(57)【要約】本発明のペプチドは、脂肪蓄積を抑制し、既に蓄積された脂肪を分解することで、抗肥満効果を示すだけでなく、血糖を効果的に減少させて糖尿病に対して優れた効果を示す。本発明のペプチドは、脂質生成標識因子であるＰＰＡＲγ、ＡＣＣ、および／またはａＰ２の発現の減少させ、脂肪分解因子であるｐＨＳＬ、ＡＭＰＫ‐α１、ＣＧＩ‐５８、および／またはＡＴＧＬの発現を増加させて、脂肪細胞の大きさおよび血中コレステロール数値を減少させる。本発明のペプチドの優れた活性および安定性は、医薬および医薬外品に非常に有利に適用可能である。
2019533680.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
抗肥満または抗糖尿病活性を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｎ‐末端に、アセチル基（ａｃｅｔｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、フルオレニルメトキシカルボニル基（ｆｌｕｏｒｅｏｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、ホルミル基（ｆｏｒｍｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、パルミトイル基（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、ミリスチル基（ｍｙｒｉｓｔｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、ステアリル基（ｓｔｅａｒｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、およびポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ；ＰＥＧ）からなる群から選択される保護基が結合している、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｃ‐末端に、ヒドロキシ基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｇｒｏｕｐ、‐ＯＨ）、アミノ基（ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐ、‐ＮＨ２）、またはアジド（ａｚｉｄｅ、‐ＮＨＮＨ２）が結合している、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
ＰＰＡＲγ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ）、ＡＣＣ（Ａｃｅｔｙｌ‐ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、およびａＰ２（ａｄｉｐｏｓｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）からなる群から選択される１種以上の脂質生成標識因子の発現を減少させる、請求項２に記載のペプチド。
【請求項６】
ｐＨＳＬ（ｐｈｏｓｐｈｏ‐ｈｏｒｍｏｎｅ‐ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｌｉｐａｓｅ）、ＡＭＰＫ‐α１（ＡＭＰ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  α１）、ＣＧＩ‐５８（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ‐５８）、およびＡＴＧＬ（Ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｌｉｐａｓｅ）からなる群から選択される１種以上の脂肪分解因子の発現を増加させる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
脂肪分解を増加させる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
脂質生成を抑制する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
血糖を減少させる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
脂肪細胞の大きさを減少させる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
血中コレステロールを減少させる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１２】
配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種以上のペプチドを有効成分として含む、肥満の予防または治療用医薬組成物。
【請求項１３】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種以上のペプチドをさらに含む、請求項１２に記載の肥満の予防または治療用医薬組成物。
【請求項１４】
配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種以上のペプチドを有効成分として含む、糖尿病の予防または治療用医薬組成物。
【請求項１５】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種以上のペプチドをさらに含む、請求項１４に記載の糖尿病の予防または治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗肥満および抗糖尿病効能を有するペプチド、並びにその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、韓国では、経済成長および食生活の西欧化により食物から得る脂肪分の摂取量が増加しており、運動不足などにより、肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化症、および脂肪肝などのような代謝性疾患が増加している傾向にある。また、肥満は、若者にとって、痩せ体型を好む美容上の外見を損なうだけでなく、肥満の持続により、種々の疾患が取り扱われている。
【０００３】
現在、肥満を治療する治療剤は、中枢神経系に作用して食欲に影響を与える薬剤と、胃腸管に作用して吸収を阻害する薬物と、に大別される。中枢神経系に作用する薬物としては、それぞれの機序によって、セロトニン（５‐ＨＴ）神経系を阻害するフェンフルラミン、デクスフェンフルラミンなどの薬物、ノルアドレナリン神経系を介したエフェドリンおよびカフェインなどの薬物、および近年は、セロトニンおよびノルアドレナリン神経系に同時に作用して肥満を阻害するシブトラミンなどの薬物が市販されている。その他にも、胃／腸管に作用して肥満を阻害する薬物であって、腸管リパーゼを阻害して脂肪の吸収を減らす肥満治療剤として許可されたオルリスタートなどが代表的な薬物として用いられている。
【０００４】
しかしながら、従来に用いられてきた薬物のうち、フェンフルラミンなどの薬物は、その副作用により、原発性肺高血圧や心臓弁膜病変を引き起こし、最近使用が禁止されており、他の薬物も、血圧減少や乳酸血症などの問題が発生し、心不全、腎臓疾患などの患者には使用できないという問題がある。
【０００５】
糖尿病は、インスリンの分泌量が足りないか、正常な機能がなされないなどの代謝疾患の一種であって（ＤｅＦｒｏｎｚｏ、１９８８）、血中ブドウ糖の濃度が高くなる高血糖を特徴とし、高血糖によって種々の症状および徴候を引き起こし、小便にブドウ糖を排出することになる疾患である。近年、肥満率、特に、腹部肥満の増加により、糖尿病の発生率が爆発的に増加している傾向にある。
【０００６】
糖尿病患者の数は、２０００年に全世界的に１億７千万名と評価されており、２０３０年には３億７千万名に達すると予想されていたが、最近の分析によると、２００８年に既に全世界的に約３億５千万名に達したと報告され、予想よりも遥かに深刻な水準である（Ｄａｎａｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。２型糖尿病患者の約８０％以上が肥満であるのに比べて、肥満患者のただ１０％未満のみが糖尿病であると報告されている（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。
【０００７】
かかる糖尿病と肥満の連関性は、アディポカイン（ａｄｉｐｏｋｉｎｅ）と遊離脂肪酸（ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ）の不規則的な分泌により、脂肪酸がベータ細胞や腎臓、肝、心臓などのインスリン敏感性組織内に蓄積されて脂肪毒性（ｌｉｐｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を示すためである。慢性的な高血糖状態で適切な治療が行われないと、身体で種々の病的症状が伴われるが、代表的なものが網膜病症、腎機能障害、神経病症、血管障害などであって、これらによる合併症を予防するためには、効果的な血糖管理が必須である。
【０００８】
現在、血糖を調節する方法としては、生活習慣の矯正（食餌療法、運動療法）および薬物療法などが用いられている。しかし、食餌療法や運動療法は厳格な管理および実施が困難であり、その効果においても限界がある。したがって、殆どの糖尿病患者は、生活習慣の矯正とともに、インスリン、インスリン分泌促進剤、インスリン感受性改善剤、および血糖降下剤などの薬物による血糖調節に依存している。
【０００９】
組換え方法により生産されているインスリンは、１型糖尿病患者や、血糖が調節されない２型糖尿病患者において必須な薬物であって、血糖の調節においては有利であるが、注射針に対する拒否感、投与方法の困難性、低血糖の危険、そして体重増加などの欠点を有している。
【００１０】
インスリン分泌促進剤の一種であるメグリチニド系は、薬効が非常に速い製剤であって、食前に服用し、ノボナム（レパグリニド）、ファスティック（ナテグリニド）、グルファスト（ミチグリニド）などがある。インスリン感受性改善剤は、単独で服用時に低血糖が殆どないことが特徴であり、ビグアナイド（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）系薬物であるメトフォルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）、チアゾリジンジオン（ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ）系のアバンディア（ロシグリタゾン）、アクトス（ピオグリタゾン）などがある。
【００１１】
最近開発されている薬物としては、インスリン分泌を促進させるホルモンであるグルカゴン様ペプチド‐１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ‐ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ‐１）の作用を利用して開発されたＧＬＰ‐１アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）が挙げられ、エキセナチド（ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）とビクトーザ（ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）がこれに該当する。また、ＧＬＰ‐１を速かに不活性化させる酵素であるＤＰＰ‐４（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ‐４）の作用を抑制するＤＰＰ‐４抑制剤（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）も最近開発された新薬であり、ジャヌビア（成分名：シタクリプチン（ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ））が代表的である。
【００１２】
しかしながら、これらの薬剤は、肝毒性、胃膓障害、心血関系疾患、および発癌性などの副作用が報告されており、年間治療費用も高いため、糖尿病の治療において障害となっている。実際に、前糖尿病（ｐｒｅ‐ｄｉａｂｅｔｅｓ）および糖尿病関連費用は、２００７年を基準として米国のみで約２００兆ウォンに肉薄し（Ｄａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、肥満関連費用も２００８年を基準として米国のみで１５０兆ウォンに肉薄する（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。したがって、体重を減少させ、血糖を効果的に低めることで、糖尿病および肥満性糖尿病の治療の両方に使用でき、且つ副作用の少ない薬剤の開発が至急な状況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
そこで、本発明者らは、肥満治療のためのより改善された方法を見出すために、近年、エネルギー代謝を調節する機序に関心を持ち、こちらの系の化合物がより高い安全性（低い毒性）を有しなければならないということを前題に、ヒトが高脂肪食餌を摂取した時に脂肪として蓄積されるシグナルと、脂肪の蓄積に影響を与えるタンパク質に関する研究を行い、かかる脂肪蓄積に関与するタンパク質の発現を抑制し、既に蓄積された脂肪を分解させるためのシグナルおよび関与タンパク質の研究により、脂肪分解を促進するペプチドを開発するに至った。
【００１４】
そこで、本発明の目的は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドを提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、抗肥満または抗糖尿病活性を有する、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドを提供することにある。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種以上のペプチドを含む、肥満の予防および／または治療用医薬組成物を提供することにある。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種以上のペプチドを含む、糖尿病の予防および／または治療用医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、生物学的に有効な活性を有する多数の優れたペプチドを開発するために鋭意努力した結果、配列番号１〜配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドが、高脂肪食餌により誘導された脂肪蓄積を抑制し、既に蓄積された脂肪を分解して抗肥満効果を示すだけでなく、糖尿病、肥満性糖尿病、および糖尿病合併症に対して優れた予防および／または治療効果を示すということを糾明することにより、本発明を完成した。
【００１９】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００２０】
本発明の一態様は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドに関する。
【００２１】
本発明の他の態様は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなる抗肥満および／または抗糖尿病活性を有するペプチドに関する。
【００２２】
前記ペプチドは、アミノ酸配列の一部部位を選定し、その活性を増加させるために、Ｎ‐末端および／またはＣ‐末端の変形が誘導されたものであってもよい。このようなＮ‐末端および／またはＣ‐末端の変形により、本発明のペプチドの安定性を著しく向上させることができ、例えば、ペプチドの生体内への投与時に、半減期を増加させることができる。
【００２３】
前記Ｎ‐末端の変形は、ペプチドのＮ‐末端に、アセチル基（ａｃｅｔｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、フルオレニルメトキシカルボニル基（ｆｌｕｏｒｅｏｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、ホルミル基（ｆｏｒｍｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、パルミトイル基（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、ミリスチル基（ｍｙｒｉｓｔｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、ステアリル基（ｓｔｅａｒｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、およびポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ；ＰＥＧ）からなる群から選択される保護基が結合したものであってもよい。前記保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。
【００２４】
前記Ｃ‐末端の変形は、ペプチドのＣ‐末端に、ヒドロキシ基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｇｒｏｕｐ、‐ＯＨ）、アミノ基（ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐ、‐ＮＨ２）、アジド（ａｚｉｄｅ、‐ＮＨＮＨ２）などが結合したものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００２５】
本発明の一態様によると、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドは、高脂肪食餌により誘導された脂肪蓄積を抑制し、既に蓄積された脂肪を分解する効果を奏する。
【００２６】
また、前記ペプチドは、脂質生成標識因子であるＰＰＡＲγ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ）、ＡＣＣ（Ａｃｅｔｙｌ‐ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、および／またはａＰ２（ａｄｉｐｏｓｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ‐ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）の発現を減少させる。
【００２７】
また、前記ペプチドは、脂肪分解因子であるｐＨＳＬ（ｐｈｏｓｐｈｏ‐ｈｏｒｍｏｎｅ‐ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｌｉｐａｓｅ）、ＡＭＰＫ‐α１（ＡＭＰ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  α１）、ＣＧＩ‐５８（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ‐５８）、および／またはＡＴＧＬ（Ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｌｉｐａｓｅ）の発現を増加させ、脂肪細胞の大きさを減少させる。
【００２８】
また、前記ペプチドは、脂肪分解の増加、脂質生成の抑制、血糖の減少、脂肪細胞の大きさの減少、血中コレステロール数値の減少という効果がある。
【００２９】
このような結果は、本発明のペプチドが、肥満、糖尿病、および肥満性糖尿病の治療において非常に優れた効能を有するということを意味する。
【００３０】
本発明によると、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドは、それぞれ配列番号３または配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチドのＳｅｒがＣｙｓで置換されたものであって、ペプチドとしてのこれらの抗肥満および／または抗糖尿病活性は略同様である。
【００３１】
本発明のさらに他の態様は、配列番号１〜配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドの２種以上を含む、抗肥満および／または抗糖尿病活性を有するペプチド複合体に関する。
【００３２】
前記ペプチド複合体は、配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドの１種以上を含み、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドの１種以上をさらに含んでもよい。
【００３３】
例えば、前記ペプチド複合体は、下記のようなペプチドの組み合わせであってもよい：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド；および
（ｃ）配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列からなるペプチド。
【００３４】
また、前記ペプチド複合体は、下記のようなペプチドの組み合わせであってもよい：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド；および
（ｃ）配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列からなるペプチド。
【００３５】
本発明のペプチドは、配列番号１〜配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドだけでなく、これらの複合体も、優れた抗肥満および抗糖尿病活性を示す。
【００３６】
本発明のさらに他の態様は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種以上を有効成分として含む、肥満の予防または治療用医薬組成物に関する。
【００３７】
前記ペプチドは、脂肪の生成を抑制し、脂質を分解する機能に著しく優れ、肥満の予防および／または治療に用いられることができる。
【００３８】
前記肥満の予防および／または治療用医薬組成物は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種以上のペプチドをさらに含んでもよい。
【００３９】
本発明のさらに他の態様は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種以上を有効成分として含む、糖尿病の予防および／または治療用医薬組成物に関する。
【００４０】
前記ペプチドは、糖尿病動物モデルで、増加された血糖を効果的に減少させる効能を示し、糖尿病の予防および／または治療に用いられることができる。
【００４１】
前記糖尿病の予防および／または治療用医薬組成物は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される１種以上のペプチドをさらに含んでもよい。
【００４２】
本発明の好ましい態様によると、前記肥満または糖尿病の予防または治療用医薬組成物は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドの薬学的有効量；および薬学的に許容される担体；を含んでもよい。
【００４３】
前記薬学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない。
【００４５】
適した薬学的に許容される担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【００４６】
前記医薬組成物は、経口または非経口、好ましくは非経口で投与することができ、非経口投与の場合は、筋肉注入、静脈内注入、皮下注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などで投与してもよいが、これに限定されるものではない。
【００４７】
前記医薬組成物の投与量は、１日当たり０．０００１〜１０００ｕｇ（マイクログラム）、０．００１〜１０００ｕｇ、０．０１〜１０００ｕｇ、０．１〜１０００ｕｇ、または１．０〜１０００ｕｇであってもよいが、これに限定されるものではなく、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度、および反応感応性などのような要因によって多様に処方可能である。
【００４８】
前記医薬組成物は、当該発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化することで、単位用量形態で製造されるか、または多用量容器中に納めて製造されてもよい。
【００４９】
前記剤型は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤および／または安定化剤をさらに含んでもよい。
【００５０】
本明細書において用語「ペプチド」は、ペプチド結合によってアミノ酸残基が互いに結合されて形成された直鎖状の分子を意味する。本発明のペプチドは、当業界で公知の化学的合成方法、特に、固相合成技術（ｓｏｌｉｄ‐ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９‐５４（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ．ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１（１９８４））または液相合成技術（ＵＳ登録特許第５，５１６，８９１号）により製造されてもよい。
【００５１】
本明細書において用語「安定性」は、インビボ安定性だけでなく、保存安定性（例えば、常温保存安定性）も含む意味である。
【００５２】
本明細書において用語「薬学的有効量」は、上述のペプチドの効能または活性を達成するのに十分な量を意味する。
【発明の効果】
【００５３】
本発明は、抗肥満および抗糖尿病効能を有するペプチド、およびそれを含む肥満または糖尿病の予防または治療用組成物に関し、本発明のペプチドは、糖尿病および肥満性糖尿病において顕著な効能を示す。高脂肪食餌により誘発される脂肪蓄積または肝や筋肉などの脂肪蓄積により現れるインスリンのシグナルの抑制、およびそれにより誘発されるインスリンの耐性が糖尿病の原因となるが、本発明のペプチドは、このような糖尿病および肥満性糖尿病の予防または治療用途に用いられることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１ａ】本発明の一実施例による配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを処理した時に、蓄積された脂肪をオイルレッドＯ染色により確認した結果である。
【図１ｂ】本発明の一実施例による配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドを処理した時に、蓄積された脂肪をオイルレッドＯ染色により確認した結果である。
【図２ａ】本発明の一実施例によるペプチド複合体を濃度毎に処理した時に、蓄積された脂肪を確認するためにオイルレッドＯ染色により確認した結果グラフである。
【図２ｂ】本発明の一実施例によるペプチド複合体を濃度毎に処理した時に、蓄積された脂肪を確認するためにオイルレッドＯ染色により確認した結果写真である。
【図３ａ】本発明の一実施例による配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを処理した時に、脂肪の生成に関与する遺伝子であるａＰ２の発現量を測定した結果である。
【図３ｂ】本発明の一実施例による配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドを処理した時に、脂肪の生成に関与する遺伝子であるａＰ２の発現量を測定した結果である。
【図４】本発明の一実施例によってペプチド複合体を濃度毎に処理した時に、脂質合成時における重要な遺伝子であるＰＰＡＲγ、ＡＣＣ、ａＰ２遺伝子の発現量を測定した結果である。
【図５ａ】本発明のペプチド複合体を濃度毎に処理した時に、脂質合成時における重要なタンパク質であるＰＰＡＲγ、および脂質分解時における重要なタンパク質であるｐｈｏｓｐｈｏ‐ＨＳＬタンパク質の発現量を測定した結果である。
【図５ｂ】本発明のペプチド複合体を濃度毎に処理した時に、脂質合成時における重要なタンパク質であるＰＰＡＲγタンパク質の発現量を測定した結果グラフである。
【図５ｃ】本発明のペプチド複合体を濃度毎に処理した時に、脂質分解時における重要なタンパク質であるｐｈｏｓｐｈｏ‐ＨＳＬタンパク質の発現量を測定した結果グラフである。
【図６ａ】本発明の一実施例による配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを処理した時に、蓄積された脂肪を分解する過程に関与する遺伝子であるＡＭＰＫ‐α１とＣＧＩ５８の発現量を測定した結果である。
【図６ｂ】本発明の一実施例による配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドを処理した時に、蓄積された脂肪を分解する過程に関与する遺伝子であるＡＭＰＫ‐α１とＣＧＩ５８の発現量を測定した結果である。
【図６ｃ】本発明の一実施例によるペプチド複合体を処理した時に、蓄積された脂肪を分解する過程に関与する遺伝子であるＡＭＰＫ‐α１とＣＧＩ５８の発現量を測定した結果である。
【図７ａ】本発明のペプチド複合体を濃度毎に処理した時に、蓄積された脂肪を分解する過程に関与するタンパク質であるＡＴＧＬの発現量を測定した結果写真である。
【図７ｂ】本発明のペプチド複合体を濃度毎に処理した時に、蓄積された脂肪を分解する過程に関与するタンパク質であるＡＴＧＬの発現量を測定した結果グラフである。
【図８ａ】本発明の一実施例による配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを処理した時に、蓄積された脂肪を分解する過程に関与するタンパク質であるＰｈｏｓｐｈｏ‐ＨＳＬの発現量を免疫染色により測定した結果である。
【図８ｂ】本発明の一実施例による配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドを処理した時に、蓄積された脂肪を分解する過程に関与するタンパク質であるＰｈｏｓｐｈｏ‐ＨＳＬの発現量を免疫染色により測定した結果である。
【図８ｃ】本発明の一実施例によるペプチド複合体を処理した時に、蓄積された脂肪を分解する過程に関与するタンパク質であるＰｈｏｓｐｈｏ‐ＨＳＬの発現量を免疫染色により測定した結果である。
【図９】本発明のペプチド複合体を濃度毎に処理した時に、グリセロールの生成量を測定した結果である。
【図１０ａ】本発明のペプチド複合体を肥満マウス実験モデルに濃度毎に処理した後、分解される脂肪組織を測定した結果である。
【図１０ｂ】本発明のペプチド複合体を肥満マウス実験モデルに処理した後、分解される脂肪組織の大きさおよび数値を測定した結果である。
【図１１】本発明のペプチド複合体を処理した時に、蓄積された脂肪を分解する過程に関与するタンパク質であるＰｈｏｓｐｈｏ‐ＨＳＬの発現量を免疫染色により測定した結果である。
【図１２】本発明のペプチド複合体を処理した時に、肥満マウスにおける体重変化（ａ）および飼料摂取変化（ｂ）を測定した結果である。
【図１３】本発明のペプチド複合体を処理した時に、肥満マウスの姿を測定した結果である。
【図１４】実験動物モデルであるＣ５７ＢＬ／６マウスモデルに脂っこい飼料を摂取させて肥満マウスモデルを作製し、本発明のペプチド複合体を処理した後、マイクロＣＴ撮影により脂肪の分布を測定した結果である。
【図１５】実験動物モデルであるＣ５７ＢＬ／６マウスモデルに脂っこい飼料を摂取させて肥満マウスモデルを作製し、本発明のペプチド複合体を処理した後、脂肪細胞組織を採取して観察した結果である。
【図１６ａ】実験動物モデルであるＣ５７ＢＬ／６マウスモデルに脂っこい飼料を摂取させて肥満マウスモデルを作製し、本発明のペプチド複合体を処理した後、脂肪細胞組織を採取して脂肪細胞の形状を観察した結果である。
【図１６ｂ】実験動物モデルであるＣ５７ＢＬ／６マウスモデルに脂っこい飼料を摂取させて肥満マウスモデルを作製し、本発明のペプチド複合体を処理した後、脂肪細胞組織を採取して脂肪細胞の大きさを観察した結果である。
【図１６ｃ】実験動物モデルであるＣ５７ＢＬ／６マウスモデルに脂っこい飼料を摂取させて肥満マウスモデルを作製し、本発明のペプチド複合体を処理した後、脂肪細胞組織を採取して脂肪細胞の大きさを観察した結果グラフである。
【図１７】実験動物モデルであるＣ５７ＢＬ／６マウスモデルに脂っこい飼料を摂取させて肥満マウスモデルを作製し、本発明のペプチド複合体を処理した後、脂肪細胞組織を採取して脂肪細胞中の脂肪分解に作用するタンパク質であるｐｈｏｓｐｈｏ‐ＨＳＬの発現量を観察した結果である。
【図１８】実験動物モデルであるＣ５７ＢＬ／６マウスモデルに脂っこい飼料を摂取させて肥満マウスモデルを作製し、本発明のペプチド複合体を処理した後、血液を採取してコレステロールの量を測定した結果である。
【図１９】実験動物モデルであるＣ５７ＢＬ／６マウスモデルに脂っこい飼料を摂取させて肥満マウスモデルを作製し、本発明のペプチド複合体を処理した後、血液を採取して血糖を測定した結果である。
【図２０】糖尿病が誘発されたｄｂ／ｄｂマウスモデルに本発明のペプチド複合体を処理した後、血液を採取して血糖の変化を測定した結果である。
【図２１】糖尿病が誘発されたｄｂ／ｄｂマウスモデルに本発明のペプチド複合体を処理した後、血液を採取してコレステロールの変化を測定した結果である。
【図２２】本発明の一実施例によって、糖尿病が誘発されたｄｂ／ｄｂマウスモデルに配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを処理した後、血液を採取して血糖の変化を測定した結果である。
【図２３】本発明の一実施例によって、糖尿病が誘発されたｄｂ／ｄｂマウスモデルに配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドを処理した後、血液を採取して血糖の変化を測定した結果である。
【図２４ａ】本発明の一実施例によって、血糖の高い糖尿病患者に本発明のペプチド複合体を処理した後、血液を採取して血糖の変化を測定した結果である。
【図２４ｂ】本発明の一実施例によって、血糖の高い糖尿病患者に本発明のペプチド複合体を処理した後、血液を採取して血糖の変化を測定した結果である。
【図２４ｃ】本発明の一実施例によって、血糖の高い糖尿病患者に本発明のペプチド複合体を処理した後、血液を採取して血糖の変化を測定した結果である。
【図２４ｄ】本発明の一実施例によって、血糖の高い糖尿病患者に本発明のペプチド複合体を処理した後、血液を採取して血糖の変化を測定した結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドに関する。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
以下、本発明を下記の実施例によりさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示するためのものにすぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５７】
実施例
合成例１：ペプチドの合成
クロロトリチルクロリドレジン（Ｃｈｌｏｒｏ  ｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ；ＣＴＬ  ｒｅｓｉｎ、Ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ  Ｎｏ．０１‐６４‐００２１）７００ｍｇを反応容器に入れ、メチレンクロリド（ＭＣ）１０ｍｌを加えて３分間撹拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌを入れて３分間撹拌した後、さらに溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン溶液を入れ、Ｆｍｏｃ‐Ａｓｎ（Ｔｒｔ）‐ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かし、１時間撹拌しながら反応させた。反応後に洗浄し、メタノールとＤＩＥＡ（２：１）をＤＣＭ（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）に溶かして１０分間反応させ、過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を１０ｍｌ入れて３分間撹拌した後、さらに溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピペリジン（Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）／ＤＭＦ）１０ｍｌを反応容器に入れ、１０分間常温で撹拌してから溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れ、さらに１０分間反応を維持した後、溶液を除去し、それぞれ３分ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄してＡｓｎ‐ＣＴＬレジン（Ｒｅｓｉｎ）を製造した。新しい反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れ、Ｆｍｏｃ‐Ａｒｇ（Ｐｂｆ）‐ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ２００ｍｍｏｌｅ、およびＢｏｐ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅのＤＩＥＡを分画で２回にわたって入れた後、全ての固体が溶けるまで少なくとも５分間撹拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を、脱保護されたレジンのある反応容器に入れ、１時間常温で撹拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で３回５分ずつ撹拌してから除去した。少量の反応レジンを取り、カイザーテスト（Ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ  Ｔｅｓｔ）により反応程度を調べた。脱保護溶液で、上記と同様に２回脱保護反応させ、Ａｒｇ‐Ａｓｎ‐ＣＴＬレジンを製造した。ＤＭＦとＭＣで十分に洗浄し、さらに１回カイザーテストを行った後、上記と同様に下記のアミノ酸付着実験を行った。選定されたアミノ酸配列に基づき、Ｆｍｏｃ‐Ｔｈｒ（ｔＢｕ）‐ＯＨ、Ｆｍｏｃ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）‐ＯＨ、およびＦｍｏｃ‐Ｌｅｕ‐ＯＨの順に連鎖反応させた。Ｆｍｏｃ‐保護基を脱保護溶液で１０分ずつ２回反応させた後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔを入れてアセチル化を１時間行った後、製造されたペプチジルレジンをＤＭＦ、ＭＣ、およびメタノールでそれぞれ３回洗浄し、窒素空気をゆっくりと流して乾燥した後、Ｐ２Ｏ５下で真空減圧して完全に乾燥した後、脱漏溶液［トリフルオロ酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）８１．５％、蒸留水５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）５％、フェノール（Ｐｈｅｎｏｌ）５％、ＥＤＴ２．５％、およびＴＩＳ１％］３０ｍｌを入れた後、常温でたまに振りながら反応を２時間維持した。フィルタリングしてレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧により、全体積の半分程度残るように蒸留し、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈殿を誘導した後、遠心分離により沈殿を集め、さらに冷たいエーテルで２回洗浄した。母液を除去し、窒素下で十分に乾燥することで、精製前のＮＨ２‐Ｌｅｕ‐Ｌｙｓ‐Ｔｈｒ‐Ａｒｇ‐Ａｓｎ‐ＣＯＯＨのペプチド（配列番号１）を０．８５ｇ合成（収率：９２％）した。ＮＨ２‐Ｌｙｓ‐Ｇｌｙ‐Ａｌａ‐Ｃｙｓ（Ｓｅｒ）‐Ｔｈｒ‐Ｇｌｙ‐Ｔｒｐ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐ＣＯＯＨ（配列番号２）を０．７８ｇ合成し（収率：８２％）、ＮＨ２‐Ａｌａ‐Ｃｙｓ（Ｓｅｒ）Ｔｈｒ‐Ｌｅｕ‐Ｐｒｏ‐Ｈｉｓ‐Ｐｒｏ‐Ｔｒｐ‐Ｐｈｅ‐Ｃｙｓ（Ｓｅｒ）‐ＣＯＯＨ（配列番号３）を０．９２ｇ合成した（収率：８５％）。ＮＨ２‐Ｃｙｓ（Ｓｅｒ）‐Ａｓｐ‐Ｌｅｕ‐Ａｒｇ‐Ａｒｇ‐Ｌｅｕ‐Ｇｌｕ‐Ｍｅｔ‐Ｔｙｒ‐Ｃｙｓ（Ｓｅｒ）‐ＣＯＯＨ（配列番号４）を０．７６ｇ合成した（収率：８８％）。分子量測定機により測定したところ、配列番号１のペプチドの分子量６３０．７（理論値：６３０．７）、配列番号２のペプチドの分子量９２４．５（理論値：９２４．１）、配列番号３のペプチドの分子量１２３６（理論値：１２３６．５）、配列番号４のペプチドの分子量１３０１．５（理論値：１３０１．５）が得られた。
【００５８】
【表１】
2019533680.tif 000003
【００５９】
一方、それぞれの配列番号１、配列番号３、および配列番号７のアミノ酸配列からなるペプチドを同量で混合してペプチド複合体を作製し、その効能を評価した。
【００６０】
実施例１：脂質生成抑制活性の評価
１‐１．脂肪前駆細胞を用いた脂質蓄積の抑制（オイルレッドＯ染色）
脂肪前駆細胞（ｐｒｅ‐ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）である３Ｔ３‐Ｌ１細胞をＣｏｎｆｌｕｅｎｔ状態まで培養した後、１０ｕｇ／ｍｌのインスリン、０．１ｕＭのデキサメタゾン、および０．５ｕＭのＩＢＭＸが含まれた分化培地に交換、およびペプチドを濃度毎に処理して２日間培養した。その後、２日毎に１０ｕｇ／ｍｌのインスリンが含まれた培地に交換し、１０日間分化を誘導した後、細胞中の滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）の生成を確認するために、オイルレッドＯ染色を行った。
【００６１】
準備された３Ｔ３‐Ｌ１脂肪前駆細胞をＰＢＳで洗浄した後、３．７％のホルマリンで１時間固定し、６０％のイソプロパノールを用いて洗浄してからオイルレッドＯ溶液を処理し、室温で２０分間染色した。染色後、オイルレッドＯ溶液を除去し、蒸留水で３回洗浄した後、染色された細胞を位相差顕微鏡で観察し、その結果を図１ａおよび図１ｂに示した。また、定量分析のために、１００％のイソプロパノールを用いて脂肪を抽出した後、９６ウェルプレートに２００ｕｌずつ移し、ＥＬＩＳＡリーダーで５００ｎｍでの吸光度を測定し、その結果を図２に示した。
【００６２】
図１ａおよび図１ｂから確認されるように、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドを処理した時に、細胞中における脂肪蓄積程度が減少することをオイルレッドＯ染色により確認することができた。
【００６３】
また、図２から確認されるように、ペプチド複合体を濃度毎に処理した時に、細胞中における脂肪蓄積程度が減少することを確認することができた。
【００６４】
１‐２．脂質生成に関与する遺伝子の発現の抑制
３Ｘ１０５細胞／ウェルの細胞密度で、６ウェルプレートに３Ｔ３‐Ｌ１（脂肪前駆細胞）をシーディングした。２４時間培養した後、ペプチドを濃度毎（０．１、１、１０ｕｇ／ｍｌ）に処理し、３７℃の培養器にて１４日間培養した。培養が完了された細胞を回収した後、ＲＮＡ抽出溶液（Ｅａｓｙ  Ｂｌｕｅ、Ｉｎｔｒｏｎ）を処理してＲＮＡを準備し、ＲＴプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した。各標識因子（ＰＰＡＲγ、ＡＣＣ、ａＰ２）に対するプライマーとＰＣＲプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ）を用いてＰＣＲを行った。次に、１％のアガロースゲルにＰＣＲ産物を５ｕｌずつローディングして電気泳動した後、Ｇｅｌ‐Ｄｏｃでバンドを確認し、その結果を図３ａおよび図３ｂに示した。
【００６５】
脂質生成標識因子ＰＣＲに用いられたターゲット‐特異的プライマー配列は、次のとおりである：
【００６６】
【表２】
2019533680.tif 000004
【００６７】
図３ａおよび図３ｂから確認されるように、マウス骨芽細胞株３Ｔ３‐Ｌ１に、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドを処理して３日間培養した結果、脂質生成標識因子であるａＰ２の発現が減少されることを観察することができた。
【００６８】
また、図４から確認されるように、マウス骨芽細胞株３Ｔ３‐Ｌ１に、ペプチド複合体を０．１ｕｇ／ｍｌ、１ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌの濃度で処理して３日間培養した結果、脂質生成標識因子であるＰＰＡＲγ、ＡＣＣ、ａＰ２の発現が、陽性対照群として１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを処理した群とペプチド複合体処理群の何れでも減少していることを観察することができた。
【００６９】
１‐３．脂肪前駆細胞を用いた脂質生成および分解誘導タンパク質発現の観察
３Ｘ１０５細胞／ウェルの細胞密度で、６ウェルプレートに３Ｔ３‐Ｌ１（脂肪前駆細胞）をシーディングした。２４時間培養した後、ペプチド複合体を濃度毎（０．１、１、１０ｕｇ／ｍｌ）に処理し、３７℃の培養器にて１４日間培養した。細胞溶解バッファーを処理して溶解物を確保した後、タンパク質を定量し、脂肪生成因子である抗‐ＰＰＡＲγ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）と脂肪分解因子である抗‐ｐＨＳＬ  抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いてウエスタンブロットを行った。
【００７０】
図５から確認されるように、脂肪生成標識因子であるＰＰＡＲγタンパク質の発現が、ペプチド複合体を濃度毎に処理した時に、何れも濃度依存的に減少していることを観察することができ、脂肪分解標識因子であるｐＨＳＬタンパク質の発現量を観察した時に、ペプチド複合体処理群は何れも増加していることを観察することができた。
【００７１】
実施例２：脂質分解活性の評価
２‐１．脂質分解に関与する遺伝子の発現増加
３Ｘ１０５細胞／ウェルの細胞密度で、６ウェルプレートに３Ｔ３‐Ｌ１（脂肪前駆細胞）をシーディングした。２４時間培養した後、ペプチドを濃度毎（０．１、１、１０ｕｇ／ｍｌ）に処理し、３７℃の培養器にて１４日間培養した（陽性対照群：１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（ＳＩＧＭＡ））。培養が完了された細胞を回収した後、ＲＮＡ抽出溶液（Ｅａｓｙ  Ｂｌｕｅ、Ｉｎｔｒｏｎ）を処理してＲＮＡを準備し、ＲＴプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した。各標識因子（ＡＭＰＫ‐α１、ＣＧＩ５８）に対するプライマーとＰＣＲプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ）を用いてＰＣＲを行った。次に、１％アガロースゲルにＰＣＲ産物を５ｕｌずつローディングして電気泳動した後、Ｇｅｌ‐Ｄｏｃでバンドを確認し、その結果を図６に示した。
【００７２】
脂質生成標識因子ＰＣＲに用いられたターゲット‐特異的プライマー配列は、次のとおりである：
【００７３】
【表３】
2019533680.tif 000005
【００７４】
図６ａおよび図６ｂから確認されるように、脂肪前駆細胞（３Ｔ３‐Ｌ１）にペプチドを処理して培養した結果、脂質分解標識因子であるＡＭＰＫ‐α１とＣＧＩ‐５８の発現が、各ペプチド処理群の何れでも増加していることを観察することができた。
【００７５】
また、図６ｃから確認されるように、ペプチド複合体を処理した場合、ＡＭＰＫ‐α１とＣＧＩ‐５８の発現が濃度依存的に増加することを確認することができ、陽性対照群である１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα処理群に比べても、脂肪分解因子の発現増加が高く現れることを観察することができた。
【００７６】
２‐２．脂肪前駆細胞を用いた脂質分解誘導タンパク質発現の観察
３Ｘ１０５細胞／ウェルの細胞密度で、６ウェルプレートに３Ｔ３‐Ｌ１（脂肪前駆細胞）をシーディングした。２４時間培養した後、ペプチド複合体を濃度毎（０．１、１、１０ｕｇ／ｍｌ）に処理し、３７℃の培養器にて１４日間培養した（陽性対照群：１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（ＳＩＧＭＡ））。細胞溶解バッファーを処理して溶解物を確保した後、タンパク質を定量し、脂肪分解因子である抗‐ＡＴＧＬ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いてウエスタンブロットを行った。
【００７７】
図７から確認されるように、脂肪分解因子であるＡＴＧＬの発現がペプチド複合体によって増加することを確認することができた。
【００７８】
２‐３．脂肪前駆細胞を用いた脂質分解誘導タンパク質発現の蛍光顕微鏡観察
３Ｘ１０５細胞／ウェルの細胞密度で、６ウェルプレートに３Ｔ３‐Ｌ１（脂肪前駆細胞）をシーディングした。２４時間培養した後、各ペプチドまたはペプチド複合体（１ｕｇ／ｍｌ）を処理し、３７℃の培養器にて１４日間培養した（陽性対照群：１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（ＳＩＧＭＡ））。培養が完了された細胞を７０％エタノールを用いて細胞を固定した後、抗‐Ｐｈｏｓｐｈｏ‐ＨＳＬ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を用いて細胞免疫染色法により脂肪分解誘導因子であるｐｈｏｓｐｈｏ‐ＨＳＬの細胞中の発現を観察した。
【００７９】
図８ａから図８ｃから確認されるように、各ペプチド（図８ａおよび図８ｂ）およびペプチド複合体（図８ｃ）により、脂肪分解誘導因子であるｐｈｏｓｐｈｏ‐ＨＳＬの発現が増加することを確認することができた。
【００８０】
２‐４．脂肪分解産物であるグリセロール量の測定
肥満誘導マウス動物の腹部から脂肪組織を採取した後、２４ウェル培養プレートにウェル当たり１００ｍｇずつ脂肪組織を入れ、培養培地（１ｍｌ  Ｋｒｅｂｓ‐Ｒｉｎｇｅｒ  ｂｕｆｆｅｒ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５．５ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ、ａｎｄ  ２％（ｗ／ｖ）  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）に培養した。培養時に、ペプチド複合体を０．１ｕｇ／ｍｌ、１ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌの濃度で処理し、陽性対照群として１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを処理して、４８時間培養した後、脂肪が分解されながら生じたグリセロールの量を測定した。
【００８１】
図９から確認されるように、ペプチド複合体を濃度毎に処理した時に、脂肪が分解されながら生じたグリセロールの量がペプチド複合体処理濃度依存的に増加することを観察することができた。陽性対照群であるＴＮＦα処理群に比べて多量のグリセロールが検出されることを確認した。
【００８２】
２‐５．肥満マウス分離脂肪組職に対する分解効果の確認
脂肪組織は、色によって白色脂肪（Ｗｈｉｔｅ  Ｆａｔ）、褐色脂肪（Ｂｒｏｗｎ  Ｆａｔ）に分けられ、部位によって皮下脂肪、腹膜脂肪、腸間膜脂肪（内臓脂肪）、および副睾丸脂肪に分けられる。解剖後に各脂肪を摘出して白色脂肪を分離した後、それぞれ１００ｍｇ／ウェルの重量で、２４ウェルプレートに複合剤を濃度毎に処理し、培養培地（１ｍｌ  Ｋｒｅｂｓ‐Ｒｉｎｇｅｒ  ｂｕｆｆｅｒ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５．５ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ、ａｎｄ  ２％（ｗ／ｖ）  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）で７２時間培養してから組織を切片化してヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、２００倍で顕微鏡（ＴＳ１００、Ｎｉｃｏｎ）観察して脂肪細胞の大きさを比較した。
【００８３】
図１０ａから確認されるように、ペプチド複合体を濃度毎に処理した時に、脂肪細胞の大きさを比較した結果、脂肪細胞の大きさが対照群に比べて小さくなることを確認した。
【００８４】
また、図１０ｂから確認されるように、染色後、脂肪細胞の大きさを測定するために、プログラムを用いて脂肪細胞の大きさを測定した結果、ペプチド複合体処理群で、明らかな細胞膜区画を有する脂肪組職中の細胞の大きさの減少が観察された。
【００８５】
２‐６．脂肪組職に対する脂肪分解因子の観察
肥満誘導マウス動物の腹部から脂肪組織を採取した後、２４ウェル培養プレートにウェル当たり１００ｍｇずつ脂肪組織を入れ、培養培地（１ｍｌ  Ｋｒｅｂｓ‐Ｒｉｎｇｅｒ  ｂｕｆｆｅｒ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５．５ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ、ａｎｄ  ２％（ｗ／ｖ）  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）に培養した。培養時に、ペプチド複合体を処理し、陽性対照群として１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを処理して、４８時間培養した後、脂肪分解因子であるｐｈｏｓｐｈｏ‐ＨＳＬ（緑色蛍光物質）の発現を確認した。
【００８６】
図１１から確認されるように、脂肪組職における脂肪分解因子であるｐｈｏｓｐｈｏ‐ＨＳＬの発現を確認した結果、ペプチド複合体を処理した時に、脂肪分解因子であるｐｈｏｓｐｈｏ‐ＨＳＬの発現が増加していることを確認することができた。
【００８７】
実施例３：実験動物を用いた脂肪生成抑制および脂肪分解促進の効果
正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに高脂肪食餌をさせて誘導した肥満誘導モデルＤＩＯ（Ｄｉｅｔｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ）を用いて抗肥満効能実験を行い、陽性対照群薬物として、５ｕｇ／ｍｌのＴＮＦαを使用した。対照群は、高脂肪食餌でなく一般食餌で進行した。実験は、高脂肪食餌を１２週間進行しながら、それぞれペプチド複合体または陽性対照群を処理して体重の減少を確認した。
【００８８】
ＴＮＦαおよび抗肥満効能化合物は、１２週間毎週午後３時‐４時に、８４日間強制的に腹腔注射した。体重と食餌量は、最初に薬物を投与する直前に測定し、その後、一週間隔で体重と食餌量を測定した。
【００８９】
血糖は、薬物投薬実験の終了後、尾静脈から採血した後、アキュチェックアクティブ（Ａｃｃｕ‐Ｃｈｅｃｋ  Ａｃｔｉｖｅ）（Ｒｏｃｈｅ）を用いて測定し、コレステロールも尾静脈から採血した血清をＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いて分析した。
【００９０】
脂肪組織は、色によって白色脂肪（Ｗｈｉｔｅ  Ｆａｔ）、褐色脂肪（Ｂｒｏｗｎ  Ｆａｔ）に分けられ、部位によって皮下脂肪、腹膜脂肪、腸間膜脂肪（内臓脂肪）、および副睾丸脂肪に分けられる。解剖後、各脂肪を摘出して観察し、組織学的検査のために、脂肪を１０％の中性緩衝ホルマリンに固定した後、パラフィンブロックに包埋し、５ｕｍに区画してヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）とエオシン（ｅｏｓｉｎ）で染色した。
【００９１】
脂質分解因子であるＨＳＬのリン酸化程度を確認するために、抗‐ｐＨＳＬ抗体を用いた蛍光染色を行った。組織サンプルを製作した後、グリセリンゼルマウンティングメディア（ｇｌｙｃｅｒｉｎｅ  Ｊｅｌｌ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉａ）でマウンティングし、カバーガラスを覆って顕微鏡（Ｎｉｃｏｎ、ＴＳ１００）で観察した。この際、顕微鏡に内蔵されているデジタルカメラで組織を撮影した。
【００９２】
一般食餌を１２週間したマウスは、実験初期に２０．９ｇ、１２週後に２８．７４ｇの体重を示し、高脂肪食餌をしたマウスは、初期に２０．９９ｇであった体重が、１２週後に４９．５ｇまで増加することを確認した。しかし、高脂肪食と並行してペプチド複合体を処理した群では、初期に２１．１ｇで、１２週後には３６．７６ｇであって、高脂肪食餌のみを進行した対照群（２３５．８％）に比べて、高い体重減少（１７４．２％）が起こることを確認することができた（表４、表５、および図１２）。表４および表５は、肥満マウスモデルにペプチド複合体を処理した後、体重測定の結果をグラム（ｇ）とパーセント（％）で示したものである。
【００９３】
【表４】
2019533680.tif 000006
【００９４】
【表５】
2019533680.tif 000007
【００９５】
図１３から確認されるように、１２週間の実験が完了された動物の写真を測定した結果、ペプチド複合体処理群が、高脂肪食餌のみを進行した群に比べてマウスの体が正常マウス（一般食）と類似の大きさの体に維持されることを観察することができた。
【００９６】
【表６】
2019533680.tif 000008
【００９７】
図１４および表６から確認されるように、１２週間の実験を進行したマウスに対し、マイクロ‐ＣＴ撮影をして全身に分布されている脂肪（黄色を呈している）を確認した結果、一般食餌を進行した対照群に比べて、高脂肪食餌を進行した対照群のマウスで、全身に分布されている脂肪の量が急激に増加していることを確認することができ、高脂肪食餌とともにペプチド複合体を処理した群では、全身に分布されている脂肪の量が急激に減少していることを確認することができた。
【００９８】
図１５から確認されるように、上記のマイクロ‐ＣＴ撮影が終わったマウスを解剖し、全身に分布されている脂肪組職を採取して脂肪組職の量を観察した結果、一般食餌を進行した対照群に比べて、高脂肪食餌を進行した対照群のマウスで、脂肪の量が多いことを確認することができ、高脂肪食餌とともにペプチド複合体を処理した群で、脂肪の量が急激に減少していることを確認した。
【００９９】
図１６ａから確認されるように、脂肪を分離し、Ｈ＆Ｅ染色により脂肪の大きさを観察した結果、高脂肪食餌対照群に比べて、高脂肪食餌とともにペプチド複合体を処理した群で、脂肪の大きさが小さくなることを確認することができた。
【０１００】
図１６ｂおよび図１６ｃから確認されるように、脂肪の大きさをプログラムにより分析した結果、一般食餌対照群の脂肪の大きさを１００％として計算したときに、高脂肪食餌対照群の脂肪の大きさは１２７％であって、脂肪の大きさが大きくなっていることを確認し、高脂肪食餌とともにペプチド複合体を処理した群の脂肪の大きさは、９７％に減少していることを確認した。
【０１０１】
図１７から確認されるように、脂肪を分離し、脂肪組織中に発現されている脂肪分解因子であるＰｈｏｓｐｈｏ‐ＨＳＬの発現量を確認した結果、高脂肪食餌とともにペプチド複合体を処理した群で、ｐｈｏｓｐｈｏ‐ＨＳＬの発現が増加していることを確認した。
【０１０２】
図１８から確認されるように、実験が終わったマウスの血液中のコレステロールの量を確認した結果、一般食餌を進行した対照群のコレステロール量は２．５２ｕｇ／ｍｌ、高脂肪食餌対照群のコレステロールの量は３．５ｕｇ／ｍｌ、高脂肪食餌とともにペプチド複合体を処理した群では２．８６ｕｇ／ｍｌのコレステロールの量が検出されることを確認することができた。ペプチド複合体処理群で、肥満時に上昇するコレステロールの数値を低めることを確認することができた。
【０１０３】
図１９から確認されるように、実験が終わったマウスの血液中の血糖の数値を確認した結果、一般食餌を進行した対照群のマウスの血糖は１７４ｍｇ／ｄＬ、高脂肪食餌対照群の血糖は２３５ｍｇ／ｄＬであって、血糖数値が上昇することを確認することができ、高脂肪食餌とともにペプチド複合体を処理した群での血糖の数値は１８３ｍｇ／ｄＬであって、一般食餌対照群と類似に血糖数値が減少していることを確認した。
【０１０４】
実施例４：血糖調節
本動物実験では、Ｃ５７ＢＬ／６（正常マウス）（（株）ＳＡＭＴＡＫＯ）とＣ５７ＢＬＫＳ／ＪＬｅｐｒ（糖尿病モデルマウス、ｄｂ／ｄｂマウス）（（株）中央実験動物から購入）雄を使用し、抗糖尿病および／または抗肥満効能物質としては複合剤を使用し、陽性対照群薬物としてはシタグリプチン（ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ）を使用した。
【０１０５】
本実施例では、正常マウスモデルと遺伝的に糖尿病の可能性があるモデルに対する急性抗糖尿病効能（単回投与）を、代表的な糖尿病診断検査方法であるＧＴＴ（Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｔｅｓｔ）方法により抗糖尿病および／または抗肥満効能複合剤に対して評価した。
【０１０６】
マウスの飼育環境の条件は、２２〜２４℃、相対湿度５０〜３０％と設定し、飼育箱当たり４匹ずつ飼育した。午前８時から午後８時まで１５０〜３００ルクス（Ｌｕｘ）の照明を与え、一日に１２時間点灯、１２時間消灯した。飼料は、一般食餌（１８％のタンパク質、２０１８、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ，ＵＳＡ製）を用いて自由摂取させ、ＩＴＴ実験を行う前に４時間以上絶食させ、ＧＴＴ実験を行う１２時間前から絶食させた。ＧＴＴ実験の１時間前に、複合剤をそれぞれ経口投与用使い捨て注射器を用いて強制経口投与し、ＧＴＴ実験のために、実験０時間目に高脂肪食餌を４０分間自由食餌させた。高脂肪自由食餌４０分後に、それぞれ血液中のグルコースレベルの検査のために、０分、３０分、６０分、９０分、１２０分、および１８０分間隔で尾静脈から採血し、アキュチェックアクティブ（Ａｃｃｕ‐Ｃｈｅｋ  ａｃｔｉｖｅ）（Ｒｏｃｈｅ）を用いて血糖レベルを測定した。一方、陽性対照群薬物としては、現在糖尿治療剤として用いられているシタグリプチン（ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ）を選定し、１００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した。抗糖尿病および／または抗肥満効能候補物質として選定した複合剤を１００ｍｇ／ｋｇの投与量別に実験群を分け、各実験群当たり４匹のマウスを使用した。
【０１０７】
図２０から確認されるように、高脂肪食餌により増加された血糖数値が、ペプチド複合体の処理によって減少する血糖減少効果が観察された。糖尿病誘発マウスモデルで糖尿病の高い血糖が減少されることを確認した。
【０１０８】
また、図２１から確認されるように、コレステロールの量が、高脂肪食餌の対照群に比べて高脂肪食餌とともにペプチド複合体を処理した群で低くなっていることを確認した。
【０１０９】
また、ＤＢ／ＤＢ糖尿病が誘導されたマウスを１６時間空腹とした後、３０分間食餌を与えてから、ペプチドを摂取させ、時間毎に血糖数値を測定し、図２２、図２３、表７、および表８に示した。
【０１１０】
【表７】
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【０１１１】
【表８】
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【０１１２】
図２２、図２３、表７、および表８から確認されるように、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドを処理した群で、高血糖の数値が時間依存的に低くなることを観察した。
【０１１３】
実施例５：臨床実験による血糖減少効果の観察
空腹血糖１７０ｍｇ／ｄＬ以上の４５〜６５歳を対象として、簡易臨床実験を行った。空腹血糖を基準として、食後３０分に複合製剤を摂取させ３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０分間隔で採血し、アキュチェックアクティブ（Ａｃｃｕ‐Ｃｈｅｋ  ａｃｔｉｖｅ）（Ｒｏｃｈｅ）により血糖レベルを測定し、図２４ａ〜図２４ｄに示した。
【０１１４】
図２４ａ〜図２４ｄから確認されるように、実験結果、複合製剤による血糖減少がそれぞれの実験者で観察された。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明は、抗肥満および抗糖尿病効能を有するペプチド、並びにその用途に関する。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２４ｃ】
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【図２４ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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