(57)【要約】  本発明では、ＩＬ−１５又は機能性多様体を含む１つのドメイン、及び疾患の抗原、免疫チェックポイント又はシグナル分子に特異的な結合ドメインを有する複数特異的なタンパク質複合体を取り上げて記載する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２の可溶性タンパク質を含む単離された可溶性融合タンパク質複合体であって、
第一の可溶性タンパク質がインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドドメインを含み、かつ第二の可溶性タンパク質がイムノグロブリンＦｃドメインと融合した可溶性のＩＬ−１５受容体αスシ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）であって、
第一又は第二の可溶性タンパク質のうちの１つが疾患の抗原、免疫チェックポイント分子又は免疫シグナル分子と特異的に結合する結合ドメインをさらに含むものであって、
第一の可溶性タンパク質のＩＬ−１５ドメインが第二の可溶性タンパク質のＩＬ−１５ＲαＳｕドメインと結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する、
可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項２】
第一又は第二の可溶性タンパク質のうちの１つが疾患の抗原、免疫チェックポイント分子又は免疫シグナル分子と特異的に結合する第二の結合ドメインをさらに含む、請求項１に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項３】
前記ＩＬ−１５ポリペプチドがＮ７２Ｄ変異体を含むＩＬ−１５多様体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）である、請求項１又は２に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項４】
前記結合ドメインが、ポリペプチドリンカー配列によってイムノグロブリン重鎖可変ドメインと共有結合したイムノグロブリン軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項５】
前記結合ドメインが、プログラム細胞死リガンド（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球に関連したタンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、分化抗原群３３（ＣＤ３３）、分化抗原群４７（ＣＤ４７）、グルココルチコイドに誘発される腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）群に関する遺伝子（ＧＩＴＲ）、リンパ球機能に関連した抗原１（ＬＦＡ−１）、組織因子（ＴＦ）、デルタ様タンパク質４（ＤＬＬ４）、一本鎖ＤＮＡ又はＴ細胞イムノグロブリン及びムチンドメイン含有−３（Ｔｉｍ−３）を含む１又はそれ以上の分子と特異的に結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項６】
第一の可溶性タンパク質が配列番号：２、６、１０、１８、２０、２４、２８、３２又は３８のうちの１つに示されたアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項７】
第二の可溶性タンパク質が配列番号：４、８、１２、１４、１６、２２、２６、３０、３４、３６、４０、４２、４４、４６、５１、５２、５３又は５４のうちの１つに示されたアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の第二の可溶性融合タンパク質複合体と共有結合した請求項１〜７のいずれか１項に記載の第一の可溶性融合タンパク質複合体を含む、可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項９】
第一の可溶性融合タンパク質複合体が、第一の可溶性融合タンパク質複合体のＦｃドメインと第二の可溶性融合タンパク質複合体のＦｃドメインを結合するジスルフィド結合によって、第二の可溶性融合タンパク質複合体と共有結合される、請求項８に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項１０】
請求項６に記載の第一の可溶性タンパク質をコードする核酸配列であって、前記核酸配列が配列番号：１、５、９、１７、１９、２３、２７、３１又は３７のうちの１つに示された配列を含む核酸配列。
【請求項１１】
前記核酸配列が前記可溶性タンパク質をコードする配列と作動可能に結合されたプロモーター、翻訳開始シグナル及びリーダー配列をさらに含む、請求項１０に記載の核酸配列。
【請求項１２】
請求項７に記載の第二の可溶性タンパク質をコードする核酸配列であって、前記核酸配列が配列番号：３、７、１１、１３、１５、２１、２５、２９、３３、３５、３９、４１、４３、４５、４７、４８、４９又は５０のうちの１つに示された配列を含む核酸配列。
【請求項１３】
前記核酸配列が、可溶性タンパク質をコードする配列と作動可能に結合されたプロモーター、翻訳開始シグナル及びリーダー配列をさらに含む、請求項１２に記載の核酸配列。
【請求項１４】
請求項１１及び／又は請求項１３に記載の核酸配列を含むＤＮＡベクター。
【請求項１５】
前記疾患の抗原が新生組織形成、感染症又は自己免疫性疾患と関連している、請求項１〜９のいずれか１項に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項１６】
標的細胞を殺傷する方法であって：
ａ）複数の細胞を請求項１に記載の可溶性融合タンパク質複合体に接触させ、そこで複数の細胞が請求項１又は２に記載のＩＬ−１５ドメインによって認識されたＩＬ−１５受容体（ＩＬ−１５Ｒ）鎖を保有する免疫細胞をさらに含むか、あるいは請求項１又は２に記載の結合ドメインによって認識された疾患の抗原、チェックポイント又はシグナル分子、及び標的細胞を保有する免疫細胞をさらに含むこと；
ｂ）ＩＬ−１５Ｒ若しくはシグナル分子を介して、又はチェックポイント分子の阻害を介して、免疫細胞を活性化させること；
ｃ）活性化免疫細胞によって標的細胞を殺傷すること；
を含む方法。
【請求項１７】
標的細胞を殺傷する方法であって：
ａ）複数の細胞を請求項２に記載の可溶性融合タンパク質複合体に接触させ、そこで複数の細胞が請求項１又は２に記載のＦｃドメインによって認識されたＦｃ受容体鎖を保有する免疫細胞、及び請求項１又は２に記載の抗原に特異的な結合ドメインによって認識された抗原を保有する標的細胞をさらに含むこと；
ｂ）免疫細胞を結合し活性化させるのに十分な標的細胞上の抗原と免疫細胞上のＦｃ受容体鎖間の特異的な結合複合体（架橋）を形成すること；
ｃ）結合した活性化免疫細胞によって標的細胞を殺傷すること；
を含む方法。
【請求項１８】
標的細胞が腫瘍細胞、感染細胞又は自己免疫性疾患に関連した細胞である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
結合ドメインが抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２０】
対象の免疫反応を刺激する方法であって、請求項１〜９又は１５のいずれか１項に記載の可溶性融合タンパク質複合体の有効量を対象に投与することを含む方法。
【請求項２１】
治療を必要とする対象の新生組織形成、感染症又は自己免疫性疾患の治療方法であって、前記対象に請求項１〜１５又は１７のいずれか１項に記載の可溶性融合タンパク質複合体を含む医薬組成物の有効量を投与することを含み、それにより前記新生組織形成、感染症又は自己免疫性疾患を治療することを含む方法。
【請求項２２】
前記新生組織形成が、膠芽腫、前立腺癌、血液のがん、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ種、充実性腫瘍、尿路上皮／膀胱腫瘍、黒色腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、胃癌及び食道癌、前立腺癌、膵癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、並びに頭部及び頸部の扁平上皮癌からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記有効量が約１〜１００μｇ／ｋｇ間の前記融合タンパク質複合体である、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記融合タンパク質複合体が少なくとも１週間に１回投与される、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記医薬組成物が全身、局所、静脈内、皮下又は腫瘍内に投与される、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記融合タンパク質複合体が対象の免疫反応を誘発する、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記融合タンパク質複合体が免疫細胞の増殖を増加させる、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記融合タンパク質複合体が、前記新生物形成、感染症又は自己免疫性疾患に関連した細胞に対する免疫細胞の反応を刺激する、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３５、３９、４１、４３、４５、４７、４８、４９又は５０を含む核酸配列。
【請求項３０】
配列番号：２、４、６、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５１、５２、５３又は５４を含むペプチド。
【請求項３１】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染を予防又は治療する方法であって、配列番号：５１、５２、５３又は５４を含む可溶性融合タンパク質複合体の治療上の有効量を含む組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項３２】
請求項１〜９又は１５のいずれか１項に記載の単離された可溶性融合タンパク質複合体、請求項１０、１２又は２９のいずれか１項に記載の核酸配列、請求項１４に記載のＤＮＡベクター、請求項３０に記載のペプチド配列を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年６月１日に出願された米国特許仮出願第６２／５１３，９６４号及び２０１６年１０月２１日に出願された米国特許仮出願第６２／４１１，２１６号の優先権を主張する。これらの出願の全内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は概して多量体融合分子の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書に記載の発明に先立ち、疾患の部位に対して多様なエフェクター分子を標的化し、非特異的免疫活性と関連のある副作用を伴わずに治療上の利益を提供するための新たな戦略を発展させることが急務であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、少なくとも部分的には、複数特異的なＩＬ−１５に基づくタンパク質複合体が免疫細胞の刺激を高め、疾患細胞に対してそれらの活性を促進させ、それにより疾患の低減又は予防をもたらすという驚くべき発見に基づく。これらのＩＬ−１５に基づくタンパク質複合体は疾患及び標的抗原との増加した結合をまた示す。本明細書では、ＩＬ−１５又は機能性多様体を含む１つのドメイン、及び疾患抗原、免疫チェックポイント又はシグナル分子に特異的な結合ドメインを有する複数特異的なタンパク質複合体を提供する。具体的には、本明細書に記載のタンパク質複合体は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球に関連したタンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、分化抗原群４７（ＣＤ４７）、Ｔ細胞イムノグロブリン及びムチンドメイン含有−３（ＴＩＭ−３、ＴＩＭ３）、若しくはグルココルチコイドに誘発された腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）群に関する遺伝子（ＧＩＴＲ）を認識する結合ドメインと融合したＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ−Ｉｇ  Ｆｃ骨格（スキャフォールド）を含む。これらの複合体はＩＬ−１５活性を介してＮＫ細胞及びＴ細胞反応を誘発し、抗ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４７、ＴＩＭ３又はＧＩＴＲ結合ドメインを介して免疫チェックポイント阻害を通じ免疫反応を増加させる（図１）。一部の場合では、これらの複合体は疾患細胞上に発現した抗原、例えばＰＤ−Ｌ１、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、ＣＤ２０、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、ＣＤ３３、Ｎｏｔｃｈ  １、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、組織因子又はＨＩＶエンベロープをまた認識し、Ｆｃ結合ドメインを介して疾患細胞に対し抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を刺激する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書に提供される単離された可溶性融合タンパク質複合体は、少なくとも２つの可溶性タンパク質を含む。例えば、第一のタンパク質はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチド、例えば、Ｎ７２Ｄ変異を含む多様体ＩＬ−１５ポリペプチド（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）を含む。第二のタンパク質はイムノグロブリンＦｃドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ）と融合した可溶性ＩＬ−１５受容体αスシ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含む。単離された可溶性融合タンパク質複合体の第三の成分は、疾患抗原、免疫チェックポイント分子又はシグナル分子、例えばＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４７、ＴＩＭ３又はＧＩＴＲを認識する結合ドメインを含み、そこで該結合ドメインはＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質のどちらかと融合している。一部の場合では、これらの結合ドメインはＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質の両方と結合している。他の場合では、これらの結合ドメインのうちの１つが、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質と融合しており、第二の結合ドメイン、すなわち免疫チェックポイント又はシグナル分子又は疾患抗原に特異的な結合ドメインは他のタンパク質と融合している。一態様において、疾患抗原は新生組織形成、感染症又は自己免疫性疾患と関連している。一部の場合では、第一又は第二の可溶性タンパク質は、疾患細胞上に発現した疾患抗原、例えばＰＤ−Ｌ１、ｓｓＤＮＡ、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＧＤ２、ＣＤ３３、Ｎｏｔｃｈ  １、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、組織因子又はＨＩＶエンベロープ又は他の既知の抗原を認識する結合ドメインをさらに含む。あるいは、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質のどちらかが疾患抗原、免疫チェックポイント又はシグナル分子に特異的な結合ドメインを含み、他方のタンパク質（それぞれＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ又はＩＬ−１５Ｎ７２Ｄタンパク質）が追加の融合した結合ドメインを含まない。第一のタンパク質のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄドメインは第二のタンパク質の可溶性ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインと結合し、可溶性融合タンパク質複合体を形成する。例示的な融合タンパク質複合体は、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び／又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質と共有結合した抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む（図１及び図２）。あるいは、第一のタンパク質がイムノグロブリンＦｃドメインと融合した可溶性ＩＬ−１５受容体αスシ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）と共有結合した抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む一方、第二のタンパク質はＮ７２Ｄ変異を含む多様体インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチド（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）と共有結合した疾患抗原を認識する結合ドメインを含む。
【０００６】
一部の場合では、該結合ドメインが一本鎖抗体（ｓｃＡｂ又はｓｃＦｖ）を含み、そこでイムノグロブリン軽鎖可変ドメインがポリペプチドリンカー配列によってイムノグロブリン重鎖可変ドメインと共有結合している。あるいは、該結合ドメインは免疫チェックポイント阻害剤又は免疫アゴニストとして作用可能な可溶性又は細胞外リガンド又は受容体ドメインを含む。
【０００７】
例示的な第一のタンパク質は配列番号：２、６、１０、１８、２０、２４、２８、３２又は３８に示されたアミノ酸配列を含む。例示的な第二のタンパク質は配列番号：４、８、１２、１４、１６、２２、２６、３０、３４、３６、４０、４２、４４、４６、５１、５２、５３又は５４に示されたアミノ酸配列を含む。第一のタンパク質をコードする例示的な核酸配列は、配列番号：１、５、９、１７、１９、２３、２７、３１又は３７に示された配列を含む。第二のタンパク質をコードする例示的な核酸配列は配列番号：３、７、１１、１３、１５、２１、２５、２９、３３、３５、３９、４１、４３、４５、４７、４８、４９又は５０に示された配列を含む。一態様において、該核酸配列は該融合タンパク質をコードする配列と作動可能に結合されたプロモーター、翻訳開始シグナル及びリーダー配列をさらに含む。本明細書に記載の核酸配列を含むＤＮＡベクターもまた提供される。例えば、該核酸配列は複製、発現又はその両方のためにベクター内に存在する。
【０００８】
第二の可溶性融合タンパク質複合体と共有結合した第一の可溶性融合タンパク質複合体を含む可溶性融合タンパク質複合体もまた提供される。例えば、本発明の可溶性融合タンパク質複合体は多量体化され、例えば、二量体化、三量体化又はその他に多量体化（例えば、４つの複合体、５つの複合体等）される。例えば、多量体はホモ多量体又はヘテロ多量体である。該可溶性融合タンパク質複合体は共有結合、例えばジスルフィド結合、化学架橋剤によって結合される。一部の場合では、ある可溶性融合タンパク質は、第一の可溶性タンパク質のＦｃドメインと第二の可溶性タンパク質のＦｃドメインを結合するジスルフィド結合によって、別の可溶性融合タンパク質と共有結合している。
【０００９】
該Ｆｃドメイン又はその機能性フラグメントは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメイン、ＩｇＡ  Ｆｃドメイン、ＩｇＤ  Ｆｃドメイン、ＩｇＥ  Ｆｃドメイン及びＩｇＭ  Ｆｃドメイン；マウスＩｇＧ２Ａドメインからなる群から選択されるＦｃドメイン、又はそれらの任意の組み合わせを含む。任意選択的に、該Ｆｃドメインは、変化した相補体若しくはＦｃ受容体結合特性、又は変化した二量体化又はグリコシル化プロフィールを有するＦｃドメインをもたらすアミノ酸変化を含む。変化した相補体若しくはＦｃ受容体結合特性、又は変化した二量体化又はグリコシル化プロフィールを有するＦｃドメインを産生するアミノ酸変化が当該分野において知られている。例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ２の２３４位と２３５位のロイシン残基（抗体コンセンサス配列に基づくナンバリング）（すなわち、……ＰＥＬＬＧＧ……）とアラニン残基（すなわち、……ＰＥＡＡＧＧ……）の置換は、Ｆｃγ受容体結合の損失をもたらす一方、ＩｇＧ１  ＣＨ２の３２２位のリジン残基（抗体コンセンサス配列に基づくナンバリング）（すなわち、……ＫＣＫＳＬ……）とアラニン残基（すなわち、……ＫＣＡＳＬ……）の置換は、補体活性化の損失をもたらす。一部の場合では、かかる変異は組み合わさっている。
【００１０】
一部の態様において、該結合ドメインはポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５ポリペプチド（又はその機能性フラグメント）と共有結合している。同様に、該結合ドメインはポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５Ｒαポリペプチド（又はその機能性フラグメント）と共有結合している。任意選択的に、該ＩＬ−１５Ｒαポリペプチド（又はその機能性フラグメント）はポリペプチドリンカー配列によって該Ｆｃドメイン（又はその機能性フラグメント）と共有結合している。各ポリペプチドリンカー配列は独立して選択され得る。任意選択的に、ポリペプチドリンカー配列は同一である。あるいは、それらは異なっている。
【００１１】
任意選択的に、少なくとも１つの可溶性融合タンパク質が検出可能な標識を含む本発明の可溶性融合タンパク質複合体が提供される。検出可能な標識は、限定されないが、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素、又はその触媒活性フラグメント、放射性核種、ナノ粒子、常磁性金属イオン、又は蛍光、リン光性若しくは化学発光分子、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
【００１２】
一部の実施形態では、第一の可溶性タンパク質をコードする核酸配列は配列番号：１、５、９、１７、１９、２３、２７、３１又は３７に示された配列を含む。一部の実施形態では、第二の可溶性タンパク質をコードする核酸配列は配列番号：３、７、１１、１３、１５、２１、２５、２９、３３、３５、３９、４１、４３、４５、４７、４８、４９又は５０に示された配列を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、核酸配列は配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４８、４９又は５０を含む。
【００１４】
該核酸配列は、該可溶性タンパク質をコードする配列と作動可能に結合されたプロモーター、翻訳開始シグナル及びリーダー配列をさらに含む。
【００１５】
他の実施形態では、ポリペプチドは配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５１、５２、５３又は５４を含む。
【００１６】
本発明は、本発明の可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法を提供する。該方法は以下の段階を含む：ａ）第一の宿主細胞内に第一のタンパク質をコードする適切な制御配列を有するＤＮＡベクターを導入すること、ｂ）第一のタンパク質が細胞内又は培地内で発現するのに十分な状況下で宿主細胞を培地で培養すること、ｃ）宿主細胞又は培地から第一のタンパク質を精製すること、ｄ）第二の宿主細胞内に第二のタンパク質をコードする適切な制御配列を有するＤＮＡベクターを導入すること、ｅ）第二のタンパク質が細胞内又は培地内で発現するのに十分な状況下で宿主細胞を培地で培養すること；及びｆ）宿主細胞又は培地から第二のタンパク質を精製すること、及びｇ）第一と第二のタンパク質を、第一のタンパク質のＩＬ−１５ドメインと第二のタンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメイン間が結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成するのに十分な状況下で精製すること。
【００１７】
一部の場合では、該方法は発現ベクターから発現したポリペプチド間のジスルフィド結合を形成するのに十分な状況下で第一と第二のタンパク質を混合することをさらに含む。
【００１８】
あるいは、本発明の可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法は、ａ）宿主細胞内に第一のタンパク質をコードする適切な制御配列を有するＤＮＡベクター、及び第二のタンパク質をコードする適切な制御配列を有するＤＮＡベクターを導入すること、ｂ）タンパク質が細胞内又は培地内で発現し、第一のタンパク質のＩＬ−１５ドメインと第二のタンパク質のＩＬ−１５Ｒαドメイン間を関連させて可溶性融合タンパク質複合体を形成させるのに十分な状況下で宿主細胞を培地で培養すること、及びｃ）宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製することによって実行される。
【００１９】
一態様において、該方法は発現ベクターから発現されたポリペプチド間のジスルフィド結合を形成するのに十分な状況下で第一及び第二のタンパク質を混合することをさらに含む。
【００２０】
以下を含む可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法がまた提供される：ａ）宿主細胞に第一及び第二のタンパク質をコードする適切な制御配列を有するＤＮＡベクターを導入すること、ｂ）タンパク質が細胞内又は培地内で発現し、第一のタンパク質のＩＬ−１５ドメインと第二のタンパク質のＩＬ−１５Ｒαドメイン間を関連させて可溶性融合タンパク質複合体を形成させ、ポリペプチド間のジスルフィド結合を形成させるのに十分な状況下で宿主細胞を培地で培養すること；ｃ）宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製すること。
【００２１】
任意選択的に、該方法は発現ベクターから発現されたポリペプチド間のジスルフィド結合を形成するのに十分な状況下で第一及び第二のタンパク質を混合することをさらに含む。
【００２２】
治療を必要とする対象の新生組織形成、感染症又は自己免疫性疾患を治療する方法は、本明細書に記載の可溶性融合タンパク質複合体、例えば可溶性抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体を含む有効量の医薬組成物を対象に投与し、それにより新生組織形成、感染症又は自己免疫性疾患を治療することにより実行される。例えば、治療を必要とする対象の固形又は血液悪性腫瘍を治療する方法は、可溶性抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質複合体を対象に投与し、それにより悪性腫瘍を治療することにより実行される。例示的な抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄタンパク質は、配列番号：２及び６に示されたアミノ酸配列を含む。例示的な抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃタンパク質は、配列番号：４及び８に示されたアミノ酸配列を含む。
【００２３】
本明細書に記載の方法による治療に適した新生組織形成は、膠芽腫、前立腺癌、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ種、充実性腫瘍、尿路上皮／膀胱腫瘍、黒色腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、胃癌及び食道癌、頭部及び頸部癌、前立腺癌、膵癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、並びに頭部及び頸部の扁平上皮癌を含む。
【００２４】
本明細書に記載の方法を用いる治療のための例示的な感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を有する感染である。例示的な核酸配列は、配列番号：４７、４８、４９又は５０を含む。例示的なアミノ酸配列は、配列番号：５１、５２、５３又は５４を含む。本明細書に記載の方法は細菌感染（例えばグラム陽性菌又はグラム陰性菌）を治療することにまた有用である（Oleksiewicz et al. 2012. Arch Biochem Biophys. 526:124-31）。本明細書に記載の方法を用いる治療のための例示的な自己免疫性疾患は、Ｂ細胞によって介在される自己免疫性疾患である。かかる自己免疫性疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、突発性血小板増加症、ＩｇＭ介在性多発ニューロパチー、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、炎症性筋炎、尋常性天疱瘡、視神経脊髄炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、自己免疫性貧血、赤芽球癆、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、エバンス症候群、血管炎（例えばかつてウェゲナー肉芽腫症と呼ばれた多発血管炎性肉芽腫症）、水疱性皮膚疾患（例えば天疱瘡、類天疱瘡）、１型糖尿病、抗ＮＭＤＡ受容体抗体脳炎及びデビック病、グレイブス眼病、自己免疫性膵炎、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）並びにＩｇＧ４に関する疾患を含む。
【００２５】
融合タンパク質複合体を含む医薬組成物は有効量で投与される。例えば、該医薬組成物の有効量は約１μｇ／ｋｇと約１００μｇ／ｋｇの間、例えば１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００μｇ／ｋｇである。あるいは、ＴｘＭ複合体は固定用量又は体表面積（すなわち、ｍ２あたり）に基づいて投与される。
【００２６】
該融合タンパク質複合体を含む医薬組成物は少なくとも１ヶ月に１回、例えば１ヶ月に２回、１週間に１回、１週間に２回、１日に１回、１日に２回、８時間ごとに、４時間ごとに、２時間ごとに又は１時間ごとに投与される。該医薬組成物のための適した投与の様式は全身投与、静脈内投与、局所投与、皮下投与、筋肉内投与、腫瘍内投与、吸入及び腹腔内投与である。
【００２７】
好ましくは、該融合タンパク質複合体はインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の血中濃度を増加させる、及び／又はＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞及びＮＫ細胞を刺激して対象の疾患細胞又は腫瘍細胞を殺傷する。
【００２８】
本発明の可溶性タンパク質複合体の一部の態様において、該ＩＬ−１５ポリペプチドは天然のＩＬ−１５ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するＩＬ−１５Ｒ多様体である。ヒトのＩＬ−１５ポリペプチドは、本明細書中ではｈｕＩＬ−１５、ｈＩＬ−１５、ｈｕＩＬ１５、ｈＩＬ１５、ＩＬ−１５野生型（ｗｔ）を指し、それらの多様体は天然のアミノ酸を用いること、成熟配列中のその位置及び多様体アミノ酸を指す。例えば、ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄは７２位においてＮのＤへの置換を含むヒトＩＬ−１５を指す。一態様において、ＩＬ−１５アゴニストとしてのＩＬ−１５多様体機能は、例えば天然のＩＬ−１５ポリペプチドと比較してＩＬ−１５／ＩＬ−２βγｃ受容体（ＩＬ−１５Ｒ）の増加した結合活性によって明らかにされている。あるいは、ＩＬ−１５アンタゴニストとしてのＩＬ−１５多様体機能は、例えば天然のＩＬ−１５ポリペプチドと比較してＩＬ−１５Ｒの減少した結合活性によって明らかにされている。
【００２９】
標的細胞を殺傷する方法は、ａ）複数の細胞を本発明の可溶性融合タンパク質と接触させ、そこで複数の細胞がＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖を保有する免疫細胞、又はチェックポイント阻害剤若しくは免疫アゴニスト結合ドメインによって調節されるチェックポイント又はシグナル分子を保有する免疫細胞、及び標的疾患細胞をさらに含むこと；ｂ）ＩＬ−１５Ｒ若しくはシグナル分子を介して、又はチェックポイント分子の阻害を介して免疫細胞を活性化させること；ｃ）活性化免疫細胞によって標的疾患細胞を殺傷することによって実行される。例えば、該標的細胞は腫瘍細胞、自己免疫性細胞又はウイルス感染細胞である。一部の場合では、該結合ドメインは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。
【００３０】
標的細胞を殺傷する方法は、ａ）複数の細胞を本発明の可溶性融合タンパク質複合体に接触させ、そこで複数の細胞がＦｃドメインによって認識されるＦｃ受容体鎖を保有する免疫細胞、及び結合ドメイン、例えば抗原に特異的なｓｃＡｂによって認識される抗原を保有する標的疾患細胞をさらに含むこと；ｂ）免疫細胞を結合して活性化させるのに十分な標的細胞上の抗原と免疫細胞上のＦｃ受容体鎖間の特異的な結合複合体（架橋）を形成させること；ｃ）結合した活性化免疫細胞によって標的細胞を殺傷することをさらに含む。例えば、該標的細胞は腫瘍細胞、自己免疫性細胞又はウイルス感染細胞である。一部の場合では、該結合ドメインは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。
【００３１】
患者の疾患を予防又は治療する方法がまた提供され、該方法は以下の段階を含む：ａ）本発明の可溶性融合タンパク質複合体を患者に投与すること；ｂ）患者の免疫細胞を活性化すること；ｃ）患者の疾患を予防又は治療するのに十分な活性化免疫細胞を介して疾患細胞を損傷又は殺傷すること。
【００３２】
本発明により、疾患細胞を有する患者の疾患を予防又は治療する方法であって、以下の段階を含む方法がまた提供される：ａ）ＩＬ−１５Ｒ鎖又はチェックポイント又はシグナル分子を保有する免疫細胞を本発明の可溶性融合タンパク質と混合すること；ｂ）免疫細胞を活性化させること；ｃ）活性化免疫細胞を患者に投与すること；及びｄ）患者の疾患を予防又は治療するのに十分な活性化免疫細胞を介して疾患細胞を損傷又は殺傷すること。
【００３３】
本発明の融合タンパク質複合体の投与は対象の免疫反応を誘発する。例えば、本発明の融合タンパク質複合体の投与は新生組織形成、感染症又は自己免疫性疾患と関連した細胞に対して免疫反応を誘発する。一態様において、本発明の融合タンパク質複合体は免疫細胞増殖を増加させる。
【００３４】
本発明により、本発明の可溶性融合タンパク質複合体の有効量を哺乳類に投与することによって哺乳類の免疫反応を刺激する方法が提供される。本発明により、本発明のいずれかの可溶性融合タンパク質複合体の有効量を哺乳類に投与することによって哺乳類の免疫反応を抑制する方法がまた提供される。
【００３５】
他に定義されていない限り、本明細書に使用されているすべての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解される意味を有する。以下の参考文献は本発明で使用されている多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)及びHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書に使用されているように、以下の用語は、他に指定されていない限り、以下のそれらが帰する意味を有する。
【００３６】
「剤」はペプチド、核酸分子又は小さな化合物を意味する。
【００３７】
「ＴｘＭ」は結合ドメインに結合されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ骨格を含む複合体を意味する（図２）。例示的なＴｘＭは、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する結合ドメインとの融合を含むＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ複合体である（ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ）。
【００３８】
「改善する」は疾患の発展又は進行を減少させること、抑制させること、衰えさせること、減退させること、阻止させること又は安定させることを意味する。
【００３９】
「類似体」は、同一でないが類似の機能的又は構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチド類似体は対応する自然発生的なポリペプチドの生物学的活性を保有する一方、自然発生的なポリペプチドと関連した類似体の機能を高める特定の生化学的修飾を有する。かかる生化学的修飾は類似体のプロテアーゼ抵抗性、膜透過性、又は半減期を、例えばリガンド結合を変化させることなしに増加させることができる。類似体は非天然アミノ酸を含んでいてもよい。
【００４０】
用語「結合ドメイン」は抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｔ細胞受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、受容体結合ドメイン又は当該分野に知られている他の抗原に特異的なポリペプチドを包含することを意図している。
【００４１】
本発明は、抗体又はかかる抗体のフラグメントであって、それらが望ましい生物学的活性を示す限りのものを含む。本発明にはキメラ抗体、例えばヒト化抗体もまた含まれる。概して、ヒト化抗体は非ヒトである源から導入される１又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば当該分野に記載の方法を用いて、齧歯類の相補性決定領域の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域に置き換えることによって実行される。
【００４２】
用語「抗体」又は「イムノグロブリン」はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を包含することを意図している。好ましい抗体は抗原に反応性のあるモノクローナル抗体である。用語「抗体」は１つ以上の抗原に反応性のある抗体の混合物（例えば、抗原に反応性のある異なった型のモノクローナル抗体のカクテル）を包含することをまた意図している。用語「抗体」は全抗体、その生物学的に機能性のあるフラグメント、一本鎖抗体及び遺伝子操作された抗体、例えば１種以上からの部分を含むキメラ抗体、バイファンクショナル抗体、抗体共役体、ヒト化抗体及びヒト抗体を包含することをさらに意図している。生物学的に機能性のある抗体フラグメントをまた使用することができ、それらは抗原との結合に十分な抗体に由来するペプチドフラグメントである。本明細書に使用される「抗体」は目的のエピトープ、抗原又は抗原性フラグメントを結合可能な完全な抗体及び任意の抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）を含むことを意味する。
【００４３】
「結合している」はその分子に対して物理化学的親和性を有する分子を意味する。
【００４４】
「検出する」は検出されるべき検体の存在、非存在又は量を特定することを指す。
【００４５】
「疾患」は細胞、組織又は器官の通常の機能を損傷又は干渉する任意の状態又は障害を意味する。疾患の例には新生組織形成、自己免疫性疾患及びウイルス感染が含まれる。
【００４６】
製剤又は製剤の成分の用語「有効量」及び「治療上の有効量」は、単独又は組み合わせで望ましい効果を提供するのに十分な製剤又は成分の量を意味する。例えば、「有効量」は単独又は組み合わせで未治療の患者に関連する疾患の症状を改善するために必要な化合物の量を意味する。疾患の治療的処置に本発明を実践するために使用される活性化合物の有効量は、投与の様式、対象の年齢、体重及び全体的な健康状態によって異なる。最終的には、主治医又は主治獣医が適切な量と投薬量のレジメンを決定するであろう。かかる量は「有効」量として称される。
【００４７】
「フラグメント」はポリペプチド又は核酸分子の一部を意味する。この一部は、好ましくは参考核酸分子又はポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を含む。例えば、フラグメントは１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００のヌクレオチド又はアミノ酸を含んでいてもよい。しかしながら、本発明はポリペプチド及び核酸フラグメントを、それらがそれぞれ全長のポリペプチド及び核酸の望ましい生物学的活性を示す範囲内でまた含む。ほとんどいかなる長さの核酸フラグメントも用いられる。例えば、実例として、長さにして約１０，０００、約５，０００、約３，０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０の塩基対の全長（すべての中間の長さを含む）を有するポリヌクレオチドのセグメントが本発明の多くの実施に含まれる。同様に、ほとんどいかなる長さのポリペプチドのフラグメントも用いられる。例えば、実例として、長さにして約１０，０００、約５，０００、約３，０００、約２，０００、約１，０００、約５，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００又は約５０のアミノ酸の全長（すべての中間の長さを含む）を有するポリヌクレオチドのセグメントが本発明の多くの実施に含まれる。
【００４８】
用語「単離された」、「精製された」及び「生物学的に純粋な」は、その天然状態中に見いだせるような通常それに付随する成分とは異なる度合の含まれていない物質を指す。「単離する」は元の源又は環境からの分離の度合を意味する。「精製する」は単離より高度な分離の度合を意味する。
【００４９】
「精製された」又は「生物学的に純粋な」タンパク質は、任意の不純物が実質的にそのタンパク質の生物学的特性に影響したり、他の反する結果を引き起こしたりするのに十分なほどの他の物質を含まない。すなわち、本発明の核酸又はポリペプチドは、組み換えＤＮＡ技術によって産生される際の細胞物質、ウイルス物質若しくは培養培地、又は化学合成された際の化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に伴わない場合に精製される。純度及び均一性は、典型的には分析的化学技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動法又は高パフォーマンス液体クロマトグラフィーを用いて決定される。用語「精製された」は核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルに実質的に１本のバンドを生じさせることを意味してもよい。修飾、例えばリン酸化反応又はグリコシル化を受けたタンパク質では、異なる修飾が異なる単離されたタンパク質を生じ得るし、それらは分離して精製され得る。
【００５０】
同様に、「実質的に純粋な」は自然に付随する成分から分離したヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。典型的には、該ヌクレオチド及びポリペプチドは少なくとも重量にして６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％でさえあり、それらが自然に関連するタンパク質及び自然発生的な有機分子を伴わない場合、実質的に純粋である。
【００５１】
「単離された核酸」はその核酸が由来する生物の自然発生的なゲノム中で、その側面に位置する遺伝子を伴わない核酸を意味する。該用語は例えば以下をカバーする：（ａ）自然発生的なゲノムＤＮＡ分子の一部であるＤＮＡだが、自然に発生する生物のゲノム中では分子のその部分の側面に位置している核酸配列の両方が側面に位置していない；（ｂ）ある様式で原核生物又は真核生物のベクター又はゲノムＤＮＡに組み込まれた核酸で、生じる分子がいずれの自然発生的なベクター又はゲノムＤＮＡとも同一でない核酸；（ｃ）分離された分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノムフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって産生されたフラグメント、又は制限フラグメント；（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組み換えヌクレオチド配列。単離された核酸分子は、本発明によって合成により産生された分子及び化学的に変化された、及び／又は修飾された骨格を有する任意の核酸をさらに含む。例えば、単離された核酸は精製されたｃＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドである。単離された核酸分子はメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子をまた含む。
【００５２】
「単離されたポリペプチド」は自然に付随する成分から分離された本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、該ポリペプチドは少なくとも重量にして６０％であり、自然に付随するタンパク質及び自然発生的な有機分子を伴わない場合に単離されている。好ましくは、調製は重量にして本発明のポリペプチドの少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９９％である。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば自然源からの抽出により、かかるポリペプチドをコードする組み換え核酸の発現により、又はタンパク質の化学合成により入手され得る。任意の適切な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はＨＰＬＣ分析によって純度を測定することができる。
【００５３】
「マーカー」は、疾患又は障害に関連している発現レベル又は活性に変化を有する任意のタンパク質又はポリヌクレオチドを意味する。
【００５４】
「新生組織形成」は、過剰な増殖又は減少したアポトーシスによって特徴づけられる疾患又は障害を意味する。本発明を使用できる例示的な新生組織形成は、限定されないが、白血病（例えば急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、及び充実性腫瘍、例えば肉腫及び癌腫（例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉種、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌（ｎｉｌｅ  ｄｕｃｔ  ｃａｎｃｅｒ）、絨毛腫、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｒｏｇｌｉｏｍａ）、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽腫）を含む。特定の実施形態では、該新生組織形成は多発性骨髄腫、β細胞リンパ腫、尿路上皮／膀胱癌又は黒色腫である。本明細書で使用されているように、「剤を入手する」の「入手する」はその剤を合成すること、購入すること、又は他の方法で獲得することを含む。
【００５５】
「減少する」は少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％の負の変化を意味する。
【００５６】
「参考」は標準的な、又は対照の状態を意味する。
【００５７】
「参考配列」は配列比較のための基準として用いられる定義された配列である。参考配列は特定の配列の全体のサブセット；例えば、全長のｃＤＮＡ又は遺伝子配列のセグメント、又は完全なｃＤＮＡ又は遺伝子配列であってもよい。ポリペプチドでは、参考ポリペプチド配列の長さは概して少なくとも約１６のアミノ酸、好ましくは少なくとも約２０のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５のアミノ酸、さらにより好ましくは約３５のアミノ酸、約５０のアミノ酸又は約１００のアミノ酸であろう。核酸では、参考核酸配列の長さは概して少なくとも約５０のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５のヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約１００のヌクレオチド又は約３００のヌクレオチド又はおよその整数又はそれらの間であろう。
【００５８】
「特異的に結合する」は、本発明のポリペプチドを認識して結合するが、実質的に試料、例えば本発明のポリペプチドを自然に含む生物学的試料内の他の分子を認識して結合するのではない、化合物又は抗体を意味する。
【００５９】
本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチド又はそのフラグメントをコードする任意の核酸分子を含む。かかる核酸分子は内因性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示すであろう。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には二本鎖核酸分子の少なくとも一本鎖をハイブリダイゼーションすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチド又はそのフラグメントをコードする任意の核酸分子を含む。かかる核酸分子は内因性核酸配列と１００％同一である必要はないが、定型的には実質的な同一性を示すであろう。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的に二本鎖核酸分子の少なくとも一本鎖をハイブリダイゼーションすることができる。「ハイブリダイゼーションする」は、様々な緊縮の状況下で、相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子）又はその部分間で二本鎖の核酸分子を形成する組を意味する。（例えば、Wahl, G.M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照されたい）。
【００６０】
例えば、緊縮塩分濃度は通常７５０ｍＭのＮａＣｌ及び７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは５００ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満、より好ましくは２５０ｍＭのＮａＣｌ及び２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満であろう。低緊縮のハイブリダイゼーションは有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で入手され得る一方、高緊縮のハイブリダイゼーションは少なくとも約３５％のホルムアミド、好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で入手され得る。緊縮温度状態は通常少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含む。異なる追加のパラメーター、例えばハイブリダイゼーションの時間、洗浄剤の濃度、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及びキャリアＤＮＡの内包又は排除が当該分野の当業者によく知られている。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは３０℃の７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム及び１％のＳＤＳ内で生じるであろう。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは３７℃の５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド及び１００．ｍｕ．ｇ／ｍｌの変性したサケの精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）内で生じるであろう。最も好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは４２℃の２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド及び２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ内で生じるであろう。これらの状況における有用な多様性が当業者には容易に明白であろう。
【００６１】
多くの適用では、ハイブリダイゼーションに続く洗浄段階は緊縮においてまた異なるであろう。洗浄緊縮状態は塩分濃度によって、及び温度によって定義され得る。上記のように、洗浄緊縮は塩分濃度を下げることによって、又は温度を上げることによって増加され得る。例えば、洗浄段階の緊縮塩分濃度は、好ましくは約３０ｍＭのＮａＣｌ及び３ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満、最も好ましくは約１５ｍＭのＮａＣｌ及び１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム未満であろう。洗浄段階の緊縮温度状態は通常少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４２℃、さらにより好ましくは少なくとも約６８℃の温度を含むであろう。好ましい実施形態では、洗浄段階は２５℃の３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１％のＳＤＳ内で生じるであろう。より好ましい実施状況では、洗浄段階は４２Ｃの１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び０．１％のＳＤＳ内で生じるであろう。より好ましい実施状況では、洗浄段階は６８℃の１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び０．１％のＳＤＳ内で生じるであろう。これらの状況における追加の多様性が当業者には容易に明白であろう。ハイブリダイゼーション技術は当該分野の当業者にはよく知られており、例えば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977), Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York)及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。
【００６２】
「実質的に同一な」は参考アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のいずれか１つのアミノ酸配列）又は核酸配列（例えば、本明細書に記載のいずれか１つの核酸配列）に対して少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチド又は核酸分子を意味する。好ましくは、かかる配列は比較のために用いられる配列に対して少なくとも６０％、より好ましくは８０％又は８５％、より好ましくは９０％、９５％又は９９％さえもアミノ酸レベル又は核酸が同一である。
【００６３】
配列同一性は典型的に配列分析ソフトウェア（例えば、Sequencher, Gene Codes Corporation, 775 Technology Drive, Ann Arbor, MI; Vector NTI, Life Technologies, 3175 Staley Rd. Grand Island, NY）を用いて測定される。かかるソフトウェアは多様な置換、欠失及び／又は他の修飾に対する相同の度合を割り当てることによって同一又は類似の配列とマッチングさせる。同類置換は典型的に以下の群の範囲内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。同一性の度合を決定するための例示的なアプローチでは、密接に関連した配列を示すｅ−３とｅ−１００間の可能性スコアを用いてＢＬＡＳＴプログラムを使用してもよい。
【００６４】
「対象」は限定されないが、ヒト又は非ヒト哺乳類、例えばウシ属、ウマ科、イヌ科、ヒツジ属又はネコ科を含む哺乳類を意味する。該対象は、好ましくはかかる治療を必要とする哺乳類、例えばＢ細胞リンパ腫又はその傾向があると診断された対象である。該哺乳類は任意の哺乳類であり、例えばヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ及び家畜又は食品消費のために育てられる動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ及びヤギである。好ましい実施形態では、該哺乳類はヒトである。
【００６５】
本明細書に提供される範囲は、範囲内のすべての値の簡潔な表現であることが理解される。例えば、１〜５０までの範囲は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０からなる群からの任意の数字、数字の組み合わせ又はサブ範囲を含むと理解される。
【００６６】
本明細書で使用される用語「治療する」や「治療」は逆の状態、障害又は疾患に苦しめられる臨床的な症状を示す個体に対して、症状の重篤さ及び／又は頻度の減少に影響するための、症状及び／又は根本原因を取り除くための、及び／又は損傷の改良又は改善を容易にするための剤又は製剤の投与を指す。排除できないとしても、疾患又は状態を治療することが、それらと関連した障害、状態又は症状を完全に取り除くことが要求されるわけではないことが理解されるであろう。
【００６７】
用語「予防する」又は「予防」は特定の逆の状態、障害又は疾患に感染しやすい又は罹患しやすい臨床的な症状を示す個体への、剤又は組成物の投与を指し、それゆえに症状及び／又は根本原因の発生を予防することに関する。
【００６８】
具体的に記載されている、又は内容から明白である場合を除き、本明細書に使用されるように、用語「又は」は包括的であると理解される。具体的に記載されている、又は内容から明白である場合を除き、本明細書に使用されるように、用語「１の」（“ａ，”  “ａｎ”）及び「その」（“ｔｈｅ”）は単数又は複数であると理解される。
【００６９】
具体的に記載されている、又は内容から明白である場合を除き、本明細書に使用されるように、用語「約」は当該分野において通常の許容範囲内、例えば平均値の２の標準偏差内として理解される。約は記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％又は０．０１％と理解されてもよい。内容から明らかでない場合は、本明細書に記載のすべての数値は用語「約」で修飾される。
【００７０】
本明細書の変数の任意の定義における化学基のリストの列挙は、その変数がリストアップされた基の任意の単独の基又は組み合わせであるという定義を含む。本明細書の変数又は態様のための一実施形態の列挙は、その実施形態が任意の単独の実施形態又は任意の他の実施形態又はその部分との組み合わせであるものを含む。
【００７１】
本明細書に提供される組成物又は方法は、本明細書に提供される１又はそれ以上の任意のその他の組成物及び方法と組み合わせることができる。
【００７２】
暫定的な用語「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、「含む」（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、「含む」（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）又は「によって特徴づけられる」と類義語であり、包括的又は制限がなく、追加の、列挙されていない要素又は方法段階を除外しない。対照的に、暫定的な語句「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）は請求項で具体的に述べられていない任意の要素、段階又は材料を除外する。暫定的な語句「本質的に……からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）は本発明の請求項に具体的に述べられた物質又は段階「及び基本かつ新たな特徴に物質的に影響しないもの」に請求項の範囲を限定する。
【００７３】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の好ましい実施形態の記述から、及び請求項から明白であろう。他に定義されていない場合、本明細書に使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は等価の方法及び物質を本発明の実践又は試験において使用することができるが、適した方法と物質が下記に記載されている。本明細書に引用されているすべての公開された外国特許及び特許出願は参照により本明細書中に組み込まれる。
【００７４】
本明細書にアクセッション番号によって引用されるＧｅｎｂａｎｋ及びＮＣＢＩ寄託が参照により本明細書中に組み込まれる。本明細書に引用される他のすべての公開された参考文献、文書、原稿及び科学文献は参照により本明細書中に組み込まれる。不一致があった場合、定義を含む本明細書は制御されるであろう。加えて、物質、方法及び例示は説明のためだけのものであり、限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質を含むＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の活性、並びにＰＤ−Ｌ１抗原を発現する疾患細胞に対するその免疫介在性効果を示した概略図である。
【図２】図２は、免疫チェックポイント分子、免疫シグナル分子及び／又は疾患抗原を認識する結合ドメインと融合したＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ骨格を含む異なるＴｘＭ複合体を示した概略図である。
【図３】図３は、ジスルフィド結合の減少に続くＴｘＭ複合体のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を示した写真である。右側レーン：ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ；左側レーン：マーカー。
【図４】図４Ａは、ヒトＩＬ−１５及びヒトＩｇＧに特異的な抗体に対する抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の結合活性を示した折れ線グラフである。図４Ｂは、ヒトＩＬ−１５及びヒトＩｇＧに特異的な抗体に対する第二の抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の結合活性を示した折れ線グラフである。図４Ｃは、ヒトＩＬ−１５及びマウスＩｇＧに特異的な抗体に対する抗マウスＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の結合活性を示した折れ線グラフである。
【図５】図５Ａは、ヒトＭＢ２３１腫瘍細胞を有するＰＤ−Ｌ１に対するＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の結合活性を示した折れ線グラフである。図５Ｂは、ヒトＭＢ２３１腫瘍細胞上に発現したＰＤ−Ｌ１のＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の阻害活性を示した折れ線グラフである。図５Ｃは、ヒトＭＢ２３１腫瘍細胞を有するＰＤ−Ｌ１に対するＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の結合活性を示した折れ線グラフである。
【図６】図６Ａは、マウス５Ｔ３３Ｐ腫瘍細胞上に発現したＰＤ−Ｌ１のＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の阻害活性を示した折れ線グラフである。図６Ｂは、マウスＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍細胞上に発現したＰＤ−Ｌ１のＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の阻害活性を示した折れ線グラフである。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、マウスＡ２０腫瘍細胞上に発現したＰＤ−Ｌ１の抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ及びＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の阻害活性を比較する折れ線グラフである。
【図８】図８は、ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体によって介在されるＩＬ−１５依存性３２Ｄβ細胞の増殖を示した折れ線グラフである。
【図９】図９Ａは、「四頭」及び「二頭」のＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体を示した概略図である。図９Ｂは、四頭及び二頭のマウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の、ジスルフィド結合の減少に続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示した写真である。図９Ｃ及び図９Ｄは、分析的サイズ排除カラム上の溶出に続く、二頭及び四頭のマウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体のクロマトグラフィープロフィールを表している折れ線グラフをそれぞれ示しており、タンパク質会合体からのＴｘＭ複合体の分離を明らかにしている。
【図１０】図１０Ａは、ＩＬ−２Ｒβγを保有する３２Ｄβ細胞に対する二頭及び四頭のマウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の結合活性を示した折れ線グラフである。図１０Ｂ及び図１０Ｃは、５Ｔ３３Ｐ骨髄腫細胞上に発現したＰＤ−Ｌ１の二頭及び四頭のマウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の阻害活性を明らかにした折れ線グラフを示している。
【図１１】図１１Ａは、ＡＬＴ−８０３と比較した、二頭のマウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体に介在されたＩＬ−１５依存性３２Ｄβ細胞の増殖を示した折れ線グラフである（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ複合体）。図１１Ｂは、ＡＬＴ−８０３と比較した、四頭のマウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体に介在されたＩＬ−１５依存性３２Ｄβ細胞の増殖を示した折れ線グラフである。
【図１２】図１２Ａは、ジスルフィド結合の減少に続く二頭及び四頭のヒト特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示した写真である。図１２Ｂ及び図１２Ｃは、分析的サイズ排除カラム上の溶出に続く、二頭及び四頭のヒト特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体のクロマトグラフィープロフィールを表している折れ線グラフをそれぞれ示しており、タンパク質会合体からのＴｘＭ複合体の分離を明らかにしている。
【図１３】図１３は、ＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞上に発現したＰＤ−Ｌ１の二頭及び四頭のヒト特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の阻害活性を示した折れ線グラフである。
【図１４】図１４Ａは、ＡＬＴ−８０３と比較して、二頭のヒト特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体によって介在されるＩＬ−１５依存性３２Ｄβ細胞の増殖を示した折れ線グラフである。図１４Ｂは、ＡＬＴ−８０３と比較して、四頭のヒト特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体によって介在されるＩＬ−１５依存性３２Ｄβ細胞の増殖を示した折れ線グラフである。
【図１５】図１５Ａは、ＰＢＳ、ＡＬＴ−８０３、四頭のマウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（Ｔ４Ｍ−ｍＰＤ−Ｌ１）及び二頭のマウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（Ｔ２Ｍ−ｍＰＤ−Ｌ１）で処置されたマウスの脾臓重量を示した棒グラフである。図１５Ｂ及び図１５Ｃは、ＰＢＳ、ＡＬＴ−８０３、四頭のマウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（Ｔ４Ｍ−ｍＰＤ−Ｌ１）及び二頭のマウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（Ｔ２Ｍ−ｍＰＤ−Ｌ１）で処置されたマウスの脾臓及びリンパ節内の異なる免疫細胞サブセットの百分率をそれぞれ示した棒グラフである。
【図１６】図１６は、ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ、抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ又はＡＬＴ−８０３によって誘発された５Ｔ３３骨髄腫細胞に対する免疫細胞の細胞傷害性を示した棒グラフである。
【図１７】図１７は、培地単独と比較して、抗ヒトＰＤ−Ｌ１  Ａｂ、二頭のヒト特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（Ｔ４Ｍ−ｍＰＤ−Ｌ１）又は四頭のヒト特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（Ｔ２Ｍ−ｍＰＤ−Ｌ１）によって誘発されたＰＤ−Ｌ１陽性ＳＷ１９９０ヒト膵癌細胞に対するヒト免疫細胞の細胞傷害性を示した棒グラフである。
【図１８】図１８は、ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体、ＡＬ−８０３、ＡＬＴ−８０３＋抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ又はＰＢＳを用いた処置に続く５Ｔ３３骨髄腫腫瘍を保有するマウスの生存を示した折れ線グラフである。
【図１９】図１９は、２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体、ＡＬ−８０３、ＡＬＴ−８０３＋抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ又はＰＢＳを用いた処置に続く同所性ＭＢ４９ｌｕｃ膀胱腫瘍を保有するマウスの生存を示した折れ線グラフである。
【図２０】図２０は、分析的サイズ排除カラム上の溶出に続く異なる精製されたＴｘＭタンパク質のクロマトグラフィープロフィールを表している折れ線グラフであり、タンパク質会合体からのＴｘＭ複合体の分離を明らかにしている。
【図２１】図２１Ａは、マウスリンパ球上に発現したＣＴＬＡ−４のＣＴＬＡ−４  ＴｘＭ複合体の阻害活性を示した折れ線グラフである。図２１Ｂは、ヒトリンパ球上に発現したＣＴＬＡ−４のＣＴＬＡ−４  ＴｘＭ複合体の阻害活性を示した折れ線グラフである。
【図２２】図２２Ａは、マウス５Ｔ３３Ｐ腫瘍細胞上に発現したＰＤ−Ｌ１のＰＤ−Ｌ１／ＣＴＬＡ−４  ＴｘＭ複合体の阻害活性を示した折れ線グラフである。図２２Ｂは、マウスリンパ球上に発現したＣＴＬＡ−４のＰＤ−Ｌ１／ＣＴＬＡ−４  ＴｘＭ複合体の阻害活性を示した折れ線グラフである。
【図２３】図２３Ａは、ＣＤ４７を保有するマウスＢ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍細胞に対するＣＤ４７  ＴｘＭ複合体の結合活性を示した折れ線グラフである。図２３Ｂは、ＣＤ４７を保有するヒトＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に対するＣＤ４７  ＴｘＭ複合体の結合活性を示した折れ線グラフである。
【図２４】図２４Ａは、一本鎖ＤＮＡに対するＴＮＴ  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ複合体の結合活性を明らかにした折れ線グラフである。図２４Ｂは、一本鎖ＤＮＡに対するＴＮＴ  ｓｃＡｂ／抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ複合体の結合活性を明らかにした折れ線グラフである。
【図２５】図２５Ａは、透過性ヒトＭＢ２３１乳癌細胞に対するＴＮＴ  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ、ＴＮＴ  ｓｃＡｂ／抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ及び二頭の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ複合体の結合活性を示した折れ線グラフである。図２５Ｂは、透過性ヒトＡ５４９肺癌細胞に対するＴＮＴ  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ、ＴＮＴ  ｓｃＡｂ／抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ及び二頭の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ複合体の結合活性を示した折れ線グラフである。
【図２６】図２６は、ヒトＴＦ陽性ＰＤ−Ｌ１陽性ＳＷ１９９０ヒト膵癌細胞に対する二頭のｈＯＡＴ  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ、抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈＯＡＴ  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ、二頭の抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ複合体及びｈＯＡＴ及び抗ヒトＰＤ−Ｌ１対照Ａｂｓの結合活性を示した折れ線グラフである。
【図２７】図２７Ａは、ヒトＩＬ−１５及びヒトＩｇＧに特異的な抗体に対するＬＦＡ−１  ＴｘＭ複合体の結合活性を明らかにした折れ線グラフである。図２７Ｂは、ＩＣＡＭ−１に対するＬＦＡ−１  ＴｘＭ複合体の結合活性を示した棒グラフである。
【図２８】図２８は、ヒトＩＬ−１５及びヒトＩｇＧに特異的な抗体に対するＮｏｔｃｈ  １特異的ＴｘＭ複合体の結合活性を明らかにした折れ線グラフである。
【図２９】図２９は、ヒトＩＬ−１５及びヒトＩｇＧに特異的な抗体に対する抗ヒトＴＩＭ３  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ複合体の結合活性を示した折れ線グラフである。
【図３０】図３０Ａ及び図３０Ｂは、ヒトＩＬ−１５及びヒトＩｇＧに特異的な抗体に対するＨＩＶ特異的ｂＮＡｂ  ｓｃＦｖ  ＴｘＭ複合体の結合活性を明らかにした折れ線グラフである。図３０Ｃから図３０Ｆは、ＨＩＶエンベロープタンパク質に対するＨＩＶ特異的ｂＮＡｂ  ＴｘＭ複合体の結合活性を明らかにした折れ線グラフを示している。
【図３１】図３１は、培地単独と比較して、二頭のｈＯＡＴ  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ又はｈＯＡＴ対照Ａｂに誘発されたヒトＴＦ陽性ＳＷ１９９０ヒト膵癌細胞に対するヒト免疫細胞の細胞傷害性を示した棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
本発明は、少なくとも一部は、複数特異的なＩＬ−１５に基づくタンパク質複合体が免疫細胞の活性を高め、疾患細胞に対するそれらの活性を促進し、それにより疾患の低減又は予防をもたらすという驚くべき発見に基づいている。これらのタンパク質複合体は、疾患及び標的抗原への増加した結合をまた示す。ＩＬ−１５又は機能性多様体を含む１つのドメイン、及び疾患特異的結合ドメイン、免疫チェックポイント阻害剤又は免疫アゴニストを含む結合ドメインを有する複数特異的タンパク質複合体が本明細書に提供される。かかるタンパク質複合体は対象の新生組織形成、感染症又は自己免疫性疾患を治療するための方法に有用性がある。具体的には、以下に詳細に記載されているように、可溶性抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ複合体（「ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ」）が免疫細胞を刺激して腫瘍標的細胞を殺傷した（図１）。このように、ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭを取り上げた組成物、及び新生組織形成（例えば、充実性及び血液腫瘍）に対して免疫反応を高めるためにかかる組成物を用いる方法が本明細書に提供される。
【００７７】
本明細書に記載のように、宿主免疫認識及び反応のための疾患細胞を標的化する能力を有するタンパク質の使用は、がん、感染症及び自己免疫性疾患に効果的な戦略である。米国特許第８，５０７，２２２号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、ＩＬ−１５及びＩＬ−１５受容体αドメインを含むタンパク質骨格は、疾患細胞上の抗原及び免疫細胞上の受容体を認識できる複数特異的タンパク質を生成するために使用されてきた。米国特許第８，５０７，２２２号の実施例１５を参照されたい。免疫チェックポイント又はシグナル分子を認識する１又はそれ以上の結合ドメインと結合したＩＬ−１５及びＩＬ−１５受容体αを含む可溶性複数特異的タンパク質複合体の生成が本明細書に記載される。一部の場合では、これらの複合体は疾患細胞上に発現する抗原、例えばＰＤ−Ｌ１、ｓｓＤＮＡ、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＧＤ２、ＣＤ３３、Ｎｏｔｃｈ  １、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、組織因子、ＨＩＶエンベロープ又は他の腫瘍抗原を認識する結合ドメインをまた含む。
【００７８】
一部の場合では、該結合ドメインは一本鎖抗体を含み、そこでイムノグロブリン軽鎖可変ドメインがポリペプチドリンカー配列によってイムノグロブリン重鎖可変ドメインと共有結合している。該一本鎖抗体ドメインはＶＨ−リンカー−ＶＬ又はＶＬ−リンカー−ＶＨフォーマットのどちらかで配置される。あるいは、該結合ドメインは免疫チェックポイント阻害剤又は免疫アゴニストとして作用することができる可溶性若しくは細胞外リガンド又は受容体ドメインを含む。免疫チェックポイント又はシグナル分子を認識する結合ドメインは、結合活性が維持される限り、追加のリンカー配列を伴う又は伴わないＩＬ−１５又はＩＬ−１５受容体αタンパク質のＮ末端又はＣ末端のどちらかと結合する。好ましくは、該結合ドメインはヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄスーパーアゴニストタンパク質（ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）のＮ末端と結合している。あるいは、該結合ドメインはヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄタンパク質のＣ末端と結合している。好ましくは、該結合ドメインはヒトＩＬ−１５受容体αスシドメイン（ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ）のＮ末端と結合している。あるいは、該結合ドメインはｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕＦｃタンパク質のＣ末端と結合している。一部の場合では、本発明の複数特異的タンパク質複合体は、免疫細胞上のタンパク質二量化及びＣＤ１６受容体の認識のためのＩｇＧ  Ｆｃドメインをさらに含む。かかるドメインは、標的細胞に対して、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の刺激を介在する。一部の例では、高められた、又は減少したＣＤ１６結合活性を有するＦｃドメインを用いることが有用である。一態様では、該ＦｃドメインはＡＤＣＣ活性を低減するが、ジスルフィド結合二量体を形成する能力を保有するアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）（Ｆｃコンセンサス配列に基づく番号）を含む。
【００７９】
インターロイキン−１５
インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）はエフェクターＮＫ細胞及びＣＤ８＋記憶Ｔ細胞の発展、増殖及び活性化のための重大なサイトカインである。ＩＬ−１５はＩＬ−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα）と結合し、エフェクター細胞上のＩＬ−２／ＩＬ−１５受容体βコモンγ鎖（ＩＬ−１５Ｒβγｃ）複合体にトランスで提供される。ＩＬ−１５及びＩＬ−２はＩＬ−１５Ｒβγｃとの結合を共有し、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５経路を通してシグナルを送る。しかしながら、ＩＬ−２とは異なり、ＩＬ−１５はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋調節Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の維持を支持しないし、活性化ＣＤ＋８Ｔ細胞の細胞死、多発性骨髄腫に対してＩＬ−２の治療的活性を制限していたかもしれない効果を誘発しない。さらに、ＩＬ−１５はエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞へ抗アポトーシスシグナルを提供することが知られている唯一のサイトカインである。単独又はＩＬ−１５Ｒαとの複合体としてのどちらかで投与されるＩＬ−１５は、実験動物モデル内に定着した充実性腫瘍に対する潜在的抗腫瘍活性を示し、このように、潜在的にがんを治癒することができる最も有望な免疫治療薬の１つとして特定された。
【００８０】
ＩＬ−１５に基づくがん治療の臨床的発展を容易にするために、ＩＬ−１５と比較して増加した生物学的活性を有するＩＬ−１５変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）が特定された（Zhu et al., J Immunol, 183: 3598-3607, 2009）。このＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）の薬物動態学及び生物学的活性は、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合複合体（ＡＬＴ−８０３）の創出によってさらに改良され、該スーパーアゴニスト複合体がインビボでの天然のサイトカインの少なくとも２５倍の活性を有するほどである（Han et al., Cytokine, 56:804-810, 2011）。
【００８１】
免疫チェックポイント阻害剤及び免疫アゴニストドメイン
他の実施形態では、該結合ドメインは免疫チェックポイント又はシグナル分子又はそのリガンドに特異的であり、免疫チェックポイント抑制活性の阻害剤として、又は免疫刺激活性のアゴニストとして作用する。かかる免疫チェックポイント及びシグナル分子及びリガンドは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１３７、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４７、ＣＩＳ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＤＯ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ１５５、ＴＩＧＩＴ、ＬＩＧＨＴ、ＬＡＩＲ−１、シグレック（Ｓｉｇｌｅｃｓ）及びＡ２ａＲを含む（Pardoll DM. 2012. Nature Rev Cancer 12:252-264, Thaventhiran T, et al. 2012. J Clin Cell Immunol S12:004）。さらに、本発明の好ましい抗体ドメインは、イピリムマブ及び／又はトレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ４）、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、ＴＳＲ−０４２、ＡＮＢ０１１、ＡＭＰ−５１４及びＡＭＰ−２２４（リガンド−Ｆｃ融合）（抗ＰＤ１）、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、ＭＥＤＩ０６８０及びＢＭＳ−９３６５５６９（抗ＰＤＬ１）、ＭＥＤＩ６４６９（抗ＯＸ４０アゴニスト）、ＢＭＳ−９８６０１６、ＩＭＰ７０１、ＩＭＰ７３１、ＩＭＰ３２１（抗ＬＡＧ３）及びＧＩＴＲリガンドを含んでいてもよい。
【００８２】
抗体特異的結合ドメイン
抗体特異的結合ドメインは疾患細胞上の標的と特異的に結合するポリペプチドからなる。あるいは、これらのドメインは疾患状態を支持する他の細胞上の標的、例えば腫瘍の成長を支持する間質細胞上の標的又は疾患介在性免疫抑制を支持する免疫細胞上の標的と結合してもよい。抗原特異的結合ドメインは当該分野で知られている抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂｓ、Ｆｖ、Ｔ細胞受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、受容体結合ドメイン、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、ミニボディ、ナノボディ、ペプチボディ又は多様な他の抗体模倣体（例えばアフィマー（ａｆｆｉｍｅｒｓ）、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎ）、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｉｅｓ）、アトリマー（ａｔｒｉｍｅｒｓ）、ＣＴＬＡ−４に基づく分子、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎｓ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインに基づくタンパク質、アビマー（ａｖｉｍｅｒｓ）、ノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎｓ）、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒｓ）、ダルピン（ｄａｒｐｉｎｓ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎｓ）、モノボディ及びアルマジロ反復タンパク質に基づくタンパク質（Weidle, UH, et al. 2013. Cancer Genomics & Proteomics 10:155-168））を含む。
【００８３】
特定の実施形態では、抗原特異的結合ドメインのための抗原は、細胞表面受容体又はリガンドを含む。さらなる実施形態では、該抗原はＣＤ抗原、サイトカイン又はケモカイン受容体又はリガンド、成長因子受容体又はリガンド、組織因子、細胞間接着分子、ＭＨＣ／ＭＨＣ様分子、Ｆｃ受容体、トル（Ｔｏｌｌ）様受容体、ＮＫ受容体、ＴＣＲ、ＢＣＲ、陽性／陰性共刺激受容体又はリガンド、死受容体又はリガンド、腫瘍に関連した抗原又はウイルスがコードした抗原を含む。
【００８４】
好ましくは、抗原特異的結合ドメインは腫瘍細胞上の抗原と結合することができる。腫瘍特異的結合ドメインはがんを有する患者の治療のために承認された抗体に由来していてもよく、以下のものを含む：リツキシマブ、オファツムマブ及びオビヌツズマブ（抗ＣＤ２０  Ａｂｓ）；トラスツズマブ及びペルツズマブ（抗ＨＥＲ２  Ａｂｓ）；セツキシマブ及びパニツムマブ（抗ＥＧＦＲ  Ａｂｓ）；並びにアレムツズマブ（抗ＣＤ５２  Ａｂ）。同様に、ＣＤ２０（９０Ｙ標識化イブリツモマブチウキセタン、１３１Ｉ標識化トシツモマブ）、ＨＥＲ２（アド−トラスツズマブエムタンシン）、ＣＤ３０（ブレンツキシマブベドチン）及びＣＤ３３（ゲムツズマブオゾガマイシン）（Sliwkowski MX, Mellman I. 2013 Science 341:1192）に特異的な承認された抗体−エフェクター分子複合体からの結合ドメインを使用し得る。
【００８５】
さらに、本発明の好ましい結合ドメインは当該分野で知られている多様な他の腫瘍特異的抗体ドメインを含んでいてもよい。がんの治療のための抗体及びそれらの各標的は、限定されないが以下を含む：ニボルマブ（抗ＰＤ−１  Ａｂ）、ＴＡ９９（抗ｇｐ７５）、３Ｆ８（抗ＧＤ２）、８Ｈ９（抗Ｂ７−Ｈ３）、アバゴボマブ（抗ＣＡ−１２５（模造））、アデカツムマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、アフツズマブ（抗ＣＤ２０）、アラシズマブペゴル（抗ＶＥＧＦＲ２）、ペンテト酸アルツモマブ（抗ＣＥＡ）、アマツキシマブ（抗メソテリン）、ＡＭＥ−１３３（抗ＣＤ２０）、アナツモマブマフェナトックス（抗ＴＡＧ−７２）、アポリズマブ（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、アルシツモマブ（抗ＣＥＡ）、バビツキシマブ（抗ホスファチジルセリン）、ベクツモマブ（抗ＣＤ２２）、ベリムマブ（抗ＢＡＦＦ）、ベシレソマブ（抗ＣＥＡ関連抗原）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ−Ａ）、ビバツズマブメルタンシン（抗ＣＤ４４  ｖ６）、ブリナツモマブ（抗ＣＤ１９）、ＢＭＳ−６６３５１３（抗ＣＤ１３７）、ブレンツキシマブベドチン（抗ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８））、カンツズマブメルタンシン（抗ムチンＣａｎＡｇ）、カンツズマブラブタンシン（抗ＭＵＣ１）、カプロマブペンデチド（抗前立腺癌細胞）、カルルマブ（抗ＭＣＰ−１）、カツマキソマブ（抗ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３）、ｃＢＲ９６−ドキソルビシン免疫抱合体（抗ルイスＹ抗原）、ＣＣ４９（抗ＴＡＧ−７２）、セデリズマブ（抗ＣＤ４）、Ｃｈ．１４．１８（抗ＧＤ２）、ｃｈ−ＴＮＴ（抗ＤＮＡ関連抗原）、シタツズマブボガトックス（抗ＥｐＣＡＭ）、シキスツムマブ（抗ＩＧＦ−１受容体）、クリバツズマブテトラキセタン（抗ＭＵＣ１）、コナツムマブ（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＣＰ−８７０８９３（抗ＣＤ４０）、ダセツズマブ（抗ＣＤ４０）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）、ダロツズマブ（抗インスリン様成長因子Ｉ受容体）、ダラツムマブ（抗ＣＤ３８（環状ＡＤＰリボースヒドロラーゼ））、デムシズマブ（抗ＤＬＬ４）、デツモマブ（抗Ｂリンパ腫細胞）、ドロジツマブ（抗ＤＲ５）、ズリゴツマブ（抗ＨＥＲ３）、ズシギツマブ（抗ＩＬＧＦ２）、エクロメキシマブ（抗ＧＤ３ガングリオシド）、エドレコロマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、エロツズマブ（抗ＳＬＡＭＦ７）、エルシリモマブ（抗ＩＬ−６）、エナバツズマブ（抗ＴＷＥＡＫ受容体）、エノチクマブ（抗ＤＬＬ４）、エンシツキシマブ（抗５ＡＣ）、エピツモマブシツキセタン（抗エピシアリン）、エプラツズマブ（抗ＣＤ２２）、エルツマキソマブ（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ３）、エタラシズマブ（抗インテグリンανβ３）、ファラリモマブ（抗インターフェロン受容体）、ファルレツズマブ（抗葉酸受容体１）、ＦＢＴＡ０５（抗ＣＤ２０）、フィクラツズマブ（抗ＨＧＦ）、フィギツムマブ（抗ＩＧＦ−１受容体）フランボツマブ（抗ＴＹＲＰ１（糖タンパク質７５））、フレソリムマブ（抗ＴＧＦ  β）、フツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ガリキシマブ（抗ＣＤ８０）、ガニツマブ（抗ＩＧＦ−１）、ゲムツズマブオゾガマイシン（抗ＣＤ３３）、ギレンツキシマブ（抗炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ））、グレムバツムマブベドチン（抗ＧＰＮＭＢ）、グセルクマブ（抗ＩＬ１３���、イバリズマブ（抗ＣＤ４）、イブリツモマブチウキセタン（抗ＣＤ２０）、イクルクマブ（抗ＶＥＧＦＲ−１）、イゴボマブ（抗ＣＡ−１２５）、ＩＭＡＢ３６２（抗ＣＬＤＮ１８．２）、ＩＭＣ−ＣＳ４（抗ＣＳＦ１Ｒ）、ＩＭＣ−ＴＲ１（ＴＧＦβＲＩＩ）、イムガツズマブ（抗ＥＧＦＲ）、インクラクマブ（抗セレクチンＰ）、インダツキシマブラブタンシン（抗ＳＤＣ１）、イノツズマブオゾガマイシン（抗ＣＤ２２）、インテツムマブ（抗ＣＤ５１）、イピリムマブ（抗ＣＤ１５２）、イラツムマブ（抗ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８））、ＫＭ３０６５（抗ＣＤ２０）、ＫＷ−０７６１（抗ＣＤ１９４）、ＬＹ２８７５３５８（抗ＭＥＴ）、ラベツズマブ（抗ＣＥＡ）、ラムブロリズマブ（抗ＰＤＣＤ１）、レキサツムマブ（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）、リンツズマブ（抗ＣＤ３３）、リリルマブ（抗ＫＩＲ２Ｄ）、ロルボツズマブメルタンシン（抗ＣＤ５６）、ルカツムマブ（抗ＣＤ４０）、ルミリキシマブ（抗ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体））、マパツムマブ（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）、マルゲツキシマブ（抗ｃｈ４Ｄ５）、マツズマブ（抗ＥＧＦＲ）、マブリリムマブ（抗ＧＭＣＳＦ受容体α鎖）、ミラツズマブ（抗ＣＤ７４）、ミンレツモマブ（抗ＴＡＧ−７２）、ミツモマブ（抗ＧＤ３ガングリオシド）、モガムリズマブ（抗ＣＣＲ４）、モキセツモマブパスドトックス（抗ＣＤ２２）、ナコロマブタフェナトックス（抗Ｃ２４２抗原）、ナプツモマブエスタフェナトックス（抗５Ｔ４）、ナルナツマブ（抗ＲＯＮ）、ネシツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、ネスバクマブ（抗アンジオポイエチン２）、ニモツズマブ（抗ＥＧＦＲ）、ニボルマブ（抗ＩｇＧ４）、ノフェツモマブメルペンタン、オクレリズマブ（抗ＣＤ２０）、オカラツズマブ（抗ＣＤ２０）、オララツマブ（抗ＰＤＧＦ−Ｒ  α）、オナルツズマブ（抗ｃ−ＭＥＴ）、オンツキシズマブ（抗ＴＥＭ１）、オポルツズマブモナトックス（抗ＥｐＣＡＭ）、オレゴボマブ（抗ＣＡ−１２５）、オトレルツズマブ（抗ＣＤ３７）、パンコマブ（ＭＵＣ１の抗腫瘍特異的グリコシル化）、パルサツズマブ（抗ＥＧＦＬ７）、パスコリズマブ（抗ＩＬ−４）、パルチツマブ（抗ＨＥＲ３）、ペムツモマブ（抗ＭＵＣ１）、ペルツズマブ（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ピジリズマブ（抗ＰＤ−１）、ピナツズマブベドチン（抗ＣＤ２２）、ピンツモマブ（抗腺癌抗原）、ポラツズマブベドチン（抗ＣＤ７９Ｂ）、プリツムマブ（抗ビメンチン）、ＰＲＯ１３１９２１（抗ＣＤ２０）、キリズマブ（抗ＩＧＨＥ）、ラコツモマブ（抗Ｎグリコリルノイラミン酸）、ラドレツマブ（抗フィブロネクチンエキストラドメイン−Ｂ）、ラムシルマブ（抗ＶＥＧＦＲ２）、リロツムマブ（抗ＨＧＦ）、ロバツムマブ（抗ＩＧＦ−１受容体）、ロレズマブ（抗ＲＨＤ）、ロベリズマブ（抗ＣＤ１１＆ＣＤ１８）、サマリズマブ（抗ＣＤ２００）、サツモマブペンデチド（抗ＴＡＧ−７２）、セリバンツマブ（抗ＥＲＢＢ３）、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ（抗ＣＤ１９）、ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ（抗ＣＤ３３）、シブロツズマブ（抗ＦＡＰ）、シルツキシマブ（抗ＩＬ−６）、ソリトマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、ソンツズマブ（抗エピシアリン）、タバルマブ（抗ＢＡＦＦ）、タカツズマブテトラキセタン（抗αフェトプロテイン）、タプリツモマブパプトックス（抗ＣＤ１９）、テリモマブアリトックス、テナツモマブ（抗テネイシンＣ）、テネリキシマブ（抗ＣＤ４０）、テプロツムマブ（抗ＣＤ２２１）、ＴＧＮ１４１２（抗ＣＤ２８）、チシリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、チガツズマブ（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＴＮＸ−６５０（抗ＩＬ−１３）、トシツモマブ（抗ＣＳ２０）、トベツマブ（抗ＣＤ１４０ａ）、ＴＲＢＳ０７（抗ＧＤ２）、トレガリズマブ（抗ＣＤ４）、トレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、ＴＲＵ−０１６（抗ＣＤ３７）、ツコツズマブセルモロイキン（抗ＥｐＣＡＭ）、ウブリツキシマブ（抗ＣＤ２０）、ウレルマブ（抗４−１ＢＢ）、バンチクツマブ（抗フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）受容体）、バパリキシマブ（抗ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１））、バテリズマブ（抗ＩＴＧＡ２）、ベルツズマブ（抗ＣＤ２０）、ベセンクマブ（抗ＮＲＰ１）、ビシリズマブ（抗ＣＤ３）、ボロシキシマブ（抗インテグリンα５β１）、ボルセツズマブマフォドチン（抗ＣＤ７０）、ボツムマブ（抗腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８）、ザルツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、ザノリムマブ（抗ＣＤ４）、ザツキシマブ（抗ＨＥＲ１）、ジラリムマブ（抗ＣＤ１４７ベイシジン（ｂａｓｉｇｉｎ））、ＲＧ７６３６（抗ＥＴＢＲ）、ＲＧ７４５８（抗ＭＵＣ１６）、ＲＧ７５９９（抗ＮａＰｉ２ｂ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤ−Ｌ１）、ＲＧ７４５０（抗ＳＴＥＡＰ１）及びＧＤＣ−０１９９（抗Ｂｃｌ−２）。
【００８６】
本発明に有用な他の抗体ドメイン又は腫瘍標的結合タンパク質（例えばＴＣＲドメイン）は、限定されないが、以下の抗原を結合するものを含む（表示されているがんの表示は限定しない例を表していることに注意されたい）：アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）、アネキシンＡ１、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６、様々ながん）、ＣＡ１２５（卵巣癌）、ＣＡ１５−３（がん）、ＣＡ１９−９（がん）、Ｌ６（がん）、ルイスＹ（がん）、ルイスＸ（がん）、αフェトプロテイン（がん）、ＣＡ２４２（結腸直腸癌）、胎盤アルカリ性ホスファターゼ（がん）、前立腺特異的抗原（前立腺）、前立腺酸性ホスファターゼ（前立腺）、上皮細胞成長因子（がん）、ＣＤ２（ホジキン病、ＮＨＬリンパ腫、多発性骨髄腫）、ＣＤ３ε（Ｔ細胞リンパ腫、肺癌、乳癌、胃癌、卵巣癌、自己免疫性疾患、悪性腹水）、ＣＤ１９（Ｂ細胞悪性腫瘍）、ＣＤ２０（非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞新生組織形成（ｎｅｏｐｌａｓｍａｓ）、自己免疫性疾患）、ＣＤ２１（Ｂ細胞リンパ腫）、ＣＤ２２（白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ＳＬＥ）、ＣＤ３０（ホジキンリンパ腫）、ＣＤ３３（白血病、自己免疫性疾患）、ＣＤ３８（多発性骨髄腫）、ＣＤ４０（リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病（ＣＬＬ））、ＣＤ５１（転移性黒色腫、肉腫）、ＣＤ５２（白血病）、ＣＤ５６（小細胞肺癌、卵巣癌、メルケル細胞がん、液体腫瘍、多発性骨髄腫）、ＣＤ６６ｅ（がん）、ＣＤ７０（転移性腎細胞癌及び非ホジキンリンパ腫）、ＣＤ７４（多発性骨髄腫）、ＣＤ８０（リンパ腫）、ＣＤ９８（がん）、ＣＤ１２３（白血病）、ムチン（がん）、ＣＤ２２１（充実性腫瘍）、ＣＤ２２７（乳癌、卵巣癌）、ＣＤ２６２（ＮＳＣＬＣ及び他のがん）、ＣＤ３０９（卵巣癌）、ＣＤ３２６（充実性腫瘍）、ＣＥＡＣＡＭ３（直腸結腸癌、胃癌）、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ、ＣＤ６６ｅ）（乳癌、直腸結腸癌及び肺癌）、ＤＬＬ４（Ａ様４）、ＥＧＦＲ（多様ながん）、ＣＴＬＡ４（黒色腫）、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４、ヘム腫瘍学（ｈｅｍｅ−ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、充実性腫瘍）、エンドグリン（ＣＤ１０５、充実性腫瘍）、ＥＰＣＡＭ（上皮細胞間接着分子、膀胱癌、頭部癌、頸部癌、結腸癌、ＮＨＬ前立腺癌及び卵巣癌）、ＥＲＢＢ２（肺癌、乳癌、前立腺癌）、ＦＣＧＲ１（自己免疫性疾患）、ＦＯＬＲ（葉酸受容体、卵巣癌）、ＦＧＦＲ（がん）、ＧＤ２ガングリオシド（がん）、Ｇ−２８（細胞表面抗原糖脂質、黒色腫）、ＧＤ３イディオタイプ（がん）、ヒートショックプロテイン（がん）、ＨＥＲ１（肺癌、胃癌）、ＨＥＲ２（乳癌、肺癌及び卵巣癌）、ＨＬＡ−ＤＲ１０（ＮＨＬ）、ＨＬＡ−ＤＲＢ（ＮＨＬ、Ｂ細胞白血病）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（がん）、ＩＧＦ１Ｒ（充実性腫瘍、血液のがん）、ＩＬ−２受容体（Ｔ細胞白血病及びリンパ腫）、ＩＬ−６Ｒ（多発性骨髄腫、ＲＡ、キャッスルマン病、ＩＬ６依存性腫瘍）、インテグリン（ανβ３、α５β１、α６β４、α１１β３、α５β５、ανβ５、多様ながん）、ＭＡＧＥ−１（がん）、ＭＡＧＥ−２（がん）、ＭＡＧＥ−３（がん）、ＭＡＧＥ４（がん）、抗トランスフェリン受容体（がん）、ｐ９７（黒色腫）、ＭＳ４Ａ１（膜貫通４ドメイン亜科Ａ構成員１、非ホジキンＢ細胞リ���パ腫、白血病）、ＭＵＣ１（乳癌、卵巣癌、頸癌、気管支癌及び消化管癌）、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）（卵巣癌）、ＣＥＡ（直腸結腸癌）、ｇｐ１００（黒色腫）、ＭＡＲＴＩ（黒色腫）、ＭＰＧ（黒色腫）、ＭＳ４Ａ１（膜貫通４ドメイン亜科Ａ、小細胞肺癌、ＮＨＬ）、ヌクレオリン、Ｎｅｕがん遺伝子産物（がん）、Ｐ２１（がん）、ネクチン−４（がん）、抗（Ｎグリコリルノイラミン酸、乳癌、黒色腫癌）のパラトープ、ＰＬＡＰ様精巣アルカリ性ホスファターゼ（卵巣癌、精巣癌）、ＰＳＭＡ（前立腺腫瘍）、ＰＳＡ（前立腺）、ＲＯＢ０４、ＴＡＧ７２（腫瘍関連糖タンパク質７２、ＡＭＬ、胃癌、直腸結腸癌、卵巣癌）、Ｔ細胞膜貫通タンパク質（がん）、Ｔｉｅ（ＣＤ２０２ｂ）、組織因子、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（腫瘍壊死因子受容体上科構成員１０Ｂ、がん）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（腫瘍壊死因子受容体上科構成員１３Ｂ、多発性骨髄腫、ＮＨＬ、他のがん、ＲＡ及びＳＬＥ）、ＴＰＢＧ（トロホブラスト糖タンパク質、腎細胞癌）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（リガンド受容体１、リンパ腫、ＮＨＬ、直腸結腸癌、肺癌を含む腫瘍壊死アポトーシス）、ＶＣＡＭ−１（ＣＤ１０６、黒色腫）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−２（ＣＤ３０９）（多様ながん）。一部の他の腫瘍関連抗原標的が精査されている（Gerber, et al, mAbs 2009 1:247-253; Novellino et al, Cancer Immunol Immunother. 2005 54:187-207, Franke, et al, Cancer Biother Radiopharm. 2000, 15:459-76, Guo, et al., Adv Cancer Res. 2013; 119:421-475, Parmiani et al. J Immunol. 2007 178:1975-9）。これらの抗原の例は分化抗原群（ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２ｗ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７９、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ１００、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１２０、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１５６、ＣＤ１５８、ＣＤ１６３、ＣＤ１６６、ＣＤ１６８、ＣＤ１８４、ＣＤｗ１８６、ＣＤ１９５、ＣＤ２０２（ａ、ｂ）、ＣＤ２０９、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２７１、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４）、アネキシンＡ１、ヌクレオリン、エンドグリン（ＣＤ１０５）、ＲＯＢ０４、アミノペプチダーゼＮ、様４（ＤＬＬ４）、ＶＥＧＦＲ−２（ＣＤ３０９）、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）、Ｔｉｅ２、Ｂ７−Ｈ３、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、イディオタイプ、ＭＡＧＥ  Ａ３、ｐ５３非変異体（ｎｏｎｍｕ���ａｎｔ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＧＤ２、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｇｐ１００、ｐ５３変異体、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、スルビビン、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ  Ａ１、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰＩＢ  Ｉ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＰＤＧＦＲ−β、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｎｏｔｃｈ  １、ＩＣＡＭ及びＦｏｓ関連抗原１を含む。
【００８７】
さらに、本発明の好ましい結合ドメインは、当該分野で知られている感染した細胞に関連する抗原及びエピトープ標的に特異的なものを含む。かかる標的は、限定されないが、以下の目的の病原菌に由来するものを含む：ＨＩＶウイルス（特にＨＩＶエンベロープスパイク及び／又はｇｐ１２０及びｇｐ４１エピトープに由来する抗原）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト結核菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、化膿レンサ球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、ハンセン菌、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、単純ヘルペスウイルスＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、水痘帯状ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣ウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス４０、マウス乳腺腫瘍ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、ウエストナイルウイルス、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ原虫、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒａｎｇｅｌｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｅｌｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ、回旋糸状虫、熱帯リーシュマニア、旋毛虫、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ、Ｔａｅｎｉａ  ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ、Ｔａｅｎｉａ  ｏｖｉｓ、無鉤条虫、単包条虫、Ｍｅｓｏｃｅｓｔｏｉｄｅｓ  ｃｏｒｔｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ、Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ及びＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ。
【００８８】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲｓ）
Ｔ細胞は他の免疫細胞型（多核白血球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）とともに、免疫系の細胞成分を構成する細胞のサブグループである。生理学的状態下で、Ｔ細胞は免疫学的監視及び外来抗原の除外において機能する。しかしながら、病的状態下では、Ｔ細胞が疾患の因果関係及び伝播において主要な役割を果たしているとの有力な証拠がある。これらの障害において、中央又は末梢いずれかのＴ細胞の免疫寛容の故障が自己免疫性疾患の因果関係における基本的な経過である。
【００８９】
該ＴＣＲ複合体は少なくとも７の膜貫通タンパク質から構成される。ジスルフィド結合（αβ又はγδ）ヘテロ二量体は単一型抗原認識ユニットを形成する一方、ε、γ、δ、ζ及びη鎖を含むＣＤ３の不変鎖は、Ｔ細胞活性化及び細胞性免疫反応の生成をもたらすシグナル経路と結合しているリガンドと結合することに責任を負う。ＴＣＲ鎖の遺伝子多様性にかかわらず、２の構造特性はすべての知られているサブユニットに共通である。第一に、それらは単独の膜貫通ドメインを有する膜貫通タンパク質――推定するにαヘリックスである。第二に、すべてのＴＣＲ鎖は予測された膜貫通ドメイン内に荷電アミノ酸を保有するという普通でない特徴を有する。該不変鎖はマウスとヒトの間で保たれる単独の負電荷を有し、該可変鎖は１つ（ＴＣＲ−β）又は２つ（ＴＣＲ−α）の正電荷を有する。ＴＣＲ−αの膜貫通配列は多くの種に高度に保存されており、それゆえに系統発生学的に重大な機能的役割を果たしていてもよい。親水性アミノ酸アルギニン及びリジンを含むオクタペプチド配列はそれらの種の間で同一である。
【００９０】
Ｔ細胞反応はＴＣＲと結合する抗原によって調節される。ＴＣＲの１つの型はイムノグロブリン可変（Ｖ）及び不変（Ｃ）領域に類似したα及びβ鎖からなる膜結合ヘテロ二量体である。該ＴＣＲα鎖は共有結合したＶ−α及びＣ−α鎖を含み、該β鎖はＣ−β鎖と共有結合したＶ−β鎖を含む。該Ｖ−α鎖及びＶ−β鎖は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）（ヒトにおいてはＨＬＡ複合体として知られる）との関連で、スーパー抗原又は抗原と結合できるポケット又は裂け目を形成する。Davis Ann. Rev. of Immunology 3: 537 (1985); Fundamental Immunology 3rd Ed., W. Paul Ed. Rsen Press LTD. New York (1993)を参照されたい。
【００９１】
ＴＣＲ鎖（αβ又はγδ）の細胞外ドメインは、細胞表面上での発現のために異種膜貫通ドメインとの融合としてまた設計されてもよい。かかるＴＣＲｓはＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ及び／又はキメラ活性化受容体（ＣＡＲ）膜貫通又は活性化ドメインとの融合を含んでいてもよい。ＴＣＲｓはαβ又はγδ鎖の１又はそれ以上の抗原結合ドメインを含む可溶性タンパク質であってもまたよい。かかるＴＣＲｓはＴＣＲ不変ドメインを有する、又は有さないＴＣＲ可変ドメイン又はその機能フラグメントを含んでいてもよい。可溶性ＴＣＲｓはヘテロ二量体又は一本鎖分子であってもよい。
【００９２】
Ｆｃドメイン
本発明のタンパク質複合体はＦｃドメインを含んでいてもよい。例えば、ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭは抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合複合体を含む。ＩｇＧのＦｃ領域と別のタンパク質のドメインを結合させる融合タンパク質、例えば多様なサイトカイン及び可溶性受容体が報告されている（例えば、Capon et al., Nature, 337:525-531, 1989; Chamow et al., Trends Biotechnol., 14:52-60, 1996）；米国特許第５，１１６，９６４号及び第５，５４１，０８７号を参照されたい）。該プロトタイプ融合タンパク質はＩｇＧ  Ｆｃのヒンジ領域でシステイン残基を介して結合したホモ二量体タンパク質であり、重鎖可変及びＣＨ１ドメイン及び軽鎖を伴わない、ＩｇＧ分子と類似した分子をもたらす。Ｆｃドメインを含む融合タンパク質の二量体の性質は、他の分子との高次相互作用（二価結合又は二重特異性結合）を提供するのに好都合であり得る。構造的相同性のために、Ｆｃ融合タンパク質は、類似のアイソトープを有するヒトＩｇＧのそれと比較可能な、薬物動態プロフィールをインビボで示す。ＩｇＧクラスのイムノグロブリンはヒトの血液中で最も豊富なタンパク質であり、循環半減期は２１日にも届くことがある。ＩＬ−１５又はＩＬ−１５融合タンパク質の循環半減期を引き伸ばすため、及び／又は、その生物学的活性を増加させるために、ヒト重鎖ＩｇＧタンパク質のＦｃ部分と共有結合したＩＬ−１５αと非共有結合したＩＬ−１５ドメインを含む融合タンパク質複合体が本明細書に記載される。
【００９３】
用語「Ｆｃ」はＦｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体及び補体系の一部のタンパク質と相互作用する抗体の不変領域であるフラグメント結晶化可能領域を指す。かかる「Ｆｃ」は二量体形である。天然のＦｃの元のイムノグロブリン源は好ましくはヒト由来であり、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましいが、任意のイムノグロブリンであってもよい。天然のＦｃ’ｓは共有会合（すなわちジスルフィド結合）及び非共有会合によって二量体形又は多量体形と結合していてもよい単量体ポリペプチドから構成される。天然のＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）によって１から４の幅がある。天然のＦｃの一例はＩｇＧのパパイン分解から生じるジスルフィド結合二量体である（Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9を参照されたい）。プロテインＡ、プロテインＧ、多様なＦｃ受容体及び補体タンパク質の結合部位を含むＦｃドメイン。一部の実施形態では、該複合体のＦｃドメインはＦｃ受容体と相互作用して抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を介在することができる。他の適用では、該複合体は効果的にＡＤＣＣ又はＡＤＣＰを介在することのできないＦｃドメイン（例えば、ＩｇＧ４  Ｆｃ）を含む。
【００９４】
一部の実施形態では、用語「Ｆｃ変異体」は天然のＦｃから修飾された分子又は配列を指すが、サルベージ受容体ＦｃＲｎのための結合部位をまだ含んでいる。参照によって本明細書に組み込まれる公開ＰＣＴ出願第ＷＯ９７／３４６３１号及び第ＷＯ９６／３２４７８号により、例示的なＦｃ多様体及びサルベージ受容体との相互作用が記載されている。このように、用語「Ｆｃ多様体」は非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子又は配列を含む。さらに、天然のＦｃは本発明の融合分子には必要とされない構造特性又は生物学的活性を提供するために、除去されてもよい部位を含む。このように、特定の実施形態では、用語「Ｆｃ多様体」は、（１）ジスルフィド結合構造、（２）選択された宿主細胞との不和合性、（３）選択された宿主細胞における発現のＮ末端異質性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体との結合、（７）抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、若しくは（８）抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）に影響する、又は関与する１又はそれ以上の天然のＦｃ部位若しくは残基を変更する分子又は配列を含む。かかる変化は、これらのＦｃ特性の任意の１つ又はそれ以上を増加又は減少させることがある。Ｆｃ多様体は以下にさらに詳細に記載される。
【００９５】
用語「Ｆｃドメイン」は、上記に定義された天然のＦｃ及びＦｃ多様体分子及び配列を包含する。Ｆｃ多様体及び天然のＦｃ’ｓと同様に、用語「Ｆｃドメイン」は、全抗体から分解されるか、又は組み換え遺伝子発現により産生されるか、又は他の方法のいずれかによって、単量体形又は多量体形の分子を含む。
【００９６】
融合タンパク質複合体
本発明は融合タンパク質複合体を提供する（図１及び図２）。一部の場合では、第一のタンパク質がインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）又はその機能性フラグメントと共有結合した第一の生物学的に活性なポリペプチドを含み；第二のタンパク質が可溶性インターロイキン−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα）ポリペプチド又はその機能性フラグメントと共有結合した第二の生物学的に活性なポリペプチドを含み、そこで第一のタンパク質のＩＬ−１５ドメインが第二のタンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインと結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する。本発明の融合タンパク質複合体は、第一及び第二のタンパク質の１つ又は両方と結合したイムノグロブリンＦｃドメイン又はその機能性フラグメントをまた含む。好ましくは、該融合タンパク質と結合したＦｃドメインは相互作用して融合タンパク質複合体を形成する。かかる複合体はイムノグロブリンＦｃドメイン間のジスルフィド結合構造によって安定していてもよい。一態様において、本発明の可溶性融合タンパク質複合体はＩＬ−１５ポリペプチド、ＩＬ−１５多様体又はその機能性フラグメント及び可溶性ＩＬ−１５Ｒαポリペプチド又はその機能性フラグメントを含み、そこでＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαポリペプチドの１つ又は両方がイムノグロブリンＦｃドメイン又はその機能性フラグメントをさらに含む。
【００９７】
特定の例では、第一又は第二のタンパク質の１つ又は両方が抗体又はその機能性フラグメントを含む。例えば、結合ドメインの１つが可溶性抗ＰＤ−Ｌ１一本鎖抗体又はその機能性フラグメントを含む。別の例では、他の、又は第二の結合ドメインが抗ＣＴＬＡ４一本鎖抗体又は疾患抗原特異的抗体又はそれらの機能性フラグメントを含む。一実施形態では、本発明により可溶性抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質複合体を含むＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭが提供される。この複合体では、ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕドメインは２つの抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のｈｕＩｇＧ１  Ｆｃドメインと相互作用し、複数鎖融合タンパク質複合体を形成する。
【００９８】
本明細書に使用されているように、用語「生物学的に活性なポリペプチド」又は「エフェクター分子」は、本発明に論じられる望ましい効果を提供することができるアミノ酸配列、例えばタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド；糖類又は多糖；脂質又は糖脂質、糖タンパク質又はリポタンパク質を意味する。エフェクター分子は化学薬品をまた含む。生物学的に活性なタンパク質又はエフェクタータンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするエフェクター分子核酸配列がまた意図される。それゆえに、適した分子は制限因子、酵素、抗体又は薬剤並びにＤＮＡ、ＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドを含む。生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子は自然発生的であってもよく、又はそれは、例えば組み換え又は化学合成によって、既知の成分から合成されていてもよく、異種成分を含んでいてもよい。生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子は概して約０．１から１００ＫＤの間、より大きくは約１０００ＫＤまで、好ましくは約０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０及び５０ＫＤの間であり、標準的な細胞サイジング技術、例えば遠心分離又はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって判断される。本発明の望ましい効果は、限定されないが、例えば、増加した結合活性を有する本発明の融合タンパク質複合体を形成すること、標的細胞を殺傷すること、例えば疾患を予防又は治療することにおいて、細胞増殖又は細胞死を誘発させて、免疫反応を開始させるか、又は診断目的で検出分子として作用させることのどちらかを含む。かかる検出のために、アッセイ、例えば増殖させるために細胞を培養すること、そして本発明の融合複合体に該細胞を接触させること、それから該融合複合体が細胞のさらなる発展を示すかどうかを評価することの逐次段階を含むアッセイを用いることができる。
【００９９】
本発明と関連してエフェクター分子を本発明の融合タンパク質複合体と共有結合させることは、多くの有意な利益を提供する。既知の構造のペプチドを含む、単独のエフェクター分子を含む本発明の融合タンパク質複合体を産生することができる。加えて、類似のＤＮＡベクターで広範囲のエフェクター分子を産生することができる。すなわち、異なるエフェクター分子のライブラリーが感染細胞又は疾患細胞の認識のための融合タンパク質複合体と結合していてもよい。さらに、治療上の適用として、本発明の融合タンパク質複合体の対象への投与よりもむしろ、該融合タンパク質複合体をコードするＤＮＡ発現ベクターを、該融合タンパク質複合体のインビボ発現のために投与することができる。かかるアプローチは組み換えタンパク質の調製と典型的に関連している高価な精製段階を回避し、慣例的なアプローチと関連した抗原の取り込み及びプロセシングの複雑性を回避する。
【０１００】
言及したように、本明細書に開示される融合タンパク質の成分、例えばエフェクター分子、例えばサイトカイン、ケモカイン、成長因子、タンパク質毒素、イムノグロブリンドメイン又は他の生物活性分子及び任意のペプチドリンカーを、該融合タンパク質がその意図された機能を有する条件下において、ほとんどいかなる方法でも組織化することができる。特に、該融合タンパク質の各成分は、望ましい場合、少なくとも１つの可溶性ペプチドリンカー配列によって、別の成分から間隔を空けていてもよい。さらに、該融合タンパク質は、例えば該融合タンパク質の修飾、同定及び／又は精製を容易にするためのタグを含み得る。より具体的な融合タンパク質は下記に記載の実施例中にある。
【０１０１】
リンカー
本発明の融合複合体は、好ましくはＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインと生物学的に活性なポリペプチドの間に介入したフレキシブルリンカー配列をまた含む。該リンカー配列は、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインに関連した生物学的に活性なポリペプチドの効果的な配置を許容し、両方のドメインの機能的活性を許容するべきである。
【０１０２】
一部の場合では、該可溶性融合タンパク質複合体はリンカーを有し、そこで第一の生物学的に活性なポリペプチドはポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５（又はその機能性フラグメント）と共有結合している。他の態様では、本明細書に記載の該可溶性融合タンパク質複合体はリンカーを有し、そこで第二の生物学的に活性なポリペプチドはポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５Ｒαポリペプチド（又はその機能性フラグメント）と共有結合している。
【０１０３】
該リンカー配列は、好ましくは、提示抗原の認識のためのＴＣＲ分子の結合グルーブ、又は抗原の認識のための抗体分子の結合ドメインを効果的に配置できるペプチドをもたらすヌクレオチド配列によってコードされる。本明細書に使用されるように、語句「該ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインに関して生物学的に活性なポリペプチドの効果的な配置」又は他の類似の語句は、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインと結合した生物学的に活性なポリペプチドが、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインがお互いに相互作用してタンパク質複合体を形成することが可能であるように配置されていることを意味することが意図される。例えば、該ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインは、免疫細胞との相互作用が免疫反応を開始又は阻害すること、あるいは細胞の発展を阻害又は刺激することを許容するために効果的に配置されている。
【０１０４】
本発明の融合複合体は、好ましくは、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５ＲαドメインとイムノグロブリンＦｃドメイン間に介入したフレキシブルリンカー配列をまた含む。該リンカー配列は、該Ｆｃドメイン、生物学的に活性なポリペプチド及びＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインの効果的な配置を許容し、各ドメインに機能的活性を許容するべきである。例えば、該Ｆｃドメインは、オプソニン化、細胞溶解、マスト細胞、好塩基球及び好酸球の脱顆粒、並びに他のＦｃ受容体依存性プロセスを含むＦｃ介在性効果を刺激する、適した融合タンパク質複合体の形成、及び／又は補体系の免疫細胞又はタンパク質のＦｃ受容体との相互作用；補体経路の活性化；該融合タンパク質複合体の高められたインビボ半減期を許容するために効果的に配置される。
【０１０５】
生物学的に活性なポリペプチドの２又はそれ以上のポリペプチドと結合して望ましい機能的活性を有する一本鎖分子を生成するために、リンカー配列をまた使用することができる。
【０１０６】
好ましくは、該リンカー配列は約７から２０のアミノ酸、より好ましくは約１０から２０のアミノ酸を含む。該リンカー配列は、単独の望ましくない構造において生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子を保有しないように、好ましくはフレキシブルである。例えば、融合した分子から認識部位に間隔を空けるために該リンカー配列を使用することができる。具体的には、該ペプチドリンカー配列は、例えば同じものと化学的に架橋して分子フレキシビリティを提供するために、該生物学的に活性なポリペプチド及び該エフェクター分子の間に位置することができる。該リンカーは、好ましくは、フレキシビリティを提供する小さい側鎖、例えばグリシン、アラニン、及びセリンを有するアミノ酸を主に含む。好ましくは、該リンカー配列の約８０又は９０パーセント又はそれ以上が、グリシン、アラニン又はセリン残基、特にグリシン及びセリン残基を含む。
【０１０７】
抗体可変領域に共に加わることに成功して用いられた多くのフレキシブルリンカー設計のいずれかを含む、異なるリンカー配列を使用することができる（Whitlow, M. et al., (1991) Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2:97-105を参照されたい）。
【０１０８】
薬物療法
本発明により、治療剤としての使用のための融合タンパク質複合体を含む医薬組成物が提供される。一態様では、本発明の融合タンパク質複合体は、例えば薬学的に許容できるバッファー、例えば生理食塩水中に製剤化されて、全身投与される。好ましい投与経路は、例えば、患者における継続的な、持続した又は効果的なレベルの組成物を提供する、膀胱への点滴注入、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、皮内注射を含む。ヒトの患者又は他の動物の治療は、生理的に許容できる担体内の本明細書に特定された治療剤の治療上の有効量を用いて実行される。適した担体及びその製剤が、例えばE. W. MartinによるRemington’s Pharmaceutical Sciencesに記載されている。投与されるべき治療剤の量は、投与形式、患者の年齢及び体重、新生組織形成の臨床症状によって多様である。特定の例では化合物の増加した特異度のために低用量が必要となるであろうが、概して、量は新生組織形成、自己免疫性疾患又は感染症と関連した他の疾患の治療において使用される他の剤のために使用されるものの範囲内であろう。対象の免疫反応を高める、又は当業者に知られている方法によって決定された新生細胞、感染細胞又は自己免疫性細胞の増殖、生存又は侵襲性を低減する用量で化合物は投与される。
【０１０９】
医薬組成物の製剤
新生組織形成、感染症又は自己免疫性疾患の治療のための本発明の融合タンパク質複合体の投与は、他の成分と組み合わせて、前記新生組織形成、感染症又は自己免疫性疾患を改善、低減、又は安定させるのに有効な治療剤内の濃度をもたらす任意の適した方法による。本発明の融合タンパク質複合体は任意の適した担体物質内で適した量で含まれてもよいし、概して該組成物の全体量の重量にして１〜９５％の量で存在する。該組成物は非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、膀胱内、腫瘍内又は腹腔内）投与経路に適している投薬形態で提供されてもよい。例えば、該医薬組成物は慣例的な医薬実務によって製剤化される（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000及びEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkを参照されたい）。
【０１１０】
動物モデルと比較してヒトのための用量を修正することが当該分野ではルーティンであると当業者が認識するように、ヒト投薬量はマウス又は非ヒトの類人猿において使用される化合物の量から推定することによってまず決定される。例えば、該用量は約１μｇ化合物／ｋｇ体重から約５０００ｍｇの化合物／ｋｇ体重まで；又は約５ｍｇ／ｋｇ体重から約４，０００ｍｇ／ｋｇ体重まで、又は約１０ｍｇ／ｋｇ体重から約３，０００ｍｇ／ｋｇ体重まで；又は約５０ｍｇ／ｋｇ体重から約２０００ｍｇ／ｋｇ体重まで；又は約１００ｍｇ／ｋｇ体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ体重まで；又は約１５０ｍｇ／ｋｇ体重から約５００ｍｇ／ｋｇ体重まで多様である。例えば、該用量は約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，０５０、１，１００、１，１５０、１，２００、１，２５０、１，３００、１，３５０、１，４００、１，４５０、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００又は５，０００ｍｇ／ｋｇ体重である。あるいは、用量は約５ｍｇ化合物／Ｋｇ体重から約２０ｍｇ化合物／ｋｇ体重の幅内である。別の例では、該用量は約８、１０、１２、１４、１６又は１８ｍｇ／ｋｇ体重である。好ましくは、該融合タンパク質複合体は０．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．５、１、３、５、１０ｍｇ／ｋｇ）で投与される。もちろん、この用量はかかる治療プロトコルにおいてルーティンでなされているように、初めの臨床試験の結果及び特定の患者の必要によって上方又は下方に調整されてもよい。
【０１１１】
医薬組成物は、投与時に制御された方法で治療剤を開放する医薬組成物内に、適した賦形剤とともに製剤化される。例としては単独又は複数ユニット錠剤又はカプセル組成物、油剤、懸濁剤、乳剤、マイクロカプセル、ミクロスフェア、分子複合体、ナノ粒子、パッチ及びリポソームが含まれる。好ましくは、該融合タンパク質複合体は非経口投与に適した賦形剤内に製剤化される。
【０１１２】
非経口投与
本発明の融合タンパク質複合体を含む医薬組成物は、投薬形態、剤形においては注射、注入又は移植（皮下、静脈内、筋肉内、腫瘍内、膀胱内、腹腔内）によって、又は慣例的な、非毒性の薬学的に許容できる担体及びアジュバントを含む、適した送達装置又は移植片を介して、非経口で投与される。かかる組成物の製剤化及び調製は製剤処方の分野における当業者にはよく知られている。剤形化は上記のRemington: The Science and Practice of Pharmacy内に見出すことができる。
【０１１３】
非経口使用のための本発明の融合タンパク質複合体を含む組成物は、ユニット投薬形態（例えば、単回投与アンプル内で）で提供される。あるいは、該組成物は、適した保存料を添加してもよい複数回分の用量を含むバイラルで提供される（下記を参照）。該組成物は溶剤、懸濁剤、乳剤、注入装置又は移植のための送達装置の形態であり、あるいは使用前に水又は他の適した媒体とともに戻されるべき乾燥粉末として提示される。新生組織形成、感染症又は自己免疫性疾患を低減又は改善させる活性剤とは別に、該組成物は適した非経口の許容できる担体及び／又は賦形剤を含む。該活性治療剤は制御された放出のためのミクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームに組み込まれていてもよい。さらに、該組成物は懸濁化剤、可溶化剤、安定剤、ｐＨ調整剤、等張化剤及び／又は分散剤を含んでいてもよい。
【０１１４】
上記に示されたように、本発明の融合タンパク質複合体を含む該医薬組成物は、滅菌注射に適した形態であってもよい。かかる組成物を調製するために、その適した活性治療剤は非経口の許容できる液体媒体内で溶解又は懸濁している。用いられ得るのに許容できる媒体及び溶媒には、水、適した量の塩酸の添加により適したｐＨに調節された水、水酸化ナトリウム又は適したバッファー、１，３−ブタンジオール、リンガー溶液及び生理食塩水及びデキストロース溶液が含まれる。その水性の製剤は１又はそれ上の保存料（例えばメチル、エチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル）をまた含んでいてもよい。該化合物の１つが水にやや溶けにくい、又はわずかしか溶けないだけの場合、薬剤を高める又は可溶化する溶解剤が添加されることがあり、又は該溶剤は１０〜６０％ｗ／ｗのプロピレングリコールを含んでいてもよい。
【０１１５】
本発明により新生組織形成、感染症又は自己免疫性疾患又はそれらの症状を治療する方法が提供され、それには本明細書の化学式の化合物を含む医薬組成物の治療上の有効量を対象（例えば哺乳類、例えばヒト）に投与することが含まれる。このように、一実施形態は新生組織形成、感染症又は自己免疫性疾患又はその症状に罹患した、又はその疑いのある対象を治療する方法である。該方法は、疾患又は障害が治療される状況下で、疾患又は障害又はその症状を治療するのに十分な治療量の本明細書の化合物の量を哺乳類に投与する段階を含む。
【０１１６】
本明細書の方法は対象（かかる治療が必要であると同定された対象を含む）に本明細書に記載の化合物、又はかかる効果を提供する本明細書に記載の組成物の有効量を投与することを含む。かかる治療が必要な対象を同定することは、対象又はヘルスケア専門家の判断においてであり得、主観的（例えば意見）又は客観的（例えば試験又は診断方法によって測定可能）であり得る。
【０１１７】
本発明の治療方法（予防的治療を含む）は、概して、本明細書の化合物、例えば該化学式の化合物の治療上の有効量を、哺乳類、特にヒトを含む治療を必要とする対象（例えば動物、ヒト）に投与することを含む。かかる治療は新生組織形成、感染症又は自己免疫性疾患、障害、又はその症状に罹患した、それらを有する、それらの疑いのある又はそれらのリスクのある対象、特にヒトに適して投与されるであろう。これらの「リスクのある」対象の決定は、診断試験、又は対象若しくはヘルスケア提供者の意見（例えば、遺伝子試験、酵素又はタンパク質マーカー、Ｍａｒｋｅｒ（本明細書に定義される）、家族歴等）によって、任意の主観的又は客観的決定によってなされてもよい。本発明の融合タンパク質複合体を、免疫反応における増加が望ましい任意の他の疾患の治療に使用してもよい。
【０１１８】
本発明により治療プロセスを測定する方法もまた提供される。該方法は、対象が疾患又はその症状を治療するのに十分な本明細書の化合物の治療量を投与されている、新生組織形成と関連した障害又はその症状に罹患した、若しくはその疑いのある対象において、診断マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）（例えば、本明細書の化合物、タンパク質又はその指標等によって調節される本明細書に描写された任意の標的）のレベルを決定する段階又は診断的測定（例えば、スクリーニング、アッセイ）を含む。該方法で決定されるＭａｒｋｅｒのレベルを、健康な通常対照又は他の罹患した患者におけるＭａｒｋｅｒの既知のレベルと比較して、該対象の疾患状態を確立してもよい。一部の場合では、該対象におけるＭａｒｋｅｒの第二のレベルを第一のレベルの決定より遅い時点で決定し、２つのレベルは疾患の経過又は該治療の有効性を測定するために比較される。特定の態様では、対象のＭａｒｋｅｒの前治療レベルが本発明による治療の開始に先立って決定される；それからこのＭａｒｋｅｒの前治療レベルを治療開始後の対象のＭａｒｋｅｒのレベルと比較して、治療の有効性を決定することができる。
【０１１９】
組み合わせ療法
任意選択的に、本発明の融合タンパク質複合体は、任意の他の標準的治療と組み合わせて投与される；かかる方法は当業者には知られており、E. W. MartinによるRemington’s Pharmaceutical Sciencesに記載されている。望ましい場合は、本発明の融合タンパク質複合体は、限定されないが免疫療法、治療抗体、標的療法、手術、放射線治療、又は化学療法を含む、任意の慣例的な抗新生組織形成療法と組み合わせて投与される。
【０１２０】
キット又は医薬システム
本発明の融合タンパク質複合体を含む医薬組成物は、新生組織形成、感染症又は自己免疫性疾患の改善における使用のためにキット又は医薬システムに組み入れられてもよい。本発明のこの態様によるキット又は医薬システムは、その中に厳重に密閉された１又はそれ以上の容器手段、例えばバイアル、チューブ、アンプル、ボトル等を有する輸送手段、例えば箱、カートン、チューブを含む。本発明のキット又は医薬システムは、本発明の融合タンパク質複合体の使用に関連した指示書をまた含んでいてもよい。
【０１２１】
組み換えタンパク質発現
概して、本発明の融合タンパク質複合体（例えばＴｘＭ複合体の成分）の調製は本明細書に記載の手順によって、及び認識された組み換えＤＮＡ技術によって完成され得る。
【０１２２】
概して、組み換えポリペプチドは、適した宿主細胞と、適した発現媒体中のポリペプチドをコードする核酸分子又はそのフラグメントの全部又は一部の形質転換によって産生される。分子生物学分野の当業者は、発現システムの幅広い多様性のいずれかが該組み換えタンパク質を提供するために使用され得ることを理解するであろう。使用される的確な宿主細胞は本発明にとって重大ではない。組み換えポリペプチドは事実上任意の真核生物宿主（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、昆虫細胞、例えばＳｆ２１細胞、又は哺乳類の細胞、例えばＮＩＨ  ３Ｔ３、ＨｅＬａ又は好ましくはＣＯＳ細胞）内で産生され得る。かかる細胞は広範囲の源から入手可能である（例えば、the American Type Culture Collection, Rockland, Md.; 例えば、Ausubel et al., Current Protocol in Molecular Biology, New York: John Wiley and Sons, 1997もまた参照されたい）。トランスフェクションの方法及び発現媒体の選択は、選択される宿主系によるであろう。形質転換の方法は、例えばAusubel et al.（上記）に記載されており；発現媒体は例えばCloning Vectors: A Laboratory Manual (P. H. Pouwels et al., 1985, Supp. 1987) に提供されるものから選択されてもよい。
【０１２３】
組み換えポリペプチドの産生のために発現システムの多様性が存在する。かかるポリペプチドを産生するために有用な発現ベクターは、限定されないが、染色体ベクター、エピソームベクター、ウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入要素、酵母染色体要素、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルスに由来するベクター、並びにその組み換えに由来するベクターを含む。
【０１２４】
組み換えポリペプチドが発現すると、それを例えば親和性クロマトグラフィーを使用して単離する。一例では、該ポリペプチドに対して生じる抗体（例えば本明細書に記載されているように産生されたもの）を、カラムと付着させて、該組み換えポリペプチドを単離するために使用することがある。親和性クロマトグラフィーに先立つ、ポリペプチドを保有する細胞の溶解及び分画は、標準的方法によって実行され得る（例えば、上記のAusubel et al.を参照されたい）。単離されると、望ましい場合、例えば高パフォーマンス液体クロマトグラフィーによって該組み換えタンパク質をさらに精製することができる（例えばFisher, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, eds., Work and Burdon, Elsevier, 1980を参照されたい）。
【０１２５】
本明細書に使用されているように、本発明の生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子は因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、成長因子、タンパク質毒素、イムノグロブリンドメイン又は他の生物活性タンパク質、例えば酵素を含んでいてもよい。また、生物学的に活性なポリペプチドは他の化合物、例えば非タンパク質毒素、細胞傷害剤、化学療法剤、検出可能標識、放射性物質等との共役体を含んでいてもよい。
【０１２６】
本発明のサイトカインは、他の細胞に影響する細胞によって産生される任意の因子により定義され、細胞性免疫の任意の数の多重効果の原因となる。サイトカインの例としては、限定されないが、ＩＬ−２群、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＬ−１０、ＩＬ−１、ＩＬ−１７、ＴＧＦ及びＴＮＦサイトカイン群、並びにＩＬ−１からＩＬ−３５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮγ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α及びＴＮＦβが含まれる。
【０１２７】
本発明の一態様では、第一のタンパク質はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ドメイン又はその機能性フラグメントと共有結合した第一の生物学的に活性なポリペプチドを含む。ＩＬ−１５はＴ細胞活性化及び増殖に影響するサイトカインである。基本的な差異はよく特性化されているが、免疫細胞の活性化及び増殖に影響するＩＬ−１５活性は一部の点でＩＬ−２に類似している（Waldmann, T A, 2006, Nature Rev. Immunol. 6:595-601）。
【０１２８】
本発明の別の態様では、第一のタンパク質がＩＬ−１５多様体（本明細書ではＩＬ−１５変異体とも称される）であるインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ドメインを含む。該ＩＬ−１５多様体は、好ましくは天然の（又は野生型の）ＩＬ−１５タンパク質とは異なるアミノ酸配列を含む。該ＩＬ−１５多様体は、好ましくはＩＬ−１５Ｒαポリペプチドと結合してＩＬ−１５アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する。好ましくは、アゴニスト活性を有するＩＬ−１５多様体はスーパーアゴニスト活性を有する。該ＩＬ−１５多様体はＩＬ−１５Ｒαとの関連から独立したＩＬ−１５アゴニスト又はアンタゴニストとしても機能することができる。ＩＬ−１５アゴニストは野生型ＩＬ−１５と比較可能な、又は増加した生物学的活性によって例示される。ＩＬ−１５アンタゴニストは野生型ＩＬ−１５と比較して減少した生物学的活性によって、あるいはＩＬ−１５介在性反応を阻害する能力によって例示される。一部の例では、該ＩＬ−１５多様体は、増加又は減少した活性でＩＬ−１５ＲβγＣ受容体と結合する。一部の場合では、ＩＬ−１５多様体の配列は天然のＩＬ−２配列と比較して、少なくとも１のアミノ酸変化、例えば置換又は欠失を有し、かかる変化がＩＬ−１５アゴニスト又はアンタゴニスト活性をもたらす。好ましくは、該アミノ酸置換／欠失はＩＬ−１５Ｒβ及び／又はγＣと相互作用するＩＬ−１５ドメイン内に存在する。より好ましくは、該アミノ酸置換／欠失はＩＬ−１５Ｒαポリペプチドとの結合、又はＩＬ−１５多様体を産生する能力には影響しない。ＩＬ−１５多様体を生成するのに適したアミノ酸置換／欠失は、本明細書又は他の経験による方法によって提供される、合理的又は無作為な変異生成及び機能的アッセイを通して、推測又は既知のＩＬ−１５構造、相同分子、例えば既知の構造を有するＩＬ−２を有するＩＬ−１５との比較に基づいて特定され得る。さらに、適したアミノ酸置換は保存変化又は非保存変化、及び追加のアミノ酸の挿入であってもよい。好ましくは、本発明のＩＬ−１５多様体は成熟ヒトＩＬ−１５配列の６、８、１０、６１、６５、７２、９２、１０１、１０４、１０５、１０８、１０９、１１１又は１１２位での１又は１以上のアミノ酸置換／欠失を含む；特に、Ｄ８Ｎ（「Ｄ８」は天然の成熟ヒトＩＬ−１５配列におけるアミノ酸及び残基位置を指し、「Ｎ」はＩＬ−１５多様体におけるその位置で置換されたアミノ酸残基を指す）、Ｉ６Ｓ、Ｄ８Ａ、Ｄ６１Ａ、Ｎ６５Ａ、Ｎ７２Ｒ、Ｖ１０４Ｐ又はＱ１０８Ａ置換はアンタゴニスト活性を有するＩＬ−１５多様体をもたらし、Ｎ７２Ｄ置換はアゴニスト活性を有するＩＬ−１５多様体をもたらす。
【０１２９】
ケモカインは、サイトカインに類似しており、他の細胞にさらされると細胞性免疫の任意の数の多重効果の原因となる任意の化学因子又は分子として定義される。適したケモカインは、限定されないが、ＣＸＣ、ＣＣ、Ｃ及びＣＸ３Ｃケモカイン群並びにＣＣＬ−１からＣＣＬ−２８、ＣＸＣ−１からＣＸＣ−１７、ＸＣＬ−１、ＸＣＬ−２、ＣＸ３ＣＬ１、ＭＩＰ−１ｂ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１及びランテス（Ｒａｎｔｅｓ）を含んでいてもよい。
【０１３０】
成長因子は特定の細胞にさらされると、その影響した細胞の増殖及び／又は分化を誘発する任意の分子を含む。成長因子はタンパク質及び化学分子を含み、その一部はＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ヒト成長因子及び幹細胞成長因子を含む。追加の成長因子が本明細書に記載の使用にまた適していることがある。
【０１３１】
毒剤又は細胞傷害剤は、細胞にさらされると致死効果又は成長の阻害効果を有する任意の物質を含む。より具体的には、該エフェクター分子は、例えば植物起源又は細菌起源の細胞毒素、例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ）、志賀毒素、アブリン、コレラ毒素、リシン、サポリン、緑膿菌外毒素（ＰＥ）、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質又はゲロニンであってもよい。かかる毒素の生物学的に活性なフラグメントは当該分野にはよく知られており、例えばＤＴ  Ａ鎖及びリチンＡ鎖を含む。さらに、該毒素は細胞表面で活性な薬剤、例えばホスホリパーゼ酵素（例えばホスホリパーゼＣ）であってもよい。
【０１３２】
さらに、該エフェクター分子は化学療法剤、例えばビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、アドリアマイシン、ブレオマイシン及びシスプラチンであってもよい。
【０１３３】
さらに、該エフェクター分子は、診断研究又は画像研究に適している、検出可能に標識化された分子であってもよい。かかる標識はビオチン又はストレプトアビジン／アビジン、検出可能なナノ粒子又はクリスタル、酵素又はその触媒的に活性なフラグメント、蛍光標識、例えば緑色蛍光タンパク質、ＦＩＴＣ、フィコエリトリン、サイコム（ｃｙｃｈｏｍｅ）、テキサスレッド又は量子ドット；放射性核種、例えばヨウ素１３１、イットリウム９０、レニウム１８８、ビスマス２１２；リン光性分子若しくは化学発光分子、又はＰＥＴ、超音波又はＭＲＩ、例えばＧｄ−ＭＲＩ又は常磁性金属イオンに基づく造影剤によって検出可能な標識を含む。エフェクター又はタグを含むタンパク質の製造及び使用に関する開示には、例えば、Moskaug, et al. J. Biol. Chem. 264, 15709(1989); Pastan, I. et al. Cell 47, 641, 1986; Pastan et al., Recombinant Toxins as Novel Therapeutic Agents, Ann. Rev. Biochem. 61, 331, (1992); “Chimeric Toxins” Olsnes and Phil, Pharmac. Ther., 25, 355 (1982)；公開ＰＣＴ出願第ＷＯ  ９４／２９３５０号；公開ＰＣＴ出願第ＷＯ  ９４／０４６８９号；公開ＰＣＴ出願第ＷＯ２００５０４６４４９号及び米国特許第５，６２０，９３９号を参照されたい。
【０１３４】
共有結合したＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαドメインを含むタンパク質融合又は共役複合体は、複数の重要な用途を有する。例えば、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を特定の細胞、例えばＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍細胞へ送達するために、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂを含むタンパク質融合又は共役複合体を用いることができる。それゆえに、該タンパク質融合又は共役複合体により、該リガンドを含む細胞を選択的に損傷又は殺傷する方法が提供される。該タンパク質融合又は共役複合体によって損傷又は殺傷することが可能な細胞又は組織の例は、１又はそれ以上のリガンドを発現する腫瘍、及びウイルス感染細胞又は細菌感染細胞を含む。損傷又は殺傷したと疑われる細胞又は組織は、本明細書に記載の方法で容易に検査することができる。
【０１３５】
本発明のＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαポリペプチドは、自然発生的なＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒα分子、例えばヒト、マウス若しくはその他の齧歯類、又は他の動物のＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒα分子に対してアミノ酸配列が適切に対応する。これらのポリペプチドの配列及びコーディング核酸は参考文献にて知られており、ヒトインターロイキン１５（ＩＬ１５）ｍＲＮＡ――ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ１４４０７．１（参照によって本明細書に組み込まれる）、Ｍｕｓ筋肉インターロイキン１５（ＩＬ１５）ｍＲＮＡ――ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ１４３３２．１（参照によって本明細書に組み込まれる）、ヒトインターロイキン−１５受容体α鎖前駆体（ＩＬ１５ＲＡ）ｍＲＮＡ――ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ３１６２８．１（参照によって本明細書に組み込まれる）、Ｍｕｓ筋肉インターロイキン１５受容体、α鎖――ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ０９５９８２．１（参照によって本明細書に組み込まれる）を含む。
【０１３６】
一部の環境下では、本発明のタンパク質融合又は共役複合体を多価化すること、例えばｓｃ抗体の価数を増やすことが有用であってもよい。特に、該融合タンパク質複合体のＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαドメイン間の相互作用により、多価複合体を生成する方法が提供される。さらに、例えば標準的なビオチン−ストレプトアビジン標識化付与技術の使用によって、又は適した固体支持体、例えばラテックスビーズとの接合による共有結合又は非共有結合によって、１〜４間のタンパク質と共に多価の融合タンパク質を製造することができる。化学的に架橋しているタンパク質（例えばデンドリマーと架橋している）がまた適した多価の種である。例えば、該タンパク質は修飾され得るタグ配列、例えばビオチン化ＢｉｒＡタグ又は化学反応性の側鎖、例えばＣｙｓ又はＨｉｓを有するアミノ酸残基をコードする配列を含むことによって修飾されてもよい。かかるアミノ酸タグ又は化学反応性のアミノ酸は、該融合タンパク質の多様な位置、好ましくは生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子の活性部位の末端に配置されていてもよい。例えば、可溶性融合タンパク質のＣ末端は、かかる反応性アミノ酸を含むタグ又は他の融合タンパク質と共有結合していてもよい。適した側鎖は２又はそれ以上の融合タンパク質と適したデンドリマー又は他のナノ粒子を化学結合して、多価分子を生じさせるために含まれていてもよい。デンドリマーはその表面に任意の数の異なる機能性グループを有することができる合成化学ポリマーである（D. Tomalia, Aldrichimica Acta, 26:91:101(1993)）。本発明と関連した使用のための例示的なデンドリマーは、例えば、シスチン残基と連結することができるＥ９スターバーストポリアミンデンドリマー及びＥ９コンバストポリアミンデンドリマーを含む。例示的なナノ粒子はリポソーム、コアシェル粒子又はＰＬＧＡに基づく粒子を含む。
【０１３７】
別の態様では、該融合タンパク質の１又は両方のポリペプチドがイムノグロブリンドメインを含む。あるいは、タンパク質結合ドメイン−ＩＬ−１５融合タンパク質がイムノグロブリンドメインとさらに結合していてもよい。好ましいイムノグロブリンドメインは他のイムノグロブリンドメインと相互作用を許容して、上記に提供されるような複数鎖タンパク質を形成する領域を含む。例えば、該イムノグロブリン重鎖領域、例えばＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３は安定的に相互作用してＦｃ領域を創出することができる。Ｆｃドメインを含む好ましいイムノグロブリンドメインは、Ｆｃ受容体若しくは補体タンパク質結合活性を含む、及び／又はグリコシル化部位を有するエフェクター機能を有する領域をまた含む。一部の態様では、該融合タンパク質複合体のイムノグロブリンドメインは、Ｆｃ受容体若しくは補体結合活性若しくはグリコシル化又は二量化を低減又は増加させる変異を含み、それによりもたらされるタンパク質の生物学的活性に影響する。例えば、Ｆｃ受容体との結合を低減する変異を含むイムノグロブリンドメインは、Ｆｃ受容体を保有する細胞との低い結合活性を有する本発明の融合タンパク質複合体を生成するために使用され得るし、それは特異的な抗原を認識又は検出するために設計される試薬にとって有益であってもよい。
【０１３８】
核酸及びベクター
本発明により、本発明の融合タンパク質（例えばＴｘＭの成分）をコードする核酸配列、特にＤＮＡ配列がさらに提供される。好ましくは、該ＤＮＡ配列は染色体外複製、例えばファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ又はエピソームに適したベクターによって運搬される。特に、本明細書に記載の調製方法を容易にするため、及び該融合タンパク質の有意な量を入手するために望ましい融合タンパク質をコードするＤＮＡベクターを使用することができる。該ＤＮＡ配列は、適した発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質をコードする配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入されてもよい。該タンパク質をコードする配列を発現するために多様な宿主ベクター系を活用してもよい。これらはウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス等）に感染した哺乳類細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；微生物、例えば酵母ベクターを含む酵母、又はバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡで形質転換された細菌を含む。活用する宿主ベクター系によって、任意の数の適した転写及び翻訳要素を使用してもよい。上記のSambrook et al.及び上記のAusubel et al.を参照されたい。
【０１３９】
本発明には、可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法であって、本明細書に記載の第一及び第二のタンパク質をコードするＤＮＡベクターを宿主細胞に導入すること、宿主細胞を細胞又は培地において該融合タンパク質を発現させるのに十分な状況下の培地で培養すること、第一のタンパク質のＩＬ−１５ドメインと第二のタンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインの関連を許容して該可溶性融合タンパク質複合体を形成すること、宿主細胞又は培地から該融合タンパク質複合体を精製することを含む方法が含まれる。
【０１４０】
概して、本発明による好ましいＤＮＡベクターは、エフェクター分子をコードする配列と作動可能に結合した、生物学的に活性なポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列の導入のための第一のクローニング部位を５’から３’の方向に含む、ホスホジエステル結合によって結合したヌクレオチド配列を含む。
【０１４１】
該ＤＮＡベクターによってコードされる融合タンパク質成分はカセット形式で提供され得る。用語「カセット」は標準的組み換え方法によって各成分を容易に別の成分と置換できることを意味する。特に、カセット形式で構成されるＤＮＡベクターは、コードされた融合複合体が血清型を有するか、又は血清型を発展させる能力を有する病原体に対して使用されるべき時に、特に望ましい。
【０１４２】
融合タンパク質複合体をコードするベクターを製造するために、生物学的に活性なポリペプチドをコードする配列は、適したリガーゼの使用によってエフェクターペプチドをコードする配列と結合される。本発明のペプチドのためのＤＮＡコーディングを天然源、例えば適した細胞株からＤＮＡを単離することによって、又は既知の合成方法、例えばリン酸トリエステル方法によって入手することができる。例えば、Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (M. J. Gait, ed., 1984)を参照されたい。市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機を用いて合成オリゴヌクレオチドを調製してもまたよい。単離すると、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は他の当該分野に既知の方法によって増幅することができる。生物学的に活性なポリペプチド遺伝子を増幅するのに適したＰＣＲプライマーは、該ＰＣＲ産物に制限部位を加えてもよい。該ＰＣＲ産物は、好ましくは生物学的に活性なポリペプチド−エフェクター融合複合体の適した発現及び分泌に必要なエフェクターペプチド及びリーダー配列のためのスプライス部位を含む。該ＰＣＲ産物は、好ましくはリンカー配列をコードする配列、又はかかる配列のライゲーションのための制限酵素部位をまた含む。
【０１４３】
本明細書に記載の融合タンパク質は、好ましくは標準的な組み換えＤＮＡ技術によって産生される。例えば、生物学的に活性なポリペプチドをコードするＤＮＡ分子が単離されると、配列はエフェクターポリペプチドをコードする別のＤＮＡ分子にライゲーションされる。生物学的に活性なポリペプチドをコードする核酸配列は、直接エフェクターペプチドをコードするＤＮＡ配列に加わってもよく、また、より典型的には、本明細書に論じられるリンカー配列をコードするＤＮＡ配列は、生物学的に活性なポリペプチドをコードする配列とエフェクターペプチドをコードする配列の間に介入して、適したリガーゼを用いて加わってもよい。得られたハイブリッドＤＮＡ分子は適した宿主細胞内に発現され、該融合タンパク質複合体を産生し得る。該ＤＮＡ分子は５’から３’の方向へ互いにライゲーションされ、ライゲーション後にはコードされたポリペプチドの翻訳フレームに変化はない（すなわち、ＤＮＡ分子はインフレームで互いにライゲーションされている）。もたらされるＤＮＡ分子はインフレーム融合タンパク質をコードする。
【０１４４】
他のヌクレオチド配列が遺伝子構造内にまた含まれ得る。例えば、エフェクターペプチドと融合した生物学的に活性なポリペプチドをコードする配列の発現を制御するプロモーター配列、又は該融合タンパク質を細胞表面又は培養培地に向かわせるリーダー配列が、該構築物に含まれ得るか、該構築物が挿入される発現ベクター内に存在していてもよい。イムノグロブリン又はＣＭＶプロモーターは特に好ましい。
【０１４５】
多様体の生物学的に活性なポリペプチド、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα又はＦｃドメインコーディング配列を入手するために、当該分野の当業者は該ポリペプチドが特定のアミノ酸置換、添加、欠失、及び翻訳後の修飾によって、生物学的活性の喪失又は低減なしに修飾され得ることを認識するであろう。特に、同類アミノ酸置換、すなわち１つのアミノ酸を類似の大きさ、電荷、極性及び構造の別のアミノ酸との置換が、タンパク質機能を有意に変化させる見込みのないことはよく知られている。タンパク質の構成物質である２０の標準アミノ酸を以下の４つの基の同類アミノ酸におおまかに分類することができる：アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン及びバリンを含む非極性（疎水性）基；アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニン及びチロシンを含む極性基（非荷電、中性）基；アルギニン、ヒスチジン及びリジンを含む正電荷（塩基性）基；並びにアスパラギン酸及びグルタミン酸を含む負電荷（酸性）基。タンパク質において１つのアミノ酸を同じ基内の別のものへ置換することは、該タンパク質の生物学的活性に悪影響を及ぼす見込みがない。他の例では、アミノ酸配置への修飾は該タンパク質の生物学的活性を低減又は強化させるためになされてもよい。かかる変化は無作為に、又は標的化された残基の既知又は推定される構造的又は機能的特性に基づいた部位特異的変異を介して、導入され得る。多様体タンパク質の発現に続く、該修飾に起因する生物学的活性における変化を、結合又は機能的アッセイを用いて容易に評価することができる。
【０１４６】
ヌクレオチド配列間の相同はＤＮＡハイブリダイゼーション分析によって決定されてもよく、そこで二本鎖ＤＮＡハイブリッドの安定性は生じる塩基対合の範囲によって変化する。高温及び／又は低塩含有量の状態は、ハイブリッドの安定性を低減させ、多様化して選択された相同性の度合未満のものを有する配列のアニールを防ぐことがある。例えば、約５５％のＧ−Ｃ含有量を有する配列には、ハイブリダイゼーション及び４０〜５０Ｃ、６ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸酸ナトリウムバッファー）及び０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の洗浄状態が約６０〜７０％の相同性を示し、ハイブリダイゼーション、５０〜６５Ｃ、１ｘＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳの洗浄状態が約８２〜９７％の相同性を示し、並びにハイブリダイゼーション、５２Ｃ、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳの洗浄状態が約９９〜１００％の相同性を示す。ヌクレオチドとアミノ酸配列を比較する（及び相同性の度合を測定する）広範囲のコンピュータプログラムがまた利用可能であり、市販及びフリーのソフトウェアの両方の源を提供するリストがAusubel et al.(1999)に見出される。すでに利用可能な配列比較及び複数配列アラインメントアルゴリズムは、それぞれＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）(Altschul et al., 1997)及びＣｌｕｓｔａｌＷプログラムである。ＢＬＡＳＴはワールドワイドウェブでncbi.nlm.nih.govにて利用可能であり、ＣｌｕｓｔａｌＷのあるバージョンは2.ebi.ac.ukで利用可能である。
【０１４７】
該融合タンパク質の成分は、各々が意図された機能を実行することが可能である場合、ほとんどいかなる順序においても組織化され得る。例えば、一実施形態において、生物学的に活性なポリペプチドは該エフェクター分子のＣ又はＮ端末側終端に位置する。
【０１４８】
本発明の好ましいエフェクター分子は、これらのドメインが意図する機能に導電性のあるサイズを有するであろう。本発明のエフェクター分子を製造し、よく知られた化学架橋方法を含む多様な方法によって生物学的に活性なポリペプチドと融合させることができる。Means, G. E. and Feeney, R. E. (1974) in Chemical Modification of Proteins, Holden-Dayを参照されたい。S. S. Wong (1991) in Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Pressもまた参照されたい。しかしながら、組み換え操作を使用して該インフレーム融合タンパク質を製造することが概して好まれる。
【０１４９】
言及したように、本発明と合致した融合分子又は共役分子を複数の方法で組織化することができる。例示的な構造において、該生物学的に活性なポリペプチドのＣ末端は、該エフェクター分子のＮ末端と作動可能に結合されている。このリンケージは望ましい場合、組み換え方法によって獲得され得る。しかしながら、他の構造では、該生物学的に活性なポリペプチドのＮ末端が該エフェクター分子のＣ末端に連結している。
【０１５０】
あるいは、又はさらに、１又はそれ以上の追加のエフェクター分子を生物学的に活性なポリペプチド又は共役複合体に必要に応じて挿入することができる。
【０１５１】
ベクター及び発現
本発明の融合タンパク質複合体（例えばＴｘＭ）の成分を発現するために複数の戦略を用いることができる。例えば、本発明の融合タンパク質複合体の１又はそれ以上の成分をコードする構築物を、制限酵素を用いて適したベクターに組み込み、該構築物の挿入のために該ベクターに切れ目を入れ、続いてライゲーションすることができる。該遺伝子構築物を含むベクターを、それから該融合タンパク質の発現のために適した宿主に組み込む。概して上記のSambrook et al.を参照されたい。適したベクターの選択を、クローニングプロトコルに関する因子に基づいて経験的に行うことができる。例えば、該ベクターは用いられる宿主細胞と比較され、それに適したレプリコンを有するべきである。該ベクターは発現されるべき融合タンパク質複合体をコードするＤＮＡ配列と適合することが可能でなければならない。適した宿主細胞は真核細胞及び原核細胞を含み、好ましくは容易に形質転換することができ、培養培地で迅速な成長を示す細胞を含む。具体的には、好ましい宿主細胞は原核細胞、例えば大腸菌、枯草菌等、及び真核細胞、例えば動物細胞及び酵母菌株、例えばＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む。哺乳類の細胞、特にＪ５５８、ＮＳＯ、ＳＰ２−Ｏ又はＣＨＯが概して好まれる。他の適した宿主は、例えば昆虫細胞、例えばＳｆ９を含む。慣例的な培養状態が用いられる。上記のSambrookを参照されたい。適した形質転換又はトランスフェクション細胞株をそれから選択することができる。本発明の融合タンパク質複合体を発現する細胞を既知の手順によって決定することができる。例えばイムノグロブリンと結合した融合タンパク質複合体の発現を、結合したイムノグロブリンに特異的なＥＬＩＳＡによって、及び／又はイムノブロッティングによって決定することができる。ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインと結合した生物学的に活性なポリペプチドを含む融合タンパク質を検出する他の方法が実施例において開示される。
【０１５２】
上記に概して述べたように、望ましい融合タンパク質をコードする核酸を増殖させるための調製目的で、宿主細胞を使用することができる。それゆえに、宿主細胞は該融合タンパク質の産物が具体的に意図する原核細胞又は真核細胞を含むことができる。それゆえに、宿主細胞は、具体的には該融合をコードする核酸を増殖させることが可能な酵母、ハエ、虫、植物、カエル、哺乳類の細胞及び器官を含む。使用できる哺乳類の細胞株の限定されない例は、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ細胞（Urlaub and Chasm, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)）、２９３細胞（Graham et al., J Gen. Virol., 36:59 (1977)）又はＳＰ２若しくはＮＳＯのような骨髄腫細胞（Galfre and Milstein, Meth. Enzymol., Virol., 73(B):3 (1981)）を含む。
【０１５３】
望ましい融合タンパク質複合体をコードする核酸を増殖させることができる宿主細胞は、非哺乳類の真核細胞もまた包含し、昆虫（例えばＳｐ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、酵母（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ；Fleer, R., Current Opinion in Biotechnology, 3(5):486496 (1992)によって概して精査されたもの）、真菌及び植物細胞を含む。特定の原核細胞、例えば大腸菌及び桿菌がまた考慮される。
【０１５４】
細胞をトランスフェクションする標準的な技術によって望ましい融合タンパク質をコードする核酸を宿主細胞に導入することができる。用語「トランスフェクションする」又は「トランスフェクション」は核酸を宿主細胞に導入するためのすべての慣例的な技術を包含することが意図され、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウイルスのトランスダクション及び／又はインテグレーションを含む。宿主細胞をトランスフェクションするための適した方法を上記のSambrook et al.及び他の実験テキストに見出すことができる。
【０１５５】
多様なプロモーター（転写開始調節領域）を本発明により使用してもよい。適切なプロモーターの選択は、提示された発現細胞による。選ばれた宿主において機能性があるかぎり、異種の源からのプロモーターを使用してもよい。
【０１５６】
プロモーターの選択はペプチド又はタンパク質の産生の望ましい能率及びレベルによってまた変化する。大腸菌におけるタンパク質発現レベルを劇的に増加させるために、誘導プロモーター、例えばｔａｃがしばしば用いられる。タンパク質の過剰発現は宿主細胞にとって有害なこともある。結果として、宿主細胞の成長は制限され得る。誘導プロモーター系の使用によって、遺伝子発現の誘発に先立って宿主細胞を許容できる密度まで育成することができ、それによりさらに高い産生収率が容易になる。
【０１５７】
多様なシグナル配列を本発明により使用してもよい。生物学的に活性なポリペプチドコーディング配列と相同であるシグナル配列を使用してもよい。あるいは、発現細胞における効率的な分泌及びプロセシングのために選択又は設計されたシグナル配列をまた使用してもよい。例えば、適したシグナル配列／宿主細胞の組は枯草菌における分泌のための枯草菌ｓａｃＢシグナル配列、及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ分泌のためのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−交配因子又はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酸性ホスファターゼｐｈｏＩシグナル配列を含む。該シグナル配列は、シグナルペプチダーゼ開裂部位をコードする配列を通して、あるいは通常は１０未満のコドンからなる短いヌクレオチド架橋を通して、タンパク質コーディング配列に直接加えられてもよく、そこで該架橋は下流ＴＣＲ配列の正確なリーディングフレームを保証する。
【０１５８】
真核タンパク質発現系では転写及び翻訳を高める要素が特定されている。例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーターの１，０００ｂｐを異種プロモーターの両側に配置することは、植物細胞における転写レベルを１０〜４００倍高めることがある。該発現構築物は適した翻訳開始配列をまた含むべきである。適切な翻訳開始のためのコザックコンセンサス配列を含む発現構築物の修飾は、翻訳レベルを１０倍増加させることがある。
【０１５９】
選択性マーカーがしばしば用いられ、それは発現構築物の一部であり得るか、又はそれから分離していてもよく（例えば発現ベクターによって運搬され）、そのために該マーカーは目的の遺伝子とは異なる部位にインテグレートしてもよい。例としては、抗生物質への抵抗性を与えるマーカー（例えばｂｌａは大腸菌宿主細胞にアンピシリンに対する抵抗性を与え、ｎｐｔＩＩは多種多様な原核細胞及び真核細胞にカナマイシン抵抗性を与える）、又は宿主が最小限の培地で成長することを認めるマーカー（例えばＨＩＳ４はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ又はＨｉｓ  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅをヒスチジンの非存在下で成長させる）が含まれる。該選択性マーカーは自己の転写及び翻訳開始領域並びに調節領域を有し、それによってマーカーの独立した発現を可能にする。抗生物質の抵抗性がマーカーとして用いられる場合、選択のための抗生物質の濃度は該抗生物質によって多様化し、概して培地の抗生物質／ｍＬの１０から６００μｇまで及ぶであろう。
【０１６０】
該発現構築物は既知の組み換えＤＮＡ技術を用いて集められる（Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1999）。制限酵素の消化及びライゲーションは、ＤＮＡの２つのフラグメントを加えるために用いられる基礎的な段階である。ＤＮＡフラグメントの両末端はライゲーション前に修飾を必要とすることがあり、このことはオーバーハングにおいて果たすこと、ヌクレアーゼ（例えばＥｘｏＩＩＩ）、部位指向性変異を有する該フラグメントの末端部分を欠失させること、又は新しい塩基対をＰＣＲによって追加することによって達成されてもよい。選択されたフラグメントの加入を容易にするためにポリリンカー及びアダプターを用いてもよい。該発現構築物は、典型的には大腸菌の制限、ライゲーション及び形質転換の期間を用いる段階で集められる。発現構築物の構築に適した多数のクローニングベクターが当該分野に知られており（λＺＡＰ及びｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＳＫ−１、Stratagene, La Jolla, CA, ｐＥＴ、Novagen Inc., Madison, WI、Ausubel et al., 1999から引用）、特定の選択が本発明に重大なわけではない。クローニングベクターの選択は、発現構築物の宿主細胞への導入のために選択される遺伝子送達システムによって影響されるであろう。各段階の終わりに、結果として生じる構築物を制限、ＤＮＡ配列、ハイブリダイゼーション及びＰＣＲ分析を用いて分析してもよい。
【０１６１】
発現構築物は、線型ベクター又は環状ベクターのどちらかのクローニングベクター構築物として宿主細胞に形質転換されてもよく、該クローニングベクターから除去され、そのままで使用され若しくは送達ベクターに導入されてもよい。該送達ベクターは選択された宿主細胞型において発現構築物の導入及び維持を容易にする。該発現構築物は任意の数の既知の遺伝子送達システム（例えば天然の能力、化学的に介在された形質転換、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、バイオリスティック形質転換、トランスフェクション又は接合）によって宿主細胞に導入される（Ausubel et al., 1999; Sambrook et al., 1989）。選択される遺伝子送達システムは、使用される宿主細胞及びベクターシステムによる。
【０１６２】
例えば、該発現構築物をプロトプラスト形質転換又はエレクトロポレーションによってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞に導入することができる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのエレクトロポレーションは容易に達成され、スフェロプラスト形質転換と比較可能な形質転換効率を生じる。
【０１６３】
本発明により、目的の融合タンパク質を単離するための産生プロセスがさらに提供される。該プロセスでは、調節配列と作動可能に結合された目的のタンパク質をコードする核酸を導入された宿主細胞（例えば酵母、真菌、昆虫、細菌又は動物細胞）を、産生スケールで培養培地にて成長させ、目的の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を刺激する。続いて、採取された宿主細胞から、又は培養培地から目的の融合タンパク質を単離する。目的のタンパク質を培地から又は採取された細胞から単離するために、標準的なタンパク質精製技術を使用できる。特に、ローラーボトル、スピナーフラスコ、組織培養プレート、生物反応器又は発酵槽を含む多様な実施からラージスケール（すなわち少なくともミリグラム量）での望ましい融合タンパク質を発現させて精製するために、該精製技術を使用することができる。
【０１６４】
発現した融合タンパク質複合体を既知の技術により単離して精製することができる。典型的には、培養培地を遠心分離又は濾過し、それから親和性又は免疫親和性クロマトグラフィー、例えばプロテインＡ若しくはプロテインＧ親和性クロマトグラフィー、又は発現された融合複合体と結合するモノクローナル抗体の使用を含む免疫親和性プロトコルによって上清を精製する。既知の技術の適切な組み合わせによって本発明の融合複合体を分離して精製することができる。これらの方法は、例えば溶解度を活用する方法、例えば塩沈殿及び溶媒沈殿、分子量における差異を活用する方法、例えば透析、限外濾過、ゲル濾過及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、電荷における差異を活用する方法、例えばイオン交換カラムクロマトグラフィー、特異的親和性を活用する方法、例えば親和性クロマトグラフィー、疎水性における差異を活用する方法、例えば逆相高パフォーマンス液体クロマトグラフィー、及び等電点における差異を活用する方法、例えば等電点電気泳動、金属親和性カラム、例えばＮｉ−ＮＴＡを含む。これらの方法に関する開示には上記のSambrook et al.及びAusubel et al.を概して参照されたい。
【０１６５】
本発明の融合タンパク質は実質的に純粋であることが好ましい。すなわち、該融合タンパク質は、それに天然に付随する細胞置換基から単離されているため、該融合タンパク質は好ましくは少なくとも８０％又は９０％から９５％の均質性（ｗ／ｗ）で存在する。少なくとも９８％から９９％の均質性（ｗ／ｗ）を有する融合タンパク質が、多くの医薬、臨床又は研究の適用にはもっとも好ましい。実質的に精製されると、該融合タンパク質は治療適用にとっての混入物質を実質的に有するべきではない。部分的に精製又は実質的に精製すると、該可溶性融合タンパク質を治療的に使用でき、本明細書に開示されるインビボアッセイ又はインビトロアッセイにおいて実行できる。実質的な精製は多様な標準技術、例えばクロマトグラフィー及びゲル電気泳動によって決定される。
【０１６６】
本発明の融合タンパク質複合体は、がんである、又は感染した細胞である、又は１若しくはそれ以上の疾患に感染しているかもしれない多様な細胞を有するインビボ又はインビトロでの使用に適している。
【０１６７】
ヒトインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）は、抗原提示細胞に発現したヒトＩＬ−１５受容体α鎖（ｈｕＩＬ−１５Ｒα）によって、免疫エフェクター細胞に対してトランスで存在する。ＩＬ−１５Ｒαは、細胞外スシドメイン（ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ）を通して、初めは高い親和性（３８ｐＭ）でｈｕＩＬ−１５と結合する。本明細書に記載のように、ｈｕＩＬ−１５及びｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕドメインを、マルチドメイン融合複合体を構築するための骨格として使用することができる。
【０１６８】
ＩｇＧドメイン、特にＦｃフラグメントは、認可されたバイオ医薬品を含む複数の治療分子のための二量体骨格として成功して使用されている。例えば、エタネルセプトはヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと結合した可溶性ヒトｐ７５腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）受容体（ｓＴＮＦＲ）の二量体である。この二量化によってエタネルセプトはＴＮＦ−α活性を阻害するのに単量体のｓＴＮＦＲよりも１，０００倍まで強力であることができ、単量体形態より５倍長い血清半減期を有する融合を提供する。結果として、エタネルセプトはインビボでのＴＮＦ−αの前炎症性活性の中和に効果的であり、複数の異なる自己免疫性兆候に対する患者の結果を好転させる。
【０１６９】
その二量化活性に加えて、該Ｆｃフラグメントは補体活性化並びにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、食細胞又は樹枝状細胞に表示されたＦｃγ受容体との相互作用を通じて、細胞傷害性エフェクター機能をまた提供する。抗がん治療抗体及び他の抗体ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質と関連して、これらの活性は動物腫瘍モデルにおいて、及びがん患者において観察される有効性におそらく重要な役割を演じる。しかしながら、この細胞傷害性エフェクター反応は複数の治療適用には十分ではないこともある。それゆえに、Ｆｃドメインのエフェクター活性を改良して拡大し、標的化された治療分子を介して疾患部位にＴ細胞活性を含む細胞溶解性免疫反応を採用する他の方法を発展させることに少なからぬ関心が払われている。ＩｇＧドメインは二重特異性抗体を形成し、伝統的なハイブリドーマ融合技術によって生成される産物の質と量を改良するための骨格として使用されてきた。これらの方法は他の骨格の欠点を回避するが、哺乳類の細胞において臨床開発及び使用を支えるのに十分なレベルの二重特異性抗体を産生することは難しかった。
【０１７０】
ヒト由来の免疫刺激性多量体骨格を発展させようと努力して、ヒトＩＬ−１５（ｈｕＩＬ−１５）及びＩＬ−１５受容体ドメインを使用した。ｈｕＩＬ−１５は高い結合親和性（平衡解離定数（ＫＤ）〜１０−１１Ｍ）を有するｈｕＩＬ−１５受容体α鎖（ｈｕＩＬ−１５Ｒα）と関連したサイトカインの小さな４のαヘリックスバンドル群の構成員である。結果として生じる複合体はそのときＴ細胞及びＮＫ細胞の表面上に表示されるヒトＩＬ−２／１５受容体β／コモンγ鎖（ｈｕＩＬ−１５ＲβγＣ）複合体に対してトランスに存在する。このサイトカイン／受容体相互作用は、ウイルスに感染した細胞又は悪性細胞を根絶させるのに重大な役割を演じるエフェクターＴ細胞及びＮＫ細胞の拡大及び活性化をもたらす。通常、ｈｕＩＬ−１５及びｈｕＩＬ−１５Ｒαは樹枝状細胞内で共産生され、複合体を細胞内で形成し、該複合体は続けて細胞表面にヘテロ二量体分子として分泌され表示される。それゆえに、ｈｕＩＬ−１５及びｈｕＩＬ−１５Ｒα相互作用の特性は、これらの鎖間結合ドメインがヒト由来の免疫刺激性骨格として機能し、標的特異的結合が可能な可溶性二量体分子を製造することを示唆する。
【０１７１】
下記に詳細に記載されているように、ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭを創出するためにｈｕＩＬ−１５：ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕに基づく骨格を使用した。該二量体融合タンパク質複合体はｈｕＩＬ−１５ドメインと結合ドメインの免疫刺激性及び標的特異的生物学的活性を保有しており、ｈｕＩＬ−１５及びｈｕＩＬ−１５Ｒαの添加が該融合タンパク質の空間的配置を有意に変化させなかったことと、サイトカイン活性に影響を与えることなく適正な度合の立体配座フレキシビリティを提供したことを示した。このように、この骨格を、多価融合複合体、例えばＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭを形成し、分子の全体的な結合親和性を増加させるのに使用することができた。該可溶性融合タンパク質を組み換えＣＨＯ細胞培養において比較的高いレベルで産生し（広範囲の細胞株スクリーニング又は最適化を伴わない細胞培養上清内でリットル当たりｍｇｓ）、該細胞培養上清から容易に精製することができた。
【０１７２】
本発明の実施には、他に示されていない限り、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の慣例的な技術が用られ、これらは当業者の十分な範囲内である。かかる技術は参考文献、例えば、”Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition (Sambrook, 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (Gait, 1984); “Animal Cell Culture” (Freshney, 1987); “Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology” (Weir, 1996); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 1987); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis, 1994); “Current Protocols in Immunology” (Coligan, 1991)に十分に説明されている。これらの技術は本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生に適用可能であり、及びそのようなものが本発明を製造及び実施するのに考慮されてもよい。特に、特定の実施形態のために有用な技術は以下のセクションにて論じられるであろう。
【０１７３】
リンパ腫
リンパ腫はＢリンパ球又はＴリンパ球が正常細胞より速く分裂する、又は意図されるより長く生きるときに発生する血液のがんの一種である。例えば、Ｂ細胞リンパ腫はホジキンリンパ腫及び多くの非ホジキンリンパ腫の両方を含む。Ｂ細胞リンパ腫はＣＤ２０を発現する。
【０１７４】
リンパ腫はリンパ節、脾臓、骨髄、血液及び他の器官で発展することがある。これらの悪性細胞はリンパ節をしばしば起源とし、節の増大、すなわちリンパ球様細胞の充実性腫瘍として現れる。リンパ腫はリンパ節生検、すなわちリンパ節の部分的又は全体切除によって決定的に診断され、顕微鏡で検査される。この検査はリンパ腫を示し得る組織病理学的特徴を明らかにすることがある。治療は化学療法、放射線療法及び／又は骨髄移植を含んでいてもよい。
【０１７５】
以下の実施例は本発明のアッセイ、スクリーニング及び治療方法を製造及び使用する方法の完全な開示及び記述を当業者に提供するために示され、発明者が本発明とみなすものの範囲を制限することを意図するものではない。
【０１７６】
実施例
実施例１：抗ＰＤ−Ｌ１結合ドメイン（ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ）を含むＩＬ−１５に基づく融合タンパク質複合体の生成及び特性化
がん細胞は免疫チェックポイント分子及びリガンド、例えばＰＤ−Ｌ１によって調節される多様な免疫阻害経路を刺激することが可能である。これらのチェックポイント分子を阻害する抗体は抗腫瘍免疫を高めることが示されている。ＩＬ−１５はＮＫ細胞及びＣＤ８＋細胞を活性化させ、拡大させる一方で、それらの細胞溶解性活性を増加させる。Ｉｇ分子のＦｃ領域はＮＫ細胞及びマクロファージのＦｃγ受容体と相互作用することができ、標的疾患細胞に対して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を介在する。下記に詳細に記載されているように、抗ＰＤ−Ｌ１結合ドメインと融合したＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ骨格を含むタンパク質複合体が生成される。これらの複合体は抗ＰＤ−Ｌ１結合ドメインを介して腫瘍細胞を認識し、ＩＬ−１５活性を介してＮＫ細胞及びＴ細胞反応を誘発させ、Ｆｃ結合ドメインを介してＡＤＣＣ及びＣＤＣを刺激する。
【０１７７】
具体的には、一本鎖抗ＰＤ−Ｌ１抗体とｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ鎖を結合する構築物を製造した。該抗ＰＤ−Ｌ１一本鎖抗体（抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ）配列は、フレキシブルリンカー配列を介して結合した重鎖及び軽鎖Ｖ抗体ドメイン抗体のコーディング領域を含む。該一本鎖抗体ドメインはＶＨ−リンカー−ＶＬ又はＶＬ―リンカー―ＶＨフォーマットのどちらかで配置され得る。一部の場合では、該抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂがＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び／又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ鎖のＣ末端と結合する。他の場合では、該抗ＰＤ−Ｌ１はＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び／又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ鎖のＮ末端と結合する。マウス又はヒトＰＤ−Ｌ１分子のどちらかに特異的な抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂｓをこれらの構築物中で使用した。
【０１７８】
１）ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ鎖のＮ末端と結合した抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂを含む構築物の核酸配列及びタンパク質配列が以下に示される。抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ構築物の核酸配列（シグナルペプチド配列及び終止コドンを含む）は以下の通りである（配列番号：１）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000003
（抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000004
（リンカー）
2019533449.tif 000005
（ＶＨ）
2019533449.tif 000006
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019533449.tif 000007
【０１７９】
抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質のアミノ酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号：２）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000008
（抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000009
（リンカー）
2019533449.tif 000010
（ＶＨ）
2019533449.tif 000011
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019533449.tif 000012
【０１８０】
一部の場合では、該リーダーペプチドが成熟ポリペプチドから開裂される。
【０１８１】
抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：３）：
（リーダー配列）
2019533449.tif 000013
（抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000014
（リンカー）
2019533449.tif 000015
（ＶＨ）
2019533449.tif 000016
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000017
2019533449.tif 000018
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000019
【０１８２】
抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：４）：
（リーダー配列）
2019533449.tif 000020
（抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000021
（リンカー）
2019533449.tif 000022
（ＶＨ）
2019533449.tif 000023
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000024
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000025
【０１８３】
一部の場合では、該リーダーペプチドが成熟ポリペプチドから開裂される。
【０１８４】
２）ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ鎖のＮ末端と結合した第二の抗ヒトＰＤ−Ｌ１（アベルマブ）を含む構築物の核酸配列及びタンパク質配列が以下に示される。抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ構築物の核酸配列（シグナルペプチド配列及び終止コドンを含む）は以下の通りである（配列番号：５）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000026
（抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000027
（リンカー）
2019533449.tif 000028
（ＶＨ）
2019533449.tif 000029
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019533449.tif 000030
【０１８５】
抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質のアミノ酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号：６）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000031
（抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000032
（リンカー）
2019533449.tif 000033
（ＶＨ）
2019533449.tif 000034
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019533449.tif 000035
【０１８６】
一部の場合では、該リーダーペプチドが成熟ポリペプチドから開裂される。
【０１８７】
抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：７）：
（リーダー配列）
2019533449.tif 000036
（抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000037
（リンカー）
2019533449.tif 000038
（ＶＨ）
2019533449.tif 000039
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000040
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000041
【０１８８】
抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：８）：
（リーダー配列）
2019533449.tif 000042
（抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000043
（リンカー）
2019533449.tif 000044
（ＶＨ）
2019533449.tif 000045
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000046
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000047
【０１８９】
一部の場合では、該リーダーペプチドが成熟ポリペプチドから開裂される。
【０１９０】
３）ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｍｕＩｇＧ２Ａ  Ｆｃ鎖のＮ末端と結合した抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂを含む構築物の核酸配列及びタンパク質配列が以下に示される。抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ構築物の核酸配列（シグナルペプチド配列及び終止コドンを含む）は以下の通りである（配列番号：９）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000048
（抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000049
（リンカー）
2019533449.tif 000050
（ＶＨ）
2019533449.tif 000051
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019533449.tif 000052
【０１９１】
抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質のアミノ酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号：１０）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000053
（抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000054
（リンカー）
2019533449.tif 000055
（ＶＨ）
2019533449.tif 000056
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019533449.tif 000057
【０１９２】
一部の場合では、該リーダーペプチドが成熟ポリペプチドから開裂される。
【０１９３】
抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｍｕＩｇＧ２Ａ  Ｆｃ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：１１）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000058
（抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000059
（リンカー）
2019533449.tif 000060
（ＶＨ）
2019533449.tif 000061
2019533449.tif 000062
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000063
（マウスＩｇＧ２ａ  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン）
2019533449.tif 000064
【０１９４】
抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｍｕＩｇＧ２Ａ  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号：１２）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000065
（抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000066
（リンカー）
2019533449.tif 000067
（ＶＨ）
2019533449.tif 000068
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000069
（マウスＩｇＧ２ａ  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン）
2019533449.tif 000070
【０１９５】
一部の場合では、該リーダーペプチドが成熟ポリペプチドから開裂される。
【０１９６】
抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ配列を、以前（米国特許第８，５０７，２２２号、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のように発現ベクターにクローニングし、該発現ベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。ＣＨＯ細胞内での２つの構築物の共発現により、可溶性抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体の形成及び分泌が許容され、プロテインＡクロマトグラフィーを用いてＣＨＯ細胞培養上清からそれを精製した。
【０１９７】
精製された抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が図３に示される。可溶性抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｍｕＩｇＧ２Ａ及び抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄタンパク質に対応するバンドが、それぞれ〜６０ｋＤａ及び〜４０ｋＤａで観察された。
【０１９８】
実施例２：ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭの活性のインビトロ特性化
ＥＬＩＳＡに基づく技術によりＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の形成が裏付けられた。図４Ａでは、トランスフェクションされたＣＨＯ細胞に由来する細胞上清中の抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質複合体を、捕捉抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch）及び検出抗体、ビオチン化抗ヒトＩＬ−１５抗体（BAM 247, R&D Systems）を有するｈｕＩｇＧ１／ｈｕＩＬ−１５に特異的なＥＬＩＳＡを用いて検出した。
【０１９９】
マウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭでは、捕捉抗体、ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅロバ抗ネズミＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch）又はヒト／類人猿ＩＬ１５抗体（MAB647, R&D Systems）、及び検出抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼ−ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅロバ抗ネズミＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch）又はビオチン化抗ヒトＩＬ−１５抗体（BAM 247, R&D Systems）をそれぞれ有するｍＩｇＧ２ａ特異的又はｈｕＩＬ１５特異的ＥＬＩＳＡを用いて、該融合タンパク質複合体を検出した（図４Ｃ）。陽性対照と比較して、精製されたマウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭへの抗体反応性により該複合体の構造が立証された。
【０２００】
腫瘍細胞においてこれらの融合タンパク質のＰＤ−Ｌ１と結合する能力をまた調査した。ＭＢ２３１腫瘍細胞を保有する受容体を用いるフローサイトメトリーによって、ヒト特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭの結合を評価した。これらの調査において、１×１０５の細胞をＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体で染色した。図５Ａに示したように、ＡＰＣ共役マウス抗ヒトＦｃ  Ａｂ（Biolegend）を用いて検出すると、フローサイトメトリー分析によりＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体のＭＢ２３１細胞との結合が明らかになった。図５Ｂでは、ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体を用いてこの結合の特異性を試験し、市販のＡＰＣ共役抗ヒトＰＤ−Ｌ１  Ａｂ（Biolegend）を有するＭＢ２３１細胞の染色を阻害した。同様に、フローサイトメトリー分析によりアベルマブに基づくＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体のＭＢ２３１腫瘍細胞との結合が明らかになった（図５Ｃ）。
【０２０１】
マウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の結合を評価するために、ＰＤ−Ｌ１陽性５Ｔ３３Ｐ骨髄腫及びＭＢ４９ｌｕｃ膀胱腫瘍細胞（５×１０５細胞／試験）をＰＥ又はＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔで標識化した抗マウスＰＤ−Ｌ１  Ａｂ（１００μＬ中２μｇ／試験）で初めに染色した（図６Ａ及び図６Ｂ）。精製されたマウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の追加によってこの結合の特異性を試験し、ＰＤ−Ｌ１リガンドと結合している抗体を阻害した。精製された抗ｍＰＤ−Ｌ１  Ａｂ（Ｓ１−ＰＤ−Ｌ１）を陽性対照として使用した。興味深いことに、該ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体が腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１染色を、同量の抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂよりもよく阻害することを見出した。このことをＡ２０  Ｂ細胞リンパ腫細胞を用いる阻害調査においてさらに評価した。滴定分析により、ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭが抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂの少なくとも５倍、腫瘍細胞表面に発現したＰＤ−Ｌ１との相互作用を阻害するのに効果的であったことが示された（図７Ａ及び図７Ｂ）。
【０２０２】
ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体のＩＬ−１５免疫刺激性活性を評価するために、ＩＬ−１５依存性３２Ｄβ細胞（マウス造血細胞株）の増殖を評価した。増加したレベルのＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭを３２Ｄβ細胞（１０４細胞／ウェル）に添加し、２日後にＷＳＴ−１増殖試薬を用いて細胞増殖を決定した。図８に示すように、３２Ｄβ細胞増殖における用量に依存的な増加はＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭによって介在され、該複合体の免疫刺激性活性を立証した。
【０２０３】
異なった形態のＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の特性及び活性を評価するためにさらなる調査を行った。ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質を含む複合体は４つの抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ結合ドメイン（すなわち、四頭（４Ｈ））を有することが期待される一方、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質を含む複合体は２つの抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ結合ドメイン（すなわち、二頭（２Ｈ））を有することが期待される（図９Ａ）。これらの複合体は、２Ｈ  ＴｘＭと比較して４Ｈ  ＴｘＭの標的細胞を結合する高い結合活性に基づく、異なる活性を有することが期待される。ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄとのタンパク質融合は、ＩＬ−１５の生物学的活性を低減することがまた示されている。それゆえに、４Ｈ  ＴｘＭフォーマットは２Ｈ  ＴｘＭと比較して低いＩＬ−１５活性を有することが期待される。高い（抗体様）標的化及び低い免疫刺激性活性が好まれる場合（すなわち４Ｈ  ＴｘＭフォーマット）、又は低い標的化及び高い免疫刺激性活性（免疫サイトカイン）が好まれる場合には、これらの差異により利点が提供されることが期待される。
【０２０４】
これらのフォーマットを評価するために、４Ｈマウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（２Ｃ２）及び２Ｈマウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（ＰＤＮ３）を、抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ−／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ発現ベクター又はＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ−／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ発現ベクターをそれぞれ用いてＣＨＯ細胞をトランスフェクションすることによって生成した。それからトランスフェクションされたＣＨＯ細胞上清からプロテインＡクロマトグラフィーによって該ＴｘＭ複合体を精製し、精製されたタンパク質を低減したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した（図９Ｂ）。可溶性抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｍｕＩｇＧ２Ａ、抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びＩＬ−１５Ｎ７２Ｄタンパク質と対応するバンドを、〜６０ｋＤａ、〜４０ｋＤａ及び〜１６ｋＤａでそれぞれ観察した。さらに、精製した４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（２Ｃ２）及び２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（ＰＤＮ３）複合体は、分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した際に、単独のタンパク質ピークとして移動した（図９Ｃ及び図９Ｄ）。これらの結果により、２つの異なるＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体を産生でき、期待される構造特性を有する可溶性タンパク質として精製できることが示される。
【０２０５】
上記に記載の調査と同様に、これらの融合タンパク質複合体の、免疫細胞のＩＬ−２Ｒβ／γ及び腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１と結合する能力を調査した。ＩＬ−２Ｒβ／γ陽性３２Ｄβ細胞を４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（２Ｃ２）、２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（ＰＤＮ３）又は対照のＡＬＴ−８０３複合体でインキュベートした。洗浄段階に続いて、抗ヒトＩＬ−１５  Ａｂ−ＰＥ（又はイソタイプ対照Ａｂ）を添加し、フローサイトメトリーによって結合したＴｘＭ／ＡＬＴ−８０３複合体を検出した。図１０Ａに示されるように、４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（２Ｃ２）、２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（ＰＤＮ３）及びＡＬＴ−８０３タンパク質は、対照と比較して３２Ｄβ細胞の能力がある。ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ１陽性５Ｔ３３Ｐ骨髄腫細胞との結合を評価するために、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１（ＢＶ４２１）で標識化した抗マウスＰＤ−Ｌ１  Ａｂ（１０Ｆ．９Ｇ２）で初めに染色した。精製した４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（２Ｃ２）及び２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（ＰＤＮ３）複合体の追加によってこの結合の特異性を試験し、ＰＤ−Ｌ１リガンドと結合しているＢＶ４２１抗体を阻害した（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。精製した抗ｍＰＤ−Ｌ１  Ａｂ（ＮＪＩ６）を陽性対照として使用した。高い結合活性と一致して、１μｇの４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭは６μｇの２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭと同じくらい、抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ染色を阻害するのに効果的であった。これらの結果により、４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１及び２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体がＩＬ−２Ｒβ／γ及びＰＤ−Ｌ１標的結合能力を保有することが裏付けられた。
【０２０６】
上記に記載のように、マウス特異的４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１及び２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体のＩＬ−１５免疫刺激性活性を、ＩＬ−１５依存性３２Ｄβ細胞の増殖に基づいて決定した。図１１Ａ及び図１１Ｂに示されるように、３２Ｄβ細胞増殖における用量依存性増加は４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１及び２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体のどちらかによって介在されており、これらのＴｘＭフォーマットの免疫刺激性活性を立証する。２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体（ＰＤＮ−３）は、ＡＬＴ−８０３と比較するとＩＬ−１５生物活性においてわずかな減少を示す一方、４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体（２Ｃ２）はＩＬ−１５生物活性において約３０倍の減少を示す。このことは以前の結合ドメイン−ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質の低いＩＬ−１５活性と一致する。
【０２０７】
４Ｈヒト特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ及び２Ｈヒト特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体で同様の調査を行った。抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ−／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ発現ベクター又はＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ発現ベクターでＣＨＯ細胞をそれぞれトランスフェクションすることによりこれらのタンパク質を生成し、続いてプロテインＡクロマトグラフィーを介して細胞培養上清から精製した。低減したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、精製した４Ｈヒト特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ及び２Ｈヒト特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ調製内に期待されたタンパク質バンドが裏付けられた（図１２Ａ）。同様に、分析的ＳＥＣにより、精製した４Ｈヒト特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ及び２Ｈヒト特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体が単独のタンパク質ピークとして移動することが示された（図１２Ｂ及び図１２Ｃ）。
【０２０８】
これらの融合タンパク質複合体の、腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１と結合する能力を調査した。ＰＤ−Ｌ１陽性ＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞を、１０ｎＭの精製したヒト特異的４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ、２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ又は対照２Ｈ抗ＣＤ２０  ｓｃＡｂ（２Ｂ８）ＴｘＭ複合体の存在下、又は非存在下で、ＡＰＣで標識化した抗マウスＰＤ−Ｌ１Ａｂで染色した（図１３）。その結果により、ヒト特異的４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１及び２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体が、ヒト腫瘍細胞と結合する抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂを阻害する能力がある一方、対照のＴｘＭ複合体にはその能力がないことが示されている。以前の結果と一致して、４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体は２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体よりよい結合活性を示した。これらの結果により、ヒト特異的４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１及び２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体が、ヒト腫瘍細胞に関してＰＤ−Ｌ１標的結合活性を保有することが裏付けられる。
【０２０９】
上記に記載のように、ヒト特異的４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１及び２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体のＩＬ−１５免疫刺激性活性を、ＩＬ−１５依存性３２Ｄβ細胞の増殖に基づいて決定した。図１４Ａ及び図１４Ｂに示されるように、３２Ｄβ細胞増殖における用量依存性増加が、４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１と２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体のどちらかによって介在され、これらのＴｘＭフォーマットの免疫刺激性活性を立証した。２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体がＡＬＴ−８０３と比較してＩＬ−１５生物活性においてわずかな減少を示す一方、４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体はＡＬＴ−８０３と比較してＩＬ−１５生物活性において約５倍の減少を示す。このことは以前の結合ドメイン−ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質の低いＩＬ−１５活性と一致する。
【０２１０】
実施例３：インビトロ及びインビボでのＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭの免疫刺激性及び抗腫瘍活性
ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭがインビボで免疫反応を刺激する能力をマウス内で評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２００μｌのＰＢＳ、ＡＬＴ−８０３（０．４ｍｇ／ｋｇ、対照）、４Ｈマウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（２００μｇ、２Ｃ２（Ｔ４Ｍ−ｍＰＤ−Ｌ１））又は２Ｈマウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（２００μｇ、ＰＤＮ３（Ｔ２Ｍ−ｍＰＤ−Ｌ１））を皮下注射した。処置から３日後、脾臓及びリンパ節を採取した。抗ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ及びＣＤ１９Ａｂｓを用いる免疫細胞サブセットの染色に続くフローサイトメトリーのために脾細胞及びリンパ球を調製した。図１５Ａに示されるように、ＡＬＴ−８０３、２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ及び４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭでの処置はこれらのタンパク質の免疫刺激性活性と一致して脾臓重量の増加を誘発した。特に、２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ処置は、これらの複合体で観察されるＩＬ−１５活性における差異と一致して、４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭと比較して脾臓重量における重大な増加を誘発した。２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ及び４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭでの処置は、ＰＢＳ対照群と比較して、マウスの脾臓及びリンパ節におけるＣＤ８  Ｔ細胞及びＮＫ細胞のパーセンテージの増加をまたもたらした（図１５Ｂ及び図１５Ｃ）。これらの免疫反応はこれらのＴｘＭ複合体のＩＬ−１５生物活性と一致している。
【０２１１】
さらに、ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭの、腫瘍細胞に対して細胞傷害性を刺激する能力をインビボで評価した。ＰＤ−Ｌ１陽性細胞を製造者の指示に従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（Invitrogen）で標識化し、免疫エフェクター細胞（すなわち脾細胞）と、Ｒ１０培地（１０％のウシ胎児血清を有するＲＰＭＩ−１６４０）において１０：１のエフェクター：５Ｔ３３Ｐ骨髄腫標的の比率で、３７℃かつ５％のＣＯ２内で培養した。Ｐ−ｍｅｌマウス脾細胞の刺激によって３日間、抗ＣＤ３Ａｂ（２Ｃ１１：４μｇ／ｍｌ）を用いてエフェクター細胞を調製した。腫瘍細胞及びエフェクター細胞を４日間、マウス特異的ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭでインキュベートし、それからフローサイトメトリーによって分析し、標的細胞の生存を決定した。ＰＢＳは陰性対照として機能し、ＡＬＴ−８０３（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ）、抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ及びＡＬＴ−８０３＋抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂは陽性対照として機能した。図１６に示されるように、５Ｔ３３Ｐ腫瘍細胞の有意な殺傷を、ＰＢＳ処置と比較して２．１μｇのＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭを含む群において見出した。
【０２１２】
同様にインビトロでの抗腫瘍活性を、ヒト特異的２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ及び４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体を用いて評価した。２人の異なるドナーからのヒトＮＫ細胞を、Stemcell TechnologiesのＮＫ細胞単離キットを用いて血液バフィーコートから精製し、エフェクター細胞として使用した。ＰＤ−Ｌ１陽性ヒト膵臓腫瘍細胞（ＳＷ１９９０）をＣｅｌｌｔｒａｃｅ−ｖｉｏｌｅｔで標識化し、標的細胞として使用した。ヒトＮＫ細胞及びＳＷ１９９０腫瘍細胞を５：１のＥ：Ｔ比率で、培地単独又は５０ｎＭの抗ヒトＰＤ−Ｌ１  Ａｂ（対照）、ヒト特異的２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体又は４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体を含む培地で混合した。４０時間後、標的細胞の死滅のパーセントを、ｖｉｏｌｅｔで標識化した標的細胞のヨウ化プロピジウム染色に基づくフローサイトメトリーによって評価した。図１７に示されるように、ヒト特異的２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ又は４Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体のどちらかでインキュベートしたヒトＮＫ細胞は、未処置のＮＫ細胞又は抗ヒトＰＤ−Ｌ１  Ａｂ（すなわち伝統的なＡＤＣＣ）で処置されたＮＫ細胞よりも、ＰＤ−Ｌ１陽性ヒト腫瘍細胞に対して重大な細胞傷害性を介在することができた。これらの結果は抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂｓと比較してＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体における免疫細胞介在性の標的化抗腫瘍活性の有意な改良を表している。
【０２１３】
同所性５Ｔ３３Ｐ骨髄腫モデルを使用して、腫瘍を保有する動物におけるＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭの有効性を評価した。メスのＣ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄマウス（４匹のマウス／群）に５Ｔ３３Ｐ骨髄腫細胞（１×１０７／マウス）を０日目に静脈内注射した。低用量のＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（０．１１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇのＡＬＴ−８０３に対するモル当量用量）又は高用量のＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（５２．５μｇ／用量、２５μｇ／用量の抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂに対するモル当量用量）を、それから７日目と１４日目に皮下投与した。ＡＬＴ−８０３（０．１５ｍｇ／ｋｇ）及びＡＬＴ−８０３（０．０５ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ（２５μｇ／用量）は陽性対照として機能し、ＰＢＳは陰性対照として機能した。生存（又は後肢麻痺による病的状態）を研究終点として観測した。明らかに、高用量のＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（５２．５μｇ／マウス）処置はＰＢＳ処置と比較して腫瘍を保有するマウスの生存を長引かせることが見出された（図１８）。この効果は比較可能なＡＬＴ−８０３＋抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂの組み合わせの治療で観察されたものと等しかった。腫瘍を保有する動物のＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ処置に続く明らかな毒性は観察されなかった。
【０２１４】
さらに、同所性ＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍を保有するマウスにおけるＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ複合体の抗腫瘍活性を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄマウス（６マウス／群）の膀胱に、ＭＢ４９ｌｕｃ膀胱腫瘍細胞（３×１０４／マウス）を０日目に膀胱内注入した。腫瘍を保有するマウスをマウス特異的２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ（２．８ｍｇ／ｋｇ）で７日目、１１日目、１４日目及び１８日目に皮下で処置した。ＡＬＴ−８０３処置（０．２ｍｇ／ｋｇ、ｓｕｂＱ）及びＡＬＴ−８０３（０．２ｍｇ／ｋｇ、ｓｕｂＱ）＋抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ（５０μｇ／用量、ｓｕｂＱ）が陽性対照として機能し、ＰＢＳが陰性対照として機能した。生存（又は病的状態）を研究終点として観測した。図１９に示されるように、２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ処置がＰＢＳ処置と比較してＭＢ４９ｌｕｃ腫瘍を保有するマウスの生存を長引かせることを見出した。２Ｈ  ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭの抗腫瘍効果はＡＬＴ−８０３及びＡＬＴ−８０３＋抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ陽性対照で観察されたものと同じくらい良いか、それらより良かった。
【０２１５】
実施例４：抗ＣＴＬＡ４結合ドメイン（ＣＴＬＡ４  ＴｘＭ）及び抗ＰＤ−１結合ドメイン（ＰＤ−１  ＴｘＭ）を含むＩＬ−１５に基づく融合タンパク質複合体の生成
実施例１〜３に記載された融合タンパク質複合体と同様に、ＣＴＬＡ４及びＰＤ−Ｌ１を認識する結合ドメインを含む本発明の融合タンパク質を生成した。具体的には、一本鎖抗ＣＴＬＡ４抗体とｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ鎖を結合する構築物を製造した。抗ＣＴＬＡ４一本鎖抗体（抗ＣＴＬＡ４ｓｃＡｂ）配列はフレキシブルリンカー配列を介して結合した重鎖及び軽鎖Ｖ抗体ドメイン抗体のコーディング領域を含む。一本鎖抗体ドメインはＶＨ−リンカー−ＶＬ又はＶＬ−リンカー−ＶＨフォーマットのどちらかに配置されていてもよい。一部の場合では、抗ＣＴＬＡ４ｓｃＡｂはＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び／又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ鎖のＣ末端と結合している。他の場合では、抗ＣＴＬＡ４はＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び／又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ鎖のＮ末端と結合している。これらの構築物において、マウス又はヒトＣＴＬＡ４分子のいずれかに特異的な抗ＣＴＬＡ４ｓｃＡｂｓを使用した。
【０２１６】
抗ヒトＣＴＬＡ−４  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：１３）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000071
（抗ヒトＣＴＬＡ−４  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000072
（リンカー）
2019533449.tif 000073
（ＶＨ）
2019533449.tif 000074
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000075
2019533449.tif 000076
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000077
【０２１７】
ヒトＣＴＬＡ−４  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃタンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：１４）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000078
（抗ヒトＣＴＬＡ−４  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000079
（リンカー）
2019533449.tif 000080
（ＶＨ）
2019533449.tif 000081
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000082
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000083
【０２１８】
一部の場合では、該リーダーペプチドが成熟ポリペプチドから開裂される。
【０２１９】
同様に、抗マウスＣＴＬＡ−４  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｍＩｇＧ２ａ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：１５）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000084
（抗マウスＣＴＬＡ−４  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000085
（リンカー）
2019533449.tif 000086
（ＶＨ）
2019533449.tif 000087
2019533449.tif 000088
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000089
（マウスＩｇＧ２ａ  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン）
2019533449.tif 000090
【０２２０】
抗マウスＣＴＬＡ−４  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：１６）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000091
（抗マウスＣＴＬＡ−４  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000092
（リンカー）
2019533449.tif 000093
（ＶＨ）
2019533449.tif 000094
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000095
（マウスＩｇＧ２ａ  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン）
2019533449.tif 000096
【０２２１】
一部の場合では、該リーダーペプチドが成熟ポリペプチドから開裂される。
【０２２２】
上記に示されるように、抗ヒト及びマウスＣＴＬＡ４  ｓｃＡｂドメインをＩＬ−１５Ｎ７２Ｄタンパク質との融合としてまた生成した。
【０２２３】
同様に、抗ヒトＰＤ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ構築物の核酸配列（シグナルペプチド配列及び終止コドンを含む）は以下の通りである（配列番号：１７）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000097
（抗ヒトＰＤ１  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000098
2019533449.tif 000099
（リンカー）
2019533449.tif 000100
（ＶＨ）
2019533449.tif 000101
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019533449.tif 000102
【０２２４】
抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ−ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質のアミノ酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号：１８）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000103
（抗ヒトＰＤ１  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000104
（リンカー）
2019533449.tif 000105
（ＶＬ）
2019533449.tif 000106
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019533449.tif 000107
【０２２５】
一部の場合では、該リーダーペプチドが成熟ポリペプチドから開裂される。上記に示されるように、抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂドメインをｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ構築物の融合としてまた生成した。
【０２２６】
実施例１及び以前（米国特許第８，５０７，２２２号の実施例１及び２、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のように、該配列を発現ベクター内にクローニングし、該発現ベクターをＣＨＯ細胞内にトランスフェクションした。一部の場合では、同じ又は異なる（すなわち抗ＰＤ−Ｌ１及び抗ＣＴＬＡ４  ｓｃＡｂ）結合ドメインを有するｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質の両方をコードするベクターで該ＣＨＯ細胞をトランスフェクションした。該融合タンパク質複合体を、ＣＨＯ細胞培養上清からプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いて上記に記載のように精製した。
【０２２７】
上記に記載の抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／抗ヒトＣＴＬＡ−４  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ複合体に加えて、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／抗ヒトＣＴＬＡ−４  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ複合体を、抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ（配列番号：１）及び抗ヒトＣＴＬＡ−４  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号：１５）構築物を含む発現ベクターでＣＨＯ細胞を共トランスフェクションすることによって生成した。これらの融合タンパク質複合体を、ＣＨＯ細胞培養上清からプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いて上記に記載のように精製した。
【０２２８】
実施例５：他の結合ドメインを含むＩＬ−１５に基づく融合タンパク質複合体の生成
実施例１〜４に記載の融合タンパク質複合体と同様に、ＣＤ４７、ＧＩＴＲ、ｓｓＤＮＡ及び他の疾患関連標的（すなわちＣＤ２０、ＣＤ１９等）を認識する結合ドメインを含む、本発明の融合タンパク質複合体を生成した。
【０２２９】
ＣＤ４７は、マクロファージの抑制性受容体として機能するシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）と関与することによって免疫回避を促進する細胞表面分子である。この「私を食べないで（ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ）シグナル」は、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの相互作用を阻害することによって中断させることがあり、それゆえにマクロファージによる抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を回復させる。本発明のＩＬ−１５ドメインはＮＫ細胞及びＣＤ８＋細胞を活性化させ拡大させる一方、それらの細胞傷害性活性を増加させる。十分に高い濃度で、本発明のＦｃ領域はＮＫ細胞及びマクロファージのＦｃγ受容体と、それぞれＡＤＣＣ又はＡＤＣＰに相互作用してもよい。この例により、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα経路、ＩＬ−１５ドメインを通じたＮＫ細胞及びＣＤ８＋細胞の活性化を阻害し、Ｆｃ介在性ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰを介した腫瘍のクリアランスを許容するナノボディのＶｈ領域（ＮｂＶｈ；ＰＮＡＳ２０１６  １１３（１９）Ｅ２６４６−Ｅ２６５４）を含む融合タンパク質複合体の生成及び初めの特性化が記載される。下記に詳細に記載のように、抗マウスＣＤ４７  ＮｂＶｈ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び抗マウスＣＤ４７  ＮｂＶｈ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃを含むタンパク質複合体を生成した。
【０２３０】
具体的には、抗マウスＣＤ４７  ＮｂＶｈをｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ鎖と結合させる構築物を製造した。該抗マウスＣＤ４７  ＮｂＶｈ配列はアルパカナノボディの重鎖可変ドメインのコーディング領域を含む。該抗マウスＣＤ４７  ＮｂＶｈはｈｕＩＬ−１５Ｎ７２ＤのＮ末端と結合している。ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２ＤのＮ末端と結合した抗マウスＣＤ４７  ＮｂＶｈを含む構築物の核酸配列及びタンパク質配列を下記に示した。
【０２３１】
抗マウスＣＤ４７  ＮｂＶｈ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ構築物の核酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号：１９）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000108
（ナノボディの抗マウスＣＤ４７  Ｖｈ鎖）
2019533449.tif 000109
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019533449.tif 000110
【０２３２】
抗マウスＣＤ４７  ＮｂＶｈ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質のアミノ酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号：２０）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000111
（ナノボディの抗マウスＣＤ４７  Ｖｈ鎖）
2019533449.tif 000112
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019533449.tif 000113
【０２３３】
抗マウスＣＤ４７  ＮｂＶｈ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：２１）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000114
（ナノボディの抗マウスＣＤ４７  Ｖｈ鎖）
2019533449.tif 000115
2019533449.tif 000116
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000117
（マウスＩｇＧ２ａ  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000118
【０２３４】
抗マウスＣＤ４７  ＮｂＶｈ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：２２）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000119
（ナノボディの抗マウスＣＤ４７  Ｖｈ鎖）
2019533449.tif 000120
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000121
（マウスＩｇＧ２ａ  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000122
【０２３５】
上記に示されるように、一部の場合では、該リーダーペプチドが成熟ポリペプチドから開裂される。
【０２３６】
ヒトＣＤ４７に特異的な抗体に由来する一本鎖抗体ドメインを用いて、同様の構築物を生成した。抗ヒトＣＤ４７  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ構築物の核酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号：２３）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000123
（抗ヒトＣＤ４７  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000124
（リンカー）
2019533449.tif 000125
（ＶＨ）
2019533449.tif 000126
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019533449.tif 000127
【０２３７】
抗ヒトＣＤ４７  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質のアミノ酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号：２４）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000128
（抗ヒトＣＤ４７  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000129
（リンカー）
2019533449.tif 000130
（ＶＨ）
2019533449.tif 000131
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019533449.tif 000132
【０２３８】
抗ヒトＣＤ４７  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈＩｇＧ１  Ｆｃ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：２５）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000133
（抗ヒトＣＤ４７  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000134
（リンカー）
2019533449.tif 000135
（ＶＨ）
2019533449.tif 000136
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000137
2019533449.tif 000138
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000139
【０２３９】
抗ヒトＣＤ４７  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：２６）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000140
（抗ヒトＣＤ４７  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000141
（リンカー）
2019533449.tif 000142
（ＶＨ）
2019533449.tif 000143
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000144
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000145
【０２４０】
ＧＩＴＲリガンドとＧＩＴＲ間の相互作用が免疫細胞に刺激性シグナルを提供することが知られており、それゆえにＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）がＩＬ−１５の免疫刺激性活性と潜在的に協力して作用することができる免疫アゴニスト分子であることが知られている。それゆえに、ヒトＧＩＲＴＬとｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ鎖を結合する構築物を製造した。
【０２４１】
ヒトＧＩＴＲＬ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ構築物の核酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号：２７）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000146
（ヒトＧＩＴＲＬ）
2019533449.tif 000147
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019533449.tif 000148
【０２４２】
ヒトＧＩＴＲＬ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質のアミノ酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号：２８）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000149
（ヒトＧＩＴＲＬ）
2019533449.tif 000150
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019533449.tif 000151
【０２４３】
ヒトＧＩＴＲＬ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈＩｇＧ１  Ｆｃ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：２９）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000152
（ヒトＧＩＴＲＬ）
2019533449.tif 000153
2019533449.tif 000154
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000155
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000156
【０２４４】
ヒトＧＩＴＲＬ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：３０）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000157
（ヒトＧＩＴＲＬ）
2019533449.tif 000158
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000159
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000160
【０２４５】
疾患細胞によって発現される抗原を標的化する結合ドメインを含む本発明の融合タンパク質複合体を生成することがまた可能である。かかる抗原は腫瘍細胞を含む疾患細胞によって放出された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含むことができる。それゆえに、本発明の融合タンパク質複合体を、ｓｓＤＮＡを認識する一本鎖Ａｂドメインを用いて生成した（Ｈｕ５１−４抗体からのＴＮＴ  ｓｃＡｂ）。
【０２４６】
ＴＮＴ  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ構築物の核酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号：３１）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000161
（ＴＮＴ  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000162
（リンカー）
2019533449.tif 000163
（ＶＨ）
2019533449.tif 000164
2019533449.tif 000165
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019533449.tif 000166
【０２４７】
ＴＮＴ  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質のアミノ酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号：３２）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000167
（ＴＮＴ  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000168
（リンカー）
2019533449.tif 000169
（ＶＨ）
2019533449.tif 000170
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019533449.tif 000171
【０２４８】
ＴＮＴ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈＩｇＧ１  Ｆｃ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：３３）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000172
（ＴＮＴ  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000173
（リンカー）
2019533449.tif 000174
（ＶＨ）
2019533449.tif 000175
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000176
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000177
【０２４９】
ＴＮＴ  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：３４）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000178
（ＴＮＴ  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000179
（リンカー）
2019533449.tif 000180
（ＶＨ）
2019533449.tif 000181
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000182
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000183
【０２５０】
疾患細胞によって発現される他の抗原を標的化する結合ドメインを含む本発明の融合タンパク質複合体をまた生成することができる。かかる抗原は腫瘍細胞を含む疾患細胞に発現した組織因子若しくはＣＤ３３、又は免疫細胞に発現したチェックポイント阻害剤を含むことができる。
【０２５１】
組織因子（ＴＦ）は複数の腫瘍細胞型で過剰発現することが報告されている膜貫通糖タンパク質である。重要なことに、増加したＴＦ発現は、高められた転移の可能性に繋がるがん細胞のシグナリング、腫瘍細胞の移動及び減少したアポトーシスと関係している。それゆえに、ＴＦの標的化はこのタンパク質を過剰発現する腫瘍細胞型に対する免疫療法戦略において有益であることがある。キメラ抗組織因子抗体（ＡＬＴ−８０３）がかつて生成され、臨床的に試験されてきた。この抗体のヒト化された可変鎖（ｈＯＡＴ）がまた特性化された。それゆえに、ヒト組織因子を認識する一本鎖Ａｂドメイン（ｈＯＡＴ  ｓｃＡｂ）を有する本発明の融合タンパク質複合体を生成した。
【０２５２】
ｈＯＡＴ  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈＩｇＧ１  Ｆｃ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：３５）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000184
（ｈＯＡＴ  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000185
2019533449.tif 000186
（リンカー）
2019533449.tif 000187
（ＶＨ）
2019533449.tif 000188
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000189
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000190
【０２５３】
ｈＯＡＴ  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号：３６）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000191
（ｈＯＡＴ  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000192
（リンカー）
2019533449.tif 000193
（ＶＨ）
2019533449.tif 000194
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000195
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000196
【０２５４】
一部の場合では、該リーダーペプチドが成熟ポリペプチドから開裂される。
【０２５５】
ｈＯＡＴ  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質を発現する、同様の構築物をまた生成することができる。
【０２５６】
実施例１及び以前（米国特許第８，５０７，２２２号の実施例１及び２、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のように、発現ベクターに該配列をクローニングし、該発現ベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。一部の場合では、本発明と同じ又は異なる結合ドメインを有するｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質の両方をコードするベクターを用いて該ＣＨＯ細胞をトランスフェクションした。上記に記載のように、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いてＣＨＯ細胞培養上清から融合タンパク質複合体を精製した。
【０２５７】
本発明の融合タンパク質複合体を、ＣＤ３３を認識する一本鎖Ａｂドメイン（ＣＤ３３  ｓｃＡｂ）を用いてまた生成した。ＣＤ３３  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ構築物の核酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号：３７）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000197
（ＣＤ３３  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000198
（リンカー）
2019533449.tif 000199
（ＶＨ）
2019533449.tif 000200
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019533449.tif 000201
2019533449.tif 000202
【０２５８】
ＣＤ３３  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質のアミノ酸配列（シグナルペプチド配列を含む）は以下の通りである（配列番号：３８）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000203
（ＣＤ３３  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000204
（リンカー）
2019533449.tif 000205
（ＶＨ）
2019533449.tif 000206
（ヒト  ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
2019533449.tif 000207
【０２５９】
一部の場合では、該リーダーペプチドが成熟ポリペプチドから開裂される。
【０２６０】
ＣＤ３３  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈＩｇＧ１  Ｆｃ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：３９）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000208
（ＣＤ３３  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000209
（リンカー）
2019533449.tif 000210
（ＶＨ）
2019533449.tif 000211
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000212
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000213
2019533449.tif 000214
【０２６１】
ＣＤ３３  ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：４０）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000215
（ＣＤ３３  ｓｃＡｂ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000216
（リンカー）
2019533449.tif 000217
（ＶＨ）
2019533449.tif 000218
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000219
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000220
2019533449.tif 000221
【０２６２】
一部の場合では、該リーダーペプチドが成熟ポリペプチドから開裂される。
【０２６３】
該配列を実施例１及び以前（米国特許第８，５０７，２２２号の実施例１及び２、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のように発現ベクター内にクローニングし、該発現ベクターをＣＨＯ細胞内にトランスフェクションした。一部の場合では、本発明と同じ又は異なる結合ドメインを有するｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質の両方をコードするベクターで該ＣＨＯ細胞をトランスフェクションした。該融合タンパク質複合体をＣＨＯ細胞培養上清から上記に記載のようにプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。
【０２６４】
細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）はイムノグロブリン上科の細胞表面糖タンパク質である。細胞表面上のＩＣＡＭ−１タンパク質発現のレベルが、多様な充実性腫瘍の転移能と正に相関していることが明らかにされた。リンパ球機能と関連した抗原１（ＬＦＡ−１）はすべてのＴ細胞及びＢ細胞、マクロファージ、好中球並びにＮＫ細胞上に見いだせる。これがＩＣＡＭ−１と、具体的にはその「Ｉドメイン」を通じて結合し、細胞間接着（免疫学的／細胞傷害性シナプス形成）又はローリング（管外遊出に先立って血流中の細胞の動作を遅くすること）を維持することが知られている。該Ｉドメインは単独で２の変異体、すなわちＫ２８７Ｃ及びＫ２９４Ｃの添加を有するＩＣＡＭ−１との高親和性結合を支持することができる。そのために、腫瘍を標的化し、ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ複合体を介してエフェクター免疫分子の活性化及び局在化を容易にするために、変異体を有するＬＦＡ−１  Ｉドメインを含むＴｘＭを創出した。
【０２６５】
ヒトＬＦＡ−１  Ｉドメイン（Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ）／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：４１）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000222
（ヒトＬＦＡ−１  Ｉドメイン（Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ））
2019533449.tif 000223
2019533449.tif 000224
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000225
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000226
【０２６６】
成熟ヒトＬＦＡ−１  Ｉドメイン（Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ）／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：４２）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000227
（ヒトＬＦＡ−１  Ｉドメイン（Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ）
2019533449.tif 000228
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000229
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000230
【０２６７】
一部の場合では、該リーダーペプチドが成熟ポリペプチドから開裂される。
【０２６８】
ヒトＬＦＡ−１  Ｉドメイン（Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ）／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質を発現する、同様の構築物を生成することができる。
【０２６９】
実施例１及び以前（米国特許第８，５０７，２２２号の実施例１及び２、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のように該配列を発現ベクター内にクローニングし、該発現ベクターをＣＨＯ細胞内にトランスフェクションした。一部の場合では、本発明と同じ又は異なる結合ドメインを有するｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質の両方をコードするベクターで該ＣＨＯ細胞をトランスフェクションした。該融合タンパク質複合体を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いて該ＣＨＯ細胞培養上清から精製した。
【０２７０】
例えば、ＣＨＯ細胞をｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ発現ベクターでトランスフェクションした。細胞をヒトＬＦＡ−１  Ｉドメイン（Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ）／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ構築物）を発現するベクターでまたトランスフェクションした。ＣＨＯ細胞内の２つの構築物の共発現により、可溶性ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ヒトＬＦＡ−１  Ｉドメイン（Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ）／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ複合体（２＊ｈＬＦＡ１／ＴｘＭと称する）の形成と分泌を可能にした。
【０２７１】
Ｎｏｔｃｈ  １はＩ型膜貫通タンパク質群の構成員であり、複数の上皮細胞成長因子様（ＥＧＦ）リピートからなる細胞外ドメインを含む構造的特性を共有している。その過剰発現は、いくつかの腫瘍型において、免疫療法のための魅力的な標的になる。デルタ様タンパク質４（ＤＬＬ４）はＮｏｔｃｈ  １のいくつかのリガンドであり、高親和性を有することが示されている。それゆえに、ＤＬＬ４の細胞外ドメイン（２７〜５２９位）を、ＴｘＭ複合体の創出においてＮｏｔｃｈ  １の標的化に使用した。
【０２７２】
ｈＤＬＬ４／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：４３）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000231
（ｈＤＬＬ４）
2019533449.tif 000232
2019533449.tif 000233
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000234
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000235
【０２７３】
成熟ｈＤＬＬ４／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：４４）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000236
（ｈＤＬＬ４）
2019533449.tif 000237
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000238
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000239
【０２７４】
一部の場合では、該リーダーペプチドが成熟ポリペプチドから開裂される。
【０２７５】
ｈＤＬＬ４ドメイン／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質を発現する、同様の構築物を生成することができる。
【０２７６】
実施例１及び以前（米国特許第８，５０７，２２２号の実施例１及び２、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のように該配列を発現ベクター内にクローニングし、該発現ベクターをＣＨＯ細胞内にトランスフェクションした。一部の場合では、本発明と同じ又は異なる結合ドメインを有するｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質の両方をコードするベクターで該ＣＨＯ細胞をトランスフェクションした。上記に記載のように、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いて該融合タンパク質複合体をＣＨＯ細胞培養上清から精製した。
【０２７７】
例えば、ＣＨＯ細胞内のｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びｈＤＬＬ４／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ発現ベクターの共発現によって、可溶性ＴｘＭ複合体（２＊ｈＤＬＬ４／ＴｘＭと称する）の形成と分泌を可能にした。
【０２７８】
Ｔ細胞イムノグロブリン及びムチンドメイン含有−３（Ｔｉｍ−３）は、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４＋Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）及びＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性１（Ｔｃ１）Ｔ細胞に見出される免疫チェックポイントである。それゆえに、がんの免疫療法にとって魅力的な標的である。それゆえに、本発明の融合タンパク質複合体を、ヒトＴｉｍ−３を認識する一本鎖Ａｂドメイン（ｈａＴＩＭ３ｓｃＦｖ）を用いて生成した。
【０２７９】
ｈａＴＩＭ３ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：４５）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000240
（ｈａＴＩＭ３ｓｃＦｖ：ＶＬ−リンカー−ＶＨ  ｓｃＦｖ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000241
（リンカー）
2019533449.tif 000242
（ＶＨ）
2019533449.tif 000243
2019533449.tif 000244
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000245
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000246
【０２８０】
ｈａＴＩＭ３ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：４６）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000247
（ｈａＴＩＭ３ｓｃＦｖ：ＶＬ−リンカー−ＶＨ  ｓｃＦｖ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000248
（リンカー）
2019533449.tif 000249
（ＶＨ）
2019533449.tif 000250
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000251
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000252
【０２８１】
一部の場合では、該リーダーペプチドが成熟ポリペプチドから開裂される。
【０２８２】
ｈａＴＩＭ３ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質を発現する、同様の構築物を生成することができる。
【０２８３】
実施例１及び以前（米国特許第８，５０７，２２２号の実施例１及び２、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のように該配列を発現ベクター内にクローニングし、該発現ベクターをＣＨＯ細胞内にトランスフェクションした。一部の場合では、本発明と同じ又は異なる結合ドメインを有するｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質の両方をコードするベクターで該ＣＨＯ細胞をトランスフェクションした。上記に記載のように、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いて該融合タンパク質複合体を該ＣＨＯ細胞培養上清から精製した。
【０２８４】
例えば、ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ発現ベクターでＣＨＯ細胞をトランスフェクションした。細胞をｈａＴＩＭ３ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ構築物を発現するベクターでまたトランスフェクションした。ＣＨＯ細胞内の２つの構築物の共発現により、可溶性ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ｈａＴＩＭ３ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ複合体（２＊ｈａＴＩＭ３／ＴｘＭと称する）の形成と分泌を可能にした。
【０２８５】
腫瘍標的化分子に加えて、ウイルス感染した細胞を検出して、それに反した行動を取るＴｘＭ複合体を創出することができる。極めて強力な、広く中和するＨＩＶ特異的モノクローナル抗体（ｂＮＡｂｓ）の近年の発見により、強力な治療剤の新しい種類が提供される。中和抗体がＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）を標的化し、インビボでのウイルス複製を効率的に抑圧できることが以前から知られている。このＡｂ介在性の抑圧を、潜在的ウイルス複製を目覚めさせ、活性化したエフェクター細胞で（ＩＬ−１５刺激を介して）殺傷する「キック・アンド・キル」アプローチと組み合わせるために、ｂＮＡｂｓの一本鎖抗体ドメイン（ｓｃＦｖｓ）を含むＴｘＭ複合体を産生した。ｂＮＡｂｓ  Ｎ６、２Ｇ１２、ＶＲＣ０７及び１０−１０７４に由来する４つの異なる抗ＨＩＶ  ＴｘＭの創出及び特性化を下記に記載した。
【０２８６】
Ｎ６ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：４７）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000253
（Ｎ６  ｓｃＦｖ：ＶＬ−リンカー−ＶＨ  ｓｃＦｖ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000254
（リンカー）
2019533449.tif 000255
（ＶＨ）
2019533449.tif 000256
2019533449.tif 000257
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000258
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000259
【０２８７】
２Ｇ１２ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：４８）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000260
（２Ｇ１２  ｓｃＦｖ：ＶＬ−リンカー−ＶＨ  ｓｃＦｖ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000261
（リンカー）
2019533449.tif 000262
（ＶＨ）
2019533449.tif 000263
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000264
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000265
2019533449.tif 000266
【０２８８】
ＶＲＣ０７（５２３）ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：４９）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000267
（ＶＲＣ０７（５２３）ｓｃＦｖ：ＶＬ−リンカー−ＶＨ  ｓｃＦｖ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000268
（リンカー）
2019533449.tif 000269
（ＶＨ）
2019533449.tif 000270
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000271
2019533449.tif 000272
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000273
【０２８９】
１０−１０７４ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ構築物の核酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：５０）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000274
（１０−１０７４  ｓｃＦｖ：  ＶＬ−リンカー−ＶＨ  ｓｃＦｖ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000275
（リンカー）
2019533449.tif 000276
（ＶＨ）
2019533449.tif 000277
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000278
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000279
【０２９０】
成熟Ｎ６ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：５１）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000280
（Ｎ６  ｓｃＦｖ：ＶＬ−リンカー−ＶＨ  ｓｃＦｖ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000281
（リンカー）
2019533449.tif 000282
（ＶＨ）
2019533449.tif 000283
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000284
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000285
【０２９１】
成熟２Ｇ１２ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：５２）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000286
（２Ｇ１２  ｓｃＦｖ：ＶＬ−リンカー−ＶＨ  ｓｃＦｖ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000287
（リンカー）
2019533449.tif 000288
（ＶＨ）
2019533449.tif 000289
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000290
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000291
【０２９２】
成熟ＶＲＣ０７（５２３）ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：５３）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000292
（ＶＲＣ０７（５２３）ｓｃＦｖ：ＶＬ−リンカー−ＶＨ  ｓｃＦｖ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000293
（リンカー）
2019533449.tif 000294
（ＶＨ）
2019533449.tif 000295
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000296
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000297
【０２９３】
成熟１０−１０７４ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（リーダー配列を含む）は以下の通りである（配列番号：５４）：
（シグナルペプチド）
2019533449.tif 000298
（１０−１０７４）ｓｃＦｖ：ＶＬ−リンカー−ＶＨ  ｓｃＦｖ）
（ＶＬ）
2019533449.tif 000299
（リンカー）
2019533449.tif 000300
（ＶＨ）
2019533449.tif 000301
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
2019533449.tif 000302
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
2019533449.tif 000303
【０２９４】
一部の場合では、該リーダーペプチドが成熟ポリペプチドから開裂される。
【０２９５】
上記に記載のｂＮＡｂ  ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質を発現する、同様の構築物を生成することができる。
【０２９６】
実施例１及び以前（米国特許第８，５０７，２２２号の実施例１及び２、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のように該配列を発現ベクター内にクローニングし、該発現ベクターをＣＨＯ細胞内にトランスフェクションした。一部の場合では、本発明と同じ又は異なる結合ドメインを有するｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質の両方をコードするベクターで該ＣＨＯ細胞をトランスフェクションした。上記に記載のように、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いて該融合タンパク質複合体をＣＨＯ細胞培養上清から精製した。
【０２９７】
例えば、ＣＨＯ細胞内のｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びＮ６ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ発現ベクターの共発現によって、２＊ｈＮ６／ＴｘＭと称する可溶性ＴｘＭ複合体の形成と分泌を可能にした。ＣＨＯ細胞内のｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び２Ｇ１２ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ発現ベクターの共発現によって、２＊ｈ２Ｇ１２／ＴｘＭと称する可溶性ＴｘＭ複合体の形成と分泌を可能にした。ＣＨＯ細胞内のｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びＶＲＣ０７（５２３）ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ発現ベクターの共発現によって、２＊ｈＶＲＣ０７（５２３）／ＴｘＭと称する可溶性ＴｘＭ複合体の形成と分泌を可能にした。ＣＨＯ細胞内のｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び１０−１０７４ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ発現ベクターの共発現によって、２＊ｈ１０−１０７４／ＴｘＭと称する可溶性ＴｘＭ複合体の形成と分泌を可能にした。
【０２９８】
上記に示されるように、プロテインＡクロマトグラフィー又は他の分離法（すなわちイオン交換、疎水性及び／又はサイズ排除クロマトグラフィー、並びに濾過方法）によって該ＴｘＭ複合体をＣＨＯ細胞上清から精製することができる。さらに、精製したタンパク質はゲル、クロマトグラフィー及び他の分析方法によって特性化することができる。例えば、図２０は２のｓｃＡｂ若しくは結合ドメイン（すなわち二頭（２Ｈ）のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体）又は４のｓｃＡｂ若しくは結合ドメイン（すなわち四頭（４Ｈ）の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体）又は異なる標的化ドメインの組み合わせ（すなわち腫瘍標的化ドメイン／抗ＰＤＬ１  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ複合体）を含む多様なＴｘＭ複合体のサイズ排除クロマトグラフィー分析を示している。ＳＥＣクロマトグラフは、プロテインＡで精製したＴｘＭタンパク質が初めはＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体と一致した移動パターンを有する大きなタンパク質ピークに含まれることを示している。
【０２９９】
ｓｃＡｂ又は結合ドメインを含む類似のＴｘＭ構築物を、他のＣＤ抗原、サイトカイン又はケモカイン受容体又はリガンド、成長因子受容体又はリガンド、細胞間接着分子、ＭＨＣ／ＭＨＣ様分子、Ｆｃ受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、ＮＫ受容体、ＴＣＲｓ、ＢＣＲｓ、陽性／陰性共刺激性受容体又はリガンド、死受容体又はリガンド、腫瘍関連抗原、ウイルスにコードされる又はバクテリアにコードされる抗原、及びバクテリアに特異的な抗原配列を用いて容易に生成することができる。特に関心を引くのは、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、ＣＤ１５２、ＣＤ１４７、ＣＤ２２１、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ−１、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＣＥＡ、ＯＸ４０リガンド、ｃＭｅｔ、組織因子、ネクチン４、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＬ７、ＦＧＦＲ、ＩＬ−６受容体、ＩＧＦ−１受容体、ＧＤ２、ＣＡ−１２５、ＥｐＣａｍ、死受容体５、ＭＵＣ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ、Ｔｒａｉｌ  Ｒ２、葉酸受容体、アンジオポイエチン２、ａｌｐｈａｖｂｅｔａ３インテグリン受容体、ＨＬＡ−ＤＲ抗原及び本明細書に記載の他の疾患標的の抗原に対して疾患特異的に結合するドメイン（例えばｓｃＡｂｓ）を有するＴｘＭである。ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＣ、ＣＭＶ、ＨＴＬＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＲＳＶ及び他のウイルスに由来するウイルス抗原に対する抗体ドメイン、特にＨＩＶエンベロープスパイク及び／又はｇｐ２１０及びｇｐ４１エピトープを認識するものが、また関心を引くものである。当該分野で知られている配列から、又は当該分野で知られている多様な源（すなわち脊椎動物の宿主又は細胞、組み合わせライブラリー、ランダム合成ライブラリー、コンピューターモデリング等）から単離されたデノボから、かかる抗体ドメインを生成することができる。
【０３００】
実施例６：他のＴｘＭの活性の特性化
ＣＴＬＡ−４陽性免疫細胞を用いてＣＴＬＡ−４  ＴｘＭの結合活性を評価した。マウス特異的ＣＴＬＡ−４  ＴｘＭの調査において、マウスのリンパ球におけるＣＴＬＡ−４の発現は、まず抗ＣＤ３  Ａｂ（２Ｃ１１、４μｇ／ｍｌ）によって４日間にわたり誘発された。ＰＥ抗マウスＣＴＬＡ−４抗体（クローンＵＣ１０−４Ｂ９）又はＰＥアルメニアンハムスターＩｇＧアイソトープ対照での染色によってＣＴＬＡ−４発現を評価した。図２１Ａに示されるように、フローサイトメトリー分析によりマウスＣＴＬＡ−４が著しく誘発されたことが明らかになった。マウス特異的ＣＴＬＡ−４  ＴｘＭ（１００μｌ上清）の添加により、陽性対照抗ｍＣＴＬＡ−４抗体（クローンＨＢ３０４）に行ったように、抗マウスＣＴＬＡ−４抗体結合を阻害することができた。ヒト特異的ＣＴＬＡ−４  ＴｘＭの調査のために、ヒトＰＢＭＣ中のＣＴＬＡ−４の発現が抗ＣＤ３  Ａｂ（ＯＫＴ３：４μｇ／ｍｌ）によって３日間にわたり誘発された。それからＰＥ抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体（クローンＢＮＩ３、Biolegend）又はＰＥマウスＩｇＧ２ａ、κアイソタイプ対照で細胞を染色した。上記に記載の結果と一致して、ヒト特異的ＣＴＬＡ−４  ＴｘＭ（ＣＬ−８−１００ｕｌ）はヒト免疫細胞の表面上のＣＴＬＡ−４を阻害することができた（図２１Ｂ）。これらの結果はＣＴＬＡ−４  ＴｘＭ複合体の特異性を明らかにしている。
【０３０１】
同様に、ＰＤ−Ｌ１陽性５Ｔ３３黒色腫腫瘍細胞（実施例２に記載の方法による）及びＣＴＬＡ−４陽性免疫細胞上のマウス特異的ＰＤ−Ｌ１／ＣＴＬＡ−４  ＴｘＭ複合体の結合活性を評価した。図２２Ａ及び図２２Ｂに示されるように、ＰＤ−Ｌ１／ＣＴＬＡ−４  ＴｘＭ（上清）は細胞表面上に発現したＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４両方との結合を阻害することができた。このことは複数特異的なＴｘＭ複合体が、結合した結合ドメインの各々の反応性を保持することをまた示している。
【０３０２】
ＣＤ４７陽性細胞を用いてＣＤ４７  ＴｘＭ構築物の直接結合を評価した。図２３Ａ及び図２３Ｂに示されるように、マウス及びヒトに特異的なＣＤ４７  ＴｘＭ複合体はマウスＢ１６Ｆ１０黒色腫及びヒトＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞をそれぞれ染色することができた。これらの結果は、これらの複合体がＣＤ４７結合活性を保持していることを示している。
【０３０３】
一本鎖ＤＮＡ  ＥＬＩＳＡ方法（ＡＬＰＣＯ  ｓｓＤＮＡ  ＥＬＩＳＡキット３５−ＳＳＳＨＵ−Ｅ０１）を、ＴＮＴ  ｓｃＡｂドメインを含むＴｘＭ複合体の結合を評価するために使用した。簡潔には、ＴＮＴ  ｓｃＡｂドメインを含む精製したＴｘＭタンパク質を逐次希釈し、１００μＬをヒト組み換え一本鎖ＤＮＡでコーティングされたＥＬＩＳＡウェルに追加した。３０分のインキュベーション後、該ウェルを洗浄し、１００μＬのＨＲＰ抗ヒトＩｇＧ抗体を添加した。さらなるインキュベーション及び洗浄段階後、結合したＴｘＭタンパク質をＴＭＢ基質で検出した。ウェルの吸収度は４５０ｎＭと読めた。図２４Ａ及び図２４Ｂに示したように、ＴＮＴ  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ及びＴＮＴ  ｓｃＡｂ／抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ複合体は、潜在的にＴＮＴ  ｓｃＡｂ／抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ内の２Ｈ  ＴＮＴ  ｓｃＡｂと比較してＴＮＴ  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ内の４Ｈ  ＴＮＴ  ｓｃＡｂの高い結合活性のために、ＴＮＴ  ｓｃＡｂ／抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ（１０２７９ｐＭ）のものと比較して低いＫｄ（１８８ｐＭ）を有するＴＮＴ  ｓｃＡｂ  ＴｘＭと一本鎖ＤＮＡを結合することができた。
【０３０４】
ＴＮＴ  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ複合体の腫瘍細胞と結合する能力を、該細胞を固定し透過させることで腫瘍細胞のＤＮＡをさらして、また評価した。初めの調査では、ＭＢ２３１乳癌細胞を１．５％のパラホルムアルデヒドでまず固定し、０．１％のサポニンで透過し、それから１０５の細胞（１０６細胞／ｍＬ）を３０分間にわたり室温で、０．０１〜１００ｎＭのＴＮＴ  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ、ＴＮＴ  ｓｃＡｂ／抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ又は２Ｈ抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ（陰性対照）でインキュベートした。該細胞を洗浄し、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＡＰＣで染色し、それからフローサイトメトリーで分析した。図２５Ａは、異なるＴｘＭ濃度でのＭＢ２３１細胞染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示しており、透過した乳腫瘍細胞とのＴＮＴ  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ及びＴＮＴ  ｓｃＡｂ／抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ  ＴｘＭの特異的及び濃度依存性の結合を裏付けている。最小の結合は陰性対照のＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ複合体に見られ、ＭＢ２３１細胞株上のＰＤ−Ｌ１の低いレベルの発現と一致した。固定し透過したＰＤ−Ｌ１陰性Ａ５４９ヒト肺腫瘍細胞で類似の調査を行った。再度、その結果（図２５Ｂ）により、透過した肺腫瘍細胞とのＴＮＴ  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ及びＴＮＴ  ｓｃＡｂ／抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ  ＴｘＭの特異的かつ濃度依存性の結合が裏付けられた。
【０３０５】
さらに、ｈＯＡＴ  ｓｃＡｂ及び／又は抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂドメインを含むＴｘＭ複合体の、腫瘍細胞と結合する能力を評価した。ＳＷ１９９０ヒト膵癌細胞株は高いレベルのヒトＴＦ及び低いレベルのＰＤ−Ｌ１を発現する。この調査では、１０５のＳＷ１９９０細胞（１０６細胞／ｍＬ）を３０分間にわたり室温で、０．０１〜１００ｎＭの二頭（ｈ２）のｈＯＡＴｓｃＡｂ／ＴｘＭ、抗ヒトＰＤ−Ｌ１ｓｃＡｂ／ｈＯＡＴｓｃＡｂ／ＴｘＭ、ｈ２＊抗ヒトＰＤ−Ｌ１ｓｃＡｂ／ＴｘＭ又は対照のｈＯＡＴ  Ａｂ又は対照の抗ヒトＰＤ−Ｌ１  Ａｂ（アベルマブ）とインキュベートした。該細胞を洗浄し、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＡＰＣで染色し、それからフローサイトメトリーで分析した。図２６は、異なるタンパク質濃度でのＳＷ１９９０細胞染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。その結果、ｈＯＡＴ  ｓｃＡｂ（ｈ２＊ｈＯＡＴｓｃＡｂ／ＴｘＭ及び抗ヒトＰＤ−Ｌ１ｓｃＡｂ／ｈＯＡＴｓｃＡｂ／ＴｘＭ）を含むＴｘＭ複合体が、対照のｈＯＡＴ  Ａｂと類似した高いレベルの、ＳＷ１９９０腫瘍細胞上のヒトＴＦの染色を示すことが裏付けられた。抗ヒトＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ（ｈ２＊抗ヒトＰＤ−Ｌ１ｓｃＡｂ／ＴｘＭ）を含むＴｘＭ複合体は、対照の抗ヒトＰＤ−Ｌ１  Ａｂ（アベルマブ）と類似して、ＳＷ１９９０腫瘍細胞上のヒトＰＤ−Ｌ１の低いレベルの染色を示す。
【０３０６】
ＥＬＩＳＡに基づく方法を使用して、ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ヒトＬＦＡ−１  Ｉドメイン（Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ）／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ複合体の形成を裏付けた。ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びヒトＬＦＡ−１  Ｉドメイン（Ｋ２８７Ｃ／Ｋ２９４Ｃ）／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ発現ベクターで共トランスフェクションしたＣＨＯ細胞からの培養上清内の結合活性を評価した。図２７Ａでは、捕捉抗体、抗ヒトＩＬ−１５抗体（R&D Systems）及び検出抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch）を有するｈｕＩＬ１５／ｈｕＩｇＧ１に特異的なＥＬＩＳＡを用いて融合タンパク質複合体を検出した。この結合を、トランスフェクションされなかったＣＨＯ細胞を含む培地の上清のみを用いて対照サンプルと比較した。その結果により、２＊ｈＬＦＡ１／ＴｘＭの産生及び適切な複合体の形成が示されている。
【０３０７】
その上、ＩＣＡＭ−１との２＊ｈＬＦＡ１／ＴｘＭ結合をＥＬＩＳＡで評価した（図２７Ｂ）。イムノプレートのウェルを１μｇのヒトＩＣＡＭ−１−Ｆｃ（Biolegend）でコーティングした。洗浄段階後、２＊ｈＬＦＡ１／ＴｘＭを含むＣＨＯ培養上清を該細胞に添加した。インキュベーション及びさらなる洗浄段階後、ＨＲＰ共役抗ヒトＩＬ−１５抗体（R&D Systems）を用いて融合タンパク質複合体の結合を検出した。ＡＢＴＳのインキュベーション後にウェルの吸収度は４０５ｎｍと読めた。図２７Ｂの結果により、この複合体がＩＣＡＭ−１を認識することが示される。
【０３０８】
類似のＥＬＩＳＡに基づく方法により、トランスフェクションされたＣＨＯ細胞培養上清内のｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ｈＤＬＬ４／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ複合体の形成が裏付けられた。図２８では、捕捉抗体、抗ヒトＩＬ−１５抗体（R&D Systems）及び検出抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch）を有するｈｕＩＬ１５／ｈｕＩｇＧ１に特異的なＥＬＩＳＡを用いて、培養上清内の融合タンパク質複合体を検出した。トランスフェクションされなかったＣＨＯ細胞を含む培地の上清のみを用いて、該サンプルを対照サンプルと比較した。その結果により、２＊ｈＤＬＬ４／ＴｘＭ複合体の産生及び適切な複合体形成が示される。
【０３０９】
ＥＬＩＳＡに基づく方法により、ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ｈａＴＩＭ３ｓｃＦｖ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ複合体の形成がまた裏付けられた。図２９では、捕捉抗体、抗ヒトＩＬ−１５抗体（R&D Systems）及び検出抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch）を有するｈｕＩＬ１５／ｈｕＩｇＧ１に特異的なＥＬＩＳＡを用いて、トランスフェクションされたＣＨＯ培養上清内の融合タンパク質複合体を検出した。トランスフェクションされなかったＣＨＯ細胞を含む培地の上清のみを用いて、この結合を対照サンプルと比較した。その結果により、２＊ｈａＴＩＭ３／ＴｘＭ複合体の産生及び適切な複合体形成が示される。
【０３１０】
ｂＮＡｂ  ｓｃＦｖ  ＴｘＭ発現ベクターで共トランスフェクションしたＣＨＯ細胞からの上清を使用して、該ＴｘＭ複合体の発現及び結合能力を決定した。ＥＬＩＳＡに基づく方法により、ｂＮＡｂ  ｓｃＦｖ  ＴｘＭ複合体の形成が裏付けられた。図３０Ａ及び図３０Ｂでは、捕捉抗体、抗ヒトＩＬ−１５抗体（R&D Systems）及び検出抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch）を有するｈｕＩＬ１５／ｈｕＩｇＧ１に特異的なＥＬＩＳＡを用いて、トランスフェクションされたＣＨＯ培養上清内の融合タンパク質複合体を検出した。陽性対照のＴｘＭはｈＣＤ２０を認識するものの１つである。その結果により、４つの異なるｂＮＡｂ  ｓｃＦｖ  ＴｘＭ複合体の産生及び適した複合体形成が示される。
【０３１１】
その上、ＨＩＶタンパク質標的（ｇｐ１２０（ＳＦ１６２．ＬＳ）及びｇｐ１４０（ＳＦ１６２．ＬＳ））とのｂＮＡｂ  ｓｃＦｖ  ＴｘＭ結合をＥＬＩＳＡで評価した。この調査のために、イムノプレートのウェルを０．１μｇのＨＩＶ  ｇｐ１２０（ＳＦ１６２．ＬＳ）又はｇｐ１４０（ＳＦ１６２．ＬＳ）（ProtTech, Inc.）でコーティングした。洗浄段階後、ｂＮＡｂ  ｓｃＦｖ  ＴｘＭを含むＣＨＯ培養上清を該細胞に添加した。陰性対照のＴｘＭはｈＣＤ２０を認識するものの１つである。インキュベーション及びさらなる洗浄段階に続いて、ＨＲＰ共役抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch）を用いて融合タンパク質複合体の結合を検出した。ＡＢＴＳでのインキュベーション後のウェルの吸収度は４０５ｎｍと読めた。図３０Ｃから図３０Ｆの結果により、ｂＮＡｂ  ｓｃＦｖ  ＴｘＭ複合体がＨＩＶタンパク質標的を認識することが示される。
【０３１２】
全体としてこれらの結果は、多様な免疫チェックポイント及びシグナル分子に特異的な結合ドメインを有するＴｘＭ複合体を生成できることを明らかにし、分子を標的化するための高められた結合活性を提供する。これらの複合体はＩＬ−１５免疫刺激性活性を示し、細胞の標的抗原に対して免疫介在性細胞傷害性を向かわせることができる。これらの複合体は動物腫瘍モデルにおいてまた高い有効性がある。
【０３１３】
実施例７：ＴｘＭ複合体の免疫刺激性及び抗腫瘍活性
実施例２に示されるように、ＴｘＭ複合体のＩＬ−１５免疫刺激性活性を、ＩＬ−２Ｒβ／γを保有する免疫細胞、例えば３２Ｄβ細胞株の増殖に基づいて評価した。簡潔には、増加する濃度の精製したＴｘＭタンパク質を、２００μＬのＩＭＤＭ：１０％のＦＢＳ培地内の３２Ｄβ細胞（１０４細胞／ウェル）に添加し、細胞を３日間にわたり３７℃でインキュベートした。４時間後、吸収度を（正常化のための６００ｎｍの参照波長で）５７０ｎｍと測定し、代謝的に活性な細胞によるＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ、すなわちレザズリンに基づく溶液の減少に基づいて細胞増殖を決定した。ＴｘＭ複合体のＩＬ−１５生物活性の半値有効濃度（ＥＣ５０）を、吸収度とＴｘＭタンパク質濃度間の関係に基づいてそれから決定した。表１は、本発明の結合ドメインを含む多様なＴｘＭ複合体のＩＬ−１５  ＥＣ５０の値を示す。その結果により、２つのｓｃＡｂ／結合ドメイン（すなわち二頭（２Ｈ）の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体）又は４つのｓｃＡｂ／結合ドメイン（すなわち四頭（４Ｈ）の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＡｂ／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体）又は異なる標的化ドメインの組み合わせ（すなわち腫瘍標的化ドメイン／抗ＰＤＬ１ｓｃＡｂ  ＴｘＭ複合体）を有するものを含む、多様な精製されたＴｘＭ複合体の免疫刺激性活性が裏付けられた。
【０３１４】
【表１】
2019533449.tif 000304
【０３１５】
ｈＯＡＴ  ｓｃＡｂ  ＴｘＭの、腫瘍細胞に対する免疫細胞傷害性を刺激する能力をインビトロで評価した。ヒトＮＫ細胞をStemcell TechnologiesによるＮＫ細胞単離キットで血液バフィーコートから精製し、エフェクター細胞として使用した。ＴＦ陽性ヒト膵臓腫瘍細胞、すなわちＳＷ１９９０をＣｅｌｌｔｒａｃｅ−ｖｉｏｌｅｔで標識化し、標的細胞として使用した。ヒトＮＫ細胞及びＳＷ１９９０腫瘍細胞を１：１のＥ：Ｔ比で、培地単独又は１０ｎＭのｈＯＡＴ  Ａｂ（対照）又は２Ｈ  ｈＯＡＴ  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ複合体を含む培地で混合した。４０時間後、標的細胞死のパーセントをｖｉｏｌｅｔで標識化された標的細胞のヨウ化プロピジウム染色に基づくフローサイトメトリーで評価した。図３１に示されるように、２Ｈ  ｈＯＡＴ  ｓｃＡｂ  ＴｘＭ複合体でインキュベートしたヒトＮＫ細胞は、未処置のＮＫ細胞又はｈＯＡＴ  Ａｂで処置されたＮＫ細胞（すなわち従来のＡＤＣＣ）よりも、ＴＦ陽性ヒト腫瘍細胞に対して高い細胞傷害性を介在することができた。これらの結果により、抗ＴＦ  Ａｂｓと比較して、免疫細胞介在性の標的化した抗ＴＦ  ＴｘＭ複合体の抗腫瘍活性に有意な改良が示される。
【０３１６】
ＴｘＭ複合体の、Ｔ細胞活性のチェックポイント介在性阻害を克服する活性は以前に記載のインビトロアッセイで評価される（Steward, R, et al Cancer Immunol Res 2015 3(9)1052-1062）。例えば、単離したばかりの一次ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８でコーティングされたビーズと共に培養し、増加した免疫細胞増殖（ＢｒＤＵ取り込みによって測定）及びＩＦＮγ放出（ＥＬＩＳＡによって測定）を明らかにした。ビーズ上のＰＤ−Ｌ１抗体の添加は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用の阻害シグナルのために、Ｔ細胞増殖及びＩＦＮγ放出を有意に低減させた。抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、ＰＤ−Ｌ１にコーティングされたビーズ及びＴ細胞と関連した可溶性ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ又はＰＤ−１  ＴｘＭの添加は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用の阻害のためにＴ細胞増殖及びＩＦＮγ放出を増加させる。抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＴＬＡ−４にコーティングされたビーズ及びＴ細胞と関連してＣＴＬＡ−４  ＴｘＭを用いる類似のアッセイは、ＣＴＬＡ−４  ＴｘＭの免疫チェックポイント阻害活性をまた明らかにする。
【０３１７】
これらの複合体の抗腫瘍活性をマウスの異種移植片モデルにおいて、ヒト腫瘍細胞株及び患者由来の腫瘍細胞を用いて評価する（Morton, J. J., et al. Cancer Research 2016 doi: 10.1158/0008-5472）。市販のヒト化されたマウスモデル（すなわちＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭ， Jackson laboratory）を発展させ、ヒト腫瘍細胞株及び患者由来の腫瘍細胞に由来する腫瘍に対してのヒト免疫細胞反応に関する免疫療法の活性を評価した。例えば、ＰＤ−Ｌ１陽性の皮下ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌腫瘍を保有するＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭマウスを、ＰＢＳ又は増加するレベルのＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ又はＰＤ−１  ＴｘＭ（すなわち２週間にわたり、１週間に２回の皮下投与）で処置し、腫瘍成長を評価する。腫瘍容積における用量依存性の減少は、ＰＤ−Ｌ１陽性ヒト腫瘍に対するＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ及び／又はＰＤ−１  ＴｘＭの治療活性の証拠を提供する。充実性腫瘍マウスモデルが患者由来のＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞（すなわちＢＲ１１２６（ＴＭ０００９８）、ＬＧ１３０６（ＴＭ００３０２））を用いてまた使用可能である。ＢＲ１１２６腫瘍を保有するＨｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧＴＭマウスのＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ及び／又はＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭの活性を、処置後の腫瘍成長又はマウス生存を判断して評価する。加えて、血液及び腫瘍ミクロ環境内のＴ細胞反応の処置依存性変化をこれらのモデルにおいて評価した。ＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ及び／又はＰＤ−１  ＴｘＭ処置後の血液又は腫瘍中のＴ細胞のレベル又は活性（すなわちＩＦＮγ陽性細胞）の増加により、腫瘍保有マウス内のこれらの複合体の免疫刺激性活性の証拠が提供される。併せて、これらの調査はインビボでのヒト腫瘍に対するＰＤ−Ｌ１  ＴｘＭ及び／又はＰＤ−１  ＴｘＭの免疫細胞介在性活性を明らかにする。
【０３１８】
他の実施形態
本発明はその詳細な記載と共に記載されている一方、前述の記載は説明を意図しており、本発明の範囲を限定することを意図しておらず、それは添付の請求項の範囲によって定義される。他の態様、便宜、修正が以下の請求項の範囲内に存在する。
【０３１９】
本明細書に引用される特許文献及び科学文献は、当業者に入手可能である知識を証明する。本明細書に引用されるすべての米国特許及び公開公報又は非公開の米国特許出願は、参照によって組み込まれる。本明細書に引用されるすべての公開された外国特許及び特許出願は、参照によって組み込まれる。本明細書に引用されるアクセッション番号によって示されるＧｅｎｂａｎｋ及びＮＣＢＩ寄託は、参照によって組み込まれる。本明細書に引用されるすべての他の公開文献、文書、原稿、及び科学文献は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３２０】
本発明がその好ましい実施形態に関して詳細に示され記載されている一方で、添付の請求項によって包含される本発明の範囲から逸脱しない限り、形式上及び詳細において多様な変更がなされてもよいことが当業者には理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
2019533449.tif 000336
【図２９】
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【図３０−１】
2019533449.tif 000338
【図３０−２】
2019533449.tif 000339
【図３０−３】
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【図３１】
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【配列表】
2019533449000001.app
【国際調査報告】
2019533449.tif 000342
2019533449.tif 000343
2019533449.tif 000344