(57)【要約】  本発明は、ブドウの木の組織の細胞培養からステビオシドを用いてビニフェリンを大量生産する方法に関し、本発明のビニフェリンは、肝臓保護、抗癌、抗酸化及び皮膚美白に効果的であり、低密度リポタンパク質と高密度リポタンパク質の酸化を阻害し、血管平滑筋細胞の増殖と移動を阻害する効果があることが知られている。よって、本発明は、ブドウ植物体の葯組織由来のカルスから有用物質（スチルベン化合物）、とりわけビニフェリンを大量生産するのに非常に有用な方法であり、関連産業において非常に重要である。【代表図】図５
2019508053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ブドウの木の組織切片をカルス誘導培地に置床してブドウの木のカルスを誘導するステップと、
（ｂ）前記誘導したブドウの木のカルスを増殖培地で培養して増殖するステップと、
（ｃ）前記増殖したカルスに活性誘導剤及び可溶化剤を添加して振盪培養するステップとを含む、ブドウの木由来のビニフェリン（viniferin）を大量生産する方法。
【請求項２】
前記（ｃ）ステップの活性誘導剤及び可溶化剤は、それぞれジャスモン酸メチル（methyl jasmonate）及びステビオシド（stevioside）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ジャスモン酸メチル及びステビオシドは、それぞれ５０〜３５０μＭ及び４０〜６０ｍＭの濃度で添加することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ビニフェリンは、δ−ビニフェリン又はε−ビニフェリンであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）及びステビオシド（stevioside）を有効成分として含有する、ブドウの木のカルスからビニフェリンを大量生産するための組成物。
【請求項６】
５０〜３５０μＭのジャスモン酸メチル及び４０〜６０ｍＭのステビオシドであることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
（ａ）ブドウの木の組織切片をカルス誘導培地に置床してブドウの木のカルスを誘導するステップと、
（ｂ）前記誘導したブドウの木のカルスを増殖培地で培養して増殖するステップと、
（ｃ）前記増殖したカルスにジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）及びステビオシド（stevioside）を添加して静置培養するステップとを含む、ブドウの木由来のレスベラトロール（resveratrol）を大量生産する方法。
【請求項８】
前記静置培養は、２４〜２６℃にて４〜７日間静置培養することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブドウの木の組織の細胞培養からステビオシドを用いてビニフェリンを大量生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
主にレスベラトロール化合物で表されるスチルベンは、フェニルアラニンから始まる一般的なフェニルプロパノイド経路に由来する植物二次代謝産物の小さなクラスである。レスベラトロール（resveratrol；3,4',5-transtrihydroxystilbene）は、ＵＶ照射やカビ感染などの環境ストレスに対する反応により、ブドウ、ピーナッツ、ベリー類などの一部の植物から生産され、自然に発生するファイトアレキシン（phytoalexin）である。レスベラトロール及びその誘導体は、植物防御反応においてファイトアレキシン及び抗酸化物質として重要な役割を果たすだけでなく、抗癌効果、抗炎症効果、抗腫瘍活性及び抗老化効果をはじめとする多くの有意義な特性を示す。
【０００３】
しかし、このように抗癌、抗酸化活性などが知られているレスベラトロールは、その可能性が確認された有望な天然機能性資源であり、今後の様々な研究により機能性食品素材及び新薬素材として活用できるにもかかわらず、いまだ韓国産ブドウ品種を対象にこの物質の含有量を増加させるための栽培生理及び生命工学面での研究はほとんど行われていない。近年、これに関して、レスベラトロールの含有量を増加させる方法として、収穫されたブドウにプラスモパラ・ビチコラ（Plasmopara viticola）菌株を人為的に接種する方法（特許文献１）、収穫後にブドウをＵＶ−Ｃ光線で処理する方法（非特許文献１）、又はアルミニウムでブドウを処理する方法（特許文献２）などが開示されているが、これらは全てブドウ収穫後の処理方法又はブドウ栽培時の単処理方法にすぎない。
【０００４】
特許文献３には、「環境因子を用いたレスベラトロール高含有ブドウの生産方法」が開示されており、特許文献１には、「ブドウ由来の天然抗癌物質のレスベラトロールの含有量を増加させたレスベラトロール強化ブドウ及びその生産方法」が開示されているが、本発明のように「ブドウの木の組織の細胞培養からステビオシドを用いてビニフェリンを大量生産する方法」については全く開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】韓国公開特許第２００３−００２１９７６号公報
【特許文献２】米国特許第６８３４３９８号明細書
【特許文献３】韓国公開特許第２００５−００８９４９２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Argic Food Chem. 2002 Oct 23;50(22):6322-9; W00200192
【非特許文献２】Kim CY et al. 2010, Physiologia Plantarum 139: 259-261
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、このような要求に応えるべくなされたものであり、本発明者らは、ブドウ植物体の葯組織由来のカルスから有用物質（スチルベン化合物）を大量に生産する方法を確立するために、ブドウの木の葯組織切片を植物生長調節物質が添加されたＭＳ固体培地に置床、培養してカルスを誘導し、前記誘導したカルスを増殖培地で培養して増殖し、その後前記増殖したカルスを、活性誘導剤としてジャスモン酸メチル、可溶化剤としてステビオシドを含む液体培地で振盪培養した結果、フラスコレベルではレスベラトロールは生産されず、δ−ビニフェリン（δ-viniferin）のみ生産されることが確認され（図３）、スケールアップ（scale-up）条件であるバイオリアクターレベルではδ−ビニフェリンだけでなく、高価なε−ビニフェリンの生産にも非常に効果的であることが確認された（図５）。
【０００８】
また、前記増殖したカルス培養培地を活性誘導剤及び可溶化剤（ステビオシド）で処理し、その後フラスコレベルで静置培養を行った結果、ビニフェリンは全く生産されず、レスベラトロールのみ生産されること（図６Ａ）が確認され、振盪培養を行った結果、レスベラトロールは全く生産されず、ビニフェリンのみ生産されること（図６Ｂ）が確認された。
【０００９】
本発明によりスチルベンを大量生産することができ、特に、本発明のステビオシドを可溶化剤として用いたブドウの木の組織由来のカルスの培養方法により、δ−ビニフェリンだけでなく、高価なε−ビニフェリンの生産に非常に効果的であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するために、本発明は、（ａ）ブドウの木の組織切片をカルス誘導培地に置床してブドウの木のカルスを誘導するステップと、（ｂ）前記誘導したブドウの木のカルスを増殖培地で培養して増殖するステップと、（ｃ）前記増殖したカルスに活性誘導剤及び可溶化剤を添加して振盪培養するステップとを含む、ブドウの木由来のビニフェリン（viniferin）を大量生産する方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、ジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）及びステビオシド（stevioside）を有効成分として含有する、ブドウの木のカルスからビニフェリンを大量生産するための組成物を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、（ａ）ブドウの木の組織切片をカルス誘導培地に置床してブドウの木のカルスを誘導するステップと、（ｂ）前記誘導したブドウの木のカルスを増殖培地で培養して増殖するステップと、（ｃ）前記増殖したカルスにジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）及びステビオシド（stevioside）を添加して静置培養するステップとを含む、ブドウの木由来のレスベラトロール（resveratrol）を大量生産する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のスチルベンは、抗癌、抗ウイルス、抗炎症、抗老化、抗酸化などの様々な生理活性により健康機能性食品、化粧品、医薬品、染料、及び機能性家畜飼料などに活用されており、特にビニフェリンは、肝臓保護、抗癌、抗酸化及び皮膚美白に効果的であり、低密度リポタンパク質と高密度リポタンパク質の酸化を阻害し、血管平滑筋細胞の増殖と移動を阻害する効果があることが知られている。よって、本発明は、ブドウ植物体の葯組織由来のカルスから有用物質（スチルベン化合物）、とりわけビニフェリンを大量生産するのに非常に有用な方法であり、関連産業において非常に重要である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明のスチルベン類化合物の生成過程を示す図である。チロシン、フェニルアラニンなどのアミノ酸からｐ−クマル酸（p-coumaric acid）が生成され、４ＣＬ（4-coumarate:CoA ligase）によりｐ−クマロイル−ＣｏＡが生成される。これが再びＳＴＳ酵素によりレスベラトロールに変換され、オキシダーゼにより酸化されると、２つのレスベラトロールは１つの二量体ビニフェリンとなる。
【図２】ブドウカルスの細胞培養及び活性誘導剤処理によるレスベラトロール生合成遺伝子（ＳＴＳ、ＲＯＭＴ）の転写発現を分析した結果である。ここで、活性誘導剤としては、ＭｅＪＡ（ジャスモン酸メチル）、ＡＢＡ（アブシジン酸）、ＳＡ（サリチル酸）、エテホン、フラジェリン２２（Ｆｌｇ２２）、ＭＶ（メチルビオロゲン）及びキトサンを用いた。
【図３】植物液体培養により有用代謝物を大量生産する際の可溶化剤として知られているＣＤ−Ｍ（メチル−β−シクロデキストリン）とステビオシドの可溶化及び物質生産効率を比較するために、ブドウカルス培養液を１００μＭのＭｅＪＡと５０ｍＭのＣＤ−Ｍ（ＭＪ＋ＣＤ）又は１００μＭのＭｅＪＡと５０ｍＭのステビオシド（ＭＪ＋Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ）で処理して培養し、その後レスベラトロール及びδ−ビニフェリンを抽出し、ＨＰＬＣ分析を行った結果である。また、可溶化剤で処理せずに１００μＭのＭｅＪＡ（ＭＪ）でのみ処理して対照区として用いた。
【図４Ａ】ブドウカルス培養液を１００μＭのＭｅＪＡと５０ｍＭのＣＤ−Ｍで処理し、ｐ−クマル酸（ｐ−ｃｏｕ）及びレスベラトロール（ｒｅｓ）を前駆体として用いて可溶化剤処理による生物変換の違いを確認した結果である。
【図４Ｂ】ブドウカルス培養液を１００μＭのＭｅＪＡと５０ｍＭのステビオシド（Ｅ９５）で処理し、ｐ−クマル酸（ｐ−ｃｏｕ）及びレスベラトロール（ｒｅｓ）を前駆体として用いて可溶化剤処理による生物変換の違いを確認した結果である。
【図５】大量培養（バイオリアクターレベル）を行い、その培養液を１００μＭのＭｅＪＡ及び５０ｍＭのステビオシドで処理して培養し、その後培養液を抽出してδ−ビニフェリン及びε−ビニフェリンの生成をＨＰＬＣ分析で確認した結果である。
【図６】本発明によるレスベラトロール及びδ−ビニフェリンの選択的生産方法により生産されたレスベラトロール（Ａ）及びδ−ビニフェリン（Ｂ）の生産結果をＨＰＬＣで確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）ブドウの木の組織切片をカルス誘導培地に置床してブドウの木のカルスを誘導するステップと、（ｂ）前記誘導したブドウの木のカルスを増殖培地で培養して増殖するステップと、（ｃ）前記増殖したカルスに活性誘導剤及び可溶化剤を添加して培養するステップとを含む、ブドウの木由来のビニフェリン（viniferin）を大量生産する方法を提供する。
【００１６】
本発明の一実施例による方法において、前記（ｃ）ステップの活性誘導剤は、ジャスモン酸メチル（methyl jasmonate）、ＳＡ（サリチル酸）又はフラジェリン２２（Ｆｌｇ２２）であってもよく、ジャスモン酸メチルであることがより好ましいが、これらに限定されるものではない。また、可溶化剤は、ステビオシド（stevioside）であってもよいが、これに限定されるものではない。前記ジャスモン酸メチル及びステビオシドは、それぞれ５０〜３５０μＭ及び４０〜６０ｍＭの濃度で添加することが好ましく、それぞれ１００μＭ及び５０ｍＭの濃度で添加することがより好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
本発明の一実施例による方法において、前記ビニフェリンは、δ−ビニフェリン又はε−ビニフェリンであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
本発明の一実施例による方法において、前記（ａ）ステップのカルス誘導培地は、生長調節剤として０．０５〜０．２ｍｇ／ＬのＩＡＡ（インドール−３−酢酸）、０．０５〜０．２ｍｇ／ＬのＮＡＡ（１−ナフタレン酢酸）、１〜２ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、及び０．２〜０．３ｍｇ／Ｌのカイネチンが添加された培地であってもよく、０．１ｍｇ／ＬのＩＡＡ（インドール−３−酢酸）、０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ（１−ナフタレン酢酸）、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、及び０．２５ｍｇ／Ｌのカイネチンが添加された培地（表１）であることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
本発明の一実施例による方法において、前記（ｂ）ステップの増殖培地は、０．５〜２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄが含まれるＭＳ（ムラシゲ・スクーグ）培地であってもよく、１ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄが含まれるＭＳ（ムラシゲ・スクーグ）培地であることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本発明の一実施例による方法は、（ａ）滅菌したブドウの木の組織切片を生長調節剤として０．０５〜０．２ｍｇ／ＬのＩＡＡ（インドール−３−酢酸）、０．０５〜０．２ｍｇ／ＬのＮＡＡ（１−ナフタレン酢酸）、１〜２ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、及び０．２〜０．３ｍｇ／Ｌのカイネチンが添加されたカルス誘導培地に置床してブドウの木のカルスを誘導するステップと、（ｂ）前記誘導したブドウの木のカルスを０．５〜２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含むＭＳ（ムラシゲ・スクーグ）培地で培養して増殖するステップと、（ｃ）前記増殖したカルスに５０〜３５０μＭのジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）及び４０〜６０ｍＭのステビオシド（stevioside）を添加し、振盪培養してδ−ビニフェリン又はε−ビニフェリンを大量生産するステップとを含むことが好ましく、（ａ）滅菌したブドウの木の組織切片を生長調節剤として０．０５〜０．２ｍｇ／ＬのＩＡＡ（インドール−３−酢酸）、０．０５〜０．２ｍｇ／ＬのＮＡＡ（１−ナフタレン酢酸）、１〜２ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、及び０．２〜０．３ｍｇ／Ｌのカイネチンが添加されたカルス誘導培地に置床して２３〜２７℃にて２５〜３０日間継代培養してブドウの木のカルスを誘導するステップと、（ｂ）前記誘導したブドウの木のカルスを０．５〜２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含むＭＳ（ムラシゲ・スクーグ）培地で２３〜２７℃にて５〜１０日間培養して増殖するステップと、（ｃ）前記増殖したカルスに１００μＭのジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）及び５０ｍＭのステビオシド（stevioside）を添加し、振盪培養してδ−ビニフェリン又はε−ビニフェリンを大量生産するステップとを含むことがより好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
また、本発明は、ジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）及びステビオシド（stevioside）を有効成分として含有する、ブドウの木のカルスからビニフェリンを大量生産するための組成物を提供する。
【００２２】
本発明の一実施例による組成物において、前記ジャスモン酸メチル（methyl jasmonate）及びステビオシド（stevioside）は、それぞれ５０〜３５０μＭ及び４０〜６０ｍＭの濃度で添加することが好ましく、それぞれ１００μＭ及び５０ｍＭの濃度で添加することがより好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明の一実施例による組成物において、前記ビニフェリンは、δ−ビニフェリン又はε−ビニフェリンであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
また、本発明は、（ａ）ブドウの木の組織切片をカルス誘導培地に置床してブドウの木のカルスを誘導するステップと、（ｂ）前記誘導したブドウの木のカルスを増殖培地で培養して増殖するステップと、（ｃ）前記増殖したカルスにジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）及びステビオシド（stevioside）を添加して静置培養するステップとを含む、ブドウの木由来のレスベラトロール（resveratrol）を大量生産する方法を提供する。
【００２５】
本発明の一実施例による方法は、（ａ）滅菌したブドウの木の組織切片を生長調節剤として０．０５〜０．２ｍｇ／ＬのＩＡＡ（インドール−３−酢酸）、０．０５〜０．２ｍｇ／ＬのＮＡＡ（１−ナフタレン酢酸）、１〜２ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、及び０．２〜０．３ｍｇ／Ｌのカイネチンが添加されたカルス誘導培地に置床してブドウの木のカルスを誘導するステップと、（ｂ）前記誘導したブドウの木のカルスを０．５〜２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含むＭＳ（ムラシゲ・スクーグ）培地で培養して増殖するステップと、（ｃ）前記増殖したカルスに５０〜３５０μＭのジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）及び４０〜６０ｍＭのステビオシド（stevioside）を添加して静置培養するステップとを含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
本発明の一実施例による方法において、前記静置培養は、２４〜２６℃にて４〜７日間静置培養するものであってもよく、２５℃にて５日間静置培養するものであることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）ブドウカルスの誘導及び増殖
本発明においては、代表的な市販のブドウ品種であるキャンベル（Vitisvinifera L. cv Campbell Early）からカルスを誘導した。キャンベルの花を切り取って流水で洗浄し、その後７０％のエタノール溶液に１分間浸漬して表面殺菌を行った。表面殺菌は、クリーンベンチ内でブドウの花組織をガラス瓶に入れて市販の漂白剤（約１％の次亜塩素酸ナトリウム）溶液で１５分間行い、滅菌蒸留水で３回洗浄した。表面殺菌が完了した組織は、滅菌濾紙を用いて残存する湿気を除去して培養に用いた。表面殺菌が完了したブドウ組織をメスで切り取り、その後それぞれの組織（花弁、葯、花糸）を培養培地に置床した。ブドウカルスの誘導に用いた培地を表１に示す。生長調節剤として０．１ｍｇ／ＬのＩＡＡ、０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、及び０．２５ｍｇ／Ｌのカイネチンが添加された培地を用いた。培養条件は、２５℃の恒温器における暗培養とした。培養後に形成された白色のカルスは、同一組成の固体培地に約４週間間隔で継代培養した。
【００２９】
【表１】
2019508053.tif 000003
【００３０】
（実施例２）ブドウカルスの細胞培養及び活性誘導剤処理によるレスベラトロール生合成遺伝子（ＳＴＳ、ＲＯＭＴ）の転写発現の分析
ブドウカルスからレスベラトロール生産システムを確立するために、前記実施例１で誘導されて安定化したブドウカルスの液体培養により転写発現の分析を行った。１ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄが含まれるＭＳ（ムラシゲ・スクーグ）培地ともいうＭＳ１Ｄ（ＭＳ４．４ｇ、スクロース３０ｇ、ＭＥＳ  ０．５ｇ、ミオイノシトール０．１ｇ、チアミンＨＣｌ  ０．４ｍｇ、２，４−Ｄ  １ｍｇ／Ｌ）液体培地で２５℃、９０ｒｐｍで７日間培養し、その後活性誘導剤で処理して２４ｈ経過したブドウカルスから総ＲＮＡを分離した（非特許文献２）。分離した総ＲＮＡ（５μｇ）は、一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（First-Strand cDNA Synthesis Kit；Fermantas社、カナダ）を用いて、説明書に従ってｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡ（２０μｌ）を２．５倍に希釈し、その後２μｌを鋳型とし、ブドウカルスにおいてレスベラトロール及びプテロスチルベン生合成関連遺伝子を対象にＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅は、９４℃で２分間の変性、９５℃で３０秒間、５０℃で４０秒間、７２℃で１分間を１サイクルとして２５サイクル、及び７２℃で１０分間の最終延長反応により行われた。本実験のために用いたブドウレスベラトロール、プテロスチルベン生合成遺伝子及びブドウアクチンＲＴ−ＰＣＲ用プライマーは次の通りである。
ＳＴＳ−Ｆ：５'−ＡＴＧＧＣＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＡＡＴＣＡＧＡ−３'（配列番号１）
ＳＴＳ−Ｒ：５'−ＴＴＡＡＴＴＴＧＴＣＡＣＣＡＴＡＧＧＡＡＴＧＣＴＡ−３'（配列番号２）
ＲＯＭＴ−Ｆ：５'−ＡＴＧＧＡＴＴＴＧＧＣＡＡＡＣＧＧＴＧＴＧＡ−３'（配列番号３）
ＲＯＭＴ−Ｒ：５'−ＴＣＡＡＧＧＡＴＡＡＡＣＣＴＣＡＡＴＧＡＧＧＧＡ−３'（配列番号４）
ＡＣＴＩＮ−Ｆ：５'−ＴＧＣＴＧＡＣＡＧＡＡＴＧＡＧＣＡＡＧＧ−３'（配列番号５）
ＡＣＴＩＮ−Ｒ：５'−ＴＡＣＴＡＡＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＣＣＣＡＧＴＡＴＡ−３'（配列番号６）
【００３１】
様々な活性誘導剤で処理してスチルベン化合物の生産増大を図った。ここで、活性誘導剤としては、ＭｅＪＡ（ジャスモン酸メチル）、ＡＢＡ（アブシジン酸）、ＳＡ（サリチル酸）、エテホン、フラジェリン２２（Ｆｌｇ２２）、ＭＶ（メチルビオロゲン）、キトサンを用いた。その結果、ＭｅＪＡ、ＳＡ、Ｆｌｇ２２で処理した場合に２つの遺伝子の発現の増加が確認され、とりわけＭｅＪＡで処理した場合に遺伝子の発現が最も高いことが確認された（図２）。
【００３２】
（実施例３）ブドウカルスにおける活性誘導剤及び可溶化剤処理
前記実施例２で選択した活性誘導剤（１００μＭのＭｅＪＡ）を用いてスチルベン化合物生産を誘導した。２０ｍｌのＭＳに２ｇのブドウカルスを接種してから１２５ｍｌフラスコで７日間培養し、その後１００μＭのＭｅＪＡで処理して５日後にブドウカルスを確保した。抽出してＨＰＬＣ分析を行った結果、ブドウカルス内で微量のピセイド（piceid）が確認されており（データ未提示）、ステビオシド処理により生産されたスチルベン化合物を可溶化して生産率を高める実験を行った。前述したように、ブドウカルスを７日間培養した培養液を５ｍＭ、１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭのステビオシドで濃度別に処理するか、１００μＭのＭｅＪＡと共に濃度別に処理し、培養５日後に試料をフィルターで濾過してカルスとカルス培養液に分離した。分離したカルスは、フィルターで濾過して脱水作業を行い、液体窒素で凍らせ、その後抽出するまで−８０℃で保管して用いた。カルス培養液試料は、保管期間をおかずにすぐに抽出して用いた。
【００３３】
その結果、ステビオシド５０ｍＭの濃度で最も安定してスチルベン化合物を生産することが確認された。また、植物組織又は細胞培養時の可溶化剤として知られているＣＤ−Ｍ（メチル−β−シクロデキストリン）及びステビオシドの可溶化及びスチルベン化合物の生産効率を分析するために、１００μＭのＭｅＪＡと共に各可溶化剤で５０ｍＭずつ処理し、その後培養液を抽出してスチルベン化合物の生産傾向を確認した。その結果、１００μＭのＭｅＪＡと５０ｍＭのＣＤ−Ｍで処理した場合は、トランス−レスベラトロールが最も多く生産され、１００μＭのＭｅＪＡと５０ｍＭのステビオシドで処理した場合は、δ−ビニフェリンが生産されたスチルベン化合物の大部分を占めた。１００μＭのＭｅＪＡと５０ｍＭのＣＤ−Ｍで処理した処理区では、最大４０ｍｇ／Ｌのレスベラトロールが生産され、１００μＭのＭｅＪＡと５０ｍＭのステビオシドで処理した処理区では、最大７００ｍｇ／Ｌのδ−ビニフェリンが生産された（図３）。
【００３４】
（実施例４）ブドウカルスにおける生物変換
前記実施例３の結果に基づいて、ブドウカルス懸濁培養時のｐ−クマル酸及びレスベラトロールを基質として用いて生物変換を試みた。まず、１００μＭのＭｅＪＡと５０ｍＭのＣＤ−Ｍに基質を入れていないものを対照区とし、２ｍＭのｐ−クマル酸及びレスベラトロールを基質として処理したものを実験区としてそのパターンを確認した（図４Ａ）。その結果、基質を入れた場合、レスベラトロール以外にパリドール（Pallidol）、パルテノシッシンＡ（Parthenocissin A）、クアドラングラリンＡ（Quadrangularin A）及びδ−ビニフェリンが生産された（図４Ａ）。次に、１００μＭのＭｅＪＡと５０ｍＭのステビオシド（Ｅ９５）に基質を入れていないものを対照区とし、２ｍＭのｐ−クマル酸及びレスベラトロールを基質として処理したものを実験区としてそのパターンを確認した（図４Ｂ）。その結果、基質で処理していない対照区と同様に、基質で処理した実験区においてδ−ビニフェリンが多く生産されることが確認された。これらの結果から、ステビオシドをブドウカルス懸濁培養時の可溶化剤として用いるとδ−ビニフェリンを生産するのに非常に効果的であることが確認された（図４）。
【００３５】
（実施例５）バイオリアクターを用いたブドウカルスの大量培養における活性誘導剤及び可溶化剤処理
前記実施例１で安定化したブドウカルスを１００ｍｌのＭＳ１Ｄ液体培地に１０ｇずつ３つのフラスコにそれぞれ接種し、その後２５℃、９０ｒｐｍで１４日間培養した。１４日間培養して増殖したカルスを予め滅菌して乾燥させた３Ｌバイオリアクターに全て継代し、その後１．２ＬのＭＳ１Ｄ液体培地を追加した。前記実施例３と同様に、１００μＭのＭｅＪＡと共に５０ｍＭのステビオシドで処理し、培養５日後に試料をフィルターで濾過してカルスとカルス培養液に分離した。分離したカルスは、フィルターで濾過して脱水作業を行い、液体窒素で凍らせ、その後抽出するまで−８０℃で保管して用いた。カルス培養液試料は、保管期間をおかずにすぐに抽出して用いた。カルス培養液抽出物をＨＰＬＣ分析した結果、ε−ビニフェリン及びδ−ビニフェリンが生産されることが確認された（図５）。
【００３６】
（実施例６）ブドウカルス培養液抽出及びＨＰＬＣ分析
前記実施例３、４及び５で分離したブドウカルスは、液体窒素を用いて粉末化した。前記カルス粉末１ｇを３ｍｌの８０％メタノールで抽出し、その後遠心分離することにより上層部のカルス抽出物を得た。抽出した濾液に空気（air）を注入して乾燥させ、乾燥物を６００μｌの８０％メタノールに溶解し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルター（親水性、アドバンテック社、日本）で濾過してＨＰＬＣ分析に用いた。１０ｍｌのカルス培養液は、同量の酢酸エチルにより水と酢酸エチルで分配抽出して得られた酢酸エチル層に空気を注入して乾燥させた。乾燥物を１ｍｌの８０％メタノールに溶解し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターで濾過してＨＰＬＣ分析に用いた。ＨＰＬＣは、アジレント・テクノロジー社の１２００シリーズを用いて分析した。ポンプシステムには、クォータナリポンプ（quaternary pump）を用い、カラムには、アジレント社のＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−１８（５ｍｍ、４．６×１５０ｍｍ）を用い、移動相には、水（Ａ、０．０５％トリフルオロ酢酸）とアセトニトリル（Ｂ、０．０５％トリフルオロ酢酸）を用いて傾斜溶離で分析を行った。前記ブドウカルスを７日間培養した培養液を１００μＭのＭｅＪＡと５ｍＭ、１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭのステビオシドで濃度別に処理した結果、低い濃度から高い濃度にステビオシドで処理した場合、濃度が高くなるにつれてスチルベン含有量が増加する様相を示し、５０ｍＭで最も高いスチルベン化合物含有量が確認され（データ未提示）、ステビオシドで処理していない処理区に比べて、はるかにスチルベン化合物含有量が増加することが観察された（図３）。ステビオシドで処理していない処理区及びカルス抽出物においては、スチルベン化合物が確認されなかった。
【００３７】
（実施例７）ブドウカルス生産ビニフェリンの分離及びＮＭＲ分析
前記実施例３で準備した可溶化剤処理ブドウ葯由来のカルス培養液を水と酢酸エチルで分配抽出して得られた酢酸エチル層を減圧濃縮した。得られた濃縮物（１５ｇ）をＭＰＬＣ機器で逆相カラム（１０×３０ｃｍ）にて１段階分離した。ここで、溶離溶媒としては水−アセトニトリルを用い、水−アセトニトリル混合溶液を１００：１から１００％アセトニトリルまで極性を低くしながら溶離させることにより、７つの分画物（Ａ〜Ｇ）を得た。目標化合物であるδ−ビニフェリン（trans-δ-viniferin、下記化学式１）が多量に含まれる分画Ｃを濃縮して濃縮物１．３ｇを得た。得られた濃縮物１．３ｇにＲｅｃｙｌｃｉｎｇ  ＬＣ機器で逆相カラムクロマトグラフィーを水−アセトニトリル（２：２）混合溶媒条件で行い、８０％以上の純度のδ−ビニフェリン１６０ｍｇを得た。得られた分画物を９５％メタノールで溶離させるゲルクロマトグラフィー（Sephadex LH-20）を行い、９８％の純度のδ−ビニフェリン１２ｍｇを得た。得られた化合物の構造は、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、２Ｄ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ及び質量分析器を用いて解明した。
ｔｒａｎｓ−δ−ビニフェリン：１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）ｄ  ７．４５（ｄｄ、Ｊ＝８．５、２．０Ｈｚ、Ｈ−６）、７．２７（ｓ、Ｈ−４）、７．２５（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、Ｈ−２，６Ａ）、７．０７（ｄ、Ｊ＝１６．５Ｈｚ、Ｈ−２´）、６．９２（ｄ、Ｊ＝１６．５Ｈｚ、Ｈ−１´）、６．８８（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、Ｈ−７）、６．８６（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、Ｈ−３，５Ａ）、６．５５（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、Ｈ−２，６Ｃ）、６．２９（ｔ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、Ｈ−２Ｂ）、６．２７（ｔ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、Ｈ−４Ｃ）、６．２１（ｄ、Ｊ＝２．０、Ｈ−４，６Ｂ）、５．４７（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、Ｈ−２）、４．４８（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、Ｈ−３）；１３ＣＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）ｄ  １５９．７（Ｃ−７ａ）、１５８．８（Ｃ−１，３Ｂ）、１５８．６（Ｃ−３，５Ｃ）、１５７．５（Ｃ−４Ａ）、１４４．３（Ｃ−５Ｂ）、１３９．８（Ｃ−１Ｃ）、１３１．６（Ｃ−３ａ）、１３１．２（Ｃ−１Ａ）、１３０．８（Ｃ−５）、１２８．２（Ｃ−２´）、１２７．７（Ｃ−６）、１２７．６（Ｃ−２，６Ａ）、１２６．３（Ｃ−１´）、１２３．０（Ｃ−４）、１１５．２（Ｃ−３，５Ａ）、１０９．２（Ｃ−７）、１０６．４（Ｃ−４，６Ｂ）、１０４．７（Ｃ−２，６Ｃ）、１０１．８（Ｃ−４Ｃ）、１０１．４（Ｃ−２Ｂ）、９３．１（Ｃ−２）、５６．９（Ｃ−３）。
【００３８】
【化１】
2019508053.tif 000004
【００３９】
（実施例８）ブドウカルス生産ε−ビニフェリンの分離及びＮＭＲ分析
前記実施例５で準備した可溶化剤処理ブドウ葯由来のカルス培養液を水と酢酸エチルで分配抽出して得られた酢酸エチル層を減圧濃縮した。得られた濃縮物（１０ｇ）をＭＰＬＣ機器で逆相カラム（１０×３０ｃｍ）にて１段階分離した。ここで、溶離溶媒としては水−アセトニトリルを用い、水−アセトニトリル混合溶液を７０：１から１００％アセトニトリルまで極性を低くしながら溶離させることにより、５つの分画物（Ａ〜Ｅ）を得た。目標化合物であるε−ビニフェリン（trans-ε-viniferin、下記化学式２）が多量に含まれる分画Ｂを濃縮して濃縮物１．５ｇを得た。得られた濃縮物１．５ｇにＲｅｃｙｌｃｉｎｇ  ＬＣ機器で逆相カラムクロマトグラフィーを水−アセトニトリル（２：１）混合溶媒条件で行い、８５％以上の純度のε−ビニフェリン１００ｍｇを得た。得られた分画物を９５％メタノールで溶離させるゲルクロマトグラフィー（Sephadex LH-20）を行い、９８％の純度のε−ビニフェリン３０ｍｇを得た。得られた化合物の構造は、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、２Ｄ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ及び質量分析器を用いて解明した。
ｔｒａｎｓ−ε−ビニフェリン：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）ｄ  ７．１４（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、Ｈ−２（６）ａ）、７．０３（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、Ｈ−２（６）ｂ）、６．８０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１３．６Ｈｚ、Ｈ−７ｂ）、６．７８（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、Ｈ−３（５）ａ）、６．６５（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、Ｈ−３（５）ｂ）、６．５６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１３．６Ｈｚ）、６．２８（１Ｈ、ｂｒｓ、Ｈ−１２ｂ）、６．２１（１Ｈ、ｂｒｓ、Ｈ−１２ａ）、６．１８（２Ｈ、ｂｒｓ、Ｈ−１０ａ，１４ａ）、５．３７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、Ｈ−７ａ）、４．３５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、Ｈ−８ａ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）ｄ  １６１．３（Ｃ−１１ｂ）、１５８．６（Ｃ−１１ａ，１３ａ）、１５８．３（Ｃ−１３ｂ）、１５７．１（Ｃ−４ａ）、１５６．９（Ｃ−４ｂ）、１４６．０（Ｃ−９ａ）、１３５．６（Ｃ−９ｂ）、１３２．５（Ｃ−１ａ）、１２９．１（Ｃ−１ｂ，７ｂ）、１２７．５（Ｃ−２（６）ｂ）、１２７．０（Ｃ−２（６）ａ）、１２２．４（Ｃ−８ｂ）、１１８．８（Ｃ−１０ｂ）、１１５．１（Ｃ−３（５）ｂ）、１１５．１（Ｃ−３（５）ａ）、１０６．３（Ｃ−１４ａ，１０ａ）、１０３．１（Ｃ−１４ｂ）、１０１．０（Ｃ−１２ａ）、９５．６（Ｃ−１２ｂ）、９３．５（Ｃ−７ａ）、５６．９（Ｃ−８ａ）。
【００４０】
【化２】
2019508053.tif 000005
【００４１】
（実施例９）レスベラトロール及びδ−ビニフェリン（δ-viniferin）の選択的生産技術の開発
前記実施例１で誘導されたブドウカルスからレスベラトロール及びδ−ビニフェリンをそれぞれ主に生産するために、異なる条件で物質生産を誘導した。１ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含むＭＳ（ムラシゲ・スクーグ）培地１００ｍｌに１０ｇのブドウカルスを接種し、その後２５℃にて９０ｒｐｍで６日間培養した。これを２５ｍｌずつ分注して２４時間同一条件で培養し、その後１００μＭのＭｅＪＡ及び５０ｍＭのステビオシドでそれぞれ処理し、２５℃での静置培養又は９０ｒｐｍの２つのグループに分けて５日間培養した。その後、前記実施例６の方法で物質を抽出してＨＰＬＣ分析に用いた。培養速度条件を異なる条件にした結果、静置培養した試料においては、レスベラトロールがδ−ビニフェリンに比べてはるかに多く生成されることが確認され、振盪培養した試料においては、δ−ビニフェリンがレスベラトロールに比べてはるかに多く生成されることが確認された（図６）。
【図１】
2019508053.tif 000006
【図２】
2019508053.tif 000007
【図３】
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【図４Ａ】
2019508053.tif 000009
【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2019508053000001.app
【国際調査報告】
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2019508053.tif 000014
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