(57)【要約】  骨髄由来抑制細胞阻害剤と組み合わせて扁平上皮癌の治療に使用するための、免疫原性組成物を含む組成物、および対応する治療方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における扁平上皮癌（ＳＣＣ）の治療またはＳＣＣの進行の遅延に用いるための、免疫原性組成物と任意選択により薬学的に許容される担体とを含む組成物であって、該治療が、該組成物と、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）阻害剤またはＭＤＳＣエフェクター機能阻害剤および任意選択により薬学的に許容される担体を含む第２の組成物とを組み合わせて投与することを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記個体が、
−末梢血単核細胞における単球系ＭＤＳＣ（Ｍ−ＭＤＳＣ）の生細胞の割合が、少なくとも０．０８％、好ましくは少なくとも０．１％であること、
−腫瘍組織内の単球系ＭＤＳＣ（Ｍ−ＭＤＳＣ）の生細胞の割合が、少なくとも０．００５％、好ましくは少なくとも０．００８％であること、
−血清中または血漿中のＬＯＸ−１濃度が、７５ｐｇ／ｍＬより高く、好ましくは１００ｐｇ／ｍＬより高いこと、
−多形核ＭＤＳＣ（ＰＭＮ−ＭＤＳＣ）全体に占める、ＬＯＸ−１を発現するＰＭＮ−ＭＤＳＣの割合が、少なくとも５％、好ましくは１０％であること、
−腫瘍組織内のＰＭＮ−ＭＤＳＣの生細胞の割合が、少なくとも２％、好ましくは少なくとも２．５％であること、
−末梢血単核細胞におけるＴｒｅｇ細胞の生細胞の割合が、１．８％以下、好ましくは１．５％以下であること、
−腫瘍組織内のＴｒｅｇ細胞の生細胞の割合が、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の１０％以下、好ましくはＣＤ４＋  Ｔ細胞の９％以下であること、
−末梢血単核細胞におけるＣＤ４＋Ｔ細胞中のＣＤ３ζの割合が、対照となる健常個体のＣＤ４＋Ｔ細胞に比べて低く、健常個体の０．９倍以下、好ましくは０．８倍以下であること
−末梢血単核細胞におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞中のＣＤ３ζの割合が、対照となる健常個体のＣＤ８＋  Ｔ細胞に比べて低く、健常個体の０．７５倍以下、好ましくは０．６５倍以下であること、ならびに／または
−患者の末梢血単核細胞のアルギナーゼ１の相対的発現量が、対照となる健常個体の末梢血単核細胞に比べて高く、健常個体の２．５倍以上であること
という特徴をさらに有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
個体における非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療またはＮＳＣＬＣの進行の遅延に用いるための、免疫原性組成物と任意選択により薬学的に許容される担体とを含む組成物であって、該治療が、該組成物と、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）阻害剤またはＭＤＳＣエフェクター機能阻害剤および任意選択により薬学的に許容される担体を含む第２の組成物とを組み合わせて投与することを含み、該個体が、ＭＤＳＣの存在に起因する免疫抑制性の腫瘍微小環境を有するという特徴をさらに有することを特徴とする組成物。
【請求項４】
免疫抑制性の腫瘍微小環境を有する前記個体が、
−末梢血単核細胞における単球系ＭＤＳＣ（Ｍ−ＭＤＳＣ）の生細胞の割合が、少なくとも０．０８％、好ましくは少なくとも０．１％であること、
−腫瘍組織内の単球系ＭＤＳＣ（Ｍ−ＭＤＳＣ）の生細胞の割合が、少なくとも０．００５％、好ましくは少なくとも０．００８％であること、
−血清中または血漿中のＬＯＸ−１濃度が、７５ｐｇ／ｍＬより高く、好ましくは１００ｐｇ／ｍＬより高いこと、
−ＰＭＮ−ＭＤＳＣ全体に占める、ＬＯＸ−１を発現するＰＭＮ−ＭＤＳＣの割合が、少なくとも５％、好ましくは１０％であること、
−腫瘍組織内のＰＭＮ−ＭＤＳＣの生細胞の割合が、少なくとも２％、好ましくは少なくとも２．５％であること、
−末梢血単核細胞におけるＴｒｅｇ細胞の生細胞の割合が、１．８％以下、好ましくは１．５％以下であること、
−腫瘍組織内のＴｒｅｇ細胞の生細胞の割合が、ＣＤ４＋細胞の１０％以下、好ましくはＣＤ４＋細胞の９％以下であること、
−末梢血単核細胞におけるＣＤ４＋Ｔ細胞中のＣＤ３ζの割合が、対照となる健常個体のＣＤ４＋Ｔ細胞に比べて低く、健常個体の０．９倍以下、好ましくは０．８倍以下であること
−末梢血単核細胞におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞中のＣＤ３ζの割合が、対照となる健常個体のＣＤ８＋  Ｔ細胞に比べて低く、健常個体の０．７５倍以下、好ましくは０．６５倍以下であること、ならびに／または
−患者の末梢血単核細胞のアルギナーゼ１の相対的発現量が、対照となる健常個体の末梢血単核細胞に比べて高く、健常個体の２．５倍以上であること
という特徴をさらに有する、請求項３の組成物。
【請求項５】
Ｍ−ＭＤＳＣが、ＣＤ１４＋ＣＤ１５−ＣＤ３３ｈｉＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏの表現型を有することを特徴とする、請求項２または４に記載の組成物。
【請求項６】
ＰＭＮ−ＭＤＳＣが、抑制性のＣＤ１４−ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ＋の表現型を有し、好ましくはＬＯＸ−１を発現していることを特徴とする、請求項２、４または５に記載の組成物。
【請求項７】
ＳＣＣが、肺癌の一種であることを特徴とする、請求項１、２、５または６に記載の組成物。
【請求項８】
前記個体が、ＳＣＣ、好ましくは肺ＳＣＣと診断されていることを特徴とする、請求項１、２および５〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記免疫原性組成物が、樹状細胞療法／樹状細胞ワクチン（ＤＣワクチン）、養子Ｔ細胞療法、ペプチドワクチン、ＤＮＡワクチン、ｍＲＮＡワクチンおよび腫瘍溶解性ウイルスからなる群より選択され、好ましくはＤＣワクチンであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
ＤＣワクチンが、腫瘍関連ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡに由来する抗原全体、抗原タンパク質全体、イディオタイプタンパク質、腫瘍溶解物／腫瘍細胞全体、およびウイルスベクターにより送達される抗原全体から選択される抗原材料を用いて調製されたものであることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記腫瘍細胞全体が、高水圧で調製されたものであることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ＭＤＳＣ阻害剤が、ＭＤＳＣの分化／成熟を阻止または阻害するか、ＭＤＳＣの遊走を阻止または阻害するか、ＭＤＳＣの枯渇／ＭＤＳＣのアポトーシスを誘導するか、ＭＤＳＣの増殖を阻害することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
ＭＤＳＣの分化／成熟を阻害する物質が、オールトランスレチノイン酸およびクルクミン誘導体から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ＭＤＳＣの遊走を阻害する物質が、ゾレドロン酸、抗グリカン抗体およびＣＳＦ−１Ｒ阻害物質から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
ＭＤＳＣの枯渇またはアポトーシスを誘導する物質が、チロシンキナーゼ阻害物質から選択され、好ましくはスニチニブ、抗Ｇｒ１抗体、ＩＬ４Ｒαアプタマー、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＤＭＡＧ）または５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）であることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
ＭＤＳＣの増殖を阻害する物質が、ベバシズマブ、セレコキシブおよびピモジドから選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
ＭＤＳＣエフェクター機能阻害剤が、酸化ストレス誘導物質であり、好ましくはＮ−ヒドロキシル−Ｌ−アルギニン（ＮＯＨＡ）、ニトロアスピリン、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、ＣｐＧオリゴデオキシ−ヌクレオチド、バルドキソロンメチル（ＣＤＤＯ−Ｍｅ）、ウィザフェリンＡおよびＳｔａｔｔｉｃであることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
肺癌は、最もよく診断されるがんの１つであり、悪性疾患の中でも死亡原因として最も多く、５年生存率は５〜１５％である。米国において、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、肺癌の症例全体の８５％を超える割合を占めており、ＮＳＣＬＣ患者は、転移病変を伴う進行した状態で診断されることが多い（Ｄｅｒｍａｎら、２０１５年）。ＮＳＣＬＣは、組織学的に腺癌（ＡＣ、５０％）、扁平上皮癌（ＳＣＣ、３０％）および大細胞癌（５％）の３つのサブタイプに分類することができる。ＮＳＣＬＣ腫瘍の種類を区分する組織学的分類は、世界保健機構により２０１５年に改訂されている（Ｔｒａｖｉｓら、２０１５年）。また、遺伝子のメチル化の違いによりＡＣとＳＣＣを識別できることが報告されている（Ｈｕａｎｇら、２０１６年）。小細胞癌は、肺癌症例の残りの１５％を占める。肺癌の発症率と死亡率はいまだ高いことから、改善された治療法の開発が緊急に求められており、そのために免疫療法の手法を利用できるのではないかと考えられている。
【０００２】
免疫療法の分野で多大な努力がなされてきたものの、これまで実用化までこぎつけた治療法はほとんどないのが現状である。その理由として、腫瘍における免疫細胞の浸潤と、がん患者に共通して見られる免疫抑制のメカニズムとの関係がいまだ十分に理解されていないということが考えられる。
【０００３】
免疫抑制は、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の主要な機能の１つである。ＭＤＳＣの主要ターゲットはＴ細胞である。ＭＤＳＣを介する免疫抑制に関与する主要因子としては、例えば、アルギナーゼ（ＡＲＧ１）、ｉＮＯＳ、ＴＧＦｂ、ＩＬ１０、ＣＯＸ２、インドールアミン  ２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、システインの囲い込み、Ｔ細胞におけるＬ−セレクチン発現の低下などが挙げられる。単球系ＭＤＳＣ（Ｍ−ＭＤＳＣ）は、ＮＯやサイトカインの産生に関わるメカニズムを利用して、抗原特異的に、また抗原非特異的にＴ細胞応答を抑制する（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈら、２０１２年）。多形核ＭＤＳＣ（ＰＭＮ−ＭＤＳＣ）は、主として抗原特異的に免疫応答を抑制する作用を有し、抗原特異的なＴ細胞寛容を誘導する（Ｋｏｅｈｎら、２０１５年、Ｍａｒｉｇｏら、２０１０年）。活性酸素種（ＲＯＳ）の産生は、この作用にとって不可欠である。ＮＯとスーパーオキシドとの反応により過酸化亜硝酸（ＰＮＴ）が生成され、このＰＮＴが、Ｔ細胞レセプターをニトロ化して、該レセプターの同種抗原−ＭＨＣ複合体に対する反応性を低下させることにより、直接Ｔ細胞を阻害する（Ｎａｇａｒａｊら、２００７年）。またＰＮＴは、抗原性ペプチドと腫瘍細胞表面のＭＨＣ分子との結合を抑制する（Ｌｕら、２０１１年ｂ）とともに、Ｔ細胞特異的なケモカインをニトロ化することにより、Ｔ細胞の遊走を阻害する（Ｍｏｌｏｎら、２０１１年）。
【０００４】
腫瘍微小環境における別の種類の免疫抑制細胞としては、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が挙げられ、この細胞は、肺癌における免疫応答の阻害において重要な役割を担っていることが報告されている（Ｄｏｍａｇａｌａ−Ｋｕｌａｗｉｋら、２０１４年）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
種々の腫瘍や腫瘍サブタイプにおける腫瘍微小環境は、いまだ十分に解明されていない。本発明において、驚くべきことに、ＭＤＳＣが、肺癌のあるサブタイプ、すなわちＳＣＣにおいて免疫抑制の主要な役割を担っているという事実が見出された。したがって、本発明は、がんの治療、より具体的にはＳＣＣを患う患者または層別化されたＮＳＣＬＣを患う患者の腫瘍における免疫抑制性の微小環境を制限する治療のための免疫原性組成物に関する。
【０００６】
定義
「免疫原性組成物」は、個体における免疫応答を誘導する組成物を表す。このような免疫原性組成物は、典型的にはあらゆる種類のワクチンであり、抗原性組成物（ワクチン）の接種により、当該抗原、すなわち、がんの場合には、腫瘍特異抗原に対する免疫応答を誘発する。典型的ながんワクチンとしては、樹状細胞療法／樹状細胞ワクチン（ＤＣワクチン）、養子Ｔ細胞療法、ペプチドワクチン、ＤＮＡワクチン、ｍＲＮＡワクチンおよび腫瘍溶解性ウイルスが挙げられる。好ましい一実施形態において、ＤＣワクチンが用いられる。
【０００７】
「ＤＣワクチン」は、抗原材料を用いて、または抗原材料を用いずに調製された、投与可能な治療用のＤＣを表す。このＤＣは、好ましくは、腫瘍関連ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡに由来する抗原全体、抗原タンパク質全体、イディオタイプタンパク質、腫瘍溶解物／腫瘍細胞全体、およびウイルスベクターにより送達される抗原全体から選択される抗原材料を用いて調製されたものである。
【０００８】
「Ｔｒｅｇ」は、ＣＤ４、ＣＤ２５およびＦｏｘｐ３転写因子が陽性のＴ細胞で、腫瘍特異的なＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞ならびにＮＫ細胞の機能ならびに増殖を抑制する。
【０００９】
「骨髄由来抑制細胞」または「ＭＤＳＣ」は、Ｔｒｅｇを誘導し（Ｍａｌｅｋら、２０１６年）、種々の免疫抑制分子の産生によりエフェクターＴ細胞の増殖を抑制することが報告されている。より具体的には、ＭＤＳＣは、２つの細胞群に大別される。１つは、「多形核」ＭＤＳＣ（ＰＭＮ−ＭＤＳＣ）あるいは「顆粒球性」ＭＤＳＣ（Ｇ−ＭＤＳＣ）とも称される、表現型および形態学的特徴が好中球に類似している細胞群であり、もう一方は、「単球系」ＭＤＳＣ（Ｍ−ＭＤＳＣ）と称される、表現型および形態学的特徴が単球に類似している細胞群である。さらに、初期段階のＭＤＳＣ（ｅＭＤＳＣ）も存在する（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ、２０１７年）。本願において、ＭＤＳＣという用語が単独で用いられる場合は、Ｍ−ＭＤＳＣおよびＰＭＮ−ＭＤＳＣが包含されるものと理解される。ヒトにおいて、ＰＭＮ−ＭＤＳＣは、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４−ＣＤ１５＋またはＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４−ＣＤ６６ｂ＋と定義され、Ｍ−ＭＤＳＣは、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏＣＤ１５−と定義される。Ｍ−ＭＤＳＣは、ＭＨＣクラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＤＲの発現に基づいて、単球と分離することが可能である。ＰＭＮ−ＭＤＳＣは、例えば、標準的なフィコール勾配を用いた勾配遠心分離により好中球と分離することが可能である。好中球は高密度細胞であるのに対し、ＰＭＮ−ＭＤＳＣは低密度画分（ＰＢＭＣ）に多く含まれる（Ｄｕｍｉｔｒｕら、２０１２年）。近年、ＰＭＮ−ＭＤＳＣのマーカーとして、レクチン様酸化ＬＤＬ受容体１（ＬＯＸ−１）を利用できることが明らかとなった（Ｃｏｎｄａｍｉｎｅら、２０１６年）。
【００１０】
「ＭＤＳＣ阻害剤」は、ＭＤＳＣを減少、妨害および／または阻害する作用を有する分子を表し、ＭＤＳＣの増殖または分化を抑制する。例えば、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）は、ＭＤＳＣの分化を阻害する。ＭＤＳＣ阻害剤は、ＭＤＳＣの分化／成熟を阻止または阻害するか、ＭＤＳＣの遊走を阻止または阻害するか、ＭＤＳＣの枯渇／ＭＤＳＣのアポトーシスを誘導するか、ＭＤＳＣの増殖を阻害する。また、ＭＤＳＣ阻害剤は、ＭＤＳＣを不活性化する分子群に分類される場合もあり、ＭＤＳＣの成熟細胞への分化を阻害するか、ＭＤＳＣの発達を阻止するか、ＭＤＳＣを枯渇させる（Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉら、２０１３年）。ここで言う分子は、好ましくは、分子量が２，５００Ｄａ以下、特に９００Ｄａ以下の低分子量分子および／または生物製剤としての高分子、好ましくは治療用の組換えタンパク質を表す。
【００１１】
「健常個体」は、悪性疾患の病歴を持たない個体を表す。同様に、「健康な組織」は、治療対象である腫瘍の由来臓器の、悪性疾患の兆候が見られない組織、例えば悪性疾患の兆候が見られない肺組織を表す。
【００１２】
本願の明細書および請求項において「含む」という用語が用いられている場合、記載外の要素を除外しないことを意味する。本発明の目的のために用いられる「からなる」という用語は、「含む」という用語の好ましい一実施形態と見なされる。以下、ある群が少なくとも特定の数の実施形態を含むと定義されている場合は、そのような実施形態のみからなる群が好ましい例として開示されているものと理解される。
【００１３】
単数名詞を表す際に不定冠詞または定冠詞、例えば、「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」が用いられている場合、特に明記しない限りは、その名詞の複数形も包含される。
【００１４】
専門用語は、関連する専門分野の常識に基づいて用いられる。ある用語に特定の意味を付与する場合は、以下その用語を使用する際に用語の定義を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】腫瘍および健康な組織に存在する細胞の生存率および由来。（Ａ）腫瘍（Ｔｕ）および非腫瘍性の健康な肺組織（ＮＴｕ）からそれぞれ単離した全細胞の生存率を、ＤＡＰＩ染色によるフローサイトメトリーによって測定した（上段パネル）。ＡＣおよびＳＣＣの腫瘍（Ｔｕ）および非腫瘍性の健康な肺組織（ＮＴｕ）における上皮細胞のパーセンテージを、サイトケラチンの免疫染色によるフローサイトメトリーによって測定した（下段パネル）。（Ｂ）腫瘍（Ｔｕ）および非腫瘍性の健康な肺組織（ＮＴｕ）におけるリンパ球のパーセンテージを、ＣＤ４５の免疫染色によるフローサイトメトリーによって測定した。（Ｃ）フローサイトメトリーのゲーティング方法。
【図２】腺癌（ＡＣ）および扁平上皮癌（ＳＣＣ）におけるＮＳＣＬＣ腫瘍および非腫瘍組織への免疫細胞の浸潤。（Ａ）ＡＣおよびＳＣＣの腫瘍（Ｔｕ）および非腫瘍性の健康な肺組織（ＮＴｕ）の生細胞に占める、ｃＤＣのパーセンテージ（ＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋、左上パネル）、単球のパーセンテージ（ＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋、右上パネル）、肥満細胞のパーセンテージ（ＣＤ１１７＋、左下パネル）およびＢ細胞のパーセンテージ（ＣＤ１９／２０＋、右下パネル）をフローサイトメトリーにより推定した。（Ｂ）ＡＣおよびＳＣＣの腫瘍（Ｔｕ）および非腫瘍性の健康な肺組織（ＮＴｕ）の生細胞に占める、ＮＫ細胞のパーセンテージ（ＣＤ３−ＣＤ５６＋、左上パネル）、Ｔｒｅｇのパーセンテージ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋、右上パネル）、ＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセンテージ（ＣＤ４＋、左下パネル）およびＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセンテージ（ＣＤ８＋、右下パネル）をフローサイトメトリーにより推定した。（Ｃ）ＡＣおよびＳＣＣの腫瘍（Ｔｕ）および非腫瘍性の健康な肺組織（ＮＴｕ）における、ＣＤ３＋細胞に占めるＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセンテージ（ＣＤ４＋、左上パネル）、ＣＤ３＋細胞に占めるＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセンテージ（ＣＤ８＋、右上パネル）、生細胞に占めるメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセンテージ（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４＋、左下パネル）および生細胞に占めるメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセンテージ（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ８＋、右下パネル）をフローサイトメトリーにより推定した。
【図３】ＳＣＣ腫瘍の腫瘍内のＩＮＦ−γを産生するＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞は、非腫瘍組織およびＡＣ患者の腫瘍より有意に阻害されていた。ＡＣおよびＳＣＣの腫瘍（Ｔｕ）および非腫瘍性の健康な肺組織（ＮＴｕ）における、ＣＤ４＋  生存Ｔ細胞に占めるＩＦＮ−γ＋細胞のパーセンテージ（上段パネル）およびＣＤ８＋  生存Ｔ細胞に占めるＩＦＮ−γ＋細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより測定した。
【図４】ＮＳＣＬＣ患者の腫瘍および非腫瘍組織におけるサイトカイン産生量。細胞をＰＭＡ＋イオノマイシンで２４時間刺激した後、ＡＣおよびＳＣＣの腫瘍（Ｔｕ）および非腫瘍性の健康な肺組織（ＮＴｕ）におけるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１βおよびＩＬ−２の産生量（Ａ）、ならびにＴＮＦ−α、ＩＬ−２３およびＩＬ−１０の産生量（Ｂ）をＬｕｍｉｎｅｘにより測定した。
【図５】腫瘍内のＭ−ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇの存在量、ならびに腫瘍微小環境に対するそれらの影響。Ｔ細胞におけるＣＤ３ζ発現抑制およびＰＢＭＣにおけるＡＲＧ１  ｍＲＮＡ抑制。（Ａ）健康な同年齢対照者、ＡＣ患者およびＳＣＣ患者のＰＢＭＣ生細胞に占める、Ｍ−ＭＤＳＣのパーセンテージ（ＣＤ１５−ＣＤ１４＋ＣＤ３３ｈｉＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏ、左パネル）およびＴｒｅｇのパーセンテージ（右パネル）をフローサイトメトリーにより測定した。（Ｂ）健康な同年齢対照者、ＡＣ患者およびＳＣＣ患者のＰＢＭＣ生細胞中のＣＤ３ζ＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞の量（左パネル）およびＣＤ３ζ＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞の量（右パネル）をフローサイトメトリーにより測定した。（Ｃ）健常対照者、ＡＣ患者およびＳＣＣ患者のＰＢＭＣから抽出したｍＲＮＡに対するＡＲＧ１の相対的発現量をｑＰＣＲにより測定した。
【図６】ＡＣおよびＳＣＣにおける種類の異なる免疫抑制性細胞間の相関分析。ＡＣ患者（左上）、ＳＣＣ患者（右上）および健康な同年齢対照者（左下）のＰＢＭＣにおけるＭ−ＭＤＳＣ（ＣＤ１５−ＣＤ１４＋ＣＤ３３ｈｉＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏ）数とＴｒｅｇ数との相関分析。
【図７】実験プロトコール。
【図８】ＮＳＣＬＣのＳＣＣ患者の腫瘍内のＴ細胞およびＮＫ細胞は、ＮＳＣＬＣのＡＣ患者と比べて、その機能が抑制されている。腫瘍または非腫瘍組織の細胞懸濁液をＰＭＡおよびイオノマイシンで１時間刺激した後、ブレフェルジンを加えてさらに３時間インキュベートした。その後、細胞内ＩＦＮ−γに対する染色を行い、染色した細胞をフローサイトメトリーにより解析した。（Ａ）ＩＦＮ−γを産生するＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  Ｔ細胞を検出するゲーティング方法。（Ｂ）ＰＭＡ＋イオノマイシンで２４時間刺激した後、ｌｕｍｉｎｅｘで測定したサイトカイン産生量。グラフは、ＡＣ（ｎ＝４３）およびＳＣＣ（ｎ＝３９）それぞれの平均値を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５または＊＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【図９】腫瘍内のＴｒｅｇ、多形核ＭＤＳＣ（ＰＭＮ−ＭＤＳＣ）（ＣＤ１４−ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ＋）および単球系ＭＤＳＣ（Ｍ−ＭＤＳＣ）（ＣＤ１５−ＣＤ１４＋ＣＤ３３ｈｉＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏｗ）を検出するゲーティング方法。
【図１０】ＴｒｅｇはＳＣＣ患者よりＡＣ患者の血液中に多く含まれているが、ＭＤＳＣ数はＳＣＣ患者の血液中の方が多い。Ａ）ＮＳＣＬＣ患者の血液中のＴｒｅｇ、ＰＭＮ−ＭＤＳＣ（ＣＤ１４−ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ＋）およびＭ−ＭＤＳＣ（ＣＤ１５−ＣＤ１４＋ＣＤ３３ｈｉＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏｗ）を検出するゲーティング方法。（ＢおよびＣ）凍結保存したＰＢＭＣサンプルのＰＢＭＣにおけるＭＤＳＣの定量分析。ＮＳＣＬＣ患者の凍結保存サンプル（Ｂ）および新鮮な（非凍結）サンプル（Ｃ）のＰＢＭＣにおけるＴｒｅｇ量とＰＭＮ−ＭＤＳＣ量との相関。
【図１１】ＮＳＣＬＣのＡＣ患者とＳＣＣ患者の血液中のＴｒｅｇの抑制機能は、ＭＤＳＣとは異なり、同等である。（Ａ）Ｔｒｅｇ抑制試験。（Ｂ）Ｍ−ＭＤＳＣ抑制試験−磁気ビーズ分離法。ＥＬＩＳＡにより検出したＩＬ−２およびＩＦＮ−γの分泌量のデータも含む。（Ｃ）Ｍ−ＭＤＳＣ抑制試験−細胞選別。ＥＬＩＳＡにより検出したＩＬ−２およびＩＦＮ−γの分泌量データも含む。（Ｄ）ＮＳＣＬＣ患者の新鮮な（非凍結）サンプルのＴ細胞におけるＣＤ３ζ発現のフローサイトメトリー検出。（Ｅ）血漿サンプル中のＬＯＸ−１タンパク質をＥＬＩＳＡにより検出した。グラフは、ＡＣ（ｎ＝５６）、ＳＣＣ（ｎ＝５２）および対照者（ｎ＝４１）それぞれの平均値を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５または＊＊＊＊ｐ＜０．００５）。（Ｆ）ＬＯＸ−１陽性ＰＭＮ−ＭＤＳＣをフローサイトメトリーにより定量した。グラフは、ＡＣ（ｎ＝３）、ＳＣＣ（ｎ＝１）および対照者（ｎ＝２）それぞれの平均値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
がんの不均一性は、クローン原性生存および治療抵抗性を可能にするがんの特徴の１つであり、活発な免疫応答により形成される。抗原特異的Ｔ細胞は、養子Ｔ細胞の移植、チェックポイント阻害などの免疫療法により臨床的に証明されているように、がんを制御することが可能である。しかし、がん免疫療法はいまだ成功率が低く、どのような人に効果があるのか、そしてそれはなぜなのかについて詳細に理解する必要がある（Ｈａｒｒｏｐ、２０１３年）。
【００１７】
本発明の基礎をなす研究において、初めに、ネオアジュバント療法後手術を受けた非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者のうち３８名の腺癌（ＡＣ）患者および３５名の扁平上皮癌（ＳＣＣ）患者から採取した原発性腫瘍（Ｔｕ）および非腫瘍性肺組織（ＮＴｕ）における免疫細胞の浸潤、Ｔ細胞応答およびサイトカインの産生、ならびに１３名のＡＣ患者、１２名のＳＣＣ患者および１０名の同年齢の対照者／良性患者から採取した血液サンプル（表１参照）を比較した。「ＰＢＭＣ」という用語は、ＰＢＭＣが血液サンプル以外から単離されたことが明記されていない限り、血液サンプルから当業者に一般に知られている方法で単離されたＰＢＭＣを表すものとする。本研究を完成させるために、採取するサンプル数を増やし、最終的に、４３名のＡＣ患者および３９名のＳＣＣ患者から腫瘍組織サンプルを採取し、３２名のＡＣ患者、３０名のＳＣＣ患者および１７名の同年齢の健常対照者から血液サンプルを採取し、５７名のＡＣ患者、５２名のＳＣＣ患者および４１名の同年齢の健常対照者から血漿サンプルを採取した（表２参照）。そして同様に、ＮＳＣＬＣ患者および同年齢の健常人ドナーのＰＢＭＣにおける骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）数およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞数を比較した。いずれの腫瘍サブタイプにおいても、非腫瘍組織と比べて、様々な免疫細胞集団が極めて高度に浸潤していることが確認された。腫瘍サンプルにおいては、既に公開されているデータ（Ｂｌａｃｋら、２０１３年）で示されている、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇの浸潤がＳＣＣよりＡＣで高度に見られるという結果も本研究において確認された。
【００１８】
しかし、驚くべきことに、ＳＣＣ患者においては、血液サンプル中および腫瘍サンプル中のＣＤ１５−ＣＤ１４＋ＣＤ３３ｈｉＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏ  Ｍ−ＭＤＳＣ数ならびに腫瘍サンプル中のＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４−ＣＤ１５＋  ＰＭＮ−ＭＤＳＣ数が、ＡＣ患者および対照者より有意に多かった。さらに、ＳＣＣ患者のＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＣＤ３ζの発現低下ならびにＰＢＭＣにおけるＡＲＧ１の発現増加が確認された。このＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＣＤ３ζの発現低下は、いずれもＰＭＮ−ＭＤＳＣの存在と負の相関が見られた。抑制機能評価試験を行ったところ、ＳＣＣ患者では、ＡＣ患者とは異なり、ＴｒｅｇよりもＭ−ＭＤＳＣおよびＰＭＮ−ＭＤＳＣが抑制作用において主たる役割を担っていることが示唆された。
【００１９】
本研究におけるさらなる目的は、ＮＳＣＬＣの原発性腫瘍および非腫瘍組織における免疫細胞の浸潤の解析、ならびに腫瘍内のＩＦＮ−γを産生するＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞ならびに刺激後のサイトカイン産生の解析である。ＮＳＣＬＣ患者および同年齢の健常対照者の腫瘍および末梢血に存在するＭＤＳＣおよびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇの解析も行った。
【００２０】
ＳＣＣとＡＣを比較検討したところ、いずれのサブタイプにおいても、腫瘍内では、免疫細胞の浸潤が、非腫瘍組織よりも高度に見られることが分かった。通常の樹状細胞（ＤＣ）（ＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲｈｉ）を除けば、ＳＣＣとＡＣで免疫細胞の浸潤に違いは見られなかった。通常の樹状細胞は、ＳＣＣではＡＣより有意に減少しており、ＳＣＣ腫瘍においては抗原提示能力が低下していることが示唆される。
【００２１】
驚くべきことに、末梢血の単核細胞集団を解析したところ、ＳＣＣ患者の血液でのみ単球系ＣＤ１５−ＣＤ１４＋ＣＤ３３ｈｉＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏ  ＭＤＳＣが確認され、またＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＣＤ３ζの発現低下、ならびにＰＢＭＣにおけるＡＲＧ１の発現増加も確認された。ＡＣおよびＳＣＣのＭＤＳＣは、いずれもＴ細胞の増殖を阻害するが、Ｔ細胞におけるＩＬ−２およびＩＦＮ−γの強い抑制が見られたのはＳＣＣのみであった。したがって、ＳＣＣのＭＤＳＣはより強い抑制活性を有することが示された。さらに、腫瘍内に浸潤したＭＤＳＣを解析したところ、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４−ＣＤ１５＋  ＰＭＮ−ＭＤＳＣの数およびＣＤ１４＋ＣＤ３３ｈｉＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏ  Ｍ−ＭＤＳＣの数は、ＡＣ腫瘍よりＳＣＣ腫瘍の方が多かった。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ１２７ｌｏｗ  Ｔｒｅｇは、ＡＣ患者の冷凍保存血液サンプルのみ増加しており、ＣＤ１５−ＣＤ１４＋ＣＤ３３ｈｉＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏ  ＭＤＳＣ数と負の相関が見られたことから、ＮＳＣＬＣの２つの組織型であるＡＣとＳＣＣで全身的な免疫抑制メカニズムが異なることが示唆される。冷凍保存していない新鮮な血液サンプルを分析した場合も、同様の結果が得られた。ＡＣでは、ＴｒｅｇとＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４−ＣＤ１５＋  ＰＭＮ−ＭＤＳＣの間に負の相関が見られたが、ＳＣＣでは見られなかった。ＰＭＮ−ＭＤＳＣは凍結保存によりかなりの数の細胞が破壊されてしまうため、この現象を凍結サンプルで確認することはできなかった。患者の血液中のＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４−ＣＤ１５＋  ＰＭＮ−ＭＤＳＣの量を表現型の特徴に基づいて分析したところ、新鮮な血液サンプル、凍結血液サンプルのいずれにおいても、ＡＣとＳＣＣに違いは見られなかった。腫瘍サンプルを分析したところ、腫瘍内で検出されたＴｒｅｇの数は、ＮＳＣＬＣの２つの組織学的サブタイプのいずれも非腫瘍組織より多かった。しかし、Ｔｒｅｇの浸潤の程度は、ＳＣＣ腫瘍よりＡＣ腫瘍の方が高かった。
【００２２】
つまり、ＳＣＣでは、免疫抑制性の腫瘍微小環境においてＭＤＳＣが優勢であることが示されたが、ＡＣを患うがん患者では、ほとんどの場合、腫瘍微小環境におけるＭＤＳＣの寄与は小さい。ＭＤＳＣは腫瘍微小環境において強い免疫抑制活性を有していることが示されている（Ｕｍａｎｓｋｙら、２０１６年）ことから、ＳＣＣまたはＭＤＳＣ表現型を有するＮＳＣＬＣを撃退するための宿主免疫システムを利用する方法の１つとして、樹状細胞ワクチンなどの免疫療法とＭＤＳＣ阻害剤との併用が考えられる。
【００２３】
したがって、第１の態様において、本発明は、ＳＣＣを患う個体における扁平上皮癌（ＳＣＣ）の治療またはＳＣＣの進行の遅延に用いるための、免疫原性組成物と任意選択により薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。前記治療は、前記組成物と、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）阻害剤またはＭＤＳＣエフェクター機能阻害剤および任意選択により薬学的に許容される担体を含む第２の組成物とを組み合わせて投与することを含む。
【００２４】
ＭＤＳＣがＳＣＣの優勢な免疫抑制細胞であるという驚くべき知見から、ＭＤＳＣを抑制することによって、またはＭＤＳＣのエフェクター機能を抑制することによって、腫瘍微小環境における免疫システムの抑制が大幅に緩和され、それにより併用免疫療法がより効果的に行われることが想定される。この方法は、免疫療法の重大な課題全体を克服し、かつ細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識される腫瘍関連抗原の同定が進展しているにもかかわらず免疫療法の臨床効果が低い（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎら、２０１０年）という問題を克服するための、重要な方法かもしれない。
【００２５】
前記ＳＣＣを患う個体は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＣＤ１５−ＣＤ１４＋ＣＤ３３ｈｉＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏ  Ｍ−ＭＤＳＣの生細胞の割合が、少なくとも０．０８％、好ましくは少なくとも０．１％であるという特徴をさらに有するものであってよい。この％値は、ＰＢＭＣの生細胞の総数に対する百分率（％）である。Ｍ−ＭＤＳＣに関する上記のパーセンテージは、実施例７に記載されているような細胞選別により、凍結保存したＰＢＭＣサンプルから得られた測定値に対応している。凍結保存していない新鮮なサンプルでＰＢＭＣにおける生細胞の割合を測定する場合、個体は、ＰＢＭＣにおけるＭ−ＭＤＳＣの生細胞の割合が、少なくとも０．２５％、好ましくは少なくとも０．３５％であるという特徴を有するものであってよい。ＰＢＭＣは、フィコール・パーク勾配遠心分離または当技術分野で公知のその他の手法により、患者の血液から回収、単離することができる。死細胞は、ＤＡＰＩ染色、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎまたは当技術分野で公知のその他の手法を用いた細胞計数法により生細胞と識別することができる。Ｍ−ＭＤＳＣは、例えば、特定のゲーティングパラメータを用いたフローサイトメトリーにより、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ３３抗体および抗−ＨＬＡ−ＤＲ抗体を用いて計数することができる。特に好ましい一実施形態において、Ｍ−ＭＤＳＣの割合は、実施例７に記載の方法と同様にして求められる。
【００２６】
前記ＳＣＣを患う個体は、腫瘍組織内のＭ−ＭＤＳＣの生細胞の割合が、少なくとも０．００５％、好ましくは少なくとも０．００８％であるという特徴をさらに有するものであってよい。好ましい一実施形態において、前記腫瘍組織は、新鮮な腫瘍組織、すなわち凍結していない腫瘍組織である。別の一実施形態において、腫瘍組織サンプルは凍結したものである。
【００２７】
ＳＣＣを患う個体の別の特徴としては、血清中または血漿中のＬＯＸ−１濃度が、少なくとも７５ｐｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１００ｐｇ／ｍＬであるということが挙げられる。血清または血漿は、当技術分野で公知の手法により患者の血液から得ることができる。ＬＯＸ−１は、レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体１（ＬＯＸ−１）、ＯＬＲ１、ＣＬＥＣ８Ａ、ＬＯＸ１、ＬＯＸＩＮ、ＳＣＡＲＥ１、ＳＬＯＸ１または酸化低密度リポタンパク質受容体１（Ｏｘ−ＬＤＬ受容体１）を意味する。ＬＯＸ−１は、内皮細胞、単球、血小板、心筋細胞および血管平滑筋細胞に存在する、酸化低密度リポタンパク質（ｏｘ−ＬＤＬ）の主要な受容体の１つとして同定された。ＬＯＸ−１は、生理的状態ではほとんど発現していないが、病的状態において発現が誘導されると考えられている（Ｌｕら、２０１１年ａ）。また、ＬＯＸ−１は、切り離されて可溶性形態として体循環に入ると考えられている（Ｂｉｏｃｃａら、２０１３年）。血液中または血漿中の可溶性ＬＯＸ−１濃度は、当技術分野で公知の手法により測定することが可能であり、例えばＥＬＩＳＡにより測定することができる。
【００２８】
ＳＣＣを患う個体の別の特徴としては、ＣＤ１５＋末梢血単核細胞の少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％がＬＯＸ−１＋（ＬＯＸ−１発現ＰＭＮ−ＭＤＳＣ）であるということが挙げられる。ＬＯＸ−１陽性細胞のパーセンテージは、実施例７に記載の方法と同様にして、末梢血中のＣＤ１５陽性ＭＤＳＣに占める割合として測定される。
【００２９】
ＳＣＣを患う個体は、腫瘍組織内のＰＭＮ−ＭＤＳＣの生細胞の割合が、少なくとも２％、好ましくは少なくとも２．５％であるという特徴をさらに有するものであってよい。このＰＭＮ−ＭＤＳＣの割合は、実施例７の記載の方法と同様にして求めたものである。フローサイトメトリーによる測定では、ＰＭＮ−ＭＤＳＣとして計数した細胞には、同じ抗体で認識される好中球も含まれる可能性があると理解される。好中球は、フローサイトメトリー測定前に、フィコール勾配によりＰＭＮ−ＭＤＳＣと分離することが可能である。好中球は高密度細胞であるのに対し、ＰＭＮ−ＭＤＳＣは低密度画分に多く含まれる。
【００３０】
別の一態様において、前記ＳＣＣを患う個体は、ＰＢＭＣにおけるＴｒｅｇ細胞の生細胞の割合が、１．８％以下、好ましくは１．５％以下であるという特徴を有するものであってよい。この％値は、ＰＢＭＣの生細胞の総数に対する百分率（％）である。Ｔｒｅｇ細胞に関する上記のパーセンテージは、凍結保存したＰＢＭＣサンプルから得られた測定値に対応している。凍結保存していない新鮮なサンプルでＰＢＭＣにおける生細胞の割合を測定する場合、個体は、ＰＢＭＣにおけるＴｒｅｇ細胞の生細胞の割合が、１％以下、好ましくは０．８％以下であるという特徴を有するものであってよい。特に好ましい一実施形態において、Ｔｒｅｇの割合は、実施例７に記載の方法と同様にして求められる。
【００３１】
また、腫瘍組織内のＴｒｅｇ細胞の生細胞の割合を、ＭＤＳＣが優勢を占める腫瘍環境を有する個体の特徴として用いてもよい。この場合、腫瘍組織内のＰＢＭＣにおけるＴｒｅｇ細胞の生細胞の割合は、ＣＤ４＋細胞の１０％以下、好ましくはＣＤ４＋細胞の９％以下である。本発明者らは結論として、ＳＣＣ患者は概して免疫抑制性の腫瘍環境を有しており、これが腫瘍組織内にＴｒｅｇ細胞が多く存在することに起因するものでないのであれば、ＭＤＳＣが多く存在することに起因するとした。
【００３２】
さらに別の一態様において、前記ＳＣＣを患う個体は、ＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋  Ｔ細胞中のＣＤ３ζの割合が、対照となる健常個体のＣＤ４＋  Ｔ細胞に比べて低く、健常個体の０．９倍以下、好ましくは０．８倍以下であるという特徴を有するものであってよい。このＣＤ３ζの割合は、凍結保存したＰＢＭＣサンプルから得られた測定値に対応している。凍結保存していない新鮮なサンプルでＰＢＭＣにおける生細胞の割合を測定する場合、個体は、ＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋  Ｔ細胞中のＣＤ３ζの割合が、対照となる健常個体のＣＤ４＋  Ｔ細胞に比べて低く、健常個体の０．７倍以下、好ましくは０．６倍以下であるという特徴を有するものであってよい。ＣＤ４＋  Ｔ細胞中のＣＤ３ζの割合は、例えば、単離したＣＤ４＋  Ｔ細胞を抗ＣＤ３ζ抗体で免疫染色することにより測定することができる。これまでに、Ｔ細胞表面のＣＤ３ζ発現の低下は、ＭＤＳＣの抑制活性の増大と相関することが示されており、このことは、ＭＤＳＣのＡＲＧ１活性の増大によりＬ−アルギニンが欠乏することで説明できる（ＧａｂｒｉｌｏｖｉｃｈおよびＮａｇａｒａｊ、２００９年）。
【００３３】
別の一実施形態において、前記ＳＣＣを患う個体は、ＰＢＭＣにおけるＣＤ８＋  Ｔ細胞中のＣＤ３ζの割合が、対照となる健常個体のＣＤ８＋  Ｔ細胞に比べて低く、健常個体の０．７５倍以下、好ましくは０．６５倍以下であるという特徴を有するものであってよい。このＣＤ３ζの割合は、凍結保存したＰＢＭＣサンプルから得られた測定値に対応している。凍結保存していない新鮮なサンプルでＰＢＭＣにおける生細胞の割合を測定する場合、個体は、ＰＢＭＣにおけるＣＤ８＋  Ｔ細胞中のＣＤ３ζの割合が、対照となる健常個体のＣＤ８＋  Ｔ細胞に比べて低く、健常個体の０．７倍以下、好ましくは０．５倍以下であるという特徴を有するものであってよい。
【００３４】
さらに別の一実施形態において、ＳＣＣを患う個体は、ＰＢＭＣのＡＲＧ１の相対的発現量が、健常個体のＰＢＭＣ細胞に比べて高く、健常個体の２．５倍以上であるという特徴を有する。ＰＢＭＣのＡＲＧ１の相対的発現量は、定量的ＰＣＲにより測定することができる。好ましい一実施形態において、発現レベルは、実施例７に記載されているような定量的ＰＣＲにより求められる。
【００３５】
第３の態様において、本発明は、個体における非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療またはＮＳＣＬＣの進行の遅延に用いるための、免疫原性組成物と任意選択により薬学的に許容される担体とを含む組成物に関し、該治療は、該組成物と、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）阻害剤またはＭＤＳＣエフェクター機能阻害剤および任意選択により薬学的に許容される担体を含む第２の組成物とを組み合わせて投与することを含み、該個体は、ＭＤＳＣの存在に起因する免疫抑制性の腫瘍微小環境を有するという特徴をさらに有する。本発明において、ＭＤＳＣの存在に起因する免疫抑制性の腫瘍微小環境とは、ＭＤＳＣによって、免疫システムの種々の細胞、主にＴ細胞が抑制されていることを意味する。ＭＤＳＣを介する免疫抑制に関与する主要因子としては、ＡＲＧ１の発現増加、ｉＮＯＳの発現増加、ＭＤＳＣによるＴＧＦβおよびＩＬ１０の産生亢進、ＭＤＳＣにおけるＣＯＸ２活性の増大、ＭＤＳＣまたは腫瘍細胞におけるインドールアミン  ２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の発現増加、ＭＤＳＣによるシステインの囲い込み、Ｔ細胞におけるＬ−セレクチンの発現低下などが挙げられる（Ｂｒｏｎｔｅら、２０１６年、表３：この文献は参照により本明細書に組み込まれる）。これらの因子における健康な組織との違いを、免疫抑制性の腫瘍微小環境の特徴として用いてもよい。Ｍ−ＭＤＳＣは、ＮＯおよびサイトカインの産生に関わるメカニズムを利用して、Ｔ細胞応答を抑制すると考えられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈら、２０１２年にて総説）。一方、ＰＭＮ−ＭＤＳＣは、主に抗原特異的に、例えば抗原特異的なＴ細胞寛容を誘導することにより、免疫応答を抑制する（Ｋｏｅｈｎら、２０１５年、Ｍａｒｉｇｏら、２０１０年）。
【００３６】
本発明において、ＳＣＣ患者ではＭＤＳＣの有意な増加が全般的に認められているが、多くのＡＣ患者でも同レベルのＭＤＳＣを有することが確認されている。したがって、ＭＤＳＣの存在に起因する免疫抑制性の腫瘍微小環境を有するあらゆるＮＳＣＬＣ患者が、免疫原性組成物と、ＭＤＳＣ阻害剤またはＭＤＳＣエフェクター機能阻害剤との併用治療によって利益を得るということになる。
【００３７】
別の一態様において、本発明は、個体における非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療またはＮＳＣＬＣの進行の遅延に用いるための、免疫原性組成物と任意選択により薬学的に許容される担体とを含む組成物に関し、該治療は、該組成物と、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）阻害剤またはＭＤＳＣエフェクター機能阻害剤および任意選択により薬学的に許容される担体を含む第２の組成物とを組み合わせて投与することを含み、ＭＤＳＣの存在に起因する免疫抑制性の腫瘍微小環境を有する個体は、ＰＢＭＣにおけるＭ−ＭＤＳＣの生細胞の割合が、少なくとも０．０８％、好ましくは少なくとも０．１％であるという特徴を有する。Ｍ−ＭＤＳＣに関する上記のパーセンテージは、凍結保存したＰＢＭＣサンプルから得られた測定値に対応している。凍結保存していない新鮮なサンプルでＰＢＭＣにおける生細胞の割合を測定する場合、個体は、ＰＢＭＣにおけるＭ−ＭＤＳＣの生細胞の割合が、少なくとも０．２５％、好ましくは少なくとも０．３５％であるという特徴を有するものであってよい。
【００３８】
ＭＤＳＣの存在に起因する免疫抑制性の腫瘍微小環境を有する個体は、腫瘍組織内のＭ−ＭＤＳＣの生細胞の割合が、少なくとも０．００５％、好ましくは少なくとも０．００８％であるという特徴をさらに有するものであってよい。好ましい一実施形態において、前記腫瘍組織は、新鮮な腫瘍組織、すなわち凍結していない腫瘍組織である。これは、ＭＤＳＣが凍結／融解による影響を受けやすいためである。
【００３９】
ＭＤＳＣの存在に起因する免疫抑制性の腫瘍微小環境を有する個体の別の特徴としては、血清中または血漿中のＬＯＸ−１濃度が、少なくとも７５ｐｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１００ｐｇ／ｍＬであるということが挙げられる。血清または血漿は、当技術分野で公知の手法により患者の血液から得ることができる。
【００４０】
ＭＤＳＣの存在に起因する免疫抑制性の腫瘍微小環境を有する個体の別の特徴としては、ＣＤ１５＋末梢血単核細胞の少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％がＬＯＸ−１＋（ＬＯＸ−１発現ＰＭＮ−ＭＤＳＣ）であるということが挙げられる。ＬＯＸ−１陽性細胞のパーセンテージは、実施例７に記載の方法と同様にして、末梢血中のＣＤ１５陽性ＭＤＳＣに占める割合として測定される。
【００４１】
ＭＤＳＣの存在に起因する免疫抑制性の腫瘍微小環境を有する個体は、腫瘍組織内のＰＭＮ−ＭＤＳＣの生細胞の割合が、少なくとも２％、好ましくは少なくとも２．５％であるという特徴をさらに有するものであってよい。このＰＭＮ−ＭＤＳＣの割合は、実施例７の記載の方法と同様にして求めたものである。フローサイトメトリーによる測定では、ＰＭＮ−ＭＤＳＣとして計数した細胞には、同じ抗体で認識される好中球も含まれる可能性があると理解される。好中球は、フローサイトメトリー測定前に、フィコール勾配によりＰＭＮ−ＭＤＳＣと分離することが可能である。好中球は高密度細胞であるのに対し、ＰＭＮ−ＭＤＳＣは低密度画分に多く含まれる。
【００４２】
ＭＤＳＣの存在に起因する免疫抑制性の腫瘍微小環境を有する個体は、末梢血単核細胞におけるＴｒｅｇ細胞の生細胞の割合が、１．８％以下、好ましくは１．５％以下であるという特徴を有するものであってよい。Ｔｒｅｇ細胞に関する上記のパーセンテージは、凍結保存したＰＢＭＣサンプルから得られた測定値に対応している。凍結保存していない新鮮なサンプルでＰＢＭＣにおける生細胞の割合を測定する場合、個体は、ＰＢＭＣにおけるＴｒｅｇ細胞の生細胞の割合が、１％以下、好ましくは０．８％以下であるという特徴を有するものであってよい。
【００４３】
また、腫瘍組織内のＴｒｅｇ細胞の生細胞の割合を、免疫抑制性の腫瘍微小環境を有する個体の特徴として用いてもよい。この場合、腫瘍組織内のＰＢＭＣにおけるＴｒｅｇ細胞の生細胞の割合は、ＣＤ４＋細胞の１０％以下、好ましくはＣＤ４＋細胞の９％以下である。本発明者らは結論として、ＮＳＣＬＣ患者は概して免疫抑制性の腫瘍環境を有しており、これが腫瘍組織内にＴｒｅｇ細胞が多く存在することに起因するものでないのであれば、ＭＤＳＣが多く存在することに起因するとした。
【００４４】
ＣＤ３ζの減少は、ＡＲＧ１活性の増大によりアルギニンが枯渇して起こるＴ細胞の抑制を表す間接的指標であり（ＧａｂｒｉｌｏｖｉｃｈおよびＮａｇａｒａｊ、２００９年）、ＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の抑制を間接的に示す。
【００４５】
したがって、ＭＤＳＣの存在に起因する免疫抑制性の腫瘍微小環境を有する個体の別の特徴としては、ＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋  Ｔ細胞中のＣＤ３ζの割合が、対照となる健常個体のＣＤ４＋  Ｔ細胞に比べて低く、健常個体の０．９倍以下、好ましくは０．８倍以下であるということが挙げられる。このＣＤ３ζの割合は、凍結保存したＰＢＭＣサンプルから得られた測定値に対応している。凍結保存していない新鮮なサンプルでＰＢＭＣにおける生細胞の割合を測定する場合、個体は、ＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋  Ｔ細胞中のＣＤ３ζの割合が、対照となる健常個体のＣＤ４＋  Ｔ細胞に比べて低く、健常個体の０．７倍以下、好ましくは０．６倍以下であるという特徴を有するものであってよい。ＣＤ４＋  Ｔ細胞中のＣＤ３ζの割合は、例えば、単離したＣＤ４＋  Ｔ細胞を抗ＣＤ３ζ抗体で免疫染色することにより測定することができる。
【００４６】
さらに、ＭＤＳＣの存在に起因する免疫抑制性の腫瘍微小環境を有する個体の別の特徴としては、ＰＢＭＣにおけるＣＤ８＋  Ｔ細胞中のＣＤ３ζの割合が、対照となる健常個体のＣＤ８＋  Ｔ細胞に比べて低く、健常個体の０．７５倍以下、好ましくは０．６５倍以下であるということが挙げられる。このＣＤ３ζの割合は、凍結保存したＰＢＭＣサンプルから得られた測定値に対応している。凍結保存していない新鮮なサンプルでＰＢＭＣにおける生細胞の割合を測定する場合、個体は、ＰＢＭＣにおけるＣＤ８＋  Ｔ細胞中のＣＤ３ζの割合が、対照となる健常個体のＣＤ８＋  Ｔ細胞に比べて低く、健常個体の０．７倍以下、好ましくは０．５倍以下であるという特徴を有するものであってよい。
【００４７】
ＭＤＳＣの存在に起因する免疫抑制性の腫瘍微小環境を有する個体は、ＰＢＭＣのＡＲＧ１の相対的発現量が、健常個体のＰＢＭＣに比べて高く、健常個体の２．５倍以上であるという特徴をさらに有するものであってよい。ＰＢＭＣのＡＲＧ１の相対的発現量は、定量的ＰＣＲにより測定することができる。
【００４８】
本発明の一態様において、Ｍ−ＭＤＳＣは、ＣＤ１４＋ＣＤ１５−ＣＤ３３ｈｉＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏの表現型を有することを特徴とし、ＰＭＮ−ＭＤＳＣは、抑制性のＣＤ１４−ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ＋の表現型を有すること、好ましくはＬＯＸ−１を発現していることを特徴とする。これらの細胞の表現型の特性解析は、フローサイトメトリーまたは当技術分野で公知のその他の手法を用いて行うことができる。ＣＤ１４−ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ＋という表現型を有するという特徴は、ＰＭＮ−ＭＤＳＣだけでなく、好中球にも当てはまる。しかし、本研究の腫瘍患者における好中球の混入は無視できると考えられる。一方で、フローサイトメトリー測定前に、フィコール勾配により好中球をＰＭＮ−ＭＤＳＣと分離できるという報告もある（ＳｃａｐｉｎｉおよびＣａｓｓａｔｅｌｌａ、２０１４年）。好中球は高密度細胞であるのに対し、ＰＭＮ−ＭＤＳＣは低密度画分（ＰＢＭＣ）に多く含まれる。さらに、好中球は、ＰＭＮ−ＭＤＳＣに特徴的な抑制能を有していない。抑制能は、例えば抗ＣＤ３／ＣＤ２８（またはポリヒドロキシアルカノエート）に誘導されるＴ細胞増殖の抑制またはＩＬ−２およびＩＦＮ−γの産生の抑制により確認することができる。Ｔ細胞増殖の測定には、３Ｈ−チミジン取り込みまたはＣＦＳＥ希釈を用いることができ、ＩＦＮ−γ産生量の測定には、ＥＬＩＳＰＯＴまたは細胞内染色を用いることができる。
【００４９】
別の一態様において、本発明の組成物は、肺ＳＣＣの治療または肺ＳＣＣの進行の遅延を目的とするものである。肺扁平上皮癌（肺ＳＣＣ）は、非小細胞肺癌の１つの形態である。ＳＣＣは、肺の気道を裏打ちする組織で発生する。ＳＣＣは、類表皮癌という名称でも知られている。ほとんどの肺ＳＣＣは、肺の中心部、通常、肺と気管を連結する太い気管支に位置している。ＳＣＣは、その他の形態の非小細胞肺癌より喫煙との関連が強く、また、女性より男性でよく見られる。また、ＳＣＣは成長が遅い傾向があり、その存在位置から、その他の形態の肺癌より早期に発見されることが多い。肺癌でよく見られる症状としては、持続性咳嗽、喀血および喘鳴が挙げられる。ＳＣＣは大きな気道の近傍に存在する傾向があるため、その他の形態の肺癌より早期に症状が現れることが多い。気道の閉塞は、肺炎などの感染症または肺の一部虚脱（無気肺）に至る場合がある。ＳＣＣは、パンコースト症候群または肺尖部胸壁症候群の最も多い原因である。パンコースト症候群は、肺の上部付近で発生した肺癌がその周辺組織に浸潤することにより引き起こされる。症状としては、腕の内側を下方に向かって放散する肩痛、手の脱力またはチクチクする感覚、顔半面の紅潮または発汗、および眼瞼下垂（ホルネル症候群）がしばしば見られる。また、ＳＣＣを有する個体は、高カルシウム血症を伴う可能性が高く、その結果、筋力低下および筋痙攣が引き起こされる場合がある。高カルシウム血症は、腫瘍随伴症候群の症状の１つであり、腫瘍が血液中のカルシウムレベルを上昇させるホルモン様物質を分泌することが原因で起こる。
【００５０】
本発明の別の一態様において、本発明の組成物は、ＳＣＣと診断された個体の治療を目的とするものである。ＳＣＣの診断方法は、当技術分野でよく知られている（Ｔｒａｖｉｓら、２０１５年）。Ｘ線写真で異常が認められる場合は、多くの場合、まず肺ＳＣＣが疑われる。さらなる検査としては、胸部ＣＴスキャン、喀痰細胞診、気管支鏡検査、ＰＥＴスキャン、気管支内超音波検査が挙げられる。結果によっては、診断を確定するために肺生検が行われる場合もある（Ｔｒａｖｉｓら、２０１３年）。肺ＳＣＣは、以下の４つの段階に分類される。
ステージＩ：癌は肺の内部に局在しており、リンパ節への進展は一切見られない。
ステージＩＩ：癌はリンパ節または肺の裏打ち組織に進展しているか、主気管支の特定の領域に存在する。
ステージＩＩＩ：癌は肺近傍の組織に進展している。
ステージＩＶ：癌は体の別の部位に進展している（転移している）。
【００５１】
本発明の別の一態様において、肺ＳＣＣの治療または肺ＳＣＣの進行の遅延を目的とした本発明の組成物は、標準的な治療処置（ここではＳＣＣとＡＣとを区別しない）と組み合わせて投与してもよい。組み合わせる好ましい標準的な治療処置としては、ステージＩＶのＮＳＣＬＣの治療に対しては、カルボプラチンとパクリタキセルの併用、ステージＩＶのＥＧＦＲ野生型ＮＳＣＬＣの治療に対しては、ペメトレキセドとカルボプラチンの併用、ステージＩＩＩＢ〜ＩＶのＥＧＦＲ野生型ＮＳＣＬＣの治療に対しては、ゲムシタビンとシスプラチンの併用、またはペメトレキセドとシスプラチンの併用、ステージＩＩＩＡ〜ＩＶのＮＳＣＬＣの治療に対しては、ビノレルビンとカルボプラチンの併用が挙げられる。
【００５２】
さらに別の一態様において、本発明は、ＭＤＳＣ阻害剤またはＭＤＳＣエフェクター機能阻害剤と組み合わせる免疫原性組成物に関し、該免疫原性組成物は、樹状細胞療法／樹状細胞ワクチン（ＤＣワクチン）、養子Ｔ細胞療法、ペプチドワクチン、ＤＮＡワクチン、ｍＲＮＡワクチンおよび腫瘍溶解性ウイルスからなる群より選択され、好ましくはＤＣワクチンである。養子Ｔ細胞療法の様々な手法は、Ｈｏｕｏｔ  Ｒら（２０１５）に記載されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。ペプチドワクチンの様々な手法は、Ｘｉａｏ  ＹＦら（２０１５）に記載されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。ＤＮＡワクチンの様々な手法は、Ｙａｎｇ  Ｂら（２０１４）に記載されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。ｍＲＮＡワクチンの様々な手法は、ＭｃＮａｍａｒａ  ＭＡら（２０１５）に記載されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。腫瘍溶解性ウイルスワクチンの様々な手法は、Ａｉｔｋｅｎ  ＡＳら（Ａｉｔｋｅｎら、２０１７年）に記載されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。樹状細胞ワクチンの様々な手法は、ＴｕｒｎｉｓおよびＲｏｏｎｅｙ（２０１０）に記載されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５３】
好ましい一実施形態において、ＤＣワクチンは、ＴｕｒｎｉｓおよびＲｏｏｎｅｙ（２０１０）の表１（この文献は、参照により本明細書に組み込まれる）に例示されているような、腫瘍関連ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡに由来する抗原全体、抗原タンパク質全体、イディオタイプタンパク質、腫瘍溶解物／腫瘍細胞全体、およびウイルスベクターにより送達される抗原全体から選択される抗原材料を用いて調製される。
【００５４】
特に好ましい一実施形態において、前記腫瘍細胞全体（未成熟ＤＣ上にローディングするために用いられる）は、国際公開第２０１３／００４７０８号および国際公開第２０１５／０９７０３７号（これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法と同様にして、高水圧（ＨＨＰ）で調製されたものである。腫瘍細胞全体をＨＨＰで処理することにより、特殊なアポトーシスである免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を誘導することができる。ＩＣＤを起こして死滅した腫瘍細胞は、カルレティキュリン、ＨＳＰ７０およびＨＳＰ９０などの極めて強力な「ｅａｔ−ｍｅ」シグナルを提示する。これらの「ｅａｔ−ｍｅ」シグナルが引き金となり、未成熟ＤＣはアポトーシスを起こした腫瘍細胞を効率的に貪食し、成熟ＤＣは腫瘍抗原を効率的に提示する。ＨＨＰを用いてＮＳＣＬＣまたはＳＣＣの強力なＤＣワクチンを製造する条件として、肺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ５２０またはＮＣＩ−Ｈ５２２を単独または組み合わせて２５０ＭＰａの圧力下に１０分間晒し、免疫原性細胞死を起こした当該細胞を未成熟ＤＣに添加することが好ましい。
【００５５】
好ましい一実施形態において、ＭＤＳＣ阻害剤は、ＭＤＳＣの分化／成熟を阻止または阻害するか、ＭＤＳＣの遊走を阻止または阻害するか、ＭＤＳＣの枯渇／ＭＤＳＣのアポトーシスを誘導するか、ＭＤＳＣの増殖を阻害する。ＭＤＳＣを標的とする前臨床化合物および臨床化合物は、Ｄｒａｇｈｉｃｉｕら（２０１５年、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる）の表１、ＫｏおよびＫｉｍ（２０１６年、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる）の表２、ならびにＴａｌｍａｄｇｅおよびＧａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ（２０１３年、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる）の表１およびボックス２に記載されている。
【００５６】
ＭＤＳＣの分化／成熟を阻害する物質の好ましい例として、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）およびクルクミン誘導体が挙げられる。ＡＴＲＡは、ワクチン接種の数日前に１５０ｍｇ／ｍ２で投与してもよい。ＭＤＳＣの遊走を阻害する物質の好ましい例として、ゾレドロン酸、抗グリカン抗体およびＣＳＦ−１Ｒ阻害物質が挙げられる。ＭＤＳＣの枯渇またはアポトーシスを誘導する物質の好ましい例として、チロシンキナーゼ阻害物質が挙げられ、好ましくはスニチニブ、抗Ｇｒ１抗体、ＩＬ４Ｒαアプタマー、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＤＭＡＧ）および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）である。ＭＤＳＣの増殖を阻害する物質の好ましい例として、ベバシズマブ、セレコキシブおよびピモジドが挙げられる。ＭＤＳＣエフェクター機能阻害剤の好ましい例として、酸化ストレス誘導物質が挙げられ、好ましくはＮ−ヒドロキシル−Ｌ−アルギニン（ＮＯＨＡ）、ニトロアスピリン、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、ＣｐＧオリゴデオキシ−ヌクレオチド、バルドキソロンメチル（ＣＤＤＯ−Ｍｅ）、ウィザフェリンＡおよびＳｔａｔｔｉｃである。ＡＴＲＡ、パクリタキセル、ゲムシタビンまたはシスプラチンとの組み合わせが特に好ましい。
【実施例】
【００５７】
【表１】
2019517537.tif 000002
【００５８】
実施例１
ＮＳＣＬＣ腫瘍から単離した細胞は、高い生存率を示したものの、非腫瘍組織から単離した細胞の生存率と比較すると、腫瘍から単離した細胞の生存率は有意に低かった（図１Ａ上段パネル参照）。扁平上皮癌（ＳＣＣ）には、上皮細胞（ＦＩＴＣ標識抗体によるヒト上皮抗原および汎サイトケラチン（ｐａｎ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）の検出による測定）が腺癌（ＡＣ）より高レベルで含まれていた（図１Ａ下段パネル参照）。ＣＤ４５＋リンパ球系細胞の浸潤の程度は、腫瘍において、非腫瘍組織よりも有意に高かった（図１Ｂ参照）。細胞の割合は、ＤＡＰＩ陰性細胞の総数に対する％として求めた（図１Ｃのゲーティング方法参照）。
【００５９】
実施例２
免疫細胞の浸潤は、調べた免疫細胞集団のいずれも、異なる組織学的サブタイプであるＡＣとＳＣＣで同程度であった（図２参照）。免疫細胞の浸潤の程度は、腫瘍において、非腫瘍組織よりも有意に高かった。断りのない限り、免疫細胞集団のパーセンテージは、生細胞（ＤＡＰＩ陰性）の総数に対する割合として求めたものである。
【００６０】
実施例３
ＳＣＣ腫瘍の腫瘍内のＩＮＦ−γを産生するＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞（図３の上段パネルおよび下段パネルをそれぞれ参照）は、非腫瘍組織およびＡＣ患者の腫瘍より有意に阻害されていた。
【００６１】
実施例４
細胞懸濁液にＰＭＡおよびイオノマイシンを加えて２４時間刺激した後、Ｌｕｍｉｎｅｘによりサイトカインを測定した。ＡＣ患者の腫瘍では、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αなどの炎症促進性サイトカインの産生量が非腫瘍組織より有意に高かった（図４Ａおよび図４Ｂ参照）。また、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αの産生量は、ＳＣＣ患者の腫瘍よりＡＣ患者の腫瘍の方が高かった。ＩＬ−２３も同様の結果であった（図４Ａおよび図４Ｂ参照）。ＩＬ−１０は、いずれのＮＳＣＬＣサブタイプの腫瘍でも有意に増加していた（図４Ｂ参照）。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＬ−９、ＩＬ−２１、ＩＬ−４およびＩＬ−６は、非腫瘍組織との比較において腫瘍に関わる産生は見られなかった。
【００６２】
実施例５
Ｍ−ＭＤＳＣ（ＣＤ１５−ＣＤ１４＋ＣＤ３３ｈｉＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏ）は、ＳＣＣ患者の血液中に多く存在しており、制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ１２７ｌｏｗ）は、ＡＣ患者で増加していた（図５Ａ参照）。ＳＣＣ患者では、Ｔ細胞におけるＣＤ３ζ鎖の発現低下（図５Ｂ参照）およびＡＲＧ１レベルの増加（図５Ｃ参照）が見られたが、ＡＣ患者ではいずれも見られなかった。
【００６３】
実施例６
ＡＣ患者の血液では、Ｍ−ＭＤＳＣ（ＣＤ１５−ＣＤ１４＋ＣＤ３３ｈｉＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏ）集団のパーセンテージと、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ１２７ｌｏｗ）のパーセンテージとの間に負の相関が見られたが、ＳＣＣ患者および同年齢健常対照者では見られなかった（図６参照）。これらのデータから、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ１２７ｌｏｗ  Ｔｒｅｇが、ＡＣを患うＮＳＣＬＣ患者の主要な免疫抑制性細胞集団である可能性が示唆される。
【００６４】
実施例７：材料および方法
【００６５】
【表２】
2019517537.tif 000003
【００６６】
実験のプロトコールの概要を図７に示す。
【００６７】
ＮＳＣＬＣ患者の原発性腫瘍および非腫瘍組織の処理
ネオアジュバント療法後手術を受けた８２名のＮＳＣＬＣ患者から腫瘍組織（Ｔｕ）および非腫瘍組織（ＮＴｕ）を採取した。ＮＳＣＬＣ患者の特徴を表２に示す。手術日に採取した組織サンプルを細かく切り刻み、１００ｎｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅ  Ｉおよび２０ｎｇ／ｍＬコラゲナーゼＤ（いずれもＲｏｃｈｅ社）を含むＲＭＰＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社）に加えて、振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートした。次いで、この細胞懸濁液を１００μｍのストレーナーを通して５０ｍＬのファルコンチューブに回収し、単一細胞に分離された細胞の懸濁液を得た。浸潤した免疫細胞集団を、以下に記載の各種特異的抗体を用いて４℃で３０分間染色した後、すぐにフローサイトメトリーで解析した。細胞に刺激を加えるための準備として、リンパ球を計数し、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＰＡＡ）、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ  ＣＴＳ（Ｇｉｂｃｏ社）および１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中に１×１０６個／ｍＬの濃度になるように９６穴プレートに播種した。細胞を３７℃で１時間、５０ｎｇ／ｍＬ  ＰＭＡおよび１０ｎｇ／ｍＬイオノマイシン（いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で刺激した後、ブレフェルジンＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、１０００×）を加えて３時間インキュベートし、ＣＤ８＋  Ｔ細胞内およびＣＤ４＋  Ｔ細胞内のＩＦＮ−γを検出した。一部の実験においては、細胞培養物に組換えＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、１３ｎｇ／ｍＬ）を加えて、３７℃で３日間または７日間インキュベートし、増殖性ＣＤ８＋  Ｔ細胞および増殖性ＮＫ細胞をフローサイトメトリーで検出した。細胞の生存率は、ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）またはＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（４０５ｎｍ励起用）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて測定した。
【００６８】
ＰＢＭＣ単離および血漿回収
ネオアジュバント療法後手術を受けた６０名のＮＳＣＬＣ患者および悪性疾患の病歴を持たない１７〜３０名の同年齢ボランティアから、それぞれ末梢血を２〜３本の９ｍＬのＶＡＣＵＥＴＴＥ（登録商標）  Ｋ３  ＥＤＴＡチューブに採取した。採取した末梢血を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、２〜４ｍＬの血漿を回収して−８０℃で保存した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール・パーク勾配遠心分離により単離した。単離したＰＢＭＣを計数し、完全培地中に１×１０６個／ｍＬの濃度になるように９６穴プレートに播種した。また、ｍＲＮＡを保存するために、計数後、上記の通りにＲＬＴバッファー中で細胞を溶解した。単離したばかりのＰＢＭＣを、以下に記載の各種特異的抗体を用いて４℃で３０分間染色した後、すぐにフローサイトメトリーで分析し、Ｔｒｅｇ含量およびＭＤＳＣ含量を求めた。一部のＰＢＭＣは、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）  ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）に懸濁し、液体窒素中で凍結保存した後、含量分析を行った。
【００６９】
免疫細胞の分析に用いた抗体および染色プロトコール
上皮腫瘍細胞：ＣＤ４５  ＰＥ−ＤｙＬｉｇｈｔ  ５９４（Ｅｘｂｉｏ社）、抗汎サイトケラチン  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、抗ヒト上皮抗原−ＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ社）
樹状細胞：Ｌｉｎ  ｎｅｇ（ＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＣＤ１９−ＦＩＴＣ、ＣＤ２０−ＦＩＴＣ、ＣＤ５６−ＦＩＴＣ）、ＣＤ４５−ＰＥ−ＤｙＬｉｇｈｔ  ５９４、ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣ（いずれもＥｘｂｉｏ社）、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ−Ｃｙ７（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））
リンパ球／ＮＫ細胞：ＣＤ３−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ１９−ＦＩＴＣ、ＣＤ２０−ＦＩＴＣ（いずれもＥｘｂｉｏ社）、ＣＤ４−ＥＣＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）、ＣＤ５６−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）
ナイーブＴ細胞／メモリーＴ細胞：ＣＤ３−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ、ＣＤ４５ＲＯ−ＡＰＣ、ＣＤ６２Ｌ−ＦＩＴＣ（いずれもＥｘｂｉｏ社）、ＣＣＲ７−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、ＣＤ４−ＥＣＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）
ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞：ＣＤ３−Ａｌｅｘａ  ７００、ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ７（いずれもＥｘｂｉｏ社）、ＣＤ４−ＥＣＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）、ＩＦＮ−γ−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）
腫瘍内制御性Ｔ細胞：ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ７（Ｅｘｂｉｏ社）、ＣＤ４−ＥＣＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）、Ｆｏｘｐ３−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）
ＰＢＭＣにおける制御性Ｔ細胞：ＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ８−ｅＦｌｕｏｒ  ４５０、ＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ１２７−ＡＰＣ、Ｆｏｘｐ３−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、ＣＤ３ζ−ＰＥ（いずれもｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、Ｋｉ−６７−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）
ＭＤＳＣ：ＣＤ１４−ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｖ４５０（ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ）、ＨＬＡ−ＤＲ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、ＣＤ３３−ＰＥ−Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、ＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣ、ＣＤ１５−ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、場合により＋ＬＯＸ１−ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）
【００７０】
対応する抗体をＰＢＳ中で混合し、この抗体液を用いて細胞外染色を４℃で３０分間行った。ＩＦＮ−γ、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ３ζおよびＫｉ−６７の細胞内染色においては、細胞を固定バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で３０分間固定して、膜透過化バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で透過処理を行った後、細胞内染色を４℃で３０分間行った。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で解析を行った。データの解析には、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ社）を用いた。フローサイトメトリーデータは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示す場合がある。
【００７１】
サイトカイン産生および血漿中ＬＯＸ−１の検出
サイトカイン産生を調べるために、ＰＭＡおよびイオノマイシンで２４時間刺激した後、細胞上清を回収した。また、上記の通りにＩＬ−１５で刺激し、３日目および７日目に細胞上清を回収した。回収した細胞培養上清を−８０℃で保存した。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＬ−９、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−４、ＩＬ−２３、ＩＬ−６およびＴＮＦαは、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ａｓｓａｙ（ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（商標）  ＭＡＰ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｈ１７  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄ  Ｐａｎｅｌ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて、ＭａｇＰｉｘ（ＸＭＡＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｕｍｉｎｅｘ社）で測定した。ＰＭＮ−ＭＤＳＣの存在を示すマーカーであるＬＯＸ−１タンパク質は、ＮＳＣＬＣ患者から得られた血漿サンプル（１：１０希釈または１：５０希釈）を用いて、ＥＬＩＳＡ（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により検出した。
【００７２】
磁気マイクロビーズを用いたＣＤ３３＋ＨＬＡＤＲ−  ＭＤＳＣの単離
ＣＤ３３＋ＨＬＡＤＲ−細胞を、白血球分離により得られたＮＳＣＬＣ患者のＰＢＭＣから、ＭＡＣＳマイクロビーズおよびＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて単離した。以下に方法を簡潔に説明する。解凍したＰＢＭＣを、冷却したＭＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＨＬＡ−ＤＲマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）とともに氷上で１５分間インキュベートした。次いで、未結合のビーズを除去するために、冷却したＭＡＣＳバッファーで細胞を洗浄し、その後、ＭＡＣＳカラムを用いて、メーカーの取扱説明書に従いＨＬＡ−ＤＲ＋細胞を除去した。ＨＬＡ−ＤＲ陰性細胞画分を回収して洗浄した後、ＣＤ３３マイクロビーズとともにインキュベートした。ＭＡＣＳカラムを用いて、ＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−細胞のポジティブセレクションを行った。ＣＤ３３＋細胞集団の純度をフローサイトメトリーで測定したところ、９０％を上回る値であった。
【００７３】
細胞選別によるＣＤ３３＋ＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ−  ＭＤＳＣの単離
以下に方法を簡潔に説明する。フィコール・パックを用いた白血球分離によりＮＳＣＬＣ患者のＰＢＭＣを単離し、−８０℃で保存した。解凍したＰＢＭＣを、冷却したＭＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＣＤ３３マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）とともに、氷上で１５分間インキュベートした。次いで、未結合のビーズを除去するために、冷却したＭＡＣＳバッファーで細胞を洗浄し、その後、ＭＡＣＳカラムを用いて、メーカーの取扱説明書に従いＣＤ３３陰性細胞を除去した。ＣＤ３３＋細胞画分を回収して洗浄した後、抗ＣＤ１４  Ａｂおよび抗−ＨＬＡ−ＤＲ  Ａｂを用いて４℃で２０分間染色を行った。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｓ３ｅセルソータ（Ｂｉｏｒａｄ社）を用いて、ＣＤ３３＋ＣＤ１４＋ＨＬＡＤＲ−／ｌｏｗ  ＭＤＳＣを選別した。
【００７４】
ＭＤＳＣ抑制試験
精製した自己Ｔ細胞（５０，０００個／ウェル）をＣＦＳＥで標識した後、抗ＣＤ３／ＣＤ２８エキスパンダービーズ（２．５×１０５個／ウェル）を用いて活性化し、磁気ビーズ精製または細胞選別したＭＤＳＣとともに様々な比率（Ｔ細胞／ＭＤＳＣ比＝１：１、１：２または１：４）でインキュベートした。６日目にフローサイトメトリーを用いて、Ｔ細胞の増殖をＣＦＳＥ希釈度を指標として測定した。抑制の程度は、対照に対する％＝（分析サンプルの増殖−非増殖細胞の増殖）／（対照の増殖−非増殖細胞の増殖）として算出される。また、細胞培養上清中のＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の産生量を、ＥＬＩＳＡ（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により測定した。
【００７５】
制御性Ｔ細胞の単離および抑制試験
ＮＳＣＬＣ患者から白血球分離により得られたＰＢＭＣを解凍して、冷却したＰＢＳに再懸濁し、３０μｍストレーナーを通して凝集した細胞塊を除去した。ＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏｗ  Ｔｒｅｇは、ＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ２５＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて単離した。ＣＤ３＋エフェクター細胞は、ＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて単離し、ＣＦＳＥ（１μＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で染色した。純度およびＣＦＳＥ染色を、フローサイトメトリーで確認した。抑制試験を実施するために、ＣＦＳＥで染色したＣＤ３＋  Ｔエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ：５０，０００個／ウェル）を９６穴プレートに播種したもの（ネガティブコントロール）、細胞播種後、抗ＣＤ３／ＣＤ２８エキスパンダービーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、１６．７×１０３個／ウェル、Ｔ細胞／ビーズ比＝３：１）を用いて活性化したもの（ポジティブコントロール）、細胞播種後、抗ＣＤ３／ＣＤ２８エキスパンダービーズを用いて活性化し、精製したＴｒｅｇとともに様々な比率（Ｔｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比＝２：１、１：１、０．２５：１または０．１２５：１）でインキュベートしたものをそれぞれ準備した。細胞は、１０％ヒトＡＢ血清を添加した完全ＲＰＭＩ  １６４０（２００μＬ／ウェル）中でインキュベートした。３日目にＴ細胞の増殖を調べた（対照の最適な増殖−６０〜８０％、少なくとも３世代）。抑制の程度は、上記のＭＤＳＣ抑制試験と同様にして算出される。また、細胞培養上清中のＩＬ−２の産生量を、ＥＬＩＳＡ（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍ社）により測定した。
【００７６】
ｑＰＣＲおよびプロテオミクス解析
全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて単離した。ＲＬＴバッファーと細胞溶解物とを含む各サンプルを素早く解凍し、ＤＮａｓｅ  Ｉ分解工程を含むメーカーのプロトコールに従って処理した。ＲＮＡの濃度および純度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）用いて測定し、ＲＮＡの完全性は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２０００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて調べた。精製したＲＮＡサンプルは使用するまで−８０℃で保存した。ｃＤＮＡは、１００ｎｇの全ＲＮＡからｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて合成した。ＡＲＧ１遺伝子の発現量は、ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（商標）  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いてｑＰＣＲにより測定した。各サンプルの反応液１０μＬには、ＫＡＰＡ  ＰＲＯＢＥ  ＦＡＳＴ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）５μＬ、フォワードプライマーおよびリバースプライマー各０．５μＬ（各５００ｎＭ；ＴＩＢ  Ｍｏｌｂｉｏｌ社）、ＴａｑＭａｎプローブ（２００ｎＭ；ＴＩＢ  Ｍｏｌｂｉｏｌ社）０．５μＬ、ＲＮａｓｅ不含水１．５μＬならびに５×希釈ｃＤＮＡ２μＬが含まれる。反応はｎ＝３で行った。温度サイクルプログラムは以下の通りである。初めに９５℃で３分、その後９５℃で１５秒、６０℃で６０秒のサイクルを４５回繰り返した。その後、想定される長さのＰＣＲ産物が形成されていることをアガロースゲル電気泳動法により確認した。Ｃｑ値は、ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて求め、測定対象の遺伝子の相対的発現量は、３６サイクルをカットオフとしてＧｅｎＥｘソフトウェア（ＭｕｌｔｉＤ  Ａｎａｌｙｓｅｓ社）を用いて算出した。プロテオミクス解析は、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓで公開されているＮＳＣＬＣ腫瘍サンプルの遺伝子をもとに行った。免疫細胞集団の解析は、ＡＣ患者（ｎ＝５０８）およびＳＣＣ患者（ｎ＝４９５）から採取した腫瘍サンプルを用いて、Ｂｅｃｈｔら（２０１６）により紹介されているトランスクリプトームをベースとするコンピュータを用いた微小環境細胞集団計数（ＭＣＰ−ｃｏｕｎｔｅｒ）法により行った。
【００７７】
統計解析
データ解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ  ６（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を用いて行い、対応のある両側ｔ検定または対応のないノンパラメトリック検定法であるマン−ホイットニー検定を適用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１または＊＊＊ｐ＜０．００１の場合、統計学的に有意であると判断した。データは平均±ＳＥＭで表記した。
【００７８】
実施例８：Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の浸潤は、ＡＣ腫瘍とＳＣＣ腫瘍で同程度であるが、骨髄性ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲｈｉ）の数は、ＳＣＣ腫瘍では有意に少ない
免疫細胞の浸潤は、ＮＳＣＬＣ腫瘍と隣接する非腫瘍組織では、前者でより高度に見られる。ＮＳＣＬＣの腺癌（ＡＣ）患者と扁平上皮癌（ＳＣＣ）患者の組織学的に異なる腫瘍間でＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および樹状細胞の浸潤に差異があるか否かを調べた。ネオアジュバント療法後手術を受けたＮＳＣＬＣのＡＣ患者４２名およびＳＣＣ患者３９名（表２）から得られた腫瘍および非腫瘍組織から単一細胞に分離された細胞の懸濁液を調製し、フローサイトメトリーで解析した。細胞の生存率は、腫瘍組織より非腫瘍組織の方が高いものの、腫瘍細胞の生存率は、平均で約８５％であった（図１Ａ上段パネル参照）。腫瘍内では、非腫瘍組織と比べて、特にメモリー型のＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞ならびにＤＣの高度な浸潤が確認された（表３参照）。これらの免疫細胞集団の浸潤率は、ＡＣとＳＣＣの腫瘍で統計学的な差は見られなかった。
【００７９】
【表３】
2019517537.tif 000004
【００８０】
実施例９：ＮＳＣＬＣのＳＣＣ患者の腫瘍内のＴ細胞およびＮＫ細胞は、ＮＳＣＬＣのＡＣ患者と比べて、その機能が抑制されている
腫瘍内に浸潤した免疫細胞の表現型解析では、免疫細胞の浸潤の程度を示す定量的な評価しか行えないことから、腫瘍または非腫瘍組織の細胞懸濁液をＰＭＡおよびイオノマイシンで１時間刺激した後、ブレフェルジンＡを加えてさらに３時間インキュベートした。次いで、ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生量を、フローサイトメトリーにより測定した。ゲーティング方法を図８Ａに示す。非特異的な刺激を加えた後の腫瘍および非腫瘍組織のＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生能は、ＡＣ患者とＳＣＣ患者のＴ細胞で同程度であった（表４参照）。しかし、ＳＣＣ腫瘍のＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生能は、隣接する健康な組織のＴ細胞より低かった。このことより、ＳＣＣ腫瘍のＴ細胞は、ＡＣ腫瘍のＴ細胞より、ＩＦＮ−γを介するエフェクター機能が抑制されていることが示唆される（表４参照）。なお、刺激していない組織のＴ細胞で確認したところ、デフォルトのＩＦＮ−γ産生は見られなかった。
【００８１】
【表４】
2019517537.tif 000005
【００８２】
さらに、２４時間刺激した組織におけるサイトカイン産生量（図８Ｂ参照）を、Ｌｕｍｉｎｅｘで調べた。ＡＣ腫瘍におけるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−２３、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの産生量は、隣接する非腫瘍組織より有意に高かった。これは、ＡＣ腫瘍組織のリンパ球（図１Ｂ参照）含量および上皮細胞（図１Ａの下段パネルおよび表５参照）含量が非腫瘍組織より高いことによるものと考えられる。しかし、ＳＣＣ腫瘍では、これらのサイトカイン（その多くが炎症促進性免疫サイトカインである）の産生量は非腫瘍組織と同程度であった。このことは、白血球の浸潤および腫瘍内の上皮細胞数がＳＣＣとＡＣとで同程度であることから、ＳＣＣ腫瘍では刺激後の炎症促進性サイトカインの産生がＡＣ腫瘍より抑制されていることを示唆している。刺激していない組織では、サイトカイン産生は見られなかった（図８Ｂ参照）。
【００８３】
【表５】
2019517537.tif 000006
【００８４】
ＰＭＡおよびイオノマイシンは免疫細胞に対して非特異的に作用する強力な刺激物質であることから、主にＮＫ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化するＩＬ−１５を用いて、抗腫瘍免疫で主要な役割を担うこれらの細胞を活性化した。腫瘍細胞の懸濁液を、そのまま、あるいはＩＬ−１５とともに７日間インキュベートした。０日目、３日目および７日目に、Ｋｉ６７染色によるフローサイトメトリー解析を行い、ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖を調べた。インキュベーション３日目のＡＣ腫瘍では、Ｔ細胞の６８％およびＮＫ細胞の７９％が増殖中であったのに対して、ＳＣＣ腫瘍で増殖中のＴ細胞およびＮＫ細胞は、それぞれ２３％および８％に過ぎなかった。このことより、ＳＣＣ腫瘍ではＡＣ腫瘍より強い免疫抑制環境が形成されていることが確認された（表６参照）。
【００８５】
【表６】
2019517537.tif 000007
【００８６】
ＴＣＧＡデータベース（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ、米国国立がん研究所および米国国立ヒトゲノム研究所、ｈｔｔｐｓ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ、表７参照）をもとに免疫遺伝子の発現を解析したところ、抗腫瘍関連の免疫遺伝子が、ＡＣにおいてＳＣＣより高発現していることが分かった。このことは、ＳＣＣでＡＣより強い免疫抑制微小環境が形成されていることを裏付けるものである。興味深いことに、発現している抗原数はＡＣよりＳＣＣの方が多い。
【００８７】
【表７】
2019517537.tif 000008
【００８８】
実施例１０：制御性Ｔ細胞はＡＣ腫瘍でＳＣＣ腫瘍より高度な浸潤が見られるが、骨髄由来抑制細胞はＳＣＣ腫瘍でより高度な浸潤が見られる
ＡＣ患者とＳＣＣ患者とでは免疫抑制性の腫瘍微小環境が異なることから、２種類の主要な免疫抑制性細胞集団であるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ１２７ｌｏｗ  ＴｒｅｇとＭＤＳＣ、ここでは特にＰＭＮ−ＭＤＳＣおよびＭ−ＭＤＳＣの解析を行った。新鮮な組織サンプルを用いて、フローサイトメトリー解析を行った。ゲーティング方法を図９に示す。このゲーティング方法と、ＭＤＳＣの染色に用いた抗体は、Ｗａｌｔｅｒら（２０１２）およびＢｒｏｎｔｅら（２０１６）で使用されているものと同じである。ＮＳＣＬＣの２つの組織学的サブタイプのいずれにおいても、Ｔｒｅｇ集団、ＭＤＳＣ集団ともに非腫瘍組織より腫瘍内で多く検出された（表８参照）。しかし、Ｔｒｅｇは、ＳＣＣ腫瘍よりＡＣ腫瘍で高度な浸潤が見られた（表８参照）。一方、ＰＭＮ−ＭＤＳＣおよびＭ−ＭＤＳＣは、ＡＣ腫瘍よりＳＣＣ腫瘍で多く検出された（表８参照）。表現型マーカーだけではＭＤＳＣを定義することができず、また、腫瘍内のＭＤＳＣを用いて抑制試験を行うことは技術的に難しいことから、Ｂｒｏｎｔｅら（２０１６）に記載の、ＭＤＳＣを特徴付ける遺伝子の発現解析を行った（表７参照）。ＴＣＧＡデータベースをもとにＴｒｅｇおよび／またはＴ細胞の機能に関する遺伝子の発現も、ＡＣ患者（ｎ＝５０８）およびＳＣＣ患者（ｎ＝４９５）で調べた。表７から、ＳＣＣ腫瘍ではＭＤＳＣに関連するほとんどの遺伝子が高発現しており、ＡＣ腫瘍では、特にＴｒｅｇ／Ｔ細胞に関連する遺伝子が高発現していることが分かる。この結果は、表現型の観察結果を裏付けるものである。
【００８９】
【表８】
2019517537.tif 000009
【００９０】
実施例１１：ＴｒｅｇはＳＣＣ患者よりＡＣ患者の血液中に多く含まれているが、ＭＤＳＣ数はＳＣＣ患者の血液中の方が多い
ＴｒｅｇはＳＣＣ腫瘍よりＡＣ腫瘍で高度な浸潤が見られ、ＭＤＳＣはＳＣＣ腫瘍でより高度な浸潤が見られたことから、ＮＳＣＬＣ患者の血液中に存在するこれらの細胞の分析も行った。ＮＳＣＬＣ患者および悪性疾患の病歴を持たない同年齢ドナーから単離したＰＢＭＣにおける免疫抑制性の集団を、フローサイトメトリーにより定量した（表２および図５Ａを参照）。また、ＰＢＭＣの機能も抑制試験により調べた（図１１参照）。ゲーティング方法を図１０Ａに示す。凍結したＰＢＭＣ（図５Ａおよび表９を参照）および単離したばかりのＰＢＭＣ（表１０参照）に含まれるＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ１２７ｌｏｗ）、ＰＭＮ−ＭＤＳＣ（ＣＤ１４−ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ＋）およびＭ−ＭＤＳＣ（ＣＤ１５−ＣＤ１４＋ＣＤ３３ｈｉＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏｗ）の分析を行った。Ｔｒｅｇは、ＳＣＣ患者および同年齢対照者よりもＡＣ患者の血液に多く含まれていた。さらに、Ｔｒｅｇの検出は凍結保存による影響を受けなかった。また、Ｔｒｅｇ抑制試験から、２つの異なる組織学的サブタイプからそれぞれ単離したＴｒｅｇは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖を抑制する能力において同等であることが示された（図１１Ａ参照）。このことは、ＡＣ患者とＳＣＣ患者の血液中のＴｒｅｇは量的な違いのみが存在することを示唆している。興味深いことに、Ｔｒｅｇ数と両方のＭＤＳＣ集団との間で負の相関が見られたのは、ＡＣ患者の血液中のみであった（Ｍ−ＭＤＳＣに関しては図６を参照、ＰＭＮ−ＭＤＳＣに関しては図１０Ｂおよび図１０Ｃを参照）。
【００９１】
【表９】
2019517537.tif 000010
【００９２】
Ｔｒｅｇとは異なり、ＭＤＳＣの数は、いずれのタイプのＭＤＳＣにおいても、凍結保存による影響を受ける。しかし、新鮮なＰＢＭＣサンプルを解析したところ、ＡＣ患者および同年齢対照者よりＳＣＣ患者の血液中にＭ−ＭＤＳＣ細胞が多く含まれていることが分かった（表１０参照）。ＡＣ患者とＳＣＣ患者のＰＭＮ−ＭＤＳＣの数は同程度であり、同年齢対照者より多かった。ＰＭＮ−ＭＤＳＣは、抑制性機能を持たない好中球と識別できないことから、これらの細胞表面のＬＯＸ１の発現解析をフローサイトメトリーを用いて行った（図１１Ｆ参照）。ＬＯＸ−１陽性ＰＭＮ−ＭＤＳＣ数は、ＳＣＣ患者の方がＡＣ患者および健常対照者よりはるかに多かった。さらに、ＰＭＮ−ＭＤＳＣの存在に関連するＬＯＸ−１タンパク質は、ＳＣＣ患者の血漿中の量がＡＣ患者および健常な同年齢対照者より有意に多かった（図１１Ｅ参照）。同様に、ＰＭＮ−ＭＤＳＣで主に発現しているエフェクター分子であるＡＲＧ１の発現量は、ＳＣＣ患者の方が高かった（図５Ｃ）。ＭＤＳＣの免疫抑制作用により、Ｔ細胞中のＣＤ３ζ発現が阻害されることが分かっている。実際、ＡＣ患者または同年齢対照者と比較したところ、ＣＤ３ζ鎖の発現は、ＳＣＣ患者のＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  Ｔ細胞でのみ阻害されていた（図５Ｂおよび図１１Ｄ）。
【００９３】
【表１０】
2019517537.tif 000011
【００９４】
ＳＣＣ患者のＭＤＳＣがＡＣ患者のＭＤＳＣより強い抑制作用を有することを確認するために、ＭＤＳＣの抑制試験を行った（図１１Ａ〜図１１Ｃ参照）。磁気ビーズ法により精製したＭ−ＭＤＳＣ（ＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏｗ）（図１１Ｂ参照）または細胞選別により精製したＭ−ＭＤＳＣ（ＣＤ３３＋ＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏｗ）（図１１Ｃ参照）を、刺激を加えたＣＦＳＥ標識自己Ｔ細胞と混合した。興味深いことに、２つの異なる組織学的サブタイプからそれぞれ単離したＭ−ＭＤＳＣは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖抑制において同等の効果を示した。しかし、刺激を加えたＴ細胞から産生されるＩＬ−２およびＩＦＮ−γの量において、ＡＣ患者のＭ−ＭＤＳＣと比較すると、ＳＣＣ患者のＭ−ＭＤＳＣのみが大幅な減少を示した（図１１Ａおよび図１１Ｂを参照）。これらの結果から、ＳＣＣ患者の血液中のＭ−ＭＤＳＣは、ＡＣ患者の血液中のＭ−ＭＤＳＣより多いだけではなく、Ｔ細胞に対する抑制活性も強いことが示された。
【００９５】
参考文献
AITKEN, A. S., ROY, D. G. & BOURGEOIS-DAIGNEAULT, M. C. 2017. Taking a Stab at Cancer; Oncolytic Virus-Mediated Anti-Cancer Vaccination Strategies. Biomedicines, 5.
BECHT, E., GIRALDO, N. A., LACROIX, L., BUTTARD, B., ELAROUCI, N., PETITPREZ, F., SELVES, J., LAURENT-PUIG, P., SAUTES-FRIDMAN, C., FRIDMAN, W. H. & DE REYNIES, A. 2016. Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression. Genome Biol, 17, 218.
BIOCCA, S., ARCANGELI, T., TAGLIAFERRI, E., TESTA, B., VINDIGNI, G., OTERI, F., GIORGI, A., IACOVELLI, F., NOVELLI, G., DESIDERI, A. & FALCONI, M. 2013. Simulative and experimental investigation on the cleavage site that generates the soluble human LOX-1. Arch Biochem Biophys, 540, 9-18.
BLACK, C. C., TURK, M. J., DRAGNEV, K. & RIGAS, J. R. 2013. Adenocarcinoma contains more immune tolerance regulatory t-cell lymphocytes (versus squamous carcinoma) in non-small-cell lung cancer. Lung, 191, 265-70.
BRONTE, V., BRANDAU, S., CHEN, S. H., COLOMBO, M. P., FREY, A. B., GRETEN, T. F., MANDRUZZATO, S., MURRAY, P. J., OCHOA, A., OSTRAND-ROSENBERG, S., RODRIGUEZ, P. C., SICA, A., UMANSKY, V., VONDERHEIDE, R. H. & GABRILOVICH, D. I. 2016. Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards. Nat Commun, 7, 12150.
CONDAMINE, T., DOMINGUEZ, G. A., YOUN, J. I., KOSSENKOV, A. V., MONY, S., ALICEA-TORRES, K., TCYGANOV, E., HASHIMOTO, A., NEFEDOVA, Y., LIN, C., PARTLOVA, S., GARFALL, A., VOGL, D. T., XU, X., KNIGHT, S. C., MALIETZIS, G., LEE, G. H., ERUSLANOV, E., ALBELDA, S. M., WANG, X., MEHTA, J. L., BEWTRA, M., RUSTGI, A., HOCKSTEIN, N., WITT, R., MASTERS, G., NAM, B., SMIRNOV, D., SEPULVEDA, M. A. & GABRILOVICH, D. I. 2016. Lectin-type oxidized LDL receptor-1 distinguishes population of human polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells in cancer patients. Sci Immunol, 1.
DERMAN, B. A., MILEHAM, K. F., BONOMI, P. D., BATUS, M. & FIDLER, M. J. 2015. Treatment of advanced squamous cell carcinoma of the lung: a review. Transl Lung Cancer Res, 4, 524-32.
DOMAGALA-KULAWIK, J., OSINSKA, I. & HOSER, G. 2014. Mechanisms of immune response regulation in lung cancer. Transl Lung Cancer Res, 3, 15-22.
DRAGHICIU, O., LUBBERS, J., NIJMAN, H. W. & DAEMEN, T. 2015. Myeloid derived suppressor cells-An overview of combat strategies to increase immunotherapy efficacy. Oncoimmunology, 4, e954829.
DUMITRU, C. A., MOSES, K., TRELLAKIS, S., LANG, S. & BRANDAU, S. 2012. Neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: immunophenotyping, cell biology and clinical relevance in human oncology. Cancer Immunol Immunother, 61, 1155-67.
GABRILOVICH, D. I. 2017. Myeloid-Derived Suppressor Cells. Cancer Immunol Res, 5, 3-8.
GABRILOVICH, D. I. & NAGARAJ, S. 2009. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat Rev Immunol, 9, 162-74.
GABRILOVICH, D. I., OSTRAND-ROSENBERG, S. & BRONTE, V. 2012. Coordinated regulation of myeloid cells by tumours. Nat Rev Immunol, 12, 253-68.
HARROP, R. 2013. Cancer vaccines: Identification of biomarkers predictive of clinical efficacy. Human Vaccines & Immunotherapeutics, 9, 800-804.
HOUOT, R., SCHULTZ, L. M., MARABELLE, A. & KOHRT, H. 2015. T-cell-based Immunotherapy: Adoptive Cell Transfer and Checkpoint Inhibition. Cancer Immunol Res, 3, 1115-22.
HUANG, T., LI, J., ZHANG, C., HONG, Q., JIANG, D., YE, M. & DUAN, S. 2016. Distinguishing Lung Adenocarcinoma from Lung Squamous Cell Carcinoma by Two Hypomethylated and Three Hypermethylated Genes: A Meta-Analysis. PLoS ONE, 11, e0149088.
KO, H. J. & KIM, Y. J. 2016. Signal transducer and activator of transcription proteins: regulators of myeloid-derived suppressor cell-mediated immunosuppression in cancer. Arch Pharm Res, 39, 1597-1608.
KOEHN, B. H., APOSTOLOVA, P., HAVERKAMP, J. M., MILLER, J. S., MCCULLAR, V., TOLAR, J., MUNN, D. H., MURPHY, W. J., BRICKEY, W. J., SERODY, J. S., GABRILOVICH, D. I., BRONTE, V., MURRAY, P. J., TING, J. P., ZEISER, R. & BLAZAR, B. R. 2015. GVHD-associated, inflammasome-mediated loss of function in adoptively transferred myeloid-derived suppressor cells. Blood, 126, 1621-8.
LU, J., MITRA, S., WANG, X., KHAIDAKOV, M. & MEHTA, J. L. 2011a. Oxidative stress and lectin-like ox-LDL-receptor LOX-1 in atherogenesis and tumorigenesis. Antioxid Redox Signal, 15, 2301-33.
LU, T., RAMAKRISHNAN, R., ALTIOK, S., YOUN, J. I., CHENG, P., CELIS, E., PISAREV, V., SHERMAN, S., SPORN, M. B. & GABRILOVICH, D. 2011b. Tumor-infiltrating myeloid cells induce tumor cell resistance to cytotoxic T cells in mice. J Clin Invest, 121, 4015-29.
MALEK, E., DE LIMA, M., LETTERIO, J. J., KIM, B. G., FINKE, J. H., DRISCOLL, J. J. & GIRALT, S. A. 2016. Myeloid-derived suppressor cells: The green light for myeloma immune escape. Blood Rev, 30, 341-8.
MARIGO, I., BOSIO, E., SOLITO, S., MESA, C., FERNANDEZ, A., DOLCETTI, L., UGEL, S., SONDA, N., BICCIATO, S., FALISI, E., CALABRESE, F., BASSO, G., ZANOVELLO, P., COZZI, E., MANDRUZZATO, S. & BRONTE, V. 2010. Tumor-induced tolerance and immune suppression depend on the C/EBPbeta transcription factor. Immunity, 32, 790-802.
MCNAMARA, M. A., NAIR, S. K. & HOLL, E. K. 2015. RNA-Based Vaccines in Cancer Immunotherapy. J Immunol Res, 2015, 794528.
MOLON, B., UGEL, S., DEL POZZO, F., SOLDANI, C., ZILIO, S., AVELLA, D., DE PALMA, A., MAURI, P., MONEGAL, A., RESCIGNO, M., SAVINO, B., COLOMBO, P., JONJIC, N., PECANIC, S., LAZZARATO, L., FRUTTERO, R., GASCO, A., BRONTE, V. & VIOLA, A. 2011. Chemokine nitration prevents intratumoral infiltration of antigen-specific T cells. J Exp Med, 208, 1949-62.
NAGARAJ, S., GUPTA, K., PISAREV, V., KINARSKY, L., SHERMAN, S., KANG, L., HERBER, D. L., SCHNECK, J. & GABRILOVICH, D. I. 2007. Altered recognition of antigen is a mechanism of CD8+ T cell tolerance in cancer. Nat Med, 13, 828-35.
RAMAKRISHNAN, R., ASSUDANI, D., NAGARAJ, S., HUNTER, T., CHO, H. I., ANTONIA, S., ALTIOK, S., CELIS, E. & GABRILOVICH, D. I. 2010. Chemotherapy enhances tumor cell susceptibility to CTL-mediated killing during cancer immunotherapy in mice. J Clin Invest, 120, 1111-24.
SCAPINI, P. & CASSATELLA, M. A. 2014. Social networking of human neutrophils within the immune system. Blood, 124, 710-9.
TALMADGE, J. E. & GABRILOVICH, D. I. 2013. History of myeloid-derived suppressor cells. Nat Rev Cancer, 13, 739-52.
TRAVIS, W. D., BRAMBILLA, E., NICHOLSON, A. G., YATABE, Y., AUSTIN, J. H., BEASLEY, M. B., CHIRIEAC, L. R., DACIC, S., DUHIG, E., FLIEDER, D. B., GEISINGER, K., HIRSCH, F. R., ISHIKAWA, Y., KERR, K. M., NOGUCHI, M., PELOSI, G., POWELL, C. A., TSAO, M. S., WISTUBA, I. & PANEL, W. H. O. 2015. The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification. J Thorac Oncol, 10, 1243-60.
TRAVIS, W. D., BRAMBILLA, E., NOGUCHI, M., NICHOLSON, A. G., GEISINGER, K., YATABE, Y., ISHIKAWA, Y., WISTUBA, I., FLIEDER, D. B., FRANKLIN, W., GAZDAR, A., HASLETON, P. S., HENDERSON, D. W., KERR, K. M., PETERSEN, I., ROGGLI, V., THUNNISSEN, E. & TSAO, M. 2013. Diagnosis of Lung Cancer in Small Biopsies and Cytology: Implications of the 2011 International Association for the Study of Lung Cancer/American Thoracic Society/European Respiratory Society Classification. Archives of pathology & laboratory medicine, 137, 668-684.
TURNIS, M. E. & ROONEY, C. M. 2010. Enhancement of dendritic cells as vaccines for cancer. Immunotherapy, 2, 847-62.
UMANSKY, V., BLATTNER, C., GEBHARDT, C. & UTIKAL, J. 2016. The Role of Myeloid-Derived Suppressor Cells (MDSC) in Cancer Progression. Vaccines (Basel), 4.
WALTER, S., WEINSCHENK, T., STENZL, A., ZDROJOWY, R., PLUZANSKA, A., SZCZYLIK, C., STAEHLER, M., BRUGGER, W., DIETRICH, P. Y., MENDRZYK, R., HILF, N., SCHOOR, O., FRITSCHE, J., MAHR, A., MAURER, D., VASS, V., TRAUTWEIN, C., LEWANDROWSKI, P., FLOHR, C., POHLA, H., STANCZAK, J. J., BRONTE, V., MANDRUZZATO, S., BIEDERMANN, T., PAWELEC, G., DERHOVANESSIAN, E., YAMAGISHI, H., MIKI, T., HONGO, F., TAKAHA, N., HIRAKAWA, K., TANAKA, H., STEVANOVIC, S., FRISCH, J., MAYER-MOKLER, A., KIRNER, A., RAMMENSEE, H. G., REINHARDT, C. & SINGH-JASUJA, H. 2012. Multipeptide immune response to cancer vaccine IMA901 after single-dose cyclophosphamide associates with longer patient survival. Nat Med, 18, 1254-61.
WESOLOWSKI, R., MARKOWITZ, J. & CARSON, W. E., 3RD 2013. Myeloid derived suppressor cells - a new therapeutic target in the treatment of cancer. J Immunother Cancer, 1, 10.
XIAO, Y. F., JIE, M. M., LI, B. S., HU, C. J., XIE, R., TANG, B. & YANG, S. M. 2015. Peptide-Based Treatment: A Promising Cancer Therapy. J Immunol Res, 2015, 761820.
YANG, B., JEANG, J., YANG, A., WU, T. C. & HUNG, C. F. 2014. DNA vaccine for cancer immunotherapy. Hum Vaccin Immunother, 10, 3153-64.
WO 2013/004708
WO 2015/097037
【図１Ａ】
2019517537.tif 000012
【図１Ｂ】
2019517537.tif 000013
【図１Ｃ】
2019517537.tif 000014
【図２Ａ】
2019517537.tif 000015
【図２Ｂ】
2019517537.tif 000016
【図２Ｃ】
2019517537.tif 000017
【図３】
2019517537.tif 000018
【図４Ａ】
2019517537.tif 000019
【図４Ｂ】
2019517537.tif 000020
【図５−１】
2019517537.tif 000021
【図５−２】
2019517537.tif 000022
【図６】
2019517537.tif 000023
【図７】
2019517537.tif 000024
【図８Ａ】
2019517537.tif 000025
【図８Ｂ】
2019517537.tif 000026
【図９】
2019517537.tif 000027
【図１０Ａ】
2019517537.tif 000028
【図１０Ｂ】
2019517537.tif 000029
【図１０Ｃ】
2019517537.tif 000030
【図１１Ａ】
2019517537.tif 000031
【図１１Ｂ】
2019517537.tif 000032
【図１１Ｃ】
2019517537.tif 000033
【図１１Ｄ−Ｅ】
2019517537.tif 000034
【図１１Ｆ】
2019517537.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月7日(2019.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）の治療または肺ＳＣＣの進行の遅延に用いるための、樹状細胞療法／樹状細胞ワクチン（ＤＣワクチン）を含む組成物であって、該治療が、該組成物と、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）阻害剤またはＭＤＳＣエフェクター機能阻害剤および任意選択により薬学的に許容される担体を含む第２の組成物とを組み合わせて投与することを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記個体が、
−末梢血単核細胞における単球系ＭＤＳＣ（Ｍ−ＭＤＳＣ）の生細胞の割合が、少なくとも０．０８％、好ましくは少なくとも０．１％であること、
−腫瘍組織内の単球系ＭＤＳＣ（Ｍ−ＭＤＳＣ）の生細胞の割合が、少なくとも０．００５％、好ましくは少なくとも０．００８％であること、
−血清中または血漿中のＬＯＸ−１濃度が、７５ｐｇ／ｍＬより高く、好ましくは１００ｐｇ／ｍＬより高いこと、
−多形核ＭＤＳＣ（ＰＭＮ−ＭＤＳＣ）全体に占める、ＬＯＸ−１を発現するＰＭＮ−ＭＤＳＣの割合が、少なくとも５％、好ましくは１０％であること、
−腫瘍組織内のＰＭＮ−ＭＤＳＣの生細胞の割合が、少なくとも２％、好ましくは少なくとも２．５％であること、
−末梢血単核細胞におけるＴｒｅｇ細胞の生細胞の割合が、１．８％以下、好ましくは１．５％以下であること、
−腫瘍組織内のＴｒｅｇ細胞の生細胞の割合が、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の１０％以下、好ましくはＣＤ４＋  Ｔ細胞の９％以下であること、
−末梢血単核細胞におけるＣＤ４＋Ｔ細胞中のＣＤ３ζの割合が、対照となる健常個体のＣＤ４＋Ｔ細胞に比べて低く、健常個体の０．９倍以下、好ましくは０．８倍以下であること
−末梢血単核細胞におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞中のＣＤ３ζの割合が、対照となる健常個体のＣＤ８＋  Ｔ細胞に比べて低く、健常個体の０．７５倍以下、好ましくは０．６５倍以下であること、ならびに／または
−患者の末梢血単核細胞のアルギナーゼ１の相対的発現量が、対照となる健常個体の末梢血単核細胞に比べて高く、健常個体の２．５倍以上であること
という特徴をさらに有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
個体における非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療またはＮＳＣＬＣの進行の遅延に用いるための、樹状細胞療法／樹状細胞ワクチン（ＤＣワクチン）を含む組成物であって、該治療が、該組成物と、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）阻害剤またはＭＤＳＣエフェクター機能阻害剤および任意選択により薬学的に許容される担体を含む第２の組成物とを組み合わせて投与することを含み、該個体が、ＭＤＳＣの存在に起因する免疫抑制性の腫瘍微小環境を有するという特徴をさらに有することを特徴とする組成物。
【請求項４】
免疫抑制性の腫瘍微小環境を有する前記個体が、
−末梢血単核細胞における単球系ＭＤＳＣ（Ｍ−ＭＤＳＣ）の生細胞の割合が、少なくとも０．０８％、好ましくは少なくとも０．１％であること、
−腫瘍組織内の単球系ＭＤＳＣ（Ｍ−ＭＤＳＣ）の生細胞の割合が、少なくとも０．００５％、好ましくは少なくとも０．００８％であること、
−血清中または血漿中のＬＯＸ−１濃度が、７５ｐｇ／ｍＬより高く、好ましくは１００ｐｇ／ｍＬより高いこと、
−ＰＭＮ−ＭＤＳＣ全体に占める、ＬＯＸ−１を発現するＰＭＮ−ＭＤＳＣの割合が、少なくとも５％、好ましくは１０％であること、
−腫瘍組織内のＰＭＮ−ＭＤＳＣの生細胞の割合が、少なくとも２％、好ましくは少なくとも２．５％であること、
−末梢血単核細胞におけるＴｒｅｇ細胞の生細胞の割合が、１．８％以下、好ましくは１．５％以下であること、
−腫瘍組織内のＴｒｅｇ細胞の生細胞の割合が、ＣＤ４＋細胞の１０％以下、好ましくはＣＤ４＋細胞の９％以下であること、
−末梢血単核細胞におけるＣＤ４＋Ｔ細胞中のＣＤ３ζの割合が、対照となる健常個体のＣＤ４＋Ｔ細胞に比べて低く、健常個体の０．９倍以下、好ましくは０．８倍以下であること
−末梢血単核細胞におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞中のＣＤ３ζの割合が、対照となる健常個体のＣＤ８＋  Ｔ細胞に比べて低く、健常個体の０．７５倍以下、好ましくは０．６５倍以下であること、ならびに／または
−患者の末梢血単核細胞のアルギナーゼ１の相対的発現量が、対照となる健常個体の末梢血単核細胞に比べて高く、健常個体の２．５倍以上であること
という特徴をさらに有する、請求項３の組成物。
【請求項５】
Ｍ−ＭＤＳＣが、ＣＤ１４＋ＣＤ１５−ＣＤ３３ｈｉＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏの表現型を有することを特徴とする、請求項２または４に記載の組成物。
【請求項６】
ＰＭＮ−ＭＤＳＣが、抑制性のＣＤ１４−ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ＋の表現型を有し、好ましくはＬＯＸ−１を発現していることを特徴とする、請求項２、４または５に記載の組成物。
【請求項７】
前記個体が、ＳＣＣ、好ましくは肺ＳＣＣと診断されていることを特徴とする、請求項１、２、５または６に記載の組成物。
【請求項８】
ＤＣワクチンが、腫瘍関連ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡに由来する抗原全体、抗原タンパク質全体、イディオタイプタンパク質、腫瘍溶解物／腫瘍細胞全体、およびウイルスベクターにより送達される抗原全体から選択される抗原材料を用いて調製されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記腫瘍細胞全体が、高水圧で調製されたものであることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ＭＤＳＣ阻害剤が、ＭＤＳＣの分化／成熟を阻止または阻害するか、ＭＤＳＣの遊走を阻止または阻害するか、ＭＤＳＣの枯渇／ＭＤＳＣのアポトーシスを誘導するか、ＭＤＳＣの増殖を阻害するか、ＭＤＳＣのエフェクター機能を阻害することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
ＭＤＳＣの分化／成熟を阻害する物質が、オールトランスレチノイン酸およびクルクミン誘導体から選択されること；ＭＤＳＣの遊走を阻害する物質が、ゾレドロン酸、抗グリカン抗体およびＣＳＦ−１Ｒ阻害物質から選択されること；ＭＤＳＣの枯渇またはアポトーシスを誘導する物質が、チロシンキナーゼ阻害物質から選択され、好ましくはスニチニブ、抗Ｇｒ１抗体、ＩＬ４Ｒαアプタマー、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＤＭＡＧ）または５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）であること；ＭＤＳＣの増殖を阻害する物質が、ベバシズマブ、セレコキシブおよびピモジドから選択されること；ならびにＭＤＳＣエフェクター機能阻害剤が、酸化ストレス誘導物質であり、好ましくはＮ−ヒドロキシル−Ｌ−アルギニン（ＮＯＨＡ）、ニトロアスピリン、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、ＣｐＧオリゴデオキシ−ヌクレオチド、バルドキソロンメチル（ＣＤＤＯ−Ｍｅ）、ウィザフェリンＡまたはＳｔａｔｔｉｃであることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
第２の組成物が、カルボプラチンおよびパクリタキセルを含むか、ペメトレキセドおよびカルボプラチンを含むか、ゲムシタビンおよびシスプラチンを含むか、ペメトレキセドおよびシスプラチンを含むか、ビノレルビンおよびカルボプラチンを含むことを特徴とする、請求項１または３に記載の組成物。
【国際調査報告】
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