又は獣医は、個々の対象又は対象群に最も好適な実際の用量を決定し、特定の対象の齢、体重及び応答によって変更する。
【０１７２】
本組成物は、場合により、薬学上許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又はアジュバントを含んでなり得る。医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択肢は、意図される投与経路及び標準的な製薬慣行に関して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として(又はそれに加えて)、任意の好適な結合剤、滑沢剤、沈殿防止剤、着色剤、可溶化剤、及びウイルスの送達又は免疫原性を補助又は増強し得るその他の担体薬剤を含んでなってよい。
【０１７３】
用語の定義は、本明細書全般にわたる。代表的な実施形態をさらに詳述する前に、本開示は記述される特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって、当然、変更し得ることを理解されるべきである。また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることとなるため、本明細書で使用する専門用語は、特定の実施形態の記述のみを目的とするものであり、限定することを意図するものではないことを理解されるべきである。
【０１７４】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術的及び科学的用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。当業者は、Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY、第20版、John Wiley and Sons、New York (1994)、及びHale & Marham、THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY、Harper Perennial、NY (1991)により、本開示で使用される用語の多くを包括した辞書が得られる。
【０１７５】
本開示は、本明細書に開示した代表的な方法及び材料により限定されるものではなく、本明細書に記載のこれらと同様の又は等価の任意の方法及び材料が本開示の実施形態の実施又は試験で使用され得る。数値範囲は、範囲を画定する数を含める。特段の指示がない限り、いずれの核酸配列も5'から3'方向で左から右に記し、アミノ酸配列はアミノからカルボキシ方向で左から右にそれぞれ記す。
【０１７６】
値の範囲が提供される場合、範囲の上限と下限との間に介在する各値も、文脈上明らかに別段の指示がない限り下限の単位の十分の一まで、具体的に開示されると理解されたい。指定範囲内の任意の指定値又は介在値とその指定範囲内の任意の別の指定値又は介在値との間のそれぞれのより小さい範囲は、本開示の中に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、その範囲に独立して含まれても又は排除されてもよく、上限及び下限のどちらかが含まれる、どちらも含まれない又はどちらも含まれる各範囲は、指定範囲における任意の具体的な排除条件に従って本開示の中に包含される。指定範囲が限度の一方を又はどちらも含む場合、これらの含まれる限度のどちらか又はどちらも除く範囲もまた本開示の中に含まれる。
【０１７７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含むことを留意しなければならない。したがって、例えば、「an enzyme(酵素)」に関しては、当業者に既知の複数のこのような候補薬剤及びそれらの等価物などが含まれる。
【０１７８】
用語「comprising(含んでなる)」「comprises(含んでなる)」及び「comprised of(から構成される)」は、本明細書で使用する場合、「including(含む)」、「includes(含む)」又は「containing(含む)」、「contains(含む)」と同義であり、包括的又は無制限なものであり、追加の、記載されていない部材、要素又は方法工程を排除しない。用語「comprising(含んでなる)」、「comprises(含んでなる)」及び「comprised of(から構成される)」はまた、用語「consisting of(からなる)」も含む。
【０１７９】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、これらの実施例は、本発明を実施する上で当業者を補助するために役立てることを意図し、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０１８０】
[実施例1]
M41-CKに基づくIBV逆遺伝学系の作出
M41-CK全長cDNAは、PCT/GB2010/001293(引用することにより本明細書の一部とする)に従前に記載されているワクシニアウイルス逆遺伝学系におけるBeaudette cDNAをM41コンセンサス配列から誘導された合成cDNAで置換することによって作製した。
【０１８１】
IBV Beaudette株由来のレプリカーゼと構造遺伝子及びアクセサリー遺伝子とIBV M41-CK由来の3' UTRからなった、Armesto, Cavanagh and Britton (2009). PLoS ONE 4(10): e7384. doi:10.1371/journal.pone.0007384に記載の組換えワクシニアウイルス(rVV)内のIBV cDNA、rVV-BeauR-Rep-M41構造を、Beaudette 5' UTR-Nsp2-Nsp3配列をIBV M41-CK由来の対応する配列で置換することによりさらに改変した。得られたIBV cDNAは、M41由来の5' UTR-Nsp2-Nsp3と、Beaudette由来のNsp4-Nsp16と、構造遺伝子とアクセサリー遺伝子と、M41由来の3' UTRからなった。このcDNAを、Beaudette Nsp4-Nsp16配列の欠失によりさらに改変した。得られた、Nsp4-16を欠くcDNAを、欠失したNspをM41-CK由来の対応する配列で順次置換するというさらに4段階で改変し、これらの置換cDNAは、M41-CK Nsp4-8、Nsp9-12、Nsp12-14及び最後にNsp15-16を示した。各置換cDNAは、5'末端に、先に挿入された3'のほとんどのM41配列に相当するおよそ500ヌクレオチドと、3'末端に、M41 S遺伝子配列に相当するおよそ500ヌクレオチドを含んでいた。これは、相同組換えによるM41 cDNA配列の挿入及び続いての連続するM41レプリカーゼ遺伝子配列の付加を可能とした。M41由来Nsp配列を含有する合成cDNAは、発明者が従前に記載したトランジェントドミナントセレクション(TDS)系(PCT/GB2010/001293参照)を用いた相同組換えにより付加した。
【０１８２】
[実施例2]
組換え体M41ウイルスの病原性の決定
3つの組換え体は、実施例1で記述された逆遺伝学系を用いて作製した。これらの組換え体は、rIBV M41K-S-ADRP、rIBV M41K-A-ADRP及びrIBV M41K-del3abと名付けた。
【０１８３】
前記3つの組換え体は、ニワトリ腎臓細胞で野生型M41-CK/M41-Kと同様の様式で増殖することが示された(図7及び8)。
【０１８４】
rIBV M41K-S-ADRPは、GからSへのアミノ酸突然変異を生じる、nsp-3のアデノシン二リン酸-リボース-1'-ホスファターゼ(ADRP)領域のヌクレオチドG3685A位での突然変異を有する。この突然変異を、図1に示したプラスミドを用いて、M41-Kを含むrVVの中へ導入した。
【０１８５】
rIBV M41K-A-ADRPは、NからAへのアミノ酸突然変異を生じる、nsp-3のADRP領域のヌクレオチドA3664G位及びA3665C位での2つの突然変異を有する。この突然変異を、図2に示されたプラスミドを用いて、M41-Kを含むrVVの中へ導入した。
【０１８６】
rIBV M41K-del3abは、アクセサリータンパク質3a及び3bの欠失を生じる、遺伝子3のヌクレオチド23867位から24214位までの欠失を有する。この領域を、図3に示したプラスミドを用いて、M41-Kを含むrVVから欠失された。
【０１８７】
前記3つの組換え体ウイルスを用いて、8日齢の特定病原体除去(SPF)鶏に眼及び鼻腔接種により感染させ、感染後3〜7日の毎日の臨床徴候及び感染後4日及び6日の線毛運動により観察されるようなそれらの病原性を試験した。線毛運動の低下は、IBVの病原性を決定するために十分に確立された方法である。これらの組換え体はそれぞれ、図4〜6に示すように、病原性は親ウイルスM41-CKよりも低いことが判明した。
【０１８８】
[実施例3]
ワクチン接種/M41-Rの投与試験
候補ワクチンウイルスを、受精鶏卵が胚発生19日目に卵内ワクチン接種されて接種卵の孵化率が決定される試験に供試する。ニワトリの臨床健康を調べ、21日齢のニワトリに、毒性の強いIB M41投与ウイルスを1用量当たり103.65 EID50で投与する。
【０１８９】
ワクチンによるウイルス投与保護後の臨床徴候を調べ、ウイルス投与後5日目に線毛運動障害検査を行い、線毛の運動に対する投与ウイルスの影響及び線毛運動障害(線毛運動の阻害)に対するワクチンによる保護を検討する。
【０１９０】
【表３】
2019503693.tif 000021
【０１９１】
孵化率試験の結果
SPFブロイラー卵は、通常の孵卵手順に従って孵卵した。孵卵19日目に、1群卵30個の6群に、IBワクチン株であるIB M41-K-A-ADRP、IB M41-K-S-ADRP及びIB M41-K-3abを1用量当たり104EID50で接種した。別の卵30個の群に、プラセボ、すなわちPBSを接種した。孵卵21日目に卵は孵化し、以下の結果が得られた。
-  PBS 87%(26/30)が孵化し、1羽のヒヨコが孵化後に死に、3個の卵が割れておらず胚注射の痕跡がなかった。
-  M41-K-A-ARDP 97%(29/30)が孵化し、1個の卵が割れておらず胚注射の痕跡がなかった。
-  M41-K-S-ARDP 50%(15/30)が孵化し、4個の卵が割れておらず、そのうちの1個は胚注射の痕跡があった。この他の卵/動物は生育できなかった。
-  M41-K-3ab 47%(18/30)が孵化し、7個の卵が割れておらず、そのうちの3個が胚注射の痕跡があった。この他の卵/動物は生育できなかった。
【０１９２】
IB M41-K-A-ADRPは、接種卵の良好な孵化率を示したので、卵内ワクチン接種のためのワクチンとして好適であると考えられる。この株の有効性を上記で詳述した投与試験において試験する。
【０１９３】
上記の明細書に挙げられた総ての刊行物は引用することにより本明細書の一部とされる。記載される本発明の方法及び系の様々な改変及び変形が、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者に自明である。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、特許請求される本発明はこのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際に、分子生物学、ウイルス学又は関連の分野の熟練者に自明である、本発明を実施するための記載の様式の様々な改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
2019503693.tif 000029
【図６】
2019503693.tif 000030
【図７】
2019503693.tif 000031
【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019503693.tif 000034
2019503693.tif 000035
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