(57)【要約】  本発明は、物理的刺激による環境流入を用いた細胞のリプログラミング方法に関し、より詳細には、分化した細胞への逆分化誘導因子および化学物質の導入なしに、超音波、レーザーまたは熱処理などの環境流入を促進できる物理的刺激を分化または未分化細胞に与え、外部環境の流入だけで、細胞を多能性細胞または分化または未分化細胞とは表現型が異なる任意の分化細胞にリプログラミングすることができ、このような誘導は、生産過程が簡単であり、しかも、効率的であることから、自己細胞治療の可能性を高めることができるという効果がある。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化または未分化細胞および培養培地の混合物に、
環境流入（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｉｎｆｌｕｘ）を促進できる物理的刺激を与え、
前記物理的刺激が与えられた混合物を一定時間培養してリプログラミングされた細胞を得ることを含む、細胞のリプログラミング方法。
【請求項２】
環境流入は、物理的刺激が与えられた分化または未分化細胞から排出される遺伝物質、化学物質、小分子、エキソソームまたはエキソソーム含有細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）；または培養培地成分の細胞内流入を含む、請求項１に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項３】
物理的刺激は、超音波、レーザー、磁場、プラズマ、発光ダイオード（ｌｉｇｈｔ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｄｉｏｄｅ）、電気的刺激、化学的露出、熱処理または酸処理のうちのいずれか一つである、請求項１に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項４】
分化または未分化細胞は、体細胞、癌細胞、器官内組織細胞、誘導万能幹細胞または胚芽幹細胞のうちのいずれか一つである、請求項１に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項５】
リプログラミングされた細胞は、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）細胞；または、肝細胞、造骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、神経細胞、星状細胞、角質細胞、毛根細胞、膵臓β細胞または心筋細胞を含む分化細胞のうちのいずれか一つであり、前記分化または未分化細胞とリプログラミングされた細胞とは、異なる細胞表現型を有するものである、請求項１に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項６】
多能性細胞は、Ｏｃｔ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＴＤＧＦ１、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＳＭＡ、ＧＡＴＡ４、またはＡＦＰのうちのいずれか一つの多能性マーカーまたは三胚葉マーカー遺伝子を発現する細胞である、請求項５に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項７】
分化細胞は、ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、ＭＡＰ２、ＴｕＪｌ、ＧＦＡＰまたはＯ４のうちのいずれか一つを発現する神経細胞；Ｄｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、Ｐａｘ３、ＳＭＡ、ＧＡＴＡ４またはＮＫＸ２−５のうちのいずれか一つを発現する筋肉細胞；ＡＦＰ、ＨＮＦｌａ、ＨＮＦ４ａ、ＣＫ１８またはＡＬＢのうちのいずれか一つを発現する肝細胞；またはオイルレッドＯ染色され、Ｐｐａｒｃ２、Ｃ／ｅｂｐａ、ａＰ２またはＦａｂｐ４のうちのいずれか一つを発現する脂肪細胞のうちのいずれか一つである、請求項５に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項８】
培養培地は、幹細胞培養培地、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞分化誘導培地、肝細胞分化誘導培地、骨形成分化誘導培地、脂肪細胞分化誘導培地、筋肉細胞分化誘導培地、星状細胞分化誘導培地、神経系細胞分化誘導培地、血管内皮細胞分化誘導培地、角質細胞分化誘導培地、膵臓β細胞分化誘導培地または心筋細胞分化誘導培地のうちのいずれか一つである、請求項１に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項９】
培養培地と分化または未分化細胞を混合する前に、培養培地に出力強度ｌＷ／ｃｍ２〜２０Ｗ／ｃｍ２の超音波を１分〜２０分間処理することをさらに含む、請求項１または３に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項１０】
培養培地と分化または未分化細胞の混合物に対する超音波処理は、出力強度０．５Ｗ／ｃｍ２〜３Ｗ／ｃｍ２で１秒〜５秒間行う、請求項１または３に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項１１】
培養培地と分化または未分化細胞を混合する前に、培養培地に３００〜９００ｎｍである波長帯域のパルス型レーザービームを１分〜２０分間照射することをさらに含む、請求項１または３に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項１２】
培養培地と分化または未分化細胞の混合物に対するレーザー処理は、３００〜９００ｎｍである波長帯域のパルス型レーザービームを１秒〜１０秒間照射する、請求項１または３に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項１３】
培養培地と分化または未分化細胞を混合する前に、培養培地に４０〜５０℃の温度条件で５分〜２０分間熱処理することをさらに含む、請求項１または３に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項１４】
培養培地と分化または未分化細胞の混合物に対する熱処理は、４０〜５０℃の温度条件で１分〜１０分間露出した後、０℃〜４℃の温度条件で５〜１０秒間露出して行われる、請求項１または３に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項１５】
物理的刺激が与えられた混合物は、浮遊培養または付着培養方式を通じて１日〜２０日間培養される、請求項１に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項１６】
分化または未分化細胞および培養培地の混合物に、
環境流入（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｉｎｆｌｕｘ）を促進できる物理的刺激を与え、
前記物理的刺激が与えられた混合物を１日〜６日間培養し、
前記培養物から分離したエキソソーム含有細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）と分化または未分化細胞とを混合して一定時間培養してリプログラミングされた細胞を得ることを含む、細胞のリプログラミング方法。
【請求項１７】
物理的刺激は、超音波、レーザー、磁場、プラズマ、発光ダイオード（ｌｉｇｈｔ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｄｉｏｄｅ）、電気的刺激、化学的露出、熱処理または酸処理のうちのいずれか一つである、請求項１６に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項１８】
分化または未分化細胞は、体細胞、癌細胞、器官内組織細胞、誘導万能幹細胞または胚芽幹細胞のうちのいずれか一つである、請求項１６に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項１９】
培養培地は、幹細胞培養培地、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞分化誘導培地、肝細胞分化誘導培地、骨形成分化誘導培地、脂肪細胞分化誘導培地、筋肉細胞分化誘導培地、星状細胞分化誘導培地、神経系細胞分化誘導培地、血管内皮細胞分化誘導培地、角質細胞分化誘導培地、膵臓β細胞分化誘導培地または心筋細胞分化誘導培地のうちのいずれか一つである、請求項１６に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項２０】
培養培地と分化または未分化細胞を混合する前に、培養培地に出力強度ｌＷ／ｃｍ２〜２０Ｗ／ｃｍ２の超音波を１分〜２０分間処理することをさらに含む、請求項１６または１７に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項２１】
培養培地と分化または未分化細胞の混合物に対する超音波処理は、出力強度０．５Ｗ／ｃｍ２〜３Ｗ／ｃｍ２で１秒〜５秒間行う、請求項１６または１７に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項２２】
培養培地と分化または未分化細胞を混合する前に、培養培地に３００〜９００ｎｍである波長帯域のパルス型レーザービームを１分〜２０分間照射することをさらに含む、請求項１６または１７に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項２３】
培養培地と分化または未分化細胞の混合物に対するレーザー処理は、３００〜９００ｎｍである波長帯域のパルス型レーザービームを１秒〜１０秒間照射する、請求項１６または１７に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項２４】
培養培地と分化または未分化細胞を混合する前に、培養培地に４０〜５０℃の温度条件で５分〜２０分間熱処理することをさらに含む、請求項１６または１７に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項２５】
培養培地と分化または未分化細胞の混合物に対する熱処理は、４０〜５０℃の温度条件で１分〜１０分間露出した後、０℃〜４℃の温度条件で５〜１０秒間露出して行われる、請求項１６または１７に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項２６】
物理的刺激が与えられた混合物は、浮遊培養または付着培養方式を通じて培養される、請求項１６に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項２７】
エキソソーム含有細胞外小胞は、培養物を遠心分離して回収する、請求項１６に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項２８】
エキソソーム含有細胞外小胞は、
ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＴＤＧＦ１、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＳＭＡ、ＧＡＴＡ４、またはＡＦＰのうちのいずれか一つの多能性マーカーまたは三胚葉マーカー；
ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、ＭＡＰ２、ＴｕＪｌ、ＧＦＡＰまたはＯ４のうちのいずれか一つの神経細胞マーカー；
Ｄｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、Ｐａｘ３、ＳＭＡ、ＧＡＴＡ４またはＮＫＸ２−５のうちのいずれか一つの筋肉細胞マーカー；
ＡＦＰ、ＨＮＦｌａ、ＨＮＦ４ａ、ＣＫ１８またはＡＬＢのうちのいずれか一つの肝細胞マーカー；または
オイルレッドＯ染色され、Ｐｐａｒｃ２、Ｃ／ｅｂｐａ、ａＰ２またはＦａｂｐ４のうちのいずれか一つの脂肪細胞マーカーを発現するものである、請求項１６に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項２９】
エキソソーム含有細胞外小胞と分化または未分化細胞は、浮遊培養または付着培養方式を通じて１日〜２０日間培養される、請求項１６に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項３０】
リプログラミングされた細胞は、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）細胞；または、肝細胞、造骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、神経細胞、星状細胞、角質細胞、毛根細胞、膵臓β細胞または心筋細胞を含む分化細胞のうちのいずれか一つであり、前記分化または未分化細胞とリプログラミングされた細胞とは、異なる細胞表現型を有するものである、請求項１６に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項３１】
多能性細胞は、Ｏｃｔ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＴＤＧＦ１、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＳＭＡ、ＧＡＴＡ４、またはＡＦＰのうちのいずれか一つの多能性マーカーまたは三胚葉マーカー遺伝子を発現する細胞である、請求項３０に記載の細胞のリプログラミング方法。
【請求項３２】
分化細胞は、ＰＡＸ６、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｎｅｓｔｉｎ、ＭＡＰ２、ＴｕＪｌ、ＧＦＡＰまたはＯ４のうちのいずれか一つを発現する神経細胞；Ｄｅｓｍｉｎ、Ｐａｘ３、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＳＭＡ、ＧＡＴＡ４またはＮＫＸ２−５のうちのいずれか一つを発現する筋肉細胞；ＡＦＰ、ＨＮＦｌａ、ＨＮＦ４ａ、ＣＫ１８またはＡＬＢのうちのいずれか一つを発現する肝細胞；またはオイルレッドＯ染色され、Ｐｐａｒｃ２、Ｃ／ｅｂｐａ、ａＰ２またはＦａｂｐ４のうちのいずれか一つを発現する脂肪細胞のうちのいずれか一つである、請求項３０に記載の細胞のリプログラミング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超音波、レーザーまたは熱処理などの物理的刺激による環境流入を用いた細胞のリプログラミング方法に関する。
【０００２】
本発明を支援した韓国国家研究開発事業は、韓国保健福祉部および韓国保健産業振興院が主管実施機関となって実施した先端医療技術の開発事業であって、課題固有番号が「ＨＩ１４Ｃ３２９７」であり、研究課題名が「虚血性脳損傷モデルにおけるマイクロＲＮＡ追跡システムを用いた生体内幹細胞の分布および神経分化モニターリング法の開発」であり、主管実施機関であるカソリック・クァンドン・ユニヴァーシティ・インダストリー・テクノロジー・ホールディングス・カンパニー・リミテッドが支援した。
【０００３】
また、本発明を支援した韓国国家研究開発事業は、韓国未来創造科学部および韓国研究財団が主管実施機関となって実施した中堅研究者支援事業であり、課題固有番号が「２０１３Ｒ１Ａ２Ａ２Ａ０１０６８１４０」であり、研究課題名が「マイクロＲＮＡに基づく幹細胞分化追跡放射線生体分子映像法の開発」であり、主管実施機関であるカソリック・クァンドン・ユニヴァーシティ・インダストリー・テクノロジー・ホールディングス・カンパニー・リミテッドが支援した。
【背景技術】
【０００４】
体細胞を他の種類の細胞、前駆細胞および幹細胞などにリプログラミングする方法は、細胞治療、疾患モデルおよび移植において臨床的に重要な技術である。近年、これらの技術は、いくつかの多能性遺伝子および種々の分化特異的な発現遺伝子などを標的とする分子および化学方法によって試みられた。しかしながら、従来の方法は、安定性と効率性において指摘を受けており、過程が複雑であるといったデメリットを有している。
【０００５】
細胞は、様々な環境に露出されており、このような環境は、細胞が世代を経ることに伴い、短時間または長時間にかけて細胞の遺伝子の発現に影響を及ぼし、環境の変化によるストレスにより細胞の遺伝子発現プログラムが調節される。細胞培養環境における培地成分は、様々な物質とイオンを含んでおり、このような環境の細胞内への流入は、細胞の変化を促進できる画期的な方法になり得る。しかしながら、細胞は、リン脂質から構成された細胞膜により、細胞培地の様々な成分中への、極性の度合いおよびサイズの多様性に起因して、細胞の伝達および流入がスムーズに行われていないのが現状である。近年、超音波により発生したマイクロバブルと空洞現象（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）効果による外部環境の細胞内への流入可能性が報告され、超音波刺激が細胞の発達にポジティブな効果を及ぼすという報告がある。なお、超音波によりＡＴＰが引き起こされ、このようなＡＴＰが細胞膜の受容体と反応して、物質の輸送を誘発するという報告もある。
【０００６】
このような側面から、本発明者らは、超音波などの物理的刺激を用いて、体細胞膜に一時的な損傷を与えるとともに、超音波による培地の空洞現象効果を用いて、様々な物質を細胞内に伝達する方法を工夫し、物理的刺激による環境流入を用いた細胞のリプログラミング方法、いわゆる「Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｇｕｉｄｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ；ＥＮＴＥＲ細胞」を開発することにより、本発明の完成に至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、環境流入を促進できる物理的刺激によって分化した細胞をリプログラミングする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、
本発明は、分化または未分化細胞および培養培地の混合物に、環境流入（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｉｎｆｌｕｘ）を促進できる物理的刺激を与え、
前記物理的刺激が与えられた混合物を一定時間培養してリプログラミングされた細胞を得ることを含む、細胞のリプログラミング方法を提供する。
【０００９】
本発明は、さらに、分化または未分化細胞および培養培地の混合物に、環境流入（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｉｎｆｌｕｘ）を促進できる物理的刺激を与え、
前記物理的刺激が与えられた混合物を１日〜６日間培養し、
前記培養物から分離したエキソソーム含有細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）と分化または未分化細胞とを混合して一定時間培養してリプログラミングされた細胞を得ることを含む、細胞のリプログラミング方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、分化した細胞への逆分化誘導因子および化学物質の導入なしに、超音波、レーザーまたは熱処理などの環境流入を促進できる物理的刺激を分化した細胞に与え、外部環境の流入だけで、細胞を多能性細胞または分化した細胞とは表現型が異なる任意の分化細胞にリプログラミングすることができ、このような誘導は、生産過程が簡単であり、しかも効率的であることから、自己細胞治療の可能性を高められるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明に係る様々なＥＮＴＥＲ（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｇｕｉｄｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）細胞へのリプログラミング方法を示す模式図である。
【図２】超音波刺激による細胞膜の損傷および修復を示す結果であり、図２ａは、ＳＥＭで撮影された細胞表面画像であり、図２ｂは、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ  ｋｉｔ染色画像である。
【図３】細胞内へのＣａ流入分析（ａ）、ＡＴＰ反応分析（ｂ）およびＡＴＰ受容体遺伝子の発現に対するＲＴ−ＰＣＲ分析の結果（ｃ）である。
【図４】ＱＤ６０５を用いて超音波刺激による細胞内への外部物質の流入可能性を示す結果であり、図４ａは、ｕｓＭＣ−Ｓ（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ−ｅｘｐｏｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ）スフェロイドと単一細胞におけるＱＤ６０５の流入の分析結果であり、図４ｂおよび図４ｃは、それぞれの環境条件別のｕｓＭＣ−Ｓスフェロイド（ｂ）と単一細胞（ｃ）内へのＱＤ６０５流入の分析および転写因子の発現結果を示すものである。
【図５】超音波処理された培養液内エキソソームのＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ分析した結果である。
【図６】エキソソームによる物質伝達を示す結果であり、図６ａは、エキソソームによりＱＤ６０５が他の細胞に移動する過程をキャプチャーした画像であり、図６ｂは、エキソソーム内タンパク質マーカーの発現を示し、図６ｃは、エキソソームによるｐｏｌｙ（Ａ）２７−Ｃｙ５．５の伝達実験結果を示すものである。
【図７】超音波処理された細胞の培養液内エキソソームと、超音波処理されていない細胞の空洞培養に伴う細胞の変化を示すものであり、図７ａは、培養時間に伴う細胞形態の変化であり、図７ｂは、エキソソームと６日間培養された細胞内Ｏｃｔ４の発現を示す結果である。
【図８】本発明に係るヒト真皮線維芽細胞の直接分化方法を示すものである。
【図９】脂肪細胞分化誘導培地において超音波処理されたヒト真皮線維芽細胞の脂肪細胞への分化結果を示すものであり、図９ａは、分化誘導後２０日目の細胞の変化と脂肪細胞のオイルレッドＯ染色結果であり、図９ｂは、分化誘導された細胞の脂肪細胞マーカー遺伝子発現に対するＲＴ−ＰＣＲ分析結果である。
【図１０】神経幹細胞分化誘導培地と超音波処理されたヒト真皮線維芽細胞の神経前駆細胞への分化結果を示すものであり、図１０ａは、分化誘導後３日目の細胞の変化、図１０ｂは、分化誘導された神経前駆細胞マーカーの発現、図１０ｃは、付着した細胞における神経前駆細胞マーカーの発現を分析した結果である。
【図１１】神経前駆細胞に分化誘導された細胞（ｎ／ＥＮＴＥＲ  ｃｅｌｌｓ）におけるＰａｘ６およびＮｅｓｔｉｎの発現を分析したフローサイトメトリー分析結果である。
【図１２】ｎ／ＥＮＴＥＲ細胞における増殖マーカーであるＫｉ６７の発現を示すものである。
【図１３】図１３ａは、ｎ／ＥＮＴＥＲ細胞の単一スフィアにおいて細胞が増殖される過程を、図１３ｂは、増殖された細胞における神経前駆細胞の属性維持結果を示す。
【図１４】ｎ／ＥＮＴＥＲ細胞をマウスの脳に移植した後の分化を示す結果であり、図１４ａは、移植された細胞（ＨＮＡ染色された細胞）における星状細胞マーカー（Ｇｆａｐ）の発現、図１４ｂは、移植後に分化した細胞におけるシナプシン（Ｓｙｎｌ）の分泌を示す。
【図１５】神経幹細胞分化誘導培地と超音波刺激によるＭＥＦの神経前駆細胞への分化を示す結果であり、図１５ａは、細胞形態の変化、図１５ｂは、スフィアの神経前駆細胞マーカーの発現、図１５ｃは、フローサイトメトリーを用いた神経前駆細胞マーカーの発現分析結果を示す。
【図１６】ＭＥＦにおいて分化誘導された神経前駆細胞（ｍｏｕｓｅ  ｎ／ＥＮＴＥＲ  ｃｅｌｌｓ）の分化マーカーの発現分析結果である。
【図１７】肝細胞への直接分化を図式で示したものである。
【図１８】肝細胞分化誘導培地と超音波処理されたＨＤＦの肝細胞への分化結果であり、図１８ａは、細胞形態の変化、図１８ｂは、肝細胞マーカーの発現を示す。
【図１９】肝細胞分化誘導培地と超音波処理されたＨｅＬａ細胞の肝細胞（ＨｅＬａ  ｈ／ＥＮＴＥＲ）への分化結果であり、図１９ａは、細胞形態の変化、図１９ｂは、ｑＰＣＲを用いた肝細胞マーカーの発現結果、図１９ｃは、免疫細胞化学法を用いた肝細胞マーカーの発現結果を示す。
【図２０】肝細胞分化誘導培地と超音波処理されたＨｅｐ３Ｂ細胞の肝細胞（Ｈｅｐ３Ｂ  ｈ／ＥＮＴＥＲ  ｃｅｌｌ）への分化結果であり、図２０ａは、細胞形態の変化、図２０ｂは、肝細胞マーカーの発現を示す。
【図２１】ヒトＥＳ培養培地と超音波処理されたＨＤＦのｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞への分化結果であり、図２１ａは、細胞形態の変化、図２１ｂは、培養時間に伴うＯｃｔ４発現の変化を示す。
【図２２】ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞における多能性マーカー遺伝子（ａ）およびタンパク質（ｂ）の発現を示すものである。
【図２３】ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞における多能性属性の分析結果であり、図２３ａは、フローサイトメトリーを用いた多能性マーカーの分析結果、図２３ｂは、マイクロアレイを用いた多能性遺伝子発現パターンの分析結果、図２３ｃは、バイサルファイトシーケンシングを用いたＯｃｔ４およびＮａｎｏｇプロモーターのメチル化有無の分析結果である。
【図２４】ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞における三胚葉マーカー遺伝子（ａ）およびタンパク質（ｂ）の発現を示すものである。
【図２５】培養時間別のｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞におけるＯｃｔ４および三胚葉マーカー発現の変化を示すものである。
【図２６】付着培養されたｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞における三胚葉マーカータンパク質の発現（ａ）およびバイサルファイトシーケンシングを用いたｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の三胚葉マーカーＤＮＡのメチル化分析（ｂ）結果を示すものである。
【図２７】ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の神経細胞（ａ）、心筋細胞（ｂ）および肝細胞（ｃ）へのインビトロ分化結果を示すものである。
【図２８】ＨＤＦにおける神経細胞（ａ）、心筋細胞（ｂ）および肝細胞（ｃ）マーカーの発現有無を分析した結果を示すものである。
【図２９】分化誘導されたｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の神経細胞（ａ）、心筋細胞（ｂ）および肝細胞（ｃ）分化マーカー遺伝子の発現に対するＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示すものである。
【図３０】ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の染色体Ｇ−バンド分析による核型分析結果を示すものである。
【図３１】ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の筋肉移植およびインビボ分化結果であり、図３１ａは、移植された細胞の骨格筋肉への分化結果を、図３１ｂは、移植された細胞のＯｃｔ４の発現および増殖（Ｋ１６７）有無を示す。
【図３２】ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞のマウスの脳への移植およびインビボ分化結果であり、図３２ａは、細胞が移植された座標、図３２ｂは、移植された細胞の星状細胞分化マーカー（Ｇｆａｐ）と神経細胞機能性マーカー（シナプシン、Ｓｙｎｌおよび小胞グルタミン酸輸送体（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ；ｖＧｌｕｔｌ）の分泌、図３２ｃは、移植された細胞のＯｃｔ４の発現と増殖（Ｋｉ６７）有無を示す。
【図３３】ヒトＥＳ培養培地と超音波刺激によるＭＥＦのｍｏｕｓｅ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞への分化を示す結果であり、図３３ａは、培養時間に伴う細胞の形態およびＯｃｔ４−ＧＦＰ発現の変化、図３３ｂは、培養時間に伴うスフェロイド形成率、図３３ｃは、Ｏｃｔ４発現の変化を示す。
【図３４】ｍｏｕｓｅ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞における多能性属性分析結果であり、図３４ａは、免疫細胞化学法による多能性マーカータンパク質の発現、図３４ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによる多能性マーカー遺伝子の発現、図３４ｃは、フローサイトメトリーによる多能性マーカー遺伝子の発現比率の分析結果、図３４ｄは、ｍｏｕｓｅ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞のアルカラインフォスファターゼ（ＡＰ）の染色結果を示す。
【図３５】ｍｏｕｓｅ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞における三胚葉特性を分析した結果であり、図３５ａは、免疫細胞化学法による三胚葉マーカーの発現、図３５ｂおよび図３５ｃは、培養時間別の三胚葉マーカー遺伝子（ｂ）およびタンパク質（ｃ）の発現パターンの分析結果を示す。
【図３６】ｍｏｕｓｅ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の神経細胞（ａ）、心筋細胞（ｂ）へのインビトロ分化結果と、ｍｏｕｓｅ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の染色体Ｇ−バンド分析による核型分析結果（ｃ）を示すものである。
【図３７】ヒトＥＳ培養培地と超音波刺激によるＬ１３２細胞のＬ１３２  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞への分化を示す結果であり、図３７ａは、培養時間に伴う細胞形態の変化、図３７ｂおよび図３７ｃは、Ｌ１３２  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の多能性（ｂ）および三胚葉（ｃ）の属性を示す。
【図３８】ヒトＥＳ培養培地と超音波刺激によるＭＳＣのＭＳＣ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞への分化を示す結果であり、図３８ａは、培養時間に伴う細胞形態の変化、図３８ｂおよび図３８ｃは、ＭＳＣ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の多能性（ｂ）および三胚葉（ｃ）の属性を示す。
【図３９】ヒトＥＳ培養培地と超音波刺激によるヒト皮膚線維芽細胞のＳＦ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞への分化を示す結果であり、図３９ａは、培養時間に伴う細胞形態の変化、図３９ｂおよび図３９ｃは、ＳＦ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の多能性（ｂ）および三胚葉（ｃ）の属性を示す。
【図４０】熱処理とｈＥＳ培地を用いたＨＤＦのｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞への分化を示す結果であり、図４０ａは、分化誘導されたＨＤＦスフェロイド、図４０ｂおよび図４０ｃは、ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の多能性（ｂ）および三胚葉（ｃ）の属性を示す。
【図４１】レーザー刺激とｈＥＳ培地を用いたＨＤＦのｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞への分化を示す結果であり、図４１ａは、分化誘導されたＨＤＦスフェロイド、図４１ｂおよび図４１ｃは、ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の多能性（ｂ）および三胚葉（ｃ）の属性を示す。
【図４２】正常体細胞への細胞外小胞（ＥＶｓ）の伝達有無を確認した結果である。
【図４３】ＥＶｓによるヒト線維芽細胞のリプログラミング誘導有無を確認した結果である。
【図４４】ｅｓ／ＥＮＴＥＲの誘導の際に回収した、ＥＶｓ処理されたヒト線維芽細胞の培養時間別の細胞形態の変化を示すものである。
【図４５】ＥＶｓの添加量に応じた６日間培養されたＨＤＦのＯｃｔ４の発現有無を確認したフローサイトメトリー分析結果である。
【図４６】ｅｓ／ＥＮＴＥＲの誘導の際に回収した、ＥＶｓ処理された３日間培養ＨＤＦにおける多能性マーカータンパク質（ａ：ＩＣＣ画像）および遺伝子（ｂ：ｑＰＣＲ分析）の発現有無を確認した結果である。
【図４７】ｎ／ＥＮＴＥＲの誘導の際に回収した、ＥＶｓ処理された３日間培養ＨＤＦにおける神経幹細胞マーカータンパク質（ａ：ＩＣＣ画像）および遺伝子（ｂ：ｑＰＣＲ分析）の発現有無を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の構成について具体的に説明する。
【００１３】
本発明は、分化または未分化細胞および培養培地の混合物に、環境流入（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｉｎｆｌｕｘ）を促進できる物理的刺激を与え、前記物理的刺激が与えられた混合物を一定時間培養してリプログラミングされた細胞を得ることを含む、細胞のリプログラミング方法に関するものである。
【００１４】
本発明は、分化または未分化細胞に超音波、レーザーまたは熱処理などの環境流入を促進できる物理的刺激を与えながら、目的とするリプログラミングされた細胞を誘導できる任意の培地において分化または未分化細胞を培養して多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）細胞；または前記分化または未分化細胞とは表現型が異なる任意の分化細胞、例えば、肝細胞、造骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、神経細胞、星状細胞、角質細胞、毛根細胞、膵臓β細胞または心筋細胞などに細胞のリプログラミングを誘導できることを特徴とする。
【００１５】
一例によれば、リプログラミングされた細胞を多能性細胞にすることを目指す場合、分化した細胞と幹細胞培養培地を混合し、物理的刺激を与えて一定時間培養することにより、分化した細胞は多能性細胞にリプログラミングされ得る。
【００１６】
他の例によれば、リプログラミングされた細胞を、分化した細胞とは表現型が異なる任意の分化細胞にすることを目指す場合、分化した細胞と目的とする分化細胞の分化誘導培地を混合し、物理的刺激を与えて一定時間培養することにより、分化した細胞は表現型が異なる任意の分化細胞にリプログラミングされ得る。
【００１７】
さらに他の例によれば、未分化細胞、例えば、誘導万能幹細胞または胚芽幹細胞と目的とする分化細胞の分化誘導培地を混合し、物理的刺激を与えて一定時間培養することにより、従来技術に比べて分化率の改善された、目的とする分化細胞にリプログラミングされ得る。
【００１８】
本発明の細胞のリプログラミング方法は、分化または未分化細胞への物理的刺激によって細胞外の環境流入に伴って分化または未分化細胞のリプログラミングが誘導されるものと認められる。このような環境流入とは、物理的刺激が与えられた分化した細胞から排出される遺伝物質、化学物質、小分子、エキソソーム、またはエキソソーム含有細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）；または培養培地成分などの隣り合う分化または未分化細胞への流入を意味する。
【００１９】
本発明の細胞のリプログラミング方法によれば、分化または未分化細胞への環境流入は、多能性マーカーと三胚葉マーカーを安定的に発現する多能性細胞と、前記分化または未分化細胞とは表現型が異なる分化細胞へのリプログラミングの方向性を決め得るものと認められる。
【００２０】
加えて、リプログラミングの方向性は、培養培地の種類により決められ得るものと認められる。
【００２１】
すなわち、上述したように、分化または未分化細胞から多能性細胞へのリプログラミングは、分化した細胞と幹細胞培養培地の混合物に物理的刺激を与えた場合に誘導可能であり、分化した細胞から表現型が異なる任意の分化細胞へのリプログラミングは、分化した細胞と任意の分化細胞の分化誘導培地の混合物に物理的刺激を与えた場合に誘導可能であり、未分化細胞と任意の分化細胞の分化誘導培地の混合物に物理的刺激を与える場合、任意の分化細胞にリプログラミングされ得る。
【００２２】
分化または未分化細胞への環境流入に関して、本発明者らは、特に、物理的刺激による細胞膜損傷と細胞分泌物質（エキソソームまたはエキソソーム含有細胞外小胞）を考慮した。すなわち、超音波、レーザー、または熱処理は、エネルギーによる温度上昇、超音波により生成されるマイクロバブルの振動、液体のフロー生成誘導、すなわち、細胞膜に沿ってマイクロストリーム生成を誘導し、このような効果によって細胞膜に微細な損傷を加え、孔の生成を誘導することによって、外部物質の吸収が増加するようにするが、これは、細胞内Ｃａ２＋濃度変化、すなわち、細胞内Ｃａ２＋濃度変化分析は、細胞膜に損傷や膜の流動性が増加する場合、瞬間的に細胞内（ｃｙｔｏｓｏｌ）Ｃａ２＋濃度が増加することを反映し、細胞膜の流動性の増加を確認することであり、本発明の一具体例によれば、超音波処理直後、Ｃａ２＋濃度が速く増加してから、徐々に減少し、超音波を処理しない対照群の水準まで減少することから、細胞膜の損傷が誘導された後、回復されることが分かった。また、超音波によるＡＴＰの発生および増加が様々な細胞性ストレスに対する反応および細胞膜内ＡＴＰ受容体と反応してエンドサイトーシスを誘導するものと知られている。すなわち、ＡＴＰ濃度と細胞損傷および細胞内への物質の流入との関連性があり、これを確認するために、超音波処理を行った後、細胞におけるＡＴＰ濃度を分析した結果、未処理対照群に比べて高い水準のＡＴＰ濃度が現れた。なお、ＡＴＰにより影響を受ける細胞膜内イオノトロピック型Ｐ２Ｘ受容体と代謝型Ｐ２Ｙ受容体の発現も、また超音波処理された細胞において対照群に比べて活性化された。このような結果は、超音波で細胞内損傷のみならず、細胞の外部環境の流入可能性を示唆する。
【００２３】
一方、エキソソームまたはエキソソーム含有細胞外小胞は、内部に遺伝情報物質（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｐｒｏｔｅｉｎ）を含んでいるものと知られているが、細胞膜の損傷により細胞膜外に排出されたエキソソームまたはエキソソーム含有細胞外小胞が、周辺の他の細胞に再び入る過程を通じて、エキソソームまたはエキソソーム含有細胞外小胞内に存在する遺伝情報物質が伝達され得る。したがって、超音波処理による刺激によって細胞内低発現されるか、あるいは、発現が抑制された状態に維持された多能性マーカー、三胚葉マーカー、または分化細胞マーカーの発現が誘導ないし促進されると同時に、細胞膜に損傷が生ずることによって、前記発現が誘導ないし促進された多能性マーカー、三胚葉マーカー、または分化細胞マーカーを含む細胞内に存在するエキソソームまたはエキソソーム含有細胞外小胞が外部に排出されて、周辺細胞に伝達される。ここで、周辺細胞もまた細胞膜が部分的に損傷された状態であるため、細胞膜の流動性が増加し、細胞内にエキソソームまたはエキソソーム含有細胞外小胞が入る効率が正常状態に比べてさらに高いものと推定され、このようなエキソソームまたはエキソソーム含有細胞外小胞内に存在する前記発現誘導ないし促進された多能性、発生、分化関連遺伝情報が伝達され、多能性細胞または任意の分化細胞が作られるものと考えられた。本発明の一具体例において、多能性細胞誘導過程中に培養培地を回収し、培地内のエキソソームまたはエキソソーム含有細胞外小胞を抽出し、これらの内部に多能性細胞関連多能性マーカーないし分化マーカーが存在するかを確認した結果、知られた多能性マーカー、分化マーカーが高い発現程度を示すことが確認され、本発明者らのこのような仮説を裏付けるものと考えられた。また、このような超音波、レーザーまたは熱処理においても、核型奇形がなく、正常であるものと現われた。
【００２４】
このような仮説は、細胞膜の損傷によるエキソソームまたはエキソソーム含有細胞外小胞の放出誘導により、多能性細胞、または分化細胞を製造できることを可能にする。
【００２５】
前記分化した細胞として、哺乳類由来の真皮線維芽細胞、皮膚線維芽細胞などを含む体細胞；子宮癌細胞（ＨｅＬａ）、肝癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）などを含む癌細胞；または肺上皮細胞（Ｌ１３２  ｃｅｌｌ）を含む器官内組織細胞などを使用することができる。
【００２６】
本明細書において、用語「体細胞」とは、成体を構成する細胞であって、分化能および自己生産能が制限された細胞を意味する。一実現例によれば、前記体細胞は、哺乳類の皮膚、毛髪、脂肪を構成する体細胞であってもよく、好ましくは、哺乳類由来の線維芽細胞であってもよいが、これに制限されない。
【００２７】
本明細書において、用語「未分化細胞」とは、分化能および自己生産能を有した細胞を意味する。例えば、誘導万能幹細胞、胚芽幹細胞、前駆細胞などが挙げられる。
【００２８】
本明細書において、用語「多能性細胞」とは、物理的刺激、厳格な意味として、超音波、レーザー、磁場、プラズマ、発光ダイオード（ｌｉｇｈｔ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｄｉｏｄｅ）、電気的刺激、化学的露出、熱処理、または酸処理後に多能性を獲得した細胞のことをいう。本明細書において前記多能性は、包括的に幹細胞で発現される多能性マーカーを安定的に発現する状態を意味する。また、三つの種類の内胚葉、外胚葉及び中胚葉の三胚葉マーカーを発現する状態を意味する。前記多能性細胞は、「Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｅａｉａ−ｂａｓｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ−ｇｕｉｄｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ；ｅｓ／ＥＮＴＥＲ」細胞と使用され得る。
【００２９】
本発明に係る多能性細胞は、外部環境によって分化誘導が良好に行われ、幹細胞の属性に比べて分化属性が強い前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）の属性がさらに強いという点から、公知の誘導万能幹細胞と差別化された特徴を有する。すなわち、誘導万能幹細胞のような胚芽幹細胞を細胞治療剤として使用する場合、ある程度分化過程を経る用意段階が要求され、癌に変わることができる危険要素を内包し、逆分化誘導因子の導入のためにウイルスベクターを使用することによる安全性の問題が提起されるが、本発明の多能性細胞は、遺伝子変異のための逆分化誘導因子または化学物質などの逆分化誘導物質を別に導入することなく、誘導されるので、他の種類の細胞と共同培養を通じる培養が必要ないため、細胞汚染（他の細胞が混ざる問題点）の問題点がなく、インビボ実験において癌細胞と類似のテラトーマを形成せず、癌発生の問題点がないため、安全性が確保されている。言い換えれば、本発明の多能性細胞は、誘導過程が単純で、短いため、自己細胞を処理し、移植時まで時間を画期的に短縮できるというメリットを有する。
【００３０】
前記多能性細胞は、ＯＣＴ３／４、Ｓ０Ｘ２、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＴＤＧＦ１、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＳＭＡ、ＧＡＴＡ４、またはＡＦＰのうちのいずれか一つの多能性マーカーまたは中胚葉および内胚葉からなる三胚葉マーカー遺伝子を安定的に発現することを特徴とする。
【００３１】
本明細書において、用語「リプログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）」は、分化能がない細胞またはある程度分化能がある細胞など互いに異なる態様で存在する分化した細胞から最終的に新たな類型の細胞または新たな類型の分化潜在力を有する状態に復元または切替えできるプロセスを意味する。のみならず、分化能がある細胞から最終的に新たな類型の細胞に切替えできるプロセスも含む。本発明によれば、分化した細胞は、環境流入を促進できる物理的刺激を受けるとき、多能性細胞または分化した細胞とは表現型が異なる、目的とする任意の分化細胞にリプログラミングされてもよい。なお、未分化細胞は、環境流入を促進できる物理的刺激を受けるとき、顕著に優れた分化率を示しながら任意の分化細胞にリプログラミングされてもよい。
【００３２】
前記分化細胞は、例えば、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、Ｎｅｓｔｉｎ、ＭＡＰ２、ＴｕＪ１、ＧＦＡＰまたは０４のうちのいずれか一つを発現する神経細胞（「ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａ−ｂａｓｅｄ  ＥＮＴＥＲ；ｎ／ＥＮＴＥＲ」という）；Ｄｅｓｍｉｎ、Ｐａｘ３、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＳＭＡ、ＧＡＴＡ４またはＮＫＸ２−５のうちのいずれか一つを発現する筋肉細胞（「ｍｕｓｃｌｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ−ｂａｓｅｄ  ＥＮＴＥＲ；ｍ／ＥＮＴＥＲ」という）；ＡＦＰ、ＨＮＦｌａ、ＨＮＦ４ａ、ＣＫ１８またはＡＬＢのうちのいずれか一つを発現する肝細胞（「ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ−ｂａｓｅｄ  ＥＮＴＥＲ；ｈ／ＥＮＴＥＲ」という）；またはＰｐａｒｃ２、Ｃ／ｅｂｐａ、ａＰ２またはＦａｂｐ４のうちのいずれか一つを発現する脂肪細胞（「ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ−ｂａｓｅｄ  ＥＮＴＥＲ；ａ／ＥＮＴＥＲ」という）を含んでいてもよいが、これらに制限されない。
【００３３】
本明細書において、「培養培地」は、包括的な意味において、インビトロ細胞培養に用いられる培地であり、本発明においては、幹細胞培養培地または分化誘導培地を意味し、前記幹細胞培養培地は、さらに具体的に、胚芽幹細胞培養培地を意味する。また、「分化誘導培地」は、通常の幹細胞の分化細胞への誘導に使用する培地であり、例えば、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞分化誘導培地、肝細胞分化誘導培地、骨形成分化誘導培地、脂肪細胞分化誘導培地、筋肉細胞分化誘導培地、星状細胞分化誘導培地、神経系細胞分化誘導培地、血管内皮細胞分化誘導培地、角質細胞分化誘導培地、膵臓β細胞分化誘導培地または心筋細胞分化誘導培地などを使用することができるが、これらに制限されない。
【００３４】
本発明の細胞のリプログラミング方法において、図１を参照して具体的に説明すれば、次の通りである。
【００３５】
まず、培養培地と分化または未分化細胞を混合し、前記混合物に物理的刺激を与える。
【００３６】
分化または未分化細胞を含む混合物に物理的刺激を与える前に、培養培地に物理的刺激を与えて細胞のリプログラミング効率を高めることができる。
【００３７】
前記物理的刺激は、超音波、レーザー、プラズマ、発光ダイオード（ｌｉｇｈｔ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｄｉｏｄｅ）、電気的刺激、化学的露出、熱処理または酸処理のうちのいずれか一つであってもよい。
【００３８】
前記培養培地に対する超音波処理は、出力強度１Ｗ／ｃｍ２〜２０Ｗ／ｃｍ２の超音波を１〜２０分、具体的に、出力強度２Ｗ／ｃｍ２〜１０Ｗ／ｃｍ２の超音波を５〜１５分、より具体的に、出力強度３Ｗ／ｃｍ２〜７Ｗ／ｃｍ２の超音波を７〜１３分間行うこともできる。
【００３９】
培養培地に対するレーザー処理は、３００〜９００ｎｍ波長帯域のパルス型レーザービームを１分〜２０分、より具体的に、前記波長帯域のパルス型レーザービームを３分〜１０分、さらに具体的に、前記波長帯域のパルス型レーザービームを４分〜６分間照射することができる。前記波長帯域は、例えば、４００ｎｍ、８０８ｎｍ、８８０ｎｍの波長を使用できる。
【００４０】
培養培地に対する熱処理は、４０〜５０℃の温度条件で５分〜２０分間行うことができる。
【００４１】
分化または未分化細胞に物理的刺激を与える場合、所定の強さで露出させることが好ましく、この範囲を脱する場合、細胞生存率が減少することがある。
【００４２】
したがって、培養培地と分化または未分化細胞の混合物に対する超音波処理は、出力強度０．５Ｗ／ｃｍ２〜３Ｗ／ｃｍ２で１〜５秒間、より具体的に、出力強度０．７Ｗ／ｃｍ２〜２Ｗ／ｃｍ２で１〜５秒間、さらに具体的に、出力強度０．８Ｗ／ｃｍ２〜１．５Ｗ／ｃｍ２で１〜５秒間行うことができる。
【００４３】
培養培地と分化または未分化細胞の混合物に対するレーザー処理は、３００〜９００ｎｍ波長帯域のパルス型レーザービームを１秒〜２０秒、より具体的に、前記波長帯域のパルス型レーザービームを３秒〜１０秒、さらに具体的に、前記波長帯域のパルス型レーザービームを４秒〜６秒間照射してもよい。前記波長帯域は、例えば、４００ｎｍ、８０８ｎｍ、８８０ｎｍの波長を使用できる。
【００４４】
培養培地と分化または未分化細胞の混合物に対する熱処理は、４０〜５０℃の温度条件で１分〜１０分間露出した後、０℃〜４℃の温度条件で５〜１０秒間露出して行ってもよい。
【００４５】
次いで、物理的刺激が与えられた混合物を一定時間培養し、リプログラミングされた細胞を得る。
【００４６】
物理的刺激が与えられた混合物の培養は、浮遊培養（ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）または付着培養（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ）方式を通じて多能性マーカーまたは分化マーカーを安定的に発現するスフェロイドが形成される期間、すなわち、２日〜１０日間行うことができるが、これに特に制限されるものではない。
【００４７】
本発明の一具体例によれば、浮遊培養は、付着培養に比べてさらに高いスフェロイド形成効率を示す。また、浮遊培養は、付着培養に比べてスフェロイドの数とサイズがさらに大きくて、一定のサイズ分布を示す。
【００４８】
本発明の一具体例によれば、超音波またはレーザー処理されたヒト皮膚線維芽細胞の浮遊培養時に、略３日目から多能性マーカーまたは分化マーカーの発現が増加するかあるいは安定化され、この時期からリプログラミングが始まるものと認められる。また、熱処理されたヒト皮膚線維芽細胞の浮遊培養時に、略８日目から多能性マーカーの発現が増加するかあるいは安定化され、この時期からリプログラミングが始まるものと認められる。
【００４９】
前記多能性マーカー、例えば、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＴＤＧＦ１、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０などが発現されることを通じて、スフェロイドが多能性を有することを確認できる。多能性マーカーの確認は、ＲＴ−ＰＣＲまたは免疫細胞化学法により分析できるが、特にこれに制限されるものではない。
【００５０】
また、本発明の多能性細胞は、三胚葉マーカー、すなわち外胚葉（ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ）、中胚葉（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＳＭＡ）、内胚葉（ＧＡＴＡ４、ＡＦＰ）マーカーを高い水準に発現する特徴を示す。
【００５１】
他の具体例において、分化誘導培地において皮膚線維芽細胞に対して物理的刺激を与える場合、培養後約１日〜２０日の間にスフェロイドが形成され得る。
【００５２】
分化マーカーは、神経細胞にリプログラミングされる場合、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、Ｎｅｓｔｉｎ、ＭＡＰ２、ＴｕＪｌ、ＧＦＡＰまたは０４のうちのいずれか一つであってもよい。
【００５３】
筋肉細胞にリプログラミングされる場合、Ｄｅｓｍｉｎ、Ａｃｔｉｎｉｎ、Ｐａｘ３、ＳＭＡ、ＧＡＴＡ４またはＮＫＸ２−５のうちのいずれか一つであってもよい。
【００５４】
肝細胞にリプログラミングされる場合、ＡＦＰ、ＨＮＦｌａ、ＨＮＦ４ａ、ＣＫ１８またはＡＬＢのうちのいずれか一つであってもよい。
【００５５】
脂肪細胞にリプログラミングされる場合、オイルレッドＯ染色され、Ｐｐａｒｃ２、Ｃ／ｅｂｐａ、ａＰ２またはＦａｂｐ４のうちのいずれか一つであってもよい。
【００５６】
また、本発明の多能性細胞は、増殖マーカータンパク質であるＫｉ−６７を発現し、増殖能を有する特徴がある。
【００５７】
また、前記リプログラミングされた多能性細胞を栄養細胞と共培養する場合、多能性細胞の増殖が増加し得る。
【００５８】
さらに、本発明の細胞のリプログラミング方法は、前記多能性細胞を分化誘導培地において培養する段階をさらに含んでいてもよい。前記分化誘導培地の種類に応じて、多能性細胞は、目的とする分化細胞に分化し得る。
【００５９】
前記分化誘導培地として、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞分化誘導培地、肝細胞分化誘導培地、骨形成分化誘導培地、脂肪細胞分化誘導培地、筋肉細胞分化誘導培地、星状細胞分化誘導培地、神経系細胞分化誘導培地、血管内皮細胞分化誘導培地、角質細胞分化誘導培地、膵臓β細胞分化誘導培地または心筋細胞分化誘導培地などを使用できるが、特にこれらに制限されるものではない。
【００６０】
本発明は、また、分化または未分化細胞および培養培地の混合物に、環境流入（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｉｎｆｌｕｘ）を促進できる物理的刺激を与え、
前記物理的刺激が与えられた混合物を１日〜６日間培養し、
前記培養物から分離したエキソソーム含有細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）と分化または未分化細胞とを混合して一定時間培養してリプログラミングされた細胞を得ることを含む、細胞のリプログラミング方法に関する。
【００６１】
本発明の細胞のリプログラミング方法は、物理的刺激を受けた分化または未分化細胞から分離したエキソソーム含有細胞外小胞を分化または未分化細胞と一定時間培養して任意の分化細胞にリプログラミングし得ることを特徴とする。
【００６２】
前記エキソソーム含有細胞外小胞は、分化または未分化細胞および培養培地の混合物に環境流入を促進できる物理的刺激を与え、前記物理的刺激が与えられた混合物を１日〜６日間培養して遠心分離によって回収することができる。
【００６３】
前記分化または未分化細胞の物理的刺激は、以上に記述されているため、重複する記載を避けるためにこれについての記載を省略する。
【００６４】
前記エキソソーム含有細胞外小胞は、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｃ−ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＴＤＧＦ１、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＳＭＡ、ＧＡＴＡ４、またはＡＦＰのうちのいずれか一つの多能性マーカーまたは三胚葉マーカー；ＰＡＸ６、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、ＭＡＰ２、ＴｕＪｌ、ＧＦＡＰまたはＯ４のうちのいずれか一つの神経細胞マーカー；Ｄｅｓｍｉｎ、Ｐａｘ３、Ａｃｔｉｎｉｎ、ＳＭＡ、ＧＡＴＡ４またはＮＫＸ２−５のうちのいずれか一つの筋肉細胞マーカー；ＡＦＰ、ＨＮＦｌａ、ＨＮＦ４ａ、ＣＫ１８またはＡＬＢのうちのいずれか一つの肝細胞マーカー；またはオイルレッドＯ染色され、Ｐｐａｒｃ２、Ｃ／ｅｂｐａ、ａＰ２またはＦａｂｐ４のうちのいずれか一つの脂肪細胞マーカーを発現するものであってもよい。
【００６５】
例えば、前記エキソソーム含有細胞外小胞が多能性マーカーを含む場合、分化細胞と培養すれば、前記分化細胞は多能性細胞にリプログラミングされ得る。また、前記エキソソーム含有細胞外小胞が分化マーカーを含む場合、分化細胞と培養すれば、表現型が異なる任意の分化細胞にリプログラミングされ得る。なお、前記エキソソーム含有細胞外小胞が分化マーカーを含む場合、未分化細胞と培養すれば、任意の分化細胞にリプログラミングされ得る。
【００６６】
本発明の一具体例によれば、ｅｓ／ＥＮＴＥＲの誘導の際に回収したエキソソームマーカーであるＣＤ６３が染色された細胞外小胞（ＥＶｓ）において様々な多能性マーカーの発現が確認され、前記ＥＶｓが処理された正常ヒト体細胞において３日間培養した後、多能性マーカーであるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇが発現されて細胞のリプログラミングが確認された。
【００６７】
また、ｎ／ＥＮＴＥＲの誘導の際に回収したエキソソームマーカーであるＣＤ６３が染色された細胞外小胞（ＥＶｓ）においてＰａｘ６などの神経幹細胞のマーカーの発現が確認され、前記ＥＶｓが処理された正常ヒト体細胞において３日間培養した後、神経幹細胞マーカーであるＳｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、Ｎｅｓｔｉｎの発現が確認された。
【００６８】
さらに、ｍ／ＥＮＴＥＲの誘導の際に回収したエキソソームマーカーであるＣＤ６３が染色された細胞外小胞（ＥＶｓ）においてＰａｘ３などの筋肉細胞マーカーの発現が確認され、ｈ／ＥＮＴＥＲの誘導の際に回収したエキソソームマーカーであるＣＤ６３が染色された細胞外小胞（ＥＶｓ）においてＨＮＦｌａなどの肝細胞マーカーの発現が確認された。
【００６９】
したがって、物理的刺激を受けた分化または未分化細胞は、リプログラミング因子が含まれている細胞外小胞を分泌することが分かり、これらを分化または未分化細胞に処理して浮遊培養または付着培養方式を通じて１日〜２０日間培養すれば、任意の多能性細胞、または分化細胞にリプログラミングされ得る。
【００７０】
本発明の細胞のリプログラミング方法を通じてリプログラミングされ得る細胞は、上述した種類の多能性細胞または分化細胞であってもよく、重複する記載を避けるために、記載を省略する。
【００７１】
以下、本発明を実施例により詳しく説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７２】
＜実施例１＞  物理的刺激による細胞内への環境流入の証明実験
この実施例は、物理的刺激による細胞内への環境流入に対する証明実験であり、このために、細胞はｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したプライマリー（初代）ＨＤＦ細胞を１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）と１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＤＭＥＭにおいて培養し、培養液に対する超音波処理は、５Ｗ／ｃｍ２で１０分間行い、細胞処理は、１ｘ１０６細胞に１Ｗ／ｃｍ２で５秒間処理した後、処理された培養液とともに３５ｍｍの培養ディッシュに２ｘ１０５細胞を培養した。
【００７３】
ＳＥＭ画像の分析のために、何らの処理もされていないＨＤＦ細胞と、前記のようにして処理された直後と、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて２時間培養した細胞を４℃において４％パラホルムアルデヒドで１２時間固定した後、０．１％タンニン酸溶液に１時間、１％四酸化オスミウム溶液において２時間処理した後、濃度段階ごとにアセトンで脱水させた後、液体ＣＯ２で細胞を乾燥させ、金−パラジウムでコーティングされた表面に固定して電子顕微鏡（１５５５ＶＰ−ＦＥＳＥＭ、ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）で細胞を観察した。
【００７４】
Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ画像分析のために、細胞は、何らの処理もされていないＨＤＦと、超音波処理直後と、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて２時間培養した細胞にＬｉｖｅ／ｄｅａｄ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／ｃｖｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）を用いて染色した。染色過程は、生きている細胞に２μＭカルセイン（ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｄｙｅ）および４μＭエチジウムホモダイマー−ｌ（ＥｔｈＤ−ｌ、ｄｅａｄ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｄｙｅ）を細胞培養液に添加した後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３０分間培養した後、蛍光顕微鏡（ＩＸ３−ＺＤＣ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）で赤色（ＥｔｈＤ−１染色、死ぬかまたは損傷された細胞、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ、５２８／６１７ｎｍ）と緑色蛍光（カルセイン染色、生きている細胞、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ、４９４／５１７ｎｍ）を分析した。
【００７５】
図２ａに示されたように、超音波により細胞膜が損傷されて外部環境が流入し得る孔が形成され、このような損傷は、２時間後に修復された。
【００７６】
また、超音波刺激を与えた後、損傷された細胞および細胞の修復を確認するために、細胞死滅を分析するのに用いられるＬｉｖｅ／ｄｅａｄ  ｋｉｔを用いて細胞を染色した。
【００７７】
図２ｂから明らかなように、超音波を細胞に処理した後、処理直後に染色し、２時間が経過した後に染色した結果、処理直後に緑色蛍光と赤色蛍光が共存する細胞が観察され、２時間後に赤色蛍光を示す細胞の数が格段に減って、図２ａに示されたように、細胞膜が修復されることによって赤色蛍光が減ることが分かった。
【００７８】
これは、超音波刺激によって細胞損傷が起きるとはいえ、修復可能であり、このように刺激による細胞膜損傷によって培地環境の流入が可能であるものと考え、細胞内物質の流入により現れる現象を分析した。
【００７９】
一方、図２において、ｕｓＭＣ（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ−ｅｘｐｏｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ）は、細胞および培養培地のそれぞれに超音波を処理した場合をいい、ｕｓＭＣ−Ｓは、浮遊培養されたｕｓＭＣを意味する。
【００８０】
＜実施例２＞  物理的刺激による細胞内への外部物質の流入に対する証明実験
細胞内への外部物質の流入に敏感な細胞内カルシウム濃度の変化を測定し、超音波によるＡＴＰの発生に伴う物質の流入可能性を確認するために、細胞内ＡＴＰ測定とＡＴＰ反応により細胞膜内受容体が細胞膜外部物質の流入通路を開放すると知られているＡＴＰ受容体の発現をＲＴ−ＰＣＲで分析した。
【００８１】
カルシウム濃度分析は、Ｆｌｕｏ−４  ＮＷ  Ｃａｌｓｉｕｍ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて行った。何らの処理もされていないＨＤＦ細胞と、超音波（ｌＷ／ｃｍ２、５秒）で直接処理された後、超音波処理された培地（５Ｗ／ｃｍ２、１０分）に露出された細胞（ｕｓＭＣ−Ｓ）をそれぞれキット内構成品のうち分析バッファーと混ぜ、９６−ウェルプレートのウェル当たりに３ｘｌ０４細胞を分注した後、ウェル当たりに５０μｌのＦｌｕｏ−４ＮＷ試薬と混ぜた後、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で励起波長４９４ｎｍ／放出波長５１６ｎｍの範囲の蛍光を１０秒おきに１５分間測定した。
【００８２】
ＡＴＰは、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いて測定した。細胞は、何らの処理もされていない細胞と、超音波（１Ｗ／ｃｍ２、５秒）で直接処理された後、超音波処理された培地（５Ｗ／ｃｍ２、１０分）に露出された細胞（ｕｓＭＣ−Ｓ）を９６−ウェルプレートのウェル当たりに３ｘｌ０４細胞を分注した後、ウェル当たりに１００μｌのＡＴＰ分析ミックスとＡＴＰ標準物質を分注して室温において３分間培養した後、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発光強度を測定した。
【００８３】
ＡＴＰ受容体発現の分析のためのＲＴ−ＰＣＲは、処理された細胞をＲＮｅａｓｙ  ｐｌｕｓ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐＩＩ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、ＵＳＡ）でｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲは、ＰＣＲプレミックス（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）にｃＤＮＡとプライマーを混ぜた後、Ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ  ｄｉｃｅ  ＰＣＲ  ｍａｃｈｉｎｅ（ＴＰ６００、ＴＡＫＡＲＡ、Ｏｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）を用いて９５℃５分変性、９５℃で３０秒、ｇｒａｄｉｅｎｔ（５０−６５℃）３０秒および７２℃で１分を３５サイクル、および７２℃で１５分の条件で行われた。
【００８４】
【表１】
2019508068.tif 000003
【００８５】
図３に示されたように、超音波刺激を与えた後、細胞内へのカルシウムの流入が６０秒まで増加し、６０分で細胞内のＡＴＰ濃度が最大に増加し、細胞膜内ＡＴＰ受容体もまた、１時間および４時間で発現が増加した。このことは、超音波刺激により初期に細胞内に外部物質が流入することがカルシウムの濃度増加により確認され、超音波によりＡＴＰが発生し、これにより、ＡＴＰ受容体が反応して細胞膜通路が開放されて外部物質の流入が可能であることが分かった。
【００８６】
＜実施例３＞  ＱＤ６０５を用いた物理的刺激による細胞内への外部物質の流入に対する証明実験
ＱＤ６０５を外部物質とし、ＱＤ６０５が超音波により細胞内に流入するか否かを確認した。ＱＤ６０５は、蛍光を帯びるナノ物質であり、生きている細胞における浸透性に劣ることが知られているため、ＱＤ６０５を用いた超音波による細胞内への外部物質の流入を確認した。
【００８７】
このために、ＨＤＦに実施例１の方法と同様にして超音波刺激を与えた後、ＱＤ６０５  ｌ００ｐｍｏｌを処理し、２４時間後に単一細胞とスフェロイド内のＱＤ６０５の存在を確認した。
【００８８】
図４に示されたように、超音波刺激を受けなかったＨＤＦからは蛍光が認められなかった。しかしながら、超音波刺激を受けたＨＤＦからは蛍光が観察された。
【００８９】
また、外部物質の流入に伴う細胞変化に対する可能性を確認するために、それぞれの培地環境（ＥＳ、Ｎｅｕｒｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ、ｍｕｓｃｌｅ）において超音波を処理した後、ＱＤ６０５  ｌ００ｐｍｏｌを入れ、２４時間後にそれぞれの分化過程上の転写因子（ＥＳ：Ｏｃｔ４、Ｎｅｕｒｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ：Ｐａｘ６、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ：ＨＮＦｌａ、Ｍｕｓｃｌｅ：Ｐａｘ３）の発現をＩＣＣから確認した。
【００９０】
図４ｂおよび図４ｃに示されたように、外部物質（ＱＤ６０５）が流入した細胞およびスフェロイドのそれぞれにおいて転写因子が観察された。このことは、外部物質の流入に伴う細胞のリプログラミングの可能性を示唆する結果である。
【００９１】
実験過程において、四つの種類の環境流入サンプルのうち、ｅｓ／ＥＮＴＥＲとｎ／ＥＮＴＥＲにのみスフェロイドを形成した。しかしながら、ｍ／ＥＮＴＥＲとｈ／ＥＮＴＥＲはスフェロイドを形成しなかった。これは、細胞の特性と培地造成による。ＥＳと神経前駆細胞の場合、浮遊培養過程においてスフェロイドやスフィアの形成が行われる細胞であるが、筋肉細胞と肝細胞の場合にはスフェロイドを形成しない。これは、分化誘導過程においてコーティングされた培養ディッシュにおいて付着させて培養したからであり、特に、筋肉細胞の培地にＦＢＳが入っているが、ＦＢＳは、細胞付着力を高めるため、スフェロイドが形成できないものと認められる。
【００９２】
＜実施例４＞  物理的刺激を受けた細胞培養液内のエキソソーム分析
超音波による細胞刺激は、全ての細胞に一様に刺激されるわけではないため、細胞のリプログラミングは、一部の細胞において行われることがあり、このようにして変化された細胞とそうではない細胞の細胞交流の可能性を考えてみた。近年、エキソソームによる細胞間の物質交流に対する可能性を参考にし、超音波処理された細胞から排出された培養培地内のエキソソームが遺伝物質を含んでいる可能性があり、これは、リプログラミングされた細胞から分泌される物質中に、リプログラミングに重要な役割を果たす遺伝物質が含まれている可能性を有しているため、超音波処理後に培養された培養培地内のエキソソームを培養時間別の培地の交換の際に回収して培養液内のエキソソームのＲＮＡをＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５  ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で抽出し、ｃＤＮＡの合成は、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐＩＩ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、ＵＳＡ）で行った。ＰＣＲは、ＰＣＲプレミックス（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）にｃＤＮＡとプライマーを混ぜた後、Ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ  ｄｉｃｅ  ＰＣＲ  ｍａｃｈｉｎｅ（ＴＰ６００、ＴＡＫＡＲＡ、Ｏｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）を用いて９５℃で５分変性、９５℃で３０秒、ｇｒａｄｉｅｎｔ  ３０秒および７２℃で１分を３５サイクル、７２℃で１５分の条件でＲＴ−ＰＣＲ分析を行った（表２）。
【００９３】
図５に示されたように、エキソソームのＲＮＡのうち、多能性ＲＮＡの発現が確認された。
【００９４】
一方、図５において、ｕｓＭＣは、細胞および培養培地のそれぞれに超音波を処理した場合をいい、ｕｓＭＣ−Ａは、付着培養されたｕｓＭＣを意味する。
【００９５】
【表２】
2019508068.tif 000004
2019508068.tif 000005
【００９６】
＜実施例５＞  エキソソームによる物質伝達に対する証明実験
前記実施例４において超音波処理された細胞の培養液内エキソソームにおいて多能性マーカーの発現が確認されたため、このようなエキソソームにより遺伝物質およびタンパク質が伝達されるか否かを確認した。
【００９７】
超音波処理後にＱＤ６０５を添加し、生きている細胞の画像を撮影した結果、図６ａに示されたように、７時間４５分頃にＱＤ６０５の流入した細胞のＱＤ６０５が細胞質の一部とともに脱落して他の細胞に移動する現象を確認することができた。
【００９８】
このようにして脱落した細胞質の一部がエキソソームであると予想し、ｕｓＭＣ処理された細胞を様々な培地環境に露出させた後、４％パラホルムアルデヒドに１０分間固定し、０．１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳに４０分間染み込ませた。５％（ｖ／ｖ）ヤギ血清を含むＰＢＳ溶液で１時間ブロッキングし、１次抗体でエキソソームマーカーであるＣＤ６３（１：１００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とそれぞれの分化誘導培地により誘導されるべき細胞の初期発現マーカーである胚芽幹細胞（Ｏｃｔ４１：２００；Ｎａｎｏｇ１：２００；ａｂｅａｍ）、神経幹細胞（Ｐａｘ６、１：２００；ａｂｅａｍ）、筋肉細胞（Ｐａｘ３、１：２００；ａｂｅａｍ）および肝細胞（ＨＮＦｌａ、１：２００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）などを４℃において一晩中染色した。そして、０．０３％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳバッファーで洗浄し、２次抗体、Ａｌｅｘａ−４８８または−５９４が結合された抗−ウサギ、抗−マウス抗体（１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ、４９５／５１９ｎｍ、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ、５９０／６１７ｎｍ）を室温において１時間半くらい染色した後、０．０３％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳバッファーで洗浄し、ＤＡＰＩ入りマウンティングゾル（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ、４２０／４８０ｎｍ）でマウンティングして、共焦点レーザー蛍光顕微鏡（ＬＳＭ７００；ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）で画像を分析した。
【００９９】
図６ｂに示されたように、細胞の周りに出ていた細胞質の一部分であると推測されるものがＣＤ６３により染色され、ｅｓ／ＥＮＴＥＲの誘導の際にエキソソームマーカーであるＣＤ６３が染色された細胞外小胞（ＥＶｓ）においてＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇなどの多能性細胞マーカーの発現が確認され、ｎ／ＥＮＴＥＲの誘導の際にエキソソームマーカーであるＣＤ６３が染色された細胞外小胞（ＥＶｓ）においてＰａｘ６などの神経幹細胞のマーカーの発現が確認され、ｍ／ＥＮＴＥＲの誘導の際にエキソソームマーカーであるＣＤ６３が染色された細胞外小胞（ＥＶｓ）においてＰａｘ３などの筋肉細胞マーカーの発現が確認され、ｈ／ＥＮＴＥＲの誘導の際にエキソソームマーカーであるＣＤ６３が染色された細胞外小胞（ＥＶｓ）においてＨｎｆｌａなどの肝細胞マーカーの発現が確認された。
【０１００】
前記結果から、エキソソームが細胞質から脱落し、それは、遺伝物質とタンパク質を含んでいるため、周辺細胞に伝達して周辺細胞の変化を誘導することができるという仮設を立てた。これを立証するために、エキソソームを抽出してエキソソームをＣＤ６３で染色（培養中の細胞中にもエキソソームが存在するため、新たに注入するエキソソームであることを区別するために染色する）した後、そのエキソソーム内にｐｏｌｙ（Ａ）２７−Ｃｙ５．５を修飾した遺伝物質をエキソソームに流入させた後、処理されていないＨＤＦとともに培養すれば、エキソソームによりｐｏｌｙ（Ａ）２７−Ｃｙ５．５が伝達されるのではないかと考えた。
【０１０１】
図６ｃに示されたように、ＣＤ６３が染色されたエキソソームが細胞内において発見され、ＣＤ６３とともにｃｙ５．５が発現されることが確認された。これは、エキソソームにより注入した遺伝子（ｐｏｌｙ−Ａ）が伝達されたことを意味する。
【０１０２】
＜実施例７＞  物理的刺激を受けた細胞と正常細胞の共同培養
エキソソームにより遺伝物質が伝達され得るので、ヒトＥＳ培地において培養された細胞から分泌されるエキソソームが周りの細胞や、それとも、何らの処理もされていない細胞の属性も変化させ得るという仮設を立て、これを証明するために、ヒトＥＳ培地環境において培養された超音波処理された細胞の２日間培養された培地からエキソソームを抽出し、ヒトＥＳ培地と線維芽細胞培養培地であるＤＭＥＭで何らの処理もされていない細胞を培養する過程においてエキソソーム抽出物を混ぜて６日間培養した。
【０１０３】
その結果、エキソソームが添加されたグループにおいてスフェロイドが生成され（図７ａ）、この細胞におけるＯｃｔ４の発現を確認した結果、多能性マーカーであるＯｃｔ４の発現が観察された（図７ｂ）。このことは、エキソソームによる遺伝物質伝達が細胞リプログラミングを誘導できることを意味する。
【０１０４】
＜実施例８＞  線維芽細胞の直接リプログラミング
前記実施例１〜７において、培地環境の変化による細胞リプログラミングの可能性と周辺細胞までリプログラミングできることが立証されたため、これを基づいて、様々な培地環境を適用して細胞のリプログラミングを確認してみた。
【０１０５】
そのために、図８のように、ヒト線維芽細胞をｌｍＬの分化誘導培地にｌｘｌ０６細胞の密度で集めた後、超音波をｌＷ／ｃｍ２の強度で５秒間処理した後、３５ｍｍ培養ディッシュまたは６−ウェルプレートに２ｘｌ０５／Ｗｅｌｌで分注した後、超音波を１０Ｗ／ｃｍ２の強度で１０分間処理した２ｍＬの分化誘導培地において培養した。
【０１０６】
分化誘導培地の種類によって違いがあるが、培養後約２日〜６日でスフェロイドが形成された。
【０１０７】
また、脂肪細胞分化誘導培地を用いてｕｓＭＣ処理した後、２０日間培養した結果、細胞内気泡が生成されることが観察され、この気泡に対する分析を行ったところ、脂肪細胞の判別のための脂質染色試薬であるオイルレッドＯが染色されることが分かった。これは、細胞が脂肪を生産することを示す指標である（図９ａ）。
【０１０８】
また、細胞のＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲを用いて脂肪細胞マーカー遺伝子、Ｐｐａｒｃ２、Ｃ／ｅｂｐａ、ａＰ２、Ｆａｂｐ４の発現を確認した結果、分化誘導後に発現が増加することが示された（図９ｂ）。
【０１０９】
さらに、神経幹細胞（神経前駆細胞）分化誘導培地と超音波によるＨＤＦの神経前駆細胞への分化を確認するために、分化誘導後３日目に生成されたスフェロイドと付着した細胞において神経前駆細胞マーカー、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、Ｎｅｓｔｉｎの発現を免疫細胞化学的方法で染色して確認した。
【０１１０】
図１０ａは、分化誘導された細胞の様子であり、図１０ｂは、スフェロイドにおける神経前駆細胞マーカーを示すものであり、分化誘導されると、Ｏｃｔ４の発現が減少し、Ｓｏｘ２とＰａｘ６、並びにＮｅｓｔｉｎの発現が高く現われることを確認した。図１０ｃは、付着した細胞における発現を調べてみた結果であり、同様に、前記と同じ発現パターンを示した。このとき、神経前駆細胞や神経幹細胞のマーカーは、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、Ｎｅｓｔｉｎであり、Ｏｃｔ４は、多能性マーカーで成体幹細胞や前駆細胞である場合、Ｏｃｔ４の発現能が低下する。
【０１１１】
【表３】
2019508068.tif 000006
【０１１２】
図１１は、分化誘導後、７日間分化誘導された細胞におけるＰａｘ６／Ｎｅｓｔｉｎの発現パターンをフローサイトメトリーによって分析した結果であり、処理後１日目のＰａｘ６とＮｅｓｔｉｎが相対的に５０％以上発現され、３日目にＰａｘ６、Ｎｅｓｔｉｎの発現が最も高く現われた。
【０１１３】
図１２は、分化誘導後３日目に、細胞のうち神経前駆細胞マーカー（Ｐａｘ６／ｎｅｓｔｉｎ）が発現される細胞において増殖有無を確認すべく、ｋｉ６７の発現を確認した結果であり、白抜き矢印が指し示す細胞を見ると、Ｎｅｓｔｉｎが発現される細胞におけるｋｉ６７の発現を確認することができた。このような結果は、分化誘導された細胞が増殖能力を有することを意味する。図１２において、矢印は、Ｎｅｓｔｉｎが染色された細胞が増殖していることを示す標識である。
【０１１４】
図１３は、分化誘導された細胞（ｎ／ＥＮＴＥＲ  ｃｅｌｌｓ）の自己再生（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）を確認した実験結果であり、図１３ａは、動画で一つのスフェロイドから増殖されて出た細胞がＰａｘ６とｎｅｓｔｉｎを発現することを確認することにより、その後に増殖された細胞に神経前駆細胞属性がそのまま伝わることが分かった。
【０１１５】
次いで、５週齢のマウスの脳に分化誘導された細胞（ｎ／ＥＮＴＥＲ  ｃｅｌｌｓ）を注入して４週後に脳を回収した後、注入された細胞の周辺細胞への分化を確認し、分化した細胞の機能を確認した。
【０１１６】
図１４ａに示されたように、脳に注入された細胞（ｎ／ＥＮＴＥＲ  ｃｅｌｌｓ）をＨｕｍａｎ  Ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＮＡ）で染色して表示した後、表示された細胞をＧｆａｐ抗体で染色した結果、注入された細胞におけるＧｆａｐが発現されることを確認した。
【０１１７】
また、Ｇｆａｐが発現される細胞が正常的な機能をするか否かを確認するために、シナプシンを分泌するか否かをシナプシン１抗体（１：５００、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）で染色した。その結果、ＨＮＡが発現される細胞のうち、Ｇｆａｐが発現される細胞においてシナプシン１の発現が観察された（図１４ｂ）。
【０１１８】
次いで、分化誘導後３日目に生成されたスフェロイドにおける神経前駆細胞マーカー（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、Ｎｅｓｔｉｎ）の発現を免疫細胞化学方法で染色して確認した。
【０１１９】
このために、スフェロイドと付着した細胞は４％パラホルムアルデヒドに１０分間固定し、０．１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳに４０分間染み込ませた。５％（ｖ／ｖ）ヤギ血清を含むＰＢＳで１時間ブロッキングし、１次抗体でＯｃｔ４（１：２００）、Ｓｏｘ２（１：２００）、Ｐａｘ６（ｌ；２００）、Ｎｅｓｔｉｎ（１：２００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）などを４℃において一晩中染色した。また、０．０３％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳバッファーで洗浄し、２次抗体、Ａｌｅｘａ−４８８または−５９４が結合された抗−ウサギ、抗−マウス抗体（１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ、４９５／５１９ｎｍ、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ、５９０／６１７ｎｍ）を室温において１時間半くらい染色した後、０．０３％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳバッファーで洗浄し、ＤＡＰＩ入りマウンティングゾル（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ、４２０／４８０ｎｍ）でマウンティングし、共焦点レーザー蛍光顕微鏡（ＬＳＭ７００；ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）で画像を分析した。
【０１２０】
図１５ａにおいてスフェロイドの形成を確認し、スフェロイドにおいて神経前駆細胞マーカーであるＰａｘ６およびＮｅｓｔｉｎの発現が高く現われることを確認した（図１５ｂ）。
【０１２１】
図１５ｃは、分化誘導後３日間分化誘導された細胞におけるＰａｘ６／Ｎｅｓｔｉｎの発現パターンをフローサイトメトリーによって分析した結果であり、処理後１日目にＰａｘ６とＮｅｓｔｉｎが７０％以上発現され、３日目にＰａｘ６、Ｎｅｓｔｉｎの発現が最も高く現われた。
【０１２２】
図１６は、分化誘導後２０日目の細胞における神経前駆細胞マーカー（Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、Ｎｅｓｔｉｎ）の発現を免疫細胞化学方法で染色して確認した結果であり、上段および中間の写真は、Ｓｏｘ２とＰａｘ６、並びにＮｅｓｔｉｎの発現が高く現われることが示され、下段の写真は、希突起膠細胞マーカーの発現を調べてみた結果であり、同様に前記と同じ発現パターンを示した。
【０１２３】
この結果は、分化誘導された細胞が神経前駆細胞分化能力と類似の分化能力を有しているという意味である。
【０１２４】
＜実施例９＞  直接肝細胞分化
図１７に図式化して示すように、ＨＤＦ、ＨｅＬａ細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞をｌｍＬの分化誘導培地にｌｘｌ０６細胞の密度で集めた後、超音波をｌＷ／ｃｍ２の強度で５秒間処理した後、３５ｍｍのラミニンコーティング培養ディッシュに２ｘｌ０５で分注した後、超音波を１０Ｗ／ｃｍ２の強度で１０分間処理した２ｍＬの肝細胞分化誘導培地において培養した。肝細胞分化誘導培地を用いて分化誘導された細胞をｈ／ＥＮＴＥＲと命名した。
【０１２５】
図１８は、肝細胞分化誘導培地と超音波処理されたＨＤＦの肝細胞（ｈ／ＥＮＴＥＲ）への分化を誘導し、ＨＤＦを分化誘導してから２０日後の細胞の外形の変化を示すものであり、ＨＤＦ分化誘導２０日後に、免疫細胞化学方法によって肝細胞マーカー（ＡＦＰ、ＨＮＦ４ａ、ＣＫ１８、ＡＬＢ）を確認した結果、ｈ／ＥＮＴＥＲ細胞において肝細胞マーカーの発現が確認された。
【０１２６】
次いで、肝細胞分化誘導培地と超音波処理されたＨｅＬａ細胞の肝細胞（ＨｅＬａ  ｈ／ＥＮＴＥＲ）への分化を誘導した。ＨｅＬａ細胞を分化誘導してから１９日後の細胞（ＨｅＬａ  ｈ／ＥＮＴＥＲ）の外形の変化を示すものであり、ＨｅＬａ細胞分化誘導２０日後に（ＨｅＬａ  ｈ／ＥＮＴＥＲ）ｑＰＣＲによって肝細胞マーカー（ＡＬＢ、ＨＮＦ４ａ、ＣＹＰ３Ａ４Ｆ、ＣＹＰ３Ａ７Ｆ、ＡＩＡＴ、ＳＯＸ７、ＧＡＴＡ６）を確認した。
【０１２７】
図１９ａのように、ＨｅＬａ細胞と比較し、分化誘導したＨｅＬａ細胞において肝細胞マーカーのほとんどが増加したことを確認した。
【０１２８】
また、ＨｅＬａ細胞分化誘導３週後に、免疫細胞化学法によって肝細胞マーカー（ＨＮＦ４ａ、ＣＫ１８、ＡＬＢ）を確認した結果、ＨｅＬａ細胞と比較し、分化させたＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ  ｈ／ＥＮＴＥＲ）において肝細胞マーカーの発現が増加することを確認した（図１９ｂ）。
【０１２９】
ＨｅＬａ細胞分化誘導３週後に、免疫細胞化学法によって肝細胞マーカー（ＨＮＦ４ａ、ＣＫ１８、ＡＬＢ）を確認した結果、ＨｅＬａ細胞と比較して、分化させたＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ  ｈ／ＥＮＴＥＲ）において肝細胞マーカーの発現が増加することを確認した（図１９ｃ）。
【０１３０】
次いで、肝細胞分化誘導培地と超音波処理されたＨｅｐ３Ｂ細胞の肝細胞（Ｈｅｐ３Ｂ  ｈ／ＥＮＴＥＲ  ｃｅｌｌ）への分化を誘導した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞を分化誘導してから１９日後の細胞の外形の変化と、Ｈｅｐ３Ｂ細胞分化誘導３週後の免疫細胞化学による肝細胞マーカー（ＨＮＦ４ａ、ＣＫ１８、ＡＬＢ）の発現有無を確認した。
【０１３１】
図２０ｂに示されたように、Ｈｅｐ３Ｂ細胞と比較し、分化させたＨｅｐ３Ｂ細胞（Ｈｅｐ３Ｂ  ｈ／ＥＮＴＥＲ）において肝細胞マーカーの発現が増加することを確認した。
【０１３２】
次いで、ヒトＥＳ培養培地と超音波処理されたＨＤＦのｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞への分化を誘導した。図２１ａは、培養時間に伴う細胞形態の変化を、図２１ｂは、培養時間に伴うＯｃｔ４発現の違いを示す結果であり、ヒトＥＳ培地で分化誘導されてから１日目にスフェロイドが形成され、多能性マーカーであるＯｃｔ４の発現が培養時間に伴い増加した。
【０１３３】
６日間培養されて形成されたスフェロイドを回収し、多能性マーカーの発現をＲＴ−ＰＣＲとＩＣＣを通じて確認した。その結果、ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞において多能性マーカー遺伝子（ａ）およびタンパク質（ｂ）の発現が確認された。
【０１３４】
前記ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞において多能性属性を分析した結果、フローサイトメトリーを用いてｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞のＳＳＥＡ４とＴＲＡ−１−６０の発現を確認し（図２３ａ）、多能性遺伝子発現のパターンをマイクロアレイ（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｃｈｉｐ）で分析した結果、ＨＤＦに比べて、ＥＳ細胞に類似のパターンを示した（図２３ｂ）。なお、バイサルファイトシーケンシングを通じて発現されるＤＮＡ遺伝子における合成が始まるプロモーター部分のメチル化が消去されているか否かを確認した結果、重要な多能性遺伝子Ｏｃｔ４とＮａｎｏｇが開放されていることを確認した。これらの結果から、ヒトＥＳ培地で分化誘導されたｅｓ／ＥＮＴＥＲは、多能性属性を有するということが分かる（図２３ｃ）。
【０１３５】
【表４】
2019508068.tif 000007
【０１３６】
次いで、ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞において分化マーカーを確認した。図２４は、ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞における三胚葉マーカー遺伝子の発現（ａ）とタンパク質発現（ｂ）を示すものであり、図２５は、培養時間別ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞におけるＯｃｔ４と三胚葉マーカー遺伝子発現の変化を示すものであり、図２６は、付着培養されたｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞における三胚葉マーカータンパク質の発現（ａ）およびバイサルファイトシーケンシングを用いたｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の三胚葉マーカーＤＮＡメチル化の分析（ｂ）結果である。
【０１３７】
【表５】
2019508068.tif 000008
2019508068.tif 000009
2019508068.tif 000010
【０１３８】
ｅｓ／ＥＮＴＥＲスフェロイドにおける三胚葉マーカーの発現がＲＴ−ＰＣＲとＩＣＣによって確認され、このような結果は、ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞が多分化分化属性を有することを示す指標である。
【０１３９】
したがって、培養時間に伴う多能性マーカーであるＯｃｔ４の発現パターンを確認した結果、６日後に多能性属性であるＯｃｔ４の発現が減少し、三胚葉マーカーの発現が増加することを確認した。このような結果は、ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の分化が、多能性属性において進められることを示す。そのことから、ｅｓ／ＥＮＴＥＲスフェロイドを付着して２日間培養したスフェロイドから出た細胞が、三胚葉マーカーを発現することが確認され、代表的な三胚葉マーカー遺伝子のＤＮＡメチル化を分析した結果、三胚葉マーカー遺伝子は開放されていることが確認された。
【０１４０】
図２７は、ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の神経細胞（ａ）、心筋細胞（ｂ）および肝細胞（ｃ）へのインビトロ分化実験結果であり、ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞をそれぞれの三種類の胚葉から分化する細胞に分化誘導する培地を用いて４週間分化誘導した結果、神経細胞（外胚葉）、心筋細胞（中胚葉）、肝細胞（内胚葉）に分化誘導され、それぞれの分化マーカーが発現された。
【０１４１】
図２８は、ＨＤＦにおける神経細胞（ａ）、心筋細胞（ｂ）および肝細胞（ｃ）の分化マーカーの発現を確認した結果であり、ＨＤＦにおいては分化マーカーが発現されなかった。
【０１４２】
図２９は、分化誘導されたｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の神経細胞（ａ）、心筋細胞（ｂ）および肝細胞（ｃ）の分化マーカー遺伝子の発現を示すＲＴ−ＰＣＲ分析結果であり、分化誘導されたｅｓ／ＥＮＴＥＲにおける分化マーカー遺伝子の発現が増加した。これらの結果は、ｅｓ／ＥＮＴＥＲの多分化能を証明する結果である。
【０１４３】
図３０は、ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の染色体Ｇ−バンド分析による核型を示す結果であり、ｅｓ／ＥＮＴＥＲの生成に当たって超音波刺激による細胞染色体の突然変異の有無を分析した結果、正常であることが分かった。
【０１４４】
次いで、ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞を５週齢のＳＣＩＤマウスの脚筋肉に移植した後、４週後にＨＮＡを用いて移植した細胞を確認した。
【０１４５】
図３１に示されたように、ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞は、骨格筋肉に分化したことが確認された。なお、移植された細胞におけるＯｃｔ４が発現および増殖されなかったことを確認した。
【０１４６】
次いで、ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞をマウスの脳に移植して、インビボ分化を確認した。
【０１４７】
そのために、ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞を５週齢のＳＣＩＤマウスの脳に移植した後、４週後にＨＮＡを用いて移植した細胞を確認した。
【０１４８】
その結果、ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞は、星状細胞（Ｇｆａｐ）に分化したことが確認され、シナプシンと小胞グルタミン酸輸送体が分泌されることを確認した。このことは、移植された細胞が正常的に分化して機能を果たしていることを意味する。なお、移植された細胞におけるＯｃｔ４が発現されておらず、増殖されていないことを確認した（図３２）。
【０１４９】
次いで、ＭＥＦ（マウス胎児線維芽細胞）も、ＨＤＦと同じ方法であるｈＥＳ培地でｍｏｕｓｅ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞に分化誘導した。今回の実験に用いられたＭＥＦは、ＯＧ２−ＭＥＦであり、Ｏｃｔ４プロモーターをベクターで形質転換させたマウスの胎児線維芽細胞をもって行った。この細胞の場合、Ｏｃｔ４が発現されると、ＧＦＰ蛍光が発現される細胞であり、Ｏｃｔ４の発現を観察するために使用した。
【０１５０】
図３３に示されたように、超音波処理によって誘導された細胞は、時間が経過するに伴い、スフェロイドの数とサイズ並びにＧＦＰ発現が増加された。
【０１５１】
次いで、前記ｍｏｕｓｅ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞における多能性属性を分析した。
【０１５２】
図３４に示されたように、ｍｏｕｓｅ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲのＩＣＣ、ＲＴ−ＰＣＲ、フローサイトメトリー、ＡＰ染色を行った結果、マウスＥＳと類似の傾向を示した。
【０１５３】
次いで、前記ｍｏｕｓｅ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞における三胚葉の特性を分析した。
【０１５４】
実験の結果、ヒトｅｓ／ＥＮＴＥＲにおいて現われた三胚葉属性がｍｏｕｓｅ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞においても現われ、培養時間別ＲＴ−ＰＣＲとＩＣＣ分析により、時間が経過するに伴い、その発現の差が現われた。このような結果は、ヒトｅｓ／ＥＮＴＥＲの結果と同様であった（図３５）。
【０１５５】
図３６は、ｍｏｕｓｅ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲの神経細胞（ａ）と心筋細胞（ｂ）へのインビトロ分化を示し、図３６ｃは、ｍｏｕｓｅ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲの染色体Ｇバンド分析による核型分析結果を示す。核型分析は、ＧＴＧ  ｂａｎｄｉｎｇ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧｅｎＤｉｘ，Ｉｎｃ．；Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を用いて行った。
【０１５６】
実験の結果、ｍｏｕｓｅ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞において神経細胞および心筋細胞分化マーカーをチェックして分化したことが確認され、超音波による染色体変異を核型分析した結果、変異が起きなかったことを確認した。
【０１５７】
＜実施例１０＞  他の細胞を用いたｅｓ／ＥＮＴＥＲの分化誘導実験
このような結果から、ＨＤＦのみならず、他の個体の細胞にもこの方法が適用可能であるという結論を出し、様々な細胞（Ｌ１３２、ＭＳＣ、患者皮膚線維芽細胞）に適用してみた。
【０１５８】
Ｌ１３２（肺上皮細胞）、ＭＳＣ（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；間葉系幹細胞）およびＳｋｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（患者由来の皮膚線維芽細胞）などを用い、ｅｓ／ＥＮＴＥＲと同じ方法で分化を誘導した結果、細胞スフェロイドが形成され、ｅｓ／ＥＮＴＥＲと略同様に、多能性マーカーおよび三胚葉マーカーが発現されることが分かった。
【０１５９】
図３７は、ヒトＥＳ培養培地と超音波刺激によるＬ１３２細胞のＬ１３２  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞への分化を示す結果であり、図３７ａは、培養時間に伴う細胞形態の変化、図３７ｂおよび図３７ｃは、Ｌ１３２  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の多能性（ｂ）および三胚葉（ｃ）属性を示す。
【０１６０】
図３８は、ヒトＥＳ培養培地と超音波刺激によるＭＳＣのＭＳＣ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞への分化を示す結果であり、図３８ａは、培養時間に伴う細胞形態の変化、図３８ｂおよび図３８ｃは、ＭＳＣ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の多能性（ｂ）および三胚葉（ｃ）属性を示す。
【０１６１】
図３９は、ヒトＥＳ培養培地と超音波刺激によるヒト皮膚線維芽細胞のＳＦ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞への分化を示す結果であり、図３９ａは、培養時間に伴う細胞形態の変化、図３９ｂおよび図３９ｃは、ＳＦ  ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の多能性（ｂ）および三胚葉（ｃ）属性を示す。
【０１６２】
＜実施例１１＞  他の物理的刺激を用いたｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞への分化誘導
ヒトＥＳ培養液という同じ培地環境に、今回は分化誘導のための物理的刺激として熱処理（Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）とレーザーを使用した。
【０１６３】
まず、熱処理（Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）とｈＥＳ培地を用い、ＨＤＦのｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の分化を誘導した。熱処理のために、ＨＤＦを４２℃で２分間露出させた後、アイスにおいて約５秒間静置した。図４０ａは、分化誘導されたＨＤＦスフェロイド、図４０ｂおよび図４０ｃは、ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の多能性（ｂ）および三胚葉（ｃ）属性を示す。
【０１６４】
次いで、レーザー刺激とｈＥＳ培地を用いたＨＤＦのｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の分化を誘導した。レーザー処理条件は、Ｏｃｌａ治療用レーザー（Ｎｄｌｕｘ）を用い、８０８ｎｍのレーザーを５秒間照射した後に培養した。図４１ａは、分化誘導されたＨＤＦスフェロイド、図４１ｂおよび図４１ｃは、ｅｓ／ＥＮＴＥＲ細胞の多能性（ｂ）および三胚葉（ｃ）属性を示す。
【０１６５】
図４０および図４１に示されたように、二種類の刺激は両方とも、超音波による効果と類似するように細胞スフェロイドが形成され、多能性および三胚葉マーカーが発現されることを確認した。これらの結果は、培地環境の流入による細胞リプログラミングが様々な細胞に適用可能であり、培地環境と併せて、環境流入のための物理的な刺激もまた、様々な方法が採用可能であることを示し、以前の結果でのように、環境により細胞の属性が変わることがある。
【０１６６】
＜実施例１２＞  細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＥＶｓ）を用いた細胞のリプログラミング
細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したプライマリーＨＤＦを１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）と１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＤＭＥＭにおいて培養し、培養培地に対する超音波処理は、５Ｗ／ｃｍ２、１０分間行い、細胞処理は、ｌｘ１０６のＨＤＦに１Ｗ／ｃｍ２、５秒間処理した後、前記において超音波処理された培養培地とともに３５ｍｍの培養ディッシュに２ｘｌ０５細胞を１日間３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。培養液を回収してアミコンウルトラ遠心式ろ過フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に入れ、１４０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離して培養液内のＥＶｓをフィルターでろ過して回収した。
【０１６７】
次いで、ＨＤＦを培養ディッシュに約７０〜８０％満たされるように培養した後、培養液を回収してＤ−ＰＢＳで２回洗浄した後、胚芽幹細胞培地または神経幹細胞分化培地（Ｇｉｂｃｏ）にそれぞれｅｓ／ＥＮＴＥＲとｎ／ＥＮＴＥＲの１日目の培養培地から回収された１０μｌ／ｍＬ（ｖ／ｖ）の濃縮ＥＶｓを添加した後、前記において洗浄したＨＤＦと混合して３日間培養した。
【０１６８】
＜実施例１３＞  正常体細胞（ＨＤＦ）におけるＥＶｓの伝達実験
ＥＶｓを用いた体細胞のリプログラミングを確認するために、前記実施例１２と同様に、物理的刺激を受けた細胞の１日培養後に得たＥＶｓを濃縮した後、Ｄｉｄ  ｄｙｅを用いてＥＶｓを標識し、正常体細胞に前記ＥＶｓが伝達され、伝達された細胞においてそれぞれの多能性マーカーであるＯｃｔ４と神経幹細胞マーカーであるＰａｘ６の発現を確認した。
【０１６９】
そのために、前記実施例１２において得たＥＶｓ  ５０μｌをＤ−ＰＢＳ４５０μｌと混合して希釈し、ここに２．５μｌのＶｙｂｒａｎｔ  ＤｉＤ  ｃｅｌｌ−ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ、６４４／６６７ｎｍ）を添加して３７℃において３０分間エキソソームを染色した。染色後に、再びアミコンウルトラ遠心式ろ過フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で１４０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離してＤｉｄ染色されたＥＶｓを濃縮した後、Ｄ−ＰＢＳで希釈することを２回繰り返し行った後、３ｍＬのＨＤＦ培養液（５％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）培養液）に添加した後、３７℃、５％ＣＯ２において２４時間培養した。２４時間培養されたＨＤＦを４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、０．２％トリトンＸ１００  ｉｎ  ＰＢＳバッファーで１０分間透過させた。次いで、３％ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳバッファーで１時間ブロッキングした後、１次抗体であるウサギ−抗−Ｏｃｔ４（１：２５０、ａｂｅａｍ）とＰａｘ６（ｌ：２００、ａｂｅａｍ）で４℃において一晩中染色した後、２次抗体である抗−ウサギ共役Ａｌｅｘａ−４８８（１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ、４９５／５１９ｎｍ）を１時間かけて染色した。２次抗体が染色されたサンプルをＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ、４２０／４８０ｎｍ）入りマウンティング溶液を用いて共焦点レーザー顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌｌａｓｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＬＳＭ７００；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）画像を分析し、図４２にその結果を示した。同図において、緑色は、Ｏｃｔ４であり、赤色は、Ｄｉｄ  ｄｙｅで染色されたＥＶｓである。
【０１７０】
図４２に示されたように、物理的刺激を与えた後に細胞から分泌されるＥＶｓは、細胞培地環境に応じて様々な多能性マーカーの遺伝子およびタンパク質を含んでいることが確認され、これらの因子は、ＥＶｓにより隣り合う細胞に伝達され得ることが確認された。前記結果は、様々な培地環境において物理的刺激を受けた細胞から分泌されたＥＶｓは、正常体細胞のリプログラミングを誘導する可能性があることを示唆する。
【０１７１】
＜実施例１４＞  ＥＶｓによるヒト線維芽細胞のリプログラミング効果
前記実施例１３において様々な培地環境において物理的刺激を受けた細胞から分泌されたＥＶｓは、正常体細胞のリプログラミングを誘導する可能性があるため、これを検証するために、ヒト線維芽細胞培養培地であるＤＭＥＭ培地とヒト胚芽幹細胞またはｉＰＳ細胞の培養培地であるｈＥＳＣ培地とを用いて実験した。対照群は、ＥＶｓが添加されていない各培地において３日間培養し、処理群は、各培地に１０μｌ／ｍＬ（ｖ／ｖ）のＥＶｓを添加して３日間培養した。
【０１７２】
培養された細胞は、前記実施例１３と同様に、１次抗体としてウサギ−抗−Ｏｃｔ４（１：２５０、ａｂｅａｍ）、２次抗体として抗−ウサギ共役Ａｌｅｘａ−４８８（１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ、４９５／５１９ｎｍ）を用いて染色し、ＤＡＰＩ入りマウンティング溶液でマウンティングした後、共焦点レーザー顕微鏡で画像を分析して図４３に示した。同図において、ｈＥＳＣは、ｈｕｍａｎ  ＥＳＣ培地を示し、ＤＭＥＭは、線維芽細胞培養培地を示し、ＥＶｓは、ｅｓ／ＥＮＴＥＲの誘導の際に回収したＥＶｓを示す。
【０１７３】
図４３に示されたように、対照群においてはＯｃｔ４の発現が観察されなかったが、処理群においてはＯｃｔ４の発現および細胞がスフェロイドを形成する現象が観察された。前記結果は、細胞リプログラミングが培養培地による影響ではなく、単にＥＶｓにより誘導されたことを示す。
【０１７４】
＜実施例１５＞  ＥＶｓ処理されたヒト線維芽細胞の培養時間別の細胞形態の変化
ｅｓ／ＥＮＴＥＲの誘導の際に回収した１０μｌ／ｍＬ（ｖ／ｖ）のＥＶｓをヒト線維芽細胞に処理した後、６日間培養して細胞形態の変化を観察した。
【０１７５】
図４４に示されたように、培養時間の経過に伴い細胞の形態が変化しており、３日目にスフェロイドが形成されることを観察した。
【０１７６】
＜実施例１６＞  ｅｓ／ＥＮＴＥＲの誘導の際に回収したＥＶｓの添加量に応じた６日間培養されたＨＤＦの多能性マーカーの発現に対する確認実験
細胞リプログラミングのための適正なＥＶｓの濃度を調べるために、ＥＶｓの添加量を相違させてＨＤＦに処理し、６日間培養した。また、ｅｓ／ＥＮＴＥＲの誘導の際に回収したＥＶｓを用いるため、多能性マーカーであるＯｃｔ４が発現される細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【０１７７】
そのために、ｅｓ／ＥＮＴＥＲの誘導の際に回収したＥＶｓを線維芽細胞の培養に際してそれぞれ０、５、１２．５、２５、５０および１００μｌ／ｍＬ（ｖ／ｖ）の濃度で添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６日間培養した。培養された細胞は、前記実施例１３と同様に、１次抗体としてウサギ−抗−Ｏｃｔ４（１：２５０、ａｂｅａｍ）、２次抗体として抗−ウサギ共役Ａｌｅｘａ−４８８（１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ、４９５／５１９ｎｍ）を用いて染色し、ＢＤＡ  ｃｃｕｒｉＴＭ  Ｃ６フローサイトメトリー（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【０１７８】
図４５に示されたように、１２．５μｌ／ｍＬ（ｖ／ｖ）のＥＶｓを処理したときに、最も多い８４．６％の細胞においてＯｃｔ４の発現が確認された。
【０１７９】
＜実施例１７＞  ｅｓ／ＥＮＴＥＲの誘導の際に回収した、ＥＶｓ処理された３日間培養ＨＤＦにおける多能性マーカーの発現に対する確認実験
ｅｓ／ＥＮＴＥＲの誘導の際に回収した１０μｌ／ｍＬ（ｖ／ｖ）のＥＶｓをヒト線維芽細胞に処理した後、３日間培養して細胞リプログラミング効果を確認した。培養された細胞は、ＩＣＣ分析のために、前記実施例１３と同様に、１次抗体としてウサギ−抗−Ｏｃｔ４（１：２５０、ａｂｅａｍ）、Ｓｏｘ２（１：２５０、ａｂｅａｍ）およびＮａｎｏｇ（１：２５０、ａｂｅａｍ）、２次抗体として抗−ウサギ共役Ａｌｅｘａ−４８８（１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ、４９５／５１９ｎｍ）を用い、ＤＡＰＩ入りマウンティング溶液でマウンティングした後、共焦点レーザー顕微鏡で画像を分析した。ｑＰＣＲ分析は、３日間培養された細胞からトリゾール（Ｔａｋａｒａ）を用いてすべてのＲＮＡを回収した後、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐ  ２  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でｃＤＮＡを合成して行った。ＰＣＲ分析は、多能性マーカーであるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇに対してリアルタイムＰＣＲ機器（ａｂ  ｓｔｅｐ  ｏｎｅ  ｐｌｕｓ、ＡＢ）で分析した。
【０１８０】
図４６に示されたように、ＩＣＣ分析を行った結果、ヒト線維芽細胞核において多能性マーカーであるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇの発現が観察され、遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲでｑＰＣＲ分析した結果、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇ遺伝子は、ＥＶｓ処理されていない正常線維芽細胞に比べて約５０倍程度過発現された。
【０１８１】
＜実施例１８＞  ｎ／ＥＮＴＥＲの誘導の際に回収した、ＥＶｓ処理された３日間培養ＨＤＦにおける神経幹細胞マーカーの発現に対する確認実験
ｎ／ＥＮＴＥＲの誘導の際に回収した１０μｌ／ｍＬ（ｖ／ｖ）のＥＶｓをヒト線維芽細胞に処理した後、３日間培養して細胞リプログラミング効果を確認した。培養された細胞は、ＩＣＣ分析のために、前記実施例１３と同様に、１次抗体としてウサギ−抗−Ｓｏｘ１（ｌ：２００、ａｂｅａｍ）、Ｓｏｘ２（１：２５０、ａｂｅａｍ）、Ｐａｘ６（１：２００、ａｂｅａｍ）およびマウス−抗−Ｎｅｓｔｉｎ（１：２５０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２次抗体として抗−ウサギ共役Ａｌｅｘａ−４８８（１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ、４９５／５１９ｎｍ）および抗−マウス共役Ａｌｅｘａ−５９４（１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ、ａｌｅｘａ４８８  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ、４９５／５１９ｎｍ；ａｌｅｘａ５９４  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ、５９０／６１７ｎｍ）を用い、ＤＡＰＩ入りマウンティング溶液でマウンティングした後、共焦点レーザー顕微鏡で画像を分析した。ｑＰＣＲ分析は、３日間培養された細胞からトリゾール（Ｔａｋａｒａ）を用いてすべてのＲＮＡを回収した後、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐ  ２  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でｃＤＮＡを合成して行った。ＰＣＲ分析は、神経幹細胞マーカーであるＳｏｘ１、Ｓｏｘ２およびＮｅｓｔｉｎに対してリアルタイムＰＣＲ機器（ａｂ  ｓｔｅｐ  ｏｎｅ  ｐｌｕｓ、ＡＢ）で分析した。
【０１８２】
図４７に示されたように、ＩＣＣ分析により、ヒト線維芽細胞核において神経幹細胞マーカーであるＳｏｘ１、Ｓｏｘ２およびＰａｘ６の発現が観察され、細胞質においてＮｅｓｔｉｎの発現が観察された。遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲでｑＰＣＲ分析した結果、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６およびＮｅｓｔｉｎ遺伝子は、ＥＶｓ処理されていない正常線維芽細胞に比べて約２００倍程度過発現された。
【０１８３】
【表６】
2019508068.tif 000011
【産業上の利用可能性】
【０１８４】
本発明は、細胞治療剤分野において使用され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【国際調査報告】
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