(57)【要約】  本発明では、ＥＭＴ及び／又は血管擬態の阻害、並びに血管形成関連疾患の治療及び／又は予防に対するＤｓｇ２由来ペプチドが提供される。また、本発明のペプチドを含む医薬組成物、並びにＥＭＴ及び／又は血管擬態の阻害、並びに血管形成関連疾患の治療及び／又は予防において本発明のペプチドを使用する方法が提供される。【選択図】図１
2019517583.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
ＭＸ１ＥＸ２ＷＸ３ＩＸ４Ｒ（配列番号１）
（式中、
Ｘ１はＡ、Ｔ又はＳであり、
Ｘ２はＫ、Ｒ又はＨであり、
Ｘ３はＫ、Ｒ、Ｎ、Ｈ又はＱであり、
Ｘ４はＡ、Ｖ、Ｉ、Ｇ、Ｌ又はＰである）のアミノ酸配列を含む合成ペプチド又はその変異体ペプチド又はその修飾ペプチド。
【請求項２】
Ｘ１がＡ又はＴであり、Ｘ２がＫ又はＲであり、Ｘ３がＫ、Ｒ又はＮであり、Ｘ４がＡ、Ｖ又はＩである、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項３】
【表１】
2019517583.tif 000007
上記の表からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項４】
前記変異体ペプチドが、配列番号１の配列と、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項５】
前記変異体ペプチドが、アミノ酸の挿入、欠失又は置換を有する、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項６】
前記変異体ペプチドが、保存的アミノ酸置換を有する、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項７】
前記変異体ペプチドが、以下の表：
【表２】
2019517583.tif 000008
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項８】
前記変異体ペプチドが、
ＳＥＱ１２  ＭＡＥＫＷＫＩＡＲＱＥＳＴＳ（配列番号４５）、
ＳＥＱ１３  ＭＡＥＫＷＫＩＡＲＱＥＳＴ（配列番号４６）、
ＳＥＱ１４  ＭＡＥＫＷＫＩＡＲＱＥＳ（配列番号４７）、
ＳＥＱ１５  ＭＡＥＫＷＫＩＡＲＱＥ（配列番号４８）、
ＳＥＱ１６  ＭＡＥＫＷＫＩＡＲＱ（配列番号４９）、
ＳＥＱ１８  ＭＡＥＫＷＫＩＡ（配列番号５０）、
ＳＥＱ１９  ＭＡＥＫＷＫＩ（配列番号５１）、
ＳＥＱ２０  ＡＥＫＷＫＩＡＲＱＥＳＴＳＶ（配列番号５２）、
ＳＥＱ２１  ＥＫＷＫＩＡＲＱＥＳＴＳＶ（配列番号５３）、
ＳＥＱ２２  ＫＷＫＩＡＲＱＥＳＴＳＶ（配列番号５４）、
ＳＥＱ２３  ＷＫＩＡＲＱＥＳＴＳＶ（配列番号５５）、
ＳＥＱ２４  ＫＩＡＲＱＥＳＴＳＶ（配列番号５６）、
ＳＥＱ２５  ＩＡＲＱＥＳＴＳＶ（配列番号５７）、
ＳＥＱ２６  ＡＲＱＥＳＴＳＶ（配列番号５８）、
ＳＥＱ２７  ＲＱＥＳＴＳＶ（配列番号５９）、
ＳＥＱ２８  ＡＥＫＷＫＩＡＲＱＥＳＴＳ（配列番号６０）、
ＳＥＱ２９  ＥＫＷＫＩＡＲＱＥＳＴ（配列番号６１）、ＳＥＱ３０  ＫＷＫＩＡＲＱＥＳ（配列番号６２）
、及び、
ＳＥＱ３１  ＷＫＩＡＲＱＥ（配列番号６３）、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項９】
前記修飾ペプチドが、１以上の非天然起源のアミノ酸修飾を含む、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項１０】
前記修飾ペプチドが、以下：
ＭＲ９  ＤＦ：ＭＡＥＫＷＫＩＡＲ（配列番号６４）、
ＣＭＲ９Ｃ  ＤＦ：ＣＭＡＥＫＷＫＩＡＲＣ（配列番号６５）、
ＭＲ９Ｄ６  ＤＦ：ＭＡＥＫＷＫＩＡＲＤＤＤＤＤＤ（配列番号６６）、及び、
ＣＭＲ９Ｄ６Ｃ  ＤＦ：ＣＭＡＥＫＷＫＩＡＲＤＤＤＤＤＤＣ（配列番号６７）、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の合成ペプチド。
【請求項１１】
前記修飾ペプチドが環状修飾を有する、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項１２】
前記修飾ペプチドが、
ＣＭＲ９Ｃ  ＤＦ：ＣＭＡＥＫＷＫＩＡＲＣ（配列番号６５）、及び、
ＣＭＲ９Ｄ６Ｃ  ＤＦ：ＣＭＡＥＫＷＫＩＡＲＤＤＤＤＤＤＣ（配列番号６７）、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の合成ペプチド。
【請求項１３】
前記修飾ペプチドが、ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、又はＮ末端とＣ末端の両方に連結された合成ポリアミノ酸ポリマーを含む、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項１４】
前記合成ポリアミノ酸ポリマーが、ポリリシン（ポリＫ）、ポリＬ−アスパラギン酸（ポリＤ）、ポリＬ−アルギニン（ポリＲ）、ポリＬ−グルタミン酸（ポリＥ）である、請求項１３に記載の合成ペプチド。
【請求項１５】
前記合成ポリアミノ酸ポリマーが、１個〜１２個のＫ、Ｄ、Ｒ若しくはＥ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の合成ペプチド。
【請求項１６】
前記修飾ペプチドが、以下の表：
【表６】
2019517583.tif 000009
2019517583.tif 000010
からなる群から選択される合成ポリアミノ酸ポリマーを有するペプチドである、請求項１３に記載の合成ペプチド。
【請求項１７】
前記修飾ペプチドが、１以上の非天然起源のアミノ酸修飾を更に含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
【請求項１８】
前記修飾ペプチドが環状修飾を有する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
【請求項１９】
以下：
ＳＥＱ２  ＩＥＰＶＱＴＩＣＨＤＡＥＹＶＮ（配列番号１２６）、
ＳＥＱ３  ＡＥＹＶＮＶＴＡＥＤＬＤＧＨＰ（配列番号１２７）、
ＳＥＱ４  ＬＤＧＨＰＮＳＧＰＦＳＦＳＶＩ（配列番号１２８）、
ＳＥＱ５  ＳＦＳＶＩＤＫＰＰＧＭＡＥＫＷ（配列番号１２９）、
ＳＥＱ６  ＭＡＥＫＷＫＩＡＲＱＥＳＴＳＶ（配列番号１３０）、
ＳＥＱ７  ＥＳＴＳＶＬＬＱＱＳＥＫＫＬＧ（配列番号１３１）、
ＳＥＱ８  ＥＫＫＬＧＲＳＥＩＱＦＬＩＳＤ（配列番号１３２）、
ＳＥＱ９  ＦＬＩＳＤＮＱＧＦＳＣＰＥＫＱ（配列番号１３３）、
ＳＥＱ１０  ＣＰＥＫＱＶＬＴＬＴＶＣＥＣＬ（配列番号１３４）、及び、
ＳＥＱ１１  ＶＣＥＣＬＨＧＳＧＣＲＥＡＱＨ（配列番号１３５）、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む合成ペプチド。
【請求項２０】
前記修飾ペプチドが、ＳＥＱ１３２：ＶＳＴＳＥＱＲＡＩＫＷＫＥＡＭ（配列番号１３６）のアミノ酸配列を含むＳＥＱ６の逆配列である、請求項１９に記載の合成ペプチド。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の合成ペプチド又はその変異体ペプチド又はその修飾ペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２２】
被験体において、ＥＭＴ及び／又は血管擬態を阻害するとともに、血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患を治療及び／又は予防する医薬の製造における、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の合成ペプチド、又はその変異体ペプチド若しくは修飾ペプチドの使用。
【請求項２３】
前記合成ペプチド、又はその変異体ペプチド若しくは修飾ペプチドが、非経口、局所、又は経口の経路によって投与される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記局所投与が眼に対するものである、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患が、新生物、黄斑変性、血管性網膜症又は網膜変性である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２６】
前記新生物が悪性腫瘍又は癌である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記悪性腫瘍又は癌が、膠芽腫、子宮頸癌、肛門癌、口腔癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、子宮頸部癌、子宮体癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、腎臓癌、脳腫瘍、頭頸部癌、眼癌又は眼球の癌、咽喉癌、黒色腫、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、基底細胞癌及び扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、絨毛癌、横紋筋肉腫、血管肉腫、血管内皮腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、口／咽頭癌、食道（esophageal）癌、喉頭癌、腎臓癌及びリンパ腫である、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患が、乾癬、座瘡、酒渣、疣贅、湿疹、血管腫、リンパ脈管新生、神経線維腫症、スタージ−ウェーバー症候群、皮膚の静脈性潰瘍、結節性硬化症、慢性炎症性疾患及び関節炎、又は炎症である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２９】
前記血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患が、視神経円板血管新生、虹彩血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、角膜血管新生、又は硝子体内血管新生である、請求項２２に記載の使用。
【請求項３０】
前記血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患が、眼性血管新生疾患又は黄斑変性である、請求項２２に記載の使用。
【請求項３１】
前記黄斑変性が加齢黄斑変性である、請求項３０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管擬態及び血管形成関連疾患を阻害するためのペプチドを提供する。特に、本発明は、Ｄｓｇ２由来ペプチド、並びに血管擬態及び血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患の阻害、予防又は治療におけるそれらの適用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
デスモソームは、上皮組織、心筋組織及び他の組織の間の主な細胞−細胞接着結合の一種である。かかるデスモソームは、デスモソームカドヘリン、デスモコリン（Ｄｓｃ）及びデスモグレイン（Ｄｓｇ）と称される膜貫通糖タンパク質を含む。それぞれ、組織特異的発現パターンを示す少なくとも３つの全く異なる遺伝的アイソフォームとして生じる。
【０００３】
Ｄｓｇ２は、デスモソームを形成する全ての組織において偏在性に（ubiquitously）発現される。Ｄｓｇ２の細胞外ドメインは、それぞれ約１１０個のアミノ酸長の４つのカドヘリン反復ドメイン（ＥＣ１−４）をそれぞれ含む。細胞外反復ドメインＥＣ１は、細胞−細胞接着を提供する細胞接着認識（ＣＡＲ）部位を含む。そのため、Ｄｓｇ２は膜貫通性細胞接着分子であると同定された。さらに、最近の研究から、Ｄｓｇ２が単なる単純な細胞−細胞接着分子ではないことが示されている。Ｄｓｇ２は、血管形成の促進、アポトーシスのシグナル伝達に関与し、ＭＭＰに対する基質である。
【０００４】
Ｄｓｇ２はＥＭＴの調節に重要な役割を持つ。（１）肝細胞増殖因子／細胞分散因子（ＨＧＦ／ＳＦ）を使用してＥＭＴを誘発することにより、Ｄｓｇ２以外のほとんどのデスモソームの接着成分が下方制御されることが示されている。（２）Ｄｓｇ２でトランスフェクトされた上皮細胞は、間葉系様の形態を呈し、ＨＧＦ／ＳＦによる処理のもと、より大きな遊走及び侵入の能力を示す。（３）Ｄｓｇ２のＥＣ２ドメインに対する抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＧＦ／ＳＦ誘導性ＥＭＴを顕著に阻止する。さらに、本発明者らは、Ｄｓｇ２のＥＣ２ドメインに対する抗体が、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞、ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞及びＫＭ１２ヒト結腸癌細胞を含む癌細胞の侵入を阻害することを実証した。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、Ｄｓｇ２は細胞においてＥＭＴを促進するように機能し得ることが提唱されている。特許文献１は、哺乳動物においてｄｓｃ及び／又はｄｓｇを発現する細胞の接着を阻害することによる癌の治療を教示する。特許文献２は、Ｄｓｇ２のＥＣ２ドメインに由来する細胞接着認識（ＣＡＲ）部位を、癌の治療及び／又は転移の阻害に対する調節物質として使用することができることを示唆する。特許文献３は、Ｄｓｇ２のアンタゴニストを開示し、該アンタゴニストは、Ｄｓｇ２のＥＣ２ドメインの機能を調節する。
【０００５】
Ｄｓｇ２は、癌等のヒト疾患に関与することが示唆され、Ｄｓｇ２は、基底細胞癌（ＢＣＣ）、扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）、胃癌、黒色腫、転移性前立腺癌、及び膀胱癌を含む、幾つかの上皮由来悪性腫瘍で高度に発現される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４０２２９８１１号明細書
【特許文献２】国際公開第９９／５７１４９号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１２０２７６０８２号明細書
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ＥＭＴの阻害、血管擬態を阻害すること、血管形成関連疾患の治療及び／又は予防に対するＤｓｇ２由来ペプチドの開発に基づく。本発明のペプチドは、Ｄｓｇ２の５００位〜６０４位のアミノ酸残基（ＩＥＰＶＱＴＩＣＨＤＡ  ＥＹＶＮＶＴＡＥＤＬ  ＤＧＨＰＮＳＧＰＦＳ  ＦＳＶＩＤＫＰＰＧＭＡＥＫＷＫＩＡＲＱＥＳＴＳＶＬＬＱＱＳＥＫＫＬＧＲＳＥＩＱＦＬＩＳＤＮＱＧＦＳＣＰＥＫＱＶＬＴＬＴＶＣＥＣＬＨＧＳＧＣＲＥＡＱＨ（配列番号：１３６））に由来し得て、それらは更に修飾され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、式（Ｉ）：
ＭＸ１ＥＸ２ＷＸ３ＩＸ４Ｒ（配列番号１）
（式中、
Ｘ１はＡ、Ｔ又はＳであり、
Ｘ２はＫ、Ｒ又はＨであり、
Ｘ３はＫ、Ｒ、Ｎ、Ｈ又はＱであり、
Ｘ４は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｇ、Ｌ又はＰである）のアミノ酸配列を含む合成ペプチド又はその変異体ペプチド又はその修飾ペプチドを提供する。
【０００９】
幾つかの実施の形態では、式（Ｉ）において、Ｘ１がＡ又はＴであり、Ｘ２がＫ又はＲであり、Ｘ３がＫ、Ｒ又はＮであり、Ｘ４がＡ、Ｖ又はＩである。幾つかの更なる実施の形態では、本発明のペプチドは、配列番号２〜配列番号３７のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【００１０】
幾つかの実施の形態では、本発明の変異体ペプチドは、配列番号１の配列と、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。幾つかの実施の形態では、本発明の変異体ペプチドは、１以上の置換、欠失、又は挿入を有する。更なる実施の形態では、本発明の変異体ペプチドは、保存的変化を有する。
【００１１】
幾つかの実施の形態では、本発明の変異体ペプチドは、配列番号４５〜配列番号６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
幾つかの実施の形態では、本発明の修飾ペプチドは、限定されないが、本発明のペプチドのＮ末端、Ｃ末端、又はＮ末端とＣ末端の両方に連結された、１以上の非天然起源の又は修飾されたアミノ酸、環状ペプチド、及び合成ポリアミノ酸ポリマー（例えば、ポリリシン（ポリＫ）、ポリＬ−アスパラギン酸（ポリＤ）、ポリＬ−アルギニン（ポリＲ）、ポリＬ−グルタミン酸（ポリＥ））を含み得る。幾つかの実施の形態では、本発明の修飾ペプチドは、配列番号６４〜配列番号６７、及び配列番号６８〜配列番号１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
また、本発明は、配列番号１２６〜配列番号１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列又はその変異体ペプチド又はその修飾ペプチドを含む合成ペプチドを提供する。一実施の形態では、修飾ペプチドは、ＳＥＱ１３２：ＶＳＴＳＥＱＲＡＩＫＷＫＥＡＭ（配列番号１３５）のアミノ酸配列を含むＳＥＱ６の逆配列である。
【００１４】
また、本発明は、本発明の合成ペプチド又はその変異体ペプチド又はその修飾ペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、本発明の合成ペプチド、又はその変異体ペプチド若しくは修飾ペプチドを被験体に投与することを含む、被験体において、ＥＭＴ及び／又は血管擬態を阻害するとともに、血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患を治療及び／又は予防する方法を提供する。また、本発明は、被験体において、ＥＭＴ及び／又は血管擬態を阻害するとともに、血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患を治療及び／又は予防する医薬の製造における、本発明のペプチド、又はそのペプチド変異体若しくは修飾ペプチドの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明のペプチドのＥＭＴアッセイを示す図である。図１（Ａ）は、Ｄｓｇ２細胞外ドメインのアミノ酸５００〜６０４（ＳＥＱ１）に由来するＳＥＱ２〜ＳＥＱ１１の配列に基づく設計の概要図である。図１（Ｂ）において、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）誘導性ＥＭＴ（上皮間葉転換（epithelial-mesenchymal transition））は合成ペプチドＳＥＱ５、ＳＥＱ６、ＳＥＱ８及びＳＥＱ１０によって阻害された。
【図２】図２（Ａ）及び（Ｂ）は、ＥＭＴアッセイにおけるＳＥＱ６のペプチド欠失研究を示す図である。図２（Ａ）は、ＳＥＱ６欠失合成ペプチドＳＥＱ１２〜ＳＥＱ３１の概要図である。ペプチドのＳＥＱ１２〜ＳＥＱ３１の配列。図２（Ｂ）において、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）誘導性ＥＭＴ（上皮間葉転換）は、合成ペプチドＳＥＱ１２〜ＳＥＱ３１によって阻害された。さらに、ＳＥＱ１５及びＳＥＱ１７は、ＳＥＱ６と同様の優れた阻害能力を示す。
【図３】図３（Ａ）及び（Ｂ）は、Ｕ８７細胞のチューブ形成の阻止の機能に対するＳＥＱ１７のトリプトファン残基（Ｗ、Ｄｓｇ２アミノ酸５４４位）の寄与を決定するＵ８７細胞を使用する血管擬態研究を示す図である。ＳＥＱ３２〜ＳＥＱ３８は血管擬態を阻止することができる。図３（Ａ）において、膠芽腫（ＧＢＭ：Glioblastoma）は非常に悪性度が高く、根本的には不治である。その悪性腫瘍は活発な微小血管の増殖を特徴とする。最近の証拠は、腫瘍細胞が、血液灌流された血管擬態（ＶＭ）、すなわち内皮細胞血管形成と無関係の代替の微小血管循環を促す能力を呈することを示した。血管擬態研究において、マトリゲルによって誘発されるチューブ構造を阻止することによりＳＥＱ１７のトリプトファン残基（Ｗ、Ｄｓｇ２アミノ酸５４４位）の寄与を判断するため、膠芽腫細胞株（Ｕ−８７）を使用する。チューブで満たされたＰＢＳ対照と比較して、ＳＥＱ１７及びＳＥＱ３２〜ＳＥＱ３８のペプチドは、Ｕ−８７のチューブネットワーク構築を強力に阻止する効能を示す。図３（Ｂ）は、各処理群において３つの無作為に選択された視野を使用し、チューブを数えることによって定量した（平均チューブ数±ＳＤ）。
【図４】図４（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明のペプチドのＨＵＶＥＣチューブ形成アッセイを示す図である。図４（Ａ）は、マトリゲル上で培養されたＨＵＶＥＣ細胞において、合成ペプチドＳＥＱ１７、ＳＥＱ７８及びＳＥＱ９７が血管形成を阻害することを実証するものである。図４（Ｂ）は、ＭＲ９及びＭＲ９に由来する３つのペプチド（ＭＲ９；ＭＲ９  ＤＦ：非天然アミノ酸ペプチド、９個のアミノ酸残基がＤ形である；ＣＭＲ９Ｃ：環状ペプチド、Ｎ末端及びＣ末端のシスチンによる環状化；並びにＣＭＲ９Ｃ  ＤＦ：非天然アミノ酸を有する環状ペプチド）を、ＨＵＶＥＣ細胞のマトリゲル誘導性血管系に対して処理した。これらのペプチドは、チューブ構造の４０％〜８０％を分解する潜在的な能力を示すことができる。図４（Ｃ）は、ＳＥＱ１３２ペプチド、すなわちＳＥＱ６の逆配列が、ＨＵＶＥＣチューブ形成アッセイにおいてＨＵＶＥＣチューブ構造を強力に阻害する効能を示す。図４（Ｄ）は、ＭＲ９Ｄ６及びＭＲ９Ｄ６に由来する２つのペプチド（ＭＲ９Ｄ６；ＭＲ９Ｄ６  ＤＦ：非天然アミノ酸ペプチド、１５個のアミノ酸残基がＤ形である；並びにＣＭＲ９Ｄ６Ｃ  ＤＦ：環状ペプチド、Ｎ末端及びＣ末端のシスチンによる環状化、全てアミノ酸が非天然Ｄ形である）を、ＨＵＶＥＣ細胞のマトリゲル誘導性血管系に対して処理した。これらのＰＢＳに溶解されたペプチドは、ＰＢＳで処理された対照と比較して、チューブ構造の９５％の体積を崩壊させる非常に効果的な能力を示すことができる。
【図５】図５（Ａ）及び（Ｂ）は、動物モデルの調査（ラット脈絡膜血管新生モデル）を示す図である。図５（Ａ）は、ＰＢＳ処理された対照、Ｅｙｌｅａ（２００μｇ／５μｌ）及びＳＥＱ９７（５００μｇ／５μｌ）の蛍光眼底血管造影の写真である。図５（Ｂ）において、Ｅｙｌｅａ及びＳＥＱ９７はラットの眼の脈絡膜血管新生を有意に阻害した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下の説明において多数の用語を使用するが、それらには特許請求される主題の理解を容易にするために以下の定義が与えられる。本明細書で明確に定義されない用語は、それらの平易な通常の意味に従って使用される。
【００１８】
他に指定のない限り、数量を特定していない単数形（a or an）は「１つ以上（one or more）」を意味する。
【００１９】
本出願を通して、「約」の用語は、或る値が誤差の固有のばらつきを含むことを示すため使用される。
【００２０】
本出願の主題のために本明細書において使用される「合成ペプチド」の句は、アミノ酸の既知の化学反応、又は上に記載される生体物質の単離及び精製によって作製されるペプチドを指す。
【００２１】
本明細書で使用される「天然起源（の）」の用語は、或る対象物が自然界で見られ得るという事実を指す。例えば、自然界における供給源から単離され得る供給源に存在するタンパク質。
【００２２】
本明細書で使用される「投与する」、「投与すること」又は「投与するため」の用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与と並んで、ｅｘ  ｖｉｖｏでの組織に対する直接投与を含む、医薬を与えること又はそれを供給することを指す。
【００２３】
「アミノ酸残基」、又は「アミノ酸」、又は「残基」の用語は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドに組み込まれるアミノ酸を指すのに区別なく使用され、限定されないが、天然起原のアミノ酸、天然起源のアミノ酸と同じように機能し得る天然アミノ酸の既知の類縁体を含む。アミノ酸に対して本明細書で使用される略語は、従来使用される略語である：Ａ＝Ａｌａ＝アラニン；Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン；Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン；Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸；Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン；Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン；Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸；Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン；Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン；Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン；Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン；Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン；Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン；Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン；Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン；Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン；Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン；Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン；Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン；Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン。アミノ酸はＬ−アミノ酸であってもよく、又はＤ−アミノ酸であってもよい。アミノ酸は、ペプチドの半減期を増加させるように、又はペプチドの効力を増加させるように、又はペプチドのバイオアベイラビリティーを増加させるように変更された合成アミノ酸で置換されてもよい。互いに保存的置換であるアミノ酸の群は、以下の通りである。
アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び、
フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００２４】
本明細書で使用される「ペプチド」の用語は、化学的に連結された２個以上のアミノ酸の分子を指す。ペプチドは、ポリペプチド、タンパク質又はペプチド模倣物（peptidomimetic）を指す場合がある。本発明のペプチドは、特殊な特性を伝えるため、Ｄ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の組み合わせ、及び種々の「デザイナー」アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、及びＮ−α−メチルアミノ酸等）を含み得る。合成アミノ酸として、リシンに対するオルニチン、及びロイシン又はイソロイシンに対するノルロイシンが挙げられる。さらに、上記ペプチドは、新規な特性を有するペプチドを作製するため、エステル結合等のペプチド模倣結合を有し得る。
【００２５】
本明細書で使用される「環状ペプチド模倣物」又は「環状ポリペプチド模倣物」の用語は、その構造の一部として、ループ、架橋部分、及び／又は内部結合等の１以上の環状特性を有するペプチド模倣物を指す。
【００２６】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な」の用語は、毒性、刺激、及び／又はアレルギー反応等の過度の有害な副作用を伴わず、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、ヒト及び／又は動物に対する投与に適している化合物及び組成物を指す。
【００２７】
本明細書で使用される「被験体」及び「患者」の用語は区別なく使用され、温血動物、特に哺乳動物を指すと理解される。この用語の範囲及び意味に含まれる動物の非限定的な例として、モルモット、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、動物園の動物、非ヒト霊長類及びヒトが挙げられる。
【００２８】
本明細書で使用される「有効量」の用語は、本発明の概念の方法で使用された場合に、過剰の有害な副作用（毒性、刺激、及び／又はアレルギー反応等）を伴わず、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、検出可能な治療効果を呈するのに十分なペプチド化合物の量を指す。
【００２９】
本明細書で使用される「治療的有効量」の用語は、疾患を治療するため哺乳動物又は他の被験体に投与された場合、その疾患に対するかかる治療を達成するのに十分な主題のＤｓｇ２ペプチドの量を指す。
【００３０】
本明細書で使用される「治療」、「治療する（treating）」等の用語は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患に罹る素因を有し得るが、それに罹っているとは診断されていない被験体において疾患が生じるのを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその進行を停止させること、及び（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち疾患の退行を生じさせることを含む。
【００３１】
一態様では、本発明は、式（Ｉ）：
ＭＸ１ＥＸ２ＷＸ３ＩＸ４Ｒ（配列番号１）
（式中、
Ｘ１はＡ、Ｔ又はＳであり、
Ｘ２はＫ、Ｒ又はＨであり、
Ｘ３はＫ、Ｒ、Ｎ、Ｈ又はＱであり、
Ｘ４は、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｇ、Ｌ又はＰである）のアミノ酸配列を含む合成ペプチド又はその変異体ペプチド又はその修飾ペプチドを提供する。
【００３２】
幾つかの実施形態では、式（Ｉ）において、Ｘ１がＡ又はＴであり、Ｘ２がＫ又はＲであり、Ｘ３がＫ、Ｒ又はＮであり、Ｘ４がＡ、Ｖ又はＩである。更に幾つかの実施形態では、本発明のペプチドは、
【表１】
2019517583.tif 000003
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３３】
幾つかの実施形態では、ＥＭＴ、血管擬態又は血管形成関連疾患に対する阻害活性を維持するペプチドをなおもコードしながら、変異体ペプチドのいずれかのアミノ酸残基がこれらのペプチドの対応する残基から変更されてもよい。一実施形態では、ペプチドの変異体は、配列番号１の配列と、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００３４】
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、２つの配列をアラインメントさせる場合に参照（親）ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。％アミノ酸同一性を決定するため、配列をアラインメントさせ、必要に応じて最大％配列同一性を達成するためにギャップを導入する。パーセント同一性を決定するためのアミノ酸配列のアラインメント手順は、当業者によく知られている。しばしば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、ペプチド配列をアラインメントさせる。当業者は、比較されている配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するために適したパラメーターを決定することができる。
【００３５】
幾つかの実施形態では、本発明の変異体ペプチドは、その配列の特定の位置の残基が他のアミノ酸によって置換された変異体を含み、親ペプチド／ポリペプチドの２つの残基間に追加の残基（複数の場合もある）を挿入する可能性と並んで、親配列から１以上の残基を欠失する又は親配列に１以上の残基を付加する可能性を更に含む。任意のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失が本発明により包含される。特定の状況では、置換は、本明細書に記載される保存的置換である。
【００３６】
保存的変化は、一般には、得られるタンパク質の構造及び機能にほとんど変化をもたらさない。例えば、本開示のペプチドは、以下の１以上の保存的アミノ酸置換を含む：アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン等の脂肪族アミノ酸の別の脂肪族アミノ酸による置換；セリンのトレオニンによる置換；トレオニンのセリンによる置換；アスパラギン酸及びグルタミン酸等の酸性残基の別の酸性残基による置換；アスパラギン及びグルタミン等のアミド基を持つ残基のアミド基を持つ別の残基による置換；リシン及びアルギニン等の塩基性残基の別の塩基性残基による交換；並びにフェニルアラニン及びチロシン等の芳香族残基の別の芳香族残基による置換。
【００３７】
更に幾つかの実施形態では、本発明の変異体ペプチド（アミノ酸置換）が、以下：
【表２】
2019517583.tif 000004
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３８】
更に幾つかの実施形態では、本発明の変異体ペプチド（アミノ酸欠失）が、
ＳＥＱ１２  ＭＡＥＫＷＫＩＡＲＱＥＳＴＳ（配列番号４５）、
ＳＥＱ１３  ＭＡＥＫＷＫＩＡＲＱＥＳＴ（配列番号４６）、
ＳＥＱ１４  ＭＡＥＫＷＫＩＡＲＱＥＳ（配列番号４７）、
ＳＥＱ１５  ＭＡＥＫＷＫＩＡＲＱＥ（配列番号４８）、
ＳＥＱ１６  ＭＡＥＫＷＫＩＡＲＱ（配列番号４９）、
ＳＥＱ１８  ＭＡＥＫＷＫＩＡ（配列番号５０）、
ＳＥＱ１９  ＭＡＥＫＷＫＩ（配列番号５１）、
ＳＥＱ２０  ＡＥＫＷＫＩＡＲＱＥＳＴＳＶ（配列番号５２）、
ＳＥＱ２１  ＥＫＷＫＩＡＲＱＥＳＴＳＶ（配列番号５３）、
ＳＥＱ２２  ＫＷＫＩＡＲＱＥＳＴＳＶ（配列番号５４）、
ＳＥＱ２３  ＷＫＩＡＲＱＥＳＴＳＶ（配列番号５５）、
ＳＥＱ２４  ＫＩＡＲＱＥＳＴＳＶ（配列番号５６）、
ＳＥＱ２５  ＩＡＲＱＥＳＴＳＶ（配列番号５７）、
ＳＥＱ２６  ＡＲＱＥＳＴＳＶ（配列番号５８）、
ＳＥＱ２７  ＲＱＥＳＴＳＶ（配列番号５９）、
ＳＥＱ２８  ＡＥＫＷＫＩＡＲＱＥＳＴＳ（配列番号６０）、
ＳＥＱ２９  ＥＫＷＫＩＡＲＱＥＳＴ（配列番号６１）、ＳＥＱ３０  ＫＷＫＩＡＲＱＥＳ（配列番号６２）
、及び、
ＳＥＱ３１  ＷＫＩＡＲＱＥ（配列番号６３）、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３９】
幾つかの実施形態では、本発明の修飾ペプチドは、修飾のため１以上の非天然起源アミノ酸を含み得る。「非天然起源アミノ酸残基」は、ポリペプチド鎖中の近接するアミノ酸残基（複数の場合もある）を共有結合することができる、それらの天然起源アミノ酸残基以外の残基を指す。非天然アミノ酸として、限定されないが、ホモ−リシン、ホモ−アルギニン、ホモ−セリン、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、ターシャリー−ブチルグリシン、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフタアラニン（naphthalanine）、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、シトルリン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸、及びチオプロリンが挙げられる。修飾アミノ酸として、可逆的に又は不可逆的に化学的閉塞型（chemically blocked）の又は例えばＮメチル化Ｄ及びＬアミノ酸、別の官能基へと化学修飾される側鎖官能基のように、それらのＮ末端アミノ基若しくはそれらの側鎖基に対して修飾される天然及び非天然のアミノ酸が挙げられる。例えば、修飾アミノ酸として、メチオニンスルホキシド；メチオニンスルホン；アスパラギン酸の修飾アミノ酸であるアスパラギン酸−（β−メチルエステル）；グリシンの修飾アミノ酸であるＮ−エチルグリシン；又はアラニンカルボキサミド及びアラニンの修飾アミノ酸が挙げられる。
【００４０】
幾つかの実施形態では、本発明の修飾ペプチドが、以下：
ＭＲ９  ＤＦ：ＭＡＥＫＷＫＩＡＲ（配列番号６４）、
ＣＭＲ９Ｃ  ＤＦ：ＣＭＡＥＫＷＫＩＡＲＣ（配列番号６５）、
ＭＲ９Ｄ６  ＤＦ：ＭＡＥＫＷＫＩＡＲＤＤＤＤＤＤ（配列番号６６）、及び、
ＣＭＲ９Ｄ６Ｃ  ＤＦ：ＣＭＡＥＫＷＫＩＡＲＤＤＤＤＤＤＣ（配列番号６７）、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４１】
一実施形態では、修飾ペプチドは環状形態である。一修飾は、アミノ酸の架橋に基づいて、環状構造をもたらす。タンパク質中の環状領域は、構造的柔軟性及び回転自由度を減少させ、標的タンパク質に対する非常に高い親和性結合をもたらすリジッドドメイン（rigid domain）を含む。ポリペプチドを環状化する多くの方法が当業者にとって利用可能であり、それらは引用することにより本明細書の一部をなす。典型的には、特定のアミノ酸側鎖及び／又はポリペプチドのカルボキシル末端若しくはアミノ末端の化学反応性を利用して、ポリペプチドの２つの部位を架橋し、環状分子をもたらす。一方法では、２つのシステイン残基のチオール基は、ジブロモキシレンとの反応によって架橋される。
【００４２】
幾つかの実施形態では、本発明の環状形態の修飾ペプチドは、
ＣＭＲ９Ｃ  ＤＦ：ＣＭＡＥＫＷＫＩＡＲＣ（配列番号６５）、及び、
ＣＭＲ９Ｄ６Ｃ  ＤＦ：ＣＭＡＥＫＷＫＩＡＲＤＤＤＤＤＤＣ（配列番号６７）、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４３】
別の例示的な方法では、側鎖アミノ基及び末端アミノ基は、グルタル酸ジスクシンイミジルで架橋される。他のアプローチでは、環状化は、ポリペプチド上の２つの部位の間にチオエーテル架橋基を作ることによって成される。一化学的手法は、ポリペプチドのＮ末端のＮ−クロロアセチル修飾アミノ酸の組み込みに続く、内部システイン残基のチオール側鎖との自発反応に依存する。酵素法は、ランチビオティック（lantibiotic）合成酵素によって触媒されて、（１）システインと（２）デヒドロアラニン基又はデヒドロブチリン基の間の反応に依存して、チオエーテル架橋基を作り出す。また、デヒドロ官能基は、翻訳中に組み込まれたセレンを含むアミノ酸側鎖の酸化によって、化学的に生成され得る。
【００４４】
一実施形態では、本発明の修飾ペプチドは、本発明のペプチドのＮ末端、Ｃ末端、又はＮ末端とＣ末端の両方に連結された、合成ポリアミノ酸ポリマー（例えば、ポリリシン（ポリＫ）、ポリＬ−アスパラギン酸（ポリＤ）、ポリＬ−アルギニン（ポリＲ）、ポリＬ−グルタミン酸（ポリＥ）又はポリグルタミン（ポリＱ））を含む。幾つかの実施形態では、ＳＥＱ１７に対する修飾は、多くの合成ペプチドＳＥＱ７４〜ＳＥＱ１３１を得るため、ポリアルギニン（Ｒ）又はポリアスパラギン酸（Ｄ）を付加することによって成される。更なる実施形態では、合成ポリアミノ酸は、１個〜１２個のポリアミノ酸、好ましくは３個〜８個のポリアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、合成ポリアミノ酸は、１個〜１２個のＫ残基、１個〜１２個のＤ残基、１個〜１２個のＲ残基、１個〜１２個のＱ残基若しくは１個〜１２個のＥ残基、又はそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、合成ポリアミノ酸は、３個〜７個のＲ残基若しくは３個〜７個のＤ残基、又はそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、修飾ペプチドは、
【表３】
2019517583.tif 000005
2019517583.tif 000006
からなる群から選択される合成ポリアミノ酸ポリマーを有する本発明のペプチドである。
【００４５】
別の態様では、本発明は、以下：
ＳＥＱ２  ＩＥＰＶＱＴＩＣＨＤＡＥＹＶＮ（配列番号１２６）、
ＳＥＱ３  ＡＥＹＶＮＶＴＡＥＤＬＤＧＨＰ（配列番号１２７）、
ＳＥＱ４  ＬＤＧＨＰＮＳＧＰＦＳＦＳＶＩ（配列番号１２８）、
ＳＥＱ５  ＳＦＳＶＩＤＫＰＰＧＭＡＥＫＷ（配列番号１２９）、
ＳＥＱ６  ＭＡＥＫＷＫＩＡＲＱＥＳＴＳＶ（配列番号１３０）、
ＳＥＱ７  ＥＳＴＳＶＬＬＱＱＳＥＫＫＬＧ（配列番号１３１）、
ＳＥＱ８  ＥＫＫＬＧＲＳＥＩＱＦＬＩＳＤ（配列番号１３２）、
ＳＥＱ９  ＦＬＩＳＤＮＱＧＦＳＣＰＥＫＱ（配列番号１３３）、
ＳＥＱ１０  ＣＰＥＫＱＶＬＴＬＴＶＣＥＣＬ（配列番号１３４）、及び、
ＳＥＱ１１  ＶＣＥＣＬＨＧＳＧＣＲＥＡＱＨ（配列番号１３５）、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む合成ペプチド又はその変異体ペプチド又は修飾ペプチドを提供する。
【００４６】
一実施形態では、修飾ペプチドは、ＳＥＱ１３２：ＶＳＴＳＥＱＲＡＩＫＷＫＥＡＭ（配列番号１３６）のアミノ酸配列を含む配列６の逆配列である。
【００４７】
ＳＥＱ２〜ＳＥＱ１１の変異体ペプチドは、本明細書に記載されるアミノ酸配列同一性を有し、本明細書に記載されるアミノ酸の置換、付加又は欠失を有するペプチドを含む。修飾ペプチドとして、非天然起源のアミノ酸修飾、環状修飾、及び合成ポリアミノ酸ポリマー修飾を有するペプチドが挙げられる。
【００４８】
本発明のペプチドは、Ｄｓｇ２の５００位〜６０４位のアミノ酸残基（ＩＥＰＶＱＴＩＣＨＤＡ  ＥＹＶＮＶＴＡＥＤＬ  ＤＧＨＰＮＳＧＰＦＳ  ＦＳＶＩＤＫＰＰＧＭ  ＡＥＫＷＫＩＡＲＱＥＳＴＳＶＬＬＱＱＳＥＫＫＬＧＲＳＥＩＱＦＬＩＳＤＮＱＧＦＳＣＰＥＫＱＶＬＴＬＴＶＣＥＣＬＨＧＳＧＣＲＥＡＱＨ（配列番号１３７））に由来し得て、それらは更に修飾され得る。また、ここに記載されるペプチドは、化学合成又は組換ＤＮＡ技術を使用する製造によって作製されてもよい。例えば、ペプチドを、当該技術分野で知られている、アジド、酸塩化物、酸無水物、酸無水物の化合物、ＤＣＣ、活性化エステル、ウッドワード試薬Ｋ、カルボニルイミダゾール、脱酸素、ＤＣＣ／ＨＯＮＢ、ＢＯＰ試薬等を使用する方法によって得ることができる。また、本発明のペプチドは、自動ペプチド合成装置を使用する化学合成によっても作製され得る。
【００４９】
かかる化学反応に続いて、ペプチドを既知の精製方法によって分離し、精製することができる。かかる精製方法の一例として、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフイー、液体クロマトグラフィー、再結晶等の組み合わせを挙げることができる。
【００５０】
さらに、宿主細胞（大腸菌（E. coli）等）における組み換え発現系を使用して、特定の酵素、例えばエンテロキナーゼの切断部位を有する融合タンパク質としてここに記載されるペプチドを発現させてもよい。次いで、細胞を破壊して遠心分離し、得られるスープは上記ペプチドを含む。その後、ペプチドを特定の親和性カラム、例えばＮｉ２＋又はグルタチオンカラムに充填し、溶離することができる。溶離の後、精製されたペプチドを特異的酵素切断反応に供する。その後、ＨＰＬＣ又はイオン交換クロマトグラフィーによって得られた混合物からペプチドを精製する。従来の分析化学、分子生物学、及び細胞生物学的な技術に関する方法は、多くの公然に知られている参照文献において詳述される。
【００５１】
別の態様では、本発明は、本発明の合成ペプチド、又はその変異体ペプチド若しくはその修飾ペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００５２】
本開示は、本発明の合成ペプチド又はその変異体ペプチド又はその修飾ペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤とを含む、ＥＭＴを阻害する、血管擬態を阻害する、並びに血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患を治療及び／又は予防することができる医薬組成物を提供する。本発明のペプチドは、好ましくは、医薬組成物等の組成物において担体等の他の成分と組み合わされる。上記組成物は、血管形成関連疾患の医学的な治療又は予防の方法において投与される場合に有用である。薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、採用される投薬量及び濃度で受容者に対して非毒性である。それらは、固体、半固体、又は液体であってもよい。本発明の医薬組成物は、錠剤、丸剤、粉末、口内錠、サッシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、エマルジョン、溶液又はシロップ剤の形態であってもよい。
【００５３】
幾つかの実施形態では、本発明は、本発明の合成ペプチド、又はその変異体ペプチド若しくは修飾ペプチドを被験体に投与することを含む、被験体において、ＥＭＴ及び／又は血管擬態を阻害するとともに、血管形成依存性疾患若しくは血管形成関連疾患を治療及び／又は予防する方法を提供する。したがって、本発明は、被験体において、ＥＭＴ及び／又は血管擬態を阻害するとともに、血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患を治療及び／又は予防する医薬の製造における、本発明の合成ペプチド、又はその変異体ペプチド若しくは修飾ペプチドの使用を提供する。
【００５４】
血管形成は、生体において血管の発生をもたらす、又は組織の血管分布を増加する生物学的プロセスを説明するため、本明細書を通して使用される。持続的で無秩序な血管形成は、多様な疾患状態、腫瘍転移及び内皮細胞による成長異常にて起こっており、これらの状態で見られる病理学的損傷を支持する。無秩序な血管形成により生み出される多様な病理学的状態を、血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患として分類した。血管形成プロセスの制御を対象とする治療は、これらの疾患の抑止又は鎮静と結びつく可能性がある。
【００５５】
本発明によって治療、改善、又は予防される疾患又は障害として、以下が挙げられる：黄斑変性、加齢黄斑変性、新生物、眼癌又は眼球の癌（ocular cancer）、直腸癌、結腸癌、子宮頸癌（cervical cancer）、前立腺癌、乳癌及び膀胱癌等の内部悪性腫瘍、肛門及び口腔の癌、胃癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、腎臓（renal）癌、口／咽頭癌、食道癌、喉頭癌、腎臓（kidney）癌、脳／腸神経系（ｅｎｓ）癌（例えば神経膠腫）、頭頸癌、喉癌等の様々な癌を含む良性及び悪性の腫瘍、皮膚黒色腫、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、基底細胞癌及び扁平上皮癌、小細胞肺癌、絨毛癌、横紋筋肉腫、血管肉腫、血管内皮腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、リンパ腫、神経線維腫症、結節性硬化症（それぞれの状態が皮膚の良性腫瘍をもたらす）、血管腫、リンパ脈管新生、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、骨肉腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫、通常貧血、血液凝固不全、並びにリンパ節、肝臓及び脾臓の肥大を伴う、白血病、白血球の制御されていない増殖が起こる様々な骨髄の急性又は慢性の腫瘍性疾患のいずれかといった血液由来の腫瘍、乾癬、にきび、酒渣、疣贅、湿疹、神経線維腫症、スタージ−ウェーバー症候群、皮膚の静脈性潰瘍、結節性硬化症、慢性炎症性疾患、関節炎、狼瘡、強皮症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植後拒絶反応、血管新生緑内障及び後水晶体線維増殖症、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズオーバーウエアー（contact lens overwear）、アトピー性角膜炎、上輪部角結膜炎、翼状片、角膜乾燥症、シェーグレン病、フリクテン症、梅毒、マイコバクテリア感染症、脂肪変性症、化学熱傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染症、帯状ヘルペス感染症、原虫感染症、モーレン潰瘍、テリエン周辺角膜変性、辺縁角膜表皮剥離（marginal keratolysis）、外傷、関節リウマチ、全身性狼瘡、多発動脈炎、ウェゲナーサルコイドーシス（Wegener's sarcoidosis）、強膜炎、スティーヴンズ−ジョンソン病、類天疱瘡、放射状角膜切開、角膜移植後拒絶反応、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、黄斑変性、鎌状赤血球貧血、サルコイド、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、ライム病、全身性エリテマトーデス、ベール病、ベーチェット病、網膜炎又は脈絡膜炎を引き起こす感染症、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、眼陥凹、シュタルガルト病、扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラズマ症、外傷、ポストレーザー（post-laser）合併症、ルベオーシス（足首の血管新生）、糖尿病、血管新生性疾患、パンヌス、糖尿病性黄斑浮腫、血管性網膜症、網膜変性、網膜の炎症性疾患、増殖性硝子体網膜症、ルベオーシス（足首の血管新生）と関連する疾患と関連するか否かにかかわらず全ての形態の増殖性硝子体網膜症を含む血管結合組織若しくは線維組織の異常増殖によって引き起こされる疾患、全ての形態の増殖性硝子体網膜症、クローン病及び潰瘍性大腸炎、サルコイドーシス、骨関節炎、炎症性腸疾患、皮膚病変、オスラー−ウェーバー−ランデュ病を含む血管結合組織若しくは線維組織の異常増殖によって引き起こされる疾患、又は遺伝性出血性毛細管拡張症、骨関節炎、サルコイドーシス、皮膚病変、後天性免疫不全症候群、並びに小腸閉塞。
【００５６】
幾つかの実施形態では、血管形成依存性疾患又は血管形成関連疾患は、新生物（悪性腫瘍又は癌を含む）、黄斑変性（加齢黄斑変性を含む）、血管新生疾患、血管性網膜症又は網膜変性である。
【００５７】
本発明の血管新生を阻害するペプチドは、とりわけ、子宮頸癌、肛門癌、口腔癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、子宮頸部癌（cervix uteri cancer）、子宮体癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、腎臓癌、脳腫瘍（例えば神経膠腫）、頭頸部癌、眼癌又は眼球の癌、咽喉癌、黒色腫、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、基底細胞癌及び扁平上皮癌、小細胞肺癌、絨毛癌、横紋筋肉腫、血管肉腫、血管内皮腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、口／咽頭癌、食道（esophageal）癌、喉頭癌、腎臓癌及びリンパ腫等の様々な癌を含む、良性及び悪性の腫瘍を治療、改善、又は予防するために使用される。さらに、とりわけ神経線維腫症、結節性硬化症（それぞれの状態が皮膚の良性腫瘍を生じる）、血管腫及びリンパ脈管新生等の状態は、本発明による化合物で効果的に治療され得る。
【００５８】
血管形成は、固形腫瘍の形成及び転移において顕著である。
【００５９】
血管形成因子は、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、及び骨肉腫等の幾つかの固形腫瘍と関係することがわかった。腫瘍は、栄養素を提供し、細胞廃棄物を除去するため、血液供給なしでは拡大することができない。血管形成が重要な腫瘍として、固形腫瘍、及び聴神経腫瘍、神経線維腫、トラコーマ、及び化膿性肉芽腫等の良性腫瘍が挙げられる。血管形成の予防は、これらの腫瘍の成長及び腫瘍の存在に起因して結果として動物に生じる損傷を止めることができた。
【００６０】
血管形成は、通常貧血、血液凝固不全、並びにリンパ節、肝臓及び脾臓の肥大を伴う、白血病、白血球の制御されていない増殖が起こる様々な骨髄の急性又は慢性の腫瘍性疾患のいずれかといった血液由来の腫瘍と関係していることに注目すべきである。血管形成は、白血病様腫瘍（leukemia-like tumors）を起こす骨髄マット（bone marrow mat）の異常に役割を果たすと考えられている。
【００６１】
血管形成は、腫瘍転移の２つの段階で重要である。血管形成の刺激が重要である第１の段階は、腫瘍の血管侵入にあり、腫瘍細胞が血流に入り込み、全身に循環することを可能とする。腫瘍細胞が原発部位を去り、二次的な転移部位に定着した後、新たな腫瘍が成長して拡大し得る前に、血管形成が起こらなければならない。したがって、血管形成の予防又は制御は、原発部位での新生物の成長を含み得る腫瘍の転移の予防に結びつく可能性がある。
【００６２】
幼少期の最も頻繁な血管形成性疾患の一つは血管腫である。ほとんどの場合、腫瘍は良性で、介入なしに寛解する。より重篤な場合では、腫瘍は大きな空洞性で浸潤性の形態へと進行し、臨床的な合併症を引き起こす。全身の血管腫の形態である血管腫症は高い死亡率を有する。現在使用されている治療法で治療することができない治療抵抗性の血管腫が存在する。
【００６３】
血管形成疾患、血管形成障害及び血管形成性皮膚障害は、障害、概して組織における血管侵入の増加の結果として起こる又は結果としてそれをもたらす皮膚障害又は関連する障害を記載するため本明細書を通して使用される。一次的な又は二次的な特徴として血管侵入の増加を有する任意の皮膚障害は、本発明の目的に対する血管形成性皮膚障害とみなされ、本発明による化合物を用いる治療を受けることができる。
【００６４】
また、乾癬、にきび、酒渣、疣贅、湿疹、血管腫、リンパ脈管新生、神経線維腫症、スタージ−ウェーバー症候群、皮膚の静脈性潰瘍、結節性硬化症、慢性炎症性疾患及び関節炎と並んで、関節炎、狼瘡及び強皮症を含む慢性炎症性疾患等の炎症等の血管形成性皮膚障害を治療、改善又は予防する方法も本発明によって検討され、かかる方法は、かかる治療を必要とする患者に、治療的有効量の開示される１以上の化合物を投与することを含む。
【００６５】
血管新生に関連する疾患として、視神経円板血管新生、虹彩血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、角膜血管新生、及び硝子体内血管新生が挙げられる。
【００６６】
血管形成によって媒介される疾患の一例は、眼性の血管新生性疾患である。この疾患は、網膜又は角膜等の眼の構造への新たな血管の侵入を特徴とする。この新たな血管の侵入は失明の最も一般的な原因であり、およそ２０の眼疾患に関与する。加齢黄斑変性では、関連する視力の問題は、網膜色素上皮下の血管結合組織の増殖を伴うブルッフ膜の欠損を介する脈絡膜毛細血管の入り込み（ingrowth）によって引き起こされる。
【００６７】
慢性炎症及び関節炎と関連する疾患は、本発明のペプチド、組成物及び方法によって治療、改善、又は予防され得る。慢性炎症の症状を伴う疾患として、クローン病及び潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシス、関節リウマチ、骨関節炎、狼瘡及び強皮症が挙げられる。血管形成は、これらの慢性炎症性疾患に共通する重要な要素である。慢性炎症は、炎症細胞の移入を維持するように毛細血管発芽（capillary sprouts）の継続的な形成に依存する。炎症細胞の移入及び存在は肉芽腫をもたらすため、慢性の炎症状態を持続させる。
【００６８】
１回用量又は分割用量でヒト又は他の動物宿主に投与される本発明のペプチドの合計１日用量は、例えば、１日に約０．０００１ｍｇ／体重ｋｇ〜約７５０ｍｇ／体重ｋｇ、通例は約１ｍｇ／体重ｋｇ〜約３００ｍｇ／体重ｋｇの量であってもよい。幾つかの実施形態では、医薬組成物は、本発明のペプチドが、注射１回当たり約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇ、より好ましくは注射１回当たり約０．３ｍｇ〜約４０ｍｇ、最も好ましくは注射１回当たり約０．５ｍｇ〜約３０ｍｇ、約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、約３ｍｇ〜約３０ｍｇ、約５ｍｇ〜約３０ｍｇ、約８ｍｇ〜約３０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約３０ｍｇ、約１５ｍｇ〜約３０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約３０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約２５ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約２０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１５ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ、又は約０．５ｍｇ〜約３ｍｇの用量で与えられるように、注射によって眼に投与される。さらに、上記医薬組成物は、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約６００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約２０ｍｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約３０ｍｇ／ｍｌ〜約４００ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ〜約３５０ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ〜約４００ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ〜約４００ｍｇ／ｍｌ、約１５０ｍｇ／ｍｌ〜約４００ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ〜約４００ｍｇ／ｍｌ、約２５０ｍｇ／ｍｌ〜約４００ｍｇ／ｍｌ、約３００ｍｇ／ｍｌ〜約４００ｍｇ／ｍｌ、又は約３５０ｍｇ／ｍｌ〜約４００ｍｇ／ｍｌの濃度の本発明のペプチドを含む溶液の１滴が眼に適用されるように、眼への点眼によって投与される。
【００６９】
治療的有効量の本発明の医薬組成物の投与は、所望の結果を達成するために有効な量、投薬量、及びそれに必要な期間として定義される。例えば、ペプチドの治療的に活性な量は、個体の疾患の状態、年齢、性別、及び体重等の因子、並びに物質がその個体において所望の反応を誘発する能力に応じて変化し得る。投薬レジメンは、最適な治療反応を提供するように調整され得る。例えば、幾つかの分割用量を毎日投与してもよく、又はその用量は治療的状況での緊急性によって指示される通り比例的に減少されてもよい。
【００７０】
医薬組成物は、非経口（例えば、動脈内、静脈内、筋肉内、皮下を含む）、局所（皮膚、経皮、皮下等を含む）、経口、鼻、粘膜（舌下を含む）、又は腔内の経路等による任意の従来の又は好適な経路によってそれを必要とする被験体に投与され得る。したがって、組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン及び固体の形態を含む多様な形態に製剤化され得て、典型的には、例えば、非経口投与に適した注射用製剤、カプセル剤、錠剤、カプレット剤、経口摂取用のエリキシル剤、吸入による（鼻腔内吸入又は経口吸入等による）投与に適ししたエアロゾル形態、又は局所性投与に適した軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤若しくはローション剤として、選択される投与経路に適するように製剤化される。
【００７１】
例えば、非経口注射剤用の医薬組成物は、薬学的に許容可能な無菌の水性又は非水性の溶液、分散液、懸濁液、又はエマルジョンと並んで、使用の直前に無菌の注射用溶液又は分散液へと再構成するための無菌粉末を含む。好適な水性及び非水性の担体、希釈剤、溶媒、又はビヒクルの例として、水、エタノール、多価アルコール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、カルボキシメチルセルロース及びその好適な混合物、植物油（オリーブオイル等）、並びにオレイン酸エチル等の注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング物質の使用によって、分散液の場合の必要な粒子径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。また、これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤等のアジュバントを含んでもよい。
【００７２】
例えば、本発明のペプチドとの使用と適合する経口の剤形又は単位服用量は、ペプチドの混合物、及び非薬物成分又は賦形剤と並んで、原料又は包装のいずれかと見なされ得る他の再使用不能な材料を含み得る。経口組成物は、液体、固体及び半固体の剤形の少なくとも１つを含み得る。幾つかの実施形態では、有効量のペプチドを含む経口の剤形が提供され、ここで剤形は、丸剤、錠剤、カプセル剤、ゲル剤、ペースト剤、飲料及びシロップ剤の少なくとも１つを含む。幾つかの例では、被験体の小腸でペプチド二量体の遅延放出を達成するように設計され、構成される経口の剤形が提供される。
【００７３】
例えば、局所投与として、皮膚、又は肺及び眼の表面を含む粘膜への投与を含む。吸入及び鼻腔内に対するものを含む局所の肺投与用の組成物は、水性及び非水性の製剤における溶液及び懸濁液を含む場合があり、加圧又は非加圧であってもよい乾燥粉末として調製され得る。非加圧粉末組成物では、微細化形態の有効成分は例えば、直径が最大１００マイクロメートルのサイズを有する粒子を含む、サイズの大きな薬学的に許容可能な不活性担体との混合物で使用され得る。好適な不活性担体として、ラクトース等の糖が挙げられる。
【００７４】
局所性投与の更なる形態は、眼に対するものである。本発明の化合物は、該化合物を、角膜領域及び例えば、前眼房、後眼房、硝子体、房水、硝子体液、角膜、虹彩／毛様体、レンズ、脈絡膜／網膜及び強膜のような眼の内部領域に浸透させるのに十分な時間に亘って化合物と眼球表面との接触が維持されるように、薬学的に許容可能な眼科用ビヒクルにて送達される。薬学的に許容可能な眼科用ビヒクルは、例えば、軟膏、植物油、又はカプセル化材であってもよい。代替法としては、本発明の化合物を、硝子体液及び眼房水に直接注入してもよい。
【００７５】
また、本発明のペプチドは、リポソームの形態で投与されてもよい。当該技術分野で知られているように、リポソームは、一般的にリン脂質又は他の脂質物質に由来する。リポソームは、水性媒質中に分散されるモノラメラの又はマルチラメラの水和液晶によって形成される。リポソームを形成し得る任意の非毒性の生理学的に許容可能で代謝可能な脂質を使用することができる。リポソーム形態の本発明の組成物は、本発明の化合物に加えて、安定化剤、防腐剤、賦形剤等を含み得る。好ましい脂質は、天然と合成の両方のリン脂質及びホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームを形成する方法は当該技術分野で知られている。
【００７６】
任意の先行する刊行物（又はそれから得られる情報）、又は知られているあらゆる事柄に対する本明細書における参照は、その先行する刊行物（又はそれから得られる情報）、又は知られている事柄が、本明細書が関連する努力傾注分野における共通の一般的知識の一部をなすことの自認又は承認又はいかなる形式の示唆でもなく、そのように捉えられるべきではない。
【００７７】
ここで、本発明を以下の具体的な実施例に関して記載するが、それらの実施例は、本発明の範囲を何ら限定しないと解釈するものとする。
【実施例】
【００７８】
実施例１  本発明のペプチドのＥＭＴアッセイ
ＭＤＣＫ細胞（８００細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに蒔き、１０％のサブコンフルエントになるまで３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。次いで、ＥＭＴを、細胞分散因子ＨＧＦ（R&D system、２．５ｎｇ／ｍｌ）を含む培養培地を添加することによって誘発し、ＥＭＴを阻止するため試験するペプチドを添加した（ＳＥＱ２〜ＳＥＱ３１）。核間距離を測定するため、正立顕微鏡を使用して無作為の画像を５０倍の倍率でキャプチャーした。核間距離は、１つの核の中心から近隣の／近接する核の中心までを測定した。２つの核間の距離を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して測定した。
【００７９】
ペプチドＳＥＱ１〜ＳＥＱ１１は、Ｄｓｇ２の５００位〜６０４位のアミノ酸残基から断片化され、添付の図１（Ａ）に示される。さらに、ＥＭＴアッセイを行って、これらのペプチドフラグメントのＥＭＴ阻害能力を実証した。図１（Ｂ）に示されるように、ＳＥＱ６は、ＥＭＴの阻害において有利な効果を示す。したがって、ＳＥＱ６に対してペプチド欠失研究を行った。ＳＥＱ６の配列の一部を欠失することによって、合成ペプチドＳＥＱ１２〜ＳＥＱ３１を得る。合成ペプチドＳＥＱ１２〜ＳＥＱ３１の配列、及びＥＭＴに対するそれらの阻害効果を図２に示す。
【００８０】
実施例２  本発明のペプチドの血管擬態研究
ヒト膠芽腫細胞（Ｕ−８７）をマトリゲル被覆ウェル（９６ウェルプレート中の６×１０３細胞／ウェル）に蒔いた。次いで、試験したペプチド（ＳＥＱ１７、ＳＥＱ３２〜ＳＥＱ３８、又はＰＢＳ対照）をそれぞれウェルに添加し、数日間インキュベートした。チューブの定量のため各ウェルを３つの視野について無作為に撮影し、統計のためチューブの数を数えた。
【００８１】
図２によれば、ＳＥＱ１７はＥＭＴの阻害に有利な作用を示す。ＳＥＱ１７のアラニンスクリーニングを行った。ＳＥＱ１７のアラニン置換合成ペプチドから得られたＳＥＱ３２〜ＳＥＱ３８の合成ペプチド配列。膠芽腫（ＧＢＭ）は非常に悪性度が高く、根本的には不治である。その悪性腫瘍は、活発な微小血管の増殖を特徴とする。最近の証拠は、腫瘍細胞が、血液灌流された血管擬態（ＶＭ）、すなわち内皮細胞血管形成と無関係の代替の微小血管循環を促す能力を呈することを示した。血管擬態研究において、マトリゲルによって誘発されるチューブ構造を阻止することによって、ＳＥＱ１７のトリプトファン残基（Ｗ、Ｄｓｇ２アミノ酸５４４位）の寄与を判断するため、膠芽腫細胞株（Ｕ−８７）を使用する。チューブで満たされたＰＢＳ対照と比較して、ＳＥＱ１７及びＳＥＱ３２〜ＳＥＱ３８のペプチドは、Ｕ−８７チューブネットワーク構築を強力に阻止する効能を示す（図３（Ａ）を参照）。各治療群において無作為に選択された３つの視野を使用して、チューブを数えることによって定量する（図３（Ｂ）を参照）（平均チューブ数±ＳＤ）。
【００８２】
実施例３  本発明のペプチドのＨＵＶＥＣチューブ形成アッセイ（血管形成アッセイ）
一晩飢餓状態にしたヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を収集し、内皮細胞増殖培地で１．５×１０４細胞／ウェル（９６ウェルプレートにおいて）に調整した後、マトリゲル被覆ウェルに細胞を蒔いた。種々のペプチド、並びにＤ形非天然アミノ酸、及び／又はＮ末端及びＣ末端のシスチンを付加することによる環状化によるそれらの修飾形態；また、ＳＥＱ１３２は、ペプチド骨格ＳＥＱ６の方向の反転である（レトロ修飾）：（ＳＥＱ１７、ＳＥＱ７８、ＳＥＱ９７、ＭＲ９  ＤＦ、ＣＭＲ９Ｃ、ＣＭＲ９Ｃ  ＤＦ、ＭＲ９Ｄ６  ＤＦ、ＣＭＲ９Ｄ６Ｃ  ＤＦ及びＳＥＱ１３２）又は対照ＰＢＳをウェルに添加し、３７℃で５時間インキュベーションした。各ウェルを、正立顕微鏡によって４０倍の倍率で撮影した。チューブの合計の長さを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用することにより定量した。マトリゲル上で培養されたＨＵＶＥＣ細胞は、合成ペプチドが血管形成を阻害することができることを実証し、その結果を図４（Ａ）〜（Ｄ）に示す。
【００８３】
実施例４  ラットのレーザー誘導性脈絡膜血管新生モデル
ケタミン塩酸塩／キシラジン塩酸塩（７：１、体積／体積）の混合物１ｍＬ／ｋｇの大腿筋への筋肉内注射によって動物を完全に麻酔にかけた。Ｍｙｄｒｉｎ（商標）−Ｐ眼科用液（参天製薬株式会社）を眼に滴下して瞳孔を散大させた。細隙灯ＳＬ−１３０（Carl Zeiss Meditec AG）及び多色レーザー光凝固装置ＭＣ−３００（NIDEK Co., Ltd.）を使用することによって、レーザー（波長：５３２ｎｍ）を使用して各動物の右眼に照射した。次いで、マイクロシリンジ（ＭＳ−Ｎ１０、株式会社伊東商会）及び３３Ｇ針（株式会社伊東商会）を使用して、ペプチド投薬製剤を右眼の硝子体に注入した。レーザー照射の１４日後、４％ＦＩＴＣ−デキストラン溶液を動物１匹当たり１ｍＬの量で尾静脈に投与した。次いで、動物を麻酔薬の過剰投与によって安楽死させた。眼球を摘除し、１２時間〜２４時間、４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液中で固定した。実体顕微鏡（ＥＺ−４、Leica Microsystems）下で脈絡膜のフラットマウント（flat mounts）を作製した。その後、共焦点顕微鏡（株式会社ニコンのＥＣＬＩＰＳＥ  ＴＥ２０００−Ｕ）による写真撮影のためラット眼の脈絡膜フラットマウントを作製した。高いフルオレセイン強度を有するレーザー誘導性血管新生部位（単位：ピクセル）の区域を測定するため、ソフトウェアＩｍａｇｅＪ（国立保健研究所（ＮＩＨ）、米国）を使用する。
【００８４】
ラットの眼に５３２ｎｍの波長のレーザーを照射し、ペプチド（ＳＥＱ９７）、Ｅｙｌｅａ又はＰＢＳで硝子体内処理をした。１４日後、次いで、蛍光眼底血管造影によって網膜区域における流体の漏出を識別するため、４％ＦＩＴＣ−デキストラン溶液を静脈内注射する。図５（Ａ）は、ＰＢＳで処理した対照、Ｅｙｌｅａ（２００μｇ／５μｌ）及びＳＥＱ９７（５００μｇ／５μｌ）の蛍光眼底血管造影写真を示す。１４日間の処理（ＰＢＳ、Ｅｙｌｅａ又はＳＥＱ９７）の後、脈絡膜血管新生部位の写真を撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで定量した（ｎ＝１０）。ＥｙｌｅａとＳＥＱ９７はいずれも、ラット眼の脈絡膜血管新生を有意に阻害する（図５（Ｂ）を参照）（統計学的分析はＳｔａｔＬｉｇｈｔ  ＃４を使用した）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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