(57)【要約】本開示は、蛍光色素の分野に関し、特に、蛍光シグナルを増加させ、そして蛍光消光を減少させるための組成物および方法に関する。【選択図】図１
2019531474.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の抗体を含む組成物であって、
２つ以上の蛍光標識および２つ以上のスペーサー分子が前記第１の抗体に共有結合し、
前記蛍光標識およびスペーサー分子が互いに共有結合していない、組成物。
【請求項２】
前記第１の抗体が、等量の蛍光標識を用いて調製されたが前記スペーサー分子を含まない第２の抗体よりも高い蛍光発光レベルを示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１の抗体が第２の抗体よりも高い蛍光発光レベルを示し、前記第１の抗体および前記第２の抗体がそれぞれ同数の共有結合した蛍光標識を有し、前記第２の抗体が共有結合したスペーサー分子を有さない、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記スペーサー分子が、前記蛍光標識の消光を、前記スペーサー分子の非存在下での消光と比較して減少させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記スペーサー分子が、反応性基に対して前記抗体にコンジュゲートされている、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記反応性基がアミン基である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記アミン基がリジン残基上にある、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記蛍光標識がコンジュゲーション分子によって前記抗体にコンジュゲートされている、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記蛍光標識が正に荷電している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記蛍光標識がＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）色素またはＤＹＬＩＧＨＴ（商標）色素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記蛍光標識が、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５１４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６１０−Ｘ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ジニトロフェニル、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＭＡＲＩＮＡ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）４８８、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）５１４、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＬＵＥ（商標）、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＯＲＡＮＧＥ（商標）、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５、ＲＯＸ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＲＥＤ（商標）、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、ＦＡＭ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）、または７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）スクシンイミジルエステル（ＤＤＡＯ−ＳＥ）からなる群から選択される色素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記蛍光標識が、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）３５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４０５、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５９４、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６３３、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）７５５、およびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００からなる群から選択される色素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記スペーサー分子が負に荷電しているか中性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記スペーサー分子が、アセテートおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記スペーサー分子がアセチル基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記スペーサー分子がアセテート分子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記アセテート分子がスルホ−ＮＨＳ−アセテートである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記スペーサー分子が（ＰＥＧ）ｎを含むかまたはそれからなり、式中、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記スペーサー分子がＭＳ−（ＰＥＧ）ｎを含み、式中、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記スペーサー分子が、アルカノイル、アルケノイル、およびアルキノイル（−Ｃ（Ｏ）ＣｎＨｍ）から選択される基を含むか、またはそれらからなり、式中、ｎが１〜２０個の原子であり、ｍ＞ｎであり、炭素原子が、単結合、二重結合、および／または三重結合によって互いに結合し得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記アルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基が、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−（ＣＨ２）ｙ−ＯＲによってさらに置換され、式中、ｘが１〜２０であり、ｙが１〜６であり、ＲがＨまたはＣ１〜６アルキルである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記アルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基が、アンモニウム（−ＮＨ３＋）、第４級アンモニウム（−ＮＲ３＋）基でさらに置換され、式中、ＲがＣ１〜６アルキルである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記蛍光色素が、１つ以上のＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５１４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６１０−Ｘ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ジトロフェニル、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＭＡＲＩＮＡ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）４８８、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）５１４、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＬＵＥ（商標）、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＯＲＡＮＧＥ（商標）、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５、ＲＯＸ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＲＥＤ（商標）、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、ＦＡＭ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）、または７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）スクシンイミジルエステル（ＤＤＡＯ−ＳＥ）、ならびにＤＹＬＩＧＨＴ（商標）３５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４０５、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５９４、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６３３、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）７５５、およびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８０からなる群からのものを含み、
前記スペーサー分子が、
スルホ−ＮＨＳ−アセテート；
（ＰＥＧ）ｎ（式中、ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択される）；
ＭＳ−（ＰＥＧ）ｎ（式中、ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択される）；
アルカノイル、アルケノイル、またはアルキノイル（−Ｃ（Ｏ）ＣｎＨｍ）（式中、ｎが１〜２０個の原子であり、ｍ＞ｎであり、炭素原子が、単結合、二重結合、および／または三重結合で互いに結合し得る）；あるいは
−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−（ＣＨ２）ｙ−ＯＲ（式中、ｘが１〜２０であり、ｙが１〜６であり、ＲがＨもしくはＣ１〜６アルキルである）によってさらに置換されたアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基であって、または前記アルキル、アルケニル、および／もしくはアルキニル基がアンモニウム（−ＮＨ３＋）、第４級アンモニウム（（−ＮＲ３＋）基でさらに置換され、式中、ＲがＣ１〜６アルキルである、アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基
のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記アルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基が、ホスホニウム基（−ＰＱ３＋）によってさらに置換され、式中、Ｑがアリール、置換されたアリール、またはＣ１〜６アルキルである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
蛍光標識の抗体に対する比が１〜５０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
蛍光標識の抗体に対する前記比が５〜３０である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
蛍光標識の抗体に対する前記比が１〜２０である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記スペーサー分子の抗体に対する比が１〜５０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
前記スペーサー分子の抗体に対する前記比が５〜３０である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記スペーサー分子の抗体に対する前記比が５〜３０である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記スペーサー分子の抗体に対する前記比が１〜２０である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
前記スペーサー分子が、０．１〜２５倍、１〜１５倍、または２．５〜１０倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記スペーサー分子が、２．５倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記スペーサー分子が、５倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記スペーサー分子が、７．５倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
前記スペーサー分子が、１０倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３７】
前記複数の蛍光標識によって占有されている前記抗体上の結合部位の割合が１％〜９９％である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３８】
前記スペーサー分子の存在が、前記蛍光標識の検出可能な蛍光を、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％増加させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３９】
蛍光標識された生体分子の蛍光を増加させる方法であって、
（ａ）スペーサー分子を生体分子にコンジュゲートすることと、
（ｂ）前記生体分子に蛍光標識をコンジュゲートすることと、を含み、
ステップ（ａ）および（ｂ）は同時にまたは任意の順序で行うことができ、
前記スペーサーと蛍光標識は互いにコンジュゲートされていない、方法。
【請求項４０】
前記スペーサー分子が、前記蛍光標識の消光を、前記スペーサー分子の非存在下での消光と比較して減少させる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記スペーサー分子が、反応性基に対して前記抗体にコンジュゲートされている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記反応性基がアミン基である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記アミン基がリジン残基上にある、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記蛍光標識が正に荷電している、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記蛍光色素がＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）およびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記蛍光標識が、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５１４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６１０−Ｘ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ジニトロフェニル、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＭＡＲＩＮＡ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）４８８、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）５１４、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＬＵＥ（商標）、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＯＲＡＮＧＥ（商標）、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５、ＲＯＸ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＲＥＤ（商標）、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、ＦＡＭ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）、および７−ヒドロキシ−９Ｈ−（ｌ，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）スクシンイミジルエステル（ＤＤＡＯ−ＳＥ）からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記蛍光標識が、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）３５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４０５、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５９４、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６３３、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）７５５、およびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記スペーサー分子が負に荷電しているか中性である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
前記スペーサー分子が、アセテートおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
前記スペーサー分子がアセチル基を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５１】
前記スペーサー分子がアセテート分子を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５２】
前記アセテート分子がスルホ−ＮＨＳ−アセテートである、請求項３９に記載の方法。
【請求項５３】
前記スペーサー分子が（ＰＥＧ）ｎを含み、式中、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５４】
前記スペーサー分子がＭＳ−（ＰＥＧ）ｎを含み、式中、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５５】
前記スペーサー分子が、アルカノイル、アルケノイル、およびアルキノイル（−Ｃ（Ｏ）ＣｎＨｍから選択される基を含み、式中、ｎが１〜２０個の原子であり、ｍ＞ｎであり、炭素原子が、単結合、二重結合、および／または三重結合によって互いに結合し得る、請求項３９に記載の方法。
【請求項５６】
前記アルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基が、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−（ＣＨ２）ｙ−ＯＲによってさらに置換され、式中、ｘが１〜２０であり、ｙが１〜６であり、ＲがＨまたはＣ１〜６アルキルである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記アルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基が、アンモニウム（（−ＮＨ３＋）、第４級アンモニウム（−ＮＲ３＋）基でさらに置換され、式中、ＲがＣ１〜６アルキルである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記アルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基が、ホスホニウム基（−ＰＱ３＋）によってさらに置換され、式中、Ｑがアリール、置換されたアリール、またはＣ１〜６アルキルである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
蛍光標識の抗体に対する比が１〜５０である、請求項３９に記載の方法。
【請求項６０】
蛍光標識の抗体に対する前記比が５〜３０である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
蛍光標識の抗体に対する前記比が１〜２０である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記スペーサー分子のタンパク質に対する比が１〜５０である、請求項３９に記載の方法。
【請求項６３】
前記スペーサー分子のタンパク質に対する前記比が５〜３０である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記スペーサー分子のタンパク質に対する前記比が５〜３０である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記スペーサー分子のタンパク質に対する前記比が１〜２０である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記スペーサー分子が、０．１〜２５倍、１〜１５倍、または２．５〜１０倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、請求項３９に記載の方法。
【請求項６７】
前記スペーサー分子が、２．５倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記スペーサー分子が、５倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記スペーサー分子が、７．５倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記スペーサー分子が、１０倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記複数の蛍光標識によって占有されている前記抗体上の結合部位の割合が１％〜９９％である、請求項３９に記載の方法。
【請求項７２】
前記スペーサー分子の存在が、前記蛍光標識の検出可能な蛍光を、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％増加させる、請求項３９に記載の方法。
【請求項７３】
蛍光標識された生体分子の蛍光発光を増強することができるスペーサー分子を同定する方法であって、
（ａ）生体分子にコンジュゲートされた複数の蛍光標識とは独立して、スペーサー分子を前記生体分子にコンジュゲートすることと、
（ｂ）前記生体分子にコンジュゲートされた前記複数の蛍光標識に加えて前記スペーサー分子の存在が前記複数の蛍光標識の検出可能な蛍光を増加させるかどうかを試験することと、
（ｃ）前記スペーサー分子を、前記生体分子にコンジュゲートされた前記複数の蛍光標識に加えて前記スペーサー分子の存在が前記複数の蛍光標識の検出可能な蛍光を増加させるときに、前記タンパク質にコンジュゲートされた前記蛍光標識の消光を減少させるものとして同定することと、を含む、方法。
【請求項７４】
前記スペーサー分子が、前記生体分子上に存在する最初のリジン側鎖で前記生体分子にコンジュゲートされている、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記生体分子が抗体または抗体断片である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記複数の蛍光標識が正に荷電している、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記スペーサー分子が正に荷電している、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
前記複数の蛍光標識が負に荷電している、請求項７３に記載の方法。
【請求項７９】
前記スペーサー分子が負に荷電している、請求項７３に記載の方法。
【請求項８０】
前記複数の蛍光標識がＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）およびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）分子から選択される色素である、請求項７３に記載の方法。
【請求項８１】
前記複数の蛍光標識が、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５１４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６１０−Ｘ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ジニトロフェニル、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＭＡＲＩＮＡ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）４８８、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）５１４、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＬＵＥ（商標）、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＯＲＡＮＧＥ（商標）、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５、ＲＯＸ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＲＥＤ（商標）、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、ＦＡＭ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）、および７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）スクシンイミジルエステル（ＤＤＡＯ−ＳＥ）から選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項８２】
前記複数の蛍光標識が、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）３５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４０５、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５９４、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６３３、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）７５５、およびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００から選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項８３】
前記スペーサー分子が、アセテートおよびＰＥＧから選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項８４】
前記複数の蛍光標識がコンジュゲーション分子によって前記抗体にコンジュゲートされている、請求項７３に記載の方法。
【請求項８５】
前記複数の蛍光標識が最初のリジン側鎖で前記抗体にコンジュゲートされている、請求項７３に記載の方法。
【請求項８６】
前記スペーサー分子が、最初のリジン側鎖で前記抗体にコンジュゲートされている、請求項７３に記載の方法。
【請求項８７】
前記抗体への前記複数の蛍光標識の、前記色素とタンパク質の比が１〜５０である、請求項７３に記載の方法。
【請求項８８】
前記抗体への前記複数の蛍光標識の、前記色素とタンパク質の前記比が５〜３０である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記抗体への複数の蛍光標識の、前記色素とタンパク質の前記比が１〜２０である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記スペーサー分子のタンパク質に対する比が１〜５０である、請求項７３に記載の方法。
【請求項９１】
前記スペーサー分子のタンパク質に対する前記比が５〜３０である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記スペーサー分子のタンパク質に対する前記比が５〜３０である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記スペーサー分子のタンパク質に対する前記比が１〜２０である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
前記スペーサー分子が、０．１〜２５倍、１〜１５倍、または２．５〜１０倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、請求項７３に記載の方法。
【請求項９５】
前記スペーサー分子が、２．５倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記スペーサー分子が、５倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記スペーサー分子が、７．５倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
前記スペーサー分子が、１０倍の量で前記複数の蛍光標識に対してモル過剰である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
前記複数の蛍光標識によって占有されている前記抗体上の結合部位の割合が１％〜９９％である、請求項７３に記載の方法。
【請求項１００】
前記スペーサー分子の存在が、前記蛍光標識の検出可能な蛍光を、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％増加させる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
生体試料中の所望の標的の存在を決定する方法であって、
（ａ）前記生体試料を組成物、抗体と接触させることであって、２つ以上の蛍光標識と２つ以上のスペーサー分子が前記抗体と共有結合し、前記蛍光体とスペーサー分子が互いに共有結合していない、接触させることと、
（ｂ）前記複数の蛍光標識によって発光される蛍光を検出することと、
（ｃ）前記複数の蛍光標識によって発光された蛍光が検出されるときに、前記生体試料中の前記所望の標的の存在を決定することと、を含む、方法。
【請求項１０２】
前記生体試料が細胞溶解物を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記生体試料が無傷の細胞を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記生体試料が単離されたタンパク質を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
前記生体試料が組換えタンパク質を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０６】
前記生体試料が固体支持体上に固定化されている、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０７】
前記生体試料が流体中の無傷の細胞を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０８】
前記生体試料が生きている動物である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０９】
前記生きている動物が哺乳動物である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
第１の核酸分子を含む組成物であって、
２つ以上の蛍光標識および２つ以上のスペーサー分子が前記第１の核酸分子に共有結合し、
前記蛍光体およびスペーサー分子が互いに共有結合していない、組成物。
【請求項１１１】
前記第１の核酸分子が、等量の蛍光標識を用いて調製されたが前記スペーサー分子を含まない第２の核酸分子よりも高い蛍光発光レベルを示す、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記第１の核酸分子が第２の核酸分子よりも高い蛍光発光レベルを示し、前記第１の核酸分子および前記第２の核酸分子がそれぞれ同数の共有結合した蛍光標識を有し、前記第２の核酸分子が、共有結合したスペーサー分子を有さない、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１３】
複数の蛍光標識にコンジュゲートされた抗体を含むコンジュゲート抗体であって、以下の特徴、
（ａ）蛍光標識１個あたりに基づいて０．５以上の蛍光比、
（ｂ）少なくとも４つの蛍光標識を前記抗体にコンジュゲートすること、および／または
（ｃ）前記抗体の全蛍光が、非コンジュゲート蛍光分子の蛍光より少なくとも２０パーセント大きい、のうちの１つ以上を含む、コンジュゲート抗体。
【請求項１１４】
前記蛍光標識が１つ以上のマルチアームポリマーによって前記抗体にコンジュゲートされている、請求項１１３に記載のコンジュゲート抗体。
【請求項１１５】
前記蛍光標識が１つのマルチアームポリマーによって前記抗体にコンジュゲートされている、請求項１１４に記載のコンジュゲート抗体。
【請求項１１６】
前記蛍光標識が２〜１０のマルチアームポリマーによって前記抗体にコンジュゲートされている、請求項１１４に記載のコンジュゲート抗体。
【請求項１１７】
２つ以上の蛍光標識が前記抗体にコンジュゲートされている、請求項１１６に記載のコンジュゲート抗体。
【請求項１１８】
前記マルチアームポリマーのアームが、
（ａ）ポリエチレングリコール、
（ｂ）多糖類、および
（ｃ）ポリペプチド
からなる群から選択される種類の化学物質から構成される、請求項１１３に記載のコンジュゲート抗体。
【請求項１１９】
前記蛍光標識間の平均ブラシ距離が２００〜８００オングストロームである、請求項１１３に記載のコンジュゲート抗体。
【請求項１２０】
前記蛍光標識が少なくとも１６の共有結合によって前記抗体から離れている、請求項１１３に記載のコンジュゲート抗体。
【請求項１２１】
前記蛍光標識が１６〜８００の共有結合によって前記抗体から離れている、請求項１２０に記載のコンジュゲート抗体。
【請求項１２２】
前記蛍光標識が、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５１４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６１０−Ｘ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ジニトロフェニル、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＭＡＲＩＮＡ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）４８８、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）５１４、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＬＵＥ（商標）、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＯＲＡＮＧＥ（商標）、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５、ＲＯＸ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＲＥＤ（商標）、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、ＦＡＭ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）、または７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）スクシンイミジルエステル（ＤＤＡＯ−ＳＥ）からなる群から選択される色素、ならびにＤＹＬＩＧＨＴ（商標）３５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４０５、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５９４、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６３３、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）７５５、およびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００、およびＰＥＧ化ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）色素からなる群からの蛍光標識である、請求項１２０に記載のコンジュゲート抗体。
【請求項１２３】
蛍光標識された生体分子を調製する方法であって、
（ａ）反応性基および２つ以上の蛍光標識をスペーサー分子にコンジュゲートし、それによって蛍光標識されたスペーサー分子を形成することと、
（ｂ）前記蛍光標識されたスペーサー分子を前記生体分子にコンジュゲートし、それによって前記蛍光標識された生体分子を形成することと、を含み、
前記蛍光標識された生体分子の個々の蛍光標識が、蛍光標識１個あたりに基づいて０．５以上の蛍光比を有する、方法。
【請求項１２４】
平均１〜１０個の蛍光標識されたスペーサー分子が各生体分子にコンジュゲートされている、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
平均３〜１０個の蛍光標識されたスペーサー分子が各生体分子にコンジュゲートされている、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２６】
前記蛍光標識されたスペーサー分子がマルチアームポリマーである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２７】
マルチアームポリマーが分岐鎖ポリエチレングリコール分子である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記マルチアームポリマーが４〜１０個の蛍光標識にコンジュゲートされている、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２９】
前記マルチアームポリマーが、４，０００〜８０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３０】
蛍光標識された生体分子を検出する方法であって、
（ａ）前記生体分子にコンジュゲートされた蛍光標識を励起する光に前記蛍光標識された生体分子を曝露することと、
（ｂ）前記生体分子にコンジュゲートされた前記蛍光標識によって生成された発光を検出することと、を含み、
前記蛍光標識された生体分子が、４つ以上の蛍光標識にコンジュゲートされ、
前記蛍光標識された生体分子の個々の蛍光標識が、蛍光標識１個あたりに基づいて０．７以上の蛍光比を有する、方法。
【請求項１３１】
前記蛍光標識された生体分子が抗体である、請求項１３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本開示は、蛍光色素の分野に関し、具体的には、蛍光シグナルを増加させ、そして蛍光消光を減少させるための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
蛍光標識された生体分子は、定量アッセイおよび細胞イメージングに関連するものを含む様々な方法において広く使用されている。抗体、抗原、ＤＮＡ、およびＲＮＡなどの生体分子は蛍光標識されており、免疫蛍光（ＩＦＣ）、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウエスタンブロッティング、薬物結合試験、酵素反応速度論、ＨＣＡを含むイメージング（免疫細胞化学ＩＣＣ）、インビボイメージングなどの用途において、および核酸ハイブリダイゼーションにおいて使用される。蛍光色素は、使用しやすく、特異的かつ高感度であるだけでなく、多重化の選択肢も提供するので、これらの用途に引き続き選ばれている。しかしながら、全ての用途が蛍光標識化に適しているわけではない。例えば、多くの用途において、増加した量の蛍光標識（高い色素対タンパク質比）が生体分子に付加されるにつれて、蛍光の強度は減少し得る（消光）。さらに、蛍光はまた、生体分子の蛍光標識化によって引き起こされる立体障害を通して減少し得る。増強されたシグナル強度を示す蛍光標識およびコンジュゲーション方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本明細書に開示されているのは、例えば修飾リンカー、化学物質、および特定のプロトコールを介して生体分子にコンジュゲートした蛍光色素の強度を増加させるための組成物および方法である。したがって、本発明の一態様は、色素の性能を向上させることである。蛍光強度は、色素単独で作られた対応するコンジュゲートと比較して、生体分子が色素とスペーサー分子の両方で標識されているときに増加し得ることが見出された。これらのスペーサー分子を用いて作製したコンジュゲートは、ウエスタンブロッティング、ドットブロットアッセイ、プレートアッセイ、フローサイトメトリー、およびイムノアッセイ用途（例えば、免疫蛍光イメージング用途）において蛍光増強を示す。
【０００４】
さらに、より少数の色素分子が（共有結合的または非共有結合的に）各生体分子と結合しているときにでも、増強された蛍光が見られる。この効果は、増強された蛍光を示す生体分子へのスペーサー基の結合に関連すると考えられている。理論に束縛されるものではないが、増強された蛍光は色素発光の消光の減少から生じると考えられる。いくつかの態様では、本発明は、部分的に、第１の生体分子（例えば第１の抗体）を含む組成物であって、２つ以上の蛍光標識および２つ以上のスペーサー分子が第１の生体分子に共有結合し、蛍光体とスペーサー分子は互いに共有結合していない組成物に関する。いくつかの場合では、第１の生体分子（例えば、第１の抗体）は、等量の蛍光標識を用いて調製されたがスペーサーを含まない第２の生体分子（例えば、第２の抗体）よりも高い蛍光発光レベルを示す。さらなる例では、第１の生体分子は第２の生体分子よりも高い蛍光発光レベルを示し、第１の生体分子および第２の生体分子はそれぞれ同数の共有結合した蛍光標識を有し、第２の生体分子は共有結合したスペーサーを有さない。特定の実施形態では、スペーサー分子は、スペーサーの非存在下での消光と比較して、蛍光標識の消光を減少させる。
【０００５】
本発明のいくつかの態様において、スペーサー分子は反応性基を介して生体分子にコンジュゲートしている。そのような反応性基は、アミン反応性基（例えば、ＮＨＳエステル、１つまたは複数のアミン基はポリペプチドおよび／またはリジン側鎖のアミン末端にあり得る）、スルフヒドリル基、カルボン酸基などであり得る。スペーサー分子がコンジュゲートされ得るさらなる基としては、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、および／またはポリペプチドのカルボキシ末端が含まれる。さらに、蛍光標識は、コンジュゲーションアームによって生体分子にコンジュゲートすることができる。これらの蛍光標識は、正に荷電していても、中性でも、および／または負に荷電していてもよい。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本発明の実施（組成物と方法の両方）において使用される蛍光標識は、シアニン、ベンゾローダミン、ボディピー、フルオレセイン、ベンゾピリリウム誘導体であり得、さらにＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）色素および／またはＤＹＬＩＧＨＴ（商標）色素を含み得る。そのような色素は、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５１４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６１０−Ｘ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ジニトロフェニル、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＭＡＲＩＮＡ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）４８８、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）５１４、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＬＵＥ（商標）、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＯＲＡＮＧＥ（商標）、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５、ＲＯＸ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＲＥＤ（商標）、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、ＦＡＭ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）、７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）スクシンイミジルエステル（ＤＤＡＯ−ＳＥ）、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）３５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４０５、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５９４、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６３３、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）７５５、およびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００からなる群から選択され得る。当然のことながら、他の色素、および上述の色素の修飾形態を本発明の実施において使用することができる。
【０００７】
本発明の実施において、スペーサーは負に荷電していても中性に荷電していてもよい。さらに、スペーサーは、例えば、アセテートおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択され得る。スペーサーは、アセチル基を含み得、そしてアセテート分子（例えば、スルホ−ＮＨＳ−アセテート）であり得る。さらに、スペーサーは、（ＰＥＧ）ｎを含むかまたはそれからなることができ、式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択され、および／またはＭＳ−（ＰＥＧ）ｎを含むかまたはそれからなることができ、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択される。
【０００８】
さらに、本発明の実施において使用されるスペーサーは、アルカノイル、アルケノイル、およびアルキノイル（−Ｃ（Ｏ）ＣｎＨｍ）から選択される１つ以上の基を含むか、またはそれらからなることができ、式中、ｎは１〜２０個の原子であり、ｍ＞ｎであり、炭素原子は、単結合、二重結合、および／または三重結合によって互いに結合することができる。アルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基は、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−（ＣＨ２）ｙ−ＯＲによってさらに置換されていてもよく、式中、ｘは１〜２０であり、ｙは１〜６であり、そしてＲはＨまたはＣ１〜６アルキルである。さらに、アルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基は、アンモニウム（−ＮＨ３＋）、第４級アンモニウム（−ＮＲ３＋）基でさらに置換されていてもよく、ここで、ＲはＣ１〜６アルキルである。
【０００９】
さらに、本発明の特定の実施形態では、蛍光色素は、１つ以上のＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５１４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６１０−Ｘ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（登録商標）ジニトロフェニル、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＭＡＲＩＮＡ  ＢＬＵＥ（登録商標）ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）４８８、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）５１４、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＬＵＥ（商標）、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＯＲＡＮＧＥ（商標）、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５、ＲＯＸ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＲＥＤ（商標）、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＦＡＭ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）、または７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）スクシンイミジルエステル（ＤＤＡＯ−ＳＥ）を含み得、スペーサーは、スルホ−ＮＨＳ−アセテート；（ＰＥＧ）ｎ（式中、ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択される）；ＭＳ−（ＰＥＧ）ｎ（式中、ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択される）；アルカノイル、アルケノイル、またはアルキノイル（−Ｃ（Ｏ）ＣｎＨｍ）（式中、ｎが１〜２０個の原子であり、ｍ＞ｎであり、炭素原子が、単結合、二重結合、および／または三重結合で互いに結合し得る）；あるいは−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−（ＣＨ２）ｙ−ＯＲ（式中、ｘが１〜２０であり、ｙが１〜６であり、ＲがＨもしくはＣ１〜６アルキルである）によってさらに置換されたアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基であって、またはアルキル、アルケニル、および／もしくはアルキニル基がアンモニウム（−ＮＨ３＋）、第４級アンモニウム（（−ＮＲ３＋）基でさらに置換され、式中、ＲがＣ１〜６アルキルである、アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基、のうちの１つ以上を含み得る。さらに、アルキル、アルケニル、および��またはアルキニル基は、Ｑがアリール、置換されたアリール、またはＣ１〜６アルキルである、ホスホニウム基（−ＰＱ３＋）でさらに置換されていてもよい。
【００１０】
本発明の組成物および方法は、蛍光標識された生体分子（例えば、抗体）を含むかまたは使用することができ、蛍光標識された生体分子に対する比は、１〜５０、５〜３０、または１〜２０である。本発明の組成物および方法は、蛍光標識された生体分子（例えば、抗体）を含むかまたは使用することができ、スペーサー剤の生体分子に対する比は、１〜５０、５〜３０、５〜３０、または１〜２０である。
【００１１】
さらに、本発明の組成物および方法は、蛍光標識された生体分子（例えば、抗体）を含むかまたは使用することができ、ここでスペーサー剤は０．１〜２５倍、１〜１５倍、もしくは２．５〜１０倍の量で、複数の蛍光標識に対してモル過剰であるか；ここでスペーサー剤は２．５倍の量で、複数の蛍光標識に対してモル過剰であるか；ここでスペーサー剤は５倍の量で、複数の蛍光標識に対してモル過剰であるか；ここでスペーサー剤は７．５倍の量で、複数の蛍光標識に対してモル過剰であるか；または、ここでスペーサー剤は１０倍の量で、複数の蛍光標識に対してモル過剰である。
【００１２】
さらに、本発明の組成物および方法は、蛍光標識された生体分子（例えば、抗体）を含むかまたは使用することができ、複数の蛍光標識によって占められる生体分子上の結合部位（例えば、アクセス可能なアミン基）の割合は１％〜９９％である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、スペーサーの存在は、蛍光標識の検出可能な蛍光を、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％増加させる。
【００１４】
本発明はまた、部分的には、蛍光標識された生体分子の蛍光を増大させる方法に関する。そのような方法には、（ａ）スペーサー分子を生体分子にコンジュゲートさせることと、（ｂ）生体分子に蛍光標識をコンジュゲートさせることとを含むものが含まれ、ここでステップ（ａ）および（ｂ）は同時にまたは任意の順序で実施することができ、ここでスペーサーと蛍光標識は互いにコンジュゲートしていない。さらに、スペーサー分子は、スペーサーの非存在下で生じる消光の量と比較して、蛍光標識の消光を減少させ得る。
【００１５】
本発明はまた、部分的には、蛍光発光蛍光標識された生体分子を増強することができるスペーサー分子を同定するための方法にも関する。そのような方法は、（ａ）生体分子にコンジュゲートした複数の蛍光標識と独立して、スペーサー分子を生体分子にコンジュゲートすることと、（ｂ）生体分子にコンジュゲートした複数の蛍光標識に加えてスペーサー剤の存在が複数の蛍光標識の検出可能な蛍光を増加させるかどうかを試験することと、（ｃ）スペーサー剤を、生体分子にコンジュゲートした複数の蛍光標識に加えてスペーサー剤の存在が複数の蛍光標識の検出可能な蛍光を増加させるときにタンパク質にコンジュゲートした蛍光標識の消光を減少させるものとして同定することと、を含み得る。いくつかの場合において、スペーサー剤は、生体分子上に存在する最初のリジン側鎖で生体分子にコンジュゲートされる。さらに、生体分子は抗体または抗体断片である。また、複数の蛍光標識は、負および／または正に荷電していてもよい。さらに、スペーサー剤は、負および／または正に荷電していてもよい。
【００１６】
本発明はさらに、部分的には、生体試料中の所望の標的の存在を決定するための方法に関する。そのような方法は、（ａ）生体試料を組成物の抗体と接触させることであって、ここで２つ以上の蛍光標識および２つ以上のスペーサー分子は抗体に共有結合し、蛍光分子およびスペーサー分子は互いに共有結合しない、接触させることと、（ｂ）複数の蛍光標識が発光する蛍光を検出することと、（ｃ）複数の蛍光標識によって発光された蛍光が検出されたときに、生体試料中の所望の標的の存在を決定することと、を含み得る。本発明の実施において使用される生体試料は、細胞溶解物、無傷の細胞（例えば、体液などの流体中の無傷の細胞）、単離されたタンパク質、および／または組換えタンパク質を含み得る。さらに、生体試料は、固体支持体上に固定化されてもよい。さらに、生体試料は哺乳動物のような生きている動物を含む。
【００１７】
本発明はまた、部分的に、第１の核酸分子を含む組成物であって、２つ以上の蛍光標識および２つ以上のスペーサー分子が第１の核酸分子に共有結合し、蛍光体とスペーサー分子は互いに共有結合していない組成物に関する。いくつかの実施形態では、第１の核酸分子は、等量の蛍光標識を用いて調製されたがスペーサーを含まない第２の核酸分子よりも高い蛍光発光レベルを示す。さらに、いくつかの実施形態では、第１の核酸分子は第２の核酸分子よりも高い蛍光発光レベルを示してもよく、第１の核酸分子および第２の核酸分子はそれぞれ同数の共有結合した蛍光標識を有し、第２の核酸分子は、共有結合したスペーサーを有さない。
【００１８】
本発明はまた、それぞれが複数の蛍光標識（例えば、約２〜約３０、約２〜約２０、約３〜約３０、約２〜約１５、約３〜約１５、約４〜約３０、約６〜約２０、約７〜約３０などの平均）とコンジュゲートした抗体を含むコンジュゲート抗体を含み、ここで、コンジュゲート抗体は、以下の特徴、
（ａ）蛍光標識１個あたりに基づいて０．５以上の蛍光比、
（ｂ）少なくとも４つの蛍光標識を抗体にコンジュゲートすること、
（ｃ）抗体の全蛍光が、非コンジュゲート蛍光分子の蛍光より少なくとも２０パーセント大きい、および／または
（ｄ）各抗体分子に結合した平均約３〜約８０個の蛍光標識、のうちの１つ以上を含む。
【００１９】
さらに、蛍光標識は、１つ以上（例えば、約１〜約１５、約２〜約１０、約２〜約１５、約２〜約８、約３〜約１０、約３〜約６など）のマルチアームポリマーによって生体分子（例えば、抗体）にコンジュゲートされ得る。さらに、マルチアームポリマーのアームは、（ａ）ポリエチレングリコール、（ｂ）多糖類、および（ｃ）ポリペプチド、ならびに他の物質からなる群から選択される種類の化学物質から構成されてもよい。さらに、蛍光標識間の平均ブラシ距離は、２００〜８００オングストローム（例えば、約２００〜約７００、約３００〜約８００、約４００〜約８００、約５００〜約８００、約２００〜約６００、約５００〜約８００、約３００〜約７００、約３５０〜約８００など）であり得る。また、抗体（または他の生体分子）にコンジュゲートした蛍光標識は、抗体（または他の生体分子）から少なくとも１６（例えば、約１６〜約８００、約２５〜約８００、約４０〜約８００、約６０〜約８００、約１００〜約８００、約２００〜約８００、約２５０〜約８００、約１５０〜約６００など）の共有結合によって分離され得る。さらに、コンジュゲート抗体（または他の生体分子）は、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５１４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６１０−Ｘ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ジニトロフェニル、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＭＡＲＩＮＡ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）４８８、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）５１４、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＬＵＥ（商標）、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＯＲＡＮＧＥ（商標）、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５、ＲＯＸ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＲＥＤ（商標）、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、ＦＡＭ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）、または７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）スクシンイミジルエステル（ＤＤＡＯ−ＳＥ）からなる群から選択される１つ以上の色素であり得る蛍光標���、ならびにＤＹＬＩＧＨＴ（商標）３５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４０５、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５９４、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６３３、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）７５５、およびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００、およびＰＥＧ化ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）色素からなる群からの蛍光標識にコンジュゲートされ得る。
【００２０】
本発明はまた、蛍光標識された生体分子を調製する方法であって、（ａ）反応性基および２つ以上の蛍光標識をスペーサー分子にコンジュゲートし、それによって蛍光標識されたスペーサー分子を形成することと、（ｂ）蛍光標識されたスペーサー分子を生体分子にコンジュゲートし、それによって蛍光標識された生体分子を形成することと、を含み得、ここで、蛍光標識された生体分子の個々の蛍光標識が、蛍光標識１個あたりに基づいて０．５以上の蛍光比を有する、方法を含む。さらに、平均１〜１０（例えば、約１〜約９、約２〜約１０、約３〜約１０、約４〜約１０、約５〜約１０、約２〜約６、約３〜約６、約３〜約７など）の蛍光標識されたスペーサー分子を各生体分子にコンジュゲートさせることができる。さらに、蛍光標識されたスペーサー分子は、マルチアームポリマー（例えば、分岐鎖ポリエチレングリコール分子）であり得る。さらに、スペーサー分子（例えば、マルチアームポリマー）は、それぞれ平均４〜２０（例えば、約４〜約１０、約３〜約８、約４〜約８、約３〜約９など）の蛍光標識にコンジュゲートされ得る。さらに、スペーサー分子（例えば、マルチアームポリマー）は、４，０００〜８０，０００ダルトン（例えば、約４，０００〜約７０，０００、約４，０００〜約６０，０００、約４，０００〜約５０，０００、約４，０００〜約４０，０００、約１０，０００〜約７０，０００、約１５，０００〜約６０，０００など）の分子量を有してもよい。
【００２１】
本発明はさらに、蛍光標識された生体分子を検出する方法を含む。そのような方法は、（ａ）生体分子にコンジュゲートした蛍光標識を励起する光で蛍光標識された生体分子（例えば、抗体）を露光することと、（２）生体分子にコンジュゲートした蛍光標識によって生成される発光を検出することと、を含み得る。いくつかの場合において、蛍光標識された生体分子は、４つ以上の蛍光標識にコンジュゲートし得る。さらに、蛍光標識された生体分子の個々の蛍光標識は、蛍光標識１個あたりに基づいて０．７以上（例えば、約０．７〜約１．０、約０．７〜約０．９５、約０．７〜約０．９、約０．７〜約０．８５、約０．７５〜約０．９５など）の蛍光比を有し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
（図１）本発明の一実施形態の概略図を示す。この実施形態では、抗体を、５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中で２つの異なる色素モル過剰でＮＨＳ蛍光色素およびスルホＮＨＳ−アセテートスペーサーとコンジュゲートさせる。色素とスペーサーのコンジュゲーションは、感度の増強と消光の減少をもたらす。
（図２）本発明のいくつかの実施形態の概略図を示す。この実施形態では、抗体を、５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中でＮＨＳ蛍光色素およびメチル−ＰＥＧ−ＮＨＳ−エステルスペーサーとコンジュゲートさせる。この実施形態で使用されるスペーサーは、ＭＳ（ＰＥＧ）４、ＭＳ（ＰＥＧ）８およびＭＳ（ＰＥＧ）１２である。
（図３）イメージング機器を用いて撮影したドットブロットのソフトウェア解析の結果を示す。ドットブロットを、ＮＨＳアセテートまたはＭＳ（ＰＥＧ）４スペーサーおよびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８蛍光色素（表１において略称「ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８」）で共標識したＧＡＭ抗体を用いて試験した。ＮＨＳアセテートまたはＭＳ（ＰＥＧ）４を用いて作製されたＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８−ＧＡＭコンジュゲートは、（スペーサーなしで作製された）基本コンジュゲートに対して１．２〜１．８倍の範囲の蛍光強度の１．２〜１．８倍の改善をもたらした。この図のレーンは次の通りである。
（表１）
2019531474.tif 000003
（図４）ドットブロット−マウスＩｇＧのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８−ＧＡＭ検出、様々なモル過剰の色素で、基本コンジュゲートに比べてＮＨＳアセテート（２．５×、５×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×）の改善倍率。この図は、イメージング機器を用いて撮影したドットブロットのソフトウェア解析の結果を示す。ドットブロットを、ＮＨＳアセテートまたはＭＳ（ＰＥＧ）４スペーサーおよびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８蛍光色素で共標識したＧＡＭ抗体を用いるアッセイによって試験した。これらのデータは、抗体についての別の供給源を用いて図３からの結果を確認した。ＮＨＳアセテートとＭＳ（ＰＥＧ）４スペーサーの両方が、抗体−色素コンジュゲート単独と比較して蛍光シグナル強度において顕著な改善（約２．６倍程度の増加）をもたらした。
（図５）ドットブロット−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２×ＰＥＧ−ＧＡＲを用いたマウスＩｇＧの検出。様々なモル過剰で、基本コンジュゲートに比べてＮＨＳアセテート（２．５×、５×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×）からのシグナル／バックグランドの改善倍率。これは、イメージング機器を用いて撮影したドットブロットのソフトウェア解析の結果を示す。ドットブロットを、ＮＨＳアセテートまたはＭＳ（ＰＥＧ）４スペーサーおよびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０蛍光色素で共標識したＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−ＧＡＭ抗体を用いて試験した。マウスＩｇＧを１０００ｎｇ／ドットから１：１で段階希釈した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２×ＰＥＧ−ＧＡＲ二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／５０００に希釈した。コンジュゲーション混合物に付加されたＮＨＳアセテートまたはＭＳ（ＰＥＧ）４は、各々のそれぞれの色素のモル過剰での基本コンジュゲートと比較して、シグナル強度の改善（約１．６程度の増加）をもたらした。改善は１．２〜１．６倍の範囲であり、特に、以下のＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２×ＰＥＧ：１０×色素＋５×アセテート、１５×色素＋３．７５×ＭＳ（ＰＥＧ）４、２０×色素＋５×アセテート、および２０×＋３．７５×ＭＳ（ＰＥＧ）４は、それぞれの基本コンジュゲートに対して１．３倍を超える改善を示した。
（図６）ドットブロット−マウスＩｇＧのＤｙＬｉｇｈｔ６５０−４×ＰＥＧ−ＧＡＭ検出、各々の色素のモル過剰での基本コンジュゲートに対するＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×、５×、１０×）での改善倍率。この図は、イメージング機器を用いて撮影したドットブロットのソフトウェア解析の結果を示す。ドットブロットを、ＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×）およびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ（表２において略称「ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０」）（１０×〜２０×）で共標識したＧＡＭ抗体を用いて試験した。マウスＩｇＧを１０００ｎｇ／ドットから１：１で段階希釈した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ−ＧＡＲ二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／１０，０００に希釈した。高度の色素の置換を有するコンジュゲートは、ドットブロットおよびウエスタンブロッティングなどの用途においてよりよく機能する傾向がある。ＮＨＳアセテートと（ＭＳ）ＰＥＧ４の両方は、初期の基本コンジュゲートよりも感度およびシグナル／バックグラウンド（約２．２程度の増加）において顕著な改善をもたらす。２．５×モル過剰でＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ−１５×に付加されたＮＨＳアセテートは、強度を１．７倍改善した。ＮＨＳアセテートによってもたらされた改善は、最高モル過剰（２０×）で調製されたコンジュゲートを用いた場合よりも１．３倍優れた性能を示した。ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ−１５×コンジュゲーションに付加された全てのＭＳ（ＰＥＧ）４は、蛍光強度を１．８〜２．２倍改善し、対応する最高基本コンジュゲートＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ−２０×よりも良好に機能した。この図のレーンは次の通りである。
（表２）
2019531474.tif 000004
（図７）ドットブロット−各々のモル過剰での基本コンジュゲートに対するＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×、５×、１０×）でのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８８０−４×ＰＥＧコンジュゲートの改善倍率。この図は、蛍光ドットブロットアッセイでの、ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００−４×ＰＥＧ（表３において略称「ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００」）の検出可能な蛍光レベルに対するＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×、５×、１０×）の付加の効果を実証する。マウスＩｇＧを１０００ｎｇ／ドットから１：２に段階希釈した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００−４×ＰＥＧ−ＧＡＲ二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／２０，０００に希釈した。このドットブロット用途は、ＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×および５×）およびＮＨＳアセテート（５×）の付加が、基本のＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００−４×ＰＥＧコンジュゲートの蛍光強度および感度を１．５〜６倍で顕著に増強したことを示す。この図のレーンは次の通りである。
（表３）
2019531474.tif 000005
（図８）５×〜２０×の範囲の色素のモル過剰で抗体にコンジュゲートしたＧＡＲ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８の蛍光検出レベルに対する、ＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×モル過剰）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×モル過剰）の付加の効果を示すウエスタンブロットアッセイ。Ａ４３１細胞溶解物を１μｇ／ウェルから３倍に希釈した。使用したウサギ一次抗体は、１ｍｇ／ｍｌから１／５０００に希釈した抗Ｈｓｐ９０および１ｍｇ／ｍｌから１／５０００に希釈した抗シクロフィリンＢであった。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックから１／５０００に希釈した。これらの結果は、ウエスタンブロット用途において、ＮＨＳアセテートまたはＭＳ（ＰＥＧ）４の付加とコンジュゲートしたＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８−ＧＡＲについて７．５×〜２０×までの各色素モル過剰において、基本コンジュゲート（スペーサーを含まず作製）を超える蛍光強度の顕著な増加があることを示す。
（図９）ウエスタンブロットでのＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ−ＧＡＲ（７．５×モル過剰の色素で）に対するＮＨＳアセテート（５×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（５×）の効果を示す。ＨｅＬａ細胞溶解物を０．５μｇ／ウェルから４倍に希釈した。一次抗体マウス抗ＰＤＩを１ｍｇ／ｍｌの１／５０００に希釈した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／５０００に希釈した。５×モル過剰でＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ−７．５×コンジュゲートに付加されたＮＨＳアセテートは、強度を１．５倍改善した。３．７５×モル過剰でＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ−７．５×コンジュゲートに付加されたＮＨＳアセテートは、強度を１．４倍改善した。
（図１０）ＧＡＲ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００−４×ＰＥＧ（表４において略称「ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００」）の検出可能な蛍光レベルに対するＮＨＳアセテート（２．５×、５×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４の効果を試験するウエスタンブロットアッセイの結果を示す。Ａ４３１細胞溶解物を１：１で段階希釈した。一次抗体ウサギ抗Ｈｓｐ９０と抗シクロフィリンＢを両方とも１／５０００に希釈した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／２０，０００に希釈した。このウエスタンブロッティング用途で、ＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×と５×）およびＮＨＳアセテート（２．５〜５×）の付加は、異なるモル過剰の色素で、基本ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００−４×ＰＥＧコンジュゲートの蛍光強度と感度を２０〜１００％顕著に増強した。この図のレーンは次の通りである。
（表４）
2019531474.tif 000006
（図１１）蛍光のウエスタンブロットおよびドットブロットアッセイでの、ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２×ＰＥＧ（１２．５×モル過剰の色素で）へのＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（５×）およびＭＳ（ＰＥＧ）８（５×）の付加の効果を示す。ＨｅＬａ細胞溶解物を０．５μｇ／ウェルから４倍に希釈し、１ｍｇ／ｍｌの１／５０００に希釈した抗ＰＤＩ一次抗体で染色した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／５０００に希釈した。ウエスタンブロッティングおよびドットブロットアッセイは、ＭＳ（ＰＥＧ）４（５×）およびＮＨＳアセテート（２．５×および５×）を付加すると、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２×ＰＥＧコンジュゲートの蛍光強度と感度が少なくとも２倍、顕著に増強したことを示した。長鎖ＭＳ（ＰＥＧ）８によって調製されたコンジュゲートは、基本コンジュゲートを超えて顕著な改善を示さなかった。
（図１２）ウエスタンブロットおよびドットブロットアッセイでは、ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４×ＰＥＧ−ＧＡＲ（１０倍モル過剰での色素）に対するＮＨＳアセテート（２．５×、５×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（５×）の効果を示す。ウエスタンブロットのために、ＨｅＬａ細胞溶解物を０．５μｇ／ウェルから４倍に希釈し、抗ＰＤＩ一次抗体を１ｍｇ／ｍｌの１／５０００に希釈した。ドットブロットのために、マウスＩｇＧを１０００ｎｇ／ドットから１：２に段階希釈した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４×ＰＥＧ−ＧＡＲ二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／２００００に希釈した。ウエスタンブロッティングとドットブロットアッセイの両方は、ＭＳ（ＰＥＧ）４（５×）およびＮＨＳアセテート（２．５×および５×）を付加すると、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４×ＰＥＧコンジュゲートの蛍光強度と感度が３〜４倍、顕著に増強したことを示した。
（図１３Ａ）（ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８−ＧＡＭ４μｇ／ｍｌによるＩＦＣ。様々なモル過剰で、基本コンジュゲートに比べてＮＨＳアセテート（２．５×、５×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×）からのシグナル／バックグランドの改善倍率、そして図１３Ｂ（ＩＦＣ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８−ＧＡＲ４μｇ／ｍｌによるＰＤＩの検出。様々なモル過剰で、基本コンジュゲートに比べてＮＨＳアセテート（２．５×、５×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×）の倍率でシグナル／バックグランドの向上）は、細胞イメージングアッセイでの７．５×〜２０×モル過剰の色素でのＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８（１３Ａ）およびＧＡＲ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８（１３Ｂ）の蛍光に対するＮＨＳアセテート（２．５×および５×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４細胞（３．７５×）の付加の効果を実証する。図１３Ａ：Ａ５４９細胞を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／１０００に希釈したｐＨ２Ａ×一次抗体で染色した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８二次抗体を１ｍｇ／ｍｌストックの１／２５０に希釈した。ＮＨＳアセテート修飾コンジュゲートは、１５×の色素モル過剰で基本コンジュゲートと比較してシグナル／バックグラウンドの１．４〜１．５倍（ＧＡＭ）および１．１〜１．６倍（ＧＡＲ）の範囲での改善をもたらした。ＧＡＭコンジュゲートについては、５×でのＮＨＳアセテートおよび３．７５×でのＧＡＲコンジュゲートについてのＭＳ（ＰＥＧ）４で最も顕著な改善が観察され、２．５×でのＮＨＳアセテートおよび３．７５×でのＭＳ（ＰＥＧ）４でより顕著な改善が観察された。
（図１３Ｂ）図１３Ｂは、Ａ５４９細胞をｐＨ２Ａ×一次抗体で染色した同様の実験を示す。
（図１４）ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２×ＰＥＧ（７．５×〜２０×）４μｇ／ｍｌによるＰＤＩのＩＦＣ検出。各々の色素モル過剰での基本コンジュゲートに対するＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×、５×、１０×）の付加からの改善倍率。この図は、蛍光細胞イメージングアッセイでの、ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２×ＰＥＧ−ＧＡＭ（７．５×〜２０×モル過剰の色素での）へのＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×、５×、および１０×）の付加の効果を示す。Ｕ２ＯＳ細胞を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／１００に希釈した抗ＰＤＩ一次抗体で染色した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２×ＰＥＧ−ＧＡＭ二次抗体（表５において略称「ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０」）を１ｍｇ／ｍｌストックの１／２５０に希釈した。この細胞イメージング用途において、５×ＮＨＳアセテートの付加は、１２．５×色素モル過剰のＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２×ＰＥＧ  ＧＡＭコンジュゲートについての基本コンジュゲート（付加なしで作られた）と比較して約５０％の改善をもたらし、３．７５×ＭＳ（ＰＥＧ）４の付加は、２０倍の色素モル過剰で、基本コンジュゲートに対して約５０％の改善をもたらした。この図のレーンは次の通りである。
（表５）
2019531474.tif 000007
（図１５）ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ（７．５×〜２０×）４μｇ／ｍｌによるＰＤＩのＩＦＣ検出。各々の色素モル過剰での基本コンジュゲートに対するＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×、５×、１０×）の付加からの改善倍率。この図は、蛍光細胞イメージングアッセイのＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧでの、ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧに対するＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×、５×、１０×）付加の効果を示す。Ｕ２ＯＳ細胞を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／１００に希釈した抗ＰＤＩ一次抗体で染色した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ−ＧＡＭ二次抗体（表６において略称「ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０」）を１ｍｇ／ｍｌストックの１／２５０に希釈した。この用途において、ＮＨＳアセテート−５×の付加は、２０×モル過剰のＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ  ＧＡＭコンジュゲートについての基本コンジュゲート（付加なしで作られた）と比較して約７０％の改善をもたらし、ＭＳ（ＰＥＧ）４−３．７５×の付加は、２０倍のモル過剰で、基本コンジュゲートに対して約９０％の改善を示した。この図のレーンは次の通りである。
（表６）
2019531474.tif 000008
（図１６）ＩＦＣ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４×ＰＥＧ、各々のモル過剰での基本コンジュゲートに対するＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×、５×、１０×）での改善倍率。この図は、細胞イメージングアッセイでの、ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４×ＰＥＧ）へのＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．３．７５×、５×、１０×）の付加の効果を示す。Ｕ２ＯＳ細胞を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／１００に希釈したマウス抗ＰＤＩ一次抗体で染色した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４×ＰＥＧ−ＧＡＭ二次抗体（表７において略称「ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０」）を１ｍｇ／ｍｌストックの１／２５０に希釈し、この細胞イメージング用途では、ＮＨＳアセテート−５×の付加は、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４×ＰＥＧの基本コンジュゲート（付加なしで作製）と比較して、７．５×と１０×の両方で色素コンジュゲートの約７０％の改善をもたらした。１５×モル過剰のモル過剰でのＧＡＭコンジュゲートとＭＳ（ＰＥＧ）４−３．７５×は、１５×モル過剰での基本コンジュゲートよりも約８０％の改善を示した。この図のレーンは次の通りである。
（表７）
2019531474.tif 000009
（図１７）ベタイン有りまたはなしのＴＡＭＲＡ−ＧＡＭ共コンジュゲート。この図は、ベタイン有りまたはなしの、ＴＡＭＲＡ−ヤギ抗マウス抗体（ＧＡＭ）コンジュゲートの様々な色素／タンパク質モル比で観察された蛍光レベルを例示する。抗体のモル数と比較して、２．５、５、および１０×モル過剰でベタインのレベルを試験した。ＮＨＳ−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）で標識し、様々なＮＨＳ−ベタイン濃度（ベタイン２．５×、ベタイン５×、ベタイン１０×モル過剰の色素）とコンジュゲートしたこれらの抗体は、抗体をスペーサー剤としてのベタインとコンジュゲートするときに全蛍光の増加を示した。
（図１８）蛍光標識を含む分岐鎖ＰＥＧ分子の生成および抗体分子への結合の概略図を示す。ステップ１では、反応性基および蛍光標識を分岐鎖ＰＥＧ分子上のＮＨ２基に結合させる。ステップ２において、付着部位が抗体分子に付加される。ステップ３では、蛍光標識された分岐鎖ＰＥＧ分子を抗体分子に共有結合させる。
（図１９）シングルアームコネクター（アミロースなど）とマルチアームコネクター（デキストラン）の各々の一例を示す図である。ＢＭは生体分子を表し、ＡＰは結合点を表し、これは蛍光標識がその点に結合されることを意味する。
（図２０）スターポリマーの種々の種類といくつかのスターポリマーの成分の例およびスターポリマーの製造方法の例である。図２０Ａは、コア（黒丸）および複数のアーム（黒線）を有するスターポリマーの図である。スターはアームに共有結合した蛍光標識を表す。いくつかのアームは蛍光標識されておらず、標識が完了しなかったことを示している。図２０Ｂは、アームが２つの異なる種類（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリビニルアルコール）であり、異なるアームの種類が実線および破線で表される、同様のスターポリマーの図である。図２０Ｃの左側は、他の化学物質を結合するため、または重合のための開始剤として作用するために使用することができる反応性基（灰色のバー）を有するコア（黒い半円）の部分図を示す。コアは反応性基に結合したアダプター（黒い実線）を有して中心に表される。ポリマーアームは、アダプターに結合した右側（黒い破線）に示され、そして蛍光分子（スター）で標識されている。
（図２１）本発明の実施において使用することができる種類の例示的なポリリジン分子を示す。Ｒ１およびＲ２基は標識なしとして示されている。これらの基は、蛍光標識のためのおよび生体分子（例えば、抗体）へのコンジュゲートのための結合点として使用することができる。
（図２２）ＡＦ６４７分岐鎖ＰＥＧコンストラクトとコンジュゲートしたＳＫ３マウス抗ヒトＣＤ４抗体。ＳＫ３マウス抗ヒトＣＤ４抗体（５．５ｍｇ／ｍＬ）を、抗体に対して１０倍モル過剰エステルでのＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７スクシンイミジルエステルで修飾した（破線）。抗体に対して１０倍過剰のアジド−ＳＥでタグ化されたＳＫ３を、１ｍｇ／ｍＬのアジド−ＳＫ３抗体で１００μＭのＡＦ６４７−ＨＧ２０Ｋ８  ＰＥＧ−ｓＤＩＢＯに２５℃で２０時間クリックコンジュゲートし、５ｍＭのＮａＮ３でクエンチし、コンジュゲートをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＭＩＣＯＮ（商標）Ｕｌｔｒａ−２  １００ｋＤａ遠心分離フィルターで精製した（点線）。抗体に対して２０倍過剰のアジド−ＳＥでタグ化されたＳＫ３を、３ｍｇ／ｍＬのアジド−ＳＫ３抗体で６００μＭのＡＦ６４７−ＨＧ２０Ｋ８  ＰＥＧ−ｓＤＩＢＯに３７℃で３時間クリックコンジュゲートし、５ｍＭのＮａＮ３でクエンチし、コンジュゲートをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＭＩＣＯＮ（商標）Ｕｌｔｒａ−２  １００ｋＤａ遠心分離フィルターで精製した（実線）。９６ウェルプレート中の１００万個のＦｉｃｏｌｌで単離されたＰＢＭＣ／ウェルを、１μｇ〜０．０１５μｇの抗体の７点滴定を用いてＳＫ３コンジュゲートで染色した。染色された細胞の分析は、ＡＴＴＵＮＥ（商標）ＮｘＴフローサイトメーターを用いて実施された。
（図２３）ＡＦ６４７分岐鎖ＰＥＧコンストラクトとコンジュゲートしたＳＫ３マウス抗ヒトＣＤ４抗体。ＳＫ３マウス抗ヒトＣＤ４抗体（５．５ｍｇ／ｍＬ）を、抗体に対して１０倍モル過剰エステルでのＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７スクシンイミジルエステルで修飾した（ＡＦ）。抗体に対して２０倍過剰のアジド−ＳＥでタグ化されたＳＫ３を、３ｍｇ／ｍＬのアジド−ＳＫ３抗体で６００μＭのＡＦ６４７−ＨＧ２０Ｋ８  ＰＥＧ−ｓＤＩＢＯに３７℃で３時間クリックコンジュゲートし、５ｍＭのＮａＮ３でクエンチし、コンジュゲートをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＭＩＣＯＮ（商標）Ｕｌｔｒａ−２  １００ｋＤａ遠心分離フィルターで精製した（Ｂ１）。抗体に対して１０倍過剰のアジド−ＳＥでタグ化されたＳＫ３を、１ｍｇ／ｍＬのアジド−ＳＫ３抗体で１００μＭのＡＦ６４７−ＨＧ２０Ｋ８  ＰＥＧ−ｓＤＩＢＯに２５℃で２０時間クリックコンジュゲートし、５ｍＭのＮａＮ３でクエンチし、コンジュゲートをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＭＩＣＯＮ（商標）Ｕｌｔｒａ−２  １００ｋＤａ遠心分離フィルターで精製した（Ｂ２）。９６ウェルプレート中の１００万個のＦｉｃｏｌｌで単離されたＰＢＭＣ／ウェルを、１μｇ〜０．０１５μｇの抗体の７点滴定を用いてＳＫ３コンジュゲートで染色した。染色された細胞の分析は、ＡＴＴＵＮＥ（商標）ＮｘＴフローサイトメーターを用いて実施し、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＨＣＤ０４０５）と比較された。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
詳細な説明
蛍光標識は、タンパク質および核酸を含む生体分子の直接的、定量的、特異的、および高感度の検出をもたらすので、イメージングに広く用いられている。スルホン化および／またはＰＥＧ修飾されている修飾蛍光標識は、塩基性の未修飾色素と比較して感度が高い。しかしながら、これらの修飾蛍光標識でさえも、特定の色素対タンパク質（Ｄ／Ｐ）比で蛍光消光を示す。
【００２４】
蛍光の増加は標識色素のモル過剰の増加と共に見られるが、タンパク質に対する最適色素の比（Ｄ／Ｐ）を超えるモル過剰は、典型的には特に抗原／抗体またはＤＮＡ／ＲＮＡ相互作用の空間的立体配座が静的消光を引き起こし得る蛍光イメージング用途において生体分子の消光および／または沈殿をもたらす。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本発明は、標準的なコンジュゲーションにおいて蛍光の減少をもたらす高度に標識されたコンジュゲート（例えば、高い色素対タンパク質比（Ｄ／Ｐ）を有する生体分子）を用いて消光を低減および／または蛍光シグナルを増加させる方法を含む。タンパク質、核酸および他の生体分子（例えば、オリゴ糖）に修飾を加えることができる。いくつかの実施形態において、本発明は、蛍光シグナルの増加および／または消光の減少を示す蛍光標識された生体分子を含む組成物を含み、組成物は生体分子、スペーサー、および蛍光標識を含み、スペーサーと蛍光標識は、互いに直接コンジュゲートしていない。
【００２６】
本発明はまた、蛍光標識１個あたりに基づいて増強された蛍光を示す組成物、ならびにそのような組成物を製造および使用する方法に関する。例として、生体分子に結合した単一の蛍光標識が１００％の蛍光発光のベースラインを設定すると仮定する。さらに、２つの蛍光標識が同一の生体分子に結合しているとき、２つの蛍光標識のそれぞれがベースライン蛍光発光の平均８０％を示すと仮定する。本発明は、部分的には、平均蛍光発光をベースラインの８０％を超えて増加させるための組成物および方法に関する。
【００２７】
いくつかの場合において、本発明の組成物、および本発明の方法で使用される組成物は、１つ以上の機能的特性によって定義され得る。そのような特性の例は、標識された分子（例えば、生体分子）に結合する蛍光標識の数、標識された分子上の蛍光標識間の平均距離（多数の異なる方法のいずれかで測定される）、および／または標識された分子上の蛍光標識の量子収率である。
【００２８】
蛍光強度を測定する１つの手段は、量子収率の測定によるものである。蛍光系についての量子収率（Φ）は、事実上、所与のフルオロフォアの発光効率であり、そして以下の式によって決定され得る。
2019531474.tif 000010
【００２９】
以下の実施例８に示されるように、量子収率も消光効果を測定するために使用され得る。さらに、量子収率を測定するために使用され得るＨａｍａｍａｔｓｕ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ＰＬ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｙｉｅｌｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ  ＮＪ  ０８８０７，Ｃ１１３４７−１１Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−ＱＹ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ＰＬ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｙｉｅｌｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）のような装置は市販される。
【００３０】
実施例８および表２５に示すように、蛍光標識された分子の量子収率は遊離の蛍光標識の量子収率と比較することができる。消光が実質的に起こらない条件下での単一ユニットの遊離の蛍光標識の量子収率を１と設定すれば、これは標識された分子に結合した各蛍光標識によって発生する蛍光の比較のためのベンチマークとして使用できる。多くの場合、本発明の組成物は、複数の蛍光標識で標識された蛍光標識された分子を含み、ここで蛍光発光の平均量は、蛍光標識１個あたりに基づいて、遊離の蛍光標識の蛍光発光の、少なくとも７０％（０．７蛍光比）（例えば、約７０％〜約９９％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９９％、約８５％〜約９９％、約８７％〜約９９％、約９０％〜約９９％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９６％など）である。
【００３１】
実施例８および表２５に示すように、蛍光強度は、遊離の標識の蛍光と比較した蛍光標識された分子の全蛍光の測定によって決定することができる。消光が実質的に起こらない条件下での単一ユニットの遊離の蛍光標識の蛍光を１と設定すれば、これは標識された分子に結合した各蛍光標識によって発生する蛍光の比較のためのベンチマークとして使用できる。多くの場合、本発明の組成物は、複数の蛍光標識で標識された蛍光標識された分子を含み、ここで蛍光発光の平均量は、蛍光標識１個あたりに基づいて、遊離の蛍光標識の蛍光発光の、少なくとも７０％（０．７蛍光比）（例えば、約７０％〜約９９％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９９％、約８５％〜約９９％、約８７％〜約９９％、約９０％〜約９９％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９６％など）である。
【００３２】
表２５に示されるように、遊離の蛍光標識と比較した蛍光標識された分子の明度を決定することができる。明度は、次の式で与えられるように、量子収量（Φ）、吸光係数（ε）、および１分子あたりの色素数（Ｎ）の積に比例する。
Ｂ＝Φ×ε×Ｎ
したがって、遊離の蛍光標識の明度の標識された分子の明度に対する比を用いて、全蛍光増強を記載することができる。
【００３３】
例として、表２５のデータは、脱イオン水中のＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７のベンチマークとして設定されている。さらに、これは遊離の色素の１００％量子収率および１．０の明度の比のベンチマークを設定する。試料のうちで、分子ＡＦ６４７−２０Ｋ８は遊離の色素の７３％の量子収率を有していたが、遊離の色素に対して５．８×の蛍光増強を示した。試料ＡＦ６４７−１０Ｋ４が遊離の色素の最高量子収率（８９％）を有するが、遊離の色素に対してわずか３．６×の蛍光増強を有することもまた示される。これらのデータは、これらの分子について見られる蛍光増強の程度がアームの長さと直接相関し得ることを示す。データはまた、アームの長さを一定に保ち、より多くの蛍光標識されたアームをポリマーに付加すると、蛍光増強が増大する傾向があることを示している。
【００３４】
したがって、本発明は、蛍光標識が蛍光シグナルを増強する様式で間隔を空けられるように、複数の蛍光標識を個々の分子（例えば、生体分子）に連結するための組成物および方法を含む。これは消光の減少によってなされ得る。蛍光シグナルを増強するための１つの方法は、試料中に存在する蛍光標識を空間的に分離することである。これは、複数の蛍光標識が検出されるべき同一の分子（例えば、生体分子）に結合しているときに特に有用である。
【００３５】
いくつかの態様において、本発明は、スペーサーと蛍光標識とにコンジュゲートした抗体を産生する方法であって、ここでスペーサー剤を用いてスペーサーを抗体にコンジュゲートし、そしてスペーサーは蛍光標識にコンジュゲートしていない、方法を含む。スペーサー、抗体、および蛍光標識を含む組成物であって、ここでスペーサーが蛍光標識にコンジュゲートしていない組成物もまた包含される。
【００３６】
いくつかの実施形態において、スペーサーは、抗体にコンジュゲートした複数の蛍光標識の消光を低減することができる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、スペーサー剤にコンジュゲートされた核酸を産生する方法であって、ここでスペーサー剤が蛍光標識に直接コンジュゲートされていない方法が包含される。そのようなスペーサー剤は、核酸にコンジュゲートした蛍光標識の消光を低減させ得る。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本発明は、それらがコンジュゲートしている分子（例えば、生体分子）上の点からの空間的に分離した蛍光標識に関する組成物および方法を含む。多くの場合、これは１つ以上の蛍光標識をスペーサーに接続し、スペーサーを分子（例えば、生体分子）に接続することにより実施される。そのような組成物および方法の例を図１８に示す。
【００３９】
定義
本明細書および例示的な実施形態は、限定的なものとして捉えられるべきではない。本明細書および添付の特許請求の範囲の目的において、別途示されない限り、数量、割合、または比率を表す全ての数、ならびに明細書および特許請求の範囲に使用される他の数値は、全ての場合において、それらが修正されすぎない程度まで「約」という用語によって修正されているものとして理解されるべきである。したがって、反対が示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、得ようとする所望の特性によって変化し得る近似値である。最低でも、特許請求の範囲に対する均等の原則の適用を限定することを企図しないように、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の桁数に照らしてかつ通常の四捨五入の技術を適用することによって解釈されるべきである。
【００４０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」、ならびに任意の単語の任意の単数使用には、明確かつ疑いの余地なく１つの指示対象に限定されていない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本明細書で使用されるとき、「含む」という用語およびその文法的異形は、リスト中の項目の列挙が、列挙される項目と置き換えられるか、またはそこに追加され得る他の同様の項目を除外するものではないように、非限定的であることが意図される。
【００４１】
本明細書中で使用されるとき、「生体分子」とは、合成または天然に存在する、タンパク質またはその断片、糖タンパク質、リポタンパク質、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、糖、脂質、脂肪酸、ハプテン、抗体などを含むがこれらに限定されない。
【００４２】
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを含むように一般的な意味で使用されている。本明細書で使用されるとき、「ペプチド」という用語は、モノマーがアミノ酸であり、アミド結合を介して互いに結合しているポリマーを指し、あるいはポリペプチドと呼ばれる。アミノ酸がα−アミノ酸であるとき、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のいずれかを使用することができる。さらに、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンもまた含まれる。遺伝子コードされていない一般的に遭遇するアミノ酸もまた本発明において使用され得る。本発明で使用される全てのアミノ酸は、Ｄ−またはＬ−異性体のいずれかであり得る。Ｌ−異性体が一般的に使用されている。さらに、他のペプチド模倣薬もまた本発明において有用である。一般的な概説については、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，単Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）を参照のこと。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、ハイブリドーマ細胞株によって、ポリクローナル抗体応答を誘発するための免疫化によって、化学合成によって、および抗体をコードする発現ベクターで形質転換された組換え宿主細胞によって、産生される抗体を含むがこれに限定されない抗体−抗原複合体を形成するために特定の物質（例えば、抗原および免疫原）に非共有結合的に結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのタンパク質を指す。ヒトにおいて、免疫グロブリン抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭとして分類され、そして各クラスのメンバーは同一のアイソタイプを有すると言われる。ヒトＩｇＡおよびＩｇＧアイソタイプはさらにサブタイプＩｇＡ１およびＩｇＡ２、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４にさらに細分される。マウスは概してヒトと同一のアイソタイプを有するが、ＩｇＧアイソタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３サブタイプに細分される。したがって、本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語はその範囲内に、（ａ）免疫グロブリンの任意の様々なクラスまたはサブクラス（例えば、抗体を産生する任意の動物由来のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ）、ならびに（ｂ）マウス、キメラ、またはヒト化抗体などのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含むことが理解されよう。抗体分子は、抗原決定基として作用し得るアミノ酸配列の領域（例えば、Ｆｃ領域、カッパ軽鎖、ラムダ軽鎖、ヒンジ領域など）を有する。選択された領域に対して生成された抗体は抗−［領域］（例えば、抗Ｆｃ、抗カッパ軽鎖、抗ラムダ軽鎖など）と呼ばれる。抗体は、典型的には、免疫グロブリンタンパク質を発現させるためにリンパ球活性化を開始するために高分子で生物を免疫することによって抗原に対して生成される。本明細書で使用されるとき、用語「抗体」はまた、非限定的に、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）を含む抗体結合ドメインであるか、またはそれと相同な結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質を包含し、ここでＶＨドメインとＶＬドメインは、２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーによって連結されている（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３（１９８８）、およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９（１９８８））。これらは天然源に由来することができ、あるいはそれらは部分的または全体的に合成的に産生されてもよい。
【００４４】
さらに、ＶＨＨ抗体は、抗原刺激細胞から得られたものとして、または遺伝子操作された抗原結合タンパク質としてのいずれかで使用され得る。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「抗体断片」という用語は、抗体全体の主要な選択的結合特性を保持する抗体の断片を指す。特定の断片、例えば様々なプロテアーゼでの消化により得られ、そして無傷の抗体のＦｃ断片を欠くＦａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、または無傷抗体中の重鎖成分を連結するジスルフィド結合の還元的切断により得られるいわゆる「半分子」断片は、当該技術分野において周知である。そのような断片には、軽鎖可変領域からなる単離された断片、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、ならびに軽鎖可変領域と重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結されている組換え単鎖ポリペプチド分子もまた含まれる。結合断片の他の例には、（ｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４（１９８９））、（ｉｉｉ）単離されたＣＤＲ領域、ならびに（ｉｖ）上述の単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）が含まれる。さらに、抗原認識特性を保持する組換え技術を用いて任意の断片を作製することができる。
【００４６】
使用され得る例示的なＶＨＨ抗体は、単一のモノマーの可変抗体ドメインからなる抗体断片である単一ドメイン抗体である。そのような抗体断片は、典型的にはわずか１２〜２５ｋＤａの分子量を有し、したがって２本の重鎖タンパク質鎖および２本の軽鎖からなる他の多くの抗体（１５０〜１６０ｋＤａ）よりも小さい。
【００４７】
本明細書中で使用されるとき、「抗原」とは、抗体の形成を誘導するか、または誘導することができる、または抗体が選択的に結合する、生物由来物質を含むがこれらに限定されない分子を指す。抗原はまた「免疫原」を指す。存在する他の物質との交差反応性または干渉が相対的に欠如するとき、抗体は抗原に選択的に結合する。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、「反応性基」という用語は、別の化学基と反応して共有結合を形成することができる、すなわち適切な反応条件下で共有結合的に反応する基を指し、一般的に別の物質に対する結合点を表す。反応性基は一般に求核性、求電子性、および光活性化可能の基を含む。例示的な反応基としては、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、酸化物、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、硫酸、スルフェン酸イソニトリル、アミジン、イミド、イミダート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、アルキン、およびアジドが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４９】
本明細書中で使用されるとき、「スペーサー」、「スペーサー分子」、または「スペーサー剤」とは、生体分子に直接または間接的にコンジュゲートしたときに、生体分子から発光される蛍光を増強し得る化合物（例えば、有機化合物）をいう。これは蛍光標識の蛍光消光の低減から生じると考えられている。任意の数の化合物がスペーサーとして作用し得、例示的な化合物には、ＮＨＳ−アセテートおよび様々な形態のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は、エチレンオキシドのオリゴマーまたはポリマーを指す。ＰＥＧポリマー鎖長は大きく変動し得るが、１０，０００，０００ｇ／ｍｏｌ程度の高い分子量を有する傾向がある。ＰＥＧもまた、様々な形状で利用可能である。例えば、分岐鎖ＰＥＧは典型的には、中心コア基から生じる３〜１０個のＰＥＧ鎖を有する。スターＰＥＧは、中心コア基から生じる３〜１００個のＰＥＧ鎖を有する。コームＰＥＧは、通常ポリマー骨格にグラフトされた複数のＰＥＧ鎖を有する。ほとんどのＰＥＧは、分子量分布を有する分子を含む（すなわち、それらは多分散性である）。サイズ分布は、その重量平均分子量およびその数平均分子量によって統計的に特徴付けることができ、その比は多分散性指数と呼ばれる。本発明の実施において使用され得る例示的なＰＥＧ化合物としては、ＭＳ（ＰＥＧ）４、ＭＳ（ＰＥＧ）８、およびＭＳ（ＰＥＧ）１２（それぞれ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、カタログ番号２２３４１、２２５０９Ｂ、および２２６８６）、ならびに（メチル−ＰＥＧ１２）３−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、カタログ番号２２４２１）などの分岐鎖ＰＥＧ化合物が含まれる。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、用語「直接スペーサー」は、それに結合した少なくとも１つの蛍光標識を有し、生体分子に直接結合する分子を指す。直接スペーサーは、（１）単一ポリマーまたは（２）コアに結合した複数のポリマーであり得る。直接スペーサーの例には、シングルアームポリマーおよびマルチアームポリマーが含まれる。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、「ポリマー」は、繰り返しサブユニット（典型的には少なくとも４つの繰り返しサブユニット）からなる分子である。ポリマーは合成でも天然に存在するものでもよい。ポリマーの繰り返し単位は同一である必要はない。例えば、タンパク質は、異なるアミノ酸サブユニットからなるポリマーである。さらに、ポリマーは完全に直鎖状の分子である必要はなく、したがってデキストランのように分岐していてもよい。
【００５２】
本明細書中で使用されるとき、用語「シングルアームポリマー」とは、少なくとも１つの蛍光標識が結合し、非分岐鎖構造を有する、非分岐鎖分子を指す（図１９を参照）。本発明の実施において使用され得るシングルアームポリマーの例は、「直鎖状」多糖類（例えば、アミロース）、ポリエチレングリコール、長鎖炭素分子（例えば、Ａｈｘ）、およびポリペプチドである。いくつかの場合では、非分枝鎖／直鎖多糖類は、α１，４結合によって互いに結合したモノマーからなる。
【００５３】
本明細書中で使用されるとき、用語「マルチアームポリマー」とは、少なくとも１つの蛍光標識が結合し、そして非分岐鎖構造を有する分岐鎖分子を指す（図１９参照）。本発明の実施において使用され得るマルチアームポリマーの例は、分岐鎖多糖類（例えば、デキストラン、グリコゲーゲン）、ポリエチレングリコール、分岐鎖状長鎖炭素分子（例えば、Ａｈｘ）、および分岐鎖ポリペプチドである。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「コンジュゲーション分子」または「コンジュゲーションアーム」とは、それを通して色素が分子（例えば、生体分子）に結合される（例えば、共有結合される）リンカーを指す。コンジュゲーション分子は、単一の色素分子または複数の色素分子（同一の色素または異なる色素）に結合してもよい。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、用語「蛍光」は、分子が高エネルギー光子を吸収し、それを低エネルギー（長波長）光子として再発光する光学現象を指し、吸収された光子と発光された光子とのエネルギーの差分は分子振動または熱として終わる。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、「蛍光標識」、「蛍光色素」、「フルオロフォア」、または「蛍光部分」という用語は、本質的に蛍光性である化合物、化学基、または組成物を指す。フルオロフォアは、フルオロフォアの溶解度、スペクトル特性、または物理的特性を改変する置換基を含み得る。多数のフルオロフォアが当業者に既知であり、クマリン、シアニン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、フラン、ベンザゾール、ボラポリアザインダセン、ならびにフルオレセイン、ローダミンおよびロドールを含むキサンテン、ならびにＲＩＣＨＡＲＤ  Ｐ．ＨＡＵＧＬＡＮＤ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ（９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＤ−ＲＯＭ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００２）に記載される他のフルオロフォアを含むがこれらに限定されない。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、マレイミド、およびヒドラジドなどの反応性化学ならびにクリック化学（例えば、ＳＩＴＥＣＬＩＣＫ（商標））が、現在、蛍光標識の生体分子へのコンジュゲーションに使用されている。
【００５７】
本明細書中で使用されるとき、用語「コンジュゲート」とは、共有結合または非共有結合のいずれかによって、直接的または間接的のいずれかで別の分子に結合している分子をさす。
【００５８】
「色素コンジュゲート」という用語は、抗体などの別の担体分子に共有結合または非共有結合で結合した色素分子を指し、多くの場合、色素は共有結合している。色素コンジュゲートは、単一の共有結合を介した直接結合、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰからなる群から選択される１〜２０個の非水素原子を組み込んだ一連の安定な共有結合などのリンカーを介した架橋または結合によって結合され得、抗体または化学反応性基などの別の部分または生物学的および非生物学的構成要素へと蛍光色素を共有結合させる。コンジュゲーションまたはリンカーは、ビオチン／アビジンなどの受容体結合モチーフを含み得る。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、「近赤外色素」または「近赤外レポーター分子」または「ＮＩＲ色素」または「ＮＩＲレポーター分子」という用語は、約５８０ｎｍ〜約８００ｎｍの励起波長を有する色素またはレポーター分子を指す。多くの場合、ＮＩＲ色素は約５９０ｎｍ〜約８６０ｎｍの範囲で発光する。多くの場合、ＮＩＲ色素は約６８０〜約７９０ｎｍで励起される。多くの場合、色素には、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６０色素、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０色素、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００色素、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０色素、およびＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０色素が含まれる。ＮＩＲ色素は、生体内に存在する内在性物質を励起することなく、選択的に可視化することができるので、インビボイメージングに特に有利である。いくつかのＮＩＲ色素は大きなストークスシフトを有し、そのため励起波長と発光波長は少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、または８０ｎｍ離れている。
【００６０】
「固体支持体」は、硬質または半硬質表面を有する基材材料を意味する。典型的には、基材の少なくとも１つの表面は実質的に平坦であるが、例えばウェル、隆起領域、エッチングされたトレンチ、または他のそのようなトポロジーによって特定の領域を物理的に分離することが望ましい場合がある。固体支持体物質はまた、球体（ミクロスフェアを含む）、棒状体（例えば光ファイバー）、ならびに加工品および不規則成形品を含む。
【００６１】
固体支持体物質は、非限定的に、ポリ（ビニリデンジフルオリド）（ＰＶＤＦ）、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ナイロン、ガラス、デキストラン、キチン、砂、軽石、ポリテトラフルオロエチレン、アガロース、多糖類、デンドリマー、バッキーボール、ポリアクリルアミド、珪藻土−ポリアクリルアミド非共有結合複合体、ポリスチレン−ポリアクリルアミド共有結合複合体、ポリスチレン−ＰＥＧ［ポリ（エチレングリコール）］複合体、シリコン、ゴム、固相合成、アフィニティー分離および精製、ハイブリダイゼーション反応、イムノアッセイおよび他のそのような用途のための支持体として使用される他の物質などの親和性マトリックスまたは化学的および生物学的分子合成および分析用支持体として使用される任意の材料を含む。固体支持体は粒状であってもよく、またはマイクロタイターディッシュもしくはウェル、スライドガラス、シリコンチップ、ニトロセルロースシート、ナイロンメッシュ、または他のそのような物質などの連続表面の形態であってもよい。
【００６２】
「キット」とは、関連する構成要素、典型的には１つ以上の化合物または組成物の包装されたセットを意味する。
【００６３】
検出可能な生体分子
いくつかの実施形態において、スペーサー剤をも含む複数の蛍光標識で検出可能に標識されている生体分子が本明細書に開示されている。
【００６４】
ａ．スペーサー
スペーサーは、生体分子にコンジュゲートしたときに、独立して生体分子にコンジュゲートした複数の蛍光標識の励起から生じる蛍光発光を増強することができる任意の分子であり得る。これは蛍光標識の蛍光消光の低減によるものと考えられる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、スペーサーはアセチル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）基を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーはアセテート分子である。いくつかの実施形態では、アセテート分子はスルホ−ＮＨＳ−アセテートである。
【００６６】
いくつかの実施形態では、スペーサー剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、スペーサー剤は（ＰＥＧ）ｎを含み、式中、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択される。いくつかの実施形態では、スペーサー剤はＭＳ−（ＰＥＧ）ｎを含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、スペーサーは、アルカノイル、アルケノイル、およびアルキノイル（−Ｃ（Ｏ）ＣｎＨｍから選択され、式中、ｎは１〜２０個の原子であり、ｍ＞ｎであり、炭素原子が、単結合、二重結合、および／または三重結合によって互いに結合することができ、ならびにアルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基はさらに置換されていてもよい。いくつかの実施形態では、具体的な置換は、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−（ＣＨ２）ｙ−ＯＲなどのポリ（エチレン）グリコール部分を含み、式中、ｘは１〜２０であり、ｙは１〜６であり、そしてＲはＨまたはＣ１〜６アルキルである。いくつかの実施形態では、具体的な置換は、アンモニウム（−ＮＨ３＋）、第４級アンモニウム（（−ＮＲ３＋）基（式中、ＲはＣ１〜６アルキルである）、またはホスホニウム基（−ＰＱ３＋）（式中、Ｑはアリール、置換アリール、またはＣ１〜６アルキルである）を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、スペーサーは、アルキル、アルケニル、またはアルキニル基（−ＣｎＨｍから選択され、式中、ｎは１〜２０個の原子であり、ｍ＞ｎであり、炭素原子が、単結合、二重結合、および／または三重結合によって互いに結合することができ、ならびにアルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基はさらに置換されていてもよい。いくつかの実施形態では、具体的な置換は、負に荷電したスルホネート基（−ＯＳＯ３−）、カルボキシレート基（−ＣＯ２−）、ホスフェート基（−ＯＰＯ３−）、および／またはホスホネート基（−ＰＯ３−）を含む。いくつかの実施形態では、他の置換は、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−（ＣＨ２）ｙ−ＯＲなどのポリ（エチレン）グリコール部分を含み、式中、ｘは１〜２０であり、ｙは１〜６であり、そしてＲはＨまたはＣ１〜６アルキルである。いくつかの実施形態では、他の具体的な置換は、アンモニウム（−ＮＨ３＋）、第４級アンモニウム（（−ＮＲ３＋）基（式中、ＲはＣ１〜６アルキルである）、またはホスホニウム基（−ＰＱ３＋）（式中、Ｑはアリール、置換アリール、またはＣ１〜６アルキルである）を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、スペーサーは正に荷電している。いくつかの実施形態において、スペーサー剤はベタイン（すなわち、トリメチルグリシン）を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、スペーサー剤は負に荷電している。
【００７１】
ｂ．蛍光標識
本明細書に記載の蛍光色素は、アミン基またはチオール基を非限定的に含む、タンパク質上の官能基へのコンジュゲーションの結果として直接的または間接的に検出可能なシグナルを試料に与えるレポーター分子として機能する。これは、一般に試料の全タンパク質のサブセットの検出と組み合わせて、試料中の全タンパク質を検出する能力をもたらす。そのような場合、全タンパク質標識は、試料中の全タンパク質のサブセットを標識する色素とは区別して識別可能である。
【００７２】
典型的には、検出可能な応答とは、蛍光の変化、例えば、蛍光の強度、蛍光の励起または発光波長、蛍光の分布、蛍光寿命、蛍光偏光、またはそれらの組み合わせの変化である。
【００７３】
蛍光色素は、当業者に既知の任意のフルオロフォアであり得る。典型的には、色素は、ハロゲン、ニトロ、スルホ、シアノ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル、アリールもしくはヘテロアリール環系、ベンゾ、または当該技術分野で既知の発色団もしくはフルオロフォア上に典型的に存在する他の置換基を含む様々な置換基で１回以上任意選択で置換されている１つ以上の芳香環またはヘテロ芳香環を含むがこれらに限定されない。
【００７４】
本明細書中に記載されるような全タンパク質標識化に適切であり得る多種多様なフルオロフォアは、当該技術分野において既に知られている（ＲＩＣＨＡＲＤ  Ｐ．ＨＡＵＧＬＡＮＤ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ（２００２））。本明細書に記載の方法および組成物に使用される蛍光色素は、２８０ｎｍを超える吸収極大を示す任意の化学部分である。そのような化学部分としては、ピレン、スルホン化ピレン、スルホン化クマリン、スルホン化カルボシアニン、スルホン化キサンテン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール、イソインドール、インドリジン、ベンズインドール、オキサゾールまたはベンゾオキサゾール、チアゾールまたはベンゾチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、カルボシアニン、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチレート、アントラニレート、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、クロメン、ボラポリアザインダセン、キサンテン、フルオレセイン、ロサミン、ローダミン、ローダミン、ベンゾ−またはジベンゾフルオレセイン、セミナフトフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、ビマン、オキサジンまたはベンゾオキサジン、カルバジン、フェナレノン、クマリン、ベンゾフラン、ベンズフェナレノン）およびそれらの誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書で使用されるとき、オキサジンは、レゾルフィン、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジン、およびそれらのベンゾ置換類似体を含む。
【００７５】
一態様では、蛍光色素は、ハロゲン、ニトロ、スルホ、シアノ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル、アリールもしくはヘテロアリール環系、ベンゾ、または当該技術分野で既知の発色団もしくはフルオロフォア上に典型的に存在する他の置換基を含む様々な置換基で１回以上任意選択で置換されている１つ以上の芳香環またはヘテロ芳香環を含む。一態様では、フルオロフォアは、１つ以上のジュロリジン環を含むキサンテンである。
【００７６】
例示的な実施形態では、色素は、水素、ハロゲン、アミノ、置換アミノ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、スルホ、反応性基、固体支持体および担体分子からなる群から選択される置換基によって独立して置換される。別の実施形態では、本発明のキサンテン色素は、キサンテン系色素に典型的に見られる置換基、例えばフェニルおよび置換フェニル部分による、キサンテンの中心環の炭素原子上での置換および非置換の両方の化合物を含む。多くの場合、色素はローダミン、フルオレセイン、ボラポリアザインダセン、インドール、およびそれらの誘導体である。
【００７７】
コンジュゲートされるタンパク質に全タンパク質標識または発現タグ標識を結合させるために使用される反応基の選択は、典型的には、コンジュゲートさせる物質上の反応性または官能基および所望の共有結合の種類または長さに依存する。有機または無機の基材（生体分子または非生体分子）に典型的に存在する官能基の種類には、アミン、アミド、チオール、アルコール、フェノール、アルデヒド、ケトン、ホスホネート、イミダゾール、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、二置換アミン、ハロゲン化物、エポキシド、ハロゲン化シリル、カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、プリン、ピリミジン、カルボン酸、オレフィン結合、またはこれらの基の組み合わせを含むがこれらに限定されない。タンパク質において、アミン、チオール、アルコール、およびフェノールを含むがこれらに限定されない様々な部位が生じ得る。
【００７８】
本明細書中に記載されるタンパク質標識化方法において使用され得るアミン反応性蛍光色素には、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５１４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６１０−Ｘ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ジニトロフェニル、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＭＡＲＩＮＡ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）４８８、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）５１４、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＬＵＥ（商標）、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＯＲＡＮＧＥ（商標）、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５、ＲＯＸ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＲＥＤ（商標）、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、ＦＡＭ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）、および７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）スクシンイミジルエステル（ＤＤＡＯ−ＳＥ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質標識化方法で使用されるタンパク質に結合したタグに結合する蛍光発生試薬／色素は、ほんの一例としてＦｌＡｓＨ−ＥＤＴ２（４’−５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−ｙｌ）フルオレセイン−（２，２−エタンジチオール）２）（ＬＵＭＩＯ（商標）Ｇｒｅｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などのフルオレセインの二ヒ素誘導体を含む二ヒ素フルオロフォア、またはほんの一例としてＲｅＡｓｈ−ＥＤＴ２（ＬＵＭＩＯ（商標）Ｒｅｄ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などのレゾルフィンの二ヒ素誘導体であり、あるいは、代替的に、ＣｈｏＸＡｓＨ−ＥＤＴ２もしくはＨｏＸＡｓＨ−ＥＤＴ２などの酸化誘導体であり得る。さらに、二ヒ素フルオロフォアは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）から市販される、ほんの一例として、  ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６３、およびＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６０などの本明細書に記載のＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）シリーズを含むがこれらに限定されない他の既知のフルオロフォアの二ヒ素誘導体であり得る。
【００８０】
いくつかの実施形態では、二ヒ素フルオロフォアは、少なくとも約１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、またはそれ以上の濃度で、および約５００μＭ、４００μＭ、３００μＭ、２００μＭ、１００μＭ、９０μＭ、８０μＭ、７０μＭ、６０μＭ、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、１５μＭ、１０μＭ、５μＭ、４μＭ、３μＭ、２μＭ、または１μＭ以下の濃度で存在することができる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、そのような蛍光色素が結合するタンパク質に結合したタグは、テトラシステインペプチドモチーフ、ｃｙｓ−ｃｙｓ−Ｘｎ−ｃｙｓ−ｃｙｓ（配列番号１）であり、式中各Ｘは任意の天然アミノ酸、非天然アミノ酸、またはそれらの組み合わせであり、そしてｎは２〜１００の整数である。特定の実施形態では、ｎは２〜９０の整数であり、他の実施形態ではｎは２〜８０の整数である。特定の実施形態では、ｎは２〜７０の整数であり、他の実施形態ではｎは２〜６０の整数である。特定の実施形態において、ｎは、２〜５０の整数であり、他の実施形態において、ｎは、２〜４０の整数である。特定の実施形態では、ｎは２〜３０の整数であり、他の実施形態ではｎは２〜２０の整数である。特定の実施形態では、ｎは２〜１０の整数であり、他の実施形態ではｎは２〜５の整数である。そのようなモチーフである場合、天然アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンを含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、テトラシステインタグは配列ＣＣＰＧＣＣ（配列番号２）を有する。他の実施形態では、アミノ酸配列、ＡＧＧＣＣＰＧＣＣＧＧＧ（配列番号３）を含むがこれに限定されない、テトラシステインモチーフを含む１２アミノ酸ペプチドが使用される。さらに、タンパク質は単一のテトラシステインタグで標識することができ、またはタンパク質は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のテトラシステインタグを含むがこれらに限定されない複数のテトラシステインタグで標することができる。そのようなタグは、タンパク質の一次アミノ酸配列内で互いに分離されてもよく、またはコンカテマーとして直列に直接多量体化されていてもよい。
【００８２】
ある特定の実施形態では、テトラシステインペプチドは、配列ｃｙｓ−ｃｙｓ−Ｘｎ−ｃｙｓ−Ｘ−ｃｙｓ−Ｘ（配列番号１）を有し、式中、各Ｘは、任意の天然アミノ酸、非天然アミノ酸、またはそれらの組み合わせであり、そしてｎは２〜１００の整数である。特定の実施形態では、ｎは２〜９０の整数であり、他の実施形態ではｎは２〜８０の整数である。特定の実施形態では、ｎは２〜７０の整数であり、他の実施形態ではｎは２〜６０の整数である。特定の実施形態において、ｎは、２〜５０の整数であり、他の実施形態において、ｎは、２〜４０の整数である。特定の実施形態では、ｎは２〜３０の整数であり、他の実施形態ではｎは２〜２０の整数である。特定の実施形態では、ｎは２〜１０の整数であり、他の実施形態ではｎは２〜５の整数である。そのようなモチーフである場合、天然アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンを含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、テトラシステインタグは配列ＣＣＧＧＫＧＮＧＧＣＧＣ（配列番号４）を有する。
【００８３】
テトラシステインペプチドタグ（単数または複数）は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはタンパク質配列内のインフレームのいずれかで、標識されることが望まれるタンパク質に組換え的に融合され得、テトラシステイン融合組換えタンパク質を作製するための発現ベクターは、当業者に既知の技術を用いて容易に構築され得る。ある特定の実施形態では、テトラシステインタグ化タンパク質は、細菌宿主細胞、真菌宿主細胞、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない宿主細胞において組換え発現される。そのような細菌宿主細胞には、ほんの一例としてエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ））、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびシュードモナス・シリンゲ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ））、ならびにサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属（例えば、サルモネラ・チフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、およびサルモネラ・チフィリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））を含む、任意の属のグラム陰性およびグラム陽性細菌が含まれるがこれらに限定されない。本発明に適した好適な細菌株および血清型は、大腸菌血清型Ｋ、Ｂ、Ｃ、およびＷを含み得る。典型的な細菌宿主は大腸菌株Ｋ−１２である。真菌宿主細胞は、ほんの一例としてサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞を含み、一方で哺乳類細胞はほんの一例としてヒト細胞を含む。そのような実施形態では、対象のタンパク質を含むタンパク質試料は宿主細胞の溶解物であり、これは本明細書に記載の方法を用いた標識化および分析の前に、未精製であり得、部分的に精製され得、または実質的に精製され得る。
【００８４】
他の実施形態では、テトラシステインタグ化タンパク質はインビトロで発現され、対象のタンパク質を含むタンパク質試料は、翻訳（および場合によっては転写）が実施される無細胞抽出物、またはその部分的精製もしくは精製画分である。大腸菌に基づくＥＸＰＲＥＳＳＷＡＹ（商標）またはＥＸＰＲＥＳＳＷＡＹ（商標）Ｐｌｕｓシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）のような、抽出物が単一の無細胞抽出物中での共役した転写と翻訳を可能にする実施形態において、試料は、転写および翻訳が通常起こる無細胞抽出物、またはその画分である。
【００８５】
代替的に、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）は、対象の遺伝子を大腸菌内で発現させるために使用することができる普遍的なクローニング技術である。
【００８６】
本明細書に記載の二ヒ素色素を用いて標識されるタンパク質は、テトラシステインモチーフを有する任意のタンパク質であり得る。テトラシステインタグ（単数または複数）が融合またはコンジュゲートされるタンパク質は、標識されることが望まれる任意のタンパク質（天然に存在するかまたは非天然に存在する）のいずれかであり得る。天然に存在するタンパク質は、既知の生物学的機能を有していてもいなくてもよく、そして発現することが知られていてもよいかまたはゲノム配列から予測されるだけであってもよい。タンパク質は、天然に存在するものである場合、完全長タンパク質またはその断片のみであり得る。したがって、テトラシステインタグ化タンパク質は、ヒトタンパク質または非ヒト哺乳動物タンパク質、真菌タンパク質、真正細菌タンパク質および古細菌タンパク質を含む細菌タンパク質、植物タンパク質、昆虫タンパク質、またはウイルスタンパク質などの動物タンパク質であり得る。
【００８７】
テトラシステインタグに加えて、他のタンパク質配列を標識することが望まれるタンパク質に組換え的に有用に付加することができる。そのような追加のタンパク質配列の中には、リンカーおよび／もしくは短いタグ、有用にはＦＬＡＧタグもしくはｍｙｃタグなどのエピトープタグ、またはポリヒスチジン（例えば、６ｘｈｉｓ）タグなどの精製に有用な他の配列がある。代替的に、テトラシステインタグ（単数または複数）は、当該技術分野で慣用されているコンジュゲーション化学を用いて標識されるタンパク質に化学的にコンジュゲートすることができる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、蛍光標識は正に荷電している。いくつかの実施形態では、蛍光標識は負に荷電している。
【００８９】
いくつかの実施形態では、蛍光標識の励起波長は３５０〜８５０ｎｍの間である。いくつかの実施形態では、蛍光標識の励起波長は遠赤色である。いくつかの実施形態では、蛍光標識の励起波長は近赤外である。いくつかの実施形態では、蛍光標識の励起波長は紫外（ＵＶ）である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、蛍光標識はＤＹＬＩＧＨＴ（商標）（登録商標）蛍光体を含む。いくつかの実施形態では、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）（登録商標）蛍光体は、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）３５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４０５、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５９４、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６３３、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）７５５、およびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００から選択される。いくつかの実施形態において、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）蛍光体は、ＰＥＧ分子（例えば、２×ＰＥＧ、４×ＰＥＧ、８×ＰＥＧ、または１２×ＰＥＧ）にコンジュゲートしている。
【００９１】
いくつかの実施形態において、蛍光標識はＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）を含む。いくつかの実施形態において、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）は、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６１０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、およびＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０から選択される。
【００９２】
いくつかの実施形態では、蛍光標識はキサンテン、クマリン、シアニン、ピレン、オキサジン、ボラポリアザインダセン、ベンゾピリリウム、およびカルボピロニンから選択される部分を含む。
【００９３】
いくつかの実施形態では、蛍光標識はフルオレセイン（例えば、Ｃｙ２またはＦＩＴＣ）を含む。いくつかの実施形態では、蛍光標識はローダミン（例えば、ＴＲＩＴＣまたはＣｙ３）を含む。いくつかの実施形態では、蛍光標識は、ＭＣＡ、クマリン、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＲＥＤ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＩＲ６８０、ＩＲ８００、およびＣｙ７を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態では、蛍光標識は修飾蛍光標識である（例えば、蛍光標識はスルホン化されているかまたはＰＥＧとコンジュゲートされている）。
【００９５】
いくつかの実施形態では、蛍光標識は蛍光タンパク質である。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質はフィコビリタンパク質である。本発明において有用なフィコビリタンパク質の例は、アロフィコシアニン、フィコシアニン、フィコエリスリン、アロフィコシアニンＢ、Ｂ−フィコエリスリン、フィコエリスロシアニン、およびｂ−フィコエリスリンである。フィコビリタンパク質の構造は研究されており、それらの蛍光スペクトル特性は既知である。Ａ．Ｎ．Ｇｌａｚｅｒ，「Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｂｉｌｉｎ  Ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  Ｇｒｏｕｐｓ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ８，Ｍ．Ｄ．Ｈａｔｃｈ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋ．Ｂｏａｒｄｍａｎ，ＥＤＳ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５１−９６（１９８１）、およびＡ．Ｎ．Ｇｌａｚｅｒ，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｔｈｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｂ．Ｓ．Ｓｉｇｍａｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｂｒａｚｉｅｒ，ＥＤＳ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．２２１−２４４（１９８０）を参照されたい。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質は、少なくとも約４５０ｎｍ、多くの場合少なくとも約５００ｎｍの吸収極大を有し、少なくとも１５ｎｍ、多くの場合少なくとも約２５ｎｍのストークスシフトを有し、少なくとも約５００ｎｍ、多くの場合少なくとも約５５０ｎｍの最大蛍光発光を有する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、蛍光標識は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１４／０３４９，８９３に開示されているような、ジピロメテンボロン二ふっ化色素である。
【００９７】
本明細書に記載のタンパク質標識化方法で使用されるアミン反応性蛍光色素としては、アロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド型の試薬が含まれるが、これらに限定されない。そのような試薬は、米国特許第５，４５９，２７２号および米国特許第５，６３１，３７４号に記載されており、これらのそれぞれは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、使用されるアロイル−２−キノリン−カルボキシアルデヒド試薬は、３−（４−カルボキシベンゾイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒドまたは３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒドである。ある特定の実施形態において、アミン反応性蛍光色素は３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド）であり、一方、他の実施形態においてアミン反応性蛍光色素は３−（４カルボキシベンゾイル）−キノリン−２−カルボキシアルデヒドである。
【００９８】
ｃ．生体分子
本明細書に開示される組成物および方法において使用され得る生体分子は、分子生物学的用途において有用である任意の生体分子を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態において、生体分子は抗体（例えば、一次抗体または二次抗体）である。いくつかの実施形態では、生体分子は抗体断片である。本発明の実施において使用される抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または遺伝子操作された抗体であり得、そして任意の供給源（例えば、サメ、トリ、またはラマ、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、ラットなどの哺乳動物）からのものであり得る。さらに、ヒト化抗体を使用することができる。
【０１００】
いくつかの実施形態において、抗体はキメラである。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、生体分子はタンパク質またはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、生体分子は組換えポリペプチドである。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、生体分子は核酸分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子はオリゴヌクレオチド（例えば、１５〜５０ヌクレオチド長）である。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５０ヌクレオチド長を超え、１００ヌクレオチド長を超え、５００ヌクレオチド長を超え、１ｋｂ長を超え、２ｋｂ長を超え、または５ｋｂ長を超える。
【０１０３】
ｄ．蛍光色素の生体分子へのコンジュゲーション
典型的には励起波長が少なくとも５８０ｎｍである場合、所望のスペクトル特性を有する適切な色素を選択した後、当該技術分野で周知の方法を用いて色素を標的担体分子にコンジュゲートさせることができる（Ｈａｕｇｌａｎｄ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ，上述（２００２））。多くの場合、共有結合を形成するためのコンジュゲーションは、反応性化合物とコンジュゲートされるスペーサー分子の両方が可溶性である適切な溶媒中で本発明の反応性化合物を単に混合することからなる。多くの場合、反応は試薬を添加することなく、室温以下で自然に進行する。光活性化されているそれらの反応性化合物については、反応性化合物を活性化するための反応混合物の照射によってコンジュゲーションが促進される。所望の化合物−コンジュゲートを調製し得るような非水溶性物質の化学修飾は、多くの場合、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、酢酸エチル、トルエン、またはクロロホルムなどの非プロトン性溶媒中で実施される。水溶性物質の同様の修飾は、本反応性化合物を使用してそれらを有機溶媒中により容易に溶解させることによって容易に達成される。
【０１０４】
生体分子（例えば、タンパク質）コンジュゲートの調製は、典型的には、最初にコンジュゲートされる生体分子を水性緩衝液中に室温以下で約１〜１０ｍｇ／ｍＬで溶解することを含む。例えば、重炭酸緩衝液（ｐＨ約８．３）、炭酸緩衝液およびホウ酸緩衝液（ｐＨ約９）は、スクシンイミジルエステルとの反応に特に好適であり、リン酸緩衝液（ｐＨ約７．２〜８）は、チオール反応性官能基との反応に特に好適であり、炭酸緩衝液およびホウ酸緩衝液（ｐＨ約９）は、イソチオシアネートおよびジクロロトリアジンとの反応に特に好適である。次いで、適切な反応性化合物を、コンジュゲートされる生体分子の溶液に添加したときに適切な程度のコンジュゲーションを与えるのに十分な量で非ヒドロキシル溶媒（通常はＤＭＳＯまたはＤＭＦ）中に溶解させる。任意の生体分子（例えば、タンパク質）または他の成分に対する化合物の適切な量は、様々な量の化合物を生体分子に付加し、コンジュゲートをクロマトグラフィーで精製して非コンジュゲート化合物を分離し、化合物−生体分子コンジュゲートを所望の用途で試験する実験によって都合よく事前に決定される。
【０１０５】
任意の数の緩衝液が、コンジュゲーション反応のために、そして本明細書中に示される他のために使用され得る。説明の目的で実施例１および５を使用すると、リン酸緩衝生理食塩水およびホウ酸緩衝液がコンジュゲーション反応に使用され得、そして使用される。ｐＨ９．５の炭酸塩緩衝液を使用できるとも考えられる。そのため、より高いｐＨのコンジュゲーションはより低いモル過剰の色素およびスペーサー分子を必要とすると考えられている。したがって、本発明は、ｐＨが約４．０〜約１０．０（例えば、約４．０〜約１０．０、約５．０〜約１０．０、約６．０〜約１０．０、約７．０〜約１０．０、約７．５〜約１０．０、約８．０〜約１０．０など）であるコンジュゲーション反応を実施するための組成物および方法を含む。コンジュゲーション反応は、様々なモル過剰での、蛍光色素または各蛍光色素の混合物と、ＮＨＳ−アセテート、ＮＨＳ−ＭＳ（ＰＥＧ）４、ＮＨＳ−ＭＳ（ＰＥＧ）８、またはＮＨＳ−ＭＳ（ＰＥＧ）１２から選択されるスペーサーと共に、ホウ酸緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ８．５中で実施され得る。標識化反応は、室温（ＲＴ）で約１時間インキュベートすることができる。ＮＨＳ活性化色素およびＮＨＳ活性化スペーサー剤は、両方の反応が同時に起こるように抗体に添加する前に組み合わせることができ、色素置換およびスペーサーのランダムな間隔を可能にする。
【０１０６】
本発明の実施において使用され得る緩衝剤としては、例として、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、リン酸塩、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、ホウ酸塩、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、および炭酸塩緩衝液が含まれる。
【０１０７】
本明細書に記載の生体分子（例えば、タンパク質）標識化方法において使用される蛍光試薬の濃度は、５０ｎＭ〜１００ｍＭ（例えば、約５０ｎＭ〜約２５ｍＭ、約５０ｎＭ〜約１０ｍＭ、約５０ｎＭ〜約５ｍＭ、約１００ｎＭ〜約１０ｍＭ、約１００ｎＭ〜約５ｍＭ、約２００ｎＭ〜約５ｍＭ、約５０ｎＭ〜約１００μＭ、約１μＭ〜約１００μＭなど）の範囲内である。ある特定の実施形態では、そのような濃度は、１００ｎＭ〜２００ｍＭ（例えば、約１０μＭ〜約５００μＭ、約１μＭ〜約１００μＭ、約１００μＭ〜約２００μＭなど）の範囲内の濃度を有する蛍光色素の原液の希釈によって得られる。ある特定の実施形態では、原液の濃度は１００ｍＭである。ある特定の実施形態では、原液の濃度は５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、原液の濃度は２０ｍＭである。ある特定の実施形態では、原液の濃度は１０ｍＭである。ある特定の実施形態では、原液の濃度は１ｍＭである。ある特定の実施形態では、原液の濃度は５００μＭである。ある特定の実施形態では、原液の濃度は１０μＭである。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の生体分子（例えば、タンパク質）の標識化方法において使用されるアミン反応性蛍光色素の濃度は、５０ｎＭ〜約１００ｍＭ（例えば、約５０ｎＭ〜約５０ｍＭ、約５０ｎＭ〜約２５ｍＭ、約５０ｎＭ〜約１０ｍＭ、約５０ｎＭ〜約５ｍＭ、約５０ｎＭ〜約５μＭ、約５０ｎＭ〜１００μＭ、約１００ｎＭ〜約５ｍＭなど）の範囲内である。ある特定の実施形態では、そのような濃度は、１００ｎＭ〜２００ｍＭの範囲内の濃度を有する蛍光色素の原液の希釈によって得られる。ある特定の実施形態では、原液の濃度は１００ｍＭである。ある特定の実施形態では、原液の濃度は５０ｍＭである。ある特定の実施形態では、原液の濃度は２０ｍＭである。ある特定の実施形態では、原液の濃度は１０ｍＭである。ある特定の実施形態では、原液の濃度は１ｍＭである。ある特定の実施形態では、原液の濃度は５００μＭである。ある特定の実施形態では、原液の濃度は１０μＭ〜５００μＭである。ある特定の実施形態では、原液の濃度は１μＭ〜１００μＭである。ある特定の実施形態では、原液の濃度は１０μＭである。ある特定の実施形態では、原液の濃度は１００μＭ〜２００μＭである。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法を用いて標識されたタンパク質またはタンパク質断片（例えば、抗体断片）の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬの範囲内（例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約０．２ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約０．２ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．２ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、約０．４ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬなど）である。
【０１１０】
いくつかの例では、生体分子上の各位置に１つを超える色素分子を結合させることができる。生体分子上の単一の位置に１つを超える色素分子を結合させる１つの方法は、１つを超える色素分子に結合するコンジュゲーション分子の使用によるものである。次いで、これらのコンジュゲーション分子は生体分子に結合し、それらと共に複数の色素分子を担持する。一例として、米国特許出願公開第２０１２／０２５６１０２号に記載されているものなどのポリマーデンドリマーを、これらの色素分子の生体分子への結合のために単一ポリマー主鎖またはコア（本明細書では「デンドリマー」と呼ぶ）にコンジュゲートした複数の蛍光色素分子を使用できる。これらのデンドリマーは、コンビナトリアル様式で、複数の色素分子、複数の色の色素、および／または複数の官能基の化学結合を可能にする規則的または不規則な、分岐鎖ポリマーネットワーク構造を有してもよい。
【０１１１】
使用され得るコンジュゲーション分子のさらなる例は、スペーサーとして使用される同一分子の多くを含む。したがって、いくつかの例において、スペーサー分子およびコンジュゲーション分子は、コンジュゲーション分子がそれに結合した色素分子を有することを除いて同一の構造を有するであろう。そのため、様々な形態のＰＥＧ分子がコンジュゲーション分子として使用され得る。したがって、スペーサー分子は、色素分子（例えば、蛍光標識）を含み得る（図１８参照）。
【０１１２】
したがって、本発明は、各々が平均で約２〜約５０個（例えば、約２〜約４５個、約２〜約４０個、約２〜約３５個、約２〜約３０、約２〜約２０、約５〜約４５、約１０〜約４５など）の結合した色素分子を有するコンジュゲーション分子の使用を企図する。多くの場合、コンジュゲーション分子に結合した色素分子の平均数の標準偏差は１０％、１５％、および／または２０％未満であろう。
【０１１３】
標識度は、標識された生体分子について測定され得る。標識度は以下のように計算することができる。第一に、標識された生体分子のモル濃度は、例えば以下の式を用いて計算される。
2019531474.tif 000011
ε＝タンパク質のモル吸光係数（例えば、ＩｇＧのモル吸光係数は約２１０，０００Ｍ−１ｃｍ−１である）
Ａ最大＝色素分子についての最大波長（λｍａｘ）で測定された色素溶液の吸光度（Ａ）
ＣＦ＝補正係数、色素によって引き起こされる２８０ｎｍの吸光度の量を調整する（表８参照）
希釈率＝タンパク質：色素試料を吸光度測定のために希釈した程度（もし希釈していれば）
【０１１４】
次に、以下の式を使用して標識度を計算する。
2019531474.tif 000012
ε’＝蛍光色素のモル吸光係数
【０１１５】
（表８）例示的な色素の特性
2019531474.tif 000013
【０１１６】
本発明のいくつかの実施形態において、増強された蛍光は、スペーサーを有さない生体分子よりも低い標識度（ＤＯＬ）を有するスペーサーを含む生体分子について観察される。一例として、スペーサーの有無にかかわらず、蛍光色素で標識された抗体があると仮定する。同等のＤＯＬ基準で、それに結合したスペーサーも有する色素で標識された抗体は、１．５〜３．５倍の間の蛍光の増強を示し得、ここで、１は両方の抗体について同一のレベルの蛍光を示す。重要なのは、色素とスペーサーの両方に結合した生体分子について、色素分子１個あたりに基づく蛍光シグナル量が増加することである。
【０１１７】
成分溶液への反応性化合物の添加に続いて、混合物を適切な期間（典型的には室温で約１時間から氷上で数時間）インキュベートし、過剰の化合物をゲル濾過、透析、ＨＰＬＣ、イオン交換もしくは疎水性ポリマーへの吸着、または他の適切な手段によって除去する。化合物−コンジュゲートは溶液中で使用されるかまたは凍結乾燥される。このようにして、適切なコンジュゲートは、抗体、抗体断片、および他の標的化担体分子から調製され得る。
【０１１８】
本明細書に記載の方法で使用されるインキュベーション温度は、室温、周囲温度、またはほんの一例として少なくとも約２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃などの室温を超える温度、さらには９０℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、または１００℃までの高温であり得る。本明細書に記載の方法で使用される第１のインキュベーション温度および第２のインキュベーション温度は、同一でも異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、第１のインキュベーション温度は、２０℃〜８０℃の間、２５℃〜３０℃の間、および／または周囲温度もしくは室温である。いくつかの実施形態において、第２のインキュベーション温度は、２０℃〜８０℃の間、６５℃〜７５℃の間、および／または約７０℃である。他の態様において、第２のインキュベーション温度は周囲温度または室温である。
【０１１９】
本明細書に記載の方法で使用されるインキュベーション時間は、少なくとも３０秒間、少なくとも１分間、少なくとも２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、少なくとも１時間、または本明細書中の任意の範囲を含むがこれらに限定されない。本明細書に記載の方法で使用される第１のインキュベーション時間および第２のインキュベーション時間は、同一でも異なっていてもよい。一実施形態において、第１のインキュベーション時間は、０〜６０分、５〜１０分、および／または室温で５〜１０分である。いくつかの実施形態では、第２のインキュベーション時間は０〜２０分および／または約１０分である。特定の例において、第２のインキュベーション時間は、約７０℃で約１０分である。他の実施形態において、第１のインキュベーション時間は２５℃で１〜３時間であり、第２のインキュベーション時間は２５℃で一晩であり、そして第３のインキュベーション時間は３７℃で２〜３時間である。
【０１２０】
バイオポリマーおよび他の高分子量ポリマーを含むポリマーのコンジュゲートは、典型的には当該技術分野でよく知られている手段によって調製される（例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，３：２（１９９２））。これらの実施形態では、多糖類に典型的なように単一種類の反応部位が利用可能であり得るか）、またはタンパク質に典型的なように複数種類の反応部位（例えば、アミン、チオール、アルコール、フェノール）が利用可能であり得る。標識化の選択性は適切な反応性色素の選択によって最もよく得られる。例えば、ハロアセトアミドまたはマレイミドなどのチオール選択的試薬によるチオールの修飾、または活性エステル、アシルアジド、イソチオシアネートまたは３，５−ジクロロ−２，４，６−トリアジンなどのアミン反応性試薬によるアミンの修飾。反応条件を注意深く制御することによって部分選択性もまた得ることができる。
【０１２１】
ポリマーを化合物で修飾するとき、予想される化合物置換度に対して過剰の化合物が典型的に使用される。任意の残留する未反応の化合物、または化合物加水分解生成物は、通常、透析、クロマトグラフィー、または沈殿によって除去される。残留する非コンジュゲート色素の存在は、色素をそのコンジュゲートから溶出させる溶媒を用いた薄層クロマトグラフィーによって検出することができる。全ての場合において、適切な速度のコンジュゲーションを得るために、試薬は実用的な限り濃縮されているのが普通である。
【０１２２】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、並行反応において、または標識されることが望まれるタンパク質から容易に分離可能な場合は、同一の反応に含めることによってかのいずれかで対照タンパク質またはタンパク質を標識して標識化の有効性をモニターし得る。
【０１２３】
本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、標識された試料のタンパク質は一連の蛍光分子量標準と並行して有用に分離することができる。有用には、標準は、タンパク質を標識するために使用される少なくとも１つのフルオロフォアとスペクトル的に一致する。そのようなスペクトルマッチングは、例えば、タンパク質試料を標識するのに使用されるのと同一の二ヒ素フルオロフォアと並行して標識されるテトラシステインタグ化タンパク質標準を使用することによって、または試料タンパク質を標識するために使用される二ヒ素フルオロフォアもしくは他のフルオロフォアとスペクトル的に一致する蛍光部分を有する標準を使用することによって達成できる。本発明の実施に有用な標準の例には、ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ（商標）ファミリーのタンパク質標準（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびＭＡＲＫＬ２（商標）Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれる。
【０１２４】
本明細書に記載の方法および組成物はまた、試料中に存在する蛍光標識されたタンパク質の量を定量化するためにも使用され得る。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の方法は、二ヒ素フルオロフォアからの蛍光の量を定量化することをさらに含む。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の方法は、アミン反応性蛍光色素からの蛍光の量を定量化することをさらに含む。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の方法は、アミン反応性蛍光色素の蛍光部分からの蛍光の量を定量化することをさらに含む。タンパク質試料中に存在するタンパク質を分離せずに、またはＰＡＧＥ、２Ｄ−ＰＡＧＥ、もしくはＩＥＦなどの電気泳動またはクロマトグラフィーまたははそれらの組み合わせによって、タンパク質を部分的または完全に分離した後に、定量化を実施することができる。
【０１２５】
ｅ．スペーサー分子の生体分子へのコンジュゲーション
いくつかの実施形態において、スペーサー分子は、本明細書の実施例に記載されているＮＨＳ−エステル化学を用いて生体分子にコンジュゲートされ、他の化学、例えばマレイミド、ピリジルジスルフィド、およびヒドラジド、ならびにアジド／アルキンを含むＳＩＴＥＣＬＩＣＫ（商標）技術もまた、このコンジュゲーション戦略のために使用され得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、スペーサー分子は、抗体などのタンパク質上に存在する最初のリジン側鎖で生体分子（例えば、抗体）にコンジュゲートされている。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法を用いて標識されたタンパク質、タンパク質断片、または他の生体分子の濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの範囲内（例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約０．２ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約０．２ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．２ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約０．４ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬなど）である。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、抗体への蛍光標識の、色素とタンパク質の比は１〜５０である。いくつかの実施形態において、抗体への蛍光標識の、色素とタンパク質の比は５〜３０である。いくつかの実施形態において、抗体への蛍光標識の、色素とタンパク質の比は１〜２０である。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、スペーサーのタンパク質に対する比は１〜５０である。いくつかの実施形態において、スペーサー剤のタンパク質に対する比は５〜３０である。いくつかの実施形態において、スペーサー剤のタンパク質に対する比は１〜２０である。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、スペーサー剤が、０．１〜２５倍、１〜１５倍、または２．５〜１０倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰で付加される。いくつかの実施形態において、スペーサー剤は、２．５倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である。いくつかの実施形態において、スペーサー剤は、５倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である。いくつかの実施形態において、スペーサー剤は、７．５倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である。いくつかの実施形態において、スペーサー剤は、１０倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、スペーサー剤は核酸分子にコンジュゲートされている。部分（例えば、蛍光標識）を核酸にコンジュゲートするためのプロトコールは当該技術分野において記載されている（例えば、Ｒｏｍｂｏｕｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２７：２８０−２０７（２０１６）を参照）。核酸分子を標識化するための１つの方法は、ＡＲＥＳ（商標）ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ２１６６５）の使用によるものである。アミン修飾ヌクレオチドもまた、核酸分子の標識化を可能にするために使用され得る。例えば、５−アミノヘキシルアクリルアミド−ｄＵＴＰ（ａｈａ−ｄＵＴＰ）および５−アミノヘキシルアクリルアミド−ｄＣＴＰ（ａｈａ−ｄＣＴＰ）を用いて、逆転写、ニックトランスレーション、ランダムプライムラベリング、またはＰＣＲなどの従来の酵素組み込み方法によってアミン修飾ＤＮＡを産生することができる。次いでアミン修飾ＤＮＡを任意のアミン反応性色素またはハプテンで標識することができる。この二段階技術は、他の方法では得ることが困難である、均一で高度のＤＮＡ標識化を一貫して作り出す。
【０１３２】
空間的に分離された蛍光標識を用いて高いＤＯＬを達成するための１つの方法が図１８に示される。図１８は、蛍光標識された分岐鎖ＰＥＧ分子の調製および得られたＰＥＧ分子（直接スペーサー）の抗体への結合を示し、ここでＰＥＧ分子はＣＬＩＣＫ−ＩＴ（商標）反応によって抗体に共有結合している（実施例７参照）。
【０１３３】
図１８に示すＰＥＧ分子は、それぞれ７つの蛍光標識に共有結合している。さらに、蛍光標識は、標識が標識された分子に対して特定の「ブラシ」長を有するように、個々のＰＥＧ分子に結合させることができる。「ブラシ長」は、蛍光標識を標識された分子に結合させる化学基の延長された長さを指す。一例として、ＰＥＧ分子中の平均モノマー長が約３．５オングストロームであると仮定すると、図１８においてｎ＝１のとき、蛍光標識のブラシ長は約５〜約１０オングストロームの範囲であろう。多くの場合、図１８のｎは１にはならない。さらに、ＰＥＧ分子は典型的にはサイズが異なり、平均分子量に基づいて記載されている。したがって、説明の目的で図１８に示すＰＥＧ分子を使用すると、１０，０００の平均重量を有するＰＥＧ分子の集団は、約３０のｎを有するであろう。また、４０，０００の平均重量を有するＰＥＧ分子の集団は、約１２０のｎを有するであろう。この分子を標識された分子に連結する分岐鎖ＰＥＧ分子のアームおよび他のアームの両方が全て反復領域を有するという事実を考慮すると、ブラシ長は、約１５オングストローム〜約８００オングストロームの範囲（例えば、約２５〜約８００、約１５０〜約８００、約４５０〜約８００、約６００〜約８００、約６５〜約８００、約２５〜約７００、約４０〜約７００、約２８〜約６００、約２８〜約５００、約７０〜約７００など）であり得る。したがって、本発明は、少なくとも１つの蛍光標識に共有結合している分子を産生および使用するための組成物および方法を含み、蛍光標識は約２２オングストローム〜約８００オングストロームのブラシ長を有する。
【０１３４】
代替として、本発明の組成物は、分子とそれらが結合している蛍光標識との間の共有結合の数によって記載され得る。説明の目的で図１８に示した分岐鎖ＰＥＧ分子を再び使用すると、介在する共有結合の数は、蛍光標識が分岐鎖ＰＥＧ分子に結合している場所に応じて、約２４〜約３２となる。本発明は、少なくとも１つの蛍光標識に共有結合している分子を産生および使用するための組成物および方法を含み、ここで蛍光標識は約１６〜約８００（例えば、約１６〜約７００、約３２〜約８００、約６０〜約８００、約１００〜約８００、約１５０〜約８００、約２００〜約８００、約２５０〜約８００、約２５０〜約７００、約２５０〜約６５０、約２５０〜約６００、約３５０〜約８００など）の介在する共有結合で分子に結合する。
【０１３５】
本発明はまた、部分的には、個々の標識された分子上の同一の位置に結合した複数の蛍光標識の間隔を空けることに関する。標識された分子からの蛍光標識の分離に関して上述したものと同様に、個々の標識された分子上の同一の位置に結合した複数の蛍光標識は、約１５オングストローム〜約８００オングストローム（上述の範囲を含む）の距離で、および／または約１６〜約８００（上述の範囲を含む）の介在する共有結合で、互いに分離することができる。
【０１３６】
本明細書で述べたように、本発明の態様は蛍光標識の間隔に関する。表９は、一連の分岐鎖ＰＥＧ分子の推定された特性を示す。これらのＰＥＧ分子、ならびに他の分子は、異なる時点で複数のフォーマットで存在することを理解されたい。例えば、分岐鎖ＰＥＧ分子のアームは、完全に伸長（ブラシ）または完全にコイル状（マッシュルーム）であり得、さらにその間の実質的に全ての立体配座もあり得る。さらに、各アームは、ある時点での他のアームとは独立して異なる伸長状態またはコイル状態にあり得る。従って、表９において、用語「ブラシ」は完全に伸長したＰＥＧアームを指し、そして用語「マッシュルーム」は完全にコイル状のＰＥＧアームを指す。マッシュルーム状態は、最小数を得るために８０オングストロームの非常に大きいＦｌｏｒｙ半径（隣接するＰＥＧアーム間の距離）をモデルにする。
【０１３７】
表９のＦ−Ｆ距離は、全てのフルオロフォアが互いに等距離にあると仮定した、異なるアームの末端上の２つのフルオロフォア間の距離である。最大距離はアームの長さの２倍である。さらに、最近傍の値は、４本のアームに対しては四面体配置、８本のアームに対しては球形／立方体を仮定する。当然のことながら、ある時点でのＦ−Ｆ距離の実際の値は、典型的にはブラシ距離とマッシュルーム距離の間のどこかとなるであろう。
【０１３８】
（表９）分岐鎖ＰＥＧのアームの長さ（推定フルオロフォア〜フルオロフォア（Ｆ−Ｆ）距離）
2019531474.tif 000014
【０１３９】
デキストランは、蛍光標識を分子に結合するための別の適切な物質である。デキストランは、それらの中程度から高分子量、良好な水溶性、および低い毒性を特徴とする親水性多糖類である。デキストランは、それらの卓越したポリ−（α−Ｄ−１，６−グルコース）結合のために生物学的に不活性である傾向がある。これらの結合はそれらを大部分の内在性細胞グリコシダーゼによる切断に対して耐性にする。それらはまた、通常は低い免疫原性を有し、一般に分岐鎖分子である。
【０１４０】
デキストランは、３０００ダルトン〜２，０００，０００ダルトンの間で変動する公称分子量（ＭＷ）で市販されている。本発明の実施における使用に適したデキストランは、３０００、１０，０００、４０，０００、７０，０００、５００，０００、および２，０００，０００ダルトン（例えば、約４，０００〜約１５０，０００、約６，０００〜約１５０，０００、約８，０００〜約１５０，０００、約１５，０００〜約１５０，０００、約１０，０００〜約８０，０００、約１２，０００〜約７０，０００など）を含む任意の数の異なる分子量のものであり得る。
【０１４１】
デキストランは、通常、１０，０００ＭＷの範囲のデキストランについて、デキストラン分子あたり０．２〜２の色素分子の置換度（例えば、ＤＯＬ）を有する。さらに、デキストランは典型的には３０００ＭＷ範囲のデキストランあたり０．２〜０．７の色素、１０，０００ＭＷ範囲のデキストランあたり０．４〜２の色素、４０，０００ＭＷ範囲で１〜４の色素、および７０，０００ＭＷ範囲で２〜６の色素を含む。したがって、本発明の実施において使用されるデキストラン、ならびに他の標識されたポリマーは、１，０００ＭＷあたり約０．０３〜０．３（例えば、１，０００ＭＷあたり、約０．０３〜約０．２５、約０．０８〜約０．３、約０．０９〜約０．３、約０．１〜約０．３、約０．０５〜約０．２、約０．０７〜約０．２５など）の蛍光標識の範囲のＤＯＬを有し得る。
【０１４２】
デキストラン、ならびに他のポリマーは、いくつかの方法で標され得る。例えば、蛍光標識されたデキストランは、水溶性アミノデキストランとスクシンイミジルエステル基を有する蛍光標識との反応によって調製され得る。蛍光標識されたデキストランは、天然デキストランとＦＩＴＣのような蛍光標識のイソチオシアネート誘導体との反応によってもまた調製され得る。適切な場合には、一旦蛍光標識が付加されると、デキストラン上の未反応アミンをキャップして中性または荷電デキストラン（すなわち、負または正に荷電）を得ることができる。さらに、キャッピングが実施されない場合でも、デキストランをアニオン性またはカチオン性にすることができる荷電蛍光標識を使用することができる。
【０１４３】
本発明の実施において有用であり得る別の種類の多糖類はアミロースである。アミロースは、α−１，４−グリコシド結合によって連結されたα−Ｄ−グルコース単位からなる直鎖多糖類である。水素結合のために、アミロースは１ターンあたり６個のグルコース単位を含むらせん構造を形成する傾向がある。この種類の分子は、意識的に設計された方法で配置された蛍光標識を使用することができる構造規則性を提供する。したがって、本発明は、蛍光標識間の距離を均一に保つために使用することができるかなり静的な構造的特徴を有する組成物、ならびにそのような組成物を製造および使用する方法を含む。多くの場合、２つの蛍光標識をもたらすような様式および条件下でそのような分子と結合した２つの蛍光標識間の距離は、互いから３０％を超えて（例えば約５％〜約３０％、約１０％〜約３０％、約１５％〜約３０％、約２０％〜約３０％、約１０％〜約２０％など）距離が変化しない。
【０１４４】
ポリペプチドもまた本発明の実施において使用され得る。そのような分子の一例は図２１に示される分岐鎖ポリリジン分子である。この分子は、米国特許出願公開第２０１０／０２７８７５０号に記載されている方法に従って作製することができる。蛍光標識を結合させることができる位置を表すいくつかの「Ｒ基」を図２１に示す。そのような分子では、Ｒ基は同一でも異なって（例えば、Ｒ１およびＲ２）いてもよい。さらに、いくつかのＲ基が同一である場合、これらの基は、Ｒ基が完全に標識されていない蛍光標識された結合点として作用し得る。
【０１４５】
例として、図２１は、３３個のＲ基、すなわち３２個のＲ１基および１個のＲ２基を有するポリマーを示す。全てのＲ基が同一の種類であると仮定する。これらのＲ基は半ランダム方式で部分的に蛍光標識されてもよい。これは、ある割合のＲ基のみが蛍光標識を受けるように条件が提供され得ることを意味する。さらに、ポリマー中のそれらの位置のために、いくつかのＲ基が蛍光標識をより多く受ける傾向があるので、標識化は半ランダムである。したがって、本発明は、所望の蛍光効果のために、ポジショニングとＤＯＬが調整されている蛍光標識されたポリマーの設計を含む。いくつかの場合において、標識を受容するポリマーあたりに基づいて利用可能な結合部位の平均数は、１０％〜９０％の範囲内（例えば、約１０％〜約８５％、約１５％〜約８５％、約２０％〜約８５％、約２０％〜約７５％、約３０％〜約７５％、約３０％〜約８０％、約４０％〜約８０％など）である。
【０１４６】
上述のように、図２１は、Ｒ１およびＲ２基を有するポリマーを示す。ポリマーの生体分子（例えば、抗体）への「指向性」結合が望まれる場合、Ｒ２基はＲ１基と異なってもよい。Ｒ基が同一である場合、ポリマー上の適切な位置にある任意のＲ基が生体分子へのコンジュゲーション点として作用することができるという意味で、結合しているのは「無指向性」であろう。当然ながら、生体分子に対する高レベルの生物活性（例えば、抗原結合）を維持しながら、高レベルの蛍光を達成するように条件を調整する。
【０１４７】
生体分子蛍光の最大化は、対象の生体分子上の蛍光標識の数と部分的に無関係であり得る。例えば、第１の組の条件下で標識したときには特定の抗体上に７つの蛍光標識があり、第２の組の条件下で標識したときには同一の抗体上に１０の蛍光標識があると仮定する。さらに、第１の組の条件下で標識された抗体の全蛍光量が、第２の組の条件下で標識された抗体の全蛍光量よりも大きいと仮定する。この場合、より少ない蛍光標識はより多くの蛍光をもたらした。したがって、他の要素（例えば、生体分子の機能的活性）が等しい場合、第１の条件セットは第２の条件セットよりも好ましいであろう。
【０１４８】
蛍光標識を生体分子に結合させるために任意の数の連結基を使用することができる。これらの結合は、非共有結合または共有結合であり得る。さらに、非共有結合または共有結合は、（１）蛍光標識のポリマーへの結合、（２）コア（存在するとき）へのポリマーの結合、および／または（３）ポリマーまたはコア（存在するとき）の生体分子への結合の１つまたは全てを指すことができる。
【０１４９】
多くの場合、ポリマー（コアを有するかまたは有さない）、ならびに本明細書に記載の他の種類のスペーサーは、生体分子に結合した蛍光標識の蛍光強度を増大させる機能を果たし得る。
【０１５０】
本発明の実施において有用である分子の１つのカテゴリーはスターポリマーと呼ばれる（Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔａｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１１６：６７４３−６８３６（２０１６）を参照）。スターポリマーは、コアと一連の直鎖状ポリマー（「アーム」と呼ばれる）を含むマルチアーム分子である。これらのアームは通常、他の分子の結合を促進するために末端官能基を含む。スターポリマーは、ホモ−アーム（１種のみの組成のアームを含む）またはミクト−アーム（１種を超える組成、分子量、または末端官能基のアームを含む）として分類することができる。スターポリマーの合成は、典型的には、コアファースト、アームファースト、または接ぎ木のアプローチのいずれかを用いて行われる。
【０１５１】
コアは、アームの分岐点として効果的に機能する。任意の数の分子が本発明の組成物のためのコアとして機能し得る。適切なコアの例には、オリゴグリセロール（例えばヘキサグリセロール）、オリゴエリスリトール（例えばペンタエリスリトール、ジペンタエリスリトール、トリペンタエリスリトール）、ソルビトール、トリメチロールプロパン、シラン（例えば１，２−ビス（メチルシリル）エタン）、アダマンタン、ＰＡＭＡＭ（第１−、第２−、および第３世代（Ｇ−１−３）ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）分岐鎖ポリマー、ペプチド（例えば、ポリリジン、ポリアスパラギン酸など）が含まれる。
【０１５２】
コアは、重合の開始またはアーム上への結合のための官能基を既に有していてもよく、または図２０に示すように、アームの結合を促進するために化学修飾を必要としてもよい。
【０１５３】
例としてヘキサグリセロールを使用すると、この化合物は市販されており、スター型ＰＥＧポリマーのコアファースト合成に使用することができる。ヘキサグリセロールコアを有するスターＰＥＧは、薬物の制御放出および創傷密閉のために使用され得る。ヘキサグリセロールコアを有するスターＰＥＧは、ヘキサグリセロールコアからのエチレンオキシドの制御された重合によって産生することができる。この場合、コアはヘキサグリセロールであり、アームはポリエチレングリコールである。
【０１５４】
アームは任意の数の直鎖状ポリマーからなり得、典型的には蛍光標識のための結合点として、およびこれらの標識を互いに間隔を開けさせるために、ならびに標識を、同一の標識された分子（例えば、生体分子）に結合した他の蛍光標識から間隔を開けさせるために機能するであろう。適切なアームの例には、ポリエチレングリコール、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリグリセロール、およびポリビニルアルコール、双性イオンポリマー（例えば、ポリスフロベタイン）、ならびに水溶性ポリマーが含まれる。多くの場合、本発明での使用に適したポリマーは荷電していないであろう。
【０１５５】
存在すると、蛍光標識の結合に特に有用である抗体の一領域は、Ｆｃ（断片結晶化可能）領域である。Ｆｃ領域は、抗原結合部位に対して抗体の遠端にある。抗体のこの領域は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体および補体系のタンパク質と相互作用する。典型的には、Ｆｃ領域またはその近傍における化学物質の結合は、抗体による抗原結合にほとんど影響を与えない。しかしながら、抗原結合事象との干渉は、抗体に結合した化学物質のサイズに伴い増大する傾向がある。さらに、大きな結合した化学物質は、立体障害のために、生体分子に結合する能力に関して互いに干渉する傾向がある。従って、高レベルの蛍光と高レベルの機能的活性（例えば、抗原結合能）の両方を有する生体分子（例えば抗体）を生産するために一連の要素をバランスさせる必要がある場合がある。これらの要素のいくつかは以下の通りである。（１）生体分子のサイズ、（２）蛍光標識化のための生体分子上の結合点の位置、および（３）生体分子に結合した蛍光標識された分子のサイズおよび三次元構造。
抗体に関して、本発明は以下の特徴のうちの１つ以上を含む抗体を含む。
−抗体分子上の平均２〜１０個の異なる位置で結合（例えば、共有結合）した蛍光標識ポリマー。
−各抗体分子に結合した平均３〜８０個の蛍光標識。
−蛍光標識された抗体分子の抗原結合親和性（ＫＤ）は、標識されていない形態の抗体と比較して、２桁以下（例えば、約０．５〜約２．０、約１．０〜約２．０、約０．５〜約１．５、約０．７５〜約１．５など）減少する。
−抗体分子に結合した蛍光標識あたりに基づいて、平均蛍光発光量は、遊離の蛍光標識の少なくとも６０％（例えば、約６０％〜約９８％、約７０％〜約９８％、約８０％〜約９８％、約８５％〜約９８％、約８０％〜約９３％など）である。
【０１５６】
ｆ．生体分子／蛍光標識／スペーサーの組み合わせ
本発明は、部分的には、３つの成分：生体分子、蛍光標識、およびスペーサーの組み合わせに基づく。タンパク質（例えば、抗体）に関して、特にタンパク質が変性していないとき、蛍光標識およびスペーサーのための結合部位として使用され得る基は、常に結合のためにアクセス可能であるとは限らない。さらに、多くの場合、タンパク質を未変性形態に維持することが望ましいであろう。
【０１５７】
蛍光発光の増強は、生体分子（例えば、抗体）を標識するために使用される蛍光標識およびスペーサーの様々な比に関係することが見出されている。さらに、各生体分子は、特定の増強された蛍光レベルを生じるためにコンジュゲーションプロセスにおいて異なる比の成分を必要とする可能性を有する。これは、抗体などの生体分子の異なる構造（例えば、一次、二次、三次および四次構造）、ならびに特定の蛍光標識および特定のスペーサーの特性に起因し得る。
【０１５８】
いくつかの例では、比は成分のそれぞれの重量に基づき得る。他の例では、比はモル比に基づき得る。本出願のいくつかの図および例は、モル比に関する。場合によっては（例えば、生体分子が大きく、多数のコンジュゲーション部位を有する場合）、成分重量の使用がより適切であり得る。
【０１５９】
抗体、および他の生体分子について、コンジュゲーションプロセスにおいて使用される以下の生体分子対蛍光標識対スペーサーの比は大きく変動し得るが、ほとんどの場合、生体分子の量は蛍光標識およびスペーサーの両方の量よりも少ないであろう。
【０１６０】
さらに、生体分子上のコンジュゲーション部位の密度および／または間隔は、蛍光標識のスペーサーに対する最適な比率をしばしば決定する１つの要素である。これは、増強された蛍光が低減した消光によるものであると仮定すると、コンジュゲーション部位の全体または局所の密度が低いほど、消光量が少なくなると予想されるためである。いずれにしても、使用することができる生体分子対蛍光標識対スペーサーの比は、以下のように示される：Ｂ１：ＦＬ２〜３０：Ｓ２〜２０、Ｂは生体分子であり、ＦＬは蛍光標識であり、Ｓはスペーサーである。本発明の実施において使用され得る比の具体的な範囲は、１：２〜２５：２〜２０（例えば、約１：２：２〜約１：２５：２０、約１：５：２〜約１：２５：５、約１：１０：２〜約１：２５：５、約１：５：２〜約１：１５：１０、約１：１０：５〜約１：２５：２０、約１：１０：５〜約１：１５：２０、約１：１０：５〜約１：２０：２０など）に入る比を含み、ここで最初の数字は生体分子の量（例えば、モル）であり、２番目の数字は蛍光標識の量、３番目の数字はスペーサーの量である。
【０１６１】
いくつかの場合では、コンジュゲーションに使用される蛍光標識およびスペーサーの濃度は、生体分子上の利用可能な結合部位が効果的に飽和するようになる（例えば、利用可能な結合部位の少なくとも９５％が蛍光標識またはスペーサーのいずれかに結合する）。そのような場合、蛍光標識とスペーサーの比は、蛍光増強のレベルにおける決定要素となり得る。多くの場合、蛍光標識のスペーサーに対する比は、１０：１〜１０：５０（例えば、約１０：１〜約１０：２５、約１０：１〜約１０：１０、約１０：１〜約１０：５、約１０：５〜約１０：５０、約１０：５〜約１０：２０、約１０：３〜約１０：３０、約１０：５〜約１０：３０、約１０：１０〜約１０：２５など）であろう。
【０１６２】
スペーサーおよび色素は、同時にまたは逐次的に、最初にスペーサーまたは色素のいずれかを生体分子にコンジュゲートさせて、生体分子にコンジュゲートさせることができる。多くの場合、スペーサーおよび色素が同一の場所で生体分子結合すると、それらは同時に生体分子にコンジュゲートする。しかしながら、結合部位が生体分子であり、飽和していない条件下で（例えば、スペーサーによる）第１のコンジュゲーション反応が実施される場合、したがって、結合部位を（例えば色素による）第２のコンジュゲーション反応のために利用可能とする場合に、逐次的なコンジュゲーションを使用することができる。
【０１６３】
ｇ．緩衝剤
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、緩衝液中に１つ以上のスペーサー、１つ以上の蛍光標識を含む。本明細書に開示されている蛍光分子およびスペーサー分子のいずれも、当該技術分野において既知の任意の緩衝剤と一緒に使用することができる。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物は、分子生物学的用途のために適切な任意の緩衝剤を含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、緩衝剤は適切な保存緩衝剤（例えば、ホウ酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、または炭酸塩緩衝剤）である。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、緩衝剤は、検出アッセイにおける使用中に、本明細書に開示されるように検出可能な生体分子を緩衝するのに適している。
【０１６７】
方法
本発明は、基礎研究、ハイスループットスクリーニング、免疫組織化学、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、マイクロアレイ技術、診断学、および医学療法において有用な用途を有する。本発明は、微生物学、免疫学、血液学および輸血、組織病理学、法医学的病理学、および獣医学的病理学の分野における診断用途のための様々なアッセイ形式で使用することができる。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、蛍光標識された分子が検出される任意の分子生物学的用途に使用することができる。例えば、本明細書に開示されるように、検出可能な生体分子は、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、フローサイトメトリー、およびＦＲＥＴを含む用途において使用され得る。本明細書中に開示されるような検出可能な生体分子はまた、蛍光免疫組織化学（ＩＨＣ）、蛍光免疫細胞化学（ＩＣＣ）、およびインビボイメージング用途において使用され得る。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、生体試料中の所望の標的の存在を決定するための方法が包含され、該方法は、ａ）生体試料を１つ以上の蛍光標識および１つ以上のスペーサー分子を含む組成物と接触させることであって、スペーサーおよび蛍光標識は生体分子にはコンジュゲートしているが互いにはコンジュゲートしていない、接触させることと、ｂ）複数の蛍光標識によって発光される蛍光を検出することと、ｃ）複数の蛍光標識によって発光された蛍光が検出されるときに、生体試料中の所望の標的の存在を決定することと、を含む。いくつかの実施形態では、生体試料は細胞溶解物を含む。いくつかの実施形態では、生体試料は無傷の細胞を含む。いくつかの実施形態では、生物学的試料は組織試料を含む。さらにそのような組織試料は固定されてもよい。さらに、本発明の組成物は免疫組織化学などの用途に使用することができる。いくつかの実施形態では、生体試料は単離されたタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、生体試料は組換えタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、生体試料は固体支持体上に固定化されている。いくつかの実施形態では、生体試料は流体中の無傷の細胞を含む。いくつかの実施形態では、生体試料は生きている動物である。いくつかの実施形態では、生きている動物は哺乳動物である。いくつかの例において、試料は肝臓、肺、筋肉、および皮膚などの組織を含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、生体内の標的抗原を画像化するための方法が本明細書に開示され、該方法は、ａ）本明細書に開示されているように、標的抗原に結合する複数の蛍光標識およびスペーサー剤に結合した抗体を提供することと、ｂ）抗体を生体内に導入して接触体を形成することと、ｃ）接触体を適切な波長で照射して照明体を形成することと、ｄ）標的抗原が撮像された照明体を観察することと、を含む。いくつかの実施形態では、生体内の標的または抗原に特異的なこれらの抗体、または他の標的タンパク質またはペプチドは、インビボイメージングに適合する励起波長、典型的には約５８０ｎｍ〜約８００ｎｍを有する蛍光色素とコンジュゲートしている。標的特異的色素コンジュゲートは、それらの優先的隔離が病的または傷害組織部位などの標的の病理学的または非病理的組織部位で起こるまで、循環血中を比較的自由に移動する。
【０１７１】
ｈ．キット
本発明の組成物は、様々なアッセイの実施を容易にするキットに組み込むことができる。キットは、乾燥形態の組成物または溶液中の組成物と共に包装されてもよい。キットは、アッセイを実施するための、典型的には水溶液として存在する１つ以上の緩衝剤、試料調製試薬、追加の検出試薬、有機溶媒、他の蛍光検出プローブ、標準物質、ミクロスフェア、特定の細胞株、抗体および／または取扱説明書をさらに含み得る。追加の任意の剤は、化合物と共に他の細胞機能を試験するための成分を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に開示されるように、生体分子、スペーサー剤、および蛍光標識を含む。いくつかの実施形態において、キットは緩衝剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、生体分子はすでにスペーサー剤および蛍光標識にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態において、キットは、バイオコンジュゲーションキットとして、蛍光標識および反応基にコンジュゲートしたポリマーを含み得る。
【０１７３】
本発明のキットは、蛍光標識された生体分子（例えば、抗体）を調製するために使用される試薬をさらに含み得る。例示的な試薬は、以下の１つ以上を含む：蛍光色素、キットに提供される説明書に従って予め標識されているかまたは標識されているかのいずれかのスペーサー、ならびに（１）スペーサーを生体分子にコンジュゲートするためおよび／または（２）蛍光標識を生体分子にコンジュゲートするために使用され得る化合物。
【０１７４】
本明細書および例示的な実施形態は、限定的なものとして捉えられるべきではない。本明細書および添付の特許請求の範囲の目的において、別途示されない限り、数量、割合、または比率を表す全ての数、ならびに明細書および特許請求の範囲に使用される他の数値は、全ての場合において、それらが修正されすぎない程度まで「約」という用語によって修正されているものとして理解されるべきである。したがって、反対が示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、得ようとする所望の特性によって変化し得る近似値である。最低でも、特許請求の範囲に対する均等の原則の適用を限定することを企図しないように、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の桁数に照らしてかつ通常の四捨五入の技術を適用することによって解釈されるべきである。
【実施例】
【０１７５】
以下の実施例は、特定の開示された実施形態を説明するために提供されており、決して本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０１７６】
実施例１：蛍光ウエスタンブロッティング法
ａ）ＮＨＳ活性化蛍光色素およびスルホＮＨＳ−アセテート／ＮＨＳ−アセテートおよびＮＨＳ−ＭＳ（ＰＥＧ）４、ＮＨＳ−ＭＳ（ＰＥＧ）８およびＮＨＳ−ＭＳ（ＰＥＧ）１２を用いた抗体標識化。
ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧなどのＮＨＳ活性化蛍光色素をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に１０ｍｇ  ／ｍｌで再構成した。ＮＨＳ−アセテートをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に１ｍｇ／ｍｌで新たに調製した。ＮＨＳ−ＭＳ（ＰＥＧ）４（カタログ番号２２３４１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＮＨＳ−ＭＳ（ＰＥＧ）８（カタログ番号２２５０９（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、ＮＨＳ−ＭＳ（ＰＥＧ）１２（カタログ番号２２６８６（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））をＤＭＦ中に１００ｍｇ／ｍｌで再構成した。使用直前に、ＰＥＧ試薬をＤＭＦ中で１ｍｇ／ｍｌにさらに希釈した。ホウ酸緩衝液５０ｍＭ（カタログ番号２８３８４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ｐＨ８．５）中７〜１０ｍｇ／ｍｌの１ｍｇのヤギ抗マウス（ＧＡＭ）およびヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）抗体を、様々なモル過剰での、蛍光色素または各蛍光色素の混合物と、ＮＨＳ−アセテート、ＮＨＳ−ＭＳ（ＰＥＧ）４、ＮＨＳ−ＭＳ（ＰＥＧ）８、またはＮＨＳ−ＭＳ（ＰＥＧ）１２から選択されるスペーサーと共に、標識した。標識化反応は、室温（ＲＴ）で約１時間インキュベートした。ＮＨＳ活性化色素およびＮＨＳ活性化スペーサー剤は、両方の反応が同時に起こるように抗体に添加する前に組み合わせ、色素置換およびスペーサーのランダムな間隔を可能にした。ｐＨ４．７の１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液を各試料に添加して、ｐＨを８．５から約７．２に下げた。この時点で、コンジュゲートの濃度を、保存緩衝液中の最終希釈物を収容するために約６ｍｇ／ｍｌに調整した。Ｄｙｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｒｅｓｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号  ２２８５８）および５μｍのＨａｒｖａｒｄカラム（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、カタログ番号７４−３８２０）を用いて遊離の色素を除去した。タンパク質１ｍｇあたり０．２ｍｌの５０％精製樹脂スラリーを使用した。コンジュゲートを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）で１：５０に希釈し、ＵＶ  Ｃａｒｙ分光光度計を使用してスキャンした。ＯＤスキャン（２５２ｎｍ〜９００ｎｍ）を用いてコンジュゲートの濃度を決定し、色素モル／タンパク質モルの比（Ｄ／Ｐ）を計算した。最後に、長期保存のためにコンジュゲートをＳＴＡＢＩＬＺＹＭＥ（登録商標）ＮＯＢＬＥ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ、カタログ番号ＳＺ０４）で１ｍｇ／ｍｌに希釈した。
【０１７７】
段階希釈した細胞溶解物（５００ｎｇ〜２ｎｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファーと混合した。試料を９５℃で５分間加熱し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔｒｉｓ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘ  Ｇｅｌｓ、４〜２０％、１０ウェル、カタログ番号ＷＴ４２０２ＢＸ１０）にロードした。製造者の指示に従ってゲルを電気泳動し、次いでセミドライ転写法を用いてニトロセルロース膜に転写した。膜をＳＥＡ  ＢＬＯＣＫブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号００３７５２７）で３０分間ブロッキングした。一次抗体を、Ｓｅａ  Ｂｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ中で最終濃度０．１〜２．５μｇ／ｍｌに調製した。ブロットをＳｅａ  Ｂｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで調製した抗体と共に室温（ＲＴ）で振盪しながら１時間インキュベートした。抗体溶液をデカントし、膜を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．２（ＴＢＳＴ）中で１０分間２回洗浄した。蛍光標識された二次抗体コンジュゲートをＳＥＡ  ＢＬＯＣＫ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで２０〜１０００ｎｇ／ｍＬの終濃度に希釈した。洗浄した膜を適切な二次抗体コンジュゲートと共に撹拌しながら３０〜６０分間インキュベートした。緩衝液をデカントし、膜をＴＢＳＴで５分間６回洗浄した。適合性蛍光イメージャーを用いて膜を画像化した。
【０１７８】
ウエスタンブロッティングアッセイにおいて、５×〜２０×モル過剰でＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８にコンジュゲートしたＧＡＭ二次抗体に対するＮＨＳアセテート（２．５×、５×および１０×）ならびにＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×）スペーサーの付加の効果を試験する実験についての結果を図８に示す。Ａ４３１細胞溶解物を１μｇ／ウェルから３倍に希釈した。使用した一次抗体ウサギは、１ｍｇ／ｍｌから１／５０００に希釈した抗Ｈｓｐ９０であった。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックから１／５０００に希釈した。ウエスタンブロット用途において、ＮＨＳアセテートまたはＭＳ（ＰＥＧ）４の付加とコンジュゲートしたＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８−ＧＡＲについて７．５×〜２０×までの各色素モル過剰において、基本のコンジュゲート（スペーサーを含まず作製）を超える蛍光強度の顕著な増加がある。
【０１７９】
ウエスタンブロットアッセイにおける、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４ｘＰＥＧ（７．５×色素で）にコンジュゲートしたＧＡＭ二次抗体へのＮＨＳアセテート（５Ｘ）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（５ｘ）スペーサーの付加の効果を実証する結果を図９に示す。ＨｅＬａ細胞溶解物を０．５μｇ／ウェルから４倍に希釈した。一次抗体マウス抗ＰＤＩを１ｍｇ／ｍｌの１／５０００に希釈した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／５０００に希釈した。５×モル過剰でＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ−７．５×コンジュゲートに付加されたＮＨＳアセテートは、強度を１．５倍改善した。３．７５×モル過剰でＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ−７．５×コンジュゲートに付加されたＮＨＳアセテートは、強度を１．４倍改善した。
【０１８０】
ウエスタンブロットアッセイにおける、ＧＡＲ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００−４ｘＰＥＧ二次抗体へのＮＨＳアセテート（２．５×、５Ｘ）およびＭＳ（ＰＥＧ）４スペーサーの付加の効果を実証する結果を図１０および表１０に示す。Ａ４３１細胞溶解物を１：１で段階希釈した。一次抗体ウサギ抗Ｈｓｐ９０と抗シクロフィリンＢを１／５０００に希釈した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／２０，０００に希釈した。このウエスタンブロッティング用途で、ＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×と５×）およびＮＨＳアセテート（２．５〜５×）の付加は、異なるモル過剰の色素で、基本のＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００−４×ＰＥＧコンジュゲートの蛍光強度と感度を２０〜１００％顕著に増強した。
【０１８１】
（表１０）ウエスタンブロットアッセイにおけるＧＡＲ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００−４ｘＰＥＧに対する±ＮＨＳアセテート（２．５Ｘ、５Ｘ）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（５Ｘ）の効果
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ＮＡ＝付加なし
【０１８２】
ウエスタンブロットアッセイにおける、ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２×ＰＥＧコンジュゲート（１２．５×モル過剰の色素で）へのＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）およびＭＳ（ＰＥＧ）４（５×）およびＭＳ（ＰＥＧ）８（５×）スペーサーの付加の効果を実証する結果を図１１に示す。ＨｅＬａ細胞溶解物を０．５μｇ／ウェルから４倍に希釈し、１ｍｇ／ｍｌの１／５０００に希釈した抗ＰＤＩ一次抗体で染色した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／５０００に希釈した。この実験は、ウエスタンブロットアッセイにおいて、ＭＳ（ＰＥＧ）４（５×）およびＮＨＳアセテート（２．５×および５×）を付加すると、基本のＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２×ＰＥＧコンジュゲートの蛍光強度と感度が少なくとも２倍、顕著に増強することを示した。長鎖ＭＳ（ＰＥＧ）８を用いて調製したコンジュゲートは、この実験において基本のコンジュゲートを超える顕著な改善を示さなかった。
【０１８３】
ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４×ＰＥＧ−ＧＡＲ（１０×モル過剰の色素で）へのＮＨＳアセテート（２．５×、５×）およびＭＳ（ＰＥＧ）４（５×）スペーサーの付加の効果を実証する結果を図１２に示す。ＨｅＬａ細胞溶解物を０．５μｇ／ウェルから４倍に希釈し、抗ＰＤＩ一次抗体を１ｍｇ／ｍｌの１／５０００に希釈した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４×ＰＥＧ−ＧＡＲ二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／２０，０００に希釈した。この実験は、ウエスタンブロッティングアッセイにおいて、ＭＳ（ＰＥＧ）４（５×）およびＮＨＳアセテート（２．５×および５×）を付加すると、基本のＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４×ＰＥＧコンジュゲートの蛍光強度と感度が３〜４倍、顕著に増強することを示す。
【０１８４】
実施例２：ドットブロットアッセイ
段階希釈（１：１）マウスまたはウサギＩｇＧを選択されたストック濃度から作製した。２０μＬの１２チャンネルマルチピペットを用いて、希釈液を最高から最低まで９６ウェルプレートに入れた。１１の段階希釈液のうち１または２μＬをニトロセルロースメンブレン上に慎重にスポットした。膜を一晩乾燥させ、次いでＴＢＳＴ中の２％ＢＳＡブロッキング緩衝液でブロックした。膜を室温で１時間撹拌しながらインキュベートした。ブロッキング溶液を容器からデカントした。二次抗体コンジュゲートをＴＢＳまたはブロッキング緩衝液で希釈した。二次抗体コンジュゲート希釈物は、コンジュゲートされた標識に応じて変動した：１：５，０００（ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８および５５０−２×ＰＥＧコンジュゲート）；１：１０，０００（ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧコンジュゲート）；ならびに１：２０，０００（ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４×ＰＥＧおよびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００−４×ＰＥＧコンジュゲート）。膜を適切な二次抗体コンジュゲートと共に撹拌しながら３０〜６０分間インキュベートした。膜をＴＢＳＴ緩衝液で５分間５回洗浄した。膜を適切な画像装置、例えばＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（４８８、５５０、６５０、６８０ｎｍ）およびＬｉＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＣＬｘ（６５０、６８０、８００ｎｍ）で画像化した。
【０１８５】
図３および表１１に示した結果は、ドットブロットアッセイにおける、ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８（５×〜２０×モル過剰の色素）に対するＮＨＳアセテート（２．５×、５×および１０×）およびＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×）スペーサーの効果を示す。ドットブロット用途において、ＮＨＳアセテートおよびＭＳ（ＰＥＧ）４を付加して作製したＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８−ＧＡＭコンジュゲートは、種々の色素の７．５倍〜２０倍のモル過剰で、（スペーサーなしで作製した）基本のコンジュゲートに対して１．２〜１．８倍の範囲の蛍光強度の明らかな改善をもたらした。
【０１８６】
（表１１）ドットブロットにおける５ｘ〜２０ｘのモル過剰でのＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８のコンジュゲーションにおけるＮＨＳアセテート（２．５ｘ、５ｘ、および１０ｘ）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５ｘ〜１０ｘ）付加の効果
2019531474.tif 000016
ＮＡ＝付加なし
【０１８７】
図４および表１２に示した結果は、ドットブロットアッセイにおける、ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８（７．５×〜２０×モル過剰の色素）に対するＮＨＳアセテート（２．５×および５×）ならびにＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×）の付加の効果を実証する。この実験では、異なる二次抗体源を使用した。コンジュゲーション混合物にＮＨＳアセテートおよびＭＳ（ＰＥＧ）４を付加すると、５×、１５×および２０×の色素モル過剰で、シグナル強度が、基本のコンジュゲーションと比較して１．２〜２．６倍の範囲で顕著に改善された。
【０１８８】
（表１２）ドットブロットアッセイにおける５ｘ〜２０ｘのモル過剰でのＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８のコンジュゲーションにおけるＮＨＳアセテート（２．５ｘ、５ｘ、および１０ｘ）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５ｘ）付加の効果
2019531474.tif 000017
【０１８９】
図５および表１３に示した結果は、ドットブロットアッセイにおける、ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２×ＰＥＧ−ＧＡＲ（１０×〜２０×モル過剰の色素）に対するＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）ならびにＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×）の付加の効果を実証する。マウスＩｇＧを１０００ｎｇ／ドットから１：１で段階希釈した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２×ＰＥＧ−ＧＡＲ二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／５０００に希釈した。コンジュゲーション混合物に付加されたＮＨＳアセテートまたはＭＳ（ＰＥＧ）４は、各々のそれぞれの色素のモル過剰での基本コンジュゲートと比較して、シグナル強度の改善をもたらした。改善は１．２〜１．６倍の範囲であった。
【０１９０】
（表１３）ドットブロットアッセイにおける１０ｘ〜２０ｘのモル過剰でのＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２ｘＰＥＧ−ＧＡＲのコンジュゲーションにおけるＮＨＳアセテート（２．５ｘ、５ｘ、および１０ｘ）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５ｘ）付加の効果
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【０１９１】
図６および表１４に示す結果［ＳｕｒｂｈｉとＭａｒｉｅ：図６および表１４のデータは完全には一致していない。どちらが正しいのかわからない。これを整理されたい。これは大きな問題ではないが、正しく実行する必要がある。］は、ドットブロットアッセイにおける、ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ−ＧＡＭ（１０×〜２０×モル過剰）に対するＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）ならびにＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×）の付加の効果を実証する。マウスＩｇＧを１０００ｎｇ／ドットから１：１で段階希釈した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ−ＧＡＲ二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／１００００に希釈した。ＮＨＳアセテートと（ＭＳ）ＰＥＧ４の両方は、初期の基本コンジュゲートよりも感度およびシグナル／バックグラウンドにおいて顕著な改善をもたらした。２．５×モル過剰でＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ−１５×に付加されたＮＨＳアセテートは、強度を１．７倍改善した。ＮＨＳアセテートによってもたらされた改善は、最高モル過剰の色素（２０×）で調製されたコンジュゲートを用いた場合よりも１．３倍優れた性能を示した。ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ−１５×コンジュゲートに付加された全てのＭＳ（ＰＥＧ）４は、蛍光強度を１．８〜２．２倍改善し、対応する最高基本コンジュゲートＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ−２０×よりも良好に機能した。
【０１９２】
（表１４）ドットブロットアッセイにおける１０ｘ〜２０ｘのＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４ｘＰＥＧ−ＧＡＲのコンジュゲーションにおけるＮＨＳアセテート（２．５ｘ、５ｘ、および１０ｘ）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５ｘ）付加の効果
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ＮＡ＝付加なし
【０１９３】
図７および表１５に示した結果は、ドットブロットアッセイにおける、ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００−４×ＰＥＧ−に対するＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）ならびにＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×、５×、１０×）スペーサーの付加の効果を実証する。マウスＩｇＧを１０００ｎｇ／ドットから１：２に段階希釈した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００−４×ＰＥＧ−ＧＡＲ二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／２０，０００に希釈した。この実験は、ドットブロット用途において、ＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×および５×）およびＮＨＳアセテート（５×）の付加が、基本のＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００−４×ＰＥＧコンジュゲートの蛍光強度および感度を１．５〜６倍で顕著に増強したことを示す。
【０１９４】
（表１５）ドットブロットアッセイにおけるGAM−DYLIGHT（商標）８００−４ｘPEGへのＮＨＳアセテート（２．５ｘ、５ｘ、および１０ｘ）またはMS（PEG）４（３．７５ｘ、５ｘ、および１０ｘ）付加の効果
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ＮＡ＝付加なし
【０１９５】
図１１に示した結果は、ドットブロットアッセイにおける、ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２×ＰＥＧ−ＧＡＲ（１２．５×モル過剰の色素）に対するＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）ならびにＭＳ（ＰＥＧ）４（５×）およびＭＳ（ＰＥＧ）８（５×）スペーサー付加の効果を実証する。マウスＩｇＧを０．５μｇ／ウェルから３倍に希釈した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／５０００に希釈した。これらのドットブロットアッセイは、ＭＳ（ＰＥＧ）４（５×）およびＮＨＳアセテート（２．５×および５×）を付加すると、基本ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２×ＰＥＧコンジュゲートの蛍光強度と感度が少なくとも２倍、顕著に増強することを示した。長鎖ＭＳ（ＰＥＧ）８によって調製したコンジュゲートは、基本コンジュゲートを超えて顕著な改善を示さなかった。
【０１９６】
図１２に示した結果は、ドットブロットアッセイにおける、ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４×ＰＥＧ−ＧＡＲ（１０×モル過剰の色素）に対するＮＨＳアセテート（２．５×、５×）およびＭＳ（ＰＥＧ）４（５×）スペーサーの付加の効果を実証する。マウスＩｇＧを１０００ｎｇ／ドットから１：２に段階希釈した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４×ＰＥＧ−ＧＡＲ二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／２０，０００に希釈した。これらのドットブロットアッセイは、ＭＳ（ＰＥＧ）４（５×）およびＮＨＳアセテート（２．５×および５×）を付加すると、基本ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４×ＰＥＧコンジュゲートの蛍光強度と感度が顕著に増強したことを示す。
【０１９７】
実施例３：プレートアッセイ法
プレートを調製するために、１０μｇ／ｍｌから始まるマウスまたはウサギＩｇＧの１１の（１：１）段階希釈物を調製した。３００μＬの１２チャンネルマルチピペットを使用して、１００μＬの各希釈液を９６ウェルプレートの対応するウェルの最高から最低までの１〜１１の間で入れ、ＰＢＳを最後のカラムに加えた（＃１２；陰性対照）。これを列ＡからＨまで繰り返した。プレートを一晩インキュベートした後、以下の通りに、ブロッキングし、ＳＵＰＥＲＢＬＯＣＫ（商標）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号３７５１５）でインキュベートした：２００μＬで５分間を２回、続いて２００μＬで１０分間を１回。プレートを乾燥させ、次いで４℃で乾燥して保存した。
【０１９８】
マウスＩｇＧまたはウサギＩｇＧでコーティングしたプレートをＰＢＳＴ  ２０を２００μＬで２回洗浄し、次いでＰＢＳで１回洗浄した。二次抗体コンジュゲートをＴＢＳまたはＰＢＳで希釈した。二次抗体コンジュゲートを１：１００に希釈した（ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８および５５０−２×ＰＥＧ、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４×ＰＥＧおよびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００−４×ＰＥＧコンジュゲート）。マウスＩｇＧコートプレート中の１００μＬの適切なコンジュゲートＧＡＭ、ウサギＩｇＧコートプレート中のＧＡＲをプレートウェルに添加した。各希釈物を、試験する各コンジュゲートについて異なる列に加えた。全ての比較は同じプレート上で行われた。プレートを６０分間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴまたはＰＢＳＴ緩衝液により２００μＬで３回洗浄した。１００μＬのＰＢＳを各ウェルの各列に添加した。蛍光強度は、ＶａｒｉｏｓＫａｎ装置を使用するか、またはＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（４８８、５５０、６５０、６８０ｎｍ）およびＬｉＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＣＬｘ（６５０、６８０、８００ｎｍ）などの適切な撮像装置で蛍光シグナルを画像化することによって測定した。
【０１９９】
実施例４：免疫蛍光（ＩＦＣ）法（すなわち、細胞イメージング法）
方法１：−８０℃で保存した凍結Ｕ２ＯＳ細胞プレートを５０℃で３０分間解凍した。保存緩衝液（ＰＢＳ）を除去し、細胞を１×ＰＢＳ緩衝液中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で１５分間（１００μｌ／ウェル）透過処理した。プレートを２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００ブロッカーで３０分間ブロッキングした。２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で希釈した一次抗体マウス抗ＰＤＩまたはウサギ抗ＨＤＡＣ２（１０μｇ／ｍｌ）（カタログ番号ＰＡ１−８６１、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、プレートに加え、室温で１時間インキュベートした。陰性対照は２％のＢＳＡ／ＰＢＳ−０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００ブロッカーのみを含む。インキュベーション後、一次抗体溶液をプレートから除去し、プレートを１００μｌ／ウェルＰＢＳＴで３回および１００μｌ／ウェルＰＢＳで１回洗浄した。次に、種々のモル過剰の色素で標識されたＧＡＭまたはＧＡＲ二次抗体をＰＢＳ中で４μｇ／ｍｌに希釈し、そして室温で１時間インキュベートした。プレートを１００μｌ／ウェルＰＢＳＴおよび１×１００μｌ／ウェルＰＢＳで３回洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（カタログ番号６２２４９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）（ＰＢＳ中０．１μｇ／ｍｌに希釈）を各ウェル（１００μｌ／ウェル）に加えた。プレートをＡＲＲＡＹＳＣＡＮ（商標）Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＶＴＩ３、２０×対物レンズでスキャンした。
【０２００】
方法２：３８４ウェルプレート中のＡ５４９細胞において特定の実験を行った。二次抗体の希釈率を変えつつ、一次抗体を同一の濃度（１μｇ／ｍｌ）で使用した。エトポシド（５０μＭで３時間、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１２−２６１−００）で処理した細胞中でのｐＨ２ＡＸ測定を用いてＢシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ、シグナル対バックグラウンドとも呼ばれる）を測定し、異なる抗体を比較するために明度を比較した。二次抗体コンジュゲートを４つの異なる希釈（０．５、１、２、および４ｍｇ／ｍｌ）で試験した。標準的な手順を抗体染色に使用した：１５分間の４％ホルムアルデヒド固定。透過処理は、０．５％Ｔｒｉｔｏｎｘ−１００中で１０分間行った。ブロッキングを３％ＢＳＡで３０分間行った。一次抗体インキュベーションを室温で１時間行った。これに続いてＰＢＳで３回洗浄した。二次抗体コンジュゲートを室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞をＡＲＲＡＹＳＣＡＮ（商標）ＶＴＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で分析した。
【０２０１】
図１３ならびに表１６および１７に示す結果は、細胞イメージング用途において、ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８（１３Ａ）およびＧＡＲ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８（（１３Ｂ）７．５×〜２０×モル過剰の色素で）へのＮＨＳアセテート（２．５×および５×）およびＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×）スペーサー付加の効果を実証する。ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８−ＧＡＭおよびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８−ＧＡＲ。Ａ５４９細胞を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／１０００に希釈したｐＨ２Ａ×一次抗体で染色した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８二次抗体を１ｍｇ／ｍｌストックの１／２５０に希釈した。コンジュゲーション混合物へと付加されたＮＨＳアセテートは、１５×の色素モル過剰で基本コンジュゲートと比較してシグナル／バックグラウンドの１．４〜１．５倍（ＧＡＭ）および１．１〜１．６倍（ＧＡＲ）の範囲での改善をもたらした。ＧＡＭコンジュゲートについては、５×でのＮＨＳアセテートおよび３．７５×でのＧＡＲコンジュゲートについてのＭＳ（ＰＥＧ）４で最も顕著な改善が観察され、２．５×でのＮＨＳアセテートおよび３．７５×でのＭＳ（ＰＥＧ）４でより顕著な改善が観察された。
【０２０２】
（表１６）細胞イメージング用途における５ｘ〜２０ｘのモル過剰でのＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８のコンジュゲーションにおけるＮＨＳアセテート（２．５ｘ、５ｘ、および１０ｘ）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５ｘ）付加の効果−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８−ＧＡＭ
2019531474.tif 000021
ＮＡ＝付加なし
【０２０３】
（表１７）細胞イメージング用途における５ｘ〜２０ｘのモル過剰でのＧＡＲ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８のコンジュゲーションにおけるＮＨＳアセテート（２．５ｘ、５ｘ、および１０ｘ）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５ｘ）付加の効果−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８−ＧＡＲ
2019531474.tif 000022
ＮＡ＝付加なし
【０２０４】
図１４および表１８に示す結果は、細胞蛍光イメージング用途での、ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２×ＰＥＧ−ＧＡＭ（７．５×〜２０×モル過剰の色素での）へのＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）ならびにＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×、５×、および１０×）の効果を実証する。Ｕ２ＯＳ細胞を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／１００に希釈した抗ＰＤＩ一次抗体で染色した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２×ＰＥＧ−ＧＡＭ二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／２５０に希釈した。この細胞イメージング用途において、５×ＮＨＳアセテートの付加は、１２．５×色素モル過剰のＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２×ＰＥＧ  ＧＡＭコンジュゲートについての基本コンジュゲート（付加なしで作られた）と比較して約５０％の改善をもたらし、３．７５×ＭＳ（ＰＥＧ）４の付加は、２０倍の色素モル過剰で、基本コンジュゲートに対して約５０％の改善をもたらした。
【０２０５】
（表１８）細胞イメージング用途におけるＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０−２ｘＰＥＧの蛍光強度に対する２．５ｘ〜１０ｘのＮＨＳアセテートおよびＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５ｘ〜１０ｘ）の効果
2019531474.tif 000023
ＮＡ＝付加なし
【０２０６】
細胞イメージング用途における、ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ）に対するＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）ならびにＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５×、５×、１０×）スペーサーの効果を試験する実験の結果を図１５および表１９に示す。Ｕ２ＯＳ細胞を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／１００に希釈した抗ＰＤＩ一次抗体で染色した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ−ＧＡＭ二次抗体を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／２５０に希釈した。この細胞イメージング用途において、ＮＨＳアセテート−５×の付加は、２０×モル過剰のＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４×ＰＥＧ  ＧＡＭコンジュゲートについての基本コンジュゲート（付加なしで作られた）と比較して約７０％の改善をもたらし、ＭＳ（ＰＥＧ）４−３．７５×の付加は、２０倍のモル過剰で、基本コンジュゲートに対して約９０％の改善を示した。
【０２０７】
（表１９）ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０−４ｘＰＥＧへのＮＨＳアセテート（２．５ｘ、５ｘ、および１０ｘ）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．７５ｘ、５ｘ、１０ｘ）の付加の効果−細胞イメージング用途
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ＮＡ＝付加なし
【０２０８】
細胞イメージング用途における、ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４×ＰＥＧ）の検出可能な蛍光レベルに対するＮＨＳアセテート（２．５×、５×、および１０×）ならびにＭＳ（ＰＥＧ）４（３．３．７５×、５×、１０×）スペーサーの付加の効果を試験する実験の結果を図１６および表２０に示す。Ｕ２ＯＳ細胞を、１ｍｇ／ｍｌストックの１／１００に希釈したマウス抗ＰＤＩ一次抗体で染色した。全てのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４×ＰＥＧ−ＧＡＭ二次抗体を１ｍｇ／ｍｌストックの１／２５０に希釈し、この細胞イメージング用途では、ＮＨＳアセテート−５×の付加は、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４×ＰＥＧの基本コンジュゲート（付加なしで作製）と比較して、７．５×と１０×の両方で色素コンジュゲートの約７０％の改善をもたらした。１５×モル過剰のモル過剰でのＧＡＭコンジュゲートとＭＳ（ＰＥＧ）４−３．７５×は、１５×モル過剰での基本コンジュゲートよりも約８０％の改善を示した。
【０２０９】
（表２０）ＧＡＭ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０−４ｘＰＥＧへのＮＨＳアセテート（２．５ｘ、５ｘ、および１０ｘ）またはＭＳ（ＰＥＧ）４（３．３．７５ｘ、５ｘ、１０ｘ）の付加の効果−細胞イメージング用途
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ＮＡ＝付加なし
【０２１０】
結果
ＮＨＳ−アセテート、ＮＨＳ−ＭＳ（ＰＥＧ）、およびＮＨＳ−ベタインなどのスペーサー剤の使用は、蛍光シグナル感度および強度を、典型的には消光をもたらす最適Ｄ／Ｐレベルを超えて増加させた。これは、ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）およびヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）二次抗体を、ＮＨＳ−アセテートならびにＮＨＳ−ＭＳ（ＰＥＧ）４、ＮＨＳ−ＭＳ（ＰＥＧ）８およびＮＨＳ−ＭＳ（ＰＥＧ）１２を含むがこれらに限定されないスペーサー剤と組み合わせて、ＮＨＳ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８、ＮＨＳ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０  ２×ＰＥＧ、ＮＨＳ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０  ４×ＰＥＧ、ＮＨＳ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０  ４×ＰＥＧ、ＮＨＳ−ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００  ４×ＰＥＧで標識化することによって実証された。色素コンジュゲーションおよび精製後のＤ／Ｐ値の我々による計算は、スペーサー剤の付加がＤ／Ｐ比に顕著な差を生じさせなかったことを実証したが、これは、これらの試薬およびフルオロフォアが抗体上の異なる第１級アミンを標識したことを示す（すなわち、それらは同一の第１級アミンについて競合しなかった）。
【０２１１】
異なる色素およびスペーサー剤を用いて作製したコンジュゲートを、ＩＦＣ、ウエスタンブロッティング、ドットブロッティング、またはＩｇＧ結合プレートベースのアッセイを含む様々な用途において試験した。それぞれの場合において、色素に対するスペーサー剤の特定のモル過剰値における特定のスペーサー剤では、スペーサー剤を使用したときに、スペーサー剤を欠く対照と比較して、蛍光強度の増加が観察された。
【０２１２】
上記の実験に加えて、ＮＨＳ−ローダミンで標識し、様々なＮＨＳ−ベタイン濃度（ベタイン２．５、ベタイン５、ベタイン１０モル比）とコンジュゲートした抗体は、抗体をスペーサー修飾試薬としてのベタインとコンジュゲートしたとき、全蛍光の増加を示した。以下の図１７ならびに表２１および２２を参照のこと。異なるベタイン鎖長のうち、ベタイン１０は、色素の全モル過剰でのＴＡＭＲＡおよびＤ／Ｐ比が１２を超えるＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５に対して正の効果を示した（データ示さず）。
【０２１３】
（表２１）ＴＡＭＲＡ―ＧＡＭコンジュゲートの蛍光にライする２．５ｘ〜１０ｘベタインの効果
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ＭＲ＝モル比
ＤＯＬ＝標識度
【０２１４】
実施例５：Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルブロミド（ベタイン−ＳＥ）有りおよびなしのヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧＡＭ）および５−（および−６）−カルボキシテトラメチルローダミン、スクシンイミジルエステル（５（６）−ＴＡＭＲＡ−ＳＥ）の反応
ＴＡＭＲＡ−ＳＥを秤量して無水ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍＬの原液として調製し、ベタイン−ＳＥを秤量して無水ＤＭＳＯ中４ｍｇ／ｍＬのストックとして調製した。次いで、ＤＭＳＯ溶液を反応バイアルに移し、ＴＡＭＲＡ−ＳＥ＋／−ベタイン−ＳＥを、ＩｇＧに対する５、１０、または２０倍の色素のＩｇＧに対するモル比に基づいて測定してバイアルに入れ、ベタイン−ＳＥのＩｇＧに対するモル比０または１０の当量もまたバイアルに添加した。
【０２１５】
別個に、１０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）中のＧＡＭの８．４ｍｇ／ｍＬ溶液の０．４１７ｍＬ（３．５ｍｇ）をプラスチックチューブに測定して入れ、ｐＨを１Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．０の４２μＬで＞８．０に上げた。０．５ｍｇのＧＡＭ溶液をＳＥを含む反応バイアルに添加し、室温で１時間反応させた。色素−タンパク質コンジュゲートを、ＰＢＳ中のＢＩＯＲＡＤ（商標）ＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）Ｐ−３０微粒子を充填した５〜０．７５×２０ｃｍカラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって遊離の色素およびベタインから分離し、同一のもので溶離した。各カラムからの最初のタンパク質含有バンドを回収した。
【０２１６】
吸光度スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  ３５  ＵＶ／Ｖｉｓ分光計で得られ、各試料について置換度（ＤＯＳ）または色素モル／ＧＡＭモルを決定した。蛍光発光スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ  ５５蛍光分光計を用いて、５４５ｎｍで一致した光学濃度を有し、５４５ｎｍで励起された試料を用いて得た。発光データは５５０〜７５０ｎｍから収集した。相対量子収率（ＲＱＹ）は、試料スペクトルの面積／試料標準スペクトルの面積として測定した。次いで、全蛍光をＲＱＹ＊ＤＯＳの積として計算した。
【０２１７】
（表２２）ＴＡＭＲＡ／ＧＡＭの異なるモル比の全蛍光出力
2019531474.tif 000027
【０２１８】
実施例６：１，３−プロパンスルトン（３−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸γ−スルトン）有りおよびなしのヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧＡＭ）とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８カルボン酸、スクシンイミジルエステル、ジリチウム塩（ＡＦ４８８−ＳＥ）との反応
ＡＦ４８８−ＳＥを秤量して無水ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍＬの原液として調製し、プロパン−スルトンを秤量してＥ−ＰｕｒｅＨ２Ｏ中１ｍｇ／ｍＬのストックとして調製した。
【０２１９】
１０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）中のＧＡＭの１１．２ｍｇ／ｍＬ溶液の０．３５７ｍＬ（４．０ｍｇ）をプラスチックチューブに測定して入れ、ｐＨを１Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．０の３６μＬで＞８．０に上げた。０．５ｍｇのＧＡＭ溶液を反応バイアルに移し、０、２、５または１０倍モル過剰のプロパンスルトンと２分間反応させ、次いでＡＦ４８８ストックをＧＡＭに対して８または１５倍モル過剰で混合物に加え、室温で１時間反応させた。色素−タンパク質コンジュゲートを、ＰＢＳ中のＢＩＯＲＡＤ（商標）ＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）Ｐ−３０微粒子を充填した５〜０．７５×２０ｃｍカラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって遊離の色素およびプロパンスルトンから分離し、同一のもので溶離した。各カラムからの最初のタンパク質含有バンドを回収した。
【０２２０】
吸光度スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  ３５  ＵＶ／Ｖｉｓ分光計で得られ、各試料について置換度（ＤＯＳ）または色素モル／ＧＡＭモルを決定した。蛍光発光スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ  ５５蛍光分光計を用いて、４７５ｎｍで一致した光学濃度を有し、４７５ｎｍで励起された試料を用いて得た。発光データは４８０〜８００ｎｍから収集した。相対量子収率（ＲＱＹ）は、試料スペクトルの面積／試料標準スペクトルの面積として測定した。次いで、全蛍光をＲＱＹ＊ＤＯＳの積として計算した。
【０２２１】
（表２３）ＡＦ４８８／ＧＡＭの異なるモル比の全蛍光出力
2019531474.tif 000028
【０２２２】
実施例７：ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７  ＮＨＳエステル、トリス（トリエチルアンモニウム塩）（ＡＦ６４７−ＳＥ）で修飾された２０ｋＤａの８アームＰＥＧアミン（２０Ｋ８ＰＥＧ）を用いたＳＫ３マウス抗ヒトＣＤ４アジドの標識化
「ＡＦ６４７−ＳＥ」と略されるＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７  ＮＨＳ／スクシンイミジルエステル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３７５７３）を秤量し、無水ＤＭＳＯ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄ１２３４５）中３２ｍＭの原液として調製した。ＣＬＩＣＫ−ＩＴ（商標）ＳＤＰエステルｓＤＩＢＯアルキン（ｓＤＩＢＯ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｃ２００２５）を無水ＤＭＳＯ中９ｍｇ／ｍＬの原液として調製した。以下の構造を有し、「２０Ｋ８  ＰＥＧ」と称される、８アームＰＥＧアミン（ヘキサグリセロール）、ＨＣｌ塩（ＪｅｎＫｅｍ，Ｐｌａｎｏ，ＴＸ  ７５０２４，カタログ番号８ＡＲＭ−ＮＨ２ＨＣｌ）
2019531474.tif 000029
を秤量し、無水ＤＭＳＯ中４０ｍｇ／ｍＬの原液として調製した。
【０２２３】
プラスチックチューブに、３００μＬの２０Ｋ８  ＰＥＧ原液、１７６μＬのｓＤＩＢＯ原液（２．４倍モル過剰／２０Ｋ８  ＰＥＧ）、および６μＬのニートトリエチルアミン（ＴＥＡ）を加え、２５℃で３時間反応させた。反応後、３００μＬのＡＦ６４７−ＳＥ原液（２倍モル過剰／ＰＥＧ−アミン）をチューブに添加し、そして反応を２５℃で一晩進行させた。ＡＦ６４７−２０Ｋ８  ＰＥＧ−ｓＤＩＢＯコンストラクトを、ＰＢＳ中のＢｉｏＲａｄ  ＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）Ｐ−１０Ｆを充填した１×３０ｃｍカラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにより遊離の色素およびｓＤＩＢＯから精製し、同一のもので溶離した。最初の色素含有画分を集めそしてＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＭＩＣＯＮ（商標）Ｕｌｔｒａ−４  １０ｋＤａ遠心分離フィルターを用いて濃縮した。
【０２２４】
「Ａｚｉｄｅ−ＳＥ」と略されるＡｚｉｄｏ（ＰＥＯ）４プロピオン酸、スクシンイミジルエステル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１０２８０）を秤量し、無水ＤＭＳＯ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄ１２３４５）中１０ｍＭの原液として調製した。２６６μＬのＳＫ３マウス抗ヒトＣＤ４抗体（２．５ｍｇ）および１３４μＬのＰＢＳをプラスチックチューブに添加し、５０μＬの１Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．０でｐＨを＞８．０に上げた。８．３μＬのアジド−ＳＥ原液（５倍モル過剰／抗体）および４２μＬのＤＭＳＯを抗体溶液に添加した。反応を２５℃で２時間進行させた。アジド−ＳＫ３抗体を２ｍＬのＢｉｏＲａｄ  ＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）Ｐ−３０Ｍスピンカラムを用いて精製した。アジド−ＳＫ３抗体は、抗体に対して５倍〜２０倍過剰のアジド−ＳＥで調製した。
【０２２５】
ＡＦ６４７−２０Ｋ８  ＰＥＧ−ｓＤＩＢＯの２ｍＭ溶液（ＤＩＢＯ濃度）の２４．２μＬおよび４．３ｍｇ／ｍＬアジド−ＳＫ３の１１６μＬをプラスチックチューブ中で混合した。３６０μＬのＰＢＳを添加して、溶液の最終濃度を１００μＭのＡＦ６４７−２０Ｋ８  ＰＥＧ−ｓＤＩＢＯ（ＤＩＢＯの濃度）および１ｍｇ／ｍＬのアジド−ＳＫ３抗体にした。クリック反応を３７℃で２時間進行させ、続いて５ｍＭのＮａＮ３で室温で１時間クエンチした。ＡＦ６４７−２０Ｋ８  ＰＥＧ−ＳＫ３コンジュゲートをＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。１〜３ｍｇ／ｍＬのアジド−ＳＫ３抗体を用いて、１００〜６００μＭの最終ＤＩＢＯ濃度で、２５℃〜３７℃の反応温度で、２時間〜２０時間、コンジュゲーション反応を行った。実施した実験ごとの具体的な条件を表２４に示す。
【０２２６】
ＡＦ６４７−２０Ｋ８  ＰＥＧ−ｓＤＩＢＯの２ｍＭ溶液（ＤＩＢＯ濃度）の２４．２μＬおよび４．３ｍｇ／ｍＬアジド−ＳＫ３の１１６μＬをプラスチックチューブ中で混合した。３６０μＬのＰＢＳを添加して、溶液の最終濃度を１００μＭのＡＦ６４７−２０Ｋ８  ＰＥＧ−ｓＤＩＢＯ（ＤＩＢＯの濃度）および１ｍｇ／ｍＬのアジド−ＳＫ３抗体にした。クリック反応を３７℃で２時間進行させ、続いて５ｍＭのＮａＮ３で室温で１時間クエンチした。コンジュゲートを精製し、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＭＩＣＯＮ（商標）Ｕｌｔｒａ−４  １００ｋＤａ遠心分離フィルターを用いて濃縮した。ＡＦ６４７−２０Ｋ８  ＰＥＧ−ＳＫ３コンジュゲートをＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。１〜３ｍｇ／ｍＬのアジド−ＳＫ３抗体を用いて、１００〜６００μＭの最終ＤＩＢＯ濃度で、２５℃〜３７℃の反応温度で、２時間〜２０時間、コンジュゲーション反応を行った。実施した実験ごとの具体的な条件を表２４に示す。
【０２２７】
（表２４）コンジュゲーション条件
2019531474.tif 000030
【０２２８】
実施例８：分岐鎖ＰＥＧ  ＡＦ６４７コンストラクトの量子収率の分析
量子収量測定用の試料を調製するために、ＡＦ６４７分岐鎖ＰＥＧコンストラクト（ＡＦ６４７−２Ｋ４、ＡＦ６４７−１０Ｋ４、ＡＦ６４７−１０Ｋ８、およびＡＦ６４７−２０Ｋ８）の溶液を脱イオン水中０．１６μＭの最終色素濃度に希釈した。量子収率（Φ）は、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ＰＬ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｙｉｅｌｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。分岐鎖ＰＥＧコンストラクトについての量子収率を遊離色素のものと比較して、最終コンストラクトにおける消光度を決定した。さらに、分岐鎖ＰＥＧスペーサーを用いて達成される蛍光増強を決定するために明度を決定した。最小のコンストラクト、ＡＦ６４７−２Ｋ４（４つのアームを有する２，０００分子量の分岐鎖ＰＥＧ）は最大の消光（２０％の遊離色素のＱＹ、０．２の蛍光比）を示し、そして全蛍光における全体的な改善が最も低かった。８９％までの蛍光量子収率が遊離色素（蛍光比０．９）で保持されている４つまたは８つのアーム（ＡＦ６４７−１０Ｋ４およびＡＦ６４７−２０Ｋ８）のいずれかを有する高分子量コンストラクトについて最大の蛍光増強が見られ、そして５．８倍までの明度の改善が見られた。
【０２２９】
（表２５）ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７のパーセント量子収率（ＱＹ）および明度（Ｂ）に対する分岐鎖ＰＥＧスペーサーの効果
2019531474.tif 000031
【０２３０】
実施例９：ＡＦ６４７−２０Ｋ８  ＰＥＧ−ＳＫ３コンストラクトのフローサイトメトリー評価
新たに採取した抗凝固全血（ヒト）を、ＡＣＫ溶解緩衝液を用いて室温で２０分間溶解した。白血球を遠心分離（４００×ｇ、５分）により単離し、そして１％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）中で２回洗浄した。単離後、ＣＯＵＮＴＥＳＳ（登録商標）自動細胞計数器を用いて白血球の全数を決定し、次いで１ｍＬあたり１０００万細胞に希釈した。９６ウェルプレート中の１００万個の細胞／ウェルを、１μｇ〜０．０１５μｇの抗体の７点滴定を用いてＡＦ６４７−２０Ｋ８  ＰＥＧ−ＳＫ３コンジュゲートで染色した。染色細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄した。染色された細胞の分析は、ＡＴＴＵＮＥ（商標）ＮｘＴフローサイトメーターを用いて実施し、ＡＰＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＨＣＤ０４０５）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＭＨＣＤ０４２０）、ＦＩＴＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＡ１−８１１０３）およびＢＲＩＬＬＩＡＮＴ  ＶＩＯＬＥＴ（商標）６０５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号３００５５５）ＣＤ４コンジュゲートと比較された。
【０２３１】
図２２は、ＡＴＴＵＮＥ（商標）ＮｘＴフローサイトメーターのＲＬ１チャンネルにおける蛍光強度の関数としてのＣＤ４陽性リンパ球細胞のヒストグラムプロットを示す。ＣＤ４にコンジュゲートされたＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７は破線として示され、そしてＡＦ６４７−２０Ｋ８  ＰＥＧ−ＳＫ３コンジュゲートは点線または実線として示される。ＡＦ６４７コンジュゲート単独と比較して、スターＰＥＧコンジュゲートは、明度において０．５ｌｏｇより大きい増加を示す。図２３は、フローサイトメトリー実験においてコンジュゲート濃度の関数としてプロットしたシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）および陽性パーセント（陽性％）を示す。スターＰＥＧコンストラクト（ここではＢ１およびＢ２）は、試料中のいくつかのＣＤ４陽性細胞数を正確に評価する能力を保持しながら、ＡＰＣ  ＣＤ４ベンチマークコンジュゲートに対してＳ／Ｎにおいて２．５倍までの増加、およびＡＦ６４７  ＣＤ４ベンチマークコンジュゲートに対してＳ／Ｎにおいて２倍までの増加を有する。
【０２３２】
実施例１０：ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８のアミノデキストラン足場へのコンジュゲーション
７０ｋＤのアミノデキストランＡＦ４８８足場の調製：１０ｍｇのアミノデキストラン（７０，０００ＭＷ、２０個のアミノ基；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｄ１８６２）を１．０μｌのＤＩＥＡを含む１．２ｍｌの乾燥ＤＭＳＯに溶解した。０．９ｍｇのＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８スクシンイミジルエステルリチウム塩（６４３ＭＦ；  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２００００）を溶液に添加し、混合物を周囲温度で３．５時間撹拌した。溶液を１２ｍＬの酢酸エチルで希釈し、得られた懸濁液を遠心分離した。上清を廃棄し、そして固形物を１０ｍＬの新たな酢酸エチルと共に振盪し、そして遠心分離した。この洗浄を１０ｍＬの新たな酢酸エチルでさらに３回繰り返し、得られた沈殿物を真空中で乾燥させた。固体を０．５ｍｌの水に再溶解し、そして溶液を両側から切り取った１０ｃｍのＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ、ＭＷＣＯ１２−１４，０００、平坦、幅１０ｍｍ）中に入れた。透析膜を１Ｌの水中で１週間ゆっくり撹拌した。水は１日に２回交換した。透析膜を一端から開け、溶液を凍結乾燥してアミノデキストランＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）足場を得た。測定されたＤＯＬは９．７であり、相対ＱＹは０．６である（ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８のＱＹを基準とする）。
【０２３３】
７０ｋＤのアミノデキストランＡＦ４８８足場へのチオールリンカーの結合：アミノデキストランＡＦ４８８足場（４．５ｍｇ）を、０．０５５μＬのＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を含む０．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）（２０μｇ）を溶液に加え、混合物を一晩周囲温度に保ち、次いで酢酸スクシミジルエステル（１．０ｍｇ、３時間）でキャップした。溶液を１０ｍＬの酢酸エチルで希釈した。得られた懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。固体を１０ｍＬの新たな酢酸エチルと共に振盪し、そして遠心分離した。洗浄をさらに５回繰り返した。得られた固体を真空乾燥した。測定されたＤＯＬは０．７４である。この物質を２ｍＬの水に再溶解し、１６ｍｇのＤＴＴを溶液に加えた。混合物を５分間撹拌し、Ｇ１５  ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）カラムにロードし、生成物を緑色蛍光溶液としてＤＥ水で溶離し、これをＳＭＣＣ修飾ストレプトアビジンへのコンジュゲーションに使用した。決定された濃度は４８μＭであった（色素吸着による）。
【０２３４】
チオールリンカーで修飾されたアミノデキストランＡＦ４８８足場のＳＭＣＣ修飾ストレプトアビジンへのコンジュゲーション：ＳＭＣＣ修飾ストレプトアビジン（３５μＬ水溶液）を１、２、３および４当量のチオール修飾アミノデキストランＡＦ４８８足場（４８μＭ水溶液）で処理した。反応を周囲温度で３時間実施し、その後反応混合物を一晩４℃に保持した。コンジュゲートを１０ｎＭのＰＢＳ緩衝液を用いてＰ１００サイズ排除カラムで精製する。
【０２３５】
（表２６）７０ｋＤアミノデキストランＡＦ４８８足場で標識されたストレプトアビジン（足場あたり平均９．７分子の色素）
2019531474.tif 000032
【０２３６】
（表２７）ＡＦ４８８色素で標識されたストレプトアビジン
2019531474.tif 000033
【０２３７】
結果：表２６および２７に示されるように、足場から作製されたコンジュゲートは、単一のＡＦ４８８色素から作製されたコンジュゲートと比較してより明るい。同様に、アミノデキストラン足場で標識化するためのほぼ一定のＱＹとは対照的に、ＡＦ４８８フルオロフォアのＱＹは、単一色素コンジュゲーションについて０．７０から０．３４に低下する。
【０２３８】
本発明はさらに以下の項によって提示される。
【０２３９】
１．第１の抗体を含む組成物であって、２つ以上の蛍光標識および２つ以上のスペーサー分子が第１の抗体に共有結合し、蛍光標識とスペーサー分子は互いに共有結合していない組成物。
【０２４０】
２．第１の抗体が、等量の蛍光標識を用いて調製されたがスペーサー分子を含まない第２の抗体よりも高い蛍光発光レベルを示す、項１に記載の組成物。
【０２４１】
３．第１の抗体が第２の抗体よりも高い蛍光発光レベルを示し、第１の抗体および第２の抗体がそれぞれ同数の共有結合した蛍光標識を有し、第２の抗体が共有結合したスペーサー分子を有さない、項１および２に記載の組成物。
【０２４２】
４．スペーサー分子が、蛍光標識の消光を、スペーサー分子の非存在下での消光と比較して減少させる、項１〜３に記載の組成物。
【０２４３】
５．スペーサー分子が、反応性基に対して抗体にコンジュゲートされている、項１〜４に記載の組成物。
【０２４４】
６．反応性基がアミン基である、項５に記載の組成物。
【０２４５】
７．アミン基がリジン残基上にある、項６に記載の組成物。
【０２４６】
８．蛍光標識がコンジュゲーション分子によって抗体にコンジュゲートされている、項１に記載の組成物。
【０２４７】
９．蛍光標識が正に荷電している、項１〜５に記載の組成物。
【０２４８】
１０．蛍光標識がＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）色素またはＤＹＬＩＧＨＴ（商標）色素である、項１〜５に記載の組成物。
【０２４９】
１１．蛍光標識が、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５１４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６１０−Ｘ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ジニトロフェニル、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＭＡＲＩＮＡ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）４８８、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）５１４、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＬＵＥ（商標）、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＯＲＡＮＧＥ（商標）、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５、ＲＯＸ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＲＥＤ（商標）、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、ＦＡＭ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）、または７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）スクシンイミジルエステル（ＤＤＡＯ−ＳＥ）からなる群から選択される色素である、項１〜９に記載の組成物。
【０２５０】
１２．蛍光標識が、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）３５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４０５、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５９４、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６３３、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）７５５、およびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００からなる群から選択される色素である、項１０に記載の組成物。
【０２５１】
１３．スペーサー分子が負に荷電しているか中性である、項１〜１２に記載の組成物。
【０２５２】
１４．スペーサー分子が、アセテートおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される、項１〜１３に記載の組成物。
【０２５３】
１５．スペーサー分子がアセチル基を含む、項１〜１２に記載の組成物。
【０２５４】
１６．スペーサー分子がアセテート分子を含む、項１〜１４に記載の組成物。
【０２５５】
１７．アセテート分子がスルホ−ＮＨＳ−アセテートである、項１６に記載の組成物。
【０２５６】
１８．スペーサー分子が（ＰＥＧ）ｎを含むかまたはそれからなり、式中、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択される、項１〜１７に記載の組成物。
【０２５７】
１９．スペーサー分子がＭＳ−（ＰＥＧ）ｎを含み、式中、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択される、項１〜１７に記載の組成物。
【０２５８】
２０．スペーサー分子が、アルカノイル、アルケノイル、およびアルキノイル（−Ｃ（Ｏ）ＣｎＨｍから選択される基を含むか、またはそれらからなり、式中、ｎが１〜２０個の原子であり、ｍ＞ｎであり、炭素原子が、単結合、二重結合、および／または三重結合によって互いに結合することができる、項１〜１９に記載の組成物。
【０２５９】
２１．アルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基が、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−（ＣＨ２）ｙ−ＯＲによってさらに置換され、式中、ｘが１〜２０であり、ｙが１〜６であり、ＲがＨまたはＣ１〜６アルキルである、項２０に記載の組成物。
【０２６０】
２２．アルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基が、アンモニウム（−ＮＨ３＋）、第４級アンモニウム（−ＮＲ３＋）基でさらに置換され、式中、ＲがＣ１〜６アルキルである、項２１に記載の組成物。
【０２６１】
２３．蛍光色素が、１つ以上のＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５１４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６１０−Ｘ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（登録商標）ジニトロフェニル、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＭＡＲＩＮＡ  ＢＬＵＥ（登録商標）ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）４８８、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）５１４、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＬＵＥ（商標）、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＯＲＡＮＧＥ（商標）、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５、ＲＯＸ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＲＥＤ（商標）、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＦＡＭ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）、または７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）スクシンイミジルエステル（ＤＤＡＯ−ＳＥ）を含み、ならびに、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）３５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４０５、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５９４、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６３３、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）７５５、およびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８０からなる群からのものであり、
スペーサー分子が、
スルホ−ＮＨＳ−アセテート；
（ＰＥＧ）ｎ（式中、ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択される）；
ＭＳ−（ＰＥＧ）ｎ（式中、ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択される）；
アルカノイル、アルケノイル、またはアルキノイル（−Ｃ（Ｏ）ＣｎＨｍ）（式中、ｎが１〜２０個の原子であり、ｍ＞ｎであり、炭素原子が、単結合、二重結合、および／または三重結合で互いに結合し得る）；あるいは
−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−（ＣＨ２）ｙ−ＯＲ（式中、ｘが１〜２０であり、ｙが１〜６であり、ＲがＨもしくはＣ１〜６アルキルである）によってさらに置換されたアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基であって、またはアルキル、アルケニル、および／もしくはアルキニル基がアンモニウム（−ＮＨ３＋）、第４級アンモニウム（（−ＮＲ３＋）基でさらに置換され、式中、ＲがＣ１〜６アルキルである、アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基
のうちの１つ以上を含む、項１〜２２に記載の組成物。
【０２６２】
２４．アルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基が、ホスホニウム基（−ＰＱ３＋）によってさらに置換され、式中、Ｑがアリール、置換されたアリール、またはＣ１〜６アルキルである、項２３に記載の組成物。
【０２６３】
２５．蛍光標識の抗体に対する比が１〜５０である、項１〜２４に記載の組成物。
【０２６４】
２６．蛍光標識の抗体に対する比が５〜３０である、項２５に記載の組成物。
【０２６５】
２７．蛍光標識の抗体に対する比が１〜２０である、項２５に記載の組成物。
【０２６６】
２８．スペーサー分子の抗体に対する比が１〜５０である、項１〜２７に記載の組成物。
【０２６７】
２９．スペーサー分子の抗体に対する比が５〜３０である、項２８に記載の組成物。
【０２６８】
３０．スペーサー分子の抗体に対する比が５〜３０である、項２８に記載の組成物。
【０２６９】
３１．スペーサー分子の抗体に対する比が１〜２０である、項２８に記載の組成物。
【０２７０】
３２．スペーサー分子が、０．１〜２５倍、１〜１５倍、または２．５〜１０倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、項１〜３１に記載の組成物。
【０２７１】
３３．スペーサー分子が、２．５倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、項３２に記載の組成物。
【０２７２】
３４．スペーサー分子が、５倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、項３３に記載の組成物。
【０２７３】
３５．スペーサー分子が、７．５倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、項３３に記載の組成物。
【０２７４】
３６．スペーサー分子が、１０倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、項３３に記載の組成物。
【０２７５】
３７．複数の蛍光標識によって占有されている抗体上の結合部位の割合が１％〜９９％である、項３３に記載の組成物。
【０２７６】
３８．スペーサー分子の存在が、蛍光標識の検出可能な蛍光を、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％増加させる、項１〜３７に記載の組成物。
【０２７７】
３９．蛍光標識された生体分子の蛍光を増加させる方法であって、
（ａ）スペーサー分子を生体分子にコンジュゲートすることと、
（ｂ）生体分子に蛍光標識をコンジュゲートすることと、を含み、
ステップ（ａ）および（ｂ）は同時にまたは任意の順序で行うことができ、
スペーサーと蛍光標識は互いにコンジュゲートしていない、方法。
【０２７８】
４０．スペーサー分子が、蛍光標識の消光を、スペーサー分子の非存在下での消光と比較して減少させる、項３９に記載の方法のための方法。
【０２７９】
４１．スペーサー分子が、反応性基に対して抗体にコンジュゲートされている、項３９に記載の方法。
【０２８０】
４２．反応性基がアミン基である、項４１に記載の方法。
【０２８１】
４３．アミン基がリジン残基上にある、項４２に記載の方法。
【０２８２】
４４．蛍光標識が正に荷電している、項３９〜４３に記載の方法。
【０２８３】
４５．蛍光色素がＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）およびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）から選択される、項３９〜４３に記載の方法。
【０２８４】
４６．蛍光標識が、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５１４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６１０−Ｘ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ジニトロフェニル、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＭＡＲＩＮＡ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）４８８、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）５１４、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＬＵＥ（商標）、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＯＲＡＮＧＥ（商標）、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５、ＲＯＸ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＲＥＤ（商標）、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、ＦＡＭ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）、および７−ヒドロキシ−９Ｈ−（ｌ，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）スクシンイミジルエステル（ＤＤＡＯ−ＳＥ）からなる群から選択される、項３９〜４３に記載の方法。
【０２８５】
４７．蛍光標識が、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）３５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４０５、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５９４、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６３３、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）７５５、およびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００からなる群から選択される、項３９〜４３および４５に記載の方法。
【０２８６】
４８．スペーサー分子が負に荷電しているか中性である、項３９〜４３に記載の方法。
【０２８７】
４９．スペーサー分子が、アセテートおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される、項３９〜４３に記載の方法。
【０２８８】
５０．スペーサー分子がアセチル基を含む、項３９〜４８に記載の方法。
【０２８９】
５１．スペーサー分子がアセテート分子を含む、項３９〜４９に記載の方法。
【０２９０】
５２．アセテート分子がスルホ−ＮＨＳ−アセテートである、項５１に記載の方法。
【０２９１】
５３．スペーサー分子が（ＰＥＧ）ｎを含み、式中、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択される、項３９〜５２に記載の方法。
【０２９２】
５４．スペーサー分子がＭＳ−（ＰＥＧ）ｎを含み、式中、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５から選択される、項３９〜５２に記載の方法。
【０２９３】
５５．スペーサー分子が、アルカノイル、アルケノイル、およびアルキノイル（−Ｃ（Ｏ）ＣｎＨｍ）から選択される基を含み、式中、ｎが１〜２０個の原子であり、ｍ＞ｎであり、炭素原子が、単結合、二重結合、および／または三重結合によって互いに結合することができる、項３９〜４８に記載の方法。
【０２９４】
５６．アルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基が、−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−（ＣＨ２）ｙ−ＯＲによってさらに置換され、式中、ｘが１〜２０であり、ｙが１〜６であり、ＲがＨまたはＣ１〜６アルキルである、項３９〜４８に記載の方法。
【０２９５】
５７．アルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基が、アンモニウム（−ＮＨ３＋）、第４級アンモニウム（−ＮＲ３＋）基でさらに置換され、式中、ＲがＣ１〜６アルキルである、項５５に記載の方法。
【０２９６】
５８．アルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基が、ホスホニウム基（−ＰＱ３＋）によってさらに置換され、式中、Ｑがアリール、置換されたアリール、またはＣ１〜６アルキルである、項５５に記載の方法。
【０２９７】
５９．蛍光標識の抗体に対する比が１〜５０である、項３９〜５８に記載の方法。
【０２９８】
６０．蛍光標識の抗体に対する比が５〜３０である、項５９に記載の方法。
【０２９９】
６１．蛍光標識の抗体に対する比が１〜２０である、項５９に記載の方法。
【０３００】
６２．スペーサー分子のタンパク質に対する比が１〜５０である、項３９〜６１に記載の方法。
【０３０１】
６３．スペーサー分子のタンパク質に対する比が５〜３０である、項６２に記載の方法。
【０３０２】
６４．スペーサー分子のタンパク質に対する比が５〜３０である、項６２に記載の方法。
【０３０３】
６５．スペーサー分子のタンパク質に対する比が１〜２０である、項６２に記載の方法。
【０３０４】
６６．スペーサー分子が、０．１〜２５倍、１〜１５倍、または２．５〜１０倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、項３９〜６５に記載の方法。
【０３０５】
６７．スペーサー分子が、２．５倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、項６６に記載の方法。
【０３０６】
６８．スペーサー分子が、５倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、項６６に記載の方法。
【０３０７】
６９．スペーサー分子が、７．５倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、項６６に記載の方法。
【０３０８】
７０．スペーサー分子が、１０倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、項６６に記載の方法。
【０３０９】
７１．複数の蛍光標識によって占有されている抗体上の結合部位の割合が１％〜９９％である、項３９〜７０に記載の方法。
【０３１０】
７２．スペーサー分子の存在が、蛍光標識の検出可能な蛍光を、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％増加させる、項３９〜７１に記載の方法。
【０３１１】
７３．蛍光標識された生体分子の蛍光発光を増強することができるスペーサー分子を同定する方法であって、
（ａ）生体分子にコンジュゲートした複数の蛍光標識とは独立して、スペーサー分子を生体分子にコンジュゲートすることと、
（ｂ）生体分子にコンジュゲートした複数の蛍光標識に加えてスペーサー分子の存在が複数の蛍光標識の検出可能な蛍光を増加させるかどうかを試験することと、
（ｃ）スペーサー分子を、生体分子にコンジュゲートした複数の蛍光標識に加えてスペーサー分子の存在が複数の蛍光標識の検出可能な蛍光を増加させるときにタンパク質にコンジュゲートした蛍光標識の消光を減少させるものとして同定することと、を含む、方法。
【０３１２】
７４．スペーサー分子が、生体分子上に存在する最初のリジン側鎖で生体分子にコンジュゲートされている、項７３に記載の方法。
【０３１３】
７５．生体分子が抗体または抗体断片である、項７３〜７４に記載の方法。
【０３１４】
７６．複数の蛍光標識が正に荷電している、項７３〜７５に記載の方法。
【０３１５】
７７．スペーサー分子が正に荷電している、項７３〜７６に記載の方法。
【０３１６】
７８．複数の蛍光標識が負に荷電している、項７３〜７４に記載の方法。
【０３１７】
７９．スペーサー分子が負に荷電している、項７３〜７６に記載の方法。
【０３１８】
８０．複数の蛍光標識がＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）およびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）分子から選択される色素である、項７３〜７９に記載の方法。
【０３１９】
８１．複数の蛍光標識が、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５１４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６１０−Ｘ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ジニトロフェニル、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＭＡＲＩＮＡ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）４８８、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）５１４、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＬＵＥ（商標）、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＯＲＡＮＧＥ（商標）、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５、ＲＯＸ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＲＥＤ（商標）、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、ＦＡＭ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）、および７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）スクシンイミジルエステル（ＤＤＡＯ−ＳＥ）から選択される、項７３〜７９に記載の方法。
【０３２０】
８２．複数の蛍光標識が、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）３５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４０５、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５９４、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６３３、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）７５５、およびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００から選択される、項７３〜８０に記載の方法。
【０３２１】
８３．スペーサー分子が、アセテートおよびＰＥＧから選択される、項７３〜８２に記載の方法。
【０３２２】
８４．複数の蛍光標識がコンジュゲーション分子によって抗体にコンジュゲートされている、項７３〜８３に記載の方法。
【０３２３】
８５．複数の蛍光標識が最初のリジン側鎖で抗体にコンジュゲートされている、項７３〜８４に記載の方法。
【０３２４】
８６．スペーサー分子が、最初のリジン側鎖で抗体にコンジュゲートされている、項８５に記載の方法。
【０３２５】
８７．抗体への複数の蛍光標識の、色素とタンパク質の比が１〜５０である、項７３〜８６に記載の方法。
【０３２６】
８８．抗体への複数の蛍光標識の、色素とタンパク質の比が５〜３０である、項８７に記載の方法。
【０３２７】
８９．抗体への複数の蛍光標識の、色素とタンパク質の比が１〜２０である、項８７に記載の方法。
【０３２８】
９０．スペーサー分子のタンパク質に対する比が１〜５０である、項７３〜８８に記載の方法。
【０３２９】
９１．スペーサー分子のタンパク質に対する比が５〜３０である、項９０に記載の方法。
【０３３０】
９２．スペーサー分子のタンパク質に対する比が５〜３０である、項９０に記載の方法。
【０３３１】
９３．スペーサー分子のタンパク質に対する比が１〜２０である、項９０に記載の方法。
【０３３２】
９４．スペーサー分子が、０．１〜２５倍、１〜１５倍、または２．５〜１０倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、項７３〜８９に記載の方法。
【０３３３】
９５．スペーサー分子が、２．５倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、項９４に記載の方法。
【０３３４】
９６．スペーサー分子が、５倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、項９４に記載の方法。
【０３３５】
９７．スペーサー分子が、７．５倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、項９４に記載の方法。
【０３３６】
９８．スペーサー分子が、１０倍の量で複数の蛍光標識に対してモル過剰である、項９４に記載の方法。
【０３３７】
９９．複数の蛍光標識によって占有されている抗体上の結合部位の割合が１％〜９９％である、項７３〜９８に記載の方法。
【０３３８】
１００．スペーサー分子の存在が、蛍光標識の検出可能な蛍光を、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％増加させる、項９９に記載の方法。
【０３３９】
１０１．生体試料中の所望の標的の存在を決定する方法であって、
（ａ）生体試料を組成物、抗体と接触させることであって、２つ以上の蛍光標識と２つ以上のスペーサー分子が抗体と共有結合し、蛍光体とスペーサー分子が互いに共有結合していない、接触させることと、
（ｂ）複数の蛍光標識によって発光される蛍光を検出することと、
（ｃ）複数の蛍光標識によって発光された蛍光が検出されるときに、生体試料中の所望の標的の存在を決定することと、を含む、方法。
【０３４０】
１０２．生体試料が細胞溶解物を含む、項１０１に記載の方法。
【０３４１】
１０３．生体試料が無傷の細胞を含む、項１０１に記載の方法。
【０３４２】
１０４．生体試料が単離されたタンパク質を含む、項１０１に記載の方法。
【０３４３】
１０５．生体試料が組換えタンパク質を含む、項１０１に記載の方法。
【０３４４】
１０６．生体試料が固体支持体上に固定化されている、項１０１〜１０５に記載の方法。
【０３４５】
１０７．生体試料が流体中の無傷の細胞を含む、項１０１に記載の方法。
【０３４６】
１０８．生体試料が生きている動物である、項１０１に記載の方法。
【０３４７】
１０９．生きている動物が哺乳動物である、項１０８に記載の方法。
【０３４８】
１１０．第１の核酸分子を含む組成物であって、２つ以上の蛍光標識および２つ以上のスペーサー分子が第１の核酸分子に共有結合し、蛍光体とスペーサー分子は互いに共有結合していない組成物。
【０３４９】
１１１．第１の核酸分子が、等量の蛍光標識を用いて調製されたがスペーサー分子を含まない第２の核酸分子よりも高い蛍光発光レベルを示す、項１１０に記載の組成物。
【０３５０】
１１２．第１の核酸分子が第２の核酸分子よりも高い蛍光発光レベルを示し、第１の核酸分子および第２の核酸分子がそれぞれ同数の共有結合した蛍光標識を有し、第２の核酸分子が、共有結合したスペーサー分子を有さない、項１１０に記載の組成物。
【０３５１】
１１３．複数の蛍光標識にコンジュゲートした抗体を含むコンジュゲート抗体であって、以下の特徴、
（ａ）蛍光標識１個あたりに基づいて０．５以上の蛍光比、
（ｂ）少なくとも４つの蛍光標識を抗体にコンジュゲートすること、および／または
（ｃ）抗体の全蛍光が、非コンジュゲート蛍光分子の蛍光より少なくとも２０パーセント大きい、のうちの１つ以上を含む、コンジュゲート抗体。
【０３５２】
１１４．蛍光標識が１つ以上のマルチアームポリマーによって抗体にコンジュゲートされている、項１１３に記載のコンジュゲート抗体。
【０３５３】
１１５．蛍光標識が１つのマルチアームポリマーによって抗体にコンジュゲートされている、項１１３〜１１４に記載のコンジュゲート抗体。
【０３５４】
１１６．蛍光標識が２〜１０のマルチアームポリマーによって抗体にコンジュゲートされている、項１１３および１１４に記載のコンジュゲート抗体。
【０３５５】
１１７．２つ以上の蛍光標識が抗体にコンジュゲートしている、項１１６に記載のコンジュゲート抗体。
【０３５６】
１１８．マルチアームポリマーのアームが、
（ａ）ポリエチレングリコール、
（ｂ）多糖類、および
（ｃ）ポリペプチド
からなる群から選択される種類の化学物質から構成される、項１１３〜１１７に記載のコンジュゲート抗体。
【０３５７】
１１９．蛍光標識間の平均ブラシ距離が２００〜８００オングストロームである、項１１３〜１１８に記載のコンジュゲート抗体。
【０３５８】
１２０．蛍光標識が少なくとも１６の共有結合によって抗体から離れている、項１１３〜１１９に記載のコンジュゲート抗体。
【０３５９】
１２１．蛍光標識が１６〜８００の共有結合によって抗体から離れている、項１２０に記載のコンジュゲート抗体。
【０３６０】
１２２．蛍光標識が、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５１４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６１０−Ｘ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６６０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６８０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７００、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７９０、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ジニトロフェニル、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＭＡＲＩＮＡ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）４８８、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）５１４、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＬＵＥ（商標）、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＯＲＡＮＧＥ（商標）、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５、ＲＯＸ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＲＥＤ（商標）、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、ＦＡＭ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（登録商標）、または７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）スクシンイミジルエステル（ＤＤＡＯ−ＳＥ）からなる群から選択される色素、ならびにＤＹＬＩＧＨＴ（商標）３５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４０５、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）５９４、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６３３、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）６８０、ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）７５５、およびＤＹＬＩＧＨＴ（商標）８００、およびＰＥＧ化ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）色素からなる群からの蛍光標識である、項１２０に記載のコンジュゲート抗体。
【０３６１】
１２３．蛍光標識された生体分子を調製する方法であって、
（ａ）反応性基および２つ以上の蛍光標識をスペーサー分子にコンジュゲートし、それによって蛍光標識されたスペーサー分子を形成することと、
（ｂ）蛍光標識されたスペーサー分子を生体分子にコンジュゲートし、それによって蛍光標識された生体分子を形成することと、を含み、
蛍光標識された生体分子の個々の蛍光標識が、蛍光標識１個あたりに基づいて０．５以上の蛍光比を有する、方法。
【０３６２】
１２４．平均１〜１０個の蛍光標識されたスペーサー分子が各生体分子にコンジュゲートしている、項１２３に記載の方法。
【０３６３】
１２５．平均３〜１０個の蛍光標識されたスペーサー分子が各生体分子にコンジュゲートしている、項１２３に記載の方法。
【０３６４】
１２６．蛍光標識されたスペーサー分子がマルチアームポリマーである、項１２３〜１２５に記載の方法。
【０３６５】
１２７．マルチアームポリマーが分岐鎖ポリエチレングリコール分子である、項１２６に記載の方法。
【０３６６】
１２８．マルチアームポリマーが４〜１０個の蛍光標識にコンジュゲートしている、項１２６に記載の方法。
【０３６７】
１２９．マルチアームポリマーが、４，０００〜８０，０００ダルトンの分子量を有する、項１２６に記載の方法。
【０３６８】
１３０．蛍光標識された生体分子を検出する方法であって、
（ａ）生体分子にコンジュゲートした蛍光標識を励起する光に蛍光標識された生体分子を曝露することと、
（ｂ）生体分子にコンジュゲートした蛍光標識によって生成された発光を検出することと、を含み、
蛍光標識された生体分子が、４つ以上の蛍光標識にコンジュゲートし、
蛍光標識された生体分子の個々の蛍光標識が、蛍光標識１個あたりに基づいて０．７以上の蛍光比を有する、方法。
【０３６９】
１３１．蛍光標識された生体分子が抗体である、項１３０に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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