(57)【要約】  本発明は、キメラエンガルフメント受容体分子、食細胞性エンガルフメント分子を含むように改変された宿主細胞、ならびにかかる受容体分子および改変細胞を作製および使用する方法に関する。
2019536471.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖キメラタンパク質を含むキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）であって、
該一本鎖キメラタンパク質が、
ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメイン；
エンガルフメントシグナル伝達ドメイン；および、
細胞外ドメインとエンガルフメントシグナル伝達ドメインとの間に位置し、それらを連結する、膜貫通ドメイン
を含む、キメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項２】
結合ドメインが、ＰｔｄＳｅｒに特異的なｓｃＦｖ、またはＴｉｍ１、Ｔｉｍ４、Ｔｉｍ３、スタビリン−２、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）、脳特異的血管新生阻害因子１（ＢＡＩ１）、乳脂肪球−ＥＧＦ因子８タンパク質（ＭＦＧ−Ｅ８）、細胞増殖停止特異的因子６（ＧＡＳ６）、プロテインＳ、プロテインＣ、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、β２糖タンパク質Ｉ、α５β３ インテグリンおよび他のインテグリン類、ＣＲ３補体受容体、ＣＲ４補体受容体、ＣＤ１４、ＣＤ９３、アネキシンＶ、ホスファチジルセリン受容体（ＰＳｒ）、プロトロンビンもしくはスカベンジャー受容体由来のＰｔｄＳｅｒ結合ドメインを含む、請求項１に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項３】
結合ドメインが、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＴＩＭ１ドメイン、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＴＩＭ４ドメイン、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＴｉｍ３ドメイン、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＦＡ５８Ｃ２ドメイン、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＧＡＳ６ドメイン、配列番号３３のアミノ酸配列を含むプロテインＳ結合ドメインまたは配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＢＡＩ１ドメインを含む、請求項２に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項４】
細胞外ドメインが、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する細胞外スペーサードメインをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項５】
細胞外スペーサードメインが、免疫グロブリンヒンジ領域、Ｉ型膜タンパク質の細胞外領域、タイプＩＩのＣ型レクチンのストーク領域、免疫グロブリン定常ドメイン、またはそれらの断片を含む、請求項４に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項６】
細胞外スペーサードメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡまたはＩｇＤヒンジ領域を含む、請求項５に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項７】
細胞外スペーサードメインが、配列番号６７のアミノ酸配列を含む修飾されたＩｇＧ４ヒンジ領域を含む、請求項６に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項８】
膜貫通ドメインが、Ｔｉｍ１、Ｔｉｍ４、Ｔｉｍ３、ＦｃＲ、ＣＤ８ａ、ＣＤ２８、ＭＥＲＴＫ、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、ＢＡＩ１、ＣＤ４、ＤＡＰ１２またはＭＲＣ１膜貫通ドメインを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項９】
膜貫通ドメインが、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＴｉｍ１膜貫通ドメイン、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＴｉｍ４膜貫通ドメイン、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＦｃγＲＩ膜貫通ドメイン、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＭＥＲＴＫ膜貫通ドメイン、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＡｘｌ膜貫通ドメイン、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＴｙｒｏ３膜貫通ドメイン、配列番号６８のＣＤ２８膜貫通ドメイン、配列番号１４２のＢＡＩ１膜貫通ドメイン、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤ４膜貫通ドメイン、配列番号８９のアミノ酸配列を含むＦｃεＲＩγ膜貫通ドメイン、配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＭＲＣ１膜貫通ドメイン、または配列番号８１のアミノ酸配列を含むＤＡＰ１２膜貫通ドメインを含む、請求項８に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項１０】
ＦｃＲ膜貫通ドメインが、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃεＲ１またはＦｃαＲ１膜貫通ドメインを含む、請求項８に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項１１】
エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインまたは炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである、請求項１から１０のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項１２】
恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、ＩｔｇＢ５、ＭＥＲＴＫ、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、ＢＡＩ１、ＥＬＭＯまたはＭＲＣ１シグナル伝達ドメインである、請求項１１に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項１３】
炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、ＰＩ３Ｋ、Ｔｒａｆ６、Ｓｙｋ、ＭｙＤ８８、Ｚａｐ７０、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃεＲ１、ＦｃαＲ１、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＤＡＰ１２、ＮＦＡＭ１またはＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインである、請求項１１に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項１４】
恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメイン、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＴｙｒｏ３シグナル伝達ドメイン、配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＩｔｇＢ５シグナル伝達ドメイン、配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＭＲＣ１シグナル伝達ドメイン、配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＢＡＩ１シグナル伝達ドメイン、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＥＬＭＯシグナル伝達ドメイン、または配列番号４４のアミノ酸配列を含むＡｘｌシグナル伝達ドメインである、請求項１２に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項１５】
炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＴｒａｆ６シグナル伝達ドメイン、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＳｙｋシグナル伝達ドメイン、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン、配列番号７８のアミノ酸配列を含む切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＺａｐ７０シグナル伝達ドメイン、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ１シグナル伝達ドメイン、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ２Ａシグナル伝達ドメイン、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ２Ｃシグナル伝達ドメイン、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ３Ａシグナル伝達ドメイン、配列番号８８のアミノ酸配列を含むＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメイン、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＢＡＦＦ−Ｒシグナル伝達ドメイン、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＤＡＰ１２シグナル伝達ドメイン、配列番号９２のアミノ酸配列を含むＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメイン、または配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインである、請求項１３に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項１６】
恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインによるシグナル伝達により、抗炎症性または免疫抑制性サイトカインの少なくとも１つの発現がもたらされる、請求項１１、１２または１４に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項１７】
抗炎症性または免疫抑制性サイトカインが、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０または両方である、請求項１６に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項１８】
炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインによるシグナル伝達により、炎症性サイトカイン、炎症性ケモカイン、または共刺激細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つの発現がもたらされる、請求項１１、１３または１５に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項１９】
炎症性サイトカインが、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２またはＩＬ−２３であり、炎症性ケモカインが、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ１０であり、共刺激細胞表面マーカーが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＨＶＥＭまたは４−１ＢＢＬであるか、あるいはそれらの何れかの組合せである、請求項１８に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項２０】
エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項２１】
第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであり、第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである、請求項２０に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項２２】
第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであり、第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである、請求項２０に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項２３】
第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであり、第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである、請求項２０に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項２４】
第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであり、第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである、請求項２０に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項２５】
第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、同じかまたは異なる、請求項２１または２２に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項２６】
恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、ＩｔｇＢ５、ＭＥＲＴＫ、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、ＢＡＩ１、ＥＬＭＯまたはＭＲＣ１シグナル伝達ドメインである、請求項２１、２３、２４または２５に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項２７】
恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメイン、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＴｙｒｏ３シグナル伝達ドメイン、配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＩｔｇＢ５シグナル伝達ドメイン、配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＭＲＣ１シグナル伝達ドメイン、配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＢＡＩ１シグナル伝達ドメイン、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＥＬＭＯシグナル伝達ドメイン、または配列番号４４のアミノ酸配列を含むＡｘｌシグナル伝達ドメインである、請求項２６に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項２８】
炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、ＰＩ３Ｋ、Ｔｒａｆ６、Ｓｙｋ、ＭｙＤ８８、Ｚａｐ７０、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃεＲ１、ＦｃαＲ１、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＤＡＰ１２、ＮＦＡＭ１、またはＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインである、請求項２２、２３、２４または２５に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項２９】
炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＴｒａｆ６シグナル伝達ドメイン、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＳｙｋシグナル伝達ドメイン、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン、配列番号７８のアミノ酸配列を含む切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＺａｐ７０シグナル伝達ドメイン、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ１シグナル伝達ドメイン、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ２Ａシグナル伝達ドメイン、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ２Ｃシグナル伝達ドメイン、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ３Ａシグナル伝達ドメイン、配列番号８８のアミノ酸配列を含むＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメイン、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＢＡＦＦ−Ｒシグナル伝達ドメイン、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＤＡＰ１２シグナル伝達ドメイン、配列番号９２のアミノ酸配列を含むＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメイン、または配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインである、請求項２８に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項３０】
結合ドメインが、Ｔｉｍ４ ＰｔｄＳｅｒ結合ドメインおよびＦＡ５８Ｃ２ ＰｔｄＳｅｒ結合ドメインから選択され、
膜貫通ドメインが、Ｔｉｍ４膜貫通ドメインおよびＣＤ２８膜貫通ドメインから選択され、
エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインおよびＳＹＫシグナル伝達ドメインから選択され、そして
細胞外ドメインが、要すれば、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する細胞外スペーサードメインを含む、
請求項１に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項３１】
Ｔｉｍ４ ＰｔｄＳｅｒ結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメインおよびＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインを含む、請求項３０に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項３２】
ＦＡ５８Ｃ２ ＰｔｄＳｅｒ結合ドメイン、ＩｇＧ４ヒンジ領域を含む細胞外スペーサードメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、およびＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインを含む、請求項３０に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項３３】
ＦＡ５８Ｃ２ ＰｔｄＳｅｒ結合ドメイン、ＩｇＧ４ヒンジ領域を含む細胞外スペーサードメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、およびＳＹＫシグナル伝達ドメインを含む、請求項３０に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項３４】
Ｔｉｍ４ ＰｔｄＳｅｒ結合ドメインが、配列番号２９のアミノ酸配列を含む、請求項３０または３１に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項３５】
Ｔｉｍ４膜貫通ドメインが、配列番号３６のアミノ酸配列を含む、請求項３０または３１に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項３６】
ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインが、配列番号６９のアミノ酸配列を含む、請求項３０、３１または３２のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項３７】
配列番号７１のアミノ酸配列または配列番号７１のアミノ酸２３−７７６を含む、請求項３１に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項３８】
ＦＡ５８Ｃ２ ＰｔｄＳｅｒ結合ドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項３０、３２または３３のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項３９】
ＣＤ２８膜貫通ドメインが、配列番号６８のアミノ酸配列を含む、請求項３０、３２および３３のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項４０】
ＩｇＧ４ヒンジ領域が、配列番号６７のアミノ酸配列を含む、請求項３２または３３に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項４１】
ＳＹＫシグナル伝達ドメインが、配列番号４６のアミノ酸配列を含む、請求項３０または３３に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項４２】
配列番号７５のアミノ酸配列または配列番号７５のアミノ酸２３−６９９を含む、請求項３２に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項４３】
配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０アミノ酸２３−４８４を含む、請求項３３に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項４４】
一本鎖キメラタンパク質を含むキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）であって、該一本鎖キメラタンパク質が、
プエンガルフメント促進マーカーまたは標的抗原に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメイン；
炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメイン；および、
細胞外ドメインと炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインの間に位置し、それらを連結している膜貫通ドメインを含む、
キメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項４５】
エンガルフメント促進マーカーが、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）、ＩＣＡＭ−３、酸化低密度リポタンパク質、カルレティキュリン、アネキシンＩ、補体Ｃ１ｑ、およびトロンボスポンジンから選択される、請求項４４に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項４６】
ＰｔｄＳｅｒに結合し、ＰｔｄＳｅｒに特異的なｓｃＦｖである結合ドメイン、またはＴｉｍ１、Ｔｉｍ４、Ｔｉｍ３、スタビリン−２、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）、脳特異的血管新生阻害因子１（ＢＡＩ１）、乳脂肪球−ＥＧＦ因子８タンパク質（ＭＦＧ−Ｅ８）、細胞増殖停止特異的因子６（ＧＡＳ６）、プロテインＳ、プロテインＣ、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、β２糖タンパク質Ｉ、α５β３インテグリンおよび他のインテグリン類、ＣＲ３補体受容体、ＣＲ４補体受容体、ＣＤ１４、ＣＤ９３、アネキシンＶ、ホスファチジルセリン受容体（ＰＳｒ）、プロトロンビン、またはスカベンジャー受容体由来のＰｔｄＳｅｒ結合ドメインを含む、請求項４５に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項４７】
結合ドメインが、腫瘍抗原に特異的なｓｃＦｖである、請求項４４に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項４８】
腫瘍抗原が、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、ＭＵＣ−１６、Ｌ１ＣＡＭ、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＡ１２５、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＧＤ−３、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、葉酸受容体α、ＣＤ９７、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＷＴ１、ＶＥＧＦ−α、ＶＥＧＦＲ１、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−１１Ｒα、ＰＳＡ、ＦｃＲＨ５、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＡＧ−７２、ＣＥＡ、エフリンＡ２、エフリンＢ２、ルイスＡ抗原、ルイスＹ抗原、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＲＡＧＥ−１、葉酸受容体β、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、ＶＥＧＦＲ−２、ＬＧＲ５、ＳＳＸ２、ＡＫＡＰ−４、ＦＬＴ３、フコシルＧＭ１、ＧＭ３、Ｏ−アセチル−ＧＤ２またはＧＤ２である、請求項４７に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項４９】
結合ドメインが、宿主において持続感染を確立することができる微生物の抗原に特異的なｓｃＦｖである、請求項４４に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項５０】
細胞外ドメインが、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する細胞外スペーサードメインをさらに含む、請求項４４から４９のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項５１】
細胞外スペーサードメインが、免疫グロブリンヒンジ領域、Ｉ型膜タンパク質の細胞外領域、タイプＩＩ−Ｃ型レクチンのストーク領域、免疫グロブリン定常ドメイン、またはそれらの断片を含む、請求項５０に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項５２】
細胞外スペーサードメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡまたはＩｇＤヒンジ領域を含む、請求項５１に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項５３】
細胞外スペーサードメインが、配列番号６７のアミノ酸配列を含む修飾されたＩｇＧ４ヒンジ領域を含む、請求項５２に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項５４】
膜貫通ドメインが、Ｔｉｍ１、Ｔｉｍ４、Ｔｉｍ３、ＦｃＲ、ＣＤ８ａ、ＣＤ２８、ＭＥＲＴＫ、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、ＢＡＩ１、ＣＤ４、ＭＲＣ１、またはＤＡＰ１２膜貫通ドメインを含む、請求項４４から５３のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項５５】
膜貫通ドメインが、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＴｉｍ１膜貫通ドメイン、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＴｉｍ４膜貫通ドメイン、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＦｃγＲＩ膜貫通ドメイン、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＭＥＲＴＫ膜貫通ドメイン、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＡｘｌ膜貫通ドメイン、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＴｙｒｏ３膜貫通ドメイン、配列番号６８のＣＤ２８膜貫通ドメイン、配列番号１４２のＢＡＩ１膜貫通ドメイン、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤ４膜貫通ドメイン、配列番号８９のアミノ酸配列を含むＦｃεＲＩγ膜貫通ドメイン、配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＭＲＣ１膜貫通ドメイン、または配列番号８１のアミノ酸配列を含むＤＡＰ１２膜貫通ドメインを含む、請求項５４に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項５６】
ＦｃＲ膜貫通ドメインが、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃεＲ１、またはＦｃαＲ１膜貫通ドメインを含む、請求項５４に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項５７】
炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、ＰＩ３Ｋ、Ｔｒａｆ６、Ｓｙｋ、ＭｙＤ８８、Ｚａｐ７０、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃεＲ１、ＦｃαＲ１、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＤＡＰ１２、ＮＦＡＭ１、またはＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインである、請求項４４から５６のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項５８】
炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＴｒａｆ６シグナル伝達ドメイン、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＳｙｋシグナル伝達ドメイン、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン、配列番号７８のアミノ酸配列を含む切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＺａｐ７０シグナル伝達ドメイン、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ１シグナル伝達ドメイン、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ２Ａシグナル伝達ドメイン、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ２Ｃシグナル伝達ドメイン、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ３Ａシグナル伝達ドメイン、配列番号８８のアミノ酸配列を含むＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメイン、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＢＡＦＦ−Ｒシグナル伝達ドメイン、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＤＡＰ１２シグナル伝達ドメイン、配列番号９２のアミノ酸配列を含むＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメイン、または配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインである、請求項５７に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項５９】
炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインによるシグナル伝達により、炎症性サイトカイン、炎症性ケモカインまたは共刺激細胞表面マーカーの少なくとも１つの発現がもたらされる、請求項４４から５８のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項６０】
炎症性サイトカインが、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２またはＩＬ−２３であり；炎症性ケモカインが、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ１０であり；そして、共刺激細胞表面マーカーが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＨＶＥＭまたは４−１ＢＢＬであるか；あるいは、それらの何れかの組合せである、請求項５９に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項６１】
一本鎖キメラタンパク質を含むキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）であって、該一本鎖キメラタンパク質が、
エンガルフメント促進マーカーまたは標的抗原に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメイン；
第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメイン；および、
細胞外ドメインと前記第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインの間に位置し、それらを連結している膜貫通ドメインを含む、
キメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項６２】
エンガルフメント促進マーカーが、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）、ＩＣＡＭ−３、酸化低密度リポタンパク質、カルレティキュリン、アネキシンＩ、補体Ｃ１ｑおよびトロンボスポンジンから選択される、請求項６１に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項６３】
ＰｔｄＳｅｒに結合し、ＰｔｄＳｅｒに特異的なｓｃＦｖである結合ドメイン、またはＴｉｍ１、Ｔｉｍ４、Ｔｉｍ３、スタビリン−２、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）、脳特異的血管新生阻害因子１（ＢＡＩ１）、乳脂肪球−ＥＧＦ因子８タンパク質（ＭＦＧ−Ｅ８）、細胞増殖停止特異的因子６（ＧＡＳ６）、プロテインＳ、プロテインＣ、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、β２糖タンパク質Ｉ、α５β３インテグリンおよび他のインテグリン類、ＣＲ３補体受容体、ＣＲ４補体受容体、ＣＤ１４、ＣＤ９３、アネキシンＶ、ホスファチジルセリン受容体（ＰＳｒ）、プロトロンビン、またはスカベンジャー受容体由来のＰｔｄＳｅｒ結合ドメインを含む、請求項６２に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項６４】
結合ドメインが、腫瘍抗原に特異的なｓｃＦｖである、請求項６１に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項６５】
腫瘍抗原が、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、ＭＵＣ−１６、Ｌ１ＣＡＭ、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＡ１２５、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＧＤ−３、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、葉酸受容体α、ＣＤ９７、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＷＴ１、ＶＥＧＦ−α、ＶＥＧＦＲ１、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１１Ｒα、ＰＳＡ、ＦｃＲＨ５、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＡＧ−７２、ＣＥＡ、エフリンＡ２、エフリンＢ２、ルイスＡ抗原、ルイスＹ抗原、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＲＡＧＥ−１、葉酸受容体β、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、ＶＥＧＦＲ−２、ＬＧＲ５、ＳＳＸ２、ＡＫＡＰ−４、ＦＬＴ３、フコシルＧＭ１、ＧＭ３、Ｏ−アセチル−ＧＤ２またはＧＤ２である、請求項６４に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項６６】
結合ドメインが、微生物抗原に特異的なｓｃＦｖである、請求項６１に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項６７】
細胞外ドメインが、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する細胞外スペーサードメインをさらに含む、請求項６１から６６のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項６８】
細胞外スペーサードメインが、免疫グロブリンヒンジ領域、Ｉ型膜タンパク質の細胞外領域、タイプＩＩのＣ型レクチンのストーク領域、免疫グロブリン定常ドメイン、またはそれらの断片を含む、請求項６７に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項６９】
細胞外スペーサードメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡまたはＩｇＤヒンジ領域を含む、請求項６８に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項７０】
細胞外スペーサードメインが、配列番号６７のアミノ酸配列を含む修飾されたＩｇＧ４ヒンジ領域を含む、請求項６９に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項７１】
膜貫通ドメインが、Ｔｉｍ１、Ｔｉｍ４、Ｔｉｍ３、ＦｃＲ、ＣＤ８ａ、ＣＤ２８、ＭＥＲＴＫ、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、ＢＡＩ１、ＣＤ４、ＭＲＣ１またはＤＡＰ１２膜貫通ドメインを含む、請求項６１から７０のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項７２】
膜貫通ドメインが、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＴｉｍ１膜貫通ドメイン、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＴｉｍ４膜貫通ドメイン、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＦｃγＲＩ膜貫通ドメイン、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＭＥＲＴＫ膜貫通ドメイン、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＡｘｌ膜貫通ドメイン、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＴｙｒｏ３膜貫通ドメイン、配列番号６８のＣＤ２８膜貫通ドメイン、配列番号１４２のＢＡＩ１膜貫通ドメイン、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤ４膜貫通ドメイン、配列番号８９のアミノ酸配列を含むＦｃεＲＩγ膜貫通ドメイン、配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＭＲＣ１膜貫通ドメイン、または配列番号８１のアミノ酸配列を含むＤＡＰ１２膜貫通ドメインを含む、請求項７１に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項７３】
ＦｃＲ膜貫通ドメインが、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃεＲ１またはＦｃαＲ１膜貫通ドメインを含む、請求項７１に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項７４】
第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであり、前記第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである、請求項６１から７３のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項７５】
第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであり、第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである、請求項６１から７３のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項７６】
第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであり、第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである、請求項６１から７３のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項７７】
第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであり、第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである、請求項６１から７３のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項７８】
第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、同じかまたは異なる、請求項７４または７５に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項７９】
恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、ＩｔｇＢ５、ＭＥＲＴＫ、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、ＢＡＩ１、ＥＬＭＯまたはＭＲＣ１シグナル伝達ドメインである、請求項７４、７６、７７または７８に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項８０】
恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメイン、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＴｙｒｏ３シグナル伝達ドメイン、配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＩｔｇＢ５シグナル伝達ドメイン、配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＭＲＣ１シグナル伝達ドメイン、配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＢＡＩ１シグナル伝達ドメイン、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＥＬＭＯシグナル伝達ドメイン、または配列番号４４のアミノ酸配列を含むＡｘｌシグナル伝達ドメインである、請求項７９に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項８１】
炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、ＰＩ３Ｋ、Ｔｒａｆ６、Ｓｙｋ、ＭｙＤ８８、Ｚａｐ７０、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃεＲ１、ＦｃαＲ１、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＤＡＰ１２、ＮＦＡＭ１、またはＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインである、請求項７５から７８のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項８２】
炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＴｒａｆ６シグナル伝達ドメイン、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＳｙｋシグナル伝達ドメイン、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン、配列番号７８のアミノ酸配列を含む切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＺａｐ７０シグナル伝達ドメイン、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ１シグナル伝達ドメイン、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ２Ａシグナル伝達ドメイン、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ２Ｃシグナル伝達ドメイン、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ３Ａシグナル伝達ドメイン、配列番号８８のアミノ酸配列を含むＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメイン、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＢＡＦＦ−Ｒシグナル伝達ドメイン、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＤＡＰ１２シグナル伝達ドメイン、配列番号９２のアミノ酸配列を含むＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメイン、または配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインである、請求項８１に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項８３】
一本鎖キメラタンパク質を含むキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）であって、該一本鎖キメラタンパク質が、
エンガルフメント促進マーカーまたは標的抗原に結合するｓｃＦｖを含む細胞外ドメイン；
エンガルフメントシグナル伝達ドメイン；および、
前記細胞外ドメインとエンガルフメントシグナル伝達ドメインとの間に位置し、それらを連結している膜貫通ドメインを含み、
ここで、該膜貫通ドメインおよびエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、それぞれ異なる分子に由来する、
キメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項８４】
ｓｃＦｖが、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）、ＩＣＡＭ−３、酸化低密度リポタンパク質、カルレティキュリン、アネキシンＩ、補体Ｃ１ｑおよびトロンボスポンジンから選択されるエンガルフメント促進マーカーに結合する、請求項８３に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項８５】
ｓｃＦｖが腫瘍抗原に結合する、請求項８３に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項８６】
腫瘍抗原が、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、ＭＵＣ−１６、Ｌ１ＣＡＭ、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＡ１２５、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＧＤ−３、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、葉酸受容体α、ＣＤ９７、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＷＴ１、ＶＥＧＦ−α、ＶＥＧＦＲ１、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−１１Ｒα、ＰＳＡ、ＦｃＲＨ５、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＡＧ−７２、ＣＥＡ、エフリンＡ２、エフリンＢ２、ルイスＡ抗原、ルイスＹ抗原、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＲＡＧＥ−１、葉酸受容体β、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、ＶＥＧＦＲ−２、ＬＧＲ５、ＳＳＸ２、ＡＫＡＰ−４、ＦＬＴ３、フコシルＧＭ１、Ｏ−アセチルＧＤ２またはＧＤ２である、請求項８５に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項８７】
結合ドメインが、微生物抗原に特異的なｓｃＦｖである、請求項８３に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項８８】
細胞外ドメインが、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する細胞外スペーサードメインをさらに含む、請求項８３から８７のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項８９】
細胞外スペーサードメインが、免疫グロブリンヒンジ領域、Ｉ型膜タンパク質の細胞外領域、タイプＩＩのＣ型レクチンのストーク領域、免疫グロブリン定常ドメイン、またはそれらの断片を含む、請求項８８に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項９０】
細胞外スペーサードメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡまたはＩｇＤヒンジ領域を含む、請求項８９に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項９１】
細胞外スペーサードメインが、配列番号６７のアミノ酸配列を含む修飾されたＩｇＧ４ヒンジ領域を含む、請求項９０に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項９２】
膜貫通ドメインが、Ｔｉｍ１、Ｔｉｍ４、Ｔｉｍ３、ＦｃＲ、ＣＤ８ａ、ＣＤ２８、ＭＥＲＴＫ、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、ＢＡＩ１、ＣＤ４、ＭＲＣ１またはＤＡＰ１２膜貫通ドメインを含む、請求項８３から９１のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項９３】
膜貫通ドメインが、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＴｉｍ１膜貫通ドメイン、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＴｉｍ４膜貫通ドメイン、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＦｃγＲＩ膜貫通ドメイン、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＭＥＲＴＫ膜貫通ドメイン、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＡｘｌ膜貫通ドメイン、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＴｙｒｏ３膜貫通ドメイン、配列番号６８のＣＤ２８膜貫通ドメイン、配列番号１４２のＢＡＩ１膜貫通ドメイン、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤ４膜貫通ドメイン、配列番号８９のアミノ酸配列を含むＦｃεＲＩγ膜貫通ドメイン、配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＭＲＣ１膜貫通ドメイン、または配列番号８１のアミノ酸配列を含むＤＡＰ１２膜貫通ドメインを含む、請求項９２に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項９４】
ＦｃＲ膜貫通ドメインが、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃεＲ１またはＦｃαＲ１膜貫通ドメインを含む、請求項９２に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項９５】
エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインまたは炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである、請求項８３から９４のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項９６】
恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、ＩｔｇＢ５、ＭＥＲＴＫ、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、ＢＡＩ１、ＥＬＭＯまたはＭＲＣ１シグナル伝達ドメインである、請求項９５に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項９７】
炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、ＰＩ３Ｋ、Ｔｒａｆ６、Ｓｙｋ、ＭｙＤ８８、Ｚａｐ７０、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃεＲ１、ＦｃαＲ１、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＤＡＰ１２、ＮＦＡＭ１またはＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインである、請求項９５に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項９８】
恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメイン、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＴｙｒｏ３シグナル伝達ドメイン、配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＩｔｇＢ５シグナル伝達ドメイン、配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＭＲＣ１シグナル伝達ドメイン、配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＢＡＩ１シグナル伝達ドメイン、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＥＬＭＯシグナル伝達ドメイン、または配列番号４４のアミノ酸配列を含むＡｘｌシグナル伝達ドメインである、請求項９６に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項９９】
炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＴｒａｆ６シグナル伝達ドメイン、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＳｙｋシグナル伝達ドメイン、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン、配列番号７８のアミノ酸配列を含む切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＺａｐ７０シグナル伝達ドメイン、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ１シグナル伝達ドメイン、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ２Ａシグナル伝達ドメイン、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ２Ｃシグナル伝達ドメイン、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ３Ａシグナル伝達ドメイン、配列番号８８のアミノ酸配列を含むＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメイン、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＢＡＦＦ−Ｒシグナル伝達ドメイン、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＤＡＰ１２シグナル伝達ドメイン、配列番号９２のアミノ酸配列を含むＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメイン、または配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインである、請求項９７に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項１００】
恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインによるシグナル伝達により、抗炎症性または免疫抑制性サイトカインの少なくとも１つの発現がもたらされる、請求項９５、９６または９８に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項１０１】
抗炎症性または免疫抑制性サイトカインが、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−１０または両方である、請求項１００に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項１０２】
炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインによるシグナル伝達により、炎症性サイトカイン、炎症性ケモカインまたは共刺激細胞表面マーカーの少なくとも１つの発現がもたらされる、請求項９５、９７または９９のいずれか一項に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項１０３】
炎症性サイトカインが、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２またはＩＬ−２３であり；炎症性ケモカインが、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ１０であり；そして、共刺激細胞表面マーカーが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＨＶＥＭまたは４−１ＢＢＬであるか；あるいは、それらの何れかの組合せである、請求項１０２に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項１０４】
ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖを含む結合ドメインおよびＩｇＧ４ヒンジ領域を含む細胞外スペーサードメインを含む、細胞外ドメイン；
ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメイン；および、
前記細胞外ドメインとエンガルフメントシグナル伝達ドメインとの間に位置し、それらを連結しているＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含み、
ここで、前記細胞外スペーサードメインが、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置している、請求項８３に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項１０５】
配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４アミノ酸２３−７８３を含む、請求項１０４に記載のキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）。
【請求項１０６】
請求項１から１０５のいずれか一項に記載のＣＥＲをコードする核酸分子。
【請求項１０７】
少なくとも１つの低分子量ＧＴＰアーゼをコードする配列をさらに含む、請求項１０６に記載の核酸分子。
【請求項１０８】
低分子量ＧＴＰアーゼが、Ｒａｃ１、Ｒａｂ５、Ｒａｂ７、Ｒａｐ１、ＲｈｏＡまたはＣＤＣ４２である、請求項１０７に記載の核酸分子。
【請求項１０９】
低分子量ＧＴＰアーゼが、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＲａｃ１、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＲａｂ５、配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＲａｂ７、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＲａｐ１Ａ、配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＲｈｏＡ、配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＣ４２、またはそれらの何れかの組合せである、請求項１０８に記載の核酸分子。
【請求項１１０】
ＩＲＥＳ配列、フリン切断部位配列またはウイルス２Ａペプチド配列が、ＣＥＲをコードする配列と低分子量ＧＴＰアーゼをコードする配列との間に配置されている、請求項１０７から１０９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１１】
形質導入マーカー、自殺遺伝子またはその両方をコードする配列をさらに含む、請求項１０６から１１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１２】
形質導入マーカーが、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む切断型ＥＧＦＲタンパク質である、請求項１１１に記載の核酸分子。
【請求項１１３】
請求項１０６から１１２のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１１４】
ベクターがマルチシストロン性ベクターである、請求項１１３に記載のベクター。
【請求項１１５】
ベクターが、ウイルスベクター、修飾ｍＲＮＡベクター、またはトランスポゾン介在遺伝子導入ベクターである、請求項１１３または１１４に記載のベクター。
【請求項１１６】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項１１５に記載のベクター。
【請求項１１７】
請求項１から１０５のいずれか一項に記載のＣＥＲ、請求項１０６から１１２のいずれか一項に記載の核酸、または請求項１１３から１１６のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１１８】
請求項１から１０５のいずれか一項に記載の少なくとも２つの異なるＣＥＲを含む、請求項１１７に記載の宿主細胞。
【請求項１１９】
低分子量ＧＴＰアーゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む、請求項１１７または１１８に記載の宿主細胞。
【請求項１２０】
ＣＥＲおよび低分子量ＧＴＰアーゼが、同じベクターにコードされている、請求項１１９に記載の宿主細胞。
【請求項１２１】
ＣＥＲおよび低分子量ＧＴＰアーゼが、別のベクターにコードされている、請求項１１９に記載の宿主細胞。
【請求項１２２】
低分子量ＧＴＰアーゼが、Ｒａｃ１、Ｒａｂ５、Ｒａｂ７、Ｒａｐ１、ＲｈｏＡまたはＣＤＣ４２である、請求項１１９から１２１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２３】
低分子量ＧＴＰアーゼが、配列番号７６のアミノ酸配列を含むＲａｃ１、配列番号７７のアミノ酸配列を含むＲａｂ５、配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＲａｂ７、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＲａｐ１Ａ、配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＲｈｏＡ、配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＣ４２、またはそれらの何れかの組合せである、請求項１２２に記載の宿主細胞。
【請求項１２４】
前記宿主細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナイーブ（ＣＤ４５ ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ４５ＲＯ−）Ｔ細胞、セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋）Ｔ細胞、エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ２７−）Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞、γδ（ｇｄ）Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、および組織常在型Ｔ細胞を含むＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、リンパ球系共通前駆細胞を含むリンパ球系前駆細胞、樹状細胞を含む抗原提示細胞、ランゲルハンス細胞、骨髄系前駆細胞、または成熟骨髄細胞である、請求項１１７から１２３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２５】
Ｂ細胞が、ナイーブＢ細胞、血漿細胞、制御性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞Ｂ細胞、リンパ形質細胞様細胞、プラズマブラスト細胞、またはメモリーＢ細胞である、請求項１２４に記載の宿主細胞。
【請求項１２６】
宿主細胞がヒト細胞である、請求項１１７から１２５に記載の宿主細胞。
【請求項１２７】
宿主細胞が、ＣＥＲの細胞外ドメインがエンガルフメント促進マーカーまたは標的抗原に結合するとき、エンガルフメント活性を示す、請求項１１７から１２６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２８】
宿主細胞が、ＣＥＲの細胞外ドメインがエンガルフメント促進マーカーまたは標的抗原に結合するとき、食細胞作用活性を示す、請求項１２７に記載の宿主細胞。
【請求項１２９】
請求項１１７から１２８のいずれか一項に記載の宿主細胞集団。
【請求項１３０】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、リンパ球系前駆細胞、抗原提示細胞、ランゲルハンス細胞、骨髄系前駆細胞、成熟骨髄細胞、またはそれらの何れかの組合せの集団を含む、請求項１２９に記載の宿主細胞集団。
【請求項１３１】
宿主細胞集団を濃縮工程に付す、請求項１２９または１３０に記載の宿主細胞集団。
【請求項１３２】
宿主細胞または宿主細胞集団が、標的細胞に対して少なくとも２０の食細胞作用指数を示す、請求項１１７から１２８のいずれか一項に記載の宿主細胞または請求項１２９から１３１のいずれか一項に記載の宿主細胞集団。
【請求項１３３】
請求項１０６から１１２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１１３から１１６のいずれか一項に記載のベクター、請求項１１７から１２８のいずれか一項に記載の宿主細胞、または請求項１２９から１３１のいずれか一項に記載の宿主細胞集団、および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１３４】
癌を有する対象を処置する方法であって、有効量の、請求項１から１０５のいずれか一項に記載のＣＥＲを発現するように遺伝子改変された細胞、請求項１１７から１２８のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項１２９から１３１のいずれか一項に記載の宿主細胞集団、または請求項１３３に記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項１３５】
腫瘍抗原の過剰発現と関連する疾患、障害または望ましくない病状を有する対象を処置する方法であって、有効量の、請求項１から１０５のいずれか一項に記載のＣＥＲを発現するように遺伝子改変された細胞、請求項１１７から１２８のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項１２９から１３１のいずれか一項に記載の宿主細胞集団、または請求項１３３に記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項１３６】
自己免疫疾患、障害または望ましくない病状を有する対象を処置する方法であって、有効量の、請求項１から１０５のいずれか一項に記載のＣＥＲを発現するように遺伝子改変された細胞、請求項１１７から１２８のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項１２９から１３１のいずれか一項に記載の宿主細胞集団、または請求項１３３に記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項１３７】
対象における感染性疾患を処置または予防する方法であって、有効量の、請求項１から１０５のいずれか一項に記載のＣＥＲを発現するように遺伝子改変された細胞、請求項１１７から１２８のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項１２９から１３１のいずれか一項に記載の宿主細胞集団、または請求項１３３に記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項１３８】
前記遺伝子改変された細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナイーブ（ＣＤ４５ ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ４５ＲＯ−）Ｔ細胞、セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋）Ｔ細胞、エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ２７−）Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞、γδ（ｇｄ）Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、および組織常在型Ｔ細胞を含むＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、リンパ球系共通前駆細胞を含むリンパ球系前駆細胞、樹状細胞を含む抗原提示細胞、ランゲルハンス細胞、骨髄系前駆細胞、または成熟骨髄細胞である、請求項１３４から１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記Ｂ細胞が、ナイーブＢ細胞、血漿細胞、制御性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞Ｂ細胞、リンパ形質細胞様細胞、プラズマブラスト細胞、またはメモリーＢ細胞である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
遺伝子改変された細胞が自家細胞である、請求項１３８または１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
遺伝子改変された細胞が同種異系細胞である、請求項１３８または１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
癌を有する対象を処置する方法であって、有効量の、請求項１１３から１１６のいずれか一項に記載のベクターを該対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４３】
腫瘍抗原の過剰発現と関連する疾患、障害または望ましくない病状を有する対象を処置する方法であって、有効量の、請求項１１３から１１６のいずれか一項に記載のベクターを該対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４４】
自己免疫疾患、障害または望ましくない病状を有する対象を処置する方法であって、有効量の、請求項１１３から１１６のいずれか一項に記載のベクターを該対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４５】
対象における感染性疾患を処置または予防する方法であって、有効量の、請求項１１３から１１６のいずれか一項に記載のベクターを該対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４６】
低分子量ＧＴＰアーゼをコードする核酸分子を含む第二のベクターを投与することをさらに含む、請求項１４２から１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
低分子量ＧＴＰアーゼが、Ｒａｃ１、Ｒａｂ５、Ｒａｂ７、Ｒａｐ１、ＲｈｏＡまたはＣＤＣ４２である、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
遺伝子改変された細胞、宿主細胞集団、医薬組成物またはベクターが、第二の治療剤と組み合わせて対象に投与される、請求項１３４から１４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４９】
第二の治療剤が、抗体、放射線療法、化学療法剤、細胞免疫療法、抗生物質、抗真菌薬または抗ウイルス剤である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
ＣＥＲが、第二の治療剤の投与後に投与される、請求項１４８または１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
第二の治療剤が治療用量以下の用量で投与される、請求項１４８または１４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表に関する説明
本出願に関連する配列表は、紙コピーに代えてテキスト形式で提供され、引用により本明細書に組み込まれている。配列表を含むテキストファイルの名称は、200265_401WO_SEQUENCE_LISTING.txtである。このテキストファイルは、２７５ＫＢであり、２０１７年９月２６日に作成され、そしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００２】
背景
標的、細胞タイプおよび周囲の環境によって影響を受ける食細胞作用には２つの主な種類がある。微生物に対する食細胞作用は、疾患の原因となる微生物を排除および分解し、サイトカインおよびケモカインの分泌を介して炎症誘発性のシグナル伝達を誘導し、ならびに免疫細胞を動員して効果的な炎症反応を引き起こす。この種の食細胞作用はしばしば、“炎症性食細胞作用”（または“免疫原性食細胞作用”）と呼ばれる。しかしながら、ある種の持続感染症のようないくつかの例では、抗炎症反応が微生物の取り込み後に生じ得る。微生物に対する食細胞作用は、一般的に、未成熟樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージのような骨髄系のプロフェッショナル食細胞によって、ならびに組織常在型免疫細胞によって行われる。
【０００３】
これとは対照的に、損傷を受けた自己由来のアポトーシス細胞または細胞片の食細胞作用（例えば、エフェロサイトーシス）は、一般的には、非炎症性（“非免疫原性”とも称される）プロセスである。何十億もの損傷を受けた細胞、死につつある細胞、および不要な細胞が、毎日、アポトーシスを起こしている。不要な細胞には、例えば、発生中に生成された過剰な細胞、老化細胞、感染細胞（細胞内細菌またはウイルス）、形質転換細胞または悪性細胞、および細胞傷害物質によって不可逆的に損傷を受けた細胞が含まれる。食細胞は、周囲の組織に損傷を与えたり、炎症誘発性免疫応答を誘導したりすることなく、アポトーシス細胞の特異的で迅速な除去を行う。アポトーシス細胞のクリアランスのための工程は以下を含む：（１）アポトーシス細胞からの、アポトーシス細胞の位置に食細胞を動員するための“ファインドミー”シグナルの放出；（２）アポトーシス細胞の表面に露出した“イートミー”シグナルが、特異的受容体を介して食細胞に結合される；（３）アポトーシス細胞を取り込むための細胞骨格再配列；および、（４）取り込まれたアポトーシス細胞が消化され、特異的な食細胞作用反応が誘発される（例えば、抗炎症性サイトカインの分泌が起こる）。
【０００４】
感染症、炎症性疾患、免疫疾患および種々の癌を処置するための新規組成物および方法が必要とされている。本明細書に記載される方法および組成物は、種々の癌、急性および慢性の感染症、炎症性疾患、免疫疾患および選択された神経性疾患の処置において、身体からの、感染細胞、形質転換細胞、悪性細胞、アポトーシス細胞、損傷を受けた細胞または壊死細胞もしくは粒子の除去を促進することによってそのようなニーズを満たす。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本明細書には、キメラのエンガルフメント（engulfment）受容体が記載されている。特定の態様において、キメラエンガルフメント受容体（単数形で“ＣＥＲ”および複数形で“ＣＥＲｓ”）は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内エンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。膜貫通ドメインは、細胞外ドメインとエンガルフメントシグナル伝達ドメインの間に位置し、それらを連結している。細胞外ドメインは、結合ドメイン、および要すれば、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する細胞外スペーサードメインを含む。特定の態様において、本明細書に記載のキメラエンガルフメント受容体は、（ａ）疾患、障害、病状または感染と関連する、エンガルフメント促進マーカー(pro-engulfment marker)または標的抗原を標的とする細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）エンガルフメントシグナル伝達ドメインを有するキメラタンパク質である。特定の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、恒常性エンガルフメントドメインおよび炎症誘発性エンガルフメントドメインのうち少なくとも１つを含む。ある態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。特定の態様において、キメラエンガルフメント受容体は、一本鎖キメラタンパク質である。キメラエンガルフメント受容体は、標的細胞／臓器／組織／領域に対する炎症反応を生じるように設計することができる。アポトーシス細胞クリアランスは一般的には非炎症過程であるが、炎症は、例えば、残存腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するためのアポトーシス腫瘍細胞のクリアランスなど、特定の状況において宿主にとって有益であり得る。
【０００６】
ある態様において、ＣＥＲの細胞外ドメインは、エンガルフメント促進マーカーに特異的な結合ドメインを含む。かかる特定の態様において、細胞外ドメインは、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）結合ドメインを含む。本明細書に記載のＣＥＲの態様において、ＰｔｄＳｅｒ結合ドメインは、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン１（Ｔｉｍ１）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン４（Ｔｉｍ４）またはＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン３（Ｔｉｍ３）の細胞外ドメインの全部または一部を含み得る。他の態様において、ＰｔｄＳｅｒ結合ドメインは、ＦＡ５８Ｃ２、ＧＡＳ６、プロテインＳ、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、またはプロトロンビンＰＳに由来する結合ドメインの全部または一部を含み得る。
【０００７】
さらなる態様において、細胞外ドメインは標的抗原に結合する。かかる特定の態様において、細胞外ドメインは、例えば、ＦｃＧＲ１、ＦｃＧＲ２Ａ、ＦｃＧＲ２Ｂ２、ＦｃＧＲ２Ｃ、ＦｃＧＲ３Ａ、ＦｃεＲ１およびＦｃαＲ１などのＦｃ受容体（ＦｃＲ）の細胞外ドメインの全部または一部を含む。さらに他の態様において、細胞外ドメインが標的抗原に結合するとき、該細胞外ドメインは抗体またはその抗原結合ドメインを含み得る。例えば、細胞外ドメインは、イントラボディ、ペプチボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体、ＳＭＩＰおよび多重特異性抗体から選択される抗体または抗原結合ドメインを含み得る。かかる特定の態様において、細胞外ドメインはＦａｂ結合ドメインを含む。さらに他のそのような態様において、細胞外ドメインはｓｃＦｖを含む。
【０００８】
エンガルフメン促進マーカーまたは標的化抗原へのＣＥＲの細胞外ドメインの結合により、ＣＥＲのエンガルフメントシグナル伝達ドメインは、エンガルフメントシグナル伝達活性を刺激する。従って、活性化により、ＣＥＲに含まれるエンガルフメントシグナル伝達ドメインは、宿主細胞にエンガルフするように指示するエフェクター機能的シグナルを伝達する。特定の態様において、ＣＥＲのエンガルフメントシグナル伝達ドメインは、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインの例には、ＭＲＣ１、ＩｔｇＢ５、ＭＥＲＴＫ、Ｔｙｒｏ３およびＡｘｌシグナル伝達ドメインが含まれる。他の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインの例には、Ｔｒａｆ６、Ｓｙｋ、ＭｙＤ８８、Ｚａｐ７０、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃεＲ１、ＦｃαＲ１、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＮＦＡＭ１、ＤＡＰ１２およびＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインが含まれる。さらに他の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。かかる態様において、前記第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインは、本明細書に記載のものを含む、恒常性および炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインから独立して選択され得る。
【０００９】
さらなる側面において、本発明は、ＣＥＲを発現するように遺伝子改変された細胞に関する。特定の態様において、ＣＥＲは、単一の天然受容体タンパク質によっては現されないエンガルフメント表現型をもたらす。他の態様において、本発明のＣＥＲは、エンガルフメント活性を天然では示さない細胞に、エンガルフメント表現型を付与する。特定の態様において、細胞は、死細胞、死につつある細胞、損傷を受けた細胞、感染細胞または壊死細胞と関連するエンガルフメント促進マーカーを標的とするＣＥＲを発現するように遺伝子改変されている。他の態様において、細胞は、感染性微生物または感染性粒子によって誘導される分子と結合する抗体などのマーカーを標的とするＣＥＲを発現するように遺伝子改変されている。かかる態様において、遺伝子改変細胞は、標的化感染微生物または感染粒子によって誘導される標的分子と関連するマーカーのＣＥＲによる結合により、標的化細胞または微生物の除去または分解を促進する。他の特定の態様において、細胞は、通常はエンガルフメントを引き起こさない抗原マーカーを標的とするＣＥＲを発現するように遺伝子改変されている。例えば、かかる態様において、ＣＥＲの細胞外ドメインは、抗体またはその抗原結合部分、例えばＦａｂ結合ドメインまたは抗原マーカーに特異的なｓｃＦｖなどを含み得る。かかる特定の態様において、抗原マーカーは、疾患、障害または他の望ましくない状態に関連する異常細胞に特徴的な表面タンパク質、糖タンパク質または糖脂質であり得る。かかる態様において、遺伝子改変された細胞は、ＣＥＲによる抗原マーカーの結合の際に異常細胞の排除または分解を促進する。
【００１０】
さらなる態様において、ＣＥＲ改変細胞は、低分子量ＧＴＰアーゼを共発現するようにさらに改変されてもよい。低分子量ＧＴＰアーゼは、ＣＥＲおよび低分子量ＧＴＰアーゼの両方をコードするベクターを用いてＣＥＲ改変細胞に導入することができる。あるいは、低分子量ＧＴＰアーゼは、ＣＥＲを導入するために用いたベクターとは異なるベクターを用いて、ＣＥＲ改変細胞またはＣＥＲ改変細胞となり得る細胞に導入することができる。
【００１１】
またさらなる側面では、本発明は、疾患、障害または望ましくない状態に罹患している対象を処置する方法に関する。これらの方法の態様は、治療的有効量の、１以上のＣＥＲを含む医薬組成物または本明細書の記載に従って１以上のＣＥＲを発現するように遺伝子改変された細胞集団を対象に投与することを含む。
【００１２】
他の側面において、本発明は、宿主細胞のエンガルフメント表現型を改変するための方法を提供する。特定の態様において、そのような方法としては１以上の以下の方法が挙げられる：エンガルフメント表現型を天然に示さない宿主細胞にＣＥＲを導入し、それを発現させることにより、エンガルフメント表現型を示す細胞集団を作製する方法；宿主細胞にＣＥＲを導入して発現させることによって細胞集団のエンガルフメント表現型を改変する方法（ここで、ＣＥＲは、宿主細胞によって天然に標的とされないエンガルフメント促進マーカーまたは抗原マーカーに特異的なエンガルフメント表現型を付与する）；および、宿主細胞にＣＥＲを導入して発現させることによって細胞集団のエンガルフメント表現型を増強するための方法（ここで、ＣＥＲは、宿主細胞によって天然に標的とされるエンガルフメント促進マーカーまたは抗原マーカーに特異的であり、宿主細胞によるＣＥＲの発現は、標的化されたエンガルフメント促進マーカーまたは抗原マーカーを示す、細胞、微生物または粒子の、宿主細胞によるエンガルフメントを増強する）。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａから１Ｄは、キメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）の例示的概略図を示す。図１Ａは、ホスファチジルセリンに特異的な細胞外ドメインを有する２つの例示的なＣＥＲ（Ｔｉｍ４およびｓｃＦｖ）を示し、単一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。図１Ｂは、ホスファチジルセリンに特異的な結合ドメインを有する２つの例示的なＣＥＲ（Ｔｉｍ４およびｓｃＦｖ）を示し、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む１つのエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。ＣＥＲへのアクセサリードメインまたは第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインの組み込みは、アクセサリー受容体に対する発現リガンドが存在しない場合でもエンガルフメント応答を増強し得る。図１Ｃは、ＦａｂまたはＦｃＲを含む細胞外ドメインを有する２つの例示的ＣＥＲを示し、単一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。図１Ｄは、ＦａｂまたはＦｃＲを含む２つの例示的なＣＥＲを示し、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。“ＴＭＤ”は膜貫通ドメイン。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、例示的なＣＥＲベクターを示す。図２Ａに示されるＣＥＲベクターは、単一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。図２Ｂに示されるＣＥＲベクターは、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。“ＥＣＤ”＝細胞外ドメイン。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、天然リンパ球と本発明のＣＥＲで改変されたリンパ球との比較を示す。図３Ａは、内因性リンパ球を示す。図３Ｂは、本発明のＣＥＲで改変されたリンパ球を示す。
【図４】図４は、本発明のＣＥＲの例示的な投与方法を示す。
【図５】図５Ａから５Ｃは、例示的な処置タイムスケジュールを示す。図５Ａは、ＣＥＲで改変された細胞を用いる処置のための治療計画を示す。図５Ｂは、非食細胞作用性Ｔ細胞免疫療法と組み合わせて用いられるＣＥＲ改変細胞の治療計画を示す。図５Ｃは、モノクローナル抗体、従来の化学療法または放射線療法と組み合わせて用いられるＣＥＲ改変細胞の治療計画を示す。
【００１４】
【図６】図６Ａから６Ｆは、アポトーシス標的細胞のＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）介在性のインビトロでのエンガルフメントを示す。図６Ａは、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲの例示的概略図を示す。ＥＣＤ＝細胞外ドメイン；ＴＭＤ＝膜貫通ドメイン；ＥＳＤ＝エンガルフメントシグナル伝達ドメイン。図６Ｂは、図６ＡのＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲをコードするヌクレオチド配列および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするヌクレオチド配列を含むｐＭＳＣＶレトロウイルスベクター（ＧＦＰ Ｖｅｃｔｏｒ）を形質導入されたマウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣｓ）プロットを示す。陽性のＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞形質導入体を、フローサイトメトリーを用いて、緑色蛍光タンパク質マーカーおよびＴｉｍ４について染色して、Ｂａ／Ｆ３ Ｂ細胞の細胞膜上のＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲの存在を示すことにより選別した。図６Ｃは、ＦＡＣｓにより定量された、インキュベーションの２時間後および２４時間後での、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ キメラエンガルフメント受容体を発現するＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞によるアポトーシス初代胸腺細胞の食細胞作用の棒グラフを示す。Ｔｉｍ４およびＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を含むｐＭＳＣＶを形質導入されたＢＡ／Ｆ３ Ｂ細胞を陰性対照として用いた。図６Ｄは、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ表面発現の量、ならびに標的細胞インキュベーションの時間と、アポトーシス初代胸腺細胞の食細胞作用との相関関係を図示する折れ線グラフを示す。図６Ｅは、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲを発現する細胞が、ｐＨｒｏｄｏ赤色色素で染色されたアポトーシス初代胸腺細胞をエンガルフすることを示す、蛍光顕微鏡からの画像を示す。黄色三角は、ファゴリソソーム内部のアポトーシス初代胸腺細胞を示す。白色四角は、エンガルフされていないアポトーシス初代胸腺細胞の低強度の染色を示す。図６Ｆは、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ発現について二重陽性であり、インビトロでの食細胞作用を示している、Ｂａ／Ｆ３細胞のＦＡＣおよびヒストグラムプロットを示す。
【図７】図７Ａ−７Ｂは、アポトーシス標的細胞のＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）介在性エンガルフメントを示す。図７Ａは、１２時間および４８時間のインキュベーション時間での、標的アポトーシス胸腺細胞のＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ介在性クリアランスのタイムラプス画像を示す。４日以内に標的細胞の９５％以上が除去された。アポトーシス胸腺細胞のシートは、Ｔｉｍ４を発現する対照Ｂａ／Ｆ３細胞（下パネル）（白矢印は胸腺細胞を指す）の存在下で持続する。図７Ｂは、対照サンプル（Ｔｉｍ４発現Ｂａ/Ｆ３細胞）およびＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ発現Ｂａ／Ｆ３細胞サンプル中の高倍率顕微鏡視野あたりに存在する胸腺細胞数を定量化する折れ線グラフを示す。図７Ｂは、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲを発現するリンパ球によるアポトーシス胸腺細胞の本質的に完全な除去を実証する。
【図８】図８Ａ−８Ｃは、Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞のＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫキメラエンガルフメント受容体介在性クリアランスを示す。図８Ａは、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ発現について二重陽性であるＢａ／Ｆ３細胞のＦＡＣｓプロットを示し、インビトロ食細胞作用を実証する。図８Ｂは、Ｔｉｍ４を発現する対照Ｂａ／Ｆ３ Ｂ細胞と比較した、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ発現Ｂａ／Ｆ３ Ｂ細胞によるＲａｊｉバーキットリンパ腫細胞の食細胞作用の棒グラフを示す。図８Ｃは、Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞のＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲを介したクリアランスの蛍光顕微鏡写真を示す。
【００１５】
【図９】図９Ａ−９Ｆは、アポトーシス標的細胞のＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）介在性インビトロエンガルフメントを示す。図９Ａは、ＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲの例示的概略図を示す。図９Ｂは、ＦＡＣｓにより定量された、インキュベーションの２時間後および２４時間後でのＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ発現Ｂａ／Ｆ３ Ｂ細胞によるアポトーシス初代胸腺細胞の食細胞作用の棒グラフを示す。Ｔｉｍ４およびＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を含むｐＭＳＣＶを形質導入されたＢＡ／Ｆ３ Ｂ細胞を陰性対照として用いた。図９Ｃは、ＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ表面発現の量、ならびに標的細胞のインキュベーション時間と、アポトーシス初代胸腺細胞の食細胞作用との間の相関関係を示す折れ線グラフを示す。図９Ｄは、ＦＡ５８Ｃ３−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ発現細胞が、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ色素染色されたアポトーシス初代胸腺細胞を取り込むことを示す、蛍光顕微鏡からの画像を示す。黄色三角は、ファゴリソソーム内のアポトーシス初代胸腺細胞を示す。図９Ｅは、ＦＡＣｓプロットを示す。図９Ｆは、図９Ｆは、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ発現について二重陽性であるＢａ／Ｆ３細胞のヒストグラムプロットを示し、インビトロ食細胞作用を実証する。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｅは、低分子量ＧＴＰアーゼＲａｃ１によるＣＥＲ介在性食細胞作用の増強を示す。図１０Ａは、Ｐ２Ａ配列を間に挿入されたＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲおよびＲａｃ１またはＲａｂ５の双シストロン性レトロウイルス発現カセット（上パネル）およびその結果同時発現されたＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲおよびＧＴＰａｓｅ（Ｒａｃ１）（下パネル）の概略図を示す。図１０Ｂは、ＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲまたはＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ＋Ｒａｃ１を発現するＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞における、２４時間のインキュベーションでの、ＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ表面発現の量とアポトーシス初代胸腺細胞の食細胞作用との相関関係を示す折れ線グラフを示す。図１０Ｃは、ＦＡ５８Ｃ３−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ＋Ｒａｃ１発現細胞が、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ色素染色されたアポトーシス初代胸腺細胞を取り込むことを示す蛍光顕微鏡からの画像を示す。図１０Ｄは、ＦＡＣｓプロットを示す。図１０Ｅは、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ＋Ｒａｃ１発現について二重陽性であるＢａ／Ｆ３細胞のヒストグラムプロットを示し、インビトロ食細胞作用を実証する。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｅは、標的アポトーシス細胞のＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲ介在性インビトロエンガルフメントを示す。図１１Ａは、ＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲのレトロウイルス発現カセットならびにＰ２Ａ配列を間に挿入されたＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲおよび低分子量ＧＴＰアーゼＲａｃ１の双シストロン性レトロウイルス発現カセット（上パネル）、ならびにその結果同時発現されたＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲおよびＲａｃ１（下パネル）の概略図を示す。図１１Ｂは、ＦＡＣｓにより定量された、インキュベーションの２時間後および２４時間後における、ＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲ−またはＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲ＋Ｒａｃ１発現Ｂａ／Ｆ３ Ｂ細胞によるアポトーシス初代胸腺細胞の食細胞作用の棒グラフを示す。Ｔｉｍ４および緑色蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むｐＭＳＣＶを形質導入されたＢＡ／Ｆ３ Ｂ細胞を陰性対照として用いた。図１１Ｃは、ＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲまたはＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲ＋Ｒａｃ１を発現するＢａ／Ｆ３Ｂ細胞における２４時間のインキュベーションでの、ＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲ表面発現の量とアポトーシス初代胸腺細胞の食細胞作用との間の相関関係を示す折れ線グラフを示す。低分子量ＧＴＰアーゼ Ｒａｃ１の添加により、食細胞作用が増強される。図１１Ｄは、ＦＡ５８Ｃ３−ＳｙｋＣＥＲ＋Ｒａｃ１発現細胞が、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ色素染色されたアポトーシス初代胸腺細胞を取り込むことを示す蛍光顕微鏡からの画像を示す。黄色三角は、ファゴリソソーム内のアポトーシス初代胸腺細胞を示す。図１１Ｅは、インビトロでの食細胞作用を実証する、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲ＋Ｒａｃ１発現について二重陽性であるＢａ／Ｆ３細胞のＦＡＣｓプロットを示す。
【００１６】
【図１２】図１２Ａ−１２Ｄは、低分子量ＧＴＰアーゼ Ｒａｂ５の共発現が、ＣＥＲ介在性食細胞作用を増強することを示す。図１２Ａは、Ｐ２Ａ配列を間に挿入されたＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲおよび低分子量ＧＴＰアーゼＲａｂ５の双シストロン性レトロウイルス発現カセット（上パネル）ならびにその結果同時発現されたＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲおよびＲａｂ５（下パネル）の概略図を示す。図１２Ｂは、ＦＡＣｓにより定量された、インキュベーションの２時間後での、ＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲ−またはＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲ＋Ｒａｂ５発現 Ｂａ／Ｆ３ Ｂ細胞によるアポトーシス初代胸腺細胞の食細胞作用の棒グラフを示す。Ｔｉｍ４およびＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を含むｐＭＳＣＶを形質導入されたＢＡ／Ｆ３ Ｂ細胞を陰性対照として用いた。図１２Ｃは、ＦＡ５８Ｃ３−ＳｙｋＣＥＲ＋Ｒａｂ５発現細胞が、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ色素染色された初代胸腺細胞アポトーシス初代胸腺細胞を取り込むことを示す蛍光顕微鏡からの画像を示す。図１２Ｄは、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲについて二重陽性であるＢａ／Ｆ３細胞（左プロット）、ＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲ＋Ｒａｂ５発現について二重陽性であるＢａ／Ｆ３細胞（中プロット）またはＴｉｍ４対照のＢａ／Ｆ３細胞のＦＡＣｓプロットを示し、ＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲ発現細胞のインビトロでの食細胞作用（９％）およびＲａｂ５の添加による食細胞作用の増加（１２．５％）を実証する。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｈは、標的Ｂ細胞のＣＤ１９−ＭＥＲＴＫキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）介在性インビトロエンガルフメントを示す。図１３Ａは、ＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲのレトロウイルス発現カセット（上パネル）およびその結果同時発現されたＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ（下パネル）の例示的概略図を示す。図１３Ｂは、Ｐ２Ａ配列を間に挿入されたＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲおよび低分子量ＧＴＰアーゼ Ｒａｃ１の双シストロン性レトロウイルス発現カセット（上パネル）およびその結果同時発現されたＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲおよびＲａｃ１（下パネル）の例示的概略図を示す。図１３Ｃは、ＦＡＣｓにより定量化された、インキュベーションの２時間後および２４時間後の、ＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ−またはＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ＋Ｒａｃ１発現Ｂａ／Ｆ３ Ｂ細胞によるＲａｊｉバーキットリンパ腫細胞の食細胞作用の棒グラフを示す。Ｔｉｍ４およびＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を含むｐＭＳＣＶを形質導入されたＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を陰性対照として用いた。図１３Ｄは、ＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲを発現するＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞中で、２４時間インキュベートしたときの、ＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ表面発現の量とＲａｊｉバーキットリンパ腫細胞の食細胞作用との間の相関関係を示す折れ線グラフである。図１３Ｅは、ＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ＋Ｒａｃ１発現細胞が、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ色素染色されたＲａｊｉバーキットリンパ腫細胞を取り込むことを示す蛍光顕微鏡による画像を示す。黄色三角は、ファゴリソソーム内のアポトーシス初代胸腺細胞を示す。図１３Ｆは、インビトロでの食細胞作用を実証する、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ発現について二重陽性であるＢａ／Ｆ３細胞の、Ｒａｊｉバーキットリンパ腫標的細胞との２時間のインキュベーションでのＦＡＣｓプロットを示し、図１３Ｇは、Ｒａｊｉバーキットリンパ腫標的細胞との２４時間のインキュベーションでのＦＡＣｓプロットを示す。図１３Ｈは、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ色素染色したＲａｊｉバーキットリンパ腫細胞を取り込んだＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ発現細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。白色矢印は、エンガルフメント事象を示す。
【図１４】図１４は、本発明のＣＥＲの例を示す、表１および２を示す。
【図１５】図１５は、本発明のＣＥＲの例を示す、表３を示す。
【図１６】図１６は、配列番号７１のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ０１”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ０１は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメインおよびＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ０１配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図１７】図１７Ａ−Ｄは、ＣＥＲ０１を形質導入したＢａ／Ｆ３マウス細胞のＦＡＣＳ精製を示す。ビオチン標識されたセツキシマブ（抗ＥＧＦＲ抗体）、次いでストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）コンジュゲートを用いて、形質導入されていないＢａ／Ｆ３細胞（図１７Ａ）およびＣＥＲ０１−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ含有レンチウイルスを形質導入されたＢａ／Ｆ３マウスＢ細胞（図１７Ｂ）において、形質導入の４８時間後に、ＦＡＣＳによりＥＧＦＲ発現を検出した。ＣＥＲ＋ＥＧＦＲｔ＋発現細胞（図１７Ｃ）をＦＡＣｓにより選択し、その後のアッセイのために増殖させた。図１７Ｄは、ＥＧＦＲｔ精製後の形質導入されていないＢａ／Ｆ３対照細胞を示す。
【００１７】
【図１８】図１８Ａ−Ｂは、ＣＥＲ０１＋ Ｂａ／Ｆ３マウスＢ細胞によるデキサメタゾン処理胸腺細胞のインビトロエンガルフメントを示す。図１８Ａは、デキサメタゾン処理胸腺細胞と共培養したＥＧＦＲｔ＋対照を形質導入したＢａ／Ｆ３細胞の蛍光顕微鏡画像を示す；図１８Ｂは、デキサメタゾン処理胸腺細胞と共培養したＣＥＲ０１を形質導入したＢａ／Ｆ３細胞の蛍光顕微鏡画像を示す（白色矢印はエンガルフメント事象を示す）。図１８Ｂの一部の拡大画像を右側に示す。
【図１９】図１９Ａ−Ｂは、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性に染色された細胞集団を測定することによる、ＣＥＲ０１＋Ｂａ／Ｆ３エフェクター細胞のＦＡＣＳ分析（図１９Ａ）およびＣＥＲ０１＋Ｂａ／Ｆ３マウスＢ細胞によるデキサメタゾン処理胸腺細胞のエンガルフメントの定量化（図１９Ｂ）を示す。
【図２０】図２０Ａ−Ｂは、ＣＥＲ０１＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての食細胞作用指数を示す。図２０Ａは、デキサメタゾン処理胸腺細胞と共培養したＣＥＲ０１＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞の、食細胞作用している細胞のパーセント値およびハイブリッドキャプチャー値の表を示す。図２０Ｂは、ＣＥＲ０１＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての食細胞作用指数のグラフを示す。
【図２１】図２１は、ＣＥＲ０１＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＣＴ２６結腸癌細胞の食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は、食細胞作用事象を示す。
【図２２】図２２Ａ−Ｂ  ハイブリッドキャプチャーアルゴリズムを用いて、食細胞作用アッセイの蛍光画像上のＣＥＲ０１＋Ｂａ／Ｆ３細胞のＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ染色領域内のｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ染色された標的細胞の蛍光を検出した。図２２Ａは、ＣＥＲ０１＋Ｂａ／Ｆ３細胞からＣＴ２６標的細胞領域を抽出するハイブリッド細胞数のヒストグラムプロットを示す。図２２Ｂは、ＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞についてのハイブリッド細胞数を示す。面積比率は、Ｂａ／Ｆ３細胞内のＣＴ２６細胞の重複面積を表す。
【図２３】図２３は、ＣＥＲ０１＋Ｂａ／Ｆ３細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞からＣＴ２６標的細胞領域を抽出するハイブリッド細胞数の散布図を示す。面積比率は、Ｂａ／Ｆ３細胞内のＣＴ２６細胞の重複面積を表す。
【図２４】図２４Ａ−Ｂは、ＣＴ２６結腸癌細胞と共培養したＣＥＲ０１＋Ｂａ／Ｆ３細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用の頻度（Ａ）および食細胞作用指数（Ｂ）を示す。
【図２５】図２５は、ＣＥＲ０１＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＡ２０リンパ腫細胞の食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は、食細胞作用事象を示す。
【図２６】図２６Ａ−Ｂ  ハイブリッドキャプチャーアルゴリズムを用いて、食細胞作用アッセイの蛍光画像上のＣＥＲ０１＋Ｂａ／Ｆ３細胞のＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ染色領域内のｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ染色標的細胞の蛍光を検出した。図２６Ａは、ＣＥＲ０１＋Ｂａ／Ｆ３細胞からＡ２０標的細胞領域を抽出するハイブリッド細胞数のヒストグラムプロットを示す。図２６Ｂは、ＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞についてのハイブリッド細胞数を示す。面積比率は、Ｂａ／Ｆ３細胞内のＡ２０細胞の重複面積を表す。
【００１８】
【図２７】図２７は、ＣＥＲ０１＋Ｂａ／Ｆ３細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞からＡ２０標的細胞領域を抽出するハイブリッド細胞数の散布図を示す。面積比率は、Ｂａ／Ｆ３細胞内のＡ２０細胞の面積を表す。
【図２８】図２８は、Ａ２０細胞と共培養したＣＥＲ０１＋Ｂａ／Ｆ３細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数のグラフを示す。
【図２９】図２９は、ＣＥＲ０１＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＷＲ１９Ｌ Ｔ細胞リンパ腫細胞の食細胞作用の顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図３０】図３０は、ＣＥＲ０１＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＷＲ１９Ｌ細胞の食細胞作用の頻度のグラフを示す。
【図３１】図３１Ａ−Ｂは、ＣＥＲ０１＋ヒト初代Ｂ細胞の形質導入および増殖を示す。図３１Ａは、抗ＥＧＦＲ抗体、次いで抗Ｔｉｍ４ Ｋａｔ５−１８抗体を用いた、ＣＥＲ０１を形質導入したヒト初代Ｂ細胞（右ヒストグラム）および対照Ｂ細胞（左ヒストグラム）のＦＡＣＳ分析を示す。図３１Ｂは、２４時間、４８時間および７２時間で増殖した精製ＣＥＲ０１＋Ｂ細胞を示す。
【図３２】図３２Ａ−Ｂは、切断型ＥＧＦＲを形質導入した対照ヒト初代Ｂ細胞（図３２Ｂ）と比較した、ＣＥＲ０１＋ヒト初代Ｂ細胞（図３２Ａ）によるスタウロスポリン処理したＪｕｒｋａｔ細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図３３】図３３は、ＦＡＣＳにより分析された、ＣＥＲ０１＋ヒト初代Ｂ細胞による、スタウロスポリン処理ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ染色Ｊｕｒｋａｔ細胞の食細胞作用を示す。生存ＣＤ１９＋、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識細胞でゲーティングを行い（左プロット）、二重陽性染色事象（ＡＰＣおよびｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ）の頻度を食細胞作用事象（右プロット）として定義した。
【図３４】図３４は、ＣＥＲ０１＋ヒト初代Ｂ細胞と同時インキュベートしたスタウロスポリン処理ジャーカット細胞の食細胞作用頻度のグラフを示す。
【図３５】図３５は、ＣＥＲ０１＋ヒト初代Ｂ細胞によるオキサリプラチンおよびフルオロウラシル処理Ｊｕｒｋａｔ細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図３６】図３６は、配列番号８３のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ０８”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ０８は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、およびＴｙｒｏ３シグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ０８配列から離されている切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）を含む。
【図３７】図３７Ａ−Ｂは、デキサメサゾン処理された、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ染色された胸腺細胞とＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ染色されたＣＥＲ０８＋マウスＢａ／Ｆ３細胞の共培養における、生存ＣＥＲ０８＋改変Ｂａ／Ｆ３細胞（図３７Ａ）ならびに食細胞作用の頻度を示すｐＨｒｏｄｏ ｒｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔに二重染色された細胞集団（図３７Ｂ）のＦＡＣＳプロットを示す。
【００１９】
【図３８】図３８は、ＥＧＦＲｔ＋Ｂａ／Ｆｅ対照細胞（上の写真）と比較した、ＣＥＲ０８＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるデキサメサゾン処理した胸腺細胞の食細胞作用（下の写真）の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は、食細胞作用事象を示す。高倍率のエンガルフメント事象を右側に表示する。
【図３９】図３９Ａ−Ｂは、ＣＥＲ０８＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての食細胞作用指数を示す。図３９Ａは、デキサメタゾン処理胸腺細胞と共培養したＣＥＲ０８＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞の、食細胞作用している細胞の割合およびハイブリッドキャプチャー値の表を示す。図３９Ｂは、ＣＥＲ０８＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての食細胞作用指数のグラフを示す。
【図４０】図４０は、配列番号８４のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ０９”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ０９は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、およびＤＡＰ１２シグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ０９配列から離されている切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図４１】図４１Ａ−Ｂは、デキサメタゾン処理した、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ染色した胸腺細胞と、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ染色したＣＥＲ０９＋マウスＢａ／Ｆ３細胞の共培養における、生存ＣＥＲ０９＋改変Ｂａ／Ｆ３細胞（図４１Ａ）ならびに食細胞作用の頻度を示すｐＨｒｏｄｏ ｒｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔに二重染色された細胞集団（図４１Ｂ）のＦＡＣＳプロットを示す。
【図４２】図４２Ａ−Ｂは、ＥＧＦＲｔ＋Ｂａ／Ｆｅ対照細胞（図４２Ａ）と比較した、ＣＥＲ０９＋Ｂａ／Ｆ３細胞（図４２Ｂ）によるデキサメサゾン処理した胸腺細胞の食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。エンガルフメント事象の拡大画像を右側に示す。
【図４３】図４３Ａ−Ｂは、ＣＥＲ０９＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての食細胞作用指数を示す。図４３Ａは、デキサメタゾン処理した胸腺細胞と共培養したＣＥＲ０９＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞の、食細胞作用している細胞の割合およびハイブリッドキャプチャー値の表を示す。図４３Ｂは、ＣＥＲ０９＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての食細胞作用指数のグラフを示す。
【図４４】図４４Ａ−Ｂは、ＣＥＲ０９＋Ｂａ／Ｆ３細胞（図４４Ａ）およびＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞によるスタウロスポリン処理したＣＴ２６結腸癌腫細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図４５】図４５は、ＣＥＲ０９＋Ｂａ／Ｆ３細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞からＣＴ２６標的細胞領域を抽出するハイブリッド細胞数の散布図を示す。面積比率は、Ｂａ／Ｆ３細胞内のＣＴ２６細胞の面積を表す。
【図４６】図４６は、スタウロスポリン処理したＣＴ２６細胞と共インキュベートしたＣＥＲ０９＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての食細胞作用指数を示す。
【図４７】図４７は、ＣＥＲ０９＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるスタウロスポリン処理したＷＲ１９Ｌリンパ腫細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図４８】図４８は、ＣＥＲ０９＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるスタウロスポリン処理したＡ２０リンパ腫細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図４９】図４９Ａ−Ｂは、ＣＥＲ０９＋ヒト初代Ｂ細胞の形質導入および増殖を示す。図４９Ａは、抗ＥＧＦＲ抗体、次いで抗Ｔｉｍ４ Ｋａｔ５−１８抗体を用いた、ＣＥＲ０９を形質導入したヒト初代Ｂ細胞（右ヒストグラム）および対照Ｂ細胞（左ヒストグラム）のＦＡＣＳ分析を示す。図４９Ｂは、２４時間、４８時間および７２時間で増殖した精製されたＣＥＲ０９＋Ｂ細胞を示す。
【図５０】図５０は、ＦＡＣＳによって分析された、ＣＥＲ０９＋ヒト初代Ｂ細胞によるスタウロスポリン処理したｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ染色されたＪｕｒｋａｔ細胞の食細胞作用を示す。生存ＣＤ１９＋、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識細胞（左のプロット）でゲーティングを行い、二重陽性染色事象（ＡＰＣおよびｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ）の頻度を食細胞作用事象として定義した（右のプロット）。
【００２０】
【図５１】図５１は、ＣＥＲ０９＋ヒト初代Ｂ細胞または対照ＥＧＦＲｔ＋ヒト初代Ｂ細胞によるスタウロスポリン処理したＪｕｒｋａｔ細胞の食細胞作用頻度のグラフを示す。
【図５２】図５２は、ＣＥＲ０９＋ヒト初代Ｂ細胞（左の写真）またはＥＧＦＲｔ＋ヒト初代Ｂ細胞（右の写真）によるスタウロスポリン処理したＪｕｒｋａｔ細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図５３】図５３は、配列番号８６のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ１０”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ１０は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、ＤＡＰ１２膜貫通ドメイン、およびＤＡＰ１２シグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ＣＥＲ１０配列との間にウイルスＰ２Ａ配列を挿入されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図５４】図５４Ａ−Ｂは、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性染色された細胞集団を測定することによる、生存ＣＥＲ１０＋Ｂａ／Ｆ３エフェクター細胞のＦＡＣＳ分析（図５４Ａ）ならびにＣＥＲ１０＋Ｂａ／Ｆ３マウスＢ細胞によるデキサメタゾン処理した胸腺細胞のエンガルフメントの定量化（図５４Ｂ）を示す。
【図５５】図５５Ａ−Ｂは、ＣＥＲ１０＋Ｂａ／Ｆ３細胞（図５５Ｂ）または対照ＥＧＦＲｔ＋Ｂａ／Ｆ３細胞（図５５Ａ）によるデキサメサゾン処理した胸腺細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。エンガルフメント事象の拡大画像を右側に示す。
【図５６】図５６Ａ−Ｂは、ＣＥＲ１０＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての食細胞作用指数を示す。図５６Ａは、デキサメタゾン処理した胸腺細胞と共培養したＣＥＲ１０＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞の、食細胞作用している細胞の割合およびハイブリッドキャプチャー値の表を示す。図５６Ｂは、ＣＥＲ１０＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての食細胞作用指数のグラフを示す。
【図５７】図５７は、配列番号８７のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ１１”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターについてのベクターマップを示す。ＣＥＲ１１は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、およびＡｘｌシグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ１１配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図５８】図５８Ａ−Ｂは、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性染色された細胞集団を測定することによる、ＣＥＲ１１＋Ｂａ／Ｆ３エフェクター細胞のＦＡＣＳ分析（図５８Ａ）ならびにＣＥＲ１１＋Ｂａ／Ｆ３マウスＢ細胞によるデキサメサゾン処理した胸腺細胞のエンガルフメントの定量化（図５８Ｂ）を示す。
【図５９】図５９Ａ−Ｂは、ＣＥＲ１１＋Ｂａ／Ｆ３細胞（図５９Ｂ）または対照ＥＧＦＲｔ＋Ｂａ／Ｆ３細胞（図５９Ａ）によるデキサメタゾン処理した胸腺細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。エンガルフメント事象の拡大画像を右側に示す。
【図６０】図６０Ａ−Ｂは、ＣＥＲ１１＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数を示す。図６０Ａは、デキサメタゾン処理した胸腺細胞と共培養したＣＥＲ１１＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用を受けている細胞の割合およびハイブリッドキャプチャー値の表を示す。図６０Ｂは、ＣＥＲ１１＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての食細胞作用指数のグラフを示す。
【図６１】図６１Ａ−Ｂは、ＣＥＲ１１＋Ｂａ／Ｆ３細胞（左写真）または対照ＥＧＦＲｔ＋Ｂａ／Ｆ３細胞（右写真）によるスタウロスポリン処理したＣＴ２６結腸癌細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【００２１】
【図６２】図６２は、ＣＥＲ１１＋Ｂａ／Ｆ３細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞からＣＴ２６標的細胞領域を抽出するハイブリッド細胞数の散布図を示す。面積比率は、Ｂａ／Ｆ３細胞内のＣＴ２６細胞の面積を表す。
【図６３】図６３は、ＣＥＲ１１＋Ｂａ／Ｆ３によるＷＲ１９Ｌ細胞のインビトロ食細胞作用を示す蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図６４】図６４Ａ−Ｂは、ｐＨＲｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性染色された細胞集団を測定することによる、ＣＥＲ１１＋Ｂａ／Ｆ３エフェクター細胞のＦＡＣＳ分析（図６４Ａ）ならびにＣＥＲ１１＋Ｂａ／Ｆ３マウスＢ細胞によるＷＲ１９Ｌリンパ腫細胞のエンガルフメントの定量化（図６４Ｂ）を示す。
【図６５】図６５Ａ−Ｂは、ＣＥＲ１１＋Ｂａ／Ｆ３細胞（左写真）または対照ＥＧＦＲｔ＋Ｂａ／Ｆ３細胞（右写真）によるスタウロスポリン処理したＡ２０リンパ腫細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図６６】図６６は、スタウロスポリン処理したＡ２０細胞と共インキュベートしたＣＥＲ１１＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての食細胞作用指数を示す。
【図６７】図６７は、ＣＥＲ１１＋ヒト初代Ｂ細胞（左写真）または対照ＥＧＦＲｔ＋ヒト初代Ｂ細胞（右写真）によるオキサリプラチンおよびフルオロウラシル処理したＪｕｒｋａｔ細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図６８】図６８は、ＣＥＲ１１＋ヒト初代Ｂ細胞によるゲムシタビン処理したＣＯＬＯ３２０ＨＳＲ結腸癌細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図６９】図６９は、ＣＥＲ１１＋ヒト初代Ｂ細胞によるパクリタキセル処理したＡ２０４横紋筋肉腫細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。矢印は食細胞作用事象を示す。
【図７０】図７０は、ＣＥＲ１１＋ヒト初代Ｂ細胞による、パクリタキセルまたはパクリタキセル＋ゲムシタビン処理したＨ１７０３非小細胞肺癌細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。矢印は食細胞作用事象を示す。
【図７１】図７１は、配列番号９０のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ１２”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ１２は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、およびＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ１２配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図７２】図７２Ａ−Ｂは、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性染色された細胞集団を測定することによる、ＣＥＲ１２＋Ｂａ／Ｆ３エフェクター細胞のＦＡＣＳ分析（図７２Ａ）ならびにＣＥＲ１２＋Ｂａ／Ｆ３マウスＢ細胞による胸腺細胞のエンガルフメントの定量化（図７２Ｂ）を示す。
【図７３】図７３Ａ−Ｂは、ＣＥＲ１２＋Ｂａ／Ｆ３細胞（図７３Ｂ）または対照ＥＧＦＲｔ＋Ｂａ／Ｆ３細胞（図７３Ａ）によるデキサメタゾン処理した胸腺細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。エンガルフメント事象の拡大画像を右側に示す。
【図７４】図７４Ａ−Ｂは、ＣＥＲ１２＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての食細胞作用指数を示す。図７４Ａは、デキサメタゾン処理した胸腺細胞と共培養したＣＥＲ１２＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用を受けている細胞の割合およびハイブリッドキャプチャー値の表を示す。図７４Ｂは、ＣＥＲ１２＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての食細胞作用指数のグラフを示す。
【００２２】
【図７５】図７５は、ＣＥＲ１２＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるスタウロスポリン処理したＷＲ１９Ｌリンパ腫細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図７６】図７６は、ＣＥＲ１２＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるスタウロスポリン処理したＡ２０リンパ腫細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図７７】図７７は、スタウロスポリン処理したＡ２０細胞と同時インキュベートしたＣＥＲ１２＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての食細胞作用指数を示す。
【図７８】図７８は、配列番号９１のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ１３”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターについてのベクターマップを示す。ＣＥＲ１３は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、ＦｃεＲＩγ膜貫通ドメイン、およびＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ１３配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図７９】図７９Ａ−Ｂは、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性染色された細胞集団を測定することによる、ＣＥＲ１３＋Ｂａ／Ｆ３エフェクター細胞のＦＡＣＳ分析（図７９Ａ）およびＣＥＲ１３＋Ｂａ／Ｆ３マウスＢ細胞による胸腺細胞のエンガルフメントの定量化（図７９Ｂ）を示す。
【図８０】図８０は、ＣＥＲ１３＋ヒト初代Ｂ細胞によるパクリタキセルおよびゲムシタビン処理したＣｏｌｏ３２０ ＨＳＲ結腸癌細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。矢印は食細胞作用事象を示す。
【図８１】図８１は、ＣＥＲ１３＋ヒト初代Ｂ細胞によるパクリタキセル処理したＡ２０４横紋筋肉腫細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。矢印は食細胞作用事象を示す。
【図８２】図８２は、ＣＥＲ１３＋ヒト初代Ｂ細胞によるパクリタキセルおよびゲムシタビン処理したＣｏｌｏ３２０ ＨＳＲ結腸癌細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。矢印は食細胞作用事象を示す。
【図８３】図８３は、配列番号７９のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ１５”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ１５は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、および切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ１５配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図８４】図８４Ａ−Ｂは、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性染色された細胞集団を測定することによる、ＣＥＲ１５＋Ｂａ／Ｆ３エフェクター細胞のＦＡＣＳ分析（図８４Ａ）およびＣＥＲ１５＋Ｂａ／Ｆ３マウスＢ細胞による胸腺細胞のエンガルフメントの定量化（図８４Ｂ）を示す。
【図８５】図８５Ａ−Ｂは、ＣＥＲ１５＋Ｂａ／Ｆ３細胞（図８５Ｂ）または対照ＥＧＦＲｔ＋Ｂａ／Ｆ３細胞（図８５Ａ）によるデキサメタゾン処理した胸腺細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。エンガルフメント事象の拡大画像を右側に示す。
【００２３】
【図８６】図８６Ａ−Ｂは、ＣＥＲ１５＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての食細胞作用指数を示す。図８６Ａは、デキサメタゾン処理した胸腺細胞と共培養したＣＥＲ１５＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用を受けている細胞割合およびハイブリッドキャプチャー値の表を示す。図８６Ｂは、ＣＥＲ１５＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての食細胞作用指数のグラフを示す。
【図８７】図８７は、ＣＥＲ１５＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるスタウロスポリン処理したＣＴ２６結腸癌細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図８８】図８８は、ＣＥＲ１５＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるスタウロスポリン処理したＷＲ１９Ｌリンパ腫細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図８９】図８９は、ＣＥＲ１５＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるスタウロスポリン処理したＡ２０リンパ腫細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図９０】図９０Ａ−Ｂは、ＣＥＲ１５＋ヒト初代Ｂ細胞の形質導入および増殖を示す。図９０Ａは、抗ＥＧＦＲ抗体、次いで抗Ｔｉｍ４ Ｋａｔ５−１８抗体を用いた、ＣＥＲ１５（右ヒストグラム）および対照Ｂ細胞（左ヒストグラム）で形質導入されたヒト初代Ｂ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。図４９Ｂは、２４時間、４８時間および７２時間で増殖した精製されたＣＥＲ１５＋Ｂ細胞を示す。
【図９１】図９１は、ＦＡＣＳによって分析された、ＣＥＲ１５＋ヒト初代Ｂ細胞によるスタウロスポリン処理した、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ染色されたＪｕｒｋａｔ細胞の食細胞作用を示す。生存ＣＤ１９＋、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識細胞でゲーティングを行い（左プロット）、二重陽性染色事象（ＡＰＣおよびｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ）の頻度を食細胞作用事象として定義した（右プロット）。
【図９２】図９２は、切断型ＥＧＦＲで形質導入した対照ヒト初代Ｂ細胞と比較した、スタウロスポリン処理したＪｕｒｋａｔ細胞と同時インキュベートしたＣＥＲ１５＋ヒト初代Ｂ細胞による食細胞作用の頻度のグラフを示す。
【図９３】図９３Ａ−Ｂは、切断型ＥＧＦＲで形質導入された対照ヒト初代Ｂ細胞（図９３Ｂ）と比較した、ＣＥＲ１５＋ヒト初代Ｂ細胞（図９３Ａ）によるスタウロスポリン処理したＪｕｒｋａｔ細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図９４】図９４は、配列番号８０のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ１６”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ１６は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、およびＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ１６配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図９５】図９５は、ＣＥＲ１６＋ヒト初代Ｂ細胞によるオキサリプラチンおよびフルオロウラシルで処理したＪｕｒｋａｔ細胞のインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図９６】図９６は、配列番号９３のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ２５”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ２５は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、およびＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ２５配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【００２４】
【図９７】図９７Ａ−Ｂは、切断型ＥＧＦＲで形質導入された対照Ｂａ／Ｆ３細胞（図９７Ａ）と比較して、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性染色された細胞集団を測定することによるＣＥＲ２５＋Ｂａ／Ｆ３マウスＢ細胞によるデキサメタゾン処理した胸腺細胞のエンガルフメントのＦＡＣＳ定量化（図９７Ｂ）を示す。
【図９８】図９８は、デキサメサゾン処理した胸腺細胞と共培養したＣＥＲ２５＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。エンガルフメント事象の拡大画像を右側に示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図９９】図９９は、切断型ＥＧＦＲで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞と比較した、デキサメタゾン処理した胸腺細胞と共培養したＣＥＲ２５＋Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数のグラフを示す。
【図１００】図１００は、配列番号９５のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ８５”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ８５は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＢＡＦＦＲシグナル伝達ドメインである第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ８５配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図１０１】図１０１Ａ−Ｂは、切断型ＥＧＦＲで形質導入した対照Ｂａ／Ｆ３細胞（図１０１Ｂ）と比較して、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性染色された細胞集団を測定することによる、ＣＥＲ８５＋Ｂａ／Ｆ３マウスＢ細胞によるデキサメタゾン処理した胸腺細胞のエンガルフメントのＦＡＣＳ定量化（図１０１Ａ）を示す。
【図１０２】図１０２は、デキサメサゾン処理した胸腺細胞と共培養したＣＥＲ８５＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。エンガルフメント事象の拡大画像を右側に示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図１０３】図１０３は、切断型ＥＧＦＲを形質導入した対照Ｂａ／Ｆ３細胞と比較した、デキサメタゾン処理胸腺細胞と共培養したＣＥＲ８５＋Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数のグラフを示す。
【図１０４】図１０４は、配列番号９６のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ８６”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ８６は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＤＡＰ１２シグナル伝達ドメインである第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ８６配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図１０５】図１０５は、配列番号１３０のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ８７”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ８７は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、ＢＡＦＦＲシグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、および切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインである第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ８７配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図１０６】図１０６Ａ−Ｂは、切断型ＥＧＦＲで形質導入した対照Ｂａ／Ｆ３細胞（図１０６Ｂ）と比較して、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性染色された細胞集団を測定することによるＣＥＲ８７＋Ｂａ／Ｆ３マウスＢ細胞によるデキサメタゾン処理した胸腺細胞のエンガルフメントのＦＡＣＳ定量化（図１０６Ａ）を示す。
【００２５】
【図１０７】図１０７は、デキサメタゾン処理した胸腺細胞と共培養したＣＥＲ８７＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。エンガルフメント事象の拡大画像を右側に示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図１０８】図１０８は、切断型ＥＧＦＲを形質導入した対照Ｂａ／Ｆ３細胞と比較した、デキサメタゾン処理した胸腺細胞と共培養したＣＥＲ８７＋Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数のグラフを示す。
【図１０９】図１０９は、配列番号１３１のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ８８”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ８８は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１２シグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、および切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインである第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ８８配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図１１０】図１１０は、配列番号９８のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ８９”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ８９は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインである第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ８９配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図１１１】図１１１は、配列番号１００のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ９０”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ９０は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメインである第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ９０配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図１１２】図１１２は、配列番号１０５のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ９１”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ９１は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、ＣＥＲ配列との間にウイルスＰ２Ａ配列を挿入されたＲａｂ５ａをコードする配列、およびウイルスＴ２Ａ配列によってＲａｂ５ａ配列から離されている切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）を含む。
【図１１３】図１１３Ａ−Ｂは、切断型ＥＧＦＲを形質導入した対照Ｂａ／Ｆ３細胞（図１１３Ｂ）と比較して、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性染色された細胞集団を測定することによる、ＣＥＲ９１＋Ｂａ／Ｆ３マウスＢ細胞によるデキサメタゾン処理胸腺細胞のエンガルフメントのＦＡＣＳ定量化（図１１３Ａ）を示す。
【図１１４】図１１４は、デキサメタゾン処理胸腺細胞と共培養したＣＥＲ９１＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。エンガルフメント事象の拡大画像を右側に示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図１１５】図１１５は、切断型ＥＧＦＲを形質導入した対照Ｂａ／Ｆ３細胞と比較した、デキサメタゾン処理した胸腺細胞と共培養したＣＥＲ９１＋Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数のグラフを示す。
【図１１６】図１１６は、配列番号１３３のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ９２”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ９２は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、および切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインである第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ９２配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図１１７】図１１７Ａ−Ｂは、切断型ＥＧＦＲで形質導入された対照Ｂａ／Ｆ３細胞（図１１７Ｂ）と比較して、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性染色された細胞集団を測定することによる、ＣＥＲ９２＋Ｂａ／Ｆ３マウスＢ細胞によるデキサメタゾン処理胸腺細胞のエンガルフメントのＦＡＣＳ定量化（図１１７Ａ）を示す。
【００２６】
【図１１８】図１１８は、デキサメサゾン処理胸腺細胞と共培養したＣＥＲ９２＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。エンガルフメント事象の拡大画像を右側に示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図１１９】図１１９は、切断型ＥＧＦＲを形質導入した対照Ｂａ／Ｆ３細胞と比較した、デキサメタゾン処理した胸腺細胞と共培養したＣＥＲ９２＋Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数のグラフを示す。
【図１２０】図１２０は、配列番号１０３のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ９３”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ９３は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＢＡＦＦＲシグナル伝達ドメインである第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ９３配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図１２１】図１２１Ａ−Ｂは、切断型ＥＧＦＲで形質導入した対照Ｂａ／Ｆ３細胞（図１２１Ｂ）と比較して、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性染色された細胞集団を測定することによる、ＣＥＲ９３＋Ｂａ／Ｆ３マウスＢ細胞によるデキサメタゾン処理胸腺細胞のエンガルフメントのＦＡＣＳ定量化（図１２１Ａ）を示す。
【図１２２】図１２２は、デキサメサゾン処理した胸腺細胞と共培養したＣＥＲ９３＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるインビトロ食細胞作用の蛍光顕微鏡画像を示す。エンガルフメント事象の拡大画像を右側に示す。白色矢印は食細胞作用事象を示す。
【図１２３】図１２３は、切断型ＥＧＦＲを形質導入した対照Ｂａ／Ｆ３細胞と比較した、デキサメタゾン処理胸腺細胞と共培養したＣＥＲ９３＋Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数のグラフを示す。
【図１２４】図１２４は、配列番号１３４のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ９４”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ９４は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＤＡＰ１２シグナル伝達ドメインである第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ９４配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図１２５】図１２５は、配列番号１５２のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ９７”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ９７は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、Ａｘｌシグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＤＡＰ１２シグナル伝達ドメインである第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ９７配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図１２６】図１２６は、配列番号１５３のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ９８”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ９８は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、Ａｘｌシグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインである第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ９８配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【００２７】
【図１２７】図１２７は、配列番号１０１のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ９５”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ９５は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインである第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ９５配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図１２８】図１２８は、配列番号１０２のアミノ酸配列を有する“ＣＥＲ９６”キメラエンガルフメント受容体を含むレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。ＣＥＲ９６は、Ｔｉｍ４結合ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメインである第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。レンチウイルスベクターはまた、ウイルスＴ２Ａ配列によってＣＥＲ９６配列から離されている、切断型ＥＧＦＲをコードする配列（配列番号１２１）も含む。
【図１２９】図１２９は、切断型ＥＧＦＲｔtを形質導入した対照Ｂａ／Ｆ３細胞と比較した、デキサメタゾン処理した胸腺細胞と同時インキュベートした種々のＣＥＲ＋Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数を示す。
【図１３０】図１３０は、切断型ＥＧＦＲｔを形質導入した対照Ｂａ／Ｆ３細胞と比較した、スタウロスポリン処理したＣＴ２６結腸癌細胞と共インキュベートした種々のＣＥＲ＋Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数を示す。
【図１３１】図１３１は、切断型ＥＧＦＲｔを形質導入した対照Ｂａ／Ｆ３細胞と比較した、スタウロスポリン処理したＡ２０リンパ腫細胞と同時インキュベートした種々のＣＥＲ＋Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数を示す。
【図１３２】図１３２Ａ−Ｃは、リンパ腫のマウスモデルにおける低線量放射線によるＣＥＲ０１（Ｔｉｍ４ＭｅｒＴｋ）処置のインビボ相乗作用を示す。図１３２Ａは、併用療法レジメンの例示的なスケジュールを示す。図１３２Ｂは、未処置マウス、放射線＋対照Ｔ細胞を投与されたマウス、または放射線＋ＣＥＲＯ１改変Ｔ細胞を投与されたマウスにおける、腫瘍サイズの測定を示す。
【図１３３】図１３３Ａ−Ｂは、リンパ腫のマウスモデルにおけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法によるＣＥＲ０１（Ｔｉｍ４ＭｅｒＴｋ）処置のインビボ相乗作用を示す。図１３３Ａは、併用療法レジメンの例示的なスケジュールを示す。図１３３Ｂは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ改変Ｔ細胞およびｐＭＳＣＶ空レトロウイルスベクター改変Ｔ細胞を投与された対照マウス（左写真）と比較した、ＣＥＲ注射後４日目の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ改変Ｔ細胞およびＣＥＲ改変Ｂ細胞（ｎ＝３）またはＴ細胞（ｎ＝２）を投与されたマウスにおける腫瘍サイズのルシフェラーゼ画像（右画像）を示す。
【図１３４】図１３４は、図１３４は、放射線療法、ＣＥＲ免疫療法（例えば、ホスファチジルセリン発現細胞を標的とする）、その後のＴＣＲまたはＣＡＲ免疫療法を含む、例示的な３剤（triple）併用治療のスケジュールを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
（ａ）細胞外結合ドメインおよび場合により細胞外スペーサードメインを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）エンガルフメントシグナル伝達ドメインを含むキメラタンパク質、ならびに該キメラタンパク質をコードする核酸分子が、本明細書に記載される。さらに、これらのキメラタンパク質を発現するように改変された細胞、ならびにそのような改変細胞を、それを必要とする対象に送達するための方法および組成物を提供する。キメラタンパク質は、本明細書中、“キメラエンガルフメント受容体（複数可）”（単数形の“ＣＥＲ”および複数形の“ＣＥＲｓ”）と称される。本明細書に記載のキメラエンガルフメント受容体は、該キメラエンガルフメント受容体を発現するように遺伝子的に改変されている宿主細胞にエンガルフメント表現型を付与することができる。そのようなある態様において、本明細書に記載のＣＥＲの発現は、エンガルフメント表現型を天然には示さない宿主細胞にエンガルフメント表現型を付与する。他のそのような態様において、宿主細胞による本明細書に記載のＣＥＲの発現は、宿主細胞によって天然に標的とされないエンガルフメント促進マーカーまたは抗原マーカーに特異的なエンガルフメント表現型を付与する。さらに他のそのような態様において、宿主細胞による本明細書に記載のＣＥＲの発現は、宿主細胞により天然に標的とされるエンガルフメント促進マーカーまたは抗原マーカーに特異的なエンガルフメント表現型を付与し、該宿主細胞によるＣＥＲの発現は、標的化されたエンガルフメント促進または抗原マーカーを示す細胞、微生物または粒子の宿主細胞によるエンガルフメントを増強する。
【００２９】
特定の態様において、ＣＥＲは、アポトーシス細胞、死細胞、死にかけの細胞、損傷細胞、感染細胞または壊死細胞に関連するエンガルフメントマーカーを標的とする。他の態様において、ＣＥＲは、感染性微生物または粒子に関連する抗体結合細胞を標的とする。さらに他の態様において、ＣＥＲは、疾患、障害、または他の望ましくない病状に関連する異常な細胞またはミスフォールドタンパク質によって提示される抗原マーカーを標的とする。
【００３０】
本明細書に記載の１つまたはそれ以上のＣＥＲは、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、リンパ系前駆細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、および骨髄細胞などの細胞に形質導入され、発現され得る。特定の態様において、特定の標的分子（例えば、エンガルフメントマーカーまたは抗原マーカー）に結合するようにＣＥＲを操作することに加えて、ＣＥＲのエンガルフメントシグナル伝達ドメインは、所望のエンガルフメント活性を提供するように選択される。そのような一態様では、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは恒常性のエンガルフメントシグナル伝達を誘導するように選択される。別のそのような態様では、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達を誘導するように選択される。さらに別の態様では、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。前記第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび前記第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインは、両方とも恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであり得るか、両方とも炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであり得るか、または前記第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインは恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであり、前記第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインは炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであり得る（またはその逆である）。
【００３１】
本明細書に記載の１つまたはそれ以上のＣＥＲを発現するように改変されている宿主細胞は、ＣＥＲの細胞外ドメインが結合する標的分子を発現する標的細胞または粒子の特異的エンガルフメントのために用いられ得る。特定の態様において、標的細胞または粒子は、感染、疾患、障害もしくは他の望ましくない病状に関連する、腫瘍細胞、癌細胞、微生物（例えば、細菌、真菌、ウイルス）、原虫寄生虫、異常細胞、またはミスフォールドタンパク質であり得る。さらなる態様において、本明細書に記載の１つま他はそれ以上のＣＥＲを発現するように遺伝子改変されている宿主細胞は、対象において、癌、感染症（ウイルス、細菌、真菌、原生動物）、炎症性疾患、免疫疾患（例えば、自己免疫疾患）、または神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）を処置するための、一次療法または補助療法もしくは併用療法として用いられる。本明細書に記載のＣＥＲは、標的分子および治療適応症に依存して、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインまたは炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインの選択を介して、特定のエンガルフメント表現型（例えば、恒常性（非免疫原性）または炎症誘発性（免疫原性））を付与するように設計され得る。理論はともかく、炎症誘発性エンガルフメントドメインを含むＣＥＲは、癌の微小環境を改善し、そして腫瘍退縮を増強するのに有用であり得る。
【００３２】
定義
本発明をより詳細に説明する前に、本明細書で用いる特定の用語の定義を提供することがその理解に役立ち得る。
【００３３】
本明細書中、任意の濃度範囲、百分率範囲、比範囲、または整数範囲は、特記しない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適当な場合にはその端数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１など）を含むと理解されるべきである。また、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さなどの任意の物理的特徴に関する本明細書に列挙された任意の数の範囲は、特記しない限り、列挙された範囲内の任意の整数を含むと理解される。本明細書で用いる用語“約”は、特記しない限り、指示された範囲、値、または構造の±２０％を意味する。本明細書で用いる用語“ａ”および“ａｎ”は、列挙された構成要素のうちの“１つまたはそれ以上”を意味することを理解されたい。代替物の使用（例えば、“または”）は、代替物の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。本明細書で用いる用語“含む（include）”、“有する”および“含む（comprise）”は、互換的に用いられ、その用語およびその変形は非限定的と解釈されることを意図している。
【００３４】
抗体の技術分野の当業者によって理解される用語は、本明細書において明らかに異なるように定義されていない限り、それぞれ当技術分野で受け入れられている意味を有する。用語“抗体”は、最も広い意味で用いられ、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を包含する。“抗体”は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む無傷（インタクト）抗体、ならびに標的分子に結合する能力を有するかまたは保持する無傷抗体の抗原結合部分（または抗原結合ドメイン）を意味し得る。抗体は、天然に存在する、組換え産生された、遺伝子操作された、または修飾された形態の免疫グロブリン、例えば、イントラボディ（intrabody）、ペプチボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体、ＳＭＩＰ、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、タンデムジ−ｓｃＦＶ、タンデムトリ−ｓｃＦｖ、ＡＤＡＰＴＩＲ）であり得る。モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、非ヒト、キメラ、ヒト化、またはヒト、好ましくはヒト化またはヒトであり得る。免疫グロブリン構造および機能は、例えばHarlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual、Chapter 14 （Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988）に記載されている。無傷抗体の“抗原結合部分”または“抗原結合ドメイン”は、無傷抗体の一部を示し、無傷抗体の抗原決定可変領域または相補性決定領域を意味する“抗体断片”を包含することを意味する。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直線状抗体、ｓｃＦｖ抗体、ＶＨ、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。“Ｆａｂ”（抗原結合断片）は、抗原に結合する抗体の一部であり、鎖間ジスルフィド結合を介して軽鎖に結合している重鎖の可変領域およびＣＨ１を含む。抗体は、ＩｇＧおよびそのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤを含む任意のクラスまたはサブクラスのものであり得る。
【００３５】
用語“可変領域”または“可変ドメイン”は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを意味する。天然抗体の重鎖および軽鎖（それぞれＶＨおよびＶＬ）の可変ドメインは一般的に、類似の構造を有し、各ドメインは４つの保存的フレームワーク領域（ＦＲ）および３つのＣＤＲを含む（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照のこと）。単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原を結合する抗体は、該抗原を結合する抗体からのＶＨまたはＶＬドメインを用いて、それぞれ相補的なＶＨまたはＶＬドメインのライブラリーをスクリーニングすることにより単離され得る。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照のこと。
【００３６】
“超可変領域”または“ＨＶＲ”と同義である、用語“相補性決定領域”および“ＣＤＲ”は、抗原特異性および／または結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸の非連続配列を意味することが当技術分野において知られている。一般的に、各重鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）および各軽鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）がある。
【００３７】
用語“抗原”および“Ａｇ”は、免疫応答を誘発する分子を意味する。誘発された免疫応答は、抗体産生、特定の免疫適な細胞（immunologically-competenＴ細胞）の活性化、またはその両方を含み得る。タンパク質、糖タンパク質および糖脂質を含む巨大分子は、抗原として役立ち得る。抗原は組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。本明細書で企図されるように、抗原は、（ｉ）遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみによって、または（ｉｉ）“遺伝子”によって全くコードされる必要はない。抗原を生成または合成することができるか、または抗原を生物学的試料から誘導することができる。そのような生物学的試料は、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または体液を含み得るが、これらに限定されない。
【００３８】
用語“エピトープ”または“抗原エピトープ”は、抗体またはその断片（例えば、ｓｃＦｖ）などの同種の免疫結合分子、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラエンガルフメント受容体、あるいは他の結合分子、ドメインまたはタンパク質によって特異的に結合される抗原内の任意の分子、構造、アミノ酸配列またはタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、一般的に、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基を含み、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、線形エピトープまたは立体構造的エピトープであってよい。
【００３９】
用語“抗腫瘍効果”は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、または癌状態と関連する種々の生理学的症状の改善によって明らかにされ得る生物学的効果を意味する。“抗腫瘍効果”は、血液癌または腫瘍形成の予防によっても明らかにされ得る。
【００４０】
“自己免疫疾患”は、自己免疫応答の結果生じる障害を意味する。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切に過剰は応答の結果である。自己免疫応答は、自己抗体を産生する自己反応性Ｂ細胞、自己反応性Ｔ細胞、またはその両方を含み得る。本明細書で用いる“自己抗体”は、対象によっても産生される自己抗原に結合する、該対象により産生される抗体である。
【００４１】
“自己由来”とは、後で再導入されるのと同じ対象に由来する任意の材料を意味する。
【００４２】
“同種異系”とは、同じ種の異なる対象に由来する移植片を意味する。
【００４３】
本明細書で用いる用語“結合ドメイン”、“結合領域”および“結合部分”は、特異的かつ非共有結合的に結合する、関連する、合する、認識するまたは標的分子（例えば、ＰｔｄＳｅｒ、ＩｇＧ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＡ抗体、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ７９ｂ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、ＭＵＣ−１６、Ｌ１ＣＡＭ、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、ＶＥＧＦＲ−２またはＧＤ２）と結合する能力を有する、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質などの分子を意味する。結合ドメインは、生物学的分子または他の目的の標的に対する任意の天然の、合成された、半合成されたまたは組換え産生された結合パートナーを含む。ある態様において、結合ドメインは、抗体、またはその機能的結合ドメインもしくは抗原結合部分などの抗原結合ドメインである。例示的な結合ドメインとしては、一本鎖抗体可変領域（例えば、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）、受容体エクトドメイン（ectodomain）(例えば、ＴＮＦ−α)、リガンド（例えば、サイトカイン、ケモカイン）、または生体分子に結合する特異的能力に対して選択された合成ポリペプチドが挙げられる。
【００４４】
特定の標的に特異的に結合する本発明の結合ドメインを同定するため、ならびにウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、およびＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析などの結合ドメイン親和性を決定するための様々なアッセイが知られている（例えば、Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949；および、米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、またはその同等物も参照のこと）。本明細書で用いる“特異的に結合する”は、結合ドメインまたはその融合タンパク質が、１０５Ｍ−１以上の親和性またはＫａ（すなわち１／Ｍの単位の特定の結合相互作用の平衡結合定数）で標的分子へ会合または結合するが、サンプル中の他の分子または成分と有意に会合または結合していないことを意味する。
【００４５】
本明細書で用いる用語“癌”は、異常細胞の急速、かつ制御されない増殖を特徴とする疾患として定義される。異常な細胞は固形腫瘍を形成するか、または血液癌を構成し得る。癌細胞は、局所的に、または血液系およびリンパ系を通って体の他の部分に拡がり得る。種々の癌の例としては、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
“疾患”とは、対象が恒常性を維持することができず、かつ疾患が改善されない場合、対象の健康が悪化し続ける、対象の健康状態である。対照的に、対象における“障害”または“望ましくない状態”は、対象が恒常性を維持し得るが、対象の健康状態は、障害または望ましくない状態が存在しない場合よりも好ましくない健康状態である。未処置のままの障害または望ましくない状態は、必ずしも対象の健康状態のさらなる低下をもたらすわけではない。
【００４７】
“病原菌”または“微生物”は、細菌、ウイルス、古細菌、または真菌の任意の種を意味する。
【００４８】
“粒子”とは、細胞の断片または直径が少なくとも１００ｎｍから最大６μｍの小物質を意味し、それは生細胞または生物に由来する。粒子は、ウイルス粒子、小さな鉱物粒子、細胞片、または合成粒子であり得る。
【００４９】
“〜をコードする”とは、定義されたヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸配列およびそれから生じる生物学的産物のいずれかを有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマーおよび高分子を合成するための鋳型として役立つ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ配列などの特定のポリヌクレオチド配列の固有の性質を意味する。
【００５０】
従って、ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物系においてタンパク質を産生する場合にそのタンパク質をコードする。コード鎖および非コード鎖の両方とも、タンパク質またはポリヌクレオチドの他の産物をコードすると称され得る。
【００５１】
他に特記されない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、互いの縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列を含む。
【００５２】
本明細書で用いる用語“内生”または“天然”とは、宿主または宿主細胞中に通常存在する遺伝子、タンパク質、化合物、分子または活性を意味する。
【００５３】
本明細書で用いる用語“エンガルフメント”は、直径１００ｎｍを超える内生もしくは外生の細胞または粒子が本明細書に記載の食細胞または宿主細胞によって内在化される受容体介在プロセスを意味する。エンガルフメントは、一般的には、以下の複数の工程からなる：（１）標的細胞または粒子上のエンガルフメント促進マーカーもしくは抗原マーカーへの直接的または間接的な（架橋分子を介して）エンガルフメント受容体の結合による標的細胞または粒子の繋留（tethering）；および、（２）標的細胞全体もしくは粒子、またはその一部の内在化または取り込み。特定の態様において、内部移行は、食細胞または宿主細胞の細胞骨格再配列を介して起こり、内部移行標的を含む膜結合区画であるファゴソームを形成し得る。エンガルフメントはファゴソームの成熟をさらに含み、ここで、ファゴソームはますます酸性になり、リソソームと融合して（ファゴリソソームを形成する）、それにより取り込まれた標的は分解される（例えば、“食細胞作用（phagocytosis）”）。あるいは、ファゴソーム−リソソーム融合は、エンガルフメントでは観察されないかもしれない。さらに別の態様において、ファゴソームは、完全な分解の前にその内容物を細胞外環境に吐き戻す（regurgitate）または放出し得る。ある態様において、エンガルフメントは、食細胞作用を意味する。ある態様において、エンガルフメントは、本明細書に記載の宿主細胞の食細胞による標的細胞または粒子の繋留を含むが、内在化は含まない。ある態様において、エンガルフメントは、本明細書に記載の宿主細胞の食細胞による標的細胞または粒子の繋留および標的細胞または粒子の一部の内在化を含む。
【００５４】
本明細書で用いる用語“食細胞作用”は、標的細胞または粒子の繋留、標的細胞または粒子のエンガルフメント、および内在化標的細胞または粒子の分解が起こる、細胞または大きな粒子（≧０．５μｍ）のエンガルフメントプロセスを意味する。特定の態様において、食細胞作用は、内在化標的細胞または粒子を包含するファゴソームの形成、およびリソソームとのファゴソーム融合によるファゴリソソームの形成を含み、そこでその内容物は分解される。特定の態様において、食細胞作用の間、本明細書に記載の食細胞または宿主細胞上に発現されたＣＥＲが標的細胞または粒子によって発現されたエンガルフメントマーカーに結合した後、食細胞作用シナプスが形成される。アクチンが豊富な食細胞作用カップ（phagocytic cup）が食細胞作用シナプスで生成される。食細胞作用アーム（phagocytic arm）は、細胞骨格の再配列を通して標的細胞または粒子の周りに伸びてくる。そして最終的に、標的細胞または粒子は、モータータンパク質によって生じる力によって食細胞または宿主細胞内に取り込まれる。本明細書で用いる“食細胞作用”は、“エフェロサイトーシス”のプロセスを含み、これは具体的には、非炎症性様式におけるアポトーシス細胞または壊死細胞の食細胞作用を意味する。
【００５５】
本明細書で用いる用語“エンガルフメント促進マーカー”とは、アポトーシス細胞、壊死細胞、ピロトーシスを起こした細胞（pyroptotic cell）、または感染細胞が、それぞれ非アポトーシス細胞、非壊死細胞、非ピロトーシス細胞、腫脹（oncotic）細胞、または未感染細胞と区別するためにその表面に示す部分（例えば、タンパク質、脂質、または多糖）を意味する。エンガルフメント促進マーカーは、アポトーシス細胞もしくは壊死細胞上で表面露出されている細胞内部分、アポトーシス細胞もしくは壊死細胞上でグリコシル化もしくは表面電荷が変化している部分、またはアポトーシス細胞、壊死細胞、ピロトーシスを起こした細胞または腫脹細胞に結合している血清部分であり得る。アポトーシス細胞のエンガルフメント促進マーカーの例には、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）、ＩＣＡＭ−３、酸化低密度リポタンパク質、カルレティキュリン、アネキシンＩ、補体Ｃ１ｑ、およびトロンボスポンジンが含まれる。壊死細胞、腫脹細胞およびピロトーシスを起こした細胞はまた、細胞表面上にＰｔｄＳｅｒエンガルフメント促進マーカーを露出させる。エンガルフメント受容体は、エンガルフメント促進マーカーに結合する中間体として可溶性架橋分子を用いて、直接的または間接的に標的細胞（例えば、損傷を受けた細胞、感染細胞、アポトーシス細胞、壊死細胞、ピロトーシスを起こした細胞または腫脹細胞）上のエンガルフメント促進マーカーを検出（または結合）し得る。
【００５６】
“エンガルフメントシグナル伝達ドメイン”は、宿主細胞によって発現されるＣＥＲの細胞外ドメインによって標的化された標的分子（例えば、エンガルフメント促進マーカーまたは抗原マーカー）の結合時に、宿主細胞において１以上のシグナル伝達経路を活性化し、結果として、具体的な態様では、宿主細胞の細胞骨格再配列、ならびにマーカーもしくは抗原に関連する標的細胞、病原菌または粒子の内在化を含むエンガルフメントが起こる、細胞内エフェクタードメインを意味する。特定の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは１以上のシグナル伝達経路を活性化し、結果として標的細胞、病原菌または粒子の食細胞作用をもたらす。特定の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。他の特定の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。第一のエンガルフメントは、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインまたは炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであり得る。エンガルフメントシグナル伝達ドメインが第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む態様において、前記第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインは、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインまたは炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであり得る。同様に、第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインは、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインから選択され得る。特定の態様において、ＣＥＲは、両方とも恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。他の特定の態様において、ＣＥＲは、両方とも炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。さらに他の態様において、ＣＥＲは、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、および炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。さらに他の態様において、ＣＥＲは、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、および恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。
【００５７】
用語“恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメイン”は、（ｉｉ）一般的に炎症性または免疫原性応答を刺激する内生受容体またはシグナル伝達分子に由来することなく、（ｉ）標的細胞、微生物、または粒子のエンガルフメントを刺激するエフェクタードメインを意味する。ある態様において、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、抗炎症性および／または免疫抑制性サイトカイン、例えばＴＧＦ−βおよびＩＬ−１０などの宿主細胞分泌を刺激する。特定の態様において、恒常性エンガルフメントシグナル伝達の刺激は、局所組織環境における炎症を低減（dampen）、軽減（attenuate）、または解消（resolve）する。恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインはまた、“非炎症性”エンガルフメントシグナル伝達ドメインまたは“非免疫原性”エンガルフメントシグナル伝達ドメインとも称され得る。
【００５８】
“炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメイン”は、（ｉ）標的細胞、病原菌または粒子のエンガルフメントを刺激し、（ｉｉ）一般的に、化学療法、抗体ベースの免疫療法、または例えばＴ細胞標的化療法などの細胞療法を誘導、増強または補完する、（ａ）炎症性サイトカイン、例えばＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３などの宿主細胞分泌、（ｂ）炎症性ケモカイン、例えばＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０などの宿主細胞分泌、（ｃ）細胞表面共刺激マーカー、例えばＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＨＶＥＭおよび４−１ＢＢＬなどの上方制御、ならびに（ｄ）１以上のシグナル伝達カスケード、例えばＮＦ−κＢなどの活性化、の１以上を刺激する、内生受容体またはシグナル伝達分子に由来する、エフェクタードメインを意味する。特定の態様において、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達の刺激は、局所組織環境における炎症を促進する。炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインはまた、“免疫原性”エンガルフメントシグナル伝達ドメインまたは“炎症性”エンガルフメントシグナル伝達ドメインとも称され得る。
【００５９】
本明細書で用いる“エフェクタードメイン”は、適切なシグナルを受けたときにエフェクタードメインを発現する細胞において直接的または間接的に生物学的または生理学的応答を促進し得る融合タンパク質または受容体の細胞内部分である。特定の態様において、エフェクタードメインは、結合したときにシグナルを受け取るタンパク質またはタンパク質複合体の一部であるか、あるいはそれが標的分子に直接結合してエフェクタードメインからのシグナルを誘発する。例えば、標的分子へのＣＥＲの結合に応答して、エフェクタードメインは、宿主細胞の内部にシグナルを伝達して、エフェクター機能、例えば、エンガルフメント、ファゴリソソーム成熟、抗炎症性および／または免疫抑制性サイトカインの分泌、炎症性サイトカインおよび／またはケモカインの分泌を誘導し得る。エフェクタードメインは、それが１以上のシグナル伝達ドメインまたはモチーフを含む場合、細胞応答を直接促進し得る。他の態様において、エフェクタードメインは、細胞応答を直接促進する１つまたは複数の他のタンパク質と会合することによって細胞応答を間接的に促進し得る。
【００６０】
本明細書で用いる“異種”または“非内生（non-endogenous）”または“外生（exogenous）”は、宿主細胞または対象に固有のものではない遺伝子、タンパク質、化合物、分子または活性を意味するか、あるいは対象または宿主細胞に固有の遺伝子、タンパク質、化合物、分子または活性であるが、構造、活性またはその両方が天然分子と変異分子との間で異なるように改変または変異されているものを意味する。特定の態様において、異種、非内生または外生分子（例えば、受容体、リガンド）は、宿主細胞または対象にとって内生ではなくともよいが、代わりにかかる分子をコードする核酸が、接合、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどによって宿主細胞に添加され得て、ここで、添加された核酸分子は、宿主細胞ゲノムに組み込まれてもよいか、または染色体外遺伝物質として（例えば、プラスミドまたは他の自己複製ベクターとして）存在してもよい。用語“相同”または“相同体”は、宿主細胞、種または株に見出されるまたはそれらに由来する分子または活性を意味する。例えば、異種もしくは外生分子または該分子をコードする遺伝子は、それぞれ天然の宿主もしくは宿主細胞分子または該分子をコードする遺伝子と相同であり得るが、改変された構造、配列、発現レベル、またはそれらの組み合わせを有し得る。非内生分子は、同じ種、異なる種またはそれらの組み合わせに由来し得る。
【００６１】
“接合アミノ酸”または“接合アミノ酸残基”とは、ポリペプチドの２つの隣接モチーフ、領域またはドメイン間の１つまたは複数（例えば、約２から２０）のアミノ酸残基を意味する。接合アミノ酸は、キメラタンパク質の構築物設計から生じ得る（例えば、融合タンパク質をコードする核酸分子の構築中に制限酵素部位の使用から生じるアミノ酸残基であり得る）。
【００６２】
“核酸分子”および“ポリヌクレオチド”は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含む、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態であり得る。核酸分子は、二本鎖または一本鎖であり得て、そして一本鎖である場合、コード鎖または非コード（アンチセンス鎖）であり得る。コーディング分子は、当技術分野で公知のコーディング配列と同一のコーディング配列を有し得るか、あるいは遺伝コードの冗長性(redundancy)もしくは縮重(degeneracy)の結果として、またはスプライシングにより、同じポリペプチドをコードし得る、異なるコード配列を有し得る。
【００６３】
用語“過剰発現された”または抗原の“過剰発現”は、細胞内での異常に高いレベルの抗原発現を意味する。過剰発現された抗原または抗原の過剰発現は、血液癌および対象の特定の組織または臓器内に固形腫瘍を形成している細胞におけるような疾患状態に関連することが多い。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍または血液癌は、当技術分野において公知の標準的なアッセイ法によって決定することができる。
【００６４】
本明細書で用いる用語“ペプチド”、“ポリペプチド”および“タンパク質”は互換的に用いられ、ペプチド結合により共有結合されたアミノ酸残基を含む化合物を意味する。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、タンパク質配列またはペプチド配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含むペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で用いる用語は、当技術分野で通常、例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも呼ばれる短鎖と、当技術分野で一般にタンパク質（多くの種類がある）と呼ばれる長鎖との両方を意味する。“ポリペプチド”には、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類縁体、融合タンパク質などが含まれる。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。
【００６５】
本明細書で用いる用語“成熟ポリペプチド”または“成熟タンパク質”は、細胞膜中または特定の細胞オルガネラ（例えば、小胞体、ゴルジ体またはエンドソーム）中に分泌または局在するタンパク質またはポリペプチドを意味し、Ｎ末端シグナルペプチドを含まない。
【００６６】
“シグナル配列”、“リーダー配列”、“リーダーペプチド”、“局在化シグナル”または“局在化配列”とも呼ばれる“シグナルペプチド”は、分泌経路に向かう予定の新しく合成されたタンパク質のＮ末端に存在する短いペプチド（通常、１５〜３０アミノ酸長）である。シグナルペプチドは、一般的に、Ｎ末端に親水性の正荷電アミノ酸の短い配列、５〜１５残基の中央の疎水性ドメイン、およびシグナルペプチダーゼのための切断部位を有するＣ末端領域を含む。真核生物では、シグナルペプチドは、新たに合成されたタンパク質の小胞体への移行を促し、そこでシグナルペプチダーゼによって切断されて成熟タンパク質を生成し、それがその後適切な目的地へと進む。
【００６７】
２以上の核酸またはアミノ酸配列間の“同一性パーセント”は、その配列によって共有される同一位置の数の関数であり（すなわち、同一性パーセント（％）＝同一位置の数／位置の総数×１００）、２以上の配列のアライメントを最適化するために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さも考慮に入れる。配列の比較および２つ以上の配列間の同一性パーセントの決定は、それらのデフォルトパラメーターでＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムなどの数学的アルゴリズムを用いて達成することができる（例えば、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990；BLASTN（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）も参照のこと）。
【００６８】
“保存的置換”は、当技術分野において、類似の特性を有する別のアミノ酸に対するあるアミノ酸の置換として認識されている。保存的置換の例は、当技術分野において周知である（例えば、ＷＯ９７／０９４３３、１０頁、１９９７年３月１３日公開；Lehninger, Biochemistry, Second Edition；Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77；Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA (1990), p.8参照）。
【００６９】
用語“キメラ”は、内生ではなく、天然には共に結合または連結していることが通常は見られない、共に結合または連結された配列を含む、核酸分子またはタンパク質を意味する。例えば、キメラ核酸分子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同じ供給源に由来するが天然に見出だされるものとは異なる様式で配置された調節配列およびコーディング配列を含み得る。
【００７０】
本明細書で用いる用語“プロモーター”は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するのに必要とされる、細胞の合成機構によって認識されるＤＮＡ配列、または導入された合成機構として定義される。
【００７１】
本明細書で用いる用語“プロモーター／調節配列”は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。ある例において、この配列はコアプロモーター配列であり得て、他の例において、この配列は、エンハンサー配列および遺伝子産物の発現に必要とされる他の制御要素を含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的に遺伝子産物を発現するものであり得る。
【００７２】
“構成的”プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されたときに、細胞のほとんどまたはすべての生理的条件下で遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
【００７３】
“誘導性”プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されたときに、プロモーターに対応するインデューサーが実質的に細胞内に存在する場合にのみ細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【００７４】
“組織特異的”プロモーターは、遺伝子によってコードされるかまたは特定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結されたときに、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合にのみ細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【００７５】
用語“対象”、“患者”および“個体”は、本明細書中、互換的に用いられ、免疫応答を誘発することができる生物（例えば、哺乳動物）を含むことを意図している。対象の例には、ヒト、霊長動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタおよびそれらのトランスジェニック種が含まれる。
【００７６】
用語“Ｔ細胞”は、Ｔ細胞系統の細胞を意味する。“Ｔ細胞系統の細胞”とは、他のリンパ系細胞および赤血球もしくは骨髄系列の細胞から該細胞を区別する、Ｔ細胞またはその前駆細胞（precursorもしくはprogenitor）の少なくとも１つの表現型の特徴を示す細胞を意味する。そのような表現型の特徴は、Ｔ細胞に特異的な１以上のタンパク質（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）の発現、またはＴ細胞に特異的な生理的、形態学的、機能的もしくは免疫学的特徴を含み得る。例えば、Ｔ細胞系統の細胞は、Ｔ細胞系統に関与する前駆細胞（precursorもしくはprogenitor cell）；ＣＤ２５＋未成熟および不活性化Ｔ細胞；ＣＤ４またはＣＤ８系統の関与を受けた細胞；ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性である胸腺前駆細胞；ＣＤ４＋またはＣＤ８＋の単一陽性細胞；ＴＣＲαβまたはＴＣＲγκ；または、成熟および機能的もしくは活性化Ｔ細胞であり得る。用語“Ｔ細胞”には、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ４５ＲＯ−）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ２７−）、粘膜関連インバリアントＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、および組織常在性Ｔ細胞が包含される。
【００７７】
用語“Ｂ細胞”は、Ｂ細胞系統の細胞を意味する。“Ｂ細胞系統の細胞”とは、他のリンパ系細胞および赤血球もしくは骨髄系列の細胞から該細胞を区別する、Ｂ細胞またはその前駆細胞（precursorもしくはprogenitor）の少なくとも１つの表現型の特徴を示す細胞を意味する。そのような表現型の特徴は、Ｂ細胞に特異的な１以上のタンパク質（例えば、ＣＤ１９＋、ＣＤ７２＋、ＣＤ２４＋、ＣＤ２０＋）の発現、またはＢ細胞に特異的な生理的、形態学的、機能的もしくは免疫学的特徴を含み得る。例えば、Ｂ細胞系統の細胞は、Ｂ細胞系統に関与する前駆細胞（precursorもしくはprogenitor cell）（例えば、プレプロ−Ｂ細胞、プロ−Ｂ細胞、およびプロ−Ｂ細胞）；未成熟および不活化Ｂ細胞または成熟および機能的もしくは活性化Ｂ細胞であり得る。従って、“Ｂ細胞”には、ナイーブＢ細胞、血漿細胞、制御性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞Ｂ細胞、リンパ形質細胞様細胞、プラズマブラスト細胞、およびメモリーＢ細胞（例えば、ＣＤ２７＋、ＩｇＤ−）が包含される。
【００７８】
本発明のキメラタンパク質またはキメラタンパク質を発現する細胞（例えば、ＣＥＲまたはＣＥＲを発現する細胞）の“治療的有効量”または“有効量”は、処置されている疾患、障害または望ましくない病状の１以上の症状の改善をもたらすのに十分なタンパク質または細胞の量を意味する。単独で投与される、個々の活性成分または単一の活性成分を発現する細胞について言及するとき、治療的有効量は、その成分またはその成分を単独で発現する細胞の効果を意味する。組合せについて言及するとき、治療的有効量は、連続的に投与されるか同時に投与されるかにかかわらず、活性成分の組み合わせた量または治療的効果をもたらす活性成分を発現する細胞と組み合わせた補助活性成分の組み合わせた量を意味する。
【００７９】
“処置する”または“処置”または“改善する”は、対象の疾患、障害または望ましくない病状の医学的管理を意味する。一般的に、本発明のＣＥＲを発現する宿主細胞を含む適切な用量または処置レジメンは、治療上または予防上の利益をもたらすのに十分な量で投与される。治療上または予防上／阻止上の利益には、改善された臨床成果；疾患、障害または望ましくない病状に関連する症状の緩和または軽減；症状の発生の減少；生活の質の向上；より長期の無疾患状態；疾患、障害または望ましくない病状の程度の低下；疾患状態の安定化；疾患の進行の遅延；寛解；生存；生存期間の延長；または、それらの何れかの組合せが含まれる。
【００８０】
本明細書で用いる語句“転写制御下”または“作動可能に連結された”は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために、該ポリヌクレオチドに対して正しい位置および配向にあることを意味する。
【００８１】
“ベクター”は、別の核酸を輸送することができる核酸分子である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、またはファージであり得る。この用語は、細胞への核酸の移動を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。“発現ベクター”は、それが適切な環境に存在するとき、ベクターによって運ばれる１つまたは複数の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を指示することができるベクターである。
【００８２】
特定の態様において、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。“レトロウイルス”は、ＲＮＡゲノムを有するウイルスである。“ガンマレトロウイルス”は、レトロウイルス科ファミリーを意味する。ガンマレトロウイルスの例には、マウス幹細胞ウイルス、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、およびトリ細網内皮症ウイルス（reticuloendotheliosis virus）が含まれる。“レンチウイルス”とは、分裂細胞および非分裂細胞に感染することができるレトロウイルス属を意味する。レンチウイルスの例には、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ １型およびＨＩＶ ２型を含む）、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
他の態様において、ベクターは非ウイルスベクターである。非ウイルスベクターの例としては、脂質ベースのＤＮＡベクター、修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）、自己増幅ｍＲＮＡ、閉鎖末端直鎖状二本鎖（ＣＥＬｉＤ）ＤＮＡ、およびトランスポゾン介在遺伝子導入（ＰｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）が挙げられる。非ウイルス送達系が用いられるとき、送達ビークルはリポソームであり得る。脂質製剤は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで核酸を宿主細胞に導入するために用いられ得る。核酸は、リポソームの内部に封入されるか、リポソームの脂質二重層内に散在しているか、リポソームと核酸の両方と会合している連結分子を介してリポソームに付着しているか、ミセルを含むかもしくはそれと複合体を形成しているか、そうでなければ脂質と結合していてよい。
【００８４】
本明細書を通してさらなる定義が提供される。
【００８５】
キメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）
キメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）は本明細書に記載されている。特定の態様において、ＣＥＲは、膜貫通ドメインによって連結されている細胞外ドメインおよびエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む、キメラの一本鎖タンパク質である。細胞外ドメインは、細胞外結合ドメイン、および場合により、細胞外スペーサードメインを含む。宿主細胞において発現されるとき、ＣＥＲは、標的細胞、病原菌、粒子または他の物質上に存在するかまたはそれらにより発現される選択されたエンガルフメント促進マーカーまたは抗原性マーカーに特異的な改変された宿主細胞（宿主細胞は、エンガルフメント表現型に“切り替えられる”）にエンガルフメント表現型を付与する。特定の態様において、ＣＥＲは、標的細胞、病原菌、粒子または他の物質上に存在するかまたはそれらにより発現される選択されたエンガルフメン促進マーカーまたは抗原性マーカーに特異的に改変された宿主細胞に食細胞作用表現型を付与する。特定のＣＥＲの態様において、キメラタンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、標的分子に特異的な結合ドメインを有する細胞外ドメインおよび要すれば細胞外スペーサードメイン；膜貫通ドメイン；ならびに、エンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（例えば、図１Ａおよび図１Ｂ参照）。
【００８６】
本明細書に記載のＣＥＲの構成部分は、所望のエンガルフメント表現型を提供するように選択および配置され得る。例えば、特定の態様では、細胞外ドメインは、（ｉ）アポトーシス細胞、死細胞、死にそうな細胞、損傷細胞または壊死細胞に関連するエンガルフメント促進マーカー；あるいは、（ｉｉ）感染症、疾患、障害または他の望ましくない病状に関連する、外来物（例えば、病原菌）、感染Ｔ細胞または異常なＴ細胞によって提示される抗原マーカー、に特異的な結合ドメインを含み得る。
【００８７】
エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、標的細胞のエンガルフメントを駆動する１以上のエフェクタードメイン（“シグナル伝達”ドメインとも言う）を含み得る。エンガルフメントシグナル伝達ドメインによるシグナル伝達は、細胞外ドメインの、標的化されたエンガルフメント促進または抗原性マーカーへの結合によって引き起こされる。特定の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。特定の態様において、前記第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインは、恒常性エンガルフメント応答を開始するように選択される。さらに、他の態様において、前記第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインは、炎症誘発性エンガルフメント応答を開始するように選択される。さらに他の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含み、ここで、前記第一および第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが、両方とも恒常性シグナル伝達ドメインであるか、両方とも炎症誘発性シグナル伝達ドメインであるか、またはそれぞれいずれか一方である（何れの順でも可）。本明細書に記載のＣＥＲは、種々の治療的状況（例えば、アポトーシス細胞、死細胞、死にかけの細胞、損傷細胞、感染細胞または壊死細胞の排除、感染症の原因となる病原菌の排除、および疾患、障害または望ましくない病状に関連する異常細胞の排除）における適用のために設計され得て、所望の治療結果を補完するエンガルフメントシグナル伝達（例えば、恒常性または炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達）を提供する。
【００８８】
図３Ａおよび３Ｂは、本発明のＣＥＲの態様で改変されたリンパ球と天然リンパ球との機能的比較を提供する。図３Ａは内生リンパ球を示し、該図に示されるように、天然リンパ球はエンガルフメント表現型を示さない。しかしながら、図３Ｂに示されるように、本明細書に記載のＣＥＲを発現するように改変されたリンパ球は、標的化された癌細胞に特異的なエンガルフメント表現型を示し、エンガルフメント（例えば、食細胞作用）および標的化癌細胞の排除をもたらす。さらにまた、図３Ｂに示されるように、ある態様において、ＣＥＲは、エンガルフメントプロセスの分極化（polarization）を行うに設計され得る。特定の態様において、本明細書に記載のＣＥＲに含まれるエンガルフメントシグナル伝達ドメインは、恒常性エンガルフメントシグナル伝達または炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達を駆動するように選択され得る。
【００８９】
本発明の融合タンパク質の構成部分は、本明細書にさらに記載されている。
【００９０】
細胞外ドメイン
本明細書に記載の通り、ＣＥＲは、標的分子に特異的な細胞外ドメインを含む。特定の態様において、細胞外ドメインは、標的化エンガルフメント促進マーカーまたは抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメインを含む。結合ドメインによる標的分子の結合は、標的分子（例えば、受容体またはリガンド）と別の分子との間の相互作用を阻止し、例えば、標的分子の特定の機能（例えば、シグナル伝達）を妨害するか、低減するか、または排除し得る。ある態様において、標的分子の結合は、特定の生物学的経路を誘導し得るか、または標的分子もしくは標的分子を発現する細胞を排除するために同定し得る。
【００９１】
結合ドメインは、目的の標的分子に特異的に結合する任意のポリペプチドまたはペプチドであり得る。結合ドメインの供給源には、受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、および抗体または抗原結合部分、例えばヒト、げっ歯動物、鳥類またはヒツジを含む様々な種由来の抗体可変領域（それらは、抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖベースのグラバボディ（grababody）、または可溶性ＶＨドメインもしくはドメイン抗体であり得る）などが含まれる。結合ドメインのさらなる供給源には、ラクダ科動物（ラクダ、ヒトコブラクダまたはラマ由来のもの；Ghahroudi et al., FEBS Lett. 414:521, 1997; Vincke et al., J. Biol. Chem. 284:3273, 2009; Hamers-Casterman et al., Nature 363:446, 1993 およびNguyen et al., J. Mol. Biol. 275:413, 1998）、コモリザメ（Roux et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. (USA) 95:11804, 1998）、スポッティドラットフィッシュ（Nguyen et al., Immunogen. 54:39, 2002）またはヤツメウナギ（Herrin et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. (USA) 105:2040, 2008 およびAlder et al. Nat. Immunol. 9:319, 2008）などの他の種由来の抗体の可変領域が含まれる。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを用いて抗原結合領域を形成することができる。すなわち、これらの機能的抗体は、重鎖のみのホモ二量体である（“重鎖抗体”と称される）（Jespers et al., Nat. Biotechnol. 22:1161, 2004; Cortez-Retamozo et al., Cancer Res. 64:2853, 2004; Baral et al., Nature Med. 12:580, 2006；および、Barthelemy et al., J. Biol. Chem. 283:3639, 2008）。
【００９２】
ある態様において、細胞外ドメインは、エンガルフメント促進マーカーに結合する。かかる特定の態様において、細胞外ドメインによって標的化されるエンガルフメント促進マーカーは、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）、ＩＣＡＭ−３、酸化低密度リポタンパク質、カルレティキュリン、アネキシンＩ、補体Ｃ１ｑ、またはトロンボスポンジンである。さらなる態様において、エンガルフメント促進マーカーに結合する細胞外ドメインは、内生エンガルフメント受容体またはエンガルフメント受容体のための可溶性架橋分子（例えば、ＧＡＳ６、プロテインＳ、ＭＦＧ−Ｅ８）に由来する。ある態様において、細胞外部分全体（膜貫通分子の場合）、架橋分子全体またはエンガルフメント受容体もしくは架橋分子の切断部分が用いられる。ただし、該切断部分が、エンガルフメント促進マーカーへの十分な結合活性を保持する（すなわち、機能的変異体である）という条件がある。さらなる態様において、細胞外ドメインに用いられるエンガルフメント受容体または架橋分子の細胞外部分は、細胞外部分全体（膜貫通分子の場合）、架橋分子全体またはエンガルフメント受容体もしくは架橋分子の細胞外部分の変異体であり、ただし、該変異体は、エンガルフメント促進マーカーへの十分な結合活性を保持する（すなわち、機能的変異体である）。
【００９３】
ある態様において、細胞外ドメインは、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン１（Ｔｉｍ１）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン４（Ｔｉｍ４）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン３（Ｔｉｍ３）、スタビリン−２、ＲＡＧＥ、またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）細胞外ドメインを含む。特定の態様において、ＦｃＲ細胞外ドメインは、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃεＲ１またはＦｃαＲ１由来の結合ドメインを含み得る。さらなる態様において、細胞外ドメインは、Ｔｉｍ１、Ｔｉｍ４、Ｔｉｍ３、スタビリン−２、糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ）、脳特異的血管新生阻害因子１（ＢＡＩ１）、乳脂肪小球ＥＧＦ因子８タンパク質（Milk Fat Globule-EGF factor 8, ＭＦＧ−Ｅ８）（例えば、ＰｔｄＳｅｒへの高親和性結合を媒介するＦＡ５８Ｃ２ドメイン）、増殖停止特異的６（ＧＡＳ６）、プロテインＳ、プロテインＣ、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、β ２−糖タンパク質Ｉ、α５β３インテグリンおよび他のインテグリン、ＣＲ３補体受容体、ＣＲ４補体受容体、ＣＤ１４、ＣＤ９３、アネキシンＶ、ホスファチジルセリン受容体（ＰＳｒ）、プロトロンビン、またはスカベンジャー受容体Ｂ（ＳＲＢ）（例えば、ＳＲＢ１（ＣＤ３６））、スカベンジャー受容体Ｃ（ＳＲＣ）（例えば、ＬＯＸ−１、ＳＲＣＬ）、スカベンジャー受容体Ｄ（ＳＲＤ）（例えば、ＣＤ６８、マクロシアニン）などのスカベンジャー受容体、ならびにＰＳＯＸ由来のＰｔｄＳｅｒ結合ドメインを含み得る。
【００９４】
ある態様において、細胞外ドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１６−２９２を含むＦｃγＲＩ結合ドメイン、配列番号２８のアミノ酸配列または配列番号２８のアミノ酸２１−２９０を含むＴＩＭ１結合ドメイン、配列番号２９のアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２５−３１４を含むＴＩＭ４結合ドメイン、配列番号３４のアミノ酸配列または配列番号３４アミノ酸２２−２０２を含むＴＩＭ３結合ドメイン、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＦＡ５８Ｃ２結合ドメイン、配列番号３２のアミノ酸配列または配列番号３２のアミノ酸３１−９４を含むＧＡＳ６結合ドメイン、配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＢＡＩ１結合ドメイン、あるいは配列番号３３のアミノ酸配列または配列番合３３のアミノ酸２５−８７を含むプロテインＳ結合ドメインと、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列を含むか、または該配列である。任意の他の態様において、細胞外ドメインは、配列番号４のＦｃγＲＩ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号１のＴＩＭ１結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号２のＴＩＭ４結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号７のＴＩＭ３結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号３のＦＡ５８Ｃ２結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号５のＧＡＳ６結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号１３５のＢＡＩ１結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号６のプロテインＳ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列を含むか、または該配列であるポリヌクレオチド配列によってコードされている。
【００９５】
他の態様において、細胞外ドメインは、以下のうちの少なくとも１つに由来する：ＩＣＡＭ３に結合するＣＤ１４；酸化ＬＤＬに結合するスカベンジャー受容体細胞外ドメイン；改変糖類（altered sugar）に結合するレクチン；トロンボスポンジンに結合するＣＤ３６；または、カルレティキュリンに結合するＬＲＰ１／ＣＤ９１もしくはレクチン部分。
【００９６】
さらに他の態様において、細胞外ドメインは、目的の標的分子に特異的なＶＨおよびＶＬ領域を含む一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）などの、抗体またはその抗原結合断片を含む。特定の態様において、抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である。さらなる態様において、ＶＨおよびＶＬ領域は、ヒトまたはヒト化抗体由来である。特定の態様において、細胞外ドメインは、エンガルフメント促進マーカーに特異的な抗体またはその抗原結合部分である。ホスファチジルセリンに特異的な抗体は、当技術分野で公知である（米国特許第７，２４７，３０３号；Khogeer et al., 2015, Lupus 24:186-90; Gerber et al., 2015, Am. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 5:493-503を参照こと。これらの各々は、その内容全体が引用により本明細書中に包含される）。特定の態様において、目的の標的分子は、腫瘍抗原であり、例えばＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、ＭＵＣ−１６、Ｌ１ＣＡＭ、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＡ１２５、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＧＤ−３、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、葉酸受容体α、ＣＤ９７、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＷＴ１、ＶＥＧＦ−α、ＶＥＧＦＲ１、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−１１Ｒα、ＰＳＡ、ＦｃＲＨ５、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＡＧ−７２、ＣＥＡ、エフリンＡ２、エフリンＢ２、ルイスＡ抗原、ルイスＹ抗原、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＲＡＧＥ−１、ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、ＶＥＧＦＲ−２、ＬＧＲ５、ＳＳＸ２、ＡＫＡＰ−４、ＦＬＴ３、フコシルＧＭ１、ＧＭ３、ｏ−アセチル−ＧＤ２、およびＧＤ２であり、例示的なＶＨおよびＶＬ領域には、それぞれ、抗ＣＤ１３８、−ＣＤ３８、−ＣＤ３３、−ＣＤ１２３、−ＣＤ７２、−ＣＤ７９ａ、−ＣＤ７９ｂ、−メソテリン、−ＰＳＭＡ、−ＢＣＭＡ、−ＲＯＲ１、−ＭＵＣ−１６、−Ｌ１ＣＡＭ、−ＣＤ２２、−ＣＤ１９、−ＣＤ２０、−ＣＤ２３、−ＣＤ２４、−ＣＤ３７、−ＣＤ３０、−ＣＡ１２５、−ＣＤ５６、−ｃ−Ｍｅｔ、−ＥＧＦＲ、−ＧＤ−３、−ＨＰＶ Ｅ６、−ＨＰＶ Ｅ７、−ＭＵＣ−１、−ＨＥＲ２、−葉酸受容体α、−ＣＤ９７、−ＣＤ１７１、−ＣＤ１７９ａ、−ＣＤ４４ｖ６、−ＷＴ１、−ＶＥＧＦ−α、−ＶＥＧＦＲ１、−ＩＬ−１３Ｒα１、−ＩＬ−１３Ｒα２、−ＩＬ−１１Ｒα、−ＰＳＡ、−ＦｃＲＨ５、−ＮＫＧ２Ｄリガンド、−ＮＹ−ＥＳＯ−１、−ＴＡＧ−７２、−ＣＥＡ、−エフリンＡ２、−エフリンＢ２、−ルイスＡ抗原、−ルイスＹ抗原、−ＭＡＧＥ、−ＭＡＧＥ−Ａ１、−ＲＡＧＥ−１、−葉酸受容体β、−ＥＧＦＲｖｉｉｉ、−ＶＥＧＦＲ−２、−ＬＧＲ５、−ＳＳＸ２、−ＡＫＡＰ−４、−ＦＬＴ３、−フコシルＧＭ１、−ＧＭ３、−ｏ−アセチル−ＧＤ２、および−ＧＤ２特異的モノクローナル抗体のセグメントが含まれる。
【００９７】
さらなる態様において、細胞外ドメインは、目的の標的に特異的なＦａｂを含む。かかる態様において、目的の標的には、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、ＭＵＣ−１６、Ｌ１ＣＡＭ、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＡ１２５、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＧＤ−３、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、葉酸受容体α、ＣＤ９７、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＷＴ１、ＶＥＧＦ−α、ＶＥＧＦＲ１、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−１１Ｒα、ＰＳＡ、ＦｃＲＨ５、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＡＧ−７２、ＣＥＡ、エフリンＡ２、エフリンＢ２、ルイスＡ抗原、ルイスＹ抗原、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＲＡＧＥ−１、葉酸受容体β、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、ＶＥＧＦＲ−２、ＬＧＲ５、ＳＳＸ２、ＡＫＡＰ−４、ＦＬＴ３、フコシルＧＭ１、ＧＭ３、ｏ−アセチル−ＧＤ２、およびＧＤ２が含まれ、Ｆａｂ領域には、それぞれ、抗ＣＤ１３８、−ＣＤ３８、−ＣＤ３３、−ＣＤ１２３、−ＣＤ７２、−ＣＤ７９ａ、−ＣＤ７９ｂ、−メソテリン，−ＰＳＭＡ、−ＢＣＭＡ、−ＲＯＲ１、−ＭＵＣ−１６、−Ｌ１ＣＡＭ、−ＣＤ２２、−ＣＤ１９、−ＣＤ２０、−ＣＤ２３、−ＣＤ２４、−ＣＤ３７、−ＣＤ３０、−ＣＡ１２５、−ＣＤ５６、−ｃ−Ｍｅｔ、−ＥＧＦＲ、−ＧＤ−３、−ＨＰＶ Ｅ６、−ＨＰＶ Ｅ７、−ＭＵＣ−１、−ＨＥＲ２、−葉酸受容体α、−ＣＤ９７、−ＣＤ１７１、−ＣＤ１７９ａ、−ＣＤ４４ｖ６、−ＷＴ１、−ＶＥＧＦ−α、−ＶＥＧＦＲ１、−ＩＬ−１３Ｒα１、−ＩＬ−１３Ｒα２、−ＩＬ−１１Ｒα、−ＰＳＡ、−ＦｃＲＨ５、−ＮＫＧ２Ｄリガンド、−ＮＹ−ＥＳＯ−１、−ＴＡＧ−７２、−ＣＥＡ、−エフリンＡ２、−エフリンＢ２、−ルイスＡ抗原、−ルイスＹ抗原、−−ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、−ＲＡＧＥ−１、−葉酸受容体β、−ＥＧＦＲｖｉｉｉ、−ＶＥＧＦＲ−２、−ＬＧＲ５、−ＳＳＸ２、ＡＫＡＰ−４、−ＦＬＴ３、−フコシルＧＭ１、−ＧＭ３、−ｏ−アセチル−ＧＤ２、および−ＧＤ２特異的モノクローナル抗体の一部分が含まれる。
【００９８】
本発明のＣＥＲの細胞外ドメインに特異的に結合する標的分子は、目的の細胞（“標的細胞”）上にまたはそれと関連して見いだされ得る。例示的な標的細胞には、癌細胞、自己免疫疾患もしくは障害または炎症性疾患もしくは障害に関連する細胞、および感染性病原菌（例えば、細菌、ウイルスまたは真菌）、あるいは感染細胞（例えば、ウイルス感染細胞）が含まれる。哺乳動物寄生虫などの感染性生物の細胞もまた、標的細胞として意図される。
【００９９】
ある態様において、細胞外ドメインは、要すれば、細胞外の非シグナリングスペーサーまたはリンカードメインを含む。含まれる場合、そのようなスペーサーまたはリンカードメインは、適当な細胞／細胞接触、結合および活性化をさらに可能にするために、結合ドメインを宿主細胞表面から離して配置してもよい。細胞外スペーサードメインは、一般的に、細胞外結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置する。細胞外スペーサーの長さは、選択された標的分子、選択された結合エピトープ、結合ドメインサイズおよび親和性に基づいて標的分子の結合を最適化するように変えることができる（例えば、Guest et al., J. Immunother. 28:203-11, 2005；ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１４／０３１６８７参照）。特定の態様において、細胞外スペーサードメインは、免疫グロブリンヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ）である。免疫グロブリンヒンジ領域は、野生型免疫グロブリンヒンジ領域であるか、または改変された野生型免疫グロブリンヒンジ領域であり得る。改変されたＩｇＧ４ヒンジ領域は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１４／０３１６８７に記載されており、その文献の内容全体が引用により本明細書中に包含される。特定の態様において、細胞外スペーサードメインは、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰのアミノ酸配列（配列番号６７）を有する修飾されたＩｇＧ４ヒンジ領域を含む。本明細書に記載のＣＥＲに用いられ得るヒンジ領域の他の例には、野生型またはその変異体であり得る、ＣＤ８ａ、ＣＤ４、ＣＤ２８およびＣＤ７などのＩ型膜タンパク質の細胞外領域に存在するヒンジ領域が含まれる。さらなる態様において、細胞外スペーサードメインは、以下から選択される免疫グロブリンＦｃドメインの全部または一部を含む：ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらの組合せ（例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１４／０３１６８７参照、その内容全体は引用により本明細書中に包含される）。なおさらなる態様において、細胞外スペーサードメインは、ＩＩ型Ｃ−レクチンのストーク領域（Ｃ型レクチンドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する細胞外ドメイン）を含み得る。ＩＩ型Ｃ−レクチンには、ＣＤ２３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ９４、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｄが含まれる。なおさらなる態様において、細胞外スペーサードメインは、ＭＥＲＴＫに由来し得る。
【０１００】
エンガルフメントシグナル伝達ドメイン
ＣＥＲのエンガルフメントシグナル伝達ドメインは、細胞内エフェクタードメインであり、標的分子への該ＣＥＲの細胞外ドメインの結合に応答して細胞に機能的シグナルを伝達することができる。特定の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、１以上の恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメイン、１以上の炎症誘発性シグナリングドメイ、または恒常性シグナル伝達ドメインおよび炎症誘発性シグナル伝達ドメインの両方を含み得る。
【０１０１】
特定の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、内生エンガルフメント受容体の細胞内シグナル伝達ドメインである。エンガルフメントシグナル伝達ドメインが由来し得る内生エンガルフメント受容体の例としては、Ｍｅｒチロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）、Ｔｙｒｏ３タンパク質チロシンキナーゼ、Ａｘｌ受容体チロシンキナーゼ、ＢＡＩ１、マンノース受容体Ｃ−１型（ＭＲＣ１）、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃεＲ１またはＦｃαＲ１）が挙げられる。他の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、食細胞作用中のシグナル伝達経路に関連する内生キナーゼまたはアダプタータンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインである。食細胞作用シグナル伝達経路に関連するキナーゼの例としては、脾臓関連チロシンキナーゼ（ＳＹＫ）、Ｔ細胞受容体関連タンパク質キナーゼ７０のゼータ鎖（Ｚａｐ７０）、およびホスホイノシチド ３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）が挙げられる。
【０１０２】
エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、十分なシグナル伝達活性を保持するエンガルフメントシグナル伝達分子の任意の部分であり得る。ある態様において、エンガルフメントシグナル伝達分子の全長またはその全長細胞内成分を用いる。ある態様において、エンガルフメントシグナル伝達分子の切断部分またはエンガルフメントシグナル伝達分子の細胞内成分の切断部分を用いる。ただし、該切断部分は、十分なシグナル伝達活性を保持している。さらなる態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、エンガルフメントシグナル伝達分子の全体または切断部分の変異体である。ただし、該変異体は、十分なシグナル伝達活性を保持している（すなわち、それは機能的変異体である）。
【０１０３】
特定の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメイン、例えばＭＲＣ１シグナル伝達ドメイン、ＩｔｇＢ５シグナル伝達ドメイン、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメイン、Ｔｙｒｏ３シグナル伝達ドメイン、Ａｘｌシグナル伝達ドメイン、ＢＡＩ１シグナル伝達ドメイン、またはＥＬＭＯシグナル伝達ドメインを含む。より特定の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＭＲＣ１シグナル伝達ドメイン、配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＩｔｇＢ５シグナル伝達ドメイン、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメイン、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＴｙｒｏ３シグナル伝達ドメイン、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＡｘｌシグナル伝達ドメイン、配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＢＡＩ１シグナル伝達ドメイン、または配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＥＬＭＯシグナル伝達ドメインと、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一の配列を含むか、または該配列である恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。他の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインを含み、該恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、配列番号５５のＭＲＣ１シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号１３７のＩｔｇＢ５シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号１３８のＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号１８のＴｙｒｏ３シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号１７のＡｘｌシグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号１３９のＢＡＩ１シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド、または配列番号１４０のＥＬＭＯシグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドと、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一の配列を含むか、または該配列であるポリヌクレオチド配列によりコードされている。
【０１０４】
特定の態様において、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインによるシグナル伝達は、抗炎症性サイトカインおよび免疫抑制性サイトカインのうち少なくとも１つの発現をもたらす。特定の態様において、抗炎症性サイトカインおよび免疫抑制性サイトカインの少なくとも１つは、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０またはその両方である。
【０１０５】
特定の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、例えばＴｒａｆ６シグナル伝達ドメイン、Ｓｙｋシグナル伝達ドメイン、ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン、切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン（例えば、デスドメイン（death domain）を含むが、Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１受容体（ＴＩＲ）相同性ドメインを欠く）、Ｚａｐ７０シグナル伝達ドメイン、ＰＩ３Ｋシグナル伝達ドメイン、ＦｃＲシグナル伝達ドメイン（ＦｃγＲ１シグナル伝達ドメイン、ＦｃγＲ２Ａシグナル伝達ドメイン、ＦｃγＲ２Ｃシグナル伝達ドメイン、ＦｃγＲ２Ｂ２シグナル伝達ドメイン、ＦｃγＲ３Ａシグナル伝達ドメイン、ＦｃγＲ２Ｃシグナル伝達ドメイン、ＦｃγＲ３Ａシグナル伝達ドメイン、ＦｃεＲ１シグナル伝達ドメインおよびＦｃαＲ１シグナル伝達ドメインを含む）、Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）シグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質（ＴＹＲＯＢＰ）とも呼ばれる）シグナル伝達ドメイン、ＩＴＡＭモチーフ１を有するＮＦＡＴ活性化タンパク質（ＮＦＡＭ１）シグナル伝達ドメイン、またはＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインである、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。
【０１０６】
特定の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＴｒａｆ６シグナル伝達ドメイン、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＳｙｋシグナル伝達ドメイン、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン、配列番号７８のアミノ酸配列を含む切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＺａｐ７０シグナル伝達ドメイン、配列番号８８のアミノ酸配列を含むＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメイン、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ１シグナル伝達ドメイン、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ２Ａシグナル伝達ドメイン、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ２Ｃシグナル伝達ドメイン、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＦｃγＲ３Ａシグナル伝達ドメイン、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＢＡＦＦ−Ｒシグナル伝達ドメイン、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＤＡＰ１２シグナル伝達ドメイン、配列番号９２のアミノ酸配列を含むＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメイン、配列番号１３２のアミノ酸配列を含む切断型ＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメイン、または配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインと、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一の配列を含むか、または該配列である、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。
【０１０７】
他の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインを含み、該炎症誘発性シグナル伝達ドメインは、配列番号２７のＴｒａｆ６シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号１９のＳｙｋシグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号２６のＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号９９の切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号２０のＺａｐ７０をコードするポリヌクレオチド、配列番号１４１のＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号２１のＦｃγＲ１シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号２２のＦｃγＲ２Ａシグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号２３のＦｃγＲ２Ｃシグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号２４のＦｃγＲ３Ａシグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号１２６のＢＡＦＦ−Ｒシグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号１２７のＤＡＰ１２シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号１２９のＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド、配列番号１２８のＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドと、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一の配列を含むか、または該配列であるポリヌクレオチド配列によって提供される。
【０１０８】
さらなる態様において、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインによるシグナル伝達は、炎症性サイトカイン、炎症性ケモカインまたは共刺激細胞表面マーカーの少なくとも１つの発現をもたらす。なおさらなる態様において、炎症性サイトカインは、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２またはＩＬ−２３あるいはそれらの何れかの組合せであり、炎症性ケモカインは、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ１０あるいはそれらの何れかの組合せであり、共刺激細胞表面マーカーは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＨＶＥＭまたは４−１ＢＢＬあるいはそれらの何れかの組合せである。
【０１０９】
なおさらなる態様において、ＣＥＲのエンガルフメントシグナル伝達ドメインは、２以上のシグナル伝達ドメインを含み得る。かかる特定の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。該エンガルフメントシグナル伝達ドメインが、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む態様において、前記第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインは、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインまたは炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであり得る。同様に、第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインは、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインまたは炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインから選択され得る。特定の態様において、ＣＥＲは、両方とも恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。特定の他の態様において、ＣＥＲは、両方とも炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のシグナル伝達ドメインを含む。さらに他の態様において、ＣＥＲは、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。さらに他の態様において、ＣＥＲは、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインが両方とも恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであるか、または両方とも炎症誘発性シグナル伝達ドメインである態様において、該第一および第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインは、同じでも異なっていてもよい。特定の態様において、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインとして利用されるドメインは、ＭＲＣ１、ＩｔｇＢ５、ＭＥＲＴＫ、ＥＬＭＯ、ＢＡＩ１、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、Ｔｒａｆ６、Ｓｙｋ、ＭｙＤ８８、Ｚａｐ７０、ＰＩ３Ｋ、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃεＲ１、ＦｃαＲ１、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＤＡＰ１２、ＮＦＡＭ１およびＣＤ７９ｂを含む、本明細書に記載の特定のシグナル伝達ドメインの１以上から選択される。
【０１１０】
特定の態様において、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインの存在は、ＣＥＲのエンガルフメント活性を増強するか、ＣＥＲで改変された宿主細胞の持続性を増すか、ＣＥＲで改変された宿主細胞の増殖を増加させるか、またはそれらの組合せである。特定の態様において、炎症誘発性シグナル伝達ドメインである第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインと恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインの包含は、ＣＥＲのエンガルフメント活性を増強するか、ＣＥＲで改変された宿主細胞の持続性を増すか、ＣＥＲで改変された宿主細胞の増殖を増加させるか、またはそれらの組合せである。
【０１１１】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、細胞外ドメインとエンガルフメントシグナル伝達ドメインとを連結し、それらの間に位置する。膜貫通ドメインは、宿主細胞膜を横切る疎水性αへリックスである。膜貫通ドメインは、結合ドメインまたは存在する場合、細胞外スペーサードメインに直接融合することができる。特定の態様において、膜貫通ドメインは、内在性膜タンパク質（例えば、受容体、分化クラスター（ＣＤ）分子、酵素、トランスポーター、細胞接着分子など）に由来する。膜貫通ドメインは、ＣＥＲに含まれる細胞外ドメインまたはエンガルフメントシグナル伝達ドメインのいずれかと天然に結合し得る（例えば、ＣＥＲは、Ｔｉｍ４結合ドメインおよびＴｉｍ４膜貫通ドメインを含む）。特定の態様において、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインは異なる分子に由来するか、膜貫通ドメインおよびエンガルフメントシグナル伝達ドメインは異なる分子に由来するか、または膜貫通ドメイン、細胞外ドメインおよびエンガルフメントシグナル伝達ドメインは全て異なる分子に由来する。
【０１１２】
特定の態様において、膜貫通ドメインは、Ｔｉｍ１膜貫通ドメイン、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン、ＦｃＲ膜貫通ドメイン（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ２Ｃ、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃεＲ１、ＦｃαＲ１膜貫通ドメイン）、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＭＥＲＴＫ膜貫通ドメイン、Ａｘｌ膜貫通ドメイン、Ｔｙｒｏ３膜貫通ドメイン、ＢＡＩ１膜貫通ドメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＭＲＣ１膜貫通ドメイン、またはＤＡＰ１２膜貫通ドメインである。
【０１１３】
特定の態様において、膜貫通ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＴｉｍ１膜貫通ドメイン、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＴｉｍ４膜貫通ドメイン、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＦｃγＲＩ膜貫通ドメイン、配列番号８９のアミノ酸配列を含むＦｃεＲＩγ膜貫通ドメイン、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＭＥＲＴＫ膜貫通ドメイン、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＡｘｌ膜貫通ドメイン、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＴｙｒｏ３膜貫通ドメイン、配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＢＡＩ１膜貫通ドメイン、配列番号６８のアミノ酸配列で示されるＣＤ２８膜貫通ドメイン、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤ４膜貫通ドメイン、配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＭＲＣ１膜貫通ドメイン、または配列番号８１のアミノ酸配列を含むＤＡＰ１２膜貫通ドメインと、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一の配列を含むか、または該配列である。他の態様において、膜貫通ドメインは、配列番号８のＴｉｍ１膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、配列番号９のＴｉｍ４膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、配列番号８５のＦｃεＲＩγ膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１０のＦｃγＲＩ膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１１のＣＤ８ａ膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１２のＭＥＲＴＫ膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１３のＡｘｌ膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４のＴｙｒｏ３膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４４のＣＤ２８膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４３のＢＡＩ１膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１５のＣＤ４膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１４５のＤＡＰ１２膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一の配列を含むか、または該配列であるポリヌクレオチド配列により提供される。
【０１１４】
本明細書に記載のＣＥＲの、あるドメインの別のドメインへの直接結合は、介在するジャンクションアミノ酸の存在を排除しないことが理解される。ジャンクションアミノ酸は、天然または非天然（例えば、キメラタンパク質の構築物設計から生じたもの）であってよい。
【０１１５】
ＣＥＲの例
本明細書に記載のＣＥＲの構成部分は、宿主細胞に所望のエンガルフメント表現型を提供するために種々の組合せで選択および配置され得る。ＣＥＲで改変された宿主細胞によって標的化される分子を発現するか、またはそれによって特徴付けられる細胞、病原菌または粒子のエンガルフメントを誘導することに加えて、本明細書に記載のＣＥＲは、標的細胞または粒子、病状および所望の治療結果に応じて、恒常性エンガルフメント応答または炎症誘発性エンガルフメント応答を開始するように設計され得る。
【０１１６】
一側面において、本発明は、一本鎖キメラタンパク質を含むキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）を提供し、該一本鎖キメラタンパク質は、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメイン；エンガルフメントシグナル伝達ドメイン；ならびに、細胞外ドメインおよびエンガルフメントシグナル伝達ドメインの間に位置し、それらを連結している膜貫通ドメインを含む。
【０１１７】
特定の態様において、細胞外ドメインは、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する細胞外スペーサードメインをさらに含む。
【０１１８】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む特定の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインまたは炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインである。かかる特定の態様において、恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインまたは炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、本明細書に記載のものの１つ以上から選択され得る。ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む他の態様において、エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインは、両方とも恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであるか、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであるか、またはそれぞれいずれか一方であってもよい（何れの順でも可）。かかる特定の態様において、前記第一のシグナル伝達ドメインおよび前記第二のシグナル伝達ドメインに包含される恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインまたは炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインは、本明細書に記載の恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインの１以上から選択され得る。
【０１１９】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む一態様は、ＴＩＭ４ ＰｔｄＳｅｒ結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、およびＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ０１”とも呼ばれる）（例えば、図６Ａ参照）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号７１のアミノ酸１−２２）を除く配列番号７１のアミノ酸配列を含む。
【０１２０】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＦＡ５８Ｃ２ ＰｔｄＳｅｒ結合ドメインおよび修飾されたＩｇＧ４ヒンジ領域を含む細胞外スペーサードメインを含む細胞外ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、ならびにＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ０３”とも呼ばれる）（例えば、図９Ａ参照）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号７５のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号７５のアミノ酸１−２２）を除く配列番号７５のアミノ酸配列を含む。
【０１２１】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含むさらに別の態様は、ＦＡ５８Ｃ２ ＰｔｄＳｅｒ結合ドメインおよび修飾されたＩｇＧ４ヒンジ領域を含む細胞外スペーサードメインを含む細胞外ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、ならびにを含むＳＹＫシグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ０４”とも呼ばれる）（例えば、図１１Ａ参照）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号７０のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号７０のアミノ酸１−２２）を除く配列番号７０のアミノ酸配列を含む。
【０１２２】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、およびＴｙｒｏ３シグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ０８”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号８３のアミノ酸１−２２）を除く配列番号８３のアミノ酸配列を含む。
【０１２３】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、およびＤＡＰ１２シグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ０９”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号８４のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号８４のアミノ酸１−２２）を除く配列番号８４のアミノ酸配列を含む。
【０１２４】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＤＡＰ１２膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、およびＤＡＰ１２シグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ１０”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号８６のアミノ酸１−２２）を除く配列番号８６のアミノ酸配列を含む。
【０１２５】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、およびＡｘｌシグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ１１”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号８７のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号８７のアミノ酸１−２２）を除く配列番号８７のアミノ酸配列を含む。
【０１２６】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、およびＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ１２”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号９０のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号９０のアミノ酸１−２２）を除く配列番号９０のアミノ酸配列を含む。
【０１２７】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＦｃεＲＩγ膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、およびＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ１３”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号９１のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号９１のアミノ酸１−２２）を除く配列番号９１のアミノ酸配列を含む。
【０１２８】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、およびデスドメイを含むがＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ１５”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号７９のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号７９のアミノ酸１−２２）を除く配列番号７９のアミノ酸配列を含む。
【０１２９】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、およびＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ１６”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号８０のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号８０のアミノ酸１−２２）を除く配列番号８０のアミノ酸配列を含む。
【０１３０】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、およびＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ２５”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号９３のアミノ酸１−２２）を除く配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
【０１３１】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインを含む第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＢＡＦＦ−Ｒシグナル伝達ドメインを含む第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ８５”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号９５のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号９５のアミノ酸１−２２）を除く配列番号９５のアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインを含む第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＤＡＰ１２シグナル伝達ドメインを含む第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ８６”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号９６のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号９６のアミノ酸１−２２）を除く配列番号９６のアミノ酸配列を含む。
【０１３３】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインを含む第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインを含む第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ８９”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号９８のアミノ酸１−２２）を除く配列番号９８のアミノ酸配列を含む。
【０１３４】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインを含む第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメインを含む第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ９０”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号１００のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号１００のアミノ酸１−２２）を除く配列番号１００のアミノ酸配列を含む。
【０１３５】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインを含む第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインを含む第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ９５”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号１０１のアミノ酸１−２２）を除く配列番号１０１のアミノ酸配列を含む。
【０１３６】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインを含む第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメインを含む第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ９６”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号１０２のアミノ酸１−２２）を除く配列番号１０２のアミノ酸配列を含む。
【０１３７】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインを含む第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＢＡＦＦ−Ｒシグナル伝達ドメインを含む第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ９３”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号１０３のアミノ酸１−２２）を除く配列番号１０３のアミノ酸配列を含む。
【０１３８】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、ＢＡＦＦ−Ｒシグナル伝達ドメインを含む第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、および切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインを含む第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ８７”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号１３０のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号１３０のアミノ酸１−２２）を除く配列番号１３０のアミノ酸配列を含む。
【０１３９】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、ＤＡＰ１２シグナル伝達ドメインを含む第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、および切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインを含む第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ８８”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号１３１のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号１３１のアミノ酸１−２２）を除く配列番号１３１のアミノ酸配列を含む。
【０１４０】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインを含む第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、および切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインを含む第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ９２”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号１３３のアミノ酸１−２２）を除く配列番号１３３のアミノ酸配列を含む。
【０１４１】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインを含む第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＤＡＰ１２シグナル伝達ドメインを含む第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ９４”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号１３４のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号１３４のアミノ酸１−２２）を除く配列番号１３４のアミノ酸配列を含む。
【０１４２】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインを含む第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメインを含む第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ９６”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号１０２のアミノ酸１−２２）を除く配列番号１０２のアミノ酸配列を含む。
【０１４３】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインを含む第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、および切断型ＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメインを含む第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“切断型ＮＦＡＭ１を有するＣＥＲ９６”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号１１６のアミノ酸１−２２）を除く配列番号１１６のアミノ酸配列を含む。
【０１４４】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、ＢＡＦＦＲシグナル伝達ドメインを含む第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、および切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインを含む第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ８７”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号１３０のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号１３０のアミノ酸１−２２）を除く配列番号１３０のアミノ酸配列を含む。
【０１４５】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、Ａｘｌシグナル伝達ドメインを含む第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＤＡＰ１２シグナル伝達ドメインを含む第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ９７”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号１５２のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号１５２のアミノ酸１−２２）を除く配列番号１５２のアミノ酸配列を含む。
【０１４６】
ＣＥＲがＰｔｄＳｅｒに結合する結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む別の態様は、ＴＩＭ４結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＴＩＭ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、Ａｘｌシグナル伝達ドメインを含む第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインを含む第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む（本明細書中、“ＣＥＲ９８”とも呼ばれる）。特定の態様において、そのようなＣＥＲは、配列番号１５３のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチドは、シグナルペプチド配列（配列番号１５３のアミノ酸１−２２）を除く配列番号１５３のアミノ酸配列を含む。
【０１４７】
別の側面において、本発明は、一本鎖キメラタンパク質を含むＣＥＲを提供し、ここで、該一本鎖キメラタンパク質は、エンガルフメント促進マーカーまたは標的抗原に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメイン；炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメイン；および、細胞外ドメインと炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインとの間に位置する膜貫通ドメインを含む。かかるＣＥＲは、標的分子（例えば、エンガルフメント促進マーカーまたは標的抗原）に結合した際に炎症性または免疫原性エンガルフメント表現型を提供するように特に“分極化（polarized）”されている。
【０１４８】
炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインを含むＣＥＲの特定の態様において、細胞外ドメインは、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する細胞外スペーサードメインをさらに含む。
【０１４９】
さらに別の側面において、本発明は、一本鎖キメラタンパク質を含むＣＥＲを提供し、ここで、該一本鎖キメラタンパク質は、エンガルフメント促進マーカーまたは標的抗原に結合する結合ドメインを含む細胞外ドメイン；第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメイン；ならびに、細胞外ドメインと炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインとの間に位置し、それらを連結している膜貫通ドメインを含む。前記第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインは、両方とも恒常性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであるか、炎症誘発性エンガルフメントシグナル伝達ドメインであるか、またはそれぞれがいずれか一方である（何れの順でも可）。
【０１５０】
第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含むＣＥＲの任意の態様において、細胞外ドメインは、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する細胞外スペーサードメインをさらに含む。
【０１５１】
さらに別の側面において、本発明は、一本鎖キメラタンパク質を含むＣＥＲを提供し、ここで、該一本鎖キメラタンパク質は、エンガルフメント促進マーカーまたは標的抗原に結合するｓｃＦｖを含む細胞外ドメイン；エンガルフメントシグナル伝達ドメイン；および、細胞外ドメインとエンガルフメントシグナル伝達ドメインとの間に位置し、それらを連結している膜貫通ドメイン（ここで、膜貫通ドメインおよびエンガルフメントシグナル伝達ドメインはそれぞれ異なる分子に由来する）を含む。
【０１５２】
ＣＥＲがエンガルフメント促進マーカーまたは標的抗原に結合するｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを含む特定の態様において、該細胞外ドメインは、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する細胞外スペーサードメインをさらに含む。
【０１５３】
ＣＥＲがエンガルフメント促進マーカーまたは標的抗原に結合するｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを含む態様は、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ結合ドメイン（例えば、ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖ（配列番号６６））および修飾されたＩｇＧ４ヒンジ領域を含む細胞外スペーサードメインを含む細胞外ドメイン；ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメイン；および、細胞外ドメインとエンガルフメントシグナル伝達ドメインとの間に位置し、それらを連結しているＣＤ２８膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含み、ここで該細胞外スペーサードメインは、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置している（“ＣＥＲ４０”とも称される）（例えば、図１３Ａ参照）。特定の態様において、かかるＣＥＲは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチド配列は、シグナルペプチド配列（配列番号６４のアミノ酸１−２２）を除く配列番号６４のアミノ酸配列を含む。
【０１５４】
ＣＥＲがエンガルフメント促進マーカーまたは標的抗原に結合するｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを含む態様は、メソテリンに特異的なｓｃＦｖ（例えば、Ｍ９１２ ｓｃＦｖ、配列番号１０６のアミノ酸２３−２６４、配列番号１０６のアミノ酸１−２２はシグナルペプチド）および修飾されたＩｇＧ４ヒンジ領域を含む細胞外スペーサードメインを含む細胞外ドメイン；切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメイン；および、細胞外ドメインとエンガルフメントシグナル伝達ドメインとの間に位置し、それらを連結しているＴｉｍ４膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含み、ここで該細胞外スペーサードメインは、ｓｃＦｖと膜貫通ドメインとの間に位置している（“ＣＥＲ５０”とも称される）。特定の態様において、かかるＣＥＲは、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチド配列は、シグナルペプチド配列（配列番号１０７のアミノ酸１−２２）を除く配列番号１０７のアミノ酸配列を含む。
【０１５５】
特定の態様において、宿主細胞の表面上に発現されたＣＥＲの、その類似の（cognate）標的分子への結合後に、ＣＥＲの側方（lateral）クラスター形成が宿主細胞表面上で起こり、局所的にＣＥＲ濃度が上昇する。クラスター化は、標的細胞または粒子表面上の多価リガンドの存在によって促進される。
【０１５６】
特定の態様において、宿主細胞の表面上に発現されたＣＥＲの、その類似の標的分子への結合後に、ＣＥＲの二量体化または多量体化が起こり、細胞内エンガルフメントシグナル伝達ドメインも結合し、その後、それは細胞内キナーゼの標的となる。
【０１５７】
特定の態様において、本発明のＣＥＲは、宿主細胞の表面上に発現されるとき、標的分子または粒子を繋留し、内在化し、そしてプロセシング（分解）する（例えば、標的を貪食する）ことができる。他の態様において、本発明のＣＥＲは、標的分子または粒子をつなぎ留め、内在化する（例えば、標的を貪食する）ことができる。ある態様において、ファゴソーム内の標的細胞または粒子は、ファゴソーム成熟前または成熟中に排出され得る。さらに、内在化は、ＣＥＲの細胞外ドメインによって結合されている細胞または粒子の全体を内在化することを含んでもよいか、またはＣＥＲの細胞外ドメインによって結合されている細胞または粒子の断片または一部分の内在化を含んでもよい。
【０１５８】
特定の態様において、本発明のＣＥＲは、内在化なしに標的分子または粒子を繋留する。ＣＥＲを発現する宿主細胞は、多数の標的細胞または粒子をエンガルフするかまたは繋留する（tether）ことができる。理論はともかく、標的細胞または粒子の内在化および分解がなくとも、ＣＥＲを発現する宿主細胞による標的細胞または粒子の繋留は、標的細胞または粒子の分解をもたらすか、または炎症性環境を促進することができ、それは、特定の治療的状況（例えば、癌）において望ましい
【０１５９】
本明細書によるＣＥＲの態様は、表１〜３、図６Ａ、９Ａ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ａ、１３Ａ、１３Ｂ、配列表および実施例に示されている。
【０１６０】
宿主細胞および核酸
特定の側面において、本発明は、本明細書に記載のＣＥＲの任意の１つまたはそれ以上をコードする核酸分子を提供する。所望のＣＥＲをコードする核酸配列は、所望の配列またはその一部を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすること、該配列を含むことが公知のベクターからそれを導出すること、または該配列を含む細胞もしくは組織から直接その配列もしくはその一部を単離することなどにより、当技術分野で知られている組換え方法を用いて、標準的技術を用いて、得られ得るかまたは産生され得る。
【０１６１】
本明細書に記載のＣＥＲ組成物をコードするポリヌクレオチドは、ヒト、霊長動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、またはブタなどの任意の動物に由来し得る。特定の態様において、ＣＥＲをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが挿入されている宿主細胞と同じ動物種に由来する。
【０１６２】
本明細書に記載のＣＥＲ組成物をコードするポリヌクレオチドはまた、分泌経路への前駆体タンパク質の標的化のためにＣＥＲのアミノ末端にシグナルペプチド（リーダーペプチドまたはシグナル配列とも称される）をコードする配列を含み得る。シグナルペプチドは、要すれば、細胞プロセシングの間およびＣＥＲの細胞膜への局在化の間に細胞外ドメインのＮ末端から切断されてよい。シグナルペプチド配列が切断または除去されたポリペプチドはまた、成熟ポリペプチドとも呼ばれる。本発明のＣＥＲにおいて用いられ得るシグナルペプチドの例としては、例えばＧＭ−ＣＳＦ（配列番号６５のアミノ酸配列）、Ｔｉｍ４（配列番号７２のアミノ酸配列）を含む、内生分泌タンパク質由来のシグナルペプチドが挙げられる。特定の態様において、本発明のＣＥＲのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、成熟ポリペプチドのための配列を含む。シグナルペプチド配列を含む本明細書に記載の配列について、シグナルペプチド配列は、コードされたタンパク質を細胞外膜に輸送することができる別のシグナルペプチドと置き換えられ得ることが、当業者により理解される。
【０１６３】
特定の態様において、本発明のＣＥＲをコードする核酸分子は、発現 標的宿主細胞における効率的な発現のためにコドン最適化されている。
【０１６４】
所望のＣＥＲをコードする核酸分子は、適当なベクター（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスプラスミドベクターおよび非ウイルスベクター、例えば脂質ベースのＤＮＡベクター、修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）、自己増幅ｍＲＮＡ、ＣＥＬｉＤおよびトランスポゾン介在遺伝子導入（PiggyBac、Sleeping Beauty）など）中に、目的の宿主細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、リンパ球前駆細胞、抗原提示細胞、ランゲルハンス細胞または骨髄細胞）への導入のために挿入され得る。本発明のＣＥＲをコードする核酸分子は、発現ベクター、複製ベクター、プローブ作製ベクター、または配列決定ベクターなどの好適なベクター中にクローニングされ得る。特定の態様において、細胞外ドメインをコードする核酸配列、膜貫通ドメインをコードする核酸配列およびエンガルフメントシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、単一のポリヌクレオチドに共に連結され、その後、ベクターに挿入される。他の態様において、細胞外ドメインをコードする核酸配列、膜貫通ドメインをコードする核酸配列およびエンガルフメントシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、得られたアミノ酸配列が機能的ＣＥＲを生じるようにベクターに別々に挿入され得る。ＣＥＲをコードするベクターは、本明細書中、“ＣＥＲベクター”と呼ばれる。
【０１６５】
特定の態様において、ベクターは、１つのＣＥＲをコードする核酸分子を含む。他の態様において、ベクターは、２以上のＣＥＲをコードする１以上の核酸分子を含む。一態様において、それぞれがＣＥＲをコードする２以上の核酸分子を、異なる複数のクローニング部位でベクターに順次クローニングし、各ＣＥＲを異なるプロモーターの制御下で発現させることができる。別の態様において、複数のＣＥＲをコードする単一の核酸分子をクローニング部位にクローニングし、単一のプロモーターから発現させ、各ＣＥＲはＩＲＥＳまたはウイルス２Ａペプチド配列によって互いに分離されて、単一のオープンリーディングフレームからの複数の遺伝子の同時発現を可能にする（例えば、マルチシストロン性ベクター）。特定の態様において、ウイルス２ＡペプチドはＴ２Ａ（配列番号１４７）、Ｐ２Ａ（配列番号１０４）、Ｅ２Ａ（配列番号１４８）、またはＦ２Ａ（配列番号１４９）である。
【０１６６】
ある態様において、導入遺伝子の長期組込みおよび娘細胞への増殖を可能にするベクターが利用される。例としては、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ポックスウイルス、またはレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターなどが挙げられる。レンチウイルスに由来するベクターは、長期間の遺伝子導入を達成するために用いることができ、そして肝細胞などの非増殖細胞を形質導入する能力および低い免疫原性を含むベクターを超える利点を追加した。
【０１６７】
特定の態様において、ＣＥＲベクターは、空間的および時間的制御を最適化するように構築され得る。例えば、ＣＥＲベクターは、空間的および時間的制御を最適化するためのプロモーターエレメントを含み得る。ある態様において、ＣＥＲベクターは、腫瘍または感染組織などの臓器または病理学的微小環境へのＣＥＲの特異的誘導を可能にする組織特異的プロモーターまたはエンハンサーを含む。“エンハンサー”は、転写を活性化するために協調的にまたは独立して機能することができるさらなるプロモーターエレメントである。他の態様において、ＣＥＲベクターは、構成的プロモーターを含む。さらに他の態様において、ＣＥＲベクターは誘導プロモーターを含む。
【０１６８】
さらなる態様において、ＣＥＲベクターは、インビボでのホーミング（homing）および抗腫瘍活性を改善するために、ＣＣＲ４またはＣＸＣＲ４などのホーミング受容体を含み得る。
【０１６９】
時間的制御が望まれる場合、ＣＥＲベクターは、形質導入細胞の誘導的除去を可能にする要素（element）を含み得る。例えば、そのようなベクターは、誘導性自殺遺伝子を含み得る。自殺遺伝子は、アポトーシス遺伝子、または化学的に誘導可能なカスパーゼ９（ｉＣＡＳＰ９）、化学的に誘導可能なＦａｓもしくはＨＳＶ−ＴＫ（ガンシクロビルに対する感受性を付与する）などの物質（例えば、薬物）に対する感受性を付与する遺伝子であり得る。さらなる態様において、ＣＥＲベクターは、関連する抗体の注入時に形質導入細胞の枯渇を可能にする既知の細胞表面抗原を発現するように設計することができる。形質導入細胞の枯渇に用い得る細胞表面抗原およびそれらの関連抗体には、ＣＤ２０およびリツキシマブ、ＲＱＲ８（ＣＤ３４選択および抗ＣＤ２０欠失を可能にする、ＣＤ３４およびＣＤ２０エピトープの組合せ）およびリツキシマブ、ならびにＥＧＦＲおよびセツキシマブが含まれる。
【０１７０】
誘導性ベクター系、例えばドキシサイクリンを用いて導入遺伝子発現を活性化する、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）−Ｏｎベクター系（Heinz et al., Hum. Gene Ther. 2011, 22:166-76）もまた、誘導性ＣＥＲ発現に用いることができる。誘導性ＣＥＲ発現はまた、フックを通して小胞体の膜に固定化されたストレプトアビジンおよびＣＥＲ構造に導入されたストレプトアビジン結合タンパク質に基づく選択的フック（ＲＵＳＨ）システムを用いた保持によっても達成され得て、ここで該システムへのビオチンの添加は、小胞体からのＣＥＲの放出をもたらす（Agaugue et al., 2015, Mol. Ther. 23(Suppl. 1):S88）。
【０１７１】
本明細書で用いる用語“組換え”または“非天然”は、少なくとも１つの遺伝子改変を含むか、または外生核酸分子の導入により改変されている、生物、微生物、細胞、核酸分子またはベクターを意味し、ここで、かかる改変または修飾は、遺伝子工学によって導入される。遺伝子改変には、例えば、タンパク質、キメラタンパク質もしくは酵素をコードする発現可能な核酸分子を導入する改変、または細胞の遺伝物質の他の核酸分子の付加、欠失、置換もしくは他の機能的破壊が含まれる。さらなる修飾には、例えば、その修飾が遺伝子またはオペロンの発現を変化させる非コーディング調節領域が挙げられる。特定の態様において、対象から得られたＴ細胞などの細胞は、本明細書に記載のＣＥＲをコードする核酸を導入することによって、非天然または組換え細胞（例えば、非天然または組換えＴ細胞）に遺伝子改変することができ、それにより細胞は細胞表面に位置するＣＥＲを発現する。
【０１７２】
コアウイルスをコードするベクターは、本明細書中、“ウイルスベクター”と呼ばれる。ヒト遺伝子治療用途について同定されたものを含む、本明細書に記載の組成物と共に用いるのに適する多数の入手可能なウイルスベクターが存在する（Pfeifer and Verma, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177, 2001）。好適なウイルスベクターとしては、レトロウイルス由来のベクター、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクターなどのＲＮＡウイルスに基づくベクターが挙げられ、より複雑なレトロウイルス由来のベクター、例えば、レンチウイルス由来のベクターが含まれる。ＨＩＶ−１由来のベクターはこのカテゴリーに属する。他の例には、ＨＩＶ−２、ＦＩＶ、ウマ感染性貧血ウイルス、ＳＩＶ、およびＭａｅｄｉ−Ｖｉｓｎａウイルス（ヒツジレンチウイルス）に由来するレンチウイルスベクターが含まれる。レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスウイルスベクターを使用する方法ならびにキメラ受容体導入遺伝子を含むウイルス粒子で哺乳動物宿主細胞を形質導入するために細胞をパッケージングする方法は、当技術分野において公知であり、例えば米国特許第８，１１９，７７２号； Walchli et al., PLoS One 6:327930, 2011; Zhao et al., J. Immunol. 174:4415, 2005; Engels et al., Hum. Gene Ther. 14:1155, 2003; Frecha et al., Mol. Ther. 18:1748, 2010; Verhoeyen et al., Methods Mol. Biol. 506:97, 2009に既報である。レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物および発現系もまた市販されている。
【０１７３】
特定の態様において、ウイルスベクターは、標的に特異的なＣＥＲをコードする非内生核酸配列を導入するために用いられる。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターはまた、形質導入のためのマーカーをコードする核酸配列を含み得る。ウイルスベクターのための形質導入マーカーは、当技術分野で公知であり、そして薬剤耐性を付与し得る選択マーカー、またはフローサイトメトリーのような方法によって検出され得る蛍光マーカーもしくは細胞表面タンパク質のような検出可能なマーカーを含む。特定の態様において、ウイルスベクターは、蛍光タンパク質（例えば、緑色、黄色）、ヒトＣＤ２の細胞外ドメイン、または切断型ヒトＥＧＦＲ（配列番号１２１のアミノ酸配列をコードする）（ｈｕＥＧＦＲｔ；Wang et al., Blood 118:1255, 2011を参照のこと）を含む形質導入のためのマーカーをさらに含む。ウイルスベクターゲノムが別個の転写物として宿主細胞中で発現されるべき複数の核酸配列を含む場合、ウイルスベクターはまた、双シストロン性またはマルチシストロン性発現を可能にする２つ（またはそれ以上）の転写物間にさらなる配列を含み得る。ウイルスベクターに用いられるそのような配列の例としては、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、フリン切断部位、ウイルス２Ａペプチド（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ）、またはそれらの何れかの組合せが挙げられる。
【０１７４】
図２Ａおよび２Ｂは、例示的なＣＥＲベクターを提供する。図２Ａに示されるＣＥＲベクターは、単一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。図２Ｂに示されるＣＥＲベクターは、第一のエンガルフメントシグナル伝達ドメインおよび第二のエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含むエンガルフメントシグナル伝達ドメインを含む。
【０１７５】
例えばアデノウイルスベースのベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターを含むＤＮＡウイルスベクター；アンプリコンベクター、複製欠損型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）および弱毒化ＨＳＶを含む、単純ヘルペスウイルス由来のベクターを含む、他のウイルスベクターもまた、ポリヌクレオチド送達のために用いることができる（Krisky et al., Gene Ther. 5: 1517, 1998）。
【０１７６】
遺伝子治療用途のために最近開発された他のウイルスベクターもまた、本明細書に記載の組成物および方法と共に用いられ得る。かかるベクターには、バキュロウイルスおよびα−ウイルス由来のもの（Jolly, D J. 1999.  Emerging Viral Vectors. pp 209-40 in Friedmann T. ed. The Development of Human Gene Therapy. New York: Cold Spring Harbor Lab）、またはプラスミドベクター（例えば、スリーピングビューティーまたは他のトランスポゾンベクター）が含まれる。ある態様において、ウイルスまたはプラスミドベクターはさらに、形質導入のための遺伝子マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質、ｈｕＥＧＦＲｔ（配列番号１２１のアミノ酸配列をコードする）を含む。
【０１７７】
特定の態様において、遺伝子編集方法は、本発明のＣＥＲをコードするポリヌクレオチドを含むように宿主細胞ゲノムを改変するために用いられる。遺伝子編集またはゲノム編集は、遺伝子操作されたエンドヌクレアーゼを用いて、ＤＮＡを挿入、置換、または宿主細胞のゲノムから除去する遺伝子操作の方法である。ヌクレアーゼは、ゲノム内の標的遺伝子座に特異的な二本鎖切断を引き起こす。次いで、宿主細胞の内生ＤＮＡ修復経路は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによって、誘導された切断を修復する。遺伝子編集に有用な例示的エンドヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクティベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）、メガヌクレアーゼまたはそれらの組合せが挙げられる。遺伝子編集エンドヌクレアーゼを用いて、Ｂ細胞およびＴ細胞を含む免疫細胞における遺伝子または遺伝子発現を破壊またはノックアウトする方法は、当技術分野において公知であり、例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ ２０１５／０６６２６２；ＷＯ ２０１３／０７４９１６；ＷＯ ２０１４／０５９１７３； Cheong et al., Nat. Comm. 2016 7:10934; Chu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2016 113:12514-12519に記載されている（それらのそれぞれからの方法は、その全体が引用により本明細書中に包含される）。
【０１７８】
特定の態様において、Ｂ細胞、共通リンパ球前駆細胞を含むリンパ球系前駆細胞、樹状細胞を含む抗原提示細胞、ランゲルハンス細胞、骨髄系前駆細胞または成熟骨髄細胞は、本発明のＣＥＲをコードする非内生核酸分子を含むように改変される。
【０１７９】
ある態様において、Ｂ細胞は、一般的に、１以上のＣＥＲを発現するように遺伝子改変されている。Ｂ細胞は、宿主細胞として有利であり得る特定の性質を有し、これには、炎症部位（例えば、リンパ節、腫瘍）への輸送、抗原を内在化および提示することができる、Ｔ細胞を共刺激することができる、高度に増殖性である、そして自己複製することができる（生存し続ける）ことが含まれる。特定の態様において、ＣＥＲで改変されたＢ細胞は、エンガルフされた標的細胞またはエンガルフされた標的粒子をより小さいペプチドに消化し、それらをＭＨＣ分子を介してＴ細胞に提示することができる。ＣＥＲで改変されたＢ細胞による抗原提示は、非標的抗原に対する免疫応答の抗原拡散に寄与し得る。Ｂ細胞には、Ｂ細胞系統（例えば、プレプロ−Ｂ細胞、プロ−Ｂ細胞およびプレ−Ｂ細胞）；未成熟および不活化Ｂ細胞または成熟および機能的または活性化Ｂ細胞に関与する前駆細胞（progenitorまたはprecursor）が含まれる。特定の態様において、Ｂ細胞は、ナイーブＢ細胞、血漿細胞、制御性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞Ｂ細胞、リンパ形質細胞様細胞、プラズマブラスト細胞、メモリーＢ細胞、またはそれらの何れかの組合せであり得る。メモリーＢ細胞は、ナイーブＢ細胞には存在しないＣＤ２７の発現によりナイーブＢ細胞特別され得る。特定の態様において、Ｂ細胞は、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物に由来する初代細胞または細胞株であり得る。Ｂ細胞系は当技術分野で周知である。哺乳動物から得られる場合、Ｂ細胞は、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、または他の組織もしくは体液を含む多数の供給源から得ることができる。特定の態様において、Ｂ細胞は、腫瘍部位（腫瘍浸潤性Ｂ細胞）から単離される。Ｂ細胞組成物は、濃縮または精製され得る。
【０１８０】
特定の態様において、宿主Ｂ細胞の内生遺伝子の発現は、阻害、ノックダウンまたはノックアウトされる。Ｂ細胞において阻害、ノックダウンまたはノックアウトされ得る内生遺伝子の例には、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）遺伝子（例えば、ＣＤ７９ｂ、ＩＧＨ、ＩＧκ、ＩＧλ、またはそれらの何れかの組合せ）、免疫チェックポイント分子（例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、アデノシン、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＰＶＲＬ２、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲ、ＣＤ２４４／２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ−１、ＰＶＲＩＧ／ＣＤ１１２Ｒ、またはそれらの何れかの組合せ）、またはそれらの何れかの組合せが含まれる。ＢＣＲ遺伝子、免疫チェックポイント分子遺伝子、またはその両方の発現は、遺伝子レベル、転写レベル、もしくは翻訳レベル、またはそれらの組み合わせで阻害、ノックダウン、またはノックアウトされ得る。ＢＣＲ遺伝子、免疫チェックポイント分子遺伝子、またはその両方を阻害、ノックダウンまたはノックアウトする方法は、例えば、ＲＮＡ干渉物質（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）または人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはそれらの何れかの組合せ）により達成することができる。ある態様において、内生遺伝子（例えば、ＢＣＲ遺伝子または免疫チェックポイント分子遺伝子）は、本発明のＣＥＲをコードするポリヌクレオチドを、人工エンドヌクレアーゼを用いるなどして、内生Ｂ細胞遺伝子の遺伝子座に挿入することによってノックアウトされる。
【０１８１】
ある態様において、細胞表面上に本発明のＣＥＲを発現することができる細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ナイーブ（ＣＤ４５ ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ４５ＲＯ−）、セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋）、エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ２７−）、ウイルス特異的、粘膜関連インバリアント、γδ（ｇｄ）、組織常在性Ｔ細胞、およびナチュラルキラーＴ細胞を含むＴ細胞である。特定の態様において、Ｔ細胞は、ヒト、マウス、ラットまたは他の哺乳動物に由来する初代細胞または細胞株であり得る。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、または他の組織もしくは体液を含む多数の供給源から得ることができる。特定の態様において、Ｔ細胞は、腫瘍部位（腫瘍浸潤性Ｔ細胞）から単離される。Ｔ細胞組成物は、濃縮または精製され得る。Ｔ細胞株は当技術分野で周知であり、そのいくつかは、Sandberg et al., Leukemia 21:230, 2000に記載されている。特定の態様において、ＴＣＲαおよびβ鎖の内生発現を欠くＴ細胞を用いる。そのようなＴ細胞は、ＴＣＲαおよびβ鎖の内生発現を天然に欠くか、または発現を遮断するように（例えば、ＴＣＲαおよびβ鎖を発現しないトランスジェニックマウス由来のＴ細胞またはＴＣＲαおよびβ鎖の発現を阻害するように操作された細胞）、またはＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、または両方の遺伝子をノックアウトするように改変されていてもよい。特定の態様において、細胞表面上に本発明のキメラタンパク質を発現することができる細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞系統の細胞ではなく、前駆細胞、幹細胞、または細胞表面抗ＣＤ３を発現するように改変された細胞である。
【０１８２】
特定の態様において、本発明のＣＥＲを発現するようにトランスフェクトされた宿主Ｔ細胞は、ウイルス特異的Ｔ細胞、腫瘍抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリー幹Ｔ細胞、セントラルメモリーもしくはエフェクターメモリーＴ細胞、またはＣＤ４＋ ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞などの、機能的Ｔ細胞である。
【０１８３】
特定の態様において、宿主Ｔ細胞の内生遺伝子の発現は、阻害されるか、ノックダウンされるか、またはノックアウトされる。Ｔ細胞において阻害、ノックダウン、またはノックアウトされ得る内生遺伝子の例には、ＴＣＲ遺伝子（ＴＲＡ、ＴＲＢまたは両方）、ＨＬＡ遺伝子（ＨＬＡ クラスＩ遺伝子、ＨＬＡ クラスＩＩ遺伝子、または両方）、免疫チェックポイント分子（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、アデノシン、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＰＶＲＬ２、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲ、ＣＤ２４４／２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ−１、ＰＶＲＩＧ／ＣＤ１１２Ｒ、またはそれらの何れかの組合せ）、またはそれらの何れかの組合せが含まれる。ＴＣＲ遺伝子、ＨＬＡ遺伝子、免疫チェックポイント分子遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせの発現は、遺伝子レベル、転写レベル、もしくは翻訳レベル、またはそれらの何れかの組合せの阻害、ノックダウン、またはノックアウトを可能にする。ＴＣＲ遺伝子、ＨＬＡ遺伝子、免疫チェックポイント分子遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせを阻害、ノックダウン、またはノックアウトする方法は、例えば、ＲＮＡ干渉物質（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）または人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはそれらの何れかの組合せ）によって達成することができる。ある態様において、内生遺伝子（例えば、ＴＣＲ遺伝子、ＨＬＡ遺伝子、または免疫チェックポイント分子遺伝子）は、本発明のＣＥＲをコードするポリヌクレオチドを、例えば人工エンドヌクレアーゼを介して内生Ｔ細胞遺伝子の遺伝子座に挿入することによってノックアウトされる。
【０１８４】
特定の態様において、宿主細胞は、１種類のＣＥＲを発現するように遺伝子改変されていてもよい。他の態様において、宿主細胞は、少なくとも２つ以上の異なるＣＥＲを発現し得る。
【０１８５】
特定の態様において、１つまたは複数のＣＥＲを発現するように改変されている宿主細胞集団は、Ｂ細胞の集団、Ｔ細胞の集団、ナチュラルキラー細胞の集団、共通リンパ球前駆細胞を含むリンパ球系前駆細胞の集団、樹状細胞、ランゲルハンス細胞を含む抗原提示細胞の集団、骨髄系前駆細胞の集団、成熟骨髄細胞の集団、またはそれらの何れかの組合せであり得る。特定の態様において、１つまたは複数のＣＥＲを発現するように改変されている宿主細胞集団は、Ｂ細胞の集団、Ｔ細胞の集団、またはその両方である。
【０１８６】
特定の態様において、宿主細胞集団内の各宿主細胞は、同じＣＥＲまたはＣＥＲのセットを発現する。他の態様において、宿主細胞集団は、２以上の宿主細胞亜集団の混合物を含み、ここで、各亜集団は、異なるＣＥＲまたはＣＥＲのセットを発現する。
【０１８７】
特定の態様において、ＣＥＲを発現するように遺伝子的に改変された宿主細胞はまた、１つまたは複数の低分子量ＧＴＰアーゼを共発現するように修飾されてもよい。小さい（〜２１ｋＤａ）シグナル伝達Ｇタンパク質のファミリーであり、かつＲａｓスーパーファミリーのサブファミリーであるＲｈｏ ＧＴＰａｓｅｓは、種々の細胞タイプにおいてアクチン細胞骨格組織化を調節し、そして食細胞作用の間の仮足伸長（pseudopod extension）およびファゴソーム閉鎖を促進する（例えば、Castellano et al., 2000, J. Cell Sci. 113:2955-2961）。エンガルフメントは、繋がれた細胞または粒子の下にＦ−アクチンを動員すること、および細胞または粒子の内在化をもたらす膜の伸長を可能にするためのＦ−アクチンの再配置を必要とする。ＲｈｏＧＴＰａｓｅには、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、ＲｈｏＧ、およびＣＤＣ４２が含まれる。Ｒａｐ１などの他の低分子量ＧＴＰアーゼは、補体介在食細胞作用の調節に関与している。低分子量ＧＴＰアーゼとＣＥＲとの共発現は、宿主細胞による標的細胞または粒子の内在化および／またはファゴソーム形成を促進し得る。ある態様において、ＧＴＰａｓｅをコードする組換え核酸分子は、ＣＥＲ含有ベクターとは別のベクター上にコードされている。他の態様において、ＧＴＰａｓｅをコードする組換え核酸分子は、マルチシストロン性発現構築物と同じＣＥＲ含有ベクター上にコードされる。ＣＥＲおよび低分子量ＧＴＰアーゼ（複数可）をコードするポリヌクレオチド配列は、ウイルス２Ａペプチド配列（例えば、Ｔ２Ａ（配列番号１４７）、Ｐ２Ａ（配列番号１０４）、Ｅ２Ａ（配列番号１４８）、Ｆ２Ａ（配列番号１４９））によって互いに分離されており、単一のオープンリーディングフレームからのマルチシストロン性発現を可能にし得る。ＣＥＲと同時発現させることができるＧＴＰａｓｅの例には、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、Ｒａｂ５（Ｒａｂ５ａとも称される）、Ｒａｂ７、Ｒａｐ１、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＧ、ＣＤＣ４２、またはそれらの何れかの組合せが含まれる。特定の態様において、ＧＴＰａｓｅは、配列番号７６のＲａｃ１アミノ酸配列、配列番号７７のＲａｂ５アミノ酸配列、配列番号１２２のＲａｂ７アミノ酸配列、配列番号１２３のＲａｐ１アミノ酸配列、配列番号１２４のＲｈｏＡアミノ酸配列、配列番号１２５のＣＤＣ４２アミノ酸配列、またはそれらの何れかの組合せと、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または１００％同一の配列を含むか、または該配列である。マルチシストロン性発現構築物の特定の態様において、Ｐ２Ａ配列を間に挿入されたＴｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ ＣＥＲおよび低分子量ＧＴＰアーゼであるＲａｂ５ａをコードする発現構築物は、配列番号１０５のアミノ酸配列（ＣＥＲ９１）を含み得る。さらに別の特定の態様において、ＣＥＲ成熟ポリペプチド配列は、アミノ酸１−２２のシグナルペプチドを含まない配列番号１０５を含む。
【０１８８】
特定の態様において、本明細書に記載のＣＥＲを発現する宿主細胞、例えばＢ細胞またはＴ細胞を調製するとき、宿主細胞、例えばＢ細胞またはＴ細胞の増殖を促進する１以上の増殖因子サイトカインを、細胞培養物へ添加することができる。該サイトカインは、ヒトまたは非ヒトであってよい。Ｔ細胞増殖を促進するために用い得る増殖因子サイトカインの例には、ＩＬ−２、ＩＬ−１５などが含まれる。Ｂ細胞増殖を促進するために用い得る増殖因子サイトカインの例には、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＢＡＦＦなどが含まれる。
【０１８９】
さらなる態様において、選択的遺伝子導入を用いて、ＣＥＲベクターを特定の領域または臓器に局在化させる。ある態様において、選択的遺伝子導入を用いて、ＣＥＲベクターを対象の肝臓または肺に局在化させる。
【０１９０】
ＣＥＲベクターを用いた宿主細胞の遺伝子改変の前に、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞など）の供給源を、対象から得て（例えば、全血、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水脾臓組織）、それから得られた宿主細胞を当技術分野で公知の方法を用いて単離する。特定の宿主細胞サブセットは、公知の技術に従って収集され得て、そして抗体への親和性結合、フローサイトメトリーおよび／または免疫磁気選択のような公知の技術によって濃縮または枯渇され得る。濃縮および／または枯渇工程およびＣＥＲの導入後、所望の改変宿主細胞のインビトロでの増殖は、当業者には明らかであろう既知の技術またはその変形に従って実施することができる。
【０１９１】
特定の態様において、本明細書に記載の態様のいずれかによるＣＥＲを含む、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、リンパ球系前駆細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、骨髄系前駆細胞、および成熟骨髄細胞を含む宿主細胞は、標的細胞に対して約２０から約１，５００の食細胞作用指数を有する。“食細胞作用指数”は、培地中の標的細胞およびＣＥＲで改変された宿主細胞の懸濁液の一定期間のインキュベーション中にＣＥＲで改変された宿主細胞あたりに取り込まれた標的細胞の数を数えることによって決定される形質導入宿主細胞の食細胞作用活性の尺度である。食細胞作用指数は、［エンガルフされた標的細胞の総数／計数されたＣＥＲで改変された細胞の総数（例えば、食細胞作用頻度）］に、［ＣＥＲ＋Ｂａ／Ｆ３細胞当たりの標的細胞染色の平均面積×１００（例えば、ハイブリッドキャプチャー）］を乗じることによって計算できるか、または［エンガルフされた粒子の総数／計数されたＣＥＲで改変された宿主細胞の総数］に［エンガルフされた粒子を含むＣＥＲで改変されたされた宿主細胞の総数／計数されたＣＥＲ細胞の総数］×１００を乗じることによって計算できる。特定の態様において、ＣＥＲで改変された細胞は、約３０から約１，５００；約４０から約１，５００；約５０から約１，５００；約７５から約１，５００；約１００から約１，５００；約２００から約１，５００；約３００から約１，５００；約４００から約１，５００；約５００から約１，５００；約２０から約１，４００；約３０から約１，４００；約４０から約１，４００；約５０から約１，４００；約１００から約１，４００；約２００から約１，４００；約３００から約１，４００；約４００から約１，４００；約５００から約１，４００；約２０から約１，３００；約３０から約１，３００；約４０から約１，３００；約５０から約１，３００；約１００から約１，３００；約２００から約１，３００；約３００から約１，３００；約４００から約１，３００；約５００から約１，３００；約２０から約１，２００；約３０から約１，２００；約４０から約１，２００；約５０から約１，２００；約１００から約１，２００；約２００から約１，２００；約３００から約１，２００；約４００から約１，２００；約５００から約１，２００；約２０から約１，１００；約３０から約１，１００；約４０から約１，１００；約５０から約１，１００；約１００から約１，１００；約２００から約１，１００；約３００から約１，１００；約４００から約１，１００；または、約５００から約１，１００；約２０から約１，０００；約３０から約１，０００；約４０から約１，０００；約５０から約１，０００；約１００から約１，０００；約２００から約１，０００；約３００から約１，０００；約４００から約１，０００；または、約５００から約１，０００；約２０から約７５０；約３０から約７５０；約４０から約７５０；約５０から約７５０；約１００から約７５０；約２００から約７５０；約３００から約７５０；約４００から約７５０；または、約５００から約７５０；約２０から約５００；約３０から約５００；約４０から約５００；約５０から約５００；約１００から約５００；約２��０から約５００；または、約３００から約５００の食細胞作用指数を有する。さらなる態様において、インキュベーション時間は約２時間から約４時間、約２時間、約３時間、または約４時間である。なおさらなる態様において、ＣＥＲで改変された細胞は、切断型ＥＧＦＲ対照で形質導入された細胞よりも統計的に有意に高い食細胞作用指数を示す。食細胞作用指数は、当技術分野において公知であり、実施例にさらに記載されているように、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡による定量化を含む方法を用いて計算することができる。
【０１９２】
宿主細胞は、霊長動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、またはブタなどの動物由来であり得る。好ましい態様において、動物はヒトである。宿主細胞は、健康な対象または抗原の発現に関連する疾患を有する対象から得られ得る。
【０１９３】
ＣＥＲおよびＣＥＲを発現するように改変された細胞の使用
本発明は、宿主細胞のエンガルフメント表現型を変化させるための方法を提供する。一側面において、本発明は、エンガルフメント表現型を天然に示さない宿主細胞集団に、本明細書に記載の態様のいずれかの、少なくとも１つのＣＥＲをコードする核酸分子または少なくとも１つのＣＥＲを含むベクターを導入し、そして該宿主細胞集団において少なくとも１つのＣＥＲを発現させることを含む、エンガルフメント表現型を示す細胞集団を作製する方法を提供する。特定の態様において、エンガルフメント表現型とは食細胞作用である。
【０１９４】
別の側面において、本発明は、本明細書に記載の態様のいずれかの、少なくとも１つのＣＥＲをコードする核酸分子または少なくとも１つのＣＥＲを含むベクターを宿主細胞集団に導入し、そして該宿主細胞集団において少なくとも１つのＣＥＲを発現させることを含む（ここで、少なくとも１つのＣＥＲは、宿主細胞によって天然には標的化されていない、エンガルフメント促進マーカーまたは抗原マーカー（標的抗原）に特異的なエンガルフメント表現型を付与する）、細胞集団のエンガルフメント表現型を改変する方法を提供する。特定の態様において、エンガルフメント表現型とは食細胞作用である。
【０１９５】
さらに別の側面において、本発明は、本明細書に記載の態様のいずれかの少なくとも１つのＣＥＲをコードする核酸分子または少なくとも１つのＣＥＲを含むベクターを宿主細胞集団に導入し、該宿主細胞集団において少なくとも１つのＣＥＲを発現させることを含む（ここで、少なくとも１つのＣＥＲは、宿主細胞によって天然に標的とされるエンガルフメント促進マーカーまたは抗原マーカー（標的抗原）に特異的であり、宿主細胞による少なくとも１つのＣＥＲの発現は、標的化されたエンガルフメント促進マーカーまたは抗原マーカーを提示する細胞、病原菌または粒子の宿主細胞いによるエンガルフメントを増強する）、細胞集団のエンガルフメント表現型を増強する方法を提供する。
【０１９６】
本明細書に記載の態様のいずれかの、ＣＥＲ、ＣＥＲをコードする核酸分子、ＣＥＲを含むベクター、およびＣＥＲを発現する宿主細胞もまた、疾患、障害または望ましくない病状に罹患している対象を処置する方法において用い得る。これらの方法の態様は、本明細書に記載の、１以上のＣＥＲ、１以上のＣＥＲをコードする核酸分子、１以上のＣＥＲを含むベクター、または１以上のＣＥＲを発現するように遺伝子改変された宿主細胞集団を含む治療的有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【０１９７】
本明細書に記載のＣＥＲを発現する細胞で処置することができる疾患には、癌、感染症（ウイルス、細菌、真菌、原虫感染症）、炎症性または免疫疾患（例えば、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、多発性硬化症）、変性疾患（例えば、関節および軟骨）、および神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）が含まれる。養子免疫療法および遺伝子療法は、様々な種類の癌（Morgan et al., Science 314:126, 2006; Schmitt et al., Hum. Gene Ther. 20:1240, 2009; June, J. Clin. Invest. 117:1466, 2007）および感染症（Kitchenen et al., PLoS One 4:38208, 2009; Rossi et al., Nat. Biotechnol. 25:1444, 2007; Zhang et al., PLoS Pathog. 6:e1001018, 2010; Luo et al., J. Mol. Med. 89:903, 201）に対する有望な治療法である。
【０１９８】
本明細書に記載の組成物および方法により処置され得る対象には、ヒト、霊長動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、またはブタなどの動物が含まれる。対象は男性でも女性でもよく、幼児、若年、青年、成人および老年の対象を含む任意の適切な年齢であり得る。
【０１９９】
固形腫瘍および白血病を含む多数の癌が、本明細書に記載の組成物および方法に適している。処置され得る例示的な癌種には、乳線、前立腺および結腸の腺癌；肺の全ての型の気管支原発癌；気管支原発癌；黒色腫；肝細胞癌；神経芽腫；乳頭腫；アプドーマ；分離腫（choristoma）；鰓腫（branchioma）；悪性カルチノイド症候群；カルチノイド心臓病；および、癌腫（例えば、ウォーカー癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、ブラウン・ピアース癌、乳管癌、エールリッヒ腫瘍、Ｋｒｅｂｓ２、メルケル細胞癌、粘液癌、非小細胞肺癌、エンバク細胞癌、乳頭癌、スキルス癌、細気管支癌、気管支原性癌、扁平細胞癌および移行上皮癌）が含まれる。処置され得るさらなる癌種には、組織球症；悪性組織球症；白血病；ホジキン疾患；免疫増殖性小腸疾患；非ホジキンリンパ腫；形質細胞腫；多発性骨髄腫；形質細胞腫；細網内皮症；黒色腫；軟骨芽細胞腫；軟骨腫；軟骨肉腫；線維腫；線維肉腫；巨細胞腫；組織球腫；脂肪腫；脂肪肉腫；中皮腫；粘液腫；粘液肉腫；骨腫；骨肉腫；脊索腫；頭蓋咽頭腫；胚細胞腫；過誤腫；間葉腫；中腎腫；筋肉腫；エナメル上皮腫；セメント腫；歯牙腫；奇形腫；胸腺腫；絨毛性腫瘍が含まれる。さらに、以下の癌種もまた処置に適していると考えられる：腺腫；胆管腫；真珠腫；円柱腫；嚢胞腺癌；嚢胞腺腫；顆粒膜細胞腫；男性胚腫（gynandroblastoma）；肝細胞癌；汗腺腫；膵島細胞腫；ライディッヒ細胞腫；乳頭腫；セルトリ細胞腫；莢膜細胞腫；平滑筋腫；平滑筋肉腫；筋芽細胞腫；子宮筋腫（myomma）；筋肉腫；横紋筋腫；横紋筋肉腫；上衣細胞腫；神経節腫；神経膠腫；髄芽腫；髄膜腫；神経鞘腫；神経芽細胞腫；神経上皮腫；神経線維腫；神経細胞腫；傍神経節腫；非クロム親和性傍神経筋腫。処置され得る癌種には、被角血管腫；好酸球増多随伴性血管類リンパ組織増殖症；硬化性血管腫；血管腫症；血管球腫瘍；血管内皮細胞腫；血管腫；血管周皮腫；血管肉腫；リンパ管腫；リンパ管筋腫；リンパ管肉腫；松果体腫；癌肉腫；軟骨肉腫；嚢胞肉腫；葉状嚢胞肉腫；線維肉腫；血管肉腫；平滑筋肉腫；白血肉腫；脂肪肉腫；リンパ管肉腫；筋肉腫；粘液肉腫；卵巣癌腫；横紋筋肉腫；肉腫；新生物；神経線維腫症；および、子宮頸部形成異常が含まれる。
【０２００】
ＣＥＲ療法に適する過増殖性疾患の例としては、Ｂ細胞リンパ腫を含むＢ細胞癌（例えば、さまざまな形態のホジキン病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）または中枢神経系リンパ腫）、白血病（例えば、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病のＢ細胞芽球形質転換）および骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）である。さらなるＢ細胞癌には、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、粘膜に関連したリンパ系組織（ＭＡＬＴ）の節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、悪性度不明のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、および移植後リンパ増殖性疾患が含まれる。
【０２０１】
炎症性疾患および自己免疫疾患には、関節炎、リウマチ性関節炎、若年性リウマチ性関節炎、骨関節症、多発性軟骨炎、乾癬性関節炎、乾癬、皮膚炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、封入体筋炎、炎症性筋疾患、中毒性表皮壊死症、全身性強皮症（systemic scleroderma and sclerosis）、ＣＲＥＳＴ症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギー症状、湿疹、喘息、Ｔ細胞浸潤および慢性炎症性応答を伴う症状、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球粘着不全症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、亜急性皮膚エリテマトーデス、円板状ループス、ループス脊髄炎、ループス脳炎、若年発症糖尿病、多発性硬化症、アレルギー性脳炎、視神経脊髄炎、リウマチ熱、シドナム舞踏病、サイトカインおよびＴリンパ球が介在する急性および遅延型過敏反応に関連する免疫応答、結核、サルコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症およびチャーグ・ストラウス症候群を含む肉芽腫症、無顆粒球症、血管炎（過敏性血管炎／血管炎、ＡＮＣＡおよびリウマトイド血管炎を含む）、再生不良性貧血、先天性赤芽球癆（Diamond Blackfan anemia）、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫性溶血性貧血、悪性貧血、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球滲出を伴う疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性疾患、アルツハイマー病、多臓器損傷症候群、重症筋無力症、抗原−抗体複合体介在疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、ランバート−イートン筋無力症候群、レイノー症候群、ジョルゲン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、固形臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、類天疱瘡、天疱瘡、自己免疫性多発性内分泌障害、血清反応陰性脊椎関節症、ライター病、スティッフマン症候群、巨細胞性動脈炎、免疫複合腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発神経障害またはＩｇＭ介在ニューロパシー、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性精巣炎および卵巣炎を含む精巣および卵巣の自己免疫性疾患、原発性甲状腺機能低下症；自己免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病、グレーブ病、自己免疫性多腺性症候群（または、多腺性内分泌障害症候群）、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）とも称されるＩ型糖尿病およびシーハン症候群を含む、自己免疫性内分泌疾患；自己免疫性肝炎、リンパ系間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植性）、非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）、ギランバレー症候群、大血管血管炎（リウマチ性多発筋痛症および大細胞（タカヤス）動脈炎を含む）、中型血管炎（川崎病および結節性多発性動脈炎を含む）、結節性多発性動脈炎（ＰＡＮ）、強直性脊椎炎、バーガー病（ＩｇＡ腎症）、急速進行性糸球体腎炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアック病（グルテン性腸症）、クリオグロビン血症、肝炎と関連するクリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、冠状動脈疾患、家族性地中海熱、顕微鏡的多発性血管炎、コーガン症候群、ウィスコット−アルドリッチ症候群ならびに閉塞性血栓性血管炎が含まれる。特定の態様において、炎症性疾患を処置するという状況において、恒常性（非炎症性）エンガルフメントシグナル伝達ドメインを有するＣＥＲを設計することが好ましい場合がある。
【０２０２】
感染症は、感染性病原体に関連するものを含み、そして種々の細菌（例えば、病原性大腸菌、ネズミチフス菌、緑膿菌、炭疽菌、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシル、ウェルシュ菌、ヘリコバクター・ピロリ菌、コレラ菌、リステリア菌、リケッチア菌、クラミジア菌など）、マイコバクテリア、および寄生虫（原虫の既知の寄生虫メンバーを含む）が含まれる。感染性ウイルスには、アデノウイルス、ブニヤウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、パピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ）、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病）、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザ）、ポックスウイルス（例えば、ワクシニア）、レオウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）、フラビウイルス（例えば、ＨＣＶ、ＨＢＶ）などの真核生物ウイルスが含まれる。特定の態様において、本発明のＣＥＲを含む組成物は、対象において持続感染を確立することができる病原菌による感染症を処置するために用いられる。
【０２０３】
神経変性疾患は、レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ−ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳変性症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、ユビキチン陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＬＴＤ−Ｕ）、タウオパチー（アルツハイマー病および核上性麻痺を含むが、これに限定されない）、プリオン病（牛海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト−ヤコブ症候群、クールー（kuru）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、慢性消耗病および致死性家族性不眠症を含むが、これに限定されない、伝達性海綿状脳症としても公知)、眼球麻痺、運動神経疾患（筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリッグ病）を含む）、および神経系ヘテロ変性疾患（カナバン病、ハンチントン病、神経性ステロイドリポフスチン症、アレクサンダー病、トゥレット症候群、メンケス変態症候群、コケイン症候群、ハールフォルデン−スパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュナイハン症候群およびウンフェルリヒト・ルントボルク病を含むが、これに限定されない）、認知症（ピック病および脊髄小脳失調症を含むが、これに限定されない）、癌（例えば、体内の何れかの部位の癌に起因する脳転移を含む、ＣＮＳの癌および／または脳腫瘍）を含む。アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリッグ病患）およびプリオン病を含む多くの神経変性疾患は、神経病理学的徴候を共有し、アミロイドβまたはアルツハイマー病におけるタウなどのタンパク質；パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、またはアルツハイマー病におけるαシヌクレイン；ハンチントン病におけるハンチントン、筋萎縮性側索硬化症におけるＳＯＤ１、ハンチントン病または筋萎縮性側索硬化症におけるポリグルタミン（ｐｏｌｙＱ）リピートを含むタンパク質；筋萎縮性側索硬化症またはＦＬＴＤ−ＵにおけるＴＤＰ−４３；あるいは、プリオン病におけるプリオンタンパク質（例えば、ＰｒＰＳｃ）の異常な蓄積がある。従って、特定の態様において、ＣＥＲ療法は、異常なタンパク質蓄積を低減または防止し、それによって神経変性疾患の進行を遅延または防止するために、疾患関連タンパク質を標的とするように設計され得る。
【０２０４】
本発明のＣＥＲは、細胞結合形態（例えば、標的細胞集団（成熟Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋ Ｔ細胞）またはＴ細胞系統の他の細胞）の遺伝子治療）で対象に投与され得る。従って、例えば、本発明のＣＥＲは、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、リンパ球系前駆細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、骨髄系前駆細胞、成熟骨髄細胞（それらのサブセットを含む）、またはそれらの何れかの組合せの表面上に発現されるものを対象に投与され得る。特定の態様において、患者を処置する方法は、有効量のＣＥＲにより改変された細胞（すなわち、１つまたは複数のＣＥＲを発現する組換え細胞）を投与することを含む。そのような態様において、ＣＥＲにより改変された細胞は、Ｔ細胞系統、ナチュラルキラー細胞系統、ナチュラルキラーＴ細胞系統、Ｂ細胞系統、リンパ系前駆細胞系統、樹状細胞系統、ランゲルハンス細胞系統、骨髄性細胞系統、またはそれらの何れかの組合せの異種細胞、同系細胞、同種異系細胞または自家細胞である。
【０２０５】
ＣＥＲにより改変された細胞を含む医薬組成物は、医薬分野の当業者によって決定されるように、処置される（または予防される）疾患または病状に適した方法で投与され得る。組成物の、好適な用量、好適な期間および投与頻度は、患者の状態、体格、体重、体表面積、年齢、性別、疾患の種類および重症度、投与される具体的な治療薬、特定の形態の活性成分、投与時間および投与方法、ならびに同時に投与される他の薬物などの要因によって決定され得る。本発明は、ＣＥＲで改変された細胞および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。好適な賦形剤には、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールなど、およびそれらの組合せが含まれる。他の好適な注射媒体は、生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ Ｒ（Abbott）、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ Ａ（Baxter）、５％デキストロース水溶液、または乳酸リンゲル液を含む任意の等張媒体製剤であり得る。
【０２０６】
医薬組成物中の細胞の処置有効量は、少なくとも１つの細胞（例えば、１つのＣＥＲで改変されたＢ細胞）であるか、または一般的には１０２細胞を超える細胞、例えば、最大１０６細胞、最大１０７細胞、最大１０８細胞、最大１０９細胞、最大１０１０細胞、または最大１０１１細胞もしくはそれ以上である。特定の態様において、細胞は、約１０６から約１０１０細胞／ｍ２の範囲で、好ましくは約１０７から約１０９細胞／ｍ２の範囲で投与される。細胞の数は、該組成物が意図される最終用途ならびにそれに含まれる細胞タイプよって変わり得る。例えば、特定の抗原に特異的なＣＥＲを含むように改変された細胞を含む組成物は、５％〜約９５％またはそれ以上のそのような細胞を含む細胞集団を含み得る。特定の態様において、ＣＥＲ改変細胞を含む組成物は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上のそのような細胞を含む細胞集団を含む。本明細書で提供される使用のために、細胞は、一般的に、１リットル以下、５００ｍｌ以下、２５０ｍｌ以下、または１００ｍｌ以下の容量である。それ故、所望の細胞の密度は、一般的に、１０４細胞／ｍｌを超え、一般的には、１０７細胞／ｍｌを超え、一般的に１０８細胞／ｍｌを超えるか、またはそれ以上である。細胞は、単回注射として、またはある範囲の期間にわたる複数回注射で投与され得る。ＣＥＲ改変細胞の反復注射は、疾患の再発または疾患活動性が存在する場合、数日、数週間、数ヶ月、または数年でさえも隔てて行われ得る。臨床的に意義のある数の免疫細胞を、累積的に１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０または１０１１細胞に等しいかそれを超える複数回の注射に配分することができる。本明細書に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞の投与に好適な用量は、約１０７細胞／ｍ２、約５ｘ１０７細胞／ｍ２、約１０８細胞／ｍ２、約５ｘ１０８細胞／ｍ２、約１０９細胞／ｍ２、約５ｘ１０９細胞／ｍ２、約１０１０細胞／ｍ２、約５ｘ１０１０細胞／ｍ２、または約１０１１細胞／ｍ２である。特定の態様において、ＣＥＲ改変Ｂ細胞の組成物およびＣＥＲ改変Ｔ細胞の組成物は両方とも投与され、その投与は同時投与（simultaneous, concurrent）または逐次投与であり得る。
【０２０７】
ある態様において、本明細書に記載の組成物は、静脈内、腹腔内、腫瘍内、骨髄内、リンパ節内および／または脳脊髄液内に投与される。ある態様において、キメラエンガルフメント受容体改変組成物は、腫瘍部位に送達される。
【０２０８】
ある態様において、ＣＥＲ改変細胞は、１以上の追加の療法と共同して、または組合せて対象に投与される。かかる態様において、１以上の追加の療法は、放射線療法、遺伝子操作細胞免疫療法（例えば、Ｔ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法）、抗体療法、免疫チェックポイント分子阻害剤療法、または化学療法剤、治療用ペプチド、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌薬、抗炎症剤もしくは小分子療法剤などの薬物療法のうちの１つまたは複数であり得る。そのような態様において、ＣＥＲ改変細胞は、１以上の追加の療法の設定において誘導されるアポトーシス促進マーカーを表示するアポトーシス細胞、死細胞、死につつある細胞、損傷細胞、感染細胞または壊死細胞を除去し得る。ＣＥＲ改変細胞が１以上の追加の療法と組み合わせて投与される特定の態様において、該１以上の追加の療法は、ＣＥＲ療法との組み合わせの相加効果または相乗効果のために治療用量以下の用量で投与され得る。併用療法は、追加療法の前（例えば、追加療法の１日から３０日またはそれ以上前）、追加療法と同時（同日）、または追加療法の後（例えば、追加療法の１日から３０日またはそれ以上後）のＣＥＲの投与を含む。特定の態様において、ＣＥＲ改変細胞は、１以上の追加の療法の投与後に投与される。さらなる態様において、ＣＥＲ改変細胞は、１以上の追加の療法の投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日後に投与される。なおさらなる態様において、ＣＥＲ改変細胞は、１以上の追加の療法の投与後４週間以内、３週間以内、２週間以内、または１週間以内に投与される。１以上の追加の治療が複数回投与を含む場合、ＣＥＲで改変された細胞は、１以上の追加の療法の初回投与後、１以上の追加の療法の最終投与後、または１以上の追加の療法の複数回投与の間に投与され得る。
【０２０９】
３剤併用療法（放射線＋ＣＥＲ＋ＣＡＲ／またはＴＣＲ）レジメンの一例を図１３４に示す。放射線療法後、本明細書に記載の腫瘍抗原特異的、ＣＥＲ改変宿主細胞（例えば、腫瘍抗原に結合する結合ドメインを含む）を、抗腫瘍免疫応答を促進し、免疫活性化細胞を腫瘍微小環境に動員するために対象に投与する。特定の態様において、ＣＥＲは局所的な照射された腫瘍に移動し、腫瘍組織を免疫浸潤および破壊に対して許容性にし（例えば、炎症性サイトカインの発現、エフェクターＴ細胞の活性化、樹状細胞の活性化、制御性Ｔ細胞の阻害など)、それにより、その後の養子Ｔ細胞免疫療法（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ免疫療法）に対して腫瘍微小環境を感作する。特定の態様において、ＣＥＲ改変細胞は、放射線療法後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日後に投与される。さらなる態様において、ＣＥＲ改変細胞は、放射線療法後、４週間以内、３週間以内、２週間以内、または１週間以内に投与される。特定の態様において、ＣＡＲまたはＴＣＲ免疫療法は、ＣＥＲ療法の投与後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日後、あるいはＣＥＲ療法の投与後、４週間以内、３週間以内、２週間以内、または１週間以内に投与される。特定の態様において、放射線療法、ＣＡＲまたはＴＣＲ免疫療法あるいはその両方は、治療量以下のレベルで投与される。
【０２１０】
ＣＥＲ療法と組み合わせて用いられ得る放射線療法の例には、外部照射療法（例えば、従来の外部照射療法、定位放射療法、３次元コンフォーマル放射線療法、強度変調放射線療法、強度変調回転放射線治療、粒子療法、プロトン療法およびオーガー療法）、近接照射療法、全身性放射性同位体療法、術中放射線療法、またはそれらの何れかの組合せが含まれる。
【０２１１】
ＣＥＲ療法と組み合わせて標的とされ得る免疫チェックポイント分子の例には、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、アデノシン、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＰＶＲＬ２、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲ、ＣＤ２４４／２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ−１、ＰＶＲＩＧ／ＣＤ１１２Ｒ、またはそれらの何れかの組合せが含まれる。特定の態様において、免疫チェックポイント分子阻害剤は、抗体、ペプチド、ＲＮＡｉ剤、または小分子である。ＣＴＬＡ−４に特異的な抗体は、イピリムマブまたはトレメリムマブであり得る。ＰＤ−１に特異的な抗体は、ピジリズマブ、ニボルマブ、またはペンブロリズマブであり得る。ＰＤ−Ｌ１に特異的な抗体は、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、またはアベルマブであり得る。
【０２１２】
例示的な化学療法剤としては、アルキル化剤、白金系薬剤、血管形成阻害剤（例えば、ＶＥＧＦ経路阻害剤）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ＥＧＦ経路阻害剤）、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、細胞傷害性薬剤、クロマチン機能阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、代謝拮抗剤（例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類縁体、プリン類縁体、および糖修飾類縁体）、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ相互作用剤（例えば、挿入剤）、ならびにＤＮＡ修復阻害剤が挙げられる。
【０２１３】
併用療法での使用が考慮される化学療法剤の例としては、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、トラメチニブ、コビメチニブ、アナストロゾール（アリミデックス（登録商標））、ビカルタミド（カソデックス（登録商標））、ブレオマイシン硫酸塩（ブレノキサン（登録商標））、ブスルファン（マイレラン（登録商標）)、ブスルファン注射（ブスルフェックス（登録商標））、カペシタビン（ゼローダ（登録商標））、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン（パラプラチン（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（リューケラン（登録商標））、シスプラチン（プラチノル（登録商標））、クラドリビン（ロイスタチン（登録商標）)、シクロホスファミド（サイトキサン（登録商標）またはネオサー（Neosar）（登録商標）)、シタラビン、シトシンアラビノシド（サイトサール（Cytosar）−Ｕ（登録商標）)、シタラビンリポソーム注射剤（デポサイト（登録商標）)、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標）)、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、コスメガン（Cosmegan））、ダウノルビシン塩酸塩（セルビジン（Cerubidine）（登録商標））、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射剤（ダウノキソーム（登録商標）)、デキサメサゾン、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））、ドキソルビシン塩酸塩（アドリアマイシン（登録商標）、ルベックス（登録商標））、エトポシド（ベプシド（登録商標））、フルダラビンホスフェート（フルダラ（登録商標））、５−フルオロウラシル（アドルシル（登録商標）、エフデックス（登録商標）)、フルタミド（ユーレキシン(Eulexin)（登録商標）)、テザシチビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシウレア（ハイドレア（登録商標））、イダルビシン（イダマイシン（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（カンポトスター（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（アルケラン（登録商標））、６−メルカプトプリン（ピュリネソール（Purinethol）（登録商標））、メトトレキサート（フォレックス（登録商標））、ミトキサントロン（ノバントロン（登録商標）)、マイロターグ、パクリタキセル（タキソール（登録商標）)、フェニックス（Ｙｔｔｒｉｕｍ９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、ポリフェプロサン２０とカルムスチンインプラント（ギリアデル（登録商標）)、タモキシフェンシトレート（ノルバデックス（登録商標））、テニポシド（ブモン（Vumon）（登録商標）)、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（チラゾン（登録商標）)、注射用トポテカン塩酸塩（ハイカムチン（登録商標））、ビンブラスチン（ベルバン（Velban）（登録商標））、ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））、およびビノレルビン（ナベルビン（登録商標））が挙げられる。
【０２１４】
アルキル化剤の例としては、窒素マスタード（エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素およびトリアゼン）：ウラシルマスタード（アミノウラシルマスタード（登録商標）、クロレタナシル（登録商標）、デスメチルドパン（登録商標）、デスメチルドパン（登録商標））、ヘマンタンアミン（登録商標）、ノルドパン（登録商標）、ウラシル窒素マスタード（登録商標）、ウラシルロスト（登録商標）、ウラシルモスタザ（Uracilmostaza）（登録商標）、ウラムスチン（Uramustin）（登録商標）、ウラムスチン（Uramustine）（登録商標））、クロルメチン（マスタージェン（登録商標））、シクロホスファミド（サイトキサン（登録商標）、ネオサール（登録商標）、クラフェン（登録商標）、エンドキサン（登録商標）、プロシトックス（登録商標）、レビミュン（Revimmune）（商標）)、イホスファミド（ミトキサナ（登録商標））、メルファラン（アルケラン（登録商標）)、クロラムブシル（リューケラン（登録商標）)、ピポブロマン（アメデル（登録商標）、ベルシト（登録商標）)、トリエチレンメラミン（ヘイメル（登録商標）、ヘキサレン（登録商標）、ヘキサスタット（登録商標）)、トリエチレンチオホスホラミン、テモゾロミド（テモダール（登録商標））、チオテパ（チオプレックス（登録商標））、ブスルファン（ブシルベックス（Busilvex）（登録商標）、ミレラン（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ（登録商標））、ストレプトゾシン（ザノサー（登録商標））およびダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））が挙げられる。さらなる例示的なアルキル化剤としては、オキサリプラチン（エロキサチン（登録商標））；テモゾロミド（テモダール（Temodar, Temodal）（登録商標））；ダクチノマイシン（アクチノマイシン−Ｄとしても公知、コスメゲン（登録商標））；メルファラン（Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシンおよびフェニルアラニンマスタードとしても公知、アルケラン（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）としても公知、ヘキサレン（登録商標））；カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））；ベンダムスチン（トレアンダ（登録商標））；ブスルファン（ブスルフェクス（登録商標）およびマイレラン（登録商標））；カルボプラチン（パラプラチン（登録商標））；ロムスチン（ＣＣＮＵとしても公知、ＣｅｅＮＵ（登録商標））；シスプラチン（ＣＤＤＰとしても公知、プラチノル（登録商標）およびプラチノル（登録商標）−ＡＱ）；クロラムブシル（リューケラン（登録商標））；シクロホスファミド（サイトキサン（登録商標）およびネオサー（Neosar）（登録商標））；ダカルバジン（ＤＴＩＣ、ＤＩＣおよびイミダゾールカルボキサミドとしても公知、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）としても公知、ヘキサレン（登録商標））；イホスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））；プレヌムスチン；プロカルバジン（マチュレーン（登録商標））；メクロレタミン（窒素マスタード、マスタチンおよび塩酸メクロロエタミンとしても公知、マスタージェン（登録商標））；ストレプトゾシン（ザノサー（登録商標））；チオテパ（��オホスホアミド、ＴＥＳＰＡおよびＴＳＰＡとしても公知、チオプレックス（登録商標））；シクロホスファミド（エンドキサン（登録商標）、サイトキサン（登録商標）、ネオサール（登録商標）、プロシトックス（登録商標）、レビミュン（Revimmune）（登録商標））；および、ベンダムスチンＨＣｌ（トレアンダ（登録商標）)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１５】
白金系薬剤の例としては、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン、フェナントリプラチン、および四硝酸トリプラチンが挙げられる。
【０２１６】
血管形成阻害剤の例としては、Ａ６（Angstrom Pharmaceuticals）、ＡＢＴ−５１０（Abbott Laboratories）、ＡＢＴ−６２７（アトラセンタン）（Abbott Laboratories/Xinlay）、ＡＢＴ−８６９（Abbott Laboratories）、アクチミド（ＣＣ４０４７、ポマリドミド）（Celgene Corporation）、ＡｄＧＶＰＥＤＦ.１１Ｄ（GenVec）、ＡＤＨ−１（エクスヘリン）（Adherex Technologies）、ＡＥＥ７８８（Novartis）、ＡＧ−０１３７３６（アクシチニブ）（Pfizer）、ＡＧ３３４０（プリノマスタット）（Agouron Pharmaceuticals）、ＡＧＸ１０５３（AngioGenex）、ＡＧＸ５１（AngioGenex）、ＡＬＮ−ＶＳＰ（ALN-VSP O2）（Alnylam Pharmaceuticals）、ＡＭＧ ３８６（Amgen）、ＡＭＧ７０６（Amgen）、アパチニブ（ＹＮ９６８Ｄ１）（Jiangsu Hengrui Medicine）、ＡＰ２３５７３（リダフォロリムス／ＭＫ８６６９）（Ariad Pharmaceuticals）、ＡＱ４Ｎ（ノバヴィア（Novavea））、ＡＲＱ １９７（ArQule）、ＡＳＡ４０４（Novartis/Antisoma）、アチプリモド（Callisto Pharmaceuticals）、ＡＴＮ−１６１（Attenuon）、ＡＶ−４１２（Aveo Pharmaceuticals）、ＡＶ−９５１（Aveo Pharmaceuticals）、アバスチン（ベバシズマブ）（Genentech）、ＡＺＤ２１７１（セジラニブ／レセンチン）（AstraZeneca）、ＢＡＹ ５７−９３５２（テラチニブ）（Bayer）、ＢＥＺ２３５（Novartis）、ＢＩＢＦ１１２０（Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals）、ＢＩＢＷ ２９９２（Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals）、ＢＭＳ−２７５２９１（Bristol-Myers Squibb）、ＢＭＳ−５８２６６４（ブリバニブ）（Bristol-Myers Squibb）、ＢＭＳ−６９０５１４（Bristol-Myers Squibb）、カルシトリオール、ＣＣＩ−７７９（トーリセル）（Wyeth）、ＣＤＰ−７９１（ImClone Systems）、セフラトニン（ceflatonin）（ホモハリングトニン／ＨＨＴ）（ChemGenex Therapeutics）、セレブレックス（セレコキシブ）（Pfizer）、ＣＥＰ−７０５５（Cephalon/Sanofi）、ＣＨＩＲ−２６５（Chiron Corporation）、ＮＧＲ−ＴＮＦ、ＣＯＬ−３（メタスタット）（Collagenex Pharaceuticals）、コンブレタスタチン（Oxigene）、ＣＰ−７５１，８７１（フィギツムマブ）（Pfizer）、ＣＰ−５４７，６３２（Pfizer）、ＣＳ−７０１７（第一三共）、ＣＴ−３２２（アンジオセプト)（Adnexus）、クルクミン、ダルテパリン（フラグミン）（Pfizer）、ジスルフィラム（Antabuse）、E７８２０（エーザイ株式会社）、Ｅ７０８０（エーザイ株式会社）、ＥＭＤ １２１９７４（シレンジタイド）（EMD Pharmaceuticals）、ＥＮＭＤ−１１９８（EntreMed）、ＥＮＭＤ−２０７６（EntreMed）、エンドスター（Simcere）、エルビタックス（ImClone/Bristol-Myers Squibb）、ＥＺＮ−２２０８（Enzon Pharmaceuticals）、ＥＺＮ−２９６８（Enzon Pharmaceuticals）、ＧＣ１００８（Genzyme）、ゲニステイン、ＧＳＫ１３６３０８９（フォレチニブ）（GlaxoSmithKline）、ＧＷ７８６０３４（パゾパニブ）（GlaxoSmithKline）、ＧＴ−１１１（Vascular Biogenics Ltd.）、ＩＭＣ−１１２１Ｂ（ラムシルマブ）（ImClone Systems）、ＩＭＣ−１８Ｆ１（ImClone Systems）、ＩＭＣ−３Ｇ３（ImClone LLC）、ＩＮＣＢ００７８３９（Incyte Corporation）、ＩＮＧＮ２４１（Introgen Therapeutics）、イレッサ（ＺＤ１８３９／ゲフィチニブ）、ＬＢＨ５８９（ファリダク／パノビノストスト）（Novartis）、ルセンティス（ラニビズマブ）（Genentech/Novartis）、ＬＹ３１７６１５（エンザスタウリン）（Eli Lilly and Company）、マクジェン（ペガプタニブ）（Pfizer）、ＭＥＤＩ５２２（アベグリン）（MedImmune）、ＭＬＮ５１８（タントゥチニブ）（Millennium）、ネオバスタット（ＡＥ９４１／ベネフィン）（Aeterna Zentaris）、ネクサバール（Bayer/Onyx）、ＮＭ−３（Genzyme Corporation）、ノスカピン（Cougar Biotechnology）、ＮＰＩ−２３５８（Nereus Pharmaceuticals）、ＯＳＩ−９３０（OSI）、パロミド５２９（Paloma Pharmaceuticals、Inc.）、パンゼム（Panzem）カプセル（２ＭＥ２）（EntreMed）、Panzem ＮＣＤ（２ＭＥ２）（EntreMed）、ＰＦ−０２３４１０６６（Pfizer）、ＰＦ−０４５５４８７８（Pfizer）、ＰＩ−８８（Progen Industries/Medigen Biotechnology）、ＰＫＣ４１２（Novartis）、ポリフェノンＥ（緑茶エキス）（Polypheno E International, Inc）、ＰＰＩ−２４５８（Praecis Pharmaceuticals）、ＰＴＣ２９９（PTC Therapeutics）、ＰＴＫ７８７（バタラニブ）（Novartis）、ＰＸＤ１０１（ベリノスタット）（CuraGen Corporation）、ＲＡＤ００１（エベロリムス）（Novartis）、ＲＡＦ２６５（Novartis）、レゴラフェニブ（ＢＡＹ７３−４５０６）（Bayer）、レブラミド（Celgene）、レタアン(Retaane)(Alcon Research)、ＳＮ３８（リポソーマル）（Neopharm）、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）（Sunesis）、ＳＯＭ２３０（パシレオチド）（Novartis）、スクアラミン（Genaera）、スラミン、スーテント（Pfizer）、タルセバ（Genentech）、ＴＢ−４０３（Thrombogenics）、テンポスタチン（Collard Biopharmaceuticals）、テトラチオモリブデン酸（Sigma-Aldrich）、ＴＧ１００８０１（TargeGen）、サリドマイド（Celgene Corporation）、チンザパリンナトリウム、ＴＫＩ２５８（Novartis）、ＴＲＣ０９３（Tracon Pharmaceuticals Inc.）、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ（アフリベルセプト）（Regeneron Pharmaceuticals）、ＶＥＧＦトラップアイ（Regeneron Pharmaceuticals）、ベグリン（Veglin）（VasGene Therapeutics）、ボルテゾミブ（Millennium）、ＸＬ１８４（Exelixis）、ＸＬ６４７（Exelixis）、ＸＬ７８４（Exelixis）、ＸＬ８２０（Exelixis）、ＸＬ９９９（Exelixis）、ＺＤ６４７４（AstraZeneca）、ボリノスタット（Merck）、およびＺＳＴＫ４７４が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１７】
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体阻害剤の例としては、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、アクシチニブ（インリタ（登録商標））；アラニネート酸ブリバニブ（ＢＭＳ−５８２６６４、（Ｓ）−（（Ｒ）−１−（４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ）プロパン−２−イル）２−アミノプロパノエート）；ソラフェニブ（ネクサバール（登録商標））；パゾパニブ（ヴォトリエント（登録商標））; スニチニブマレート（スーテント（登録商標））；セジラニブ（ＡＺＤ２１７１、ＣＡＳ２８８３８３−２０−１）；バルガテフ（Vargatef）（ＢＩＢＦ１１２０、ＣＡＳ９２８３２６−８３−４）；フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９）；テラチニブ（ＢＡＹ５７−９３５２、ＣＡＳ３３２０１２−４０−５）；アパチニブ（ＹＮ９６８Ｄ１、ＣＡＳ８１１８０３−０５−１）；イマチニブ（グリベック（登録商標））；ポナチニブ（ＡＰ２４５３４、ＣＡＳ９４３３１９−７０−８）；チボザニブ（ＡＶ９５１、ＣＡＳ４７５１０８−１８−０）；レゴラフェニブ（ＢＡＹ７３−４５０６、ＣＡＳ７５５０３７−０３−７）；バタラニブ二塩酸塩（ＰＴＫ７８７、ＣＡＳ２１２１４１−５１−０）；ブリバニブ（ＢＭＳ−５４０２１５、ＣＡＳ６４９７３５−４６−６）；バンデタニブ（カプレルサ（登録商標）またはＡＺＤ６４７４）；モテサニブ二リン酸（ＡＭＧ７０６、ＣＡＳ８５７８７６−３０−３、Ｎ−（２，３−ジヒドロ−３,３−ジメチル−１Ｈ−インドール−６−イル）−２−［（４−ピリジニルメチル）アミノ］−３−ピリジンカルボキサミド（ＰＣＴ公開公報ＷＯ０２／０６６４７０に記載）；ドビチニブ乳酸塩（ＴＫＩ２５８、ＣＡＳ８５２４３３−８４−２）；リンファニブ（ＡＢＴ８６９、ＣＡＳ７９６９６７−１６−３）；カボザンチニブ（ＸＬ１８４、ＣＡＳ８４９２１７−６８−１）；レスタウルチニブ（ＣＡＳ１１１３５８−８８−４）；Ｎ−［５−［［［５−（１，１−ジメチルエチル）−２−オキサゾリル］メチル］チオ］−２−チアゾリル］−４−ピペリジンカルボキサミド（ＢＭＳ３８７０３、ＣＡＳ３４５６２７−８０−７）；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２−メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリンアミン（ＸＬ６４７、ＣＡＳ７８１６１３−２３−８）；４−メチル−３−［［１−メチル−６−（３−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イル］アミノ］−Ｎ−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］−ベンズアミド（ＢＨＧ７１２、ＣＡＳ９４０３１０−８５−０）；および、アフリベルセプト（アイリーア（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１８】
ＥＧＦ経路阻害剤の例としては、チルホスチン４６、ＥＫＢ−５６９、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、エルビタックス、ニモツズマブ、ラパチニブ（タイカーブ（登録商標））、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲｍＡｂ）、１８８Ｒｅ−標識ニモツズマブ（抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ）、ならびにＷＯ９７／０２２６６、ＥＰ０５６４４０９、ＷＯ９９／０３８５４、ＥＰ０５２０７２２、ＥＰ０５６６２２６、ＥＰ０７８７７２２、ＥＰ０８３７０６３、米国特許第５，７４７，４９８号、ＷＯ９８／１０７６７、ＷＯ９７／３００３４、ＷＯ９７／４９６８８、ＷＯ９７／３８９８３およびＷＯ９６／３３９８０に一般的および具体的に開示されている化合物が挙げられるが、これらに限定されない。ＥＧＦＲ抗体の例としては、セツキシマブ（Erbitux（登録商標））；パニツムマブ（Vectibix（登録商標））；マツズマブ（ＥＭＤ−７２０００）；トラスツマブ（ハーセプチン（登録商標））；ニモツズマブ（ｈＲ３）；ザルツムマブ；ＴｈｅｒａＣＩＭ ｈ−Ｒ３；ＭＤＸ０４４７（ＣＡＳ３３９１５１−９６−１）；および、ｃｈ８０６（ｍＡｂ−８０６、ＣＡＳ９４６４１４−０９−１）が挙げられるが、これに限定されない。上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤の例としては、エルロチニブ塩酸塩（Tarceva（登録商標））、ゲフィチニブ（Iressa（登録商標））；Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［［（３”Ｓ”）−テトラヒドロ−３−フラニル］オキシ］−６−キナゾリニル］−４（ジメチルアミノ）−２−ブタナミド、Ｔｏｖｏｋ（登録商標））；バンデタニブ（カプレルサ（登録商標））；ラパチニブ（タイケルブ（登録商標））；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；カネルチニブ塩酸塩（ＣＩ−１０３３）；６−［４−［（４−エチル−１−ピペラジニル）メチル］フェニル］−Ｎ−［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン（ＡＥＥ７８８、ＣＡＳ４９７８３９−６２−０）；ムブリチニブ（ＴＡＫ１６５）；ペリチニブ（ＥＫＢ５６９）；アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）；ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）；Ｎ−［４−［［１−［（３−フルオロフェニル）メチル］−１Ｈ−インダゾール−５−イル］アミノ］−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イル］−カルバミン酸、（３Ｓ）−３−モルホリニルメチルエステル（ＢＭＳ５９９６２６）；Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２−メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリンアミン（ＸＬ６４７、ＣＡＳ７８１６１３−２３−８）；ならびに、４−［４−［［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］−フェノール（ＰＫＩ１６６、ＣＡＳ１８７７２４−６１−４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１９】
ｍＴＯＲ阻害剤の例としては、ラパマイシン（ラパミューン（登録商標））ならびにその類縁体および誘導体；SDZ−RAD；テムシロリムス（トーリセル（登録商標）、ＣＣＩ−７７９としても公知）；リダフォロリムス（正式にはデフェロリムスとして知られている、（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−４−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても公知、ＰＣＴ公開公報ＷＯ０３／０６４３８３に記載）；エベロリムス（アフィニトール（登録商標）またはＲＡＤ００１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９、シロリムス（登録商標）)；シマピモド（ＣＡＳ１６４３０１−５１−３）；（５−｛２，４−ビス［（３Ｓ）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［トランス−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ１０１３１０１−３６−４）；ならびに、Ｎ２−［１，４−ジオキソ−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−、内部塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ９３６４８７−６７−１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２０】
ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤の例としては、４−［２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）ピペラジン−１−イル］メチル］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−イル］モルホリン（ＧＤＣ ０９４１としても公知、ＰＣＴ公開公報ＷＯ０９／０３６０８２およびＷＯ０９／０５５７３０に記載）；２−メチル−２−［４−［３−メチル−２−オキソ−８−（キノリン−３−イル）−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］フェニル］プロピオニトリル（ＢＥＺ ２３５またはＮＶＰ−ＢＥＺ ２３５としても公知、ＰＣＴ公開公報ＷＯ０６／１２２８０６に記載）；４−（トリフルオロメチル）−５−（２，６−ジモルホリノピリミジン−４−イル）ピリジン−２−アミン（ＢＫＭ１２０またはＮＶＰ−ＢＫＭ１２０としても公知、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００７／０８４７８６に記載）；トザセルチブ（ＶＸ６８０またはＭＫ−０４５７、ＣＡＳ６３９０８９−５４−６）；（５Ｚ）−５−［［４−（４−ピリジニル）−６−キノリニル］メチレン］−２，４−チアゾリジンジオン（ＧＳＫ１０５９６１５、ＣＡＳ９５８８５２−０１−２）；（１Ｅ，４Ｓ，４ａＲ，５Ｒ，６ａＳ，９ａＲ）−５−（アセチルオキシ）−１−［（ジ−２−プロペニルアミノ）メチレン］−４，４ａ，５，６，６ａ，８，９，９ａ−オクタヒドロ−１１−ヒドロキシ−４−（メトキシメチル）−４ａ，６ａ−ジメチル−シクロペンタ［５，６］ナフト［１，２−ｃ］ピラン−２，７，１０（１Ｈ）−トリオン（ＰＸ８６６、ＣＡＳ５０２６３２−６６−８）；および、８−フェニル−２−（モルホリン−４−イル）−クロメン−４−オン（ＬＹ２９４００２、ＣＡＳ１５４４４７−３６−６）が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）またはＡＫＴ阻害剤の例としては、８−［４−（１−アミノシクロブチル）フェニル］−９−フェニル−１，２，４−トリアゾロ［３，４−ｆ］［１，６］ナフチリジン−３（２Ｈ）−オン（ＭＫ−２２０６、ＣＡＳ１０３２３４９−９３−１）；ペリホシン（ＫＲＸ０４０１）；４−ドデシル−Ｎ−１，３，４−チアジアゾール−２−イル−ベンゼンスルホンアミド（ＰＨＴ−４２７、ＣＡＳ１１９１９５１−５７−１）；４−［２−（４−アミノ−１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）−１−エチル−７−［（３Ｓ）−３−ピペリジニルメトキシ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−４−イル］−２−メチル−３−ブチン−２−オール（ＧＳＫ６９０６９３、ＣＡＳ９３７１７４−７６−０）；８−（１−ヒドロキシエチル）−２−メトキシ−３−［（４−メトキシフェニル）メトキシ］−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン（パロミド５２９、Ｐ５２９、またはＳＧ−００５２９）；トリシルビン（６−アミノ−４−メチル−８−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４Ｈ，８Ｈ−ピロロ［４，３，２−デ］ピリミド［４，５−ｃ］ピリダジン）；（αＳ）−α−［［［５−（３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−３−ピリジニル］オキシ］メチル］−ベンゼンエタンアミン（Ａ６７４５６３、ＣＡＳ５５２３２５−７３−２）；４−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−４−ピペリジンアミン（ＣＣＴ１２８９３０、ＣＡＳ８８５４９９−６１−６）；４−（４−クロロフェニル）−４−［４−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）フェニル］−ピペリジン（ＡＴ７８６７、ＣＡＳ８５７５３１−００−１）；ならびに、Ａｒｃｈｅｘｉｎ（ＲＸ−０２０１、ＣＡＳ６６３２３２−２７−７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２１】
図５Ａ−５Ｃ、９３および９４は、ＣＥＲ改変細胞を利用するレジメンの態様を例示する。図５Ａに示すように、白血球除去療法に続いて、細胞をエクスビボで処理して活性化することができ、対象への注入のために遺伝子改変および増殖を行う。図５Ｂは、従来のＴ細胞ベースの療法と組み合わせて用いられるＣＥＲ改変細胞のための治療スキーム例を示す。操作されたＴ細胞の最初の注入は、抗腫瘍効果を示す腫瘍細胞アポトーシスを誘導する。その後、ＣＥＲ改変細胞を注入する。ＣＥＲ改変細胞は、エンガルフメント促進（例えば、ＰｔｄＳｅｒ）を示す腫瘍細胞を除去し、それはＴ細胞抑制性腫瘍微小環境も回避しながら腫瘍退縮を促進する。その後、腫瘍微小環境の変化は、Ｔ細胞療法に対して腫瘍を再感作し、Ｔ細胞の２回目の注入を可能にする。治療方法の別の態様を図５Ｃに示す。図５Ｃに示される処置スキームは、モノクローナル抗体療法と組み合わせてＣＥＲ改変細胞を利用する。ＥＧＦＲを標的とするセツキシマブまたはＣＤ２０を標的とするリツキシマブなどの腫瘍特異的抗体の注入は、細胞死を誘発し得るか、またはＣＥＲ改変細胞によって結合される標的部分を誘導し得る。その後、対象は、抗体結合細胞に結合してそれを除去するＣＥＲ改変細胞を投与される。そのような態様において、ＣＥＲ細胞外ドメインは、ＦｃＲ結合ドメイン、ＰｔｄＳｅｒ結合ドメインまたは他の抗原結合ドメインを含み得る。
【０２２２】
別のシナリオでは、ＣＥＲ改変細胞は、小分子阻害剤、例えばＢＴＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、アデノシン経路阻害剤Ａ２ＡＲアンタゴニスト、ＩＤＯ１阻害剤、レナリドマイドなどのＩＭｉＤ、ＰＩ３Ｋδ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、またはＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤などと併用することができる。
【０２２３】
特定の態様において、本発明の方法は枯渇工程を含む。対象からＣＥＲを除去するための枯渇工程は、対象に対する毒性を軽減するために、治療上の利益のために十分な時間の後に行われ得る。かかる態様において、ＣＥＲベクターは、ｉＣＡＳＰ９、誘導性ＦａｓまたはＨＳＶ−ＴＫなどの誘導性自殺遺伝子を含む。同様に、ＣＥＲベクターは、関連するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、例えばＣＤ２０に対するリツキシマブまたはＥＧＦＲに対するセツキシマブの注入を介して形質導入細胞の枯渇を促進する、ＣＤ２０または切断型ＥＧＦＲ（配列番号１２１）などの公知の細胞表面抗原の発現のために設計され得る。成熟リンパ球の表面に存在するＣＤ５２を標的とするアレムツズマブもまた、形質導入されたＢ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞を枯渇させるために用いられ得る。
【０２２４】
さらなる態様において、本発明のＣＥＲを発現する細胞は、本明細書中で同定された適応症または病状に関して用いられる方法を含む、診断方法または画像化方法において使用され得る。
【実施例】
【０２２５】
実施例
実施例１
ＣＥＲ構築物の作製
ＣＥＲをコードする天然または合成核酸分子の発現は、ＣＥＲタンパク質またはその一部をコードする核酸分子をプロモーターに作動可能に連結させて、真核生物の複製および組み込み適した発現ベクターに構築物を組み込むことによって達成される。ベクターは、所望の核酸配列の発現の調節に有用な、転写および翻訳ターミネーター、開始配列ならびにプロモーターを含む。
【０２２６】
ＣＥＲタンパク質またはその一部の発現を評価するために、細胞に導入された発現ベクターは、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させようとした細胞集団からの発現細胞の同定および選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子、またはレポーター遺伝子を含む。選択可能マーカーは、別のＤＮＡ断片上に担持され、そして同時トランスフェクション法において用いられる。選択可能なマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子は、宿主細胞における発現を可能にするために調節配列に隣接している。発現ベクターは、レトロウイルスベクターによって宿主細胞に導入される。宿主細胞中の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、ＲＴ−ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡを含む種々のアッセイが行われる。
【０２２７】
ＣＥＲ性能の評価
ＣＥＲを同定および特徴付けるために、候補ＣＥＲのレトロウイルス介在形質導入を用いて食細胞のエンガルフメントを再構成するインビトロ系が確立されている。細胞をエンガルフする能力を通常は欠いているマウスおよびヒトリンパ球細胞株は、機能獲得活性について評価するためにＣＥＲを形質導入される。ＣＥＲが成功裏に発現されれば、エンガルフメントが異種細胞で起こる。それらのエンガルフメント活性に加えて、ＣＥＲは以下の能力について評価される：（１）細胞を分極化させて炎症性サイトカインおよびケモカインを放出させる；（２）下流の増殖経路を活性化する；および、（３）標的細胞を非治療誘導性の耐性パターンにする。候補ＣＥＲを評価するために、多次元フローサイトメトリー、サイトカイン／ケモカインアレイ、および機能的アッセイ（下記）が使用される。
【０２２８】
実施例２
インビトロ食細胞作用
マウスプロ−Ｂ細胞株Ｂａ／Ｆ３またはヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、インビトロでアポトーシス細胞または腫瘍細胞を貪食するための内因性の食細胞作用能力を欠き、リードＣＥＲ候補を同定するための最初のスクリーニング細胞株として用いられる。ＣＥＲレトロウイルス形質導入後、Ｂａ／Ｆ３またはＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を精製し、標識し、そして免疫表現型を特徴付ける。食細胞作用活性は、様々な共培養条件下で所定の標的細胞を用いたインビトロ共培養試験を用いて測定され、そしてエンガルフメントはＦＡＣまたは発光顕微鏡により測定される。細胞外ＰｔｄＳｅｒ標的化ドメインを有するＣＥＲを形質導入されたＢａ／Ｆ３細胞またはＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、ｐＨｒｏｄｏ標識したアポトーシス細胞と共培養する。このアッセイは、細胞質リソソームに入るアポトーシス細胞の食細胞作用の評価を可能にする。他の場合において、Ｆｃ受容体の細胞外ドメインを有するＣＥＲを形質導入したＢａ／Ｆ３細胞またはＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、腫瘍特異的抗体などの抗体と共に予めインキュベートした標的細胞と同時インキュベートして、これらの細胞の抗体被覆腫瘍細胞を貪食する能力を測定する。最後に、一本鎖可変断片などの抗体結合部分を介して腫瘍抗原に結合する、ＣＥＲを形質導入したＢａ／Ｆ３細胞またはＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、腫瘍細胞と共培養し、食細胞作用を定量する。ある場合において、標的細胞は、共培養試験の前に、従来の化学療法、放射線療法または小分子療法で予め処理されて、‘食細胞作用促進性(pro-phagocytic)’の分子状態に誘導される。食細胞作用活性は、９０分間の共培養試験後の標識されたＢａ／Ｆ３ Ｊｕｒｋａｔ形質転換体中のセルトラッカー陽性細胞の割合として定量される。
【０２２９】
馴化培地からのサイトカイン/ケモカインアレイ分析
並行して、馴化培地を、Ｂａ／Ｆ３細胞またはＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞形質転換体の共培養試験から集め、炎症性サイトカイン／ケモカインアッセイの放出について分析した。Ｂａ／Ｆ３ Ｊｕｒｋａｔ形質導入前後のサイトカイン／ケモカイン変化および相対的比較を、機能性獲得について評価するために定量する。（ｉ）ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βなどの免疫抑制性サイトカインである、未成熟単球および骨髄由来抑制性細胞の動員に関与する単球化学誘引物質を下方制御すること、および（ｉｉ）炎症性サイトカイン ＴＮＦα、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＦＮαおよびＩＦＮγを上方制御することの両方により細胞を炎症状態に分極化させるＣＥＲ候補が同定される。
【０２３０】
多次元フローサイトメトリー
Ｂａ／Ｆ３およびＪｕｒｋａｔ形質転換体を、多次元サイトメトリーを用いて並行して分析して、活性化および阻害受容体プロファイルを特徴付ける。活性化プロファイルは、ＣＤ１３７、ＣＤ６９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１２３、ＣＤ１１ｃ、ＴＮＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、グランザイム、パーフォリン、ＣＤ２５、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８０、およびＣＤ８６を含み得るが、阻害プロファイルは、ＰＤ−１、Ｔｉｍ−３、Ｌａｇ−３、ＩＣＯＳおよびＣＤ１７２ａを含み得る。培養中のバイスタンダー細胞は、治療誘導性の耐性パターンについて免疫表現型的に評価される。
【０２３１】
増殖アッセイ
ＣＥＲカセットで形質導入した初代ヒトＴ細胞を、外因性サイトカインまたはフィーダー細胞の存在下または不存在下で、構成的または非構成的増殖パターンについて分析する。
【０２３２】
下流の炎症誘発性シグナル伝達経路
下流の炎症誘発性応答をさらに試験するために、ホスホ−ＣＹＴＯＦを実施して、ＩｋＢｔｏｔ、ｐＳＴＡＴ１、ｐ３８およびＪＮＫなどの候補ＣＥＲによって活性化される下流のシグナル伝達経路を測定する。
【０２３３】
実施例３
インビボ分析
ＣＥＲ改変細胞をインビボで試験するために、動物モデルおよびエクスビボ試験を用いる。ヒト原発腫瘍細胞または異種移植片をＮｏｄ／ＳＣＤγマウスに移植する。ＣＥＲで改変された細胞の増殖性および持続性は、血液および組織標本から液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）装置とＣＥＲカセットに特異的なプライマーを用いて定量することができる。エクスビボでＣＥＲ細胞の機能的能力を分析するために、腫瘍組織および脾細胞を処理し、ＣＥＲ改変細胞の養子移入後の表現型決定およびインビボ食細胞作用の証明のためにＦＡＣＳおよび組織染色により分析する。腫瘍増殖をインビボでモニタリングし、定量化する。
【０２３４】
実施例４
ＴＩＭ４−ＭＥＲＴＫキメラエンガルフメント受容体（ＣＥＲ）“ＣＥＲ０１”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列によりコードされる）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列によりコードされる）を含むホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４の細胞外ドメイン（配列番号７３のアミノ酸配列）（一体となって、配列番号５７のポリヌクレオチド配列を有する）を、チロシンキナーゼＭＥＲＴＫの細胞内キナーゼドメイン（配列番号５８によりコードされる）に融合させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ０１”（配列番号７１のアミノ酸配列を有するＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ）を作製した（図６Ａ）。ＭＥＲＴＫ受容体チロシンキナーゼは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、近年、ホスファチジルセリン結合受容体として記載されている（Miyanishi et al., Nature, 2007, 450:435-9；Nishi et al., 2014, Mol. Cell Biol. 34:1512-20）。その後、Ｔｉｍ−４−ＭＥＲＴＫキメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列をｐＭＳＣＶ（マウス幹細胞ウイルス）レトロウイルスベクター中に挿入した。初期継代のマウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、形質導入マーカーとして黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を発現するｐＭＳＣＶ Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫレトロウイルスを用いて形質導入した。陽性Ｂａ／Ｆ３細胞形質導入体を、フローサイトメトリー（ＦＡＣ）を用いてＧＦＰ発現により選別し、培養中に増殖させて、インビトロ試験に用いた。
【０２３５】
初代培養アポトーシス胸腺細胞に対する食細胞作用活性
初代培養胸腺細胞を、１０μＭのデキサメサゾンと共に２４時間インキュベートして、細胞死を誘導した。次いで、胸腺細胞を、１μＭのｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ色素のＰＢＳ溶液を用いて、室温にて１５分間標識し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ培地で２回洗浄して、食細胞作用アッセイのために標的細胞として用いた。５０μｌのｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ標識した胸腺細胞（１０６／ｍＬ）を、５０μｌのＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫキメラエンガルフメント受容体を発現する選別されたＢａ／Ｆ３細胞（１０５／ｍＬ）と共にインキュベートした（標的細胞 対 エフェクター細胞の比は１０：１である）。標的細胞をｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ色素で標識することにより、酸性リソソーム環境におけるそれらの増大した発光のために、取り込まれてリソソーム中に移行される細胞の可視化が可能になる（Miksa et al., 2009, Immunol. Methods 342:71-7）。共培養試験を行い、インキュベーションの２時間、２４時間、４８時間および７２時間後に、蛍光顕微鏡およびＦＡＣにより、Ｂａ／Ｆ３ ＧＦＰ＋細胞を食細胞作用について連続的に定量した。Ｔｉｍ４およびＧＦＰ（非エンガルフメント受容体）を発現するｐＭＳＣＶベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を、陰性対照として用いた。
【０２３６】
通常の条件下で、Ｂａ／Ｆ３マウスＢ細胞株は、標的細胞をエンガルフする能力を欠いており、それ故に、エンガルフメントのためのアッセイ系を確立するために選択された。アポトーシス胸腺細胞のＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ介在エンガルフメントを最初に試験した（図６Ａ−Ｆ）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞株におけるＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲの発現は、ホスファチジルセリン陽性（ＰｔｄＳｅｒ＋）胸腺細胞の食細胞作用性取り込みを強く増強した（図６Ｃ−６Ｆ）。蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓによる観察は、食細胞作用の量が標的細胞とのインキュベーション時間ならびにＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ発現の量と相関することを示している（図６Ｃ−６Ｄ）。共インキュベーションの２時間後、対照群の０％と比較して、２１．６％のＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞が、標的アポトーシス胸腺細胞をエンガルフしていた（図６Ｃ）。Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲを発現する食細胞作用性Ｂａ／Ｆ３細胞の数は、２４時間のインキュベーションで５７．５％に増え、７２時間のインキュベーションで７５％に増えた（図６Ｃ−６Ｄ）。さらに、最大量のＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲを発現したＢａ／Ｆ３細胞は、最大量の食細胞作用を示し、上位四分位の発現細胞では８０％に近く（図６Ｄ）、このことは、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲの濃度依存的効果を示した。
【０２３７】
次いで、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲが取り込まれた標的細胞のファゴリソソームへの移行を促進する能力を調べた。加水分解酵素を含むリソソームは、低ｐＨの細胞内環境中で取り込んだ細胞を消化する（Arandjelovic et al., 2015, Nat. Immunol. 16:907-17）。この設定において、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ標識した標的胸腺細胞は、蛍光強度が増加する。蛍光顕微鏡による観察は、ほとんどのＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ発現Ｂａ／Ｆ３細胞の内部に存在するいくつかのｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ陽性細胞を示した（図６Ｅ）。この観察と完全に一致して、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ発現Ｂａ／Ｆ３細胞のファゴリソソームへの標的細胞の移行は、それらのクリアランスと関連していた。４日目までに、９７％の標的細胞が、食細胞作用の取り込みおよびリソソーム分解によって排除された（図７Ａ−７Ｂ）。これらの結果は、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲの添加が、ＰｔｄＳｅｒ＋細胞のクリアランスを強く増強することを示している。
【０２３８】
ＣＥＲ発現細胞が腫瘍細胞を除去する能力を調べるために、Ｒａｊｉ ヒトＢｕｒｋｉｔｔ Ｂ細胞リンパ腫細胞株のＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ介在エンガルフメントを試験した（図８Ａ−８Ｂ）。この試験は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）が、抗ＩｇＭ活性化Ｂ細胞において、構成的に活性なＲａｊｉリンパ腫細胞に存在するような異常なシグナル伝達活性の設定において、ＰｔｄＳｅｒを膜ミクロドメインに取り込むことを示す（Dillon et al., 2000, J. Immunol. 164:1322-32）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞株におけるＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲの発現は、Ｒａｊｉ細胞の食細胞作用性取り込みを増強し（図８Ａ−８Ｃ）、このことは、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ介在抗腫瘍効果を示した。
【０２３９】
実施例５
ＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ“ＣＥＲ０３”の構築
マクロファージオプソニンＭＦＧＥ８由来のホスファチジルセリン結合モチーフＦＡ５８Ｃ２（配列番号３０のアミノ酸配列）を、修飾されたＩｇＧ４細胞外スペーサードメイン（配列番号６７のアミノ酸配列）、共刺激分子ＣＤ２８の膜貫通ドメイン（配列番号６８のアミノ酸配列）、およびＭＥＲＴＫの細胞質キナーゼドメイン（配列番号４３のアミノ酸配列）に結合させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ０３”（ＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ）（配列番号５９のポリヌクレオチド配列、配列番号７５のアミノ酸配列）を作製した（図９Ａ）。この構築物は、ＧＭ−ＣＳＦ由来のシグナルペプチド（配列番号６５のアミノ酸配列にコードされる）を有していた。ＭＥＲＴＫ受容体チロシンキナーゼは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、ＭＦＰ−Ｅ８の第二のＦＡ５８Ｃリピート（Ｃ２）のＣ末端ドメイン（本明細書中、ＦＡ５８Ｃ２と言う）は、ホスファチジルセリン結合に関与し得ることが示されている（Hanayama et al., 2002, Nature, 417:182-7; Nishi et al., 前出）。次いで、ＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲヌクレオチド配列をｐＭＳＣＶ（マウス幹細胞ウイルス）レトロウイルスベクター中に挿入した。初期継代のマウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を発現するｐＭＳＣＶ ＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲレトロウイルスを用いて形質導入した。陽性Ｂａ／Ｆ３細胞形質導入体を、フローサイトメトリー（ＦＡＣ）を用いてＧＦＰ発現により選別し、培養中に増殖させて、インビトロ試験に用いた。
【０２４０】
初代培養アポトーシス胸腺細胞に対する食細胞作用活性
初代培養胸腺細胞を、１０μＭのデキサメサゾンと共に２４時間インキュベートして、細胞死を誘導した。次いで、胸腺細胞を、１μＭのｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ色素のＰＢＳ溶液を用いて、室温にて１５分間標識し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で２回洗浄して、食細胞作用アッセイのために標的細胞として用いた。５０μｌのｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ標識した胸腺細胞（１０６／ｍＬ）を、５０μｌのＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ選別Ｂａ／Ｆ３細胞（１０５／ｍＬ）と共にインキュベートした（標的細胞 対 エフェクター細胞の比は１０：１である）。標的細胞をｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ色素で標識することにより、酸性リソソーム環境におけるそれらの増大した発光のために、取り込まれてリソソーム中に移行される細胞の可視化が可能になる（Miksa et al., 2009, 前出）。共培養試験を行い、インキュベーションの２時間、２４時間、４８時間および７２時間後に、蛍光顕微鏡およびＦＡＣにより、Ｂａ／Ｆ３ ＧＦＰ＋細胞を食細胞作用について連続的に定量した。Ｔｉｍ４およびＧＦＰ（非エンガルフメント受容体）を発現するｐＭＳＣＶベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を、陰性対照として用いた。
【０２４１】
アポトーシス胸腺細胞のＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ介在エンガルフメントを最初に試験した（図９Ｂ−９Ｆ）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞におけるＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲの発現は、ホスファチジルセリン陽性（ＰｔｄＳｅｒ＋）胸腺細胞の食細胞作用性取り込みを強く増強した（図９Ｂ−９Ｆ）。蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓによる観察は、食細胞作用の量が標的細胞とのインキュベーション時間ならびにＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ発現の量と相関することを示している（図９Ｂ−９Ｃ）。共インキュベーションの２時間後、対照群の０％と比較して、１１％のＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞がエンガルフされていた（図９Ｂ）。ＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲを発現する食細胞作用性Ｂａ／Ｆ３細胞の数は、２４時間のインキュベーションで４８％に増えた（図９Ｂ−９Ｆ）。さらに、最大量のＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲを発現したＢａ／Ｆ３細胞は、最大量の食細胞作用を示し、上位四分位の発現細胞では８０％に近く（図９Ｃ）、このことは、ＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲの濃度依存的効果を示している。
【０２４２】
ＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫエンガルフメントに対する低分子量ＧＴＰアーゼの効果
低分子量ＧＴＰアーゼＲａｃ１および／またはＲａｂ５ａの、ＣＥＲ発現Ｂａ／Ｆ３細胞によるエンガルフメントに対する効果を試験した。ＲｈｏおよびＲａｂファミリーのＧＴＰａｓｅは、マクロファージおよび未成熟樹状細胞によるアポトーシス細胞のエンガルフメントを調節する。細胞をエンガルフするための食細胞作用カップを形成するために、マクロファージによって発現されるインテグリン受容体は、ＧＴＰａｓｅのＲｈｏファミリーのＲａｃ１を活性化して、アクチン重合を誘導する（Albert et al., 2000, Nat. Cell Biol. 2:899-905）。ＧＴＰａｓｅのＲａｂファミリーの一員であるＲａｂ５は、ファゴソームとエンドソームとの融合を調節し、リソソーム生合成において役割を果たし得る（Duclos et al., 2000, J. Cell Sci. 113:3531-41）。Ｒａｃ１をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号６０）、Ｒａｂ５をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号６１）、またはその両方をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号６２）を、双シストロン性またはトリシストロン性レトロウイルス発現カセット（ｐＭＳＣＶ ＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ−Ｐ２Ａ−Ｒａｃ１、ｐＭＳＣＶ ＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ−Ｐ２Ａ−Ｒａｂ５ａ、またはｐＭＳＣＶ ＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ−Ｐ２Ａ−Ｒａｃ１−Ｔ２Ａ−Ｒａｂ５ａ）を用いてＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫと同時発現させた（図１０Ａ）。図１０Ｂ−１０Ｅに示すように、Ｒａｃ１の添加は、標的アポトーシス胸腺細胞のＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ介在エンガルフメントを増加させた（図１０Ｅ 対 図９Ｆに示すように、５６％ 対 ４８％）。さらに、ファゴリソソームへの取り込まれた胸腺細胞の移行が観察された。蛍光顕微鏡による観察は、いくつかのｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ陽性細胞がほとんどのＦＡ５８Ｃ２−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ／Ｒａｃ１発現Ｂａ／Ｆ３ Ｂ細胞中に存在することを示す（図１０Ｃ）。
【０２４３】
実施例６
ＦＡ５８Ｃ２−ＳＹＫＣＥＲ “ＣＥＲ０４”の構築
ＧＭ−ＣＳＦ由来のシグナルペプチドに融合したマクロファージオプソニンＭＦＧＥ８に由来するホスファチジルセリン結合モチーフＦＡ５８Ｃ２を、修飾されたＩｇＧ４細胞外スペーサードメイン、共刺激分子ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、およびＳｙｋキナーゼドメインに結合させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ０４”（ＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲ）を作製した（配列番号６３のポリヌクレオチド配列、配列番号７０のアミノ酸配列、図１１Ａ）。クラスター化Ｓｙｋチロシンキナーゼドメインは、ＣＯＳ細胞における食細胞作用を誘発する（Greenberg et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1103-7）。次いで、ＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲヌクレオチド配列をｐＭＳＣＶ（マウス幹細胞ウイルス）レトロウイルスベクター中に挿入した。初期継代のマウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、ＧＦＰ蛍光タンパク質を発現するｐＭＳＣＶ ＦＡ５８Ｃ２−Ｓｙｋレトロウイルスを用いて形質導入した。陽性Ｂａ／Ｆ３細胞形質導入体を、フローサイトメトリー（ＦＡＣｓ）を用いてＧＦＰ発現により選別し、培養中に増殖させて、インビトロ試験に用いた。
【０２４４】
初代培養アポトーシス胸腺細胞に対する食細胞作用活性
初代培養胸腺細胞をアポトーシスに誘導し、実施例４に記載のようにｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ色素で標識した。共培養試験を行い、実施例４に記載のように蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓによりＢａ／Ｆ３ ＧＦＰ＋細胞を食細胞作用について連続的に定量した。Ｔｉｍ４およびＧＦＰ（非エンガルフメント受容体）を発現するｐＭＳＣＶベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。
【０２４５】
アポトーシス胸腺細胞のＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲ−介在エンガルフメントを試験した（図１１Ａ−１１Ｅ）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞株におけるＦＡ５８Ｃ２−ＳｙｋＣＥＲの発現は、ホスファチジルセリン陽性（ＰｔｄＳｅｒ＋）胸腺細胞の食細胞作用性取り込みを強く増強した（図１１Ｂ−１１Ｅ）。蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓによる観察は、食細胞作用の量が、標的細胞のインキュベーション時間、ならびにＦＡ５８Ｃ２−Ｓｙｋ ＣＥＲ発現の量と相関することを示している。共インキュベーションの２時間後、対照群の０％と比較して、９．５％のＦＡ５８Ｃ２−Ｓｙｋ ＣＥＲ形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞がエンガルフされていた（図１１Ｂ）。ＦＡ５８Ｃ２−Ｓｙｋ ＣＥＲを発現する食細胞作用性Ｂａ／Ｆ３細胞の数は、２４時間のインキュベーションで４８％に増えた（図１１Ｂ、１１Ｃおよび１１Ｅ）。さらに、最大量のＦＡ５８Ｃ２−Ｓｙｋ ＣＥＲを発現したＢａ／Ｆ３細胞は、最大量の食細胞作用を示し（図１１Ｃ）、このことは、ＦＡ５８Ｃ２−Ｓｙｋ ＣＥＲの濃度依存的効果を示している。
【０２４６】
ＦＡ５８Ｃ２−ＳＹＫエンガルフメントに対する低分子量ＧＴＰアーゼの効果
Ｂａ／Ｆ３細胞によるエンガルフメントに対する低分子量ＧＴＰアーゼＲａｃ１および／またはＲａｂ５ａの添加の効果を調べた。Ｒａｃ１（配列番号６０）および／またはＲａｂ５（配列番号６１）、または両方（配列番号６２）をコードするｃＤＮＡ配列を、双シストロン性またはトリシストロン性レトロウイルス発現カセット（ｐＭＳＣＶ ＦＡ５８Ｃ２−Ｓｙｋ−Ｐ２Ａ−Ｒａｃ１、ｐＭＳＣＶ ＦＡ５８Ｃ２−Ｓｙｋ−Ｐ２Ａ−Ｒａｂ５ａ、およびｐＭＳＣＶ ＦＡ５８Ｃ２−Ｓｙｋ−Ｐ２Ａ−Ｒａｃ１−Ｔ２Ａ−Ｒａｂ５ａ構築物）を用いてＦＡ５８Ｃ２−Ｓｙｋ ＣＥＲと同時発現させた（図１１Ａ、１２Ａ）。図１１Ｂおよび１１Ｃから明らかなように、Ｒａｃ１の添加は、ＦＡ５８Ｃ２−Ｓｙｋ ＣＥＲ介在エンガルフメントを増加させるか、または標的アポトーシス胸腺細胞を増加させる。さらに、Ｒａｂ５の添加はまた、食細胞作用も増加させた（図１２Ｂ−１２Ｄ）。
【０２４７】
実施例７
ＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ“ＣＥＲ４０”の構築
ＦＭＣ６３マウスＩｇＧ２ａマウスモノクローナル抗体に由来し、ＧＭ−ＣＳＦ由来シグナルペプチド（配列番号６５のアミノ酸配列によりコードされる）に融合された、抗ＣＤ１９一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）（配列番号６６のアミノ酸配列によりコードされる）を、改変されたＩｇＧ４細胞外スペーサードメイン（配列番号６７のアミノ酸配列によりコードされる）、共刺激分子ＣＤ２８の膜貫通ドメイン（配列番号６８のアミノ酸配列によりコードされる）およびＭＥＲＴＫの細胞内キナーゼドメイン（配列番号４３のアミノ酸配列）に融合させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ４０”（ＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ）を作製した（配列番号６４のアミノ酸配列を有する）（図１３Ａ）（Kochenderfer et al., 2009, J. Immunother. 32:689-702）。エンガルフメントを増強するために、ＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲおよびＲａｃ１を含む双シストロン性レトロウイルス発現構築物を構築した（図１３Ｂ）。次に、ＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲヌクレオチド配列をｐＭＳＣＶ（マウス幹細胞ウイルス）レトロウイルスベクターに挿入した。初期継代のマウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するｐＭＳＣＶ ＣＥＲレトロウイルスを用いて形質導入した。陽性Ｂａ／Ｆ３細胞形質導入体を、フローサイトメトリー（ＦＡＣｓ）を用いてＧＦＰ発現により選別し、培養中に増殖させて、インビトロ試験に用いた。
【０２４８】
ヒトリンパ腫細胞株に対する食細胞作用活性
ＣＤ１９＋である、Ｒａｊｉ ヒト Ｂｕｒｋｉｔｔ Ｂ細胞リンパ腫細胞を１μＭのｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ色素で標識し、実施例４に記載の食細胞作用アッセイのための標的細胞として用いた。共培養試験を行い、実施例４に記載のように蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓによりＢａ／Ｆ３ ＧＦＰ＋細胞を食細胞作用について連続的に定量した。Ｔｉｍ４およびＧＦＰ（非エンガルフメント受容体）を発現するｐＭＳＣＶベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞および非形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。
【０２４９】
Ｒａｊｉ Ｂｕｒｋｉｔｔ Ｂ細胞リンパ腫細胞のＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ介在エンガルフメントを、初めに調べた（図１３Ｃ−１３Ｆ）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞株におけるＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲの発現が、Ｒａｊｉリンパ腫細胞の食細胞作用性取り込みを強く増強した（図１３Ｃ−１３Ｆ）。蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓによる観察は、食細胞作用の量が、標的細胞のインキュベーション時間、ならびにＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ発現の量と相関することを示している。共インキュベーションの２４時間後、対照群の０％と比較して、１７％のＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ−Ｐ２Ａ−Ｒａｃ１ ＣＥＲ形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞がエンガルフされていた（図１３Ｃ、１３Ｇ）。最大量のＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲを発現したＢａ／Ｆ３細胞は、最大量の食細胞作用を示し（図１３Ｄ）、このことは、ＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲの濃度依存的効果を示している。
【０２５０】
ＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲが取り込まれたＲａｊｉ細胞のファゴリソソームへの移行を促進する能力を調べた。蛍光顕微鏡検査は、Ｒａｊｉ細胞が、ＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ ＋ Ｒａｃ１発現Ｂａ／Ｆ３細胞の内側に存在することを示すｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ陽性を示した（図１３Ｅ）。図１３Ｈは、ＣＤ１９−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲを発現するＢａ／Ｆ３細胞によるＲａｊｉ細胞のエンガルフメントを示す（白色矢印は食細胞作用を示す）。これらの結果は、ＣＤ１９−ＭｅｒＴｋ ＣＥＲ発現についての、ＣＤ１９特異的に標的を除去する能力を実証している。
【０２５１】
実施例８
ＴＩＭ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲ “ＣＥＲ０１”の構築
実施例４に記載の、配列番号７１のアミノ酸配列を有するＣＥＲ０１をコードするＴｉｍ−４−ＭＥＲＴＫキメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、１２ウェルプレート中、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１０Ｎｇ／ｍＬ マウスＩＬ−３（Peprotech カタログ番号２１３−１３）を添加したＲＭＰＩ １６４０培地中で、５０万細胞／ｍｌの密度で培養した。Ｂａ／Ｆ３細胞を形質導入するために、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ（ＣＥＲ０１）および形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｔとも呼ばれる）（図１６参照）を発現する１００μｌのｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターならびに５μｌのＴＲＡＮＳＤＵＸ（商標）形質導入試薬を０．５ｍｌの完全細胞増殖培地で希釈し、Ｂａ／Ｆ３細胞に添加した。その後、Ｂａ／Ｆ３細胞を３２℃に予め温めた遠心機で２７０ ｘ ｇ ｒｐｍで１時間遠心した。Ｂａ／Ｆ３細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。Ｂａ／Ｆ３細胞を完全細胞増殖培地中でさらに４８時間増殖させた。陽性Ｂａ／Ｆ３細胞形質導入体を、標識したＴｉｍ４特異的抗体（Kat5-18、Abcam カタログ番号176486）または標識したＥＧＦＲ特異的抗体（セツキシマブ）で染色することにより蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣｓ）（Sony Sorter SH800）を用いて選別した（図１７Ａ−Ｂ参照）。選別後、レンチウイルスを含むＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫ−Ｔ２Ａ−切断型ＥＧＦＲを含む、精製され、形質導入されたＢａ／Ｆ３細胞（図１７Ｃ参照）を、食細胞作用アッセイに利用する前に４８時間静置した。陽性染色を有する細胞の割合が各ヒストグラムに示されている。
【０２５２】
初代培養アポトーシス胸腺細胞に対する食細胞作用活性
食細胞作用アッセイの１日前に、初代培養胸腺細胞をＣ３Ｈマウス（Charles River Laboratories International、Inc.）から単離した。胸腺細胞を、６ウェルプレート中、１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加した完全ＲＰＭＩ１６４０増殖培地中で培養した。アポトーシスおよび細胞表面上でのホスファチジルセリン発現を誘導するために、胸腺細胞を１μＭデキサメタゾンで２４時間処理した。未処理の胸腺細胞を陰性対照として用いた。胸腺細胞を６ウェルプレートから回収し、滅菌１Ｘ ＰＢＳで１回洗浄し、その後、ＰＢＳ中、１ｎｇ／μｌのｐＨ感受性ｐＨｒｏｄｏ(商標) Ｒｅｄ色素（ThermoFisher Scientific、カタログ番号P36600）で１５分間、室温で染色した。その後、細胞に増殖培地を添加し、もう一度洗浄して、過剰のｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄを除去した。ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ染色された胸腺細胞を、ＲＭＰＩ １６４０完全培地中、２５０，０００細胞／ウェルで平底９６ウェルプレートに播いた。
【０２５３】
上記のようにして作製したＢａ／Ｆ３ ＣＥＲ０１＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞を、１Ｘ ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中、１μＭ ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素（ThermoFisher Scientific、カタログ番号C34557）で、３７℃にて１０分間染色した。染色された形質導入されたＢａ／Ｆ３細胞に増殖培地を添加し、１Ｘ ＰＢＳで１回洗浄して、過剰量のＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔを除去して、ＲＭＰＩ１６４０完全培地中、約２５，０００細胞／ウェルで平底９６ウェルプレートに播いた。
【０２５４】
標的胸腺細胞を染色されたＢａ／Ｆ３ ＣＥＲ０１＋ｔＥＧＦＲ＋細胞と共に、１０：１（標的細胞：エフェクター細胞）の比率で、３７℃にて３時間または一晩（〜１４時間）培養した。インキュベーション後、プレートを遠心分離し、培地を、２％ウシ胎仔血清（ｐＨ９）を添加したＰＢＳと交換した。その後、９６ウェルプレートを、ＫＥＹＥＮＣＥ ＢＺ−Ｘ７１０蛍光顕微鏡を２０倍対物レンズで用いて観察した。フローサイトメトリーによる分析のために、デュプリケートの９６ウェル共培養プレートも並行して試験した。７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）色素を、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで染色された標的胸腺細胞およびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔで染色されたエフェクター細胞と共に、細胞生存性色素として用いた。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。蛍光顕微鏡検査は、切断型ＥＧＦＲ形質導入Ｂａ/Ｆ３対照細胞（図１８Ａ参照）と比較して、ＣＥＲ０１＋Ｂａ／Ｆ３細胞が、デキサメサゾン処理した胸腺細胞をエンガルフすることを示した（白色矢印は、エンガルフメント事象を示す）（図１８Ｂ参照）。エンガルフメント事象の拡大画像を図１８Ｂの右側に表示する。
【０２５５】
ＦＡＣＳにより測定されたＢａ/Ｆ３エフェクター細胞の量を図１９Ａに示す。食細胞作用は、ＦＡＣＳによって測定されるようにｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性に染色される細胞集団として定量された（図１９Ｂ参照）。
【０２５６】
食細胞作用指数は、ＥＧＦＲｔで形質導入されたＢａ／Ｆ３対照細胞と比較して、［エンガルフされた標的細胞の総数／計算されたＣＥＲ改変細胞の総数の平均（例えば、食細胞作用頻度）］に、［ＣＥＲ＋ Ｂａ／Ｆ３細胞当たりの標的細胞染色の平均面積 ｘ １００（例えば、ハイブリッドキャプチャー）］を乗じて計算された（図２０Ａ−Ｂ参照）
。
【０２５７】
マウス細胞株に対する食細胞作用活性
食細胞作用アッセイの１日前に、ＣＴ２６マウス結腸癌腫細胞を、６ウェルプレート中、１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加した完全ＲＰＭＩ １６４０増殖培地中で培養し、１ｍＭのスタウロスポリン（ＳＴＳ）で１２時間処理して、アポトーシスを誘導した。未処理のＣＴ２６細胞を陰性対照として用いた。
【０２５８】
食細胞作用アッセイの日に、ＣＴ２６細胞を回収し、１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄して、過剰のスタウロスポリンを除去し、その後、ＰＢＳ中、１ｎｇ／μｌのｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで、室温にて１５分間染色した。ＣＴ２６細胞に増殖培地を添加し、１回洗浄して、過剰のｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄを除去し、ＲＰＭＩ １６４０完全培地中、平底９６ウェルプレートに２５０，０００細胞／ウェルで播いた。
【０２５９】
上記のようにして作製したＢａ／Ｆ３ ＣＥＲ０１＋ ＥＧＦＲ＋細胞を、１Ｘ ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中、１μＭ ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素（ThermoFisher Scientific、カタログ番号Ｃ３４５５７）で、３７℃にて１０分間染色した。染色され、形質導入されたＢａ／Ｆ３細胞に増殖培地を添加し、１Ｘ ＰＢＳで１回洗浄して、過剰のＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔを除去し、ＲＰＭＩ １６４０完全培地中、同じ平底９６ウェルプレートに約５０，０００細胞／ウェルで播いた。
【０２６０】
標的ＣＴ２６細胞を、染色したＣＥＲ０１＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞と共に、５：１（標的細胞：エフェクター細胞）の比で、３７℃にて３時間、培養した。インキュベーション後、プレートを遠心分離し、培地を、２％ウシ胎仔血清（ｐＨ９）を添加したＰＢＳと交換した。その後、９６ウェルプレートを、ＫＥＹＥＮＣＥ ＢＺ−Ｘ７１０蛍光顕微鏡で、２０倍対物レンズを用いて観察した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入されたＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。インビトロ食細胞作用を示す蛍光顕微鏡写真を、図２１に示す（白色矢印は、食細胞作用事象を示す）。ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識されたＣＴ２６細胞は、エンガルフされるとリソソームの低ｐＨ区画内で蛍光を発した（ピンク色の輪郭）。
【０２６１】
ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ染色領域内でｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄの蛍光を検出するハイブリッドキャプチャーアルゴリズムを蛍光画像に適用して、エンガルフされた標的細胞の面積／ＣＥＲ＋ Ｂ細胞の面積を定量した。図２２は、ＣＥＲ０１＋ＥＧＦＲ＋（図２２Ａ）またはＥＧＦＲ＋対照（図２２Ｂ）を形質導入したＢａ／Ｆ３細胞内のＣＴ２６標的細胞領域を抽出するハイブリッド細胞数のヒストグラムプロットを示す。図２３は、ＣＥＲ０１＋ＥＧＦＲ＋またはＥＧＦＲ＋対照を形質導入したＢａ／Ｆ３細胞内のＣＴ２６標的細胞領域を抽出するハイブリッド細胞数の散布図を示す。面積比率は、Ｂａ／Ｆ３細胞内のＣＴ２６細胞の共局在化面積を表す。ＣＥＲ０１＋ＥＧＦＲ＋またはＥＧＦＲ＋対照を形質導入したＢａ／Ｆ３細胞の食細胞作用の頻度を図２４Ａに示す。ＥＧＦＲｔ形質導入Ｂａ／Ｆ３対照細胞と比較した、ＣＥＲ０１＋Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数を、図２４Ｂに示す。
【０２６２】
Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ０１＋ ＥＧＦＲ＋細胞を、上記のように形質導入し、精製し、増殖させ、そしてＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素で染色した。Ａ２０マウスＢ細胞リンパ腫細胞をスタウロスポリンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで染色し、ＣＴ２６細胞を用いた食細胞作用アッセイについて上述したように、染色されたＣＥＲ０１＋ｔＥＧＦＲ＋細胞を５：１（標的細胞：エフェクター細胞）の比で共培養した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。ＣＴ２６細胞を用いたアッセイについて上述したように、ハイブリッドキャプチャーアルゴリズムを用いて、蛍光顕微鏡法（ＫＥＹＥＮＣＥ ＢＺ−Ｘ７１０蛍光顕微鏡、２０倍対物レンズ）によって食細胞作用事象を定量化した。
【０２６３】
標的Ｔ Ａ２０細胞のインビトロ食細胞作用を示す蛍光顕微鏡画像を図２５に示す（白色矢印は、食細胞作用事象を示す）。図２６は、ＣＥＲ０１＋ ＥＧＦＲ＋（図２６Ａ）またはＥＧＦＲ＋ 対照（図２６Ｂ）を形質導入したＢａ／Ｆ３細胞内のＡ２０標的細胞領域を抽出するハイブリッド細胞数のヒストグラムプロットを示す。図２７は、ＣＥＲ０１＋ＥＧＦＲ＋またはＥＧＦＲ＋対照を形質導入したＢａ／Ｆ３細胞内のＡ２０標的細胞領域を抽出するハイブリッド細胞数の散布図を示す。面積比率は、Ｂａ／Ｆ３細胞内のＡ２０細胞の共局在化面積を表す。ＣＥＲ０１＋ＥＧＦＲ＋またはＥＧＦＲ＋対照を形質導入したＢａ／Ｆ３細胞の食細胞作用の頻度を図２４Ａに示す。ＥＧＦＲｔ形質導入Ｂａ／Ｆ３対照細胞と比較した、ＣＥＲ０１＋Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数を、図２８に示す。
【０２６４】
Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ０１＋ ＥＧＦＲ＋ 細胞もまた、ＣＴ２６細胞についてのアッセイにおいて上記の通り、標的細胞 対 エフェクター細胞の比が５：１で、スタウロスポリン処理したＷＲ１９ＬマウスＴ細胞リンパ腫細胞と共に培養し、３時間共インキュベーションした。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。ＣＥＲ０１＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＷＲ１９Ｌ細胞の食細胞作用は、上記のように蛍光顕微鏡により定量化された。インビトロ食細胞作用を示す蛍光顕微鏡画像を図２９に示す（白色矢印は、食細胞作用事象を示す）。図３０は、ＣＥＲ０１＋ＥＧＦＲ＋（＋ または − スタウロスポリン（ＳＴＳ））またはＥＧＦＲ＋対照を形質導入したＢａ／Ｆ３細胞によるＷＲ１９Ｌ細胞の食細胞作用の頻度を示す。
【０２６５】
ヒト細胞株に対するヒトＣＥＲ０１＋ Ｂ細胞の食細胞作用活性
ヒト初代Ｂ細胞を、形質導入したヒトＢ細胞を標識した抗ＥＧＦＲ抗体（セツキシマブ）を用いてＦＡＣＳにより選別し、その後、Ｋａｔ５−１８抗体（Ｔｉｍ４特異的）（Abcam カタログ番号１７６４８６）で染色したこと以外、Ｂａ／Ｆ３細胞について上述したように形質導入マーカーとして切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉ Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ（ＣＥＲ０１）レンチウイルスで形質導入した（図３１Ａ参照のこと。ここで、右のＦＡＣＳプロットの％は、Ｔｉｍ４結合ドメインを発現する細胞（ＣＥＲ０１）の割合を示す）。精製したＣＥＲ０１＋ Ｂ細胞を増殖させ、２４時間、４８時間および７２時間に画像化し、それを図３１Ｂに示す。
【０２６６】
食細胞作用アッセイを設定する１日前に、ＪｕｒｋａｔヒトＢリンパ球を、６ウェルプレート中、１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加した完全ＲＰＭＩ １６４０増殖培地中で培養し、１ｍＭ スタウロスポリンで３時間処理して、アポトーシスを誘導した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄し、過剰のスタウロスポリンを除去後、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ（ＰＢＳ中、１ｎｇ／μｌ）で、室温にて１５分間染色した。Ｊｕｒｋａｔ細胞に増殖培地を添加し、１回洗浄して、過剰のｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄを除去し、ＲＰＭＩ １６４０完全培地中、平底９６ウェルプレートに約２５０，０００細胞／ウェルで播いた。
【０２６７】
形質導入したヒト初代Ｂ細胞を１Ｘ ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中、１μＭ ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔで、３７℃にて１０分間染色した。ヒト初代Ｂ細胞に増殖培地を添加し、１Ｘ ＰＢＳで１回洗浄し、過剰のＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔを除去し、ＲＰＭＩ １６４０完全培地中、９６ウェルプレートに約５０，０００細胞／ウェルで播いた。ヒト初代Ｂ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞を、標的細胞 対 エフェクター細胞比が５：１で、３７℃にて３時間、共培養した。インキュベーション後、共培養プレートを遠心分離し、培地を、２％ウシ胎仔血清（ｐＨ９）を添加したＰＢＳと交換した。食細胞作用事象を蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ ＢＺ−Ｘ７１０蛍光顕微鏡、２０倍対物レンズ）によって定量した。インビトロ食細胞作用を示す蛍光顕微鏡画像を、ＣＥＲ０１＋ Ｂ細胞について図３２Ａに、ＥＧＦＲ＋対照について図３２Ｂに示す（白色矢印は食細胞作用事象を示す）。
【０２６８】
デュプリケートの９６ウェル共培養プレートもまた、１０：１の標的細胞 対 エフェクター細胞比を用いたフローサイトメトリーによる分析のために、並行して設定した（約３００，０００細胞／ウェルのｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ標識された、スタウロスポリン処理されたＪｕｒｋａｔ細胞を、約３０，０００細胞／ウェル ＣＥＲ０１＋を形質導入したヒト初代Ｂ細胞と共培養した）。共培養プレートを１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培地を１：５０希釈のアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識ＣＤ１９抗体を含有するＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ウシ胎仔血清）と交換して、ヒト初代Ｂ細胞を染色した。ヒト初代Ｂ細胞をＡＰＣ標識したＣＤ１９抗体と共に、４℃にて３０分間インキュベートし、１回洗浄し、細胞培養プレートに、細胞生存率のマーカーとして用いたＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を含むＦＡＣＳ緩衝液を添加した。ＦＡＣＳ分析中、生存ＣＤ１９−ＡＰＣ陽性細胞に対してゲーティングを行い（図３３ 左ＦＡＣＳプロット参照）、食細胞作用事象として定義されるＣＤ１９陽性−ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ陽性事象（二重陽性事象）の頻度を評価した（図３３ 右ＦＡＣＳプロット参照）。図３４は、ＣＥＲ０１＋ＥＧＦＲ＋またはＥＧＦＲ＋対照を形質導入したＢ細胞によるＪｕｒｋａｔ細胞の食細胞作用の頻度を示す。
【０２６９】
化学療法処理したヒト細胞株に対するヒトＣＥＲ０１＋ Ｂ細胞の食細胞作用活性
ヒト初代Ｂ細胞を、上記のように、形質導入マーカーとして切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉ Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ（ＣＥＲ０１）レンチウイルスで形質導入した。食細胞作用アッセイを設定する１日前に、ＪｕｒｋａｔヒトＢリンパ球細胞を、６ウェルプレート中、１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加した完全ＲＰＭＩ １６４０増殖培地中で培養し、オキサリプラチン（５μＭ）およびフルオロウラシル（５−ＦＵ）（１０μＭ）で処理した。翌日、標的Ｊｕｒｋａｔ細胞を回収し、１Ｘ ＰＢＸで２回洗浄し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ（ＰＢＳ中、１ｎｇ／ｍＬ）で、室温にて１５分間、染色した。Ｊｕｒｋａｔ細胞に増殖培地を添加し、１回洗浄し、過剰のｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄを除去して、ＲＰＭＩ １６４０完全培地中、平底９６ウェルプレートに約２００，０００細胞／ウェルで播いた。形質導入したヒト初代Ｂ細胞を１Ｘ ＰＢＳで１回洗浄後、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ（ＰＢＳ中、１ｍＭ）で、３７℃にて１０分間染色した。ヒト初代Ｂ細胞に増殖培地を添加し、１Ｘ ＰＢＳで１回洗浄し、過剰のＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔを除去して、ＲＰＭＩ完全培地中、約５０，０００細胞で９６ウェルプレートに播いた。ヒト初代Ｂ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞を、標的細胞 対 エフェクター細胞比が４：１で、３７℃にて３時間、共培養した。次いで、プレートを、２０倍対物レンズで、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ−Ｘ７１０顕微鏡を用いて画像化した。図３５は、ＣＥＲ０１＋ヒト初代Ｂ細胞による化学療法処理したＪｕｒｋａｔ細胞のエンガルフメントを示す蛍光顕微鏡画像を示す（右の画像は食細胞作用事象の拡大図を示す；白色矢印は食細胞作用を示す）。
【０２７０】
実施例９
ＴＩＭ４−ＴＹＲＯ３ ＣＥＲ“ＣＥＲ０８”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４の細胞外ドメイン（配列番号７３のアミノ酸配列）（一体となって、配列番号５７のポリヌクレオチド配列を有する）を、Ｔｙｒｏ３の細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号４５）に結合させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ０８”（配列番号８３のアミノ酸配列を有するＴｉｍ４−Ｔｙｒｏ３ ＣＥＲ）を作製した。Ｔｙｒｏ３シグナル伝達ドメインは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、ホスファチジルセリン結合受容体である。その後、Ｔｉｍ４−Ｔｙｒｏ３（ＣＥＲ０８）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図３６参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、Ｔｉｍ４−Ｔｙｒｏ３（ＣＥＲ０８）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別し、そして実施例８に記載のようなインビトロ試験に用いた。
【０２７１】
初代培養アポトーシス胸腺細胞に対する食細胞作用活性
実施例８に記載のように、初代培養Ｃ３Ｈマウス胸腺細胞を単離し、デキサメサゾンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで染色した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ０８＋ ｔＥＧＦＲ＋ 細胞を、実施例８に記載のように、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識した。共培養試験を、１０：１の標的細胞 対 エフェクター細胞比で行い、Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ０８＋ ｔＥＧＦＲ＋ 細胞をその食細胞作用について、実施例８に記載のように、蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。
【０２７２】
ＦＡＣＳによって定量化された生存ＣＥＲ０８＋形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞の量を図３７Ａに示す。食細胞作用の頻度を、ＦＡＣＳによって検出されるように、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性に染色される細胞集団として定量化した（図３７Ｂ参照）。
【０２７３】
蛍光顕微鏡検査は、ｔＥＧＦＲ形質導入Ｂａ／Ｆ３対照細胞と比較して、ＣＥＲ０８＋Ｂａ／Ｆ３細胞が、デキサメサゾン処理した胸腺細胞をエンガルフすることを示した（白色矢印は、エンガルフメント事象を示す）（図３８参照）。エンガルフメント事象の拡大画像を図３８の右側に示す。
【０２７４】
食細胞作用指数は、ＥＧＦＲｔで形質導入されたＢａ／Ｆ３対照細胞と比較して、［エンガルフされた標的細胞の総数／計数されたＣＥＲで改変された細胞の総数の平均（例えば、食細胞作用頻度）］に、［ＣＥＲ＋Ｂａ／Ｆ３細胞当たりの標的細胞染色の平均面積×１００（例えば、ハイブリッドキャプチャー）］を乗じることによって計算された（図３９Ａ−Ｂ参照）。
【０２７５】
実施例１０
ＴＩＭ４−ＤＡＰ１２ＣＥＲ“ＣＥＲ０９”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含むホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４の細胞外ドメイン（配列番号７３のアミノ酸配列）（一体となって、配列番号 ５７のポリヌクレオチド配列を有する）を、ＤＡＰ１２の細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号８２）に結合させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ０９”（配列番号８４のアミノ酸配列を有するＴｉｍ４−ＤＡＰ１２ ＣＥＲ）を作製した。ＤＡＰ１２は、エンガルフメントについてのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、ホスファチジルセリン結合受容体である。その後、Ｔｉｍ４−ＤＡＰ１２（ＣＥＲ０９）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図４０参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、Ｔｉｍ４−ＤＡＰ１２（ＣＥＲ０９）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別し、そして実施例８に記載のようなインビトロ試験に用いた。
【０２７６】
初代培養アポトーシス胸腺細胞に対する食細胞作用活性
実施例８に記載のように、初代培養Ｃ３Ｈマウス胸腺細胞を単離し、デキサメサゾンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで染色した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ０９＋ ｔＥＧＦＲ＋ 細胞を、実施例８に記載のように、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素で染色した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ０９＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞および初代培養胸腺細胞の共培養試験を、１０：１の標的細胞 対 エフェクター細胞比で行い、Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ０９＋ ＥＧＦＲ＋ 細胞をその食細胞作用について、実施例８に記載のように、蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。
【０２７７】
ＦＡＣＳによって定量化された生存ＣＥＲ０９＋形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞の量を図４１Ａに示す。食細胞作用の頻度を、ＦＡＣＳによって検出されるように、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性に染色される細胞集団として定量化した（図４１Ｂ参照）。
【０２７８】
蛍光顕微鏡検査は、ｔＥＧＦＲ形質導入Ｂａ／Ｆ３対照細胞と比較して、ＣＥＲ０９＋Ｂａ／Ｆ３細胞が、デキサメサゾン処理した胸腺細胞をエンガルフすることを示した（白色矢印は、エンガルフメント事象を示す）（図４２Ａ−Ｂ参照）。エンガルフメント事象の拡大画像を図４２Ｂの右側に示す。
【０２７９】
食細胞作用指数は、ＥＧＦＲｔで形質導入されたＢａ／Ｆ３対照細胞と比較して、［エンガルフされた標的細胞の総数／計数されたＣＥＲで改変された細胞の総数の平均（例えば、食細胞作用頻度）］に、［ＣＥＲ＋Ｂａ／Ｆ３細胞当たりの標的細胞染色の平均面積×１００（例えば、ハイブリッドキャプチャー）］を乗じることによって計算された（図４３Ａ−Ｂ参照）。
【０２８０】
マウス細胞株に対する食細胞作用活性
Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ０９＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞を、実施例８に記載のように、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識した。ＣＴ２６マウス結腸癌腫細胞を、実施例８に記載のように、スタウロスポリンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識し、Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ０９＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞と共に、標的細胞 対 エフェクター細胞の比が５：１で、３時間共培養した。ＣＥＲ０９＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＣＴ２６細胞の食細胞作用を、実施例８に記載のように、蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。ＣＥＲ０９＋Ｂａ／Ｆ３細胞およびＥＧＦＲｔ＋ 対照細胞によるインビトロの食細胞作用を示す蛍光顕微鏡画像を、図４４Ａ−Ｂに示す（白色矢印は食細胞作用事象を示す）。ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識されたＣＴ２６細胞は、エンガルフされるとリソソームの低ｐＨ区画内で蛍光を発する（ピンク色の輪郭）。
【０２８１】
ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ染色領域内でｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄの蛍光を検出するハイブリッドキャプチャーアルゴリズムを蛍光画像に適用して、エンガルフされた標的細胞の領域／ＣＥＲ＋ Ｂ細胞の領域を定量した。図４５は、ＣＥＲ０９＋ ｔＥＧＦＲ＋またはｔＥＧＦＲ＋対照で形質導入したＢａ／Ｆ３細胞内のＣＴ２６標的細胞領域を抽出するハイブリッド細胞数の散布図を示す。面積比率は、Ｂａ／Ｆ３細胞内のＣＴ２６細胞の共局在化面積を示す。ＥＧＦＲｔ形質導入Ｂａ／Ｆ３対照細胞と比較したＣＥＲ０９＋Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数を図４６に示す。
【０２８２】
実施例８に記載したように、ＷＲ１９Ｌマウスリンパ腫細胞をスタウロスポリンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識し、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ標識したＢａ／Ｆ３ ＣＥＲ０９＋ ＥＧＦＲ＋細胞と共に、標的細胞 対 エフェクター細胞比が５：１で、３時間共培養した。ＣＥＲ０９＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＷＲ１９Ｌ細胞の食細胞作用を、実施例８に記載のように蛍光顕微鏡により定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。ＣＥＲ０９＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＷＲ１９Ｌ細胞のインビトロ食細胞作用を示す蛍光顕微鏡画像が、図４７に示される（白色矢印は食細胞作用事象を示す）。
【０２８３】
実施例８に記載のように、Ａ２０マウスリンパ腫細胞をスタウロスポリンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識し、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ標識したＢａ／Ｆ３ ＣＥＲ０９＋ ＥＧＦＲ＋細胞と共に、標的細胞 対 エフェクター細胞比が５：１で、３時間共培養した。ＣＥＲ０９＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＡ２０細胞の食細胞作用を、実施例８に記載のように蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。ＣＥＲ０９＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＡ２０細胞のインビトロ食細胞作用を示す蛍光顕微鏡画像が、図４８に示される（白色矢印は食細胞作用事象を示す）。
【０２８４】
ヒト細胞株に対するヒトＣＥＲ０９＋ Ｂ細胞の食細胞作用活性
実施例８に記載のように、ヒト初代Ｂ細胞に形質導入マーカーとして切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉ Ｔｉｍ４−ＤＡＰ１２（ＣＥＲ０９）レンチウイルスを形質導入した。形質導入されたヒトＢ細胞を、標識抗ＥＧＦＲ抗体（セツキシマブ）を用いてＦＡＣＳにより選別し、次いで、Ｋａｔ５−１８抗体（Ｔｉｍ４特異的）（Abcam カタログ番号１７６４８６）で染色した（図４９Ａ参照のこと。ここで、右のＦＡＣＳプロットの％は、Ｔｉｍ４結合ドメインを発現する細胞（ＣＥＲ０９）の割合を示す）。精製したＣＥＲ０９＋ Ｂ細胞を増殖させ、２４時間、４８時間および７２時間に画像化し、それを図４９Ｂに示す。
【０２８５】
実施例８に記載のように、食細胞作用アッセイにおいて、Ｊｕｒｋａｔ ヒトＴリンパ球をスタウロスポリンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識し、ＣＥＲ０９＋初代培養Ｂ細胞と共に、標的細胞 対 エフェクター細胞比が５：１で、３時間共インキュベーションした。ＣＥＲ０９＋ ヒトＢ細胞によるＪｕｒｋａｔ細胞の食細胞作用を、実施例８に記載のように、蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより定量した。生存ＣＤ１９陽性ヒト初代Ｂ細胞の頻度およびＣＤ１９陽性‐ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ陽性事象の頻度（二重陽性事象）を、図５０に示す（それぞれ左および右のプロット）。図５１は、ＣＥＲ０９＋ ｔＥＧＦＲ＋またはＥＧＦＲ＋対照を形質導入したＢ細胞の食細胞作用の頻度を示す。
【０２８６】
ＣＥＲ０９＋ ヒト初代Ｂ細胞によるＪｕｒｋａｔ細胞のインビトロ食細胞作用を示す蛍光顕微鏡画像を図５２に示し（左写真）、ｔＥＧＦＲ＋ ヒト初代Ｂ細胞対照によるＪｕｒｋａｔ細胞の食細胞作用を図５２に示す（右写真）（白色矢印は食細胞作用事象を示す）。
【０２８７】
実施例１１
ＴＩＭ４−ＤＡＰ１２−ＤＡＰ１２ ＣＥＲ“ＣＥＲ１０”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、ＤＡＰ１２膜貫通ドメイン（配列番号８１）および細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号８２）と連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ１０”（配列番号８６のアミノ酸配列を有するＴｉｍ４−ＤＡＰ１２−ＤＡＰ１２ＣＥＲ）を作製した。ＤＡＰ１２シグナル伝達ドメインは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、ホスファチジルセリン結合受容体である。その後、Ｔｉｍ４−ＤＡＰ１２−ＤＡＰ１２（ＣＥＲ１０）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、Ｐ２Ａ配列（配列番号１０４）を間に挿入された形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共にｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図５３参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＤＡＰ１２−ＤＡＰ１２（ＣＥＲ１０）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別し、そしてインビトロ試験に用いた。
【０２８８】
初代培養アポトーシス胸腺細胞に対する食細胞作用活性
実施例８に記載のように、初代培養Ｃ３Ｈマウス胸腺細胞を単離し、デキサメサゾンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで染色した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１０＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞を、実施例８に記載のように、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１０＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞および初代培養胸腺細胞を、１０：１の標的細胞 対 エフェクター細胞比で共培養して、Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１０＋ ＥＧＦＲ＋ 細胞を、実施例８に記載のように、蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより標的胸腺細胞の食細胞作用について定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。
【０２８９】
ＦＡＣＳによって定量化された生存ＣＥＲ１０＋形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞の量を図５４Ａに示す。食細胞作用の頻度を、ＦＡＣＳによって検出されるように、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性に染色される細胞集団として定量化した（図５４Ｂ参照）。
【０２９０】
蛍光顕微鏡検査は、ｔＥＧＦＲ形質導入Ｂａ／Ｆ３対照細胞と比較して、ＣＥＲ１０＋Ｂａ／Ｆ３細胞が、デキサメサゾン処理した胸腺細胞をエンガルフすることを示した（白色矢印は、エンガルフメント事象を示す）（図５５Ａ−Ｂ参照）。エンガルフメント事象の拡大図を図５５Ｂの右下側に示す。
【０２９１】
食細胞作用指数は、ＥＧＦＲｔで形質導入されたＢａ／Ｆ３対照細胞と比較して、［エンガルフされた標的細胞の総数／計数されたＣＥＲで改変された細胞の総数の平均（例えば、食細胞作用頻度）］に、［ＣＥＲ＋Ｂａ／Ｆ３細胞当たりの標的細胞染色の平均面積×１００（例えば、ハイブリッドキャプチャー）］を乗じることによって計算された（図５６Ａ−Ｂ参照）。
【０２９２】
実施例１２
ＴＩＭ４−Ａｘｌ ＣＥＲ“ＣＥＲ１１”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、Ａｘｌ細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号４４）に連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ１１”（配列番号８７のアミノ酸配列を有するＴｉｍ４−Ａｘｌ ＣＥＲ）を作製した。Ａｘｌシグナル伝達ドメインは、エンガルフメントについてのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４はホスファチジルセリン結合受容体である。次いで、Ｔｉｍ４−Ａｘｌ（ＣＥＲ１１）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図４９参照）。実施例８に記載のように、マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞に、Ｔｉｍ４−Ａｘｌ（ＣＥＲ１１）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターを形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。インビトロ研究に使用した。
【０２９３】
初代培養アポトーシス胸腺細胞に対する食細胞作用活性
実施例８に記載のように、初代培養Ｃ３Ｈマウス胸腺細胞を単離し、デキサメサゾンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで染色した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１１＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞を、実施例８に記載のように、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１１＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞および初代培養胸腺細胞を、１０：１の標的細胞 対 エフェクター細胞比で共培養して、Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１１＋ ＥＧＦＲ＋ 細胞を、実施例８に記載のように、蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより標的胸腺細胞の食細胞作用について定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。
【０２９４】
ＦＡＣＳによって定量化された生存ＣＥＲ１１＋形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞の量を図５８Ａに示す。食細胞作用の頻度を、ＦＡＣＳによって検出されるように、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性に染色される細胞集団として定量化した（図５８Ｂ参照）。
【０２９５】
蛍光顕微鏡検査は、ｔＥＧＦＲ形質導入Ｂａ／Ｆ３対照細胞と比較して、ＣＥＲ１１＋Ｂａ／Ｆ３細胞が、デキサメサゾン処理した胸腺細胞をエンガルフすることを示した（白色矢印は、エンガルフメント事象を示す）（図５９Ａ−Ｂ参照）。エンガルフメント事象の拡大図を図５９Ｂの右下側に示す。
【０２９６】
食細胞作用指数は、ＥＧＦＲｔで形質導入されたＢａ／Ｆ３対照細胞と比較して、［エンガルフされた標的細胞の総数／計数されたＣＥＲで改変された細胞の総数の平均（例えば、食細胞作用頻度）］に、［ＣＥＲ＋Ｂａ／Ｆ３細胞当たりの標的細胞染色の平均面積×１００（例えば、ハイブリッドキャプチャー）］を乗じることによって計算された（図６０Ａ−Ｂ参照）。
【０２９７】
マウス細胞株に対する食細胞作用活性
実施例８に記載のように、Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１１＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞を、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識した。ＣＴ２６マウス結腸癌腫細胞を、実施例８に記載のように、スタウロスポリンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識し、Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１１＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞と共に、標的細胞 対 エフェクター細胞の比が５：１で、３時間共培養した。ＣＥＲ１１＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＣＴ２６細胞の食細胞作用を、実施例８に記載のように、蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。ＣＥＲ１１＋Ｂａ／Ｆ３細胞およびＥＧＦＲｔ＋ 対照細胞によるインビトロの食細胞作用を示す蛍光顕微鏡画像を、図６１Ａ−Ｂに示す（白色矢印は食細胞作用事象を示す）。ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識されたＣＴ２６細胞は、エンガルフされるとリソソームの低ｐＨ区画内で蛍光を発する（ピンク色の輪郭）。
【０２９８】
ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ染色領域内でｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄの蛍光を検出するハイブリッドキャプチャーアルゴリズムを蛍光画像に適用して、エンガルフされた標的細胞の領域／ＣＥＲ＋ Ｂ細胞の領域を定量した。図６２は、ＣＥＲ１１＋ ｔＥＧＦＲ＋またはｔＥＧＦＲ＋対照で形質導入したＢａ／Ｆ３細胞内のＣＴ２６標的細胞領域を抽出するハイブリッド細胞数の散布図を示す。面積比率は、Ｂａ／Ｆ３細胞内のＣＴ２６細胞の共局在化面積を示す。
【０２９９】
実施例８に記載したように、ＷＲ１９Ｌマウスリンパ腫細胞をスタウロスポリンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識し、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ標識したＢａ／Ｆ３ ＣＥＲ１１＋ ＥＧＦＲ＋細胞と共に、標的細胞 対 エフェクター細胞比が５：１で、３時間共培養した。ＣＥＲ１１＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＷＲ１９Ｌ細胞の食細胞作用を、実施例８に記載のように蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。ＣＥＲ１１＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＷＲ１９Ｌ細胞のインビトロ食細胞作用を示す蛍光顕微鏡画像を図６３に示す（白色矢印は食細胞作用事象を示す）。ＦＡＣＳによって定量化された生存ＣＥＲ１１＋形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞の量を図６４Ａに示す。食細胞作用の頻度を、ＦＡＣＳによって検出されるように、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性に染色される細胞集団として定量化した（図６４Ｂ参照）。
【０３００】
実施例８に記載のように、Ａ２０マウスリンパ腫細胞をスタウロスポリンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識し、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ標識したＢａ／Ｆ３ ＣＥＲ１１＋ ＥＧＦＲ＋細胞と共に、標的細胞 対 エフェクター細胞比が５：１で、３時間共培養した。ＣＥＲ１１＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＡ２０細胞の食細胞作用を、実施例８に記載のように蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。ＥＧＦＲｔで形質導入したＢａ／Ｆ３対照（図６５Ｂ）と比較して、ＣＥＲ１１＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＡ２０細胞のインビトロ食細胞作用を示す蛍光顕微鏡画像を図６５Ａに示す（白色矢印は食細胞作用事象を示す）。ＥＧＦＲｔ＋対照細胞と比較したＣＥＲ１１＋ Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数を計算し、図６６に示す。
【０３０１】
化学療法剤処理したヒト細胞株に対するヒトＣＥＲ１１＋ Ｂ細胞の食細胞作用活性
ヒト初代Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、形質導入マーカーとして切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉ Ｔｉｍ４−Ａｘｌ（ＣＥＲ１１）レンチウイルスで形質導入した。食細胞作用アッセイを設定する１日前に、ＪｕｒｋａｔヒトＢリンパ球細胞を、６ウェルプレート中、１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加した完全ＲＰＭＩ １６４０増殖培地中で培養し、オキサリプラチン（５μＭ）およびフルオロウラシル（５−ＦＵ）（１０μＭ）で処理した。翌日、標的Ｊｕｒｋａｔ細胞を回収し、１Ｘ ＰＢＸで２回洗浄し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ（ＰＢＳ中、１ｎｇ／ｍＬ）で、室温にて１５分間、染色した。Ｊｕｒｋａｔ細胞に増殖培地を添加し、１回洗浄し、過剰のｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄを除去して、ＲＰＭＩ １６４０完全培地中、平底９６ウェルプレートに約２００，０００細胞／ウェルで播いた。形質導入したヒト初代Ｂ細胞を１Ｘ ＰＢＳで１回洗浄後、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ（ＰＢＳ中、１ｍＭ）で、３７℃にて１０分間染色した。ヒト初代Ｂ細胞に増殖培地を添加し、１Ｘ ＰＢＳで１回洗浄し、過剰のＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔを除去して、ＲＰＭＩ完全培地中、約５０，０００細胞で９６ウェルプレートに播いた。ヒト初代Ｂ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞を、標的細胞 対 エフェクター細胞比が４：１で、３７℃にて３時間、共培養した。その後、プレートを、２０倍対物レンズで、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ−Ｘ７１０顕微鏡を用いて画像化した。図６７は、ＣＥＲ１１＋ヒト初代Ｂ細胞による化学療法処理したＪｕｒｋａｔ細胞のエンガルフメントを示す蛍光顕微鏡画像を示す（右の画像は食細胞作用事象の拡大図を示す；白色矢印は食細胞作用を示す）。
【０３０２】
ヒト初代Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、形質導入マーカーとして切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉ Ｔｉｍ４−Ａｘｌ（ＣＥＲ１１）レンチウイルスで形質導入した。食細胞作用アッセイを設定する１日前に、Ｃｏｌｏ３２０ ＨＳＲ結腸癌細胞を、無血清培地中、ホスファチジルセリン誘導化学療法剤ゲムシタビン（１０μＭ）と共に２４時間インキュベートした。処理後の浮遊および接着標的細胞を回収し、遠心分離し、ＰＢＳ中、ｐＨｒｏｄｏ ｒｅｄ（１ｎｇ／μＬ）と共に、室温にて１５分間インキュベートし、洗浄し、その後、非接着性の９６ウェルプレートに播いた。ヒトＣＥＲ１１＋発現Ｂ細胞およびＣｏｌｏ３２０ＨＳＲ細胞を、標的細胞 対 エフェクター細胞比が４：１で、３７℃にて３時間共培養した。その後、プレートを、２０倍対物レンズで、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ−Ｘ７１０顕微鏡を用いて画像化した（図６７参照。白色矢印は食細胞作用を示す）。
【０３０３】
ヒト初代Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、形質導入マーカーとして切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉ Ｔｉｍ４−Ａｘｌ（ＣＥＲ１１）レンチウイルスで形質導入した。食細胞作用アッセイを設定する１日前に、Ａ２０４横紋筋肉腫細胞を、ホスファチジルセリン誘導化学療法剤パクリタキセル中でインキュベートし、Ｈ１７０３非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腺癌細胞を、無血清培地中、ホスファチジルセリン誘導化学療法剤パクリタキセル（３０μＭ）＋ゲムシタビン（１０μＭ）と共に２４時間インキュベートした。処理後の浮遊および接着標的細胞を回収し、遠心分離し、ＰＢＳ中、ｐＨｒｏｄｏ ｒｅｄ（１ｎｇ／μＬ）と共に、室温にて１５分間インキュベートし、洗浄し、その後、非接着性の９６ウェルプレートに播いた。ヒトＣＥＲ１１＋発現Ｂ細胞およびＡ２０４細胞またはＨ１７０３細胞を、標的細胞 対 エフェクター細胞比が４：１で、３７℃にて３時間共培養した。その後、プレートを、２０倍対物レンズで、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ−Ｘ７１０顕微鏡を用いて画像化した（Ａ２０４細胞について図６９参照。Ｈ１７０３細胞について図７０参照。矢印は食細胞作用を示す）。
【０３０４】
実施例１３
ＴＩＭ４−ＦｃεＲ１γ ＣＥＲ“ＣＥＲ１２”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含むホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、ＦｃεＲ１γ 細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号８８）に結合させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ１２”（配列番号９０のアミノ酸配列を有する、Ｔｉｍ４−ＦｃεＲ１γ ＣＥＲ）を作製した。ＦｃεＲ１γシグナル伝達ドメインは、エンガルフメントについてのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４はホスファチジルセリン結合受容体である。その後、Ｔｉｍ４−ＦｃεＲ１γ（ＣＥＲ１２）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図７１参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＦｃεＲ１γ（ＣＥＲ１２）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターを形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３０５】
初代培養アポトーシス胸腺細胞に対する食細胞作用活性
実施例８に記載のように、初代培養Ｃ３Ｈマウス胸腺細胞を単離し、デキサメサゾンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで染色した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１２＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞を、実施例８に記載のように、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１２＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞および初代培養胸腺細胞を、１０：１の標的細胞 対 エフェクター細胞比で共培養して、Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１２＋ ＥＧＦＲ＋ 細胞を、実施例８に記載のように、蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより標的胸腺細胞の食細胞作用について定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。
【０３０６】
ＦＡＣＳによって定量化された生存ＣＥＲ１２＋形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞の量を図７２Ａに示す。食細胞作用の頻度を、ＦＡＣＳによって検出されるように、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性に染色される細胞集団として定量化した（図７２Ｂ参照）。
【０３０７】
蛍光顕微鏡検査は、ｔＥＧＦＲ形質導入Ｂａ／Ｆ３対照細胞と比較して、ＣＥＲ１２＋Ｂａ／Ｆ３細胞が、デキサメサゾン処理した胸腺細胞をエンガルフすることを示した（白色矢印は、エンガルフメント事象を示す）（図７３Ａ−Ｂ参照）。エンガルフメント事象の拡大画像を図７３Ｂの右側に示す。
【０３０８】
食細胞作用指数は、ＥＧＦＲｔで形質導入されたＢａ／Ｆ３対照細胞と比較して、［エンガルフされた標的細胞の総数／計数されたＣＥＲで改変された細胞の総数の平均（例えば、食細胞作用頻度）］に、［ＣＥＲ＋Ｂａ／Ｆ３細胞当たりの標的細胞染色の平均面積×１００（例えば、ハイブリッドキャプチャー）］を乗じることによって計算された（図７４Ａ−Ｂ参照）。
【０３０９】
マウス細胞株に対する食細胞作用活性
実施例８に記載したように、ＷＲ１９Ｌマウスリンパ腫細胞をスタウロスポリンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識し、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ標識したＢａ／Ｆ３ ＣＥＲ１２＋ ＥＧＦＲ＋細胞と共に、標的細胞 対 エフェクター細胞比が５：１で、３時間共培養した。ＣＥＲ１２＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＷＲ１９Ｌ細胞の食細胞作用を、実施例８に記載のように蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。ＣＥＲ１２＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＷＲ１９Ｌ細胞のインビトロ食細胞作用を示す蛍光顕微鏡画像を図７５に示す（白色矢印は食細胞作用事象を示す）。
【０３１０】
実施例８に記載のように、Ａ２０マウスＢ細胞リンパ腫細胞をスタウロスポリンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識し、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ標識したＢａ／Ｆ３ ＣＥＲ１２＋ ＥＧＦＲ＋細胞と共に、標的細胞 対 エフェクター細胞比が５：１で、３時間共培養した。ＣＥＲ１２＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＡ２０細胞の食細胞作用を、実施例８に記載のように蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。ＣＥＲ１２＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＡ２０細胞のインビトロ食細胞作用を示す蛍光顕微鏡画像を図７６に示す（白色矢印は食細胞作用事象を示す）。ＥＧＦＲｔ形質導入Ｂａ／Ｆ３対照細胞と比較したＣＥＲ１２＋ Ｂａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数を計算し、図７７に示す。
【０３１１】
実施例１４
ＴＩＭ４−ＦｃεＲ１γ−ＦｃεＲ１γ ＣＥＲ“ＣＥＲ１３”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）を含むホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、ＦｃεＲ１γ膜貫通ドメイン（配列番号８９のアミノ酸配列）および細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号８８）に結合させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ１３”（配列番号９１のアミノ酸配列を有する、Ｔｉｍ４−ＦｃεＲ１γ−ＦｃεＲ１γ ＣＥＲ）を作製した。ＦｃεＲ１γシグナル伝達ドメインは、エンガルフメントについてのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４はホスファチジルセリン結合受容体である。その後、Ｔｉｍ４−ＦｃεＲ１γ−ＦｃεＲ１γ（ＣＥＲ１３）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図７８参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＦｃεＲ１γ−ＦｃεＲ１γ（ＣＥＲ１３）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターを形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３１２】
初代培養アポトーシス胸腺細胞に対する食細胞作用活性
実施例８に記載のように、初代培養Ｃ３Ｈマウス胸腺細胞を単離し、デキサメサゾンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで染色した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１３＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞を、実施例８に記載のように、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１３＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞および初代培養胸腺細胞を、１０：１の標的細胞 対 エフェクター細胞比で共培養して、Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１３＋ ＥＧＦＲ＋ 細胞を、実施例８に記載のように、蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより標的胸腺細胞の食細胞作用について定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。
【０３１３】
ＦＡＣＳによって定量化された生存ＣＥＲ１３＋形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞の量を図６４Ａに示す。食細胞作用の頻度を、ＦＡＣＳによって検出されるように、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性に染色される細胞集団として定量化した（図６４Ｂ参照）。
【０３１４】
化学療法剤処理したヒト細胞株に対するヒトＣＥＲ１３＋ Ｂ細胞の食細胞作用活性
ヒト初代Ｂ細胞を、実施例１１に記載のように、形質導入マーカーとして切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉ Ｔｉｍ４−ＦｃεＲ１γ−ＦｃεＲ１γ（ＣＥＲ１３）レンチウイルスで形質導入した。食細胞作用アッセイを設定する１日前に、Ｃｏｌｏ３２０ ＨＳＲ結腸癌細胞を、無血清培地中、ホスファチジルセリン誘導化学療法剤ゲムシタビン（１０μＭ）およびパクリタキセル（３０μＭ）と共に２４時間インキュベートした。処理後の浮遊および接着標的細胞を回収し、遠心分離し、ＰＢＳ中、ｐＨｒｏｄｏ ｒｅｄ（１ｎｇ／μＬ）と共に、室温にて１５分間インキュベートし、洗浄し、その後、非接着性の９６ウェルプレートに播いた。ヒトＣＥＲ１３＋発現Ｂ細胞およびＣｏｌｏ３２０ＨＳＲ細胞を、標的細胞 対 エフェクター細胞比が４：１で、３７℃にて３時間共培養した。その後、プレートを、２０倍対物レンズで、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ−Ｘ７１０顕微鏡を用いて画像化した（図８０参照。矢印は食細胞作用を示す）。
【０３１５】
ヒト初代Ｂ細胞を、実施例１１に記載のように、形質導入マーカーとして切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉ Ｔｉｍ４−ＦｃεＲ１γ−ＦｃεＲ１γ（ＣＥＲ１３）レンチウイルスで形質導入した。食細胞作用アッセイを設定する１日前に、Ａ２０４横紋筋肉腫を、ホスファチジルセリン誘導化学療法剤パクリタキセル（３０μＭ）中でインキュベートし、Ｈ１７０３非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腺癌細胞を、無血清培地中、ホスファチジルセリン誘導化学療法剤パクリタキセル（３０μＭ）＋ゲムシタビン（１０μＭ）と共に２４時間インキュベートした。処理後の浮遊および接着標的細胞を回収し、遠心分離し、ＰＢＳ中、ｐＨｒｏｄｏ ｒｅｄ（１ｎｇ／μＬ）と共に、室温にて１５分間インキュベートし、洗浄し、その後、非接着性の９６ウェルプレートに播いた。ヒトＣＥＲ１３＋発現Ｂ細胞およびＡ２０４細胞またはＨ１７０３細胞を、標的細胞 対 エフェクター細胞比が４：１で、３７℃にて３時間共培養した。その後、プレートを、２０倍対物レンズで、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ−Ｘ７１０顕微鏡を用いて画像化した（Ａ２０４細胞について図８１参照。Ｈ１７０３細胞について図８２参照。矢印は食細胞作用を示す）。
【０３１６】
実施例１５
ＴＩＭ４−ＭｙＤ８８ｔ ＣＥＲ“ＣＥＲ１５”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、デスドメインを含むがＴＩＲドメインを欠く切断型ＭｙＤ８８（ＭｙＤ８８ｔ）（配列番号７８）に融合して、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ１５”（配列番号７９のアミノ酸配列を有する、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ ＣＥＲ）を作製した。切断型ＭｙＤ８８は、エンガルフメントについてのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４はホスファチジルセリン結合受容体である。その後、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ（ＣＥＲ１５）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図８３参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ（ＣＥＲ１５）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３１７】
初代培養アポトーシス胸腺細胞に対する食細胞作用活性
実施例８に記載のように、初代培養Ｃ３Ｈマウス胸腺細胞を単離し、デキサメサゾンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで染色した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１５＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞を、実施例８に記載のように、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１５＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞および初代培養胸腺細胞を、１０：１の標的細胞 対 エフェクター細胞比で共培養して、Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１５＋ ＥＧＦＲ＋ 細胞を、実施例８に記載のように、蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより標的胸腺細胞の食細胞作用について定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。
【０３１８】
ＦＡＣＳによって定量化された生存ＣＥＲ１５＋形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞の量を図８４Ａに示す。食細胞作用の頻度を、ＦＡＣＳによって検出されるように、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性に染色される細胞集団として定量化した（図８４Ｂ参照）。
【０３１９】
蛍光顕微鏡検査は、ｔＥＧＦＲ形質導入Ｂａ／Ｆ３対照細胞と比較して、ＣＥＲ１５＋Ｂａ／Ｆ３細胞が、デキサメサゾン処理した胸腺細胞をエンガルフすることを示した（白色矢印は、エンガルフメント事象を示す）（図８５Ａ−Ｂ参照）。エンガルフメント事象の拡大画像を図８５Ｂの右側に示す。
【０３２０】
食細胞作用指数は、ＥＧＦＲｔで形質導入されたＢａ／Ｆ３対照細胞と比較して、［エンガルフされた標的細胞の総数／計数されたＣＥＲで改変された細胞の総数の平均（例えば、食細胞作用頻度）］に、［ＣＥＲ＋Ｂａ／Ｆ３細胞当たりの標的細胞染色の平均面積×１００（例えば、ハイブリッドキャプチャー）］を乗じることによって計算された（図８６Ａ−Ｂ参照）。
【０３２１】
マウス細胞株に対する食細胞作用活性
実施例８に記載のように、Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１５＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞をＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識した。実施例８に記載のように、ＣＴ２６マウス結腸癌腫細胞をスタウロスポリンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識し、Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ１５＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞と共に、標的細胞 対 エフェクター細胞比が５：１で、３時間共培養した。ＣＥＲ１５＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＣＴ２６細胞の食細胞作用を、実施例８に記載のように蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。ＣＥＲ１５＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＣＴ２６細胞のインビトロ食細胞作用を示す蛍光顕微鏡画像を、図８７に示す（白色矢印は食細胞作用事象を示す）。ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識されたＣＴ２６細胞は、エンガルフされるとリソソームの低ｐＨ区画内で蛍光を発する（ピンク色の輪郭）。
【０３２２】
実施例８に記載のように、ＷＲ１９Ｌマウスリンパ腫細胞をスタウロスポリンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識し、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ標識したＢａ／Ｆ３ ＣＥＲ１５＋ ＥＧＦＲ＋細胞と共に、標的細胞 対 エフェクター細胞比が５：１で、３時間共培養した。ＣＥＲ１５＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＷＲ１９Ｌ細胞の食細胞作用を、実施例８に記載のように蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。ＣＥＲ１５＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＷＲ１９Ｌ細胞のインビトロ食細胞作用を示す蛍光顕微鏡画像を図８８に示す（白色矢印は食細胞作用事象を示す）。
【０３２３】
実施例８に記載のように、Ａ２０マウスリンパ腫細胞をスタウロスポリンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識し、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ標識したＢａ／Ｆ３ ＣＥＲ１５＋ ＥＧＦＲ＋細胞と共に、標的細胞 対 エフェクター細胞比が５：１で、３時間共培養した。ＣＥＲ１５＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＡ２０細胞の食細胞作用を、実施例８に記載のように蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。ＣＥＲ１５＋Ｂａ／Ｆ３細胞によるＡ２０細胞のインビトロ食細胞作用を示す蛍光顕微鏡画像を図８９に示す（白色矢印は食細胞作用事象を示す）。
【０３２４】
ヒト細胞株に対するヒトＣＥＲ１５＋ Ｂ細胞の食細胞作用活性
実施例８に記載のように、ヒト初代Ｂ細胞に形質導入マーカーとして切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉ Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ（ＣＥＲ１５）レンチウイルスを形質導入した。形質導入されたヒトＢ細胞を、標識抗ＥＧＦＲ抗体（セツキシマブ）を用いてＦＡＣＳにより選別し、次いで、Ｋａｔ５−１８抗体（Ｔｉｍ４特異的）（Abcam カタログ番号１７６４８６）で染色した（図９０Ａ参照のこと。ここで、右のＦＡＣＳプロットの％は、Ｔｉｍ４結合ドメインを発現する細胞（ＣＥＲ１５）の割合を示す）。精製したＣＥＲ１５＋ Ｂ細胞を増殖させ、２４時間、４８時間および７２時間に画像化し、それを図９０Ｂに示す。
【０３２５】
実施例８に記載のように、食細胞作用アッセイにおいて、Ｊｕｒｋａｔ ヒトＴリンパ球をスタウロスポリンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで標識し、ＣＥＲ１５＋初代培養Ｂ細胞と共に、標的細胞 対 エフェクター細胞比が５：１で、３時間共インキュベーションした。ＣＥＲ１５＋ ヒトＢ細胞によるＪｕｒｋａｔ細胞の食細胞作用を、実施例８に記載のように、蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより定量した。生存ＣＤ１９陽性ヒト初代Ｂ細胞の頻度およびＣＤ１９陽性‐ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ陽性事象の頻度（二重陽性事象）を、図９１に示す（それぞれ左および右のプロット）。図９２は、ＣＥＲ１５＋ ｔＥＧＦＲ＋またはＥＧＦＲ＋対照を形質導入したＢ細胞の食細胞作用の頻度を示す。
【０３２６】
ＣＥＲ１５＋ ヒト初代Ｂ細胞によるＪｕｒｋａｔ細胞のインビトロ食細胞作用を示す蛍光顕微鏡画像を図９３Ａに示し、ｔＥＧＦＲ＋ ヒト初代Ｂ細胞対照によるＪｕｒｋａｔ細胞の食細胞作用を図９３Ｂに示す（白色矢印は食細胞作用事象を示す）。
【０３２７】
実施例１６
ＴＩＭ４−ＭｙＤ８８ ＣＥＲ“ＣＥＲ１６”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、デスドメインおよびＴＩＲドメイン（配列番号５３）を含むＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインに連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ１６”（配列番号８０のアミノ酸配列を有する、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ＣＥＲ）を作製した。ＭｙＤ８８は、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、ホスファチジルセリン結合受容体である。次いで、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８（ＣＥＲ１６）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図９４参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ（ＣＥＲ１６）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３２８】
化学療法剤処理したヒト細胞株に対するヒトＣＥＲ１６＋ Ｂ細胞の食細胞作用活性
ヒト初代Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、形質導入マーカーとして切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉ Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８（ＣＥＲ１６）レンチウイルスで形質導入した。食細胞作用アッセイを設定する１日前に、ＪｕｒｋａｔヒトＢリンパ球細胞を、６ウェルプレート中、１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加した完全ＲＰＭＩ １６４０増殖培地中で培養し、オキサリプラチン（５μＭ）およびフルオロウラシル（５−ＦＵ）（１０μＭ）で処理した。翌日、標的Ｊｕｒｋａｔ細胞を回収し、１Ｘ ＰＢＸで２回洗浄し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ（ＰＢＳ中、１ｎｇ／ｍＬ）で、室温にて１５分間、染色した。Ｊｕｒｋａｔ細胞に増殖培地を添加し、１回洗浄し、過剰のｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄを除去して、ＲＰＭＩ １６４０完全培地中、平底９６ウェルプレートに約２００，０００細胞／ウェルで播いた。形質導入したヒト初代Ｂ細胞を１Ｘ ＰＢＳで１回洗浄後、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔ（ＰＢＳ中、１ｍＭ）で、３７℃にて１０分間染色した。ヒト初代Ｂ細胞に増殖培地を添加し、１Ｘ ＰＢＳで１回洗浄し、過剰のＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔを除去して、ＲＰＭＩ完全培地中、約５０，０００細胞で９６ウェルプレートに播いた。ヒト初代Ｂ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞を、標的細胞 対 エフェクター細胞比が４：１で、３７℃にて３時間、共培養した。その後、プレートを、２０倍対物レンズで、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ−Ｘ７１０顕微鏡を用いて画像化した。図９５は、ＣＥＲ１６＋ヒト初代Ｂ細胞による化学療法処理したＪｕｒｋａｔ細胞のエンガルフメントを示す蛍光顕微鏡画像を示す（白色矢印は食細胞作用を示す）。
【０３２９】
実施例１７
ＴＩＭ４−ＮＦＡＭ１ ＣＥＲ“ＣＥＲ２５”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、ＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメイン（配列番号９２）に連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ２５”（配列番号９３のアミノ酸配列を有する、Ｔｉｍ４−ＮＦＡＭ１ＣＥＲ）を作製した。ＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメインは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４はホスファチジルセリン結合受容体である。次いで、Ｔｉｍ４−ＮＦＡＭ１（ＣＥＲ２５）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図９６参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＮＦＡＭ１（ＣＥＲ２５）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３３０】
初代培養アポトーシス胸腺細胞に対する食細胞作用活性
実施例８に記載のように、初代培養Ｃ３Ｈマウス胸腺細胞を単離し、デキサメサゾンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで染色した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ２５＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞を、実施例８に記載のように、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ２５＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞および初代培養胸腺細胞を、１０：１の標的細胞 対 エフェクター細胞比で共培養して、Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ２５＋ ＥＧＦＲ＋ 細胞を、実施例８に記載のように、蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより標的胸腺細胞の食細胞作用について定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。
【０３３１】
ＦＡＣＳによって定量化された生存ＣＥＲ２５＋形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞を図９７に示す。デキサメサゾン処理した胸腺細胞と共培養したＣＥＲ２５＋Ｂａ／Ｆ３細胞による食細胞作用の頻度を、ＦＡＣＳによって検出されるように、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性に染色される細胞集団として定量化した（図９７Ｂ参照）。切断型ＥＧＦＲを形質導入し、デキサメタゾン処理した胸腺細胞と共培養した対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての二重陽性染色細胞の頻度を図９７Ａに示す。
【０３３２】
蛍光顕微鏡検査は、ｔＥＧＦＲ形質導入Ｂａ／Ｆ３対照細胞と比較して、ＣＥＲ２５＋Ｂａ／Ｆ３細胞が、デキサメサゾン処理した胸腺細胞をエンガルフすることを示した（白色矢印は、エンガルフメント事象を示す）（図９８参照。エンガルフメント事象の拡大画像を図９８の右側に示す）。
【０３３３】
食細胞作用指数は、ＥＧＦＲｔで形質導入されたＢａ／Ｆ３対照細胞と比較して、［エンガルフされた標的細胞の総数／計数されたＣＥＲで改変された細胞の総数の平均（例えば、食細胞作用頻度）］に、［ＣＥＲ＋Ｂａ／Ｆ３細胞当たりの標的細胞染色の平均面積×１００（例えば、ハイブリッドキャプチャー）］を乗じることによって計算された（図９９参照）。
【０３３４】
実施例１８
ＴＩＭ４−ＭｙＤ８８ｔ−ＢＡＦＦＲ ＣＥＲ “ＣＥＲ８５”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、切断型ＭｙＤ８８（配列番号７８）を含む第一のシグナル伝達ドメインおよびＢＡＦＦ−Ｒシグナル伝達ドメイン（配列番号９４）を含む第二のシグナル伝達ドメインに連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ８５”（配列番号９５のアミノ酸配列を有する、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ−ＢＡＦＦＲ ＣＥＲ）を作製した。ＭｙＤ８８ｔまたはＢＡＦＦ−Ｒシグナル伝達ドメインは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、ホスファチジルセリン結合受容体である。次いで、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ−ＢＡＦＦ４（ＣＥＲ８５）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図１００参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ−ＢＡＦＦＲ（ＣＥＲ８５）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３３５】
初代培養アポトーシス胸腺細胞に対する食細胞作用活性
実施例８に記載のように、初代培養Ｃ３Ｈマウス胸腺細胞を単離し、デキサメサゾンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで染色した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ８５＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞を、実施例８に記載のように、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ８５＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞および初代培養胸腺細胞を、１０：１の標的細胞 対 エフェクター細胞比で共培養して、Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ８５＋ ＥＧＦＲ＋ 細胞を、実施例８に記載のように、蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより標的胸腺細胞の食細胞作用について定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。
【０３３６】
ＦＡＣＳによって定量化された生存ＣＥＲ８５＋形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞の量を図１０１に示す。デキサメサゾン処理した胸腺細胞と共培養したＣＥＲ８５＋Ｂａ／Ｆ３細胞による食細胞作用の頻度を、ＦＡＣＳによって検出されるように、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性に染色される細胞集団として定量化した（図１０１Ａ参照）。切断型ＥＧＦＲを形質導入し、デキサメタゾン処理した胸腺細胞と共培養した対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての二重陽性染色細胞の頻度を図１０１Ｂに示す。
【０３３７】
蛍光顕微鏡検査は、ｔＥＧＦＲ形質導入Ｂａ／Ｆ３対照細胞と比較して、ＣＥＲ８５＋Ｂａ／Ｆ３細胞が、デキサメサゾン処理した胸腺細胞をエンガルフすることを示した（白色矢印は、エンガルフメント事象を示す）（図１０２参照。エンガルフメント事象の拡大画像を図１０２の右側に示す）。
【０３３８】
食細胞作用指数は、ＥＧＦＲｔで形質導入されたＢａ／Ｆ３対照細胞と比較して、［エンガルフされた標的細胞の総数／計数されたＣＥＲで改変された細胞の総数の平均（例えば、食細胞作用頻度）］に、［ＣＥＲ＋Ｂａ／Ｆ３細胞当たりの標的細胞染色の平均面積×１００（例えば、ハイブリッドキャプチャー）］を乗じることによって計算された（図１０３参照）。
【０３３９】
実施例１９
ＴＩＭ４−ＭｙＤ８８ｔ−ＤＡＰ１２ ＣＥＲ“ＣＥＲ８６”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、切断型ＭｙＤ８８（配列番号７８）を含む第一のシグナル伝達ドメインおよびＤＡＰ１２シグナル伝達ドメイン（配列番号８２）を含む第二のシグナル伝達ドメインに連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ８６”（配列番号９６のアミノ酸配列を有する、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ−ＤＡＰ１２ＣＥＲ）を作製した。ＭｙＤ８８ｔまたはＤＡＰ１２シグナル伝達ドメインは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、ホスファチジルセリン結合受容体である。次いで、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ−ＤＡＰ（ＣＥＲ８６）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図１０４参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ−ＤＡＰ１２（ＣＥＲ８６）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３４０】
実施例２０
ＴＩＭ４−ＢＡＦＦＲ−ＭＹＤ８８ ＣＥＲ“ＣＥＲ８７”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、ＢＡＦＦ−Ｒシグナル伝達ドメイン（配列番号９４）を含む第一のシグナル伝達ドメインおよび切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン（配列番号７８）を含む第二のシグナル伝達ドメインに連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ８７”（配列番号１３０のアミノ酸配列を有する、Ｔｉｍ４−ＢＡＦＦＲ−ＭｙＤ８８ ＣＥＲ）を作製した。ＢＡＦＦ−Ｒまたは切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、ホスファチジルセリン結合受容体である。次いで、Ｔｉｍ４−ＢＡＦＦＲ−ＭｙＤ８８（ＣＥＲ８７）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図１０５参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＢＡＦＦＲ−ＭｙＤ８８（ＣＥＲ８７）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３４１】
初代培養アポトーシス胸腺細胞に対する食細胞作用活性
実施例８に記載のように、初代培養Ｃ３Ｈマウス胸腺細胞を単離し、デキサメサゾンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで染色した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ８７＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞を、実施例８に記載のように、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ８７＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞および初代培養胸腺細胞を、１０：１の標的細胞 対 エフェクター細胞比で共培養して、Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ８７＋ ＥＧＦＲ＋ 細胞を、実施例８に記載のように、蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより標的胸腺細胞の食細胞作用について定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。
【０３４２】
ＦＡＣＳによって定量化された生存ＣＥＲ８７＋形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞の量を図１０６に示す。デキサメサゾン処理した胸腺細胞と共培養したＣＥＲ８７＋Ｂａ／Ｆ３細胞による食細胞作用の頻度を、ＦＡＣＳによって検出されるように、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性に染色される細胞集団として定量化した（図１０６Ｂ参照）。切断型ＥＧＦＲを形質導入し、デキサメタゾン処理した胸腺細胞と共培養した対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての二重陽性染色細胞の頻度を図１０６Ａに示す。
【０３４３】
蛍光顕微鏡検査は、ｔＥＧＦＲ形質導入Ｂａ／Ｆ３対照細胞と比較して、ＣＥＲ８７＋Ｂａ／Ｆ３細胞が、デキサメサゾン処理した胸腺細胞をエンガルフすることを示した（白色矢印は、エンガルフメント事象を示す）（図１０７参照）。エンガルフメント事象の拡大画像を図１０７の右側に示す。
【０３４４】
食細胞作用指数は、ＥＧＦＲｔで形質導入されたＢａ／Ｆ３対照細胞と比較して、［エンガルフされた標的細胞の総数／計数されたＣＥＲで改変された細胞の総数の平均（例えば、食細胞作用頻度）］に、［ＣＥＲ＋Ｂａ／Ｆ３細胞当たりの標的細胞染色の平均面積×１００（例えば、ハイブリッドキャプチャー）］を乗じることによって計算された（図１０８参照）。
【０３４５】
実施例２１
ＴＩＭ４−ＤＡＰ１２−ＭＹＤ８８ ＣＥＲ“ＣＥＲ８８”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、ＤＡＰ１２シグナル伝達ドメイン（配列番号８２）を含む第一のシグナル伝達ドメインおよび切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン（配列番号７８）を含む第二のシグナル伝達ドメインに連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ８８”（配列番号１３１のアミノ酸配列を有する、Ｔｉｍ４−ＤＡＰ１２−ｔＭｙＤ８８ ＣＥＲ）を作製した。ＤＡＰ１２または切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、ホスファチジルセリン結合受容体である。次いで、Ｔｉｍ４−ＤＡＰ１２−ＭｙＤ８８（ＣＥＲ８８）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図１０９参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＤＡＰ１２−ＭｙＤ８８（ＣＥＲ８８）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３４６】
実施例２２
ＴＩＭ４−ＭＹＤ８８ｔ−ＣＤ７９ｂ ＣＥＲ“ＣＥＲ８９”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン（配列番号７８）を含む第一のシグナル伝達ドメインおよびＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメイン（配列番号９７）を含む第二のシグナル伝達ドメインに連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ８９”（配列番号９８のアミノ酸配列を有する、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ−ＣＤ７９ｂ ＣＥＲ）を作製した。ＭｙＤ８８ｔまたはＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、ホスファチジルセリン結合受容体である。次いで、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ−ＣＤ７９ｂ（ＣＥＲ８９）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図１１０参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ−ＣＤ７９ｂ（ＣＥＲ８９）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３４７】
実施例２３
ＴＩＭ４−ＭＹＤ８８ｔ−ＮＦＡＭ１ ＣＥＲ“ＣＥＲ９０”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン（配列番号７８）を含む第一のシグナル伝達ドメインおよびＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメイン（配列番号９２）を含む第二のシグナル伝達ドメインに連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ９０”（配列番号１００のアミノ酸配列を有する、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ−ＮＦＡＭ１ ＣＥＲ）を作製した。ＭｙＤ８８ｔまたはＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメインは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、ホスファチジルセリン結合受容体である。次いで、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ−ＮＦＡＭ１（ＣＥＲ９０）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図１１１参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ−ＮＦＡＭ１（ＣＥＲ９０）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３４８】
実施例２４
ＴＩＭ４−ＭＹＤ８８ｔ−Ｐ２Ａ−ＲＡＢ５Ａ ＣＥＲ “ＣＥＲ９１”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン（配列番号７８）に連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ９１”を作製した。ＭｙＤ８８ｔシグナル伝達ドメインは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、ホスファチジルセリン結合受容体である。次いで、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ（ＣＥＲ９１）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、Ｒａｂ５ａおよび形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｐ２Ａ配列およびＴ２Ａ配列をそれぞれ間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図１１２参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ−Ｒａｂ５ａ（ＣＥＲ９１）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３４９】
初代培養アポトーシス胸腺細胞に対する食細胞作用活性
実施例８に記載のように、初代培養Ｃ３Ｈマウス胸腺細胞を単離し、デキサメサゾンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで染色した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ９１＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞を、実施例８に記載のように、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ９１＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞および初代培養胸腺細胞を、１０：１の標的細胞 対 エフェクター細胞比で共培養して、Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ９１＋ ＥＧＦＲ＋ 細胞を、実施例８に記載のように、蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより標的胸腺細胞の食細胞作用について定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。
【０３５０】
ＦＡＣＳによって定量化された生存ＣＥＲ９１＋形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞の量を図１１３に示す。デキサメサゾン処理した胸腺細胞と共培養したＣＥＲ９１＋Ｂａ／Ｆ３細胞による食細胞作用の頻度を、ＦＡＣＳによって検出されるように、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性に染色される細胞集団として定量化した（図１１３Ａ参照）。切断型ＥＧＦＲを形質導入し、デキサメタゾン処理した胸腺細胞と共培養した対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての二重陽性染色細胞の頻度を図１１３Ｂに示す。
【０３５１】
蛍光顕微鏡検査は、ｔＥＧＦＲ形質導入Ｂａ／Ｆ３対照細胞と比較して、ＣＥＲ９１＋Ｂａ／Ｆ３細胞が、デキサメサゾン処理した胸腺細胞をエンガルフすることを示した（白色矢印は、エンガルフメント事象を示す）（図１１４参照）。エンガルフメント事象の拡大図を図１１４の右側に示す。
【０３５２】
食細胞作用指数は、ＥＧＦＲｔで形質導入されたＢａ／Ｆ３対照細胞と比較して、［エンガルフされた標的細胞の総数／計数されたＣＥＲで改変された細胞の総数の平均（例えば、食細胞作用頻度）］に、［ＣＥＲ＋Ｂａ／Ｆ３細胞当たりの標的細胞染色の平均面積×１００（例えば、ハイブリッドキャプチャー）］を乗じることによって計算された（図１１５参照）。
【０３５３】
実施例２５
ＴＩＭ４−ＭＥＲＴＫ−ＭＹＤ８８ ＣＥＲ “ＣＥＲ９２”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメイン（配列番号６９）を含む第一のシグナル伝達ドメインおよび切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン（配列番号７８）を含む第二のシグナル伝達ドメインに連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ９２”（配列番号１３３のアミノ酸配列を有する、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ−ｔＭｙＤ８８ ＣＥＲ）を作製した。ＭＥＲＴＫまたは切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、ホスファチジルセリン結合受容体である。次いで、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ−ｔＭｙＤ８８ｔ（ＣＥＲ９２）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図１１６参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ−ｔＭｙＤ８８（ＣＥＲ９２）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３５４】
初代培養アポトーシス胸腺細胞に対する食細胞作用活性
実施例８に記載のように、初代培養Ｃ３Ｈマウス胸腺細胞を単離し、デキサメサゾンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで染色した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ９２＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞を、実施例８に記載のように、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ９２＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞および初代培養胸腺細胞を、１０：１の標的細胞 対 エフェクター細胞比で共培養して、Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ９２＋ ＥＧＦＲ＋ 細胞を、実施例８に記載のように、蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより標的胸腺細胞の食細胞作用について定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。
【０３５５】
ＦＡＣＳによって定量化された生存ＣＥＲ９２＋形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞の量を図１１７に示す。ＣＥＲ９２＋Ｂａ／Ｆ３細胞による食細胞作用の頻度を、ＦＡＣＳによって検出されるように、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性に染色される細胞集団として定量化した（図１１７Ａ参照）。切断型ＥＧＦＲを形質導入し、デキサメタゾン処理した胸腺細胞と共培養した対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての二重陽性染色細胞の頻度を図１１７Ｂに示す。
【０３５６】
蛍光顕微鏡検査は、ｔＥＧＦＲ形質導入Ｂａ／Ｆ３対照細胞と比較して、ＣＥＲ９２＋Ｂａ／Ｆ３細胞が、デキサメサゾン処理した胸腺細胞をエンガルフすることを示した（白色矢印は、エンガルフメント事象を示す）（図１１８参照）。エンガルフメント事象の拡大図を図１１８の右側に示す。
【０３５７】
食細胞作用指数は、ＥＧＦＲｔで形質導入されたＢａ／Ｆ３対照細胞と比較して、［エンガルフされた標的細胞の総数／計数されたＣＥＲで改変された細胞の総数の平均（例えば、食細胞作用頻度）］に、［ＣＥＲ＋Ｂａ／Ｆ３細胞当たりの標的細胞染色の平均面積×１００（例えば、ハイブリッドキャプチャー）］を乗じることによって計算された（図１１９参照）。
【０３５８】
実施例２６
ＴＩＭ４−ＭＥＲＴＫ−ＢＡＦＦＲ ＣＥＲ “ＣＥＲ９３”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメイン（配列番号４３のアミノ酸配列）を含む第一のシグナル伝達ドメインおよびＢＡＦＦ−Ｒ（配列番号９４のアミノ酸配列）を含む第二のシグナル伝達ドメインに連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ９３”（配列番号１０３のアミノ酸配列を有する、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ−ＢＡＦＦＲ ＣＥＲ）を作製した。ＭＥＲＴＫまたはＢＡＦＦ−Ｒシグナル伝達ドメインは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、ホスファチジルセリン結合受容体である。次いで、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ−ＢＡＦＦＲ（ＣＥＲ９３）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図１２０参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ−ＢＡＦＦＲ（ＣＥＲ９３）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３５９】
初代培養アポトーシス胸腺細胞に対する食細胞作用活性
実施例８に記載のように、初代培養Ｃ３Ｈマウス胸腺細胞を単離し、デキサメサゾンで処理し、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄで染色した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ９３＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞を、実施例８に記載のように、ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ色素で標識した。Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ９３＋ ｔＥＧＦＲ＋細胞および初代培養胸腺細胞を、１０：１の標的細胞 対 エフェクター細胞比で共培養して、Ｂａ／Ｆ３ ＣＥＲ９３＋ ＥＧＦＲ＋ 細胞を、実施例８に記載のように、蛍光顕微鏡およびＦＡＣｓにより標的胸腺細胞の食細胞作用について定量した。切断型ＥＧＦＲを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を陰性対照として用いた。
【０３６０】
ＦＡＣＳによって定量化された生存ＣＥＲ９３＋形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞の量を図１２１に示す。ＣＥＲ９３＋Ｂａ／Ｆ３細胞による食細胞作用の頻度を、ＦＡＣＳによって検出されるように、ｐＨｒｏｄｏ ＲｅｄおよびＣＥＬＬＴＲＡＣＥ Ｖｉｏｌｅｔについて二重陽性に染色される細胞集団として定量化した（図１２１Ａ参照）。切断型ＥＧＦＲを形質導入し、デキサメタゾン処理した胸腺細胞と共培養した対照Ｂａ／Ｆ３細胞についての二重陽性染色細胞の頻度を図１２１Ｂに示す。
【０３６１】
蛍光顕微鏡検査は、ｔＥＧＦＲ形質導入Ｂａ／Ｆ３対照細胞と比較して、ＣＥＲ９３＋Ｂａ／Ｆ３細胞が、デキサメサゾン処理した胸腺細胞をエンガルフすることを示した（白色矢印は、エンガルフメント事象を示す）（図１２２参照）。エンガルフメント事象の拡大図を図１２２の右側に示す。
【０３６２】
食細胞作用指数は、ＥＧＦＲｔで形質導入されたＢａ／Ｆ３対照細胞と比較して、［エンガルフされた標的細胞の総数／計数されたＣＥＲで改変された細胞の総数の平均（例えば、食細胞作用頻度）］に、［ＣＥＲ＋Ｂａ／Ｆ３細胞当たりの標的細胞染色の平均面積×１００（例えば、ハイブリッドキャプチャー）］を乗じることによって計算された（図１２３参照）。
【０３６３】
実施例２７
ＴＩＭ４−ＭＥＲＴＫ−ＤＡＰ１２ ＣＥＲ“ＣＥＲ９４”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメイン（配列番号４３のアミノ酸配列）を含む第一のシグナル伝達ドメインおよびＤＡＰ１２シグナル伝達ドメイン（配列番号８２のアミノ酸配列）を含む第二のシグナル伝達ドメインに連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ９４”（配列番号１３４のアミノ酸配列を有する、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ−ＤＡＰ１２ ＣＥＲ）を作製した。ＭＥＲＴＫまたはＤＡＰ１２シグナル伝達ドメインは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、ホスファチジルセリン結合受容体である。次いで、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ−ＤＡＰ１２（ＣＥＲ９４）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図１２４参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ−ＤＡＰ１２（ＣＥＲ９４）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３６４】
実施例２８
ＴＩＭ４−ＡＸＬ−ＤＡＰ１２ ＣＥＲ“ＣＥＲ９７”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、Ａｘｌシグナル伝達ドメイン（配列番号４４）を含む第一のシグナル伝達ドメインおよびＤＡＰ１２シグナル伝達ドメイン（配列番号８２）を含む第二のシグナル伝達ドメインに連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ９７”（配列番号１５２のアミノ酸配列を有する、Ｔｉｍ４−ＡＸＬ−ＤＡＰ１２ ＣＥＲ）を作製した。ＡＸＬまたはＤＡＰ１２シグナル伝達ドメインは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、ホスファチジルセリン結合受容体である。次いで、Ｔｉｍ４−ＡＸＬ−ＤＡＰ１２（ＣＥＲ９７）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図１２５参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＡＸＬ−ＤＡＰ１２（ＣＥＲ９７）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３６５】
実施例２９
ＴＩＭ４−ＡＸＬ−ＣＤ７９ｂ ＣＥＲ“ＣＥＲ９８”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、Ａｘｌシグナル伝達ドメイン（配列番号４４のアミノ酸配列）を含む第一のシグナル伝達ドメインおよびＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメイン（配列番号９７のアミノ酸配列）を含む第二のシグナル伝達ドメインに連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ９８”（配列番号１５３のアミノ酸配列を有する、Ｔｉｍ４−ＡＸＬ−ＣＤ７９ｂ ＣＥＲ）を作製した。ＡＸＬまたはＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、ホスファチジルセリン結合受容体である。次いで、Ｔｉｍ４−ＡＸＬ−ＣＤ７９ｂ（ＣＥＲ９８）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図１２６参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＡＸＬ−ＣＤ７９ｂ（ＣＥＲ９８）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３６６】
実施例３０
ＴＩＭ４−ＭＥＲＴＫ−ＣＤ７９ｂ ＣＥＲ“ＣＥＲ９５”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメイン（配列番号４３のアミノ酸配列）を含む第一のシグナル伝達ドメインおよびＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメイン（配列番号９７のアミノ酸配列）を含む第二のシグナル伝達ドメインに連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ９５”（配列番号１０１のアミノ酸配列を有する、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ−ＣＤ７９ｂ ＣＥＲ）を作製した。ＭＥＲＴＫまたはＣＤ７９ｂシグナル伝達ドメインは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、ホスファチジルセリン結合受容体である。次いで、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ−ＣＤ７９ｂ（ＣＥＲ９５）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図１２７参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ−ＣＤ７９ｂ（ＣＥＲ９５）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３６７】
実施例３１
ＴＩＭ４−ＭＥＲＴＫ−ＮＦＡＭ１ ＣＥＲ“ＣＥＲ９６”の構築
シグナルペプチド（配列番号７２のアミノ酸配列）および膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）を含む、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４（配列番号７３のアミノ酸配列）の細胞外ドメインを、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメイン（配列番号４３）を含む第一のシグナル伝達ドメインおよびＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメイン（配列番号９９）を含む第二のシグナル伝達ドメインに連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ９６”（配列番号１０２のアミノ酸配列を有する、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ−ＮＦＡＭ１ ＣＥＲ）を作製した。ＭＥＲＴＫまたはＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメインは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｔｉｍ４は、ホスファチジルセリン結合受容体である。次いで、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ−ＮＦＡＭ１（ＣＥＲ９６）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した（図１２８参照）。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｔｉｍ４−ＭＥＲＴＫ−ＮＦＡＭ１（ＣＥＲ９６）およびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３６８】
シグナルペプチドおよび膜貫通ドメインを含むホスファチジルセリン結合タンパク質Ｔｉｍ４の細胞外ドメインを有するＣＥＲ９６の変異体も構築し、ＭＥＲＴＫシグナル伝達ドメインを含む第一のシグナル伝達ドメインおよび切断型ＮＦＡＭ１シグナル伝達ドメインを含む第二のシグナル伝達ドメインを融合させて、配列番号１１６のアミノ酸配列を有する、キメラエンガルフメント受容体ＣＥＲ９６ｔを作製した。
【０３６９】
実施例３２
Ｍ９１２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４−Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ ＣＥＲ“ＣＥＲ５０”の構築
シグナルペプチド（配列番号８５のアミノ酸配列）を含むメソテリン特異的ヒトモノクローナル抗体Ｍ９１２（Feng et al., 2009, Mol, Cancer Ther. 8:1113-1118）（配列番号１０６のアミノ酸配列）由来のｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを、修飾されたＩｇＧ４ヒンジ領域の細胞外スペーサードメイン（配列番号６７）、Ｔｉｍ４膜貫通ドメイン（配列番号７４のアミノ酸配列）および切断型ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン（配列番号６９）に連結させて、キメラエンガルフメント受容体“ＣＥＲ５０”（配列番号１０７のアミノ酸配列を有する、Ｍ９１２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４−Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ ＣＥＲ）を作製した。ＭｙＤ８８ｔシグナル伝達ドメインは、エンガルフメントのためのシグナルを伝達し、Ｍ９１２ｓｃＦｖは、細胞表面結合メソテリンに結合する。次いで、Ｍ９１２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４−Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔ ＣＥＲ（ＣＥＲ５０）キメラエンガルフメント受容体ヌクレオチド配列を、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲと共に、Ｔ２Ａ配列を間に挿入して、ｐＬｅｎｔｉレンチウイルスベクターに挿入した。マウスＢａ／Ｆ３ Ｂ細胞を、実施例８に記載のように、Ｍ９１２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４−Ｔｉｍ４−ＭｙＤ８８ｔおよびＥＧＦＲｔを発現するｐＬｅｎｔｉベクターで形質導入し、増殖させ、ＦＡＣｓにより選別して、インビトロ試験に用いた。
【０３７０】
実施例３３
インビトロ食細胞作用データの編集
上記のように実施された様々な細胞タイプについてのＣＥＲ＋改変Ｂａ／Ｆ３細胞についての食細胞作用データを集めた。図１２９は、デキサメサゾン処理した初代培養胸腺細胞と共培養した、ＣＥＲ０１、ＣＥＲ０８、ＣＥＲ０９、ＣＥＲ１０、ＣＥＲ１１、ＣＥＲ１２、ＣＥＲ１５またはＥＧＦＲｔ対照を形質導入したＢａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数を示す。図１３０は、スタウロスポリン処理したＣＴ２６結腸癌腫細胞と共培養した、ＣＥＲ０１、ＣＥＲ０９、ＣＥＲ１１、ＣＥＲ１２、ＣＥＲ１５またはＥＧＦＲｔ対照を形質導入したＢａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数を示す。図１３１は、スタウロスポリン処理したＡ２０リンパ腫細胞と共培養した、ＣＥＲ０１、ＣＥＲ０９、ＣＥＲ１１、ＣＥＲ１２、ＣＥＲ１５またはＥＧＦＲｔ対照を形質導入したＢａ／Ｆ３細胞の食細胞作用指数を示す。
【０３７１】
実施例３４
リンパ腫マウスモデルにおけるＣＥＲ０１の食細胞作用活性
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするヌクレオチド配列と共に、配列番号７１のアミノ酸配列を有するＣＥＲ０１をコードするＴｉｍ４−ＭＥＲＴＫ ＣＥＲヌクレオチド配列（図６Ａも参照）を、ｐＭＳＣＶレトロウイルスベクターに挿入した。リンパ腫マウスモデルにおける放射線療法およびＣＥＲ免疫療法の併用療法レジメンのスケジュールを図１３２Ａに示す。
【０３７２】
０．５ ｘ １０６個の３８ｃ１３マウスＢ細胞リンパ腫細胞を、ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）免疫不全マウスに移植した。移植の４日後、マウスに、腫瘍部位への５Ｇｙの局所照射を行い、次いで、６ ｘ １０６個のＣＥＲ０１＋形質導入マウスＴ細胞（Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ−ＭＴＶ−陰性マウス由来）を静脈内注射した。腫瘍サイズを精密なキャリパーを用いて二次元で測定し、ＣＥＲ０１＋形質導入Ｔ細胞の注射後４日目にルシフェラーゼイメージングを行った。ｐＭＳＣＶ空レトロウイルスベクターを形質導入したＴ細胞を対照として用いた。図１３２Ｂのグラフに示すように、ホスファチジルセリンを標的とするＣＥＲ改変Ｔ細胞は、低線量放射線療法との相乗作用を示した。図１３２Ｃに示す写真において、ホスファチジルセリンを標的とするＣＥＲ改変Ｔ細胞および低線量放射線の併用療法を受けているマウスでは、腫瘍増殖が減少した。
【０３７３】
リンパ腫のマウスモデルにおけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）免疫療法およびＣＥＲ免疫療法のための代替の併用療法レジメンのスケジュールを図１３３Ａに示す。０．５ ｘ １０６ ３８ｃ１３リンパ腫細胞を、ＮＳＧ免疫不全マウスに移植した。移植の４日後、マウスに、５ ｘ １０６個のマウスＣＤ１９−標的化ＣＡＲ−Ｔ細胞（抗ＣＤ１９ １Ｄ３ ｓｃＦｖ、ＣＤ３−ζ細胞質ドメインおよびＣＤ２８細胞質ドメインを有する“１Ｄ３ １９ｚ２８” ＣＡＲ）を注射した。ＣＡＲ改変Ｔ細胞の注射後３日目に、６ ｘ １０６個のＣＥＲ０１＋形質導入Ｔ細胞をマウスに注射した。腫瘍サイズを精密なキャリパーを用いて二次元で測定し、ＣＥＲ０１＋形質導入Ｔ細胞またはＣＥＲ０１＋形質導入Ｂ細胞の注射後４日目にルシフェラーゼイメージングを行った（図１３３Ｂの下部の表示を参照のこと）。ｐＭＳＣＶ空レトロウイルスベクターを形質導入したＴ細胞を対照として用いた。図１３３Ｂに示すように、ＰｔｄＳｅｒ＋を標的とするＣＥＲ＋ Ｔ細胞またはＣＥＲ＋ Ｂ細胞は、低用量のＣＡＲ改変Ｔ細胞療法との相乗作用を示した。
【０３７４】
上記の種々の態様は、さらなる態様を提供するために組み合わせることができる。２０１６年９月２７日出願の米国特許出願第６２／４００，５７８および２０１７年１月１１日出願の米国特許出願第６２／４４５，２３５を含む、本明細書で言及される、および／または出願データシートに記載されている、全ての米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許文献は、引用によりその内容全体を本明細書中に包含される。複数の態様の複数の側面は、必要に応じて、さらに別の態様を提供するために様々な特許、特許出願および刊行物の概念を採用して変更することができる。
【０３７５】
上記の詳細な説明に照らして、これらおよび他の変更を態様に加えることができる。一般的に、添付の特許請求の範囲において、用いる用語は、特許請求の範囲を明細書および特許請求の範囲に記載された特定の態様に限定するように解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲と共にすべての可能な形態を含むものとして解釈されるべきである。従って、特許請求の範囲は本明細書の記載によって限定されない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【図１２２】
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【図１２３】
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【図１２４】
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【図１２５】
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【図１２６】
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【図１２７】
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【図１２８】
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【図１２９】
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【図１３０】
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【図１３１】
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【図１３２Ａ】
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【図１３２Ｂ】
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【図１３２Ｃ】
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【図１３３Ａ】
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【図１３３Ｂ】
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【図１３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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