(57)【要約】  ビスピリジンは、アミン及びチオールを含む求核剤の標識を向上し、特に、酸性標識及び塩基性標識での標識の向上に有用である。ビスピリジンとそのような標識の使用は、ビスピリジンを用いないプロトコールに比べて劇的に標識を増加させる。標識した求核剤はその後に標準的な分析方法に供することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の求核剤をインビトロで標識する方法であって、
前記求核剤を、（ａ）溶媒、（ｂ）前記求核剤と反応する求電子標識、及び（ｃ）前記溶媒に可溶なビスピリジンを含む溶液とインキュベーションするステップを含み、
それによって前記求核剤を標識する方法。
【請求項２】
前記求核剤がアミンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アミンがグリコシルアミンである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
さらに前記グリコシルアミンが、前記インキュベーションステップ前に糖タンパク質から遊離される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
さらに前記糖タンパク質からの前記グリコシルアミンの前記遊離が酵素消化による請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記糖タンパク質の前記酵素消化がＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素による消化を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記求核剤がチオールである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記求核剤がタンパク質又はペプチドのグアニジン又はイミダゾール基である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記求核剤が核酸の環外アミンである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ビスピリジンが、ピリジン，４，４’−（１，３−プロパンジイル）ビス−、又はピリジン，４，４’−（１，２−エタンジイル）ビス−である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶媒が、ジメチルホルムアミド又はジメチルスルホキシドである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記求電子標識が水溶液中で酸性である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記求電子標識が水溶液中で塩基性である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
対象の糖タンパク質から遊離されたＮ−グリカンを標識する方法であって、
（ａ）前記糖タンパク質を、前記Ｎ−グリカンを前記糖タンパク質からグリコシルアミンとして遊離させる酵素とインキュベーションすること、並びに
（ｂ）前記グリコシルアミンを、溶媒、アミン反応性標識、及びビスピリジンを含む溶液と、前記アミン反応性標識による前記グリコシルアミンの標識を可能にする条件下で接触させること
を含み、
それによって、前記糖タンパク質から遊離された前記Ｎ−グリカンを標識する方法。
【請求項１５】
前記糖タンパク質が抗体である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
さらに前記糖タンパク質が、ステップ（ｂ）の前に固体担体上に固定される請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
さらに前記脱グリコシル化酵素がエンドグリコシダーゼである請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
さらに前記脱グリコシル化酵素がアミダーゼである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
さらに前記アミダーゼがＰＮＧ  Ｆである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
さらに前記溶媒が、ジメチルホルムアミド又はジメチルスルホキシドである請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ビスピリジンが、ピリジン，４，４’−（１，３−プロパンジイル）ビス−又はピリジン，４，４’−（１，２−エタンジイル）ビス−である請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
さらに前記標識されたグリコシルアミンが分析手段に提供される請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記分析手段が、高圧液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、マイクロ流体分離、及び質量分析からなる群より選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記分析手段が高圧液体クロマトグラフィーである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記分析手段が質量分析である請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
対象の求核剤を標識するキットであって、
（ａ）ビスピリジン、
（ｂ）前記対象の求核剤と反応する標識、及び
（ｃ）前記求核剤を標識することに関する取扱説明書
を含むキット。
【請求項２７】
前記求核剤がグリコシルアミンである請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記標識がアミン反応性色素である請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
前記ビスピリジンが、ピリジン，４，４’−（１，３−プロパンジイル）ビス−又はピリジン，４，４’−（１，２−エタンジイル）ビス−である請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
前記標識が、乾燥２−（ジエチルアミノ）エチル  ４−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルアミノ］ベンゾアートであり、前記ビスピリジンがピリジン，４，４’−（１，３−プロパンジイル）ビス−又はピリジン，４，４’−（１，２−エタンジイル）ビス−である請求項２６に記載のキット。
【請求項３１】
さらに前記ビスピリジンが溶媒中にある請求項２６に記載のキット。
【請求項３２】
前記溶媒がジメチルホルムアミドである請求項３１に記載のキット。求核剤の標識を向上するためのビスピリジンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年２月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／３００，６０９号に基づく優先権を主張し、該仮特許出願の内容はあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府の助成金に関する陳述
【０００２】
該当なし。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、求電子標識による求核生体分子の標識を向上する分野に関し、特にグリコシルアミンの標識に関する。
【０００４】
真核細胞によって産生されるタンパク質の多くは、共有結合した直鎖炭水化物又は分枝鎖炭水化物の付加によって翻訳後修飾される。これらのタンパク質−炭水化物複合体は糖タンパク質と呼ばれ、炭水化物が結合する位置はグリコシル化部位と呼ばれる。付加される多糖又はオリゴ糖はグリカンと呼ばれる。さまざまなグリカンが、特定の糖タンパク質の相異なるグリコシル化部位に見出される。特定の糖タンパク質のグリカンの特定のパターンは、そのタンパク質を産生する特有の細胞株及び細胞が増殖する条件によって決定される。
【０００５】
タンパク質に結合したグリカンは、薬物動態、安定性、生体活性、免疫原性を含む、その機能に重要な特性に影響を与える可能性があるため、多くの用途においてどのグリカンが存在するかを見極めることが重要である。したがって、タンパク質からグリカンの一部又は全部を除去し、グリカンを分析してその組成を決定する能力は、糖タンパク質が所望の効果を有するかどうかを判定するのに有用である。例えば、食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、生物製剤（治療用糖タンパク質やワクチンなど）に結合する炭水化物の特性を明らかにして製品の組成及び製造の一貫性を示すことを求めており、製品の総括的な特性評価が必要とされている。また、遊離炭水化物のプロファイルの分析は、組換えタンパク質の生産における品質管理にとっても重要であり、炭水化物プロファイルの変化はその系におけるストレスを示し、高価なタンパク質の商業規模の発酵槽を廃棄する必要があるかもしれない状況を示唆しうる。したがって、治療用糖タンパク質などの生物試料中のグリカンの分布プロファイルを決定することに、生化学者、臨床化学者、及び製薬メーカーから非常に高い関心が集まっている。
【０００６】
典型的には、グリカンは糖タンパク質に２つの方法のいずれかで結合している。Ｎ−グリカンと呼ばれる第１のものでは、グリカンはＮ−グリコシド結合を介してアスパラギン残基に結合している。Ｏ−グリカンと呼ばれる第２のものでは、グリカンはアミノ酸残基の酸素原子に結合している。例えば、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンは、セリン残基又はスレオニン残基の酸素に酵素的に結合することができる。
【０００７】
Ｎ−グリカンは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（ペプチド−Ｎ４−（アセチル−β−グルコサミニル）−アスパラギンアミダーゼ、ＥＣ３．５．１．５２）などのさまざまな酵素による酵素切断によって糖タンパク質から酵素的に遊離されうる。糖タンパク質などの糖複合体からの酵素によるグリカンの遊離は、当技術分野において「酵素消化」と呼ばれることがある。Ｎ−グリカンの酵素消化、例えばＰＮＧａｓｅ  Ｆによる酵素消化は、典型的には水溶液中で起こり、Ｎ−グリカンをβ−グリコシルアミンとして最初に遊離させ、遊離したグリカンの遊離還元末端はアンモニアと結合している（例えば、Tarentino, et al. TIGG 1993, 23:163-170; Rasmussen J. R. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114:1124-1126; Risley, et al. J. Biol. Chem. 1985, 260:15488-15494, 1985を参照されたい）。ＰＮＧａｓｅ  Ｆ遊離Ｎ−グリカンは、最も一般的には還元アミノ化によって標識され、そこでは、グリカンの遊離還元末端が蛍光色素又は電荷などの標識の遊離アミノ基に結合する。使用される標識に応じて、標識されたグリカンは、その後に、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、キャピラリー電気泳動（「ＣＥ」）、炭水化物ゲル電気泳動、又はマイクロ流体分離などのさまざまな分析方法のいずれかによって分析することができる。Ｎ−グリカンの標識は、例えば、共有米国特許第８，１２４，７９２号及び同第８，４４５，２９２号に教示されている。
【０００８】
グリコシルアミンの安定性はｐＨに依存し、ｐＨが低いほど、急速にグリコシルアミンが遊離還元末端をもつグリカンとアンモニウムに加水分解される。これに対して、ｐＨが高くなるとグリコシルアミン加水分解が遅くなり、グリコシルアミンとして遊離したグリカンが遊離還元末端ではなくアミノ基に対して反応する試薬で標識できるようになる。したがって、遊離グリコシルアミンは、約ｐＨ７．５〜約ｐＨ９のｐＨ範囲内で、より安定であり、標識試薬との反応性がより高い。残念なことに、さまざまな分析技術に適合するアミン反応性色素の多くは、酸性又は塩基性のいずれかであり、６未満のｐＨでより安定である。グリコシルアミンの安定性に最も好ましい条件と塩基性色素又は酸性色素の安定性に最も好ましい条件との間のこの対立（dichotomy）は、酵素消化によって糖タンパク質から遊離したグリカンの不完全な標識を引き起こす可能性がある。
【０００９】
グリコシルアミン及び他の求核剤の標識を向上する組成物及び方法が、当該分野で必要とされている。驚くべきことに、本発明はこれら及び他の必要性を満たす。
【発明の概要】
【００１０】
幾つかの実施形態では、本発明は、対象の求核剤をインビトロで標識する方法を提供する。その方法は、求核剤を、（ａ）溶媒、（ｂ）求核剤と反応する求電子標識、及び（ｃ）溶媒に可溶なビスピリジンを含む溶液とインキュベーションするステップを含み、それによって前記求核剤を標識する。幾つかの実施形態では、求核剤はアミンである。幾つかの実施形態では、アミンはグリコシルアミンである。幾つかの実施形態では、グリコシルアミンはインキュベーションステップ前に糖タンパク質から遊離される。幾つかの実施形態では、糖タンパク質からのグリコシルアミンの遊離は酵素消化による。幾つかの実施形態では、糖タンパク質の酵素消化はＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素による消化を含む。幾つかの実施形態では、求核剤はチオールである。幾つかの実施形態では、求核剤はタンパク質又はペプチドのグアニジン又はイミダゾール基である。幾つかの実施形態では、求核剤は核酸の環外アミンである。幾つかの実施形態では、ビスピリジンは、ピリジン，４，４’−（１，３−プロパンジイル）ビス−、又はピリジン，４，４’−（１，２−エタンジイル）ビス−である。幾つかの実施形態では、溶媒はジメチルホルムアミド（dimethylforamide）又はジメチルスルホキシドである。幾つかの実施形態では、求電子標識は水溶液中で酸性である。幾つかの実施形態では、求電子標識は水溶液中で塩基性である。
【００１１】
幾つかの実施形態では、さらに本発明は、対象の糖タンパク質から遊離されたＮ−グリカンを標識する方法を提供する。その方法は、（ａ）糖タンパク質を、Ｎ−グリカンを糖タンパク質からグリコシルアミンとして遊離させる酵素とインキュベーションすること、並びに（ｂ）グリコシルアミンを、溶媒、アミン反応性標識、及びビスピリジンを含む溶液と、アミン反応性標識によるグリコシルアミンの標識を可能にする条件下で接触させることを含み、それによって、糖タンパク質から遊離された前記Ｎ−グリカンを標識する。幾つかの実施形態では、糖タンパク質は抗体である。幾つかの実施形態では、糖タンパク質はステップ（ｂ）の前に固体担体上に固定される。幾つかの実施形態では、脱グリコシル化酵素はエンドグリコシダーゼである。幾つかの実施形態では、脱グリコシル化酵素はアミダーゼである。幾つかの実施形態では、アミダーゼはＰＮＧ  Ｆである。幾つかの実施形態では、溶媒はジメチルホルムアミド又はジメチルスルホキシドである。幾つかの実施形態では、ビスピリジンは、ピリジン，４，４’−（１，３−プロパンジイル）ビス−又はピリジン，４，４’−（１，２−エタンジイル）ビス−である。幾つかの実施形態では、標識されたグリコシルアミンは分析手段によって分析される。幾つかの実施形態では、分析手段は、高圧液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、マイクロ流体分離、及び質量分析からなる群より選択される。
【００１２】
幾つかの実施形態では、さらに本発明は、対象の求核剤を標識するためのキットを提供する。そのキットは、（ａ）ビスピリジン、（ｂ）対象の求核剤と反応する標識、及び（ｃ）求核剤を標識することに関する取扱説明書を含む。幾つかの実施形態では、求核剤はグリコシルアミンである。幾つかの実施形態では、標識はアミン反応性色素である。幾つかの実施形態では、ビスピリジンは、ピリジン，４，４’−（１，３−プロパンジイル）ビス−又はピリジン，４，４’−（１，２−エタンジイル）ビス−である。幾つかの実施形態では、標識は、乾燥２−（ジエチルアミノ）エチル  ４−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルアミノ］ベンゾアートであり、ビスピリジンは、ピリジン，４，４’−（１，３−プロパンジイル）ビス−又はピリジン，４，４’−（１，２−エタンジイル）ビス−である。幾つかの実施形態では、ビスピリジンは溶媒中にある。幾つかの実施形態では、溶媒はジメチルホルムアミドである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、例示的な糖タンパク質であるブタガンマグロブリンからＰＮＧａｓｅ  Ｆで遊離させ、１Ｍピリジン（「ＰＹＲ」、四角で表される）、１Ｍピリジン，４，４’−（１，２−エタンジイル）ビス−（「ＢＰＥ」、ひし形で表される）、又は１Ｍピリジン，４，４’−（１，３−プロパンジイル）ビス−（「ＴＭＤ」、三角で表される）の存在下で、酸性色素である８−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルアミノ］ナフタレン−１，３，５−トリスルホン酸で標識したグリコシルアミンの総グリカンシグナルを示すグラフである。これらの化学物質の各々を、溶媒として無水ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）に溶かした。丸で表されている対照は、ピリジン又はビスピリジンを含まないＤＭＳＯ溶媒であった。縦軸：４３０ｎｍで測定した相対蛍光単位（「ＲＦＵ」）における総グリカンシグナル。横軸：アッセイに存在する色素（「ＡＮＴＳ」）のマイクロリットル数。使用した色素の量は、０．１μｌ、１μｌ、２．５μｌ、及び５μｌであった。
【００１４】
【図２】図２は、例示的な糖タンパク質であるブタガンマグロブリンからＰＮＧａｓｅ  Ｆで遊離させ、無水ジメチルホルムアミド（「ＤＭＦ」）に溶かした１Ｍピリジン，４，４’−（１，３−プロパンジイル）ビス−（「ＴＭＤ」）、ＤＭＦ中の４Ｍ  ＴＭＤ、又はＴＭＤを含まないＤＭＦ（「対照」）のいずれかの存在下で、異なる酸性色素、４−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルアミノ］安息香酸で標識した標識グリコシルアミンの総グリカンシグナルを示すグラフである。縦軸：４３０ｎｍで測定した、ＲＦＵ単位での総グリカンシグナル。横軸：バーは、対照又は示された濃度のＴＭＤの存在下におけるＲＦＵの平均値を示しており、すぐに比較できるようにバーの上に平均の数値を示す。エラーバーは１標準偏差を示す。
【００１５】
【図３】図３は、総グリカンシグナルに対するＴＭＤ濃度の効果に関する範囲試験を示すグラフである。ブタガンマグロブリンからＰＮＧａｓｅ  Ｆで遊離されたグリコシルアミンは、無水ＤＭＳＯに溶かした塩基性色素InstantPC（商標）で標識し、全蛍光シグナルを３４５ｎｍで測定してＨＰＬＣで分析した。縦軸：丸は、試験したＴＭＤの各濃度に対するＲＦＵ単位でのグリカンシグナルを示す。横軸：試験したＴＭＤのモル濃度。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
背景技術（Background）で記載したように、糖タンパク質に結合したグリカンの分析は、治療用糖タンパク質の組成及び製造の一貫性を示しことを含むさまざまな規制要件を満たし、組換え糖タンパク質の製造中に品質管理を実現するために重要になっている。背景技術でさらに説明したように、Ｎ−グリカンは典型的には、酵素消化でそれらを遊離させた後に、得られたグリコシルアミンをアミン反応性色素で標識することによって分析される。残念なことに、糖タンパク質から遊離されるグリコシルアミンは、約ｐＨ７．５〜約ｐＨ９のｐＨ範囲内で、より安定で、標識試薬との反応性がより高いが、グリコシルアミンを標識するために使用されるアミン反応色素の多くは、６より低いｐＨでより安定である。より高いｐＨ、例えばｐＨ９より上では、グリコシルアミンは安定であるが、特に水が主要な溶媒である場合、求核剤反応性タグは急速に加水分解する。したがって、グリコシルアミンに添加する前に、アミン反応性色素を中和することが有利である。グリコシルアミンの安定性に最も好ましい条件と、塩基性色素又は酸性色素の安定性に最も好ましい条件との間のこの対立は、酵素消化によって糖タンパク質から遊離したグリカンの完全に標識される能力を低下させる。
【００１７】
その対立にもかかわらず、現在、標識プロトコールにおいてバッファーは典型的に、有機溶媒部分に添加されない。典型的なプロトコールは、水溶液の緩衝のみ、すなわち、ｐＨ７〜９の炭酸ナトリウムなどのバッファーでの緩衝を推奨する。一般にこれらのプロトコールは、第一級アミンなどの安定した求核剤に適用され、低ｐＨで急速に加水分解されるグリコシルアミンの一時的な性質を考慮しない。これは、リン酸緩衝生理食塩水などの一般的な実験室用バッファーが、それ自体アミン反応性色素及び他の標識を加水分解する水溶液であるからでありうる。したがって、水溶液バッファーが使用される場合、そのバッファーは、グリカンを含有する溶液に標識又は色素を加える直前又は直後に、アミン反応性標識又は色素に加えなければならないことになる。緩衝中のいかなる遅延も、一部のグリコシルアミンが標識される前に加水分解される結果になりうるので、そのようなバッファーを加えるタイミング自体が、溶液中に存在するグリカンの測定に望ましくない変動をもたらす可能性がある。水性求核剤を標識する前に求電子標識を緩衝することが好ましい。さらに、多くのアミン反応性色素又は他の標識は粉末として販売されており、使用者が溶かした後、そのまま又はさらなる保存寿命が望ましい場合には冷凍庫で、使用するまで保存する。したがって、色素を最初に溶かした時点でバッファーを加えて、それによって標識プロトコールの間にスピードが重視される追加ステップを回避できるなら、使用者にとってより便利である。水溶液バッファーは、上記の理由により、予め溶かしたアミン反応性色素への添加と適合しない。
【００１８】
驚くべきことに、ポリマー化学で一般に使用されているビスピリジンが、グリコシルアミンの酸性色素又は塩基性色素による標識を、現在の標識プロトコールと比較して劇的に向上することが今般判明した。下記及び実施例に示すように、２つの異なるビスピリジン、２つの異なる酸性アミン反応性色素及び塩基性アミン反応性色素、並びに２つの異なる溶媒を用いた研究は、標識手順中のビスピリジンの存在が、ビスピリジンが存在しない標準的な標識手順に比べて、グリコシルアミンの驚くほどより完全な標識をもたらす結果となった。
【００１９】
図１は、例示的な糖タンパク質から遊離されたグリコシルアミンを標識するために酸性アミン反応性色素を用いて、（ａ）無水ＤＭＳＯ中に調製されたビスピリジンピリジン，４，４’−（１，２−エタンジイル）ビス−（「ＢＰＥ」、下記のビスピリジンのリストの化合物１）、（ｂ）無水ＤＭＳＯ中に調製されたビスピリジン４，４’−（１，３−プロパンジイル）ビス−ピリジン（「ＴＭＤ」、下記のビスピリジンのセクションの構造リストの化合物２）、（ｃ）ＤＭＳＯ中のピリジン（「ＰＹＲ」）、又は（ｄ）ピリジンもビスピリジンも含まないＤＭＳＯ（「対照」）の存在下で行った研究の結果を示す。図１に示されるように、ＤＭＳＯ中のピリジンの使用は、ＤＭＳＯのみの対照とほぼ同じグリカン標識をもたらした。対照的に、比較的十分な標識を形成するのに十分な標識（２．５μｌ）が存在すると、ＴＭＤの存在は、対照及びピリジン溶液と比較して標識されたグリコシルアミンの量をほぼ倍増し、その一方で、５μｌの色素を用いた場合、ＴＭＤ又はＢＰＥのいずれかの存在は、ピリジン又はＤＭＳＯ対照のいずれかを含有する混合物と比較して２倍を超えるグリカンを標識した。
【００２０】
理論に拘束されるものではないが、ビスピリジンの存在が溶液を緩衝化し、グリコシルアミン、アミン反応性色素、又はその両方を安定化し、グリコシルアミン又は色素が加水分解される前に多量のグリコシルアミンを標識できると考えられる。しかしながら、ｐＨ８のＨＥＰＥＳバッファーを含有する溶液中のＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素による酵素消化によってグリコシルアミンが糖タンパク質から遊離され、そのバッファーはのちに色素での標識に供された試料の各々に既に存在していたので、その結果は緩衝作用単独では説明できないかもしれない。
【００２１】
本発明の実施形態の基礎となる研究に基づいて、ビスピリジンは、アミン及びチオール、並びにタンパク質及びペプチドのグアニジン及びイミダゾール基、並びに核酸の環外アミンを含む求核剤の求電子標識による標識を向上するために使用できると考えられる。幾つかの実施形態では、標識はアミンとアミン反応性色素のものであり、幾つかの実施形態では、標識はチオールとチオール反応性色素のものである。幾つかの実施形態では、求核剤はアミンである。幾つかの実施形態では、求核剤はチオールである。標識は、蛍光色素などの光学的に検出できるもの、又はＭＳによって検出可能な固定電荷を付加できるもの、又はキャピラリー電気泳動などの動電学的な分離技術によって標識された部分の分離及び検出を容易にすることができるものである。
【００２２】
本発明の実施形態の基礎となるさらなる研究は、さまざまビスピリジンの、相異なる溶媒中での能力又は溶媒中で凍結を受ける能力の間に若干の差異が存在することを明らかにした。好ましい実施形態では、選択されたビスピリジンは、色素が溶けている溶媒中で室温にて可溶である。上で述べたように水はアミン反応性色素を加水分解するので、色素−ビスピリジン混合物の保存が望まれる用途では、溶媒は水ではないことが好ましい。
【００２３】
研究によって、例えば、上記の例示的なビスピリジンであるＴＭＤ及びＢＰＥがともにＤＭＳＯに可溶であり、ＴＭＤはジメチルホルムアミド（「ＤＭＦ」）溶媒にも可溶であることが見出された。研究された別のビスピリジン，４，４’−メチレンビス−ピリジン（下記リストの化合物２１）は、ＤＭＦには溶けないが、いくつかの標識手順で使用可能なジメチルスルホキシドなどの他の有機溶媒には可溶であることが予想される。上記のようにビスピリジンを含有しない同様の混合物と比べてグリカンの標識を劇的に増加させるビスピリジンＢＰＥは水溶液に可溶であった。しかしながら、このビスピリジンは、凍結すると溶液から出て、色素−ビスピリジン混合物を解凍したときに溶液に戻らなかった。したがって、このビスピリジンは、実行者が混合物を凍結させることによって保存する必要がない実施形態では非常に有用であるが、使用者が混合物を凍結させることによって保存寿命を延ばすことを望む実施形態では好ましくない。
【００２４】
ビスピリジンはまた、例えばβ−脱離によってＯ−グリカンから遊離したグリコシルアミンを標識するために使用することができる。さらにビスピリジンは、タンパク質又はペプチドに存在するシステインなどのチオールを標識するためのプロトコールにおいて使用することができる。ビスピリジンはまた、Ｎ末端（標識に利用可能な第一級アミンを有することができる）、又はリジン、アルギニン、又はヒスチジンなどのタンパク質の求核基の標識を向上するために使用されうる。同様に、ビスピリジンはまた、アデニン及びグアニンの環外アミンなどの核酸塩基の求核基の標識を向上するために使用されうる。最後に、ビスピリジンまた、溶液中での保存中に求電子標識の安定性を向上するために使用されうる。タンパク質、ペプチド、又は核酸のアミン及びチオールなどの求核剤が、標識される例示的な求核剤としてグリコシルアミンを用いる実施例で論じられたのと同じプロトコールを使用して標識できることを当業者なら認識するであろう。
【００２５】
いずれの特定のビスピリジンも、試験管中で選択された溶媒と混合し、溶液になるかどうかを観察するだけで、選択された溶媒に室温で可溶であるかどうかを容易に試験して判定することができる。同様に、いずれの特定のビスピリジンも、選択された溶媒にビスピリジンをいれ、生じた混合物を凍らせ、それを解凍し、ビスピリジンが凍結時に溶液に留まるかどうか、沈殿するかどうか、解凍時に混合物に可溶かどうかを観察することによって、使用者が、選択された溶媒に選択された色素を含有する溶液をのちに使用するために凍結させることになる用途に適するかどうか容易に試験して判定することができる。さらに、いずれの特定のビスピリジンも、（ａ）ビスピリジンの有り無しで標識の並列アリコート（parallel aliquots）を保存すること、（ｂ）次いで、過剰の上記求核剤にいずれかを各アリコートに加えることによってそれらを試験すること、（ｃ）標識求核剤の量を測定すること、及び（ｄ）標識求核剤の結果として得られた量が、ビスピリジンを含まないアリコートに比べて、ビスピリジンを含むアリコートにおいて多いか少ないかを判定することによって、溶液中での任意の特定の求電子標識の保存をよくするかどうかを容易に試験して確かめることができる。
【００２６】
本明細書で報告されている研究は、ビスピリジンが水溶液中で酸性又は塩基性である標識を使用する場合に特に有用であることを示す。水溶液中で中性である標識は、微量の水しか存在しえない有機溶媒に溶解された場合、十分に特徴付けられていないように作用する可能性がある。いずれの特定の中性標識も、前の段落で記載したように、ビスピリジン有り及び無しの中性標識の並列アリコートを試験することによって、特定のビスピリジンが存在しない場合よりもそれが存在するほうが対象の求核剤をより良好に標識するかどうかを容易に試験して判定することができる。
【００２７】
ビスピリジン
名称によって示唆されるように、ビスピリジンは２つのピリジン環を含む化合物の類である。ウィキペディアによって特徴付けられるように、ピリジン環はベンゼンに類似した複素環であるが、１つのメタン基が窒素で置き換えられている。化合物ピリジンは不快な魚様の臭いがあり、危険である。対照的に、ビスピリジンは不快な臭いがなく、可燃性でなく、ピリジンよりもかなり安全に且つ快適に使用できる。図１に示されるように、ピリジンに比べてビスピリジンは、グリコシルアミン（並びに拡大解釈して（by extension）他のアミン及び求核剤）を標識するためのプロトコールにおいて驚くほど優れた試薬であり、適切な量の標識が存在すると、その研究で使用されるアミン反応性色素でのグリコシルアミンの標識を大幅に向上させる。
【００２８】
ビスピリジンは、ポリマー化学で一般に使用されている。Chemical Abstract Services（CAS）によって維持管理されているSciFinder（登録商標）データベースの検索では、３つ以上の供給元から市販されている１００個を超えるビスピリジンが出てきた。以下の２１個のビスピリジンは、入手できるプロバイダー（providers）の数が最も多いとして列挙されたものであった。それぞれは、そのＣＡＳレジストリ番号、その構造、その化学組成、その学名によって識別される。下のリストは、本発明の方法で使用できるビスピリジンの例示に過ぎず、限定することを意図するものではないことが理解されよう。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【００２９】
求核剤反応性標識
数多くのアミン反応性標識が当技術分野において公知である。例えば、Thermo Fisher Scientific（Waltham, MA）のウェブサイトには、以下を含む152個の試薬が分類表示「Amine-Reactive Fluorophores, Biotins, Quantum Dots, & Other Labels」の下に掲載されている。１−ピレンブタン酸、スクシンイミジルエステル、２’，７’−ジフルオロフルオレセイン（Oregon Green（登録商標）488）、５（６）−ＣＲ  ６Ｇ、ＳＥ（５−（及び−６）−カルボキシローダミン  ６Ｇ、スクシンイミジルエステル）、混合異性体、並びに７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸。ProZyme, Inc.（Hayward、CA）は、塩基性色素、InstantPC（商標）（２−（ジエチルアミノ）エチル  ４−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルアミノ］ベンゾアート）を含む多様なアミン反応性標識を販売している。共有米国特許第８，１２４，７９２号に開示されている２つの酸標識（acid labels）、８−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルアミノ］ナフタレン−１，３，５−トリスルホン酸（「InstantANTS（商標）」）及び４−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルアミノ］安息香酸（「InstantAA（商標）」）を下で報告する実施例で使用した。InstantANTS（商標）はグリカンに３つの負電荷とフルオロフォアを付加し、キャピラリー電気泳動による分離と検出を容易にする。そして、Waters Corporation（Milford, MA）は、グリコシルアミンの標識に「RapiFluor-MS（商標）」を販売している。これらのアミン反応性標識を各々用いた標識を向上するためにビスピリジンが使用できると予想される。
【００３０】
同様に、数多くのチオール反応性標識が当技術分野において公知である。例えば、Thermo Fisher Scientificのウェブサイトには、以下を含む９４個の試薬がタイトル「Thiol-Reactive Fluorophores, Biotins & Other Labels」の下に掲載されている。BODIPY（登録商標）507/545 IA（Ｎ−（４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−イル）ヨードアセトアミド、５−（ブロモメチル）フルオレセイン、Alexa Fluor（登録商標）350 C5マレイミド、及びＤＡＣＭ、Ｎ−（７−ジメチルアミノ−４−メチルクマリン−３−イル））マレイミド。これらのチオール反応性標識を各々用いる標識を向上するためにビスピリジンが使用できると予想される。
【００３１】
上記の化合物は、「アミン反応性」又は「チオール反応性」あると供給業者によって指定された求電子剤であるが、多くの化合物は、タンパク質又はペプチドのグアニジン又はイミダゾール基及び核酸の環外アミンなどの対象の求核剤の他の部分も標識することになり、これらの求核剤を標識するために使用できることを当業者なら理解するであろう。いずれの特定の標識も、第１のアリコートに研究される標識を含み、第２のアリコートにおいて求核剤を標識することが知られている標識を含む、求核剤の並列アリコートを実行し、次いで２つのアリコートを分析し、研究されている標識がその求核剤を標識することが知られている標識と少なくとも同じくらい良好に求核剤を標識するかどうかを判定することによって、任意の所与の求核剤又は対象となる求核性部分を適切に標識するかどうかを容易に試験して確かめることができる。
【００３２】
濃度
典型的には、ビスピリジンは約０．５Ｍ〜約２．５Ｍの濃度で使用されることになり、幾つかの実施形態では、約０．５Ｍ〜約２．２５Ｍの濃度で使用されることになり、幾つかの実施形態では、約０．７５Ｍ〜約２．０Ｍの濃度で使用されることになり、幾つかの実施形態では、約０．８Ｍ〜約１．７５Ｍの濃度、より好ましくは約１Ｍ〜１．７５Ｍの濃度で使用されることになり、幾つかの実施形態では、約１Ｍ〜約１．５Ｍの濃度で使用されることになり、幾つかの実施形態では、約０．８Ｍ〜約１．２５Ｍの濃度、さらにより好ましくは約１Ｍの濃度で使用されることになる。ここで「約」という用語は、プラス又はマイナス０．２Ｍを意味する。
【００３３】
ビスピリジンの除去
幾つかの実施形態では、標識化合物を質量分析などの分析技術に供する前にビスピリジンを除去することが望ましい場合がある。ビスピリジンは、当該技術分野において公知のいずれかの簡便な手段によって除去することができる。好ましい実施形態において、ビスピリジンは、固相カートリッジ又は溶液から望ましくない成分を除去するために当該分野で用いられる他の固相抽出装置を使用することによって除去される。標識されたグリカンは、典型的には、選択されたクリーンアップカートリッジに充填され、洗浄されて大部分の非グリカン混入物質を除去し、そののちに溶出される。標識されたグリカンのクリーンアップ手順は、当技術分野において慣習的に使用されており、グリカンの標識及び分析の分野の当業者には周知であると予想される。
【実施例】
【００３４】
実施例１
本実施例は、以下の実施例のいくつかにおいて例示的なビスピリジンを用いて行われる脱グリコシル化及び標識手順の例示的なワークフローで使用される試薬のいくつかに関する略語を示す。
【００３５】
「ＨＥＰＥＳ」：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
【００３６】
「ＤＭＦ」：ジメチルホルムアミド
【００３７】
「ＤＭＳＯ」：ジメチルスルホキシド
【００３８】
「ＴＭＤ」：ピリジン，４，４’−（１，３−プロパンジイル）ビス−
【００３９】
「ＢＰＥ」：ピリジン，４，４’−（１，２−エタンジイル）ビス−
【００４０】
「ＰＮＧａｓｅ  Ｆミックス」：ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（〜１ｍｇ／ｍｌ）と７５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０バッファーの１：１混合物。
【００４１】
実施例２
本実施例は、例示的なビスピリジンを用いてアミン反応性化合物を脱グリコシル化及び標識するための例示的なワークフローを示す。
【００４２】
変性ステップ
２０μｌの２ｍｇ／ｍｌ糖タンパク質をＰＣＲプレートの底に加える。２μｌの界面活性剤、例えばラウロイルサルコシンナトリウムなどを加える。随意に、ビス（２−メルカプトエチル）スルホンなどの還元剤を加えることができる。混合物を９０℃で３分間インキュベーションする。
【００４３】
酵素消化ステップ
２μｌのＰＮＧａｓｅ  Ｆミックスを加える。結果として生じる混合物を５０℃で５分間インキュベーションする。
【００４４】
標識ステップ
遊離させたグリコシルアミンを、選択した色素で標識する。色素は典型的には蛍光色素であり、いくつかの実施形態では質量分析に適合もする。一例として、色素は、InstantPC（ProZyme, Inc.、Hayward、CA）として販売されている活性型プロカインであることができる。例えば、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの作用によって糖タンパク質から遊離させるグリカンを、最初にグリコサミンとして遊離させ、そのグリコサミンを、例えば、ＤＭＳＯ中の０．２Ｍ  ２−ジエチルアミノエチル  ４−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルアミノ］ベンゾアートと１Ｍ  ＴＭＤの新鮮に調製した１：１混合物を５μｌ加えることによって標識することができる。標識を２分間進行させる。
【００４５】
クリーンアップステップ
所望により、標識したグリカンは、１つ以上分析技術で分析する前に、例えばカートリッジに載せることによる固相抽出に供することによって、分析の前にクリーンアップすることができる。例えば、カートリッジを２００μｌの１：３：９６のギ酸：水：アセトニトリル溶液で３００×ｇで３分間洗浄することができ、２０％ＤＭＳＯを含有する５０μｌの２００ｍＭギ酸アンモニウム溶液、ｐＨ７で試料を溶出する。
【００４６】
分析ステップ
溶出後、ＰＮＧａｓｅ  Ｆで遊離させたグリカンを分析することができる。例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析のために１μｌの溶出試料を注入することができる。
【００４７】
実施例３
本実施例は、グリコシルアミンの標識におけるビスピリジンの使用に関する研究の効果を報告する。
【００４８】
例示的な糖タンパク質であるブタガンマグロブリンを、例示的な脱グリコシル化酵素であるＰＮＧａｓｅ  Ｆによる酵素消化に供した。糖タンパク質から遊離させたグリコシルアミンを、ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ８を含有し、無水ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）を溶媒として用い、４つの異なる量、０．１μｌ、１μｌ、２．５μｌ、又は５μｌの酸性色素、８−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルアミノ］ナフタレン−１，３，５−トリスルホン酸を０．２Ｍの濃度で用いて、２．５μｌの以下のものの存在下で標識した。（ａ）１Ｍ  ピリジン，４，４’−（１，３−プロパンジイル）ビス−（「ＴＭＤ」）、（ｂ）１Ｍ  ピリジン，４，４’−（１，２−エタンジイル）ビス−（「ＢＰＥ」）、又は（ｃ）１Ｍピリジン（「ＰＹＲ」）。これらの各々はやはり無水ＤＭＳＯで調製した。対照として、同量の色素を用いて、ＤＭＳＯ溶媒のみを用いてもグリコシルアミンを標識した（「対照」）。標識したグリカンをＨＰＬＣで分析し、全蛍光シグナルを、励起については３１０ｎｍ、発光については４３０ｎｍの蛍光波長を用いて測定した。
【００４９】
図１に示されるように、すべての試験において、混合物中にピリジンが存在する場合に標識された量は、ＤＭＳＯがピリジンなしで存在する場合に標識された量に非常に近かった。対照的に、色素が、存在するグリコシルアミンの大部分を標識するのに十分な量で存在すると、ビスピリジンのいずれかの存在下で標識された量は、対照又はピリジンの存在下で標識された量よりも驚くほど多かった。２．５μｌの色素が存在した場合、ＢＰＥの存在は、ＤＭＳＯのみを用いて標識された量と比べて標識されたグリコシルアミンの量を約７０％増加させ、一方でＴＭＤの存在は標識されたグリカンを１００％足らず増加させた。５μｌの色素を使用した場合、ＢＰＥ及びＴＭＤはともに、相対蛍光単位又は「ＲＦＵ」によって示される標識グリコシルアミンの量を２倍以上にする結果をもたらした。
【００５０】
実施例４
本実施例は、グリコシルアミンの標識に対するさまざまな濃度のビスピリジンの効果を判定するための研究の効果を報告する。
【００５１】
例示的な糖タンパク質であるブタガンマグロブリンを、例示的な脱グリコシル化酵素であるＰＮＧａｓｅ  Ｆによる酵素消化に供した。糖タンパク質から遊離させたグリコシルアミンを、ジメチルホルムアミド（「ＤＭＦ」）を溶媒として用いて、（ａ）対照としてＤＭＦ単独（ｂ）２．５μｌの４Ｍ  ＴＭＤ、又は（ｃ）１Ｍ  ＴＭＤの存在下で、２．５μｌの酸性色素、４−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルアミノ］安息香酸を０．２Ｍの濃度で用いて標識した。標識したグリカンをＨＰＬＣで分析し、総蛍光シグナルを、励起については３８０ｎｍ、発光については４３０ｎｍの蛍光波長を用いて測定した。
【００５２】
図２に示されるように、１Ｍ  ＴＭＤの使用は、対照、溶媒単独の使用と比べて、２倍足らずの標識グリコシルアミンの量をもたらした。４Ｍ  ＴＭＤの使用は、標識グリコシルアミンの６９％を超える増加をもたらし、一方で１Ｍ  ＴＭＤの使用は、標識グリコシルアミンの８６％を超える増加をもたらした。便利のよいように、標識グリコシルアミンの量の平均読み取り値を、図２において各バーの上に数値で示し、エラーバーは１標準偏差を示す。
【００５３】
実施例５
本実施例は、グリコシルアミンを標識する際のビスピリジンの至適濃度を決める研究の効果を報告している。
【００５４】
例示的な糖タンパク質であるブタガンマグロブリンを、例示的脱グリコシル化酵素であるＰＮＧａｓｅ  Ｆによる酵素消化に供した。２．５μｌの塩基性色素InstantPC（商標）（ProZyme, Inc.、Hayward、CA）をＤＭＦ中に０．２Ｍの濃度で、２．５μｌの０．５、１、１．５、又は２Ｍ  ＴＭＤと混合して用いて、糖タンパク質から遊離させたグリコシルアミンを標識した。次いで、標識したグリカンをＨＰＬＣで分析し、総蛍光シグナルを、励起については２８５ｎｍ、発光については３４５ｎｍの蛍光波長を用いて測定した。図３に示されるように、この色素と、１Ｍ、１．５Ｍ、及び２Ｍ  ＴＭＤを用いて、非常に類似した量の標識が見られた。
【００５５】
実施例６
本実施例は、例示的なビスピリジンを含有する溶液中の例示的な塩基性標識で、例示的な求核剤であるグリコシルアミンを標識するための溶液を調製する例示的なプロトコールを記載する。
【００５６】
０．５Ｍ  ＴＭＤの無水ＤＭＦ溶液を調製する。１５０μｌのこの溶液を、３０ｍｇの乾燥InstantPC（商標）（２−（ジエチルアミノ）エチル  ４−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルアミノ］安息香酸塩）に加える。５μｌのこの溶液（ＤＭＦ中の０．５Ｍ  ＴＭＤとInstantPC（商標））を、ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ８中のグリコシルアミンを含有する２５μｌのタンパク質消化物に加える。
【００５７】
本明細書に記載の実施例及び実施形態は、単なる例示目的のものに過ぎず、それらを鑑みてさまざまな修正又は変更が当業者に示唆されることになり、本出願の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解されよう。本明細書で引用した全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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