(57)【要約】  本発明の実施形態は、生物学的又は化学的分析のための改良されたバイオセンサを提供する。本発明の実施形態によれば、裏面照射型（ＢＳＩ）相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサは、試料の蛍光又は化学発光を効果的に分析及び測定するために使用することができる。この測定値を利用して、試料の同定に役立てることができる。本発明の実施形態はまた、生物学的又は化学的分析のための改良されたバイオセンサを製造する方法、並びにＤＮＡ配列決定のシステム及び方法を提供する。
2019536020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオセンサであって、以下：
裏面照射型相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサであって、以下：
電子回路層；及び
前記電子回路層上の光検知層、
を含むイメージセンサ、ここで、前記光検知層は、
基板層と、
前記電子回路層を覆う複数のフォトダイオードとを含み、
ここで、受光面は、前記電子回路層とは反対側の前記複数のフォトダイオードの面によって規定される；
前記受光面上の複数のスポット、ここで、各スポットは、核酸高分子を含むようにサイズ設定及び官能化され、かつ、各スポットは単一のフォトダイオードを覆うか、又は複数のフォトダイオードを含むユニットセルを覆う、
を含む、バイオセンサ。
【請求項２】
前記電子回路層が、以下：
誘電体層；及び
第１の誘電体層において形成された金属配線、ここで、前記金属配線は、前記複数のフォトダイオードを外部装置に結合するように構成される、
を含む、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサ上にパッシベーション層（passivation layer）をさらに含む、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
各フォトダイオードと各スポットとの間に挿入されたカラーフィルター材料をさらに含む、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記基板層上に第１の金属層をさらに含む、請求項４に記載のバイオセンサであって、前記第１の金属層が、前記複数のフォトダイオード上に複数の第１の開口部を含み、かつ複数のカラーフィルター材料が、前記複数の第１の開口部内に配置される、バイオセンサ。
【請求項６】
前記第１の金属層の上に、及び前記複数の第１の開口部内の各カラーフィルター材料と前記第１の金属層との間に、誘電体層をさらに含む、請求項５に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記第１の金属層及び前記複数のカラーフィルター材料の上に、パッシベーション層をさらに含む、請求項５に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記パッシベーション層の上に第２の金属層をさらに含む、請求項７に記載のバイオセンサであって、前記第２の金属層が、前記複数のカラーフィルター材料の上に複数の第２の開口部を含む、バイオセンサ。
【請求項９】
前記第２の金属層の上に複数のマイクロレンズをさらに含む、請求項８に記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
前記複数のマイクロレンズの上に第３の金属層をさらに含む、請求項９に記載のバイオセンサであって、前記複数のマイクロレンズ及び前記第３の金属層が、前記複数の第２の開口部と重なる複数の第３の開口部を含む、バイオセンサ。
【請求項１１】
前記第３の金属層の上に平坦化層をさらに含む、請求項１０に記載のバイオセンサであって、前記平坦化層が、前記複数の第３の開口部及び前記複数の第２の開口部と重なる複数の第４の開口部を含む、バイオセンサ。
【請求項１２】
以下：
前記第１の金属層及び前記複数のカラーフィルター材料の上の、第１の材料層、ここで、前記第１の材料層は第１の屈折率によって特徴づけられる；及び
前記第１の材料層の上の第２の材料層、ここで、前記第２の材料層は第２の屈折率によって特徴づけられ、かつ前記第１の屈折率は前記第２の屈折率よりも高い、
をさらに含む、請求項４に記載のバイオセンサ。
【請求項１３】
複数の核酸高分子をさらに含む、請求項１に記載のバイオセンサであって、各核酸高分子が、前記複数のスポットの１つのスポット内に配置されている、バイオセンサ。
【請求項１４】
前記複数のフォトダイオードの各フォトダイオードが、前記複数の核酸高分子の１つの核酸高分子上の蛍光又は化学発光標識から放出された光を検出するように構成されている、請求項１３に記載のバイオセンサ。
【請求項１５】
前記光が、スポット上に固定化された核酸アンプリコンにハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブから放出される、請求項１４に記載のバイオセンサ。
【請求項１６】
前記光が、スポット上に固定化された核酸アンプリコンにハイブリダイズした蛍光標識プライマー伸長産物から放出される、請求項１４に記載のバイオセンサ。
【請求項１７】
前記核酸アンプリコンが、ゲノムＤＮＡ断片又はｃＤＮＡライブラリー由来である、請求項１５又は１６に記載のバイオセンサ。
【請求項１８】
前記アンプリコンが、ローリングサークル増幅又はブリッジポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成される、請求項１５から１７のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１９】
前記複数のスポットが、複数のウェルである、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項２０】
励起光源をさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項２１】
各スポットが、単一のフォトダイオードを覆い、かつ単一のカラーフィルター材料が、前記フォトダイオードと前記スポットとの間に挿入されている、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項２２】
各スポットが、フォトダイオードのユニットセルを覆い、かつカラーフィルター材料が、前記スポットと前記ユニットセルの各フォトダイオードとの間に挿入されている、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項２３】
各ユニットセルが、２、３又は４つのフォトダイオードを含む、請求項２２に記載のバイオセンサ。
【請求項２４】
ユニットセルの各フォトダイオードに関連付けられたカラーフィルター材料がそれぞれ、異なる色の光をフィルタリングする、請求項２３に記載のバイオセンサ。
【請求項２５】
以下：
裏面照射型相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサを設けること、ここで、裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサを設けることは、以下：
電子回路層を設けること；及び
前記電子回路層上に光検知層を設けること、
を含み、ここで、前記光検知層は、
基板層と、
前記電子回路層と接触している複数のフォトダイオードとを含み、
ここで、受光面は、前記電子回路層とは反対側の前記複数のフォトダイオードの面によって規定される；
前記複数のフォトダイオードの上に複数のカラーフィルター材料を堆積させること；並びに
前記受光面上に複数のスポットを設けること、ここで、各スポットは、核酸高分子を含むようにサイズ設定及び官能化され、各スポットは単一のフォトダイオードを覆うか、又は複数のフォトダイオードを含むユニットセルを覆い、かつ、前記複数のカラーフィルター材料の１つのカラーフィルター材料は、各フォトダイオードと各スポットとの間に挿入されている、
を含む、方法。
【請求項２６】
スポットに含まれる核酸高分子から放出された光が、１つのフォトダイオードの受光面によって受光される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
スポットに含まれる核酸高分子から放出された光が、２つ以上のフォトダイオードの受光面から受光される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記フォトダイオードのそれぞれが、単一のスポットからの光を受光する、請求項２６又は２７の方法。
【請求項２９】
前記電子回路層を設けることが、以下：
誘電体層を堆積させること；及び
前記誘電体層内に金属配線を形成すること、ここで、前記金属配線は、前記複数のフォトダイオードを外部装置に結合するように構成される、
を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサの上にパッシベーション層を堆積させること、
をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
以下：
前記基板層の上に第１の金属層を形成すること；及び
前記複数のフォトダイオード上の前記第１の金属層内に複数の第１の開口部をエッチングすること、
ここで、前記複数のカラーフィルター材料は、前記複数の第１の開口部内に堆積される、
をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数の第１の開口部内に前記複数のカラーフィルター材料を堆積させる前に、以下：
前記第１の金属層の上及び前記複数の第１の開口部内に誘電体層を形成すること、
をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記複数の第１の開口部内に前記複数のカラーフィルター材料を堆積させた後に、以下：
第１の金属層及び前記複数のカラーフィルター材料の上にパッシベーション層を形成すること、
をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
以下：
前記パッシベーション層の上に第２の金属層を形成すること；及び
前記複数のカラーフィルター材料上の前記第２の金属層内に複数の第２の開口部をエッチングすること、
をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第２の金属層の上に複数のマイクロレンズを形成すること、
をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記複数のマイクロレンズの上に第３の金属層を形成すること、
をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
以下：
前記第３の金属層の上に平坦化層を形成すること；及び
前記第３の金属層、複数のマイクロレンズ及び平坦化層内に複数の第３の開口部をエッチングすること、ここで、前記複数の第３の開口部は前記複数の第２の開口部と重なる、
をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
以下：
第１の金属層及び前記複数のカラーフィルター材料の上に第１の材料層を形成すること、ここで、前記第１の材料層は第１の屈折率によって特徴づけられる；及び
前記第１の材料層の上に第２の材料層を形成すること、ここで、前記第２の材料層は第２の屈折率によって特徴づけられ、かつ前記第１の屈折率は前記第２の屈折率よりも高い、
をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
前記複数のスポットの１つのスポットに複数の核酸高分子の１つの核酸高分子を付着させること、
をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４０】
前記複数のフォトダイオードの１つのフォトダイオードを用いて核酸高分子上の蛍光又は化学発光標識から放出される光を検出すること、
をさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記光が、スポット上に固定化された核酸アンプリコンにハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブから放出される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記光が、スポット上に固定化された核酸アンプリコンにハイブリダイズした蛍光標識プライマー伸長産物から放出される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸アンプリコンが、ゲノムＤＮＡ断片又はｃＤＮＡライブラリー由来である、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記アンプリコンが、ローリングサークル増幅又はブリッジポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成される、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
励起光源で核酸高分子を照射すること、
をさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
各スポットが、単一のフォトダイオードを覆い、かつ単一のカラーフィルター材料が、前記フォトダイオードと前記スポットとの間に挿入されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項４７】
各スポットが、フォトダイオードのユニットセルを覆い、かつカラーフィルター材料が、前記スポットと前記ユニットセルの各フォトダイオードとの間に挿入されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項４８】
各ユニットセルが、２、３又は４つのフォトダイオードを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ユニットセルの各フォトダイオードに関連付けられたカラーフィルター材料がそれぞれ、異なる色の光をフィルタリングする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＤＮＡ配列決定の方法であって、以下：
核酸高分子内の特定の位置でヌクレオチド塩基を同定する蛍光標識で核酸高分子を標識すること；
核酸高分子に関連付けられた蛍光標識を検出すること、
ここで、前記蛍光標識を検出することは、以下：
核酸高分子を励起光で照射すること、ここで、核酸高分子は励起光を吸収し、カラーフィルター材料を通して、裏面照射型相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサのフォトダイオード上に放射光を透過させる；
フォトダイオードで受光された放射光の少なくとも１つのパラメータを測定すること；及び
蛍光標識に対して放射光の少なくとも１つのパラメータを相関させること、
を含む；並びに
核酸高分子から蛍光標識を除去すること、
を含むプロセスを反復して実施することを含む、方法。
【請求項５１】
裏面照射型相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサを含むバイオセンサであって、前記裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサが、以下：
電子回路層；及び
前記電子回路層上の光検知層、ここで、前記光検知層は、
基板層と、
前記電子回路層と接触している複数のフォトダイオードとを含み、
ここで、受光面は、前記電子回路層とは反対側の前記複数のフォトダイオードの面によって規定される；
複数の核酸高分子を含むようにサイズ設定及び官能化されている受光面上の保護層、ここで、前記保護層は、単一のフォトダイオードを覆うか、又は複数のフォトダイオードを含むユニットセルを覆う；並びに
各フォトダイオードと前記保護層との間に挿入されたカラーフィルター材料、
を含む、バイオセンサ。
【請求項５２】
バイオセンサであって、以下：
裏面照射型相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサであって、以下：
電子回路層；及び
前記電子回路層と接触している複数のフォトダイオード、
を含むイメージセンサ、ここで、受光面は、前記電子回路層とは反対側の複数のフォトダイオードの面によって規定され、かつ、前記複数のフォトダイオードはそれぞれ、第１の長さ寸法（linear dimension）によって特徴づけられる；
前記複数のフォトダイオードの上のパッシベーション層；並びに
前記パッシベーション層上の受光面の上の複数のスポット、ここで、各スポットは、核酸高分子を含むようにサイズ設定及び官能化され、かつ、各スポットは単一のフォトダイオードを覆うか、又は複数のフォトダイオードを含むユニットセルを覆う、
ここで、前記複数のスポットはそれぞれ、第２の長さ寸法によって特徴づけられ、前記第２の長さ寸法は、前記第１の長さ寸法よりも小さい、
を含む、バイオセンサ。
【請求項５３】
裏面照射型相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサを含むバイオセンサであって、前記裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサが、以下：
電子回路層；及び
前記電子回路層上の光検知層、ここで、前記光検知層は、
基板層と、
前記電子回路層と接触している複数のフォトダイオードとを含み、ここで、受光面は、前記電子回路層とは反対側の前記複数のフォトダイオードの面によって規定される；
前記複数のフォトダイオードの上のパッシベーション層；並びに
前記受光面の上の前記パッシベーション層上の複数のスポット、ここで、各スポットは、核酸高分子を含むようにサイズ設定及び官能化され、かつ、各スポットは単一のフォトダイオードを覆うか、又は複数のフォトダイオードを含むユニットセルを覆う、
を含む、バイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年１１月３日に出願された米国仮特許出願第６２／４１６，８１３号の優先権を主張し、その内容は参照によりその全体が組み込まれる。
【０００２】
分野
本発明は、一般に、生物学的又は化学的分析のためのバイオセンサに関し、より具体的には、裏面照射型（ＢＳＩ）相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサを含むバイオセンサ、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ＣＭＯＳイメージセンサは、デジタルカメラ、医療用画像機器、レーダー装置などを含む電子画像装置に使用される。集積回路及び一連のフォトダイオードを用いて、ＣＭＯＳイメージセンサは、光を捕らえて、それを電気信号に変換することができる。
【０００４】
ＣＭＯＳイメージセンサは、典型的には、チップ上に実装される。チップは、各ピクセルに対して増幅器を有し得る。チップ内に多くの増幅器を含むことにより、光の捕捉のための面積が小さくなる可能性があるが、他の構成要素をチップ上に集積して、フォトダイオードにより多くの光を向けることができる。例えば、マイクロレンズをフォトダイオードの前に配置して、フォトダイオードに光を向けることができる。フォトダイオードに当たる光の量をさらに増やすためには、裏面照射型（ＢＳＩ）が使用され得る。ＢＳＩは、集積回路配線の下及び間ではなく、光源のより近くにフォトダイオードを効果的に配置し、相殺的干渉（destructive interference）を低減する。ＢＳＩ  ＣＭＯＳセンサは他の利点も有する。例えば、ＢＳＩ  ＣＭＯＳセンサは、低い動作電圧、低い電力消費、高い効率、及び低いノイズも有し得る。
【０００５】
ＢＳＩ  ＣＭＯＳイメージセンサは、典型的には、２つの機能領域：光感知領域及び電子回路領域、を有する。光感知領域は、光強度を検出する金属酸化物半導体（ＭＯＳ）トランジスタに結合された、アレイ状に配置されたフォトダイオードを含む。電子回路領域は、例えばＭＯＳトランジスタからのデータを処理するための他の装置への、ＭＯＳトランジスタと外部接続との間の接続を提供する。
【０００６】
実際に、ＢＳＩ  ＣＭＯＳイメージセンサは、入射光を異なる波長の光のバンドに分割するフィルターを使用する。光は基板上のフォトダイオードによって受光され、異なる強度の電気信号に変換される。例えば、入射ビームは、赤、緑及び青の光に分割され、各色についてのそれぞれのフォトダイオードによって受光され得る。各フォトダイオードは、検出した光強度を電気信号に変換する。これは、フォトダイオードが電荷を蓄積することによって達成される。例えば、光の強度が高くなるほど、フォトダイオードで蓄積される電荷が高くなる。次に、蓄積された電荷は、色及び明るさに相関する。
【０００７】
上述の使用に加えて、ＣＭＯＳイメージセンサは、生物学的又は化学的分析にも使用することができる。そのような分析のために、生物学的又は化学的試料をフォトダイオード上に置くことができ、生物学的又は化学的試料から放出された光はフォトダイオードに向けられる。試料の蛍光又は化学発光は、フォトダイオードによって検出することができ、色及び明るさを決定することができる。色及び明るさは、生物学的又は化学的試料を同定するために使用され得る。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明の実施形態は、生物学的又は化学的分析のための改良されたバイオセンサを提供することによって、従来のアプローチに関連した欠点に対処する。本発明の実施形態によれば、ＢＳＩ  ＣＭＯＳイメージセンサは、試料の蛍光又は化学発光を効果的に分析及び測定するために使用することができる。この測定値を使用して、試料の同定に役立てることができる。本発明の実施形態はまた、生物学的又は化学的分析のための改良されたバイオセンサを製造する方法を提供する。本明細書で使用される場合、用語「バイオセンサ」は、生物学的分子内の又は生物学的分子に結合した発光物質を測定するための装置を指すために使用することができ、斯かる生物学的分子は、特にＤＮＡ及び分枝鎖又はそうでなければ誘導体化された核酸によって例示される核酸高分子である。本明細書で使用される場合、用語「核酸高分子」は、例えば、ＤＮＢ又は一本鎖の実施形態を指し得る。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、バイオセンサが提供される。バイオセンサは、裏面照射型相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサを含む。裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサは、電子回路層、及び電子回路層上に光検知層を含む。光検知層は、基板層、及び電子回路層と接触しているフォトダイオードを含む。受光面は、電子回路層とは反対側のフォトダイオードの面によって規定される。バイオセンサはさらに、フォトダイオード上にカラーフィルター材料を含む。バイオセンサはさらに、カラーフィルター材料上にスポット又はウェルを含み、斯かるスポット又はウェルは、核酸高分子を受けようにサイズ設定及び官能化され、核酸高分子から光を吸収するか、又は核酸高分子から受光面に光を通過させる。
【００１０】
いくつかの実施形態による製造方法は、裏面照射型相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサを提供することを含む。裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサを提供することは、電子回路層を提供すること、及び電子回路層上に光検知層を提供することを含む。光検知層は、基板層、及び電子回路層と接触しているフォトダイオードを含む。受光面は、電子回路層とは反対側のフォトダイオードの面によって規定される。当該方法はさらに、フォトダイオード上にカラーフィルター材料を堆積させることを含む。当該方法はさらに、カラーフィルター材料上にスポット又はウェルを提供することを含み、斯かるスポット又はウェルは、核酸高分子を受けて、核酸高分子から光を吸収するか、又は核酸高分子から受光面に光を通過させるようにサイズ設定及び官能化されている。
【００１１】
いくつかの実施形態によるＤＮＡ配列決定の方法は、核酸高分子内の特定の位置でヌクレオチド塩基を同定する蛍光標識で核酸高分子を標識することを含み得るプロセスを反復して実施することを含む。当該プロセスはさらに、核酸高分子と関連した蛍光標識を検出することを含む。蛍光標識を検出することは、核酸高分子を励起光で照射することを含む。核酸高分子は励起光を吸収し、カラーフィルターを通して、裏面照射型相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサのフォトダイオード上に、放射光を透過させる。蛍光標識を検出することはさらに、フォトダイオードで受光された放射光の少なくとも１つのパラメータを測定することを含む。蛍光又は化学発光標識を検出することはさらに、蛍光標識に対して放射光の少なくとも１つのパラメータを相関させることを含む。当該プロセスはさらに、核酸高分子から蛍光標識を除去することを含む。限定するものではないが、本発明の実施形態のバイオセンサは、合成による配列決定（sequencing-by-synthesis）（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（sequencing -by-ligation）、ｃＰＡＬ配列決定、パイロシーケンシング（pyrosequencing）、及びこれらの組み合わせを実行するために使用され得る。
【００１２】
前述のことは、他の特徴及び実施形態と共に、以下の明細書、特許請求の範囲、及び添付の図面を参照することでより明らかになるであろう。
【００１３】
図面の簡単な説明
以下の図面を参照して、本発明の例示的な実施形態を以下に詳述する：
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、いくつかの実施形態による、裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサの断面図である。
【図２】図２は、いくつかの実施形態による、第１のパッシベーション層を有する裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサの断面図である。
【図３】図３は、いくつかの実施形態による、第１の金属層を有する裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサの断面図である。
【図４】図４は、いくつかの実施形態による、エッチングされた第１の金属層を有する裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサの断面図である。
【図５】図５は、いくつかの実施形態による、誘電体層を有する裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサの断面図である。
【図６】図６は、いくつかの実施形態による、カラーフィルター層を有する裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサの断面図である。
【図７】図７は、いくつかの実施形態による、平坦化されたカラーフィルター層を有する裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサの断面図である。
【図８Ａ】図８Ａは、いくつかの実施形態による、第２のパッシベーション層、第１の材料層、及び第２の金属層を有する裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサの断面図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、いくつかの実施形態による、第２のパッシベーション層及び第２の金属層を有する裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサの断面図である。
【図９】図９は、いくつかの実施形態による、裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサを用いるバイオセンサの断面図である。
【図１０】図１０は、いくつかの実施形態による、裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサ及びマイクロレンズを用いるバイオセンサの断面図である。
【図１１】図１１は、いくつかの実施形態による、裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサ、マイクロレンズ及び第３の金属層を用いるバイオセンサの断面図である。
【図１２】図１２は、いくつかの実施形態による、裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサ、マイクロレンズ、第３の金属層、及び平坦化層を用いるバイオセンサの断面図である。
【図１３】図１３は、いくつかの実施形態による、裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサを用いるバイオセンサの断面図である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、いくつかの実施形態による、バイオセンサに使用され得る２チャネルカラーフィルターの上面図である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、いくつかの実施形態による、バイオセンサに使用され得る４チャネルカラーフィルターの上面図である。
【図１５】１５Ａ〜１５Ｃは、いくつかの実施形態による、多段階配列決定の様々な段階でのＢＳＩ  ＣＭＯＳチップにおけるアレイ上の多数のスポットにおけるＤＮＢからのシグナルを示す写真画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
図１〜１３は、本発明の実施形態によるバイオセンサの製造の様々な段階を説明している。製造及び構成の他の実施形態は、この説明から当業者には明らかであろう。それゆえ、以下の記載は説明的であり、限定的ではないことが意図される。
【００１６】
読みやすくするために、以下の文章はセクションで構成されている。しかしながら、１つのセクションにおける主題の説明（例えば、高分子、フィルター、配列決定方法等の説明）は、他のセクションにおける主題にも適用され得ることが理解されるであろう。
【００１７】
本発明の実施形態によるバイオセンサは、特定の用途に限定されない。一態様では、本発明の実施形態のバイオセンサは、超並列ＤＮＡ配列決定のための特定の用途を見出す。ＤＮＡ配列決定技術は良く知られているので（例えば、Drmanacら、2010、「Human genome sequencing using unchained base reads on self-assembling DNA nanoarrays,」Science 327:78-81；Shendure & Ji、（2008、「Next-generation DNA sequencing」Nature Biotechnology 26:1135-45参照）、以下のセクションには一般的な用語のみを説明する。以下のパラグラフは、以下に記載のバイオセンサの特定の特徴がより容易に理解できるように、配列決定の簡単な最初の考察及び関連用語を提供する。
【００１８】
様々なＤＮＡ配列決定方法が知られている。多くの手法において、巨大分子（例えば、ゲノムＤＮＡ）は多数のより小さな断片に分解され、それぞれが特徴的なＤＮＡ配列を有する。アレイベースの技術では、断片は、基板上の位置のアレイに分配され、従ってアレイ内の各位置は単一の特徴的配列を有するＤＮＡ断片を含む。配列情報（「読み取り」）は、数千、又はより多くの場合には数百万の位置のそれぞれにおけるＤＮＡから同時に得られ、コンピューターによって集められる。ほとんどの配列決定手法において、断片は、配列決定の前に増幅される。増幅は、各位置に断片を配置する前、各位置に断片を配置した後、又は配置の前後両方で行われ得る。増幅ステップ（複数）は、配列決定プロセスにおける「鋳型」として働く「アンプリコン」を生成する。したがって、例示のために、増幅は、ＲＣＡを使用して、アレイ上の各位置で一本鎖コンカテマー（例えばＤＮＡナノボール）を生成し得るか、あるいはブリッジＰＣＲを使用して、各位置で同じ配列を有するＤＮＡ分子のクローン集団（又はクラスター）を生成し得る。
【００１９】
「ＤＮＡ高分子」などへの言及は、ＤＮＡナノボール、分枝鎖構造、及びクラスター化されたクローン集団（すなわち、単一分子を超える）又はそれらの前駆体を包含することが理解されるであろう。さらに、「ＤＮＡ高分子」などは、補助的なＤＮＡ分子、例えばプライマー、及びプライマー伸長によって生成される伸長鎖（growing strands）を包含しうるか、あるいは他のプロセスが包含する。多くの配列決定技術において、それは、バイオセンサのフォトダイオードによって検出される光を放出する検出可能な（例えば、蛍光又は化学発光）色素を含む（又はそれらで「標識されている」）補助的なＤＮＡ分子である。したがって、「核酸高分子を励起光源で照射し、高分子から放出された光を検出する」などの表現は、「ＤＮＡナノボール又はクローンクラスター及び関連する標識された補助的な分子を励起光源で暴露し、標識された補助的な分子の色素から放出された光を検出すること」を含むことが理解されるであろう。
【００２０】
アレイベースの配列決定方法、及び本発明の実施形態のバイオセンサにおいて、ＤＮＡ高分子は、ウェル内の基板上、又は「スポット」上に配置される。ウェル又はスポットは、高分子を受けて保持することができる。しばしば、スポット（時には「不連続離間領域（discrete spaced apart regions）」又は「パッド」と呼ばれる）は、核酸高分子を受容するように官能化された基板を含み、スポットは、ＤＮＡ高分子がそのような領域に結合しないという意味で「不活性」である領域によって分離される。例えば、限定するものではないが、上記Drmanac 2010参照。「ウェル」は、ＤＮＡ高分子に対する境界又は障壁を形成する壁を含む一種のスポットである。文脈から明らかな場合を除いて、以下の「スポット」への言及はウェルを含み得る。
【００２１】
本発明の実施形態のバイオセンサにおいて、スポットは一般に、均一な寸法を有し、規則的な（すなわち、ランダムではない）アレイとして編成されている。アレイのスポットは一般に、直線的なパターンで、多くは列と行で編成されるが、他の規則的なパターンが使用されてもよい（例えば、らせん）。アレイのスポットは、特徴的な寸法、ピッチ、及び密度を有し得る。スポットそれ自体は、円形、正方形、六角形又は他の形状であり得る。以下の議論において、スポットは一般に、円形であると仮定される（すなわち、直径を有すると説明され得る）。「直径」への言及はまた、他の形状のスポットの直線寸法（例えば、対角線、長さ又は幅）を指すこともできることが理解されるであろう。したがって、本明細書で使用される場合、「直線寸法（長さ寸法）」は、円の直径、正方形の幅、対角線などを指すことができる。本発明の実施形態のバイオセンサの文脈において、スポットのサイズは２つの点で意味がある。第１に、スポットは、占有を単一の標的配列に限定するようにサイズ設定及び／又は官能化され得る。これは、単一のＤＮＡナノボール（単一の標的配列のコンカテマー）又は単一の標的配列を有するクローンクラスターであり得る。例えば、米国特許第８，１３３，７１９号明細書及び米国特許出願公開第２０１３／０１１６１５３号明細書（いずれも、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。第２に、一般的に、スポットは、各フォトダイオードが単一のスポットからの放射光を受光するように、下層のフォトダイオードに対してサイズ設定及び配置され得る。いくつかの実施形態では、スポットのアレイは、１対１の相関で対応するフォトダイオード（複数）（及び／又はカラーフィルター）のアレイ上に配置されてもよい。すなわち、例えば、個々のスポットでＤＮＡ高分子から放出された光は下層のフィルターを通過し、フィルターによって遮断されなかった光は、フィルターに関連する単一のフォトダイオードによって検出されるか、あるいは、例えば、個々のスポットでＤＮＡ高分子から放出された光は、複数の下層のフィルターを通過し、それぞれは（特定の波長に特異的な）フィルターに関連付けられ、それぞれは単一のフォトダイオードに関連付けられ、フィルターによって遮断されなかった光は、関連付けられたフォトダイオードによって検出される。したがって、以下でも論じるように、いくつかの実施形態では、単一のスポットから放出された光は、２つ以上のフォトダイオード（例えば、２、３、４つ等のフォトダイオード）によって検出され得る。これらの実施形態では、単一のスポットに関連付けられた一群の複数のフォトダイオードは、フォトダイオードの「ユニットセル」と呼ばれ得る。スポット及びフィルター（例えば、単一のフィルター又はユニットセル）は、ユニットセル内の各フォトダイオードが同じ単一のスポットから放出された光を受光するように、バイオセンサ内に配置され得る。さらに、いくつかの実施形態では、フォトダイオードの受光面の面積、又は同じスポットに関連付けられた複数のフォトダイオードの受光面の合わせた面積は、スポット（そこから光が放出される）の面積よりも小さい。別の言い方をすれば、スポットの境界が、フォトダイオード（複数）の受光面に投影された場合、受光面内に含まれるように、スポットは、下層のフォトダイオード（複数）よりも小さくてもよい。
【００２２】
良く知られているように、核酸配列決定は一般に、反復プロセスを含み、斯かるプロセスでは、蛍光又は化学発光標識は、配列決定されているＤＮＡ鋳型（アンプリコン）と特異的な方法で配列内に結合され、その結合が検出され、標識はそれがもはや信号を発しないという意味で除去される。例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２３７４８８号明細書；米国特許出願公開第２０１２／０２２４０５０号明細書；米国特許第８，１３３，７１９；７，９１０，３５４；９，２２２，１３２；６，２１０，８９１；６，８２８，１００、６，８３３，２４６；及び６，９１１，３４５号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。したがって、例えば、「蛍光標識で核酸高分子を標識する」とは、スポット上に固定化されたＤＮＡ鋳型と標識された補助的な分子（複数）とを関連付けることを指し得ることが理解されるであろう。
【００２３】
ここで図面を参照すると、図１は、いくつかの実施形態による裏面照射型（ＢＳＩ）ＣＭＯＳイメージセンサ１００の断面図である。ＢＳＩ  ＣＭＯＳイメージセンサ１００は、第１の誘電体層１１０を含んでもよい。誘電体として記載されているが、第１の誘電体層１１０は、任意の好適な電気絶縁材料を含んでもよいことが企図される。第１の誘電体層１００は、金属配線１１３を含んでもよい。金属配線１１３は、集積回路材料及び外部接続を含んでもよい。合わせて、第１の誘電体層１００及び金属配線１１３は本明細書ではまとめて、ＢＳＩ  ＣＭＯＳイメージセンサの「電子回路層」と呼ばれることがある。
【００２４】
基板層１１５は、第１の誘電体層１１０及び金属配線１１３の上に設けられてもよい。基板層１１５は、任意の好適な材料から作られてもよく、斯かる材料は例えば、シリコン、シリコン上のＩＩＩ−Ｖ族、グラフェン−オン−シリコン、シリコン−オン−インシュレーター、これらの組み合わせなどである。基板層１１５は、開口部を含んでもよく、斯かる開口部には、光検知構成要素（例えば、フォトダイオード１１７）が配置されてもよい。フォトダイオード１１７に関して本明細書で説明されているが、任意の好適な光検知構成要素が使用され得ることが企図される。フォトダイオード１１７は、測定された光を電流に変換するように構成されてもよい。フォトダイオード１１７は、ＭＯＳトランジスタ（図示せず）のソース及びドレインを含んでもよく、斯かるソース及びドレインは、電流を他の構成要素、例えば他のＭＯＳトランジスタに転送することができる。他の構成要素は、リセットトランジスタ、電流源フォロワ（current source follower）又は電流をデジタル信号に変換するための行セレクタ（row selector）などを含んでもよい。合わせて、基板層１１５及びフォトダイオード１１７は本明細書ではまとめて、ＢＳＩ  ＣＭＯＳイメージセンサの「光検知層」と呼ばれることがある。
【００２５】
フォトダイオード１１７は、金属配線１１３と接触して、金属配線１１３を介して外部接続にデジタル信号を伝達することができる。図１に示されたＢＳＩ  ＣＭＯＳイメージセンサ１００では、受光面はフォトダイオード１１７の最上部（すなわち、電子回路層と接触しておらず、かつ電子回路層とは反対側の面）に位置しており、入射光は、この受光面でフォトダイオード１１７によって受光される。
【００２６】
図２によれば、バイオセンサ２００を構成するために、第１のパッシベーション層１２０が、ＢＳＩ  ＣＭＯＳイメージセンサ１００の基板層１１５及びフォトダイオード１１７上に、従来の半導体処理技術（例えば、低温プラズマ化学気相成長法）によって堆積されてもよい。第１のパッシベーション層１２０は、任意の好適な保護材料を含んでもよい。例えば、第１のパッシベーション層１２０は、シリコン、酸化物、金属、これらの組み合わせなどのような材料を含んでもよい。第１のパッシベーション層１２０は、本説明書でさらに説明されるように、後のエッチングステップのためのエッチストップとして作用してもよい。第１のパッシベーション層１２０は、代替的に又は付加的に、能動装置（すなわち、裏面照射型ＣＭＯＳセンサ）を保護するように作用し得る。第１のパッシベーション層１２０は、代替的に又は付加的に、頻繁な使用によって引き起こされる摩耗からフォトダイオード１１７を保護するように作用し得る。第１のパッシベーション層１２０は、透明であり得る。一例では、第１のパッシベーション層１２０は、１００ナノメートル以下の厚さを有し得る。
【００２７】
Ａ．図２のバイオセンサ２００
図２は、いくつかの実施形態による、（例えば、高分子又は高分子複合体の化学発光を検出するための）生物学的又は化学的分析に使用することができるバイオセンサ２００を示す。バイオセンサ２００は、裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサ１００を含む。裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサ１００は、電子回路層（第１の誘電体層１１０及び金属配線１１３からなる）並びに電子回路層上の光検知層（基板層１１５及びフォトダイオード１１７からなる）を含む。フォトダイオード１１７は、電気信号が、フォトダイオード１１７から電子回路層に、及びいくつかの実施形態では、外部装置に伝達され得るように、電子回路層と接触していてもよい。受光面は、電子回路層とは反対側であるフォトダイオード１１７の面によって規定される（すなわち、第１のパッシベーション層１２０と接触している表面）。
【００２８】
バイオセンサ２００はさらに、裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサ１００上の第１のパッシベーション層１２０、及び第１のパッシベーション層１２０の上又は内に形成されたスポット又はウェル（図示せず）を含んでもよく、斯かるスポット又はウェルの上（on）又は上（over）に化学的又は生物学的試料が分析のために配置されてもよい。いくつかの実施形態では、バイオセンサ２００は、生体分子の対応するアレイからの光信号（例えば、蛍光又は化学発光）を検出するために適合され得、ここで、個々の生体分子は、１つ又は複数のフォトダイオード上に（例えば、スポット又はウェル内に）配置することができ、従って１つ又は複数のフォトダイオードは、以下により詳細に論じるように、生体分子から光を受光する。
【００２９】
裏面照射型ＣＭＯＳセンサ１００を用いてバイオセンサを構築するための様々なさらなる実施形態を、ここで説明することができる。図３によれば、第１の金属層１２３Ａは、バイオセンサ２００の第１のパッシベーション層１２０上に従来の半導体処理技術によって（例えば、金属堆積技術によって）堆積され得る。第１の金属層１２３Ａは、任意の好適な金属材料を含んでもよい。例えば、第１の金属層１２３Ａは、タングステン、アルミニウム、金、銅、それらの組み合わせ又は合金などのような材料を含んでもよい。いくつかの実施形態では、第１の金属層１２３Ａは、厚い層、例えば、第１のパッシベーション層１２０よりも厚い層であり得る。例えば、第１の金属層１２３Ａは、最大で３マイクロメートルであり得る。
【００３０】
図４によれば、第１の金属層１２３Ａは、第１の金属層１２３Ｂを残して、フォトダイオード１１７上に第１の開口部を設けるためにエッチングされてもよい。第１の金属層１２３Ａは、例えば、ウェットエッチング、ドライエッチング、これらの組み合わせなどのような任意の好適なプロセスによってエッチングされ得る。第１の金属層１２３Ａをエッチングすることは、例えば、マスクの使用を含み得ることが企図される。エッチングは、例えば、酸（例えば、塩酸、フッ化水素酸、硝酸等）、酸化剤を含むアルカリ、これらの組み合わせなどのような、様々な材料のいずれかを用いて完了することができる。第１の金属層１２３Ａをエッチングするために必要とされる酸の種類は、第１の金属層１２３Ａを形成するために使用される材料に依存し得ることが企図される。いくつかの実施形態では、第１の開口部は、フォトダイオード１１７と中心を合わせて配列されてもよく、後の使用におけるフォトダイオード１１７の効率を最大にする。マスク（図示せず）は、フォトダイオード１１７上に開口部を規定して、第１の金属層１２３Ｂを残存させることができ、第１のパッシベーション層１２０は、第１の金属層１２３Ａにおける開口部をエッチングする際のエッチストップとして作用し得る。本明細書で説明するように、第１の金属層１２３Ｂの柱は、別々のカラーフィルターによって受けられた光を分離することができ、そして、特定のカラーフィルターに向けられた光をそのカラーフィルターに又は対応するフォトダイオード１１７に反射することができる。
【００３１】
図５によれば、第２の誘電体層１２５が、従来の半導体処理技術によって、第１の金属層１２３Ｂ上及び第１の開口部内に堆積され得る。いくつかの実施形態では、第２の誘電体層１２５は、第１の金属層１２３Ｂの全ての露出面上に形成され得る。誘電体であるとして記載されているが、第２の誘電体層１２５は、窒化シリコン、酸化タンタル、これらの組み合わせなどのような任意の好適な電気絶縁材料を含んでもよいことが企図される。第２の誘電体層１２５は、第１の誘電体層１１０と同じ又は異なる材料から形成されてもよい。
【００３２】
図６によれば、カラーフィルター材料１２７Ａは、第２の誘電体層１２５上に堆積されてもよい。いくつかの実施形態では、カラーフィルター材料１２７Ａは、スピンコーティングによって堆積されてもよい。カラーフィルター材料１２７Ａは、第２の誘電体層１２５によって形成された開口部を満たす。この実施形態において、カラーフィルター材料１２７Ａはまた、開口部間の第２の誘電体層１２５の部分上に堆積される。したがって、図７によれば、第２の誘電体層１２５の開口部上の余分なカラーフィルター材料１２７Ａは、例えば、化学機械平坦化（ＣＭＰ）などによって除去され、第２の誘電体層１２５の開口部内にカラーフィルター材料１２７Ｂを残すことができる。
【００３３】
しかしながら、いくつかの実施形態では、図６に示されたプロセスが省略されてもよいことが企図される。換言すれば、図７におけるように、カラーフィルター材料１２７Ｂは、第２の誘電体層１２５の開口部にのみ選択的に堆積されてもよく、従って２つ以上の（例えば、２、３又は４つの）異なるカラーフィルター材料１２７Ｂがフォトダイオード１１７上に配置されてもよい。いくつかの用途では、それぞれの異なるカラーフィルター材料１２７Ｂを、別々のフォトダイオード１１７に関連付けることができる。
【００３４】
カラーフィルター材料１２７Ｂは、例えば、顔料系ポリマー、顔料系染料、染料系ポリマー、樹脂又は他の有機系材料、これらの組み合わせなどを含み得る。例えば、フォトダイオード１１７が、ほとんど又は全く波長特異性なしに光強度を単独で検出し、したがって色情報を分離することができないために、カラーフィルター材料１２７Ｂは、バイオセンサに必要であり得る。
【００３５】
カラーフィルター材料１２７Ｂは、青色フィルター材料、赤色フィルター材料、緑色フィルター材料、エメラルドフィルター材料、シアンフィルター材料、黄色フィルター材料、マゼンタフィルター材料、白色フィルター材料、これらの組み合わせなどを含んでもよい。したがって、カラーフィルター材料１２７Ｂは、波長範囲によって入射光をフィルタリングすることができ、従って別々のフィルタリングされた強度が光の色についての情報を含む。例えば、赤色カラーフィルター材料１２７Ｂは、赤色波長領域における光の強度についての情報を与え得る。青色カラーフィルター材料１２７Ｂは、青色波長領域における光の強度についての情報を与え得る。緑色カラーフィルター材料１２７Ｂは、緑色波長領域における光の強度についての情報を与え得る、など。
【００３６】
いくつかの実施形態では、カラーフィルター材料１２７Ｂは、単色の材料を含んでもよい。例えば、カラーフィルター材料１２７Ｂのそれぞれは、赤色であってもよい。いくつかの実施形態では、カラーフィルター材料１２７Ｂは、異なる色の材料を含んでもよく、各カラーフィルター材料１２７Ｂは、別々のフォトダイオード１１７に対応する。例えば、１つのカラーフィルター材料１２７Ｂが赤色であってもよく、かつ隣接するカラーフィルター材料１２７Ｂが緑色であってもよい。図１４Ａは、２チャネルカラーフィルターが使用されるそのような実施形態を示す。図１４Ａでは、生物学的又は化学的試料（例えば、ＤＮＡ高分子）は、スポット又はウェル１４５０内に配置されてもよく、従って、高分子からの発光は、赤色カラーフィルター材料１４２７Ｂ及び緑色カラーフィルター材料１４２７Ａの両方に入り（例えば、赤色カラーフィルター材料１４２７Ｂ及び緑色カラーフィルター材料１４２７Ａの両方に重なり）、かつ、カラーフィルター材料の異なる色を通る光の放出波長が検出され得る。別の例では、２つを超える周囲カラーフィルター材料１２７Ｂが、異なる色の材料を含んでもよい。図１４Ｂは、４チャネルカラーフィルターが使用されるそのような実施形態を示す。４チャネルカラーフィルターは、赤色である１つのカラーフィルター材料１４２７Ｂ、黄色である１つのカラーフィルター材料１４２７Ｄ、緑色である１つのカラーフィルター材料１４２７Ａ、及び青色である１つのカラーフィルター材料１４２７Ｃを含んでもよい。この例では、生物学的又は化学的試料は、４つのカラーフィルターの交点のスポット又はウェル１４５０内に配置されてもよく、従って、カラーフィルター材料の４色を通る光の放出波長が検出され得る。いくつかの実施形態では、スポット又はウェル１４５０は、下層のカラーフィルター材料（及び対応するフォトダイオード）のそれぞれの上に等しくあってもよく、すなわち、各フィルターの等しい面積がスポットの下にある。
【００３７】
図８Ａは、バイオセンサ８００が構築されている実施形態を示す。図８Ａによれば、第２のパッシベーション層１３０は、第２の誘電体層１２５及びカラーフィルター材料１２７Ｂ上に従来の半導体技術に従って堆積され得る。第２のパッシベーション層１３０は、図８Ｂに関して以下に記載する通りであり得る。第１の材料層１３５は、第２のパッシベーション層１３０の上に堆積され得る。第１の材料層１３５は、任意の好適な材料、例えば窒化シリコン、酸化タンタル、これらの組み合わせなどを含んでもよい。第２の材料層１３７は、第１の材料層１３５の上に堆積され得る。第２の材料層１３７は、任意の好適な材料、例えば二酸化シリコンなどを含んでもよい。いくつかの実施形態では、第１の材料層１３５は、第２の材料層１３７の屈折率よりも高い屈折率を有し得る。いくつかの実施形態では、第１の材料層１３５は、第２のパッシベーション層１３０よりも高い屈折率を有し得る。したがって、図８Ａの実施形態は、蛍光測定の場合に受光面への励起光の効率的送達をもたらし得る。例えば、第１の材料層１３５は、光導波路のコアを形成することができ、したがって励起光の低損失伝達を可能にする。いくつかの実施形態では、生物学的又は化学的試料は、フォトダイオード１１７上の第２の材料層１３７上に配置することができ（いくつかの実施形態では、第２の材料層１３７上に形成された開口部又はウェル内に）、それらの蛍光又は化学発光は、本明細書でさらに説明されるように、フォトダイオード１１７によって測定され得る。しかしながら、図８Ａに示された実施形態において蛍光を測定する場合、いくつかの例では、励起光は、バイオセンサ８００の表面に沿って横方向に向けられてもよい。
【００３８】
Ｂ．図８Ａのバイオセンサ８００
したがって、図８Ａは、いくつかの実施形態による、生物学的又は化学的分析に使用することができるバイオセンサ８００を示す。バイオセンサ８００は、裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサ１００を含んでもよい。裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサ１００は、電子回路層（第１の誘電体層１１０及び金属配線１１３からなる）並びに電子回路層上の光検知層（基板層１１５及びフォトダイオード１１７からなる）を含む。フォトダイオード１１７は、電気信号が、フォトダイオード１１７から電子回路層に、及びいくつかの実施形態では、外部装置に伝達され得るように、電子回路層と接触していてもよい。受光面は、電子回路層とは反対側であるフォトダイオード１１７の面によって規定される（すなわち、第１のパッシベーション層１２０と接触している表面）。
【００３９】
バイオセンサ８００はさらに、裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサ１００上の第１のパッシベーション層１２０、及び第１のパッシベーション層１２０上の第１の金属層１２３Ｂを含んでもよい。第１の金属層１２３Ｂはまた、基板層１１５上に配置されてもよい。第１の金属層１２３Ｂは、第１の開口部を含んでもよい。バイオセンサ８００はさらに、金属層１２３Ｂ及び第１のパッシベーション層１２０の上に第２の誘電体層１２５を含んでもよい。第２の誘電体層１２５はまた、金属層１２３Ｂの第１の開口部内に配置されてもよい。
【００４０】
バイオセンサ８００はさらに、第２の誘電体層１２５の上に、並びに金属層１２３Ｂの第１の開口部の内及び上に、カラーフィルター材料１２７Ｂを含んでもよく、従って、カラーフィルター材料１２７Ｂの上面は、金属層１２３Ｂの上の第２の誘電体層１２５の上面と平面になり得る。バイオセンサ８００はさらに、第２の誘電体層１２５及びカラーフィルター材料１２７の上に第２のパッシベーション層１３０を含んでもよい。バイオセンサ８００はさらに、第１の材料層１３５及び第２の材料層１３７を含んでもよい。第１の材料層１３５は、第２の材料層１３７よりも高い屈折率を有し得る。生物学的又は化学的試料は、さらに本明細書に記載されるように、分析のために第２の材料層１３７内又は上に形成されたスポット又はウェル（図示せず）内に配置され得る。
【００４１】
図８Ｂは、図８Ａの代替的な実施形態を示す。図８Ｂによれば、第２のパッシベーション層１３０は、第２の誘電体層１２５及びカラーフィルター材料１２７Ｂの上に、従来の半導体技術に従って堆積され得る。第２のパッシベーション層１３０は、例えば、窒化シリコン、酸化タンタル、これらの組み合わせなどのような任意の好適な材料を含んでもよい。いくつかの実施形態では、第２のパッシベーション層１３０は、１つ又は複数の高誘電率（ｈｉｇｈ−ｋ）材料を含んでもよい。第２のパッシベーション層１３０は、第１のパッシベーション層１２０と同じ又は異なる材料を含んでもよい。いくつかの実施形態では、第２のパッシベーション層１３０は、第１のパッシベーション層１２０よりも密度の高い材料で作られる。第２のパッシベーション層１３０は、いくつかの実施形態では、分析される試料とカラーフィルター材料１２７Ｂとの間の保護材料として作用し得る。いくつかの実施形態では、第２のパッシベーション層１３０は、後のエッチングステップのためのエッチストップとして作用する。第２のパッシベーション層１３０は透明であり得る。
【００４２】
さらに図８Ｂによれば、第２の金属層１３３Ａは、第２のパッシベーション層１３０の上に、従来の半導体技術に従って堆積され得る。第２の金属層１３３Ａは、例えば、タングステン、アルミニウム、銅、これらの組み合わせなどのような任意の好適な金属材料を含んでもよい。第２の金属層１３３Ａは、第１の金属層１２３Ｂと同じ又は異なる材料で作られていてもよい。第２の金属層１３３Ａは、入射光又は励起光を通さなくてもよい。
【００４３】
次に、図９によれば、第２の金属層１３３Ｂは、第２の金属層１３３Ａからエッチングされるか、又はパターニングされて、第２の金属層１３３Ａ内に第２の開口部１５０Ａ〜Ｃを形成し得る。いくつかの実施形態では、第２の開口部１５０Ａ〜Ｃは、フォトダイオード１１７と中心を合わせて配列されてもよく。いくつかの実施形態では、第２の開口部１５０Ａ〜Ｃは、１００ナノメートルから１マイクロメートルの範囲の直径を有し得る。第２の開口部１５０Ａ〜Ｃは、カラーフィルター材料１２７Ｂよりも小さな幅又は直径を有し得る。いくつかの実施形態では、生物学的又は化学的試料は、第２の開口部１５０Ａ〜Ｃ内に配置することができ、本明細書でさらに説明されるように、試料から放出された光はそれらの蛍光又は化学発光を測定するために使用することができる。第２の開口部１５０Ａ〜Ｃが、カラーフィルター材料１２７Ｂよりも小さい幅又は直径を有する実施形態では、入射光又は励起光の遮蔽が増大する可能性があり、試料の蛍光又は発光の検出におけるノイズが少なくなる。第２の開口部１５０Ａ〜Ｃの幅又は直径は、分析されている生物学的又は化学的試料のサイズにほぼ対応し得る。
【００４４】
Ｃ．図９のバイオセンサ９００
したがって、図９は、いくつかの実施形態による、生物学的又は化学的分析に使用することができるバイオセンサ９００を示す。バイオセンサ９００は、裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサ１００を含む。裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサ１００は、電子回路層（第１の誘電体層１１０及び金属配線１１３からなる）並びに電子回路層上の光検知層（基板層１１５及びフォトダイオード１１７からなる）を含む。フォトダイオード１１７は、電気信号が、フォトダイオード１１７から電子回路層に、及びいくつかの実施形態では、外部装置に伝達され得るように、電子回路層と接触していてもよい。受光面は、電子回路層とは反対側であるフォトダイオード１１７の面によって規定される（すなわち、第１のパッシベーション層１２０と接触している表面）。
【００４５】
バイオセンサ９００はさらに、裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサ１００上の第１のパッシベーション層１２０、及び第１のパッシベーション層１２０上の第１の金属層１２３Ｂを含んでもよい。第１の金属層１２３Ｂはまた、基板層１１５上に配置されてもよい。第１の金属層１２３Ｂは、第１の開口部を含んでもよい。バイオセンサ９００はさらに、金属層１２３Ｂ及び第１のパッシベーション層１２０の上に第２の誘電体層１２５を含んでもよい。第２の誘電体層１２５はまた、金属層１２３Ｂの第１の開口部内に配置されてもよい。
【００４６】
バイオセンサ９００はさらに、第２の誘電体層１２５の上に、並びに金属層１２３Ｂの第１の開口部の内及び上に、カラーフィルター材料１２７Ｂを含んでもよく、従って、カラーフィルター材料１２７Ｂの上面は、金属層１２３Ｂの上の第２の誘電体層１２５の上面と平面になり得る。バイオセンサ９００はさらに、第２の誘電体層１２５及びカラーフィルター材料１２７の上に第２のパッシベーション層１３０を含んでもよい。バイオセンサ９００はさらに、第２の開口部１５０Ａ〜Ｃを有する第２の金属層１３３Ｂを含み得る。第２の開口部１５０Ａ〜Ｃは、本明細書でさらに説明されるように、生物学的又は化学的試料を受けるように構成されたスポット又はウェルとして機能し得る。
【００４７】
図９の実施形態を再度参照すると、図１０〜１３に関して本明細書で記載されるように、様々なさらなる製造技術がさらなる信号増強のために実施され得る。図１０によれば、マイクロレンズ１４０Ａは、第２のパッシベーション層１３０及び第２の金属層１３３Ｂの上に成長され得る。いくつかの実施形態では、マイクロレンズ１４０Ａは、フォトダイオード１１７と中心を合わせて配列されてもよく。マイクロレンズ１４０Ａは、様々な材料、例えばガラス、ポリマー、プラスチック、これらの組み合わせなどを含んでもよい。マイクロレンズ１４０Ａは、カラーフィルター１２７Ｂのそれぞれに放出された光を集束させるために、カラーフィルター１２７Ｂのそれぞれの上の装置に含まれてもよい。
【００４８】
マイクロレンズ１４０Ａは、ＣＭＯＳイメージセンサに対して一般的に使用されるような任意の好適なマイクロレンズ製造プロセスに従って、成長させることができる。一例として、フォトリソグラフィは、フォトレジスト又は紫外線硬化性エポキシ材料上で行うことができ、その材料は融解されて、マイクロレンズ１４０Ａのアレイを形成することができる。他の例としては、ガラスの小さなフィラメントが融解してもよく、融解ガラスの表面張力が滑らかな球状表面を形成してもよい。次に、球状表面ガラスを適切に取り付け、研磨して、マイクロレンズ１４０Ａを形成することができる。さらに別の例では、ウェハレベル光学系（wafer-level optics）（ＷＬＯ）を使用することができ、斯かるウェハレベル光学系では、複数のレンズウェハが精密に整列され、互いに接着し、そしてダイシング（diced）されて、マイクロレンズ１４０Ａとして使用され得る多要素スタックを形成する。
【００４９】
図１１によれば、第３の金属層１４３Ａは、マイクロレンズ１４０Ａ上に、従来の半導体処理技術に従って堆積され得る。第３の金属層１４３Ａは、タングステン、アルミニウム、銅、これらの組み合わせなどのような任意の好適な材料を含んでもよい。第３の金属層１４３Ａは比較的薄い層、例えば第２の金属層１２３Ｂよりも薄い層であり得る。第３の金属層１４３Ａは、第１の金属層１２３Ｂ及び／又は第２の金属層１３３Ｂと同じ又は異なる材料から作られていてもよい。
【００５０】
図１２によれば、平坦化層１４５Ａは、第３の金属層１４３Ａの上に堆積され得る。平坦化層１４５Ａは、任意の好適な材料を含んでもよい。平坦化層１４５Ａは、例えばスピンコーティングによって、又は任意の他の好適な方法によって堆積され得る。平坦化層１４５Ａが、第３の金属層１４３Ａの上部露出表面を超える場合、平坦化層１４５Ａは、例えば化学機械平坦化（ＣＭＰ）によって、平坦化されてもよく、第３の金属層１４３Ａの間の開口部に平坦化層１４５Ａを残し、実質的に平坦な上部表面を形成する。
【００５１】
図１３によれば、第３の開口部１５５Ａ〜Ｃは、平坦化層１４５Ａ（平坦化層１４５Ｂは残したまま）、第３の金属層１４３Ａ（第３の金属層１４３Ｂは残したまま）、及びマイクロレンズ１４０Ａ（マイクロレンズ１４０Ｂは残したまま）を通してエッチングすることができる。例えば、平坦化層１４５Ｂは、第３の開口部１５５Ａ〜Ｃをエッチングするために、フォトレジスト（図示せず）でスピンコーティングすることができる。いくつかの実施形態では、第２の金属層１３３Ｂをさらにエッチングする必要が無いように、第３の開口部１５５Ａ〜Ｃの幅は、第２の開口部１５０Ａ〜Ｃの幅に対応してもよい。第３の開口部１５５Ａ〜Ｃは、第２のパッシベーション層１３０がエッチストップとして作用して、第２のパッシベーション層１３０までエッチングされ得る。いくつかの例では、第３の開口部１５５Ａ〜Ｃは、１００ナノメートル〜１マイクロメートルの直径を有してもよく、カラーフィルター材料１２７Ｂ及び／又はフォトダイオード１１７と中心を合わせて配列されてもよい。いくつかの実施形態では、生物学的又は化学的試料は、第２のパッシベーション層１３０上の第３の開口部１５５Ａ〜Ｃ内に配置することができ、本明細書でさらに説明されるように、試料の蛍光又は化学発光を測定することができる。
【００５２】
Ｄ．図１３のバイオセンサ１３００
したがって、図１３は、いくつかの実施形態による、生物学的又は化学的分析に使用することができるバイオセンサ１３００を示す。バイオセンサ１３００は、裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサ１００を含む。裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサ１００は、電子回路層（第１の誘電体層１１０及び金属配線１１３からなる）並びに電子回路層上の光検知層（基板層１１５及びフォトダイオード１１７からなる）を含む。電気信号が、フォトダイオード１１７から電子回路層に、及びいくつかの実施形態では、外部装置に伝達され得るように、フォトダイオード１１７は電子回路層と接触していてもよい。受光面は、電子回路層とは反対側であるフォトダイオード１１７の面によって規定される（すなわち、第１のパッシベーション層１２０と接触している表面）。
【００５３】
バイオセンサ１３００はさらに、裏面照射型ＣＭＯＳイメージセンサ１００上の第１のパッシベーション層１２０、及び第１のパッシベーション層１２０上の第１の金属層１２３Ｂを含んでもよい。第１の金属層１２３Ｂはまた、基板層１１５上に配置されてもよい。第１の金属層１２３Ｂは、第１の開口部を含んでもよい。バイオセンサ１３００はさらに、金属層１２３Ｂ及び第１のパッシベーション層１２０の上に第２の誘電体層１２５を含んでもよい。第２の誘電体層１２５はまた、金属層１２３Ｂの第１の開口部内に配置されてもよい。
【００５４】
バイオセンサ１３００はさらに、第２の誘電体層１２５の上に、並びに金属層１２３Ｂの第１の開口部の内及び上に、カラーフィルター材料１２７Ｂを含んでもよく、従って、カラーフィルター材料１２７Ｂの上面は、金属層１２３Ｂの上の第２の誘電体層１２５の上面と平面になり得る。バイオセンサ１３００はさらに、第２の誘電体層１２５及びカラーフィルター材料１２７の上に第２のパッシベーション層１３０を含んでもよい。バイオセンサ１３００はさらに、第２の開口部１５０Ａ〜Ｃを有する第２のパッシベーション層１３０の上に、第２の金属層１３３Ｂを含んでもよい。
【００５５】
バイオセンサ１３００はさらに、第２の金属層１３３Ｂ上のマイクロレンズ１４０Ｂ、マイクロレンズ１４０Ｂ上の第３の金属層１４３Ｂ、及び第３の金属層１４３Ｂ上の平坦化層１４５を含んでもよい。第３の金属層１４３Ｂは、バイオセンサ１３００における多数の異なる目的を果たし得る。例えば、第３の金属層１４３Ｂは、入射光がカラーフィルター材料１２７Ｂに入るのを阻止することを助け得る。さらに、第３の金属層１４３Ｂは湾曲しているので、生物学的又は化学的試料から放出された任意の光は、マイクロレンズ１４０Ｂを通過し、第３の金属層１４３Ｂで反射し、そしてカラーフィルター材料１２７Ｂに向かって、及び従ってフォトダイオード１１７の受光面に向かって戻るように向けられ得る。換言すれば、フォトダイオード１１７によって測定され得る放射光の量が最大化され得る。
【００５６】
平坦化層１４５は、第３の金属層１４３Ｂ上に平坦な表面を形成してもよい。マイクロレンズ１４０Ｂ、第３の金属層１４３Ｂ、及び平坦化層１４５は、その中に形成された第３の開口部１５５Ａ〜Ｃを有してもよく、斯かる開口部は、いくつかの実施形態における第２の開口部１５０Ａ〜Ｃと重なり合ってもよい。例えば、第３の開口部１５５Ａ〜Ｃは、第２の開口部１５０Ａ〜Ｃと同じ幅を有してもよい。しかしながら、いくつかの実施形態では、第３の開口部１５５Ａ〜Ｃは、第２の開口部１５０Ａ〜Ｃとは異なる幅を有し得ることが企図される。合わせて、第２の開口部１５０Ａ〜Ｃ及び第３の開口部１５５Ａ〜Ｃは、本明細書でさらに説明されるように、生物学的又は化学的試料を受けるように構成されたスポット又はウェルとして機能し得る。図１３の第３の開口部１５５Ａ〜Ｃは、図９の第２の開口部１５０Ａ〜Ｃよりも深いので、励起光は一般に、バイオセンサ１３００における第３の開口部１５５Ａ〜Ｃの真上に位置する光源から向けられ得る。第２の開口部１５０Ａ〜Ｃは、第３の開口部１５５Ａ〜Ｃほど深くないので、バイオセンサ９００は、励起光のより大きな角度ずれ（angular misalignment）を許容できる。
【００５７】
核酸配列決定適用
図２、８Ａ、９及び１３に関して上述したように、生物学的又は化学的試料は、カラーフィルター材料１２７Ｂ及びフォトダイオード１１７の上の記載されたバイオセンサのそれぞれの上に配置され得る。生物学的又は化学的試料は、任意の数の構成要素を含んでもよい。例えば、試料は、核酸高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、タンパク質などを含み得る。試料は、遺伝子配列、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、一塩基多型、タンパク質相互作用、ペプチド相互作用、抗原−抗体相互作用、グルコースモニタリング、コレステロールモニタリングなどを決定するために分析され得る。
【００５８】
上述したように、いくつかの実施形態では、生体分子は、核酸、例えばＤＮＡである。限定することなく、ＤＮＡ生体分子はＤＮＡナノボール（一本鎖コンカテマー）であってもよく、斯かるＤＮＡナノボールは、標識プローブ（例えば、ライゲーション又はｃＰＡＬ法によるＤＮＢ配列決定において）若しくは相補的成長鎖（例えば、合成方法によるＤＮＢ配列決定において）、又はその両方に；あるいは単一のＤＮＡ分子（例えば、単一分子配列決定において）に；あるいはブリッジＰＣＲベースの配列決定で生成されるようなＤＮＡ分子のクローン集団に、ハイブリダイズされる。したがって、「生体分子」、「ＤＮＡ高分子」又は「核酸高分子」への言及は、２つ以上の分子（例えば、複数の成長相補鎖に関連付けられたＤＮＢ、あるいは数百又は数千のＤＮＡ分子のクローン集団を含むＤＮＡクラスター）を包含し得る。例えば、米国特許第８，１３３，７１９号明細書；米国特許出願公開第２０１３／０１１６１５３号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０２３７４８８号明細書；米国特許出願公開第２０１２／０２２４０５０号明細書；米国特許第８，１３３，７１９；７，９１０，３５４；９，２２２，１３２；６，２１０，８９１；６，８２８，１００、６，８３３，２４６；及び６，９１１，３４５号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００５９】
いくつかの実施形態では、核酸高分子は、ゲノムＤＮＡ断片又はｃＤＮＡライブラリーのアンプリコンであり得る。本明細書で使用される場合、「アンプリコン」は、核酸分子の増幅産物、典型的にはゲノムＤＮＡの断片又はｃＤＮＡライブラリーの増幅産物であり得る。増幅の方法としては、これらに限定されるものではないが、例えば米国特許第８，４４５，１９４号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載された、ローリングサークル増幅、又は例えば米国特許第７，９７２，８２０号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載された、ブリッジポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。例えば米国特許第７，９１０，３５４号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、増幅は、核酸がバイオセンサと接触する前に、又はインサイチュ（in situ）で行われてもよい。
【００６０】
いくつかの実施形態では、カラーフィルター材料１２７Ｂは、いくつかの例では、（カラーフィルター材料１２７Ｂの上のスポット又はウェル内で）生物学的又は化学的試料を受けて、そして生物学的又は化学的試料から放出された光を吸収するようにサイズ設定され及び官能化され得る。例えば、カラーフィルター材料１２７Ｂが赤色であり、かつ生物学的又は化学的試料からの放射光が緑色である場合、カラーフィルター材料１２７Ｂは緑色の放射光を吸収し得る。いくつかの実施形態では、カラーフィルター材料１２７Ｂは、（カラーフィルター材料１２７Ｂの上のスポット又はウェル内で）生物学的又は化学的試料を受けて、そして生物学的又は化学的試料から放出された光をカラーフィルター材料１２７Ｂを介してフォトダイオード１１７の受光面上に通過させるようにサイズ設定され及び官能化され得る。例えば、カラーフィルター材料１２７Ｂが青色であり、かつ生物学的又は化学的試料からの放射光が青色である場合、カラーフィルター材料１２７Ｂは、対応するフォトダイオード１１７の受光面に青色放射光を通過させ得る。換言すれば、いくつかの実施形態では、放射光は、カラーフィルター材料１２７Ｂによって吸収され得る。いくつかの実施形態では、放射光は、カラーフィルター材料１２７Ｂを通してフォトダイオード１１７上に透過され得る。
【００６１】
例えば、生物学的試料、例えばＤＮＡ高分子、オリゴヌクレオチド、又はヌクレオチドであって、蛍光又は化学発光色素に関連付けられた試料が、フォトダイオード１１７上に配置され得る。蛍光の場合、色素は、励起光源からの励起光によって照射され得る。励起光は、例えば、可視光、赤外線（ＩＲ）、紫外線（ＵＶ）などを含む、任意の好適なタイプ又は強度の光に対応し得る。励起光はまた、任意の好適な光源、例えば発光ダイオード（ＬＥＤ）、ランプ、レーザー、これらの組み合わせなどから発せられる。色素が特定の波長の励起光で照射される場合、生物学的試料は光を吸収し、次に異なる波長の光を放出し得る。例えば、生物学的試料は、４５０ｎｍの波長を有する励起光を吸収するが、５５０ｎｍの波長を有する光を放出し得る。換言すれば、色素が、特徴的な異なる波長の光（すなわち、励起光源）によって照射される場合、特徴的波長の蛍光が放出され得る。しかしながら、励起光は蛍光を測定するために使用されるので、フォトダイオード１１７での正確な測定を行うためにはそれをフィルタリングしなければならない。
【００６２】
化学発光の場合、放射光を検出するために、励起光源はフォトダイオード１１７に必要とされない。代わりに、生物学的試料は、生物学的試料と化学発光色素（又は他の溶液）との間で起こり得る化学的又は酵素的反応によって光を放出することができ、化学的結合の破壊又は形成によって光の放出を引き起こす。
【００６３】
蛍光及び化学発光のいずれについても、フォトダイオード１１７は、放射光の強度を検出し、それを光の強度に基づく電気信号に変換することができ、斯かる電気信号は、金属配線１１３を介して外部装置に提供され得る。外部装置は、電気信号と、その特定のフォトダイオード１１７の上で使用されるカラーフィルター材料１２７Ｂの色とに基づいて、電気信号を特定の波長及び明るさに相関させることができる。
【００６４】
高密度を達成し、かつ核酸高分子とバイオセンサのフォトダイオード１１７との間のアラインメントを補助するために、バイオセンサの表面は、活性スポット又はウェル（例えば、開口部１５０Ａ〜Ｃ、開口部１５５Ａ〜Ｃ等）が存在するように構成されてもよく、斯かるスポット又はウェルは、核酸高分子を受けるためにサイズ設定及び化学的に官能化され、核酸高分子が結合し得ない表面の領域によって囲まれている。核酸高分子は、任意の好適な表面化学を用いてフォトダイオード１１７と位置合わせされた活性表面に固定され得る。これは、非共有相互作用（例えば、正電荷を帯びた領域への）、あるいは、核酸高分子に含まれる配列に相補的な配列を有する捕捉プローブ又は表面に結合したオリゴヌクレオチドとの相互作用を含んでもよい。例えば、米国特許第８，４４５，１９４号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００６５】
いくつかの実施形態では、バイオセンサの表面上の活性スポット又はウェルと核酸高分子とは、各スポットが１つの核酸高分子のみに結合するように、相互に構成され得る。これは、例えば、活性スポットにサイズが対応するアンプリコンと表面とを接触させることによって達成され得る（例えば、活性スポットの直径と有効に同等又はそれよりも大きな直径を有するアンプリコン）。米国特許第８，４４５，１９４号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。あるいは、活性スポットは、単一ＤＮＡ断片を結合するように化学的に適合することができ、これは、元の結合部位で、及びその周辺でより大きな領域を満たすように増幅され得る。
【００６６】
いくつかの本発明の実施形態は、異なる光の波長に対応する異なる標識を決定するために使用され得る。標識は、例えば、蛍光、化学発光又は生物発光標識であり得る。例えば、遺伝子配列決定（又はＤＮＡ配列決定）において、本発明の実施形態は、核酸高分子（例えば、ＤＮＡの鎖）内のヌクレオチド塩基の正確な順序を決定するために使用され得る。ヌクレオチド塩基は、特定の蛍光標識（例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、又はチミン（Ｔ））で標識され得る。あるいは、例えば、１色、２色、又は３色配列決定方法が使用され得る。
【００６７】
蛍光に関して、ヌクレオチド塩基のそれぞれは、核酸高分子を励起光で連続して励起することによって順に決定することができる。核酸高分子は、本明細書で記載したように（例えば、図２、８Ａ、９又は１３に示すように）、励起光を吸収し、バイオセンサ上に異なる波長の放射光を透過させることができる。バイオセンサは、放射光の波長及びフォトダイオードによって受光される強度を測定することができる。各ヌクレオチドは、特定の波長及び／又は強度の励起光によって励起されると、特定の光の波長及び／又は強度をフォトダイオードに放出することができ（すなわち、「蛍光標識」）、核酸高分子における特定の位置で特定のヌクレオチド塩基の存在の同定を可能にする。その特定のヌクレオチド塩基が決定されると、それは核酸高分子から除去され、従って次の連続するヌクレオチド塩基が同様のプロセスに従って決定され得る。
【００６８】
核酸高分子は、任意の目的のためにバイオセンサに付着させる前又は後に、１つ又は複数の異なる蛍光、化学発光、又は生物発光標識で標識され得る。例えば、核酸高分子は、標識されたオリゴヌクレオチドプローブ又は増幅プライマーとハイブリダイズされ得る。あるいは、核酸高分子は、非標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされてもよく、これは次に標識プローブに結合されるか、又は標識ヌクレオチドアナログを用いて伸長され得る。例として、標識は、核酸高分子を特徴づける目的で（例えば、疾患に関連付けられた一塩基多型（ＳＮＰ）の存在）、あるいは上述のように、核酸高分子の全て又は一部の核酸配列決定のために行われ得る。プローブハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列決定は、例えば米国特許第８，１０５，７７１号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。アンカープローブライゲーション（anchor probe ligation）による配列決定は、例えば米国特許第８，５９２，１５０号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。合成による配列決定は、例えば米国特許第７，８８３，８６９号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。一般的に、合成による配列決定は、鋳型配列にハイブリダイズした配列決定プライマーによって提供された遊離３’ヒドロキシル基に、連続的にヌクレオチドが追加され、５’から３’方向に核酸鎖の合成をもたらす方法である。１つの手法では、別の例示的タイプのＳＢＳ、パイロシーケンシング技術が用いられる（Ronaghiら、1998、Science 281:363）。
【００６９】
いくつかの実施形態では、図２、８Ａ、９及び１３に示されたバイオセンサは、フローセル（図示せず）に結合されてもよい。核酸高分子は、バイオセンサとフローセル中の液体試料とを接触させることによって、バイオセンサに付着され得る。フローセルは、反応部位と流体連通（fluid communication）する１つ又は複数のフローチャネル（例えば、開口部１５０Ａ〜Ｃ、開口部１５５Ａ〜Ｃ等）を含んでもよい。一例では、バイオセンサは、バイオアッセイシステムに流体的及び電気的に結合され得る。バイオアッセイシステムは、所定のプロトコルに従って試薬を反応部位に送達し、画像化事象を行うことができる。例えば、バイオアッセイシステムは、溶液が反応部位に沿って流れるように指示することができる。溶液は、同じ又は異なる蛍光標識を有する４種類のヌクレオチドを含んでもよい。次に、バイオアッセイシステムは、励起光源を用いて反応部位を照らすことができる。励起光は、所定の波長又は波長（複数）を有し得る。励起された蛍光標識は、フォトダイオード１１７によって検出され得る発光信号を提供し得る。
【００７０】
ユーザは、（例えば、図２、８Ａ、９及び１３に）記載の実施形態によるバイオセンサと、核酸アンプリコンとを、又は後に増幅される核酸とを接触させることによって配列決定の準備をすることができ、従って核酸高分子は結合し、活性スポット又はウェルによって保持され、そして過剰の核酸高分子は洗い流され得る。核酸高分子は、事前に又はインサイチュで、標識試薬と接触される。次に、バイオセンサは、本明細書に記載のように操作され、アレイ上の核酸高分子の上又はその周辺に放出された光を決定することができる。光は定量化されるか、あるいは表面上の核酸高分子のどれが、特定の波長で発光する標識で標識されているかを二元的に決定するのに十分であり得る。異なる波長で発光する標識を有する異なるプローブ又は異なる核酸アナログを同時に使用することができ、例えば、配列中の特定の位置で異なる塩基を決定するか、又は複数の位置を配列決定することができる。
【実施例】
【００７１】
実施例
本実施例は、ＢＳＩ  ＣＩＳセンサが、表面に付着した光子放出分子からの弱い信号を検出するために使用され得ることを実証する。本発明者らは、図９に記載されたように、ただしカラーフィルター層は無しに（すなわち、要素１２０、１２３Ｂ、１２５、及び１２７Ｂを欠いて）、バイオセンサを構築した。さらに、表面１３３Ｂを疎水性にし、かつ開口部１５０Ａ／Ｂ／Ｃの底面を親水性にした（従ってＤＮＢが親水性表面に向かって、かつ疎水性表面から離れて分布するように）。
【００７２】
ＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）の希釈溶液をバイオセンサアレイに適用して、個々のＤＮＢをアレイのスポット上に沈降させた。この実験の目的のために、ＤＮＢの全ては同じ配列を有し、これは、アレイ上の本質的に全てのＤＮＢが異なる配列を有することになり、かつＤＮＢの配列が任意の特定のスポットであり／位置が配列決定の前に知られていないであろう配列決定方法とは対照的である。
【００７３】
２つのプライマーがＤＮＡ鋳型にハイブリダイズされた（図１５Ａ、上を参照）。「左」のプライマーは、ブロックされた（伸長不可能な）３’末端を有し、蛍光色素で５’末端が標識されている。蛍光色素は、アレイ上のＤＮＢの位置を確立するために使用された（図示せず）。「右」のプライマーは、合成によって配列決定するための伸長可能なプライマーとして作用する。配列決定試薬及び検出試薬４（ＤＮＡポリメラーゼ、ストレプトアビジン、ビオチン化ルシフェラーゼ３、ＡＴＰ及びルシフェリン）を、切断可能なリンカーを介してビオチンでタグ付けされたｄＡＴＰと共に添加した。このシステムでは、ストレプトアビジン２は、取り込まれたヌクレオチドにコンジュゲートしたビオチンと会合し、また、図１５Ａに示されたようにビオチン化ルシフェラーゼと会合する（ビオチン１はひし形で表される）。ＡＴＰは、ルシフェラーゼに媒介されるルシフェリンのオキシルシフェリンへの変換による光の生成のための基質として作用する。光はフォトダイオードによって受光され、信号を生成する。信号はｄＡＴＰの取り込みと相関し、鋳型配列の対応する位置におけるチミンの存在を示している。図１５Ａは、アレイ上の多数のスポットにおけるＤＮＢからの信号を示す。
【００７４】
次に、ＴＨＰＰを使用して切断可能なリンカーを切断し、ビオチン／ストレプトアビジン／ルシフェラーゼ複合体を放出し、そしてアレイを洗浄して全ての可溶性試薬を除去した。図１５Ｂは、洗浄ステップ後にアレイからの信号が存在しないか、又は有意に減少していることを示す。
【００７５】
第２の取り込みラウンドを、図１５Ｃに示すように、ｄＴＴＰ−ジゴキシン及びＤＮＡポリメラーゼを用いて行った。ｄＴＴＰの取り込みは、ビオチン化抗ジゴキシン抗体、ストレプトアビジン、ビオチン化ルシフェラーゼ、ＡＴＰ及びルシフェリンを用いて検出される。ビオチン化抗ジゴキシン抗体の使用は、各取り込み事象によって生成された信号を増幅する。図１５Ｃは、化学発光光がアレイ上の多数のスポットで生じたことを示す画像である。この例は、２つの異なるｄＮＴＰ及び２つの異なる検出システムを用いて、本発明のＢＳＩ  ＣＩＳセンサが、表面に付着した光子放出分子、例えばＤＮＢからの弱い信号を検出するために使用することができることを実証する。
【００７６】
本明細書に記載のプロセスは、特定の順序で行われる特定数のステップに関して記載されているが、明示的に示されていない及び／又は記載されていない付加的なステップが含まれてもよいことが企図される。さらに、示され及び記載されたものよりも少ないステップが、記載の実施形態の範囲から逸脱することなく含まれてもよいことが企図される（すなわち、記載されたステップの１つ又はいくつかは任意であってもよい）。さらに、本明細書に記載されたステップは、記載されたものとは異なる順序で行われてもよいことが企図される。
【００７７】
前述の説明において、本出願の態様はその特定の実施形態を参照して説明されるが、当業者は本発明がそれらに限定されないことを認識するであろう。したがって、本出願の例示的実施形態が本明細書に詳細に記載されているが、本発明の概念は他にもさまざまに実施及び採用できること、並びに添付の特許請求の範囲は、先行技術によって限定される場合を除き、そのような変形を含むと解釈されることを意図するものであることが理解されるべきである。上記発明の様々な特徴及び態様は、個別に又は一緒に使用することができる。さらに、実施形態は、本明細書のより広い趣旨及び範囲から逸脱することなく本明細書に記載されたものを超えて、任意の数の環境及び用途において利用することができる。従って、明細書及び図面は、限定的ではなく例示的であるとみなされるべきである。例示の目的のために、方法は特定の順序で記載した。代替的な実施形態では、方法は記載されたものとは異なる順序で実施されてもよいことが理解されるべきである。
【００７８】
他の変形は本開示の趣旨の範囲内である。したがって、開示された技術は様々な改変及び代替の構成を受け入れる余地があるが、その特定の例示された実施形態は図面に示されており、上記に詳述されてきた。しかしながら、開示を特定の形態又は開示された形態に限定することを意図するものではないが、対照的に、その意図は、添付の特許請求の範囲に定義されたように、開示の趣旨及び範囲内にある全ての改変、代替構成及び等価物を網羅することであると理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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