(57)【要約】  本発明は、被験体におけるアレルギーを調節または検出するための組成物および方法に関する。本発明を、食品などの組成物のアレルゲン性を低減するのに、またはワクチンなどの製品の免疫原性を刺激するのに使用してよい。本発明を、ヒトなどの任意の哺乳動物において使用してよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物の免疫原性またはアレルゲン性を低減するための方法であって、組成物を処理して陽イオン性タンパク質を除去することを含む、方法。
【請求項２】
７．４を超える等電点を有する組成物の陽イオン性タンパク質の少なくとも５０重量％、好ましくは、組成物の陽イオン性タンパク質の少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％を除去することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
処理された組成物が、２重量％未満、より好ましくは１％未満、さらにより好ましくは０．５％未満、０．２％未満、または０．１％未満の８を超える等電点を有する陽イオン性タンパク質を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
陽イオン性タンパク質が、転写インフィデリティーから生じる陽イオン性タンパク質を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
陽イオン性タンパク質が、転写インフィデリティーギャップから生じるペプチド配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
組成物が、陽イオン交換および／またはアフィニティークロマトグラフィーによって処理される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）組成物の溶液を提供すること、（ｉｉ）必要に応じて、組成物の溶液を、７〜９の間に含まれるｐＨを有するように調整すること、（ｉｉｉ）溶液を、調整されたｐＨを超える等電点を有する溶液の成分の結合を可能にする陽イオン交換クロマトグラフィーに供すること、および（ｉｖ）溶出液を回収することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
組成物を、転写インフィデリティー抗体を使用したアフィニティークロマトグラフィーに供する（さらなる）工程を含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
組成物が、食品成分、飼料成分、もしくは薬物であるか、またはそれを含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
組成物が、精製されたおよび／または組換えタンパク質を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
組成物が乳製品または酪農製品を含み、そして、配列番号１〜５から選択されるＴＩギャップペプチド配列を含む少なくとも１つのタンパク質を除去することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
組成物がピーナッツ製品を含み、そして、配列番号１１０〜１２０から選択されるＴＩギャップペプチド配列を含む少なくとも１つのタンパク質を除去することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）食品調製物を提供すること、（ｉｉ）食品調製物を処理してそこから陽イオン性タンパク質を除去すること、および（ｉｉｉ）場合により、処理された食品を１以上の好適な賦形剤と共に製剤化することを含む、食品を調製するための方法。
【請求項１４】
工程（ｉｉ）が、調製物を処理して転写インフィデリティーから生じる陽イオン性タンパク質を除去することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
処理された食品が、２重量％未満、より好ましくは０．５％未満、０．３％未満、０．２％未満、または０．１％未満の転写インフィデリティーから生じる陽イオン性タンパク質を含有する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）医薬品調製物を提供すること、（ｉｉ）医薬品調製物を処理してそこから陽イオン性タンパク質を除去すること、および（ｉｉｉ）場合により、処理された医薬品を１以上の好適な賦形剤と共に製剤化することを含む、医薬品を調製するための方法。
【請求項１７】
医薬品が、ワクチン、免疫原、アレルゲンもしくは薬物であるか、またはそれを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
食品と好適な賦形剤とを含む食品組成物であって、食品が、１重量％未満、より好ましくは０．５％未満、０．３％未満、０．２％未満、または０．１％未満の陽イオン性タンパク質を含有する、食品組成物。
【請求項１９】
ピーナッツの免疫原性またはアレルゲン性を低減するための方法であって、Ａｒａ  ｈ  １、Ａｒａ  ｈ  ２、Ａｒａ  ｈ  ３、Ａｒａ  ｈ  ５、Ａｒａ  ｈ  ６、Ａｒａ  ｈ  ７、Ａｒａ  ｈ  ８、Ａｒａ  ｈ  ９、Ａｒａ  ｈ  １０およびＡｒａ  ｈ  １１から選択される１以上のピーナッツタンパク質における転写インフィデリティー率を低減することを含む、方法。
【請求項２０】
転写インフィデリティーから生じる配列を有するタンパク質に対するＩｇＥのレベルを被験体由来の試料中で測定することを含む、アレルギーになりやすい傾向を有する被験体を検出するための方法であって、対照値と比較した場合の前記レベルの差がアレルギーになりやすい傾向を有する被験体を示す、方法。
【請求項２１】
哺乳動物における抗体産生を刺激するためのアジュバントとして使用するための、転写インフィデリティーから生じる陽イオン性タンパク質またはペプチド。
【請求項２２】
免疫原と転写インフィデリティーから生じる配列を有するタンパク質またはペプチドとを含む、ワクチン組成物。
【請求項２３】
配列番号１〜５、配列番号７４〜１０９もしくはＳＥＱ  ＩＤ：１１０〜１２０から選択される配列を含む、タンパク質もしくはペプチド、またはその少なくとも１０の連続アミノ酸を含有するその断片。
【請求項２４】
配列番号６〜１０、配列番号１６〜５１、または配列番号１２１〜１３１のいずれか１つを含む、請求項２３に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験体におけるアレルギーを調節または検出するための組成物および方法に関する。本発明は、本発明者らによる、哺乳動物におけるアレルギーの分子起源の発見に端を発し、かつ、例えば、医療、栄養、化粧品または農産業界において広範な用途を有する。本発明を、食品などの組成物のアレルゲン性を低減するのに、またはワクチンなどの製品の免疫原性を刺激するのに使用してよい。本発明を、ヒトなどの任意の哺乳動物において使用してよい。
【背景技術】
【０００２】
背景
アレルギー反応の臨床症状は、非常に多岐にわたり、外部環境と接触できる実質的に全ての臓器、すなわち、呼吸器、皮膚、消化器および婦人科泌尿器（gyneco urinary）に影響を及ぼし、ついには、深刻な血行動態的結果を多かれ少なかれ伴って全身性アナフィラキシーショックに至る可能性がある。ＩｇＥ抗体は、喘息、花粉症、湿疹、蕁麻疹、食物アレルギーおよびアナフィラキシーなどの疾患を引き起こすＩ型過敏症の要となるものである。ＩｇＥは、血中循環していることも、肥満細胞、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージおよびランゲルハンス細胞の表面に発現されるＦｃεＲＩに固定されていることもある。組織肥満細胞上のＦｃεＲＩに固定されているＩｇＥのアレルゲン誘導性架橋は、同じくＦｃεＲＩに固定されているＩｇＥを備えた血中循環好塩基球を動員することによって、共に反応の増幅の一因となるヒスタミンおよび複数のサイトカインを放出する一連の事象を誘発する。これらの事象は、極めて詳細に特徴付けられているが、なぜほとんどの個体にとって無害である任意の所与のタンパク質が他のものにとって潜在的に致死的なアレルゲンとなるのかという素朴な疑問にまだ答えは出ていない。ここに提示する研究は、ＩｇＥ産生の最初の誘引が、公知のアレルゲンにより起こるのではなく、転写エラーによって引き起こされたフレームシフトを持つｍＲＮＡから翻訳された微量の変異体により起こることを説明する。
【０００３】
概要
本発明は、本発明者らによる、哺乳動物におけるアレルギーの分子起源の発見に端を発する。したがって、本発明は、哺乳動物における免疫応答またはアレルギーを検出する、制御するまたは調節するための、新規組成物および方法を提供する。本発明は、特定すると、アレルギーが、哺乳動物における転写インフィデリティー（transcription infidelity）（「ＴＩ」）によって生成されるタンパク質（またはそのエピトープ）によって誘引されるという、本発明者らによる発見に端を発する。特に、本発明者らによって過去に実証されている通り、ＴＩは、Ｃ末端が修飾された異常なタンパク質を生成する。それらの調査を継続し、本発明者らは、今般驚くべきことに、ＴＩギャップが、哺乳動物において免疫原性を獲得しかつインビボでアレルギーを誘引する、タンパク質を創出することを見いだした。本発明者らはまた、ＴＩギャップから生じるそのようなタンパク質が本質的に陽イオン性であること、および、そのようなタンパク質を食品または他の組成物から除去することで低アレルゲン性組成物が生成されることを見いだした。
【０００４】
したがって、本発明は、哺乳動物における免疫原性およびアレルギーを検出する、モニタリングするおよび調節するための、新規組成物および方法を提供する。
【０００５】
本発明のある目的は、より特定すると、組成物のアレルゲン性または免疫原性を低減するための方法であって、組成物を処理して陽イオン性タンパク質を除去することを含む方法にある。
【０００６】
本発明のある目的は、組成物のアレルゲン性または免疫原性を低減するための方法であって、組成物を処理して転写インフィデリティーから生じるタンパク質、より特定すると転写インフィデリティーギャップから生じる配列を有するタンパク質を除去することを含む方法にある。
【０００７】
該組成物は、例えば、食品、飼料、医薬品、動物用製品、化粧品などの任意の組成物であり得る。
【０００８】
特定の実施態様において、本発明は、食品を調製するための方法であって、（ｉ）食品調製物を提供すること、（ｉｉ）食品調製物を処理してそこから陽イオン性タンパク質を除去すること、および（ｉｉｉ）場合により、処理された食品を１以上の好適な賦形剤と共に製剤化することを含む方法を提供する。
【０００９】
本発明の別の特定の実施態様は、医薬品を調製するための方法であって、（ｉ）医薬品調製物を提供すること、（ｉｉ）医薬品調製物を処理してそこから陽イオン性タンパク質を除去すること、および（ｉｉｉ）場合により、処理された医薬品を１以上の好適な賦形剤と共に製剤化することを含む方法に関する。
【００１０】
本発明はまた、食品と好適な賦形剤とを含む食品組成物であって、食品が、１重量％未満、より好ましくは０．５％未満、０．３％未満、０．２％未満、または０．１％未満の陽イオン性タンパク質を含有する、食品組成物を提供する。
【００１１】
本発明はまた、医薬品／動物用製品と好適な賦形剤とを含む医薬組成物であって、医薬品／動物用製品が１重量％未満、より好ましくは０．５％未満、０．３％未満、０．２％未満、または０．１％未満の陽イオン性タンパク質を含有するように処理されている、医薬組成物を提供する。
【００１２】
本発明はまた、被験体を処置する方法であって、被験体に、上に定義した通りの医薬品または動物用製品の有効量を投与することを含む方法に関する。
【００１３】
本発明はまた、転写インフィデリティーから生じる配列を有するタンパク質に対して指向されるＩｇＥのレベルを被験体由来の試料中で測定することを含む、アレルギーになりやすい傾向を有する被験体を検出するための方法であって、対照値と比較した場合の前記レベルの差がアレルギーになりやすい傾向を有する被験体を示す方法を提供する。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、アジュバント（例えば、哺乳動物における抗体産生を刺激するための）として使用するための、転写インフィデリティーから生じる配列を有する陽イオン性タンパク質またはペプチドである。
【００１５】
本発明はまた、哺乳動物における抗体産生を誘導するまたは刺激する方法であって、哺乳動物に、転写インフィデリティーから生じる配列を有する陽イオン性タンパク質またはペプチドを投与することを含む方法を提供する。
【００１６】
本発明は、さらに、ＩｇＥを産生するための方法であって、（ｉ）ヒト以外の哺乳動物に、転写インフィデリティーから生じる陽イオン性タンパク質またはペプチドを、ＩｇＥ産生の誘導を可能にする条件下で投与すること、および（ｉｉ）産生されたＩｇＥを収集することを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明は、さらに、ＩｇＥを産生するための方法であって、（ｉ）ヒト以外の哺乳動物に、転写インフィデリティーから生じる陽イオン性タンパク質またはペプチドを、ＩｇＥ産生の誘導を可能にする条件下で投与すること、（ｉｉ）ＩｇＥ産生細胞を収集すること、ならびに（ｉｉｉ）前記収集された細胞からモノクローナルおよび／またはヒト化ＩｇＥを得ることを含む方法を提供する。工程（ｉｉｉ）は、典型的には、ハイブリドーマの産生、ハイブリドーマのクローン選択およびモノクローナル抗体の産生を含む。
【００１８】
本発明はまた、抗ＩｇＥ抗体を製造する方法であって、（ｉ）ヒト以外の哺乳動物に、転写インフィデリティーから生じる陽イオン性タンパク質またはペプチドを、抗体の誘導を可能にする条件下で投与すること、（ｉｉ）産生された抗体を収集すること、および（ｉｉｉ）Ｆｃ受容体に結合する抗体を選択することを含む方法に関係する。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、Ｆｃ受容体に結合する抗体を含む医薬組成物である。
【００２０】
本発明はまた、免疫原と転写インフィデリティーから生じる配列を有するタンパク質またはペプチドとを含むワクチン組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
図面の説明
【図１】ＴＩペプチドおよび非ＴＩペプチドの胃内投与後のＩｇＥ産生。ペプチドの投与日およびマウスからの血液の採取日を上部に表示する。血液中のＩｇＥのアッセイをＥＬＩＳＡ技術によって行い、そして、その結果を光学密度として表す。２つのペプチド間の差は有意である（ｐ＜１０−６）。
【図２】ＴＩペプチドおよび非ＴＩペプチドの腹腔内投与後のＩｇＥ産生。ペプチドの投与日およびマウスからの血液の採取日を上部に表示する。血液中のＩｇＥのアッセイをＥＬＩＳＡ技術によって行い、そして、その結果を光学密度として表す。２つのペプチド間の差は有意である（ｐ＜１０−３）。
【図３】ＲＮＡ上のＴＩギャップ（赤色で）は、タンパク質のリーディングフレームのシフトを引き起こす。ギャップから生じるタンパク質の配列は、正常なタンパク質と大きく異なる。
【図４】陽イオン性タンパク質が濃縮した画分および枯渇した画分のマウス（１群当たり６匹のマウス）への投与。血液試料から、ＩｇＥのアッセイをＥＬＩＳＡ技術によって行い、そして、その結果を光学密度として表す。エラーバーは、群全体についての測定の変動性を表示する。
【図５】欠失は、アレルゲンのＯＲＦ内に主に位置する。欠失の数は、アレルゲン（黒色）および非アレルゲン（白色）について決定されている。次いで、欠失の位置が、ＯＲＦ  ＩＮ（コーディング配列内に位置する）またはＯＲＦ  ＯＵＴ（非翻訳領域内に位置する）として定義される。
【図６】Ａ、Ｔ、ＣおよびＧの反復に影響を及ぼす欠失についての、アレルゲン（黒色）および非アレルゲン（白色）のＯＲＦ内およびＵＴＲ内に位置する欠失の数の間の比。ＮＤ：未決定（アレルゲン中のＧの反復に影響を及ぼす欠失はない）。
【図７Ａ】３３日目（Ａ）および４９日目（Ｂ）のピーナッツに対するＩｇＥ抗体応答。マウス（１実験当たり、１処置群当たりｎ＝１０）に、ピーナッツ抽出物（タンパク質４００μg）または組換えＡｒａＨ２（４００μg）を、０、７、１４および３６日目に腹腔内注射によって、ＬｅｗｉｓＸアジュバントと共にまたはそれなしで与えた。血清試料（３３日目および４９日目）を、ＥＬＩＳＡによって特異的ＩｇＥ抗体について分析した。データを平均（±ＳＥＭ）として示す。ノンパラメトリックウィルコクソン検定を実施する（＊ｐ＜０．０５、＊＊ ｐ＜０．０１、＊＊＊ ｐ＜０．００１）。
【図７Ｂ】３３日目（Ａ）および４９日目（Ｂ）のピーナッツに対するＩｇＥ抗体応答。マウス（１実験当たり、１処置群当たりｎ＝１０）に、ピーナッツ抽出物（タンパク質４００μg）または組換えＡｒａＨ２（４００μg）を、０、７、１４および３６日目に腹腔内注射によって、ＬｅｗｉｓＸアジュバントと共にまたはそれなしで与えた。血清試料（３３日目および４９日目）を、ＥＬＩＳＡによって特異的ＩｇＥ抗体について分析した。データを平均（±ＳＥＭ）として示す。ノンパラメトリックウィルコクソン検定を実施する（＊ｐ＜０．０５、＊＊ ｐ＜０．０１、＊＊＊ ｐ＜０．００１）。
【図８】Ａｒａ  ｈ  ２に影響を及ぼす欠失の位置ならびにＴＩタンパク質およびペプチドの予測。２つのアイソフォームを示す。各アイソフォーム由来のエピトープを灰色で表し、そして、免疫優性エピトープを黒色で表す。縦棒は、同じ終止コドンを暗示する欠失の群の位置を表示する。いくつかの群について、配列を示す。転写インフィデリティー（ＴＩ）配列は太字である；エピトープに下線を引く。ダイアグラム１１、１２および１３はまた、これらのＴＩ変異体の生化学的および情報生物学的特徴を含有する。参照配列の終止コドンを星印で標識する。
【図９】３３日目（Ａ）、４９日目（Ｂ）のＡｒａＨ２−ｖ３６に対するＩｇＥ抗体応答；３３日目（Ｃ）、４９日目（Ｄ）のＡｒａＨ２−ｖ３８に対するＩｇＥ抗体応答；３３日目（Ｅ）、４９日目（Ｆ）のＡｒａＨ２−ｖ４０に対するＩｇＥ抗体応答。マウス（１実験当たり、１処置群当たりｎ＝１０）に、ピーナッツ抽出物（タンパク質４００μg）または組換えＡｒａＨ２（４００μg）を、０、７、１４および３６日目に腹腔内注射によって、ＬｅｗｉｓＸアジュバントと共にまたはそれなしで与えた。血清試料（３３日目および４９日目）を、ＥＬＩＳＡによって特異的ＩｇＥ抗体について分析した。データを平均（±ＳＥＭ）として示す。ノンパラメトリックウィルコクソン検定を実施する（＊ｐ＜０．０５、＊＊ ｐ＜０．０１、＊＊＊ ｐ＜０．００１）。
【図１０】ピーナッツＡｒａ  ｈ  １〜３およびＡｒａ  ｈ  ５〜１１転写産物におけるギャップ事象（１０００塩基当たりのＯＲＦ内のＡの反復に影響を及ぼす前記ギャップ事象）の数とピーナッツアレルゲンの有病率との間の相関。
【図１１】コーディング領域ＯＲＦ内のＡ、Ｃ、ＧおよびＴ塩基の反復に影響を及ぼす欠失についての、ピーナッツ（暗灰色）およびサヤマメ（白色）の全ての転写産物位置について計算された包括的ＲＤＤ比の比較。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、特異的な転写インフィデリティー（ＴＩ）事象を保有するｍＲＮＡの翻訳によって産生された任意の所与のタンパク質変異体が、どのように天然の免疫グロブリンの特異性の脱制御を引き起こすか、および、それがアレルギーの起源であるかを説明する統合モデルを提供する。より特定すると、本発明は、標準的な塩基対合によって転写されたＲＮＡから翻訳された公知のアレルゲンが天然の免疫グロブリン特性の修飾を誘発することができないことを明確にする。対照的に、それらの転写インフィデリティー（ＴＩ）変異体は、明らかに、これらの修飾を引き起こし、かつ、アレルギーを誘引することができる。
【００２３】
本発明はまた、種々の食品または医薬組成物もしくは医薬品（例えば、乳製品または酪農製品、ピーナッツ製品、ピーナッツ、医薬調製物など）のアレルゲン性を低減するための方法を提供する。より特定すると、本発明は、天然の免疫グロブリン特性の変化を誘発する能力を低減するための、アレルギー誘引物を除去および／または化学的に修飾する方法を提供する。本発明は、種々の形態のアレルギー（例えば、乳、ピーナッツ、ダニアレルギー）についておよびヒトを含む種々の哺乳動物種において例示される。
【００２４】
アレルギーのネズミモデルを使用して、本発明者らは、驚くべきことに、ＩｇＥ産生を誘導できないタンパク質が、転写インフィデリティーから生じるギャップ修飾を受けたときに、この能力を獲得したことを観察した。これは、アレルギーの分子起源が、従来のアレルゲンではなく転写インフィデリティーから生じるそれらのタンパク質変異体にあることを示唆している。この仮説を裏付けるために、本発明者らは、牛乳のＲＮＡを配列決定し、αＳ１−カゼインおよびβ−ラクトグロブリンなどの乳タンパク質の主要なＢエピトープの近傍にギャップの存在を観察した。本発明者らはまた、転写インフィデリティーから生じるギャップ修飾タンパク質が陽イオン性を有したことを実証した。したがって、本発明者らは、ＴＩが産生した陽イオン性タンパク質を濃縮するためのホエーの分画、次いで、濃縮した画分と枯渇した画分のＩｇＥを誘導する能力の比較を進めた。注目すべきことに、そして、意外なことに、５７μgの用量で投与された濃縮した画分は、ホエータンパク質１．９mgで観察された場合と同等のＩｇＥ産生を誘導する。その一方で、枯渇した画分５７μgは、あまりＩｇＥ産生を誘導しない。したがって、これらの結果は、微量なタンパク質の変異体がＩｇＥの産生を誘引することができることを示す（Ｎ末端部へ向かう伸長によって、ＩｇＥはまた、正常なタンパク質とも結合する）。したがって、本発明は、アレルギーの起源の分子機序を開示し、かつ、アレルギーの早期診断、治療および予防のための、ならびに免疫応答を調節するための新たなアプローチを提供する。
【００２５】
本発明のある目的は、より特定すると、組成物のアレルゲン性または免疫原性を低減するための方法であって、組成物を処理して転写インフィデリティーから生じるタンパク質を除去することを含む方法にある。
【００２６】
本発明の別の目的は、組成物のアレルゲン性または免疫原性を低減するための方法であって、組成物を処理して陽イオン性タンパク質を除去することを含む方法にある。
【００２７】
本発明はまた、上の方法によって得ることが可能な組成物ならびにその使用に関する。
【００２８】
本発明の文脈内で、用語「免疫原性」は、哺乳動物において免疫応答を誘導する組成物またはタンパク質または分子の能力を指す。これは、例えば、抗体産生もしくはＴ細胞応答を誘引する能力、または既存の免疫応答を刺激もしくは増幅する能力を含む。免疫原性という用語は、例えば、アレルゲン性を含む。
【００２９】
本発明の文脈内で、用語「アレルゲン性」は、例えば、哺乳動物においてアレルギーを誘導する組成物またはタンパク質または分子の能力を指す。これは、例えば、アレルギーを誘引する能力、またはアレルギーを刺激もしくは増幅する能力を含む。特定の例において、アレルゲン性は、ＩｇＥのインビボ産生を誘導または刺激する能力を指す。
【００３０】
アレルゲン性または免疫原性を「低減すること」は、アレルゲン性または免疫原性の、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％またはそれより多くの減少を示す。好ましい実施態様において、アレルゲン性または免疫原性を「低減すること」は、組成物のアレルゲン性または免疫原性の少なくとも７０％、８０％、９０％またはそれより多くの低減を指す。用語「低減すること」はまた、アレルゲン性または免疫原性の抑制も包含する。
【００３１】
成分を「除去すること」は、前記成分の量を少なくとも低減すること、好ましくは参照材料と比較した場合に少なくとも２０％低減することを意味する。本発明の特定の実施態様において、成分を「除去すること」は、前記成分の少なくとも５０％、６０％、７０％またはそれより多くの除去、さらにより好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多くの除去を指す。特定の実施態様において、除去することは、生じた材料が成分を実質的に含まない、成分の完全な除去を包含する。
【００３２】
「タンパク質」は、アミノ酸を含む分子を指す。したがって、該用語は、天然起源、精製された、修飾された、組換え、合成などであり得る、ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドを指す。本発明に係るペプチドは、典型的には、３〜７０、特定すると５〜５０、５〜４０、または５〜３０アミノ酸長を含有する。
【００３３】
「陽イオン性」タンパク質は、本発明の文脈内で、７．４以上、好ましくは７．６以上、７．８以上、８以上、８．５以上、より好ましくは９以上の等電点を有するタンパク質を意味する。組成物の「陽イオン画分」は、陽イオン性タンパク質を含有するその組成物の画分を指す。
【００３４】
用語「アレルゲン」は、哺乳動物においてアレルギーを引き起こすことができる任意の分子を指す。タンパク質性アレルゲンは、その構造内にアミノ酸を含むアレルゲンを指す。本発明に係るアレルゲンは、食品、呼吸、接触、または環境アレルゲン、例えば、ピーナッツ、卵、乳またはダニアレルゲンから選択してよい。ピーナッツアレルゲンの例は、Ａｒａ  ｈ  １、Ａｒａ  ｈ  ２、Ａｒａ  ｈ  ３、Ａｒａ  ｈ  ５、Ａｒａ  ｈ  ６、Ａｒａ  ｈ  ７、Ａｒａ  ｈ  ８、Ａｒａ  ｈ  ９、Ａｒａ  ｈ  １０およびＡｒａ  ｈ  １１ピーナッツタンパク質の中から選択される。
【００３５】
用語「転写インフィデリティー」（ＴＩ）は、ＤＮ転写が間違った配列を有するＲＮＡ分子を生成し、その後異常なタンパク質を導く、制御された機序のことを言う。転写インフィデリティーは、出願人によって発見され、例えば、ＷＯ２００８／００９７５１に記載されている。ＴＩは、１以上の差異を有するＲＮＡを生成することができる。そのような差異は、例えば、最終的に異常な配列を有するＴＩタンパク質を生成する、ヌクレオチドの置換、挿入および／またはギャップ（欠失）であり得る。本発明の文脈において特に興味深いＴＩタンパク質は、ＴＩギャップタンパク質であり、それは、Ｃ末端が修飾されたタンパク質を導く、転写中のヌクレオチドの抑制から生じる配列を含む。
【００３６】
本出願の実施例１に記載の通り、出願人は、驚くべきことに、免疫応答（ＩｇＥ産生）を通常誘導できないタンパク質が、転写インフィデリティーから生じるギャップ修飾を受けたときに、この能力を獲得したことを観察した。したがって、ギャップから生じるＣ末端配列の存在は、このタンパク質に、正常なタンパク質にはない免疫原性（アレルゲン性）を与えるモチーフを導入する。
【００３７】
この機序の重要性を確認するために、出願人は、主要な乳タンパク質に対して全ての転写インフィデリティー事象のバイオインフォマティクスアノテーションを行った。ＴＩ事象の出現を正確に定義するために、本発明者らは、したがって、乳タンパク質をコードするＲＮＡの次世代シーケンシング（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）を行った。注目すべきことに、得られた配列によって、乳タンパク質中のＴＩの位置を厳密に特定すること、ならびにＴＩギャップタンパク質の配列を正確に知ることが可能となった（実施例２を参照のこと）。特に、本発明者らは、ＴＩギャップから生じ、かつ、対応するタンパク質にアレルゲン性を付与する、以下のペプチドを特定した（表１）：
【００３８】
【表１】
2019513413.tif 000002
【００３９】
研究を継続して、本発明者らはまた、驚くべきことに、ＲＮＡ配列内の塩基の脱落（ギャップ）によるリーディングフレームのシフトから生じるＴＩタンパク質が、正電荷を帯びた塩基性アミノ酸のより高い含量および酸性アミノ酸の極めて低い含量を有することを観察した。これは、陽イオン性を有するタンパク質を生じる。例示として、乳において特定されたＴＩギャップタンパク質の等電点を以下の表２に与える：
【００４０】
【表２】
2019513413.tif 000003
【００４１】
この表２から、アレルゲン性を有するＴＩギャップタンパク質がまた、標準的なタンパク質よりもはるかに高い等電点を有することが分かる。これらのタンパク質のこの陽イオン性は、それによって、特に等電点に基づいた分離技術によってそれらを除去することが可能となるため、有利である。したがって、陽イオン交換技術によって、事前に定義された値を超える等電点を有するタンパク質を除去することが可能である。よって、陽イオン画分をそこから除去することによって低アレルゲン性（または低免疫原性）組成物を生産することが可能である。この点において、実施例３において裏付けられる通り、陽イオン画分が枯渇した乳は、インビボでＩｇＥを誘導しないが、陽イオン画分は、大規模なＩｇＥ産生を導く。
【００４２】
したがって、本発明によって、ｉ）全ての形態の臨床的に重要なアレルギーの早期および正確な分子診断のための、ｉｉ）陽イオン性タンパク質もしくはＴＩが産生したタンパク質の除去によってより少ない免疫原性／アレルゲン性を有する組成物を生産するための、ｉｉｉ）アレルギーの発症を防止もしくは低減するために、ＴＩが産生した陽イオン性タンパク質をある特定の食品調製物から除去するための、ｉｖ）リスクがあると特定された被験体を対象としたある特定の食品調製物のアレルゲンの主要供給源を除去するための、ｖ）抗体を誘導するために使用される新たなアジュバントを生産するための、またはｖｉ）それらの特異性とは関係なしに全ての形態のアレルギーに対応することができる新たな脱感作戦略を定義するための、新たなツールおよびプロセスを設計することが可能となる。
【００４３】
したがって、本発明のある態様は、製品のアレルゲン性または免疫原性を低減するための方法であって、ＴＩタンパク質をそこから除去することまたは陽イオン画分をそこから除去することによる方法に関する。この方法を、例えば、食品（例えば、乳、ピーナッツ）、化粧品、飼料、医薬品などの種々の製品に適用してよい。
【００４４】
これに関して、本発明のある目的は、食品を調製するための方法であって、（ｉ）食品調製物を提供すること、（ｉｉ）食品調製物を処理してそこからＴＩタンパク質、好ましくはＴＩギャップタンパク質を除去すること、および（ｉｉｉ）場合により、処理された食品を１以上の好適な賦形剤と共に製剤化することを含む方法に関する。
【００４５】
本発明の別の目的は、食品を調製するための方法であって、（ｉ）食品調製物を提供すること、（ｉｉ）食品調製物を処理してそこから陽イオン性タンパク質を除去すること、および（ｉｉｉ）場合により、処理された食品を１以上の好適な賦形剤と共に製剤化することを含む方法に関する。
【００４６】
本発明の別の目的は、化粧品を調製するための方法であって、（ｉ）化粧用物質を提供すること、（ｉｉ）化粧用物質を処理してそこからＴＩタンパク質（好ましくは、ＴＩギャップタンパク質）または陽イオン性タンパク質を除去すること、および（ｉｉｉ）場合により、処理された化粧用物質を１以上の好適な賦形剤と共に製剤化することを含む方法に関する。
【００４７】
本発明の別の目的は、医薬用物質を調製するための方法であって、（ｉ）医薬用物質を提供すること、（ｉｉ）医薬用物質を処理してそこからＴＩタンパク質（好ましくは、ＴＩギャップタンパク質）または陽イオン性タンパク質を除去すること、および（ｉｉｉ）場合により、処理された医薬用物質を１以上の好適な賦形剤と共に製剤化することを含む方法に関する。
【００４８】
好ましい実施態様において、上の方法は、製品または組成物から、転写インフィデリティーから、さらにより特定すると転写インフィデリティーギャップから生じる、陽イオン性タンパク質を除去することを含む。より好ましくは、該方法は、７．４以上の等電点を有する陽イオン性タンパク質の少なくとも５０％を除去することを含む。
【００４９】
好ましい実施態様において、処理された組成物は、２重量％未満、より好ましくは１％未満、さらにより好ましくは０．５％未満、０．２％未満、または０．１％未満の８を超える等電点を有する陽イオン性タンパク質を含有する。
【００５０】
例えば、本発明者らの分析は、未処理の乳が、およそ３重量％の７．４を超える等電点を有する陽イオン性タンパク質を含有することを示す。本発明の方法は、好ましくは、前記タンパク質の少なくとも５０％を除去し、したがって、１．５重量％未満の陽イオン性タンパク質を含有する乳調製物を導く。好ましい実施態様において、本発明の処理された乳調製物は、１％未満、より好ましくは０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、またはさらに０．１重量％未満の８を超える等電点を有する陽イオン性タンパク質を含有する。乳は、ウシ、ヤギまたはヒツジなどの任意のヒト以外の哺乳動物由来であり得る。乳は、人工乳であってもよい。
【００５１】
これに関して、本発明はまた、食品と好適な賦形剤とを含む食品組成物であって、食品が、１重量％未満、より好ましくは０．５％未満、０．３％未満、０．２％未満、または０．１％未満の７．４を超える等電点を有する陽イオン性タンパク質を含有する、食品組成物に関する。最も特定の実施態様において、食品は、乳、穀物またはピーナッツである。
【００５２】
本発明はまた、食品と好適な賦形剤とを含む食品組成物であって、食品が、１重量％未満、より好ましくは０．５％未満、０．３％未満、０．２％未満、または０．１％未満のＴＩギャップから生じる配列を有するタンパク質を含有する、食品組成物に関する。最も特定の実施態様において、食品は、乳、穀物またはピーナッツである。
【００５３】
特定の実施態様において、本発明は、乳製品または酪農製品を調製するための方法であって、配列番号１〜５から選択されるＴＩギャップペプチド配列を含む少なくとも１つのタンパク質を除去することを含む方法に関する。
【００５４】
別の特定の実施態様において、本発明は、ピーナッツ製品を調製するための方法であって、配列番号１１０〜１２０から選択されるＴＩギャップペプチド配列を含む少なくとも１つのタンパク質を除去することを含む方法に関する。
【００５５】
特定の実施態様において、本発明は、乳製品または酪農製品を調製するための方法であって、配列番号６〜１０から選択される配列を含む少なくとも１つのタンパク質を除去することを含む方法に関する。
【００５６】
別の特定の実施態様において、本発明は、ピーナッツ製品を調製するための方法であって、配列番号１２１〜１３１から選択される配列を含む少なくとも１つのタンパク質を除去することを含む方法に関する。
【００５７】
本発明はまた、０．５重量％未満、好ましくは０．３％未満、０．２％未満、または０．１％未満の、それぞれ配列番号１〜５または配列番号１１０〜１２０から選択されるＴＩギャップペプチド配列を含むタンパク質を含む、乳製品もしくは酪農製品、またはピーナッツ製品に関する。
【００５８】
本発明はまた、０．５重量％未満、好ましくは０．３％未満、０．２％未満、または０．１％未満の、それぞれ配列番号６〜１０または配列番号１２１〜１３１から選択される配列を含むタンパク質を含む、乳製品もしくは酪農製品、またはピーナッツ製品に関する。
【００５９】
本発明はまた、化粧用物質と好適な賦形剤とを含む化粧用組成物であって、化粧用物質が、１重量％未満、より好ましくは０．５％未満、０．３％未満、０．２％未満、または０．１％未満の７．５を超える等電点を有する陽イオン性タンパク質を含有する、化粧用組成物に関する。
【００６０】
本発明はまた、医薬用物質と好適な賦形剤とを含む医薬組成物であって、医薬用物質が、１重量％未満、より好ましくは０．５％未満、０．３％未満、０．２％未満、または０．１％未満の７．５を超える等電点を有する陽イオン性タンパク質を含有する、医薬組成物に関する。
【００６１】
本発明をまた、アレルギー被験体の脱感作に好適な、低減されたアレルゲン性を有する免疫原性調製物を生産するのに使用してもよい。これに関して、本発明のある目的はまた、アレルゲン組成物を調製するための方法であって、（ｉ）タンパク質性アレルゲン調製物を提供すること、（ｉｉ）調製物を処理してそこから陽イオン性タンパク質を除去すること、および（ｉｉｉ）場合により、調製物を１以上の好適な賦形剤と共に製剤化することを含む方法に関する。そのような処理された調製物は、免疫原性を保持し、かつ、アレルギー被験体において抵抗性を誘導するのに使用してよい。しかしながら、そのような処理された調製物は、それ自体、低減されたアレルゲン性を有し、かつ、望ましくない副作用を誘導する可能性は低い。そのような方法を、任意のアレルゲン調製物、例えば、呼吸、接触、食品、または環境アレルゲン（すなわち、ピーナッツ、卵、乳、ダニアレルゲンなど）と共に使用してよい。アレルゲンは、組換えタンパク質性アレルゲンであっても、部分的に精製された天然のアレルゲンであってもよい。
【００６２】
したがって、本発明はまた、タンパク質性アレルゲンと好適な賦形剤とを含む組成物であって、タンパク質性アレルゲンが、２重量％未満、より好ましくは１％未満、０．５％未満、０．２％未満、または０．１％未満の陽イオン性タンパク質を含有する、組成物に関する。
【００６３】
本発明はまた、アレルゲンに対してアレルギーがある被験体を処置して、前記アレルゲンに対して前記被験体を脱感作する方法であって、被験体に、上に定義した通りの組成物の有効量を投与することを含む方法に関係する。
【００６４】
本発明をまた、低減されたアレルゲン性または免疫原性を有する医薬調製物を生産するのに使用してもよい。これに関して、本発明のある目的はまた、医薬組成物を調製するための方法であって、（ｉ）タンパク質性薬物調製物を提供すること、（ｉｉ）調製物を処理してそこから陽イオン性タンパク質を除去すること、および（ｉｉｉ）場合により、調製物を１以上の好適な賦形剤と共に製剤化することを含む方法に関する。そのような処理された調製物は、薬学的活性を保持し、かつ、被験体を処置するのに使用してよい。しかしながら、そのような処理された調製物は、それ自体、低減されたアレルゲン性／免疫原性を有し、かつ、望ましくない副作用を誘導する可能性は低い。そのような方法を、任意のタンパク質性薬物調製物、例えば薬物、ホルモン、サイトカイン、酵素、成長因子などと共に使用してよい。
【００６５】
過去に言及されている通り、陽イオン画分またはタンパク質の除去は、当技術分野においてそれ自体公知の技術によって達成され得る。特に、陽イオン性タンパク質は、陽イオン交換技術を使用した分離によって除去してよい。陽イオン交換のための好適な材料の例は、例えば、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰもしくはＣＭ、ＨｉＬｏａｄ  ＳＰもしくはＣＭ、またはＢｕｌｋ  ＳＰもしくはＣＭを含む。特定の方法では、該プロセスは、（ｉ）ｐＨを所望の値に調整する工程（典型的には、７．４〜９の間）、および（ｉｉ）調製物を陽イオン交換に供する工程であって、調整されたｐＨ値を超える等電点を有する本質的に全ての材料が除去される工程を含む。特定の実施態様において、したがって、該方法は、（ｉ）組成物の溶液を、７．４〜９の間、好ましくは７．４〜８．５の間に含まれるｐＨを有するように調整すること、（ｉｉ）該溶液を陽イオン交換クロマトグラフィーに供すること、および（ｉｉｉ）溶出液を回収することを含む。
【００６６】
代替的に、または陽イオン交換に加えて、該方法は、例えば転写インフィデリティータンパク質に対して指向される抗体を使用した、アフィニティークロマトグラフィーの工程を含んでよい。そのような抗体は、当技術分野において一般的に公知の手順によって産生され得る。例えば、ポリクローナル抗体は、ＴＩタンパク質もしくはそのＴＩペプチド、または生体試料の陽イオン画分（単独でまたは好適な担体またはアジュバントに連結された）をヒト以外の動物に注射することによって産生され得る。適切な期間の後、動物から出血させ、血清を回収し、そして、当技術分野において公知の技術によって精製する（Paul, W.E. “Fundamental Immunology” Second Ed. Raven Press, NY, p. 176, 1989; Harlow et al. “Antibodies: A laboratory Manual”, CSH Press, 1988; Ward et al (Nature 341 (1989) 544）。
【００６７】
本発明はまた、ピーナッツの免疫原性またはアレルゲン性を低減するための方法であって、Ａｒａ  ｈ  １、Ａｒａ  ｈ  ２、Ａｒａ  ｈ  ３、Ａｒａ  ｈ  ５、Ａｒａ  ｈ  ６、Ａｒａ  ｈ  ７、Ａｒａ  ｈ  ８、Ａｒａ  ｈ  ９、Ａｒａ  ｈ  １０およびＡｒａ  ｈ  １１から選択される１以上のピーナッツタンパク質における転写インフィデリティー率を低減することを含む方法に関する。そのような方法は、合成ＤＮＡヌクレオチド配列をピーナッツ粒、種子、または植物中に組み込む工程であって、前記合成配列がＴＩギャップを生じる転写インフィデリティー（ＴＩ）率を制限する工程を含んでよい。そのような方法は、代替的に、転写インフィデリティー率を制限するためにおよびＴＩピーナッツタンパク質変異体の生成を回避するために、クラスター化反復短回文配列リピート（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）（ＣＲＩＳＰＲ）技術などの種々の公知の遺伝子工学技術を使用することによって、ＤＮＡ配列を修正および／または遺伝子改変する工程を含んでよい。特定の実施態様において、本発明は、低減された転写インフィデリティー率を有する改変されたＡｒａ  ｈタンパク質遺伝子を含む、トランスジェニックピーナッツ植物またはその種子もしくは粒に関する。改変された遺伝子は、好ましくは、改変されたＴまたはＡリピートドメインを含む。
【００６８】
本発明はまた、被験体におけるアレルギーを検出するための方法の開発を可能にする。この点において、したがって、本発明はまた、転写インフィデリティーから生じる配列を有するタンパク質に対して指向されるＩｇＥのレベルを被験体由来の試料中で測定することを含む、アレルギーになりやすい傾向を有する被験体を検出するための方法であって、対照値と比較した場合の前記レベルの差がアレルギーになりやすい傾向を有する被験体を示す方法に関係する。
【００６９】
本発明はまた、免疫応答の刺激を可能にする。実際に、特定されたＴＩタンパク質またはペプチドは、増加した免疫原性を示し、かつ、例えばアジュバントとして、免疫応答を誘導または刺激するのに使用してよい。
【００７０】
したがって、本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を刺激するための、特定すると抗体産生を刺激するためのアジュバントとして使用するための、転写インフィデリティーから生じる配列を含む陽イオン性タンパク質またはペプチドに関する。本発明は、特定すると、哺乳動物においてＩｇＥ産生を刺激または誘導するのに好適である。哺乳動物は、ヒト以外の哺乳動物であってもヒト哺乳動物であってもよい。
【００７１】
本発明はまた、哺乳動物、例えばヒトにおける抗体産生を誘導するまたは刺激する方法であって、哺乳動物に、転写インフィデリティーから生じる配列を有する陽イオン性タンパク質またはペプチドを投与することを含む方法に関係する。
【００７２】
本発明はまた、免疫原と転写インフィデリティーから生じる配列を有するタンパク質またはペプチドとを含むワクチン組成物に関係する。
【００７３】
本発明のさらなる目的は、抗体を産生するための方法であって、（ｉ）ヒト以外の哺乳動物に、転写インフィデリティーから生じる陽イオン性タンパク質またはペプチドを投与すること、（ｉｉ）産生された抗体を収集すること、および（ｉｉｉ）場合により、前記収集された抗体からモノクローナルおよび／またはヒト化抗体を得ることを含む方法に関する。
【００７４】
また、本発明のある目的は、抗ＩｇＥ抗体を製造する方法であって、（ｉ）ヒト以外の哺乳動物に、転写インフィデリティーから生じる陽イオン性タンパク質またはペプチドを、抗体産生の誘導を可能にする条件下で投与すること、（ｉｉ）産生された抗体を収集すること、および（ｉｉｉ）Ｆｃ受容体に結合する抗体を選択することを含む方法を提供することである。
【００７５】
本発明はまた、配列番号１〜５または配列番号７４〜１０９または配列番号１１０〜１２０から選択される配列を含むタンパク質またはペプチド、その断片、およびそのようなタンパク質またはペプチドを含む組成物に関する。本発明のペプチド、またはその断片は、好ましくは、７０以下、さらにより好ましくは６０以下、５０以下、４０、３５以下、または３０以下のアミノ酸残基長を有する。本発明の特定のペプチドは、配列番号１〜５のいずれか１つからなるか、またはその少なくとも１０の連続残基を含有するその断片である。断片は、好ましくは、免疫原性またはアレルゲン性を保持するものとする。本発明はまた、配列番号６〜１０または配列番号１６〜５１または配列番号１２１〜１３１のいずれか１つを含むタンパク質に関する。
【００７６】
本発明のさらなる態様および利点は、以下の実験の部において開示されるが、それは、特許請求の範囲を例示するものである。
【実施例】
【００７７】
実施例１：アレルギーの分子起源の概念実証
出願人は、マウスの実験用の認可動物施設を有し、２つのアレルギーの前臨床ネズミモデルを開発および公表した：一方はピーナッツ（Proust et al., 2008, Int Arch Allergy Immunol 146, 212-218）、他方は牛乳（Proust et al., 2009, European Annals of AllergyおよびClinical Immunology 41(3): 85-94）を用いた。
【００７８】
アレルギーの分子起源の仮説を、タンパク質がアレルゲン性である場合にタンパク質の６回の逐次的な胃内投与（１週間当たり１回の割合で）がＩｇＥ産生を誘導する、乳アレルギーモデルで試験した。仮説を試験するために２つの異なるペプチドを選択した：ＴＩ事象を受けていない正常なペプチド（非ＴＩペプチド）、およびＴＩペプチド（転写インフィデリティー事象から生じる）。これらの２つのペプチドをマウスに６週間投与し、そして、ＩｇＥ産生を経時的に追跡した（図１）。
【００７９】
図１に示す通り、ＩｇＥ合成は、マウスをＴＩペプチドに曝露させたとき大規模であるが、非ＴＩペプチドではごくわずかである。ＴＩペプチドおよび非ＴＩペプチドの単回腹腔内投与を使用して、同じ結果が得られた（図２）。
【００８０】
これらの２つの実験は、ＴＩペプチドが、胃内および腹腔内の両投与において、それらの特定の物理化学的特性によって、ＩｇＥ産生の起源であることを示す。この例は、転写インフィデリティーによって生成される大きなタンパク質異質性がアレルギー誘引物の供給源であることを例示する。
【００８１】
実施例２：乳タンパク質の分析
乳タンパク質をコードするＲＮＡを得るために、本発明者らは、乳中に存在する上皮細胞を使用した。実際に、これらの細胞は、ウシ乳腺において発現されるＲＮＡの発現を研究するための良好な代替物である（Canovas et al., 2014, Scientific Reports 4:5297）。
【００８２】
本発明者らは、農場から未処理のプリム・ホルスタイン（Prim’Holstein）牛の乳を得た。この乳から上皮細胞を精製した。
【００８３】
これらの細胞から、トータルＲＮＡを抽出した。Illumina次世代シーケンシングのためのライブラリーを調製する前に、これらのＲＮＡの完全性を確認した（RNA Integrity Number（ＲＩＮ）＝７．６）。このＲＩＮ値は、Illuminaライブラリーの調製と互換性がある。
【００８４】
本発明者らは、２つのライブラリーの平均品質指数が３０を超えること（ライブラリー１：３５．６およびライブラリー２：３５．６）、ならびに２つのライブラリーについて読み取り値の９４％が３０を上回る品質指数を有することを確認することができた。配列の品質は、本発明者らの分析に必要な標準と互換性がある。
【００８５】
ＴＩが起こる位置を定義するために、得られた読み取り値を、Bos taurus reference genome version UMD_3.1.1（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/82）に対して、およびゲノムから構築されたトランスクリプトームに対して整列させた。
【００８６】
最初に、本発明者らは、ＲＮＡによってコードされるタンパク質の配列の最も重要な修飾を導くＴＩ差の種類を研究した。これは、「ＴＩギャップ」とも呼ばれる欠失である（図３）。
【００８７】
ＴＩギャップがＲＮＡ配列内に現れるとき、タンパク質配列は、高度に修飾されている。実際に、塩基の欠失は、リーディングフレームのシフトを引き起こし、それ自体、事象の下流に位置するタンパク質配列に対して劇的な影響をもたらす。注目すべきことに、本発明者らは、転写インフィデリティー（欠失）から生じるタンパク質のカルボキシ末端部分で、塩基性アミノ酸が濃縮し、酸性アミノ酸が窮乏したことを発見した。よって、ＴＩから生じるタンパク質は、陽イオン性を有する。
【００８８】
概念実証として、本発明者らは、Allergome database（http://www.allergome.org/）において特定された主要な乳アレルゲンの配列を分析した。アレルゲンを以下の表３に提示する。
【００８９】
【表３】
2019513413.tif 000004
【００９０】
配列データを用いて、本発明者らは、乳から単離された細胞におけるこれらの遺伝子の発現を推定することができる。そのために、本発明者らは、各遺伝子に対して整列された読み取り値の数を算出した（ＲＰＫＭ：Reads Per Kilobase per Million mapped reads）（Mortazavi et al., 2008, Nature Methods, 5(7): 621-28）。
【００９１】
結果を以下の表４に示す：
【００９２】
【表４】
2019513413.tif 000005
【００９３】
本発明者らは、２つのライブラリーにおいて同じ位置に高頻度で起こるＴＩギャップ事象を選択した。同様に、塩基性アミノ酸が最も濃縮した配列を有するタンパク質をコードするＴＩギャップを選択した。したがって、本発明者らは、乳において以下のＴＩタンパク質を特定することができた（配列番号６〜１０）：下線部は、ＴＩギャップペプチドの配列に対応する。比較のために、標準的なタンパク質の配列を提供する（配列番号１１〜１５）：
【００９４】
ＣＳＮ１Ｓ１  （配列番号１１）
【化１】
2019513413.tif 000006
ＣＳＮ１Ｓ１＿ＴＩ  （配列番号６）
【化２】
2019513413.tif 000007
ＣＳＮ１Ｓ２  （配列番号１２）
【化３】
2019513413.tif 000008
ＣＳＮ１Ｓ２＿ＴＩ  （配列番号７）
【化４】
2019513413.tif 000009
ＣＳＮ２  （配列番号１３）
【化５】
2019513413.tif 000010
ＣＳＮ２＿ＴＩ  （配列番号８）
【化６】
2019513413.tif 000011
ＣＳＮ３  （配列番号１４）
【化７】
2019513413.tif 000012
ＣＳＮ３＿ＴＩ  （配列番号９）
【化８】
2019513413.tif 000013
ＰＡＥＰ  （配列番号１５）
【化９】
2019513413.tif 000014
ＰＡＥＰ＿ＴＩ  （配列番号１０）
【化１０】
2019513413.tif 000015
【００９５】
本発明者らは、全ゲノムを分析し、開示されるペプチドが、ウシのトランスクリプトームまたはゲノムにおいて別の配列から産生され得ないことを確認した。
【００９６】
そのように特定されたペプチド、およびそれらを含有する完全長タンパク質は、乳アレルゲンである。乳からこれらのタンパク質を除去することによって、低アレルゲン性乳を得ることが可能となる。さらに、これらのタンパク質およびペプチドはまた、哺乳動物における免疫応答を刺激するための、特に抗体産生を刺激するための、アジュバントとして使用することもできる。
【００９７】
実施例３：低アレルゲン性乳の生産
ＴＩペプチドの物理化学的特性およびＩｇＥ産生におけるそれらの重要性は、これらのタンパク質を欠く低アレルゲン性の乳児用調製粉乳の開発へと導いた。
【００９８】
この目的のために、本発明者らは、２つの画分を生産するために乳のクロマトグラフ分画を行った：一方はＴＩタンパク質が濃縮した画分、他方はＴＩタンパク質が枯渇した画分。
【００９９】
初期の粗材料は、固相状態である（ホエー粉末）。
【０１００】
材料は、カゼイン以外、全て可溶性天然乳タンパク質から構成される。
【０１０１】
材料を、所望の値（すなわち、ｐＨ７．４）に調整された緩衝液に溶解する。次いで、残りの不溶性部分を濾過によってまたは遠心分離によって除去する。材料を、Akta Xpressクロマトグラフシステム（GE Healthcare Lifesciences）を使用する陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（HiTrap SP FF）に注入する。分離は、各タンパク質の等電点に基づく。その等電点がｐＨ７．４より高いタンパク質（すなわち、陽イオン画分）は樹脂に結合し、そして、その等電点がｐＨ７．４以下であるタンパク質（すなわち、非荷電および陰イオン画分）はフロースルー（ＦＴ）で溶出する。ＦＴを収集したら、カラムを洗浄する。次いで、ｐＨ７．４の緩衝液を注入することによって、陽イオン画分（それは、ｐＨ７．４より高い等電点を有するタンパク質を含有する）がカラムから溶出し、これを収集する。
【０１０２】
それ故、ＦＴは、その陽イオン画分が枯渇した初期材料に対応し、生成物ｎ°１と呼ばれる。生成物ｎ°１の主な特性は、アレルギーを誘引する陽イオン画分の９５％が除去されていることである。したがって、生成物ｎ°１は、１工程の物理化学的分離によって得ることが可能であり、産業に適合可能である。
【０１０３】
好適であれば、さらなる処理工程を実施して、本質的に全てのＴＩタンパク質を除去してよい。そのようなさらなる処理は、転写インフィデリティー抗体（ＴＩＡＢ）を使用する親和性結合工程である。より特定すると、ＴＩＡＢは、ウシ血清から得られる。簡潔に述べると、ウシ血清を熱活性化し、次いで、総ＩｇＧをアフィニティークロマトグラフィー（タンパク質Ｇに基づく）によって精製する。生成物ｎ°１をウシＴＩＡＢとインキュベートし、次いで、タンパク質Ｇに基づくアフィニティークロマトグラフィーに送る。総ＩｇＧ（転写インフィデリティーから生じたタンパク質と複合体化したものを含む）は、樹脂に結合し、そして、ＦＴは、アレルギー誘引物が全体的に枯渇した材料を含有する（生成物ｎ°２と呼ばれる）。
【０１０４】
生産された画分を、図１に示すプロトコルに従って、胃内経路を介してマウスに投与し、そして、ＩｇＥ産生を経時的に追跡した（図４）。
【０１０５】
図４に提示する結果は、ＴＩタンパク質が濃縮した画分に曝露されたマウスはＩｇＥを大規模に産生するが、枯渇した画分に曝露されたマウスはＩｇＥをほとんど産生しないことを示す。それによって、本発明者らは、１／乳中のＴＩタンパク質が、実際に、乳のアレルゲン性の起源である、および、２／枯渇した画分が濃縮した画分よりもはるかに低いアレルゲン性であると結論付けることができる。したがって、本発明によって、低アレルゲン性乳を生産することが可能となる。
【０１０６】
実施例４：ダニアレルゲンの分析
この分析は、ダニアレルゲンおよび非アレルゲンにおけるＴＩギャップ事象の位置確認に基づく。本発明者らは、驚くべきことに、ＴＩ欠失事象が、ダニアレルゲンをコードする転写産物のコーディング領域内（ＯＲＦ−ＩＮ）に主に存在するが、ダニアレルゲンをコードしない転写産物の場合ではＴＩ欠失事象が主にコーディング領域の外側（ＯＲＦ−ＯＵＴ）であることを観察した。
【０１０７】
この研究を行うために、本発明者らは、Illumina次世代シーケンシングによってコナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farina）のＲＮＡ配列を分析した。本発明者らは、２つの配列の群を作った：（１）アレルゲンとして公知の転写産物、および（２）アレルゲンではない転写産物。２つの群は、表５にまとめる通り、類似の配列特徴（例えば、４つの塩基の頻度、各位置における平均適用範囲（mean coverage）、適用される転写産物の長さ、エクソン数）を有する。
【０１０８】
【表５】
2019513413.tif 000016
表５：アレルゲンをコードする転写産物対非アレルゲン（すなわち、アレルゲンと称されないタンパク質）をコードする転写産物の比較。各群は、３５の転写産物を含む。評価されたパラメーターは、２つの群が類似することを示す。
【０１０９】
本発明者らは、これらの転写産物における転写インフィデリティー（ＴＩ）の事象を特定し、そして、本発明者らは、２つの群、すなわちアレルゲンと非アレルゲンを比較した。本発明者らの結果は、非コーディング領域に主に見いだされる非アレルゲンの配列に影響を及ぼすＴＩ欠失事象とは違って、アレルゲンの配列に影響を及ぼすＴＩ欠失は、コーディング領域内、すなわちＯＲＦ内に主に位置することを示す（図５を参照のこと）。
【０１１０】
本発明者らはまた、コーディング配列における欠失の数と非コーディング配列における欠失の数の間の比を分析し、そして、本発明者らは、アレルゲンのコーディング配列における欠失がＡ塩基またはＴ塩基の反復に優先的に影響を及ぼすことを観察した（図６を参照のこと）。
【０１１１】
影響を受けたＡ塩基の反復の後に、主にＴ塩基が続き、そして、影響を受けたＴ塩基の反復の後にＧ塩基が続く；したがって、これらの２つの種類の事象は、これらがＯＲＦ内に位置するとき、アレルゲンに非常に特異的である。これらの事象は、約０．２％〜１０％、より好ましくは０．２％〜５％の転写産物のかなりの部分に影響を及ぼす。
【０１１２】
本発明者らは、コナヒョウヒダニにおける全てのＴＩギャップ事象について以下のＴＩアレルゲン性タンパク質を特定することができた：配列番号１６〜５１。配列の下線部は、配列番号７４〜１０９としても以下に列挙されるＴＩギャップペプチドの配列に対応する。比較のために、標準的なタンパク質の配列がまた提供される（配列番号５２〜７３）。
【０１１３】
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ１  （配列番号５２）
【化１１】
2019513413.tif 000017
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号１６）
【化１２】
2019513413.tif 000018
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号１７）
【化１３】
2019513413.tif 000019
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号１８）
【化１４】
2019513413.tif 000020
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号１９）
【化１５】
2019513413.tif 000021
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ２  （配列番号５３）
【化１６】
2019513413.tif 000022
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ２＿ＴＩ  （配列番号２０）
【化１７】
2019513413.tif 000023
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ２＿ＴＩ  （配列番号２１）
【化１８】
2019513413.tif 000024
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ２＿ＴＩ  （配列番号２２）
【化１９】
2019513413.tif 000025
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ２＿ＴＩ  （配列番号２３）
【化２０】
2019513413.tif 000026
Ｄｅｒ  ｆ  ２３＿ｉｓｏ１  （配列番号５４）
【化２１】
2019513413.tif 000027
Ｄｅｒ  ｆ  ２３＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号２４）
【化２２】
2019513413.tif 000028
Ｄｅｒ  ｆ  １１＿ｉｓｏ１  （配列番号５５）
【化２３】
2019513413.tif 000029
Ｄｅｒ  ｆ  １１＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号２５）
【化２４】
2019513413.tif 000030
Ｄｅｒ  ｆ  １１＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号２６）
【化２５】
2019513413.tif 000031
Ｄｅｒ  ｆ  １５＿ｉｓｏ１  （配列番号５６）
【化２６】
2019513413.tif 000032
Ｄｅｒ  ｆ  １５＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号２７）
【化２７】
2019513413.tif 000033
Ｄｅｒ  ｆ  ３２＿ｉｓｏ１  （配列番号５７）
【化２８】
2019513413.tif 000034
Ｄｅｒ  ｆ  ３２＿ｉｓｏ１＿ＴＩ    （配列番号２８）
【化２９】
2019513413.tif 000035
Ｄｅｒ  ｆ  ２５＿ｉｓｏ１  （配列番号５８）
【化３０】
2019513413.tif 000036
Ｄｅｒ  ｆ  ２５＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号２９）
【化３１】
2019513413.tif 000037
Ｄｅｒ  ｆ  ２５＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号３０）
【化３２】
2019513413.tif 000038
Ｄｅｒ  ｆ  １６＿ｉｓｏ１  （配列番号５９）
【化３３】
2019513413.tif 000039
Ｄｅｒ  ｆ  １６＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号３１）
【化３４】
2019513413.tif 000040
Ｄｅｒ  ｆ  ２６＿ｉｓｏ１  （配列番号６０）
【化３５】
2019513413.tif 000041
Ｄｅｒ  ｆ  ２６＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号３２）
【化３６】
2019513413.tif 000042
Ｄｅｒ  ｆ  ２６＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号３３）
【化３７】
2019513413.tif 000043
Ｄｅｒ  ｆ  ２３＿ｉｓｏ２  （配列番号６１）
【化３８】
2019513413.tif 000044
Ｄｅｒ  ｆ  ２３＿ｉｓｏ２＿ＴＩ  （配列番号３４）
【化３９】
2019513413.tif 000045
Ｄｅｒ  ｆ  １３＿ｉｓｏ１  （配列番号６２）
【化４０】
2019513413.tif 000046
Ｄｅｒ  ｆ  １３＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号３５）
【化４１】
2019513413.tif 000047
Ｄｅｒ  ｆ  ７＿ｉｓｏ１  （配列番号６３）
【化４２】
2019513413.tif 000048
Ｄｅｒ  ｆ  ７＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号３６）
【化４３】
2019513413.tif 000049
Ｄｅｒ  ｆ  ２７＿ｉｓｏ１  （配列番号６４）
【化４４】
2019513413.tif 000050
Ｄｅｒ  ｆ  ２７＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号３７）
【化４５】
2019513413.tif 000051
Ｄｅｒ  ｆ  ７＿ｉｓｏ２  （配列番号６５）
【化４６】
2019513413.tif 000052
Ｄｅｒ  ｆ  ７＿ｉｓｏ２＿ＴＩ    （配列番号３８）
【化４７】
2019513413.tif 000053
Ｄｅｒ  ｆ  ２９＿ｉｓｏ１  （配列番号６６）
【化４８】
2019513413.tif 000054
Ｄｅｒ  ｆ  ２９＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号３９）
【化４９】
2019513413.tif 000055
Ｄｅｒ  ｆ  １８＿ｉｓｏ１  （配列番号６７）
【化５０】
2019513413.tif 000056
Ｄｅｒ  ｆ  １８＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号４０）
【化５１】
2019513413.tif 000057
Ｄｅｒ  ｆ  １６＿ｉｓｏ２  （配列番号６８）
【化５２】
2019513413.tif 000058
Ｄｅｒ  ｆ  １６＿ｉｓｏ２＿ＴＩ  （配列番号４１）
【化５３】
2019513413.tif 000059
Ｄｅｒ  ｆ  ７＿ｉｓｏ３  （配列番号６９）
【化５４】
2019513413.tif 000060
Ｄｅｒ  ｆ  ７＿ｉｓｏ３＿ＴＩ  （配列番号４２）
【化５５】
2019513413.tif 000061
Ｄｅｒ  ｆ  ２０＿ｉｓｏ１  （配列番号７０）
【化５６】
2019513413.tif 000062
Ｄｅｒ  ｆ  ２０＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号４３）
【化５７】
2019513413.tif 000063
Ｄｅｒ  ｆ  ２０＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号４４）
【化５８】
2019513413.tif 000064
Ｄｅｒ  ｆ  ２０＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号４５）
【化５９】
2019513413.tif 000065
Ｄｅｒ  ｆ  ２０＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号４６）
【化６０】
2019513413.tif 000066
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ３  （配列番号７１）
【化６１】
2019513413.tif 000067
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ３＿ＴＩ  （配列番号４７）
【化６２】
2019513413.tif 000068
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ３＿ＴＩ  （配列番号４８）
【化６３】
2019513413.tif 000069
Ｄｅｒ  ｆ  １５＿ｉｓｏ２  （配列番号７２）
【化６４】
2019513413.tif 000070
Ｄｅｒ  ｆ  １５＿ｉｓｏ２＿ＴＩ  （配列番号４９）
【化６５】
2019513413.tif 000071
Ｄｅｒ  ｆ  ２０＿ｉｓｏ２  （配列番号７３）
【化６６】
2019513413.tif 000072
Ｄｅｒ  ｆ  ２０＿ｉｓｏ２＿ＴＩ  （配列番号５０）
【化６７】
2019513413.tif 000073
Ｄｅｒ  ｆ  ２０＿ｉｓｏ２＿ＴＩ  （配列番号５１）
【化６８】
2019513413.tif 000074
【０１１４】
上のＴＩタンパク質に含まれるＴＩギャップペプチドの配列（下線の形態）は、以下である：
【０１１５】
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号７４）
【化６９】
2019513413.tif 000075
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号７５）
【化７０】
2019513413.tif 000076
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号７６）
【化７１】
2019513413.tif 000077
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号７７）
【化７２】
2019513413.tif 000078
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ２＿ＴＩ  （配列番号７８）
【化７３】
2019513413.tif 000079
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ２＿ＴＩ  （配列番号７９）
【化７４】
2019513413.tif 000080
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ２＿ＴＩ  （配列番号８０）
【化７５】
2019513413.tif 000081
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ２＿ＴＩ  （配列番号８１）
【化７６】
2019513413.tif 000082
Ｄｅｒ  ｆ  ２３＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号８２）
【化７７】
2019513413.tif 000083
Ｄｅｒ  ｆ  １１＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号８３）
【化７８】
2019513413.tif 000084
Ｄｅｒ  ｆ  １１＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号８４）
【化７９】
2019513413.tif 000085
Ｄｅｒ  ｆ  １５＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号８５）
【化８０】
2019513413.tif 000086
Ｄｅｒ  ｆ  ３２＿ｉｓｏ１＿ＴＩ    （配列番号８６）
【化８１】
2019513413.tif 000087
Ｄｅｒ  ｆ  ２５＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号８７）
【化８２】
2019513413.tif 000088
Ｄｅｒ  ｆ  ２５＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号８８）
【化８３】
2019513413.tif 000089
Ｄｅｒ  ｆ  １６＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号８９）
【化８４】
2019513413.tif 000090
Ｄｅｒ  ｆ  ２６＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号９０）
【化８５】
2019513413.tif 000091
Ｄｅｒ  ｆ  ２６＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号９１）
【化８６】
2019513413.tif 000092
Ｄｅｒ  ｆ  ２３＿ｉｓｏ２＿ＴＩ  （配列番号９２）
【化８７】
2019513413.tif 000093
Ｄｅｒ  ｆ  １３＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号９３）
【化８８】
2019513413.tif 000094
Ｄｅｒ  ｆ  ７＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号９４）
【化８９】
2019513413.tif 000095
Ｄｅｒ  ｆ  ２７＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号９５）
【化９０】
2019513413.tif 000096
Ｄｅｒ  ｆ  ７＿ｉｓｏ２＿ＴＩ    （配列番号９６）
【化９１】
2019513413.tif 000097
Ｄｅｒ  ｆ  ２９＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号９７）
【化９２】
2019513413.tif 000098
Ｄｅｒ  ｆ  １８＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号９８）
【化９３】
2019513413.tif 000099
Ｄｅｒ  ｆ  １６＿ｉｓｏ２＿ＴＩ  （配列番号９９）
【化９４】
2019513413.tif 000100
Ｄｅｒ  ｆ  ７＿ｉｓｏ３＿ＴＩ  （配列番号１００）
【化９５】
2019513413.tif 000101
Ｄｅｒ  ｆ  ２０＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号１０１）
【化９６】
2019513413.tif 000102
Ｄｅｒ  ｆ  ２０＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号１０２）
【化９７】
2019513413.tif 000103
Ｄｅｒ  ｆ  ２０＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号１０３）
【化９８】
2019513413.tif 000104
Ｄｅｒ  ｆ  ２０＿ｉｓｏ１＿ＴＩ  （配列番号１０４）
【化９９】
2019513413.tif 000105
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ３＿ＴＩ  （配列番号１０５）
【化１００】
2019513413.tif 000106
Ｄｅｒ  ｆ  １＿ｉｓｏ３＿ＴＩ  （配列番号１０６）
【化１０１】
2019513413.tif 000107
Ｄｅｒ  ｆ  １５＿ｉｓｏ２＿ＴＩ  （配列番号１０７）
【化１０２】
2019513413.tif 000108
Ｄｅｒ  ｆ  ２０＿ｉｓｏ２＿ＴＩ  （配列番号１０８）
【化１０３】
2019513413.tif 000109
Ｄｅｒ  ｆ  ２０＿ｉｓｏ２＿ＴＩ  （配列番号１０９）
【化１０４】
2019513413.tif 000110
【０１１６】
結論として、したがって、本発明者らは、ダニアレルゲンのコーディング配列に対して影響を与える転写インフィデリティー（ＴＩ）事象であって、ダニアレルギーを誘引する原因となるタンパク質変異体を生じるＴＩ事象を特定することができた。
【０１１７】
実施例５：ピーナッツアレルゲンの分析：転写インフィデリティー（ＴＩ）ペプチドとピーナッツアレルギー間の相関
Ａ−ピーナッツへの感作
この実験では、本発明者らは、ピーナッツへの感作を誘導するために、ピーナッツ抽出物（タンパク質４００μg）、または組換え標準ピーナッツタンパク質ＡｒａＨ２（４００μg）のいずれかを、ＢａｌｂＣマウスに、１週間に１回を３週間腹腔内に注射した（１０匹のマウスの群）。
【０１１８】
免疫化プロトコルを、以下のダイアグラムに従って行った：
【０１１９】
【表６】
2019513413.tif 000111
【０１２０】
試験したアジュバントは、ＬｅｗｉｓＸであった。アジュバントなしの対照試料も試験した。次いで、本発明者らは、注射の開始後の３３日目（図７Ａを参照のこと）および４９日目（図７Ｂを参照のこと）に収集した試料中のピーナッツ抽出物に対するＩｇＥの割合を測定した。
【０１２１】
本発明者らの結果は、ピーナッツ抽出物が、３３日目に感作を大幅に、４９日目にはさらに２倍多く誘導するが、組換え標準ピーナッツタンパク質ＡｒａＨ２単独は、ＡｒａＨ２で感作されたマウスについて得られたピーナッツ抽出物に対するＩｇＥのレベルが対照の場合に得られたものと同等であるので、感作を誘導することができなかったことを明らかに示す（図７に示す通り）。
【０１２２】
Ｂ−組換えＡｒａＨ２−ＴＩタンパク質の生産およびそれらのアレルゲン性の確認
本発明者らは、Illumina次世代シーケンシングによってマメ科ラッカセイ（Arachis hypogaea）のＡｒａＨ２  ＲＮＡ配列を分析し、次いで、それを、組換え転写インフィデリティー（ＴＩ）タンパク質、すなわち、ＡｒａＨ２−ＴＩを生産するために、連続免疫化技術に適合させた。
【０１２３】
転写インフィデリティー（ＴＩ）事象が起こる位置を定義するために、得られた読み取り値を整列させ、そして、本発明者らは、ＡｒａＨ２のエピトープのレベルに位置する欠失の転写インフィデリティー（ＴＩ）位置を選択した。ＡｒａＨ２のエピトープ内のこれらのＴＩ欠失は、図８に示される通り段階的に存在する。
【０１２４】
本発明者らは、ピーナッツにおいて以下のＴＩタンパク質を特定することができた（配列番号１２１〜１３１）：
【０１２５】
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ１−ｇ１１−ｉｄ３０  （配列番号１２１）
【化１０５】
2019513413.tif 000112
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ１−ｇ１１−ｉｄ３１  （配列番号１２２）
【化１０６】
2019513413.tif 000113
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ１−ｇ１１−ｉｄ３２  （配列番号１２３）
【化１０７】
2019513413.tif 000114
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ１−ｇ１１−ｉｄ３３  （配列番号１２４）
【化１０８】
2019513413.tif 000115
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ１−ｇ１１−ｉｄ３４  （配列番号１２５）
【化１０９】
2019513413.tif 000116
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ１−ｇ１２−ｉｄ３５  （配列番号１２６）
【化１１０】
2019513413.tif 000117
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ１−ｇ１２−ｉｄ３６  （配列番号１２７）
【化１１１】
2019513413.tif 000118
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ２−ｇ１３−ｉｄ３７  （配列番号１２８）
【化１１２】
2019513413.tif 000119
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ２−ｇ１３−ｉｄ３８  （配列番号１２９）
【化１１３】
2019513413.tif 000120
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ２−ｇ１３−ｉｄ３９  （配列番号１３０）
【化１１４】
2019513413.tif 000121
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ２−ｇ１３−ｉｄ４０  （配列番号１３１）
【化１１５】
2019513413.tif 000122
【０１２６】
図８に太字で表されるＴＩギャップペプチドの配列（配列番号１２１〜１３１の上のＴＩピーナッツタンパク質に含まれ、かつ、それに下線を引く）は、以下である：
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ１−ｇ１１−ｉｄ３０  （配列番号１１０）
【化１１６】
2019513413.tif 000123
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ１−ｇ１１−ｉｄ３１  （配列番号１１１）
【化１１７】
2019513413.tif 000124
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ１−ｇ１１−ｉｄ３２  （配列番号１１２）
【化１１８】
2019513413.tif 000125
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ１−ｇ１１−ｉｄ３３  （配列番号１１３）
【化１１９】
2019513413.tif 000126
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ１−ｇ１１−ｉｄ３４  （配列番号１１４）
【化１２０】
2019513413.tif 000127
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ１−ｇ１２−ｉｄ３５  （配列番号１１５）
【化１２１】
2019513413.tif 000128
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ１−ｇ１２−ｉｄ３６  （配列番号１１６）
【化１２２】
2019513413.tif 000129
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ２−ｇ１３−ｉｄ３７  （配列番号１１７）
【化１２３】
2019513413.tif 000130
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ２−ｇ１３−ｉｄ３８  （配列番号１１８）
【化１２４】
2019513413.tif 000131
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ２−ｇ１３−ｉｄ３９  （配列番号１１９）
【化１２５】
2019513413.tif 000132
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ２−ｇ１３−ｉｄ４０  （配列番号１２０）
【化１２６】
2019513413.tif 000133
【０１２７】
比較のために、標準的なタンパク質の配列を、以下の配列番号１３２および１３３に提供する：
【０１２８】
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ１  （配列番号１３２）
【化１２７】
2019513413.tif 000134
Ａｒａｈ２−ｒｅｆ２  （配列番号１３３）
【化１２８】
2019513413.tif 000135
【０１２９】
次いで、本発明者らは、組換えタンパク質を生産し、変異体３６、３８および４０（前記変異体３６、３８および４０は、配列番号１１６、１１８および１２０のＴＩギャップペプチドをそれぞれ含む配列番号１２７、１２９および１３１のＴＩタンパク質に対応する）に対するＩｇＥを測定した。
【０１３０】
本発明者らは、先に記載したＢａｌｂＣマウスを使用した（図９を参照のこと）。それ故、図９は、ピーナッツへの感作が、変異体−４０に対して特異的であるが変異体−３８に対して特異的でないＩｇＥ反応性を誘導することを示す。変異体−４０は、変異体−３８に存在しない２つのエピトープ（エピトープ８および９）を含有する。
【０１３１】
ピーナッツへの感作を誘導するために、ＡｒａＨ２の組換え変異体をＢａｌｂＣマウスに注射する。陰性対照は、感作を誘導しないＡｒａＨ２組換え標準タンパク質である。
【０１３２】
この例は、組換え標準ＡｒａＨ２タンパク質（当技術分野において「アレルゲン」と見なされる）が全くアレルゲン性でないことを示すことが可能である。対照的に、組換えＡｒａＨ２−ＴＩタンパク質は、高アレルゲン性である。結論として、転写インフィデリティー（ＴＩ）欠失事象から生じるＡｒａＨ２−ＴＩタンパク質変異体だけがピーナッツアレルギーの起源である。
【０１３３】
Ｃ−ピーナッツアレルギーの有病率
種々のピーナッツアレルゲンに関するアレルギーの有病率の百分率データは、表６にまとめる通り、文献において公知である（Crit Rev Food Sci Nutr. 2013, Peanut allergens: Saiz J1, Montealegre C, Marina ml, Garcia-Ruiz C）。
【０１３４】
【表７】
2019513413.tif 000136
【０１３５】
この実験では、本発明者らは、転写インフィデリティー欠失事象を特定するために、Illumina次世代シーケンシングによってＡｒａ  ｈ  １、Ａｒａ  ｈ  ２、Ａｒａ  ｈ  ３、Ａｒａ  ｈ  ５、Ａｒａ  ｈ  ６、Ａｒａ  ｈ  ７、Ａｒａ  ｈ  ８、Ａｒａ  ｈ  ９、Ａｒａ  ｈ  １０およびＡｒａ  ｈ  １１のｍＲＮＡを分析した。次いで、本発明者らは、Ａ塩基の反復に存在する欠失を選択し、転写産物のサイズに関して特定された欠失の数を報告した。
【０１３６】
本発明者らの分析および公知のピーナッツアレルゲンの有病率との比較（表６から）の結果を図１０に示す。この図は、ＴＩ欠失事象（すなわち、１０００塩基当たりのＯＲＦ内のＡの反復に影響を及ぼすギャップ事象の数）とピーナッツアレルゲンの有病率との間の強い相関の存在を明確に実証する。これらの２つの変数（有病率およびＡの反復における欠失）間の相関は非常に有意である（rho Spearman＝０．６８；ｐ値＝０，００３）。
【０１３７】
結論として、Ａｒａ  ｈ  １、Ａｒａ  ｈ  ２、Ａｒａ  ｈ  ３、Ａｒａ  ｈ  ５、Ａｒａ  ｈ  ６、Ａｒａ  ｈ  ７、Ａｒａ  ｈ  ８、Ａｒａ  ｈ  ９、Ａｒａ  ｈ  １０およびＡｒａ  ｈ  １１ピーナッツタンパク質のアレルゲン性は、転写インフィデリティー（ＴＩ）事象と厳密な相関性があり、そして、ピーナッツアレルギーは、したがって、転写インフィデリティーギャップ事象から生じる、Ａｒａ  ｈ  １、Ａｒａ  ｈ  ２、Ａｒａ  ｈ  ３、Ａｒａ  ｈ  ５、Ａｒａ  ｈ  ６、Ａｒａ  ｈ  ７、Ａｒａ  ｈ  ８、Ａｒａ  ｈ  ９、Ａｒａ  ｈ  １０およびＡｒａ  ｈ  １１のＴＩ変異体の産生に起因する。
【０１３８】
実施例６：強アレルゲン性のピーナッツおよび基本的に非アレルゲン性のサヤマメにおけるＴＩ事象の比較
この研究は、ピーナッツ（強アレルゲン性である）とサヤマメ（基本的に非アレルゲン性である）などの別のマメ科植物における、転写インフィデリティー（ＴＩ）欠失事象の現象の比較に関する。
【０１３９】
異なるサイズの転写産物に影響を及ぼしかつその発現も変動する、これらの２つの植物におけるＴＩ現象を比較するために、本発明者らは、（ＲＮＡとＤＮＡの差異）ＲＤＤ比（参照配列との比較に基づいてＲＮＡ配列内の配列変動を特定することによって算出され、全ての転写産物位置について計算された欠失の比として表される）の測定を使用した（以下の表７に例示の通り）。
【０１４０】
【表８】
2019513413.tif 000137
【０１４１】
ピーナッツとサヤマメにおけるＲＤＤ比を比較する本発明者らの結果は、ＴＩ欠失事象に対応する全ＲＤＤ比が、サヤマメよりもピーナッツにおいて、とりわけＡ塩基またはＴ塩基の反復に影響を及ぼすコーディング領域（ＯＲＦ）に存在するＴＩ欠失事象に関して大幅に高いことを明らかに示す。これらの差異は、図１１に実証される通り非常に有意である（ウィルコクソン検定  ｐ値＜０，００１）。
【０１４２】
上のデータは、アレルゲン性のピーナッツタンパク質に多く存在するＴＩ欠失事象が、必然的にピーナッツアレルギーの起源であることをさらに裏付ける。
【図１】
2019513413.tif 000138
【図２】
2019513413.tif 000139
【図３】
2019513413.tif 000140
【図４】
2019513413.tif 000141
【図５】
2019513413.tif 000142
【図６】
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【図７Ａ】
2019513413.tif 000144
【図７Ｂ】
2019513413.tif 000145
【図８】
2019513413.tif 000146
【図９】
2019513413.tif 000147
【図１０】
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【図１１】
2019513413.tif 000149
【配列表】
2019513413000001.app
【国際調査報告】
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