(57)【要約】本開示は、誘導心筋細胞を生成するための方法を提供する。本開示は、心血管疾患を治療するための方法および組成物をさらに提供する。本開示は、非心筋細胞哺乳動物細胞を、例えば、心筋細胞または心筋細胞様細胞へと誘導するための向上された方法を提供する。本開示は、ヒト細胞を、ヒト心臓細胞、例えばヒト心筋細胞へと誘導するための方法を提供する。本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの誘導心筋細胞の効率的な生成を可能にする、リプログラミング因子および導入作用剤の組合せの使用を提供する。
2019513366.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、有効量のＷＮＴ阻害剤および１つまたは複数のリプログラミング因子を導入することを含み、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する、方法。
【請求項２】
前記ＷＮＴ阻害剤が低分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＷＮＴ阻害剤がｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、有効量のＴＧＦ−β阻害剤および１つまたは複数のリプログラミング因子を導入することを含み、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する、方法。
【請求項５】
前記ＴＧＦ−β阻害剤が低分子である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＧＦ−β阻害剤がｓｉＲＮＡである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、有効量のＷＮＴ阻害剤、有効量のＴＧＦ−β阻害剤、および１つまたは複数のリプログラミング因子を導入することを含み、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する、方法。
【請求項８】
前記非心筋細胞が、ヒト細胞である、請求項１〜８に記載の方法。
【請求項９】
前記ＷＮＴ阻害剤が低分子である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＷＮＴ阻害剤がｓｉＲＮＡである、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＧＦ−β阻害剤が低分子である、請求項７〜１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＧＦ−β阻害剤がｓｉＲＮＡである、請求項７〜１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＧＦ−β阻害剤が、前記ＷＮＴ阻害剤を投与する前に投与される、請求項７〜１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＴＧＦ−β阻害剤が、前記ＷＮＴ阻害剤の投与と同時に投与される、請求項７〜１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記非心筋細胞が、体細胞、心臓線維芽細胞、非心臓線維芽細胞、心臓前駆細胞、および幹細胞からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
投与される前記リプログラミング因子が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５を含む、請求項１〜１５に記載の方法。
【請求項１７】
投与される前記リプログラミング因子が、ミオカルディン、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５を含む、請求項１〜１５に記載の方法。
【請求項１８】
誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、有効量のＷＮＴ阻害剤、有効量のＴＧＦ−β阻害剤、ならびにＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５を含むリプログラミング因子を投与することを含み、それにより誘導心筋細胞を生成する、方法。
【請求項１９】
誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、有効量のＷＮＴ阻害剤、有効量のＴＧＦ−β阻害剤、ならびにミオカルディン、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５を含むリプログラミング因子を投与することを含み、それにより誘導心筋細胞を生成する、方法。
【請求項２０】
前記非心筋細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで心筋細胞へと誘導される、請求項１〜１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗炎症剤を投与することをさらに含む、請求項１〜１９に記載の方法。
【請求項２２】
ｉｎ  ｖｉｖｏで誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成するための方法であって、対象に、有効量のＷＮＴ阻害剤、有効量のＴＧＦ−β阻害剤、および１つまたは複数のリプログラミング因子を投与することを含み、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する、方法。
【請求項２３】
前記非心筋細胞が、ヒト細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＷＮＴ阻害剤が低分子である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＷＮＴ阻害剤がｓｉＲＮＡである、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＴＧＦ−β阻害剤が低分子である、請求項２２〜２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＴＧＦ−β阻害剤がｓｉＲＮＡである、請求項２２〜２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＴＧＦ−β阻害剤が、前記ＷＮＴ阻害剤を投与する前に投与される、請求項２２〜２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＴＧＦ−β阻害剤が、前記ＷＮＴ阻害剤の投与と同時に投与される、請求項２２〜２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記リプログラミング因子が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５を含む、請求項２２〜２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記リプログラミング因子が、ミオカルディン、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５を含む、請求項２２〜２９に記載の方法。
【請求項３２】
抗炎症剤を投与することをさらに含む、請求項２２〜３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜２１に記載の方法に従って産生された単離された誘導心筋細胞の集団を含む組成物。
【請求項３４】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
安定化剤および／または保存剤をさらに含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
請求項１〜２１に記載の心筋細胞の実質的に均質な集団。
【請求項３７】
心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法により産生された有効量の誘導心筋細胞集団を投与することを含む方法。
【請求項３８】
心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のＷＮＴ阻害剤、有効量のＴＧＦ−β阻害剤、および１つまたは複数のリプログラミング因子を投与することを含む方法。
【請求項３９】
前記１つまたは複数のリプログラミング因子が、ミオカルディン、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つまたは複数のリプログラミング因子が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記対象に、有効量の抗炎症剤を投与することをさらに含む、請求項３８〜４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年３月３０日に出願された米国仮出願番号第６２／３１５,４３７号、および２０１６年８月３日に出願された米国仮出願番号第６２／３７０,３４４号に基づく優先権を主張しており、これらの仮出願は、すべての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書によって援用される。
【０００２】
ＮＩＨ資金提供に関する記載
本発明は、国立衛生研究所が授与した補助金ＨＬ１００４０６に基づく政府支援でなされたものである。政府は、本発明にある特定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、概して、細胞リプログラミングおよび細胞分化の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
以下の論述において、ある特定の物品および方法が、背景および導入の目的で記載される。本明細書の記載はいずれも、従来技術の「承認」として解釈されるべきでない。本出願人は、必要に応じて、本明細書で参照されている物品および方法が、適用される法規条項に基づき従来技術を構成しないことを説明する権利を明示的に留保する。
【０００５】
心筋梗塞（ＭＩ）または心臓発作は、心臓の血流の遮断により引き起こされ、これは、酸素レベルを低下させ、組織を損傷し（虚血）、ほぼ１０億個の心筋細胞を死滅させる場合がある。Burridgeら（２０１２年）Cell  Stem  Cell、１０巻：１６〜２８頁。
【０００６】
ＭＩ後、線維芽細胞は、梗塞区域内に遊走して増殖し、電気生理学的に駆動される心臓の収縮に寄与することができない、心筋細胞が枯渇した傷痕を作り出す。心不全が続いて起こることが多く、疲労、末梢性浮腫、および死亡にさえ至る。
【０００７】
誘導心筋細胞様マウス細胞（ｉＣＭ）の生成が最初に成功して以来、哺乳動物細胞の心臓リプログラミングを誘導または増強するために使用することができる遺伝子の組合せが特定されている。Iedaら（２０１０年）Cell、１４２巻：３７５〜３８６頁；Christoforouら（２０１３年）PLoS  ONE、８巻：e63577；Addisら（２０１３年）J.  Mol.  Cell  Cardiol.、６０巻：９７〜１０６頁；Jayawardenaら（２０１２年）Circ.  Res.、１１０巻：１４６５〜１４７３頁；Nam  Yら、PNAS  USA.、２０１３年；１１０巻：５５８８〜５５９３頁；Wada  Rら、PNAS  USA.、２０１３年；１１０巻：１２６６７〜１２６７２頁；およびFu  Jら、Stem  Cell  Reports.、２０１３年；１巻：２３５〜２４７頁。リプログラミングは、最初のリプログラミングカクテル中に、因子Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２Ｃ、およびＴｂｘ５、Ｈａｎｄ２、Ｎｋｘ２．５、ミオカルディン、ＳＲＦ、Ｍｅｓｐ１、またはｍｉＲ−１３３を含む、ある特定の中心的な転写因子（ＴＦ）を使用することに基づいている。より最近では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたｉＣＭの品質および効率には幾つかのわずかな向上がなされている。Wangら（２０１５年）Circ.  Res.１１６巻：２３７〜２４頁。
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究でも、リプログラミングされたｉＣＭが産生されている。例えば、心臓リプログラミングカクテルを傷害マウス心臓にｉｎ  ｖｉｖｏで導入すると、リプログラミングされたｉＣＭが産生され、心臓機能が増加し、傷害後の傷痕サイズが減少した。しかしながら、心臓機能は完全には回復しなかった。Jayawardenaら（２０１２年）Circ.  Res.、１１０巻：１４６５〜１４７３頁；Qianら（２０１２年）Nature、４８５巻：５９３〜５９８頁。心臓機能および傷痕サイズは、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２Ｃ、およびＴｂｘ５により向上し、チモシンβ４およびＶＥＧＦでさらに増強された。Bock-Marquetteら（２００４年）Nature、４３２巻：４６６〜４７２頁；Mathisonら（２０１２年）J.  Am.  Heart  Assoc.、１巻：e005652。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Burridgeら（２０１２年）Cell  Stem  Cell、１０巻：１６〜２８頁
【非特許文献２】Iedaら（２０１０年）Cell、１４２巻：３７５〜３８６頁
【非特許文献３】Christoforouら（２０１３年）PLoS  ONE、８巻：e63577
【非特許文献４】Addisら（２０１３年）J.  Mol.  Cell  Cardiol.、６０巻：９７〜１０６頁
【非特許文献５】Jayawardenaら（２０１２年）Circ.  Res.、１１０巻：１４６５〜１４７３頁
【非特許文献６】Nam  Yら、PNAS  USA.、２０１３年；１１０巻：５５８８〜５５９３頁
【非特許文献７】Wada  Rら、PNAS  USA.、２０１３年；１１０巻：１２６６７〜１２６７２頁
【非特許文献８】Fu  Jら、Stem  Cell  Reports.、２０１３年；１巻：２３５〜２４７頁
【非特許文献９】Wangら（２０１５年）Circ.  Res.１１６巻：２３７〜２４頁
【非特許文献１０】Jayawardenaら（２０１２年）Circ.  Res.、１１０巻：１４６５〜１４７３頁
【非特許文献１１】Qianら（２０１２年）Nature、４８５巻：５９３〜５９８頁
【非特許文献１２】Bock-Marquetteら（２００４年）Nature、４３２巻：４６６〜４７２頁
【非特許文献１３】Mathisonら（２０１２年）J.  Am.  Heart  Assoc.、１巻：e005652
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
多大な努力にも関わらず、心不全に有効な療法は、依然として見つかっていない。心臓状態を治療するためのより良好な治療手法の開発に結び付くことになる、リプログラミングおよび心臓細胞運命転換を向上させる必要性が依然として存在している。本発明は、この必要性に取り組むものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
本発明は、非心筋細胞哺乳動物細胞を、例えば、心筋細胞または心筋細胞様細胞へと誘導するための向上された方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒト細胞を、ヒト心臓細胞、例えばヒト心筋細胞へと誘導するための方法を提供する。本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの誘導心筋細胞の効率的な生成を可能にする、リプログラミング因子および導入作用剤の組合せの使用を提供する。
【００１１】
一態様では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、有効量の１つまたは複数のリプログラミング因子および１つまたは複数の作用剤を非心筋細胞に投与することを含み、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する方法を提供する。リプログラミング因子および作用剤を投与する方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施して、誘導心筋細胞を生成することができる。
【００１２】
特定の態様では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、ＷＮＴ活性を阻害する有効量の作用剤を投与することを含む方法を提供する。他の特定の態様では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、ＷＮＴ活性を阻害する有効量の作用剤および少なくとも１つのリプログラミング因子を投与することを含む方法を提供する。さらに他の特定の態様では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、ＷＮＴ活性を阻害する有効量の作用剤および抗炎症剤を投与することを含む方法を提供する。関連する態様では、ｉｎ  ｖｉｖｏで誘導心筋細胞を生成するために、対象にＷＮＴ活性を阻害する作用剤を投与する方法が提供される。そのような作用剤の非限定的な例としては、本明細書でより詳しく記載されているような、ＷＮＴ活性の低分子阻害剤およびＷＮＴ活性のｓｉＲＮＡ阻害剤が挙げられる。
【００１３】
他の態様では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、ＴＧＦ−β活性を阻害する有効量の作用剤を投与することを含む方法を提供する。他の特定の態様では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、ＴＧＦ−β活性を阻害する有効量の作用剤および少なくとも１つのリプログラミング因子を投与することを含む方法を提供する。さらに他の特定の態様では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、ＴＧＦ−β活性を阻害する有効量の作用剤および抗炎症剤を投与することを含む方法を提供する。関連する態様では、ｉｎ  ｖｉｖｏで誘導心筋細胞を生成するために、対象にＴＧＦ−β活性を阻害する作用剤を投与するための方法が提供される。そのような作用剤の非限定的な例としては、本明細書により詳しく記載されているような、ＴＧＦ−β活性の低分子阻害剤およびＴＧＦ−β活性のｓｉＲＮＡ阻害剤が挙げられる。
【００１４】
ある特定の態様では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、有効量のＷＮＴ阻害剤、有効量のＴＧＦ−β阻害剤、および１つまたは複数のリプログラミング因子を投与することを含み、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する方法を提供する。
【００１５】
本発明で使用される例示的なリプログラミング因子としては、例えば、Ｂａｆ６０ｃ、Ｅｓｒｒｇ、Ｇａｔａ４、Ｇａｔａ６、Ｈａｎｄ２、Ｉｒｘ４、Ｉｓｌ１、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｅｓｐ１、Ｍｅｓｐ２、ミオカルディン、Ｎｋｘ２．５、ＳＲＦ、Ｔｂｘ５、Ｔｂｘ２０、Ｚｆｐｍ２、ｍｉＲ−１３３、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【００１６】
ある特定の態様では、ＷＮＴ阻害剤および／またはＴＧＦ−β阻害剤は、低分子である。他のある特定の態様では、ＷＮＴ阻害剤および／またはＴＧＦ−β阻害剤は、それぞれＷＮＴシグナル伝達活性またはＴＧＦ−βシグナル伝達活性を阻害するｓｉＲＮＡである。ＷＮＴ阻害剤およびＴＧＦ−β阻害剤を両方とも投与する場合、ＴＧＦ−β阻害剤は、ＷＮＴ阻害剤の投与前に投与してもよく、またはＷＮＴ阻害剤の投与と同時に投与してもよい。
【００１７】
使用される非心筋細胞は、心筋細胞へと誘導し易い任意の細胞であってもよい。非限定的な例としては、体細胞、心臓線維芽細胞、非心臓線維芽細胞、心臓前駆細胞、および幹細胞が挙げられる。特定の態様では、非心筋細胞はヒト細胞である。
【００１８】
特定の実施形態では、非心筋細胞に投与されるリプログラミング因子は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５（すなわち、ＧＭＴ）を含む。他の特定の実施形態では、非心筋細胞に投与されるリプログラミング因子は、ミオカルディン、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５（すなわち、ＭＭＴ）を含む。さらに他の特定の実施形態では、非心筋細胞に投与されるリプログラミング因子は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、およびミオカルディン（すなわち、４Ｆ）を含む。他の実施形態では、リプログラミング因子は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５、Ｅｓｓｒｇ、ミオカルディン、Ｚｆｐｍ２、およびＭｅｓｐ１（すなわち、７Ｆ）を含む。
【００１９】
したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、有効量のＷＮＴ阻害剤、有効量のＴＧＦ−β阻害剤、ならびにＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５（すなわち「ＧＭＴ」）を含むリプログラミング因子を投与することを含む方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、有効量のＷＮＴ阻害剤、有効量のＴＧＦ−β阻害剤、ならびにミオカルディン、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５（すなわち「ＭＭＴ」）を含むリプログラミング因子を投与することを含む方法を提供する。また、これらの方法は、抗炎症剤の投与を含んでいてもよい。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。
【００２０】
ＴＧＦ−β阻害剤およびＷＮＴ阻害剤は、同時にまたは順次に対象に投与してもよく、また、１つまたは複数のリプログラミング因子および／または抗炎症剤と同時にまたは順次に投与してもよい。より特定の態様では、ＷＮＴ阻害剤を添加する前に、第１の期間にわたって非心筋細胞に有効量のＴＧＦ−β阻害剤を投与することにより、誘導心筋細胞を生成するための方法が提供される。別の特定の態様では、ＷＮＴ阻害剤の添加と同時に、非心筋細胞に有効量のＴＧＦ−β阻害剤を投与することにより、誘導心筋細胞を生成するための方法が提供される。
【００２１】
特定の態様では、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２Ｃ、およびＴｂｘ５と組み合わせて、有効量のＴＧＦ−β阻害剤および有効量のＷＮＴ阻害剤と共に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非心筋細胞を培養することにより、誘導心筋細胞を生成するための方法が提供される。他の特定の態様では、ミオカルディン、Ｍｅｆ２Ｃ、およびＴｂｘ５と組み合わせて、有効量のＴＧＦ−β阻害剤および有効量のＷＮＴ阻害剤と共に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非心筋細胞を培養することにより、誘導心筋細胞を生成するための方法が提供される。
【００２２】
特定の態様では、方法では、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５を含むリプログラミング因子が使用される。他の特定の態様では、方法では、ミオカルディン、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５を含むリプログラミング因子が使用される。また、方法は、対象に、コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン）などのステロイド系抗炎症剤または非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含む、有効量の抗炎症分子を投与することをさらに含んでもよい。
【００２３】
ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、および１つまたは複数のリプログラミング因子の使用に加えて、コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン）を非心筋細胞に投与して、心筋細胞または心筋細胞様細胞への細胞の誘導の効率を増加させることができる。
【００２４】
本発明は、心血管疾患を治療するための種々の方法を提供する。ある特定の態様では、本開示は、心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のＷＮＴ阻害剤を投与することを含み、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する方法を提供する。他の態様では、本開示は、心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のＴＧＦ−β阻害剤を投与することを含み、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する方法を提供する。好ましい態様では、本開示は、心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のＷＮＴ阻害剤および有効量のＴＧＦ−β阻害剤を投与することを含み、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する方法を提供する。
【００２５】
したがって、別の特定の実施形態では、本発明は、心血管疾患を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、有効量のＷＮＴ阻害剤、有効量のＴＧＦ−β阻害剤、および１つまたは複数のリプログラミング因子を投与することを含む方法を提供する。本発明のある特定の態様では、ＷＮＴ阻害剤および／またはＴＧＦ−β阻害剤は、低分子であってもよい。本発明の他の態様では、ＷＮＴ阻害剤および／またはＴＧＦ−β阻害剤は、ｓｉＲＮＡ分子であってもよい。本発明のある特定の態様では、投与することができるリプログラミング因子としては、例えば、Ｂａｆ６０ｃ、Ｅｓｒｒｇ、Ｇａｔａ４、Ｇａｔａ６、Ｈａｎｄ２、Ｉｒｘ４、Ｉｓｌ１、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｅｓｐ１、Ｍｅｓｐ２、ミオカルディン、Ｎｋｘ２．５、ＳＲＦ、Ｔｂｘ５、Ｔｂｘ２０、Ｚｆｐｍ２、ｍｉＲ−１３３、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。好ましい態様では、リプログラミング因子、例えば、Ｂａｆ６０ｃ、Ｅｓｒｒｇ、Ｇａｔａ４、Ｇａｔａ６、Ｈａｎｄ２、Ｉｒｘ４、Ｉｓｌ１、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｅｓｐ１、Ｍｅｓｐ２、ミオカルディン、Ｎｋｘ２．５、ＳＲＦ、Ｔｂｘ５、Ｔｂｘ２０、Ｚｆｐｍ２、ｍｉＲ−１３３、またはそれらの任意の組合せの他の組合せの投与と組み合わせて、非心筋細胞に有効量のＴＧＦ−β阻害剤および有効量のＷＮＴ阻害剤を投与することにより、誘導心筋細胞を生成するための方法が提供される。
【００２６】
特定の態様では、心血管疾患を治療する方法は、それを必要とする対象に、有効量のＷＮＴ阻害剤および有効量のＴＧＦ−β阻害剤を、リプログラミングカクテルＧＭＴと共に投与して、対象中にｉｎ  ｖｉｖｏで誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成することを含む。他の特定の態様では、心血管疾患を治療する方法は、それを必要とする対象に、有効量のＷＮＴ阻害剤および有効量のＴＧＦ−β阻害剤を、リプログラミングカクテルＭＭＴと共に投与して、対象中にｉｎ  ｖｉｖｏで誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成することを含む。
【００２７】
他の実施形態では、本発明は、心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の方法により産生された有効量の誘導心筋細胞を投与することを含む方法を提供する。さらに別の態様では、本開示は、本明細書に記載の単離された誘導心筋細胞の集団、および担体、任意選択で薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、安定化剤および／または保存剤をさらに含む。
【００２８】
一部の実施形態では、非心筋細胞は、ＷＮＴ阻害剤を添加する前に、例えば、ＷＮＴ阻害剤を添加する約６時間〜約７２時間前に、ＴＧＦ−β阻害剤の存在下で、ある期間にわたって培養される。１つの好ましい実施形態では、非心筋細胞は、ＷＮＴ阻害剤を添加する前に約２４時間にわたってＴＧＦ−β阻害剤の存在下で培養される。一部の実施形態では、非心筋細胞は、ある期間にわたってＴＧＦ−β阻害剤およびＷＮＴ阻害剤の存在下で同時に培養される。
【００２９】
一部の実施形態では、本発明は、本発明の方法により生成された単離された誘導心筋細胞であって、少なくとも１つの心臓遺伝子を、天然に存在する心筋細胞よりも高いレベルまたは低いレベルで発現する誘導心筋細胞を提供する。ある特定の態様では、誘導心筋細胞の実質的に均質な集団が生成される。一部の実施形態では、実質的に均質な集団の誘導心筋細胞は、少なくとも１つの心臓遺伝子を、天然に存在する心筋細胞よりも高いレベルまたは低いレベルで発現する。
【００３０】
本発明のある特定の態様は、単離された誘導心筋細胞の集団を含む組成物の産生を含む。そのような組成物は、例えば、担体、薬学的に許容される賦形剤、安定化剤、および／または保存剤をさらに含んでいてもよい。特定の態様では、組成物は、実質的に均質である単離された誘導心筋細胞の集団を含む。
【００３１】
一部の実施形態では、方法は、ＴＧＦ−β阻害剤を非心筋細胞に投与した後で、ＴＧＦ−β活性化因子を細胞に投与することを含む。
【００３２】
一部の実施形態では、非心筋細胞は、体細胞、心臓線維芽細胞、非心臓線維芽細胞、心臓前駆細胞、および幹細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、非心筋細胞は、哺乳動物非心筋細胞である。好ましい実施形態では、非心筋細胞は、ヒト非心筋細胞である。
【００３３】
一部の実施形態では、非心筋細胞は、リプログラミング因子を導入した約１２時間〜約３６時間後に、ＴＧＦ−β阻害剤と最初に接触させる。他の実施形態では、非心筋細胞は、リプログラミング因子を導入した約２４時間〜約７２時間後に、ＷＮＴ阻害剤と最初に接触させる。
【００３４】
一部の実施形態では、ＷＮＴ阻害剤は、ＸＡＶ９３９、Ｄ４４７６、ＩＷＲ１、およびミリセチンからなる群から選択される。他の実施形態では、ＷＮＴ阻害剤は、ＷＮＴまたはＷＮＴシグナル伝達経路のメンバーに対するｓｉＲＮＡである。
【００３５】
一部の実施形態では、ＴＧＦ−β阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、Ｄ４４７６、ＬＤＮ−１９３１８９、デキサメタゾン、およびＬＹ３６４９４７からなる群から選択される。他の実施形態では、ＴＧＦ−β阻害剤は、ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−βシグナル伝達経路のメンバーに対するｓｉＲＮＡである。
【００３６】
一部の実施形態では、ＷＮＴ阻害剤および／またはＴＧＦ−β阻害剤は、それぞれＷＮＴ経路および／またはＴＧＦ−β経路の活性を阻害するｓｉＲＮＡ分子である。
【００３７】
一部の実施形態では、ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、またはその両方は、リプログラミングの１０日目後に除去される。
【００３８】
一部の実施形態では、ＴＧＦ−β阻害剤は、ＷＮＴ阻害剤を投与する前に、例えば、ＷＮＴ阻害剤を投与する約６時間〜約７２時間前に、ある期間にわたって、対象に投与される。１つの好ましい実施形態では、対象には、ＷＮＴ阻害剤を投与する前に約２４時間にわたってＴＧＦ−β阻害剤が投与される。一部の実施形態では、対象には、ある期間にわたってＴＧＦ−β阻害剤およびＷＮＴ阻害剤が同時に投与される。
【００３９】
一部の実施形態では、ＴＧＦ−β阻害剤は、リプログラミング因子を導入した約１２時間〜約３６時間後に、対象に投与される。他の実施形態では、ＷＮＴ阻害剤は、リプログラミング因子を導入した約２４時間〜約７２時間後に、対象に投与される。
【００４０】
本発明のこれらの態様ならびに他の特徴および利点は、下記により詳細に記載されている。当業者であれば、日常的な実験を使用するだけで、本明細書に記載されている本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し得るか、または確認し得る。そのような等価物は、以下の開示および特許請求の範囲により包含されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、直接心臓リプログラミングにおけるＷＮＴおよびＴＧＦ−βシグナル伝達障壁を、Ｔｈｙ１＋マウス心臓線維芽細胞中でα−ＭＨＣ−ＧＦＰリポーターを使用して示す薬物スクリーニング戦略の模式図である。
【００４２】
【図２】図２は、図１の薬物スクリーニング戦略を使用して特定された５５００個の化合物のＺスコアプロットであり、Ｚスコアが５を超える上位ヒットを示す。
【００４３】
【図３】図３は、図１の薬物クリーニング戦略を使用した有効ヒットの効率を示す棒グラフであり、有効ヒットのうち７つがＴＧＦ−βまたはＷＮＴを阻害する（ｎ＝３）。
【００４４】
【図４】図４は、様々な投薬量のＳＢ４３１５４２が、ＧＭＴのリプログラミング効率に及ぼす効果の定量化を示す棒グラフである（ｎ＝２、独立実験、＊ｐ＜０．０５）。
【００４５】
【図５】図５は、様々な時点でのＳＢ４３１５４２の添加が、ＧＭＴのリプログラミング効率に及ぼす効果の定量化を示す棒グラフである（ｎ＝２、独立実験、＊ｐ＜０．０５）。
【００４６】
【図６】図６は、様々な時点でのＸＡＶ９３９の添加が、ＧＭＴのリプログラミング効率に及ぼす効果の定量化を示す棒グラフである（ｎ＝２、独立実験、＊ｐ＜０．０５）。
【００４７】
【図７】図７は、単独でまたはＳＢ４３１５４２の存在下もしくは非存在下のいずれかにおいて、様々な投薬量のＸＡＶ９３９が、ＧＭＴのリプログラミング効率に及ぼす効果の定量化を示す棒グラフである（ｎ＝２、独立実験、＊ｐ＜０．０５）。
【００４８】
【図８】図８は、１日目にＳＢ４３１５４２を添加した場合の様々な投薬量のＸＡＶ９３９が、ＧＭＴのリプログラミング効率に及ぼす効果の定量化を示す棒グラフである（ｎ＝２、独立実験、＊ｐ＜０．０５）。
【００４９】
【図９】図９は、ＧＭＴｃを形質導入した線維芽細胞からＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９が除去された時間的経過を、ＧＭＴでリプログラミングした後の表示されている日数で示す棒グラフである。
【００５０】
【図１０】図１０は、ＴＧＦ−β阻害剤ＳＢ４３１５４２およびＷＮＴ阻害剤ＸＡＶ９３９でリプログラミングした２週間後の、αＭＨＣ−ＧＦＰをリプログラミングのリポーターとして使用したＧＦＰ＋ｉＣＭの代表的なＦＡＣＳプロットである。
【００５１】
【図１１】図１１は、自発的カルシウムトランジエントを示すｉＣＭのパーセントの定量化を、リプログラミングの８週間にわたって示す図である（ｎ＝２００個の細胞を、２つの独立実験の各時点で分析した。ＧＭＴと比較して＊ｐ＜０．０５）。
【００５２】
【図１２】図１２は、ＧＭＴでリプログラミングされた線維芽細胞が、線維芽細胞と心筋細胞との中間状態にあることを示す主成分分析プロットである。
【００５３】
【図１３】図１３は、５週目にＧＭＴ  ｉＣＭとＧＭＴｃ  ｉＣＭとで発現が異なる上位の遺伝子を示す棒グラフである。
【００５４】
【図１４】図１４は、リプログラミング中に導入された過剰なＴＧＦβ１（ＴＧＦ−β）リガンドが、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβｉ）の効果を反転させ、ＢＭＰ４およびアクチビンが有意な効果を示さなかったことを示す棒グラフである。
【００５５】
【図１５】図１５は、構成的に活性なＳＭＡＤ２またはＳＭＡＤ３の過剰発現が、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβｉ）による心臓リプログラミング増強を消失させたことを示す棒グラフである（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。
【００５６】
【図１６】図１６は、ＡＬＫ４またはＡＬＫ５受容体のいずれかのノックダウンが、ＳＢ４３１５４２によるリプログラミングの効率に影響を及ぼさずに、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβｉ）と同様に心臓リプログラミングを増強したことを示す棒グラフである（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。
【００５７】
【図１７】図１７は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３β）阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１が、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβｉ）およびＸＡＶ９３９（ＷＮＴｉ）の効果の大部分を反転させ、ＷＮＴ５またはＷＮＴ１１による非古典的ＷＮＴ経路の活性化は、有意ではない効果しか示さなかったことを示す棒グラフである（ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。
【００５８】
【図１８】図１８は、ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９が、ＧＭＴによるｉｎ  ｖｉｖｏリプログラミングを増強することを示す折れ線グラフであり、これは、実験中の１、２、４、８、および１２週目に心エコー検査により評価した駆出率の変化（ΔＥＦ）により証拠付けられている。
【００５９】
【図１９】図１９は、ＧＭＴｃ処置マウスにおける心拍血液量（ＳＶ）、駆出率（ＥＦ）、心拍出量（ＣＯ）、および傷痕サイズは、ＧＭＴ処置および対照マウス（ｄｓＲｅｄまたはｄｓＲｅｄｃ）と比較して、有意に向上したことを示す一連の棒グラフである。
【図２０】図２０は、ＲＯＳＡ−ＹＦＰ／ペリオスチンＣｒｅマウスを使用して心筋細胞への線維芽細胞の細胞運命転換を追跡するための系統追跡の模式図である。
【００６０】
【図２１】図２１は、ＧＭＴおよびＧＭＴｃを使用して、複数の心臓区画でのｉｎ  ｖｉｖｏでリプログラミングされたｉＣＭ数の増加倍数の定量化を示す棒グラフである（各群ｎ＝５の動物、＊ｐ＜０．０５）。
【００６１】
【図２２】図２２は、線維芽細胞、ＲＮＡ−ｓｅｑにより評価した、新生仔マウス心筋細胞（ＣＭ）、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＭＴ  ｉＣＭ（ＧＭＴ）、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＭＴｃ  ｉＣＭ（ＧＭＴｃ）、および成体心室心筋細胞のグローバルトランスクリプトームの主成分分析（ＰＣＡ）プロットである。
【００６２】
【図２３】図２３は、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＧＭＴ  ｉＣＭとＧＭＴｃ  ｉＣＭとで発現が異なる遺伝子の上位ＧＯターム（GO  term）の棒グラフである。
【００６３】
【図２４】図２４は、ｌｏｘＰが導入されたＴ−抗原を使用して、ヒト心臓線維芽細胞の細胞株を生成するための戦略の概略図である。
【００６４】
【図２５】図２５は、代表的なＦＡＣＳプロットを示す図であり、定量化は、ＴＮＴ−ＧＣａＭＰをリポーターとして使用し、αＭＨＣ抗体染色を使用する、ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９による成人ヒト心臓線維芽細胞リプログラミングの効率を示す。
【００６５】
【図２６】図２６は、リプログラミングの３週間以内の自発的カルシウムトランジエント（上段パネル）、およびリプログラミングの２、４、６、および８週目に自発的カルシウムトランジエントを示した細胞のパーセントの定量化（下段パネル）を示す（各群ｎ＝１００個の細胞、＊ｐ＜０．０５）。
【００６６】
【図２７】図２７は、ヒト心臓線維芽細胞、７ＦでリプログラミングされたｉＣＭ、または７ＦｃでリプログラミングされたｉＣＭのＲＮＡｓｅｑの完全遺伝子発現プロファイルの主成分分析（ＰＣＡ）プロットを示す図である。
【００６７】
【図２８】図２８は、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ７Ｆ  ｉＣＭと７Ｆｃ  ｉＣＭとで発現が異なる遺伝子の上位遺伝子オントロジーターム（Gene  Ontology  term）（ＧＯ）アノテーションの棒グラフである。
【００６８】
【図２９】図２９は、ヒト線維芽細胞リプログラミングが、ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９および４つの因子（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、およびミオカルディン）（４Ｆｃ）により生じたことを示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。
【００６９】
【図３０】図３０は、ヒト線維芽細胞リプログラミングが、ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９および４つの因子（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、およびミオカルディン）（４Ｆｃ）により生じたことを示す棒グラフである。
【００７０】
【図３１】図３１は、ＧＭＴおよびＧＭＴｃを使用して、複数の心臓区画でのｉｎ  ｖｉｖｏでリプログラミングされたｉＣＭ数の増加倍数の定量化を示す棒グラフである（各群ｎ＝５の動物、＊ｐ＜０．０５）。
【００７１】
【図３２】図３２は、ｓｉＲＮＡ分子をＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、またはその両方のいずれかとして使用したＭＭＴリプログラミングの効率を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
本発明は、記載されている特定の実施形態に限定されず、したがって無論、様々であってもよいことが理解されるべきである。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるため、本明細書で使用されている用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定は意図されていないことも理解されるべきである。
【００７３】
本開示の詳細な説明は、種々のセクションに分割されているが、それは読者の便宜のために過ぎず、任意のセクションに見出される開示は、別のセクションの開示と組み合わせることができる。別様に定義されていない限り、本明細書で使用されている全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または等価である任意の方法および物質も、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および物質をここに記載する。本明細書で言及されている全ての刊行物は、参照により組み込まれ、刊行物がそれらに関して引用されている方法および／または物質が開示および記載される。
【００７４】
本開示の実施は、別様に示されない限り、当技術分野の技術内にある組織培養、免疫学、分子生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来技法を使用する。例えば、SambrookおよびRussell編（２００１年）Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第３版；Ausubelら編（２００７年）Current  Protocols  in  Molecular  Biologyのシリーズ；Methods  in  Enzymology（Academic  Press,  Inc.、Ｎ．Ｙ．）のシリーズ；MacPhersonら（１９９１年）PCR  1:  A  Practical  Approach（IRL  Press  at  Oxford  University  Press）；MacPhersonら（１９９５年）PCR  2:  A  Practical  Approach；HarlowおよびLane編（１９９９年）Antibodies、A  Laboratory  Manual；Freshney（２００５年）Culture  of  Animal  Cells:  A  Manual  of  Basic  Technique、第５版；Gait編（１９８４年）Oligonucleotide  Synthesis；米国特許第４，６８３，１９５号；HamesおよびHiggins編（１９８４年）Nucleic  Acid  Hybridization；Anderson（１９９９年）Nucleic  Acid  Hybridization；HamesおよびHiggins編（１９８４年）Transcription  and  Translation；IRL  Press（１９８６年）Immobilized  Cells  and  Enzymes；Perbal（１９８４年）A  Practical  Guide  to  Molecular  Cloning；MillerおよびCalos編（１９８７年）Gene  Transfer  Vectors  for  Mammalian  Cells  (Cold  Spring  Harbor  Laboratory)；Makrides編（２００３年）Gene  Transfer  and  Expression  in  Mammalian  Cells；MayerおよびWalker編（１９８７年）Immunochemical  Methods  in  Cell  and  Molecular  Biology（Academic  Press、ロンドン）；Herzenbergら編（１９９６年）Weir's  Handbook  of  Experimental  Immunology;  Manipulating  the  Mouse  Embryo:  A  Laboratory  Manual、第３版（２００２年）Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press；Sohail（２００４年）Gene  Silencing  by  RNA  Interference:  Technology  and  Application  (CRC  Press)；Sell（２０１３年）Stem  Cells  Handbookを参照されたい。
【００７５】
文脈が別様に示さない限り、本明細書に記載されている本発明の種々の特徴は、任意の組合せで使用することができることが特に意図されている。さらに、本開示は、一部の実施形態では、本明細書に示されている任意の特徴または特徴の組合せを除外または省くことができることも企図している。例えば、本明細書にて、複合体が、成分Ａ、Ｂ、およびＣを含むと記載されている場合、Ａ、Ｂ、もしくはＣのいずれかまたはそれらの組合せを、単独でまたは任意の組合せで省くおよび放棄することができることが、特に意図されている。
【００７６】
全ての数値指定、例えば、範囲を含むｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、必要に応じて１．０もしくは０．１の増分だけ、または代わりに＋／−１５％、または代わりに１０％、または代わりに５％、または代わりに２％の変分だけ、（＋）または（−）で変動する近似値である。全ての数値指定は、必ずしも明示的に記載されていないが、用語「約」がそれらの前に付いていると理解されるべきである。そのような範囲形式は、便利さおよび簡潔さのために使用されており、範囲の限界として明示的に指定されている数値を含むが、個々の数値またはその範囲内に包含される部分範囲も全て、あたかも各数値および部分範囲が明示的に指定されているかの如く含むと柔軟に理解されるべきであることを理解すべきである。例えば、約１〜約２００の範囲の比は、約１および約２００の明示的に記載されている限界を含むが、約２、約３、および約４などの個々の比、ならびに約１０〜約５０および約２０〜約１００などの部分範囲も含むと理解されるべきである。また、必ずしも明示的に記載されていないが、本明細書に記載されている試薬は例示に過ぎず、そのようなものの等価物は当技術分野で公知であると理解されるべきである。
【００７７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明白にそうではないと指示しない限り、複数の指示物を含むことが留意されなければならない。したがって、例えば、「心筋細胞」への言及は、複数の心筋細胞を含む。
【００７８】
定義
本明細書中で使用されている用語は、当業者により理解されるような平易で通常の意味を有することが意図されている。以下の定義は、読者による本発明の理解を支援するためのものであり、特に示されていない限り、そのような用語の意味を変更またはそうでなければ限定することは意図されていない。
【００７９】
量または濃度などの測定可能な値を参照する際の用語「約」は、本明細書で使用される場合、指定されている量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらに０．１％の変動を包含することを意図する。
【００８０】
用語「許容される」、「有効な」、または「十分な」は、本明細書で開示されている任意の成分、範囲、剤形などの選択を記載するために使用されている場合、前記成分、範囲、剤形などが、開示されている目的に好適であることを意図している。
【００８１】
また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙項目の１つまたは複数のありとあらゆる考え得る組合せ、ならびに選択肢（「または」）として解釈される場合は組合せの欠如を指し、包含する。
【００８２】
「投与」および「投与すること」などは、本発明の組成物に関して使用される場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非心筋細胞に投与すること、ｉｎ  ｖｉｖｏで非心筋細胞に投与すること、医療従事者によりもしくは対象の自己投与により対象に投与することであってもよい直接投与、および／または本発明の組成物を処方する行為であってもよい間接投与の両方を指す。細胞に関して本明細書で使用される場合、組成物を細胞に導入することを指す。典型的には、有効量が投与され、その量は、当業者により決定することができる。任意の投与方法を使用することができる。低分子は、例えば、低分子を細胞培養培地に添加することにより、または心外傷の部位にｉｎ  ｖｉｖｏで注射することにより、細胞に投与することができる。対象への投与は、例えば、血管内注射および心筋内送達などにより達成することができる。
【００８３】
本明細書で使用される場合、用語「心臓細胞」は、心収縮もしくは血液供給などの心臓機能を提供するか、またはそうでなければ心臓の構造を維持する役目を果たす、心臓に存在する任意の細胞を指す。心臓細胞は、本明細書で使用される場合、心臓の心外膜、心筋層、または心内膜に存在する細胞を包含する。また、心臓細胞としては、例えば、心臓筋肉細胞または心筋細胞、および冠状動脈または静脈の細胞などの心臓血管構造の細胞が挙げられる。心臓細胞の他の非限定的な例としては、心筋、血管、および心臓細胞支持構造を構成する上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞または前駆細胞、心臓伝導細胞（cardiac  conducting  cell）、および心臓ペースメーカー細胞（cardiac  pacemaking  cell）が挙げられる。心臓細胞は、例えば、胚幹細胞または誘導多能性幹細胞を含む幹細胞から導出されてもよい。
【００８４】
用語「心筋細胞」または「心筋細胞（複数）」は、本明細書で使用される場合、骨格筋細胞に対立するものとして、哺乳動物の心臓に天然で見出される、サルコメア含有横紋筋細胞を指す。心筋細胞は、特殊な分子、例えば、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、心臓α−アクチニンのようなタンパク質の発現により特徴付けられる。用語「心筋細胞」は、本明細書で使用される場合、任意の心筋細胞部分集団または心筋細胞サブタイプ、例えば、心房性、心室性、およびペースメーカー心筋細胞を含む包括的用語である。
【００８５】
用語「心筋細胞様細胞」は、心筋細胞と特徴を共有するが、全ての特徴を共有していなくてもよい細胞を意味することが意図されている。例えば、心筋細胞様細胞は、ある特定の心臓遺伝子の発現が心筋細胞と異なる場合がある。
【００８６】
用語「培養」または「細胞培養」は、人工のｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境中で細胞を維持することを意味する。「細胞培養系」は、本明細書中では、細胞の集団を単層としてまたは懸濁中で成長させることができる培養条件を指すために使用される。「培養培地」は、本明細書中では、細胞の培養、成長、または増殖のための栄養溶液を指すために使用される。培養培地は、これらに限定されないが、細胞を特定の状態（例えば、多能性状態、休止状態など）に維持する能力、細胞を成熟させる能力、一部の場合では、特に、特定の系統の細胞（例えば、心筋細胞）への前駆細胞の分化を促進する能力などの機能的特性により特徴付けることができる。
【００８７】
本明細書で使用される場合、ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、またはそれらの組合せの組成物に関する用語「有効量」は、誘導心筋細胞を生成するのに十分な量である。非心筋細胞を、誘導心筋細胞を生成するのに有効な量の、ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、またはそれらの組合せの組成物と接触させる。それを必要とする対象への投与に関して本明細書で使用される場合、「有効な量」または「有効量」という用語は、ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、もしくはそれらの組合せ、または心血管疾患を治療する誘導心筋細胞の組成物の量を意味する。有効量は、１つまたは複数の投与、適用、または投薬で投与することができる。そのような送達は、個々の投薬単位が使用されることになる期間、組成物の生物学的利用能、投与経路などを含む、幾つかの変数に依存する。しかしながら、任意の特定の対象のための、組成物（例えば、ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、もしくはそれらの組合せ、または誘導心筋細胞の組成物）の具体的な量は、使用される特定の作用剤の活性、対象の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食事、投与の時間、排泄率、組成物の組合せ、治療している特定の心血管疾患の重症度、ならびに投与の形態を含む、様々な要因に依存することが理解される。
【００８８】
本明細書で使用される場合、用語「発現」または「発現する」は、ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡへと転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが、その後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから導出される場合、発現は、真核細胞でのｍＲＮＡのスプライシングを含む場合がある。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織試料中のｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することにより決定することができる。さらに、複数の遺伝子の発現レベルを決定して、特定の試料の発現プロファイルを確立することができる。本明細書で使用される場合、発現レベルに関する「より低いレベル」という用語は、天然心筋細胞対照試料中の量よりも少ない誘導心筋細胞の量を指す。発現レベルに関する「より高いレベル」という用語は、天然心筋細胞対照試料中の量よりも少ない誘導心筋細胞の量を指す。
【００８９】
用語「誘導心筋細胞」は、心筋細胞（および／または心筋細胞様細胞）へと転換された非心筋細胞（およびその後代）を指す。本開示の方法は、現時点で公知であるかまたは今後発見される、誘導心筋細胞を生成するための任意の方法と共に使用して、例えば、他の技法を増強することができる。例えば、ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、またはそれらの組合せの組成物は、直接リプログラミング技法と共に使用することができる。
【００９０】
用語「阻害剤」は、本明細書で使用される場合、標的分子またはシグナル伝達経路の発現、機能、活性などを阻害する能力を有する作用剤を指す。本発明の阻害剤としては、これらに限定されないが、低分子、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、およびそれらの断片が挙げられる。
【００９１】
本明細書で使用される場合、細胞に関する「単離された」という用語は、細胞が天然に生じる環境とは異なる環境にある細胞を指す。例えば、天然では多細胞生物中で生じる細胞が、多細胞生物から取り出された場合、細胞は「単離」されている。例えば、単離された細胞は、表現型または遺伝子型が異なる組織または細胞から分離されている細胞である。
【００９２】
用語「非心筋細胞」は、本明細書で使用される場合、本明細書で定義および使用されている「心筋細胞」の基準を満たさない細胞調製物中の任意の細胞または細胞の集団を指す。非心筋細胞の非限定的な例としては、体細胞、心臓線維芽細胞、非心臓線維芽細胞、心臓前駆細胞、および幹細胞が挙げられる。
【００９３】
語句「薬学的に許容される」は、本明細書では、合理的なベネフィット／リスク比に見合う、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに好適な、健全な医学的判断の範囲内にある、化合物、物質、組成物、および／または剤形を指すために使用される。
【００９４】
用語「再生する」および「再生」などには、傷害を受けた心臓組織の文脈で本明細書中で使用される場合、それらの通常の意味が与えられるものとし、また、傷害を受けた、例えば、虚血、梗塞、再潅流、または他の疾患により傷害を受けた心臓または心臓組織中に新しい心臓組織を成長および／または発生させるプロセスを指すものとする。一部の実施形態では、心臓組織再生は、心筋細胞の生成を含む。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「リプログラミング」は、分化転換および脱分化などを含む。
【００９６】
本明細書で使用される場合、用語「リプログラミング効率」は、試料中の細胞の総数に対する、心筋細胞へのリプログラミングが成功した試料中の細胞の数を指す。リプログラミング効率は、心筋細胞マーカーの関数として測定してもよい。そのような多能性マーカーとしては、これらに限定されないが、心筋細胞マーカータンパク質およびｍＲＮＡの発現、心筋細胞形態、および電気生理学的表現型が挙げられる。心筋細胞マーカーの非限定的な例としては、α−サルコグリカン、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、コネクシン３７、コネクシン４０、ｃｒｙｐｔｏ、デスミン、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＨ６、ミオシン重鎖、ＮＫＸ２．５、ＴＢＸ５、およびトロポニンＴが挙げられる。一部の態様では、リプログラミング効率は、対照と比べて、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれを超えて増加する。適切な対照の非限定的な例としては、リプログラミング因子と共にもしくは伴わずに、有効量のＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、またはそれらの任意の組合せに曝露されていない試料が挙げられる。
【００９７】
用語「リプログラミング因子」は、本明細書で使用される場合、細胞中で発現させて、誘導心筋細胞への細胞のリプログラミングを支援するために導入される因子が挙げられる。リプログラミング因子としては、これに限定されないが、転写因子が挙げられる。
【００９８】
用語「幹細胞」は、自己再生し、分化した後代を生成する能力を有する細胞を指す。用語「多能性幹細胞」は、３つ全ての胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の細胞を生じさせることができるが、完全な生物を生じさせる能力を有していない幹細胞を指す。
【００９９】
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、哺乳動物、好ましくは、ヒトを指すが、非ヒト霊長類、ネズミ科（すなわち、マウスおよびラット）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギなどを含み、それらに限定されない。一部の実施形態では、対象はヒト対象である。用語「対象」および「患者」は、本明細書では同義的に使用される場合がある。
【０１００】
用語「形質転換増殖因子ベータ」、「ＴＧＦ−β」、およびそれらの等価物は、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーの亜科に属するＴＧＦβ分泌タンパク質のいずれかを指す。ＴＧＦβ（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）は、増殖、分化、接着、および遊走を制御する多機能ペプチドであり、多くの細胞型に存在する。成熟ペプチドは、ホモダイマー、または他のＴＧＦβファミリーメンバーとのヘテロダイマーとして見出される場合がある。ＴＧＦβは、細胞表面の形質転換増殖因子ベータ受容体（ＴＧＦ−βＲまたはＴＧＦβＲ）と相互作用し、その結合は、ＭＡＰキナーゼ、Ａｋｔ、Ｒｈｏ、およびＲａｃ／ｃｄｃ４２により指図されるシグナル伝達経路、細胞構造の再編成、およびＳＭＡＤタンパク質の核局在化、および標的遺伝子転写の調節を活性化する。ＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤は、当業者であれば、幾つかの方法のいずれかにより、例えば、当技術分野で周知のように、ＴＧＦβもしくはＴＧＦβ受容体との結合に関する競合結合アッセイ、または機能アッセイ、例えば、ＭＡＰＫ、Ａｋｔ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、およびＳＭＡＤなどの下流シグナル伝達タンパク質、例えば、ＡＲ−Ｓｍａｄなどの活性の抑制を測定することにより、容易に特定することができる。
【０１０１】
「治療」、「治療すること」、および「治療する」は、作用剤を用いて、疾患、障害、または状態に作用して、疾患、障害、もしくは状態、および／またはその症状の有害なまたは任意の他の望ましくない効果を低減または緩和することと定義される。「治療」は、本明細書で使用される場合、それを必要とする対象の治療を包含し、心血管疾患、例えば、心不全、心筋虚血、低酸素症、脳卒中、心筋梗塞、および慢性虚血性心疾患の治療を含む。それを必要とする状態または対象を「治療すること」または「治療」は、（１）症状の低減などの臨床結果を含む、有益なもしくは所望の結果を得るためのステップを行うこと；（２）疾患を予防すること、例えば、その疾患に罹り易い可能性があるが、その疾患の症状をまだ経験していないかもしくは呈していない患者にその疾患の臨床症状を発生させないこと；（３）疾患を阻害すること、例えば、疾患もしくはその臨床症状の進行を停止もしくは低減させること；（４）疾患を軽減すること、例えば、疾患もしくはその臨床症状の退行を引き起こすこと；または（５）疾患を遅延させることを指す。本発明の目的では、有益なまたは所望の臨床結果としては、これらに限定されないが、誘導心筋細胞の生成および／または心筋再生の促進が挙げられる。
【０１０２】
用語「ＷＮＴ」は、胚形成および成熟組織の両方に重要な役割を果たす高度に保存された分泌シグナル伝達分子のファミリーを含むことを意図する。ヒトＷＮＴ遺伝子ファミリーは、少なくとも１９個のメンバーを有する（ＷＮＴ−１、ＷＮＴ−２、ＷＮＴ−２Ｂ／ＷＮＴ−１３、ＷＮＴ−３、ＷＮＴ３ａ、ＷＮＴ−４、ＷＮＴ−５Ａ、ＷＮＴ−５Ｂ、ＷＮＴ−６、ＷＮＴ−７Ａ、ＷＮＴ−７Ｂ、ＷＮＴ−８Ａ、ＷＮＴ−８Ｂ、ＷＮＴ−９Ａ／ＷＮＴ−１４、ＷＮＴ−９Ｂ／ＷＮＴ−１５、ＷＮＴ−１０Ａ、ＷＮＴ−１０Ｂ、ＷＮＴ−１１、ＷＮＴ−１６）。ＷＮＴタンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）ファミリーのタンパク質に由来するポリペプチドおよび低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）関連タンパク質（ＬＲＰ）ファミリータンパク質のポリペプチドを含むＷＮＴ受容体複合体に結合することにより、細胞活性を調節する。ＷＮＴ受容体複合体は、ＷＮＴ結合により活性化されると、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達カスケードを活性化することになる。細胞内シグナル伝達カスケードとしては、古典的ＷＮＴシグナル伝達経路；ＷＮＴ／平面内細胞極性（ＷＮＴ／ＰＣＰ）経路；およびＷＮＴ−カルシウム（ＷＮＴ／Ｃａ２＋）経路が挙げられる。
【０１０３】
リプログラミング方法
非心筋細胞は、当業者が利用可能である任意の方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで心筋細胞へと分化させることができる。例えば、Iedaら（２０１０年）Cell、１４２巻：３７５〜３８６頁；Christoforouら（２０１３年）PLoS  ONE、８巻：e63577；Addisら（２０１３年）J.  Mol.  Cell  Cardiol.、６０巻：９７〜１０６頁；Jayawardenaら、（２０１２年）Circ.  Res.、１１０巻：１４６５〜１４７３頁；Nam  Yら、PNAS  USA.、２０１３年；１１０巻：５５８８〜５５９３頁；Wada  Rら、PNAS  USA.、２０１３年；１１０巻：１２６６７〜１２６７２頁；およびFu  Jら、Stem  Cell  Reports.、２０１３年；１巻：２３５〜２４７頁に記載されている方法を参照されたい。
【０１０４】
一部の実施形態では、使用されるリプログラミング因子は、Ｂａｆ６０ｃ、Ｅｓｒｒｇ、Ｇａｔａ４、Ｇａｔａ６、Ｈａｎｄ２、Ｉｒｘ４、Ｉｓｌ１、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｅｓｐ１、Ｍｅｓｐ２、ミオカルディン、Ｎｋｘ２．５、ＳＲＦ、Ｔｂｘ５、Ｔｂｘ２０、Ｚｆｐｍ２、ｍｉＲ−１３３、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、上記の列挙されているリプログラミング因子の１つまたは複数は、明示的に除外される。
【０１０５】
一部の実施形態では、使用されるリプログラミング因子は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５（すなわち、ＧＭＴ）である。一部の実施形態では、リプログラミング因子は、ミオカルディン、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５（すなわち、ＭＭＴ）である。一部の実施形態では、リプログラミング因子は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、およびミオカルディン（すなわち、４Ｆ）である。他の実施形態では、リプログラミング因子は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５、Ｅｓｓｒｇ、ミオカルディン、Ｚｆｐｍ２、およびＭｅｓｐ１（すなわち、７Ｆ）である。
【０１０６】
リプログラミング因子は、当業者に一般的に知られている様々な機序により、非心筋細胞に導入することができる。例えば、好適な宿主中でウイルスを産生させることにより、ウイルス構築物を送達することができる。次いで、ウイルスを宿主細胞から回収し、心臓細胞と接触させる。目的の遺伝子を発現することが可能なウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを、ＤＮＡ／リポソーム複合体、ミセル、および標的化ウイルスタンパク質−ＤＮＡ複合体により非心筋細胞に送達することができる。
【０１０７】
本発明の方法では、標的指向性抗体またはその断片も含むリポソームを使用することができる。非心筋細胞または細胞集団へのポリヌクレオチドの送達に加えて、非心筋細胞または細胞集団への本明細書に記載のタンパク質の直接導入は、タンパク質トランスフェクションの非限定的な技法により実施することができ、あるいは本発明のタンパク質の発現を増強および／または活性を促進することができる培養条件は、他の非限定的な技法である。
【０１０８】
リプログラミング因子をコードするベクターを送達する他の方法としては、これらに限定されないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合法、またはリポソーム媒介性トランスフェクションが挙げられる。本発明のベクターをトランスフェクトする宿主細胞としては、これらに限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の細菌、酵母、真菌、またはマウス、ヒト、もしくは他の動物（例えば、哺乳動物）から導出される細胞を挙げることができる。クローニングされたＤＮＡによりコードされたタンパク質、融合タンパク質、ポリペプチド断片、または突然変異体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現も使用することができる。分子生物学分野の当業者であれば、幅広く様々な発現系および精製系を使用して、組換えタンパク質およびそれらの断片を産生することができることを理解するだろう。
【０１０９】
一部の実施形態では、非心筋細胞は、リプログラミング因子を導入した約１２時間〜約３６時間後に、ＴＧＦ−β阻害剤と最初に接触させる。１つの好ましい実施形態では、非心筋細胞は、リプログラミング因子を導入した約２４時間後に、ＴＧＦ−β阻害剤と最初に接触させる。
【０１１０】
一部の実施形態では、非心筋細胞は、リプログラミング因子を導入した約２４時間〜約７２時間後に、ＷＮＴ阻害剤と最初に接触させる。１つの好ましい実施形態では、非心筋細胞は、リプログラミング因子を導入した約４８時間後に、ＷＮＴ阻害剤と最初に接触させる。
【０１１１】
細胞および培養条件
本開示を読むと当業者に明白となるように、本開示は、非心筋細胞から誘導心筋細胞および心筋細胞様細胞を生成するための方法を提供する。
【０１１２】
細胞
本発明で使用される非心筋細胞は、当業者に公知の任意の非心筋細胞であってもよい。非心筋細胞の非限定的な例としては、例えば、体細胞、心臓線維芽細胞、非心臓線維芽細胞、心臓前駆細胞、および幹細胞が挙げられる。非心筋細胞は、心臓の心外膜、心筋層、または心内膜に由来する心臓細胞であってもよい。非心筋細胞心臓細胞としては、例えば、平滑筋および内皮細胞が挙げられる。心臓細胞の他の非限定的な例としては、心筋、血管、および心臓細胞支持構造を構成する上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞または前駆細胞、心臓伝導細胞、および心臓ペースメーカー細胞が挙げられる。
【０１１３】
一部の実施形態では、非心筋細胞は、対象内の内因性細胞であり、誘導心筋細胞を生成する方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ誘導によるものである。他の実施形態では、非心筋細胞は、外因性であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで改変される。
【０１１４】
心筋細胞へと誘導される非心筋細胞は、様々な供給源のいずれに由来していてもよい。哺乳動物非心筋細胞（例えば、ヒトまたはマウス）を使用してもよい。一部の実施形態では、心筋細胞は、哺乳動物心筋細胞であり、特定の実施形態では、非心筋細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、非心筋細胞は、幹細胞（例えば、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、リプログラミングされた心臓細胞、または心臓幹細胞）または前駆細胞（例えば、心臓前駆細胞）から導出されてもよい。心筋細胞は、心臓細胞または非心臓細胞から導出されてもよい。心筋細胞は、様々な組織供給源のいずれに由来してもよく、または導出されてもよい。例えば、心臓線維芽細胞、包皮線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞など。非心筋細胞は、胚細胞、胎仔細胞、または出生後（例えば成体）細胞であってもよい。好ましい実施形態では、非心筋細胞は、成体細胞である。
【０１１５】
非心筋細胞は、生体対象から得ることができる。細胞は、生体対象から採取される組織から得ることができる。細胞は、好適な組織ドナーと考えられる最近死亡した対象から得ることができる。一部の実施形態では、対象を、種々の遺伝子障害、ウイルス感染などについてスクリーニングして、対象が細胞の好適な供給源であるか否かを決定する。一般的に、本発明での使用に好適な細胞は、形質転換されておらず（例えば、正常な細胞増殖を示す）、そうでなければ正常である（例えば、正常な核型を示す）。
【０１１６】
リプログラミングするための細胞が、非心筋細胞の集団である場合、細胞の集団は、少なくとも約３０％の非心筋細胞、少なくとも約３５％の非心筋細胞、少なくとも約４０％の非心筋細胞、少なくとも約４５％の非心筋細胞、少なくとも約５０％の非心筋細胞、少なくとも約５５％の非心筋細胞、少なくとも約６０％の非心筋細胞、少なくとも約６５％の非心筋細胞、少なくとも約７０％の非心筋細胞、少なくとも約７５％の非心筋細胞、少なくとも約８０％の非心筋細胞、少なくとも約８５％の非心筋細胞、少なくとも約９０％の非心筋細胞、少なくとも約９５％の非心筋細胞、少なくとも約９８％の非心筋細胞、少なくとも約９９％の非心筋細胞、または９９％よりも多くの非心筋細胞で構成されている。
【０１１７】
細胞（心臓または非心臓）は、非胎仔対象、新生幼仔、小仔、または成体の組織から導出されてもよい。細胞は、帝王切開による出生を含む出生から死亡までの期間内の対象から収集された新生仔組織または出生後組織から導出されてもよい。例えば、非心筋細胞は、約１０分齢より年長の、約１時間齢よりも年長の、約１日齢よりも年長の、約１か月齢よりも年長の、約２か月齢よりも年長の、約６か月齢よりも年長の、約１歳よりも年長の、約２歳よりも年長の、約５歳よりも年長の、約１０歳よりも年長の、約１５歳よりも年長の、約１８歳よりも年長の、約２５歳よりも年長の、約３５歳よりも年長の、＞４５歳、＞５５歳、＞６５歳、＞８０歳、＜８０歳、＜７０歳、＜６０歳、＜５０歳、＜４０歳、＜３０歳、＜２０歳、または＜１０歳の対象に由来してもよい。
【０１１８】
非心筋細胞を組織から単離する方法は、当技術分野で公知であり、任意の公知の方法を使用することができる。非限定的な例として、成体心臓細胞は、心臓外科手術を受けている患者から得られるヒト心臓心房生検標本から得ることができる。心臓組織を、細かく刻み、コラゲナーゼで消化し、心臓幹細胞／前駆細胞を、Choiら（２０１３年）Transplantation  Proceedings、４５巻：４２０〜４２６頁の方法を使用して、ｃ−ｋｉｔ＋前駆細胞増殖培地中で増殖させることができる。加えて、心臓線維芽細胞は、Iedaら（２００９年）Dev.  Cell、１６巻（２号）：２３３〜２４４頁の方法を使用して得ることができる。包皮線維芽細胞は、雄個体の包皮組織から得ることができる。線維芽細胞は、包皮組織を細かく刻み、次いで組織を単一細胞へと解離させることにより得ることができる。包皮細胞集塊は、物理的脱集塊または例えばトリプシンを使用する酵素消化を含む、当技術分野で公知の任意の手段により解離させることができる。
【０１１９】
心筋細胞に特異的な種々のマーカーの発現は、従来の生化学的または免疫化学的方法（例えば、酵素結合免疫吸着測定法および免疫組織化学的アッセイなど）により検出することができる。あるいは、心筋細胞特異的マーカーをコードする核酸の発現を評価してもよい。心筋細胞に特異的なマーカーをコードする核酸の細胞での発現は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）またはハイブリダイゼーション分析、任意のマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡを増幅、検出、および分析するために過去に一般的に使用されている分子生物学的方法により確認することができる。心筋細胞に特異的なマーカーをコードする核酸配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースから入手可能である。したがって、プライマーまたはプローブとして使用するために必要なマーカー特異的配列は、容易に決定される。
【０１２０】
培養条件
本開示の細胞は、当業者に公知の任意の条件下で培養することができる。一部の実施形態では、細胞（例えば、非心筋細胞、心筋細胞、およびそれらの組合せ）は、１〜２０％の酸素（Ｏ２）および５％の二酸化炭素（ＣＯ２）の条件で培養される。一部の実施形態では、本開示の細胞は、低酸素条件下（例えば、１０％未満のＯ２の存在下）で培養される。一部の実施形態では、本開示の細胞は、約３７℃で培養される。一部の実施形態では、本開示の細胞は、約３７℃、５％ＣＯ２、および１０〜２０％のＯ２で培養することができる。一部の実施形態では、細胞は、ある期間にわたって低酸素条件で培養される。例えば、細胞は、ある期間にわたって正常酸素圧条件下（約２０％Ｏ２）で培養し、次いで低酸素条件、例えば約５％Ｏ２に切り替えてもよい。
【０１２１】
非心筋細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで心筋細胞へと分化させる利点は、移植に好適な細胞を容易に特定し、または損傷しているかもしくは未分化の細胞を識別することができることである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで分化させることにより、未分化の非心筋細胞から誘導心筋細胞を精製または単離することが可能になる。
【０１２２】
一部の実施形態では、有効量の作用剤（低分子またはｓｉＲＮＡ）を使用して非心筋細胞を誘導し、誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する。
【０１２３】
一部の実施形態では、作用剤は、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ−１９３１８９、デキサメタゾン、ＬＹ３６４９４７、Ｄ４４７６、ミリセチン、ＩＷＲ１、ＸＡＶ９３９、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）、Ｈｈ−Ａｇ１．５、アルプロスタジル、クロマカリム、ＭＮＩＴＭＴ、Ａ７６９６６２、レチノイン酸ｐ−ヒドキシアニリド（retinoic  acid  p-hydoxyanlide）、デカメトニウムジブロミド、ニフェジピン、ピロキシカム、バシトラシン、アズトレオナム、ハルマロール塩酸塩、アミド−Ｃ２（Ａ７）、Ｐｈ−Ｃ１２（Ｃ１０）、ｍＣＦ３−Ｃ−７（Ｊ５）、Ｇ８５６−７２７２（Ａ４７３）、５４７５７０７、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される低分子である。
【０１２４】
リプログラミングのための作用剤
形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）阻害剤
形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）は、細胞機能の多くの局面を制御するサイトカインの大ファミリーの原型的メンバーである多機能制御ポリペプチドである。ＴＧＦ−β経路は、線維化、アポトーシス、分化転換、増殖、および他の細胞機能に影響を及ぼす。Leask,  A.（２０１５年）Circ.  Res.、１１６巻：１２６９〜１２７６頁；Xu,  J.ら（２００９年）Cell  Res.、１９巻：１５６〜１７２頁；Schmierer,  B.ら（２００７年）Nat.  Rev.  Mol.  Cell.  Biol.、８巻：９７０〜９８２頁。ＴＧＦβシグナル伝達脱制御は、腫瘍では頻繁に起こり、腫瘍発生、進行、および転移に重大な役割を有する。ＴＧＦβシグナル伝達阻害は、がん療法の新たな戦略である。
【０１２５】
ＴＧＦ−β阻害剤は、ＴＧＦ−βリガンド、ＴＧＦ−βＩ型受容体、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、（β−グリカンおよびエンドグリン）、可溶型のＴＧＦ−β受容体、Ｓｍａｄタンパク質、シグナル伝達経路に関与する受容体およびリガンドに対する抗体、経路メンバーを標的とする核酸に基づく分子（例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、およびリボザイム）、またはそれらの組合せなどの、ＴＧＦ−βシグナル伝達系経路を構成する因子のいずれかを阻害することによりＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する化合物である。
【０１２６】
一部の実施形態では、ＴＧＦ−β阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、Ｄ４４７６、ＬＤＮ−１９３１８９、デキサメタゾン、およびＬＹ３６４９４７からなる群から選択される。ＴＧＦ−β阻害剤は、当技術分野では抗ＴＧＦ−β化合物と呼ばれる場合もある。抗ＴＧＦ−β化合物の非限定的な例としては、抗体（例えば、フレソリムマブ（Fresolumimab）／ＧＣ１００８（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ））、ＰＦ−０３４４６９６２（Ｐｆｉｚｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ））、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（例えば、トラベデルセン（ＡＰ１２００９）（Ｉｓａｒｎａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ））、受容体キナーゼ阻害剤（例えば、ＬＹ２１５７２９９（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）、およびＴＧＦ−β  ＡＳＯとワクチンとの組合せ（例えば、Ｌｕｃａｎｉｘ（商標）（Ｂｅｌａｇｅｎｐｕｍａｔｕｃｅｌ−Ｌ）（Ｎｏｖａ  Ｒｘ  Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ））、およびＴＧＦ−β２  ＡＳＯ＋ＧＭＣＳＦ発現ベクター（Ｍａｒｙ  Ｃｒｏｗｌｅｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ、ＵＳＡ））が挙げられる。
【０１２７】
ＷＮＴ阻害剤
ＷＮＴ阻害剤は、ＷＮＴの発現または活性を下方制御する作用剤である。ＷＮＴ／β−カテニンシグナル伝達は、幹細胞、胚発生、および成体器官を含む広囲な生物系に関与する。ＷＮＴ／β−カテニンシグナル伝達に関与する成分の脱制御は、幾つかのがんおよび変性疾患を含む広範な疾患に関与している。ＷＮＴシグナル伝達は、３つの主要経路：古典的平面内細胞極性、非古典的平面内細胞極性、および非古典的ＷＮＴ／カルシウムを介して生じる。古典的経路では、ＷＮＴは、ｆｒｉｚｚｌｅｄに結合して、ユビキチン化およびプロテアソームでの分解のためにβ−カテニンを標的とする複合体の機能を妨害する。幹細胞の再生、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞リプログラミング、および種々の系統への細胞分化におけるＷＮＴシグナル伝達の役割は、依然として議論されている。
【０１２８】
しかしながら、心筋細胞への幹細胞分化中のＷＮＴシグナル伝達の二相性調節は、中胚葉分化を促進し、純粋な心筋細胞を高収率で産生する。目的の作用剤、例えば、薬物、すなわち低分子、遮断抗体などは、ＷＮＴと直接的に相互作用することができるか、またはＷＮＴ関連タンパク質、例えば、ＷＮＴ共受容体ＬＲＰ５／６および膜貫通型タンパク質Ｋｒｅｍｅｎと相互作用することができる。幾つかのＷＮＴ阻害剤が記載されており、当技術分野で公知である。
【０１２９】
目的のＷＮＴ阻害剤は、可溶性細胞外ＷＮＴタンパク質と、正常細胞の表面に存在するｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体との相互作用に干渉する。そのような作用剤としては、限定ではないが、ＷＮＴ結合ドメインを含む可溶性ｆｒｉｚｚｌｅｄポリペプチド；可溶性ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連ポリペプチド；ＷＮＴ特異的抗体；ｆｒｉｚｚｌｅｄ特異的抗体；および細胞外ＷＮＴシグナル伝達を遮断することが可能な他の分子が挙げられる。
【０１３０】
公知のＷＮＴ阻害剤の中には、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）遺伝子ファミリーのメンバーがある（Krupnikら（１９９９年）Gene、２３８巻（２号）：３０１〜１３頁を参照）。ヒトＤｋｋ遺伝子ファミリーのメンバーとしては、Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−３、およびＤｋｋ−４、ならびにＤｋｋ−３関連タンパク質Ｓｏｇｇｙ（Ｓｇｙ）が挙げられる。
ＷＮＴの他の阻害剤としては、分泌タンパク質であるＷｉｓｅ（Itasakiら（２００３年）Development、１３０巻（１８号）：４２９５〜３０頁）が挙げられる。Ｗｉｓｅタンパク質は、ＷＮＴ共受容体、リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）と物理的に相互作用し、ＬＲＰ６との結合をＷＮＴ８と競合することができる。
【０１３１】
また、阻害剤としては、天然阻害剤の誘導体、変異体、および生物学的活性断片を挙げることができる。
【０１３２】
一部の実施形態では、ＷＮＴ阻害剤は、ＸＡＶ９３９、Ｄ４４７６、ＩＷＲ１、ＩＷＲ類似体、ＩＷＰ類似体、５３ＡＨ、ＷＮＴ−Ｃ５９、およびミリセチンなどの低分子である。ＷＮＴを標的とする化合物の非限定的な例としては、ＯＭＰＴ−１８ＲＳ（ＯｎｃｏＭｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｂａｙｅｒ、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＯＭＰ−５４Ｆ２８（ＯｎｃｏＭｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｂａｙｅｒ、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＰＲＩ−７２４（株式会社ＰＲＩＳＭ  Ｐｈａｒｍａ／エーザイ株式会社、横浜、日本）、ＬＧＫ９７４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ、ＵＳＡ）、およびＪＷ５５（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＵＫ）が挙げられる。
【０１３３】
特定の実施形態では、ＷＮＴ阻害剤は、ＷＮＴ活性を標的とするｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡ  ＷＮＴ阻害剤の例としては、ＷＮＴ自体の発現に干渉するｓｉＲＮＡ、またはＷＮＴシグナル伝達経路の伝達に必要な分子、例えばタンキラーゼ１の発現に干渉するｓｉＲＮＡが挙げられる
【０１３４】
抗炎症剤
ある特定の実施形態では、リプログラミングは、１つまたは複数の抗炎症剤、例えば抗炎症性ステロイドまたは非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与することにより増強される。
【０１３５】
本発明で使用される抗炎症性ステロイドとしては、コルチコステロイド、および特にグルココルチコイド活性を有するもの、例えば、デキサメタゾンおよびプレドニゾンが挙げられる。本発明で使用される非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、一般的に、炎症および疼痛を引き起こすプロスタグランジン、シクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）、および／またはシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の産生を遮断することにより作用する。従来のＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２を両方とも遮断することにより働く。ＣＯＸ−２選択的阻害剤は、ＣＯＸ−２酵素のみを遮断する。ある特定の実施形態では、ＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ−２選択的阻害剤、例えばセレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標））、ロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ（登録商標））、およびバルデコキシブ（Ｂｅｘｔｒａ（登録商標））である。ある特定の実施形態では、抗炎症剤は、ＮＳＡＩＤプロスタグランジン阻害剤、例えばピロキシカムである。
【０１３６】
本発明で使用される抗炎症剤の投薬量は、使用される特定の抗炎症剤、対象が受けている場合がある他の治療および薬剤、ならびに当業者が知ることになる対象の他の必要性に関する知識に基づいて決定することができる。例えば、セレコキシブは、従来、１００ｍｇまたは２００ｍｇのカプセルで処方され、一般的用量（例えば、関節炎により引き起こされる疼痛の場合）は、１日当たり１００〜４００ｍｇが一般的である。
【０１３７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで改変するための方法
本開示は、心筋細胞および／または心筋細胞様細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成するための方法を提供する。
【０１３８】
一部の態様では、本明細書では、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、有効量のＷＮＴ阻害剤の存在下で非心筋細胞を培養し、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成することを含む方法が提供される。
【０１３９】
一部の態様では、本明細書では、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、ａ）ＷＮＴ阻害剤を添加する前に、第１の期間にわたって有効量のＴＧＦ−β阻害剤を非心筋細胞に投与すること；およびｂ）第２の期間にわたって、有効量のＷＮＴ阻害剤と同時に有効量のＴＧＦ−β阻害剤を非心筋細胞に投与することを含む方法が提供される。
【０１４０】
一部の実施形態では、方法は、有効量のＴＧＦ−β阻害剤の存在下で、非心筋細胞を培養することを含む。
【０１４１】
一部の実施形態では、非心筋細胞は、ＷＮＴ阻害剤を添加する前に、例えば、ＷＮＴ阻害剤を添加する約６時間〜約７２時間前に、ＴＧＦ−β阻害剤の存在下で、ある期間にわたって培養される。一部の実施形態では、非心筋細胞は、ＷＮＴ阻害剤を添加する前に、ＴＧＦ−β阻害剤の存在下で、約１２時間〜約６０時間、約１８時間〜約４８時間、約２４時間〜約４２時間、約３０時間〜約３６時間（数値のいずれか２つの間の任意の範囲、終点を含む）にわたって培養される。一部の実施形態では、非心筋細胞は、ＷＮＴ阻害剤を添加する前に、ＴＧＦ−β阻害剤の存在下で、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約６０時間、または約７２時間にわたって培養される。
【０１４２】
一部の実施形態では、非心筋細胞は、ＷＮＴ阻害剤を添加する前に、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、または約４８時間にわたって、ＴＧＦ−β阻害剤の存在下で培養される。１つの好ましい実施形態では、非心筋細胞は、ＷＮＴ阻害剤を添加する前に約２４時間にわたってＴＧＦ−β阻害剤の存在下で培養される。
【０１４３】
一部の実施形態では、非心筋細胞は、ある期間にわたってＴＧＦ−β阻害剤およびＷＮＴ阻害剤の存在下で同時に培養される。
【０１４４】
別の実施形態では、非心筋細胞は、ＴＧＦ−β阻害剤の後で、ＴＧＦ−β活性化因子の存在下で培養される。ＴＧＦ−β活性化因子は、当技術分野で周知である。市販のＴＧＦ−β活性化因子の非限定的な例は、例えば、ＳＤ２０８（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＵＫ）が挙げられる。
【０１４５】
一部の実施形態では、ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、またはその両方は、リプログラミングの１日目後、２日目後、３日目後、４日目後、５日目後、６日目後、７日目後、８日目後、９日目後、１０日目後、１１日目後、１２日目後、１３日目後、１４日目後、１５日目後、２０日目後、２５日目後、３０日目後、１か月後、２か月後、３か月後、または４か月後に除去される。一部の実施形態では、ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、またはその両方は、リプログラミングの１０日目後に除去される。
【０１４６】
組成物
また、本開示は、本発明の方法により生成される単離された誘導心筋細胞を提供する。誘導心筋細胞は、少なくとも１つの心臓遺伝子を、天然の心筋細胞で見出されるものよりも高いレベルまたは低いレベルで発現し得る。
【０１４７】
一部の実施形態では、天然の心筋細胞に見出されるものよりも高いレベルで発現される心臓遺伝子は、Ｔｎｎｔ２、Ａｃｔｎ２、Ａｔｐ２ａ２、Ｍｙｈ６、Ｒｙｒ２、Ｍｙｈ７、およびＡｃｔｃ１からなる群から選択される。一部の実施形態では、天然の心筋細胞に見出されるものよりも低いレベルで発現される心臓遺伝子は、Ｍｙｂｐｃ３、Ｐｌｎ、Ｍｂ、Ｌｍｏｄ２、Ｍｙｌ２、Ｍｙｌ３、Ｃｏｘ６ａ２、Ａｔｐ５ａ１、Ｔｔｎ、Ｔｎｎｉ３、Ｐｄｋ４、Ｍｙｃｚ２、Ｃａｃｎａ１ｃ、Ｓｃｎ５ａ、Ｍｙｃｏｄ、およびＮｐｐａからなる群から選択される。
【０１４８】
別の態様では、本発明の方法により生成された誘導心筋細胞の実質的に均質な集団が提供される。一部の実施形態では、実質的に均質な集団の誘導心筋細胞は、少なくとも１つの心臓遺伝子を、天然の心筋細胞に見出されるものよりも高いレベルまたは低いレベルで発現する。
【０１４９】
一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の単離された誘導心筋細胞の集団、および担体、任意選択で薬学的に許容される賦形剤を含む。一部の実施形態では、組成物は、安定化剤および／または保存剤をさらに含む。
【０１５０】
組成物は、薬学的に許容される賦形剤、薬学的に許容される塩、希釈剤、担体、媒体、および当業者に周知のそのような他の不活性作用剤を含んでいてもよい。医薬調製物に一般的に使用される媒体および賦形剤としては、例えば、タルク、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、カカオ脂、水性または非水性溶媒、油、パラフィン誘導体、グリコールなどが挙げられる。溶液は、水、またはエタノール、１，２−プロピレングリコール、ポリグリコール、ジメチルスルホキシド、脂肪アルコール、トリグリセリド、およびグリセリンの部分エステルなどの、生理学的に適合する有機溶媒を使用して調製することができる。
【０１５１】
無菌等張性生理食塩水、水、１，３−ブタンジオール、エタノール、１，２−プロピレングリコール、水と混合されたポリグリコール、リンゲル液などを含んでいてもよい非経口組成物は、従来技法を使用して調製することができる。一態様では、組成物を意図する治療部位に位置させることおよび適切に配置することを容易にするために、着色剤が添加される。
【０１５２】
組成物は、移植可能なデバイスを使用して投与される作用剤を含むことができる。本開示により企図されている好適な移植可能なデバイスとしては、血管内ステント（例えば、自己拡張型ステント、バルーン拡張型ステント、およびステントグラフト）、スキャフォールド、およびグラフトなどが挙げられる。そのような移植可能デバイスは、少なくとも１つの表面が、誘導心筋細胞を生成することが可能な組成物でコーティングされていてもよくまたは含浸されていてもよい。また、組成物は、移植可能なデバイスのレザバー内に含有されている作用剤を含んでいてもよい。作用剤が移植可能なデバイスのレザバー内に含有されている場合、レザバーは、デバイスからの作用剤の溶出を可能にするように構成されている。移植可能なデバイスから投与される組成物の作用剤は、ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、またはその両方を含んでもよい。
【０１５３】
医薬組成物は、投与し易い任意の形態で提供することができる。組成物は、保存剤および／または安定化剤を含んでいてもよい。保存剤の非限定的な例としては、メチル−、エチル−、プロピル−パラベン、安息香酸ナトリウム、安息香酸、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、プロピオン酸、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、チメロサール、フェニル水銀酸塩、クロルヘキシジン、フェノール、３−クレゾール、四級アンモニウム化合物（ＱＡＣ）、クロルブタノール（chlorbutanol）、２−エトキシエタノール、およびイミドウレアが挙げられる。
【０１５４】
張性を制御するために、水性医薬組成物は、ナトリウム塩などの生理学的塩を含んでいてもよい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、塩化ナトリウムは１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在していてもよい。存在していてもよい他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸水素二ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カルシウムが挙げられる。
【０１５５】
組成物は、１つまたは複数の緩衝剤を含んでいてもよい。典型的な緩衝剤としては、リン酸緩衝剤、Ｔｒｉｓ緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、またはクエン酸緩衝剤が挙げられる。緩衝剤は、典型的には、５〜２０ｍＭの範囲の濃度で含まれるだろう。組成物のｐＨは、一般的には、５〜８、より典型的には６〜８、例えば、６．５〜７．５、または７．０〜７．８であり得る。
【０１５６】
組成物は、好ましくは無菌である。組成物は、好ましくはグルテンを含まない。組成物は、好ましくは非発熱性である。
【０１５７】
医薬組成物は、任意の適切な経路により投与することができ、適切な経路は、当業者であれば、治療しようとする疾患または状態に応じて明白である。典型的な投与経路としては、経口、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、頭蓋内、鼻腔内、または腹腔内が挙げられる。
【０１５８】
一部の実施形態では、細胞を含む組成物は、凍結保護剤を含んでいてもよい。凍結保護剤の非限定的な例としては、グリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、およびグリセロール）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド、スクロース、トレハロース、デキストロース、およびそれらの任意の組合せが挙げられる。
【０１５９】
一部の実施形態では、本発明の方法で使用される１つまたは複数の作用剤は、制御放出製剤で提供される。用語「制御放出製剤」は、持続放出製剤および徐放製剤を含む。制御放出製剤は、当技術分野で周知である。それらには、組成物の持続放出、定期的放出、パルス放出、または遅延放出を可能にする賦形剤が挙げられる。制御放出製剤としては、限定ではないが、組成物（ＷＮＴ阻害剤および／またはＴＧＦ−β阻害剤）をマトリックスに埋め込むこと；腸溶コーティング；マイクロカプセル化；ゲルおよびヒドロゲル；インプラント；ならびに組成物の制御放出を可能にする任意の他の製剤が挙げられる。
【０１６０】
一態様では、上述の作用剤、組成物、または製剤を含む部分のキットが提供される。
【０１６１】
治療の方法
本開示の組成物、細胞、および方法を使用した治療を必要とする対象としては、これらに限定されないが、先天性心臓欠陥を有する個体、変性筋肉疾患を罹患している個体、および虚血性心臟組織をもたらす状態を罹患している個体（例えば、冠状動脈疾患を有する個体）などが挙げられる。一部の例では、方法は、変性筋肉疾患または状態（例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、またはその結果として虚心性心筋症を起こす冠状動脈疾患）の治療に有用である。一部の例では、本方法は、心臓または心血管疾患または障害、例えば、心血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管発作（脳卒中）、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、冠状動脈弁疾患（valve  disease  coronary）、拡張型動脈疾患、拡張機能障害、心内膜炎、高血圧（高血圧症）、心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、その結果として虚血性心筋症を起こす冠状動脈疾患、僧帽弁逸脱、心筋梗塞（心臓発作）、または静脈血栓塞栓症を有する個体の治療に有用である。
【０１６２】
本開示の組成物、細胞、および方法を使用する治療に好適な対象としては、虚血性心臓組織をもたらす状態を含むがそれに限定される、心臓の状態を有する個体（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、飼育哺乳動物などの哺乳動物対象、マウス、ラットなどの実験非ヒト哺乳動物対象）（例えば、冠状動脈疾患を有する個体）などが挙げられる。一部の例では、治療に好適な個体は、心臓または心血管疾患または状態、例えば、心血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管発作（脳卒中）、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、冠状動脈弁疾患、拡張型動脈疾患、拡張機能障害、心内膜炎、高血圧（高血圧症）、心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、その結果として虚血性心筋症を起こす冠状動脈疾患、僧帽弁逸脱、心筋梗塞（心臓発作）、または静脈血栓塞栓症を罹患している。一部の例では、本方法による治療に好適な個体としては、変性筋肉疾患、例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、またはその結果として虚血性心筋症を起こす冠状動脈疾患を有する個体が挙げられる。
【０１６３】
誘導心筋細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ生成
一部の態様では、心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、および１つまたは複数のリプログラミング因子を投与し、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ＴＧＦ−β阻害剤およびＷＮＴ阻害剤は、リプログラミング因子と同時に投与される。他の実施形態では、ＴＧＦ−β阻害剤およびＷＮＴ阻害剤は、互いに同時に投与される。さらに他の実施形態では、ＴＧＦ−β阻害剤およびＷＮＴ阻害剤は、互いにおよび／またはリプログラミング因子と順次的に投与される。
【０１６４】
一部の実施形態では、ＴＧＦ−β阻害剤は、ＷＮＴ阻害剤の前に、例えば、ＷＮＴ阻害剤を投与する約６時間〜約７２時間前に、ある期間にわたって投与される。一部の実施形態では、ＴＧＦ−β阻害剤は、ＷＮＴ阻害剤を添加する約１２時間〜約６０時間、約１８時間〜約４８時間、約２４時間〜約４２時間、約３０時間〜約３６時間前に（または数値のいずれか２つの間の任意の範囲、終点を含む）、ＴＧＦ−β阻害剤の存在下で送達される。一部の実施形態では、ＴＧＦ−β阻害剤は、ＷＮＴ阻害剤を添加する約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約６０時間、または約７２時間前に、対象に送達される。
【０１６５】
ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、またはその両方は、当業者に公知の任意の方法により投与することができる。例えば、ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、またはその両方は、例えば、経口送達、血管内送達、筋肉内送達、心筋内送達、および腹腔内送達などにより達成することができる。
【０１６６】
ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、またはその両方は、任意のスケジュールに従って、例えば、毎日、１日毎、１日２回、２日毎、３日毎、４日毎、および５日毎などで投与することができる。一部の実施形態では、ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、またはその両方は、およそ５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、またはそれよりも長期間にわたって毎日投与される。
【０１６７】
一部の実施形態では、ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、またはその両方は、およそ１４日間にわたって毎日投与される。
【０１６８】
一部の実施形態では、対象には、ＴＧＦ−β阻害剤およびＷＮＴ阻害剤がある期間にわたって同時に投与される。
【０１６９】
一部の実施形態では、対象には、ＴＧＦ−β阻害剤の後でＴＧＦ−β活性化因子が投与される。ＴＧＦ−β活性化因子は、当技術分野で周知である。市販のＴＧＦ−β活性化因子の非限定的な例は、例えば、ＳＤ２０８（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＵＫ）が挙げられる。
【０１７０】
一部の実施形態では、少なくとも１つのリプログラミング因子、例えばＢａｆ６０ｃ、Ｅｓｒｒｇ、Ｇａｔａ４、Ｇａｔａ６、Ｈａｎｄ２、Ｉｒｘ４、Ｉｓｌ１、Ｍｅｆ２ｃ、Ｍｅｓｐ１、Ｍｅｓｐ２、ミオカルディン、Ｎｋｘ２．５、ＳＲＦ、Ｔｂｘ５、Ｔｂｘ２０、Ｚｆｐｍ２、ｍｉＲ−１３３、またはそれらの任意の組合せが、対象に投与されている。好ましい実施形態では、リプログラミング因子の２つまたはそれよりも多くの、より好ましくは３つまたはそれよりも多くの組合せが、対象に投与される。一部の実施形態では、上記の列挙されているリプログラミング因子の１つまたは複数は、明示的に除外される。他の実施形態では、リプログラミング因子は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、ミオカルディン、またはそれらの任意の組合せの群から選択される。特定の実施形態では、リプログラミング因子は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５（ＧＭＴ）である。他の特定の実施形態では、リプログラミング因子は、ミオカルディン、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５（すなわち、ＭＭＴ）である。他の特定の実施形態では、リプログラミング因子は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、およびミオカルディン（すなわち、４Ｆ）である。他の実施形態では、リプログラミング因子は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５、Ｅｓｓｒｇ、ミオカルディン、Ｚｆｐｍ２、およびＭｅｓｐ１（すなわち、７Ｆ）である。
【０１７１】
一部の実施形態では、ＴＧＦ−β阻害剤は、リプログラミング因子を導入した約１２時間〜約３６時間後に、対象に投与される。ＴＧＦ−β阻害剤の非限定的な例としては、ＳＢ４３１５４２、Ｄ４４７６、ＬＤＮ−１９３１８９、デキサメタゾン、およびＬＹ３６４９４７が挙げられる。また、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β受容体、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路のメンバーを標的とするｓｉＲＮＡを、本発明と共に使用することができる。
【０１７２】
一部の実施形態では、ＷＮＴ阻害剤は、リプログラミング因子を導入した約２４時間〜約７２時間後に、対象に投与される。一部の実施形態では、ＷＮＴ阻害剤は、ＸＡＶ９３９、Ｄ４４７６、ＩＷＲ１、およびミリセチンからなる群から選択される。
【０１７３】
誘導心筋細胞を使用する治療方法
本発明は、心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の方法により産生された有効量の誘導心筋細胞を投与することを含む方法を提供する。
【０１７４】
一部の態様では、本開示の誘導心筋細胞を使用して、それを必要とする対象を治療することができる。一部の実施形態では、誘導心筋細胞を、それを必要とする対象体に投与することができ、対象への誘導心筋細胞の投与は、対象において心血管疾患を治療する。したがって、一部の実施形態では、心血管疾患を治療する方法は、それを必要とする対象に誘導心筋細胞の集団を投与することを含む。他の実施形態では、心血管疾患を治療する方法は、それを必要とする対象に、ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、またはその両方を含む有効量の組成物を投与することを含む。
【０１７５】
一部の実施形態では、非心筋細胞は、ＷＮＴ阻害剤を添加する前に、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、または約４８時間にわたって、ＴＧＦ−β阻害剤の存在下で培養される。１つの好ましい実施形態では、非心筋細胞は、ＷＮＴ阻害剤を添加する前に約２４時間にわたってＴＧＦ−β阻害剤の存在下で培養される。
【０１７６】
本明細書の全体にわたって使用されている略語は、別様の記載がない限り、以下の意味を有する：α−ＭＨＣ−ＧＦＰ、アルファ−ミオシン重鎖緑色蛍光タンパク質；ＣＦ、心臓線維芽細胞；ｃｍ、センチメートル；ＣＯ、心拍出量；ＥＦ、駆出率；ＦＡＣＳ、蛍光活性化細胞選別；ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質；ＧＭＴ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５；ＧＭＴｃ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、ＴＧＦβｉ、ＷＮＴｉ；ＧＯ、遺伝子オントロジー；ＨＣＦ、ヒト心臓線維芽細胞；ｉＣＭ、誘導心筋細胞；ｋｇ、キログラム；μｇ、マイクログラム；  μｌ、マイクロリットル；ｍｇ、ミリグラム；ｍｌ、ミリリットル；ＭＩ、心筋梗塞；ｍｓｅｃ、ミリ秒；ｍｉｎ、分；ＭＭＴ、ミオカルディン、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５；ＭＭＴｃ、ミオカルディン、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、ＴＧＦβｉ、ＷＮＴｉ；ＭＲＩ、磁気共鳴画像法；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；ＰＢＳＴ、リン酸緩衝生理食塩水、ｔｒｉｔｏｎ；ＰＦＡ、パラホルムアルデヒド；ｑＰＣＲ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応；ｑＲＴ−ＰＣＲ、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応；ＲＮＡ、リボ核酸；ＲＮＡ−ｓｅｑ、ＲＮＡ配列決定；ＲＴ−ＰＣＲ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応；ｓｅｃ、秒；ＳＶ、心拍血液量；ＴＧＦ−β、形質転換増殖因子ベータ；ＴＧＦ−βｉ、形質転換増殖因子ベータ阻害剤；ＷＮＴ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−Ｉｎｔ；ＷＮＴｉ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ−Ｉｎｔ阻害剤；ＹＦＰ、黄色蛍光タンパク質；４Ｆ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、ＴＢＸ５、およびミオカルディン；４Ｆｃ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、ＴＢＸ５、およびミオカルディン＋ＴＧＦ−βｉおよびＷＮＴｉ；７Ｆ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５、Ｅｓｓｒｇ、ミオカルディン、Ｚｆｐｍ２、およびＭｅｓｐ１；７Ｆｃ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５、Ｅｓｓｒｇ、ミオカルディン、Ｚｆｐｍ２、およびＭｅｓｐ１＋ＴＧＦ−βｉおよびＷＮＴｉ。
【実施例】
【０１７７】
以下の実施例は、本開示のある特定の実施形態をさらに例示するためのものである。これらの実施例は、当業者に提供するために示されており、その範囲を限定するためのものではない。
【０１７８】
（実施例１）
ＴＧＦ−βおよびＷＮＴシグナル伝達は、心臓リプログラミングの障壁である
心臓リプログラミングを向上させるために操作することができる生物学的経路を特定するために、無作為低分子ライブラリースクリーニングを含む化学生物学的手法を使用した。Wangら（２０１５年）Circ.  Res.、１１６巻：２３７〜２４４頁に詳細に記載されているように、最近記載された多シストロン性ＧＭＴレトロウイルスＭｅｆ２ｃ−Ｐ２Ａ−Ｇａｔａ４−Ｔ２Ａ−Ｔｂｘ５を用いて、心臓リプログラミングを誘導し、３つの転写因子の各々が至適に発現されることを保証した。
【０１７９】
手短に言えば、マウス心臓線維芽細胞（ＣＦ）を、以前に記載されるような遊走法を使用して、ＰＯ−Ｐ４  αＭＨＣ−ＧＦＰトランスジェニック新生仔から単離した。Burridgeら（２０１２年）Cell  Stem  Cell、１０巻：１６〜２８頁；Iedaら（２０１０年）Cell、１４２巻：３７５〜３８６頁。心臓を単離し、細かく刻み、ゼラチンコーディングプレートに配置し、線維芽細胞外植片培地（ＩＭＯＭ中の２０％ＦＢＳ）で１週間３７℃にてインキュベートした。組織を２×ＰＢＳで洗浄し、０．０５％トリプシンで５分間消化し、線維芽細胞外植片培地に再懸濁した。組織を、７０μΜフィルターでろ過し、ペレットにした。ペレットにした細胞を、以前に記載されているように、Ｔｈｙ−１−ＡＰＣ（抗マウス／ラットＣＤ９０．１  ｔｈｙ−１．１）（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で２０分間染色し、ＰＢＳで２回洗浄した。Iedaら（２０１０年）Cell、１４２巻：３７５〜３８６頁。細胞を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によりＡＰＣ＋細胞について選別し、１０ｃｍのゼラチンコーティングプレートに播種し、凍結させずに新鮮なまま全ての研究に使用した。
【０１８０】
Ｔｈｙ１＋  ＣＦのｉＣＭへの直接転換を、Iedaら（２０１０年）Cell、１４２巻：３７５〜３８６頁に以前に記載されているように完了させた。手短に言えば、ｐＭＸ−Ｇａｔａ４、ｐＭＸ−Ｍｅｆ２ｃ、ｐＭＸ−Ｔｂｘ５、多シストロン性ｐＭＸ−Ｍｅｆ２ｃ−Ｇａｔａ４−Ｔｂｘ５（ＧＭＴ多シストロン性）、またはｐＭＸ−ｄｓＲｅｄを、以前に記載されているように構築した。Iedaら（２０１０年）Cell、１４２巻：３７５〜３８６頁；Wang,  L.ら（２０１５年）Circ  Res、１１６巻、２３７〜２４４頁（２０１５年）。レトロウイルスベクターを、以前に記載のように、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してパッケージングし、線維芽細胞外植片培地中約８０％コンフルエントＰｌａｔＥ細胞を含む１５ｃｍプレートに、ＯｐｔｉＭＥＭ（１０μｇ）中で送達した。Qian,  L.ら（２０１２年）Nature、４８５巻、５９３〜５９頁。トランスフェクションの４８時間後にウイルス上清を収集し、０．６μｇ／ｍｌポリブレン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を添加した心臓線維芽細胞に感染させるために使用し、−１日目に心臓線維芽細胞に添加した。２４時間後、０日目に、培養培地を、心筋細胞培養培地（ｉＣＭ培地（Qian,  L.ら（２０１３年）Nature  Protocols、８巻：１２０４〜１２１５頁））で置換し、３〜４日毎に置換した。３つの個別のＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５レトロウイルスを、初期薬物スクリーニングおよびｉｎ  ｖｉｖｏ実験に使用した。しかしながら、初期スクリーニング後のさらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験では、ＧＭＴ多シストロン性レトロウイルスを使用した。
【０１８１】
薬物スクリーニングでは、α−ＭＨＣ−ＧＦＰトランスジェニックマウスに由来するＴｈｙ１＋新生仔心臓線維芽細胞を、２０００細胞／ウェルの密度で３８４ウェルプレートに播種した。細胞を、上述のようにＧＭＴレトロウイルスでリプログラミングした。リプログラミングの１日目に、ウイルスをｉＣＭ培地で置換し、Ｂｉｏｍｅｋ液体ハンドリングロボットステーションを使用して、化合物をウェルに添加して、薬物−ライブラリー濃度の１：１０００希釈を達成した。５５００個の毒物学的に試験された化合物のライブラリー（例えば、ＬＯＰＡＣ、ＴＯＣＲＩＳ、ＬＯＮＺＡ、およびＳＰＥＣＴＲＵＭ）をスクリーニングした。リプログラミングの１４日目に、プレートを固定し、免疫細胞化学法に記載されているように、ＧＦＰおよびトロポニンＴについて染色し、ＩＮＣＥＬＬシステムを用いたハイスループットハイコンテントイメージングを使用して画像化した。データは、ＩＮＣＥＬＬ画像分析パッケージを使用して分析した。
【０１８２】
免疫細胞化学的分析および定量化では、試料を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を使用して固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で２回洗浄し、以前に記載のように、Ｐｏｗｅｒ  Ｂｌｏｃｋユニバーサルブロッキング試薬（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ、＃ＨＫ０８５−５Ｋ）を用いて１５分間室温でブロッキングした。Qianら（２０１３年）Nature  protocols、８巻：１２０４〜１２１５頁。ＰＢＳＴおよびブロッキング緩衝液（１：１）で希釈し、４℃で一晩インキュベートした一次抗体を含む混合液中で、試料をインキュベートした。以下の一次抗体を使用した：トロポニンＴ、心臓アイソフォームＡｂ−１、マウスモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃ＭＳ−２９５−ＰＯ、１：２００）、モノクローナル抗α−アクチニンサルコメア抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ａ７８１１、１／２００）、および抗ＧＦＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ａ１１１２０、１：２００）。試料を、各々室温で１５分間ＰＢＳＴで２回洗浄し、次いで、ＰＢＳＴおよびブロッキング緩衝液（１：１）で希釈した二次抗体を含む混合液中で１時間室温にてインキュベートした。試料を、各々室温で１５分間ＰＢＳＴで３回洗浄し、視覚化した。染色した細胞を、ＩｍａｇｅＪ画像分析ソフトウェアで定量化した。標準誤差平均を全ての比較のために算出した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
【０１８３】
潜在的ｉＣＭを、α−ＭＨＣ−駆動性ＧＦＰリポーターの活性化により検出した。３８４ウェル形式で直接リプログラミングするこの方法を最適化した後、毒物学的に試験された化合物のライブラリー（例えば、ＬＯＰＡＣ、ＴＯＣＲＩＳ、およびＳＰＥＣＴＲＵＭ薬物ライブラリー）に由来する化合物を、ハイスループットハイコンテントイメージングを使用してスクリーニングした（図１）。化合物を、ＧＭＴ形質導入の１日後に添加し、α−ＭＨＣ−ＧＦＰ＋細胞を２週間後に定量化した。Ｚスコアが５よりも高い上位２６ヒット（図２）を特定し、その後検証したところ、これらヒットは、ＧＦＰ＋ｉＣＭのパーセントを２倍〜６倍増加させた（図３）。上位ヒットは、ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する３つの分子（ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ−１９３１８９、およびデキサメタゾン）、ＷＮＴシグナル伝達を阻害する３つの分子（ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ１、およびミリセチン）、ならびにＷＮＴシグナル伝達およびＴＧＦ−βシグナル伝達を両方とも阻害する１つの分子（Ｄ４４７６）、ならびに抗炎症特性を有する分子（例えば、デキサメタゾン、ＤＨＡ、およびピロキシカム）を含んでいた（図３）。共通の経路に複数ヒットがあることは、これらシグナル伝達経路が、心臓リプログラミングに影響を及ぼしていることを示唆した。
【０１８４】
ＷＮＴ阻害剤化合物またはＴＧＦ−β阻害剤化合物のうちどちらが最も効果的にリプログラミング品質を向上させるかを特定するために、一連の心臓遺伝子および線維芽細胞遺伝子についてｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。手短に言えば、全ＲＮＡを、市販キットで単離した（Ｄｉｒｅｃｔ−Ｚｏｌ  ＲＮＡミニプレップ、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。オリゴ（ｄＴ）およびランダム六量体プライマーの混合物を使用して逆転写を実施した（ｑＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。７９００ＨＴ  ＦＡＳＴリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でリアルタイムＰＣＲ分析を実施した。使用したＴａｑｍａｎプローブは、表１に列挙されている。ハイスループットリアルタイムＰＣＲ分析では、試料を、９６．９６  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｒｒａｙ  ＩＦＣを用いてＢｉｏｍａｒｋ  ＨＤシステム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）で分析した。
【０１８５】
【表１−１】
2019513366.tif 000003
【表１−２】
2019513366.tif 000004
ＳＢ４３１５４２は、ＴＧＦ−β阻害剤の中で、線維芽細胞遺伝子発現の下方制御が最も効率的であり、ＸＡＶ９３９は、ＷＮＴ阻害剤の中で、リプログラミングの２週目での心臓遺伝子発現の活性化が最も効率的であった。また、ＳＢ４３１５４２（２．６μΜ）（図４）は、リプログラミングの１日目に添加した場合が最も効果的であることも見出された（図５）。ＸＡＶ９３９の種々の用量およびタイミングを試験して、その最適なタイミングおよび濃度を特定した。５μΜが最も効果的な用量であり、リプログラミングの最初の８日間中のいずれの時点で添加しても、同じ増強効果を示すことが見出された（図６）。２つの低分子を組み合わせる場合、１日目にＳＢ４３１５４２を添加した後で、リプログラミングの２日目にＸＡＶ９３９を添加することにより、最大のリプログラミング効率が達成されることが見出された（図７）。α−ＭＨＣ−ＧＦＰ＋ｉＣＭの増加により示されているように、このプロトコールは、心臓リプログラミングの約９倍増加をもたらした（図８）。さらに、リプログラミングの１０日目以降は、化合物は必須ではなかった（図９）。
【０１８６】
（実施例２）
ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｉＣＭの効率および品質を増加させる
低分子をリプログラミングカクテルに添加するタイミング、用量、および条件を検証および最適化した後、ＧＭＴ−過剰発現線維芽細胞を、１日目にはＳＢ４３１５４２（２．６μΜ）で、および２日目にはＸＡＶ９３９（５μΜ）で処理した。ＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析の場合、リプログラミングされた心臓線維芽細胞を、培養皿から回収し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＬＳＲ−ＩＩ（ＢＤ）で分析した。生細胞選別および分析の場合、ＴＲＹＰＬＥ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して細胞を解離させ、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ）機械を使用して選別した。固定細胞ＦＡＣＳの場合、細胞を、ホルマリンで１５分間固定し、０．１％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理し、抗ＧＦＰ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、および抗α−サルコメアアクチニン抗体（Ｓｉｇｍａ）または抗心筋ミオシン２抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）のいずれかで染色し、その後、Ａｌｅｘａ−５９４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）にコンジュゲートされている二次抗体で染色した。
【０１８７】
１日目のＳＢ４３１５４２（２．６μΜ）および２日目のＸＡＶ９３９（５μΜ）の組合せは、２週間以内に心臓線維芽細胞のリプログラミング効率を約３０％増加させた（図１０）。ＳＢ４３１５４２単独の場合、細胞は、より速く成熟し、ＧＭＴ感染の３週間後には早くも拍動細胞が出現した。驚くべきことに、ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９の組合せでは、ＧＭＴ単独の場合の６〜８週間と比較して、早くも１週間で拍動細胞が出現した。また、トロポニンＴ染色およびサルコメア組織化の進行は、ＧＭＴ単独の場合の４〜６週間と比べて、ＧＭＴ＋ＳＢ４３１５４２／ＸＡＶ９３９によるリプログラミングのわずか２週間後にｉＣＭで観察された。
【０１８８】
カルシウムトランジエントを、以前に記載されているように評価した。Qian,  L.ら（２０１２年）Nature、４８５巻：５９３〜５９８頁。手短に言えば、単離筋細胞を、室温で３０分間Ｆｌｕｏ−４で負荷してから、潅流チャンバーに移した。負荷溶液は、乾燥ＤＭＳＯ中５ｍＭのＦｌｕｏ−４  ＡＭと、懸濁筋細胞を含む細胞外タイロード溶液で１００倍希釈されたＰｏｗｅｒｌｏａｄ（商標）濃縮液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）との１：１０混合物を含んでいた。脱エステル化のためにさらに２０分間を取ってから記録を取った。目的の細胞のいずれかの側に配置され、電場刺激装置（ＩｏｎＯｐｔｉｘ、Ｍｙｏｐａｃｅｒ）に接続された白金線間に１Ｈｚの電圧パルスを印加することにより、収縮およびカルシウムトランジエントを誘発させた。Ｆｌｕｏ−４蛍光トランジエントを、標準フィルターセット（＃４９０１１  ＥＴ、Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で記録した。ペーシングの停止後に休止蛍光を記録し、実験の終了時に細胞をピックアップして視野から取り除いた後でバックグラウンド光を得た。収縮は、明視野にある目的の細胞に光を当て、その後、ＣＣＤカメラ（ＩｏｎＯｐｔｉｘ  Ｍｙｏｃａｍ）に向けることにより、カルシウムトランジエントと同時に光学的に記録した。細胞長シグナルを、ビデオモーションディレクター（ｖｉｄｅｏ  ｍｏｔｉｏｎ  ｄｉｒｅｃｔｏｒ）（ＶＥＤ２０５；Ｃｒｅｓｃｅｎｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）により電圧に変換し、様々な筋細胞の収縮振幅を、細胞長の変化パーセントを算出することにより正規化した。これらの研究は、２つの化合物の存在下でのリプログラミングの４週間以内に、約５０％よりも多くの細胞が、自発的なカルシウムトランジエントを示したことを明らかにした（図１１）。
【０１８９】
また、ＲＮＡｓｅｑを使用して、心臓リプログラミングの３、５、および６週間後のｉＣＭの遺伝子発現プロファイルを調査した。これら実験では、α−ＭＨＣ−ＧＦＰ＋  ｉｎ  ｖｉｔｒｏマウスｉＣＭ、ＴＮＴ−ＧＦＰ＋  ヒトｉＣＭ、および対照ｄｓＲｅｄ感染心臓線維芽細胞（偽）を、ＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩ細胞選別器で選別した。ＲＮＡｓｅｑ用に生細胞を選別する場合、α−ＭＨＣ−ＧＦＰマウス心臓線維芽細胞またはｈＴＮＴ−ＧＦＰ＋のリプログラミングされたヒト心臓線維芽細胞を、培養皿から解離させ、ＡｒｉａＩＩ  ＦＡＣＳ選別器を用いてＧＦＰ＋発現について選別した。ｉｎ  ｖｉｖｏでリプログラミングされたｉＣＭのランゲンドルフ単離後、ｉＣＭを、それらのｐｅｒｉｏｓｔｉｎ  ｃｒｅ  ＹＦＰリポーターの発現に基づき、マイクロピペットを使用してピックアップした。それらのＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏキット＃２１０８７４を使用して単離した。Ｏｖａｔｉｏｎ  ＲＮＡ−ｓｅｑシステムｖ２キット（ＮｕＧＥＮ）を使用し、ランダム六量体およびポリＴキメラプライマーの組合せを使用して、全ＲＮＡ（２０〜５０ｎｇ）を逆転写して、第一鎖ｃＤＮＡを合成した。次いで、加熱することによりＲＮＡ鋳型を部分的に分解し、ＤＮＡポリメラーゼを使用して第二鎖ｃＤＮＡを合成した。次いで、単一プライマー等温増幅法（ＳＰＩＡ）を使用して、二本鎖ＤＮＡを増幅した。ＳＰＩＡは、ＲＮａｓｅＨが、二本鎖ＤＮＡの５’末端のＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖のＲＮＡを分解し、その後、ＳＰＩＡプライマーがｃＤＮＡと結合し、ポリメラーゼが、既存のフォワード鎖を置換することによりプライマーの３’末端で複製を開始する、線形ｃＤＮＡ増幅プロセスである。次いで、ランダム六量体を使用して、第二鎖ｃＤＮＡを線形的に増幅した。ｃＤＮＡ試料を、Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ２ソニケーターを使用して、２００ｂｐの平均サイズに断片化した。断片化ｃＤＮＡから、Ｏｖａｔｉｏｎ  Ｕｌｔｒａｌｏｗ  Ｖ２キット（ＮｕＧｅｎ）を使用してライブラリーを作製した。末端修復およびライゲーション後、ライブラリーを、９サイクルでＰＣＲ増幅した。ライブラリー品質は、高感度ＤＮＡチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒで評価し、濃度は、ｑＰＣＲ（ＫＡＰＡ）で定量化した。ＨｉＳｅｑ  ２５００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を、シングルリード、５０サイクルシーケンシングランで用いて、ライブラリーを配列決定した。ＲＮＡｓｅｑ分析パイプラインを、以前に報告されているように使用した。Theodoris,  C.V.ら（２０１５年）Cell、１６０巻：１０７２〜１０８６頁。
【０１９０】
単一の化合物で３週間処理したｉＣＭではなく、ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９（ＧＭＴｃ）で３週間処理したｉＣＭのみが、主成分分析（ＰＣＡ）および発現が異なる上位遺伝子のヒートマップにより反映されているように、より心筋細胞様の転写プロファイルを示した（図１２）。ＧＭＴｃによる５または６週間のリプログラミングは、ＧＭＴ単独によるリプログラミングよりも、成体マウス心室心筋細胞により近い遺伝子発現プロファイルをもたらした（図１２）。ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９（＋ＳＢＸＡＶ）を、ＧＭＴ形質導入線維芽細胞に添加すると、ＧＭＴ単独（−ＳＢＸＡＶ）と比較して、心筋細胞（ＣＭ）状態により近い、リプログラミングの進行状態がもたらされた。ＧＭＴと組み合わせたＳＢ４３１５４２（＋ＳＢ）単独またはＸＡＶ９３９（＋ＸＡＶ）単独はいずれも、この効果を示さなかった。
【０１９１】
さらに、ＧＭＴｃで３、５、または６週間リプログラミングされたｉＣＭは、心筋細胞と同様に、ＴＧＦ−βおよびＷＮＴシグナル伝達に関連する遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームを示す遺伝子を有意に下方制御した。５週目のＧＭＴとＧＭＴｃとの遺伝子発現プロファイルを比較すると、制御が異なる上位ＧＯタームは、細胞外マトリックス、イオンチャネル、および筋肉形成の制御と関連していることが見出された（図１３）。最も高度に発現された心臓収縮性イオンハンドリングおよび細胞外マトリックス遺伝子をより詳細に分析すると、これら遺伝子の発現は、化合物により、完全でないとはいえ、成体心筋細胞の遺伝子発現と非常に近いものにされることが見出された。したがって、ＴＧＦ−βおよびＷＮＴシグナル伝達の阻害は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、細胞運命転換の品質および速度を両方とも増加させた。
【０１９２】
（実施例３）
ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９は、古典的ＴＧＦ−βおよびＷＮＴシグナル伝達を阻害することにより心臓リプログラミングを増強する
次に、低分子が、ＴＧＦ−βおよびＷＮＴシグナル伝達を制御する機序を調査した。２０μｇのタンパク質を含む細胞溶解物からＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離し、電気泳動的にポリビニリデンジフルオリド膜（ＢｉｏＲａｄ）へと移した。次いで、膜をＰＢＳで洗浄し、ブロッキング緩衝液（Ｌｉ−ｃｏｒ）で処理し、次いで、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。以下の一次抗体を使用した：抗ＧＡＰＤＨ抗体負荷対照（Ａｂｃａｍ  ＃ａｂ９４８４、０．５μｇ／ｍｌ）、抗活性β−カテニン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃０５−６６５、１：１０００）、抗Ｔ−抗原（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ１６８７９、１：１０００）、および抗ホスホＳｍａｄ２／３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃８６８５Ｓ、１：１０００）。膜をＰＢＳで洗浄し、適切な二次抗体（Ｌｉ−Ｃｏｒ、ＩＲＤｙｅ  ６００ＬＴ；ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ、１：１０，０００）と共に室温で１時間インキュベートした。膜を洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｆｃデュアルモードイメージングシステムで視覚化した。
【０１９３】
ＳＭＡＤ２／３のリン酸化（ＴＧＦ−β活性化の指標）、および活性βカテニンの発現（ＷＮＴ活性化の指標）は、ＳＢ４３１５４２またはＸＡＶ９３９により有意に低減された。また、ＴＧＦ−βまたは古典的ＷＮＴシグナル伝達を活性化させると、それぞれＳＢ４３１５４２またはＸＡＶ９３９により誘導されたリプログラミング効率増加が反転することが観察された。リプログラミング中に過剰なＴＧＦ−β１リガンドを添加すると、ＳＢ４３１５４２の効果が反転し、ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９の併用効果が部分的に阻害された。しかしながら、ＴＧＦ−βシグナル伝達の他の局面を制御するＢＭＰ４は、心臓リプログラミングに有意な影響を及ぼさなかった（図１４）。さらに、構成的に活性なＳＭＡＤ２またはＳＭＡＤ３（ＴＧＦ−βシグナル伝達エフェクター）の過剰発現は、ＳＢ４３１５４２による心臓リプログラミング増強を消失させた（図１５）。ＳＢ４３１５４２は、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）４およびＡＬＫ５受容体を特異的に阻害するため、ｓｉＲＮＡによるＡＬＫ４またはＡＬＫ５のノックダウンが、直接心臓リプログラミングに及ぼす効果を試験した。ＡＬＫ４またはＡＬＫ５の約８０％の低減（図１６）は、ＳＢ４３１５４２と同様に、直接心臓リプログラミングを増強した（図１６）。同様に、古典的ＷＮＴシグナル伝達を活性化するＷＮＴ３ａは、心臓リプログラミングに対するＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９の効果を部分的に遮断した。しかしながら、ＷＮＴ５またはＷＮＴ１１による非古典的ＷＮＴ経路の活性化は、有意な効果を示さなかった。さらに、古典的ＷＮＴ経路を活性化するグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１の添加は、ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９の併用効果を反転させた（図１７）。したがって、ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９は、ＴＧＦ−βおよび古典的ＷＮＴシグナル伝達を阻害することにより心臓リプログラミングを増強する。
【０１９４】
（実施例４）
ＴＧＦ−βおよびＷＮＴ阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏで心臓リプログラミングを増強する
ＧＭＴの心筋内注射は、ｉｎ  ｖｉｖｏで線維芽細胞をｉＣＭへとリプログラミングすることに成功し、心臓機能を増加させ、傷害後の傷痕サイズを減少させたが、心臓機能を完全には回復させないことが以前に示された。Qian,  L.ら（２０１２年）Nature、４８５巻：５９３〜５９８頁。ＴＧＦ−βおよびＷＮＴシグナル伝達の阻害が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの心臓リプログラミングに及ぼす効果を、冠状動脈結紮およびＧＭＴをコードするレトロウイルス（ＧＭＴｃ）の心筋内注射後の２週間にわたって、ＳＢ４３１５４２（１０ｍｇ／ｋｇ／日）およびＸＡＶ９３９（２．５ｍｇ／ｋｇ／日）を毎日腹腔内注射することにより試験した。
【０１９５】
動物研究では、Ｐｏｓｔｎ−ＣｒｅマウスおよびＲｏｓａ２６−ＥＹＦＰマウスを交配することにより、Ｐｏｓｔｎ−Ｃｒｅ：Ｒ２６Ｒ−ＹＦＰマウスを得た。外科手術の動物プロトコールは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物実験倫理委員会により承認を受けた。全ての外科手術は、以前に記載のように実施した。Qian,  L.ら（２０１２年）Nature、４８５巻：５９３〜５９８頁。手短に言えば、マウスを、２．４％イソフルラン／９７．６％酸素で麻酔し、保温パッド（３７℃）に仰臥位で配置した。動物に１９Ｇ断端針を挿管し、ＭｉｎｉＶｅｎｔ８４５型マウス人工呼吸器（Ｈｕｇｏ  Ｓａｃｈｓ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ−Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ；心拍血液量、２５０μｌ；呼吸数、１２０呼吸／分）を使用して、室内空気で人工呼吸した。Qian,  L.ら（２０１２年）Nature、４８５巻：５９３〜５９８頁に記載されているように、７−０  ｐｒｏｌｅｎｅ縫合で左前下行枝（ＬＡＤ）動脈を恒久的に結紮することにより、心筋梗塞（ＭＩ）を誘導した。偽手術動物は、外科手術対照としての役目を果たし、ＬＡＤを結紮しなかったことを除いて実験動物と同じ手順に供した。濃縮ウイルス（ＧＭＴ）のプールを混合し、１０μｌの混合ウイルスおよび１０μｌのＰＢＳを、一体型２９Ｇ針を有するインスリン用注射器（ＢＤ）で心筋層内に注射した。全投薬量の注射は、冠状動脈閉塞後の分岐梗塞区域に基づき、梗塞域と境界域との境界に沿って実施した。２日目から１５日目まで、動物に、ＳＢ４３１５４２（１０ｍｇ／ｋｇ／日）およびＸＡＶ９３９（２．５ｍｇ／ｋｇ／日）を毎日腹腔内注射した。
【０１９６】
連続心エコー検査を、ＭＩの前、ならびにＭＩの１、２、４、８、および１２週間後に実施して、心臓機能を評価した。心エコー検査は、１５ＭＨｚ線形アレイ超音波振動子を有するＶｅｖｏ７７０高解像度マイクロイメージングシステム（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ）を用いて実施した。左心室を、フレームレートが１２０Ｈｚの傍胸骨長軸像および傍胸骨短軸像の両方で評価した。収縮終期または拡張終期は、それぞれ左心室が最も小さくおよび最も大きく見えた位相と定義し、駆出率測定に使用した。短縮率を算出するために、左心室収縮終期および拡張終期直径を、掃引速度が５０ｍｍ／ｓの乳頭筋における左心室Ｍモードトレースから測定した。収縮終期および拡張終期寸法の二次元測定のためにＢモードを使用した。
【０１９７】
実験の終了時に（ＭＩの１２週間後）、動物を磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）にかけ、心臓の構造および機能を評価した。ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＲＩ画像法は、Ａｇｉｌｅｎｔイメージングコンソールに接続された７Ｔ前臨床水平ボアマグネットで実施した。動物を２％イソフルランおよび９８％酸素の吸入により麻酔し、２８ｍｍ内径（ＩＤ）を有する自作線形極性化バードケージコイルに配置した。画像化実験中の体温は、３４℃に維持した。動物の心拍動、呼吸、および体温を、ＭＲＩ互換性の小動物生命維持システム（ＳＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ、Ｓｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ、ＮＹ）でモニターした。マウス心臓の位置ならびに長軸および短軸を、以下のパラメーターを用いたスカウト画像から決定した：繰り返し時間（ＴＲ）、１０ｍｓｅｃ；エコー時間（ＴＥ）、４ｍｓｅｃ；励起フリップ角、２０度；視野（ＦＯＶ）、６ｃｍ２；マトリックス寸法、１２８×１２８；スライス厚、１ｍｍ；反復数、２回。対照および梗塞心臓の機能パラメーターを評価するため、短軸のＭＲＩ画像をスピンエコーパルスシーケンスで取得した。取得のパラメーターは、ＴＲ＝１ｓｅｃ、ＴＥ＝１０ｍｓｅｃ、面内画像解像度＝２００□ｍ、および取得時間＝約２０分間（心拍数に依存する）であった。心臓および呼吸ゲーティングを使用した。駆出率を測定するため、心臓の９枚または１０枚の短軸スライスを、心拡張期（Ｒ−心臓ピーク後ゼロ遅延）および心収縮期（ＲピークからのＲＲ間隔遅延の４５％）で取得した。
【０１９８】
この評価の後、動物を犠牲にし、組織学的研究のために心臓を回収した。ウイルス送達および冠状動脈結紮の１２週間後、心臓に標準的マッソン三色染色法を実施した。傷痕サイズを決定するため、ＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェアを使用して、ＭＩ心臓の左心室内の４つのレベルにわたって横断面の傷痕面積（青色）および健常面積（赤色）を測定した。各レベルの４スライスの組織を、技術的４回反復として測定した（合計１６区画）。
【０１９９】
ＧＭＴｃは、心エコー検査により評価した駆出率（ＥＦ）の変化により反映されているように、ＧＭＴ単独による治療と比較して、心臓機能を有意に増強した（図１８）。ＧＭＴｃによる治療は、ＧＭＴ単独で治療した動物と比較して、心臓機能を有意に保存した。機能改善は、早くもＭＩの１週間後に生じた。これは、リプログラミング速度の増加を示すｉｎ  ｖｉｔｒｏ観察と一致している。阻害剤単独は、心臓機能に有意な影響を及ぼさなかった。ＭＩの１２週間後、盲検磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を実施して、心臓の構造および機能を評価した。これは、磁気共鳴画像法が、最も正確な測定形態であるためである。ＧＭＴｃで治療した群でのみ、梗塞領域内に、心臓の心尖部にさえ厚い筋肉が観察された。ＭＲＩにより明らかにされた心臓機能は、心拍血液量（ＳＶ）、ＥＦ、および心拍出量（ＣＯ）の変化により評価したところ、ＧＭＴ単独と比較して、ＧＭＴｃで治療した動物で有意に改善された（図１９）。
【０２００】
組織学的分析を実施して、傷痕サイズを定量化し、治療した心臓の梗塞区域内の筋肉の存在を検出した。以前の報告と同様に、ＧＭＴ単独で治療した心臓の梗塞部位内に糸状の筋細胞が発生したことが見出された。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化観察と一致していた。しかしながら、ＧＭＴｃで治療した動物から単離した心臓では、筋細胞の厚いバンドが梗塞域内に観察された。この筋肉再形成が、リプログラミングによるものであったことを確認するために、ＲＯＳＡ−Ｌｏｘ−Ｓｔｏｐ−Ｌｏｘ−ＹＦＰマウスを、ＰｅｒｉｏｓｔｉｎＣｒｅマウスと交配して、ＲＯＳＡ−ＹＦＰ／Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−Ｃｒｅ系統追跡マウスを生成した。これらマウスは、線維芽細胞およびそれらの後代でのみＹＦＰを発現するため、線維芽細胞由来心筋細胞は、内因性心筋細胞と区別される（図２０）。これら細胞がトロポニンＴおよびＹＦＰリポーターについて陽性染色されたため、梗塞区域周囲での筋肉再形成は、新たに形成されたｉＣＭによるものであることが見出された。しかしながら、ＹＦＰ＋細胞は、対照群または梗塞部位の遠位区域では見出されなかった。
【０２０１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉＣＭの機能性および品質を評価するために、ランゲンドルフ調製を使用して、ＲＯＳＡ−ＹＦＰ／Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−ＣｒｅマウスからｉＣＭを単離した。成体心筋細胞（ＣＭ）を、多少の変更を加えたが、Qian,  L.ら（２０１２年）Nature、４８５巻：５９３〜５９８頁に記載されているように単離した。手短に言えば、成体マウスを、イソフルランで麻酔し、人工呼吸器を装着した。心臓を取り出し、ランゲンドルフ装置を用いて３ｍｌ／分の定流にて大動脈カニューレ挿入により逆行的に潅流した。心臓を、１１６ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、６．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１２ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミン、３．５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．０  ＮａＨ２ＰＯ４、２１  ＨＥＰＥＳを含むヴィッテンベルク分離培地（ＷＩＭ）、１．５ｎＭインスリン、必須ビタミン（ＧＩＢＣＯ）、および必須ｍＭアミノ酸（ＧＩＢＣＯ）（ｐＨ７．４）で５分間３７℃にて潅流し、その後、消化溶液（０．８ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＩおよび１０μΜ  ＣａＣｌ２で補完されたＷＩＭ）で１０分間（細胞間結合実験で使用した対のＣＭで４分間）潅流した。次いで、心臓を、完全性を保ったまま（組織が緩く繋がったまま）、ランゲンドルフ装置から取り外した。次いで、所望の区域（すなわち、境界／梗塞域）を、顕微鏡下で顕微解剖し、機械的に解離させ、すりつぶし、低カルシウム溶液（５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１０ｍＭタウリン、および１５０μΜ  ＣａＣｌ２で補完されたＷＩＭ）に再懸濁した。次いで、細胞を低速で遠心分離し、上清を除去し、一連の洗浄によりカルシウムを徐々に再導入した。電気生理学実験の場合、単離した同じ日に細胞を使用し、記録するまで、５ｍＭクレアチン、２ｍＭ  １−カルニチン、５ｍＭタウリン、および１．５ｎＭインスリンで補完されたＭ１９９（Ｇｉｂｃｏ）中で室温（２１℃）にて保管した。免疫組織化学的検査の場合、細胞を、単離した日に、ラミニンコーティング培養スライドに播種し、付着させ、固定した。ＲＮＡｓｅｑ、収縮性分析、およびカルシウムトランジエント測定の場合、ｉＣＭを、単離直後に蛍光顕微鏡下でｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−Ｃｒｅ：Ｒ２６Ｒ−ＹＦＰシグナルの存在に基づき、マイクロピペットにより手作業で選択した。
【０２０２】
ＧＭＴｃで治療した動物のＹＦＰ＋ｉＣＭの数は、ＧＭＴ単独と比較して、５倍と著しく増加した。（図３１）ＧＭＴまたはＧＭＴｃ治療マウスから単離した全てのｉＣＭは、成体心筋細胞と同様に、桿状であり、良好に組織化されたサルコメア構造を形成した。収縮性の点では、ＧＭＴ治療マウスから単離した全ての細胞は、自発的カルシウムトランジエントを示したが、ＧＭＴｃマウスから単離した細胞の７０％よりも多くは、自発的に拍動しなかった。しかしながら、それらは、外部的電気刺激と同期し、より成熟した表現型を示した（図３１）。
【０２０３】
また、ＲＮＡ−ｓｅｑを実施して、対照心筋細胞、ｉｎ  ｖｉｖｏでリプログラミングされた心臓から単離したＧＭＴ  ｉＣＭおよびＧＭＴｃ  ｉＣＭの間の全トランスクリプトーム変化を比較した。ＰＣＡ分析により反映されているように、ＧＭＴｃ  ｉＣＭの遺伝子発現は、ＧＭＴ  ｉＣＭよりも、成体心室心筋細胞に類似していたが、新生仔心筋細胞とは異なっていた（図２２）。加えて、ＧＭＴｃ  ｉＣＭは、成体心筋細胞と同様に、ＴＧＦ−βおよびＷＮＴシグナル伝達と関連するＧＯタームを有する遺伝子のより完全な下方制御を示した。ＧＭＴ  ｉＣＭとＧＭＴｃ  ｉＣＭとの間で制御が少なくとも２倍異なる遺伝子のＧＯ分析により、ＧＭＴｃでは、細胞分裂および有糸分裂に関与する遺伝子の下方制御、ならびにより成熟した表現型と一致する代謝遺伝子およびｃＡＭＰ関連遺伝子の上方制御が明らかになった（図２３）。高度に発現された主要な心臓遺伝子および線維芽細胞遺伝子の変化に着目すると、ＧＭＴｃ  ｉＣＭは、ＧＭＴ  ｉＣＭと比較して、心臓遺伝子のより完全な上方制御および線維芽細胞遺伝子の下方制御を示すことが見出された。
【０２０４】
（実施例５）
ＴＧＦ−βおよびＷＮＴ阻害剤は、ヒト成人心臓線維芽細胞のリプログラミングを増強する
ＧＭＴ単独では、ヒト線維芽細胞のリプログラミングには不十分であることが以前に報告されていたが、ＧＭＴ（７Ｆ）をＥＳＳＲＧ、ＭＹＯＣＤ、ＺＦＰＭ２、およびＭＥＳＰ１と組み合わせると、ヒト細胞を、マウスと同様の品質にリプログラミングすることができることが見出された。Fu,  J.D.ら（２０１３年）Stem  Cell  Reports、１巻：２３５〜２４７頁。ここでは、ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９の添加が、７Ｆにより誘導されるヒト心臓リプログラミングに及ぼす効果を試験した。
【０２０５】
心室正常ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）を、Ｌｏｎｚａから購入した。最も関連するタイプの線維芽細胞を使用するために、ｌｏｘＰが導入されたＴ−抗原を用いて、成人ヒト心臓線維芽細胞の可逆的に不死化された細胞株を生成した。安定不死化細胞株を生成するために、細胞を、ピューロマイシン選択カセットを含むｌｏｘＰが導入されたヒトＴ−抗原レンチウイルスに感染させた（Ａｄｄｇｅｎｅ  プラスミド＃１８９２２）。１μｇ／ｍｌピューロマイシンを５日間使用して細胞を選択した。次いで、細胞を、リプログラミングの日にＣｒｅウイルスに感染させて、Ｔ−抗原を切り出した。リプログラミングは、以前に記載されているように実施した。Fu,  J.D.ら（２０１３年）Stem  Cell  Reports、１巻：２３５〜２４７頁。手短に言えば、７つのヒト心臓発生因子（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、ミオカルディン、Ｅｓｒｒｇ、Ｍｅｓｐ１、およびＺｎｆｐｍ２）をコードするｐＭＸｓレトロウイルスベクターを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ａ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）細胞にトランスフェクトして、ウイルスを生成した。４８時間後、ＨＣＦを、上清を含むウイルスのプールで一晩形質導入し、６μｇ／ｍｌポリブレンを補完した。次いで、培地を、感染の２４時間後にＳＢ４３１５４２（２．６μΜ）を含むｉＣＭ培地［ＤＭＥＭ：Ｍ１９９（４：１）、１０％ＦＢＳ、１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン］と置換し、感染の４８時間後にＸＡＶ９３９（５μΜ）を含むｉＣＭ培地［ＤＭＥＭ：Ｍ１９９（４：１）、１０％ＦＢＳ、１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン］と置換した。リプログラミングの視覚化および細胞選別の場合、リプログラミングされたＨＣＦを、ｐｌｘ−ｈＴＮＴ−ＧＦＰまたはｐｌｘ−ｈＴＮＴ−ＧＣａＭＰ５のいずれかで形質導入した。手短に言えば、ｐｌｘ−ｈＴＮＴ−ＧＦＰまたはｐｌｘ−ｈＴＮＴ−ＧＣａＭＰ５を、レンチウイルスパッケージングプラスミドｐＭＤ２．ＧおよびｐｓＰＡＸ２と共にＦｕｇｅｎｅ  ＨＤを用いてＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトして、レンチウイルスを生成した。４８時間後、ＨＣＦを、一晩形質導入し、６μｇ／ｍｌポリブレンを補完した。リプログラミングの４日目に、Ｂ２７補完剤を有するＲＰＭＩ１６４０を、１５日目にｉＣＭ培地と完全に置換されるまで、２５％のｉＣＭ増分で３日毎に添加した。
【０２０６】
ＴＮＴ−ＧＣａＭＰリポーターを使用して心臓リプログラミングを検出したところ（図２４）、７Ｆ＋ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９（７Ｆｃ）は、７ＦによりリプログラミングされたｉＣＭのパーセントを２倍にさせることが見出された（図２５）。また、７ＦｃでリプログラミングされたｉＣＭは、早くも３週間でサルコメア形成を示した。さらに、７Ｆｃでリプログラミングしたわずか１０日後には、カルシウムスパークが生じ、これらのカルシウムトランジエントは、リプログラミングの３週間以内に、細胞全体にわたってより均質になった。４週間以内に、７Ｆｃリプログラミングの５０％よりも多くが、自発的なカルシウムトランジエントを示したのに比べて７Ｆでは５％未満であったが、これは、それらが成熟していることを示している可能性がある（図２６）。
【０２０７】
リプログラミングされた細胞の品質を評価するために、化学薬品を用いてまたは用いずに７Ｆでリプログラミングを誘導した４週間後に、ＲＮＡ−ｓｅｑを実施した。実際、７Ｆｃ  ｉＣＭの遺伝子発現プロファイル変化は、ＰＣＡにより示されているように、７Ｆ  ｉＣＭと比較して加速された（図２７）。４ＦＣによるリプログラミングは、７Ｆｃを使用してリプログラミングし、ＴＮＴ−ＧＦＰをリポーターとして使用した場合と同様の結果をもたらした。さらに、ＷＮＴおよびＴＧＦ−βシグナル伝達経路の遺伝子発現は、７Ｆ  ｉＣＭと比較して、７Ｆｃ  ｉＣＭでは有意に下方制御された。７Ｆ  ｉＣＭと７Ｆｃ  ｉＣＭとの間で制御が少なくとも２倍異なる遺伝子のＧＯ分析を実施し、これら遺伝子はほとんどが、マウスリプログラミングで見出されたものと同様に、細胞外マトリックス形成およびコラーゲンの下方制御、ならびにカルシウムおよびイオン輸送関連遺伝子の上方制御に関与していることが見出された。（図２８）主要な心臓遺伝子および線維芽細胞遺伝子をより詳しく分析すると、化学薬品は、心臓遺伝子の発現を有意に増強し、線維芽細胞遺伝子の発現を抑制することが見出された。４ＦＣによるリプログラミングは、７Ｆｃを使用してリプログラミングし、ＴＮＴ−ＧＦＰをリポーターとして使用した場合と同様の結果をもたらした。
【０２０８】
まとめると、これらのデータは、低分子によりＴＧＦ−βおよびＷＮＴシグナル伝達を阻害すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの生後マウスおよびヒト心臓線維芽細胞の心臓リプログラミングを有意に増強したことを示す。
【０２０９】
驚くべきことに、ＴＧＦ−βシグナル伝達は、ＳＢ４３１５４２、ＡＬＫ５（ＴＧＦ−β  Ｉ型受容体）、ＡＬＫ４、およびＡＬＫ７を選択的に阻害する低分子でこの経路を阻害することによる直接心臓リプログラミングにとって不可欠であることも発見された。
【０２１０】
興味深いことには、ＲＮＡ−ｓｅｑデータは、ＧＭＴｃ  ｉＣＭが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで、新生仔心筋細胞ではなく成体心室心筋細胞とより一致する遺伝子発現プロファイルを有することを明らかにした。驚くべきことには、ＧＭＴｃ  ｉＣＭ中のある特定の心臓遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＮＡ発現レベルは、実際に、単離された対照内因性心筋細胞よりも高かった（例えば、ＴＮＮＴ、ＡＣＴＣ１、ＡＣＴＮ２、ＭＹＨ７、およびＲＹＲ２）。この予期しない観察は、ｉＣＭが、依然としてリプログラミング中であり、したがって、これら系統特異的遺伝子を高レベルで活発に転写して、細胞運命転換を支援していることを反映している可能性がある。あるいは、これら遺伝子は、外因性ＧＭＴの活性保持に特に感受性である標的である可能性がある。それにもかかわらず、ＧＭＴｃは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで、線維芽細胞遺伝子のほとんどを、効率的に、成体心室心筋細胞と同様のレベルに下方制御した。
【０２１１】
（実施例６）
従来の７Ｆ系よりも少数の因子によるヒト線維芽細胞のリプログラミング
ヒト線維芽細胞の心筋細胞への十分な分化転換に必要であることが以前に報告されている７Ｆリプログラミング因子のいずれか１つまたは組合せが非必須であるか否かを決定するために、単一の因子および複数の因子の種々の組合せを取り除いて、リプログラミングを評価した。
【０２１２】
まず、７Ｆｃ中の単一因子の除去を試験して、それを除去しても、ヒト心臓線維芽細胞を依然として完全にリプログラミングすることができるか否かを観察した。一度に１つの因子を除去することにより、Ｍｅｓｐ１、ＺＦＰＭ２、またはＥＳＳＲＧがなくとも、ヒト線維芽細胞のリプログラミングは、７Ｆｃリプログラミング法と比較して同様の遺伝子発現プロファイルをもたらすことが見出された。加えて、２つの因子の異なる組合せを除去した場合、（１）Ｚｆｐｍ２およびＥｓｒｒｇならびに（２）Ｚｆｐｍ２およびＭｅｓｐ１の組合せが無くとも、ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９の存在下でのリプログラミングから同様の遺伝子発現プロファイルがもたらされることが見出された。その一方で、ミオカルディンは、ヒト線維芽細胞の心筋細胞への効率的なリプログラミングにとって特に重要であると考えられた。リプログラミングカクテルからミオカルディンを除去すると、心筋細胞遺伝子の発現が低下し、線維芽細胞遺伝子の残留発現が増加した。
【０２１３】
驚くべきことに、ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９の存在下でリプログラミングする場合にわずか４つの因子：ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、およびミオカルディンにより同程度のリプログラミングを達成することができることも見出された（４Ｆｃ）。ＦＡＣＳ分析は、同様のパーセントのＴＮＴ＋  ｉＣＭが、４Ｆｃ法を使用して得られることを示し、免疫蛍光法は、４Ｆｃおよび７Ｆｃで誘導したｉＣＭでは、サルコメアが高度に組織化されていることを明らかにした（図２９、３０）。特に、リプログラミング因子カクテルからＭｅｓｐ１、Ｚｆｐｍ２、およびＥｓｒｒｇを取り除いても、７Ｆｃリプログラミング法でリプログラミングされたヒト線維芽細胞と比較して、同様の発現レベルの心筋細胞遺伝子がもたらされる。
【０２１４】
驚くべきことに、ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９の存在下では、わずか３つの因子の組合せ、ミオカルディン、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５（ＭＭＴ）により、ヒト線維芽細胞を心筋細胞へと効率的にリプログラミングすることができることが発見された。ＭＭＴの組合せは、ＴＮＴ−ＧＦＰリポーターの発現増加により示されるように、ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９の存在下での心臓リプログラミングの誘導に十分である。また、抗炎症試薬（デキサメタゾン）の添加は、ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９の存在下でのＭＭＴリプログラミングを可能にすることが見出された（データ非表示）。加えて、ＭＭＴおよび化合物の組合せは、リプログラミングの３週間以内に、サルコメア組織化が進行したトロポニン−Ｔ陽性細胞の出現をもたらした。
【０２１５】
（実施例７）
ＭＭＴｃリプログラミングにおけるｓｉＲＮＡおよびデキサメタゾンの併用
ＭＭＴｃの低分子化学阻害剤の代わりにｓｉＲＮＡ分子を使用することができることを、ＴＧＦ−β受容体１およびタンキラーゼ１に対するｓｉＲＮＡを使用して試験した。低分子干渉ＲＮＡの使用は、同じ程度に効率的にヒト線維芽細胞をｉＣＭへとリプログラミングし、ＴＧＦ−β受容体１およびタンキラーゼ１に対するｓｉＲＮＡは、リプログラミング活性がそれぞれＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９と本質的に等しいことが示された（図３２）。
【０２１６】
手短に言えば、ＲＮＡｉＭＡＸを１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡ／ウェルの濃度で使用して、２００００細胞／ウェルをリプログラミングの−１日目にトランスフェクトし、トランスフェクション試薬を２４時間後に除去した。ＭＭＴをコードするレトロウイルスを、実験の０日目にヒト心臓線維芽細胞に感染させ、２４時間後に除去した。次いで、リプログラミングを、以前に記載されているように実施した。Mohamed  TMAら、Circulation.、２０１７年；１３５巻：９７８〜９９５頁。手短に言えば、各々３つのリプログラミング因子の１つをコードする３つの別個のレトロウイルスベクターのカクテルを使用して、１日目にＨＣＦを感染させ、２４時間後に過剰ウイルスを除去した。レトロウイルスは、実験の全期間にわたってゲノムへの組み込みが維持された。ＳＢ４３１５４２（２．６ｕＭ）を、１日目から８日目まで添加し、ＸＡＶ９３９３（５ｕＭ）を、２日目から８日目まで添加し、デキサメタゾン（１００ｎΜ）を、１日目から２１日目まで添加した。
【０２１７】
上記に示されている例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのリプログラミング因子を使用した生後ヒトおよびマウス心臓線維芽細胞の直接心臓リプログラミングを増強する能力を有する、低分子またはｓｉＲＮＡのいずれかを使用した最初の単純なカクテルを提供する。これらのデータは、ＴＧＦ−β阻害剤およびＷＮＴ阻害剤が、心臓機能を有意に改善し、ヒトリプログラミングに必要とされるリプログラミング因子の数を、７つから４つまたはわずか３つの因子へと減少させることを示している。
【０２１８】
本発明は、上記の実施形態と共に記載されているが、上述の記載および例は例示のためのものであり、本発明の範囲を限定することは意図されていないことが理解されるべきである。本発明の範囲内にある他の態様、利点、および改変は、本発明が関する分野の当業者にとって明白である。
【０２１９】
加えて、本発明の特徴または態様が、マーカッシュ群の観点で記載されている場合、当業者であれば、本発明は、それにより、マーカッシュ群の任意の個々の要素または要素の部分群の観点でも記載されていることを認識するだろう。
【０２２０】
本明細書で言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、各々が参照により個々に組み込まれているのと同じ程度まで、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先されることになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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