(57)【要約】TLR9発現がんなどのがんの標的治療のための組成物および方法が開示される。特に、細胞溶解性ペプチドをTLR9発現悪性細胞に標的化する、CpGオリゴデオキシヌクレオチドなどのTLR9標的リガンドを含有する分子が開示される。
2019524787.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二価リンカーを介して細胞溶解性ペプチドに結合したToll様受容体-9(TLR9)標的リガンドを含む分子であって、細胞溶解性ペプチドが、アミノ酸配列 PHHPPHHPHHPPHHPHHP(配列番号：2)(ここで、Pは、Pは、正に荷電したアミノ酸であり、Hは、疎水性アミノ酸である)を含む、分子。
【請求項２】
細胞溶解性ペプチドが、配列番号：1のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
TLR9標的リガンドが、非メチル化CpGオリゴヌクレオチド、またはTLR9に結合するその類似体もしくは誘導体である、請求項１または２に記載の分子。
【請求項４】
二価リンカーが、C6アミノ-SMCC-Cysリンカーを含む、請求項１〜３のいずれか1つに記載の分子。
【請求項５】
二価リンカーを介して細胞毒性薬に結合したがん標的薬を含む分子であって、二価リンカーがC6アミノ-SMCC-Cysリンカーを含む、分子。
【請求項６】
細胞毒性薬が、細胞溶解性ペプチドを含む、請求項５に記載の分子。
【請求項７】
がん標的薬が、TLR9標的リガンドを含む、請求項５または６に記載の分子。
【請求項８】
TLR9標的リガンドが、非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチド、またはTLR9に結合するその類似体もしくは誘導体である、請求項７に記載の分子。
【請求項９】
薬学的に許容される担体中に請求項１〜８のいずれか1つに記載の分子を含む医薬組成物。
【請求項１０】
治療有効量の請求項９に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象におけるがんの治療方法。
【請求項１１】
がんが、骨髄異形成症候群(MDS)を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
がんが、肝臓がんを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
治療の前に、TLR9発現について対象からの生検サンプルをアッセイすることをさらに含む、請求項１０〜１２のいずれか1つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2016年8月3日出願の米国仮出願第62/370,428号の利益を主張し、該出願の開示の全体は、参照することにより本出願に包含される。
技術分野
本出願は、一般に、骨髄異形成症候群(MDS)などのがんを治療するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄異形成症候群(MDS)は造血幹細胞悪性腫瘍であり、アメリカ人の高齢化により有病率が上昇している。MDSは、赤血球生成障害、骨髄分化の調節異常および急性骨髄性白血病(AML)転化のリスク増加に関連する悪性血液疾患の一群を含む。MDSの発生率は、米国における毎年15,000〜20,000の新たな症例、および慢性の輸血を必要とする多数の患者が存在し、増加している。無効な赤血球生成は、MDSクローンに固有の遺伝的異常と骨髄(BM)微小環境内の老化依存性炎症シグナルとの間の複雑な相互作用によって引き起こされる、より緩慢なサブタイプを有する患者にとって依然として主要な治療上の課題である。米国(US)では、3種類の薬剤がMDSの治療薬として承認されているが、レナリドマイド(LEN)が唯一の標的治療薬である。LENによる治療は、染色体5q欠失(del5q)を有する患者の大多数において部分的または完全な細胞遺伝学的異常の解消を伴う持続的な赤血球輸血非依存性をもたらすが、少数の非del5q MDS患者においてのみ、まれに細胞遺伝学的改善を伴う意味のある応答を達成する。del5q MDS患者の応答は、比較的長続きし、中央値は2.5年であるが、輸血依存性の再開とともに耐性が徐々に現れる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
非del(5q)の患者に有効な治療法の選択肢は限られている。特に、MDSの症例は、アメリカの高齢化人口とその組み合わせの増加により、年々増加している。多くの場合、それらは誤診されて深刻な感染症の治療の失敗をもたらすか、または高価な治療や貴重な資源を無駄にする。適切な診断が下されると、患者は頻繁な輸血と非特異的化学療法に頼らなければならず、これらは重度の副作用を有し、非del(5q)の患者には限られた利益しかもたらされない。del(5q)のないMDS患者に対する効果的な治療法の欠如は、患者と介護者の両方にこの疾患の大きな負担を与え、そしてAML転化のリスクを増大させる。したがって、確かに、この患者集団における特定の標的治療薬を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
腫瘍抗原を発現するがんまたはがん幹細胞の標的治療のための組成物および方法が開示される。開示された組成物および方法において、抗体またはリガンドなどの腫瘍抗原標的薬は、たとえば、二価リンカーを介して、細胞毒性薬に結合する。いくつかの実施形態では、細胞毒性薬は、細胞溶解性ペプチドである。
【０００５】
いくつかの実施態様では、分子は、たとえば、二価リンカーを介して細胞溶解性ペプチドに結合された抗腫瘍関連抗原(TAA)結合剤を含む。いくつかの実施態様では、細胞溶解性ペプチドは、アミノ酸配列 KAFKKAFKAFKKAFKAFK(配列番号：1)を含む。いくつかの実施態様では、細胞溶解性ペプチド機能は、交互に正および負に架電したアミノ酸に起因する。したがって、いくつかの実施態様では、細胞溶解性ペプチドは、アミノ酸配列 PHH PPH HPH HPP HHP HHP(配列番号：2)を含み、ここで、Pは、正に荷電したアミノ酸であり、Hは、疎水性アミノ酸である。いくつかの実施態様では、細胞溶解性ペプチドは、配列番号：2のアミノ酸配列に対して少なくとも65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または少なくとも12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個のアミノ酸長を有するそのフラグメントを含む。
【０００６】
特定の実施態様では、初代ヒトMDS前駆細胞、造血幹細胞(HSC)、および肝臓がんなどの細胞外Toll様受容体-9(TLR9)発現を有するがんまたはがん幹細胞の標的治療のための組成物および方法が開示される。いくつかの場合、がんは固形腫瘍を含む。いくつかの場合、がんは、骨髄異形成症候群(MDS)を含む。たとえば、がんは、非del(5q)MDSでありうる。図4は、TLR9発現が増加している他のがん、たとえば、肺がん、肝臓がん、および乳がんを同定する。図5は、さまざまな腫瘍組織におけるTLR9タンパク質の発現を示す。たとえば、皮膚、食道、結腸、直腸、肝臓、肺、および子宮のがんは、TLR9タンパク質の発現が増加していることが示される。いくつかの場合、この方法はさらに、治療前に対象からの生検サンプルをTLR9発現についてアッセイすることを含む。
【０００７】
特に、細胞溶解性ペプチドをTLR9発現悪性細胞に標的化するTLR9標的リガンドを含む分子が開示される。
【０００８】
いくつかの態様では、TLR9標的リガンドは、非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチド、またはTLR9に結合するその類似体もしくは誘導体である。CpGオリゴデオキシヌクレオチド(またはCpG ODN)は、シトシン三リン酸デオキシヌクレオチド(C)とそれに続くグアニン三リン酸デオキシヌクレオチド(G)を含む短い一本鎖合成DNA分子である。「p」は、連続したヌクレオチド間のホスホジエステル結合を示すが、いくつかのODNは、代わりに修飾ホスホロチオエート(PS)骨格を有する。PS修飾は、体内のDNaseなどのヌクレアーゼによる分解からODNを保護し、ポリGテールは、細胞取り込みを促進する。
【０００９】
中心の非メチル化CpGを有するヘキサマーからなるコアCpGモチーフは、一般式RRCGYY(式中、Rはプリンを表し、Yはピリミジンを表す)を有する。初期の経験的構造活性相関(SAR)研究は、最適なCpGモチーフ(ヒトにとってはGTCGTT)における種特異的な差異を明らかにした。ヘキサマーであるCpGモチーフ以外に、ODNの免疫刺激活性は、それが含有するCpGモチーフの数(通常2〜4が最適である)、CpGモチーフの間隔(通常少なくとも2つの介在塩基、好ましくはチミン残基が最適である)、ODNにおけるpoly-G配列または他の隣接配列の存在(効果はODNの構造と骨格に依存する)、およびODN骨格(ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート骨格が最も安定でB細胞の活性化に最適であるが、CpGジヌクレオチド中の天然ホスホジエステル結合と比較して、pDCからのIFNα分泌の誘導は比較的弱い)によって決定される。さらに、5’末端においてTpCジヌクレオチドがある場合、および3’側においてODNがピリミジンに富む場合、ODNの免疫刺激効果は増強される。
【００１０】
多数の配列が、CpG二量体の数および位置、ならびにCpG二量体に隣接する正確な塩基配列を変化させてTLR9を刺激することが明らかにされている。これにより、それらの配列、二次構造、およびヒト末梢血単核細胞(PBMC)における効果に基づいて、5つの非公式なクラスまたはカテゴリーのCpGオリゴヌクレオチド(ODN)が創製された。5つのクラスは、クラスA(タイプD)、クラスB(タイプK)、クラスC、クラスP、およびクラスSである。CpGオリゴヌクレオチドおよびそれらがTLR9に結合する能力の概説は、Krieg、AM. Nature Reviews 2006 5：471-484に見出すことができ、この文献は、全体を参照することにより本願に組み込まれる。例のTLR9アゴニストCpG ODNとして、CPG 10101(Coley)、ODN 1018 ISS(Dynavax)、CPG 7909(GlaxoSmithKline(GSK)/ColeyおよびDARPA/NIAID/Coley)、ODN PF-3512676(Pfizer/Coley)、ならびにODN 1018 ISS(Dynavax)が挙げられる。
【００１１】
いくつかの場合、TLR9リガンドは、CpG配列 TCCATGACGTTCCTGATGCT(配列番号：3)を含む。いくつかの場合、TLR9リガンドは、CpG配列 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(配列番号：4)を含む。いくつかの場合、TLR9リガンドは、CpG配列 TCCATGACGTTCCTGACGTT(配列番号：5)を含む。いくつかの場合、TLR9リガンドは、CpG配列 GGGGACGACGTCGTGGGGGGG(配列番号：6)を含む。いくつかの場合、TLR9リガンドは、CpG配列 GGGGGACGATCGTCGGGGGG(配列番号：7)を含む。いくつかの場合、TLR9リガンドは、CpG配列 TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT(配列番号：8)を含む。いくつかの場合、TLR9リガンドは、CpG配列 TCGACGTTCGTCGTTCGTCGTTC(配列番号：9)を含む。いくつかの場合、TLR9リガンドは、CpG配列 TCGCGACGTTCGCCCGACGTTCGGTA(配列番号：10)を含む。いくつかの場合、TLR9リガンドは、CpG配列 TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(配列番号：11)を含む。いくつかの場合、TLR9リガンドは、CpG配列 TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT(配列番号：12)を含む。いくつかの場合、TLR9リガンドは、CpG配列 TCGCGAACGTTCGCCGCGTTCGAACGCGG(配列番号：13)を含む。
【００１２】
いくつかの場合、一部またはすべてのCpGヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格を有する。しかしながら、いくつかの実施態様では、1つ以上のヌクレオチドは、修飾ホスホロチオエート(ヌクレアーゼ耐性)骨格を有する。たとえば、いくつかの場合、TLR9リガンドは、CpG配列 T*C*C*A*T*G*A*C*G*T*T*C*C*T*G*A*T*G*C*T*(配列番号：14、*=ホスホロチオエート)を含む。いくつかの場合、TLR9リガンドは、CpG配列 G*G*G*GACGACGTCGTGG*G*G*G*G*G*(配列番号：15、*=ホスホロチオエート)を含む。いくつかの場合、TLR9リガンドは、CpG配列 G*G*GGGACGATCGTCG*G*G*G*G*G*(配列番号：16、*=ホスホロチオエート)を含む。いくつかの場合、TLR9リガンドは、CpG配列 T*C*G*T*C*G*T*C*G*T*T*C*G*A*A*C*G*A*C*G*T*T*G*A*T*(配列番号：17、*=ホスホロチオエート)を含む。
【００１３】
いくつかの実施態様では、組成物および方法は、急性骨髄性白血病(AML)などの細胞外CD33発現を有するがんまたはがん肝細胞の標的治療のために開示される。いくつかの実施態様では、組成物および方法は、肺、頭頸部、および多くの他の上皮がんなどの細胞外EGF-R発現を有するがんまたはがん肝細胞の標的治療のために開示される。いくつかの実施態様では、組成物および方法は、乳がんなどの細胞外HER2発現を有するがんまたはがん肝細胞の標的治療のために開示される。いくつかの実施態様では、組成物および方法は、B細胞非ホジキンリンパ腫(NHL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、およびB細胞急性リンパ芽球性白血病(ALL)などの細胞外CD19発現を有するがんまたはがん肝細胞の標的治療のために開示される。いくつかの実施態様では、組成物および方法は、AML、芽球形質細胞様樹状細胞腫瘍、有毛細胞白血病、およびALLなどの細胞外CD123発現を有するがんまたはがん肝細胞の標的治療のために開示される。いくつかの実施態様では、組成物および方法は、多発性骨髄腫などの細胞外B細胞成熟抗原(BCMA)発現を有するがんまたはがん肝細胞の標的治療のために開示される。腫瘍細胞上のCD33、EGF-R、HER2、CD19、CD123、またはBCMAに結合する腫瘍抗原標的薬は公知であり、開示される組成物および方法において使用されうる。
【００１４】
いくつかの実施態様では、二価リンカーは、C6アミノ-SMCC-Cysリンカーである。いくつかの実施態様では、リンカーは、クリックケミストリー反応を用いて生成される。クリックケミストリーアプローチは、もともとは、小さなサブユニットをモジュラー方式で結合することによって複雑な物質を迅速に生成する方法として着想された。「クリック反応」と呼ばれることが多いヒュスゲン1,3-双極子付加環化銅触媒反応などのさまざまな形態のクリックケミストリー反応が、当技術分野において知られている。他の代替法として、ディールス-アルダーなどの付加環化反応、求核置換反応(特に、エポキシおよびアジリジン化合物などの小さな歪みのある環への)、尿素化合物のカルボニル化学形成およびチオール-イン反応におけるアルキンなどの炭素-炭素二重結合を含む反応が挙げられる。
【００１５】
また、薬学的に許容される担体中の本明細書に開示された分子を含む医薬組成物が開示される。また、対象に治療有効量の開示される医薬組成物を投与することを含む、対象におけるTLR9陽性がんなどのがんの治療方法が開示される。
【００１６】
開示された方法のがんは、TLR9、CD33、EGF-R、HER2、CD19、CD123、およびBCMAなどの、腫瘍抗原を発現している、無秩序な増殖、浸潤、または転移を受けている対象における任意の細胞であり得る。したがって、がんは、肉腫、リンパ腫、白血病、がん腫、芽細胞腫、または胚細胞腫瘍である。代表的であるが非限定的ながんのリストは、リンパ腫、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱がん、脳腫瘍、神経系がん、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん、腎臓がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんなどの肺がん(lung がん)、神経芽細胞腫/膠芽腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、肝臓がん、黒色腫、口、喉、喉頭、および肺の扁平上皮がん、結腸がん、子宮頸がん(cervical がん)、子宮頸がん(cervical carcinoma)、乳がん、上皮がん、腎がん、泌尿生殖器がん、肺がん(pulmonary がん)、食道がん、頭頸部がん、大腸がん、造血器がん；精巣がん；結腸および直腸がん、前立腺がん、および膵臓がんを包含する。
【００１７】
いくつかの場合、がんは、骨髄異形成症候群(MDS)を含む。たとえば、がんは、非del(5q) MDSでありうる。図4は、TLR9発現が増加している他のがん、たとえば、肺がん、肝臓がん、および乳がんを同定する。図5は、さまざまな腫瘍組織におけるTLR9タンパク質の発現を示す。たとえば、皮膚、食道、結腸、直腸、肝臓、肺、および子宮のがんは、TLR9タンパク質の発現が増加することが明らかにされている。いくつかの場合、この方法はさらに、治療の前に対象からの生検サンプルをTLR9発現についてアッセイすることを含む。
【００１８】
本発明の1つ以上の実施態様の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Click-IT化学を用いる結合の合成経路を示す。
【図２】結合したホスホロチオエート化CpGの配列およびペプチド配列ならびにC6アミノ-SMCC-Cysリンカー戦略を示す。
【図３】細胞溶解性ペプチド3D構造および使用されるスクランブルコントロールの構造の例を示す。
【図４】さまざまな腫瘍におけるTLR9の過剰発現を示す箱ひげ図である。箱ひげ図は、箱内の黒い線で表される中央値と25〜75パーセンタイル(箱)を表す。外れ値は、絶対偏差の中央値を表す円の中にある(2 SDはほぼ同じである)。
【図５】組織マイクロアレイ(TMA)スライドを抗TLR9抗体で染色した結果を示す。一番上のグラフは、コントロールTMA中のコアについての表にしたデータおよび茶色の着色がないことを実証しているコアのうちの1つからの代表的な写真を示す。そのスライドの唯一の陽性コアは、炎症を起こした扁桃腺であり、陽性コントロールとして機能する。第2のグラフは、さまざまなレベルのTLR9陽性染色を示す多腫瘍TMA(15種のがんの48の症例)からの表形式の結果を示す。写真は、代表的な図として、濃い茶色の染色を示した黒色腫の症例のコアを表す。
【図６】2つの別々のMDS BM一次標本を、14日間増殖因子を添加したメチルセルロース培地中で再培養する前に48時間培養した、Bmal1配列1および2またはそれらの組み合わせを標的とするsiRNAを結合したCpGで処理したことを示す。その時点で、造血コロニーを、BFU-EおよびCFU-GMについてカウントした。
【図７】MDS BM一次標本を、スライドにサイトスピンする前に48時間培養した、Bmal1配列1および2(2つの異なる配列)を標的とするsiRNAと結合したCpGで処理したことを示す。次いで、細胞をBmal1発現について染色し、核染色についてDAPI染色した。スライドを共焦点顕微鏡で撮影した。
【図８】3つの別々のMDS BM一次標本を、14日間増殖因子を添加したメチルセルロース培地中で再培養する前に48時間培養した、細胞溶解性ペプチドを結合したCpGで処理したことを示す。その時点で、造血コロニーを、BFU-EおよびCFU-GMについてカウントした。
【図９Ａ−９Ｃ】図9Aおよび図9Bは、原発性患者の骨髄において、CpG細胞溶解性ペプチドが、エクスビボで低用量(図9A)および迅速な持続応答(図9B)で効果的に作用することを示す。図9Cは、正常細胞の基底レベルに影響を及ぼすことなく、野生型マウスおよびS100A9Tgマウスにおける過剰発現TLR9+細胞が減少することを示す。
【図１０】高い表面TLR9発現を有するMDS患者由来の細胞株であるSKM1を用いるCpG-siRNA構築物(BCL2、BCL-XLおよびMCL1)の有効性を示す。
【図１１】CpG-siRNAによるBmal1の標的化も、一次標本中の表面TLR9+細胞の割合を減少させたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な記載
Toll様受容体-9(TLR9)、CD33、EGF-R、HER2、CD19、CD123、およびBCMAなどの腫瘍関連抗原(TAA)を発現するがんまたはがん幹細胞の標的治療のための組成物および方法が開示される。いくつかの実施態様では、抗体またはリガンドなどの抗TAA結合剤を、たとえば、本明細書に開示の二価リンカーを用いて、本明細書に開示の細胞溶解性ペプチドに結合させる。
【００２１】
抗TAA結合剤
いくつかの実施態様では、抗TAA結合剤は、一本鎖可変フラグメント(scFv)抗体である。抗TAA scFvの親和性／特異性は、大部分、重鎖(VH)および軽鎖(VL)中の相補性決定領域(CDR)内の特定の配列によって促進される。各VHおよびVL配列は、3つのCDR(CDR1、CDR2、CDR3)を有するであろう。いくつかの場合、抗TAA結合剤は、親和性成熟scFvである。いくつかの場合、抗TAAは、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、15 nM、または10 nM未満である、TAAについての解離定数(KD)を有する。
【００２２】
いくつかの実施態様では、抗TAA結合剤は、モノクローナル抗体などの天然抗体由来である。いくつかの場合、抗体は、ヒトである。いくつかの場合、抗体は、ヒトに投与したときに免疫原性が低くなるように改変されている。たとえば、改変は、キメラ化、ヒト化、CDR移植、脱免疫化、および最も近いヒト生殖系列配列に対応するようなフレームワークアミノ酸の突然変異からなる群から選択される1つ以上の技術を含む。
【００２３】
腫瘍抗原は、免疫応答、特に、T細胞媒介性免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。追加の抗原結合ドメインは、腫瘍抗原の抗体または天然のリガンドでありうる。追加の抗原結合ドメインの選択は、治療されるがんの特定の種類に依存するであろう。腫瘍抗原は、当技術分野において周知であり、たとえば、神経膠腫関連抗原、がん胎児性抗原(CEA)、EGFRvIII、IL-llRa、IL-13Ra、EGFR、FAP、B7H3、Kit、CA LX、CS-1、MUC1、BCMA、bcr-abl、HER2、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン(AFP)、ALK、CD19、CD123、サイクリンBl、レクチン反応性AFP、Fos関連抗原1、ADRB3、サイログロブリン、EphA2、RAGE-1、RUl、RU2、SSX2、AKAP-4、LCK、OY-TESl、PAX5、SART3、CLL-1、フコシルGM1、グロボH、MN-CA IX、EPCAM、EVT6-AML、TGS5、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ポリシアル酸、PLAC1、RUl、RU2(AS)、腸内カルボキシルエステラーゼ、ルイスY、sLe、LY6K、mut hsp70-2、M-CSF、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIBI、BORIS、プロスターゼ、前立腺特異抗原(PSA)、PAX3、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、LMP2、NCAM、p53、p53突然変異体、Ras突然変異体、gplOO、プロステイン、OR51E2、PANX3、PSMA、PSCA、Her2/neu、hTERT、HMWMAA、HAVCR1、VEGFR2、PDGFR-ベータ、サバイビンおよびテロメラーゼ、レグマイン、HPV E6,E7、精子タンパク質17、SSEA-4、チロシナーゼ、TARP、WT1、前立腺がん腫瘍抗原-1(PCTA-1)、ML-IAP、MAGE、MAGE-A1,MAD-CT-1、MAD-CT-2、MelanA/MART 1、XAGE1、ELF2M、ERG(TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、好中球エラスターゼ、肉腫転座ブレークポイント、NY-BR-1、ephnnB2、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD97、CD171、CD179a、アンドロゲン受容体、FAP、インスリン増殖因子(IGF)-I、IGFII、IGF-I受容体、GD2、o-アセチル-GD2、GD3、GM3、GPRC5D、GPR20、CXORF61、葉酸受容体(FRa)、葉酸受容体ベータ、ROR1、Flt3、TAG72、TN Ag、Tie 2、TEM1、TEM7R、CLDN6、TSHR、UPK2、およびメソテリンが挙げられる。好ましい実施態様では、腫瘍抗原は、葉酸受容体(FRa)、メソテリン、EGFRvIII、IL-13Ra、CD123、CD19、CD33、BCMA、GD2、CLL-1、CA-IX、MUCl、HER2、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００２４】
腫瘍抗原の非限定的例として、以下のものが挙げられる：チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2などの分化抗原およびMAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pi 5などの腫瘍特異的多系列抗原；CEAなどの過剰発現胚抗原；過剰発現がん遺伝子およびp53、Ras、HER-2/neuなどの突然変異腫瘍抑制遺伝子；BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RARなどの染色体転座から得られるユニークな腫瘍抗原；およびエプスタインバールウイルス抗原EBVAなどのウイルス抗原およびヒトパピローマウイルス抗原(HPV)E6およびE7。他の大きな、タンパク質系抗原として、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm- 23H1、PSA、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、ベータ-カテニン、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、アルファフェトプロテイン、ベータ-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3/CA 27.29/BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733/EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCASl、SDCCAG1 6、TA-90/Mac-2結合タンパク質/サイクロフィリンC関連タンパク質、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、GPC3、MUC16、LMP1、EBMA-1、BARF-1、CS1、CD319、HER1、B7H6、L1CAM、IL6、およびMETが挙げられる。
【００２５】
TLR9標的リガンド
いくつかの場合、TAAは、TLR9である。したがって、初代ヒトMDS造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)などのTLR9発現がんを標的にする組成物および方法が開示される。図4は、肺がんや乳がんなど、TLR9の発現が増加している他のがんを示す。図5は、さまざまな腫瘍組織におけるTLR9タンパク質の発現を示す。たとえば、皮膚、食道、結腸、直腸、肝臓、肺、および子宮のがんでは、TLR9タンパク質の発現が増加していることが示されている。
【００２６】
特に、TLR9発現悪性細胞に対する細胞毒性薬を標的とするTLR9標的リガンドを含有する分子が開示される。したがって、分子は、本明細書に開示されるTLR9標的リガンド(TTL)および溶解性ペプチドを含むことができる。たとえば、TTLおよび細胞毒性薬を二価リンカーによって連結することができる。いくつかの実施態様では、分子は、本明細書に開示された二価リンカーを介して、診断薬または治療薬などの任意のペイロードに結合したTTLを含む。ペイロードの非限定的例として、治療薬および診断薬が挙げられる。たとえば、治療薬として、細胞毒性化合物、細胞溶解性ペプチド、カチオン性毒性脂質部分、放射性アイソタイプ、または他の化学化合物が挙げられる。
【００２７】
TTLは、いくつかの実施形態では、非メチル化CpGオリゴデオキシヌクレオチド、またはTLR9に結合するその類似体もしくは誘導体などのCpGオリゴデオキシヌクレオチドでありうる。CpGオリゴデオキシヌクレオチド(またはCpG ODN)は、シトシン三リン酸デオキシヌクレオチドとそれに続くグアニン三リン酸デオキシヌクレオチドを含む短い一本鎖合成DNA分子である。「p」は、連続したヌクレオチド間のホスホジエステル結合を示すが、いくつかのODNは、代わりに修飾ホスホロチオエート(PS)骨格を有する。これらのCpGモチーフが非メチル化されている場合、それらは免疫刺激物質として作用する。CpGモチーフは、微生物ゲノム中に豊富に存在するが脊椎動物ゲノム中には稀であることから、病原体関連分子パターン(PAMP)であると考えられている。CpG PAMPは、ヒトおよび他の高等霊長類においてB細胞および形質細胞様樹状細胞(pDC)においてのみ構成的に発現される、パターン認識受容体(PRR)であるToll様受容体9(TLR9)によって認識される。しかしながら、この受容体の細胞外発現は、特定の病状においてのみ起こる。さらに、MDS前駆細胞、特にMDS幹細胞(HSC)は、細胞外でToll様受容体(TLR)-9を過剰発現させ、細胞送達のための生物活性ペイロードに連結された非メチル化CpGオリゴヌクレオチドを用いる標的化アプローチの開発を可能にする。
【００２８】
合成CpG ODNは、それらが典型的なホスホジエステル主鎖の代わりに部分的または完全ホスホロチオエート化(PS)主鎖および3’末端、5’末端、またはその両方にポリGテールを有するという点で微生物DNAと異なる。PS修飾は、体内のDNaseなどのヌクレアーゼによる分解からODNを保護し、そしてポリGテールは、細胞取り込みを増強する。ポリGテールは、分子間四分子(intermolecular tetrads)を形成し、それは、高分子量凝集体をもたらす。多数の配列が、CpG二量体の数および位置、ならびにCpG二量体に隣接する正確な塩基配列を変化させてTLR9を刺激することが示されている。これにより、それらの配列、二次構造、およびヒト末梢血単核球(PBMC)に対する効果に基づいて、5つの非公式のクラスまたはカテゴリーのCpG ODNが創出された。5つのクラスは、クラスA(タイプD)、クラスB(タイプK)、クラスC、クラスP、およびクラスSである。
【００２９】
いくつかの実施態様では、TTLは、抗体を含む。用語「抗体」は、標的抗原に選択的に結合する天然または合成抗体を示す。この用語は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を包含する。インタクトな免疫グロブリン分子に加えて、「抗体」という用語には、それらの免疫グロブリン分子のフラグメントまたはポリマー、および標的抗原に選択的に結合するヒトまたはヒト化バージョンの免疫グロブリン分子も含まれる。
【００３０】
本開示の組成物および方法に用いることができる抗原として、任意のクラスの全免疫グロブリン(すなわち、インタクトな抗体)、そのフラグメント、および少なくとも抗体の抗原結合可変ドメインを含む合成タンパク質が挙げられる。可変ドメインは、抗体間で配列が異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性において使用される。しかしながら、可変性は、通常、抗体の可変ドメインを通して均一に分布していない。それは、典型的には、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方における相補性決定領域(CDR)または超可変領域と呼ばれる3つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク(FR)と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、4つのFR領域を含み、主にβシート構造を採用し、3つのCDRによって連結され、それらは連結してループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。各鎖中のCDRは、FR領域によってごく接近して一緒に保持され、そして他の鎖からのCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。
【００３１】
生物活性を有する抗体のフラグメントも開示される。他の配列に結合しているかどうかにかかわらず、フラグメントの活性が非修飾抗体または抗体フラグメントと比較して有意に変化または損なわれないという条件で、フラグメントは、挿入、欠失、置換、または特定の領域または特定のアミノ酸残基の他の選択された修飾を含む。
【００３２】
技術を、本開示の抗原性タンパク質に特異的な一本鎖抗体の産生にも適合させることができる。一本鎖抗体の産生方法は当業者に周知である。一本鎖抗体は、短いペプチドリンカーを用いて重鎖および軽鎖の可変ドメインを融合し、それによって単一分子上に抗原結合部位を再構成することによって作製することができる。１つの可変ドメインのC末端が15〜25アミノ酸のペプチドまたはリンカーを介して他の可変ドメインのN末端につながれている一本鎖抗体可変フラグメント(scFv)が、抗原結合または結合特異性を著しく妨げることなく開発されている。リンカーは、重鎖および軽鎖がそれらの適切な立体配座配向で互いに結合するのを可能にするように選択される。
【００３３】
二価の一本鎖可変フラグメント(di-scFv)は、2つのscFvを連結することによって工作することができる。これは、2つのVH領域および２つのVL領域を有する単一ペプチド鎖を作製し、タンデムscFvを得ることによって行うことができる。ScFvはまた、2つの可変領域を一緒に折り畳むには短すぎるリンカーペプチド(約5アミノ酸)を用いて設計することができ、scFvを二量体化させることができる。このタイプは、ダイアボディとして知られる。ダイアボディは、対応するscFvの40分の1までの解離定数を有することが示されており、このことは、それらがそれらの標的に対してはるかに高い親和性を有することを意味する。さらに短いリンカー(1個または2個のアミノ酸)は、三量体(トリアボディまたはトリボディ)の形成をもたらす。テトラボディも生産されている。それらは、それらの標的に対してダイアボディよりもさらに高い親和性を示す。
【００３４】
二価リンカー
二価リンカーは、化合物、ポリペプチド、または核酸を、TTL(たとえば、CpG ODN)に連結するのに適した任意の分子でありうる。ポリヌクレオチドなどの生体分子を結合するための方法および組成物は、G.T. Hermanon、Bioconjugate Techniques(2nd ed.)、Academic Press(2008)(これらの技術の教示については、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に開示される。
【００３５】
いくつかの実施態様では、二価リンカーは、非ヌクレオチドリンカーである。本明細書中で使用される場合、用語「非ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含まないリンカーを示す。典型的には、非ヌクレオチドリンカーは、酸素またはイオウなどの原子、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH、などのユニット、または置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールなどの原子鎖を含み、ここで、1つ以上のメチレンは、O、S、SS、S(O)、SO2、N(R1)2、NR1、C(O)、C(O)O、C(O)NH、--OPO2O--、切断可能な連結基、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロ環によって中断または終了されうる；ここで、R1は、水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。
【００３６】
いくつかの実施態様では、二価リンカーは、少なくとも1つの切断可能な連結基を含み、すなわち、このリンカーは切断可能なリンカーである。本明細書で使用される場合、「切断可能なリンカー」は、さまざまな条件下で切断することが可能であるリンカーを示す。切断に適した条件として、pH、UV照射、酵素活性、温度、加水分解、脱離および置換反応、酸化還元反応、ならびに結合の熱力学的性質が挙げられうるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、切断可能なリンカーを用いて、所望の標的へ輸送した後に連結した成分を放出させることができる。共役またはカップリング相互作用の意図された性質、あるいは所望の生物学的効果が、リンカー基の選択を決定するであろう。たとえば、二価リンカーは、光切断可能なPCリンカーを含むことができる。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ダイサー(dicer)によって切断可能であり、オリゴヌクレオチドから個々のsiRNAが単離される。
【００３７】
リンカーのさらなる例として、ヘキサンジオール、スペーサー9、スペーサー18、1',2'-ジデオキシリボース(dSc)、およびI-リンカーが挙げられる。
【００３８】
いくつかの実施態様では、リンカーは、m-マレイミドベンジオール-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、スルホ-m-マレイミドベンジオール-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(スルホ-MBS)、またはスルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレート(SMCC)を含む。
【００３９】
いくつかの実施態様では、リンカーは、図2に示されるC6アミノ-SMCC-Cysリンカーである。
【００４０】
いくつかの実施態様では、リンカーは、図1に示されるように、クリックケミストリー反応を用いて生成される。クリックケミストリーアプローチは、もともとは、小さなサブユニットをモジュラー方式で結合することによって複雑な物質を迅速に生成する方法として着想された。「クリック反応」と呼ばれることが多いヒュスゲン1,3-双極子付加環化銅触媒反応などのさまざまな形態のクリックケミストリー反応が、当技術分野において知られている。他の代替法として、ディールス-アルダーなどの付加環化反応、求核置換反応(特に、エポキシおよびアジリジン化合物などの小さな歪みのある環への)、尿素化合物のカルボニル化学形成およびチオール-イン反応におけるアルキンなどの炭素-炭素二重結合を含む反応が挙げられる。
【００４１】
細胞毒性薬
開示された組成物の細胞毒性薬は、たとえば、細胞によって内在化された場合にがん細胞を殺すことができる任意の薬剤でありうる。たとえば、細胞毒性薬は、細胞毒性ペプチド(たとえば、細胞溶解性ペプチド)または放射性核種でありうる。適切な細胞毒は、当業者に知られており、アブリン、アルファトキシン、ジフテリア毒素、外毒素、ゲロニン、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、リシン、サポリンなどの植物性および細菌性毒素を包含する。
【００４２】
細胞溶解活性を有する多くの天然および合成ペプチドおよびタンパク質が知られている。細胞溶解性ペプチドは、孔形成ペプチドまたは細胞溶解素としても記載されている。孔形成ペプチドと膜の表面との相互作用は、正に荷電したペプチドと負に荷電した細胞膜表面との非特異的静電相互作用に基づくものでありうる。これらのペプチドは、一般に陽イオン性であるため、それらは主に負に荷電した粒子を有する表面と静電相互作用することができる。
細胞表面上の脂質と細胞溶解性ペプチドとの接触および相互作用の際に、そしてミトコンドリア膜の表面上の脂質と共に細胞内に貫通した後に、細胞膜の連続性の中断が起こり、続いて、小サイズの膜貫通孔が形成され、それによって、イオンを含む細胞質の内容物の細胞外への漏出が起こり、細胞内で急速かつ不可逆的な電解質の不均衡、細胞溶解および死をもたらされる。孔形成ペプチドと膜の表面との相互作用はまた、該表面に存在する特定の受容体との相互作用を含みうる。
【００４３】
孔を形成することができる、細菌、植物または哺乳動物由来の天然に存在する細胞溶解性ペプチドとして、セクロピンAおよびB、オーレイン1.2、シトロピン1.1、デフェンシン(HNP-2)、ラクトフェリシンB、タキプレシン、PR-39、大便連鎖球菌の細胞溶解素、デルタ溶血素、ジフテリア毒素、コレラ菌の細胞溶解素、ウメボシイソギンチャクからの毒素、グラニュリシン、ストレプトコッカス・インテルメディウスからの細胞溶解性ペプチド、レンチウイルス細胞溶解性ペプチド、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの白血球毒素、マガイニン、メリチン、リンホトキシン、エンケファリン、パラダキシン、パーフォリン(特にそのN末端フラグメント)、ウェルシュ菌からのパーフリンゴリシン0(PFO/シータ毒素)、およびストレプトリシンが挙げられる。
【００４４】
合成細胞溶解性孔形成ペプチドも知られている。それらは、天然の細胞内溶解性ペプチドフラグメントのハイブリッド、たとえば、セクロピンAフラグメントとマガイニン2フラグメントのハイブリッド、またはセクロピンAフラグメントとメリチンフラグメントのハイブリッドであることが多い。その他の周知の細胞溶解性合成ペプチドは、たとえば、Regenら、Biochem. Biophys. Res. Commun.(199) 159：566-571に記載されており、この文献は、これらのペプチドについて参照することにより本願に組み込まれる。
【００４５】
いくつかの実施態様では、細胞溶解性ペプチドは、アミノ酸配列 KAFKKAFKAFKKAFKAFK(配列番号：1)を含む。いくつかの実施態様では、細胞溶解性ペプチド機能は、交互に正および負に架電したアミノ酸に起因する。したがって、いくつかの実施態様では、細胞溶解性ペプチドは、アミノ酸配列 PHHPPHHPHHPPHHPHHP(配列番号：2)を含み、ここで、Pは、正に荷電したアミノ酸であり、Hは、疎水性アミノ酸である。いくつかの実施態様では、細胞溶解性ペプチドは、配列番号：2のアミノ酸配列に対して少なくとも65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または少なくとも12、13、14、15、16、または17個のアミノ酸長を有するそのフラグメントを含む。
【００４６】
いくつかの実施態様では、細胞溶解性ペプチドは、KIKMVISWKG(配列番号：18；HYD1)；AIAMVISWAG(配列番号：19；HYD8)；AIKMVISWAG(配列番号：20；HYD6)；AIKMVISWKG(配列番号：21；HYD2)；AKMVISW(配列番号：22)；AKMVlSWKG(配列番号：23)；IAMVISW(配列番号：24)；IAMVISWKG(配列番号：25)；IKAVISW(配列番号：26)；IKAVISWKG(配列番号：27)；IKMAISW(配列番号：28)；IKMAISWKG(配列番号：29)；IKMVASW(配列番号：30)；IKMVASWKG(配列番号：31)；IKMVIAW(配列番号：32)；IKMVIAWKG(配列番号：33)；IKMVISA(配列番号：34)；IKMVISAKG(配列番号：35)；IKMVISW(配列番号：36)；IKMVISWAG(配列番号：37)；KMVISWKA(配列番号：38)；IKMVISWKG(配列番号：39；HYDl 8；(-K)HYDl)；ISWKG(配列番号：40)；KAKMVISWKG(配列番号：41)；KIAMVISWAG(配列番号：42；HYD7)；KIAMVISWKG(配列番号：43)；KIKAVISWKG(配列番号：44)；KIKMAISWKG(配列番号：45)；KIKMV(配列番号：46)；KIKMVASWKG(配列番号：47)；KIKMVI(配列番号：48；HYDl 6)；KIKMVIA WKG(配列番号：49)；KIKMVIS(配列番号：50；HYDl 5)；KIKMVISAKG(配列番号：51)；KIKMVISW(配列番号：52；HYD14)；KIKMVISWAG(配列番号：53)；KIKMVISWK(配列番号：54；HYD17；HYDl(-G))；KIKMVISWKA(配列番号：55)；KMVISWKG(配列番号：56；HYD9)；LSWKG(配列番号：57；HYD12)；MVISWKG(配列番号：58；HYDlO)；SWKG(配列番号：59；HYD13)；VISWKG(配列番号：60；HYDI l)；WIKSMKIVKG(配列番号：61)；KMVIXW(配列番号：62)；IKMVISWXX(配列番号：63)；and KMVISWXX(配列番号：64)；ここで、Xは、アミノ酸(既存または非既存(traditional or non-traditional)アミノ酸)である；からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。もう1つの実施態様では、ペプチドは、同定されたアミノ酸配列からなる。もう1つの実施態様では、ペプチドは、本質的に、同定されたアミノ酸配列からなる。細胞溶解性ペプチドは、少なくとも1つのD-アミノ酸を含みうる。いくつかの場合、ペプチドの各アミノ酸は、D-アミノ酸である。
【００４７】
いくつかの実施態様では、細胞毒性薬は、ピロロベンゾジアゼピン(PBD)である。ピロロベンゾジアゼピン(PBD)は、当技術分野で知られており、そのいくつかは、DNAの特定の配列を認識し、それに結合する能力を有する。PBDは、以下の一般構造を有する：
【化１】
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それらは、置換基の数、種類および位置において、それらの芳香族A環およびピロロC環の両方において、ならびにC環の飽和度において相違する。B環には、DNAのアルキル化の原因となる求電子中心であるN10-C11位にイミン(N＝C)、カルビノールアミン(NH-CH(OH))、またはカルビノールアミンメチルエーテル(NH-CH(OMe))のいずれかが存在する。すべての既知の天然産物は、キラルC11a位に(S)-立体配置を有し、それは、C環からA環に向かって見たときにそれらに右回りのねじれを付与する。これは、B型DNAの小溝に対してイソらせん性(isohelicity)となるための適当な三次元形状を該天然物に付与して、結合部位におけるぴったりした嵌合をもたらす(Kohn、InAntibiotics III. Springer-Verlag、New York、pp. 3-11(1975)；HurleyおよびNeedham-VanDevanter、Acc. Chem. Res.、19、230-237(1986))。それらが、該小溝内で付加体を形成しうる能力は、それらがDNAのプロセシングを妨げることを可能にする。
【００４８】
いくつかの実施態様では、細胞毒性薬は、抗アポトーシス遺伝子標的(たとえば、Bcl-2、Bcl-xL、およびMcl-1)を阻害するもの、またはアポトーシス遺伝子標的(たとえば、Bax、Bak、およびBcl-xS)を促進するものなどの機能的核酸である。
【００４９】
機能的核酸分子は、以下のカテゴリーに分類されうるが、これは、分子の限定を意味するものではない。たとえば、機能的核酸として、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、RNAi、および外部ガイド配列が挙げられる。機能性核酸分子は、標的分子が有する特定の活性のアフェクター、インヒビター、モジュレーター、および刺激因子として作用することができ、または機能性核酸分子は他の分子とは無関係にデノボ活性を有することができる。
【００５０】
機能的核酸分子は、DNA、RNA、ポリペプチド、または炭水化物鎖などの任意の巨大分子と相互作用することができる。多くの場合、機能性核酸は、標的分子と機能性核酸分子との間の配列相同性に基づいて他の核酸と相互作用するように設計されている。他の状況では、機能的核酸分子と標的分子との間の特異的認識は、機能的核酸分子と標的分子との間の配列相同性に基づくのではなく、むしろ特異的認識が起こるのを可能にする三次構造の形成に基づく。
【００５１】
アンチセンス分子は、標準的または非標準的塩基対合のいずれかを介して標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、たとえば、RNaseH媒介RNA-DNAハイブリッド分解を介して標的分子の破壊を促進するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は、転写または複製などの、標的分子上で通常起こるプロセシング機能を妨害するように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最も接近可能な領域を見出すことによってアンチセンス効率を最適化するための多くの方法が存在する。例示的な方法は、インビトロ選択実験およびDMSおよびDEPCを用いたDNA修飾研究であろう。アンチセンス分子が、10-6、10-8、10-10、または10-12以下の解離定数(Kd)で標的分子に結合することが好ましい。アンチセンス分子の設計および使用に役立つ方法および技術の代表的実例は、米国特許番号5,135,917、5,294,533、5,627,158、5,641,754、5,691,317、5,780,607、5,786,138、5,849,903、5,856,103、5,919,772、5,955,590、5,990,088、5,994,320、5,998,602、6,005,095、6,007,995、6,013,522、6,017,898、6,018,042、6,025,198、6,033,910、6,040,296、6,046,004、6,046,319、および6,057,437に見出すことができる。
【００５２】
アプタマーは、好ましくは特定の方法で、標的分子と相互作用する分子である。典型的には、アプタマーは、ステムループまたはGカルテットなどの規定の二次構造および三次構造に折り畳まれる長さ15-50塩基の範囲の小さい核酸である。アプタマーは、ATP(米国特許番号5,631,146)およびテオフィリン(米国特許番号5,580,737)などの小分子、ならびに逆転写酵素(米国特許番号5,786,462)およびトロンビン(米国特許5,543,293)などの大分子に結合することができる。アプタマーは、10-12 M未満のKdで標的分子と非常に強く結合することができる。アプタマーが、10-6、10-8、10-10、または10-12未満のKdで標的分子に結合することが好ましい。アプタマーは、非常に高度の特異性で標的分子に結合することができる。たとえば、標的分子と分子上の単一の位置のみが異なる他の分子との間の結合親和性において10,000倍を超える差異を有するアプタマーが単離されている(米国特許第5,543,293号)。アプタマーは、バックグラウンド結合分子とのKdの、少なくとも10、100、1000、10,000、または100,000分の1の標的分子とのKdを有することが好ましい。ポリペプチドについて比較を行う場合、たとえば、バックグラウンド分子が異なるポリペプチドであることが好ましい。さまざまな異なる標的分子に結合するアプタマーの作製および使用方法の代表例は、米国特許番号5,476,766、5,503,978、5,631,146、5,731,424 、5,780,228、5,792,613、5,795,721、5,846,713、5,858,660 、5,861,254、5,864,026、5,869,641、5,958,691、6,001,988、6,011,020、6,013,443、6,020,130、6,028,186、6,030,776、および6,051,698に見出すことができる。
【００５３】
リボザイムは、分子内または分子間のいずれかで化学反応を触媒することができる核酸分子である。したがって、リボザイムは触媒核酸である。リボザイムが、分子間反応を触媒するのが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイム(米国特許番号5,334,711、5,436,330、5,616,466、5,633,133、5,646,020、5,652,094、5,712,384、5,770,715、5,856,463、5,861,288、5,891,683、5,891,684、5,985,621、5,989,908、5,998,193、5,998,203；LudwigおよびSproatによる国際特許出願番号WO 9858058、LudwigおよびSproatによるWO 9858057、ならびにLudwigおよびSproatによるWO 9718312)、ヘアピンリボザイム(たとえば、米国特許番号5,631,115、5,646,031、5,683,902、5,712,384、5,856,188、5,866,701、5,869,339、および6,022,962)、およびテトラヒメナリボザイム(たとえば、米国特許番号5,595,873および5,652,107)などの、天然の系に見られるリボザイムに基づく、ヌクレアーゼまたは核酸ポリメラーゼ型反応を触媒する多数の異なる種類のリボザイムがある。天然の系には見られないが、特定の反応を新たに触媒するように設計された多数のリボザイムもある(たとえば、米国特許番号5,580,967、5,688,670、5,807,718、and 5,910,408)。好ましいリボザイムは、RNAまたはDNA基質を切断し、そしてより好ましくは、RNA基質を切断する。リボザイムは、典型的には、標的基質の認識および結合とそれに続く切断によって核酸基質を切断する。この認識は、多くの場合、標準的または非標準的な塩基対相互作用に基づいている。標的基質の認識は、標的基質配列に基づいているので、この性質が、リボザイムを核酸の標的特異的切断のための特に良好な候補にする。さまざまな異なる反応を触媒するためにリボザイムの作製および使用方法の代表例は、米国特許番号5,646,042、5,693,535、5,731,295、5,811,300、5,837,855、5,869,253、5,877,021、5,877,022、5,972,699、5,972,704、5,989,906、および6,017,756に見出すことができる。
【００５４】
三重鎖形成機能性核酸分子は、二本鎖または一本鎖核酸と相互作用し得る分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用すると、三重鎖と呼ばれる構造が形成され、そこには、ワトソン-クリック塩基配列とフーグスティーン塩基対の両方に依存して複合体を形成する3本のDNA鎖が存在する。三重鎖分子は、高い親和性および特異性で標的領域に結合することができるので好ましい。三重鎖形成分子が、10-6、10-8、10-10、または10-12未満のKdで標的分子と結合するのが好ましい。さまざまな異なる標的分子を結合するための三重鎖形成分子の作製および使用方法の代表例は、米国特許番号5,176,996、5,645,985、5,650,316、5,683,874、5,693,773、5,834,185、5,869,246、5,874,566、および5,962,426に見出すことができる。
【００５５】
外部ガイド配列(EGS)は、複合体を形成する標的核酸分子と結合する分子であり、そしてこの複合体は、標的分子を切断するRNase Pによって認識される。EGSは、最適なRNA分子を特異的に標的とするように設計することができる。RNase Pは、細胞内のトランスファーRNA(tRNA)のプロセシングを助ける。標的RNA：EGS複合体に天然のtRNA基質を模倣させるEGSを使用することにより、細菌性RNase Pを動員して、事実上あらゆるRNA配列を切断することができる(YaleによるWO92/03566、およびForsterおよびAltman、Science 238：407-409(1990))。
【００５６】
同様に、真核生物のEGS/RNase PによるRNAの切断は、真核細胞内の所望の標的を切断するために利用されうる(Yuanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：8006-8010(1992)；YaleによるWO 93/22434；YaleによるWO 95/24489；YuanおよびAltman、EMBO J 14：159-168(1995)、ならびにCarraraら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92：2627-2631(1995))。さまざまな異なる標的分子の切断を容易にするためのEGS分子の作製および使用方法の代表例は、米国特許番号5,168,053、5,624,824、5,683,873、5,728,521、5,869,248、および5,877,162に見出すことができる。
【００５７】
遺伝子発現はまた、RNA干渉(RNAi)を介して非常に特異的な方法で効果的に抑制されうる。このサイレンシングはもともと二本鎖RNAの添加によって観察された(dsRNA)(Fire、A.ら、(1998) Nature、391：806-11；Napoli、C.ら、(1990) Plant Cell 2：279-89；Hannon、G.J. (2002) Nature、418：244-51)。dsRNAが細胞に入ると、RNase III様酵素、ダイサーによって切断され、3’末端に2ヌクレオチドオーバーハングを含む長さ21-23の二本鎖低分子干渉RNA(siRNA)になる(Elbashir、S.M.ら、(2001) Genes Dev.、15：188-200；Bernstein、E.ら、(2001) Nature、409：363-6；Hammond、S.M.ら、(2000) Nature、404：293-6)。ATP依存性工程において、siRNAは、siRNAを標的RNA配列に導く、マルチサブユニットタンパク質複合体(一般にRNAi誘導サイレンシング複合体(RISC)として知られる)に組み込まれるようになる(Nykanen、A.ら、(2001) Cell、107：309-21)。ある時点において、siRNA二重鎖はほぐれ、そしてアンチセンス鎖はRISCに結合したままであり、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼの組み合わせによる相補的mRNA配列の分解を指示するように思われる(Martinez、J.ら、(2002) Cell、110：563-74)。しかしながら、iRNAもしくはsiRNAの効果またはそれらの使用は、いかなる種類のメカニズムにも限定されない。
【００５８】
低分子干渉RNA(siRNA)は、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導することができ、それによって遺伝子発現を減少させるか、または阻害さえすることができる二本鎖RNAである。一例では、siRNAは、siRNAと標的RNAの両方の間の配列同一性の領域内で、mRNAなどの相同RNA分子の特異的分解を引き起こす。たとえば、WO02/44321は、3’突出末端と塩基対合したときに標的mRNAの配列特異的分解が可能なsiRNAを開示しており、これらのsiRNAを作製する方法について参照により本明細書に組み込まれる。配列特異的遺伝子サイレンシングは、酵素ダイサーによって産生されたsiRNAを模倣する合成の短い二本鎖RNAを用いて哺乳動物細胞において達成することができる(Elbashir、S.M.ら、(2001) Nature、411：494 498)(Ui-Tei、K.ら、(2000) FEBS Lett 479：79-82)。siRNAは、化学的またはインビトロで合成することができるか、あるいは細胞内でsiRNAにプロセシングされる短い二本鎖ヘアピン様RNA(shRNA)の結果でありうる。合成siRNAは、一般に、アルゴリズムおよび従来のDNA/RNA合成装置を使用して設計される。供給業者として、Ambion(オースチン、テキサス)、ChemGenes(アッシュランド、マサチューセッツ)、Dharmacon(ラファイエット、コロラド)、Glen Research(スターリング、ヴァージニア)、MWB Biotech(エバースベルク、ドイツ)、Proligo(ボールダー、コロラド)、およびQiagen(ヴェント、オランダ)が挙げられる。siRNAは、AmbionのSILENCER(登録商標)siRNA構築キットなどのキットを使用してインビトロで合成することもできる。抗アポトーシスBcl-2メンバータンパク質、たとえば、Bcl-2、Bcl-xL、およびMcl-1の配列に基づいて、上記のように設計された任意のsiRNAが本明細書に開示される。
【００５９】
ベクターからのsiRNAの生産は、より一般的には、短いヘアピンRNA(shRNA)の転写を通して行われる。たとえば、ImgenexのGENESUPPRESSOR(商標)構築キットおよびInvitrogenのBLOCK-IT(商標)誘導性RNAiプラスミドおよびレンチウイルスベクターなどの、shRNAを含むベクターの産生のためのキットが利用可能である。本明細書に開示される炎症性メディエーターの配列に基づいて上記のように設計された任意のshRNAが本明細書に開示される。
【００６０】
いくつかの実施態様では、開示された分子は、各標的薬に結合した複数の細胞毒性薬を含む。たとえば、分子は、標的薬物に直接または間接的に結合した1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の細胞毒性薬物を含み得る。
【００６１】
医薬組成物
本明細書に開示される分子を薬学的に許容される担体中に含む医薬組成物も開示される。医薬担体は当業者に知られている。これらは最も典型的なものは、滅菌水、生理食塩水、および生理的pHの緩衝液などの溶液を含む、ヒトへの薬物投与のための標準的な担体であろう。たとえば、適切な担体およびそれらの製剤はRemington： The Science and Practice of Pharmacy(21 ed.) ed. PP. Gerbino、Lippincott Williams & Wilkins、Philadelphia、PA. 2005に記載されている。典型的には、適切な量の薬学的に許容される塩を製剤中に使用して製剤を等張にする。薬学的に許容される担体の例として、食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のpHは、好ましくは約5〜約8、さらに好ましくは約7〜約7.5である。溶液はRNaseフリーでなければならない。さらなる担体として、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性製剤が挙げられ、これらのマトリックスは、造形品、たとえば、フィルム、リポソームまたは微粒子の形態である。たとえば、投与経路および投与される組成物の濃度に応じて、特定の担体がより好ましいことが当業者には明らかであろう。
【００６２】
医薬組成物は、適切な分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤などを含みうる。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などの1つ以上の活性成分を含みうる。
【００６３】
非経口投与用の製剤として、無菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳濁液が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体は、食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む。非経口ビヒクルとして、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとして、液体および栄養補給剤、電解質補給剤(リンゲルデキストロースに基づくものなど)などが挙げられる。たとえば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの防腐剤および他の添加剤も存在しうる。
【００６４】
組成物のいくつかは、潜在的に、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸などの有機酸との反応によって形成されるか、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、ならびにモノ、ジ、トリアルキルおよびアリールアミンならびに置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される薬学的に許容される酸または塩基付加塩として投与されうる。
【００６５】
治療方法
治療的有効量の、開示された医薬組成物を対象に投与することによって、対象における骨髄異形成症候群(MDS)などのTLR9発現がんの治療方法も開示される。この方法は、レナリドマイド、またはその類似体もしくは誘導体を対象に投与することをさらに含みうる。図4は、TLR9発現が増加している他のがん、たとえば、肺および乳がんを同定する。図5は、さまざまな腫瘍組織におけるTLR9タンパク質の発現を示す。たとえば、皮膚、食道、結腸、直腸、肝臓、肺、および子宮のがんは、TLR9タンパク質の発現が増加していることが示されている。
【００６６】
がんの代表的であるが、非限定的なリストは、リンパ腫、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱がん、脳がん、神経系がん、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん、腎臓がん、小細胞肺がんや非小細胞肺がんなどの肺がん、神経芽細胞腫/神経膠芽腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、肝臓がん、黒色腫、口腔、咽頭、喉頭、および肺の扁平上皮がん、結腸がん、子宮頸がん(cervical cancer)、子宮頸がん(cervical carcinoma)、乳がん、上皮がん、腎がん、尿生殖器がん、肺がん、食道がん、頭頸部がん、大腸がん、造血器がん；精巣がん；結腸および直腸がん、前立腺がん、および膵臓がんを包含する。
【００６７】
いくつかの場合、この方法はさらに、治療前に対象からの生検サンプルをTLR9発現についてアッセイすることを含む。これは、免疫検出法などの日常的な方法を用いて行うことができる。免疫アッセイの多くの種類および形式が知られており、すべてが、開示されたバイオマーカーを検出するのに適している。イムノアッセイの例は、酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、放射性免疫沈降法(RIPA)、免疫ビーズ捕捉アッセイ、ウエスタンブロッティング、ドットブロッティング、ゲルシフトアッセイ、フローサイトメトリー、タンパク質アレイ、多重ビーズアレイ、磁気捕捉、インビボイメージング、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、および光退色後の蛍光回復/局在化(FRAP/FLAP)である。
【００６８】
医薬組成物などの開示された組成物は、局所治療が望ましいか、全身治療が望ましいか、ならびに治療される領域に応じて、多くの方法で投与することができる。たとえば、開示された組成物は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮的に投与することができる。組成物は、経口、非経口(たとえば、静脈内)、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮、体外、眼科的、膣内、直腸内、鼻腔内、局所などに投与することができ、局所鼻腔内投与または吸入による投与が含まれる。
【００６９】
使用される場合、組成物の非経口投与は、一般に、注射によって特徴付けられる。注射剤は、液体溶液もしくは懸濁液、注射前に液体に懸濁した溶液に適した固体形態、またはエマルジョンとしてのいずれかの従来の形態で調製することができる。非経口投与のための修正されたアプローチは、一定の投与量が維持されるような徐放または持続放出システムの使用を含む。
【００７０】
本明細書に開示される組成物は、患者またはがんのTLR9を発現するがんなどの開示される腫瘍抗原を発現するがんの危険性がある対象に予防的に投与することができる。したがって、本方法は、本明細書に開示される組成物の投与の前に、TLR9を発現するがんなどのがんの危険性がある対象を同定することをさらに含み得る。
【００７１】
必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重および全身状態、治療されるアレルギー性疾患の重症度、使用される特定の核酸またはベクター、その投与方法に応じて、対象ごとに変化する。したがって、すべての組成物について正確な量を特定することは可能ではない。しかしながら、適切な量は、本明細書の教示を与えられた日常的な実験のみを用いて、当業者によって決定されうる。たとえば、組成物を投与するための有効投与量およびスケジュールは経験的に決定することができ、そしてそのような決定をすることは当業者の範囲内である。組成物の投与のための投与量範囲は、症状の障害が影響を受ける所望の効果を生み出すのに十分に大きいものである。投与量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用を引き起こすほど大きくすべきではない。一般に、投与量は、患者の年齢、状態、性別および疾患の程度、投与経路、あるいは他の薬物が投与計画に含まれるかどうか、に応じて変化し、当業者によって決定されうる。禁忌の場合には、投与量を、個々の医師が調節することができる。投与量はさまざまであることができ、そして1日または数日間、1日１回以上の用量投与で投与されうる。与えられたクラスの医薬品の適切な投与量についての手引きは文献に見出すことができる。単独で使用される開示の組成物の典型的な1日投与量は、上記の要因に応じて、1日当たり約1 μg/体重kg〜100mg/体重kgまたはそれ以上の範囲でありうる。
【００７２】
いくつかの実施態様では、分子は、約0.1ng〜約100g/体重kg、約10ng〜約50g/体重kg、約100ng〜約1g/体重kg、約1μg〜約100mg/体重kg、約1μg〜約50mg/体重kg、約1mg〜約500mg/体重kg；および約1mg〜約50mg/体重kgの非経口投与と同等の投与量で投与される。あるいは、治療有効量を達成するために投与される分子の量は、約0.1ng、1ng、10ng、100ng、1 μg、10 μg、100 μg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、500mg/体重kgまたはそれ以上である。
【００７３】
定義
用語「担体」は、化合物または組成物と組み合わせた場合に、その意図した用途または目的のために、化合物または組成物の調製、貯蔵、投与、送達、有効性、選択性、または他の任意の特徴を補助または促進する化合物、組成物、物質または構造を意味する。たとえば、担体は、活性成分の分解を最小限に抑え、対象における有害な副作用を最小限に抑えるように選択することができる。
【００７４】
用語「CpGモチーフ」は、リン酸結合によって連結された非メチル化シトシン-グアニンジヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を示す。
【００７５】
用語「CpGオリゴデオキシヌクレオチド」または「CpG ODN」は、少なくとも１つのCpGモチーフを含み、TLR9に結合するオリゴデオキシヌクレオチドを示す。
【００７６】
「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」は、少なくとも2つの異なるポリペプチド由来のポリペプチド部分を含むハイブリッドポリペプチドを示す。これらの部分は、同じ生物のタンパク質に由来してもよく、その場合、融合タンパク質は、「種内」、「遺伝子内」などであると呼ばれる。さまざまな実施態様では、融合ポリペプチドは、第一のポリペプチドに連結された1つ以上のアミノ酸配列を含みうる。2つ以上のアミノ酸配列が第一のポリペプチドに融合される場合、融合配列は、同じ配列の複数のコピーであり得るか、あるいは、異なるアミノ酸配列でありうる。第一のポリペプチドは、第二のポリペプチドのN末端、C末端、またはN末端およびC末端に融合されうる。さらに、第一のポリペプチドを第二のポリペプチドの配列内に挿入することができる。
【００７７】
「遺伝子構築物」は、ポリペプチドの「コード配列」を含むか、そうでなければ生物学的に活性なRNAに転写可能である、ベクター、プラスミド、ウイルスゲノムなどの核酸(たとえば、アンチセンス、デコイ、リボザイムなど)を示し、細胞に、特定の実施形態では、哺乳動物細胞に、トランスフェクトされることが可能であり、構築物でトランスフェクトされた細胞においてコード配列の発現を引き起こしうる。遺伝子構築物は、コード配列、ならびにイントロン配列、ポリアデニル化部位、複製起点、マーカー遺伝子などに機能的に連結された1つ以上の調節要素を含みうる。
【００７８】
用語「単離ポリペプチド」は、組換えDNAもしくはRNAから調製されうるか、または合成起源のものであるか、それらの何らかの組み合わせであり得るか、または天然ポリペプチドでありえ、それは、(1)自然界で通常関連するタンパク質と関連しないか、(2)それが通常存在する細胞から単離されるか、(3)同じ細胞供給源からの他のタンパク質を本質的に含まないか、(4)異なる種に由来する細胞によって発現されるか、または(5)天然には生じない。
【００７９】
用語「単離された核酸」は、ゲノム、cDNA、合成、または天然起源のポリヌクレオチド、あるいはそれらの組み合わせを示し、それは、(1)「単離された核酸」が天然に見出される細胞と会合しないか、または(2)天然では連結されないポリヌクレオチドに作動可能に連結される。
【００８０】
用語「リンカー」は、当技術分野において認識されており、2つのポリペプチドなどの2つの化合物を連結する分子または分子の群を示す。リンカーは、単一の連結分子から構成されていてもよく、または連結分子と化合物とを特定の距離だけ分離することを目的とした連結分子およびスペーサー分子を含んでいてもよい。
【００８１】
用語「核酸」は、ポリマー形態のヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態を示す。その用語はまた、同等物として、ヌクレオチド類似体から作製されたRNAまたはDNAのいずれかの類似体、ならびに記載される実施態様に対して適用可能なように、一本鎖(センスまたはアンチセンスなど)および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解される。
【００８２】
用語「薬学的に許容される」は、妥当な医学的判断の範囲内で、合理的な利益/リスク比と釣り合って、過度の毒性、刺激性、アレルギー反応、または他の問題や合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適している化合物、材料、組成物および／または剤形を示す。
【００８３】
用語「タンパク質」(一本鎖である場合)、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書では、たとえば、コード配列によってコードされる場合があるように、遺伝子産物を示す場合に交換可能に用いられる。本明細書で「ポリペプチド」を称する場合、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、当業者はタンパク質を代わりに使用することができることを認識するであろう。「タンパク質」はまた、1つ以上のポリペプチドの会合を示してもよい。「遺伝子産物」は、遺伝子の転写の結果として産生される分子を意味する。遺伝子産物は、遺伝子から転写されたRNA分子、ならびにそのような転写物から翻訳されたタンパク質を含む。
【００８４】
特定のポリペプチドに関して使用される場合、「ポリペプチドフラグメント」または「フラグメント」という用語は、参照ポリペプチド自体と比較してアミノ酸残基が欠失しているが、残りのアミノ酸配列が通常、参照ポリペプチドのそれと同一であるポリペプチドを示す。このような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端、あるいはその両方で起こりうる。フラグメントは、典型的に、少なくとも約5、6、8または10アミノ酸長、少なくとも約14アミノ酸長、少なくとも約20、30、40または50アミノ酸長、少なくとも約75アミノ酸長、あるいは少なくとも約100、150、200、300、500またはそれ以上のアミノ酸長である。フラグメントは、参照ポリペプチドの1つ以上の生物学的活性を保持することができる。さまざまな実施態様において、フラグメントは、参照ポリペプチドの酵素活性および／または相互作用部位を含むことができる。もう1つの実施態様では、フラグメントは、免疫原性を有することができる。
【００８５】
本明細書で使用される「特異的に送達する」という用語は、特定の標的分子またはマーカーを有する細胞または組織との分子の優先的会合を示し、その標的分子を欠く細胞または組織へのものではない。もちろん、分子と非標的細胞または組織との間に、ある程度の非特異的相互作用が起こりうることは認識されている。それにもかかわらず、特異的送達は、標的分子の特異的認識を介して媒介されるものとして区別されうる。典型的には、特異的送達は、送達分子と標的分子を欠く細胞との間よりも送達分子と標的分子を有する細胞との間のはるかに強い会合をもたらす。
【００８６】
用語「対象」は、投与または治療の標的である任意の個体を示す。対象は、脊椎動物、たとえば、哺乳動物でありうる。したがって、対象は、ヒトまたは動物の患者でありうる。用語「患者」は、臨床医、たとえば、内科医の治療を受けている対象を示す。
【００８７】
「治療上有効な」という用語は、使用される組成物の量が、疾患または障害の1つ以上の原因または症状を改善するのに十分な量のものであることを示す。そのような改善は、減少または変更を必要とするだけであり、必ずしも排除する必要はない。
【００８８】
用語「治療」は、疾患、病的状態、または障害を治癒、改善、安定化、または予防することを意図する患者の医学的管理を示す。この用語は、積極的な治療、すなわち、疾患、病的状態、または障害の改善を特に目的とした治療を含み、そして、原因治療、すなわち、関連する疾患、病的状態、または障害の原因の除去を目的とする治療も含む。さらに、この用語には、緩和治療、すなわち、疾患、病的状態、または障害の治癒よりもむしろ症状の軽減のために設計された治療；予防的治療、すなわち、関連する疾患、病的状態、または障害の発症を最小限に抑えるか、または部分的もしくは完全に阻害することを目的とする治療；および支持療法、すなわち、関連する疾患、病的状態、または障害の改善を目的とする別の特定の療法を補うために採用される治療；が含まれる。
【００８９】
本発明の多くの実施態様が記載されている。それにもかかわらず、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、さまざまな修正を加えることができることが理解されよう。したがって、他の実施態様は、添付の特許請求の範囲内に存在する。
【００９０】
本発明の多くの実施態様が記載されている。それにもかかわらず、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、さまざまな修正を加えることができることが理解されよう。したがって、他の実施態様は、添付の特許請求の範囲内に存在する。
【実施例１】
【００９１】
幹細胞の表面における受容体TLR9の高い表面発現を利用する目的で、TLR9によって認識される、CpG、同種損傷関連分子パターン(DAMP)を、内在化した場合にのみ溶解することができる両親媒性細胞溶解性ペプチドの内在化の標的として使用した。これにより、がんの悪性TLR9+造血幹細胞を的確に殺すことができる。
【００９２】
チオエート結合で修飾されたCpG配列 T*C*C*A*T*G*A*C*G*T*T*C*C*T*G*A*T*G*C*T*(配列番号：14)(*=ホスホロチオエート結合)を用いた。最初の試みは、図1に示すように、クリックイット(Click-It)反応を使用して、CpGと細胞溶解性ペプチドを結合させることであった。しかしながら、このように調製されたCpG溶解物を用いて行われた最初の反応が既にTLR9+幹細胞を減少させることにおける有効性を示していたとしても、この反応はより不安定であるかもしれない。第2の戦略は、図2に示されるように、C6アミノ-SMCC-Cysリンカーの使用を含む。CpG部分の安定性を高めるために、CpG配列は完全にホスホチオエート化される。
【００９３】
図2はまた、新しい細胞溶解性ペプチドおよびコントロールとして使用されたスクランブル配列の配列も示す。注目すべき重要なことは、残基が両親媒性であるため、配列それ自体が重要であるが、その主な機能は、ペプチドのらせん構造に依存する。したがって、コントロールとして同じペプチド配列が使用されたが、スクランブル配列が見出されるまで3D構造プレディクターを介してループされ、らせん構造が破壊された(図3)。
【００９４】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、開示された発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に引用された刊行物およびそれらに引用されている資料は、参照により具体的に組み込まれる。
【００９５】
当業者であれば、本明細書に記載の本発明の特定の実施態様に対する多くの等価物を認識するか、または単なる日常的な実験を用いて確かめることができるであろう。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１】
2019524787.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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