(57)【要約】   本発明は、キシロースからポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）とその共重合体生産能を有する組換え微生物に関し、より詳細には、外部からのグリコレート前駆体を供給しなくても、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）およびその共重合体を生産する能力を有する組換え微生物、およびそれを用いたポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）共重合体の製造方法に関する。【選択図】図１
2019503188.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピルビン酸からラクテート生産能を有する微生物に、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子、プロピオニル‐ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子、キシロースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、およびキシロノラクトナーゼをコードする遺伝子が導入されており、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）生産能を有する組換え微生物。
【請求項２】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６‐１９）のＰＨＡ合成酵素、または下記から選択されるアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素の変異酵素であることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物：
配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ、Ｓ４７７Ｆ、Ｓ４７７Ｙ、Ｓ４７７Ｇ、およびＱ４８１Ｋからなる群から選択される１つ以上の変異を含むアミノ酸配列；
配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０ＤおよびＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１２０２）；
配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、およびＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１３０１）；
配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ、およびＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１３１０）；
配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ、およびＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１４３７）；および
配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ、およびＱ４８１Ｒが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１４３９）。
【請求項３】
前記プロピオニル‐ＣｏＡ転移酵素は、配列番号２のアミノ酸配列で表示されるＰｃｔ５４０酵素であることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項４】
ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のクロモソーム上のプロモーターが、ｔｒｃ、 ｔａｃ、 ｐＢＡＤ、ｔｒｐ、 ｌａｃＵＶ５ およびＴ７で構成される群から選択される強力プロモーターで置換されていることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項５】
グルコースＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントをコードする遺伝子が欠失されていることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項６】
アルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子、フマレートレダクターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子、およびピルベートオキシダーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子がさらに欠失されていることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項７】
アルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子、フマレートレダクターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子、ピルベートオキシダーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子およびラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるｄｌｄ遺伝子がさらに欠失されていることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項８】
グルコースＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントをコードする遺伝子、アルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子、フマレートレダクターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子、およびピルベートオキシダーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子がさらに欠失されていることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項９】
グルコースＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントをコードする遺伝子、アルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子、フマレートレダクターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子、ピルベートオキシダーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子 、およびラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるｄｌｄ遺伝子がさらに欠失されていることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
グルコースＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントをコードする遺伝子、アルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子、フマレートレダクターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子、ピルベートオキシダーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるｄｌｄ遺伝子、マレートシンターゼ（ｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子、およびグリコレートオキシダーゼ（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子がさらに欠失されていることを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
βケトチオラーゼ（ｂｅｔａ‐ｋｅｔｏｔｈｉｏｌａｓｅ）をコードする遺伝子およびアセトアセチル‐ＣｏＡレダクターゼ（ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ‐ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子が導入されており、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐３‐ヒドロキシブチレート）生産能を有することを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
グルコースＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントをコードする遺伝子、アルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子、フマレートレダクターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子、およびピルベートオキシダーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子がさらに欠失されていることを特徴とする請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
グルコースＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントをコードする遺伝子、アルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子、フマレートレダクターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子、ピルベートオキシダーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子、およびラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるｄｌｄ遺伝子がさらに欠失されていることを特徴とする請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
グルコースＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントをコードする遺伝子、アルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子、フマレートレダクターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子、ピルベートオキシダーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるｄｌｄ遺伝子、マレートシンターゼ（ｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子、およびグリコレートオキシダーゼ（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子がさらに欠失されていることを特徴とする請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
ＣｏＡ‐依存スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子および４‐ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（４‐ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子がさらに導入されており、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐４‐ヒドロキシブチレート）生産能を有するを有することを特徴とする請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項１６】
グルコースＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントをコードする遺伝子、アルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子、フマレートレダクターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子、およびピルベートオキシダーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子がさらに欠失されていることを特徴とする請求項１５に記載の組換え微生物。
【請求項１７】
グルコースＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントをコードする遺伝子、アルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子、フマレートレダクターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子、ピルベートオキシダーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子、およびラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるｄｌｄ遺伝子がさらに欠失されていることを特徴とする請求項１５に記載の組換え微生物。
【請求項１８】
グルコースＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントをコードする遺伝子、アルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子、フマレートレダクターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子、ピルベートオキシダーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるｄｌｄ遺伝子、マレートシンターゼ（ｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子、およびグリコレートオキシダーゼ（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子がさらに欠失されていることを特徴とする請求項１５に記載の組換え微生物。
【請求項１９】
（ａ） 請求項１〜１０のいずれかに記載のポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）生産能を有する組換え微生物を培養して、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）を生成させるステップと、
（ｂ）前記生成されたポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）を回収するステップと、
を含む、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）の製造方法。
【請求項２０】
（ａ）請求項１１〜１４のいずれかに記載のポリ（ラクテート‐ｃｏ‐３‐ヒドロキシブチレート）生産能を有する組換え微生物を培養して、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐３‐ヒドロキシブチレート）を生成させるステップと
（ｂ）前記生成されたポリ（ラクテート‐ｃｏ‐３‐ヒドロキシブチレート）を回収するステップと、
を含む、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐３‐ヒドロキシブチレート）の製造方法。
【請求項２１】
（ａ）請求項１５〜１８のいずれかに記載のポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐４‐ヒドロキシブチレート）生産能を有する組換え微生物を培養して、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐４‐ヒドロキシブチレート）を生成させるステップと、
（ｂ）前記生成されたポリ（ラクテート‐ｃｏ‐４‐ヒドロキシブチレート）を回収するステップと、
を含む、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐４‐ヒドロキシブチレート）の製造方法。
【請求項２２】
（ａ） 請求項１〜１０のいずれかに記載の組換え微生物をヒドロキシカルボン酸の存在下に培養して、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐ヒドロキシカルボン酸）を生成させるステップと、
（ｂ）前記生成されたポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐ヒドロキシカルボン酸）を回収するステップと、
を含む、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐ヒドロキシカルボン酸）の製造方法。
【請求項２３】
前記ヒドロキシカルボン酸は、２‐ヒドロキシイソバレレート、５‐ヒドロキシバレレート、および６‐ヒドロキシヘキサノエートで構成された群から選択されることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キシロースを単一炭素源として用いるか、またはキシロースとグルコースを同時に炭素源として用いてポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）とその共重合体を生産する能力を有する組換え微生物に関し、より詳細には、外部からのラクテートとグリコレートの前駆体を供給しなくても、（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）共重合体を生産する能力を有する組換え微生物、およびそれを用いた（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）共重合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）［Ｐｏｌｙ（ｌａｃｔａｔｅ‐ｃｏ‐ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）、ＰＬＧＡ］は、ラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）とグリコレート（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）のランダム共重合体であり、代表的な生分解性高分子であって、汎用高分子または医療用高分子として高い応用性を有する高分子である。現在、ＰＬＧＡは、ラクテートとグリコレートとの直接重合反応により製造されているが、前記反応では、主に低分子量（１，０００‐５，０００ダルトン）のＰＬＧＡのみが生成される。１００，０００ダルトン以上の高分子量のＰＬＧＡは、ラクチド（ｌａｃｔｉｄｅ）とグリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）の開環縮合反応により合成されることができる。ラクチドおよびグリコリドはそれぞれ、ラクテートとグリコレートの環状ジエステル（ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｅｓｔｅｒ）であり、それぞれ、ラクテートオリゴマーとグリコレートオリゴマーの熱分解により製造される。開環縮合反応には、２‐エチルヘキサン酸スズ（ｔｉｎ（ＩＩ）２‐ｅｔｈｙｌｈｅｘａｎｏａｔｅ）、スズアルコキシド（ｔｉｎ（ＩＩ）ａｌｋｏｘｉｄｅ）、またはアルミニウムイソプロポキシド（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｉｓｏｐｒｏｐｏｘｉｄｅ）などの触媒の使用が要求される。直接重合により得られた低分子量の高分子から、鎖カップリング剤（ｃｈａｉｎ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を用いてより高い分子量の高分子を重合する方法があるが、このように高分子量のＰＬＧＡを製造する方法は、鎖カップリング剤を用いるため、有機溶剤（ｓｏｌｖｅｎｔ）や鎖カップリング剤の添加により工程が複雑となり、またそれらを除去することが容易ではないという欠点がある。現在商用化されている高分子量のＰＬＧＡの生産工程では、ラクテートとグリコレートをそれぞれラクチドとグリコリドに転換した後、ラクチドとグリコリドの開環縮合反応によりＰＬＧＡを合成する方法が用いられている。
【０００３】
一方、ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ（ＰＨＡ）とは、リン、窒素、マグネシウム、酸素などの栄養分が不足する際に、微生物が余剰炭素源をエネルギーや炭素源貯蔵物質として細胞内部に蓄積するポリエステル（ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ）である。ＰＨＡは、完全な生分解性を有し、且つ既存の石油由来の合成高分子と類似の物性を有することができるため、石油ベースの合成プラスチックを代替する、環境にやさしい物質として取り上げられている。
【０００４】
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、組換え大腸菌などの様々な生物体から生産されることができ、現在まで１５０種程度の様々な単量体がＰＨＡに含まれ得ると知られている。かかるＰＨＡは、短い炭素鎖長さを有するＳＣＬ‐ＰＨＡ（ｓｈｏｒｔ‐ｃｈａｉｎ‐ｌｅｎｇｔｈ  ＰＨＡ）と、長い炭素鎖長さを有するＭＣＬ‐ＰＨＡ（ｍｅｄｉｕｍ‐ｃｈａｉｎ‐ｌｅｎｇｔｈ  ＰＨＡ）とに大別され、ＰＨＡを合成する核心酵素であるＰＨＡ合成酵素は、基質として用いる単量体の種類および酵素を成すサブユニットによって４つの種類に大別される(Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 157:155, 1997; Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 167:89, 1998; Langenbach et al., FEMS Microbiol. Lett., 150:303, 1997; WO 01/55436; US 6,143,952; WO 98/54329; WO 99/61624)。
【０００５】
グリコール酸（ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）は、２個の炭素原子を有する最も単純なヒドロキシカルボン酸であって、自然にグリコール酸を含むＰＨＡに対する報告はない。しかし、ポリラクテートとともに、代表的な合成バイオ高分子として活用度が高いため、ＰＨＡ単量体として挿入しようとする多くの試みがあった。
【０００６】
本発明者らは、以前特許（ＵＳ８，８８３，４６３Ｂ２）にて、グルコースを炭素源として用いてグリオキシレートシャント（ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ  ｓｈｕｎｔ）の代謝回路を操作することで、外部からの前駆体の添加なしにグリコレートを生産する大腸菌を製造しており、ラクテートとグリコレートをそれぞれラクチル‐ＣｏＡとグリコリル‐ＣｏＡに転換する酵素であるクロストリジウム・プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のプロピオニル‐ＣｏＡ転移酵素（Ｐｃｔ）をコードする遺伝子と、ラクチル‐ＣｏＡとグリコリル‐ＣｏＡを基質として用いることができるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素（ＰｈａＣ１）をコードする遺伝子で形質転換された前記組換え大腸菌を培養することで、グルコースからＰＬＧＡが生成されることを確認した。
【０００７】
そこで、本発明者らは、キシロースを主炭素源として用いて、グリコレートを外部から添加しなくてもグリコレート分画の含量が高いＰＬＧＡをさらに高効率で生産できる組換え大腸菌を開発するために鋭意努力した結果、クロストリジウム・プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）のプロピオニル‐ＣｏＡ転移酵素と、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６‐１９のＰＨＡ合成酵素、キシロースデヒドロゲナーゼおよびキシロノラクトナーゼを発現する組換え微生物を製作し、前記微生物が、キシロースを単一炭素源として用いるか、またはキシロースとグルコースを同時に炭素源として用いてポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）とその共重合体を生産することを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、グリコレートの外部添加なしに、高濃度のポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）と様々なポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）共重合体を生産できる組換え微生物を提供するところにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、グリコレートの外部添加なしに、高濃度のポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）と様々なＰＬＧＡ共重合体を生産できる組換え微生物を用いた（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）の製造方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、ピルビン酸からラクチル‐ＣｏＡ生産能を有する微生物に、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子、プロピオニル‐ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子、およびキシロースデヒドロゲナーゼとキシロノラクトナーゼをコードする遺伝子が導入されており、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）生産能を有する組換え微生物、およびそれを用いたポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）の製造方法 を提供する。 
【００１１】
本発明はまた、ピルビン酸からラクチル‐ＣｏＡ生産能を有する微生物に、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子、プロピオニル‐ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子、キシロースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、キシロノラクトナーゼをコードする遺伝子 、βケトチオラーゼ（ｂｅｔａ‐ｋｅｔｏｔｈｉｏｌａｓｅ）をコードする遺伝子およびアセトアセチル‐ＣｏＡレダクターゼ（ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ‐ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子が導入されており、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐３‐ヒドロキシブチレート）生産能を有する 組換え微生物、およびそれを用いたポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐３‐ヒドロキシブチレートの製造方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、ピルビン酸からラクチル‐ＣｏＡ生産能を有する微生物に、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子、プロピオニル‐ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子、キシロースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、キシロノラクトナーゼをコードする遺伝子、ＣｏＡ‐依存スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子および４‐ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（４‐ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子が導入されており、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐４‐ヒドロキシブチレート）生産能を有する組換え微生物およびそれを用いたポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐４‐ヒドロキシブチレートの製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ａは、本発明で製造するＰＬＧＡの化学式を示したものであり、Ｂは、本発明で行った代謝操作によるＰＬＧＡの生産経路を示したものである。
【図２】ＡはｐＴａｃｘｙｌＢＣプラスミド、ＢはｐＴａｃｘｙｌＢＣ＿ｐｈａＡＢプラスミド、ＣはｐＴａｃｘｙｌＢＣ＿ｓ４Ｄプラスミドを示したものである。
【図３】本発明で行った代謝操作による、キシロースを単一炭素源として用いるポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）の生産経路を示したものである。
【図４】本発明で製作された組換え大腸菌が生成するラクテートおよびグリコレート生産能を示したものである。
【図５】本発明で製作された組換え大腸菌が生成するラクテートおよびグリコレート生産能を示したものである。
【図６】本発明で製作された組換え大腸菌Ｘ１７ｌｄ‐ｐから生産されたＰＬＧＡの１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲ分析結果を示したものである。
【図７】本発明で行った代謝操作によるポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐３‐ヒドロキシブチレート）の生産経路を示したものである。
【図８】本発明で行った代謝操作によるポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐４‐ヒドロキシブチレート）の生産経路を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明者らは、グルコースではなくキシロースを主炭素源として用いて、グリコレートを外部から添加しなくても、グリコレート分画の含量が高いＰＬＧＡをさらに高効率で生産できる組換え大腸菌菌体、およびラクテートとグリコレートを含む様々な高分子の生産が可能な大腸菌菌体を開発するために、クロストリジウム・プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）のプロピオニル‐ＣｏＡ転移酵素と、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６‐１９のＰＨＡ合成酵素、キシロースデヒドロゲナーゼおよびキシロノラクトナーゼを導入させ、グルコースＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントをコードする遺伝子（ｐｔｓＧ）、アルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｄｅｈｙｄｅ‐ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子（ａｄｈＥ）、ピルベートホルメートリアーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ‐ｆｏｒｍａｔｅ  ｌｙａｓｅ）をコードする遺伝子（ｐｆｌＢ）、フマレートレダクターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子（ｆｒｄＢ）、ピルベートオキシダーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子（ｐｏｘＢ）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子（ｄｌｄ）、マレートシンターゼ（ｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子（ａｃｅＢ）、グリコレートオキシダーゼ（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子（ｇｌｃＤＥＦＧ）、また他のマレートシンターゼ（ｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子（ｇｌｃＢ）が欠失され、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）のクロモソーム上のプロモーターがｔｒｃプロモーターで置換された場合に、グリコレート分画の含量が高いＰＬＧＡおよびポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐２‐ヒドロキシブチレート）を高濃度で生産できるということを確認した。
【００１５】
また、前記開発された組換え大腸菌菌体から、外部からの前駆体の供給なしに、βケトチオラーゼ（ｂｅｔａ‐ｋｅｔｏｔｈｉｏｌａｓｅ）をコードする遺伝子（ｐｈａＡ）およびアセトアセチル‐ＣｏＡレダクターゼ（ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ‐ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子（ｐｈａＢ）をさらに導入させ、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐３‐ヒドロキシブチレート）を生成するようにし、ＣｏＡ‐依存スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子（ｓｕｃＤ）および４‐ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（４‐ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子（４ｈｂＤ）をさらに導入した時には、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐４‐ヒドロキシブチレート）を生産した。その他にも、外部から前駆体を供給する方法により、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐２‐ヒドロキシイソバレレート）、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐５‐ヒドロキシバレレート）、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐６‐ヒドロキシヘキサノエート）が生産可能であることを確認した。
【００１６】
したがって、本発明は、一観点において、ピルビン酸からラクチル‐ＣｏＡ生産能を有する微生物に、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子、プロピオニル‐ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子、およびキシロースデヒドロゲナーゼとキシロノラクトナーゼをコードする遺伝子が導入されており、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）生産能を有する組換え微生物、およびそれを用いたポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）の製造方法に関する。
【００１７】
本発明において、前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６‐１９）のＰＨＡ合成酵素、または下記から選択されるアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素の変異酵素であることを特徴とする：
配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ、Ｓ４７７Ｆ、Ｓ４７７Ｙ、Ｓ４７７Ｇ、およびＱ４８１Ｋからなる群から選択される１つ以上の変異を含むアミノ酸配列；配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０ＤおよびＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１２０２）；配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、およびＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１３０１）；配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ、およびＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１３１０）；配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ、およびＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１４３７）；および配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ、およびＱ４８１Ｒが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１４３９）。
【００１８】
本発明において、前記キシロースデヒドロゲナーゼとキシロノラクトナーゼをコードする遺伝子は、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ由来であってもよく、前記遺伝子を導入してダムス代謝回路（Ｄａｈｍｓ  ｐａｔｈｗａｙ）を用いるものであってもよい。 
【００１９】
本発明において、前記キシロースデヒドロゲナーゼとキシロノラクトナーゼをコードする遺伝子は、それぞれ 配列番号３および配列番号４の塩基配列を有するものであってもよい。
【００２０】
本発明のポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）の製造方法は、（ａ）前記ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）生産能を有する組換え微生物を培養して、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）を生成させるステップと、（ｂ）前記生成されたポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）を回収するステップと、を含み、前記培養の炭素源としては、キシロースを単独で、またはキシロースとグルコースを同時に供給するものであってもよい。 
【００２１】
本発明者らは、グリコレートの外部添加なしに、キシロースのようなバイオマス由来の炭素源から直ちにＰＬＧＡを生産することができる大腸菌変異体を製作するために、大腸菌菌株の操作を行った。大腸菌ＸＬ１‐Ｂｌｕｅ菌株の場合、グリオキシレート（ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ）を経てグリコレートが生成される代謝回路に該当する遺伝子を有しているが、培養時にグリコレートを自然的に生産しないことを確認した。したがって、グリコレート代謝回路の強化、および代謝流れの最適化を行った。
【００２２】
大腸菌内でグリコレートを生産することができる代謝回路を調べると、ＴＣＡサイクルを成す代謝体であるイソシトレート（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ）がグリオキシレートに転換された後（ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ  ｓｈｕｎｔ）、グリオキシレートがグリオキシレート酵素によってグリコレートに転換されら。すなわち、イソシトレート節で、イソシトレートリアーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｌｙａｓｅ）酵素によりグリオキシレートに転換されるか、イソシトレートデヒドロゲナーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）酵素により２‐ケトグルタレート（２‐ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ）に転換され、ＴＣＡサイクルに流れることになる。このような代謝の流れのメカニズムは、イソシトレートデヒドロゲナーゼのリン酸化／脱リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ／ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）によって活性が調節され、様々なレギュレータ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）によって調節される。かかる代謝回路を用いて、グルコースからＰＬＧＡを生産する試みが行われている（ＵＳ８，８８３，４６３Ｂ２）。
【００２３】
本発明では、キシロースを主炭素源として用いて高濃度のＰＬＧＡを生産する大腸菌を製作しようとしたが、ダムス代謝回路（Ｄａｈｍｓ  ｐａｔｈｗａｙ）と呼ばれるキシロース利用回路からグリコレートが生産されることができるということに着目した。
【００２４】
ダムス代謝回路は、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒのような菌株がキシロースを炭素源として用いる際に、キシロノラクトン（ｘｙｌｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ）、キシロネート（ｘｙｌｏｎａｔｅ）、２‐デヒドロ‐３‐デオキシペントネート（２‐ｄｅｈｙｄｒｏ‐３‐ｄｅｏｘｙ‐ｐｅｎｔｏｎａｔｅ）に順に転換された後、アルドラーゼ（ａｌｄｏｌａｓｅ）酵素によってグリコールアルデヒド（ｇｌｙｃｏｌａｌｄｅｈｙｄｅ）とピルベート（ｐｙｒｕｖａｔｅ）に分けられ、グリコールアルデヒドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）によってグリコレートに転換される（図１のＢ参照）。大腸菌の場合、キシロースを炭素源として用いる際に、トランスポータ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）によって細胞内部に入った後、ダムス代謝回路ではなく、キシロースイソメラーゼ（ｘｙｌｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、キシルロース（ｘｙｌｕｌｏｓｅ）酵素によって転換され、ペントースホスフェート代謝回路（ｐｅｎｔｏｓｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ）を介して代謝される。したがって、ダムス代謝回路を用いる微生物から外来遺伝子を導入して大腸菌内にダムス代謝回路を構築しようとした。大腸菌は、ダムス代謝回路のダウンストリームを成す酵素が存在すると知られているため、アップストリームに該当するキシロースデヒドロゲナーゼ（ｘｙｌｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）およびキシロノラクトナーゼ（ｘｙｌｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ）をＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓのクロモソームから増幅して、ｐＴａｃｘｙｌＢＣプラスミドを製作した。大腸菌ＸＬ１‐Ｂｌｕｅ菌株にｐＴａｃｘｙｌＢＣベクターを形質転換させた後、ＭＲ培地にキシロースを単一炭素源として（２０ｇ／ｌ）培養した結果、０．８９ｇ／Ｌのグリコレートが生産された。
【００２５】
本発明において、前記組換え微生物のラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のクロモソーム上のプロモーターは、ｔｒｃ、 ｔａｃ、 ｐＢＡＤ、ｔｒｐ, ｌａｃＵＶ５ およびＴ７で構成される群から選択される強力プロモーターで置換されているものであってもよい。
【００２６】
本発明で製作された菌株は、生産能が増加するだけでなく、グルコースとキシロースを同時に用いることができて、精製された炭素源ではなく、廃木材、稲わらなどの食用で用いず、且つ地球上で最も豊富なリグノセルロースバイオマス（ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｂｉｏｍａｓｓ）を炭素源として用いることで、バイオマス加水分解物から直ちにＰＬＧＡ高分子を生産することができるため、基質のコストを著しく節約することができる。
【００２７】
本発明において、前記組換え微生物は、グルコースＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントをコードする遺伝子が欠失されているものであってもよい。
【００２８】
本発明において、前記組換え微生物は、アルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ａｄｈＥ）、ピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子（ｐｆｌＢ）、フマレートレダクターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子、およびピルベートオキシダーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子がさらに欠失されているものであってもよい。
【００２９】
本発明において、前記組換え微生物は、また他のラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子であるｄｌｄ遺伝子がさらに欠失されているものであってもよい。
【００３０】
本発明において、前記組換え微生物は、マレートシンターゼ（ｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子およびグリコレートオキシダーゼ（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子がさらに欠失されているものであってもよい。
【００３１】
本発明の一態様において、ＰＬＧＡのさらに他の単量体であるラクテートは、ピルベートを前駆体として作製されるため、ピルベートがそれぞれアセテート、ホルメートに転換され、ラクテートへのフラックスを減少させないことが重要である。したがって、該当遺伝子であるｐｏｘＢ（ピルベートオキシダーゼ、ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）とｐｆｌＢ（ピルベートホルメートリアーゼ、ｐｙｒｕｖａｔｅ‐ｆｏｒｍａｔｅ  ｌｙａｓｅ）を欠失させ、また、可能な副産物であるスクシネートの生産を阻止し、且つラクテートの生産増加に効果があると知られたｆｒｄＢ（フマレートレダクターゼ、ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子も欠失させた。そして、ラクテートとグリコレートがＰｃｔ５４０酵素によってラクチル‐ＣｏＡおよびグリコリル‐ＣｏＡに転換される際に、コエンザイム（Ｃｏｅｎｚｙｍｅ）Ａを提供する役割をするアセチル‐ＣｏＡ（ａｃｅｔｙｌ‐ＣｏＡ）のプールを増やし、大腸菌の発酵副産物であるエタノールの生産を抑えるために、ａｄｈＥ遺伝子も欠失させてＸ１５菌株を製作した。このように完成されたＸ１５菌株は、１．０６ｇ／Ｌのグリコレートを生産した（図３）。
【００３２】
しかし、この場合、ラクテートが生産されなかったため、ラクテートの生産増大のために、ピルベートをラクテートに転換させる酵素であるラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）に該当するｌｄｈＡ遺伝子の既存プロモーターをさらに強いｔｒｃプロモーターで置換させ、Ｘ１５‐ｐ菌株を製作した。その結果、ラクテートの生産量が微量増加して、最大０．０７ｇ／ｌのラクテートが生産されることを確認した（図３）。さらに強いラクテートのフラックスを維持することが、ＰＬＧＡの生産において重要であると考えられ、時間の経過によるラクテートの減少を阻止しようとした。大腸菌は、ｌｄｈＡ以外に、ｄｌｄという他のラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有しているが、これが、ラクテートをさらにピルベートに転換させるのであろうと推測し、該当遺伝子を欠失させてＸ１５ｌｄ菌株を製作した。Ｘ１５ｌｄ菌株の場合、ラクテートの生産量が０．６７ｇ／Ｌと著しく増加しただけでなく、培養時間の経過によって減少する傾向が無くなるとともに、グリコレートも０．９５ｇ／Ｌで生産する菌株が完成された（図３）。
【００３３】
したがって、本発明は、一態様において、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子、プロピオニル‐ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子、およびキシロースデヒドロゲナーゼとキシロノラクトナーゼをコードする遺伝子が挿入され、グルコースＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントをコードする遺伝子（ｐｔｓＧ）、アルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｄｅｈｙｄｅ‐ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子（ａｄｈＥ）、ピルベートホルメートリアーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ‐ｆｏｒｍａｔｅ  ｌｙａｓｅ）をコードする遺伝子（ｐｆｌＢ）、フマレートレダクターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子（ｆｒｄＢ）、ピルベートオキシダーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子（ｐｏｘＢ）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子（ｄｌｄ）、マレートシンターゼ（ｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子（ａｃｅＢ）、グリコレートオキシダーゼ（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子（ｇｌｃＤＥＦＧ）、また他のマレートシンターゼ（ｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子（ｇｌｃＢ）が欠失され、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）のクロモソーム上のプロモーターがｔｒｃプロモーターで置換されているポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）共重合体生産能を有する組換え微生物を製造した。
【００３４】
他の観点において、本発明は、ピルビン酸からラクチル‐ＣｏＡ生産能を有する微生物に、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子、プロピオニル‐ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子、キシロースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、キシロノラクトナーゼをコードする遺伝子、βケトチオラーゼ（ｂｅｔａ‐ｋｅｔｏｔｈｉｏｌａｓｅ）をコードする遺伝子およびアセトアセチル‐ＣｏＡレダクターゼ（ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ‐ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子が導入されており、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐３‐ヒドロキシブチレート）生産能を有する組換え微生物、およびそれを用いたポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐３‐ヒドロキシブチレートの製造方法に関する。
【００３５】
本発明のポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐３‐ヒドロキシブチレート）の製造方法、（ａ）前記ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐３‐ヒドロキシブチレート）生産能を有する組換え微生物を培養して、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐３‐ヒドロキシブチレート）を生成させるステップと、（ｂ）前記生成されたポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐３‐ヒドロキシブチレート）を回収するステップと、を含み、前記培養の炭素源としては、キシロースを単独で、またはキシロースとグルコースを同時に供給するものであってもよい。
【００３６】
本発明において、前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６‐１９）のＰＨＡ合成酵素、または下記から選択されるアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素の変異酵素であることを特徴とする：
配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ、Ｓ４７７Ｆ、Ｓ４７７Ｙ、Ｓ４７７Ｇ、およびＱ４８１Ｋからなる群から選択される１つ以上の変異を含むアミノ酸配列；配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０ＤおよびＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１２０２）；配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、およびＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１３０１）；配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ、およびＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１３１０）；配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ、およびＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１４３７）；および配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ、およびＱ４８１Ｒが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１４３９）。
【００３７】
本発明において、前記プロピオニル‐ＣｏＡ転移酵素は、配列番号２のアミノ酸配列で表示されるＰｃｔ５４０酵素であってもよい。
【００３８】
本発明において、前記組換え微生物は、グルコースＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントをコードする遺伝子、アルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子、フマレートレダクターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子、ピルベートオキシダーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子であるｄｌｄ遺伝子、およびマレートシンターゼ（ｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子およびグリコレートオキシダーゼ（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子で構成された群から選択される遺伝子がさらに欠失されているものであってもよい。
【００３９】
さらに他の観点において、本発明は、ピルビン酸からラクチル‐ＣｏＡ生産能を有する微生物に、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする遺伝子、プロピオニル‐ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子、キシロースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、キシロノラクトナーゼをコードする遺伝子、ＣｏＡ‐依存スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子および４‐ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（４‐ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子が導入されており、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐４‐ヒドロキシブチレート）生産能を有する組換え微生物およびそれを用いたポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐４‐ヒドロキシブチレートの製造方法に関する。
【００４０】
本発明のポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐４‐ヒドロキシブチレート）の製造方法、（ａ） 前記ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐４‐ヒドロキシブチレート）生産能を有する組換え微生物を培養して、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐４‐ヒドロキシブチレート）を生成させるステップと、（ｂ）前記生成されたポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐４‐ヒドロキシブチレート）を回収するステップと、を含み、前記培養の炭素源としては、キシロースを単独で、またはキシロースとグルコースを同時に供給するものであってもよい。 また、培養時にイソロイシンおよび/または前駆体として２‐ヒドロキシイソバレレートを添加してもよい。
【００４１】
本発明において、前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６‐１９）のＰＨＡ合成酵素、または下記から選択されるアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素の変異酵素であることを特徴とする：
配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ、Ｓ４７７Ｆ、Ｓ４７７Ｙ、Ｓ４７７Ｇ、およびＱ４８１Ｋからなる群から選択される１つ以上の変異を含むアミノ酸配列；配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０ＤおよびＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１２０２）；配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、およびＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１３０１）；配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ、およびＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１３１０）；配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ、およびＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１４３７）；および配列番号１のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ、およびＱ４８１Ｒが変異されたアミノ酸配列（ＰｈａＣ１４３９）。
【００４２】
本発明において、前記プロピオニル‐ＣｏＡ転移酵素は、配列番号２のアミノ酸配列で表示されるＰｃｔ５４０酵素であってもよい。
【００４３】
本発明において、前記組換え微生物は、グルコースＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントをコードする遺伝子、アルデヒドアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子、フマレートレダクターゼ（ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子、ピルベートオキシダーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子であるｄｌｄ遺伝子、およびマレートシンターゼ（ｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子およびグリコレートオキシダーゼ（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子で構成された群から選択される遺伝子がさらに欠失されているものであってもよい。
【００４４】
本発明において「欠失」とは、遺伝子の置換、削除、変異により、遺伝子がコードするタンパク質が元の機能をすることができない状態となるように操作することを意味する。
【００４５】
本発明において、グルコースＰＴＳ酵素ＩＩＢＣコンポーネントをコードする遺伝子（ｐｔｓＧ）の 欠失により、キシロースとグルコースが同時に炭素源として用いられるものであってもよい。
【００４６】
本発明において、前記組換え微生物は、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）のクロモソーム上のプロモーターがｔｒｃプロモーターで置換され、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）が欠失されているものであってもよい。
【００４７】
本発明において、前記組換え微生物は、マレートシンターゼ（ｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子（ａｃｅＢ）、グリコレートオキシダーゼ（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子（ｇｌｃＤＥＦＧ）、およびまた他のマレートシンターゼ（ｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子（ｇｌｃＢ）が欠失されているものであってもよい。
【００４８】
本発明では、自然状態では生産されないポリマーであるＰＬＧＡを生産する大腸菌菌株を開発し、大腸菌の代謝経路を操作することで、様々な単量体分画を有するＰＬＧＡを高濃度で生産するようにした。また、本発明は、 外部からの前駆体の供給なしに、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐３‐ヒドロキシブチレート）、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐４‐ヒドロキシブチレート）、およびポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐２‐ヒドロキシブチレート）を生産するステップと、 前記生産されたポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）共重合体を回収するステップと、を含む、 共重合体の製造方法に関する。 
【００４９】
さらに他の観点において、本発明は、（ａ）前記組換え微生物をヒドロキシカルボン酸の存在下に培養して、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐ヒドロキシカルボン酸）を生成させるステップと、（ｂ）前記生成されたポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐ヒドロキシカルボン酸）を回収するステップと、を含む、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐ヒドロキシカルボン酸）の製造方法に関する。
【００５０】
本発明において、前記ヒドロキシカルボン酸は、２‐ヒドロキシイソバレレート、５‐ヒドロキシバレレート、および６‐ヒドロキシヘキサノエートで構成された群から選択されるものであってもよい。
【００５１】
本発明において、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）生産能を有する組換え微生物から様々な前駆体を供給してポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐２‐ヒドロキシイソバレレート、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐５‐ヒドロキシバレレート、およびポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐６‐ヒドロキシヘキサノエートを生産および回収するステップと、を含むポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）製造方法を提供する。
【００５２】
本発明の一態様において、Ｐｃｔ５４０Ｃｐ、ＰｈａＣ１４３７Ｐｓ６‐１９、およびＣ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓのキシロースデヒドロゲナーゼとキシロノラクトナーゼを発現する組換え大腸菌Ｘ１７ｌｄ‐ｐ菌株は、ポリ（６８．４ｍｏｌ％のラクテート‐ｃｏ‐３１．６ｍｏｌ％のグリコレート）を４．５重量％の濃度で生産した。これは、代謝工学的に組換えられた大腸菌でキシロースを主炭素源として用いてポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）を生産した最初の結果である。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００５４】
実施例１：ＰＬＧＡの生産に関与する遺伝子のプラスミドの製作および菌株、培養方法
下記実施例で使用した菌株、プラスミド、およびプライマーを表１および表２に示した。
【００５５】
１‐１：プラスミドｐＴａｃｘｙｌＢＣの製作
ＫＣＴＣから購入したＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ菌株のクロモソームからキシロースデヒドロゲナーゼ（ｘｙｌｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子であるｘｙｌＢ、キシロノラクトナーゼ（ｘｙｌｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ）をコードする遺伝子であるｘｙｌＣがオペロンの形態で存在しているため、ｘｙｌＢＣ遺伝子を、表２に記載のｘｙｌＢＣ＿ＦおよびｘｙｌＢＣ＿Ｒプライマーを用いて同時にＰＣＲにより増幅した後、ｐＴａｃ１５ｋベクター（表１）にＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ制限酵素サイトを用いてクローニングして、ｔａｃプロモーター下で発現するように製作した。
【００５６】
１‐２：プラスミドｐＴａｃｘｙｌＢＣ＿ｐｈａＡＢの製作
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ（ＫＣＴＣ  Ｎｏ．２２４６９）由来のｐｈａＣＡＢオペロンとそのプロモーターをクローニングしたｐＣｎＣＡＢベクターを鋳型として、２つのプライマー（Ｐｃｎｃａｂ＿ｉｎｖＦ、Ｐｃｎｃａｂ＿ｉｎｖＲ）を用いてｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ方法によりｐｈａＣが除去されたｐＣｎＡＢベクターを構築した。ｐＣｎＡＢプラスミドからＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＡ生合成プロモーターとｐｈａＡＢ遺伝子を、２つのプライマー（ｐｈａＡＢ＿Ｆ、ｐｈａＡＢ＿Ｒ）を用いたＰＣＲにより増幅させた後、ＳｐｈＩ制限酵素サイトを用いてｐＴａｃｘｙｌＢＣベクターにクローニングして、ｐＴａｃｘｙｌＢＣ＿ｐｈａＡＢベクターを製作した。
【００５７】
１‐３：プラスミドｐＴａｃｘｙｌＢＣ＿ｓ４Ｄの製作
２つのプライマー（ｓ４Ｄ＿Ｆ、ｓ４Ｄ＿Ｒ  ｐｒｉｍｅｒｓ）を用いて、ｐＴｒｃ９９ｓ４プラスミドからｔｒｃプロモーター‐ｓｕｃＤ‐４ｈｂＤに該当するＤＮＡをＰＣＲにより増幅させた後、ＳｐｈＩ制限酵素サイトを用いてｐＴａｃｘｙｌＢＣプラスミドにクローニングした。
【００５８】
１‐４：培養条件および分析方法
本発明の実施例における組換え大腸菌において、ＰＬＧＡ共重合体を生産するために用いられる１００ｍＭのＭＯＰＳ添加のＭＲ培地は、１Ｌ当たりに、６．６７ｇのＫＨ２ＰＯ４、４ｇの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．８ｇのＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．８ｇのクエン酸、０．８ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１００ｍＭのＭＯＰＳ（３‐ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ‐１‐ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、および５ｍｌの微量金属（ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ）溶液を含有して、前記微量金属（ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ）溶液は、１Ｌ当たりに、０．５ ＭＨＣｌ: １０ ｇ ＦｅＳＯ４・Ｈ２Ｏ、２ｇ ＣａＣｌ２、２．２ｇ  ＺｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．５ｇ  ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１ｇ  ＣｕＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．１ｇ  （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・Ｈ２Ｏ、および ０．０２ｇ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ を含有する。
【００５９】
各菌株培養において、種菌培養は、５ｍＬのＬＢ培地が添加された２５ｍＬのチューブで３０℃で一晩振盪培養し、１ｍＬの培養液を、１０ｇ／Ｌのキシロースと１０ｇ／Ｌのグルコースを含有する１００ｍＭのＭＯＰＳ添加のＭＲ培地１００ｍＬを含有する２５０ｍＬのフラスコに接種し、３０℃で９６時間振盪培養した。
【００６０】
ｔｒｃプロモーターにより調節されるｌｄｈＡ遺伝子の発現のために、ＯＤ６００数値が０．４‐０．６である時に、１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。必要に応じて、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、３０μｇ／ｍＬのカナマイシン、および１０μｇ／ｍＬのチアミンを培地に添加した。
【００６１】
本発明で使用された組換え菌株およびプラスミドの遺伝的特徴を表１に示し、本発明で組換え菌株およびプラスミドの製作に使用されたプライマーを表２に示した。
【００６２】
【表１】
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2019503188.tif 000004
2019503188.tif 000005
【００６３】
【表２】
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2019503188.tif 000008
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【００６４】
キシロースとグルコース、ピルビン酸、酢酸、ギ酸、ラクテート、スクシネートを含む代謝産物は、ＵＶ／ＶＩＳ(Varian ProStar 320, USA) およびｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ(Shodex RI-71, 日本)が装着されたＨＰＬＣ(Varian ProStar 210, USA)により、ＭｅｔａＣａｒｂ  ８７Ｈカラム（３００ｘ７．８ｍＭ）を用いて分析した。細胞の成長は、６００ｎｍの吸光度でＵｌｔｒａｓｐｅｃ  ３００スペクトロメータ(Amersham Bioscience, スウェーデン)を用いて測定した。
【００６５】
細胞中の高分子濃度と成分の分析は、ガスクロマトグラフィー｛Ａｇｉｌｅｎｔ  ７６８３自動インジェクター、水素炎イオン化検出器（ｆｌａｍｅ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）、溶融シリカキャピラリーカラム（ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｃｏｌｕｍｎ、ＡＴＴＭ‐Ｗａｘ、３０ｍ、ＩＤ０．５３ｍｍ、フィルムの厚さ１．２０ｍ、Alltech, Deerfield, IL, USA ）が装着されたＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０Ｎ｝を用いて測定した。
【００６６】
実施例２：ＰＨＡ合成酵素、プロピオニル‐ＣｏＡ転移酵素を発現させた組換え大腸菌菌体でのグリコレートを含む高分子生成の確認
本実施例では、グリコレートを含むＰＨＡ生産組換え大腸菌を製作するために、挿入されるべきの遺伝子を確認した。
【００６７】
クロストリジウム・プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）のプロピオニル‐ＣｏＡ転移酵素において、Ｖ１９３Ａ変異とＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃの４種のサイレント変異を有する酵素（Ｐｃｔ５４０）を選択し、グリコレートがグリコリル‐ＣｏＡに転換されるようにし、該当酵素はｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性測定を行って確認した。
【００６８】
次に、ＰＨＡ合成酵素の選択にあたっては、高いラクテート分画を有するポリ（ラクテート‐ｃｏ‐３‐ヒドロキシブチレート）共重合体を生産するシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６‐１９由来のＰＨＡ合成酵素野生型のＰｈａＣ１と変異酵素５種、PhaC1202 (E130D, Q481K), PhaC1301 (E130D, S325T, Q481K), PhaC1310 (E130D, S477F, Q481K), PhaC1437 (E130D, S325T, S477GおよびQ481K), PhaC1439 (E130D, S325T, S477F, Q481K) テストを行った。グリコレートが細胞中の高分子に合成される程度を確認するために、培地に、前駆体として２ｇ／Ｌの濃度でグルコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）を添加するとともに、ＰＨＡ活性酵素が好む基質である３‐ヒドロキシブチレート‐ＣｏＡを提供することで高分子の生産を促進させるために、２ｇ／Ｌのナトリウム３‐ヒドロキシブチレートを添加した。前記培地で培養された形質転換された組換え大腸菌ＸＬ１‐Ｂｌｕｅ菌株から生産された高分子の分析結果を表３に示した。
【００６９】
【表３】
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【００７０】
前記遺伝子のうち、野生型のＰｈａＣ１を除いた残りの変異酵素に対しては、グリコレートとラクテートが含まれた高分子が生成されることを確認した。この際、ＰｈａＣ１４３７変異酵素の場合、相対的に最も高いグリコレートとラクテートの含量を有する高分子を生成したため、今後の実験は、ＰｈａＣ１４３７を用いて進行した。
【００７１】
実施例３：キシロースを炭素源として用いる大腸菌菌体の代謝操作によるＰＬＧＡの生産
実施例２で、大腸菌ＸＬ１‐Ｂｌｕｅ菌株が、外部から添加したグリコレートを、ＰｈａＣ１４３７とＰｃｔ５４０によって細胞中で高分子に転換させることができることを確認した。したがって、本実施例では、グリコレートの外部添加なしに、キシロースのようなバイオマス由来の炭素源から直ちにＰＬＧＡを生産するために、大腸菌菌株の操作を行った。大腸菌ＸＬ１‐Ｂｌｕｅ菌株の場合、グリオキシレート（ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ）を経てグリコレートが生成される代謝回路に該当する遺伝子を有しているが、培養時にグリコレートを自然的に生産しないことを確認した。したがって、グリコレート代謝回路の強化、および代謝流れの最適化を行った。 
【００７２】
大腸菌内でグリコレートを生産することができる代謝回路を調べると、ＴＣＡサイクルを成す代謝体であるイソシトレート（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ）がグリオキシレートに転換された後（ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ  ｓｈｕｎｔ）、グリオキシレートがグリオキシレート酵素によってグリコレートに転換されら。すなわち、イソシトレート節で、イソシトレートリアーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｌｙａｓｅ）酵素によりグリオキシレートに転換されるか、イソシトレートデヒドロゲナーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）酵素により２‐ケトグルタレート（２‐ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ）に転換され、ＴＣＡサイクルに流れることになる。このような代謝の流れのメカニズムは、イソシトレートデヒドロゲナーゼのリン酸化／脱リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ／ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）によって活性が調節され、様々なレギュレータ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）によって調節される。かかる代謝回路を用いて、グルコースからＰＬＧＡを生産する試みが行われている（ＵＳ８，８８３，４６３Ｂ２）。
【００７３】
本発明では、キシロースを主炭素源として用いて高濃度のＰＬＧＡを生産する大腸菌を製作しようとしたが、ダムス代謝回路（Ｄａｈｍｓ  ｐａｔｈｗａｙ）と呼ばれるキシロース利用回路からグリコレートが生産されることができるということに着目した。
【００７４】
ダムス代謝回路は、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒのような菌株がキシロースを炭素源として用いる際に、キシロノラクトン（ｘｙｌｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ）、キシロネート（ｘｙｌｏｎａｔｅ）、２‐デヒドロ‐３‐デオキシペントネート（２‐ｄｅｈｙｄｒｏ‐３‐ｄｅｏｘｙ‐ｐｅｎｔｏｎａｔｅ）に順に転換された後、アルドラーゼ（ａｌｄｏｌａｓｅ）酵素によってグリコールアルデヒド（ｇｌｙｃｏｌａｌｄｅｈｙｄｅ）とピルベート（ｐｙｒｕｖａｔｅ）に分けられ、グリコールアルデヒドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）によってグリコレートに転換される（図１のＢ参照）。大腸菌の場合、キシロースを炭素源として用いる際に、トランスポータ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）によって細胞内部に入った後、ダムス代謝回路ではなく、キシロースイソメラーゼ（ｘｙｌｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、キシルロース（ｘｙｌｕｌｏｓｅ）酵素によって転換され、ペントースホスフェート代謝回路（ｐｅｎｔｏｓｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ）を介して代謝される。したがって、ダムス代謝回路を用いる微生物から外来遺伝子を導入して大腸菌内にダムス代謝回路を構築しようとした。大腸菌は、ダムス代謝回路のダウンストリームを成す酵素が存在すると知られているため、アップストリームに該当するキシロースデヒドロゲナーゼ（ｘｙｌｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）およびキシロノラクトナーゼ（ｘｙｌｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ）をＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓのクロモソームから増幅して、ｐＴａｃｘｙｌＢＣプラスミドを製作した。大腸菌ＸＬ１‐Ｂｌｕｅ菌株にｐＴａｃｘｙｌＢＣベクターを形質転換させた後、ＭＲ培地にキシロースを単一炭素源として（２０ｇ／ｌ）培養した結果、０．８９ｇ／Ｌのグリコレートが生産された。
【００７５】
ＰＬＧＡのさらに他の単量体であるラクテートは、ピルベートを前駆体として作製されるため、ピルベートがそれぞれアセテート、ホルメートに転換され、ラクテートへのフラックスを減少させないことが重要である。したがって、該当遺伝子であるｐｏｘＢ（ピルベートオキシダーゼ、ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）とｐｆｌＢ（ピルベートホルメートリアーゼ、ｐｙｒｕｖａｔｅ‐ｆｏｒｍａｔｅ  ｌｙａｓｅ）を欠失させ、また、可能な副産物であるスクシネートの生産を阻止し、且つラクテートの生産増加に効果があると知られたｆｒｄＢ（フマレートレダクターゼ、ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子も欠失させた。そして、ラクテートとグリコレートがＰｃｔ５４０酵素によってラクチル‐ＣｏＡおよびグリコリル‐ＣｏＡに転換される際に、コエンザイム（Ｃｏｅｎｚｙｍｅ）Ａを提供する役割をするアセチルＣｏＡ（ａｃｅｔｙｌ‐ＣｏＡ）のプールを増やし、大腸菌の発酵副産物であるエタノールの生産を抑えるために、ａｄｈＥ遺伝子も欠失させてＸ１５菌株を製作した。このように完成されたＸ１５菌株は、１．０６ｇ／Ｌのグリコレートを生産した（図３）。
【００７６】
しかし、この場合、ラクテートが生産されなかったため、ラクテートの生産増大のために、ピルベートをラクテートに転換させる酵素であるラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）に該当するｌｄｈＡ遺伝子の既存プロモーターをさらに強いｔｒｃプロモーターで置換させ、Ｘ１５‐ｐ菌株を製作した。その結果、ラクテートの生産量が微量増加して、最大０．０７ｇ／ｌのラクテートが生産されることを確認した（図３）。さらに強いラクテートのフラックスを維持することが、ＰＬＧＡの生産において重要であると考えられ、時間の経過によるラクテートの減少を阻止しようとした。大腸菌は、ｌｄｈＡ以外に、ｄｌｄという他のラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有しているが、これが、ラクテートをさらにピルベートに転換させるのであろうと推測し、該当遺伝子を欠失させてＸ１５ｌｄ菌株を製作した。Ｘ１５ｌｄ菌株の場合、ラクテートの生産量が０．６７ｇ／Ｌと著しく増加しただけでなく、培養時間の経過によって減少する傾向が無くなるとともに、グリコレートも０．９５ｇ／Ｌで生産する菌株が完成された（図３）。
【００７７】
Ｘ１５ｌｄ菌株にＸｙｌＢＣ、ＰｈａＣ１４３７、Ｐｃｔ５４０を全て発現した結果、全乾燥菌体重量に対して３．１重量％の濃度で高分子が生産され、ラクテートとグリコレートがそれぞれ６３．８ｍｏｌ％、３４．９ｍｏｌ％含まれたＰＬＧＡ類似高分子が生産された（表４）。しかし、予想とは異なって、２‐ヒドロキシブチレート（２‐ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）が微量含まれた高分子が生成されたため、それを解決するために、大腸菌内で２‐ヒドロキシブチレートが生成され得る経路であると考えられる２‐ケトブチレート生合成代謝回路を遮断しようとした。トレオニンを２‐ケトブチレートに転換させる酵素であるトレオニンデヒドラターゼ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をコードする２つの遺伝子（ｉｌｖＡ、ｔｄｃＢ）のうち、好気性培養で主な役割を果たすと知られたｉｌｖＡの場合、イソロイシンによって活性が抑制される（ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）。したがって、前記組換え大腸菌を５ｍＭ濃度のイソロイシンが添加された培地に培養し、その結果、乾燥菌体重量の１．８重量％の濃度に該当する７４．５ｍｏｌ％、２３．７ｍｏｌ％のＰＬＧＡの生産を確認した（表４）。
【００７８】
【表４】
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【００７９】
実施例４：キシロースとグルコースを同時に用いる大腸菌菌体の開発およびＰＬＧＡ生産能の確認
実施例３で言及したように、大腸菌ＸＬ１‐Ｂｌｕｅ菌株を、キシロースデヒドロゲナーゼをコードするｘｙｌＢ遺伝子およびキシロノラクトナーゼをコードするｘｙｌＣ遺伝子で形質転換させて培養した結果、０．８９ｇ／Ｌのグリコレートが生産されたが、この場合、ＸｙｌＢＣを発現しないコントロール菌株に比べて成長速度が遅く、そして細胞密度を示すＯＤ６００値が半分水準に減少する結果を示した。このような細胞成長の阻害問題を解決する方法として、グルコースを追加炭素源として同時に用いるように菌株を操作した。大腸菌は、キシロースとグルコースがともに与えられる場合、炭素カタボライト抑制（ｃａｒｂｏｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）というメカニズムにより、グルコースを先に用いた後、グルコースが全て消耗されてからキシロースを炭素源として用いる。これを克服し、２つの炭素源を同時に用いることができる菌株を開発するために、グルコース輸送システムに関与するｐｔｓＧ遺伝子を大腸菌ＸＬ１‐Ｂｌｕｅ菌株で欠失させ、ＸＢ‐ｐ菌株を製作した。ｐＴａｃｘｙｌＢＣで形質転換させたＸＢ‐ｐ菌株の場合、グルコースとキシロースを同時に用いることができた。また、細胞の成長水準が、ＸｙｌＢＣを発現させない場合と類似の水準に回復された。さらに、グリコレートの生産量も１．８２ｇ／Ｌと著しく増加された。したがって、グルコースを追加炭素源として導入する戦略が効果的であることを確認し、実施例４では、２つの炭素源を用いる菌株を構築してＰＬＧＡ生産能を向上させた。
【００８０】
ＸＢ‐ｐ菌株からｐｏｘＢ（ピルベートオキシダーゼ、ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）、ｐｆｌＢ（ピルベートホルメートリアーゼ、ｐｙｒｕｖａｔｅ‐ｆｏｒｍａｔｅ  ｌｙａｓｅ）、ｆｒｄＢ（フマレートレダクターゼ、ｆｕｍａｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、およびａｄｈＥ遺伝子が欠失されたＸ１５‐ｐ菌株の場合、１．８２ｇ／Ｌのグリコレートを生産し、培養後半に行くに従って減少するが、最大０．９９ｇ／Ｌのラクテートを生産した（図４）。
【００８１】
Ｘ１５‐ｐ菌株を、ＸｙｌＢＣとＰｈａＣ１４３７およびＰｃｔ５４０を全て発現させて培養したが、無視できる程度の非常に微量の高分子のみが生産されることを確認した。グリコレートの場合、培養時間中に一定水準以上に生産が維持された。これに対し、ラクテートの場合、最大０．９９ｇ／ｌで生産されるが、一定時間以後にはさらに減少した。このようなことから、アラクテートへのフラックスの強化が、ＰＬＧＡの生産において重要であると判断された（図４）。
【００８２】
ラクテートの生産増大のために、ピルベートをラクテートに転換させる酵素であるラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子に該当するｌｄｈＡ遺伝子の既存プロモーターがさらに強いｔｒｃプロモーターで置換されたＸ１５ｌ‐ｐ菌株で、ＸｙｌＢＣ発現培養時に最大１．３８ｇ／ｌのラクテートが生産され、ラクテートのフラックスが強化されたことを確認した（図５）が、上記の菌株と同様に、一定時間後には生産されたラクテートがさらに消耗され、培養最後時間には、培地内に残っているラクテートが殆どなかった。しかし、Ｘ１５ｌ‐ｐ菌株にＸｙｌＢＣ、ＰｈａＣ１４３７およびＰｃｔ５４０を全て発現させた場合には、ラクテートとグリコレートからなる高分子を生産することができた。これは、ラクテートが、上記の菌株と同様に特定培養時間後には減少されるが、さらに高い生産量を示すため、高分子が生産されたと考えられる（表５）。
【００８３】
ｄｌｄという他のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子をさらに欠失させたＸ１５ｌｄ‐ｐ菌注の場合、ラクテートの生産量が２．５１ｇ／Ｌと著しく増加しただけでなく、培養時間の経過によって減少する傾向が無くなるとともに、グリコレートも１．４８ｇ／Ｌとやや増加して、両方の化合物を培養時間中に一定濃度以上維持しながら生産する菌株が完成された（図５）。
【００８４】
Ｘ１５ｌｄ‐ｐ菌株にＸｙｌＢＣ、ＰｈａＣ１４３７、Ｐｃｔ５４０を全て発現した結果、全乾燥菌体重量に対して１６．５重量％の濃度で高分子が生産され、ラクテートとグリコレートがそれぞれ７７．６ｍｏｌ％、１９．６ｍｏｌ％含まれたＰＬＧＡ類似高分子が生産された（表５）。しかし、予想とは異なって、２‐ヒドロキシブチレート（２‐ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）が微量含まれた高分子が生成されたため、それを解決するために、大腸菌内で２‐ヒドロキシブチレートが生成され得る経路であると考えられる２‐ケトブチレート生合成代謝回路を遮断しようとした。トレオニンを２‐ケトブチレートに転換させる酵素であるトレオニンデヒドラターゼ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）をコードする２つの遺伝子（ｉｌｖＡ、ｔｄｃＢ）のうち、好気性培養で主な役割を果たすと知られたｉｌｖＡ遺伝子を欠失させて、イソロイシン栄養要求株であるＸ１５ｌｄ‐ｐｉ菌株を製作した。ＰｈａＣ１４３７、Ｐｃｔ５４０、およびＸｙｌＢＣを全て発現させたＸ１５ｌｄ‐ｐｉ菌株の培養結果、２‐ヒドロキシブチレートが含まれていない８９．６ｍｏｌ％のラクテートと１０．２ｍｏｌ％のグリコレートからなるＰＬＧＡを生産することができた（表５）。
【００８５】
【表５】
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【００８６】
実施例５：追加の代謝操作による高いグリコレート含量を有するＰＬＧＡの生産
実施例４で、ＸＬ１‐Ｂｌｕｅから操作された組換えＸ１５ｌ‐ｐ、Ｘ１５ｌｄ‐ｐ菌株を用いて、キシロースおよびグルコースからＰＬＧＡを成功的に生産したが、ラクテートの含量が相対的に高い高分子のみが生成された。したがって、高分子のグリコレートの含量を増加させるために、細胞中のグリコレートの生成を強化させるための操作を行った（図５）。グリオキシレート経路を増加させるために、染色体ＤＮＡにおいて、マレートシンターゼ（ｍａｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子であるａｃｅＢ、グリコレートオキシダーゼ（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子ｇｌｃＤＥＦＧ、およびさらに他のマレートシンターゼをコードする遺伝子ｇｌｃＢがオペロンを成しているため、ｇｌｃＤＥＦＧを一度に欠失させてＸ１７ｌｄ‐ｐ菌株を製作した。Ｘ１７ｌｄ‐ｐ菌株の場合、キシロースデヒドロゲナーゼとキシロノラクトナーゼを発現させた時に、２．３２ｇ／Ｌのグリコレートが生産された。これは、上記の組換え菌株（Ｘ１５ｌｄ‐ｐ）に比べて１．６倍増加したことであり、前記遺伝子の欠失が、グリコレートの増加に効果的であることを示す。大腸菌Ｘ１７ｌｄ‐ｐ菌株に、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素およびプロピオニル‐ＣｏＡ転移酵素、キシロースデヒドロゲナーゼとキシロノラクトナーゼを全て発現させて培養した場合、２つのモノマーの生産比率の変化から予測可能であるように、グリコレートのモル分率が著しく増加して、約４８％のグリコレートを含むＰＬＧＡ類似高分子が１５．０重量％の濃度で生成された（表６）。この場合にも同様に、微量の２‐ヒドロキシブチレートが含まれたため、ｉｌｖＡ遺伝子を欠失させて培養したが、細胞の成長が非常に阻害され、十分な量の高分子が生産されなかった。したがって、他の代案として、ｉｌｖＡを欠失させず、イソロイシンを培地内に添加する方法によりＩｌｖＡの活性を阻害させるために、５ｍＭのイソロイシンを培地に添加して培養した。その結果、細胞の成長が著しく阻害されることがなく、２‐ヒドロキシブチレートが含まれておらず、Ｘ１５ｌｄ‐ｐｉ菌株に比べてグリコレートが著しく増加した、６８．４ｍｏｌ％のラクテートと３１．６ｍｏｌ％のグリコレートからなるＰＬＧＡを成功的に生産することができた（表６）。
【００８７】
【表６】
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【００８８】
実施例６：組換え大腸菌菌体により合成されたＰＬＧＡの特質
本発明で合成された共重合体の単量体の成分分析は、ガスクロマトグラフィおよびＮＭＲにより分析した。重合体は、細胞から有機溶媒抽出方法(Jacquel et al., Biochem Eng J 39:15-27, 2008)により精製した。ポリマーの分子量および熱物性は、ＧＰＣ（ｇｅｌ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）およびＤＳＣ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）を用いてそれぞれ測定した。
【００８９】
大腸菌Ｘ１７ｌｄ‐ｐにより生産されるＰＬＧＡは、５０．３ｍｏｌ％のラクテートと４８．１ｍｏｌ％のグリコレートからなっており、１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲにより、化学的に合成されるＰＬＧＡと同一の構造を有することを確認した（図５）。ＰＬＧＡの６００ＭＨｚ  １Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおいて、ラクテートのオキシメチン（ｏｘｙｍｅｔｈｉｎｅ）プロトン（‐ＯＣＨ‐）は５．２ｐｐｍで、グリコレートのメチルプロトン（‐ＣＨ３）に該当するピークである４．６〜４．９ｐｐｍでピークを確認することができた（図６のＡ）。ＰＬＧＡの１２５ＭＨｚ  １３Ｃ  ＮＭＲスペクトルにおいて、ＧＡ＊‐ＧＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅのカルボニルカーボンのピークは１６９．４ｐｐｍ、ＬＡ＊‐ＬＡ  ａｎｄ  ＬＡ‐ＬＡ＊  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓのカルボニルのピークは１６９．６３ｐｐｍ、ＬＡ＊‐ＧＡ＋ＧＡ‐ＬＡ＊ｓｅｑｕｅｎｃｅｓのカルボニルのピークは１６９．８０ｐｐｍで現われた（図６のＢ）。
【００９０】
ＧＰＣ分析により得られた分子量と、ＤＳＣ分析により得られた熱物性値を表５に示した。分子量は、１５ｋＤａ‐２５ｋＤａの範囲であって、薬物輸送時に多く用いられるＰＬＧＡの分子量に好適であった。ＤＳＣグラフから、溶融温度（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）に該当するピークが観測されず、化学合成により生産されるＰＬＧＡと同一の無定形のＰＬＧＡが生産されることが分かった。ガラス転移温度（ｇｌａｓｓ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｇ）値も４０℃〜４６℃の範囲であって、２ＨＢが微量含まれた場合にも、販売されるＰＬＧＡと同様の範囲の温度値を示した（表７）。
【００９１】
【表７】
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【００９２】
実施例７：ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐３‐ヒドロキシブチレート）を生成する組換え微生物菌株の製作
３‐ヒドロキシブチレートは最もよく知られたＰＨＡ単量体であって、ポリ３‐ヒドロキシブチレートの生合成代謝回路を導入することで、ラクテートとグリコレート、３‐ヒドロキシブチレートからなる新規高分子を生成する微生物菌株を開発しようとした（図７）。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のβケトチオラーゼをコードする遺伝子であるｐｈａＡおよびアセトアセチル‐ＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子であるｐｈａＢをクローニングしたｐＴａｃｘｙｌＢＣ＿ｐｈａＡＢ（表１）プラスミドおよびｐＰｓ６１９Ｃ１４３７Ｐｃｔ５４０プラスミドを、Ｘ１５ｌｄ‐ｐ、Ｘ１７ｌｄ‐ｐ菌株にそれぞれ形質転換させた。前記菌株を、５ｍＭのイソロイシンが添加された１００ｍＭのＭＯＰＳ添加のＭＲ培地で９６時間培養した結果、組換え大腸菌Ｘ１５ｌｄ‐ｐ菌株の場合、ポリ（５１．９ｍｏｌ％のラクテート‐ｃｏ‐７．３ｍｏｌ％のグリコレート‐ｃｏ‐４０．８ｍｏｌ％の３‐ヒドロキシブチレート）を２９．５重量％の濃度で生産し、Ｘ１７ｌｄ‐ｐ菌株の場合、ポリ（６３．３ｍｏｌ％のラクテート‐ｃｏ‐１３．２ｍｏｌ％のグリコレート‐ｃｏ‐２３．５ｍｏｌ％の３‐ヒドロキシブチレート）を２０．０重量％の濃度で生産した。
【００９３】
実施例８：ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート‐ｃｏ‐４‐ヒドロキシブチレート）を生成する組換え微生物菌株の製作
外部からの前駆体の提供なしに４‐ヒドロキシブチレートを生産するために、ＣｏＡ‐依存スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＣｏＡ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子であるｓｕｃＤおよび４‐ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（４‐ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子である４ｈｂＤをＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉのクロモソームから増幅して、ｐＴａｃｘｙｌＢＣ＿ｓ４Ｄプラスミドを製作した（表１）。ｐＴａｃｘｙｌＢＣ＿ｓ４ＤプラスミドおよびｐＰｓ６１９Ｃ１４３７Ｐｃｔ５４０プラスミドで形質転換させた組換え大腸菌Ｘ１７ｌｄ‐ｐ菌株を、５ｍＭのイソロイシン、１００ｍＭのＭＯＰＳが添加されたＭＲ培地で培養しながら、１０ｇ／Ｌのキシロースと１０ｇ／Ｌのグルコースを炭素源として前記培地に供給して９６時間培養した結果、ポリ（６１．２ｍｏｌ％のラクテート‐ｃｏ‐３８．４ｍｏｌ％のグリコレート‐ｃｏ‐０．４ｍｏｌ％の４‐ヒドロキシブチレート）が７．３重量％の濃度で生成された。４‐ヒドロキシブチレート分画を増加させるために、スクシネートセミアルデヒドをスクシネートに転換し、４Ｈｂｄと競争関係にあるスクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする２つの遺伝子であるｙｎｅＩおよびｇａｂＤをＸ１７ｌｄ‐ｐ菌株から欠失させ、Ｘ１７ｌｄ‐ｐｙｇ菌株を製作した（表１および図８）。Ｘ１７ｌｄ‐ｐｙｇ菌株にＰｈａＣ１４３７、Ｐｃｔ５４０、ＸｙｌＢＣ、ＳｕｃＤ、および４ＨｂＤを全て発現させ、前記培養条件で培養した結果、１３．８重量％の濃度を有するポリ（６７．１ｍｏｌ％のラクテート‐ｃｏ‐２３．８ｍｏｌ％のグリコレート‐ｃｏ‐９．１ｍｏｌ％の４‐ヒドロキシブチレート）が生産された。この際、４‐ヒドロキシブチレートの含量が９．１ｍｌ％と著しく増加し、ｙｎｅＩとｇａｂＤの２つの遺伝子の欠失が、４‐ヒドロキシブチレートのフラックスの増加に効果的であることを確認した。
【００９４】
実施例９：ＰＬＧＡ生産組換え微生物菌株を用いた、ラクテートとグリコレートを含む様々な共重合体の製造
実施例７および実施例８で製造した３‐ヒドロキシブチレートおよび４‐ヒドロキシブチレートの他にも、様々なヒドロキシカルボン酸を含む共重合体を製造するために、２‐ヒドロキシイソバレレート（２‐ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ）、５‐ヒドロキシバレレート（５‐ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ）、および６‐ヒドロキシヘキサノエート（６‐ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏａｔｅ）を選択した。
【００９５】
ｐＴａｃｘｙｌＢＣとｐＰｓ６１９Ｃ１４３７Ｐｃｔ５４０プラスミドで形質転換された組換え大腸菌Ｘ１７ｌｄ‐ｐ菌株の場合、５ｍＭのイソロイシンが添加された培地で、前駆体として２ｇ／Ｌ濃度の２‐ヒドロキシイソバレレートを添加して培養した際に、ポリ（５３．６ｍｏｌ％のラクテート‐ｃｏ‐２３．３ｍｏｌ％のグリコレート‐ｃｏ‐２３．１ｍｏｌ％の２‐ヒドロキシイソバレレート）２０．８重量％の濃度で生成した。
【００９６】
前記組換え菌株に対して、前駆体として２ｇ／Ｌ濃度のナトリウム５‐ヒドロキシバレレートを添加して培養した結果、ポリ（６９．２ｍｏｌ％のラクテート‐ｃｏ‐２４．７ｍｏｌ％のグリコレート‐ｃｏ‐６．１ｍｏｌ％の５‐ヒドロキシバレレート）が１６．７重量％で生産された。また、前記菌株の場合、２ｇ／Ｌ濃度の６‐ヒドロキシヘキサノエートを前駆体として添加した場合、ポリ（７６．４ｍｏｌ％のラクテート‐ｃｏ‐２２．０ｍｏｌ％のグリコレート‐ｃｏ‐１．６ｍｏｌ％の６‐ヒドロキシヘキサノエート）が１６．５重量％の濃度で生成された。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明によると、外部からラクテートとグリコレート前駆体を供給しなくても、ポリ（ラクテート‐ｃｏ‐グリコレート）およびその共重合体を高濃度で 製造することができる。
【００９８】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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