(57)【要約】  ヒドロゲルパッチ、その製造方法、及びそれを含む脊髄損傷治療用組成物に係り、一様相によるヒドロゲルパッチによれば、脊髄損傷患者を脊髄非浸襲的方法で治療することができる効果がある。
2019517484.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリン、またはフィブリン及びフィブリノゲンと、
ラミニンと、
ヒアルロン酸またはその塩と、を含むヒドロゲルパッチ。
【請求項２】
細胞成長因子をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項３】
前記細胞成長因子は、神経細胞成長因子、血管内皮細胞成長因子、線維芽細胞成長因子、骨形成タンパク質、上皮細胞成長因子、肝細胞成長因子、形質転換成長因子、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする請求項２に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項４】
前記神経細胞成長因子は、ＢＤＮＦ（brain-derived neurotropic factor）、ＧＤＮＦ（glial cell derived neurotropic factor）、ＣＮＴＦ（ciliary neurotropic factor）、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）、ｃＡＭＰ（cyclic adenocyne monophosphate）、ＮＴ（neurotropin）、ＮＴ３（neurotropin−３）、ＮＴ４（neurotropin−４）、Ｔ３（triiodo−Ｌ−thyronine）、ＳＨＨ（sonic hedgehog）及びＰＤＧＦ（platelet-derived growth factor）からなる群で選択された１種以上を含むことを特徴とする請求項３に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項５】
前記血管内皮細胞成長因子は、ＶＥＧＦ（vascular endothelial growth factor）であることを特徴とする請求項３に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項６】
細胞を含まないことを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項７】
表面に多孔性を有することを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項８】
温度により、固体、半固体または液体の状態に、可逆的な相転移が起こることを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項９】
組織損傷部位に塗布されて損傷部位の形態に合わせて形態が変形されることを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項１０】
損傷された組織の再生用または修復用であることを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項１１】
前記損傷された組織は、脊髄であることを特徴とする請求項１０に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項１２】
前記損傷された組織は、慢性脊髄損傷であることを特徴とする請求項１０に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項１３】
フィブリンまたはフィブリノゲンを、０．５ないし２０ｍｇ／ｍｌの濃度、ラミニンを１ないし１００μｇ／ｍｌの濃度、またはヒアルロン酸を１０μｇ／ｍｌないし５ｍｇ／ｍｌの濃度で含むことを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項１４】
前記ヒドロゲルパッチは、脊髄損傷患者の損傷部位に、脊髄非浸襲的方法によって使用可能なことを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項１５】
トロンビンを追加して含むことを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項１６】
フィブリン、またはフィブリン及びフィブリノゲンと、
ラミニンと、
ヒアルロン酸、またはその薬学的に許容可能な塩と、を含む脊髄損傷治療用薬学的組成物。
【請求項１７】
細胞成長因子をさらに含むことを特徴とする請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記細胞成長因子は、神経細胞成長因子、血管内皮細胞成長因子、線維芽細胞成長因子、骨形成タンパク質、上皮細胞成長因子、肝細胞成長因子、形質転換成長因子、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記神経細胞成長因子は、ＢＤＮＦ（brain-derived neurotropic factor）、ＧＤＮＦ（glial cell derived neurotropic factor）、ＣＮＴＦ（ciliary neurotropic factor）、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）、ｃＡＭＰ（cyclic adenocyne monophosphate）、ＮＴ（neurotropin）、ＮＴ３（neurotropin−３）、ＮＴ４（neurotropin−４）、Ｔ３（triiodo−Ｌ−thyronine）、ＳＨＨ（sonic hedgehog）、及びＰＤＧＦ（platelet-derived growth factor）からなる群で選択された１種以上を含むことを特徴とする請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記組成物が固体、または半固体である場合、表面に多孔性を有することを特徴とする請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
パウダー剤形であることを特徴とする請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
損傷された組織の再生用または修復用であることを特徴とする請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
フィブリンまたはフィブリノゲンを、０．５ないし２０ｍｇ／ｍｌの濃度、ラミニンを、１ないし１００μｇ／ｍｌの濃度、またはヒアルロン酸を、１０μｇ／ｍｌないし５ｍｇ／ｍｌの濃度で含むことを特徴とする請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
トロンビンを追加して含むことを特徴とする請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記脊髄損傷は、慢性脊髄損傷であることを特徴とする請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
フィブリノゲンと、
ラミニンと、
ヒアルロン酸、またはその薬学的に許容可能な塩と、を含むゾル状態の組成物に対してトロンビンを添加し、ヒドロゲルパッチを製造する方法。
【請求項２７】
前記ゾル状態の組成物に、神経細胞成長因子、血管内皮細胞成長因子、線維芽細胞成長因子、骨形成タンパク質、上皮細胞成長因子、肝細胞成長因子、形質転換成長因子、またはそれらの組み合わせを配合する段階を追加して含むことを特徴とする請求項２６に記載のヒドロゲルパッチを製造する方法。
【請求項２８】
ヒドロゲルパッチを、溶液内で、４ないし−２１０℃に低温保存または凍結保存する段階を含むことを特徴とする請求項２６に記載のヒドロゲルパッチを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロゲルパッチ、その製造方法、及びそれを含む脊髄損傷治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経系（脊髄）に損傷を負った場合、運動機能障害及び泌尿器障害の医療的障害だけではなく、心理的障害を伴う。現在、脊髄損傷治療法として、神経損傷を緩和させるために、外科的治療、メチルプレドニゾロン（methylprednisolone）のようなステロイド（steroid）系の薬物治療、またはリハビリ治療が行われている。しかし、それらは、神経損傷による障害を緩和させる治療法であるのみ、損傷された脊髄神経再生のための根本的な脊髄神経再生治療法は、現在まで全くない状態である。
【０００３】
損傷された脊髄神経再生誘導のために、神経損傷部位に、生物学的神経再生誘導環境を造成する方法、または神経幹細胞、希少突起阿膠前駆細胞、間葉系幹細胞、シュワン氏細胞または嗅覚神経外被細胞などを投与する細胞治療法が開発されている。前記細胞治療法に使用する細胞治療剤開発のために成体幹細胞（adult stem cell）、胚芽幹細胞（embryonic stem cell）または誘導万能幹細胞（induced pluripotent stem cell）が主に使用されている。
【０００４】
しかし、成体幹細胞の場合、希少性、制限された分化能、そして他家細胞使用による免疫拒否反応の問題が存在する。また、胚芽幹細胞の場合、倫理的問題、及び他家細胞使用による免疫拒否反応の問題が存在し、胚芽幹細胞及び誘導万能幹細胞は、共通して発癌可能性の問題が存在する。
【０００５】
脊髄損傷の場合、脊髄損傷の急性期間である損傷後４８時間が、脊髄損傷治療の適正期として知られている。細胞治療剤の場合、免疫拒否反応を回避するために、自家神経幹細胞、希少突起阿膠前駆細胞などの神経再生細胞が必要であるが、急性脊髄損傷患者から、前述の細胞を採取し、急性期間内に細胞治療剤として使用する細胞数の確保は、不可能な現実である。また、患者体細胞から作製される誘導万能幹細胞または直接交差分化細胞は、自家再生能により、細胞治療剤作製に必要な細胞数を充足することができるが、それらを作製する時間、及び目的細胞に分化する期間が、急性期治療に合わないので、脊髄損傷治療の適正期である急性期間に治療が不可能である。
【０００６】
従って、損傷された脊髄神経を、適正時期に、脊髄非浸襲的方法で、脊髄の損傷を最小化させ、損傷された脊髄神経再生を誘導する根本的な脊髄神経再生技術開発が要求されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995
【非特許文献２】Kim JB et al. Nat Protoc. 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一様相は、フィブリン及び／またはフィブリノゲン；ラミニン、またはラミニン由来ペプチドまたはタンパク質；及び／またはヒアルロン酸またはその塩を含むヒドロゲルパッチを提供するものである。
【０００９】
他の様相は、フィブリノゲン、ラミニンまたはラミニン由来ペプチド；及び／またはヒアルロン酸またはその塩を含むゾル（sol）状態の組成物に対してトロンビンを添加し、ヒドロゲルパッチを製造する方法を提供するものである。
【００１０】
さらに他の様相は、フィブリン及び／またはフィブリノゲン；ラミニン、またはラミニン由来ペプチドまたはタンパク質；及び／またはヒアルロン酸またはその塩を含む組成物を提供するものである。
【００１１】
さらに他の様相は、ラミニン、またはラミニン由来ペプチドまたはタンパク質；及びヒアルロン酸またはその塩を含む組成物を提供するものである。
【００１２】
さらに他の様相は、前記ヒドロゲルパッチを溶液上で、４ないし−２１０℃で、低温保存または凍結保存する方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
ヒドロゲルパッチ及び前記ヒドロゲルパッチを製造する方法に係り、一様相によるヒドロゲルパッチによれば、損傷された組織を回復させ、脊髄損傷を含んだ多様な疾患に使用される効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】一具体例によるヒドロゲルパッチ作製方法と、０．３ｍｍないし０．８ｍｍの多様な大きさのヒドロゲルパッチとを示した図面である。
【図２】一具体例によるヒドロゲルパッチ剤形（液体、ゲル、パウダー）（上側パネルの左側から右側）と、パウダー剤形のゲル化（下側パネル）を示した図面である。
【図３】一具体例によるヒドロゲルパッチの断面、表面を、走査電子scanning顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した凍結保存の前後を示したイメージである。
【図４】一具体例によるヒドロゲルパッチの組成物（フィブリン、ヒアルロン酸及びラミニン）と、それを処理していないグループ（無処理（bare））との試験管内（in vitro）マウス神経幹細胞分化に対する影響を、光学顕微鏡及び免疫蛍光染色法を使用して確認した図面であり、スケールバーは、それぞれ１００μｍ及び５０μｍを示す。
【図５】一具体例によるヒドロゲルパッチの各構成成分単独と、２成分組み合わせとによる試験管内マウス神経幹細胞分化に対する影響を、免疫蛍光染色法を使用し、神経細胞（Ｔｕｊ１）、星状膠細胞（ＧＦＡＰ）の分化分布図で示したイメージであり、スケールバーは、５０μｍを示す。
【図６】一具体例によるヒドロゲルパッチの各構成成分単独と、２成分組み合わせとによる試験管内マウス神経幹細胞分化に対する影響を、神経細胞（Ｔｕｊ１）分化分布図で定量化して示したグラフであり、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５である。
【図７】一具体例によるヒドロゲルパッチの各構成成分単独と、２成分組み合わせとに成長因子を追加し、それらの試験管内マウス神経幹細胞分化に対する影響を、神経細胞（Ｔｕｊ１）分化分布図で定量化して示したグラフであり、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５である。
【図８】一具体例によるヒドロゲルパッチに、各成長因子（ＦＧＦ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ｃＡＭＰ、ＮＴ３、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＳＨＨ、Ｔ３またはＶＥＧＦ）を追加し、それらの試験管内マウス神経幹細胞分化に対する影響を、神経細胞（Ｔｕｊ１）分化分布図で定量化して示したグラフであり、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５である。
【図９】一具体例によるヒドロゲルパッチを生体内に移植した場合、生分解されることを示したイメージである。
【図１０】一具体例によるヒドロゲルパッチを、損傷された脊髄に移植する過程を示したイメージである。
【図１１】脊髄損傷動物モデルの脊髄損傷１週間後、脊髄損傷によって損失された脊髄損傷動物モデルの後足動きを観察した図面である。
【図１２】ヒドロゲルパッチの移植なしに、ＰＢＳのみを移植部位に塗布した脊髄損傷動物モデルの脊髄損傷８週目の後足動きを観察した図面である。
【図１３】ヒドロゲルパッチ２（hydrogel patch ２ without ＧＦ）を移植した脊髄損傷動物モデルの脊髄損傷８週目の後足動きを観察した図面である。
【図１４】ヒドロゲルパッチ５（hydrogel patch２ with ＧＦ）を移植した脊髄損傷動物モデルの脊髄損傷８週目の後足動きを観測した図面である。
【図１５】一具体例によるヒドロゲルパッチ（パッチ３ with ＰＢＳ、パッチ３及びパッチ６）移植によるＢＢＢ点数値を示したグラフである。
【図１６】一具体例によるヒドロゲルパッチ（パッチ１、パッチ２及びパッチ３）移植によるＢＢＢ点数値を示したグラフである。
【図１７】一具体例によるヒドロゲルパッチ（パッチ４、パッチ５及びパッチ６）移植によるＢＢＢ点数値を示したグラフである。
【図１８】一具体例によるヒドロゲルパッチ（パッチ２及びパッチ５）移植によるＢＢＢ点数値を示したグラフである。
【図１９】一具体例によるヒドロゲルパッチの移植による組織学的分析結果を示したイメージである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一様相は、ヒドロゲルパッチを提供する。
【００１６】
他の様相は、薬学的組成物を提供する。
【００１７】
さらに他の様相は、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、個体に投与する段階を含む疾病、例えば、脊髄損傷を治療したり予防したりする方法を提供する。
【００１８】
さらに他の様相は、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物を、疾病の治療剤製造に使用するための用途を提供する。
【００１９】
前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、フィブリン及び／またはフィブリノゲン；ラミニン、またはラミニン由来ペプチドまたはタンパク質；及び／またはヒアルロン酸またはその塩を含んでもよい。例えば、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、ラミニン、またはラミニン由来ペプチドまたはタンパク質と、ヒアルロン酸またはその塩とを含んでもよい。
【００２０】
用語「治療」は、疾患、障害または病態、またはその１以上の症状の軽減、進行抑制または予防を称したり、それを含んだりし、「薬剤学的有効量」は、疾患、障害または病態、またはその１以上の症状の軽減、進行抑制または予防に十分である、本願で提供される発明を実施する過程で利用される組成物の任意量を意味する。
【００２１】
用語「投与する」、「塗布する」、「導入する」及び「移植する」は、相互交換的に使用され、一具体例によるパッチまたはその組成物の所望部位への、少なくとも部分的局所化をもたらす方法または経路による個体内への一具体例によるパッチまたはその組成物の配置を意味する。
【００２２】
本明細書において、用語「パッチ」は、一定形状を有し、目的部位に塗布、付着または接触される手段を意味する。
【００２３】
一具体例において、ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、固体と液体との中間性質を有するものでもある。前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、無定形、球形、半球形、円盤形または円柱形でもある。また、例えば、前記ヒドロゲルパッチの直径は、０．０５ｍｍないし１０ｃｍ、０．１ｍｍないし５ｃｍ、０．１ｍｍないし３ｃｍ、または０．２ｍｍないし１．５ｃｍでもあり、そういう大きさまたは形態でも提供される。また、前記ヒドロゲルパッチは、目的部位（例えば、組織損傷部位）に、塗布、移植、付着または接触され、損傷部位の形態に合わせて形態が変形されるものでもある。
【００２４】
他の具体例において、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、固体（パウダー含む）、半固体または液体でもある。また、例えば、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、固体（パウダー含む）、半固体または液体状態に、可逆的な相転移（例えば、温度変化による）が起こるものでもある。前記ヒドロゲルパッチは、温度条件など周辺状況により、可逆的な相転移が起こるので、一具体例によるヒドロゲルパッチは、固体（パウダー含む）または液体の状態に生産、提供された後、目的部位に、投与前、投与時または投与後に、ヒドロゲルパッチに転換されても使用される。例えば、前記ヒドロゲルパッチは、フィブリノゲン、ラミニン及びヒアルロン酸を含むゾル（sol）状態で提供され、ユーザがフィブリノゲンをフィブリンに転換させることができる物質（例えば、トロンビン）を使用することにより、一具体例によるヒドロゲルパッチを作製して使用することができる。従って、一具体例によるヒドロゲルパッチは、フィブリン及び／またはフィブリノゲン；ラミニン；及び／またはヒアルロン酸を含む組成物、例えば、固体（パウダー）、液体（ゾル）または半固体の組成物の前駆薬物形態でも提供される。前駆薬物の形態で提供された組成物は、生体内で、ヒドロゲルパッチに製造または変形されて作用することができる。また、一具体例によるヒドロゲルパッチは、トロンビンをさらに含むか、あるいはトロンビンがキットとして共に提供される。
【００２５】
さらに他の具体例において、ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、多孔性でもある。詳細には、ヒドロゲルパッチの表面に、多孔性（微細孔）を有するものでもある。特定理論に制限されることがなしに、一具体例によるヒドロゲルパッチは、多孔性を有することにより、活性物質間の相互作用を増進させることができる。
【００２６】
前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、患者の脊髄損傷部位に、脊髄非浸襲的方法で使用可能である。本明細書において、非浸襲的な方法は、注射針を利用した、脊髄に浸湿的方法の細胞治療剤または薬物投与法と区分されたものであり、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、目的部位に、他の伝達手段（例えば、シリンジ）なしに、移植、塗布、付着または接触される。前記脊髄非浸襲的な方法でもって使用可能であるということは、注射針と共に、脊髄に浸湿的に治療用組成物を注入し、注射針による注入部位の脊髄損傷を起こす方法と異なり、脊髄非浸襲的な方法は、脊髄の損傷なしに、損傷部位に塗布または移植を介して、注射針を介した組成物の注入方法によって発生する脊髄損傷なしに、組成物を損傷部位に伝達する方法を意味する。また、前記ヒドロゲル配置または組成物は、前記の浸湿的方法によって発生する脊髄の二次損傷を防止する役割を行うことができる。また、前記ヒドロゲルパッチは、一定時間が経過した後、生体内で生分解されもする。
【００２７】
一具体例において、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、フィブリン及び／またはフィブリノゲンを含んでもよい。生体内で作用する最終薬理学的物質には、フィブリンを含むが、前駆薬物の形態として、フィブリノゲンをフィブリンの代わりに使用することができる。また、フィブリンをフィブリノゲンに転換させる物質の量により、一具体例による前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物には、フィブリノゲンまたはトロンビンが一部含まれてもよい。従って、本明細書は、フィブリノゲン；ラミニン；及び／またはヒアルロン酸を含む前駆薬物を追加して提供することができる。前記フィブリンまたはフィブリノゲンは、０．５ないし２０ｍｇ／ｍｌ、０．８ないし１６ｍｇ／ｍｌ、０．８ないし１２ｍｇ／ｍｌ、１．０ないし１０ｍｇ／ｍｌ、２ないし８ｍｇ／ｍｌ、または４ないし８ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれてもよい。
【００２８】
前記フィブリノゲン（fibrinogen）糖蛋白質は、肝臓の肝細胞で作られる溶解性のα，β及びγサブユニットからなるヘキサマー（hexamer）である。フィブリノゲンは、トロンビン（thrombin）酵素と反応し、溶解性から不溶解性のフィブリン（fibrin）ポリマー（polymer）纎維質（fiber）に相転移することになる。
【００２９】
前記トロンビン酵素は、セリンタンパク質加水分解酵素（serine protease）であり、溶解性フィブリノゲンを不溶解性フィブリンに形質変化させる酵素である。前記トロンビンは、フィブリノゲンをフィブリンに変化させ、ゾル状態のヒドロゲルをゲル化させる役割を行うことができる。
【００３０】
本明細書において、用語「ラミニン（laminin）」は、基底板（basal lamina）を構成する細胞外基質タンパク質であり、α，β及びγサブユニットからなるヘテロ三量体（heterotrimeric）タンパク質を意味する。従って、前記ラミニンは、ラミニン全長タンパク質だけでなく、ラミニン由来ペプチドまたはタンパク質を含んでもよい。例えば、前記ラミニンは、ラミニン−１、ラミニン−２、ラミニン−３、ラミニン−４、ラミニン−５Ａ、ラミニン−５Ｂ、ラミニン−６、ラミニン−７、ラミニン−８、ラミニン−９、ラミニン−１０、ラミニン−１１、ラミニン−１２、ラミニン−１４またはラミニン−１５でもある。また、前記ラミニン由来ペプチドは、α鎖、γ鎖またはβ鎖でもある。前記ラミニンは、１ないし１００μｇ／ｍｌ、２ないし８０μｇ／ｍｌ、５ないし５０μｇ／ｍｌ、５ないし２５μｇ／ｍｌ、８ないし２０μｇ／ｍｌ、または８ないし１５μｇ／ｍｌの濃度で含まれてもよい。
【００３１】
前記ヒアルロン酸（hyaluronic acid）グリコサミノグリカン（glycosaminoglycan）は、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとが、β−（１→４）とβ−（１→３）との変化を有するグルコシド結合（glycosidic bonds）によってなる二糖結合の多糖類であり、二糖結合の長さにより、多様な分子量を有している。一具体例において、ヒアルロン酸の分子量は、５，０００ないし２０，０００，０００Ｄａでもある。さらに詳細には、ヒアルロン酸の分子量は、０．５ないし４．０ｘ１０６Ｄａ、１．０ないし２．０ｘ１０６Ｄａ、または１．５ないし１．８ｘ１０６Ｄａでもある。前記ヒアルロン酸は、１０μｇ／ｍｌないし５ｍｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌないし５ｍｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌないし３ｍｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌないし１ｍｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌないし１ｍｇ／ｍｌ、または３００μｇ／ｍｌないし８００μｇ／ｍｌの濃度で含まれてもよい。また、前記ヒアルロン酸は、塩、薬学的に許容可能な塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩またはマグネシウム塩などの形態でも提供される。
【００３２】
他の具体例において、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、細胞成長因子をさらに含んでもよい。前記細胞成長因子は、神経細胞成長因子、血管内皮細胞成長因子、線維芽細胞成長因子、骨形成タンパク質（bone morphogenetic protein）、上皮細胞成長因子（epidermal growth factor）、肝細胞成長因子、形質転換成長因子、またはそれらの組み合わせでもある。さらに詳細には、前記成長因子は、胎盤成長因子、大食細胞コロニー刺激因子、顆粒球大食細胞コロニー刺激因子、ニューロピリン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）−１、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、エリスロポエチン、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−ベータ、ＩＧＦ−１、オステオホンティン、プレイオトロピン、アクチピン、エンドセリン−１、及びそれらの組み合わせを含んでもよい。前記神経細胞成長因子は、ＢＤＮＦ（brain-derived neurotropic factor）、ＧＤＮＦ（glial cell derived neurotropic factor）、ＣＮＴＦ（ciliary neurotropic factor）、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）、ｃＡＭＰ（cyclic adenocyne monophosphate）、ＮＴ（neurotropin）、ＮＴ３（neurotropin−３）、ＮＴ４（neurotropin−４）、Ｔ３（triiodo−Ｌ−thyronine）、ＳＨＨ（sonic hedgehog）及びＰＤＧＦ（platelet-derived growth factor）からなる群で選択された１種以上を含むものでもある。前記血管内皮細胞成長因子は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）−Ａ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｅを含んでもよい。前記細胞成長因子は、成長因子の種類により、ヒドロゲルパッチまたはその組成物に含まれる濃度が異なるが、一般的には、１ｎｇ／ｍｌないし１，０００ｎｇ／ｍｌ、または０．１μＭないし１００μＭの濃度で含まれてもよい。前記細胞成長因子は、フィブリン、ラミニン及びヒアルロン酸を含むヒドロゲルパッチまたはその組成物の組織損傷回復効果を上昇
させる役割を行うことができる。
【００３３】
前記ＢＤＮＦ（brainderivedneurotrophicfactor（ＢＤＮＦ）タンパク質は、ＢＤＮＦ遺伝子によってコーディングされる。ＢＤＮＦタンパク質は、中枢神経系神経細胞の生存、並びにｇ新たな神経細胞の分化及び成長に一助となると知られている。
【００３４】
前記ＧＤＮＦ（glial cell line-derived neurotrophic facto）タンパク質は、ＧＤＮＦ遺伝子によってコーディングされる。ＧＤＮＦタンパク質は、中枢神経系の神経細胞において、ドパミン作動性神経細胞（dopaminergic neuron）と運動神経細胞（motor neuron）との生存及び分化に一助となると知られている。
【００３５】
前記ＣＮＴＦ（ciliary neuro trophic factor）タンパク質は、ＣＮＴＦ遺伝子によってコーディングされる。ＣＮＴＦタンパク質は、神経伝達物質の生成を促進し、神経細胞と希少突起阿膠細胞との生存に一助になると知られている。
【００３６】
前記ＮＴ−３（neurotrophin−３）タンパク質は、ＮＴ−３遺伝子によってコーディングされる。ＮＴ−３タンパク質は、中枢神経系神経細胞の生存、並びに新たな神経細胞の分化及び成長に一助になると知られている。
【００３７】
前記 ｃＡＭＰ（cyclic adenosine monophosphate）タンパク質は、アデニル酸シクラーゼ（adenylate cyclase）の作用で、ＡＴＰ（adenosine triphosphate）に由来するタンパク質であり、細胞の二次伝達子（second messenger）の役割を行う。神経細胞においては、神経伝達物質の生産、保存、配布のように、神経伝達物質の全般的な統制に係わっていると知られており、神経細胞の生存と分化とに一助になると知られており、血管内皮細胞の障壁の役割、増殖、酸化窒素（nitric oxide）生成に役割を行うと知られている。
【００３８】
前記ＳＨＨ（sonic hedgehog）タンパク質は、ＳＨＨ遺伝子によってコーディングされる。ＳＨＨは、hedgehog信号伝達経路に役割を行う、神経系においては、特に、運動神経細胞の分化に役割を行うと知られている。
【００３９】
前記Ｔ３（triiodothyronine）ホルモンは、甲状腺ホルモンの一種であり、生体内大部分の生理学的役割に影響を与える。神経系においては、特に、希少突起阿膠前駆細胞の増殖を阻止し、希少突起阿膠細胞への分化を促進させる役割を行うと知られている。
【００４０】
前記ＰＤＧＦ（platelet-derived growth factor）のsubtypeとしては、−ＡＡ、−ＢＢ、−ＡＢ、−ＣＣ、−ＤＤがあり、ＰＤＧＦＡ（platelet-derived growth factor subunit Ａ遺伝子からコーディングされるＰＤＧＦＡ subunitのhomodimerの場合、ＰＤＧＦ−ＡＡであり、各subtypeごとに、bindingするＰＤＧＦのreceptor（ＰＤＧＦＲ）が異なる。ＰＤＧＦ−ＡＡ（platelet-derived growth factor−ＡＡ）は、２合体の糖蛋白質であり、特に、神経系においては、希少突起阿膠前駆細胞のＰＤＧＦ受容体（receptor）を活性化させるＦＧＦ（fibroblast growth factor）と共に、希少突起阿膠前駆細胞の増殖を維持する役割を行うと知られている。
【００４１】
前記ＶＥＧＥ（vascular endothelial growth factor）タンパク質は、血管透過成長因子（ＶＰＦ：vascular permeability factor）の一種であり、新生血管生成（angiogenesis）及び血管化（vascularization）に役割を行う。特に、ＶＥＧＦは、胚発達（embryonic development）、傷などの要素であり、新たな血管生成に役割を行うと知られていて、毒性及びストレスによる神経細胞の死滅を防止し、神経細胞生存の一助になると知られている。
【００４２】
他の具体例において、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、コラーゲンを含むか、あるいは実質的に含まない。特定理論に制限されることなしに、前記コラーゲンは、組成物の構成成分として含まれるか、あるいは実質的に含まれないが、含まれないことが、含まれることより、一側面によっては、さらに有利な場合がある。
【００４３】
また、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、細胞を実質的に含まない。本明細書において、「実質的に含まない（substantially does not comprise）」は、コラーゲンまたは細胞がヒドロゲルパッチまたはその組成物の活性、または薬理的活性に影響を及ぼさないほどに含まれるか、あるいは全然含まれないことを意味する。一具体例による前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、細胞を実質的に含まないことにより、一般的に、損傷された組織の再生に使用される細胞治療剤とは区分されたものでもある。
【００４４】
前記コラーゲンタンパク質は、代表的には、Type Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖに区分され、Type Ｉコラーゲンが身体に最も多く存在する。コラーゲンは、α１とα２との三重螺旋（triple helix）構造をなしている。
【００４５】
一具体例において、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、フィブリン及び／またはフィブリノゲンと、ラミニンと、ヒアルロン酸またはその塩とから構成されたものでもある。またそれ以外にも、本明細書において言及された成分のうち１種以上が追加して含まれて構成されもする。例えば、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、フィブリン及び／またはフィブリノゲンと、ラミニンと、ヒアルロン酸またはその塩と、選択的には、トロンビンと、選択的には、コラーゲンと、選択的には、細胞成長因子とから構成されたものでもある。
【００４６】
一具体例において、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、細胞接着を向上させるものでもある。従って、本明細書は、追加して、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物を個体に投与する段階を含む個体の細胞（例えば、神経細胞）の接着を向上させる方法を提供する。
【００４７】
さらに他の具体例において、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、神経幹細胞の神経細胞への分化を増大させることでもある。従って、本明細書は、追加して、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物を個体に投与する段階を含む個体の神経幹細胞の神経細胞への分化を増大させる方法を提供する。
【００４８】
さらに他の具体例において、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、炎症反応を減らし、神経損傷を抑制したり、運動神経細胞と希少突起阿膠細胞との再生の一助となり、髄鞘が形成された運動神経細胞の再生を向上させることでもある。
【００４９】
さらに他の具体例において、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、脊髄損傷のような外傷によって損傷された神経、及び脳卒中のような神経退化によって損傷された神経再生を誘導する機能を行うことができる。従って、本明細書は、追加して、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物を個体に投与する段階を含む個体の神経細胞の損傷を抑制するか、神経再生を誘導するか、あるいは運動神経細胞を再生させる方法を提供する。
【００５０】
さらに他の具体例において、前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、脊髄損傷治療によって引き起こされる脊髄二次損傷を抑制することでもある。
【００５１】
従って、一具体例による前記ヒドロゲルパッチまたはその組成物は、損傷された組織の再生用または修復用でもある。詳細には、前記損傷された組織は、脊髄でもある。
【００５２】
本明細書において、脊髄損傷（ＳＣＩ：spinal cord injury）は、脊髄の圧迫、脱臼による損傷を意味する。該脊髄損傷は、外傷性脊髄損傷、脊椎退行性疾患（脊椎症など）、脊椎炎症性疾患（脊椎炎、慢性リュウマチ関節炎など）、腫瘍（脊髄腫瘍、脊椎腫瘍など）、血管性疾患（脊髄出血、脳卒中、骨髓外血管障害による脊髄マヒなど）、脊髄炎（くも膜炎、ウイルス性脊髄炎、細菌性脊髄炎など）、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症などを含んでもよい。一具体例によるヒドロゲルパッチまたはその組成物は、急性脊髄損傷だけでなく、慢性脊髄損傷にも治療効果を有するものでもある。従って、前記脊髄損傷は、慢性脊髄損傷でもある。
【００５３】
一具体例による前記組成物の投与用量は、０．０１ｍｇないし１０，０００ｍｇ、０．１ｍｇないし１，０００ｍｇ、１ｍｇないし１００ｍｇ、０．０１ｍｇないし１，０００ｍｇ、０．０１ｍｇないし１００ｍｇ、０．０１ｍｇないし１０ｍｇ、または０．０１ｍｇないし１ｍｇでもある。ただし、該投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢・体重・性別・病的状態・食べ物・投与時間・投与経路・排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様に処方され、当業者であるならば、そのような要因を考慮し、投与量を適切に調節することができる。投与回数は、１回、または臨床的に容認可能な副作用の範囲内において、２回以上が可能であり、投与部位についても、１ヵ所または２ヵ所以上に投与することができる。ヒト以外の動物についても、ｋｇ当たりヒトと同一投与量にするか、あるいは、例えば、目的とするの動物とヒトとの器官（心臓など）の容積比（例えば、平均値）などにより、前述の投与量を換算した量を投与することができる。可能な投与経路には、経口、舌下、非経口（例えば、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、硬膜内または静脈内）、直腸、局所（経皮含む）、吸入及び注射、または移植性装置または物質挿入を含んでもよい。一具体例による治療の対象動物としては、ヒト、及びそれ以外の目的とする哺乳動物を例として挙げることができ、具体的には、ヒト、猿、マウス、ラット、兎、羊、牛、犬、馬、豚などが含まれる。
【００５４】
一具体例による薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体及び／または添加物を含んでもよい。例えば、滅菌水、生理食塩水、慣用の緩衝剤（リン酸、クエン酸、それ以外の有機酸など）、安定剤、塩、酸化防止剤（アスコルビン酸など）、界面活性剤、懸濁液剤、等張化剤または保存剤などを含んでもよい。局所投与のために、生体高分子（biopolymer）などの有機物、ヒドロキシアパタイトなどの無機物、具体的には、コラーゲンマトリックス、ポリ乳酸の重合体または共重合体、ポリエチレングリコールの重合体または共重合体、及びその化学的誘導体などと組み合わせるものも含んでもよい。
【００５５】
一具体例による薬学的組成物は、その投与方法や剤形により、必要な場合、懸濁液剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、還元剤、酸化防止剤などを適切に含んでもよい。前述のところに例示されたものなどを始めとし、本発明に適する薬学的に許容される担体及び製剤は、文献［Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995］に詳細に記載されている。一具体例による薬学的組成物は、当該発明が属する技術分野において当業者であるならば、容易に実施することができる方法により、薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位用量形態に製造されるか、あるいは多用量容器内に移し入れて製造される。このとき、該剤形は、オイル内または水性媒質内の溶液、懸濁液または乳化液の形態であったり、粉末、顆粒、錠剤またはカプセル型であったりもする。
【００５６】
さらに他の様相は、フィブリノゲン；ラミニンまたはラミニン由来ペプチド；及びヒアルロン酸、またはその薬学的に許容可能な塩を含むゾル状態の組成物に対して、トロンビンを添加し、ヒドロゲルパッチを製造する方法を提供する。
【００５７】
前記方法は、また前記ゾル状態の組成物に、細胞成長因子を配合する段階を追加して含んでもよい。
【００５８】
前記方法は、またトロンビンを添加してゲル化させた後、さらにトロンビンを添加し、二次ゲル化させる段階を含んでもよい。前記ゲル化は、１０ないし４０℃で、５分ないし３時間行われもする。また、前記トロンビンは、約１ないし１０Ｕ／ｍｌの濃度で添加されるものでもある。前記ヒドロゲルパッチは、フレームの様子により、多様な形態または大きさに作製することができる。
【００５９】
前記方法は、またヒドロゲルパッチを、溶液内において、４ないし−２１０℃に低温保存または凍結保存する段階を含んでもよい。前記溶液は、ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）を含んでもよいが、ヒドロゲルパッチの化学的または物理的な性質を実質的に変化させないものであるならば、いかなるものでも使用される。前記ヒドロゲルパッチは、低温保存または凍結保存しても、その形態または活性が実質的に変わらない。
【００６０】
前記ヒドロゲルパッチ、フィブリン及び／またはフィブリノゲン、ラミニン、ヒアルロン酸または細胞成長因子については、前述の通りである。
【００６１】
さらに他の様相は、前記ヒドロゲルパッチを、溶液（例えば、ＤＭＳＯ）において、４ないし−２１０℃で低温保存または凍結保存する方法を提供する。
【００６２】
前記方法において、低温保存または凍結保存したヒドロゲルパッチは、脊髄損傷治療の適正期である急性段階の脊髄損傷患者治療のために、患者発生時、直ちに使用可能であり、低温保存状態または凍結保存状態から常温に移されて溶けても、形態学的変化がなく、脊髄損傷治療効果に大差がない。
【００６３】
以下、本発明について、参考例及び実施例によって詳細に説明する。ただし、下記参考例及び実施例は、本発明を例示するためのものであるのみ、本発明を制限するものであると解釈されるものではない。
【実施例】
【００６４】
＜実施例＞ヒドロゲル配合及びパッチ作製
１−１．ヒドロゲル配合
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（Gibco、１１３３０−０５７）培養液に、フィブリノゲン（Sigma、Ｆ８６３０）が２０ｍｇ／ｍｌになるように、３７℃で３０分間溶解し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（Gibco、１１３３０−０５７）培養液に、ヒアルロン酸（Sigma、５３７４７）が５ｍｇ／ｍｌになるように、４℃で一日溶解し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（Gibco、１１３３０−０５７）培養液に、トロンビン（Sigma、Ｔ４６４８）が２００Ｕ／ｍｌになるように溶解した。コラーゲン（Corning、３５４２３６）は、１０Ｘ ＤＰＢＳ（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline、Sigma、Ｄ５６５２−１０Ｌ）、３次水及び１Ｎ ＮａＯＨ（Millipore、１．００９８３．１０１１）で中性化及びイオン化させ、最終濃度が３．００ｍｇ／ｍＬになるように希釈した。
【００６５】
その後、前記成分を配合し、ゾル状態のヒドロゲルを作製した。各成分の最終濃度は、次の通りである：
フィブリノゲン（Sigma、Ｆ８６３０）１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍＬまたは１０ｍｇ／ｍｌ
ラミニン（Thermofisher、２３０１７−０１５）５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ
ヒアルロン酸（Sigma、５３７４７）０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌ
コラーゲン（Corning、３５４２３６）１．２ｍｇ／ｍｌ
【００６６】
１−２．ヒドロゲル配合に神経細胞成長因子の添加
実施例１−１で配合したゾル状態のヒドロゲルに対して、Penicillin／Streptomycin（Invitrogen、１５１４０−１２２）、２ｍＭ Ｌ−Glutamine（Invitrogen、２５０３０−０８１）、Ｎ２ supplement（Gibco、１７５０−０４８）及びＢ２７ supplement minus vitamin Ａ（Gibco、１２５８７０１０）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Gibco、１１３３０−０５７）と、Neurobasal medium（Gibco、２１１０３０４９）とを１：１で配合した培養液に、下記神経細胞成長因子及び／または血管内皮細胞成長因子を添加したものを配合した：
recombinant Human ＢＤＮＦ（Peprotech、４５０−０２）１０ｎｇ／ｍｌ、recombinant Human ＧＤＮＦ（Peprotech、４５０−１０）１０ｎｇ／ｍｌ、recombinant Human ＮＴ−３（Peprotech、４５０−０３）、５ｎｇ／ｍｌ、ｄｂ−ｃＡＭＰ（Sigma、Ｄ０２６０）１μＭ、Ｔ３（Sigma、Ｔ６３９７）６０ｎｇ／ｍｌ、recombinant Human sonic hedgehog（ＳＨＨ；Peprotech、１００−４５）５０ｎｇ／ｍｌ、recombinant Human ＰＤＧＦ−ＡＡ（Peprotech、１００−１３Ａ−１００）、recombinant Human ＦＧＦ−ｂａｓｉｃ（Peprotech、１００−１８Ｂ）１０ｎｇ／ｍｌ及びrecombinant Human ＶＥＧＦ１６５（Peprotech、１００−２０）２０ｎｇ／ｍｌ
【００６７】
１−３．ヒドロゲルパッチの作製
図１に図式化して示したように、ヒドロゲルパッチを作製した。
【００６８】
具体的には、実施例１−１または１−２で配合したゾル状態のヒドロゲルに、５Ｕ／ｍｌのトロンビン（Sigma、Ｔ４６４８）を添加し、３７℃で１時間培養してゲル化させた後、紫外線（ultraviolet light）で滅菌されたパラフィルムに、円形に、０．３から０．８ｍｍの円縁をパンチングし、１０ｃｍ petridishに付着させた。その後、５Ｕ／ｍｌのトロンビンを円縁に分注した後、１５ないし６０μＬのヒドロゲルを分注し、ヒドロゲルに気泡が発生しないように、ヒドロゲルとトロンビンとを配合し、約２分間常温でゲル化過程を経た後、３７℃で１時間二次ゲル化過程を経た。ゲル状態のヒドロゲルを、円縁のパラフィルムから分離し、０．３ｍｍから０．８ｍｍの多様なサイズのパッチ状に作製した。作製されたヒドロゲルパッチは、実施例１−２の神経細胞成長因子及び血管内皮細胞成長因子が添加された培養液に保存した。
【００６９】
前記方法によって作製されたヒドロゲル形態をヒドロゲルパッチとし、作製されたヒドロゲルパッチの種類を以下に整理した。
【００７０】
以下、明細書においては、ヒドロゲルパッチ１ないし６と記載する。
ヒドロゲルパッチ１：フィブリン、
ヒドロゲルパッチ２：フィブリン＋ラミニン＋ヒアルロン酸
ヒドロゲルパッチ３：フィブリン＋ラミニン＋ヒアルロン酸＋コラーゲン
ヒドロゲルパッチ４：フィブリン＋神経細胞成長因子及び血管内皮細胞成長因子（実施例１−２に記載された全ての成長因子）
ヒドロゲルパッチ５：フィブリン＋ラミニン＋ヒアルロン酸＋神経細胞成長因子及び血管内皮細胞成長因子（実施例１−２に記載された全ての成長因子）
ヒドロゲルパッチ６：フィブリン＋ラミニン＋ヒアルロン酸＋コラーゲン＋神経細胞成長因子及び血管内皮細胞成長因子（実施例１−２に記載された全ての成長因子）
【００７１】
１−４．ヒドロゲルパッチの剤形及び凍結保存可能いかん確認
前記作製したヒドロゲルパッチの多様な剤形を製造し、その凍結保存可能いかんを確認した。
【００７２】
具体的には、実施例１−３のような方法で作製したヒドロゲルパッチ２の可逆的な相転移を確認し、その結果を図２に示した。
【００７３】
図２に示されているように、ヒドロゲルパッチ２を、実施例１−１のような方法で、液体剤形に製造した後、バイアルに浸しておき、トロンビンを、実施例１−３のような方法でシリンジに浸しておいた。また、ヒドロゲルパッチ２を、−８０℃、０．３３Ｔｏｒｒ気圧で、２４時間凍結乾燥（テーハンScientific、Ｆ７８）させて固体剤形にした後、それを粉にしてパウダー状で製造した。また、パウダー状の剤形を製造した。前記パウダー状の剤形を、実施例１−３のような方法でトロンビンを添加し、ゲル化させてパウダー状の剤形が、さらにゲル状に製造される可ことを確認した。
【００７４】
以上の結果により、一具体例によるヒドロゲルパッチは、可逆的な相転移が起こり、固体、半固体、液体またはパウダーの剤形など多様な剤形で提供されるということが分かった。
【００７５】
追加して、凍結保存可能いかんを確認した。
【００７６】
具体的には、実施例１−２のような方法によって製造された培養液に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Sigma、Ｄ２６５０）を添加し、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯになるようにしたものに、ヒドロゲルパッチ２を添加した。その後、４℃（３０分）、−２０℃（１時間）、−８０℃に順次温度を低くし、凍結保存して凍結乾燥（freeze-dry）処理した。その後、低温走査電子顕微鏡（ＣｏｌｄＦＥ−ＳＥＭ：cold ＦＥ-scanning electron microscopy、Hitach High-Technologies、Ｓ−４８００）撮影を介して、凍結保存前後のヒドロゲルパッチの形態学的分析を行い、その結果を図３に示した。
【００７７】
図３に示されているように、凍結保存前、及び凍結保存１ヵ月後に解凍したヒドロゲルパッチの形態学的な差がないことを確認することができた。また、ヒドロゲルパッチの表面が多孔性であることが分かった。
【００７８】
＜実験例１＞試験管内神経幹細胞分化の評価
５日齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ Japan ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）を犠牲にし、脳を採取し、公知の方法で、マウス神経幹細胞を、primary cell cultureし、１００ｍｍ dish（ＳＡＲＳＴＥＤＴ、８３１８０２）で培養した。
【００７９】
前記マウス神経幹細胞に、一具体例による物質と、比較例物質とを塗布し、マウス神経幹細胞の分化に及ぼす影響を確認した。
【００８０】
具体的には、公知の方法（Kim JB et al. Nat Protoc. 2009）で、マウス神経幹細胞を抽出及び培養し、前記神経幹細胞１ｘ１０４個に対して、実施例１−２のような方法で作製したヒドロゲル（フィブリン５ｍｇ／ｍＬ、ラミニン１０μｇ／ｍｌ及びヒアルロン酸０．５ｍｇ／ｍｌ）を塗布し、トロンビンを添加し、ヒドロゲルパッチにした。その後、実施例１−２の神経細胞成長因子及び血管内皮細胞成長因子を含むか、あるいは含まない培養液で培養した。また、最適濃度を選定するために、比較例物質として、フィブリン単独１ｍｇ／ｍｌ，５ｍｇ／ｍＬまたは１０ｍｇ／ｍｌ、ラミニン単独５μｇ／ｍｌ，１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ、及びヒアルロン酸単独０．１ｍｇ／ｍｌ，０．５ｍｇ／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌ、またはラミニン１０μｇ／ｍｌ及びヒアルロン酸０．５ｍｇ／ｍｌを使用した。
【００８１】
次に、１４日間培養した後、免疫蛍光染色を行った。具体的には、免疫細胞化学のために、細胞は、４％（ｗ／ｖ）Paraformaldehyde in Phosphate Buffer Solution（Wako、１６３−２０１４５）で、常温で１０分間固定した。固定した細胞は、１０Ｘ ＰＢＳ（phosphate buffer saline、Ｐ２００７）で１Ｘに希釈し、常温で５分間３回洗浄し、１Ｘ ＰＢＳに溶かした０．１％（ｖ／ｖ）Triton Ｘ−１００（Sigma、Ｔ９２８４）を使用し、常温で１０分間透過させた（permeabilized）。１Ｘ ＰＢＳで、常温で５分間３回洗浄した後、非特異的結合を阻害するために、１Ｘ ＰＢＳに溶かした４％（ｖ／ｖ）牛胎児血清で、常温で１時間ブロッキング（blocking）した。その後、細胞を一次抗体抗beta ＩＩＩ tubulin（Ｔｕｊ１）（１：４００；Ａｂｃａｍ）または抗 ＧＦＡＰ（glial fibrillary acidic protein；１：４００、Sigma）で、常温で１時間培養し、３回１Ｘ ＰＢＳに溶かした０．０５％（ｖ／ｖ）Tween−２０（Sigma、Ｐ７９４９）（ＰＢＳＴ）を使用し、常温で１０分間３回洗浄した。その後、二次蛍光抗体（Alexa Fluorophore-conjugated secondary antibodies ４８８（１：１，０００）またはAlexa Fluor（登録商標）５９４（１：１，０００）で光を遮断した後、常温で３０分間培養した。二重染色が必要な場合、前述の他の一次抗体と培養する前、３０分間常温で、さらなるブロッキングを行った。ＰＢＳＴを使用し、常温で１０分間３回洗浄した後、細胞核染色のために、ＤＡＰＩ（１：１，０００；Invitrogen）で、１５秒間光を遮断して培養した後、ＰＢＳＴを使用し、常温で１０分間３回洗浄した。細胞は、蛍光顕微鏡を使用した視覚化のために、ＰＢＳに保管した。
【００８２】
その後、デジタル黒白カメラ（Leica、ＤＦＣ３４５ＦＸ）が付着された倒立蛍光顕微鏡（Leica、ＤＭＩ３０００Ｂ）を使用し、神経細胞（Ｔｕｊ１）及び星状膠細胞（ＧＦＡＰ）を観察した。倒立蛍光顕微鏡で観察したイメージは、ＩｍａｇｅＪ（National Institutes of Health（http://rsb.info.nih.gov/ij）ソフトウェアを使用し、神経細胞または星状膠細胞の数をカウンティングして分化率を計算した。
【００８３】
全ての統計的分析は、unpaired two-tailed Student’st-testを使用して行い、有意度は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５または＊＊＊Ｐ＜０．０００５である。
【００８４】
図４に示されているように、神経幹細胞に、一具体例によるヒドロゲルを塗布した場合、塗布していない条件（bare）に比較し、神経幹細胞の細胞接合が向上したということが分かった。
【００８５】
図５及び図６に示されているように、フィブリン単独、ラミニン単独、ヒアルロン酸単独、及びラミニンとヒアルロン酸との組み合わせを塗布した場合に比べ、一具体例による組成物（フィブリン、ラミニン、ヒアルロン酸）を塗布した場合、神経幹細胞の神経細胞への分化が相乗的に起きたということが分かった。詳細には、何も処理していない対照群において、５％の神経細胞が示され、各物質単独は、１２％未満の神経細胞が示されることが分かった。それに反し、ヒアルロン酸とラミニンとの組み合わせにおいては、約１５％の神経細胞が示されることが分かり、単独では、実質的に効果が示されないフィブリンを、ヒアルロン酸及びラミニンと組み合わせたとき、２０％以上の神経細胞が示されることが分かった。それは、ヒアルロン酸とラミニンとの組み合わせにより、神経細胞分化の効果が著しく、特に、３種組成物の組み合わせは、相乗的な効果を起こし、神経細胞への分化を著しく増大させたということを意味する。
【００８６】
また、図７に示されているように、成長因子を追加したとき、図６の結果と一致するように、フィブリン単独、ラミニン単独、ヒアルロン酸単独、及びラミニンとヒアルロン酸との組み合わせを塗布した場合に比べ、一具体例による組成物（フィブリン、ラミニン、ヒアルロン酸）を塗布した場合、神経幹細胞の神経細胞への分化が相乗的に起きたことが分かった。詳細には、成長因子自体でも、神経細胞への分化を上昇させるが、３種組成物と成長因子との組み合わせにより、相乗的な効果を起こし、約３０％ほどの神経細胞を示し、そのような結果は、一具体例によるヒドロゲルパッチまたはその組成物が、一般的に予測し難い相乗的効果を示すということを意味する。
【００８７】
また、図８に示されているように、一具体例による組成物に、それぞれの成長因子一つずつを追加して確認した結果、マウス神経幹細胞の神経細胞への分化率を、約２．５ないし５倍向上させるということを確認することができた。
【００８８】
前述の結果により、一具体例による組成物は、それ自体として、分化度上昇の相乗的効果があるだけではなく、成長因子と組み合わされ、さらに相乗的な効果を示し、成長因子の細胞に対する効果を上昇させるということが分かった。
【００８９】
＜実験例２＞生分解性評価
実施例１で作製したヒドロゲルパッチの生分解性評価のために、６週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ Japan ＳＬＣ，Ｉｎｃ．）に、２，２，２−tribromoethanol（Sigma、Ｔ４８４０２）をＴｅｒｔ−amyl alcohol（Sigma、１５２４６３）に溶解して作製した２５ｍｇ／ｍｌのAvertin麻酔剤を、マウス当たり１２５〜２５０ｍｇ／ｋｇ body weightで投与して麻酔をかけた。その後、ヒドロゲルパッチ５を皮下に移植した。ゲルパッチを移植して２週後に、皮下切開して移植したゲルパッチの生分解いかんを確認した。
【００９０】
その結果、図９で確認することができるように、一具体例によるヒドロゲルパッチが、生体内で生分解されることを確認することができた。
【００９１】
＜実験例３＞ヒドロゲルパッチ脊髄損傷治療効果の確認
４−１．脊髄損傷動物モデルを利用したヒドロゲルパッチ脊髄損傷治療効果の確認
一具体例によるヒドロゲルパッチの脊髄損傷再生効果を確認するために、脊髄損傷動物モデルに、ゲルパッチを移植した後、８週間行動評価を行った。
【００９２】
公式小型脊髄損傷動物モデル評価方法は、慢性脊髄損傷研究の行動分析を評価する方法であり、動物の関節、後足、歩き方、前足と後足との調和運動、腰のポジション、足裏での支え、及び尾のポジションを観察及び評価し、行動能の回復を評価する方法である。それを反映させ、各動物に、０から２１まで点数（score）を付けて回復力を定量化し、０から７までは、初期段階（early stage）であり、後足の動きがほとんど回復されていない最小の行動能復旧を示し、８から１３までは、中間回復段階（intermediate recovery stage）であり、後足の動きが回復されたが、前足と後足との調節が良好になされていない調和運動の間隔があることを示す。最後に、１４から２１までは、後期回復段階（late recovery stage）であり、前足と後足との調和運動を示す。
【００９３】
まず、adult雄スプラーグドーリー（Sprague-Dawley）ラット（OrientBio）に、１０ｍｇ／rat Zoletil ５０（Virbac）を注入させて麻酔をかけた後、Ｔ９部分の脊髄椎宮を除去した。その後、血管クリップ（vascular clip）を使用し、１０分間脊髄を圧迫し、脊髄損傷動物モデルを作製した。脊髄損傷手術後、自発的排尿が可能になるまで、約２週間一日に２回ずつ膀胱を圧迫して排尿管理を行った。脊髄損傷動物モデルを作製し、１週間後、図１０に図示されているように、一具体例によるヒドロゲルパッチを、脊髄損傷部位に直接移植した。行動評価は、８週間、脊髄損傷動物モデル評価方法（ＢＢＢ test、open field test）を使用して行い、検査結果は、２名の検事者観測値の平均値を使用し、その結果を、図１５ないし図１８に示した。
【００９４】
図１１は、脊髄損傷動物モデルの脊髄損傷１週間後、脊髄損傷によって損失された脊髄損傷動物モデルの後足動きを観察した図面である。図１２は、ヒドロゲルパッチの移植なしに、ＰＢＳのみを移植部位に撒いた脊髄損傷動物モデルの脊髄損傷８週目の後足動きを観察した図面である。図１３は、ヒドロゲルパッチ２（hydrogel patch２ without ＧＦ）を移植した脊髄損傷動物モデルの脊髄損傷８週目の後足動きを観察した図面である。図１４は、ヒドロゲルパッチ５（hydrogel patch２ with ＧＦ）を移植した脊髄損傷動物モデルの脊髄損傷８週目の後足動きを観測した図面である。
【００９５】
図１５ないし図１８は、一具体例によるヒドロゲルパッチの移植によるＢＢＢ点数値を示したグラフである。
【００９６】
図１１ないし図１４に示されているように、ヒドロゲルパッチの移植なしに、ＰＢＳのみを移植部位に塗布した脊髄損傷動物モデルは、脊髄損傷８週後、損傷された後足の運動能に変化がなかったことが分かった。それに反し、ヒドロゲルパッチ２を移植した脊髄損傷動物モデルは、脊髄損傷８週後、左側後足の運動能が回復し、神経細胞成長因子及び血管内皮細胞成長因子を追加したヒドロゲルパッチ５を移植した脊髄損傷動物モデルは、脊髄損傷８週後、両側後足の運動能が顕著に復旧されていることを確認した。
【００９７】
また、脊髄損傷動物モデル評価方法（ＢＢＢ test、open field test）を利用し、脊髄損傷回復能を評価した結果、図１５ないし図１８に示されているように、ヒドロゲルパッチの移植なしに、ＰＢＳのみを移植部位に塗布した脊髄損傷動物モデルは、４ないし６のＢＢＢ点数を示した。それは、脊髄損傷再生過程の初期段階（early stage）を示す。それに反し、ヒドロゲルパッチ２を移植した脊髄損傷動物モデルにおいては、約８ないし１０のＢＢＢ点数を示し、脊髄損傷再生過程の中間回復段階を示すということが分かった。また、ヒドロゲルパッチ５を移植した脊髄損傷動物モデルは、約１０ないし１２のＢＢＢ点数を示し、脊髄損傷再生過程の後期回復段階にあるということが分かった。
【００９８】
次に、図１５ないし図１８に示されているように、ヒドロゲルパッチ１，４を移植した脊髄損傷動物モデルは、約６から８の間のＢＢＢ点数を示し、脊髄損傷再生過程の初期段階（early stage）を示すということが分かった。以上の結果は、フィブリン、ラミニン、ヒアルロン酸を含むヒドロゲルパッチが、異なる組み合わせに比べ、著しい効果を示すということを意味する。
【００９９】
また、ヒドロゲルパッチ２、ヒドロゲルパッチ５とコラーゲンとを追加したヒドロゲルパッチ３、及びヒドロゲル６を比較した結果、ＢＢＢ点数は、大差がないことが分かった。
【０１００】
また、ヒドロゲルパッチ３と、前記ヒドロゲルパッチ３にＰＢＳだけ添加したものを比較した結果、ＢＢＢ点数は、大差がないことが分かり、それを介して、細胞培養液がヒドロゲルパッチ効能に役割を行わないことが分かった。
【０１０１】
従って、前記結果により、一具体例によるヒドロゲルパッチは、脊髄損傷によって損失された運動能を顕著に復旧する治療効果があるということを確認することができた。
【０１０２】
４−２．組織学的分析を利用したヒドロゲルパッチ脊髄損傷治療効果の確認
一具体例によるヒドロゲルパッチの脊髄損傷再生効果を確認するために、組織学的分析を行った。
【０１０３】
具体的には、ヒドロゲルパッチの脊髄損傷部位神経再生効果の組織学的分析のために、ヒドロゲルパッチ移植手術８週後、レッドを犠牲にした後、４％（ｗ／ｖ）paraformaldehyde（Merck）を使用し、貫流させて脊髄を採取した。その後、１０μｍ厚に脊髄を切断し、切断した脊髄サンプルを、実験例１と同一方法で、抗neurofilament（ＮＦ）（１：３０００、Ａｂｃａｍ）、抗ＧＦＡＰ（１：１，０００、Ａｂｃａｍ）、抗２’，３’−ＣＮＰａｓｅ（Cyclic−nucleotide ３’−phosphodiesterase）（１：８００、Ａｂｃａｍ）、抗Homeobox ＨＢ９（Ｈｂ９）（１：１００、ＤＳＨＢ）、抗 Ｉｂａ−１（ionized calcium-binding adapter molecule １）（１：５００、Ａｂｃａｍ）を使用して染色した。その後、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７００、Ｚｅｉｓｓ）で撮影し、ヒドロゲル移植部位の神経再生いかんを評価し、その結果を図１９に示した。
【０１０４】
その結果、図１９に示されているように、ＰＢＳを移植部位に塗布した場合に比べ、ヒドロゲルパッチ２または５を移植した場合、脊髄損傷病変部位に、ＧＦＡＰ星状膠細胞の分布度が低いところに比べ、ＮＦ神経細胞の分布度が高いということが分かった。また、ヒドロゲルパッチ２または５を移植した場合、ＣＮＰａｓｅ希少突起阿膠細胞が、ＮＦ神経細胞のような位置に発現（co-localization）するということが分かった。そのような結果は、ヒドロゲルパッチの塗布により、損傷された神経細胞の再生、及び再生された神経細胞の髄鞘形成が顕著に増大したということを意味する。
【０１０５】
また、ＰＢＳを移植部位に塗布した場合、ＮＦ神経細胞の分布が小さく、炎症反応を示すＩｂａ−１微細阿膠細胞の分布度が高い一方、ヒドロゲルパッチ２または５を移植した場合、脊髄のＨｂ９とＮＦとを共に発現する運動神経細胞の分布度が高く、Ｉｂａ−１微細阿膠細胞の分布が顕著に低下しているということを確認することができた。そのような結果は、ヒドロゲルパッチ移植時、脊髄損傷によって引き起こされる炎症反応を減らし、神経損傷を阻害し、運動神経細胞と希少突起阿膠細胞との再生の一助となり、髄鞘が形成された運動神経細胞の再生の一助となるということを意味する。
【０１０６】
前述の結果により、ヒドロゲルパッチは、損傷された脊髄神経再生誘導、及び星状膠細胞の活性化を阻害し、損失された運動能を復旧する治療効果の著しい上昇があり、注射器を使用する脊髄損傷治療によって引き起こされる脊髄二次損傷を、ヒドロゲルパッチを使用することにより、顕著に阻害することができるという効果があることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月27日(2018.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリン及びフィブリノゲンから選択される少なくとも一つと、
ラミニンと、
ヒアルロン酸またはその塩と、を含むヒドロゲルパッチ。
【請求項２】
細胞成長因子をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項３】
前記細胞成長因子は、神経細胞成長因子、血管内皮細胞成長因子、線維芽細胞成長因子、骨形成タンパク質、上皮細胞成長因子、肝細胞成長因子、形質転換成長因子、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする請求項２に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項４】
前記神経細胞成長因子は、ＢＤＮＦ（brain-derived neurotropic factor）、ＧＤＮＦ（glial cell derived neurotropic factor）、ＣＮＴＦ（ciliary neurotropic factor）、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）、ｃＡＭＰ（cyclic adenocyne monophosphate）、ＮＴ（neurotropin）、ＮＴ３（neurotropin−３）、ＮＴ４（neurotropin−４）、Ｔ３（triiodo−Ｌ−thyronine）、ＳＨＨ（sonic hedgehog）及びＰＤＧＦ（platelet-derived growth factor）から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする請求項３に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項５】
前記血管内皮細胞成長因子は、ＶＥＧＦ（vascular endothelial growth factor）であることを特徴とする請求項３に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項６】
細胞を含まないことを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項７】
表面に多孔性を有することを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項８】
温度により、固体、半固体または液体の状態に、可逆的な相転移が起こることを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項９】
組織損傷部位に塗布されて損傷部位の形態に合わせて形態が変形されることを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項１０】
損傷された組織の再生用または修復用であることを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項１１】
フィブリンまたはフィブリノゲンを、０．５ないし２０ｍｇ／ｍｌの濃度、ラミニンを１ないし１００μｇ／ｍｌの濃度、またはヒアルロン酸もしくはその塩を１０μｇ／ｍｌないし５ｍｇ／ｍｌの濃度で含むことを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項１２】
トロンビンを追加して含むことを特徴とする請求項１に記載のヒドロゲルパッチ。
【請求項１３】
フィブリン及びフィブリノゲンから選択される少なくとも一つと、
ラミニンと、
ヒアルロン酸、またはその薬学的に許容可能な塩と、を含む脊髄損傷治療用薬学的組成物。
【請求項１４】
細胞成長因子をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記組成物が固体、または半固体である場合、表面に多孔性を有することを特徴とする請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
パウダー剤形であることを特徴とする請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
フィブリンまたはフィブリノゲンを、０．５ないし２０ｍｇ／ｍｌの濃度、ラミニンを、１ないし１００μｇ／ｍｌの濃度、またはヒアルロン酸を、１０μｇ／ｍｌないし５ｍｇ／ｍｌの濃度で含むことを特徴とする請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
トロンビンを追加して含むことを特徴とする請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記脊髄損傷は、慢性脊髄損傷であることを特徴とする請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
フィブリノゲンと、
ラミニンと、
ヒアルロン酸、またはその薬学的に許容可能な塩と、を含むゾル状態の組成物に対してトロンビンを添加する工程を含む、ヒドロゲルパッチを製造する方法であって、ヒドロゲルパッチを、溶液中で、４℃〜−２１０℃の温度で低温保存または凍結保存する、方法。
【国際調査報告】
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