(57)【要約】  本発明は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を標的化する抗体及びその使用に関する。本発明者らは、腫瘍関連マクロファージを検出及び標的化するために、腫瘍に随伴したマクロファージの表面上に露出した特異的なマーカーを調べた。本発明者らは、正常なマクロファージには存在しないシデロフレキシン３が、腫瘍関連マクロファージによって発現されていることを示した。本発明者らはさらに、シデロフレキシン３に対して指向される抗体を使用して、本発明者らは、慢性リンパ球性白血病患者から得られたＰＢＭＣ試料中の腫瘍関連マクロファージを枯渇させ、白血病性Ｂ細胞数を強力に減少させることを実証した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体であって、前記抗体は、
（ａ）可変ドメインが：
−配列番号１として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ１、及び
−配列番号２として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ２、及び
−配列番号３として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ３
を含む、重鎖；
（ｂ）可変ドメインが：
−配列番号４として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ１、及び
−配列番号５として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ２、及び
−配列番号６として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ３
を含む、軽鎖
を含み、
（ｃ）抗体６−２５の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び／又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する抗体と実質的に同じ親和性でシデロフレキシン−３に結合する、前記抗体。
【請求項２】
前記抗体が、
（ａ）可変ドメインが：      
−配列番号１として示される配列を有するＨ−ＣＤＲ１、及び
−配列番号２として示される配列を有するＨ−ＣＤＲ２、及び
−配列番号３として示される配列を有するＨ−ＣＤＲ３
を含む、重鎖；
（ｂ）可変ドメインが：
−配列番号４として示される配列を有するＬ−ＣＤＲ１、及び
−配列番号５として示される配列を有するＬ−ＣＤＲ２、及び
−配列番号６として示される配列を有するＬ−ＣＤＲ３
を含む、軽鎖
を含む、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、
−可変ドメインが、配列番号７として示される配列と少なくとも７０％又は８０％又は９０％の同一性を有する、重鎖、
−可変ドメインが、配列番号８として示される配列と少なくとも７０％又は８０％又は９０％の同一性を有する、軽鎖
を含み、抗体６−２５の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び／又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する抗体と実質的に同じ親和性でシデロフレキシン−３に結合する、請求項１記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、
−可変ドメインが、配列番号７として示される配列を有する、重鎖、
−可変ドメインが、配列番号８として示される配列を有する、軽鎖
を含む、請求項１記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が腫瘍関連マクロファージを枯渇させることができる、請求項１〜４の一項記載の抗体。
【請求項６】
キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１〜５の一項記載の抗体。
【請求項７】
請求項１の抗体をコードしている核酸分子。
【請求項８】
請求項１の抗体の重鎖又は軽鎖をコードする核酸分子。
【請求項９】
配列番号９又は配列番号１０に対して少なくとも７０％又は８０％又は９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１の核酸分子。
【請求項１０】
請求項７〜９記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１１】
請求項７〜９記載の核酸及び／又は請求項１０記載のベクターによってトランスフェクトされているか、感染しているか、又は形質転換されている宿主細胞。
【請求項１２】
医薬品としての使用のための請求項１の抗体。
【請求項１３】
生物学的試料中の腫瘍関連マクロファージを検出及び／又はその量を評価するための方法であって、該方法は、該試料を請求項１の抗体と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
がんの処置に使用するための請求項１の抗体。
【請求項１５】
請求項１の抗体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を標的化する抗体及びその使用に関する。
【０００２】
発明の背景：
がんのイニシエーション及び腫瘍増殖の促進における腫瘍微小環境の重要性は、過去１０年間にわたりますます認識されるようになっている（H. Korkaya JCI, 121, (10),  3804-3809, 2011; E. Lonardo, J. Frias-Aldeguer, Cell Cycle, 11(7), 1282-1290, 2012; J. W. Pollard, Nature Reviews Immunology, 9 (4), 259-270,2009）。
【０００３】
腫瘍微小環境は、慢性炎症によって特徴付けられ、これは腫瘍増殖を抑制するのではなく、細胞増殖を刺激し、がん幹細胞（ＣＳＣ）を活性化し、転移を促進することによって腫瘍の形成を支持する［V. Plaks, Cell Stem Cell, 16(3), 225-238, 2015; S. M. Cabarcas, L. A. International Journal of Cancer, 129(10), 2315-2327, 2011］。腫瘍炎症応答を誘導するのは、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）である［R. Noy Immunity, 41(1),.49-61, 2014］。多数のＴＡＭと急速な疾患の進行と患者の悪い転帰との間の相関が数十年間にわたり観察されている［L. Bingle, Journal of Pathology, 196 (3), 254-265, 2002; B.-Z. Qian Cell, 141(1), 39-51, 2010］；しかしながら、最近になってやっと、この逆説的な表現型が説明された。この相関は、ＴＡＭにより媒介されるパラ分泌シグナル伝達に起因し、このシグナル伝達ではマクロファージに由来する因子がＣＳＣ区画を活性化し、ＣＳＣの幹細胞様の特色を促進し、腫瘍の進行、転移、及びさらにはＣＳＣの化学療法抵抗性さえも悪化させることが今では解明されている。
【０００４】
腫瘍への単球の浸潤は、ケモカイン（例えば、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、及びＣＸＣＬ１２）、ＣＳＦ−１、及び補体カスケード成分によって媒介される［E. Bonavita, Advances in Cancer Research, 128, 141-171, 2015; E. Bonavita, Cell, 160(4), 700-714, 2015］。単球が一旦腫瘍内に入ると、腫瘍環境は迅速に、単球から腫瘍条件マクロファージへの分化を促進する。ＴＡＭは、Ｍ１表現型とは異なる方向に偏り、Ｍ２前腫瘍マーカーを発現していると当初考えられていた［Biswas SK. Nature Immunology, 11(10), 889-896, 2010］。
【０００５】
Ｍ２型様ＴＡＭ及びサブセットをより具体的に同定するために、ヘモグロビンのスキャベンジャー受容体ＣＤ１６３［Heusinkveld M. The Journal of Immunology, 187(3), 1157-1165, 2011; Martinez FO., Annual Review of Immunology, 27, 451-483, 2009］、マクロファージのスキャベンジャー受容体１ＣＤ２０４［Biswas SK. Nature Immunology, 11(10), 889-896, 2010, Laoui, D. International Journal of Developmental Biology, 55(7-9), 861-867, 2011］、マンノース受容体ＣＤ２０６［Mantovani, A. Trends in Immunology, 23(11), 549-555, 2002］、マクロファージ受容体ＣＤ６８（Tang X, Cancer Letter 2013, Takeuchi H, Oncol Lett 2016 ; Hu H, tumour biol 2016 ; Kim KJ, PlosOne 2015）、及びもっと最近ではＴ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有タンパク質−３（Ｔｉｍ−３）［Yan W., Gut, 64(10), 1593-1604, 2015］が非常に成功裏に使用されてきた。
【０００６】
がんのイニシエーション及び腫瘍増殖の促進における腫瘍微小環境の重要な役割が認識されているので、特にＴＡＭの役割、ＴＡＭの抑制及び／又は枯渇は、魅力的な抗がん免疫療法アプローチを示す（Noy, R., and Pollard, J.W. 2014. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity 41:49-61）。しかしながら、非常に僅かな薬物しか開発されておらず、臨床段階の「抗ＴＡＭ」療法としては主にＣＤ１１５（ＴＡＭの機能的マーカー）の標的化が挙げられる（Cassier, P.A., Italiano, A., Gomez-Roca, C.A., Le Tourneau, C., Toulmonde, M., Cannarile, M.A., Ries, C., Brillouet, A., Muller, C., Jegg, A.M., et al. 2015. CSF1R inhibition with emactuzumab in locally advanced diffuse-type tenosynovial giant cell tumours of the soft tissue: a dose-escalation and dose-expansion phase 1 study. Lancet Oncol 16:949-956）。
【０００７】
それ故、腫瘍内に存在するＴＡＭを標的化する新規な薬物が必要とされる。特に、ＴＡＭの特異的な生物学的マーカーを標的化する薬物が非常に望ましいだろう。
【０００８】
発明の要約：
本発明は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を標的化する抗体及びその使用に関する。特に、本発明は特許請求の範囲によって定義される。
【０００９】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭは、白血病においてナース様細胞（ＮＬＣ）とも呼ばれる）におけるシデロフレキシン−３の存在を示し、これは先行技術においては記載されたことがなかった。
【００１０】
より特定すると、本発明者らは、正常なマクロファージには存在しないシデロフレキシン３が、腫瘍関連マクロファージによって発現されているという証拠を提示する。これは、腫瘍関連マクロファージの表面上に露出し、結果として、ＴＡＭを検出及び標的化（がんの治療のために）するための独特な機会を与える、最初の特異的なマーカーである。本発明者はさらに、シデロフレキシン−３に指向された抗体を使用して、慢性リンパ球性白血病患者から得られたＰＢＭＣ試料中においてＴＡＭを枯渇させ、白血病性Ｂ細胞数を強力に減少させたという証拠を提示する。
【００１１】
ここで、本発明者らは、ＴＡＭを検出及び標的化するために、腫瘍関連マクロファージの表面上に露出している特異的なマーカーを調べた。慢性リンパ球性白血病患者から得られたＴＡＭを用いてマウスを免疫化することによって、本発明者らは、２００個の画分の中から、ＴＡＭを特異的に認識することのできる４個の抗体画分（１個のサブタイプを含む４個のハイブリドーマ：６−１６、６−２５、６−６６−４９及び６−６６−７４）を回収する。驚くべきことに、シークエンス実験により、３個のハイブリドーマが同じＶＨ配列及びＶＬ配列を有することが示された。本発明者らは驚くべきことに、１）画分中の抗体は、腫瘍関連マクロファージの表面上に特異的に発現されているシデロフレキシン３タンパク質を認識することができた、２）抗体はＴＡＭに対して特異的であり、患者又は健康なドナー（Ｂ及びＴリンパ球のような）又は腫瘍細胞由来の他のＰＢＭＣを認識しなかった、３）慢性リンパ球性白血病患者から得られたＰＢＭＣ試料中のシデロフレキシン３抗体の使用はＴＡＭを枯渇させ、腫瘍細胞数を減少させた、及び４）シデロフレキシン３抗体はまた、乳腺腫瘍試料中に存在するＴＡＭも検出することができたことを発見した。これらの結果は、それ故、ＴＡＭ上に発現されたシデロフレキシン３を標的化することにより、がんにおける有益な抗腫瘍免疫の回復が可能となることを示す。
【００１２】
本発明の抗体
１つの実施態様では、本発明の抗体は、
（ａ）重鎖（ここでの可変ドメインは：
−配列番号１として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ１、及び
−配列番号２として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ２、及び
−配列番号３として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ３
を含む）；
（ｂ）軽鎖（ここでの可変ドメインは：
−配列番号４として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ１、及び
−配列番号５として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ２、及び
−配列番号６として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ３
を含む）
を含み、
（ｃ）抗体６−２５の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び／又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する抗体と実質的に同じ親和性でシデロフレキシン−３に結合する。
【００１３】
１つの実施態様では、本発明の抗体は、
（ａ）重鎖（ここでの可変ドメインは：      
−配列番号１として示される配列を有するＨ−ＣＤＲ１、及び
−配列番号２として示される配列を有するＨ−ＣＤＲ２、及び
−配列番号３として示される配列を有するＨ−ＣＤＲ３
を含む）；
（ｂ）軽鎖（ここでの可変ドメインは：      
−配列番号４として示される配列を有するＬ−ＣＤＲ１、及び
−配列番号５として示される配列を有するＬ−ＣＤＲ２、及び
−配列番号６として示される配列を有するＬ−ＣＤＲ３
を含む）
を含む。
【００１４】
１つの実施態様では、本発明の抗体は、
−重鎖（ここでの可変ドメインは、配列番号７として示される配列と少なくとも７０％の同一性を有する）、
−軽鎖（ここでの可変ドメインは、配列番号８として示される配列と少なくとも７０％の同一性を有する）
を含み、
抗体６−２５の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び／又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する抗体と実質的に同じ親和性でシデロフレキシン−３に結合する。
【００１５】
１つの実施態様では、本発明の抗体は、
−重鎖（ここでの可変ドメインは、配列番号７として示される配列と少なくとも８０％の同一性を有する）、
−軽鎖（ここでの可変ドメインは、配列番号８として示される配列と少なくとも８０％の同一性を有する）
を含み、
抗体６−２５の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び／又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する抗体と実質的に同じ親和性でシデロフレキシン−３に結合する。
【００１６】
１つの実施態様では、本発明の抗体は、
−重鎖（ここでの可変ドメインは、配列番号７として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する）、
−軽鎖（ここでの可変ドメインは、配列番号８として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する）
を含み、
抗体６−２５の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び／又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する抗体と実質的に同じ親和性でシデロフレキシン−３に結合する。
【００１７】
１つの実施態様では、本発明の抗体は、
−重鎖（ここでの可変ドメインは、配列番号７として示される配列を有する）、
−軽鎖（ここでの可変ドメインは、配列番号８として示される配列を有する）
を含む。
【００１８】
特定の実施態様では、本発明の抗体は、腫瘍関連マクロファージを枯渇させることができる。
【００１９】
ＴＡＭの枯渇を評価するための試験は、当技術分野において周知である。例えば、以下の試験は、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を用いたナース様細胞の枯渇を評価する：Avery Polk , Ye Lu , Tianjiao Wang , Erlene Seymour , Nathanael G. Bailey , Jack W. Singer , Philip S. Boonstra , Megan S. Lim , Sami Malek , and Ryan A. Wilcox. 2016. Colony-stimulating Factor-1 Receptor is Required for Nurse-like Cell Survival in Chronic Lymphocytic Leukemia. Clin. Cancer Res. Jun 22. pii: clincanres.3099.2015。
【００２０】
本出願における関心対象の配列は、以下の表１に示されている：
【表１】
2019531703.tif 000002
2019531703.tif 000003
【００２１】
本明細書において使用する「抗体」又は「免疫グロブリン」という用語は同じ意味を有し、本発明において同等に使用されるだろう。本明細書において使用する「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有している分子を指す。したがって、抗体という用語は、完全な抗体分子だけでなく、抗体断片、並びに、抗体及び抗体断片の変異体（誘導体も含む）も包含する。天然抗体では、２本の重鎖は互いにジスルフィド結合によって連結され、各々の重鎖は軽鎖にジスルフィド結合によって連結されている。軽鎖には２種類存在する：ラムダ（λ）及びカッパ（κ）。抗体分子の機能的活性を決定する、主に５つの重鎖のクラス（又はアイソタイプ）が存在する：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ。各々の鎖は、個別の配列ドメインを含有している。軽鎖は、２つのドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、まとめてＣＨと称される）を含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原に対する結合認識及び特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動、補体との結合、及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合などの重要な生物学的特性を付与する。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端部分であり、１本の軽鎖と１本の重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性に存する。抗体結合部位は、主に超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基から作られる。時に、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基が、抗体結合部位に関与し得るか、又は、全体的なドメイン構造に影響を及ぼし得、したがって結合部位に影響を及ぼし得る。相補性決定領域すなわちＣＤＲは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を一緒に規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は各々、それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３、及びＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と称される３つのＣＤＲを有する。それ故、抗原結合部位は、典型的には、重鎖及び軽鎖の各々のＶ領域に由来するＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列を指す。本発明の文脈において、本発明の抗体のアミノ酸残基は、ＩＭＧＴ番号付け体系に従って番号付けされる。ＩＭＧＴの独特な番号付けは、抗原受容体、鎖の種類、又は種がどのようなものであれ、可変ドメインを比較するために定義されている（Lefranc M.-P., "Unique database numbering system for immunogenetic analysis" Immunology Today, 18, 509 (1997) ; Lefranc M.-P., "The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist, 7, 132-136 (1999).; Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, G., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains" Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)）。ＩＭＧＴの独特な番号付けでは、保存されたアミノ酸は常に、同じ位置を有し、例えばシステイン２３、トリプトファン４１、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４、フェニルアラニン又はトリプトファン１１８を有する。ＩＭＧＴの独特な番号付けは、フレームワーク領域（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１位〜２６位、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９位〜５５位、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６位〜１０４位、及びＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８位〜１２８位）及び相補性決定領域：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７位〜３８位、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６位〜６５位、及びＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５位〜１１７位という標準的な境界決めを提供する。ＣＤＲ３−ＩＭＧＴの長さが１３アミノ酸未満である場合、ループの上端からギャップが、以下の順番で（１１１、１１２、１１０、１１３、１０９、１１４など）作られる。ＣＤＲ３−ＩＭＧＴの長さが１３アミノ酸を超える場合、ＣＤＲ３−ＩＭＧＴループの上端の１１１位と１１２位との間に以下の順番で（１１２．１、１１１．１、１１２．２、１１１．２、１１２．３、１１１．３など）追加の位置が作られる（http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Nomenclature/IMGT-FRCDRdefinition.html）。
【００２２】
本明細書において使用する「特異性」という用語は、シデロフレキシン−３以外のタンパク質又は構造（例えば、ＴＡＭ上又は他の細胞型上に発現されている他のタンパク質）と比較的僅かな検出可能な反応性を有しつつ、シデロフレキシン−３などの抗原上に存在するエピトープに抗体が検出可能なように結合できることを指す。特異性は、本明細書の何処か他の場所に記載のように、例えばビアコア機器を使用した、結合アッセイ又は競合結合アッセイによって相対的に決定され得る。特異性は、特異的な抗原への結合、対、他の関連性のない分子への非特異的な結合における親和性／結合力の比が、例えば約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、１０，０００：１、又はそれ以上によって示され得る（この場合、特異的な抗原はシデロフレキシン−３である）。
【００２３】
本明細書において使用する「親和性」という用語は、エピトープに対する抗体の結合強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］として定義される解離定数Ｋｄによって示され、ここでの［Ａｂ−Ａｇ］は、抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は結合していない抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は結合していない抗原のモル濃度である。親和性定数Ｋａは、１／Ｋｄによって定義される。ｍＡｂの親和性を決定するための好ましい方法は、Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)、及びMuller, Meth. Enzymol. 92:589-601（1983）に認められ得、その文献は参照により本明細書に全体が組み込まれる。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野において周知である１つの好ましくかつ標準的な方法は、ビアコア機器の使用である。
【００２４】
本発明の抗体は、当技術分野において公知である任意の方法によって特異的結合についてアッセイされ得る。多くの異なる競合結合アッセイフォーマット（群）を、エピトープ結合のために使用し得る。使用され得るイムノアッセイとしては、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素アッセイ、ゲル拡散沈降素アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、及び補体結合アッセイなどの技術を使用した競合的アッセイシステムが挙げられるがこれらに限定されない。このようなアッセイは、当技術分野において慣用的であり周知である（例えば、Ausubel et al., eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., New Yorkを参照）。例えば、ビアコア（登録商標）（ＧＥヘルスケア社、ピスカタウェイ、ＮＪ州）は、一連のモノクローナル抗体をエピトープビニングするために慣用的に使用される様々な表面プラズモン共鳴アッセイフォーマットの１つである。さらに、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988に記載のアッセイなどの慣用的な交差遮断アッセイを実施することもできる。
【００２５】
本明細書において使用する「モノクローナル抗体」、「モノクローナルＡｂ」、「モノクローナル抗体組成物」、「ｍＡｂ」などの用語は、単一の分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。
【００２６】
本明細書において使用する、２つの配列間の同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要のある、ギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮しながら、配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）。配列の比較及び２つの配列間の同一性の決定は、以下に記載のような数学的アルゴリズムを使用して成し遂げられ得る。
【００２７】
２つのアミノ酸配列間の同一性は、ＡＬＩＧＮプログラムに取り込まれている、E. Myers及びW. Miller（Comput. Appl. Biosci. 4: 1 1-17, 1988）のアルゴリズムを使用して決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれている、Needleman and Wunsch（J. Mol. Biol. 48:443- 453, 1970）アルゴリズムを使用して決定され得る。同一性を決定するためのさらに別のプログラムは、ＣＬＵＳＴＡＬ（M. Larkin et al., Bioinformatics 23:2947-2948, 2007; first described by D. Higgins and P. Sharp, Gene 73:237-244, 1988）であり、これは独立プログラムとして又はウェブサーバーを介して利用可能である（http://www.clustal.org/を参照）。
【００２８】
２つのヌクレオチドアミノ酸配列間の同一性もまた、例えば、デフォールトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を使用して、核酸配列用のＢＬＡＳＴＮプログラムなどのアルゴリズムを使用して決定され得る。
【００２９】
本明細書において使用する「シデロフレキシン３」すなわち「ＳＦＸＮ３」という用語は、「ＳＦＸ３」又は「ＢＡ１０８Ｌ７．２」としても知られているが、シデロフレキシンタンパク質の一員であり、ヒトにおいてはＳＦＸＮ３遺伝子［遺伝子ＩＤ：８１８５５］によってコードされているタンパク質を指す。シデロフレキシンは一般的に、ミトコンドリア内で鉄の輸送に関与しているタンパク質として言及されている。さらに、ヒトシデロフレキシンはまた、膵β細胞の分化において重要な役割を果たしていることが報告されている（Yoshikumi Y, J Cell Biochem.,95, 1157-1168 (2005)）。野生型シデロフレキシン３ヒトアミノ酸配列の一例は、ＮＣＢＩウェブサイト上に参照配列：ＮＰ＿１１２２３３で提供されている。野生型シデロフレキシン３アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列の一例は、ＮＣＢＩウェブサイト上に参照配列：ＮＭ＿０３０９７１で提供されている。
【００３０】
「腫瘍関連マクロファージ」すなわち「ＴＡＭ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、マクロファージ系統に属する細胞型を説明することを意図する。それらは、腫瘍塊に近接して又は腫瘍塊内に見られる［Shih, J-Y., Journal of Cancer Molecules 2(3): 101-106 2006］。ＴＡＭは、循環中の単球又は組織常在マクロファージに由来し、これは多くの腫瘍型の間質内に見られる主要な白血球浸潤物を形成している。前腫瘍（例えば、腫瘍血管新生を通した増殖及び転移の促進）プロセスにおいてＴＡＭが関与している証拠がますます増えている［Birbrair, A. American Journal of Physiology. Cell Physiology 307 (1): C25-C38. 2014; Thoreau, M;Oncotarget 6(29) 27832- 27832 2015］。ＴＡＭは、腫瘍微小環境において多種多様な増殖因子、サイトカイン、及びケモカインと相互作用し、微小環境は様々な種類の腫瘍間で異なるので、該腫瘍微小環境は、ＴＡＭを教育し、それらの特異的な表現型を及び従って機能的な役割を決定すると考えらえている。それ故、ＴＡＭは、それらが随伴する腫瘍の種類に応じて、それらの役割が異なることが示されている［Lewis, CE; Cancer Research 66 (2): 605-612. (2006)］。多くの腫瘍型において、ＴＡＭの浸潤レベルは、重要な予後予測値であることが示されている。ＴＡＭは、乳癌、卵巣癌、神経膠腫及びリンパ腫の種類における悪い予後；大腸癌及び胃癌におけるより良好な予後、並びに、肺癌及び前立腺癌における悪い予後及び良い予後の両方に関連している［Allavena, P. Critical Reviews in Oncology/Hematology 66: 1. (2008)］。白血病ではＴＡＭはまた、ナース様細胞（ＮＬＣ）とも呼ばれる。
【００３１】
ＴＡＭ細胞の調節機能／抑制機能の実証は、当技術分野において公知である任意の適切な方法によって決定され得る（Qian BZ and Pollard JW, Cell, 2010, vol 141, 1:39-41）。特に、このような試験の例は、実施例の章に示されている。具体的には、実施例に具現化された試験は、ＴＡＭ機能の評価のための標準的なインビトロ試験であると捉えられる。
【００３２】
いくつかの実施態様では、本発明による腫瘍関連マクロファージは、哺乳動物腫瘍関連マクロファージ、最も特定するとヒト腫瘍関連マクロファージである。
【００３３】
１つの実施態様では、本発明の抗体は、Ｋａｂａｔ体系に従って定義される。
【００３４】
抗体可変ドメイン内の残基は慣用的には、Kabat et al.によって考案された体系に従って番号付けされる。この体系は、Kabat et al., 1987、Sequences of Proteins of Immunological Interest、米国保健福祉省、米国衛生研究所、米国（本明細書では以後「Kabat et al.」）に示されている。Ｋａｂａｔの残基の呼称は、配列番号の配列内のアミノ酸残基の直線的な番号付けに常に直接対応しているわけでなない。実際の直線的なアミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造（フレームワーク領域であれ又は相補性決定領域（ＣＤＲ）であれ）の構造成分の短縮又は構造成分への挿入に相当する、厳密なＫａｂａｔ番号付けよりも、少ない又は追加されたアミノ酸を含有し得る。所与の抗体についての正しいＫａｂａｔによる残基の番号付けは、抗体の配列内の相同性を有する残基を、「標準的な」Ｋａｂａｔにより番号付けされた配列と整列させることによって決定され得る。重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付け体系によると残基３１〜３５Ｂ（Ｈ−ＣＤＲ１）、残基５０〜６５（Ｈ−ＣＤＲ２）、及び残基９５〜１０２（Ｈ−ＣＤＲ３）に位置する。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付け体系によると残基２４〜３４（Ｌ−ＣＤＲ１）、残基５０〜５６（Ｌ−ＣＤＲ２）、及び残基８９〜９７（Ｌ−ＣＤＲ３）に位置する。
【００３５】
Ｋａｂａｔ体系によると、本発明の抗体の６つのＣＤＲは、
−Ｈ−ＣＤＲ１：配列番号１１：GFSLTGY；
−Ｈ−ＣＤＲ２：配列番号１２：WGDGS；
−Ｈ−ＣＤＲ３：配列番号１３：DLKFAY；
−Ｌ−ＣＤＲ１：配列番号１４：KASQHVTTAVA；
−Ｌ−ＣＤＲ２：配列番号１５：SASFRYT；
−Ｌ−ＣＤＲ３：配列番号１６：QQHYTTPWTである。
【００３６】
１つの実施態様では、本発明の抗体は、
（ａ）重鎖（ここでの可変ドメインは：
−配列番号１１として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ１；
−配列番号１２として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ２；
−配列番号１３として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ３
を含む）；
（ｂ）軽鎖（ここでの可変ドメインは：
−配列番号１４として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ１；
−配列番号１５として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ２；
−配列番号１６として示される配列と９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ３
を含む）
を含み、
（ｃ）抗体６−２５の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び／又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する抗体と実質的に同じ親和性でシデロフレキシン−３に結合する。
【００３７】
１つの実施態様では、本発明の抗体は、
（ａ）重鎖（ここでの可変ドメインは：      
−配列番号１１として示される配列を有するＨ−ＣＤＲ１；
−配列番号１２として示される配列を有するＨ−ＣＤＲ２；
−配列番号１３として示される配列を有するＨ−ＣＤＲ３
を含む）；
（ｂ）軽鎖（ここでの可変ドメインは：      
−配列番号１４として示される配列を有するＬ−ＣＤＲ１；
−配列番号１５として示される配列を有するＬ−ＣＤＲ２；
−配列番号１６として示される配列を有するＬ−ＣＤＲ３
を含む）
を含む。
【００３８】
本発明の抗体は、例えば、任意の化学的、生物学的、遺伝子的、又は酵素的技術を単独で又は組み合わせてのいずれかであるがこれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の技術によって生成される。典型的には、所望の配列のアミノ酸配列が分かれば、当業者は、標準的なポリペプチド作製技術によって、該抗体を容易に作製することができる。例えば、それらは、周知の固相法を使用して、好ましくは市販のペプチド合成装置（例えばアプライド・バイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア州によって製造されたもの）を使用して、製造業者の説明書に従って合成され得る。あるいは、本発明の抗体は、当技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術によって合成され得る。例えば、抗体をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、このようなベクターを、所望の抗体を発現するであろう適切な真核宿主又は原核宿主に導入した後にＤＮＡ発現産物として抗体を得ることができ、それから周知の技術を使用して後にそれらを単離することができる。
【００３９】
１つの実施態様では、本発明のモノクローナル抗体は、キメラ抗体、特にキメラマウス／ヒト抗体である。
【００４０】
本発明によると、「キメラ抗体」という用語は、非ヒト抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインと、ヒト抗体のＣＨドメイン及びＣＬドメインとを含む、抗体を指す。
【００４１】
いくつかの実施態様では、本発明のヒトキメラ抗体は、以前に記載されているようなＶＬドメイン及びＶＨドメインをコードしている核酸配列を得て、ヒト抗体ＣＨ及びヒト抗体ＣＬをコードしている遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクターにそれらを挿入することによってヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞に導入することによってコード配列を発現させることによって生成され得る。ヒトキメラ抗体のＣＨドメインとして、それは、ヒト免疫グロブリンに属する任意の領域でもよいが、ＩｇＧクラスのものが適切であり、ＩｇＧクラスに属するサブクラスのいずれか１つ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４も使用され得る。また、ヒトキメラ抗体のＣＬとして、それは、Ｉｇに属する任意の領域であり得、κクラス又はλクラスのものが使用され得る。キメラ抗体を作製するための方法は、当技術分野において周知である組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション技術を含む（Morrison SL. et al. （1984）及び特許文書の米国特許第５，２０２，２３８号；及び米国特許第５，２０４，２４４号参照）。
【００４２】
別の実施態様では、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト化抗体である。特に、該ヒト化抗体では、可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域、及び場合によりヒト定常ドメイン（存在する場合）、及び非ヒトドナーＣＤＲ、例えばマウスＣＤＲを含む。
【００４３】
別の実施態様では、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト化と同じ方法に基づいて、イヌ化又は霊長類化されている。
【００４４】
本発明によると、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体に由来する可変領域のフレームワーク領域及び定常領域を有しているが、以前の非ヒト抗体のＣＤＲを保持している抗体を指す。
【００４５】
本発明のヒト化抗体は、以前に記載されているようなＣＤＲドメインをコードしている核酸配列を得る工程、（ｉ）ヒト抗体のそれと同一である重鎖定常領域と（ｉｉ）ヒト抗体のそれと同一である軽鎖定常領域とをコードしている遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクターにそれらを挿入することによってヒト化抗体発現ベクターを構築する工程、並びに該発現ベクターを動物細胞に導入することによって該遺伝子を発現させる工程によって生成され得る。ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードしている遺伝子と抗体軽鎖をコードしている遺伝子が別々のベクター上に存在する型、又は両方の遺伝子が同じベクター上に存在する型（直列型）のいずれかであり得る。ヒト化抗体発現ベクターの構築し易さ、動物細胞への導入のし易さ、及び動物細胞における抗体Ｈ鎖の発現レベルとＬ鎖の発現レベルとの間の均衡の観点から、直列型のヒト化抗体発現ベクターが好ましい。直列型ヒト化抗体発現ベクターの例としては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開公報第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８などが挙げられる。従来の組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション技術に基づいたヒト化抗体の生成法は、当技術分野において周知である（例えば、Riechmann L. et al. 1988; Neuberger MS. et al. 1985を参照）。抗体は、例えばＣＤＲの移植（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開公報の国際公開公報第９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；及び第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（veneering）又はリサーフェシング（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Padlan EA (1991); Studnicka GM et al. (1994)); Roguska MA. et al. (1994))、及び鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）をはじめとする当技術分野において公知である様々な技術を使用してヒト化され得る。このような抗体の調製のための一般的な組換えＤＮＡ技術も公知である（欧州特許出願の欧州特許第１２５０２３号及び国際特許出願の国際公開公報第９６／０２５７６号を参照）。
【００４６】
本発明の抗体断片
１つの実施態様では、本発明の抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体、ＳｃＦｖ、Ｓｃ（Ｆｖ）２、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ユニボディ、ミニボディ、マキシボディ、小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰ）、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）としての抗体の超可変領域を模倣したアミノ酸残基からなる最少認識単位、及び、ＶＬ鎖又はＶＨ鎖を含むか又はからなる断片、並びに、配列番号７又は配列番号８に対して少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８，７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択された抗原結合断片である。
【００４７】
本明細書において使用する抗体の「抗原結合断片」という用語は、所与の抗原（例えばシデロフレキシン−３）に特異的に結合する能力を保持した、インタクトな抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、インタクトな抗体の断片によって実施され得る。抗体の抗原結合断片という用語内に包含される結合断片の例としては、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域からなる一価断片であるＦａｂ’断片；ヒンジ領域においてジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂ’断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；抗体の単一アームのＶＨドメインからなるＦｄ断片；ＶＨドメイン又はＶＬドメインからなる単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）断片（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；及び、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、すなわちＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を使用して、ＶＬ領域とＶＨ領域が対を形成することにより一価分子を形成している単一タンパク質鎖としてそれらが作製されることを可能とする人工ペプチドリンカーによって接続されていてもよい（一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al., 1989 Science 242:423-426; and Huston et al., 1988 proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883参照）。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって安定化されたＶＨ：ＶＬヘテロ二量体である。二価及び多価抗体断片は、一価ｓｃＦｖの会合によって自然発生的に形成され得るか、又は、二価ｓｃ（Ｆｖ）２などの、ペプチドリンカーによって一価ｓｃＦｖを結合させることによって作製され得る。このような一本鎖抗体は、抗体の１つ以上の抗原結合部分又は断片を含む。これらの抗体断片は、当業者には公知である慣用的な技術を使用して得られ、該断片を、インタクトな抗体と同じような方法で有用性についてスクリーニングする。ユニボディは、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域を欠失した別の種類の抗体断片である。ヒンジ領域の欠失により、伝統的なＩｇＧ４抗体の実質的に半分のサイズであり、ＩｇＧ４抗体の二価結合領域ではなく一価結合領域を有する、分子が得られる。抗原結合断片は、単一ドメイン抗体、ＳＭＩＰ、マキシボディーズ、ミニボディーズ、イントラボディーズ、ディアボディーズ、トリアボディーズ、及びテトラボディーズに組み込まれ得る（例えば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136参照）。「ディアボディーズ」、「トリボディーズ」又は「テトラボディーズ」という用語は、多価抗原結合部位（２、３、又は４つ）を有する小型抗体断片を指し、該断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間で対を形成することはできないリンカーを使用することによって、ドメインを、別の鎖の相補的ドメインと対を形成させ、２つの抗原結合部位を作る。抗原結合断片は、一対の直列Ｆｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む一本鎖分子に取り込まれ得、これは相補性軽鎖ポリペプチドと一緒に、一対の抗原結合領域を形成する（Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10); 1057-1062及び米国特許第５，６４１，８７０号）。
【００４８】
本発明のＦａｂは、シデロフレキシン−３と特異的に反応する抗体を、プロテアーゼであるパパインで処理することによって得ることができる。また、Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードしているＤＮＡを、原核細胞発現系又は真核細胞発現系のためのベクターに挿入し、該ベクターを原核細胞又は真核細胞（適宜）に導入することによりＦａｂを発現させることによって産生され得る。
【００４９】
本発明のＦ（ａｂ’）２は、シデロフレキシン−３と特異的に反応する抗体を、プロテアーゼであるペプシンで処理することによって得ることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２は、下記のＦａｂ’を、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を介して結合させることによって作製されてもよい。
【００５０】
本発明のＦａｂ’は、シデロフレキシン−３と特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を、還元剤であるジチオトレイトールで処理することによって得ることができる。また、Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’断片をコードしているＤＮＡを、原核細胞用の発現ベクター又は真核細胞用の発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核細胞又は真核細胞（適宜）に導入してその発現を遂行することによって生成され得る。
【００５１】
本発明のｓｃＦｖは、以前に記載されているようなＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードしているｃＤＮＡを得て、ｓｃＦｖをコードしているＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核細胞用の発現ベクター又は真核細胞用の発現ベクターに挿入し、その後、該発現ベクターを、原核細胞又は真核細胞（適宜）に導入してｓｃＦｖを発現させることによって生成され得る。ヒト化ｓｃＦｖ断片を作製するために、ＣＤＲ移植と呼ばれる周知の技術を使用し得、これは、ドナーｓｃＦｖ断片由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択し、それらを既知の３次元構造を有するヒトｓｃＦｖ断片フレームワークに移植することを含む（例えば、国際公開公報第９８／４５３２２号；国際公開公報第８７／０２６７１号；米国特許第５，８５９，２０５号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許第０１７３４９４号参照）。
【００５２】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、抗体の最小の機能的結合単位（分子量は約１３ｋＤａ）であり、抗体の重鎖（ＶＨ）又は軽鎖（ＶＬ）のいずれかの可変領域に相当する。ドメイン抗体及びそれらの作製法に関するさらなる詳細は、米国特許第６，２９１，１５８号；第６，５８２，９１５号；第６，５９３，０８１号；第６，１７２，１９７号；及び６，６９６，２４５号；米国特許出願公開第２００４／０１１０９４１号;欧州特許第１４３３８４６号、第０３６８６８４号及び第０６１６６４０号；国際公開公報第２００５／０３５５７２号、第２００４／１０１７９０号、第２００４／０８１０２６、第２００４／０５８８２１号、第２００４／００３０１９号及び第２００３／００２６０９号に見られ、その各々のその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５３】
ユニボディーズは、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去に基づいた、別の抗体断片技術である。ヒンジ領域の欠失により、伝統的なＩｇＧ４抗体の実質的に半分のサイズであり、二価結合領域ではなく一価結合領域を有する、分子が得られる。さらに、ユニボディーズはほぼより小さいので、それらはより大きな固形腫瘍上におけるより良好な分布と、有利である可能性のある有効性を示し得る。ユニボディーズに関するさらなる詳細は、国際公開公報第２００７／０５９７８２号への参照によって得られ、これはその全体が参照により組み込まれる。
【００５４】
核酸分子、ベクター、宿主細胞
本発明のさらなる目的は、本発明に記載の抗体をコードしている核酸分子に関する。より特定すると、核酸分子は、本発明の抗体の重鎖又は軽鎖をコードする。
【００５５】
特定の実施態様では、核酸分子は、配列番号９又は配列番号１０に対して少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含む。
【００５６】
より特定すると、核酸分子は、配列番号９又は配列番号１０に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む。
【００５７】
より特定すると、核酸分子は、配列番号９又は配列番号１０に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む。
【００５８】
より特定すると、核酸分子は、配列番号９又は配列番号１０に対して少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する核酸配列を含む。
【００５９】
重鎖可変ドメイン：核酸配列ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４：配列番号９
【化１】
2019531703.tif 000004
【００６０】
軽鎖可変ドメイン：核酸配列ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４：配列番号１０
【化２】
2019531703.tif 000005
【００６１】
典型的には、前記核酸は、任意の適切なベクター、例えばプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ、又はウイルスベクターに含まれ得る、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である。本明細書において使用する「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」という用語はビヒクルを意味し、これによってＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができ、よって宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば転写及び翻訳）を促進することができる。よって、本発明のさらなる態様は、本発明の核酸を含むベクターに関する。このようなベクターは、被験者に投与されると該抗体の発現を引き起こすか又は指令する、調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、終結因子などを含み得る。動物細胞用の発現ベクターに使用されるプロモーター及びエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーター及びエンハンサー（Mizukami T. et al. 1987）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びエンハンサー（Kuwana Y et al. 1987）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Mason JO et al. 1985）及びエンハンサー（Gillies SD et al. 1983）などが挙げられる。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７（Miyaji H et al. 1990）、ｐＡＧＥ１０３（Mizukami T et al. 1987）、ｐＨＳＧ２７４（Brady G et al. 1984）、ｐＫＣＲ（O'Hare K et al. 1981）、ｐＳＧ１ ベータｄ２−４（Miyaji H et al. 1990）などが挙げられる。プラスミドの他の例としては、複製起点を含む複製プラスミド、又は組換えプラスミド、例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどが挙げられる。ウイルスベクターの他の例としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター及びＡＡＶベクターが挙げられる。このような組換えウイルスは、当技術分野において公知の技術によって、例えばヘルパープラスミド若しくはウイルスを用いてパッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、又は一過性トランスフェクションによって生成され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠損組換えウイルスを生成するための詳細なプロトコールは、例えば、国際公開公報第９５／１４７８５号、国際公開公報第９６/２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号及び国際公開公報第９４／１９４７８号に見られ得る。
【００６２】
本発明のさらなる態様は、本発明による核酸及び／又はベクターによってトランスフェクトされたか、感染したか、又は形質転換された宿主細胞に関する。
【００６３】
「形質転換」という用語は、「外来の」（すなわち外因性又は細胞外）遺伝子、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列の宿主細胞への導入を意味し、よって宿主細胞は、導入された遺伝子又は配列を発現して、所望の物質、典型的には導入された遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質又は酵素を産生する。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受け取り発現する宿主細胞は「形質転換」されている。
【００６４】
本発明の核酸を使用して、適切な発現系において本発明の抗体を産生し得る。「発現系」という用語は、例えば、ベクターによって保有されそして宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のための、適切な条件下での宿主細胞及び適格ベクターを意味する。一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫宿主細胞、及びバキュロウイルスベクター、並びに哺乳動物宿主細胞及びベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例としては、原核細胞（例えば細菌）及び真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられるがこれらに限定されない。具体例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、クリベロマイセス酵母、又はサッカロマイセス酵母、哺乳動物細胞株（例えばＶｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）並びに初代又は樹立された哺乳動物細胞培養液（例えばリンパ芽球細胞、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから産生）が挙げられる。例としては、マウスＳＰ２／０−Ａｇｌ４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（本明細書において以後「ＤＨＦＲ遺伝子」と称する）を欠失させたＣＨＯ細胞（Urlaub G et al; 1980）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、本明細書において以後「ＹＢ２／０細胞」と称する）などが挙げられる。本発明はまた、本発明に記載の抗体を発現している組換え宿主細胞を生成する方法に関し、該方法は、（ｉ）上記のような組換え核酸又はベクターを適格宿主細胞にインビトロ又はエクスビボで導入する工程、（ｉｉ）得られた組換え宿主細胞をインビトロ又はエクスビボで培養する工程、及び（ｉｉｉ）場合により、該抗体を発現及び／又は分泌する細胞を選択する工程を含む。このような組換え宿主細胞は、本発明の抗体の生成のために使用することができる。本発明の抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティクロマトグラフィーなどによって培養培地から適切に分離される。
【００６５】
機能的変異体及び競合的抗体
本発明は、６−２５抗体のＶＬ領域、ＶＨ領域、又は１つ以上のＣＤＲの機能的変異体を含む抗体を提供する。本発明のモノクローナル抗体の脈絡において使用されるＶＬ、ＶＨ又はＣＤＲの機能的変異体は、依然として該抗体が、親抗体（すなわち６−２５抗体）の親和性／結合力及び／又は特異性／選択性の少なくともかなりの比率（少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれ以上）を保持することを可能とし、場合によってはこのような本発明のモノクローナル抗体は、親抗体よりも高い親和性、選択性及び／又は特異性を伴い得る。このような変異体は、ＣＤＲの突然変異（Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995）、鎖シャッフリング（Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992）、Ｅ．ｃｏｌｉの突然変異株の使用（Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996）、ＤＮＡシャッフリング（Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997）、ファージディスプレイ（Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996）、及びセクシュアルＰＣＲ（Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998）をはじめとする、多くの親和性成熟プロトコールによって得ることができる。Vaughan et al.（上記）は、これらの親和性成熟法を考察する。このような機能的変異体は典型的には、親抗体に対してかなりの配列同一性を保持している。ＣＤＲ変異体の配列は、殆どが保存的な置換を通して親抗体配列のＣＤＲ配列とは異なり得；例えば、変異体における少なくとも約３５％、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上（例えば約６５〜９５％、例えば約９２％、９３％、又は９４％）の置換が、保存的なアミノ酸残基の置換である。ＣＤＲ変異体の配列は、殆どが保存的な置換を通して親抗体配列のＣＤＲ配列とは異なり得；例えば、変異体における少なくとも１０個、例えば少なくとも９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、又は１個の置換が、保存的なアミノ酸残基の置換である。本発明の脈絡において、保存的置換は、以下のように反映されているアミノ酸のクラス内の置換によって定義され得る：
脂肪族残基Ｉ、Ｌ、Ｖ、及びＭ
シクロアルケニルを伴う残基Ｆ、Ｈ、Ｗ、及びＹ
疎水性残基Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹ
負に荷電した残基Ｄ及びＥ
極性残基Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＴ
正に荷電した残基Ｈ、Ｋ、及びＲ
小さな残基Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、及びＶ
非常に小さな残基Ａ、Ｇ、及びＳ
ターンに関与する残基Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｐ、及び形成に関与する残基Ｔ
可動性残基Ｑ、Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ｇ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、及びＲ。
【００６６】
より保存的な置換基としては、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンが挙げられる。変異ＣＤＲにおけるヒドロパシー／親水性特性及び残基の重量／サイズに関する保存も、６−２５抗体のＣＤＲと比較して実質的に保持されている。タンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を付与する上でのヒドロパシーアミノ酸指標の重要性は当技術分野において一般的に理解されている。アミノ酸の相対的なヒドロパシー特徴は、結果として生じるタンパク質の二次構造に寄与し、これは次いでタンパク質と、他の分子、例えば酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが認められている。各アミノ酸は、それらの疎水性及び荷電の特徴に基づいてヒドロパシー指標が割り当てられている。これらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）：システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。類似の残基の保持もまた又は代替的には、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、標準的な設定のＢＬＯＳＵＭ６２、オープンギャップ＝１１及びエクステンドギャップ＝１を使用してＮＣＢＩを通して利用可能なＢＬＡＳＴ２．２．８）の使用によって決定されるような、類似性スコアによって測定され得る。適切な変異体は典型的には、親ペプチドに対して少なくとも約７０％の同一性を示す。本発明によると、第２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１の配列が、第２のアミノ酸配列と７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９；又は１００％の同一性を有することを意味する。本発明によると、第２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１の配列が、第２のアミノ酸配列と９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９；又は１００％の同一性を有することを意味する。
【００６７】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ｉ）本発明の抗体のＨ−ＣＤＲ１に対して少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ１、ｉｉ）本発明の抗体のＨ−ＣＤＲ２に対して少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）本発明の抗体のＨ−ＣＤＲ３に対して少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖を有する抗体である。
【００６８】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ｉ）本発明の抗体のＬ−ＣＤＲ１に対して少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ１、ｉｉ）本発明の抗体のＬ−ＣＤＲ２に対して少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）本発明の抗体のＬ−ＣＤＲ３に対して少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖を有する抗体である。
【００６９】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ｉ）本発明の抗体のＨ−ＣＤＲ１に対して少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ１、ｉｉ）本発明の抗体のＨ−ＣＤＲ２に対して少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）本発明の抗体のＨ−ＣＤＲ３に対して少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖、並びに、ｉ）本発明の抗体のＬ−ＣＤＲ１に対して少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ１、ｉｉ）本発明の抗体のＬ−ＣＤＲ２に対して少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）本発明の抗体のＬ−ＣＤＲ３に対して少なくとも９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖、を有する抗体である。
【００７０】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ｉ）本発明の抗体のＨ−ＣＤＲ１、ｉｉ）本発明の抗体のＨ−ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）本発明の抗体のＨ−ＣＤＲ３を含む、重鎖を有する抗体である。
【００７１】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ｉ）本発明の抗体のＬ−ＣＤＲ１、ｉｉ）本発明の抗体のＬ−ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）本発明の抗体のＬ−ＣＤＲ３を含む、軽鎖を有する抗体である。
【００７２】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ｉ）本発明の抗体のＨ−ＣＤＲ１、ｉｉ）本発明の抗体のＨ−ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）本発明の抗体のＨ−ＣＤＲ３を含む、重鎖と、ｉ）本発明の抗体のＬ−ＣＤＲ１、ｉｉ）本発明の抗体のＬ−ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）本発明の抗体のＬ−ＣＤＲ３を含む、軽鎖とを有する抗体である。
【００７３】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、配列番号７に対して少なくとも７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有する重鎖を有する抗体である。
【００７４】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、配列番号８に対して少なくとも７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有する軽鎖を有する抗体である。
【００７５】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、配列番号７に対して少なくとも７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有する重鎖と、配列番号８に対して少なくとも７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９％の同一性を有する軽鎖とを有する抗体である。
【００７６】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、配列番号７に対して同一である重鎖を有する抗体である。
【００７７】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、配列番号８に対して同一である軽鎖を有する抗体である。
【００７８】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、配列番号７に対して同一である重鎖と配列番号８に対して同一である軽鎖とを有する抗体である。
【００７９】
別の態様では、本発明は、シデロフレキシン−３に対する結合に関して本発明の抗体と競合する抗体を提供する。
【００８０】
本明細書において使用する、予め決定された抗原又はエピトープに対する抗体の結合の脈絡における「結合」という用語は典型的には、例えば、リガンドとして可溶形の抗原及び分析物として抗体を使用して、ビアコア３０００機器で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定したところ、約１０−７Ｍ以下、例えば約１０−８Ｍ以下、例えば約１０−９Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、又は約１０−１１Ｍ又はさらにはそれ以下のＫＤに相当する親和性での結合である。ビアコア（登録商標）（ＧＥヘルスケア社、ピスカタウェイ、ＮＪ州）は、一連のモノクローナル抗体をエピトープビニングするために慣用的に使用される様々な表面プラズモン共鳴アッセイフォーマットの１つである。典型的には、抗体は、予め決定された抗原とは同一ではないか又は密接に関連していない、非特異的抗原（例えば、ウシ血清アルブミン、カゼイン）に対する結合についてのそのＫＤよりも、少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い、例えば少なくとも１，０００倍低い、例えば少なくとも１０，０００倍低い、例えば少なくとも１００，０００倍低いＫＤに相当する親和性で、予め決定された抗原に結合する。抗体のＫＤが非常に低い場合（すなわち、抗体は高い親和性を有する）場合、抗体が抗原に結合するＫＤは典型的には、非特異的抗原に対するそのＫＤよりも少なくとも１０，０００倍低い。このような結合が検出不可能であるか（例えば、可溶形の抗原をリガンドとして及び抗体を分析物として使用して、ビアコア３０００機器でプラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して）、又は、該抗体と、異なる化学構造若しくはアミノ酸配列を有する抗原若しくはエピトープによって検出される結合よりも１００倍、５００倍、１０００倍、若しくは１０００倍以上低い場合、抗体は、抗原又はエピトープに実質的に結合しないと言われる。
【００８１】
抗体の工学操作
本発明の工学操作された抗体は、例えば抗体の特性を改善するために、ＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に改変が施された抗体を含む。典型的には、このようなフレームワーク改変は、抗体の免疫原性を低下させるために行なわれる。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列へと「復帰突然変異」させることである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、該抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、該抗体が由来する生殖系列配列と比較することによって同定され得る。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列の配置に戻すために、体細胞突然変異を、例えば部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ媒介突然変異誘発によって生殖系列配列に「復帰突然変異」させることができる。このような「復帰突然変異した」抗体も本発明によって包含されることを意図する。別の型のフレームワーク改変は、フレームワーク領域内の又はさらには１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基を突然変異させることにより、Ｔ細胞エピトープを除去し、これにより抗体の免疫原性の可能性を低下させることを含む。このアプローチは「脱免疫化」とも称され、Carr et al.による米国特許公開公報の第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。
【００８２】
いくつかの実施態様では、抗体のグリコシル化が改変されている。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を高めるために改変され得る。このような糖質の改変は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を改変することによって成し遂げられ得る。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位が排除され、これにより、その部位におけるグリコシル化が消失するような、１つ以上のアミノ酸置換を行ない得る。このような無グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高め得る。このようなアプローチは、Co et al.による米国特許第５，７１４，３５０号及び第６，３５０，８６１号にさらに詳述されている。
【００８３】
いくつかの実施態様では、凝集に対する抗体の感受性を低下させるために、第一のＣＤＲ（ＣＤＲ１）内及びその近くの凝集「ホットスポット」に局在するアミノ酸にいくつかの突然変異を起こす（Joseph M. Perchiacca et al., Proteins 2011; 79:2637-2647参照）。
【００８４】
本発明の抗体は任意のアイソタイプであり得る。アイソタイプの選択は典型的には、所望のエフェクター機能によって導かれるだろう。ＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、ＡＤＣＣ又はＣＤＣなどのこのようなエフェクター機能を媒介するアイソタイプであり、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４は媒介しないか又はより低い程度で媒介する。κ又はλのいずれかの軽鎖定常領域を使用し得る。所望であれば、本発明のモノクローナル抗体のクラスは、公知の方法によって切り替えられ得る。典型的には、クラススイッチ技術を使用して、あるＩｇＧサブクラスを別のサブクラスへ、例えばＩｇＧ１からＩｇＧ２へと変換し得る。したがって、本発明のモノクローナル抗体のエフェクター機能を、様々な治療用途のために、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体へとアイソタイプを切り替えることによって変化させ得る。
【００８５】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、完全長抗体である。いくつかの実施態様では、完全長抗体はＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施態様では、完全長抗体はＩｇＧ３抗体である
【００８６】
いくつかの実施態様では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が改変、例えば増加又は減少するように改変される。このアプローチは、Bodmer et al.による米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖と重鎖の会合を促進するために、又は抗体の安定性を増加若しくは減少させるために改変される。
【００８７】
いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能を改変するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することによって改変される。例えば、１つ以上のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置換することができ、これにより、該抗体は、エフェクターリガンドに対して改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能は保持している。親和性が改変されたエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体又は補体であり得る。このアプローチは、Winter et al.による米国特許第５，６２４，８２１号及び第５，６４８，２６０号にさらに詳述されている。
【００８８】
いくつかの実施態様では、アミノ酸残基から選択された１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置換することができ、これにより、抗体は、改変されたＣ１ｑへの結合及び／又は低減した若しくは消失した補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）を有する。このアプローチは、Idusogie et al.による米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳述されている。
【００８９】
いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域は、１つ以上のアミノ酸を改変することによって、抗体が抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を増加させるために及び／又はＦｃ受容体に対する抗体の親和性を増加させるために改変される。このアプローチは、PrestaによるＰＣＴ公開公報の国際公開公報第００／４２０７２号にさらに記載されている。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＦｃＲｎに対するＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされ、結合の改善された変異体が記載されている（Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604、国際公開公報第２０１０１０６１８０号参照）。
【００９０】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害活性」すなわち「ＡＤＣＣ」という用語は、当技術分野においてよく理解されている用語であり、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞障害性細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いて、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する非特異的な細胞障害性細胞としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好中球、及び好酸球が挙げられる。
【００９１】
「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指し、これは抗体のアイソタイプにより変化する。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑへの結合及び補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体への結合；抗体依存性細胞媒介性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が挙げられる。
【００９２】
追加的に又は代替的に、改変された種類のグリコシル化を有する抗体、例えば、減少した量のフコシル化残基を有するか又はフコシル残基を全く有さない低フコシル化又は無フコシル化抗体、あるいは、増加した二分岐ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体が作製され得る。このような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を増加させることが実証された。このような糖質の改変は、例えば、改変されたグリコシル化機序を有する宿主細胞内で抗体を発現させることによって成し遂げられ得る。改変されたグリコシル化機序を有する細胞は当技術分野において記載され、これを宿主細胞として使用することができ、この中で本発明の組換え抗体を発現させ、これにより改変されたグリコシル化を有する抗体を生成することができる。例えば、Hang et al.による欧州特許第１，１７６，１９５号は、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株を記載し、これにより、このような細胞株において発現された抗体は、低フコシル化を示すか、又は、フコシル残基を欠失している。それ故、いくつかの実施態様では、本発明のモノクローナル抗体は、低フコシル化又は無フコシル化パターンを示す細胞株、例えば、フコシルトランスフェラーゼをコードしているＦＵＴ８遺伝子の発現の欠損した哺乳動物細胞株における組換え発現によって産生され得る。PrestaによるＰＣＴ公開公報の国際公開公報第０３／０３５８３５号は、Ａｓｎ（２９７）に連結された糖質にフコースを付着する能力の低下した、変異ＣＨＯ細胞株であるＬｅｃｌ３細胞を記載し、その結果によりまた、その宿主細胞内で発現された抗体の低フコシル化が起こる（Shields, R.L. et al, 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照）。Umana et al.によるＰＣＴ公開公報の国際公開公報第９９／５４３４２号は、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えばβ（１，４−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように工学操作された細胞株を記載し、これにより、工学操作された細胞株において発現された抗体は、増加した二分岐ＧｌｃＮａｃ構造を示し、その結果、抗体のＡＤＣＣ活性は増加する（Umana et al, 1999 Nat. Biotech. 17: 176-180も参照）。ユーリカ・セラピューティックス社はさらに、フコシル残基の欠失した改変された哺乳動物グリコシル化パターンを有する抗体を産生することのできる遺伝子工学操作されたＣＨＯ哺乳動物細胞を記載する（http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html）。あるいは、本発明のモノクローナル抗体は、哺乳動物様グリコシル化パターンのために工学操作されかつグリコシル化パターンとしてのフコースを欠失した抗体を産生することのできる、酵母又は糸状菌において産生され得る（例えば欧州特許第１２９７１７２Ｂ１号参照）。
【００９３】
半減期
１つの実施態様では、抗体は、その生物学的半減期を延長するように改変される。様々なアプローチが可能である。例えば、Wardによる米国特許第６，２７７，３７５号に記載のように、以下の中の１つ以上の突然変異（Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ）を導入することができる。あるいは、生物学的半減期を延長するために、抗体を、ＣＨ１領域又はＣＬ領域内で、Presta et al.による米国特許第５，８６９，０４６号及び第６，１２１，０２２号に記載のように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採用されたサルベージ受容体結合性エピトープを含有するように改変させることができる。半減期が延長され、母体から胎児へのＩｇＧの移行に関与する新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合の改善された抗体は（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 （1976）及びKim et al., J. immunol. 24:249 (1994)）、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号（Hinton et al.）に記載されている。そうした抗体は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合を改善させる１つ以上の置換をＦｃ領域内に有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体としては、Ｆｃ領域残基（２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、又は４３４）の１つ以上において置換を有する変異体、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有する変異体（米国特許第７，３７１，８２６号）が挙げられる。
【００９４】
本発明によって考えられる本明細書における抗体の別の改変は、ＰＥＧ化である。抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば血清中）半減期を延長させるためにＰＥＧ化され得る。抗体をＰＥＧ化するために、抗体又はその断片は典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体と１つ以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体断片に付着するようになる条件下で反応させる。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似した反応性で水溶性のポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応によって行われ得る。本明細書において使用する「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されている任意の形態のＰＥＧ、例えばモノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミドを包含することを意図する。特定の実施態様では、ＰＥＧ化される予定の抗体は、無グリコシル化抗体である。タンパク質をＰＥＧ化するための方法は当技術分野において公知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、Nishimura et al.による欧州特許第０１５４３１６号及びIshikawa et al.による欧州特許第０４０１３８４号を参照されたい。
【００９５】
本発明によって考えられる抗体の別の改変は、結果として得られる分子の半減期を延長するための、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン又はその断片に対する本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域のコンジュゲート又はタンパク質融合物である。このようなアプローチは、例えば、Ballance et al.、欧州特許第０３２２０９４号に記載されている。別の可能性は、結果として得られる分子の半減期を延長するための、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンに結合することができるタンパク質に対する、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域の融合である。このようなアプローチは、例えば、Nygren et al.、欧州特許第０４８６５２５号に記載されている。
【００９６】
ポリシアル化は、治療用ペプチド及びタンパク質の活動的寿命を延長し、その安定性を改善するための天然ポリマーポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用する、別の技術である。ＰＳＡは、シアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質及び治療用ペプチド薬物の送達に使用される場合、ポリシアル酸は、抱合時に防御的な微小環境を提供する。これは、循環中の治療用タンパク質の活動的寿命を延長し、それが免疫系によって認識されるのを防ぐ。ＰＳＡポリマーは、ヒト生体において天然に見られる。ＰＳＡポリマーは、数百万年かけて特定の細菌の壁をＰＳＡポリマーで覆うように進化してきた該細菌によって採用された。これらの天然にポリシアル酸化された細菌は、その後、分子的模倣のお蔭で、生体防御システムを阻止することができる。天然の最終的な内密的な技術であるＰＳＡは、大量に予め規定された物理的特徴でもってこのような細菌から容易に産生され得る。細菌ＰＳＡは、タンパク質に結合させた場合でさえ完全に非免疫原性である。なぜなら、それはヒト体内のＰＳＡと化学的に同一であるからである。
【００９７】
別の技術は、抗体に連結させたヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）誘導体の使用を含む。ＨＥＳは、ワキシー（waxy）メイズデンプンから得られた改変された天然ポリマーであり、体内の酵素によって代謝され得る。ＨＥＳ溶液は通常、不足した血液量を代用するために及び血液のレオロジー特性を改善するために投与される。抗体のＨＥＳ化は、分子の安定性を高めることによって、並びに、腎クリアランスを減少させることによって、循環中の半減期の延長を可能とし、その結果、生物学的安定性は高まる。ＨＥＳの分子量などの様々なパラメーターを変更することによって、多種多様なＨＥＳ抗体抱合体をカスタムメイドすることができる。
【００９８】
別の実施態様では、抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させることにより、抗体の生物学的半減期を減少させる。より具体的には、１つ以上のアミノ酸突然変異を、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入することにより、抗体は、天然のＦｃ−ヒンジドメインの黄色ブドウ球菌プロテインＡへの結合と比較して、損なわれたＳｐＡへの結合を示す。このアプローチは、Ward et al.による米国特許第６，１６５，７４５号さらに詳述されている。
【００９９】
他の改変
本発明の特定の実施態様では、抗体は、ｐＩを増加させ、それらの薬物様特性を改善させるように工学操作されている。タンパク質のｐＩは、分子の全体的な生物物理学的特性の重要な決定因子である。低いｐＩを有する抗体は、可溶性がより低く、より不安定であり、凝集しがちであることが知られている。さらに、ｐＩの低い抗体の精製は困難であり、特に臨床使用のためのスケールアップ中に問題が起こり得る。本発明の抗体又はその断片のｐＩの上昇によりその溶解度は改善され、抗体をより高濃度（１００mg/mlを超える）で製剤化することが可能となった。高濃度（例えば１００mg/mlを超える）での抗体の製剤化は、硝子体内への注射を介して患者の眼により高用量の抗体を投与できるという利点を与え、次いで投与頻度の減少が可能となり得、これは心血管障害をはじめとする慢性疾患の処置においてかなりの利点である。より高いｐＩはまた、ＦｃＲｎにより媒介されるＩｇＧ形の抗体のリサイクリングを増加させ得、したがって、より長い期間にわたり体内に薬物が持続することが可能となり、より少ない注射回数が必要となる。最後に、抗体の全体的な安定性は、より高いｐＩに因り有意に改善され、その結果、インビボにおけるより長い貯蔵寿命及び生理活性がもたらされる。好ましくは、ｐＩは、８．２よりも高いか又は８．２に等しい。
【０１００】
本発明の抗体の抗原結合ドメインを含むＣＡＲ−Ｔ細胞
本発明はまた、本発明の抗体の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。典型的には、該キメラ抗原受容体は、本発明の抗体の少なくとも１つのＶＨ配列及び／又はＶＬ配列を含む。本発明のキメラ抗原受容体はまた、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインも含む。
【０１０１】
本明細書において使用する「キメラ抗原受容体」すなわち「ＣＡＲ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインに連結させた抗体の抗原結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）を含有している、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチドを指す。ＣＡＲの特徴は、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用して、ＭＨＣに拘束されない方法で選択された標的に向かってＴ細胞の特異性及び反応性をＣＡＲが再指向させる能力を含む。ＭＨＣに拘束されない抗原認識は、ＣＡＲを発現しているＴ細胞に、抗原のプロセシングとは独立して抗原を認識する能力を与え、したがって、腫瘍回避の主要な機序を迂回する。さらに、Ｔ細胞において発現させると、ＣＡＲは有利には、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖及びβ鎖と二量体を形成しない。
【０１０２】
いくつかの実施態様では、本発明は、本発明の抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むか、からなるか、又は実質的にからなる、抗原結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。いくつかの実施態様では、抗原結合ドメインは、リンカーペプチドを含む。リンカーペプチドは、軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間に位置し得る。
【０１０３】
いくつかの実施態様では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、及びＣＤ３ζ細胞内ドメインからなる群より選択された、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ２８は、Ｔ細胞の共刺激に重要であるＴ細胞マーカーである。４−１ＢＢは、Ｔ細胞に強力な共刺激シグナルを伝達し、分化を促進し、Ｔリンパ球の長期生存を増強する。ＣＤ３ζはＴＣＲと会合することによりシグナルを発生し、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有している。
【０１０４】
いくつかの実施態様では、本発明のキメラ抗原受容体は、例えばジスルフィド橋を介して、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ−アシル化、環化され得るか、又は、酸付加塩へと変換され得るか、及び／又は場合により二量体化若しくは多量体化され得る。
【０１０５】
本発明はまた、本発明のキメラ抗原受容体をコードしている核酸も提供する。いくつかの実施態様では、核酸は、上記のようにベクターに組み込まれる。
【０１０６】
本発明はまた、本発明のキメラ抗原受容体をコードしている核酸を含む宿主細胞も提供する。宿主細胞は、任意の細胞型であり得、任意の組織型から派生し得、任意の発達段階であり得る。１つの実施態様では、宿主細胞は、例えば末梢血リンパ球（ＰＢＬ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離された、Ｔ細胞である。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば培養されたＴ細胞、例えば初代Ｔ細胞、又は培養されたＴ細胞に由来するＴ細胞、例えばジャーカット細胞、ＳｕｐＴ１細胞など、又は哺乳動物から得られたＴ細胞であり得る。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、又は他の組織若しくは体液を含むがこれらに限定されない、数多くの入手源から得ることができる。Ｔ細胞はまた、濃縮又は精製されてもよい。Ｔ細胞は、任意の種類のＴ細胞であり得、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋ダブルポジティブＴ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えばＴｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば細胞障害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞、記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞などを含むがこれらに限定されない、任意の発達段階であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。
【０１０７】
上記のように調製されたそうしたＴ細胞個体群は、本開示に基づいて当業者には明らかであろう公知の技術又はその変法に従って、養子免疫療法のための方法及び組成物に利用され得る。例えば、Gruenberg et al.の米国特許出願公開公報第２００３／０１７０２３８号を参照；また、Rosenbergの米国特許第４，６９０，９１５号も参照。がんの養子免疫療法は、細胞が直接的に又は間接的にのいずれかで樹立された腫瘍の退縮を媒介する目的で、抗腫瘍反応性を有する免疫細胞が、腫瘍を有する宿主に投与される治療アプローチを指す。リンパ球、特にＴリンパ球の注入はこのカテゴリーに該当する。現在、殆どの養子免疫療法は、患者自身の免疫細胞を使用した処置に向けられた自己腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）に基づく。これらの療法は、免疫細胞により媒介される応答を増強させるために、又はがん細胞をはじめとする体内の特異的な抗原若しくは外来物質を認識するためにのいずれかのために、患者自身のリンパ球を処理することを含む。処置は、患者のリンパ球を取り出し、これらの細胞をインビトロで生物学的製剤及び薬物に曝露させて細胞の免疫機能を活性化させることによって成し遂げられる。一旦自己細胞が活性化されると、これらのエクスビボで活性化された細胞を、免疫系を増強してがんを処置するために患者に再注入する。いくつかの実施態様では、細胞は、まずそれらをそれらの培養培地から収集し、次いで、処置有効量での投与に適した培地及び容器システム（「薬学的に許容される」担体）中の細胞を洗浄及び濃縮することによって製剤化される。適切な注入媒体は、任意の等張性媒体調合物、典型的には通常生理食塩水、ＮｏｒｍｏｓｏｌＲ（アボット社）又はＰｌａｓｍａ−ＬｙｔｅＡ（バクスター社）であり得るが、５％デキストロース水溶液又はリンガー乳酸液を使用してもよい。注入用媒体にヒト血清アルブミンを補充してもよい。組成物中の細胞の処置有効量は、所望の特異性を有するＴ細胞の相対的比率、レシピエントの年齢及び体重、標的化される容態の重症度、並びに標的化される抗原の免疫原性に依存する。これらの細胞の量は、約１０３/kg、好ましくは５×１０３/kgまで低くてもよく；１０７/kg、好ましくは１０８/kgまで高くてもよい。細胞数は、そこに含まれる細胞型と同様に、該組成物が目的とする最終的な用途に依存するだろう。例えば、特定の抗原に対して特異的である細胞が所望である場合、個体群は、７０％以上、一般的には８０％以上、８５％以上、及び９０〜９５％以上のこのような細胞を含有しているだろう。本明細書において提供される用途のために、該細胞は一般的に、１リットル以下の容量であり、５００ml以下、さらには２５０ml又は１００ml以下であってもよい。免疫細胞の臨床的に妥当な数を複数の注入液に分配し得、これは累積すると細胞の所望の総数に等しいか又はこれを上回る。
【０１０８】
特に、本発明の細胞は、がんの処置に特に適している。したがって、本発明のさらなる目的は、治療有効量の本発明の細胞個体群を被験者に投与する工程を含む、それを必要とする被験者におけるがんの処置法に関する。
【０１０９】
多重特異的抗体
いくつかの実施態様では、本発明は、本明細書に記載の本発明の抗体分子に由来する第一の抗原結合部位と、少なくとも１つの第二の抗原結合部位とを含む、多重特異的抗体を提供する。
【０１１０】
いくつかの実施態様では、第二の抗原結合部位は、例えば、米国特許第７２３５６４１号に記載の標的抗原とＴ細胞上のＣＤ３に対して指向される二重特異的ｓｖＦｖ２であるＢｉＴＥ抗体（二重特異的Ｔ細胞誘導抗体）としてのヒトエフェクター細胞上の抗原と結合することによる、又は、細胞障害性薬剤若しくは第二の治療剤と結合することによる、死滅機序を動員するために使用される。本明細書において使用する「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認知期及び活性化期ではなく、免疫応答のエフェクター期に関与する免疫細胞を指す。例示的な免疫細胞としては、骨髄系又はリンパ系を起源とする細胞、例えばリンパ球（例えばＢ細胞及びＴ細胞、例えば細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ））、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、肥満細胞、及び顆粒球、例えば好中球、好酸球、及び好塩基球が挙げられる。いくつかのエフェクター細胞は、特異的なＦｃ受容体（ＦｃＲ）を発現し、特異的な免疫機能を遂行する。いくつかの実施態様では、ナチュラルキラー細胞などのエフェクター細胞は、ＡＤＣＣを誘導することができる。例えば、ＦｃＲを発現する単球、マクロファージは、標的細胞の特異的死滅、及び抗原を免疫系の他の成分に提示することに関与している。いくつかの実施態様では、エフェクター細胞は、標的抗原又は標的細胞を貪食し得る。エフェクター細胞上の特定のＦｃＲの発現は、サイトカインなどの体液性因子によって調節され得る。エフェクター細胞は標的抗原を貪食することができるか、又は標的細胞を貪食若しくは溶解することができる。適切な細胞障害性薬剤及び第二の治療剤を以下に例示し、これには、毒素（例えば放射標識ペプチド）、化学療法剤、及びプロドラッグが挙げられる。
【０１１１】
いくつかの実施態様では、第二の抗原結合部位は、腫瘍関連マクロファージ上の抗原、例えばＣＤ１６３、ＣＤ２０４、ＣＤ２０６、ＣＤ６８、及びＴｉｍ−３に結合する。
【０１１２】
本明細書において使用する「ＣＤ６８」（表面抗原分類６８）という用語は、「ＧＰ１１０」、「ＬＡＭＰ４」及び「ＳＣＡＲＤ１」としても知られているが、これは当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ヒトにおいてはＣＤ６８遺伝子［遺伝子ＩＤ：９６８］によってコードされているタンパク質を指す。この遺伝子は、ヒト単球及び組織マクロファージによって高度に発現されている１１０ｋＤの膜貫通糖タンパク質をコードしている。それは、リソソーム／エンドソーム結合型膜糖タンパク質（ＬＡＭＰ）ファミリーの一員である。該タンパク質は主に、リソソーム及びエンドソームに局在し、循環しているより小さな画分は細胞表面に局在している。それは、重度にグリコシル化された細胞外ドメインを有するＩ型膜内在型タンパク質であり、組織特異的及び臓器特異的レクチン又はセレクチンに結合する。該タンパク質はまた、スカベンジャー受容体ファミリーの一員でもある。スカベンジャー受容体は典型的には、細胞片を排除し、貪食作用を促進し、マクロファージの動員及び活性化を媒介するように機能する。
【０１１３】
本明細書において使用する「ＣＤ１６３」（表面抗原分類１６３）という用語は、「Ｍ１３０」、「ＭＭ１３０」、「ＳＣＡＲＩ１」としても知られているが、これは当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ヒトにおいてはＣＤ１６３遺伝子［遺伝子ＩＤ：９３３２］によってコードされているタンパク質を指す。ＣＤ１６３は、単球及びマクロファージに専ら発現されている。それは、マクロファージによるヘモグロビン／ハプトグロビン複合体の排除及びエンドサイトーシスに関与する急性期の調節受容体として機能し、これにより、遊離ヘモグロビンにより媒介される酸化による損傷から組織を防御し得る。このタンパク質はまた、細菌に対する自然免疫センサー、及び局所炎症の誘導因子としても機能し得る。分子サイズは１３０ｋＤａである。該受容体は、スカベンジャー受容体システインリッチファミリーＢ型に属し、１０４８アミノ酸残基の細胞外ドメイン、１つの膜貫通セグメント、及びいくつかのスプライス変異体を有する細胞質内尾部からなる。
【０１１４】
本明細書において使用する「ＣＤ２０４」（表面抗原分類２０４）という用語は、「マクロファージスカベンジャー受容体１」（ＭＳＲ１）としても知られているが、これは当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ヒトにおいてはＭＳＲ１遺伝子（ＮＣＢＩ参照番号：ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿１３８７１６）によってコードされているタンパク質を指す。ＣＤ２０４のＵｎｉｐｒｏｔ参照番号はＰ２１７５７であり、タンパク質配列のＮＣＢＩ参照番号はＮＰ＿００２４３６である。
【０１１５】
本明細書において使用する「ＣＤ２０６」（表面抗原分類２０６）という用語は、「マンノース受容体」としても知られているが、これは当技術分野におけるその一般的な意味を有し、マクロファージ及び未熟樹状細胞の表面上に主に存在するが、ヒト皮膚線維芽細胞及びケラチン細胞などの皮膚細胞の表面上にも発現されているＣ型レクチンも指す。ＣＤ２０６のｕｎｉｐｒｏｔ参照番号は、Ｐ２２８９７である。
【０１１６】
本明細書において使用する「Ｔｉｍ−３」という用語は、「Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２」（ＨＡＶＣＲ２）としても知られているが、これは当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ヒトにおいてはＨＡＶＣＲ２遺伝子（ＮＣＢＩ参照番号：ｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿０３２７８２）によってコードされているＴ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有−３を指す。Ｔｉｍ−３のｕｎｉｐｒｏｔ参照番号はＱ８ＴＤＱ０であり、タンパク質配列のＮＣＢＩ参照番号はＮＰ＿１１６１７１である。
【０１１７】
本発明の多重特異的抗体分子の例示的なフォーマットとしては、（ｉ）化学的なヘテロコンジュゲーションによって架橋された２つの抗体、一方はシデロフレキシン−３に対して特異性を有する抗体、及び他方は第２の抗原に対する特異性を有する抗体；（ｉｉ）２つの異なる抗原結合領域を含む単一抗体；（ｉｉｉ）２つの異なる抗原結合領域、例えば外部ペプチドリンカーによって直列に連結された２つのｓｃＦｖを含む、一本鎖抗体；（ｉｖ）デュアル可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）（各軽鎖及び重鎖は、短いペプチド結合を通して直列に２つの可変ドメインを含有している）（Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig（商標）) Molecule, In : Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)）；（ｖ）化学的に連結された二重特異的（Ｆａｂ’）２断片；（ｖｉ）２つの一本鎖ディアボディの融合により、各々の標的抗原に対して２つの結合部位を有する四価の二重特異的抗体となっている、タンデムディアボディ；（ｖｉｉ）ｓｃＦｖとディアボディの組合せにより多価分子となっているフレキシボディ；（ｖｉｉｉ）プロテインキナーゼＡにおける「二量体化及びドッキングドメイン」に基づいたいわゆる「ドッキング及びロック」分子であり、これがＦａｂに適用された場合、異なるＦａｂ断片に連結された２つの同一なＦａｂ断片からなる三価の二重特異的結合タンパク質を生成することができる；（ｉｘ）例えばヒトＦａｂアームの両末端に融合した２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるサソリ型分子；及び（ｘ）ディアボディ、が挙げられるがこれらに限定されない。二重特異的抗体の別の例示的なフォーマットは、ヘテロ二量体化を強制する相補的ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子である。このような分子は、例えばTriomab/Quadroma（トリオン・ファーマ社／フレゼニウス・バイオテック社）、Knob-into-Hole（ジェネンテック社）、CrossMAb（ロシュ社）及び静電マッチ（アムジェン社）、ＬＵＺ−Ｙ（ジェネンテック社）、Strand Exchange Engineered Domain body（ＳＥＥＤボディ）（ＥＭＤセローノ社）、ビクロニック（Biclonic）（メルス社）及びデュオボディ（DuoBody）（ジェンマブ社）技術として知られる技術などの公知の技術を使用して調製することができる。
【０１１８】
いくつかの実施態様では、二重特異的抗体は、典型的にはデュオボディ技術を使用して、制御されたＦａｂ−アーム交換を介して得られるか又は得ることができる。制御されたＦａｂ−アーム交換によって二重特異的抗体をインビトロで生成するための方法が、国際公開公報第２００８１１９３５３号及び国際公開公報第２０１１１３１７４６号（どちらもジェンマブ社による）に記載されている。国際公開公報第２００８１１９３５３号に記載された１つの例示的な方法では、還元条件下でのインキュベーション時の、２つの単一特異的抗体（どちらもＩｇＧ４様のＣＨ３領域を含む）の間の「Ｆａｂ−アーム」又は「分子の半分」の交換（重鎖と付着している軽鎖の交換）によって形成される。得られた生成物は、異なる配列を含み得る２つのＦａｂアームを有する二重特異的抗体である。国際公開公報第２０１１１３１７４６号に記載された別の例示的な方法では、本発明の二重特異的抗体は、以下の工程（ここでの第１及び第２の抗体の少なくとも一方は本発明の抗体である）；ａ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第１の抗体を提供する工程（該Ｆｃ領域は第１のＣＨ３領域を含む）；ｂ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第２の抗体を提供する工程（該Ｆｃ領域は第２のＣＨ３領域を含み、前記第１及び第２のＣＨ３領域の配列が異なり、前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が前記第１及び第２のＣＨ３領域の各々のホモ二量体相互作用より強いようなものである）；ｃ）前記第１の抗体を前記第２の抗体と共に、還元条件下においてインキュベーションする工程；及びｄ）前記二重特異性抗体を得る工程（ここで第１の抗体は本発明の抗体であり、第２の抗体は異なる結合特異性を有する、又はその逆である）を含む方法によって調製される。還元条件は、例えば、２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンから選択される還元剤を加えることにより提供することができる。工程ｄ）は、例えば、還元剤の除去により、例えば、脱塩により、非還元性又は低還元性となるように条件を回復させることをさらに含むことができる。好ましくは、第１及び第２のＣＨ３領域の配列は異なり、ほんの僅かの、かなり保存された、非対称な突然変異を含んでいるので、前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用は、前記第１及び第２のＣＨ３領域の各々のホモ二量体相互作用より強力である。これらの相互作用及びそれらをどのようにして達成することができるかの詳細は、国際公開公報第２０１１１３１７４６号に提供され、これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。下記は、場合により、一方又は両方のＦｃ領域がＩｇＧ１アイソタイプのものである、このような非対称の突然変異の組み合わせの例示的な実施態様である。
【０１１９】
イムノコンジュゲート
検出可能な標識
本発明の抗体を検出可能な標識とコンジュゲートさせ、イムノコンジュゲートを形成することができる。適切な検出可能な標識としては、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、又はコロイド状金が挙げられる。このような検出可能なように標識されたイムノコンジュゲートを作製及び検出する方法は当業者には周知であり、以下においてより詳細に記載されている。検出可能な標識は、オートラジオグラフィーによって検出される放射性同位体であり得る。本発明の目的のために特に有用である同位体は、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、及び１４Ｃである。
【０１２０】
イムノコンジュゲートはまた、蛍光化合物を用いて標識されていてもよい。蛍光標識された抗体の存在は、適切な波長の光にイムノコンジュゲートを曝し、得られた蛍光を検出することによって決定される。蛍光標識化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、及びフルオレサミンが挙げられる。
【０１２１】
あるいは、イムノコンジュゲートは、抗体を化学発光化合物と結合させることによって検出可能なように標識され得る。化学発光でタグ化されたイムノコンジュゲートの存在は、化学反応の経過中に発生する発光の存在を検出することによって決定される。化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、及びシュウ酸エステルが挙げられる。
【０１２２】
同様に、生物発光化合物を使用して、本発明のイムノコンジュゲートを標識することができる。生物発光は、生物系において見られる化学発光の一種であり、ここでは触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識のために有用である生物発光化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びエクオリンが挙げられる。
【０１２３】
あるいは、イムノコンジュゲートは、本発明の抗体を酵素に連結させることによって検出可能なように標識され得る。抗体−酵素コンジュゲートを、適切な基質の存在下でインキュベートすると、酵素部分は基質と反応して化学部分を生成し、これを例えば分光光度的に、蛍光定量的に、又は視覚的な手段によって検出することができる。多重特異的イムノコンジュゲートを検出可能なように標識するために使用され得る酵素の例としては、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、及びアルカリホスファターゼが挙げられる。
【０１２４】
当業者は、本発明に従って使用され得る他の適切な標識を知っているだろう。抗体に対するマーカー部分の結合は、当技術分野において公知である標準的な技術を使用して達成され得る。これに関する典型的な方法は、Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70: 1, 1976; Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81 : 1, 1977; Shih et al., Int'U. Cancer 46: 1101, 1990; Stein et al, Cancer Res. 50: 1330, 1990；及びColiganに記載されている。
【０１２５】
さらに、免疫化学的検出の簡便性及び多用途性は、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンとコンジュゲートさせた抗体を使用することによって増強され得る。（例えば、Wilchek et al. (eds.), "Avidin-Biotin Technology," Methods In Enzymology (Vol. 184) (Academic Press 1990); Bayer et al., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology," in Methods In Molecular Biology (Vol. 10) 149- 162 (Manson, ed., The Humana Press, Inc. 1992)を参照）。
【０１２６】
イムノアッセイを実施するための方法は、十分に確立されている（例えば、Cook and Self, “Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application 180-208 (Ritter and Ladyman, eds., Cambridge University Press 1995); Perry, “The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications 107-120 (Birch and Lennox, eds., Wiley-Liss, Inc. 1995); Diamandis, Immunoassay（Academic Press, Inc. 1996）を参照）。
【０１２７】
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
いくつかの実施態様では、本発明の抗体を、治療用部分、すなわち薬物にコンジュゲートさせる。治療用部分は、例えば、細胞毒、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、免疫刺激剤、溶解性ペプチド、又は放射性同位体であり得る。このようなコンジュゲートは、本明細書において「抗体−薬物コンジュゲート」すなわち「ＡＤＣ」と称される。
【０１２８】
いくつかの実施態様では、抗体を細胞障害性部分にコンジュゲートさせる。細胞障害性部分は、例えば、タキソール；サイトカラシンＢ；グラミシジンＤ；臭化エチジウム；エメチン；マイトマイシン；エトポシド；テノポシド；ビンクリスチン；ビンブラスチン；コルヒチン；ドキソルビシン；ダウノルビシン；ジヒドロキシアントラシンジオン；チューブリン阻害剤、例えばメイタンシン又はその類似体若しくはその誘導体；有糸分裂阻害剤、例えばモノメチルアウリスタチンＥ若しくはＦ又はその類似体若しくはその誘導体；ドラスタチン１０若しくは１５又はその類似体；イリノテカン又はその類似体；ミトキサントロン；ミスラマイシン；アクチノマイシンＤ；１−デヒドロテストステロン；糖質コルチコイド；プロカイン；テトラカイン；リドカイン；プロプラノロール；ピューロマイシン；カリケアマイシン又はその類似体若しくはその誘導体；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、又はクラドリビン；アルキル化剤、例えばメクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ；白金誘導体、例えばシスプラチン又はカルボプラチン；デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、又はその類似体若しくはその誘導体；抗生物質、例えばダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミスラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）；ピローロ［２，１−ｃ］［１，４］−ベンゾジアゼピン（ＰＤＢ）；ジフテリア毒素及び関連した分子、例えばジフテリアＡ鎖及びその活性断片及びハイブリッド分子、リシン毒素、例えばリシンＡ又は脱グリコシル化リシンＡ鎖毒素、コレラ毒素、シガ様毒素、例えばＳＬＴ Ｉ、ＳＬＴ ＩＩ、ＳＬＴ ＩＩＶ、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、シガ毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、ボウマン・バーク大豆プロテアーゼ阻害剤、シュードモナス外毒素、アロリン（alorin）、サポリン、モデシン、ゲラニン（gelanin）、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Phytolacca americana）タンパク質、例えばＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ、ツルレイシ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリアコン（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、及びエノマイシン毒素；リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）；ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ；ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質；ジフテリア毒素；及びシュードモナスエンドトキシンからなる群より選択され得る。
【０１２９】
いくつかの実施態様では、抗体を、核酸又は核酸に結合した分子にコンジュゲートさせる。１つのこのような実施態様では、コンジュゲートした核酸は、細胞障害性リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）又はデオキシ−リボヌクレアーゼ（例えばＤＮａｓｅＩ）、アンチセンス核酸、阻害性ＲＮＡ分子（例えばｓｉＲＮＡ分子）、又は免疫刺激性核酸（例えば免疫刺激性ＣｐＧモチーフ含有ＤＮＡ分子）である。いくつかの実施態様では、抗体を、アプタマー又はリボザイムにコンジュゲートさせる。
【０１３０】
いくつかの実施態様では、抗体を、例えば融合タンパク質として、溶解性ペプチド、例えばＣＬＩＰ、マガイニン２、メリチン、セクロピン、及びＰ１８にコンジュゲートさせる。
【０１３１】
いくつかの実施態様では、抗体を、サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８ａ、ＩＬ−２８ｂ、ＩＬ−２９、ＫＧＦ、ＩＦＮα、ＩＦＮ３、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、Ｆｌｔ３リガンド、幹細胞因子、アンセスチム、及びＴＮＦαにコンジュゲートさせる。
【０１３２】
いくつかの実施態様では、抗体を、放射性同位体又は放射性同位体を含有しているキレートにコンジュゲートさせる。例えば、抗体を、キレートリンカー、例えばＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、又はチウキセタンにコンジュゲートさせることができ、これにより、該抗体は放射性同位体と複合体を形成することが可能となる。該抗体はまた、又は代替的には、１つ以上の放射標識されたアミノ酸又は他の放射標識された分子を含み得るか又はこれにコンジュゲートさせ得る。放射性同位体の非限定的な例としては、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ、及び２２７Ｔｈが挙げられる。治療目的のために、β又はα粒子放射線を放出している放射性同位体、例えば、１３１Ｉ、９０Ｙ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、６７Ｃｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、及び２１２Ｐｂなどを使用し得る。
【０１３３】
特定の実施態様では、抗体−薬物コンジュゲートは、抗チューブリン剤を含む。抗チューブリン剤の例としては、例えば、タキサン（例えばタキソール（登録商標）（パクリタキセル）、タキソテール（登録商標）（ドセタキセル））、Ｔ６７（Tularik社）、ビンカアルカロイド（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、及びビノレルビン）、及びドラスタチン（例えばオーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ）が挙げられる。他の抗チューブリン剤としては、例えば、バッカチン誘導体、タキサン類似体（例えばエポチロンＡ及びＢ）、ノコダゾール、コルヒチン、及びコルセミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド、及びエリュテロビンが挙げられる。いくつかの実施態様では、細胞障害性薬剤は、別の群の抗チューブリン剤である、マイタンシノイドである。例えば、具体的な実施態様では、マイタンシノイドは、マイタンシン又はＤＭ−１である（ImmunoGen, Inc.；Chari et al., Cancer Res. 52:127-131, 1992も参照）。
【０１３４】
他の実施態様では、細胞障害性薬剤は代謝拮抗剤である。代謝拮抗剤は、例えば、プリンアンタゴニスト（例えばアザチオプリン又はミコフェノール酸モフェチル）、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤（例えばメトトレキサート）、アシクロビル、ガンシクロビル、ジドブジン、ビダラビン、リババリン、アジドチミジン、シチジン、アラビノシド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ポスカルネット（poscarnet）、又はトリフルリジンであり得る。
【０１３５】
他の実施態様では、本発明の抗体を、プロドラッグ変換酵素にコンジュゲートさせる。プロドラッグ変換酵素を、公知の方法を使用して、抗体に組換え的に融合させても、又はそれに化学的にコンジュゲートさせてもよい。例示的なプロドラッグ変換酵素は、カルボキシペプチダーゼＧ２、β−グルクロニダーゼ、ペニシリン−Ｖ−アミダーゼ、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−グルコシダーゼ、ニトロ還元酵素、及びカルボキシペプチダーゼＡである。
【０１３６】
診断使用
実験の章に記載のように、本発明の抗体は、腫瘍関連マクロファージの検出を可能とし、よって、がんに関与する腫瘍微小環境の検出を可能とする。
【０１３７】
本発明の態様は、腫瘍関連マクロファージの検出のための本発明の抗体の使用に関する。
【０１３８】
したがって、本発明の態様は、生物学的試料中の腫瘍関連マクロファージを検出するための、及び／又はその量を評価するための方法に関し、該方法は、該試料を本発明の抗体と接触させる工程を含む。１つの実施態様では、該方法は、がんの診断のために使用される。
【０１３９】
本発明のさらなる態様は、シデロフレキシン−３レベルが改変（増加又は減少）されているがん疾患及び他の疾患を診断するための本発明の抗体に関する。
【０１４０】
好ましい実施態様では、本発明の抗体を、検出可能な分子又は物質、例えば蛍光分子、放射性分子、又は上記のような当技術分野において公知である任意の他の標識で標識してもよい。例えば、本発明の抗体を、当技術分野において公知である任意の方法によって放射性分子で標識してもよい。例えば、放射性分子としては、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えばＩ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の抗体をまた、核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像撮影（磁気共鳴画像撮影、ＭＲＩとしても知られる）のためのスピン標識、例えばヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、又は鉄で標識してもよい。抗体の投与後、患者内の抗体の分布を検出する。任意の特定の標識の分布を検出するための方法は当業者には公知であり、任意の適切な方法を使用することができる。いくつかの非限定的な例としては、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、磁気共鳴画像撮影（ＭＲＩ）、蛍光法、化学発光法、及び超音波検査が挙げられる。
【０１４１】
本発明の抗体は、腫瘍関連マクロファージに関連したがん疾患の診断及びステージ分類に有用であり得る。
【０１４２】
典型的には、前記診断法は、患者から得られた生物学的試料の使用を含む。本明細書において使用する「生物学的試料」という用語は、被験者から得られた様々な種類の試料を包含し、診断アッセイ又はモニタリングアッセイに使用することができる。生物学的試料としては、血液及び生物学的起源の他の液体試料、固形組織試料、例えば生検標本、又はそれから得られた組織培養液若しくは細胞、及びその子孫が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、生物学的試料は、腫瘍関連マクロファージを伴うがん疾患を有することが疑われる個体から回収された組織試料から得られた細胞を含む。
【０１４３】
生物学的試料は、臨床試料、培養液中の細胞、細胞上清、細胞溶解液、血清、血漿、生物学的液体、及び組織試料を包含する。
【０１４４】
治療使用
実験の章に記載のように、本発明の抗体は、腫瘍関連マクロファージを標的化し、これは、がんの腫瘍微小環境に関与する。腫瘍微小環境は、がんのイニシエーション及び腫瘍増殖の促進において非常に重要な役割を果たすと認識されている。
【０１４５】
本発明の抗体、断片、又はイムノコンジュゲートは、腫瘍関連マクロファージに伴う任意の疾患、優先的にはがんの処置に有用であり得る。本発明の抗体は、単独で又は任意の適切な薬剤と組み合わせて使用され得る。
【０１４６】
本明細書に記載の処置法の各々の実施態様では、本発明の抗体又は本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、処置が探求されている疾患又は障害の管理に関連した慣用的な方法に準じた様式で送達される。本明細書における開示によると、有効量の抗体又は抗体−薬物コンジュゲートを、このような処置を必要とする患者に、疾患又は障害を予防又は治療するのに十分な時間をかけて及び十分な条件下で投与する。
【０１４７】
本明細書において使用する「処置」又は「処置する」という用語は、疾患に罹患するリスクがあるか又は疾患に罹患していることが疑われる被験者、並びに病気であるか又は疾患若しくは医学的状態を患っていると診断された被験者の処置を含む、予防的処置又は防止的処置並びに治癒的処置又は疾患修飾処置の両方を指し、これは臨床的再発の抑制も含む。処置は、医学的障害を有するか又は最終的に障害を獲得する可能性がある被験者に、障害又は再発している障害の１つ以上の症状を予防、治癒、その発症を遅延、その重症度を低減、又は寛解するために、あるいはこのような処置を行なわなかった場合に予想される生存期間を超えて被験者の生存期間を延長するために投与され得る。「治療処方計画」は病気の処置のパターン、例えば療法中に使用される投薬パターンを意味する。治療処方計画は、誘導処方計画及び維持処方計画を含み得る。「誘導処方計画」又は「誘導期間」という語句は、疾患の初期処置のために使用される治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。誘導処方計画の一般的な目標は、処置処方計画の初期期間中に高いレベルの薬物を被験者に提供することである。誘導処方計画は、医師が維持処方計画中に使用するであろう用量よりもはるかに高い用量の薬物を投与する工程、医師が維持処方計画中に薬物を投与するであろう頻度よりも高い頻度で薬物を投与する工程、又はその両方の工程を含み得る、「負荷処方計画」を（部分的に又は全体的に）使用し得る。「維持処方計画」又は「維持期間」という語句は、病気の処置中の被験者の維持のために、例えば被験者を長い期間にわたり（数か月間又は数年間）寛解状態に保つために使用される治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。維持処方計画は、連続療法（例えば、薬物を規則的な間隔で、例えば週１回、月１回、年１回などで投与）又は間欠的な療法（例えば断続的な処置、間欠的な処置、再発時の処置、又は特定の予め決定された基準の達成時の処置［例えば疾患の顕現時など］）を使用し得る。
【０１４８】
本明細書において使用する「治療有効量」又は「有効量」という用語は、所望の治療結果を達成するのに必要な用量及び期間において、有効な量を指す。本発明の抗体の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体において所望の応答を惹起する本発明の抗体の能力などの要因に応じて変更され得る。治療有効量は、抗体又は抗体の一部の任意の毒性作用又は有害な作用より治療に有益な効果の方がまさるものである。本発明の抗体の有効な用量及び用量処方計画は処置される疾患又は容態に依存し、当業者によって決定され得る。当技術分野の通常の技能を有する医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し処方することができる。例えば、医師は、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで医薬組成物に使用される本発明の抗体の用量を開始し得、所望の効果が達成されるまで用量を次第に増加させることができる。一般的に、本発明の組成物の適切な用量は、特定の用量処方計画に従って治療効果を生じるのに有効な最も低い用量である化合物の量であろう。このような有効量は一般的に、上記の要因に依存するだろう。例えば、治療用途のための治療有効量は、疾患の進行を安定化させるその能力によって測定され得る。典型的には、がんを阻害する化合物の能力は、例えば、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデルシステムにおいて評価され得る。あるいは、組成物のこの特性は、当業者には公知であるインビトロアッセイによって細胞障害性を誘導する化合物の能力を調べることによって評価され得る。治療用化合物の治療有効量は、被験者における腫瘍サイズを減少させ得るか、又はさもなくば症状を寛解し得る。当業者は、被験者の大きさ、被験者の症状の重度、及び選択された具体的な組成物又は投与経路などのこのような要因に基づいてこのような量を決定することができるだろう。本発明の抗体の治療有効量の例示的で非限定的な範囲は、約０．１〜１００mg/kg、例えば約０．１〜５０mg/kg、例えば約０．１〜２０mg/kg、例えば約０．１〜１０mg/kg、例えば約０．５、例えば約０．３、約１、約３mg/kg、約５mg/kg、又は約８mg/kgである。本発明の抗体の治療有効量の例示的で非限定的な範囲は、０．０２〜１００mg/kg、例えば約０．０２〜３０mg/kg、例えば約０．０５〜１０mg/kg、又は０．１〜３mg/kg、例えば約０．５〜２mg/kgである。投与は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下であり得、例えば、標的部位の近くに投与され得る。上記の処置法及び使用における用量処方計画は、最適な所望の応答（例えば治療応答）を与えるように調整される。例えば、１回のボーラスが投与されても、数回に分割された用量が経時的に投与されても、又は用量は、治療状況の緊急性によって指示されるように比例的に減少又は増加させてもよい。いくつかの実施態様では、処置の有効性は、療法中に、例えば規定の時点においてモニタリングされる。いくつかの実施態様では、有効性は、疾患領域の可視化によって、又は本明細書にさらに記載されている他の診断法によって、例えば標識された本発明の抗体、断片、又は本発明の抗体に由来するミニ抗体を使用して例えば１回以上のＰＥＴ−ＣＴスキャンを実施することによってモニタリングされ得る。所望であれば、医薬組成物の１日有効量は、場合により単位投与剤形で、１日を通じて適切な間隔で別々に投与される２回、３回、４回、５回、６回、又はそれ以上の分割用量として投与され得る。いくつかの実施態様では、本発明のモノクローナル抗体は、あらゆる所望ではない副作用を最小限にするために、例えば２４時間以上などの長い期間かけての緩徐な連続注入によって投与される。本発明の抗体の有効量はまた、週１回、週２回、又は週３回の投薬期間を使用して投与されてもよい。投薬期間は、例えば８週間まで、１２週間まで、又は臨床的な前進が確立されるまでに制限され得る。非限定的な例として、本発明による処置は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０日目の少なくとも１日に、約０．１〜１００mg/kg/日、例えば０．２、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００mg/kg/日の量の本発明の抗体の１日量として、又は代替的には、処置開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０週目の少なくとも１つの週若しくはその任意の組合せの週において、１回量、又は２４、１２、８、６、４若しくは２時間毎の分割用量、又はその任意の組合せを使用して提供され得る。
【０１４９】
したがって、本発明の１つの目的は、治療有効量の本発明の抗体を被験者に投与する工程を含む、それを必要とする被験者におけるがんを処置する方法に関する。
【０１５０】
別の態様では、本発明は、医薬品としての使用のための、その中の任意の態様又は実施態様において定義されているような、本発明の抗体に関する。
【０１５１】
別の態様では、本発明は、がんの処置のための本発明の抗体の使用に関する。
【０１５２】
特定の実施態様では、本発明の抗体又は抗体−薬物コンジュゲートは、疾患又は障害の処置のための第二の薬剤と組み合わせて使用される。がんの処置に使用される場合、本発明の抗体又は本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、例えば手術、放射線療法、化学療法、又はその組み合わせなどの従来のがん療法と組み合わせて使用されてもよい。
【０１５３】
「がん」、「悪性腫瘍」及び「腫瘍」という用語は、制御不能な細胞増殖によって典型的には特徴付けられる哺乳動物における病理学的容態を指すか又は説明する。より正確には、本発明の使用において、疾患、すなわちがんは、腫瘍関連マクロファージＴＡＭを伴い、これは腫瘍細胞に共生的に関連していることが示されている。さらに、本発明者らは、シデロフレキシン−３に指向される抗体のような本発明のアンタゴニストは、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を死滅させ、腫瘍細胞増殖を減少させることを示す。腫瘍細胞はＴＡＭを動員し、該ＴＡＭは腫瘍細胞に、腫瘍微小環境において生存因子及び血管新生因子を提供する（Dirkx A.E.M. Journal of Leukocyte Biology vol. 80 no. 6 1183-1196 December 2006の概説を参照）。
【０１５４】
特に、がんは、固形腫瘍、又は未分化骨髄細胞の制御不能な増殖（すなわち白血病、リンパ腫）を伴い得る。
【０１５５】
様々ながん及び他の増殖疾患（以下を含むがこれらに限定されない）は、本発明の方法及び組成物を使用して処置され得る：
−膀胱癌、乳癌、子宮癌／子宮頸癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、食道癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌癌及び皮膚癌（扁平上皮細胞癌を含む）をはじめとする細胞癌；
−線維肉腫及び横紋筋肉腫をはじめとする、間葉系を起源とする腫瘍；
−黒色腫、セミノーマ、奇形癌、神経芽細胞腫、及び神経膠腫をはじめとする、他の腫瘍；
−星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、及びシュワン細胞腫をはじめとする、中枢神経系及び末梢神経系の腫瘍；
−線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉種をはじめとする、間葉系を起源とする腫瘍；及び
−黒色腫、色素性乾皮症、ケラトカルシノーマ（keratoacarcinoma）、セミノーマ、甲状腺濾胞癌、及び奇形癌をはじめとする、その他の腫瘍；
−ホジキン病、非ホジキン病などであるがこれらに限定されないリンパ腫；くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌型骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性白血病、孤立性形質細胞腫、及び髄外性形質細胞腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫などであるがこれらに限定されない多発性骨髄腫；
−急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、例えば骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、及び骨髄異形成症候群などであるがこれらに限定されない白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病などであるがこれらに限定されない慢性白血病。
【０１５６】
１つの実施態様では、前記がんは、全ての急性及び慢性の白血病：慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＬＭＭＣ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）からなる群より選択される、白血病である。
【０１５７】
好ましい実施態様では、前記白血病は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）である。
【０１５８】
１つの実施態様では、前記がんは、全ての非ホジキンリンパ腫又はホジキンリンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）からなる群より選択される、リンパ腫である。
【０１５９】
１つの実施態様では、前記がんは、脳、頭頸部、副腎、大腸、小腸、胃、心臓、肝臓、皮膚、腎臓、肺、膵臓、精巣、卵巣、前立腺、子宮、甲状腺、膀胱、乳房、子宮内膜の腫瘍、多発性骨髄腫、及び肉腫からなる群より選択される固形腫瘍である。
【０１６０】
本明細書において前に及びその後に腫瘍、腫瘍疾患、細胞癌、又は癌が記載されている場合には、初発の臓器若しくは組織及び／又は任意の他の場所における転移も、腫瘍及び／又は転移の場所が何処であろうと、代替的に又は追加的に暗黙的に意味する。
【０１６１】
組合せ
本発明はまた、本発明の抗体が、例えばがんの処置用の少なくとも１つのさらに他の治療剤と組み合わせて使用される治療適用も提供する。このような投与は、同時、別々、又は順次であり得る。同時投与のために該薬剤は、適宜、１つの組成物として又は別々の組成物として投与され得る。さらなる治療剤は典型的には、処置される予定の障害にとって妥当である。例示的な治療剤としては、他の抗がん抗体、細胞障害性薬剤、化学療法剤、抗血管新生剤、抗がん免疫源、細胞周期制御剤／アポトーシス調節剤、ホルモン調節剤、及び以下に記載の他の薬剤が挙げられる。
【０１６２】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、化学療法剤と組み合わせて使用される。「化学療法剤」という用語は、腫瘍増殖を抑制するのに効果的である化合物を指す。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド；アルキルスルホネート類、例えばブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン；アジリジン類、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパ；エチレンイミン類及びメチルメラミン類、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロールメラミン；アセトゲニン類（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン類（合成類似体のトポテカンなど）；ブリオスタチン類；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（例えば、そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（例えば合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢＩ−ＴＭＩなど）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノボエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア類、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシン（１１及びカリケアマイシン２１１、例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186（1994）参照）；ダイネミシン、例えばダイネミシンＡ；エスペラマイシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連したクロモプロテイン系エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（例えばモルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えばメトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シ��ラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、５−ＦＵ；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充物質、例えばフォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド、例えばメイタンシン及びアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲンナニウム（spirogennanium）；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベルカリンＡ、ロリジンＡ、及びアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール（登録商標）、Bristol-Myers Squibb Oncology、プリンストン、N.J.州）及びドセタキセル（タキソテール（登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer、アントニー、フランス）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸塩；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；カペシタビン；並びに、上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体が挙げられる。またこの定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホルモン拮抗剤、例えばエストロゲン拮抗薬、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（フェアストン）；並びにアンドロゲン拮抗薬、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに、上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体も含まれる。
【０１６３】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、標的化癌療法と組み合わせて使用される。標的化癌療法は、癌の増殖、進行、及び拡大に関与する特定の分子（「分子標的」）に干渉することによって、癌の増殖及び拡大を遮断する薬物又は他の物質である。標的化癌療法は、時々、「分子標的化薬」、「分子標的化療法」、「精密医療」又は類似の名称で呼ばれる。いくつかの実施態様では、標的化療法は、被験者にチロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程からなる。「チロシンキナーゼ阻害剤」という用語は、受容体型及び／又は非受容体型チロシンキナーゼの選択的又は非選択的阻害剤として作用する様々な治療剤又は薬物のいずれかを指す。チロシンキナーゼ阻害剤及び関連化合物は当技術分野において周知であり、米国特許公開公報第２００７／０２５４２９５号に記載され、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。チロシンキナーゼ阻害剤に関連した化合物は、チロシンキナーゼ阻害剤の効果を再現するだろう、例えば関連化合物は、異なるメンバーのチロシンキナーゼシグナル伝達経路に作用して、そのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ阻害剤と同じ作用を生じることが当業者によって理解されるだろう。本発明の実施態様の方法に使用するのに適したチロシンキナーゼ阻害剤及び関連化合物の例としては、ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）、ＰＰ２、ＢＥＺ２３５、サラカチニブ、ゲフィチニブ（イレッサ）、スニチニブ（スーテント；ＳＵ１１２４８）、エルロチニブ（タルセバ；ＯＳＩ−１７７４）、ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６；ＧＷ２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）、イマチニブ（グリベック：ＳＴＩ５７１）、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ザクチマ；ＺＤ６４７４）、ＭＫ−２２０６（８−［４−アミノシクロブチル）フェニル］−９−フェニル−１，２，４−トリアゾロ［３，４−ｆ］［１，６］ナフチリジン−３（２Ｈ）−オン塩酸塩）、その誘導体、類似体、及び組合せが挙げられるがこれらに限定されない。本発明に使用するに適した追加のチロシンキナーゼ阻害剤及び関連化合物は、例えば、米国特許公開公報第２００７／０２５４２９５号、米国特許第５，６１８，８２９号、第５，６３９，７５７号、第５，７２８，８６８号、第５，８０４，３９６号、第６，１００，２５４号、第６，１２７，３７４号、第６，２４５，７５９号、第６，３０６，８７４号、第６，３１３，１３８号、第６，３１６，４４４号、第６，３２９，３８０号、第６，３４４，４５９号、第６，４２０，３８２号、第６，４７９，５１２号、第６，４９８，１６５号、第６，５４４，９８８号、第６，５６２，８１８号、第６，５８６，４２３号、第６，５８６，４２４号、第６，７４０，６６５号、第６，７９４，３９３号、第６，８７５，７６７号、第６，９２７，２９３号、及び第６，９５８，３４０号に記載され、これら全てのその全体が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの実施態様では、チロシンキナーゼ阻害剤は、経口投与され、少なくとも１回の第Ｉ相臨床試験、より好ましくは少なくとも１回の第ＩＩ相臨床試験、さらにより好ましくは少なくとも１回の第ＩＩＩ相臨床試験の、最も好ましくは少なくとも１つの血液学的又は腫瘍学的適応症についてＦＤＡによって承認されている対象である、低分子キナーゼ阻害剤である。このような阻害剤の例としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ＢＭＳ−５９９６２６（ＡＣ−４８０）、ネラチニブ、ＫＲＮ−６３３、ＣＥＰ−１１９８１、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ＡＺＭ−４７５２７１、ＣＰ−７２４７１４、ＴＡＫ−１６５、スニチニブ、バタラニブ、ＣＰ−５４７６３２、バンデタニブ、ボスチニブ、レスタウルチニブ、タンデュチニブ、ミドスタウリン、エンザスタウリン、ＡＥＥ−７８８、パゾパニブ、アキシチニブ、モテサニブ、ＯＳＩ−９３０、セジラニブ、ＫＲＮ−９５１、ドビチニブ、セリシクリブ、ＳＮＳ−０３２、ＰＤ−０３３２９９１、ＭＫＣ−１（Ｒｏ−３１７４５３；Ｒ−４４０）、ソラフェニブ、ＡＢＴ−８６９、ブリバニブ（ＢＭＳ−５８２６６４）、ＳＵ−１４８１３、テラチニブ、ＳＵ−６６６８、（ＴＳＵ−６８）、Ｌ−２１６４９、ＭＬＮ−８０５４、ＡＥＷ−５４１、及びＰＤ−０３２５９０１が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６４】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、免疫療法剤と組み合わせて使用される。本明細書において使用する「免疫療法剤」という用語は、癌細胞に対する生体の免疫応答を間接的に若しくは直接的に増強、刺激、若しくは増大させ、及び／又は、他の抗癌療法の副作用を低減する化合物、組成物、又は処置を指す。したがって、免疫療法は、癌細胞に対する免疫系の応答を直接的に若しくは間接的に刺激若しくは増強させ、及び／又は、他の抗癌剤によって引き起こされ得る副作用を和らげる療法である。免疫療法はまた、当技術分野において免疫学的療法、生物学的療法、生体応答調節剤療法、及び生物療法とも呼ばれる。当技術分野において公知である一般的な免疫療法剤の例としては、サイトカイン、癌ワクチン、モノクローナル抗体、及び非サイトカインアジュバントが挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、免疫療法処置は、ある量の免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞など）を被験者に投与することからなり得る。免疫療法剤は非特異的であってもよく、すなわち、免疫系を全般的にブーストし、よってヒト生体が癌細胞の増殖及び／又は蔓延に対して戦うのにより効果的となるか、あるいは、それらは特異的であってもよく、すなわち、癌細胞それ自体に標的化されてもよく、免疫療法計画は、非特異的な免疫療法剤と特異的な免疫療法剤を併用してもよい。非特異的免疫療法剤は、免疫系を刺激するか又は間接的に増大させる物質である。非特異的免疫療法剤は、癌の処置のための主要な療法として単独で使用されているだけでなく、主要な療法に付加して使用され、この場合には、非特異的免疫療法剤は、他の療法（例えば癌ワクチン）の効力を増強させるアジュバントとして機能する。非特異的免疫療法剤はまた、この後者の状況において、他の療法の副作用、例えば特定の化学療法剤によって誘発された骨髄抑制などを低減させるように機能することができる。非特異的免疫療法剤は、重要な免疫系の細胞に対して作用することができ、そして二次応答、例えばサイトカイン及び免疫グロブリンの増加した産生を引き起こすことができる。あるいは、該薬剤は、それ自体、サイトカインを含んでいてもよい。非特異的免疫療法剤は、一般的に、サイトカイン又は非サイトカインアジュバントとして分類される。多くのサイトカインが、免疫系をブーストさせるように設計された一般的な非特異的免疫療法剤として、又は、他の療法と共に施されるアジュバントとしてのいずれかとして癌の処置に適用を見出す。適切なサイトカインとしては、インターフェロン、インターロイキン、及びコロニー刺激因子が挙げられるがこれらに限定されない。本発明によって考えられるインターフェロン（ＩＦＮ）としては、一般的な種類のＩＦＮ、ＩＦＮ−アルファ（ＩＦＮ−α）、ＩＦＮ−ベータ（ＩＦＮ−β）、及びＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−γ）が挙げられる。ＩＦＮは、例えば、癌細胞の増殖を減速させることによって、癌細胞からより正常な行動を有する細胞への発達を促進することによって、及び／又は、癌細胞による抗原の産生を増加させて免疫系が癌細胞をより容易に認識し破壊できるようにすることによって、癌細胞に対して直接的に作用することができる。ＩＦＮはまた、例えば、血管新生を減速させることによって、免疫系をブーストすることによって、並びに／又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞及びマクロファージを刺激することによって、癌細胞に対して間接的に作用することもできる。組換え型ＩＦＮ−αは、ロフェロン（ロシュ製薬）及びイントロンＡ（シェリング社）として市販されている。本発明によって考えられるインターロイキンとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１１及びＩＬ−１２が挙げられる。市販されている組換え型インターロイキンの例としては、プロロイキン（登録商標）（ＩＬ−２；カイロン社）及びニューメガ（登録商標）（ＩＬ−１２；ワイス製薬）が挙げられる。ザイモジェネティクス社（シアトル、ワシントン州）は、組換え型ＩＬ−２１を現在試験中であり、これもまた本発明の合剤への使用に考えられる。本発明によって考えられるコロニー刺激因子（ＣＳＦ）としては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ又はフィルグラスチム）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ又はサルグラモスチム）及びエリスロポエチン（エポエチンアルファ、ダルベポエチン）が挙げられる。１つ以上の増殖因子を用いての処置は、従来の化学療法を受けている被験者において新たな血球の生成を刺激するのに役立ち得る。したがって、ＣＳＦを用いての処置は、化学療法に伴う副作用を低減させるのに役立ち得、またより高用量の化学療法剤の使用を可能とし得る。様々な組換え型コロニー刺激因子、例えば、ニューポジェン（登録商標）（Ｇ−ＣＳＦ；アムジェン社）、ニューラスタ（ペグフィルグラスチム；アムジェン社）、ロイキン（ＧＭ−ＣＳＦ；バーレックス社）、プロクリット（エリスロポエチン；オーソバイオテック社）、エポジェン（エリスロポエチン；アムジェン社）、アラネスプ（エリスロポエチン）が市販されている。本発明の組合せ組成物及び組合せ投与法はまた、「完全細胞」及び「養子」免疫療法も含み得る。例えば、このような方法は、免疫系細胞（例えば、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、例えばＣＣ２＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、腫瘍特異的抗原及び／又は遺伝子的増強物質と共に増殖させたＴ細胞）、抗体を発現しているＢ細胞又は他の抗体産生細胞又は抗体提示細胞、樹状細胞（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ及び／又はＦｌｔ３−ＬなどのＤＣ増殖剤と共に培養した樹状細胞、並びに／あるいは、腫瘍関連抗原の積載された樹状細胞）、抗腫瘍ＮＫ細胞、いわゆるハイブリッド細胞、又はその組合せの注入又は再注入を含み得る。細胞溶解液もまた、このような方法及び組成物において有用であり得る。このような態様において有用であり得る臨床試験における細胞性「ワクチン」としては、カンバキシン（Canvaxin）（商標）、ＡＰＣ−８０１５（デンドレオン社）、ＨＳＰＰＣ−９６（アンティジェニックス社）、及びメラシン（Melacine）（登録商標）細胞溶解液が挙げられる。ミョウバンなどのアジュバントと場合により混合された、癌細胞から剥がれた抗原及びその混合物（例えば、Bystryn et al., Clinical Cancer Research Vol. 7, 1882-1887, July 2001を参照）もまた、このような方法及び組合せ組成物における成分であり得る。
【０１６５】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、放射線療法と組み合わせて使用される。放射線療法は、放射線照射又はそれに伴う患者への放射性医薬品の投与を含み得る。放射線源は、処置される患者にとって外部又は内部のいずれかであり得る（放射線による処置は、例えば、外照射放射線療法（ＥＢＲＴ）又は小線源療法（ＢＴ）の形態であり得る）。このような方法を実施するのに使用され得る放射性元素としては、例えば、ラジウム、セシウム−１３７、イリジウム−１９２、アメリシウム−２４１、金−１９８、コバルト−５７、銅−６７、テクネチウム−９９、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、及びインジウム−１１１が挙げられる。
【０１６６】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、共刺激分子に対して特異的である抗体と組み合わせて使用される。共刺激分子に対して特異的である抗体の例としては、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えばイピリムマブ）、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＴＩＭＰ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、又は抗Ｂ７Ｈ６抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６７】
本発明のさらなる目的は、癌細胞抗原に対して選択的な第一の抗体を被験者に投与する工程、及び本発明の抗体を被験者に投与する工程を含む、それを必要とする被験者におけるがんの処置法に関する。
【０１６８】
多くの抗体が現在、がんの処置のために臨床的に使用され、その他は、様々な臨床開発段階にある。本発明の方法のための関心対象の抗体は、ＡＤＣＣを通して作用し、典型的には腫瘍細胞に対して選択的であるが、当業者は、いくつかの臨床的に有用な抗体は、腫瘍ではない細胞、例えばＣＤ２０に対して作用することを認識しているだろう。Ｂ細胞悪性疾患の処置のための多くの抗原及び対応するモノクローナル抗体が存在する。１つの一般的な標的抗原はＣＤ２０であり、これはＢ細胞悪性疾患上に見られる。リツキシマブは、ＣＤ２０抗原に指向されるキメラ非コンジュゲートモノクローナル抗体である。ＣＤ２０は、Ｂ細胞の活性化、増殖、及び分化において重要な機能的役割を果たす。ＣＤ５２抗原は、モノクローナル抗体のアレムツズマブによって標的化され、これは慢性リンパ球性白血病の処置に適応される。ＣＤ２２は、多くの抗体によって標的化され、近年、化学療法抵抗性ヘアリー細胞白血病において毒素と組み合わせて有効性を実証した。ＣＤ２０を標的化するモノクローナル抗体は、トシツモマブ及びイブリツモマブも含む。固形腫瘍に使用されている、本発明の方法において有用なモノクローナル抗体としては、エドレコロマブ及びトラスツズマブ（ハーセプチン）が挙げられるがこれらに限定されない。エドレコロマブは、大腸癌及び直腸癌において見られる１７−１Ａ抗原を標的化し、これらの適応症のために欧州で使用が認可されている。その抗腫瘍作用はＡＤＣＣ、ＣＤＣ、抗イディオタイプネットワークの誘導を通して媒介される。トラスツズマブは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原を標的化する。この抗原は、乳癌の２５％から３５％に見られる。トラスツズマブは、様々な方法で作用すると考えられている：ＨＥＲ−２受容体発現のダウンレギュレーション、ＨＥＲ−２タンパク質を過剰発現するヒト腫瘍細胞の増殖阻害、ＨＥＲ−２タンパク質を過剰発現する腫瘍細胞に対する免疫動員及びＡＤＣＣの増強、並びに血管新生因子のダウンレギュレーション。アレムツズマブ（キャンパス）は、慢性リンパ球性白血病；大腸癌及び肺癌の処置に使用され；ゲムツズマブ（マイロターグ）は、急性骨髄性白血病の処置に用途を見い出し；イブリツモマブ（ゼバリン）は、非ホジキンリンパ腫の処置に用途を見い出し；パニツブマブ（ベクティビックス）は大腸癌の処置に用途を見い出す。セツキシマブ（アービタックス）もまた、本発明の方法に使用するのに興味深い。該抗体は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）に結合し、大腸癌及び頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）をはじめとする固形腫瘍の処置に使用されている。
【０１６９】
医薬組成物
本発明の態様は、本発明の抗体を含む医薬組成物に関する。
【０１７０】
典型的には、本発明の抗体は、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で被験者に投与される。これらの組成物に使用され得る薬学的に許容される担体としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、トリケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースを基剤とした物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂が挙げられるがこれらに限定されない。患者への投与に使用するために、該組成物は患者への投与用に製剤化されるだろう。本発明の組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸内に、経鼻的に、頬側に、膣内に、又は埋め込まれたレザバーを介して投与され得る。本明細書における使用としては、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、くも膜下腔内、肝内、病巣内、及び頭蓋内への注射又は注入技術が挙げられる。本発明の組成物の滅菌注射剤形は、水性又は油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して当技術分野において公知の技術に従って製剤化され得る。無菌注射調製物はまた、無毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌注射溶液又は懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中溶液であり得る。使用され得る許容されるビヒクル及び溶媒には、水、リンガー液、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の不揮発性油が、溶媒又は懸濁化媒体として慣用的に使用される。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドをはじめとするあらゆる配合不揮発性油が使用され得る。脂肪酸、例えばオレイン酸、及びそのグリセリド誘導体は、天然の薬学的に許容される油、例えばオリーブ油又はヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチレン化形と同様に、注射剤の調製に有用である。これらの油性溶液又は懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤若しくは分散剤（例えばカルボキシメチルセルロース）、又は薬学的に許容される剤形（例えばエマルション及び懸濁液）の製剤化に一般的に使用される類似の分散剤を含有していてもよい。薬学的に許容される固形剤、液剤、又は他の剤形の製造に一般的に使用される、他の一般的に使用される界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ）及び他の乳化剤又はバイオアベイラビリティ増強剤も、製剤化の目的に使用され得る。本発明の組成物は、カプセル、錠剤、水性懸濁剤、又は液剤を含むがこれらに限定されない、任意の経口的に許容される剤形で経口投与され得る。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用される担体は、乳糖及びコーンスターチを含む。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も典型的には添加される。カプセル剤形での経口投与のために有用な希釈剤としては、例えば乳糖が挙げられる。水性懸濁液が経口使用のために必要とされる場合、活性成分を乳化剤及び懸濁化剤と配合する。所望であれば、特定の甘味剤、芳香剤、又は着色剤も添加してもよい。あるいは、本発明の組成物は、直腸投与用の坐剤の剤形で投与されてもよい。これらは、室温では固体であるが直腸温度では液体であり、それ故、直腸内で融解して薬物を放出する、適切な非刺激性の賦形剤と該薬剤を混合することによって調製され得る。このような材料としては、ココアバター、蜜蝋、及びポリエチレングリコールが挙げられる。本発明の組成物はまた、特に処置の標的が、局所適用によって容易に近づける領域又は器官を含む場合（眼、皮膚、又は下部腸管の疾患を含む）、局所的に投与されてもよい。これらの各領域又は器官のための適切な局所的製剤は容易に調製される。局所適用のために、該組成物は、１つ以上の担体に懸濁又は溶解された活性成分を含有している適切な軟膏中で製剤化され得る。本発明の化合物の局所投与用の担体としては、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化蝋、及び水が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、該組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体中に懸濁又は溶解された活性成分を含有している適切なローション又はクリームで製剤化され得る。適切な担体としては、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステル蝋、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水が挙げられるがこれらに限定されない。下部腸管への局所適用は、直腸坐剤製剤（上記参照）又は適切な浣腸製剤で行なわれ得る。パッチを使用してもよい。本発明の組成物はまた、鼻腔内へのエアゾール又は吸入によって投与され得る。このような組成物は、医薬製剤の分野において周知である技術に従って調製され、これは、ベンジルアルコール若しくは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを増強するための吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／又は他の慣用的な可溶化剤若しくは分散剤を使用して、食塩水中溶液として調製され得る。例えば、本発明の医薬組成物中に存在する抗体は、１００mg（１０mL）又は５００mg（５０mL）のいずれかの１回使用のバイアル中に１０mg/mLの濃度で供給され得る。製品は、静脈内投与用に、９．０mg/mLの塩化ナトリウム、７．３５mg/mLのクエン酸ナトリウム二水和物、０．７mg/mLのポリソルベート８０、及び滅菌注射用水中で製剤化される。ｐＨは６．５に調整される。本発明の医薬組成物における抗体の例示的な適切な用量範囲は、１mg/m2から５００mg/m2の間であり得る。しかしながら、これらの計画は例であり、最適な計画及び処方計画は、臨床試験で決定されなければならない医薬組成物中の特定の抗体の親和性及び耐容性を考慮しながら適応させることができる。注射用（例えば筋肉内、静脈内）の本発明の医薬組成物は、滅菌緩衝水（例えば筋肉内用では１ml）及び１ngから約１００mg、例えば約５０ngから約３０mg、又はより好ましくは約５mgから約２５mgの本発明の抗ミオシン１８Ａ抗体を含有するように調製され得る。
【０１７１】
特定の実施態様では、リポソーム及び／又はナノ粒子の使用が、宿主細胞への抗体の導入に考えられる。リポソーム及び／又はナノ粒子の形成及び使用は、当業者には公知である。
【０１７２】
ナノカプセルは一般的に、安定した再現可能な方法で化合物を封入することができる。細胞内へのポリマーの過剰負荷に起因する副作用を回避するために、このような超微細粒子（サイズは約０．１μm）が一般的に、インビボで分解可能なポリマーを使用して設計される。これらの必要条件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリル酸ナノ粒子が、本発明における使用に考えられ、このような粒子は容易に作製され得る。
【０１７３】
リポソームは、水性媒体に分散されたリン脂質から形成され、自発的に多層の同心円状の二重層小胞（多重層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成する。ＭＬＶは一般的に２５nm〜４μmの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理により、コアに水溶液を含有している、２００〜５００Åの範囲の直径を有する小型単層小胞（ＳＵＶ）が形成される。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、及び二価陽イオンの存在に依存する。
【０１７４】
キット
最後に、本発明はまた、少なくとも１つの本発明の抗体を含むキットも提供する。本発明の抗体を含有しているキットは、シデロフレキシン−３の発現（増加又は減少）の検出、又は治療用若しくは診断用アッセイにおいて用途を見い出す。本発明のキットは、固相支持体、例えば組織培養プレート又はビーズ（例えばセファロースビーズ）に結合させた抗体を含有することができる。インビトロでの例えばＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロット若しくはフローサイトメトリーにおけるシデロフレキシン−３の検出及び定量のための抗体を含有しているキットが提供され得る。検出のために有用なこのような抗体には、蛍光又は放射性標識などの標識が施され得る。
【０１７５】
本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１Ａ】４つの抗ＮＬＣ抗体によるナース様細胞（ＮＬＣ）の高度染色。Ａ．慢性リンパ球性白血病患者からゲーティングされたＢ細胞性慢性リンパ球性白血球（Ｂ−ＣＬＬ）及びナース様細胞、並びに、健康なドナーの血液試料に由来する単球、Ｔ細胞、及びＢ細胞を４つの抗ＮＬＣ抗体で染色（実線：アイソタイプ対照；点線：抗体）。Ｂ．ゲーティングされたＣＤ１６３＋ナース様細胞上での６−２５抗体を用いての陽性染色、及び他の細胞上での陰性染色。Ｃ．アイソタイプ対照と比較して、ゲーティングされたナース様細胞上で染色している４つの抗体の平均蛍光強度。
【図１Ｂ】４つの抗ＮＬＣ抗体によるナース様細胞（ＮＬＣ）の高度染色。Ａ．慢性リンパ球性白血病患者からゲーティングされたＢ細胞性慢性リンパ球性白血球（Ｂ−ＣＬＬ）及びナース様細胞、並びに、健康なドナーの血液試料に由来する単球、Ｔ細胞、及びＢ細胞を４つの抗ＮＬＣ抗体で染色（実線：アイソタイプ対照；点線：抗体）。Ｂ．ゲーティングされたＣＤ１６３＋ナース様細胞上での６−２５抗体を用いての陽性染色、及び他の細胞上での陰性染色。Ｃ．アイソタイプ対照と比較して、ゲーティングされたナース様細胞上で染色している４つの抗体の平均蛍光強度。
【図１Ｃ】４つの抗ＮＬＣ抗体によるナース様細胞（ＮＬＣ）の高度染色。Ａ．慢性リンパ球性白血病患者からゲーティングされたＢ細胞性慢性リンパ球性白血球（Ｂ−ＣＬＬ）及びナース様細胞、並びに、健康なドナーの血液試料に由来する単球、Ｔ細胞、及びＢ細胞を４つの抗ＮＬＣ抗体で染色（実線：アイソタイプ対照；点線：抗体）。Ｂ．ゲーティングされたＣＤ１６３＋ナース様細胞上での６−２５抗体を用いての陽性染色、及び他の細胞上での陰性染色。Ｃ．アイソタイプ対照と比較して、ゲーティングされたナース様細胞上で染色している４つの抗体の平均蛍光強度。
【図２】４つの抗体と共に培養された場合のナース様細胞の枯渇及び白血病細胞の死滅。アイソタイプ条件と比較して、各々の抗ＮＬＣ抗体の存在下において６日後の慢性リンパ球性白血病患者に由来するＰＢＭＣの培養液中のナース様細胞（囲まれている）の枯渇の顕微鏡による可視化。これらの培養液中のナース様細胞の絶対数は、各々の抗体を含む条件においてゼロに近かった。
【図３】６−２５抗体又はアイソタイプ対照と共に１０日間培養した後に２人の慢性リンパ球性白血病患者由来のＰＢＭＣの染色、及びＦＡＣＳ分析（ＭＦＩ：平均蛍光強度）。
【図４】６−２５抗体又はアイソタイプ対照を用いた健康なドナー由来のＰＢＭＣの染色、及びＦＡＣＳ分析（ＭＦＩ：平均蛍光強度）。
【図５】２つの市販の抗ＳＦＸＮ３抗体及び６−２５抗体又はアイソタイプによって判明した、組換えシデロフレキシン−３のウェスタンブロット。
【図６】６−２５抗体又はアイソタイプ対照と共に又は伴わない慢性リンパ球性白血病患者由来のＰＢＭＣの１０日間培養液の顕微鏡及びＢ細胞性慢性リンパ球性白血病細胞の生存率分析。ＦＡＣＳ：枠に囲まれたＢ細胞性慢性リンパ球性白血病細胞の比率。
【図７】６−２５又はアイソタイプ対照と共に又は伴わずに慢性リンパ球性白血病患者のＰＢＭＣを１０日間培養した後のナース様細胞数。
【０１７７】
実施例１：腫瘍関連マクロファージを標的化するシデロフレキシン
材料及び方法
患者由来のＰＢＭＣをフィコールを使用して単離し、ＲＰＭＩ １０％ＦＢＳ中で１０×１０６個の細胞/mlで１０日間培養した。次いで、上清を除去し、接着した細胞（ナース様細胞）をＰＢＳで２回洗浄した。ナース様細胞を細胞スクレイパーを使用して剥がし、計数し、乾燥させたペレットを凍結させた。接着していない細胞の乾燥ペレットも凍結させた。幾人かの患者由来のナース様細胞をプールし、膜タンパク質を、「Proteo-extract native membrane protein extractionキット」（カルビオケム社）を使用して抽出した。
【０１７８】
ピアス（商標）High Capacityストレプトアビジンアガロースビーズ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）をヤギ抗マウスＩｇＧ−ビオチン（シグマアルドリッチ社、Ｂ７４０１）と共に室温で２０分間インキュベートし、３回洗浄し、次いでハイブリドーマの上清培養培地と共に又は対照培地と共に４℃で２時間インキュベートした。３回ＰＢＳで洗浄した後、コーティングされたビーズを、ナース様細胞又は非接着細胞由来の５００μgの膜タンパク質と共に４℃で一晩インキュベートした。ビーズを洗浄し、Laemmli溶液で溶出した。これらの溶液をアクリルアミドゲルにローディングし、泳動後にinstant blue（ユーロメディックス社）で着色した。ゲル片を切り出し、ペプチドを抽出した。簡潔に言えば、片をアセトニトリル及び重炭酸アンモニウムで洗浄し、還元し、ＤＴＴ及びヨードアセトアミドを用いてアルキル化し、トリプシンで消化し、次いで、ペプチドをアセトニトリル及びギ酸で抽出した。次いで、ペプチドを質量分析によって同定した。各条件（ハイブリドーマ上清を含まない、タンパク質を含まない、非接着細胞に由来する及びナース様細胞に由来するタンパク質を含む）において同定されたペプチドを比較した。
【０１７９】
結果
ナース様細胞を特異的に認識する４つの抗体の標的を決定するために、本発明者らは、４つのハイブリドーマ培養上清を免疫沈降によって試験した。このようにして本発明者らは、質量分析によって、各ハイブリドーマに関連したペプチドを同定した。
【０１８０】
本発明者らは、これらのペプチドを発見した：
６−１６：シデロフレキシン３及びＧＲＰ７８
６−２５：シデロフレキシン３
６−６６−４９：ＧＲＰ７８
６−６６−７４：エンドプラスミン及びＧＲＰ７８。
【０１８１】
実施例２：腫瘍関連マクロファージの標的化
材料及び方法
ナース様細胞に対する抗体の作製
ナース様細胞は、ＲＰＭＩ １０％ＦＢＳ中１０×１０６個で細胞/mlの慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）患者の血液試料から単離されたＰＢＭＣの培養液から生成された。３７℃及び５％ＣＯ２雰囲気中で１４日間培養した後、Ｂリンパ球を除去し、接着細胞（ナース様細胞）を回収した。異なるドナー由来の３００万個から１５００万個のナース様細胞を、マウスの腹腔内に１５日間毎に４回注入した。次いで、脾臓細胞を脾臓から単離し、α６３ｓ２マウス骨髄腫細胞株との融合により、２００個のハイブリドーマを産生した。これらのハイブリドーマ培養液の２００個の馴化培地をナース様細胞又は白血病細胞と共に４℃で３０分間インキュベートし、次いで、蛍光二次抗マウス抗体と共にインキュベートした。次いで、これらの細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
【０１８２】
フローサイトメトリー分析
各ハイブリドーマ培養上清 ５０μlを、２０万個の細胞（ナース様細胞、Ｂ細胞性白血病細胞、又は慢性リンパ球性白血病患者若しくは健康なドナー由来のＰＢＭＣ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、蛍光色素に結合させたヤギ抗マウス抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、様々な蛍光色素に結合させた、抗ヒトＣＤ１６３抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ１９抗体、及び抗ヒトＣＤ１４抗体と共に４℃で１５分間インキュベートした。洗浄後、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
【０１８３】
抗体との培養
慢性リンパ球性白血病患者から単離されたＰＢＭＣを、５μg/mlのハイブリドーマ培養上清から精製された抗体と共に若しくは伴わずに、又は５μg/mlのアイソタイプ対照と共に６日間インキュベートした。次いで、ナース様細胞の数を、顕微鏡下で計数することによって推定し、生存白血病細胞は、生存率についてヨウ化プロピジウムを使用して細胞計数装置により評価された。
【０１８４】
免疫組織化学的検査
免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）を、近傍に正常組織を有する４μm厚の型通りの手順で処理されたホルマリン固定されパラフィン包埋された腫瘍標本の薄片に対して実施した。クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中で熱誘導エピトープ賦活化技術を実施した。各抗体を３０分間インキュベートし、製造業者のプロトコールに従ってEnVision G/2 System/AP（ダコ社）酵素にコンジュゲートさせたポリマー骨格を使用して顕現させ、キットに含まれるパーマネントレッド色素原（ファーストレッド）によって可視化した。μm厚の薄片を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。免疫組織化学的検査を、Autostainer plus（ダコ社）スライド処理装置を使用して処理した。
【０１８５】
結果
ナース様細胞に対する４つの特異的な抗体のフローサイトメトリー分析
ナース様細胞は、慢性リンパ球性白血病の腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）として記載された。ナース様細胞を標的化するために、本発明者らは、ナース様細胞に対する特異的な抗体を作製することを決断した。したがって、本発明者らは、慢性リンパ球性白血病患者から精製されたナース様細胞を用いてマウスを免疫化した。ナース様細胞は、患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のインビトロ培養液によって生成された。１４日後、ナース様細胞を単離し、次いで、マウスに注入した。約２００個のハイブリドーマを得て、その上清を、患者由来のナース様細胞を認識するその能力についてフローサイトメトリーで試験した。これらの２００個の上清の中で、４個（６−１６、６−２５、６−６６−４９、６−６６−７４）が、ナース様細胞を認識して結合したが、慢性リンパ球性白血病患者由来の白血病細胞及び非常に僅かな単球を認識して結合することはなかった。図１Ａは、各上清を用いての黄色のアイソタイプと比較した青色のアイソタイプの染色を示す。これらの上清は、健康なドナーに由来するＴリンパ球（ＣＤ３＋）又はＢリンパ球（ＣＤ１９＋）には結合しなかった（図１Ａ）。図１Ｂは、腫瘍関連マクロファージ／ナース様細胞に対する特異的な抗体であるＣＤ１６３、及び６−２５抗体を用いてのナース様細胞の二重染色を示し、一方、他のＰＢＭＣは、これらの２つの抗体によって認識されなかった。したがって、これらの上清は、ナース様細胞に対して特異的な抗体を含有し、そのアイソタイプはＩｇＧ１であると決定された。４つの抗体の平均蛍光強度は、アイソタイプの平均蛍光強度と比較して図１Ｃに示されている。
【０１８６】
抗体の機能性
抗体の機能性を試験するために、本発明者らは、慢性リンパ球性白血病患者由来のＰＢＭＣを４つの各抗体と共に培養し、培養６日目に、抗体を含まないか又はアイソタイプ対照を含む培養液と比較して、ナース様細胞数（大型細胞に囲まれている）の強力な減少及び生存Ｂ細胞性白血病細胞数の減少を示した（図２）。
【０１８７】
乳腺腫瘍における腫瘍関連マクロファージの検出
４個の抗体が、慢性リンパ球性白血病においてナース様細胞以外の他の腫瘍関連マクロファージを認識することができるかどうかを試験するために、本発明者らは、免疫組織化学的検査において４個の抗体を用いた乳腺腫瘍の染色を実施した。本発明者らは、ｐＨ６の条件において、これらの中の２つの抗体、すなわち６−２５及び６−６６−４９が、マクロファージ上に、優先的には炎症領域に特徴的な腫瘍の辺縁部及び腫瘍内部に、特異的な褐色の染色を生じたことを示した。しかしながら、腫瘍から離れた場所、すなわち「健康な」組織において非常に低い染色が検出された。さらに、がん細胞又は他の免疫細胞は褐色に染色されなかった。
【０１８８】
実施例３
材料及び方法
フローサイトメトリー分析による６−２５抗体を用いてのナース様細胞及び慢性リンパ球性白血病細胞の染色
２人の慢性リンパ球性白血病患者の血液試料から単離されたＰＢＭＣを１０日間培養した。次いで、ＰＢＭＣを、６−２５抗体又は適切なアイソタイプ対照を用いて４℃で３０分間染色した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、蛍光色素に結合させたヤギ抗マウス抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、様々な蛍光色素に結合させた抗ヒトＣＤ１６３抗体、抗ヒトＣＤ６８抗体、抗ヒトＣＤ５抗体、及び抗ヒトＣＤ１９抗体と共に４℃で１５分間インキュベートした。洗浄後、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。ナース様細胞を、ＣＤ１６３／ＣＤ６８についての陽性染色によって選択し、慢性リンパ球性白血病細胞を、ＣＤ１９／ＣＤ５についての陽性染色によって選択した。
【０１８９】
フローサイトメトリー分析による、６−２５抗体を用いての、健康なドナーに由来するＰＢＭＣの染色
健康なドナーのバフィーコートから単離されたＰＢＭＣを、６−２５抗体又は適切なアイソタイプ対照と共に４℃で３０分間かけて染色した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、蛍光色素に結合させたヤギ抗マウス抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、様々な蛍光色素に結合させた抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ４抗体、抗ヒトＣＤ８抗体、抗ヒトＣＤ１４抗体、及び抗ヒトＣＤ１９抗体と共に４℃で１５分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。各個体群は、それらの特異的なマーカーによって選択された（ＣＤ４Ｔ細胞についてはＣＤ３＋／ＣＤ４＋、ＣＤ８Ｔ細胞についてはＣＤ３＋／ＣＤ８＋、Ｂリンパ球についてはＣＤ３−／ＣＤ１９＋、単球についてはＣＤ３−／ＣＤ１４＋）。
【０１９０】
６−２５抗体と共に培養後の、Ｂ細胞性慢性リンパ球性白血病細胞及びナース様細胞の生存率
慢性リンパ球性白血病患者の血液試料から単離されたＰＢＭＣを、５μg/mlの精製された６−２５抗体と共に若しくは伴わずに、又は５μg/mlのアイソタイプ対照（マウスＩｇＧ１）と共に６日間培養した。Ｂ細胞性慢性リンパ球性白血病細胞の枯渇前及び枯渇後に、位相差顕微鏡（２０倍率）で写真撮影した。ナース様細胞を、Malassez薄層上で計数した。生存白血病細胞は、７ＡＡＤ及びアネキシンＶを用いての染色、その後のＦＡＣＳ分析により評価された。
【０１９１】
ウェスタンブロット
５、１０、５０、又は１００ngの組換えシデロフレキシン３をウェスタンブロットにかけ、ウサギポリクローナル抗ＳＦＸＮ３抗体又はマウスモノクローナル抗ＳＦＸＮ３抗体又は６−２５抗体又はマウスＩｇＧ１アイソタイプを含む、１０μg/mlの抗体溶液を用いて４℃で一晩かけてプローブした。洗浄後、膜を、二次抗体（１／１００００、ＨＲＰ）溶液と共に室温で１時間インキュベートした。次いで、電気化学発光法を用いて顕現させた。
【０１９２】
結果
２人の慢性リンパ球性白血病患者由来のＰＢＭＣの１０日間培養液から生成されたナース様細胞（ＣＤ６８＋ＣＤ１６３＋細胞）を、アイソタイプ対照と比較して、６−２５抗体によって染色した。しかしながら、同じ培養液からゲーティングされた慢性リンパ球性白血病細胞（ＣＤ５＋ＣＤ１９＋）は、６−２５抗体によって染色されず、同じような平均蛍光強度が、６−２５を含む慢性リンパ球性白血病細胞及びアイソタイプ対照を含む慢性リンパ球性白血病細胞において得られた（図３）。
【０１９３】
健康なドナー由来のＰＢＭＣを６−２５抗体又はアイソタイプ対照と共にインキュベートし、ＣＤ４Ｔ細胞も、ＣＤ８Ｔ細胞も、Ｂリンパ球も、単球も、６−２５抗体で染色されなかった。ゲーティングされた各個体群について、６−２５を用いて得られた平均蛍光強度は、アイソタイプ対照を用いて得られたものと類似していた（図４）。
【０１９４】
ヒト組換えシデロフレキシン３は、ウェスタンブロットにおいて、６−２５抗体によって認識され、２２ｋＤａのサイズに相当するバンドを有する。このヒト組換えシデロフレキシン３の認識は、２つの市販の抗体であるウサギポリクローナル抗体及びマウスモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロットによって確認された。２本のバンドは、これらの２つの抗体を用いて得られ、そのうち一方はシデロフレキシン３（２２ｋＤａ）のサイズに相当する（図５）。
【０１９５】
６−２５抗体の機能性を分析するために、本発明者らは、６−２５又はアイソタイプ対照と共に又は伴わずに慢性リンパ球性白血病患者のＰＢＭＣを６日間培養した。６日後、ナース様細胞の枯渇が、６−２５を含む培養液において示された。枯渇は、Ｂ細胞性慢性リンパ球性白血病細胞の排除後により明白であった。ナース様細胞の発生は、アイソタイプ対照を含むか又は抗体を含まない培養液中では影響を受けなかった。丸い細胞及び接着した細胞は実際、６−２５抗体を含む培養液と比較して、これらの培養液において可視化された。次いで、これらの３つの培養液中のＢ細胞性慢性リンパ球性白血病細胞の生存率を、アネキシンＶ及び７−ＡＡＤを用いての染色及びＦＡＣＳ分析を用いて分析した。Ｂ細胞性慢性リンパ球性白血病細胞の生存率は、アイソタイプ対照と共に又は伴わずに６日間培養した後に高く、死滅細胞は僅か６．４％であった。しかしながら、Ｂ細胞性慢性リンパ球性白血病細胞の８１．５％は、６−２５抗体の存在下において６日間培養した後に死滅していた（図６）。
【０１９６】
ナース様細胞はまた、６−２５又はアイソタイプ対照を含む又は含まない、２人の慢性リンパ球性白血病患者由来のＰＢＭＣ培養液中でも計数された。ナース様細胞数は、アイソタイプ対照を含む又は含まない対照と比較して、６−２５を含む培養液においてゼロに近かった（図７）。
【０１９７】
参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する当技術分野の最新技術を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。
【図１Ａ】
2019531703.tif 000006
【図１Ｂ】
2019531703.tif 000007
【図１Ｃ】
2019531703.tif 000008
【図２】
2019531703.tif 000009
【図３】
2019531703.tif 000010
【図４】
2019531703.tif 000011
【図５】
2019531703.tif 000012
【図６】
2019531703.tif 000013
【図７】
2019531703.tif 000014
【配列表】
2019531703000001.app
【国際調査報告】
2019531703.tif 000015
2019531703.tif 000016
2019531703.tif 000017