(57)【要約】  本発明者らは、体細胞核移植細胞（ＳＣＮＴ細胞）を第１非ヒト哺乳動物の発生した胚盤胞に注入することによって、第１非ヒト哺乳動物における標的器官の発生の欠如に至る発生上の欠損を補完することにより、腎臓などの標的器官を再生することができることを開示している。また、本発明者らは、ＳＣＮＴ細胞を用いて、発生段階において標的器官の発生の欠如に関連する異常を有する第１非ヒト哺乳動物の生体内で標的器官を産生する方法であって、標的器官が、第１非ヒト哺乳動物とは異なる個体である第２哺乳動物に由来して産生される方法を開示している。
2019517818.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発生段階における標的器官の発生の欠如に関連する異常を有する第１非ヒト哺乳動物の生体に前記標的臓器を産生する方法であって、産生される前記標的器官は、前記第１非ヒト哺乳動物とは異なる個体である第２哺乳動物に由来し、ａ）前記第２哺乳動物由来の体細胞核移植細胞（ＳＣＮＴ細胞）を作成すること、ｂ）前記ＳＣＮＴ細胞を前記第１非ヒト哺乳動物の胚盤胞に移植してキメラ胚を得ること、ｃ）前記標的器官を含む少なくとも１子孫を得るために、第３非ヒト哺乳動物の子宮に前記キメラ胚を発生させること、およびｄ）前記少なくとも１子孫から前記標的器官を取得すること、を含む方法。
【請求項２】
前記第２哺乳動物が、ヒト、ラット、またはマウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記産生される器官が、膵臓、腎臓、胸腺、および毛髪から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１非ヒト哺乳動物が、マウス、ラット、サル、またはブタである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１非ヒト哺乳動物がマウスであり、前記マウスが、Ｓａｌｌ１ノックアウトマウス、Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックマウス、Ｐｄｘ１ノックアウトマウス、およびヌードマウスのうちの１つ以上である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記標的器官が前記第２哺乳動物に完全に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第２哺乳動物および前記第１非ヒト哺乳動物が異種の関係にある、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
発生段階における標的器官の発生の欠如に関連する異常を有する第１非ヒト哺乳動物であって、ａ）前記第１非ヒト哺乳動物とは異なる個体である第２哺乳動物由来のＳＣＮＴ細胞を作成すること、ｂ）前記ＳＣＮＴ細胞を前記第１非ヒト哺乳動物の胚盤胞に移植してキメラ胚を得ること、およびｃ）前記標的器官を含む少なくとも１子孫を得るために、第３非ヒト哺乳動物の子宮に前記キメラ胚を発生させることを含む方法により産生される哺乳動物。
【請求項１０】
標的器官を産生するためのキットであって、Ａ）発生段階において前記標的器官の発生の欠如に関連する異常を有する第１非ヒト哺乳動物、およびＢ）前記第１非ヒト哺乳動物とは異なる個体である第２哺乳動物に由来するＳＣＮＴ細胞を含むキット。
【請求項１１】
標的器官および標的身体部分の１つ以上を産生するための方法であって、
器官および身体部分の１つ以上の欠損を引き起こす因子をコードする欠損責任遺伝子を含み、前記因子が機能すれば生存不可能および生存困難の１つ以上をもたらす非ヒト動物を準備すること、それにおいては前記器官および身体部分の１つ以上が胚盤胞補完によって補完され、前記欠損責任遺伝子が前記標的器官および標的身体部分の１つ以上の欠損を引き起こす因子をコードする、
前記非ヒト動物から得られた卵を胚盤胞に成長させること、
標的体細胞核移植細胞（ＳＣＮＴ細胞）を前記胚盤胞に導入して、キメラ胚盤胞を産生すること、ここで前記標的ＳＣＮＴ細胞は、前記欠損責任遺伝子によって引き起こされる欠損を補完することができる所望のゲノムを有する、
前記キメラ胚盤胞から個体を産生すること、および
前記個体から前記標的器官および標的身体部分の１つ以上を得ることを含む方法。
【請求項１２】
前記個体を産生することが、第３非ヒト哺乳動物の子宮で前記キメラ胚盤胞を発生させて、前記標的器官を含む少なくとも１子孫を得て、前記少なくとも１子孫から前記標的器官を得ることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的ＳＣＮＴ細胞がヒト由来である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的器官および標的身体部分の１つ以上が、膵臓、腎臓、胸腺および毛髪から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記非ヒト動物が、マウス、ラット、サル、またはブタである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１非ヒト哺乳動物がマウスであり、前記マウスが、Ｓａｌｌ１ノックアウトマウス、Ｐｄｘ１ノックアウトマウス、Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックマウス、およびヌードマウスの１つ以上である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的器官および標的身体部分の１つ以上が、前記標的ＳＣＮＴ細胞に完全に由来する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＳＣＮＴ細胞を作成することをさらに含み、前記ＳＣＮＴ細胞は、第２哺乳動物に由来する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２哺乳動物および前記非ヒト動物が異種の関係にある、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
標的器官および標的身体部分の１つ以上を産生するためのキットであって、Ａ）器官および身体部分の１つ以上の欠損を引き起こす因子をコードする遺伝子を含み、前記因子が機能すれば生存不可能および生存困難の１つ以上をもたらす非ヒト動物であって、前記器官および身体部分の１つ以上が補完により補完される非ヒト動物、およびＢ）前記非ヒト動物とは異なる個体である第２哺乳動物に由来するＳＣＮＴ細胞を含むキット。
【請求項２１】
前記非ヒト動物および前記第２哺乳動物が異種間関係にある、請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下で２０１６年６月１４日に出願された先願の仮出願第６２／３５０，００５号の利益を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本開示の発明の分野の背景
概して、本開示は、ＳＣＮＴ細胞を用いてインビボで所望の細胞由来の器官を産生するための方法に関する。
【０００３】
関連技術の説明
細胞移植や器官移植の形態をとる再生医療に関する論では、胚盤胞の内部空間に誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を注入した場合、得られた個体がキメラマウスを形成する。この技術を応用した胚盤胞補完によるＴ細胞およびＢ細胞系統のレスキュー実験が既に報告されており、そのレスキュー実験はＴ細胞およびＢ細胞系統が欠損したＲａｇ−２ノックアウトマウスで行われている。このキメラマウスアッセイは、インビトロアッセイシステムが利用できないＴ細胞系統の分化を検証するためのインビボアッセイシステムとして使用される。
【０００４】
また、器官の再生に関して、Ｎａｋａｕｃｈｉと共同研究者ら（米国特許第２０１１／０２５８７１５号明細書）は、発育した胚盤胞へｉＰＳ細胞を注入することによりＰｄｘ１ＬａｃＺ／ＬａｃＺマウスの膵臓欠損の補完がなされたことを報告し、さらに、こうして補完された膵臓を有するトランスジェニック動物は、その表現型を創始者として次世代に伝えることができることを見出した。これらの発見により、そのような創始者を用いて器官の再生を達成できることが明らかになった。
【０００５】
しかし、Ｎａｋａｕｃｈｉらが実践した技術は、体細胞を再プログラミング因子で培養し、ｉＰＳ細胞をそれから樹立することによる、体細胞における多能性の誘発を必要とする。適切な再プログラミング因子を選択し、推定されるｉＰＳ細胞の導入される多能性を保証し、ｉＰＳ細胞を樹立することは、ヒトまたは動物の健康状態を改善するための診療所でＮａｋａｕｃｈｉの作業を実施する際に生じる難題に対する好機を表している。
【０００６】
器官を再生する他の試みが、ｉＰＳ細胞ではなく胚性幹細胞（ＥＳ細胞）で始まった。しかし、所与の種の最初の胚由来のＥＳ細胞は、同じ種であっても再生される器官を所望し得る第２の個体とは遺伝的に異なる。したがって、第１の胚由来のＥＳ細胞から生じる再生器官の移植では、第２の個体を免疫不全にする望ましくない再生器官の拒絶反応を防止するために、第２の個体に免疫抑制療法を行うことが必要となることがある。また、様々な当事者が、最初のヒト胚由来のＥＳ細胞を使用することが非倫理的であるとみなすことがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示は、先行技術に関して上で特定された問題の１つ以上に対処し、および／または少なくとも減らし、および／または上記の望ましい特徴のうちの１つ以上を提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示の概要
以下に、本開示のいくつかの態様の基本的な理解をもたらすために、開示の簡略化された概要を提示する。この概要は、開示を網羅する概観ではない。本開示の重要なまたは決定的な要素を特定すること、または本開示の範囲を定めることを意図するものではない。その唯一の目的は、後述するより詳細な説明の前置きとして、いくつかの概念を簡略化した形で提示することである。
【０００９】
概して、本開示は、容易に作成可能な体細胞核移植細胞（ＳＣＮＴ細胞）を用いた器官再生技術を対象とするものであり、産業的な用途に適している技術である。具体的には、本開示は、ｉＰＳ細胞の使用から生じ得る難題なしに、個体の「自分の器官」を、皮膚などの個体の体細胞の１つから再生するための技術を提供することができる。
【００１０】
本開示は、添付の図面と併せて以下の説明を参照することによって理解することができ、同様の参照番号は同様の要素を特定する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】関連する背景を提示するものとして本明細書に含まれる、生殖クローニングのための体細胞核移植（ＳＣＮＴ）プロセスの概略図を示す。
【図１Ｂ】本明細書の実施形態による、胚盤胞補化が可能なＳＣＮＴ細胞を産生することができる体細胞核移植（ＳＣＮＴ）プロセスの概略図を示す。
【図２】本明細書の実施形態による、ＳＣＮＴ細胞を用いた胚盤胞補体の概略図を示す。
【図３】本明細書の実施形態による第１の方法に関するフローチャートを示す。
【図４】本明細書の実施形態による第２の方法に関するフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書に開示された主題は、様々な修正および代替の形態が可能であるが、それらの特定の実施形態は、例として図面に示されており、本明細書において詳細に記載されている。しかし、特定の実施形態に関する本明細書の記載は、本開示を開示している特定の形態に限定することを意図したものではなく、むしろ、添付の特許請求の範囲によって規定される本開示の精神および範囲内に入るすべての修正、均等物および代替物を網羅することを意図するものであることを理解されたい。
【００１３】
詳細な説明
本開示の種々の例示的な実施形態を以下に記載する。わかりやすくするために、実際の実装のすべての特徴を本明細書に記載してはいない。任意のそのような実際の実施形態の開発において、実装毎に多様である、システムに関わる制約やビジネスに関わる制約への準拠など、開発者の特定の目標を達成するための多数の実装特有の決定を行わなければならないことは、当然認識される。さらに、このような開発努力は複雑で時間がかかるが、依然として、本開示の恩恵を受ける当業者にとって日常的な仕事であることは理解されよう。
【００１４】
これから、添付の図面を参照しながら本主題を説明する。説明の目的のためだけに、また当業者に周知の細部を用いて本開示を不明瞭にしないようにするために、様々な構造、システム、および装置を、図面に概略的に示している。それでも依然、添付の図面は、本開示の例示的な実施例を記載し説明するために挙げられている。本明細書で使用される単語および語句は、当業者によるそれらの単語や語句の理解と一致した意味があると理解し、解釈するべきものである。用語または語句の特別な定義、すなわち、当業者が理解する通常および慣習的な意味とは異なる定義は、本明細書の用語または語句を一貫して使用することで暗示されることを意図している。用語または語句が特別な意味、すなわち当業者によって理解されるもの以外の意味を有することを意図しているため、このような特別な定義を、直接かつ明解に用語や語句の特殊な定義を付与する明確な様式で、本明細書に明示的に記載している。
【００１５】
一実施形態において、胚盤胞補完法では、キメラ胚を生じさせるべく、体細胞核移植細胞（ＳＣＮＴ細胞）を胚盤胞に注入して腎臓などの器官の欠損を補完したときに次世代が誕生し、そのように補完された腎臓を有するトランスジェニック動物は、その表現型を創始者として次世代に伝えることができる。換言すれば、このような創始者を用いて器官の再生を達成することができる。
【００１６】
一実施形態では、本開示は、発生段階における標的器官の発生の欠如に関連する異常を有する第１非ヒト哺乳動物の生体に標的臓器を産生する方法であって、産生される標的器官は、第１非ヒト哺乳動物とは異なる個体である第２哺乳動物に由来し、
ａ）第２哺乳動物由来の体細胞核移植細胞（ＳＣＮＴ細胞）を作成すること、
ｂ）細胞を第１非ヒト哺乳動物の胚盤胞に移植してキメラ胚を得ること、
ｃ）標的器官を含む少なくとも１子孫を得るために、第３非ヒト哺乳動物の子宮にキメラ胚を発生させること、および
ｄ）少なくとも１子孫から標的器官を取得すること、
を含む方法を提供する。
【００１７】
一実施形態では、ＳＣＮＴ細胞は、ヒト、ラット、およびマウスの１つ以上に由来する。
【００１８】
一実施形態では、ＳＣＮＴ細胞は、ラット、およびマウスの１つ以上に由来する。
一実施形態では、産生される器官は、膵臓、腎臓、胸腺、および毛髪から選択される。
【００１９】
一実施形態では、第１非ヒト哺乳動物はマウスである。
一実施形態では、マウスは、Ｓａｌｌ１ノックアウトマウス、Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックマウス、Ｐｄｘ１ノックアウトマウス、およびヌードマウスの１つ以上である。
【００２０】
一実施形態では、標的器官は、第２哺乳動物に完全に由来する。
一実施形態では、本方法は、第２哺乳動物の体細胞の核を脱核卵母細胞に移植してＳＣＮＴ細胞を得ることをさらに含むことができる。一実施形態では、脱核卵母細胞は、第２哺乳動物と同じ種であり得る。
【００２１】
一実施形態では、ＳＣＮＴ細胞および第１非ヒト哺乳動物は異種の関係にあり得る、すなわち、第２哺乳動物および第１非ヒト哺乳動物は異なる種に由来し得る。
【００２２】
一実施形態では、ＳＣＮＴ細胞はラットに由来し、第１非ヒト哺乳動物はマウスである。
【００２３】
別の態様において、本開示は、発生段階における標的器官の発生の欠如に関連する異常を有する第１非ヒト哺乳動物であって、
ａ）第１非ヒト哺乳動物とは異なる個体である第２哺乳動物由来のＳＣＮＴ細胞を作成すること、
ｂ）ＳＣＮＴ細胞を第１非ヒト哺乳動物の胚盤胞に移植してキメラ胚を得ること、および
ｃ）標的器官を含む少なくとも１子孫を得るために、第３非ヒト哺乳動物の子宮にキメラ胚を発生させること
を含む方法により産生される哺乳動物を提供する。
【００２４】
別の態様では、本開示は、ＳＣＮＴ細胞を用いて標的器官を産生するための、発生段階における標的器官の発生の欠如に関連する異常を有する第１非ヒト哺乳動物の使用に関する。
【００２５】
別の態様において、本開示は、標的器官を産生するためのキットであって、
Ａ）発生段階において標的器官の発生の欠如に関連する異常を有する第１非ヒト哺乳動物、および
Ｂ）第１非ヒト哺乳動物とは異なる個体である第２哺乳動物に由来するＳＣＮＴ細胞
を含むキットを提供する。
【００２６】
別の態様では、本開示は、標的器官および標的身体部分の１つ以上を産生するための方法であって、
Ａ）器官および身体部分の１つ以上の欠損を引き起こす因子をコードする欠損責任遺伝子を含み、因子が機能すれば生存不可能および生存困難の１つ以上をもたらす動物を準備すること、それにおいては器官および身体部分の１つ以上が胚盤胞補完によって補完され、欠損責任遺伝子が標的器官および標的身体部分の１つ以上の欠損を引き起こす因子をコードする、
Ｂ）動物から得られた卵を胚盤胞に成長させること、
Ｃ）標的ＳＣＮＴ細胞を胚盤胞に導入して、キメラ胚盤胞を産生すること、ただし標的ＳＣＮＴ細胞は、欠損責任遺伝子によって引き起こされる欠損を補完することができる所望のゲノムを有する、および
Ｄ）キメラ胚盤胞から個体を産生すること、次いで個体から標的器官および標的身体部分の１つ以上を得ること
を含む方法を提供する。
【００２７】
一実施形態では、本方法は、第２哺乳動物の体細胞の核を脱核卵母細胞に移植してＳＣＮＴ細胞を得ることをさらに含む。一実施形態では、脱核された卵母細胞は、第２哺乳動物と同じ種に由来し得る。一実施形態では、工程Ｄ）は、第３非ヒト哺乳動物の子宮でキメラ胚盤胞を発生させて、標的器官を含む少なくとも１子孫を得て、少なくとも１子孫から標的器官を得ることを含む。
【００２８】
別の実施形態では、標的ＳＣＮＴ細胞は、ラットおよびマウスの１つ以上に由来する。
別の実施形態では、標的器官および標的身体部分の１つ以上が、膵臓、腎臓、胸腺および毛髪から選択される。
【００２９】
さらに別の実施形態では、動物はマウスである。
別の実施形態では、マウスは、Ｓａｌｌ１ノックアウトマウス、Ｐｄｘ１ノックアウトマウス、Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックマウス、およびヌードマウスの１つ以上である。
【００３０】
さらに別の実施形態では、標的器官および標的身体部分の１つ以上は、ＳＣＮＴ細胞に完全に由来する。
【００３１】
さらに別の実施形態では、ＳＣＮＴ細胞および第１非ヒト哺乳動物は異種の関係にある。
【００３２】
さらに別の実施形態では、ＳＣＮＴ細胞はラットに由来し、第１非ヒト哺乳動物はマウスである。
【００３３】
別の態様では、本開示は、標的器官および標的身体部分の１つ以上を産生するためのキットであって、
Ａ）器官および身体部分の１つ以上の欠損を引き起こす因子をコードする遺伝子を含み、因子が機能すれば生存不可能および生存困難の１つ以上をもたらす非ヒト動物であって、器官および身体部分の１つ以上が補完により補完される非ヒト動物、および
Ｂ）第１非ヒト哺乳動物とは異なる個体である第２哺乳動物に由来するＳＣＮＴ細胞
を含むキットを提供する。
【００３４】
一実施形態では、非ヒト動物とＳＣＮＴ細胞が異種の関係にある。
図１Ａは、いわゆる生殖クローニングとの関連での体細胞核移植（ＳＣＮＴ）の技術に関する一般的な背景を提示している。成体マウスは、卵母細胞（半数体または１ｎ）を精子（同様に一倍体または１ｎ）と受精させて接合体（二倍体または２ｎ）を生じさせること、その後、接合体を胚盤胞に発育させること、雌の子宮でのその移植、妊娠、出産、および成体マウスを得るための生後の発育により産生できる。受精および移植は、従来の交配または体外受精（ＩＶＦ）技術のいずれかによって行うことができる。成体マウスは、接合体と遺伝的に同一である。
【００３５】
引き続き図１Ａで、成体マウスの二倍体または２ｎ体細胞（すなわち、非配偶子細胞）を、例えば、成体マウスの皮膚または頬側腔（内頬）からの得る細胞をかき取ることによって得ることができる。体細胞の核は、公知の技術を用いて単離することができる。同様に、既知の技術によって、卵母細胞を準備し、その核を除去することができる。次いで体細胞核を脱核卵母細胞に移植してＳＣＮＴ接合体を得ることができる。ＳＣＮＴ接合体は、成体マウスと遺伝的に同一である（すなわち、そのクローンである）。ＳＣＮＴ接合体はＳＣＮＴ胚盤胞に発育することができ、ＩＶＦ技術により雌の子宮に移植することができる。ＳＣＮＴ胚盤胞は、妊娠期間中に発育し、出産し、出生後には成体マウスのクローンである成熟した個体に発育し得る。各ステップに必要な技術は、一般によく知られている。
【００３６】
図１Ｂは、本明細書の実施形態に従って使用されるＳＣＮＴ技術を概略的に示す。患者、例えば、標的器官を再生することが望まれる患者に由来する体細胞（二倍体、２ｎ）を準備する。体細胞の核を単離し、脱核卵母細胞に移植してＳＣＮＴ接合体を得る。ＳＣＮＴ接合体は、患者と遺伝的に同一である（すなわち、患者のクローンである）。ＳＣＮＴ接合体は、ＳＣＮＴ胚盤胞およびＳＣＮＴ胚に発育し得る。ＳＣＮＴ胚盤胞または胚を雌の子宮に移植するのではなく、妊娠期間の発育が起こり得ない条件下で、ＳＣＮＴ胚盤胞または胚をインビトロで保持することができる。しかし、インビトロでさえ、幹細胞はＳＣＮＴ胚盤胞または胚に発育する可能性がある。ＳＣＮＴ胚盤胞または胚から幹細胞を単離して、本明細書の実施形態による使用可能であり得るＳＣＮＴ細胞を得ることができる。
【００３７】
図２にさらなる技術を概略的に示す。それにより第２哺乳動物に由来する器官（例えば、図示された実施形態では腎臓）を含む動物、例えば非ヒト哺乳動物（例えば、図示の実施形態ではマウス）が産生できる。例えば、Ｓａｌｌ１遺伝子座（Ｓａｌｌ１（＋／−））でそれぞれヘテロ接合である雄性および雌性が繁殖し、胚盤胞が回収し得る。回収された胚盤胞の約１／４がＳａｌｌ１（−／−）遺伝子型を有し、それは腎臓が成体マウスに欠損している表現型を生じさせる。しかし、Ｓａｌｌ１（−／−）胚盤胞がＳＣＮＴ細胞を受ける場合（図１Ｂに示される技術によって産生され得るような場合）、ＳＣＮＴ細胞（それらがＳａｌｌ１（＋／−）、Ｓａｌｌ１（＋／＋）である、または腎臓の発生が正常に進行し得る比較可能な遺伝子型を有することを推定）は、成体Ｓａｌｌ１（−／−）マウスに腎臓が発生する可能性がある。
【００３８】
図２はマウスおよびＳａｌｌ１遺伝子座に関するものであるが、本開示の利益を有する当業者は、使用される技術が、マウスにおける他の遺伝子座または他の動物における任意の遺伝子座に関して応用可能であることを認識するであろう。
【００３９】
別の実施形態において、ホモ接合Ｓａｌｌ１（−／−）胚は、いわゆる「遺伝子ドライブ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）技術の使用により、性的成熟Ｓａｌｌ１（＋／−）ヘテロ接合動物を繁殖させる必要なく作成することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ技術を用いて、卵母細胞および精子をＳａｌｌ１（−）に遺伝的に改変することができ、そのとき体外受精技術はホモ接合Ｓａｌｌ１（−／−）胚を産生することができる。
【００４０】
図３に、本明細書の実施形態による第１の方法３００のフローチャートを提示する。方法３００は、第２哺乳動物に由来する体細胞核移植細胞（ＳＣＮＴ細胞）を作成すること（３１０）、ＳＣＮＴ細胞を第１非ヒト哺乳動物の胚盤胞に移植して（３２０）、キメラ胚を得ること、標的器官を含む少なくとも１子孫を得るために、第３非ヒト哺乳動物の子宮にキメラ胚を発生させること（３３０）、および少なくとも１子孫から標的器官を得ること（３４０）を含み得る。方法３００を実施することにより、発生段階において標的器官の発生の欠如に関連する異常を有する第１非ヒト哺乳動物の生体内で標的器官を産生することができ、その標的器官は、第１非ヒト哺乳動物とは異なる個体である第２哺乳動物に由来して産生される。
【００４１】
図４は、本明細書の実施形態による第２の方法４００のフローチャートを提示する。図示されるように、方法４００は、器官および身体部分の１つ以上の欠損を引き起こす因子をコードする欠損責任遺伝子を含み、因子が機能すれば生存不可能および生存困難の１つ以上をもたらす非ヒト動物を準備すること（４１０）を含み得、それにおいて器官および身体部分の１つ以上が胚盤胞補完により補完され、欠損責任遺伝子が標的器官および標的身体部分の１つ以上の欠損を引き起こす因子をコードする。方法４００はまた、非ヒト動物から得られた卵を胚盤胞に成長させること（４２０）を含み得る。方法４００は、標的体細胞核移植細胞（ＳＣＮＴ細胞）を胚盤胞に導入（４３０）してキメラ胚盤胞を産生することをさらに含むことができ、この場合標的ＳＣＮＴ細胞は、欠損責任遺伝子に起因する欠損を補完することができる所望のゲノムを有する。方法４００はまた、キメラ胚盤胞から個体を産生すること（４４０）を含み得る。方法４００は、個体から１つ以上の標的器官および標的身体部分を得ること（４５０）を、さらに含むことができる。
【００４２】
方法４００は、１つ以上の標的器官または標的身体部分を産生するために使用できる。
本開示において、移植されるＳＣＮＴ細胞は、産生される器官の動物の種に応じて作成される。例えば、ヒトの器官を産生する場合には、ヒトの体細胞由来の核を含むＳＣＮＴ細胞を作成する。ヒト以外の哺乳動物の器官を産生する場合には、哺乳動物由来の細胞を作成する。
【００４３】
本開示の方法において産生される器官は、腎臓、心臓、膵臓、小脳、肺、甲状腺、毛髪および胸腺などの固定した形状を有する任意の固形器官であり得る。好ましい例として、腎臓、膵臓、毛髪、胸腺などが挙げられる。そのような固形器官は、レシピエントとして機能するキメラ胚内でＳＣＮＴ細胞を発育させることにより、標的器官を含む少なくとも１子孫の体内で産生される。ＳＣＮＴ細胞は、胚で発育することによってあらゆる種類の器官を形成することができる。したがって、使用するＳＣＮＴ細胞の種類に応じて、産生できる固形器官が限定されるものではない。
【００４４】
一方、本開示は、移植された細胞のみに由来する器官が、レシピエントとして機能する非ヒト胚由来の標的器官個体を含む少なくとも１子孫の体内に形成されることを特徴とする。したがって、移植された細胞とレシピエント非ヒト胚由来の細胞とのキメラ細胞組成物を有することは望ましくない。したがって、レシピエント非ヒト胚としては、発生段階で産生される器官の発生の欠如に関連する異常を有する動物由来の胚を使用することが望ましく、またその子孫は、器官の欠損を伴う。動物がこのような器官欠損を呈する限り、特定の遺伝子の欠損の結果として器官欠損を有するノックアウト動物、または特定の遺伝子を組み込んだ結果として器官欠損を有するトランスジェニック動物を使用することができる。あるいは、本明細書に記載の「創始」動物を使用してもよい。
【００４５】
ある実施形態では、腎臓が器官として産生される場合、発生段階における腎臓の発生の欠如に関連する異常を有するＳａｌｌ１ノックアウト動物の胚（Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２８，ｐ．３１０５−３１１５，２００１）などを、レシピエント非ヒト胚として使用することができる。一方、器官として膵臓を産生する場合に、発生段階で膵臓の発生の欠如に関連した異常を有するＰｄｘ１ノックアウト動物の胚（Ｏｆｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２２，ｐ．９８３−９９５，１９９６）を、レシピエント非ヒト胚として使用することができる。器官として小脳を産生する場合に、発生段階で小脳の発生の欠如に関連した異常を有するＷｎｔ−１（ｉｎｔ−１）ノックアウト動物の胚（ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ  Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．６２，ｐ．１０７３−１０８５，１９９０）を、レシピエント非ヒト胚として使用することができる。器官として肺および甲状腺を産生する場合に、発生段階で肺および甲状腺の発生の欠如に関連する異常を有するＴ／ｅｂｐノックアウト動物の胚（Ｋｉｍｕｒａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１０，ｐ．６０−６９，１９９６）などを、レシピエント非ヒト胚として使用することができる。さらに、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体（ＦＧＦＲ）の細胞内ドメインの欠損を過剰発現するドミナントネガティブ型トランスジェニック突然変異動物モデル（Ｃｅｌｌｉ，  Ｇ．，ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，Ｖｏｌ．１７  ｐｐ．１６４２−６５５，１９９８）の胚であり、腎臓や肺などの複数の器官の欠損を引き起こすものを、使用することができる。あるいは、ヌードマウスを、毛髪または胸腺の産生に使用することができる。
【００４６】
本開示において、レシピエント胚に由来する非ヒト動物は、ブタ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ヒヒ、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、サル、マーモセットおよびボノボなどのヒト以外の任意の動物であってよい。産生される器官の動物種と同様の成体の大きさである非ヒト動物由来の胚を採取することが好ましい。
【００４７】
一方、レシピエント胚盤胞に移植され、産生される器官を形成する細胞の起源として機能する哺乳動物は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物、例えばブタ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ヒヒ、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、サル、マーモセットおよびボノボであってよい。
【００４８】
レシピエント胚と移植されるＳＣＮＴ細胞との間の関係は、同種間（同一種）の関係または異種（異なる種）の関係であり得る。
【００４９】
上記のように作成したＳＣＮＴ細胞をレシピエント胚盤胞の内部空間に移植することにより、胚盤胞由来の内部細胞と移植されたＳＣＮＴ細胞のキメラ混合物が胚盤胞の内部空間に形成され得る。
【００５０】
上記のようにＳＣＮＴ細胞が移植された胚盤胞または胚は、代理親、例えば胚盤胞が由来する種の疑似妊娠または妊娠する雌の動物の子宮に移植することができる。胚盤胞は、標的器官を含む少なくとも１子孫を得るために代理親の子宮において発生することができる。次いで、哺乳動物細胞由来の標的器官としてその同腹仔から標的器官を取得することができる。
【００５１】
本開示によれば、産業的な用途に適した器官再生技術が提供される。これはまた、個体の状況に応じて、皮膚などの体細胞から「自身の器官」を再生する技術を提供する。器官のレシピエントと遺伝的に同一であり得る移植可能な器官によりもたらされるヒトの健康への利益は、当業者に明白である。
【００５２】
また、標的ゲノムを有する細胞からＳＣＮＴ細胞を産生することで本開示を実行することにより器官を得て、多様なゲノムに由来する器官を用いた研究開発を行うことが可能となる。
【００５３】
本開示の実施形態を具体的に説明するために、例示的な実施形態を以下で説明する。例として、マウスの生体内で哺乳動物細胞由来の腎臓を産生する方法について以下に説明する。このような方法により、膵臓、毛髪および胸腺を産生することもできることが理解される。（非ヒト動物）
ヒト以外の哺乳動物の細胞由来の腎臓をマウスなどの動物の生体に産生させるために、発生段階における腎臓の発生の欠如に関連する異常を有するマウスなどの動物を作成することができる。本開示の１つの実施形態では、発生段階の腎臓の発生の欠如に関連する異常を有するマウスとして、Ｓａｌｌ１ノックアウトマウス（Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２８，ｐ．３１０５−３１１５，２００１）を使用することができる。その動物がＳａｌｌ１（−／−）のホモ接合ノックアウト遺伝子型を有する場合、動物は腎臓が発生しないことを特徴とし、少なくとも１人の子孫は腎臓を有さないことを特徴とする。あるいは、本明細書に記載の創始動物を使用することもできる。
【００５４】
このマウスには腎臓が形成されておらず、Ｓａｌｌ１遺伝子の欠損がホモ接合状態（Ｓａｌｌ１（−／−））であれば生存できない。したがって、Ｓａｌｌ１遺伝子の欠損はヘテロ接合状態（Ｓａｌｌ１（＋／−））で維持される。それぞれヘテロ接合状態のマウスを互いに交配させ（Ｓａｌｌ１（＋／−）対（．ｔｉｍｅｓ．）Ｓａｌｌ１（＋／−））、子宮から受精卵を採取する。受精卵は、確率的にＳａｌｌ１（＋／＋）：Ｓａｌｌ１（＋／−）：Ｓａｌｌ１（−／−）＝１：２：１という比の確率で発生する。本開示では、２５％の確率で発達するＳａｌｌ１（−／−）の胚が使用される。しかし、初期の胚の段階で遺伝子型を判定することは困難であり、したがって、出生後に標的器官を含む少なくとも１子孫の遺伝子型を判定し、後続の工程で所望の遺伝子型Ｓａｌｌ１（−／−）を有する個体のみを用いることが実際的である。
【００５５】
このノックアウトマウスは、Ｓａｌｌ１遺伝子を作成段階でノックアウトしたものや、検出可能な蛍光タンパク質、すなわち緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子を発現可能な状態でＳａｌｌ１遺伝子領域にノックインしたものであってもよい（Ｔａｋａｓａｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２１，ｐ．５４７−５５７，２００４）。このような蛍光タンパク質をノックインすることによってこの遺伝子の調節領域が活性化されると、Ｓａｌｌ１の代わりにＧＦＰの発現が起こり、Ｓａｌｌ１遺伝子の欠損状態が蛍光検出によって判定され得る。
【００５６】
さらに、本開示におけるレシピエント胚と移植される細胞との関係は、同種間関係であっても異種関係であってもよい。当技術分野におけるこのような異種間関係におけるキメラ動物の作成に関するこれまでの報告は、多数存在している。例えば、ラットとマウスとの間のキメラの作成（Ｍｕｌｎａｒｄ，Ｊ．Ｇ，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ．２７６，３７９−３８１（１９７３）；Ｓｔｅｒｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ．２４３，４７２−４７３（１９７３）；Ｔａｃｈｉ，Ｓ．＆Ｔａｃｈｉ，Ｃ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．８０，１８−２７（１９８０）；Ｚｅｉｌｍａｒｋｅｒ，Ｇ，Ｎａｔｕｒｅ，２４２，１１５−１１６（１９７３））や、ヒツジとヤギとの間のキメラの作成（Ｆｅｈｉｌｌｙ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３０７，６３４−６３６（１９８４））などの密接に関連する動物種間の奇形キメラ動物について、実際に報告されている。したがって、本発明では、例えば、ヒト以外の哺乳動物の細胞由来の腎臓をマウスの生体内で作成する場合、これら公知のキメラ作成方法（例えば、レシピエント胚盤胞に移植する細胞を挿入する方法（Ｆｅｈｉｌｌｙ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３０７，６３４−６３６（１９８４））を基に、特定の異種器官をレシピエント胚に作成することができる。
【００５７】
本明細書で使用している場合、「第１非ヒト哺乳動物」という用語は、ＳＣＮＴ細胞を用いてキメラ動物、キメラ胚、キメラ胚盤胞などが産生される、対応する哺乳動物を意味する。
【００５８】
本明細書で使用している場合、「第２哺乳動物」という用語は、第１非ヒト哺乳動物とは異なる個体である任意の哺乳動物を示し、同種の個体でも異種の個体であってもよい。
【００５９】
本明細書で使用している場合、「第３非ヒト哺乳動物」という用語は、第１非ヒト哺乳動物とは異なる個体である第２哺乳動物に由来する細胞を胚盤胞に移植することにより形成されるキメラ胚が、第３非ヒト哺乳動物（代理親として機能する）の子宮において発生する哺乳細胞を示す。
【００６０】
「第１非ヒト哺乳動物」および「第３非ヒト哺乳動物」という用語は、「非ヒト宿主哺乳動物」または「宿主」と呼ばれることもあるが、「第１非ヒト哺乳動物」と「ヒト第３哺乳動物」は、互いに異なる動物であってよいことに留意されたい。本開示の文脈において、示されたものが当業者に明らかであることは理解すべきである。
【００６１】
器官として膵臓を産生する場合、発生段階で膵臓の発生の欠如に関連する異常を有するＰｄｘ１ノックアウト動物の胚（Ｏｆｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１２２，ｐ．９８３−９９５，１９９６）または本明細書に記載の創始動物を、レシピエント非ヒト胚として使用することができる。
【００６２】
器官として毛髪を産生する場合、無毛ヌードマウスの胚をレシピエント非ヒト胚として用いることができる。
【００６３】
器官として胸腺を産生する場合、ヌードマウスの胚をレシピエント非ヒト胚として用いることができる。
【００６４】
（移植される細胞）
次に、例として腎臓に移植される細胞について説明する。哺乳動物細胞に由来する腎臓を産生するために、ＳＣＮＴ細胞が作成される。Ｓａｌｌ１遺伝子に関して、細胞は野生型遺伝子型（Ｓａｌｌ１（＋／＋））を有し、腎臓のあらゆる種類の細胞に発育することができる。
【００６５】
一実施形態では、この細胞は、移植前に、発現可能な状態で特異的に検出するための蛍光タンパク質をさらに組み込むことができる。例えば、そのような検出に使用される蛍光タンパク質として、ＤｓＲｅｄの配列がある。ＤｓＲｅｄ遺伝子突然変異体であるＴ４（Ｂｅｖｉｓ  Ｂ．Ｊ．ａｎｄ  Ｇｌｉｃｋ  Ｂ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２０，ｐ．８３−８７，２００２）は、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリアクチン遺伝子プロモーター）の制御下でほぼ全身の器官に発現するように設計することができ、また次いでエレクトロポレーションによりＳＣＮＴ細胞に組み込むことができる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの当技術分野で公知の蛍光タンパク質を使用することができる。このような移植用細胞に蛍光標識を施すことにより、産生された器官が移植された細胞のみで構成されているか否かを容易に検出することができる。
【００６６】
上記Ｓａｌｌ１（−／−）遺伝子型を有する胚盤胞の内部空間にＳＣＮＴ細胞を移植し、キメラ内部細胞塊を有する胚盤胞を産生する。キメラ内部細胞塊を有するこの胚盤胞は、代理親の子宮で発生し、標的器官を含む少なくとも１子孫を得る。ＧＦＰなどのマーカーを発現しないＳＣＮＴ細胞を用いる場合、キメラの産生に用いるときに細胞を宿主の胚と区別することができず、また器官の補完が達成されたかどうかを判別することができない。したがって、この問題を解決するために、この細胞株に蛍光色素を導入することができ、それによって実施例などに記載のプロトコルと同様のプロトコルで実験を行うことができる。
【００６７】
（再現用の創始動物を産生する方法）。
本開示において使用される再現用の創始動物は、以下の特徴を有する：動物は、器官および身体部分の１つ以上の欠損を引き起こす因子をコードする遺伝子を含み、その因子が機能すれば生存不可能および生存困難の１つ以上をもたらし、器官および身体部分のうちの１つ以上が胚盤胞補完により補完される。この動物（本明細書において「創始動物」とも称する）を用いて次世代動物を産生することにより、標的器官を欠損させ、欠損した器官に関する所望のゲノム型の器官を産生することができる。また、この方法を用いた産生により次世代の器官産生も同様に可能になること、またＳＣＮＴ細胞でこの方法を使用できることが明らかになった。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「因子が機能すれば生存不可能および生存困難の１つ以上をもたらす器官および身体部分の１つ以上」という用語は、ある因子に関して、因子が器官および身体部分の１つ以上に欠損または機能不全（例えば正常ではない状態）を生じさせるときに、生存不可能および生存困難の１つ以上をもたらすものを示す。例えば、外来遺伝子の場合、遺伝子を動物に導入して正常に発現したとき、ある器官または身体部分に欠損が生じ、動物が生存不可能または生存困難になる。生存困難には、次世代の出現が不可能であることや、ヒトの場合社会生活が営みにくいことが含まれる。このような器官または身体部分は、例えば、膵臓、肝臓、毛髪、胸腺などであり得るが、これらに限定されない。
【００６９】
そのような事象に関与する遺伝子の例には、Ｐｄｘ−１（膵臓用）、Ｓａｌｌ１（腎臓用）などが含まれる。
【００７０】
ついでながら、器官の再生用に用いるには、器官を補完することができること、および他の因子（例えば、母マウスから乳を摂取することができないこと）に起因して得られた同腹仔が誕生後死亡しないことにより、遺伝子を選択すべきである。そのような遺伝子の一例はＳａｌｌ１である。このような性質を有する遺伝子を用いることにより、本願の開示を実行することができる。さらに、膵臓の欠損などの同じ表現型であっても、有意性は大きく異なる。具体的には、ノックアウトされた個体は産生性の向上という特徴を有するが、トランスジェニック個体は、産生性の向上という特徴に加えて、致死的な表現型のクローン解析を可能にする特徴を有する。
【００７１】
本明細書で使用している場合、「因子が機能すれば生存不可能および生存困難の１つ以上をもたらす」という用語は、ある因子に関して、因子が機能する場合、宿主である動物が一切生存できず死亡する状態、または生存することができるが成長や再現の困難などの理由により後に生き続けることが実質的に不可能である状態を示す。この用語は、当技術分野における通常の知識を使用することによって理解することができる。
【００７２】
本明細書で使用している場合、「器官」という用語は、当技術分野で通常の意味を有するように使用され、概して動物の内臓を構成する器官を示す。
【００７３】
本明細書で使用している場合、「身体部分」という用語は、身体の任意の部分を示し、概して器官と呼ばれないものも含む。例えば、腎臓を例にとると、遺伝子が正常であれば完全な腎臓が形成される。しかし、一部の遺伝子が欠損している場合や異常を有する場合は、腎臓と似た器官を作出し得るが、器官の一部に異常や欠損があることがある。このような異常や欠損を有する部分は、この「身体部分」の例といえる。遺伝子欠損や異常は、必ずしも各器官に一致するとは限らず、その一部が罹患することが多い。したがって、遺伝子との対応関係を考慮する必要がある場合には、身体部分との対応を考慮した方が良い。したがって、このような対応関係も本明細書で考慮する。
【００７４】
本明細書で使用している場合、「胚盤胞補完」という用語は、例えばＳＣＮＴ細胞を胚盤胞の内部空間に注入することで得られる生じた個体がキメラ胚（また、正常な出生前および出生後の発達においては、キメラの成体）を形成する現象を利用することによって、欠損のある器官または身体部分を補完する技術を示す。動物の生体、特に非ヒト動物において、複数種類の細胞で形成される複雑な細胞の構成を有する哺乳動物の器官、例えば腎臓、膵臓、毛髪、胸腺を産生することができる。
【００７５】
本明細書で使用している場合、「標識」という用語は、補完された器官を識別するためにそれが使用される限り、任意の因子であり得る。例えば、特定の遺伝子（例えば、蛍光タンパク質を発現させるための遺伝子）を補完された器官のみで発現させることによって、補完された器官を、特定の遺伝子に由来する特性（例えば、蛍光）により補完の宿主と区別することができる。上記のように、動物が外因性細胞に由来する細胞を補完することによって完全になったか、動物が内在性細胞に由来する細胞を補完することによって完全になったかを区別することができる。これにより、本開示において用いられる創始動物をより容易に選択することが可能となる。これらの細胞は、移植前に発現可能な状態で特異的に検出するための蛍光タンパク質を組み込むことができる。例えば、そのような検出に使用される蛍光タンパク質として、ＤｓＲｅｄの配列がある。ＤｓＲｅｄ遺伝子突然変異体であるＴ４（Ｂｅｖｉｓ  Ｂ．Ｊ．ａｎｄ  Ｇｌｉｃｋ  Ｂ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２０，ｐ．８３−８７，２００２）は、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリアクチン遺伝子プロモーター）の制御下でほぼ全身の器官に発現するように設計することができ、また次いでエレクトロポレーションによりＳＣＮＴ細胞に組み込むことができる。このような移植用細胞に蛍光標識を施すことにより、産生された器官が移植された細胞のみで構成されているか否かを容易に検出することができる。
【００７６】
そのような標識の例には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子；赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）；シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）；他の蛍光タンパク質；ＬａｃＺ；などが挙げられる。
【００７７】
一実施形態では、本開示で使用される創始動物を産生するための方法は、Ａ）遺伝子を有する第１接合体を準備すること、Ｂ）第１接合子を胚盤胞に成長させること、Ｃ）遺伝子によって引き起こされる欠損を補完できるＳＣＮＴ細胞を胚盤胞に導入してキメラ胚を産生すること、およびＤ）キメラ胚盤胞から個体を産生すること、次いで器官およびその一部の１つ以上がＳＣＮＴ細胞によって補完された個体を選択することを含み得る。
【００７８】
本明細書で使用している場合、「器官や身体部分の１つ以上の欠損を引き起こし、因子が機能すれば生存不可能および生存困難の１つ以上をもたらす因子をコードする（欠損責任）遺伝子」、および「欠損責任遺伝子」という用語は、互換的に用いられ、また、特定の遺伝子に関して、因子が機能したとき（例えば、外来遺伝子の場合は遺伝子が導入され発現されたとき、内因性遺伝子の場合はかかる遺伝子がその遺伝子が機能する状態に曝されたとき、またはそれ以外の場合）、器官と身体部分の１つ以上の欠損または機能不全（例えば、正常ではない状態）をもたらすように、生存不可能および生存困難の１つ以上をもたらす遺伝子を示す。
【００７９】
ＳＣＮＴ細胞は、本明細書では「多能性細胞」と示すことができる。
本明細書において、「欠損を補完できる」という用語は、因子や遺伝子などに関して、器官または身体部分を補完できることを示す。
【００８０】
本明細書で使用している場合、「キメラ胚盤胞」または「キメラ胚」という用語は、キメラ状態にあるＳＣＮＴ細胞を含む胚盤胞または胚を示す。このようなキメラ胚盤胞または胚は、注入の方法に加えて、胚＋胚または胚＋細胞をペトリで互いに密着させキメラ胚盤胞を産生する、いわゆる「凝集法」などの方法を用いて産生することができる。さらに、本開示においてレシピエント胚盤胞または胚と移植される細胞との関係は、同種間関係または異種間関係であり得る。
【００８１】
本明細書の実施形態による創始動物を産生する方法において、胚盤胞を成長させる工程は、卵母細胞または接合体を胚盤胞に成長させるための任意の公知の方法によって実行することができる。このための条件は当技術分野で周知であり、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ３．ｓｕｐ．ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００２（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００８２】
本発明の実施形態による創始動物を産生する方法において、遺伝子によって引き起こされる欠損を補完できる体細胞核移植細胞（ＳＣＮＴ細胞）を胚盤胞に導入してキメラ胚盤胞を産生する方法は、体細胞核移植細胞（ＳＣＮＴ細胞）を胚盤胞に導入することができれば、当技術分野において公知の任意の方法を採用することができる。このような方法としては、例えば、注入の方法、凝集法が挙げられるが、方法はこれらに限定されるものではない。
【００８３】
本明細書の実施形態による創始動物を産生する方法において、キメラ胚盤胞から個体を産生する方法は、当技術分野において公知の技術を採用することができる。一般に、キメラ胚盤胞は代理親に戻され、次いで代理親の疑似妊娠は、代理親の子宮で得られる個体を生育させるように引き起こされ得る。しかし、方法はこの技術に限定されるものではない。
【００８４】
本明細書の実施形態による創始動物を産生する方法において、器官および身体部分の１つ以上が補完される個体を選択することは、器官または身体部分の補完の確認を可能にする任意の技術を使用して実施することができる。
【００８５】
その例は、体細胞核移植細胞（ＳＣＮＴ細胞）に由来する識別子を同定することである。本明細書で使用している場合、「識別子」という用語は、特定の個体、種などの特定、およびその起源の識別を可能にする任意の因子を意味し、その略語の「ＩＤ」とも呼ばれる。そのような識別子は、例えば、体細胞核移植細胞（ＳＣＮＴ細胞）に特有のゲノム配列、表現型などであり得る。あるいは、（遺伝子発現によるものを含む）標識するまたは標識できるＳＣＮＴ細胞を用いることによる、そのような選択に関して、創始動物の産生方法における選択は、標識を識別することによって、実行することができる。加えて、この技術を必要に応じて変更することにより当業者が選択を行うことができることが理解される。
【００８６】
（創始動物を用いた器官再生法）
別の態様では、本開示は、創始動物を使用し、体細胞核移植細胞（ＳＣＮＴ細胞）を使用して、標的器官および標的身体部分の１つ以上を産生する方法を提供する。この方法は、創始動物を準備すること、それにおいて欠損責任遺伝子が標的器官および標的身体部分の１つ以上の欠損を引き起こす因子をコードする、動物から得た卵を胚盤胞に成長させること、体細胞核移植細胞（ＳＣＮＴ細胞）を胚盤胞に導入してキメラ胚盤胞を得ること、およびキメラ胚盤胞から個体を産生すること、および次いで個体から標的器官および身体部分の１つ以上を得ることを含む。ＳＣＮＴ細胞は、遺伝子によって引き起こされる欠損を補うことができる所望のゲノムを有することができる。
【００８７】
キメラ胚盤胞の発生は、第３非ヒト哺乳動物の子宮において実施して、標的器官を含む少なくとも１子孫を得て、少なくとも１子孫から標的器官を得ることができる。
【００８８】
（膵臓の形成）
膵臓の形成は、目視検査、染色後の顕微鏡観察、蛍光使用の観察などの方法を用いて、巨視的または顕微鏡的な形態学的分析や遺伝子発現解析などを行うことにより調べることができる。
【００８９】
例えば、目視検査を行うことにより、実際の器官の有無、外観などの器官の特徴を調べることができる。このような巨視的な形態学的分析と共に、ヘマトキシリン−エオジン染色などの一般的な組織染色の後に得られた組織は、顕微鏡を用いて微視的に観察することができる。このような顕微鏡観察により、膵臓内の様々な具体的な細胞の組成であっても調査を行うことができる。
【００９０】
また、条件に応じて蛍光を発するように蛍光を用いた遺伝子発現解析を行ってもよい。例えば、Ｐｄｘ１−Ｌａｃ−Ｚノックインにより得られたノックアウトマウスは、以下の特徴を有することができる。野生型（＋／＋）またはヘテロ接合体（＋／−）の個体で、蛍光標識したＥＳ細胞を用いた場合、ＥＳ細胞の寄与が認められてもキメラ状態でのまだらの蛍光が示される。一方、ホモ接合性（−／−）の個体では、ＥＳ細胞から完全に誘導された細胞によって膵臓が構築されるため、均一な蛍光が示される。このような特徴を利用して、Ｐｄｘ１遺伝子に対して標的器官または標的器官を構成する細胞がどの遺伝子型を有するかを簡便に調べることができる。標識されていないＳＣＮＴ細胞が使用される場合、キメラの産生に使用されるときに、細胞は宿主の胚と区別することができず、器官の補完が達成されたかどうかを区別することができない。したがって、蛍光色素をＳＣＮＴ細胞株に導入することができ、それにより上記と同じプロトコルで実験を行うことができる。上述したこのような細胞を用いることにより、ＳＣＮＴ細胞を用いた場合と同じプロトコルで器官を産生し、その起源を明らかにすることができる。
【００９１】
（腎臓の形成）
腎臓の形成を、目視検査、染色後の顕微鏡観察、蛍光使用の観察などの方法を用いて、巨視的または顕微鏡的な形態学的分析や遺伝子発現解析などを行うことにより調べることができる。
【００９２】
例えば、目視検査を行うことにより、実際の器官の有無、外観などの器官の特徴を調べることができる。このような巨視的な形態学的分析と共に、ヘマトキシリン−エオジン染色などの一般的な組織染色の後に得られた組織は、顕微鏡を用いて微視的に観察することができる。このような顕微鏡観察により、腎臓内の様々な具体的な細胞の組成であっても調査を行うことができる。
【００９３】
また、条件に応じて蛍光を発するように蛍光を用いた遺伝子発現解析を行ってもよい。例えば、上記Ｓａｌｌ１遺伝子ノックアウトマウスは、以下の特徴を有する。蛍光が１つの対立遺伝子にのみ生じるＳａｌｌ１遺伝子の欠損がヘテロ接合状態（Ｓａｌｌ１（＋／−）であるときの蛍光の場合と比較して、Ｓａｌｌ１遺伝子の欠損が、ＧＦＰ蛍光が両対立遺伝子から生じるホモ接合状態（Ｓａｌｌ１（−／−））であるとき、蛍光強度は低い。このような特徴を利用して、Ｓａｌｌ１遺伝子に対して標的器官または標的器官を構成する細胞がどの遺伝子型を有するかを簡便に調べることができる。標識されていないＳＣＮＴ細胞が使用される場合、キメラの産生に使用されるときに、細胞は宿主の胚と区別することができず、器官の補完が達成されたかどうかを区別することができない。したがって、ＳＣＮＴ細胞株に蛍光色素を導入することができ、それにより起源を明らかにすることができる。
【００９４】
（毛髪の形成）
毛髪の形成を、目視検査や蛍光使用の観察などの手法を用いて、巨視的または顕微鏡的な形態学的解析や遺伝子発現解析などを行うことにより調べることができる。
【００９５】
例えば、目視検査を行うことにより、実際の毛髪の有無、毛髪の特徴、例えば外観を調べることができる。このような巨視的な形態学的分析と共に、ヘマトキシリン−エオジン染色などの一般的な組織染色の後に得られた組織は、顕微鏡を用いて微視的に観察することができる。このような顕微鏡観察により、毛髪内の様々な具体的な細胞の組成であっても調査を行うことができる。
【００９６】
また、条件に応じて蛍光を発するように蛍光を用いた遺伝子発現解析を行ってもよい。例えば、上記ヌードマウスの場合、毛髪の自己蛍光が強いため、産生された毛髪がヌードマウス由来のものであるのか、ＳＣＮＴ細胞由来のものであるのかは、蛍光顕微鏡下の裸眼では判定しづらい。しかしまた、蛍光を適切に観察する手段によって観察することができる。このような特徴を利用して、標的器官または標的器官を構成する細胞がどの遺伝子型を有するかを簡便に調べることができる。標識されていないＳＣＮＴ細胞が使用される場合、キメラの産生に使用されるときに、細胞は宿主の胚と区別することができず、器官の補完が達成されたかどうかを区別することができない。したがって、蛍光色素をＳＣＮＴ細胞株に導入することができ、それにより上記と同じプロトコルで実験を行うことができる。上述したこのような細胞を用いることによって、ＳＣＮＴ細胞を用いた場合と同じプロトコルで器官を産生し、その起源を明らかにすることができる。
【００９７】
（胸腺の形成）
胸腺の形成を、目視検査、顕微鏡写真、ＦＡＣＳ、および蛍光使用の観察などの手法を用いて、巨視的または顕微鏡的な形態学的解析や遺伝子発現解析などを行うことにより調べることができる。例えば、目視検査を行うことにより、実際の器官の有無、外観などの器官の特徴を調べることができる。このような巨視的な形態学的分析と共に、ヘマトキシリン−エオジン染色などの一般的な組織染色の後に得られた組織は、顕微鏡を用いて微視的に観察することができる。このような顕微鏡観察により、胸腺内の様々な具体的な細胞の組成であっても調査を行うことができる。
【００９８】
また、条件に応じて蛍光を発するように蛍光を用いた遺伝子発現解析を行ってもよい。例えば、上記のヌードマウスは、以下の特徴を有する。ヌードマウスは通常胸腺を有していないが、これは生存に影響しない。したがって、ヌードマウスは胸腺なしでも自然に生まれ、生存する。蛍光標識したＳＣＮＴ細胞を胚盤胞補完により注入すると、ＳＣＮＴ細胞の寄与が確認された多数の個体が、胸腺に蛍光を示す。このような特徴を利用して、標的器官または標的器官を構成する細胞がどの遺伝子型を有するかを簡便に調べることができる。
【００９９】
本明細書の実施形態に従って得られた標的器官は、第２哺乳動物から完全に誘導されることによって特徴付けられ得る。
【０１００】
本開示はまた、本明細書の実施形態による方法によって産生される哺乳動物を提供する。さらに、本開示はまた、標的器官の産生のための、発生段階における標的器官の発生の欠如に関連する異常を有する第１非ヒト哺乳動物の使用を提供する。
【０１０１】
（種々の動物を利用する際の留意点）
マウス以外の動物を使用する場合は、以下の点に注意を払って、本明細書の実施例に記載の技術を適用することで行うことができる。例えば、他の種の動物、特にマウス以外の種のキメラの産生に関しては、キメラを形成することができる多能性幹細胞の確立の報告よりも、胚、または胚の一部でありＥＳ細胞の起源である内部細胞塊を注入するキメラについてより多くの報告がある（ラット：（Ｍａｙｅｒ，Ｊ．Ｒ．Ｊｒ．＆Ｆｒｅｔｚ，Ｈ．Ｉ．Ｔｈｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｒａｔ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｌｏｐｈｅｎｉｃ  ｒａｔｓ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．３９，１−１０（１９７４））、ウシ：（Ｂｒｅｍ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔｔｌｅ  ｃｈｉｍｅｒａｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｍｂｒｙｏ  ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ．２３，１８２（１９８５））；ブタ：（Ｋａｓｈｉｗａｚａｋｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｉｇｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ，Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１３０，１８６−１８７（１９９２）））。しかし、内部細胞塊を注入したキメラを用いた場合であっても、本明細書に記載の方法を適用することができる。上記のような内部細胞塊を用いることにより、欠損動物の欠損器官を補完することは実質的に可能である。換言すると、例えば、上記の細胞を各々培養してインビトロで胚盤胞に成長させ、そうして得られた胚盤胞から内部細胞塊の一部を物理的に分離し、その後、その部分を胚盤胞に注入することができる。キメラ胚は、途中で８細胞期のものまたは桑実胚を凝集させることによって産生することができる。
【０１０２】
（一般的な技術）
本明細書で使用される分子生物学的、生化学的および微生物学的技術は、当技術分野において周知であり、一般的に使用されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ．Ｈａｒｂｏｒ，ａｎｄ  ｉｔｓ  ３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；ｓｅｐａｒａｔｅ−ｖｏｌｕｍｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＆  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｙｏｄｏｓｈａ，１９９７；などにおいて開示されている。本明細書に関連するこれらの文書は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
人工的に合成された遺伝子を産生するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学は、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；などにおいて開示されている。本明細書に関連するこれらの文書の諸部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
科学文献、特許、および特許出願などの、本明細書に引用されている参考文献は、その各々が具体的に記載されている程度まで、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
好ましい実施形態は、本開示を容易に理解するために記載してきた。以下、本開示を実施例に基づいて説明する。しかし、上記の説明および以下の実施例は、例示的な目的のためにのみ提供しており、本開示を限定する目的で提供するものではない。したがって、本開示の範囲は、本明細書で具体的に説明される実施形態または実施例に限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０１０６】
本明細書の教示の恩恵を受ける当業者に明らかであり、異なるが同等の方法で変更および実施することができるため、上述の特定の実施形態は例示のみである。例えば、上述のプロセスの工程は、異なる順序で実行してもよい。さらに、以下の特許請求の範囲に記載されたもの以外に、本明細書に示された構成または設計の詳細に対する制限は、意図していない。したがって、上に開示された特定の実施形態は、変更または修正されてもよく、そのような変更形態はすべて、本開示の範囲および趣旨内にあるとみなされることは明らかである。したがって、本明細書で求められる保護は、以下の特許請求の範囲に記載されている。
【図１Ａ】
2019517818.tif 000003
【図１Ｂ】
2019517818.tif 000004
【図２】
2019517818.tif 000005
【図３】
2019517818.tif 000006
【図４】
2019517818.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月15日(2019.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発生段階における標的器官の発生の欠如に関連する異常を有する第１非ヒト哺乳動物の生体に前記標的臓器を産生する方法であって、産生される前記標的器官は、前記第１非ヒト哺乳動物とは異なる個体である第２哺乳動物に由来し、ａ）前記第２哺乳動物由来の体細胞核移植細胞（ＳＣＮＴ細胞）を作成すること、ｂ）前記ＳＣＮＴ細胞を前記第１非ヒト哺乳動物の胚盤胞に移植してキメラ胚を得ること、ｃ）前記標的器官を含む少なくとも１子孫を得るために、第３非ヒト哺乳動物の子宮に前記キメラ胚を発生させること、およびｄ）前記少なくとも１子孫から前記標的器官を取得すること、を含む方法。
【請求項２】
前記第２哺乳動物が、ヒト、ラット、またはマウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記産生される器官が、膵臓、腎臓、胸腺、および毛髪から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１非ヒト哺乳動物が、マウス、ラット、サル、またはブタである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１非ヒト哺乳動物がマウスであり、前記マウスが、Ｓａｌｌ１ノックアウトマウス、Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックマウス、Ｐｄｘ１ノックアウトマウス、およびヌードマウスのうちの１つ以上である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記胚盤胞が、前記異常に関連する１つ以上の遺伝子がＣＲＩＳＰＲ技術によってサイレンシングされている第１非ヒト哺乳動物の卵母細胞、および前記異常に関連する１つ以上の遺伝子がＣＲＩＳＰＲ技術によってサイレンシングされている前記第１非ヒト哺乳動物の精子から作成される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記標的器官が前記第２哺乳動物に完全に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２哺乳動物および前記第１非ヒト哺乳動物が異種の関係にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
発生段階における標的器官の発生の欠如に関連する異常を有する第１非ヒト哺乳動物であって、ａ）前記第１非ヒト哺乳動物とは異なる個体である第２哺乳動物由来のＳＣＮＴ細胞を作成すること、ｂ）前記ＳＣＮＴ細胞を前記第１非ヒト哺乳動物の胚盤胞に移植してキメラ胚を得ること、およびｃ）前記標的器官を含む少なくとも１子孫を得るために、第３非ヒト哺乳動物の子宮に前記キメラ胚を発生させることを含む方法により産生される哺乳動物。
【請求項１１】
標的器官を産生するためのキットであって、Ａ）発生段階において前記標的器官の発生の欠如に関連する異常を有する第１非ヒト哺乳動物、およびＢ）前記第１非ヒト哺乳動物とは異なる個体である第２哺乳動物に由来するＳＣＮＴ細胞を含むキット。
【請求項１２】
標的器官および標的身体部分の１つ以上を産生するための方法であって、
器官および身体部分の１つ以上の欠損を引き起こす因子をコードする欠損責任遺伝子を含み、前記因子が機能すれば生存不可能および生存困難の１つ以上をもたらす非ヒト動物を準備すること、それにおいては前記器官および身体部分の１つ以上が胚盤胞補完によって補完され、前記欠損責任遺伝子が前記標的器官および標的身体部分の１つ以上の欠損を引き起こす因子をコードする、
前記非ヒト動物から得られた卵を胚盤胞に成長させること、
標的体細胞核移植細胞（ＳＣＮＴ細胞）を前記胚盤胞に導入して、キメラ胚盤胞を産生すること、ここで前記標的ＳＣＮＴ細胞は、前記欠損責任遺伝子によって引き起こされる欠損を補完することができる所望のゲノムを有する、
前記キメラ胚盤胞から個体を産生すること、および
前記個体から前記標的器官および標的身体部分の１つ以上を得ることを含む方法。
【請求項１３】
前記個体を産生することが、第３非ヒト哺乳動物の子宮で前記キメラ胚盤胞を発生させて、前記標的器官を含む少なくとも１子孫を得て、前記少なくとも１子孫から前記標的器官を得ることをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的ＳＣＮＴ細胞がヒト由来である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的器官および標的身体部分の１つ以上が、膵臓、腎臓、胸腺および毛髪から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記非ヒト動物が、マウス、ラット、サル、またはブタである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１非ヒト哺乳動物がマウスであり、前記マウスが、Ｓａｌｌ１ノックアウトマウス、Ｐｄｘ１ノックアウトマウス、Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックマウス、およびヌードマウスの１つ以上である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的器官および標的身体部分の１つ以上が、前記標的ＳＣＮＴ細胞に完全に由来する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＳＣＮＴ細胞を作成することをさらに含み、前記ＳＣＮＴ細胞は、第２哺乳動物に由来する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２哺乳動物および前記非ヒト動物が異種の関係にある、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記胚盤胞が、前記欠損責任遺伝子を含む１つ以上の遺伝子がＣＲＩＳＰＲ技術によってサイレンシングされている第１非ヒト哺乳動物の卵母細胞、および前記欠損責任遺伝子を含む１つ以上の遺伝子がＣＲＩＳＰＲ技術によってサイレンシングされている前記第１非ヒト哺乳動物の精子から作成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
標的器官および標的身体部分の１つ以上を産生するためのキットであって、Ａ）器官および身体部分の１つ以上の欠損を引き起こす因子をコードする遺伝子を含み、前記因子が機能すれば生存不可能および生存困難の１つ以上をもたらす非ヒト動物であって、前記器官および身体部分の１つ以上が補完により補完される非ヒト動物、およびＢ）前記非ヒト動物とは異なる個体である第２哺乳動物に由来するＳＣＮＴ細胞を含むキット。
【請求項２３】
前記非ヒト動物および前記第２哺乳動物が異種間関係にある、請求項２２に記載のキット。
【国際調査報告】
2019517818.tif 000008
2019517818.tif 000009
2019517818.tif 000010