(57)【要約】本開示は、対象の腸で生成されるＧＡＢＡの量をモジュレートすることによって、対象の精神障害または中枢神経系の疾患の少なくとも１つの症状を処置する方法に関する。本開示は、新たな細菌株を培養する方法にも関する。ＧＡＢＡを生成することができる細菌株を特定し、ＧＡＢＡを生成するように菌株を操作する方法も開示されている。本開示はまた、例えば、生理学的に適切なｐＨなどの生理学的に適切な条件下で、例えば、ＧＡＢＡを生成することができる細菌株を特定する方法を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象において、ＧＡＢＡを生成することができる細菌からなる少なくとも１つの精製細菌集団を含む治療用組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの細菌集団が、表１に示した配列番号１〜３１のうちの１つから選択される１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも約９５％同一である１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌からなる、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１つの精製細菌集団が、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｃｃａｅ  ＫＬＥ１９１１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｌａｒｕｓ  ＫＬＥ１９３０；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ  ＫＬＥ１９１２；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ  ＫＬＥ１９３１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１９５８；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  ＫＬＥ１９３２；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＫＬＥ１７７０；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ  ＫＬＥ１９３３；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＫＬＥ１９３４；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＬＥ１９１３；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ  ＫＬＥ１９１０；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＫＬＥ１９３５；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ  ＫＬＥ  １８７９；Ｂｌａｕｔｉａ  ｏｂｅｕｍ  ＫＬＥ１９１４；Ｂｌａｕｔｉａ  ｗｅｘｌｅｒａｅ  ＫＬＥ１９１６；Ｂｕｔｙｒｉｃｉｍｏｎａｓ  ｖｉｒｏｓａ  ＫＬＥ１９３８；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ＫＬＥ１９３７；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ  ＫＬＥ１９３９；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＬＥ１８６２；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＬＥ１９１８；Ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＬＥ１７７９；Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＫＬＥ１８８０；Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ  ＫＬＥ１９１７；Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ  ＫＬＥ１９２６；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ  ＫＬＥ１９２２；Ｇｏｒｄｏｎｉｂａｃｔｅｒ  ｐａｍｅｌａｅａｅ  ＫＬＥ１９１５；Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＫＬＥ１９２８；Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ  ＫＬＥ２０２０；Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ  ＫＬＥ１８６３；Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｎａｖｕｓ  ＫＬＥ１９４０；Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ  ＫＬＥ１９４１、およびこれらの組合せからなる群から選択される細菌からなる、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１つの精製細菌集団が、表２に示した配列番号３２〜２７４のうちの１つから選択される１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも約９５％同一である１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌からなる、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つの精製細菌集団が、表１０に示した配列番号３０５〜２２１７のうちの１つから選択される１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも９５％の類似性を有する１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌からなる、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１つの精製細菌集団が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、またはこれらの組合せから選択される酵素をコードするＤＮＡ配列を含む細菌からなる、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項７】
前記グルタミン酸デカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、またはこれらの組合せが、表３に示した配列番号２７５〜３０４のうちのいずれか１つと、ＤＮＡ配列において少なくとも７０％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項６に記載の治療用組成物。
【請求項８】
前記グルタミン酸デカルボキシラーゼが、表４に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項６に記載の治療用組成物。
【請求項９】
前記プトレシンアミノトランスフェラーゼが、表５に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項６に記載の治療用組成物。
【請求項１０】
前記ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼが、表６に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項６に記載の治療用組成物。
【請求項１１】
前記アルギニンデカルボキシラーゼが、表７に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項６に記載の治療用組成物。
【請求項１２】
前記アグマチナーゼが、表８に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項６に記載の治療用組成物。
【請求項１３】
前記オルニチンデカルボキシラーゼが、表９に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項６に記載の治療用組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの精製細菌集団が、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７、またはこれらの組合せ
からなる群から選択される基準細菌と少なくとも９５％の類似性を有する１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌からなる、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項１５】
前記細菌集団が、生理学的に適切なｐＨでＧＡＢＡを生成することができる細菌からなる、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項１６】
前記細菌集団が、約４．５から約７．５の間のｐＨ範囲でＧＡＢＡを生成することができる細菌からなる、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項１７】
前記細菌集団が、ヒトの腸の内側でＧＡＢＡを生成することができる細菌からなる、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項１８】
プロバイオティクス、プレバイオティクス、カプセル剤、錠剤、カプレット、丸剤、トローチ、ロゼンジ、散剤、顆粒剤、医療食、またはこれらの組合せの形態である、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項１９】
糞便移植として投与される、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項２０】
前記細菌が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチナーゼ、および／またはオルニチンデカルボキシラーゼの任意の組合せの発現を介してＧＡＢＡを生成することができる、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項２１】
ＧＡＢＡ消費細菌に対して細胞毒性または細胞増殖抑制性である精製細菌株をさらに含む、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項２２】
前記ＧＡＢＡ消費細菌が、Ｅｖｔｅｐｉａ  ｇａｂａｖｏｒｏｕｓまたはＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＭＧＳ：１１４である、請求項２１に記載の治療用組成物。
【請求項２３】
ＧＡＢＡ生成細菌の成長またはＧＡＢＡ生成レベルを刺激することができるプレバイオティクスをさらに含む、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項２４】
それを必要とする対象の疾患または障害を処置する方法であって、前記対象に、それを必要とする対象において、ＧＡＢＡを生成することができる細菌からなる少なくとも１つの精製細菌集団を含む治療用組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項２５】
前記疾患または障害が、精神疾患または障害である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記精神疾患または障害が、うつ病、双極性障害、統合失調症、不安、不安障害、嗜癖、ソーシャルホビア、処置抵抗性大うつ病障害（ＴＲ−ＭＤＤ）、大うつ病障害およびそのサブタイプ（メランコリー型うつ病、非定型うつ病、緊張病性うつ病、産後うつ病、および季節性感情障害）、神経変性アミロイド障害（パーキンソン、アルツハイマー、およびハンチントン病）、起立性振戦、ラフォラ病、むずむず脚症候群、神経障害性疼痛、疼痛障害、認知症、てんかん、スティッフパーソン症候群、月経前不快気分障害、自閉症スペクトラム障害、睡眠障害、ならびに注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
疾患または障害を処置することが、疲労、不眠症、運動機能障害、ストレス、持続性の不安、持続的な悲しみ、社会的ひきこもり、物質離脱、過敏性、希死念慮、自傷念慮、不穏、性欲の低下、集中の欠如、けいれん、記憶喪失、怒り、情動反応の発作、錯乱、疼痛、および筋痙攣、食欲不振、腸運動の変化、ならびにこれらの組合せなどの前記疾患または障害の少なくとも１つの症状を減少させることを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの細菌集団が、表１に示した配列番号１〜３１のうちの１つから選択される１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも約９５％同一である１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの精製細菌集団が、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｃｃａｅ  ＫＬＥ１９１１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｌａｒｕｓ  ＫＬＥ１９３０；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ  ＫＬＥ１９１２；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ  ＫＬＥ１９３１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１９５８；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  ＫＬＥ１９３２；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＫＬＥ１７７０；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ  ＫＬＥ１９３３；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＫＬＥ１９３４；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＬＥ１９１３；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ  ＫＬＥ１９１０；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＫＬＥ１９３５；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ  ＫＬＥ  １８７９；Ｂｌａｕｔｉａ  ｏｂｅｕｍ  ＫＬＥ１９１４；Ｂｌａｕｔｉａ  ｗｅｘｌｅｒａｅ  ＫＬＥ１９１６；Ｂｕｔｙｒｉｃｉｍｏｎａｓ  ｖｉｒｏｓａ  ＫＬＥ１９３８；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ＫＬＥ１９３７；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ  ＫＬＥ１９３９；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＬＥ１８６２；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＬＥ１９１８；Ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＬＥ１７７９；Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＫＬＥ１８８０；Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ  ＫＬＥ１９１７；Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ  ＫＬＥ１９２６；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ  ＫＬＥ１９２２；Ｇｏｒｄｏｎｉｂａｃｔｅｒ  ｐａｍｅｌａｅａｅ  ＫＬＥ１９１５；Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＫＬＥ１９２８；Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ  ＫＬＥ２０２０；Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ  ＫＬＥ１８６３；Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｎａｖｕｓ  ＫＬＥ１９４０；Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ  ＫＬＥ１９４１、およびこれらの組合せからなる群から選択される細菌からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの精製細菌集団が、表２に示した配列番号３２〜２７４のうちの１つから選択される１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも約９５％同一である１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの細菌集団が、表１０に示した配列番号３０５〜２２１７のうちのいずれか１つと少なくとも約９５％同一である１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの精製細菌集団が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、またはこれらの組合せから選択される酵素をコードするＤＮＡ配列を含む細菌からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記グルタミン酸デカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、またはこれらの組合せが、表３に示した配列番号２７５〜３０４のうちの１つから選択されるＤＮＡ配列において少なくとも７０％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記グルタミン酸デカルボキシラーゼが、表４に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記プトレシンアミノトランスフェラーゼが、表５に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼが、表６に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記アルギニンデカルボキシラーゼが、表７に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記アグマチナーゼが、表８に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記オルニチンデカルボキシラーゼが、表９に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記細菌が、ＧＡＢＡを生成するように遺伝子操作されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項４１】
前記細菌が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、またはこれらの組合せの発現を介してＧＡＢＡを生成するように操作されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記グルタミン酸デカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、またはこれらの組合せが、表３に示した配列番号２７５〜３０４のうちの１つから選択されるＤＮＡ配列において少なくとも７０％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記グルタミン酸デカルボキシラーゼが、表４に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記プトレシンアミノトランスフェラーゼが、表５に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼが、表６に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記アルギニンデカルボキシラーゼが、表７に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記アグマチナーゼが、表８に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記オルニチンデカルボキシラーゼが、表９に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも１つの精製細菌集団が、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７、またはこれらの組合せ
からなる群から選択される基準細菌と少なくとも９５％の類似性を有する１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項５０】
前記細菌集団が、生理学的に適切なｐＨでＧＡＢＡを生成することができる細菌からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項５１】
前記細菌集団が、約４．５から約７．５の間のｐＨ範囲でＧＡＢＡを生成することができる細菌からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項５２】
前記細菌集団が、ヒトの腸の内側でＧＡＢＡを生成することができる細菌からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項５３】
前記組成物が、糞便移植として投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項５４】
前記組成物が、プロバイオティクスとして投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項５５】
前記細菌が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、およびこれらの組合せの任意の組合せの発現を介してＧＡＢＡを生成することができる、請求項２４に記載の方法。
【請求項５６】
前記少なくとも１つの細菌株が、ＧＡＢＡ消費細菌に対して細胞毒性または細胞増殖抑制性である、請求項２４に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＧＡＢＡ消費細菌が、Ｅｖｔｅｐｉａ  ｇａｂａｖｏｒｏｕｓまたはＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＭＧＳ：１１４である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記対象の便のＧＡＢＡの初期量を測定することにより、前記対象が内因性ＧＡＢＡの増加から利益を得るかどうかを決定することによって、処置を必要とする対象を特定するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項５９】
前記対象の便のＧＡＢＡの前記初期量が、湿便または乾燥便１グラム当たり約８μｇ未満である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記対象の便のＧＡＢＡの量が、前記治療用組成物を投与した後、前記初期量に対して増加している、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記対象の便のＧＡＢＡ生成細菌の初期量を測定することにより、前記対象が内因性ＧＡＢＡの増加から利益を得るかどうかを決定することによって、処置を必要とする対象を特定するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項６２】
前記対象の便のＧＡＢＡ生成細菌の初期量が、１６Ｓ配列マッピングで測定した全細菌の約１０％未満である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
少なくとも１種のＧＡＢＡ生成細菌が、前記治療用組成物を投与した後、前記対象の便のＧＡＢＡ生成細菌の前記初期量に対して前記対象の便において増加している、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記対象の血液または血清のＧＡＢＡの初期量を測定することにより、前記対象が内因性ＧＡＢＡの増加から利益を得るかどうかを決定することによって、処置を必要とする対象を特定するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項６５】
前記対象の血液または血清のＧＡＢＡの量が、血液１リットル当たり約１０μｇ未満である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記対象の血液または血清のＧＡＢＡの量が、前記治療用組成物を投与した後、前記初期量に対して増加している、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記対象の脳のＧＡＢＡの量を測定することにより、前記対象が内因性ＧＡＢＡの増加から利益を得るかどうかを決定することによって、処置を必要とする対象を特定するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項６８】
前記対象の脳のＧＡＢＡの量が、約１．０ｍＭ／ｋｇ未満である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記対象の脳のＧＡＢＡの量が、前記治療用組成物を投与した後、前記初期量に対して増加している、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記対象の便のＧＡＢＡ生成酵素発現の初期量を測定することにより、前記対象が内因性ＧＡＢＡの増加から利益を得るかどうかを決定することによって、処置を必要とする対象を特定するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＧＡＢＡ生成酵素が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、およびこれらの組合せから選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
酵素発現の前記初期量が、ｑＰＣＲで測定される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記酵素発現が、前記治療用組成物を投与した後、酵素発現の前記初期量に対して増加している、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記対象の脳のＧＡＢＡ作動性応答の初期量を測定することにより、前記対象が内因性ＧＡＢＡの増加から利益を得るかどうかを決定することによって、処置を必要とする対象を特定するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項７５】
前記対象の脳の前記ＧＡＢＡ作動性応答の量が、前記治療用組成物を投与した後、前記初期量に対して増加している、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記治療用組成物が、ＧＡＢＡ生成細菌の成長またはＧＡＢＡ生成を刺激することができるプレバイオティクスを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項７７】
ＧＡＢＡ依存性細菌を培養する方法であって、少なくとも１種の生存するＧＡＢＡ依存性細菌細胞を適切な基質上に配置するステップ、およびＧＡＢＡの供給源を提供するステップを含む方法。
【請求項７８】
前記適切な基質が寒天である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
ＧＡＢＡの供給源を提供するステップが、別の細菌株と共培養することを含み、前記菌株はＧＡＢＡを生成することができる、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
ＧＡＢＡが基質に加えられる、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＧＡＢＡ依存性細菌が、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
ヒトの腸管の生理学的に適切なｐＨでＧＡＢＡを生成することができる細菌株（単数または複数）を特定する方法であって、
（ａ）ＧＡＢＡ生成細菌を含有すると考えられる試料を基質内に分散させるステップであって、前記基質が少なくとも部分的にＧＡＢＡ透過性であるステップと、
（ｂ）潜在的ＧＡＢＡ生成細菌を添加した前記基質をＧＡＢＡ依存性細菌と接触させるステップと、
（ｃ）前記基質において、潜在的ＧＡＢＡ生成細菌の周囲の前記ＧＡＢＡ依存性細菌のコロニーの形成を観察することによって、ＧＡＢＡ生成細菌を特定するステップと
を含む方法。
【請求項８３】
前記基質が、ヒトの胃腸管で見られる生理学的範囲にｐＨを維持するために緩衝されている、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＧＡＢＡ依存性細菌が、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記ｐＨ範囲が、約４．５から約７．５の間である、請求項８２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１６年３月１４日に出願された米国仮出願番号第６２／３０７，９９１号に基づく優先権および利益を主張しており、その内容は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
配列表の援用
２０１７年３月１３日に作成され、そしてサイズが７．６ＭＢの“ＨＯＢＥ００１００１ＷＯＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ”と命名されたテキストファイルの内容は、それらの全体が参考として本明細書によって援用される。
【０００３】
政府の資金援助
この発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって与えられた３Ｒ０１ＨＧ００５８２４−０２Ｓ１の下、政府の支援を得てなされた。政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００４】
発明の分野
本開示は、対象の疾患の少なくとも１つの症状を処置するための組成物および方法に関する。一部の場合には、疾患は、精神障害または中枢神経系の疾患である。本開示は、対象の体内の内因性ＧＡＢＡの量をモジュレート（改変）する（例えば、増加させる）ことによる疾患の処置について教示する。一部の実施形態では、本開示は、対象の腸内の細菌によって腸内で生成されるＧＡＢＡの量をモジュレートすること（例えば、増加させること）を教示する。例えば、本開示は、それを必要とする対象への、ＧＡＢＡを生成することができる（例えば、ヒトの腸の内側で）細菌の投与について教示する。
【０００５】
本開示は、以前に培養されていない細菌株を培養する方法にも関する。例えば、本開示は、以前に培養されていない細菌株、Ｅｖｔｅｐｉａ  ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８について教示する。本明細書に示されるように、Ｅｖｔｅｐｉａ  ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８などの培養されていない細菌株を細菌の成長および増殖に必要な成長因子を与えることによって新たに培養することができる。
【０００６】
ある特定の成長因子を生成することができる細菌株を特定する方法も開示されている。例えば、生理学的に適切なｐＨなどの生理学的に適切な条件下で、例えば、ＧＡＢＡを生成することができる細菌株を特定する方法が本明細書に記載されている。
【背景技術】
【０００７】
背景
腸内ミクロビオームは、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、肥満、心疾患、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、ならびに大腸がんなどのある特定の胃腸および代謝障害に影響を及ぼす。
【０００８】
微生物学の研究は、これまで、やむを得ず、培養可能な微小生物に限定されてきた。一部の推定によると、外部環境においては細菌の９９％が、培養されたことがない細菌であると考えられる。したがって、以前に培養されていない、または培養できない細菌を培養するための新たな技術の開発は、微生物学調査の範囲を拡大する助けとなりうる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
本開示は、精神疾病または中枢神経系の疾患などの疾患を処置するための組成物および方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＧＡＢＡを生成することができる１種または複数の細菌（例えば、精製細菌）を含む治療用組成物について教示する。細菌は、ヒトの腸内を含む生理学的に適切な条件下でＧＡＢＡを生成することができる。本開示は、それを必要とする対象を処置する方法であって、対象に、ＧＡＢＡ生成細菌を含む治療用組成物を投与するステップを含む方法も提供する。本明細書に示されるように、ＧＡＢＡ生成細菌は、対象の腸内でＧＡＢＡを生成することができる。ＧＡＢＡは、対象の体内の他の系（例えば、循環器系および神経系）に拡散しうる。そこで、内因性ＧＡＢＡは、神経伝達物質として作用することができる。一部の実施形態では、ＧＡＢＡのレベル上昇により（例えば、神経系において）、精神疾病または中枢神経系の疾患の症状を改善することができる。
【００１０】
一部の実施形態では、本開示は、生理学的に適切なｐＨ範囲で、ヒトにおいて、ＧＡＢＡを生成する細菌を特定するための方法、および精神疾病を処置するために、ヒトのＧＡＢＡレベルをモジュレートするためのこれらの細菌の使用も提供する。
【００１１】
本開示は、以前に培養されていない細菌種を培養する方法にも関する。例えば、本開示は、暫定的にＥｖｔｅｐｉａ  ｇａｂａｖｏｒｏｕｓと称されていた細菌種ＫＬＥ１７３８の単離および特徴付けについて教示する。Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの成長には、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８などのＧＡＢＡ生成細菌によって供給されうる成長因子ＧＡＢＡの存在が必要とされる。
【００１２】
一態様では、本開示は、それを必要とする対象においてＧＡＢＡを生成することができる細菌からなる少なくとも１つの精製細菌集団を含む治療用組成物を提供する。
【００１３】
一部の実施形態では、少なくとも１つの細菌集団は、表１に示した配列番号１〜３１のうちの１つから選択される１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも約９５％同一である１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌からなる。一部の実施形態では、少なくとも１つの精製細菌集団は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｃｃａｅ  ＫＬＥ１９１１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｌａｒｕｓ  ＫＬＥ１９３０；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ  ＫＬＥ１９１２；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ  ＫＬＥ１９３１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１９５８；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  ＫＬＥ１９３２；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＫＬＥ１７７０；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ  ＫＬＥ１９３３；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＫＬＥ１９３４；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＬＥ１９１３；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ  ＫＬＥ１９１０；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＫＬＥ１９３５；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ  ＫＬＥ  １８７９；Ｂｌａｕｔｉａ  ｏｂｅｕｍ  ＫＬＥ１９１４；Ｂｌａｕｔｉａ  ｗｅｘｌｅｒａｅ  ＫＬＥ１９１６；Ｂｕｔｙｒｉｃｉｍｏｎａｓ  ｖｉｒｏｓａ  ＫＬＥ１９３８；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ＫＬＥ１９３７；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ  ＫＬＥ１９３９；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＬＥ１８６２；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＬＥ１９１８；Ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＬＥ１７７９；Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＫＬＥ１８８０；Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ  ＫＬＥ１９１７；Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ  ＫＬＥ１９２６；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ  ＫＬＥ１９２２；Ｇｏｒｄｏｎｉｂａｃｔｅｒ  ｐａｍｅｌａｅａｅ  ＫＬＥ１９１５；Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＫＬＥ１９２８；Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ  ＫＬＥ２０２０；Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ  ＫＬＥ１８６３；Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｎａｖｕｓ  ＫＬＥ１９４０；Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ  ＫＬＥ１９４１、およびこれらの組合せからなる群から選択される細菌からなる。
【００１４】
一部の実施形態では、少なくとも１つの精製細菌集団は、表２に示した配列番号３２〜２７４のうちの１つから選択される１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも約９５％同一である１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌からなる。一部の実施形態では、少なくとも１つの精製細菌集団は、表１０に示した配列番号３０５〜２２１７のうちの１つから選択される１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも９５％の類似性を有する１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌からなる。一部の実施形態では、少なくとも１つの精製細菌集団は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、またはこれらの組合せから選択される酵素をコードするＤＮＡ配列を含む細菌からなる。一部の実施形態では、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、またはこれらの組合せは、表３に示した配列番号２７５〜３０４のうちのいずれか１つと、ＤＮＡ配列において少なくとも７０％類似するＤＮＡ配列でコードされている。
【００１５】
一部の実施形態では、グルタミン酸デカルボキシラーゼは、表４に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている。一部の実施形態では、プトレシンアミノトランスフェラーゼは、表５に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている。一部の実施形態では、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、表６に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている。一部の実施形態では、アルギニンデカルボキシラーゼは、表７に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている。一部の実施形態では、アグマチナーゼは、表８に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている。一部の実施形態では、オルニチンデカルボキシラーゼは、表９に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている。
【００１６】
一部の実施形態では、少なくとも１つの精製細菌集団は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７、またはこれらの組合せからなる群から選択される基準細菌と少なくとも９５％の類似性を有する１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌からなる。
【００１７】
一部の実施形態では、細菌集団は、生理学的に適切なｐＨでＧＡＢＡを生成することができる細菌からなる。一部の実施形態では、細菌集団は、約４．５から約７．５の間のｐＨ範囲でＧＡＢＡを生成することができる細菌からなる。一部の実施形態では、細菌集団は、ヒトの腸の内側でＧＡＢＡを生成することができる細菌からなる。
【００１８】
一部の実施形態では、組成物は、プロバイオティクス、プレバイオティクス、カプセル剤、錠剤、カプレット、丸剤、トローチ、ロゼンジ、散剤、顆粒剤、医療食、またはこれらの組合せの形態である。一部の実施形態では、組成物は、糞便移植として投与される。
【００１９】
一部の実施形態では、細菌は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチナーゼ、および／またはオルニチンデカルボキシラーゼの任意の組合せの発現を介してＧＡＢＡを生成することができる。
【００２０】
一部の実施形態では、治療用組成物は、ＧＡＢＡ消費細菌に対して細胞毒性または細胞増殖抑制性である精製細菌株をさらに含む。一部の実施形態では、ＧＡＢＡ消費細菌は、Ｅｖｔｅｐｉａ  ｇａｂａｖｏｒｏｕｓまたはＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＭＧＳ：１１４である。
【００２１】
一部の実施形態では、治療用組成物は、ＧＡＢＡ生成細菌の成長またはＧＡＢＡ生成レベルを刺激することができるプレバイオティクスをさらに含む。
【００２２】
一態様では、本開示は、それを必要とする対象の疾患または障害を処置する方法であって、対象に、それを必要とする対象においてＧＡＢＡを生成することができる細菌からなる少なくとも１つの精製細菌集団を含む治療用組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００２３】
一態様では、本開示は、疾患の処置のための医薬品の製造における、ＧＡＢＡを生成することができる細菌からなる少なくとも１つの精製細菌集団を含む治療用組成物の使用を提供する。
【００２４】
一態様では、本開示は、疾患の処置のための、ＧＡＢＡを生成することができる細菌からなる少なくとも１つの精製細菌集団を含む治療用組成物の使用を提供する。
【００２５】
一部の実施形態では、疾患または障害は、精神疾患または障害である。一部の実施形態では、精神疾患または障害は、うつ病、双極性障害、統合失調症、不安、不安障害、嗜癖、ソーシャルホビア、処置抵抗性大うつ病障害（ＴＲ−ＭＤＤ）、大うつ病障害およびそのサブタイプ（メランコリー型うつ病、非定型うつ病、緊張病性うつ病、産後うつ病、および季節性感情障害）、神経変性アミロイド障害（パーキンソン、アルツハイマー、およびハンチントン病）、起立性振戦、ラフォラ病、むずむず脚症候群、神経障害性疼痛、疼痛障害、認知症、てんかん、スティッフパーソン症候群、月経前不快気分障害、自閉症スペクトラム障害、睡眠障害、ならびに注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、疾患または障害を処置するステップは、疲労、不眠症、運動機能障害、ストレス、持続性の不安、持続的な悲しみ、社会的ひきこもり、物質離脱、過敏性、希死念慮、自傷念慮、不穏、性欲の低下、集中の欠如、けいれん、記憶喪失、怒り、情動反応の発作、錯乱、疼痛、および筋痙攣、食欲不振、腸運動の変化、ならびにこれらの組合せなどの疾患または障害の少なくとも１つの症状を減少させることを含む。
【００２６】
一部の実施形態では、少なくとも１つの細菌集団は、表１に示した配列番号１〜３１のうちの１つから選択される１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも約９５％同一である１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌からなる。一部の実施形態では、少なくとも１つの精製細菌集団は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｃｃａｅ  ＫＬＥ１９１１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｌａｒｕｓ  ＫＬＥ１９３０；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ  ＫＬＥ１９１２；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ  ＫＬＥ１９３１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１９５８；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  ＫＬＥ１９３２；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＫＬＥ１７７０；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ  ＫＬＥ１９３３；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＫＬＥ１９３４；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＬＥ１９１３；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ  ＫＬＥ１９１０；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＫＬＥ１９３５；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ  ＫＬＥ  １８７９；Ｂｌａｕｔｉａ  ｏｂｅｕｍ  ＫＬＥ１９１４；Ｂｌａｕｔｉａ  ｗｅｘｌｅｒａｅ  ＫＬＥ１９１６；Ｂｕｔｙｒｉｃｉｍｏｎａｓ  ｖｉｒｏｓａ  ＫＬＥ１９３８；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ＫＬＥ１９３７；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ  ＫＬＥ１９３９；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＬＥ１８６２；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＬＥ１９１８；Ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＬＥ１７７９；Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＫＬＥ１８８０；Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ  ＫＬＥ１９１７；Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ  ＫＬＥ１９２６；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ  ＫＬＥ１９２２；Ｇｏｒｄｏｎｉｂａｃｔｅｒ  ｐａｍｅｌａｅａｅ  ＫＬＥ１９１５；Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＫＬＥ１９２８；Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ  ＫＬＥ２０２０；Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ  ＫＬＥ１８６３；Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｎａｖｕｓ  ＫＬＥ１９４０；Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ  ＫＬＥ１９４１、およびこれらの組合せからなる群から選択される細菌からなる。
【００２７】
一部の実施形態では、少なくとも１つの精製細菌集団は、表２に示した配列番号３２〜２７４のうちの１つから選択される１６ＳｒＤＮＡ配列と少なくとも約９５％同一である１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌からなる。
【００２８】
一部の実施形態では、少なくとも１つの細菌集団は、表１０に示した配列番号３０５〜２２１７のうちのいずれか１つと少なくとも約９５％同一である１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌からなる。
【００２９】
一部の実施形態では、少なくとも１つの精製細菌集団は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、またはこれらの組合せから選択される酵素をコードするＤＮＡ配列を含む細菌からなる。
【００３０】
一部の実施形態では、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、またはこれらの組合せは、表３に示した配列番号２７５〜３０４のうちの１つから選択されるＤＮＡ配列と少なくとも７０％類似するＤＮＡ配列でコードされている。
【００３１】
一部の実施形態では、グルタミン酸デカルボキシラーゼは、表４に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている。一部の実施形態では、プトレシンアミノトランスフェラーゼは、表５に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている。一部の実施形態では、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、表６に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている。一部の実施形態では、アルギニンデカルボキシラーゼは、表７に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている。一部の実施形態では、アグマチナーゼは、表８に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている。一部の実施形態では、オルニチンデカルボキシラーゼは、表９に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている。
【００３２】
一部の実施形態では、細菌は、ＧＡＢＡを生成するように遺伝子操作されている。一部の実施形態では、細菌は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、またはこれらの組合せの発現を介してＧＡＢＡを生成するように操作されている。
【００３３】
一部の実施形態では、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、またはこれらの組合せは、表３に示した配列番号２７５〜３０４のうちの１つから選択されるＤＮＡ配列において少なくとも７０％類似するＤＮＡ配列でコードされている。
【００３４】
一部の実施形態では、グルタミン酸デカルボキシラーゼは、表４に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている。一部の実施形態では、プトレシンアミノトランスフェラーゼは、表５に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている。一部の実施形態では、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、表６に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている。一部の実施形態では、アルギニンデカルボキシラーゼは、表７に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている。一部の実施形態では、アグマチナーゼは、表８に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている。一部の実施形態では、オルニチンデカルボキシラーゼは、表９に見られるＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤを有する遺伝子と、ＤＮＡ配列において少なくとも９５％類似するＤＮＡ配列でコードされている。
【００３５】
一部の実施形態では、少なくとも１つの精製細菌集団は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７、またはこれらの組合せからなる群から選択される基準細菌と少なくとも９５％の類似性を有する１６ＳｒＤＮＡ配列を含む細菌からなる。
【００３６】
一部の実施形態では、細菌集団は、生理学的に適切なｐＨでＧＡＢＡを生成することができる細菌からなる。一部の実施形態では、細菌集団は、約４．５から約７．５の間のｐＨ範囲でＧＡＢＡを生成することができる細菌からなる。一部の実施形態では、細菌集団は、ヒトの腸の内側でＧＡＢＡを生成することができる細菌からなる。一部の実施形態では、組成物は、糞便移植として投与される。一部の実施形態では、組成物は、プロバイオティクスとして投与される。一部の実施形態では、細菌は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、およびこれらの組合せの任意の組合せの発現を介してＧＡＢＡを生成することができる。
【００３７】
一部の実施形態では、少なくとも１つの細菌株は、ＧＡＢＡ消費細菌に対して細胞毒性または細胞増殖抑制性である。一部の実施形態では、ＧＡＢＡ消費細菌は、Ｅｖｔｅｐｉａ  ｇａｂａｖｏｒｏｕｓまたはＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＭＧＳ：１１４である。
【００３８】
一部の実施形態では、対象を処置する方法は、対象の便のＧＡＢＡの初期量を測定することにより、対象が内因性ＧＡＢＡの増加から利益を得るかどうかを決定することによって、処置を必要とする対象を特定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、対象の便のＧＡＢＡの初期量は、湿便または乾燥便１グラム当たり約８μｇ未満である。一部の実施形態では、対象の便のＧＡＢＡの量は、治療用組成物を投与した後、初期量に対して増加している。
【００３９】
一部の実施形態では、対象を処置する方法は、対象の便のＧＡＢＡ生成細菌の初期量を測定することにより、対象が内因性ＧＡＢＡの増加から利益を得るかどうかを決定することによって、処置を必要とする対象を特定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、対象の便のＧＡＢＡ生成細菌の初期量は、１６Ｓ配列マッピングで測定した全細菌の約１０％未満である。一部の実施形態では、少なくとも１種のＧＡＢＡ生成細菌は、治療用組成物を投与した後、対象の便のＧＡＢＡ生成細菌の初期量に対して対象の便において増加している。
【００４０】
一部の実施形態では、対象を処置する方法は、対象の血液または血清のＧＡＢＡの初期量を測定することにより、対象が内因性ＧＡＢＡの増加から利益を得るかどうかを決定することによって、処置を必要とする対象を特定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、対象の血液または血清のＧＡＢＡの量は、血液１リットル当たり約１０μｇ未満である。一部の実施形態では、対象の血液または血清のＧＡＢＡの量は、治療用組成物を投与した後、初期量に対して増加している。
【００４１】
一部の実施形態では、対象を処置する方法は、対象の脳のＧＡＢＡの量を測定することにより、対象が内因性ＧＡＢＡの増加から利益を得るかどうかを決定することによって、処置を必要とする対象を特定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、対象の脳のＧＡＢＡの量は、約１．０ｍＭ／ｋｇ未満である。一部の実施形態では、対象の脳のＧＡＢＡの量は、治療用組成物を投与した後、初期量に対して増加している。
【００４２】
一部の実施形態では、対象を処置する方法は、対象の便のＧＡＢＡ生成酵素発現の初期量を測定することにより、対象が内因性ＧＡＢＡの増加から利益を得るかどうかを決定することによって、処置を必要とする対象を特定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＧＡＢＡ生成酵素は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アグマチナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、およびこれらの組合せから選択される。一部の実施形態では、酵素発現の初期量は、ｑＰＣＲで測定される。一部の実施形態では、酵素発現は、治療用組成物を投与した後、酵素発現の初期量に対して増加している。
【００４３】
一部の実施形態では、対象を処置する方法は、対象の脳のＧＡＢＡ作動性応答の初期量を測定することにより、対象が内因性ＧＡＢＡの増加から利益を得るかどうかを決定することによって、処置を必要とする対象を特定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、対象の脳のＧＡＢＡ作動性応答の量は、治療用組成物を投与した後、初期量に対して増加している。一部の実施形態では、治療用組成物は、ＧＡＢＡ生成細菌の成長またはＧＡＢＡ生成を刺激することができるプレバイオティクスを含む。
【００４４】
一態様では、本開示は、ＧＡＢＡ依存性細菌を培養する方法であって、少なくとも１種の生存するＧＡＢＡ依存性細菌細胞を適切な基質上に配置するステップ、およびＧＡＢＡの供給源を提供するステップを含む方法を提供する。
【００４５】
一部の実施形態では、適切な基質は寒天である。一部の実施形態では、ＧＡＢＡの供給源を提供するステップは、別の細菌株と共培養することを含み、前記菌株はＧＡＢＡを生成することができる。一部の実施形態では、ＧＡＢＡは基質に加えられる。一部の実施形態では、ＧＡＢＡ依存性細菌は、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓである。
【００４６】
一態様では、本開示は、ヒトの腸管の生理学的に適切なｐＨでＧＡＢＡを生成することができる細菌株（単数または複数）を特定する方法であって、
（ａ）ＧＡＢＡ生成細菌を含有すると考えられる試料を基質内に分散させるステップであって、基質が少なくとも部分的にＧＡＢＡ透過性であるステップと、
（ｂ）潜在的ＧＡＢＡ生成細菌を添加した基質をＧＡＢＡ依存性細菌と接触させるステップと、
（ｃ）基質において、潜在的ＧＡＢＡ生成細菌の周囲のＧＡＢＡ依存性細菌のコロニーの形成を観察することによって、ＧＡＢＡ生成細菌を特定するステップと
を含む方法を提供する。
【００４７】
一部の実施形態では、基質は、ヒトの胃腸管で見られる生理学的範囲にｐＨを維持するために緩衝されている。一部の実施形態では、ＧＡＢＡ依存性細菌は、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓである。一部の実施形態では、ｐＨ範囲は、約４．５から約７．５の間である。
【００４８】
本開示は、対象の精神疾病または中枢神経系の疾患を処置するための組成物および方法、ならびに同じ目的のための治療用組成物を提供する。方法は、対象に、生理学的に適切なｐＨで対象の腸内で内因性ＧＡＢＡを生成することができる１種の細菌および／または複数種の細菌を投与するステップを含む場合がある。本発明の技術は、不要な副作用を有する可能性のある合成医薬（例えば、抗うつ剤）の補助なしで、または既存の医薬と組み合わせて、精神疾病または中枢神経系の疾患の症状を緩和する利益を有する場合がある。さらに、本発明の技術は、腸運動を改善する、および胃腸管疼痛を低減するなど、対象の消化の健康をさらに改善するという利点を有する場合がある。本発明の技術のさらなる特徴および利点は、以下の発明の詳細な説明を読めば当業者にとって明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１Ａは、以前に培養できなかった細菌を成長させ、特定するための共培養アッセイを示す。
【００５０】
図１Ｂは、ヘルパー細菌Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８の存在下でのＥｖｔｅｐｉａ  ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長を示す。
【００５１】
【図２Ａ】図２Ａは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ由来の上清の存在下でのＥｖｔｅｐｉａ  ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長を示す。
【００５２】
【図２Ｂ】図２Ｂは、エンプティビヒクルの存在下でのＥｖｔｅｐｉａ  ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長の欠如を示す。
【００５３】
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８由来の上清の最も極性の高い画分の存在下でのＥｖｔｅｐｉａ  ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの成長を示す。
【００５４】
【図２Ｄ】図２Ｄは、エンプティビヒクルの存在下でのＥｖｔｅｐｉａ  ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長の欠如についての近接図を示す。
【００５５】
【図２Ｅ】図２Ｅは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８由来の上清の存在下でのＥｖｔｅｐｉａ  ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長についての近接図を示す。
【００５６】
【図２Ｆ】図２Ｆは、エンプティビヒクルの存在下（細菌培地）でのＥｖｔｅｐｉａ  ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長の欠如についての近接図を示す。
【００５７】
【図２Ｇ】図２Ｇは、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８に対する潜在的成長因子の表を示し、緑は成長の誘導を示す。
【００５８】
【図３】図３は、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の提案されたＧＡＢＡ代謝を示す。
【００５９】
【図４Ａ】図４ａは、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８のＧＡＢＡ生成が、５．５およびそれより低いｐＨでのみ観察されることを示し、細菌のある特定の菌株または種について、ＧＡＢＡ生成に関する酸性ｐＨの重要性を強調する。
【００６０】
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８のＧＡＢＡ要件を使用して、４．５から７．５の間のｐＨで、ＧＡＢＡを生成することができるＧＡＢＡ生成細菌の特定に関するアッセイを示す。培地は、所望の範囲のｐＨを維持し、ヒトの腸に相当する生理学的ｐＨでＧＡＢＡを生成することができる細菌株を特定するために、緩衝される程度が非常に高い。
【００６１】
【図４Ｃ】図４Ｃは、本明細書の方法で特定される、約４．５から約７．５のｐＨでＧＡＢＡを生成することができるＧＡＢＡ生成株の系統樹を示す。
【００６２】
【図５】図５は、実施例７に記載されているスクリーニングを使用して特定されたいくつかの菌株のＧＡＢＡ生成能を示す。ｐＨ条件の範囲で、ＧＡＢＡを生成する生物の能力が強調される。
【００６３】
【図６Ａ】図６Ａは、グルタミン酸デカルボキシラーゼｇａｄＡを発現するように操作されたＥ．ｃｏｌｉの存在下でのＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長を示す。
【００６４】
【図６Ｂ】図６Ｂは、グルタミン酸デカルボキシラーゼｇａｄＢを発現するように操作されたＥ．ｃｏｌｉの存在下でのＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長を示す。
【００６５】
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＧＡＢＡを生成することが知られるＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８の存在下でのＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長を示す。
【００６６】
【図６Ｄ】図６Ｄは、グルタミン酸デカルボキシラーゼｇａｄＣを発現するように操作されたＥ．ｃｏｌｉの存在下でのＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長の非存在を示す。
【００６７】
【図６Ｅ】図６Ｅは、エンプティベクターの存在下でのＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長の非存在を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
発明の詳細な説明
本開示は、対象の疾患の症状を処置するかまたは減少させるための組成物および方法に関する。疾患は、精神疾病または中枢神経系の疾患でありうる。精神疾病または中枢神経系の疾患を有する対象を特定した後、方法は、例えば、対象の便、血液、血清、もしくは他の体液のＧＡＢＡの量を測定すること、脳の様々な領域のＧＡＢＡのレベルを測定すること、脳の様々な領域のＧＡＢＡ作動性応答を測定すること、便のＧＡＢＡ生成酵素の活性を測定することによって、または対象の便のＧＡＢＡ生成細菌の量を測定することによって、対象が内因性ＧＡＢＡの増加から利益を得るかどうかを決定することを含みうる。方法は、対象に、対象の腸内で（例えば、腸の生理学的に適切なｐＨで）ＧＡＢＡを生成することができる可能性のあるＧＡＢＡ生成細菌（単数または複数）を投与するステップをさらに含みうる。
【００６９】
一部の細菌は、ガンマ−アミノブチレートからＧＡＢＡを生成し、酸ストレスを克服するために細胞内ｐＨホメオスタシスを維持する。本明細書に示されるように、ヒトの腸内の微生物（例えば、細菌）によるＧＡＢＡの生成は、対象の健康に影響を与えうる。例えば、ヒトの腸内で細菌により生成されるＧＡＢＡは、精神疾病、中枢神経系の疾患を処置するか、または対象の胃腸の健康を改善するための神経伝達物質として作用することができる。
定義
【００７０】
本明細書で使用される場合、「投与する」および「投与」は、ある特定の方式でおよび／またはある特定の目的で、１人のヒトが別のヒトに細菌または細菌組成物を消費させるよう仕向ける実施形態、ならびにまた、第２のヒトから受けた任意の指示とは無関係にまたはそれとは相違して、ある特定の方式でおよび／またはある特定の目的で、使用者が細菌または細菌組成物を使用する状況を包含する。ある特定の方式でおよび／またはある特定の目的で、１人のヒトが別のヒトに細菌または細菌組成物を消費させるよう仕向ける実施形態の非限定例として、医師が患者に一連の実施および／または処置を処方する場合、親が未成年の使用者（子供など）に細菌または細菌組成物を消費するよう命じる場合、トレーナーが使用者（運動選手など）に特定の実施および／または処置に従うよう勧める場合、ならびに製造業者、流通業者、または販売業者が、例えば、製品の売買または販売に関連して提供されるパッケージまたは他の材料への広告またはラベルにより、最終消費者に使用の条件を推奨する場合が挙げられる。
【００７１】
用語「単離した」は、（１）最初に生成された際に、関連する成分（天然ではヒトの便など、実験設定では人工成長培地からなるペトリプレートなど）の少なくとも一部から分離された、ならびに／または（２）ヒトの手で生成され、調製され、精製され、および／もしくは製造された細菌または他の実体もしくは物質を包含する。単離した細菌は、最初に関連した他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれより多くから分離されてもよい。一部の実施形態では、単離した細菌は、約８０％を超えて、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を超えて純粋である。本明細書で使用される場合、他の成分（他の細菌種など）を実質的に含まなければ、物質は「純粋」である。用語「精製する」、「精製すること」および「精製した」は、細菌培養の当業者によって認識されるように、最初に生成されたかもしくは生じた場合（例えば、天然に生じると実験設定で生じるとを問わず）、または最初の生成後の任意の時間の間のいずれかに、関連する成分の少なくとも一部から分離された細菌または他の材料を指す。細菌または細菌集団は、例えば、細菌または細菌集団を含有する材料または環境から、生成の際または生成後に単離される場合に、精製されたとみなしてよく、精製細菌または細菌集団は、最大約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％の、または約９０％を超えて他の材料を含有してもよく、依然として「単離された」とみなされる。一部の実施形態では、精製細菌および細菌集団は、約８０％を超えて、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を超えて純粋である。本明細書で提供される細菌組成物の例では、組成物中に存在する１種または複数の細菌型は、生成された、および／またはこの細胞型を含有する材料もしくは環境に存在する１種または複数の他の細菌から独立して精製することができる。細菌組成物およびその細菌成分は、一般的に、残留する生育地産物から精製されている。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「プロバイオティクス」は、世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）によって現在定義されているように、「適正な量で投与された場合に、宿主に健康上の利益を与える生存微小生物」を意味するものと理解される。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「プレバイオティクス」は、宿主に利益を与える場合のある（または与えない場合もある）胃腸細菌叢の組成および／または活性を特異的に変化させる成分を意味するものと理解される。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「医療食」は、オーファンドラッグ法（Ｏｒｐｈａｎ  Ｄｒｕｇ  Ａｃｔ）（２１Ｕ．Ｓ．Ｃ．３６０ｅｅ（ｂ）（３））の５（ｂ）によって定義されているように、「医師の監督下で消費されるかまたは経腸投与されるように配合され、認識される科学原理に基づいて、特有の栄養所要量が医学的評価により確立されている疾患または状態の特定の食事管理を意図する食物」を意味するものと理解される。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「初期量」は、対象へのＧＡＢＡ生成細菌の投与前の試料のアリコートにおける物質、例えば、ＧＡＢＡの量を意味するものと理解される。初期量は、濃度について測定することができる。例えば、初期量は、試料１ミリリットル当たりの物質のマイクログラム、例えば、血液または血清１ミリリットル当たりのＧＡＢＡのマイクログラム（ＧＡＢＡのμｇ／血液または血清１ｍＬ）について測定することができる。初期量は、例えば、ＧＡＢＡ生成細菌の投与前の前頭前野などの脳の領域のＧＡＢＡの量として測定することもできる。ＧＡＢＡの量は、組織１ｋｇ当たりのＧＡＢＡのミリモル（脳組織１ｋｇ当たりのＧＡＢＡのｍｍｏｌ）について表すことができる。初期量は、例えば、対象へのＧＡＢＡ生成細菌の投与前の対象の便試料のＧＡＢＡの量として測定することもできる。ＧＡＢＡの量は、便１グラム当たりのＧＡＢＡのマイクログラム（ＧＡＢＡのμｇ／便１ｇ）について表すことができる。初期量は、ｑＰＣＲまたは他の適当な方法によって測定される、便のＧＡＢＡ生成酵素の発現レベル（読み取り値の対数変化）である場合もある。本明細書で他に定義されていなければ、便は、湿っているかまたは乾燥している場合、すなわち、積極的に乾燥させることなく、便が生成されて１時間以内に秤量される。例えば、便は、便の生成から４５分、３０分、１５分、１０分以内、または５分以内に秤量することができる。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「ＧＡＢＡ作動性応答」は、所与の器官（例えば、脳または迷走神経）が曝露されるＧＡＢＡ、ＧＡＢＡ生成細菌、またはプレバイオティクスの濃度の差に対する所与の器官の応答を意味する。ＧＡＢＡ作動性応答として、ＧＡＢＡの濃度変化ならびに様々なＧＡＢＡＡ、ＧＡＢＡＢ、および／またはＧＡＢＡＣ受容体の発現レベルおよび／または活性を挙げることができる。
【００７７】
「ＧＡＢＡ生成細菌」は、ＬＣ／ＭＳ、ＥＬＩＳＡ、または他の適当な分析アッセイによって検出される測定可能量のＧＡＢＡを生成することができる細菌を意味するものと理解される。一部の実施形態では、ＧＡＢＡ生成細菌は、ヒトの生理学的条件下、例えば、ヒトの腸のＰＨおよび温度下でＧＡＢＡを生成することができる。
【００７８】
ヒトの腸管の「生理学的に適切なｐＨ」は、体内に存在するｐＨ範囲を意味するものと理解される。例えば、ヒトの腸に対して生理学的に適切であるｐＨ範囲は、約４．５から約７．５の範囲内でありうる。
【００７９】
用語「腸」は、消化管としても公知の、ヒトの胃腸管を指すものと理解される。腸として、口腔、咽頭、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（盲腸および結腸）および直腸が挙げられる。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）」または「細菌株（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｔｒａｉｎ）」は、細菌の種を意味するものと理解される。「細菌（ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）」は、所与の種の単一の細菌細胞として理解される。
【００８１】
対象に関して、用語「処置すること」は、対象の障害の少なくとも１つの症状を改善することを指す。処置することとして、障害を治癒させること、改善すること、または少なくとも部分的に軽快させることが挙げられる。
【００８２】
用語「ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ  ＩＤ」は、欧州分子生物学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（ＥＭＢＬ）、ＧｅｎＢａｎｋ、または日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）などのデータベースに関して、それらのそれぞれのインターネットウェブサイトを介して、入力して使用する場合に、遺伝子のヌクレオチド配列、およびそのゲノムにおいてその配列をコードする細菌などの情報にアクセスすることができる受託番号を指す。ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ  ＩＤは、この出願において、配列情報にアクセスする簡便な手段として使用される。
ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）
【００８３】
用語「ＧＡＢＡ」は、ガンマ−アミノ酪酸（γ−アミノ酪酸）を意味するものと理解される。ＧＡＢＡは、化学構造：
【化１】
2019508479.tif 000002
を有する。
【００８４】
ＧＡＢＡは、哺乳動物の中枢神経系の主要な阻害神経伝達物質である。ＧＡＢＡは、神経系全体にわたる神経興奮性を低減するのに主な役割を果たす。ＧＡＢＡは、流出および半減期の制限により、治療上送達しにくい化合物でありうる。例えば、げっ歯類では、ＧＡＢＡの脳における流出量は、流入量より１７倍高いことが見出された。さらに、ＧＡＢＡは、マウスではわずか１７分の半減期しか有さない。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＡＢＡの半減期が短いため、徐放性カプセル剤を用いた場合でさえ、頻度の高い投与が要求される場合があるため、経口によるＧＡＢＡの補給は有効ではない可能性がある。
【００８５】
本開示は、一貫してＧＡＢＡを体循環へと（例えば、神経系へと）送達するために、腸管内でＧＡＢＡを生成することができる１種または複数の細菌の治療用組成物を送達することを提供する。内因的に生成されたＧＡＢＡはまた、迷走神経受容体を直接活性化することができる。このことにより、ＧＡＢＡの本来の半減期が減じる場合がある。
【００８６】
一部の実施形態では、ミクロビオームは、脳内のＧＡＢＡレベルおよびＧＡＢＡ作動性応答に影響を与えうる。例えば、無菌動物では、管腔および血清のＧＡＢＡレベルが実質的に低減していることがある。理論に拘泥されることを望むものではないが、このことは、ミクロビオームが、この重要な神経伝達物質レベルを調節するのに重要であることを示唆する。本明細書に示されるように、ミクロビオームの介入（例えば、本明細書に記載されている方法および組成物を使用すること）によるＧＡＢＡ作動性のモジュレーションが治療上の有効性を有する可能性がある。
【００８７】
一部の実施形態では、ＧＡＢＡは、精神疾病または中枢神経系の疾患において、役割を果たすことができる。例えば、一部の実施形態では、ＧＡＢＡレベルが低いと、うつ病、双極性障害、統合失調症、不安、不安障害、嗜癖、ソーシャルホビア、処置抵抗性大うつ病障害（ＴＲ−ＭＤＤ）、大うつ病障害およびそのサブタイプ（メランコリー型うつ病、非定型うつ病、緊張病性うつ病、産後うつ病、および季節性感情障害）、神経変性アミロイド障害（パーキンソン、アルツハイマー、およびハンチントン病）、起立性振戦、ラフォラ病、むずむず脚症候群、神経障害性疼痛、疼痛障害、認知症、てんかん、スティッフパーソン症候群、月経前不快気分障害、自閉症スペクトラム障害、睡眠障害、ならびに注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）を伴う可能性がある。本明細書に示されるように、本開示は、対象の内因性ＧＡＢＡの量を増加させることを提供し、対象の精神疾病または中枢神経系の疾患のレベルを低下させることができる。
【００８８】
一部の実施形態では、腸内細菌によって生成されたＧＡＢＡは、腸管を末梢および中枢神経系に接続する迷走神経を介して、精神疾病または中枢神経系の疾患において役割を果たすことができる。
【００８９】
一部の実施形態では、腸内細菌によって生成されたＧＡＢＡは、末梢および中枢神経系に影響を与える可能性のある、宿主の全身のＧＡＢＡの循環レベルに影響を及ぼすことにより、精神疾病または中枢神経系の疾患において役割を果たすことができる。
微生物によるＧＡＢＡ生成手段
【００９０】
細菌は、種々の異なる経路を使用してＧＡＢＡを生成することができる。細菌および他の微生物がＧＡＢＡを生成するために使用することができる代表的な経路（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで）を以下に示す。以下に示すように、本明細書に記載されているＧＡＢＡ生成経路のいずれかは、所与の細菌において天然に存在する場合がある。あるいは、必要な酵素または酵素群を細菌のＤＮＡ配列に加えて、細菌にＧＡＢＡを生成させることを可能とすることができる。
グルタミン酸経路
【００９１】
一部の実施形態では、微生物は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ酵素（例えば、グルタミン酸デカルボキシラーゼＥＣ４．１．１．１５）を使用してＧＡＢＡを生成することができる。一部の実施形態では、グルタミン酸デカルボキシラーゼは、グルタメートをＧＡＢＡに直接変換することができる。
プトレシンの４−アミノブタナールへの経路
【００９２】
一部の実施形態では、微生物は、プトレシンの４−アミノブタナールへの経路を使用してＧＡＢＡを生成することができる。次いで、微生物は、４−アミノブタナールをＧＡＢＡに変換することができる。一部の実施形態では、プトレシンアミノトランスフェラーゼ（例えば、プトレシンアミノトランスフェラーゼＥＣ２．６．１．８２）を使用して、プトレシンを４−アミノブタナールに変換することができる。次いで、４−アミノブタナールを、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（例えば、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１９））の存在下で、ＧＡＢＡに変換することができる。
アルギニンのアグマチンへの、さらにプトレシンへの経路
【００９３】
一部の実施形態では、微生物は、アルギニンのアグマチンへの、さらにプトレシンへの経路を使用してＧＡＢＡを生成することができる。プトレシンが生成されると、プトレシンは、上述のように（例えば、プトレシンの４−アミノブタナールへの経路を使用して）ＧＡＢＡに変換されうる。一部の実施形態では、アルギニンデカルボキシラーゼ（例えば、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１９））はアルギニンをアグマチンに変換することができる。次いで、アグマチンは、アグマチナーゼ（例えば、アグマチナーゼ（ＥＣ３．５．３．１１））を使用してプトレシンに変換されうる。
Ｌ−オルニチンのプトレシンへの経路
一部の実施形態では、オルニチンデカルボキシラーゼ（例えば、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１７））を使用してオルニチンをプトレシンに変換することができる。プトレシンが生成されると、プトレシンは、上述のように（例えば、プトレシンの４−アミノブタナールへの経路を使用して）ＧＡＢＡに変換されうる。
細菌株
【００９４】
本開示は、細菌株（例えば、精製菌株）およびそれを必要とする対象に投与するためのこの細菌株を含む治療用組成物を提供する。細菌は、天然に存在しうるか、またはＧＡＢＡを生成するように操作する（例えば、菌株の工学的操作または淘汰を介して）ことができる。一部の実施形態では、ＧＡＢＡ生成細菌のうちの１種の菌株を対象に投与することができる。一部の実施形態では、ＧＡＢＡ生成細菌のうちの複数種の菌株を、それを必要とする対象に投与することができる。一部の実施形態では、１種または複数の細菌（例えば、精製細菌）は、相乗的に作用することができる。例えば、複数種の細菌は、相乗的に作用して高レベルのＧＡＢＡを生成することができる。一部の実施形態では、１種または複数の細菌は、ヒトの腸内のＧＡＢＡ消費細菌の数を低減するのに役立つ場合もある。したがって、本明細書で教示されているＧＡＢＡ生成細菌のうちのいずれか１種、または任意の組合せを、それを必要とする対象に投与することができる。
【００９５】
一部の実施形態では、本明細書で教示されている細菌は、ヒトの腸の条件下のような生理学的に適切な条件でＧＡＢＡを生成することができる。一部の実施形態では、本明細書で教示されているＧＡＢＡ生成細菌はＧＡＢＡを生成することができ、ヒトの腸にとって適切なｐＨは、約４．５から約７．５の間である。例えば、ｐＨは、約４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、または約４．５から７．５の間の任意の値でありうる。
【００９６】
生理学的に適切なｐＨでＧＡＢＡを生成する能力は、多くの細菌のＧＡＢＡ生成のｐＨによる制限の点から重要である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、ｐＨ４．５を超えるとＧＡＢＡを生成することができない。代わりに、理論に拘泥されることを望むものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉは、例えば、細胞内環境を中和する手段として、ＧＡＢＡの搬出とカップルしたグルタメートのＧＡＢＡへの変換を使用することができる。したがって、本開示は、より中性に近い大腸など（例えば、約ｐＨ４．５から約ｐＨ７．５の間）の宿主の環境にとって適切なｐＨでＧＡＢＡを生成することができる細菌を提供する。一部の実施形態では、本明細書で教示されている細菌は、ヒトの腸内に存在する他の適切な条件下でＧＡＢＡを生成することもできる。すなわち、本明細書で教示されているＧＡＢＡ生成細菌は、酸素の非存在下、栄養競合および変動環境、ならびに光の非存在下でＧＡＢＡを生成することができる。
天然の菌株
【００９７】
一部の実施形態では、ＧＡＢＡ生成細菌は、表１に列挙され、配列番号１〜３１を有する基準細菌の１６Ｓ配列と実質的に類似する１６Ｓ核酸配列を有することによって特定することができる。一部の実施形態では、ＧＡＢＡ生成細菌は、表１で与えられる１６Ｓ配列と少なくとも９０％の１６Ｓ配列類似性（例えば、少なくとも９１％の類似性、少なくとも９２％の類似性、少なくとも９３％の類似性、少なくとも９４％の類似性、少なくとも９５％の類似性、少なくとも９６％の類似性、少なくとも９７％の類似性、少なくとも９８％の類似性、少なくとも９９％の類似性、少なくとも９９．５％の類似性、少なくとも９９．９％の類似性、または１００％の類似性）を有する可能性がある。
【００９８】
一部の実施形態では、ＧＡＢＡ生成細菌は、それらが１６Ｓ配列によって最も関連付けられる生物のＮＣＢＩ  Ｔａｘｏｎ  ＩＤによって特定することができる。これらの細菌として、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｃｃａｅ  ＫＬＥ１９１１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｌａｒｕｓ  ＫＬＥ１９３０；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｏｒｅｉ  ＫＬＥ１９１２；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ  ＫＬＥ１９３１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１９５８；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  ＫＬＥ１９３２；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＫＬＥ１７７０；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ  ＫＬＥ１９３３；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＫＬＥ１９３４；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＫＬＥ１９１３；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ  ＫＬＥ１９１０；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＫＬＥ１９３５；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ  ＫＬＥ  １８７９；Ｂｌａｕｔｉａ  ｏｂｅｕｍ  ＫＬＥ１９１４；Ｂｌａｕｔｉａ  ｗｅｘｌｅｒａｅ  ＫＬＥ１９１６；Ｂｕｔｙｒｉｃｉｍｏｎａｓ  ｖｉｒｏｓａ  ＫＬＥ１９３８；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ＫＬＥ１９３７；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ  ＫＬＥ１９３９；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＬＥ１８６２；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＫＬＥ１９１８；Ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＬＥ１７７９；Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＫＬＥ１８８０；Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ  ＫＬＥ１９１７；Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ  ＫＬＥ１９２６；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ  ＫＬＥ１９２２；Ｇｏｒｄｏｎｉｂａｃｔｅｒ  ｐａｍｅｌａｅａｅ  ＫＬＥ１９１５；Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＫＬＥ１９２８；Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ  ＫＬＥ２０２０；Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ  ＫＬＥ１８６３；Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｎａｖｕｓ  ＫＬＥ１９４０；Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ  ＫＬＥ１９４１、およびこれらの組合せと同一のＮＣＢＩ  Ｔａｘｏｎの割当てに属するものが挙げられる。
【表１】
2019508479.tif 000003
【００９９】
ＧＡＢＡを生成することができる（例えば、生理学的に適切な条件下および／またはヒトの腸内で）と予測される細菌も本明細書で開示されている。細菌は、それらのゲノムに、ＧＡＢＡ生合成に関与する酵素をコードしていた場合に、ＧＡＢＡ生成細菌の候補として特定される。一部の実施形態では、ＧＡＢＡを生成することができると予測される細菌は、表２に列挙され、配列番号３２〜２７４を有する基準細菌の１６Ｓ配列と実質的に類似する１６Ｓ核酸配列を有することによって特定することができる。一部の実施形態では、予測されるＧＡＢＡ生成細菌は、表２で与えられ、配列番号３２〜２７４を有する１６Ｓ配列と少なくとも９０％の１６Ｓ配列類似性（例えば、少なくとも９１％の類似性、少なくとも９２％の類似性、少なくとも９３％の類似性、少なくとも９４％の類似性、少なくとも９５％の類似性、少なくとも９６％の類似性、少なくとも９７％の類似性、少なくとも９８％の類似性、少なくとも９９％の類似性、少なくとも９９．５％の類似性、少なくとも９９．９％の類似性、または１００％の類似性）を有する可能性がある。
【表２−１】
2019508479.tif 000004
【表２−２】
2019508479.tif 000005
【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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操作された菌株
【０１００】
一部の実施形態では、細菌は、ＧＡＢＡを生成するように操作することができる（例えば、ヒトの腸の条件下で）。細菌は、分子生物学の技術を使用して操作される場合があり、またはヒトの腸でＧＡＢＡを生成するように、淘汰のプロセスを使用して進化させることができる。
【０１０１】
上記に示されるように、ＧＡＢＡは、微生物細胞内の複数の経路で生成されうる。例えば、ＧＡＢＡは、グルタメート経路、プトレシンの４−アミノブタナールへの経路、アルギニンのアグマチン、さらにプトレシンへの経路、Ｌ−オルニチンのプトレシンへの経路、または経路の組合せによって生成されうる。一部の実施形態では、細菌は、細菌にＧＡＢＡまたはＧＡＢＡに必要な前駆体を生成させることができる上記経路のうちのいずれか１つにおいて１種または複数の酵素を含有するように操作することができる。
【０１０２】
様々な異なる宿主細菌は、ＧＡＢＡを生成するように操作することができる。例えば、一部の実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７は、ＧＡＢＡを生成するように遺伝子改変するかまたは進化により淘汰することができる。一部の実施形態では、細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７）は、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡまたはグルタミン酸デカルボキシラーゼＢを発現または過剰発現するように改変することができる。細菌は、本明細書に記載されている他の経路のうちの１つまたは複数によってＧＡＢＡを生成するように作製される場合もある。
【０１０３】
したがって、一部の実施形態では、操作されたＧＡＢＡ生成菌株をそのゲノムにコードされている特異的酵素を有するものとして特定することができる。例えば、酵素は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１５）、プトレシンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．８２）、ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１９）、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１９）、アグマチナーゼ（ＥＣ３．５．３．１１）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１７）、またはこれらの組合せでありうる。一部の実施形態では、ＧＡＢＡ生成菌株は、表３に列挙されている代表的な配列と少なくとも５０％の類似性（例えば、少なくとも６０％の類似性、少なくとも７０％の類似性、少なくとも８０％の類似性、少なくとも９０％の類似性、少なくとも９１％の類似性、少なくとも９２％の類似性、少なくとも９３％の類似性、少なくとも９４％の類似性、少なくとも９５％の類似性、少なくとも９６％の類似性、少なくとも９７％の類似性、少なくとも９８％の類似性、少なくとも９９％の類似性、少なくとも９９．５％の類似性、少なくとも９９．９％の類似性、または１００％の類似性）を有する酵素を含有するように操作することができる。酵素の分類は、酵素（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（ＥＣ））番号で特定され、表３に列挙されている。
【表３】
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【０１０４】
グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１５）の代表例は、以下の表４に与えられており、それらのＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤ番号で特定される。表１０に与えられている細菌のいずれかを表３または表４に示されるグルタミン酸デカルボキシラーゼのいずれかのバージョンを用いて操作することができる。例えば、細菌は、表４に与えられているグルタミン酸デカルボキシラーゼバージョンのいずれかと少なくとも５０％のヌクレオチド類似性（例えば、少なくとも６０％のヌクレオチド類似性、少なくとも７０％のヌクレオチド類似性、少なくとも８０％のヌクレオチド類似性、少なくとも９０％のヌクレオチド類似性、少なくとも９１％のヌクレオチド類似性、少なくとも９２％のヌクレオチド類似性、少なくとも９３％のヌクレオチド類似性、少なくとも９４％のヌクレオチド類似性、少なくとも９５％のヌクレオチド類似性、少なくとも９６％のヌクレオチド類似性、少なくとも９７％のヌクレオチド類似性、少なくとも９８％のヌクレオチド類似性、少なくとも９９％のヌクレオチド類似性、少なくとも９９．５％のヌクレオチド類似性、少なくとも９９．９％のヌクレオチド類似性、または１００％のヌクレオチド類似性）を有するグルタミン酸デカルボキシラーゼ酵素のバージョンを用いて操作することができる。
【表４−１】
2019508479.tif 000012
【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【０１０５】
プトレシンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．８２）の代表例は、以下の表５に与えられており、それらのＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ  ＩＤ番号で特定される。表１０に与えられている細菌のいずれかを表３および表５に示されるプトレシンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．８２）のいずれかのバージョンを用いて操作することができる。例えば、細菌は、表５に与えられているプトレシンアミノトランスフェラーゼバージョンのいずれかと少なくとも５０％のヌクレオチド類似性（例えば、少なくとも６０％のヌクレオチド類似性、少なくとも７０％のヌクレオチド類似性、少なくとも８０％のヌクレオチド類似性、少なくとも９０％のヌクレオチド類似性、少なくとも９１％のヌクレオチド類似性、少なくとも９２％のヌクレオチド類似性、少なくとも９３％のヌクレオチド類似性、少なくとも９４％のヌクレオチド類似性、少なくとも９５％のヌクレオチド類似性、少なくとも９６％のヌクレオチド類似性、少なくとも９７％のヌクレオチド類似性、少なくとも９８％のヌクレオチド類似性、少なくとも９９％のヌクレオチド類似性、少なくとも９９．５％のヌクレオチド類似性、少なくとも９９．９％のヌクレオチド類似性、または１００％のヌクレオチド類似性）を有するプトレシンアミノトランスフェラーゼ酵素のバージョンを用いて操作することができる。
【表５−１】
2019508479.tif 000024
【表５−２】
2019508479.tif 000025
【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【０１０６】
ガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１９）の代表例は、以下の表６に与えられており、それらのＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤ番号で特定される。表１０に与えられている細菌のいずれかを表３および表６に示されるガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１９）のいずれかのバージョンを用いて操作することができる。例えば、細菌は、表６に与えられているガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼバージョンのいずれかと少なくとも５０％のヌクレオチド類似性（例えば、少なくとも６０％のヌクレオチド類似性、少なくとも７０％のヌクレオチド類似性、少なくとも８０％のヌクレオチド類似性、少なくとも９０％のヌクレオチド類似性、少なくとも９１％のヌクレオチド類似性、少なくとも９２％のヌクレオチド類似性、少なくとも９３％のヌクレオチド類似性、少なくとも９４％のヌクレオチド類似性、少なくとも９５％のヌクレオチド類似性、少なくとも９６％のヌクレオチド類似性、少なくとも９７％のヌクレオチド類似性、少なくとも９８％のヌクレオチド類似性、少なくとも９９％のヌクレオチド類似性、少なくとも９９．５％のヌクレオチド類似性、少なくとも９９．９％のヌクレオチド類似性、または１００％のヌクレオチド類似性）を有するガンマ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素のバージョンを用いて操作することができる。
【表６−１】
2019508479.tif 000032
【表６−２】
2019508479.tif 000033
【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
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【表６−８】
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【表６−９】
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【表６−１０】
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【０１０７】
アルギニンデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１９）の代表例は、以下の表７に与えられており、それらのＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤ番号で特定される。表１０に与えられている細菌のいずれかを表３および表７に示されるアルギニンデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１９）のいずれかのバージョンを用いて操作することができる。例えば、細菌は、表７に与えられているアルギニンデカルボキシラーゼバージョンのいずれかと少なくとも５０％のヌクレオチド類似性（例えば、少なくとも６０％のヌクレオチド類似性、少なくとも７０％のヌクレオチド類似性、少なくとも８０％のヌクレオチド類似性、少なくとも９０％のヌクレオチド類似性、少なくとも９１％のヌクレオチド類似性、少なくとも９２％のヌクレオチド類似性、少なくとも９３％のヌクレオチド類似性、少なくとも９４％のヌクレオチド類似性、少なくとも９５％のヌクレオチド類似性、少なくとも９６％のヌクレオチド類似性、少なくとも９７％のヌクレオチド類似性、少なくとも９８％のヌクレオチド類似性、少なくとも９９％のヌクレオチド類似性、少なくとも９９．５％のヌクレオチド類似性、少なくとも９９．９％のヌクレオチド類似性、または１００％のヌクレオチド類似性）を有するアルギニンデカルボキシラーゼ酵素のバージョンを用いて操作することができる。
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
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【表７−９】
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【表７−１０】
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【表７−１１】
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【表７−１２】
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【表７−１３】
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【表７−１４】
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【表７−１５】
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【表７−１６】
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【表７−１７】
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【表７−１８】
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【表７−１９】
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【表７−２０】
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【表７−２１】
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【表７−２２】
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【表７−２３】
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【表７−２４】
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【表７−２５】
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【表７−２６】
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【０１０８】
アグマチナーゼ（ＥＣ３．５．３．１１）の代表例は、以下の表８に与えられており、それらのＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤ番号で特定される。表１０に与えられている細菌のいずれかを表３および表８に示されるアグマチナーゼ（ＥＣ３．５．３．１１）のいずれかのバージョンを用いて操作することができる。例えば、細菌は、表８に与えられているアグマチナーゼバージョンのいずれかと少なくとも５０％のヌクレオチド類似性（例えば、少なくとも６０％のヌクレオチド類似性、少なくとも７０％のヌクレオチド類似性、少なくとも８０％のヌクレオチド類似性、少なくとも９０％のヌクレオチド類似性、少なくとも９１％のヌクレオチド類似性、少なくとも９２％のヌクレオチド類似性、少なくとも９３％のヌクレオチド類似性、少なくとも９４％のヌクレオチド類似性、少なくとも９５％のヌクレオチド類似性、少なくとも９６％のヌクレオチド類似性、少なくとも９７％のヌクレオチド類似性、少なくとも９８％のヌクレオチド類似性、少なくとも９９％のヌクレオチド類似性、少なくとも９９．５％のヌクレオチド類似性、少なくとも９９．９％のヌクレオチド類似性、または１００％のヌクレオチド類似性）を有するアグマチナーゼ酵素のバージョンを用いて操作することができる。
【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【表８−４】
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【表８−５】
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【表８−６】
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【表８−７】
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【表８−８】
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【表８−９】
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【表８−１０】
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【表８−１１】
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【表８−１２】
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【表８−１３】
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【表８−１４】
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【表８−１５】
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【表８−１６】
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【表８−１７】
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【表８−１８】
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【０１０９】
オルニチンデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１７）の代表例は、以下の表９に与えられており、それらのＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ／ＤＤＢＪ  ＩＤ番号で特定される。表１０に与えられている細菌のいずれかを表３および９に示されるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１７）のいずれかのバージョンを用いて操作することができる。例えば、細菌は、表９に与えられているオルニチンデカルボキシラーゼバージョンのいずれかと少なくとも５０％のヌクレオチド類似性（例えば、少なくとも６０％のヌクレオチド類似性、少なくとも７０％のヌクレオチド類似性、少なくとも８０％のヌクレオチド類似性、少なくとも９０％のヌクレオチド類似性、少なくとも９１％のヌクレオチド類似性、少なくとも９２％のヌクレオチド類似性、少なくとも９３％のヌクレオチド類似性、少なくとも９４％のヌクレオチド類似性、少なくとも９５％のヌクレオチド類似性、少なくとも９６％のヌクレオチド類似性、少なくとも９７％のヌクレオチド類似性、少なくとも９８％のヌクレオチド類似性、少なくとも９９％のヌクレオチド類似性、少なくとも９９．５％のヌクレオチド類似性、少なくとも９９．９％のヌクレオチド類似性、または１００％のヌクレオチド類似性）を有するオルニチンデカルボキシラーゼ酵素のバージョンを用いて操作することができる。
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【表９−７】
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【０１１０】
様々な微生物（例えば、細菌）を、ＧＡＢＡを生成するように操作することができる（例えば、表２に示される酵素のうちの１種または複数を操作することによって）。例えば、表１０に示される細菌のいずれかを、ＧＡＢＡを生成するように操作することができる。すなわち、以下の表１０に示されるものと少なくとも５０％類似する１６ＳｒＤＮＡヌクレオチド配列を有する細菌を、ＧＡＢＡを生成するように操作する（例えば、表３〜９の酵素のうちの１種を用いて）ことができる。細菌は、表１０に与えられている１６ＳｒＤＮＡヌクレオチド配列と少なくとも６０％類似する、少なくとも７０％類似する、少なくとも８０％類似する、少なくとも９０％類似する、少なくとも９１％類似する、少なくとも９２％類似する、少なくとも９３％類似する、少なくとも９４％類似する、少なくとも９５％類似する、少なくとも９６％類似する、少なくとも９７％類似する、少なくとも９８％類似する、少なくとも９９％類似する、少なくとも９９．５％類似する、または１００％類似する１６ＳｒＤＮＡ配列を有してもよい。
【０１１１】
実施例８に示すように、Ｅ．ｃｏｌｉは、グルタミン酸デカルボキシラーゼを過剰発現するように操作され、理論に拘泥されることを望むものではないが、これは、操作されたＥ．ｃｏｌｉによるＧＡＢＡの発現を導いた。図６に示すように、操作されたＥ．ｃｏｌｉは、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長を誘導することができた。ＧＡＢＡは、グルタメートの脱炭酸によって、腸の上皮細胞および一部の細菌、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって生成されうる。Ｅ．ｃｏｌｉでは、グルタメートの脱炭酸は細胞内ｐＨを低下させる機序として作用しうるため、一部の実施形態では、ＧＡＢＡ生成は、一般的に、低ｐＨで起こる。
【０１１２】
実施例８に示すように、発現、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのグルタミン酸デカルボキシラーゼ（例えば、ｇａｄＡまたはｇａｄＢ）の過剰発現により、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８に関して見られるレベルまでＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８成長が誘導される。例えば、図６Ａは、グルタミン酸デカルボキシラーゼｇａｄＡを発現するよう操作されたＥ．ｃｏｌｉの存在下で、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８が誘導されることを示す。同様に、図６Ｂは、グルタミン酸デカルボキシラーゼｇａｄＢを発現するよう操作されたＥ．ｃｏｌｉの存在下で、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８が誘導されることを示す。図６Ｃで示すように、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８の存在下で見られるものと質的に類似していた。対照的に、図６Ｄで示すように、Ｅ．ｃｏｌｉが、ＧＡＢＡアンチポーターであるｇａｄＣを発現するよう操作されると、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長は観察されなかった。同様に、エンプティビヒクルの存在下でも、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長は観察されなかった（図６Ｅ）。理論に拘泥されることを望むものではないが、実施例８の結果は、ＧＡＢＡを生成するように細菌を操作することができる（例えば、グルタミン酸デカルボキシラーゼの発現または過剰発現を介して）ことを実証する。一部の実施形態では、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）を、ヒトの腸の内部でＧＡＢＡを生成するように操作することができる。
【０１１３】
一部の実施形態では、本開示は、ＧＡＢＡ生成の１種または複数のリプレッサー（例えば、ｇａｄＸまたはｇａｄＷ）を損なうことも提供する。一部の実施形態では、これらのリプレッサーは、Ｅ．ｃｏｌｉのＧＡＢＡ生成のｐＨによる制限を調節することができ、ネイティブなＧＡＢＡ生成を増加させる方法である。これは、例えば、分子生物学の技術分野の当業者によって公知であるように、遺伝子の欠失、挿入、または置換により達成されうる。
【０１１４】
ＫＬＥ１７３８に関する成長培地のｐＨを変更することによって、ＧＡＢＡ依存性の表現型は変化しなかった。理論に拘泥されることを望むものではないが、このことは、グルタミン酸デカルボキシラーゼを過剰発現するよう細菌を操作することが、ＧＡＢＡを生成し、かつＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの成長を誘導する有効な方法であることを示唆する。
【０１１５】
Ｅ．ｃｏｌｉに加えて、他の細菌を、ＧＡＢＡを生成するように操作することができる（例えば、生理学的に適切なｐＨ、例えば、４．５から７．５の間で）。例えば、表１０に示される細菌のいずれかを、ＧＡＢＡを生成するように操作することができる（例えば、生理学的に適切なｐＨ、例えば、４．５から７．５の間で）。例えば、表３〜９に示される１種または複数の酵素をコードするＤＮＡを含有するように、細菌を操作することができる。列挙されている細菌の１６Ｓヌクレオチド配列に関する配列ＩＤ番号も表１０に示される。一部の実施形態では、ＧＡＢＡを生成するように操作されている細菌は、表１０に与えられている１６Ｓ配列と少なくとも９０％の１６Ｓ配列類似性（例えば、少なくとも９１％の類似性、少なくとも９２％の類似性、少なくとも９３％の類似性、少なくとも９４％の類似性、少なくとも９５％の類似性、少なくとも９６％の類似性、少なくとも９７％の類似性、少なくとも９８％の類似性、少なくとも９９％の類似性、少なくとも９９．５％の類似性、少なくとも９９．９％の類似性、または１００％の類似性）を有する場合がある。
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１０−６】
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【表１０−７】
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【表１０−８】
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【表１０−９】
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【表１０−１０】
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【表１０−１１】
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【表１０−１２】
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【表１０−１３】
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【表１０−１４】
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【表１０−１５】
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【表１０−１６】
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【表１０−１７】
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【表１０−１８】
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【表１０−１９】
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【表１０−２０】
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【表１０−２１】
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【表１０−２２】
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【表１０−２３】
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【表１０−２４】
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【表１０−２５】
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治療用組成物
【０１１６】
本明細書に記載されているＧＡＢＡ生成細菌のいずれか（例えば、天然の細菌または操作された細菌）、またはこれらの任意の組合せ（天然の細菌と操作された細菌の組合せを含む）を治療用組成物に加えることができる。例えば、治療用組成物は、それを必要とする患者に投与して、精神疾病または中枢神経系の疾患の症状を処置または緩和することができる。
菌株の精製
【０１１７】
一部の実施形態では、細菌は、治療用組成物に加える前に精製される。例えば、細菌の集団が実質的に他の細菌を含まない（例えば少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、または少なくとも９８％、少なくとも９９％の、組成物中に望まれる特異的な細菌株（単数または複数）を含有する）ように細菌を精製することができる。
【０１１８】
一部の実施形態では、治療用組成物は、少なくとも１種のＧＡＢＡ生成細菌株を含むプロバイオティクスまたは医療食である。菌株は、例えば、プロバイオティクスとして、カプセル剤、錠剤、カプレット、丸剤、トローチ、ロゼンジ、散剤、および／または顆粒剤として投与することができる。菌株は、医療食として配合することもできる。ＧＡＢＡ生成細菌は、糞便移植または坐剤として投与することもできる。
【０１１９】
一部の実施形態では、治療薬の用量は、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１または１×１０１１より多いコロニー形成単位（ＣＦＵ）の所望の細菌種を含有することができる。例えば、所望の細菌種は、ＧＡＢＡ生成細菌、ＧＡＢＡ消費細菌の成長を阻害することができる細菌、またはこれらの組合せでありうる。
【０１２０】
一部の実施形態では、治療用組成物または投与単位は、胃の酸度で生存して、小腸または大腸に送達することができる腸溶コーティングまたはそれに類似するものを含む薬学的に許容される製剤、プレバイオティクス（例えば、これらに限定されないが、アミノ酸（アルギニン、グルタメート、およびオルニチンを含む）、ビオチン、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ヘミセルロース（例えば、アラビノキシラン、キシラン、キシログルカン、およびグルコマンナン）、イヌリン、キチン、ラクトース、マンナンオリゴ糖、オリゴフルクトース濃縮イヌリン、ガム（例えば、グアーガム、アラビアガムおよびカラギーナン）、オリゴフルクトース、オリゴデキストロース、タガトース、耐性マルトデキストリン（例えば、耐性デンプン）、トランスガラクトオリゴ糖、ペクチン（例えば、キシロガラクトウロナン、シトラスペクチン、アップルペクチン、およびラムノガラクトウロナン−Ｉ）、食物繊維（例えば、ダイズ繊維、サトウダイコン繊維、エンドウ繊維、トウモロコシふすま、およびエンバク繊維）およびキシロオリゴ糖、ポリアミン（例えば、これらに限定されないが、スペルミジンおよびプトレシン）、有効量の抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、もしくは抗寄生虫剤、または上記のものの任意の組合せを含む。例えば、治療用組成物は、ＧＡＢＡ生成細菌の１種または複数の精製菌株を含有するヨーグルトの形態である場合もある。
適応症（ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）
【０１２１】
上記態様のいずれか１つまたは複数の実施形態では、本明細書に記載されている治療用組成物の投与によって処置することができる精神疾病または中枢神経系の疾患は、うつ病、双極性障害、統合失調症、不安、不安障害、嗜癖、ソーシャルホビア、大うつ病障害、処置抵抗性大うつ病障害（ＴＲ−ＭＤＤ）、大うつ病障害およびそのサブタイプ（メランコリー型うつ病、非定型うつ病、緊張病性うつ病、産後うつ病、および季節性感情障害）、神経変性アミロイド障害（パーキンソン、アルツハイマー、およびハンチントン病）、起立性振戦、ラフォラ病、むずむず脚症候群、神経障害性疼痛、疼痛障害、認知症、てんかん、スティッフパーソン症候群、月経前不快気分障害、自閉症スペクトラム障害、睡眠障害、ならびに注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）から選択される。
【０１２２】
一部の実施形態では、方法は、疲労、不眠症、運動機能障害、ストレス、持続性の不安、持続的な悲しみ、社会的ひきこもり、物質離脱、過敏性、希死念慮、自傷念慮、不穏、性欲の低下、集中の欠如、食欲不振、けいれん、記憶喪失、怒り、情動反応の発作、錯乱、疼痛、および筋痙攣からなる群から選択される、対象の精神障害または中枢神経系の疾患の少なくとも１つの症状を減少させることをさらに含む。
処置方法
【０１２３】
本明細書に記載されている治療用組成物は、例えば、精神疾病または中枢神経系の疾患の処置のために、それを必要とする患者に投与することができる。一部の実施形態では、処置方法は、本明細書に記載されている治療用組成物による処置から利益を得ることができる患者を最初に診断するステップを含むことができる。一部の実施形態では、方法は、患者に、本明細書に記載されている治療用組成物を投与するステップをさらに含む。
患者の診断
【０１２４】
一部の実施形態では、精神疾病または中枢神経系の疾患を有する対象を特定するプロセスは、熟練の心理学者、精神病医、または神経学者によって行われうる。例えば、精神病医、心理学者、または神経学者は、精神疾病または中枢神経系の疾患の症状に関する対象の挙動を評価して、精神疾病または中枢神経系の疾患を有する対象を診断することができる。当業者であれば、精神障害の診断と統計マニュアル（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）（ＤＳＭ−５）、（アメリカ精神医学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ））の助けを借りて、対象の精神疾病が特定されうることも理解するであろう。
【０１２５】
１つまたは複数の実施形態では、精神疾病または中枢神経系の疾患を有する対象を特定するプロセスは、精神疾病または中枢神経系の疾患を有する対象を診断することを含むこともできる。一部の実施形態では、精神疾病または中枢神経系の疾患は、ｆＭＲＩを使用して特定または診断される。一部の実施形態では、精神疾病または中枢神経系の疾患は、標準の心理学および神経学調査を用いて、または当分野の専門家に公知の他の方法で特定されうる。
【０１２６】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている治療用組成物を用いる処置を必要とする対象は、対象の血液、血清、便、または他の体液の低いＧＡＢＡレベルを特定することによって特定されうる。一部の実施形態では、対象の便のＧＡＢＡの量（例えば、対象の便のＧＡＢＡの初期量）は、便１グラム当たり約８μｇ未満のＧＡＢＡである。ＧＡＢＡの量は、ＬＣ／ＭＳまたは当技術分野で公知の別の技術によって、便の湿重量または乾燥重量を使用して測定することができる。一部の実施形態では、対象の血液または血清のＧＡＢＡの量（例えば、対象の血液または血清のＧＡＢＡの初期量）は、血液または血清１グラム当たり約１０μｇ／Ｌ＋／−５μｇ／Ｌ未満のＧＡＢＡである（例えば、ＬＣ／ＭＳで測定した場合）。一部の実施形態では、前頭前野、または脳の他のエリアのＧＡＢＡの量は、プロトン磁気共鳴（ＰＭＲ）または別の同様の技術によって測定した場合、約１．０ｍＭ／ｋｇ未満である。
【０１２７】
一部の実施形態では、対象の腸内のＧＡＢＡ生成細菌の割合（例えば、初期量）は、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングまたは定量的ＰＣＲのような方法を使用して、シークエンシングによって測定した場合、全１６Ｓ配列の約１０％を表す。一部の実施形態では、対象の腸内のＧＡＢＡ生成細菌の割合は、対象の腸内で測定される全１６Ｓ配列の約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または約１％未満を表す。
【０１２８】
対象の血液、血清、脳の領域、または便のＧＡＢＡの初期量の決定は、ＧＡＢＡ生成細菌の投与による処置から利益を得ることができる対象を特定する助けとなりうる。一部の実施形態では、血清または血液中のＧＡＢＡの初期量が、１Ｌ当たり１０μｇ未満のＧＡＢＡである対象は、ＧＡＢＡ生成細菌の投与から利益を得ることができる。一部の実施形態では、血清または血液中のＧＡＢＡの初期量が、血液または血清１Ｌ当たり１００μｇ未満、５０μｇ未満、２５μｇ未満、２０μｇ未満、１５μｇ未満、１０μｇ未満、９μ未満、８μｇ未満、７μｇ未満、６μｇ未満、５μｇ未満、４μｇ未満、３μｇ未満、２μｇ未満、１μｇ未満、０．５μｇ未満、０．１μｇ未満、０．０１μｇ未満、１０ｎｇ未満、または１ｎｇ未満、または０．１ｎｇ未満である対象は、ＧＡＢＡ生成細菌の投与から利益を得ることができる。
【０１２９】
一部の実施形態では、前頭前野（または脳の他のエリア）などの領域で、脳のＧＡＢＡの初期量が約１．０ｍＭ／ｋｇである対象は、ＧＡＢＡ生成細菌の投与による処置から利益を得ることができる。一部の実施形態では、前頭前野（または脳の他のエリア）などの領域で、脳のＧＡＢＡの初期量が、ＧＡＢＡ１００ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、２５ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１５ｍＭ未満、１０ｍＭ未満、９ｍＭ未満、８ｍＭ未満、７ｍＭ未満、６ｍＭ未満、５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、３ｍＭ未満、２ｍＭ未満、１ｍＭ未満、０．５ｍＭ未満、０．１ｍＭ未満、または０．０１ｍＭ未満、または０．００１ｍＭ未満である対象は、ＧＡＢＡ生成細菌の投与による処置から利益を得ることができる。
【０１３０】
一部の実施形態では、便中のＧＡＢＡの初期量が便（湿重量または乾燥重量）１グラム当たりＧＡＢＡ８μｇ未満である対象は、ＧＡＢＡ生成細菌の投与から利益を得ることができる。一部の実施形態では、便のＧＡＢＡの初期量が、便１グラム当たり１００μｇ未満、５０μｇ未満、２５μｇ未満、２０μｇ未満、１５μｇ未満、１０μｇ未満、９μｇ未満、８μｇ未満、７μｇ未満、６μｇ未満、５μｇ未満、４μｇ未満、３μｇ未満、２μｇ未満、１μｇ未満、０．５μｇ未満、０．１μｇ未満、０．０１μｇ未満、１０ｎｇ未満、または１ｎｇ未満、または０．１ｎｇ未満である対象は、ＧＡＢＡ生成細菌の投与から利益を得ることができる。
【０１３１】
上記態様のいずれかの一部の実施形態では、対象の便のＧＡＢＡの量は、例えば、上記態様のいずれかのステップ（ｂ）で測定した場合、対象の便のＧＡＢＡの初期量に対して、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００パーセント、またはそれより大きく増加している。一部の実施形態では、対象の血液または血清のＧＡＢＡの量は、例えば、上記態様のいずれかのステップ（ｂ）で測定した場合、対象の血液または血清のＧＡＢＡの初期量に対して、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００パーセント、またはそれより大きく増加している。一部の実施形態では、対象の脳の領域、例えば、これらに限定されないが、前頭前野のＧＡＢＡの量は、例えば、上記態様のいずれかのステップ（ｂ）で測定した場合、対象の脳のＧＡＢＡの初期量に対して、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００パーセント、またはそれより大きく増加している。一部の実施形態では、対象の便の少なくとも１種のＧＡＢＡ生成細菌は、例えば、上記態様のいずれかのステップ（ｂ）で測定した場合、対象の便のＧＡＢＡ生成細菌の初期量に対して、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００パーセント、またはそれより大きく増加している。一部の実施形態では、対象の便の少なくとも１種のＧＡＢＡ生成酵素発現のレベルは、当分野に精通する者に公知のｑＰＣＲまたはいくつかの他の適当な方法で測定した場合、対象の便のＧＡＢＡ生成酵素発現の初期レベルに対して、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００パーセント、またはそれより大きく増加している。
【０１３２】
本開示の一部の実施形態では、ＧＡＢＡ消費細菌の量は、低減、例えば、対象の便、血清などで低減しうる。ＧＡＢＡ消費細菌は、例えば、Ｅｖｔｅｐｉａ  ｇａｂａｖｏｒｏｕｓまたはＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＭＧＳ：１１４でありうる。一部の実施形態では、ＧＡＢＡ消費細菌は、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００パーセント、またはそれを超えて低減しうる。
【０１３３】
したがって、本開示は、対象に、ＧＡＢＡ生成細菌、またはプレバイオティクスを投与して、ＧＡＢＡ生成細菌の成長またはＧＡＢＡ生成能を刺激することを含む、精神疾病または中枢神経系の疾患の処置を提供する。
ＧＡＢＡ消費細菌を培養する方法
【０１３４】
一部の実施形態では、本開示は、生存および複製のためにＧＡＢＡを必要とする細菌を培養する方法を提供する。一部の場合には、これらの細菌は以前に培養されていないかまたは培養できなかった。一部の場合には、細菌は、内因性ＧＡＢＡを成長培地に供給することによって培養される。一部の実施形態では、細菌は、ＧＡＢＡを生成することができる異なる細菌（例えば、上記の細菌）と共に細菌を共培養することによって培養される。
【０１３５】
一部の実施形態では、以前に培養されていない細菌は、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓである。Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓは、寒天などの適切な基質上で培養することができる。一部の実施形態では、寒天は、加えられたＧＡＢＡを含有しうる。一部の実施形態では、本開示は、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓを培養する方法であって、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓを、例えば、生理学的に適切であり、人の胃腸管に見られる条件（例えば、約４．５から約７．５の間未満のｐＨ）で、ＧＡＢＡを生成することができる別の細菌株と共培養するステップを含む方法を提供する。
【０１３６】
理論に拘泥されることを望むものではないが、いくつかの以前に培養できなかった細菌（例えば、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ）は、生存または成長するために細菌が必要とする成長因子を生成する、培養できる生物の近くで成長できる場合がある。したがって、本開示は、必要な成長因子としてのＧＡＢＡの存在下でのＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの発見および培養を教示する。
【０１３７】
Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８と近い空間で成長の遅いコロニーとして特定された。Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長が、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８に由来する上清の存在下で誘導されたことが見出された。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７３８の上清のＨＰＬＣおよびＮＭＲによる化学分析により、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓに必要な成長因子としてＧＡＢＡが明らかとなった。
【０１３８】
図１、および実施例２に示されるように、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８の存在下で成長するため、最初に見出された。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８が、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの成長および生存に必要である成長因子を生成することが提唱された。図１Ａは、ヒトの便で処置した後の細菌のコロニーを含有する寒天プレートの写真を示す。右上部の挿入図は、すぐ近くで成長している１７３８のコロニーと一緒のＫＬＥ１７５８のコロニーの近接写真を示す。図１Ｂは、他の細菌を含まない寒天プレート上で複数のＫＬＥ１７３８のコロニーをサポートすることができるＫＬＥ１７５８のコロニーを示す。理論に拘泥されることを望むものではないが、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８は、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長をサポートすることができる。理論に拘泥されることを望むものではないが、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８とＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８は、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８がＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８によって生成されるＧＡＢＡを消費することができる共生関係で共存することができる。
【０１３９】
図２および実施例３〜４に示されるように、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８の４８時間培養物由来の上清は、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長をサポートすることが見出され、一方、標準の寒天では見出されなかった。ＫＬＥ１７５８の上清の一連の精製および単離ステップの後、ＧＡＢＡがＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長の要因であることが発見された。図２Ａは、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８がＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓの上清の存在下で成長したことを示す。しかし、図２Ｂは、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８が、標準寒天における滅菌ビヒクルの存在下では成長しなかったことを示す。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８の使用済み培地の最初の画分化の後、最も極性の高い断片はＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長を誘導することができたが（図２Ｃ）、極性の低い断片は成長を誘導できなかった（図２Ｄ）ことが見出された。図２Ｅおよび２Ｆは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８の上清の最も極性の高い画分がＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長を誘導することができたが（図２Ｅ）、極性の低い画分はできなかった（図２Ｆ）ことを実証する近接図を示す。図２Ｇに示されるように、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の成長を誘導することができるものとして、ＧＡＢＡだけが特定された。
【０１４０】
Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の１６Ｓヌクレオチド配列は、配列番号２２８６に与えられている。
【０１４１】
Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８の遺伝子配列は、実施例５に示されるように特定された。Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの注釈付きゲノム（２，５００，００９ｂｐ）は、配列番号１〜２２８８を含む添付の配列表に与えられており、配列番号２２１８〜２２８５に与えられている。理論に拘泥されることを望むものではないが、ゲノムによって、一般的な糖類または他の炭素供給源の代謝に対する明白なエントリーポイントは明らかにならなかった。
【０１４２】
理論に拘泥されることを望むものではないが、一般的な糖類または他の炭素供給源に対する輸送系も不完全であることが発見された。理論に拘泥されることを望むものではないが、これらの非存在により、機能が最近失われたことが示唆される。Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓは、表１０で予測されるように、メチオニン、分枝鎖アミノ酸、ジペプチド、オリゴペプチド、およびコリン／ベタインに対するものを含む、制限された一組の輸送体を有することが予測される。
【０１４３】
【表１０Ａ】
2019508479.tif 000118
【０１４４】
理論に拘泥されることを望むものではないが、これらのアミノ酸は、セリン、トレオニン、グルタメートなどと異なり、単一の炭素供給源として、常に細菌の成長をサポートすることができる訳ではない。このことは、試験されたアミノ酸でＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓが成長できないことによって裏付けられる。
【０１４５】
理論に拘泥されることを望むものではないが、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの代謝経路は、この経路のすべての酵素がＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓのゲノムで特定されたため（表１１）、図３に示されるように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍのものと類似することが提唱される。
【表１１】
2019508479.tif 000119
【０１４６】
Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８のＧＡＢＡを生成する能力のｐＨ依存性が調査された。実施例６に示されるように、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８は、種々のｐＨ値で成長し、その成長に由来する上清をＬＣＭＳを使用して分析した。図４Ａに示されるように、ＧＡＢＡは、主に、グルタメートと比較して比較的低いｐＨ（例えば、約５．５およびそれより低い）で生成される。
【０１４７】
したがって、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８は、低いｐＨでＧＡＢＡを生成することができることが見出された一方で、比較的高いｐＨでは、主に、グルタメートを生成することが見出された。実施例６および図４Ａで示されるように、約５および約５．５のｐＨで、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８は、グルタメートよりもかなり多いＧＡＢＡを生成した。しかし、約６および約６．５のｐＨでは、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８は、主にグルタメートを生成し、ＧＡＢＡは比較的少量しか生成しないことが見出された。
ＧＡＢＡ生成株に対する生物学的スクリーニング
【０１４８】
本開示は、ＧＡＢＡを生成することができる細菌を特定する方法も教示する。Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの成長に対してＧＡＢＡの厳格な要求があると仮定して、本開示は、例えば、バイオアッセイとして、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓおよび／または他のＧＡＢＡ依存性細菌の成長を使用して、ＧＡＢＡを生成することができる細菌に対するスクリーニング方法を提供する。重要なことに、緩衝培地（例えば、緩衝寒天）を使用することによって、本明細書に示されるアッセイ技術を使用して、種々のｐＨ値（例えば、約５．５から約７．５の間）でｂａｃｔｅｒｉを生成することができる細菌を特定することができる。
【０１４９】
実施例７に示されるように、ヒトの便試料のように、ＧＡＢＡ生成細菌を含有すると考えられる試料は、溶かした寒天と混合することができる。次いで、細菌試料を含有する寒天に、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの希釈溶液をストリークすることができる。本明細書に示されるように、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓはＧＡＢＡが存在しなければ成長できず、したがって、形成するＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓのコロニーはいずれも、ＧＡＢＡ生成株に近接する空間で必然的に成長することになる。
【０１５０】
Ｅ．ｃｏｌｉを含む一部の細菌によるＧＡＢＡ生成が非常に低いｐＨでのみ（例えば、ヒトの腸には適切でないｐＨで）生じるため、本明細書に示されるアッセイ方法は、約４．５から約７．５の間のｐＨでＧＡＢＡを生成することができる生物の特定を可能にする培地のｐＨを制御するよう適合された。理論に拘泥されることを望むものではないが、約４．５から約７．５の間のｐＨは、ヒトの腸内で適切なｐＨである。したがって、一部の実施形態では、これらのｐＨ値でＧＡＢＡを生成することができる細菌は、ヒトの腸内でＧＡＢＡを生成することができうる。
【０１５１】
言い換えれば、成長培地のｐＨを制御することによって（例えば、溶かした寒天を緩衝することによって）、本開示は、生理学的に適切なｐＨでＧＡＢＡを生成することができない細菌（例えば、約４．５未満のｐＨでのみ実質量のＧＡＢＡを生成することができる細菌）から、生理学的に適切なｐＨ（例えば、約４．５から約７．５の間）でＧＡＢＡを生成することができるＧＡＢＡ生成株を区別可能とすることができる。
【０１５２】
この方法を使用して、これらに限定されないが、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉｂａｃｔｅｒ、Ｄｏｒｅａ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍを含む複数の属からいくつかの代表例が特定された。図４Ｂは、ＧＡＢＡ生成細菌の存在下でＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの成長を示す代表的寒天プレートを示す。図４Ｃは、この方法を使用して特定されたＧＡＢＡ生成細菌の系統樹を示す。
【０１５３】
図５は、本明細書に記載されている技術を使用して特定されるＧＡＢＡ生成株のある特定の菌株のＧＡＢＡ生成能を示す。図５に示されるように、ＧＡＢＡ生成体の８種の菌株は、緩衝培地（例えば、約ｐＨ４．５から約ｐＨ５．０の間、および約ｐＨ６．５から約ｐＨ７．０の間）中で成長した。実施例６に記載されている方法を使用して、種々のｐＨ値におけるＧＡＢＡ生成細菌のＧＡＢＡ生成能が調査された。図５に示されるように、ある特定の細菌（例えば、Ｂ．ｄｏｒｅｉ  ＫＬＥ１９１２）は、低いｐＨ（例えば、約４．５から約５．０の間）で比較的少量のＧＡＢＡを生成した。対照的に、ある特定の細菌は、ｐＨによって異なる量のＧＡＢＡを生成した（例えば、Ｂ．ｖｕｌｇａｔｕｓ  ＫＬＥ１９１０およびＢ．ｏｖａｔｕｓ  ＫＬＥ１７７０）。留意すべきことに、Ｂ．ｖｕｌｇａｔｕｓ  ＫＬＥ１９１０およびＢ．ｏｖａｔｕｓ  ＫＬＥ１７７０に対して示されるように、一部の細菌は、高いｐＨよりも低いｐＨで比較的多量のＧＡＢＡを生成することが見出されたが、一方、一部の細菌は、低いｐＨよりも高いｐＨで比較的多量のＧＡＢＡを生成することが見出された。
【０１５４】
ＧＡＢＡを生成することができる細菌を特定する方法の一部の実施形態では、基質は寒天である。一部の実施形態では、基質をＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓと接触させるステップは、寒天にＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの希釈溶液をストリークすることを含む。次いで、ＧＡＢＡ生成コロニーは、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの成長誘導によって特定される。上記に示されるように、成長したＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓを使用して、細菌株がＧＡＢＡを生成するかどうかが特定される。しかし、当業者であれば、成長および生存にＧＡＢＡを厳格に要求する任意の細菌は、同様に、上記に記載されるように、ＧＡＢＡを生成することができる細菌を特定するために使用することができることを理解するであろう。
【実施例】
【０１５５】
本開示は、以下の実施例および合成例によってさらに例証され、これらの例は、この開示の範囲または精神を、本明細書に記載されている特定の手順に限定するものとして解釈されるべきではない。これらの例はある特定の実施形態を例証するために提供され、本開示の範囲に対していかなる制限もこれによって意図されていないことを理解されたい。本開示の精神および／または添付の特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく、当業者に示唆されうる種々の他の実施形態、修正、およびその均等物に対する手段が有されうることをさらに理解されたい。
【０１５６】
他に記載されていなければ、すべての材料は商業的供給者から入手され、さらなる精製を行わずに使用された。無水溶媒はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から入手され、直接使用された。
【０１５７】
他に特定されていなければ、ＰＣＲは、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅するために、一般的な細菌プライマーである２７Ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）（配列番号２２８７で示される）および１４９２Ｒ（５’−ＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）（配列番号２２８８で示される）を使用して実施した。ＰＣＲ反応混合物は、ＧｏＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１２．５μＬ、１０μＭの２７Ｆおよび１４９２Ｒプライマー１μＬ、ヌクレアーゼフリー水（Ｐｒｏｍｅｇａ）９．５μＬ、および滅菌蒸留水１００μＬに再懸濁したコロニー１μＬであった。増幅条件は、９５℃で５分間を１サイクル；９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間を３０サイクル；７２℃で９０秒間；および最後に７２℃で７分間を１サイクルであった。次いで、ＰＣＲ反応の増幅をエチジウムブロマイドを添加した０．８％アガロースゲルでのゲル電気泳動を使用して確認した。成功したＰＣＲ産物は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの３７３０ｘｌ  ＤＮＡアナライザーを使用して、２７Ｆプライマーを使用して、Ｍａｃｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎでシークエンシングした。配列に関する品質管理を、１８塩基ウインドウ中７５％を超える良好な塩基（２５より高いＱＶスコアを有することによって定義される）が存在するまで末端をトリミングするＤＮＡ  Ｂａｓｅｒ（ｗｗｗ．ＤｎａＢａｓｅｒ．ｃｏｍ）を使用して実施した。系統発生的に隣接するものの特定およびペアワイズ配列の類似性の計算は、ＥｚＴａｘｏｎサーバーを使用して行った。
（実施例１）
ヒトの便の採取
【０１５８】
健康なヒトドナー由来の便試料を市販の便採取容器を使用して採取した。採取の５分以内に、便１グラムをＰＢＳ中２０％の滅菌グリセロール９ｍＬに再懸濁し、ボルテックスを使用して３０秒間ホモジナイズした。この混合物のアリコート１ｍＬを凍結管に充填し、培養のために−８０℃で保存した。
（実施例２）
ヒトの便試料由来のヘルパー−無培養ペアの培養
【０１５９】
すべての培養作業は、５％の水素、１０％のＣＯ２、８５％の窒素の雰囲気を有するＣｏｙ社の嫌気性ビニールチャンバー内で実施した。嫌気的に、解凍した便試料の連続希釈物をＰＢＳ中で調製し、２．５％の酵母抽出物を含む１Ｘ  Ｆａｓｔｉｄｉｏｕｓ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ａｇａｒ（Ａｃｃｕｍｅｄｉａ）（ＦＡＡｙ）プレートにビーズで広げた（１プレート当たり７〜１０個のビーズ）。プレートを３７℃で１週間嫌気的にインキュベートし、各日のコロニーの出現を、異なる色のマーカーでプレートの外側をスポットを付けることによって追跡した。週の終わりに、遅れて形成するコロニー（４〜７日後に出現）の連続希釈物をＰＢＳ中で調製し、ＦＡＡｙプレートにビーズで広げた。次いで、近くに（２ｃｍ未満）、早期に形成するコロニー（１〜３日後に出現）を高濃度でＰＢＳ中に再懸濁した。この懸濁液５μＬをそれぞれ広げた候補物依存性のプレート上にスポットし、チャンバー内で最大１週間インキュベートし、毎日観察した。スポットしたヘルパー周辺の依存性生物の成長誘導はポジティブヒットを示した。
【０１６０】
健康なヒトドナー由来の便試料を希釈し、富栄養培地のプレートに広げ、新たに形成したコロニーを１週間毎日記録した。遅れて形成するコロニー（３〜７日）を希釈して、栄養寒天プレートに広げ、図１Ａに示すように、隣接する、早期に形成するコロニー（１〜２日）の大量の接種菌液をスポットした。この方法を使用して、いくつかのヘルパー−無培養ペアを特定し、ここで、プレートに広げた無培養単離菌は、スポットした培養できるヘルパー周辺に成長のグラジエントを形成した。
【０１６１】
１種の単離菌である、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓ  ＫＬＥ１７３８（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列によりＦｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ  ｐｌａｕｔｉｉ  ＡＴＣＣ  ２９８６３と９３．２２％類似する）は、成長に関してＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列によりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２５８５２と１００％類似する）に依存した（図１Ｂ）。Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ分類のグラム陽性生物である。
（実施例３）
Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓに対する成長因子としてのＧＡＢＡの決定
【０１６２】
富栄養培地中で成長したＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８の４８時間培養物の上清は、図２Ａおよび２Ｂに示されるように、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの成長を誘導し、成長因子のバイオアッセイを駆動する精製を可能とした。上清を、酢酸エチルを用いて溶媒分配し、水残留物画分はＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの成長を誘導した。次いで、水画分は、ＨＰ−２０カラムクロマトグラフィーを使用して精製し、図２Ｃに示すように、最も極性の高い画分は、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの成長を誘導した。次いで、この活性画分を、分取ＨＰＬＣによってさらに画分化した。ＨＰＬＣにより１つの活性画分が得られ、１０種の化合物、主にＧＡＢＡ、トレオニン、乳酸、バリン、グルタミン、マロン酸、コハク酸、およびアラニンが含有されていることがＮＭＲにより示された。すべての化合物をプレート上にスポットし、ここでＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓを広げたところ、図２Ｅ〜Ｆに示すようにＧＡＢＡのみが成長誘導を引き起こした。画分中の構成成分を特定するために、１Ｈ、１３Ｃ、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ、ＴＯＣＹ、ＨＳＱＣ、およびＨＭＢＣ  ＮＭＲ実験を含むＮＭＲ分析によって化合物を特定した。すべてのＮＭＲ実験は、間接検出プローブを備えたＶａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ  ６００  ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計で行った。
（実施例４）
Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの誘導に関する他の化合物の試験
【０１６３】
図２Ｇに示すように、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの成長を誘導する能力に関して、複数の化合物を試験した。各化合物（ＡＴＣＣのミネラルとビタミンのミックスを除き、Ｓｉｇｍａから購入した）のストックは、図２Ｇに示す濃度で水中への溶解度に応じて調製した。次いで、ストック５μＬをＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓを広げたＦＡＡｙプレートにスポットし、１週間嫌気的にインキュベートし、任意の成長を観察した。ＧＡＢＡ以外の化合物は成長を誘導しなかった。
（実施例５）
全ゲノムシークエンシングおよび注釈
【０１６４】
ＧＡＢＡ１．０ｍｇ／ｍＬを含むＦＡＡｙプレートで嫌気的に４８時間成長したＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの細胞由来のＤＮＡを、製造業者の仕様に従ってＰｏｗｅｒＳｏｉｌ（登録商標）ＤＮＡ単離キット（Ｍｏ  Ｂｉｏ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、ゲノムシークエンシングのために単離し、約５．０μｇの質の高いＤＮＡを得た。ゲノムシークエンシングおよびｄｅ  ｎｏｖｏアセンブリーをマサチューセッツ州ボストンのタフツ大学（Ｔｕｆｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のＧｅｎｏｍｉｃ  Ｃｏｒｅで実施した。Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓのゲノムを、ペアエンド２５０塩基フォーマットを用いるＭｉＳｅｑ  Ｖ２の５００サイクルの化学作用を使用するＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑでシークエンシングした。簡潔には、ゲノムＤＮＡ１００ｎｇをＣｏｖａｒｉｓ  Ｍ２２０でおよそ６００塩基の平均断片サイズまでせん断した。断片化ＤＮＡをインプットとして使用し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  Ｎａｎｏ  ＤＮＡ試料調製キットを製造業者の指示により用いてシークエンシングライブラリーを調製した。ベースコールおよびデマルチプレクシングは、ＣＡＳＡＶＡを使用するＭｉＳｅｑからの生データに関して実施し、ｆａｓｔｑファイルを作成した。ゲノムのｄｅ  ｎｏｖｏアセンブリーは、カスタマイズしたパラメーター最適化パイプラインを有するＥｄｅｎａ  Ｖ３．１３１０２８を使用して実施した。コンティグの統計で評価した場合に、最もアセンブルしたゲノムを報告した。アセンブリーにより６８個のコンティグ（ｎ）が得られ、すべてのコンティグは２００塩基より長い配列長を有していた（ｎ：２００）。７個のコンティグはＮ５０（１１９７４８）より大きな値を有し、最小のコンティグ長は３５５（最小）である。Ｎ２０、Ｎ５０およびＮ２０は、それぞれ、３３４０３、１１９７４８および２０４６７０である。最も長いコンティグ長（最大）は３４４０８０であり、推定ゲノムサイズは２５００００９である。ＲＡＳＴサーバーおよびＫＥＧＧ（京都遺伝子ゲノム百科事典（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ））データベースのＫＡＡＳ（ＫＥＧＧ自動アノテーションサーバー）分析ツールを使用してドラフトゲノムに注釈を付けた。Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓのゲノムにはＲＡＳＴを使用して注釈を付け、ＣＡＧ：１１３とＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓのゲノムをＲＡＳＴを使用して比較した。
（実施例６）
Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓにおけるグルタメートおよびＧＡＢＡ生成の定量化
【０１６５】
Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８の上清に含有されるグルタメートおよびＧＡＢＡの絶対量を、検出を補助するためにフルオロフォアを使用して、ＨＰＬＣによって決定した。具体的には、製造業者のプロトコールに従って、ＡｃｃＱ試薬（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて反応させることによって、遊離アミンを分析のために標識した。ＧＡＢＡ（２．０ｍｇ）を水（２００μＬ）中に、グルタメート（Ｇｌｕ）（１０．２ｍｇ）を水（１０２０μＬ）中におよびシステイン酸（ＣＳＡ）（１６．９ｍｇ）を水（１６９０μＬ）中に溶解することによって調製したストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）から検量線を作成した。これらは連続して希釈することによって濃度勾配を生じた。具体的には、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬおよび０．００１ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで、ストックを作製した。所与のストック溶液のアリコートをＡｃｃＱ反応緩衝液（最終２５μＬ）に加え、続いて、アセトニトリルに溶解したＡｃｃＱ試薬（２５μＬ）を加えた。これを、５５〜６０℃で１０分間反応させて、次いで、ガラスインサートでフィッティングしたＬＣＭＳバイアルに直接移した。アミノ酸の反応濃度は、２０ｎｇ／μＬ、１０ｎｇ／μＬ、５ｎｇ／μＬ、２．５ｎｇ／μＬ、１ｎｇ／μＬ、０．５ｎｇ／μＬ、１ｎｇ／μＬおよび０ｎｇ／μＬ（対照）であった。以下の時間過程：１）２％のＢから９８％のＢの直線勾配で０〜４０分、２）９８％のＢの均一濃度で４０〜４５分、３）９８％のＢから２％のＢの直線勾配で４５〜４５．５分、４）２％のＢの均一濃度で４５．５〜５５分にわたって、溶媒Ａ（水／０．１％のギ酸）およびＢ（アセトニトリル／０．１％のギ酸）の勾配を使用して、これらの試料をＡｇｉｌｅｎｔのＬＣＭＳに注射した（１０μＬ）。ＣＳＡ−ＡｃｃＡ誘導体が９．５分に溶出し、Ｇｌｕ−ＡｃｃＱ誘導体が１２．１分に溶出し、ＧＡＢＡ−ＡｃｃＱ誘導体が１２．５分に溶出した。抽出イオン（ＥＩＣ）モード（ｍ／ｚは、ＧＡＢＡ−ＡｃｃＱに関して２７４、Ｇｌｕ−ＡｃｃＱに関して３１８およびＣＳＡ−ＡｃｃＱに関して３４０）での曲線下面積を使用して、注射したもとのＧｌｕ、ＣＳＡまたはＧＡＢＡ（ｎｇ）の量に対する面積をプロットすることにより検量線が得られた。各試験濃度に対する２回のランの平均を使用して、検量線を作成した。ＧＡＢＡおよびＧｌｕの場合には、ＣＳＡを、最終濃度２．５μｇ／ｍＬまですべての反応に加え、内部標準として使用した。
【０１６６】
Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８の三連の培養物は、ＢＨＩｙｃｈ中で、嫌気的に４８時間成長し、細胞を遠心分離して、上清を０．２μｍのフィルターを通して濾過した。分析まで、試料を４℃で保存した。試料を分析するために、各試料のアリコート（２μＬ）をＡｃｃＱ反応緩衝液（１６μＬ）、ＣＳＡ内部標準（緩衝液中５０μｇ／ｍＬの溶液２μＬ）に加え、続いて、ＡｃｃＱ試薬（２０μＬ）を加えた。これらの試料を１０分間で５５℃まで加熱し、次いで、ガラスインサートでフィッティングしたＬＣＭＳバイアルに直接移した。各試料のアリコート（１０μＬ）をＬＣＭＳに注射し、検量線に対して使用されるのと同じ注射プログラムに従って分離した。ＧＡＢＡ、ＧｌｕおよびＣＳＡを表す全ＥＩＣの曲線下面積は、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して決定した。各注射は、もとの培地濃度の２５％を表し、したがって、決定された試料の全量（ｎｇ）に４つの因子を掛けてもとの濃度（ｎｇ／μＬ＝μｇ／ｍＬ）を決定した。すべての面積を内部標準（ＣＳＡ）の曲線下面積に対して正規化し、実験全体を通して一定濃度に保った。結果を図４Ａに与える。
（実施例７）
Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓを使用するＧＡＢＡ生成株に関する共培養スクリーニング
【０１６７】
ＧＡＢＡの分泌によって、細菌が酸ストレスで生存することが可能となりうる。グルタメートの脱炭酸によりＧＡＢＡが生成され、ＧＡＢＡはプロトン化形態で細胞から搬出され、これにより細胞質はアルカリ化する。Ｅ．ｃｏｌｉならびに一部のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株はＧＡＢＡを生成することが示されたが、これらの生物は、典型的には、ヒトの腸管内で低い存在量でしか見られず、Ｅ．ｃｏｌｉの場合には低ｐＨに依存する（例えば、約４．２およびそれより低い）。Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓのヘルパーであるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓは、一般的な腸内細菌であるが、図４Ａに示すように、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＫＬＥ１７５８によるＧＡＢＡ生成は、Ｅ．ｃｏｌｉと同様に、約５．５未満のｐＨでのみ観察されることが見出された。それぞれのｐＨ値で、ＧＡＢＡは左側のカラムに示され、グルタメートは右側のカラムに示されている。理論に拘泥されることを望むものではないが、したがって、ヒトの大腸に対して生理学的に適切なｐＨ（例えば、約５．５から約７．５、または約５．７から約７．４のｐＨ）でＧＡＢＡを生成することができる微小生物を特定することは有用であると考えられた。
【０１６８】
これを達成するために、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの厳格なＧＡＢＡ要求性を利用して、緩衝力の高い培地でＧＡＢＡを分泌することができる細菌に対するスクリーニングを行った。細菌成長の代謝副産物は、緩衝液が存在しないと培地のｐＨを低下させる場合がある。嫌気チャンバー内で、便試料を溶かした寒天と混合し、ペトリプレートに注ぎ、固化された寒天の上にＥ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓを広げた。Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの成長誘導ゾーンを探し、寒天のｐＨを測定することによって、図４Ｂに示すように約４．５から約５．０のｐＨでＧＡＢＡを生成する細菌と同様に、約６．０から約７．０の間のｐＨでＧＡＢＡを生成する細菌を特定した。全１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、２７Ｆおよび１４９２Ｒユニバーサルプライマーを使用してシークエンシングし、ＥＺＴａｘｏｎを用いる注釈により、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉｂａｃｔｅｒ、Ｄｏｒｅａ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍを含む複数の属に由来するいくつかの代表例が明らかとなった（図４Ｃ）。これらのうち、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓだけが、ＧＡＢＡを生成することについて以前に報告されていた。
（実施例８）
操作されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ菌株を使用してＧＡＢＡを生成し、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの成長を誘導する
【０１６９】
腸の上皮細胞で、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなどの一部の細菌により、グルタメートの脱炭酸によって、ＧＡＢＡを生成することができる。Ｅ．ｃｏｌｉでは、グルタメートの脱炭酸は、細胞内ｐＨを低下させる機序として作用し、ＧＡＢＡの生成は、通常、低ｐＨで起こる。Ｅ．ｃｏｌｉを、ＧＡＢＡを生成するように操作することができるかどうかを調査するために、ｐＣＡ２４Ｎ  ＩＰＴＧ誘導性の高コピー数ベクターにおいて、ネイティブのグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ｇａｄＡ、ｇａｄＢ）、またはＧＡＢＡアンチポーター、（ｇａｄＣ）を保有するＥ．ｃｏｌｉのクローン（colones）を、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓを用いる共培養アッセイによりＧＡＢＡ生成について試験した。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるグルタミン酸デカルボキシラーゼの過剰発現（ｇａｄＡまたはｇａｄＢ）により、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓで見られるレベルまでＫＬＥ１７３８の成長の誘導が生じ、一方、ＧＡＢＡアンチポーターであるｇａｄＣの発現では生じなかった（図６）。ＫＬＥ１７３８に対する成長培地のｐＨを変更しても、ＧＡＢＡ依存性の表現型は変化しなかった。理論に拘泥されることを望むものではないが、このことは、グルタミン酸デカルボキシラーゼまたは他のＧＡＢＡ生成酵素を過剰発現するように細菌を操作することは、Ｅ．ｇａｂａｖｏｒｏｕｓの成長を誘導するのと同様に、構成的にまたは誘導的に、ＧＡＢＡを生成する有効な方法であることを示唆している。
均等物
【０１７０】
本開示は、上記に示す特定の実施形態に関連して記載されているが、それらの多くの代替、修正および他の変形は当業者にとって明らかであろう。すべてのそのような代替、修正および変形は、本開示の精神および範囲内にあることが意図されている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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