(57)【要約】改善されたｄｓＲＮＡのインビボ産生のための方法及び材料が提示される。ｄｓＲＮＡの収率は、キャプシドタンパク質の存在下で著しく増加する。ｄｓＲＮＡの改善された収率は、ｄｓＲＮＡに関連するキャプシドタンパク質への特異的同族結合部位の存在に依存するのではなく、キャプシドタンパク質に依存する。本発明は、例えば、微生物細胞中で非キャプシド化ｄｓＲＮＡを産生するための方法であって、前記ｄｓＲＮＡが、キャプシドタンパク質をコードするコートタンパク質遺伝子と共発現される、方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物細胞中で非キャプシド化ｄｓＲＮＡを産生するための方法であって、前記ｄｓＲＮＡが、キャプシドタンパク質をコードするコートタンパク質遺伝子と共発現される、方法。
【請求項２】
前記キャプシドタンパク質が、レビウイルスコートタンパク質遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キャプシドタンパク質が、バクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記キャプシドタンパク質が、バクテリオファージＱβのコートタンパク質遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｄｓＲＮＡをコードする遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、誘導性プロモーターから発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、構成的プロモーターから発現され、前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子が、誘導性プロモーターから発現される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子の前に、またはこれと同時に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記微生物細胞内の1つのプラスミドまたは染色体外要素上に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記微生物細胞内の別々のプラスミドまたは染色体外要素上に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記遺伝子のうちの一方が、プラスミドまたは染色体外要素上に存在し、前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記遺伝子のうちの他方が、前記微生物細胞の染色体上に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｄｓＲＮＡをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記微生物細胞の前記染色体上に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉ前駆体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｄｓＲＮＡの産生後に、前記微生物細胞が続いて溶解され、前記ｄｓＲＮＡが、適用のための処理に先立って、前記溶解物から精製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｄｓＲＮＡの産生後に、前記微生物細胞が溶解され、前記ｄｓＲＮＡをさらに精製することなく、適用のために処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｄｓＲＮＡの産生後に、前記微生物細胞が、前記ｄｓＲＮＡを溶解またはさらに精製することなく、適用のために処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記キャプシドタンパク質が、短縮型キャプシドタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記キャプシドタンパク質のＮ末端から本質的になる、請求項１６に記載の短縮型ＭＳ２キャプシドタンパク質。
【請求項１８】
前記キャプシドタンパク質の最初の４１個のアミノ酸を含む、請求項１６に記載の短縮型キャプシドタンパク質。
【請求項１９】
前記キャプシドタンパク質の最初の35個のアミノ酸を含む、請求項１６に記載の短縮型キャプシドタンパク質。
【請求項２０】
前記キャプシドタンパク質の最初の25個のアミノ酸を含む、請求項１６に記載の短縮型キャプシドタンパク質。
【請求項２１】
前記キャプシドタンパク質の最初の21個のアミノ酸を含む、請求項１６に記載の短縮型キャプシドタンパク質。
【請求項２２】
前記キャプシドタンパク質の最初の11個のアミノ酸を含む、請求項１６に記載の短縮型キャプシドタンパク質。
【請求項２３】
前記微生物細胞が、細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記微生物細胞が、グラム陰性細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記微生物細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの株である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記微生物細胞が、グラム陽性細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記微生物細胞が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの株である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記微生物細胞が、酵母である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記微生物細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３０８，３８１号の利益を主張する。
配列表の組み込み
【０００２】
配列表は、２０１７年３月３日に作成され、４０８KBのサイズを有する「１０３８２７−５００９＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ＿ＳＴ２５」というタイトルのテキストファイルとして本明細書と共に提供される。テキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、二本鎖ＲＮＡのインビボ産生を増加させるための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
標的遺伝子配列と相同なＲＮＡを用いて遺伝子発現を抑制する能力は、そのようなＲＮＡの大規模生産に対する要求を大きく増加させている。しかしながら、ＲＮＡの化学的脆弱性が、これらの技術の多くの商業的発展を制限している。精製されたＲＮＡの大規模生産は、インビトロ合成方法に関連する高コスト、ならびにインビボ方法に関連する低い収率及び複雑なプロセシング要件によって制約される。
【０００５】
酵素分解及び環境劣化に対するＲＮＡの感受性は、ＲＮＡ分子の性質に応じて大きく異なる。一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）は、分解に対して非常に敏感であり、そのような分子のインビボ産生は、内因性ＲＮＡｓｅを欠如する産生株の使用を必要とし、ＲＮＡの産生を、ウイルスキャプシド殻内にキャプシド化してウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生することと結び付けることにより利益を得る。キャプシド化は、製造中のＲＮＡの分解を減少させ、精製中のより積極的な処理を可能にする。ＶＬＰは、比較的不活性なタンパク質外殻内でＲＮＡを隔離することにより、そのような脆弱なＲＮＡを効果的に分解から保護する。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、細胞内及び環境ＲＮＡｓｅによる分解に対して多少なりとも感受性が低いが、ｄｓＲＮＡの最も高いインビボ収量もまたＲＮＡｓｅを欠く産生株を伴い、多くのｄｓＲＮＡもまたキャプシド化から利益を得る。残念なことに、ｄｓＲＮＡの二本鎖ステム領域の半剛性が、二本鎖ステム構造の長さがキャプシドの内径を超えることができないため、キャプシド化され得るｄｓＲＮＡの範囲を制限する。
【０００６】
キャプシド化され得るｄｓＲＮＡステムの範囲を増加させる技術を探索する過程で、本発明者らは、特定の条件下では、宿主細胞がキャプシドタンパク質またはその特定部分を共発現する場合にのみ、大量の非キャプシド化ｄｓＲＮＡを細胞溶解物から直接回収できることを発見した。粗細胞溶解物中の多量のインタクトな非キャプシド化ｄｓＲＮＡの存在は、遺伝子抑制及び他の活性のためのそのようなＲＮＡの商業的な量を産生する能力の著しい進歩を表す。
【０００７】
レビウイルスＭＳ２またはＱβのものなどのバクテリオファージキャプシドタンパク質の二量体は、同族のｐａｃ配列に対する親和性を認識して、これと結合する。そのようなｐａｃ配列は、離散ヘアピン構造を形成することができる８塩基対の膨潤ステム及び４塩基ループを含む約１９〜２１個のヌクレオチドを含む。そのような配列は、本明細書では、ｐａｃ部位、ｐａｃ配列、ｐａｃ部位配列、ｐａｃ部位ヘアピン、またはｐａｃ部位ヘアピン配列と称することができる。キャプシド二量体とそれらの同族のｐａｃ部位ヘアピンとの相互作用は十分に特徴付けられており、バクテリオファージのライフサイクルにおいて少なくとも２つの重要な役割を果たすことが知られている。同族のｐａｃ部位へのキャプシド二量体の結合は、感染初期にのみ発現されるファージにコードされたレプリカーゼのプログラムされた翻訳抑制のために必要とされる。さらに、ｐａｃ部位配列及び同族のコートタンパク質親和性を有する複数の分散及び縮退ＲＮＡ部位の両方へのキャプシドタンパク質結合（Ｄｙｋｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  Ｔｗｏ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  Ｉｍｐｌｙ  ａ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  Ｇｅｏｍｅｔｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｃｋａｇｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２５：３２３５−３２４９（２０１３））が、子孫バクテリオファージへの適切な組み立てに必要とされる。
同族ｐａｃ部位を有するキャプシド二量体の相互作用は、直接共有結合によるか、または様々な親和性法によるかのいずれかで、所望のカーゴ分子をｐａｃ部位配列と関連付けることによって、様々な種類の異種ＲＮＡのキャプシド化を可能にするように設計された多くの異なる公開されたインビトロ及びインビボ法の対象である。本発明は、キャプシド化されたＲＮＡよりむしろ非キャプシド化ｄｓＲＮＡを産生するキャプシドタンパク質の共発現を含む点で、このようなアプローチとは著しく異なる。さらに、本発明は、ｐａｃを完全に欠くｄｓＲＮＡ、または同族タンパク質親和性を有する認識された分散及び縮退ＲＮＡ部位のインビボ産生を可能にする。そのようなｄｓＲＮＡ分子のインビボ産生は、外来配列を減少させることにより、オフターゲットＲＮＡｉ相互作用の機会が減少するために、非常に望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄｙｋｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  Ｔｗｏ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  Ｉｍｐｌｙ  ａ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  Ｇｅｏｍｅｔｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｃｋａｇｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２５：３２３５−３２４９（２０１３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
以下の実施形態に記載される本発明は、インビボで大量の非キャプシド化ｄｓＲＮＡを産生するための方法及び組成物を提供する。開示された方法及び組成物は、ｄｓＲＮＡを産生する現在のインビボの方法よりも著しい改善を示す。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、相補的配列のハイブリダイゼーションの際にステムループ構造が形成されるように非相補的配列によって分離された自己相補的な一続きの配列をコードする遺伝子を含有する微生物細胞を含み、分子のステム部分は、標的生物に導入されたときにＲＮＡｉ前駆体として機能する。微生物細胞はまた、キャプシドタンパク質をコードするバクテリオファージコートタンパク質遺伝子も含有する。ｄｓＲＮＡ遺伝子及びコートタンパク質遺伝子の発現は、非分解ｄｓＲＮＡ及びキャプシドタンパク質の増加した蓄積を結果としてもたらす。このようにして産生されたｄｓＲＮＡの量は、キャプシドタンパク質の非存在下で産生されるｄｓＲＮＡの量を大きく上回る。
【００１１】
一実施形態では、バクテリオファージキャプシドタンパク質は、レビウイルス科の種のコートタンパク質遺伝子によってコードされる。好ましい実施形態では、コートタンパク質遺伝子は、バクテリオファージＭＳ２のキャプシドタンパク質をコードする。別の好ましい実施形態では、コートタンパク質遺伝子は、バクテリオファージＱベータのキャプシドタンパク質をコードする。
【００１２】
一実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＭＳ２キャプシドタンパク質のN末端を含む。別の実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＭＳ２キャプシドタンパク質のN末端の４１、３５、２５、２１、または１２個のアミノ酸を含む。一実施形態では、キャプシドタンパク質は、Ｑベータキャプシドタンパク質のN末端を含む。一実施形態では、キャプシドタンパク質は、Ｑベータキャプシドタンパク質のN末端の４１、３５、２５、２１、または１２個のアミノ酸を含む。
【００１３】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡをコードする遺伝子は、誘導性転写プロモーターと関連付けられ、かつこれから発現することができる。コートタンパク質遺伝子は、構成的または誘導性転写プロモーターと関連付けられ、かつこれから発現することができる。ｄｓＲＮＡの発現に関連する誘導性転写プロモーターは、同じ誘導性転写プロモーターであってもよく、またはコートタンパク質遺伝子の発現に関連する転写プロモーター由来の異なる転写プロモーターであってもよい。一実施形態では、コートタンパク質遺伝子の発現に関連する誘導性転写プロモーターは、ｄｓＲＮＡの産生に先立ってキャプシドタンパク質の蓄積を可能にするｄｓＲＮＡの発現に関連する誘導性転写プロモーターの誘導前に誘導される。別の実施形態では、コートタンパク質遺伝子の発現に関連する転写プロモーターは、構成的転写プロモーターである。
【００１４】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡをコードする遺伝子及びキャプシドタンパク質をコードするコートタンパク質遺伝子は、プラスミドまたは染色体外要素上に存在する。ｄｓＲＮＡ及びコートタンパク質遺伝子をコードする遺伝子は、同じプラスミドまたは染色体外要素上に存在してもよく、または別々のプラスミドまたは染色体外要素上に存在してもよい。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ及びコートタンパク質をコードする遺伝子の一方または両方が、微生物宿主細胞染色体（複数可）上に存在してもよい。
【００１５】
関連する実施形態において、ｄｓＲＮＡは、細胞を溶解して溶解物を産生し、適用のために精製されたｄｓＲＮＡを処理する前に、溶解物内の細胞成分からｄｓＲＮＡを精製することによって、微生物宿主細胞から精製することができる。そのような処理には、物理的取扱い特性を改善するための賦形剤、結合剤もしくは充填剤との混合、分解を減少させる安定剤、または適用標的の範囲を拡大するための化学的殺虫剤、殺菌剤、枯草剤もしくは他のＲＦＮＡｉ分子などの他の活性剤を挙げることができるが、これらに限定されず、ペレット化、噴霧乾燥、または液体担体に材料を溶解することを含むことができる。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、溶解物からさらに精製されず、直接適用のために処理される。さらに別の実施形態では、微生物宿主細胞は溶解されず、適用のために直接処理され、ｄｓＲＮＡは処理された細胞内で未精製のままである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】３つのpac部位ヘアピン配列を有するRNAステムループ構造を描写しており、１つはステムループ構造の５’に位置し、１つはステムループ構造のループ内にあり、もう１つはステムループ構造の３’に位置する。
【００１７】
【図２】ｐａｃ部位ヘアピン配列によって各側に隣接する一本鎖（センス）配列を描写している。
【００１８】
【図３】ｐａｃ部位のヘアピン配列によって各側に隣接する一本鎖（アンチセンス）配列を描写している。
【００１９】
【図４】２つのｐａｃ部位ヘアピン配列を有するＲＮＡステムループ構造を描写しており、一方はステムループ構造の５’に位置し、他方はステムループ構造の３’に位置する。
【００２０】
【図５】ステムループ構造の３’に位置する単一のｐａｃ部位ヘアピン配列を有するＲＮＡステムループ構造を描写している。
【００２１】
【図６】任意のｐａｃ部位ヘアピン配列を欠いているＲＮＡステムループ構造を描写している。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、インビボで大量のｄｓＲＮＡを産生するための組成物及び方法を含み、いくつかの実施形態では、そのようなｄｓＲＮＡを細胞溶解物から直接回収する。最も基本的な形態では、本発明は、ｄｓＲＮＡの宿主細胞への蓄積を可能にするために十分な時間、バクテリオファージキャプシドタンパク質、またはその一部を、所望のｄｓＲＮＡと共に共発現させることと、宿主細胞を溶解させることと、任意選択でインタクトな非キャプシド化ｄｓＲＮＡを細胞溶解物から直接回収することとを伴う。バクテリオファージキャプシドタンパク質の非存在下では、インタクトなｄｓＲＮＡは細胞溶解物中にごくわずかしか存在しない。対照的に、バクテリオファージキャプシドタンパク質の存在下では、比較的大量の非キャプシド化ｄｓＲＮＡを細胞溶解物から回収することができる。
【００２３】
本発明の必須要素を決定し、本発明によって産生されるｄｓＲＮＡの収率を最適化するために、ＲＮＡ構造及びコートタンパク質の多数の順列を調べた。この研究は、以下に詳細に例と共に記載される本発明の様々な要素を概説する表１にまとめられている。表１の最も左の列は、列挙されたプラスミド構築物のそれぞれから産生された予測されたRNA構造の素描を表す個々の図を示す。各図において、「Ｓ」はセンス鎖を表し、「ＡＳ」はアンチセンス鎖を表し、小さなヘアピン構造はｐａｃ部位配列を表す）。表はまた、コートタンパク質（もしあれば）及び列挙されたプラスミド構築物のそれぞれに関連するｄｓＲＮＡ（または示されたようなｓｓＲＮＡ）の収率も列挙する。
【表１】
2019508060.tif 000003
Ａ．定義
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「キャプシドタンパク質」または「キャプシド」は、バクテリオファージＲＮＡのｐａｃ部位を高親和性で結合させて、その中でバクテリオファージＲＮＡが中空の三次構造内で完全にキャプシド化されている、複雑な中空の三次構造に組み立てることができるバクテリオファージＭＳ２またはＱβのコートタンパク質を指す。ＶＬＰにおいて、キャプシドタンパク質は、その中で異種ＲＮＡが完全にキャプシド化されている中空の三次構造を形成する。用語「キャプシド」はまた、個々のキャプシドタンパク質の集合体によって形成された中空の三次構造を指す。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「ｓｓＲＮＡ」及び「ｄｓＲＮＡ」は、それぞれ、「一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡを指す。ｓｓＲＮＡは、相補配列間のヌクレオチド塩基のワトソン−クリック塩基対形成を介した互いの内部相補配列のハイブリダイゼーションに依存するヘアピンまたは他の構造などの任意の重要な二次構造を形成するのに十分な内部相同性を欠く任意の長さのＲＮＡ配列から構成される。対照的に、ｄｓＲＮＡは、相補配列内のヌクレオチド塩基のワトソン−クリック塩基対形成を介した互いの内部相補配列のハイブリダイゼーションに起因するヘアピンなどの重要な二次構造を形成するのに十分な内部相同性を有するＲＮＡ配列を含む。重要な二次構造は、一般に、約９塩基を超える一続きの相同性を伴うが、正確な長さは、状況にある程度依存し、そのような二次構造が分子に何らかの生物学的機能を付与するかどうかに依存する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「プラスミド」または「染色体外要素」は、宿主細胞内で複製または安定した維持が可能な任意の染色体外エピソームを指す。この定義によって具体的に包含されるのは、記載のプラスミドの骨格を表すｐＢＲ３２２、ｐＣＧ１、及びｐＡＣＹＣ１８４などのプラスミドである。当業者であれば、他のプラスミドまたは安定に維持されたウイルスエピソームが、維持、発現及び選択の必要な同じ機能を提供できること、及び本明細書に記載の塩基性プラスミドの代替物が、このような他のプラスミドまたは安定に維持されたウイルスエピソームから過度の実験をすることなく、生成することができることを認識するであろう。本発明の重要な特徴は、ｄｓＲＮＡ及びキャプシドタンパク質をコードする遺伝子を含有するエピソーム上で見出される特定の複製様式、発現または選択マーカーではなく、ｄｓＲＮＡ及びキャプシドタンパク質をコードする遺伝子を発現する能力である。
【００２７】
「実質的に類似の配列」とは、本明細書に記載される微生物宿主細胞におけるｄｓＲＮＡの蓄積を促進する能力を保持する、特許請求されるキャプシドタンパク質の配列変異体を指す。このような実質的に類似の配列は、ＭＳ２とQベータキャプシドタンパク質配列の間の相違（ｂｌａｓｔｐによって決定される）によって示されるように、少なくとも２６％の同一性及び４７％の類似性を有する配列を含む。結果的に、実質的に類似の配列は、微生物宿主中でのｄｓＲＮＡの蓄積を容易にするために、ＭＳ２またはＱベータキャプシドタンパク質配列と９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、または２５％ほどの同一性と、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、または４０％ほどの類似性を有する配列変異体を可能にする保存されかつ相同な置換を包含する。
Ｂ．一般的な材料、及び方法
【００２８】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質を産生及び精製するため、及び本明細書に記載の宿主生物を形質転換し、組換えタンパク質及び核酸を発現させるためのものを含む、ルーチンの微生物及び分子クローニング方法ならびにツールは、当業者の能力の範囲内であり、文献に十分に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｄａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９８６）；及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ（１９９５）を参照されたい。これらの各々における開示は、本明細書に組み込まれる。
【００２９】
以下にさらに詳細に記載する組換えＤＮＡ構築物のそれぞれは、プラスミドｐＢＲ３２２に由来する一般的なプラスミドベクター系に基づいている。このプラスミドベクター系の最初のものは、バクテリオファージＭＳ２キャプシド遺伝子、続いてＴ７ターミネーターの単一コピーの転写を駆動させることができるＴ７プロモーター配列を含むカスタム合成ＤＮＡ断片（ＰＣＲ  ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪによって製造される）を含有する。この合成配列をＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ制限断片としてｐＢＲ３２２の対応する部位に挿入してプラスミドｐＡＰＳＥ１０１１８を形成した。Ｔ７プロモーター配列、続いてＭＳ２  ｐａｃ部位配列、ＡｓｉＳＩ−ＰｍｅＩ−ＡｓｃＩ−ＲｓｒＩＩ−ＮｏｔＩ−ＰａｃＩ制限部位を（５’から３’の）順に含有するマルチクローニング部位、第２の高親和性変異体ＭＳ２  ｐａｃ型配列（Ｃ−ｐａｃ）、Ｔ７ターミネーター及びＳｐｈＩ制限部位を含む第２の合成配列を合成し（ＰＣＲ  Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ｐＡＰＳＥ１０１１８のＥｃｏＲＶ部位に挿入してｐＡＰＳＥ１０１３６を形成した。これらの２つは、Ｔ７プロモーターがｐＡＰＳＥ１０１３６の同じ鎖（標準的なｐＢＲ３２２マップ上で時計回り）の転写を指示するが、単一のＴ７ターミネーターによって互いに分離されるように配向されている。
【００３０】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｒｋＡ遺伝子の１８０個のヌクレオチド断片（ヌクレオチド１５６〜３３５の間のＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＭ＿００１３００７０６の配列に対応する）を、それぞれＡｓｉＳＩ及びＰｍｅＩ制限部位を５’及び３’側に組み込んだＰＣＲによって増幅した。このＥｒｋＡ遺伝子断片のｐＡＰＳＥ１０１３６の対応する部位への挿入が、ｐＡＰＳＥ１０１６９を産生した。ＥｒｋＡ遺伝子断片配列の第２の相補的なコピーを、５’末端にＰｍｅＩ制限部位、続いて追加のＭＳ２  ｐａｃ配列を含有する合成ループ配列、続いてＮｏｔＩ制限部位、続いて相補的（アンチセンス）なＥｒｋＡ遺伝子断片配列及びＰＣＲ断片の３’末端のＰａｃＩ制限部位を組み込んだＰＣＲ増幅によって産生した。合成ループ配列は、ＥｒｋＡ遺伝子断片配列とハイブリダイズすることができないランダム配列を含む。ＥｒｋＡ遺伝子断片のこの相補的な（アンチセンス）コピーをｐＡＰＳＥ１０１３６のＰｍｅＩ及びＰａｃＩ制限部位に挿入して、ｐＡＰＳＥ１０１８０（配列番号１）を形成する。ＭＳ２キャプシドタンパク質を欠く、第２の一連のプラスミドベクターは、ｐＡＰＳＥ１０１８１（配列番号２）を産生するために、ＳｐｈＩ制限消化及び再ライゲーションによるＭＳ２キャプシド発現配列を欠失させることによってｐＡＰＳＥ１０１８０から誘導される。
【００３１】
プラスミドｐＡＰＳＥ１０１８０及びｐＡＰＳＥ１０１８１は、本明細書で論じるＲＮＡ構築物の発現のための基本的なプラットフォームを表す。これらのプラスミドにおけるＥｒｋＡカセットの転写は、１８０個の塩基対のステムと、ステムの５’及び３’に位置し、かつループそれ自体の中に位置する３つの個別のＭＳ２  ｐａｃ配列を有する１３９個の塩基ループとを含む大きなステムループ構造を形成することができるＲＮＡ転写物を産生すると予想される。当業者は、他の配列によるＥｒｋＡ遺伝子断片配列の置換が、標準的なクローニング法及びサブクローニング法によって容易に達成できることを理解するであろう。
【００３２】
プラスミドｐＡＰＳＥ１０１８０またはｐＡＰＳＥ１０１８１、もしくはそれらの誘導体のいずれかの、Ｔ７ポリメラーゼの誘導性発現が可能な宿主細胞への形質転換は、ＲＮＡ転写物を発現することができる細胞株を作製する。誘導可能にＲＮＡ転写産物を産生するそのような株は全て、本明細書では一般に「発現株」と称される。別途記載のない限り、本明細書に記載されるプラスミドのそれぞれを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＨＴ１１５（ＤＥ３）（遺伝子型Ｆ−、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢ、IN（ｒｒｎD−ｒｒｎE）１、ｒｎｃ１４：：Ｔｎ１０（ラムダＤＥ３溶原：ｌａｃＵＶ５プロモーター-Ｔ７ポリメラーゼ）を有する）に電気穿孔し、得られた組換え軽質転換体を、１２μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び／または１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する寒天平板培地上で選択した。単一コロニーを単離し、インタクトなプラスミドの存在を制限酵素分析により確認し、確認された形質転換細胞を将来の使用のために保管した。
【００３３】
標準的な発現試験は、形質転換細胞を、０．１％グルコース、０．４％ラクトース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び／または１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有する１００ｍｌのスーパーブロスに接種することと、３７°Ｃで激しく振盪しながら培養物をインキュベートすることを含んだ。Ｔ７ポリメラーゼの発現は、利用可能なグルコースの枯渇とラクトース誘導物質の存在とによる自己誘導によって達成された。これにより、全ての培養物が同じ増殖段階で誘導されることが確実にされる。細胞を、３，０００ｇ、４℃で３０分間の遠心分離によって、誘導の１２〜１８時間後（後期定常期）に採集し、溶解するまで氷上で保管した。
【００３４】
ＲＮＡを、採集した細胞の細胞培養物の５ｍｌ相当をＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７、１０ｍＭのＮａＣｌを含む超音波処理緩衝液に再懸濁し、懸濁された細胞を氷上で３分間超音波処理することにより、採集した細胞から単離した。細胞残渣を１６，０００ｇで遠心分離によって除去し、上清（透明な溶解物）を直ちに処理して記載のようにＲＮＡ及びＶＬＰを回収した。ＲＮＡを、市販のＰｕｒｅｌｉｎｋ  ＲＮＡミニキット法（Ａｍｂｉｏｎ  カタログ番号１２１８３０１８Ａ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、製造元の指示に従って、清澄化した溶解物の半分から回収した。
【００３５】
全量１ｍｌに希釈し、３７℃で２時間、１００ユニットのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理した、清澄化した溶解物の残りの半分からＶＬＰを精製した。引き続いて、０．１５ｍｇのプロテイナーゼＫを添加し、酵素的に処理し清澄化した溶解物を３７℃でさらに３時間インキュベートした。ＶＬＰＳを、酵素的に処理し清澄化した溶解物から分別沈殿によって回収した。飽和に達するまで（およそ４．１Ｍ）、硫酸アンモニウムを水に添加することによって、飽和硫酸アンモニウム溶液を調製した。５０マイクロリットルの飽和硫酸アンモニウム溶液を酵素的に処理し清澄化した溶解物に添加し、混合物を氷上に置き、２時間インキュベートした。望ましくない沈殿物を１６，０００ｇでの遠心分離によって混合物から除去し、水溶液を清潔なエッペンチューブに移した。次いで、水溶液に０．１７１ｇの乾燥硫酸アンモニウムを直接添加することによって、水溶液を第２の沈殿に供した。水溶液をボルテックスし、氷上で２時間インキュベートした。沈殿物を１６，０００ｇで遠心分離して水相を捨て、精製したＶＬＰを表す固体沈殿物を１００マイクロリットルの超音波処理緩衝液に再懸濁した。
【００３６】
ＲＮＡを、３倍量のＴｒｉｚｏｌ  ＬＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎカタログ番号１０２９６０２８、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を添加し、混合物を激しくボルテックスし、１ｍｌのクロロホルムを添加し、パルス遠心分離の前に混合物をさらにボルテックスして混合物の水相及び有機相を分離することによって、再懸濁した精製ＶＬＰから回収した。水相を清潔なエッペンチューブに置き、ＲＮＡを市販のＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）キット（カタログ番号Ｒ１０１８、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて、製造元の指示に従って精製した。
【００３７】
細菌及びＶＬＰ試料由来のＲＮＡを５０μｌのヌクレアーゼフリー水に溶解した。試料中のｄｓＲＮＡの濃度を決定するために、試料を製造業者の推奨条件下でＲＮＡｓｅ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＡＭ２２７４，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）で処理して一本鎖ＲＮＡを分解し、ｄｓＲＮＡの濃度を、Ｎｏｖｅｘ  ６％ＴＢＥ−尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）に充填したＯＤ２６０及び１μｇを測定することによって分光光度的に決定した。各ゲルの１つのレーンに既知の濃度のｄｓＤＮＡサイズマーカを充填し、試料を電気泳動し、ゲルを臭化エチジウムで染色し、そしてｄｓＤＮＡマーカーを標準曲線として使用して各バンドをデンシトメトリーで定量した。
【００３８】
ｓｓＲＮＡを産生する構築物からのＲＮＡ収率は、誘導された細胞またはＶＬＰから回収されたセンス鎖またはアンチセンス鎖を過剰の同族鎖とアニーリングすることによって決定した。次いで、アニーリングした混合物をＲＮＡｓｅ  Ａで処理し、目的のｓｓＲＮＡを組み込んだｄｓＲＮＡの量を上記のように測定した。
【００３９】
試料が採集された培養物のいずれかの間で最終細胞密度の差はほとんどまたは全く観察されず、全ての場合において培養物は採集前に定常期に達したようである。ＲＮＡ収率の直接的な試料間の比較を可能にするために、全てのｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡ濃度は、１L当量の培養物中に存在するそのようなＲＮＡの量として報告される。
【００４０】
各ｄｓＲＮＡ構築物（５’−ＧＧＣＣＧＧＣＧＴＣＴ−ＡＴＴＡＧＴＡＧＡＴＧＣＣ−３’、配列番号３）のループを含むランダム配列に対するＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ノーザンブロット解析を用いてｄｓＲＮＡ転写物を含有するバンドの同一性を確認した。６％ポリアクリルアミド変性尿素−ＴＢＥゲルからのＲＮＡを、正に帯電したＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ−Ｐｌｕｓナイロン膜（Ａｍｂｉｏｎ  カタログ番号１０１０２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）に、セミドライトランスブロットＳＤ移動装置（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて０．３Ａの定電流で１時間移動させた。ＲＮＡは、「最適架橋」設定を用いてＳｐｅｃｔｒｏＬｉｎｋｅｒ  ＸＬ−１５００  ＵＶ架橋装置（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）によって膜上に固定した。膜を水で短時間濯ぎ、穏やかに振盪しながら４５℃で５０ｍｌの５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ緩衝液中でプレハイブリダイズさせた。穏やかに振盪しながら、３ｍｌのプレハイブリダイゼーション緩衝液中で、４５℃で一晩プローブハイブリダイゼーションを行った。ヘアピンＲＮＡループを標的とするオリゴヌクレオチドプローブをＴＡＭＲＡとコンジュゲートさせた。室温で１００ｍｌの水で３回の洗浄（それぞれ２分間）を完了させ、ローダミンチャンネルを用いてＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）でブロットした。
Ｃ．好ましい実施形態
【００４１】
以下は、本発明の好ましい実施形態のうちの１つである。
【００４２】
本発明の一実施形態は、所望のｄｓＲＮＡ及びキャプシドタンパク質遺伝子が転写されて所望のｄｓＲＮＡが産生され、キャプシドタンパク質遺伝子が転写されてキャプシドタンパク質を産生するように、所望のｄｓＲＮＡの遺伝子及びバクテリオファージキャプシドタンパク質遺伝子の両方をコードするプラスミドを含む細菌宿主細胞を含み、適切な期間の後、キャプシドタンパク質の非存在下よりもはるかに高い程度で、非キャプシド化ｄｓＲＮＡが細胞内に蓄積する。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡ遺伝子及びキャプシドタンパク質遺伝子は、別々の適合性プラスミド、自律的に維持されたファージもしくは他の後成要素上に存在してもよく、または一方または両方の遺伝子が細菌宿主細胞の染色体内に存在してもよい。
【００４３】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ遺伝子及びキャプシドタンパク質遺伝子は、それぞれ、転写プロモーターから転写される。この転写プロモーターは誘導性であり得る。一実施形態では、転写プロモーターは同一であり、他の実施形態では、プロモーターは異なる。さらに他の実施形態では、転写プロモーターは差次的に誘導され得る。このような差次的に誘導可能な実施形態では、ｄｓＲＮＡの発現を誘導する前にキャプシドタンパク質の発現を誘導することが好ましい場合がある。
【００４４】
別の実施形態では、キャプシドタンパク質及びｄｓＲＮＡは、単一のプロモーターからの単一の転写物として転写され得る。このプロモーターは誘導性であり得る。このような実施形態では、ｄｓＲＮＡは、転写後プロセシングによってキャプシドタンパク質コード配列を含む最初のＲＮＡ転写物から切断され、このような転写後プロセシングは、細菌宿主細胞プロセスに依存し得るか、またはリボザイムまたは特異的リボヌクレアーゼなどの他のＲＮＡプロセシングシステムによって導かれ得る。
【００４５】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ及びキャプシドタンパク質遺伝子の一方または両方が転写プロモーターから誘導的に転写され、転写は転写ターミネーターによって終結される。一実施形態では、誘導性転写プロモーターは、バクテリオファージＴ７遺伝子１プロモーターである。他の実施形態において、誘導性転写プロモーターは、バクテリオファージラムダPLまたはPRプロモーター、ｌａｃオペロン、ｔｒｐオペロン、または合成ｔａｃプロモーター、もしくはバクテリオファージＴ５プロモーターであり得る。当業者に既知の他の転写プロモーター（構成的及び誘導的の両方）も、いくつかの実施形態において使用されてもよい。一実施形態では、転写ターミネーターは、バクテリオファージＴ７後期ターミネーターである。当業者に既知の他の転写ターミネーター（ｒｈｏ依存的及びｒｈｏ非依存的の両方）も、いくつかの実施形態において使用されてもよい。
【００４６】
一実施形態では、コートタンパク質遺伝子は、レビウイルスキャプシドタンパク質をコードする。コートタンパク質遺伝子は、ＭＳ２キャプシドタンパク質をコードするＭＳ２コートタンパク質遺伝子であり得るか、または微生物宿主細胞中でｄｓＲＮＡの蓄積を可能にする能力を保持する実質的に類似の配列であり得る。コートタンパク質遺伝子は、Ｑベータキャプシドタンパク質をコードするＱベータコートタンパク質遺伝子であり得るか、または微生物宿主細胞中でｄｓＲＮＡの蓄積を可能にする能力を保持する実質的に類似の配列であり得る。
【００４７】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、化学的または機械的方法によってバクテリオファージキャプシドタンパク質を共発現する細菌宿主細胞から回収され、宿主細胞溶解物を産生する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡを宿主細胞溶解物からさらに精製して、宿主細胞由来のタンパク質、核酸及びキャプシドタンパク質を含む膜を除去する。別の実施形態では、宿主細胞溶解物をさらに精製することなく直接処理する。別の実施形態では、細菌宿主細胞を、化学的または熱的または溶解のない他の手段によって死滅させて、インタクトな死滅細胞をさらに精製することなく処理する。
【実施例】
【００４８】
実施例1
非キャプシド化ｄｓＲＮＡは、キャプシドタンパク質の非存在下よりも高いレベルでキャプシドタンパク質の存在下で産生される。
ｐＡＰＳＥ１０１８０及びｐＡＰＳＥ１０１８１を含む発現株を構築し、上記の標準的な発現手順によってｄｓＲＮＡ産生を誘導した。記載されているように、産生されたそれぞれの菌株のキャプシド化及び非キャプシド化ｄｓＲＮＡの量を測定した。この実験の初期の推進力は、１８０個の塩基対の二本鎖ステム構造を有するＲＮＡ分子がＶＬＰ内に充填され得るか否かを決定することであった。１８０ｂｐのｄｓＲＮＡステムは、長さがおよそ６０ｎｍであるのに対し、ＭＳ２キャプシドの内径はおよそ２０ｎｍである。この幾何学的限界に基づいて、ほとんどまたはまったくキャプシド化が予想されず、宿主ヌクレアーゼ活性のために、ほとんどまたは全く取り込まれていないｄｓＲＮＡが細胞溶解物から回収可能であると予想された。予想されるように、ｐＡＰＳＥ１０１８０発現細胞から少量のキャプシド化ｄｓＲＮＡ（ｅｎキャプシド）が回収された（＜２ｍｇ／Ｌ）。対照的に、驚くべきことに、ｐＡＰＳＥ１０１８０発現細胞からは、大量の非キャプシド化ｄｓＲＮＡ（ｅｘキャプシド）が回収された（７５〜９０ｍｇ／Ｌ）。さらに驚くべきことに、ｐＡＰＳＥ１０１８１発現細胞からは、実質上、非キャプシド化ｄｓＲＮＡは回収されなかった。
【００４９】
ＲＮＡの蓄積がＥｒｋＡ配列の特異的な特性であるか、またはキャプシドタンパク質の存在下でｄｓＲＮＡを発現するより一般的な特性であるかどうかを決定するために、コロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ株  Ｆｒｅｅｖｉｌｌｅ，ヌクレオチド１５６〜３３５の間のＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＭ＿００１３００７０６）のベータアクチン遺伝子からの２９４個の塩基配列を発現する一連の発現構築物を作製し、試験した。
【００５０】
最初に、コロラドハムシ由来の２９４個の塩基のベータアクチン配列をセンス及びアンチセンス配向で発現するプラスミドを、ＥｒｋＡ配列を置換することによってｐＡＰＳＥ１０１８０から構築し、それぞれｐＡＰＳＥ１０１８９（配列番号４）及びｐＡＰＳＥ１０１９０（配列番号５））を作製した。ベータアクチンセンス及びアンチセンス鎖配列を、それぞれ５’及び３’末端にＡｓｉＳＩ及びＰｍｅＩ制限部位を導入するプライマーを用いて、ｇＢｌｏｃｋ鋳型からＰＣＲ（Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  ｐｆｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１２３４４０４０，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）により増幅した（ｇＢｌｏｃｋ鋳型ＤＮＡ及びＰＣＲプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ  ＩＡによって合成され、全ての制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡからのものであった）。ｐＡＰＳＥ１０１８０及びベータアクチンセンスならびにアンチセンスＰＣＲ断片のＡｓｉＳＩ及びＰｍｅＩを用いた制限消化により、所望の様式で一緒に連結され得るＤＮＡ断片をもたらした。ＥｒｋＡ配列を欠くｐＡＰＳＥ１０１８０プラスミド骨格をゲル精製し、センス及びアンチセンスベータアクチン配列をゲル精製ベクターに連結して、ｐＡＰＳＥ１０１８９及びｐＡＰＳＥ１０１９０をそれぞれ作製した。ＨＴ１１５（ＤＥ３）などの好適な発現宿主に形質転換するとき、ｐＡＰＳＥ１０１８９を含有する細胞は、記載のように培養かつ誘導されるとき、ｐａｃ配列に隣接したベータアクチン遺伝子のセンス鎖の２９４個の塩基を含むｓｓＲＮＡ転写物を産生すると共にＭＳ２キャプシドタンパク質を共発現する。同様に、ｐＡＰＳＥ１０１９０を含有する細胞は、記載のように好適な発現宿主に形質転換され、培養され、かつ誘導されるとき、ｐａｃ配列に隣接したベータアクチン遺伝子の同じ領域のアンチセンス鎖の２９４個の塩基を含むｓｓＲＮＡ転写物を産生すると共にＭＳ２キャプシドタンパク質を共発現する。上記のように、ｐＡＰＳＥ１０１８１のＥｒｋＡ配列をベータアクチン遺伝子のセンス及びアンチセンスの２９４個の塩基断片に置き換えることによって、ＭＳ２キャプシドタンパク質を発現する能力を欠く、プラスミドの第２のセットも作製した。これらのプラスミド、ｐＡＳＰＥ１０２７４（配列番号６）及びｐＡＰＳＥ１０２７５（配列番号７）のそれぞれを、ＨＴ１１５（ＤＥ３）に形質転換し、記載のように培養し、誘導した。
【００５１】
キャプシドタンパク質と共発現する（ｐＡＰＳＥ１０１８９及びｐＡＰＳＥ１０１９０のように）か、またはそうでない（ｐＡＰＳＥ１０２７４及びｐＡＰＳＥ１０２７５のように）にかかわらず、細胞から回収された非キャプシド化ＲＮＡの分析は、事実上、全くｓｓＲＮＡを回収することができないことを示した。しかしながら、ｐＡＰＳＥ１０１８９及びｐＡＰＳＥ１０１９０から回収されたＶＬＰは、それぞれ少なくとも２０ｍｇ／Ｌのセンスまたはアンチセンス配列のｓｓＲＮＡを産生する。これは、プラスミド発現系がｓｓＲＮＡ及びキャプシドタンパク質を予測通りに産生することができることを確認する。
【００５２】
２９４個の塩基のコロラドハムシベータアクチン遺伝子を含むｄｓＲＮＡ発現カセットを、ｄｓＲＮＡ  ＥｒｋＡ発現カセットについて記載されるものと同様のプロセスによって構築した。この場合、ベータアクチン配列のセンス鎖とアンチセンス鎖との間のループを含むランダムＤＮＡ配列は、ｐＡＰＳＥ１０１８０及び１０１８１に見られるものと同じ内部ｐａｃ部位配列を含む１６６個の塩基を含んでいた。このベータアクチン発現カセットを、ＥｒｋＡ関連のステムループ配列と置き換えてｐＡＰＳＥ１０１８０にクローニングして、プラスミドｐＡＰＳＥ１０２６９（配列番号８）を形成し、ｐＡＰＳＥ１０１８１にプラスミドｐＡＰＳＥ１０３０６（配列番号９）を形成した。これらのプラスミドを、ＨＴ１１５（ＤＥ３）に形質転換し、記載のように培養し、誘導した。ｐＡＰＳＥ１０２６９株を含有する細胞によって産生されたキャプシド化ｄｓＲＮＡの分析は、２〜１０ｍｇ／ＬのｄｓＲＮＡをＶＬＰから回収することができることを示した。しかしながら、はるかに高いレベルのベータアクチンｄｓＲＮＡは、非キャプシド化形態のｐＡＰＳＥ１０２６９を含有する細胞から回収することができた（２００ｍｇ／Ｌ）。驚くべきことに、ｐＡＰＳＥ  １０３０６株によって産生されたＲＮＡの分析は、共発現キャプシドタンパク質の非存在下で、約３ｍｇ／ＬのｄｓＲＮＡのみを回収することができることを示した。
【００５３】
したがって、高レベルの非キャプシド化ｄｓＲＮＡは、このようなｄｓＲＮＡが効率的にパッケージ化されないモデルと一致するが、何らかの理由で、キャプシドタンパク質を欠く細胞よりもずっと高いレベルでｄｓＲＮＡとキャプシドタンパク質を共発現する細胞内に存在するようである。この観察を説明する１つのモデルは、キャプシドタンパク質のｐａｃ部位への結合が宿主細胞ヌクレアーゼによる分解を阻害することである。
実施例2
特定のｐａｃ部位キャプシドタンパク質相互作用は、ｄｓＲＮＡの高レベル産生に必要とされない。
【００５４】
ｄｓＲＮＡ中のｐａｃ部位に結合したキャプシドタンパク質が、キャプシドタンパク質を共発現する細胞におけるｄｓＲＮＡ産生の観察された増加をもたらし、おそらくは結合したｄｓＲＮＡの内因性宿主ヌクレアーゼ分解を阻害するかどうかを試験するために、上述の塩基性ベータアクチンｄｓＲＮＡを含む一連の構築物を、ｐａｃ部位の数及び位置を変化させて作製した。プラスミドｐＡＰＳＥ１０２１６（配列番号１０）及びｐＡＰＳＥ１０３０５（配列番号１１）は、内部ループｐａｃ部位を欠くことを除いて、それぞれｐＡＰＳＥ１０２６９及びｐＡＰＳＥ１０３０６と同一である。プラスミドｐＡＰＳＥ１０２１９（配列番号１２）及びｐＡＰＳＥ１０３０４（配列番号１３）は、これらがｄｓＲＮＡのステムの３’末端上に位置する単一のｐａｃ部位のみを有することを除いて、それぞれｐＡＰＳＥ１０２１７及びｐＡＰＳＥ１０３０６と同一である。プラスミドｐＡＰＳＥ１０２７９（配列番号１４）及びｐＡＰＳＥ１０３０３（配列番号１５）は、これらが全てのｐａｃ部位配列を完全に欠くことを除いて、ｐＡＰＳＥ１０２１６及びｐＡＰＳＥ１０３０６と同一である。これらのプラスミドのそれぞれを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＴ１１５（ＤＥ３）に形質転換し、記載のように培養し、誘導した。ｐＡＰＳＥ１０２１６及びｐＡＰＳＥ１０２１９のそれぞれのＶＬＰから回収されたキャプシド化ＲＮＡの分析は、５〜２０ｍｇ／ＬのｄｓＲＮＡがキャプシド化されることを示している。驚くべきことに、ｐａｃ部位を完全に欠いているｐＡＰＳＥ１０２７９を含有する株でさえ、４ｍｇ／Ｌのキャプシド化ｄｓＲＮＡを産生し、このレベルのキャプシド化が、キャプシド化時の細胞内に存在するｄｓＲＮＡの非特異的引き込みを示し得ることを示唆している。さらに、ｐＡＰＳＥ１０２１６を含有する株は、キャプシドタンパク質の存在下で、２５０ｍｇ／Ｌほどの非キャプシド化ｄｓＲＮＡを産生した。ｐＡＰＳＥ１０２１９及びｐＡＰＳＥ１０２７９を含有する株は、キャプシドタンパク質の存在下で、それぞれ３０〜６０ｍｇ／Ｌ及び６５ｍｇ／Ｌの非キャプシド化ｄｓＲＮＡを産生した。キャプシドタンパク質の共発現を伴わない発現カセットを含むプラスミドを含む株の全ては、＜４ｍｇ／ＬのｄｓＲＮＡを産生した。
【００５５】
まとめると、これらの結果は、キャプシドタンパク質が細胞溶解物から回収することができる非キャプシド化ｄｓＲＮＡの量を増加させる能力は、キャプシドタンパク質のその同族のｐａｃ部位配列への特異的結合に依存しないことを示す。最高レベルの非キャプシド化ｄｓＲＮＡは、少なくとも５’及び３’隣接ｐａｃ部位を含有する（およそ２００ｍｇ／Ｌ）構築物から回収されるが、有意な量の非キャプシド化ｄｓＲＮＡは、単一の３’隣接ｐａｃ部位のみを有するか、または完全にpac部位が欠けている構築物によって産生される。キャプシドタンパク質が完全に欠いている細胞系（３〜４ｍｇ／Ｌ）と比較して、キャプシドタンパク質がｄｓＲＮＡと共発現される場合、ｐａｃ部位を完全に欠いているｄｓＲＮＡを産生するプラスミドを含有する細胞は、大量のｄｓＲＮＡ（６５ｍｇ／Ｌ）を産生するキャプシドタンパク質を共発現する細胞とキャプシドタンパク質を欠くものとの間の回収可能なｄｓＲＮＡのおよそ１６倍の増加（６５ｍｇ／Ｌ対３〜４ｍｇ／Ｌ）は、ｐａｃ部位の存在による約３倍〜４倍の増加よりもはるかに多い（６５ｍｇ／Ｌ対２００〜２５０ｍｇ／Ｌ）。キャプシドタンパク質の共発現の効果は、ｄｓＲＮＡ上に存在してもよい（またはそうでなくてもよい）同族のｐａｃ部位配列への単なる結合以外の何かを含むようである。
実施例3
ループのサイズ及び構造は、ｄｓＲＮＡの高レベル産生とは無関係である。
【００５６】
存在する場合、ループ配列の相違が共発現キャプシドタンパク質の存在下及び非存在下でｄｓＲＮＡの産生にどのような影響を及ぼすかを試験するために、異なる長さの内部非相同ループ配列を有する一連の構築物を、ｐＡＰＳＥ１０２６９の２９４個の塩基のセンス及びアンチセンスベータアクチン配列のそれぞれの間に挿入した。
【００５７】
プラスミドｐＡＰＳＥ１０２７０（配列番号１６）、ｐＡＰＳＥ１０２７１（配列番号１７）、ｐＡＰＳＥ１０２７２（配列番号１８）、及びｐＡＰＳＥ１０２９２（配列番号１９）は、それぞれ、１１６個の塩基１３６個の塩基、１５６個の塩基、及び１６６個の塩基を有する。これらのループ配列のそれぞれは、m倍構造予測プログラム（Ｚｕｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（１９８１）Ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ａｕｘｉｌｉａｒｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．９（１）：１３３−４８）によって決定される任意の二次構造に対する非常にわずかな傾向性を有する。加えて、ｐＡＰＳＥ１０１８０中のＥｒｋＡステム配列に関連し、ループ内の構造的相互作用の傾向がわずかに高い１３９個の塩基ループ配列も、ｐＡＰＳＥ１０２６９のセンス及びアンチセンスベータアクチン配列の間に配置され、ｐＡＰＳＥ１０２９２を形成した。さらに、内部相同性に基づいて二次構造を形成する傾向が高い１４２個の塩基ループ配列を含むｐＡＰＳＥ１０２９１（配列番号２０）を合成し、記載のように構築した。
【００５８】
この実施例に記載したプラスミドのそれぞれをＥ．ｃｏｌｉ発現株ＨＴ１１５（ＤＥ３）に形質転換し、培養し、誘導して、キャプシド化及び非キャプシド化ｄｓＲＮＡの量を記載の通りに測定した。それぞれの場合において、プラスミドの発現を誘導することによって産生されたＶＬＰから２〜１０ｍｇ／ＬのｄｓＲＮＡが回収され、ループサイズまたは構造がｄｓＲＮＡをキャプシド化するＶＬＰの能力にほとんどまたは全く影響しないことが示された。同様に、プラスミドのそれぞれからの発現は、１００〜２００ｍｇ／Ｌの非キャプシド化ｄｓＲＮＡを産生しており、ループサイズまたは構造がキャプシドタンパク質の存在下で非キャプシド化ｄｓＲＮＡの全体的な産生にほとんどまたは全く影響しないことが示された。
実施例4
ステムサイズは、ｄｓＲＮＡの高レベル産生とは無関係である。
【００５９】
ｐＡＰＳＥ１０１８０から発現されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＥｒｋＡ遺伝子配列に由来するステム配列と、ｐＡＰＳＥ１０２６９から発現されたコロラドハムシベータアクチン遺伝子配列との差異は、大量の非キャプシド化ｄｓＲＮＡを産生する発現株における能力に有意差をもたらさない（ｐＡＰＳＥ１０１８０由来の７５〜９０ｍｇ／Ｌ対ｐＡＰＳＥ１０２６９由来の２００ｍｇ／Ｌ）。また、ｄｓＲＮＡステムの長さにも有意差をもたらさない（ｐＡＰＳＥ１０１８０から産生されたｄｓＲＮＡでは１８０個の塩基対、ｐＡＰＳＥ１０２６９由来のｄｓＲＮＡでは２９４個の塩基対）。存在する場合、ループ配列の相違が共発現キャプシドタンパク質の存在下及び非存在下でｄｓＲＮＡの産生にどのような影響を及ぼすかをより体系的に試験するために、異なる長さのステム配列を有する一連の発現構築物を、ｐＡＰＳＥ１０２６９のセンス及びアンチセンスβアクシン配列を形成する２９４個の塩基ステムのそれぞれに置き換えた。
【００６０】
プラスミドｐＡＰＳＥ１０２７６（配列番号２１）及びｐＡＰＳＥ１０２７７（配列番号２２）は、それぞれ５０及び７５個の塩基対の潜在的な二本鎖ステムを有するｄｓＲＮＡをコードする。両方のプラスミドによって発現されるｄｓＲＮＡは、１６６個の塩基の非相同ループ配列を含む。これらのｄｓＲＮＡ構造は、対応するＥｒｋＡ及びベータアクチン構築物由来のｄｓＲＮＡのものよりも著しく短いが、これらは依然としてＭＳ２  ＶＬＰの内径を超える。
【００６１】
上記のように培養して誘導したＥ．ｃｏｌｉ発現株ＨＴ１１５（ＤＥ３）に形質転換すると、ｐＡＰＳＥ１０２７６は５〜１０ｍｇ／Ｌのキャプシド化ｄｓＲＮＡ及び８０〜１２０ｍｇ／Ｌの非キャプシド化ｄｓＲＮＡを産生する。プラスミドｐＡＰＳＥ１０２７７は、２０〜３０ｍｇ／Ｌのキャプシド化ｄｓＲＮＡ及び２００〜２５０ｍｇ／Ｌの非キャプシド化ｄｓＲＮＡを産生する。これらの値は、本実施例の先に記載したｐＡＰＳＥ１０１８０及びｐＡＰＳＥ１０２６９について観察された値と類似しており、キャプシドタンパク質を共発現する細胞においてステム長さ及び配列の相違がｄｓＲＮＡを産生するのに重要な役割を果たさないことを示している。
実施例5
キャプシドタンパク質は、ｄｓＲＮＡの高レベル産生に必要である。
【００６２】
キャプシドタンパク質の必要性を確認するために、キャプシドタンパク質の存在下で高レベルでｄｓＲＮＡ産物を産生するプラスミドｐＡＰＳＥ１０２１６を、ＭＳ２コートタンパク質遺伝子をｅＧＦＰで置き換えるように変更した。ＭＳ２コートタンパク質のコード配列をｅＧＦＰのコード配列で置換したｐＡＰＳＥ１０２１６のＴ７プロモーターからＴ７ターミネーター配列まで（プラスミドの特徴的なＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ部位の間の配列にわたる配列）を含むｇＢｌｏｃｋ鋳型を設計し、５’側にＢａｍＨＩ部位を、及び３’側にＳａｌＩ部位を包含するプライマーで増幅した。得られた１ｋｂの断片をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化し、次いでＢａｍＨＩ−ＳａｌＩで消化したｐＡＰＳＥ１０２１６に連結してｐＡＰＳＥ１０３６６（配列番号２４）を形成した。プラスミドｐＡＰＳＥ１０３６６を制限消化により確認し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現株ＨＴ１１５（ＤＥ３）に形質転換し、記載されるように培養し、誘導したところ、ｐＡＰＳＥ１０３６６が、ｐＡＰＳＥ１０２１６によって産生された２００ｍｇ／Ｌとは対照的に、＜２ｍｇ／Ｌの非キャプシド化ｄｓＲＮＡを産生した。加えて、これらの研究を通じて使用された基本的な二重発現プラスミドが期待通りに機能することを確認する、誘導時に産生された強い蛍光（データは示さず）によって証明されるように、細胞は高い量のｅＧＦＰを発現した。この結果は、キャプシドタンパク質が、キャプシドタンパク質の存在下で非キャプシド化ｄｓＲＮＡを他の方法で蓄積する標的ＲＮＡ遺伝子を発現する細胞中に非キャプシド化ｄｓＲＮＡの蓄積に必要であることをさらに実証している。
【００６３】
キャプシドタンパク質の存在が高レベルの非キャプシド化ｄｓＲＮＡ産生に必須であることをさらに確認するために、ｐＡＰＳＥ１０１８１に適合し、ＭＳ２キャプシドタンパク質の誘導発現が可能なプラスミドが構築される。ｐＡＰＳＥ１０１４９（配列番号２３）は、ｐＡＣＹＣ１８４に基づく。このプラスミドは、ｐＡＰＳＥ１０１８１（アンピシリン耐性をコードする）及びｐＡＰＳＥ１０１４９（クロラムフェニコール耐性をコードする）の両方を含有する共形質転換体の選択を可能にする、ｐＡＰＳＥ１０１８１の複製のｃｏｌＥ１ベースの起源及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ抗生物質マーカーによって排除されないＰ１５Ａ複製起点を含む。プラスミドｐＡＰＳＥ１０１４９はまた、バクテリオファージＭＳ２キャプシド遺伝子の単一コピーの転写を駆動し得る同じＴ７プロモーター配列、続いてｐＡＣＹＣ１８４のＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩ部位にクローニングされたｐＡＰＳＥ１０１１８に見出されるＴ７ターミネーターを含む。プラスミドｐＡＰＳＥ１０１４９を、既にｐＡＰＳＥ１０１８１を含む発現株に形質転換して、アンピシリン及びクロラムフェニコール耐性二重形質転換体を産生する。そのような二重形質転換体の発現研究は、ｐＡＰＳＥ１０１４９からのキャプシドタンパク質とｐＡＰＳＥ１０１８１との共発現が、２００ｍｇ／Ｌの非カプセル化ｄｓＲＮＡを産生するが、ｐＡＰＳＥ１０１８１を含有する細胞が、＜２ｍｇ／Ｌの非キャプシド化ｄｓＲＮＡを産生することを示している（実施例１を参照）。これは、キャプシドタンパク質の非存在下で非キャプシド化ｄｓＲＮＡを蓄積しないｄｓＲＮＡ標的を発現するプラスミドを含有する宿主細胞への高レベルの非キャプシド化ｄｓＲＮＡの産生を促進するのに十分であることを実証している。
実施例6
他のキャプシドタンパク質は、ｄｓＲＮＡの高レベル産生を誘導することができる。
【００６４】
非キャプシド化ｄｓＲＮＡの蓄積がバクテリオファージＭＳ２キャプシドタンパク質の特徴的な特性であるかどうか、または他のキャプシドタンパク質がこの特性を共有するかどうかを試験するために、ｐＡＰＳＥ１０２１６に類似のプラスミド発現系を構築した。このプラスミドｐＡＰＳＥ１０３５９（配列番号２５）は、ベータアクチンｄｓＲＮＡ発現カセットの５’及び３’末端にQベータキャプシドタンパク質及びＱベータｐａｃ部位を含むが、全ての他の観点では、ｐＡＰＳＥ１０２１６に類似する。
【００６５】
簡潔に述べると、Ｑベータコートタンパク質遺伝子配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号ＮＣ  ００１８９０、ヌクレオチド１３４３〜１７４４）を、ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡによって、ｇＢｌｏｃｋ断片として合成した。合成断片を、ＢａｍＨＩ制限部位、続いてＱベータコートタンパク質遺伝子の上流のＴ７プロモーター配列、続いてＴ７ターミネーター及びＳｐｈＩ制限部位を導入したプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。増幅された合成断片及びプラスミドｐＢＲ３２２をＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩで消化し、一緒に連結して中間プラスミドｐＡＰＳＥ１０３５８を形成した。ｐＡＰＳＥ１０２６９のベータアクチンｄｓＲＮＡ配列を、ＥｃｏＲＩ制限部位、続いてQベータｐａｃ配列、続いてベータアクチンｄｓＲＮＡ配列、続いてQベータｐａｃ配列の第２のコピー、続いてＢａｍＨＩ制限部位を導入したプライマーによるＰＣＲによって増幅した。この増幅されたベータアクチン含有配列及びプラスミドｐＡＰＳＥ１０３５８をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、一緒に連結してｐＡＰＳＥ１０３７４を形成した。プラスミドｐＡＰＳＥ１０３７４及びｐＡＰＳＥ１０２１６を、ＡｓｉＳＩ及びＮｏｔＩで消化した。これは、ｐＡＰＳＥ１０３７４を４，７１３個及び１１３個の塩基対の２つの断片に切断し、ｐＡＰＳＥ１０２１６を５，２０４個及び７８６個の塩基対の２つの断片に切断する。この４，７１３個及び７８６個の塩基対断片を単離し、一緒に連結してｐＡＰＳＥ１０３５９を産生した。
【００６６】
上記のようにＥ．ｃｏｌｉ発現株ＨＴ１１５（ＤＥ３）に形質転換し、培養し、誘導すると、ｐＡＰＳＥ１０３５９はキャプシドタンパク質を欠く同様の構築物（ｐＡＰＳＥ１０３０５）から産生されたｄｓＲＮＡの量に対して大量の非キャプシド化ｄｓＲＮＡを産生するであろう。このパターンは、実施例1に記載のｐＡＰＳＥ１０２１６及びｐＡＰＳＥ１０３０５について観察されたものと同様に、ＭＳ２キャプシドタンパク質のようなQベータキャプシドタンパク質の発現が、インビボで産生されるｄｓＲＮＡの量を増加させるのに十分であることを確認するであろう。
実施例7
キャプシドタンパク質以外のＲＮＡ結合タンパク質は、ｄｓＲＮＡの高レベル産生には不十分である。
【００６７】
非キャプシド化ｄｓＲＮＡの蓄積が一般的なＲＮＡ結合の機能であるか、またはバクテリオファージキャプシドタンパク質に特異的であるかを試験するために、ヒトＵ１Aタンパク質のＲＮＡ結合ドメインと、ベータアクチンｄｓＲＮＡのセンス及びアンチセンスステムループ構造のヒトＵ１  ｓｎＲＮＡの５’及び３’からのそのヘアピン同族結合部位を含むｐＡＰＳＥ１０３５７（配列番号２６）を構築した。プラスミドｐＡＰＳＥ10357は、ベータアクチンｄｓＲＮＡ発現カセットの５’及び３’末端でヒトＵ１Ａ  ＲＮＡ結合タンパク質及びＵ１Ａ結合部位配列によってキャプシドタンパク質を置換したｐＡＰＳＥ１０２１６と類似しているが、全ての他の観点では、ｐＡＰＳＥ１０２１６に類似する。
【００６８】
ヒトＵ１Ａタンパク質のＲＮＡ結合ドメインを含むＮ末端の１０２個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を、ＢａｍＨＩ制限部位、続いてＵ１Ａ遺伝子断片の上流のＴ７プロモーター配列、続いてＴ７ターミネーター及びＳｐｈＩ制限部位を導入したＰＣＲプライマーを用いて、Ｕ１Ａタンパク質のクローン化コピー（プラスミドｐＡＶ１０５、Ｋａｔｈｌｅｅｎ  Ｈａｌｌ教授、ワシントン大学、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から増幅した。増幅された合成断片及びプラスミドｐＢＲ３２２をＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩで消化し、一緒に連結して中間プラスミドｐＡＰＳＥ１０３５６を形成した。ｐＡＰＳＥ１０２６９のベータアクチンｄｓＲＮＡ配列を、ＥｃｏＲＩ制限部位、続いてヒトＵ１  ｓｎＲＮＡ配列からのヘアピン結合部位配列、続いてベータアクチンｄｓＲＮＡ配列、続いてヒトＵ１  ｓｎＲＮＡ配列からのヘアピン結合部位配列の第２のコピー、続いてＢａｍＨＩ制限部位を導入したプライマーによるＰＣＲによって増幅した。この増幅されたベータアクチン含有配列及びプラスミドｐＡＰＳＥ１０３５６をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、一緒に連結してｐＡＰＳＥ１０３７３を形成した。プラスミドｐＡＰＳＥ１０３７３及びｐＡＰＳＥ１０２１６を、ＡｓｉＳＩ及びＮｏｔＩで消化した。これは、ｐＡＰＳＥ１０３７３を4，627個及び１１３個の塩基対の２つの断片に切断し、ｐＡＰＳＥ１０２１６を５，２０４個及び７８６個の塩基対の２つの断片に切断する。この４，７１３個及び７８６個の塩基対断片を単離し、一緒に連結してpAPSE10357を産生した。
【００６９】
上記のようにＥ．ｃｏｌｉ発現株ＨＴ１１５（ＤＥ３）に形質転換し、培養し、誘導すると、ｐＡＰＳＥ１０３５７はキャプシドタンパク質を欠く同様の構築物（ｐＡＰＳＥ１０３０５）から産生されたｄｓＲＮＡの量に対して著しい量の非キャプシド化ｄｓＲＮＡを産生しないであろう。これにより、ＲＮＡ結合部位及び結合タンパク質のｄｓＲＮＡとの単なる存在がインビボで産生されるｄｓＲＮＡの量を増加させるのに十分でないことを確認するであろう。あるいは、著しい量の非キャプシド化ｄｓＲＮＡの産生は、５’及び３’末端でのＲＮＡ結合部位及び同族ＲＮＡ結合タンパク質の存在が、ｄｓＲＮＡのインビボ産生を増加させるのに十分であることを示すであろう。
実施例8
キャプシドタンパク質のN末端は、ｄｓＲＮＡの高レベル産生に十分である。
【００７０】
ｄｓＲＮＡ遺伝子及びコートタンパク質遺伝子の両方を含有するプラスミドからのｄｓＲＮＡの増加した産生がインタクトなキャプシドタンパク質を必要とするか、またはタンパク質の一部のみが必要であるかどうかを調べるために、フレームシフト変異をｐＡＰＳＥ１０１８０のコートタンパク質遺伝子配列中に導入した。ｐＡＰＳＥ１０１８０を制限酵素ＳｔｕＩ及びＰｍｌＩで二重消化すると、５，４８５個の塩基対の大きな断片及びｐＡＰＳＥ１０１８０のコートタンパク質開始コドンから約４０個のコドンのキャプシドタンパク質ＣＤＳの約４個のコドンを含む小さな１３個の塩基対断片が産生される。制限酵素は平滑末端化末端を産生し、より大きな断片を再連結して、プラスミドｐＡＰＳＥ１０３７２（配列番号２７）を産生し、このプラスミドｐＡＰＳＥ１０３７２（配列番号２７）は、インタクトな誘導性ｄｓＲＮＡ  ＥｒｋＡに特異的な配列を産生することに加えて、終止コドン（配列番号２８）で終結する前に、ＭＳ２コートタンパク質のＮ末端の４１個のコドン、続いてフレームシフト配列の２７個のコドンを含む誘導性フレームシフトしたタンパク質も含む。ｐＡＰＳＥ１０３７２をＥ．ｃｏｌｉ発現株ＨＴＥ１１５（ＤＥ３）に形質転換し、記載のように培養して誘導すると、７５ｍｇ／ＬのｄｓＲＮＡが産生された。これは、キャプシドタンパク質のＮ末端のみがｄｓＲＮＡならびにインタクトなキャプシドタンパク質の産生を増加させるのに十分であることを示している（表１のｐＡＰＳＥ１０１８０及びｐＡＰＳＥ１０３７２からの収率と比較して）。
【００７１】
ＭＳ２キャプシドタンパク質のN末端は、４つの別個のベータシートからなる特徴的な３次元構造を形成する（Ｄ．Ｐｅａｂｏｄｙ，Ｔｈｅ  ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＭＳ２  ｃｏａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １２（２）５９５−６００（１９９３））。これらのシートのそれぞれは、アミノ酸３１〜３５からのβＤ、アミノ酸２２〜２５からのβＣ、アミノ酸１９〜２１からのβＢ、及びアミノ酸８〜１１からのβＡは、Ｎ末端キャプシドタンパク質断片のｄｓＲＮＡ産生を改善するための能力において役割を果たす可能性がある。命名法はＰｅａｂｏｄｙのものであり、ナンバリングはＰｅａｂｏｄｙによって省略されたN末端メチオニンを含むことに留意されたい。これらの構造モチーフの各々の段階的欠失は、ｄｓＲＮＡ産生を改善するための最小配列要件を決定することができる。
実施例９
フェドバッチ発酵はｄｓＲＮＡの非常に高レベルの産生をもたらす。
【００７２】
微生物増殖条件を改善することによってｄｓＲＮＡの量を増加させることができるかどうかを決定するために、グルコースフェドバッチ発酵を行った。簡単に言うと、フェドバッチ発酵は、３７°ＣでエッペンドルフＢｉｏＦｌｏ  １１５発酵槽中で行った。ｐＨは、３０％水酸化アンモニウムの自動添加によって制御した。溶存酸素プローブは、ＤＯプローブを抜くことにより0％に、空気飽和により１００％に較正した。容器を２ｖｖｍで通気させ、溶存酸素を攪拌のカスケード制御により３０％に維持した。ｐＡＰＳＥ１０３７９を含有するＨＴ１１５（ＤＥ３）の一晩培養物を３７°Ｃで１００ｕg／ｕｌのアンピシリン及び１２．５ｕｇ／ｕｌテトラサイクリンを含有するＬＢ中で増殖させて、種培地に接種した。種培地は、７．０のＰＨで維持された、５．６８ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、１．３４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、６．６ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｇ／Ｌのグルコース、１倍の微量金属及び１倍のビタミン溶液からなる限定倍地である。プラスミドの安定性を確実にするために、１００ｕｇ／ｕｌのアンピシリン及び１２．５ｕｇ／ｕｌのテトラサイクリンで抗生物質を添加する。飽和（ＯＤ６００  ３〜５）時に、種培養物を使用して、発酵槽のための１０％の接種材料を提供する。
【００７３】
フェドバッチ培養中に、５０％（重量／体積）のグルコース溶液を、炭素制限ＤＯ静止供給戦略に従って添加した。基礎培地は、６ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、３ｇ／ＬのＮａＨＰＯ４、１０ｇ／Ｌの（ＭＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、１倍の微量金属溶液と共に、１００ｕｇ／ｕｌのアンピシリン及び１２．５ｕｇ／ｕｌのテトラサイクリンで添加された抗生物質からなる。グルコースによって提供される最初の炭素源が使い尽くされると、供給溶液は、ＤＯレベルを飽和の３０％に維持する様式で自動的に加えられる。
【００７４】
細胞培養物が６０のＯＤ６００に達したら、グルコース供給物をラクトース供給物に切り替えることにより、細胞を１ｍＭのＩＰＴＧまた２０ｇ／Ｌのラクトースの供給物で誘導する。誘導後、誘導後の異なる時間に１ｍＬの試料を採取する。サンプルを、細胞ペレットをｐＨ７の２０ｍＭトリス−ＨＣｌ中に超音波処理することによって溶解させる。細胞ペレットからの全ＲＮＡを、周知のＴｒｉｚｏｌ抽出手順を用いて精製する。簡単に言えば、１容量の細胞溶解物を１容量のＴｒｉｚｏｌ  ＲＮＡ抽出試薬に加える。１容量のクロロホルムを添加すると、ＲＮＡが水層に分配され、タンパク質及びＤＮＡ混入物が後に残る。
【００７５】
ｄｓＲＮＡの収率を分析するために、全ＲＮＡサンプルを1ｕｇ／ｕｌに希釈し、ＲＮＡｓｅＡ処理に供する。反応は、ｐＨ７．０及び３７°Ｃで４０分間、２０ｍＭのトリス中で行われる。これが行われた後、プロテイナーゼKを、ヌクレアーゼを除去するために反応物に添加し、３７°Ｃで４０分間反応させる。この工程が完了すると、ゲルデンシトメトリーを使用してｄｓＲＮＡの濃度を決定するために、残りのｄｓＲＮＡを半分、４分の１、及び８分の1に希釈する。
【００７６】
ゲルデンシトメトリーによるｄｓＲＮＡ収率の定量は、既知の質量及び重量のｄｓＤＮＡバンド対ｄｓＲＮＡバンドの強度を、臭化エチジウムを含む１．５％アガロースゲルで比較することによって行った。ラムダ１００ｂｐの定量可能なＤＮＡマーカーを使用し、発酵からのｄｓＲＮＡが確実に定量される範囲を決定するための標準曲線を作成した。コンピュータプログラムは、ゲルにロードされたサンプルの量におけるｄｓＲＮＡの量を計算し、希釈工程を考慮した逆算が実行される。これらの条件下で誘導物質としてＩＰＴＧ及びラクトースの両方を用いて３ｇ／ＬのレベルでのｄｓＲＮＡの収率を計算した。これらの結果は、発酵条件を改善することによってｄｓＲＮＡ産生のさらなる増加が可能であることを示している。
実施例10
グラム陽性細菌におけるｄｓＲＮＡ産生のための組成物及び方法。
【００７７】
キャプシドタンパク質の共発現によるｄｓＲＮＡのレベルの増加をもたらすグラム陽性細菌の能力は、以下の方法で調べることができる。誘導性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＭＢ００１（ＤＥ３）下部ＤＳＭ  １０２０７１（Ｋｏｒｔｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌ．．Ｍｉｃｒｏｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．８（２）：２５３−６５．Ｍａｒ．２０１５に記載されている）を、ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩをコードするｒｎｃ遺伝子ホモログをノックアウトするように改変する。簡単に言うと、ｒｎｃ遺伝子のすぐ上流側のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＭＢ００１（ＤＥ３）中に存在する配列に相同な１．２ｋｂの配列を増幅することができるＰＣＲプライマー及びｒｎｃ遺伝子のすぐ下流側の配列に相同な１．５ｋｂの配列を増幅することができるＰＣＲプライマーを合成する。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＭＢ００１（ＤＥ３）ゲノムＤＮＡ及び該プライマーを用いるＰＣＲ増幅は、およそ２．７ｋｂのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ合成ＤＮＡ断片を産生するために、互いに結合した１．２ｋｂ及び１．５ｋｂの標的配列を含む単一のＤＮＡ断片をもたらす（標準的なオーバーラップＰＣＲ法によって）。このＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片及びプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ  （ＡＴＣＣ  ８７０９７、Ｓｃｈａｆｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｍａｌｌ  ｍｏｂｉｌｉｚａｂｌｅ  ｍｕｌｔｉ−ｐｕｒｐｏｓｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｐＫ１８  ａｎｄ  ｐＫ１９：ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ．Ｇｅｎｅ  １４５：６９−７３）を、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで消化し、産物を一緒に連結してプラスミドｐＡＰＳＥ１０４２９（配列番号２９）を産生する。プラスミドｐＡＰＳＥ１０４２９を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＭＢ００１に形質転換し、形質転換体は、染色体の組み込み体を同定するためのカナマイシン含有固体LB培地上で選択する。カナマイシン耐性クローンを、２０％スクロースを含有する固体ＬＢ培地に移す。ｓａｃＢ遺伝子の産物によるスクロースの変換は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＭＢ００１にとって毒性であり、それにより、染色体からｓａｃＢ遺伝子をその後欠失する染色体組み込み体だけがそのような培地で生存することができる。生存コロニーを増殖させ、ＰＣＲによりスクリーニングして、染色体からのｒｎｃ遺伝子座の付随的損失を確認する。所望の株は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＭＢ００１（ＤＥ３）  ｒｎｃと表記される。この株は、誘導性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを有し、ｒｎｃ遺伝子を欠き、キャプシドタンパク質の存在下���び非存在下でのｄｓＲＮＡ産生の有効性を試験するのに適している。
【００７８】
Ｅ．ｃｏｌｉ及びＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの両方においてキャプシドコートタンパク質及びｄｓＲＮＡの発現が可能なシャトルベクターは、グラム陽性プラスミドｐＣＧ１の複製起点及びｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢのカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＡＢ０２７７１４；Ｔｒａｕｔｗｅｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｎｃｏ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＣＧ１００  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３７：２０９３−１０１  １９９１により記載されている）を合成することによって構築される。グラム陽性Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＭＢ００１（ＤＥ３）ｒｎｃ株中のキャプシドタンパク質の存在が、以下の記載されるようにｄｓＲＮＡを高レベルで産生するかどうかを試験することを可能にするために、この合成ＤＮＡ（配列番号３０）を前述したｄｓＲＮＡ含有プラスミド中に連結する。
【００７９】
ｐＣＧ１複製起点及びカナマイシン耐性遺伝子を含む合成ＤＮＡの挿入は、ｐＡＰＳＥ１０２７９をＮｒｕＩで消化し、リン酸化された合成ＤＮＡをプラスミドに連結して、プラスミドｐＡＰＳＥ１０４３０（配列番号３１）を産生することによって達成される。プラスミドｐＡＰＳＥ１０４３０は、１６６個の塩基の非相同ループによって分離され、かつ任意のｐａｃ配列を完全に欠くコロラドハムシのベータアクチン遺伝子に相同で、以前に記載された２９４個の塩基センス及びアンチセンス配列に基づくカナマイシン耐性遺伝子、バクテリオファージＭＳ２コートタンパク質及びｄｓＲＮＡ構築物を含有する。同様にして、ｐＣＧ１複製起点及びカナマイシン耐性遺伝子を含む合成ＤＮＡをＮｒｕＩ消化ｐＡＰＳＥ１０３０３に連結してｐＡＰＳＥ１０４３１（配列番号３２）を産生する。プラスミドｐＡＰＳＥ１０４３１は、アンピシリン及びカナマイシンに対する耐性遺伝子、ならびにｐＡＰＳＥ１０４３０と同じ誘導性ｄｓＲＮＡ構築物を含む。しかしながら、ｐＡＰＳＥ１０４３１は、ｐＡＰＳＥ１０４３０の誘導性ＭＳ２コートタンパク質遺伝子を欠いている。ｐＡＰＳＥ１０４３０及びｐＡＰＳＥ１０４３１の関連する特徴を表２に示し、これらの２つのプラスミド及びそれらの親プラスミド、ｐＡＰＳＥ１０２７９及びｐＡＰＳＥ１０３０３の間の関係は、それぞれ表２及び表１を比較することによって決定することができる。
【００８０】
ＭＳ２コートタンパク質を含む及び含まない１つ、２つ及び３つのｐａｃ部位を含むさらなるプラスミドを同じ手順を用いて構築する。βアクチンステムループ構造の３’側のpac部位を含み、ＭＳ２コートタンパク質遺伝子をコードするプラスミドｐＡＰＳＥ１０４３２（配列番号３３）は、合成ＤＮＡ断片をｐＡＰＳＥ１０２１９のＮｒｕＩ部位に連結することによって産生される。プラスミドｐＡＰＳＥ１０４３３（配列番号３４）は、合成ＤＮＡ断片をｐＡＰＳＥ１０３０４のＮｒｕＩ部位に連結することによって産生される。プラスミドｐＡＰＳＥ１０４３３は、誘導性ＭＳ２コートタンパク質遺伝子を欠くことを除いて、ｐＡＰＳＥ１０４３２と同一である。βアクチンステムループの両側に位置し、ＭＳ２コートタンパク質をコードする２つのｐａｃ部位配列を含み、ｐＡＰＳＥ１０２１６のＮｒｕＩ部位に合成ＤＮＡ断片を連結することにより、プラスミドｐＡＰＳＥ１０４３４（配列番号３５）が産生される。プラスミドｐＡＰＳＥ１０４３５（配列番号３６）は、合成ＤＮＡ断片をｐＡＰＳＥ１０３０５のＮｒｕＩ部位に連結することによって産生される。プラスミドｐＡＰＳＥ１０４３５は、誘導性ＭＳ２コートタンパク質遺伝子を欠くことを除いて、ｐＡＰＳＥ１０４３４と同一である。１つずつがベータアクチンステムループの各５’及び３’の両側に位置し、１つがループ配列それ自体の中にある３つのｐａｃ部位配列を含有し（図１に描写されるように）、ＭＳ２コートタンパク質をコードするプラスミドｐＡＰＳＥ１０４３６（配列番号３７）は、ｐＡＰＳＥ１０２６９のＮｒｕＩ部位に合成ＤＮＡ断片を連結することによって産生される。プラスミドｐＡＰＳＥ１０４３７（配列番号３８）は、合成ＤＮＡ断片をｐＡＰＳＥ１０３０６のＮｒｕＩ部位に連結することによって産生される。プラスミドｐＡＰＳＥ１０４３７は、誘導性ＭＳ２コートタンパク質遺伝子を欠くことを除いて、ｐＡＰＳＥ１０４３６０と同一である。
【００８１】
それぞれの場合において、標的プラスミドの形質転換体のＮｒｕＩ部位に合成ＤＮＡ断片のライゲーションに続いて、ライゲーション反応は、脱塩し、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＭＢ００１（ＤＥ３）ｒｎｃに形質転換し、カナマイシンに対する耐性を選択する。選択されたクローンを、その後、培養物が０．８のＯＤ６００に達するまでカナマイシンを含有する１００ｍｌのＬＢ培地中で、３２℃で増殖させ、その時点でイソプロピルβ-Ｄ-チオガラクトピラノシドを最終濃度１ｍＭになるように添加して、ＭＳ２コートタンパク質及びｄｓＲＮＡ、またはコートタンパク質を欠くプラスミド中のｄｓＲＮＡ前駆体のみの転写に向けられるＴ７ポリメラーゼを誘導する。誘導された培養物を誘導後少なくとも４時間増殖させて、ＭＳ２コートタンパク質及びｄｓＲＮＡ標的の蓄積に十分な時間を与える。４℃で３，０００gで遠心分離することによって細胞を採集する。各ペレットを処理するまで４℃で保存する。
【００８２】
ｄｓＲＮＡは、各ペレットを１０ｍＭのＮａＣｌを含有するおよそ０．１用量の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０中に再懸濁し、超音波処理して細胞を溶解することによって精製する。１６，０００ｇでの遠心分離によって細胞残渣を除去する。得られた溶解物を３容量のＴｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合し、１容量のクロロホルムを添加してＲＮＡを抽出する。水層への５００ｍＭの最終濃度へのＮａＣｌの添加及びその後のエタノール沈殿により、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主から２９４ｂｐのｓｉＲＮＡ前駆体及びＲＮＡを含有するペレットが得られる。
【００８３】
ＭＳ２コートタンパク質を含む及び含まない、様々なｐａｃ部位構成を含むプラスミドで形質転換されたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍによって産生されるｄｓＲＮＡの量を決定するために、エタノールペレットを、３７℃で１時間、ＲＮＡｓｅＡで再懸濁かつ処理し、続いて、３７℃で１時間プロテイナーゼＫ消化する。ｄｓＲＮＡの定量は、ＢｉｏＲａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システムを用いたゲルデンシトメトリーによって達成する。処理したｄｓＲＮＡのいくつかの希釈液を、０．００１％の臭化エチジウムを含む１．５％アガロースゲル上で流す。１００ｂｐの定量可能なｄｓＤＮＡラダー（ＱｕａｎｔｉＢＰ  ＤＮＡラダーラムダ）を標準曲線として使用し、ｄｓＲＮＡを標準曲線の直線範囲内の濃度で定量する。Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ  ４．１などのソフトウェアは、ゲル上にロードされたｄｓＲＮＡの濃度を決定し、ｄｓＲＮＡの最終収率は、ゲル上に存在するｄｓＲＮＡ試料に関連する希釈を考慮して決定される。
【００８４】
表２は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＭＢ００１（ＤＥ３）  ｒｎｃと上記の種々のプラスミドによって産生されたコロラドハムシベータアクチンｄｓＲＮＡのｄｓＲＮＡの収率決定の予測結果をまとめたものである。このような結果は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのグラム陽性宿主が、ＭＳ２コート遺伝子及び目的のｄｓＲＮＡ標的の共発現によって大量のｄｓＲＮＡを産生することを確認する。
【表２−１】
2019508060.tif 000004
実施例11
酵母におけるｄｓＲＮＡ産生のための組成物及び方法。
【００８５】
ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質を利用するｄｓＲＮＡ蓄積に好適なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ＿生産宿主を作製するために、S  cerevisiae  ＹＰＨ  ５００のＲｎｔ１遺伝子  （ＡＴＣＣ７６６２６)  を、Ｇａｒｄｅｎｒ及びＪａｓｐｅｒｓｏｎの手順に従ってノックアウトする（（Ｇａｒｄｎｅｒ，ＪＭ  ａｎｄ  Ｊａｓｐｅｒｓｅｎ，ＳＬ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｏｍｅ：ｄｅｌｅｔｉｏｎ，ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔａｇｇｉｎｇ  ｂｙ  ＰＣＲ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１２０５：４５−７８，２０１４）。ＫａｎＭｘ４遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｒｎｔ１遺伝子の６０個の塩基対（bp）上流（フォワードプライマー）領域及び６０ｂｐの下流（リバースプライマー）領域を含むPCRプライマーを用いて、ｐＭＬ１０４−ＫａｎＭｘ４プラスミドから増幅される（Ｌａｕｇｈｅｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｓｈｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｙｅａｓｔ  ３２（１２）：７１１−２０  Ｓｅｐ．２１，２０１５）。得られたＰＣＲ産物を、確立されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ形質転換プロトコルに従って化学的にコンピテントなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞に導入する。形質転換された細胞を、選択マーカーなしで一晩インキュベートして相同組換えを起こさせ、Ｒｎｔ１の６０ｂｐの上流及び下流領域を担持するｋａｎＭｘ４遺伝子においてＲｎｔ１遺伝子を置換する。一晩のインキュベーションの後、形質転換された細胞を、選択マーカーとしてＧ４１８を保有するＹＰＤプレート上にプレーティングする。Ｇ４１８耐性コロニーをＰＣＲによってスクリーニングして、ＹＰＨ  ５００ゲノム中のｋａｎＭｘ４遺伝子の存在及びＲｎｔ１遺伝子の欠失を確認する。
【００８６】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＥＳＣ−Ｈｉｓ、ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ、ｐＥＳＣ−Ｕｒａ及びｐＥＳＣ−Ｔｒｐは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける組換えタンパク質発現に広く使用されている。ｐＥＳＣベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＣＡ）のそれぞれは、同じベクター骨格内に４つの異なる酵母選択マーカー（ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、またはＵＲＡ３）のうちの1つを含み、単一の酵母細胞において２つの異なる遺伝子。ｐＥＳＣ系ベクターは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＹＰＨ  ５００  (ＭＡＴα  ｕｒａ３−５２  ｌｙｓ２−８０１＿ａｍｂｅｒ  ａｄｅ２−１０１＿ｏｃｈｒｅ  ｔｒｐ１−Δ６３  ｈｉｓ３−Δ２００  ｌｅｕ２−Δ１）で使用される。この例では、ｐＥＳＣ−Ｔｒｐベクターは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内部のＭＳ２コートタンパク質及び標的ｄｓＲＮＡ配列の発現のために選択されるが、これらのベクターが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅならびにＥ．ｃｏｌｉ中で複製することができ、ｄｓＲＮＡを産生にするのに必要な分子操作を容易にするために、他のｐＥＳＣベクターのいずれも同様な方法を用いて使用することができる。
【００８７】
このｐＥＳＣ−Ｔｒｐベクターは、ＧＡＬ１プロモーターの下流のＢａｍＨＩ、ＳｗａＩ、ＡｓｉＳＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｃＩＩ及びＮｈｅＩ部位を含有する５０塩基対のマルチクローニング部位リンカーを、既存のＢａｍＨＩ及びＮｈｅＩ部位中にクローニングすることによって改変される。これに続いて、ｐＡＰＳＥ１０２７９のベータアクチンステムループ配列（ｄｓＲＮＡ）をＡｓｉＳ１／Ｎｏｔ１断片として切り出し、改変したｐＥＳＣ−ＴｒｐベクターのＡｓｉＳ１／Ｎｏｔ１部位に連結する。このプラスミド中のｄｓＲＮＡの発現は、ガラクトース誘導性プロモーターＧＡＬ１の制御下にある。新しいベクターは、ｐＡＰＳＥ１０４３９（配列番号３９）と命名される。別のプラスミド、ｐＡＰＳＥ１０４４０（配列番号４０）は、ｐＡＰＳＥ１０４３９と同一であるが、ＭＳ２コートタンパク質も含む。プラスミドｐＡＰＳＥ１０４４０は、ｐＡＰＳＥ１０２７９のＭＳ２コートタンパク質発現配列を、５’末端にＥｃｏＲＩ制限部位を有するフォワードプライマー及び３’末端にＳａｃＩ部位を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅することによって構築する。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩで消化し、ｐＡＰＳＥ１０４３９の同族部位にクローニングする。従って、ｐＡＰＳＥ１０４３９はＧＡＬ１プロモーター由来のｄｓＲＮＡを誘導的に発現するが、ｐＡＰＳＥ１０４４０はＧＡＬ１プロモーター由来のｄｓＲＮＡ配列及びＧＡＬ１０プロモーター由来のＭＳ２コートタンパク質を誘導的に発現する。
【００８８】
この技術を用いて同様のプラスミド対を構築する。ｐＡＰＳＥ１０４３９及びｐＡＰＳＥ１０４４０をＡｓｉＳＩ及びＮｏｔＩで消化し、ベクター断片を単離することにより、プラスミドｐＡＰＳＥ１０４４１（配列番号４１）及びｐＡＰＳＥ１０４４２（配列番号４２）を産生する。プラスミドｐＡＰＳＥ１０２１９もまた、ＡｓｉＳＩ及びＮｏｔＩで消化し、ｄｓＲＮＡ配列を単離する。単離されたｄｓＲＮＡ配列をｐＡＰＳＥ１０４３９ベクターに連結してｐＡＰＳＥ１０４４１を形成させ、単離されたｄｓＲＮＡ配列をｐＡＰＳＥ１０４４０ベクターに連結してｐＡＰＳＥ１０４４２を形成する。ｐＡＰＳＥ１０４３９及びｐＡＰＳＥ１０４４０をＡｓｉＳＩ及びＮｏｔＩで消化し、ベクター断片を単離することにより、プラスミドｐＡＰＳＥ１０４４３（配列番号４３）及びｐＡＰＳＥ１０４４４（配列番号４４）を産生する。プラスミドｐＡＰＳＥ１０２１６もまた、ＡｓｉＳＩ及びＮｏｔＩで消化し、ｄｓＲＮＡ配列を単離する。単離されたｄｓＲＮＡ配列をｐＡＰＳＥ１０４３９ベクターに連結してｐＡＰＳＥ１０４４３を形成させ、単離されたｄｓＲＮＡ配列をｐＡＰＳＥ１０４４０ベクターに連結してｐＡＰＳＥ１０４４４を形成する。ｐＡＰＳＥ１０４３９及びｐＡＰＳＥ１０４４０をＡｓｉＳＩ及びＮｏｔＩで消化し、ベクター断片を単離することにより、プラスミドｐＡＰＳＥ１０４４５（配列番号４５）及びｐＡＰＳＥ１０４４６（配列番号４６）を産生する。プラスミドｐＡＰＳＥ１０２６９もまた、ＡｓｉＳＩ及びＮｏｔＩで消化し、ｄｓＲＮＡ配列を単離する。単離されたｄｓＲＮＡ配列をｐＡＰＳＥ１０４３９ベクターに連結してｐＡＰＳＥ１０４４５を形成させ、単離されたｄｓＲＮＡ配列をｐＡＰＳＥ１０４４０ベクターに連結してｐＡＰＳＥ１０４４６を形成する。
【００８９】
化学的にコンピテントなＹＰＨ  ５００  ＤＲｎｔ１細胞を、上記のプラスミド（ｐＡＰＳＥ１０４３９〜４６）のそれぞれで別々に形質転換し、合成デキストロース最小（ＳＤ）トリプトファン（ｔｒｐ）で選択した個々のクローンをプレートから脱落させる。１００ｍｌのSD-Trp脱落ブロスを接種した後、培養物を１２〜１６時間増殖させる。次いで、培養物からの細胞を３０００ｇで５分間遠心分離して採集し、細胞ペレットを滅菌水で1回洗浄し、トリプトファンを含まない合成ガラクトース最小ブロス（ＳＧ）に細胞を再懸濁する。細胞をＳＧ−ｔｒｐ脱落ブロス中で一晩増殖させて、ｄｓＲＮＡ及びＭＳ２コートタンパク質の産生及び蓄積を誘導する（必要に応じて）。４℃で３０００ｇでの遠心分離によって細胞を採集する。各ペレットを処理するまで−２０℃で保存する。
【００９０】
ｄｓＲＮＡは、およそ１．０ｍｌの酵母細胞溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ｃ４４８２）中に各ペレット（培養液１０ｍｌ）を再懸濁することによって精製される。得られた溶解物を３容量のＴｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合し、１容量のクロロホルムを添加してＲＮＡを抽出する。水層への５００ｍＭの最終濃度へのＮａＣｌの添加及びその後のエタノール沈殿により、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主からｄｓＲＮＡ及びＲＮＡを含有するペレットが得られる。得られたＲＮＡペレットを２０ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ７．０に溶解し、試料のＲＮＡ濃度を決定する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株によって産生されたｄｓＲＮＡの量を決定するために、ｐＡＰＳＥ１０４３９〜ｐＡＰＳＥ１０４４６由来の各ＲＮＡ試料からの既知量のＲＮＡ（１０ｈｇ）をＲＮＡｓｅＡで３７℃にて１時間消化し、続いて３７℃で１時間、プロテイナーゼＫ消化する。得られた試料は、ｄｓＲＮＡ標的のみを含む。ｄｓＲＮＡの定量は、ＢｉｏＲａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システムを用いたゲルデンシトメトリーによって行われる。１．５％アガロース及び０．００１％臭化エチジウムを含有するゲル上で、ＲＮＡｓｅＡ反応のいくつかの希釈を行う。１００ｂｐの定量可能なｄｓＤＮＡラダー（ＱｕａｎｔｉＢＰ  ＤＮＡラダーラムダ）を標準曲線として使用し、ｄｓＲＮＡを標準曲線の直線範囲内の濃度で定量する。Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ  ４．１ソフトウェアを用いて、ゲル上にロードされたｄｓＲＮＡの濃度を決定し、ｄｓＲＮＡの最終収率は、ゲル上にロードされたｄｓＲＮＡのる希釈を考慮して算出される。
【００９１】
表２は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ−５００と上記の種々のプラスミドによって産生されたコロラドハムシベータアクチンｄｓＲＮＡのｄｓＲＮＡの収率決定の予測結果をまとめたものである。このような結果は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母が、ＭＳ２コート遺伝子及び目的のｄｓＲＮＡ標的の共発現によって大量のｄｓＲＮＡを産生することを確認する。
【表２−２】
2019508060.tif 000005
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2019508060.tif 000011
【配列表】
2019508060000001.app
【国際調査報告】
2019508060.tif 000012