(57)【要約】  ウイルス負荷の低下において有効な高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）を現在受容しているＨＩＶ感染個体をリクルートし、第１ａ相、第１ｂ相、および第１ｃ相において遺伝子編集または遺伝子切断系治療剤を個体に投与し、個体の細胞からのＨＩＶウイルスゲノム切断を確認するためのアッセイを実施することにより、ヒトにおけるＨＩＶを治療するための遺伝子編集または遺伝子切断系について臨床試験を実施する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおけるＨＩＶを治療するための遺伝子編集または遺伝子切断系について臨床試験を実施する方法において、
ウイルス負荷の低下に有効な高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）を現在受容しているＨＩＶ感染個体をリクルートするステップと、
第１ａ相、第１ｂ相、および第１ｃ相臨床試験において遺伝子編集または遺伝子切断系治療剤を前記個体に投与するステップと、
前記個体の細胞からのＨＩＶウイルスゲノム切断を確認するためのアッセイを実施するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記遺伝子編集または遺伝子切断系が、ＣＲＩＳＰＲ系であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、前記遺伝子編集または遺伝子切断系が、ＥＢＴ１０１であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法において、前記ＣＲＩＳＰＲ系が、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１からなる群から選択されるヌクレアーゼを含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記遺伝子編集または遺伝子切断系が、アルゴノート系であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、前記アルゴノート系が、ナトロノバクテリウム・グレゴリイ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ）アルゴノート（ＮｇＡｇｏ）であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、ウイルス複製が無いこと、ウイルス負荷が無いこと、および健常ＣＤ４Ｔ細胞数を計測することにより、ウイルス負荷の低下に有効なＨＡＡＲＴを受容している前記個体を決定することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、前記ＨＡＡＲＴが、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、融合阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、ＣＣＲ５アンタゴニスト、およびそれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、前記個体が、前記臨床試験全体にわたりＨＡＡＲＴを受け続けることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、第１ａ相が、最大３つの異なる用量の前記遺伝子編集または遺伝子切断系により治療される６〜１８人の個体を含むものとさらに定義されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記アッセイ実施ステップが、ＰＣＲアッセイを実施し、安全性および忍容性ならびにウイルスＤＮＡ切断の効力および精度を決定するものとさらに定義されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、第１ｂ相が、単回低用量、単回高用量、１〜５日間の時間で分ける２回の用量、およびプラセボの４つの等しいコホートで治療される最大３２人の個体を含むものとさらに定義されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記アッセイ実施ステップが、ＰＣＲアッセイにより血液白血球除去試料をＨＩＶゲノムの適切な切断について試験するものとさらに定義されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、前記遺伝子編集または遺伝子切断系の最適用量を決定するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法において、第１ｃ相が、プラセボの１２〜１６人の個体、最適用量の６〜８人、および前記第１ｂ相の最適用量よりも０．５ｌｏｇ高い用量における６〜８人の個体の３つのコホートにおける２４〜３２人の個体を含むものとさらに定義されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、前記アッセイ実施ステップが、ＰＣＲアッセイにより血液白血球除去試料をＨＩＶゲノムの適切な切断について試験するものとさらに定義されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法において、前記アッセイ実施ステップが、ＧＩ管粘膜リンパ節生検物におけるＨＩＶゲノム切断についての試験および血液白血球除去によるＨＩＶゲノム切断についての循環Ｔ細胞の試験からなる群から選択される試験により前記個体の細胞からのＨＩＶウイルスゲノム切断を確認するものとさらに定義されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法において、前記アッセイ実施ステップが、ＨＩＶの存在を示すバイオマーカーまたは代謝産物を検出する前記遺伝子編集または切断治療剤の有効性を決定するための診断パネルを使用するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法において、前記診断パネル使用ステップが、前記個体から試料を採取し、ＨＩＶを示す少なくとも１つのバイオマーカーを含む前記診断パネルに前記試料をアプライし、少なくとも１つのバイオマーカーの存在を検出し、前記バイオマーカーのレベルをベースラインと比較し、前記遺伝子編集または遺伝子切断系治療剤が前記ＨＩＶを抑止し、または予防するように機能しているか否かを決定するものとさらに定義されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法において、前記バイオマーカーが、１，３−ジメチルウレート、レボグルコサン、１−メチルニコチンアミド、メタボライト１、２−ヒドロキシイソブチレート、２−オキソグルタレート、３−アミノイソブチレート、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシイソバレレート、３−インドキシルスルフェート、４−ヒドロキシフェニルアセテート、４−ヒドロキシフェニルラクテート、４−ピリドキセート、アセテート、アセトアセテート、アセトン、アジペート、アラニン、アラントイン、アスパラギン、ベタイン、カルニチン、シトレート、クレアチン、クレアチニン、ジメチルアミン、エタノールアミン、ホルメート、フコース、フマレート、グルコース、グルタミン、グリシン、メタボライト２、メタボライト３、ヒプレート、ヒスチジン、ヒポキサンチン、イソロイシン、ラクテート、ロイシン、リジン、マンニトール、メタボライト４、メタボライト５、メタボライト６、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、Ｏ−アセチルカルニチン、パントテネート、プロピレングリコール、ピログルタメート、ピルベート、キノリネート、セリン、スクシネート、スクロース、メタボライト７、タウリン、トレオニン、トリゴネリン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、トリプトファン、チロシン、ウラシル、尿素、バリン、キシロース、シス−アコニテート、ミオ−イノシトール、トランス−アコニテート、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、アスコルベート、フェニルアセチルグルタミン、４−ヒドロキシプロリン、グルコネート、ガラクトース、ガラクチトール、ガラクトネート、ラクトース、フェニルアラニン、プロリンベタイン、トリメチルアミン、ブチレート、プロピオネート、イソプロパノール、マンノース、３−メチルキサンチン、エタノール、ベンゾエート、グルタメート、グリセロール、グアノシン、グアニン、キサンチン、尿酸、アデノシン、イノシン、イノシン酸、ＣＯ２、Ｈ２Ｏ、Ｎ−カルバモイル−β−アラニン、ベータ−アラニン、アンモニア、β−アミノイソブチレート、プトレスシン、スペルミジン、スペルミン、メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、脱カルボキシル化Ｓ−アデノシルメチオニン、アルギニン、オルニチン、プトレスシン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ１−アセチルスペルミン、ｅｌＦ５Ａ（Ｌｙｓ）、ｅｌＦ５Ａ（Ｄｈｐ）、ｅｌＦ５Ａ（Ｈｐｕ）、Ｎ１Ｎ２−ジアセチルスペルミン、３−アミノプロパナール、３−アセチルアミノプロパナール、アクロレイン、ＦＤＰ−リジンタンパク質、トレオ−Ｄｓ−イソシトレート、オキサロ−スクシネート、２−オキソ−グルタレート、オキサロ−アセテート、Ｌ−グルタメート、２−ヒドロキシ−グルタレート、アセチル−ＣｏＡ、シス−アコニテート、Ｄ−イソシトレート、α−ケトグルタレート、スクシニル−ＣｏＡ、マレート、（−）Ｏ−アセチル−カルニチン、イタコネート、グリコレート、グリオキシレート、オキサレート、オキサリル−ＣｏＡ、ホルミル−ＣｏＡ、グルコース６−ホスフェート（Ｇ６Ｐ）、フルクトース６−ホスフェート（Ｆ６Ｐ）、フルクトース１，６−ビスホスフェート（Ｆ１，６ＢＰ）、グリセルアルデヒド３−ホスフェート（ＧＡＤＰ）、ジヒドロキシアセトンホスフェート（ＤＨＡＰ）、１，３−ビスホスホグリセリン酸（１，３ＢＰＧ）、３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）、２−ホスホグリセリン酸（２ＰＧ）、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン、Ｄ−グルコネート、α−Ｄ−マンノース６−Ｐ、Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ソルビトール、グリセロン−Ｐ、ｓｎ−グリセロール−３Ｐ、Ｄ−グリセルアルデヒド、１，２プロパン−ジオール、２−ヒドロキシプロピオンアルデヒド、３−Ｐセリン、３−Ｐ−ヒドロキシピルベート、Ｄ−グリセレート、ヒドロキシピルベート、Ｌ−アラニン、Ｌ−アラニル−ｔＲＮＡ、Ｌ−グルタメート、２−オキソグルタレート、Ｌ−ラクテート、Ｄ−ラクテート、アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、アデノシンジホスフェート（ＡＤＰ）、Ｈ＋、スクシネート、Ｏ２、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ、６−ホスホグルコノラクトン、６−ホスホグルコネート、リブロース−５−ホスフェート、リボース−５−ホスフェート、キシルロース−５−ホスフェート、グリセルアルデヒド３−ホスフェート、セドヘプツロース７−ホスフェート、フルクトース６−ホスフェート、エリスロース４−ホスフェート、キシルロース５−ホスフェート、Ｄ−リブロース、Ｄ−リビトール、Ｄ−リボース、Ｌ−リブロース、セドヘプツロース１，７Ｐ２、３−オキソ−６−Ｐ−ヘキスロース、Ｌ−オルニチン、カルバモイルホスフェート、Ｌ−シトルリン、アルギニノスクシネート、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパルテート、アデノシンモノホスフェート（ＡＭＰ）、ピロホスフェート、トランス−Δ２−エノイル−ＣｏＡ、Ｌ−β−ヒドロキシアシルＣｏＡ、β−ケトアシルＣｏＡ、ＦＡＤＨ２、アシル−ＣｏＡ、プロピオニル−ＣｏＡ、イノシンモノホスフェート（ＩＭＰ）、キサントシンモノホスフェート（ＸＭＰ）、グアノシンモノホスフェート（ＧＭＰ）、キサントシン、アデニロスクシネート、ウリジン、ウリジンモノホスフェート（ＵＭＰ）、チミジン、チミン、デオキシリボース−１−ホスフェート、デオキシチミジンモノホスフェート（ｄＴＭＰ）、デオキシシチジン、デオキシシチジンモノホスフェート（ｄＣＭＰ）、レチニルパルミテート、パルミテート、パルミチル−ＣｏＡ、レチノエート、β−グルクロニド、レチナール、β−カロテン、レチノイン酸、カルシジオール、２５−ヒドロイエルゴカルシフェロール、カルシトリオール、メチルコバラミン、５’−デオキシアデノシルコバラミン、α−ＣＥＣＨ、ＮＨ４＋、α−ケトグルタレート、オキサロアセテート、グルタメートγ−セミアルデヒド、Δ１−ピロリン−５−カルボキシレート、シトルリン、ＮＨ３、Ｎ５，Ｎ１０−メチレンＴＨＦ、３−ホスホグリセレート、α−ケトブチレート、α−アミノ−β−ケトブチレート、アミノアセトン、システインスルフィネート、β−スルフィニルピルベート、ビスルファイト、スルファイト、スルフェート、グルタチオン、ヒポタウリン、アデノシン５’−ホスホスルフェート、３’−ホスホアデノシン５’−ホスホスルフェート、ホモシステイン、α−ケト−β−メチルバレレート、α−ケトイソカプロエート、α−ケトイソバレレート、α���メチルブチリル−ＣｏＡ、チグリル−ＣｏＡ、３−メチル−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、２−メチルアセトアセチル−ＣｏＡ、イソバレリル−ＣｏＡ、３−メチルクロトニル−ＣｏＡ、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、アセトアセテート、イソブチリルＣｏＡ、メタクリリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ、メチルマロン酸セミアルデヒド、ｐ−ヒドロキシフェニルピルベート、ホモゲンチセート、４−マレイルアセトアセテート、４−フマリルアセトアセテート、フマレート、３−ヒドロキシトリメチルリジン、４−Ｎ−トリメチルアミノブチルアルデヒド、γ−ブチロベタイン、ウロカネート、４−イミダゾロン−５−プロピオネート、Ｎ−ホルムイミドイル−Ｌ−グルタメート、Ｎ５−ホルムイミノ−テトラヒドロホレート、ヒスタミン、Ｎ−ホルミル−キヌレニン、キヌレニン、キヌレネート、３−ヒドロキシキヌレニン、アントラニレート、３−ヒドロキシアントラニレート、グルタリル−ＣｏＡ、アセトアセチル−ＣｏＡ、およびそれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１８に記載の方法において、前記バイオマーカーを、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー−質量分析、ガスクロマトグラフィー−質量分析、高速液体クロマトグラフィー−質量分析、キャピラリー電気泳動−質量分析、核磁気共鳴分光分析（ＮＭＲ）、ラマン分光分析、および赤外線分光分析からなる群から選択される方法により検出することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全性および忍容性を決定する一方、作用機序の確認を得、さらに後続の臨床試験の設計をガイドするための投与情報を得る目的で臨床試験を実施する方法に関する。より具体的には、本発明は、遺伝子治療薬による臨床試験を実施する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト参加者による臨床試験はＦｅｄｅｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）により、それが医学的治療の安全性および有効性を承認するために要求される。臨床試験は、全ての新たな薬物、生物製剤、遺伝子療法、栄養補助食品、および医療機器について要求される。一般に、最初に小規模の予備試験が実施され、続いて大規模な試験が実施される。ヒト参加者は、通常、治療のために新たな治療が設計されるいくらかの医学的病態を罹患している。新たな治療の利益がリスクを上回ることが見出された場合、ＦＤＡはその新たな治療をその使用目的について承認する。
【０００３】
これまで多くの遺伝子治療薬が臨床試験において試験されているが、ＦＤＡにより遺伝子治療薬は承認されていない。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（クラスター化された規則的に間隔が空いた短鎖回文反復配列（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ））についての最初の臨床試験の開始が、ＣＲＩＳＰＲがヒトにおける使用に安全であるか否かを決定するために近年承認されたばかりである。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼの使用により生物体のゲノムを挿入し、欠失させ、またはそうでなければ突然変異させるために使用することができる微生物体に由来する遺伝子編集系である。３つのタイプ（Ｉ〜ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲ系が同定されている。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー、先行可動エレメントに相補的な配列を含有する。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、転写され、成熟ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔が空いた短鎖回文反復配列）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされる。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に属し、標的ＤＮＡの切断を許容する強力なエンドヌクレアーゼ活性を有する。Ｃａｓ９は、約２０塩基対（ｂｐ）のユニーク標的配列（スペーサーと呼ばれる）を含有する成熟ｃｒＲＮＡと、プレｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼＩＩＩ補助プロセシングのガイドとして機能するトランス活性化小分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とによりガイドされる。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖は、Ｃａｓ９をｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、標的ＤＮＡ上の相補的配列（プロトスペーサーと呼ばれる）との間の相補的塩基対合を介して標的ＤＮＡに配向する。Ｃａｓ９は、トリヌクレオチド（ＮＧＧ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識して切断部位（ＰＡＭから３番目のヌクレオチド）を規定する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは別個に発現させることができ、または人工融合小分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）中に合成ステムループ（ＡＧＡＡＡＵ）を介して遺伝子操作して天然ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を模倣することができる。このようなｓｇＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡは、直接的なＲＮＡ形質移入のために合成することができ、もしくはインビトロで転写させることができ、またはＵ６もしくはＨ１プロモーター駆動ＲＮＡ発現ベクターから発現させることができるが、人工ｓｇＲＮＡの開裂効率は別個に発現されるｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを用いる系のものよりも低い。ＣＲＩＳＰＲおよびＣＲＩＳＰＲ様技術を研究する他の会社、例として、ＣＲＩＳＰＲ  Ｉｎｃ．（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｅｄｉｔａｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）、およびＣａｒｉｂｏｕ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  ＣＡ）は、ウイルスゲノムの大きなセグメントの欠失とは対照的に規定の遺伝子編集を作出し、または遺伝子発現を遮断するためにそれらの技術を利用している。
【０００４】
ＣＲＩＳＰＲは、ウイルスを不活性化させることにより、または宿主のＤＮＡからウイルスゲノムを欠失させることにより、多くの異なるウイルスの治療において使用することができる。例えば、Ｋｈａｌｉｌｉ，ｅｔ  ａｌ．の米国特許出願第１４／８３８，０５７号明細書は、レトロウイルスが潜伏感染した宿主細胞のゲノム中に組み込まれたプロウイルスＤＮＡを不活性化させる方法において、クラスター化された規則的に間隔が空いた短鎖回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ、および２つ以上の異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物により宿主細胞を処理するステップ（少なくとも２つのｇＲＮＡのそれぞれは、プロウイルスＤＮＡの長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）中の異なる標的核酸配列に相補的である）；およびプロウイルスＤＮＡを不活性化させるステップを含む方法を開示している。好ましくは、不活性化されるプロウイルスＤＮＡは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。
【０００５】
特にＨＩＶの治療剤としてのＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系についての臨床試験設計が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ウイルス負荷の低下において有効な高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）を現在受容しているＨＩＶ感染個体をリクルートし、第１ａ相、第１ｂ相、および第１ｃ相において遺伝子編集または遺伝子切断系治療剤を個体に投与し、個体の細胞からのＨＩＶウイルスゲノム切断を確認するためのアッセイを実施することにより、ヒトにおけるＨＩＶを治療するための遺伝子編集または遺伝子切断系について臨床試験を実施する方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、ヒトにおけるＨＩＶを治療するための遺伝子編集または遺伝子切断系について臨床試験を実施する方法を提供する。本方法は、高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）を現在受容しており、それに対して十分に応答している（すなわち、それがウイルス負荷の低下において有効である）ＨＩＶ感染個体をリクルートすること、第１ａ相、第１ｂ相、および第１ｃ相において遺伝子編集または遺伝子切断系治療剤を個体に投与すること、ならびに個体の細胞からのＨＩＶウイルスゲノム切断を確認するためのアッセイを実施することを含む。
【０００８】
好ましくは、（限定されるものではないが）、遺伝子編集または遺伝子切断系は、ＣＲＩＳＰＲ系またはアルゴノート系であり、宿主細胞からＨＩＶのゲノム全体を有効に切断する。最も好ましくは、治療剤は、ＥＢＴ１０１（３’および５’ＬＴＲ（長鎖末端反復配列配列）のＵ３領域を標的化する少なくとも２つのｇＲＮＡを使用するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系）、ならびにＨＩＶ−１のプロウイルスおよび組み込まれていないウイルスのＧａｇおよびＰｏｌ遺伝子である。
【０００９】
本明細書において使用される「ヌクレアーゼ」は、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を開裂し得る酵素を指す。
【００１０】
ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）もしくはＣｐｆ１ヌクレアーゼ、または標的ＤＮＡもしくはＲＮＡを標的化し、遺伝子全体または遺伝子クラスターの付加、欠失、突然変異、および好ましくは、切断を行い得る任意の他の好適なヌクレアーゼを使用し得る。
【００１１】
アルゴノート系は、ガイドＲＮＡまたはガイドＤＮＡに相補的な任意の配列を開裂し得るＲＮＡガイド型またはＤＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ酵素である。アルゴノートタンパク質は、ＰＩＷＩ（Ｐエレメント誘導精巣機能不全（Ｐ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｉｍｐｙ  ｔｅｓｔｉｓ））ドメイン、ＭＩＤ（中間）ドメイン、ＰＡＺ（Ｐｉｗｉ−アルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）−Ｚｗｉｌｌｅ）ドメイン、およびＮ末端ドメインを含有するＰＩＷＩタンパク質スーパーファミリーのタンパク質である。アルゴノートタンパク質は、小分子ＲＮＡ、例えば、マイクロＲＮＡ、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびＰｉｗｉ相互作用ＲＮＡに結合し得る。アルゴノートタンパク質は、それらのＲＮＡにより標的配列にガイドさせて標的配列においてｍＲＮＡを開裂し、翻訳を阻害し、またはｍＲＮＡ分解を誘導することができる。ナトロノバクテリウム・グレゴリイ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ）アルゴノート（ＮｇＡｇｏ）は、ヒト細胞におけるゲノム編集に好適なＤＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである。
【００１２】
本方法は、第１相の終了まで拡張して現在の臨床試験において使用される既存の標準的ＰＣＲアッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイにより安全性、忍容性、および有効な切断／欠失の作用機序を確立する。質量分析／ＮＭＲ診断アッセイに基づく生化学的メタボロミクスを、標準的ＰＣＲアッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイと並行して使用してメタボロミクスアッセイが独立した併用診断物としての将来的使用についての感度、特異度、選択性、堅牢性および正確性を増加させたことをバリデートすることができる。このアッセイはさらに以下に記載される。
【００１３】
これらの試験は、（１）ウイルス複製が無いこと、（２）ウイルス負荷が無いこと、および（３）健常ＣＤ４Ｔ細胞数により計測してＨＡＡＲＴ（高活性抗レトロウイルス療法）に十分に応答している（すなわち、ＨＡＡＲＴ治療が有効である）ＨＩＶ感染個体をリクルートし得る。個体が現在受けているＨＡＡＲＴ治療は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、融合阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、ＣＣＲ５アンタゴニスト、またはそれらの組合せであり得る。
【００１４】
第１ａ相は、最大３つの異なる用量の治療剤（ＥＢＴ１０１）により治療される６〜１８人の個体を含む。この第１ａ相試験のエンドポイントは、分子バイオマーカー分析（ＰＣＲアッセイ）により指標付与されるとおり（ｉ）安全性および忍容性ならびに（ｉｉ）ウイルスＤＮＡ切断の効力および精度を含む。分子アッセイは、非臨床表現型依存的にＣＲＩＳＰＲ治療薬の効力に関する情報を提供する。この効力データを使用して第１ｂ相試験の設計をガイドする。
【００１５】
第１ｂ相は、４つの等しいコホート：（ｉ）単回低用量、（ｉｉ）単回高用量（低用量を０．５〜１ｌｏｇ上回る）、（ｉｉｉ）１〜５日間の時間で分ける２回の用量、および（ｉｖ）プラセボで治療される最大３２人の個体を含む。前述のとおり、安全性および忍容性はプライマリーエンドポイントであり、ＰＣＲアッセイを使用して血液白血球除去試料をＨＩＶゲノムの適切な切断について試験することができる。これらの試験により最適用量を決定することができる。第１ｃ相は、３つのコホート：（１）プラセボの１２〜１６人、（２）最適用量（第１ｂ相から）の６〜８人および（３）第１ｂ相の最適用量よりも０．５ｌｏｇ高い用量における６〜８人における２４〜３２人の個体においてＥＢＴ１０１を試験する。前述のとおり、安全性および忍容性はプライマリーエンドポイントである。ＰＣＲアッセイを使用して血液白血球除去試料をＨＩＶゲノムの適切な切断について試験することができる。遺伝子編集または遺伝子切断治療剤の有効性の分析において、種々のアッセイを実施して試験における個体の細胞からのＨＩＶウイルスゲノム切断を確認することができる。ＧＩ管粘膜リンパ節生検物を採取してＨＩＶゲノム切断を試験することができる（分子決定は１〜２日後に行うべきである）。血液白血球除去を実施して循環Ｔ細胞をＨＩＶゲノム切断について試験することができる（分子決定は１〜２日後に行うべきである）。
【００１６】
第１ａ〜１ｃ相における上記アッセイは、米国仮特許出願第６２／３４０，６２４号明細書に記載の、遺伝子編集または切断治療剤の有効性を決定するための診断パネルを使用することを含み得る。診断パネルは、臨床試験において現在使用されるＰＣＲおよびＥＬＩＳＡアッセイが検出し得ないウイルス（ＨＩＶ）の存在を示すバイオマーカーまたは代謝産物を検出し得る。試料は臨床試験において試験の間の任意の時点において必要に応じて個体から採取することができ、ＨＩＶを示す少なくとも１つのバイオマーカーを含む診断パネルに試料をアプライし、少なくとも１つのバイオマーカーの存在を検出し、バイオマーカーのレベルをベースラインと比較し、治療剤（ＥＢＴ１０１）がＨＩＶを抑止し、または予防するように機能しているか否かを決定する。診断パネルは、臨床試験における個体の細胞からＨＩＶゲノムが切断されたことを裏付け得る。健常個体のベースラインは、臨床試験における個体における代謝産物レベルと比較するように選択することができる。代謝産物は、治療開始前および治療後の両方で（試験における任意の時点において）、ＨＡＡＲＴを受けている臨床試験におけるＨＩＶを有する個体において計測して治療剤が機能しているか否かを決定することができる。
【００１７】
バイオマーカーは、好ましくは、疾患、特にウイルス（ＨＩＶ）の存在を示す代謝産物である。代謝産物は、エネルギー産生、成長、発生、シグナリングおよび生殖のための細胞反応に関与する化学物質（一般に、１，０００Ｄａ未満）であり、細胞の要求に従って細胞に取り込まれ、または細胞から放出され得る。これらの化学物質としては、糖、アミノ酸、有機酸、および生体異物化合物が挙げられる。メタボロミクス（またはメタボロミクスと称されることがあるもの）は、細胞または系における全ての代謝産物および内部または外部ストレス、例えば、感染、病状、または毒素への曝露から生じ得る変化の試験に費やされる。代謝変化は、それらの代謝産物（すなわち、代謝経路）、またはそれらの代謝産物を取り込み、もしくは放出する輸送体を使用する化学反応の変化から生じ得る。ウイルスまたは細菌によるヒトの感染は、細胞レベル（感染部位）、および全身（自然免疫応答を介する）の両方において大きな変化を引き起こす。これらの応答としては、限定されるものではないが、規定の免疫細胞のシグナリング、アポトーシスのシグナリング、輸送体の変化、ならびにミトコンドリア機能およびエネルギー産生の変化（細胞レベル、および血液または尿中で全身における代謝産物濃度の変化として観察することができる変化）が挙げられる。
【００１８】
代謝産物としては、限定されるものではないが、１，３−ジメチルウレート、レボグルコサン、１−メチルニコチンアミド、メタボライト１、２−ヒドロキシイソブチレート、２−オキソグルタレート、３−アミノイソブチレート、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシイソバレレート、３−インドキシルスルフェート、４−ヒドロキシフェニルアセテート、４−ヒドロキシフェニルラクテート、４−ピリドキセート、アセテート、アセトアセテート、アセトン、アジペート、アラニン、アラントイン、アスパラギン、ベタイン、カルニチン、シトレート、クレアチン、クレアチニン、ジメチルアミン、エタノールアミン、ホルメート、フコース、フマレート、グルコース、グルタミン、グリシン、メタボライト２、メタボライト３、ヒプレート、ヒスチジン、ヒポキサンチン、イソロイシン、ラクテート、ロイシン、リジン、マンニトール、メタボライト４、メタボライト５（メチルアミンであり得る）、メタボライト６（メチルグアニジンであり得る）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、Ｏ−アセチルカルニチン、パントテネート、プロピレングリコール、ピログルタメート、ピルベート、キノリネート、セリン、スクシネート、スクロース、メタボライト７（タートレートであり得る）、タウリン、トレオニン、トリゴネリン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、トリプトファン、チロシン、ウラシル、尿素、バリン、キシロース、シス−アコニテート、ミオ−イノシトール、トランス−アコニテート、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、アスコルベート、フェニルアセチルグルタミン、４−ヒドロキシプロリン、グルコネート、ガラクトース、ガラクチトール、ガラクトネート、ラクトース、フェニルアラニン、プロリンベタイン、トリメチルアミン、ブチレート、プロピオネート、イソプロパノール、マンノース、３−メチルキサンチン、エタノール、ベンゾエート、グルタメート、またはグリセロールを挙げることができる。
【００１９】
代謝産物は、以下の代謝サイクルからのいずれかであってもよい。
【００２０】
ポリプリン：グアノシン、グアニン、キサンチン、尿酸、アデノシン、イノシン、イノシン酸、ヒポキサンチン、キサンチン、ＣＯ２、Ｈ２Ｏ、尿素、Ｎ−カルバモイル−β−アラニン、ベータ−アラニン、アンモニア、およびβ−アミノイソブチレート。
【００２１】
ポリアミン：プトレスシン、スペルミジン、スペルミン、メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニン、脱カルボキシル化Ｓ−アデノシルメチオニン、アルギニン、オルニチン、プトレスシン、Ｎ１−アセチルスペルミジン、Ｎ１−アセチルスペルミン、ｅｌＦ５Ａ（Ｌｙｓ）、ｅｌＦ５Ａ（Ｄｈｐ）、ｅｌＦ５Ａ（Ｈｐｕ）、Ｎ１Ｎ２−ジアセチルスペルミン、３−アミノプロパナール、３−アセチルアミノプロパナール、アクロレイン、およびＦＤＰ−リジンタンパク質。
【００２２】
ＫＲＥＢＳ／ＴＣＡサイクル：トレオ−Ｄｓ−イソシトレート、オキサロ−スクシネート、２−オキソ−グルタレート、オキサロ−アセテート、Ｌ−グルタメート、２−ヒドロキシ−グルタレート、ピルベート、アセチル−ＣｏＡ、シス−アコニテート、Ｄ−イソシトレート、α−ケトグルタレート、スクシニル−ＣｏＡ、スクシネート、フマレート、マレート、グリシン、シトレート、カルニチン、（−）Ｏ−アセチル−カルニチン、シス−アコニテート、イタコネート、グリコレート、グリオキシレート、オキサレート、オキサリル−ＣｏＡ、ホルメート、ホルミル−ＣｏＡ、およびＣＯ２。
【００２３】
解糖および糖新生：グルコース、グルコース６−ホスフェート（Ｇ６Ｐ）、フルクトース６−ホスフェート（Ｆ６Ｐ）、フルクトース１，６−ビスホスフェート（Ｆ１，６ＢＰ）、グリセルアルデヒド３−ホスフェート（ＧＡＤＰ）、ジヒドロキシアセトンホスフェート（ＤＨＡＰ）、１，３−ビスホスホグリセリン酸（１，３ＢＰＧ）、３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）、２−ホスホグリセリン酸（２ＰＧ）、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、ピルベート、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン、Ｄ−グルコネート、α−Ｄ−マンノース、６−Ｐ、Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ソルビトール、グリセロン−Ｐ、ｓｎ−グリセロール−３Ｐ、グリセロール、Ｄ−グリセルアルデヒド、１，２プロパン−ジオール、２−ヒドロキシプロピオンアルデヒド、３−Ｐセリン、３−Ｐ−ヒドロキシピルベート、Ｄ−グリセレート、ヒドロキシピルベート、Ｌ−アラニン、Ｌ−アラニル−ｔＲＮＡ、Ｌ−グルタメート、２−オキソグルタレート、Ｌ−ラクテート、およびＤ−ラクテート。
【００２４】
酸化的リン酸化：アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、アデノシンジホスフェート（ＡＤＰ）、（ＡＤＰ）、Ｈ＋、スクシネート、フマレート、Ｈ２Ｏ、Ｏ２、ＮＡＤＨ、およびＮＡＤ＋。
【００２５】
ペントースホスフェート：グルコース−６−ホスフェート、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ、６−ホスホグルコノラクトン、Ｈ２Ｏ、Ｈ＋、６−ホスホグルコネート、ＣＯ２、リブロース−５−ホスフェート、リボース−５−ホスフェート、キシルロース−５−ホスフェート、グリセルアルデヒド３−ホスフェート、セドヘプツロース７−ホスフェート、フルクトース６−ホスフェート、エリスロース４−ホスフェート、およびキシルロース５−ホスフェート、Ｄ−リブロース、Ｄ−リビトール、Ｄ−リボース、Ｌ−リブロース、セドヘプツロース１，７Ｐ２、３−オキソ−６−Ｐ−ヘキスロース。
【００２６】
尿素サイクル：Ｌ−オルニチン、カルバモイルホスフェート、Ｌ−シトルリン、アルギニノスクシネート、フマレート、Ｌ−アルギニン、尿素、Ｌ−アスパルテート、アデノシンジホスフェート（ＡＤＰ）、アデノシンモノホスフェート（ＡＭＰ）、およびピロホスフェート。
【００２７】
脂肪酸β酸化：トランス−Δ２−エノイル−ＣｏＡ、Ｌ−β−ヒドロキシアシルＣｏＡ、β−ケトアシルＣｏＡ、ＦＡＤＨ２、ＮＡＤＨ、アセチル−ＣｏＡ、アシル−ＣｏＡ、プロピオニル−ＣｏＡ、およびスクシニル−ＣｏＡ。
【００２８】
ヌクレオチド代謝：ＡＭＰ、イノシンモノホスフェート（ＩＭＰ）、キサントシンモノホスフェート（ＸＭＰ）、グアノシンモノホスフェート（ＧＭＰ）、リボース−５−ホスフェート、アデノシン、イノシン、ヒポキサンチン、キサントシン、キサンチン、グアノシン、グアニン、尿酸、フマレート、アデニロスクシネート、ウリジン、ウリジンモノホスフェート（ＵＭＰ）、ＡＤＰ、チミジン、チミン、デオキシリボース−１−ホスフェート、デオキシチミジンモノホスフェート（ｄＴＭＰ）、デオキシシチジン、ＡＴＰ、およびデオキシシチジンモノホスフェート（ｄＣＭＰ）。
【００２９】
補因子およびビタミン：レチニルパルミテート、パルミテート、パルミチル−ＣｏＡ、レチノエート、β−グルクロニド、レチナール、β−カロテン、レチノイン酸、カルシジオール、２５−ヒドロイエルゴカルシフェロール（２５−ｈｙｄｒｏｙｅｒｇｏｃａｌｃｉｆｅｒｏｌ）、カルシトリオール、メチルコバラミン、５’−デオキシアデノシルコバラミン、α−ＣＥＣＨ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、ＡＤＰ、およびＡＴＰ。
【００３０】
アミノ酸代謝：グルタメート、ＮＨ４＋、α−ケトグルタレート、ピルベート、オキサロアセテート、グルタメートγ−セミアルデヒド、Δ１−ピロリン−５−カルボキシレート、シトルリン、アルギニン、尿素、オルニチン、グリシン、ＣＯ２、ＮＨ３、Ｎ５，Ｎ１０−メチレンＴＨＦ、３−ホスホグリセレート、α−ケトブチレート、プロピオニル−ＣｏＡ、スクシニル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡ、セリン、α−アミノ−β−ケトブチレート、アミノアセトン、システインスルフィネート、β−スルフィニルピルベート、ビスルファイト、スルファイト、スルフェート、アラニン、グルタチオン、タウリン、ヒポタウリン、アデノシン５’−ホスホスルフェート、３’−ホスホアデノシン５’−ホスホスルフェート、ホモシステイン、α−ケト−β−メチルバレレート、α−ケトイソカプロエート、α−ケトイソバレレート、α−メチルブチリル−ＣｏＡ、チグリル−ＣｏＡ、３−メチル−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、２−メチルアセトアセチル−ＣｏＡ、イソバレリル−ＣｏＡ、３−メチルクロトニル−ＣｏＡ、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、アセトアセテート、イソブチリルＣｏＡ、メタクリリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ、メチルマロン酸セミアルデヒド、チロシン、ｐ−ヒドロキシフェニルピルベート、ホモゲンチセート、４−マレイルアセトアセテート、４−フマリルアセトアセテート、フマレート、３−ヒドロキシトリメチルリジン、４−Ｎ−トリメチルアミノブチルアルデヒド、γ−ブチロベタイン、カルニチン、ウロカネート、４−イミダゾロン−５−プロピオネート、Ｎ−ホルムイミドイル−Ｌ−グルタメート、Ｎ５−ホルムイミノ−テトラヒドロホレート、ヒスタミン、Ｎ−ホルミル−キヌレニン、キヌレニン、キヌレネート、３−ヒドロキシキヌレニン、アントラニレート、３−ヒドロキシアントラニレート、キノリネート、グルタリル−ＣｏＡ、およびアセトアセチル−ＣｏＡ。
【００３１】
病状の決定において、単一代謝産物、および代謝産物の任意の組合せを使用することができる。
【００３２】
種々の方法、例えば、限定されるものではないが、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー−質量分析、ガスクロマトグラフィー−質量分析、高速液体クロマトグラフィー−質量分析、キャピラリー電気泳動−質量分析、核磁気共鳴分光分析（ＮＭＲ）、ラマン分光分析、または赤外線分光分析を使用してバイオマーカーの存在を検出することができる。
【００３３】
安全性および忍容性について、１５日間〜６ヵ月間（好ましくは、３０日間）のフォローアップを実施することができる。さらに、個体は、それらが現在受けている抗ウイルス（ＨＡＡＲＴ）療法を停止されず、臨床試験全体にわたりＨＡＡＲＴを受け続け得る。
【００３４】
本出願全体にわたり、種々の刊行物、例として、米国特許が著者および年ならびに特許番号により参照される。刊行物についての完全な引用は以下に列記される。これらの刊行物および特許のそれらの全体としての開示は、本発明が属する技術水準をより十分に説明するために参照により本出願に組み込まれる。
【００３５】
本発明は説明的に記載され、使用された用語は、限定されるものではなく説明の語の性質におけるものとすることが理解すべきである。
【００３６】
上記教示に照らし、本発明の多くの改変および変更が可能であることは明らかである。したがって、添付の特許請求の範囲の範囲内で、具体的に記載されているもの以外で本発明を実施することができることを理解すべきである。
【国際調査報告】
2019536428.tif 000002
2019536428.tif 000003
2019536428.tif 000004