(57)【要約】本発明は、固相ペプチド合成（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＳＰＰＳ）によって調製されたペプチドの精製プロセス、及びこのプロセスにおいて使用するための対応するリンカー分子に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式  Ｘ１−Ｌ−Ｘ２（１）の化合物であって、
Ｘ１は：
【化１】
2019508487.tif 000059
、
【化２】
2019508487.tif 000060
、
【化３】
2019508487.tif 000061
から選択され、
−Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立してＨ又はＢから選択され、少なくともＲ１又はＲ２はＢであり；
−Ｒ３はＨ又はＢから選択され；
−ここでＢは、酸不安定性アミン保護基であり；
−Ｒ４はＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル又はアリールから選択され、ここでアルデヒド又はケト基は酸不安定性保護基で保護でき；
Ｌは、Ｘ２によって求核性切断が可能な官能性リンカー化合物から選択され、特にＬは−Ｔ−Ｕ−の形態を有し、ここで：
−ＴはＸ１とＵとの間のスペーサであり、ここでＴは特に、置換又は非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル−、特にＣ１−Ｃ６−アルキル、特にＣ１−Ｃ３−アルキル、−Ｒ５−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ６−、−Ｒ５−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ６−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ６−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ６−、−Ｃ（＝Ｏ）、−Ｒ５−フェニル−Ｒ６−、−Ｒ５−フェニル−、−フェニル−Ｒ６−、−フェニル−から選択され、
−Ｒ５及びＲ６は互いに独立して、置換又は非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、特にＣ１−Ｃ６−アルキル、特にＣ１−Ｃ３アルキルから選択され；
−Ｕは、官能性リンカー化合物の切断活性化部分であり、ここで上記活性化部分は、Ｘ２による塩基性切断時に形成されるアニオンを安定化するよう設計され；
Ｘ２は−Ｙ−Ｚの形態を有し：
−Ｙは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｓ（＝Ｏ）２−から選択され；
−Ｚは電子求引性脱離基である、前記化合物。
【請求項２】
Ｂは、Ｂｏｃ（−Ｃ＝ＯＯｔＢｕ）、トリチル（−Ｃ（Ｐｈ）３）、Ｍｍｔ（−Ｃ（Ｐｈ）２Ｃ６Ｈ４ＯＭｅ）、ＤＭＴ（−Ｃ（Ｐｈ）（Ｃ６Ｈ４ＯＭｅ）２）、Ｃｂｚ（−Ｃ＝ＯＯＣＨ２Ｐｈ）、ベンジリデンアミン（＝ＣＰｈ）、フタルイミド（＝（ＣＯ）２Ｃ６Ｈ４）、ｐ−トルエンスルホンアミド（−ＳＯ２Ｃ６Ｈ４Ｍｅ）、ベンジルアミン（−ＣＨ２Ｐｈ）、アセトアミド（−ＣＯＭｅ）、トリフルオロアセトアミド（−ＣＯＣＦ３）、Ｄｄｅ（１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキス−１−イリデン）−３−エチル）、及び１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキス−１−イリデン）−３−メチルブチル（ｉｖＤｄｅ）から選択され、Ｂは特にＢｏｃであり、及び／又は
アセタール又はケタール保護基は：
【化４】
2019508487.tif 000062
又は
【化５】
2019508487.tif 000063
から選択され、ここでｒは０〜１２、特に０、１又は２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｔは、Ｃ１−Ｃ１２アルキル−、−Ｒ５−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ６−、−Ｒ５−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ６−、−Ｒ５−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ６−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ６−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−から選択され、Ｒ５及びＲ６は互いに独立して、Ｃ１−Ｃ６−アルキル,特にＣ１−Ｃ２アルキルであり、特に
Ｔは、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−Ｃ（＝Ｏ）−、特に−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−から選択される、請求項１又は２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４】
化合物Ｔ−Ｕ−ＹのＵが、式（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）及び（１１）、特に式（５）、（６）、（８）、（９）及び（１０）：
【化６】
2019508487.tif 000064
【化７】
2019508487.tif 000065
【化８】
2019508487.tif 000066
【化９】
2019508487.tif 000067
【化１０】
2019508487.tif 000068
【化１１】
2019508487.tif 000069
【化１２】
2019508487.tif 000070
から選択され、ここでＲ８は、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、
【化１３】
2019508487.tif 000071
又は
【化１４】
2019508487.tif 000072
から、特にＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−から選択され、Ｒ７ｎ、Ｒ９ｍ、Ｒ１０ｐ、Ｒ１１ｑ、Ｒ１３ｒ及びＲ１４ｓは、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、又はＩ及び／又はＭ効果を生成する置換基、特にＣ１−Ｃ３−アルキル、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＮ−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＣＦ３、−ＳＯ３Ｈ、及び−ＣＯ２Ｈであり、
−ｎは０、１、２、３又は４に等しく、特にｎは０又は１、特に０であり、
−ｍは０、１、２又は３に等しく、特にｍは０又は１、特に０であり、
−ｐは０、１、２、３又は４に等しく、特にｐは０又は１、特に０であり、
−ｑは０、１、２又は３に等しく、特にｑは０又は１、特に０であり、
−ｒは０、１、２又は３に等しく、特にｒは０又は１、特に０であり、
−ｓは０、１、２又は３に等しく、特にｓは０又は１、特に０である、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｚは、基−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｎ３、−ＳＲ１２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ２ＣＦ３、−ＯＳＯ２ＣＦ３、−ＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３、−ＳＯ２ＣＦ３、−ＳＯ２ＣＨ３、
【化１５】
2019508487.tif 000073
から選択され、特に−Ｃｌ、
【化１６】
2019508487.tif 000074
又は
【化１７】
2019508487.tif 000075
から、特に
【化１８】
2019508487.tif 000076
又は
【化１９】
2019508487.tif 000077
から選択され、
Ｒ１２はＣ１−Ｃ６−アルキル、アリール、又はベンジル残基である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｘ１は、式（２）又は（３）、特に式（３）の化合物であり、
Ｒ３はＨであり、Ｒ１及びＲ２はＢｏｃ−保護基を有するか、又はＲ１はＨであり、かつＲ２はＢｏｃ−保護基であり、
特にＲ１はＨであり、かつＲ２はＢｏｃ−保護基である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｙは形態−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｔは形態−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−、特に−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−及び−（ＣＨ２）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−、具体的には−（ＣＨ２）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−を有し、Ｕは、式（５）又は（６）：
【化２０】
2019508487.tif 000078
【化２１】
2019508487.tif 000079
の化合物、特に式（6）の化合物であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｔは形態−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−であって、特に−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−を有し、Ｕは式（７）：
【化２２】
2019508487.tif 000080
の化合物であり、Ｒ７は、Ｃ１−Ｃ６−アルキル又はＩ及び／又はＭ効果を発揮する置換基、特にＣ１−Ｃ３−アルキル、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＮ−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＣＦ３、−ＳＯ３Ｈ、及び−ＣＯ２Ｈから選択され、ｎは０、１、２、３、又は４、特に０又は１、特に０に等しい、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｔは形態−ＣＨ２−を有し、Ｕは式（８）：
【化２３】
2019508487.tif 000081
の化合物であり、Ｒ８はＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−であり、ｒは０に等しい、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｔは形態−ＣＨ２−、−（Ｃ＝Ｏ）−、特に−ＣＨ２−を有し、Ｕは式（９）：
【化２４】
2019508487.tif 000082
の化合物であり、ｓは０に等しい、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｔは形態−Ｃ（＝Ｏ）−を有し、Ｕは式（１０）：
【化２５】
2019508487.tif 000083
の化合物であり、ｍは０に等しく、Ｙは形態−ＳＯ２−を有し、ＺはＣｌである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
全長ペプチドのＮ末端アミノ基と固相との間の化合物としての、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
式：Ｘ１−Ｌ−Ｙ−ＰＥＰ（１２）の化合物であって、
Ｘ１、Ｌ及びＹは、独立請求項１及び請求項１の従属請求項によって定義され、
ＰＥＰは、Ｎ末端においてＸ２’と結合した全長ペプチドを含む、化合物。
【請求項１５】
式：Ｄ−Ｘ１’−Ｌ−Ｙ−ＰＥＰ（１３）の化合物であって、
−Ｄは、表面が合成又は天然ポリマーで修飾されていることを特徴とする表面修飾固体支持体、特に修飾された多糖、特にアルデヒド又はヒドラジン修飾された、セファロース／アガロース又はセルロースであり、
−Ｘ１’は形態−ＮＨ−Ｏ−、−ＮＨ−ＮＨ−又は−Ｃ（＝Ｏ）−を有し、
−Ｌ、Ｙ及びＰＥＰは、請求項１２によって定義される、化合物。
【請求項１６】
ペプチド、特に固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）で調製されたペプチドを精製するプロセスであって、
前記プロセスは、以下のステップ：
ｉ．精製対象の全長ペプチドと、少なくとも１つの汚染物質、特に少なくとも１つのアセチル化末端配列との化合物を、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のスカベンジャー化合物と接触させ、続いて反応させて、式（１２）の化合物を形成するステップ；
ｉｉ．酸を添加することによって酸不安定性保護基を切断するステップ；
ｉｉｉ．ｉｉからの組成物を表面修飾固体支持体と接触させ、共有ヒドラゾン又はオキシム結合を前記スカベンジャー化合物と前記固体支持体との間に形成し、式（１３）の化合物を提供するステップ；
ｉｖ．固体支持体から全長ペプチドを切断するステップ
を含む、前記プロセス。
【請求項１７】
前記固体支持体は表面に、官能基アルデヒド、特に−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨＯ、ケトン、ヒドロキシルアミン、特に−ＯＮＨ２、及びヒドラジン、特に−Ｎ２Ｈ３を有する、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記固体支持体からの前記全長ペプチドの切断後又は切断時、前記固体支持体Ｄは、前記スカベンジャー化合物の残基Ｘ１−Ｌから切断され、前記固体支持体は再生される、請求項１６に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相ペプチド合成（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＳＰＰＳ）によって調製されたペプチドの精製プロセス、及びこのプロセスにおいて使用するための対応するリンカー分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
固相ペプチド合成は、公知のペプチド生成プロセスである。ペプチドの合成の他に、その精製も必須のプロセスステップである。
【０００３】
ペプチドの精製に広く使用されている１つの方法は、分取高速液体クロマトグラフィ（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）である。この方法の欠点は、所望の生産量に関するスケーラビリティが不十分であるため、１つの設備では異なる複数の量を生産できず、これにより、対応する複雑なデバイスに関して比較的高いコストが必要となることである。別の欠点は、個々の画分の正確な分析評価に比較的広範な知識が必要となること、及びそれに加えて、動作中に溶媒及びカラム材料（固相）が消費されることである。
【０００４】
従って、ペプチド生産のコストの削減のために、より低コストで失敗しにくい方法が有利である。
【０００５】
特許文献１は、いわゆるリンカーが、一方では合成全長ペプチドのＮ末端と、またもう一方ではチオール基と官能性珪藻土との反応によってチオエーテルと、共有結合する、ペプチドの精製プロセスを記載している。これによって全長ペプチドは不動化され、精製可能となる。続いて全長ペプチドは塩基性条件下に放出される。しかしながらこのプロセスは、例えばアミノ酸システイン又はペニシラミンを含有するもの等のチオール含有ペプチドには不適当である。更に、精製に使用される固相（この場合は珪藻土）は、再使用を意図していないか又は再使用に適していないという欠点がある。
【０００６】
特許文献２は類似のプロセスを提案しており、このプロセスでは、リンカーが、一方では合成全長ペプチドのＮ末端を介して、及びアジド（−Ｎ３）とアルキンとの間の１，３双極子環付加（ヒュスゲン反応）によって、固相（合成親水性ポリマー、例えばＰＥＧＡ）に結合する。このプロセスの欠点は、１，３双極子環付加を実行するために銅又は銅含有化合物が必要となることである。多くのペプチド、特に硫黄を含むもの、即ちメチオニン及び／又はシステインを含有するものは、銅を錯体化し、また同様にアルギニン及びリジンは銅に結合できる。従って銅の除去は困難であり、残留する銅の毒性により、この方法は全てのケースに適用可能なわけではなく、特にペプチド治療薬の精製には適用できない。更に、精製に使用される固相は、再使用を意図していないか又は再使用に適していないという欠点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】欧州特許公報０５５２３６８  Ａ１
【特許文献２】欧州特許公報２５０１７１１  Ｂ１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って本発明の目的は、完全なＨＰＬＣ設備を必要とせず、また硫黄含有又は銅結合ペプチドにも好適な、ペプチドの精製のためのプロセスを提供することである。更に本発明の目的は、精製に使用される固相の再生及び再使用が可能な、ペプチドの精製に好適なプロセスを提供することである。更に本発明の目的は、全長ペプチドのＮ末端アミノ基と固相との間の結合を可能とする、化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様では、上記目的は、一般式Ｘ１−Ｌ−Ｘ２（１）を有する化合物によって達成され、
Ｘ１は：
【化１】
2019508487.tif 000002
【化２】
2019508487.tif 000003
【化３】
2019508487.tif 000004
から選択され、
−Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立してＨ又はＢから選択され、少なくともＲ１又はＲ２はＢであり；
−Ｒ３はＨ又はＢから選択され；
−ここでＢは、酸不安定性アミン保護基であり；
−Ｒ４はＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル又はアリールから選択され、ここでアルデヒド又はケト基は酸不安定性保護基で保護でき；
Ｌは、Ｘ２によって求核性切断が可能な官能性リンカー化合物から選択され、特にＬは−Ｔ−Ｕ−の形態を有し、ここで：
−ＴはＸ１とＵとの間のスペーサであり、ここでＴは特に、置換又は非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル−、特にＣ１−Ｃ６−アルキル、特にＣ１−Ｃ３−アルキル、−Ｒ５−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ６−、−Ｒ５−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ６−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ６−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ６−、−Ｃ（＝Ｏ）、−Ｒ５−フェニル−Ｒ６−、−Ｒ５−フェニル−、−フェニル−Ｒ６−、−フェニル−から選択され、
−Ｒ５及びＲ６は互いに独立して、置換又は非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、特にＣ１−Ｃ６−アルキル、特にＣ１−Ｃ３アルキルから選択され；
−Ｕは、官能性リンカー化合物の切断活性化部分であり、ここで上記活性化部分は、Ｘ２による塩基性切断時に形成されるアニオンを安定化するよう設計され；
Ｘ２は−Ｙ−Ｚの形態を有し：
−Ｙは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｓ（＝Ｏ）２−から選択され；
−Ｚは電子求引性脱離基である。
【００１０】
本発明の文脈では、分子の「切断活性化部分（Ｓｐａｌｔｕｎｇ  ａｋｔｉｖｉｅｒｅｎｄｅｒ  Ｔｅｉｌ）」という用語は、反応性官能基の構造要素を指す。
【００１１】
「反応性官能基（Ｒｅａｋｔｉｖｅ  Ｆｕｎｋｔｉｏｎ）」とは、反応性種を生成するために励起（活性化）できる化合物を指す。これは例えば、触媒又はｐＨ値の変化によって起こり得る。反応性種は、好適な反応物と短時間で共有結合、例えばカルバメート結合を形成できる。反応性官能基は、活性化後に他の官能基、例えばアミン基又はアミド基と特異的に反応する基を含む。
【００１２】
用語「スペーサ（Ａｂｓｔａｎｄｓｈａｌｔｅｒ）」は、それ自体は反応性官能基を含まず、分子の２つの官能基を空間的に隔てる、ある分子内の複数の原子からなる化合物を指す。スペーサは、炭素、リン、硫黄、ケイ素、窒素及び／又は酸素原子からなる、共有結合鎖又は環状構造である。スペーサは、隔てられる官能基間の距離に寄与しない置換基を含有してよい。
【００１３】
用語「グルーピング（Ｇｒｕｐｐｉｅｒｕｎｇ）」は、ある分子内の複数の原子の化合物を指す。これらの原子は典型的には、スペーサ、反応性官能基、又はメソメリー若しくは誘導効果を発揮する分子構造といった、官能性ユニットを形成する。
【００１４】
用語「官能性リンカー化合物（ｆｕｎｋｔｉｏｎｅｌｌｅ  Ｌｉｎｋｅｒｖｅｒｂｉｎｄｕｎｇ）」又は「リンカー化合物（Ｌｉｎｋｅｒｖｅｒｂｉｎｄｕｎｇ）」は、１つの分子内で２つの官能性ユニットが結合した官能基を指す。リンカー化合物は、官能基と共有結合する。
【００１５】
用語「リンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）」、「リンカー分子（Ｌｉｎｋｅｒｍｏｌｅｋｕｌ）」、「リンカー系（Ｌｉｎｋｅｒｓｙｓｔｅｍ）」及び「スカベンジャー化合物（Ｆａｎｇｅｒｖｅｒｂｉｎｄｕｎｇ）」は、２つの他の分子を、上記他の分子それぞれと共有結合を形成することによって結合する分子を指す。上記２つの他の分子の、官能基に対する共有結合は、特定の反応条件下でのみ発生する。特に用語「リンカー」、「リンカー分子」、「リンカー系」及び「スカベンジャー化合物」は、式（１）に従う、あるペプチドのＮ末端と、固体支持体との間の結合を生成できる結合を指す。
【００１６】
用語「置換された（ｓｕｂｓｔｉｔｕｉｅｒｔ）」は、原子又は分子基若しくは化合物を親化合物に付加することを指す。置換基又は化合物は、親分子の１つ以上の利用可能な部位に、保護された又は保護されていない状態で付加できる。置換基又は化合物自体は、置換されていてもされていなくてもよく、また置換基又は化合物自体は、置換又は非置換であり、親分子と直接、又はアルキル、アミド若しくは炭化水素基といった結合基若しくは化合物を介して、結合してよい。置換基又は化合物は例えば、ハロゲン、酸素、窒素、硫黄、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボキシル−（−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ）、アシル−（−Ｃ（Ｏ）Ｒａ）−基、脂肪族、脂環式基、アルコキシ−、アミノ（（−Ｎ（Ｒｂ）（Ｒｃ））、イミノ−（＝ＮＲｂ）、アミド−（−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）（Ｒｃ）又は−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（Ｏ）Ｒａ）基、ヒドラジン誘導体（−Ｃ（ＮＨ）ＮＲａＲｂ）、トリアゾール、テトラゾール（ＣＮ４Ｈ２）、アジド−（−Ｎ３）、ニトロ（−ＮＯ２）、シアノ（−ＣＮ）、イソシアノ（−ＮＣ）、シアナート（−ＯＣＮ）、イソシアナート−（−ＮＣＯ）、チオシアナート−（−ＳＣＮ）；イソチオシアナート−（−ＮＣＳ）；カルバミド−（−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｂ）（Ｒｃ）又は−（Ｒｂ）Ｃ（Ｏ）ＯＲａ）基、チオール（−ＳＲｂ）、スルフィニル−（−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ）、スルホニル−（−Ｓ（Ｏ）２Ｒｂ）、スルホンアミドミル−（−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｂ）（Ｒｃ）又は−Ｎ（Ｒｂ）Ｓ（Ｏ）２Ｒｂ）基、及び例えば−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、−ＳＯＣＦ３又は−ＳＯ２ＣＦ３といったフッ素化化合物を含む。Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは互いに独立して、Ｈ又は他の置換基である。
【００１７】
用語「アルキル（Ａｌｋｙｌ）」は、１２個までの炭素原子を有する飽和直鎖又は分岐炭化水素鎖を指す。好ましいアルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｎ−ヘキシル、オクチル、デシル基である。
【００１８】
用語「アリール（Ａｒｙｌ）」は、環構造を形成するために炭素原子間に二重結合及び単結合を交互に有する炭化水素化合物を指す。
【００１９】
用語「脱離基（Ｆｌｕｃｈｔｇｒｕｐｐｅ）」は、Ｍ及び／又はＩ効果を発揮する分子内の官能基を指し、従って容易に分裂して、脱離基の後に結合電子対を残す。
【００２０】
用語「表面修飾固体支持体（ｏｂｅｒｆｌａｃｈｅｎｍｏｄｉｆｉｚｉｅｒｔｅｒ  ｆｅｓｔｅｒ  Ｔｒａｇｅｒ）」は、例えば多糖、ポリリジン、ポリアリールアミド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はアクリルアミド−ＰＥＧコポリマーといった合成又は天然ポリマーによって修飾された、例えばセファロース、アガロース又はセルロースユニット、シリカゲル又はポリデキストランのような固体構造を指す。固体支持体の表面は、アルデヒド、ケトン、ヒドロキシルアミン又はヒドラジン基を特徴とする。
【００２１】
いくつかの実施形態では、Ｚは、Ｍ及び／又はＩ効果を発揮する電子求引性脱離基であり、異方性結合破壊において結合電子対を同伴する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、Ｚは電子求引性脱離基であり、上記脱離基のアニオンに対応する酸が、５未満のｐｋｓ値を有することを特徴とする。
【００２３】
いくつかの実施形態では、Ｚは電子求引性脱離基であり、上記脱離基のアニオンに対応する酸が、５未満のｐｋｓ値を有することを特徴とし、また上記脱離基は特に、Ｍ及び／又はＩ効果を発揮し、異方性結合破壊において結合電子対を同伴する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、Ｕは、官能性リンカー化合物の切断活性化部分であり、この活性化部分は、Ｍ及びＩ効果によってアニオンを形成できるグルーピングを示し、得られたアニオン性化合物は電子対シフトによって安定化され、この安定化はＵとＸ２との間の異方性結合破壊をもたらす。
【００２５】
いくつかの実施形態では、Ｂは、Ｂｏｃ（−Ｃ＝ＯＯｔＢｕ）、トリチル（−Ｃ（Ｐｈ）３）、Ｍｍｔ（−Ｃ（Ｐｈ）２Ｃ６Ｈ４ＯＭｅ）、ＤＭＴ（−Ｃ（Ｐｈ）（Ｃ６Ｈ４ＯＭｅ）２）、Ｃｂｚ（−Ｃ＝ＯＯＣＨ２Ｐｈ）、ベンジリデンアミン（＝ＣＰｈ）、フタルイミド（＝（ＣＯ）２Ｃ６Ｈ４）、ｐ−トルエンスルホンアミド（−ＳＯ２Ｃ６Ｈ４Ｍｅ）、ベンジルアミン（−ＣＨ２Ｐｈ）、アセトアミド（−ＣＯＭｅ）、トリフルオロアセトアミド（−ＣＯＣＦ３）、Ｄｄｅ（１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキス−１−イリデン）−３−エチル）、及び１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキス−１−イリデン）−３−メチルブチル（ｉｖＤｄｅ）から選択され、Ｂは特にＢｏｃである。
【００２６】
いくつかの実施形態では、アセタール又はケタール保護基は：
【化４】
2019508487.tif 000005
又は
【化５】
2019508487.tif 000006
から選択され、ここでｒは０〜１２、特に０、１又は２である。
【００２７】
本発明の化合物は、他の酸不安定性保護基で形成することもできることは、当業者には公知である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、Ｔは、置換又は非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル−、特にＣ１−Ｃ６−アルキル、特にＣ１−Ｃ３−アルキル、−Ｒ５−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ６−、−Ｒ５−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ６−、−Ｒ５−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ６−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ６−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−から選択され、Ｒ５及びＲ６は互いに独立して、置換又は非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、特にＣ１−Ｃ６−アルキル、特にＣ１−Ｃ３アルキルから選択される。
【００２９】
Ｔが置換アルキルである場合、置換基は特に、水溶性が高めたられた置換基、例えば−ＳＯ３Ｈ、−ＣＯ２Ｈ又は−ＮＯ２である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、Ｔは、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−から選択される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、Ｔは、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−から選択される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、Ｕは、式（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）及び（１１）、特に式（５）、（６）、（８）、（９）及び（１０）：
【化６】
2019508487.tif 000007
【化７】
2019508487.tif 000008
【化８】
2019508487.tif 000009
【化９】
2019508487.tif 000010
【化１０】
2019508487.tif 000011
【化１１】
2019508487.tif 000012
【化１２】
2019508487.tif 000013
から選択された化合物Ｔ−Ｕ−Ｙであり、ここでＲ８は、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、
【化１３】
2019508487.tif 000014
及び
【化１４】
2019508487.tif 000015
から、特にＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−から選択され、Ｒ７ｎ、Ｒ９ｍ、Ｒ１０ｐ、Ｒ１１ｑ、Ｒ１３ｒ及びＲ１４ｓは、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、又はＩ及び／若しくはＭ効果を生成する置換基、特にＣ１−Ｃ３−アルキル、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＮ−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＣＦ３、−ＳＯ３Ｈ、及び−ＣＯ２Ｈであり、
−ｎは０、１、２、３又は４に等しく、特にｎは０又は１、特に０であり、
−ｍは０、１、２又は３に等しく、特にｍは０又は１、特に０であり、
−ｐは０、１、２、３又は４に等しく、特にｐは０又は１、特に０であり、
−ｑは０、１、２又は３に等しく、特にｑは０又は１、特に０であり、
−ｒは０、１、２又は３に等しく、特にｒは０又は１、特に０であり、
−ｓは０、１、２又は３に等しく、特にｓは０又は１、特に０である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、Ｒ７ｎ、Ｒ９ｍ、Ｒ１０ｐ、Ｒ１１ｑ、Ｒ１３ｒ及びＲ１４ｓは、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、又はＩ及び／若しくはＭ効果を生成する置換基、特にＣ１−Ｃ３−アルキル、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＮ−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＣＦ３、−ＳＯ３Ｈ、及び−ＣＯ２Ｈ、特に−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、及び−Ｎ３から選択され、
−ｎは０、１、２、３又は４に等しく、特にｎは０又は１、特に０であり、
−ｍは０、１、２又は３に等しく、特にｍは０又は１、特に０あり、
−ｐは０、１、２、３又は４に等しく、特にｐは０又は１、特に０あり、
−ｑは０、１、２又は３に等しく、特にｑは０又は１、特に０あり、
−ｒは０、１、２又は３に等しく、特にｒは０又は１、特に０あり、
−ｓは０、１、２又は３に等しく、特にｓは０又は１、特に０である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、Ｒ７ｎ、Ｒ９ｍ、Ｒ１０ｐ、Ｒ１１ｑ、Ｒ１３ｒ及びＲ１４ｓは、水溶性が高められた置換基、特に−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ及び−ＣＯ２Ｈから選択される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、Ｚは、基−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｎ３、−ＳＲ１２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ２ＣＦ３、−ＯＳＯ２ＣＦ３、−ＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３、−ＳＯ２ＣＦ３、−ＳＯ２ＣＨ３、
【化１５】
2019508487.tif 000016
から選択され、Ｒ１２はＣ１−Ｃ６−アルキル、アリール、又はベンジル残基である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、Ｚは、−Ｃｌ、
【化１６】
2019508487.tif 000017
、
【化１７】
2019508487.tif 000018
から、特に
【化１８】
2019508487.tif 000019
及び
【化１９】
2019508487.tif 000020
から選択される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、Ｘ１は、式（２）又は（３）の化合物であり、Ｒ３はＨであり、Ｒ１及びＲ２はＢｏｃ−保護基を有するか、又はＲ１はＨであり、かつＲ２はＢｏｃ−保護基である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、Ｘ１は式（３）の化合物であり、Ｒ１及びＲ３はＨであり、Ｒ２はＢｏｃ−保護基である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、Ｙは形態−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−を有する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、Ｔは形態−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−、−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−を有し、Ｕは、式（５）又は（６）：
【化２０】
2019508487.tif 000021
【化２１】
2019508487.tif 000022
の化合物である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、Ｔは、形態−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−又は−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−を有し、Ｕは式（６）の化合物である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、Ｔは形態−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−又は−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−を有し、Ｕは式（６）の化合物である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、Ｔは形態−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−を有し、Ｕは式（６）の化合物である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、Ｔは形態−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−を有し、Ｕは式（７）：
【化２２】
2019508487.tif 000023
の化合物であり、Ｒ７は、Ｃ１−Ｃ６−アルキル又はＩ及び／若しくはＭ効果を発揮する置換基、特にＣ１−Ｃ３−アルキル、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＮ−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＣＦ３、−ＳＯ３Ｈ、及び−ＣＯ２Ｈから選択され、ｎは０、１、２、３、又は４、特に０又は１、特に０に等しい。
【００４５】
いくつかの実施形態では、Ｔは形態ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−を有し、Ｕは式（７）の化合物であり、ｎは０に等しい。
【００４６】
いくつかの実施形態では、Ｔは形態−ＣＨ２−を有し、Ｕは式（８）：
【化２３】
2019508487.tif 000024
の化合物であり、Ｒ８はＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−であり、ｒは０に等しい。
【００４７】
いくつかの実施形態では、Ｔは形態−ＣＨ２−又は−（Ｃ＝Ｏ）−を有し、Ｕは式（９）：
【化２４】
2019508487.tif 000025
の化合物であり、ｓは０に等しい。
【００４８】
いくつかの実施形態では、Ｔは形態−ＣＨ２−を有し、Ｕは式（９）の化合物である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、Ｔは形態−Ｃ（＝Ｏ）−を有し、Ｕは式（１０）：
【化２５】
2019508487.tif 000026
の化合物であり、ｍは０に等しく、Ｙは形態−ＳＯ２−を有し、ＺはＣｌである。
【００５０】
いくつかの実施形態では、式（１）の化合物は、２，２−ジメチルプロパノイルオキシ−［２−［２−［２−（４−ニトロフェノキシ）カルボニルオキシプロピルスルホニル］エチルアミノ］−２−オキソ−エトキシ］アミノ］２，２−ジメチルプロパノエート（式（１４））、［［２−［２−［２−（４−ニトロフェノキシ）カルボニルオキシプロピルスルホニル］エチルアミノ］−２−オキソエトキシ］アミノ］２，２−ジメチルプロパノエート（式（１５））、［２−（４−クロロスルホニル−３−ニトロベンゾイル）ヒドラジノ］２，２−ジメチルプロパノエート（式（１６））、［２，２−ジメチルプロパノイルオキシ−［２−［４−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルオキシメチル］フェノキシ］−２−オキソ−エトキシ］アミノ］２，２−ジメチルプロパノエート（式（１７））、［２−（２，２−ジメチルプロパノイルオキシ）−２−［２−［２−［２−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルオキシプロピルスルホニル］エチルアミノ］−２−オキソ−エチル］ヒドラジノ］２，２−ジメチルプロパノエート（式（１８））、［２−（２，２−ジメチルプロパノイルオキシ）−２−［２−［２−［２−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルオキシエチルスルホニル］エチルアミノ］−２−オキソ−エチル］ヒドラジノ］２，２−ジメチルプロパノエート（式（１９））、［２−［５−アジド−２−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルオキシメチル］ベンゾイル］ヒドラジノ］２，２−ジメチルプロパノエート（式（２０））、［３−［（２，２−ジメチルプロパノイルオキシアミノ）カルバモイル］−４−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルオキシメチル］フェニル］２，６−ビス（２，２−ジメチルプロパノイルオキシアミノ）ヘキサノエート（式（２１））、［２−［２−［２−［２−（４−ニトロフェノキシ）カルボニルオキシプロピルスルホニル］エチルアミノ］−２−オキソ−エチル］ヒドラジノ］２，２−ジメチルプロパノエート（式（２２））、［２−［２−［２−［２−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルオキシ−プロピルスルホニル］エチルアミノ］−２−オキソ−エチル］ヒドラジノ］２，２−ジメチルプロパノエート（式（２３））、［２−［２−［４−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルオキシメチル］フェノキシ］−２−オキソ−エチル］ヒドラジノ］２，２−ジメチルプロパノエート（式（２４））、［２−［２−［２−（４−ニトロフェノキシ）カルボニルオキシエチルスルホニル］エトキシカルボニル］ヒドラジノ］２，２−ジメチルプロパノエート（式（２５））、［３−［［２−（２，２−ジメチルプロパノイルオキシ）ヒドラジノ］メチル］−４−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルオキシメチル］フェニル］２，６−ビス（２，２−ジメチルプロパノイルオキシアミノ）ヘキサノエート（式（２６））、［２−［［５−アジド−２−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルオキシメチル］フェニル］メチル］ヒドラジノ］２，２−ジメチルプロパノエート（式（２７））から選択される：
【化２６】
2019508487.tif 000027
、
【化２７】
2019508487.tif 000028
、
【化２８】
2019508487.tif 000029
、
【化２９】
2019508487.tif 000030
、
【化３０】
2019508487.tif 000031
、
【化３１】
2019508487.tif 000032
、
【化３２】
2019508487.tif 000033
、
【化３３】
2019508487.tif 000034
、
【化３４】
2019508487.tif 000035
、
【化３５】
2019508487.tif 000036
、
【化３６】
2019508487.tif 000037
、
【化３７】
2019508487.tif 000038
、
【化３８】
2019508487.tif 000039
及び
【化３９】
2019508487.tif 000040
【００５１】
いくつかの実施形態では、式（１）の化合物は、式（１４）、（１５）、（１６）、（１７）、（１８）、（１９）、（２０）及び（２１）の化合物から選択される。
【００５２】
いくつかの実施形態では、式（１）の化合物は、式（１６）、（１９）、（２０）及び（２１）の化合物から選択される。
【００５３】
更なる態様では、本発明の目的は、第１の態様による化合物の使用によって達成され、上記化合物は、全長ペプチドのＮ末端アミノ基と固相との間に化合物を形成する。
【００５４】
更なる態様では、本発明の目的は、式（１２）：Ｘ１−Ｌ−Ｙ−ＰＥＰ（１２）の化合物によって達成され、Ｘ１、Ｌ及びＹは第１の態様及びその実施形態によって定義され、ＰＥＰは、Ｎ末端においてＸ２’と結合した全長ペプチドを含む。
【００５５】
更なる態様では、本発明の目的は、式（１３）：Ｄ−Ｘ１’−Ｌ−Ｙ−ＰＥＰ（１３）の化合物によって達成され、Ｄは、表面が合成又は天然ポリマーで修飾されていることを特徴とする表面修飾固体支持体であり、Ｘ１’は形態−ＮＨ−Ｏ−、−ＮＨ−ＮＨ−又は−Ｃ（＝Ｏ）−を有し、Ｌ、Ｙ及びＰＥＰは、第１の態様及びその実施形態によって定義される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、表面修飾固体支持体Ｄは、修飾された多糖を特徴とする。
【００５７】
いくつかの実施形態では、表面修飾固体支持体Ｄは、アルデヒド又はヒドラジンで修飾された、セファロース／アガロース又はセルロースを特徴とする。
【００５８】
更なる態様では、本発明の目的は、ペプチド、特に固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）で調製されたペプチドを精製するプロセスによって達成され、上記プロセスは、以下のステップを含む：
ｉ．精製対象の全長ペプチドと、少なくとも１つの汚染物質、特に少なくとも１つのアセチル化末端配列との化合物を、第１の態様及びその実施形態によって定義されたスカベンジャー化合物と接触させ、続いて反応させて、式（１２）の化合物を形成するステップ；
ｉｉ．酸を添加することによって酸不安定性保護基を切断するステップ；
ｉｉｉ．ｉｉからの組成物を表面修飾固体支持体と接触させ、共有ヒドラゾン又はオキシム結合をスカベンジャー化合物と固体支持体との間に形成し、式（１３）の化合物を提供するステップ；
ｉｖ．固体支持体から全長ペプチドを切断するステップ。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ステップｉは、全長ペプチドと固相（合成樹脂）上の末端配列との混合物を、一般式Ｘ１−Ｌ−Ｘ２の化合物（スカベンジャー分子）と接触させるステップを含み、Ｘｌ、Ｘ２及びＬは上述のように定義され、上記接触させるステップは、化合物Ｘ１−Ｌ−Ｘ２をＸ２において、全長ペプチドの遊離Ｎ末端アミノ基と接触させて反応させ、共有結合を形成するステップをもたらす。固相（合成樹脂）からペプチドを切断するステップは、酸によって実施され、これにより、スカベンジャー分子と共有結合した全長ペプチドと、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）からのペプチドのアセチル化末端配列との混合物が得られる。固相と液相との分離は、例えばろ過によって実施される。非ペプチド不純物は、−７８℃〜０℃のエーテル中での沈殿によって除去される。この場合、好ましくは、最初に装入されたエーテルに酸混合物を添加することによって、全てのペプチド材料を沈殿させ、有機不純物がエーテル中に残る。続いて、例えば遠心分離によって、エーテル溶液をペプチド混合物から分離する。ペプチド混合物が非晶質固体として得られる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ステップｉｉは、ステップｉ）からの非晶質固体を、ｐＨ２〜４、好ましくは２．５〜３．５、特に好ましくは３の、少なくとも部分的に水性の緩衝液中に取り込むステップを含む。上記ｐＨは、酸又は塩基の添加によって好適に調整される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ステップｉｉｉは、ｉｉ）からの混合物を、表面修飾固体支持体（精製樹脂）と接触させて、ヒドラゾン又はオキシム結合の形成によって、スカベンジャー分子によって修飾された（ステップｉ）全長ペプチドを共有結合させるステップを含む。特に有利には、アミン及び／又は酢酸を触媒として添加して、結合反応の動態を改善する。
【００６２】
ヒドラゾン／オキシム結合によって固体支持体に結合していないペプチド末端配列は、有機溶媒、並びに／又は、好ましくは非共有結合ペプチドを溶解するために不安定化物質を添加した、水及び緩衝液で洗浄することによって除去される。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ステップｉｖは、塩基性（求核性）条件下でリンカーＬをＹから切断することによって、全長ペプチドを固相から分離するステップを含み、Ｙは、ＣＯ２又はＳＯ２の形態で放出される。
【００６４】
式（１３）（Ｄ−Ｘ１’−Ｌ−Ｙ−ＰＥＰ）から開始される全長ペプチドの切断において、全長ペプチド（ＰＥＰ）は、ＣＯ２又はＳＯ２（Ｙ’）、並びにＤ−Ｘ１’−Ｌ又はＤ’及びＸ１’−Ｌ’から生じる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、固体支持体はその表面に、官能基アルデヒド、ケトン、ヒドロキシルアミン及びヒドラジンを有する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、固体支持体はその表面に、官能基−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨＯを有する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、固体支持体はその表面に、官能基−ＯＮＨ２又は−Ｎ２Ｈ３を有する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、固相はろ過によって所望の全長ペプチドから分離され；固相（精製樹脂、Ｄ）は、ヒドラジン（Ｈ４Ｎ２）及び／若しくは水酸化アンモニウムＨ４ＮＯＨ及び／若しくはアルデヒド及び／若しくはケトンでの処理、並びに／又は水での洗浄によって再生される。
【００６９】
ペプチドを合成樹脂から切断する（ステップｉ）ために酸を使用し、これは好ましくは、ｐｋｓ値が４未満の有機及び無機酸である。特に好適なのは、フッ素含有酸：トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、フッ化水素酸（ＨＦ）及びトリフルオロメタンスルホン酸からなる群から選択された酸である。また、臭化水素酸（ＨＢｒ）、塩酸（ＨＣｌ）、亜硫酸（Ｈ２ＳＯ３）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、硝酸（ＨＮＯ３）又はメタンスルホン酸も好適である。
【００７０】
ステップｉ）における沈殿のために、沈殿温度において液体形態の有機溶媒が使用され、このような溶媒は当業者に公知である。エーテルの群からの有機溶媒が好ましく、特には、ジエチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルが好ましい。また、沈殿温度において液体形態であるアルカンも使用でき、ｎ−ヘキサン及び／又はｎ−ペンタンが特に好ましい。ステップｉｉ）で使用される好適な少なくとも部分的に水性の緩衝液は当業者に公知であり、即ち、ｐＨ２〜５の緩衝能を有する緩衝液、即ちアニオン：クエン酸塩、リンゴ酸塩、ギ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、ピバリン酸塩及びリン酸塩と、カチオン：ナトリウム、カリウム、アンモニア（ＮＨ４、ＮＭｅ４、ＮＥｔ４、ＮＰｒ４、ＮＢｕ４、ＨＮＣ５Ｈ５）とを組み合わせた緩衝液である。
【００７１】
ｐＨ値を調整するために、有機又は無機酸、好ましくはＨＣｌ、並びに塩基として好ましくはアルカリ及び／又はアルカリ土類水酸化物、特に好ましくはＮａＯＨ及び／又はＫＯＨを使用できる。
【００７２】
ペプチドの可溶性を高めるために、ステップｉｉ）において、系に水混和性有機溶媒を添加することが有利となり得、このような有機溶媒は当業者に公知であり、群：ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ピリジン、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、ホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）から選択できる。
【００７３】
ステップｉｉｉ）での不動化を促進するために、アミン及び／又は酢酸を水溶液に添加できる。ここでアミンは、群：ピリジン、ピペリジン、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、アニリン及びジメチルアミンから選択できる。
【００７４】
ステップｉｉｉ）での表面修飾固体支持体（精製樹脂）としては、合成及び天然ポリマーが好適である。表面修飾は、Ｘ１を用いてヒドラゾン又はオキシムと反応するようなものである。Ｘ１が式（２）又は（３）の化合物である場合、表面修飾はアルデヒド又はケトン基におけるものとなり、これらのアルデヒド又はケトン基は対応するヒドラゾン又はオキシムと反応する。Ｘ１が一般式（４）のアルデヒド又はケトン官能基である場合、表面修飾は、−ＯＮＨ２、又は−Ｎ２Ｈ３を有することになる。固体支持体として好ましいのは、表面修飾された天然又はバイオポリマーであり、特に好ましいのは、表面修飾された多糖である。最も好ましいのは、アルデヒド修飾セファロース／アガロース、及びセルロースの使用であり、ここではＸ１は式（３）の化合物であり、Ｒ１及びＲ３はＨである。
【００７５】
ステップｉｉｉ（精製樹脂に結合した全長ペプチドの洗浄）では、水、水性洗浄剤、又は有機溶媒で洗浄できる。ステップｉｉｉ）の水性洗浄溶液に対する不安定化物質としては：バリウム塩、塩酸グアニジウム、グアニジウムチオシアネート、チオシアネート、過塩素酸塩、ヨウ化物、ブタノール、フェノール、チオ尿素、尿素、又は硫酸アンモニウムが好適である。溶媒は、群：ジクロロメタン（ＤＣＭ）、トリクロロメタン、四塩化炭素、酢酸エチル、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、酢酸、２，２，２−トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ピリジン、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、フェノール、ホルムアミド及びＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）から選択できる。
【００７６】
ステップｉｖでの切断は、水性溶液、又はペプチドを溶解する有機溶媒中の塩基によって行われる。塩基は、群：ＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、アンモニウム（ＮＨ４、ＮＭｅ４、ＮＥｔ４、ＮＰｒ４、ＮＢｕ４、ＨＮＥｔ（ｉＰｒ）２、ＨＮＭｅ３、ＨＮＥｔ３、ＨＮＰｒ３、ＨＮＢｕ３、ＨＮＣ５Ｈ５）水酸化物、ピペリジン、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、メチルヒドラジン及びＯ−メチルヒドロキシルアミンから選択できる。ペプチドを溶解する有機溶媒は、群：ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ピリジン、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール及び１−ブタノールから選択できる。
【００７７】
ステップｉｖ）でのろ過は、好ましくは市販のシリンジ反応器又はフィルタシステムによって実施される。フィルタ孔サイズは１０〜１００μｍとする。
【００７８】
いくつかの実施形態では、固体支持体からの全長ペプチドの切断後又は切断時、固体支持体Ｄは、スカベンジャー化合物の残基Ｘ１−Ｌから切断され、固体支持体は再生される。
【００７９】
本発明による方法のある特定の利点は、ヒドラゾン及びオキシム結合の可逆性にある。
【００８０】
本明細書に記載のプロセスは、ヒドラゾン／オキシム結合の平衡性質、例えばアフィニティクロマトグラフィによって使用できる。不純物を洗い流すか又は洗浄し、塩基不安定性リンカーを切断することによって標的ペプチドを得た後、精製樹脂を再生でき、従って更なる精製のために利用可能となる。アルデヒド又はケト基が精製樹脂の表面に元々存在する場合、アルデヒド又はケトンを溶解した酸性水溶液を用いた洗浄により、アルデヒド又はケトンの官能性が回復する。ヒドラジン又はヒドロキシルアミン誘導体が精製樹脂の表面に元々存在する場合、ヒドラジン又はヒドロキシルアミンを有する酸性水溶液での洗浄により、ヒドラジン又はヒドロキシルアミンの官能性が回復する。アフィニティクロマトグラフィによるタンパク質精製と同一の材料、セファロース／アガロースが使用される。
【００８１】
更に、このプロセスは、地球上で最もありふれた生体材料であり、従って低コストで利用可能である、セルロースに移行できる。
【００８２】
タンパク質は標準的にはアフィニティクロマトグラフィによって精製され、この方法もまた、ＨＰＬＣ精製に比べて極めて安価かつ効率的であり、またスケーラブルである。低圧及び高付加密度により、アフィニティクロマトグラフィは、ＨＰＬＣよりもはるかに大量の合成に好適である。
【００８３】
本発明の第１の態様の副次的態様では、上述の目的は、リンカーとして全長ペプチドのＮ末端アミノ基と固相との間に化合物を形成する化合物によって、達成される。本発明の化合物は、一般式：
Ｘ１−Ｌ−Ｘ２
を有し、ここでＸ１は、
【化４０】
2019508487.tif 000041
から選択され、Ｙ１＝Ｏ、Ｎであり、Ｒ１及びＲ２は同一であっても異なっていてもよく、Ｒ１及びＲ２はＨ又はＢであり、Ｂは、酸性条件下でアミンを提供する、アミノ基のための塩基不安定性ではない保護基である。
【００８４】
ある好ましい実施形態では、Ｂは、群：Ｂｏｃ（−Ｃ＝ＯＯｔＢｕ）、トリチル（−Ｃ（Ｐｈ）３）、Ｍｍｔ（−Ｃ（Ｐｈ）２Ｃ６Ｈ４ＯＭｅ）、ＤＭＴ（−Ｃ（Ｐｈ）（Ｃ６Ｈ４ＯＭｅ）２）、Ｃｂｚ（−Ｃ＝ＯＯＣＨ２Ｐｈ）、ベンジリデンアミン（＝ＣＰｈ）、フタルイミド（＝（ＣＯ）２Ｃ６Ｈ４）、ｐ−トルエンスルホンアミド（−ＳＯ２Ｃ６Ｈ４Ｍｅ）、ベンジルアミン（−ＣＨ２Ｐｈ）、アセトアミド（−ＣＯＭｅ）、トリフルオロアセトアミド（−ＣＯＣＦ３）、Ｄｄｅ（１−（４，４−ジメチル２，６−ジオキソヘキサ−１−イリデン）−３−エチル）、及び１−（４，４−ジメチル２，６−ジオキソヘキサ−１−イリデン）−３−メチルブチル（ｉｖＤｄｅ）から選択される。
【００８５】
当業者には、Ｐ．  Ｇ．  Ｍ．  Ｗｕｔｓ，  Ｔ．  Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ，  Ｇｒｅｅｎｅ'ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ，  ２００７，  Ｓｅｉｔｅ  ６９６−９２６  から、更なる保護基が公知である。
【００８６】
あるいは、Ｘ１は
【化４１】
2019508487.tif 000042
とすることもでき、Ｒ３＝Ｈであるか、又は長さが１２炭素原子までの、飽和若しくは不飽和、分岐若しくは非分岐、置換若しくは非置換、脂肪族又は芳香族鎖であり、アルデヒド又はケト基は、当業者には公知の方法で保護でき：
【化４２】
2019508487.tif 000043
ｎは０〜１２、特に好ましくは０、１又は２とすることができる。
【００８７】
保護されたアルデヒド又はケトンは、酸性条件下で切断され得る全てのアセタール−ケタール保護基とすることができる。概説を特に：Ｐ．  Ｇ．  Ｍ．  Ｗｕｔｓ，  Ｔ．  Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ，  Ｇｒｅｅｎｅ'ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ，  ２００７，  Ｓｅｉｔｅ  ４３５−４７７に見ることができる。
【００８８】
Ｘ２は
【化４３】
2019508487.tif 000044
とすることができ、Ｚは、異方性結合破壊において結合電子対を同伴する電子求引性脱離基である。ある特定の実施形態では、Ｚは群：Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｊ、Ｎ３、ＳＲ８（Ｒ８はＲ３と同様に定義される）、ＯＣＦ３、ＯＣＨ２ＣＦ３、
【化４４】
2019508487.tif 000045
から選択される。
【００８９】
従ってＸ２は、全長ペプチドのアミノ基とカルバメートを形成することを目的とした、カルバメート前駆体を表す。
【００９０】
Ｌは官能性リンカーであり、これはＸ１及びＸ２を分離し、塩基性条件下で（求核性）切断可能である。求核性切断が可能なリンカーの選択肢については、Ｆ．  Ｇｕｉｌｌｉｅｒ，  Ｄ．  Ｄｒａｉｎ，  Ｍ．  Ｂｒａｄｌｅｙ，  Ｌｉｎｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ２０００，  １００，  ２０９１−２１５７で見ることができる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、一般式Ｘ１−Ｌ−Ｘ２の化合物は、その薬学的に許容可能な塩である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、一般式Ｘ１−Ｌ−Ｘ２の化合物は、リンカーとして使用され、全長ペプチドのＮ末端アミノ基と固相との間に化合物を形成する。
【００９３】
ある好ましい実施形態では、リンカーＬは、一般構造ａ、ｂ又はｃ：
【化４５】
2019508487.tif 000046
から選択され、Ａは、長さが１２炭素原子までの、飽和又は不飽和、分岐又は非分岐、置換又は非置換、脂肪族又は芳香族鎖であり、Ｒ４＝Ｈであり、０〜１２炭素原子のアルキル鎖、又は誘導効果若しくはメソメリーによって電子を求引できる基である。
【００９４】
Ｒ５及びＲ６は同一であっても異なっていてもよく、Ｒ５、Ｒ６＝Ｈ、長さが１〜１２炭素原子のアルキル鎖、又はメソメリー若しくは誘導効果によって電子を求引できる基である。Ｒ７は、Ｈ、長さが１〜１２炭素原子のアルキル鎖、又はメソメリー若しくは誘導効果によって電子を求引できる基である。
【００９５】
Ｒ８はＲ３と同様である。
【００９６】
更なる態様では、本発明の課題は、以下のステップを含むプロセスによって達成される：
ｉ）全長ペプチドと固相（合成樹脂）上の末端配列との混合物を、一般式Ｘ１−Ｌ−Ｘ２の化合物（スカベンジャー分子）と接触させるステップであって、Ｘｌ、Ｘ２及びＬは上述のように定義され、上記接触させるステップは、化合物Ｘ１−Ｌ−Ｘ２をＸ２において、全長ペプチドの遊離Ｎ末端アミノ基と接触させて反応させ、共有結合を形成するステップをもたらす、ステップ；
ｉｉ）酸によって固相（合成樹脂）からペプチドを切断し、スカベンジャー分子と共有結合した全長ペプチドと、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）からのペプチドのアセチル化末端配列との混合物を得るステップ；
ｉｉｉ）例えばろ過によって、固相と液相とを分離するステップ：
ｉｖ）−７８℃〜０℃のエーテル中での沈殿によって非ペプチド不純物を除去するステップ。この場合、好ましくは、最初に装入されたエーテルに酸混合物を添加することによって、全てのペプチド材料を沈殿させ、有機不純物がエーテル中に残る。続いて、例えば遠心分離によって、エーテル溶液をペプチド混合物から分離する。ペプチド混合物が非晶質固体として得られる；
ｖ）ステップｉｖ）からの非晶質固体を、ｐＨ２〜４、好ましくは２．５〜３．５、特に好ましくは３の、少なくとも部分的に水性の緩衝液中に取り込むステップ。上記ｐＨは、酸又は塩基の添加によって好適に調整される；
ｖｉ）ｖ）からの混合物を、表面修飾固体支持体（精製樹脂）と接触させて、ヒドラゾン又はオキシム結合の形成によって、スカベンジャー分子によって修飾された（ステップｉ）全長ペプチドを共有結合させるステップ。特に有利には、アミン及び／又は酢酸を触媒として添加して、結合反応の動態を改善する；
ｖｉｉ）ヒドラゾン／オキシム結合によって固体支持体に結合していないペプチド末端配列を、有機溶媒、並びに／又は、好ましくは非共有結合ペプチドを溶解するために不安定化物質を添加した、水及び緩衝液で洗浄することによって除去するステップ；
ｖｉｉｉ）塩基性（求核性）条件下でリンカーＬを切断することによって、全長ペプチドを固相から分離するステップ；
ｉｘ）固相をろ過によって所望の全長ペプチドから分離するステップ；並びに
ｘ）固相（精製樹脂）を、ヒドラジン（Ｈ４Ｎ２）及び／若しくは水酸化アンモニウムＨ４ＮＯＨ及び／若しくはアルデヒド及び／若しくはケトンでの処理、並びに／又は水での洗浄によって再生するステップ。
【００９７】
ペプチドを合成樹脂から切断する（ステップｉｉ）ために酸を使用し、これは好ましくは、ｐｋｓ値が４未満の有機及び無機酸である。特に好適なのは、フッ素含有酸：トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、フッ化水素酸（ＨＦ）及びトリフルオロメタンスルホン酸からなる群から選択された酸である。また、臭化水素酸（ＨＢｒ）、塩酸（ＨＣｌ）、亜硫酸（Ｈ２ＳＯ３）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、硝酸（ＨＮＯ３）、メタンスルホン酸も好適である。
【００９８】
ステップｉｉｉ）における沈殿のために、沈殿温度において液体形態の有機溶媒が使用され、このような溶媒は当業者に公知である。好ましくは、エーテルの群からの有機溶媒が好ましくは、特には、ジエチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルが好ましい。また、沈殿温度において液体形態であるアルカンも使用でき、ｎ−ヘキサン及び／又はｎ−ペンタンが特に好ましい。
【００９９】
ステップｖ）で使用される好適な少なくとも部分的に水性の緩衝液は当業者に公知であり、即ち、ｐＨ２〜５の緩衝能を有する緩衝液、即ちアニオン：クエン酸塩、リンゴ酸塩、ギ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、ピバリン酸塩及びリン酸塩と、カチオン：ナトリウム、カリウム、アンモニア（ＮＨ４、ＮＭｅ４、ＮＥｔ４、ＮＰｒ４、ＮＢｕ４、ＨＮＣ５Ｈ５）とを組み合わせた緩衝液である。
【０１００】
ｐＨ値を調整するために、有機又は無機酸、好ましくはＨＣｌ、並びに塩基として好ましくはアルカリ及び／又はアルカリ土類水酸化物、特に好ましくは及び／又はＫＯＨを使用できる。
【０１０１】
ペプチドの可溶性を高めるために、ステップｖ）において、系に水混和性有機溶媒を添加することが有利となり得、このような有機溶媒は当業者に公知であり、群：ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ピリジン、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、ホルムアミド、及びＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）から選択できる。
【０１０２】
ステップｖｉ）での不動化を促進するために、アミン及び／又は酢酸を水溶液に添加できる。ここでアミンは、群：ピリジン、ピペリジン、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、アニリン及びジメチルアミンから選択できる。
【０１０３】
ステップｖｉ）での表面修飾固体支持体（精製樹脂）としては、合成及び天然ポリマーが好適である。表面修飾は、Ｘ１を用いてヒドラゾン又はオキシムと反応するようなものである。Ｘ１が：
【化４６】
2019508487.tif 000047
（Ｙ１＝ＮＨ、Ｏ）である場合、表面修飾はアルデヒド又はケトン基におけるものとなり、これらのアルデヒド又はケトン基は対応するヒドラゾン又はオキシムと反応する。Ｘ１が一般式Ｒ３Ｃ＝Ｏのアルデヒド又はケトン官能基である場合、表面修飾は、ＮＨ２−Ｙ１−Ｒ７（Ｒ７＝固体支持体）基を有することになる。固体支持体として好ましいのは、表面修飾された天然又はバイオポリマーであり、特に好ましいのは、表面修飾された多糖である。最も好ましいのは、アルデヒド修飾セファロース／アガロース、及びセルロースの使用であり、Ｘ１＝ＮＨ２−ＮＨ−Ｃ＝ＯＯ−である。
【０１０４】
ステップｖｉ（精製樹脂に結合した全長ペプチドの洗浄）では、水、水性洗浄剤、又は有機溶媒で洗浄できる。ステップｖｉ）の水性洗浄溶液に対する不安定化物質としては：バリウム塩、塩酸グアニジウム、グアニジウムチオシアネート、チオシアネート、過塩素酸塩、ヨウ化物、ブタノール、フェノール、チオ尿素、尿素、硫酸アンモニウムが好適である。溶媒は、群：ジクロロメタン（ＤＣＭ）、トリクロロメタン、四塩化炭素、酢酸エチル、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、酢酸、２，２，２−トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ピリジン、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、フェノール、ホルムアミド及びＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）から選択できる。
【０１０５】
ステップｖｉｉでの分離は、水性溶液、又はペプチドを溶解する有機溶媒中の塩基によって行われる。塩基は、群：ＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、アンモニア（ＮＨ４、ＮＭｅ４、ＮＥｔ４、ＮＰｒ４、ＮＢｕ４、ＨＮＥｔ（ｉＰｒ）２、ＨＮＭｅ３、ＨＮＥｔ３、ＨＮＰｒ３、ＨＮＢｕ３、ＨＮＣ５Ｈ５）水酸化物、ピペリジン、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、メチルヒドラジン及びＯ−メチルヒドロキシルアミンから選択できる。ペプチドを溶解する有機溶媒は、群：ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ピリジン、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール及び１−ブタノールから選択できる。ステップｖｉｉｉ）でのろ過は、好ましくは市販のシリンジ反応器又はフィルタシステムによって実施される。フィルタ孔サイズは１０〜１００μｍとする。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、固相と液相との分離がろ過によって行われることを特徴とする。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、ステップｖｉにおいてアミン及び／又は酢酸を触媒として添加することを特徴とする。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、ステップｖの緩衝液のｐＨ値が２．５〜３．５、好ましくは３であることを特徴とする。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、ステップｖｉｉにおける除去が、有機溶媒を用いて、並びに／又は、好ましくは非共有結合ペプチドを溶解するために不安定化物質を添加した水及び水性緩衝液を用いて、実施されることを特徴とする。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、ステップｖｉｉｉにおける固相からの全長ペプチドの分離が、塩基性（求核性）条件下におけるリンカーＬの切断によって実施されることを特徴とする。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、ステップｉｉにおける合成樹脂からのペプチドの分離が、ｐｋｓ値が４未満の酸を使用することを特徴とする。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、ステップｉｉｉにおける沈殿のために、群：エーテル、特に好ましくはジエチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル又はｎ−ヘキサン及び／又はｎ−ペンタンからの有機溶媒を使用することを特徴とする。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本発明によるプロセスは、ステップｖｉの表面修飾固体支持体（精製樹脂）として、合成及び天然ポリマー、例えば表面修飾された多糖、特に好ましくはアルデヒド修飾セファロース／アガロース、又はセルロース及びＸ１＝ＮＨ２−ＮＨ−Ｃ＝ＯＯ−を使用することを特徴とする。
【０１１４】
本発明による方法のある特定の利点は、ヒドラゾン及びオキシム結合の可逆性にある。
【０１１５】
本明細書に記載のプロセスは、ヒドラゾン／オキシム結合の平衡性質、例えばアフィニティクロマトグラフィによって使用できる。不純物を洗い流すか又は洗浄し、塩基不安定性リンカーを切断することによって標的ペプチドを得た後、精製樹脂を再生でき、従って更なる精製のために利用可能となる。アルデヒド又はケト基が精製樹脂の表面に元々存在する場合、アルデヒド又はケトンを溶解した酸性水溶液を用いた洗浄により、アルデヒド又はケトンの官能性が回復する。ヒドラジン又はヒドロキシルアミン誘導体が精製樹脂の表面に元々存在する場合、ヒドラジン又はヒドロキシルアミンを有する酸性水溶液での洗浄により、ヒドラジン又はヒドロキシルアミンの官能性が回復する。アフィニティクロマトグラフィによるタンパク質精製と同一の材料、セファロース／アガロースが使用される。
【０１１６】
更に、このプロセスは、地球上で最もありふれた生体材料であり、従って低コストで利用可能である、セルロースに移行できる。
【０１１７】
タンパク質は標準的にはアフィニティクロマトグラフィによって精製され、この方法もまた、ＨＰＬＣ精製に比べて極めて安価かつ効率的であり、またスケーラブルである。低圧及び高付加密度により、アフィニティクロマトグラフィは、ＨＰＬＣよりもはるかに大量の合成に好適である。
【０１１８】
これより、本教示の一般性を制限することなく、本発明について、図面を参照し、いくつかの実施例に基づいて説明する。
【０１１９】
一般的な合成スキーム
本発明によるスカベンジャー分子は、一般的な合成スキーム（１）に従って調製できる。このスキームによると、ヒドロキシルアミンとヒドラジンとの間のリンカー分子の求核性左側部分を変化させることができる。リンカーＬの切断可能な部分も同様に変化させることができる。スルホンリンカーとフェノールエステルリンカー系とを区別できる。更に、リンカー系の右側のカルボネート部分は、異なる脱離基を有することができる。これにより、豊富な組み合わせの選択肢が得られる。構成要素Ｌ１及びＬ３は市販されており、Ｌ２はスキーム２に従って調製できる。
【化４７】
2019508487.tif 000048
スキーム１：モジュラー原理によるリンカー合成のための一般的な合成スキーム。ａ）ｉ）ＣＨ２Ｃｌ２、ｉｉ）チオエーテル構成要素の場合、Ｌ１及びＬ２は、ＣＨ２Ｃｌ２中のｍＣＰＢＡによってスルホンに酸化される。ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド、ＤＩＥＡ：ジイソプロピルアミン、ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド、ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン、Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル。
【化４８】
2019508487.tif 000049
スキーム２：リンカー構成要素Ｌ１及びＬ２の合成
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、本発明によるプロセスを明確化するための、上記プロセスの概略図である。ｉ）各結合の後にアセチル化を伴うＳＰＰＳ、ｎ回反復；ｉｉ）分子Ｘ１−Ｌ−Ｘ２の付加、ｉｉｉ）不動化；ｉｖ）洗浄；ｖ）塩基性切断；ｖｉ）ろ過；ｖｉｉ）再生。１：精製樹脂、２：スカベンジャー分子、３：天然ペプチド（所望の産物）、４：末端配列、ｘ＝１〜ｎ、ｎ：全長ペプチド、ｎ−ｘ：末端配列。
【図２】図２は、実施例１からのヒドラゾン結合の可逆性を実証するために、０．５体積％のＮ２Ｈ４を有するペプチド（スキーム３における化合物３）の切断後の上清の測定による、２７８ｎｍにおける吸光度を示す。Ａｂｓ．：ペプチドが装入されたアルデヒド修飾アガロース支持体からの上清の、２７８ｎｍにおける吸光度。ｔ：０．５％ヒドラジン溶液の添加後の時間（分）。ｎ：吸光度に基づいて算出された上清中のペプチドの量（ｎｍｏｌ）。破線：式：ｙ＝０．１４２＊ｘ／（３．１６＋ｘ）、Ｒ２＝９２、ｔ１／２＝３．１６分による、ヒル線形回帰。
【図３】図３は、実施例２からの天然化学ライゲーション（Ｎａｔｉｖｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ：ＮＣＬ）による、本発明によるペプチドの精製の際の個々の相のクロマトグラムを示す。クロマトグラム１は、２４時間後の、ＮＣＬの反応混合物中の所望の産物（Ｐ）を示す。クロマトグラム２は、３０分の不動化の後の上清を示す。クロマトグラム３は、３０分の洗浄及び切断の後の、所望の産物（Ｐ）を示す。Ｐ：所望の産物のピーク。
【図４ＡＢ】図４ＡＢは、実施例４からの固相ペプチド合成後の、本発明によるペプチド７〜１３の精製に関するクロマトグラムを示す。上清によって標識されたクロマトグラムは、本方法によって分離できる不純物を示す。ＦＭ＝本発明によるスカベンジャー分子；（ａ）ペプチド７（Ｔａｕ１）；（ｂ）ペプチド８（Ｔａｕ２）；（ｃ）ペプチド９（ＧＮＲＨ）、（ｄ）ペプチド１０（マガイニン）；（ｅ）ペプチド１１（Ｔｅｒｔｓ７２Ｙ）；（ｆ）ペプチド１２（ビバルルジン）；（ｇ）ペプチド１３（ＴＡＴ）、（ｈ）ペプチド１４（研究用ペプチド）。上側の各図は合成後のペプチドを示し、下側の各図は精製後のペプチドを示す。
【図４ＣＤ】図４ＣＤは、実施例４からの固相ペプチド合成後の、本発明によるペプチド７〜１３の精製に関するクロマトグラムを示す。上清によって標識されたクロマトグラムは、本方法によって分離できる不純物を示す。ＦＭ＝本発明によるスカベンジャー分子；（ａ）ペプチド７（Ｔａｕ１）；（ｂ）ペプチド８（Ｔａｕ２）；（ｃ）ペプチド９（ＧＮＲＨ）、（ｄ）ペプチド１０（マガイニン）；（ｅ）ペプチド１１（Ｔｅｒｔｓ７２Ｙ）；（ｆ）ペプチド１２（ビバルルジン）；（ｇ）ペプチド１３（ＴＡＴ）、（ｈ）ペプチド１４（研究用ペプチド）。上側の各図は合成後のペプチドを示し、下側の各図は精製後のペプチドを示す。
【図４ＥＦ】図４ＥＦは、実施例４からの固相ペプチド合成後の、本発明によるペプチド７〜１３の精製に関するクロマトグラムを示す。上清によって標識されたクロマトグラムは、本方法によって分離できる不純物を示す。ＦＭ＝本発明によるスカベンジャー分子；（ａ）ペプチド７（Ｔａｕ１）；（ｂ）ペプチド８（Ｔａｕ２）；（ｃ）ペプチド９（ＧＮＲＨ）、（ｄ）ペプチド１０（マガイニン）；（ｅ）ペプチド１１（Ｔｅｒｔｓ７２Ｙ）；（ｆ）ペプチド１２（ビバルルジン）；（ｇ）ペプチド１３（ＴＡＴ）、（ｈ）ペプチド１４（研究用ペプチド）。上側の各図は合成後のペプチドを示し、下側の各図は精製後のペプチドを示す。
【図４Ｇ】図４Ｇは、実施例４からの固相ペプチド合成後の、本発明によるペプチド７〜１３の精製に関するクロマトグラムを示す。上清によって標識されたクロマトグラムは、本方法によって分離できる不純物を示す。ＦＭ＝本発明によるスカベンジャー分子；（ａ）ペプチド７（Ｔａｕ１）；（ｂ）ペプチド８（Ｔａｕ２）；（ｃ）ペプチド９（ＧＮＲＨ）、（ｄ）ペプチド１０（マガイニン）；（ｅ）ペプチド１１（Ｔｅｒｔｓ７２Ｙ）；（ｆ）ペプチド１２（ビバルルジン）；（ｇ）ペプチド１３（ＴＡＴ）、（ｈ）ペプチド１４（研究用ペプチド）。上側の各図は合成後のペプチドを示し、下側の各図は精製後のペプチドを示す。
【図４Ｈ】図４Ｈは、実施例４からの固相ペプチド合成後の、本発明によるペプチド７〜１３の精製に関するクロマトグラムを示す。上清によって標識されたクロマトグラムは、本方法によって分離できる不純物を示す。ＦＭ＝本発明によるスカベンジャー分子；（ａ）ペプチド７（Ｔａｕ１）；（ｂ）ペプチド８（Ｔａｕ２）；（ｃ）ペプチド９（ＧＮＲＨ）、（ｄ）ペプチド１０（マガイニン）；（ｅ）ペプチド１１（Ｔｅｒｔｓ７２Ｙ）；（ｆ）ペプチド１２（ビバルルジン）；（ｇ）ペプチド１３（ＴＡＴ）、（ｈ）ペプチド１４（研究用ペプチド）。上側の各図は合成後のペプチドを示し、下側の各図は精製後のペプチドを示す。
【図５】図５は、本発明によるプロセスを明確化するための、上記プロセスの概略図である。図５は、図１の代替的な図示である。
【発明を実施するための形態】
【０１２１】
配列番号１〜１０は、実施例１、２及び４からのペプチドを示す。
【実施例】
【０１２２】
実施例１：ヒドラゾン結合／オキシム結合の可逆性の実証
ヒドラゾン結合を例として、アルデヒド修飾アガロースビーズへのペプチドの可逆的結合を以下に示す；その電子的類似性によって（Ａ．  Ｄｉｒｋｓｅｎ，  Ｐ．  Ｄａｗｓｏｎ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ２００８，  １９，  ２５４３−２５４８も参照のこと）、この結果はオキシム結合に転用可能である。平衡はヒドラジン（Ｎ２Ｈ４）の添加によって制御できることが分かる。
【化４９】
2019508487.tif 000050
スキーム３：ペプチドと精製樹脂との間のヒドラゾン結合の可逆性
ｉ）０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ＝４、０．１Ｍ  ＰｈＮＨ２、３０分；ｉｉ）０．５％Ｎ２Ｈ４、５ｍＭ  ＴＣＥＰ；ペプチド配列（黒地に白文字）には、配列番号１が割り当てられる。
【０１２３】
ペプチド３をコンジュゲーション緩衝液（０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ、０．１Ｍ  ＰｈＮＨ２、ｐＨ＝３）中で３０分間、支持体１上に配置した（スキーム３）。続いてこれを水で洗浄して、上清を除去した。次に０．５体積％のヒドラジン水和物の溶液をビーズに添加して、２７８ｎｍにおける上清（２００μＬ）の吸光度を、（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社のデバイス、ＮＤ−Ｉ０００吸光光度計を用いて）ある時間間隔で測定した。１０分後、ペプチドの８０％を上清中で測定できることが分かった。更に５０分後、ペプチドの８６％を回復できた。非線形回帰により、３分の半減期が決定された。図２は、Ｎ２Ｈ４の添加後の上清の測定による、２７８ｎｍにおける吸光度を示す。
【０１２４】
実施例２：天然化学ライゲーション（ＮＣＬ）によるペプチドの精製
ペプチド材料と有機及び無機不純物との混合物を含有する複雑な系からのペプチドの精製を実施した。
【化５０】
2019508487.tif 000051
スキーム４：天然化学ライゲーションによるペプチドの精製
ｉ）０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３Ｍ  Ｇｄｎ＊ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＴＣＥＰ、５０ｍＭ  ＭｅｓＮａ、１％（ｖ／ｖ）ＰｈＳＨ、ｐＨ＝７、１５時間；ｉｉ）セファロース樹脂、及び２倍の体積の０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃの添加、ｐＨ＝２．５、ｐＨ＝４、３０分；ｉｉｉ）Ｈ２Ｏ、ＥｔＯＨでの洗浄；ｉｖ）Ｎ２Ｈ４、４ｍＭ  ＴＣＥＰ、３０分。ペプチド配列には、配列番号１（黒地に白文字）及び配列番号２（白地の「ＹＥＮＤＲＩＫ」）が割り当てられる。
【０１２５】
精製対象の混合物は、ＮＣＬによって得られた（スキーム４）。この反応は、水性緩衝系で起こり、比較的大きなペプチド及びタンパク質ドメインを合成するために使用される。ＮＣＬの２４時間の反応時間の後、粗混合物が得られ、これは主に、所望のライゲーション産物と、過剰に使用されたチオエステル（Ｈ−ＹＥＮＲＩＫ−ＭＥＳＡ）とを含有していた。これは図３のクロマトグラム（Ｗａｔｅｒｓ社のＵＰＬＣ−ＭＳ、Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  ＰＤＡ／ＱＤａ、Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｃ１８  Ａ  ５μｍ  ２５０／４カラム上）で確認できる。
【０１２６】
ライゲーション緩衝液（０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２０ｍＭ  ＴＣＥＰ、５０ｍＭ  ＭｅｓＮａ、ｐＨ＝７）に、２倍の体積のコンジュゲーション緩衝液に添加した。続いて修飾セファロースビーズを添加し、この２相系を３０分間振盪した。セファロースゲルの上清を、接続された質量分析計において、ＵＰＬＣ−ＭＳを用いて分析した（図３、クロマトグラム２）が、ライゲーション産物に割り当てることができる質量は見出だせなかった。しかしながら、産物の保持時間において吸収信号を見出すことができるため、これにより、ＨＰＬＣを用いて分離できない不純物を除去できていることは明らかである。水並びに多少のエタノール及びアセトニトリルでの洗浄後、水中の０．５体積％のヒドラジン水和物を、ペプチドが装入されたセファロースビーズに添加し、３０分後に上清を分析した結果、クロマトグラム３（図３）が得られた。これは、ペプチド（所望の産物）の、９０％を超える高い純度を示している。
【０１２７】
実施例３：固相ペプチド合成によるペプチド混合物の例示的な精製
本発明による精製の反応スキーム（スキーム５）を以下に示す。
【化５１】
2019508487.tif 000052
スキーム５：固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によるペプチド混合物の本発明による精製
ｉ）各結合の後にアセチル化を伴うＳＰＰＳ、ｎ回反復；ｉｉ）分子２の付加；ｉｉｉ）ＴＦＡによる切断；ｉｖ）ｐＨ３〜４のＰｈ−ＮＨ２の添加による精製樹脂上での不動化；ｖ）水及び緩衝液による洗浄；ｖｉ）塩基５％ＮＨ４ＯＨ；ｖｉｉ）Ｈ２Ｏ／アセトン／ＴＦＡ（４９．５／４９．５／１）の添加による精製樹脂の再生。１：精製樹脂、２：スカベンジャー分子、３：天然ペプチド（所望の産物）、４：末端配列、ｘ＝１〜ｎ、ｎ：全長ペプチド、ｎ−ｘ：末端配列。
【化５２】
2019508487.tif 000053
スキーム６：アガロースビーズの官能化
ｉ）ＮａＯＨ、ＮａＢＨ４、Ｈ２Ｏ、室温、ｏ／ｎ、１８時間；ｉｉ）２０ｍＭ  ＮａＩＯ４、Ｈ２Ｏ、室温、１時間。
【０１２８】
固相合成（ＳＰＰＳ）の後、スカベンジャー分子２（スキーム５）を、最後に結合したアミノ酸に適用する。ここでの重要な条件は、前のステップにおけるアセチル化が完了していることである。その後、全ての末端配列及びスカベンジャー分子修飾全長ペプチドを、樹脂によって切断する。続いて非ペプチド不純物をエーテル沈殿によって除去し、粗ペプチド混合物を、ｐＨ値が３〜４の酢酸緩衝液に溶解し、触媒としての０．１Ｍアニリンに添加する。続いてこの溶液を、官能化セファロースビーズ１に添加する（スキーム５及び６）。この材料は、アフィニティクロマトグラフィのための材料として、タンパク質精製において用途を有する。このセファロースは、ペプチドに容易に浸透できるという利点を有する。セファロースは事前にアルデヒド修飾され（上記のスキームを参照のこと）、セファロースのアルデヒド修飾は：Ｊ．  Ｇｕｉｓａｎ，  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  １９８８，  １０，  Ｓ．３７５から公知である。
【０１２９】
ここでは、ヒドラジド官能基を有するスカベンジャー分子を支持する固体支持体上にペプチドのみが固定されている。理論的にアルデヒドとも反応できるアミンは、使用されるｐＨ値においてプロトン化され、よってアルデヒドに係合するために十分な求核性を有しない。依然としてセファロース内にある末端配列は、水で洗い流すことができる。塩基性溶液、例えば水中のアンモニアでセファロースを処理することにより、スカベンジャー分子が崩壊し、全長ペプチドは溶液中に溶解する。続いてこの溶液を凍結乾燥して、アンモニアを除去できる。そしてペプチドを、純粋な形態で固体として得る。この方法の利点は、迅速な不動化、及び様々なペプチドに対する広範な適用可能性である。
【０１３０】
実施例４：精製樹脂の例示的な再生
スカベンジャー分子２によるペプチド精製（スキーム５）の後、１の元々のアルデヒド官能基は、ヒドラジンによってブロックされたままであり、新たな精製サイクルのための精製樹脂を提供するためには、精製樹脂を再生することによってアルデヒド官能基を回復しなければならない。これは、アルデヒド又はケトンの添加によって平衡をシフトさせることによって達成される。例示的な実現可能性を、以下のように示した。精製樹脂１を３つの等量のアリコート（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）に分割し、２つのアリコート（ＩＩ、ＩＩＩ）を、コンジュゲーション緩衝液中で３０分間、ヒドラジンで処理した。次にこれを水で洗浄し、またアリコートＩＩＩを、水、アセトン及びＴＦＡの混合物（４９．５：４９．５：１）で７回洗浄した。その後、全てのアリコートをコンジュゲーション緩衝液中で１４時間、ＦｍｏｃＮ２Ｈ３で処理して、それぞれ水、ＤＭＦ及び水で５回洗浄した。続いて、ＤＭＦ／ピペリジン（２０％）で２回、それぞれ４分間処理し、得られた上清中のフルオレンピペリジン付加物の、３０１ｎｍでのＵＶ吸収を測定した（Ｈｅｌｌｍａ社の１ｍＬセミミクロ石英キュベット中の、ＢｉｏＲａｄ社のＳｍａｒｔＳｐｅｃ（商標）Ｐｌｕｓ分光光度計）。未処理のアリコートは、２７μｍｏｌ／ｇの装入量を示し、再生していないアリコートＩＩは、１８μｍｏｌ／ｇ（Ｉの６７％）の装入量を有し、再生した樹脂は、２５μｍｏｌ／ｇ（Ｉの９３％）の装入密度を有していた。この実験は、精製樹脂の良好な再生を示している。
【０１３１】
【表１】
2019508487.tif 000054
【０１３２】
実施例５：ペプチド混合物の精製
ペプチドの精製のための本発明によるプロセスを、以下の異なる極性の７つのペプチドに適用した：Ｈ−ＴＬＡＤＥＶＳＡＳＬＡＫ−ＯＨ（配列番号３）（７）；アルツハイマー関連Ｔａｕタンパク質の断片４２７−４３８、Ｈ−ＡＴＬＡＤＥＶＳＡＳＬＡＫ−ＮＨ２（配列番号４）（８）；Ｈ−ＧＩＧＫＦＬＨＳＡＫＫＦＧＫＡＦＶＧＥＩＭＮＳ−ＮＨ２（配列番号６）マガイニン（１０）；Ｈ−ＹＬＦＦＹＲＫＳＶ−ＮＨ２Ｔｅｒｔｓ７２Ｙ（配列番号７）（１１）；Ｈ−ＦＰＲＰＧＧＧＧＮＧＤＦＥＥＩＰＥＥＹＬ−ＮＨ２（配列番号８）ビバリルジン（１２）；Ｈ−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ−ＮＨ２ＴＡＴ（配列番号９）（１３）。
【０１３３】
粗ペプチド混合物をコンジュゲーション緩衝液に溶解し、３０〜６０分にわたってセファロースビーズに適用した後、水及び水性中性溶液（４Ｍ尿素、１Ｍ一般塩）で洗浄して、アセチル化末端配列及び他の不純物を除去した。リンカー２の切断（スキーム７）を、水中の５％のアンモニア溶液を用いて２０分にわたって実施した後、そのまま酢酸で中和し、可溶性を上昇させた。
【０１３４】
ＵＰＬＣ−ＭＳを用いて、個々の相の純度を確認した。精製されていない（スカベンジャー分子ＦＭを有しない）ペプチド及び精製されたペプチド、並びに不純物を含有する上清のクロマトグラムを図４に示す。７では８５％（元は３９％）、８では９３％（元は３９％）、９では８０％（元は２４％）、１０では９０％（元は２３％）、１１では８７％（元は６０％）、１２では９０％（元は４０％）、１３では９５％（元は３７％）のペプチド純度を得ることができた（図４を参照のこと）。
【０１３５】
【表２】
2019508487.tif 000055
【０１３６】
塩基不安定性リンカー２の合成は、以下のスキーム７に従って実施した。
【化５３】
2019508487.tif 000056
スキーム７：塩基不安定性リンカーの合成
ｉ）Ｎ２Ｈ４＊Ｈ２Ｏ；ｉｉ）２．２当量のｐＮＯ２ＰｈＣＯ２Ｃｌ；ｉｉｉ）ｍＣＰＢＡ；ｎ：ペプチド。
【０１３７】
材料及び方法
ペプチドの固相ペプチド合成及び精製
Ｉｎｔａｖｉｓ  ＡＧ社のＭｕｌｔｉＰｅｐＲＳ−ペプチド自動合成装置を用いて、２５μｍｏｌのバッチで自動固相ペプチド合成を実施した。ペプチドアミドの合成は、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒ社のＴｅｎｔａｇｅｌ  Ｒ  ＲＡＭ樹脂（０．２ｍｍｏｌ・ｇ−１）上で実施した。合成の開始前に、樹脂を３ｍｌシリンジ反応器（Ｍｕｌｔｉｓｙｎｔｅｃｈ社のＰＥ反応器）に入れ、ＤＭＥ中で膨潤させた。特段明記されていない限り、当量の表示は、使用される樹脂の初期装入量を指す。
【０１３８】
Ｆｍｏｃ切断：一時的なＦｍｏｃ−保護基の切断のために、樹脂を４００μＬのピペリジン／ＤＭＦ（４：１）で、まず４分間、次に６分間処理し、次に８００μＬのＤＭＦで５回洗浄し、その後、Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体の結合を行った。
【０１３９】
Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体の結合：ＤＭＦ（０．３Ｍ）中の５当量のアミノ酸の溶液を、ＤＭＦ（０．３Ｍ）中の４．５当量のＨＣＴＵ及びＤＭＦ（０．６Ｍ）中の１０当量のＮＭＭを用いて室温で１分間インキュベートし、樹脂に添加した。３０分の反応時間の後、樹脂を８００μＬのＤＭＦで３回洗浄し、末端配列のブロックを継続した。
【０１４０】
末端配列のブロック：樹脂を４００μｌのＡＣ２Ｏ／２，６−ルチジン／ＤＭＦ（５：６：８９）の溶液で５分間、１回処理し、続いてそれぞれ８００μＬのＤＭＦで３回洗浄した。
【０１４１】
スカベンジャー分子の最終ステップ結合：固相ペプチド合成の最終ステップとして、スカベンジャー分子２を所望の標的ペプチドに結合させた。これを、ＤＭＦ（０．３Ｍ）中の５当量のスカベンジャー分子２及びＤＭＦ（０．３Ｍ）中の５当量のオキシム、及びＤＭＦ（０．７Ｍ）中の１２当量のＤＩＰＥＡの溶液と混合した。６０分の反応時間の後、それぞれ８００μＬのＤＭＦで２回洗浄した。
【０１４２】
ポリマー支持体からの放出：樹脂に、９６％のＴＦＡ、２％の水、２％のトリイソプロピルシランの２ｍＬの溶液を添加した。標的配列中のチオール含有アミノ酸（システイン又はメチオニン）の場合、溶液には０．５％エタンジチオール及び０．５％チオアニソールの溶液が添加され、これによりＴＦＡの量は１％減少した。合成樹脂をこの切断混合物と混合し、室温で２時間振盪した。次に切断溶液を回収し、樹脂をそれぞれ１ｍＬのＴＦＡで２回洗浄した。切断溶液を洗浄液と合わせ、５０ｍｌの低温ジエチルエーテル中で沈殿させた。続いてこの懸濁液を遠心分離し、有機上清を廃棄した。
【０１４３】
精製樹脂上での不動化：遠心分離により、粗沈殿物を３ｍｌのコンジュゲーション緩衝液（０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ、０．１Ｍ  アニリン、ｐＨ＝３）中に取り出した。混合物が完全に溶解していない場合にはアセトニトリルを添加した。この溶液を、Ｍｕｌｔｉｓｙｎｔｅｃｈ社の細孔サイズ２５μｍのフィルタ要素ＰＥを備えた、ｂＢｒａｕｎ社の６ｍｌシリンジに入れ、このシリンジにグラム官能化セファロースを入れた。３０〜６０分にわたって不動化を行った。続いて、純度ＭｉｌｌｉＱの脱イオン水で５回、４Ｍ尿素溶液で５回、水で５回洗浄した。その後、所望のペプチドを、水中の５体積％のＮＨ４ＯＨ及び１体積％のメルカプトエタノールを用いて、樹脂から切断した。凍結乾燥により、所望のペプチドが白色のふわふわとした固体として得られた。
【０１４４】
スカベンジャー分子２（スキーム７の化合物２−化合物（２５）に対応）の合成
ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジンカルボキシレート５（スキーム７の化合物５）
ヒドラジン一水和物（８０％、３２．５ｇ、５２０ｍｍｏｌ）に、０℃のイソプロパノール（１００ｍｌ）を、イソプロパノール（５０ｍｌ）中のＢｏｃ２Ｏ（５０．０ｇ、２３０ｍｍｏｌ）の溶液と共に滴下した。添加後、反応混合物は濁り、室温で２時間撹拌し続けた。溶媒を除去し、残渣をジクロロメタンに溶解し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。続いて溶媒を蒸発させ、残渣をヘキサンから再結晶化し、標記の化合物５（２２．８ｇ、７５％）を無色の結晶として得た。Ｓｍｐ３６−３７°Ｃ  Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘａｎ  １：１）０．２０。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．１６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）、３．６７（ｓ，２Ｈ，ＮＨ２）、１．４２（ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ３）３）。１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ１５８．３，７７．２，２８．５。分析データは文献データ（Ａ．  Ｂｒｅｄｉｈｈｉｎ，  Ｕ．  Ｍａｅｏｒｇ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００８，  ６４，  ６７８８−６７９３）と一致する。
【０１４５】
ビス（４−ニトロフェニル）（チオビス（エタン−２，１−ジイル））ビス（カルボネート）６（スキーム７の化合物６）
４０ｍｌの無水ジクロロメタン中の１．８７ｍｌ（２．１２ｇ、１５ｍｍｏｌ）の２，２−チオジエタノールの溶液に、６．７２（３３ｍｍｏｌ）の４−ニトロフェニルクロロホルメートを添加した。続いて氷冷下において、２．６８ｍｌ（３３ｍｍｏｌ）の無水ピリジンを、激しく撹拌しながらゆっくりと滴下した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応溶液に１００ｍｌの飽和塩化アンモニウム水溶液を添加し、１００ｍｌのクロロホルムで３回抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。有機相を合わせ、真空下で蒸発させた。残渣を酢酸エチル中に取り、少量のシクロヘキサンを用いて産物を沈殿させた。ろ過後、５．４３ｇ（１２ｍｍｏｌ、８０％）を白色固体として得た。融点：１３６．５℃、Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ／シクロヘキサン１：１）０．７８。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ８．３０（ｄ，Ｊ＝９．２  Ｈｚ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．５５（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．４２（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．９６（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）。１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）：δ１５５．２２，１５１．９３，１４５．１７，１２５．４１，１２２．５６，６７．８５，２９．６３。
【０１４６】
２−［２−（１−（（ｔｅｒｔ−ブチル）オキシ−カルボニル）オキシ−カルボニル）−ヒドラジル−エチルスルファニル］−エチル４−ニトロフェニルカルボネート７（スキーム７の化合物７）
１．９７ｇ（４．３１ｍｍｏｌ）のビス（４−ニトロフェニル）（チオビス（エタン−２，１−ジイル））ビス（カルボネート）６を、まず２０ｍｌの乾燥ジクロロメタン中に導入し、０℃において１当量（０．５８ｇ、４．３１ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブチルヒドラジンカルボキシレート５と３当量（１．１３ｍｌ、６．６６ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡとを、１時間にわたってゆっくりと滴下した。反応溶液を更に１２時間撹拌した後、水で処理した。産物を１００ｍｌのジクロロメタンで３回抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。有機相を合わせ、真空下で蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ／シクロヘキサン２：１）で精製して、１．０３ｇ（２．３１ｍｍｏｌ、５３％）の透明な油を得た。Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ／シクロヘキサン１：１）０．２０。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｈ）δ８．２８（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．３９（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．６４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）、６．３３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）、４．４４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、４．３３（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．９２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．８４（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、１．４６（ｓ，９Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５５．５２，１５２．５７，１２５．４７，１２１．９６，８２．０９，６８．０６，６５．３４，６４．１８，３１．１０，３０．５９，２８．２７，２７．０３。
【０１４７】
２−［２−（１−（（ｔｅｒｔ−ブチル）オキシ−カルボニル）オキシ−カルボニル）−ヒドラジル−エチルスルホニル］−エチル４−ニトロフェニルカルボネート２（スキーム７の化合物２）
５０ｍｌのジクロロメタン中のチオエーテル７（０．５２ｇ、１．１ｍｍｏｌ）の溶液に、室温において、ｍ−ＣＰＢＡ７７％（４８９ｇ、２．２ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。１２時間の撹拌後、反応混合物に１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液を添加し、有機相を５０ｍｌのジクロロメタンで３回抽出した。合わせた有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒をロータリーエバポレータで除去すると、産物が、０．５２ｍｇ（１．１ｍｏｌ、定量的）の白色非晶質固体として沈殿した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．２９（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．４１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）、６．３６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）、４．７４（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、４．６３（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．５４（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．４５（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、１．４５（ｓ，  ９Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５５．８５，  １５５．８，  １５２．２９，  １４５．７９，  １２５．５６，  １２２．００，  ８２．３２，  ６２．２５，  ５９．４５，  ５４．０１，  ５３．２４，  ２８．２３。
【０１４８】
式（１４）、（１５）、（１７）、（１８）、（１９）の化合物の合成を、一般的な合成スキーム（スキーム１）に示されているモジュラー原理に従って実施した。
【０１４９】
式（１４）の化合物を調製するための合成
Ｎ，Ｎ’−ビス−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−アミノオキシアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＳ２：Ｘ＝Ｏ、Ｒ１＝Ｂｏｃ）
１１ｍｌの酢酸エチル／ジオキサン（１：１）中の市販のＮ，Ｎ’−ビス−Ｂｏｃ−アミノ−オキシ酢酸（１．００ｇ、３．２０ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃において、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．４１ｇ、３．２０ｍｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（０．６７ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を添加した。室温において、上記溶液を３時間撹拌し、この懸濁液をセライトでろ過して、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を真空下で乾燥させて濃縮し、１００ｍｌの酢酸エチルに再び溶解した。これを、５％ＮａＨＣＯ３溶液、飽和ＮａＣｌ溶液及び水（それぞれ１００ｍｌ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空下で蒸発させることによって、１．２４ｇ（３．２０ｍｍｏｌ）の産物を白色固体として得た。収量：１．２４ｇ（定量的）；Ｒｆ（シクロヘキサン／酢酸エチル、１：１）０．５０；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．８６（ｓ，２Ｈ）、２．８５（ｓ，４Ｈ）、１．５３（ｓ，１８Ｈ）。
【０１５０】
Ｎ，Ｎ’−ビス−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−アミノオキシアセチル−１−（（２−アミノエチル）チオ）プロパン−２−オールアミド（ＢＳ３：Ｘ＝Ｏ、Ｒ１＝Ｂｏｃ）
ＢＳ２（Ｘ＝Ｏ、Ｒ１＝Ｂｏｃ、１．００ｇ、２．５５ｍｍｏｌ）を、２５ｍｌのジクロロメタン中において１−（（２−アミノエチル）チオ）プロパン−２−オール（０．３８ｇ、２．５５ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、０．５３ｍｌ、３．０６ｍｍｏｌ）と混合し、一晩撹拌した。これを、５％ＮａＨＣＯ３溶液、飽和ＮａＣｌ溶液及び水（それぞれ１００ｍｌ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空下で蒸発させることによって、１．０４ｇ（２．５５ｍｍｏｌ）の産物を白色固体として得た。収量：１．０４ｇ（定量的）；Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ，９８：２）０．３５；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．９５（ｓ，１Ｈ）、４．４４（ｓ，２Ｈ）、３．９２‐３．８２（ｍ，１Ｈ）、３．５３（ｑｄ，Ｊ＝６．７，１．５Ｈｚ，２Ｈ）、２．８３‐２．６５（ｍ，４Ｈ）、２．４９（ｄｄ，Ｊ＝１３．７，８．７Ｈｚ，１Ｈ）、１．５５（ｓ，１８Ｈ）、１．２５（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６７．９４，  １５０．５７，  ８５．４１，  ６５．９８，  ４１．８６，  ３８．８１，  ３２．２１，  ２８．１９，  ２２．２３。
【０１５１】
２，２−ジメチルプロパノイルオキシ−［２−［２−［２−（４−ニトロフェノキシ）カルボニルオキシプロピルチオニル］エチルアミノ］−２−オキソ−エトキシ］アミノ］２，２−ジメチルプロパノエートＰ’（Ｘ＝Ｏ、Ｒ１＝Ｂｏｃ、Ｒ２＝ＯＣ６Ｈ４ｐＮＯ２）
ビス（４−ニトロフェニル）カルボネート（１．０１ｇ、４．９５ｍｍｏｌ）を、５ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＢＳ３（Ｘ＝Ｏ、Ｒ１＝Ｂｏｃ）（１．５２ｇ、３．３０ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。次に、氷冷下において乾燥ピリジン（０．４０ｍｌ、４．９５ｍｍｏｌ）を滴下した。反応溶液を１８時間にわたって撹拌した。沈殿物をろ過し、５０ｍｌのＤＣＭで洗浄した。ろ液を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（５０ｍｌ）で洗浄し、水相を５０ｍｌのＣＨＣｌ３で抽出した。ＭｇＳＯ４での乾燥後、合わせた有機相をロータリーエバポレータで蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィ（シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ、２：１）で精製した。収量：１．２７ｇ（６７％）；Ｒｆ（シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ，１：１）０．４４；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．２７（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ）、７．８９（ｓ，１Ｈ）、７．３９（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ）、５．００（ｄｄ，Ｊ＝１２．５，６．３Ｈｚ，１Ｈ）、４．４３（ｓ，２Ｈ）、３．５３（ｄｄ，Ｊ＝１３．３，６．５Ｈｚ，１Ｈ）、２．８６‐２．６９（ｍ，２Ｈ）、１．５３（ｓ，１８Ｈ）、１．４７（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）。
【０１５２】
２，２−ジメチルプロパノイルオキシ−［２−［２−［２−（４−ニトロフェノキシ）カルボニルオキシプロピルスルホニル］エチルアミノ］−２−オキソ−エトキシ］アミノ］２，２−ジメチルプロパノエート（式（１４））
２１ｍｌのジクロロメタン中のＰ’（Ｘ＝Ｏ、Ｒ１＝Ｂｏｃ、Ｒ２＝ＯＣ６Ｈ４ｐＮＯ２）（１．２７ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）の溶液に、室温においてｍ−ＣＰＢＡ（０．９６ｇ、４．３０ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。１２時間の撹拌後、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１５ｍｌ）で２回洗浄し、有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させた後、真空下で濃縮した。スルホンが白色固体として得られた。収量：１．２６ｇ（９７％）；Ｒｆ（シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ，１：１）０．２９；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．２８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）、８．１５（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．４１（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）、５．４８‐５．３９（ｍ，  １Ｈ）、４．４４（ｓ，１Ｈ）、３．８３（ｄｄ，Ｊ＝６．２，４．２Ｈｚ，１Ｈ）、３．５６（ｄｄ，Ｊ＝１４．９，８．３Ｈｚ，１Ｈ）、３．３７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ）、３．２７（ｄｄ，Ｊ＝１４．９，３．９Ｈｚ，１Ｈ）、１．５７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）、１．５４（ｓ，７Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６８．５８，  １５５．４２，  １５１．５８，  １５０．５２，  １４５．６７，  １２５．４６，  １２２．０４，  ８５．６０，  ７７．１６，  ７６．６２，  ７０．６３，  ５８．１９，  ５３．６７，  ３３．０７，  ２８．１６，  ２０．２１；ＥＳＩ−ＭＳ：（計算値ＭＮａ＋：６２８．１６ｇ／ｍｏｌ，実測値：６２８．１７ｍ／ｚ）。
【０１５３】
式（１８）の化合物を調製するための合成
（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）グリシン（ＢＳ１Ｘ＝ＮＨ、Ｒ１＝Ｈ）
ＮａＯＨ（０．７０ｇ、１７．４ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ−ヒドラジン（１．１７ｇ、８．７ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１０ｍｌ）に、０℃においてＢｒｏｍ酢酸（１．４８ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を５時間還流した。続いてＭｅＯＨを除去し、５０ｍｌの水を添加した。水相を酢酸エチル（５０ｍｌ）で３回抽出した。続いて水相をクエン酸でｐＨ２とし、５０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。収量：０．８５ｇ（５１％）白色固体；Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ，８：２）０．１５。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ８．５５（ｓ，２Ｈ）、８．１７（ｓ，２Ｈ）、３．４０（ｓ，２Ｈ）、１．３７（ｓ，９Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ：（計算値ＭＨ＋：１９１．１０  ｇ／ｍｏｌ，実測値：１９１．３３ｍ／ｚ）。
【０１５４】
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）グリシン（ＢＳ１Ｘ＝ＮＢｏｃ、Ｒ１＝Ｈ）
１０４ｍｌのジオキサン／Ｈ２Ｏ（１：１）中の（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）グリシン（５．００ｇ、２６．０ｍｍｏｌ）及びＮａＯＨ（１．５７ｇ、３９．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、固体のＢｏｃ２Ｏ（５．７４ｇ、２６．０３ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を室温で１８時間にわたって一晩撹拌した後、減圧下でジオキサンを除去した。水性残渣を１００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３溶液で処理し、１００ｍｌのＥｔ２Ｏで２回洗浄した。水相をクエン酸でｐＨ２にした。白色懸濁液を１５０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した。ＭｇＳＯ４での乾燥後、溶媒を除去することで、白色固体を得た。収量：７．５６ｇ（定量的）；Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ，９：１）０．７５；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１２．３４（ｓ，１Ｈ）、９．２４（ｓ，１Ｈ）、３．５６（ｓ，２Ｈ）、１．４６‐１．３２（ｍ，１８Ｈ）。
【０１５５】
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）グリシニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＢＳ２Ｘ＝ＮＢｏｃ、Ｒ１＝Ｈ）
１５ｍｌの酢酸エチル／ジオキサン（１：１）中のＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）グリシン（１．３６ｇ、４．４５ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃において、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．５２ｇ、４．４５ｍｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、０．９３ｇ、４．４５ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を室温において１５時間にわたって撹拌した。続いて、懸濁液をセライトでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を真空下で乾燥させて濃縮し、１００ｍｌの酢酸エチルに再び溶解した。これを、５％ＮａＨＣＯ３溶液、飽和ＮａＣｌ溶液及び水（それぞれ１００ｍｌ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空下で蒸発させて、１．２４ｇ（３．２０ｍｍｏｌ）の産物を白色泡状物として得た。収量：１．５１ｇ（８８％）；Ｒｆ  （シクロヘキサン／酢酸エチル，１：１）０．４５；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．６７（ｓ，１Ｈ）、４．１９（ｓ，２Ｈ）、２．８７（ｓ，  ４Ｈ）、１．４９（ｍ，１８Ｈ）。
【０１５６】
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）グリシニル−１−（（２−アミノエチル）チオ）プロパン−２−オールアミド（ＢＳ３：Ｘ＝ＮＢｏｃ、Ｒ１＝Ｈ）
ＢＳ２（Ｘ＝ＮＢｏｃ、Ｒ１＝Ｈ、０．３６ｇ、０．９２ｍｍｏｌ）を、１０ｍｌのジクロロメタン中において１−（（２−アミノエチル）チオ）プロパン−２−オール（０．１３ｇ、０．９２ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．１８ｍｌ、１．０１ｍｍｏｌ）と混合し、一晩撹拌した。これを、５％ＮａＨＣＯ３溶液、飽和ＮａＣｌ溶液及び水（それぞれ１００ｍｌ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空下で蒸発させて、０．２７ｇ（０．６５ｍｍｏｌ）の産物を白色泡状物として得た。収量：０．２７ｇ（定量的）；Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ，９８：２）０．３６；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．３４（ｓ，１Ｈ）、６．６６（ｓ，１Ｈ）、４．０５（ｓ，２Ｈ）、３．９０‐３．８１（ｍ，１Ｈ）、３．４９（ｄｄ，Ｊ＝１０．４，４．０Ｈｚ，２Ｈ）、２．７８‐２．６３（ｍ，３Ｈ）、２．４７（ｄｄ，Ｊ＝１３．７，８．７Ｈｚ，１Ｈ）、１．４９（ｓ，９Ｈ）、１．４６（ｓ，９Ｈ）、１．２３（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ）。
【０１５７】
［２−（２，２−ジメチルプロパノイルオキシ）−２−［２−［２−［２−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルオキシプロピルチオニル］エチルアミノ］−２−オキソ−エチル］ヒドラジノ］２，２−ジメチルプロパノエートＰ’（Ｘ＝Ｏ、Ｒ１＝Ｂｏｃ、Ｒ２＝ＯＮＯ２Ｃ２Ｈ４）
Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカルボネート（０．１９ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を、５ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＢＳ３（Ｘ＝ＮＢｏｃ、Ｒ１＝Ｈ）（０．２５ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。次に、氷冷下において乾燥ピリジン（０．０６ｍｌ、０．７３ｍｍｏｌ）を滴下した。反応溶液を１７時間撹拌した。この溶液に５０ｍｌのＤＣＭを添加した。有機相を１０％クエン酸溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。合わせた有機相をロータリーエバポレータで蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、１９：１）で精製した。収量：１．２７ｇ（６７％）；Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ，９：１）０．６０；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．５３（ｄ，Ｊ＝９５．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．０７（ｓ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．０１（ｓ，２Ｈ）、３．８２（ｄｄｄ，Ｊ＝８．２，６．１，３．９Ｈｚ，１Ｈ）、３．４１（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，４Ｈ）、２．６７（ｄｔ，Ｊ＝１３．２，９．３Ｈｚ，４Ｈ）、２．４６（ｄｄ，Ｊ＝１３．７，８．２Ｈｚ，２Ｈ）、１．４４（ｓ，９Ｈ）、１．４１（ｓ，９Ｈ）、１．１８（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６９．７１，  １６２．４７，  １５４．４３，  ７７．１６，  ６６．０４，  ５０．５３，  ４１．５７，  ３９．１３，  ３２．２２，  ２８．１８，  ２８．１２，  ２５．５７，  ２２．０６，  １８．８８。
【０１５８】
［２−（２，２−ジメチルプロパノイルオキシ）−２−［２−［２−［２−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシカルボニルオキシプロピルスルホニル］エチルアミノ］−２−オキソ−エチル］ヒドラジノ］２，２−ジメチルプロパノエート（式（１８））
５ｍｌのジクロロメタン中のＰ’（Ｘ＝ＮＢｏｃ、Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝ＯＮＯ２Ｃ２Ｈ４）（０．１０ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の溶液を、室温において、ｍ−ＣＰＢＡ（０．８１ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）にゆっくりと添加した。１４時間の撹拌後、反応混合物を、飽和ＮａＣｌ溶液中の５％ＮａＨＣＯ３（それぞれ３３ｍｌ）で３回洗浄し、有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、スルホンを白色非晶質固体として得た。収量：０．０８ｇ（７６％）；Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ，９：１）０．４５１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．４８（ｓ，１Ｈ）、６．９５（ｓ，１Ｈ）、４．３９（ｄｔ，Ｊ＝１５．７，７．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．０６（ｓ，２Ｈ）、３．７３（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，２Ｈ）、３．４８‐３．１７（ｍ，４Ｈ）、３．４１（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ）、３．０２（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ）、２．８５‐２．６８（ｍ，３Ｈ）、１．４６（ｓ，９Ｈ）、１．４３（ｓ，９Ｈ）、１．３０（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７０．１８，  １６７．９９，  １５４．７１，  １３３．３０，  １３１．８６，  １３０．１３，  １２９．８３，  １２８．２０，  ７７．１６，  ６２．８８，  ５３．３７，  ３３．５３，  ２８．２３，  ２８．１６，  ２５．５７，  ２３．２５。ＥＳＩ−ＭＳ：（計算値ＭＮａ＋：６０３．１９ｇ／ｍｏｌ，実測値：６０３．０６ｍ／ｚ）。
【０１５９】
式（１５）の化合物を調製するための合成
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−アミノオキシアセチル−１−（（２−アミノエチル）チオ）プロパン−２−オールアミド（ＢＳ３：Ｘ＝Ｏ、Ｒ１＝Ｈ）
市販の２−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オキシ）酢酸（１．００ｇ、４．７３ｍｍｏｌ）を、乾燥ＣＨ３ＣＮ（４７ｍｌ）中に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．６６ｇ、５．６８ｍｍｏｌ）及びＤＣＣ（１．１８ｇ、５．６８ｍｍｏｌ）を溶液に順次添加し、得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。続いて、３ｍｌの乾燥ＣＨ３ＣＮ中の１−（（２−アミノエチル）チオ）プロパン−２−オール（０．８５ｇ、５．６８ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、得られた反応混合物を室温で１８時間撹拌した。ＣＨ３ＣＮを除去し、５０ｍｌの酢酸エチル中の濃縮物を得た。これを、１０％クエン酸溶液（５０ｍｌ）及び飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した。得られた残渣を、移動相としてのＣＨ２Ｃｌ２中においてＭｅＯＨの段階勾配（１〜８％）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製した。所望の構成要素を、白色の泡状物として得た。収量：０．２６ｇ（１６％）；Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ，  ９：１）０．５０；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，アセトン）δ８．１４（ｓ，１Ｈ）、４．２２（ｓ，２Ｈ）、３．８５（ｔ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ）、３．５３‐３．３８（ｍ，２Ｈ）、２．７２‐２．６６（ｍ，２Ｈ）、２．６２‐２．５８（ｍ，２Ｈ）、１．４６（ｓ，９Ｈ）、１．１９（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，３Ｈ）。
【０１６０】
［２−［２−［２−（４−ニトロフェノキシ）カルボニルオキシプロピルチオニル］エチルアミノ］−２−オキソ−エトキシ］アミノ］２，２−ジメチルプロパノエートＰ’（Ｘ＝Ｏ、Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝ＯＣ６Ｈ４ｐＮＯ２）
ビス（４−ニトロフェニル）カルボネート（０．２７６ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）を、５ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中のＢＳ３（Ｘ＝Ｏ、Ｒ１＝Ｈ）（０．２４ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。次に、氷冷下において乾燥ピリジン（０．０７ｍｌ、０．７５ｍｍｏｌ）を滴下した。反応溶液を１８時間にわたって撹拌した。沈殿物をろ過し、５０ｍｌのＤＣＭで洗浄した。ろ液を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（５０ｍｌ）で洗浄し、水相を５０ｍｌのＣＨＣｌ３で抽出した。ＭｇＳＯ４での乾燥後、合わせた有機相をロータリーエバポレータで蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィ（シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ、２：１）で精製した。収量：０．２７ｇ（９６％）；Ｒｆ（シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ，１：１）０．３４；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．３５（ｓ，１Ｈ）、８．２７（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ）、７．５８（ｓ，１Ｈ）、７．４０（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ）、５．０６‐４．９４（ｍ，１Ｈ）、４．３２（ｓ，２Ｈ）、３．５４（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）、２．８７‐２．７３（ｍ，４Ｈ）、１．４８（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，３Ｈ）、１．４７（ｓ，Ｈｚ，９Ｈ）。
【０１６１】
［２−［２−［２−（４−ニトロフェノキシ）カルボニルオキシプロピルスルホニル］エチルアミノ］−２−オキソ−エトキシ］アミノ］２，２−ジメチルプロパノエート（式（１５））
５ｍｌのジクロロメタン中のＰ’（Ｘ＝Ｏ、Ｒ１＝Ｂｏｃ、Ｒ２＝ＯＣ６Ｈ４ｐＮＯ２）（０．３０ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）の溶液に、室温においてｍ−ＣＰＢＡ（０．２６３ｇ、１．１８ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。１２時間の撹拌後、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１５ｍｌ）で２回洗浄し、有機相を、ＭｇＳＯ４での乾燥後に真空下で濃縮した。スルホンが白色泡状物として得られた。
収量：０．２５０ｇ（８４％）；Ｒｆ（シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ，１：１）０．０５；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．５１（ｓ，１Ｈ）、８．２８（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ）、７．６４（ｓ，１Ｈ）、７．４１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，３Ｈ）、５．４７‐５．３５（ｍ，１Ｈ）、４．３３（ｓ，２Ｈ）、３．８８‐３．７９（ｍ，２Ｈ）、３．５７（ｄｄ，Ｊ＝１４．９，８．３Ｈｚ，１Ｈ）、３．４１‐３．３４（ｍ，２Ｈ）、３．２８（ｄｄ，Ｊ＝１４．８，３．８Ｈｚ，１Ｈ）、１．５７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）、１．４８（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６８．５８，  １５５．４２，  １５１．５８，  １５０．５２，  １４５．６７，  １２５．４６，  １２２．０４，  ８５．６０，  ７７．１６，  ７６．６２，  ７０．６３，  ５８．１９，  ５３．６７，  ３３．０７，  ２８．１６，  ２０．２１；ＥＳＩ−ＭＳ：（計算値ＭＨ＋：５２８．１６ｇ／ｍｏｌ，実測値：５２８．１５ｍ／ｚ）。
【０１６２】
式（１６）の化合物を調製するための合成
４−カルボキシ−２−ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム
４−スルファニル安息香酸を、５ｍｌの発煙ＨＮＯ３及び１０ｍｌのＨ２ＳＯ４（９５％）中に溶解した。反応溶液を９０℃で一晩撹拌した後、１００ｍｌの水で希釈した。０℃において、この酸をＮａ２ＣＯ３の添加により中和した。ＨＣｌの添加により、混合物をｐＨ値が２になるまで酸性化した。水を除去し、残渣をＥｔＯＨ／ｉＰｒＯＨ（１：１）で抽出した。その後有機溶媒を除去して、産物を褐色固体として得た。収量：６．８６ｇ（６１％）；Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ，７：２：１）０．０５；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ８．２３（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ）、８．１７（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ）、８．１６（ｓ，１Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）：（計算値（Ｍ−Ｎａ）−：２４５．９７ｇ／ｍｏｌ，実測値：２９６．００ｍ／ｚ）。
【０１６３】
４−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジン−１−カルボニル）−２−ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム
ｔ−ブチルカルバゼート（１．９１ｇ、１４．２７ｍｍｏｌ）及び４−カルボキシ−２−ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（３．８４ｇ、１４．２７ｍｍｏｌ）、並びに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（２．７６ｇ、１４．２７ｍｍｏｌ）の溶液を、６０ｍｌのメタノール／Ｈ２Ｏ（１：１）中で、室温において一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をカラムクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９：１）で精製した。収量：６．８６ｇ（６１％）；Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ，７：２：１）０．３０；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１０．４６（ｓ，１Ｈ）、９．０４（ｓ，１Ｈ）、８．０１（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．９９（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．９６（ｓ，１Ｈ）、１．４３（ｓ，９Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）：（計算値（Ｍ−Ｎａ）−：３６０．０５ｇ／ｍｏｌ，実測値：３６０．００ｍ／ｚ）。
【０１６４】
ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−（クロロスルホニル）−３−ニトロベンゾイル）ヒドラジン−１−カルボキシレート
４−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジン−１−カルボニル）−２−ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（０．５５ｇ、１．４２ｍｍｏｌ）及び１８−クラウン−６エーテル（０．０２ｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の溶液に、乾燥アセトン中の塩化シアヌル（０．２６ｇ、１．４２ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を１８時間還流した。冷却後、反応混合物をセライトでろ過し、カラムクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９：１）で精製した。収量：０．２３ｇ（４３％）；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．１８（ｓ，２Ｈ）、８．２２（ｄ，Ｊ＝０．５Ｈｚ，１Ｈ）、８．２２（ｄｄ，Ｊ＝１．７，０．５Ｈｚ，１Ｈ）、８．１８（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ）、８．１５（ｄ，Ｊ＝０．６Ｈｚ，１Ｈ）、１．２３（ｓ，９Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）：（計算値（Ｍ）−：３７９．０２ｇ／ｍｏｌ，実測値：３７８．９２ｍ／ｚ）。
【０１６５】
式（２０）の化合物を調製するための合成
６−アジドイソベンゾフラン−１（３Ｈ）−オン
１Ｍ  ＨＣｌ（２８ｍｌ）中の６−アミノフタリド（２．５０ｇ、１５．９２ｍｍｏｌ）の透明な溶液を０℃に冷却し、３ｍｌのＮａＮＯ２（１．６６ｇ、１３．８９ｍｍｏｌ）水溶液を滴下した。得られた懸濁液を０℃で１０分間撹拌し、１０ｍｌのＮａＮ３（２．０９ｇ、３１．８５ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で滴下した（激しいＨＮ３ガスの発生、発泡）。泡状懸濁液を０℃で１時間撹拌した。沈殿物を吸引ろ過し、３００ｍｌの水で数回洗浄した。褐色固体を粉砕し、乾燥炉内で一晩乾燥させた。次にこれを３００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、ろ過した。真空下で溶媒をろ液から除去して、淡褐色固体を得た。収量：２．５３ｇ（９１％）；Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ，７：２：１）０．３０；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５８（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．４７（ｄｄ，Ｊ＝８．２，０．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．３１（ｄｄ，Ｊ＝８．２，２．１Ｈｚ，１Ｈ）、５．３１（ｓ，２Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ：（計算値（ＭＨ）＋：１７６．０５ｇ／ｍｏｌ，実測値：１７６．２３ｍ／ｚ）。
【０１６６】
５−アジド−２−（ヒドロキシメチル）ベンゾヒドラジド
６−アジドイソベンゾフラン−１（３Ｈ）−オン（０．５０ｇ、２．８３ｍｍｏｌ）を６ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、ヒドラジン水和物（０．７１ｍｌ、１４．１３ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を７０℃で３時間撹拌した。ＤＭＦ及びヒドラジン水和物を真空下で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９：１）で精製して、淡黄色の粉体を得た。収量：０．１０ｇ（１７％）。Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ，９：１）０．５３；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ９．６２（ｓ，１Ｈ）、７．５７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．２０（ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．０９（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、５．３１‐５．２１（ｍ，１Ｈ）、４．５７（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）、４．５０（ｓ，２Ｈ）、３．３３（ｓ，２Ｈ）、ＥＳＩ−ＭＳ：（計算値（ＭＨ）＋：２０８．０８ｇ／ｍｏｌ，実測値：２０７．９０  ｍ／ｚ）、（計算値（ＭＮａ）＋：２３０．０７  ｇ／ｍｏｌ，実測値：２３０．０１ｍ／ｚ）。
【０１６７】
ｔｅｒｔ−ブチル２−（５−アジド−２−（ヒドロキシメチル）ベンゾイル）ヒドラジン−１−カルボキシレート
５−アジド−２−（ヒドロキシメチル）ベンゾヒドラジド（０．１０ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）をジオキサン／ＥｔＯＡｃ／ｉＰｒＯＨ（１：１：１）１０ｍｌ中に溶解し、Ｂｏｃ無水物（０．１０５ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．１０ｍｌ、０．５７ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で１２時間撹拌した後、溶媒を減圧下で除去した。残渣を５０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中に取り、１０％クエン酸で２回洗浄した（それぞれ５０ｍｌ）。ＭｇＳＯ４で乾燥させ、有機溶媒を除去した後、黄色の油を得た。収量：０．１０ｇ（６７％）。Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ，９：１）０．７５；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１０．０６（ｓ，１Ｈ）、９．０４（ｄ，Ｊ＝３０．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．６９‐７．５８（ｍ，１Ｈ）、７．２５（ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．１０（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ）、５．２８（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．６２（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ）、１．４３（ｓ，９Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ：（計算値（ＭＮａ）＋：３３０．１２ｇ／ｍｏｌ，実測値：３３０．２９ｍ／ｚ）。
【０１６８】
ｔｅｒｔ−ブチル２−（５−アジド−２−（（（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）オキシ）メチル）ベンゾイル）ヒドラジン−１−カルボキシレート
Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジルカルボネート（０．１０５ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を、５ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミド中のｔｅｒｔ−ブチル２−（５−アジド−２−（ヒドロキシメチル）ベンゾイル）ヒドラジン−１−カルボキシレート（０．１０５ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。次に乾燥ピリジン（０．０３ｍｌ、０．４１ｍｍｏｌ）を滴下した。反応溶液を１７時間、室温で撹拌した。溶媒を真空下で除去した。この溶液に５０ｍｌのＤＣＭを添加した。有機相を、１０％クエン酸溶液で洗浄し（２×５０ｍｌ）、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。合わせた有機相をロータリーエバポレータで蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、１９：１）で精製した。収量：０．０６ｇ（４０％）。Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ，１９：１）０．４５；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１０．０６（ｓ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，１Ｈ）、８．９９（ｓ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．６２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．５３（ｓ，１Ｈ）、７．２５（ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．４Ｈｚ，１Ｈ）、５．７６（ｓ，２Ｈ）、３．３４（ｓ，４Ｈ）、１．４３（ｓ，９Ｈ）、ＥＳＩ−ＭＳ：（計算値（ＭＮａ）＋：４７１．１２ｇ／ｍｏｌ，実測値：４７１．２５ｍ／ｚ）。
【０１６９】
式（２１）の化合物を調製するための合成
６−メトキシイソベンゾフラン−１（３Ｈ）−オン
３−メトキシ安息香酸（１０．００ｇ、６５．０７ｍｍｏｌ）、３７％ホルマリン溶液（７．５ｍｌ、８０ｍｍｏｌ）、３７％ＨＣｌ（８．００ｍｌ）及び７５ｍｌの１００％酢酸の混合物を、１８時間加熱還流した。冷却後、溶液が透明であれば撹拌器をオフにし、この温度で１４時間静置する。酢酸を８０℃において空気流中で除去した。残滓を１５０ｍｌのトルエン中に取り、４０ｍｌに濃縮した。この８０℃の高温溶液を、４０ｍｌずつの２０％Ｎａ２ＣＯ３溶液（３回）、及び４０ｍｌの水で洗浄した。３ｍｌのモルホリンを添加した後、有機相を８０℃で２時間撹拌し、続いて５０ｍｌずつの１０％Ｈ２ＳＯ４（３回）及び水で洗浄した。産物の結晶化のために、混合物を２５ｍｌまで濃縮し、混合物を撹拌した。ろ過によって、白色結晶の形態で産物を得た。収量：３．５２ｇ（３３％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ７．５８（ｄｄ，Ｊ＝８．３，０．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．３５（ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．３１（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．３４（ｓ，２Ｈ）、３．８４（ｓ，３Ｈ）。
【０１７０】
６−ヒドロキシイソベンゾフラン−１（３Ｈ）−オン
窒素雰囲気下において、６−メトキシイソベンゾフラン−１（３Ｈ）オン（３．００ｇ、１８．０９ｍｍｏｌ）を、無水ジクロロメタン（１００ｍｌ）中に溶解した。得られた混合物を磁気撹拌し、氷浴中で１０分間冷却した。続いてＢＢｒ３（３．４６ｍｌ、３６．１８ｍｍｏｌ）を滴下した。その後、反応混合物を室温まで加熱し、１２時間撹拌した。次に５ｍｌの水を添加し、混合物を分液漏斗に移し、酢酸エチル（３×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して、白色固体を得た。収量：１．５２ｇ（５６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１０．０８（ｓ，１Ｈ）、７．４７（ｄｄ，Ｊ＝８．３，０．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．１９（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．１６（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．１０（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）、５．２８（ｓ，２Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ：（計算値（ＭＨ）＋：１５１．０４ｇ／ｍｏｌ，実測値：１５１．０５ｍ／ｚ）。
【０１７１】
５−アジド−２−（ヒドロキシメチル）ベンゾヒドラジド
６−ヒドロキシイソベンゾフラン−１（３Ｈ）−オン（０．４３ｇ、２．８３ｍｍｏｌ）を、６ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、ヒドラジン水和物（１．４２ｍｌ、２８．２６ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を１００℃で３時間撹拌した。ＤＭＦ及びヒドラジン水和物を真空下で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９：１）で精製して、淡黄色の粉体を得た。収量：０．１０ｇ（１７％）。Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ，９：１）０．４０；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１０．０８（ｓ，１Ｈ）、９．７３（ｓ，１Ｈ）、７．４７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．１８（ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．１０（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ）、４．５７（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ、４．５０（ｓ，２Ｈ）、３．３３（ｓ，２Ｈ）、ＥＳＩ−ＭＳ：（計算値（ＭＨ）＋：１８３．０８ｇ／ｍｏｌ，実測値：１８３．１５ｍ／ｚ）。
【０１７２】
スカベンジャー分子（１４）を用いた例示的な精製
更なる例示的なペプチド１４（ＡＫＡＤＥＶＳＬＨＫＷＹＧ；配列番号１０）及び式（１４）のリンカー（スカベンジャー分子１４）を用いて、市販のアルデヒド修飾アガロース（ＡＢＴ製の高密度グリオキサール、６ＢＣＴ）上で精製を実施した。
【０１７３】
ペプチドの固相ペプチド合成及び精製
Ｉｎｔａｖｉｓ  ＡＧ社のＭｕｌｔｉＰｅｐＲＳ−ペプチド自動合成装置を用いて、１００μｍｏｌのバッチで自動固相ペプチド合成を実施した。合成は、Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ社のＷａｎｇ樹脂（１．０〜１．４ｍｍｏｌ／ｇ）上で実施した。合成の開始前に、適量のペプチド合成樹脂を５ｍｌシリンジ反応器（Ｉｎｔａｖｉｓ社のＰＥ反応器）中で計量し、ＤＭＥ中で膨潤させた。特段明記されていない限り、アミノ酸の当量の計量は、使用される樹脂の初期装入量を指す。
【０１７４】
Ｆｍｏｃ切断：
一時的なＦｍｏｃ−保護基の切断のために、樹脂を１５００μＬのピペリジン／ＤＭＦ（４：１）で、まず５分間、次に８分間処理し、次に１０．２ｍＬのＤＭＦで７回洗浄し、その後、Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体の結合を行った。
【０１７５】
Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体の結合：
ＤＭＦ（０．３Ｍ）中の５当量のアミノ酸の溶液を、ＤＭＦ（０．３Ｍ）中の４．５当量のＨＣＴＵ及びＤＭＦ（０．６Ｍ）中の１０当量のＮＭＭを用いて室温で１分間インキュベートし、樹脂に添加した。３０分の反応時間の後、樹脂を１０．２ｍＬのＤＭＦで３回洗浄し、末端配列のブロックを継続した。
【０１７６】
末端配列のブロック：
樹脂を１．５ｍＬのＡＣ２Ｏ／２，６−ルチジン／ＤＭＦ（５：６：８９）の溶液で５分間、２回処理し、続いてそれぞれ１０．２ｍＬのＤＭＦで７回洗浄した。
【０１７７】
スカベンジャー分子の最終ステップ結合：
固相ペプチド合成の最終ステップとして、スカベンジャー分子（１４）を所望の標的ペプチド（５０μｍｏｌ）に結合させた。これを、２当量のスカベンジャー分子２、ＤＭＦ（０．４Ｍ）中の６当量のＨＯＢｔ、及びＤＭＦ（０．３Ｍ）中の４当量のＤＩＰＥＡの溶液と混合した。６０分の反応時間の後、それぞれ２ｍＬのＤＭＦで２回、２ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で２回、そして最後に２ｍＬのＤＭＦで２回洗浄した。
【０１７８】
全長ペプチドのアセチル化の代替的な最終ステップ：
末端配列のブロックの手順と同様に、対照試料としての全長ペプチドも同様にアセチル化（ペプチド−アセチル化）した。
【０１７９】
ポリマー支持体からの放出：
樹脂を、９５％のＴＦＡ、２．５％の水及び２．５％のトリイソプロピルシランの３ｍＬの溶液で処理した。合成樹脂をこの切断混合物と混合し、室温で３時間振盪した。次に切断溶液を回収し、樹脂をそれぞれ１ｍＬのＴＦＡで２回洗浄した。切断溶液を洗浄液と合わせ、アルゴン流によって約１ｍＬの体積まで蒸発させた。続いて１０ｍＬの低温ジエチルエーテル中で沈殿させた後、沈殿物を遠心分離して除去した。上清を廃棄した。図４Ｈ（上）に、純度４５％の、リンカーを含まないペプチドのクロマトグラムを示す。
【０１８０】
精製
粗沈殿物（理論上の収量約５μｍｏｌ）をコンジュゲーション緩衝液（０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ、０．１Ｍアニリン、ｐＨ＝３．８）に取った。混合物が完全に溶解しなかった場合、アセトニトリルを添加した。２５μｍのＰＥプレフィルタを備えた３ｍＬシリンジ反応器に４００μＬ（〜１６０ｍｇ）のアガロースを加えた。次に精製樹脂を、コンジュゲーション緩衝液（０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ、０．０５Ｍアニリン、ｐＨ＝３．８）で３回洗浄することによって、調整した。続いてペプチド溶液を精製樹脂に添加した。その後、６０分間の不動化を実施した。続いてこれをコンジュゲーション緩衝液で３回、５Ｍ尿素溶液で３回、７０％エタノールで３回、そして最後に水で５回洗浄した。続いてこの混合物を、水中の５体積％ＮＨ４ＯＨを用いて塩基性とし、コンジュゲートしたペプチドを樹脂から切断した。凍結乾燥により、ペプチドが白色のふわふわとした固体として得られた。
【０１８１】
不動化の実証
不動化をはっきりと実証するために、修飾アガロース及び純アガロース（ＡＢＴ製６％ＢアガロースビーズＳＴＡＮＤＡＲＤ）上の、この実験におけるアセチル化ペプチドと、リンカーが結合したペプチドとを、ＰＥＣで精製した。リンカー切断後の溶出液を、それぞれＵＰＬＣ−ＵＶを用いて測定した。その結果、切断後に、修飾された界面活性剤樹脂上の、リンカーが結合したペプチドのみにおいて、産物の質量による有意なシグナルが検出された。更に、純アガロースを用いた場合でも、修飾アガロースの場合と比較して約２．３％の産物が得られることが分かった。
【０１８２】
【表３】
2019508487.tif 000057
【０１８３】
精製樹脂の再生
スカベンジャー分子（１４）によるペプチド精製の後、１の元々のアルデヒド官能基は、ヒドロキシル修飾スカベンジャー分子によってブロックされたままである。新たな精製サイクルのための精製樹脂を提供するためには、精製樹脂を再生することによってアルデヒド官能基を回復しなければならない。これは、アルデヒド又はケトンの添加によって平衡をシフトさせることによって達成される。反復精製サイクルのための再生は、以下のように示された：
【０１８４】
ペプチド１４の２つの精製を同時に実施した（精製Ｉ）。続いて再生のために、精製樹脂を、水、アセトン及びＴＦＡ（ケトン、４９．９５：４９．９５：０．１）、又は水、アセトアルデヒド及びＴＦＡ（アルデヒド、８９．９５：９．９５：０．１）の混合物でそれぞれ４回、及び水で５回洗浄した。その後、調整を含む精製を、上述の手順と同様に実施した。再生及び精製を合計３回実施し（精製ＩＩ〜ＩＶ）、凍結乾燥産物をそれぞれ同体積の水、アセトニトリル及びＴＦＡ（６９．９：２９．９：１）に取り、ＵＰＬＣ−ＭＳで測定した。
【０１８５】
【表４】
2019508487.tif 000058
【０１８６】
その結果、いずれの場合においても樹脂は再生可能であることが分かった。ケトンを用いた再生は、第３サイクル（精製（ＩＶ）においてのみ有意に低下する。対照的に、アルデヒド再生における精製能力は、初期能力の約１／４のままであったが、第２サイクル（精製ＩＩＩ）の後にこの値まで降下した。両方の実験において、約６０％の純度を達成でき、これは再生サイクルにわたって一定のまま維持された（精製Ｉ、アルデヒド、図４Ｈ（下側）の例示的なクロマトグラム）。
【図１】
2019508487.tif 000084
【図２】
2019508487.tif 000085
【図３】
2019508487.tif 000086
【図４ＡＢ】
2019508487.tif 000087
【図４ＣＤ】
2019508487.tif 000088
【図４ＥＦ】
2019508487.tif 000089
【図４Ｇ】
2019508487.tif 000090
【図４Ｈ】
2019508487.tif 000091
【図５】
2019508487.tif 000092
【配列表】
2019508487000001.app
【国際調査報告】
2019508487.tif 000093
2019508487.tif 000094
2019508487.tif 000095
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