(57)【要約】  本発明は、飼料製品または食品製品のための製造のための細菌性３−フィターゼの使用に関する。さらに、本発明は、動物に給餌するための、および食品または飼料添加剤の製造のための、細菌性３−フィターゼの使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
飼料製品または食品製品の製造のための少なくとも１種の細菌性３−フィターゼの使用。
【請求項２】
前記フィターゼが、０．２Ｕ／ｍＬの酵素用量を用いる３７℃およびｐＨ５．５で２．７ｍｍｏｌ／Ｌのフィテートのアッセイ内で、３５％の無機ホスフェート放出後に、中間体生成物イノシトール−テトラホスフェートの蓄積が２５％（重量／重量  遊離ホスフェート）未満であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記フィターゼが、０．２１μｇ／ｍＬの酵素濃度を用いて１時間後にｐＨ５．５で２．７ｍｍｏｌ／Ｌフィテートからの少なくとも１５％のホスフェート放出を特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記フィターゼが属ディケヤー（Ｄｉｃｋｅｙａ）またはセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）からのフィターゼである、請求項１〜３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項５】
前記フィターゼが、ディケヤー種（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｓｐ．）、セラチア種（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．）、ディケヤー・ジアエ（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｚｅａｅ）、ディケヤー・クリサンセミー（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、ディケヤー・ダダンティイ（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ）、ディケヤー・ソラニ（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｓｏｌａｎｉ）またはディケヤー・パラディシアカ（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ）からのフィターゼである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記フィターゼが配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を示す、請求項１〜５のいずれか１つに記載の使用。
【請求項７】
前記フィターゼが３０〜６５℃の温度最適条件および／またはｐＨ２．５〜５．５のｐＨ最適条件を示す、請求項１〜６のいずれか１つに記載の使用。
【請求項８】
前記飼料製品または食品製品が、ビタミン、鉱物、有機酸、プロバイオティック成分、油、脂肪、顔料、増殖因子、抗菌剤、セルロース、デンプンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１つに記載の使用。
【請求項９】
前記飼料製品または食品製品が乾燥または液体形態である、請求項１〜８のいずれか１つに記載の使用。
【請求項１０】
動物に給餌するための、細菌性３−フィターゼの使用。
【請求項１１】
食品もしくは飼料添加剤の製造のための細菌性３−フィターゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飼料製品または食品製品のための製造のための細菌性３−フィターゼの使用に関する。さらに、本発明は、動物に給餌するための、および食品または飼料添加剤の製造のための、細菌性３−フィターゼの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィターゼは、有機ホスフェート化合物、例えばフィテートからホスフェートを切り離すことができる酵素である。多くのタイプのフィターゼが本技術分野において知られており、それらの一部は既に、動物飼料製品材料、例えばトウモロコシ、コムギおよびダイズ内に天然に存在するフィテートの代謝および利用を改善するために動物飼料製品への添加剤として使用されている。フィターゼの分類は、最初の段階におけるフィテート分子からのホスフェートの開裂の開始位置に依存する。３−フィターゼは、フィテート分子の３位におけるホスフェートから開始する。６−フィターゼは、６位におけるホスフェートから開始する。フィターゼのタイプに応じて、他の位置のさらなる開裂が生じる。
【０００３】
ホスフェートは動物の食餌の重要な要素であるため、フィターゼを動物の飼料に添加することにより、飼料の天然のフィテート部分のより良好な代謝が可能となるが、動物の排出物における残留リンの減少ももたらされる。動物の排出物における高リン含有量は通常、肥料としてのその使用の厳格な制限をもたらし、なぜならば多くの国々が厳しい制限を課しているためである。
【０００４】
不十分な天然フィテート代謝および、特に肥料中における残留リン含有量を増加させることも知られている飼料の費用のかかる人工的なリン富化のこれらの欠点を克服するために、フィターゼは既に、動物の胃および消化管におけるフィテート代謝を増加させるために動物飼料製品に導入されてきた。  
【０００５】
現在市販されているそのようなフィターゼの例は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ）、ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）種およびアスペルギニス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）に由来する。
【０００６】
こららのフィターゼ製品の各々は、少なくとも比活性、必要用量、反応時間および阻害中間体化合物の蓄積において制限を有する。その種で最初の製品は、所望の効果を達成するためには高い酵素用量を必要とする真菌性の３−フィターゼを含んでいた。現在入手可能な市販の飼料製品は、細菌起源の６−フィターゼを使用することによりこの効果の克服を試みている。しかしながら、これらの６−フィターゼの重大な欠点は、中間体化合物であるイノシトール−テトラホスフェートの蓄積であり、これは効率的なフィテート代謝を大きく限定する。さらに、フィテートおよびその中間体、特にイノシトール−テトラホスフェートは、二価イオン、例えばＣａ２＋、Ｚｎ２＋およびＭｇ２＋と複合体を形成する。さらに、本技術分野内において公知のフィターゼ製品の多くは、最大１．５時間という動物の胃における飼料の現実の臨界的な保持時間に関して十分なホスフェートの放出を保障するためには、高量のフィターゼの使用を必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、技術水準内において、動物に給餌する場合にフィテート代謝を改善するためのより効率の高い方法を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
今回驚くべきことに、本発明の発明者等は、細菌性３−フィターゼを使用することによりこの必要性を改善できることを見出した。
【０００９】
従って、第１の態様内において、本発明は、飼料製品または食品製品の製造のための、少なくとも１種の細菌性３−フィターゼの使用に向けられている。第２の態様内において、本発明は、動物に給餌するための、少なくとも１種の細菌性３−フィターゼの使用に向けられている。そして、最終の態様において、本発明の態様は、食品もしくは飼料添加剤の製造のための、少なくとも１種の細菌性３−フィターゼの使用に向けられている。
【００１０】
本出願内において、語句「３−フィターゼ」は、Ｅ．Ｃ．  ３．１．３．８の分類に属する任意のフィターゼと理解されるべきであり、１−フィターゼ；ミオイノシトール−ヘキサキスホスフェート  ３−ホスホヒドロラーゼ；フィテート１−ホスファターゼまたはフィテート３−ホスファターゼとも呼ばれる。
【００１１】
語句「細菌性フィターゼ」は、本出願内において、細菌起源である任意のフィターゼを含むと理解されるべきである。「細菌起源」は、任意の種類の細菌ゲノムから単離された改変されたもしくは改変されていない形態の任意のフィターゼ、例えばいわゆる野生型フィターゼに関するが、改変された、例えば遺伝的に改変されたまたは遺伝子操作されたまたは突然変異した形態のフィターゼにも関する。
【００１２】
本発明では、属ディケヤー（Ｄｉｃｋｅｙａ）およびセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）からのフィターゼが特に好ましく、ディケヤー種（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｓｐ．）、セラチア種（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．）、ディケヤー・ジアエ（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｚｅａｅ）、ディケヤー・クリサンセミー（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、ディケヤー・ダダンティイ（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ）、ディケヤー・ソラニ（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｓｏｌａｎｉ）またはディケヤー・パラディシアカ（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ）からのフィターゼが最も好ましい。
【００１３】
特に好ましい実施態様内において、０．２Ｕ／ｍＬの酵素用量を用いる３７℃およびｐＨ５．５で２．７ｍｍｏｌ／Ｌのフィテートのアッセイ内で、３５％の無機ホスフェート放出後に、中間体生成物イノシトール−テトラホスフェートの蓄積が２５％（重量／重量  遊離ホスフェート）未満であることを特徴とするフィターゼが使用される。中間体生成物イノシトール−テトラホスフェートの蓄積は、動物の胃内の飼料の適切な残留時間内におけるフィテートの完全なホスフェート放出を妨げるので、そのようなフィターゼは特に有利である。さらに、中間体イノシトール−テトラホスフェートの蓄積は、二価イオンの利用を妨げる。動物の飼料製品用に一般に使用されるフィターゼは、飼料塊がさらなる消化のために動物の胃を去る前に、完全なリン放出を妨げるこの中間体生成物を大量に蓄積する。
【００１４】
中間体生成物イノシトール−テトラホスフェートの２５％（重量／重量）未満の蓄積が、０．２Ｕ／ｍＬという極めて低い酵素用量を実行することによりさらに達成される。従って、上記のフィターゼは、経済的な理由からも極めて有利である。０．２Ｕ／ｍＬの酵素用量を用いる３７℃およびｐＨ５．５での２．７ｍｍｏｌ／Ｌフィテートのアッセイ内において３５％の無機ホスフェート放出後に、中間体生成物イノシトール−テトラホスフェートの２０％（重量／重量  遊離ホスフェート）未満の蓄積、または１５％（重量／重量  遊離ホスフェート）未満の蓄積、最も好ましくは１０％（重量／重量  遊離ホスフェート）未満の蓄積を特徴とするフィターゼの使用が特に好ましい。
【００１５】
さらなる実施態様において、０．２１μｇ／ｍＬの酵素濃度を用いて１時間後にｐＨ５．５で２．７ｍｍｏｌ／Ｌフィテートからの少なくとも１５％のホスフェート放出を特徴とするフィターゼが使用される。動物の胃内での飼料の保持時間は通常約１時間なので、これらのフィターゼの使用が好ましい。従って、１時間の時間枠内に大部分のリンを放出するフィターゼが好ましい。胃保持時間内に放出できるホスフェートが多いほど、飼料製品内で使用するフィターゼを少なくできる。これはさらに、経済的利点に貢献する。従って、０．２１μｇ／ｍＬの酵素濃度を用いて１時間後にｐＨ５．５で２．７ｍｍｏｌ／Ｌフィテートから、少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも２５％、特に好ましくは少なくとも３０％または少なくとも３５％ならびに少なくとも４０％または少なくとも４５％、最も好ましくは少なくとも５０％のホスフェート放出を特徴とするフィターゼを使用することが特に好ましい。
【００１６】
動物の胃における消化の間の温度は大きく変動するので、特に好ましい実施態様内において、３７〜４２℃の温度最適条件を有するフィターゼが使用され、ここで、３５〜４５℃の温度最適条件が特に好ましく、３０〜５０℃の温度最適条件が最も好ましい。本発明のフィターゼが魚に給餌するために使用される場合、１〜４５℃、好ましくは１５〜３５℃の温度最適条件を有するフィターゼが使用される。
【００１７】
一度に消費されるそれぞれの飼料の比のために動物の胃内のｐＨは大きく変動するので、特に好ましい実施態様内において、ｐＨ３．５〜４．５、より好ましくはｐＨ３．０〜５．０、最も好ましくはｐＨ２．５〜５．５の範囲内のｐＨ最適条件を示すフィターゼが使用される。別の特に好ましい範囲は、ｐＨ５．０〜５．５である。
【００１８】
さらなる特に好ましい実施態様内において、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは配列番号１と少なくとも７５％の同一性、さらに好ましくは配列番号１と少なくとも８０％の同一性、特に好ましくは配列番号１と少なくとも８５％の同一性、また好ましくは配列番号１と少なくとも９０％、さらに特に好ましくは配列番号１と少なくとも９５％、最も好ましくは配列番号１と少なくとも９９％の配列同一性を有する細菌性３−フィターゼが使用される。特に好ましい細菌性３−フィターゼは、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５である。
【００１９】
本願内で使用される場合に語句「飼料」製品は、任意の種類の動物、好ましくは哺乳動物および鳥類、例えばこれらに限定はされないが反芻動物、ブタ、シカ、家禽に給餌するために適切なものとして当業者に公知の任意の製品に関するが、一般に魚介類と呼ばれる魚または他の水性家畜もまた含む。反芻しない動物、例えば家禽（ｐｏｕｌｔｒｙ）、ブロイラー、鳥類、鶏、七面鳥、鴨、ガチョウおよび大型の鳥（ｆｏｗｌ）；反芻動物、例えば雌牛、牛、馬および羊；豚（ｐｉｇｓ）、豚（ｓｗｉｎｅ）、子豚、育成豚および雌豚；猫、犬、げっ歯類およびウサギを含むがこれらに限定されないコンパニオンアニマル；サケ、マス、ティラピア、ナマズおよびコイを含むがこれらに限定されない魚類；シュリンプおよびエビを含むがこれらに限定されない甲殻類のための飼料製品が特に好ましい。
【００２０】
本願内において使用される場合に、語句「食品」製品は、適切なヒト消費として当業者に公知の任意の製品に関する。
【００２１】
本発明の飼料製品または食品製品は好ましくはデンプンを含む。デンプン含有飼料成分には、典型的には、植物性材料、例えば穀物（穀物類）、例えば一種以上の穀類（トウモロコシ）、小麦、大麦、ライムギ、米、モロコシおよびキビ、および／または塊茎、例えばジャガイモ、キャッサバおよびサツマイモが含まれる。前記植物性材料は、粉砕されてもよく、例えば湿式もしくは乾式粉砕粒、または穀類蒸留粕（ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  ｄｒｙ  ｇｒａｉｎ  ｓｏｌｉｄｓ）であってもよい。
【００２２】
本発明の飼料製品または食品製品は、好ましくは、タンパク質に富む飼料成分、例えばダイズ（好ましくはダイズミール）、ナタネ、パーム核、綿実およびヒマワリを含む。
【００２３】
さらなる実施態様内において、前記飼料製品または食品製品は、ビタミン類、鉱物類、有機酸、プロバイオティック成分、油類、脂肪類、顔料、増殖因子および抗菌剤からなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む。
【００２４】
さらなる実施態様内において、前記飼料製品または食品製品は、細菌性３−フィターゼに加えて、少なくとも１種以上の酵素、特に飼料の消化率を改善する飼料酵素、例えば別のフィターゼ、アミラーゼまたはプロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼを含む。飼料酵素（複数可）は、微生物、例えば細菌または真菌に由来するか、または植物または動物に由来してもよい。
【００２５】
別の好ましい実施態様内において、飼料製品または食品製品は、粒状物、圧縮物、押出物または液体の形態にある。
【００２６】
本発明の別の態様は、動物に給餌するための細菌性３−フィターゼの使用に関する。例えば、細菌性３−フィターゼは、別個の製品に組み入れられずに、動物に直接与えられる。
【００２７】
細菌性３−フィターゼが動物に直接与えられる場合、当該フィターゼは、好ましくは、押出物または粒状物、特にコーティングされた粒状物（例えば塩（例えば少なくとも６０％ｗ／ｗの塩）を含むコーティングを有する）の形態で供給される。前記塩は、ＮａＣＩ、ＫＣＩ、Ｎａ２Ｓ０４、Ｋ２Ｓ０４およびＭｇＳ０４からなる群から選択されてもよい。
【００２８】
本発明の別の態様は、食品もしくは飼料添加剤の製造のための細菌性３−フィターゼの使用に関する。食品添加剤または飼料添加剤は、市販の食品製品、例えば穀物、トウモロコシ、干し草、糖蜜およびわらのペレット化されたまたは押出成形された混合物に組み入れることができる製品であり、乾燥もしくは液体形態であってもよい。飼料製品または食品製品の製造のために使用するための上記に定義されるような３−フィターゼが特に好ましい。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「液体形態」は、好ましくはバッファー、安定剤および抗菌剤も含む組成物に関し、さらにまた少なくとも１つのさらに別の酵素を含んでいてもよく、ここで、前記酵素は、アミラーゼ、セルラーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、マンナナーゼ、アミラーゼ、アミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、トランスアミナーゼ、アミンオキシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、アンモニアリアーゼまたはそれらの任意の組み合わせである。
【００３０】
本明細書で使用される場合に、「乾燥形態」は、好ましくは１種以上の以下の成分も含む組成物に関する：担体、バッファー、安定剤、結合剤、可塑剤、抗菌剤。スクロース、塩化ナトリウム、ソルビトール、クエン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、グアーガムおよび／または小麦粉を含む乾燥形態が特に好ましい。
【００３１】
図および例
本発明を例および図によって以下にさらに詳細に説明する。例および図面は例示的な性質のみを有し、本発明の範囲を限定するものではないことを強調する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、ｐＨ５．５および３７℃での中間体生成物イノシトール−テトラホスフェートの蓄積に関して、本発明の細菌性３−フィターゼと動物に給餌するために技術水準内でこれまで使用されている細菌性６−フィターゼとの間の比較を示す。
【図２】図２は、ｐＨ５．５および３７℃でのアッセイ内で使用される同量のフィターゼに関して、本発明の細菌性３−フィターゼと、動物への給餌のために使用するために技術水準内でも知られ、ホスフェート放出に関して過去に使用されてきた真菌性３−フィターゼとの比較を示す。
【図３】図３は、ｐＨ５．５および３７℃での中間体生成物イノシトール−テトラホスフェートからのホスフェート放出に関して、本発明の細菌性３−フィターゼと動物に給餌するために技術水準内でこれまで使用されている細菌性６−フィターゼとの比較を示す。
【図４】図４は、ｐＨ５．０および４０℃での中間体生成物イノシトール−テトラホスフェートの蓄積に関して、本発明の細菌性３−フィターゼと動物に給餌するために技術水準内でこれまで使用されている細菌性６−フィターゼとの間の比較を示す。
【図５】図５は、ｐＨ５．０および４０℃でのアッセイ内で使用される同量のフィターゼに関して、本発明の細菌性３−フィターゼと、動物への給餌のために使用するために技術水準内でも知られ、ホスフェート放出に関して過去に使用されてきた真菌性３−フィターゼとの比較を示す。
【図６】図６は、ｐＨ５．０および４０℃での中間体生成物イノシトール−テトラホスフェートからのホスフェート放出に関して、本発明の細菌性３−フィターゼと動物に給餌するために技術水準内でこれまで使用されている細菌性６−フィターゼとの比較を示す。
【００３３】
方法
例内において以下の方法を適用した：
技術水準のフィターゼ
以下のフィターゼを例内で試験した：
【００３４】
【表１】
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【００３５】
酵素濃度の測定
配列番号１濃度を、ＵＶ吸光度によりそのモル吸光係数を用いて測定した。全ての他のフィターゼ溶液および抽出物を、自家ＳＤＳゲル定量化法により、配列番号１キャリブレーションカーブを用いて定量化した。フィターゼサンプルをＳＤＳゲルにアプライし、ゲルはその後Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ：Ｓ１２０００）を用いて染色した。ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｇｅｌ  ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ装置上でゲルイメージを記録した。画像解析はＩｍａｇｅＬａｂ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行った。同一ＳＤＳゲル上での配列番号１キャリブレーションカーブを用いるフィターゼ特異的なＳＤＳゲルバンドのシグナル積分により、タンパク質濃度を決定した。
【００３６】
フィターゼ活性の測定
５μＬ酵素溶液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．５、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００における）を、９５μＬ  ２．８８ｍｍｏｌ／Ｌフィチン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  ６８３８８、ｌｏｔ  ＢＣＢＭ４００６Ｖ）と、１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ ５．５において３７℃で１５分間インキュベートした。１００μＬの１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を添加することにより反応を停止した。引き続き、１００μＬの停止させた酵素反応を、１００μＬのモリブデート試薬（１．２％（ｗ／ｖ）モリブデン酸アンモニウム；４．４％（ｖ／ｖ）硫酸および２７ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）硫酸鉄の水溶液）と混合し、当該溶液を室温で１５分間インキュベートした。７００ｎｍでの吸光度を測定し、放出された無機ホスフェートの量を、無機ホスフェート標準溶液（０−１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いて計算した。１ユニットのフィターゼ活性を、３７℃で１分あたり１μｍｏｌのホスフェートを放出する酵素量として定義した。
【００３７】
市販のフィテート調製物におけるフィテートの含有量の測定
標準物質フィチン酸ナトリウム塩水和物（Ｓｉｇｍａ  Ａｒｔ．６８３８８、ｌｏｔ  ＢＣＢＭ４００６Ｖ）は、フィテート、ナトリウムおよび水を含む。フィテート含有量は分析証明書によって入手できず、酸加水分解およびその後のＩＣＰ−ＯＥＳによる遊離リンの測定によって測定した。２００ｍｇのフィテートナトリウム塩水和物（Ｓｉｇｍａ  Ａｒｔ．６８３８８、ｌｏｔ  ＢＣＢＭ４００６Ｖ）をテフロンチューブ中に秤量した。引き続き、１ｍＬ水、１ｍＬ硫酸９８％および４ｍＬの過酸化水素溶液３０％を添加した。チューブを蓋およびバースティングキャップで閉め、オートクレーブ中において３００℃で１時間インキュベートした。加水分解物を５０ｍＬ容積フラスコに定量的に移し、５０ｍＬまで水で満たした。この溶液を、ＤＩＮ  ＥＮ  ＩＳＯ  １１８８５  Ｅ２２に従ってＩＣＰ−ＯＥＳにより、リンの含有量に関して分析した。フィテートの含有量を重量により算出し、リンの含有量をモル質量により算出した。フィチン酸ナトリウム塩水和物（Ｓｉｇｍａ  Ａｒｔ．  ６８３８８，  ｌｏｔ  ＢＣＢＭ４００６Ｖ）における遊離フィテートの含有量は５４．７％であった。
【００３８】
ＨＰＡＥＣ−ＵＶによる種々のイノシトール−ホスフェート種の測定
種々のイノシトール−ホスフェート種の測定を、２９０ｎｍでＵＶ検出器を使用するポストカラム誘導体化法を用いた高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＵＶ）により行った。クロマトグラフシステムは、デュアルポンプ（ＩＣ−３０００  ＤＰ）、デュアルカラムオーブン（ＩＣＳ−３０００  ＤＣ）、冷却したオートサンプラー（ＩＣＳ−３０００  ＡＳ）およびＵＶ検出器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＭＷＤ−３０００）を備えたＤｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ−３０００であった。ポストカラムデリバリーシステムの代わりに、編み込み式反応コイル（ｋｎｉｔｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｃｏｉｌ）（４ｍｍシステム、３７５μＬ）を両ポンプシステムの流れを混合するために使用して、検出前の誘導体化反応を実施した。システム１を使用して、Ｄｉｏｎｅｘ  ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１００  Ｇｕａｒｄ  ｃｏｌｕｍｎ  ４  ｘ  ５０  ｍｍおよびＤｉｏｎｅｘ  ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１００  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｏｌｕｍｎ  ４  ｘ  ２５０  ｍｍを用いることにより異なるイノシトール−ホスフェート種を分離した。勾配溶離のために、ＨＰＬＣグレード水（ポンプシステム１／ｃａｎａｌ  Ａ）および０．５Ｍ塩酸（ポンプシステム１／ｃａｎａｌ  Ｂ）を１．０ｍＬ／分の流速で使用した。勾配条件は以下の通りであった：０分  ５％Ｂ；０−８分  ５−１０％Ｂ；８−２５分  １０−３５％Ｂ；２５−３５分  ３５−１００％Ｂ；３５−４２分  １００％Ｂ；４２−４３分  １００−５％Ｂ；４３−５５分  ５％Ｂ。ポンプシステム２が、ポストカラム反応溶液（０．１％Ｆｅ（ＮＯ３）３を含む０．３３Ｍ過塩素酸）を、編み込み式コイルと連結したティーコネクタに０．４ｍＬ／分の流速で供給する。インジェクション体積は、３０℃のカラム温度および１０℃のオートサンプラー温度で約５０μＬであった。ラン時間は５５分であった。シグナルを２９０ｎｍで検出し、手動で積分した。標準ストック溶液を以下のように調製した：１００ｍｇフィチン酸ナトリウム塩水和物（Ｓｉｇｍａ  Ａｒｔ．  ６８３８８，ｌｏｔ  ＢＣＢＭ４００６Ｖ）を、１００ｍＬのＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １０００  ｍｇ／Ｌ（Ｍｅｒｃｋ  Ａｒｔ．  １１９８９８）に希釈した。いくつかの較正レベルへの希釈を、以下の濃度になるように水（ＨＰＬＣグレード）を用いて行った：０．１ｍｇ／ｍＬフィチン酸ナトリウム塩水和物／ホスフェート、０．２ｍｇ／ｍＬフィチン酸ナトリウム塩水和物／ホスフェート、０．４ｍｇ／ｍＬフィチン酸ナトリウム塩水和物／ホスフェート、０．６ｍｇ／ｍＬフィチン酸ナトリウム塩水和物／ホスフェート、および０．８ｍｇ／ｍＬフィチン酸ナトリウム塩水和物／ホスフェート。
【００３９】
イノシトール−ホスフェート種の保持時間のリスト：
【表２】
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【００４０】
例
例１  フィテート分解パターンの測定
２．７ｍｍｏｌ／Ｌフィテート溶液（Ｓｉｇｍａ  ６８３８８，  ｌｏｔ  ＢＣＢＭ４００６Ｖ）を、１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．５において、３７℃で、０．２Ｕ／ｍＬのフィターゼとインキュベートすることにより、酵素反応を実施した。サーモシェーカーにおける９９℃で１０分間の即時インキュベーションによって、異なる時間点で酵素反応を停止させることにより、時間分解酵素的フィテート分解データを記録した。「ＨＰＡＥＣ−ＵＶによる種々のイノシトール−ホスフェート種の測定」方法に従ってサンプルを分析した。イノシトール−ホスフェート異性体（同量のホスフェート残基を有するイノシトール−ホスフェート）のピーク面積を合計した。引き続き、ピーク面積をシグナルの正規化により、異なるイノシトール−ホスフェート種のホスフェート残基の量に補正した（すなわち、フィテートは６つのホスフェート残基を含み、無機ホスフェートよりも６倍高い検出器応答係数が得られる）。分解パターンの比較のために、当量のホスフェートが放出された反応速度論的時間点のデーターを採取した。
【００４１】
結果を図１に示す。
【００４２】
例２  同一酵素量のフィターゼにおけるホスフェート放出データの測定
５μＬ酵素溶液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．５、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００における）を、９５μＬ  ２．８８ｍｍｏｌ／Ｌフィチン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  ６８３８８、ｌｏｔ  ＢＣＢＭ４００６Ｖ）と、１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ ５．５において３７℃で１時間インキュベートする。反応における最終酵素濃度は０．２１μｇ／ｍＬである。反応を、１００μＬの１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を添加することにより停止する。引き続き、停止した酵素反応を１／１０に希釈し、１００μＬの希釈液を１００μＬのモリブデート試薬（１．２％（ｗ／ｖ）モリブデン酸アンモニウム；４．４％（ｖ／ｖ）硫酸および２７ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）硫酸鉄の水溶液）と混合する。当該溶液を室温で１５分間インキュベートする。７００ｎｍでの吸光度を測定し、放出された無機ホスフェートの量を、無機ホスフェート標準溶液（０-１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いて算出する。
【００４３】
結果を図２に示す。
【００４４】
例３  イノシトール−テトラホスフェートからのホスフェート放出の測定
イノシトール−テトラホスフェート調製物を、２．７ｍｍｏｌ／Ｌフィテートを、１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．５において、３７℃で、０．１Ｕ／ｍＬの配列番号１７と１時間インキュベートすることにより調製した。反応後、酵素を９５℃で３０分間のインキュベーションにより不活性化した。得られた２．７ｍｍｏｌ／Ｌイノシトール−テトラホスフェート溶液を、０．２Ｕ／ｍＬの最終フィターゼ濃度を用いて例２に従う酵素反応において基質として使用した。
【００４５】
結果を図３に示す。図で使用される略語は以下の通りである：ＩＰ６：イノシトール−ヘキサホスフェート；ＩＰ５：イノシトール−ペンタホスフェート；ＩＰ４：イノシトール−テトラホスフェート；ＩＰ３：イノシトール−トリホスフェート；ＩＰ２：イノシトール−ジホスフェート；ＩＰ１：イノシトール−モノホスフェート；Ｐｉ：ホスフェート
例４  フィテート分解パターンの測定
例４を例１のように実施したが、ｐＨを５に設定し、インキュベーション温度は４０℃であった。
【００４６】
結果を図４に示す。
【００４７】
例５  フィテート分解パターンの測定
例２を例１のように実施したが、ｐＨを５に設定し、インキュベーション温度は４０℃であった。
【００４８】
結果を図５に示す。
【００４９】
例６  フィテート分解パターンの測定
例３を例１のように実施したが、ｐＨを５に設定し、インキュベーション温度は４０℃であった。
【００５０】
結果を図６に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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