(57)【要約】新しいミトコンドリアペプチドの産生をもたらす、ミトコンドリアにコードされる新規のオープンリーディングフレームが、本明細書に記載されている。ＮＤ２サブユニット内に存在する特定の一塩基多型が、このミトコンドリアペプチドの発現を妨害し、特に特定の民族集団において、肥満及び糖尿病の増加と相関する。このペプチドのインビトロ投与は、インスリン分泌を増加させ、脂肪蓄積を低減させ、筋細胞におけるグルコースの取り込みを改善する。このペプチドに対して作製された抗体は、ＳＮＰ検出に加えて、ペプチドの欠乏を検出するために使用することができ、診断アプローチを支援する。インビボ研究により、このペプチドの投与が、耐糖能を改善し、その結果、新規の糖尿病療法のための新規治療手段を提供し、さらに体重を低下させるため、新規の肥満療法として役立つことがさらに明らかになった。合成類似体の生成はさらに、天然のペプチドと比較して、活性を増強または抑制した。2019524666.tif 000025
2019524666.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリアペプチドを含む、組成物。
【請求項２】
前記ミトコンドリアペプチドは、アミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７］を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ミトコンドリアペプチドは、［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７］に対して約２５％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、またはそれより高い同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ミトコンドリアペプチドは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４アミノ酸長である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ミトコンドリアペプチドは、翻訳後修飾または人工的な修飾を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記人工的な修飾は、ペグ化、脂肪酸コンジュゲーション、ポリペプチド伸長、ＩｇＧ−Ｆｃ、ＣＰＴ、ＨＳＡ、ＥＬＰ、トランスフェリン、またはアルブミン修飾を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
疾患及び／または状態を処置する方法であって、前記方法は、
処置を必要とする対象を選択することと、
ある量のミトコンドリアペプチドを、処置を必要とする対象に投与することと、
を含み、前記ミトコンドリアペプチドは、前記疾患及び／または状態を処置することができる、前記方法。
【請求項８】
前記ミトコンドリアペプチドは、アミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７］を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ミトコンドリアペプチドは、［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７］に対して約２５％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、またはそれより高い同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ミトコンドリアペプチドは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４アミノ酸長である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記疾患及び／または状態は、血中インスリンレベルの低下及び／または膵島β細胞の数の減少もしくは機能の低下によって特徴づけられる疾患及び／または状態を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記疾患及び／または状態は、１型及び２型糖尿病、妊娠糖尿病、前糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、耐糖能障害、ならびに脂質異常症を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患及び／または状態は、網膜症、ニューロパチー、腎疾患をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記疾患及び／または状態は、肥満または過体重を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象は、ヒスパニック系である、請求項７、１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象は、ＳＮＰ  Ｒｓ２８３５７９８１の保有者である、請求項７、１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象は、糖尿病及び／または肥満ではない健康な正常対象と比較して低量の、生物学的サンプル中で測定される［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７］を発現する、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
個体を疾患及び／または状態に関して診断する方法であって、
対象を選択することと、
１つ以上のバイオマーカーの有無または発現レベルを検出することと、
前記１つ以上のバイオマーカーの有無または発現レベルに基づいて前記対象を疾患及び／または状態に関して診断することと
を含む、前記方法。
【請求項１９】
前記１つ以上のバイオマーカーは、配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７］のペプチドを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記有無または発現レベルの検出は、イムノアッセイを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上のバイオマーカーは、ＳＮＰ  Ｒｓ２８３５７９８１を含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
糖尿病、肥満、及び脂質異常症などの代謝関連疾患、ならびに合併症の処置において使用するためのミトコンドリアペプチドに関する方法及び組成物が本明細書に記載されている。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、継続した病理学的に高い血糖濃度と関連づけられている。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎによると、この疾患は、毎年何千人もの死と年間２００億ドルを超えるコストをもたらす。糖尿病の人々の数が２０３０年までに４億４千万人にまで増加することが予想され、こうした人々に対する処置の選択肢は限定的であり不十分な場合が多い。
【０００３】
糖尿病を処置するために使用される薬剤は、血糖レベルを低下させることによって処置する。多くのさまざまなクラスの抗糖尿薬物が存在する。インスリン、スルホニル尿素、及びグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体作動薬が、米国において現在処方されている主要なクラスの糖尿病薬である。インスリンは、１型糖尿病及び２型糖尿病の両方に処方される一方で、スルホニル尿素及びＧＬＰ−１作動薬は、通常、２型糖尿病患者に対して処方される。スルホニル尿素及びＧＬＰ−１作動薬は、本来のインスリン分泌を刺激し、インスリン抵抗性を低減させることができるが、これらの化合物が代謝におけるインスリンの働きに取って代わることはない。多くの抗糖尿病剤はまた、体重を増加させる望ましくない副作用を有する。糖尿病の患者の体重増加は、代謝及び内分泌調節不全を強めるため悪影響をもたらす。これは、実際に糖尿病の進行性悪化に対するリスク因子である可能性がある。当該技術分野において、持続的な効果があり、望ましくない副作用のない、糖尿病に対する治療的介入が大いに必要とされている。
【０００４】
ミトコンドリアペプチドは、ヒト疾患の処置に関する新規のクラスの分子である。現在、ミトコンドリアがエネルギーの産生及び細胞死の調節において重要な作用物であることは十分に確立されている。ミトコンドリアは、核ゲノムにコードされているかまたはミトコンドリア代謝の二次産物である逆行性シグナルにより細胞へ戻る情報伝達を行う。さらに最近、こうした調節プロセスにおける重要な作用物としてミトコンドリアゲノムによってコードされているミトコンドリア由来ペプチドが特定された。ミトコンドリア由来の逆行性シグナルペプチドが、ヒト疾患を処置するのに治療効果のある及び診断に役立つ遺伝子及びペプチドの特定に役立つであろうことが広く信じられている。
【０００５】
新規のミトコンドリアペプチドを使用した処置のための方法及び組成物が本明細書に記載されている。ゲノムの広範な精査により特定された、新規のミトコンドリアペプチドと関連するＳＮＰ変異が、肥満及び糖尿病と関連づけられている。当該ペプチドの投与は、インスリン分泌を増加させ、脂肪蓄積を低減させ、筋細胞におけるグルコースの取り込みを改善する。重要なことに、当該ミトコンドリアペプチドの投与は、高脂肪食／「西洋」食を与えられたマウスの耐糖能を改善するために新規の糖尿病療法として役立ち、高脂肪食を与えられたマウスの体重を低下させるために新規の肥満療法として役立つ。
【発明の概要】
【０００６】
ミトコンドリアペプチドを含む組成物が本明細書に記載されている。さまざまな実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、アミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７］を含む。さまざまな実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７］に対して約２５％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、またはそれより高い同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列を含む。さまざまな実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４アミノ酸長である。さまざまな実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、翻訳後修飾または人工的な修飾を有する。さまざまな実施形態において、人工的な修飾としては、ペグ化、脂肪酸コンジュゲーション、ポリペプチド伸長、ＩｇＧ−Ｆｃ、ＣＰＴ、ＨＳＡ、ＥＬＰ、トランスフェリン、またはアルブミン修飾が挙げられる。
【０００７】
疾患及び／または状態を処置する方法であって、処置を必要とする対象を選択することと、ある量のミトコンドリアペプチドを、処置を必要とする対象に投与することとを含み、当該ミトコンドリアペプチドは疾患及び／または状態を処置することができる、方法が本明細書にさらに記載されている。さまざまな実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、アミノ酸配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７］を含む。さまざまな実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７］に対して約２５％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、またはそれより高い同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列を含む。さまざまな実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４アミノ酸長である。さまざまな実施形態において、疾患及び／または状態としては、血中インスリンレベルの低下及び／または膵島β細胞の数の減少もしくは機能の低下によって特徴づけられる疾患及び／または状態が挙げられる。さまざまな実施形態において、疾患及び／または状態としては、１型及び２型糖尿病、妊娠糖尿病、前糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、耐糖能障害、ならびに脂質異常症が挙げられる。
【０００８】
さまざまな実施形態において、疾患及び／または状態としては、網膜症、ニューロパチー、腎疾患がさらに挙げられる。さまざまな実施形態において、疾患及び／または状態としては、肥満または過体重が挙げられる。さまざまな実施形態において、対象は、ヒスパニック系である。さまざまな実施形態において、対象は、ＳＮＰ  Ｒｓ２８３５７９８１の保有者である。さまざまな実施形態において、対象は、糖尿病及び／または肥満ではない健康な正常対象と比較して低量の、生物学的サンプル中で測定される［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７］を発現する。
【０００９】
個体を疾患及び／または状態に関して診断する方法であって、対象を選択することと、１つ以上のバイオマーカーの有無または発現レベルを検出することと、１つ以上のバイオマーカーの有無または発現レベルに基づいて、対象を疾患及び／または状態に関して診断することとを含む方法が本明細書にさらに記載されている。さまざまな実施形態において、１つ以上のバイオマーカーは、配列［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７］のペプチドを含む。さまざまな実施形態において、有無または発現レベルの検出は、イムノアッセイを含む。さまざまな実施形態において、１つ以上のバイオマーカーは、ＳＮＰ  Ｒｓ２８３５７９８１を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
参照される図に例となる実施形態が示されている。本明細書において開示されている実施形態及び図は、限定ではなく説明のためのものであると見なされるべきであることが意図される。
【００１１】
【図１】ミトコンドリアバリアントとグリコヘモグロビンとの間の関連性を調べるための９，８２５人のＨＲＳ参加者に対するＧＷＡＳ。ＧＷＡＳを、マイナー対立遺伝子頻度＞０．０１の６８のミトコンドリアＳＮＰに対して行った。モデルを、年齢及び集団の構造化に関して調整した（最初の４つの固有値）。多重検定に対して調整した後、１つのＳＮＰ（ＭｉｔｏＴ４９７８Ｃ）がＨｂＡ１ｃと有意に関連し得ることがわかった（Ｐ＝４．９Ｅ−０４、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  Ｐ＝．０３）。結果は、ＳＮＰが糖尿病のリスクの３８％の増加と関連していることを示していた。このＳＮＰは、ヒスパニック系と自己認識している参加者において、はるかに多く見られる（ＭＡＦヒスパニック系＝１８．６５対ＭＡＦ非ヒスパニック系＝０．２７）。
【図２】ＭｉｔｏＴ４９７８ＣとＢＭＩカテゴリーとの間の相互作用。ＢＭＩによるＭｉｔｏＴ４９７８ＣとＨｂ１ａｃとの間の関連性は、有意なＳＮＰ×ＢＭＩ相互作用を発見した。結果は、ＢＭＩが増加すると、ＨｂＡ１ｃに対するＳＮＰの影響が増加することを示していた。
【図３】ＭＥＮＴＳＨの欠乏は、肥満と相乗作用を示して、糖尿病を引き起こす。
【図４】ＭＥＮＴＳＨ核酸配列及びペプチドアミノ酸配列。ＳＮＰ  Ｒｓ２８３５７９８１は、ＮＤ２遺伝子内のＭＤＰ（ミトコンドリア由来ペプチド）をコードするオープンリーディングフレーム内にある。ＮＤ２発現には影響を及ぼさないが、「Ｃ」変異を有するこのＳＮＰの存在は、ミトコンドリア転写プロセシングの多シストロン性構造に基づいてＭＥＮＴＳＨペプチドの開始コドンを壊す。ミトコンドリアでは、ヌクレオチドＡＴＴは、開始コドンを始めることができる。このＳＮＰは、ＡＴＴをＡＣＴに変え、これは、もはや開始コドンとして働かず、タンパク質が産生されない。
【図５】ＭＥＮＴＳＨは、ｉｎｓ−１細胞におけるインスリン分泌を増加させる。ＭＥＮＴＳＨペプチドのラット膵臓ｉｎｓ−１細胞への投与は、未処置細胞と比較して、統計学的に有意な様式でインスリン分泌を増加させることができ、グルコース添加がある場合にインスリン分泌をさらに増加させることができた。
【図６】ＭＥＮＴＳＨは、インビトロにおいて３Ｔ３脂肪細胞における脂肪蓄積を低減させる。
【図７】ＭＥＮＴＳＨは、細胞特異的な様式でシグナル伝達を急速に活性化する。ＭＥＮＴＳＨに関するこれらの観察される効果は、部分的に細胞特異的な様式のＡｋｔシグナル伝達のためのようである。具体的には、分化３Ｔ３脂肪細胞ではリン酸化Ａｋｔの増加が観察されたが、分化Ｌ６筋細胞では観察されなかった。
【図８】ＭＥＮＴＳＨは、高脂肪食（ＨＦＤ）を与えられたマウスにおいてのみ体重増加を低減させる。ＭＥＮＴＳＨが、高脂肪食を与えられたマウスの体重増加を最も劇的に低減させることが観察され、その結果、抗肥満効果に関係する。
【図９】ＭＥＮＴＳＨは、高脂肪食または飼料に対する摂食量を変化させない。
【図１０】ＭＥＮＴＳＨは、通常の飼料で飼育されたマウスの体重及び摂食量を変化させない。
【図１１】ＭＥＮＴＳＨは、ＨＦＤで飼育されたマウスのインスリン感受性及びインスリンレベルを改善する。
【図１２】ＭＥＮＴＳＨは、ＨＦＤで飼育されたマウスのグルカゴンレベルを低下させる。
【図１３】ＨＦＤに対するグルコース応答を改善する。
【図１４】血漿のメタボロミクスが脂肪利用の増加を示唆する。脂質使用に利用される代謝産物の血中レベルの低下は、細胞内における脂質使用のレベルの増加を示唆する。
【図１５】ＭＥＮＴＳＨは、３Ｔ３／前駆脂肪細胞における生物活性を高める。
【図１６】３Ｔ３／前駆脂肪細胞におけるインビトロの類似体スクリーニング。表１に挙げられているＭＥＮＴＳＨ類似体に基づく。図に示すように、修飾は、ＭＥＮＴＳＨ活性を劇的に増強することができ、さらに抑制することもできる。
【図１７】ＭＥＮＴＳＨは、ＨＥＫ２９３細胞における生物活性を低下させる。
【図１８】インビトロにおける類似体スクリーニング。
【図１９】ＭＥＮＴＳＨのｍＲＮＡ及びペプチドの検出ならびにマウスにおける注射されたペプチドの薬物動態。ノーザンブロットハイブリダイゼーションは、ミトコンドリアｍＲＮＡにおけるＭＥＮＴＳＨ転写物の存在を特定した。本発明者らによって開発されたＭＥＮＴＳＨの検出のためのＥＬＩＳＡアッセイは、ＭＥＮＴＳＨの比較的短い持続性（例えば、約１時間）を明らかにした。
【図２０】３Ｔ３／前駆脂肪細胞におけるインビトロの類似体スクリーニング。
【図２１】ＨＥＫ２９３細胞におけるインビトロの類似体スクリーニング。
【図２２】ＨｅｐＧ２細胞におけるコレステロールレベル。ヒト、肝臓細胞株において、ＭＥＮＴＳＨによる処置は、処置（１０μＭ）の４８時間以内に全細胞のコレステロールレベルを低下させた。
【図２３】肥満マウスにおけるコレステロールレベル。食餌により引き起こされた肥満のマウスにおいて、コレステロールレベルが、ＭＥＮＴＳＨ処置（２．５ｍｇ／ｋｇ  ｂｉｄ）の７２時間以内に低下した。
【図２４】マウス脂肪細胞株におけるインビトロの類似体スクリーニング。マウス脂肪細胞株に対するＭＥＮＴＳＨ類似体の処置は、５００％を超える効力を有する多くの改善された類似体ならびに脂肪細胞に対して反対の効果を引き起こしたいくつかの新規のＭＥＮＴＳＨアンタゴニストを発見した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本明細書中で引用されるすべての参考文献は、完全に記載されているかのようにその全体が参照により組み込まれる。別に定義されない限り、本明細書中で使用される技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １５，  ２０１２）；Ｈｏｒｎｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  （２００８）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，  Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  ２００６）；Ｓｍｉｔｈ，  Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ７ｔｈ  ｅｄ．，  Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  ２０１３）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２８，  ２０１２）；及びＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  ２０１２）は、本出願において使用される多くの用語に対する一般的指針を当業者に提供する。抗体を作製する方法に関する参考文献に関して、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ，  ２０１３）；Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９７６  Ｊｕｌ，  ６（７）：５１１−９；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｉｃｋ，  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５８５，０８９  （１９９６  Ｄｅｃ）；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８８  Ｍａｒ  ２４，  ３３２（６１６２）：３２３−７を参照されたい。
【００１３】
当業者は、本発明の実施に使用できるであろう本明細書に記載されているものと類似または等価の多くの方法及び材料を認識するであろう。実際に、本発明は決して、本明細書に記載されている方法に限定されない。本発明のために、以下の用語を下に定義する。
【００１４】
「投与すること」及び／または「投与する」は、本明細書中で使用される場合、医薬組成物を患者に送達するための任意の経路を指す。送達の経路としては、非侵襲的経口経路（口を介して）、局所経路（皮膚）、経粘膜経路（経鼻、頬側／舌下、経膣、眼及び直腸）及び吸入経路、ならびに非経口経路、及び当該技術分野において既知のその他の方法を挙げることができる。非経口とは、眼窩内、注入、動脈内、頚動脈内、関節内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、くも膜下、嚢下、皮下、経粘膜、または経気管を含む注射と一般に関連する送達の経路を指す。非経口経路を介する組成物は、注入のためまたは注射のための溶液または懸濁液の形態であってもよく、あるいは凍結乾燥粉末としてであってもよい。
【００１５】
「調節」または「調節する」または「調節すること」とは、本明細書中で使用される場合、応答のアップレギュレーション（すなわち、活性化もしくは刺激）、ダウンレギュレーション（すなわち、阻害もしくは抑制）あるいは組み合わせてまたは別々にその２つを指す。
【００１６】
「薬学的に許容される担体」とは、本明細書中で使用される場合、本発明に有用な従来の薬学的に許容される担体を指す。
【００１７】
「促進する」及び／または「促進すること」とは、本明細書中で使用される場合、細胞または生物の特定の挙動の増大を指す。
【００１８】
「対象」とは、本明細書中で使用される場合、伴侶動物、家畜及び動物園の動物を含むが、それらに限定されない哺乳動物ならびにその他の動物を含むあらゆる動物を含む。「動物」という用語は、あらゆる生きた多細胞脊椎動物、例えば、哺乳動物、トリ、類人猿、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、齧歯類などを含むカテゴリーを含むことが可能である。同様に、「哺乳動物」という用語は、ヒト及び非ヒト哺乳動物の両方を含む。
【００１９】
「治療有効量」とは、本明細書中で使用される場合、処置される対象において所望の効果を実現するのに十分な特定の組成物の量、または当該組成物中の活性剤の量を指す。治療有効量は、対象の生理的状態（年齢、性別、疾患のタイプ及びステージ、全身の健康状態、所与の投与量に対する反応性、所望の臨床効果を含む）及び投与経路を含むが、これらに限定されないさまざまな要因に応じて変化することがある。臨床分野及び薬理学分野の当業者は、通常の実験により治療有効量を決定することができるであろう。
【００２０】
「処置する」、「処置すること」及び「処置」とは、本明細書中で使用される場合、治療的処置及び予防的または防止的な措置の両方を指し、この目的は、処置が最終的にうまくいかない場合であっても標的とする状態、疾患または障害（まとめて「病気」）を予防するか、または遅延させる（和らげる）ことである。処置を必要とするものとしては、既に病気を有するものならびに病気を有しやすいものまたは病気が予防されるべきものを挙げることができる。
【００２１】
記載されているとおり、ミトコンドリアは、とりわけ、エネルギー産生、プログラム細胞死（アポトーシス）の調節、及び生合成前駆体産生を含む非常に重要な細胞活動に関与する。最近まで、どのようにミトコンドリアが情報を宿主細胞に伝達するかについてほとんど理解されていなかった。細胞内プロセス及び細胞運命を調節するために、これらのプロセスに光を当てる、ミトコンドリアによって運搬される新規のクラスの情報伝達が示された。現在、ミトコンドリアは、もはや「終了機能」細胞小器官ではなく、細胞の調節プロセスにおいて生命維持の役割を持つことがさらに良く理解されている。具体的には、ミトコンドリアは、核ゲノムにコードされているか、ミトコンドリア代謝の二次産物であるか、または、さらに最近発見されたように、ミトコンドリアゲノムによってコードされている逆行性シグナルにより細胞に戻る情報伝達を行う。後者の例として、推定上の一連のミトコンドリア由来ペプチドの最初の小ペプチドであるヒューマニンは、さまざまなストレス及び疾患モデルに対する強い細胞保護作用を示すことが報告された。この新規のクラスの分子の特徴及び能力を活用することにより、新しい診断及び治療方法が可能になる。
【００２２】
ミトコンドリアにコードされる新規のオープンリーディングフレームが本明細書に記載されており、これが、ＭＥＮＴＳＨ（ヒトのＮＤ２サブユニットにコードされているミトコンドリア由来ペプチド）と呼ばれる新しいポリペプチドの産生をもたらす。ＭＥＮＴＳＨ及びその類似体は、新しいクラスのミトコンドリア由来ペプチドであり、これは、糖尿病及び肥満を含むヒト疾患の処置において治療効果のある及び診断に役立つ可能性のある遺伝子及びペプチドの特定に役立つであろう。ミトコンドリアエンコードＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ２は、ヒトではミトコンドリア遺伝子ＭＴ−ＮＤ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＮＤ２タンパク質は、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）のサブユニットであり、ミトコンドリア内膜に位置する。電子伝達系の５つの複合体の最大のものであるため、ＭＴ−ＮＤ２のバリアントの結果として生じるミトコンドリア機能不全は、成人のボディマスインデックス（ＢＭＩ）と関連し、肥満、糖尿病及び高血圧を含む代謝障害に関係している。
【００２３】
ミトコンドリア由来ペプチド（ＭＤＰ）。  これらのペプチドは、逆行性ミトコンドリアシグナル伝達ならびにミトコンドリア遺伝子発現における重要な因子である。ヒト核ゲノムと比較して、ミトコンドリアは、約１６，５７０ｂｐの中程度の大きさの環状ゲノムを有し、これは表面上は１３個のタンパク質コード遺伝子のみを含み、これらが電子伝達系のすべての構造的構成要素である。
【００２４】
ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の複製及び転写開始は、核にコードされるタンパク質によって調節され、戦略的に配置された２２種のｔＲＮＡを切断することによって個々の遺伝子にプロセシング（ｔＲＮＡ中断モデル）されて２種のｒＲＮＡ及び１３種のｍＲＮＡを生じる単一の多シストロン性前駆体として転写されると考えられている。
【００２５】
ヒトのミトコンドリアは、重鎖に近接する２つのプロモーター（メジャー及びマイナー）、及び軽鎖に１つのプロモーターを有し、それにより３つの異なる単一の多シストロン性転写物を生じる。重鎖メジャープロモーターは、すべてのミトコンドリアＲＮＡ（ｍｔＲＮＡ）転写の８０％に関与する。全遺伝子が単一の転写物として転写されると考えられているが、個々のｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ転写物の存在量は大きく異なり、ｒＲＮＡが最も豊富である。このプロセシング構造は、ミトコンドリアにおける調査されていないクラスの転写後プロセシングを示す。
【００２６】
重要なことに、ミトコンドリアから特定された多くのｍＲＮＡ種は、個別の短い長さのものであり、これは、従来のミトコンドリアタンパク質コード遺伝子には位置しない。例えば、複数のそのようなｍＲＮＡが１６Ｓ  ｒＲＮＡから確認されている。ＲＮＡ末端の並行解析（ＰＡＲＥ）は、極めて多くの予想切断部位を明らかにし、ミトコンドリアに関する予想外の切断部位が発見された。大半のｔＲＮＡ及びｍＲＮＡは、個別の主要な切断部位を５’末端に有するが、遺伝子内切断部位は特にｒＲＮＡに豊富である。特に、多シストロン性ｍＲＮＡの短いオープンリーディングフレーム（ｓＯＲＦ）によってコードされる１１〜３２アミノ酸長の生物学的に活性なペプチドを示す小ペプチドの新興分野からの説得力のある証拠が存在する。
【００２７】
ミトコンドリアは、核ミトコンドリアＤＮＡ転移プロセスまたはミトコンドリア由来の核挿入物（ＮＵＭＴ）によりミトコンドリアのゲノムを宿主の核に移し、染色体の「分身」を残すと考えられている。ＮＵＭＴは、元の配列とのさまざまな程度の相同性を有するｍｔＤＮＡのすべての部分からさまざまな大きさで到来する。全ｍｔＤＮＡを核ゲノム中に見出すことができるが、大半の場合、大幅な配列変性を有する。大半のＮＵＭＴは、＜５００ｂｐの小さな挿入物であり、わずか１２．８５％が＞１５００ｂｐである。同一性パーセンテージは、大きさと逆の相関関係があり、ＮＵＭＴとｍｔＤＮＡとの間の平均パーセンテージは７９．２％であり、６３．５％から１００％の同一性の範囲を有する。
【００２８】
糖尿病。  糖尿病は、継続した病理学的に高い血糖濃度と関連する。糖尿病は、２つの主要なサブクラス：１型（Ｉ型、若年性糖尿病、またはインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）としても知られている）及び２型（ＩＩ型、成人発症型糖尿病、またはインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）としても知られている）に分けられる。
【００２９】
正常で健康な対象では、ヒト血流中のグルコース濃度は、比較的狭い範囲内（血液１デシリットル当たり６０〜１２０ミリグラム）に制御されている。過剰な血糖、または高血糖は、過剰なグルコースの存在ならびに細胞、組織、及び臓器におけるタンパク質への蓄積付着のために、最終的に組織損傷を引き起こすことがある。この損傷が、失明、腎不全、インポテンツ、アテローム動脈硬化症、及び感染症に対する脆弱性の増加の、糖尿病合併症を引き起こすと考えられている。
【００３０】
糖尿病は、通常、体重減少と同時に起こることが多い過剰な排尿または過剰な口渇の発症後に診断される。一般に、前糖尿病の個人は、１１０ｍｇ／ｄｌを超えるが１２６ｍｇ／ｄｌ未満の空腹時血糖レベルまたは１４０ｍｇ／ｄｌを超えるが２００ｍｇ／ｄｌ未満の２時間ＰＧ測定値を有する成人を指す。糖尿病の個人は、１２６ｍｇ／ｄｌを超える空腹時血糖レベルまたは２００ｍｇ／ｄｌを超える２時間ＰＧ測定値を有することになる。耐糖能障害は、糖尿病の診断に必要とされる空腹時血糖レベルより低い空腹時血糖レベルを有するが、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）の過程において正常と糖尿病との間の血漿グルコース応答を有する個人において診断される。耐糖能障害は、前糖尿病状態と見なされ、ＩＩ型糖尿病の発症についての有力な予測因子である。
【００３１】
糖尿病を発症するリスクがある個人における初期の介入は、病理学的な高血糖または耐糖能障害を低減させて、糖尿病及び関連合併症への進行を予防するかまたは遅延させることに焦点を当てている。インスリン、スルホニル尿素、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体作動薬は、米国において現在処方されている主要なクラスの糖尿病薬である。インスリンは、１型糖尿病及び２型糖尿病の両方に処方される一方で、スルホニル尿素及びＧＬＰ−１作動薬は、通常、２型糖尿病患者に対して処方される。スルホニル尿素及びＧＬＰ−１作動薬は、本来のインスリン分泌を刺激し、インスリン抵抗性を低減させることができるが、これらの化合物が代謝におけるインスリンの働きに取って代わることはない。最終的に、スルホニル尿素を与えられる著しい数の患者は、それに抵抗性になる。一部のＩＩ型糖尿病患者は、スルホニル尿素療法に応答しない。スルホニル尿素を用いた初期の処置に対して応答する患者のうち５〜１０％は、約１０年後にスルホニル尿素の有効性の低下を経験する可能性が高い。
【００３２】
さらに、多くの抗糖尿病剤、例えば、スルホニル尿素及びチアゾリジンジオンは、体重を増加させる望ましくない副作用がある。前糖尿病状態の患者またはＩＩ型糖尿病と診断された患者の体重増加は、代謝及び内分泌調節不全を強めるため悪影響を引き起こす可能性がある。肥満自体が、ＩＩ型糖尿病の発症及び進行性悪化に対する著しいリスク因子である。膵臓における増殖効果のため、ＧＬＰ−１作動薬の安全性プロフィールに関するいくらかの問題もある。したがって、体重を維持するかまたは低下させ、効力を保持し、正常な恒常作用に対する副作用が最小限である、抗糖尿病剤があることが望ましい。
【００３３】
本明細書に記載されるとおり、本発明者らは、ＭＥＮＴＳＨ（ヒトのＮＤ２サブユニットにコードされているミトコンドリア由来ペプチド）と呼ばれる新しいポリペプチドの産生をもたらす、ミトコンドリアにコードされる新規のオープンリーディングフレームを発見した。
【００３４】
ミトコンドリアゲノムワイド関連解析を使用して、本発明者らは、ＭＥＮＴＳＨ遺伝子を破壊する特定の一塩基多型と、肥満及び糖尿病の増加との相互関係を明らかにした。興味深いことに、この多型は、メキシコ系アメリカ人に極めて広く行き渡っており、肥満がある場合のその集団の高い糖尿病の確率について説明できた。興味深いことに、ＮＤ２遺伝子に対する「Ｃ／Ｇ」変異は、同義（サイレント）であるが、ミトコンドリア転写物のプロセシングの多シストロン性の結果としてＭＥＮＴＳＨペプチドの開始コドンを壊す。ミトコンドリアでは、ヌクレオチドＡＴＴが開始コドンとなることができる。このＳＮＰはＡＴＴをＡＣＴに変え、ＡＣＴは、もはや開始コドンとして働かず、タンパク質が産生されない。したがって、ヒト対象における「Ｃ／Ｇ」変異は、ＭＥＮＴＳＨノックアウトの効果があり、少なくとも部分的に観察される関連性の原因となる。
【００３５】
さらに、本発明者らは、ＭＥＮＴＳＨのインビトロ投与が、インスリン分泌を増加させ、脂肪蓄積を低減させ、筋細胞におけるグルコースの取り込みを改善することを発見した。これらの効果は、特定の細胞種におけるＡＫＴ活性化が関係する可能性もある。ＭＥＮＴＳＨ処置マウスにおける固有のメタボロミクスシグネチャーは、ＭＥＮＴＳＨ療法に対する薬力学的マーカーとして役立つ可能性がある。ＭＥＮＴＳＨに対する抗体が作製され、本発明者らは、ＭＥＮＴＳＨの欠乏を評価し、ＭＥＮＴＳＨ療法を監視するために使用することができるＭＥＮＴＳＨに対するＥＬＩＳＡアッセイを作り出した。
【００３６】
インビボ研究は、ＭＥＮＴＳＨの投与が、高脂肪食／「西洋」食を与えられたマウスの耐糖能を改善するために新規の糖尿病療法として役立ち、高脂肪食を与えられたマウスの体重を低下させるために新規の肥満療法として役立つことをさらに明らかにした。
【００３７】
ＭＥＮＴＳＨの類似体を作製することによって、本発明者らは、天然のペプチドと比較して、活性をさらに増強するか、または阻害することができた。
【００３８】
ミトコンドリアペプチドが本明細書に記載されている。一実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、アミノ酸配列
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を有するペプチド、またはその類似体もしくは誘導体を含む。
【００３９】
一実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４アミノ酸長である。特定の実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、１８アミノ酸長である。一実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、合成アミノ酸を含む。一実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、
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に対して約２５％未満、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、またはそれより高い同一性パーセンテージを有する。当業者は、参照アミノ酸配列と第２のアミノ配列との間の比較領域を確定することを含む、同一性パーセンテージの程度を確定するための当該技術分野において既知の方法により同一性パーセンテージを確定することができる。例を表１に示す。
【００４０】
他の実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、翻訳後修飾または人工的な修飾などのその他のタイプの修飾を有する。さまざまな実施形態において、これには、とりわけ、例えば、ペグ化、脂肪酸コンジュゲーション脂質化、反復ポリペプチド伸長、ＩｇＧ−Ｆｃ、ＣＰＴ、ＨＳＡ、ＥＬＰ、トランスフェリン、またはアルブミン修飾が含まれる。例えば、修飾としては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７の位置１のメチオニンにおけるホルミル化、位置７のトレオニンにおけるリン酸化、位置１１のセリンにおけるリン酸化、位置１６におけるチロシンのリン酸化、または位置２におけるリジンのアセチル化、あるいは表１に示されている配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６によって例示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７の類似体もしくは誘導体における対応する位置における修飾が挙げられるであろう。
【００４１】
一実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、インスリン分泌を増加させる。一実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、グルカゴンレベルを低下させる。一実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、グルコース応答を改善する。一実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、脂肪蓄積を低減させる。一実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、例えば、筋細胞を含む細胞におけるグルコースの取り込みを改善する。一実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、耐糖能を改善する。
【００４２】
ペプチドが本明細書に記載されている。さまざまな実施形態において、当該ペプチドは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４アミノ酸長である。さまざまな実施形態において、当該ペプチドの位置１（すなわち、最初のＮ末端アミノ酸）はＸ１であり、位置２は（Ｘ２）であり、他も同様（Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６など）であり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６などは、天然または合成アミノ酸から成る群から選択される。さまざまな実施形態において、当該ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のうちの１つである。さまざまな実施形態において、当該ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２のうちの１つである。さまざまな実施形態において、当該ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６のうちの１つである。他の実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、翻訳後修飾または人工的な修飾などのその他のタイプの修飾を有する。さまざまな実施形態において、これには、とりわけ、例えば、ペグ化、脂肪酸コンジュゲーション脂質化、反復ポリペプチド伸長、ＩｇＧ−Ｆｃ、ＣＰＴ、ＨＳＡ、ＥＬＰ、トランスフェリン、またはアルブミン修飾が含まれる。例えば、修飾としては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７のＸ１のメチオニンにおけるホルミル化、Ｘ７のトレオニンにおけるリン酸化、Ｘ１１のセリンにおけるリン酸化、Ｘ１６におけるチロシンのリン酸化、またはＸ２におけるリジンのアセチル化、あるいは表１に示されている配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６によって例示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７の類似体もしくは誘導体における対応するＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６などの位置における修飾が挙げられるであろう。さまざまな実施形態において、当該ペプチドは、
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に対して約２５％未満、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、またはそれより高い同一性パーセンテージを有する。
【００４３】
本明細書において、ミトコンドリアペプチドを使用して疾患及び／または状態を処置する方法であって、処置を必要とする対象を選択するステップと、ある量のミトコンドリアペプチドを、処置を必要とする対象に投与するステップとを含む、方法が記載されている。一実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、
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またはその類似体もしくは誘導体である。１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４アミノ酸長。一実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、１８アミノ酸長である。
【００４４】
一実施形態において、投与される当該ミトコンドリアペプチドの量は、当該ミトコンドリアペプチドの治療有効量である。一実施形態において、対象は哺乳動物である。一実施形態において、対象はヒトである。
【００４５】
（表１）ＭＥＮＴＳＨ類似体の例
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【００４６】
さまざまな実施形態において、記載されているミトコンドリアペプチドまたは類似体組成物を用いた処置に適した疾患及び／または状態としては、血中インスリンレベルの低下、または膵島β細胞の数の減少もしくは機能の低下によって特徴づけられる障害が挙げられる。さまざまな実施形態において、疾患及び／または状態としては、１型及び２型糖尿病、妊娠糖尿病、前糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、ならびに耐糖能障害が挙げられる。本発明の組成物は、例えば、糖尿病に対する遺伝的素因を有する個体に対して予防的に使用することができる。さまざまな実施形態において、記載されているミトコンドリアペプチドまたは類似体組成物を用いた処置に適した疾患及び／または状態としては、肥満が挙げられる。他の実施形態において、疾患及び／または状態としては、網膜症、ニューロパチー、腎疾患などの糖尿病合併症が挙げられる。他の実施形態において、疾患及び／または状態としては、脂質異常症が挙げられる。
【００４７】
さまざまな実施形態において、対象は、前糖尿病患者である。さまざまな実施形態において、対象は、糖尿病患者である。さまざまな実施形態において、対象は、肥満または過体重である。さまざまな実施形態において、対象は、ヒスパニック系と自己認識している個人を含む、ヒスパニック系である。さまざまな実施形態において、対象は、ネイティブアメリカンと自己認識している個人を含む、ネイティブアメリカンである。さまざまな実施形態において、対象は、南米系と自己認識している個人を含む、南米系である。さまざまな実施形態において、対象は、中米系と自己認識している個人を含む、中米系である。さまざまな実施形態において、対象は、ＳＮＰ  Ｒｓ２８３５７９８１の保有者である。これには、例えば、
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をコードするオープンリーディングフレームの発現を抑制する「Ｇ」または「Ｃ」対立遺伝子変異が含まれる。さまざまな実施形態において、対象は、ペプチド
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を発現しない。さまざまな実施形態において、対象は、糖尿病及び／または肥満ではない健康な正常対象と比較して低量の
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を発現する。他の実施形態において、対象は、低ＭＥＮＴＳＨ活性の代謝シグネチャーを有する。他の実施形態において、対象は、高ＭＥＮＴＳＨ活性の代謝シグネチャーを有する。さまざまな実施形態において、対象は、例えば、表１に挙げられているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２のうちの１つを含む、ＭＥＮＴＳＨのドミナントネガティブな類似体及び／または誘導体を投与される。他の実施形態において、疾患及び／または状態は、がん、アルツハイマー病、及び／またはアテローム動脈硬化症である。
【００４８】
本明細書において、個体を疾患及び／または状態に関して診断する方法が記載されている。さまざまな実施形態において、本方法は、対象を選択することと、１つ以上のバイオマーカーの有無または発現レベルを検出することと、１つ以上のバイオマーカーの有無または発現レベルに基づいて対象を疾患及び／または状態に関して診断することとを含む。さまざまな実施形態において、バイオマーカーは、ミトコンドリアペプチドを含む。さまざまな実施形態において、バイオマーカーは、
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を含む。例えば、対象は、糖尿病及び／または肥満ではない健康な正常対象と比較して低量の
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を発現している場合に、前糖尿病、糖尿病、及び／または肥満と診断される可能性もある。さまざまな実施形態において、バイオマーカーの有無または発現レベルの検出としては、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清の使用を含む１つ以上のバイオマーカーの抗体検出、その他の免疫性検出、及び質量分析検出法が挙げられる。
【００４９】
別の実施形態において、バイオマーカーは、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む。さまざまな実施形態において、ＳＮＰは、Ｒｓ２８３５７９８１である。これには、例えば、
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をコードするオープンリーディングフレームの発現を抑制する「Ｇ／Ｃ」対立遺伝子変異が含まれ、
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の不在により、対象が、前糖尿病、糖尿病、及び／または肥満のサブタイプに関して診断される。ＳＮＰを検出可能な方法は、当業者に公知である。
【００５０】
さまざまな実施形態において、疾患及び／または状態としては、血中インスリンレベルの低下もしくは上昇、または膵島β細胞の数の減少もしくは機能の低下によって特徴づけられるものが挙げられる。さまざまな実施形態において、疾患及び／または状態としては、１型及び２型糖尿病、妊娠糖尿病、前糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、ならびに耐糖能障害が挙げられる。さまざまな実施形態において、疾患及び／または状態としては、肥満が挙げられる。他の実施形態において、疾患及び／または状態としては、網膜症、ニューロパチー、腎疾患などの糖尿病合併症が挙げられる。他の実施形態において、疾患及び／または状態としては、脂質異常症が挙げられる。
【００５１】
さまざまな実施形態において、対象は、前糖尿病患者である。さまざまな実施形態において、対象は、糖尿病患者である。さまざまな実施形態において、対象は、肥満または過体重である。さまざまな実施形態において、対象は、ヒスパニック系と自己認識している個人を含む、ヒスパニック系である。さまざまな実施形態において、対象は、ネイティブアメリカンと自己認識している個人を含む、ネイティブアメリカンである。さまざまな実施形態において、対象は、南米系と自己認識している個人を含む、南米系である。さまざまな実施形態において、対象は、中米系と自己認識している個人を含む、中米系である。
【００５２】
本発明は、ミトコンドリアペプチドを使用して疾患及び／または状態の処置の有効性を高める方法であって、処置を必要とする対象を選択するステップと、ある量のミトコンドリアペプチドを疾患及び／または状態の処置を受ける対象に投与するステップとを含む方法をさらに提供し、当該ミトコンドリアペプチドは、疾患及び／または状態の有効性を高め、それにより当該処置の有効性を高める。一実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、炎症性の疾患及び／または状態を処置することができる組成物と同時に投与される。一実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、疾患及び／または状態を処置することができる組成物の投与前または後に連続的に投与される。一実施形態において、対象はヒトである。例えば、本発明のミトコンドリアペプチド及び類似体組成物は、糖尿病の処置のための他の治療剤と共に投与することができる。共投与は、例えば、単一の医薬組成物としての投与であってもよいし、別々の組成物としての同時投与であってもよい。本発明の組成物はまた、他の治療薬とは別々に（例えば、独立した投薬スケジュールにて）投与することができる。
【００５３】
さまざまな実施形態において、本発明は、医薬組成物をさらに提供する。一実施形態において、当該医薬組成物は、ミトコンドリアペプチド及び薬学的に許容される担体を含む。一実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、
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である。いくつかの実施形態において、当該生理活性ミトコンドリアペプチドは、６〜９アミノ酸ほどの大きさしかなく、一部は１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４アミノ酸長である。一実施形態において、当該ミトコンドリアペプチドは、１８アミノ酸長である。一実施形態において、当該医薬組成物中のミトコンドリアペプチドとしては、治療有効量のミトコンドリアペプチドが挙げられる。一実施形態において、当該医薬組成物は、１つ以上のミトコンドリアペプチド及び薬学的に許容される担体を含む。
【００５４】
さまざまな実施形態において、本発明は、ミトコンドリアペプチドを製造する方法をさらに提供する。一実施形態において、当該製造方法は、当該ミトコンドリアペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを準備するステップと、宿主細胞において１つ以上の当該ポリヌクレオチドを発現させるステップと、当該宿主細胞から当該ミトコンドリアペプチドを抽出するステップとを含む。一実施形態において、当該製造方法は、宿主細胞において１つ以上のポリヌクレオチドを発現させるステップと、当該宿主細胞から当該ミトコンドリアペプチドを抽出するステップとを含む。一実施形態において、当該１つ以上のポリヌクレオチドは、
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をコードする配列であるか、または
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に対して約２５％未満、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、またはそれより高い同一性パーセンテージを有するミトコンドリアペプチドをコードする配列である。さまざまな実施形態において、当該ポリヌクレオチドは、
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に対して約２５％未満、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、またはそれより高い同一性パーセンテージを有する。
【００５５】
別の実施形態において、当該製造方法は、液相合成または固相合成を使用したペプチド合成のステップを含む。一実施形態において、当該固相合成は、ＦｍｏｃまたはＢＯＣ合成である。
【実施例】
【００５６】
実施例１
発見
本発明者らは、ミトコンドリアバリアントとグリコヘモグロビンＨｂＡ１ｃとの間の関連性を調べるために、Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｒｅｔｉｒｅｍｅｎｔ  Ｓｔｕｄｙ（ＨＲＳ）の参加者９，８２５人に対してゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を実施した。マイナー対立遺伝子頻度＞０．０１の６８種のミトコンドリアＳＮＰについてＧＷＡＳを行い、年齢及び集団の構造化に関してモデルを調整した（最初の４つの固有値）。多重検定に対する調整後（Ｐ＝４．９Ｅ−０４、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  Ｐ＝．０３）、１つのＳＮＰ（Ｒｓ２８３５７９８１としても知られているＭｉｔｏＴ４９７８Ｃ）がＨｂＡ１ｃと有意に関連することがわかった（図１）。
【００５７】
次に、このＳＮＰと糖尿病の診断との間の関連性に関する調査は、このＳＮＰが糖尿病のリスクの３８％の増加と関連しうるが、心臓疾患または高血圧とは関連しないことを明らかにした。
【００５８】
実施例２
民族の影響
興味深いことに、このＳＮＰは、ヒスパニック系と自己認識している参加者において、はるかに多く見られる（ＭＡＦヒスパニック系＝１８．６５対ＭＡＦ非ヒスパニック系＝０．２７）。ＭｉｔｏＴ４９７８ＣとＨｂＡ１ｃとの間の関連性をヒスパニック系によって調べたとき、結果は有意なままであった。
【００５９】
実施例３
肥満
ＭｉｔｏＴ４９７８ＣとＨｂ１ａｃとの間の関連性をボディマスインデックス（ＢＭＩ）によって調査したところ、本発明者らは、有意なＳＮＰ×ＢＭＩ相互作用を発見した（図２）。具体的には、結果は、ＢＭＩが増加すると、ＨｂＡ１ｃに対するＳＮＰの影響が増加することを示していた。年齢、性別、人種、及びＢＭＩに関して調整した後でも、糖尿病を有するリスクはＧ／Ｃ対立遺伝子群において２倍近く高い（ＯＲ：１．９０、ｐ＜．０００１）（図３）。
【００６０】
（表２）正常な体重、過体重、及び肥満の対象における対立遺伝子分布
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【００６１】
実施例４
ＭｉｔｏＴ４９７８Ｃ（ｒｓ２８３５７９８１）に関するＨｂＡ１ｃ及び糖尿病の結果
すべての分析を、年齢、性別、集団の構造化（ＰＣ１４）、教育、ＢＭＩ、及び喫煙に関して調整した。結果は、マイナー対立遺伝子（Ａ）を有することが、０．１２高いＨｂＡ１ｃ及び糖尿病リスクの示唆的な１５％の増加と関連することを示している。これらの人種／民族による関連性を調べると、非ヒスパニック系白人については有意な関連性は見られないが、Ａ対立遺伝子は、非ヒスパニック系黒人における０．５６高いＨｂＡ１ｃ及び糖尿病の８２％の増加、ならびにヒスパニック系における０．１２高いＨｂＡ１ｃ及び糖尿病の１８％の増加（示唆的）と関連する。結果はまた、糖尿病と診断されていない人及び診断された人の間でＨｂＡ１ｃがより高いことも示している（有意性を示唆）。ＳＮＰ  Ｒｓ２８３５７９８１は、ミトコンドリアのＮＤ２遺伝子に位置する。
【００６２】
（表３）ＭｉｔｏＴ４９７８Ｃ（ｒｓ２８３５７９８１）に関するＨｂＡ１ｃ及び糖尿病の結果
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【００６３】
（表４）糖尿病状態によるＭｉｔｏＴ４９７８Ｃ（ｒｓ２８３５７９８１）に関するＨｂＡ１ｃの結果
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【００６４】
（表５）ＭｉｔｏＴ４９７８Ｃ（ｒｓ２８３５７９８１）に関する糖尿病の結果
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【００６５】
実施例５
ＭＥＮＴＳＨ−ヒトのＮＤ２サブユニットにコードされているＭＤＰ
ＳＮＰ  Ｒｓ２８３５７９８１に焦点をおくことにより、ＭＤＰ（ミトコンドリア由来ペプチド）をコードする（及びミトコンドリアにおいて翻訳される）オープンリーディングフレームが明らかになった（図４）。年齢、性別、人種、及びＢＭＩに関して確認すると、糖尿病患者においてＭＥＮＴＳＨ変異頻度が２倍発現増加し、これは、ヒスパニック系の１８．５％及び非ヒスパニック系の０．３％に行き渡っている。興味深いことに、ＮＤ２遺伝子に対する「Ｃ」変異は同義（サイレント）であるが、ミトコンドリア転写プロセシングの多シストロン性の結果としてＭＥＮＴＳＨペプチドの開始コドンを壊す。したがって、ヒト対象における「Ｇ」変異は、ＭＥＮＴＳＨノックアウトの効果があり、少なくとも部分的に観察される関連に対する原因となる。
【００６６】
さらなる調査から、ｍＲＮＡが第１染色体のＮＵＭＴからコードされるＧＲＥＢＰ（１１５−ａａ）と名づけられた理論上の遺伝子とは異なるが、その一部と部分的に一致することが明らかにされた。ただし、その遺伝子は、１８アミノ酸長の小さなＭＥＮＴＳＨペプチドをコードしない。
【００６７】
実施例６
ＭＥＮＴＳＨはｉｎｓ−１細胞におけるインスリン分泌を増加させる
インビトロにおいて、ＭＥＮＴＳＨペプチドをラット膵臓ｉｎｓ−１細胞に添加すると、グルコース添加と比較した場合に、用量依存的な様式及び統計学的に有意な様式でインスリン分泌を増加させることができることが認められた（図５）。
【００６８】
実施例７
ＭＥＮＴＳＨはインビトロにおいて３Ｔ３脂肪細胞における脂肪蓄積を低減させる
インビトロにおいて、ＭＥＮＴＳＨペプチドを添加すると、３Ｔ３脂肪細胞における脂肪蓄積を低減させることができた（図６）。
【００６９】
実施例８
ＭＥＮＴＳＨはシグナル伝達を細胞特異的な様式で急速に活性化する。
ＭＥＮＴＳＨに関するこれらの観察される効果は、部分的に細胞特異的な様式のＡｋｔシグナル伝達のためであるように見える。具体的には、リン酸化Ａｋｔは分化３Ｔ３脂肪細胞で増加していることが観察されたが、分化Ｌ６筋細胞では観察されなかった（図７）。
【００７０】
実施例９
ＭＥＮＴＳＨは高脂肪食（ＨＦＤ）を与えられたマウスにおいてのみ体重増加を低減させる。
マウスへのＭＥＮＴＳＨ投与の２週間の調査においてインビボ研究を実施した。１日２回、２．５ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射により処置したマウスを、高脂肪食（ＨＦＤ）（６０％脂肪）または通常食で飼育した。予備的に、ＭＥＮＴＳＨが、高脂肪食を与えられたマウスの体重増加を最も劇的に低減させることが観察され、その結果、抗肥満効果に関係する（図８）。
【００７１】
重要なことに、ＭＥＮＴＳＨは、摂食量を変化させないため、これらの効果は摂食量の変化によるものではなかった（図９）。さらに、ＭＥＮＴＳＨは、通常の飼料で飼育したマウスの体重及び摂食量も変化させない（図１０、さらに図８及び９）。
【００７２】
実施例１０
ＭＥＮＴＳＨは、ＨＦＤで飼育されたマウスのインスリン感受性及びインスリンレベルを改善し、グルカゴンを低下させ、グルコース応答を改善する
重要なことに、ＭＥＮＴＳＨ投与が、対照と比較してＨＦＤで飼育された動物におけるインスリンレベルを低下させたため、インスリン感受性が高まったことが観察された（図１１）。さらに、ＭＥＮＴＳＨは、ＨＦＤで飼育されたマウスのグルカゴンレベルを低下させ、グルコース応答を改善する（図１２、図１３）。
【００７３】
実施例１１
血漿のメタボロミクスが脂肪利用の増加を示唆する
血漿のメタボロミクスが脂肪利用の増加を示唆する。処置マウスへのＭＥＮＴＳＨ投与が、脂肪酸代謝産物の減少と相関しており、その結果、細胞内における脂肪利用の増加を示唆する（図１４）。ＭＴＴアッセイにより、ＭＥＮＴＳＨは、３Ｔ３／前駆脂肪細胞では生物活性を高めるが、ＨＥＫ２９３細胞では生物活性を低下させることが観察された（図１５、図１７）。
【００７４】
実施例１２
インビトロにおける類似体スクリーニング
ミトコンドリアＭＥＮＴＳＨペプチドを修飾して、生物学的活性が増強または抑制された類似体を生成することができる。例示的な類似体は表１に示されており、そのような類似体の試験により、ＭＥＮＴＳＨと比較して活性が複数倍増強されたいくつかの主要な候補が既に特定された。興味深いことに、少なくとも一部の生物学的効果は、細胞特異的である。その他の例において、類似体は、抑制された活性を有する場合もある（図１６、図１８、図２０及び図２１）。
【００７５】
実施例１３
ＭＥＮＴＳＨのｍＲＮＡ及びペプチドの検出ならびにマウスにおける注射されたペプチドの薬物動態
ノーザンブロットハイブリダイゼーションは、ミトコンドリアｍＲＮＡにおけるＭＥＮＴＳＨ転写物の存在を特定した（図１９）。さらに、本発明者らは、ＭＥＮＴＳＨの検出のためのＥＬＩＳＡアッセイを開発した。薬物動態は、ＭＥＮＴＳＨの比較的短い持続性（例えば、約１時間）を明らかにした（図１９）。類似体によるＭＥＮＴＳＨの持続的なバイオアベイラビリティの増加、またはその他の人工的な修飾は、治療的使用に対する生物学的効果をさらに向上させることができる。
【００７６】
実施例１４
コレステロール、脂質異常症
本発明者らは、細胞培養モデルにおけるＭＥＮＴＳＨ処置、ＭＥＮＴＳＨ処置されたヒトＨｅｐＧ２肝臓細胞もコレステロールの減少を示したことをさらに発見した（図２２）。これらの結果を動物試験において確認し、ＭＥＮＴＳＨ処置された肥満マウスは、７２時間以内にコレステロールレベルの低下を経験し、このことは、ＭＥＮＴＳＨが高コレステロール血症及び関連疾患に対する治療薬である可能性もあることを示唆する（図２３）。
【００７７】
実施例１５
類似体スクリーニング
本発明者らは、生物活性に関して、表１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６を構成する９６種の異なるＭＥＮＴＳＨ類似体のスクリーニングを完了した。本発明者らは、ＭＥＮＴＳＨよりも５００％を超えてさらに有効ないくつかのものを有する（図２４）。
【００７８】
上記のさまざまな方法及び技術は、本発明を実施するための多くの方法を提供する。当然、本明細書に記載されているあらゆる特定の実施形態により、記載される必ずしもすべての目的または利点が達成できるわけではないことが理解されるべきである。したがって、例えば、当業者は、本方法が、本明細書において教示または提示され得るその他の目的または利点を必ずしも達成するわけではなく、本明細書において教示されている１つの利点または利点の群を達成または最適化する様式で実施することが可能であることを認識するであろう。さまざまな有利及び不利益な代替物が本明細書において言及されている。いくつかの好適な実施形態は、特に１つ、別の１つ、またはいくつかの有利な特徴を含む一方で、その他は、特に、１つ、別の１つ、またはいくつかの不利益な特徴を含まないが、それでもその他は、特に、１つ、別の１つ、またはいくつかの有利な特徴を含めることにより、存在する不利益な特徴を軽減することが理解されるべきである。
【００７９】
さらに、当業者は、さまざまな実施形態のさまざまな特徴の適用可能性を認識するであろう。同様に、上記のさまざまな要素、特徴及びステップ、ならびにそのような要素、特徴またはステップのそれぞれに対する他の既知の等価物は、本明細書に記載される原理に従った方法を実施するために、当該技術分野の当業者が組み合わされ、適合させてもよい。さまざまな要素、特徴、及びステップのうち一部が、種々の実施形態に特に含まれ、その他は、特に、除外されることになる。
【００８０】
本発明は、特定の実施形態及び例と関連して開示されてきたが、本発明の実施形態が、具体的に開示された実施形態を超えて、その他の代替実施形態及び／または使用ならびにその改変物及び等価物にまで広がることを当業者は理解するであろう。
【００８１】
本発明の実施形態において、多くの変形及び代替的要素が開示された。さらに、さらなる変形及び代替の要素が当業者には明白であろう。限定されないこれらの変形は、本発明の教示に関連するミトコンドリアペプチドならびに前記ペプチドを調製及び／または単離する方法、疾患及び／または状態の処置における前記ペプチドの使用であり、技術ならびに組成物及びそこに使用される溶液の使用、ならびに本発明の教示により作製される生成物の特定の使用をさらに含む。本発明のさまざまな実施形態は、特に任意のこれらの変形または要素を含むことができ、または除外することができる。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本発明の特定の実施形態を記載及び特許請求するために使用される、成分、濃度、反応条件などの特性の量を表す数は、一部の場合には、「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態において、書面の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載されている数値的パラメータは、特定の実施形態によって得られるよう努められる所望の特性に応じて変化する可能性のある近似値である。いくつかの実施形態において、数値的パラメータは、報告される有効数字の数に照らして及び通常の丸め手法を適用することによって解釈されるべきである。本発明のいくつかの実施形態の広い範囲を示す数量的な範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の例に記載されている数値はできる限り正確に報告されている。本発明の一部の実施形態において提示される数値は、それぞれの試験測定に見られる標準偏差から必ず生じる一定の誤差を含むことがある。
【００８３】
いくつかの実施形態において、本発明の特定の実施形態を記載する文脈において（特に、添付の請求項の特定の文脈において）使用される「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」ならびに同様の言及は、単数及び複数の両方を含むものと解釈することができる。本明細書における値の範囲の列挙は、その範囲内にあるそれぞれの個別の値を個々に言及することの省略表現法として働くことが単に意図される。本明細書において別の指示がある場合を除いて、それぞれの個別の値は、本明細書において個々に挙げられているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されているすべての方法は、本明細書において別の指示があるか、または別に文脈が明らかに否定している場合を除いて、任意の適した順序で実施することができる。本明細書における特定の実施形態に対して与えられる任意及びすべての例、または例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、本発明をさらに明確にすることが単に意図され、別に特許請求される本発明の範囲に対して限定を与えるものではない。本明細書におけるいかなる言葉も本発明の実施に必須の特許請求されていない任意の要素を示すものと解釈されるべきではない。
【００８４】
本明細書中で開示されている本発明の代替的な要素または実施形態の群は、限定として解釈されるべきではない。各群のメンバーは、個々にまたはその群の他のメンバーもしくは本明細書において見出される他の要素との任意の組み合わせで言及及び特許請求されることがある。群の１つ以上のメンバーは、利便性及び／または特許性のために、含まれてもよく、または除去されてもよい。そのようないかなる含めること、または除去することが起こる場合も、本明細書は、ここに改変された群を含むものと見なされるため、添付の特許請求の範囲に使用されるすべてのマーカッシュ群の書かれた明細を満たす。
【００８５】
本発明の好適な実施形態が本明細書に記載されており、本発明を実施するための本発明者に既知の最良の形態を含む。それらの好適な実施形態に対する変形は、前述の説明を読んだときに当業者には明白になるであろう。当業者は必要に応じてそのような変形を使用することができ、本発明は、具体的に本明細書に記載されているのと別の方法で実施することができることが意図される。したがって、本発明の多くの実施形態は、ここに添付された特許請求の範囲において挙げられる主題の、適用可能な法によって許されるすべての改変物及び等価物を含む。さらに、そのすべての可能な変形における上記の要素のあらゆる組み合わせが、本明細書において別に指示がある場合または別に文脈が明らかに否定している場合を除いて本発明に包含される。
【００８６】
さらに、本明細書全体をとおして、多くの参照が特許及び刊行物に対して行われてきた。上記の引用文献及び刊行物のそれぞれは、個々に参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８７】
最後に、本明細書中で開示されている本発明の実施形態は、本発明の原理の説明のためのものであることが理解されるべきである。使用可能なその他の改変物は、本発明の範囲内にあり得る。したがって、限定ではなく例として、本発明の代替的な構成を、本明細書における教示に従って利用することができる。それ故に、本発明の実施形態は、示され、記載されているものに正確に限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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