(57)【要約】一部の実施形態では、本発明は、炎症性腸疾患の患者を処置するのに有益な薬剤を同定する方法であって：（ａ）患者における腸管バリアの状態を判定することと；（ｂ）状態を重度の機能障害または中程度の機能障害に類別することとを含み、重度の機能障害を有すると類別された患者が、抗ＴＮＦ剤および／または抗ＩＬ−１２／２３剤からなる群から選択される薬剤による処置から利益を得ると予想される患者と同定され、中程度の機能障害を有すると類別された患者が、抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、および／またはスフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤による処置から利益を得ると予想される患者と同定される、方法を提供する。
2019508395.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性腸疾患の患者を処置するのに有益な薬剤を同定する方法であって：
（ａ）患者の状態を得るために、前記患者における腸管バリアの状態を分析することと；
（ｂ）前記患者の状態を重度の機能障害または中程度の機能障害に類別することと
を含み、
患者の状態が重度の機能障害であると類別された患者が、抗ＴＮＦ剤、抗ＩＬ−１２／２３剤、および抗ＴＮＦ剤と抗ＩＬ−１２／２３剤との組合せからなる群から選択される薬剤による処置から利益を得ると予想される患者と同定され、患者の状態が中程度の機能障害であると類別された患者が、抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤、ならびに抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、およびスフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤の２つまたはそれより多くの組合せからなる群から選択される薬剤による処置から利益を得ると予想される患者と同定される、方法。
【請求項２】
炎症性腸疾患の患者における腸管バリアの状態を同定する方法であって、前記状態が、重度の機能障害または中程度の機能障害であり、腸管バリアの前記状態を分析することを含み、
前記状態が重度の機能障害であると同定される場合、前記方法がさらに、前記患者を、抗ＴＮＦ剤、抗ＩＬ−１２／２３剤、および抗ＴＮＦ剤と抗ＩＬ−１２／２３剤との組合せからなる群から選択される薬剤で処置することを含み、
前記状態が中程度の機能障害であると同定される場合、前記方法がさらに、前記患者を、抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤、ならびに抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、およびスフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤の２つまたはそれより多くの組合せからなる群から選択される薬剤で処置することを含む、方法。
【請求項３】
炎症性腸疾患の患者を処置する方法であって、
（ａ）前記状態が重度の機能障害であるか中程度の機能障害であるかを判定するために、腸管バリアの状態を分析することと；
（ｂ）前記患者を薬剤で処置することと
を含み：
（ｉ）前記患者が重度の機能障害を有すると同定される場合、前記薬剤が、抗ＴＮＦ剤、抗ＩＬ−１２／２３剤、および抗ＴＮＦ剤と抗ＩＬ−１２／２３剤との組合せからなる群から選択され、
（ｉｉ）前記患者が中程度の機能障害を有すると同定される場合、前記薬剤が、抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤、ならびに抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、およびスフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤の２つまたはそれより多くの組合せからなる群から選択される、方法。
【請求項４】
前記腸管バリアの前記状態が、前記腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量を測定することによって分析される、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
前記活性化されたカスパーゼが、活性化されたカスパーゼ１、もしくは活性化されたカスパーゼ３、または活性化されたカスパーゼ１および活性化されたカスパーゼ３の組合せである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記活性化されたカスパーゼが、活性化されたカスパーゼ１の発現の量の、活性化されたカスパーゼ３の発現の量に対する比率である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記患者における前記活性化されたカスパーゼ発現の量が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量と比較して約４倍から約７倍増大していることが、前記患者の状態が重度の機能障害であることを示す、請求項４、５、または６に記載の方法。
【請求項８】
前記患者における前記活性化されたカスパーゼ発現の量が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量と比較して約２倍から約４倍増大していることが、前記患者の状態が中程度の機能障害であることを示す、請求項４、５、または６に記載の方法。
【請求項９】
前記腸管バリアの前記状態が、前記腸管バリアでの腸管表面の組織学的染色において、ギャップの数を計数することによって分析される、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者におけるギャップの数が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアでの腸管表面におけるギャップの数と比較して約４倍から約７倍増大していることが、前記患者の状態が重度の機能障害であることを示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者におけるギャップの数が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアでの腸管表面におけるギャップの数と比較して約２倍から約４倍増大していることが、前記患者の状態が中程度の機能障害であることを示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記腸管バリアの前記状態が、前記腸管バリアの共焦点レーザー内視鏡観察または多光子共焦点顕微鏡観察を使用して分析される、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗ＴＮＦ剤が、アダリムマブ、インフリキシマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、エタネルセプト、およびアプレミラストからなる群から選択される、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗ヤーヌスキナーゼ剤が、トファシチニブである、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗ＩＬ−１２／２３剤が、ウステキヌマブである、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項１６】
前記スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤が、オザニモドである、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗インテグリン剤が、ベドリズマブ、ナタリズマブ、およびエトロリズマブからなる群から選択される、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項１８】
前記炎症性腸疾患が、クローン病、潰瘍性大腸炎、不確定の大腸炎、および化学療法によって誘導された大腸炎からなる群から選択される、請求項１、２、または３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への参照
本特許出願は、２０１６年２月２日に出願された米国仮出願番号第６２／２９０，２０１号および２０１６年１２月１５日に出願された米国仮出願番号第６２／４３４，７４１号の利益を主張しており、これら仮出願の各々の全体は、本明細書によって参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
本発明は、生物学および薬の分野に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
処置から効果が得られると予想される炎症性腸疾患の患者を同定することが有用であろう。
【０００４】
実施形態の要旨
本発明は、炎症性腸疾患の患者に有益であると予想される薬剤を同定する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の態様では、本発明は、炎症性腸疾患の患者を処置するのに有益な薬剤を同定する方法であって、（ａ）患者の状態を得るために、患者における腸管バリアの状態を分析する（または判定する）ことと；（ｂ）患者の状態を重度の機能障害または中程度の機能障害に類別することとを含み、患者の状態が重度の機能障害であると類別された患者は、抗ＴＮＦ剤および／または抗ＩＬ−１２／２３剤による処置から利益を得ると予想される患者と同定され、患者の状態が中程度の機能障害であると類別された患者は、抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、および／またはスフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤による処置から利益を得ると予想される患者と同定される、方法を提供する。
【０００６】
別の態様では、本発明は、炎症性腸疾患の患者における腸管バリアの状態を同定する方法であって、この状態は、重度の機能障害または中程度の機能障害であり、患者の腸管バリアの状態を分析する（または判定する）ことを含み、前記状態が重度の機能障害であると同定される場合、この方法はさらに、前記患者を、抗ＴＮＦ剤および／または抗ＩＬ−１２／２３剤で処置することを含み、前記状態が中程度の機能障害を有すると同定される場合、この方法はさらに、前記患者を、抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、および／またはスフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤で処置することを含む、方法を提供する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、炎症性腸疾患の患者を処置する方法であって、（ａ）状態が重度の機能障害であるか中程度の機能障害であるかを判定するために、腸管バリアの状態を分析する（または判定する）ことと；（ｂ）前記患者を薬剤で処置することとを含み：（ｉ）前記患者が重度の機能障害を有すると同定される場合、この薬剤は、抗ＴＮＦ剤および／または抗ＩＬ−１２／２３剤であり、（ｉｉ）前記患者が中程度の機能障害を有すると同定される場合、この薬剤は、抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、および／またはスフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤である、方法を提供する。
【０００８】
本発明の種々の態様の一部の実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、不確定の大腸炎（indeterminate  colitis）、または化学療法によって誘導された大腸炎である。
【０００９】
本発明の種々の態様の種々の実施形態では、前記腸管バリアの前記状態は、前記腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量を算出または測定することによって分析される（または判定される）。一部の実施形態では、前記活性化されたカスパーゼは、活性化されたカスパーゼ１である。一部の実施形態では、前記活性化されたカスパーゼは、活性化されたカスパーゼ３である。一部の実施形態では、前記活性化されたカスパーゼは、活性化されたカスパーゼ１および活性化されたカスパーゼ３の組合せである。一部の実施形態では、前記活性化されたカスパーゼは、活性化されたカスパーゼ１の発現の量の、活性化されたカスパーゼ３の発現の量に対する比率である。
【００１０】
一部の実施形態では、前記患者における前記活性化されたカスパーゼ発現の量が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量と比較して約４倍から約７倍増大していることは、前記患者の状態が重度の機能障害であることを示す。一部の実施形態では、前記患者における前記活性化されたカスパーゼ発現の量が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量と比較して約２倍から約４倍増大していることは、前記患者の状態が中程度の機能障害であることを示す。
【００１１】
一部の実施形態では、前記腸管バリアの前記状態は、前記腸管バリアでの腸管表面の組織学的染色において、ギャップの数を計数することによって分析または判定される。一部の実施形態では、前記患者におけるギャップの数は、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアでの腸管表面におけるギャップの数と比較して約４倍から約７倍増大していることが、前記患者の状態が重度の機能障害であることを示す。一部の実施形態では、前記患者におけるギャップの数が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアでの腸管表面におけるギャップの数と比較して約２倍から約４倍増大していることは、前記患者の状態が中程度の機能障害であることを示す。
【００１２】
本発明の種々の態様の一部の実施形態では、腸管バリアの状態は、腸管の内壁およびバリアの共焦点レーザー内視鏡観察、多光子共焦点顕微鏡観察、または蛍光顕微鏡観察を使用して分析または判定される。
【００１３】
本発明の種々の態様の一部の実施形態では、前記抗ＴＮＦ剤は、アダリムマブ、インフリキシマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、エタネルセプト、およびアプレミラストからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記抗ヤーヌスキナーゼ剤は、トファシチニブである。一部の実施形態では、前記抗ＩＬ−１２／２３剤は、ウステキヌマブである。一部の実施形態では、前記スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤は、オザニモドまたはフィンゴリモドである。一部の実施形態では、前記抗インテグリン剤は、ベドリズマブ、ナタリズマブ、およびエトロリズマブからなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本特許の包袋は、色付きで仕上げた少なくとも１つの図面を含有する。本特許のカラー図面のコピーは、請求および必要な手数料の支払いの際に庁により提供される。
【００１５】
【図１】図１は、抗インテグリン剤および抗ＴＮＦ剤に対する応答を最適化すると予想される粘膜バリアベースの治療アプローチを示す概略図である。
【００１６】
【図２】図２は、腸管上皮細胞（ＩＥＣ）における活性化されたカスパーゼ１についての染色を示す写真画像である。白色の矢印は、活性化されたカスパーゼ１について陽性染色されたＩＥＣを指し、白色の矢尻頭部は、活性化されたカスパーゼ１およびＣＤ３（Ｔ細胞マーカー）の双方について陽性染色された上皮内リンパ球を指す。
【００１７】
【図３Ａ】図３Ａおよび図３Ｂは、市販のＴＵＮＥＬ染色を使用した、核断片化について（図３Ａ）、または活性化されたカスパーゼ３について（図３Ｂ）、腸管上皮細胞（ＩＥＣ）の染色を示す写真画像である。図３Ａにおいて、白色の矢印は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞（すなわち、核断片化がある細胞）を指す。図３Ｂにおいて、白色の矢印は、活性化されたカスパーゼ３陽性細胞を指す。
【図３Ｂ】図３Ａおよび図３Ｂは、市販のＴＵＮＥＬ染色を使用した、核断片化について（図３Ａ）、または活性化されたカスパーゼ３について（図３Ｂ）、腸管上皮細胞（ＩＥＣ）の染色を示す写真画像である。図３Ａにおいて、白色の矢印は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞（すなわち、核断片化がある細胞）を指す。図３Ｂにおいて、白色の矢印は、活性化されたカスパーゼ３陽性細胞を指す。
【００１８】
【図４】図４は、内視鏡検査によって判定した、罹患しているＩＢＤ患者における（左の列）、または寛解にあるＩＢＤ患者における（右の列）活性化されたカスパーゼ１陽性細胞の数の有意差を示す棒グラフである。活性化されたカスパーゼ−１陽性細胞の平均は、以下の通りであった：罹患群における３．５に対して、内視鏡的寛解群における１．５（ｐ＝０．０３８）。
【００１９】
【図５】図５は、抗ＴＮＦ治療に対して有益に応答したＩＢＤ患者（左の列、「抗ＴＮＦ応答者」）、抗ＴＮＦ治療に対して有益に応答しなかったＩＢＤ患者（中央の列、「抗ＴＮＦ非応答者」）、および抗インテグリン治療に対して有益に応答したＩＢＤ患者（右の列、「抗インテグリン応答者」）からとられた、活性化されたカスパーゼ１陽性腸管上皮細胞（ＩＥＣ）のパーセンテージを示すドットプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
特定の実施形態の詳細な説明
本発明の軸は、部分的に、患者の腸管バリア機能の評価が、患者が、腸障害、例えば慢性炎症性腸疾患または過敏性大腸症候群に罹患しているか、これらに罹患する傾向があるかの判定を予測するという発見を構成する。このように同定された患者は、炎症性腸疾患（または、頻度はより低いが、過敏性大腸症候群）を処置する薬剤、例えばα４β７インテグリンを阻止する薬剤（例えば生物学的製剤（biologics））（例えば、武田薬品工業、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓによりＥｎｔｙｖｉｏの商標名で販売されているモノクローナル抗体、ベドリズマブ）、または腫瘍壊死因子を阻止する薬剤（例えば生物学的製剤）による処置で効果を得ることができる。
【００２１】
本明細書中で参照される、公開されている特許、特許出願、ウェブサイト、会社名、および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立するものであり、そしてそれぞれが参照によって組み込まれることが具体的に、かつ個々に示されているのと同じように、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書中で引用されるあらゆる参考文献と、本明細書の具体的な教示との間のあらゆる矛盾は、後者を支持して解決されるものとする。
【００２２】
本明細書および特許請求の範囲において定義され、または使用される用語は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、示される意味を有するものとする。本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、他の意味で定義される場合を除き、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。文言またはフレーズの、当分野で理解される定義と、本明細書中で具体的に教示される文言またはフレーズの定義との間のあらゆる矛盾は、後者を支持して解決されるものとする。本明細書中で使用される以下の用語は、示される意味を有する。本明細書で使用される単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、内容が明らかに他の意味を意図する場合を除き、それらが言及する用語の複数形も明確に包含する。用語「約」は、本明細書中で、およそ、ほぼ、ざっと、またはおおよそを意味するのに使用される。用語「約」が数値範囲と共に使用される場合、これは、示される数値を上回って、かつ示される数値を下回って境界を拡張することによって、その範囲を緩和する。一般に、用語「約」は、本明細書において、数値を修飾して、その述べられた値にプラスマイナス２０％の幅を持たせるのに使用される。
【００２３】
腸管上皮は、最も大きく、かつ最も重要な、外部環境に対するバリアを構成する単細胞層である。ゆえに、この腸管上皮の層は、本明細書中で「腸管バリア」と呼ぶものとする。腸管バリアは、選択的に透過性のバリアとして作用して、栄養分、電解質、および水の吸収を可能にする一方、管内毒素、抗原、および腸内フローラに対する有効な防御を維持する。腸管バリアを構成する腸管の内壁は、連続的生理学的再生を経験する：腺窩の基底に配置された幹細胞は、成熟して、絨毛の上部に移行する。成熟した上皮細胞は、最終的に、絨毛の先端にて脱落する。
【００２４】
過去２０年の間に公開された研究は、腸管バリア崩壊が、腸管炎症の病因において、そして炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えばクローン病（Cohn's  disease）（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の重篤度において重大な役割を果たすことを、納得がいくように示してきた。クローン病は、慢性再発炎症性腸障害（ＩＢＤ）である。臨床的再発が、医学的に誘導された寛解の１年以内に、患者の３０〜６０％で起こる。過去２０年にわたる研究は、バリア崩壊が、腸管炎症の病因において、そしてクローン病の重篤度において顕著かつ重要な役割を果たすことを、納得がいくように実証してきた。
【００２５】
腸管細胞バリア機能障害を検出する方法が記載されてきた（例えば、ＰＣＴ公報第２０１４／０３９６９９号および米国特許出願公開第２０１５／０２０２３２９号参照。双方ともそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。バリア崩壊は、上皮下免疫系を、生息する微生物に曝露するだけでなく、ＴＮＦ−αおよび他の炎症誘発性サイトカインの分泌を誘導する（Neish  AS:  Microbes  in  gastrointestinal  health  and  disease.  Gastroenterology  ２００９年、１３６巻（１号）：６５〜８０頁）。サイトカイン分泌は、次々に、上皮細胞のより多くの脱落を誘導して、更なる炎症およびバリア機能障害を促進する（Watson  AJ、Duckworth  CA、Guan  Y、Montrose  MH:  Mechanisms  of  epithelial  cell  shedding  in  the  Mammalian  intestine  and  maintenance  of  barrier  function.  Annals  of  the  New  York  Academy  of  Sciences  ２００９年、１１６５巻：１３５〜１４２頁）。
【００２６】
より古いバリア機能アッセイ、例えばラクツロース／マンニトール試験（May  GR、Sutherland  LR、Meddings  JB:  Is  small  intestinal  permeability  really  increased  in  relatives  of  patients  with  Crohn's  disease?  Gastroenterology  １９９３年、１０４巻（６号）：１６２７〜１６３２頁）は、臨床的に有用でなかった。なぜなら、試験に使用される糖分子のサイズ（約１０−１０ｍ）が、生息する微生物のサイズ（約１０−６ｍ）を反映していないからである。
【００２７】
より最近では、共焦点レーザー内視鏡（ＣＬＥ）の出現により、粘膜バリア機能のｉｎ  ｖｉｖｏでのリアルタイム評価が可能になった（Kiesslich  Rら、「Identification  of  epithelial  gaps  in  human  small  and  large  intestine  by  confocal  endomicroscopy.」Gastroenterology  ２００７年、１３３巻（６号）：１７６９〜１７７８頁;  Liu  JJら、「Epithelial  cell  extrusion  leads  to  breaches  in  the  intestinal  epithelium」、Inflammatory  bowel  diseases  ２０１３年、１９巻（５号）：９１２〜９２１頁）。ＣＬＥによって観察される腸管表面における上皮ギャップ（押出ゾーンとしても公知である）の密度は、粘膜バリア機能の代用マーカーであることが示された（Liu  JJら、「Mind  the  gaps:  confocal  endomicroscopy  showed  increased  density  of  small  bowel  epithelial  gaps  in  inflammatory  bowel  disease」、Journal  of  clinical  gastroenterology  ２０１１年、４５巻（３号）：２４０〜２４５頁）。ギャップ密度は、設定数の総細胞（例えば１０００細胞）あたりの上皮ギャップの総数と定義される。上皮ギャップまたは押出ゾーンは、宿主中への、管腔微生物にとっての潜在的エントリ部位となり得る。上皮ギャップ密度もまた、従来の光学顕微鏡観察によって、上皮細胞押出の尺度として確認された（Liu  JJら、「Epithelial  gaps  in  a  rodent  model  of  inflammatory  bowel  disease:  a  quantitative  validation  study」、Clinical  and  Translational  Gastroenterology  ２０１１年、２巻：e3）。上皮ギャップ密度（従来の光学顕微鏡観察に対する上皮細胞押出の確認された尺度）（Liu  JJら、「Epithelial  gaps  in  a  rodent  model  of  inflammatory  bowel  disease:  a  quantitative  validation  study.」  Clinical  and  Translational  Gastroenterology  ２０１１年、２巻：e3）は、ＵＣ患者のほぼ半分で増大し（Turcotte  JFら、「Breaks  in  the  wall:  increased  gaps  in  the  intestinal  epithelium  of  irritable  bowel  syndrome  patients  identified  by  confocal  laser  endomicroscopy  (with  videos)」、Gastrointestinal  Endoscopy  ２０１３年、７７巻（４号）：６２４〜６３０頁）、そして１年の追跡調査期間内での中等度から重度の再燃への線形予測子である（Turcotte  JFら、「Increased  epithelial  gaps  in  the  small  intestine  are  predictive  of  hospitalization  and  surgery  in  patients  with  inflammatory  bowel  disease」、Clinical  and  Translational  Gastroenterology  ２０１２年、３巻：e19）。
【００２８】
上皮ギャップは、宿主中への、管腔微生物のエントリのための潜在的部位であるようである（Liu  JJら:  Epithelial  cell  extrusion  leads  to  breaches  in  the  intestinal  epithelium.  Inflammatory  Bowel  Diseases  ２０１３年、１９巻（５号）：９１２〜９２１頁）。したがって、ＣＬＥでギャップ密度によって測定される、管腔微生物に対する粘膜バリアの機能障害の重篤度は、疾患再発を予測する可能性がある。高い上皮ギャップ密度が、クローン病（ＣＤ）患者の６０％において、そして潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者の４５％において見出され（Turcotte  JFら、「Breaks  in  the  wall:  increased  gaps  in  the  intestinal  epithelium  of  irritable  bowel  syndrome  patients  identified  by  confocal  laser  endomicroscopy  (with  videos)」、Gastrointestinal  Endoscopy  ２０１３年、７７巻（４号）：６２４〜６３０頁）、そして１年の追跡調査期間内での中等度から重度の再燃への線形予測子であることが報告されている（Turcotte  JFら、「Increased  epithelial  gaps  in  the  small  intestine  are  predictive  of  hospitalization  and  surgery  in  patients  with  inflammatory  bowel  disease」、Clinical  and  Translational  Gastroenterology  ２０１２年、３巻：e19）。さらに、ＣＬＥによって判定されたギャップ密度が、免疫組織化学的染色の定量的分析によって判定された、粘膜生検試料中で発現された、活性化されたカスパーゼのレベルと強く相関した（未発表）。ＣＬＥでのギャップ密度と粘膜生検分析との相関は、バリア機能分析に腸管生検試料を使用することを可能にすると予想される。
【００２９】
クローン病患者の腸管にＣＬＥを使用した分子イメージングの最近の研究は、粘膜ＴＮＦ受容体発現の状態に基づく注意深い患者選択により、抗ＴＮＦ抗体治療に対する臨床応答率が９０％超に増大し得ることを明らかにした（Atreya  Rら、「In  vivo  imaging  using  fluorescent  antibodies  to  tumor  necrosis  factor  predicts  therapeutic  response  in  Crohn's  disease」、Nature  Medicine  ２０１４年、２０巻（３号）：３１３〜３１８頁）。この結果は、生物学的薬剤（biologic  agent）に対する応答率を判定する際に粘膜ＴＮＦレベルが果たす役割を強調している。ＩＢＤ患者は、ギャップ密度が高いほど、粘膜生検標本において粘膜炎症誘発性サイトカインレベルが増大することを示すことが見出された（Liu  JJら、「Epithelial  cell  extrusion  leads  to  breaches  in  the  intestinal  epithelium」、Inflammatory  bowel  diseases  ２０１３年、１９巻（５号）：９１２〜９２１頁）。
【００３０】
本発明の軸は、部分的に、粘膜ＴＮＦレベルの増大をもたらす重度のバリア機能障害のＩＢＤ患者が、腸障害を処置する薬剤に対する有益な応答を有し得るという発見に由来する。ＩＢＤを処置するそのような薬剤は、以下に限定されないが、抗ＴＮＦ剤、ならびにインターロイキン−１２およびインターロイキン−２３を阻害する薬剤が挙げられる。ＴＮＦレベルが増大したＣＤ患者は、抗ＴＮＦ治療に対して９０％を超える応答率を提示することが見出された（Atreyaら、「In  vivo  imaging  using  fluorescent  antibodies  to  tumor  necrosis  factor  predicts  therapeutic  response  in  Crohn's  disease.」  Nature  Medicine  ２０１４年、２０巻（３号）：３１３〜３１８頁）。
【００３１】
重度のバリア機能障害患者もまた、インターロイキン−１２およびインターロイキン−２３（それぞれＩＬ−１２およびＩＬ−２３）を阻害する薬剤に対する有益な応答を有し得る（すなわち、有利に応答すると予想される）。ＩＬ−１２およびＩＬ−２３は、共通のｐ４０サブユニットを共有する。ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２／２３ｐ４０サブユニットおよびＩＬ−１２ｐ３５サブユニットで構成され、ＩＬ−２３は、ＩＬ−２３ｐ１９およびＩＬ−１２／２３ｐ４０を含む。そのような薬剤として、以下に限定されないが、ウステキヌマブが挙げられ、これは、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡによりＳｔｅｌａｒａ（登録商標）の商標名で販売されている。ＩＬ−１２およびＩＬ−２３を阻害する薬剤は、本明細書中で「抗ＩＬ１２／２３剤」と呼ぶこととなる。
【００３２】
逆に、粘膜バリア機能障害がより小さい患者、そして一部の実施形態では、粘膜ＴＮＦ活性の増大がない患者は、抗ＴＮＦ治療に対する応答率がほんの１０％であった。言い換えると、バリア機能障害が中程度の患者は、抗ＴＮＦ治療に対する応答が有益でなかった。その代わりとして、患者は、抗インテグリン治療に対する応答が有益である可能性がより高い。ギャップ密度の範囲がより低い（例えば３％またはそれ未満）（すなわち、「中程度」の）クローン病患者において、抗インテグリン治療に対する応答率は、２年の追跡調査時に、１００％であることが見出された（未発表）。
【００３３】
腸管バリア機能障害が中程度の（例えば、粘膜ＴＮＦ活性の増大がない）患者もまた、スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、例えばフィンゴリモド（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能な商標名Ｇｉｌｅｎｙａ（登録商標））もしくはオザニモド（Ｒｅｃｅｐｔｏｓ，Ｉｎｃ．によって開発されて、現在Ｃｅｌｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．から入手可能）、および／またはヤーヌスキナーゼファミリーメンバーを阻害する薬剤、例えばトファシチニブ（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．から入手可能な商標名Ｘｅｌｊａｎｚ（登録商標）およびＪａｋｖｉｎｕｓ（登録商標））に対する応答が有益であると予想される。
【００３４】
本明細書中で使用される用語「抗ＴＮＦ治療」は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦまたはＴＮＦアルファと称される）を阻害する薬剤の、患者（例えばヒト患者）への投与を意味する。いくつかのそのような抗ＴＮＦ剤が市販されており、Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって、米国におけるヒト患者への使用が承認されてきた。生物学的な、または小分子のあらゆる抗ＴＮＦ剤が、本発明において意図されている。一部の実施形態では、抗ＴＮＦ剤は、アダリムマブ（Ａｂｂｉｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、ＵＳＡによって販売される商標名Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、インフリキシマブ（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｈｏｒｓｈａｍ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡによって販売される商標名Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、セルトリズマブペゴル（ＵＣＢ  Ｓ．Ａ．、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍによって販売される商標名Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））、ゴリムマブ（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｈｏｒｓｈａｍ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡによって販売される商標名Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標））、またはエタネルセプト（Ａｍｇｅｎ  ａｎｄ  Ｐｆｉｚｅｒによって販売される商標名Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））であってよい。さらに追加の非限定的な抗ＴＮＦ剤は、細胞によるＴＮＦ（例えばＴＮＦ−アルファ）の生成を阻害するものであり、これは例えば、ＴＮＦの生成を阻害するために、細胞内で酵素（例えばプロテインキナーゼ）を阻害することによる。ＴＮＦ−アルファ生成を妨げるように作用するそのような抗ＴＮＦ剤は、アプレミラスト（Ｃｅｌｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡによって販売される商標名Ｏｔｅｚｌａ）である。
【００３５】
本明細書中で使用される用語「抗インテグリン治療」は、インテグリンが、その天然の標的との接着を形成するのを阻害する薬剤の、患者への投与を意味する。ゆえに、抗インテグリン剤は、インテグリンに結合する場合、インテグリンがその標的に結合するのを部分的に、または完全に妨げる。インテグリンは、種々の細胞上に出現する膜貫通受容体のファミリーである。インテグリンは、２本の鎖−アルファ鎖およびベータ鎖で構成されるヘテロダイマーである。哺乳動物では、１８本のアルファ鎖および８本のベータ鎖が存在し、特定のインテグリンが、これが有するいずれかのアルファ鎖およびいずれかのベータ鎖によって示され得る。インテグリンの一部の非限定的な例として、α１β１インテグリン（ＶＬＡ−１とも称される）、α４β７インテグリン（ＬＰＡＭ−１とも称される）、およびαＬβ２インテグリン（ＬＦＡ−１とも称される）がある。抗インテグリン剤は、あらゆるインテグリンファミリーメンバーを阻害する（すなわち阻止する）（すなわち、１つまたは複数のインテグリンファミリーメンバーを阻害する）薬剤である。
【００３６】
一部の実施形態では、抗インテグリン剤は、ＬＰＡＭ−１を標的とするベドリズマブである（ベドリズマブの商標名はＥｎｔｙｖｉｏ（登録商標）であり、ベドリズマブは、武田薬品工業、日本の子会社、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）によって販売されている）。一部の実施形態では、抗インテグリン剤は、アルファ４鎖インテグリンを標的とするナタリズマブである。ナタリズマブの商標名はＴｙｓａｂｒｉ（登録商標）であり、ナタリズマブは、ＢｉｏＧｅｎ  Ｉｄｅｃ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）およびＥｌａｎ（Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）によって販売されている。一部の実施形態では、抗インテグリン剤は、β７鎖インテグリン（例えば、インテグリンα４β７およびαＥβ７）を標的とするエトロリズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡから入手可能）である。更なる抗インテグリン剤が、Kawamotoら、Autimmune  Diseases、２０１２巻、Article  ID  357101に記載されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３７】
患者を「処置する」ために患者に投与されるあらゆる薬剤（例えば、抗ＴＮＦ剤または抗インテグリン）の量は、治療有効量で投与されることとなり、これは、患者の体重および年齢を考慮する、通常程度に熟練した医師、薬理学者、および毒物学者によって決定されると理解されるべきである。いずれにしても、薬物が規制当局（例えばＵ．Ｓ．  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって承認されている場合、抗ＴＮＦ剤の治療有効量は、規制当局によって承認された量である。
【００３８】
勿論、投与経路は、あらゆる経路によることができ、薬剤および患者に基づいて決定されることとなる。例えば、アプレミラスト等の小分子が経口投与され得る一方、エタネルセプト等の生物学的製剤（biological）が皮下注射によって投与され得る。ＩＢＤ患者を処置する薬剤の治療有効量の他の全投与経路が、本明細書中で意図されており、以下に限定されないが、非経口（例えば、静脈内、髄腔内、皮下）もしくは経腸（例えば、経口または経直腸）、または他の経路（例えば、鼻腔内、皮内、硝子体内、皮下、経皮、局所、腹膜内、膣内、および筋肉内）が挙げられる。
【００３９】
本発明は、部分的に、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の患者がＩＢＤ治療を受けていながら、粘膜腸管バリア状態が、その治療（例えば、抗ＴＮＦ剤による処置）に応じて経時的に、臨床的寛解および内視鏡的寛解を予測するという発見に基づいている。ゆえに、本発明は、部分的に、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の患者において粘膜腸管バリア機能状態を判定することが、治療剤、例えば抗ＴＮＦ剤、抗インテグリン剤、または抗ＩＬ−１２およびＩＬ−２３剤（例えばウステキヌマブ）に対する治療応答を予測する重要なツールであるという発見に基づいている。まず第１に、ＩＢＤ患者は、ギャップ密度が高いほど、粘膜炎症誘発性サイトカインレベルが高い（Liu  JJら:「Epithelial  cell  extrusion  leads  to  breaches  in  the  intestinal  epithelium.」  Inflammatory  bowel  diseases  ２０１３年、１９巻（５号）：９１２〜９２１頁参照）。第２に、クローン病の生物学的治療に対する最も高い応答率は、手術後の患者に認められ、１年での内視鏡的寛解率が９０％を超える（Regueiro  M、Schraut  W、Baidoo  L、Kip  KE、Sepulveda  AR、Pesci  M、Harrison  J、Plevy  SE:  Infliximab  prevents  Crohn's  disease  recurrence  after  ileal  resection.  Gastroenterology  ２００９年、１３６巻（２号）：４４１〜４５０頁e441;  quiz  716参照）。第３に、顕著なバリア機能障害が、回腸切除の動物モデルにおいて、吻合部位にて観察された（未発表）。
【００４０】
ＩＢＤ（クローン病、潰瘍性大腸炎、不確定の大腸炎、または化学療法によって誘導された大腸炎）治療を受けているＩＢＤ患者についての粘膜腸管バリア機能の、健康な対照（例えば、健康なボランティア由来）レベルへの正常化が、かなりの期間（例えば１年間）の臨床的寛解および内視鏡的寛解を予測することが発見された。同様に、生物学的治療に対する異常な粘膜腸管バリア機能が、臨床応答の欠如および疾患再発を予測する。
【００４１】
したがって、バリア機能障害は、ＩＢＤ治療、例えば、ＩＢＤ患者における抗ＴＮＦ剤または抗インテグリン剤の投与に対する治療応答の強力な予測子である。
【００４２】
したがって、第１の態様では、本発明は、炎症性腸疾患の患者を処置するのに有益な薬剤を同定する方法であって、（ａ）患者の状態を得るために、患者における腸管バリアの状態を分析すること（または判定すること）と；（ｂ）患者の状態を重度の機能障害または中程度の機能障害に類別することとを含み、患者のバリア状態が重度の機能障害であると類別された患者は、抗ＴＮＦ剤、抗ＩＬ−１２／２３剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される薬剤（例えば生物学的薬剤）による処置から利益を得ると予想される患者と同定され、患者のバリア状態が中程度の機能障害であると類別された患者は、抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤、および抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤の２つまたはそれより多くの組合せからなる群から選択される薬剤（例えば生物学的薬剤）による処置から利益を得ると予想される患者と同定される、方法を提供する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、炎症性腸疾患の患者における腸管バリアの状態を同定する方法であって、この状態は、重度の機能障害または中程度の機能障害であり、患者の腸管バリアの状態を分析する（または判定する）ことを含み、前記状態が重度の機能障害であると同定される場合、この方法はさらに、前記患者を、抗ＴＮＦ剤、抗ＩＬ−１２／２３剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される薬剤で処置することを含み、前記状態が中程度の機能障害を有すると同定される場合、この方法はさらに、前記患者を、抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤、および抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤の２つまたはそれより多くの組合せからなる群から選択される薬剤で処置することを含む、方法を提供する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、炎症性腸疾患の患者を処置する方法であって、（ａ）状態が重度の機能障害であるか中程度の機能障害であるかを判定するために、腸管バリアの状態を分析する（または判定する）ことと；（ｂ）前記患者を薬剤で処置することとを含み：（ｉ）前記患者が重度の機能障害を有すると同定される場合、この薬剤は、抗ＴＮＦ剤、抗ＩＬ−１２／２３剤、およびそれらの組合せからなる群から選択され、（ｉｉ）前記患者が中程度の機能障害を有すると同定される場合、この薬剤は、抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤、および抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤の２つまたはそれより多くの組合せからなる群から選択される、方法を提供する。
【００４５】
本発明の軸は、部分的に、炎症性腸疾患の患者の腸管バリアの状態が、どの薬剤が患者を処置するのに最も有益であると予想されるかを明らかにすることができるという発見を構成する。本明細書中で使用される「有益な」は、患者が治療有効量の抗ＴＮＦまたは抗インテグリン剤で（例えば経口投与によって）処置される場合に、患者のＩＢＤ症候が緩和されることを意味する。このように処置された患者は、処置に対する応答が有益な患者と称される。
【００４６】
ＩＢＤの症候は周知であり、以下に限定されないが、下痢、発熱（例えば微熱）、腹痛および痙攣、糞便中の出血（血便）、出血性潰瘍、腹部膨満、腸閉塞症、意図しない体重減少、ならびに貧血が挙げられる。クローン病、潰瘍性大腸炎、不確定の大腸炎、および化学療法によって誘導された大腸炎は、炎症性腸疾患の全形態である。なお、化学療法によって誘導された大腸炎は、ＩＢＤの他の形態とは異なり、チェックポイント阻害剤等の化学療法薬で処置された患者の少数（３０％未満）で起こるので、予測可能でない。
【００４７】
一部の実施形態では、腸管バリアの状態は、腸管バリアの腸管表面にて、腸管上皮細胞において発現される活性化されたカスパーゼの量を測定または算出することによって判定される。例えば、活性化されたカスパーゼの量は、活性化されたカスパーゼ分子（例えば、活性化されたカスパーゼ１または活性化されたカスパーゼ３）に特異的に結合する、検出可能に標識された抗体で、患者由来の試料（例えば生検試料）を染色することによって、判定され得る。活性化されたカスパーゼの量はまた、活性化されたカスパーゼに結合する、検出可能に標識されたペプチドで、患者由来の試料を染色することによって、判定され得る。検出可能に標識されることによって、ペプチドもしくは抗体は、直接（例えば、蛍光ラベルまたは発色性タグで）標識され得、または検出可能に標識された二次抗体による二次染色中に結合されることによって（例えば、抗カスパーゼ抗体は、マウスモノクローナル抗体であり、二次抗体は、蛍光標識されたウサギ抗マウス抗体である）検出され得る点に留意すべきである。
【００４８】
一部の実施形態では、活性化されたカスパーゼは、活性化されたカスパーゼ１である。一部の実施形態では、活性化されたカスパーゼは、活性化されたカスパーゼ３である。一部の実施形態では、活性化されたカスパーゼは、活性化されたカスパーゼ１および活性化されたカスパーゼ３の組合せである。一部の実施形態では、活性化されたカスパーゼは、活性化されたカスパーゼの発現の量の、活性化されたカスパーゼ３の発現の量に対する比率である。
【００４９】
典型的には、腸管疾患を患っていない（例えば、ＩＢＤ症候もＩＢＳ症候もない）人々の腸管バリアの腸管上皮細胞は、低いレベルの、活性化されたカスパーゼを発現する（例えば、低いレベルの、活性化されたカスパーゼ１または低いレベルの、活性化されたカスパーゼ３を発現する）。ＩＢＤを患っていないそのような人々は、健康なボランティアと称され得る。したがって、一部の実施形態では、患者における活性化されたカスパーゼ発現の量が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量よりも約４倍から約７倍多いことは、患者の状態が重度の機能障害であることを示す。一部の実施形態では、患者における活性化されたカスパーゼ発現の量が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量よりも約４倍から約７倍多いことは、患者の状態が重度の機能障害であることを示す。勿論、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量よりも約７倍を超えて多くの活性化されたカスパーゼを発現する患者は、患者の状態が重度の機能障害であることを示す。一部の実施形態では、患者における活性化されたカスパーゼ発現の量が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量よりも約５倍から約６．５倍多いことは、患者の状態が重度の機能障害であることを示す。
【００５０】
一部の実施形態では、患者における活性化されたカスパーゼ発現の量が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量よりも約１．５倍から約４．５倍多いことは、患者の状態が中程度の機能障害であり、重度の機能障害でないことを示す。一部の実施形態では、患者における活性化されたカスパーゼ発現の量が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量よりも約２倍から約４．５倍多いことは、患者の状態が中程度の機能障害であり、重度の機能障害でないことを示す。一部の実施形態では、患者における活性化されたカスパーゼ発現の量が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量よりも約２倍から約４倍多いことは、患者の状態が中程度の機能障害であり、重度の機能障害でないことを示す。
【００５１】
健康なボランティアにおける活性化されたカスパーゼの発現レベル量がプールされて、他の健康なボランティアで平均されてよい。例えば、２人の健康なボランティアがいて、１人が、活性化されたカスパーゼ１を発現せず、そして他の１人が、活性化されたカスパーゼ１を１．０％発現するならば、平均は、健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞において、０．５％の活性化されたカスパーゼ１の発現である。
【００５２】
一部の実施形態では、健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量は、０．５％である。ゆえに、患者が、活性化されたカスパーゼ１を１．５％発現する場合（すなわち、１００個の腸管上皮細胞中１．５個が、活性化されたカスパーゼ１を発現する）、患者は、腸管バリアの状態の機能障害が中程度であると類別されることとなる。逆に、患者が、活性化されたカスパーゼ１を５．０％発現する場合（すなわち、１００個の腸管上皮細胞中５個が、活性化されたカスパーゼ１を発現する）、患者は、腸管バリアの状態の機能障害が重度であると類別されることとなる。
【００５３】
健康なボランティアによって発現される活性化されたカスパーゼの量は、活性化されたカスパーゼを検出するのに使用される試薬（例えば、以下で記載される、活性化されたカスパーゼ１を阻害する、Ｅｎｚｏ由来のペプチド阻害剤、Ａｃ−ＹＶＡＤ（ｔｙｒ−ｖａｌ−ａｌａ−ａｓｐ）−ＣＭＫ、または活性化されたカスパーゼ１に特異的に結合する抗体、例えば、以下に記載されるＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．由来の抗体）が挙げられるいくつかの因子によって決まることとなる点に留意すべきである。
【００５４】
一部の実施形態では、健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量は、０．５％である。ゆえに、患者が、活性化されたカスパーゼ１を３％発現する場合（すなわち、１００個の腸管上皮細胞中１．５個が、活性化されたカスパーゼ１を発現する）、患者は、健康なボランティアよりも、活性化されたカスパーゼ１を３倍多く発現するので、患者は、腸管バリアの状態の機能障害が中程度であると類別されることとなる。同様に、患者が、活性化されたカスパーゼ１を６％発現する場合（すなわち、１００個の腸管上皮細胞中６個が、活性化されたカスパーゼ１を発現する）、患者は、健康なボランティアよりも、活性化されたカスパーゼ１を６倍多く発現するので、患者は、腸管バリアの状態の機能障害が重度であると類別されることとなる。
【００５５】
一部の実施形態では、健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量は、およそ０．５％である。ゆえに、患者が、活性化されたカスパーゼ１を１．５％発現する場合（すなわち、１００個の腸管上皮細胞中１．５個が、活性化されたカスパーゼ１を発現する）、患者は、健康なボランティアよりも、活性化されたカスパーゼ１を３倍多く発現するので、患者は、腸管バリアの状態の機能障害が中程度であると類別されることとなる。同様に、患者が、活性化されたカスパーゼ１を３．０％発現する場合（すなわち、１００個の腸管上皮細胞中３個が、活性化されたカスパーゼ１を発現する）、患者は、健康なボランティアよりも、活性化されたカスパーゼ１を６倍多く発現する（すなわち、３％は、０．５％よりも６倍高い）ので、患者は、腸管バリアの状態の機能障害が重度であると類別されることとなる。
【００５６】
「１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量」について利用可能な数値もパーセンテージ値もない場合、この量は、１００個の細胞中約０．５から１．０個、すなわち０．５％から１．０％の発現の範囲にあると理解されるものとする。
【００５７】
一部の実施形態では、腸管バリアの状態は、腸管内壁のルーチンの組織学的染色において、ギャップの数を計数することによって判定される。例えば、押出ゾーンとも呼ばれる、上皮細胞の押出し後の腸管表面において細胞間に残された残留空間は、十分に保存された腸管標本上で計数されて、上皮細胞の総数に対して標準化されて、バリア状態を反映することができる。試料は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色、アルシアンブルーおよびヌクレアファストレッドが挙げられるがこれらに限定されない従来の組織学的染色技術を使用して、染色され得る。
【００５８】
一部の実施形態では、腸管バリアの状態は、腸管表面の共焦点内視鏡を使用して、ギャップ密度（すなわち、ギャップの数）を測定することによって、判定される。例えば、腸管試料は、核（例えばＤＡＰＩ）染色および細胞骨格（例えばアクチン）染色で染色され得、かつ多光子共焦点顕微鏡観察を使用してｅｘ  ｖｉｖｏで画像化され得る。
【００５９】
通常、健康なボランティアは、腸管バリアギャップをほとんど有していないと予想され、健康なボランティアにおけるギャップの数は、通常、１００個の腸管上皮細胞あたり０．５ギャップ未満である。
【００６０】
しかしながら、１人または複数の健康なボランティアのギャップの数またはギャップ密度について利用可能な数値もパーセンテージ値もない場合、この量は、１００個の腸管細胞あたりおよそ０．５ギャップ、すなわちおよそ０．５％であると理解されるものとする。
【００６１】
一部の実施形態では、粘膜（または腸管）バリアの状態または腸管バリア機能障害の程度は、腸管上皮細胞の活性化されたカスパーゼ−１および／または活性化されたカスパーゼ−３、ならびに上皮内リンパ球の抗ＣＤ３についての組合せ染色によって特徴付けられ得る。腸管上皮細胞の総数は、核染色（例えばＤＡＰＩ）を使用して定量化され得る。染色方法は、以下のプロトコールＡ「パラフィン包埋粘膜生検試料の染色プロトコール」に詳述されている。
【００６２】
腸管バリア機能障害の程度は、腸管上皮細胞の総数に対して標準化された、活性化されたカスパーゼ−１陽性細胞（例えば、核染色によって判定される）の総数；または腸管上皮細胞の総数に対して標準化された、活性化されたカスパーゼ−１陽性細胞の、活性化されたカスパーゼ−３陽性細胞に対する相対比、もしくは活性化されたカスパーゼ−１陽性細胞および活性化されたカスパーゼ−３陽性細胞の組合せによって導かれ得る。
【００６３】
腸管バリアの状態またはバリア機能障害の程度はまた、活性化されたカスパーゼ−１上皮細胞および活性化されたカスパーゼ−３上皮細胞の双方について陽性に染色すると予想されるＴＵＮＥＬ染色についての組合せ染色、マイナス、活性化されたカスパーゼ−３陽性染色細胞（上皮内リンパ球について抗ＣＤ３染色があってもなくてもよい）によって特徴付けられ得る。腸管上皮細胞の総数は、核染色、例えばＤＡＰＩを使用して定量化され得る。染色方法は、以下のプロトコールＢ「市販の染色キットを使用したパラフィン包埋粘膜生検試料のＴＵＮＥＬ染色プロトコール」に詳述されている。
【００６４】
一部の実施形態では、腸管（すなわち粘膜）バリア機能障害は代わりに、活性インターロイキン１−ベータ（ＩＬ−１β）および／またはＩＬ−１８についての染色によって特徴付けられ得、これらは双方とも、活性化されたカスパーゼ−１の代用マーカーである。活性（すなわち成熟した）インターロイキン１−ベータ（ＩＬ−１β）に特異的に結合する抗体、およびＩＬ−１８に特異的に結合する抗体が公知である（例えば、Ｃｌｅａｖｅｄ−ＩＬ−１β（Ａｓｐ１１６）（Ｄ３Ａ３Ｚ）Ｒａｂｂｉｔ  ｍＡｂ  ＃８３１８６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ、およびＡｎｔｉ−ＩＬ１８抗体（ａｂ７１４９５）、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ参照）。
【００６５】
腸管表面がｉｎ  ｖｉｖｏで、静脈内色素（例えばフルオレセイン）で染色されて（核染色（例えばアクリフラビン）があってもなくてもよい）、共焦点レーザー内視鏡を使用して画像化されてもよい。共焦点レーザー内視鏡でのギャップ密度は、押出ゾーンの有効な測定である。
【００６６】
腸管バリアの状態は、消化管症候のない健康なボランティア（例えば、１８歳から７０歳のヒト）由来の腸管バリアの状態と比較して、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の患者では、かなり損なわれている。
【００６７】
各治療剤（または、例えば、一群の治療剤の各標的）が、カスパーゼ１および／またはカスパーゼ３の染色についての独自の特異的プロファイルを示して、最適な治療有効性を示し得ることが理解されよう。例えば、抗ＴＮＦ剤について（薬剤によって決まる）、陽性カスパーゼ−１染色についての非限定的な一プロファイルが、特異的抗ＴＮＦ、および疾患の状態（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、または不確定の大腸炎）に応じて、生検試料で、１００個の腸管上皮細胞あたり約４から７個、すなわち約４％から約７％の活性化されたカスパーゼ−１陽性細胞を上回ると推定される。
【００６８】
一部の実施形態では、抗ＴＮＦ剤は、アダリムマブ、インフリキシマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、およびエタネルセプトからなる群から選択される。下記のように、炎症性腸疾患の患者（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎の患者）における抗ＴＮＦ剤に対する治療応答率は、重度の機能障害についての先の基準が満たされる（例えば、陽性染色された細胞またはギャップ密度が、クローン病または潰瘍性大腸炎について約４％から７％を超える）場合、７０を上回ると予想される。
【００６９】
一部の実施形態では、抗インテグリン剤は、ベドリズマブ、ナタリズマブ、およびエトロリズマブからなる群から選択される。下記に記載されているように、ＩＢＤ患者（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎の患者）におけるこれらの抗インテグリン剤に対する応答率は、中程度のバリア機能障害についての基準が満たされる（例えば、陽性染色された細胞またはギャップ密度が、約４％未満）場合、約７０から８０％を上回ると予想される。
【００７０】
以下の例は、いかなる形であれ本発明を限定することを意図していない。
【００７１】
染色プロトコールＡおよびＢ
【００７２】
一般に、染色（すなわち、試料を結合剤と接触させて、結合が検出され得ること）は、以下のように実行されてよい。
【００７３】
プロトコールＡ：パラフィン包埋粘膜生検試料の染色プロトコール
【００７４】
ステップＩ．脱パラフィン
【００７５】
ラック内にスライドを置いて、Ｃｏｐｌｉｎジャーまたは他の容器内で以下の連続した洗浄を実行する：
【００７６】
洗浄１．キシレン：２×５分
【００７７】
洗浄２．  １００％エタノール：２×５分
【００７８】
洗浄４．  ９５％エタノール：３分
【００７９】
洗浄５．  ７０％エタノール：３分
【００８０】
洗浄６．  ５０％エタノール：３分
【００８１】
洗浄７．蒸留Ｈ２Ｏ：２×３分
【００８２】
抗原回収を実行する準備が整うまで、スライドを蒸留水中で維持する。一部の実施形態では、スライドを、これより乾燥させてはいけない。というのも、乾燥により、非特異的な抗体結合が生じて、組織上のバックグラウンド染色が高くなる虞があるからである。
【００８３】
ステップＩＩ．抗原回収
【００８４】
１．ウォーターバスおよび抗原回収溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液）を９５℃に予熱する。
【００８５】
１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液は、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０であり、以下のように作製する：
クエン酸三ナトリウム（二水和物）  ２．９４ｇ
蒸留水  １０００ｍｌ
溶解するように混合する。１Ｎ  ＨＣｌでｐＨを６．０に調整する。
０．５ｍｌ  Ｔｗｅｅｎ２０を加えて、よく混合して、４℃にて保存する
【００８６】
２．スライドを、予熱された抗原回収溶液（スライドを約１から約８センチメートルカバーするのに十分である）中に入れる。ガラス容器が熱で割れる虞があるので、一部の実施形態では、ガラス容器は使用されない。一部の実施形態では、蒸発を妨げる蓋付きプラスチックタッパーウェア容器が使用されてもよい。一部の実施形態では、蓋付きの空のボックス（例えば、マイクロピペッター用のピペットチップを保持するのに使用されるボックス）が使用されてもよい。実施形態では、容器が浮いて漂うのを妨げるための重りが、容器のカバーの上に加えられる。
【００８７】
３．スライドを９５℃にて２０分間インキュベートする。
【００８８】
４．  ２０分経過したら、容器およびスライドをウォーターバスから取り出す。スライドを、抗原回収溶液中に浸漬させたまま、室温に冷却してから、容器から取り出す。
【００８９】
５．免疫組織化学的染色プロトコール（すなわち、ステップＩＩＩ）に続く。
【００９０】
ステップＩＩＩ．免疫染色
【００９１】
全てのインキュベーションが、組織の乾燥を回避するために、加湿されたチャンバ内で実行されるべきである。
【００９２】
蓋がシールされ、かつ湿ったティッシュペーパーを底部に有する浅いプラスチックボックスで、十分に機能する。一部の実施形態では、スライドは、ペーパーに直接接触しない。一部の実施形態では、スライドは、平らに置くことができる。一部の実施形態では、スライドは、試薬が排水されないように位置する。
【００９３】
１．スライドを、０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００入り１×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で５分間、穏やかに撹拌しながら洗浄する。２回目の洗浄を繰り返して、合計２回洗浄する。
【００９４】
２．洗浄緩衝液からスライドを取り出して、けばが少なく静電放電が低いキムワイプまたは他のきめ細かいタスクワイプを使用して、スライドから過剰な液体を拭った。ＰＡＰペンまたは他の類似のペンを使用して、組織の周りに円を描いて、試料の周りに疎水性バリアを生じさせる。
【００９５】
３．およそ１００μＬのブロッキング溶液を組織上にピペットで滴下して、組織切片が完全にカバーされるのを確実にして、組織を室温にて２時間インキュベートする。ブロッキング溶液は、以下を含有する：１０％の正常なヤギ血清および１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）入り１×ＰＢＳ
【００９６】
４．キムワイプを使用して、組織から過剰なあらゆるブロッキング溶液を拭い取り、およそ１００μＬの第１の抗体溶液を各スライドに加える。４℃にて一晩インキュベートする。第１の抗体溶液は、カスパーゼ−１  ｐ２０抗体を（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、カタログ番号４１９９から利用可能な切断カスパーゼ−１（Ａｓｐ２９７）（Ｄ５７Ａ２）ウサギｍＡｂを使用して）１：２５０希釈で、そしてＣＤ３ｅ抗体を（例えば、マウスにおいて高められたＣＤ３ｅ／ＣＤ３イプシロン抗体（ＳＰＶ−Ｔ３ｂ）ヒト；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）カタログ番号０７−０３０３を使用して）１：１００希釈で有する、１％ＢＳＡ入り１×ＰＢＳを含有する。
【００９７】
また、活性化されたカスパーゼ１の染色は、ペプチド阻害剤、例えばＥｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋから市販されており、そしてＰＣＴ公報第２０１４／０３９６９９号および米国特許出願公開第２０１５／０２０２３２９号（双方ともそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されているＡｃ−ＹＶＡＤ（ｔｙｒ−ｖａｌ−ａｌａ−ａｓｐ）−ＣＭＫ阻害剤によるイムノブロッティングによって達成され得る点に留意すべきである。ペプチドＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ（Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−クロロメチルケトン）は、カスパーゼ−１（capspase-1）の細胞透過性の不可逆阻害剤である。
【００９８】
５．過剰な一次抗体溶液を排水して、スライドを１×ＰＢＳ中で５分間、穏やかに撹拌しながら洗浄する。２回繰り返して、合計３回洗浄する。
【００９９】
６．およそ１００μＬの二次抗体溶液を組織上にピペットで滴下して、暗所で室温（例えば、２５℃）にて１時間インキュベートする。二次抗体溶液は、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８を（例えば、ヤギ抗ウサギ（Ｈ＋Ｌ）Ｓｕｐｅｒｃｌｏｎａｌ二次抗体、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ４８８；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＰＩＡ２７０３４を使用して）１：３０００希釈で、そしてヤギ抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５５５を（例えば、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ５５５；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ２１４２４を使用して）１：３０００希釈で有する、１％ＢＳＡ入り１×ＰＢＳを含有する。
【０１００】
７．過剰な抗体溶液を拭い取り、スライドを１×ＰＢＳ中で５分間、穏やかに撹拌しながら洗浄する。１回繰り返して、合計２回洗浄する。洗浄を暗所で実行する。
【０１０１】
８．スライドを、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから市販されているカタログ番号Ｄ３５７１の、０．３μｇ／ｍＬ（０．６５４ｎＭ）ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ジラクテート）を含有する１×ＰＢＳ中で１０分間、暗所で穏やかに撹拌しながらインキュベートする。例えば、２００ｍＬ  ＰＢＳ中へ５ｍｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩストックを１２μＬ入れて、一ステップにおける最終の洗浄＋染色に使用することができる。
【０１０２】
９．過剰な液体を排水して、切片の周りをティッシュペーパーで拭いて、カバースリップを組織上にマウントする。これを、マウント剤、例えば、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）、カタログ番号Ｐ３６９７０を使用して行ってよい。スライドを暗所で室温にて一晩硬化させて（すなわち、マウント剤により組織を定着（set）させて、時間とともに固めて）から、画像化する。
【０１０３】
スライドを、多光子顕微鏡観察または蛍光顕微鏡観察を使用して、使用する蛍光色素に対応する波長を使用して、画像化する。共焦点レーザー内視鏡を、内視鏡検査時に患者の試料に実行することができると同時に、多光子共焦点顕微鏡観察または蛍光顕微鏡観察を、免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色で（例えば、活性化されたカスパーゼ１に特異的な、標識されたモノクローナル抗体を使用して）染色したスライドに行うことができる点に留意すべきである。
【０１０４】
上記のプロトコールＡに使用される抗体について、色素の放射スペクトルは、以下の通りである：ＤＡＰＩは４５５ｎｍにて画像化され、抗ＣＤ３は５５５ｎｍにて画像化され、抗カスパーゼ１は４８８ｎｍにて画像化された。図２は、活性化されたカスパーゼ１について染色された（すなわち免疫染色された）腸管上皮細胞の代表的な画像を示す。スライド内に存在するＴ細胞は、Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体と関連する細胞表面分子、ＣＤ３に特異的に結合する抗体との共染色によって、同定される。図２において、白色の矢印は、カスパーゼ１の発現について陽性染色された、緑色に染色された腸管上皮細胞を指し、白色の矢尻（すなわち三角形）は、ＣＤ３およびカスパーゼ１双方の発現について陽性染色された、赤色に染色されたＴ細胞（上皮内リンパ球またはＩＥＬ）を指す。
【０１０５】
プロトコールＢ：市販の染色キットを使用したパラフィン包埋粘膜生検試料のＴＵＮＥＬ染色プロトコール。
【０１０６】
ＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識）染色は、核酸の末端を標識することによってＤＮＡ断片化を検出するための方法である。アポトーシスがＤＮＡの断片化を引き起こすので、ＴＵＮＥＬアッセイは、アポトーシスのシグナル伝達カスケードに起因するＤＮＡ断片化についての共通の方法である。このアッセイは、マーカーで二次的に標識されているｄＵＴＰの付加を触媒することとなる酵素、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼまたはＴｄＴによって同定され得る、ＤＮＡ中のニックの存在に頼っている。
【０１０７】
ステップＩ．脱パラフィン
【０１０８】
ラック内にスライドを置いて、Ｃｏｐｌｉｎジャーまたは他の容器内で以下の連続した洗浄を実行する：
【０１０９】
１．キシレン：２×５分
【０１１０】
２．  １００％エタノール：２×５分
【０１１１】
４．  ９５％エタノール：３分
【０１１２】
５．  ７０％エタノール：３分
【０１１３】
６．  ５０％エタノール：３分
【０１１４】
７．蒸留Ｈ２Ｏ：２×３分
【０１１５】
抗原回収を実行する準備が整うまで、スライドを蒸留水中で維持する。スライドを、これより乾燥させてはいけない。乾燥により、非特異的な抗体結合が生じて、組織上のバックグラウンド染色が高くなる虞がある。
【０１１６】
ステップＩＩ．抗原回収
【０１１７】
１．ウォーターバスおよび抗原回収溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液）を９５℃に予熱する。クエン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）を、以下のように作製する：
クエン酸三ナトリウム（二水和物）  ２．９４ｇ
蒸留水  １０００ｍｌ
溶解するように混合する。１Ｎ  ＨＣｌでｐＨを６．０に調整する。
０．５ｍｌ  Ｔｗｅｅｎ２０を加えて、よく混合して、４℃にて保存する
【０１１８】
２．スライドを、予熱された抗原回収溶液（スライドを数センチメートルカバーするのに十分である）中に入れる。ガラス容器が熱で割れる虞があるので、ガラス容器を使用するのは避ける。蒸発を妨げる蓋付きプラスチックタッパーウェア容器が十分に機能し、蓋付きの空のチップボックスも機能する。容器が浮いて漂うのを妨げるための重りが、カバーの上に加えられる。
【０１１９】
３．スライドを９５℃にて２０分間インキュベートする。
【０１２０】
４．  ２０分経過したら、容器およびスライドをウォーターバスから取り出す。スライドを、抗原回収溶液中に浸漬させたまま、室温に冷却してから、容器から取り出す。
【０１２１】
ステップＩＩ．核染色
【０１２２】
この時点では、市販のキットによって提供されるプロトコールに従う。以下は、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ  ＴＡＣＳ（登録商標）２  ＴｄＴ−Ｆｌｕｏｒ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から市販、カタログ番号：４８１２−３０−Ｋ）についての、省略し、かつ適合させたプロトコールである。
【０１２３】
１．試料を、１×ＰＢＳ中に１０分間浸漬させて、穏やかに撹拌する。
【０１２４】
２．試料を、５０μｌのプロテイナーゼＫ溶液で１５分間カバーする。プロテイナーゼＫ溶液（１試料あたり）は、以下を含有する：５０μｌ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｇｒａｄｅ（商標）Ｗａｔｅｒおよび１μｌプロテイナーゼＫ
【０１２５】
３．試料を脱イオン水中で２分間洗浄する。２回目の洗浄を繰り返す。
【０１２６】
４．試料を１×ＴｄＴ標識緩衝液中に５分間浸漬させる。ＴｄＴ標識緩衝液は、４５ｍｌの脱イオン水および５ｍｌの１０×ＴｄＴ標識緩衝液（Ｔｒｅｖｉｇｅｎキット由来）を含有する。
【０１２７】
５．試料を、５０μｌのＬａｂｅｌｉｎｇ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎキット由来）でカバーして、湿度チャンバ内で３７℃にて６０分間インキュベートする。１試料あたりのＬａｂｅｌｉｎｇ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘは、１μｌ  ＴｄＴ  ｄＮＴＰ、１μｌ  ５０×陽イオン（Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、またはＣｏ２＋）、１μｌ  ＴｄＴ酵素（凍結融解の繰返しは避ける）、および５０μｌ  １×ＴｄＴ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎキット由来）を含有する
【０１２８】
６．試料を、１×ＴｄＴ  Ｓｔｏｐ  Ｂｕｆｆｅｒ中に５分間浸漬させる。ＴｄＴ  Ｓｔｏｐ  Ｂｕｆｆｅｒは、４５ｍｌの脱イオン水および５ｍｌの１０×ＴｄＴ  Ｓｔｏｐ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎキット由来）を含有する
【０１２９】
７．試料を１×ＰＢＳ中で２回、それぞれ２分間洗浄する。
【０１３０】
８．試料を、５０μｌのＳｔｒｅｐ−Ｆｌｕｏｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎでカバーして、暗所で２０分間インキュベートする。Ｓｔｒｅｐ−Ｆｌｕｏｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎは、２００μｌ  １×ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０入り１×ＰＢＳ）および１μｌ  Ｓｔｒｅｐ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを含有する。
【０１３１】
９．試料を１×ＰＢＳ中で３回、それぞれ２分洗浄する。
【０１３２】
１０．  ９０％グリセロールを使用してガラスカバースリップをマウントして、４９５ｎｍフィルタを使用して蛍光顕微鏡下で見る。
【０１３３】
図３Ａおよび図３Ｂは、ＴＵＮＥＬ（例えば、先のプロトコールＢを使用する）について（図３Ａ）、そして活性化されたカスパーゼ３（例えば、先のプロトコールＡを使用する）について（図３Ｂ）染色された（すなわち、免疫染色された）腸管上皮細胞の代表的な画像を示す。図３Ａにおいて、矢印は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞を染色する市販のキットを使用した、核断片化について陽性の腸管上皮細胞染色を指す。図３Ｂにおいて、矢印は、カスパーゼ３の発現について陽性の腸管上皮細胞染色を指す。
【実施例】
【０１３４】
（実施例Ｉ）
【０１３５】
この実施例Ｉの主な目的は、治療の前に腸管バリアの機能状態を評価することによって、クローン病および潰瘍性大腸炎の処置用のベドリズマブについての患者選択を向上させることである。生物学的治療、例えば抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、抗ＩＬ１２／２３剤、および抗インテグリン剤は、過去数十年間、臨床応答率が約５０％であった。インテグリンα４β７に特異的に結合し、武田薬品工業によってＥＮＴＹＶＩＯ（登録商標）の名で販売されているモノクローナル抗体、ベドリズマブは、２０１４年に臨床使用が承認されて、他の抗ＴＮＦ剤に応答しなかった患者に広く使用されてきた。しかしながら、その臨床応答率は、特にクローン病について、抗ＴＮＦ剤と比較して低かった。本研究は、より良好な患者選択により、ベドリズマブに対する治療応答を向上させるように設計した。
【０１３６】
過去２０年にわたる研究は、バリア崩壊が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）における粘膜炎症の病因において重大かつ重要な役割を果たすことを、納得がいくように実証してきた。バリア崩壊は、上皮下免疫系を、生息する微生物に曝して、ＴＮＦ−αおよび他の炎症誘発性サイトカインの分泌を誘導し、これが今度は、腸管からの上皮細胞の脱落を誘導して、更なる炎症およびバリア機能障害の増大を促進する。
【０１３７】
この実施例Ｉは、生検試料の腸管バリア機能の評価が、炎症性腸疾患に罹患する患者（例えば、クローン病（ＣＤ）患者および潰瘍性大腸炎患者）におけるベドリズマブに対する臨床応答を予測するのに重要な予測ツールとして機能し得るという発見に基づいている。一部の実施形態では、生検試料の腸管バリア機能の評価は、将来過敏性大腸症候群に罹患する可能性がある患者および将来炎症性腸疾患に罹患する可能性がある患者におけるベドリズマブに対する臨床応答を予測する重要な予測ツールとして機能し得る。
【０１３８】
こうするために、回腸末端部由来のプレ処置生検試料の粘膜バリア機能状態によって階層化したクローン病患者および潰瘍性大腸炎患者において、ベドリズマブに対する臨床応答を判定する。判定は、結腸のバリア状態が、回腸末端部のバリア状態を反映するかに関して行うこととする。
【０１３９】
この実施例Ｉは、患者選択の向上を可能にすることとなり、これにより、ベドリズマブに対する治療応答が向上して、臨床医は、対費用効果をより高くして、疾患の経過を変え、かつ患者の転帰を向上させることが可能になると考えられる。
【０１４０】
この実施例Ｉについて、ベドリズマブ（抗インテグリン剤）で処置されている、または以前に処置されたＣＤ患者から収集したプレ処置粘膜生検試料の研究を行うこととする。これらの生検試料を、以前に報告された技術を適切に改変して使用して（未発表）、腸管バリア機能について分析することとする。ＣＤ患者および潰瘍性大腸炎患者の、ベドリズマブに対する臨床応答を、各試料における粘膜バリアのベースラインの機能状態によって階層化することとする。応答率は、クローン病および潰瘍性大腸炎の双方の処置用のベドリズマブについて、ギャップ密度、または陽性染色された、活性化されたカスパーゼが、３から４％未満の範囲にある患者において、７０から８０％の範囲にあると予想される。
【０１４１】
この実施例Ｉの主な目的は、粘膜バリアのプレ処置機能状態に基づいて、ベドリズマブ治療についての患者選択を向上させることによって、治療に対する臨床応答を向上させることである。第１の研究エンドポイントは、プレ処置バリア状態によって階層化したクローン病の患者および潰瘍性大腸炎患者におけるベドリズマブに対する治療応答の判定である。第２のエンドポイントは、粘膜バリア機能障害についてのカットポイントを判定する感度分析の完了である：このカットポイントは、ＣＤ患者および潰瘍性大腸炎患者において、値未満である患者が、ベドリズマブに対する最も高い臨床応答率をもたらす；一方、値を超える患者について、応答率は最も低い。カットポイントは、重度のバリア機能障害から軽度のバリア機能障害を分離する値である。粘膜ＴＮＦ活性化は、値未満である軽度のバリア機能障害において起こらないので、ベドリズマブは理想的な治療である。カットポイントを上回るより重度のバリア機能障害において、粘膜ＴＮＦ活性化が起こり、抗ＴＮＦ治療はより適切な処置である。抗インテグリン剤および抗ＴＮＦ剤に対する応答を最適化すると予想される粘膜バリアベースの治療アプローチを、図１に示す。
【０１４２】
この実施例Ｉの第２の目的は、結腸生検のバリア機能状態が、回腸末端部の試料として、治療について同程度の予測値を有するのかを判定することである。細胞押出による粘膜バリア機能の評価を、ＩＢＤ患者および疾患の齧歯類モデルの回腸末端部において評価して、実証した（Liu  JJ、Davis  EM、Wine  E、Lou  Y、Rudzinski  JK、Alipour  M、Boulanger  P、Thiesen  AL、Sergi  C、Fedorak  RNら:  Epithelial  cell  extrusion  leads  to  breaches  in  the  intestinal  epithelium.  Inflammatory  bowel  diseases  ２０１３年、１９巻（５号）：９１２〜９２１頁；Liu  JJ、Rudzinski  JK、Mah  SJ、Thiesen  AL、Bao  H、Wine  E、Ogg  SC、Boulanger  P、Fedorak  RN、Madsen  KL:  Epithelial  gaps  in  a  rodent  model  of  inflammatory  bowel  disease:  a  quantitative  validation  study.  Clinical  and  translational  gastroenterology  ２０１１年、２巻：e3、Kiesslich  R、Duckworth  CA、Moussata  D、Gloeckner  A、Lim  LG、Goetz  M、Pritchard  DM、Galle  PR、Neurath  MF、Watson  AJ:  Local  barrier  dysfunction  identified  by  confocal  laser  endomicroscopy  predicts  relapse  in  inflammatory  bowel  disease.  Gut  ２０１２年、６１巻：１１４６〜１１５３頁）。粘膜バリア機能の損失もまた、成体および小児双方のクローン病患者の十二指腸で起こる（Lim  LG、Neumann  J、Hansen  T、Goetz  M、Hoffman  A、Neurath  MF、Galle  PR、Chan  YH、Kiesslich  R、Watson  AJ:  Confocal  endomicroscopy  identifies  loss  of  local  barrier  function  in  the  duodenum  of  patients  with  Crohn's  disease  and  ulcerative  colitis.  Inflammatory  bowel  diseases  ２０１４年、２０巻（５号）：８９２〜９００頁；および未発表の結果参照）。この発見は、先天的な免疫介在性の上皮細胞の死（ピロトーシス）が、消化管の全体を通して起こり得ることを示唆している。ＣＤは、口から肛門までのどこでも、組織に影響を及ぼす虞がある疾患である。ゆえに、活性化されたカスパーゼ染色についての口腔／頬粘膜の生検または綿棒の染色は、ＩＢＤ治療について同程度の予測値を有し得る。
【０１４３】
クローン病における先天的な免疫活性化の正確なトリガーは同定されていないが、原因剤は、消化管全体を通過している可能性がある。回腸末端部において観察される粘膜バリア機能障害をもたらす先天的な免疫活性化は、同様に、結腸において起こる可能性がある。第２の目的は、結腸における粘膜バリア機能状態が、回腸末端部の粘膜バリア機能状態をどのくらい密接に反映するのかを判定することである。その目的を達成するために、回帰分析を使用して、結腸において測定されるバリア機能状態のマーカーが、回腸末端部において同時に測定される同じマーカーを、妥当な精度で予測するのに使用され得るという作業仮説を試験することとする。１００人のクローン病患者のコホートにおいて、回腸末端部および結腸由来の従来の生検試料のバリア機能を比較して、２つの領域におけるバリア機能状態の相関を評価することとする。その後、結腸における粘膜バリア機能状態が、回腸末端部におけるバリア状態をどのくらい密接に反映するのかを調査することとする。
【０１４４】
患者選択を、そして然るにＣＤ患者における臨床応答を向上させる目的を達成するために、２つの研究目的を以下に示す：
【０１４５】
目的１：回腸末端部におけるプレ処置粘膜バリア機能によって階層化したクローン病患者において、ベドリズマブに対する臨床応答を判定すること。
【０１４６】
目的２：結腸の粘膜バリア機能状態が、回腸末端部の粘膜バリア機能状態を反映するのかを判定すること。
【０１４７】
第１のエンドポイント
【０１４８】
目的１：ＣＤ患者における臨床応答を、プレ処置ベースラインからの５ポイントまたはそれを超えるＨａｒｖｅｙ−Ｂｒａｄｓｈａｗ  Ｉｎｄｅｘ（ＨＢＩ）の引下げと定義する。臨床的寛解を、５未満のＨＢＩと定義する（Harvey  and  Bradshaw、「A  simple  index  of  Crohn's-disease  activity」、Lancet  １９８０年、１巻（８１６７号）：５１４頁）。ＨＢＩを記録していない患者について、最近のオフィス来訪中にした臨床状態の評価を使用することとする。バリア機能障害が軽度の、そして重度のクローン病患者の臨床応答および寛解率を、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定を使用して比較することとする。
【０１４９】
目的２：回腸末端部および結腸から得た従来の生検試料の組織学的評価を実行することとする。バリア機能評価のために、活性化されたカスパーゼの染色分析を実行することとする。例えば、試料を、例えば、活性化されたカスパーゼ１およびカスパーゼ３に特異的に結合する蛍光標識された抗体と接触させることによって生検試料を染色するような標準方法を使用することとする。そのような抗体は、（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから）市販されている。回腸末端部および結腸由来の粘膜生検試料を、活性化されたカスパーゼについて染色して、分析することとする。各試料について、上皮表面における細胞の総数、および活性化されたカスパーゼ−１またはカスパーゼ−３について陽性染色された細胞の数を、盲検化した専門の病理医が手作業で計数して記録することとする。活性化されたカスパーゼ−１およびカスパーゼ−３について陽性染色された細胞の総数を、全ての生検試料にわたって計数した上皮細胞の総数のパーセンテージとして組み合わせて、表すこととする。各患者について、絨毛の断面図の８つの画像を、４つの生検試料から得ることとする。断面の向きが適切な最低でも３つの絨毛を、全ての生検試料から選択して、手作業で計数することとする。活性化されたカスパーゼの染色は、計数した１０００個の細胞あたりの陽性の細胞の連続変数として表すこととする。
【０１５０】
第２のエンドポイント
【０１５１】
目的１：クローン病患者におけるベドリズマブによる処置についての指標としてバリア機能障害を使用するためのカットポイント（閾値）を決定するために、感度分析を実行すること。
【０１５２】
患者および方法
【０１５３】
採用基準：
【０１５４】
１．患者が、標準的な臨床基準、放射線学的基準、内視鏡基準、および組織学的基準に基づいて、クローン病または潰瘍性大腸炎と診断された。
【０１５５】
２．中程度から重度の再燃、ステロイド依存性、生物学的治療の失敗、または他の薬剤に対するアレルギー反応もしくは有害反応のため、定められていた、ベドリズマブ治療の開始前に、生検が得られた。
【０１５６】
３．患者の年齢は、１８から７５歳である。
【０１５７】
除外基準
【０１５８】
１．患者が、以前にベドリズマブに曝されていた。
【０１５９】
２．回腸末端部、結腸、および／または直腸の生検が、結腸鏡検査中に得られなかった。
【０１６０】
３．生検が、ベドリズマブ治療の後に得られた。
【０１６１】
研究手順
【０１６２】
ベドリズマブ治療を受けている患者を、臨床研究情報アンケートを使用してスクリーニングすることとする。関連情報を収集して、研究データベースに登録することとする。先で一覧にした採用基準および除外基準を満たすプレ処置腸管生検試料を、現在ベドリズマブ治療を受けている、または以前にベドリズマブ治療を受けた１００人のＣＤ患者について、各研究センターから回収することとする。詳細な試料サイズの算出は、以下の統計学的手法の節で記述する。回腸末端部および結腸（近位結腸、遠位結腸、および直腸）由来の粘膜生検を、切片化した標本として、またはパラフィンブロックとして回収して、バリア機能状態の分析のためにＣｅｎｔｒａｌ  Ａｒｋａｎｓａｓ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＡＶＨＳ）に送ることとする。各患者について、先で一覧にした全ての位置由来の２から４個の生検を分析することとする。また、各患者について、病歴および結腸鏡検査の内視鏡所見の遡及的レビューを行うこととする。ベドリズマブ治療に対する臨床応答および疾患寛解率を評価して、バリア機能状態によって階層化することとする。
【０１６３】
研究期間
【０１６４】
施設内倫理委員会（ＩＲＢ）の承認およびチャートレビューが、各研究センターについて、３から６カ月かかると予想される。生検試料を、およそ１２カ月の期間にわたって、ＣＡＶＨＳでの分析のために送ることとする。全ての試料を分析した後、データ分析の完了まで６カ月かかると予想される。ゆえに、総研究期間は、約２４カ月と予想される。
【０１６５】
研究登録およびタイムライン
【０１６６】
ベドリズマブの経験が十分な５つの研究施設が、臨床的に示された結腸鏡検査から提唱した研究用の生検標本をすでに得ていた。患者に更なるリスクをもたらさない遡及的研究についてのＩＲＢ承認を得た（３カ月しかかからないはずである）後に、標本を、各施設の病理アーカイブから引き出すこととする。結腸鏡検査が過去３年以内におそらくなされていることになるので、ほとんどの施設は、生検試料を現場で保存しているはずである。一部の試料が保存のために送られて、より長い検索時間が必要とされるとしても、全ての研究試料を受け取って分析する前の１年しかない総期間の間で、毎月平均１０試料が到着すると見積もられる。
【０１６７】
統計学的方法論
【０１６８】
試料サイズの算出
【０１６９】
試料サイズの算出は、目的１のために実行し、重度の粘膜バリア機能障害の患者と軽度の粘膜バリア機能障害の患者との間で５０％の臨床応答率の差異、すなわちベドリズマブ治療に対する２０％対７０％の応答率の推測に基づいた。応答率は、応答率の７７％の差異、すなわち、ＴＮＦ抗体の陰性患者対陽性患者における１５％対９２％の以前の報告（Atreya  Rら、Nat  Med  ２０１４年、２０巻（３号）：３１３〜３１８頁）に基づいた控えめな推定値である。第Ｉ種の過誤（α）が０．０５である８０％の統計学的検出力を達成するには、合計３０人の患者（１群あたり１５人）が必要であろう。バリア機能の分析に十分な質の３０個の患者試料を得るには、およそ１００人の患者から試料を得る必要があろうと推定される。多くの患者（３０％であると推定）は、回腸生検を受けていないと予想される。回腸生検を実際に受けた残りの７０％のうち、試料のおよそ半分が、バリア機能分析に適した組織を含有しないであると予想される。バリア機能についての分析は、絨毛の構造が無傷である粘膜組織にのみ実行することができる。そして、臨床医は多くの場合、罹患部からのみ生検をとる。それゆえに、７０個の回腸試料のうち３０から３５個のみ、バリア分析に適していると予想される。それにも拘らず、統計学的比較を完了し得るのに十分な試料が、各群において入手可能である（すなわち、軽度のバリア機能障害１５人、および重度のバリア機能障害１５人）と予想される。
【０１７０】
統計学的分析
【０１７１】
目的１の第１の研究エンドポイントについて、２値応答変数（臨床応答または臨床的寛解）として表す。上記したように、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定が、２つの粘膜バリア機能群間の割合の比較に最も適切な方法であると予想される。各目的のために、推定オッズ比および９５％の信頼区間を使用して、バリア機能状態と研究エンドポイントとの関連を説明することとする。
【０１７２】
目的１の第２のエンドポイントについて、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を、バリア機能と臨床応答との関係を説明するのに構築することとする。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）を介して、臨床応答を達成する患者と、達成しない患者とを識別するバリア機能の全体的な能力を説明することとする。以下の２つの測定基準：（ａ）感度＋特異性の合計；および（ｂ）全体的な分類率に基づいて識別を最適化するバリア機能の値を報告することとする。各閾値について、閾値を上回る、そして下回る患者の割合、ならびに関連する感度、特異性、全体的な分類率、および尤度比統計量を報告することとする。
【０１７３】
目的２について、バリア機能状態のマーカーは、粘膜生検試料上で観察される、活性化されたカスパーゼの染色であるとする。マーカーを、結腸および回腸末端部において測定することとする。各マーカーについてのデータを、臓器部位によって、平均、ＳＤ、メジアン、四分位値、および範囲として要約することとする。各患者についての各マーカーについて、回腸末端部対結腸において測定したマーカーの値間の関係を、ＰｅａｒｓｏｎおよびＳｐｅａｒｍａｎｎ双方の相関係数を記載した散布図として示すこととする。散布図をガイドとして使用して、回腸末端部で測定したマーカーの値を、結腸で測定したマーカーの値に回帰させることとする。詳細には、データを、トレーニングセットと試験セットに２：１にランダムに分割して、トレーニングセットを使用して回帰モデルを開発し、そして試験セットを使用して、回帰モデルが回腸末端部におけるマーカー値をどのくらい正確に予測するのかを判定することとする。回帰モデルを開発するために、従来の最小二乗回帰を第１のツールとして使用することとする。散布図の形状が二次項または他の非線形項の根拠となるならば、それらを含むこととする。バックアップツールは、メジアン回帰およびポアソン回帰を含むこととする。含まれ得た回帰モデルの切片、傾斜、およびあらゆる非線形項についての標準誤差による点推定値を報告することとする。回帰モデルが試験セットにおいて回腸末端部のマーカー値をどのくらい十分に予測するのかを特徴付けるために、散布図を使用して、試験セットの観測値を、回帰モデルの予測された平均、９０％の信頼区間、および９０％の予測区間と共にプロットすることとする。９０％の予測区間から外れる試験セットデータポイントの数に注目することとする。試験セットにおける回腸末端部の観測マーカー値と回腸末端部の予測マーカー値との間の残差から平方二乗平均予測誤差（ＲＭＳＰＥ）を算出して、報告することとする。データセット全体（１１０データポイント）における回腸末端部の値のＳＤに対するＲＭＳＰＥの比率を使用して、予測の質を判断することとし、小さな比率（＜２５％）が良好な質を意味する。
【０１７４】
新しい治療パラダイムに基づくベドリズマブ処置の費用効果を調査する今後の研究に着手することとする。この個別化アプローチの経済的分析は、支払者に対する費用節約を実証するのに重要である。この後向き研究由来の結果の前向き確認研究もまた、バリア評価法を一般的な患者集団に使用するのに必要である。
【０１７５】
この実施例１由来の結果は、生検試料が腸管バリアにて中程度の量の機能障害を示す大多数の患者（すなわち、患者の５０％またはそれより多い）が、ベドリズマブによる処置に対する応答が有益であると考えられることを示すと予想される。「中程度」は、患者における活性カスパーゼ１および／または活性カスパーゼ３のレベルが、約１．５％から約４〜５％未満（例えば、約４％未満）であることを意味する。言い換えると、試験した１００個の腸管上皮細胞あたり約１．５個の細胞から約５個未満の細胞が、活性カスパーゼ１および／または活性カスパーゼ３についての染色が陽性であることとなる。別の例において、「中程度」はまた、腸管バリアにおけるギャップの数が、１００個の上皮細胞あたり約１．５から５ギャップであることを意味する。健康なボランティア由来の正常な腸管上皮細胞において、１％未満のカスパーゼ１陽性細胞（すなわち、１００個の細胞あたり１個未満のカスパーゼ１陽性細胞）が存在する点に留意すべきである。
【０１７６】
この例を実践するのに、メジアン年齢が５９歳であり、メジアン罹患期間が１１年（１年から３６年の範囲）である患者２７人を分析した。これらの２７人の患者のうち、１１人の患者はクローン病であり、そして１６人の患者は潰瘍性大腸炎であった。アミノサリチレート（aminosalacylate）、ステロイド、免疫調節物質もしくは生物学的製剤、または先の治療のいずれかの組合せによる、３週（３週から１０年の範囲）の最小治療期間での処置の後、図４に示すように、８人の患者が内視鏡的寛解にあり、そして１９人が依然として疾患の証拠を示した。生物学的治療（単独治療、または免疫調節物質（immunodulator）および／もしくはアミノサリチレートとの組合せ）による治療に有利に応答したことで、内視鏡的寛解にあった患者は、治療に有利に応答しなかった（またはアミノサリチレートもしくは免疫調節物質を受けた、もしくは受けた直後であった）ことで、内視鏡的疾患であった患者よりも、ＩＥＣにおける活性化されたカスパーゼレベルが低かった（図４参照）。活性化された平均カスパーゼ−１陽性細胞は、以下の通りであった：内視鏡的寛解群における１．５＋／−０．７５、対、罹患群における３．５＋／−２．５（ｐ＝０．０３８）。
【０１７７】
潰瘍性大腸炎についての臨床的寛解は、部分的Ｍａｙｏスコアが２点未満であり、あらゆるサブスコアが＞１でないと定義され；ＵＣについての軽度の疾患は、Ｍａｙｏスコアが２〜４であり、そしてＵＣについて中程度の疾患は、Ｍａｙｏスコアが５から６であると定義される点に留意すべきである。クローン病について、寛解は、Ｈａｒｖｅｙ−Ｂｒａｄｓｈａｗ  Ｉｎｄｅｘ（ＨＢＩ）が５未満であり、軽度のクローン病は、ＨＢＩ指数が５から７であり、そして中程度のクローン病は、ＨＢＩ指数が８から１６であると定義される。
【０１７８】
図４において、腸管上皮細胞（ＩＥＣ）染色は、抗カスパーゼ１抗体を使用して、患者からとった腸管生検試料の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色により実行した点に留意すべきである。
【０１７９】
（実施例２）
【０１８０】
この実施例２の主な目的は、粘膜バリアの機能状態に基づいて、クローン病（ＣＤ）についての生物学的治療に対する応答率を向上させることである。本研究の２つの目的は、（１）ＣＤ患者における抗ＴＮＦ剤セルトリズマブペゴルまたはアダリムマブに対する治療応答についてのバリア機能障害の予測値を評価すること、そして（２）セルトリズマブペゴルまたはアダリムマブでのＣＤ患者における疾患再発についての粘膜バリア機能障害の予測値を判定することである。
【０１８１】
言い換えると、この実施例２の目的は、ＣＤ患者におけるセルトリズマブペゴルに対する治療応答について粘膜バリア機能障害の予測値を判定することである。この目的は、バリア機能障害が、抗ＴＮＦ治療に対する応答の強力な予測子であるという仮説に基づいている。この仮説は、以下の観察に基づいている：（１）ＩＢＤ患者は、ギャップ密度が高いほど、粘膜炎症誘発性サイトカインレベルが高く（Liuら、「Epithelial  cell  extrusion  leads  to  breaches  in  the  intestinal  epithelium」、Inflammatory  Bowel  Diseases  ２０１３年、１９巻（５号）：９１２〜９２１頁参照）；（２）クローン病についての生物学的治療に対する最も高い応答率は、手術後の患者において見られ、１年目の内視鏡的寛解率が９０％を超え、そして（３）顕著なバリア機能障害が、回腸切除動物モデルにおいて、吻合部にて観察される（未発表の観察）。応答率は、ギャップ密度または陽性染色細胞が６〜７％を超えるクローン病患者について、７０から８０％の範囲にあると予想される。
【０１８２】
ＩＢＤ患者におけるＣＬＥによる腸管の分子イメージングの最近の研究は、抗ＴＮＦ治療が、９０％を超える短期の臨床応答率をもたらし得ることを示した（Atreyaら、Nat  Med  ２０１４年、２０巻（３号）：３１３〜３１８頁）。この結果は、生物学的薬剤に対する応答率を判定する際に粘膜ＴＮＦレベルが果たす役割を強調している。ＩＢＤ患者は、ギャップ密度が高くなるにつれ、粘膜生検標本における粘膜炎症誘発性サイトカインレベルが増大した（Liu  JJら、Inflammatory  bowel  diseases  ２０１３年、１９巻（５号）：９１２〜９２１頁参照）。ゆえに、バリア機能障害があるＣＤ患者は、粘膜ＴＮＦレベルが増大しているので、セルトリズマブペゴルに、またはアダリムマブに、もしくはそれに対して（例えば、有益な方向に）応答する可能性がより高い。詳細には、セルトリズマブペゴルに対する長期の臨床応答率を、全ＣＤ患者における５０％から、バリア機能障害があるＣＤにおける８０％から９０％にまで向上させることが可能である場合がある。
【０１８３】
採用基準
【０１８４】
１．標準的な臨床基準、放射線学的基準、内視鏡基準、および組織学的基準に基づくクローン病の診断。
【０１８５】
２．中程度から重度の再燃、ステロイド依存性、他の治療の失敗、または他の生物学的薬剤に対するアレルギー反応もしくは有害反応のため、セルトリズマブペゴル治療またはアダリムマブ治療を始める寸前の患者。
【０１８６】
３．  １８から７５歳。
【０１８７】
除外基準
【０１８８】
１．妊娠／育児。
【０１８９】
２．フルオレセインまたは甲殻類に対する公知のアレルギー。
【０１９０】
３．障害のある腎機能（血清クレアチニンが１．５ｍｇ／ｄＬを超える）。
【０１９１】
４．コントロールできない、または重度の喘息。
【０１９２】
５．活動性感染。
【０１９３】
６．陽性結核皮膚試験。
【０１９４】
７．全身性狼瘡の病歴。
【０１９５】
８．脱髄性神経疾患。
【０１９６】
９．鬱血性心不全。
【０１９７】
１０．抗ＴＮＦ剤による過去の、または現在の処置。
【０１９８】
１１．広範囲にわたって切除された小腸。
【０１９９】
この実施例２の中心的な仮説は、粘膜バリア機能障害が、ＣＤ患者における治療応答および疾患再発についての重要な予測的ツールであるというものである。
【０２００】
研究設計
【０２０１】
盲検化した前向き観察研究を、セルトリズマブペゴル治療もしくはアダリムマブ治療を受けている、またはこれを開始する寸前のＣＤ患者に実行することとする。粘膜バリア機能障害を、セルトリズマブペゴル治療またはアダリムマブ治療を受けている患者における臨床応答および再発の予測子として評価することとする。
【０２０２】
研究手順
【０２０３】
各患者は、プローブベースの共焦点レーザー内視鏡（ｐＣＬＥ）による結腸鏡検査および粘膜生検を経験することとなる。血液試料および糞便試料を、ベースライン時、そして１年の追跡調査時、または再発時に収集することとする。詳細な研究方法を、以下で概説する。
【０２０４】
血液試料および糞便試料における生物学的測定。全試料をコード化することとするので、技術者は、各研究患者の臨床状態に対して盲検化されることとなる。血中のＣ反応性タンパク質レベルを、比濁分析法（rate  nephelometry）を使用して測定することとする。血液血清試料を、結腸鏡検査時またはベースラインクリニック来院時に収集することとする。糞便カルプロテクチンを、結腸鏡検査時に収集した管腔吸引物試料中で測定することとする。高い糞便カルプロテクチンは、好中球の、腸管粘膜への移動を示しており、これは、炎症性腸疾患によって引き起こされる炎症が挙げられる腸管炎症中に起こる。全ての血清試料および糞便カルプロテクチン試料を、アッセイ時まで、−８０℃にて保存することとする。
【０２０５】
標準的な結腸鏡検査および生検データ収集。高解像度白色光結腸鏡検査（倍率または光学／デジタル増強技術なし）を、ベースラインにて、そして１年の追跡調査時に、または疾患の再燃の初回発症時に、全ての患者に実行することとする。内視鏡活性を、クローン病についての簡単な内視鏡スコア（ＳＥＳ−ＣＤ）を使用して評価することとする。結腸鏡検査の間、４個の標準的な粘膜生検試料を、ｐＣＬＥを介した光学生検からとることとし、これを、回腸末端部および直腸内で実行することとする。組織試料を、液体窒素中で保存しながら、組織病理分析およびミクロビオーム分析を待つこととする。
【０２０６】
共焦点レーザー内視鏡。プローブベースの共焦点レーザー内視鏡（ｐＣＬＥ）を、以前に報告された方法を使用して実行することとする（Hsiungら、「Detection  of  colonic  dysplasia  in  vivo  using  a  targeted  heptapeptide  and  confocal  microendoscopy」、Nature  Medicine  ２００８年、１４巻（４号）：４５４〜４５８頁;  Liu  JJら、「Increased  epithelial  gaps  in  the  small  intestines  of  patients  with  inflammatory  bowel  disease:  density  matters.」  Gastrointestinal  Endoscopy  ２０１１年、７３巻（６号）：１１７４〜１１８０頁）。手短に言えば、回腸末端部挿管後、２．５から５ｍＬの１０％フルオレセインを静脈内投与して、画像中にコントラストを生じさせることとする。蠕動を引き下げて、画像中の移動によるアーチファクトを最小にするために、鎮痙剤（グルカゴンまたはブチルスコポラミン）を与えてもよい。回腸末端部（合計５分間に３つの部位を調査）の、そして直腸（３分の調査）のフレーム単位の共焦点画像を、以前に記載した技術を使用して収集することとする（Neumannら、「Assessment  of  Crohn's  disease  activity  by  confocal  laser  endomicroscopy」、Inflammatory  Bowel  Diseases  ２０１２年、１８巻（１２号）：２２６１〜２２６９頁）。ｐＣＬＥ画像の記録にかかる総期間は、１患者あたり約１０分となろう。研究患者の登録前に、各ｐＣＬＥ技師は、全てのセンターにわたって使用される画像取得技術を標準化するための実地訓練を経験することとなる。
【０２０７】
ｐＣＬＥ画像事後解析を、以前に確立された基準を使用して、２人の盲検化した専門のレビュアーが実行することとする（Neumannら、「Assessment  of  Crohn's  disease  activity  by  confocal  laser  endomicroscopy」、Inflammatory  Bowel  Diseases  ２０１２年、１８巻（１２号）：２２６１〜２２６９頁）。上皮のギャップ密度は、腸管における上皮細胞の押出の、実証された再現性のある尺度であり、そしてまた、腸管透過性についての代用マーカーでもある。各ギャップ密度測定は、上皮ギャップの数が最も多い、最低でも３つの絨毛の画像に由来することとなる（絨毛における上皮細胞の総数に対して標準化する）（Liu  JJら、「Mind  the  gaps:  confocal  endomicroscopy  showed  increased  density  of  small  bowel  epithelial  gaps  in  inflammatory  bowel  disease」、Journal  of  Clinical  Gastroenterology  ２０１１年、４５巻（３号）：２４０〜２４５頁;  Liu  JJら、「Increased  epithelial  gaps  in  the  small  intestines  of  patients  with  inflammatory  bowel  disease:  density  matters.」Gastrointestinal  Endoscopy  ２０１１年、７３巻（６号）：１１７４〜１１８０頁）。腸管炎症のスコアリングを、クローン病患者における炎症の内視鏡評価について以前に確立された基準を使用して実行することとする（例えば、Turcotteら、「Increased  epithelial  gaps  in  the  small  intestine  are  predictive  of  hospitalization  and  surgery  in  patients  with  inflammatory  bowel  disease」、Clinical  and  Translational  Gastroenterology  ２０１２年、３巻：e19参照）。基準として、結腸クリプトの数およびねじれ、腸絨毛の外観、ミクロエロージョンの存在、固有層内の血管分布、杯細胞の数、固有層内の細胞浸潤物の存在、ならびに上皮ギャップの密度が挙げられる。
【０２０８】
組織学的評価。画像化した粘膜領域由来の生検を、ホルマリン中で固定して、パラフィン中に包埋して、切片化して、Ｈ＆Ｅで染色して、各研究患者の臨床状態に対して盲検化した専門の病理医が分析することとする。急性炎症の重篤度についての組織学的スコアリングは、生検を行った組織の好中球浸潤に基づくこととなる。組織学的スコアは、０（急性炎症なし）から３（広範囲に及ぶ急性炎症）に及び、潰瘍性大腸炎のために最初に開発されたものである（Rileyら、「Microscopic  activity  in  ulcerative  colitis:  what  does  it  mean?」  Gut  １９９１年、３２巻（２号）：１７４〜１７８頁）。クローン病についての実証されている組織学的スコアリング系の不在下で、このスコアリング系を、生検を行った組織における粘膜炎症の程度を定量化するように改変した。改変スコアを、６つの指標で構成し、これらをそれぞれ、なし（０）から重度（３点）のスケールで評価する。盲検化した経験豊かな病理医が、この系を使用して、粘膜炎症の程度を、生検の各セットにおいて判定することとする。各セット内の最も重度の変化を、グレーディング用にとることとする。６つの指標は、急性炎症性細胞浸潤（固有層における好中球）、陰窩膿瘍、ムチン減少、表面上皮の完全性の変化、慢性炎症性細胞浸潤（固有層における単核細胞）、およびクリプトの構造不規則性である。病理医による形態評価の後、組織画像を、コンピュータ処理画像解析のために第２の病理医に送って、疾患再発についての画像の予測値を判定することとする。
【０２０９】
ミクロビオーム分析。１患者あたり、１つの粘膜生検試料由来の、そして１つの管腔吸引物由来のＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｓｔｏｏｌ／Ｔｉｓｓｕｅキットを使用して抽出して、専門の分子微生物学者に送って、次世代遺伝子配列決定機器（ＨｉＳｅｑ  ２０００、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子標的配列決定によって分析した。１６Ｓ配列リードを、「ｍｏｔｈｕｒ」バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｔｈｕｒ．ｏｒｇ／）を使用して分析して、ベイズの識別器を使用して、Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ由来のＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ／ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ．ｊｓｐ）から分類することとする。
【０２１０】
臨床追跡調査。患者を、ベースライン時に、そしてその後、（患者が寛解期にあり続けるならば）合計１年間、または再発が起こるならばより短い期間、３カ月毎にクリニックにおいて見ることとする。再発は、ここでは、１５０を超えるクローン病活性指数（ＣＤＡＩ）として定義し、増大はベースラインから少なくとも６０ＣＤＡＩポイントである。患者は、悪化を示す症候が進行しているならば、医師または研究コーディネータと情報交換することを指図されることとなる。その時には、再発を確認するように来院を手配することとする。各クリニック来院時、そして／または再発時に、ＣＤＡＩを算出することとし、Ｃ反応性タンパク質の測定のために採血することとし、糞便試料をとって、糞便のカルプロテクチンレベルを判定することとし、そして維持薬との付着を確認することとする。結腸鏡検査（ｐＣＬＥによる）を手配して、再発した患者において、または１年の終わりに、疾患の内視鏡重篤度を評価することとする。
【０２１１】
第１のエンドポイント
【０２１２】
目的１：セルトリズマブペゴルまたはアダリムマブによる導入治療後の３カ月目に、臨床応答率を判定すること。ここで、臨床応答を、７０を超えるＣＤＡＩの減少と定義する。臨床的寛解を、１５０未満のＣＤＡＩと定義する。バリア機能が正常な患者および障害のある患者（標準のギャップ密度対高いギャップ密度によって示す）の臨床応答および寛解率を、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定を使用して比較することとする。
【０２１３】
目的２：粘膜バリア機能障害の患者におけるセルトリズマブペゴルによる導入治療後の再発率を判定して、これを、１年の追跡調査にわたるそのような機能障害なしの患者の再発率と比較すること。ここで、臨床再発を、１５０を超えるＣＤＡＩと定義し、増大はベースラインから少なくとも６０ポイントである。バリア機能が正常な患者および障害のある患者の再発率を、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定を使用して比較することとする。
【０２１４】
第２のエンドポイント
【０２１５】
目的１：セルトリズマブペゴルまたはアダリムマブによる導入治療後の１年目に、臨床応答率を判定すること、そして粘膜向上の内視鏡証拠を得ること。セルトリズマブペゴルまたはアダリムマブによって誘導されるバリア機能および微生物種の変化を探究することとする。バリア機能が正常な患者および障害のある患者の臨床応答と内視鏡的寛解率との相関を評価することとする。
【０２１６】
バリア機能障害の探索分析およびミクロビオーム分析を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ＣｏｌｕｍｂｉａのＢｒｅｔｔ  Ｆｉｎｌａｙ博士と協力して実行することとする。
【０２１７】
目的２：ｐＣＬＥを介して観察した（セルトリズマブペゴルまたはアダリムマブによる導入治療後の）粘膜バリア機能障害を、（ａ）粘膜生検標本、（ｂ）粘膜ミクロビオーム、および（ｃ）バイオマーカーの組織学的評価と相関させること。また、ｐＣＬＥを使用して見られる粘膜構造の形状を、組織学的発見と相関させることとする。
【０２１８】
集団、および対象の数
【０２１９】
目的１について、セルトリズマブペゴル（Ｎ＝３０）に、またはアダリムマブ（Ｎ＝３０）に置く寸前の、中程度から重度の再燃ＣＤ患者を動員することとする。試料サイズの算出は、粘膜バリア機能が正常な患者と障害のある患者との間での５５％の臨床応答率の差異（例えば、２５％対８０％の応答率）の推測に基づいた。第Ｉ種の過誤（α）が０．０５である８０％の統計学的検出力を達成するには、合計３０人の患者（１群あたり１５人）が必要であろう。
【０２２０】
目的２のために、セルトリズマブペゴル治療（Ｎ＝３０）またはアダリムマブ治療（Ｎ＝３０）を受けている、または開始することになっているＣＤ患者を動員することとする。試料サイズの算出は、ＩＢＤの疾患再発の、出願人らの以前の研究から得た結果に基づいた。粘膜バリア機能が正常な患者と障害のある患者との間での５０％の再発率の差異（例えば、１年追跡調査時に、５％対５５％の再発）を検出するのに、合計３０人の患者（１群あたり１５人）が、第Ｉ種の過誤（α）が０．０５である８０％の統計学的検出力を達成するのに必要であろう。
【０２２１】
セルトリズマブ処置の開始前にルーチンの結腸鏡検査を経験するＣＤ患者は、回腸末端部および直腸のｐＣＬＥが、以前の研究のように実行されることとなる。粘膜構造およびバリア機能もまた、ｐＣＬＥによって調査することとする。標準的な結腸鏡検査へのｐＣＬＥの付加は、手順のコストがかかるが、ＣＤにおけるセルトリズマブに対する応答についての結腸鏡検査の予測値を大いに向上させると予想される。粘膜生検および管腔吸引物を、組織学的分析、サイトカイン分析、および微生物分析のために収集することとする。バイオマーカー（Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および糞便カルプロテクチン）もまた、比較目的で分析することとする。
【０２２２】
安全性変数
【０２２３】
研究手順（共焦点レーザー内視鏡）に関係がある有害事象を、研究施設の施設内倫理委員会（ＩＲＢ）に、そして主任調査者に報告することとする。本研究は、臨床的に示されたセルトリズマブペゴル治療に対する応答についての粘膜バリア機能障害の予測値を評価するように設計しているので、データ安全性モニタリング委員会を組織することはない。
【０２２４】
期間
【０２２５】
患者の登録が、およそ１２カ月かかると予想され、追跡調査期間は、１研究患者あたり１２カ月である。ゆえに、総研究期間は、約２４カ月である。データ分析は、もう３カ月かかることとなる。本研究は、２７カ月で完了すると予想される。
【０２２６】
統計学的方法論
【０２２７】
試料サイズの算出
【０２２８】
各目的について３０人（粘膜バリア機能が正常な１５人、およびバリア機能障害の１５人）の患者の研究試料サイズを決定して、目的１および目的２の双方に対処するための８０％の統計学的検出力を実現した。関わった患者が比較的少数であったため、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定を使用して、群の事象率を比較することとする。シミュレーションを通して、各群に１５人の患者がいれば、５５パーセンテージポイントの臨床応答率の差異を検出するおよそ７８％の検出力（目的１）を、そして５％対５５％の再発率の差異を検出する８２％の検出力（目的２）を実現するであると見積もられる（第２の研究エンドポイントは探索的であり、試料サイズ評価の目的で考慮しなかった）。
【０２２９】
統計学的分析
【０２３０】
双方の第１の研究エンドポイントを、２値応答変数（３カ月目の臨床応答および１年目の疾患再発）として表す。上記したように、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定は、２つの粘膜バリア機能群間の割合の比較に最も適切な方法であると予想される。各目的のために、推定オッズ比および９５％の信頼区間を使用して、バリア機能状態と研究エンドポイントとの関連を説明することとする。
【０２３１】
第２の目的１について、臨床応答と内視鏡的寛解との２値転帰間の一致を、２×２表により示すこととする。２つの転帰間の一致を、オッズ比、一致パーセント、およびＣｏｈｅｎのカッパ係数により定量化することとする。これらの分析を、総コホート（Ｎ＝３０）について、そして各粘膜バリア機能群（それぞれＮ＝１５）において別々に、実行することとする。バリア機能状態に関する転帰間の関係の強度の差異を、ロジスティック回帰モデルによって評価することとする。
【０２３２】
第２の目的２について、組織学的評価により、６つの指標のそれぞれについてスコアが０から３に及んで、総スコアが０から１８に及ぶこととなる。これらの個々のスコアおよび総スコアがそれぞれ、ギャップ密度およびＣＬＥによって判定した炎症の程度（０から３にスコア化した）と相関することとなる。全ての比較について、ノンパラメトリック法（特に、Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関およびＳｏｍｅｒｓのＤ、順序の関連性の尺度）を使用して、パラメーター間の一致を説明することとする。
【０２３３】
（実施例３）
【０２３４】
この実施例３の目的は、ＵＣ患者におけるゴリムマブに対する治療応答について、粘膜バリア機能障害の予測値を判定することである。この目的は、バリア機能障害が、抗ＴＮＦ治療に対する応答の強力な予測子であるという出願人らの仮説に基づいている。この仮説は、以下の観察に基づいている：（１）ＩＢＤ患者は、ギャップ密度が高いほど、粘膜炎症誘発性サイトカインレベルが高く（Liu  JJ、Davis  EM、Wine  E、Lou  Y、Rudzinski  JK、Alipour  M、Boulanger  P、Thiesen  AL、Sergi  C、Fedorak  RNら;  Epithelial  cell  extrusion  leads  to  breaches  in  the  intestinal  epithelium.  Inflammatory  bowel  diseases  ２０１３年、１９巻（５号）：９１２〜９２１頁）；（２）クローン病についての生物学的治療に対する最も高い応答率は、手術後の患者において見られ、１年目の内視鏡的寛解率が９０％を超え（Regueiro  M、Schraut  W、Baidoo  L、Kip  KE、Sepulveda  AR、Pesci  M、Harrison  J、Plevy  SE:  Infliximab  prevents  Crohn's  disease  recurrence  after  ileal  resection.  Gastroenterology  ２００９年、１３６巻（２号）：４４１〜４５０頁  e441;  quiz  716）、そして（３）顕著なバリア機能障害が、回腸切除動物モデルにおいて、吻合部にて観察される（未発表の観察）。したがって、バリア機能障害は、ＵＣ患者におけるゴリムマブに対する治療応答の強力な予測子であると予想される。応答率は、ギャップ密度または陽性染色細胞が６〜７％を超える潰瘍性大腸炎患者について、７０から８０％の範囲にあると予想される。
【０２３５】
ＩＢＤ患者におけるＣＬＥによる腸管の分子イメージングの最近の研究は、粘膜ＴＮＦ受容体を発現する患者の選択が、短期臨床応答率を９０％超に向上させ得ることを示した（Atreya  R、Neumann  H、Neufert  C、Waldner  MJ、Billmeier  U、Zopf  Y、Willma  M、App  C、Munster  T、Kessler  Hら:  In  vivo  imaging  using  fluorescent  antibodies  to  tumor  necrosis  factor  predicts  therapeutic  response  in  Crohn's  disease.  Nat  Med  ２０１４年、２０巻（３号）：３１３〜３１８頁）。この結果は、生物学的薬剤に対する応答率を判定する際に粘膜ＴＮＦレベルが果たす役割を強調している。出願人らは以前に、ＩＢＤ患者は、ギャップ密度が高いほど、粘膜生検標本において粘膜炎症誘発性サイトカインレベルが増大することを示した（Liu  JJら、「Epithelial  cell  extrusion  leads  to  breaches  in  the  intestinal  epithelium」、Inflammatory  bowel  diseases  ２０１３年、１９巻（５号）：９１２〜９２１頁）。ゆえに、バリア機能障害があるＵＣ患者は、粘膜ＴＮＦレベルが増大しているので、ゴリムマブに応答する可能性がより高いと仮定することは妥当であろう。詳細には、ゴリムマブに対する短期の、そして長期の臨床応答率を、全ＵＣ患者における５０％から、選択したＵＣ患者、すなわち、バリア機能障害が証明可能な患者における８０％から９０％にまで向上させることが可能である場合がある。生物学的治療と関連したコストおよび複雑化に鑑みて、ＵＣ患者の処置における緊急性および未達成ニーズは、ゴリムマブに有利に応答すると予想される患者を同定することができる予測モデルの開発である。
【０２３６】
第１の研究エンドポイントは、ゴリムマブによる導入治療後３カ月目および１年目の臨床応答／寛解率である。分析を、導入後３カ月目に、すなわち研究開始後２７カ月目に実行することとし、最終分析を、研究開始後３６カ月目に実行することとする。臨床応答を、Ｍａｙｏスコアの引下げが≧３０％かつ≧３ポイントであり、直腸出血サブスコアが≦１であり、または出血サブスコアの減少が≧１であると定義する。臨床的寛解を、Ｍａｙｏスコアが２点であり、あらゆるサブスコアが＞１でないと定義する。
【０２３７】
第２のエンドポイントは、１年目の粘膜向上の内視鏡証拠および組織学的証拠である。内視鏡粘膜の向上を、０または１のＭａｙｏ内視鏡検査サブスコアと定義する。患者を、ＣＬＥによる初期の結腸鏡検査後の１年間、追跡することとする。
【０２３８】
内視鏡所見の、組織学的プロファイル、微生物学的プロファイル、およびサイトカインプロファイルについての粘膜生検との相関を、第２の分析において実行する。
【０２３９】
（実施例４）
【０２４０】
この実施例４において、腸管上皮細胞を含有する生検試料を、炎症性腸疾患に罹患する患者から収集した。生検を行った細胞を、先に述べたように、免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用して、活性化されたカスパーゼ１の発現について染色して、各患者を、機能障害が高い（例えば、活性化されたカスパーゼ１が約４．５％を超える（例えば、約５％から約１０％の発現））患者、または機能障害が中程度である（例えば、活性化されたカスパーゼ１が約１．５％から約４．５％未満である）患者に類別した。
【０２４１】
その後、患者にランダムに、治療有効量の抗ＴＮＦ剤または抗インテグリン剤を投与した。
【０２４２】
詳細には、本研究について、メジアン年齢が４４歳、そしてメジアン疾患期間が７．５年（１年から１８年の範囲）である１２人の患者を分析した。４人の患者は、クローン病を生検により証明し、８人は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を生検により証明した。ＵＣ患者のうち６人を、ゴリムマブ（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｃｏｒｐ．によってＳｉｍｐｏｎｉ（登録商標）の商標で販売されている、ＴＮＦ−アルファに対するモノクローナル抗体）で処置した。ＵＣ患者の１人およびクローン病患者の１人を、ＴＮＦαに対して機能し、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｃｏｒｐ．によってＲｅｍｉｃａｄｅの商標で販売されているキメラモノクローナル抗体、インフリキシマブで処置した。残りの３人のクローン病患者および１人のＵＣ患者を、インテグリンα４β７に結合するモノクローナル抗体であり、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．によってＥｎｔｙｖｉｏ（登録商標）の商標で販売されているベドリズマブ（vedolizamab）で処置した。
【０２４３】
図５は、治療の開始前の、患者の活性化されたカスパーゼレベルを示しており、抗ＴＮＦ治療に有利に応答した患者（「抗ＴＮＦ応答者」）、抗ＴＮＦ治療に有利に応答しなかった患者（「抗ＴＮＦ非応答者」）、および抗インテグリン治療に有利に応答した患者（「抗インテグリン応答者」）の列に区切っている。
【０２４４】
図５に示すように、腸管バリア機能障害が重度（活性化されたカスパーゼ１陽性細胞が、約５％から約１０％）であった患者は、抗ＴＮＦ剤による治療によく応答した。腸管バリア機能障害が中程度（活性化されたカスパーゼ１陽性細胞が、約１％から４％）であった患者は、抗ＴＮＦ剤に有益に応答しなかった（「抗ＴＮＦ非応答者」）。抗ＴＮＦ剤に応答しなかった、腸管バリア機能障害が中程度の患者について、何人かを抗インテグリン剤（ベドリズマブ）でその後処置すると、有利に応答した（図５における「抗インテグリン応答者」参照）。
【０２４５】
生物学的治療を受けている１２人の患者についての最低でも６カ月の臨床追跡調査（６から１８カ月の範囲）により、抗ＴＮＦ剤を受けている、バリア機能障害が重度の４人の患者のうち４人が、臨床的寛解にあった；抗ＴＮＦ剤を受けている、バリア機能障害が軽度から中程度の４人の患者は、引き続き軽度から中程度の重篤度の臨床症候であった；しかしながら、抗インテグリン治療を受けている、バリア機能障害が軽度から中程度の４人の患者は全員、臨床的寛解を達成した。ここで、潰瘍性大腸炎についての臨床的寛解は、部分的Ｍａｙｏスコアが２点未満であり、あらゆるサブスコアが＞１でないと定義され；クローン病について、寛解は、Ｈａｒｖｅｙ−Ｂｒａｄｓｈａｗ  Ｉｎｄｅｘ（ＨＢＩ）が５未満であると定義される。
【０２４６】
図５にデータを示す全ての患者は、抗ＴＮＦ剤で始めた（図５における左および中央の列を参照）。抗ＴＮＦ治療に応答しなかった患者について、抗ＴＮＦ剤を受けながら、結腸鏡検査をここでも実行すると、依然として中程度のバリア機能障害を示した。患者を、ベドリズマブ（インテグリンα４β７に結合する抗インテグリン剤）で処置すると、有利に応答した（図５の一番右の列を参照）。
【０２４７】
先で記載した本発明の実施形態は、単なる例示であることが意図される；多数の変形および変更が、当業者に明らかである。そのような変形および変更は全て、添付の特許請求の範囲のいずれかにおいて定義する本発明の範囲内にあることが意図される。
【０２４８】
特許請求の範囲
【図１】
2019508395.tif 000003
【図２】
2019508395.tif 000004
【図３Ａ】
2019508395.tif 000005
【図３Ｂ】
2019508395.tif 000006
【図４】
2019508395.tif 000007
【図５】
2019508395.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月3日(2018.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性腸疾患の患者を処置するための組成物であって、前記組成物は、薬剤を含み、前記患者は、前記状態が重度の機能障害であるか中程度の機能障害であるかを判定するために、腸管バリアの状態が分析され：
（ｉ）前記患者が重度の機能障害を有すると同定される場合、前記薬剤が、抗ＴＮＦ剤、抗ＩＬ−１２／２３剤、および抗ＴＮＦ剤と抗ＩＬ−１２／２３剤との組合せからなる群から選択され、
（ｉｉ）前記患者が中程度の機能障害を有すると同定される場合、前記薬剤が、抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤、ならびに抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、およびスフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤の２つまたはそれより多くの組合せからなる群から選択される、組成物。
【請求項２】
前記腸管バリアの前記状態が、前記腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量を測定することによって分析される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記活性化されたカスパーゼが、活性化されたカスパーゼ１、もしくは活性化されたカスパーゼ３、または活性化されたカスパーゼ１および活性化されたカスパーゼ３の組合せである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記活性化されたカスパーゼが、活性化されたカスパーゼ１の発現の量の、活性化されたカスパーゼ３の発現の量に対する比率である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記患者における前記活性化されたカスパーゼ発現の量が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量と比較して約４倍から約７倍増大していることが、前記患者の状態が重度の機能障害であることを示す、請求項２、３、または４に記載の組成物。
【請求項６】
前記患者における前記活性化されたカスパーゼ発現の量が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量と比較して約２倍から約４倍増大していることが、前記患者の状態が中程度の機能障害であることを示す、請求項２、３、または４に記載の組成物。
【請求項７】
前記腸管バリアの前記状態が、前記腸管バリアでの腸管表面の組織学的染色において、ギャップの数を計数することによって分析される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記患者におけるギャップの数が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアでの腸管表面におけるギャップの数と比較して約４倍から約７倍増大していることが、前記患者の状態が重度の機能障害であることを示す、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記患者におけるギャップの数が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアでの腸管表面におけるギャップの数と比較して約２倍から約４倍増大していることが、前記患者の状態が中程度の機能障害であることを示す、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記腸管バリアの前記状態が、前記腸管バリアの共焦点レーザー内視鏡観察または多光子共焦点顕微鏡観察を使用して分析される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗ＴＮＦ剤が、アダリムマブ、インフリキシマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、エタネルセプト、およびアプレミラストからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗ヤーヌスキナーゼ剤が、トファシチニブである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗ＩＬ−１２／２３剤が、ウステキヌマブである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤が、オザニモドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗インテグリン剤が、ベドリズマブ、ナタリズマブ、およびエトロリズマブからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記炎症性腸疾患が、クローン病、潰瘍性大腸炎、不確定の大腸炎、および化学療法によって誘導された大腸炎からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
腸管バリアの状態を、炎症性腸疾患の患者を処置するのに有益な薬剤の指標とする方法であって、患者の状態を、前記患者において分析された腸管バリアの状態に基づいて重度の機能障害または中程度の機能障害に類別することを含み、
患者の状態が重度の機能障害であると類別された患者が、抗ＴＮＦ剤、抗ＩＬ−１２／２３剤、および抗ＴＮＦ剤と抗ＩＬ−１２／２３剤との組合せからなる群から選択される薬剤による処置から利益を得ると予想される患者と同定され、患者の状態が中程度の機能障害であると類別された患者が、抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤、ならびに抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、およびスフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤の２つまたはそれより多くの組合せからなる群から選択される薬剤による処置から利益を得ると予想される患者と同定される、方法。
【請求項１８】
炎症性腸疾患の患者における腸管バリアの状態を、処置のために選択される薬剤の指標とする方法であって、前記状態が、重度の機能障害または中程度の機能障害であり、
前記状態が重度の機能障害であると同定される場合、前記薬剤が、抗ＴＮＦ剤、抗ＩＬ−１２／２３剤、および抗ＴＮＦ剤と抗ＩＬ−１２／２３剤との組合せからなる群から選択され、
前記状態が中程度の機能障害であると同定される場合、前記薬剤が、抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤、ならびに抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、およびスフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤の２つまたはそれより多くの組合せからなる群から選択される、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明の種々の態様の一部の実施形態では、前記抗ＴＮＦ剤は、アダリムマブ、インフリキシマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、エタネルセプト、およびアプレミラストからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記抗ヤーヌスキナーゼ剤は、トファシチニブである。一部の実施形態では、前記抗ＩＬ−１２／２３剤は、ウステキヌマブである。一部の実施形態では、前記スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤は、オザニモドまたはフィンゴリモドである。一部の実施形態では、前記抗インテグリン剤は、ベドリズマブ、ナタリズマブ、およびエトロリズマブからなる群から選択される。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
炎症性腸疾患の患者を処置するのに有益な薬剤を同定する方法であって：
（ａ）患者の状態を得るために、前記患者における腸管バリアの状態を分析することと；
（ｂ）前記患者の状態を重度の機能障害または中程度の機能障害に類別することと
を含み、
患者の状態が重度の機能障害であると類別された患者が、抗ＴＮＦ剤、抗ＩＬ−１２／２３剤、および抗ＴＮＦ剤と抗ＩＬ−１２／２３剤との組合せからなる群から選択される薬剤による処置から利益を得ると予想される患者と同定され、患者の状態が中程度の機能障害であると類別された患者が、抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤、ならびに抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、およびスフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤の２つまたはそれより多くの組合せからなる群から選択される薬剤による処置から利益を得ると予想される患者と同定される、方法。
（項目２）
炎症性腸疾患の患者における腸管バリアの状態を同定する方法であって、前記状態が、重度の機能障害または中程度の機能障害であり、腸管バリアの前記状態を分析することを含み、
前記状態が重度の機能障害であると同定される場合、前記方法がさらに、前記患者を、抗ＴＮＦ剤、抗ＩＬ−１２／２３剤、および抗ＴＮＦ剤と抗ＩＬ−１２／２３剤との組合せからなる群から選択される薬剤で処置することを含み、
前記状態が中程度の機能障害であると同定される場合、前記方法がさらに、前記患者を、抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤、ならびに抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、およびスフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤の２つまたはそれより多くの組合せからなる群から選択される薬剤で処置することを含む、方法。
（項目３）
炎症性腸疾患の患者を処置する方法であって、
（ａ）前記状態が重度の機能障害であるか中程度の機能障害であるかを判定するために、腸管バリアの状態を分析することと；
（ｂ）前記患者を薬剤で処置することと
を含み：
（ｉ）前記患者が重度の機能障害を有すると同定される場合、前記薬剤が、抗ＴＮＦ剤、抗ＩＬ−１２／２３剤、および抗ＴＮＦ剤と抗ＩＬ−１２／２３剤との組合せからなる群から選択され、
（ｉｉ）前記患者が中程度の機能障害を有すると同定される場合、前記薬剤が、抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤、ならびに抗インテグリン剤、抗ヤーヌスキナーゼ剤、およびスフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤の２つまたはそれより多くの組合せからなる群から選択される、方法。
（項目４）
前記腸管バリアの前記状態が、前記腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量を測定することによって分析される、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目５）
前記活性化されたカスパーゼが、活性化されたカスパーゼ１、もしくは活性化されたカスパーゼ３、または活性化されたカスパーゼ１および活性化されたカスパーゼ３の組合せである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記活性化されたカスパーゼが、活性化されたカスパーゼ１の発現の量の、活性化されたカスパーゼ３の発現の量に対する比率である、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記患者における前記活性化されたカスパーゼ発現の量が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量と比較して約４倍から約７倍増大していることが、前記患者の状態が重度の機能障害であることを示す、項目４、５、または６に記載の方法。
（項目８）
前記患者における前記活性化されたカスパーゼ発現の量が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量と比較して約２倍から約４倍増大していることが、前記患者の状態が中程度の機能障害であることを示す、項目４、５、または６に記載の方法。
（項目９）
前記腸管バリアの前記状態が、前記腸管バリアでの腸管表面の組織学的染色において、ギャップの数を計数することによって分析される、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目１０）
前記患者におけるギャップの数が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアでの腸管表面におけるギャップの数と比較して約４倍から約７倍増大していることが、前記患者の状態が重度の機能障害であることを示す、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記患者におけるギャップの数が、１人または複数の健康なボランティアの腸管バリアでの腸管表面におけるギャップの数と比較して約２倍から約４倍増大していることが、前記患者の状態が中程度の機能障害であることを示す、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記腸管バリアの前記状態が、前記腸管バリアの共焦点レーザー内視鏡観察または多光子共焦点顕微鏡観察を使用して分析される、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目１３）
前記抗ＴＮＦ剤が、アダリムマブ、インフリキシマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、エタネルセプト、およびアプレミラストからなる群から選択される、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目１４）
前記抗ヤーヌスキナーゼ剤が、トファシチニブである、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目１５）
前記抗ＩＬ−１２／２３剤が、ウステキヌマブである、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目１６）
前記スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト剤が、オザニモドである、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目１７）
前記抗インテグリン剤が、ベドリズマブ、ナタリズマブ、およびエトロリズマブからなる群から選択される、項目１、２、または３に記載の方法。
（項目１８）
前記炎症性腸疾患が、クローン病、潰瘍性大腸炎、不確定の大腸炎、および化学療法によって誘導された大腸炎からなる群から選択される、項目１、２、または３に記載の方法。
【国際調査報告】
2019508395.tif 000009
2019508395.tif 000010