(57)【要約】  血液試料中の無細胞ＤＮＡを用いて、例えば、血漿または血清を用いて、血液学的障害を検出するための技術が提供される。例えば、アッセイは、特定の血球系譜（例えば、赤芽球）に特異的な１つ以上の差次的にメチル化された領域を標的とすることができる。メチル化レベルは、血液試料の無細胞混合物中のメチル化されたか、またはメチル化されていないＤＮＡ断片の量を測定するためのアッセイから定量化することができる。メチル化レベルは、例えば、血液学的障害のレベルを決定する一部として、特定の血球系譜についての正常範囲に対応する１つ以上のカットオフ値と比較することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の血液試料を分析する方法であって、
複数の細胞系譜由来の無細胞ＤＮＡを含む、前記血液試料の無細胞混合物を得ることと、
前記無細胞混合物中のＤＮＡ断片を、１つ以上の差次的にメチル化された領域に対応するアッセイと接触させることであって、前記１つ以上の差次的にメチル化された領域の各々が、他の細胞系譜と比較して、低メチル化または高メチル化されていることによって特定の血球系譜に特異的である、接触させることと、
前記アッセイから得られたシグナルに基づいて、前記１つ以上の差次的にメチル化された領域の、前記無細胞混合物中のメチル化または非メチル化ＤＮＡ断片の第１の数を検出することと、
前記第１の数を用いてメチル化レベルを決定することと、
前記哺乳類における血液学的障害の分類を決定する一環として、前記メチル化レベルを１つ以上のカットオフ値と比較することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記１つ以上の差次的にメチル化された領域における前記無細胞混合物中のＤＮＡ断片の総数を決定することと、
前記第１の数および前記総数を用いて前記メチル化レベルを決定することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記無細胞混合物の体積を決定することをさらに含み、前記メチル化レベルが、前記第１の数および前記無細胞混合物の前記体積を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記無細胞混合物を得ることが、
血漿または血清を含む前記無細胞混合物を前記血液試料から分離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記特定の血球系譜および前記他の細胞系譜を含む複数の細胞系譜の各々について、複数の部位のメチル化指数を得ることと、
前記複数の部位の各部位の、前記複数の細胞系譜の前記メチル化指数を比較することと、
第１のメチル化閾値を下回る／上回る前記特定の血球系譜におけるメチル化指数と、第２のメチル化閾値を上回る／下回る前記他の細胞系譜の各々におけるメチル化指数と、を有する前記複数の部位の１つ以上の部位を特定することと、
前記１つ以上の部位を含有する差次的にメチル化された領域を特定することと、によって前記１つ以上の差次的にメチル化された領域を特定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
複数の試料を得ることであって、各試料が前記血液学的障害の特定の分類を有することが既知であり、前記複数の試料が、前記血液学的障害の少なくとも２つの分類を有する、得ることと、
前記複数の試料の各々について、前記１つ以上の差次的にメチル化された領域のメチル化レベルを決定することと、
前記血液学的障害の第１の分類を有する第１の試料セットを特定することと、
前記血液学的障害の第２の分類を有する第２の試料セットを特定することであって、前記第１の試料セットが、前記第２の試料セットよりも統計的に高いメチル化レベルを集約的に有する、特定することと、
指定された特異性および感度内で前記第１の試料セットと前記第２の試料セットとを区別するカットオフ値を決定することと、を含む、前記１つ以上のカットオフ値を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記血液学的障害の前記分類を決定することが、前記血液学的障害の特定のタイプを特定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳類が前記血液学的障害を有することを前記血液学的障害の分類が示すと決定することに応答して、前記哺乳類を前記血液学的障害について治療することと、
治療後に、前記アッセイを反復して、最新のメチル化レベルを決定することと、
前記最新のメチル化レベルに基づいて、前記治療を行い続けるかどうかを判断することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記治療を行い続けるかどうかを判断することが、
前記最新のメチル化レベルが、前記メチル化レベルと比べて指定された閾値内へと変化しなかった場合、前記治療を中止すること、治療用量を増加させること、または異なる治療を続行することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療を行い続けるかどうかを判断することが、
前記最新のメチル化レベルが、前記メチル化レベルと比べて指定された閾値内へと変化した場合、前記治療を継続することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記メチル化レベルを１つ以上のカットオフ値と比較することに基づいて、血液学的障害が存在することを判断することと、
前記血液学的障害が存在することを判断することに応答して骨髄生検を行うことと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記アッセイが、ＰＣＲアッセイまたは配列決定アッセイである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ以上の差次的にメチル化された領域が、ＣｐＧ部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上の差次的にメチル化された領域の第１の領域が、互いの１００ｂｐの範囲内にある複数のＣｐＧ部位を含み、前記複数のＣｐＧ部位がすべて低メチル化または高メチル化されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数のＣｐＧ部位が、前記哺乳類に対応する参照ゲノムの１００ｂｐ以下に及ぶ、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記特定の血球系譜が赤血球である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記血液試料のヘモグロビンレベルを測定することと、
前記ヘモグロビンレベルをヘモグロビン閾値と比較することと、
前記ヘモグロビンレベルと前記ヘモグロビン閾値との比較にさらに基づいて、前記血液学的障害の分類を決定することと、をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上の差次的にメチル化された領域のうちの１つが、ＦＥＣＨ遺伝子にある、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上の差次的にメチル化された領域のうちの１つが、ゲノム座標４８２２７６８８〜４８２２７７０１の第１２番染色体にある、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の差次的にメチル化された領域のうちの１つが、ゲノム座標４８２２８１４４〜４８２２８１５４の第１２番染色体にある、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記血液学的障害が貧血である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記血液学的障害の分類が、増加した赤血球産生活性、中程度の赤血球産生活性、または低減した赤血球産生活性に対応する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記血液学的障害の分類が、β−サラセミアに由来する増加した赤血球産生活性である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記血液学的障害の分類が、鉄欠乏性貧血に由来する中程度の赤血球産生活性である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記血液学的障害の分類が、再生不良性貧血または慢性腎不全に由来する低減した赤血球産生活性である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記１つ以上の差次的にメチル化された領域が低メチル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記無細胞混合物が血漿である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
生物学的試料中の特定の細胞系譜の細胞量を測定する方法であって、
前記生物学的試料の無細胞混合物を得ることであって、前記無細胞混合物が複数の細胞系譜由来の無細胞ＤＮＡを含む、得ることと、
前記無細胞混合物中のＤＮＡ断片を、１つ以上の差次的にメチル化された領域に対応するアッセイと接触させることであって、前記１つ以上の差次的にメチル化された領域の各々が、他の細胞系譜と比較して低メチル化または高メチル化されていることによって特定の細胞系譜に特異的である、接触させることと、
前記アッセイから得られたシグナルに基づいて、前記１つ以上の差次的にメチル化された領域の、前記無細胞混合物中のメチル化されたか、またはメチル化されていないＤＮＡ断片の第１の数を検出することと、
前記第１の数を使用して第１のメチル化レベルを決定することと、
１つ以上の較正データ点を得ることであって、各較正データ点は（１）前記特定の細胞系譜の細胞量および（２）較正メチル化レベルを指定し、前記１つ以上の較正データ点が複数の較正試料から決定される、得ることと、
前記第１のメチル化レベルを少なくとも１つの較正データ点の較正メチル化レベルと比較することと、
前記比較することに基づいて、前記生物学的試料中の前記特定の細胞系譜の前記細胞量を概算することと、を含む、方法。
【請求項２９】
前記特定の細胞系譜が、特定の血球系譜である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記１つ以上の較正データ点が、複数の較正データ点であり、前記較正データ点が較正曲線を形成する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法を実施するようにシステムを制御するための複数の命令を保存するコンピュータ可読媒体を備えた、コンピュータ製品。
【請求項３２】
請求項３１に記載のコンピュータ製品と、
前記コンピュータ可読媒体上に保存された命令を実行するための１つ以上のプロセッサと、を備えた、システム。
【請求項３３】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法を実施するように構成された、システム。
【請求項３４】
哺乳類の血液試料を分析するためのシステムを制御するための複数の命令を保存するコンピュータ可読媒体を備えた、コンピュータ製品であって、前記分析は、
アッセイから得られたシグナルに基づいて、１つ以上の差次的にメチル化された領域の、前記血液試料の無細胞混合物中のメチル化されたか、またはメチル化されていないＤＮＡ断片の第１の数を検出することであって、前記１つ以上の差次的にメチル化された領域の各々が、他の細胞系譜と比較して低メチル化または高メチル化されていることによって特定の血球系譜に特異的である、検出することと、
前記第１の数を使用してメチル化レベルを決定することと、
前記哺乳類における血液学的障害の分類を決定する一環として、前記メチル化レベルを１つ以上のカットオフ値と比較することと、によって行われる、コンピュータ製品。
【請求項３５】
生物学的試料中の特定の細胞系譜の細胞量を測定するためのシステムを制御するための複数の命令を保存するコンピュータ可読媒体を備えたコンピュータ製品であって、前記分析は、
アッセイから得られたシグナルに基づいて、１つ以上の差次的にメチル化された領域の、前記生物学的試料の無細胞混合物中のメチル化されたか、またはメチル化されていないＤＮＡ断片の第１の数を検出することであって、前記１つ以上の差次的にメチル化された領域の各々が、他の細胞系譜と比較して低メチル化または高メチル化されていることによって特定の細胞系譜に特異的である、検出することと、
前記第１の数を使用して第１のメチル化レベルを決定することと、
１つ以上の較正データ点を得ることであって、各較正データ点は（１）前記特定の細胞系譜の細胞量および（２）較正メチル化レベルを指定し、前記１つ以上の較正データ点は、複数の較正試料から決定される、得ることと、
前記第１のメチル化レベルを少なくとも１つの較正データ点の較正メチル化レベルと比較することと、
前記比較に基づいて、前記生物学的試料中の前記特定の細胞系譜の前記細胞量を概算することと、によって行われる、コンピュータ製品。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体的な内容がすべての目的にために参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年５月３０日出願の「血液中の無細胞ＤＮＡを用いた血液学的障害の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  Ｉｎ  Ｂｌｏｏｄ）」という表題の米国仮特許出願第６２／３４３０５０号に由来する優先権を主張し、その非仮出願である。
【０００２】
血液学的障害（例えば、貧血）が人に存在するかどうかを判定するために、従来技術では、骨髄生検の組織学的検査を行う。しかしながら、骨髄生検は、このような手順を受けている患者にとって疼痛および不安につながる侵襲的な手順である。それゆえ、人における血液学的障害を検出し特徴づけるための新たな技術を特定することが望ましい。
【０００３】
貧血は、各々独自の治療を用いる複数の臨床的容態によって発症し得る。したがって、貧血の症例の原因を確認した後、それに応じてさらに試験または治療することは臨床的に有用であろう。貧血の１つの原因は、鉄、Ｂ１２、葉酸塩などだがこれらに限定されない赤血球産生（赤血球を産生する過程）に必要な栄養素の欠乏である。貧血の別の原因は、失血であり、急性または慢性であり得る。失血は、例えば、過多月経または消化管からの出血によって発症し得る。貧血はまた、癌および炎症性腸疾患において認められ得る、慢性疾患の貧血とも呼ばれる、多くの慢性障害においても頻繁に認められる。
【０００４】
したがって、血液学的障害について対象をスクリーニングするための、血液学的障害の原因を判定するための、血液学的障害に罹患している対象をモニターするための、および／または血液学的障害に罹患している対象の適切な治療を判断する新たな技術を提供することが所望されている。
【発明の概要】
【０００５】
いくつかの実施形態は、血液試料中の無細胞ＤＮＡを用いて、例えば、血漿または血清を用いて、血液学的障害を検出するためのシステム、方法、および装置を提供する。例えば、アッセイは、特定の血球系譜（例えば、赤芽球）に特異的な１つ以上の差次的にメチル化された領域を標的とすることができる。メチル化レベルは、血液試料の無細胞混合物中のメチル化されたか、またはメチル化されていないＤＮＡ断片の量を測定するためのアッセイから定量化することができる。メチル化レベルは、例えば、血液学的障害のレベルを判定する一環として、特定の血球系譜についての正常範囲に対応する１つ以上のカットオフ値と比較することができる。いくつかの実施形態は、１つ以上のメチル化レベルを用いて類似の様式で、血液試料中の特定の血球系譜（例えば、赤芽球ＤＮＡ）由来のＤＮＡの量を測定することができる。
【０００６】
このような分析は、骨髄生検の侵襲的手順を行うことなく、血液学的障害の検出を提供することができる。例えば、本発明者らの結果は、骨髄細胞が循環無細胞ＤＮＡに有意な比率を寄与すると実証している。循環中の無細胞ＤＮＡ中の造血細胞のメチル化署名の分析は、骨髄細胞の状態を反映することができる。このような実施形態は、治療に対する骨髄の応答、例えば、鉄欠乏性貧血に罹患している患者における経口鉄療法に対する応答のモニタリングに特に有用であり得る。実施形態は、異なる手順、例えば、骨髄生検または侵襲性の低い試験に患者を割り当てるために使用することもできる。
【０００７】
他の実施形態は、本明細書で説明される方法と関係したシステムおよびコンピュータ可読媒体に関する。
【０００８】
本発明の実施形態の性質および利点に関するより良好な理解は、以下の発明を実施するための形態および添付の図面に関して得られ得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の実施形態によるフェロキラターゼ（ＦＥＣＨ）遺伝子のプロモーター内のＣｐＧ部位のメチル化密度を示す。
【図２Ａ】本発明の実施形態によるメチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡを検出するために設計されたデジタル式ＰＣＲアッセイを用いて普遍的にメチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡの分析を示す。
【図２Ｂ】本発明の実施形態によるメチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡを検出するために設計されたデジタル式ＰＣＲアッセイを用いて普遍的にメチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡの分析を示す。
【図３Ａ】本発明の実施形態による血球中のＥ％と有核ＲＢＣ（赤芽球）の数との相関を示すプロットである。
【図３Ｂ】本発明の実施形態による無細胞ＤＮＡを分析することによって生物学的試料中の特定の細胞系譜の細胞量を決定するための方法３００を示す流れ図である。
【図４】本発明の実施形態による健常非妊娠対象および異なる妊娠期の妊婦のバフィーコートおよび血漿における非メチル化％を示す。
【図５】バフィーコートにおける非メチル化％と血漿との相関の欠如を示すプロットである。
【図６Ａ】本発明の実施形態による健常対象における赤血球系ＤＮＡの百分率（Ｅ％（ＦＥＣＨ））を示す。Ｅ％は非メチル化％と同じであると定義することができる。
【図６Ｂ】本発明の実施形態による健常対象における赤血球系ＤＮＡの百分率（Ｅ％（ＦＥＣＨ））を示す。Ｅ％は非メチル化％と同じであると定義することができる。
【図７】血漿ＤＮＡにおけるＥ％（ＦＥＣＨ）結果と健常対象の年齢との相関の欠如を示す。
【図８】本発明の実施形態による再生不良性貧血患者、重症型ベータサラセミア患者、および健常対照対象におけるヘモグロビン濃度に対する非メチル化％のプロットである。
【図９】本発明の実施形態による鉄（Ｆｅ）欠乏性貧血患者および急性失血患者における血漿非メチル化％のプロットである。
【図１０】本発明の実施形態による再生不良性貧血患者、慢性腎不全（ＣＲＦ）患者、重症型β−サラセミア患者、鉄欠乏性貧血患者および健常対象の間での血漿中の赤血球系ＤＮＡ百分率（Ｅ％（ＦＥＣＨ））とヘモグロビンレベルとの関連性を示す。
【図１１Ａ】本発明の実施形態による再生不良性貧血患者、慢性腎不全（ＣＲＦ）患者、重症型β−サラセミア患者、および鉄欠乏性貧血患者の間での網状赤血球算定／指標とヘモグロビンレベルとの関連性を示す。
【図１１Ｂ】本発明の実施形態による再生不良性貧血患者、慢性腎不全（ＣＲＦ）患者、重症型β−サラセミア患者、および鉄欠乏性貧血患者の間での網状赤血球算定／指標とヘモグロビンレベルとの関連性を示す。
【図１２】本発明の実施形態による骨髄異形成症候群患者および真性赤血球増加症患者における血漿非メチル化％のプロットである。
【図１３Ａ】本発明の実施形態による再生不良性貧血（ＡＡ）患者と骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）患者の間の血漿中の赤血球系ＤＮＡの百分率（Ｅ％（ＦＥＣＨ））を示す。
【図１３Ｂ】本発明の実施形態による再生不良性貧血における治療応答性群と治療非応答性群の間の血漿中の赤血球系ＤＮＡの百分率（Ｅ％（ＦＥＣＨ））を示す。
【図１４】本発明の実施形態による正常対象および２名の白血病患者におけるヘモグロビン濃度に対する血漿中の非メチル化％のプロットである。
【図１５Ａ】本発明の実施形態による第１２染色体上の赤芽球特異的ＤＭＲ内のＣｐＧ部位のメチル化密度を示す。
【図１５Ｂ】本発明の実施形態による第１２染色体上の赤芽球特異的ＤＭＲ内のＣｐＧ部位のメチル化密度を示す。
【図１６】ＥＮＣＯＤＥデータベース由来の２つの他の赤芽球特異的ＤＭＲ（Ｅｒｙ−１およびＥｒｙ−２）に対するヒストン修飾（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１およびＨ３Ｋ２７Ａｃ）を示す。
【図１７Ａ】Ｅｒｙ−１マーカー（図１７Ａ）およびＥｒｙ−２マーカー（図１７Ｂ）を標的とするデジタル式ＰＣＲアッセイによって測定された重症型β−サラセミア患者のバフィーコートＤＮＡにおける赤血球系ＤＮＡ配列の百分率（Ｅ％）と、自動血液分析装置を用いて測定された末梢白血球全部における赤芽球の百分率との相関を示す。
【図１７Ｂ】Ｅｒｙ−１マーカー（図１７Ａ）およびＥｒｙ−２マーカー（図１７Ｂ）を標的とするデジタル式ＰＣＲアッセイによって測定された重症型β−サラセミア患者のバフィーコートＤＮＡにおける赤血球系ＤＮＡ配列の百分率（Ｅ％）と、自動血液分析装置を用いて測定された末梢白血球全部における赤芽球の百分率との相関を示す。
【図１８Ａ】重症型β−サラセミア患者のバフィーコートＤＮＡにおけるＥ％（ＦＥＣＨ）結果とＥ％（Ｅｒｙ−１）とＥ％（Ｅｒｙ−２）との相関を示す。
【図１８Ｂ】重症型β−サラセミア患者のバフィーコートＤＮＡにおけるＥ％（ＦＥＣＨ）結果とＥ％（Ｅｒｙ−１）とＥ％（Ｅｒｙ−２）との相関を示す。
【図１９】本発明の実施形態による３つの赤芽球特異的ＤＭＲを標的とするデジタル式ＰＣＲ分析を用いて、健常対象ならびに再生不良性貧血患者および重症型β−サラセミア患者における赤血球系ＤＮＡの百分率を示す。
【図２０Ａ】本発明の実施形態による治療前状態および治療２日後における静脈鉄療法を受けている鉄欠乏性貧血の血漿ＤＮＡにおける赤血球系ＤＮＡの百分率（Ｅ％（ＦＥＣＨ））と網状赤血球算定の百分率との連続測定結果を示す。
【図２０Ｂ】本発明の実施形態による治療前状態および治療２日後における静脈鉄療法を受けている鉄欠乏性貧血の血漿ＤＮＡにおける赤血球系ＤＮＡの百分率（Ｅ％（ＦＥＣＨ））と網状赤血球算定の百分率との連続測定結果を示す。
【図２１Ａ−２１Ｂ】本発明の実施形態による経口鉄治療を受けている過多月経起因性鉄欠乏性貧血患者における赤芽球ＤＭＲの血漿Ｅ％の連続的変化を示す。治療後のヘモグロビンの変化を示す。
【図２２】組換えエリスロポエチン（ＥＰＯ）治療または赤血球産生促進剤（ＥＳＡ）治療を受けている慢性腎疾患（ＣＫＤ）患者の赤芽球ＤＭＲにおける血漿非メチル化％の連続的変化を示す。
【図２３Ａ−２３Ｂ】本発明の実施形態による抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）治療または免疫抑制療法としてのシクロスポリンを受けている再生不良性貧血患者の赤芽球ＤＭＲにおける血漿非メチル化％の連続的変化を示す。治療を受けている再生不良性貧血患者のヘモグロビンの連続的変化を示す。
【図２４Ａ】再生不良性貧血患者４名におけるヘモグロビン濃度に対する血漿中の非メチル化％のプロットを示す。
【図２４Ｂ】再生不良性貧血患者４名におけるヘモグロビン濃度に対する血漿中の非メチル化％のプロットを示す。
【図２５】本発明の実施形態による健常対象および貧血患者におけるＦＥＣＨ遺伝子関連ＤＭＲ（コピー数／血漿ｍｌ）における赤血球系ＤＮＡの絶対濃度を示すボックスアンドウィスカープロットを示す。
【図２６】本発明の実施形態による哺乳類の血液試料を分析する方法を示す流れ図である。
【図２７】本発明の実施形態によるシステム２７００を示す。
【図２８】本発明の実施形態によるシステムおよび方法とともに使用可能な、例となるコンピュータシステムのブロック図を示す。
【００１０】
用語
「メチローム」は、ゲノムにおける複数の部位または遺伝子座のＤＮＡメチル化の量の尺度を提供する。メチロームは、ゲノムの全部、ゲノムの実質的な部分、またはゲノムの比較的わずかな部分（複数可）に対応し得る。
【００１１】
「細胞系譜」は、受精した胚からの組織または器官の発生歴を示す。異なるタイプの組織（例えば、異なるタイプの血球）は、異なる細胞系譜を有することになっている。赤血球（ＲＢＣ）は、前赤芽球から一連の中間的な細胞を通じて得られる。前赤芽球、巨核芽球および骨髄芽球は、共通の骨髄前駆細胞から得られる。リンパ球は、共通のリンパ球前駆細胞から得られる。有核ＲＢＣは赤芽球であり、未熟な除核されたＲＢＣは網状赤血球であり、成熟した除核されたＲＢＣは赤血球であり、ヘモグロビンを運ぶ血流中の赤血球である。
【００１２】
「無細胞混合物」は、種々の細胞由来の無細胞ＤＮＡ断片を含む試料に対応している。例えば、無細胞混合物は、種々の細胞系譜由来の無細胞ＤＮＡ断片を含むことができる。血漿および血清は、血液試料から、例えば、遠心分離を介して得られた無細胞混合物の例である。他の無細胞混合物は、他の生物学的試料に由来し得る。「生物学的試料」は、対象（例えば、妊婦、癌に罹患している人もしくは癌に罹患していると疑われる人、臓器移植レシピエント、または心筋梗塞における心臓、卒中における脳、もしくは貧血における造血系など、器官を包含する疾患過程を有すると疑われる人）から採取され、関心対象の１つ以上の核酸分子（複数可）を含有する何らかの試料を指す。生物学的試料は、血液、血漿、血清、尿、膣液、水腫由来の（例えば、精巣の）流体、または膣洗浄流体、胸水、腹水、脳脊髄液、唾液、汗、涙、痰、気管支肺胞洗浄液などの体液であり得る。大便試料も使用することができる。種々の実施形態において、無細胞ＤＮＡが濃縮された生物学的試料（例えば、遠心分離プロトコルを介して得られた血漿試料）におけるＤＮＡの大部分、例えば、５０％超、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、（細胞とは対照的に）無細胞であり得る。遠心分離プロトコルは、３，０００ｇ×１０分、流体部分を得ること、残りの細胞を除去するために３０，０００ｇでさらに１０分間再遠心分離することを含み得る。
【００１３】
「血漿メチローム」は、動物（例えば、ヒト）の血漿または血清から測定されたメチロームである。血漿メチロームは、血漿および血清が無細胞ＤＮＡを含むので、無細胞メチロームの例である。血漿メチロームは、体内の異なる器官または組織または細胞に由来するＤＮＡの混合物であるので、混合メチロームの例でもある。一実施形態において、このような細胞は、赤血球（すなわち、赤色細胞）系譜、骨髄系譜（例えば、好中球およびこれらの前駆体）および巨核球系譜の細胞を含むが、これらに限定されない造血細胞である。妊娠中、血漿メチロームは胎児および母親からのメチローム情報を含有することがある。癌患者において、血漿メチロームは、腫瘍細胞および患者の体内の他の細胞に由来のメチローム情報を含有し得る。「細胞性メチローム」は、患者の細胞（例えば、血球）から測定されるメチロームに対応する。血球のメチロームは、血球メチローム（または血中メチローム）と呼ばれる。メチロームを測定するための技術は、「Ｎｏｎ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｏｍｅ  Ｏｆ  Ｆｅｔｕｓ  Ｏｒ  Ｔｕｍｏｒ  Ｆｒｏｍ  Ｐｌａｓｍａ」という表題のＰＣＴ特許出願第ＷＯ２０１４／０４３７６３号に記載されており、その開示はすべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【００１４】
「部位」は、単一の塩基位置または相関する塩基位置の群、例えば、ＣｐＧ部位であり得る単一の部位に対応する。「遺伝子座」は、複数の部位を含む領域に対応し得る。遺伝子座は、領域をその脈絡における部位と等価にするであろうただ１つの部位を含むことができる。
【００１５】
各ゲノム部位（例えば、ＣｐＧ部位）についての「メチル化指数」は、この部位におけるメチル化を、その部位を網羅する読み取り総数にわたって示す、（例えば、配列読み取りまたは配列プローブから決定されるような）ＤＮＡ断片の比率を指すことができる。「読み取り」は、ＤＮＡ断片から得られた情報（例えば、部位のメチル化状態）に対応することができる。特定のメチル化状態のＤＮＡ断片と優先的にハイブリッド形成する試薬（例えば、プライマーまたはプローブ）を用いて、読み取りを得ることができる。典型的には、このような試薬は、ＤＮＡ分子のメチル化状態に応じてこのＤＮＡ分子を差別的に修飾するプロセス、例えば二亜硫酸塩変換またはメチル化感受性制限酵素による処理の後に適用される。読み取りは、配列読み取りとすることができる。「配列読み取り」は、核酸分子の任意の部分または全部から配列決定されたヌクレオチドの鎖を指す。例えば、配列読み取りは、核酸断片から配列決定された短鎖ヌクレオチド（例えば、約２０〜１５０個）、核酸断片の片端もしくは両端の短鎖ヌクレオチド、または生物学的試料中に存在する核酸断片全体の配列決定であり得る。配列読み取りは、種々の方法において、例えば、（例えば、ハイブリッド形成アレイもしくは捕捉プローブ、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくは線形増幅もしくは等温増幅などの増幅技術において）配列決定技術を用いて、またはプローブを用いて得られ得る。
【００１６】
領域の「メチル化密度」は、この領域における部位を網羅する読み取りの総数によって除されたメチル化を示す、領域内の部位の読み取りの数を指すことができる。この部位は、特定の特徴を有し得、例えば、ＣｐＧ部位であり得る。したがって、領域の「ＣｐＧメチル化密度」は、この領域におけるＣｐＧ部位（例えば、特定のＣｐＧ部位、ＣｐＧアイランド内のＣｐＧ部位、またはそれより大きな領域）を網羅する読み取りの総数によって除されたＣｐＧメチル化を示す読み取り数を指す。例えば、ヒトゲノム中の各１００ｋｂビンのメチル化密度は、１００ｋｂ領域へマッピングされた配列によって覆われたＣｐＧ部位全部の比率として、ＣｐＧ部位の（メチル化されたシトシンに対応する）二亜硫酸塩処理後に覆われていないシトシンの総数から決定することができる。この分析は、他のビンサイズに対して行うこともでき、例えば、５００ｂｐ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂまたは１Ｍｂなどである。領域は、全ゲノムまたは染色体全部または染色体の一部（例えば、染色体腕）であり得る。ＣｐＧ部位のメチル化指数は、領域がそのＣｐＧ部位のみを含む場合、この領域のメチル化密度と同じである。「メチル化シトシンの比率」は、この領域における解析されたシトシン残基の総数、すなわちＣｐＧの脈絡外のシトシンを含む、メチル化されている（例えば、二亜硫酸塩変換後に覆われていない）ことが示されているシトシン部位「Ｃ」の数を指すことができる。メチル化指数、メチル化密度およびメチル化シトシンの比率は、「メチル化レベル」の例である。二亜硫酸塩変換とは別に、当業者に既知の他のプロセスを用いてＤＮＡ分子のメチル化状態を調べることができ、このプロセスは、メチル化状態に敏感な酵素（例えば、メチル化感受性制限酵素）、メチル化結合タンパク質、メチル化状態に感受性のあるプラットフォームを用いる単一分子配列決定（例えば、ナノポア配列決定（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２０１３；１１０：１８９１０−１８９１５）およびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ単分子リアルタイム分析（Ｆｌｕｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１０；７：４６１−４６５）による単一分子配列決定）を含むがこれらに限定されない。
【００１７】
「メチル化特性」（メチル化状態とも呼ばれる）は、領域のＤＮＡメチル化と関連した情報を含む。ＤＮＡメチル化と関連した情報は、ＣｐＧ部位のメチル化指数、領域中のＣｐＧ部位のメチル化密度、連続した領域にわたるＣｐＧ部位の分布、２つ以上のＣｐＧ部位を含有する領域内の各個々のＣｐＧ部位のメチル化のパターンまたはレベル、および非ＣｐＧメチル化を含むことができるが、これらに限定されない。ゲノムの実質的な部分のメチル化特性は、メチロームと等価とみなすことができる。哺乳類ゲノムにおける「ＤＮＡメチル化」は、典型的には、ＣｐＧジヌクレオチドにおけるシトシン残基の５’炭素へのメチル基の付加（すなわち、５−メチルシトシン）を指す。ＤＮＡメチル化は、他の脈絡においてはシトシンにおいて生じ得、例えばＣＨＧおよびＣＨＨ（式中、Ｈはアデニン、シトシンまたはチミンである）である。シトシンのメチル化は、５−ヒドロキシメチルシトシンの形態でもあり得る。Ｎ６−メチルアデニンなどの非シトシンメチル化も報告されている。
【００１８】
「組織」は、機能単位として一緒に群形成する細胞の群に対応する。１つの組織内に２つ以上のタイプの細胞を認めることができる。異なるタイプの組織は、異なるタイプの細胞（例えば、肝細胞、肺胞または血球）からなり得るが、異なる生物（母親対胎児）由来の組織または健常細胞対腫瘍細胞に対応し得る。「参照組織」は、組織特異的メチル化レベルを決定するために使用される組織に対応する。異なる個体由来の同じ組織タイプの複数の試料を使用して、その組織タイプの組織特異的メチル化レベルを決定することができる。異なる時期の同じ個体に由来する同じ組織は、生理（例えば、妊娠）または病理（例えば、癌または貧血または感染または変異）に起因して相違を呈することがある。異なる個体由来の同じ組織タイプは、生理（例えば、年齢、性別）または病理（例えば、癌または貧血または感染または変異）に起因して相違を呈することがある。
【００１９】
「障害の分類」とも呼ばれる「障害のレベル」という用語は、障害が存在するか否かの分類、障害のタイプ、障害の病期、および／または障害の重症度に関する他の尺度を指すことができる。レベルは、数字またはその他の文字であり得る。レベルは、ゼロであり得る。障害のレベルは、種々の方法で使用することができる。例えば、スクリーニングは、癌を有することが今までわかっていない人において、障害が存在するかどうかを確認することができる。評価は、障害の進行を経時的にモニターし、療法の有効性を研究し、または予後を判断するために、障害と診断された人を調べることができる。一実施形態において、予後は、患者がこの障害で死亡する可能性、または特定の持続時間または特定の時間の後に障害が進行する可能性として表すことができる。検出は、「スクリーニング」を意味し得、または障害の示唆的な特徴（例えば、症状または他の陽性試験）を有する人が障害を有するかどうかを確認することを意味し得る。
【００２０】
貧血は、年齢、性別、海抜高度、喫煙、および妊娠状態によって変化し得る赤血球の数または赤血球の酸素運搬能力が生理学的需要を満たすには不十分である容態を指す。世界保健機関（ＷＨＯ）の勧告によると、貧血は、ヘモグロビン濃度が男性で１３０ｇ／Ｌ未満、女性で１１０ｇ／Ｌ未満である場合に診断することができる。「貧血の程度」という用語は、対象のヘモグロビン濃度によって反映され得る。より低いヘモグロビンレベルは、より重症な貧血の程度を示す。ＷＨＯの勧告によると、重度の貧血とは、男性で８０ｇ／Ｌ未満、女性で７０ｇ／Ｌ未満のヘモグロビン濃度を指し、中等度の貧血とは、男性で８０〜１０９ｇ／Ｌ、女性で７０〜９９ｇ／Ｌのヘモグロビン濃度を指し、軽度の貧血とは、男性で１１０〜１２９ｇ／Ｌ、女性で１００〜１０９ｇ／Ｌのヘモグロビン濃度を指す。
【００２１】
「分離値」は、２つの値を包含する差または比、例えば、２つの分数寄与または２つのメチル化レベルに相当する。分離値は、単純な差または比であり得る。分離値は、他の因子、例えば、倍数因子を含むことができる。他の例として、値の関数の差または比、例えば、２つの値の自然対数（ｌｎ）の差または比を使用することができる。分離値には、差および比を含むことができる。
【００２２】
本明細書で使用される場合の「分類」という用語は、試料の特定の特性と関係した任意の数（複数可）または他の特徴（複数可）を指す。例えば、「＋」記号（または「陽性」という語）は、試料が欠失または増幅を有するものとして分類されることを意味し得る。分類は、二元性（例えば、陽性または陰性）であり得、またはより多くのレベルの分類（例えば、１〜１０または０〜１の尺度）を有し得る。「カットオフ」という用語および「閾値」は、ある操作において使用される所定の数を指す。閾値は、特定の分類が要求しているものを上回るまたは下回る値であり得る。これらの用語のいずれも、これらの脈絡のいずれにおいても使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
いくつかの実施形態において、赤芽球由来の無細胞ＤＮＡの寄与は（循環ＤＮＡとも呼ばれる）は、他の組織由来の無細胞ＤＮＡと比較して、赤芽球に特異的な１つ以上のメチル化署名（例えば、マーカーにつき１つの署名）を用いて定量化される。マーカー（例えば、差次的にメチル化された領域（ＤＭＲ））は、同じ署名に寄与する１つの部位または１群の部位を含むことができる。
【００２４】
赤芽球由来の無細胞ＤＮＡの寄与は、貧血などの血液学的障害のレベルを判定するために用いることができる。例えば、実施形態は、胎児、新生児または子供における貧血を評価するために使用することができる。貧血の脈絡で、実施形態を使用して、貧血の疑いがあるか、または貧血と診断された人を調べて、（ｉ）貧血の原因を解明すること、（ｉｉ）臨床状態の進行を経時的にモニターすること、（ｉｉｉ）療法の有効性を研究すること、または（ｉｖ）予後を判断することができる。したがって、実施形態は、赤血球ＤＮＡを循環ＤＮＡプールのこれまで認識されていない主成分として、ならびに貧血および他の血液学的障害の差別的診断およびモニタリングのための非侵襲性バイオマーカーとして特定した。
【００２５】
１．序論
血漿ＤＮＡは、分子診断にとってますます遂行される分析物である。特に非侵襲的出生前検査（１〜７）および腫瘍学（８〜１２）において血漿ＤＮＡの臨床応用に関する継続的な調査研究がある。広範な種類の臨床応用にもかかわらず、循環ＤＮＡの組織起源は完全には理解されていない。
【００２６】
循環ＤＮＡは、性別ミスマッチ骨髄移植をモデル系として用いて造血細胞から主として放出されることが示されてきた（１３，１４）。Ｋｕｎらは近年、有意な比率の血漿ＤＮＡが、好中球およびリンパ球のメチル化署名を有していることを実証した（１５）。しかしながら、現在のところ、赤血球起源（赤芽球）のＤＮＡが血漿中でも検出可能であり得るかどうかに関する情報はまったくない。
【００２７】
赤血球（ＲＢＣ）は、血液中の最大数の造血細胞である。赤血球（ＲＢＣ）の濃度は、血液１リットルあたりおよそ５×１０１２である。各ＲＢＣの寿命が約１２０日であることを考慮すると、体は、１日あたり２×１０１１個のＲＢＣ、または１時間あたり９．７×１０９個のＲＢＣを産生する必要がある。ヒトの成熟ＲＢＣには核がない。
【００２８】
赤芽球が核を失い、骨髄中で網状赤血球へと成熟するのは、除核の段階中である（１６）。除核のプロセスは、細胞シグナル伝達および細胞骨格の作用の厳密に調節された作用を包含する複雑な多段階プロセスである。赤芽球の核材料は、赤芽球島中の、例えば骨髄中の骨髄マクロファージによって貪食および分解される（１７）。本発明者らは、骨髄由来の赤血球系系譜の分解されたＤＮＡ材料のいくつかが循環系に放出されると仮定している。
【００２９】
実施形態は、赤血球系起源の細胞由来のＤＮＡのメチル化署名を特定し、このような署名を用いて、赤血球ＤＮＡが、ヒト血漿中で検出可能であるかどうかを判断することができる。異なる組織および造血細胞タイプの高解像度参照メチロームは、ＢＬＵＥＰＲＩＮＴ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（１８，１９）およびＲｏａｄｍａｐ  Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（２０）含む共同プロジェクトを通じて公共的に入手可能となっている。本発明者らなどは、組織関連メチル化署名の分析を通じて血漿ＤＮＡの起源を追跡することが可能であることを既に実証している（１５，２１，２２）。無細胞混合物（例えば、血漿）に対するある特定の組織の寄与を決定するためのこのような分析のさらなる詳細は、「Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｉｎ  Ａ  ＤＮＡ  Ｍｉｘｔｕｒｅ」という表題のＰＣＴ特許出願第ＷＯ２０１６／００８４５１号において認めることができ、この開示はすべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【００３０】
本発明者らの仮説を検証し、血漿中の赤血球系ＤＮＡの存在を実証するため、本発明者らは、赤芽球および他の組織タイプのメチル化特性の解析を通じて赤芽球の特異的な差次的にメチル化された領域（ＤＭＲ）を特定した。この発見に基づいて、本発明者らは、赤芽球特異的ＤＭＲを標的としたデジタル式ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを開発し、生物学的試料中の赤血球系ＤＮＡの定量分析を可能にした。具体的には、赤芽球および他の組織タイプの高分解能メチル化特性を用いて、３つのゲノム遺伝子座が赤芽球においては低メチル化されるが、他の細胞タイプでは高メチル化されることが認められた。各遺伝子座について差次的にメチル化された領域を用いて赤血球系ＤＮＡを測定するためのデジタル漆器ＰＣＲアッセイを開発した。
【００３１】
本発明者らは、これらのデジタル式ＰＣＲアッセイを応用して、健常対象および異なるタイプの貧血に罹患している患者の血漿試料を研究した。本発明者らは、貧血評価における本アッセイの潜在的な臨床的有用性も検討した。例はＰＣＲアッセイを使用しているが、配列決定などの他のアッセイを使用してもよい。
【００３２】
病因の異なる貧血に罹患している対象において、本発明者らは、循環赤血球系ＤＮＡの定量分析（例えば、メチル化マーカーを使用する）が骨髄における赤血球産生活性を反映することを示している。エリスロポエチン活性が低下した患者については、再生不良性貧血に例示されるように、循環赤血球系ＤＮＡの百分率は低下した。赤血球産生が上昇したが有効でない患者については、重症型β−サラセミアによって例示されるように、百分率は上昇した。加えて、赤血球系ＤＮＡの血漿レベルは、再生不良性貧血および鉄欠乏性貧血における治療応答と相関することが認められた。他の２つの差次的にメチル化された領域を標的とするデジタル式ＰＣＲアッセイを用いた血漿ＤＮＡ分析も同様の所見を示した。
【００３３】
２．赤芽球の差次的にメチル化された領域（ＤＭＲ）
本発明者らは、ＲＢＣの成熟に関与する赤芽球除核プロセスまたは他のプロセスが循環無細胞ＤＮＡのプールに有意に寄与するであろうという仮説を立てている。赤芽球由来の循環ＤＮＡの寄与を決定するために、本発明者らは、赤芽球のＤＮＡメチル化特性を他の組織および血球と比較することによって、赤芽球のＤＮＡ中の差次的にメチル化された領域（ＤＭＲ）を特定した。本発明者らは、ＢＬＵＥＰＲＩＮＴ  ＰｒｏｊｅｃｔおよびＲｏａｄｍａｐ  Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔならびに本発明者らのグループによって生成したメチロームから、赤芽球および他の血球（好中球、Ｂリンパ球およびＴリンパ球）ならびに組織（肝臓、肺、結腸、小腸、膵臓、副腎、食道、心臓、脳および胎盤）のメチル化プロファイルを調べた（１８〜２０，２３）。
【００３４】
単純な例では、１つ以上のＤＭＲを直接使用して、例えば、メチル化された（高メチル化されたＤＭＲ向け）か、またはメチル化されていない（低メチル化されたＤＭＡ向け）ＤＮＡ断片の百分率を決定することによって、赤芽球由来の循環ＤＮＡの寄与を決定することができる。この百分率は、直接使用することができるか、または変更する（例えば、倍率を乗じる）ことができる。他の実施形態は、より複雑な手順、例えば、線形方程式を解くことを実行することができる。ＰＣＴ特許出願第ＷＯ２０１６／００８４５１号において説明されるように、Ｎ個のゲノム部位のメチル化レベルを用いて、Ｍ個の組織からの寄与を計算することができ、ここで、ＭはＮ以下である。各部位のメチル化レベルは、各組織について計算することができる。線形方程式Ａｘ＝ｂを解くことができ、式中、ｂはＮ個の部位で測定されたメチル化密度のベクトルであり、ｘはＭ個の組織からの寄与のベクトルであり、ＡはＭ個の行とＮ個の列の行列であり、各行は、その行の特定の部位のＮ個の組織におけるメチル化密度を提供する。ＭがＮより小さい場合、最小二乗法による最適化を実行することができる。Ｎ次元×Ｍ次元の行列Ａは、先の源から得られるように、参照組織の組織特異的メチル化レベルから形成することができる。
【００３５】
１．ＤＭＲの特定
差次的にメチル化された領域（ＤＭＲ）を特定するために、本明細書に説明されるように、特定のタイプ／系譜の組織（例えば、赤芽球）を単離した後、例えば、メチル化認識配列決定を用いて分析することができる。組織タイプ（例えば、たった２タイプの赤芽球など）にわたる部位のメチル化密度を分析して、ＤＭＲで使用する部位を特定するのに十分な相違が存在するかどうかを判定することができる。
【００３６】
いくつかの実施形態において、以下の基準の１つ以上を用いて、赤芽球のためのメチル化マーカーを特定することができる。（１）ＣｐＧ部位は、ＣｐＧ部位のメチル化密度が赤芽球において２０％未満であり、他の血球および組織において８０％を超える場合、赤芽球において低メチル化されており、逆もまた同様である。（２）ＤＭＲであるために、この領域は、低メチル化された複数のＣｐＧ部位（例えば、３、４、５、またはそれより多数）を含む必要があり得る。したがって、ＤＭＲ内の複数のＣｐＧ部位の鎖を選択して、アッセイによって分析して、ＤＭＲのシグナル対ノイズ比および特異性を改善することができる。（３）ＤＭＲは、無細胞混合物中のＤＮＡ分子を代表する大きさであるように選択することができる。血漿中では、主として短いＤＮＡ断片があり、その大部分は２００ｂｐよりも短い（１、２４、２５）。血漿中の赤血球系ＤＮＡ分子の存在を決定する実施形態については、ＤＭＲは、血漿ＤＮＡ分子の代表的な大きさ（すなわち、１６６ｂｐ）内に定義することができる（１）。このような基準の違いは、これら３つの基準と併用することができ、例えば、２０％および８０％以外の異なる閾値は、ＣｐＧ部位を低メチル化されたと特定するために使用することができる。後に考察するように、いくつかの結果は、赤芽球において低メチル化された３つの赤芽球特異的ＤＭＲ内の選択されたＣｐＧ部位を使用する。
【００３７】
先に定義した基準で、本発明者らは、全ゲノムにわたって３つの赤芽球特異的ＤＭＲを特定した。１つのＤＭＲは第１８番染色体のフェロキラターゼ（ＦＥＣＨ）遺伝子のイントロン領域内にあった。この領域において、赤芽球と他の細胞タイプとのメチル化密度の差は、特定された３つのＤＭＲの中で最も大きい。ＦＥＣＨ遺伝子は、ヘム生合成の最終段階を招来する酵素であるフェロキラターゼをコードする（２６）。図１に示すように、赤芽球特異的ＤＭＲ内の４つの選択されたＣｐＧ部位は、赤芽球においてはすべて低メチル化されていたが、他の血球および組織においては高メチル化されていた。
【００３８】
図１は、本発明の実施形態によるフェロキラターゼ（ＦＥＣＨ）遺伝子のプロモーター内のＣｐＧ部位のメチル化密度を示す。ＦＥＣＨ遺伝子は、第１８番染色体上に位置し、ＣｐＧ部位のゲノム座標はＸ軸上に示されている。示されるように、ＣｐＧ部位のメチル化密度は、ＦＥＣＨ遺伝子のイントロン領域内にある。２つの垂直点線によって境界が定められた領域１１０内に位置する４つのＣｐＧ部位は、赤芽球においてはすべて低メチル化されていたが、他の組織または細胞タイプにおいては高メチル化されていた。説明目的のために、肺、心臓、小腸、結腸、胸腺、胃、副腎、食道、膀胱、脳、卵巣および膵臓についての個々の結果は示されていない。これらの平均値は、「他の組織」によって表される。
【００３９】
この領域内に位置するＣｐＧ部位が低メチル化されているので、図１における２本の点線内の４つのＣｐＧ部位すべてについてメチル化されていない配列は、赤芽球に由来するＤＮＡに対して濃縮されるであろう。したがって、ＤＮＡ試料中の低メチル化配列の量は、赤芽球に由来するＤＮＡの量を反映するであろう。
【００４０】
特定したＣｐＧ部位でメチル化されたか、またはメチル化されていないＤＮＡを検出するためのアッセイを開発した。血漿ＤＮＡ分子内のＣｐＧ数が多いほど、アッセイはより特異的であろう。ほとんどの血漿ＤＮＡ分子は２００ｂｐ未満であり、平均して１６６ｂｐである。したがって、ＣｐＧ部位はすべて互いに１６６ｂｐ以内であり得るが、互いに１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、または１００ｂｐ以内であることができる。他の実施形態において、ＣｐＧ部位の対だけが、互いのこのような距離内にあることができる。
【００４１】
他の実施形態において、ＣｐＧ部位のメチル化密度が赤芽球においては１０％（または他の閾値）未満であり、その他の組織全部および血球においては９０％（または他の閾値）を超える場合、ＣｐＧ部位は、赤芽球において低メチル化されていると定義することができる。ＣｐＧ部位のメチル化密度が、赤芽球においては９０％（または他の閾値）を超え、その他の組織全部および血球においては１０％（または他の閾値）未満である場合、ＣｐＧ部位は赤芽球において高メチル化とされていると定義することができる。いくつかの実施形態において、ＤＭＲは、１００ｂｐ内に少なくとも２つのＣｐＧ部位を有することができ、これらはすべて、赤芽球についての差別的なメチル化を示す。
【００４２】
ＤＭＲを特定する一実施態様において、診断上有用であるために、１００ｂｐ（または何らかの他の長さ）内のＣｐＧ部位はすべて、他の組織全部および血球と比較して、赤芽球において低メチル化または高メチル化を示すことが必要とされ得る。例えば、複数のＣｐＧ部位は、哺乳類に対応する参照ゲノム上で１００ｂｐ以下に及び得る。別の例として、各ＣｐＧ部位は、別のＣｐＧ部位の１００ｂｐ以内にあり得る。したがって、ＣｐＧ部位は１００ｂｐ超に及び得る。
【００４３】
いくつかの実施形態において、この１つ以上の差次的にメチル化された領域は、以下の様式で特定され得る。複数の部位のメチル化指数（例えば、密度）は、例えば図１に示すように、特定の血球系譜およびその他の細胞系譜を含む複数の細胞系譜の各々について得ることができる。複数の部位の各部位において、複数の細胞系譜のメチル化指数を互いに比較することができる。この比較することに基づいて、複数の部位の１つ以上の部位は、各々が、第１のメチル化閾値を下回る／上回る特定の血球系譜におけるメチル化指数、および第２のメチル化閾値を上回る／下回るその他の細胞系譜の各々におけるメチル化指数を有すると特定することができる。このようにして、低メチル化部位および／または高メチル化部位を特定することができる。第１のメチル化閾値の例は、低メチル化部位について１０％、１５％または２０％であり、この場合、第２のメチル化閾値の例は、８０％、８５％、または９０％であり得る。次に、この１つ以上の部位を含有する差次的にメチル化された領域は、例えば、先に説明した基準を用いて特定することができる。
【００４４】
２．メチル化ＤＮＡ配列および非メチル化ＤＮＡ配列の検出
赤芽球特異的ＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡ配列および非メチル化ＤＮＡ配列を検出するために、２つのデジタル式ＰＣＲアッセイが開発され得る。１つは非メチル化配列を標的とし、もう１つはメチル化配列を標的とする。他の実施形態において、ＤＭＲのメチル化配列および非メチル化配列の検出および／または定量化のために、メチル化認識配列決定（例えば、二亜硫酸塩配列決定、またはＤＮＡのメチル化状態に基づいてＤＮＡを差別的に修飾するであろう生化学的プロセスまたは酵素によるプロセスに続く配列決定）、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ、メチル化感受性制限酵素分析、およびマイクロアレイ分析などの他の方法も使用することができる。したがって、ＰＣＲアッセイの他に、他のタイプのアッセイを使用することができる。
【００４５】
１例において、赤芽球ＤＭＲは、二亜硫酸塩処理後に検出することができる。ＣｐＧ部位のメチル化状態は、検出結果（例えば、ＰＣＲシグナル）に基づいて決定することができる。ＦＥＣＨ遺伝子に関して、配列決定のための二亜硫酸塩処理後の赤血球ＤＭＲを増幅するために、以下のプライマーを使用することができる：５’−ＴＴＴＡＧＴＴＴＡＴＡＧＴＴＧＡＡＧＡＧＡＡＴＴＴＧＡＴＧＧ−３’および５’−ＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＴＡＣＡＡＣＣＴＣＴＴＡＡＴ−３’。
【００４６】
別の例において、分析の特異性を高めるために、特定のＣｐＧのメチル化状態および非メチル化状態の両方を網羅する２つの順方向プライマーを用いることができる。メチル化配列および非メチル化配列を特異的に標的とする２つのデジタル式ＰＣＲアッセイに使用されるこのようなプライマーセットを以下に列挙する。
【表１】
2019524056.tif 000002
【表２】
2019524056.tif 000003
【００４７】
逆方向プライマーおよびプローブにおいて下線を付されたヌクレオチドは、ＣｐＧ部位での差別的にメチル化されたシトシンであった。逆方向プライマーならびに非メチル化アッセイおよびメチル化アッセイのプローブは、下線を付されたヌクレオチドでの相違のために、非メチル化配列およびメチル化配列へ特異的に結合する。
【００４８】
３．普遍的にメチル化されたＤＮＡおよび普遍的に非メチル化されたＤＮＡを用いた確認
普遍的にメチル化されたＤＮＡおよび普遍に非メチル化されたＤＮＡの分析を行って、２つのアッセイの正確率を確認した。
【００４９】
ＣｐＧｅｎｏｍｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）由来の普遍的にメチル化された配列と、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）由来の普遍的に非メチル化された配列とを用いて、赤芽球特異的ＤＭＲのメチル化配列および非メチル化配列の検出および定量化のために設計されたこれら２つのデジタル式ＰＣＲアッセイの特異性を確認した。ＣｐＧｅｎｏｍｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡをＨＣＴ１１６ＤＫＯ細胞から精製した後、Ｍ．ＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼを用いてＣｐＧヌクレオチドをすべて酵素でメチル化した。普遍的にメチル化されたＤＮＡ配列および普遍的に非メチル化されたＤＮＡ配列を、陽性対照および陰性対照と同じプレート上で泳動した。陽性蛍光シグナルのカットオフ値は、対照に関して決定した。各試料中のメチル化ＤＮＡ配列および非メチル化ＤＮＡ配列の数は、２つ組のウェルから組み合わせた計数の後にポアソン補正を用いて算出した（４）。
【００５０】
図２Ａおよび図２Ｂは、本発明の実施形態によるメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを検出するために設計されたデジタル式ＰＣＲアッセイを用いた、普遍的にメチル化されたＤＮＡおよび普遍的に非メチル化されたＤＮＡの分析を示す。縦軸は、非メチル化配列の相対蛍光シグナル強度に対応する。横軸は、メチル化配列の相対蛍光シグナル強度に対応する。メチル化または非メチル化のいずれかであることが既知のＤＮＡを用いてデータを生成した。これらの分析は、メチル化ＤＮＡまたは非メチル化ＤＮＡに対するアッセイの特異性を実証することを目的としている。
【００５１】
普遍的に非メチル化されたＤＮＡの分析のために、増幅シグナルを非メチル化ＤＮＡについてのアッセイに用いて検出し（図２Ａの２０５における青色の点２１０は正のＦＡＭシグナルに対応）、メチル化ＤＮＡのためのアッセイを用いたとき、青色の点２１０は検出されなかった（図２Ｂのプロット２５５）。普遍的にメチル化されたＤＮＡの分析のために、増幅シグナルをメチル化ＤＮＡについてのアッセイに用いて検出し（図２Ｂのプロット２５０における緑色の点２２０）、非メチル化ＤＮＡについてのアッセイを用いて。緑色の点２２０は検出されなかった（図２Ａのプロット２００）。各パネルの黒色の点は、増幅されたシグナルをまったく含まない液滴を表す。４つのパネルの各々の内部の太い縦線および横線は、陽性結果についての閾値蛍光シグナルを表す。これらの結果は、赤芽球特異的ＤＭＲにおけるメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡについてのこれら２つのアッセイの特異性を確認した。
【００５２】
ＦＥＣＨ遺伝子関連ＤＭＲに基づくアッセイの分析感度をさらに評価するために、非メチル化配列を有する試料を、指定分別濃度（すなわち、ＦＥＣＨ遺伝子関連ＤＭＲの（非メチル化およびメチル化）配列全部における非メチル化配列の百分率）で連続希釈した。１反応あたり合計１，０００個の分子があった。非メチル化配列は、メチル化配列および非メチル化配列の総量の０．１％程度の低さで検出することができた（表３を参照されたい）。
【表３】
2019524056.tif 000004
【００５３】
加えて、電位変動（例えば、ピペット操作に由来）を評価するために、本発明者らは、指定分別濃度（非メチル化配列％＝３０％）で２０の個別の反応において、メチル化配列および非メチル化配列の人工的に混合した試料中での非メチル化配列の百分率を反復して測定した。本発明者らは、各反応について、合計５００個のメチル化分子および非メチル化分子を使用した。この数値は、血漿ＤＮＡ試料についての本発明者らのデジタル式ＰＣＲ分析において、メチル化分子および非メチル化分子の総数において観察されたものに匹敵する。本発明者らは、非メチル化配列の百分率の２０回の反復測定について、平均３０．４％および標準偏差１．７％を観察した。アッセイ内変動係数は５．７％と計算される。
【００５４】
３．異なる試料のためのアッセイの特異性および感度
赤血球系ＤＮＡについてＦＥＣＨ遺伝子関連ＤＭＲを標的とするデジタル式ＰＣＲアッセイの組織特異性を確認するために、本発明者らは、異なる量の赤芽球細胞を有する種々の試料におけるデジタル式ＰＣＲアッセイを、これらのデジタル式ＰＣＲアッセイ以外の技術を用いて測定したように試験した。デジタル式ＰＣＲアッセイによって検出された非メチル化ＤＮＡ配列の量は、赤血球系ＤＮＡの量を反映するはずである。同様に、メチル化配列の量は、他の組織または細胞タイプに由来するＤＮＡを反映するはずである。それゆえ、本発明者らは、生物学的試料中の赤血球系ＤＮＡ（Ｅ％）の百分率を、赤芽球特異的ＤＭＲにおいて検出された（非メチル化およびメチル化）配列全部における非メチル化配列の百分率として定義した。したがって、ＤＭＲ領域についてのメチル化配列および非メチル化配列に特異的なアッセイを用いて血液試料を分析して、非メチル化配列の百分率、非メチル化％（Ｅ％とも呼ぶ）、および赤芽球由来のＤＮＡの存在の相関を決定した。非メチル化％（Ｅ％）は、メチル化レベルの例である。
【００５５】
赤血球ＤＮＡの百分率（Ｅ％）は、以下のように計算した：
【数１】
2019524056.tif 000005
【００５６】
赤芽球と他の細胞タイプとのメチル化密度の相違がＦＥＣＨ遺伝子内ＤＭＲにとって最大であるので、本発明者らはまず、本発明者らの仮説を立証するために、このマーカー部位に基づいて、Ｅ％の分析に進んだ。その後、本発明者らは、ＦＥＣＨ遺伝子関連ＤＭＲからのＥ％結果を検証するために、試料の部分セットにおける他の２つの赤芽球特異的ＤＭＲに基づいてＥ％を分析した。ＦＥＣＨ遺伝子内のＤＭＲに基づいたＥ％の結果を、Ｅ％（ＦＥＣＨ）で示すであろう。メチル化配列の百分率、または非メチル化配列に対するメチル化配列の比のみなど、他の百分率または比も使用され得、いずれの値もこの比の分子および分母にあることができる。
【００５７】
具体的には、図１からのＦＥＣＨ遺伝子上の４つのＣｐＧ部位での各試料中のメチル化ＤＮＡ配列および非メチル化ＤＮＡ配列の数を、デジタル式ＰＣＲを用いて測定した。次に、試料中の非メチル化ＤＮＡの百分率（非メチル化％／Ｅ％）を計算した。一実施形態において、ＤＮＡ断片が非メチル化とみなされるために、４つのＣｐＧ部位がすべて非メチル化されていることになっている。
【００５８】
２つのシナリオを用いて、赤芽球を定量化するアッセイシグナルの能力を試験する。１つのシナリオは、臍帯血と成人血液の２種類の試料で赤芽球の数が異なるので、臍帯血対成人血液である。また、その他のシナリオについては、重症型ベータサラセミアに罹患している対象は、血中にかなりの数の赤芽球を有している。
【００５９】
１．赤芽球濃縮試料対健常対象のバフィーコート
成人血液中の赤芽球の数は非常に低い。臍帯血は赤芽球の数が非常に多い。したがって、４つのＣｐＧ部位についてのＥ％は、健常な患者についてのものよりも臍帯血において非常に高いはずである。したがって、赤血球系ＤＮＡのＦＥＣＨ遺伝子関連ＤＭＲを標的とするデジタル式ＰＣＲアッセイの組織特異性を確認するために、本発明者らは、１２の異なる正常組織タイプから抽出されたＤＮＡを含む試料において、および赤芽球を濃縮した試料において、デジタル式ＰＣＲアッセイを試験した。本発明者らは、各組織タイプについて異なる個体から４つの試料を含めた。赤芽球濃縮試料を、分析のために臍帯血から調製した。
【００６０】
具体的には、ＤＭＲのメチル化密度とＥ％との関連を確認するために、静脈血試料を２１名の健常対象と３０名の妊婦（妊娠初期１０名、妊娠中期１０名および妊娠後期１０名）から収集した。血液試料を３，０００ｇで１０分間遠心分離して、血漿と血球とを分離した。バフィーコートを遠心分離後に回収した。血漿試料を回収し、３０，０００ｇで再遠心分離して残留血球を除去した。
【００６１】
１２種類の異なる正常組織タイプについては、本発明者らは、各組織タイプについて異なる個体からの４個の試料を含めた。表４に示すように、組織ＤＮＡすべてに由来する中央値Ｅ％（ＦＥＣＨ）値は低かった（中央値の範囲：０．００％〜２．６３％）。
【表４】
2019524056.tif 000006
【００６２】
フローサイトメトリーおよび細胞選別ならびにその後のＤＮＡ抽出による臍帯血からの濃縮のための実験手順を以下に説明する。出産後、８名の各妊婦から１〜３ｍＬの臍帯血を収集した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた密度勾配遠心分離後、臍帯血試料から単核細胞を単離した。単核細胞の収集後、１×１０８個の細胞を、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）結合抗ＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）およびフィコエリトリン（ＰＥ）結合抗ＣＤ７１抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）をリン酸緩衝塩類溶液中に１：１０希釈した混合物１ｍＬとともに、３０分間、４℃の暗所でインキュベートした。次に、ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ７１＋細胞の選別および分析を、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。ＣＤ２３５ａおよびＣＤ７１が赤芽球に特異的に存在するので、ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ７１＋細胞を赤芽球に対して濃縮されるであろう（Ｂｉａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｎａｔａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  １９９３；１３：２９３−３００）。
【００６３】
各場合から得られた細胞数はわずかであったので、８例からの細胞を下流の分析のためにプールした。これら２つの抗体は、赤芽球に特異的であり、赤芽球表面に付着する。これら２つの抗体をそれぞれ、ＦＩＴＣおよびフィコエリトリンと結合させる。これらの２つの物質は磁気ビーズへ結合し、このビーズは細胞選別機を用いて選別することができる。それゆえ、Ａｂ標識した赤芽球を捕捉することができる。抗ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）抗体および抗ＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）抗体を用いたフローサイトメトリーおよび細胞選別（補足的な材料および方法を参照されたい）を用いて、赤芽球を８つの臍帯血試料から濃縮した後、プールした。プールした試料からＤＮＡを抽出した。
【００６４】
プールした臍帯血試料に由来するＤＮＡのＥ％（ＦＥＣＨ）は、ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ７１＋細胞（大部分が赤芽球）についてのアッセイにおいて試験した４つのＣｐＧ部位において６７％であった。末梢血中の赤芽球数が検出できなかった２０名の健康対象のバフィーコートＤＮＡにおけるＥ％（ＦＥＣＨ）に関して、バフィーコートＤＮＡの中央値Ｅ％は２．２％（四分位範囲：１．２〜３．１％）であった。健常対象のバフィーコートにおける赤芽球特異的非メチル化配列の比率が低いという観察は、成熟ＲＢＣが核を有さないという事実と一致する。ＣＤ２３５ａおよびＣＤ７１は、赤芽球に特異的な細胞表面マーカーであるので（Ｂｉａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｎａｔａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  １９９３；１３：２９３−３００）、ＣＤ２３５ａおよびＣＤ７１が濃縮された細胞における高いＥ％（ＦＥＣＨ）は、赤芽球特異的ＤＭＲにおける非メチル化ＤＮＡについてのアッセイが、赤芽球由来のＤＮＡを検出することができるであろうことを示している。したがって、赤芽球が濃縮された試料についてのこの高いＥ％は、他の組織タイプ由来のＤＮＡおよび健常対象のバフィーコートＤＮＡについての低いＥ％の結果とともに、非メチル化ＦＥＣＨ配列についてのデジタル式ＰＣＲアッセイが赤芽球由来のＤＮＡに特異的であったことを示す。
【００６５】
２．重症型ベータサラセミア患者について
重症型ベータサラセミアに罹患している患者において、骨髄は、多くの赤血球（ＲＢＣ）を作ろうとしている。しかしながら、ヘモグロビンの産生に欠陥がある。結果として、多くのＲＢＣは十分なヘモグロビンを含有しておらず、多くの過剰なアルファグロビン鎖を含有している。これらの欠陥のあるＲＢＣは骨髄から除去されるであろうことから、成熟ＲＢＣとなることは決してないことになっている。グロビン鎖には、アルファとベータの２種類がある。１つのヘモグロビン分子は２つのアルファ鎖と２つのベータ鎖を必要とする。ベータ鎖が産生されない場合、過剰なアルファ鎖は互いに凝集することになっており、機能的ヘモグロビンは形成されることができない。
【００６６】
重症型ベータサラセミア患者において、高いが有効ではない赤血球産生は、成熟ＲＢＣの産生低下をもたらすであろう（Ｓｃｈｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００２；９：１２３−６）。これには、代償性髄外造血および循環中の有核赤血球の存在が伴う。後述するように、重症型ベータサラセミア患者は、健常な患者よりも有核赤血球を多く有することになっている。末梢血中の有核ＲＢＣの数は、血液塗抹標本について計数することができ、１００個の白血球（ＷＢＣ）あたりの有核ＲＢＣの数として表すことができる。
【００６７】
重症型サラセミア患者は、有効ではない赤血球産生のため、健常個体よりも末梢血中の赤芽球の数値が概して高く（２７）、このような患者はまた、アッセイの特異性および感度を試験するための良好な機序を提供する。それゆえ、本発明者らは、β重症型サラセミア患者１５名のバフィーコートＤＮＡにおける本発明者らのデジタル式ＰＣＲアッセイの感度を試験した。患者は全員、自動血液分析装置（ＵｎｉＣｅｌ  ＤｘＨ  ８００  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって測定され、手動計数によって確認されるように、末梢血中の赤芽球数は検出可能であった。
【００６８】
図３Ａは、本発明の実施形態による、血球中のＥ％（ＦＥＣＨ）と有核ＲＢＣ（赤芽球）の数との相関を示すプロットである。Ｅ％は、  ＦＥＣＨ遺伝子関連ＤＭＲを標的とするデジタル式ＰＣＲアッセイによって測定される。縦軸と横軸によって示されるように、このプロットは、自動血液分析装置を用いて測定した場合、バフィーコートＤＮＡ中の赤血球系ＤＮＡ配列の百分率（Ｅ％（ＦＥＣＨ））と末梢白血球全部における赤芽球の百分率との相関を示す。
【００６９】
図３Ａに示すように、バフィーコートＤＮＡ中のＥ％（ＦＥＣＨ）は、血液分析装置によって測定した末梢白血球中の赤芽球の百分率と十分に相関していた（ｒ＝０．９４、Ｐ＜０．０００１、ピアソン相関）。サラセミア患者のバフィーコートにおけるＥ％と赤芽球の計数との良好な直線関係は、赤血芽がＤＭＲについて非メチル化されており、他の血球がメチル化されているので、デジタル式ＰＣＲアッセイが試料中の赤血球系ＤＮＡ含量の良好な定量的測定を提供したことを示す。それゆえ、血液試料中の赤芽球の比率が高いほど、Ｅ％はより高いであろう。この実験の目的は、これらのアッセイが、試料中の赤芽球由来ＤＮＡの量を反映するために使用することができることを実証することとする。これらの結果は、ＦＥＣＨ遺伝子についてのＥ％が赤芽球由来のＤＮＡの比率を反映することをさらに支持する。
【００７０】
この相関は、他の患者についても同様に存在するであろう。しかし、赤芽球数は、重症型ベータサラセミアに罹患している患者については多くあり得、これらの患者の試料は、このような相関を特定するための良好な試験を提供する。図３Ａからわかるように、患者は広範囲のＥ％および赤芽球数を有し、それによって相関を試験するための良好な機序を提供した。
【００７１】
３．特定の細胞系譜の細胞ＤＮＡの量を測定する方法
いくつかの実施形態において、無細胞混合物（例えば、血漿試料または血清試料）中の非メチル化ＤＮＡ断片またはメチル化ＤＮＡ断片の量が特定の細胞系譜に特異的な１つ以上のＤＭＲで計数される場合、この量を用いて、特定の細胞系譜の細胞数（または他の量のＤＮＡ）を測定することができる。図３Ａに示すように、ＦＥＣＨ  ＤＭＲでメチル化されていないＤＮＡ断片の百分率は、血液試料中の赤芽球の数と相関する。絶対濃度も使用され得る。高メチル化ＤＭＲについては、メチル化ＤＮＡ断片の量（例えば、百分率または絶対濃度）を使用することができる。本明細書で説明されているように、種々の細胞系譜を使用することができる。
【００７２】
細胞数の数を決定するために、較正関数を使用することができる。図３Ａの例において、データ点に適合する線は、較正関数を提供することができる。例として、較正関数は、その関数パラメータ（例えば、線に対する傾きおよびｙ切片、または他の関数に対するより多数のパラメータ）によって保存することができるか、または曲線適合を得ることのできる一組のデータ点によって保存することができる。赤芽球数を決定したのと同じように別の技術によって決定することができるので、データ点（例えば、較正データ点と呼ばれる）は、細胞系譜のＤＮＡ量についての既知の値（例えば、細胞数）を有することができる。
【００７３】
したがって、方法は、血液試料中の特定の細胞系譜に由来するＤＮＡの量を決定することができる。１つ以上のＤＭＲの多数のメチル化配列または非メチル化配列は、本明細書に説明されるように、アッセイから決定することができる。メチル化レベルを決定して、較正関数の較正値と比較することができる。例えば、メチル化レベルを線（または他の較正関数）と比較して、この関数とそのメチル化レベルとの交差、したがって対応するＤＮＡ量（例えば、図３Ａの横軸上の値）を決定することができる。他の実施形態において、メチル化レベルは、例えば、試料の測定されたメチル化レベルに近いメチル化レベルを有する個々の較正データ点と比較することができる。
【００７４】
図３Ｂは、本発明の実施形態による無細胞ＤＮＡを分析することによって生物学的試料中の特定の細胞系譜の細胞量を決定するための方法３００を示す流れ図である。方法３００は、図３Ａに示すもののような測定値を用いることができる。方法３００の一部は手動で実行されてもよく、他の部分はコンピュータシステムによって実行されてもよい。一実施形態において、システムはステップをすべて実行することができる。例えば、システムは、（例えば、試料を得てアッセイを行うための）ロボット要素、アッセイからのシグナルを検出するための検出システム、およびシグナルを分析するためのコンピュータシステムを含むことができる。このようなシステムを制御するための命令は、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）の設定論理、フラッシュメモリ、および／またはハードドライブなど、１つ以上のコンピュータ可読媒体に保存することができる。図２７は、このようなシステムを示す。
【００７５】
ブロック３１０で、生物学的試料の無細胞混合物を得る。生物学的試料は、血液試料であってもよいが、本明細書に説明されるように、無細胞ＤＮＡを含む他の試料でもあってもよい。無細胞混合物の例としては、血漿または血清が挙げられる。無細胞混合物は、複数の細胞系譜に由来する無細胞ＤＮＡを含むことができる。
【００７６】
ブロック３２０において、無細胞混合物中のＤＮＡ断片を、１つ以上の差次的にメチル化された領域に対応するアッセイと接触させる。１つ以上の差次的にメチル化された領域の各々は、他の細胞系譜と比較して低メチル化または高メチル化されることによって、特定の細胞系譜（例えば、赤芽球などの特定の血球系譜）に特異的である。
【００７７】
種々の実施形態において、アッセイは、ＰＣＲまたは配列決定を包含することができる。ＤＮＡ断片を接触させることは、アッセイとＤＮＡ断片との相互作用を提供するためのフローセル、液滴、ビーズ、または他の機序を包含することができる。このようなアッセイの例としては、全ゲノム二亜硫酸塩配列決定、標的化二亜硫酸塩配列決定（ハイブリッド形成捕捉またはアンプリコン配列決定による）、他のメチル化用品配列決定（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）ＤＮＡ配列決定）、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ、およびデジタル式ＰＣＲが挙げられる。方法３００に使用可能なアッセイのさらなる例は、本明細書に、例えば、第ＸＩＩ節に説明されている。図３Ａの例は、赤芽球についてのものであるが、他の血球系譜を含む他の血液系譜を使用することができる。
【００７８】
ブロック３３０において、メチル化ＤＮＡ断片または非メチル化ＤＮＡ断片の第１の数を、アッセイから得られた信号に基づいて１つ以上の差次的にメチル化された領域で、無細胞混合物中で検出する。アッセイは、光信号または電気信号などの種々の信号を提供することができる。信号は、ＤＮＡ断片あたりの特異的信号、または（例えば、リアルタイムＰＣＲにおけるような）メチル化署名を有するＤＮＡ断片の総数を示す凝集信号を提供することができる。
【００７９】
一実施形態において、配列決定は、ＤＮＡ断片のための配列読み取りを得るために使用することができ、このＤＮＡ断片は、参照ゲノムと整列させることができる。ＤＮＡ断片がＤＭＲのうちの１つと整列する場合、カウンタを増分させることができる。信号が非メチル化アッセイの特定のメチル化に由来すると仮定すると、ＤＮＡ断片は、そのメチル化署名を有すると想定することができる。別の実施形態において、ＰＣＲからの読み取り（例えば、陽性ウェルからの光信号）を使用して、このようなカウンタを増分させることができる。
【００８０】
ブロック３４０において、第１のメチル化レベルを第１の数を用いて決定する。第１のメチル化レベルは、標準化され得るか、または絶対濃度、例えば、生物学的試料の体積あたりであり得る。絶対濃度の例を図２５に提供する。
【００８１】
正規化した値について、１つ以上の差次的にメチル化された領域の無細胞混合物中のＤＮＡ断片の第１の数および総数を使用して、メチル化レベルを決定することができる。先に説明した通り、メチル化レベルは、非メチル化ＤＮＡ断片の百分率であり得る。他の実施形態において、この百分率は、赤芽球についての先の例に対して逆の関係を有するであろうメチル化ＤＮＡ断片であり得る。種々の実行において、メチル化レベルは、ＤＭＲの部位全部にわたる百分率を用いて、各部位の個々の百分率の平均によって、または各部位の加重平均によって決定することができる。
【００８２】
ブロック３５０において、１つ以上の較正データ点を得る。各較正データ点は、（１）特定の血球系譜の細胞量および（２）較正メチル化レベルを指定することができる。１つ以上の較正データ点を、複数の較正試料から決定する。
【００８３】
細胞量は、特定量（例えば、数または濃度）または量の範囲として指定することができる。較正データ点は、本明細書に説明される種々の技術を介して測定され得る既知量の細胞を有する較正試料から決定することができる。少なくともいくつかの較正試料は、異なる量の細胞を有するであろうが、いくつかの較正試料は、同じ量の細胞を有してもよい。
【００８４】
種々の実施形態において、１つ以上の較正点は、１つの離散点、１組の離散点として、関数として、１つの離散点および関数として、または離散したもしくは連続した組の値の何らかの他の組み合わせとして定義してもよい。例として、較正データ点は、特定の系譜の細胞の特定量を有する試料について、１つの較正メチル化レベルから決定され得る。
【００８５】
一実施形態において、同じ量の細胞の複数の試料に由来する同じメチル化レベルの測定値を組み合わせて、特定量の細胞についての較正データ点を決定し得る。例えば、メチル化レベルの平均を同じ量の細胞の試料のメチル化データから得て、特定の較正データ点を決定してもよい（かまたは較正データ点に対応する範囲を提供してもよい）。別の実施形態において、同じ較正メチル化レベルを有する複数のデータ点を使用して、細胞の平均量を決定することができる。
【００８６】
一実行において、メチル化レベルを、多くの較正試料について測定する。メチル化レベルの較正値を各較正試料について決定し、ここで、メチル化レベルを、試料の既知量の細胞に対して（例えば、図３Ａにあるように）プロットされ得る。次に、関数をプロットのデータ点に適合させ、ここで関数適合は、新たな試料についての細胞量を決定する上で使用されることになっている較正データ点を定義する。
【００８７】
ブロック３６０において、第１のメチル化レベルを、少なくとも１つの較正データ点の較正メチル化レベルと比較する。この比較は種々の方法で行うことができる。例えば、この比較は、第１のメチル化レベルが較正メチル化レベルよりも高いか低いかであり得る。この比較は、較正曲線（較正データ点で構成される）と比較することを包含することができ、したがって、この比較により、第１のメチル化レベルを有する曲線上の点を特定することができる。例えば、第１のメチル化レベルの計算値Ｘを関数Ｆ（Ｘ）への入力として使用することができ、ここでＦは較正関数（曲線）である。Ｆ（Ｘ）の出力は細胞量である。各Ｘ値について異なり得る誤差範囲を提供することができ、それによりＦ（Ｘ）の出力として値の範囲を提供することができる。
【００８８】
ブロック３７０で、生物学的試料中の特定の細胞系譜の細胞量を比較することに基づいて概算する。一実施形態において、第１のメチル化レベルが閾値較正メチル化レベルを上回るか下回るかを判定することができ、それによって瞬間試料の細胞量が閾値較正メチル化レベルに対応する細胞量を上回るか下回るかを判定することができる。例えば、生物製剤について計算された第１のメチル化レベルＸ１が較正メチル化レベルＸＣを上回る場合、生物学的試料の細胞量Ｎ１は、ＸＣに対応する細胞量ＮＣを上回ると判定することができる。上下のこの関係は、パラメータがどのように定義されるかによることができる。このような実施形態において、唯一の較正データ点が必要とされ得る。
【００８９】
別の実施形態において、この比較は、第１のメチル化レベルを較正関数へと入力することによって達成される。較正関数は、第１のメチル化レベルに対応する曲線上の点を特定することによって、第１のメチル化レベルを較正メチル化レベルと有効に比較することができる。次に、概算された細胞量を較正関数の出力値として提供する。
【００９０】
４．血漿中の赤芽球に由来する無細胞ＤＮＡの起源
非メチル化％と赤芽球由来のＤＮＡとの確立された関係を用いて、血漿の非メチル化％を用いて血漿中の赤芽球由来のＤＮＡを定量化することができる。上述のアッセイを用いて、血漿中の非メチル化％を決定した。バフィーコートおよび血漿における非メチル化％の相違が見られる。この分析は、血漿中の無細胞赤芽球ＤＮＡが骨髄における赤血球産生に由来し、血流中の赤芽球由来ではないことを示している。
【００９１】
２つのデジタル式ＰＣＲアッセイによって決定された非メチル化％が試料中の赤芽球由来のＤＮＡの量を正確に反映することを確認した後、本発明者らは、健常対照対象および妊婦のバフィーコートおよび血漿における赤芽球由来のＤＮＡの比率を比較することへ進んだ。
【００９２】
図４は、本発明の実施形態による健常非妊娠対象および異なる妊娠期の妊婦のバフィーコートおよび血漿における非メチル化％を示す。血漿試料は、対象の各群についてバフィーコートと比較して有意に高い非メチル化％を有していた（血漿とバフィーコートとの対形成した各比較についてのウィルコクソンの符号つき順位検定でＰ＜０．０１）。
【００９３】
図４の結果は、有核ＲＢＣの数が少ないために予想されるように、赤芽球由来ＤＮＡの量が血球中で少ないことを示す。驚くべき結果は、血漿中の赤芽球由来ＤＮＡの量が多いことである。血漿中の赤芽球由来のＤＮＡが血球に由来した場合、これら２つの量が類似していると予想されるであろう。したがって、このデータは、血漿中の赤芽球由来ＤＮＡの起源が、骨髄における赤血球産生に由来することを示す。
【００９４】
図５は、バフィ−コートおよび血漿における非メチル化％間での相関の欠如を示すプロットである。有意な相関は、バフィーコートＤＮＡおよび血漿ＤＮＡについての非メチル化％の間で観察されなかった（Ｒ２＝０．００２、Ｐ＝０．９９、ピアソン相関）。相関関係の欠如は、非妊娠対象、妊娠前記の妊婦、妊娠中期の妊婦、および妊娠後期の妊婦を含む対象全員についてみることができる。図４における結果と同様に、このことは、赤芽球由来ＤＮＡの起源が血流中の血球に由来した場合に相関することになっている２つが予想されるであろうので、驚くべきことである。
【００９５】
血漿ＤＮＡがバフィーコートよりも非常に高い非メチル化％を有するという見解、ならびに血漿およびバフィーコートの非メチル化％間の相関の欠如は、赤芽球メチル化署名を保有する循環無細胞ＤＮＡが、循環血球に由来するよりもむしろ、赤血球産生のプロセス中に骨髄に由来したらしいことを示唆している。したがって、赤芽球メチル化署名を有する無細胞血漿ＤＮＡは、血流中の有核ＲＢＣ数が健常対象および妊婦において非常に少ないので血流中の有核ＲＢＣから生成されることとは対照的に、骨髄中で生成される。また、白血球（ＷＢＣ）から赤芽球メチル化署名への寄与は非常に低いので、この寄与は、赤芽球メチル化署名を有する無細胞血漿ＤＮＡに対して測定可能な依存性を提供しない。
【００９６】
５．赤血球産生活性の測定としてのメチル化レベル
先の観察に基づき、本発明者らは、赤芽球ＤＭＲの非メチル化％が、骨髄における赤血球産生活性を反映するであろうと判断した。高い非メチル化％は、増加した赤血球産生活性を示すであろう。換言すれば、血漿／血清中の赤芽球ＤＮＡの分析は、骨髄の液体生検として役立つであろう。この分析は、貧血の調査に、例えば、貧血が赤血球産生の低下（例えば、再生不良性貧血）、赤血球産生欠損（例えば、サラセミアにおける成熟したＲＢＣの産生の不全）、またはＲＢＣ消費の上昇（例えば、失血および溶血性貧血）によるものかどうかを判断するために、特に有用であろう。この目的のために、本発明者らは、３５名の健常対象および異なる病因を有する７５名の貧血患者を募集した。末梢血試料の収集および加工、血漿およびバフィーコートのＤＮＡの抽出、ならびにＤＮＡの二亜硫酸塩変換を行った。方法のさらなる詳細は、第ＸＩＩ節において説明する。
【００９７】
１．健常対象の血漿中の無細胞赤血球系ＤＮＡの測定
本発明者らのアッセイの特異性を確認した後、本発明者らは、これらのアッセイを用いて健常対象の血漿を分析した。本発明者らは、健常対象３５名の血漿中のＥ％（ＦＥＣＨ）を分析し、これには、同じくバフィーコート試料も提供した同じ群の２０名の対象も含まれた。血漿ＤＮＡの中央値Ｅ％（ＦＥＣＨ）は３０．１％（四分位範囲：２３．８〜３４．８％）であった。このことは、赤血球系ＤＮＡが健常個体の血漿中の循環ＤＮＡプールの有意な比率を構成することを示唆した。血漿赤血球系ＤＮＡの起源を判断するために、本発明者らは、２０名の健常対象の血漿およびバフィーコートにおける対応するＥ％（ＦＥＣＨ）結果を比較した。
【００９８】
図６Ａおよび図６Ｂは、健常対象における赤血球系ＤＮＡ（Ｅ％（ＦＥＣＨ））の百分率を示す。図６Ａは、健常対象のバフィーコートＤＮＡおよび血漿ＤＮＡにおけるＥ％を示し、ここでＥ％の値はバフィーコート（細胞部分）よりも血漿（無細胞部分）において高い。血漿ＤＮＡにおける中央値Ｅ％（中央値：２６．７％、四分位範囲：２３．７〜３０．４％）は、対形成したバフィーコートＤＮＡにおける中央値Ｅ％（中央値：２．２％、四分位範囲：１．２〜３．１％）よりも有意に高かった（ウィルコクソンの符号つき順位検定でＰ＜０．０００１）。
【００９９】
図６Ｂは、バフィーコートＤＮＡにおけるＥ％と、対応する健常対象の血漿ＤＮＡとの相関の欠如を示す。血漿ＤＮＡおよびバフィーコートＤＮＡにおける対形成したＥ％（ＦＥＣＨ）結果の間には相関の欠如があった（ｒ＝０．００２、Ｐ＝０．９９、ピアソン相関）。図６Ａおよび図６Ｂの両方の所見は、循環赤血球系ＤＮＡが、末梢血中の循環赤芽球に主として由来したとは考えにくかったことを示している。
【０１００】
図７は、血漿ＤＮＡのＥ％（ＦＥＣＨ）結果と健常対象の年齢との相関の欠如を示す。このプロットは、Ｅ％（ＦＥＣＨ）結果が対象の年齢と相関していないことを示している（Ｒ＝０．２１、Ｐ＝０．２３、ピアソン相関）。
【０１０１】
２．重症型ベータサラセミア患者と再生不良性貧血患者との区別
血漿中の赤血球系ＤＮＡが循環中の未処置の赤芽球から主に放出されなかったと判断した後、本発明者らは、これらのＤＮＡ分子が赤血球産生の間に骨髄から放出された可能性がより高いことを提唱した。本発明者らは、血漿中の赤血球系ＤＮＡの定量分析が、骨髄における赤血球産生活性に関する情報を提供することができるであろうと推論した。
【０１０２】
血漿を用いて骨髄における赤血球産生の活性を測定する能力を確認するために、重症型ベータサラセミアおよび再生不良性貧血に罹患している患者を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐｒｉｎｃｅ  ｏｆ  Ｗａｌｅｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（香港）から動員した。輸血前に静脈血試料を採取した。血漿ＤＮＡの非メチル化％を、各患者についてデジタル式ＰＣＲによって決定した。これらの結果は、ヘモグロビンレベルと相関していた。ヘモグロビンレベルは、当業者に既知の技術を介して、例えば自動血球計数器で行われる測光技術によって測定することができる。ヘモグロビンレベルは、例えば、遠心分離後に得られるＲＢＣ部分から測定することができる。
【０１０３】
これら２つの群の患者（重症型ベータサラセミアおよび再生不良性貧血）は、赤血球産生活性の２つの異なるスペクトルを表す。重症型ベータサラセミア患者においては、赤血球産生が非常に活発である。しかしながら、機能的ベータグロビン鎖の産生欠損のため、成熟ＲＢＣの産生が低下する。再生不良性貧血の患者においては、赤血球産生が低下し、ＲＢＣの産生低下をもたらす。
【０１０４】
図８は、本発明の実施形態による再生不良性貧血患者、重症型ベータサラセミア患者、および健常対照対象におけるヘモグロビン濃度に対する非メチル化％のプロットである。ベータサラセミア患者においては、ヘモグロビン濃度は低下したが、健常対照対象と比較して、非メチル化％は有意に上昇した（マン・ホイットニー順位和検定でＰ＜０．０１）。実際、１１名のベータサラセミア患者のうち１０名（８９％）の非メチル化％値は、健常対照対象全員の値よりも高かった。この観察は、これらの患者における高いが欠損性である赤血球産生と一致する。
【０１０５】
対照的に、定期的な輸血を受けている再生不良性貧血患者６名については、彼らの非メチル化％値は、健常対照対象全員の値よりも低かった。この観察は、これらの患者の低い赤血球産生と一致する。
【０１０６】
臨床的寛解にあった３名の再生不良性貧血患者については、彼らのヘモグロビンレベルは正常であり、定期的な輸血を必要としなかった。彼らの非メチル化％値は、健康対照対象の値と有意に異なることはなかった（マン・ホイットニー順位和検定でＰ＝０．５３）。したがって、血漿中の赤芽球特異的ＤＮＡの定量分析は、例えば、再生不良性貧血が寛解しているかどうかを判断するために、骨髄機能不全患者のモニタリングに有用であろう。さらに、赤芽球特異的ＤＮＡの定量分析を用いて。治療を誘導することができる。例えば、寛解していない再生不良性貧血患者は、定期的な輸血で治療することができる。
【０１０７】
したがって、非メチル化％は、サラセミア患者ではより高く、再生不良性貧血患者ではより低い。サラセミアについては、患者は貧血であり、骨髄は循環系に対してより多数のＲＢＣを産生したいので、骨髄は活溌である。それゆえ、赤血球産生速度は、貧血のない健常対象よりも高い。再生不良性貧血の患者については、貧血はＲＢＣの低い産生による。全体的に、これらの結果は、赤芽球特異的メチル化特性の分析が、骨髄における赤血球産生活性を反映するのに有用であろうことを示している。
【０１０８】
患者は、ヘモグロビン測定と非メチル化％との組み合わせを介して診断を受けることができる。例えば、ヘモグロビンが１１．８を下回りＥ％が５０を上回る患者は、β−サラセミアと分類することができる。一方、ヘモグロビンが１１．８を下回りＥ％が２５を下回る患者は、再生不良性貧血に罹患していると分類することができる。
【０１０９】
３．鉄欠乏性貧血および治療
貧血は、栄養素（例えば、鉄、Ｂ１２、葉酸など）の欠乏、失血（例えば、過多月経または消化管からの出血による）または慢性障害（例えば、癌、炎症性腸疾患）に起因し得る。
【０１１０】
図９は、鉄（Ｆｅ）欠乏性貧血および急性失血に罹患している患者における血漿非メチル化％のプロットである。鉄欠乏性貧血患者３名および急性消化管血を呈した患者１名を試験した。２名の鉄欠乏患者において、貧血は過多月経によるものであった。１名の患者については、鉄補充を開始する前に血液試料を採取した。もう１名は、血液試料を鉄補充療法開始１週間後に採取した。第３の鉄欠乏性貧血患者は炎症性腸疾患に罹患しており、鉄補充を開始する前に、血液試料を採取した。
【０１１１】
血漿非メチル化％を各患者について決定し、健常対照対象の値と比較した。急性消化管出血患者においては、血漿非メチル化％の上昇が観察された。鉄補充療法を開始する前に試料を採取した２名の鉄欠乏患者については、ヘモグロビンレベルが低いにもかかわらず、その血漿非メチル化％値は健常対象と比較して上昇していなかった。鉄補充開始１週間後に試料を採取したＦｅ欠乏患者については、血漿非メチル化％の上昇が観察された。
【０１１２】
これらの結果は、血漿非メチル化％が治療に応答して赤血球産生活性を反映することを示している。例えば、鉄補充治療は、増加した赤血球産生活性を示す。さらに、これらの結果は、非メチル化％における応答がヘモグロビンレベルの上昇よりも迅速であろうことを示している。非メチル化％の使用は、このような治療が有効であるかどうか、したがってこれを継続すべきか中止すべきかについての早期の識別子となり得る。それゆえ、非メチル化％は、ヘモグロビンレベルの変化が観察される前に、貧血の治療、例えば、鉄療法への反応を予測するための誘導を提供することができる。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、血漿非メチル化％は、貧血の治療に対する応答を反映するために使用することができる。例えば、鉄欠乏性貧血患者においては、経口鉄補充に対する応答は、消化管を通じての鉄の吸収の変動のために、異なる対象によって変化し得る。このようなシナリオにおいては、経口鉄補充を開始した後の血漿非メチル化％の上昇の欠如は、静脈内鉄療法の必要性を示すために使用することができる。
【０１１４】
４．種々の貧血障害の区別
本発明者らは、再生不良性貧血（ＡＡ）、慢性腎不全（ＣＲＦ）、慢性失血による鉄欠乏性貧血、および重症型β−サラセミアに罹患している貧血患者を募集した。骨髄における赤血球産生活性の範囲の両端を表すために、異なる疾患実体を募集した。
【０１１５】
図１０は、再生不良性貧血患者、慢性腎不全（ＣＲＦ）患者、重症型β−サラセミア患者、鉄欠乏性貧血患者および健常対象における血漿中の赤血球系ＤＮＡの百分率（Ｅ％（ＦＥＣＨ））とヘモグロビンレベルとの関係を示す。貧血患者および３５名の健常対照の血漿ＤＮＡのＥ％（ＦＥＣＨ）をヘモグロビンレベルに対してプロットしている。横軸方向の点線は健常対象の中央値Ｅ％を表す。縦線は、貧血に罹患している対象と貧血に罹患していない対象との測定されたヘモグロビンレベルのカットオフ値（図示の通り、１１．５）に対応する。
【０１１６】
本発明者らは、診断基準を満たし、免疫抑制療法に応答し損ねた１３名のＡＡ患者における血漿ＤＮＡのＥ％を分析した（２８）。ＡＡ群の血漿ＤＮＡの中央値Ｅ％は１２．４％（四分位範囲：７．５〜１３．７％）であり、健常対照の中央値Ｅ％よりも有意に低かった（マン・ホイットニー順位和検定でＰ＜０．０００１、図１０）。同様に、透析を必要とする１８名のＣＲＦ患者の中央値Ｅ％結果は、１６．８％（四分位範囲：１２．２〜２１．０％）であり、これも健常対照の中央値Ｅ％結果よりも有意に低かった（マン・ホイットニー順位和検定でＰ＜０．０００１、図１０）。これらの所見は、ＡＡ患者（２８、２９）およびＣＲＦ患者（３０）における低いエリスロポエチン活性の病態生理と一致している。
【０１１７】
重症型β−サラセミア患者については、骨髄は、高いが有効ではない赤血球産生で低酸素ストレスを補償しようとしている（３１）。募集された１７名の重症型β−サラセミア患者のうち、血漿ＤＮＡの中央値Ｅ％は６５．３％（四分位範囲：６０．１〜７８．９％）であり、健常対照の中央値Ｅ％よりも有意に高かった（マン・ホイットニー順位和検定でＰ＜０．０００１、図１０）。
【０１１８】
鉄欠乏性貧血に罹患している対象については、本発明者らは、過多月経または消化性潰瘍疾患に罹患している１１名の患者を募集した（トランスフェリン飽和１６％未満または血清フェリチンレベル３０ｎｇ／ｍｌ未満）。彼らの血漿ＤＮＡの中央値Ｅ％は３７．８％（四分位範囲：３１．８〜４３．０％）であり、健常対照の中央値Ｅ％よりも有意に高かった（マン・ホイットニー順位和検定でＰ＝０．００２、図１０）。所見は、慢性失血に対する応答としての骨髄赤血球産生活性の補償性亢進（３２）によって説明され得る。
【０１１９】
したがって、患者は、ヘモグロビン測定とＥ％との組み合わせを介して診断を受けることができる。例として、ヘモグロビンが１１．５（または他の値）を下回りＥ％が５０を上回る患者は、増加した赤血球産生活性の貧血、例えば、β−サラセミアに罹患していると分類することができる。一方、ヘモグロビンレベルが１１．５を下回りＥ％が５０を下回りかつ２８を上回る患者は、中程度の赤血球産生活性の貧血、例えば、鉄欠乏性貧血に罹患していると分類することができる。また、ヘモグロビンレベルが１１．５を下回りＥ％が２８を下回る患者は、低減した赤血球産生活性の貧血、例えば、再生不良性貧血または慢性腎不全に罹患していると分類することができる。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、血液疾患の分類を判定するために、血液試料のヘモグロビンレベルを測定することができる。ヘモグロビンレベルは、ヘモグロビン閾値（例えば、１１．５）と比較することができる。したがって、血液学的障害の分類は、メチル化レベルに加えて、ヘモグロビンレベルをヘモグロビン閾値と比較することにさらに基づくことができる。
【０１２１】
対象のＥ％（ＦＥＣＨ）、赤血球、および網状赤血球のパラメータの概要を、表５および表６ならびに図１１Ａおよび図１１Ｂにそれぞれ示す。
【表５】
2019524056.tif 000007
【０１２２】
以下の表６において、中央値および四分位範囲（括弧内）を示す。以下の略語を使用する：ヘマトクリットＨｃｔ、平均赤血球容積ＭＣＶ、平均細胞ヘモグロビンＭＣＨ、平均細胞ヘモグロビン濃度ＭＣＨＣ、および赤色細胞分布幅ＲＤＷ。
【表６】
2019524056.tif 000008
【０１２３】
図１１Ａおよび図１１Ｂは、再生不良性貧血患者、慢性腎不全（ＣＲＦ）患者、重症型β−サラセミア患者、および鉄欠乏性貧血患者における網状赤血球数／指標とヘモグロビンレベルとの関係を示す。網状赤血球指数は、網状赤血球数×ヘマトクリット／正常ヘマトクリットとして計算する。明らかなように、血液中の網状赤血球（未成熟ＲＢＣ）の量は、異なる障害間で信頼可能な区別を提供しない。これらの結果は、網状赤血球数および網状赤血球指数が、異なる病因の貧血を区別すること、例えば、サラセミアを再生不良性貧血と区別することができなかったことを示す。
【０１２４】
５．骨髄異形成症候群および真正赤血球増加症
図１２は、骨髄異形成症候群および真性赤血球増加症の患者における血漿非メチル化％のプロットである。骨髄異形成症候群患者においては、高い血漿非メチル化％が、低いヘモグロビンレベルとともに観察された。高い血漿非メチル化％は、真正赤血球増加症患者においても観察された。これらの結果は、血漿中の赤芽球ＤＮＡメチル化署名の検出および定量化が、骨髄芽細胞を包含する骨髄の異常な増殖または異形成の検出およびモニタリングに有用であることを示す。
【０１２５】
したがって、わかるように、これら２つの血液障害は、赤芽球のより多量の無細胞ＤＮＡも示し、それにより血液障害の検出を可能にする。いくつかの実施形態において、正確な診断は、骨髄生検の組織学的検査に基づくことができる。したがって、高い非メチル化％を検出することに応答して、骨髄生検を実施することができる。同様に、骨髄生検は、貧血の存在下だが栄養欠乏、例えば、鉄欠乏、ビタミンＢ１２欠乏、または葉酸欠乏の非存在下で、低い非メチル化％を検出することに応答して実施することができる。骨髄生検のためのこのようなベースは、骨髄の健康状態をモニターすることをなおも可能にしながら、このような生検の数を減らすことができる。したがって、非メチル化％は、治療応答をモニターするためにより有用であろう。
【０１２６】
６．貧血についてのその他の区別
他の障害間の区別も可能である。
【０１２７】
１．再生不良性貧血（ＡＡ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）
再生不良性貧血およびＭＤＳは両方とも、骨髄不全容態である。汎血球減少に関するこれらの類似の臨床的特徴にもかかわらず、これら２つの疾患実体は、異なる病態生理学的機序を有する。ＡＡにおいては、異形成の特徴を持たない骨髄細胞減少がある。ＭＤＳにおいては、通常、１つまたは複数の系譜を包含する骨髄細胞増加および異形成がある（３３）が、細胞減少性ＭＤＳも認識されている。
【０１２８】
図１３Ａは、本発明の実施形態による再生不良性貧血（ＡＡ）患者と骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）患者との血漿中の赤血球系ＤＮＡの百分率（Ｅ％（ＦＥＣＨ））を示す。８名のＭＤＳ患者に由来する血漿ＤＮＡの中央値Ｅ％は５０．３％（範囲：３７．４〜６０．８％）であった。２つの症例は、単一系譜の異形成を有するＭＤＳに罹患しており、４例が多重系譜異の異形成に罹患しており、２例が過剰芽球を有するＭＤＳに罹患していた（３４）。これらの従前の骨髄生検はすべて、赤血球の細胞増加を示した。ＭＤＳ患者の中央値Ｅ％は、１３名の募集されたＡＡ患者の中央値Ｅ％よりも有意に高かった（マン・ホイットニー順位和検定でＰ＜０．０００１、図１３Ａ）。ＭＤＳ患者における中央値Ｅ％結果が高いほど、ＭＤＳにおける骨髄生検所見および有効ではない赤血球産生の病態生理と一致する。
【０１２９】
したがって、ＭＤＳは、Ｅ％または他のメチル化レベルを使用して、再生不良性貧血と区別することができる。例えば、３０というカットオフ値は、再生不良性貧血またはＭＤＳに対応するものとして試料を分類するために使用することができる。
【０１３０】
２．ＡＡの治療応答群および治療非応答群
図１３Ｂは、本発明の実施形態による再生不良性貧血における治療応答群と治療非応答群の間の血漿中の赤血球系ＤＮＡの百分率（Ｅ％（ＦＥＣＨ））を示す。本発明者らは、免疫抑制療法に応答し、それによりヘモグロビンレベルを上げた８名の追加の再生不良性貧血患者を分析した。治療応答群の血漿ＤＮＡの中央値Ｅ％は、２２．５％（四分位範囲：１７．２〜２７．１％）であり、非応答群の中央値Ｅ％（中央値：１２．３％、四分位範囲：７．５〜１３．７％）よりも高かった（マン・ホイットニー順位和検定でＰ＝０．０００３、図１３Ｂ）。治療反応群と健常対照のＥ％結果の間には小さいが有意な差があった（マン・ホイットニー順位和検定でＰ＝０．０１）。
【０１３１】
これらの結果は、骨髄中の赤血球産生活性の回復を反映している。Ｅ％の回復がヘモグロビンレベルよりも早く現れることができるので、Ｅ％を用いて、患者が免疫抑制療法に応答しているかどうかを早期に判断することができる。患者が応答していない場合、例えば、幹細胞移植を行うか、または骨髄刺激薬（例えば、サルグラモスチム、フィルグラスチム、およびペグフィルグラスチム）を処方するなど、他の治療（例えば、より積極的な治療）を追求することができる。
【０１３２】
７．白血病
白血病以外の他の血液障害もＦＥＣＨなどにおける、赤芽球特異的ＤＭＲを用いて検出することができる。
【０１３３】
図１４は、本発明の実施形態による正常対象および２名の白血病患者におけるヘモグロビン濃度に対する血漿中の非メチル化％のプロットである。非メチル化％は、ＦＥＣＨ  ＤＭＲを使用して決定する。白血病または骨髄増殖性障害に罹患している患者の血漿中の非メチル化％値は、正常対象の血漿中の中央値非メチル化％よりも高い。この観察は、高いが欠陥のある赤血球産生が白血病患者にあるという観察と一致する。したがって、約４５というカットオフ値を非メチル化％に使用して、健常対象と白血病に罹患している対象とを区別し得、それにより血液学的障害のレベルを判定し得る。ヘモグロビンレベルも使用することができ、例えば、ヘモグロビンが８を下回る患者は、図１０に示すように、概して８〜約１１．８のヘモグロビンレベルを有するベータサラセミアとは対照的に、白血病に罹患していると特定され得る。
【０１３４】
６．他のメチル化マーカーについての結果
本発明者らは、試料のサブセットの血漿におけるその他２つのＤＭＲに基づいてＥ％を分析して、ＦＥＣＨ遺伝子関連ＤＭＲから先のＥ％の結果を検証した。健常対象と再生不良性貧血患者および重症型β−サラセミア患者との血漿中の赤血球系ＤＮＡの百分率における類似した相違が他の２つの赤芽球特異的ＤＭＲをＦＥＣＨ遺伝子におけるＤＭＲとして用いて観察した。
【０１３５】
１．他の２つの赤芽球特異的ＤＭＲ
第１２番染色体上に位置する他の２つのＤＭＲも低メチル化されている。これら２つのＤＭＲと関連したゲノム領域は、いかなる注釈された遺伝子としても従来特定されていなかった。
【０１３６】
図１５Ａおよび図１５Ｂは、本発明の実施形態による第１２番染色体上の赤芽球特異的ＤＭＲ内のＣｐＧ部位のメチル化密度を示す。図１５Ａは、３つの部位を含む、第１２番染色体上のゲノム座標：４８２２７６８８〜４８２２７７０１における領域１５１０を示す。図１５Ｂは、３つの部位も含む、第１２番染色体上のゲノム座標：４８２２８１４４〜４８２２８１５４における領域１５６０を示す。ゲノム座標はヒト参照ゲノムｈｇ１９に対応する。網掛け領域内に位置する選択されたＣｐＧ部位はすべて、赤芽球において低メチル化されていたが、他の組織または細胞タイプにおいては高メチル化されていた。他の組織は、肺、結腸、小腸、膵臓、副腎、食道、心臓および脳を表す。
【０１３７】
これら２つの他の赤芽球特異的ＤＭＲは、Ｅｒｙ−１およびＥｒｙ−２として標識される。他の２つのＤＭＲ（ｃｈｒ１２：４８２２７６８８〜４８２２７７０１およびｃｈｒ１２：４８２２８１４４〜４８２２８１５４）に基づくＥ％はそれぞれ、Ｅ％（Ｅｒｙ−１）およびＥ％（Ｅｒｙ−２）によって示されるであろう。
【０１３８】
図１６は、ＥＮＣＯＤＥデータベース由来の２つの他の赤芽球特異的ＤＭＲ（Ｅｒｙ−１およびＥｒｙ−２）に対するヒストン修飾（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１およびＨ３Ｋ２７Ａｃ）を示す。本発明者らは、ＥＮＣＯＤＥデータベース由来の赤芽球細胞タイプにおけるこれら２つのＤＭＲに対するヒストン修飾およびＣＨＩＰ−ｓｅｑデータセットに関する公共的に入手可能なデータを再吟味した。Ｅｒｙ−１のＤＭＲおよびＥｒｙ−２のＤＭＲは、２つのエンハンサー関連ヒストン修飾（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１およびＨ３Ｋ２７Ａｃ）によって標識されており、これらは、調節機能、特にエンハンサーの機能を示唆している。最も近い下流の遺伝子はＨＤＡＣ７遺伝子であり、およそ１５ｋｂ離れている。
【０１３９】
２．赤芽球を濃縮した試料
本発明者らは、先に説明した８つの臍帯血試料由来の赤芽球濃縮試料中の他の２つのＤＭＲに基づいて赤血球系ＤＮＡの百分率を分析した。プールされた試料から抽出されたＤＮＡのＥ％（Ｅｒｙ−１）およびＥ％（Ｅｒｙ−２）は、６６．５％および６８．５％であった。これらのＥ％値は、ＦＥＣＨ遺伝子関連ＤＭＲに基づくＥ％と類似しており、すなわち、６７％であった。３つのＤＭＲ全部に由来する類似の所見を考慮すると、予想よりも低いＥ％値（すなわち、濃縮が実施される場合に予想されるよりも低い）は、濃縮プロトコルの不完全な選択性に起因し得た。
【０１４０】
３．重症型β−サラセミア患者のバフィーコートにおけるＥ％と赤芽球との相関
２つのＤＭＲに基づく赤血球系ＤＮＡの百分率を、重症型β−サラセミア患者の同じ群のバフィーコートＤＮＡにおいて分析した。バフィーコートＤＮＡ中の２つのＤＭＲについてのＥ％は、図３Ａと類似の様式で赤芽球の百分率と十分に相関した。
【０１４１】
図１７Ａおよび図１７Ｂは、Ｅｒｙ−１マーカー（図１７Ａ）およびＥｒｙ−２マーカー（図１７Ｂ）を標的とするデジタル式ＰＣＲアッセイによって測定された重症型β−サラセミア患者のバフィーコートＤＮＡにおける赤血球系ＤＮＡ配列（Ｅ％）の百分率と、自動血液分析装置によって測定した末梢白血球全部における赤芽球の百分率との相関を示す。バフィーコートＤＮＡにおけるＥ％（Ｅｒｙ−１）およびＥ％（Ｅｒｙ−２）は、血液分析装置によって測定した末梢白血球における赤芽球の百分率と十分に相関した（ｒ＝０．９３８およびｒ＝０．９２８、両者ともＰ＜０．０００１、ピアソン相関）。
【０１４２】
図１８Ａおよび図１８Ｂは、重症型β−サラセミア患者のバフィーコートＤＮＡにおけるＥ％（ＦＥＣＨ）結果とＥ％（Ｅｒｙ−１）およびＥ％（Ｅｒｙ−２）との相関を示す。これら２つのＤＭＲから得られたＥ％の結果は、１５名の重症型β−サラセミア患者のバフィーコートＤＮＡ中のＦＥＣＨ遺伝子マーカー部位に由来する対形成したＥ％結果とも十分に相関した。
【０１４３】
４．健常対象および貧血患者の血漿中のＥ％
本発明者らは、健常対象ならびに再生不良性貧血および重症型β−サラセミアに罹患している患者の血漿ＤＮＡにおけるＥ％（ＥＲＹ−１）およびＥ％（ＥＲＹ−２）を分析した。同じ群の健常対象における３つの赤芽球特異的ＤＭＲ、７つの再生不良性貧血、および９つの重症型β−サラセミアに基づくＥ％結果を分析した。
【０１４４】
図１９は、本発明の実施形態による３つの赤芽球特異的ＤＭＲを標的とするデジタル式ＰＣＲ分析を用いて、健常対象ならびに再生不良性貧血および重症型β−サラセミアに罹患している患者における赤血球系ＤＮＡの百分率を示す。１３名の健常対象の血漿ＤＮＡ中の中央値Ｅ％（Ｅｒｙ−１）は１６．７％（四分位範囲：１０．９〜２3．５％）であり、健常対象の同じ群における中央値Ｅ％（Ｅｒｙ−２）は２５．０％（四分位範囲：２２．２〜２７．３％）であった。Ｅｒｙ−１マーカーに基づいて、再生不良性貧血および重症型β−サラセミアに罹患している患者のＥ％（Ｅｒｙ−１）はそれぞれ１３．７８％および６１．６９％であった。Ｅｒｙ−２マーカーに基づいて、再生不良性貧血および重症型β−サラセミアに罹患している患者のＥ％（Ｅｒｙ−２）はそれぞれ１４．１３％および６４．９５％であった。健常対象と再生不良性貧血患者および重症型β−サラセミア患者との血漿中の赤血球系ＤＮＡの百分率における類似した相違は、２つの赤芽球特異的ＤＭＲをＦＥＣＨ遺伝子における赤芽球特異的ＤＭＲとして用いて観察した。
【０１４５】
７．治療結果
先に説明したように、Ｅ％を使用して、貧血のための治療効力をモニターすることができる。
【０１４６】
１．鉄療法前後の鉄欠乏性貧血患者における血漿ＤＮＡ中のＥ％（ＦＥＣＨ）の測定
本発明者らは、経口鉄による消化管の副作用に対する不耐性に起因して静脈内鉄療法を受けている鉄欠乏性貧血患者４名におけるヘモグロビンレベル、網状赤血球計数、および血漿ＤＮＡのＥ％の連続的な変化をモニターした。経口鉄療法を受けている患者の代わりに、本発明者らは、この群の患者の変化を観察して、様々な消化管吸収による異なる治療応答の起こり得る交絡因子を回避することを選択した。本発明者らは、これらのパラメータを治療前および治療２日後に測定した。
【０１４７】
図２０Ａおよび図２０Ｂは、本発明の実施形態による治療前状態および治療２日後の静脈鉄療法を受けている鉄欠乏性貧血の血漿ＤＮＡ中の赤血球系ＤＮＡの百分率（Ｅ％（ＦＥＣＨ））および網状赤血球計数の百分率の連続測定結果を示す。図２０Ａは、血漿ＤＮＡのＥ％の連続的な変化を示す。図２０Ｂは、網状赤血球計数の百分率における連続的な変化を示す。
【０１４８】
対象１を除き、血漿ＤＮＡのＥ％および網状赤血球計数は増加したのに対し、ヘモグロビンレベルは治療の開始後だけ、初期的に静的なままであった。ヘモグロビンレベルの最終的な変化に関して、対象３および対象４は、最終的に、それぞれ８４．７％および７５．３％という、レベルの劇的な変化があった。対象２は、経過観察を不履行とし、治療後のヘモグロビン測定のための追加試料を提供しなかった。血漿ＤＮＡのＥ％の変化が最小であった対象１は、ヘモグロビンレベルの上昇が最小であった（１２．２％）。したがって、血漿ＤＮＡのＥ％の変化は、鉄療法に対する骨髄赤血球産生活性の動的応答を実証することができ、治療に対する患者の応答の早期予測因子として使用することができる。
【０１４９】
対象１の網状赤血球計数の増加の欠如は、ＲＢＣ産生が鉄療法に対して十分に応答していなかったことを示唆している。鉄療法へ応答しなかったことは、骨髄活性に対応するＥ％の上昇の欠如によっても反映されることができる。しかし、対象１については、鉄療法の開始前のヘモグロビンレベルが他の３名の対象のものよりも高く、健常対象の基準範囲に近かった。対象１におけるＥ％（ＦＥＣＨ）の上昇の欠如は、正常レベルからのヘモグロビンレベルのより小さな欠損のために、骨髄における赤血球産生活性の補償的亢進の欠如を反映することができる。対象１の網状赤血球は、最初は他の対象とほぼ同じであり、したがって、骨髄活性が十分なレベルであることを示していないであろう。したがって、中程度の赤血球産生活性を有する貧血については、健常患者についての正常上限のＥ％は、治療に対する陽性応答、または少なくとも不確定な応答を示す可能性があり、したがって、このような場合に治療を停止させなくてもよい。
【０１５０】
ヘモグロビンレベルを正常に戻すために、ＲＢＣ産生の上昇が必要とされる。それゆえ、鉄欠乏性貧血においては、Ｅ％の正常範囲は不適切とみなすことができる。対象２〜４のＥ％の上昇は、鉄欠乏性貧血に罹患している対象に対して正常なより高い範囲のＥ％（図１０を参照されたい）またはそれをすぐ上回るＥ％が予想されるので、鉄療法後の適切な応答を示す。したがって、治療が有効かどうかを判断するためのＥ％の閾値は、Ｅ％の開始値に依存し得る。Ｅ％の閾値は、初期値に対して特定の値の変化を指定することができ、変化の量は初期値に依存することができる。
【０１５１】
鉄の経口治療の効果も調べた。例えば、過多月経による慢性的な失血に罹患している患者は、鉄欠乏性貧血に罹患するであろう。鉄補充は、鉄欠乏状態の矯正に使用されるであろう。
【０１５２】
図２１Ａは、本発明の実施形態による経口鉄治療を受けている過多月経による鉄欠乏性貧血に罹患している患者の赤芽球ＤＭＲにおける血漿Ｅ％（ＦＥＣＨ）の連続的な変化を示す。鉄治療を受けている鉄欠乏性貧血患者の血漿中のＥ％を、鉄治療の前および７日後に分析した。図２１Ａにおいて、鉄治療を受けた後、Ｅ％の上昇があった。これらの結果は、血漿Ｅ％が、治療に応答して赤血球産生活性を反映することができたことを示唆する。
【０１５３】
図２１Ｂは、経口鉄治療後のヘモグロビンの変化を示す。ヘモグロビンレベルはまだ劇的に上昇していないが、治療後の同じ時点でＥ％（ＦＥＣＨ）の上昇があった。このことは図２０Ａと類似しており、図２０Ａは、治療が有効かどうかの早期検出としてＥ％が使用できることを示している。
【０１５４】
２．慢性腎疾患（ＣＫＤ）のための治療
ＣＫＤ患者においては、貧血の主な原因は、腎臓の損傷によるエリスロポエチン産生の低下である。エリスロポエチンは、低い組織酸素レベルに応答して腎臓によって産生されるホルモンである。エリスロポエチンは、赤血球を産生するために骨髄を刺激する。外来性エリスロポエチンは、ＣＫＤの貧血の治療に使用されるであろう。
【０１５５】
図２２は、組換えエリスロポエチン（ＥＰＯ）または赤血球産生促進剤（ＥＳＡ）の治療を受けている慢性腎疾患（ＣＫＤ）患者の赤芽球ＤＭＲにおける血漿非メチル化％の連続的な変化を示す。ＥＰＯ治療を受けている７名のＣＫＤ患者の血漿中の非メチル化％を、ＥＰＯ治療の前および７〜１４日後に分析した。異なる形状（色彩）の線は、異なる患者に対応する。患者は全員、ＥＰＯ治療を受けた後、非メチル化％の上昇を示した。非メチル化％の値は、異なる患者の様々なレベルの有効性を示す。これらの結果は、血漿非メチル化％が治療に応答して赤血球産生活性を反映することを示す。
【０１５６】
３．再生不良性貧血のためのＡＴＧ治療
再生不良性貧血患者の免疫抑制療法は、患者の６０〜７０％において血液回収につながる可能性があり得る（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０８（８）：２５０９−２５１９）。免疫抑制療法を受けている再生不良性貧血患者４名の血漿中の非メチル化％値を、免疫抑制療法の開始前、ならびに２か月後および４か月後に分析した。患者は全員、治療に応答せず、ヘモグロビンレベルはその期間にわたって正常レベルに回復せず、４名の患者は全員、定期的な輸血が必要であった。
【０１５７】
図２３Ａは、本発明の実施形態による抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）治療または免疫抑制療法としてのサイクロスポリンを受けている再生不良性貧血患者の赤芽球ＤＭＲにおける血漿非メチル化％の連続的な変化を示す。３名の患者において、血漿中の非メチル化％に変化はなかった。１名の患者が、非メチル化％の有意な上昇を示した。このことは、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）クローンの症状の出現、すなわちヘモグロビンを含有する暗色尿の通過と同時に発生した。このような症状は、たとえ、非メチル化％が上昇したとしても、患者が治療に応答していないことを判断するために使用することができる。ＰＮＨは、再生不良性貧血患者においてその発生が知られており、溶血性貧血の病態生理学的機序を有する。非メチル化％の上昇は、ＰＮＨからの溶血の結果としての赤血球産生活性の上昇を反映する。
【０１５８】
図２３Ｂは、治療を受けている再生不良性貧血患者のヘモグロビンの連続的変化を示す。ヘモグロビンレベルは有意に上昇しない。これらの結果は、患者全員が図２３Ｂに示すヘモグロビンの変化の欠如によって具現化されるように、治療に応答しなかったので、血漿非メチル化％が治療経過の間に赤血球産生活性の変化を反映することを示す。
【０１５９】
図２４Ａおよび図２４Ｂは、再生不良性貧血患者４名におけるヘモグロビン濃度に対する血漿中の非メチル化％のプロットを示す。各線は、１名の患者に対応し、治療の前および４か月後の非メチル化％およびヘモグロビンレベルの変化を追跡する。図２３Ａは、ＰＮＨ患者を除いて、非メチル化％が有意に変化しなかったことを示す。図２３Ｂは、ヘモグロビンレベルが変化したが有意ではなかったことを示す。
【０１６０】
８．赤血球系ＤＮＡの絶対濃度の使用
血漿／血清中の赤血球系ＤＮＡの量を測定するために、いくつかの実施形態は、低メチル化マーカーのパラメータＥ％（非メチル化％とも呼ぶ）を使用するが、細胞系譜に特異的な高メチル化マーカーも、存在する場合、使用され得る。Ｅ％は、試料中のＤＮＡの大部分（ほとんどが高メチル化されている）に対して正規化された赤芽球ＤＮＡの量に対応する。
【０１６１】
代替パラメータは、血漿の単位容積あたりの赤血球系ＤＮＡの絶対濃度を測定することとする。Ｅ％の計算のために、実施形態は、非メチル化ＤＮＡの絶対濃度、およびメチル化ＤＮＡの絶対濃度を測定することができる。デジタル式ＰＣＲアッセイにおいて、各点は１つのＤＮＡ分子を表すことができる（例えば、図２Ａおよび図２Ｂに示すように）。メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡの計数は、直接的に計数することができる。前節において、正規化された値（例えば、Ｅ％）を計算したが、実施形態は、低メチル化マーカーについての非メチル化分子の絶対濃度、または高メチル化マーカーについてのメチル化分子の絶対濃度を使用することもできる。
【０１６２】
図２５は、本発明の実施形態による健常対象および貧血患者におけるＦＥＣＨ遺伝子関連ＤＭＲ（コピー数／血漿ｍｌ）における赤血球系ＤＮＡの絶対濃度を示すボックスアンドウィスカープロットを示す。ボックスおよび内部の線はそれぞれ、四分位範囲および中央値を表す。上部および下部のウィスカーは最大値および最小値を表す。
【０１６３】
図２５に示すように、異なる患者群間の個別のクラスターは、赤血球系ＤＮＡの絶対濃度を用いて観察され得るが、正規化された値は群間の良好な分離を可能にする。理論上、血漿のＥ％パラメータはまた、非赤血球起源の循環ＤＮＡ、例えば、骨髄由来またはリンパ由来のＤＮＡの濃度によっても影響され得る。例えば、他の造血系譜も影響される場合の貧血容態（例えば、再生不良性貧血または骨髄異形成症候群）において、赤血球系ＤＮＡの放出変化がこれらの症例のいくつかにおいてマスクされ得る。
【０１６４】
９．他の血液系譜
血液学的評価のためのこの血漿ＤＮＡベースのアプローチは、他の血液細胞系譜、例えば、骨髄、リンパ、および巨核球系列のマーカーに一般化することができる。血液系譜特異的ＤＮＡメチル化マーカーの使用に関する従来の研究は、全血または血球に焦点を絞ってきた（Ｈｏｕｓｅｍａｎ  ＥＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１５；２：１４５−１５４）。先に呈された本発明者らのデータは、血漿ＤＮＡが血球には存在しない情報を含有していることを明らかに示している。それゆえ、複数の血液細胞系譜由来の発生マーカーを用いた血漿ＤＮＡの分析は、個体の血液系に関する価値のある診断情報を提供することができる。したがって、骨髄生検の非侵襲的置き換えである。血漿または血清中の特定の細胞系譜のメチル化署名を特異的に検出し、それにより骨髄中の異なる細胞系譜の活性をモニターすることができるアッセイを設計することができる。
【０１６５】
このようなアプローチは、以下の障害を含むがこれらに限定されない多くの臨床シナリオの評価に有用であろう。例となる関連する系譜は、障害について提供される。
１．血液学的悪性腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫（リンパ球系譜）
２．骨髄障害、例えば再生不良性貧血、骨髄線維症（骨髄系細胞およびリンパ球系譜）
３．免疫系およびその機能のモニタリング、例えば、免疫不全ならびに疾患および治療の間の免疫応答の封入（リンパ球系譜）
４．骨髄に対する薬物効果、例えばアザチオプリン（骨髄系細胞系譜）
５．血小板数は少ないが正常な骨髄を特徴とする容態である、血液学的徴候を伴う自己免疫疾患、例えば、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）。血液系譜マーカー、例えば巨核球性マーカーを用いた血漿ＤＮＡ分析は、このような容態に関する価値のある診断情報を提供するであろう。（巨核症マーカー）
６．赤血球産生の低下またはさらにより重度の再生不良の危機と合併することのできる、血液学的合併症を伴う感染、例えば、パルボウイルスＢ１９による感染。（赤血球系系譜）
【０１６６】
10．方法
図２６は、本発明の実施形態による哺乳類の血液試料を分析する方法２６００を示す流れ図である。方法２６００の一部は手動で実行されてもよく、他の部分はコンピュータシステムによって実行されてもよい。一実施形態において、システムは工程全部を実行することができる。例えば、システムは、（例えば、試料を得てアッセイを行うための）ロボット要素、アッセイからのシグナルを検出するための検出システム、およびシグナルを分析するためのコンピュータシステムを含むことができる。このようなシステムを制御するための命令は、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）の構成論理、フラッシュメモリ、および／またはハードドライブなど、１つ以上のコンピュータ可読媒体に保存され得る。図２７は、このようなシステムを示す。
【０１６７】
ブロック２６１０において、血液試料の無細胞混合物を得る。無細胞混合物の例としては、血漿または血清が挙げられる。無細胞混合物は、複数の細胞系譜由来の無細胞ＤＮＡを含むことができる。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、血液試料を分離して、無細胞混合物を得る。血漿および血清は異別である。両方とも血液の流体部分に対応する。血漿を得るために、抗凝固剤を血液試料へ添加して、血液試料が凝固するのを防止する。血清を得るために、血液試料を凝固させておく。それゆえ、凝固因子は凝固プロセスの間に消費されるであろう。循環ＤＮＡに関しては、凝固中に一部のＤＮＡを血球から流体部分へと放出する。それゆえ、血清は血漿と比較して高いＤＮＡ濃度を有する。凝固中の細胞からのＤＮＡは、血漿に特異的なＤＮＡを希釈し得る。それゆえ、血漿が有利であり得る。
【０１６９】
ブロック２６２０において、無細胞混合物中のＤＮＡ断片を、１つ以上の差次的にメチル化された領域に対応するアッセイと接触させる。１つ以上の差次的にメチル化された領域（ＤＭＲ）の各々は、他の細胞系譜と比較して低メチル化または高メチル化されることによって、特定の血液細胞系譜に特異的である。赤芽球細胞系譜についてのＤＭＲの例を本明細書で提供する。
【０１７０】
種々の実施形態において、本アッセイは、ＰＣＲまたは配列決定を含むことができ、したがってＰＣＲアッセイまたは配列決定アッセイであり得る。ＤＮＡ断片を接触させることは、フローセル、液滴、ビーズ、または、アッセイとＤＮＡ断片との相互作用を提供するための他の機序を含むことができる。このようなアッセイの例としては、全ゲノム二亜硫酸塩配列決定、標的化二亜硫酸塩配列決定（ハイブリッド形成捕捉またはアンプリコン配列決定による）、他のメチル化用品配列決定（例えばＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによる単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）ＤＮＡ配列決定）、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ、およびデジタル式ＰＣＲが挙げられる。方法３００のために使用可能なアッセイのさらなる例は、本明細書に、例えば第ＸＩＩ節に説明されている。例は赤芽球を使用するが、他の血液細胞系譜を含む他の細胞系譜を使用してもよい。
【０１７１】
ブロック２６３０において、メチル化ＤＮＡ断片または非メチル化ＤＮＡ断片の第１の数は、アッセイから得られた信号に基づいて１つ以上の差次的にメチル化された領域の無細胞混合物中で検出される。アッセイは、光信号または電気信号などの種々の信号を提供することができる。信号は、ＤＮＡ断片当たりの特異的な信号を提供することができ、凝集シグナルは、（例えば、リアルタイムＰＣＲにおけるような）メチル化署名を有するＤＮＡ断片の総数を示す凝集シグナルを提供することができる。
【０１７２】
一実施形態において、配列決定は、ＤＮＡ断片のための配列読み取りを得るために使用することができ、ＤＮＡ断片は、基準ゲノムと整列させることができる。ＤＮＡ断片がＤＭＲの１つと整列する場合、カウンタを増分させることができる。信号が非メチル化アッセイの特定のメチル化されたものに由来すると仮定すると、ＤＮＡ断片は、そのメチル化署名を有すると想定することができる。別の実施形態において、ＰＣＲからの読み取り（例えば、陽性ウェルからの光シグナル）を使用して、このようなカウンタを増分させることができる。
【０１７３】
ブロック２６４０で、メチル化レベルを、第１の数を用いて決定する。第１のメチル化レベルは、正規化され得るか、または絶対濃度、例えば、生物学的試料の体積あたりであり得る。絶対濃度の例を図２５に提供する。正規化されたメチル化レベルの例としては、Ｅ％（非メチル化％とも呼ばれる）が挙げられる。
【０１７４】
正規化された値について、メチル化レベルは、１つ以上の差次的にメチル化された領域の無細胞混合物中のＤＮＡ断片の第１の数および総数を使用して決定することができる。上述のように、メチル化レベルは、非メチル化ＤＮＡ断片の百分率であり得る。他の実施形態において、百分率は、赤芽球についての先の例と逆の関係を有するであろうメチル化ＤＮＡ断片であり得る。種々の実施において、メチル化レベルは、ＤＭＲの全部位にわたる百分率を用いて、各部位の個々の百分率の平均によって、または各部位の加重平均によって決定することができる。
【０１７５】
ブロック２６５０で、メチル化レベルを、哺乳類における血液学的障害の分類を決定することの一環として、１つ以上のカットオフ値と比較する。１つ以上のカットオフ値は、例えば、図８〜図１０および図１２〜図１４において示されるように、演繹的なデータから選択することができる。カットオフ値は、例えば、正常であるようおよび障害に罹患しているよう、既知の試料のデータセットからの監督された学習に基づいて、血液学的障害の正確な分類を提供するための最適な感度および特異性を提供するように選択することができる。
【０１７６】
カットオフ値を決定するための例として、複数の試料を得ることができる。各試料は、当業者に既知であろうように、例えば、他の技術を介して、血液学的障害の特定の分類を有することが既知である。血液学的障害の少なくとも２つの分類を有する、例えば、障害に罹患しているおよび障害に罹患していない複数の試料。異なるタイプの障害も、例えば、図１０に示すように、含まれ得る。１つ以上の差次的にメチル化された領域のメチル化レベルは、図８〜図１０および図１２〜図１４のデータ点のように、複数の試料の各々について決定することができる。
【０１７７】
試料の第１のセットは、血液学的障害の第１の分類、例えば、健康である第１の分類を有すると特定することができる。第１のセットは、例えば、図８〜図１０および図１２〜図１４に示すように、一緒にクラスター化することができる。血液学的障害の第２の分類を有する第２のセットの試料を特定することができる。第２のセットは、障害に罹患している患者、または第１の分類とは異なるタイプの障害であり得る。２つの分類は、同じ障害を有する程度を変化させることに対応することができる。第１の試料セットが第２の試料セットよりも統計的に高いメチル化レベルを有する場合、指定された特異性および感度内の第１の試料セットと第２の試料セットとを区別するカットオフ値を決定することができる。したがって、特異性と感度との平衡状態を用いて、適切なカットオフ値を選択することができる。
【０１７８】
11．要約
ＲＢＣは、末梢血中に最も豊富な細胞タイプであるが、核を有していない。本開示において、本発明者らは、赤血球系譜の細胞が血漿ＤＮＡプールの有意な比率に寄与することを決定した。この研究の前に、造血細胞が、循環ＤＮＡプールに有意に寄与することは既知であった（１３，１４）が、多くの研究者はこのような造血ＤＮＡが、白血球系譜のみに由来すると仮定した（１５）。ＤＮＡメチル化マーカーを使用したより近年の結果は、血漿ＤＮＡが好中球およびリンパ球のＤＮＡメチル化署名を保有していることを示した（１５）。
【０１７９】
赤芽球を含む多くの組織の高解像度参照メチロームを使用して（１８，２０）、本発明者らは、赤芽球由来ＤＮＡ分子を、血漿ＤＮＡプールにおける他の組織タイプのＤＮＡと区別した。赤芽球特異的メチル化署名に基づく本発明者らのデジタル式ＰＣＲアッセイは、本発明者らが血漿中のこのようなＤＮＡ分子の定量分析を行うことを可能にした。このアプローチにより、本発明者らは、健常対象の血漿ＤＮＡプール中に有意な量の赤血球系ＤＮＡの存在を実証することができた。
【０１８０】
本発明者らの結果は、ＤＮＡを血漿中へと寄与する骨髄における赤血球系譜の細胞と一致している。この仮説の結論は、血漿中の赤血球系ＤＮＡの定量分析が骨髄赤血球産生活性を反映しており、したがって、貧血の差別的診断に役立ち得る。本発明者らは、健常対象の血漿中の赤血球系ＤＮＡの参照値を確立した。本発明者らは、貧血患者が病理および治療の正確な性質に応じて、循環赤血球ＤＮＡの比率を上昇または低下させるであろうことをさらに実証した。特に、本発明者らは、血漿中の赤血球系ＤＮＡの百分率の分析を通じて、本発明者らの募集した患者において、２つの骨髄不全症候群、すなわち再生不良性貧血（ＡＡ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を区別することができた。
【０１８１】
網状赤血球計数は、貧血患者における骨髄応答に関する情報を提供するために使用することができた。本発明者らが研究したベータサラセミア患者１１名のうち、４名の患者が網状赤血球計数を１％未満の検出限界の末梢血中に有した。他の７名の患者については、網状赤血球計数は１％〜１０％の範囲であった。再生不良性貧血患者９名全員について、彼らの網状赤血球計数は、定期的な輸血を受けているかどうかにかかわらず、１％未満であった。したがって、網状赤血球計数は、低濃度の網状赤血球の自動法の高い不正確性により、骨髄における正常なおよび低減した赤血球産生活性を明らかに定義していなくてもよい（３５，３６）。
【０１８２】
本発明者らは、網状赤血球計数または網状赤血球指数の分析が、本発明者らの患者コホートにおける貧血の原因を、低減した赤血球産生活性と区別することはできなかったことを実証した（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。本発明者らの結果は、血漿非メチル化％（例えば、図１０に示すような）が網状赤血球計数よりも骨髄における赤血球産生活性を反映する上で、網状赤血球計数よりも正確であることを示している。図１１Ａおよび図１１Ｂに示すように、測定された両方のパラメータを有する患者全員における血漿非メチル化％と網状赤血球計数または網状赤血球指数との相関はなかった（Ｐ＝０．３、線形回帰）。
【０１８３】
同様に、末梢血中の異常に多数の赤芽球の存在は、異常な赤血球応力を意味する（３７）。しかしながら、末梢血中の赤芽球の非存在は、正常または低減した赤血球産生活性を意味しない。逆に、血漿赤芽球由来ＤＮＡの定量分析は、末梢血からの従来の血液学的パラメータによって提供されない骨髄赤血球産生活性に関する情報をもたらす。
【０１８４】
ベータサラセミアおよび再生不良性貧血については、これら２つの容態は典型的には、血液中の鉄およびヘモグロビンパターンの分析によって診断される。しかし、ベータサラセミアおよび再生不良性貧血は両方とも、低いヘモグロビンレベルを呈し、したがって、このような技術はベータサラセミアと再生不良性貧血とを区別しない。非メチル化％を使用することにより、図８および図１０に示すように、これら２つの障害間の差別化を可能にすることによって、より特異性を提供することができる。
【０１８５】
非メチル化％は、治療をモニターすることにも使用することができる。例えば、鉄欠乏性貧血患者における非メチル化％の分析は、図９に示すように、経口鉄療法に対する骨髄応答のモニタリングに使用することができる。一部の患者においては、経口鉄補充は消化管を通して有効に吸収されないことがある。結果として、赤血球産生は治療開始後には上昇しないであろう。非メチル化％の上昇がないことは、非経口鉄治療（例えば、鉄デキストラン、グルコン酸第二鉄、および鉄ショ糖）などの他の治療を開始することができるよう、経口鉄治療に対する貧弱な応答のための指示薬として使用することができる。あるいは、非メチル化％の上昇の欠如は、治療を中止（停止）するために使用することができ、それにより、有効ではない治療の経費を節約することができる。別の実施において、非メチル化％の上昇の欠如は、いつ治療用量を増加させるか、例えば、鉄の薬用量を増加させるかを特定するために使用することができる。非メチル化％の上昇がある場合、治療を継続することができる。非メチル化％の上昇が十分に高い場合（例えば、閾値に基づく）、赤血球産生活性が、ヘモグロビンレベルを健常レベルへ最終的に戻すのに十分なレベルに到達したと仮定することができるので、治療を停止することができ、それにより高価でまたは潜在的に有害である過剰治療を回避することができる。
【０１８６】
したがって、哺乳類は、血液障害の分類で、哺乳類が血液学的障害に罹患していることを示すことを決定することに応答して、血液学的障害について治療することができる。治療後、アッセイを反復して、更新されたメチル化レベルを決定し、更新されたメチル化レベルに基づいて治療を行い続けるかどうかを判断することができる。一実施形態においては、治療を行い続けるかどうかを判断することは、更新されたメチル化レベルが指定された閾値内へとメチル化レベルに対して変化しなかった場合に、治療を停止すること、治療用量を増量すること、または異なる治療を行うことを含むことができる。別の実施形態において、治療を行い続けるかどうかを判断することは、更新されたメチル化レベルが、指定閾値内へとメチル化レベルに対して変化したときに、治療を継続することを含むことができる。
【０１８７】
治療をモニターする別の例として、非メチル化％の分析を使用して、サラセミア患者における有効ではない赤血球産生が、治療によって、例えば、輸血によって十分に抑制されたかどうかを判断することができる。髄外赤血球産生は、サラセミア患者の骨変形の原因である。髄外赤血球産生は、輸血およびヘモグロビンレベルの回復によって抑制することができる。非メチル化％は、これらの治療に対する患者の応答を示すことができ、非メチル化％を抑制し損ねることを用いて、治療が強化されるべきであることを示すことがある。
【０１８８】
非メチル化％は、鉄欠乏単独に罹患している患者を、他の原因の貧血、例えば、慢性疾病による貧血とともに鉄欠乏に罹患している患者と区別することもできる。鉄欠乏症単独に罹患している患者は、鉄治療後に非メチル化％が上昇すると予想されるであろうが、貧血の原因が複数である患者は、非メチル化％の上昇の応答を示さないであろう。
【０１８９】
したがって、本発明者ら、は循環赤血球系ＤＮＡの百分率が、鉄欠乏性貧血患者における鉄療法に応答して上昇し、したがって、骨髄の赤血球産生活性の上昇を反映すること実証した。赤血球系ＤＮＡの比率の動的変化は、血漿赤血球系ＤＮＡの定量化が、関連する細胞プロセスの非侵襲的モニタリングを可能にすることを示す。血漿ＤＮＡの迅速な動態（例えば、数十分の桁の半減期（３８，３９））は、このようなモニタリングが、ほぼリアルタイムの結果を提供し得たことを示唆している。同様に、他の細胞系譜の循環無細胞ＤＮＡの百分率は、他の細胞系譜についての骨髄における関連した細胞プロセスの非侵襲的モニタリングも可能にする。
【０１９０】
本研究は、循環中の造血始原細胞および前駆細胞の核材料の存在を実証するための証明として役立つ。さらに、他の造血系譜の前駆細胞から放出された循環ＤＮＡの存在も使用され得る。
【０１９１】
要約すると、本発明者らは、赤血球系ＤＮＡが血漿ＤＮＡプールの有意な比率に寄与することを実証した。この発見は、循環核酸の基本的な生物学的特徴に関する本発明者らの理解において重要なギャップを埋めた。臨床的に、血漿中の赤血球系ＤＮＡの測定は、異なるタイプの貧血の調査およびモニタリングのための新たなアプローチを開き、無細胞ＤＮＡを基にした血液学的検査の新たなファミリーの始まりを告げる。
【０１９２】
12．材料および方法
本節では、実施形態を実施するに使用された、および使用され得る技術を説明する。
【０１９３】
１．試料の採取および調製
【０１９４】
いくつかの実施形態において、４つの症例を各々有する１２のタイプの正常組織（肝臓、肺、食堂、胃、小腸、結腸、膵臓、副腎、膀胱、心臓、脳および胎盤）のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）を、匿名化手術標本から取り出した。採取した組織は、組織学的検査で正常であることが確認された。固定した組織について製造元のプロトコルを改変したＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＦＦＰＥ組織プロトコルからＤＮＡを抽出した。パラフィンを除去するために、キシレンの代わりに脱パラフィン溶液（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。核酸のホルムアルデヒド修飾の逆転のために、緩衝液ＡＴＬおよびプロテアーゼＫによる溶解後に、９０℃で１時間のインキュベーションの追加工程を行った。
【０１９５】
分析用に赤芽球濃縮試料を調製するために、１〜３ｍＬの臍帯血を出産直後の８名の妊婦の各々からＥＤＴＡ含有チューブへと回収した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ溶液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた密度勾配遠心分離を用いて、単核細胞を臍帯血試料から単離した。１×１０８個の単離された単核細胞を、２つの抗体、すなわち、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）結合抗ＣＤ２３５ａ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）およびフィコエリトリン（ＰＥ）結合抗ＣＤ７１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）の混合物１ｍＬとともに、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中での１：１０希釈物中で、４℃の暗所で３０分間インキュベートした。次に、ＣＤ２３５ａ＋細胞およびＣＤ７１＋細胞を、赤芽球の濃縮のために、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｆｕｓｉｏｎフローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって選別した（１）。８例のＣＤ２３５ａ＋ＣＤ７１＋細胞を、下流分析のためにプールした。製造元の説明書を備えたＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、プールしたＣＤ２３５ａ＋ＣＤ７１＋細胞からＤＮＡを抽出した。
【０１９６】
末梢血試料をＥＤＴＡ含有チューブに採取し、４℃で直ちに保存した。各患者から１０ｍＬの末梢静脈血を採取した。血漿分離は、採血後６時間以内に行った。４ｍＬの血漿から血漿ＤＮＡを抽出した。血漿およびバフィーコートのＤＮＡを、既に説明したように得た（２）。簡潔に言えば、血液試料をまず４℃、１，６００ｇで１０分間遠心分離し、血漿部分を４℃、１６，０００ｇで１０分間再遠心分離した。いかなる残留血漿も除去するために、２，５００ｇで１０分間再遠心分離した後、血球部分を回収した。血漿およびバフィーコート由来のＤＮＡをＱＩＡａｍｐ  ＤＳＰ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）およびＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてそれぞれ抽出した。
【０１９７】
２．ＤＮＡの二亜硫酸塩変換
血球およびＦＦＰＥ組織から抽出した血漿ＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを、製造元の説明書により、Ｅｐｉtｅｃｔ  Ｐｌｕｓ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、２回の二亜硫酸塩処理へ供した（３）。
【０１９８】
一実施形態において、生物学的試料から抽出されたＤＮＡをまず二亜硫酸塩で処理する。メチル化シトシンを変化させないまま、二亜硫酸塩処理は非メチル化シトシンをウラシルへと変換することになっている。それゆえ、二亜硫酸塩変換後、メチル化配列および非メチル化配列は、ＣｐＧジヌクレオチドにおける配列の相違に基づいて区別することができる。本出願の選択された例において提示された血漿試料の分析のために、ＤＮＡを２〜４ｍＬの血漿から抽出した。血球から抽出したＤＮＡの分析のために、１μｇのＤＮＡを実施例における下流分析に使用した。他の実施形態においては、他の容積の血漿およびＤＮＡ量が使用され得る。
【０１９９】
本出願における例において、製造元の説明書により、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔを用いて、各試料に関して二亜硫酸塩処理を２回行った。二亜硫酸塩変換した血漿ＤＮＡを５０μＬの水で溶出した。二亜硫酸塩変換した細胞ＤＮＡを２０μＬの水で溶出した後、下流分析のために１００倍に希釈した。
【０２００】
３．メチル化アッセイ
種々のメチル化アッセイ用いて、特定の細胞系譜からＤＮＡの量を定量化するために使用することができる。
【０２０１】
１．ＰＣＲアッセイ
１つは二亜硫酸塩変換非メチル化配列を標的とし、もう１つはメチル化配列を標的とする、３つの赤芽球特異的ＤＭＲのそれぞれについて、２つのデジタル式ＰＣＲアッセイを開発した。アッセイのためのプライマーおよびプローブ設計は、付録表７に列挙する。
【表７】
2019524056.tif 000009
【０２０２】
例として、ＰＣＲ反応は、二亜硫酸塩変換された鋳型ＤＮＡ ３μＬ、各プライマーの終濃度０．３μＭ、ＭｇＣｌ２の０．５μＭ、および２５μＬの２×ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｕｒａｃｉｌ  ＲｅａｄｙＭｉｘとともに５０μＬを含むことができる。以下のＰＣＲ温度特性を使用することができる：９５℃で５分間、ならびに９８℃、２０秒間を３５周期、５７℃で１５秒間、および７２℃、１５秒間、続いて７２℃で３０秒間の最終伸長工程。他の実施形態において、非優先ゲノムワイド配列決定を整列と組み合わせて実施することができるが、このような手順は費用対効果が高くない可能性がある。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、試料のデジタル式ＰＣＲ解析のために、２０μＬの反応混合物を二亜硫酸塩処理後に調製した。一実施形態において、反応混合物は、８μＬの鋳型ＤＮＡ、４５０ｎＭの各２つの順方向プライマー、９００ｎＭの逆方向プライマー、および２５０ｎＭのプローブを含有した。他の実施形態において、８μＬの鋳型ＤＮＡ、９００ｎＭの順方向プライマー、９００ｎＭの逆方向プライマー、および２５０ｎＭのプローブを含有する総容積２０μＬの各反応混合物を調製した。次に、ＢｉｏＲａｄ  ＱＸ２００  ｄｄＰＣＲ液滴発生装置を使用して、反応混合物を液滴生成のために使用した。典型的には、各試料について２０，０００液滴が生成されるであろう。いくつかの実施において、液滴を清浄な９６ウェルプレートへと移した後、メチル化特異的アッセイおよび非メチル化特異的アッセイの両方について同一の条件を用いて温熱周期を回した：９５℃×１０分（１周期）、９４℃×１５秒間および６０℃×１分の４０周期、９８℃×１０分間（１周期）の後、１２℃の保持工程。ＰＣＲの後、各試料についての液滴をＢｉｏＲａｄ  ＱＸ２００液滴リーダーによって分析し、結果をＱｕａｎｔａＳｏｆｔ（第１．７版）ソフトウェアを用いて解釈した。
【０２０４】
２．他のメチル化アッセイの例
メチル化認識配列決定の他の例としては、（Ｎ６−メチルアデニン、５−メチルシトシンおよび５−ヒドロキシメチルシトシンを含む）ＤＮＡ分子のメチル化状態を可能にするであろう単一分子配列決定プラットフォームを用いて（ＡＢ  Ｆｌｕｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ；７：４６１−４６５、Ｊ  Ｓｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ；３：１３８９）またはメチル化シトシンの免疫沈降を通じて（例えば、メチルシトシンに対する抗体を使用することによって、またはメチル化ＤＮＡ結合タンパク質もしくはペプチドを使用した（ＬＧ  Ａｃｅｖｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１１  Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ；３：９３−１０１）後に、配列決定、メチル化感受性制限酵素の使用の後の配列決定を通じて、二亜硫酸塩変換なしで直接解明されることが挙げられる。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ混合物中のゲノム部位についてのメチル化レベルは、全ゲノム二亜硫酸塩配列決定を用いて決定することができる。他の実施形態において、ゲノム部位のメチル化レベルは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０システムなどのメチル化マイクロアレイ分析を用いて、またはメチル化免疫沈降を用いること（例えば、抗メチルシトシン抗体を用いること）またはメチル化結合タンパク質による処理に続いてマイクロアレイ分析もしくはＤＮＡ配列決定によって、またはメチル化認識配列決定を用いること、例えば、単一分子配列決定法を用いること（例えば、ナノポア配列決定（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２０１３；１１０：１８９１０−１８９１５）によってまたはＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ単一分子リアルタイム分析（Ｆｌｕｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１０；７：４６１−４６５）によって）決定することができる。組織特異的メチル化レベルは、同じ方法で測定することができる。別の例として、標的二亜硫酸塩配列決定、メチル化特異的ＰＣＲ、非二亜硫酸塩系メチル化認識配列決定（例えば、単一分子配列決定プラットフォーム（Ｐｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｙｌｏｍｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｅ．ｃｏｌｉ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１３；１４：６７５）は、血漿ＤＮＡメチル化デコンボリューション分析のための血漿ＤＮＡのメチル化レベルの分析に使用することができる。したがって、メチル化認識配列決定の結果は、種々の方法で得ることができる。
【０２０６】
４．統計分析
ピアソンの相関を用いて、重症型β−サラセミア患者における血液分析装置によって測定された末梢白血球において、赤血球系ＤＮＡの百分率（Ｅ％（ＦＥＣＨ））と赤芽球の百分率との相関を研究した。ピアソンの相関を使用して、健常対照の血漿ＤＮＡにおけるおよびバフィーコートＤＮＡにおける対形成したＥ％（ＦＥＣＨ）の結果間の相関も研究した。ウィルコクソン符号づけ順位検定を用いて、健常対象の血漿ＤＮＡのＥ％と、対形成したバフィーコートＤＮＡとの相違を比較した。マン・ホイットニー順位和検定を用いて、健常対象および異なる疾患群の貧血患者の血漿ＤＮＡ中のＥ％の相違を比較した。
【０２０７】
本発明者らは、本文中に説明した本発明者らの基準に基づいて、赤芽球特異的ＤＭＲをマイニングするために、本発明者らのバイオインフォマティクスパイプラインも開発した。バイオインフォマティクスパイプラインは、種々のプラットフォーム、例えばＰｅｒｌプラットフォームに実装されてもよい。
【０２０８】
13．例となるシステム
【０２０９】
図２７は、本発明の一実施形態によるシステム２７００を示す。示されたシステムは、試料ホルダ２７１０内の無細胞ＤＮＡ分子などの試料２７０５を含み、試料２７０５はアッセイ２７０８と接触して物理的特徴２７１５の信号を提供することができる。試料ホルダの例は、アッセイのプローブおよび／もしくはプライマー、または液滴が（アッセイを含む液滴とともに）移動するチューブを含むフローセルであり得る。試料からの蛍光強度値などの物理的特徴２７１５は、検出器２７２０によって検出される。検出器は、データ信号を構成するデータ点を得るために、間隔（例えば、周期的な間隔）を空けて測定を行うことができる。一実施形態において、アナログデジタル変換器は、検出器からのアナログ信号をデジタル形式へと複数回変換する。データ信号２７２５は、検出器２７２０から論理システム２７３０へ送信される。データ信号２７２５は、ローカルメモリ２７３５、外部メモリ２７４０、またはストレージ装置２７４５に保存することができる。
【０２１０】
論理システム２７３０は、コンピュータシステム、ＡＳＩＣ、マイクロプロセッサなどを含んでもまたは含んでいなくてもよい。論理システム２７３０は、ディスプレイ（例えば、モニター、ＬＥＤディスプレイなど）およびユーザ入力装置（例えば、マウス、キーボード、ボタンなど）を含むこともでき、またはこれらに連結されることもできる。論理システム２７３０および他の構成要素は、スタンドアローンもしくはネットワーク接続されたコンピュータシステムの一部であってもよく、またはサーマルサイクラー装置に直接取り付けられてもよいか、もしくは組み込まれてもよい。論理システム２７３０は、プロセッサ２７５０において実行する最適化ソフトウェアを含むこともできる。論理システム１０３０は、本明細書に説明される方法のいずれかを実行するようにシステム１０００を制御するための命令を保存するコンピュータ可読媒体を含むことができる。
【０２１１】
本明細書で言及されるコンピュータシステムはいずれも、何らかの適切な数のサブシステムを利用し得る。このようなサブシステムの例は、図２８においてコンピュータシステム１０において示されている。いくつかの実施形態において、コンピュータシステムは単一のコンピュータ装置を含み、サブシステムはこのコンピュータ装置の構成要素であり得る。他の実施形態において、コンピュータシステムは、それぞれがサブシステムであり、内部構成要素を備えた複数のコンピュータ装置を含むことができる。コンピュータシステムは、デスクトップコンピュータおよびラップトップコンピュータ、タブレット、携帯電話、ならびに他の携帯装置を含むことができる。
図２８に示されるサブシステムは、システムバス７５を介して相互接続される。プリンタ７４、キーボード７８、記憶装置（複数可）７９、ディスプレイアダプタ８２へ連結されるモニター７６、およびその他などの追加のサブシステムが示されている。Ｉ／Ｏコントローラ７１へ連結する周辺機器および入出力（Ｉ／Ｏ）装置は、入出力（Ｉ／Ｏ）ポート７７（例えば、ＵＳＢ、ＦｉｒｅＷｉｒｅ（登録商標））など、当該技術分野で既知の任意の数の手段によって、コンピュータシステムへ接続することができる。例えば、Ｉ／Ｏポート７７または外部インターフェース８１（例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ、Ｗｉ−Ｆｉなど）を使用して、Ｉｎｔｅｒｎｅｔなどの広域ネットワーク、マウス入力装置、またはスキャナへ、コンピュータシステム１０を接続することができる。システムバス７５を介した相互接続は、中央処理装置７３が各サブシステムと通信し、システムメモリ７２または記憶装置（複数可）７９（例えば、ハードドライブまたは光ディスクなどの固定ディスク）からの複数の命令の実行、およびサブシステム間の情報交換を制御することを可能にする。システムメモリ７２および／または記憶装置（複数可）７９は、コンピュータ可読媒体を具現化してもよい。別のサブシステムは、カメラ、マイクロホン、および加速度計、ならびにこれらに類するものなどのデータ収集装置８５である。本明細書に言及されるデータのうちのいずれも、ある構成要素から別の構成要素へ出力することができ、ユーザに対して出力することができる。
【０２１２】
コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェース８１によって、または内部インターフェースによってともに接続された、複数の同一の構成要素またはサブシステムを含むことができる。いくつかの実施形態において、コンピュータシステム、サブシステム、または装置は、ネットワーク上で通信することができる。このような例において、１つのコンピュータをクライアント、別のコンピュータをサーバとみなすことができ、これらは各々、同一のコンピュータシステムの一部であり得る。クライアントおよびサーバは各々、複数のシステム、サブシステム、または構成要素を含むことができる。
【０２１３】
実施形態の態様は、ハードウェア（例えば、アプリケーション特異的集積回路またはフィールドプログラマブルゲートアレイ）を使用して、および／またはモジュール式もしくは統合様式で概してプログラム可能な処理装置とともにコンピュータソフトウェアを使用して、制御論理の形態で実装することができる。本明細書で使用する場合、処理装置は、シングルコア処理装置、同一の集積チップ上のマルチコア処理装置、または回路基板上もしくはネットワーク化された複数の処理ユニットを含む。本開示および本明細書に提供される教示に基づいて、当業者は、ハードウェアを用いておよびハードウェアとソフトウェアとを併用して、本発明の実施形態を実施するための他のやりかたおよび／または方法を知り、認識することになっている。
【０２１４】
本出願において説明されるソフトウェア構成要素または関数のうちのいずれも、例えば、Ｊａｖａ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ−Ｃ、Ｓｗｉｆｔなどの何らかの適切なコンピュータ言語、または例えば、従来の技術もしくはオブジェクト指向の技術を使用するＰｅｒｌもしくはＰｙｔｈｏｎなどのスクリプト言語を使用する、処理装置によって実行されるソフトウェアコードとして実装されてもよい。ソフトウェアコードは、保存および／または伝送のためのコンピュータ可読媒体上に一連の命令またはコマンドとして保存することができる。適切な非一過性コンピュータ可読媒体は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、磁気媒体（ハードドライブもしくはフロッピーディスクなど）、または光学媒体（コンパクトディスク（ＣＤ）もしくはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）など）、およびフラッシュメモリなどを含むことができる。コンピュータ可読媒体は、このようなストレージ装置または伝送装置の任意の組み合わせであってもよい。
【０２１５】
このようなプログラムはまた、コードされ、インターネットを含む種々のプロトコルに従う有線ネットワーク、光ネットワーク、および／または無線ネットワークを介した伝送に適合した搬送波信号を使用して、伝送されてもよい。このようなものとして、コンピュータ可読媒体は、このようなプログラムでコードされたデータ信号を用いて作製されてもよい。プログラムコードでコードされたコンピュータ可読媒体は、互換性のあるデバイスでパッケージ化されていても、または（例えば、インターネットダウンロードを介して）他の装置とは別個に提供されてもよい。いかなるこのようなコンピュータ可読媒体も、単一のコンピュータ製品（例えば、ハードドライブ、ＣＤ、またはコンピュータシステム全体）の上または内部に存在してもよく、システムまたはネットワーク内の異なるコンピュータ製品上またはその内部に存在してもよい。コンピュータシステムは、モニター、プリンタ、または本明細書に記載の結果のうちのいずれかをユーザへ提供するための他の適切なディスプレイを含み得る。
【０２１６】
本明細書に説明される方法のうちのいずれも、全体的または部分的に、ステップを実行するように構成され得る１つ以上の処理装置を含むコンピュータシステムを用いて実施することができる。したがって、実施形態は、本明細書に説明される方法のうちのいずれかのステップを実行するように構成されたコンピュータシステムを対象とし得、潜在的には異なる構成要素がそれぞれのステップまたはそれぞれのステップ群を実行する。番号付けされたステップとして提示されるものの、本明細書の方法のステップは、同時にまたは異なる順序で実行することができる。加えて、これらのステップの部分が、他の方法の他のステップの部分と併用されてもよい。また、ステップの全部または部分は任意であってもよい。加えて、本方法のうちのいずれかのステップのうちのいずれも、これらのステップを実行するためのシステムのモジュール、ユニット、回路、または他の手段で実行することができる。
【０２１７】
特定の実施形態の具体的な詳細は、本発明の実施形態の主旨および範囲から逸脱することなく、何らかの適切な様式で組み合わせることができる。しかしながら、本発明の他の実施形態は、各個々の態様、またはこれらの個々の態様の具体的な組み合わせに関する具体的な実施形態に向けられ得る。
【０２１８】
本発明の例となる実施形態に関する先の説明は、図示および説明の目的で提示されている。徹底的であること、または本発明を説明された正確な形態に限定することは意図されず、多くの修正および変更が、先の教示に鑑みて可能である。
【０２１９】
「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」の引用は、それとは反対に具体的に示されない限り、「１つ以上」を意味することが意図される。「または」の使用は、それとは反対に具体的に示されない限り、「を除いてまたは」ではなく「を含んでまたは」を意味することが意図される。「第１」の構成要素への参照は、第２の構成要素が提供されることを必ずしも必要としない。そのうえ、「第１」または「第２」の構成要素への参照は、明示的に述べられていない限り、参照される構成要素を特定の場所に限定するものではない。
【０２２０】
本明細書に言及される特許、特許出願、公開物、および説明はすべて、それらの全体がすべての目的のために参照により組み込まれる。いかなるものも、先行技術であるとは認められていない。
【０２２１】
14．参考文献
【０２２２】
以下の参考文献は、先に引用されており、すべての目的のためにそれらの全体が参照により組み込まれる。
１．Ｌｏ  ＹＭ，Ｃｈａｎ  ＫＣ，Ｓｕｎ  Ｈ，Ｃｈｅｎ  ＥＺ，Ｊｉａｎｇ  Ｐ，Ｌｕｎ  ＦＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｅｔｕｓ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１０；２：６１ｒａ９１．
２．Ｃｈｉｕ  ＲＷ，Ｃｈａｎ  ＫＣ，Ｇａｏ  Ｙ，Ｌａｕ  ＶＹ，Ｚｈｅｎｇ  Ｗ，Ｌｅｕｎｇ  ＴＹ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  ｂｙ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００８；１０５：２０４５８−６３．
３．Ｎｅｗ  ＭＩ，Ｔｏｎｇ  ＹＫ，Ｙｕｅｎ  Ｔ，Ｊｉａｎｇ  Ｐ，Ｐｉｎａ  Ｃ，Ｃｈａｎ  ＫＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｄｒｅｎａｌ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ  ｕｓｉｎｇ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｆｅｔａｌ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２０１４；９９：Ｅ１０２２−３０．
４．Ｂｉａｎｃｈｉ  ＤＷ，Ｐａｒｋｅｒ  ＲＬ，Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ  Ｊ，Ｍａｄａｎｋｕｍａｒ  Ｒ，Ｓａｆｆｅｒ  Ｃ，Ｄａｓ  ＡＦ，ｅｔ  ａｌ．ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｖｅｒｓｕｓ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１４；３７０：７９９−８０８．
５．Ｃｈｉｕ  ＲＷ，Ａｋｏｌｅｋａｒ  Ｒ，Ｚｈｅｎｇ  ＹＷ，Ｌｅｕｎｇ  ＴＹ，Ｓｕｎ  Ｈ，Ｃｈａｎ  ＫＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｒｉｓｏｍｙ  ２１  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：  Ｌａｒｇｅ  ｓｃａｌｅ  ｖａｌｉｄｉｔｙ  ｓｔｕｄｙ．ＢＭＪ  ２０１１；３４２：ｃ７４０１．
６．Ｂａｙｉｎｄｉｒ  Ｂ，Ｄｅｈａｓｐｅ  Ｌ，Ｂｒｉｓｏｎ  Ｎ，Ｂｒａｄｙ  Ｐ，Ａｒｄｕｉ  Ｓ，Ｋａｍｍｏｕｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｉｐｅｌｉｎｅ  ｔｏ  ｓｃｒｅｅｎ  ｆｏｒ  ａｌｌ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｆｅｔａｌ  ａｎｅｕｐｌｏｉｄｉｅｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１５；２３：１２８６−９３．
７．Ｓｃｈｅｆｆｅｒ  ＰＧ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｃｈｏｏｔ  ＣＥ，Ｐａｇｅ−Ｃｈｒｉｓｔｉａｅｎｓ  ＧＣ，ｄｅ  Ｈａａｓ  Ｍ．Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｆｅｔａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｒｈｅｓｕｓ  Ｄ，ｃ，Ｅ  ａｎｄ  ｏｆ  Ｋ  ｉｎ  ａｌｌｏｉｍｍｕｎｉｓｅｄ  ｐｒｅｇｎａｎｔ  ｗｏｍｅｎ：  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ７−ｙｅａｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．ＢＪＯＧ  ２０１１；１１８：１３４０−８．
８．Ｌｏ  ＹＭ，Ｃｈａｎ  ＬＹ，Ｌｏ  ＫＷ，Ｌｅｕｎｇ  ＳＦ，Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｃｈａｎ  ＡＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；５９：１１８８−９１．
９．Ｌｅａｒｙ  ＲＪ，Ｓａｕｓｅｎ  Ｍ，Ｋｉｎｄｅ  Ｉ，Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  Ｎ，Ｃａｒｐｔｅｎ  ＪＤ，Ｃｒａｉｇ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１２；４：１６２ｒａ５４．
１０．Ｃｈａｎ  ＫＣ，Ｊｉａｎｇ  Ｐ，Ｚｈｅｎｇ  ＹＷ，Ｌｉａｏ  ＧＪ，Ｓｕｎ  Ｈ，Ｗｏｎｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ：  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ，ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ，ａｎｄ  ｔｕｍｏｒａｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｂｙ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２０１３；５９：２１１−２４．
１１．Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  Ｃ，Ｓａｕｓｅｎ  Ｍ，Ｌｅａｒｙ  ＲＪ，Ｋｉｎｄｅ  Ｉ，Ｗａｎｇ  Ｙ，Ａｇｒａｗａｌ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−ａｎｄ  ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１４；６：２２４ｒａ２４．
１２．Ｉｚｕｍｃｈｅｎｋｏ  Ｅ，Ｃｈａｎｇ  Ｘ，Ｂｒａｉｔ  Ｍ，Ｆｅｒｔｉｇ  Ｅ，Ｋａｇｏｈａｒａ  ＬＴ，Ｂｅｄｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｃｌｏｎａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｌｕｎｇ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ  ａｎｄ  ｐａｉｒｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２０１５；６：８２５８．
１３．Ｌｕｉ  ＹＹ，Ｃｈｉｋ  ＫＷ，Ｃｈｉｕ  ＲＷ，Ｈｏ  ＣＹ，Ｌａｍ  ＣＷ，Ｌｏ  ＹＭ．Ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ａｆｔｅｒ  ｓｅｘ−ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００２；４８：４２１−７．
１４．Ｚｈｅｎｇ  ＹＷ，Ｃｈａｎ  ＫＣ，Ｓｕｎ  Ｈ，Ｊｉａｎｇ  Ｐ，Ｓｕ  Ｘ，Ｃｈｅｎ  ＥＺ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ＤＮＡ  ｉｓ  ｓｈｏｒｔｅｒ  ｔｈａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ：Ａ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２０１２；５８：５４９−５８．
１５．Ｓｕｎ  Ｋ，Ｊｉａｎｇ  Ｐ，Ｃｈａｎ  ＫＣ，Ｗｏｎｇ  Ｊ，Ｃｈｅｎｇ  ＹＫ，  Ｌｉａｎｇ  ＲＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｓｍａ  ＤＮＡ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｂｙ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆｏｒ  ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｒｅｎａｔａｌ，ｃａｎｃｅｒ，ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１５；１１２：Ｅ５５０３−１２．
１６．Ｋｅｅｒｔｈｉｖａｓａｎ  Ｇ，Ｗｉｃｋｒｅｍａ  Ａ，Ｃｒｉｓｐｉｎｏ  ＪＤ．Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ  ｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｔ  ２０１１；２０１１：１３９８５１．
１７．Ｃｈａｓｉｓ  ＪＡ，Ｍｏｈａｎｄａｓ  Ｎ．Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｉｓｌａｎｄｓ：  Ｎｉｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１２：４７０−８．
１８．Ａｄａｍｓ  Ｄ，Ａｌｔｕｃｃｉ  Ｌ，Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ  ＳＥ，Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ  Ｊ，Ｂｅｃｋ  Ｓ，Ｂｉｒｄ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．ＢＬＵＥＰＲＩＮＴ  ｔｏ  ｄｅｃｏｄｅ  ｔｈｅ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｗｒｉｔｔｅｎ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１２；３０：２２４−６．
１９．Ｍａｒｔｅｎｓ  ＪＨ，Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇ  ＨＧ．ＢＬＵＥＰＲＩＮＴ：  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｅｓ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ２０１３；９８：１４８７−９．
２０．Ｋｕｎｄａｊｅ  Ａ，Ｍｅｕｌｅｍａｎ  Ｗ，Ｅｒｎｓｔ  Ｊ，Ｂｉｌｅｎｋｙ  Ｍ，Ｙｅｎ  Ａ，Ｈｅｒａｖｉ−Ｍｏｕｓｓａｖｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １１１  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１５；５１８：３１７−３０．
２１．Ｃｈｉｍ  ＳＳ，Ｔｏｎｇ  ＹＫ，Ｃｈｉｕ  ＲＷ，Ｌａｕ  ＴＫ，Ｌｅｕｎｇ  ＴＮ，Ｃｈａｎ  ＬＹ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｓｐｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００５；１０２：１４７５３−８．
２２．Ｌｅｈｍａｎｎ−Ｗｅｒｍａｎ  Ｒ，Ｎｅｉｍａｎ  Ｄ，Ｚｅｍｍｏｕｒ  Ｈ，Ｍｏｓｓ  Ｊ，Ｍａｇｅｎｈｅｉｍ  Ｊ，Ｖａｋｎｉｎ−Ｄｅｍｂｉｎｓｋｙ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｕｓｉｎｇ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１６；１１３：Ｅ１８２６−３４．
２３．Ｌｕｎ  ＦＭ，Ｃｈｉｕ  ＲＷ，Ｓｕｎ  Ｋ，Ｌｅｕｎｇ  ＴＹ，Ｊｉａｎｇ  Ｐ，Ｃｈａｎ  ＫＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ  ＤＮＡ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２０１３；５９：１５８３−９４．
２４．Ｃｈａｎ  ＫＣ，Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｈｕｉ  ＡＢ，Ｗｏｎｇ  Ｎ，Ｌａｕ  ＴＫ，Ｌｅｕｎｇ  ＴＮ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｚｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ａｎｄ  ｆｅｔａｌ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００４；５０：８８−９２．
２５．Ｙｕ  ＳＣ，Ｃｈａｎ  ＫＣ，Ｚｈｅｎｇ  ＹＷ，Ｊｉａｎｇ  Ｐ，Ｌｉａｏ  ＧＪ，Ｓｕｎ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｚｅ−ｂａｓｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｌａｓｍａ  ＤＮＡ  ｆｏｒ  ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１４；１１１：８５８３−８．
２６．Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ＧＣ，Ｆｒａｎｃｏ  Ｒ，Ｌｌｏｙｄ  ＳＧ，Ｍｏｕｒａ  Ｉ，Ｍｏｕｒａ  ＪＪ，Ｈｕｙｎｈ  ＢＨ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｒｒｏｃｈｅｌａｔａｓｅ．Ｊ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ  １９９５；２７：２２１−９．
２７．Ｂｕｏｒｏ  Ｓ，Ｖａｖａｓｓｏｒｉ  Ｍ，Ｐｉｐｉｔｏｎｅ  Ｓ，Ｂｅｎｅｇｉａｍｏ  Ａ，Ｌｏｃｈｉｓ  Ｅ，Ｆｕｍａｇａｌｌｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｔｅｄ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｂｙ  Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＥ−２１００  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ  ｏｒ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎａｅｍｉａ  ａｎｄ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓ  ２０１５；１３：５８８−９４．
２８．Ｋｉｌｌｉｃｋ  ＳＢ，Ｂｏｗｎ  Ｎ，Ｃａｖｅｎａｇｈ  Ｊ，Ｄｏｋａｌ  Ｉ，Ｆｏｕｋａｎｅｌｉ  Ｔ，Ｈｉｌｌ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ａｐｌａｓｔｉｃ  ａｎａｅｍｉａ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ２０１６；１７２：１８７−２０７．
２９．Ｙｏｕｎｇ  ＮＳ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ  ａｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｅｍｉａ．Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  ２００２；１３６：５３４−４６．
３０．Ｅｓｃｈｂａｃｈ  ＪＷ．Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  １９９１−ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ  １９９１；１８：３−９．
３１．Ｓｃｈｒｉｅｒ  ＳＬ．Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈａｌａｓｓｅｍｉｃ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １９９７；４：７５−８．
３２．Ｋａｓｐｅｒ  ＣＫ，Ｗｈｉｓｓｅｌｌ  ＤＹ，Ｗａｌｌｅｒｓｔｅｉｎ  ＲＯ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．ＪＡＭＡ  １９６５；１９１：３５９−６３．
３３．Ｂｅｊａｒ  Ｒ，Ｓｔｅｅｎｓｍａ  ＤＰ．Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ．Ｂｌｏｏｄ，２０１４；１２４：２７９３−８０３．
３４．Ａｒｂｅｒ  ＤＡ，Ｏｒａｚｉ  Ａ，Ｈａｓｓｅｒｊｉａｎ  Ｒ，Ｔｈｉｅｌｅ  Ｊ，Ｂｏｒｏｗｉｔｚ  ＭＪ，Ｌｅ  Ｂｅａｕ  ＭＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ２０１６  ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｗｏｒｌｄ  ｈｅａｌｔｈ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１６；１２７：２３９１−４０５．
３５．Ｂｕｔｔａｒｅｌｌｏ  Ｍ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｅｍｉａ：  Ａｒｅ  ｔｈｅ  ｏｌｄ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｕｓｅｆｕｌ  ｉｎ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｈｏｗ？Ｉｎｔ  Ｊ  Ｌａｂ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１６；３８  Ｓｕｐｐｌ  １：１２３−３２．
３６．Ｂｕｔｔａｒｅｌｌｏ  Ｍ，Ｂｕｌｉａｎ  Ｐ，Ｆａｒｉｎａ  Ｇ，Ｔｅｍｐｏｒｉｎ  Ｖ，Ｔｏｆｆｏｌｏ  Ｌ，Ｔｒａｂｕｉｏ  Ｅ，Ｒｉｚｚｏｔｔｉ  Ｐ．Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ．Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  ｆｕｌｌｙ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ａｎａｌｙｚｅｒｓ：  Ａｎ  ＮＣＣＬＳ−ＩＣＳＨ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００１；１１５：１００−１１．
３７．Ｄａｎｉｓｅ  Ｐ，Ｍａｃｏｎｉ  Ｍ，Ｂａｒｒｅｌｌａ  Ｆ，Ｄｉ  Ｐａｌｍａ  Ａ，Ａｖｉｎｏ  Ｄ，Ｒｏｖｅｔｔｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｔｅｄ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ２０１２；５０：３５７−６０．
３８．Ｌｏ  ＹＭ，Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｌｅｕｎｇ  ＴＮ，Ｌａｕ  ＴＫ，Ｃｈａｎｇ  ＡＭ，Ｈｊｅｌｍ  ＮＭ．Ｒａｐｉｄ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １９９９；６４：２１８−２４．
３９．Ｔｏ  ＥＷ，Ｃｈａｎ  ＫＣ，Ｌｅｕｎｇ  ＳＦ，Ｃｈａｎ  ＬＹ，Ｔｏ  ＫＦ，Ｃｈａｎ  ＡＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｒａｐｉｄ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  ａｆｔｅｒ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３；９：３２５４−９．
【図１】
2019524056.tif 000010
【図２Ａ】
2019524056.tif 000011
【図２Ｂ】
2019524056.tif 000012
【図３Ａ】
2019524056.tif 000013
【図３Ｂ】
2019524056.tif 000014
【図４】
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【図５】
2019524056.tif 000016
【図６Ａ】
2019524056.tif 000017
【図６Ｂ】
2019524056.tif 000018
【図７】
2019524056.tif 000019
【図８】
2019524056.tif 000020
【図９】
2019524056.tif 000021
【図１０】
2019524056.tif 000022
【図１１Ａ】
2019524056.tif 000023
【図１１Ｂ】
2019524056.tif 000024
【図１２】
2019524056.tif 000025
【図１３Ａ】
2019524056.tif 000026
【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
2019524056.tif 000029
【図１５Ｂ】
2019524056.tif 000030
【図１６】
2019524056.tif 000031
【図１７Ａ】
2019524056.tif 000032
【図１７Ｂ】
2019524056.tif 000033
【図１８Ａ】
2019524056.tif 000034
【図１８Ｂ】
2019524056.tif 000035
【図１９】
2019524056.tif 000036
【図２０Ａ】
2019524056.tif 000037
【図２０Ｂ】
2019524056.tif 000038
【図２１Ａ−２１Ｂ】
2019524056.tif 000039
【図２２】
2019524056.tif 000040
【図２３Ａ−２３Ｂ】
2019524056.tif 000041
【図２４Ａ】
2019524056.tif 000042
【図２４Ｂ】
2019524056.tif 000043
【図２５】
2019524056.tif 000044
【図２６】
2019524056.tif 000045
【図２７】
2019524056.tif 000046
【図２８】
2019524056.tif 000047
【国際調査報告】
2019524056.tif 000048
2019524056.tif 000049
2019524056.tif 000050