(57)【要約】  本発明は、核酸を標的化する系、方法、及び組成物を提供する。詳細には、本発明は、新規ＤＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と、少なくとも１つのガイドＲＮＡのようなターゲティング核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされたＤＮＡターゲティング系を提供する。かかる系の作製及び使用方法並びに使用、方法、及び組成物並びにかかる方法及び使用からの産物もまた開示及び特許請求される。
2019503716.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変されたヌクレアーゼ活性を有する改変Ｃｐｆ１酵素であって、
前記改変酵素が、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として、以下のアミノ酸：Ｄ８６１、Ｒ８６２、Ｒ８６３、Ｗ３８２、Ｅ９９３、Ｄ１２６３、Ｄ９０８、Ｗ９５８、Ｋ９６８、Ｒ９５１、Ｒ１２２６、Ｓ１２２８、Ｄ１２３５、Ｋ５４８、Ｍ６０４、Ｋ６０７、Ｔ１６７、Ｎ６３１、Ｎ６３０、Ｋ５４７、Ｋ１６３、Ｑ５７１、Ｋ１０１７、Ｒ９５５、Ｋ１００９、Ｒ９０９、Ｒ９１２、Ｒ１０７２、Ｅ３７２、Ｋ１５、Ｋ８１０、Ｈ７５５、Ｋ５５７、Ｅ８５７、Ｋ９４３、Ｋ１０２２、Ｋ１０２９、Ｋ９４２、Ｋ９４９、Ｒ８４、Ｋ８７、Ｋ２００、Ｈ２０６、Ｒ２１０、Ｒ３０１、Ｒ６９９、Ｋ７０５、Ｋ８８７、Ｒ８９１、Ｋ１０８６、Ｋ１０８９、Ｒ１０９４、Ｒ１１２７、Ｒ１２２０、Ｒ１２２６、Ｑ１２２４、Ｎ１７８、Ｎ１９７、Ｎ２０４、Ｎ２５９、Ｎ２７８、Ｎ２８２、Ｎ５１９、Ｎ７４７、Ｎ７５９、Ｎ８７８、Ｎ８８９、Ｒ１７６、Ｒ１９２及びＧ７８３のうちの１つ以上及び／又は１１８９〜１１９７、１２００〜１２０８、３９８〜４００、３８０〜３８３、３６２〜４２０、１１６３〜１１７３、１２３０〜１２３３、１１５２〜１１４８、１０７６〜１２４９の領域にあるいずれか１つのアミノ酸の突然変異を含む、改変Ｃｐｆ１酵素。
【請求項２】
以下の突然変異：Ｒ８６２Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｄ１２６３Ａ、Ｄ９０８Ａ、Ｗ９５８Ａ、Ｒ９５１Ａ、Ｒ１２２６Ａ、Ｓ１２２８Ａ、Ｄ１２３５Ａ、Ｋ５４８Ａ、Ｍ６０４Ａ、Ｋ６０７Ａ、Ｋ６０７Ｒ、Ｔ１６７Ｓ、Ｎ６３１Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６３０Ｋ、Ｎ６３０Ｒ、Ｋ５４７Ｒ、Ｋ１６３Ｒ、Ｑ５７１Ｋ、Ｑ５７１Ｒ、Ｋ１００９Ａ、Ｒ９０９Ａ、Ｒ１０７２Ａ、Ｅ３２７Ａ、Ｋ１５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｈ７５５Ａ、Ｋ５５７Ａ、Ｅ８５７Ａ、Ｋ９４３Ａ、Ｋ１０２２Ａ、Ｋ１０２９Ａ、Ｋ９４２Ａ、Ｋ９４９Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ８７Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｈ２０６Ａ、Ｒ２１０Ａ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ６９９Ａ、Ｋ７０５Ａ、Ｋ８８７Ａ、Ｒ８９１Ａ、Ｋ１０８６Ａ、Ｋ１０８９Ａ、Ｒ１０９４Ａ、Ｒ１１２７Ａ、Ｒ１２２０Ａ、Ｒ１２２６Ａ、Ｑ１２２４Ａ、Ｒ１７６Ａ、Ｒ１９２Ａ、Ｇ７８３Ｐのうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の改変Ｃｐｆ１酵素。
【請求項３】
以下の突然変異：Ｒ８６２Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｄ１２６３Ａ、Ｄ９０８Ａ、Ｗ９５８Ａ、Ｒ９５１Ａ、Ｋ５４８Ａ、Ｍ６０４Ａ、Ｋ６０７Ａ、Ｋ６０７Ｒ、Ｎ６３１Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６３０Ｋ、Ｎ６３０Ｒ、Ｋ５４７Ｒ、Ｋ１６３Ｒ、Ｑ５７１Ｋ、Ｑ５７１Ｒ、Ｋ１００９Ａ、Ｒ９０９Ａ、Ｒ１０７２Ａ、Ｅ３２７Ａ、Ｋ１５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｈ７５５Ａ、Ｋ５５７Ａ、Ｅ８５７Ａ、Ｋ９４３Ａ、Ｋ１０２２Ａ、Ｋ１０２９Ａ、Ｋ９４２Ａ、Ｋ９４９Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ８７Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｈ２０６Ａ、Ｒ２１０Ａ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ６９９Ａ、Ｋ７０５Ａ、Ｋ８８７Ａ、Ｒ８９１Ａ、Ｋ１０８６Ａ、Ｋ１０８９Ａ、Ｒ１０９４Ａ、Ｒ１１２７Ａ、Ｒ１２２０Ａ、Ｒ１２２６Ａ、Ｑ１２２４Ａのうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の改変Ｃｐｆ１酵素。
【請求項４】
以下のアミノ酸：Ｎ１７８、Ｎ１９７、Ｎ２０４、Ｎ２５９、Ｎ２７８、Ｎ２８２、Ｎ５１９、Ｎ７４７、Ｎ７５９、Ｎ８７８、Ｎ８８９のうちの１つ以上の突然変異を含む、請求項１に記載の改変Ｃｐｆ１酵素。
【請求項５】
以下の突然変異：Ｒ８６２Ａ、Ｗ９５８Ａ、Ｒ９５１Ａ、Ｒ１２２６Ａ、Ｓ１２２８Ａ、Ｄ１２３５Ａ、Ｋ５４８Ａ、Ｍ６０４Ａ、Ｋ６０７Ａ、Ｋ６０７Ｒ、Ｔ１６７Ｓ、Ｎ６３１Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６３０Ｋ、Ｎ６３０Ｒ、Ｋ５４７Ｒ、Ｋ１６３Ｒ、Ｑ５７１Ｋ、Ｑ５７１Ｒ、Ｋ１００９Ａ、Ｒ９０９Ａ、Ｒ１０７２Ａ、Ｅ３２７Ａ、Ｋ１５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｈ７５５Ａ、Ｋ５５７Ａ、Ｅ８５７Ａ、Ｋ９４３Ａ、Ｋ１０２２Ａ、Ｋ１０２９Ａ、Ｋ９４２Ａ、Ｋ９４９Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ８７Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｈ２０６Ａ、Ｒ２１０Ａ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ６９９Ａ、Ｋ７０５Ａ、Ｋ８８７Ａ、Ｒ８９１Ａ、Ｋ１０８６Ａ、Ｋ１０８９Ａ、Ｒ１０９４Ａ、Ｒ１１２７Ａ、Ｒ１２２０Ａ及びＱ１２２４Ａのうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の改変Ｃｐｆ１酵素。
【請求項６】
前記改変Ｃｐｆ１酵素が改変されたヌクレアーゼ活性を含み、前記改変Ｃｐｆ１酵素が、以下のアミノ酸：Ｄ８６１、Ｗ９５８、Ｓ１２２８、Ｄ１２３５、Ｔ１６７、Ｎ６３１、Ｎ６３０、Ｋ５４７、Ｋ１６３、Ｑ５７１、Ｒ１２２６、Ｅ３７２、Ｋ１５、Ｋ８１０、Ｈ７５５、Ｋ５５７、Ｅ８５７、Ｋ９４３、Ｋ１０２２、Ｋ１０２９、Ｋ９４２、Ｋ９４９、Ｒ８４、Ｋ８７、Ｋ２００、Ｈ２０６、Ｒ２１０、Ｒ３０１、Ｒ６９９、Ｋ７０５、Ｋ８８７、Ｒ８９１、Ｋ１０８６、Ｋ１０８９、Ｒ１０９４、Ｒ１１２７、Ｒ１２２０、Ｑ１２２４、Ｎ１７８、Ｎ１９７、Ｎ２０４、Ｎ２５９、Ｎ２７８、Ｎ２８２、Ｎ５１９、Ｎ７４７、Ｎ７５９、Ｎ８７８、Ｎ８８９のうちの１つ以上、及び／又は１１８９〜１１９７、１２００〜１２０８、３９８〜４００、３８０〜３８３、３６２〜４２０、１１６３〜１１７３、１２３０〜１２３３、１１５２〜１１４８、１０７６〜１２４９の領域にあるいずれか１つのアミノ酸の突然変異を含む、請求項１に記載の改変Ｃｐｆ１酵素。
【請求項７】
前記１つ以上の突然変異がＲ８６２Ａを含み、前記Ｃｐｆ１酵素がもはやＲＮＡに結合しない、請求項１に記載の改変Ｃｐｆ１酵素。
【請求項８】
前記１つ以上の突然変異がＫ１５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｈ７５５Ａ、Ｋ５５７Ａ、Ｅ８５７Ａ、Ｒ８６２Ａ、Ｋ９４３Ａ、Ｋ１０２２Ａ及びＫ１０２９Ａのうちの１つ以上を含み、前記Ｃｐｆ１酵素がもはやＲＮＡ結合能及び／又はプロセシング能を有しない、請求項１に記載の改変Ｃｐｆ１酵素。
【請求項９】
前記１つ以上の突然変異が、Ｋ５４７８Ａ、Ｋ６０７Ａ及びＭ６０４Ａのうちの１つ以上を含み、ＴＴＴ特異性が低下し、又は除去される、請求項１に記載の改変Ｃｐｆ１酵素。
【請求項１０】
前記１つ以上の突然変異が、Ｎ６３１Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６３０Ｋ、Ｎ６３０Ｒ、Ｋ５４７Ｒ、Ｋ１６３Ｒ、Ｑ５７１Ｋ、Ｑ５７１Ｒ及びＫ６０７Ｒのうちの１つ以上を含み、前記Ｃｐｆ１酵素の非特異的ＤＮＡ相互作用が増加する、請求項１に記載の改変Ｃｐｆ１酵素。
【請求項１１】
前記１つ以上の突然変異が、Ｒ８４Ａ、Ｋ８７Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｈ２０６Ａ、Ｒ２１０Ａ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ６９９Ａ、Ｋ７０５Ａ、Ｋ８８７Ａ、Ｒ８９１Ａ、Ｋ１０８６Ａ、Ｋ１０８９Ａ、Ｒ１０９４Ａ、Ｒ１１２７Ａ、Ｒ１２２０Ａ又はＱ１２２４Ａを含み、前記酵素の前記特異性が増加又は減少する、請求項１に記載の改変Ｃｐｆ１酵素。
【請求項１２】
以下のアミノ酸：Ｄ８６１、Ｒ８６２、Ｒ８６３、Ｗ３８２のうちの１つ以上に突然変異を含み、前記Ｃｐｆ１のＲＮＡ結合が妨げられる、請求項１に記載の改変Ｃｐｆ１酵素。
【請求項１３】
以下のアミノ酸：Ｗ９５８、Ｋ９６８、Ｒ９５１、Ｒ１２２６、Ｄ１２５３、Ｔ１６７のうちの１つ以上に突然変異を含み、Ｃｐｆ１の安定性が変化する、請求項１に記載の改変Ｃｐｆ１酵素。
【請求項１４】
以下のアミノ酸：Ｒ１７６、Ｒ１９２、Ｇ７８３、Ｋ９６８及びＲ９５１のうちの１つ以上に突然変異を含み、前記Ｃｐｆ１のＤＮＡ結合が変化する、請求項１に記載の改変Ｃｐｆ１酵素。
【請求項１５】
以下のアミノ酸：Ｎ６３１、Ｎ６３０のうちの１つ以上に突然変異を含み、ＤＮＡ骨格のリン酸との相互作用が増加する、請求項１に記載の改変Ｃｐｆ１酵素。
【請求項１６】
Ｒ１２２６に突然変異を含み、前記酵素がニッカーゼ活性を呈する、請求項１に記載の改変Ｃｐｆ１酵素。
【請求項１７】
改変されたヌクレアーゼ活性を有する改変Ｃｐｆ１酵素であって、
前記改変酵素は、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として、以下のアミノ酸：Ｌ１１７、Ｔ１１８、Ｄ１１９、Ｔ１５０、Ｔ１５１、Ｔ１５２、Ｒ３４１、Ｎ３４２、Ｅ３４３、Ｔ３９８、Ｇ３９９、Ｋ４００、Ｄ４５１、Ｑ４５２、Ｐ４５３、Ｌ４５４、Ｐ４５５、Ｔ４５６、Ｔ４５７、Ｌ４５８、Ｋ４５９、Ｖ４８６、Ｄ４８７、Ｅ４８８、Ｓ４８９、Ｎ４９０、Ｅ４９１、Ｖ４９２、Ｄ４９３、Ｐ４９４、Ｅ５０６、Ｍ５０７、Ｅ５０８、Ｑ５７１、Ｋ５７２、Ｇ５７３、Ｒ５７４、Ｙ５７５、Ｔ６２１、Ｅ６４９、Ｋ６５０、Ｅ６５１、Ｄ６６５、Ｔ７３７、Ｄ７４９、Ｆ７５０、Ｋ８１５、Ｎ８４８、Ｖ１１０８、Ｋ１１０９、Ｔ１１１０、Ｇ１１１１、Ｓ１１２４、Ａ１１９５、Ａ１１９６、Ａ１１９７、Ｎ１１９８、Ｌ１２４４、Ｎ１２４５及び／又はＧ１２４６のうちの１つ以上が突然変異していることを特徴とし、前記Ｃｐｆ１酵素の安定性及び／又は活性が実質的に影響を受けていない、改変Ｃｐｆ１酵素。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の改変Ｃｐｆ１酵素を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系。
【請求項１９】
天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達することを含む、細胞の目的のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖の逆鎖上にある第１及び第２の標的配列の操作によってオフターゲット改変を最小限に抑えることによって生物又は非ヒト生物を改変する方法であって、
前記組成物が、
−ダイレクトリピート配列に連結した第１のガイド配列であって、前記第１の標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡを含む第１のＶ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド配列、又は前記１つ以上のＶ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓポリヌクレオチド配列をコードする１つ以上のヌクレオチド配列；
−ダイレクトリピート配列に連結したガイド配列であって、前記第２の標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列を含む第２のガイドＲＮＡを含む第２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド配列、
及び
−Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であって；少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み、且つ１つ以上の突然変異を含む、ポリヌクレオチド配列、
を含み、
転写されると、前記第１及び前記第２のガイドＲＮＡが第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体のそれぞれ前記第１及び第２の標的配列への配列特異的結合を導き、前記第１のＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記第１の標的配列にハイブリダイズ可能な前記第１のガイド配列を含む前記第１のガイドＲＮＡと複合体を形成した前記Ｃｐｆ１酵素を含み、前記第２のＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記第２の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含む前記第２のガイドＲＮＡと複合体を形成した前記Ｃｐｆ１酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡであり、及び前記第１のガイド配列が前記第１の標的配列の近傍に前記ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ前記第２のガイド配列が前記第２の標的配列の近傍に他方の鎖の切断を導いて二本鎖切断を誘導し、それによりオフターゲット改変を最小限に抑えることによって前記生物又は前記非ヒト生物を改変する、方法。
【請求項２０】
前記第１のガイド配列が前記第１の標的配列の近傍に前記ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ前記第２のガイド配列が前記第２の標的配列の近傍に他方の鎖の切断を導くと、５’オーバーハングが生じる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記５’オーバーハングが高々２００塩基対である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記５’オーバーハングが高々１００塩基対である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記突然変異がＲ１２２６Ａである、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
２つ以上のガイドＲＮＡが提供される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
ガイドＲＮＡのアレイから複数のガイドＲＮＡが発現する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記アレイが、前記細胞にとって内因性の系によって互いに分離されているガイドＲＮＡを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記アレイが、内因性ｔＲＮＡプロセシング系による切断を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記アレイが、ｔＲＮＡに隣接するガイドＲＮＡを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
Ｒ１２２６Ａ突然変異Ｃｐｆ１酵素と、第１の標的配列の近傍にＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を導く第１のガイド配列と、第２の標的配列の近傍にもう一方の鎖の切断を導く第２のガイド配列とを含んで５’オーバーハングを生じさせるＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系。
【請求項３０】
ｉ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系又はその一部の範囲内にフィットする又はそれに結合する潜在的化合物を同定又は設計するためのコンピュータ支援方法であって、
ａ）結晶構造表の前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の少なくとも２つの原子の前記座標を提供するステップ、
ｂ）ｉ）前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系に対して又はその範囲内に結合するための、又はｉｉ）前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の一部分を操作するための候補分子の構造を提供するステップ、
ｃ）前記候補分子の構造を前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の前記少なくとも２つの原子にフィッティングするステップであって、フィッティングが、前記候補分子の１つ以上の原子と前記ＣＲＩＳＰＲ−ＳｐＣａｓ９系の原子との間の相互作用を決定することを含むステップ、及び
ｄ）前記候補分子が前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系に対して又はその範囲内に結合すると予想される場合、前記候補分子を選択するステップ
を含む方法。
【請求項３１】
結晶構造表の前記Ｃｐｆ１が９０８位にアスパラギン酸のアミノ酸置換を更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記候補分子が結晶構造表の前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の原子を含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記候補分子がｃｒＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖の原子を含み、前記ｃｒＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖の原子を前記Ｃｐｆ１の原子と比較することを含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｃｐｆ１の前記原子がＲＥＣローブの原子及び／又はＮＵＣローブの原子を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｃｐｆ１の前記原子が、ＲＥＣ１ドメインの原子、ＲＥＣ２ドメインの原子、及び／又はＲｕｖＣドメインの原子を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記候補分子がｃｒＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖のＰＡＭ遠位領域の原子を含み、前記ｃｒＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖の前記ＰＡＭ遠位領域の原子をＲＥＣ１−ＲＥＣ２ドメインの原子と比較することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記候補分子がｃｒＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖のＰＡＭ近位領域の原子を含み、前記ｃｒＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖の前記ＰＡＭ近位領域の原子をＷＥＤ−ＲＥＣ１−ＲｕｖＣドメインの原子と比較することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｃｐｆ１の前記原子が、Ｒ１７６、Ｒ１９２、Ｇ７８３、及び／又はＲ９５１の原子を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記候補分子がＰＡＭ二重鎖の原子を含み、前記ＰＡＭ二重鎖の原子をＷＥＤ−ＲＥＣ及びＰＩドメインによって形成される溝の原子と比較することを含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記候補分子がＰＡＭの原子を含み、前記Ｃｐｆ１の前記原子が、Ｔｈｒ１６７、Ｌｙｓ６０７、Ｌｙｓ５４８、Ｐｒｏ５９９、及び／又はＭｅｔ６０４の原子を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記候補分子が標的ＤＮＡ鎖及び／又は非標的ＤＮＡ鎖の原子を含み、前記標的ＤＮＡ鎖及び／又は前記非標的ＤＮＡ鎖の原子を前記Ｃｐｆ１の原子と比較することを含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項４２】
前記候補分子が前記標的ＤＮＡ鎖の原子を含み、前記Ｃｐｆ１の前記原子がＮｕｃドメインの原子を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記候補分子が前記標的ＤＮＡ鎖の原子を含み、前記Ｃｐｆ１の前記原子が、Ａｒｇ１２２６、Ｓｅｒ１２２８、及び／又はＡｓｐ１２３５の原子を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記候補分子が前記非標的ＤＮＡ鎖の原子を含み、前記Ｃｐｆ１の前記原子がＲｕｖＣドメインの原子を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記候補分子が前記非標的ＤＮＡ鎖の原子を含み、前記Ｃｐｆ１の前記原子が、Ａｓｐ９０８、Ｔｒｐ９５８、Ｇｌｕ９９３、及び／又はＡｓｐ１２６３の原子を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
Ｃｐｆ１の前記原子が、Ｌｅｕ４６７、Ｌｅｕ４７１、Ｔｙｒ５１４、Ａｒｇ５１８、Ａｌａ５２１及び／又はＴｈｒ５２２の原子を更に含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記候補分子がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の原子を含み、前記ＰＡＭの原子を前記Ｃｐｆ１のＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインの原子と比較することを含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項４８】
前記候補分子が前記ｃｒＲＮＡの５’−ハンドルの原子を含み、前記ｃｒＲＮＡの前記５’−ハンドルの原子をＷＥＤドメインの原子及び／又はＲｕｖＣドメインの原子と比較することを含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項４９】
前記化合物を合成してその結合又は活性を試験することを更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項５０】
細胞におけるＤＮＡ分子の発現を変化させるため前記化合物を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を試験することを更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項５１】
前記候補分子の構造を前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体の少なくとも２個の原子、又は少なくとも５個の原子、又は少なくとも１０個の原子、又は少なくとも５０個の原子、又は少なくとも１００個の原子を含む原子座標にフィッティングすることを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項５２】
前記候補分子が、前記Ｃｐｆ１と、転写リプレッサー、転写活性化因子、ヌクレアーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、タンパク質アセチルトランスフェラーゼ、タンパク質デアセチラーゼ、タンパク質メチルトランスフェラーゼ、タンパク質デアミナーゼ、タンパク質キナーゼ、タンパク質ホスファターゼ、又は後成的調節因子との原子を含む、請求項３０〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系又はその機能性の一部分にフィットする又はそれに結合するように潜在的化合物を同定又は設計するためのコンピュータ支援方法又はその逆（所望の化合物に結合するように潜在的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系又はその機能性の一部分を同定又は設計するためのコンピュータ支援方法）であって、
プロセッサとデータ記憶システムと入力装置と出力装置とを含むコンピュータシステム、例えばプログラミングされたコンピュータを使用した、以下のステップ：
（ａ）例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系結合ドメインにおける、又はそれに代えて又は加えて、Ｃｐｆ１オルソログ間の差異に基づき異なるドメインにおける、実施例３（「結晶構造表」）のＣＲＩＳＰＲ  Ｃｐｆ１結晶構造からの又はそれに関連する原子のサブセットの三次元座標を含むデータを、又はＣｐｆ１に関して又はニッカーゼに関して又は機能性基に関して、任意選択で１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系複合体からの構造情報と共に、前記プログラミングされたコンピュータに前記入力装置を用いて入力し、それによりデータセットを作成するステップ；
（ｂ）前記プロセッサを使用して、前記コンピュータデータ記憶システムに記憶された構造、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系に結合するか若しくは推定上結合する又はそれに結合することが所望される化合物の構造のコンピュータデータベースと、又はＣｐｆ１オルソログに関して（例えば、Ｃｐｆ１として又はＣｐｆ１オルソログ間で異なるドメイン又は領域に関して）又は実施例３（「結晶構造表」）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造に関して又はニッカーゼに関して又は機能性基に関して、前記データセットを比較するステップ；
（ｃ）コンピュータ方法を用いて、１つ又は複数の構造−例えば、所望の構造に結合し得るＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１構造、特定のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１構造に結合し得る所望の構造、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造の他の部分からのデータ及び／又はＣｐｆ１オルソログからのデータに例えば基づき操作され得るＣＲＩＳＰＲ−ＣＰｆ１系の一部分、トランケート型Ｃｐｆ１、新規ニッカーゼ又は特定の機能性基、又は機能性基を付加する位置又は機能性基−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を前記データベースから選択するステップ；
（ｄ）コンピュータ方法を用いて、前記選択された１つ又は複数の構造のモデルを構築するステップ；及び
（ｅ）前記選択された１つ又は複数の構造を前記出力装置に出力するステップ；
及び任意選択で、前記選択された１つ又は複数の構造のうちの１つ以上を合成するステップ；
及び更に任意選択で、前記の合成がされた前記選択された１つ又は複数の構造をＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系として又はそれにおいて試験するステップ
を含む、コンピュータ支援方法。
【請求項５４】
潜在的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のうち操作可能な範囲の予想−例えば、結晶構造データに基づくか又はＣｐｆ１オルソログのデータに基づく−に関連して、又はアクチベーター又はリプレッサーなどの機能性基をＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のどこに付加し得るかに関連して、又はＣｐｆ１トランケーションに関して又はニッカーゼ設計に関して）同定又は設計するためのコンピュータ支援方法であって、
プロセッサとデータ記憶システムと入力装置と出力装置とを含むコンピュータシステム、例えばプログラミングされたコンピュータを使用した、以下のステップ：
（ａ）例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系結合ドメインにおける、又はそれに代えて又は加えて、Ｃｐｆ１オルソログ間の差異に基づき異なるドメインにおける、実施例３（「結晶構造表」）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造からの又はそれに関連する原子のサブセットの三次元座標を含むデータを、又はＣｐｆ１に関して又はニッカーゼに関して又は機能性基に関して、任意選択で１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系複合体からの構造情報と共に、前記プログラミングされたコンピュータに前記入力装置を用いて入力し、それによりデータセットを作成するステップ；
（ｂ）前記プロセッサを使用して、前記コンピュータデータ記憶システムに記憶された構造、例えば、ＣＲｌＳＰＲ−ＣＰｆ１系に結合するか若しくは推定上結合する又はそれに結合することが所望される化合物の構造のコンピュータデータベースと、又はＣｐｆ１オルソログに関して（例えば、Ｃｐｆ１として又はＣｐｆ１オルソログ間で異なるドメイン又は領域に関して）又は実施例３（「結晶構造表」）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造に関して又はニッカーゼに関して又は機能性基に関して、前記データセットを比較するステップ；
（ｃ）コンピュータ方法を用いて、１つ又は複数の構造−例えば、所望の構造に結合し得るＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１構造、特定のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１構造に結合し得る所望の構造、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造の他の部分からのデータ及び／又はＣｐｆ１オルソログからのデータに例えば基づき操作され得るＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の一部分、トランケート型Ｃｐｆ１、新規ニッカーゼ又は特定の機能性基、又は機能性基を付加する位置又は機能性基−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を前記データベースから選択するステップ；
（ｄ）コンピュータ方法を用いて、前記選択された１つ又は複数の構造のモデルを構築するステップ；及び
（ｅ）前記選択された１つ又は複数の構造を前記出力装置に出力するステップ；
及び任意選択で、前記選択された１つ又は複数の構造のうちの１つ以上を合成するステップ；
及び更に任意選択で、前記の合成がされた前記選択された１つ又は複数の構造をＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系として又はそれにおいて試験するステップ
を含む、コンピュータ支援方法。
【請求項５５】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系又はその機能性の一部分にフィットする又はそれに結合するように潜在的化合物を同定又は設計するためのコンピュータ支援方法又はその逆（所望の化合物に結合するように潜在的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系又はその機能性の一部分を同定又は設計するためのコンピュータ支援方法）であって、
実施例３（「結晶構造表」）のＣＲＩＳＰＲ−ＣＰｆ１結晶構造の少なくとも２つの原子、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造の結晶構造表の少なくとも２つの原子の座標又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造の少なくともサブドメインの座標（「選択の座標」）を提供するステップ、結合分子を含む候補の構造又は例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造の他の部分からのデータ及び／又はＣｐｆ１オルソログからのデータに基づき操作され得るＣＲＩＳＰＲ−ＣＰｆ１系の一部分の構造、又は機能性基の構造を提供するステップ、及び候補の構造を前記の選択の座標にフィッティングし、それにより所望の構造に結合し得るＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１構造、特定のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１構造に結合し得る所望の構造、操作され得るＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の一部分、トランケート型Ｃｐｆ１、新規ニッカーゼ、又は特定の機能性基、又は機能性基を付加する位置又は機能性基−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を含む生成物データを、その出力と共に入手するステップ；及び任意選択で、前記生成物データから１つ又は複数の化合物を合成するステップを含み、及び更に任意選択で、前記合成された１つ又は複数の化合物をＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系として又はそれにおいて試験するステップを含む、コンピュータ支援方法。
【請求項５６】
潜在的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のうち操作可能な範囲の予想−例えば、結晶構造データに基づくか又はＣｐｆ１オルソログのデータに基づく−に関連して、又はアクチベーター又はリプレッサーなどの機能性基をＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のどこに付加し得るかに関連して、又はＣｐｆ１トランケーションに関して又はニッカーゼ設計に関して）同定又は設計するためのコンピュータ支援方法であって、
実施例３（「結晶構造表」）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造の少なくとも２つの原子、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造の結晶構造表の少なくとも２つの原子の座標又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造の少なくともサブドメインの座標（「選択の座標」）を提供するステップ、結合分子を含む候補の構造又は例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造の他の部分からのデータ及び／又はＣｐｆ１オルソログからのデータに基づき操作され得るＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の一部分の構造、又は機能性基の構造を提供するステップ、及び候補の構造を前記の選択の座標にフィッティングし、それにより所望の構造に結合し得るＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１構造、特定のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１構造に結合し得る所望の構造、操作され得るＣＲＩＳＰＲ−ＣＰｆ１系の一部分、トランケート型Ｃｐｆ１、新規ニッカーゼ、又は特定の機能性基、又は機能性基を付加する位置又は機能性基−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を含む生成物データを、その出力と共に入手するステップ；及び任意選択で、前記生成物データから１つ又は複数の化合物を合成するステップを含み、及び更に任意選択で、前記合成された１つ又は複数の化合物をＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系として又はそれにおいて試験するステップを含む、コンピュータ支援方法。
【請求項５７】
前記合成された選択の１つ又は複数の構造から得られた前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を、例えば、結合に関して、又は所望の機能を果たすかに関して分析することを更に含む、請求項５３〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
データ伝達、例えば、遠隔通信、電話、テレビ会議、マスコミュニケーション、例えば、コンピュータプレゼンテーション（例えばＰＯＷＥＲＰＯＩＮＴ）などのプレゼンテーション、インターネット、電子メール、コンピュータプログラム（例えばＷＯＲＤ）文書などの文書による通信等による情報の伝達を含む、請求項３０〜５７のいずれか一項に記載の方法のいずれかにおける出力。
【請求項５９】
実施例３（「結晶構造表」）の結晶構造表及び／又は図に係る原子座標データであって、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１又はその少なくとも１つのサブドメインの三次元構造を定義付けるデータ、又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１の構造因子データであって、結晶構造表及び／又は図の原子座標データから導出することが可能な構造因子データを含む、コンピュータ可読媒体。
【請求項６０】
前記方法の任意のデータを更に含む、請求項５９に記載のコンピュータ可読媒体。
【請求項６１】
結晶構造表及び／又は図に係る原子座標データであって、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１又はその少なくとも１つのサブドメインの三次元構造を定義付けるデータ、又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１の構造因子データであって、結晶構造表及び／又は図の原子座標データから導出することが可能な構造因子データのいずれかを含む、請求項３０〜５８のいずれか一項に記載の方法にあるとおりの合理的設計を生成又は実施するためのコンピュータシステム。
【請求項６２】
事業を行う方法であって、
前記コンピュータシステム又は前記媒体又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１若しくはその少なくとも１つのサブドメインの三次元構造、又はＣＲＩＳＰＲ−ＣＰｆ１の構造因子データであって、実施例３（「結晶構造表」）の結晶構造表及び／又は前記図の前記原子座標データに示される構造及びそれから導出することが可能な構造因子データ、又は本明細書におけるコンピュータ媒体又は本明細書におけるデータ伝達を使用者に提供するステップを含む方法。
【請求項６３】
実施例３（「結晶構造表」）の結晶構造を有する及び／又は前述の一部又は全てに対応する又はそれから得られるＸ線回折パターンを有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系及び／又は前記結晶構造表の少なくとも２、少なくとも５０、少なくとも１００又は全ての座標によって定義付けられる構造を有する結晶。
【請求項６４】
請求項のいずれか一項に記載の候補分子を得ることを含む研究方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願及び参照による援用
本願は、２０１６年１月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／２８１，９４７号明細書及び２０１６年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／３１６，２４０号明細書の利益及びそれらに対する優先権を主張する。
【０００２】
その中に引用されるか又はその審査手続中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）及び本明細書に引用される文献中で引用又は参照される全ての文献は、本明細書で言及されるか又は本明細書に参照によって援用される任意の文献中にある任意の製品に関する任意の製造者の指示書、説明書、製品仕様書、及びプロダクトシートと共に、本明細書によって参照により本明細書に援用され、且つ本発明の実施に用いられ得る。より具体的には、参照される全ての文献は、各個別の文献について参照によって援用されることが具体的且つ個別に指示されたものとするのと同程度に参照によって援用される。
【０００３】
連邦政府支援研究に関する記載事項
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）から付与された助成金第ＭＨ１００７０６号、ＭＨ１１００４９及びＤＫ０９７７６８に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００４】
本発明は、ＪＳＴ（日本科学技術振興機構）から交付されたＰＲＥＳＴＯ（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：若手個人研究推進事業）１５Ｈ０１４６３の助成を受けて行われた。ＪＳＴは本発明に一定の権利を有する。本研究はＪＳＰＳ科研費２６２９１０１０の助成を受けたものである。
【０００５】
本発明は、概して、遺伝子転写物の摂動又は核酸編集など、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）及びその構成成分に関するベクター系を使用し得る配列ターゲティングを含む遺伝子発現の制御に用いられる系、方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００６】
ゲノムシーケンシング技法及び解析方法の最近の進歩により、様々な生物学的機能及び疾患に関連する遺伝因子をカタログ化し及びマッピングする能力は急速に向上している。個々の遺伝エレメントを選択的に摂動させることによる原因遺伝的変異の体系的なリバースエンジニアリングを可能にするとともに合成生物学、バイオテクノロジー的、及び医学的応用を進歩させるには、正確なゲノムターゲティング技術が必要である。標的化したゲノム摂動を生じさせるためにデザイナージンクフィンガー、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）、又はホーミングメガヌクレアーゼなどのゲノム編集技法が利用可能であるものの、新規戦略及び分子機構を利用した、且つ安価で、セットアップし易く、スケーリングが可能で、及び真核生物ゲノム内の複数の位置を標的化するのに適した新規のゲノムエンジニアリング技術が依然として必要とされている。それは、ゲノムエンジニアリング及びバイオテクノロジーにおける新規適用の主要なリソースとなるであろう。
【０００７】
細菌及び古細菌適応免疫のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、タンパク質組成及びゲノム遺伝子座構成に関して極めて高度な多様性を示す。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系遺伝子座は５０を超える遺伝子ファミリーを有し、厳密な意味で普遍的な遺伝子はないことから、急速な進化及び遺伝子座構成の極めて高度な多様性が示唆される。これまでのところ、多方向からの手法をとることにより、９３個のＣａｓタンパク質について約３９５個のプロファイルのｃａｓ遺伝子が包括的に同定されている。分類に含まれるのは、シグネチャ遺伝子プロファイル＋遺伝子座構成のシグネチャである。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の新規分類が提案されており、ここではこれらの系が大まかに２つのクラス、マルチサブユニットエフェクター複合体を有するクラス１と、Ｃａｓ９タンパク質に例示される単一サブユニットエフェクターモジュールを有するクラス２とに分けられる。クラス２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に関連する新規エフェクタータンパク質は、強力なゲノムエンジニアリングツールとして開発することができ、推定上の新規エフェクタータンパク質の予測並びにそれらのエンジニアリング及び最適化が重要である。
【０００８】
本願におけるいかなる文献の引用又は特定も、かかる文献が本発明の先行技術として利用可能であると認めるものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
幅広い適用で核酸又はポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ又はこれらの任意のハイブリッド又は誘導体）を標的化する代替的且つロバストなシステム及び技法が喫緊に必要とされている。本発明はこの必要性に応え、関連する利点を提供する。本願の新規ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティング系がゲノム及びエピゲノムターゲティング技術のレパートリーに加わることにより、直接的な検出、分析及び操作を通じて特定の標的部位の研究及び摂動又は編集が変わり得る。本願のＤＮＡ又はＲＮＡターゲティング系を有害作用なしにゲノム又はエピゲノムターゲティングに有効に利用するためには、これらのＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングツールのエンジニアリング及び最適化の側面を理解することが決定的に重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列を改変する方法を提供し、この方法は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達するステップを含み、ここでエフェクタータンパク質は１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は鎖切断の導入である。
【００１１】
用語のＣａｓ酵素、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ＣＲＩＳＰＲタンパク質、Ｃａｓタンパク質及びＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓは概して同義的に用いられ、Ｃａｓ９に具体的に言及することによるなど、特に明らかでない限り、本明細書で言及する際は常に類推から本願に更に記載される新規ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を指すことが理解されるであろう。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、好ましくはＣｐｆ１エフェクタータンパク質である。
【００１２】
本発明は、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列を改変する方法を提供し、この方法は、Ｃｐｆ１遺伝子座エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を、遺伝子座に関連する又はそこにある前記配列に送達するステップを含み、ここでＣｐｆ１エフェクタータンパク質は１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は鎖切断の導入である。好ましい実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は１つの核酸成分；有利にはエンジニアリングされた又は天然に存在しない核酸成分と複合体を形成する。目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列の改変の誘導は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質−核酸ガイド下であり得る。好ましい実施形態において、１つの核酸成分はＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）である。好ましい実施形態において、１つの核酸成分は成熟ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡであり、ここで成熟ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡはスペーサー配列（又はガイド配列）及びダイレクトリピート配列又はこれらの誘導体を含む。好ましい実施形態において、スペーサー配列又はその誘導体はシード配列を含み、ここでシード配列は、標的遺伝子座における配列の認識及び／又はそれとのハイブリダイゼーションに決定的に重要である。好ましい実施形態において、Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡのシード配列は、スペーサー配列（又はガイド配列）の５’末端上の最初の約５ｎｔ以内にある。好ましい実施形態において、鎖切断は５’オーバーハングを伴う付着末端型切断である。好ましい実施形態において、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列は、線状ＤＮＡ又はスーパーコイルＤＮＡを含む。
【００１３】
本発明の態様は、Ｃｐｆ１遺伝子座エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物に関し、ここでＣｐｆ１エフェクタータンパク質は、１つ以上の核酸成分、有利にはエンジニアリングされた又は天然に存在しない核酸成分と複合体を形成可能である。好ましい実施形態において１つの核酸成分は成熟ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡであり、ここで成熟ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡはスペーサー配列（又はガイド配列）及びダイレクトリピート配列又はそれらの誘導体を含む。好ましい実施形態においてスペーサー配列又はその誘導体はシード配列を含み、ここでシード配列は、標的ＤＮＡ内の配列にハイブリダイズ可能である。詳細な実施形態において、このＤＮＡ分子は、細胞において遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子である。ガイドＲＮＡが標的配列にハイブリダイズすることにより複合体が標的ＤＮＡに標的化され、標的配列の改変が確実となる。
【００１４】
好ましい実施形態において、改変は鎖切断の導入である。好ましい実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は１つの核酸成分と複合体を形成する；
【００１５】
目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列の改変の誘導は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質−核酸ガイド下であり得る。好ましい実施形態において、前記の１つの核酸成分は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ  （ｃｒＲＮＡ）である。本発明の態様は、１つ以上の天然に存在しない又はエンジニアリングされた又は改変された又は最適化された核酸成分を有するＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体に関する。好ましい実施形態において、この複合体の核酸成分は、ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列を含むことができ、ここでダイレクトリピート配列は１つ以上のステムループ又は最適化された二次構造を含む。好ましい実施形態において、ダイレクトリピートは１６ｎｔの最小長さ及び単一のステムループを有する。更なる実施形態において、ダイレクトリピートは長さが１６ｎｔより長く、好ましくは１７ｎｔより長く、且つ２つ以上のステムループ又は最適化された二次構造を有する。好ましい実施形態において、ダイレクトリピートは１つ以上のタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを含むように改変されてもよい。好ましい実施形態において、１つ以上のアプタマーは、最適化された二次構造の一部として含まれてもよい。かかるアプタマーはバクテリオファージコートタンパク質との結合能を有し得る。バクテリオファージコートタンパク質は、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、ＭＳ２、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１を含む群から選択され得る。好ましい実施形態において、バクテリオファージコートタンパク質はＭＳ２である。本発明はまた、３０以上、４０以上又は５０以上のヌクレオチド長である複合体の核酸成分も提供する。
【００１６】
本発明はゲノム編集方法を提供し、この方法は、２ラウンド以上のＣｐｆ１エフェクタータンパク質ターゲティング及び切断を含む。特定の実施形態において、第１のラウンドは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質がシード配列から遠く離れた標的遺伝子座に関連する配列を切断することを含み、及び第２のラウンドは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質が標的遺伝子座にある配列を切断することを含む。本発明の好ましい実施形態では、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質による第１のターゲティングラウンドによってインデルが生じ、及びＣｐｆ１エフェクタータンパク質による第２のターゲティングラウンドが相同依存性修復（ＨＤＲ）によって修復され得る。本発明の最も好ましい実施形態では、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質による１つ以上のターゲティングラウンドにより、修復鋳型の挿入によって修復され得る付着末端型切断が生じる。
【００１７】
本発明は、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列のゲノム編集又は改変方法を提供し、この方法は、任意の所望の細胞型、原核細胞又は真核細胞にＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体を導入するステップを含み、それによってＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体が、真核生物又は原核細胞のゲノムにＤＮＡインサートを組み込むように有効に機能する。好ましい実施形態において、細胞は真核細胞であり、及びゲノムは哺乳類ゲノムである。好ましい実施形態において、ＤＮＡインサートの組込みは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ベースの遺伝子挿入機構によって促進される。好ましい実施形態において、ＤＮＡインサートは、外因的に導入されたＤＮＡ鋳型又は修復鋳型である。好ましい一実施形態において、外因的に導入されたＤＮＡ鋳型又は修復鋳型は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体又は１つの構成成分又は複合体の構成成分の発現用ポリヌクレオチドベクターと共に送達される。より好ましい実施形態において、真核細胞は非分裂細胞（例えば、ＨＤＲによるゲノム編集が特に難題となる非分裂細胞）である。ヒト細胞における好ましいゲノム編集方法において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質には、限定はされないが、ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１及びＬｂＣｐｆ１エフェクタータンパク質が含まれ得る。
【００１８】
本発明はまた、目的の標的遺伝子座を改変する方法も提供し、この方法は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質と１つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達するステップを含み、ここでＣｐｆ１エフェクタータンパク質は１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は鎖切断の導入である。
【００１９】
かかる方法において、目的の標的遺伝子座はインビトロでＤＮＡ分子に含まれ得る。好ましい実施形態において、そのＤＮＡ分子はプラスミドである。かかる方法において、目的の標的遺伝子座は細胞内のＤＮＡ分子に含まれ得る。細胞は原核細胞又は真核細胞であってもよい。細胞は哺乳類細胞であってもよい。
【００２０】
哺乳類細胞は、非ヒト哺乳動物、例えば、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、げっ歯類、ウサギ科（Ｌｅｐｏｒｉｄａｅ）、例えば、サル、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウサギ、ラット又はマウス細胞であってもよい。細胞は、非哺乳類真核細胞、例えば、家禽類のトリ（例えば、ニワトリ）、脊椎動物魚類（例えば、サケ）又は甲殻類（例えば、カキ、ハマグリ（ｃｌａｉｍ）、ロブスター、エビ）細胞であってもよい。細胞はまた、植物細胞であってもよい。植物細胞は、単子葉植物又は双子葉植物のもの又は作物又は穀物植物のもの、例えば、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、ダイズ、コムギ、オートムギ又はコメであってもよい。植物細胞はまた、藻類、樹木又は生産植物、果実又は野菜のもの（例えば、柑橘類の木、例えば、オレンジ、グレープフルーツ又はレモンの木などの木；モモ又はネクタリンの木；リンゴ又はセイヨウナシの木；アーモンド又はクルミ又はピスタチオの木などの堅果類の木；ナス科植物；アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の植物；アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）の植物；ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の植物；トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の植物；綿、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、トマト、ナス、コショウ、レタス、ホウレンソウ、イチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココア等）であってもよい。
【００２１】
本発明によって細胞に導入される改変は、抗体、デンプン、アルコール又は他の所望の細胞産出物などの生物学的産物の産生向上のため細胞及び細胞の子孫を変化させるようなものであり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、産生される生物学的産物を変える変化が細胞及び細胞の子孫に含まれるようなものであり得る。
【００２２】
記載される方法の任意のものにおいて、目的の標的遺伝子座は目的のゲノム又はエピゲノム遺伝子座であってもよい。記載される方法の任意のものにおいて、複合体は、多重化した使用向けに複数のガイドと共に送達されてもよい。記載される方法の任意のものにおいて、２つ以上のタンパク質が用いられてもよい。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列の生化学的な又はインビトロ若しくはインビボでの切断、例えばＡｓＣｐｆ１エフェクタータンパク質による切断は、推定トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ）配列なしに生じる。本発明の他の実施形態において、切断、例えば他のＣＲＩＳＰＲファミリーエフェクタータンパク質による切断は、推定トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ）配列を伴い生じ得る。しかしながら、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体による標的ＤＮＡ切断にｔｒａｃｒＲＮＡは必要ないこと、より具体的には、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質及びｃｒＲＮＡ（ダイレクトリピート配列とガイド配列とを含むガイドＲＮＡ）のみを含むＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体が標的ＤＮＡの切断に十分であったことが見い出された（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１５，  Ｃｅｌｌ  １６３，  ７５９−７７１）。
【００２４】
記載される方法の任意のものにおいて、エフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）及び核酸成分は、そのタンパク質及び／又は１つ又は複数の核酸成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子によって提供されてもよく、及びここで１つ以上のポリヌクレオチド分子は、タンパク質及び／又は１つ又は複数の核酸成分を発現するように作動可能に構成されている。１つ以上のポリヌクレオチド分子は、タンパク質及び／又は１つ又は複数の核酸成分を発現するように作動可能に構成された１つ以上の調節エレメントを含み得る。１つ以上のポリヌクレオチド分子は１つ以上のベクター内に含まれ得る。本発明は、かかる１つ又は複数のポリヌクレオチド分子、例えばタンパク質及び／又は１つ又は複数の核酸成分を発現するように作動可能に構成されたかかるポリヌクレオチド分子、並びにかかる１つ又は複数のベクターを包含する。
【００２５】
記載される方法の任意のものにおいて、鎖切断は一本鎖切断又は二本鎖切断であってもよい。
【００２６】
調節エレメントは誘導性プロモーターを含み得る。ポリヌクレオチド及び／又はベクター系は誘導性系を含み得る。
【００２７】
記載される方法の任意のものにおいて、１つ以上のポリヌクレオチド分子は送達系に含まれてもよく、又は１つ以上のベクターが送達系に含まれてもよい。
【００２８】
記載される方法の任意のものにおいて、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、リポソーム、粒子（例えばナノ粒子）、エキソソーム、微小胞、遺伝子銃又は１つ以上のベクター、例えば核酸分子又はウイルスベクターによって送達されてもよい。
【００２９】
本発明はまた、本明細書で考察するとおりの特徴を有するか又は本明細書に記載される方法のいずれかに定義される組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物も提供する。
【００３０】
本発明はまた、１つ以上のベクターを含むベクター系も提供し、この１つ以上のベクターは、本明細書で考察するとおりの特徴を有するか又は本明細書に記載される方法のいずれかに定義される組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む。
【００３１】
本発明はまた、１つ以上のベクター又は１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む送達系も提供し、この１つ以上のベクター又はポリヌクレオチド分子は、本明細書で考察するとおりの特徴を有するか又は本明細書に記載される方法のいずれかに定義される組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む。
【００３２】
本発明はまた、療法的治療方法に用いられる、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター又は送達系も提供する。療法的治療方法には、遺伝子若しくはゲノム編集、又は遺伝子療法が含まれ得る。
【００３３】
本発明はまた、エフェクタータンパク質の１つ以上のアミノ酸残基が改変されていてもよい方法及び組成物、例えば、エンジニアリングされた又は天然に存在しないエフェクタータンパク質又はＣｐｆ１も提供する。ある実施形態において、改変は、エフェクタータンパク質の１つ以上のアミノ酸残基の突然変異を含み得る。１つ以上の突然変異は、エフェクタータンパク質の１つ以上の触媒活性ドメインにあってもよい。このエフェクタータンパク質は、前記１つ以上の突然変異を欠くエフェクタータンパク質と比較してヌクレアーゼ活性が低下し又は消失していてもよい。このエフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座におけるいずれか一方のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖の切断を誘導しないことがあり得る。エフェクタータンパク質は目的の標的遺伝子座におけるいずれのＤＮＡ又はＲＮＡ鎖の切断も誘導しないことがあり得る。好ましい実施形態において、１つ以上の突然変異は２つの突然変異を含み得る。好ましい実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質、例えば、エンジニアリングされた又は天然に存在しないエフェクタータンパク質又はＣｐｆ１において１つ以上のアミノ酸残基が改変される。好ましい実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質はＡｓＣｐｆ１エフェクタータンパク質である。好ましい実施形態において、１つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基は、ＡｓＣｐｆ１エフェクタータンパク質のアミノ酸位置付番を基準にしてＤ９０８、Ｅ９９３、Ｄ１２６３である。更に好ましい実施形態において、１つ以上の突然変異したアミノ酸残基は、ＡｓＣｐｆ１におけるアミノ酸位置を基準としてＤ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｄ１２６３Ａである。
【００３４】
好ましい実施態様では、前記の１つ以上の改変または突然変異されたアミノ酸残基は、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６のアミノ酸位置付番を基準として、Ｄ８６１、Ｒ８６２、Ｒ８６３、Ｗ３８２、Ｅ９９３、Ｄ１２６３、Ｄ９０８、Ｗ９５８、Ｋ９６８、Ｒ９５１、Ｒ１２２６、Ｓ１２２８、Ｄ１２３５、Ｋ５４８、Ｍ６０４、Ｋ６０７、Ｔ１６７、Ｎ６３１、Ｎ６３０、Ｋ５４７、Ｋ１６３、Ｑ５７１、Ｋ１０１７、Ｒ９５５、Ｋ１００９、Ｒ９０９、Ｒ９１２、Ｒ１０７２、Ｅ３７２、Ｋ１５、Ｋ８１０、Ｈ７５５、Ｋ５５７、Ｅ８５７、Ｋ９４３、Ｋ１０２２、Ｋ１０２９、Ｋ９４２、Ｋ９４９、Ｒ８４、Ｋ８７、Ｋ２００、Ｈ２０６、Ｒ２１０、Ｒ３０１、Ｒ６９９、Ｋ７０５、Ｋ８８７、Ｒ８９１、Ｋ１０８６、Ｋ１０８９、Ｒ１０９４、Ｒ１１２７、Ｒ１２２０、Ｑ１２２４、Ｎ１７８、Ｎ１９７、Ｎ２０４、Ｎ２５９、Ｎ２７８、Ｎ２８２、Ｎ５１９、Ｎ７４７、Ｎ７５９、Ｎ８７８、Ｎ８８９、及び／又は、１１８９〜１１９７、１２００〜１２０８、３９８〜４００、３８０〜３８３、３６２〜４２０、１１６３〜１１７３、１２３０〜１２３３、１１５２〜１１４８、１０７６〜１２４９の領域にあるいずれか１つのアミノ酸から選択される。好ましい実施態様では、前記の１つ以上の改変または突然変異されたアミノ酸残基は、Ｒ８６２Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｄ１２６３Ａ、Ｄ９０８Ａ、Ｗ９５８Ａ、Ｒ９５１Ａ、Ｒ１２２６Ａ、Ｓ１２２８Ａ、Ｄ１２３５Ａ、Ｋ５４８Ａ、Ｍ６０４Ａ、Ｋ６０７Ａ、Ｋ６０７Ｒ、Ｔ１６７Ｓ、Ｎ６３１Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６３０Ｋ、Ｎ６３０Ｒ、Ｋ５４７Ｒ、Ｋ１６３Ｒ、Ｑ５７１Ｋ、Ｑ５７１Ｒ、Ｋ１００９Ａ、Ｒ９０９Ａ、Ｒ１０７２Ａ、Ｅ３２７Ａ、Ｋ１５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｈ７５５Ａ、Ｋ５５７Ａ、Ｅ８５７Ａ、Ｋ９４３Ａ、Ｋ１０２２Ａ、Ｋ１０２９Ａ、Ｋ９４２Ａ、Ｋ９４９Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ８７Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｈ２０６Ａ、Ｒ２１０Ａ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ６９９Ａ、Ｋ７０５Ａ、Ｋ８８７Ａ、Ｒ８９１Ａ、Ｋ１０８６Ａ、Ｋ１０８９Ａ、Ｒ１０９４Ａ、Ｒ１１２７Ａ、Ｒ１２２０Ａ及びＱ１２２４Ａからなるリストから選択される。好ましい実施態様では、前記の１つ以上の改変または突然変異されたアミノ酸残基は、Ｒ８６２Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｄ１２６３Ａ、Ｄ９０８Ａ、Ｗ９５８Ａ、Ｒ９５１Ａ、Ｋ５４８Ａ、Ｍ６０４Ａ、Ｋ６０７Ａ、Ｋ６０７Ｒ、Ｎ６３１Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６３０Ｋ、Ｎ６３０Ｒ、Ｋ５４７Ｒ、Ｋ１６３Ｒ、Ｑ５７１Ｋ、Ｑ５７１Ｒ、Ｋ１００９Ａ、Ｒ９０９Ａ、Ｒ１０７２Ａ、Ｅ３２７Ａ、Ｋ１５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｈ７５５Ａ、Ｋ５５７Ａ、Ｅ８５７Ａ、Ｋ９４３Ａ、Ｋ１０２２Ａ、Ｋ１０２９Ａ、Ｋ９４２Ａ、Ｋ９４９Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ８７Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｈ２０６Ａ、Ｒ２１０Ａ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ６９９Ａ、Ｋ７０５Ａ、Ｋ８８７Ａ、Ｒ８９１Ａ、Ｋ１０８６Ａ、Ｋ１０８９Ａ、Ｒ１０９４Ａ、Ｒ１１２７Ａ、Ｒ１２２０Ａ及びＱ１２２４Ａからなるリストから選択される；好ましい実施態様では、前記の１つ以上の改変または突然変異されたアミノ酸残基は、Ｎ１７８、Ｎ１９７、Ｎ２０４、Ｎ２５９、Ｎ２７８、Ｎ２８２、Ｎ５１９、Ｎ７４７、Ｎ７５９���Ｎ８７８、Ｎ８８９から選択される。好ましい実施態様では、前記の１つ以上の改変または突然変異されたアミノ酸残基は、Ｒ８６２Ａ、Ｗ９５８Ａ、Ｒ９５１Ａ、Ｒ１２２６Ａ、Ｓ１２２８Ａ、Ｄ１２３５Ａ、Ｋ５４８Ａ、Ｍ６０４Ａ、Ｋ６０７Ａ、Ｋ６０７Ｒ、Ｔ１６７Ｓ、Ｎ６３１Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６３０Ｋ、Ｎ６３０Ｒ、Ｋ５４７Ｒ、Ｋ１６３Ｒ、Ｑ５７１Ｋ、Ｑ５７１Ｒ、Ｋ１００９Ａ、Ｒ９０９Ａ、Ｒ１０７２Ａ、Ｅ３２７Ａ、Ｋ１５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｈ７５５Ａ、Ｋ５５７Ａ、Ｅ８５７Ａ、Ｋ９４３Ａ、Ｋ１０２２Ａ、Ｋ１０２９Ａ、Ｋ９４２Ａ、Ｋ９４９Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ８７Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｈ２０６Ａ、Ｒ２１０Ａ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ６９９Ａ、Ｋ７０５Ａ、Ｋ８８７Ａ、Ｒ８９１Ａ、Ｋ１０８６Ａ、Ｋ１０８９Ａ、Ｒ１０９４Ａ、Ｒ１１２７Ａ、Ｒ１２２０Ａ及びＱ１２２４Ａからなるリストから選択される。好ましい実施態様では、前記の１つ以上の改変または突然変異されたアミノ酸残基は、Ｄ８６１、Ｗ９５８、Ｓ１２２８、Ｄ１２３５、Ｔ１６７、Ｎ６３１、Ｎ６３０、Ｋ５４７、Ｋ１６３、Ｑ５７１、Ｒ１２２６、Ｅ３７２、Ｋ１５、Ｋ８１０、Ｈ７５５、Ｋ５５７、Ｅ８５７、Ｋ９４３、Ｋ１０２２、Ｋ１０２９、Ｋ９４２、Ｋ９４９、Ｒ８４、Ｋ８７、Ｋ２００、Ｈ２０６、Ｒ２１０、Ｒ３０１、Ｒ６９９、Ｋ７０５、Ｋ８８７、Ｒ８９１、Ｋ１０８６、Ｋ１０８９、Ｒ１０９４、Ｒ１１２７、Ｒ１２２０、Ｑ１２２４、Ｎ１７８、Ｎ１９７、Ｎ２０４、Ｎ２５９、Ｎ２７８、Ｎ２８２、Ｎ５１９、Ｎ７４７、Ｄ７４９、Ｎ７５９、Ｈ７６１、Ｈ８７２、Ｎ８７８、Ｎ８８９、及び／又は、１１８９〜１１９７、１２００〜１２０８、３９８〜４００、３８０〜３８３、３６２〜４２０、１１６３〜１１７３、１２３０〜１２３３、１１５２〜１１４８、１０７６〜１２４９の領域にあるいずれか１つのアミノ酸から選択される。特定の実施態様では、突然変異はＲ８６２Ａであり、前記Ｃｐｆ１酵素は、もはやＲＮＡに結合しない。特定の実施態様では、前記の１つ以上の突然変異は、Ｋ１５Ａ、Ｄ７４９Ａ、Ｈ７６１Ａ、Ｈ８７２Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｈ７５５Ａ、Ｋ５５７Ａ、Ｅ８５７Ａ、Ｒ８６２Ａ、Ｋ９４３Ａ、Ｋ１０２２Ａ及びＫ１０２９Ａから選択されて、ここで、前記Ｃｐｆ１酵素は、もはやＲＮＡ結合及び／又はプロセッシングが可能でない。特定の実施態様では、前記の１つ以上の突然変異は、Ｋ５４７Ａ、Ｋ６０７Ａ、Ｍ６０４Ａ、及びＴ１７６Ｓから選択されて、ここで、ＴＴＴ特異性は、低減または除去される。特定の実施態様では、前記の１つ以上の突然変異は、Ｎ６３１Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６３０Ｋ、Ｎ６３０Ｒ、Ｋ５４７Ｒ、Ｋ１６３Ｒ、Ｑ５７１Ｋ、Ｑ５７１Ｒ及びＫ６０７Ｒから選択されて、ここで、前記Ｃｐｆ１酵素の非特異的なＤＮＡ相互作用は増大される。特定の実施態様では、前記の１つ以上の突然変異は、Ｒ８４Ａ、Ｋ８７Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｈ２０６Ａ、Ｒ２１０Ａ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ６９９Ａ、Ｋ７０５Ａ、Ｋ８８７Ａ、Ｒ８９１Ａ、Ｋ１０８６Ａ、Ｋ１０８９Ａ、Ｒ１０９４Ａ、Ｒ１１２７Ａ、Ｒ１２２０Ａ及びＱ１２２４Ａから選択されて、それにより、前記酵素の前記特異性は、増大または低減される。特定の実施態様では、Ｄ８６１、Ｒ���６２、Ｒ８６３及びＷ３８２のうちの１つ以上は突然変異されていて、前記Ｃｐｆ１のＲＮＡ結合は破壊されている。特定の実施態様では、アミノ酸Ｗ９５８、Ｋ９６８、Ｒ９５１、Ｒ１２２６、Ｄ１２５３及びＴ１６７のうちの１つ以上及びＣｐｆ１の安定性が影響を受けている。特定の実施態様では、Ｋ９６８及びＲ９５１のうちの１つ以上は突然変異されていて、前記Ｃｐｆ１のＤＮＡ結合は破壊されている。特定の実施態様では、Ｎ６３１及びＮ６３０のうちの１つ以上は突然変異されていて、ＤＮＡ主鎖内のリン酸との相互作用は増大されている。特定の実施態様では、以下のアミノ酸：ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として、Ｌ１１７、Ｔ１１８、Ｄ１１９、Ｔ１５０、Ｔ１５１、Ｔ１５２、Ｒ３４１、Ｎ３４２、Ｅ３４３、Ｔ３９８、Ｇ３９９、Ｋ４００、Ｄ４５１、Ｑ４５２、Ｐ４５３、Ｌ４５４、Ｐ４５５、Ｔ４５６、Ｔ４５７、Ｌ４５８、Ｋ４５９、Ｖ４８６、Ｄ４８７、Ｅ４８８、Ｓ４８９、Ｎ４９０、Ｅ４９１、Ｖ４９２、Ｄ４９３、Ｐ４９４、Ｅ５０６、Ｍ５０７、Ｅ５０８、Ｑ５７１、Ｋ５７２、Ｇ５７３、Ｒ５７４、Ｙ５７５、Ｔ６２１、Ｅ６４９、Ｋ６５０、Ｅ６５１、Ｄ６６５、Ｔ７３７、Ｄ７４９、Ｆ７５０、Ｋ８１５、Ｎ８４８、Ｖ１１０８、Ｋ１１０９、Ｔ１１１０、Ｇ１１１１、Ｓ１１２４、Ａ１１９５、Ａ１１９６、Ａ１１９７、Ｎ１１９８、Ｌ１２４４、Ｎ１２４５及び／又はＧ１２４６のうちの１つ以上は突然変異しており、それにより、Ｃｐｆ１酵素の安定性及び／又は活性は、実質的に影響を受けていない。
【００３５】
本発明はまた、ＲｕｖＣドメインを含むエフェクタータンパク質の触媒活性ドメインにあるべき１つ以上の突然変異又は２つ以上の突然変異も提供する。本発明の一部の実施形態において、ＲｕｖＣドメインは、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ若しくはＲｕｖＣＩＩＩドメイン、又はＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ若しくはＲｕｖＣＩＩＩドメイン等と同種であるか又は本明細書に記載される方法のいずれかに記載されるとおりの任意の関連性のあるドメインと同種である触媒活性ドメインを含み得る。エフェクタータンパク質は１つ以上の異種機能ドメインを含み得る。１つ以上の異種機能ドメインは１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインを含み得る。１つ以上の異種機能ドメインは少なくとも２つ又はそれ以上のＮＬＳドメインを含み得る。１つ以上のＮＬＳドメインはエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）の末端に又はその近傍に又はそれに近接して位置してもよく、及びＮＬＳが２つ以上の場合には、それらの２つの各々がエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）の末端に又はその近傍に又はそれに近接して位置してもよい。１つ以上の異種機能ドメインは１つ以上の転写活性化ドメインを含み得る。好ましい実施形態において、転写活性化ドメインはＶＰ６４を含み得る。１つ以上の異種機能ドメインは１つ以上の転写抑制ドメインを含み得る。好ましい実施形態において、転写抑制ドメインはＫＲＡＢドメイン又はＳＩＤドメイン（例えばＳＩＤ４Ｘ）を含む。１つ以上の異種機能ドメインは１つ以上のヌクレアーゼドメインを含み得る。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼドメインはＦｏｋ１を含む。
【００３６】
本発明はまた、以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖ＲＮＡ切断活性、二本鎖ＲＮＡ切断活性、一本鎖ＤＮＡ切断活性、二本鎖ＤＮＡ切断活性及び核酸結合活性のうちの１つ以上を有するように１つ以上の異種機能ドメインも提供する。少なくとも１つ以上の異種機能ドメインはエフェクタータンパク質のアミノ末端にあるか又はその近傍にあってもよく、及び／又はここで少なくとも１つ以上の異種機能ドメインはエフェクタータンパク質のカルボキシ末端にあるか又はその近傍にある。１つ以上の異種機能ドメインはエフェクタータンパク質に融合されてもよい。１つ以上の異種機能ドメインはエフェクタータンパク質に繋留されてもよい。１つ以上の異種機能ドメインはリンカー部分を介してエフェクタータンパク質に連結されてもよい。
【００３７】
本発明はまた、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パルビバクラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スフェロヘータ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、パルディバクター属（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、クロストリジアリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ）、レプトトリキア属（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノメチオフィラス属（Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ヘルココッカス属（Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）、レプトスピラ属（Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ）、デスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、デスルホナトロヌム属（Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ）、オピツツス科（Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ）、ツベリバチルス属（Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）を含む属の生物由来のエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）を含むエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）も提供する。
【００３８】
本発明はまた、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．エクイシミリス（Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、Ｓ．サングイニス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）；Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、Ｃ．コリ（Ｃ．ｃｏｌｉ）；Ｎ．サルスギニス（Ｎ．ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、Ｎ．テルガルカス（Ｎ．ｔｅｒｇａｒｃｕｓ）；Ｓ．アウリクラリス（Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ）、Ｓ．カルノスス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）；Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）；リステリア菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｌ．イバノビイ（Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ）；ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、Ｃ．ソルデリイ（Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ）由来の生物のエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）を含むエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）も提供する。
【００３９】
エフェクタータンパク質は、第１のエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）オルソログ由来の第１の断片と第２のエフェクター（例えばＣｐｆ１）タンパク質オルソログ由来の第２の断片とを含むキメラエフェクタータンパク質を含むことができ、ここで第１及び第２のエフェクタータンパク質オルソログは異なる。第１及び第２のエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）オルソログのうちの少なくとも一方は、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パルビバクラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スフェロヘータ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、パルディバクター属（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、クロストリジアリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ）、レプトトリキア属（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノメチオフィラス属（Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ヘルココッカス属（Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）、レプトスピラ属（Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ）、デスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、デスルホナトロヌム属（Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ）、オピツツス科（Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ）、ツベリバチルス属（Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）を含む生物由来のエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）を含むことができ；例えば、第１の断片と第２の断片とを含むキメラエフェクタータンパク質であって、ここで第１及び第２の断片の各々は、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パルビバクラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スフェロヘータ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、パルディバクター属（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、クロストリジアリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ）、レプトトリキア属（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノメチオフィラス属（Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ヘルココッカス属（Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）、レプトスピラ属（Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ）、デスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、デスルホナトロヌム属（Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ）、オピツツス科（Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ）、ツベリバチルス属（Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）を含む生物のＣｐｆ１から選択され、ここで第１及び第２の断片は同じ細菌由来でなく；例えば、第１の断片と第２の断片とを含むキメラエフェクタータンパク質であって、ここで第１及び第２の断片の各々は、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．エクイシミリス（Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、Ｓ．サングイニス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）；Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、Ｃ．コリ（Ｃ．ｃｏｌｉ）；Ｎ．サルスギニス（Ｎ．ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、Ｎ．テルガルカス（Ｎ．ｔｅｒｇａｒｃｕｓ）；Ｓ．アウリクラリス（Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ）、Ｓ．カルノスス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）；Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）；リステリア菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｌ．イバノビイ（Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ）；ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、Ｃ．ソルデリイ（Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ）；野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、プレボテラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７  １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒ���ｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）及びポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）のＣｐｆ１から選択され、ここで第１及び第２の断片は同じ細菌由来でない。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態において、エフェクタータンパク質はＣｐｆ１遺伝子座に由来し（本明細書では、かかるエフェクタータンパク質は「Ｃｐｆ１ｐ」とも称される）、例えばＣｐｆ１タンパク質である（及びかかるエフェクタータンパク質又はＣｐｆ１タンパク質又はＣｐｆ１遺伝子座に由来するタンパク質は「ＣＲＩＳＰＲ酵素」とも称される）。Ｃｐｆ１遺伝子座には、限定はされないが、図６４に列挙される細菌種のＣｐｆ１遺伝子座が含まれる。より好ましい実施形態において、Ｃｐｆ１ｐは、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、プレボテラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７  １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）及びポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）から選択される細菌種に由来する。特定の実施形態において、Ｃｐｆ１ｐは、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６から選択される細菌種に由来する。
【００４１】
本発明の更なる実施形態において、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）又はＰＡＭ様モチーフが目的の標的遺伝子座へのエフェクタータンパク質複合体の結合を導く。本発明の好ましい実施形態において、ＰＡＭは５’ＮＴＴＴであり［式中、ＮはＡ／Ｃ又はＧである］、及びエフェクタータンパク質はＡｓＣｐｆ１ｐである。本発明の別の好ましい実施形態において、ＰＡＭは５’ＴＴＴＶであり［式中、ＶはＡ／Ｃ又はＧである］、及びエフェクタータンパク質はＰａＣｐｆ１ｐである。特定の実施形態において、ＰＡＭは５’ＴＴＮであり［式中、ＮはＡ／Ｃ／Ｇ又はＴである］、エフェクタータンパク質はＦｎＣｐｆ１ｐであり、及びＰＡＭはプロトスペーサーの５’末端の上流に位置する。本発明の特定の実施形態において、ＰＡＭは５’ＣＴＡであり、ここでエフェクタータンパク質はＦｎＣｐｆ１ｐであり、及びＰＡＭはプロトスペーサー又は標的遺伝子座の５’末端の上流に位置する。好ましい実施形態において、本発明は、Ｃｐｆ１ファミリーのＴリッチなＰＡＭによってＡＴリッチゲノムのターゲティング及び編集が可能となるＲＮＡガイド下ゲノム編集ヌクレアーゼのターゲティング範囲の拡張をもたらす。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はエンジニアリングされ、ヌクレアーゼ活性を低下又は消失させる１つ以上の突然変異を含むことができる。
【００４２】
ＡｓＣｐｆ１ｐ  ＲｕｖＣドメインにおけるアミノ酸位置としては、限定はされないが、９０８、９９３、及び１２６３が挙げられる。好ましい実施形態において、ＡｓＣｐｆ１ｐ  ＲｕｖＣドメインの突然変異は、Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、及びＤ１２６３Ａであり、ここでＤ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、及びＤ１２６３Ａ突然変異はＡｓＣｐｆ１エフェクタータンパク質のＤＮＡ切断活性を完全に不活性化する。。
【００４３】
突然変異はまた、隣接残基、例えば、ヌクレアーゼ活性（ａｃｒｉｖｉｔｙ）に関与する上記に指示したものの近傍にあるアミノ酸にも作成することができる。一部の実施形態では、ＲｕｖＣドメインのみが不活性化され、及び他の実施形態では、別の推定ヌクレアーゼドメインが不活性化され、ここでエフェクタータンパク質複合体はニッカーゼとして機能して、一方のＤＮＡ鎖のみを切断する。好ましい実施形態において、他方の推定ヌクレアーゼドメインはＨｉｎｃＩＩ様エンドヌクレアーゼドメインである。一部の実施形態では、２つのＡｓＣｐｆ１変異体（各々異なるニッカーゼ）を用いて特異性を増加させ、２つのニッカーゼ変異体を用いて標的にあるＤＮＡを切断する（ここで両方のニッカーゼが、オフターゲット改変を最小限に抑え又はなくしつつＤＮＡ鎖を切断し、ここでは一方のＤＮＡ鎖のみが切断され、続いて修復される）。好ましい実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、２つのＣｐｆ１エフェクタータンパク質分子を含むホモ二量体として目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列を切断する。好ましい実施形態において、ホモ二量体は、そのそれぞれのＲｕｖＣドメインに異なる突然変異を含む２つのＣｐｆ１エフェクタータンパク質分子を含み得る。
【００４４】
特定の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は操作されて、その活性、特異性及び／又は安定性を改変する１つ以上の突然変異を含み得る。ＡｓＣｐｆ１ｐ酵素におけるアミノ酸位置は、限定されないが：ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として、Ｄ８６１、Ｒ８６２、Ｒ８６３、Ｗ３８２、Ｅ９９３、Ｄ１２６３、Ｄ９０８、Ｗ９５８、Ｋ９６８、Ｒ９５１、Ｒ１２２６、Ｓ１２２８、Ｄ１２３５、Ｋ５４８、Ｍ６０４、Ｋ６０７、Ｔ１６７、Ｎ６３１、Ｎ６３０、Ｋ５４７、Ｋ１６３、Ｑ５７１、Ｋ１０１７、Ｒ９５５、Ｋ１００９、Ｒ９０９、Ｒ９１２、Ｒ１０７２、Ｅ３７２、Ｋ１５、Ｋ８１０、Ｈ７５５、Ｋ５５７、Ｅ８５７、Ｋ９４３、Ｋ１０２２、Ｋ１０２９、Ｋ９４２、Ｋ９４９、Ｒ８４、Ｋ８７、Ｋ２００、Ｈ２０６、Ｒ２１０、Ｒ３０１、Ｒ６９９、Ｋ７０５、Ｋ８８７、Ｒ８９１、Ｋ１０８６、Ｋ１０８９、Ｒ１０９４、Ｒ１１２７、Ｒ１２２０、Ｑ１２２４、Ｎ１７８、Ｎ１９７、Ｎ２０４、Ｎ２５９、Ｎ２７８、Ｎ２８２、Ｎ５１９、Ｎ７４７、Ｎ７５９、Ｎ８７８、Ｎ８８９、及び／又は、１１８９〜１１９７、１２００〜１２０８、３９８〜４００、３８０〜３８３、３６２〜４２０、１１６３〜１１７３、１２３０〜１２３３、１１５２〜１１４８、１０７６〜１２４９の領域にあるいずれか１つのアミノ酸を含む。好ましい実施態様では、これらの１つ以上の突然変異は、限定されないが、Ｒ８６２Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｄ１２６３Ａ、Ｄ９０８Ａ、Ｗ９５８Ａ、Ｒ９５１Ａ、Ｒ１２２６Ａ、Ｓ１２２８Ａ、Ｄ１２３５Ａ、Ｋ５４８Ａ、Ｍ６０４Ａ、Ｋ６０７Ａ、Ｋ６０７Ｒ、Ｔ１６７Ｓ、Ｎ６３１Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６３０Ｋ、Ｎ６３０Ｒ、Ｋ５４７Ｒ、Ｋ１６３Ｒ、Ｑ５７１Ｋ、Ｑ５７１Ｒ、Ｋ１００９Ａ、Ｒ９０９Ａ、Ｒ１０７２Ａ、Ｅ３２７Ａ、Ｋ１５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｈ７５５Ａ、Ｋ５５７Ａ、Ｅ８５７Ａ、Ｋ９４３Ａ、Ｋ１０２２Ａ、Ｋ１０２９Ａ、Ｋ９４２Ａ、Ｋ９４９Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ８７Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｈ２０６Ａ、Ｒ２１０Ａ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ６９９Ａ、Ｋ７０５Ａ、Ｋ８８７Ａ、Ｒ８９１Ａ、Ｋ１０８６Ａ、Ｋ１０８９Ａ、Ｒ１０９４Ａ、Ｒ１１２７Ａ、Ｒ１２２０Ａ及びＱ１２２４Ａから選択される。
【００４５】
他の好ましい実施態様では、前記の１つ以上の突然変異は、Ｒ８６２Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｄ１２６３Ａ、Ｄ９０８Ａ、Ｗ９５８Ａ、Ｒ９５１Ａ、Ｋ５４８Ａ、Ｍ６０４Ａ、Ｋ６０７Ａ、Ｋ６０７Ｒ、Ｎ６３１Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６３０Ｋ、Ｎ６３０Ｒ、Ｋ５４７Ｒ、Ｋ１６３Ｒ、Ｑ５７１Ｋ、Ｑ５７１Ｒ、Ｋ１００９Ａ、Ｒ９０９Ａ、Ｒ１０７２Ａ、Ｅ３２７Ａ、Ｋ１５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｈ７５５Ａ、Ｋ５５７Ａ、Ｅ８５７Ａ、Ｋ９４３Ａ、Ｋ１０２２Ａ、Ｋ１０２９Ａ、Ｋ９４２Ａ、Ｋ９４９Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ８７Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｈ２０６Ａ、Ｒ２１０Ａ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ６９９Ａ、Ｋ７０５Ａ、Ｋ８８７Ａ、Ｒ８９１Ａ、Ｋ１０８６Ａ、Ｋ１０８９Ａ、Ｒ１０９４Ａ、Ｒ１１２７Ａ、Ｒ１２２０Ａ及びＱ１２２４Ａから選択される。
【００４６】
特定の実施態様では、前記の１つ以上のＣｐｆ１突然変異は、ニッカ〜ゼ活性をもたらす。特定の実施態様では、突然変異は、第２のヌクレア〜ゼドメインの位置にあり、より具体的には、突然変異は、ＡｓＣｐｆ１のＲ１２２６に対応する。特定の実施態様では、前記の１つ以上の突然変異は、非標的鎖のみの切断及び標的鎖の非切断をもたらす。特定の実施態様では、突然変異はＲ１２２６Ａである。
【００４７】
本発明は、２つ以上のニッカーゼを使用する方法、詳細にはデュアル又はダブルニッカーゼ手法を企図する。一部の態様及び実施形態において、シングルタイプのＡｓＣｐｆ１ニッカーゼ、例えば、本明細書に記載されるとおりの改変ＡｓＣｐｆ１又は改変ＡｓＣｐｆ１ニッカーゼが送達されてもよい。これにより、標的ＤＮＡに２つのＡｓＣｐｆ１ニッカーゼが結合することになる。加えて、異なるオルソログ、例えば、ＤＮＡの一方の鎖（例えばコード鎖）に対するＡｓＣｐｆ１ニッカーゼと非コード鎖又は反対側のＤＮＡ鎖に対するオルソログとを使用し得ることもまた想定される。異なるＰＡＭを必要とし、また異なるガイド要件も有し得る、従って使用者のより高度な制御が可能となる２つの異なるオルソログを使用することが有利であり得る。特定の実施形態において、ＤＮＡ切断には、各タイプが標的ＤＮＡの異なる配列にガイドされる少なくとも４タイプのニッカーゼが関わることになり、ここでは各ペアが一方のＤＮＡ鎖に第１のニックを導入し、及び第２のペアが第２のＤＮＡ鎖にニックを導入する。かかる方法では、標的ＤＮＡに少なくとも２つの一本鎖切断ペアが導入され、ここで第１及び第２の一本鎖切断ペアが導入されると、第１及び第２の一本鎖切断ペアの間にある標的配列が切り出される。特定の実施形態において、オルソログの一方又は両方は制御可能、即ち誘導性である。
【００４８】
詳細な実施形態において、本発明は、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達することを含む、細胞の目的のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖の逆鎖上にある第１及び第２の標的配列の操作によってオフターゲット改変を最小限に抑えることによって生物又は非ヒト生物を改変する方法を提供し、この組成物は：
−ダイレクトリピート配列に連結した第１のガイド配列であって、前記第１の標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡを含む第１のＶ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド配列；
−ダイレクトリピート配列に連結したガイド配列であって、前記第２の標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列を含む第２のガイドＲＮＡを含む第２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド配列、
及び
−少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み、且つ１つ以上の突然変異を含むＣｐｆ１エフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、を含み、
転写されると、第１及び第２のガイドＲＮＡが第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体のそれぞれ第１及び第２の標的配列への配列特異的結合を導き、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体は、第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列を含む第１のガイドＲＮＡと複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体は、第２の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含む第２のガイドＲＮＡと複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡであり、及び第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍にＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍に他方の鎖の切断を導いて二本鎖切断を誘導し、それによりオフターゲット改変を最小限に抑えることによって生物又は非ヒト生物を改変する。詳細な実施形態において、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍にＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍に他方の鎖の切断を導くと、５’オーバーハングが生じる。詳細な実施形態において、５’オーバーハングは高々２００塩基対である。詳細な実施形態において、５’オーバーハングは高々１００塩基対、又は高々５０塩基対である。詳細な実施形態において、５’オーバーハングは少なくとも２６又は少なくとも３０塩基対である。詳細な実施形態において、５’オーバーハングは１〜１００、１〜３４塩基対又は３４〜５０塩基対である。詳細な実施形態において、５’オーバーハングは少なくとも１、少なくとも１０、又は少なくとも１５塩基対である。詳細な実施形態において、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍にＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍に他方の鎖の切断を導くと、平滑末端切断が生じる。詳細な実施形態において、Ｃｐｆ１突然変異はＲ１２２６Ａである。詳細な実施形態において、本発明は、１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達することを含む、細胞の目的のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖の逆鎖上にある第１及び第２の標的配列の操作によってオフターゲット改変を最小限に抑えることによって生物又は非ヒト生物を改変する方法を提供し、このベクターは、Ｉ．第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列を含む第１のガイドＲＮＡに作動可能に連結された第１の調節エレメント；ＩＩ．第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列を含む第２のガイドＲＮＡに作動可能に連結された第２の調節エレメント；及びＩＩＩ．Ｃｐｆ１酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された第３の調節エレメント、を含み、ここで成分Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されると、第１及び第２のガイド配列が第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体のそれぞれ第１及び第２の標的配列への配列特異的結合を導き、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体は、第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列を含む第１のガイドＲＮＡと複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体は、第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列を含む第２のガイドＲＮＡと複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含み、Ｃｐｆ１酵素をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡであり、及び第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍にＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍に他方の鎖の切断を導いて二本鎖切断を誘導し、それによりオフターゲット改変を最小限に抑えることによって生物又は非ヒト生物を改変する。詳細な実施形態において、本発明は、遺伝子産物をコードする二本鎖ＤＮＡ分子を含有してそれを発現する細胞に、１つ以上の突然変異を有するＣｐｆ１エフェクタータンパク質と、ＤＮＡ分子のそれぞれ第１の鎖及び第２の鎖を標的とする２つのガイドＲＮＡとを含む、それによってガイドＲＮＡが、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的化し、且つＣｐｆ１エフェクタータンパク質が、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖の各々にニックを入れ、それによって遺伝子産物の発現が変化する；及び、ここでＣｐｆ１エフェクタータンパク質と２つのガイドＲＮＡとは天然では一緒に存在しない、エンジニアリングされた、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入することによってオフターゲット改変を最小限に抑えることによって目的のゲノム遺伝子座を改変する方法を提供する。
【００４９】
本発明は更に、１つ以上の突然変異を有するＣｐｆ１タンパク質と、細胞の遺伝子産物をコードする二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれ第１の鎖及び第２の鎖を標的とする２つのガイドＲＮＡとを含む、それによってガイドＲＮＡが、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的化し、且つＣｐｆ１タンパク質が、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖の各々にニックを入れ、それによって遺伝子産物の発現が変化する；及び、ここでＣｐｆ１タンパク質及び２つのガイドＲＮＡは天然では一緒に存在しない、エンジニアリングされた、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を提供する。詳細な実施形態において、Ｃｐｆ１突然変異はＲ１２２６Ａである。本発明は更に、ａ）遺伝子産物をコードする二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれ第１の鎖及び第２の鎖を標的とする２つのＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系ガイドＲＮＡの各々に作動可能に連結された第１の調節エレメント、ｂ）Ｃｐｆ１タンパク質に作動可能に連結された第２の調節エレメント、を含む１つ以上のベクターを含む、ここで成分（ａ）及び（ｂ）は系の同じ又は異なるベクターに位置する、エンジニアリングされた、天然に存在しないベクター系であって、それによってガイドＲＮＡが、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的化し、且つＣｐｆ１タンパク質が、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖の各々にニックを入れ、それによって遺伝子産物の発現が変化する；及び、ここでＣｐｆ１タンパク質及び２つのガイドＲＮＡは天然では一緒に存在しない、ベクター系を提供する。
【００５０】
本発明は更に、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達することを含む、相同組換え修復の促進によって細胞の目的のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖の逆鎖上にある第１及び第２の標的配列を含む生物を改変する方法を提供し、この組成物は、Ｉ．第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系ガイドＲＮＡポリヌクレオチド配列であって、第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列とダイレクトリピート配列とを含む第１のポリヌクレオチド配列；ＩＩ．第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系ＲＮＡポリヌクレオチド配列であって、第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列とダイレクトリピート配列とを含む第２のポリヌクレオチド配列；ＩＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み、且つ１つ以上の突然変異を含むＣｐｆ１酵素をコードするポリヌクレオチド配列；及びＩＶ．合成又はエンジニアリングされた一本鎖オリゴヌクレオチドを含む修復鋳型、を含み、転写されると、第１及び第２のＣｐｆ１ガイドＲＮＡが第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体のそれぞれ第１及び第２の標的配列への配列特異的結合を導き、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体は、第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列を含む第１のＣｐｆ１ガイドＲＮＡと複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体は、第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列を含む第２のＣｐｆ１ガイドＲＮＡと複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含み、Ｃｐｆ１酵素をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡであり、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍にＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍に他方の鎖の切断を導いて二本鎖切断を誘導し、及び相同組換えによって修復鋳型がＤＮＡ二重鎖に導入され、それによって生物が改変される。
【００５１】
本発明は更に、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達することを含む、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介ライゲーションの促進によって細胞の目的のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖の逆鎖上にある第１及び第２の標的配列を含む生物を改変する方法を提供し、この組成物は、
Ｉ．第１のＣｐｆ１ガイドＲＮＡポリヌクレオチド配列であって、第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列とダイレクトリピート配列とを含む第１のポリヌクレオチド配列；ＩＩ．第２のＣｐｆ１ガイドＲＮＡポリヌクレオチド配列であって、第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列とダイレクトリピート配列とを含む第２のポリヌクレオチド配列；ＩＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み、且つ１つ以上の突然変異を含むＣｐｆ１酵素をコードするポリヌクレオチド配列；及びＩＶ．第１のオーバーハングセットを含む修復鋳型、を含み、転写されると、第１及び第２のガイド配列が第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体のそれぞれ第１及び第２の標的配列への配列特異的結合を導き、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体は、第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列を含む第１のガイドＲＮＡと複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体は、第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列を含む第２のガイドＲＮＡと複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含み、Ｃｐｆ１酵素をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡであり、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍にＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍に他方の鎖の切断を導いて、第２のオーバーハングセットを有する二本鎖切断を誘導し、第１のオーバーハングセットは第２のオーバーハングセットと適合性を有してマッチし、及びライゲーションによって修復鋳型がＤＮＡ二重鎖に導入され、それによって生物が改変される。
【００５２】
本発明は更に、
Ｉ．第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列とダイレクトリピート配列とを含む第１のポリヌクレオチド；ＩＩ．第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列とダイレクトリピート配列とを含む第２のポリヌクレオチド；及びＩＩＩ．Ｃｐｆ１酵素をコードする配列と１つ以上の核局在化配列とを含む第３のポリヌクレオチド、を含むキット又は組成物であって、第１の標的配列がＤＮＡ二重鎖の第１の鎖上にあり、且つ第２の標的配列がＤＮＡ二重鎖の逆鎖上にあり、第１及び第２のガイド配列が二重鎖の前記標的配列にハイブリダイズしたとき、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドの５’末端が二重鎖の少なくとも１塩基対だけ互いにオフセットし、及び任意選択で、Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩの各々が同じ又は異なるベクターに提供される、キット又は組成物を提供する。本発明は更に、本明細書に記載される方法における本明細書に記載されるとおりのキットの使用に関する。本発明は更に、薬剤として用いられる、より詳細には、標的配列に対応する遺伝子座の欠陥によって引き起こされる疾患の治療又は予防に用いられる本明細書に記載されるとおりの組成物を提供する。
【００５３】
本明細書に定義するとおりのＣｐｆ１酵素は、活性を失うことなく２つ以上のＲＮＡガイドを利用することができる。これにより、本明細書に定義するとおりの単一の酵素、系又は複合体による複数のＤＮＡ標的、遺伝子又は遺伝子座のターゲティングに、本明細書に定義するとおりのＣｐｆ１酵素、系又は複合体を使用することが可能になる。ガイドＲＮＡはタンデムに配置されてもよく、任意選択でヌクレオチド配列によって分離されてもよいが、好ましくはガイドＲＮＡは直接連結され、即ち２つ以上のガイドＲＮＡが互いに直接連結され、それによって各ガイドＲＮＡにおいてダイレクトリピートがガイド配列の５’側にあり、それによって各ガイド配列が隣のガイドＲＮＡのダイレクトリピートに隣接する。使用されるＣｐｆ１酵素がＡｓＣｐｆ１のＲ１２２６Ａである場合、非標的鎖が切断されることになり、標的鎖の切断はない。この情報はガイドの設計に関連性がある。これらの異なるガイドＲＮＡの位置はタンデムであり、活性に影響を及ぼさない。更なる手引きとして、以下の特定の態様及び実施形態を提供する。
【００５４】
一態様において、本発明は、複数の遺伝子座のターゲティングへの本明細書に定義するとおりのＣｐｆ１酵素、複合体又は系の使用を提供する。一実施形態において、これは、複数の（タンデム又は多重）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を用いることによって実現し得る。本明細書に定義するとおりのＣｐｆ１酵素、系又は複合体は、複数の標的ポリヌクレオチドを改変する有効な手段を提供する。本明細書に定義するとおりのＣｐｆ１酵素、系又は複合体は、多数の細胞型で１つ以上の標的ポリヌクレオチドを改変する（例えば、欠失させる、挿入する、転座させる、逆位にする、活性化させる）ことを含め、幅広い有用性がある。従って本発明の本明細書に定義するとおりのＣｐｆ１酵素、系又は複合体は、単一のＣＲＩＳＰＲ系内における複数の遺伝子座のターゲティングを含め、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、及び予後判定に広範囲の適用性を有する。
【００５５】
本発明は、タンデムに配置されたガイド配列を含むガイドＲＮＡを包含する。本発明は更に、真核細胞における発現にコドン最適化されたＣｐｆ１タンパク質コード配列を包含する。好ましい実施形態において真核細胞は哺乳類細胞、植物細胞又は酵母細胞であり、及びより好ましい実施形態において哺乳類細胞はヒト細胞である。遺伝子産物の発現は低下し得る。Ｃｐｆ１酵素はＣＲＩＳＰＲ系又は複合体の一部を形成してもよく、ＣＲＩＳＰＲ系又は複合体は、各々が細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列に特異的にハイブリダイズ可能な一連の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２５、２５、３０個、又は３０個超のガイド配列を含むタンデムに配置されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を更に含む。一部の実施形態において、機能性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系又は複合体は複数の標的配列に結合する。一部の実施形態において、機能性ＣＲＩＳＰＲ系又は複合体は複数の標的配列を編集することができ、例えば、それらの標的配列はゲノム遺伝子座を含んでもよく、及び一部の実施形態では遺伝子発現の変化があり得る。一部の実施形態において、機能性ＣＲＩＳＰＲ系又は複合体は更なる機能性ドメインを含み得る。一部の実施形態において、本発明は、複数の遺伝子産物の発現を変化させる又は改変する方法を提供する。本方法は、前記標的核酸、例えばＤＮＡ分子を含有する、又は標的核酸、例えばＤＮＡ分子を含有してそれを発現する細胞に導入することを含み得る；例えば、標的核酸は遺伝子産物をコードし得るか、又は遺伝子産物の発現をもたらし得る（例えば調節配列）。
【００５６】
好ましい実施形態において、多重ターゲティングに用いられるＣＲＩＳＰＲ酵素はＡｓＣｐｆ１であり、又は多重ターゲティングに用いられるＣＲＩＳＰＲ系又は複合体はＡｓＣｐｆ１を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＬｂＣｐｆ１であり、又はＣＲＩＳＰＲ系又は複合体はＬｂＣｐｆ１を含む。一部の実施形態において、多重ターゲティングに用いられるＣｐｆ１酵素はＤＮＡの両方の鎖を切断して二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出す。一部の実施形態において、多重ターゲティングに用いられるＣＲＩＳＰＲ酵素はニッカーゼである。一部の実施形態において、多重ターゲティングに用いられるＣｐｆ１酵素はデュアルニッカーゼである。
【００５７】
本発明の特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又は成熟ｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート配列及びガイド配列又はスペーサー配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又は成熟ｃｒＲＮＡは、ガイド配列又はスペーサー配列に連結したダイレクトリピート配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ又は成熟ｃｒＲＮＡは１９ｎｔの部分的ダイレクトリピートと、続く２０〜３０ｎｔ、有利には約２０ｎｔ、２３〜２５ｎｔ又は２４ｎｔのガイド配列又はスペーサー配列を含む。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質はＡｓＣｐｆ１エフェクタータンパク質であり、検出可能なＤＮＡ切断を達成するのに少なくとも１６ｎｔのガイド配列を必要とし、及びインビトロで効率的なＤＮＡ切断を達成するのに最低でも１７ｎｔのガイド配列を必要とする。特定の実施形態において、ダイレクトリピート配列はガイド配列又はスペーサー配列の上流（即ち５’側）に位置する。好ましい実施形態において、ＡｓＣｐｆ１ガイドＲＮＡのシード配列（即ち、標的遺伝子座の配列の認識及び／又はそれとのハイブリダイゼーションに必須の重要な配列）は、ガイド配列又はスペーサー配列の５’末端上の最初の約５ｎｔ以内にある。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態において、成熟ｃｒＲＮＡはステムループ又は最適化ステムループ構造又は最適化二次構造を含む。好ましい実施形態において、成熟ｃｒＲＮＡはダイレクトリピート配列中にステムループ又は最適化ステムループ構造を含み、ここでステムループ又は最適化ステムループ構造は切断活性に重要である。特定の実施形態において、成熟ｃｒＲＮＡは好ましくは単一のステムループを含む。特定の実施形態において、ダイレクトリピート配列は好ましくは単一のステムループを含む。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質複合体の切断活性は、ステムループＲＮＡ二重鎖構造に影響を及ぼす突然変異を導入することによって改変される。好ましい実施形態において、ステムループのＲＮＡ二重鎖を維持する突然変異が導入されてもよく、それによってエフェクタータンパク質複合体の切断活性が維持される。他の好ましい実施形態において、ステムループのＲＮＡ二重鎖構造を破壊する突然変異が導入されてもよく、それによってエフェクタータンパク質複合体の切断活性が完全に無効にされる。
【００５９】
本発明はまた、本明細書に記載される方法又は組成物のいずれかにおける真核生物又は真核細胞での発現にコドン最適化されたエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列も提供する。本発明のある実施形態において、コドン最適化エフェクタータンパク質はＡｓＣｐｆ１ｐであり、真核細胞又は生物、例えば、本明細書の他の部分で挙げるような細胞又は生物、例えば、限定なしに、酵母細胞、又は哺乳類細胞又は生物、例えば、マウス細胞、ラット細胞、及びヒト細胞又は非ヒト真核生物、例えば植物における作動性に関してコドン最適化される。
【００６０】
本発明の特定の実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質をコードする核酸配列に少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）が付加される。好ましい実施形態において、少なくとも１つ以上のＣ末端又はＮ末端ＮＬＳが付加される（従ってＣｐｆ１エフェクタータンパク質をコードする１つ又は複数の核酸分子が１つ又は複数のＮＬＳのコーディングを含むことができ、そのため発現した産物には１つ又は複数のＮＬＳが付加又は接続されていることになる）。好ましい実施形態において、真核細胞、好ましくはヒト細胞における最適な発現及び核ターゲティングのため、Ｃ末端ＮＬＳが付加される。好ましい実施形態において、コドン最適化エフェクタータンパク質はＡｓＣｐｆ１ｐであり、且つガイドＲＮＡのスペーサー長さは１５〜３５ｎｔである。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長さは、少なくとも１６ヌクレオチド、例えば少なくとも１７ヌクレオチドである。特定の実施形態において、スペーサー長さは１５〜１７ｎｔ、１７〜２０ｎｔ、２０〜２４ｎｔ、例えば、２０、２１、２２、２３、又は２４ｎｔ、２３〜２５ｎｔ、例えば、２３、２４、又は２５ｎｔ、２４〜２７ｎｔ、２７〜３０ｎｔ、３０〜３５ｎｔ、又は３５ｎｔ又はそれ以上である。本発明の特定の実施形態において、コドン最適化エフェクタータンパク質はＡｓＣｐｆ１ｐであり、且つガイドＲＮＡのダイレクトリピート長さは少なくとも１６ヌクレオチドである。特定の実施形態において、コドン最適化エフェクタータンパク質はＡｓＣｐｆ１ｐであり、且つガイドＲＮＡのダイレクトリピート長さは１６〜２０ｎｔ、例えば、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドである。特定の好ましい実施形態において、ガイドＲＮＡのダイレクトリピート長さは１９ヌクレオチドである。
【００６１】
本発明はまた、複数の核酸成分を送達する方法も包含し、ここで各核酸成分は異なる目的の標的遺伝子座に特異的であり、それにより複数の目的の標的遺伝子座を改変する。複合体の核酸成分は１つ以上のタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを含み得る。１つ以上のアプタマーはバクテリオファージコートタンパク質との結合能を有し得る。バクテリオファージコートタンパク質は、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、ＭＳ２、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１を含む群から選択され得る。好ましい実施形態において、バクテリオファージコートタンパク質はＭＳ２である。本発明はまた、３０以上、４０以上又は５０以上のヌクレオチド長である複合体の核酸成分も提供する。
【００６２】
本発明はまた、細胞、構成成分及び／又は系に微量のカチオンが存在する本発明の細胞、構成成分及び／又は系も包含する。有利には、カチオンはマグネシウム、例えばＭｇ２＋である。カチオンは微量で存在し得る。好ましい範囲は約１ｍＭ〜約１５ｍＭのカチオンであることができ、これは有利にはＭｇ２＋である。好ましい濃度は、ヒトベースの細胞、構成成分及び／又は系について約１ｍＭ、及び細菌ベースの細胞、構成成分及び／又は系について約１０ｍＭ〜約１５ｍＭであり得る。例えば、Ｇａｓｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ４，２０１２，ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２０８５０７１０９を参照のこと。
【００６３】
従って、本発明の目的は、本出願人らが権利を留保し、且つ任意の以前に公知の製品、プロセス、又は方法のディスクレーマー（ｄｉｓｃｌａｉｍｅｒ）を本明細書によって開示するような以前に公知のいかなる製品、製品の作製プロセス、又は製品の使用方法も本発明の範囲内に包含しないことである。更に、本発明は、本出願人らが権利を留保し、且つ任意の以前に記載された製品、製品の作製プロセス、又は製品の使用方法のディスクレーマー（ｄｉｓｃｌａｉｍｅｒ）を本明細書によって開示するような、米国特許商標庁（ＵＳＰＴＯ）（米国特許法第１１２条第一段落）又は欧州特許庁（ＥＰＯ）（ＥＰＣ第８３条）の明細書の記載及び実施可能要件を満たさないいかなる製品、製品の作製プロセス、又は製品の使用方法も本発明の範囲内に包含しないよう意図されることが注記される。本発明の実施においては、第５３条（ｃ）ＥＰＣ及び規則２８（ｂ）及び（ｃ）ＥＰＣに準拠することが有利であり得る。本明細書におけるいかなる事項も、見込み（ｐｒｏｍｉｓｅ）であると解釈されてはならない。
【００６４】
この開示及び特に特許請求の範囲及び／又は段落において、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「〜を含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法にあるそれに帰される意味を有し得る；例えば、これらは「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「〜を含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「〜を含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得ること；及び「〜から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」及び「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの用語が米国特許法にあるそれらに帰される意味を有することが注記される。
【００６５】
上記及び他の実施形態が開示され、又は以下の詳細な説明から明らかで、それに包含される。
【００６６】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に示される。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、及びその添付の図面を参照することにより、本発明の特徴及び利点の更なる理解が得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１Ａ−Ｃ】標的ＤＮＡ及びｃｒＲＮＡと複合体化したアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）Ｃｐｆ１タンパク質のトポロジーを示すリボンダイヤグラムを提供する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体結晶構造の様々な図から、ヘリックスをチューブとして図示し、βストランドを矢印として図示する。Ｃｐｆ１の幾つかの構造及び／又は機能性ドメインを左側の凡例に表示する。
【図２Ａ】Ｃｐｆ１タンパク質のトポロジーを示すリボンダイヤグラムを示す。
【図２Ｂ】Ｃｐｆ１のＲＮＡ結合活性を低下させるための潜在的な突然変異誘発部位を示す。
【図３】標的ＤＮＡ及びｃｒＲＮＡ（リボン・アンド・スティック）と複合体化したＡｓＣｐｆ１の構造（静電表面）を示す。表面の青色部分は相対的に正の電荷を表し、赤色部分は相対的に負の電荷を表す。
【図４Ａ】標的ＤＮＡ及びｃｒＲＮＡ（リボン・アンド・スティック）と複合体化したＡｓＣｐｆ１（リボン）の構造の部分的拡大図を示す。Ｗ３８２の側鎖は球体表現で図示し、ＤＮＡ：ＲＮＡ複合体の塩基（同様に球体として図示する）とファンデルワールス相互作用をなしている。
【図４Ｂ】複合体、ｃｒＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｎｃＤＮＡのゲル電気泳動を示す。
【図５】標的ＤＮＡ及びｃｒＲＮＡ（リボン・アンド・スティック）と複合体化したＡｓＣｐｆ１（リボン）の構造の部分的拡大図を示す。残基Ｄ１２６３、Ｅ９９３及びＤ９０８（Ａ）の側鎖はボール・アンド・スティック表現で示す。
【図６Ａ】標的ＤＮＡ及びｃｒＲＮＡ（リボン・アンド・スティック）と複合体化したＡｓＣｐｆ１（リボン）の構造を示す。
【図６Ｂ】この構造の部分的拡大図を示し、ここでＷ９５８の側鎖は球体として表現して、ＡｓＣｐｆ１のＢＨ様ヘリックスを安定化させる他の残基の近傍側鎖との疎水性相互作用を示す。
【図７】標的ＤＮＡ及びｃｒＲＮＡ（リボン・アンド・スティック）と複合体化したＡｓＣｐｆ１（リボン）の構造の拡大図を示し、ここでＫ９６８及びＲ９５１の側鎖はボール・アンド・スティックとして図示している。
【図８】標的ＤＮＡ及びｃｒＲＮＡ（リボン・アンド・スティック）と複合体化したＡｓＣｐｆ１（リボン）の構造の部分的拡大図を示し、ここでＲ１２２６、Ｄ１２３５及びＳ１２２８の側鎖はボール・アンド・スティックとして図示している。
【図９Ａ】標的ＤＮＡ及びｃｒＲＮＡ（リボン・アンド・スティック）と複合体化したＡｓＣｐｆ１（リボン）の構造の部分的拡大図を示し、ここでＲ１２２６、Ｄ１２３５及びＳ１２２８の側鎖はボール・アンド・スティックとして図示している。
【図９Ｂ】これらの残基の保存を示す種々のＣｐｆ１オルソログの配列アラインメントを示す。
【図１０】ＰＡＭ二重鎖近傍の標的ＤＮＡ及びｃｒＲＮＡ（リボン・アンド・スティック）と複合体化したＡｓＣｐｆ１の構造（静電表面）の部分的拡大図を示す。表面の青色部分は相対的に正の電荷を表し、赤色部分は相対的に負の電荷を表す。
【図１１】標的ＤＮＡ及びｃｒＲＮＡ（リボン・アンド・スティック）と複合体化したＡｓＣｐｆ１（リボン）の構造の部分的拡大図を示し、ここでＰＡＭ部位のＴ２、Ｔ３及びＴ４残基には表示を付している。
【図１２Ａ】ＰＡＭ部位の２番目のＴ：Ａ  ＤＮＡ塩基対（即ちＴ２及びＡ−２）と相互作用するＡｓＣｐｆ１構造中のＴ１６７、Ｋ５４８、Ｍ６０４及びＫ６０７の側鎖の球体表現を示す。
【図１２Ｂ】同じＡｓＣｐｆ１残基とＰＡＭ部位の３番目のＴ：Ａ  ＤＮＡ塩基対（即ちＴ３及びＡ−３）との相互作用を示す。Ｃｐｆ１とＰＡＭ部位の４番目のＴ：Ａとの間に直接的な相互作用はない。
【図１３】本明細書における結晶構造からのＤＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体をリボン・アンド・スティック表現で示し、及びＫ１０１７、Ｋ９６８、Ｒ９５１及びＲ９５５の側鎖をボール・アンド・スティック表現で示す。
【図１４】本明細書における結晶構造からのＤＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体をリボン・アンド・スティック表現で示し、及びＫ１００９、Ｋ９０９、Ｒ９１２、Ｒ１０７２及びＲ１２２６の側鎖をボール・アンド・スティック表現で示す。ＡｓＣｐｆ１のリボン表現は透明な白色で図示する。
【図１５Ａ−Ｄ】ＡｓＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ−標的ＤＮＡ複合体の全体構造の図を提供する。図１５ＡはＡｓＣｐｆ１のドメイン構成を示す。ＢＨ、ブリッジヘリックス。図１５ＢはｃｒＲＮＡ及び標的ＤＮＡの概略図を提供する。ＴＳ、標的ＤＮＡ鎖；ＮＴＳ、非標的ＤＮＡ鎖。図１５Ｃ及び図１５Ｄは、それぞれ、ＡｓＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ−ＤＮＡ複合体の略画及び表面表現を提供する。分子のグラフィック画像はＣｕｅＭｏｌ（ｗｗｗ．ｃｕｅｍｏｌ．ｏｒｇ）を用いて作成した。図２２〜図２４及び表２も参照のこと。
【図１６Ａ−Ｉ】ｃｒＲＮＡ及び標的ＤＮＡの構造的特徴を示す。図１６Ａは、ＡｓＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡ及び標的ＤＮＡの概略図を提供する。ｃｒＲＮＡのディスオーダー領域を破線で囲む。図１６Ｂは、ＡｓＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡ及び標的ＤＮＡの構造を示す。図１６Ｃは、ｃｒＲＮＡ  ５’−ハンドルの構造を示す立体図である。図１６Ｄ〜図１６Ｆは、Ｕ（−１）・Ｕ（−１６）塩基対（Ｄ）、逆フーグスティーン型Ｕ（−１０）・Ａ（−１８）塩基対（Ｅ）、及びＵ（−１３）−Ｕ（−１７）−Ｕ（−１２）塩基トリプル（Ｆ）の拡大図を提供する。水素結合は破線として示す。図１６Ｇは、ＷＥＤドメインとＲｕｖＣドメインとの間の溝へのｃｒＲＮＡ  ５’−ハンドルの結合を表す。図１６Ｈ及び図１６Ｉは、ｃｒＲＮＡ  ５’−ハンドルの３’末端（Ｈ）及び５’末端（Ｉ）の認識を表す。水素結合は破線として示す。
【図１７】Ｃｐｆ１による核酸認識の模式図を示す。ｃｒＲＮＡ及び標的ＤＮＡとそれらの主鎖を介して相互作用するＡｓＣｐｆ１残基は括弧内に示す。明確にするため、水の媒介による水素結合相互作用は省略している。図２５も参照のこと。
【図１８Ａ−Ｅ】ｃｒＲＮＡ−標的ＤＮＡヘテロ二重鎖の認識を示す。図１８Ａは、ＲＥＣ１及びＲＥＣ２ドメインによるｃｒＲＮＡ−標的ＤＮＡヘテロ二重鎖の認識を示す。図１８Ｂは、ブリッジヘリックス及びＲｕｖＣドメインによる標的ＤＮＡ鎖の認識を示す。水素結合は破線として示す。図１８Ｃは、ｃｒＲＮＡシード領域及び＋１リン酸基（＋１Ｐ）の認識を示す立体図を提供する。水素結合は破線として示す。図１８Ｄは、Ｃｐｆ１核酸結合残基の突然変異解析を提供する。２つのＤＮＭＴ１標的にインデルを誘導する能力に及ぼす突然変異の効果を調べた（ｎ＝３、エラーバーは平均値±ＳＥＭを示す）。図１８Ｅは、ヘテロ二重鎖の２０番目の塩基対とＲＥＣ２ドメインのＴｒｐ３８２との間のスタッキング相互作用を示す。
【図１９Ａ−Ｅ】５’−ＴＴＴＮ−３’ＰＡＭの認識を示す。図１９Ａは、ＷＥＤ、ＲＥＣ１及びＰＩドメイン間の溝へのＰＡＭ二重鎖の結合を示す。図１９Ｂは、５’−ＴＴＴＮ−３’ＰＡＭの認識を示す立体図である。水素結合は破線として示す。図１９Ｃ〜図１９Ｅは、ｄＡ（−２）：ｄＴ（−２＊）（Ｃ）、ｄＡ（−３）：ｄＴ（−３＊）（Ｄ）、及びｄＡ（−４）：ｄＴ（−４＊）（Ｅ）塩基対の認識を示す。図１９Ｆは、ＰＡＭ相互作用残基の突然変異解析を提供する。２つのＤＮＭＴ１標的にインデルを誘導する能力に及ぼす突然変異の効果を調べた（ｎ＝３、エラーバーは平均値±ＳＥＭを示す）。図２６もまた参照のこと。
【図２０Ａ−Ｆ】ＲｕｖＣ及びＮｕｃヌクレアーゼドメインの特徴を表す。図２０Ａは、ＲｕｖＣ及びＮｕｃドメインの全体構造を示す。ＲｕｖＣドメイン及びＮｕｃドメインのＲＮアーゼＨフォールドをとるαヘリックス（赤色）及びβストランド（青色）を付番する。ディスオーダー領域は破線として示す。図２０Ｂは、ＲｕｖＣドメインの活性部位を表す。図２０Ｃは、ＲｕｖＣ及びＮｕｃドメインにおける重要な残基の突然変異解析を提供する。２つのＤＮＭＴ１標的にインデルを誘導する能力に及ぼす突然変異の効果を調べた（ｎ＝３、エラーバーは平均値±ＳＥＭを示す）。図２０Ｄは、標的ＤＮＡの潜在的切断部位に対するヌクレアーゼドメインの空間的配置を表す。ＲｕｖＣドメインの触媒中心は赤色の丸で囲んで示す。明確にするため、ＲＥＣ１及びＰＩドメインは省略している。構造の上にｃｒＲＮＡ及び標的ＤＮＡの模式図を示す。結晶構造に含まれないＤＮＡ鎖は薄い灰色で表現する。図２０Ｅは、Ｔｒｐ９５８とＲＥＣ２ドメインの疎水性ポケットとの間の相互作用を表す。図２０Ｆは、ＡｓＣｐｆ１  Ｒ１２２６Ａ突然変異体が、非標的ＤＮＡ鎖のみを切断するニッカーゼであることを示す。ｃｒＲＮＡ及び標的配列（ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｅ）を含むｄｓＤＮＡ（両方の鎖の５’末端（ＤＮＡ１）又は非標的鎖（ＤＮＡ２）若しくは標的鎖（ＤＮＡ３）のいずれか一方の５’末端で標識した）と共に、野生型又はＲ１２２６突然変異体のＡｓＣｐｆ１をインキュベートした。切断産物は１０％ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲル電気泳動によって分析した。ＳｐＣａｓ９  Ｄ１０Ａ突然変異体は標的鎖を切断するニッカーゼであり、対照として使用した。図２７もまた参照のこと。
【図２１Ａ−Ｆ】Ｃａｓ９とＣｐｆ１との比較を提供する。図２１Ａ及び図２１Ｂは、Ｃａｓ９（ＰＤＢ  ＩＤ  ４ＵＮ３）（Ａ）とＡｓＣｐｆ１（Ｂ）とのドメイン構成及び全体構造の比較を提供する。ＲｕｖＣドメインの触媒中心は赤色の丸で囲んで示す。図２１Ｃ及び図２１Ｄは、Ｃａｓ９（Ｃ）及びＣｐｆ１（Ｄ）によるＲＮＡガイド下ＤＮＡ切断モデルを提供する。図２１Ｅ及び図２１Ｆは、Ｃａｓ９（ＰＤＢ  ＩＤ  ４ＵＮ３）（Ｅ）とＡｓＣｐｆ１（Ｆ）とのＲｕｖＣドメインの比較を提供する。保存されたＲＮアーゼＨフォールドの二次構造を付番する。図２８もまた参照のこと。
【図２２】青色のメッシュとして示される結合した核酸の２ｍＦＯ−ＤＦＣ電子密度マップ（２．０σでカウント）を提供する。＋１Ｐ、＋１リン酸。
【図２３Ａ−Ｂ】ドメイン（図２３Ａ）及び静電ポテンシャル（図２３Ｂ）に基づき陰影を付けたＡｓＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ−標的ＤＮＡ複合体の分子表面表現を提供する。明確にするため、上及び中央のパネルにおいてそれぞれＲＥＣ１及びＲＥＣ２ドメインは省略している。ＢＨ、ブリッジヘリックス。
【図２４Ａ−Ｃ】ＡｓＣｐｆ１  ＲＥＣ１、ＲＥＣ２、ＷＥＤ及びＰＩドメインを図解する。図２４Ａは、ＲＥＣ１、ＲＥＣ２、ＷＥＤ及びＰＩのドメイン構成を示す。ＷＥＤドメインのあまり保存されていない領域に淡い青色を塗る。図２４ＢはＲＥＣ１及びＲＥＣ２ドメインの構造を示し、図２４ＣはＷＥＤ及びＰＩドメインの構造を示す。ディスオーダー領域は破線として示す。
【図２５Ａ−Ｂ】Ｃｐｆ１タンパク質の多重配列アラインメントを提供し、ここで配列の上に二次構造を表示し、及び重要な残基を三角形で示す。アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６；Ｌｂ、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６；Ｆｎ、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２。本図はＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ）及びＥＳＰｒｉｐｔ（ｅｓｐｒｉｐｔ．ｉｂｃｐ．ｆｒ）を使用して作成した。
【図２６Ａ−Ｃ】ＰＡＭ二重鎖の構造的特徴を示す。図２６Ａは、ＰＡＭ二重鎖をＢ型ＤＮＡ二重鎖に重ね合わせて表す立体図である。５’−ＴＴＴＮ−３’ＰＡＭを淡い紫色で強調表示し、Ｂ型ＤＮＡ二重鎖に黄色を付ける。図２６Ｂは、ｄＡ（−２）：ｄＴ（−２＊）塩基対の特異的認識を表す。モデル化したｄＧ（−２）：ｄＣ（−２＊）塩基対はＰＩドメインのＬｙｓ６０７と立体衝突を形成し得る。図２６Ｃは、ｄＡ（−３）：ｄＴ（−３＊）塩基対の特異的認識を表す。モデル化したｄＧ（−３）：ｄＣ（−３＊）塩基対はＰＩドメインのＬｙｓ６０７と立体衝突を形成し得る。図２６Ｄは、ｄＡ（−４）：ｄＴ（−４＊）塩基対の特異的認識を表す。モデル化した塩基対、ｄＴ（−４）：ｄＡ（−４＊）、ｄＧ（−４）：ｄＣ（−４＊）及びｄＣ（−４）：ｄＧ（−４＊）は標的ＤＮＡ鎖のｄＡ（−３）と立体衝突を形成し得る。図２６Ｂ及び図２６Ｃでは、潜在的に有利な及び不利な相互作用をそれぞれ緑色及び赤色の破線として表す。
【図２７】ＲｕｖＣ触媒残基の突然変異解析を提供する。野生型又は突然変異型ＡｓＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体を二本鎖ＤＮＡ標的とインキュベートし、非変性ＴＢＥ及び変性ＴＢＥ−尿素ポリアクリルアミドゲル上で反応産物を分離させた。ゲルはＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。ＲｕｖＣ触媒残基の突然変異（Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ及びＤ１２６３Ａ）により、標的ＤＮＡ鎖及び非標的ＤＮＡ鎖の両方の切断が消失した。
【図２８Ａ−Ｂ】Ｃａｓ９（図２８Ａ）及びＣｐｆ１（図２８Ｂ）のＲＮＡガイド下ＤＮＡターゲティング機構を表す。重要なタンパク質残基、並びにシード領域及びＰＡＭ二重鎖のヌクレオチドをスティックモデルとして示す。水素結合は破線として示す。ＰＬＬ、リン酸ロックループ。
【図２９Ａ−Ｂ】ＡｓＣｐｆ１突然変異酵素のヌクレアーゼ活性を示す。標的ＤＮＡ：ＦｎＣｐｆ１スペーサーを有するｐＵＣ１９断片を含むＰＣＲ産物；ｃｒＲＮＡはＡｓＣｐｆ１及びＣａｓ９  ＤＲであった。切断産物は変性（図２９Ａ）及び非変性（図２９Ｂ）条件下で分離した。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本明細書の図は例示目的に過ぎず、必ずしも一定の尺度で描かれているとは限らない。
【００６９】
本願は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質の結晶構造を記載する。Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、これまでに記載されているＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系と機能上異なり、、従ってこれらの新規エンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｌｃｅａｓｅ）に関連するエレメントの用語は、本明細書ではそれに伴い修正される。本明細書に記載されるＣｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、追加的なｔｒａｃｒＲＮＡを必要とすることなく成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる。本明細書に記載されるｃｒＲＮＡはスペーサー配列（又はガイド配列）とダイレクトリピート配列とを含み、標的ＤＮＡの効率的な切断には、Ｃｐｆ１ｐ−ｃｒＲＮＡ複合それだけで十分である。本明細書に記載されるシード配列、例えばＡｓＣｐｆ１ガイドＲＮＡのシード配列は、スペーサー配列（又はガイド配列）の５’末端上の最初の約５ｎｔ以内にあり、シード配列内の突然変異はＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体の切断活性に悪影響を及ぼす。
【００７０】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈ではプロトスペーサーとも称される）の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈では、「標的配列」は、ガイド配列がそれを標的化する、例えばそれと相補性を有するように設計される配列を指し、ここでは標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列との相補性が切断活性（ａｃｉｔｉｖｉｔｙ）に重要となるガイド配列のセクションは、本明細書ではシード配列と称される。標的配列はＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含むことができ、目的の標的遺伝子座内に含まれる。一部の実施形態において、標的配列は細胞の核又は細胞質に位置する。
【００７１】
核酸がＤＮＡ又はＲＮＡであり、及び一部の態様においてＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド（ｈｙｂｉｒｄ）又はその誘導体もまた指し得る用語「核酸ターゲティング系」は、まとめて、ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するか又はその活性を誘導する転写物及び他のエレメントを指し、この遺伝子は、ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質をコードする配列及びＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列と（全ての系ではないが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系において）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列とを含むＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ、又はＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含み得る。本明細書に記載されるＣｐｆ１  ＤＮＡターゲティングＲＮＡガイド下エンドヌクレアーゼ系では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は不要である。一般に、ＲＮＡターゲティング系は、標的ＲＮＡ配列の部位におけるＲＮＡターゲティング複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティング複合体の形成の文脈では、「標的配列」は、ＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡがそれと相補性を有するように設計されるＤＮＡ又はＲＮＡ配列を指し、ここで標的配列とＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションが、ＲＮＡターゲティング複合体の形成を促進する。一部の実施形態において、標的配列は細胞の核又は細胞質に位置する。一部の実施形態において、標的配列は真核細胞の細胞小器官内、例えばミトコンドリア内又は葉緑体内にあり得る。標的配列を含む標的遺伝子座への組換えに用いられ得る配列又は鋳型は、「編集鋳型」又は「編集ＲＮＡ」又は「編集配列」と称される。本発明の態様において、外因性鋳型ＲＮＡは編集鋳型と称され得る。本発明のある態様において、組換えは相同組換えである。
【００７２】
本明細書に記載される核酸ターゲティング系、ベクター系、ベクター及び組成物は、様々な核酸ターゲティング適用、タンパク質などの遺伝子産物の合成の変化又は改変、核酸切断、核酸編集、核酸のスプライシング；標的核酸の輸送、標的核酸の追跡、標的核酸の単離、標的核酸の可視化等において用いられ得る。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、Ｃａｓタンパク質又はＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の新規分類に提示されるタンパク質のいずれかを指す。有利な実施形態において、本発明は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座、例えばサブタイプＶ−Ａと称されるＣｐｆ１コード遺伝子座に同定されるエフェクタータンパク質を包含する。現在、サブタイプＶ−Ａ遺伝子座は、ｃａｓ１、ｃａｓ２、ｃｐｆ１と称される異なる遺伝子及びＣＲＩＳＰＲアレイを包含する。Ｃｐｆ１（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃｐｆ１、サブタイプＰＲＥＦＲＡＮ）は、Ｃａｓ９の特徴的アルギニンリッチクラスターに対応するものと共にＣａｓ９の対応するドメインと相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む大型タンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかしながら、Ｃｐｆ１は、全てのＣａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠いており、及びＨＮＨドメインを含む長いインサートを含有するＣａｓ９と対照的に、ＲｕｖＣ様ドメインはＣｐｆ１配列において連続的である。従って、詳細な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ酵素はＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのみを含む。
【００７４】
Ｃｐｆ１遺伝子は、幾つかの多様な細菌ゲノムに見られ、典型的にはｃａｓ１、ｃａｓ２、及びｃａｓ４遺伝子及びＣＲＩＳＰＲカセット（例えば、フランシセラ属参照ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｃｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｆｘ１のＦＮＦＸ１＿１４３１−ＦＮＦＸ１＿１４２８）で同じ遺伝子座にある。従って、この推定新規ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のレイアウトはＩＩ−Ｂ型と類似しているものと思われる。更に、Ｃａｓ９と同様に、Ｃｐｆ１タンパク質は、トランスポゾンＯＲＦ−Ｂと相同の容易に同定可能なＣ末端領域を含有し、活性ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼ、アルギニンリッチ領域、及びＺｎフィンガー（Ｃａｓ９にはない）を含む。しかしながら、Ｃａｓ９と異なり、Ｃｐｆ１はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓコンテクストのない幾つかのゲノムにも存在し、ＯＲＦ−Ｂとのその比較的高い類似性から、これがトランスポゾン構成成分である可能性が示唆される。これが真正のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であったならば、Ｃｐｆ１はＣａｓ９の機能性の類似体であり、新規ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタイプ、即ちＶ型であろうことが示唆された（Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｍａｋａｒｏｖａ  ＫＳ，Ｋｏｏｎｉｎ  ＥＶ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１５；１３１１：４７−７５を参照）。
【００７５】
本発明の態様はまた、原核細胞又は真核細胞におけるインビトロ、インビボ又はエキソビボでのゲノムエンジニアリングにおける、例えば１つ以上の遺伝子又は１つ以上の遺伝子産物の発現を変化させる又は操作するための、本明細書に記載される組成物及び系の方法及び使用も包含する。
【００７６】
本発明の実施形態において、用語の成熟ｃｒＲＮＡ及びガイドＲＮＡ及びシングルガイドＲＮＡは、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）などの前述の引用文献にあるとおり同義的に使用される。一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか、又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス−ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン−ブンシュアルゴリズム、バローズ・ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えば、バローズ・ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長以上であるか、又はそれより長い。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長未満か、又はそれより短い。好ましくはガイド配列は１０〜３０ヌクレオチド長である。ガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成成分が、試験しようとするガイド配列を含め、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションによるなどして対応する標的配列を有する宿主細胞に提供されてもよく、続いて本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的配列内における優先的な切断を評価し得る。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験しようとするガイド配列を含めたＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分、及び供試ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、それらの供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間の標的配列における結合又は切断速度を比較することにより、試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者には想起されるであろう。ガイド配列は、任意の標的配列を標的化するように選択することができる。一部の実施形態において、標的配列は細胞のゲノム内の配列である。例示的標的配列には、標的ゲノムにおいてユニークなものが含まれる。
【００７７】
一般に、及び本明細書全体を通じて、用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターとしては、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端のない（例えば環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野において公知の他の種類のポリヌクレオチドが挙げられる。ある種のベクターは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術によるなどして追加のＤＮＡセグメントを挿入することのできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでベクターには、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）へのパッケージングのためのウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列が存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスによって担持されるポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞での自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。真核細胞における発現用の、及びそこでの発現をもたらすベクターは、本明細書では、「真核細胞発現ベクター」と称することができる。組換えＤＮＡ技法において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。
【００７８】
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含むことができ、これはつまり、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメント（これは、発現に用いられる宿主細胞に基づき選択されてもよい）を含むことを意味する。組換え発現ベクターの範囲内において、「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の（例えば、インビトロ転写／翻訳系における、又はベクターが宿主細胞に導入される場合に宿主細胞における）発現が可能となる形で目的のヌクレオチド配列が１つ又は複数の調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。
【００７９】
用語「調節エレメント」には、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列などの転写終結シグナル）が含まれることが意図される。かかる調節エレメントについては、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節エレメントには、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、主として、所望の目的組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、又は特定の細胞型（例えば、リンパ球）において発現を導き得る。調節エレメントはまた、細胞周期依存的又は発生段階依存的様式など、時間依存的様式で発現を導いてもよく、この発現もまた組織又は細胞型特異的であることも又はそうでないこともある。一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれより多いｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ  ＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれより多いｐｏｌ  ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ  Ｉプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれより多いｐｏｌ  Ｉプロモーター）、又はこれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、Ｕ６及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーと共に）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーと共に）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが挙げられる。また、用語「調節エレメント」には、ＷＰＲＥなどのエンハンサーエレメント；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６−４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ−グロビンのエクソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７−３１，１９８１）も包含される。当業者によれば、発現ベクターの設計が、形質転換する宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの要因に依存し得ることが理解されるであろう。ベクターは宿主細胞に導入することができ、それにより、本明細書に記載されるとおりの核酸によってコードされる転写物、タンパク質、又はペプチドが、融合タンパク質又はペプチド（例えば、クラス��ー化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの突然変異型、それらの融合タンパク質等）を含め、産生され得る。
【００８０】
有利なベクターとしては、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスが挙げられ、かかるベクターのタイプもまた、特定のタイプの細胞を標的化するように選択することができる。
【００８１】
本明細書で使用されるとき、Ｖ型又はＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質の「ｃｒＲＮＡ」又は「ガイドＲＮＡ」又は「シングルガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」又は「１つ以上の核酸成分」という用語には、標的核酸配列とハイブリダイズして標的核酸配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列が含まれる。一部の実施形態において、相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上であるか、又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス−ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン−ブンシュアルゴリズム、バローズ−ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えば、バローズ・ホイーラーアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。ガイド配列（核酸ターゲティングガイドＲＮＡ内にある）が標的核酸配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、核酸ターゲティング複合体を形成するのに十分な核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ系の構成成分が、試験しようとするガイド配列を含め、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞へと、核酸ターゲティング複合体の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションによるなどして提供されてもよく、続いて本明細書に記載されるとおりのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどにより、標的核酸配列内における優先的なターゲティング（例えば切断）を評価し得る。同様に、標的核酸配列の切断は、標的核酸配列、試験しようとするガイド配列を含めた核酸ターゲティング複合体の構成成分、及び供試ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、それらの供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間で標的配列における結合又は切断速度を比較することにより、試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者には想起されるであろう。ガイド配列、ひいては核酸ターゲティングガイドＲＮＡは、任意の標的核酸配列を標的化するように選択し得る。標的配列はＤＮＡであってもよい。標的配列は任意のＲＮＡ配列であってもよい。一部の実施形態において、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａａｌ  ＲＮＡ）（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、非コード���ＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及び小さい細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）からなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。一部の好ましい実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。一部の好ましい実施形態において、標的配列は、ｎｃＲＮＡ、及びｌｎｃＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。一部のより好ましい実施形態において、標的配列はｍＲＮＡ分子又はプレｍＲＮＡ分子内の配列であってもよい。
【００８２】
一部の実施形態において、核酸ターゲティングガイドＲＮＡは、ＲＮＡターゲティングガイドＲＮＡ内の二次構造度が低下するように選択される。一部の実施形態において、核酸ターゲティングガイドＲＮＡのヌクレオチドのうち最適に折り畳まれたとき自己相補性塩基対合に関与するのは約７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％以下であるか、又はそれより少ない。最適な折り畳みは、任意の好適なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定し得る。一部のプログラムは最小ギブズ自由エネルギーの計算に基づく。かかる一つのアルゴリズムの例は、Ｚｕｋｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３−１４８）により記載されるとおりのｍＦｏｌｄである。別の例示的な折り畳みアルゴリズムは、ウィーン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｅｎｎａ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにおいて開発された、セントロイド構造予測アルゴリズムを用いるオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ  １０６（１）：２３−２４；及びＰＡ  Ｃａｒｒ  ａｎｄ  ＧＭ  Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（１２）：１１５１−６２を参照）。
【００８３】
「ｔｒａｃｒＲＮＡ」配列又は類似の用語は、ｃｒＲＮＡ配列とハイブリダイズするのに十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含む。本明細書において上記に指摘するとおり、本発明の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡはＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体の切断活性に必要ない。
【００８４】
毒性及びオフターゲット効果を最小限に抑えるため、送達される核酸ターゲティングガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要となり得る。核酸ターゲティングガイドＲＮＡの最適濃度は、細胞モデル又は非ヒト真核生物動物モデルにおける種々の濃度の試験、及びディープシーケンシングを用いた潜在的なオフターゲットゲノム遺伝子座における改変の程度の分析によって決定することができる。最も高いレベルのオンターゲット改変をもたらす一方でオフターゲット改変レベルを最小限に抑える濃度が、インビボ送達に選択されるべきである。核酸ターゲティング系は、有利にはＶ型／ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。一部の実施形態において、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントが、内因性ＲＮＡターゲティング系を含む特定の生物に由来する。本発明の好ましい実施形態において、ＲＮＡターゲティング系はＶ型／ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系である。ホモログ及びオルソログは相同性モデリングによって同定し得る（例えば、Ｇｒｅｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ．２２８（１９８５）１０５５、及びＢｌｕｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ｖｏｌ  １７２（１９８８），５１３）又は「構造的ＢＬＡＳＴ（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＢＬＡＳＴ）」（Ｄｅｙ  Ｆ，Ｃｌｉｆｆ  Ｚｈａｎｇ  Ｑ，Ｐｅｔｒｅｙ  Ｄ，Ｈｏｎｉｇ  Ｂ．「“構造的ＢＬＡＳＴ”に向けて：構造的関係を用いて機能を推測する（Ｔｏｗａｒｄ  ａ“ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＢＬＡＳＴ”：ｕｓｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｔｏ  ｉｎｆｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２０１３  Ａｐｒ；２２（４）：３５９−６６．ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏ．２２２５を参照のこと）。また、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座の分野における適用に関して、Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）も参照のこと。しかしホモログタンパク質は構造上関係がなくてもよく、又は構造上部分的にのみ関係している。詳細な実施形態では、本明細書において言及されるとおりのＣｐｆ１のホモログ又はオルソログは、Ｃｐｆ１と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列相同性又は同一性を有する。更なる実施形態において、本明細書において言及されるとおりのＣｐｆ１のホモログ又はオルソログは、野生型Ｃｐｆ１と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列同一性を有する。Ｃｐｆ１が１つ以上の突然変異を有する場合（突然変異型）、本明細書において言及されるとおりの前記Ｃｐｆ１のホモログ又はオルソログは、突然変異型Ｃｐｆ１と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列同一性を有する。
【００８５】
詳細な実施形態では、本明細書において言及されるとおりのＣｐｆ１のようなＶ型／ＶＩ型タンパク質のホモログ又はオルソログは、ＡｓＣｐｆ１と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列相同性又は同一性を有する。更なる実施形態において、本明細書において言及されるとおりのＡｓＣｐｆ１のようなＶ型／ＶＩ型タンパク質のホモログ又はオルソログは、ＡｓＣｐｆ１と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％などの配列同一性を有する。
【００８６】
ある実施形態において、Ｖ型／ＶＩ型ＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質は、限定はされないが、コリネバクター（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロヘータ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パルビバクラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）及びカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）を含む属の生物のＣｐｆ１オルソログであってもよい。かかる属の生物種は、他に本明細書で考察するとおりであり得る。
【００８７】
本明細書に記載される機能のいずれも、複数のオルソログ由来の断片を含むキメラ酵素を含め、他のオルソログ由来のＣＲＩＳＰＲ酵素にエンジニアリングし得ることが理解されるであろう。かかるオルソログの例は、本明細書の他の部分に記載される。従って、キメラ酵素は、限定はされないが、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロヘータ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パルビバクラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）及びカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）を含む属の生物のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログの断片を含み得る。キメラ酵素は第１の断片と第２の断片とを含むことができ、これらの断片（ｆｒａｇｒｍｅｎｔ）は、本明細書に挙げられる属又は本明細書に挙げられる種の生物のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログのものであり得る；有利には断片は、異なる種のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログ由来である。
【００８８】
実施形態において、本明細書において言及されるとおりのＣｐｆ１タンパク質にはまた、ＡｓＣｐｆ１又はそのホモログ若しくはオルソログの機能変異体も包含される。タンパク質の「機能変異体」は、本明細書で使用されるとき、当該のタンパク質の活性を少なくとも部分的に保持しているかかるタンパク質の変異体を指す。機能変異体には、多型等を含め、突然変異体（これは挿入、欠失、又は置換突然変異体であり得る）が含まれ得る。また、機能変異体の範囲内には、かかるタンパク質と、別の、通常は無関係の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドとの融合産物も含まれる。機能変異体は天然に存在するものであってもよく、又は人工のものであってもよい。有利な実施形態は、エンジニアリングされた又は天然に存在しないＡｓＣｐｆ１又はそのオルソログ若しくはホモログを含み得る。
【００８９】
ある実施形態において、ＡＳＣｐｆ１又はそのオルソログ若しくはホモログをコードする１つ又は複数の核酸分子は、真核細胞での発現にコドン最適化され得る。真核生物は、本明細書に考察されるとおりのものであってもよい。１つ又は複数の核酸分子は、エンジニアリングされたもの又は天然に存在しないものであってもよい。
【００９０】
ある実施形態において、ＡｓＣｐｆ１又はそのオルソログ若しくはホモログは１つ以上の突然変異を含み得る（ひいてはそれをコードする１つ又は複数の核酸分子が１つ又は複数の突然変異を有し得る）。突然変異は人工的に導入された突然変異であってもよく、限定はされないが、触媒ドメインにおける１つ以上の突然変異が含まれ得る。Ｃａｓ９酵素に関連する触媒ドメインの例としては、限定はされないが、ＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩ、ＲｕｖＣ  ＩＩＩ及びＨＮＨドメインを挙げることができる。
【００９１】
ある実施形態において、Ｃｐｆ１又はそのオルソログ若しくはホモログは、機能ドメインと融合した又はそれに作動可能に連結された汎用核酸結合タンパク質として用いられ得る。例示的機能ドメインとしては、限定はされないが、翻訳開始因子、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、ヌクレアーゼ、詳細にはリボヌクレアーゼ、スプライソソーム、ビーズ、光誘導性／制御性ドメイン又は化学物質誘導性／制御性ドメインを挙げることができる。
【００９２】
一部の実施形態において、非改変核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は切断活性を有し得る。一部の実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、標的配列内及び／又は標的配列の相補体内又は標的配列と会合した配列においてなど、標的配列の位置又はその近傍における一方又は両方の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）鎖の切断を導き得る。一部の実施形態において、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は、標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、又はそれを超える塩基対以内にある一方又は両方のＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖の切断を導き得る。一部の実施形態において、切断は、付着末端型であり、即ち付着末端を生じ得る。一部の実施形態において、切断は、５’オーバーハングを伴う付着末端型切断である。一部の実施形態において、切断は、１〜５ヌクレオチド、好ましくは４又は５ヌクレオチドの５’オーバーハングを伴う付着末端型切断である。一部の実施形態において、切断部位はＰＡＭから離れており、例えば、切断は非標的鎖上の１８番目のヌクレオチドの後及び標的鎖上の２３番目のヌクレオチドの後で起こる（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。一部の実施形態において、切断部位は非標的鎖上の（ＰＡＭから数えて）１８番目のヌクレオチドの後及び標的鎖上の（ＰＡＭから数えて）２３番目のヌクレオチドの後に起こる。一部の実施形態において、ベクターは、対応する野生型酵素と比べて突然変異していてもよい核酸ターゲティングエフェクタータンパク質をコードし、そのため突然変異型核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方又は両方のＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖を切断する能力を欠くことになる。更なる例として、Ｃａｓタンパク質の２つ以上の触媒ドメイン（例えばＲｕｖＣ  、及び、任意選択で本明細書において特定される第２のヌクレアーゼドメイン）を突然変異させることにより、実質的に全てのＤＮＡ切断活性を欠く突然変異型Ｃａｓタンパク質が作製されてもよい。本明細書に記載されるとおり、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質の対応する触媒ドメインもまた、突然変異させることにより、全てのＤＮＡ切断活性を欠いているか又はＤＮＡ切断活性が実質的に低下した突然変異型Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質を作製し得る。一部の実施形態において、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は、突然変異酵素のＲＮＡ切断活性が非突然変異型の酵素の核酸切断活性の約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％以下、又はそれ未満であるとき、実質的に全てのＲＮＡ切断活性を欠いていると見なされ得る；一例は、突然変異型の核酸切断活性が非突然変異型と比較したときゼロ又は無視できる程度のときであり得る。エフェクタータンパク質は、Ｖ型／ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からの複数のヌクレアーゼドメインを有する最も大型のヌクレアーゼと相同性を共有する一般的な酵素クラスを参照して同定し得る。最も好ましくは、エフェクタータンパク質は、Ｃｐｆ１などのＶ型／ＶＩ型タンパク質である。更なる実施形態において、エフェクタータンパク質はＶ型タンパク質である。由来するとは、本出願人らは、由来酵素が野生型酵素と高度な配列相同性を有するという意味で概して野生型酵素をベースとするが、しかしそれは当該技術分野において公知のとおりの又は本明細書に記載されるとおりの何らかの方法で突然変異している（改変されている）ことを意味する。
【００９３】
この場合もまた、用語のＣａｓ及びＣＲＩＳＰＲ酵素及びＣＲＩＳＰＲタンパク質及びＣａｓタンパク質は、概して同義的に用いられ、Ｃａｓ９に具体的に言及することによるなど、特に明らかでない限り、本明細書で言及する際は常に類推から、本願に更に記載される新規ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を指すことが理解されるであろう。上述のとおり、本明細書において用いられる残基付番の多くは、Ｖ型／ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのエフェクタータンパク質を参照する。しかしながら、本発明には、他の微生物種由来の更に多くのエフェクタータンパク質が含まれることが理解されるであろう。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は構成的に存在しても、又は誘導可能に存在しても、又は条件的に存在しても、又は投与されても、又は送達されてもよい。エフェクタータンパク質最適化を用いて機能を増強し、又は新規機能を開発してもよく、キメラエフェクタータンパク質を作成することができる。及び本明細書に記載されるとおり、エフェクタータンパク質を汎用核酸結合タンパク質として用いられるように改変してもよい。
【００９４】
典型的には、核酸ターゲティング系のコンテクストでは、核酸ターゲティング複合体の形成（標的配列にハイブリダイズし、且つ１つ以上の核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡを含む）は、標的配列内に又はその近傍に（例えば、それから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対、又はそれ以上の範囲内に）一方又は両方のＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖の切断をもたらす。本明細書で使用されるとき、用語「目的の標的遺伝子座と会合した１つ又は複数の配列」は、標的配列付近の近傍（例えば標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対、又はそれ以上の範囲内、ここで標的配列は目的の標的遺伝子座内に含まれる）にある配列を指す。
【００９５】
コドン最適化された配列の例は、この場合、真核生物、例えばヒトでの発現に最適化されるか（即ちヒトでの発現に最適化されている）、又は別の本明細書で考察されるとおりの真核生物、動物又は哺乳動物に最適化された配列である；例えば、コドン最適化配列の例として国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照のこと（当該技術分野及び本開示における知識から、特にエフェクタータンパク質（例えばＣｐｆ１）に関して、１つ又は複数のコード核酸分子のコドン最適化は当業者の範囲内にある）。これが好ましいが、他の例が可能であることが理解され、ヒト以外の宿主種に対するコドン最適化、又は特定の器官に対するコドン最適化が公知である。一部の実施形態において、ＤＮＡ／ＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質をコードする酵素コード配列が、特定の細胞、例えば真核細胞での発現にコドン最適化される。真核細胞は、特定の生物、例えば植物又は限定はされないがヒトを含めた哺乳動物、又は本明細書で考察されるとおりの非ヒト真核生物又は動物又は哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、又は非ヒト哺乳動物又は霊長類のものであるか、又はそれに由来し得る。一部の実施形態において、ヒト又は動物に対するいかなる実質的な医学的利益もなくそれらに苦痛を生じさせる可能性のあるヒトの生殖細胞系列遺伝子アイデンティティの改変方法及び／又は動物の遺伝子アイデンティティの改変方法、更にかかる方法から得られる動物は除外され得る。一般に、コドン最適化とは、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個以上、又はそれより多いコドン）を、天然のアミノ酸配列を維持しつつ、当該の宿主細胞の遺伝子においてより高頻度で又は最も高頻度で使用されるコドンに置き換えることにより、目的の宿主細胞における発現を増強するための核酸配列の改変方法を指す。様々な種が、特定のアミノ酸のあるコドンについて特定のバイアスを呈する。コドンバイアス（生物間でのコドン使用の違い）は、多くの場合にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、次にはそれが、数ある中でも特に、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択のｔＲＮＡが優勢であることは、概して、ペプチド合成で最も高頻度に使用されるコドンを反映するものである。従って、コドン最適化に基づき所与の生物における最適な遺伝子発現に合わせて遺伝子を調整することができる。コドン使用表が、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で利用可能な「コドン使用データベース（Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）」で容易に利用可能であり、これらの表を幾つもの方法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．「国際的ＤＮＡ配列データベースから表にしたコドン使用：２０００年の状況（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔ���ｅ  ｙｅａｒ  ２０００）」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照のこと。特定の配列を特定の宿主細胞における発現にコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムもまた利用可能であり、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）などもまた利用可能である。一部の実施形態において、ＤＮＡ／ＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質をコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０以上、又は全てのコドン）が、特定のアミノ酸について最も高頻度に使用されるコドンに対応する。酵母におけるコドン使用に関しては、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／ｃｏｄｏｎ＿ｕｓａｇｅ．ｓｈｔｍｌで利用可能なオンライン酵母ゲノムデータベース、又は「酵母におけるコドン選択（Ｃｏｄｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ）」，Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８２  Ｍａｒ  ２５；２５７（６）：３０２６−３１が参照される。藻類を含めた植物におけるコドン使用に関しては、「高等植物、緑藻類、及びシアノバクテリアにおけるコドン使用（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｐｌａｎｔｓ，ｇｒｅｅｎ  ａｌｇａｅ，ａｎｄ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）」，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｏｗｒｉ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９０  Ｊａｎ；９２（１）：１−１１；並びに「植物遺伝子におけるコドン使用（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｇｅｎｅｓ）」，Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８９  Ｊａｎ  ２５；１７（２）：４７７−９８；又は「種々の植物及び藻類系統における葉緑体及びチアネレ遺伝子のコドンバイアスに関する選択（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｏｄｏｎ  ｂｉａｓ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ａｎｄ  ｃｙａｎｅｌｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  ａｌｇａｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ）」，Ｍｏｒｔｏｎ  ＢＲ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ．１９９８  Ａｐｒ；４６（４）：４４９−５９が参照される。
【００９６】
一部の実施形態において、ベクターは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いＮＬＳなど、１個以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む核酸ターゲティングエフェクタータンパク質、例えばＡｓＣｐｆ１又はそのオルソログ若しくはホモログをコードする。一部の実施形態において、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、アミノ末端又はその近傍に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いＮＬＳを含むか、カルボキシ末端又はその近傍に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いＮＬＳを含むか、又はこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端にゼロ個又は少なくとも１個以上のＮＬＳ及びカルボキシ末端にゼロ個又は１個以上のＮＬＳ）である。２個以上のＮＬＳが存在する場合、各々を他と独立して選択してもよく、従って単一のＮＬＳが２つ以上のコピーで存在してもよく、及び／又は１つ以上のコピーで存在する１つ以上の他のＮＬＳとの組み合わせで存在してもよい。一部の実施形態において、ＮＬＳは、ＮＬＳの最も近いアミノ酸がＮ末端又はＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又はそれより多いアミノ酸の範囲内にあるとき、Ｎ末端又はＣ末端の近傍にあると見なされる。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３）を有するヌクレオプラスミンビパルタイトＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号４）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号５）を有するｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号６）を有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ；インポーチン−αのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号７）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号８）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号９）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１０）；マウスｃ−ａｂｌ  ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１１）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号１２）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１３）；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１４）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１５）；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１６）；及びステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１７）に由来するＮＬＳ配列が挙げられる。一般に、１つ以上のＮＬＳは、真核細胞の核における検出可能な量のＤＮＡ／ＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質の蓄積をドライブするのに十分な強度である。一般に、核局在化活性の強度は、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質内のＮＬＳの数、用いられる詳細なＮＬＳ、又はこれらの組み合��せ要因から導き出すことができる。核内での蓄積の検出は任意の好適な技法によって実施し得る。例えば、検出可能なマーカーを核酸ターゲティングタンパク質に融合してもよく、それにより、核の位置を検出する手段（例えば、ＤＡＰＩなど、核に特異的な染色）と組み合わせるなどして細胞内での位置を可視化してもよい。細胞核はまた、細胞から単離してもよく、次にその内容物を、免疫組織化学、ウエスタンブロット、又は酵素活性アッセイなど、任意の好適なタンパク質検出方法によって分析してもよい。核内における蓄積はまた、核酸ターゲティング複合体形成の効果に関するアッセイ（例えば、標的配列におけるＤＮＡ又はＲＮＡ切断又は突然変異に関するアッセイ、又はＤＮＡ又はＲＮＡターゲティング複合体形成及び／又はＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングＣａｓタンパク質活性の影響を受けて変化した遺伝子発現活性に関するアッセイ）によるなどして、核酸ターゲティングＣａｓタンパク質又は核酸ターゲティング複合体に曝露されていない対照、又は１つ以上のＮＬＳを欠く核酸ターゲティングＣａｓタンパク質に曝露された対照と比較して間接的に決定してもよい。本明細書に記載されるＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体及び系の好ましい実施形態において、コドン最適化Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は、タンパク質のＣ末端に付加されたＮＬＳを含む。
【００９７】
一部の実施形態において、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントの発現をドライブする１つ以上のベクターが宿主細胞に導入され、核酸ターゲティング系のエレメントが発現すると、１つ以上の標的部位において核酸ターゲティング複合体の形成が導かれる。例えば、核酸ターゲティングエフェクター酵素及び核酸ターゲティングガイドＲＮＡが、各々別個のベクター上で別個の調節エレメントに作動可能に連結されてもよい。核酸ターゲティング系の１つ又は複数のＲＮＡは、トランスジェニック核酸ターゲティングエフェクタータンパク質動物又は哺乳動物、例えば、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を構成的に又は誘導性に又は条件的に発現する動物又は哺乳動物；又は本来核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を発現しているか又は核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含有する細胞を有する動物又は哺乳動物へと、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質をインビボでコードし及び発現する１つ又は複数のベクターをそれに事前投与するなどして送達することができる。或いは、同じ又は異なる調節エレメントから発現するエレメントのうちの２つ以上が単一のベクターに組み合わされてもよく、１つ以上の追加のベクターが、第１のベクターに含まれない核酸ターゲティング系の任意の構成成分を提供する。単一のベクターに組み合わされる核酸ターゲティング系エレメントは、あるエレメントが第２のエレメントに対して５’側（その「上流」）に位置し、又はそれに対して３’側（その「下流」）に位置するなど、任意の好適な向きで配置されてもよい。あるエレメントのコード配列は第２のエレメントのコード配列と同じ鎖上又は逆鎖上に位置してもよく、同じ又は逆の方向に向いていてもよい。一部の実施形態において、単一のプロモーターが、１つ以上のイントロン配列内に組み込まれた（例えば、各々が異なるイントロンにあるか、２つ以上が少なくとも１つのイントロンにあるか、又は全てが単一のイントロンにある）、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質及び核酸ターゲティングガイドＲＮＡをコードする転写物の発現をドライブする。一部の実施形態において、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と核酸ターゲティングガイドＲＮＡとは同じプロモーターに作動可能に連結されていて、そこから発現してもよい。核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントを発現させるための送達媒体、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤及びその構成成分については、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）など、前述の文献で使用されているとおりである。一部の実施形態において、ベクターは制限エンドヌクレアーゼ認識配列などの１つ以上の挿入部位（「クローニング部位」とも称される）を含む。一部の実施形態において、１つ以上の挿入部位（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多い挿入部位）は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流及び／又は下流に位置する。複数の異なるガイド配列を使用すると、単一の発現構築物を用いて細胞内の複数の異なる対応する標的配列へと核酸ターゲティング活性を標的化させることができる。例えば、単一のベクターが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個以上、又はそれより多いガイド配列を含み得る。一部の実施形態において、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いかかるガイド配列含有ベクターが提供され、及び任意選択で細胞に送達されてもよい。複数のｓｇＲＮＡはまた、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型プロモーター（例えばＵ６又はＨ１  ＲＮＡ）を用いてアレイフォーマットで発現させることもできる。上記に記載する非コードＲＮＡ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９成分は、ＡＡＶシャトルベクターにクローニングしても、標準方法を用いてＡＡＶシャトルプラスミドにクローニングされる他のエレメント、例えば、レポーター遺伝子、抗生物質耐性遺伝子又は他の配列を含むのに十分なスペースが残る。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、内因性機構によってプロセシングされ得る（例えば、アレイから切断又は分離され得る）ガイドＲＮＡを含むアレイとして提供される。例えば、Ｐｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０４６４１７）は、細胞ｔＲＮＡプロセシングを利用して複数のガイドＲＮＡを発現させるシステムについて記載している。より詳細には、特定の実施形態において、ｔＲＮＡ配列によるか、又は細胞の内因性ｔＲＮＡプロセシング系によってプロセシングされ得る（切断され得る）ヌクレオチド配列によって各々が隣と分離されるガイドＲＮＡ配列のアレイが提供されてもよい。転写されると、このアレイがプロセシングされて複数のガイドＲＮＡが放出され、それらが例えば１つ以上の標的配列への複数の変化の導入に用いられ得る。アレイから発現するガイドＲＮＡは、任意の所望の組み合わせで提供されてもよい。例えば、同じｇＲＮＡの複数のコピー、互いに排他的な複数のｇＲＮＡ、又は両方の組み合わせがあり得る。これらのガイドを用いて、ＤＮＡを切断する活性Ｃｐｆ１酵素、又はニッカーゼなどの改変Ｃｐｆ１酵素、又は他の変異Ｃｐｆ１酵素若しくはタンパク質の発現を導くことができる。特定の実施形態において、複数のガイドＲＮＡを使用して同じ遺伝子又は他の標的ＤＮＡに複数の突然変異が導入される。別の実施形態において、複数のガイドＲＮＡを使用して２つ以上の遺伝子又は標的ＤＮＡに変化が導入される。
【００９８】
一部の実施形態において、ベクターは、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節エレメントを含む。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質又は１つ又は複数の核酸ターゲティングガイドＲＮＡは別個に送達してもよく；及び有利には、これらのうちの少なくとも１つが粒子複合体によって送達される。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質に発現する時間を与えるため、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡを核酸ターゲティングガイドＲＮＡより先に送達してもよい。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡは核酸ターゲティングガイドＲＮＡの投与の１〜１２時間前（好ましくは約２〜６時間前）に投与されてもよい。或いは、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及び核酸ターゲティングガイドＲＮＡは一緒に投与されてもよい。有利には、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの初回投与から１〜１２時間後（好ましくは約２〜６時間後）にガイドＲＮＡの第２のブースター用量が投与されてもよい。核酸ターゲティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及び／又はガイドＲＮＡの追加の投与は、最も効率的なゲノム改変レベルを達成するのに有用であり得る。
【００９９】
一態様において、本発明は、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントの使用方法を提供する。本発明の核酸ターゲティング複合体は、標的ＤＮＡ又はＲＮＡ（一本鎖又は二本鎖、線状又はスーパーコイル状）を改変する有効な手段を提供する。本発明の核酸ターゲティング複合体は、非常に多数の細胞型における標的ＤＮＡ又はＲＮＡの改変（例えば、欠失、挿入、転位、不活性化、活性化）を含め、多岐にわたる有用性を有する。このように本発明の核酸ターゲティング複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、及び予後判定において、広範な適用性を有する。例示的核酸ターゲティング複合体は、目的の標的遺伝子座内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成したＤＮＡ又はＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を含む。
【０１００】
一実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡを切断する方法を提供する。本方法は、標的ＲＮＡに結合して前記標的ＤＮＡの切断を生じさせる核酸ターゲティング複合体を用いて標的ＲＮＡを改変するステップを含み得る。ある実施形態において、本発明の核酸ターゲティング複合体は、細胞に導入されると、ＲＮＡ配列に切断（例えば一本鎖又は二本鎖切断）を作り出し得る。例えば、本方法を用いて細胞内の疾患ＲＮＡを切断することができる。例えば、組み込もうとする配列に上流配列及び下流配列が隣接した外因性ＲＮＡ鋳型が細胞に導入されてもよい。これらの上流及び下流配列は、ＲＮＡにおける組込み部位の両側と配列類似性を共有している。必要に応じて、ドナーＲＮＡはｍＲＮＡであってもよい。外因性ＲＮＡ鋳型は、組み込もうとする配列（例えば、突然変異型ＲＮＡ）を含む。組込み配列は、細胞にとって内因性又は外因性の配列であってもよい。組み込もうとする配列の例としては、タンパク質をコードするＲＮＡ又は非コードＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）が挙げられる。従って、組込み配列は、１つ又は複数の適切な制御配列に作動可能に連結され得る。或いは、組込み配列が調節機能を提供し得る。外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、目的のＲＮＡ配列とドナーＲＮＡとの間の組換えを促進するように選択される。上流配列は、標的組込み部位の上流のＲＮＡ配列と配列類似性を共有するＲＮＡ配列である。同様に、下流配列は、標的組込み部位の下流のＲＮＡ配列と配列類似性を共有するＲＮＡ配列である。外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、標的ＲＮＡ配列と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、標的ＲＮＡ配列と約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。一部の方法において、外因性ＲＮＡ鋳型中の上流及び下流配列は、標的ＲＮＡ配列と約９９％又は１００％の配列同一性を有する。上流又は下流配列は、約２０ｂｐ〜約２５００ｂｐ、例えば、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、又は２５００ｂｐを含み得る。一部の方法において、例示的上流又は下流配列は、約２００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、又はより詳細には約７００ｂｐ〜約１０００ｂｐを有する。一部の方法において、外因性ＲＮＡ鋳型はマーカーを更に含み得る。かかるマーカーは標的組込みのスクリーニングを容易にし得る。好適なマーカーの例としては、制限部位、蛍光タンパク質、又は選択可能マーカーが挙げられる。本発明の外因性ＲＮＡ鋳型は組換え技術を用いて構築することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６を参照）。外因性ＲＮＡ鋳型を組み込むことによる標的ＲＮＡの改変方法では、核酸ターゲティング複合体によってＤＮＡ又はＲＮＡ配列に切断（例えば、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡにおける二本鎖又は���本鎖切断）が導入され、外因性ＲＮＡ鋳型との相同組換えによってこの切断が修復されると、鋳型がＲＮＡ標的に組み込まれる。二本鎖切断の存在が鋳型の組込みを促進する。他の実施形態において、本発明は、真核細胞におけるＲＮＡの発現を改変する方法を提供する。本方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ）に結合する核酸ターゲティング複合体を用いて標的ポリヌクレオチドの発現を増加又は減少させるステップを含む。一部の方法では、標的ＲＮＡを不活性化させて細胞の発現の改変を生じさせることができる。例えば、ＲＮＡターゲティング複合体が細胞内の標的配列に結合すると、標的ＲＮＡが不活性化され、そのためその配列は翻訳されないか、コードされたタンパク質が産生されないか、又は配列が野生型配列のようには機能しなくなる。例えば、タンパク質又はマイクロＲＮＡをコードする配列を不活性化して、タンパク質又はマイクロＲＮＡ又はプレマイクロＲＮＡ転写物が産生されないようにし得る。ＲＮＡターゲティング複合体の標的ＲＮＡは、真核細胞にとって内因性又は外因性の任意のＲＮＡであってもよい。例えば、標的ＲＮＡは、真核細胞の核に存在するＲＮＡであってもよい。標的ＲＮＡは、遺伝子産物（例えばタンパク質）をコードする配列（例えば、ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ）又は非コード配列（例えば、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はｒＲＮＡ）であってもよい。標的ＲＮＡの例としては、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列、例えば、生化学的シグナル伝達経路関連ＲＮＡが挙げられる。標的ＲＮＡの例としては、疾患関連ＲＮＡが挙げられる。「疾患関連」ＲＮＡは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して罹患組織に由来する細胞において翻訳産物を異常なレベルで、又は異常な形態で産生している任意のＲＮＡを指す。それは異常に高いレベルで発現するようになる遺伝子から転写されるＲＮＡであってもよく；それは異常に低いレベルで発現するようになる遺伝子から転写されるＲＮＡであってもよく、ここで発現の変化は疾患の発生率及び／又は進行と相関する。疾患関連ＲＮＡはまた、疾患の病因に直接関与するか、又はそれに関与する１つ又は複数の遺伝子との連鎖不平衡がある１つ又は複数の突然変異又は遺伝的変異を有する遺伝子から転写されるＲＮＡも指す。翻訳産物は既知であっても又は未知であってもよく、及び正常レベルであっても又は異常レベルであってもよい。ＲＮＡターゲティング複合体の標的ＲＮＡは、真核細胞にとって内因性又は外因性の任意のＲＮＡであってもよい。例えば、標的ＲＮＡは、真核細胞の核に存在するＲＮＡであってもよい。標的ＲＮＡは、遺伝子産物（例えばタンパク質）をコードする配列（例えば、ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ）又は非コード配列（例えば、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はｒＲＮＡ）であってもよい。
【０１０１】
一部の実施形態において、本方法は、核酸ターゲティング複合体を標的ＤＮＡ又はＲＮＡに結合させて前記標的ＤＮＡ又はＲＮＡの切断を生じさせ、それにより標的ＤＮＡ又はＲＮＡを改変するステップを含むことができ、ここで核酸ターゲティング複合体は、前記標的ＤＮＡ又はＲＮＡ内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。一態様において、本発明は、真核細胞におけるＤＮＡ又はＲＮＡの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、核酸ターゲティング複合体をＤＮＡ又はＲＮＡに結合させて、前記結合により前記ＤＮＡ又はＲＮＡの発現の増加又は減少を生じさせるステップを含み；ここで核酸ターゲティング複合体は、ガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。同様の考察及び条件が、標的ＤＮＡ又はＲＮＡを改変する方法にも上記のとおり適用される。実際上、これらの試料採取、培養及び再導入の選択肢は本発明の全態様に適用される。一態様において、本発明は、真核細胞の標的ＤＮＡ又はＲＮＡを改変する方法を提供し、これはインビボ、エキソビボ又はインビトロであってもよい。一部の実施形態において、本方法は、ヒト又は非ヒト動物から細胞又は細胞集団を試料採取するステップ、及び１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。培養は任意の段階でエキソビボで行われ得る。この１つ又は複数の細胞が、更には非ヒト動物又は植物に再導入されてもよい。再導入される細胞について、細胞は幹細胞であることが特に好ましい。
【０１０２】
実際、本発明の任意の態様において、核酸ターゲティング複合体は、標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含み得る。
【０１０３】
本発明は、核酸ターゲティング系及びその構成成分に関係した、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列ターゲティングが関わる遺伝子発現の制御に用いられる系、方法及び組成物のエンジニアリング及び最適化に関する。有利な実施形態において、エフェクター酵素は、Ｃｐｆ１、より具体的にはＡｓＣｐｆ１である。本方法の利点は、ＣＲＩＳＰＲ系がオフターゲット結合及びその結果として生じる副作用を最小限に抑え、又はそれを回避することである。これは、標的ＤＮＡ又はＲＮＡに対して高度な配列特異性を有するように構成された系を用いて達成される。
【０１０４】
核酸ターゲティング複合体又は系に関して、好ましくは、ｃｒＲＮＡ配列は１つ以上のステムループ又はヘアピンを有し、３０ヌクレオチド長以上、４０ヌクレオチド長以上、又は５０ヌクレオチド長以上であり；ｃｒＲＮＡ配列は１０〜３０ヌクレオチド長であり、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質はＣｐｆ１酵素である。特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ配列は４２〜４４ヌクレオチド長であり、及び核酸ターゲティングＣａｓタンパク質は野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｏｃｉｄａ）Ｕ１１２のＣｐｆ１である。特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドのダイレクトリピート及び２３〜２５ヌクレオチドのスペーサー配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、及び核酸ターゲティングＣａｓタンパク質は野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｏｃｉｄａ）Ｕ１１２のＣｐｆ１である。
【０１０５】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１の結晶化及び構造
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１の結晶化及び結晶構造の特徴付け：本発明の結晶は、バッチ法、液体架橋法、透析法、蒸気拡散法、及びハンギングドロップ法を含むタンパク質結晶学技術によって得ることができる。一般に、本発明の結晶は、実質的に純粋なＣＲＩＳＰＲＣｐｆ１及びそれが結合する核酸分子を、沈殿に必要な濃度よりも僅かに低い濃度の沈殿剤を含有する水性緩衝液中に溶解することによって成長させる。沈殿条件が生じるよう制御された蒸発によって水を除去し、結晶の成長が止まるまでこの条件が維持される。
【０１０６】
結晶、結晶構造、及び原子構造座標の使用：本発明の結晶、特にそれから得られる原子構造座標には、広範な用途がある。結晶及び構造座標は、ＣＲＪＳＰＲ−Ｃｐｆ１に結合する化合物（核酸分子）、及び特定の化合物（核酸分子）に結合し得るＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１を同定するのに特に有用である。従って、本明細書に記載される構造座標は、追加の合成又は突然変異ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１、Ｃｐｆ１、ニッカーゼ、結合ドメインの結晶構造を決定する際に位相モデルとして使用することができる。本明細書の結晶構造表及び／又は図中にあるとおりの核酸分子と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１の結晶構造の提供により、当業者にＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１の作用機構についての詳細な洞察がもたらされる。この洞察から、リプレッサー又はアクチベーターなどの機能性基を付加することによるなどの、改変ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１を設計する手段が得られる。リプレッサー又はアクチベーターなどの機能性基はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１のＮ末端又はＣ末端に付加することができるが、結晶構造が示すところによれば、Ｎ末端は覆われている又は隠れているように見え、一方でＣ末端の方がリプレッサー又はアクチベーターなどの機能性基に利用し易い。更に、結晶構造が示すところによれば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））残基約５３４〜６７６の間に、アクチベーター又はリプレッサーなどの機能性基を付加するのに適した可動性ループが存在する。付加は、リンカー、例えば、可動性グリシン−セリン（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）若しくは（ＧＧＧＳ）３又は強固なαヘリカルリンカー、例えば（Ａｌａ（ＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓ）Ａｌａ）を介することができる。可動性ループに加えて、ヌクレアーゼ又はＨ３領域、Ｈ２領域、及びヘリカル領域も存在する。「へリックス」又は「ヘリカル」は、限定されないがαへリックスを含め、当該技術分野において公知のへリックスを意味する。加えて、へリックス又はヘリカルという用語は、Ｎ末端ターンを有するｃ末端ヘリカルエレメントを指して用いられることもある。
【０１０７】
核酸分子と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１の結晶構造の提供により、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１に結合し得る化合物に関する新規の薬物又は化合物創薬、同定、及び設計手法が可能となり、従って本発明は、多細胞生物、例えば、藻類、植物、無脊椎動物、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類；例えば、栽培植物、家畜（例えば、ブタ、ウシ、ニワトリなどの生産動物；ネコ、イヌ、齧歯類（ウサギ、スナネズミ、ハムスター）などのペット動物；マウス、ラットなどの実験動物）、及びヒトの病態又は疾患の診断、治療、又は予防に有用なツールを提供する。従って、本明細書には、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体を合理的に設計するコンピュータベースの方法が提供される。この合理的設計は：本明細書の結晶構造表及び／又は図中の一部又は全ての（例えば、構造の少なくとも２個以上、例えば、少なくとも５個、有利には少なくとも１０個、より有利には少なくとも５０個、更により有利には少なくとも１００個の原子）座標によって定義されるとおりのＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体の構造を提供すること；それに関してＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体が所望される所望核酸分子の構造を提供すること；及び本明細書の結晶構造表及び／又は図中の一部又は全ての座標によって定義されるとおりのＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体の構造を所望核酸分子にフィッティングすること（前記フィッティングには、所望核酸分子が関わる１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体について前記所望核酸分子が結合するように本明細書の結晶構造表及び／又は図中の一部又は全ての座標によって定義されるとおりのＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体の推定上の１つ又は複数の改変を達成することが含まれる）を含み得る。この方法又はこの方法のフィッティングは、活性部位又は結合領域の近傍をモデル化するため、活性部位又は結合領域の近傍にある本明細書の結晶構造表及び／又は図中の一部又は全ての座標（例えば、構造の少なくとも２個以上、例えば、少なくとも５個、有利には少なくとも１０個、より有利には少なくとも５０個、更により有利には少なくとも１００個の原子）によって定義されるとおりのＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体の目的の原子座標を使用することができる。これらの座標を用いて空間を定義することができ、次にその空間が所望又は候補核酸分子に対して「インシリコ」でスクリーニングされる。従って、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体を合理的に設計するコンピュータベースの方法を提供する。この方法は：本明細書の結晶構造表の少なくとも２つの原子の座標（「選択された座標」）を提供すること；候補又は所望核酸分子の構造を提供すること；及び候補の構造を選択された座標に対してフィッティングすることを含み得る。このようにして、当業者は機能性基及び候補又は所望核酸分子をフィッティングすることもできる。例えば、本明細書の結晶構造表及び／又は図中の一部又は全ての（例えば、構造の少なくとも２個以上、例えば、少なくとも５個、有利には少なくとも１０個、より有利には少なくとも５０個、更により有利には少なくとも１００個の原子）座標によって定義されるとおりのＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体の構造を提供すること；それに関してＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体が所望される所望核酸分子の構造を提供すること；本明細書の結晶構造表及び／又は図中の一部又は全ての座標によって定義されるとおりのＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体の構造を所望核酸分子にフィッティングすること（前記フィッティングには、所望核酸分子が関わる１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体について前記所望核酸分子が結合するように本明細書の結晶構造表及び／又は図中の一部又は全ての座標によって定義されるとおりのＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体の推定上の１つ又は複数の改変を達成することが含まれる）；１つ又は複数の推定フィットＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１−所望核酸分子複合体を選択すること、かかる１つ又は複数の推定フィットＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１−所望核酸分子複合体を機能性基に対して、例えば、機能性基（例えば、アクチベーター、リプレッサー）を位置させる場所（例えば、可動ループ内の位置）及び／又は機能性基を位置させる場所を作るための１つ又は複数の推定フィットＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１−所望核酸分子複合体の推定上の改変に関してフィッティングすること。示唆したとおり、本発明は、活性部位又は結合領域の近傍にある本明細書の結晶構造表及び／又は図中の座標を用いて実施することができ；従って、本発明の方法は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体の目的のサブドメインを利用することができる。本明細書に開示される方法は、ドメイン又はサブドメインの座標を用いて実施することができる。本方法は、任意選択で、「インシリコ」出力から候補又は所望核酸分子及び／又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を合成すること、及び「ウェットな」又は実際の候補又は所望核酸分子に結合した「ウェットな」又は実際のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系に連結された「ウェットな」又は実際の機能性基の結合及び／又は活性を試験することを含み得る。本方法は、「インシリコ」出力からＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（機能性基を含む）を合成すること、及びインビボで「ウェットな」又は実際の候補又は所望核酸分子に結合した「ウェットな」又は実際のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系に連結された「ウェットな」又は実際の機能性基の結合及び／又は活性を試験すること、例えば、「インシリコ」出力からの、機能性基を含む「ウェットな」又は実際のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を、所望又は候補核酸分子を含む細胞と接触させること含み得る。これらの方法は、所望の反応、例えば、症状又は病態又は疾患の軽減について、細胞又は細胞を含む生物を観察することを含み得る。候補核酸分子の構造を提供するステップは、核酸分子データ、例えば、病態又は疾患に関するこのようなデータを含むデータベースをコンピュータでスクリーニングすることにより化合物を選択することを含み得る。候補核酸分子の結合に関する３Ｄ記述子は、本明細書の結晶構造からのＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体又はそのドメイン若しくは領域の構造及び化学的性質から導き出される幾何学的及び機能的制約から導き出され得る。事実上、この記述子は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１を候補又は所望核酸分子に結合するための本明細書のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体結晶構造の１つ又は複数の仮想改変のタイプであり得る。次にこの記述子を使用して核酸分子データベースに問い合わせて、記述子に対して良好な結合性を有すると推定されるデータベースの核酸分子を確認し得る。次に記述子及び良好な結合性を有すると推定される核酸分子を用いて本明細書の「ウェットな」ステップを実施することができる。
【０１０８】
「フィッティング」は、候補の少なくとも１つの原子とＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体の少なくとも１つの原子との間の相互作用を自動的又は半自動的手段によって決定すること、及びかかる相互作用がどの程度安定しているかを計算することを意味し得る。相互作用には、電荷及び立体的要因などによって生じる引力、斥力が含まれ得る。「サブドメイン」は、少なくとも１つ、例えば、１、２、３、又は４つの完全な二次構造要素を意味し得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１の特定の領域又はドメインは、本明細書の結晶構造表及び図中に同定されるものを含む。
【０１０９】
いずれにしろ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）複合体の三次元構造の決定により、様々な核酸分子に結合するＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の改変、互いに相互作用し得る、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１と相互作用し得る（例えば、機能の自己活性化及び／又は自己終結をもたらす誘導系）、核酸分子と相互作用し得る様々な機能性基の任意の１つ以上に連結されるようなＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の改変（例えば、機能性基は、転写リプレッサー、転写アクチベーター、ヌクレアーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、タンパク質トランスフェラーゼ、タンパク質デアセチラーゼ、タンパク質メチルトランスフェラーゼ、タンパク質デアミナーゼ、タンパク質キナーゼ、及びタンパク質ホスファターゼからなる群から選択され得る調節性又は機能性ドメインであってもよく；及び、一部の態様において、機能性ドメインは後成的調節因子である；例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第８，５０７，２７２号明細書を参照されたく、この場合もまた、それ及び本明細書の全ての引用文献及び全ての出願引用文献が、本明細書によって参照により本明細書に援用されることが言及される）、Ｃｐｆ１の改変、新規ニッカーゼによるなどの、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１（例えば、ＡｓＣｐｆ１）に結合する新規の且つ特異的な核酸分子の設計並びに新規のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の設計の基礎が提供される）。実際、本明細書によるＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）結晶構造には多様な用途がある。例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）結晶構造の三次元構造の情報から、コンピュータモデリングプログラムを使用して、結合部位など、可能性のある又は確認された部位と相互作用することが予想される種々の分子又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（例えばＡｓＣｐｆ１）の他の構造的若しくは機能的特徴を設計又は同定し得る。潜在的に結合する化合物（「結合体」）は、ドッキングプログラムを使用したコンピュータモデリングを用いて調べることができる。ドッキングプログラムは公知である；例えばＧＲＡＭ、ＤＯＣＫ又はＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｗａｌｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，ｖｏｌ．３，ｎｏ．４（１９９８），１６０−１７８、及びＤｕｎｂｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  ２（１９９７），２７−４２を参照）。この手順には、潜在的な結合体のコンピュータフィッティングにより、その潜在的な結合体の形状及び化学構造がＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（例えばＡｓＣｐｆ１）にいかに良好に結合するかを確かめることが含まれ得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（例えばＡｓＣｐｆ１）の活性部位又は結合部位をコンピュータ支援下で手動で調べることが行われてもよい。ＧＲＩＤ（Ｐ．Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，１９８５，２８，８４９−５７）−様々な機能性基を有する分子間の可能性の高い相互作用部位を決定するプログラム−などのプログラムもまた、結合する化合物の部分的構造を予測するための活性部位又は結合部位の分析に用いられ得る。コンピュータプログラムを用いると、２つの結合パートナー、例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（例えばＡｓＣｐｆ１）と候補核酸分子��は核酸分子と候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（例えばＡｓＣｐｆ１）の引力、斥力又は立体障害を推定することができ；及び本明細書によるＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造（ＡｓＣｐｆ１）によれば、かかる方法が可能となる。概して、フィットが緊密であるほど立体障害が減り、及び引力が大きくなるためより強力な潜在的結合体となり、なぜならこれらの特性はより緊密な結合定数と一致するからである。更に、候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（例えばＡｓＣｐｆ１）の設計において特異性が高いほど、オフターゲット分子ともまた相互作用する可能性が低くなる。また、「ウェットな」方法も本願によって可能となる。例えば、ある態様において、本明細書には、候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（例えばＡｓＣｐｆ１）に結合した候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（例えばＡｓＣｐｆ１）の結合体（例えば標的核酸分子）の構造を決定する方法が提供され、前記方法は、（ａ）本明細書に記載されるとおりの候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（ＡｓＣｐｆ１）の第１の結晶又は候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（例えばＡｓＣｐｆ１）の第２の結晶を提供すること、（ｂ）複合体が形成され得る条件下で第１の結晶又は第２の結晶を前記結合体と接触させること；及び（ｃ）前記候補（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（例えばＡｓＣｐｆ１）又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（ＡｓＣｐｆ１）複合体）の構造を決定することを含む。第２の結晶は本質的に本明細書で考察される同じ座標を有し得るが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系における僅かな変化により、この結晶は異なる空間群で形成され得る。
【０１１０】
更に本明細書には、「インシリコ」方法に代えて又は加えて、結合活性を有する化合物を選択するための結合体（例えば標的核酸分子）と候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（例えばＡｓＣｐｆ１）、又は候補結合体（例えば標的核酸分子）とＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（例えばＡｓＣｐｆ１）、又は候補結合体（例えば標的核酸分子）と候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（例えばＡｓＣｐｆ１）（上述の１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は１つ以上の機能性基を含む又は含まない）のハイスループットスクリーニングを含め、他の「ウェットな」方法が提供される。結合活性を示す結合体とＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系との対を選択し、Ｘ線解析のため、例えば共結晶化によるか又は浸漬によって、本明細書の構造を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶で更に結晶化することができる。得られたＸ線構造は、種々の目的で、例えばオーバーラップ範囲に関して本明細書の結晶構造表のもの及び図中の情報と比較し得る。結合体と本明細書のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造データの対に基づき好ましいフィッティング特性、例えば強い予想引力を有するものを決定することにより結合体とＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の可能性のある対を設計、同定、又は選択したところで、次にこれらの可能性のある対を活性に関して「ウェットな」方法によりスクリーニングすることができる。結果として、ある態様では、本方法は：可能性のある対を入手する又は合成すること；及び結合体（例えば標的核酸分子）と候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（例えばＡｓＣｐｆ１）、又は候補結合体（例えば標的核酸分子）とＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（例えばＡｓＣｐｆ１）、又は候補結合体（例えば標的核酸分子）と候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系（例えばＡｓＣｐｆ１）（上述の１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は１つ以上の機能性基を含む又は含まない）を接触させて結合能力を決定することを含み得る。後者のステップでは、接触は有利には、機能を決定する条件下である。かかるアッセイの実施に代えて、又は加えて、本方法は：前記接触から１つ又は複数の複合体を入手する又は合成すること、及びこの１つ又は複数の複合体を例えばＸ線回折又はＮＭＲ又は他の手段によって分析して結合又は相互作用能力を決定することを含み得る。次に結合に関して詳細な構造情報を入手してもよく、その情報に照らして候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系又はその構成成分の構造又は機能を調整することができる。これらのステップは必要に応じて反復及び再反復され得る。それに代えて又は加えて、上述の方法からの又は上述の方法における潜在的なＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は、それにより所望の結果（例えば症状の軽減、治療）が得られるかどうかを含め、機能を確認又は立証するため、限定されるものではないが、生物（非ヒト動物及びヒトを含む）への投与によることを含め、インビボで核酸分子と一緒にし得る。
【０１１１】
更に本明細書には、本明細書の結晶構造表の構造座標及び図中の情報を用いることにより、未知の構造の１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系又は複合体の三次元構造を決定する方法が提供される。例えば、未知の結晶構造のＣＲＩＳＰＲ系又は複合体についてＸ線結晶学的データ又はＮＭＲ分光分析データが提供される場合、本明細書の結晶構造表及び図中に定義されるとおりのＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体の構造を用いて当該のデータを解釈することにより、Ｘ線結晶学の場合における位相モデリングのような技術によって未知の系又は複合体の見込まれる構造を提供し得る。従って、方法は：未知の結晶構造を有するＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系又は複合体の表現を本明細書の結晶構造のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系及び複合体の類似の表現と相同又は類似領域（例えば相同又は類似配列）が一致するようにアラインメントすること；対応する領域（例えば配列）の本明細書の結晶構造表及び／又は図中に定義されるとおりの構造に基づき未知の結晶構造のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系又は複合体の一致した相同又は類似領域（例えば配列）の構造をモデル化すること；及び、未知の結晶構造について前記一致した相同領域の構造を実質的に維持するコンホメーションを（例えば、低エネルギーのコンホメーションが形成されるように有利な相互作用が形成されなければならないことを考慮して）決定することを含み得る。「相同領域」は、例えばアミノ酸に関しては、同一又は同様の例えば脂肪族、芳香族、極性、負電荷、又は正電荷の側鎖化学基を有する２つの配列中のアミノ酸残基を表す。核酸分子に関する相同領域は、少なくとも８５％、又は８６％、又は８７％、又は８８％、又は８９％、又は９０％、又は９１％、又は９２％、又は９３％、又は９４％、又は９５％）、又は９６％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の相同性又は同一性を含み得る。同一領域及び類似領域は、時に当業者によってそれぞれ「不変異の」及び「保存された」と記載されることもある。有利には、第１及び第３のステップはコンピュータモデリングによって実施される。ホモロジーモデリングは当業者に周知の技術である（例えば、Ｇｒｅｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ．２２８（１９８５）１０５５、及びＢｌｕｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ｖｏｌ  １７２（１９８８），５１３を参照）。本明細書におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造の保存領域のコンピュータ表現及び未知の結晶構造のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系のコンピュータ表現は、未知の結晶構造のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系の結晶構造の予測及び決定に役立つ。更にまた、インシリコでＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造を利用する本明細書に記載される態様は、本明細書のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造を用いることにより推測される新規ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ結晶構造にも等しく適用し得る。このように、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ結晶構造のライブラリを得ることができる。従って、本明細書には、合理的ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系設計が提供される。例えば、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系又は複合体のコンホメーション又は結晶構造が本明細書に記載の方法によって決定されると、かかるコンホメーションを本明細書におけるコンピュータベースの���法で用いて、結晶構造がなお未知である他のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系又は複合体のコンホメーション又は結晶構造を決定し得る。これら全ての結晶構造からのデータがデータベースにあってもよく、本明細書の方法が、ライブラリ中の１つ以上の結晶構造と比べた本明細書の結晶構造又はその一部が関わる本明細書の比較を有することによってよりロバストなものとなり得る。本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系又は複合体の構造生成及び／又は合理的設計の実施を意図したコンピュータシステムなどのシステムを更に含む。このシステムは：本明細書の結晶構造表及び図に係る又はそれから例えばモデリングによって導出される原子座標データであって、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系若しくは複合体又はその少なくとも１つのドメイン若しくはサブドメインの三次元構造を定義付けるデータ、又はその構造因子データであって、本明細書の結晶構造表及び図の原子座標データから導出することが可能な構造因子データを含み得る。本明細書にはまた、本明細書の結晶構造表及び／又は図に係る又はそれから例えばホモロジーモデリングによって導出される原子座標データであって、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系若しくは複合体又はその少なくとも１つのドメイン若しくはサブドメインの三次元構造を定義付けるデータ、又はその構造因子データであって、本明細書の結晶構造表及び／又は図の原子座標データから導出することが可能な構造因子データを含むコンピュータ可読媒体も提供される。「コンピュータ可読媒体」は、コンピュータによって直接読み出してアクセスすることのできる任意の媒体を指し、限定されないが：磁気記憶媒体；光学記憶媒体；電気記憶媒体；クラウドストレージ及びこれらのカテゴリのハイブリッドが含まれる。かかるコンピュータ可読媒体を提供することにより、モデリング又は他の「インシリコ」方法のため原子座標データにルーチン的にアクセスすることができる。更に本明細書には、インターネット又はグローバル通信／コンピュータネットワーク経由で例えば会員登録方式でかかるコンピュータ可読媒体へのアクセスを提供することにより事業を行う方法が包含され；又はコンピュータシステムは、会員登録方式でユーザーに利用可能であってもよい。「コンピュータシステム」は、本発明の原子座標データの解析に用いられるハードウェア手段、ソフトウェア手段、及びデータ記憶手段を指す。本発明のコンピュータベースのシステムの最小限のハードウェア手段は、中央演算処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、及びデータ記憶手段を含み得る。望ましくは、構造データを可視化するためディスプレイ又はモニタが提供される。更に本明細書には、本明細書に記載される任意の方法又はそのステップで得られた情報又は本明細書に記載される任意の情報を、例えば、遠隔通信、電話、マスコミュニケーション、マスメディア、プレゼンテーション、インターネット、電子メールなどによって伝達する方法が包含される。本明細書に記載される結晶構造を分析して、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系又は複合体の１つ又は複数のフーリエ電子密度図を作成することができる；有利には、三次元構造は、本明細書の結晶構造表及び／又は図に係る原子座標データによって定義されるとおりである。���ーリエ電子密度図はＸ線回折パターンに基づき計算することができる。次にこれらの密度図を用いて結合又は他の相互作用の諸側面を決定することができる。電子密度図は、ＣＣＰ４コンピュータパッケージ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎｏ．４．Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ，Ｄ５０，１９９４，７６０−７６３）のプログラムなど、公知のプログラムを用いて計算することができる。密度図の可視化及びモデル構築には、「ＱＵＡＮＴＡ」（１９９４，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  Ａ４７（１９９１），１１０−１１９）などのプログラムを使用することができる。
【０１１２】
本明細書の結晶構造表はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１（アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ））の原子座標データを提供し、各原子を固有番号によって列挙する；各アミノ酸残基の化学元素及びその位置（電子密度図及び抗体配列比較によって決定されるとおり）、元素が位置するアミノ酸残基、鎖の識別名、残基の数、それぞれの原子の原子位置（オングストローム単位）を結晶軸に対して定義する座標（例えば、Ｘ，Ｙ，Ｚ）、それぞれの位置における原子の占有率、「Ｂ」、原子中心の周りの原子の動きを説明する等方性変位パラメータ（オングストローム単位）、及び原子番号。本明細書の本文及び図もまた参照のこと。
【０１１３】
更なる態様において、本発明は、ｉ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系又はその一部の範囲内にフィットする又はそれに結合する潜在的化合物を同定又は設計する、コンピュータ支援下であってよい方法を提供し、この方法は：ａ）結晶構造表のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の少なくとも２つの原子の座標を提供するステップ、ｂ）ｉ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系に対して又はその範囲内に結合するための、又はｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の一部分を操作するための候補分子の構造を提供するステップ、ｃ）候補分子の構造をＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の少なくとも２つの原子にフィッティングするステップであって、フィッティングが、候補分子の１つ以上の原子とＣＲＩＳＰＲ−ＳｐＣａｓ９系の原子との間の相互作用を決定することを含むステップ、及びｄ）候補分子がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系に対して又はその範囲内に結合すると予想される場合、その候補分子を選択するステップを含む。本方法の特定の実施形態において、結晶構造表のＣｐｆ１は９０８位にアスパラギン酸のアミノ酸置換を更に含む。特定の実施形態において、候補分子は結晶構造表のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の原子を含む。ある実施形態において、候補分子はｃｒＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖の原子を含み、これはｃｒＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖の原子をＣｐｆ１の原子と比較することを含む。ある実施形態において、Ｃｐｆ１の原子はＲＥＣローブの原子及び／又はＮＵＣローブの原子を含む。ある実施形態において、Ｃｐｆ１の原子は、ＲＥＣ１ドメインの原子、ＲＥＣ２ドメインの原子、及び／又はＲｕｖＣドメインの原子を含む。ある実施形態において、候補分子はｃｒＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖のＰＡＭ遠位領域の原子を含み、これはｃｒＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖のＰＡＭ遠位領域の原子をＲＥＣ１−ＲＥＣ２ドメインの原子と比較することを含む。ある実施形態において、候補分子はｃｒＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖のＰＡＭ近位領域の原子を含み、これはｃｒＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖のＰＡＭ近位領域の原子をＷＥＤ−ＲＥＣ１−ＲｕｖＣドメインの原子と比較することを含む。特定の非限定的な実施形態において、Ｃｐｆ１の原子は、Ｒ１７６、Ｒ１９２、Ｇ７８３、及び／又はＲ９５１の原子を含む。
【０１１４】
ある実施形態において、候補分子はＰＡＭ二重鎖の原子を含み、これはＷＥＤ−ＲＥＣ及びＰＩドメインによって形成される溝の原子と比較される。特定の非限定的な実施形態において、候補分子はＰＡＭの原子を含み、これはＣｐｆ１のＴｈｒ１６７、Ｌｙｓ６０７、Ｌｙｓ５４８、Ｐｒｏ５９９、及び／又はＭｅｔ６０４の原子と比較される。
【０１１５】
特定の実施形態において、候補分子は標的ＤＮＡ鎖及び／又は非標的ＤＮＡ鎖の原子を含み、これは標的ＤＮＡ鎖及び／又は非標的ＤＮＡ鎖の原子をＣｐｆ１の原子と比較することを含む。候補分子が標的ＤＮＡ鎖の原子を含む特定の実施形態において、標的ＤＮＡ鎖の原子はＣｐｆ１  Ｎｕｃドメインの原子と比較される。候補分子が標的ＤＮＡ鎖の原子を含む特定の実施形態において、標的ＤＮＡ鎖の原子はＣｐｆ１のＡｒｇ１２２６、Ｓｅｒ１２２８、及び／又はＡｓｐ１２３５の原子と比較される。候補分子が非標的ＤＮＡ鎖の原子を含む特定の実施形態において、非標的ＤＮＡ鎖の原子はＣｐｆ１  ＲｕｖＣドメインの原子と比較される。候補分子が非標的ＤＮＡ鎖の原子を含む特定の実施形態において、非標的ＤＮＡ鎖の原子はＣｐｆ１のＡｓｐ９０８、Ｔｒｐ９５８、Ｇｌｕ９９３、及び／又はＡｓｐ１２６３の原子と比較される。特定のかかる実施形態において、Ｌｅｕ４６７、Ｌｅｕ４７１、Ｔｙｒ５１４、Ａｒｇ５１８、Ａｌａ５２１及び／又はＴｈｒ５２２の原子もまた比較される。
【０１１６】
ある実施形態において、候補分子はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の原子を含み、この原子はＣｐｆ１のＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインの原子と比較される。
【０１１７】
ある実施形態において、候補分子はｃｒＲＮＡの５’−ハンドルの原子を含み、この原子はＷＥＤドメインの原子及び／又はＲｕｖＣドメインの原子と比較される。
【０１１８】
本発明の特定の実施形態において、候補分子は合成され、結合又は活性に関して試験される。
【０１１９】
特定の実施形態において、候補分子は細胞におけるＤＮＡ分子の発現の変化に関してＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系で試験される。
【０１２０】
特定の実施形態において、候補分子の構造の比較又はフィッティングには、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体の少なくとも２個の原子、又は少なくとも５個の原子、又は少なくとも１０個の原子、又は少なくとも５０個の原子、又は少なくとも１００個の原子を含む原子座標が関わる。
【０１２１】
本発明の特定の実施形態において、候補分子は、Ｃｐｆ１と、転写リプレッサー、転写活性化因子、ヌクレアーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、タンパク質アセチルトランスフェラーゼ、タンパク質デアセチラーゼ、タンパク質メチルトランスフェラーゼ、タンパク質デアミナーゼ、タンパク質キナーゼ、タンパク質ホスファターゼ、又は後成的調節因子との原子を含む。
【０１２２】
更なる態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系又はその機能性の一部分にフィットする又はそれに結合するように潜在的化合物を同定又は設計するためのコンピュータ支援方法又はその逆（所望の化合物に結合するように潜在的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系又はその機能性の一部分を同定又は設計するためのコンピュータ支援方法）又は潜在的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のうち操作可能な範囲の予想−例えば、結晶構造データに基づくか又はＣｐｆ１オルソログのデータに基づく−に関連して、又はアクチベーター又はリプレッサーなどの機能性基をＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系のどこに付加し得るかに関連して、又はＣｐｆ１トランケーションに関して又はニッカーゼ設計に関して）同定又は設計するためのコンピュータ支援方法を含み、前記方法は、
【０１２３】
プロセッサとデータ記憶システムと入力装置と出力装置とを含むコンピュータシステム、例えばプログラミングされたコンピュータを使用した、以下のステップ：
（ａ）例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系結合ドメインにおける、又はそれに代えて又は加えて、Ｃｐｆ１オルソログ間の差異に基づき異なるドメインにおける、実施例３（「結晶構造表」）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造など、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造からの又はそれに関連する原子のサブセットの三次元座標を含むデータを、又はＣｐｆ１に関して又はニッカーゼに関して又は機能性基に関して、任意選択で１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系複合体からの構造情報と共に、プログラミングされたコンピュータに前記入力装置を用いて入力し、それによりデータセットを作成するステップ；
（ｂ）前記プロセッサを使用して、前記コンピュータデータ記憶システムに記憶された構造、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系に結合するか若しくは推定上結合する又はそれに結合することが所望される化合物の構造のコンピュータデータベースと、又はＣｐｆ１オルソログに関して（例えば、Ｃｐｆ１として又はＣｐｆ１オルソログ間で異なるドメイン又は領域に関して）又は実施例３（「結晶構造表」）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造など、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造に関して又はニッカーゼに関して又は機能性基に関して、前記データセットを比較するステップ；
（ｃ）コンピュータ方法を用いて、１つ又は複数の構造−例えば、所望の構造に結合し得るＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１構造、特定のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１構造に結合し得る所望の構造、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造の他の部分からのデータ及び／又はＣｐｆ１オルソログからのデータに例えば基づき操作され得るＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の一部分、トランケート型Ｃｐｆ１、新規ニッカーゼ又は特定の機能性基、又は機能性基を付加する位置又は機能性基−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を前記データベースから選択するステップ；
（ｄ）コンピュータ方法を用いて、選択された１つ又は複数の構造のモデルを構築するステップ；及び
（ｅ）選択された１つ又は複数の構造を前記出力装置に出力するステップ；
及び任意選択で、選択された構造のうちの１つ以上を合成するステップ；
及び更に任意選択で、前記合成された選択の１つ又は複数の構造をＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系として又はそれにおいて試験するステップを含み；又は、前記方法は、実施例３（「結晶構造表」）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造など、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造の少なくとも２つの原子、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造の結晶構造表の少なくとも２つの原子の座標又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造の少なくともサブドメインの座標（「選択の座標」）を提供するステップ、結合分子を含む候補の構造又は例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造の他の部分からのデータ及び／又はＣｐｆ１オルソログからのデータに基づき操作され得るＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の一部分の構造、又は機能性基の構造を提供するステップ、及び候補の構造を選択の座標にフィッティングし、それにより所望の構造に結合し得るＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１構造、特定のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１構造に結合し得る所望の構造、操作され得るＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の一部分、トランケート型Ｃｐｆ１、新規ニッカーゼ、又は特定の機能性基、又は機能性基を付加する位置又は機能性基−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を含む生成物データを、その出力と共に入手するステップ；及び任意選択で、前記生成物データから１つ又は複数の化合物を合成するステップを含み、及び更に任意選択で、前記合成された１つ又は複数の化合物をＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系として又はそれにおいて試験するステップを含む。
【０１２４】
試験するステップは、前記合成された選択の１つ又は複数の構造から得られたＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を、例えば、結合に関して、又は所望の機能を果たすかに関して分析することを含み得る。
【０１２５】
前述の方法の出力には、データ伝達、例えば、遠隔通信、電話、テレビ会議、マスコミュニケーション、例えば、コンピュータプレゼンテーション（例えばＰＯＷＥＲＰＯＩＮＴ）などのプレゼンテーション、インターネット、電子メール、コンピュータプログラム（例えばＷＯＲＤ）文書などの文書による通信等による情報の伝達が含まれ得る。従って、本発明はまた、実施例３（「結晶構造表」）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造など、本明細書において参照される結晶構造に係る原子座標データであって、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１又はその少なくとも１つのサブドメインの三次元構造を定義付けるデータ、又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１の構造因子データであって、実施例３（「結晶構造表」）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造など、本明細書において参照される結晶構造の原子座標データから導出することが可能な構造因子データを含むコンピュータ可読媒体も包含する。コンピュータ可読媒体はまた、前述の方法の任意のデータも含み得る。本発明は更に、実施例３（「結晶構造表」）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造など、本明細書において参照される結晶構造に係る原子座標データであって、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１又はその少なくとも１つのサブドメインの三次元構造を定義付けるデータ、又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１の構造因子データであって、実施例３（「結晶構造表」）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造など、本明細書において参照される結晶構造の原子座標データから導出することが可能な構造因子データのいずれかを含む、前述の方法にあるとおりの合理的設計を生成又は実施するための方法、コンピュータシステムを包含する。本発明は更に、事業を行う方法であって、コンピュータシステム又は媒体又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１若しくはその少なくとも１つのサブドメインの三次元構造、又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１の構造因子データであって、実施例３（「結晶構造表」）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１結晶構造など、本明細書において参照される結晶構造の原子座標データに示される構造及びそれから導出することが可能な構造因子データ、又は本明細書におけるコンピュータ媒体又は本明細書におけるデータ伝達を使用者に提供するステップを含む方法を包含する。更なる態様は、実施例３（「結晶構造表」）の結晶構造を有する及び／又は前述の一部又は全てに対応する又はそれから得られるＸ線回折パターンを有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系及び／又は以下の結晶構造表の少なくとも２、少なくとも５０、少なくとも１００又は全ての座標によって定義付けられる構造を有する結晶を提供する。
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【０１２６】
改変Ｃｐｆ１酵素
Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）が、Ｃｐｆ１の個別的な領域について記載している。第一にＣ末端ＲｕｖＣ様ドメイン、これは唯一機能的に特徴付けられたドメインである。第二にＮ末端α−ヘリックス領域、及び第三に、ＲｕｖＣ様ドメインとα−ヘリックス領域との間に位置する混合α及びβ領域。
【０１２７】
ここに提供されるＣｐｆ１の結晶構造は、ＤＮＡ相互作用アミノ酸に関する更なる情報を提供する（実施例を参照）。この情報に基づき、酵素の不活性化につながる又は二本鎖ヌクレアーゼをニッカーゼ活性に改変する突然変異体を作成することができる。代替的実施形態では、この情報を用いてオフターゲット効果が低下した酵素（本明細書の他の部分に記載される）が開発される。
【０１２８】
上述のＣｐｆ１酵素の特定の実施態様では、１つ以上の改変または突然変異されたアミノ酸残基は、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６のアミノ酸位置付番を基準として、Ｄ８６１、Ｒ８６２、Ｒ８６３、Ｗ３８２、Ｅ９９３、Ｄ１２６３、Ｄ９０８、Ｗ９５８、Ｋ９６８、Ｒ９５１、Ｒ１２２６、Ｓ１２２８、Ｄ１２３５、Ｋ５４８、Ｍ６０４、Ｋ６０７、Ｔ１６７、Ｎ６３１、Ｎ６３０、Ｋ５４７、Ｋ１６３、Ｑ５７１、Ｋ１０１７、Ｒ９５５、Ｋ１００９、Ｒ９０９、Ｒ９１２、Ｒ１０７２、Ｅ３７２、Ｋ１５、Ｋ８１０、Ｈ７５５、Ｋ５５７、Ｅ８５７、Ｋ９４３、Ｋ１０２２、Ｋ１０２９、Ｋ９４２、Ｋ９４９、Ｒ８４、Ｋ８７、Ｋ２００、Ｈ２０６、Ｒ２１０、Ｒ３０１、Ｒ６９９、Ｋ７０５、Ｋ８８７、Ｒ８９１、Ｋ１０８６、Ｋ１０８９、Ｒ１０９４、Ｒ１１２７、Ｒ１２２０、Ｑ１２２４、Ｎ１７８、Ｎ１９７、Ｎ２０４、Ｎ２５９、Ｎ２７８、Ｎ２８２、Ｎ５１９、Ｎ７４７、Ｎ７５９、Ｎ８７８、Ｎ８８９、及び／又は、１１８９〜１１９７、１２００〜１２０８、３９８〜４００、３８０〜３８３、３６２〜４２０、１１６３〜１１７３、１２３０〜１２３３、１１５２〜１１４８、１０７６〜１２４９の領域にあるいずれか１つのアミノ酸から選択される。好ましい実施態様では、前記の１つ以上の改変または突然変異されたアミノ酸残基は、Ｒ８６２Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｄ１２６３Ａ、Ｄ９０８Ａ、Ｗ９５８Ａ、Ｒ９５１Ａ、Ｒ１２２６Ａ、Ｓ１２２８Ａ、Ｄ１２３５Ａ、Ｋ５４８Ａ、Ｍ６０４Ａ、Ｋ６０７Ａ、Ｋ６０７Ｒ、Ｔ１６７Ｓ、Ｎ６３１Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６３０Ｋ、Ｎ６３０Ｒ、Ｋ５４７Ｒ、Ｋ１６３Ｒ、Ｑ５７１Ｋ、Ｑ５７１Ｒ、Ｋ１００９Ａ、Ｒ９０９Ａ、Ｒ１０７２Ａ、Ｅ３２７Ａ、Ｋ１５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｈ７５５Ａ、Ｋ５５７Ａ、Ｅ８５７Ａ、Ｋ９４３Ａ、Ｋ１０２２Ａ、Ｋ１０２９Ａ、Ｋ９４２Ａ、Ｋ９４９Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ８７Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｈ２０６Ａ、Ｒ２１０Ａ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ６９９Ａ、Ｋ７０５Ａ、Ｋ８８７Ａ、Ｒ８９１Ａ、Ｋ１０８６Ａ、Ｋ１０８９Ａ、Ｒ１０９４Ａ、Ｒ１１２７Ａ、Ｒ１２２０Ａ及びＱ１２２４Ａからなるリストから選択される。好ましい実施態様では、前記の１つ以上の改変または突然変異されたアミノ酸残基は、Ｒ８６２Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｄ１２６３Ａ、Ｄ９０８Ａ、Ｗ９５８Ａ、Ｒ９５１Ａ、Ｋ５４８Ａ、Ｍ６０４Ａ、Ｋ６０７Ａ、Ｋ６０７Ｒ、Ｎ６３１Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６３０Ｋ、Ｎ６３０Ｒ、Ｋ５４７Ｒ、Ｋ１６３Ｒ、Ｑ５７１Ｋ、Ｑ５７１Ｒ、Ｋ１００９Ａ、Ｒ９０９Ａ、Ｒ１０７２Ａ、Ｅ３２７Ａ、Ｋ１５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｈ７５５Ａ、Ｋ５５７Ａ、Ｅ８５７Ａ、Ｋ９４３Ａ、Ｋ１０２２Ａ、Ｋ１０２９Ａ、Ｋ９４２Ａ、Ｋ９４９Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ８７Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｈ２０６Ａ、Ｒ２１０Ａ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ６９９Ａ、Ｋ７０５Ａ、Ｋ８８７Ａ、Ｒ８９１Ａ、Ｋ１０８６Ａ、Ｋ１０８９Ａ、Ｒ１０９４Ａ、Ｒ１１２７Ａ、Ｒ１２２０Ａ及びＱ１２２４Ａからなるリストから選択される；好ましい実施態様では、前記の１つ以上の改変または突然変異されたアミノ酸残基は、Ｎ１７８、Ｎ１９７、Ｎ２０４、Ｎ２５９、Ｎ２７８、Ｎ２８２、Ｎ５１９、Ｎ７４���、Ｎ７５９、Ｎ８７８、Ｎ８８９から選択される。好ましい実施態様では、前記の１つ以上の改変または突然変異されたアミノ酸残基は、Ｒ８６２Ａ、Ｗ９５８Ａ、Ｒ９５１Ａ、Ｒ１２２６Ａ、Ｓ１２２８Ａ、Ｄ１２３５Ａ、Ｋ５４８Ａ、Ｍ６０４Ａ、Ｋ６０７Ａ、Ｋ６０７Ｒ、Ｔ１６７Ｓ、Ｎ６３１Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６３０Ｋ、Ｎ６３０Ｒ、Ｋ５４７Ｒ、Ｋ１６３Ｒ、Ｑ５７１Ｋ、Ｑ５７１Ｒ、Ｋ１００９Ａ、Ｒ９０９Ａ、Ｒ１０７２Ａ、Ｅ３２７Ａ、Ｋ１５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｈ７５５Ａ、Ｋ５５７Ａ、Ｅ８５７Ａ、Ｋ９４３Ａ、Ｋ１０２２Ａ、Ｋ１０２９Ａ、Ｋ９４２Ａ、Ｋ９４９Ａ、Ｒ８４Ａ、Ｋ８７Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｈ２０６Ａ、Ｒ２１０Ａ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ６９９Ａ、Ｋ７０５Ａ、Ｋ８８７Ａ、Ｒ８９１Ａ、Ｋ１０８６Ａ、Ｋ１０８９Ａ、Ｒ１０９４Ａ、Ｒ１１２７Ａ、Ｒ１２２０Ａ及びＱ１２２４Ａからなるリストから選択される。好ましい実施態様では、前記の１つ以上の改変または突然変異されたアミノ酸残基は、Ｄ８６１、Ｗ９５８、Ｓ１２２８、Ｄ１２３５、Ｔ１６７、Ｎ６３１、Ｎ６３０、Ｋ５４７、Ｋ１６３、Ｑ５７１、Ｒ１２２６、Ｅ３７２、Ｋ１５、Ｋ８１０、Ｈ７５５、Ｋ５５７、Ｅ８５７、Ｋ９４３、Ｋ１０２２、Ｋ１０２９、Ｋ９４２、Ｋ９４９、Ｒ８４、Ｋ８７、Ｋ２００、Ｈ２０６、Ｒ２１０、Ｒ３０１、Ｒ６９９、Ｋ７０５、Ｋ８８７、Ｒ８９１、Ｋ１０８６、Ｋ１０８９、Ｒ１０９４、Ｒ１１２７、Ｒ１２２０、Ｑ１２２４、Ｎ１７８、Ｎ１９７、Ｎ２０４、Ｎ２５９、Ｎ２７８、Ｎ２８２、Ｎ５１９、Ｎ７４７、Ｎ７５９、Ｎ８７８、Ｎ８８９、及び／又は、１１８９〜１１９７、１２００〜１２０８、３９８〜４００、３８０〜３８３、３６２〜４２０、１１６３〜１１７３、１２３０〜１２３３、１１５２〜１１４８、１０７６〜１２４９の領域にあるいずれか１つのアミノ酸から選択される。詳細な実施形態において、突然変異はＲ８６２Ａであり、前記Ｃｐｆ１酵素はもはやＲＮＡに結合しない。詳細な実施形態において、１つ以上の突然変異は、Ｋ１５Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｈ７５５Ａ、Ｋ５５７Ａ、Ｅ８５７Ａ、Ｒ８６２Ａ、Ｋ９４３Ａ、Ｋ１０２２Ａ及びＫ１０２９Ａから選択され、前記Ｃｐｆ１酵素はもはやＲＮＡ結合能及び／又はプロセシング能を有しない。詳細な実施形態において、前記１つ以上の突然変異は、Ｋ５４７８Ａ、Ｋ６０７Ａ及びＭ６０４Ａから選択され、ＴＴＴ特異性が低下し、又は除去される。詳細な実施形態において、前記１つ以上の突然変異は、Ｎ６３１Ｋ、Ｎ６１３Ｒ、Ｎ６３０Ｋ、Ｎ６３０Ｒ、Ｋ５４７Ｒ、Ｋ１６３Ｒ、Ｑ５７１Ｋ、Ｑ５７１Ｒ及びＫ６０７Ｒから選択され、前記Ｃｐｆ１酵素の非特異的ＤＮＡ相互作用が増加する。詳細な実施形態において、前記１つ以上の突然変異は、Ｒ８４Ａ、Ｋ８７Ａ、Ｋ２００Ａ、Ｈ２０６Ａ、Ｒ２１０Ａ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ６９９Ａ、Ｋ７０５Ａ、Ｋ８８７Ａ、Ｒ８９１Ａ、Ｋ１０８６Ａ、Ｋ１０８９Ａ、Ｒ１０９４Ａ、Ｒ１１２７Ａ、Ｒ１２２０Ａ及びＱ１２２４Ａから選択され、それによって前記酵素の前記特異性が増加又は減少する。詳細な実施形態において、Ｄ８６１、Ｒ８６２、Ｒ８６３及びＷ３８２のうちの１つ以上が突然変異しており、前記Ｃｐｆ１のＲＮＡ結合性が乱れてい���。詳細な実施形態において、アミノ酸Ｗ９５８、Ｋ９６８、Ｒ９５１、Ｒ１２２６、Ｄ１２５３及びＴ１６７のうちの１つ以上及びＣｐｆ１の安定性が影響を受けている。詳細な実施形態において、Ｋ９６８及びＲ９５１のうちの１つ以上が突然変異しており、前記Ｃｐｆ１のＤＮＡ結合性が乱れている。詳細な実施形態において、Ｎ６３１及びＮ６３０のうちの１つ以上が突然変異しており、ＤＮＡ骨格のリン酸との相互作用が増加している。詳細な実施形態において、以下のアミノ酸：ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として、Ｌ１１７、Ｔ１１８、Ｄ１１９、Ｔ１５０、Ｔ１５１、Ｔ１５２、Ｒ３４１、Ｎ３４２、Ｅ３４３、Ｔ３９８、Ｇ３９９、Ｋ４００、Ｄ４５１、Ｑ４５２、Ｐ４５３、Ｌ４５４、Ｐ４５５、Ｔ４５６、Ｔ４５７、Ｌ４５８、Ｋ４５９、Ｖ４８６、Ｄ４８７、Ｅ４８８、Ｓ４８９、Ｎ４９０、Ｅ４９１、Ｖ４９２、Ｄ４９３、Ｐ４９４、Ｅ５０６、Ｍ５０７、Ｅ５０８、Ｑ５７１、Ｋ５７２、Ｇ５７３、Ｒ５７４、Ｙ５７５、Ｔ６２１、Ｅ６４９、Ｋ６５０、Ｅ６５１、Ｄ６６５、Ｔ７３７、Ｄ７４９、Ｆ７５０、Ｋ８１５、Ｎ８４８、Ｖ１１０８、Ｋ１１０９、Ｔ１１１０、Ｇ１１１１、Ｓ１１２４、Ａ１１９５、Ａ１１９６、Ａ１１９７、Ｎ１１９８、Ｌ１２４４、Ｎ１２４５及び／又はＧ１２４６のうちの１つ以上が突然変異しており、それによってＣｐｆ１酵素の安定性及び／又は活性が実質的に影響を受けていない。
【０１２９】
上述のＣｐｆ１酵素の特定のものにおいて、酵素は、限定はされないが、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として８８４〜１３０７位、例えば、９９３、１２６３及び／又は９８０位を含めた１つ以上の残基（ＲｕｖＣドメイン内）の突然変異によって改変される。
【０１３０】
平均より高いＢ因子を持つ領域における改変
高分子結晶構造における秩序が低い領域（限定はされないが、ディスオーダー領域又は非構造化領域を含む）、特にタンパク質の溶媒露出領域内にある秩序が低い領域（限定はされないがループを含む）は、構造又は機能を容認し難いほど不安定化させることなく改変し得る領域を示す。Ｂ因子、温度因子、熱因子、デバイ・ワラー因子、原子変位パラメータ及び類似の用語は、結晶構造における（例えば、温度依存性原子振動又は結晶格子における静的ディスオーダーの結果としての）その平均位置からの原子の変位の指標となる値に関する。従ってタンパク質の溶媒露出領域の骨格原子の平均より高いＢ因子は、局所移動度が比較的高い領域又はタンパク質構造若しくは機能を容認し難いほど不安定化させることなく改変し得る領域の指標となる。従って、本明細書に記載されるＣｐｆ１酵素の特定のものにおいて、Ｃｐｆ１酵素は、全タンパク質又は溶媒露出領域を含むタンパク質ドメインと比較して平均より高いＢ因子を持つ１つ以上の骨格原子を有する溶媒露出領域で１つ以上の置換、挿入、欠失又は他の改変によって改変される。Ｃｐｆ１酵素の特定のものにおいて、酵素は、１つ以上の残基を含むタンパク質の平均Ｂ因子と比べて５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、又は２００％超高いＢ因子を持つＣα原子を有する前記１つ以上の残基で改変される。Ｃｐｆ１酵素の特定のものにおいて、酵素は、１つ以上の残基を含むタンパク質ドメイン（例えばＣ末端ＲｕｖＣ様ドメイン、Ｎ末端αヘリックス領域、又は前記Ｎ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間のα及びβ混合領域）の平均Ｂ因子と比べて５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％又は２００％超高いＢ因子を持つＣα原子を有する前記残基で改変される。Ｃｐｆ１酵素の特定のものにおいて、酵素は、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として、Ｌ１１７、Ｔ１１８、Ｄ１１９、Ｔ１５０、Ｔ１５１、Ｔ１５２、Ｒ３４１、Ｎ３４２、Ｅ３４３、Ｔ３９８、Ｇ３９９、Ｋ４００、Ｄ４５１、Ｑ４５２、Ｐ４５３、Ｌ４５４、Ｐ４５５、Ｔ４５６、Ｔ４５７、Ｌ４５８、Ｋ４５９、Ｖ４８６、Ｄ４８７、Ｅ４８８、Ｓ４８９、Ｎ４９０、Ｅ４９１、Ｖ４９２、Ｄ４９３、Ｐ４９４、Ｅ５０６、Ｍ５０７、Ｅ５０８、Ｑ５７１、Ｋ５７２、Ｇ５７３、Ｒ５７４、Ｙ５７５、Ｔ６２１、Ｅ６４９、Ｋ６５０、Ｅ６５１、Ｄ６６５、Ｔ７３７、Ｄ７４９、Ｆ７５０、Ｋ８１５、Ｎ８４８、Ｖ１１０８、Ｋ１１０９、Ｔ１１１０、Ｇ１１１１、Ｓ１１２４、Ａ１１９５、Ａ１１９６、Ａ１１９７、Ｎ１１９８、Ｌ１２４４、Ｎ１２４５及び／又はＧ１２４６において１つ以上の置換、挿入、欠失又は他の改変によって改変される。
【０１３１】
非活性化／不活性化Ｃｐｆ１タンパク質
Ｃｐｆ１タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する場合、Ｃｐｆ１タンパク質は、低下したヌクレアーゼ活性、例えば、野生型酵素と比較したとき少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％のヌクレアーゼ不活性化を有するように改変することができ；又は別の言い方をすれば、Ｃｐｆ１酵素は有利には、非突然変異型又は野生型Ｃｐｆ１酵素又はＣＲＩＳＰＲ酵素の約０％のヌクレアーゼ活性、又は非突然変異型又は野生型Ｃｐｆ１酵素、例えば非突然変異型又は野生型アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）Ｃｐｆ１酵素又はＣＲＩＳＰＲ酵素の約３％又は約５％又は約１０％以下のヌクレアーゼ活性を有する。これは、Ｃｐｆ１及びそのオルソログのヌクレアーゼドメインに突然変異を導入することによって可能である。
【０１３２】
より詳細には、不活性化Ｃｐｆ１酵素は、ＡｓＣｐｆ１においてＡｓＣｐｆ１のヌクレアーゼ活性に直接又は間接的に寄与すると同定されたアミノ酸位置又はＣｐｆ１オルソログにおける対応する位置において突然変異した酵素を含む。
【０１３３】
不活性化Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ酵素には、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性、及び分子スイッチ（例えば、光誘導性）を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる群からの１つ以上のドメインを含め、１つ以上の機能性ドメインが（例えば融合タンパク質を介して）会合していてもよい。好ましいドメインは、Ｆｏｋ１、ＶＰ６４、Ｐ６５、ＨＳＦ１、ＭｙｏＤ１である。Ｆｏｋ１が提供される場合、機能性二量体を実現するため複数のＦｏｋ１機能性ドメインが提供され、且つｇＲＮＡが、Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３２，Ｎｕｍｂｅｒ  ６，Ｊｕｎｅ  ２０１４）に具体的に記載されるとおり機能的使用（Ｆｏｋ１）に適切な間隔を提供するように設計されることが有利である。アダプタータンパク質は、公知のリンカーを利用してかかる機能性ドメインを結合し得る。場合によっては、更に少なくとも１つのＮＬＳが提供されることが有利である。場合によっては、ＮＬＳをＮ末端に配置することが有利である。２つ以上の機能性ドメインが含まれる場合、それらの機能性ドメインは同じであっても、又は異なってもよい。
【０１３４】
一般に、不活性化Ｃｐｆ１酵素上の１つ以上の機能性ドメインの位置は、機能性ドメインがその備えている機能的効果を標的に及ぼすのに正しい空間的配置を可能にするものである。例えば、機能性ドメインが転写アクチベーター（例えば、ＶＰ６４又はｐ６５）である場合、転写アクチベーターは、それが標的の転写に影響を及ぼすことが可能な空間的配置で置かれる。同様に、転写リプレッサーは、有利には標的の転写に影響を及ぼすように配置されることになり、及びヌクレアーゼ（例えばＦｏｋ１）は、有利には標的を切断又は部分的に切断するように配置されることになる。これには、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ末端／Ｃ末端以外の位置が含まれ得る。
【０１３５】
本発明に係る酵素は、機能スクリーニングに有益な最適化された機能性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において適用することができる
従って、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質−ガイドＲＮＡ複合体が全体として２つ以上の機能性ドメインと会合し得ることもまた想定される。例えば、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と会合した２つ以上の機能性ドメインがあってもよく、又はガイドＲＮＡと（１つ以上のアダプタータンパク質を介して）会合した２つ以上の機能性ドメインがあってもよく、又は核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と会合した１つ以上の機能性ドメイン及びガイドＲＮＡと（１つ以上のアダプタータンパク質を介して）会合した１つ以上の機能性ドメインがあってもよい。
【０１３６】
２つの異なるアプタマー（各々個別の核酸ターゲティングガイドＲＮＡと会合している）を用いると、アクチベーター−アダプタータンパク質融合物及びリプレッサー−アダプタータンパク質融合物を異なる核酸ターゲティングガイドＲＮＡと共に使用して、１つのＤＮＡ又はＲＮＡの発現を活性化する一方で別のＤＮＡ又はＲＮＡの発現を抑制することが可能になる。これらは、それらの異なるガイドＲＮＡと共に、多重化手法で一緒に、又は実質的に一緒に投与することができる。比較的少数のエフェクタータンパク質分子を多数の改変ガイドと共に使用することができるため、例えば１０又は２０又は３０個など、多数のかかる改変された核酸ターゲティングガイドＲＮＡを全て同時に使用する一方で、１つのみの（又は少なくとも最小数の）エフェクタータンパク質分子を送達するだけでよい。アダプタータンパク質は１つ以上のアクチベーター又は１つ以上のリプレッサーと会合（好ましくは連結又は融合）してもよい。例えば、アダプタータンパク質は第１のアクチベーター及び第２のアクチベーターと会合してもよい。第１及び第２のアクチベーターは同じであってもよいが、これらは好ましくは異なるアクチベーターである。３つ以上又は更には４つ以上のアクチベーター（又はリプレッサー）を使用してもよく、しかしパッケージサイズにより、個数が５を超える異なる機能性ドメインとなることは制限され得る。２つ以上の機能性ドメインがアダプタータンパク質と会合するアダプタータンパク質との直接的な融合と比べて、好ましくはリンカーが用いられる。好適なリンカーとしてはＧｌｙＳｅｒリンカーを挙げることができる。
【０１３７】
アダプタータンパク質とアクチベーター又はリプレッサーとの間の融合は、リンカーを含み得る。例えば、ＧｌｙＳｅｒリンカーＧＧＧＳ（配列番号１８）を使用することができる。これらを３個（（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１９））又は６個（配列番号２０）、９個（配列番号２１）又は更には１２個（配列番号２２）又はそれ以上の反復で使用することにより、必要に応じて好適な長さを提供することができる。リンカーは、ガイドＲＮＡと機能ドメイン（アクチベーター又はリプレッサー）との間、又は核酸ターゲティングＣａｓタンパク質（Ｃａｓ）と機能ドメイン（アクチベーター又はリプレッサー）との間に使用することができる。リンカー、使用者は適切な量の「機械的柔軟性」を操作する。
【０１３８】
本発明は、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質とガイドＲＮＡとを含む核酸ターゲティング複合体を包含し、ここで核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は少なくとも１つの突然変異［そのため核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は、その少なくとも１つの突然変異を有しない核酸ターゲティングエフェクタータンパク質の５％以下の活性を有する］、及び任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み；ガイドＲＮＡは、細胞内の目的のＲＮＡにおける標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含み；及びここで：核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は２つ以上の機能ドメインと会合し；又はガイドＲＮＡの少なくとも１つのループが、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する１つ又は複数の個別的なＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及びここでアダプタータンパク質は２つ以上の機能ドメインと会合し；又は核酸ターゲティングＣａｓタンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合し、及びガイドＲＮＡの少なくとも１つのループが、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及びここでアダプタータンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合する。
【０１３９】
ある態様において、本発明は、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むＶ型、より詳細にはＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を提供し、ここでガイドＲＮＡは、２つ以上のアダプタータンパク質（例えばアプタマー）に結合する１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及び各アダプタータンパク質は１つ以上の機能性ドメインと会合しているか；又は、ここでガイドＲＮＡは少なくとも１つの非コード機能性ループを有するように改変される。詳細な実施形態では、ガイドＲＮＡは、ダイレクトリピートの５’側、ダイレクトリピート内、又はガイド配列の３’側への１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変される。２つ以上の機能性ドメインがあるとき、それらの機能性ドメインは同じであっても又は異なってもよく、例えば、同じ２つの又は２つの異なるアクチベーター又はリプレッサーであり得る。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのガイドＲＮＡと、Ｃｐｆ１酵素であるＣＲＩＳＰＲ酵素［任意選択でＣｐｆ１酵素は少なくとも１つの突然変異を含み、そのためＣｐｆ１酵素は、その少なくとも１つの突然変異を有しないＣｐｆ１酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有し、及び任意選択で、少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む１つ以上を含む］とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体組成物を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書において考察されるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ又はＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体であって、２つ以上のアダプタータンパク質を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含む複合体を提供し、ここで各タンパク質は１つ以上の機能性ドメインと会合し、及びアダプタータンパク質は、ガイドＲＮＡに挿入された１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列に結合する。詳細な実施形態では、ガイドＲＮＡは、それに加えて又は代えて、Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体の結合をなおも確保するが、しかしＣｐｆ１酵素による切断は防ぐように改変される。
【０１４０】
オフターゲット効果を低下させる酵素突然変異
一態様において、本発明は、オフターゲット効果の低下をもたらす１つ以上の突然変異を有する本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ酵素、好ましくはクラス２  ＣＲＩＳＰＲ酵素、好ましくはＶ型又はＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば好ましくは、限定はされないが、本明細書の他の部分に記載されるとおりのＣｐｆ１、即ち、標的遺伝子座に改変を生じさせるのに用いられるが、しかしガイドＲＮＡと複合体化したときなどの、オフターゲットに向けた活性は低下又は消失させる改良されたＣＲＩＳＰＲ酵素、並びにガイドＲＮＡと複合体を形成したときなどの、ＣＲＩＳＰＲ酵素の活性を増加させるための改良されたＣＲＩＳＰＲ酵素を提供する。本明細書において以下に記載するとおりの突然変異酵素は、本明細書の他の部分に記載されるとおりの本発明に係る方法のいずれにおいても用いられ得ることが理解されるべきである。本明細書の他の部分に記載されるとおりの方法、産物、組成物及び使用のいずれも、同様に以下に更に詳述するとおりの突然変異ＣＲＩＳＰＲ酵素に適用可能である。本明細書に記載されるとおりの態様及び実施形態において、Ｃｐｆ１をＣＲＩＳＰＲ酵素として参照するとき又は読めるとき、機能性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の再構成は、好ましくはｔｒａｃｒ配列を必要とせず又はそれに依存せず、及び／又はダイレクトリピートはガイド（標的又はスペーサー）配列の５’（上流）側にあることが理解されるべきである。
【０１４１】
Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、近年、特異性が増強されたＣａｓ９オルソログの作成方法を記載した（Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１５「特異性が改善された合理的にエンジニアリングされたＣａｓ９ヌクレアーゼ（Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」）。このストラテジーを用いると、Ｃｐｆ１酵素の特異性を増強することができる。突然変異誘発用の主な残基は好ましくは、全てがＲｕｖＣドメイン内の正電荷残基である。更なる残基は、異なるオルソログ間で保存されている正電荷残基である。
【０１４２】
特定の実施形態において、酵素は、限定はされないが、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｒ９０９、Ｒ９１２、Ｒ９３０、Ｒ９４７、Ｋ９４９、Ｒ９５１、Ｒ９５５、Ｋ９６５、Ｋ９６８、Ｋ１０００、Ｋ１００２、Ｒ１００３、Ｋ１００９、Ｋ１０１７、Ｋ１０２２、Ｋ１０２９、Ｋ１０３５、Ｋ１０５４、Ｋ１０７２、Ｋ１０８６、Ｒ１０９４、Ｋ１０９５、Ｋ１１０９、Ｋ１１１８、Ｋ１１４２、Ｋ１１５０、Ｋ１１５８、Ｋ１１５９、Ｒ１２２０、Ｒ１２２６、Ｒ１２４２、及び／又はＲ１２５２を含めた、（ＲｕｖＣドメイン内の）１つ以上の残基の突然変異によって改変される。上述の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の特定のものにおいて、酵素は、限定はされないが、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）のアミノ酸位置付番を基準として位置Ｋ３２４、Ｋ３３５、Ｋ３３７、Ｒ３３１、Ｋ３６９、Ｋ３７０、Ｒ３８６、Ｒ３９２、Ｒ３９３、Ｋ４００、Ｋ４０４、Ｋ４０６、Ｋ４０８、Ｋ４１４、Ｋ４２９、Ｋ４３６、Ｋ４３８、Ｋ４５９、Ｋ４６０、Ｋ４６４、Ｒ６７０、Ｋ６７５、Ｒ６８１、Ｋ６８６、Ｋ６８９、Ｒ６９９、Ｋ７０５、Ｒ７２５、Ｋ７２９、Ｋ７３９、Ｋ７４８、及び／又はＫ７５２を含めた、（ＲＡＤ５０ドメイン内の）１つ以上の残基の突然変異によって改変される。
【０１４３】
特定の実施形態において、Ｃｐｆ１の特異性は、非標的ＤＮＡ鎖を安定させる残基を突然変異させることにより改善し得る。
【０１４４】
ある態様において、本発明はまた、Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）結合活性及び／又は結合特異性を調節する方法及び突然変異も提供する。特定の実施形態において、ヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）タンパク質が用いられる。特定の実施形態において、Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）ヌクレアーゼの結合を促進するがヌクレアーゼ活性は促進しない、改変されたガイドＲＮＡが利用される。かかる実施形態では、オンターゲット結合を増加又は減少させることができる。また、かかる実施形態では、オフターゲット結合を増加又は減少させることもできる。更に、オンターゲット結合対オフターゲット結合に関して特異性の増加又は減少があり得る。
【０１４５】
オンターゲット対オフターゲット活性の活性及び／又は特異性を増加又は減少させるため、又はオンターゲット対オフターゲット結合の結合及び／又は特異性を増加又は減少させるため様々な組み合わせで利用し得る方法及び突然変異を用いて、他の効果が促進されるように加えられる突然変異又は改変を補償し又は増強することができる。他の効果が促進されるように加えられるかかる突然変異又は改変には、Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）に対する突然変異又は改変及び／又はガイドＲＮＡに加えられる突然変異又は改変が含まれる。特定の実施形態において、本方法及び突然変異は、化学的に改変されたガイドＲＮＡと共に用いられる。ガイドＲＮＡの化学的改変の例としては、限定なしに、１つ以上の末端ヌクレオチドにおける２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、２’−Ｏ−メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、又は２’−Ｏ−メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）の取込みが挙げられる。かかる化学的に改変されたガイドＲＮＡは、改変されていないガイドＲＮＡと比較したとき高い安定性及び高い活性を含むことができ、しかしながらオンターゲット対オフターゲット特異性は予測不可能である（Ｈｅｎｄｅｌ，２０１５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）：９８５−９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０，オンライン発行  ２９  Ｊｕｎｅ  ２０１５を参照）。化学的に改変されたガイドＲＮＡには、限定なしに、ホスホロチオエート結合を有するＲＮＡ及びリボース環の２’及び４’炭素間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドが更に含まれる。本発明の方法及び突然変異は、化学的に改変されたガイドＲＮＡによるＣａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）ヌクレアーゼ活性及び／又は結合の調節に用いられる。
【０１４６】
ある態様において、本発明は、ヌクレアーゼ、転写アクチベーター、転写リプレッサーなどの機能ドメインを含む本明細書に定義するとおりの本発明に係るＣａｓ（例えばＣｐｆ１）タンパク質の結合及び／又は結合特異性を改変するための方法及び突然変異を提供する。例えば、Ｃａｓ（例えばＣｐｆ１）タンパク質は、例えば本明細書の他の部分に記載されるＣｐｆ１突然変異などの突然変異を導入することによってヌクレアーゼヌルにする、又はヌクレアーゼ活性が変化した又は低下したものにすることができ、例えば、ＡｓＣｐｆ１タンパク質によるＤ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｄ１２６３Ａ又はオルソログにおける対応する位置を含む。ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）タンパク質は、機能ドメインのＲＮＡガイド下標的配列依存性送達に有用である。本発明は、Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）タンパク質の結合を調節する方法及び突然変異を提供する。一実施形態において、機能ドメインは、ＲＮＡガイド下転写因子を提供するＶＰ６４を含む。別の実施形態において、機能ドメインは、ＲＮＡガイド下ヌクレアーゼ活性を提供するＦｏｋ  Ｉを含む。米国特許出願公開第２０１４／０３５６９５９号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３４２４５６号明細書、米国特許出願公開第２０１５／００３１１３２号明細書、及びＭａｌｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２１）：８２３−６，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３２０３３，オンライン発行  ３  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１３が挙げられ、及び本明細書の教示を通じて、本発明は、本明細書の教示と関連して適用されるこれらの文献の方法及び材料を包含する。特定の実施形態において、オンターゲット結合が増加する。特定の実施形態において、オフターゲット結合が減少する。特定の実施形態において、オンターゲット結合が減少する。特定の実施形態において、オフターゲット結合が増加する。従って、本発明はまた、機能性Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）結合タンパク質のオンターゲット結合対オフターゲット結合の特異性を増加又は減少させることも提供する。
【０１４７】
ＲＮＡガイド下結合タンパク質としてのＣａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）の使用はヌクレアーゼヌルＣａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）に限定されない。ヌクレアーゼ活性を含むＣａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）酵素もまた、特定のガイドＲＮＡと共に用いられるとき、ＲＮＡガイド下結合タンパク質として機能し得る。例えば低分子ガイドＲＮＡ及び標的とミスマッチのヌクレオチドを含むガイドＲＮＡが、標的切断はほとんど又は全くなしに、標的配列へのＲＮＡによって導かれるＣａｓ９結合を促進することができる（例えば、Ｄａｈｌｍａｎ，２０１５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（１１）：１１５９−１１６１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３３９０，オンライン発行  ０５  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１５を参照）。ある態様において、本発明は、ヌクレアーゼ活性を含むＣａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）タンパク質の結合を調節する方法及び突然変異を提供する。特定の実施形態において、オンターゲット結合が増加する。特定の実施形態において、オフターゲット結合が減少する。特定の実施形態において、オンターゲット結合が減少する。特定の実施形態において、オフターゲット結合が増加する。特定の実施形態において、オンターゲット結合対オフターゲット結合の特異性の増加又は減少がある。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ−Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）酵素のヌクレアーゼ活性もまた調節される。
【０１４８】
ＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二重鎖形成が、ＰＡＭに最も近いシード領域配列のみならず、標的領域全体にわたる切断活性及び特異性に重要である。従って、トランケート型ガイドＲＮＡは切断活性及び特異性の低下を示す。ある態様において、本発明は、変化したガイドＲＮＡを用いて切断の活性及び特異性を増加させる方法及び突然変異を提供する。
【０１４９】
天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の任意のものにおいて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は１つ以上の異種機能ドメインを含み得る。
【０１５０】
１つ以上の異種機能ドメインには１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインが含まれ得る。１つ以上の異種機能ドメインには少なくとも２つ以上のＮＬＳが含まれ得る。
【０１５１】
１つ以上の異種機能ドメインには１つ以上の転写活性化ドメインが含まれる。転写活性化ドメインにはＶＰ６４が含まれ得る。
【０１５２】
１つ以上の異種機能ドメインには１つ以上の転写抑制ドメインが含まれる。転写抑制ドメインにはＫＲＡＢドメイン又はＳＩＤドメインが含まれ得る。
【０１５３】
１つ以上の異種機能ドメインには１つ以上のヌクレアーゼドメインが含まれ得る。１つ以上のヌクレアーゼドメインにはＦｏｋ１が含まれ得る。
【０１５４】
１つ以上の異種機能ドメインは以下の活性の１つ以上を有し得る：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖ＲＮＡ切断活性、二本鎖ＲＮＡ切断活性、一本鎖ＤＮＡ切断活性、二本鎖ＤＮＡ切断活性及び核酸結合活性。
【０１５５】
少なくとも１つ以上の異種機能ドメインは、酵素のアミノ末端又はその近傍及び／又は酵素のカルボキシ末端又はその近傍にあり得る。
【０１５６】
１つ以上の異種機能ドメインはＣＲＩＳＰＲ酵素と融合しているか、又はＣＲＩＳＰＲ酵素に係留されているか、又はリンカー部分によってＣＲＩＳＰＲ酵素に連結されていてもよい。
【０１５７】
天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の任意のものにおいて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、プレボテラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７  １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）、又はポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）（例えば、本明細書に記載されるとおり改変されたこれらの生物のうちの１つのＣｐｆ１）を含む属の生物由来のＣＲＩＳＰＲ酵素を含むことができ、及び更なる突然変異若しくは変化を含み得るか、又はキメラＣａｓ（例えばＣｐｆ１）であり得る。
【０１５８】
天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の任意のものにおいて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、第１のＣａｓ（例えばＣｐｆ１）オルソログ由来の第１の断片と第２のＣａｓ（例えばＣｐｆ１）オルソログ由来の第２の断片とを含むキメラＣａｓ（例えばＣｐｆ１）酵素を含むことができ、第１及び第２のＣａｓ（例えばＣｐｆ１）オルソログは異なる。第１及び第２のＣａｓ（例えばＣｐｆ１）オルソログのうちの少なくとも一方は、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、プレボテラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７  １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア細菌（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア細菌（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）、又はポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）を含む生物由来のＣａｓ（例えばＣｐｆ１）を含み得る。
【０１５９】
天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の任意のものにおいて、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするヌクレオチド配列は真核生物での発現にコドンが最適化されていてもよい。
【０１６０】
天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の任意のものにおいて、細胞は真核細胞又は原核細胞であってもよい；ここでＣＲＩＳＰＲ複合体は細胞において作動可能であり、それによってＣＲＩＳＰＲ複合体の酵素は非改変酵素と比較したとき細胞の１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下し、及び／又はそれによってＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加する。
【０１６１】
従って、ある態様において、本発明は、本明細書に定義するとおりのエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲタンパク質又は系を含む真核細胞を提供する。
【０１６２】
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの方法は、１つ以上の目的の遺伝子のプロモーターを含む調節エレメントと細胞内で作動可能に接続した１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸が提供又は導入されるＣｐｆ１トランスジェニック細胞を提供するステップを含み得る。本明細書で使用されるとき、用語「Ｃｐｆ１トランスジェニック細胞」は、Ｃｐｆ１遺伝子がゲノム的に組み込まれている真核細胞などの細胞を指す。細胞の性質、タイプ、又は起源は、本発明によれば特に限定されない。また、Ｃｐｆ１トランス遺伝子を細胞に導入する方法も様々であってよく、当該技術分野において公知のとおりの任意の方法であり得る。特定の実施形態において、Ｃｐｆ１トランスジェニック細胞は、単離細胞にＣｐｆ１トランス遺伝子を導入することによって得られる。特定の他の実施形態において、Ｃｐｆ１トランスジェニック細胞は、Ｃｐｆ１トランスジェニック生物から細胞を単離することによって得られる。例として、及び限定なしに、本明細書において言及されるとおりのＣｐｆ１トランスジェニック細胞は、Ｃｐｆ１ノックイン真核生物など、Ｃｐｆ１トランスジェニック真核生物に由来してもよい。国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ１３／７４６６７号明細書）（参照により本明細書に援用される）が参照される。Ｒｏｓａ遺伝子座の標的化に関するＳａｎｇａｍｏ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２０１２００１７２９０号明細書及び同第２０１１０２６５１９８号明細書の方法を、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃｐｆ１系を利用するように改変し得る。Ｒｏｓａ遺伝子座の標的化に関するＣｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡された米国特許出願公開第２０１３０２３６９４６号明細書の方法もまた、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃｐｆ１系を利用するように改変し得る。更なる例として、Ｃａｓ９ノックインマウスについて記載しているＰｌａｔｔ  ｅｔ．ａｌ．（Ｃｅｌｌ；１５９（２）：４４０−４５５（２０１４））（参照により本明細書に援用される）が参照され、及びこれは本明細書に定義するとおりの本発明のＣＲＩＳＰＲ酵素に当てはめることができる。Ｃｐｆ１トランス遺伝子はＬｏｘ−Ｓｔｏｐ−ポリＡ−Ｌｏｘ（ＬＳＬ）カセットを更に含んでもよく、それによりＣｐｆ１発現をＣｒｅリコンビナーゼによって誘導可能なものにすることができる。或いは、Ｃｐｆ１トランスジェニック細胞は、単離細胞にＣｐｆ１トランス遺伝子を導入することによって得てもよい。トランス遺伝子の送達系は当該技術分野において周知である。例として、Ｃｐｆ１トランス遺伝子は、同様に本明細書の他の部分に記載されるとおり、例えば真核細胞においてベクター（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス）及び／又は粒子及び／又はナノ粒子送達を用いて送達し得る。
【０１６３】
当業者は、本明細書において参照されるとおりのＣｐｆ１トランスジェニック細胞などの細胞が、例えば、及び限定なしに、Ｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４），Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）又はＫｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．．（２００９）に記載されるとおり、組み込まれたＣｐｆ１遺伝子を有することに加えて更なるゲノム変化を含み、又はＣｐｆ１を標的遺伝子座にガイドすることが可能なＲＮＡと複合体を形成したときＣｐｆ１の配列特異的作用によって生じる突然変異、例えば１つ以上の発癌突然変異などを含み得ることを理解するであろう。
【０１６４】
本発明はまた、本節に記載されるなどの、本明細書に記載されるとおりのエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む組成物も提供する。
【０１６５】
本発明はまた、上記に記載される任意の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を含む天然に存在しないエンジニアリングされた組成物も提供する。
【０１６６】
ある態様において、本発明は、１つ以上のベクターを含むベクター系を提供し、ここで１つ以上のベクターは、
ａ）本明細書に定義するとおりのエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１の調節エレメント；及び任意選択で、
ｂ）ガイド配列、ダイレクトリピート配列を含むガイドＲＮＡを含む１つ以上の核酸分子をコードする１つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントを含み、任意選択で構成成分（ａ）及び（ｂ）は同じ又は異なるベクターに位置する。
【０１６７】
本発明はまた、
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体構成成分又は前記構成成分を含むか若しくはそれをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を細胞に送達するように作動可能に構成された送達系であって、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は細胞において作動可能である、送達系
を含む天然に存在しないエンジニアリングされた組成物も提供し、
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体構成成分又は細胞における転写及び／又は翻訳のためＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列は、
（Ｉ）本明細書に記載の天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、エンジニアリングされたＣｐｆ１）；
（ＩＩ）以下を含むＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓガイドＲＮＡ：
ガイド配列、
ダイレクトリピート配列、
を含み、ここで：
ＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下し、及び／又はそれによってＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加する。
【０１６８】
ある態様において、本発明はまた、本節に記載されるなどの、本明細書に記載されるとおりのエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む系も提供する。
【０１６９】
任意のかかる組成物において、本明細書のいずれかで記載されるとおり、送達系には、酵母系、リポフェクション系、マイクロインジェクション系、微粒子銃系、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、脂質：核酸コンジュゲート又は人工ビリオンが含まれ得る。
【０１７０】
任意のかかる組成物において、送達系には、１つ以上のベクターを含むベクター系が含まれてもよく、ここでは構成成分（ＩＩ）が、ガイド配列とダイレクトリピート配列と任意選択的に含むポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１の調節エレメントを含み、及び構成成分（Ｉ）が、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントを含む。
【０１７１】
任意のかかる組成物において、送達系には、１つ以上のベクターを含むベクター系が含まれてもよく、ここでは構成成分（ＩＩ）が、ガイド配列及びダイレクトリピート配列に作動可能に連結された第１の調節エレメントとを含み、及び構成成分（Ｉ）が、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントを含む。
【０１７２】
任意のかかる組成物において、組成物は２つ以上のガイドＲＮＡを含むことができ、各ガイドＲＮＡが異なる標的を有し、それによって多重化がある。
【０１７３】
任意のかかる組成物において、１つ又は複数のポリヌクレオチド配列が１つのベクター上にあってもよい。
【０１７４】
本発明はまた、
ａ）本明細書における本発明の構築物のいずれか１つの天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１の調節エレメント；及び
ｂ）ガイドＲＮＡの１つ以上をコードする１つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントであって、ガイドＲＮＡがガイド配列とダイレクトリピート配列とを含む、第２の調節エレメント、
を含む１つ以上のベクターを含む、エンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）ベクター系も提供し、ここで：
構成成分（ａ）及び（ｂ）は同じ又は異なるベクター上に位置し、
ＣＲＩＳＰＲ複合体が形成され；
ガイドＲＮＡが標的ポリヌクレオチド遺伝子座を標的化し、酵素がポリヌクレオチド遺伝子座を変化させ、及び
ＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下し、及び／又はそれによってＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加する。
【０１７５】
かかる系において、構成成分（ＩＩ）は、ガイド配列とダイレクトリピート配列とを含むポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第１の調節エレメントを含むことができ、及び構成成分（ＩＩ）は、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントを含むことができる。かかる系において、適用可能な場合、ガイドＲＮＡにはキメラＲＮＡが含まれ得る。
【０１７６】
かかる系において、構成成分（Ｉ）は、ガイド配列及びダイレクトリピート配列に作動可能に連結された第１の調節エレメントを含むことができ、及び構成成分（ＩＩ）は、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第２の調節エレメントを含むことができる。かかる系は２つ以上のガイドＲＮＡを含むことができ、各ガイドＲＮＡが異なる標的を有し、それによって多重化がある。構成成分（ａ）及び（ｂ）は同じベクター上にあってもよい。
【０１７７】
ベクターを含む任意のかかる系において、１つ以上のベクターには、１つ以上のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス又は単純ヘルペスウイルスなど、１つ以上のウイルスベクターが含まれ得る。
【０１７８】
調節エレメントを含む任意のかかる系において、前記調節エレメントの少なくとも１つは組織特異的プロモーターを含むことができる。組織特異的プロモーターは、哺乳類血球細胞、哺乳類肝細胞又は哺乳類眼において発現を導き得る。
【０１７９】
上述の組成物又は系の任意のものにおいて、ダイレクトリピート配列は１つ以上のタンパク質相互作用ＲＮＡアプタマーを含むことができる。１つ以上のアプタマーはテトラループに位置し得る。１つ以上のアプタマーは、ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質との結合能を有し得る。
【０１８０】
上述の組成物又は系の任意のものにおいて、細胞は真核細胞又は原核細胞であってもよい；ここでＣＲＩＳＰＲ複合体は細胞において作動可能であり、それによってＣＲＩＳＰＲ複合体の酵素は非改変酵素と比較したとき細胞の１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下し、及び／又はそれによってＣＲＩＳＰＲ複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加する。
【０１８１】
本発明はまた、上記に記載される組成物のいずれかの又は上記に記載される系のいずれかからのＣＲＩＳＰＲ複合体も提供する。
【０１８２】
本発明はまた、細胞の目的の遺伝子座を改変する方法も提供し、この方法は、本明細書に記載されるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、エンジニアリングされたＣｐｆ１）、組成物のいずれか又は本明細書に記載される系又はベクター系のいずれかに細胞を接触させるステップを含み、又はここで細胞が、細胞内に存在する本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ複合体のいずれかを含む。かかる方法において、細胞は原核細胞又は真核細胞であってもよく、好ましくは真核細胞である。かかる方法において、生物が細胞を含み得る。かかる方法において、生物はヒト又は他の動物でなくてもよい。
【０１８３】
任意のかかる方法がエキソビボ又はインビトロであってもよい。
【０１８４】
特定の実施形態において、前記ガイドＲＮＡ又はＣａｓタンパク質の少なくとも一方をコードするヌクレオチド配列は、目的の遺伝子のプロモーターを含む調節エレメントと細胞内で作動可能に接続されており、それによって少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系構成成分の発現が目的の遺伝子のプロモーターによってドライブされる。「作動可能に接続されている」は、本明細書の他の部分においても言及されるとおり、ガイドＲＮＡ及び／又はＣａｓをコードするヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を可能にする形で１つ又は複数の調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。用語「調節エレメント」もまた本明細書の他の部分に記載される。本発明によれば、調節エレメントは、好ましくは目的の内因性遺伝子のプロモーターなど、目的の遺伝子のプロモーターを含む。特定の実施形態において、プロモーターはその内因性ゲノム位置にある。かかる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ及び／又はＣａｓをコードする核酸は、その天然のゲノム位置にある目的の遺伝子のプロモーターの転写制御下にある。特定の他の実施形態において、プロモーターはベクター又はプラスミドなどの（別個の）核酸分子上に提供されるか、又は他の染色体外核酸上に提供され、即ちプロモーターはその天然のゲノム位置に提供されない。特定の実施形態において、プロモーターは非天然のゲノム位置にゲノム的に組み込まれる。
【０１８５】
任意のかかる方法、前記改変には、遺伝子発現の改変が含まれ得る。前記遺伝子発現の改変には、遺伝子発現を活性化させること及び／又は遺伝子発現を抑制することが含まれ得る。従って、ある態様において、本発明は、遺伝子発現を調節する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるとおりのエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲタンパク質又は系を細胞に導入することを含む。
【０１８６】
本発明はまた、それを必要としている個体の疾患、障害又は感染を治療する方法も提供し、この方法は、本明細書に記載されるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばエンジニアリングされたＣｐｆ１）、組成物、系又はＣＲＩＳＰＲ複合体のいずれかの有効量を投与するステップを含む。疾患、障害又は感染には、ウイルス感染が含まれ得る。ウイルス感染はＨＢＶであってもよい。
【０１８７】
本発明はまた、上記に記載されるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばエンジニアリングされたＣｐｆ１）、組成物、系又はＣＲＩＳＰＲ複合体のいずれかの遺伝子又はゲノム編集への使用も提供する。
【０１８８】
本発明はまた、哺乳類細胞における目的のゲノム遺伝子座の発現を変化させる方法も提供し、この方法は、本明細書に記載されるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばエンジニアリングされたＣｐｆ１）、組成物、系又はＣＲＩＳＰＲ複合体に細胞を接触させ、それによりＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（ベクター）を送達し、及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を形成させて標的と結合させ、及び発現の増加又は低下、又は遺伝子産物の改変など、ゲノム遺伝子座の発現が変化したかどうかを決定することを含む。
【０１８９】
本発明はまた、療法薬として用いられる、上記に記載されるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばエンジニアリングされたＣｐｆ１）、組成物、系又はＣＲＩＳＰＲ複合体のいずれかも提供する。療法薬は遺伝子若しくはゲノム編集、又は遺伝子療法のためのものであってもよい。
【０１９０】
特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりのエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばエンジニアリングされたＣｐｆ１）の活性には、任意選択で遺伝子の転写の低下をもたらすゲノムＤＮＡ切断が含まれる。
【０１９１】
ある態様において、本発明は、本明細書に記載されるとおの方法によりゲノム遺伝子座の発現が変化した単離細胞を提供し、ここで発現の変化は、ゲノム遺伝子座の発現を変化させる方法に供されていない細胞との比較である。関連する態様において、本発明は、かかる細胞から樹立された細胞株を提供する。
【０１９２】
一態様において、本発明は、例えばＨＳＣ（造血幹細胞）の目的のゲノム遺伝子座（例えば、この目的のゲノム遺伝子座は、異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する）にある標的配列の操作によって生物又は非ヒト生物を改変する方法を提供し、この方法は、
Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）ＨＳＣ内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
（ｂ）ダイレクトリピート配列、
を含むポリヌクレオチド配列、及び
ＩＩ．任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ酵素、
を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を、例えばそれを含有する粒子にＨＳＣを接触させることによって、ＨＳＣに送達するステップを含み、
ここで、ガイド配列は標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導き、及び
ここでＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、 
及び本方法は、任意選択で、例えば、ＨＤＲ鋳型を含有するＨＳＣと接触するか、又はＨＤＲ鋳型を含有する別の粒子にＨＳＣを接触させる粒子を介して、ＨＤＲ鋳型を送達するステップもまた含み、ここでＨＤＲ鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし；「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってもよく；任意選択で本方法は、生物又は非ヒト生物からＨＳＣを単離又は入手するステップ、任意選択でＨＳＣ集団を拡大するステップ、１つ又は複数の粒子とＨＳＣとの接触を実施して改変されたＨＳＣ集団を入手するステップ、任意選択で改変されたＨＳＣの集団を拡大するステップ、及び任意選択で改変されたＨＳＣを生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。
【０１９３】
この送達は、例えば、１つ以上の調節エレメントに機能的に連結している１つ以上のポリヌクレオチドを含有するベクターを含有する１つ以上の粒子を介した、ＣＲＩＳＰＲ複合体の任意の１つ以上又は全てをコードする１つ以上のポリヌクレオチドであって、有利にはｉｎ  ｖｉｖｏ発現のための１つ以上の調節エレメントに連結したポリヌクレオチドの送達であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、ガイド配列、ダイレクトリピート配列の一部又は全部がＲＮＡであってもよい。ＲＮＡであって、かかるダイレクトリピート配列の特徴を「含む」と言われるポリヌクレオチドが言及される場合、ＲＮＡ配列がその特徴を備えることは理解されるであろう。ポリヌクレオチドがＤＮＡであって、かかるダイレクトリピート配列の特徴を含むと言われる場合、ＤＮＡ配列はその問題の特徴を含むＲＮＡに転写されるか、又は転写されることができる。特徴がＣＲＩＳＰＲ酵素などのタンパク質である場合、言及されるＤＮＡ又はＲＮＡ配列は（ＤＮＡの場合には、初めに転写されてから）翻訳されるか、又は翻訳されることができる。
【０１９４】
特定の実施形態において、本発明は、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物をＨＳＣと例えば接触させることによって送達するステップを含む、目的のゲノム遺伝子座であって、例えば異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連するＨＳＣの目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作によって生物、例えばヒトを含む哺乳動物又は非ヒト哺乳動物若しくは生物を改変する方法を提供し、ここで組成物は、組成物を発現させるためその組成物を機能的にコードする１つ以上のウイルス、プラスミド又は核酸分子ベクター（例えばＲＮＡ）を含む１つ以上の粒子を含み、この組成物は、（Ａ）Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列に機能的に連結している第１の調節エレメントであって、ポリヌクレオチド配列が、（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、（ｂ）ダイレクトリピート配列を含む、第１の調節エレメント、及びＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列（又は一部の実施形態はＮＬＳが関与しないこともあるため任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列）を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されると、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及びＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］、又は（Ｂ）天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、Ｉ．（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（ｂ）少なくとも１つ以上のダイレクトリピート配列に機能的に連結している第１の調節エレメント、ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント、［構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されると、且つガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及びＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物を含み；この方法は、任意選択で、例えば、ＨＤＲ鋳型を含有するＨＳＣと接触する粒子を介するか、又はＨＤＲ鋳型を含有する別の粒子にＨＳＣを接触させることにより、ＨＤＲ鋳型を送達するステップもまた含むことができ、ここでＨＤＲ鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし；「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく；及び任意選択でこの方法は、ＨＳＣを生物又は非ヒト生物から単離又は入手するステップ、任意選択でＨＳＣ集団を拡大するステップ、１つ以上の粒子と、ＨＳＣとの接触を実施して改変されたＨＳＣ集団を入手するステップ、任意選択で改変ＨＳＣの集団を拡大するステップ及び任意選択で改変ＨＳＣを生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。一部の実施形態では、構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩが同じベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩが同じベクターに位置し、一方で構成成分ＩＩＩが別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩＩが同じベクターに位置し、一方で構成成分ＩＩが別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分ＩＩ及びＩＩＩが同じベクターに位置し、一方で構成成分Ｉが別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩの各々が異なるベクターに位置する。本発明はまた、本明細書に記載されるとおりのウイルス又はプラスミドベクター系も提供する。
【０１９５】
標的配列の操作とは、出願者らは標的配列の後成的操作も意味する。これは、標的配列のメチル化状態の改変（即ちメチル化又はメチル化パターン又はＣｐＧ島の付加又は除去）、ヒストン改変、標的配列への接触し易さの増加又は低減によるか、又は三次元折り畳みの促進によるなどの、標的配列のクロマチン状態の操作であってもよい。目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作によってヒトを含む生物若しくは哺乳動物又は非ヒト哺乳動物若しくは生物を改変する方法が言及される場合、これは生物（又は哺乳動物）に全体として適用されても、又は（その生物が多細胞生物である場合）当該生物の単一細胞若しくは細胞集団だけに適用されてもよいことは理解されるであろう。例えばヒトの場合、出願者らは特に単一細胞又は細胞集団を想定し、それらは好ましくはｅｘ  ｖｉｖｏで改変されて、次に再び導入され得る。この場合、生検又は他の組織試料若しくは生体液試料が必要となり得る。これに関して幹細胞もまた特に好ましい。しかし、当然ながらｉｎ  ｖｉｖｏ実施形態もまた想定される。そして本発明は、ＨＳＣに関して特に有利である。
【０１９６】
本発明は、一部の実施形態では、例えば、
Ｉ．第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）系ＲＮＡ（ＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、
（ｂ）第１のダイレクトリピート配列、及び
を含む第１のポリヌクレオチド配列、
ＩＩ．第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）系ガイドＲＮＡポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、
（ｂ）第２のダイレクトリピート配列、及び
を含む第２のポリヌクレオチド配列、及び
ＩＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み、且つ１つ以上の突然変異を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並ぶ］；又は
ＩＶ．Ｉ．〜ＩＩＩ．の１つ以上の１つ又は複数の発現産物、例えば第１及び第２のダイレクトリピート配列、ＣＲＩＳＰＲ酵素；
［転写されると、第１及び第２のガイド配列がそれぞれ第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体と第１及び第２の標的配列との配列特異的結合を誘導し、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第１の標的配列にハイブリダイズする第１のガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第２の標的配列にハイブリダイズする第２のガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡであり、及び第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導して二本鎖切断を生じさせ、それにより生物又は非ヒト生物を改変する］を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含む粒子をＨＳＣに接触させることによる送達するステップを含む、ＨＳＣの目的のゲノム遺伝子座であって、例えば異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する目的のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖の逆鎖上にある第１及び第２の標的配列の操作によって生物又は非ヒト生物を改変する方法を包含し、；及びこの方法は、任意選択で、例えば、ＨＤＲ鋳型を含有するＨＳＣと接触する粒子を介するか、又はＨＤＲ鋳型を含有する別の粒子にＨＳＣを接触させることにより、ＨＤＲ鋳型を送達するステップもまた含むことができ、ここでＨＤＲ鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし；「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく；及び任意選択でこの方法は、生物又は非ヒト生物からＨＳＣを単離又は入手するステップ、任意選択でこのＨＳＣ集団を拡大するステップ、１つ以上の粒子とＨＳＣとの接触を実施して改変されたＨＳＣ集団を入手するステップ、任意選択で改変ＨＳＣの集団を拡大するステップを含み、及び任意選択で改変ＨＳＣを生物又は非ヒト生物に投与するステップとを含む、前記ゲノム遺伝子座のコードエレメント、非コードエレメント又は調節エレメント内の標的配列の操作を含む方法。本発明の一部の方法において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、第１及び第２のガイド配列、第１及び第２のダイレクトリピート配列の一部又は全部がＲＮＡである。本発明のさらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列、第１及び第２のガイド配列、第１及び第２のダイレクトリピート配列をコードするポリヌクレオチドはＲＮＡであり、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達される；しかし、送達は粒子によることが有利である。本発明の特定の実施形態において、第１及び第２のダイレクトリピートは１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上のベクターを含むベクター系内に含まれ得る。好ましい実施形態において、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素は、その酵素が相補鎖ニッキング酵素となるような１つ以上の突然変異を有し、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、その酵素が非相補鎖ニッキング酵素となるような１つ以上の突然変異を有する。或いは、第１の酵素が非相補鎖ニッキング酵素であってもよく、及び第２の酵素が相補鎖ニッキング酵素であってもよい。本発明の好ましい方法において、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導することにより、５’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態において、５’オーバーハングは高々２００塩基対、好ましくは高々１００塩基対、又はより好ましくは高々５０塩基対である。本発明の実施形態において、５’オーバーハングは少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０塩基対、又はより好ましくは３４〜５０塩基対である。
【０１９７】
本発明は、一部の実施形態では、例えば、
Ｉ．第１の調節エレメントであって、
（ａ）第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のダイレクトリピート配列
に機能的に連結している第１の調節エレメント、
ＩＩ．第２の調節エレメントであって、
（ａ）第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のダイレクトリピート配列
に機能的に連結している第２の調節エレメント、
ＩＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、Ｃｐｆ１）をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第３の調節エレメント、及び
Ｖ．Ｉ．〜ＩＶ．の１つ以上の１つ又は複数の発現産物、例えば第１及び第２のダイレクトリピート配列、ＣＲＩＳＰＲ酵素；
［転写されると、構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶが系の同じ又は異なるベクターに位置し、且つ第１及び第２のガイド配列がそれぞれ第１及び第２の標的配列に対する第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導し、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第１の標的配列にハイブリダイズする第１のガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第２の標的配列にハイブリダイズする第２のガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡであり、及び第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導して二本鎖切断を生じさせ、それにより生物又は非ヒト生物を改変する］を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含む１つ以上の粒子をＨＳＣに接触させることにより送達するステップを含む、例えばＨＳＣの目的のゲノム遺伝子座であって、異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する目的のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖の逆鎖上にある第１及び第２の標的配列の操作によって生物又は非ヒト生物を改変する方法を包含し；及びこの方法は、任意選択で、例えば、ＨＤＲ鋳型を含有するＨＳＣと接触する粒子を介するか、又はＨＤＲ鋳型を含有する別の粒子にＨＳＣを接触させることにより、ＨＤＲ鋳型を送達するステップもまた含むことができ、ここでＨＤＲ鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし；「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく；及び任意選択でこの方法は、生物又は非ヒト生物からＨＳＣを単離又は入手するステップ、任意選択でこのＨＳＣ集団を拡大するステップ、１つ以上の粒子とＨＳＣとの接触を実施して改変されたＨＳＣ集団を入手するステップ、任意選択で改変ＨＳＣの集団を拡大するステップ、及び任意選択で改変ＨＳＣを生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。
【０１９８】
本発明はまた、本明細書に記載されるとおりのベクター系も提供する。この系は、１つ、２つ、３つ又は４つの異なるベクターを含み得る。従って構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶは１つ、２つ、３つ又は４つの異なるベクターに位置してもよく、本明細書では、構成成分の可能な位置の全ての組み合わせが想定され、例えば：想定される全ての位置の組み合わせで、構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶが同じベクターに位置してもよく；構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶが各々異なるベクターに位置してもよく；構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶが合計２つ又は３つの異なるベクターに位置してもよい等である。本発明の一部の方法において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、第１及び第２のガイド配列、第１及び第２のダイレクトリピート配列の一部又は全部がＲＮＡである。本発明のさらなる実施形態において、第１及び第２のダイレクトリピート配列は１００％の同一性を共有する。好ましい実施形態において、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素は、その酵素が相補鎖ニッキング酵素となるような１つ以上の突然変異を有し、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、その酵素が非相補鎖ニッキング酵素となるような１つ以上の突然変異を有する。或いは、第１の酵素が非相補鎖ニッキング酵素であってもよく、及び第２の酵素が相補鎖ニッキング酵素であってもよい。本発明のさらなる実施形態において、ウイルスベクターの１つ以上は、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達される；しかし、粒子送達が有利である。
【０１９９】
本発明の好ましい方法において、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導することにより、５’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態において、５’オーバーハングは高々２００塩基対、好ましくは高々１００塩基対、又はより好ましくは高々５０塩基対である。本発明の実施形態において、５’オーバーハングは少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０塩基対、又はより好ましくは３４〜５０塩基対である。
【０２００】
本発明はまた、上記に記載される、又は上記に記載される方法のいずれかによる改変ＣＲＩＳＰＲ酵素、組成物、系又は複合体のいずれかを含むインビトロ又はエキソビボ細胞も提供する。この細胞は真核細胞又は原核細胞であってもよい。本発明はまた、かかる細胞の子孫も提供する。本発明はまた、任意のかかる細胞又は任意のかかる子孫の産物も提供し、この産物は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の改変ＣＲＩＳＰＲ酵素によって改変されたとおりの前記１つ以上の標的遺伝子座の産物である。この産物は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質であってもよい。一部のかかる産物は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の改変ＣＲＩＳＰＲ酵素によって改変されていてもよい。一部のかかる改変された産物において、標的遺伝子座の産物は、前記改変ＣＲＩＳＰＲ酵素によって改変されていない前記標的遺伝子座の産物と物理的に異なる。
【０２０１】
本発明はまた、上記に記載される天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子も提供する。
【０２０２】
任意のかかるポリヌクレオチドが、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメントを更に含み得る。
【０２０３】
１つ以上の調節エレメントを含む任意のかかるポリヌクレオチドにおいて、１つ以上の調節エレメントは、真核細胞における天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の発現のために作動可能に構成され得る。
【０２０４】
１つ以上の調節エレメントを含む任意のかかるポリヌクレオチドにおいて、１つ以上の調節エレメントは、原核細胞における天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の発現のために作動可能に構成され得る。
【０２０５】
１つ以上の調節エレメントを含む任意のかかるポリヌクレオチドにおいて、１つ以上の調節エレメントは、インビトロ系における天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の発現のために作動可能に構成され得る。
【０２０６】
本発明はまた、上述のポリヌクレオチド分子のいずれかを含む発現ベクターも提供する。本発明はまた、１つ又は複数のかかるポリヌクレオチド分子、例えば１つ又は複数のタンパク質及び／又は核酸構成成分を発現するように作動可能に構成されたかかるポリヌクレオチド分子、並びに１つ又は複数のかかるベクターも提供する。
【０２０７】
本発明は更に、Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）に突然変異（ｍｕａｔｉｏｎ）を作成する方法又は本明細書に記載の本発明によるＣＲＩＳＰＲ酵素のオルソログである突然変異した又は改変されたＣａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）を提供し、これは、改変及び／又は突然変異のための、核酸分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｇＲＮＡ等に近接していてもよいか、又はそれに接触していてもよい当該のオルソログにおける１つ又は複数のアミノ酸、及び／又は本明細書に記載の本発明によるＣＲＩＳＰＲ酵素における本明細書に同定される１つ又は複数のアミノ酸と類似又は対応する１つ又は複数のアミノ酸を確定するステップ、及び１つ又は複数の改変及び／又は１つ又は複数の突然変異を含むか、それからなるか又はそれから本質的になるオルソログを合成し、又は調製し、又は発現させるステップ又は中性アミノ酸を荷電、例えば正電荷アミノ酸、例えばアラニンへと本明細書で考察するとおり突然変異させる、例えば改変する、例えば変更する又は突然変異させるステップを含む。このように改変されたオルソログはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に用いることができ；及びそれを発現する１つ又は複数の核酸分子は、分子を送達する又は本明細書において考察するとおりのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系構成成分をコードするベクター又は他の送達系において使用し得る。
【０２０８】
ある態様において、本発明は効率的なオンターゲット活性を提供し、且つオフターゲット活性を最小限に抑える。ある態様において、本発明はＣＲＩＳＰＲタンパク質による効率的なオンターゲット切断を提供し、且つＣＲＩＳＰＲタンパク質によるオフターゲット切断最小限に抑える。ある態様において、本発明は、ＤＮＡ切断なしに遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲタンパク質のガイド特異的結合を提供する。ある態様において、本発明は、遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲタンパク質のガイドによって導かれる効率的なオンターゲット結合を提供し、且つＣＲＩＳＰＲタンパク質のオフターゲット結合を最小限に抑える。従って、ある態様において、本発明は標的特異的遺伝子調節を提供する。ある態様において、本発明は、ＤＮＡ切断なしに遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲ酵素のガイド特異的結合を提供する。従って、ある態様において、本発明は、単一のＣＲＩＳＰＲ酵素を用いてある遺伝子座で切断を提供し、且つ別の遺伝子座で遺伝子調節を提供する。ある態様において、本発明は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲタンパク質及び／又は酵素を用いて複数の標的の直交性の活性化及び／又は阻害及び／又は切断を提供する。
【０２０９】
別の態様において、本発明は、エキソビボ又はインビボでの細胞プール中のゲノムにおける遺伝子の機能スクリーニング方法を提供し、この方法は、複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むライブラリの投与又は発現を含み、ここでスクリーニングはＣＲＩＳＰＲ酵素の使用を更に含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体は異種機能ドメインを含むように改変される。ある態様において、本発明は、ライブラリの宿主への投与又は宿主におけるインビボ発現を含むゲノムのスクリーニング方法を提供する。ある態様において、本発明は、宿主に投与されるか又は宿主において発現するアクチベーターを更に含む、本明細書に考察されるとおりの方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはＣＲＩＳＰＲタンパク質に付加される。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはＣＲＩＳＰＲタンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加される。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはｇＲＮＡループに付加される。ある態様において、本発明は、宿主に投与されるか又は宿主において発現するリプレッサー更に含む、本明細書に考察されるとおりの方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでスクリーニングは遺伝子座の遺伝子活性化、遺伝子阻害、又は切断に影響を及ぼし及びそれを検出することを含む。
【０２１０】
ある態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達を含む本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで前記１つ又は複数の核酸分子は１つ又は複数の調節配列に作動可能に連結され、且つインビボで発現する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでインビボ発現は、レンチウイルス、アデノウイルス、又はＡＡＶによる。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで送達は、粒子、ナノ粒子、脂質又は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）による。
【０２１１】
詳細な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を葉緑体に標的化することが有益であり得る。多くの場合、この標的化は、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）又はプラスチド輸送ペプチドと呼ばれるＮ末端伸長部の存在によって実現し得る。発現ポリペプチドが植物プラスチド（例えば葉緑体）に区画化されるべきである場合、細菌供給源からの染色体トランス遺伝子が、発現ポリペプチドをコードする配列に融合した、ＣＴＰ配列をコードする配列を有しなければならない。従って、外因性ポリペプチドの葉緑体への局在化は、多くの場合に、ＣＴＰ配列をコードするポリヌクレオチド配列を、外因性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’領域に作動可能に連結することによって達成される。ＣＴＰは、プラスチドへの転位中のプロセシング段階で除去される。しかしながらプロセシング効率は、ＣＴＰのアミノ酸配列及びペプチドのＮＨ２末端における近傍の配列の影響を受け得る。葉緑体を標的化するための記載されている他のオプションは、トウモロコシｃａｂ−ｍ７シグナル配列（米国特許第７，０２２，８９６号明細書、国際公開第９７／４１２２８号パンフレット）、エンドウマメグルタチオンレダクターゼシグナル配列（国際公開第９７／４１２２８号パンフレット）及び米国特許出願公開第２００９０２９８６１号明細書に記載されるＣＴＰである。
【０２１２】
ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのライブラリ、方法又は複合体を提供し、ここでｇＲＮＡは少なくとも１つの非コード機能性ループを有するように改変され、例えば少なくとも１つの非コード機能性ループは抑制性であり；例えば少なくとも１つの非コード機能性ループはＡｌｕを含む。
【０２１３】
一態様において、本発明は、遺伝子産物の発現を変化させ又は改変する方法を提供する。前記方法は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含有し及び発現する細胞に、Ｃａｓタンパク質とＤＮＡ分子を標的化するガイドＲＮＡとを含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入するステップを含むことができ、それによってガイドＲＮＡが、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的化し、及びＣａｓタンパク質が、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を切断し、それによって遺伝子産物の発現が変化し；及び、Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡとは天然では一緒に存在しない。本発明は更に、真核細胞での発現にコドン最適化されたＣａｓタンパク質を包含する。好ましい実施形態において真核細胞は哺乳類細胞であり、より好ましい実施形態において哺乳類細胞はヒト細胞である。本発明の更なる実施形態において、遺伝子産物の発現は減少する。
【０２１４】
ある態様において、本発明は、変化した細胞及びそれらの細胞の子孫、並びに当該の細胞によって作られる産物を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（例えば、Ｃｐｆ１）タンパク質及び系は、改変された標的遺伝子座を含む細胞の作製に使用される。一部の実施形態において、この方法は、核酸ターゲティング複合体を標的ＤＮＡ又はＲＮＡに結合させて前記標的ＤＮＡ又はＲＮＡの切断を生じさせ、それにより標的ＤＮＡ又はＲＮＡを改変するステップを含むことができ、ここで核酸ターゲティング複合体は、前記標的ＤＮＡ又はＲＮＡ内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。一態様において、本発明は、細胞の遺伝子座を修復する方法を提供する。別の態様において、本発明は、真核細胞におけるＤＮＡ又はＲＮＡの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、核酸ターゲティング複合体をＤＮＡ又はＲＮＡに結合させて、前記結合により前記ＤＮＡ又はＲＮＡの発現の増加又は減少を生じさせるステップを含み；ここで核酸ターゲティング複合体は、ガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。同様の考察及び条件が、標的ＤＮＡ又はＲＮＡを改変する方法にも上記のとおり適用される。実際上、これらの試料採取、培養及び再導入の選択肢は本発明の全態様に適用される。ある態様において、本発明は、真核細胞の標的ＤＮＡ又はＲＮＡを改変する方法を提供し、これはインビボ、エキソビボ又はインビトロであってもよい。一部の実施形態において、本方法は、ヒト又は非ヒト動物から細胞又は細胞集団を試料採取するステップ、及び１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。培養は任意の段階でエキソビボで行われ得る。かかる細胞は、限定なしに、植物細胞、動物細胞、任意の生物の特定の細胞型、例えば、幹細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、心血管細胞、上皮細胞、幹細胞などであり得る。細胞は、本発明により改変されると、遺伝子産物を例えば制御された量で産生することができ、これは用途に応じて増加又は減少させてもよく、及び／又は突然変異させてもよい。特定の実施形態において、細胞の遺伝子座が修復される。この１つ又は複数の細胞が、更には非ヒト動物又は植物に再導入されてもよい。再導入される細胞について、細胞は幹細胞であることが好ましい場合もある。
【０２１５】
ある態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系、又は構成成分を一過性に含む細胞を提供する。例えば、ＣＲＩＳＰＲタンパク質又は酵素及び核酸が細胞に一過性に提供され、遺伝子座が変化すると、続いてＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上の構成成分の量が減少する。続いて、ＣＲＩＳＰＲの媒介による遺伝子変化を得た細胞、その細胞の子孫、及びその細胞を含む生物は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ系構成成分を低下した量で含むか、又はその１つ以上のＣＲＩＳＰＲ系構成成分をもはや含有しない。一つの非限定的な例は、本明細書に更に記載するような自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系である。従って、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系によって変化した１つ以上の遺伝子座を含むが、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ系構成成分を本質的に欠いている細胞、及び生物、並びに細胞及び生物の子孫を提供する。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系構成成分は実質的に存在しない。かかる細胞、組織及び生物は、有利には、所望の又は選択された遺伝子変化を含むが、潜在的に非特異的に作用し、安全性の問題につながり、又は規制当局の承認の妨げとなる可能性のあるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構成成分又はその残遺物は失われている。更に、本発明は、当該の細胞、生物、並びに細胞及び生物の子孫によって作られる産物を提供する。
【０２１６】
Ｃｐｆ１による標的遺伝子座の遺伝子編集又は変化
二本鎖切断点又は鎖のうちの一方における一本鎖切断点は、有利には、修正が起こるように標的位置に十分に近くなければならない。ある実施形態において、その距離は５０、１００、２００、３００、３５０又は４００ヌクレオチド以下である。理論によって拘束されることを望むものではないが、切断点が標的位置に十分に近く、末端リセクションの間にエキソヌクレアーゼの媒介による除去を受ける領域内に切断点がなければならないと考えられる。鋳型核酸配列は末端リセクション領域内の配列の修正にのみ用いられ得るため、標的位置と切断点との間の距離が大き過ぎる場合、末端リセクションに突然変異が含まれないことになり得るとともに、ひいては修正されないことになり得る。
【０２１７】
ＨＤＲ媒介修正の誘導を目的としてガイドＲＮＡ及びＣｐｆ１ヌクレアーゼが二本鎖切断を誘導する実施形態において、切断部位は０〜２００ｂｐ（例えば、０〜１７５、０〜１５０、０〜１２５、０〜１００、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜２００、２５〜１７５、２５〜１５０、２５〜１２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜２００、５０〜１７５、５０〜１５０、５０〜１２５、５０〜１００、５０〜７５、７５〜２００、７５〜１７５、７５〜１５０、７５〜１２５、７５〜１００ｂｐ）だけ標的位置から離れている。ある実施形態において、切断部位は、０〜１００ｂｐ（例えば、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜１００、５０〜７５又は７５〜１００ｂｐ）だけ標的位置から離れている。更なる実施形態では、ＨＤＲ媒介修正を誘導するため、Ｃｐｆ１又はそのオルソログ若しくはホモログと複合体を形成した２つ以上のガイドＲＮＡを使用して多重化切断を誘導し得る。
【０２１８】
相同性アームは、例えば、リセクトされた一本鎖オーバーハングがドナー鋳型内の相補領域を見付けることが可能になるように、少なくとも末端リセクションが起こり得る領域の範囲までは延在していなければならない。全長は、プラスミドサイズ又はウイルスパッケージング制限などのパラメータによって制限されることになり得る。ある実施形態において、相同性アームは反復エレメント内までは延在しなくてもよい。例示的相同性アーム長さとしては、少なくとも５０、１００、２５０、５００、７５０又は１０００ヌクレオチドが挙げられる。
【０２１９】
標的位置は、本明細書で使用されるとき、Ｃｐｆ１分子依存性過程によって改変される標的核酸又は標的遺伝子（例えば染色体）上にある部位を指す。例えば、標的位置は、標的核酸の改変Ｃｐｆ１分子切断及び鋳型核酸の誘導による標的位置の改変、例えば修正であり得る。ある実施形態において、標的位置は、１つ以上のヌクレオチドが加えられる標的核酸上の２つのヌクレオチド間、例えば隣接するヌクレオチド間の部位であり得る。標的位置は、鋳型核酸によって変化する、例えば修正される１つ以上のヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、標的位置は標的配列（例えば、ガイドＲＮＡが結合する配列）の範囲内にある。ある実施形態において、標的位置は標的配列（例えば、ガイドＲＮＡが結合する配列）の上流又は下流にある。
【０２２０】
鋳型核酸は、この用語が本明細書で使用されるとき、標的位置の構造を変化させるためにＣｐｆ１分子及びガイドＲＮＡ分子と併せて用いることのできる核酸配列を指す。ある実施形態において、標的核酸は、典型的には１つ又は複数の切断部位又はその近傍に鋳型核酸の配列の一部又は全てを有するように改変される。ある実施形態において、鋳型核酸は一本鎖である。代替的実施形態において、鋳型核酸（ｎｕｃｅｉｃ  ａｃｉｄ）は二本鎖である。ある実施形態において、鋳型核酸はＤＮＡ、例えば二本鎖ＤＮＡである。代替的実施形態において、鋳型核酸は一本鎖ＤＮＡである。
【０２２１】
ある実施形態において、鋳型核酸は、相同組換えに関与することによって標的位置の構造を変化させる。ある実施形態において、鋳型核酸は標的位置の配列を変化させる。ある実施形態において、鋳型核酸は、標的核酸への改変された又は天然に存在しない塩基の取込みをもたらす。
【０２２２】
鋳型配列は、切断の媒介又は触媒による標的配列との組換えを起こし得る。ある実施形態において、鋳型核酸は、Ｃｐｆ１媒介性切断イベントによって切断される標的配列上の部位に対応する配列を含み得る。ある実施形態において、鋳型核酸は、第１のＣｐｆ１媒介性イベントで切断される標的配列上の第１の部位、及び第２のＣｐｆ１媒介性イベントで切断される標的配列上の第２の部位の両方に対応する配列を含み得る。
【０２２３】
特定の実施形態において、鋳型核酸は、翻訳される配列のコード配列に変化をもたらす配列、例えば、タンパク質産物中のあるアミノ酸の別のアミノ酸との置換、例えば、野生型対立遺伝子への突然変異対立遺伝子の形質転換、突然変異対立遺伝子への野生型対立遺伝子の形質転換、及び／又は終止コドンの導入、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の欠失、又はナンセンス突然変異をもたらすものを含むことができる。特定の実施形態において、鋳型核酸は、非コード配列の変化、例えば、エクソン又は５’若しくは３’非翻訳若しくは非転写領域の変化をもたらす配列を含むことができる。かかる変化には、制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーの変化、及びシス作用性又はトランス作用性制御エレメントの変化が含まれる。
【０２２４】
標的遺伝子の標的位置と相同性を有する鋳型核酸を使用して標的配列の構造を変化させてもよい。鋳型配列は、望ましくない構造、例えば望ましくない又は突然変異のヌクレオチドを変化させるために用いられ得る。鋳型核酸は、組み込まれると、陽性対照エレメントの活性の減少；陽性対照エレメントの活性の増加；陰性対照エレメントの活性の減少；陰性対照エレメントの活性の増加；遺伝子の発現の減少；遺伝子の発現の増加；障害又は疾患に対する抵抗性の増加；ウイルス侵入に対する抵抗性の増加；突然変異の修正又は望ましくないアミノ酸残基の変化、遺伝子産物の生物学的特性の付与、増加、消失若しくは減少、例えば酵素の酵素活性の増加、又は遺伝子産物が別の分子との相互作用する能力の増加をもたらす配列を含み得る。
【０２２５】
鋳型核酸は、標的配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヌクレオチド又はそれ以上の配列の変更をもたらす配列を含み得る。ある実施形態において、鋳型核酸は、２０±１０、３０±１０、４０±１０、５０±１０、６０±１０、７０±１０、８０±１０、９０±１０、１００±１０、１１０±１０、１２０±１０、１３０±１０、１４０±１０、１５０±１０、１６０±１０、１７０±１０、１８０±１０、１９０±１０、２００±１０、２１０±１０、又は２２０±１０ヌクレオチド長であってもよい。ある実施形態において、鋳型核酸は、３０±２０、４０±２０、５０±２０、６０±２０、７０±２０、８０±２０、９０±２０、１００±２０、１１０±２０、１２０±２０、１３０±２０、１４０±２０、１５０±２０、１６０±２０、１７０±２０、１８０±２０、１９０±２０、２００±２０、２１０±２０、又は２２０±２０ヌクレオチド長であってもよい。ある実施形態において、鋳型核酸は、１０〜１，０００、２０〜９００、３０〜８００、４０〜７００、５０〜６００、５０〜５００、５０〜４００、５０〜３００、５０〜２００、又は５０〜１００ヌクレオチド長である。
【０２２６】
鋳型核酸は以下の構成成分を含む：［５’相同性アーム］−［置換配列］−［３’相同性アーム］。相同性アームが染色体への組換え、従って望ましくないエレメント、例えば突然変異又はシグネチャの置換配列による置換をもたらす。ある実施形態において、相同性アームは最も遠位の切断部位に隣接する。ある実施形態において、５’相同性アームの３’末端は置換配列の５’末端の隣の位置である。ある実施形態において、５’相同性アームは、置換配列の５’末端から５’側に少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、又は２０００ヌクレオチド延在し得る。ある実施形態において、３’相同性アームの５’末端は置換配列の３’末端の隣の位置である。ある実施形態において、３’相同性アームは、置換配列の３’末端から３’側に少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、又は２０００ヌクレオチド延在し得る。
【０２２７】
特定の実施形態において、ある種の配列リピートエレメントが含まれること回避するため、一方又は両方の相同性アームが短くされ得る。例えば、配列リピートエレメントを回避するため５’相同性アームが短くされてもよい。他の実施形態において、配列リピートエレメントを回避するため３’相同性アームが短くされてもよい。一部の実施形態において、ある種の配列リピートエレメントが含まれることを回避するため、５’及び３’相同性アームの両方が短くされてもよい。
【０２２８】
特定の実施形態において、突然変異を修正するための鋳型核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチドとして用いられるように設計され得る。一本鎖オリゴヌクレオチドを用いるとき、５’及び３’相同性アームは約２００塩基対（ｂｐ）長、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００ｂｐ長にまで及ぶ範囲であり得る。
【０２２９】
Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体は機能エフェクターを送達することができる
遺伝子をＤＮＡレベルで突然変異させることにより発現を永久的に消失させるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ媒介性遺伝子ノックアウトと異なり、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓノックダウンは人工転写因子を用いて遺伝子発現を一時的に低下させることが可能である。ＡｓＣｐｆ１タンパク質によるＤ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｄ１２６３Ａなど、Ｃｐｆ１タンパク質の両方のＤＮＡ切断ドメインにある鍵となる残基を突然変異させると、触媒的に不活性なＣｐｆ１が生成される。触媒的に不活性なＣｐｆ１はガイドＲＮＡと複合体を形成し、当該のガイドＲＮＡのターゲティングドメインによって特定されるＤＮＡ配列に局在化するが、しかしながら、これは標的ＤＮＡを切断しない。ＡｓＣｐｆ１タンパク質など、不活性Ｃｐｆ１タンパク質をエフェクタードメイン、例えば転写抑制ドメインと融合させると、ガイドＲＮＡによって特定される任意のＤＮＡ部位へとそのエフェクターをリクルートすることが可能になる。特定の実施形態において、Ｃｐｆ１を転写抑制ドメインに融合させて遺伝子のプロモーター領域にリクルートしてもよい。特に遺伝子抑制について、本明細書では、内因性転写因子の結合部位を遮断すれば、遺伝子発現を下方制御する助けとなり得ることが企図される。別の実施形態において、不活性Ｃｐｆ１をクロマチン修飾タンパク質と融合させてもよい。クロマチン状態が変化すると、標的遺伝子の発現の低下が起こり得る。
【０２３０】
ある実施形態において、ガイドＲＮＡ分子は、既知の転写応答エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー等）、既知の上流活性化配列、及び／又は標的ＤＮＡの発現を制御可能であると疑われる未知又は既知の機能の配列を標的とすることができる。
【０２３１】
一部の方法において、標的ポリヌクレオチドを不活性化させることにより細胞に発現の改変を生じさせ得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体が細胞内の標的配列に結合すると、標的ポリヌクレオチドが不活性化され、そのためその配列が転写されないか、コードされたタンパク質が産生されないか、又は配列が野生型配列のようには機能しなくなる。例えば、タンパク質又はマイクロＲＮＡコード配列を不活性化してタンパク質が産生されないようにし得る。
【０２３２】
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ及びＤ１２２５Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含み、及び／又は１つ以上の突然変異はＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインにあるか、又は他に本明細書で考察するとおりの突然変異である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は触媒ドメインに１つ以上の突然変異を有し、ここで転写されると、ダイレクトリピート配列が単一のステムループを形成し、及びガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導き、及びここで酵素は機能ドメインを更に含む。一部の実施形態において、機能ドメインは転写活性化ドメイン、好ましくはＶＰ６４である。一部の実施形態において、機能ドメインは転写抑制ドメイン、好ましくはＫＲＡＢである。一部の実施形態において、転写抑制ドメインはＳＩＤ、又はＳＩＤのコンカテマー（例えばＳＩＤ４Ｘ）である。一部の実施形態において、機能ドメインは後成的に改変されるドメインであり、後成的に改変される酵素が提供される。一部の実施形態において、機能ドメインは活性化ドメインであり、これはＰ６５活性化ドメインであってもよい。
【０２３３】
Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体又はその構成成分の送達
本開示及び当該技術分野における知識から、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、特に本明細書に記載される新規ＣＲＩＳＰＲ系、又はその構成成分又はその核酸分子（例えばＨＤＲ鋳型を含む）又はその構成成分をコードし又は提供する核酸分子は、本明細書に概略的にも詳細にも記載される送達系によって送達し得る。
【０２３４】
ベクター送達、例えば、プラスミド、ウイルス送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣｐｆ１、及び／又は任意の本ＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡは、任意の適切なベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、又は他の種類のウイルスベクター、又はこれらの組み合わせを用いて送達することができる。Ｃｐｆ１及び１つ以上のガイドＲＮＡを１つ以上のベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターにパッケージングすることができる。一部の実施形態において、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターは、例えば筋肉注射によって目的の組織に送達されるが、一方で送達は、静脈内、経皮、鼻腔内、口腔、粘膜、又は他の送達方法によることもある。かかる送達は単回投与によっても、又は複数回投与によってもよい。当業者は、本明細書で送達される実際の投薬量が、ベクターの選択、標的細胞、生物、又は組織、治療する対象の全身状態、求められる形質転換／改変の程度、投与経路、投与様式、求められる形質転換／改変の種類など、種々の要因に応じて大きく異なり得ることを理解する。
【０２３５】
かかる用量は、例えば、担体（水、生理食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油など）、希釈剤、薬学的に許容可能な担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、薬学的に許容可能な賦形剤、及び／又は当該技術分野で公知の他の化合物を更に含み得る。投薬量は、１つ以上の薬学的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩を更に含み得る。加えて、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質、ゲル又はゲル化物質、香料、着色剤、ミクロスフェア、ポリマー、懸濁剤などの補助物質もまたこの中に存在し得る。加えて、１つ以上の他の従来の医薬成分、例えば、防腐剤、湿潤剤、懸濁剤、界面活性剤、酸化防止剤、固化防止剤、充填剤、キレート化剤、コーティング剤、化学安定剤などもまた、特に投薬形態が再構成可能な形態である場合に存在し得る。好適な例示的成分として、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容可能な賦形剤の徹底的な考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）（参照により本明細書に援用される）において利用可能である。
【０２３６】
本明細書のある実施形態において、送達はアデノウイルスを介し、これは、少なくとも１×１０５粒子（粒子単位、ｐｕとも称される）のアデノウイルスベクターを含有する単回ブースター用量であり得る。本明細書のある実施形態において、用量は好ましくは、少なくとも約１×１０６粒子（例えば、約１×１０６〜１×１０１２粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０７粒子、より好ましくは少なくとも約１×１０８粒子（例えば、約１×１０８〜１×１０１１粒子又は約１×１０８〜１×１０１２粒子）、及び最も好ましくは少なくとも約１×１００粒子（例えば、約１×１０９〜１×１０１０粒子又は約１×１０９〜１×１０１２粒子）、又は更には少なくとも約１×１０１０粒子（例えば、約１×１０１０〜１×１０１２粒子）のアデノウイルスベクターである。或いは、用量は、約１×１０１４粒子以下、好ましくは約１×１０１３粒子以下、更により好ましくは約１×１０１２粒子以下、更により好ましくは約１×１０１１粒子以下、及び最も好ましくは約１×１０１０粒子以下（例えば、約１×１０９粒子（ａｒｔｉｃｌｅｓ）以下）を含む。従って、用量は、例えば、約１×１０６粒子単位（ｐｕ）、約２×１０６ｐｕ、約４×１０６ｐｕ、約１×１０７ｐｕ、約２×１０７ｐｕ、約４×１０７ｐｕ、約１×１０８ｐｕ、約２×１０８ｐｕ、約４×１０８ｐｕ、約１×１０９ｐｕ、約２×１０９ｐｕ、約４×１０９ｐｕ、約１×１０１０ｐｕ、約２×１０１０ｐｕ、約４×１０１０ｐｕ、約１×１０１１ｐｕ、約２×１０１１ｐｕ、約４×１０１１ｐｕ、約１×１０１２ｐｕ、約２×１０１２ｐｕ、又は約４×１０１２ｐｕのアデノウイルスベクターを含む単回用量のアデノウイルスベクターを含有し得る。例えば、２０１３年６月４日に付与されたＮａｂｅｌ，ｅｔ．ａｌ．に対する米国特許第８，４５４，９７２  Ｂ２号明細書（参照によって本明細書に援用される）のアデノウイルスベクター、及びその第２９欄第３６〜５８行にある投薬量を参照のこと。本明細書のある実施形態において、アデノウイルスは複数回用量で送達される。
【０２３７】
本明細書のある実施形態において、送達はＡＡＶを介する。ヒトに対するＡＡＶのインビボ送達についての治療上有効な投薬量は、約１×１０１０〜約１×１０１０の機能性ＡＡＶ／ｍｌ溶液を含有する約２０〜約５０ｍｌの生理食塩水の範囲であると考えられる。投薬量は、治療利益と任意の副作用との均衡がとれるように調整され得る。本明細書のある実施形態において、ＡＡＶ用量は、概して、約１×１０５〜１×１０５０ゲノムＡＡＶ、約１×１０８〜１×１０２０ゲノムＡＡＶ、約１×１０１０〜約１×１０１６ゲノム、又は約１×１０１１〜約１×１０１６ゲノムＡＡＶの濃度範囲である。ヒト投薬量は約１×１０１３ゲノムＡＡＶであってもよい。かかる濃度は、約０．００１ｍｌ〜約１００ｍｌ、約０．０５〜約５０ｍｌ、又は約１０〜約２５ｍｌの担体溶液で送達され得る。他の効果的な投薬量が、当業者により、用量反応曲線を作成するルーチンの試験を用いて容易に確立され得る。例えば、２０１３年３月２６日に付与されたＨａｊｊａｒ，ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第８，４０４，６５８  Ｂ２号明細書、第２７欄、第４５〜６０行を参照のこと。
【０２３８】
本明細書のある実施形態において、送達はプラスミドを介する。かかるプラスミド組成物では、投薬量は、反応を誘発するのに十分な量のプラスミドでなければならない。例えば、プラスミド組成物中のプラスミドＤＮＡの好適な分量は、個体７０ｋｇ当たり約０．１〜約２ｍｇ、又は約１μｇ〜約１０μｇであり得る。本発明のプラスミドは、概して、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）前記プロモーターに作動可能に連結された、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列；（ｉｉｉ）選択可能マーカー；（ｉｖ）複製起点；及び（ｖ）（ｉｉ）の下流で（ｉｉ）に作動可能に連結された転写ターミネーターを含み得る。プラスミドはＣＲＩＳＰＲ複合体のＲＮＡ構成成分もコードし得るが、これらのうちの１つ以上は、代わりに異なるベクター上にコードされてもよい。
【０２３９】
本明細書の用量は平均７０ｋｇの個体に基づく。投与頻度は医学又は獣医学の実務者（例えば、医師、獣医師）、又は当該技術分野の科学者の裁量の範囲内にある。また、実験に使用されるマウスは典型的には約２０ｇであり、マウス実験から７０ｋｇの個体にスケールアップし得ることも注記される。
【０２４０】
一部の実施形態では本発明のＲＮＡ分子はリポソーム製剤又はリポフェクチン製剤などで送達され、当業者に周知の方法により調製することができる。かかる方法は、例えば、米国特許第５，５９３，９７２号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書及び同第５，５８０，８５９号明細書（これらは参照により本明細書に援用される）に記載されている。特に哺乳類細胞へのｓｉＲＮＡ送達の増強及び改良を目的とした送達系が開発されており（例えば、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔ．２００３，５３９：１１１−１１４；Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２，２０：１００６−１０１０；Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ．２００３，９：２１０−２１６；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３，３２７：７６１−７６６；Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２００２，３２：１０７−１０８及びＳｉｍｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ  ２００３，３１，１１：２７１７−２７２４を参照）、本発明に適用し得る。ｓｉＲＮＡは近年、霊長類における遺伝子発現の抑制への使用が成功しており（例えば、Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ  ２４（４）：６６０を参照）、これは本発明にも適用し得る。
【０２４１】
実際、ＲＮＡ送達はインビボ送達の有用な方法である。リポソーム又はナノ粒子を用いてＣｐｆ１及びｇＲＮＡ（及び、例えばＨＲ修復鋳型）を細胞内に送達することが可能である。従って、Ｃｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ酵素の送達、及び／又は本発明のＲＮＡの送達は、ＲＮＡ形態で、微小胞、リポソーム又は１つ又は複数の粒子を介することができる。例えば、Ｃｐｆ１  ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡをインビボ送達用にリポソーム粒子にパッケージングすることができる。リポソームトランスフェクション試薬、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのリポフェクタミン及び市販の他の試薬は、ＲＮＡ分子を肝臓に効果的に送達することができる。
【０２４２】
同様に好ましいＲＮＡの送達手段としてはまた、ＲＮＡの粒子または粒子による送達（Ｃｈｏ，Ｓ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｏｎ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｑ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｅｉ，Ｙ．，Ｂｏｇａｔｙｒｅｖ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，「内皮細胞への低分子干渉ＲＮＡ送達用の脂質様ナノ粒子（Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）」，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９：３１１２−３１１８，２０１０）又はエキソソームによる送達（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．，Ｌｅｖｉｎｓ，Ｃ．，Ｃｏｒｔｅｚ，Ｃ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，「ｓｉＲＮＡ送達用の脂質ベースのナノ療法（Ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６７：９−２１，２０１０，ＰＭＩＤ：２００５９６４１）も挙げられる。実際、エキソソームは、ＣＲＩＳＰＲ系とある程度の類似性を有する系であるｓｉＲＮＡの送達に特に有用であることが示されている。例えば、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（「インビトロ及びインビボでのｓｉＲＮＡのエキソソーム媒介送達（Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）」Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２  Ｄｅｃ；７（１２）：２１１２−２６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１３１．Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｎｏｖ  １５）は、エキソソームがいかに種々の生物学的障壁を越えた薬物送達に有望なツールであるか、及びｓｉＲＮＡのインビトロ及びインビボ送達に利用できるかを記載している。彼らの手法は、発現ベクターのトランスフェクションにより、ペプチドリガンドに融合したエキソソームタンパク質を含む標的エキソソームを作成するものである。次にトランスフェクト細胞上清からエキソソームが精製され、特徴付けられた後、ＲＮＡがエキソソームにロードされる。本発明に係る送達又は投与はエキソソームを用いて、詳細には、限定はされないが脳に対して行うことができる。ビタミンＥ（α−トコフェロール）をＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓにコンジュゲートさせて、例えばＵｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ２２：７１１−７１９（Ｊｕｎｅ  ２０１１））によって行われた脳への低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達と同じように、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と共に脳に送達することができる。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はフリーＴｏｃｓｉＢＡＣＥ又はＴｏｃ−ｓｉＢＡＣＥ／ＨＤＬが充填され且つＢｒａｉｎ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｋｉｔ  ３（Ａｌｚｅｔ）に接続された浸透圧ミニポンプ（モデル１００７Ｄ；Ａｌｚｅｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）でマウスが注入された。背側第三脳室内への注入のため、正中線上でブレグマから約０．５ｍｍ後方に脳注入カニューレが留置された。Ｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．は、ＨＤＬを含む僅か３ｎｍｏｌのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡが、同じＩＣＶ注入法による同程度の標的の減少を誘導可能であったことを見出した。脳を標的としてＨＤＬと共投与される、α−トコフェロールにコンジュゲートされた同様の投薬量のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓを本発明においてヒトで企図することができ、例えば、脳を標的とする約３ｎｍｏｌ〜約３μｍｏｌのＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓを企図し得る。Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（（ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ２２：４６５−４７５（Ａｐｒｉｌ  ２０１１））は、ラットの脊髄におけるインビボでの遺伝子サイレンシングのためのＰＫＣγを標的とする短鎖ヘアピンＲＮＡのレンチウイルス媒介送達方法を記載している。Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．は、１×１０９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有する約１０μｌの組換えレンチウイルスをくも膜下カテーテルによって投与した。脳を標的とするレンチウイルスベクターにおいて発現する同様の投薬量のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓを本発明においてヒトに企図することができ、例えば、１×１０９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有するレンチウイルスにおける脳を標的とする約１０〜５０ｍｌのＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓを企図し得る。
【０２４３】
脳への局所送達に関して、これは様々な方法で達成することができる。例えば、物質を線条体内に例えば注入によって送達することができる。注入は、開頭により定位的に行うことができる。
【０２４４】
ＮＨＥＪ又はＨＲ効率を増強させることもまた、送達の助けとなる。ＮＨＥＪ効率は、Ｔｒｅｘ２などの末端プロセシング酵素の共発現によって増強することが好ましい（Ｄｕｍｉｔｒａｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１１  Ａｕｇｕｓｔ；１８８（４）：７８７−７９７）。ＨＲ効率は、Ｋｕ７０及びＫｕ８６などのＮＨＥＪ機構を一過性に阻害して増加させることが好ましい。ＨＲ効率はまた、ＲｅｃＢＣＤ、ＲｅｃＡなどの原核生物又は真核生物相同組換え酵素の共発現によって増加させることもできる。
【０２４５】
パッケージング及びプロモーター
インビボでのゲノム改変を媒介するため、本発明のＣｐｆ１をコードする核酸分子、例えばＤＮＡをベクター、例えばウイルスベクターにパッケージングする方法としては、以下が挙げられる：
・ＮＨＥＪ媒介遺伝子ノックアウトを達成するため：
・シングルウイルスベクター：
・２つ以上の発現カセットを含むベクター：
・プロモーター−Ｃｐｆ１コード核酸分子−ターミネーター
・プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター
・プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター
・プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（ベクターのサイズ限界まで）
・ダブルウイルスベクター：
・Ｃｐｆ１の発現をドライブするための１つの発現カセットを含むベクター１
・プロモーター−Ｃｐｆ１コード核酸分子−ターミネーター
・１つ以上のガイドＲＮＡの発現をドライブするためのもう１つの発現カセットを含むベクター２
・プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター
・プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（ベクターのサイズ限界まで）
・相同依存性修復を媒介するため。
・上記に記載されるシングル及びダブルウイルスベクター手法に加えて、相同依存性修復鋳型の送達のため更なるベクターを使用することができる。
【０２４６】
Ｃｐｆ１コード核酸分子の発現のドライブに用いられるプロモーターには、以下が含まれ得る：
−ＡＡＶ  ＩＴＲはプロモーターとして役立ち得る：これは、追加のプロモーターエレメント（ベクター内で場所をとり得る）の必要性がなくなる点で有利である。空いた追加の空間を使用して、追加のエレメント（ｇＲＮＡなど）の発現をドライブすることができる。また、ＩＴＲ活性は比較的弱いため、Ｃｐｆ１の過剰発現による潜在的な毒性を軽減するために使用することができる。
−偏在発現には、使用し得るプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖又は軽鎖等が挙げられる。
【０２４７】
脳又は他のＣＮＳでの発現には、プロモーター：全てのニューロン用のシナプシンＩ、興奮性ニューロン用のＣａＭＫＩＩα、ＧＡＢＡ作動性ニューロン用のＧＡＤ６７又はＧＡＤ６５又はＶＧＡＴ等を使用することができる。
【０２４８】
肝臓での発現には、アルブミンプロモーターを使用することができる。
【０２４９】
肺での発現には、ＳＰ−Ｂを使用することができる。
【０２５０】
内皮細胞には、ＩＣＡＭを使用することができる。
【０２５１】
造血細胞には、ＩＦＮβ又はＣＤ４５を使用することができる。
【０２５２】
骨芽細胞には、ＯＧ−２を使用することができる。
【０２５３】
ガイドＲＮＡのドライブに用いられるプロモーターには、以下が含まれ得る：
−Ｕ６又はＨ１などのＰｏｌ  ＩＩＩプロモーター
−ｇＲＮＡを発現させるためのＰｏｌ  ＩＩプロモーター及びイントロンカセットの使用。
【０２５４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
Ｃｐｆ１及び１つ以上のガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス又は他のプラスミド又はウイルスベクタータイプを使用して、詳細には、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号明細書（アデノウイルス用の製剤、用量）、同第８，４０４，６５８号明細書（ＡＡＶ用の製剤、用量）及び同第５，８４６，９４６号明細書（ＤＮＡプラスミド用の製剤、用量）並びにレンチウイルス、ＡＡＶ及びアデノウイルスが関わる臨床試験及びそのような臨床試験に関する刊行物からの製剤及び用量を用いて送達することができる。例えば、ＡＡＶについて、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号明細書及びＡＡＶが関わる臨床試験にあるとおりであってもよい。アデノウイルスについては、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号明細書及びアデノウイルスが関わる臨床試験にあるとおりであってもよい。プラスミド送達については、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号明細書及びプラスミドが関わる臨床試験にあるとおりであってもよい。用量は、平均７０ｋｇの個体（例えば男性成人ヒト）に基づくか、又はそれに当てはめてもよく、異なる体重及び種の患者、対象、哺乳動物用に調整することができる。投与頻度は、患者又は対象の年齢、性別、全般的な健康、他の条件並びに対処される特定の状態又は症状を含めた通常の要因に応じて、医学又は獣医学実務者（例えば、医師、獣医師）の範囲内である。ウイルスベクターは、目的の組織に注射することができる。細胞型特異的ゲノム改変について、Ｃｐｆ１の発現は細胞型特異的プロモーターによってドライブすることができる。例えば、肝臓特異的発現にはアルブミンプロモーターが用いられてもよく、及びニューロン特異的発現には（例えばＣＮＳ障害を標的化するため）シナプシンＩプロモーターが用いられてもよい。
【０２５５】
インビボ送達に関しては、他のウイルスベクターと比べて幾つかの理由でＡＡＶが有利である：
低毒性（これは、免疫応答を活性化させ得る細胞粒子の超遠心が不要な精製方法に起因し得る）及び
宿主ゲノムに組み込まれないため、挿入突然変異誘発を引き起こす確率の低さ。
【０２５６】
ＡＡＶは４．５又は４．７５Ｋｂのパッケージング限界を有する。これは、Ｃｐｆ１並びにプロモーター及び転写ターミネーターが全て同じウイルスベクターに収まる必要があることを意味する。４．５又は４．７５Ｋｂよりも大きい構築物はウイルス産生の大幅な低下につながり得る。ＳｐＣａｓ９はかなり大きく、遺伝子それ自体が４．１Ｋｂを超えるため、ＡＡＶにパッケージングすることが困難である。従って本発明の実施形態は、より短いＣｐｆ１のホモログを利用することを含む。
【０２５７】
ＡＡＶに関して、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はこれらの任意の組み合わせであり得る。標的化しようとする細胞に関連するＡＡＶのＡＡＶを選択することができる；例えば、脳又は神経細胞の標的化にはＡＡＶ血清型１、２、５又はハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はこれらの任意の組み合わせを選択することができ；及び心臓組織の標的化にはＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は肝臓への送達に有用である。本明細書におけるプロモーター及びベクターが個々に好ましい。これらの細胞に関する特定のＡＡＶ血清型の一覧は以下のとおりである（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７−５９１１（２００８）を参照）。
【０２５８】
【表１】
2019503716.tif 000405
【０２５９】
レンチウイルス
レンチウイルスは、有糸分裂細胞及び分裂終了細胞の両方でその遺伝子の感染能及び発現能を有する複合的レトロウイルスである。最も一般的には、公知のレンチウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、これは他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を用いて広範囲の細胞型を標的化する。
【０２６０】
レンチウイルスは以下のとおり調製し得る。ｐＣａｓＥＳ１０（これはレンチウイルストランスファープラスミド骨格を含有する）のクローニング後、低継代（ｐ＝５）のＨＥＫ２９３ＦＴをＴ−７５フラスコに５０％コンフルエンスとなるように播種し、その翌日、１０％ウシ胎仔血清含有及び抗生物質不含のＤＭＥＭ中でトランスフェクトした。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、４時間後にトランスフェクションを行った。細胞に１０μｇのレンチウイルストランスファープラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）及び以下のパッケージングプラスミド：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ−ｇシュードタイプ）、及び７．５ｕｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）をトランスフェクトした。トランスフェクションは、カチオン性脂質デリバリー剤（５０ｕＬ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００及び１００ｕｌ  Ｐｌｕｓ試薬）を含む４ｍＬ  ＯｐｔｉＭＥＭ中で行った。６時間後、培地を１０％ウシ胎仔血清を含む抗生物質不含ＤＭＥＭに交換した。これらの方法では細胞培養中に血清を使用するが、無血清方法が好ましい。
【０２６１】
レンチウイルスは以下のとおり精製し得る。４８時間後にウイルス上清を回収した。初めに上清から残屑を除去し、０．４５ｕｍ低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルタでろ過した。次にそれを超遠心機において２４，０００ｒｐｍで２時間スピンした。ウイルスペレットを５０ｕｌのＤＭＥＭ中に４℃で一晩再懸濁した。次にそれをアリコートに分け、直ちに−８０℃で凍結した。
【０２６２】
別の実施形態において、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースとする最小限の非霊長類レンチウイルスベクターもまた、特に眼遺伝子療法に企図される（例えば、Ｂａｌａｇａａｎ，Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ２００６；８：２７５−２８５を参照）。別の実施形態において、滲出型（ｗｅｂ  ｆｏｒｍ）の加齢黄斑変性症の治療のため網膜下注射によって送達される血管新生抑制タンパク質エンドスタチン及びアンジオスタチンを発現するウマ伝染性貧血ウイルスベースのレンチウイルス遺伝子療法ベクターであるＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）もまた企図され（例えば、Ｂｉｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ２３：９８０−９９１（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１２）を参照のこと）、このベクターは本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系向けに改変し得る。
【０２６３】
別の実施形態において、ＨＩＶ  ｔａｔ／ｒｅｖによって共有される共通のエクソンを標的化するｓｉＲＮＡと、核小体局在ＴＡＲデコイと、抗ＣＣＲ５特異的ハンマーヘッド型リボザイムとを含む自己不活性化レンチウイルスベクター（例えば、ＤｉＧｉｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２：３６ｒａ４３を参照のこと）を本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に使用し及び／又は適合させてもよい。患者の体重１キログラム当たり最低２．５×１０６個のＣＤ３４＋  細胞を収集し、２μｍｏｌ／Ｌ−グルタミン、幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びトロンボポエチン（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を含有するＸ−ＶＩＶＯ  １５培地（Ｌｏｎｚａ）中２×１０６細胞／ｍｌの密度でで１６〜２０時間予備刺激し得る。フィブロネクチン（２５ｍｇ／ｃｍ２）（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）で被覆した７５ｃｍ２組織培養フラスコにおいて、予備刺激した細胞をレンチウイルスによって感染多重度５で１６〜２４時間にわたって形質導入し得る。
【０２６４】
レンチウイルスベクターについては、パーキンソン病の治療にあるとおり開示されており、例えば、米国特許出願公開第２０１２０２９５９６０号明細書及び米国特許第７３０３９１０号明細書及び同第７３５１５８５号明細書を参照のこと。レンチウイルスベクターはまた、眼疾患の治療についても開示されており、例えば、米国特許出願公開第２００６０２８１１８０号明細書、２００９０００７２８４号明細書、米国特許出願公開第２０１１０１１７１８９号明細書；米国特許出願公開第２００９００１７５４３号明細書；米国特許出願公開第２００７００５４９６１号明細書、米国特許出願公開第２０１００３１７１０９号明細書を参照のこと。レンチウイルスベクターはまた、脳への送達についても開示されており、例えば、米国特許出願公開第２０１１０２９３５７１号明細書；米国特許出願公開第２０１１０２９３５７１号明細書、米国特許出願公開第２００４００１３６４８号明細書、米国特許出願公開第２００７００２５９７０号明細書、米国特許出願公開第２００９０１１１１０６号明細書及び米国特許第７２５９０１５号明細書を参照のこと。
【０２６５】
ＲＮＡ送達
ＲＮＡ送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣｐｆ１、及び／又は本ＲＮＡのいずれか、例えばガイドＲＮＡはまた、ＲＮＡの形態で送達することもできる。Ｃｐｆ１  ｍＲＮＡはインビトロ転写を用いて作成することができる。例えば、Ｃｐｆ１  ｍＲＮＡは、以下のエレメント：βグロビン−ポリＡテール（１２０以上の一連のアデニン）由来のＴ７＿プロモーター−コザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）−Ｃｐｆ１−３’ＵＴＲを含有するＰＣＲカセットを用いて合成することができる。このカセットは、Ｔ７ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドＲＮＡはまた、Ｔ７＿プロモーター−ＧＧ−ガイドＲＮＡ配列を含有するカセットからのインビトロ転写を用いて転写することもできる。
【０２６６】
発現を増強し、及び可能性のある毒性を低下させるため、ＣＲＩＳＰＲ酵素コード配列及び／又はガイドＲＮＡを、例えば擬似Ｕ又は５−メチル−Ｃを使用して１つ以上の改変ヌクレオシドを含むように改変することができる。
【０２６７】
ｍＲＮＡ送達方法は、現在、肝臓送達に特に有望である。
【０２６８】
ＲＮＡ送達に関する多くの臨床研究はＲＮＡｉ又はアンチセンスに焦点が置かれているが、これらの系は、本発明を実施するためのＲＮＡの送達に適合させることができる。以下のＲＮＡｉ等の参考文献は、それに従い読まれるべきである。
【０２６９】
粒子送達系及び／又は製剤：
幾つかのタイプの粒子送達系及び／又は製剤が、多様な生物医学的適用において有用であることが知られている。一般に、粒子は、その輸送及び特性の点で一単位として挙動する小さい物体として定義される。粒子は、更に直径に基づき分類される。粗粒子は２，５００〜１０，０００ナノメートルの範囲を包含する。微粒子は１００〜２，５００ナノメートルのサイズを有する。超微粒子、又はナノ粒子は、概して１〜１００ナノメートルのサイズである。１００ｎｍ限度の基準は、粒子をバルク材料と区別する新規特性が典型的には１００ｎｍ未満の臨界長さスケールで生じるという事実である。
【０２７０】
本明細書で使用されるとき、粒子送達系／製剤は、本発明における粒子を含む任意の生物学的送達系／製剤として定義される。本発明における粒子は、１００ミクロン（μｍ）未満の最大径（例えば直径）を有する任意の実体である。一部の実施形態において、本発明の粒子は１０μｍ未満の最大径を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は２０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大径を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大径を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、又は１００ｎｍ未満の最大径を有する。典型的には、本発明の粒子は５００ｎｍ以下の最大径（例えば直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は２５０ｎｍ以下の最大径（例えば直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は２００ｎｍ以下の最大径（例えば直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は１５０ｎｍ以下の最大径（例えば直径）を有する。一部の実施形態において、本発明の粒子は１００ｎｍ以下の最大径（例えば直径）を有する。より小さい粒子、例えば５０ｎｍ以下の最大径を有する粒子が、本発明の一部の実施形態で使用される。一部の実施形態において、本発明の粒子は２５ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の最大径を有する。
【０２７１】
粒子の特徴付け（例えば、形態、寸法等を特徴付けることを含む）は種々の異なる技法を用いて行われる。一般的な技法は、電子顕微鏡法（ＴＥＭ、ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、紫外・可視分光法、二重偏光干渉法及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）である。特徴付け（寸法計測）は、天然粒子（即ち負荷前）に関して行われても、又はカーゴの負荷後に行われてもよく（本明細書においてカーゴとは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上の構成成分、例えばＣＲＩＳＰＲ酵素又はｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡ、又はこれらの任意の組み合わせを指し、及び更なる担体及び／又は賦形剤を含み得る）、それにより本発明の任意のインビトロ、エキソビボ及び／又はインビボ適用のための送達に最適なサイズの粒子が提供される。特定の好ましい実施形態において、粒子寸法（例えば直径）の特徴付けは、動的レーザー散乱法（ＤＬＳ）を用いた計測に基づく。粒子、その作製及び使用方法並びにその計測に関して、米国特許第８，７０９，８４３号明細書；米国特許第６，００７，８４５号明細書；米国特許第５，８５５，９１３号明細書；米国特許第５，９８５，３０９号明細書；米国特許第５，５４３，１５８号明細書；及びＪａｍｅｓ  Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｍｅｎ  Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １１  Ｍａｙ  ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４による発表が挙げられる。
【０２７２】
本発明の範囲内の粒子送達系は、限定はされないが、固体、半固体、エマルション、又はコロイド粒子を含め、任意の形態で提供され得る。従って、限定はされないが、例えば、脂質ベースのシステム、リポソーム、ミセル、微小胞、エキソソーム、又は遺伝子銃を含め、本明細書に記載される送達系の任意のものが、本発明の範囲内の粒子送達系として提供され得る。
【０２７３】
粒子
適切な場合、本明細書における粒子又はナノ粒子への言及は同義的であり得ることが理解されるであろう。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、粒子又は脂質エンベロープを使用して同時に送達し得る；例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ酵素及びＲＮＡ（例えば複合体としての）は、７Ｃ１など、Ｄａｈｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第２０１５０８９４１９  Ａ２号パンフレット及びその引用文献にあるとおりの粒子によって送達することができ（例えば、Ｊａｍｅｓ  Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｍｅｎ  Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １１  Ｍａｙ  ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４を参照）、例えば、送達粒子は脂質又はリピドイド及び親水性ポリマー、例えばカチオン性脂質及び親水性ポリマーを含み、例えばカチオン性脂質には、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）又は１，２−ジテトラデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）が含まれ、及び／又は親水性ポリマーには、エチレングリコール又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれ；及び／又は粒子は、コレステロール（例えば、製剤１＝ＤＯＴＡＰ  １００、ＤＭＰＣ  ０、ＰＥＧ  ０、コレステロール  ０；製剤番号２＝ＤＯＴＡＰ  ９０、ＤＭＰＣ  ０、ＰＥＧ  １０、コレステロール  ０；製剤番号３＝ＤＯＴＡＰ  ９０、ＤＭＰＣ  ０、ＰＥＧ  ５、コレステロール  ５からの粒子）を更に含み、粒子は効率的な多段階プロセスを用いて形成され、ここでは初めに、エフェクタータンパク質及びＲＮＡを、例えば１：１モル比で、例えば室温で、例えば３０分間、例えば無菌ヌクレアーゼフリー１×ＰＢＳ中において共に混合し；及びそれとは別に、製剤に適用し得るとおりＤＯＴＡＰ、ＤＭＰＣ、ＰＥＧ、及びコレステロールをアルコール、例えば１００％エタノール中に溶解し；及び、これらの２つの溶液を共に混合して、複合体を含有する粒子を形成する）。
【０２７４】
核酸ターゲティングエフェクタータンパク質（Ｃｐｆ１などのＶ型タンパク質など）ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、粒子又は脂質エンベロープを使用して同時に送達し得る。
【０２７５】
例えば、Ｓｕ  Ｘ，Ｆｒｉｃｋｅ  Ｊ，Ｋａｖａｎａｇｈ  ＤＧ，Ｉｒｖｉｎｅ  ＤＪ  （「脂質被包ｐＨ応答性ポリマーナノ粒子を使用したインビトロ及びインビボｍＲＮＡ送達（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．２０１１  Ｊｕｎ  ６；８（３）：７７４−８７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ１００３９０ｗ．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ａｐｒ  １）は、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアがリン脂質二重層シェルによって被包された生分解性コア−シェル構造化ナノ粒子について記載している。これらはインビボｍＲＮＡ送達のために開発された。ｐＨ応答性ＰＢＡＥ成分はエンドソーム破壊を促進するように選ばれ、一方、脂質表面層はポリカチオンコアの毒性を最小限に抑えるように選択された。従って、これは本発明のＲＮＡの送達に好ましい。
【０２７６】
一実施形態において、自己集合生体付着性ポリマーをベースとする粒子／ナノ粒子が企図され、これは、ペプチドの経口送達、ペプチドの静脈内送達及びペプチドの経鼻送達、脳への全てに適用し得る。疎水性薬物の経口吸収及び眼内送達など、他の実施形態もまた企図される。分子エンベロープ技術は、保護され且つ疾患部位に送達されるエンジニアリングされたポリマーエンベロープを含む（例えば、Ｍａｚｚａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＡＣＳＮａｎｏ，２０１３．７（２）：１０１６−１０２６；Ｓｉｅｗ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（１）：１４−２８；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ，２０１２．１６１（２）：５２３−３６；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１６６５−８０；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１７６４−７４；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，２０１２．５（５−６）：４５８−６８；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｒａｍａｎ  Ｓｐｅｃｔ，２０１２．４３（５）：６８１−６８８；Ａｈｍａｄ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ２０１０．７：Ｓ４２３−３３；Ｕｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ，２００６．３（５）：６２９−４０；Ｑｕ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００６．７（１２）：３４５２−９及びＵｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，２００１．２２４：１８５−１９９を参照）。標的組織に応じて単回又は複数回用量での約５ｍｇ／ｋｇの用量が企図される。
【０２７７】
一実施形態において、ＭＩＴのＤａｎ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ研究室によって開発された、腫瘍成長を止めるためＲＮＡを癌細胞に送達することのできる粒子／ナノ粒子を、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に使用し及び／又は適合させることができる。詳細には、Ａｎｄｅｒｓｏｎ研究室は、新規生体材料及びナノ製剤の合成、精製、特徴付け、及び製剤化のための完全に自動化されたコンビナトリアルシステムを開発した。例えば、Ａｌａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１３  Ａｕｇ  ６；１１０（３２）：１２８８１−６；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒ．２０１３  Ｓｅｐ  ６；２５（３３）：４６４１−５；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１３  Ｍａｒ  １３；１３（３）：１０５９−６４；Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１２  Ｏｃｔ  ２３；６（１０）：８４８４−７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１２  Ａｕｇ  ２８；６（８）：６９２２−９及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２  Ｊｕｎ  ３；７（６）：３８９−９３を参照のこと。
【０２７８】
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書はリピドイド化合物に関し、同様にポリヌクレオチドの投与に特に有用であり、これは、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系の送達に適用し得る。一態様において、アミノアルコールリピドイド化合物が、細胞又は対象に送達される薬剤と組み合わされて、マイクロパーティクル、ナノ粒子、リポソーム、又はミセルを形成する。粒子、リポソーム、又はミセルによって送達される薬剤は、気体、液体、又は固体の形態であってもよく、及び薬剤はポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、又は小分子であってもよい。アミノアルコール（ｍｉｎｏａｌｃｏｈｏｌ）リピドイド化合物は、他のアミノアルコールリピドイド化合物、ポリマー（合成又は天然）、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、タンパク質、脂質等と組み合わされて粒子を形成し得る。次にはこれらの粒子が任意選択で医薬賦形剤と組み合わされて医薬組成物を形成し得る。
【０２７９】
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書はまた、アミノアルコールリピドイド化合物を調製する方法も提供する。アミンの１つ以上の等価物をエポキシド末端化合物の１つ以上の等価物と好適な条件下で反応させると、本発明のアミノアルコールリピドイド化合物が形成される。特定の実施形態において、アミンの全てのアミノ基がエポキシド末端化合物と完全に反応して第三級アミンを形成する。他の実施形態において、アミンの全てのアミノ基がエポキシド末端化合物と完全には反応せずに第三級アミンを形成し、それによりアミノアルコールリピドイド化合物に第一級又は第二級アミンが生じる。これらの第一級又は第二級アミンはそのままにされるか、又は異なるエポキシド末端化合物などの別の求電子剤と反応させてもよい。当業者によって理解されるであろうとおり、アミンが過剰未満のエポキシド末端化合物と反応すると、様々な数の末端部を有する複数の異なるアミノアルコールリピドイド化合物が生じることになる。ある種のアミン類は２つのエポキシド由来化合物末端部で完全に官能化されてもよく、一方、他の分子はエポキシド末端化合物末端部で完全には官能化されない。例えば、ジアミン又はポリアミンは、分子の様々なアミノ部分の１、２、３、又は４つのエポキシド由来化合物末端部を含んで第一級、第二級、及び第三級アミンを生じ得る。特定の実施形態において、全てのアミノ基が完全には官能化されない。特定の実施形態において、同じタイプのエポキシド末端化合物のうちの２つが使用される。他の実施形態において、２つ以上の異なるエポキシド末端化合物が使用される。アミノアルコールリピドイド化合物の合成は溶媒有り又は無しで実施され、及び合成は３０〜１００℃、好ましくは約５０〜９０℃の範囲の高温で実施され得る。調製されたアミノアルコールリピドイド化合物は任意選択で精製されてもよい。例えば、アミノアルコールリピドイド化合物の混合物を精製して、特定の数のエポキシド由来化合物末端部を有するアミノアルコールリピドイド化合物を得てもよい。又は混合物を精製して、特定の立体又は位置異性体を得てもよい。アミノアルコールリピドイド化合物はまた、ハロゲン化アルキル（例えばヨウ化メチル）又は他のアルキル化剤を用いてアルキル化されてもよく、及び／又はそれらはアシル化されてもよい。
【０２８０】
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書はまた、この発明の方法によって調製されたアミノアルコールリピドイド化合物のライブラリも提供する。これらのアミノアルコールリピドイド化合物は、液体ハンドラー、ロボット、マイクロタイタープレート、コンピュータ等が関わるハイスループット技法を用いて調製され及び／又はスクリーニングされ得る。特定の実施形態において、アミノアルコールリピドイド化合物は、ポリヌクレオチド又は他の薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子）を細胞にトランスフェクトする能力に関してスクリーニングされる。
【０２８１】
米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書は、コンビナトリアル重合を用いて調製されたポリ（β−アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）類の一クラスに関する。この発明のＰＢＡＡは、コーティング（医療器具又はインプラントのフィルム又は多層フィルムコーティングなど）、添加剤、材料、賦形剤、生物付着防止剤、マイクロパターニング剤、及び細胞封入剤など、バイオテクノロジー及び生物医学的適用において用いられ得る。表面コーティングとして使用される場合、これらのＰＢＡＡは、インビトロ及びインビボの両方で、その化学構造に応じて様々なレベルの炎症を誘発した。この材料クラスの化学的多様性は大きいため、インビトロでマクロファージ活性化を阻害するポリマーコーティングを同定することが可能であった。更に、これらのコーティングは、カルボキシル化ポリスチレンマイクロパーティクルの皮下移植後の炎症細胞の動員を低減し、及び線維症を低減する。これらのポリマーを使用して、細胞封入用の高分子電解質複合体カプセルを形成し得る。本発明もまた、抗菌性コーティング、ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡ送達、及び幹細胞組織工学など、他の多くの生物学的適用を有し得る。米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書の教示は、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に適用し得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおり、及び特に、別段明らかでない限りあらゆる粒子への送達適用に関して国際公開第２０１４１１８２７２号パンフレット（参照により本明細書に援用される）及びＮａｉｒ，ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３６（４９），１６９５８−１６９６１）及び本明細書の教示を参照して、糖ベースの粒子、例えばＧａｌＮＡｃを使用してもよい。
【０２８２】
別の実施形態において、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が企図される。抗トランスサイレチン低分子干渉ＲＮＡが脂質ナノ粒子に封入され、ヒトに送達されており（例えば、Ｃｏｅｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１３；３６９：８１９−２９を参照）、及びかかるシステムを本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に適合させて応用し得る。静脈内投与される約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の用量が企図される。注入関連反応のリスクを低下させる薬物投与が企図され、デキサメタゾン、アセトアミノフェン（ａｃｅｔａｍｐｉｎｏｐｈｅｎ）、ジフェンヒドラミン又はセチリジン、及びラニチジンなどが企図される。４週間毎の５用量にわたる約０．３ｍｇ／キログラムの複数回用量もまた企図される。
【０２８３】
ＬＮＰは、ｓｉＲＮＡの肝臓への送達に極めて有効であることが示されており（例えば、Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ａｐｒｉｌ  ２０１３，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，ｐａｇｅｓ  ３６３−４７０を参照のこと）、従ってＣＲＩＳＰＲ  ＣａｓをコードするＲＮＡの肝臓への送達に企図される。２週間毎に６ｍｇ／ｋｇのＬＮＰの約４用量の投薬量が企図され得る。Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．は、０．７ｍｇ／ｋｇで投与するＬＮＰの最初の２サイクル後に腫瘍退縮が観察され、及び６サイクルの終わりまでに患者がリンパ節転移の完全退縮及び肝腫瘍の実質的な縮小を伴う部分奏効を達成したことを実証した。この患者においては４０用量後に完全奏効が得られ、２６ヵ月間にわたって投与を受けた後も患者は寛解を保ったまま治療を完了した。ＶＥＧＦ経路阻害薬による先行治療後に進行していた、腎臓、肺、及びリンパ節を含めた肝外疾患部位を有する２人のＲＣＣ患者は、約８〜１２ヵ月間全ての部位で疾患の安定が得られ、及びＰＮＥＴ及び肝転移患者は１８ヵ月間（３６用量）にわたって延長試験を継続し、疾患は安定していた。
【０２８４】
しかしながら、ＬＮＰの電荷が考慮されなければならない。カチオン性脂質を負電荷脂質と組み合わせると、細胞内送達を促進する非二重層構造が誘導されるためである。荷電ＬＮＰは静脈内注射後に循環から急速に除去されるため、ｐＫａ値が７未満のイオン化可能なカチオン性脂質が開発された（例えば、Ｒｏｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ  １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照）。ＲＮＡなどの負電荷ポリマーは低ｐＨ値（例えばｐＨ４）でＬＮＰに負荷することができ、ここでイオン化可能な脂質は正電荷を呈する。しかしながら、生理的ｐＨ値では、ＬＮＰは、より長い循環時間と適合する低い表面電荷を呈する。４種のイオン化可能なカチオン性脂質、即ち、１，２−ジリネオイル（ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ）−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−ケト−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫＤＭＡ）、及び１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）が着目されている。これらの脂質を含有するＬＮＰ  ｓｉＲＮＡシステムは、インビボで肝細胞において著しく異なる遺伝子サイレンシング特性を呈し、効力は、第ＶＩＩ因子遺伝子サイレンシングモデルを用いて系列ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ＞ＤＬｉｎＫＤＭＡ＞ＤＬｉｎＤＭＡ＞＞ＤＬｉｎＤＡＰに従い様々であることが示されている（例えば、Ｒｏｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ  １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照）。ＬＮＰ又はＬＮＰ中の又はそれに関連するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ＲＮＡの１μｇ／ｍｌの投薬量が、特にＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡを含有する製剤について企図され得る。
【０２８５】
ＬＮＰ及びＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ封入の調製は、Ｒｏｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ  １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１）を使用し及び／又は適合させ得る。カチオン性脂質１，２−ジリネオイル（ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ）−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシケト−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）、（３−ｏ−［２”−（メトキシポリエチレングリコール２０００）サクシノイル］−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリコール（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）、及びＲ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオクスルプロピル（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｌｐｒｏｐｙｌ）−３−アミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）がＴｅｋｍｉｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）によって供給され、又は合成されてもよい。コレステロールはＳｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る。特定のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ  ＲＮＡは、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ、及びＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡを含有するＬＮＰに封入してもよい（４０：１０：４０：１０モル比のカチオン性脂質：ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＰＥＧＳ−ＤＭＧ又はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）。必要な場合、０．２％ＳＰ−ＤｉＯＣ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）を取り入れて細胞取込み、細胞内送達、及び体内分布を評価する。封入は、カチオン性脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（４０：１０：４０：１０モル比）で構成される脂質混合物をエタノール中に１０ｍｍｏｌ／ｌの最終脂質濃度となるように溶解することにより実施し得る。このエタノール脂質溶液を５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、ｐＨ４．０に滴下して加えると、多層小胞が形成され、３０％エタノールｖｏｌ／ｖｏｌの最終濃度が生じ得る。エクストルーダ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用して２つの積み重ねた８０ｎｍ  Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅポリカーボネートフィルタで多層小胞を押し出した後、大きい単層小胞が形成され得る。封入は、３０％エタノールｖｏｌ／ｖｏｌを含有する５０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、ｐＨ４．０中に２ｍｇ／ｍｌのＲＮＡを、押し出されて予め形成された大きい単層小胞に滴下して加え、０．０６／１ｗｔ／ｗｔの最終ＲＮＡ／脂質重量比となるように常に混合しながら３１℃で３０分間インキュベートすることにより達成し得る。Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ２再生セルロース透析膜を使用したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４での１６時間の透析によってエタノールの除去及び製剤化緩衝液の中和を実施した。ナノ粒径分布はＮＩＣＯＭＰ  ３７０粒径測定機、小胞／強度モード、及びガウスフィッティング（Ｎｉｃｏｍｐ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎ���，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を使用した動的光散乱によって決定し得る。３つ全てのＬＮＰ系の粒径が直径約７０ｎｍであり得る。ＲＮＡ封入効率は、透析前及び透析後に収集した試料からＶｉｖａＰｕｒｅＤ  ＭｉｎｉＨカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して遊離ＲＮＡを除去することにより決定し得る。溶出したナノ粒子から封入されたＲＮＡを抽出し、２６０ｎｍで定量化し得る。Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）からのコレステロールＥ酵素アッセイを用いて小胞中のコレステロール含有量を計測することにより、ＲＮＡ対脂質比を決定した。本明細書におけるＬＮＰ及びＰＥＧ脂質の考察と併せて、ＰＥＧ化リポソーム又はＬＮＰも同様にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はその構成成分の送達に好適である。
【０２８６】
大きいＬＮＰの調製は、Ｒｏｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ  １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を使用し及び／又は応用し得る。エタノール中にＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを５０：１０：３８．５モル比で含有する脂質プレミックス溶液（２０．４ｍｇ／ｍｌ総脂質濃度）を調製し得る。酢酸ナトリウムを０．７５：１（酢酸ナトリウム：ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）のモル比でこの脂質プレミックスに加え得る。続いて混合物を１．８５容積のクエン酸塩緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ３．０）と激しく撹拌しながら合わせることにより脂質を水和させると、３５％エタノールを含有する水性緩衝液中でリポソームの自然形成が起こり得る。このリポソーム溶液を３７℃でインキュベートして、粒径を時間依存的に増加させ得る。インキュベーション中様々な時点でアリコートを取り出して、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によってリポソームサイズの変化を調べ得る。所望の粒径に達したところで、総脂質の３．５％の最終ＰＥＧモル濃度が得られるようにリポソーム混合物にＰＥＧ脂質水溶液（ストック＝３５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール中１０ｍｇ／ｍｌ  ＰＥＧ−ＤＭＧ）を加え得る。ＰＥＧ−脂質を加えると、リポソームはそのサイズで、更なる成長が事実上クエンチされるはずである。次に空のリポソームに約１：１０（ｗｔ：ｗｔ）のＲＮＡ対総脂質でＲＮＡを加え、続いて３７℃で３０分間インキュベートすると、負荷されたＬＮＰが形成され得る。続いてこの混合物をＰＢＳで一晩透析し、０．４５μｍシリンジフィルタでろ過し得る。
【０２８７】
球状核酸（ＳＮＡ（商標））構築物及び他のナノ粒子（特に金ナノ粒子）もまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を意図した標的に送達する手段として企図される。多量のデータが、核酸機能化金ナノ粒子をベースとするＡｕｒａＳｅｎｓｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの球状核酸（ＳＮＡ（商標））構築物が有用であることを示している。
【０２８８】
本明細書の教示と併せて用い得る文献としては、Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１  １３３：９２５４−９２５７、Ｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｍａｌｌ．２０１１  ７：３１５８−３１６２、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１１  ５：６９６２−６９７０、Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２  １３４：１３７６−１３９１、Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１２  １２：３８６７−７１、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２  １０９：１１９７５−８０、Ｍｉｒｋｉｎ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２  ７：６３５−６３８  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２  １３４：１６４８８−１６９１、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３  ４９５：Ｓ１４−Ｓ１６、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３  １１０（１９）：７６２５−７６３０、Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０９ｒａ１５２（２０１３）及びＭｉｒｋｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，１０：１８６−１９２が挙げられる。
【０２８９】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の遠位端に結合したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドリガンドによってポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をＰＥＧ化して、ＲＮＡを含む自己集合性ナノ粒子を構築し得る。この系は、例えば、インテグリンを発現する腫瘍新生血管系を標的化し、且つ血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦ  Ｒ２）の発現を阻害して、それにより腫瘍血管新生を達成するｓｉＲＮＡを送達する手段として用いられている（例えば、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１９を参照）。ナノプレックスは、等容積のカチオン性ポリマーと核酸との水溶液を混合して２〜６の範囲にわたって正味モル過剰のイオン化可能窒素（ポリマー）対リン酸（核酸）を得ることにより調製し得る。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用によって平均粒径分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従ってここではナノプレックスと称された。Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．の自己集合性ナノ粒子での送達には、約１００〜２００ｍｇの投薬量のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓが想定される。
【０２９０】
Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２５，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．３９）のナノプレックスもまた、本発明に適用され得る。Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．のナノプレックスは、等容積のカチオン性ポリマーと核酸との水溶液を混合して２〜６の範囲にわたって正味モル過剰のイオン化可能な窒素（ポリマー）対リン酸（核酸）を得ることにより調製される。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用によって平均粒径分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従ってここではナノプレックスと称された。Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．のＤＯＴＡ−ｓｉＲＮＡは、以下のとおり合成された：１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＤＯＴＡ−ＮＨＳエステル）をＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）から注文した。カーボネート緩衝液（ｐＨ９）中１００倍モル過剰のＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステルを有するアミン改変ＲＮＡセンス鎖を微量遠心管に加えた。室温で４時間撹拌することにより内容物を反応させた。ＤＯＴＡ−ＲＮＡセンスコンジュゲートをエタノール沈殿させて、水中に再懸濁し、及び非改変アンチセンス鎖とアニーリングさせることにより、ＤＯＴＡ−ｓｉＲＮＡを得た。液体は全てＣｈｅｌｅｘ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で前処理して微量金属の汚染が除去された。シクロデキストリン含有ポリカチオンを使用することにより、Ｔｆ標的及び非標的ｓｉＲＮＡナノ粒子を形成し得る。典型的には、３（±）の電荷比及び０．５ｇ／リットルのｓｉＲＮＡ濃度で水中にナノ粒子が形成された。標的ナノ粒子の表面上にある１パーセントのアダマンタン−ＰＥＧ分子をＴｆ（アダマンタン−ＰＥＧ−Ｔｆ）で改変した。注射用に５％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコース担体溶液中にナノ粒子を懸濁した。
【０２９１】
Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ  ４６４，１５  Ａｐｒｉｌ  ２０１０）は、標的ナノ粒子送達系を使用するＲＮＡ臨床試験を行う（臨床試験登録番号ＮＣＴ００６８９０６５）。標準ケア療法に抵抗性の固形癌患者に対し２１日間サイクルの１、３、８及び１０日目に用量の標的ナノ粒子を３０分間静脈内注入によって投与する。ナノ粒子は、（１）線状シクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、（２）癌細胞の表面上のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に会合するようにナノ粒子の外側に提示されたヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）標的リガンド、（３）親水性ポリマー（生体液中でのナノ粒子の安定性を促進するために用いられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、及び（４）ＲＲＭ２の発現を低下させるように設計されたｓｉＲＮＡ（臨床で使用された配列は、以前はｓｉＲ２Ｂ＋５と称された）を含有する合成送達系からなる。ＴＦＲは悪性細胞で上方制御されることが長く知られており、及びＲＲＭ２は確立された抗癌標的である。これらのナノ粒子（臨床版はＣＡＬＡＡ−０１と称される）は、非ヒト霊長類における複数回投与試験で良好に忍容されることが示されている。１人の慢性骨髄性白血病患者にｓｉＲＮＡがリポソーム送達によって投与されているが、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．の臨床試験は、ｓｉＲＮＡを標的送達系で全身送達して固形癌患者を治療する初期ヒト試験である。標的送達系がヒト腫瘍への機能性ｓｉＲＮＡの有効な送達を提供し得るかどうかを確かめるため、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．は、３つの異なる投与コホートからの３人の患者の生検を調べた；患者Ａ、Ｂ及びＣ、全員が転移性黒色腫を有し、それぞれ１８、２４及び３０ｍｇ・ｍ−２  ｓｉＲＮＡのＣＡＬＡＡ−０１の投与を受けた。同程度の用量が本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系にも企図され得る。本発明の送達は、線状シクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、癌細胞の表面上のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に会合するようにナノ粒子の外側に提示されたヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）標的リガンド、及び／又は親水性ポリマー（例えば、生体液中でのナノ粒子の安定性を促進するために用いられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含有するナノ粒子で達成され得る。
【０２９２】
本発明に関しては、ＣＲＩＳＰＲ複合体の１つ以上の構成成分、例えばＣＲＩＳＰＲ酵素又はｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡをナノ粒子又は脂質エンベロープを用いて送達することが好ましい。他の送達系又はベクターを本発明のナノ粒子の態様と併せて用いてもよい。
【０２９３】
一般に、「ナノ粒子」は、直径が１０００ｎｍ未満の任意の粒子を指す。特定の好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は最大径（例えば直径）が５００ｎｍ以下である。他の好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は最大径が２５ｎｍ〜２００ｎｍの範囲である。他の好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は最大径が１００ｎｍ以下である。他の好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は最大径が３５ｎｍ〜６０ｎｍの範囲である。
【０２９４】
本発明に包含されるナノ粒子（ｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅ）は、例えば、固体ナノ粒子（例えば、銀、金、鉄、チタンなどの金属）、非金属、脂質ベースの固体、ポリマー）、ナノ粒子の懸濁液、又はこれらの組み合わせとして、種々の形態で提供され得る。金属、誘電体、及び半導体ナノ粒子、並びにハイブリッド構造（例えば、コアシェルナノ粒子）を調製してもよい。半導体材料でできているナノ粒子はまた、電子エネルギーレベルの量子化が起こるのに十分に小さい（典型的には１０ｎｍ未満）ならば、標識量子ドットであってもよい。かかるナノスケール粒子は、生物医学的適用において薬物担体又は造影剤として用いられ、本発明における同様の目的に応用し得る。
【０２９５】
半固体及び軟質ナノ粒子が製造されており、本発明の範囲内にある。半固体の性質のプロトタイプナノ粒子がリポソームである。各種のリポソームナノ粒子が現在、抗癌薬及びワクチンの送達系として臨床で用いられている。一方の親水性の半体と他方の疎水性の半体とを有するナノ粒子はヤヌス粒子と呼ばれ、特にエマルションを安定化させるのに有効である。ヤヌス粒子は水／油界面で自己集合して、固体界面活性剤として働くことができる。
【０２９６】
米国特許第８，７０９，８４３号明細書（参照により本明細書に援用される）は、治療剤含有粒子を組織、細胞、及び細胞内区画に標的化して送達するための薬物送達システムを提供する。本発明は、界面活性剤、親水性ポリマー又は脂質にコンジュゲートしたポリマーを含む標的粒子を提供する。
【０２９７】
米国特許第６，００７，８４５号明細書（参照により本明細書に援用される）は、多官能化合物を１つ以上の疎水性ポリマー及び１つ以上の親水性ポリマーと共有結合的に連結することにより形成されたマルチブロック共重合体のコアを有し、且つ生物学的に活性な材料を含有する粒子を提供する。
【０２９８】
米国特許第５，８５５，９１３号明細書（参照により本明細書に援用される）は、肺系統への薬物送達のためその表面上に界面活性剤を取り込んだ、タップ密度が０．４ｇ／ｃｍ３未満で平均直径が５μｍ〜３０μｍの空気力学的に軽い粒子を有する粒子状組成物を提供する。
【０２９９】
米国特許第５，９８５，３０９号明細書（参照により本明細書に援用される）は、界面活性剤及び／又は正電荷又は負電荷治療薬又は診断薬と肺系統への送達用の逆の電荷の荷電分子との親水性又は疎水性複合体を取り込んだ粒子を提供する。
【０３００】
米国特許第５，５４３，１５８号明細書（参照により本明細書に援用される）は、生物学的に活性な材料を含有する生分解性固体コア及び表面上のポリ（アルキレングリコール）部分を有する生分解性注射用粒子を提供する。
【０３０１】
国際公開第２０１２１３５０２５号パンフレット（米国特許出願公開第２０１２０２５１５６０号明細書としても公開されている）（参照により本明細書に援用される）は、コンジュゲート型ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマー及びコンジュゲート型アザ大環状分子（まとめて「コンジュゲート型リポマー（ｌｉｐｏｍｅｒ）」又は「リポマー」と称される）について記載している。特定の実施形態において、かかるコンジュゲート型リポマーを、インビトロ、エキソビボ及びインビボゲノム摂動を達成してタンパク質発現の改変を含めた遺伝子発現の改変を行うためＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のコンテクストで使用し得ることを想定し得る。
【０３０２】
一実施形態において、ナノ粒子はエポキシド改変脂質ポリマー、有利には７Ｃ１であってもよい（例えば、Ｊａｍｅｓ  Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｍｅｎ  Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １１  Ｍａｙ  ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４を参照）。Ｃ７１は、Ｃ１５エポキシド末端脂質をＰＥＩ６００と１４：１のモル比で混合することにより合成され、Ｃ１４ＰＥＧ２０００と配合されて、ＰＢＳ溶液中で少なくとも４０日間安定なナノ粒子が作製された（直径３５〜６０ｎｍ）。
【０３０３】
エポキシド改変脂質ポリマーを利用して本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を肺細胞、心血管細胞又は腎細胞に送達し得るが、しかしながら、当業者はこの系を応用して他の標的器官に送達し得る。約０．０５〜約０．６ｍｇ／ｋｇの範囲の投薬量が想定される。数日間又は数週間にわたる、合計投薬量を約２ｍｇ／ｋｇとする投薬もまた想定される。
【０３０４】
エキソソーム
エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送する内因性のナノ小胞であり、これはＲＮＡを脳及び他の標的器官に送達することができる。免疫原性を低下させるため、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９：３４１）はエキソソーム産生に自己由来の樹状細胞を使用した。ニューロン特異的ＲＶＧペプチドに融合したエキソソーム膜タンパク質Ｌａｍｐ２ｂを発現するように樹状細胞をエンジニアリングすることにより、脳への標的化が達成された。精製エキソソームに電気穿孔によって外因性ＲＮＡが負荷された。静脈内注射されるＲＶＧ標的化エキソソームが、ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡを脳内のニューロン、ミクログリア、オリゴデンドロサイトに特異的に送達し、特異的遺伝子ノックダウンが得られた。ＲＶＧエキソソームに予め曝露してもノックダウンは減弱しなかったとともに、他の組織における非特異的取込みは観察されなかった。アルツハイマー病の治療標的であるＢＡＣＥ１の強力なｍＲＮＡ（６０％）及びタンパク質（６２％）ノックダウンによって、エキソソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達の治療可能性が実証された。
【０３０５】
免疫学的に不活性なエキソソームのプールを得るため、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．は、同種主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプの近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスから骨髄を採取した。未熟樹状細胞は、ＭＨＣ−ＩＩ及びＣＤ８６など、Ｔ細胞アクチベーターを欠くエキソソームを多量に産生するため、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．は、顆粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を有する樹状細胞を７日間選択した。翌日、十分に確立された超遠心法プロトコルを用いて培養上清からエキソソームを精製した。産生されたエキソソームは物理的に均一であり、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）及び電子顕微鏡法によって決定したとき分布サイズのピークが直径８０ｎｍであった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．は、１０６細胞当たり（タンパク質濃度に基づき計測して）６〜１２μｇのエキソソームを得た。
【０３０６】
次に、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．は、ナノスケール適用に適合させた電気穿孔プロトコルを用いて改変エキソソームに外因性カーゴを負荷する可能性を調べた。ナノメートルスケールでの膜粒子に対する電気穿孔は十分に特徴付けられていないため、非特異的Ｃｙ５標識ＲＮＡを使用して電気穿孔プロトコルを経験的に最適化した。超遠心法及びエキソソームの溶解後に、封入されるＲＮＡの量をアッセイした。４００Ｖ及び１２５μＦでの電気穿孔が最大のＲＮＡ保持をもたらし、以降の全ての実験でこれを使用した。
【０３０７】
Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．は、１５０μｇのＲＶＧエキソソームに封入された１５０μｇの各ＢＡＣＥ１  ｓｉＲＮＡを正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与し、４つの対照とノックダウン効率を比較した：未治療マウス、ＲＶＧエキソソームのみを注入したマウス、インビボカチオン性リポソーム試薬と複合体化したＢＡＣＥ１  ｓｉＲＮＡを注入したマウス、及びＲＶＧ−９Ｒ（ｓｉＲＮＡに静電的に結合する９つのＤ−アルギニンとコンジュゲートしたＲＶＧペプチド）と複合体化したＢＡＣＥ１  ｓｉＲＮＡを注入したマウス。投与３日後に皮質組織試料を分析し、ｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ−９Ｒ治療マウス及びｓｉＲＮＡＲＶＧエキソソーム治療マウスの両方で有意なタンパク質ノックダウン（４５％、Ｐ＜０．０５、対６２％、Ｐ＜０．０１）が観察され、ＢＡＣＥ１  ｍＲＮＡレベルの有意な低下がもたらされた（それぞれ６６％±１５％、Ｐ＜０．００１及び６１％±１３％、Ｐ＜０．０１）。更に、この出願人らは、ＲＶＧ−エキソソーム治療動物においてアルツハイマー病におけるアミロイド斑の主要な構成成分である総β−アミロイド１−４２レベルの有意な低下（５５％、Ｐ＜０．０５）を実証した。観察された低下は、正常マウスでＢＡＣＥ１阻害薬の脳室内注射後に実証されたβ−アミロイド１−４０の低下よりも大きかった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．はＢＡＣＥ１切断産物でｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）を実施し、これは、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ媒介性ノックダウンのエビデンスを提供した。
【０３０８】
最後に、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．は、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＴＮＦα及びＩＦＮ−α血清濃度を評価することにより、ＲＮＡ−ＲＶＧエキソソームがインビボで免疫応答を誘導したかどうかを調べた。エキソソーム治療後、ｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ−９Ｒと対照的にｓｉＲＮＡ−トランスフェクション試薬治療と同様に全てのサイトカインにおける有意でない変化を記録し、これはＩＬ−６分泌を強力に刺激したことから、エキソソーム治療の免疫学的に不活性なプロファイルが確認された。エキソソームがｓｉＲＮＡの２０％しか封入しないことを所与とすれば、対応するレベルの免疫刺激なしに５分の１のｓｉＲＮＡで同等のｍＲＮＡノックダウン及びより大きいタンパク質ノックダウンが達成されたため、ＲＶＧ−エキソソームによる送達はＲＶＧ−９Ｒ送達よりも効率的であるように見える。この実験は、ＲＶＧ−エキソソーム技術の治療可能性を実証したものであり、これは潜在的に神経変性疾患に関連する遺伝子の長期サイレンシングに適している。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．のエキソソーム送達系は、治療標的、特に神経変性疾患への本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の送達に適用し得る。約１００〜１０００ｍｇのＲＶＧエキソソームに封入された約１００〜１０００ｍｇのＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓの投薬量が本発明に企図され得る。
【０３０９】
Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ７，２１１２−２１２６（２０１２））は、培養細胞に由来するエキソソームをどのようにインビトロ及びインビボでのＲＮＡの送達に利用することができるかを開示している。このプロトコルは、初めに、ペプチドリガンドと融合したエキソソームタンパク質を含む、発現ベクターのトランスフェクションによる標的エキソソームの作成を記載している。次に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．は、トランスフェクト細胞上清からエキソソームをどのように精製し及び特徴付けるかを説明する。次に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．は、ＲＮＡをエキソソームに負荷するために重要なステップを詳説する。最後に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．は、どのようにエキソソームを使用してインビトロで及びマウス脳においてインビボでＲＮＡを効率的に送達するかを概説する。エキソソーム媒介性ＲＮＡ送達の見込まれた結果の例が機能アッセイによって評価され、イメージングもまた提供される。プロトコル全体は約３週間かかる。本発明に係る送達又は投与は、自己由来樹状細胞から産生されたエキソソームを使用して実施されてもよい。本明細書における教示から、これを本発明の実施において用いることができる。
【０３１０】
別の実施形態において、Ｗａｈｌｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１７  ｅ１３０）の血漿エキソソームが企図される。エキソソームは、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、肥満細胞、上皮細胞及び腫瘍細胞を含めた多くの細胞型によって産生されるナノサイズの小胞（３０〜９０ｎｍサイズ）である。これらの小胞は後期エンドソームの内向きの出芽によって形成され、次に細胞膜との融合時に細胞外環境へと放出される。エキソソームは天然で細胞間にＲＮＡを有するため、この特性は遺伝子療法に有用であり得るとともに、この開示から、本発明の実施に用いることができる。
【０３１１】
血漿からのエキソソームは、バフィーコートを９００ｇで２０分間遠心して血漿を単離し、続いて細胞上清を回収し、３００ｇで１０分間遠心して細胞を除去し、１６  ５００ｇで３０分間遠心し、続いて０．２２ｍｍフィルタでろ過することにより調製することができる。１２０  ０００ｇで７０分間の超遠心によってエキソソームをペレット化する。エキソソームへのｓｉＲＮＡの化学的トランスフェクションをＲＮＡｉヒト／マウススターターキット（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で製造者の指示に従い実施する。ｓｉＲＮＡを１００ｍｌ  ＰＢＳに２ｍｍｏｌ／ｍｌの最終濃度で加える。ＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬を加えた後、混合物を室温で１０分間インキュベートする。過剰なミセルを除去するため、アルデヒド／硫酸塩ラテックスビーズを使用してエキソソームを再単離する。エキソソームへのＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓの化学的トランスフェクションをｓｉＲＮＡと同様に行い得る。エキソソームを健常ドナーの末梢血から単離した単球及びリンパ球と共培養し得る。従って、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓを含有するエキソソームをヒトの単球及びリンパ球に導入し、且つヒトに自己再導入し得ることが企図され得る。従って、本発明に係る送達又は投与を血漿エキソソームを用いて実施し得る。
【０３１２】
リポソーム
本発明に係る送達又は投与は、リポソームで実施することができる。リポソームは、内部の水性区画を取り囲む単層又は多重膜脂質二重層及び比較的不透過性の外側の親油性リン脂質二重層からなる球形の小胞構造である。リポソームは、生体適合性であり、非毒性であり、親水性及び親油性の両方の薬物分子を送達することができ、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、且つ生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を越えてそのロードを輸送するため、薬物送達担体として大いに注目を集めてきた（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，１２  ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。
【０３１３】
リポソームは幾つかの異なるタイプの脂質から作製することができる；しかしながら、薬物担体としてのリポソームの作成には、リン脂質が最も一般的に用いられている。脂質薄膜が水溶液と混合されたときにリポソーム形成は自然に起こるが、また、ホモジナイザー、ソニケーター、又は押出し装置を使用して振盪の形態の力を加えることによっても促進し得る（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，１２  ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。
【０３１４】
その構造及び特性を改変するため、リポソームに幾つかの他の添加剤を加えてもよい。例えば、リポソーム構造の安定化を助けるため、及びリポソームの内部カーゴの漏出を防ぐため、リポソーム混合物にコレステロール又はスフィンゴミエリンのいずれかを加えてもよい。更に、リポソームは、水素化卵ホスファチジルコリン又は卵ホスファチジルコリン、コレステロール、及びジセチルリン酸から調製され、その平均小胞サイズは約５０及び１００ｎｍに調整された（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，１２  ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。
【０３１５】
リポソーム製剤は主に、１，２−ジステアロイル（ｄｉｓｔｅａｒｏｒｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン及びモノシアロガングリオシドなどの天然リン脂質及び脂質で構成され得る。この製剤はリン脂質のみでできているため、リポソーム製剤は多くの難題に直面しており、その１つが血漿中での不安定性である。これらの難題を解消しようとする幾つかの試みが、特に脂質膜の操作においてなされている。これらの試みの１つは、コレステロールの操作に着目するものであった。従来の製剤にコレステロールを加えると、封入された生物学的活性化合物が血漿又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）中に急速に放出されることが抑えられ、安定性が増す（例えば、レビューについては、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，１２  ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。
【０３１６】
特に有利な実施形態において、トロイの木馬リポソーム（分子トロイの木馬としても知られる）が望ましく、ｈｔｔｐ：／／ｃｓｈｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０１０／４／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７．ｌｏｎｇにおいてプロトコルを参照し得る。これらの粒子は、トランス遺伝子を血管内注射後に脳全体に送達することが可能である。制約により拘束されるものではないが、特異抗体が表面にコンジュゲートした中性脂質粒子はエンドサイトーシスによって血液脳関門を通過することが可能であると考えられる。本出願人は、トロイの木馬リポソームを利用してヌクレアーゼのＣＲＩＳＰＲファミリーを血管内注射によって脳に送達することを仮定し、これにより、胚を操作する必要なしに全脳トランスジェニック動物が実現し得る。リポソームでの生体内投与には、約１〜５ｇのＤＮＡ又はＲＮＡが企図され得る。
【０３１７】
別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその構成成分は安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）などのリポソームで投与され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ  ２００５を参照）。ＳＮＡＬＰで標的化される特定のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓの毎日の約１、３又は５ｍｇ／ｋｇ／日の静脈内注射が企図される。毎日の治療は約３日間にわたり、次に毎週、約５週間にわたり得る。別の実施形態において、特定のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓが封入されたＳＮＡＬＰの約１又は２．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注射による投与もまた企図される（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４  Ｍａｙ  ２００６を参照）。ＳＮＡＬＰ製剤は、脂質３−Ｎ−［（ｗメトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオキシ−プロピルアミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びコレステロールを２：４０：１０：４８モルパーセント比で含有し得る（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４  Ｍａｙ  ２００６を参照）。
【０３１８】
別の実施形態において、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、高度に血管新生したＨｅｐＧ２由来肝腫瘍への分子の送達に有効であるが、血管新生が不十分なＨＣＴ−１１６由来肝腫瘍においては有効でないことが分かっている（例えば、Ｌｉ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１９，７７５−７８０を参照）。ＳＮＡＬＰリポソームは、Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡをジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及びｓｉＲＮＡと共に２５：１脂質／ｓｉＲＮＡ比及び４８／４０／１０／２モル比のコレステロール／Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡを用いて製剤化することにより調製し得る。得られたＳＮＡＬＰリポソームは約８０〜１００ｎｍサイズである。
【０３１９】
更に別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）、３−Ｎ−［（ｗ−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミレスチルオキシプロピルアミン（ｄｉｍｙｒｅｓｔｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）、及びカチオン性１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎジメチルアミノアミノプロパンを含み得る（例えば、Ｇｅｉｓｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ２０１０；３７５：１８９６−９０５を参照）。例えばボーラス静脈内注入として投与される１用量当たり合計約２ｍｇ／ｋｇのＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓの投薬量が企図され得る。
【０３２０】
更に別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、及び１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ；Ｎ−ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含み得る（例えば、Ｊｕｄｇｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９：６６１−６７３（２００９）を参照）。インビボ研究に用いられる製剤は、約９：１の最終脂質／ＲＮＡ質量比を含み得る。
【０３２１】
ＲＮＡｉナノメディシンの安全性プロファイルが、Ａｌｎｙｌａｍ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＢａｒｒｏｓ  ａｎｄ  Ｇｏｌｌｏｂによってレビューされている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６４（２０１２）１７３０−１７３７を参照）。安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、４つの異なる脂質−低ｐＨでカチオン性のイオン化可能な脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）、中性ヘルパー脂質、コレステロール、及び拡散性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質で構成される。この粒子は直径約８０ｎｍであり、生理的ｐＨで電荷的に中性である。製剤化時、イオン化可能な脂質が粒子形成の間に脂質をアニオン性ＲＮＡと凝縮させる働きをする。漸進的に酸性になるエンドソーム条件下で正電荷のとき、イオン化可能な脂質はまた、ＳＮＡＬＰとエンドソーム膜との融合も媒介し、細胞質中へのＲＮＡの放出を可能にする。ＰＥＧ−脂質は粒子を安定化させ、製剤化時の凝集を低減し、続いて薬物動態特性を改善する中性の親水性外部を提供する。
【０３２２】
現在までに、ＲＮＡを有するＳＮＡＬＰ製剤を使用して２つの臨床プログラムが開始されている。Ｔｅｋｍｉｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、最近、高ＬＤＬコレステロールの成人ボランティアにおけるＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢの第Ｉ相単回投与試験を完了した。ＡｐｏＢは主に肝臓及び空腸に発現し、ＶＬＤＬ及びＬＤＬのアセンブリ及び分泌に必須である。１７人の対象に単一用量のＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢが投与された（７用量レベルにわたる用量漸増）。肝毒性（前臨床試験に基づき潜在的用量制限毒性として予想された）のエビデンスはなかった。（２人中）１人の対象が最も高い用量で免疫系刺激と一致してインフルエンザ様症状を起こし、試験終了が決定された。
【０３２３】
Ａｌｎｙｌａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓも同様にＡＬＮ−ＴＴＲ０１を進めており、これは上記に記載されるＳＮＡＬＰ技術を用い、ＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）の治療のため突然変異体及び野生型の両方のＴＴＲの肝細胞産生を標的化する。３つのＡＴＴＲ症候群が記載されている：家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）及び家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）−両方ともにＴＴＲの常染色体優性突然変異によって引き起こされる；及び野生型ＴＴＲによって引き起こされる老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１のプラセボ対照単回用量漸増第Ｉ相試験が最近、ＡＴＴＲ患者で完了した。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１が１５分間の静脈内注入として３１人の患者に（２３人は試験薬物及び８人はプラセボ）０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲内で（ｓｉＲＮＡに基づく）投与された。治療は良好に忍容され、肝機能検査値の重大な増加はなかった。≧０．４ｍｇ／ｋｇで２３人中３人の患者に注入関連反応が認められた；全員が注入速度の減速に応答し、全員が試験を続行した。２人の患者に１ｍｇ／ｋｇの最も高い用量で血清サイトカインＩＬ−６、ＩＰ−１０及びＩＬ−１ｒａの最小限且つ一過性の上昇が認められた（前臨床及びＮＨＰ試験から予想されたとおり）。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１の期待された薬力学的効果である血清ＴＴＲの低下が１ｍｇ／ｋｇで観察された。
【０３２４】
更に別の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、例えばカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ−脂質をエタノール中に、例えばそれぞれ４０：１０：４０：１０のモル比で可溶化させることにより作製し得る（Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２８  Ｎｕｍｂｅｒ  ２  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１０，ｐｐ．１７２−１７７を参照）。水性緩衝液（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４）にそれぞれ３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）及び６．１ｍｇ／ｍｌの最終エタノール及び脂質濃度となるように混合しながら脂質混合物を加え、２２℃で２分間平衡化させた後、押し出した。水和した脂質を、２つの積み重ねた８０ｎｍ細孔径フィルタ（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）で２２℃においてＬｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、動的光散乱分析によって決定したとき７０〜９０ｎｍの小胞直径が観察されるまで押し出した。これには、概して１〜３回のパスが必要であった。ｓｉＲＮＡ（３０％エタノールを含有する５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４水溶液中に可溶化した）を、予め平衡化した（３５℃）小胞に約５ｍｌ／分の速度で混合しながら加えた。０．０６（ｗｔ／ｗｔ）の最終目標ｓｉＲＮＡ／脂質比に達した後、混合物を３５℃で更に３０分間インキュベートして小胞再構築及びｓｉＲＮＡの封入を可能にした。次にエタノールを除去し、外部緩衝液を透析又はタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションのいずれかによってＰＢＳ（１５５ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）と交換した。制御された段階的希釈方法プロセスを用いてｓｉＲＮＡをＳＮＡＬＰに封入した。ＫＣ２−ＳＮＡＬＰの脂質構成要素は、５７．１：７．１：３４．３：１．４のモル比で用いられたＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（カチオン性脂質）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ）及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡであった。負荷粒子が形成されたところで、ＳＮＡＬＰをＰＢＳで透析し、使用前に０．２μｍフィルタで滅菌ろ過した。平均粒径は７５〜８５ｎｍであり、ｓｉＲＮＡの９０〜９５％が脂質粒子内に封入された。インビボ試験に使用した製剤中の最終的なｓｉＲＮＡ／脂質比は約０．１５（ｗｔ／ｗｔ）であった。使用直前に、第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含有するＬＮＰ−ｓｉＲＮＡ系を滅菌ＰＢＳ中に適切な濃度に希釈し、製剤を１０ｍｌ／ｋｇの合計容積で外側尾静脈から静脈内投与した。この方法及びこれらの送達系は、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に当てはめることができる。
【０３２５】
他の脂質
アミノ脂質２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）などの他のカチオン性脂質を利用して、例えばＳｉＲＮＡと同様に、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ又はその構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子を封入してもよく（例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，８５２９−８５３３を参照）、従って本発明の実施に用い得る。以下の脂質組成を有する予め形成された小胞が企図され得る：アミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及び（Ｒ）−２，３−ビス（オクタデシルオキシ）プロピル−１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート（ＰＥＧ−脂質）、それぞれモル比４０／１０／４０／１０、及び約０．０５（ｗ／ｗ）のＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ／総脂質比。７０〜９０ｎｍの範囲の狭い粒径分布及び０．１１±０．０４の低い多分散性指数（ｎ＝５６）が確実となるように、粒子を最大３回まで８０ｎｍ膜で押し出し、その後ガイドＲＮＡに加えた。極めて強力なアミノ脂質１６を含有する粒子を使用してもよく、ここで４つの脂質構成成分１６、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ−脂質のモル比（５０／１０／３８．５／１．５）はインビボ活性を増強させるため更に最適化され得る。
【０３２６】
Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓ  Ｄ  Ｋｏｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（「マウスにおける化学的に改変されたｍＲＮＡの送達後の治療用タンパク質の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）：Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ：２９，Ｐａｇｅｓ：１５４−１５７（２０１１））は、脂質エンベロープを用いたＲＮＡの送達について記載している。脂質エンベロープの使用は本発明においても好ましい。
【０３２７】
別の実施形態では、脂質を本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子と共に製剤化して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成してもよい。脂質としては、限定はされないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ４、Ｃ１２−２００及びコリピド（ｃｏｌｉｐｉｄ）ジステロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ）、コレステロールが挙げられ、及びＰＥＧ−ＤＭＧを小胞自然形成手順を用いてｓｉＲＮＡの代わりにＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓと共に製剤化してもよい（例えば、Ｎｏｖｏｂｒａｎｔｓｅｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（２０１２）１，ｅ４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．３を参照）。構成成分のモル比は約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ又はＣ１２−２００／ジステロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ）／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ）であってもよい。最終的な脂質：ｓｉＲＮＡ重量比は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ及びＣ１２−２００脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の場合、それぞれ約１２：１及び９：１であり得る。製剤は、＞９０％の捕捉効率で約８０ｎｍの平均粒子直径を有し得る。３ｍｇ／ｋｇ用量が企図され得る。
【０３２８】
Ｔｅｋｍｉｒａは、米国及び米国外に、ＬＮＰ及びＬＮＰ製剤の様々な態様に関する約９５のパテントファミリーのポートフォリオを有し（例えば、米国特許第７，９８２，０２７号明細書；同第７，７９９，５６５号明細書；同第８，０５８，０６９号明細書；同第８，２８３，３３３号明細書；同第７，９０１，７０８号明細書；同第７，７４５，６５１号明細書；同第７，８０３，３９７号明細書；同第８，１０１，７４１号明細書；同第８，１８８，２６３号明細書；同第７，９１５，３９９号明細書；同第８，２３６，９４３号明細書及び同第７，８３８，６５８号明細書及び欧州特許第１７６６０３５号明細書；同第１５１９７１４号明細書；同第１７８１５９３号明細書及び同第１６６４３１６号明細書を参照）、これらは全て、本発明に使用及び／又は応用することができる。
【０３２９】
ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子は、タンパク質、タンパク質前駆体、又は部分的又は完全にプロセシングされた形態のタンパク質又はタンパク質前駆体をコードし得る改変核酸分子を含む組成物の製剤の態様に関する米国特許出願公開第２０１３０２５２２８１号明細書及び同第２０１３０２４５１０７号明細書及び同第２０１３０２４４２７９号明細書（Ｍｏｄｅｒｎａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに譲渡された）に更に記載されるものなど、ＰＬＧＡミクロスフェアに封入して送達し得る。製剤は、モル比５０：１０：３８．５：１．５〜３．０（カチオン性脂質：膜融合性脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質）を有し得る。ＰＥＧ脂質は、限定はされないが、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧから選択され得る。膜融合性脂質はＤＳＰＣであり得る。また、Ｓｃｈｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、米国特許出願公開第２０１２０２５１６１８号明細書も参照のこと。
【０３３０】
Ｎａｎｏｍｅｒｉｃｓの技術は、低分子量疎水性薬物、ペプチド、及び核酸ベースの治療薬（プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を含めた広範囲の治療薬に関するバイオアベイラビリティの難題に対処している。この技術が明らかな利点を実証している特定の投与経路には、経口経路、血液脳関門を越える輸送、固形腫瘍への送達、並びに眼への送達が含まれる。例えば、Ｍａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１３  Ｆｅｂ  ２６；７（２）：１０１６−２６；Ｕｃｈｅｇｂｕ  ａｎｄ  Ｓｉｅｗ，２０１３，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．１０２（２）：３０５−１０及びＬａｌａｔｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１２  Ｊｕｌ  ２０；１６１（２）：５２３−３６を参照のこと。
【０３３１】
米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、ポリヌクレオチド分子、ペプチド及びポリペプチド及び／又は医薬品などの生理活性分子を哺乳類の体に送達するためのカチオン性デンドリマーについて記載している。デンドリマーは、生理活性分子の送達を、例えば、肝臓、脾臓、肺、腎臓又は心臓に（又は更には脳までも）標的化するのに好適である。デンドリマーは、単純な分岐単量体単位から段階的に調製される合成三次元巨大分子であり、その性質及び機能は容易に制御し、変化させることができる。デンドリマーは、構成要素を多機能コアに（ダイバージェント合成手法）、又は多機能コアに向かって（コンバージェント合成手法）反復的に加えることによって合成され、構成要素の三次元シェルを加える毎に、より高世代のデンドリマーの形成につながる。ポリプロピレンイミンデンドリマーはジアミノブタンコアから開始され、それに第一級アミンへのアクリロニトリルの二重マイケル付加によって２倍の数のアミノ基が加えられ、続いてニトリルが水素化される。この結果、アミノ基の倍増がもたらされる。ポリプロピレンイミンデンドリマーは１００％プロトン化可能な窒素及び最大６４個の末端アミノ基（第５世代、ＤＡＢ  ６４）を含有する。プロトン化可能な基は、通常、中性ｐＨでプロトンを受け取ることが可能なアミン基である。デンドリマーの遺伝子デリバリー剤としての使用は、大部分が、コンジュゲート単位としてそれぞれアミン／アミド又はＮ−−Ｐ（Ｏ２）Ｓの混合物を有するポリアミドアミン及び亜リン酸含有化合物の使用に着目したものであり、それより低い世代のポリプロピレンイミンデンドリマーの遺伝子送達への使用に関しては報告がない。ポリプロピレンイミンデンドリマーもまた、周囲アミノ酸性基によって化学的に改変されたとき薬物送達及びゲスト分子のそれらの封入のためのｐＨ感受性制御放出系として研究されている。ＤＮＡを有するポリプロピレンイミンデンドリマーの細胞傷害性及び相互作用並びにＤＡＢ  ６４のトランスフェクション有効性もまた研究されている。
【０３３２】
米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、先行の報告に反して、ポリプロピレンイミンデンドリマーなどのカチオン性デンドリマーが、特異的標的化及び低毒性など、遺伝物質など、生理活性分子の標的化した送達において用いるのに好適な特性を示すという観察に基づく。加えて、カチオン性デンドリマーの誘導体もまた、生理活性分子の標的化された送達に好適な特性を示す。また、「カチオン性ポリアミンポリマー及びデンドリマーポリマーを含めた様々なポリマーは抗増殖活性を有することが示され、従って、新生物及び腫瘍、炎症性障害（自己免疫障害を含む）、乾癬及びアテローム性動脈硬化症など、望ましくない細胞増殖によって特徴付けられる障害の治療に有用であり得る。ポリマーは単独で活性薬剤として用いられてもよく、又は遺伝子療法用の薬物分子又は核酸など、他の治療剤の送達ビヒクルとして用いられてもよい。そのような場合、ポリマーそれ自体の固有の抗腫瘍活性が、送達される薬剤の活性を補完し得る」ことを開示するＢｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，米国特許出願公開第２００８０２６７９０３号明細書も参照のこと。これらの特許公報の開示は、１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達に関する本明細書における教示と併せて用いられ得る。
【０３３３】
超荷電タンパク質
超荷電タンパク質は、異常に高い理論上の正味正電荷又は負電荷を有するエンジニアリングされた又は天然に存在するタンパク質の一クラスであり、１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達に用いられ得る。超負電荷及び超正電荷の両方のタンパク質とも、熱的又は化学的に誘導される凝集に耐える著しい能力を呈する。超正電荷タンパク質はまた、哺乳類細胞に侵入することも可能である。プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、又は他のタンパク質など、これらのタンパク質と関連付けるカーゴが、インビトロ及びインビボの両方でこれらの巨大分子を哺乳類細胞に機能的に送達することを可能にし得る。Ｄａｖｉｄ  Ｌｉｕの研究室は、２００７年に超荷電タンパク質の作成及び特徴付けを報告した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２９，１０１１０−１０１１２）。
【０３３４】
哺乳類細胞へのＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡの非ウイルス性送達は、研究及び治療適用の両方に価値がある（Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６，５６１−５６９）。精製＋３６  ＧＦＰタンパク質（又は他の超正電荷タンパク質）を適切な無血清培地中でＲＮＡと混合して複合体化させた後、細胞に加える。この段階で血清を含めると、超荷電タンパク質−ＲＮＡ複合体の形成が阻害され、治療の有効性が低下する。以下のプロトコルが種々の細胞株に有効であることが分かっている（ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６，６１１１−６１１６）（しかしながら、具体的な細胞株に対して手順を最適化するには、タンパク質及びＲＮＡの用量を変化させるパイロット実験を行わなければならない）。
【０３３５】
（１）処理前日、４８ウェルプレートにウェル当たり１×１０５細胞をプレーティングする。
【０３３６】
（２）処理当日、最終濃度２００ｎＭとなるように精製＋３６  ＧＦＰタンパク質を無血清培地中に希釈する。５０ｎＭの最終濃度となるようにＲＮＡを加える。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。
【０３３７】
（３）インキュベーション中、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。
【０３３８】
（４）＋３６  ＧＦＰ及びＲＮＡのインキュベーション後、細胞にタンパク質−ＲＮＡ複合体を加える。
【０３３９】
（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。
【０３４０】
（６）インキュベーション後、培地を吸引し、２０Ｕ／ｍＬヘパリンＰＢＳで３回洗浄する。細胞を血清含有培地と共に、活性に関するアッセイに応じて更に４８時間又はそれ以上インキュベートする。
【０３４１】
（７）免疫ブロット、ｑＰＣＲ、表現型アッセイ、又は他の適切な方法によって細胞を分析する。
【０３４２】
Ｄａｖｉｄ  Ｌｉｕの研究室は、＋３６  ＧＦＰが様々な細胞で有効なプラスミド送達試薬であることを更に見出した。プラスミドＤＮＡはｓｉＲＮＡよりも大きいカーゴであるため、プラスミドを有効に複合体化するためには、比例して更なる＋３６  ＧＦＰタンパク質が必要になる。有効なプラスミド送達のため、本出願人らは、インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質に由来する公知のエンドソーム破壊ペプチドであるＣ末端ＨＡ２ペプチドタグを担持する＋３６  ＧＦＰの変異体を開発している。以下のプロトコルが種々の細胞において有効となっているが、上記のとおり、プラスミドＤＮＡ及び超荷電タンパク質の用量を特定の細胞株及び送達の適用に最適化することが助言される。
【０３４３】
（１）処理前日、４８ウェルプレートにウェル当たり１×１０５をプレーティングする。
【０３４４】
（２）処理当日、無血清培地中の精製ｐ３６  ＧＦＰタンパク質を最終濃度２ｍＭとなるように希釈する。１ｍｇのプラスミドＤＮＡを加える。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。
【０３４５】
（３）インキュベーション中、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。
【０３４６】
（４）ｐ３６  ＧＦＰ及びプラスミドＤＮＡのインキュベーション後、タンパク質−ＤＮＡ複合体を細胞に穏やかに加える。
【０３４７】
（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。
【０３４８】
（６）インキュベーション後、培地を吸引し、ＰＢＳで洗浄する。血清含有培地中で細胞をインキュベートし、更に２４〜４８時間インキュベートする。
【０３４９】
（７）適宜、プラスミド送達を分析する（例えば、プラスミドによってドライブされる遺伝子発現による）。
【０３５０】
また、例えば、ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６，６１１１−６１１６（２００９）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５，７４７−７５２（２０１０）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １８，８３３−８３８（２０１１）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５０３，２９３−３１９（２０１２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９（７），８３１−８４３（２０１２）も参照のこと。超荷電タンパク質の方法は、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系の送達に使用及び／又は応用することができる。Ｄｒ．Ｌｕｉ及び本明細書における文献のこれらの系を本明細書における教示と併せて１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達に用いることができる。
【０３５１】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）
更に別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系の送達に細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）が企図される。ＣＰＰは、（ナノサイズ粒子から化学的小分子及び大型ＤＮＡ断片に至るまでの）様々な分子カーゴの細胞取込みを促進する短鎖ペプチドである。用語「カーゴ」は、本明細書で使用されるとき、限定はされないが、治療剤、診断プローブ、ペプチド、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、タンパク質、ナノ粒子を含めた粒子、リポソーム、発色団、小分子及び放射性物質からなる群を含む。本発明の態様では、カーゴにはまた、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系の任意の構成成分又は機能性ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系全体も含まれ得る。本発明の態様は、所望のカーゴを対象に送達する方法を更に提供し、この方法は、（ａ）本発明の細胞透過性ペプチドと所望のカーゴとを含む複合体を調製するステップ、及び（ｂ）複合体を対象に経口的に、関節内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、動脈内に（ｉｎｔｒａｒｔｅｒｉａｌｌｙ）、鼻腔内に、実質内に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、経皮的に、直腸内に、又は局所的に投与するステップを含む。カーゴは、共有結合を介した化学的連結によるか、又は非共有結合性の相互作用によるかのいずれかでペプチドと会合している。
【０３５２】
ＣＰＰの機能は、カーゴを細胞内に送達することであり、これは一般的にはエンドサイトーシスを通じて起こるプロセスであって、カーゴは哺乳類生細胞のエンドソームに送達される。細胞透過性ペプチドのサイズ、アミノ酸配列、及び電荷は様々であるが、全てのＣＰＰが、細胞膜を移行し且つ細胞質又は細胞小器官への様々な分子カーゴの送達を促進する能力である１つの個別的な特徴を有する。ＣＰＰの移行は３つの主な侵入機構に分類し得る：膜における直接の透過、エンドサイトーシスを介する侵入、及び一過性構造の形成を通じた移行。ＣＰＰは、癌及びウイルス阻害薬、並びに細胞標識用の造影剤を含め、種々の疾患の治療におけるドラッグデリバリー剤として医薬において数多くの適用が見出されている。後者の例としては、ＧＦＰ、ＭＲＩ造影剤、又は量子ドットの担体としての働きが挙げられる。ＣＰＰには、研究及び医薬に用いられるインビトロ及びインビボ送達ベクターとして大きな可能性がある。ＣＰＰのアミノ酸組成は、典型的には、リジン又はアルギニンなど正電荷アミノ酸の高い相対存在量を含むか、又は極性／荷電アミノ酸と非極性疎水性アミノ酸との交互のパターンを含む配列を有するかのいずれかである。これらの２つの構造タイプは、それぞれポリカチオン性又は両親媒性と称される。第３のＣＰＰクラスは、非極性残基のみを含む疎水性ペプチドであり、これは正味電荷が低いか又は細胞取込みに重要な疎水性アミノ酸基を有する。発見当初のＣＰＰの一つはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）由来のトランス活性化転写アクチベーター（Ｔａｔ）であり、これは多数の培養下細胞型によって周囲の培地から効率的に取り込まれることが見出された。それ以降、既知のＣＰＰの数は大幅に増え続け、より有効なタンパク質形質導入特性を有する小分子合成類似体が作成されている。ＣＰＰとしては、限定はされないが、ペネトラチン、Ｔａｔ（４８−６０）、トランスポータン、及び（Ｒ−ＡｈＸ−Ｒ４）（Ａｈｘ＝アミノヘキサノイル）が挙げられる。
【０３５３】
米国特許第８，３７２，９５１号明細書は、高い細胞透過性効率及び低毒性を呈する好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）から送達されるＣＰＰを提供する。ＣＰＰをそのカーゴで脊椎動物対象に送達する態様もまた提供されている。ＣＰＰ及びそれらの送達の更なる態様は、米国特許第８，５７５，３０５号明細書；８；同第６１４，１９４号明細書及び同第８，０４４，０１９号明細書に記載されている。ＣＰＰはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はその構成成分の送達に使用することができる。ＣＰＰを用いてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はその構成成分を送達できることはまた、論稿「Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡの細胞透過性ペプチド媒介送達による遺伝子破壊（Ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｃａｓ９    ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）」，Ｓｕｒｅｓｈ  Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ，Ａｂｕ−Ｂｏｎｓｒａｈ  Ｋｗａｋｕ  Ｄａｄ，Ｊａｇａｄｉｓｈ  Ｂｅｌｏｏｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１４  Ａｐｒ  ２．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］（全体として参照により援用される）にも提供されており、ここでは、ＣＰＰコンジュゲート組換えＣａｓ９タンパク質及びＣＰＰ複合体化ガイドＲＮＡによる処理が、ヒト細胞株における内因性遺伝子破壊につながることが実証されている。この論文では、Ｃａｓ９タンパク質はチオエーテル結合によってＣＰＰにコンジュゲートされた一方、ガイドＲＮＡはＣＰＰと複合体化され、縮合した正電荷粒子を形成した。胚性幹細胞、皮膚線維芽細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、及び胚性癌腫細胞を含めたヒト細胞を改変Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡで同時に及び逐次的に処理すると、プラスミドトランスフェクションと比べてオフターゲット突然変異が低下した効率的な遺伝子破壊につながったことが示された。
【０３５４】
植込み型デバイス
別の実施形態において、植込み型デバイスもまた、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達に企図される。例えば、米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書は、薬物を局所的に長時間溶出する植込み型医療器具を、幾つかのタイプのかかるデバイス、治療の実施態様及び植え込み方法を含めて開示しており、それが提供される。デバイスは、例えばデバイス本体として用いられるマトリックスなどのポリマー基質、及び薬物、及び場合によっては金属又は更なるポリマーなどの追加的な足場材料、及び可視性及びイメージングを増強する材料を含む。植込み型送達デバイスは局所的な長期間にわたる放出を提供するのに有利であってよく、ここで薬物は、腫瘍、炎症、変性などの罹患範囲の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に直接又は症候性の対象のため、又は損傷した平滑筋細胞に、又は予防のため放出される。薬物の一種は上記に開示されるとおりＲＮＡであり、このシステムは本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に使用及び／又は応用することができる。一部の実施形態において植え込み方法は、小線源照射療法及び針生検を含め、現在他の治療向けに開発及び使用されている既存の植え込み手技である。そのような場合、この発明に記載される新規インプラントの寸法は、元のインプラントと同様である。典型的には、同じ治療手技中に数個のデバイスが植え込まれる。
【０３５５】
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書は、例えば任意選択でマトリックスであってもよい生体安定性及び／又は分解性及び／又は生体吸収性ポリマー基質を含む、腹腔などの体腔及び／又は薬物送達システムが繋留されたり又は付着したりしない任意の他のタイプの投与に適用可能なシステムを含め、薬物送達植込み型又は挿入型システムを提供する。用語「挿入」にはまた、植込みも含まれることに留意しなければならない。薬物送達システムは、好ましくは米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書に記載されるとおりの「Ｌｏｄｅｒ」として植え込まれる。
【０３５６】
ポリマー又は複数のポリマーが生体適合性であり、薬剤及び／又は複数の薬剤を取り入れ、及び制御された速度での薬剤の放出を可能にし、ここでマトリックスなどのポリマー基質の総容積は、例えば、一部の実施形態では、任意選択で及び好ましくは、治療レベルの薬剤の放出を可能にする最大容積以下である。非限定的な例として、かかる容積は、薬剤負荷容積による必要に応じて好ましくは０．１  ｍ３〜１０００ｍｍ３の範囲内である。Ｌｏｄｅｒは、任意選択で、例えば及び限定なしに膝関節、子宮内又は子宮頸部リングなど、そのサイズが機能によって決まるデバイスで例えば取り込まれるとき、より大きくてもよい。
【０３５７】
薬物送達システム（組成物を送達するための）は、一部の実施形態において、好ましくは分解性ポリマーを用いるように設計され、ここで主な放出機構はバルク侵食である；又は一部の実施形態において、非分解性の、又は徐々に分解されるポリマーが使用され、ここで主な放出機構はバルク侵食よりむしろ拡散であり、従って外側部分が膜として機能し、及びその内側部分が、実質的に長期間にわたって（例えば約１週間〜約数ヵ月）周囲からの影響を受けない薬物リザーバとして機能する。異なる放出機構を有する異なるポリマーの組み合わせもまた、任意選択で用いられ得る。表面の濃度勾配は、好ましくは相当な期間の全薬物放出期間にわたって事実上一定に維持され、従って拡散速度は事実上一定である（「ゼロモード」拡散と呼ばれる）。用語「一定」とは、好ましくは治療有効性の下限閾値より高く維持されるが、しかしなおも任意選択で初期バーストを特徴とし得るか、及び／又は変動し得る、例えば一定限度増加及び減少し得る拡散速度が意味される。拡散速度は、好ましくは長期間そのように維持され、及び治療上有効な期間、例えば有効なサイレンシング期間を最適化するのに特定のレベルで一定であると見なすことができる。
【０３５８】
薬物送達システムは、本質的に化学的であるか、それとも酵素及び対象の体内にある他の因子からの攻撃に起因するかに関わらず、任意選択で及び好ましくは分解からヌクレオチドベースの治療剤を遮蔽するように設計される。
【０３５９】
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の薬物送達システムは、例えば任意選択で、限定はされないが、熱的加熱及び冷却、レーザービーム、及び集束超音波を含めた超音波及び／又はＲＦ（高周波）による方法又はデバイスを含め、非侵襲性及び／又は最小侵襲性の起動及び／又は加速／速度方法によって任意選択でデバイスの植込み時及び／又は植込み後に動作させる検知及び／又は起動器具と関連付けられる。
【０３６０】
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の一部の実施形態によれば、局所送達部位には、任意選択で、腫瘍、自己免疫疾患状態を含めた活性化及び／又は慢性的炎症及び感染、筋肉及び神経組織を含めた変性組織、慢性痛、変性部位、及び骨折箇所及び組織の再生強化のための他の創傷箇所、及び傷害された心筋、平滑筋及び横紋筋を含め、細胞の高度な異常増殖、及び抑制されたアポトーシスによって特徴付けられる標的部位が含まれ得る。
【０３６１】
組成物の植込み部位、又は標的部位は、好ましくは標的局所送達に十分に小さい半径、面積及び／又は容積を特徴とする。例えば、標的部位は任意選択で約０．１ｍｍ〜約５ｃｍの範囲の直径を有する。
【０３６２】
標的部位の位置は、好ましくは治療有効性を最大化するように選択される。例えば、薬物送達システム（任意選択で上記に記載したとおりの植込み用デバイスを伴う）の組成物は、任意選択で及び好ましくは、腫瘍環境、又はそれに関連する血液供給の範囲内又はその近くに植え込まれる。
【０３６３】
例えば組成物（任意選択でデバイスを伴う）は、任意選択で、脈管系の範囲内などでニップルを用いて膵臓、前立腺、乳房、肝臓の範囲内又はその近くに植え込まれる。
【０３６４】
標的の位置は、任意選択で、（任意選択で体内の任意の部位がＬｏｄｅｒの植込みに好適であり得るように、あくまでも非限定的な例として）：１．基底核、白質及び灰白質におけるパーキンソン病又はアルツハイマー病のような変性部位の脳；２．筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の場合のような脊椎；３．ＨＰＶ感染症予防のための子宮頸部；４．活性化及び慢性的炎症関節；５．乾癬の場合のような真皮；６．鎮痛効果のための交感神経及び感覚神経部位；７．骨内植え込み；８．急性及び慢性感染部位；９．腟内；１０．内耳−聴覚系、内耳の迷路、前庭系；１１．気管内；１２．心内；冠動脈、心外膜；１３．膀胱；１４．胆管系；１５．限定されないが、腎臓、肝臓、脾臓を含む実質組織；１６．リンパ節；１７．唾液腺；１８．歯肉；１９．関節内（関節の中）；２０．眼内；２１．脳組織；２２．脳室；２３．腹腔を含む腔（例えば、限定されないが、卵巣癌について）；２４．食道内及び２５．直腸内を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる群から選択される。
【０３６５】
任意選択でシステム（例えば組成物を含有するデバイス）の挿入は、標的部位及び当該部位の近傍におけるＥＣＭへの材料の注射によって、標的部位及びかかる部位の近傍の局所ｐＨ及び／又は温度及び／又はＥＣＭにおける薬物の拡散及び／又は薬物動態に影響を及ぼす他の生物学的因子に影響を及ぼすことを伴う。
【０３６６】
任意選択で、一部の実施形態によれば、前記薬剤の放出は、挿入前及び／又は挿入時及び／又は挿入後に、非侵襲性及び／又は最小侵襲性及び／又は他の起動及び／又は加速／減速方法、例えば、レーザービーム、放射線照射、熱的加熱及び冷却、及び集束超音波を含めた超音波及び／又はＲＦ（高周波）方法又はデバイス、及び化学的アクチベーターによって動作させるアプライアンスを検知及び／又は起動することを伴い得る。
【０３６７】
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の他の実施形態によれば、薬物は好ましくは、例えば以下に記載するとおり乳房、膵臓、脳、腎臓、膀胱、肺、及び前立腺における限局性の癌の場合に、ＲＮＡを含む。ＲＮＡｉで例示されるが、多くの薬物がＬｏｄｅｒへの封入に適用可能であり、かかる薬物を、例えばマトリックスなど、Ｌｏｄｅｒ基質で封入することができる限り、この発明に関連して使用することができ、このシステムは本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系の送達に使用及び／又は応用することができる。
【０３６８】
特定の適用の別の例として、異常な遺伝子発現に起因して神経及び筋肉変性疾患が発生する。ＲＮＡの局所送達は、かかる異常な遺伝子発現に干渉する治療特性を有し得る。小薬物及び巨大分子を含めた抗アポトーシス、抗炎症性及び抗変性薬物の局所送達もまた、場合により治療効果があり得る。そのような場合、Ｌｏｄｅｒは、一定の速度での及び／又は別途植え込まれる専用のデバイスを介した長期放出に適用される。これは全て、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に使用及び／又は応用することができる。
【０３６９】
特定の適用の更に別の例として、精神障害及び認知障害が遺伝子修飾薬で治療される。遺伝子ノックダウンは治療の選択肢である。薬剤を中枢神経系部位に局所的に送達するＬｏｄｅｒは、限定はされないが、精神病、双極性疾患、神経症性障害及び行動疾患を含めた精神障害及び認知障害に対する治療選択肢である。Ｌｏｄｅｒはまた、特定の脳部位における植込み時に小薬物及び巨大分子を含めた薬物を局所的に送達することもできる。これは全て、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に使用及び／又は応用することができる。
【０３７０】
特定の適用の別の例として、局所部位における自然及び／又は適応免疫メディエーターのサイレンシングにより、移植臓器拒絶反応の予防が可能となる。移植臓器及び／又は移植部位に植え込まれたＬｏｄｅｒによるＲＮＡ及び免疫調節試薬の局所送達が、移植臓器に対して活性化したＣＤ８などの免疫細胞を撃退することにより局所免疫抑制を与える。これは全て、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に使用及び／又は応用することができる。
【０３７１】
特定の適用の別の例として、ＶＥＧＦ及びアンジオゲニンなどを含む血管成長因子は、血管新生に不可欠である。因子、ペプチド、ペプチド模倣体の局所送達、又はそれらのリプレッサーの抑制は、重要な治療モダリティである；Ｌｏｄｅｒによるリプレッサーのサイレンシング並びに血管新生を刺激する因子、ペプチド、巨大分子及び小薬物の局所送達は、末梢、全身及び心血管疾患に治療効果がある。
【０３７２】
植込みなどの挿入方法は、任意選択で、かかる方法において任意選択で改変なしに、或いは任意選択で重要でない改変のみを伴い、他のタイプの組織移植及び／又は挿入及び／又は組織試料採取に既に用いられているものであってもよい。かかる方法としては、任意選択で、限定はされないが、小線源照射療法、生検、ＥＲＣＰなどの、超音波を伴う及び／又は伴わない内視鏡検査、脳組織への定位的方法、関節、腹部器官、膀胱壁及び体腔への腹腔鏡の植え込みを含む腹腔鏡検査が挙げられる。
【０３７３】
本明細書において考察される植込み型デバイス技術は、本明細書における教示と共に用いることができ、従ってこの開示及び当該技術分野における知識により、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はその構成成分又は構成成分をコードするか又はそれを提供するその核酸分子を植込み型デバイスによって送達し得る。
【０３７４】
患者特異的スクリーニング方法
ＤＮＡ、例えばトリヌクレオチドリピートを標的とする核酸ターゲティング系を使用して、かかるリピートの存在に関して患者又は患者の試料をスクリーニングすることができる。このリピートは核酸ターゲティング系のＲＮＡの標的であることができ、その核酸ターゲティング系によるこのリピートへの結合がある場合、当該の結合を検出して、それによりかかるリピートの存在を示すことができる。従って、核酸ターゲティング系を使用して、リピートの存在に関して患者又は患者試料をスクリーニングすることができる。次に、患者に好適な１つ又は複数の化合物を投与して状態に対応し得る；又は、核酸ターゲティング系を投与して結合させ、挿入、欠失、又は突然変異を生じさせて、状態を緩和し得る。
【０３７５】
本発明は核酸を使用して標的ＤＮＡ配列を結合する。
【０３７６】
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡはまた、別々に送達されてもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素に発現する時間を与えるため、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡをガイドＲＮＡより先に送達してもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡはガイドＲＮＡ投与の１〜１２時間前（好ましくは約２〜６時間前）に投与されてもよい。
【０３７７】
或いは、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは一緒に投与されてもよい。有利には、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの初回投与から１〜１２時間後（好ましくは約２〜６時間後）にガイドＲＮＡの第２のブースター用量が投与されてもよい。
【０３７８】
本発明のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、即ちＣｐｆ１エフェクタータンパク質は、時に本明細書においてＣＲＩＳＰＲ酵素と称される。エフェクタータンパク質は酵素をベースとし又はそれに由来し、従って一部の実施形態において用語「エフェクタータンパク質」は必ず「酵素」を含むことが理解されるであろう。しかしながら、また、エフェクタータンパク質は一部の実施形態において必要に応じてＤＮＡ又はＲＮＡ結合を有し得るが、デッドＣａｓエフェクタータンパク質機能を含め、必ずしも切断又はニッキング活性を有するとは限らないことも理解されるであろう。
【０３７９】
ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及び／又はガイドＲＮＡの追加の投与は、最も効率的なゲノム改変レベルを達成するのに有用であり得る。一部の実施形態において、特に治療方法の中で遺伝性疾患が標的化されるとき、好ましくは表現型の変化がゲノム改変の結果であり、好ましくはここで表現型を修正し又は変化させるため修復鋳型が提供される。
【０３８０】
一部の実施形態において、標的となり得る疾患としては、疾患を引き起こすスプライス欠損に関係しているものが挙げられる。
【０３８１】
一部の実施形態において、細胞標的としては、造血幹／前駆細胞（ＣＤ３４＋）；ヒトＴ細胞；及び眼（網膜細胞）−例えば光受容前駆細胞が挙げられる。
【０３８２】
一部の実施形態において、遺伝子標的としては、ヒトβグロビン−ＨＢＢ（鎌状赤血球貧血の治療用、遺伝子変換の（内因性鋳型として近縁のＨＢＤ遺伝子を使用した）刺激によることを含む）；ＣＤ３（Ｔ細胞）；及びＣＥＰ９２０−網膜（眼）が挙げられる。
【０３８３】
一部の実施形態において、疾患標的としてはまた、癌；鎌状赤血球貧血（点突然変異に基づく）；ＨＩＶ；β−サラセミア；及び眼科的疾患又は眼疾患−例えばレーベル先天黒内障（ＬＣＡ）を引き起こすスプライス欠損も挙げられる。
【０３８４】
一部の実施形態において、送達方法には、酵素−ガイド複合体（リボ核タンパク質）のカチオン性脂質媒介性「直接」送達及びプラスミドＤＮＡの電気穿孔が含まれる。
【０３８５】
本発明の方法は、ｄｓＯＤＮ又はｓｓＯＤＮ（以下参照）であってもよい修復鋳型などの鋳型の送達を更に含むことができる。鋳型の送達は、ＣＲＩＳＰＲ酵素又はガイドの一部又は全部の送達と同時であっても又は別個であってもよく、且つ同じ又は異なる送達機構によってもよい。一部の実施形態において、鋳型はガイドと共に、好ましくはＣＲＩＳＰＲ酵素もまた共に送達されることが好ましい；一例はＡＡＶベクターであってもよい。
【０３８６】
本発明の方法は、（ａ）前記二本鎖切断によって生じたオーバーハングに相補的なオーバーハングを含む二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を細胞に送達するステップであって、前記ｄｓＯＤＮが目的の遺伝子座に組み込まれるステップ；又は−（ｂ）一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を細胞に送達するステップであって、前記ｓｓＯＤＮが前記二本鎖切断の相同依存性修復の鋳型として働くステップを更に含むことができる。本発明の方法は個体の疾患の予防又は治療方法であってもよく、任意選択で前記疾患は前記目的の遺伝子座の欠陥によって引き起こされる。本発明の方法は個体においてインビボで行うか又は個体から採取した細胞上でエキソビボで行うことができ、任意選択で前記細胞は個体に戻される。
【０３８７】
毒性及びオフターゲット効果を最小限に抑えるため、送達されるＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要となり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの最適濃度は、細胞モデル又は動物モデルにおける種々の濃度の試験、及びディープシーケンシングを用いた潜在的なオフターゲットゲノム遺伝子座における改変の程度の分析によって決定することができる。例えば、ヒトゲノムのＥＭＸ１遺伝子の５’−ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号２３）を標的化するガイド配列について、ディープシーケンシングを用いて以下の２つのオフターゲット遺伝子座における改変レベルを評価することができる、１：５’−ＧＡＧＴＣＣＴＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号２４）及び２：５’−ＧＡＧＴＣＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号２５）。最も高いレベルのオンターゲット改変をもたらす一方でオフターゲット改変レベルを最小限に抑える濃度が、インビボ送達に選択されるべきである。
【０３８８】
誘導性系
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は誘導性系の一成分を形成し得る。この系の誘導可能な性質により、エネルギーの形態を用いた遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御が可能となり得る。エネルギーの形態としては、限定はされないが、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー及び熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）、又は光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）が含まれる。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、配列特異的に転写活性の変化を導く光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部であり得る。光の構成成分には、ＣＲＩＳＰＲ酵素、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来）、及び転写活性化／抑制ドメインが含まれ得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法の更なる例は、米国仮特許出願第６１／７３６，４６５号明細書及び米国仮特許出願第６１／７２１，２８３号明細書、及び国際公開第２０１４／０１８４２３  Ａ２号パンフレット及びＵＳ８８８９４１８、ＵＳ８８９５３０８、ＵＳ２０１４０１８６９１９、ＵＳ２０１４０２４２７００、ＵＳ２０１４０２７３２３４、ＵＳ２０１４０３３５６２０、ＷＯ２０１４０９３６３５（本明細書によって全体として参照により援用される）に提供される。
【０３８９】
本発明は、条件的又は誘導性ＣＲＩＳＰＲトランスジェニック細胞／動物を樹立し及び利用するための本発明の組成物の使用を包含する；例えば、Ｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４），１５９（２）：４４０−４５５、又は国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）などの本明細書に引用されるＰＣＴ特許公報を参照のこと。例えば、細胞又は動物、例えば非ヒト動物、例えば脊椎動物又は哺乳動物、例えばげっ歯類、例えばマウス、ラット、又は他の実験動物若しくは野外動物、例えば、ネコ、イヌ、ヒツジなどが「ノックイン」されてもよく、それによって動物がＰｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌと同様にＣｐｆ１（本明細書に記載されるとおりの改変Ｃｐｆ１のいずれかを含む）を条件的に又は誘導性に発現する。従って標的細胞又は動物はＣＲＩＳＲＰ酵素（例えば、Ｃｐｆ１）を条件的に又は誘導性に（例えばＣｒｅ依存性構築物の形態で）含み、及び／又はアダプタータンパク質を条件的に又は誘導性に含み、及び標的細胞に導入されたベクターの発現時、ベクターが、標的細胞におけるＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、Ｃｐｆ１）発現及び／又はアダプター発現を誘導し、又はその条件を生じるそれを発現する。ＣＲＩＳＰＲ複合体を作成する公知の方法と共に本発明の教示及び組成物を適用することにより、誘導性ゲノムイベントもまた本発明の態様である。これの単に一例が、ＣＲＩＳＰＲノックイン／条件的トランスジェニック動物（例えば、Ｌｏｘ−終止−ポリＡ−Ｌｏｘ（ＬＳＬ）カセットを例えば含むマウス）の作出、及び続く、１つ以上の（改変）ｇＲＮＡ（例えば、遺伝子活性化のための目的の標的遺伝子の−２００ヌクレオチドからＴＳＳまで、例えば、コートタンパク質、例えばＭＳ２によって認識される１つ以上のアプタマーを有する改変ｇＲＮＡ）、本明細書に記載されるとおりの１つ以上のアダプタータンパク質（１つ以上のＶＰ６４に連結したＭＳ２結合タンパク質）及び条件的動物を誘導する手段（例えば、Ｃｐｆ１発現を誘導性にするためのＣｒｅリコンビナーゼ）を提供する１つ以上の組成物の送達である。或いは、アダプタータンパク質が、条件的又は誘導性ＣＲＩＳＰＲ酵素と共に条件的又は誘導性エレメントとして提供されることにより、スクリーニング目的に有効なモデルが提供されてもよく、これは有利には、多種多様な適用に対して、特異的ｇＲＮＡの最小限の設計及び投与しか必要としないものである。
【０３９０】
不安定化ドメインを有する又はそれと会合した本発明に係る酵素
一態様において、本発明は、少なくとも１つの不安定化ドメイン（ＤＤ）と会合した、本明細書の他の部分に記載されるとおりのＣｐｆ１を提供し；及び、簡略にするため、少なくとも１つの不安定化ドメイン（ＤＤ）と会合したかかるＣＲＩＳＰＲ酵素は、本明細書では「ＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ酵素」と称する。本明細書の他の部分に記載されるとおりの本発明に係るＣＲＩＳＰＲ酵素のいずれも、本明細書において以下に記載するとおりの不安定化ドメインを有する又はそれと会合したものとして使用し得ることが理解されるべきである。本明細書の他の部分に記載されるとおりの方法、生成物、組成物及び使用のいずれも、以下に更に詳述するとおりの不安定化ドメインと会合したＣＲＩＳＰＲ酵素に等しく適用可能である。本明細書に記載されるとおりの態様及び実施形態において、Ｃｐｆ１をＣＲＩＳＰＲ酵素と称する又はそのように読む場合、機能性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の再構成は好ましくは不要であり、又はｔｒａｃｒ配列に依存せず、及び／又はダイレクトリピートはガイド（標的又はスペーサー）配列の５’側（上流側）にあることが理解されるべきである。
【０３９１】
更なる手引きとして、以下の特定の態様及び実施形態を提供する。
【０３９２】
本節に記載されるとおりの態様及び実施形態がＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ酵素、ＤＤ−Ｃａｓ、ＤＤ−Ｃｐｆ１、ＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ又はＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系又は複合体に関するとき、接頭語「ＤＤ」のない用語「ＣＲＩＳＰＲ」、「Ｃａｓ」、「Ｃｐｆ１」、「ＣＲＩＳＰＲ系」、「ＣＲＩＳＰＲ複合体」、「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ」、「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１」などは、特に本開示がＤＤの実施形態に読めると文脈上認められるとき、接頭語ＤＤを有するものと見なし得る。一態様において、本発明は、ＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣａｓタンパク質であるようなＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ酵素（本明細書では「ＤＤ−Ｃａｓタンパク質」と称され、即ち、「ＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体」などの用語の前にある「ＤＤ」は、少なくとも１つの不安定化ドメインが会合したＣｐｆ１タンパク質を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体を意味する）、有利にはＤＤ−Ｃａｓタンパク質、例えば少なくとも１つの不安定化ドメインと会合したＣｐｆ１タンパク質（本明細書では「ＤＤ−Ｃｐｆ１タンパク質」と称される）と、ガイドＲＮＡとを含む、エンジニアリングされた天然に存在しないＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。核酸分子、例えばＤＮＡ分子は、遺伝子産物をコードすることができる。一部の実施形態において、ＤＤ−Ｃａｓタンパク質は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を切断し得る。一部の実施形態において、遺伝子産物の発現が変化する。Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡとは天然では一緒に存在しない。本発明は、ガイド配列を含むガイドＲＮＡを包含する。一部の実施形態において、機能性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は更なる機能性ドメインを含み得る。一部の実施形態において、本発明は、遺伝子産物の発現を変化させ又は改変する方法を提供する。本方法は、標的核酸、例えばＤＮＡ分子を含有する細胞、又は標的核酸、例えばＤＮＡ分子を含有してそれを発現する細胞に導入するステップを含み得る；例えば、標的核酸は遺伝子産物をコードし、又は遺伝子産物の発現をもたらし得る（例えば調節配列）。
【０３９３】
一部の一般的な実施形態において、ＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ酵素は１つ以上の機能性ドメインと会合している。一部のより具体的な実施形態において、ＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ酵素はデッドＣｐｆ１であり、及び／又は１つ以上の機能性ドメインと会合している。一部の実施形態において、ＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ酵素は、例えばα−ヘリックス又はα／β混合二次構造のトランケーションを含む。一部の実施形態において、トランケーションには、除去又はリンカーによる置換が含まれる。一部の実施形態において、リンカーは分枝状であるか、又は他の形でＤＤ及び／又は機能性ドメインの繋留を可能にする。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は融合タンパク質を介してＤＤと会合している。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＤＤに融合している。換言すれば、ＤＤは前記ＣＲＩＳＰＲ酵素との融合によってＣＲＩＳＰＲ酵素と会合していてもよい。一部の実施形態において、酵素は改変ＣＲＩＳＰＲ酵素であるとみなされてもよく、ここでＣＲＩＳＰＲ酵素は少なくとも１つの不安定化ドメイン（ＤＤ）に融合している。一部の実施形態において、ＤＤは、コネクタータンパク質を介して、例えばストレプトアビジン−ビオチン系などのマーカー系などのシステムを用いてＣＲＩＳＰＲ酵素と会合していてもよい。このように、当該のコネクターに対する高親和性リガンドに特異的なコネクタータンパク質とＣＲＩＳＰＲ酵素との融合物が提供され、ここではＤＤが前記高親和性リガンドに結合される。例えば、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）が、ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合したコネクターであってもよく、一方、ビオチンがＤＤに結合されてもよい。共存するとき、ストレプトアビジンがビオチンに結合し、ひいてはＣＲＩＳＰＲ酵素がＤＤに結び付けられる。簡単にするため、ＣＲＩＳＰＲ酵素とＤＤとの融合が、一部の実施形態では好ましい。一部の実施形態において、この融合は、ＤＤとＣＲＩＳＰＲ酵素との間にリンカーを含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ端側末端への融合であってもよい。一部の実施形態において、少なくとも１つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ末端に融合する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＣ端側末端への融合であってもよい。一部の実施形態において、少なくとも１つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素のＣ末端に融合する。一部の実施形態において、１つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ端側末端に融合し、もう１つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素のＣ端側に融合してもよい。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は少なくとも２つのＤＤと会合し、ここでは第１のＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ末端に融合し、且つ第２のＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素のＣ末端に融合し、第１及び第２のＤＤは同じであるか又は異なる。一部の実施形態では、ＤＤのＮ端側末端への融合であってもよい。一部の実施形態では、ＤＤのＣ端側末端への融合であってもよい。一部の実施形態において、融合はＣＲＩＳＰＲ酵素のＣ端側末端とＤＤのＮ端側末端との間であってもよい。一部の実施形態において、融合はＤＤのＣ端側末端とＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ端側末端との間であってもよい。少なくとも１つのＮ端側融合を含むＤＤでは、少なくとも１つのＣ端側融合を含むＤＤと比べてバックグラウンドが低いことが観察された。Ｎ端側融合及びＣ端側融合を組み合わせるとバックグラウンドは最小になったが、全体的な活性が最も低かった。有利にはＤＤは、少なくとも１つのＮ端側融合又は少なくとも１つのＮ端側融合＋少なくとも１つのＣ端側融合で提供される。及び当然ながら、ＤＤは少なくとも１つのＣ端側融合によって提供されてもよい。
【０３９４】
特定の実施形態において、誘導性調節などのためのタンパク質不安定化ドメインは、例えばＣｐｆ１のＮ端及び／又はＣ端に融合させることができる。加えて、不安定化ドメインは、例えばＣｐｆ１の溶媒露出ループにある一次配列に導入することができる。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼの一次構造のコンピュータ分析から、３つの個別的な領域が明らかになる。第一にＣ末端ＲｕｖＣ様ドメイン、これは唯一機能的に特徴付けられたドメインである。第二にＮ末端α−ヘリックス領域、及び第三に、ＲｕｖＣ様ドメインとα−ヘリックス領域との間に位置する混合α及びβ領域、非構造化領域の幾つかの小さいストレッチが予想される。溶媒に露出していて、且つ異なるＣｐｆ１オルソログ間で保存されていない非構造化領域は、スプリット及び小さいタンパク質配列の挿入に好ましいサイドである。加えて、これらのサイドを用いてＣｐｆ１オルソログ間のキメラタンパク質を生成することができる。
【０３９５】
一部の実施形態において、ＤＤはＥＲ５０である。このＤＤの対応する安定化リガンドは、一部の実施形態において４ＨＴである。そのため、一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＤのうちの１つがＥＲ５０であり、従って安定化リガンドが４ＨＴ又はＣＭＰ８である。一部の実施形態において、ＤＤはＤＨＦＲ５０である。このＤＤの対応する安定化リガンドは、一部の実施形態においてＴＭＰである。そのため、一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＤのうち１つがＤＨＦＲ５０であり、従って安定化リガンドがＴＭＰである。一部の実施形態において、ＤＤはＥＲ５０である。このＤＤの対応する安定化リガンドは、一部の実施形態においてＣＭＰ８である。従ってＣＭＰ８は、ＥＲ５０系における４ＨＴの代替となる安定化リガンドであり得る。ＣＭＰ８及び４ＨＴを競合的に使用し得る／使用するべきである可能性があり得るが、一部の細胞型はこれらの２つのリガンドのうちのいずれか一方の影響を受け易いこともあり、及び本開示及び当該技術分野における知識から、当業者はＣＭＰ８及び／又は４ＨＴを使用することができる。
【０３９６】
一部の実施形態において、１つ又は２つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ端側末端に融合され、１つ又は２つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素のＣ端側に融合されてもよい。一部の実施形態では、少なくとも２つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素と会合し、及びそれらのＤＤは同じＤＤであり、即ちＤＤは同種である。従って、ＤＤの両方（又は２つ以上）がＥＲ５０  ＤＤであり得る。一部の実施形態ではこれが好ましい。或いは、ＤＤの両方（又は２つ以上）がＤＨＦＲ５０  ＤＤであり得る。これもまた、一部の実施形態では好ましい。一部の実施形態において、少なくとも２つのＤＤがＣＲＩＳＰＲ酵素と会合し、及びそれらのＤＤは異なるＤＤであり、即ちＤＤは異種である。従って、ＤＤのうちの１つがＥＲ５０であり得る一方、ＤＤのうちの１つ以上又は任意の他のＤＤがＤＨＦＲ５０であり得る。異種である２つ以上のＤＤを有することは、より高い分解制御レベルをもたらし得るため有利であり得る。Ｎ端又はＣ端における２つ以上のＤＤのタンデム融合が分解を増強し得る；及びかかるタンデム融合は、例えばＥＲ５０−ＥＲ５０−Ｃｐｆ１又はＤＨＦＲ−ＤＨＦＲ−Ｃｐｆ１であり得る。いずれの安定化リガンドも存在しないならば高レベルの分解が起こり、一方の安定化リガンドが存在せず、他方の（又は別の）安定化リガンドが存在するならば中間レベルの分解が起こり得る一方、安定化リガンドの両方（又は２つ以上）が存在するならば低レベルの分解が起こり得ることが想定される。制御はまた、Ｎ端側ＥＲ５０  ＤＤ及びＣ端側ＤＨＦＲ５０  ＤＤを有することによってももたらされ得る。
【０３９７】
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素とＤＤの融合は、ＤＤとＣＲＩＳＰＲ酵素との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、リンカーはＧｌｙＳｅｒリンカーである。一部の実施形態において、ＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ酵素は少なくとも１つの核外移行シグナル（ＮＥＳ）を更に含む。一部の実施形態において、ＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ酵素は２つ以上のＮＥＳを含む。一部の実施形態において、ＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ酵素は少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。これは、ＮＥＳに加えて含むのであってもよい。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素とＤＤとの間のリンカーとして、又はその一部として、局在化（核内移行又は核外移行）シグナルを含むか、又はそれから本質的になるか、又はそれからなる。ＨＡ又はＦｌａｇタグもまた、リンカーとしての本発明の範囲内にある。本出願人らはＮＬＳ及び／又はＮＥＳをリンカーとして使用し、また、ＧＳほどの短さのものから最大（ＧＧＧＧＳ）３に至るまでのグリシンセリンリンカーも使用する。
【０３９８】
ある態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素及び関連ＤＤをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態において、コードされるＣＲＩＳＰＲ酵素及び関連ＤＤは、第１の調節エレメントに作動可能に連結される。一部の実施形態において、ＤＤが同様にコードされ、且つ第２の調節エレメントに作動可能に連結される。有利には、ここでのＤＤは安定化リガンドを「モップアップ（ｍｏｐ  ｕｐ）」するものであり、そのため有利には、これは、例えば本明細書に考察されるとおり、酵素に会合したものと同じＤＤ（即ち同じタイプのドメイン）である（用語「モップアップ」は本明細書で考察するとおりの意味であり、活性に寄与し又はそれを完了させるため実施することも伝え得ると理解されるものとする）。ＣＲＩＳＰＲ酵素に会合しない過剰なＤＤで安定化リガンドをモップアップすることにより、ＣＲＩＳＰＲ酵素のより高い分解が見られることになる。理論によって拘束されないが、追加の又は過剰な非会合ＤＤが加えられることに伴い、ＣＲＩＳＰＲ酵素と会合したＤＤと複合体を形成し又はそれに結合する安定化リガンドから離れる方に平衡がシフトし、代わりに遊離ＤＤ（即ちＣＲＩＳＰＲ酵素と会合していないもの）と複合体を形成し又はそれに結合する安定化リガンドの方に一層多く移るであろうことが想定される。従って、ＣＲＩＳＰＲ酵素の分解は増加してもＣＲＩＳＰＲ酵素活性は低下することが所望される場合、過剰な又は追加の非会合（又は遊離）ＤＤを供給することが好ましい。過剰の遊離ＤＤは残りのリガンドに結合し、またＤＤ−Ｃａｓ融合物から結合したリガンドも取り上げる。従ってこれはＤＤ−Ｃａｓ分解を加速させ、Ｃａｓ活性の時間的制御を増強する。一部の実施形態において、第１の調節エレメントはプロモーターであり、任意選択でエンハンサーを含み得る。一部の実施形態において、第２の調節エレメントはプロモーターであり、任意選択でエンハンサーを含み得る。一部の実施形態において、第１の調節エレメントは初期プロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントは後期プロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントは誘導性制御エレメント、任意選択でｔｅｔ系、又は抑制性制御エレメント、任意選択でｔｅｔｒ系であるか、又はそれを含むか、又はそれから本質的になる。ドキシサイクリンの存在下におけるｔｅｔの誘導には、誘導性プロモーター、例えばｒＴＴＡが有利であり得る。
【０３９９】
結合又は会合は、本明細書の他の部分に記載されるとおりのリンカーを介することができる。代替的なリンカーが利用可能であり、しかしＣａｓの２つのパートが一緒になり、ひいてはＣａｓ活性を再構成する機会を最大限にするには、高度に可動性のリンカーが最も良好に働くと考えられる。一つの代替例は、ヌクレオプラスミンのＮＬＳをリンカーとして使用し得るものである。例えば、Ｃａｓと任意の機能性ドメインとの間にもリンカーを使用することができる。この場合もまた、ここに（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（又はその６、９、又は１２リピートバージョン）を使用してもよく、又はＣａｓと機能性ドメインとの間にヌクレオプラスミンのＮＬＳをリンカーとして使用することができる。
【０４００】
機能性ドメインなどが酵素のいずれか一方のパートと「会合」している場合、それらは典型的には融合物である。用語「〜と会合している」は、本明細書では、例えばＣＲＩＳＰＲ酵素のパートと機能性ドメインとの間で、一つの分子がどのように別の分子と「会合」しているかに関して用いられる。これらの２つは互いに繋留されていると見なし得る。かかるタンパク質間相互作用の場合、この会合は、抗体がエピトープを認識する方法における認識の観点で考えられてもよい。或いは、一つのタンパク質がもう一つのタンパク質と、それら２つの融合物を介して会合していてもよく、例えば一つのサブユニットがもう一つのサブユニットに融合していてもよい。融合は典型的には、例えば、各タンパク質又はサブユニットをコードするヌクレオチド配列を併せてスプライシングすることにより、一方のアミノ酸配列を他方のアミノ酸配列に付加することによって起こる。或いは、これは、本質的に、融合タンパク質など、２つの分子間の結合又は直接的な連結と考えられてもよい。
【０４０１】
いずれにしろ、融合タンパク質は２つの目的のサブユニット間（例えば酵素と機能性ドメインとの間又はアダプタータンパク質と機能性ドメインとの間）にリンカーを含み得る。従って、一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素のパートは機能性ドメインと、それに結合することによって会合している。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は機能性ドメインと、それらの２つが任意選択で中間リンカーを介して一体に融合されているため、会合している。リンカーの例としては、本明細書で考察されるＧｌｙＳｅｒリンカーが挙げられる。非共有結合性に結合したＤＤは会合したＣａｓ（例えばＣｐｆ１）の分解を惹起することが可能であり得るが、プロテアソーム分解はタンパク質鎖の巻き戻しが関わり；及び、分解時にＤＤがＣａｓに結び付いたまま留まることをもたらし得るため、融合が好ましい。しかしながら、ＤＤに特異的な安定化リガンドの存在下ではＣＲＩＳＰＲ酵素とＤＤとが一体になり、安定化複合体が形成される。この複合体は、ＤＤに結合した安定化リガンドを含む。この複合体はまた、ＣＲＩＳＰＲ酵素と会合したＤＤも含む。前記安定化リガンドが存在しない場合、ＤＤ及びその関連するＣＲＩＳＰＲ酵素の分解が促進される。
【０４０２】
不安定化ドメインには、広範囲のタンパク質に不安定性を付与する一般的な有用性がある；例えば、Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．Ｍａｒ  ７，２０１２；１３４（９）：３９４２−３９４５（参照により本明細書に援用される）を参照のこと。ＣＭＰ８又は４−ヒドロキシタモキシフェンは不安定化ドメインであり得る。より一般的には、Ｎ末端規則による不安定化残基である哺乳類ＤＨＦＲの温度感受性突然変異体（ＤＨＦＲｔｓ）が、許容温度で安定であるが、３７℃で不安定であることが分かった。ＤＨＦＲｔｓを発現する細胞に哺乳類ＤＨＦＲの高親和性リガンドであるメトトレキサートを加えると、タンパク質の分解が部分的に阻害された。これは、細胞において本来分解の標的となるタンパク質を小分子リガンドが安定化させ得るという重要な実証であった。ラパマイシン誘導体を使用すると、ｍＴＯＲのＦＲＢドメイン（ＦＲＢ＊）の不安定突然変異体が安定化し、融合したキナーゼＧＳＫ−３βの機能が回復した６，７。この系は、リガンド依存的な安定性が、複雑な生物学的環境において特異的タンパク質の機能を調節する魅力的な戦略に相当することを実証した。タンパク質活性を制御する系には、ラパマイシンによって誘導されたＦＫ５０６結合タンパク質とＦＫＢＰ１２との二量体化によってユビキチン相補性が生じると機能性になるＤＤが関与し得る。ヒトＦＫＢＰ１２又はｅｃＤＨＦＲタンパク質の突然変異体は、その高親和性リガンド、それぞれＳｈｉｅｌｄ−１又はトリメトプリム（ＴＭＰ）が存在しない場合には代謝的に不安定であるようにエンジニアリングすることができる。これらの突然変異体は、本発明の実施において有用な可能な不安定化ドメイン（ＤＤ）の一部であり、及びＣＲＩＳＰＲ酵素との融合物としてのＤＤの不安定性が、プロテアソームによる融合タンパク質全体のＣＲＩＳＰＲタンパク質分解をもたらす。Ｓｈｉｅｌｄ−１及びＴＭＰは用量依存的にＤＤに結合してそれを安定化させる。エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ＥＲＬＢＤ、ＥＲＳ１の残基３０５〜５４９）もまた、不安定化ドメインとしてエンジニアリングすることができる。エストロゲン受容体シグナル伝達経路は乳癌などの種々の疾患に関与するため、この経路は広く研究されており、数多くのエストロゲン受容体作動薬及び拮抗薬が開発されている。従って、ＥＲＬＢＤと薬物との適合性のあるペアが公知である。突然変異体ＥＲＬＢＤに結合するが、野生型のＥＲＬＢＤには結合しないリガンドがある。３つの突然変異（Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ）１２をコードするこれらの突然変異ドメインのうちの１つを使用することにより、内因性エストロゲン感受性ネットワークを乱すことのないリガンドを用いてＥＲＬＢＤ由来のＤＤの安定性を調節することが可能である。追加の突然変異（Ｙ５３７Ｓ）を導入してＥＲＬＢＤを更に不安定化させ、それを潜在的なＤＤ候補として構成することができる。この四重突然変異体は、有利なＤＤ展開である。この突然変異ＥＲＬＢＤをＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができ、且つリガンドを用いてその安定性を調節し又は撹乱させることができ、それによってＣＲＩＳＰＲ酵素がＤＤを有することになる。別のＤ��は、Ｓｈｉｅｌｄ１リガンドによって安定化した、突然変異ＦＫＢＰタンパク質をベースとする１２ｋＤａ（１０７アミノ酸）タグであり得る；例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５，（２００８）を参照のこと。例えばＤＤは、合成の生物学的に不活性な小分子、Ｓｈｉｅｌｄ−１に結合し、且つそれによって可逆的に安定化される、改変されたＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）であってもよく；例えば、Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ＬＡ，Ｃｈｅｎ  ＬＣ，Ｍａｙｎａｒｄ−Ｓｍｉｔｈ  ＬＡ，Ｏｏｉ  ＡＧ，Ｗａｎｄｌｅｓｓ  ＴＪ．「合成小分子を使用して生細胞のタンパク質機能を調節するための迅速で可逆的且つ調整可能な方法（Ａ  ｒａｐｉｄ，ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ，ａｎｄ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」．Ｃｅｌｌ．２００６；１２６：９９５−１００４；Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ＬＡ，Ｓｅｌｌｍｙｅｒ  ＭＡ，Ｃｏｎｔａｇ  ＣＨ，Ｗａｎｄｌｅｓｓ  ＴＪ，Ｔｈｏｒｎｅ  ＳＨ．「生存マウスにおけるタンパク質安定性及び機能の化学的制御（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｍｉｃｅ）」．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００８；１４：１１２３−１１２７；Ｍａｙｎａｒｄ−Ｓｍｉｔｈ  ＬＡ，Ｃｈｅｎ  ＬＣ，Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ＬＡ，Ｏｏｉ  ＡＧ，Ｗａｎｄｌｅｓｓ  ＴＪ．「生物学的にサイレントな小分子を用いて条件的タンパク質安定性をエンジニアリングする指向的手法（Ａ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｓｉｌｅｎｔ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００７；２８２：２４８６６−２４８７２；及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．Ｍａｒ  ２３，２０１２；１９（３）：３９１−３９８（これらは全て、参照により本明細書に援用される）を参照されたく、及び本発明の実施においてＣＲＩＳＰＲ酵素と会合させるＤＤの選択において本発明の実施で用いられ得る。理解し得るとおり、当該技術分野における知識には幾つものＤＤが含まれ、及びＤＤはＣＲＩＳＰＲ酵素と、有利にはリンカーを伴い会合させる、例えば融合することができ、それによってＤＤをリガンドの存在下で安定化させることができ、及びそれが存在しないときＤＤを不安定化させることができ、それによってＣＲＩＳＰＲ酵素が全体として不安定化し、又はＤＤはリガンドが存在しない場合に安定化させることができ、リガンドが存在するときにＤＤを不安定化させることができ；ＤＤによってＣＲＩＳＰＲ酵素及びひいてはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体又は系を調節又は制御する−いわばオン・オフを切り替えることが可能となり、それにより系を例えばインビボ又はインビトロ環境で調節又は制御する手段が提供される。例えば、目的のタンパク質をＤＤタグとの融合物として発現させると、���れは細胞内で不安定化し、例えばプロテアソームによって急速に分解される。従って、安定化リガンドが存在しないと、Ｄが会合したＣａｓの分解につながる。新規ＤＤを目的のタンパク質に融合させると、その不安定性が目的のタンパク質に付与され、融合タンパク質全体の急速な分解が生じる。Ｃａｓのピーク活性は、時にオフターゲット効果の低減に有益である。従って、高い活性の短いバーストが好ましい。本発明はかかるピークを提供することが可能である。ある意味では、本系は誘導性である。別の意味では、本系は安定化リガンドの非存在下で抑制され、安定化リガンドの存在下で抑制が解除される。いかなる理論によっても拘束されることを望むものではないが、及びいかなる約束もすることなく、本発明の他の有益としては、以下を挙げることができる：
・用量調整可能であること（例えばオン・オフを切り替える系と対照的、可変的なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又は複合体活性を実現することができる）。
・直交性であること、例えば、リガンドがそのコグネイトＤＤにのみ影響を及ぼすため、２つ以上の系を独立に操作することができ、及び／又はＣＲＩＳＰＲ酵素が１つ以上のオルソログに由来することができる。
・輸送可能であること、例えば、種々の細胞型又は細胞株で機能し得る。
・高速であること。
・時間的制御性があること。
・Ｃａｓの分解が可能であることにより、バックグラウンド又はオフターゲットＣａｓ又はＣａｓ毒性又は過剰なＣａｓ蓄積を低減可能であること。
【０４０３】
ＤＤは、スプリット（本明細書の他の部分に定義するとおり）の１つ以上のサイドにあるＤＤを含め、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ末端及び／又はＣ末端にあってもよいが、例えばＣｐｆ１（Ｎ）−リンカー−ＤＤ−リンカー−Ｃｐｆ１（Ｃ）もまた、ＤＤの一つの導入方法である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素へのＤＤの一方のみの末端会合の使用を用いる場合、ＤＤとしてＥＲ５０を使用することが好ましい。一部の実施形態において、Ｎ末端及びＣ末端の両方を用いる場合、ＥＲ５０及び／又はＤＨＦＲ５０のいずれかの使用が好ましい。Ｎ末端融合で特に良好な結果が見られたが、これは意外である。Ｎ末端融合及びＣ末端融合の両方を有すると、相乗的になり得る。不安定化ドメインのサイズは様々であるが、典型的には約１００〜３００アミノ酸のサイズである。ＤＤは、好ましくはエンジニアリングされた不安定化タンパク質ドメインである。ＤＤ、及び例えば高親和性リガンド及びそのリガンド結合ドメインからのＤＤの作製方法。本発明は、特異的リガンドのみがそのそれぞれの（コグネイト）ＤＤを安定化させ、非コグネイトＤＤの安定性には何ら効果を及ぼさないため、「直交性」と見なし得る。市販のＤＤ系は、ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ、ＰｒｏｔｅｏＴｕｎｅｒ（商標）系である；安定化リガンドはＳｈｉｅｌｄ１である。
【０４０４】
一部の実施形態において、安定化リガンドは「小分子」である。一部の実施形態において、安定化リガンドは細胞透過性である。これは、その対応するＤＤに対して高親和性を有する。好適なＤＤ−安定化リガンドペアは当該技術分野において公知である。一般に、安定化リガンドは、
−  例えばインビボでの、自然のプロセシング（例えばプロテアソーム分解）；
−  例えばエキソビボ／細胞培養下、以下によるモップアップ：
−  好ましい結合パートナーの提供；又は
−  ＸＳ基質（Ｃａｓを伴わないＤＤ）の提供
によって除去し得る。
【０４０５】
更なる態様において、本発明は、ＤＤ−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系又はその機能性の一部分の範囲内にフィットする又はそれに結合するように潜在的化合物を同定又は設計するためのコンピュータ支援方法又はその逆に関する（本明細書において他の部分に記載されるとおり、例えば「保護型ガイド」を参照のこと）。
【０４０６】
多重（タンデム）ターゲティング手法に用いられる本発明に係る酵素
本発明者らは、本明細書に定義するとおりのＣＲＩＳＰＲ酵素が活性を失うことなく２つ以上のＲＮＡガイドを利用し得ることを明らかにしている。これにより、本明細書に定義するとおりのＣＲＩＳＰＲ酵素、系又は複合体を使用した複数のＤＮＡ標的、遺伝子又は遺伝子座のターゲティングが、本明細書に定義するとおりの単一の酵素、系又は複合体によって可能となる。ガイドＲＮＡはタンデムに配置されてもよく、任意選択で本明細書に定義するとおりのダイレクトリピートなどのヌクレオチド配列によって分離されていてもよい。これらの異なるガイドＲＮＡの位置はタンデムであり、活性に影響を及ぼさない。
【０４０７】
一態様において、本発明は、タンデム又は多重ターゲティングに使用される、本明細書に記載されるとおりの本発明に係るＣｐｆ１を提供する。本明細書の他の部分に記載されるとおりの本発明に係るＣＲＩＳＰＲ（又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ又はＣａｓ）酵素、複合体、又は系のいずれも、かかる手法に使用し得ることが理解されるべきである。本明細書の他の部分に記載されるとおりの方法、生成物、組成物及び使用のいずれも、以下に更に詳述する多重又はタンデムターゲティング手法で等しく適用可能である。更なる手引きとして、以下の詳細な態様及び実施形態を提供する。
【０４０８】
一態様において、本発明は、複数の遺伝子座のターゲティングへの本明細書に定義するとおりのＣｐｆ１酵素、複合体又は系の使用を提供する。一実施形態において、これは、複数の（タンデム又は多重）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を用いることによって実現し得る。
【０４０９】
一態様において、本発明は、タンデム又は多重ターゲティングへの本明細書に定義するとおりのＣｐｆ１酵素、複合体又は系の１つ以上のエレメントの使用方法を提供し、ここで前記ＣＲＩＳＰ系は複数のガイドＲＮＡ配列を含む。好ましくは、前記ｇＲＮＡ配列は、本明細書の他の部分に定義するとおりのダイレクトリピートなど、ヌクレオチド配列によって分離されている。
【０４１０】
一態様において、本発明は、本明細書に定義するとおりのＣｐｆ１酵素、系又は複合体、即ち、Ｃｐｆ１タンパク質と、ＤＮＡ分子など、複数の核酸分子を標的化する複数のガイドＲＮＡであって、それによって各々がその対応する核酸分子、例えばＤＮＡ分子を特異的に標的化する複数のガイドＲＮＡとを有するＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を提供する。各核酸分子標的、例えばＤＮＡ分子は遺伝子産物をコードし得るか、又は遺伝子座を包含し得る。ひいては複数のガイドＲＮＡを使用することにより、複数の遺伝子座又は複数の遺伝子のターゲティングが可能になる。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１酵素は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を切断し得る。一部の実施形態において、遺伝子産物の発現が変化する。Ｃｐｆ１タンパク質及びガイドＲＮＡは天然では一緒に存在しない。本発明は、タンデムに配置されたガイド配列を含むガイドＲＮＡを包含する。Ｃｐｆ１酵素はＣＲＩＳＰＲ系又は複合体の一部を形成してもよく、ＣＲＩＳＰＲ系又は複合体は更に、各々が細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列に特異的にハイブリダイズ可能な一連の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２５、２５、３０個、又は３０個超のガイド配列を含むタンデムに配置されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。一部の実施形態において、機能性Ｃｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系又は複合体は複数の標的配列に結合する。一部の実施形態において、機能性ＣＲＩＳＰＲ系又は複合体は複数の標的配列を編集することができ、例えば、それらの標的配列はゲノム遺伝子座を含んでもよく、及び一部の実施形態では遺伝子発現の変化があり得る。一部の実施形態において、機能性ＣＲＩＳＰＲ系又は複合体は更なる機能性ドメインを含み得る。一部の実施形態において、本発明は、複数の遺伝子産物の発現を変化させる又は改変する方法を提供する。本方法は、前記標的核酸、例えばＤＮＡ分子を含有する、又は標的核酸、例えばＤＮＡ分子を含有してそれを発現する細胞に導入することを含み得る；例えば、標的核酸は遺伝子産物をコードし得るか、又は遺伝子産物の発現をもたらし得る（例えば調節配列）。
【０４１１】
好ましい実施形態において、多重ターゲティングに用いられるＣＲＩＳＰＲ酵素はＣｐｆ１であり、又はＣＲＩＳＰＲ系又は複合体はＣｐｆ１を含む。一部の実施形態において、多重ターゲティングに用いられるＣＲＩＳＰＲ酵素はＡｓＣｐｆ１であり、又は多重ターゲティングに用いられるＣＲＩＳＰＲ系又は複合体はＡｓＣｐｆ１を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＬｂＣｐｆ１であり、又はＣＲＩＳＰＲ系又は複合体はＬｂＣｐｆ１を含む。一部の実施形態において、多重ターゲティングに用いられるＣｐｆ１酵素はＤＮＡの両方の鎖を切断して二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出す。一部の実施形態において、多重ターゲティングに用いられるＣＲＩＳＰＲ酵素はニッカーゼである。一部の実施形態において、多重ターゲティングに用いられるＣｐｆ１酵素はデュアルニッカーゼである。一部の実施形態において、多重ターゲティングに用いられるＣｐｆ１酵素は、本明細書の他の部分に定義するとおりのＤＤ  Ｃｐｆ１酵素などのＣｐｆ１酵素である。
【０４１２】
一態様において、本発明は、真核細胞などの宿主細胞における複数の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、Ｃｐｆ１ＣＲＩＳＰＲ複合体を複数の標的ポリヌクレオチドに結合させて、例えば前記複数の標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせ、それにより複数の標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ここでＣｐｆ１ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の特定の標的配列に各々ハイブリダイズする複数のガイド配列と複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含み、前記複数のガイド配列はダイレクトリピート配列に連結されている。一部の実施形態において、前記切断は、前記Ｃｐｆ１酵素によって標的配列の各々の位置にある１本又は２本の鎖を切断することを含む。一部の実施形態において、前記切断により、複数の標的遺伝子の転写の減少が生じる。一部の実施形態において、本方法は、前記切断された標的ポリヌクレオチドの１つ以上を外因性鋳型ポリヌクレオチドによる相同組換えによって修復するステップを更に含み、前記修復により、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上の１ヌクレオチド以上の挿入、欠失、又は置換を含む突然変異が生じる。一部の実施形態において、前記突然変異により、標的配列の１つ以上を含む遺伝子から発現したタンパク質に１つ以上のアミノ酸変化が生じる。一部の実施形態において、本方法は、前記真核細胞に１つ以上のベクターを送達するステップを更に含み、ここで１つ以上のベクターは、Ｃｐｆ１酵素及びダイレクトリピート配列に連結された複数のガイドＲＮＡ配列のうちの１つ以上の発現をドライブする。一部の実施形態において、前記ベクターは対象の真核細胞に送達される。一部の実施形態において、前記改変は細胞培養物中の前記真核細胞で起こる。一部の実施形態において、本方法は、前記改変の前に対象から前記真核細胞を単離するステップを更に含む。一部の実施形態において、本方法は、前記真核細胞及び／又はそれに由来する細胞を前記対象に戻すステップを更に含む。
【０４１３】
本発明のある態様は、上記のエレメントが単一の組成物に含まれるもの、又は個々の組成物に含まれるものである。これらの組成物は、有利には宿主に適用されて、ゲノムレベルで機能的効果を生じ得る。
【０４１４】
各ｇＲＮＡは、同じ又は異なるアダプタータンパク質に特異的な複数の結合認識部位（例えばアプタマー）を含むように設計され得る。各ｇＲＮＡは、転写開始部位（即ちＴＳＳ）の−１０００〜＋１核酸、好ましくは−２００核酸上流のプロモーター領域に結合するように設計され得る。このように位置させると、遺伝子活性化（ａｃｔｉｖｉａｔｉｏｎ）（例えば転写アクチベーター）又は遺伝子阻害（例えば転写リプレッサー）に影響を及ぼす機能性ドメインが向上する。改変されたｇＲＮＡは、組成物に含まれる１つ以上の標的遺伝子座を標的化する１つ以上の改変されたｇＲＮＡ（例えば、少なくとも１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡ、少なくとも５個のｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも２０個のｇＲＮＡ、少なくとも３０個のｇＲＮＡ、少なくとも５０個のｇＲＮＡ）であってもよい。前記複数のｇＲＮＡ配列はタンデムに配置され、好ましくはダイレクトリピートによって分離されている。
【０４１５】
ある態様において、
Ｉ．２つ以上のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）ポリヌクレオチド遺伝子座における第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、
（ｂ）ポリヌクレオチド遺伝子座における第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、
（ｃ）ダイレクトリピート配列、を含むポリヌクレオチド配列、
及び
ＩＩ．Ｃｐｆ１酵素又はそれをコードする第２のポリヌクレオチド配列
を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
転写されると、第１及び第２のガイド配列が第１及び第２のＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体のそれぞれ第１及び第２の標的配列への配列特異的結合を導き、
第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が、第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列と複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含み、
第２のＣＲＩＳＰＲ複合体が、第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列と複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含み、及び
第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍にＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍に他方の鎖の切断を導いて二本鎖切断を誘導し、それにより生物又は非ヒト又は非動物生物が改変される、組成物が提供される。同様に、例えば各１つの標的に特異的な、且つ本明細書に記載されるとおりの組成物又はＣＲＩＳＰＲ系若しくは複合体中でタンデムに配置された、３つ以上のガイドＲＮＡを含む組成物を想定することができる。
【０４１６】
自己不活性化システム
細胞内のゲノムにおける遺伝子の全てのコピーが編集された後は、それ以上当該細胞においてＣＲＩＳＲＰ／Ｃｐｆ１ｐ発現が続行する必要はない。実際、発現が持続すれば、意図しないゲノム部位でオフターゲット効果が起こる場合等、望ましくないこともある。従って時限的発現が有用となり得る。誘導性発現は一つの手法を提供するが、更に本出願人らは、ＣＲＩＳＰＲベクターそれ自体の中の非コードガイド標的配列の使用に頼る自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ系をエンジニアリングしている。従って、発現開始後、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系はそれ自体の破壊をもたらし得るが、しかし破壊が完了する前に、標的遺伝子のゲノムコピーを編集する時間があり得る（二倍体細胞における通常の点突然変異では、これに必要となるのは高々２つの編集である）。単純に、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ酵素それ自体のコード配列を標的化するか、又は以下の１つ以上に存在するユニーク配列に相補的な１つ以上の非コードガイド標的配列を標的化する追加的なＲＮＡ（即ち、ガイドＲＮＡ）を含む：
（ａ）非コードＲＮＡエレメントの発現を駆動するプロモーター内、
（ｂ）Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質遺伝子の発現を駆動するプロモーター内、
（ｃ）Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質コード配列におけるＡＴＧ翻訳開始コドンから１００ｂｐ以内、
（ｄ）例えばＡＡＶゲノムにおける、ウイルス送達ベクターの逆方向末端反復配列（ｉＴＲ）内。
【０４１７】
更に、当該のＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ複合体をコードするベクター、例えば別個のベクター又は同じベクターで送達することができる。別個のベクターにより提供される場合、Ｃａｓ発現を標的化するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡは、逐次的に又は同時に投与することができる。逐次的に投与される場合、Ｃａｓ発現を標的とするＣＲＩＳＰＲＲＮＡは、例えば遺伝子編集又は遺伝子エンジニアリングが意図されるＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡの後に送達されるべきである。この期間は数分の期間であってもよい（例えば、５分、１０分、２０分、３０分、４５分、６０分）。この期間は数時間の期間であってもよい（例えば、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間）。この期間は数日の期間であってもよい（例えば、２日、３日、４日、７日）。この期間は数週の期間であってもよい（例えば、２週間、３週間、４週間）。この期間は数ヵ月の期間であってもよい（例えば、２ヵ月、４ヵ月、８ヵ月、１２ヵ月）。この期間は数年の期間であってもよい（２年、３年、４年）。このようにして、Ｃａｓ酵素は、１つ又は複数の目的のゲノム遺伝子座などの第１の標的にハイブリダイズ可能な第１のｇＲＮＡと会合し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の所望の１つ又は複数の機能（例えば遺伝子エンジニアリング）を受け持ち；及び続いてＣａｓ酵素は、次にＣａｓ又はＣＲＩＳＰＲカセットの少なくとも一部を含む配列にハイブリダイズ可能な第２のｇＲＮＡと会合し得る。Ｃａｓタンパク質の発現をコードする配列がガイドＲＮＡの標的である場合、酵素は妨げられ、系が自己不活性化する。同じように、本明細書に説明されるとおり、例えばリポソーム、リポフェクション、粒子、微小胞を介して適用されるＣａｓ発現を標的とするＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡが、逐次的又は同時に投与されてもよい。同様に、１つ以上の標的を標的化するために用いられる１つ以上のガイドＲＮＡの不活性化に自己不活性化が用いられ得る。
【０４１８】
一部の態様において、ＣＲＩＳＰＲ酵素開始コドンの下流の配列にハイブリダイゼーション可能なシングルｇＲＮＡが提供され、それによって幾らかの時間の後、ＣＲＩＳＰＲ酵素発現が失われる。一部の態様において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドの１つ以上のコード又は非コード領域にハイブリダイゼーション可能な１つ以上のｇＲＮＡが提供され、それによって幾らかの時間の後、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上、又は場合によっては全てが不活性化する。この系の一部の態様において、及び理論によって制限されることなく、細胞は複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を含むことができ、ここでＣＲＩＳＰＲ複合体の第１のサブセットが、編集しようとする１つ又は複数のゲノム遺伝子座を標的化可能な第１のガイドＲＮＡを含み、及びＣＲＩＳＰＲ複合体の第２のサブセットが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドを標的化可能な少なくとも１つの第２のガイドＲＮＡを含み、ここでＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の第１のサブセットが１つ又は複数の標的ゲノム遺伝子座の編集を媒介し、及びＣＲＩＳＰＲ複合体の第２のサブセットが最終的にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を不活性化し、それにより細胞における更なるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ発現が不活性化される。
【０４１９】
従って本発明は、真核細胞に送達するための１つ以上のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、ここで１つ又は複数のベクターは、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素；（ｉｉ）細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイドＲＮＡ；（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクター内の１つ以上の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイドＲＮＡコードし、細胞内で発現すると：第１のガイドＲＮＡが、細胞内の標的配列への第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導き；第２のガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクター内の標的配列への第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導き；ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ガイドＲＮＡに結合したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、そのためガイドＲＮＡはその標的配列にハイブリダイズすることができ；及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を不活性化して、細胞によるＣＲＩＳＰＲ酵素の発現の継続を妨げる。
【０４２０】
様々なコード配列（ＣＲＩＳＰＲ酵素及びガイドＲＮＡ）が単一のベクターに含まれてもよく、又は複数のベクターに含まれてもよい。例えば、あるベクター上の酵素及び別のベクター上の様々なＲＮＡ配列をコードすること、又はあるベクター上の酵素及び１つのガイドＲＮＡ、及び別のベクター上の残りのガイドＲＮＡをコードすること、又は任意の他の並べ替えが可能である。一般に、合計１つ又は２つの異なるベクターを使用する系が好ましい。
【０４２１】
複数のベクターを使用する場合、それらを不均衡な数で、及び理想的には、第２のガイドＲＮＡと比べて第１のガイドＲＮＡをコードするベクターを過剰として送達することが可能であり、それによりゲノム編集が起こる機会が得られるまでＣＲＩＳＰＲ系の最終的な不活性化を遅らせる助けとなる。
【０４２２】
第１のガイドＲＮＡは、本明細書の他の部分に記載されるとおり、ゲノム内の任意の目的の標的配列を標的化することができる。第２のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃｐｆ１酵素をコードするベクター内の配列を標的化し、それにより当該のベクターからの酵素の発現を不活性化する。従ってベクター内の標的配列は発現を不活性化可能でなければならない。好適な標的配列は、例えば、Ｃｐｆ１ｐコード配列の翻訳開始コドンの近傍又はその範囲内、非コード配列内、非コードＲＮＡエレメントの発現をドライブするプロモーター内、Ｃｐｆ１ｐ遺伝子の発現をドライブするプロモーターの範囲内、Ｃａｓコード配列におけるＡＴＧ翻訳開始コドンから１００ｂｐ以内、及び／又は例えばＡＡＶゲノムにおける、ウイルス送達ベクターの逆方向末端反復配列（ｉＴＲ）の範囲内にあり得る。この領域近傍での二本鎖切断はＣａｓコード配列のフレームシフトを引き起こし得るため、タンパク質発現の喪失が生じ得る。「自己不活性化」ガイドＲＮＡの代替的な標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の発現又はベクターの安定性に必要な調節領域／配列を編集し／不活性化することを目的としたものであり得る。例えば、Ｃａｓコード配列のプロモーターが破壊された場合、転写が阻害又は防止され得る。同様に、ベクターが複製、維持又は安定性用の配列を含む場合、それらを標的化することが可能である。例えば、ＡＡＶベクターにおいて有用な標的配列はｉＴＲ内にある。標的化に有用な他の配列は、プロモーター配列、ポリアデニル化部位（ｐｏｌｙａｄｅｎｌｙａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）等であり得る。
【０４２３】
更に、ガイドＲＮＡがアレイフォーマットで発現する場合、両方のプロモーターを同時に標的化する「自己不活性化」ガイドＲＮＡにより、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ発現構築物内から介在するヌクレオチドが切り出されることになり、事実上その完全な不活性化につながる。同様に、ガイドＲＮＡが両方のＩＴＲを標的化する場合に、又は２つ以上の他のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構成成分を同時に標的化する場合に、介在ヌクレオチドが切り出され得る。本明細書に説明されるとおりの自己不活性化は、一般に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの調節をもたらすためＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系と共に適用可能である。例えば、本明細書に説明されるとおりの自己不活性化を、本明細書に説明されるとおりの突然変異、例えば増大障害のＣＲＩＳＰＲ修復に適用してもよい。この自己不活性化の結果として、ＣＲＩＳＰＲ修復の活性はあくまでも一過性である。
【０４２４】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓが停止する前に標的ゲノム遺伝子座が編集されることを確実にする手段として、「自己不活性化」ガイドＲＮＡの５’末端（例えば１〜１０ヌクレオチド、好ましくは１〜５ヌクレオチド）への非ターゲティングヌクレオチドの付加を用いてそのプロセシングを遅らせ、及び／又はその効率を改変することができる。
【０４２５】
自己不活性化ＡＡＶ−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一態様において、１つ以上の目的のガイドＲＮＡターゲティングゲノム配列（例えば１〜２、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜３０個）を共発現するプラスミドが、エンジニアリングされたＡＴＧ開始部位又はその近傍（例えば５ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、５０ヌクレオチド以内、１００ヌクレオチド以内）でＳｐＣａｓ９配列を標的化する「自己不活性化」ガイドＲＮＡを含んで作製され得る。Ｕ６プロモーター領域における調節配列もまた、ガイドＲＮＡで標的化することができる。Ｕ６ドライブ型ガイドＲＮＡは、複数のガイドＲＮＡ配列を同時にリリースすることができるようなアレイフォーマットで設計し得る。初めに標的組織／細胞へと送達されると（細胞を離れた）ガイドＲＮＡが蓄積し始める一方、核内のＣａｓレベルが上昇する。Ｃａｓは全てのガイドＲＮＡと複合体を形成してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミドのゲノム編集及び自己不活性化を媒介する。
【０４２６】
自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一態様は、単独での、又は１〜４個まで又はそれより多い異なるガイド配列；例えば約２０又は約３０個までのガイド配列のタンデム（ｔａｎｄａｍ）アレイフォーマットでの発現である。個別の自己不活性化ガイド配列毎に異なる標的を標的化し得る。これは、例えば１つのキメラｐｏｌ３転写物からプロセシングされ得る。Ｕ６又はＨ１プロモーターなどのＰｏｌ３プロモーターが用いられ得る。本明細書において全体を通して言及されるものなどのＰｏｌ２プロモーター。逆方向末端反復（ｉＴＲ）配列がＰｏｌ３プロモーター−１つ又は複数のガイドＲＮＡ−Ｐｏｌ２プロモーター−Ｃａｓに隣接し得る。
【０４２７】
タンデムアレイ転写物の一態様は、１つ以上のガイドが１つ以上の標的を編集する一方で１つ以上の自己不活性化ガイドがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を不活性化するというものである。従って、例えば、増大障害を修復するための記載されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を本明細書に記載される自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系と直接組み合わせてもよい。かかる系は、例えば、修復のための標的領域に向けられた２つのガイド並びにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの自己不活性化に向けられた少なくとも第３のガイドを有し得る。国際公開第２０１５／０８９３５１号パンフレットとして２０１４年１２月１２日に公開された「ヌクレオチドリピート障害におけるＣｒｉｓｐｒ−Ｃａｓ系の組成物及び使用方法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｃｒｉｓｐｒ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」と題される出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９８９７号明細書が参照される。
【０４２８】
ガイドＲＮＡは制御ガイドであり得る。例えばそれは、米国特許出願公開第２０１５２３２８８１号明細書Ａ１（その開示は本明細書によって参照により援用される）に記載されるとおり、ＣＲＩＳＰＲ酵素それ自体をコードする核酸配列を標的化するようにエンジニアリングされ得る。一部の実施形態において、本系又は組成物には、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を標的化するようにエンジニアリングされたガイドＲＮＡだけが提供され得る。加えて、本系又は組成物には、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を標的化するようにエンジニアリングされたガイドＲＮＡ、並びにＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列、及び任意選択で第２のガイドＲＮＡ、及び更に任意選択で修復鋳型が提供され得る。第２のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ系又は組成物の一次標的であり得る（本明細書に定義するとおり、治療用、診断用、ノックアウト等）。このように、本系又は組成物は自己不活性化する。これは、本明細書の他の部分で参照される米国特許出願公開第２０１５２３２８８１号明細書Ａ１（国際公開第２０１５０７００８３号パンフレット（Ａ１）としても公開されている）にＣａｓ９に関連して例示され、Ｃｐｆ１に当てはめることができる。
【０４２９】
一般に、及び本明細書全体を通じて、用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターには、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端のない（例えば環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野において公知の他の種類のポリヌクレオチドが含まれる。ある種のベクターは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術によるなどして追加のＤＮＡセグメントを挿入することのできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでベクターには、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）へのパッケージングのためのウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列が存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスが保有するポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞での自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技法において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。
【０４３０】
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の（これはつまり、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結された、発現に使用する宿主細胞に基づき選択され得る１つ以上の調節エレメントを含むことを意味する）本発明の核酸を含むことができる。組換え発現ベクターの範囲内で、「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の（例えば、インビトロ転写／翻訳系における、又はベクターが宿主細胞に導入される場合に宿主細胞における）発現が可能となる形で目的のヌクレオチド配列が１つ又は複数の調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。
【０４３１】
一部の実施態様では、宿主細胞は、本明細書に記載の１つ以上のベクターによって一時的または非一時的にトランスフェクトされる。一部の実施態様では、細胞は、対象において天然に生じるようにトランスフェクトされる。一部の実施態様では、トランスフェクトされる細胞は、対象から取られる。一部の実施態様では、細胞は、対象から取られた細胞、例えば細胞株から採取される。組織培養のための幅広い種類の細胞株が、当技術分野で知られている。細胞株の例は、限定されないが、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨｅＬａ  Ｂ、ＨｅＬａ  Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３  Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３−Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ−５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ  ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ  Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＭＬ  Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２  細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−Ｍｅｌ  １−４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＣＫ  ＩＩ、ＭＤＣＫ  ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ  ６、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＡＬＭ−１、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ  ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ−９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、���ＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１、ＹＡＲ、及びそれらのトランスジェニック変種を含む。細胞株は、当業者に公知の様々な供給源から利用可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ，Ｖａ．）を参照）。一部の実施態様では、本明細書に記載の１つ以上のベクターによってトランスフェクトされた細胞は、１つ以上のベクター由来配列を含む新規の細胞株を確立するために用いられる。一部の実施態様では、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ系の構成要素によって一時的にトランスフェクトされて（例えば、１つ以上のベクターの一時的なトランスフェクション、又はＲＮＡを用いたトランスフェクションによる）、ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性によって改変された細胞は、改変を含むが任意の他の外来性の配列を欠く細胞を含む新規の細胞株を確立するために用いられる。一部の実施態様では、本明細書に記載の１つ以上のベクターによって一時的または非一時的にトランスフェクトされた細胞、またはそのような細胞から採取された細胞株は、１つ以上の試験化合物を評価するのに用いられる。
【０４３２】
概してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の使用に関しては、本開示全体を通じて引用される特許出願、特許、及び特許公報を含めた文献が、本発明の実施形態をそれらの文献にあるとおり用い得ることに伴い挙げられる。１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（例えば単一の又は多重化した）は、作物ゲノミクスにおける最近の進歩と併せて用いることができる。かかる１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用して、効率的な且つ対費用効果の高い植物遺伝子又はゲノムの探索又は編集又は操作を−例えば、植物遺伝子又はゲノムの高速での調査及び／又は選択及び／又は探索及び／又は比較及び／又は操作及び／又は形質転換のため実施することができ；例えば、１つ又は複数の形質又は１つ又は複数の特徴を作出し、同定し、開発し、最適化し、又は１つ又は複数の植物に付与し、又は植物ゲノムを形質転換することができる。従って、植物の生産向上、新規組み合わせの形質又は特徴を有する新規植物、又は形質が増強された新規植物があり得る。かかる１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、植物に関して、部位特異的組込み（ＳＤＩ）又は遺伝子編集（ＧＥ）又は任意の準逆育種（ＮＲＢ）又は逆育種（ＲＢ）技術において使用することができる。植物におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の使用に関しては、アリゾナ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｒｉｚｏｎａ）ウェブサイト「ＣＲＩＳＰＲ−ＰＬＡＮＴ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｒｉｚｏｎａ．ｅｄｕ／ｃｒｉｓｐｒ／）（後援Ｐｅｎｎ  Ｓｔａｔｅ及びＡＧＩ）が挙げられる。本発明の実施形態は、植物におけるゲノム編集又はこれまでＲＮＡｉ若しくは同様のゲノム編集技術が用いられてきたところに使用することができる；例えば、Ｎｅｋｒａｓｏｖ，「簡単な植物ゲノム編集：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用したモデル及び作物植物における標的突然変異誘発（Ｐｌａｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｍａｄｅ  ｅａｓｙ：ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｍｏｄｅｌ  ａｎｄ  ｃｒｏｐ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３，９：３９（ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４６−４８１１−９−３９）；Ｂｒｏｏｋｓ，「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用した初代のトマトにおける効率的遺伝子編集（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｏｍａｔｏ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１４  ｐｐ  １１４．２４７５７７；Ｓｈａｎ，「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用した作物植物の標的ゲノム改変（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｏｐ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，６８６−６８８（２０１３）；Ｆｅｎｇ，「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用した植物における効率的ゲノム編集（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｃｅｌｌ  Ｒｅ��ｅａｒｃｈ（２０１３）２３：１２２９−１２３２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｒ．２０１３．１１４；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ２０  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１３；Ｘｉｅ，「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用した植物におけるＲＮＡガイド下ゲノム編集（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ．２０１３  Ｎｏｖ；６（６）：１９７５−８３．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｍｐ／ｓｓｔ１１９．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ａｕｇ  １７；Ｘｕ，「コメにおけるアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用した遺伝子ターゲティング（Ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｒｉｃｅ）」，Ｒｉｃｅ  ２０１４，７：５（２０１４）、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，「木本多年生植物ポプラ属の外交配における両アレルＣＲＩＳＰＲ突然変異へのＳＮＰの利用により４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼ特異性及び冗長性が明らかになる（Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ＳＮＰｓ  ｆｏｒ  ｂｉａｌｌｅｌｉｃ  ＣＲＩＳＰＲ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｗｏｏｄｙ  ｐｅｒｅｎｎｉａｌ  Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）」，Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ（２０１５）（Ｆｏｒｕｍ）１−４（ｗｗｗ．ｎｅｗｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ．ｃｏｍにおいてのみオンライン利用が可能）；Ｃａｌｉａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ，「宿主ゲノムに安定に担持されるＣＲＩＳＰＲ装置を使用した標的ＤＮＡ分解（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＤＮＡ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ  ｄｅｖｉｃｅ  ｓｔａｂｌｙ  ｃａｒｒｉｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｇｅｎｏｍｅ）」，ＮＡＴＵＲＥ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ  ６：６９８９，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７９８９，ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎａｔｕｒｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７９８９；米国特許第６，６０３，０６１号明細書−アグロバクテリウム属媒介植物形質転換方法（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ）；米国特許第７，８６８，１４９号明細書−植物ゲノム配列及びその使用（Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ）及び米国特許出願公開第２００９／０１００５３６号明細書−農業形質が増強されたトランスジェニック植物（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ  Ｔｒａｉｔｓ）（これらの各々の内容及び開示は全て、本明細書において全体として参照により援用される）を参照のこと。本発明の実施では、Ｍｏｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ  「作物ゲノミクス：進展と応用（Ｃｒｏｐ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．２０１１  Ｄｅｃ  ２９；��３（２）：８５−９６の内容及び開示；その各々が、本明細書における実施形態が植物に関してどのように用いられ得るかに関してを含め、参照により本明細書に援用される。従って、本明細書における動物細胞への言及はまた、特に明らかでない限り、適宜修正して植物細胞にも適用し得る。
【０４３３】
本発明の態様は、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み得る本明細書に定義するとおりのＣｐｆ１酵素とを含み得る天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を包含する。
【０４３４】
本発明のある態様は、本明細書に記載される組成物のいずれかを細胞に導入することにより、目的のゲノム遺伝子座を改変して細胞における遺伝子発現を変化させる方法を包含する。
【０４３５】
本発明のある態様は、上記のエレメントが単一の組成物に含まれるか、又は個別の組成物に含まれることである。これらの組成物は、有利には、宿主に適用されるとゲノムレベルで機能的効果を誘発し得る。
【０４３６】
本明細書で使用されるとき、用語「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」は本明細書の他の部分で使用されるとおりの意味を有し、標的核酸配列とハイブリダイズして標的核酸配列への核酸ターゲティング複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含む。各ｇＲＮＡは、同じ又は異なるアダプタータンパク質に特異的な複数の結合認識部位（例えばアプタマー）を含むように設計され得る。各ｇＲＮＡは、転写開始部位（即ちＴＳＳ）の−１０００〜＋１核酸、好ましくは−２００核酸上流のプロモーター領域に結合するように設計され得る。このように位置させると、遺伝子活性化（例えば転写アクチベーター）又は遺伝子阻害（例えば転写リプレッサー）に影響を及ぼす機能ドメインが改善される。改変されたｇＲＮＡは、組成物に含まれる１つ以上の標的遺伝子座を標的化する１つ以上の改変されたｇＲＮＡ（例えば、少なくとも１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡ、少なくとも５個のｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも２０個のｇＲＮＡ、少なくとも３０個のｇＲＮＡ、少なくとも５０個のｇＲＮＡ）であってもよい。前記複数のｇＲＮＡ配列はタンデムに配置され、好ましくはダイレクトリピートによって分離されている。
【０４３７】
従って、本明細書に定義するとおりのｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ酵素は各々が個別に組成物中に含まれ、個別に又はまとめて宿主に投与され得る。或いは、これらの構成成分は、宿主への投与用の単一の組成物中に提供されてもよい。宿主への投与は、宿主への送達用の当業者に公知の又は本明細書に記載されるウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター）を介して実施され得る。本明細書に説明されるとおり、異なる選択マーカー（例えば、レンチウイルスｇＲＮＡ選択用）及びｇＲＮＡ濃度（例えば、複数のｇＲＮＡが使用されるかどうかに依存する）を使用することが、効果の向上を生じさせるのに有利であり得る。この概念に基づけば、ＤＮＡ切断、遺伝子活性化、又は遺伝子失活を含めたゲノム遺伝子座イベントを誘発するのに幾つかのバリエーションが適切である。当業者は、提供される本組成物を用いて、同じ又は異なる機能ドメインを有する単一又は複数の遺伝子座を有利に且つ特異的に標的化して、１つ以上のゲノム遺伝子座イベントを誘発することができる。本組成物は、細胞のライブラリにおけるスクリーニング及びインビボでの機能モデリング（例えば、ｌｉｎｃＲＮＡの遺伝子活性化及び機能の同定；機能獲得モデリング；機能喪失モデリング；最適化及びスクリーニング目的の細胞株及びトランスジェニック動物を樹立するための本発明の組成物の使用）のための多種多様な方法に適用され得る。
【０４３８】
本発明は、条件的又は誘導性ＣＲＩＳＰＲトランスジェニック細胞／動物を樹立し及び利用するための本発明の組成物の使用を包含する；例えば、Ｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１４），１５９（２）：４４０−４５５、又は国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）などの本明細書に引用されるＰＣＴ特許公報を参照のこと。例えば、細胞又は動物、例えば非ヒト動物、例えば脊椎動物又は哺乳類、例えばげっ歯類、例えばマウス、ラット、又は他の実験動物若しくは野外動物、例えば、ネコ、イヌ、ヒツジなどが「ノックイン」されてもよく、それによって動物が、Ｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌのようにＣｐｆ１を条件的に又は誘導性に発現する。従って標的細胞又は動物はＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばＣｐｆ１）を条件的に又は誘導性に（例えばＣｒｅ依存性構築物の形態で）含み、標的細胞に導入されたベクターの発現時、ベクターは、標的細胞におけるＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、Ｃｐｆ１）発現を誘導し、又はその条件を生じるように発現する。ＣＲＩＳＰＲ複合体を作成する公知の方法と共に本明細書に定義するとおりの教示及び組成物を適用することにより、誘導性ゲノムイベントもまた本発明の態様である。かかる誘導性イベントの例は、本明細書の他の部分に記載されている。
【０４３９】
一部の実施形態において、特に治療方法の中で遺伝性疾患が標的化されるとき、好ましくは表現型の変化がゲノム改変の結果であり、好ましくはここで表現型を修正し又は変化させるため修復鋳型が提供される。
【０４４０】
一部の実施形態において、標的となり得る疾患としては、疾患を引き起こすスプライス欠損に関係しているものが挙げられる。
【０４４１】
一部の実施形態において、細胞標的としては、造血幹／前駆細胞（ＣＤ３４＋）；ヒトＴ細胞；及び眼（網膜細胞）−例えば光受容前駆細胞が挙げられる。
【０４４２】
一部の実施形態において、遺伝子標的としては、ヒトβグロビン−ＨＢＢ（鎌状赤血球貧血の治療用、遺伝子変換の（内因性鋳型として近縁のＨＢＤ遺伝子を使用した）刺激によることを含む）；ＣＤ３（Ｔ細胞）；及びＣＥＰ９２０−網膜（眼）が挙げられる。
【０４４３】
一部の実施形態において、疾患標的としてはまた、スプライス欠損を引き起こす癌；鎌状赤血球貧血（点突然変異に基づく）；ＨＢＶ、ＨＩＶ；β−サラセミア；及び眼科的疾患又は眼疾患−例えばレーベル先天黒内障（ＬＣＡ）−も挙げられる。一部の実施形態において、送達方法には、酵素−ガイド複合体（リボ核タンパク質）のカチオン性脂質媒介性「直接」送達及びプラスミドＤＮＡの電気穿孔が含まれる。
【０４４４】
本明細書に記載される方法、生成物及び使用は、非治療目的に用いられ得る。更に、本明細書に記載される方法のいずれもインビトロ及びエキソビボで適用し得る。
【０４４５】
ある態様において、
Ｉ．２つ以上のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）ポリヌクレオチド遺伝子座の第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、
（ｂ）ポリヌクレオチド遺伝子座の第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、
（ｃ）ダイレクトリピート配列、
を含むポリヌクレオチド配列、及び
ＩＩ．Ｃｐｆ１酵素又はそれをコードする第２のポリヌクレオチド配列
を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物が提供され、
第１及び第２のガイド配列は、転写されると、それぞれ第１及び第２の標的配列への第１及び第２のＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導き、
第１のＣＲＩＳＰＲ複合体は、第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列と複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含み、
第２のＣＲＩＳＰＲ複合体は、第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列と複合体を形成したＣｐｆ１酵素を含み、
第１のガイド配列が第１の標的配列近傍におけるＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ第２のガイド配列が第２の標的配列近傍における他方の鎖の切断を導いて二本鎖切断が誘導され、それにより生物又は非ヒト若しくは非動物生物が改変される。同様に、例えば各々が１つの標的に特異的な、且つ本明細書に記載されるとおりの組成物又はＣＲＩＳＰＲ系又は複合体においてタンデムに配置された２つより多いガイドＲＮＡを含む組成物を想定することができる。
【０４４６】
別の実施形態において、Ｃｐｆ１はタンパク質として細胞に送達される。別の特に好ましい実施形態において、Ｃｐｆ１はタンパク質として、又はそれをコードするヌクレオチド配列として細胞に送達される。タンパク質としての細胞への送達には、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の送達が含まれてもよく、ここでタンパク質は複数のガイドと複合体を形成している。
【０４４７】
ある態様において、幹細胞、及びその子孫を含め、本発明の組成物、系又は改変酵素によって改変されているか又はそれを含む宿主細胞及び細胞株が提供される。
【０４４８】
ある態様において、細胞治療方法が提供され、ここでは、例えば、単一細胞又は細胞集団が試料採取又は培養され、ここで当該の１つ又は複数の細胞は本明細書に記載されるとおりエキソビボで改変されるか又は改変されており、次に生物に再導入（試料採取した細胞）又は導入（培養細胞）される。幹細胞もまた、胚性幹細胞であれ、又は人工多能性若しくは全能性幹細胞であれ、この点で特に好ましい。しかし、当然ながら、インビボ実施形態もまた想定される。
【０４４９】
本発明の方法は、ｄｓＯＤＮ又はｓｓＯＤＮ（以下参照）であってもよい修復鋳型などの鋳型の送達を更に含むことができる。鋳型の送達は、ＣＲＩＳＰＲ酵素又はガイドＲＮＡの一部又は全部の送達と同時であっても又は別個であってもよく、且つ同じ又は異なる送達機構によってもよい。一部の実施形態において、鋳型はガイドＲＮＡと共に、好ましくはＣＲＩＳＰＲ酵素もまた共に送達されることが好ましい。一例はＡＡＶベクターであってもよく、ここでＣＲＩＳＰＲ酵素はＡｓＣｐｆ１又はＬｂＣｐｆ１である。
【０４５０】
本発明の方法は、（ａ）前記二本鎖切断によって生じたオーバーハングに相補的なオーバーハングを含む二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を細胞に送達するステップであって、前記ｄｓＯＤＮが目的の遺伝子座に組み込まれるステップ；又は−（ｂ）一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を細胞に送達するステップであって、前記ｓｓＯＤＮが前記二本鎖切断の相同依存性修復の鋳型として働くステップを更に含むことができる。本発明の方法は個体の疾患の予防又は治療方法であってもよく、任意選択で前記疾患は前記目的の遺伝子座の欠陥によって引き起こされる。本発明の方法は個体においてインビボで行うか又は個体から採取した細胞上でエキソビボで行うことができ、任意選択で前記細胞は個体に戻される。
【０４５１】
本発明はまた、本明細書に定義するとおりのタンデム又はマルチターゲティングに用いられる、ＣＲＩＳＰＲ酵素又はＣａｓ酵素又はＣｐｆ１酵素又はＣＲＩＳＰＲ−ＣＲＩＳＰＲ酵素又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系を使用して得られる産物も包含する。
【０４５２】
キット
一態様において、本発明は、上記の方法及び組成物に開示されるエレメントの任意の１つ以上を含むキットを提供する。一部の実施形態において、本キットは、本明細書に教示されるとおりのベクター系とキットの使用説明書とを含む。要素は個々に又は組み合わせで提供されてもよく、及び任意の好適な容器、例えば、バイアル、ボトル、又はチューブに提供されてもよい。本キットは、本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ及び未結合の保護鎖を含み得る。本キットは、保護鎖がガイド配列に少なくとも部分的に結合したｇＲＮＡ（即ちｐｇＲＮＡ）を含み得る。従って本キットは、本明細書に記載されるとおりの部分的に二本鎖ヌクレオチド配列の形態のｐｇＲＮＡを含み得る。一部の実施形態において、本キットは１つ以上の言語、例えば２つ以上の言語による説明書を含む。取扱説明書は本明細書に記載される適用及び方法に特異的であってもよい。
【０４５３】
一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載されるエレメントの１つ以上を利用する方法に用いられる１つ以上の試薬を含む。試薬は任意の好適な容器に入れて提供され得る。例えば、キットは１つ以上の反応緩衝液又は保存緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のアッセイにおいて利用可能な形態で提供されても、又は使用前に１つ以上の他の構成成分の添加を必要とする形態（例えば、濃縮形態又は凍結乾燥形態）で提供されてもよい。緩衝液は、限定はされないが、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、及びこれらの組み合わせを含めた任意の緩衝液であってよい。一部の実施形態において、緩衝液はアルカリ性である。一部の実施形態において、緩衝液は約７〜約１０のｐＨを有する。一部の実施形態において、本キットは、ガイド配列及び調節エレメントを作動可能に連結するためベクターに挿入されるガイド配列に対応する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本キットは相同組換え鋳型ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本キットは、本明細書に記載されるベクターの１つ以上及び／又はポリヌクレオチドの１つ以上を含む。本キットは、有利には本発明のシステムの全てのエレメントを提供することが可能である。
【０４５４】
一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの使用方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変する有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、多種多様な細胞型の標的ポリヌクレオチドを改変（例えば、欠失、挿入、転位、不活性化、活性化）することを含め、幅広い有用性を有する。そのため本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、及び予後判定において、広範な適用性を有する。例示的ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む。特定の実施形態において、ガイド配列にダイレクトリピート配列が連結されている。
【０４５５】
一実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドを切断する方法を提供する。本方法は、標的ポリヌクレオチドに結合して前記標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせるＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的ポリヌクレオチドを改変することを含む。典型的には、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞に導入されると、ゲノム配列に切断（例えば、一本鎖又は二本鎖切断）を作り出す。例えば、本方法を用いて細胞内の疾患遺伝子を切断することができる。
【０４５６】
ＣＲＩＳＰＲ複合体によって作り出された切断は、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路又は高フィデリティ相同性組換え修復（ＨＤＲ）などの修復プロセスによって修復され得る。これらの修復過程でゲノム配列に外因性ポリヌクレオチド鋳型を導入することができる。一部の方法において、ＨＤＲプロセスを用いてゲノム配列が改変される。例えば、上流配列及び下流配列が隣接する組み込もうとする配列を含む外因性ポリヌクレオチド鋳型が細胞に導入される。上流及び下流配列は、染色体における組込み部位の両側と配列類似性を共有する。
【０４５７】
望ましい場合、ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えばＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、線状ＤＮＡ片、ＰＣＲ断片、ネイキッド核酸、又はリポソーム又はポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸であってもよい。
【０４５８】
外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組み込まれる組み込もうとする配列（例えば変異遺伝子）を含む。組込み配列は、細胞にとって内因性又は外因性の配列であってもよい。組み込もうとする組込み配列の例としては、タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は非コードＲＮＡ（例えばマイクロＲＮＡ）が挙げられる。従って、組込み配列は、１つ又は複数の適切な制御配列に作動可能に結合連結され得る。或いは、組み込もうとする組込み配列が調節機能を提供し得る。
【０４５９】
外因性ポリヌクレオチド鋳型中の上流及び下流配列は、目的の染色体配列とドナーポリヌクレオチドとの間の組換えを促進するように選択される。上流配列は、標的組込み部位の上流のゲノム配列と配列類似性を共有する核酸配列である。同様に、下流配列は、標的組込み部位の下流の染色体配列と配列類似性を共有する核酸配列である。外因性ポリヌクレオチド鋳型中の上流及び下流配列は、標的ゲノム配列と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、外因性ポリヌクレオチド鋳型中の上流及び下流配列は、標的ゲノム配列と約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。一部の方法において、外因性ポリヌクレオチド鋳型中の上流及び下流配列は、標的ゲノム配列と約９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【０４６０】
上流又は下流配列は、約２０ｂｐ〜約２５００ｂｐ、例えば、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、又は２５００ｂｐを含み得る。一部の方法において、例示的上流又は下流配列は、約２００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、又はより詳細には約７００ｂｐ〜約１０００ｂｐを有する。
【０４６１】
一部の方法において、外因性ポリヌクレオチド鋳型はマーカーを更に含み得る。かかるマーカーは標的組込みのスクリーニングを容易にし得る。好適なマーカーの例としては、制限部位、蛍光タンパク質、又は選択可能マーカーが挙げられる。本発明の外因性ポリヌクレオチド鋳型は組換え技術を用いて構築することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６を参照）。
【０４６２】
外因性ポリヌクレオチド鋳型を組み込むことによる標的ポリヌクレオチドを改変する例示的方法では、ＣＲＩＳＰＲ複合体によってゲノム配列に二本鎖切断が導入され、外因性ポリヌクレオチド鋳型との相同組換えによってこの切断が修復されると、鋳型がゲノムに組み込まれる。二本鎖切断の存在が鋳型の組込みを促進する。
【０４６３】
他の実施形態では、この発明は、真核細胞におけるポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。本方法は、ポリヌクレオチドに結合するＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的ポリヌクレオチドの発現を増加又は低下させることを含む。
【０４６４】
一部の方法において、標的ポリヌクレオチドを不活性化させることにより細胞に発現の改変を生じさせ得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体が細胞内の標的配列に結合すると、標的ポリヌクレオチドが不活性化され、そのためその配列が転写されないか、コードされたタンパク質が産生されないか、又は配列が野生型配列のようには機能しなくなる。例えば、タンパク質又はマイクロＲＮＡをコードする配列を不活性化してタンパク質が産生されないようにし得る。
【０４６５】
一部の方法において、制御配列を不活性化して、それがもはや制御配列として機能しないようにし得る。本明細書で使用されるとき、「制御配列」は、核酸配列の転写、翻訳、又は接触可能性を実現する任意の核酸配列を指す。制御配列の例としては、プロモーター、転写ターミネーターが挙げられ、及びエンハンサーが制御配列である。不活性化された標的配列は、欠失突然変異（即ち、１つ以上のヌクレオチドの欠失）、挿入突然変異（即ち、１つ以上のヌクレオチドの挿入）、又はナンセンス突然変異（即ち、終止コドンが導入されるような単一のヌクレオチドの別のヌクレオチドとの置換）を含み得る。一部の方法において、標的配列を不活性化すると、標的配列の「ノックアウト」がもたらされる。
【０４６６】
ＣＲＩＳＰＲ  Ｃｐｆ１系の例示的使用方法
本発明は、標的細胞をインビボ、エキソビボ又はインビトロで改変するのに用いられる、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター又は送達系を提供し、及び、改変後はＣＲＩＳＰＲにより改変された細胞の子孫又は細胞株が変化した表現型を保持するように細胞を変化させる方法で行われ得る。改変された細胞及び子孫は、ＣＲＩＳＰＲ系が所望の細胞型にエキソビボ又はインビボ適用された植物又は動物などの多細胞生物の一部であり得る。本ＣＲＩＳＰＲ発明は、療法的治療方法であり得る。療法的治療方法には、遺伝子又はゲノム編集、又は遺伝子療法が含まれ得る。
【０４６７】
ＦＩＳＨなどの検出方法への不活性化されたＣＲＩＳＰＲ  Ｃｐｆ１酵素の使用
一態様において、本発明は、本明細書に記載される触媒的に不活性なＣａｓタンパク質、好ましくは不活性Ｃｐｆ１（ｄＣｐｆ１）を含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、及び蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などの検出方法におけるこの系の使用を提供する。ＤＮＡ二本鎖切断を生じさせる能力を欠くｄＣｐｆ１を高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＥＧＦＰ）などの蛍光タンパク質などのマーカーと融合させて、小さいガイドＲＮＡと共発現させることにより、インビボで挟動原体、動原体及びテロメアリピートを標的化し得る。ｄＣｐｆ１系を使用してヒトゲノムの反復配列及び個々の遺伝子の両方を可視化することができる。標識されたｄＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系のかかる新規適用は、細胞のイメージング及び機能的核構造の研究において、特に核内低分子容積又は複合体三次元構造を含む場合に重要であり得る（Ｃｈｅｎ  Ｂ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＬＡ，Ｃｉｍｉｎｉ  ＢＡ，Ｓｃｈｎｉｔｚｂａｕｅｒ  Ｊ，Ｚｈａｎｇ  Ｗ，Ｌｉ  ＧＷ，Ｐａｒｋ  Ｊ，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ＥＨ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＪＳ，Ｑｉ  ＬＳ，Ｈｕａｎｇ  Ｂ．２０１３．「最適化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によるヒト生細胞のゲノム遺伝子座の動的イメージング（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｏｃｉ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ）」．Ｃｅｌｌ  １５５（７）：１４７９−９１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．１２．００１）。
【０４６８】
ＤＮＡの改変／検出へのＣＲＩＳＰＲ  Ｃｐｆ１の使用
ＣＲＩＳＰＲ  Ｃｐｆ１系及びその使用方法は、ＤＮＡのターゲティング及び任意選択で遺伝子改変に有益であり、これはＤＮＡの由来に関わらない。従ってＤＮＡは、原核生物ＤＮＡ、真核生物ＤＮＡ又はウイルスＤＮＡであり得る。細胞内又は細胞外での真核生物ＤＮＡのターゲティングに関する種々の適用について、本明細書の他の部分に詳述される。詳細な実施形態では、Ｃｐｆ１系を使用して原核生物ＤＮＡなどの微生物ＤＮＡが標的化される。これは、酵母又は真菌などの生物における目的の分子の組換え産生のコンテクストにおいて有益であり得る。これに関連して、本発明は、宿主細胞における目的の化合物の組換え産生方法を想定し、この方法は、前記化合物の産生を確実にするための酵母、真菌又は細菌などの宿主細胞の遺伝子改変へのＣｐｆ１系の使用を含む。本願は更に、これらの方法によって得られる化合物を想定する。それに加えて又は代えて、これは、細菌ＤＮＡ又はウイルスＤＮＡの検出及び／又は改変のコンテクストにおいて有益であり得る。詳細な実施形態において、本方法は、細菌ＤＮＡ又はウイルスＤＮＡの特異的検出及び／又は改変が関わる。
【０４６９】
夾雑ＤＮＡの分解へのＣＲＩＳＰＲ  Ｃｐｆ１の使用
詳細な実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は夾雑ＤＮＡのターゲティング及び切断に使用される。例えば、詳細な実施形態において、真核生物ＤＮＡは試料中の夾雑物であり、例えばここで真核生物の組織又は体液試料中にあるウイルスＤＮＡ又は細菌ＤＮＡなどの非真核生物ＤＮＡの検出が有益である。真核生物ＤＮＡのターゲティングは、真核生物（例えばヒト）特異的ガイド配列を使用することにより確実となる。このような方法には、真核生物ＤＮＡのターゲティング前に試料中に存在する細胞の溶解が関わることも又は関わらないこともある。真核生物ＤＮＡを選択的に切断した後、当該技術分野において公知の方法によってそれを試料中に存在するインタクトなＤＮＡと分離し得る。従って、本発明は、真核生物（例えばヒト）ＤＮＡを試料から選択的に除去する方法を提供し、本方法は、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系で真核生物ＤＮＡを選択的に切断することを含む。また、本明細書には、真核生物ＤＮＡの選択的なターゲティングを可能にする本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系の１つ以上の成分を含む、本方法を実施するためのキットも提供される。同様に、夾雑ＤＮＡの種特異的除去を確実にし得ることが想定される。
【０４７０】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系又は複合体による標的の改変（例えば、Ｃｐｆ１−ＲＮＡ複合体）
一態様において、本発明は、真核細胞内の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供し、これはインビボ、エキソビボ又はインビトロであってもよい。一部の実施形態において、本方法は、ヒト又は非ヒト動物から細胞又は細胞集団を試料採取するステップ、及び１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。培養は任意の段階でエキソビボで行われ得る。この１つ又は複数の細胞が、更には非ヒト動物又は植物に再導入されてもよい。再導入される細胞について、細胞は幹細胞であることが特に好ましい。
【０４７１】
一部の実施形態において、本方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせ、それにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ここでＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズする又はそれにハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。
【０４７２】
一態様において、本発明は、真核細胞内のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体をポリヌクレオチドに結合させて、前記結合により前記ポリヌクレオチドの発現の増加又は減少を生じさせるステップを含み；ここでＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズする又はそれにハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。同様の考察及び条件が、標的ポリヌクレオチドを改変する方法にも上記のとおり適用される。実際上、これらの試料採取、培養及び再導入の選択肢は本発明の全態様に適用される。
【０４７３】
実際、本発明の任意の態様において、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズする又はそれにハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含むことができる。同様の考察及び条件が、標的ポリヌクレオチドを改変する方法にも上記のとおり適用される。
【０４７４】
従って本明細書に記載される天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ酵素の任意のものにおいて少なくとも１つの改変を含み、それによって酵素は、ある種の向上した能力を有する。詳細には、これらの酵素のいずれも、ガイドＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ複合体を形成可能である。かかる複合体の形成時、ガイドＲＮＡは標的ポリヌクレオチド配列に結合可能であり、酵素は標的遺伝子座を改変可能である。加えて、ＣＲＩＳＰＲ複合体中の酵素は、非改変酵素と比較したとき１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下している。
【０４７５】
加えて、本明細書に記載される改変ＣＲＩＳＰＲ酵素（ｅｍｚｙｍｅ）には、ＣＲＩＳＰＲ複合体において非改変酵素と比較したとき１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加した酵素が包含される。かかる機能は、１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力の低下の上述の機能と別個に提供されてもよく、又はそれと組み合わせて提供されてもよい。任意のかかる酵素が、１つ以上の会合した異種機能ドメインによって提供される任意の活性との組み合わせ、ヌクレアーゼ活性を低下させる任意の更なる突然変異など、本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲ酵素に対する更なる改変のいずれかと共に提供されてもよい。
【０４７６】
本発明の有利な実施形態において、非改変酵素と比較したとき１つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力の低下及び非改変酵素と比較したとき１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力の増加を伴う改変ＣＲＩＳＰＲ酵素（ｅｍｚｙｍｅ）が提供される。酵素に対する更なる改変との組み合わせで、特異性の大幅な増強が実現し得る。例えば、かかる有利な実施形態と１つ以上の追加の突然変異の組み合わせが提供され、ここで１つ以上の追加の突然変異は１つ以上の触媒活性ドメインにある。かかる更なる触媒的突然変異は、本明細書の他の部分で詳細に記載されるとおりのニッカーゼ機能を付与し得る。かかる酵素では、酵素活性の点で特異性が改善されるため、特異性の増強が実現し得る。
【０４７７】
上記に記載したとおりのオフターゲット効果を低下させ、及び／又はオンターゲット効果を増強する改変は、ＲｕｖＣ−ＩＩＩドメインとＨＮＨドメインとの間にある正電荷領域／溝に位置するアミノ酸残基に行われ得る。上記に記載される機能的効果のいずれも、前述の溝内のアミノ酸の改変によって実現し得るが、当該の溝に隣接するか又は溝外にあるアミノ酸の改変によってもまた実現し得ることは理解されるであろう。
【０４７８】
本明細書に記載されるとおりの改変ＣＲＩＳＰＲ酵素となるようにエンジニアリングし得る更なる機能としては、以下が挙げられる。１．タンパク質三次又は二次構造に影響を及ぼすことなくＤＮＡ：タンパク質相互作用を破壊する改変ＣＲＩＳＰＲ酵素。これには、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖の任意の部分と接触する残基が含まれる。２．Ｃｐｆ１がＤＮＡ結合（オン又はオフターゲット）に応答したヌクレアーゼ切断に必須のコンホメーションをとるよう担持するタンパク質間相互作用を弱める改変ＣＲＩＳＰＲ酵素。例えば：ＨＮＨドメイン（切れ易いリン酸に位置する）のヌクレアーゼコンホメーションを少し阻害するものの、なおも許容する改変。３．Ｃｐｆ１がＤＮＡ結合（オン又はオフターゲット）に応答したヌクレアーゼ活性を阻害するコンホメーションをとるよう保持するタンパク質間相互作用を強める改変ＣＲＩＳＰＲ酵素。例えば：ＨＮＨドメインを切れ易いリン酸から遠ざけるコンホメーションで安定化させる改変。任意のかかる追加的な機能増強が、本明細書の他の部分で詳細に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲ酵素に対する任意の他の改変と組み合わせて提供されてもよい。
【０４７９】
本明細書に記載される向上した機能のいずれも、Ｃｐｆ１酵素など、任意のＣＲＩＳＰＲ酵素に加えることができる。しかしながら、本明細書に記載される機能のいずれも、複数のオルソログからの断片を含むキメラ酵素を含め、他のオルソログからのＣｐｆ１酵素にエンジニアリングし得ることが理解されるであろう。
【０４８０】
核酸、アミノ酸及びタンパク質、調節配列、ベクター等
本発明は核酸を使用して標的ＤＮＡ配列を結合する。核酸はタンパク質と比べて作製するのがはるかに容易で安価であり、且つ相同性が求められるストレッチの長さに応じて特異性を変化させることができるため、これは有利である。例えば、複数のフィンガーを複雑に三次元配置させる必要はない。用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」は同義的に使用される。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチドであれ又はリボヌクレオチドであれ、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、又はその類似体を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有することができ、既知又は未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片のコード領域又は非コード領域、連鎖解析によって定義される複数の遺伝子座（１つの遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造も包含し、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９１；Ｂａｓｅｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｍｉｌｌｉｇａｎ，１９９３；国際公開第９７／０３２１１号パンフレット；国際公開第９６／３９１５４号パンフレット；Ｍａｔａ，１９９７；Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ，１９９７；及びＳａｍｓｔａｇ，１９９６を参照のこと。ポリヌクレオチドは、１つ以上の改変ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変はポリマーをアセンブルする前又はその後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド構成成分で中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識構成成分とのコンジュゲーションによるなどして更に改変されてもよい。本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、当業者によって理解される当該技術分野の用語であり、突然変異体又は変異体形態とは区別されるものとして天然に存在するとおりの、典型的な形態の生物、菌株、遺伝子、又は特徴を意味する。「野生型」はベースラインであり得る。本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する質の呈示を意味するものと解釈されなければならない。用語「天然に存在しない」又は「エンジニアリングされた」は同義的に使用され、人間の手が加えられていることを示す。この用語は、核酸分子又はポリペプチドに言及するとき、核酸分子又はポリペプチドが、自然中ではそれと天然に結び付いている、且つ自然中に見られるとおりの少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する「相補性」は、従来のワトソン・クリック塩基対合又は他の非従来型の対合のいずれかによって核酸が別の核酸配列と１つ又は複数の水素結合を形成する能力を指す。「��補性」は、従来のワトソン・クリック塩基対合又は他の非従来型のいずれかによって核酸が別の核酸配列と１つ又は複数の水素結合を形成する能力を指す。パーセント相補性は、核酸分子中で第２の核酸配列と水素結合を形成（例えばワトソン・クリック塩基対合）することのできる残基のパーセンテージを示す（例えば、１０個のうち５、６、７、８、９、１０個は、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の相補性である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」は、本明細書で使用されるとき、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、又はそれ以上の領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性の程度を指し、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。本明細書で使用されるとき、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列と相補性を有する核酸が標的配列に優先的にハイブリダイズし、且つ非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は概して配列依存性であり、幾つもの要因に応じて異なる。一般に、配列が長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｃｈａｐｔｅｒ  “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳述されている。ポリヌクレオチド配列に言及する場合、相補配列又は部分的相補配列も想定される。これらは、好ましくは、高度にストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズ可能なものである。概して、ハイブリダイゼーション速度を最大にするには、比較的低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（熱融点（Ｔｍ）より約２０〜２５℃低い）が選択される。Ｔｍは、特定の標的配列の５０％が規定のイオン強度及びｐＨの溶液中で完全に相補的なプローブにハイブリダイズする温度である。概して、ハイブリダイズした配列の少なくとも約８５％のヌクレオチド相補性を要求する場合、Ｔｍより約５〜１５℃低くなるよう高度にストリンジェントな洗浄条件が選択される。ハイブリダイズした配列の少なくとも約７０％のヌクレオチド相補性を要求する場合、Ｔｍより約１５〜３０℃低くなるよう中程度にストリンジェントな洗浄条件が選択される。高度に許容的な（極めて低いストリンジェンシーの）洗浄条件はＴｍより５０℃も低いものであってよく、ハイブリダイズした配列間���高レベルのミスマッチが許容される。当業者は、ハイブリダイゼーション段階及び洗浄段階における他の物理的及び化学的パラメーターもまた、標的配列とプローブ配列との間の特定の相同性レベルからの検出可能なハイブリダイゼーションシグナルの結果に影響を与えるよう変更し得ることを認識するであろう。好ましい高度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％  ＳＤＳ中４２℃でのインキュベーション、又は５×ＳＳＣ及び１％  ＳＤＳ中６５℃でのインキュベーションと、０．２×ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳ中６５℃での洗浄を含む。「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが反応することによりヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定した複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグステイン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）結合によるか、又は任意の他の配列特異的様式で起こり得る。複合体には、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、又はこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、又は酵素によるポリヌクレオチドの切断など、より大規模なプロセスで一ステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズ可能な配列は、その所与の配列の「相補体」と称される。本明細書で使用されるとき、用語「ゲノム遺伝子座（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｏｃｕｓ）」又は「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」（複数形ｌｏｃｉ）は、染色体上の遺伝子又はＤＮＡ配列の特定の位置である。「遺伝子」は、ポリペプチドをコードする一続きのＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は生物において機能的役割を果たし、従って生体における分子的遺伝単位であるＲＮＡ鎖を指す。本発明の目的上、遺伝子は、遺伝子産物の産生を調節する領域を含むと（かかる調節配列がコード配列及び／又は転写配列に隣接しているか否かに関わらず）見なし得る。従って、遺伝子には、必ずしも限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位及び配列内リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位及び遺伝子座制御領域が含まれる。本明細書で使用されるとき、「ゲノム遺伝子座の発現」又は「遺伝子発現」は、機能的遺伝子産物の合成に遺伝子からの情報が用いられる過程である。遺伝子発現の産物は、多くの場合にタンパク質であるが、ｒＲＮＡ遺伝子又はｔＲＮＡ遺伝子などの非タンパク質コード遺伝子では、産物は機能性ＲＮＡである。遺伝子発現の過程は、あらゆる既知の生命−真核生物（多細胞生物を含む）、原核生物（細菌及び古細菌）、及びウイルスによって生存のための機能性産物の産生に用いられている。本明細書で使用されるとき、遺伝子又は核酸の「発現」には、細胞遺伝子発現のみならず、クローニング系及び任意の他のコンテクストにおける１つ又は複数の核酸の転写及び翻訳もまた包含される。本明細書で使用されるとき、「発現」はまた、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ転写物などに）転写される過程及び／又は転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペ��チド、又はタンパク質に翻訳される過程も指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と称される。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指して同義的に使用される。ポリマーは線状又は分枝状であってよく、それは修飾アミノ酸を含んでもよく、及びそれは非アミノ酸が割り込んでいてもよい。これらの用語はまた、改変されているアミノ酸ポリマー（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又はその他任意の、標識成分とのコンジュゲーションなどの操作）も包含する。本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸」には、グリシン及びＤ又はＬの両方の光学異性体、及びアミノ酸類似体及びペプチド模倣体を含め、天然及び／又は非天然又は合成のアミノ酸が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「ドメイン」又は「タンパク質ドメイン」は、タンパク質配列のうち残りのタンパク質鎖と独立に存在し及び機能し得る一部分を指す。本発明の態様に記載されるとおり、配列同一性は配列相同性と関係する。相同性比較は目測で行われてもよく、又はより通例では、容易に利用可能な配列比較プログラムの助けを借りて行われてもよい。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間のパーセント（％）相同性を計算することができ、また２つ以上のアミノ酸配列又は核酸配列が共有する配列同一性も計算することができる。
【０４８１】
本発明の態様において用語「ガイドＲＮＡ」は、推定上の又は同定されたｃｒＲＮＡ配列又はガイド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。
【０４８２】
本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、当業者によって理解される当該技術分野の用語であり、突然変異体又は変異体の形態とは区別されるものとして天然に存在するとおりの、典型的な形態の生物、菌株、遺伝子、又は特徴を意味する。「野生型」はベースラインであり得る。
【０４８３】
本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する質の呈示を意味するものと解釈されなければならない。
【０４８４】
用語「天然に存在しない」又は「エンジニアリングされた」は同義的に使用され、人間の手が加えられていることを示す。この用語は、核酸分子又はポリペプチドに言及しているとき、核酸分子又はポリペプチドが、自然中ではそれと天然に結び付いている、且つ自然中に見られるとおりの少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。これらの用語を含むか否かに関わらず、あらゆる態様及び実施形態において、好ましくはｔｈｅは任意選択であってよく、従って好ましくは含まれ、又は含まれないことは好ましくないことは理解されるであろう。更に、用語「天然に存在しない」及び「エンジニアリングされた」は同義的に用いられてもよく、そのため、従って単独で又は組み合わせで用いることができ、いずれか一方を両方とも併せた記述に置き換えてもよい。詳細には、「天然に存在しない」又は「天然に存在しない及び／又はエンジニアリングされた」の代わりに「エンジニアリングされた」が好ましい。
【０４８５】
配列相同性は、当該技術分野において公知の幾つものコンピュータプログラムのいずれか、例えばＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどによって求めることができる。かかるアラインメントの実施に好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例としては、限定はされないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  前掲−Ｃｈａｐｔｅｒ  １８を参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０）、及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは、いずれもオフライン及びオンライン検索が利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  前掲，７−５８〜７−６０頁を参照）。しかしながら、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。パーセンテージ（％）配列相同性は連続配列に関して計算されてもよく、即ち、一方の配列を他方の配列とアラインメントして、一方の配列の各アミノ酸又はヌクレオチドが他方の配列の対応するアミノ酸又はヌクレオチドと１残基ずつ直接比較される。これは「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。かかるギャップなしアラインメントは比較的少数の残基にのみ行われる。これは極めて単純で一貫した方法であるが、例えば、本来は同一の配列ペアにおいて、一つの挿入又は欠失があるために以降のアミノ酸残基がアラインメントから外れる点を考慮に入れることができず、従って大域的アラインメントを行うと潜在的に％相同性が大きく低下し得る。結果的に、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性又は同一性スコアに過度のペナルティーを与えることなく、可能性のある挿入又は欠失を考慮に入れる最適アラインメントを生成するように設計される。これは、局所的な相同性又は同一性を最大化しようと配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。しかしながら、これらの複雑性の高い方法は、アラインメント内に出現する各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てるため、同数の同一アミノ酸について、ギャップが可能な限り少ない配列アラインメント（２つの比較される配列間の高い関連性を反映する）の方が、ギャップの多い配列よりも高いスコアを達成し得る。典型的には、あるギャップの存在に比較的高いコストを課し、且つそのギャップにおけるそれぞれの後続残基のペナルティーを小さくする「アフィニティギャップコスト（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇａｐ  ｃｏｓｔｓ）」が用いられる。これが、最も一般的に用いられているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、当然ながらギャップがより少ない最適化されたアラインメントを生成し得る。多くのアラインメントプログラムで、ギャップペナルティーを変更することが可能である。しかしながら、配列比較にかかるソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ  ���ｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティーは、ギャップが−１２で各伸長が−４である。従って、最大％相同性の計算には、初めにギャップペナルティーを考慮して最適アラインメントを生成する必要がある。かかるアラインメントの実行に好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２  ｐ３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例としては、限定はされないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．−Ｃｈａｐｔｅｒ  １８を参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）、及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは、いずれもオフライン及びオンライン検索が利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７−５８〜７−６０頁を参照）。しかしながら、一部の適用には、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新規ツールもまた、タンパク質及びヌクレオチド配列の比較に利用可能である（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１９９９  １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１９９９  １７７（１）：１８７−８及び米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈ）のウェブサイトにある国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトを参照）。最終的な％相同性は同一性の点で計測され得るが、アラインメント過程それ自体は、典型的にはオール・オア・ナッシングのペア比較に基づくわけではない。代わりに、化学的類似性又は進化距離に基づき各ペアワイズ比較にスコアを割り当てるスケーリング型類似性スコア行列が概して用いられる。一般的に用いられるかかる行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列−ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルト行列−である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、概して公式のデフォルト値か、又は供給がある場合にはカスタムの記号比較テーブルかのいずれかを使用する（更なる詳細についてはユーザマニュアルを参照）。適用によっては、ＧＣＧパッケージについて公式のデフォルト値を使用し、又は他のソフトウェアの場合、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用することが好ましい。或いは、パーセンテージ相同性は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ  ＆  Ｓｈａｒｐ  ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ  ７３（１），２３７−２４４）と同様のアルゴリズムに基づくＤＮＡＳＩＳ（商標）（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）の多重アラインメント機能を用いて計算してもよい。ソフトウェアが最適アラインメントを生成すると、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能になる。ソフトウェアは、典型的には配列比較の一部としてこれを行い、数値的な結果を出す。配列はまた、サイレントな変化を生じて機能的に等価な物質をもたらすようなアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換も有し得る。アミノ酸特性（残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質など）の類似性に基づき計画的なアミノ酸置換が作製されてもよく、従ってアミノ酸を機能的なグループにまとめることが有用である。アミノ酸は、その側鎖の特性のみに基づきまとめてもよい。しかしながら、突然変異データも同様に含めることが更に有用である。このように得られた一組のアミノ酸は、構造上の理由から保存されているものと思われる。これらの組はベン図の形式で記述することができる（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｃ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂａｒｔｏｎ  Ｇ．Ｊ．（１９９３）「タンパク質配列アラインメント：残基保存の階層分析戦略（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）」Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５−７５６）（Ｔａｙｌｏｒ  Ｗ．Ｒ．（１９８６）「アミノ酸保存の分類（Ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）」Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５−２１８）。保存的置換は、例えば、一般に認められているベン図によるアミノ酸分類を記載する下記の表に従い作製し得る。
【０４８６】
【表２】
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【０４８７】
用語「対象」、「個体」、及び「患者」は、本明細書では、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを指して同義的に使用される。哺乳類としては、限定はされないが、ネズミ科動物、サル類、ヒト、農業動物、競技動物、及びペットが挙げられる。インビボで得られたか又はインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞及びそれらの子孫もまた包含される。
【０４８８】
用語「療法薬剤」、「療法的能力のある薬剤」又は「治療薬剤」は同義的に使用され、対象への投与時に何らかの有益な効果を付与する分子又は化合物を指す。有益な効果には、診断上の判断の実施可能性；疾患、症状、障害、又は病的状態の改善；疾患、症状、障害又は病態の発症の低減又は予防；及び疾患、症状、障害又は病的状態への一般的な対抗が含まれる。
【０４８９】
本明細書で使用されるとき、「治療」又は「治療する」、又は「緩和する」又は「改善する」は同義的に使用される。これらの用語は、限定はされないが治療利益及び／又は予防利益を含めた有益な又は所望の結果を達成するための手法を指す。治療利益とは、治療下の１つ以上の疾患、病態、又は症状における任意の治療的に関連性のある向上又はそれに対する効果を意味する。予防的利益については、組成物は、特定の疾患、病態、又は症状を発症するリスクのある対象、又は疾患、病態、又は症状がまだ現れていないことがあり得るにしろ、疾患の生理学的症状の１つ以上を訴えている対象に投与され得る。
【０４９０】
用語「有効量」又は「治療有効量」は、有益な又は所望の結果を生じさせるのに十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、治療下の対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与方法などのうちの１つ以上に応じて異なり得るが、当業者はこれを容易に判断することができる。この用語はまた、本明細書に記載されるイメージング方法のいずれか１つによる検出用の画像を提供し得る用量にも適用される。具体的な用量は、詳細な選択の薬剤、従うべき投与レジメン、他の化合物と併用して投与されるかどうか、投与タイミング、イメージングする組織、及びそれが担持される物理的送達系のうちの１つ以上に応じて異なり得る。
【０４９１】
本発明の幾つかの態様は、１つ以上のベクターを含むベクター系、又はベクターそれ自体に関する。ベクターは、原核細胞又は真核細胞でのＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、又は酵素）の発現用に設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、又は哺乳類細胞で発現させることができる。好適な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に詳述されている。或いは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写及び翻訳されてもよい。
【０４９２】
本発明の実施形態は、起こり得る相同置換（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及び置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）は両方ともに、本明細書では既存のアミノ酸残基又はヌクレオチドと代替の残基又はヌクレオチドとの相互交換を意味して用いられる）、即ち、アミノ酸の場合に塩基性同士、酸性同士、極性同士等、同種のもの同士の置換を含み得る配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチドの両方）を含む。非相同置換、即ち、あるクラスから別のクラスの残基への置換、或いは、オルニチン（以下、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと称する）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の取り込みが関わる置換もまた起こり得る。変異体アミノ酸配列は、グリシン又はβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加え、メチル基、エチル基又はプロピル基などのアルキル基を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入され得る好適なスペーサー基を含み得る。更に別の形態（これにはペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在が関わる）については、当業者は十分に理解し得る。誤解を避けるため、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基がα−炭素上ではなく、むしろ残基の窒素原子上にある変異体アミノ酸残基を指して使用される。ペプトイド形態のペプチドの調製方法は当該技術分野において公知である（例えばＳｉｍｏｎ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７１及びＨｏｒｗｅｌｌ  ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２−１３４）。
【０４９３】
相同性モデリング：他のＣｐｆ１オルソログにおける対応する残基は、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２（Ｎａｔｕｒｅ；４９０（７４２１）：５５６−６０）及びＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５（ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ；１１（５）：ｅ１００４２４８）の方法−ドメイン−モチーフ界面によって媒介される相互作用を予測する計算的タンパク質間相互作用（ＰＰＩ）方法によって同定することができる。構造に基づくＰＰＩ予測方法であるＰｒｅＰＰＩ（予測ＰＰＩ）は、ベイズ統計学の枠組みを用いて構造的エビデンスを非構造的エビデンスと組み合わせる。この方法は、クエリタンパク質のペアをとり、構造アラインメントを用いることにより、それらの実験的に決定された構造又は相同性モデルのいずれかに対応する構造表現を同定することを含む。構造アラインメントは、更に、大域的及び局所的幾何学関係を考慮することによって近く及び遠くの両方の隣接構造を同定するのに用いられる。構造表現の２つの隣接構造がタンパク質データバンクに報告されている複合体を形成する場合は常に、これが、これらの２つのクエリタンパク質間の相互作用をモデル化するための鋳型を定義付ける。複合体のモデルは、鋳型内の対応する隣接構造上の代表的な構造を重ね合わせることにより作成される。この手法は、Ｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３（Ｐｒｏｔ  Ｓｃｉ；２２：３５９−６６）に更に記載される。
【０４９４】
本発明の目的上、増幅は、妥当なフィデリティで標的配列を複製する能力を有するプライマー及びポリメラーゼを用いる任意の方法を意味する。増幅は、天然又は組換えＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴａｑＧｏｌｄ（商標）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、及び逆転写酵素によって行われ得る。好ましい増幅方法はＰＣＲである。
【０４９５】
特定の態様において、本発明はベクターに関する。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、ある実体を一つの環境から別の環境に移すことを可能にする又は促進するツールである。これは、別のＤＮＡセグメントが挿入されて挿入セグメントの複製をもたらし得るレプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミドである。概して、ベクターは適切な制御エレメントと会合しているとき複製能を有する。一般に、用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターとしては、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端のない（例えば環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野において公知の他の種類のポリヌクレオチドが挙げられる。ある種のベクターは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術によるなどして追加のＤＮＡセグメントを挿入することのできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでベクターには、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））へのパッケージングのためのウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列が存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスによって担持されるポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞での自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技法において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。
【０４９６】
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含むことができ、これはつまり、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメント（これは、発現に用いられる宿主細胞に基づき選択されてもよい）を含むことを意味する。組換え発現ベクターの範囲内において、「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の（例えば、インビトロ転写／翻訳系における、又はベクターが宿主細胞に導入される場合に宿主細胞における）発現が可能となる形で目的のヌクレオチド配列が１つ又は複数の調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。組換え及びクローニング方法に関しては、２００４年９月２日に米国特許出願公開第２００４−０１７１１５６  Ａ１号明細書として公開された米国特許出願第１０／８１５，７３０号明細書（この内容は、本明細書において全体として参照により援用される）が挙げられる。
【０４９７】
１つ又は複数のベクターは、１つ又は複数の調節エレメント、例えば１つ又は複数のプロモーターを含み得る。１つ又は複数のベクターはＣｐｆ１コード配列、及び／又は単一の、しかし少なくとも３又は８又は１６又は３２又は４８又は５０個を含み得る可能性もあるガイドＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）コード配列、例えば、１〜２、１〜３、１〜４  １〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０、３〜８、３〜１６、３〜３０、３〜３２、３〜４８、３〜５０個のＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）を含み得る。単一のベクターでは、有利には最大約１６個のＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）がある場合、各ＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）にプロモーターがあってもよく；及び、単一のベクターが１６個より多いＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）を提供する場合、１つ以上のプロモーターが２個以上のＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）の発現をドライブしてもよく、例えば、３２個のＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）がある場合、各プロモーターが２個のＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）の発現をドライブしてもよく、及び４８個のＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）がある場合、各プロモーターが３個のＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）の発現をドライブしてもよい。単純な算術の十分に確立されたクローニングプロトコル及び本開示の教示により、当業者は、ＡＡＶなどの好適な例示的ベクター、及びＵ６プロモーターなどの好適なプロモーターに対する１つ又は複数のＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）、例えばＵ６−ｓｇＲＮＡに関して本発明を容易に実施することができる。例えば、ＡＡＶのパッケージング限界は約４．７ｋｂである。単一のＵ６−ｓｇＲＮＡ（＋クローニング用の制限部位）の長さは３６１ｂｐである。従って、当業者は、単一のベクターに約１２〜１６、例えば１３個のＵ６−ｓｇＲＮＡカセットを容易に収めることができる。これは、ＴＡＬＥアセンブリに用いられるゴールデンゲート戦略（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／ｔａｌｅｆｆｅｃｔｏｒｓ／）など、任意の好適な手段によってアセンブルすることができる。当業者はまた、Ｕ６−ｓｇＲＮＡの数を約１．５倍増加させるため、例えば、１２〜１６、例えば１３個から約１８〜２４、例えば約１９個のＵ６−ｓｇＲＮＡに増加させるため、タンデムガイド戦略も用いることができる。従って、当業者は、単一のベクター、例えばＡＡＶベクター中に約１８〜２４、例えば約１９個のプロモーター−ＲＮＡ、例えばＵ６−ｓｇＲＮＡに容易に至ることができる。ベクター中のプロモーター及びＲＮＡ、例えば１つ又は複数のｓｇＲＮＡの数を増加させる更なる手段は、単一のプロモーター（例えばＵ６）を使用して、切断可能な配列によって分離されたＲＮＡ、例えばｓｇＲＮＡのアレイを発現させることである。及びベクター中のプロモーター−ＲＮＡ、例えばｓｇＲＮＡの数を増加させる更に別の手段は、コード配列又は遺伝子のイントロンにおいて切断可能な配列によって分離されたプロモーター−ＲＮＡ、例えばｓｇＲＮＡのアレイを発現させることである；及び、この場合、ポリメラーゼＩＩプロモーターを使用することが有利であり、それにより発現が増加し、長いＲＮＡの組織特異的転写が可能となり得る（例えば、���ｔｔｐ：／／ｎａｒ．ｏｘｆｏｒｄｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／３４／７／ｅ５３．ｓｈｏｒｔ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｍｔ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ１６／ｎ９／ａｂｓ／ｍｔ２００８１４４ａ．ｈｔｍｌを参照）。有利な実施形態において、ＡＡＶは、最大約５０遺伝子を標的とするＵ６タンデムｓｇＲＮＡをパッケージングし得る。従って、当該技術分野における知識及び本開示の教示から、当業者は、１つ以上のプロモーターの制御下にあるか、又はそれに作動可能に若しくは機能的に連結された複数のＲＮＡ又はガイド又はｓｇＲＮＡを発現する１つ又は複数のベクター、例えばシングルベクターを−特に本明細書で考察されるＲＮＡ又はガイド又はｓｇＲＮＡの数に関して、いかなる過度の実験もなしに容易に作製及び使用することができる。
【０４９８】
本発明の態様は、ガイドＲＮＡ及び（任意選択で改変若しくは突然変異）ＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばＣｐｆ１）用のバイシストロニックベクターに関する。ガイドＲＮＡ及び（任意選択で改変若しくは突然変異）ＣＲＩＳＰＲ酵素用のバイシストロニック発現ベクターが好ましい。概して、及び特に、この実施形態において（任意選択で改変又は突然変異）ＣＲＩＳＰＲ酵素は好ましくはＣＢｈプロモーターによってドライブされる。ＲＮＡは、好ましくはＵ６プロモーターなどのＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターによってドライブされ得る。理想的にはこの２つが組み合わされる。
【０４９９】
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡ中のループが提供される。これは、ステムループ又はテトラループであり得る。ループは好ましくはＧＡＡＡであるが、この配列に限定されるものではなく、又は実際には、４ｂｐ長であることのみに限定されるものではない。実際には、ヘアピン構造における使用に好ましいループ形成配列は４ヌクレオチド長であり、最も好ましくは配列ＧＡＡＡを有する。しかしながら、代替的な配列であってよいとおり、より長い又は短いループ配列が使用され得る。配列は好ましくはヌクレオチドトリプレット（例えばＡＡＡ）、及び更なるヌクレオチド（例えばＣ又はＧ）を含む。ループ形成配列の例にはＣＡＡＡ及びＡＡＡＧが含まれる。本明細書に開示される任意の方法の実施においては、限定なしに、マイクロインジェクション、電気穿孔、ソノポレーション、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペイルフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、光学的トランスフェクション、専売薬剤により増強される核酸取り込み、及びリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、又は人工ビリオンを介した送達を含めた当該技術分野で公知の１つ以上の方法によって細胞又は胚に好適なベクターを導入することができる。一部の方法において、ベクターはマイクロインジェクションによって胚に導入される。１つ又は複数のベクターが胚の核又は細胞質に微量注入され得る。一部の方法において、１つ又は複数のベクターはヌクレオフェクションによって細胞に導入され得る。
【０５００】
用語「調節エレメント」には、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列などの転写終結シグナル）が含まれることが意図される。かかる調節エレメントについては、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載される。調節エレメントには、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、主として、所望の目的組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、又は特定の細胞型（例えば、リンパ球）において発現を導き得る。調節エレメントはまた、細胞周期依存的又は発生段階依存的様式など、時間依存的様式で発現を導いてもよく、この発現もまた組織又は細胞型特異的であることも又はそうでないこともある。一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれより多いｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ  ＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれより多いｐｏｌ  ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ  Ｉプロモーター（例えば、１、２、３、４、５個、又はそれより多いｐｏｌ  Ｉプロモーター）、又はこれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、Ｕ６及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターの例としては、限定はされないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーと共に）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーと共に）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが挙げられる。また、用語「調節エレメント」には、ＷＰＲＥなどのエンハンサーエレメント；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６−４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ−グロビンのエクソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７−３１，１９８１）も包含される。複数の異なるガイド配列を使用すると、単一の発現構築物を用いて細胞内の複数の異なる対応する標的配列へとＣＲＩＳＰＲ活性を標的化させることができる。例えば、シングルベクターが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個以上、又はそれより多いガイド配列を含み得る。一部の実施形態では、約１、２、３、４、５、６��７、８、９、１０個以上、又はそれより多いかかるガイド配列含有ベクターが提供され、及び任意選択で細胞に送達され得る。一部の実施形態において、ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節エレメントを含む。ＣＲＩＳＰＲ酵素又はＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ又は１つ又は複数のＲＮＡは別個に送達してもよく；及び有利には、これらのうちの少なくとも１つがナノ粒子複合体によって送達される。ＣＲＩＳＰＲ酵素に発現する時間を与えるため、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡをガイドＲＮＡより先に送達してもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡはガイドＲＮＡの投与の１〜１２時間前（好ましくは約２〜６時間前）に投与されてもよい。或いは、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは一緒に投与されてもよい。有利には、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの初回投与から１〜１２時間後（好ましくは約２〜６時間後）にガイドＲＮＡの第２のブースター用量が投与されてもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及び／又はガイドＲＮＡの追加の投与は、最も効率的なゲノム改変レベルを達成するのに有用であり得る。当業者によれば、発現ベクターの設計が、形質転換する宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの要因に依存し得ることが理解されるであろう。ベクターは宿主細胞に導入することができ、それにより、本明細書に記載されるとおりの核酸によってコードされる転写物、タンパク質、又はペプチドが、融合タンパク質又はペプチド（例えば、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの突然変異型、それらの融合タンパク質等）を含め、産生され得る。調節配列に関しては、米国特許出願第１０／４９１，０２６号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。プロモーターに関しては、国際公開第２０１１／０２８９２９号パンフレット及び米国特許出願第１２／５１１，９４０号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。
【０５０１】
ベクターは、原核細胞又は真核細胞でのＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、又は酵素）の発現用に設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、又は哺乳類細胞で発現させることができる。好適な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に詳しく考察されている。或いは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写及び翻訳されてもよい。
【０５０２】
ベクターは、原核生物又は原核細胞に導入して増殖させてもよい。一部の実施形態において、真核細胞に導入するベクターのコピーを増幅させるため、又は真核細胞に導入するベクターの産生における中間ベクターとして（例えば、ウイルスベクターパッケージング系の一部としてプラスミドを増幅する）、原核生物が使用される。一部の実施形態において、原核生物を用いてベクターのコピーを増幅し、１つ以上の核酸を発現させて、それにより例えば宿主細胞又は宿主生物に送達するための１つ以上のタンパク質の供給源を提供する。原核生物でのタンパク質の発現は、多くの場合に、融合タンパク質又は非融合タンパク質のいずれかの発現を導く構成的プロモーター又は誘導プロモーターを含むベクターを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で行われる。融合ベクターが、そこでコードされるタンパク質、例えば組換えタンパク質のアミノ末端に幾つものアミノ酸を付加する。かかる融合ベクターは、（ｉ）組換えタンパク質の発現の増加；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度の増加；及び（ｉｉｉ）アフィニティー精製でリガンドとして作用することによる組換えタンパク質の精製の促進など、１つ以上の目的を果たし得る。多くの場合に、融合発現ベクターでは、融合タンパク質の精製後に組換えタンパク質を融合部分と分離することができるように、融合部分と組換えタンパク質との接合部にタンパク質分解切断部位が導入される。かかる酵素及びそのコグネイト認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼが含まれる。融合発現ベクターの例としては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらはそれぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる。好適な誘導性非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。一部の実施形態において、ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）における発現用のベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、及びｐｉ��Ｚ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。一部の実施形態において、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞でのタンパク質発現をドライブする。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。
【０５０３】
一部の実施形態において、ベクターは、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞での１つ以上の配列の発現をドライブする能力を有する。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳類細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、典型的には１つ以上の調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、及び本明細書に開示される及び当該技術分野において公知の他のウイルスに由来する。原核細胞及び真核細胞の両方に好適な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９のＣｈａｐｔｅｒｓ  １６及び１７を参照のこと。
【０５０４】
一部の実施形態において、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に核酸の発現を導くことが可能である（例えば、組織特異的調節エレメントが核酸の発現に使用される）。組織特異的調節エレメントは当該技術分野において公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ  ａｎｄ  Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、詳細にはＴ細胞受容体（Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）及び免疫グロブリン（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、及び乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書、及び欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）及びαフェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ  ａｎｄ  Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）もまた包含される。これらの原核生物及び真核生物ベクターに関しては、米国特許第６，７５０，０５９号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。本発明の他の実施形態はウイルスベクターの使用に関してもよく、それについては米国特許出願第１３／０９２，０８５号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。組織特異的調節エレメントは当該技術分野において公知であり、この点で、米国特許第７，７７６，３２１号明細書（その内容は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現をドライブするため、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントに調節エレメントが作動可能に連結される。一般に、ＳＰＩＤＲ（ＳＰａｃｅｒ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｐｅａｔ、スペーサー散在型ダイレクトリピート）としても知られるＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復）は、通常特定の細菌種に特異的なＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５４２９−５４３３［１９８７］；及びＮａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：３５５３−３５５６  ［１９８９］）に認めら��た特徴的なクラスの散在型短鎖配列リピート（ＳＳＲ）、及び関連遺伝子を含む。同様の散在型ＳＳＲが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、及び結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）において同定されている（Ｇｒｏｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：１０５７−１０６５［１９９３］；Ｈｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，５：２５４−２６３［１９９９］；Ｍａｓｅｐｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３０７：２６−３０［１９９６］；及びＭｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：８５−９３［１９９５］を参照）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的にはリピートの構造が他のＳＳＲと異なり、短い規則的な間隔のリピート（ＳＲＳＲ）と呼ばれている（Ｊａｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＯＭＩＣＳ  Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．，６：２３−３３［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：２４４−２４６［２０００］）。一般に、このリピートは、実質的に一定長さのユニークな介在配列によって規則的な間隔が置かれたクラスター内に存在する短いエレメントである（Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，［２０００］、前掲）。リピート配列は株間で高度に保存されているが、散在するリピートの数及びスペーサー領域の配列は、典型的には株毎に異なる（ｖａｎ  Ｅｍｂｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２：２３９３−２４０１［２０００］）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、限定はされないが、アエロピルム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピロバキュラム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルホロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アーケオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロアーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノピュルス属（Ｍｅｔｈａｎｏナシ属（Ｐｙｒｕｓ））、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィルス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクウィフェクス属（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾアルカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミキソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ザントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、及びサーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）を含め、４０を超える原核生物において同定されている（例えば、Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１５６５−１５７５  ［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，［２００５］を参照）。
【０５０５】
典型的には、内因性核酸ターゲティング系のコンテクストでは、核酸ターゲティング複合体（標的配列にハイブリダイズし、且つ１つ以上の核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡを含む）が形成されると、標的配列にあるか又はその近傍（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対、又はそれ以上の範囲内）にある一方又は両方のＲＮＡ鎖の切断が生じる。一部の実施形態において、核酸ターゲティング系の１つ以上のエレメントの発現をドライブする１つ以上のベクターが宿主細胞に導入され、核酸ターゲティング系のエレメントが発現すると、１つ以上の標的部位において核酸ターゲティング複合体の形成が導かれる。例えば、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質及びガイドＲＮＡが、各々別個のベクター上で別個の調節エレメントに作動可能に連結されてもよい。或いは、同じ又は異なる調節エレメントから発現するエレメントのうちの２つ以上が単一のベクターに組み合わされてもよく、１つ以上の追加のベクターが、第１のベクターに含まれない核酸ターゲティング系の任意の構成成分を提供する。単一のベクターに組み合わされる核酸ターゲティング系エレメントは、あるエレメントが第２のエレメントに対して５’側（その「上流」）に位置し、又はそれに対して３’側（その「下流」）に位置するなど、任意の好適な向きで配置されてもよい。あるエレメントのコード配列は第２のエレメントのコード配列と同じ鎖上又は逆鎖上に位置してもよく、同じ又は逆の方向に向いていてもよい。一部の実施形態において、単一のプロモーターが、１つ以上のイントロン配列内に組み込まれた（例えば、各々が異なるイントロンにあるか、２つ以上が少なくとも１つのイントロンにあるか、又は全てが単一のイントロンにある）核酸ターゲティングエフェクタータンパク質及びガイドＲＮＡをコードする転写物の発現をドライブする。一部の実施形態において、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質とガイドＲＮＡとは同じプロモーターに作動可能に連結され、それから発現する。
【０５０６】
一部の実施形態において、組換え鋳型もまた提供される。組換え鋳型は、別個のベクターに含まれるか、又は別個のポリヌクレオチドとして提供される、本明細書に記載されるとおりの別のベクターの構成成分であり得る。一部の実施形態において、組換え鋳型は、核酸ターゲティング複合体の一部としての核酸ターゲティングエフェクタータンパク質によってニッキング又は切断される標的配列内又はその近傍などで、相同組換えにおける鋳型として働くように設計される。鋳型ポリヌクレオチドは、約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００ヌクレオチド長以上、又はそれより長いなど、任意の好適な長さであってもよい。一部の実施形態において、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部分に相補的である。最適にアラインメントしたとき、鋳型ポリヌクレオチドは標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド以上又はそれより長い）と重複し得る。一部の実施形態において、鋳型配列と標的配列を含むポリヌクレオチドとが最適にアラインメントされたとき、鋳型ポリヌクレオチドのうち最も近いヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００ヌクレオチド以内、又はそれを超える範囲内にある。
【０５０７】
一部の実施形態において、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質に加えて約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えばＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上、又はそれより多いドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加的なタンパク質配列、及び任意選択で任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させ得るタンパク質ドメインの例としては、限定なしに、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、及び以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性及び核酸結合活性のうちの１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定はされないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）  β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合するか、又は限定はされないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ  Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン融合物、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を含めた他の細胞分子に結合するタンパク質又はタンパク質の断片をコードする遺伝子配列に融合させてもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加的なドメインは、米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載される。一部の実施形態では、タグ付加ＣＲＩＳＰＲ酵素を用いて標的配列の位置が同定される。
【０５０８】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は誘導性系の一成分を形成し得る。この系の誘導可能な性質により、エネルギーの形態を用いた遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御が可能となり得る。エネルギーの形態としては、限定はされないが、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー及び熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）、又は光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）が含まれる。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、配列特異的に転写活性の変化を導く光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部であり得る。光の構成成分には、ＣＲＩＳＰＲ酵素、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来）、及び転写活性化／抑制ドメインが含まれ得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法の更なる例は、米国仮特許出願第６１／７３６４６５号明細書及び米国仮特許出願第６１／７２１，２８３号明細書及び国際公開第２０１４／０１８４２３号パンフレット及び米国特許第８８８９４１８号明細書、米国特許第８８９５３０８号明細書、米国特許出願公開第２０１４０１８６９１９号明細書、米国特許出願公開第２０１４０２４２７００号明細書、米国特許出願公開第２０１４０２７３２３４号明細書、米国特許出願公開第２０１４０３３５６２０号明細書、国際公開第２０１４０９３６３５号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）に提供される。
【０５０９】
遺伝的及び後成的状態のモデル
本発明の方法を用いることにより、目的の突然変異のモデル又は疾患モデルによるなどの、目的の遺伝的又は後成的条件のモデル化及び／又は研究に使用し得る植物、動物又は細胞を作り出すことができる。本明細書で使用されるとき、「疾患」は、対象における疾患、障害、又は徴候を指す。例えば、本発明の方法を用いて、疾患に関連する１つ以上の核酸配列に改変を含む動物若しくは細胞、又は疾患に関連する１つ以上の核酸配列の発現が変化している植物、動物若しくは細胞を作り出すことができる。かかる核酸配列は疾患関連タンパク質配列をコードしてもよく、又は疾患関連制御配列であってもよい。従って、本発明の実施形態において植物、対象、患者、生物又は細胞は、非ヒトの対象、患者、生物又は細胞であり得ることが理解される。従って、本発明は、本方法により作製された植物、動物若しくは細胞、又はその子孫を提供する。子孫は、作製された植物又は動物のクローンであってもよく、又は更に望ましい形質をその子孫に遺伝子移入させるため同じ種の他の個体と交配させることによる有性生殖から生じてもよい。細胞は、多細胞生物、特に動物又は植物の場合にインビボ又はエキソビボであってよい。細胞が培養下にある例では、適切な培養条件が満たされる場合、且つ好ましくは細胞がこの目的に好適に適合する場合（例えば幹細胞）、細胞系が樹立され得る。本発明によって作製される細菌細胞系もまた想定される。ひいては細胞系もまた想定される。
【０５１０】
一部の方法において、疾患モデルを使用することにより、疾患の研究で一般的に用いられる手段を用いて突然変異が動物又は細胞及び疾患の発症及び／又は進行に及ぼす効果を研究することができる。或いは、かかる疾患モデルは、薬学的に活性な化合物が疾患に及ぼす効果の研究に有用である。
【０５１１】
一部の方法において、疾患モデルを使用して、見込みのある遺伝子治療戦略の有効性を評価することができる。即ち、疾患の発症及び／又は進行が阻害又は軽減されるように疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドを改変することができる。詳細には、本方法は、変化したタンパク質が産生され、結果として動物又は細胞が変化した反応を有するように疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドを改変することを含む。従って、一部の方法において、遺伝子治療イベントの効果を評価し得るように、遺伝子改変を受けた動物が、疾患を発症する素因のある動物と比較され得る。
【０５１２】
別の実施形態において、本発明は、疾患遺伝子に関連する細胞シグナル伝達イベントを調節する生物学的に活性な薬剤を開発する方法を提供する。本方法は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、及びダイレクトリピート配列に結合したガイド配列の１つ以上の発現をドライブする１つ以上のベクターを含む細胞に試験化合物を接触させるステップ；及び例えば細胞に含まれる疾患遺伝子の突然変異に関連する細胞シグナル伝達イベントの減少又は増加を示す読み取り値の変化を検出するステップを含む。
【０５１３】
細胞機能の変化をスクリーニングするため本発明の方法と組み合わせて細胞モデル又は動物モデルを構築することができる。かかるモデルを使用して、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体により改変されたゲノム配列が目的の細胞機能に及ぼす効果を研究し得る。例えば、細胞機能モデルを使用して、改変ゲノム配列が細胞内シグナル伝達又は細胞外シグナル伝達に及ぼす効果を研究することができる。或いは、細胞機能モデルを使用して、改変ゲノム配列が感覚認知に及ぼす効果を研究することができる。一部のかかるモデルにおいては、モデルにおける生化学的シグナル伝達経路に関連する１つ以上のゲノム配列が改変される。
【０５１４】
いくつかの疾患モデルが特に研究されている。それらには、デノボ自閉症リスク遺伝子ＣＨＤ８、ＫＡＴＮＡＬ２、及びＳＣＮ２Ａ；並びに症候性自閉症（アンジェルマン症候群）遺伝子ＵＢＥ３Ａが含まれる。これらの遺伝子及び得られる自閉症モデルは当然ながら好ましいが、遺伝子及び対応するモデル全体にわたる本発明の広範な適用性を明らかにすることに役立つ。生化学的シグナル伝達経路に関連する１つ以上のゲノム配列の発現の変化は、候補薬剤に接触させたときの試験モデル細胞と対照細胞との間における対応する遺伝子のｍＲＮＡレベルの差をアッセイすることにより決定され得る。或いは、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列の発現の差は、コードされたポリペプチド又は遺伝子産物のレベルの差を検出することにより決定される。
【０５１５】
ｍＲＮＡ転写物又は対応するポリヌクレオチドのレベルの薬剤により引き起こされた変化をアッセイするため、初めに試料中に含まれる核酸が当該技術分野の標準方法に従い抽出される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）に示される手順に従い種々の溶菌酵素又は化学溶液を使用してｍＲＮＡを単離することができ、又は製造者により提供される付属の説明書に従い核酸結合樹脂で抽出することができる。抽出した核酸試料に含まれるｍＲＮＡは、次に当該技術分野において広く知られている方法に従うか又は本明細書に例示する方法に基づき、増幅手順又は従来のハイブリダイゼーションアッセイ（例えばノーザンブロット解析）により検出される。
【０５１６】
本発明の目的上、増幅は、妥当なフィデリティで標的配列を複製する能力を有するプライマー及びポリメラーゼを用いる任意の方法を意味する。増幅は、天然又は組換えＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴａｑＧｏｌｄ（商標）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、及び逆転写酵素によって行われ得る。好ましい増幅方法はＰＣＲである。詳細には、単離されたＲＮＡが、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列の発現レベルを定量化するため定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）と組み合わされた逆転写アッセイに供され得る。
【０５１７】
遺伝子発現レベルの検出は、増幅アッセイ中にリアルタイムで行うことができる。一態様では、増幅産物が、蛍光ＤＮＡ結合剤、例えば限定はされないがＤＮＡインターカレート剤及びＤＮＡ溝結合剤で直接可視化され得る。二本鎖ＤＮＡ分子に組み込まれるインターカレート剤の量は、典型的には増幅されたＤＮＡ産物の量に比例するため、好都合には、当該技術分野における従来の光学的システムを使用してインターカレート色素の蛍光を定量化することにより、増幅産物の量を決定することができる。この適用に好適なＤＮＡ結合色素としては、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲブルー、ＤＡＰＩ、プロピジウムヨウ素、Ｈｏｅｓｔｅ、ＳＹＢＲゴールド、臭化エチジウム、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、蛍光クマリン（ｆｌｕｏｒｃｏｕｍａｎｉｎ）、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシンなどが挙げられる。
【０５１８】
別の態様では、配列特異的プローブなどの他の蛍光標識を増幅反応に用いて増幅産物の検出及び定量化を促進し得る。プローブベースの定量的増幅は、所望の増幅産物の配列特異的検出に頼る。この増幅は、特異性及び感度の増加をもたらす蛍光性の標的特異的プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を利用する。プローブベースの定量的増幅を実施する方法は当該技術分野で十分に確立されており、米国特許第５，２１０，０１５号明細書に教示される。
【０５１９】
更に別の態様では、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列と配列相同性を共有するハイブリダイゼーションプローブを使用して従来のハイブリダイゼーションアッセイを実施し得る。典型的には、プローブは、被験対象から得られた生体試料内に含まれる生化学的シグナル伝達経路に関連する配列と安定した複合体をハイブリダイゼーション反応で形成することが可能である。アンチセンスがプローブ核酸として使用される場合、試料中に提供される標的ポリヌクレオチドがアンチセンス核酸の配列と相補的であるように選択されることは、当業者に理解されるであろう。逆に、ヌクレオチドプローブがセンス核酸である場合、標的ポリヌクレオチドはセンス核酸の配列と相補的であるように選択される。
【０５２０】
ハイブリダイゼーションは、種々のストリンジェンシーの条件下で実施することができる。本発明の実施に好適なハイブリダイゼーション条件は、プローブと生化学的シグナル伝達経路に関連する配列との間の認識相互作用が十分に特異的であるとともに十分に安定しているものである。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーが増加する条件は当該技術分野で広く知られており、発表されている。例えば、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）；Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照のこと。ハイブリダイゼーションアッセイは、限定はされないが、ニトロセルロース、ガラス、ケイ素、及び種々の遺伝子アレイを含めた任意の固体支持体上に固定化されたプローブを使用して形成され得る。好ましいハイブリダイゼーションアッセイは、米国特許第５，４４５，９３４号明細書に記載されるとおりの高密度遺伝子チップで実施される。
【０５２１】
ハイブリダイゼーションアッセイ中に形成されるプローブ−標的複合体を好都合に検出するため、ヌクレオチドプローブが検出可能標識にコンジュゲートされる。本発明における使用に好適な検出可能標識には、光化学的、生化学的、分光学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段で検出可能な任意の組成物が含まれる。幅広い種類の適切な検出可能標識が当該技術分野において公知であり、それには、蛍光又は化学発光標識、放射性同位元素標識、酵素又は他のリガンドが含まれる。好ましい実施形態では、ジゴキシゲニン、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼ、アビジン／ビオチン複合体など、蛍光標識又は酵素タグを用いることが所望されるものと思われる。
【０５２２】
ハイブリダイゼーション強度の検出又は定量化に用いられる検出方法は、典型的には上記で選択される標識に依存することになる。例えば、放射標識は、写真フィルム又はホスフォイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）を使用して検出し得る。蛍光マーカーは、放出される光を検出するため光検出器を使用して検出及び定量化し得る。酵素標識は、典型的には酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用によって産生された反応産物を計測することにより検出される；及び最後に、比色標識は、単純に、着色した標識を可視化することにより検出される。
【０５２３】
薬剤により引き起こされる、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列の発現の変化はまた、対応する遺伝子産物を調べることによっても決定し得る。タンパク質レベルの決定には、典型的には、ａ）生体試料中に含まれるタンパク質を、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質に特異的に結合する薬剤と接触させるステップ；及び（ｂ）そのようにして形成された任意の薬剤：タンパク質複合体を同定するステップが関わる。この実施形態の一態様において、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質に特異的に結合する薬剤は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
【０５２４】
反応は、薬剤と生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質との間で複合体が形成されることを可能にする条件下で、被験試料から得られた生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質の試料に薬剤を接触させることにより実施される。複合体の形成は、当該技術分野の標準的手順に従い直接的又は間接的に検出することができる。直接的な検出方法では、薬剤に検出可能標識が提供され、複合体から未反応薬剤が除去され得る；従って残る標識の量が、形成された複合体の量を示す。かかる方法には、ストリンジェントな洗浄条件の中にあっても薬剤に結合したまま留まる標識を選択することが好ましい。標識は結合反応を妨げないことが好ましい。代替として、間接的な検出手順では、化学的に、或いは酵素的に導入された標識を含む薬剤を使用し得る。望ましい標識は、概して得られる薬剤：ポリペプチド複合体の結合又は安定性を妨げない。しかしながら、標識は典型的には、有効な結合、ひいては検出可能なシグナルの生成のため抗体に接触可能であるように設計される。
【０５２５】
タンパク質レベルの検出に好適な幅広い種類の標識が当該技術分野において公知である。非限定的な例としては、放射性同位元素、酵素、コロイド金属、蛍光化合物、生物発光化合物、及び化学発光化合物が挙げられる。
【０５２６】
結合反応中に形成された薬剤：ポリペプチド複合体の量は、標準的な定量アッセイにより定量化することができる。上記に説明したとおり、薬剤：ポリペプチド複合体の形成は、結合部位に残る標識の量によって直接計測することができる。代替例では、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質が、特定の薬剤上の結合部位に関して標識類似体と競合するその能力に関して試験される。この競合アッセイでは、捕捉される標識の量は、被験試料中に存在する生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質配列の量に反比例する。
【０５２７】
上記に概説した一般的原理に基づく多くのタンパク質分析技術は、当該技術分野において利用可能である。これには、限定はされないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノラジオメトリックアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、インサイチュイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素又は放射性同位元素標識を使用する）、ウエスタンブロット分析、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光アッセイ、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥが含まれる。
【０５２８】
前述のタンパク質分析の実施には、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質を特異的に認識し又は結合する抗体が好ましい。望ましい場合、特定のタイプの翻訳後改変（例えば、生化学的シグナル伝達経路誘導性改変）を認識する抗体を使用することができる。翻訳後改変としては、限定はされないが、グリコシル化、脂質化、アセチル化、及びリン酸化が挙げられる。これらの抗体は、商業的な供給業者から購入してもよい。例えば、チロシンリン酸化タンパク質を特異的に認識する抗ホスホチロシン抗体が、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒを含む多くの供給業者から入手可能である。抗ホスホチロシン抗体は、ＥＲストレスに応答してそのチロシン残基で別様にリン酸化されるタンパク質の検出において特に有用である。かかるタンパク質としては、限定はされないが、真核生物翻訳開始因子２α（ｅＩＦ−２α）が挙げられる。或いは、これらの抗体は、従来のポリクローナル又はモノクローナル抗体技術を用いて、所望の翻訳後改変を呈する標的タンパク質で宿主動物又は抗体産生細胞を免疫することにより作成し得る。
【０５２９】
主題の方法を実施するにおいて、異なる体組織、異なる細胞型、及び／又は異なる細胞内構造における生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質の発現パターンを識別することが望ましいこともある。こうした試験は、特定の組織、細胞型、又は細胞内構造で優先的に発現するタンパク質マーカーと結合する能力を有する組織特異的、細胞特異的又は細胞内構造特異抗体を使用して実施することができる。
【０５３０】
生化学的シグナル伝達経路に関連する遺伝子の発現の変化はまた、対照細胞と比べた遺伝子産物の活性の変化を調べることにより決定し得る。薬剤により引き起こされる、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質の活性の変化に関するアッセイは、調べている生物学的活性及び／又はシグナル伝達経路に依存し得る。例えば、タンパク質がキナーゼである場合、下流の１つ又は複数の基質をリン酸化するその能力の変化を当該技術分野において公知の種々のアッセイにより決定することができる。代表的なアッセイとしては、限定はされないが、リン酸化タンパク質を認識する抗ホスホチロシン抗体などの抗体による免疫ブロット及び免疫沈降が挙げられる。加えて、キナーゼ活性は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから入手可能）及びｅＴａｇ（商標）アッセイ（Ｃｈａｎ−Ｈｕｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１１：１６２−１７４）などのハイスループット化学発光アッセイにより検出することができる。
【０５３１】
生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質が細胞内ｐＨ条件の変動をもたらすシグナル伝達カスケードの一部である場合、蛍光ｐＨ色素などのｐＨ感受性分子をレポーター分子として使用することができる。生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質がイオンチャネルである別の例では、膜電位及び／又は細胞内イオン濃度の変動をモニタすることができる。多くの市販キット及びハイスループット装置が、イオンチャネルの調節因子に関する迅速且つロバストなスクリーニングに特に適している。代表的な機器としては、ＦＬＩＰＲ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）及びＶＩＰＲ（Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。これらの機器は、マイクロプレートの１０００個を超えるサンプルウェルで同時に反応を検出し、且つ１秒又は更には１ミリ秒（ｍｉｎｉｓｅｃｏｎｄ）以内にリアルタイムの計測値及び機能データを提供する能力を有する。
【０５３２】
本明細書に開示される任意の方法の実施においては、限定なしに、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介性形質移入、カチオン性形質移入、リポソーム形質移入、デンドリマー形質移入、熱ショック形質移入、ヌクレオフェクション形質移入、マグネトフェクション、リポフェクション、インペイルフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、光学的トランスフェクション、専売薬剤により増強される核酸取り込み、及びリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、又は人工ビリオンを介した送達を含めた当該技術分野で公知の１つ以上の方法によって細胞又は胚に好適なベクターを導入することができる。一部の方法において、ベクターはマイクロインジェクションにより胚に導入される。１つ又は複数のベクターが胚の核又は細胞質に微量注入され得る。一部の方法において、１つ又は複数のベクターはヌクレオフェクションにより細胞に導入され得る。
【０５３３】
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞にとって内因性又は外因性の任意のポリヌクレオチドであってもよい。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであってもよい。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えばタンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）であってもよい。
【０５３４】
標的ポリヌクレオチドの例としては、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列、例えば、生化学的シグナル伝達経路関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して罹患組織に由来する細胞において異常なレベルで又は異常な形態で転写又は翻訳産物を産生している任意の遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。それは異常に高いレベルで発現するようになる遺伝子であってもよく；異常に低いレベルで発現するようになる遺伝子であってもよく、ここで発現の変化は疾患の発生及び／又は進行と相関する。疾患関連遺伝子はまた、疾患の原因に直接関与するか又はそれに関与する１つ又は複数の遺伝子との連鎖不平衡がある１つ又は複数の突然変異又は遺伝的変異を有する遺伝子も指す。転写又は翻訳された産物は既知であっても又は未知であってもよく、及び正常レベルであっても又は異常レベルであってもよい。
【０５３５】
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞にとって内因性又は外因性の任意のポリヌクレオチドであってもよい。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであってもよい。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えばタンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）であってもよい。理論によって拘束されることを望むものではないが、標的配列はＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）、即ちＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列を伴わなければならないと考えられる。ＰＡＭの正確な配列及び長さ要件は、用いられるＣＲＩＳＰＲ酵素に応じて異なるが、ＰＡＭは、典型的にはプロトスペーサー（即ち標的配列）に隣接する２〜５塩基対の配列である。ＰＡＭ配列の例は以下の実施例の節に示され、当業者は、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素と共に使用される更なるＰＡＭ配列を同定することができるであろう。更に、ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインをエンジニアリングすることにより、ＰＡＭ特異性をプログラムし、標的部位認識の忠実度を向上させ、且つＣａｓ、例えばＣａｓ９ゲノムエンジニアリングプラットフォームの多用途性を増加させることが可能となり得る。Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質は、例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ＢＰ  ｅｔ  ａｌ．「ＰＡＭ特異性が変化したエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ＰＡＭ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５  Ｊｕｌ  ２３；５２３（７５６１）：４８１−５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４５９２に記載されるとおり、そのＰＡＭ特異性が変化するようにエンジニアリングし得る。
【０５３６】
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドとしては、両方ともにＳＹＳＴＥＭＳ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮと題される、それぞれ２０１２年１２月１２日及び２０１３年１月２日に出願された、それぞれＢｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ  代理人整理番号４４０６３−７０１．１０１及びＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ  代理人整理番号４４０６３−７０１．１０２を有する米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書及び同第６１／７４８，４２７号明細書、及び２０１３年１２月１２日に出願されたＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳと題されるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書（これらの内容は全て、本明細書において全体として参照により援用される）に挙げられるとおりの幾つもの疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチド並びに生化学的シグナル伝達経路関連遺伝子及びポリヌクレオチドが含まれ得る。
【０５３７】
標的ポリヌクレオチドの例としては、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列、例えば、生化学的シグナル伝達経路関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して罹患組織に由来する細胞において異常なレベルで又は異常な形態で転写又は翻訳産物を産生している任意の遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。それは異常に高いレベルで発現するようになる遺伝子であってもよく；異常に低いレベルで発現するようになる遺伝子であってもよく、ここで発現の変化は疾患の発生及び／又は進行と相関する。疾患関連遺伝子はまた、疾患の原因に直接関与するか又はそれに関与する１つ又は複数の遺伝子との連鎖不平衡がある１つ又は複数の突然変異又は遺伝的変異を有する遺伝子も指す。転写又は翻訳された産物は既知であっても又は未知であってもよく、及び正常レベルであっても又は異常レベルであってもよい。
【０５３８】
ゲノムワイドノックアウトスクリーニング
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲタンパク質及び系は、効率的で対費用効果の高い機能性ゲノムスクリーニングの実施に用いることができる。かかるスクリーニングは、ゲノムワイドライブラリベースのＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を用いることができる。かかるスクリーニング及びライブラリにより、遺伝子の機能、遺伝子が関与する細胞経路、及び遺伝子発現の任意の変化が如何に特定の生物学的過程をもたらし得るかを決定することが可能となり得る。本発明の利点は、ＣＲＩＳＰＲ系がオフターゲット結合及びその結果として生じる副作用を回避することである。これは、標的ＤＮＡに対して高度な配列特異性を有するように構成された系を用いて達成される。本発明の好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質複合体はＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体である。
【０５３９】
本発明の実施形態において、ゲノムワイドライブラリは、本明細書に記載されるとおりの、真核細胞集団内の複数のゲノム遺伝子座における複数の標的配列を標的化可能なガイド配列を含む複数のＣｐｆ１系ガイドＲＮＡを含み得る。細胞集団は胚性幹（ＥＳ）細胞集団であってもよい。ゲノム遺伝子座にある標的配列は非コード配列であってもよい。非コード配列は、イントロン、調節配列、スプライス部位、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、又はポリアデニル化シグナルであり得る。前記標的化により、１つ以上の遺伝子産物の遺伝子機能が変化し得る。標的化は遺伝子機能のノックアウトをもたらし得る。遺伝子産物の標的化は２つ以上のガイドＲＮＡを含み得る。遺伝子産物は、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のガイドＲＮＡ、好ましくは遺伝子当たり３〜４個によって標的化され得る。オフターゲット改変は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体によって作成される付着末端型の二本鎖切断を利用することによるか、又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系で用いられるものと類似の方法を利用することにより、最小限に抑えることができる（例えば、参照により本明細書に援用される「ＲＮＡガイド下Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＤＮＡターゲティング特異性（Ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｍａｙ  ｂｅ  ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ（Ｓｅｅ，ｅ．ｇ．，ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）」．Ｈｓｕ，Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｒａｄｉｃｋ，ＴＪ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，ＬＡ．，Ｂａｏ，Ｇ．，＆  Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）を参照）。約１００個以上の配列の標的化であってもよい。約１０００個以上の配列の標的化であってもよい。約２０，０００個以上の配列の標的化であってもよい。ゲノム全体の標的化であってもよい。関連性のある又は望ましい経路に焦点を置いた標的配列のパネルの標的化であってもよい。経路は免疫経路であってもよい。経路は細胞分裂経路であってもよい。
【０５４０】
本発明の一態様は、複数のゲノム遺伝子座の複数の標的配列を標的化可能なガイド配列を含み得る複数のＣｐｆ１ガイドＲＮＡを含み得るゲノムワイドライブラリを包含し、ここで前記標的化により遺伝子機能のノックアウトが生じる。このライブラリは、生物のゲノム内の一つ一つの遺伝子を標的化するガイドＲＮＡを潜在的に含み得る。
【０５４１】
本発明の一部の実施形態において、生物又は対象は真核生物（ヒトを含めた哺乳動物を含む）又は非ヒト真核生物又は非ヒト動物又は非ヒト哺乳動物である。一部の実施形態において、生物又は対象は非ヒト動物であり、節足動物、例えば昆虫であってもよく、又は線虫であってもよい。本発明の一部の方法において、生物又は対象は植物である。本発明の一部の方法において、生物又は対象は哺乳動物又は非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物は、例えばげっ歯類（好ましくはマウス又はラット）、有蹄類、又は霊長類であってもよい。本発明の一部の方法において、生物又は対象は微細藻類を含む藻類であり、又は真菌類である。
【０５４２】
遺伝子機能のノックアウトには、Ｉ．Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質、及びＩＩ．１つ以上のガイドＲＮＡを含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣｐｆ１エフェクタータンパク質系を含む１つ以上のベクターのベクター系を細胞集団における各細胞に導入するステップ［構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクター上にあってもよい］、構成成分Ｉ及びＩＩを各細胞に組み込むステップ［ガイド配列は各細胞内のユニークな遺伝子を標的化し、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質は調節エレメントに作動可能に連結されており、ガイド配列を含むガイドＲＮＡは、転写されると、ユニークな遺伝子のゲノム遺伝子座における標的配列へのＣｐｆ１エフェクタータンパク質系の配列特異的結合を導く］、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質によるゲノム遺伝子座の切断を誘導するステップ、及び細胞集団の各細胞内の複数のユニークな遺伝子における異なるノックアウト突然変異を確認するステップが含まれてもよく、それにより遺伝子ノックアウト細胞ライブラリが生成される。本発明は、細胞集団が真核細胞集団であり、及び好ましい実施形態において、細胞集団が胚性幹（ＥＳ）細胞の集団であることを包含する。
【０５４３】
１つ以上のベクターはプラスミドベクターであってもよい。ベクターは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質、ｇＲＮＡ、及び任意選択で選択マーカーを含む標的細胞への単一のベクターであってもよい。理論によって拘束されないが、単一のベクターでＣｐｆ１エフェクタータンパク質及びｇＲＮＡを同時に送達可能であることにより、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質を発現する細胞株を初めに作成する必要なしに、いかなる目的の細胞型にも適用することができる。調節エレメントは誘導性プロモーターであってもよい。誘導性プロモーターはドキシサイクリン誘導性プロモーターであってもよい。本発明の一部の方法において、ガイド配列の発現はＴ７プロモーターの制御下にあり、Ｔ７ポリメラーゼの発現によってドライブされる。種々のノックアウト突然変異の確認は全エクソームシーケンシングによることができる。ノックアウト突然変異は１００個以上のユニークな遺伝子において実現し得る。ノックアウト突然変異は１０００個以上のユニークな遺伝子において実現し得る。ノックアウト突然変異は２０，０００個以上のユニークな遺伝子において実現し得る。ノックアウト突然変異はゲノム全体で実現し得る。遺伝子機能のノックアウトは、特定の生理学的経路又は条件において機能する複数のユニークな遺伝子に実現してもよい。経路又は条件は免疫経路又は条件であってもよい。経路又は条件は細胞分裂経路又は条件であってもよい。
【０５４４】
本発明はまた、本明細書に記載するゲノムワイドライブラリを含むキットも提供する。本キットは、本発明のライブラリを含むベクター又はプラスミドを含む単一の容器を含み得る。本キットはまた、本発明のライブラリからのガイド配列を含むユニークなＣｐｆ１エフェクタータンパク質系ガイドＲＮＡの選択された一部を含むパネルも含むことができ、ここで選択された一部は、特定の生理的条件を示すものである。本発明は、標的化が約１００配列以上、約１０００配列以上又は約２０，０００配列以上又はゲノム全体であることを包含する。更に、標的配列のパネルは、免疫経路又は細胞分裂など、関連性のある又は望ましい経路に焦点が置かれ得る。
【０５４５】
本発明の更なる態様において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質酵素は１つ以上の突然変異を含んでもよく、機能ドメインへの融合を伴う又は伴わない一般的なＤＮＡ結合タンパク質として用いられ得る。突然変異は人工的に導入された突然変異か又は機能獲得型若しくは機能喪失型突然変異であってもよい。本明細書に記載のとおり突然変異が特徴付けられている。本発明の一態様において、機能ドメインは転写活性化ドメインであってもよく、これはＶＰ６４であり得る。本発明の他の態様において、機能ドメインは転写リプレッサードメインであってもよく、これはＫＲＡＢ又はＳＩＤ４Ｘであり得る。本発明の他の態様は、限定はされないが、転写アクチベーター、リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ヒストンリモデラー、デメチラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロム、光誘導性／制御性ドメイン又は化学物質誘導性／制御性ドメインを含むドメインに融合した変異Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質酵素に関する。本発明の一部の方法は、標的遺伝子の発現を誘導するステップを含み得る。一実施形態において、真核細胞集団内の複数のゲノム遺伝子座における複数の標的配列を標的化することによる発現の誘導は、機能ドメインの使用による。
【０５４６】
Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体を利用する本発明の実施では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系で用いられる方法が有用であり、以下が参照される。
【０５４７】
・「ヒト細胞におけるゲノム規模のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ノックアウトスクリーニング（Ｇｅｎｏｍｅ−Ｓｃａｌｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ）」．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｃ  １２．（２０１３）．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］；最終的な改訂版が以下として発表された：Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４  Ｊａｎ  ３；３４３（６１６６）：８４−８７。
【０５４８】
・Ｓｈａｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．は、ゲノムワイド規模で遺伝子機能を探索する新規方法に関する。彼らの研究は、６４，７５１個のユニークなガイド配列で１８，０８０個の遺伝子を標的化するゲノム規模のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリを送達することにより、ヒト細胞におけるネガティブ選択及びポジティブ選択の両方のスクリーニングが可能になったことを示した。第一に、この著者らは、ＧｅＣＫＯライブラリを用いて癌及び多能性幹細胞における細胞生存能力に必須の遺伝子を同定することを示した。次に、この著者らはメラノーマモデルにおいて、その欠損がベムラフェニブ（突然変異プロテインキナーゼＢＲＡＦを阻害する治療薬）に対する耐性に関わる遺伝子をスクリーニングした。彼らの研究は、最も上位に位置付けられる候補には、既に検証されている遺伝子ＮＦ１及びＭＥＤ１２並びに新規ヒットＮＦ２、ＣＵＬ３、ＴＡＤＡ２Ｂ、及びＴＡＤＡ１が含まれたことを明らかにした。この著者らは、同じ遺伝子を標的化する独立したガイドＲＮＡ間における高度な一貫性及び高いヒット確認率を観察し、従ってＣａｓ９によるゲノム規模のスクリーニングの有望さを実証した。
【０５４９】
また、米国特許出願公開第２０１４０３５７５３０号明細書；及び国際公開第２０１４０９３７０１号パンフレット（本明細書によって参照により本明細書に援用される）も参照される。「研究者がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓゲノム編集ツールの代替となる可能性のあるものを特定する：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の進化に光を当てる新規Ｃａｓ酵素（Ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ：Ｎｅｗ  Ｃａｓ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｓｈｅｄ  ｌｉｇｈｔ  ｏｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ）」と題される２０１５年１０月２２日のＮＩＨプレスリリース（参照により援用される）もまた参照される。
【０５５０】
機能的変化及びスクリーニング
別の態様において、本発明は、遺伝子の機能的評価及びスクリーニング方法を提供する。機能ドメインを正確に送達するため、遺伝子を活性化若しくは抑制するため又は目的の特定の遺伝子座上のメチル化部位を正確に変化させることによりエピジェネティック状態を変化させるための本発明のＣＲＩＳＰＲ系の使用は、単細胞又は細胞集団に適用される１つ以上のガイドＲＮＡを伴うか、又は複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むライブラリの投与又は発現を含む、エキソビボ又はインビボで細胞のプール内のゲノムに適用されるライブラリを伴うことができ、及びここでスクリーニングはＣｐｆ１エフェクタータンパク質の使用を更に含み、ここでＣｐｆ１エフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体は、異種機能ドメインを含むように改変される。ある態様において、本発明は、ライブラリの宿主への投与又は宿主におけるインビボ発現を含む、ゲノムのスクリーニング方法を提供する。ある態様において、本発明は、宿主に投与される又は宿主で発現するアクチベーターを更に含む、本明細書に考察されるとおりの方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはＣｐｆ１エフェクタータンパク質に付加される。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはＣｐｆ１エフェクタータンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加される。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはｇＲＮＡループに付加される。ある態様において、本発明は、宿主に投与される又は宿主で発現するリプレッサーを更に含む、本明細書に考察されるとおりの方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでスクリーニングは、遺伝子活性化、遺伝子阻害、又は遺伝子座における切断に影響を及ぼし、及びそれを検出することを含む。
【０５５１】
ある態様において、本発明は、効率的なオンターゲット活性を提供し、且つオフターゲット活性を最小限に抑える。ある態様において、本発明は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質による効率的なオンターゲット切断を提供し、且つＣｐｆ１エフェクタータンパク質によるオフターゲット切断を最小限に抑える。ある態様において、本発明は、ＤＮＡ切断のない、遺伝子座におけるＣｐｆ１エフェクタータンパク質のガイド特異的結合を提供する。従って、ある態様において、本発明は、標的特異的遺伝子調節を提供する。ある態様において、本発明は、ＤＮＡ切断のない、遺伝子座におけるＣｐｆ１エフェクタータンパク質のガイド特異的結合を提供する。従って、ある態様において、本発明は、単一のＣｐｆ１エフェクタータンパク質を使用したある遺伝子座における切断及び別の遺伝子座における遺伝子調節を提供する。ある態様において、本発明は、１つ以上のＣｐｆ１エフェクタータンパク質及び／又は酵素を使用した複数の標的の直交性の活性化及び／又は阻害及び／又は切断を提供する。
【０５５２】
ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで宿主は真核細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで宿主は哺乳類細胞である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで宿主は非ヒト真核生物である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで非ヒト真核生物は非ヒト哺乳類である。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで非ヒト哺乳類はマウスである。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、この方法は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子の送達を含み、ここで前記１つ又は複数の核酸分子は１つ又は複数の調節配列に作動可能に連結され、且つインビボで発現する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでインビボ発現は、レンチウイルス、アデノウイルス、又はＡＡＶを介する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここで送達は、粒子、ナノ粒子、脂質又は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を介する。
【０５５３】
ある態様において、本発明は、細胞の目的のゲノム遺伝子座にある標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を各々が含む、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の対を提供し、ここで各ｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する１つ又は複数の個別のＲＮＡ配列の挿入によって改変され、及びここでアダプタータンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合し、ここで各Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体の各ｇＲＮＡは、ＤＮＡ切断活性を有する機能ドメインを含む。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの対のＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体を提供し、ここでＤＮＡ切断活性はＦｏｋ１ヌクレアーゼに起因する。
【０５５４】
ある態様において、本発明は、目的のゲノム遺伝子座にある標的配列の切断方法を提供し、この方法は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体又はその１つ又は複数の構成成分又はそれをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞に送達することを含み、ここで前記１つ又は複数の核酸分子は１つ又は複数の調節配列に作動可能に連結され、且つインビボで発現する。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの方法を提供し、ここで送達は、レンチウイルス、アデノウイルス、又はＡＡＶを介する。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの方法又は本明細書において考察するとおりの対のＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体を提供し、ここで対のうちの第１の複合体の標的配列は二本鎖ＤＮＡの第１の鎖上にあり、且つ対のうちの第２の複合体の標的配列は二本鎖ＤＮＡの第２の鎖上にある。ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりの方法又は本明細書において考察するとおりの対のＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体を提供し、ここで第１及び第２の複合体の標的配列は互いに近接しているため、ＤＮＡが相同依存性修復を促進する形で切断される。ある態様において、本明細書における方法は、細胞に鋳型ＤＮＡを導入するステップを更に含むことができる。ある態様において、本明細書における方法又は本明細書における対のＣｐｆ１エフェクタータンパク質複合体は、突然変異していないＣｐｆ１エフェクター酵素のヌクレアーゼ活性の約５％以下を有するように突然変異しているＣｐｆ１エフェクター酵素を各Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体が有することを含み得る。
【０５５５】
ある態様において、本発明は、本明細書において考察するとおりのライブラリ、方法又は複合体を提供し、ここでｇＲＮＡは、少なくとも１つの非コード機能性ループを有するように改変され、例えば少なくとも１つの非コード機能性ループが抑制性であり；例えば少なくとも１つの非コード機能性ループがＡｌｕを含む。
【０５５６】
一態様において、本発明は、遺伝子産物の発現を変化させ又は改変する方法を提供する。前記方法は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含有し及び発現する細胞に、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質とＤＮＡ分子を標的化するガイドＲＮＡとを含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ系を導入するステップを含むことができ、それによってガイドＲＮＡが、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的化し、及びＣｐｆ１エフェクタータンパク質が、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を切断し、それによって遺伝子産物の発現が変化し；及び、ここでＣｐｆ１エフェクタータンパク質とガイドＲＮＡとは天然では一緒に存在しない。本発明は、ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列を含むガイドＲＮＡを包含する。本発明は更に、真核細胞での発現にコドン最適化されたＣｐｆ１エフェクタータンパク質を包含する。好ましい実施形態において真核細胞は哺乳類細胞であり、より好ましい実施形態において哺乳類細胞はヒト細胞である。本発明の更なる実施形態において、遺伝子産物の発現は減少する。
【０５５７】
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインがＣｐｆ１エフェクタータンパク質に会合する。一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインが、例えばＫｏｎｎｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ５１７，５８３−５８８，２９  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１５）の改変ガイドと共に使用されるとおり、アダプタータンパク質に会合する。一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインがデッドｇＲＮＡ（ｄＲＮＡ）に会合する。一部の実施形態において、例えばＤａｈｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，「触媒活性Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる直交性遺伝子制御（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅ）」（印刷中）によるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系に類似的に記載のとおり、活性Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質を含むｄＲＮＡ複合体が、ある遺伝子座上で機能ドメインによる遺伝子調節を導く一方、ｇＲＮＡが別の遺伝子座で活性Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質によるＤＮＡ切断を導く。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、オフターゲット調節と比較して目的の遺伝子座に関する調節の選択性が最大となるように選択される。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、標的遺伝子調節が最大となり、且つ標的切断が最小限に抑えられるように選択される。
【０５５８】
以下の考察の目的上、機能ドメインへの言及は、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質と会合した機能ドメイン又はアダプタータンパク質と会合した機能ドメインのことであり得る。
【０５５９】
本発明の実施では、個別的な１つ又は複数のＲＮＡループ又は個別的な１つ又は複数の配列に結合することのできるアダプタータンパク質をリクルートし得る個別的な１つ又は複数のＲＮＡループ又は個別的な（ｄｉｓｃｔｉｎｃｔ）１つ又は複数の配列の挿入により、Ｃｐｆ１タンパク質と衝突することなく、ｇＲＮＡのループを伸長させてもよい。アダプタータンパク質には、限定はされないが、バクテリオファージコートタンパク質の多様性の範囲内にある直交性のＲＮＡ結合タンパク質／アプタマーの組み合わせが含まれ得る。かかるコートタンパク質のリストには、限定はされないが、以下が含まれる：Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ及びＰＲＲ１。これらのアダプタータンパク質又は直交性ＲＮＡ結合タンパク質は、１つ以上の機能ドメインを含むエフェクタータンパク質又は融合物を更にリクルートし得る。一部の実施形態において、機能ドメインは、トランスポザーゼドメイン、インテグラーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン、リゾルバーゼドメイン、インベルターゼドメイン、プロテアーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン、ＤＮＡヒドロキシルメチラーゼドメイン、ＤＮＡデメチラーゼドメイン、ヒストンアセチラーゼドメイン、ヒストンデアセチラーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン、リプレッサードメイン、アクチベータードメイン、転写調節タンパク質（又は転写複合体リクルート）ドメイン、細胞取込み活性関連ドメイン、核酸結合ドメイン、抗体提示ドメイン、ヒストン修飾酵素、ヒストン修飾酵素のリクルーター；ヒストン修飾酵素の阻害因子、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、ヒストンキナーゼ、ヒストンホスファターゼ、ヒストンリボシラーゼ、ヒストンデリボシラーゼ、ヒストンユビキチナーゼ、ヒストンデユビキチナーゼ、ヒストンビオチナーゼ及びヒストンテールプロテアーゼからなる群から選択され得る。一部の好ましい実施形態では、機能ドメインは転写活性化ドメイン、例えば、限定なしに、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９又はヒストンアセチルトランスフェラーゼである。一部の実施形態において、機能ドメインは転写抑制ドメイン、好ましくはＫＲＡＢである。一部の実施形態において、転写抑制ドメインはＳＩＤ、又はＳＩＤのコンカテマー（例えばＳＩＤ４Ｘ）である。一部の実施形態において、機能ドメインは後成的に改変されるドメインであり、後成的に改変される酵素が提供される。一部の実施形態において、機能ドメインは活性化ドメインであり、これはＰ６５活性化ドメインであってもよい。
【０５６０】
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインはＮＬＳ（核局在化配列）又はＮＥＳ（核外移行シグナル）である。一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは転写活性化ドメインであり、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９及びヒストンアセチルトランスフェラーゼを含む。ＣＲＩＳＰＲ酵素と会合したものに関する活性化（又はアクチベーター）ドメインへの本明細書中の他の言及には、任意の公知の転写活性化ドメイン及び具体的には、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、ＳＥＴ７／９又はヒストンアセチルトランスフェラーゼが含まれる。
【０５６１】
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは転写リプレッサードメインである。一部の実施形態において、転写リプレッサードメインはＫＲＡＢドメインである。一部の実施形態において、転写リプレッサードメインは、ＮｕＥドメイン、ＮｃｏＲドメイン、ＳＩＤドメイン又はＳＩＤ４Ｘドメインである。
【０５６２】
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ組込み活性又は核酸結合活性を含む１つ以上の活性を有する。
【０５６３】
ヒストン修飾ドメインもまた、一部の実施形態において好ましい。例示的ヒストン修飾ドメインは以下で考察する。トランスポザーゼドメイン、ＨＲ（相同組換え）機構ドメイン、リコンビナーゼドメイン、及び／又はインテグラーゼドメインもまた、本機能ドメインとして好ましい。一部の実施形態において、ＤＮＡ組込み活性は、ＨＲ機構ドメイン、インテグラーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン及び／又はトランスポザーゼドメインを含む。ヒストンアセチルトランスフェラーゼが一部の実施形態において好ましい。
【０５６４】
一部の実施形態において、ＤＮＡ切断活性はヌクレアーゼに起因する。一部の実施形態において、ヌクレアーゼはＦｏｋ１ヌクレアーゼを含む。「高度に特異的なゲノム編集のための二量体ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡガイド下ＦｏｋＩヌクレアーゼ（Ｄｉｍｅｒｉｃ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＦｏｋＩ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ）」，Ｓｈｅｎｇｄａｒ  Ｑ．Ｔｓａｉ，Ｎｉｃｏｌａｓ  Ｗｙｖｅｋｅｎｓ，Ｃｙｄ  Ｋｈａｙｔｅｒ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ａ．Ｆｏｄｅｎ，Ｖｉｓｈａｌ  Ｔｈａｐａｒ，Ｄｅｅｐａｋ  Ｒｅｙｏｎ，Ｍａｔｈｅｗ  Ｊ．Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ａｒｙｅｅ，Ｊ．Ｋｅｉｔｈ  Ｊｏｕｎｇ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２（６）：５６９−７７（２０１４）を参照されたく、これは、伸長配列を認識し、且つヒト細胞において内因性遺伝子を高効率で編集することのできる二量体ＲＮＡガイド下ＦｏｋＩヌクレアーゼに関する。
【０５６５】
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは、ｓｇＲＮＡ及び標的への結合時に機能ドメインがその帰属機能で機能することが可能な空間的配置に機能ドメインが置かれるようにＣｐｆ１エフェクタータンパク質に付加される。
【０５６６】
一部の実施形態において、１つ以上の機能ドメインは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質がｇＲＮＡ及び標的に結合すると、機能ドメインがその帰属機能で機能することが可能な空間的配置に機能ドメインが置かれるようにアダプタータンパク質に付加される。
【０５６７】
ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの組成物を提供し、ここで１つ以上の機能ドメインは、本明細書で考察するとおりのリンカー、任意選択でＧｌｙＳｅｒリンカーを介してＣｐｆ１エフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質に付加される。
【０５６８】
内因性転写抑制は、多くの場合に、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）及びデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）などのクロマチン修飾酵素によって媒介される。抑制性ヒストンエフェクタードメインについては公知であり、以下に例示的一覧を提供する。この例示的な表中では、効率的なウイルスパッケージング（例えばＡＡＶによる）を促進するため、小さいサイズのタンパク質及び機能的トランケーションを優先した。しかしながら、一般に、これらのドメインには、ＨＤＡＣ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、及びヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）阻害因子、並びにＨＤＡＣ及びＨＭＴリクルートタンパク質が含まれ得る。機能ドメインは、一部の実施形態において、ＨＤＡＣエフェクタードメイン、ＨＤＡＣリクルーターエフェクタードメイン、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）エフェクタードメイン、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）リクルーターエフェクタードメイン、又はヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害因子エフェクタードメインであってもよく、又はそれを含み得る。
【０５６９】
【表３】
2019503716.tif 000407
【０５７０】
従って、本発明のリプレッサードメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）阻害因子、並びにＨＤＡＣ及びＨＭＴリクルートタンパク質から選択され得る。
【０５７１】
ＨＤＡＣドメインは、上記の表中にあるもの、即ち：ＨＤＡＣ８、ＲＰＤ３、ＭｅｓｏＬｏ４、ＨＤＡＣ１１、ＨＤＴ１、ＳＩＲＴ３、ＨＳＴ２、ＣｏｂＢ、ＨＳＴ２、ＳＩＲＴ５、Ｓｉｒ２Ａ、又はＳＩＲＴ６のうちのいずれかであってもよい。
【０５７２】
一部の実施形態では、機能ドメインはＨＤＡＣリクルーターエフェクタードメインであってもよい。好ましい例としては、以下の表中にあるもの、即ち、ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ２ｂ、Ｓｉｎ３ａ、ＮｃｏＲ、ＳＡＬＬ１、ＲＣＯＲ１が挙げられる。本実施例ではＮｃｏＲが例示され、好ましいものの、このクラス内の他のものもまた有用となり得ることが想定される。
【０５７３】
【表４】
2019503716.tif 000408
【０５７４】
一部の実施形態では、機能ドメインはメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）エフェクタードメインであってもよい。好ましい例としては、以下の表中にあるもの、即ち、ＮＵＥ、ｖＳＥＴ、ＥＨＭＴ２／Ｇ９Ａ、ＳＵＶ３９Ｈ１、ｄｉｍ−５、ＫＹＰ、ＳＵＶＲ４、ＳＥＴ４、ＳＥＴ１、ＳＥＴＤ８、及びＴｇＳＥＴ８が挙げられる。本実施例ではＮＵＥが例示され、好ましいものの、このクラス内の他のものもまた有用となり得ることが想定される。
【０５７５】
【表５】
2019503716.tif 000409
【０５７６】
一部の実施形態では、機能ドメインはヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）リクルーターエフェクタードメインであってもよい。好ましい例としては、以下の表中にあるもの、即ち、Ｈｐ１ａ、ＰＨＦ１９、及びＮＩＰＰ１が挙げられる。
【０５７７】
【表６】
2019503716.tif 000410
【０５７８】
一部の実施形態では、機能ドメインはヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害因子エフェクタードメインであってもよい。好ましい例としては、以下の表中に掲載されるＳＥＴ／ＴＡＦ−１βが挙げられる。
【０５７９】
【表７】
2019503716.tif 000411
【０５８０】
また、プロモーター又はプロモーター近位エレメントに加え、内因性（調節）制御エレメント（エンハンサー及びサイレンサーなど）を標的化することも好ましい。従って、本発明はまた、プロモーターの標的化に加え、内在性対照エレメント（エンハンサー及びサイレンサーを含む）の標的化にも用いることができる。これらの制御エレメントは、転写開始部位（ＴＳＳ）の上流及び下流に、ＴＳＳから２００ｂｐを始端として１００ｋｂ離れたところまで位置し得る。公知の制御エレメントの標的化を用いて目的の遺伝子を活性化又は抑制し得る。場合によっては、単一の制御エレメントが複数の標的遺伝子の転写に影響を及ぼし得る。従って、単一の制御エレメントの標的化を用いて、複数の遺伝子の転写を同時に制御することができる。
【０５８１】
他方で推定制御エレメントの（例えば推定制御エレメントの領域並びにエレメントの周囲２００ｂｐ〜１００ｋＢをタイリングすることによる）標的化は、かかるエレメントの確認手段（目的の遺伝子の転写を計測することによる）又は新規制御エレメントの検出手段（例えば目的の遺伝子のＴＳＳの１００ｋｂ上流及び下流をタイリングすることによる）として用いることができる。加えて、推定制御エレメントの標的化は、疾患の遺伝的原因を解明する文脈において有用であり得る。疾患表現型に関連する多くの突然変異及び共通ＳＮＰ変異体が、コード領域外に位置する。本明細書に記載される活性化系又は抑制系のいずれかによるかかる領域の標的化は、その後に、ａ）一組の推定標的（例えば制御エレメントにごく近接して位置する一組の遺伝子）又はｂ）例えばＲＮＡｓｅｑ又はマイクロアレイによる全トランスクリプトーム読取りのいずれかの転写の読取りが続き得る。これにより、疾患表現型に関わると見込まれる候補遺伝子の同定が可能となり得る。かかる候補遺伝子は、新規薬物標的として有用であり得る。
【０５８２】
ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）阻害因子が本明細書において言及される。しかしながら、一部の実施形態における代替例は、１つ以上の機能ドメインがアセチルトランスフェラーゼ、好ましくはヒストンアセチルトランスフェラーゼを含むものである。これらはエピゲノミクスの分野において、例えばエピゲノムの探索方法で有用である。エピゲノムの探索方法には、例えばエピゲノム配列の標的化が含まれ得る。エピゲノム配列の標的化には、ガイドがエピゲノム標的配列に向けられることが含まれ得る。エピゲノム標的配列には、一部の実施形態において、プロモーター、サイレンサー又はエンハンサー配列が含まれ得る。
【０５８３】
本明細書に記載されるとおりのＣｐｆ１エフェクタータンパク質、好ましくはデッドＣｐｆ１エフェクタータンパク質、より好ましくはデッドＦｎＣｐｆ１エフェクタータンパク質に連結した機能ドメインを用いることによるエピゲノム配列の標的化は、プロモーター、サイレンサー又はエンハンサーを活性化し又は抑制するために用いることができる。
【０５８４】
アセチルトランスフェラーゼの例は公知であり、しかし一部の実施形態ではヒストンアセチルトランスフェラーゼを含み得る。一部の実施形態において、ヒストンアセチルトランスフェラーゼはヒトアセチルトランスフェラーゼｐ３００の触媒コアを含み得る（Ｇｅｒｂａｓｃｈ  ＆  Ｒｅｄｄｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ６ｔｈ  Ａｐｒｉｌ  ２０１５）。
【０５８５】
一部の好ましい実施形態では、機能ドメインがデッドＣｐｆ１エフェクタータンパク質に連結され、プロモーター又はエンハンサーなどのエピゲノム配列を標的化及び活性化する。かかるプロモーター又はエンハンサーに向けられる１つ以上のガイドもまた提供されて、かかるプロモーター又はエンハンサーへのＣＲＩＳＰＲ酵素の結合を導き得る。
【０５８６】
用語「〜と会合している」は、ここでは機能ドメインとＣｐｆ１エフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質の会合に関して用いられる。これは、例えばアダプタータンパク質と機能ドメインとの間、又はＣｐｆ１エフェクタータンパク質と機能ドメインとの間で、一つの分子がどのように別の分子と「会合」しているかに関して用いられる。かかるタンパク質間相互作用の場合、この会合は、抗体がエピトープを認識する方法における認識の観点で考えられてもよい。或いは、一つのタンパク質が別のタンパク質と、それら２つの融合物を介して会合していてもよく、例えば一つのサブユニットが別のサブユニットに融合していてもよい。融合は典型的には、例えば、各タンパク質又はサブユニットをコードするヌクレオチド配列を併せてスプライシングすることにより、一方のアミノ酸配列を他方のアミノ酸配列に加えることによって起こる。或いは、これは、本質的に、融合タンパク質など、２つの分子間の結合又は直接的な連結と考えられてもよい。いずれにしろ、融合タンパク質は２つの目的のサブユニット間（即ち酵素と機能ドメインとの間又はアダプタータンパク質と機能ドメインとの間）にリンカーを含んでもよい。従って、一部の実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質は機能ドメインへの結合によってそれと会合している。他の実施形態において、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質又はアダプタータンパク質は機能ドメインと、それらの２つが任意選択で中間リンカーを介して一体に融合されているため、会合している。リンカーの例としては、本明細書で考察されるＧｌｙＳｅｒリンカーが挙げられる。
【０５８７】
機能ドメイン又は融合タンパク質の結合は、リンカー、例えば可動性グリシン−セリン（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）若しくは（ＧＧＧＳ）３か、又は（Ａｌａ（ＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓ）Ａｌａ）などの強固なα−ヘリックスリンカーを介することができる。本明細書では、タンパク質又はペプチドドメインを分離するため、（ＧＧＧＧＳ）３などのリンカーが好ましくは使用される。（ＧＧＧＧＳ）３は、比較的長いリンカー（１５アミノ酸）であるため好ましい。グリシン残基は最も可動性が高く、及びセリン残基はリンカーがタンパク質の外側にある可能性を高める。（ＧＧＧＧＳ）６  （ＧＧＧＧＳ）９又は（ＧＧＧＧＳ）１２が、好ましくは代替として用いられ得る。他の好ましい代替例は、（ＧＧＧＧＳ）１、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）４、（ＧＧＧＧＳ）５、（ＧＧＧＧＳ）７、（ＧＧＧＧＳ）８、（ＧＧＧＧＳ）１０、又は（ＧＧＧＧＳ）１１である。代替的なリンカーが利用可能であり、しかしＣｐｆ１の２つのパートが一緒になり、ひいてはＣｐｆ１活性が元に戻る機会を最大限にするには、高度に可動性のリンカーが最も良好に働くと考えられる。一つの代替例は、ヌクレオプラスミンのＮＬＳをリンカーとして使用し得ることである。例えば、Ｃｐｆ１と任意の機能ドメインとの間にもリンカーを使用することができる。この場合もまた、ここに（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（又はその６、９、又は１２リピートバージョン）を使用してもよく、又はＣｐｆ１と機能ドメインとの間にヌクレオプラスミンのＮＬＳをリンカーとして使用することができる。
【０５８８】
飽和突然変異誘発
本明細書に記載される１つ又は複数のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系は、例えば、遺伝子発現、薬剤耐性、及び疾患の好転に必要な機能性エレメントの重要な最小限の特徴及び個別的な脆弱性を決定するための、細胞表現型と併せたゲノム遺伝子座における飽和又はディープスキャニング突然変異誘発の実施に用いることができる。飽和又はディープスキャニング突然変異誘発とは、ゲノム遺伝子座内であらゆる又は本質的にあらゆるＤＮＡ塩基が切断されることを意味する。Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質ガイドＲＮＡのライブラリが細胞集団に導入される。このライブラリは、各細胞がシングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を受け取るように導入され得る。本明細書に記載されるとおり、ライブラリがウイルスベクターの形質導入によって導入される場合、低い感染多重度（ＭＯＩ）が用いられる。ライブラリは、ゲノム遺伝子座において（プロトスペーサー隣接モチーフ）（ＰＡＭ）配列の上流にある全ての配列を標的化するｇＲＮＡを含み得る。ライブラリは、ゲノム遺伝子座内の１０００塩基対毎にＰＡＭ配列の上流に少なくとも１００個の非重複ゲノム配列を含み得る。ライブラリは、少なくとも１つの異なるＰＡＭ配列の上流の配列を標的化するｇＲＮＡを含み得る。１つ又は複数のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系は２つ以上のＣｐｆ１タンパク質を含み得る。異なるＰＡＭ配列を認識するオルソログ又はエンジニアリングされたＣｐｆ１エフェクタータンパク質を含め、本明細書に記載されるとおりの任意のＣｐｆ１エフェクタータンパク質を用いることができる。ｇＲＮＡに関するオフターゲット部位の頻度は５００未満であり得る。オフターゲットスコアを作成して、最も低いオフターゲット部位のｇＲＮＡを選択し得る。単一の実験で同じ部位を標的化するｇＲＮＡを用いることにより、ｇＲＮＡ標的部位における切断に関連すると決定された任意の表現型を確認し得る。標的部位の検証はまた、本明細書に記載されるとおりの改変Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質、及び目的のゲノム部位を標的化する２つのｇＲＮＡを用いることにより行ってもよい。理論によって拘束されないが、標的部位は、検証実験で表現型の変化が観察された場合に真のヒットである。
【０５８９】
ゲノム遺伝子座は少なくとも１つの連続ゲノム領域を含み得る。少なくとも１つの連続ゲノム領域とは、ゲノム全体に至るまでを含み得る。少なくとも１つの連続ゲノム領域は、ゲノムの機能性エレメントを含み得る。機能性エレメントは、非コード領域、コード遺伝子、イントロン領域、プロモーター、又はエンハンサーの範囲内にあってもよい。少なくとも１つの連続ゲノム領域は、少なくとも１ｋｂ、好ましくは少なくとも５０ｋｂのゲノムＤＮＡを含み得る。少なくとも１つの連続ゲノム領域は転写因子結合部位を含み得る。少なくとも１つの連続ゲノム領域はＤＮアーゼＩ高感受性領域を含み得る。少なくとも１つの連続ゲノム領域は転写エンハンサー又はリプレッサーエレメントを含み得る。少なくとも１つの連続ゲノム領域は、エピジェネティックシグネチャがエンリッチされた部位を含み得る。少なくとも１つの連続ゲノムＤＮＡ領域はエピジェネティックインスレーターを含み得る。少なくとも１つの連続ゲノム領域は、物理的に相互作用する２つ以上の連続ゲノム領域を含み得る。相互作用するゲノム領域は「４Ｃ技術」によって決定し得る。４Ｃ技術によれば、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（（２００６）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３８，１３４１−７）及び米国特許第８，６４２，２９５号明細書（両方ともに全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるとおり、選択のＤＮＡ断片と物理的に相互作用するＤＮＡセグメントに関して偏りのない方法でゲノム全体をスクリーニングすることが可能である。エピジェネティックシグネチャは、ヒストンアセチル化、ヒストンメチル化、ヒストンユビキチン化、ヒストンリン酸化、ＤＮＡメチル化、又はそれらの欠如であり得る。
【０５９０】
飽和又はディープスキャニング突然変異誘発のために１つ又は複数のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系を細胞集団で使用することができる。１つ又は複数のＣｐｆ１エフェクタータンパク質系は、限定はされないが哺乳類細胞及び植物細胞を含め、真核細胞で使用することができる。細胞集団は原核細胞であってもよい。真核細胞集団は胚性幹（ＥＳ）細胞、神経細胞、上皮細胞、免疫細胞、内分泌細胞、筋細胞、赤血球、リンパ球、植物細胞、又は酵母細胞の集団であってもよい。
【０５９１】
一態様において、本発明は、表現型の変化に関連する機能性エレメントのスクリーニング方法を提供する。Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質を含むように適合された細胞集団にライブラリを導入し得る。細胞を表現型に基づき少なくとも２つの群に分類し得る。表現型は、遺伝子の発現、細胞成長、又は細胞生存度であってもよい。各群に存在するガイドＲＮＡの相対的表現を決定し、それによって表現型の変化に関連するゲノム部位を、各群に存在するガイドＲＮＡの表現によって決定する。表現型の変化は、目的の遺伝子の発現の変化であってもよい。目的の遺伝子は上方制御され、下方制御され、又はノックアウトされ得る。細胞は高発現群と低発現群とに分類され得る。細胞集団は、表現型の決定に用いられるレポーター構築物を含み得る。レポーター構築物は検出可能なマーカーを含み得る。細胞は、検出可能なマーカーを用いることによって分類し得る。
【０５９２】
別の態様において、本発明は、化学的化合物耐性に関連するゲノム部位のスクリーニング方法を提供する。化学的化合物は薬物又は農薬であり得る。Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質を含むように適合された細胞集団にライブラリを導入することができ、ここで集団の各細胞は１つ以下のガイドＲＮＡを含有する；細胞集団を化学的化合物で処理する；及び化学的化合物による処理後、早い時点と比較した遅い時点におけるガイドＲＮＡの表現を決定し、それによって化学的化合物耐性に関連するゲノム部位をガイドＲＮＡのエンリッチメントによって決定する。ｇＲＮＡの表現はディープシーケンシング方法によって決定してもよい。
【０５９３】
Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体を利用する本発明の実施では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系で用いられる方法が有用であり、「Ｃａｓ９媒介インサイチュー飽和突然変異誘発によるＢＣＬ１１Ａエンハンサー分析（ＢＣＬ１１Ａ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」と題される論文が参照される。Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｃ．，Ｓｈｅｒ，Ｆ．，Ｐｉｎｅｌｌｏ，Ｌ．，Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｃｈｕｐｐ，Ｐ．Ｇ．，Ｖｉｎｊａｍｕｒ，Ｄ．Ｓ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｓ．Ｐ．，Ｌｕｃ，Ｓ．，Ｋｕｒｉｔａ，Ｒ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｙ．，Ｍａｅｄａ，Ｔ．，Ｙｕａｎ，Ｇ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｏｒｋｉｎ，Ｓ．Ｈ．，＆  Ｂａｕｅｒ，Ｄ．Ｅ．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１５５２１，オンライン発行  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １６，２０１５が参照され、この論文は本明細書において参照により援用され、及び以下に簡単に考察する。
【０５９４】
・Ｃａｎｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）レベルに関連する且つそのマウスオルソログが赤血球ＢＣＬ１１Ａ発現に必要であるエンハンサーとして既に同定されたヒト及びマウスＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーのインサイチュ飽和突然変異誘発を実施するための新規プールＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ガイドＲＮＡライブラリについて包含している。この手法から、これらのエンハンサーの重要な最小限の特徴及び個別的な脆弱性が明らかになった。この著者らは、初代ヒト前駆細胞の編集及びマウストランスジェネシスを用いて、ＨｂＦ再誘導の標的としてのＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーを実証した。この著者らは、治療的ゲノム編集についての情報を与える詳細なエンハンサーマップを作成した。
【０５９５】
Ｃｐｆ１系を用いて細胞又は生物（ｏｇａｎｉｓｍ）を改変する方法
一部の実施形態における本発明は、細胞又は生物を改変する方法を包含する。細胞は原核細胞又は真核細胞であってもよい。細胞は哺乳類細胞であってもよい。哺乳類細胞は、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、げっ歯類又はマウス細胞であってもよい。細胞は、家禽、魚類又はエビなどの非哺乳類真核細胞であってもよい。細胞はまた、植物細胞であってもよい。植物細胞は、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、又はコメなどの作物植物であってもよい。植物細胞はまた、藻類、樹木又は野菜であってもよい。本発明によって細胞に導入される改変は、抗体、デンプン、アルコール又は他の所望の細胞産出物などの生物学的産物の産生向上のため細胞及び細胞の子孫を変化させるようなものであり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、産生される生物学的産物を変える変化が細胞及び細胞の子孫に含まれるようなものであり得る。
【０５９６】
本系は１つ以上の異なるベクターを含み得る。本発明のある態様において、Ｃａｓタンパク質は、所望の細胞型、優先的に真核細胞、好ましくは哺乳類細胞又はヒト細胞での発現にコドンが最適化されている。
【０５９７】
パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞への感染能を有するウイルス粒子の形成に使用される。かかる細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞又はＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする細胞株を作製することにより作成される。ベクターは、典型的には、パッケージング及び続く宿主中への組込みに必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させるポリヌクレオチド用の発現カセットに置き換えられる。欠損ウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージング及び宿主ゲノム中への組込みに必要なＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、即ちｒｅｐ及びｃａｐをコードするもののＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞株中にパッケージングされる。この細胞株もまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染させ得る。ヘルパーウイルスはＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドはＩＴＲ配列がないため、大きい量でパッケージングされることはない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも高い感受性を有する熱処理によって低減することができる。
【０５９８】
送達
本発明は、少なくとも１つのナノ粒子複合体によって送達されるＣＲＩＳＰＲ複合体の少なくとも１つの構成成分、例えばＲＮＡに関する。一部の態様において、本発明は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、又は本明細書に記載されるとおりの１つ以上のベクター、その１つ以上の転写物、及び／又はそれから転写されるもの又はタンパク質を、宿主細胞に送達するステップを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明は、かかる方法によって作製される細胞、及びかかる細胞を含むか、又はそれから作製される動物を更に提供する。一部の実施形態では、ガイド配列と組み合わせた（及び任意選択でそれと複合体を形成した）ＣＲＩＳＰＲ酵素が細胞に送達される。哺乳類細胞又は標的組織における核酸の導入には、従来のウイルスベース及び非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いることができる。かかる方法を用いて、ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分をコードする核酸を培養下の細胞に、又は宿主生物中の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば本明細書に記載されるベクターの転写物）、ネイキッド核酸、及び送達ビヒクルと複合体を形成した核酸、例えばリポソームが含まれる。ウイルスベクター送達系にはＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれ、これは細胞への送達後にエピソームゲノム又は組込みゲノムのいずれかを有する。遺伝子療法手順のレビューに関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ  ＆  Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ  ＆  Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ  ＆  Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｅｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）；及びＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３−２６（１９９４）を参照のこと。
【０５９９】
核酸の非ウイルス送達方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤で促進するＤＮＡ取込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、同第４，９４６，７８７号明細書；及び同第４，８９７，３５５号明細書に記載され）、及びリポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性及び中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが含まれる。送達は、細胞に対してであってもよく（例えばインビトロ又はエキソビボ投与）、又は標的組織に対してであってもよい（例えば生体内投与）。
【０６００】
脂質：核酸複合体の調製は、免疫脂質複合体などの標的リポソームを含め、当業者に周知されている（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号明細書、同第４，２１７，３４４号明細書、同第４，２３５，８７１号明細書、同第４，２６１，９７５号明細書、同第４，４８５，０５４号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、同第４，７７４，０８５号明細書、同第４，８３７，０２８号明細書、及び同第４，９４６，７８７号明細書を参照）。
【０６０１】
ＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベースの系を使用した核酸の送達では、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化してウイルスペイロードを核に輸送する高度に進化したプロセスが利用される。ウイルスベクターは患者に直接投与してもよく（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の処理に使用してもよく、任意選択でその改変細胞が患者に投与され得る（ｅｘ  ｖｉｖｏ）。従来のウイルスベースの系は、遺伝子導入用にレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴及び単純ヘルペスウイルスベクターを含み得る。レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルス遺伝子導入方法では宿主ゲノムにおける組込みが可能であり、多くの場合に挿入されたトランス遺伝子の長期発現がもたらされる。加えて、多くの異なる細胞型及び標的組織で高い形質導入効率が観察されている。
【０６０２】
レトロウイルスの向性は外来性エンベロープタンパク質の取込みによって変えることができ、標的細胞の潜在的標的集団が拡大し得る。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入し、又は感染させることが可能な、且つ典型的には高いウイルス価を生じるレトロウイルスベクターである。従ってレトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存し得る。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来配列のパッケージング能力を有するシス作用性長末端反復配列で構成される。ベクターの複製及びパッケージングには、最小のシス作用性ＬＴＲが十分であり、次にはこれを用いて治療遺伝子を標的細胞に組み込むと、永続的なトランス遺伝子発現がもたらされる。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びそれらの組み合わせをベースとするものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００号明細書を参照）。
【０６０３】
別の実施形態において、コーカル（Ｃｏｃａｌ）ベシクロウイルスエンベロープ偽型レトロウイルスベクター粒子が企図される（例えば、フレッド・ハッチンソン癌研究センター（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）に譲渡された米国特許出願公開第２０１２０１６４１１８号明細書を参照）。コーカルウイルスはベシクロウイルス属（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）であり、哺乳動物における水疱性口内炎の原因病原体である。コーカルウイルスは、当初はトリニダードでダニから分離されたもので（Ｊｏｎｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２５：２３６−２４２（１９６４））、トリニダード、ブラジル、及びアルゼンチンで昆虫、ウシ、及びウマから感染が同定されている。哺乳動物に感染するベシクロウイルスの多くは、自然感染した節足動物から分離されており、それがベクター媒介性であることが示唆される。ベシクロウイルスに対する抗体は農村地域に住む人々によく見られ、そこではこのウイルスが地方病性であり、実験室内感染性である；ヒトにおける感染は、通常はインフルエンザ様症状をもたらす。コーカルウイルスエンベロープ糖タンパク質はアミノ酸レベルでＶＳＶ−Ｇインディアナと７１．５％の同一性を共有し、ベシクロウイルスのエンベロープ遺伝子の系統発生学的比較では、ベシクロウイルスの中でコーカルウイルスがＶＳＶ−Ｇインディアナ株と血清学的には異なるものの最も近縁であることが示される。Ｊｏｎｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２５：２３６−２４２（１９６４）及びＴｒａｖａｓｓｏｓ  ｄａ  Ｒｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｍｅｄ．＆  Ｈｙｇｉｅｎｅ  ３３：９９９−１００６（１９８４）。コーカルベシクロウイルスエンベロープ偽型レトロウイルスベクター粒子には、例えば、レトロウイルスのＧａｇ、Ｐｏｌ、及び／又は１つ以上のアクセサリータンパク質及びコーカルベシクロウイルスエンベロープタンパク質を含み得るレンチウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、及びイプシロンレトロウイルスベクター粒子が含まれ得る。これらの実施形態の特定の態様の範囲内において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びアクセサリータンパク質はレンチウイルス及び／又はガンマレトロウイルスのものである。本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系をコードする外来性核酸分子、例えば、プロモーターと、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（推定ヌクレアーゼ又はヘリカーゼタンパク質）、例えばＣｐｆ１をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる第１のカセット、及びプロモーターと、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる２つ、又はそれ以上の、有利にはベクターのパッケージングサイズ限界に至るまでの、例えば合計で（第１のカセットを含めて）５つのカセット（例えば、各カセットは概略的に、プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター、プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター．．．プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（式中、Ｎは、ベクターのパッケージングサイズ限界の上限である挿入可能な数である）と表される）を含む又はそれからなる複数のカセットを含む又はそれから本質的になるＡＡＶ、又は２つ以上の個々のｒＡＡＶであって、各々がＣＲＩＳＰＲ系の１つ又は２つ以上のカセットを含み、例えば、第１のｒＡＡＶが、プロモーターと、Ｃａｓ、例えばＣａｓ（Ｃｐｆ１）をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる第１のカセットを含み、及び第２のｒＡＡＶが、プロモーターと、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる複数の４つのカセット（例えば、各カセットは概略的に、プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター、プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター．．．プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（式中、Ｎは、ベクターのパッケージングサイズ限界の上限である挿入可能な数である）と表される）を含むｒＡＡＶを提供する。ｒＡＡＶはＤＮＡウイルスであるため、ＡＡＶ又はｒＡＡＶに関する本明細書の考察における核酸分子は、有利にはＤＮＡである。プロモーターは、一部の実施形態では、有利にはヒトシナプシンＩプロモーター（ｈＳｙｎ）である。核酸を細胞に送達する更なる方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００３００８７８１７号明細書を参照のこと。
【０６０４】
一部の実施形態において、宿主細胞が本明細書に記載の１つ以上のベクターによって一過性に又は非一過性にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、細胞は、それが対象において天然に存在するとおりにトランスフェクトされる。一部の実施形態において、トランスフェクトされる細胞は対象から採取される。一部の実施形態において、細胞は、細胞株など、対象から採取された細胞に由来する。組織培養向けの広範な細胞株が、当技術分野において公知である。細胞株の例としては、限定はされないが、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、ジャーカット、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨｅＬａ  Ｂ、ＨｅＬａ  Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３スイス、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３−Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ−５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ  Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＭＬ  Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、ジャーカット、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−Ｍｅｌ１−４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＣＫ  ＩＩ、ＭＤＣＫ  ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ６、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＡＬＭ−１、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ−９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ���３７、ＶＣａＰ、ベロ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１、ＹＡＲ、及びそれらのトランスジェニック変種が挙げられる。細胞株は、当業者に公知の種々の供給元から入手可能である（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ，Ｖａ．）を参照）。一部の実施形態において、本明細書に記載される１つ以上のベクターによってトランスフェクトされた細胞を使用して、１つ以上のベクター由来配列を含む新規の細胞株が樹立される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ系の構成成分によって一過性にトランスフェクトされ（例えば、１つ以上のベクターの一過性のトランスフェクション、又はＲＮＡによるトランスフェクションによる）、且つＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を通して改変された細胞を使用して、改変は含むものの他のあらゆる外因性配列を欠く細胞を含む新規の細胞株が樹立される。一部の実施形態において、本明細書に記載される１つ以上のベクターによって一過性に又は非一過性にトランスフェクトされた細胞、又はかかる細胞から誘導される細胞株が、１つ以上の試験化合物の評価において使用される。
【０６０５】
一部の実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のベクターを用いて非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物が作製される。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、マウス、ラット、又はウサギなどの哺乳動物である。トランスジェニック動物及び植物の作製方法は当該技術分野において公知であり、一般には、本明細書に記載されるものなど、細胞トランスフェクション方法から始まる。別の実施形態において、針のアレイを備える流体送達装置（例えば、フレッド・ハッチンソン癌研究センター（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）に譲渡された米国特許出願公開第２０１１０２３０８３９号明細書を参照）が、固形組織に対するＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓの送達に企図され得る。流体を固形組織に送達するための米国特許出願公開第２０１１０２３０８３９号明細書の装置は、アレイ状に配置された複数の針と；各々が複数の針のそれぞれ１つと流体連通している複数のリザーバと；複数のリザーバのそれぞれ１つに動作可能に結合され且つリザーバ内の流体圧力を制御するように構成された複数のアクチュエータとを含み得る。特定の実施形態では、複数のアクチュエータの各々が複数のプランジャの１つを含むことができ、複数のプランジャの各々の第１の端部が複数のリザーバのそれぞれ１つに受け入れられ、及び特定の別の実施形態では複数のプランジャのプランジャがそれぞれの第２の端部で一体に動作可能に結合され、同時に押し下げることが可能である。特定の更に別の実施形態は、複数のプランジャの全てを選択的に変更可能な速度で押し下げるように構成されたプランジャ駆動装置を含み得る。他の実施形態では、複数のアクチュエータの各々が、第１の端部と第２の端部とを有する複数の流体送出路の１つを含むことができ、複数の流体送出路の各々の第１の端部が複数のリザーバのそれぞれ１つに結合される。他の実施形態では、この装置は流体圧力源を含むことができ、及び複数のアクチュエータの各々が流体圧力源と複数のリザーバのそれぞれ１つとの間の流体継手を含む。更なる実施形態において、流体圧力源は、圧縮機、真空アキュムレータ、蠕動ポンプ、マスターシリンダー、マイクロ流体ポンプ、及びバルブのうちの少なくとも１つを含み得る。別の実施形態において、複数の針の各々は、その長さに沿って配置された複数のポートを含み得る。
【０６０６】
一態様において、本発明は、真核細胞内の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、核酸ターゲティング複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせ、それにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ここで核酸ターゲティング複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。
【０６０７】
一態様において、本発明は、真核細胞内のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、核酸ターゲティング複合体をポリヌクレオチドに結合させて、前記結合により前記ポリヌクレオチドの発現の増加又は減少を生じさせるステップを含み；ここで核酸ターゲティング複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体を形成した核酸ターゲティングエフェクタータンパク質を含む。
【０６０８】
ＣＲＩＳＰＲ複合体構成成分は、輸送部分とコンジュゲートし又は会合させることにより送達し得る（例えば、米国特許第８，１０６，０２２号明細書；同第８，３１３，７７２号明細書に記載される手法を応用する）。核酸送達戦略は、例えば、ガイドＲＮＡ、又はＣＲＩＳＰＲ複合体構成成分をコードするメッセンジャーＲＮＡ又はコードＤＮＡの送達の向上に用いられ得る。例えば、ＲＮＡに改変ＲＮＡヌクレオチドを取り込むことにより、安定性が向上し、免疫刺激が低下し、及び／又は特異性が向上し得る（Ｄｅｌｅａｖｅｙ，Ｇｌｅｎ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９，Ｉｓｓｕｅ  ８，９３７−９５４；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，１９９５，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６：１５７−１８２；Ｃａｌｉｃｅｔｉ  ａｎｄ  Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，２００３，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５５：１２６１−１２７７を参照）。疎水性を高め且つ非アニオン性にして、それにより細胞への侵入を改善するためのｇＲＮＡの改変に適し得る可逆的電荷中和リン酸トリエステル骨格修飾など、より効率的な送達に向けたｇＲＮＡなどの核酸の改変に使用し得る様々な構築物が記載されている（Ｍｅａｄｅ  ＢＲ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２，１２５６−１２６１）。更なる代替的実施形態において、選択されるＲＮＡモチーフは、細胞トランスフェクションの媒介に有用なものであってよい（Ｍａｇａｌｈａｅｓ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）；２０  ３，６１６−６２４）。同様に、例えばｇＲＮＡにアプタマーを付加することにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体構成成分の送達にアプタマーを適合させ得る（Ｔａｎ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１１，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．１２）。
【０６０９】
一部の実施形態において、トリアンテナリーＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）とオリゴヌクレオチド構成成分のコンジュゲーションが、送達、例えば、選択の細胞型、例えば肝細胞への送達の向上に用いられ得る（国際公開第２０１４１１８２７２号パンフレット（参照により本明細書に援用される）；Ｎａｉｒ，ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３６（４９），１６９５８−１６９６１を参照）。これは糖ベースの粒子と見なすことができ、他の粒子送達系及び／又は製剤に関する更なる詳細は本明細書に提供される。従ってＧａｌＮＡｃは、本明細書に記載される他の粒子の意味における粒子と見なすことができ、一般的な使用及び他の考察、例えば前記粒子の送達が、ＧａｌＮＡｃ粒子にも同様に適用される。例えば溶相コンジュゲーション戦略を用いて、ＰＦＰ（ペンタフルオロフェニル）エステルとして活性化したトリアンテナリーＧａｌＮＡｃクラスター（分子量約２０００）を５’−ヘキシルアミノ修飾オリゴヌクレオチド（５’−ＨＡ  ＡＳＯ、分子量約８０００Ｄａ；Φｓｔｅｒｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２０１５，２６（８），ｐｐ  １４５１−１４５５）に付加し得る。同様に、インビボ核酸送達にポリ（アクリレート）ポリマーが記載されている（国際公開第２０１３１５８１４１号パンフレット（参照により本明細書に援用される）を参照）。更なる代替的実施形態において、ＣＲＩＳＰＲナノ粒子（又はタンパク質複合体）を天然に存在する血清タンパク質と予め混合したものが、送達の向上に用いられ得る（Ａｋｉｎｃ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｏｌ．１８  ｎｏ．７，１３５７−１３６４）。
【０６１０】
送達エンハンサーを例えば化学的ライブラリをスクリーニングすることによって同定するスクリーニング技法が利用可能である（Ｇｉｌｌｅｒｏｎ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４３（１６）：７９８４−８００１）。脂質ナノ粒子などの送達ビヒクルの効率を評価するための手法もまた記載されており、これはＣＲＩＳＰＲ構成成分に有効な送達ビヒクルを同定するために用いられ得る（Ｓａｈａｙ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，６５３−６５８を参照）。
【０６１１】
一部の実施形態において、例えばインビボでの機能性を向上させるため、タンパク質の疎水性を変えるペプチドなど、機能性ペプチドをタンパク質に加えることにより、タンパク質ＣＲＩＳＰＲ構成成分の送達を促進し得る。ＣＲＩＳＰＲ構成成分タンパク質も同様に、続く化学反応を促進するように改変し得る。例えば、クリック化学を起こす基を有するアミノ酸がタンパク質に加えられてもよい（Ｎｉｋｉｃ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １０，７８０−７９１）。この種の実施形態において、次にはクリック化学基を用いて、安定性のためのポリ（エチレングリコール）、細胞透過性ペプチド、ＲＮＡアプタマー、脂質、又は炭水化物、例えばＧａｌＮＡｃなどの多種多様な代替的構造を加え得る。更なる代替例において、ＣＲＩＳＰＲ構成成分タンパク質は、細胞への侵入にタンパク質を適合させるため（Ｓｖｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．４を参照）、例えばタンパク質に細胞透過性ペプチドを加えることにより改変し得る（Ｋａｕｆｆｍａｎ，Ｗ．Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４０，Ｉｓｓｕｅ  １２，７４９−７６４；Ｋｏｒｅｎ  ａｎｄ  Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，２０１２，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．７を参照）。更なる代替的実施形態において、患者又は対象は、ＣＲＩＳＰＲ構成成分の後の送達を促進する化合物又は製剤で予め処理されてもよい。
【０６１２】
Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体は植物で使用することができる
Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質系（例えば単一の又は多重化した）は、作物ゲノミクスにおける近年の進歩と併せて用いることができる。本明細書に記載される系を使用して、効率的で且つ対費用効果の高い植物遺伝子又はゲノムの探索又は編集又は操作を−例えば、植物遺伝子又はゲノムの迅速な調査及び／又は選択及び／又は探索及び／又は比較及び／又は操作及び／又は形質転換のため、実施することができ；例えば、１つ又は複数の形質又は１つ又は複数の特徴を作出し、同定し、開発し、最適化し、又は１つ又は複数の植物に付与し、又は植物ゲノムを形質転換することができる。従って、植物の生産の向上、新規組み合わせの形質又は特徴を有する新規植物、又は形質が増強された新規植物があり得る。Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質系は、植物に関して、部位特異的組込み（ＳＤＩ）又は遺伝子編集（ＧＥ）又は任意の準逆育種（ＮＲＢ）又は逆育種（ＲＢ）技術において使用することができる。本明細書に記載されるＣｐｆ１エフェクタータンパク質系を利用する態様は、植物におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）系の使用と同様であってもよく、アリゾナ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｒｉｚｏｎａ）ウェブサイト「ＣＲＩＳＰＲ−ＰＬＡＮＴ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｒｉｚｏｎａ．ｅｄｕ／ｃｒｉｓｐｒ／）（後援Ｐｅｎｎ  Ｓｔａｔｅ及びＡＧＩ）が挙げられる。本発明の実施形態（ｅｍｏｄｉｍｅｎｔｓ）は、植物におけるゲノム編集で、又はＲＮＡｉ若しくは同様のゲノム編集技法が既に用いられているところで用いることができる；例えば、Ｎｅｋｒａｓｏｖ，「容易になった植物ゲノム編集：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用したモデル及び作物植物における標的突然変異誘発（Ｐｌａｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｍａｄｅ  ｅａｓｙ：ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｍｏｄｅｌ  ａｎｄ  ｃｒｏｐ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３，９：３９（ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４６−４８１１−９−３９）；Ｂｒｏｏｋｓ，「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用した第一世代のトマトにおける効率的遺伝子編集（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｏｍａｔｏ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１４  ｐｐ  １１４．２４７５７７；Ｓｈａｎ，「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用した作物植物の標的ゲノム改変（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｏｐ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，６８６−６８８（２０１３）；Ｆｅｎｇ，「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用した植物における効率的なゲノム編集（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１３）２３：１２２９−１２３２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃ��．２０１３．１１４；オンライン発行  ２０  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１３；Ｘｉｅ，「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用した植物におけるＲＮＡガイド下ゲノム編集（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ．２０１３  Ｎｏｖ；６（６）：１９７５−８３．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｍｐ／ｓｓｔ１１９．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ａｕｇ  １７；Ｘｕ，「コメにおけるアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用した遺伝子ターゲティング（Ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｒｉｃｅ）」，Ｒｉｃｅ  ２０１４，７：５（２０１４）、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，「木本多年生植物ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）の外交配における両アレルＣＲＩＳＰＲ突然変異へのＳＮＰの利用により、４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼ特異性及び冗長性が明らかになる（Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ＳＮＰｓ  ｆｏｒ  ｂｉａｌｌｅｌｉｃ  ＣＲＩＳＰＲ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｕｔｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｗｏｏｄｙ  ｐｅｒｅｎｎｉａｌ  Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ：ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）」，Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ（２０１５）（Ｆｏｒｕｍ）１−４（ｗｗｗ．ｎｅｗｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ．ｃｏｍにおいてオンラインでのみ入手可能）；Ｃａｌｉａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ，「宿主ゲノムを安定に担持するＣＲＩＳＰＲデバイスを使用した標的ＤＮＡ分解（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＤＮＡ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ  ｄｅｖｉｃｅ  ｓｔａｂｌｙ  ｃａｒｒｉｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｇｅｎｏｍｅ）」，ＮＡＴＵＲＥ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ  ６：６９８９，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７９８９，ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎａｔｕｒｅｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７９８９；米国特許第６，６０３，０６１号明細書−アグロバクテリウム属媒介性植物形質転換方法（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ）；米国特許第７，８６８，１４９号明細書−植物ゲノム配列及びその使用（Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ）及び米国特許出願公開第２００９／０１００５３６号明細書−農業形質が増強されたトランスジェニック植物（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ  Ｔｒａｉｔｓ）（これらの各々の内容及び開示は全て、本明細書において全体として参照により援用される）を参照のこと。本発明の実施では、Ｍｏｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ「作物ゲノミクス：進展と応用（Ｃｒｏｐ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．２０１１  Ｄｅｃ  ２９；１３（２）：８５−９６の内容及び開示；その各々が、本明細書における実施形態が植物に関してどのように用いられ得るかに関してを含め、参照により本明細書に援用される。従って、本明細書において動物細胞への言及はまた、特に明らかでない限り、適宜修正して植物細胞にも適用し得る；及び、オフターゲット効果が低下した本明細書における酵素及びかかる酵素を利用する系は、本明細書に記載するものを含め、植物適用（ａｐｐｌｃｉａｔｉｏｎｓ）に用いることができる。
【０６１３】
Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体は非ヒト生物／動物において使用することができる
ある態様において、本発明は、記載される実施形態のいずれかに係る真核生物宿主細胞を含む非ヒト真核生物；好ましくは多細胞真核生物を提供する。他の態様において、本発明は、記載される実施形態のいずれかに係る真核生物宿主細胞を含む真核生物；好ましくは多細胞真核生物を提供する。これらの態様の一部の実施形態における生物は、動物；例えば哺乳類であってもよい。また、生物は、昆虫などの節足動物であってもよい。生物はまた、植物であってもよい。更に、生物は真菌であってもよい。
【０６１４】
本発明はまた、例えば家畜及び生産動物など、他の農業適用にも関し得る。例えば、ブタは、それを特に再生医学における生物医学モデルとして魅力的なものにする多くの特徴を備えている。詳細には、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）のブタが、再生医学、異種移植（本明細書のいずれかにもまた記載される）、及び腫瘍発生の有用なモデルを提供し得るとともに、ヒトＳＣＩＤ患者に対する治療薬の開発の助けとなり得る。Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１４  Ｍａｙ  ２０；１１１（２０）：７２６０−５）はレポーター−ガイド下転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系を利用して、両方の対立遺伝子に影響を及ぼすものを含め、高効率で体細胞に組換え活性化遺伝子（ＲＡＧ）２の標的改変を作成した。Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質を同様の系に適用し得る。
【０６１５】
Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１４  Ｍａｙ  ２０；１１１（２０）：７２６０−５）の方法は、以下のとおり類似的に本発明に適用し得る。胎児線維芽細胞におけるＲＡＧ２の標的改変と、それに続くＳＣＮＴ及び胚移植によって突然変異ブタを作製する。ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ及びレポーターをコードする構築物を胎児由来の線維芽細胞に電気穿孔処理する。４８時間後、緑色蛍光タンパク質を発現するトランスフェクト細胞を９６ウェルプレートの個々のウェル中に１ウェル当たり推定希釈の単一細胞で保存する。ＲＡＧ２の標的改変は、任意のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ切断部位に隣接するゲノムＤＮＡ断片を増幅し、続いてＰＣＲ産物をシーケンシングすることによりスクリーニングする。スクリーニングし、オフサイト突然変異がないことを確認した後、ＲＡＧ２の標的改変を有している細胞をＳＣＮＴに使用する。極体を卵母細胞の隣接細胞質の一部分（恐らく第二分裂中期の中期板を含有する）と共に除去し、及びドナー細胞を卵黄周囲に置く。次に再構成された胚を電気穿孔処理してドナー細胞を卵母細胞と融合させ、次に化学的に活性化させる。活性化した胚を０．５μＭスクリプタイド（Ｓ７８１７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）含有ブタ接合子培地３（ＰＺＭ３）中で１４〜１６時間インキュベートする。次に胚を洗浄してスクリプタイドを除去し、胚が代理母ブタの卵管に移されるまでＰＺＭ３中で培養する。
【０６１６】
本発明はまた、雌ウシなどの他の動物のＳＮＰの改変にも適用可能である。Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１３  Ｏｃｔ  ８；１１０（４１）：１６５２６−１６５３１）は、プラスミド、ｒＡＡＶ、及びオリゴヌクレオチド鋳型を使用した転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）刺激性及びクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９刺激性相同依存性修復（ＨＤＲ）を含むように家畜遺伝子編集ツールボックスを展開した。遺伝子特異的ｇＲＮＡ配列が彼らの方法によってＣｈｕｒｃｈ  ｌａｂ  ｇＲＮＡベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ：４１８２４）にクローニングされた（Ｍａｌｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）「Ｃａｓ９によるＲＮＡガイド下ヒトゲノムエンジニアリング（ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２１）：８２３−８２６）。ｈＣａｓ９プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ：４１８１５）又はＲＣＩＳｃｒｉｐｔ−ｈＣａｓ９から合成されたｍＲＮＡのいずれかのコトランスフェクションによってＣａｓ９ヌクレアーゼが提供された。このＲＣＩＳｃｒｉｐｔ−ｈＣａｓ９は、ｈＣａｓ９プラスミド（ｈＣａｓ９  ｃＤＮＡを包含する）からＲＣＩＳｃｒｉｐｔプラスミドにＸｂａＩ−ＡｇｅＩ断片をサブクローニングすることにより構築された。
【０６１７】
Ｈｅｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２０１５  Ｆｅｂ  １；２４（３）：３９３−４０２．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｓｃｄ．２０１４．０２７８．Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｎｏｖ  ３）は、ウシ多能性細胞及びクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いたウシゲノムにおける極めて効率的な遺伝子ターゲティングを報告した。第一に、Ｈｅｏ  ｅｔ  ａｌ．はウシ体細胞線維芽細胞から山中因子の異所性発現並びにＧＳＫ３β及びＭＥＫ阻害因子（２ｉ）処理によって人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作成した。Ｈｅｏ  ｅｔ  ａｌ．は、これらのウシｉＰＳＣが遺伝子発現及び奇形腫発生可能性の点でナイーブ多能性幹細胞に極めて類似していることを観察した。更に、ウシＮＡＮＯＧ遺伝子座に特異的なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ウシｉＰＳＣ及び胚においてウシゲノムの極めて効率的な編集を示した。
【０６１８】
Ｉｇｅｎｉｔｙ（登録商標）は、屠体組成、屠体品質、母系及び繁殖形質並びに平均１日増体量など、経済的重要性のある経済的形質の形質を実施し及び伝達するための、雌ウシなどの動物のプロファイル解析を提供している。網羅的Ｉｇｅｎｉｔｙ（登録商標）プロファイルの解析は、ＤＮＡマーカー（ほとんどの場合一塩基変異多型又はＳＮＰ）の発見から始まる。Ｉｇｅｎｉｔｙ（登録商標）プロファイルの背後にあるマーカーは全て、大学、研究組織、及びＵＳＤＡなどの政府機関を含めた研究機関の独立した科学者らによって発見された。次にバリデートされた集団においてＩｇｅｎｉｔｙ（登録商標）でマーカーが解析される。Ｉｇｅｎｉｔｙ（登録商標）は、様々な作製環境及び生物学的タイプを代表する複数のリソース集団を使用し、一般に入手可能でない表現型を収集するため牛肉産業のシードストック、雌ウシ−仔ウシ、フィードロット及び／又はパッキングセグメントからの工業的パートナーと協働することも多い。ウシゲノムデータベースは広く利用可能であり、例えば、ＮＡＧＲＰウシゲノムコーディネーションプログラム（Ｃａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｎｉｍａｌｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃａｔｔｌｅ／ｍａｐｓ／ｄｂ．ｈｔｍｌ）を参照のこと。従って、本発明は、ウシＳＮＰの標的化に適用し得る。当業者は、例えば、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．又はＨｅｏ  ｅｔ  ａｌ．によるとおり、上記のプロトコルをＳＮＰの標的化に利用して、及びそれらをウシＳＮＰに適用し得る。
【０６１９】
Ｑｉｎｇｊｉａｎ  Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ａｃｃｅｓｓ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １２，２０１５）は、イヌミオスタチン（ＭＳＴＮ）遺伝子（骨格筋量の負の調節因子）の第１のエクソンを標的化することによりイヌにおける筋量の増加を実証した。第一に、ＭＳＴＮを標的化するｓｇＲＮＡをＣａｓ９ベクターと共にイヌ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）にコトランスフェクトすることを用いてｓｇＲＮＡの効率が検証された。その後、正常な形態の胚にＣａｓ９  ｍＲＮＡとＭＳＴＮ  ｓｇＲＮＡとの混合物をマイクロインジェクションし、及び接合子を同じ雌イヌの卵管に自家移植することにより、ＭＳＴＮ  ＫＯイヌが作成された。ノックアウト仔イヌはその野生型同腹姉妹と比較して大腿上に明らかな筋肉表現型を示した。これはまた、本明細書に提供されるＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系を用いて実施することもできる。
【０６２０】
家畜−ブタ
家畜におけるウイルス標的には、一部の実施形態において、例えばブタマクロファージ上のブタＣＤ１６３が含まれ得る。ＣＤ１６３は、ＰＲＲＳｖ（アルテリウイルスであるブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス）による感染に関連する（ウイルスの細胞への侵入を介すると考えられている）。ＰＲＲＳｖが特にブタ肺胞マクロファージ（肺に見られる）に感染すると、飼育ブタの生殖障害、体重減少及び高死亡率を含めた被害をもたらす、以前は不治であったブタ症候群（「ミステリーブタ病」又は「青耳病」）が引き起こされる。マクロファージ活性が失われることによる免疫不全に起因して、流行性肺炎、髄膜炎及び耳浮腫などの日和見感染症が見られることが多い。また、抗生物質の使用増加及び金銭的損失に起因して、経済的及び環境的影響も大きい（毎年推定６億６千万ドル）。
【０６２１】
Ｇｅｎｕｓ  Ｐｌｃと共同でミズーリ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）のＫｒｉｓｔｉｎ  Ｍ  Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ及びＤｒ  Ｒａｎｄａｌｌ  Ｐｒａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３４３４  オンライン発行  ０７  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１５）によって報告されるとおり、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いてＣＤ１６３が標的化されており、編集されたブタの子孫はＰＲＲＳｖへの曝露時に抵抗性であった。１匹のファウンダー雄及び１匹のファウンダー雌（両方ともにＣＤ１６３のエクソン７に突然変異を有した）を繁殖させて子孫が作製された。ファウンダー雄は一方の対立遺伝子上のエクソン７に１１ｂｐの欠失を有したが、これはフレームシフト突然変異及びドメイン５のアミノ酸４５におけるミスセンス翻訳及びアミノ酸６４の続く未成熟終止コドンをもたらす。他方の対立遺伝子はエクソン７に２ｂｐの付加及び先行するイントロンに３７７ｂｐの欠失を有したが、これらはドメイン５の初めの４９アミノ酸の発現と、続くアミノ酸８５の未成熟終止コードをもたらすと予想された。雌ブタは一方の対立遺伝子に７ｂｐの付加を有し、これにより翻訳時にドメイン５の初めの４８アミノ酸が発現し、それにアミノ酸７０の未成熟終止コドンが続くと予想された。雌ブタの他方の対立遺伝子は増幅不能であった。選択された子孫はヌル動物（ＣＤ１６３−／−）、即ちＣＤ１６３ノックアウトであると予想された。
【０６２２】
従って、一部の実施形態において、ブタ肺胞マクロファージがＣＲＩＳＰＲタンパク質によって標的化され得る。一部の実施形態において、ブタＣＤ１６３がＣＲＩＳＰＲタンパク質によって標的化され得る。一部の実施形態において、ブタＣＤ１６３は、ＤＳＢの誘導によるか、又は上記に記載されるものの１つ以上を含め、例えばエクソン７の欠失若しくは改変を標的化するなど、挿入若しくは欠失によるか、又は遺伝子の他の領域における、例えばエクソン５の欠失又は改変によりノックアウトされ得る。
【０６２３】
編集されたブタ及びその子孫、例えばＣＤ１６３ノックアウトブタもまた想定される。これは、家畜、育種又はモデル化目的（即ちブタモデル）であり得る。遺伝子ノックアウトを含む精液もまた提供される。
【０６２４】
ＣＤ１６３は、スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）スーパーファミリーのメンバーである。インビトロ研究に基づけば、このタンパク質のＳＲＣＲドメイン５は、ウイルスゲノムのアンパッケージング及び放出に関与するドメインである。そのため、ＳＲＣＲスーパーファミリーの他のメンバーもまた、他のウイルスに対する抵抗性を評価するため標的化され得る。ＰＲＲＳＶはまた、哺乳類アルテリウイルス群（これにはマウス乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス、サル出血熱ウイルス及びウマ動脈炎ウイルスもまた含まれる）のメンバーである。アルテリウイルスは、マクロファージ向性及び重症疾患及び持続感染の両方を引き起こす能力を含め、重要な病因特性を共有する。従って、アルテリウイルス、及び詳細にはマウス乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス、サル出血熱ウイルス及びウマ動脈炎ウイルスが、例えばブタＣＤ１６３又は他の種、及びマウス、サル及びウマモデルにおけるそのホモログを介して標的化されてもよく、及びノックアウトもまた提供される。
【０６２５】
実際、この手法は、インフルエンザＣ型並びにＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ１、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、及びＨ２Ｎ３として知られるインフルエンザＡ型のサブタイプを含むブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）株など、ヒトに伝染し得る他の家畜疾患並びに上述の肺炎、髄膜炎及び浮腫を引き起こすウイルス又は細菌にまで拡張し得る。
【０６２６】
ＲＮＡガイド下Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質複合体による治療的ターゲティング
明らかなとおり、本系を用いていかなる目的のポリヌクレオチド配列も標的化し得ることが想定される。本発明は、標的細胞をインビボ、エキソビボ又はインビトロで改変するために用いられる、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、又は前記組成物の構成成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター若しくは送達系を提供し、及び改変後はＣＲＩＳＰＲにより改変された細胞の子孫又は細胞株が変化した表現型を保持するように細胞を変化させる形で行われ得る。改変された細胞及び子孫は、ＣＲＩＳＰＲ系が所望の細胞型にエキソビボ又はインビボ適用された植物又は動物などの多細胞生物の一部であり得る。本ＣＲＩＳＰＲ発明は、療法的治療方法であり得る。療法的治療方法には、遺伝子又はゲノム編集、又は遺伝子療法が含まれ得る。
【０６２７】
Ｃｐｆ１結晶構造の応用
本出願人らの結晶構造は、Ｃｐｆ１によるＲＮＡガイド下ＤＮＡターゲティングの分子機構の理解に向けた重要なステップを提供する。この結晶構造を用いて、標的ＤＮＡ上のＰＡＭ配列のＣｐｆ１媒介認識を決定することができる。従って、本発明は、１つ以上のアミノ酸残基を改変すること、及び改変されたＣｐｆ１活性を同定することを含むＣｐｆ１の改変方法を含む。本方法の詳細な実施形態では、ＰＡＭ感受性（ｓｅｎｓｉｓｔｉｖｉｔｙ）に影響を及ぼすことを目的として、本明細書に記載されるとおりＰＡＭ配列と相互作用すると同定された残基が改変される。或いは、Ｃｐｆ１結晶構造に基づきｃｒＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖間のミスマッチ耐性が調査される。本明細書において想定される方法には、合理的エンジニアリング及び／又はランダム突然変異誘発が関わり得る。詳細な実施形態では、同定されたＣｐｆ１ドメインのうちの１つ以上をエンジニアリングすることにより、ＰＡＭ特異性をプログラムし、標的部位認識の忠実度を向上させ、及びＣｐｆ１ゲノムエンジニアリングプラットフォームの多用途性を高めることが可能になる。
【０６２８】
ＣＲＩＳＰＲの開発及び使用
本発明は、いずれも本発明の実施に有用な、その成分及び複合体を含めたＣＲＩＳＰＲ系、並びに、方法、材料、送達媒体、ベクター、粒子、ＡＡＶを含めたかかる成分及び複合体の送達、並びに量及び製剤に関することを含めたその作製及び使用の態様に基づき更に例示及び展開することができ、これらに関しては以下が挙げられる：米国特許第８，９９９，６４１号明細書、同第８，９９３，２３３号明細書、同第８，９４５，８３９号明細書、同第８，９３２，８１４号明細書、同第８，９０６，６１６号明細書、同第８，８９５，３０８号明細書、同第８，８８９，４１８号明細書、同第８，８８９，３５６号明細書、同第８，８７１，４４５号明細書、同第８，８６５，４０６号明細書、同第８，７９５，９６５号明細書、同第８，７７１，９４５号明細書及び同第８，６９７，３５９号明細書；米国特許出願公開第２０１４−０３１０８３０号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３１号明細書）、同第２０１４−０２８７９３８  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２１３，９９１号明細書）、同第２０１４−０２７３２３４  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９３，６７４号明細書）、同第２０１４−０２７３２３２  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９０，５７５号明細書）、同第２０１４−０２７３２３１号明細書（米国特許出願第１４／２５９，４２０号明細書）、同第２０１４−０２５６０４６  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２６，２７４号明細書）、同第２０１４−０２４８７０２  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５８，４５８号明細書）、同第２０１４−０２４２７００  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２２，９３０号明細書）、同第２０１４−０２４２６９９  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，５１２号明細書）、同第２０１４−０２４２６６４  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９９０号明細書）、同第２０１４−０２３４９７２  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４７１号明細書）、同第２０１４−０２２７７８７  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５６，９１２号明細書）、同第２０１４−０１８９８９６  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３５号明細書）、同第２０１４−０１８６９５８号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０１７号明細書）、同第２０１４−０１８６９１９  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９７７号明細書）、同第２０１４−０１８６８４３  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９００号明細書）、同第２０１４−０１７９７７０  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，８３７号明細書）及び同第２０１４−０１７９００６  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４８６号明細書）、同第２０１４−０１７０７５３号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４２９号明細書）；欧州特許第２  ７８４  １６２  Ｂ１号明細書及び同第２  ７７１  ４６８  Ｂ１号明細書；欧州特許出願第２  ７７１  ４６８号明細書（ＥＰ１３８１８５７０．７号明細書）、同第２  ７６４  １０３号明細書（ＥＰ１３８２４２３２．６号明細書）、及び同第２  ７８４  １６２号明細書（ＥＰ１４１７０３８３．５号明細書）；及び国際公開第２０１４／０９３６６１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７４３号明細書）、同第２０１４／０９３６９４号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７９０号明細書）、同第２０１４／０９３５９５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６１１号明細書）、同第２０１４／０９３７１８号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８２５号明細書）、同第２０１４／０９３７０９号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１２号明細書）、同第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）、同第２０１４／０９３６３５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６９１号明細書）、同第２０１４／０９３６５５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７３６号明細書）、同第２０１４／０９３７１２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１９号明細書）、同第２０１４／０９３７０１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８００号明細書）、同第２０１４／０１８４２３号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８号明細書）、同第２０１４／２０４７２３号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１７９０号明細書）、同第２０１４／２０４７２４号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８００号明細書）、同第２０１４／２０４７２５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０３号明細書）、同第２０１４／２０４７２６号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０４号明細書）、同第２０１４／２０４７２７号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０６号明細書）、同第２０１４／２０４７２８号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０８号明細書）、同第２０１４／２０４７２９号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０９号明細書）。また、それぞれ２０１３年１月３０日；２０１３年３月１５日；２０１３年３月２８日；２０１３年４月２０日；２０１３年５月６日及び２０１３年５月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／７５８，４６８号明細書；同第６１／８０２，１７４号明細書；同第６１／８０６，３７５号明細書；同第６１／８１４，２６３号明細書；同第６１／８１９，８０３号明細書及び同第６１／８２８，１３０号明細書も参照される。また、２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８３６，１２３号明細書も参照される。加えて、各々２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８３５，９３１号明細書、同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書及び同第６１／８３５，９７３号明細書が参照される。更に、２０１３年８月５日に出願された米国仮特許出願第６１／８６２，４６８号明細書及び同第６１／８６２，３５５号明細書；２０１３年８月２８日に出願された同第６１／８７１，３０１号明細書；２０１３年９月２５日に出願された同第６１／９６０，７７７号明細書及び２０１３年１０月２８日に出願された同第６１／９６１，９８０号明細書が参照される。更にまた、各々２０１４年６月１０日（６／１０／１４）に出願されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８００号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０９号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０４号明細書及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０６号明細書；２０１４年６月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０８号明細書；及び２０１４年１０月２８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／６２５５８号明細書、及び各々２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，１５０号明細書、同第６１／９１５，３０１号明細書、同第６１／９１５，２６７号明細書及び同第６１／９１５，２６０号明細書；２０１３年１月２９日及び２０１３年２月２５日に出願された同第６１／７５７，９７２号明細書及び同第６１／７６８，９５９号明細書；２０１３年６月１７日に出願された同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書、同第６１／８３５，９７３号明細書、及び同第６１／８３５，９３１号明細書；両方ともに２０１４年６月１１日に出願された同第６２／０１０，８８８号明細書及び同第６２／０１０，８７９号明細書；各々２０１４年６月１０日に出願された同第６２／０１０，３２９号明細書及び同第６２／０１０，４４１号明細書；各々２０１４年２月１２日に出願された同第６１／９３９，２２８号明細書及び同第６１／９３９，２４２号明細書；２０１４年４月１５日に出願された同第６１／９８０，０１２号明細書；２０１４年８月１７日に出願された同第６２／０３８，３５８号明細書；各々２０１４年９月２５日に出願された同第６２／０５４，４９０号明細書、同第６２／０５５，４８４号明細書、同第６２／０５５，４６０号明細書及び同第６２／０５５，４８７号明細書；及び２０１４年１０月２７日に出願された同第６２／０６９，２４３号明細書が参照される。また、２０１４年９月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／０５５，４８４号明細書、同第６２／０５５，４６０号明細書、及び同第６２／０５５，４８７号明細書；２０１４年４月１５日に出願された同第６１／９８０，０１２号明細書；及び２０１４年２月１２日に出願された同第６１／９３９，２４２号明細書も参照される。特に米国を指定するＰＣＴ出願、２０１４年６月１０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号明細書が参照される。２０１４年１月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／９３０，２１４号明細書が参照される。各々２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；同第６１／９１５，２６０号明細書及び同第６１／９１５，２６７号明細書が参照される。２０１４年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／９８０，０１２号明細書が参照される。特に米国を指定するＰＣＴ出願、２０１４年６月１０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号明細書が参照される。２０１４年１月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／９３０，２１４号明細書が参照される。各々２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；同第６１／９１５，２６０号明細書及び同第６１／９１５，２６７号明細書が参照される。
【０６２９】
また、米国仮特許出願第６２／０９１，４５５号明細書、２０１４年１２月１２日出願、保護型ガイドＲＮＡ（ＰＧＲＮＡ）（ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ  ＧＵＩＤＥ  ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ））；米国仮特許出願第６２／０９６，７０８号明細書、２０１４年１２月２４日、保護型ガイドＲＮＡ（ＰＧＲＮＡ）（ＰＲＯＴＥＣＴＥＤ  ＧＵＩＤＥ  ＲＮＡＳ（ＰＧＲＮＡＳ））；米国仮特許出願第６２／０９１，４６２号明細書、２０１４年１２月１２日、ＣＲＩＳＰＲ転写因子用デッドガイド（ＤＥＡＤ  ＧＵＩＤＥＳ  ＦＯＲ  ＣＲＩＳＰＲ  ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ  ＦＡＣＴＯＲＳ）；米国仮特許出願第６２／０９６，３２４号明細書、２０１４年１２月２３日、ＣＲＩＳＰＲ転写因子用デッドガイド（ＤＥＡＤ  ＧＵＩＤＥＳ  ＦＯＲ  ＣＲＩＳＰＲ  ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ  ＦＡＣＴＯＲＳ）；米国仮特許出願第６２／０９１，４５６号明細書、２０１４年１２月１２日、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ系に対するエスコート下機能化ガイド（ＥＳＣＯＲＴＥＤ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬＩＺＥＤ  ＧＵＩＤＥＳ  ＦＯＲ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ）；米国仮特許出願第６２／０９１，４６１号明細書、２０１４年１２月１２日、造血幹細胞（ＨＳＣ）に関するゲノム編集用のＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ系及び組成物の送達、使用及び治療適用（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＧＥＮＯＭＥ  ＥＤＩＴＩＮＧ  ＡＳ  ＴＯ  ＨＥＭＡＴＯＰＯＥＴＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ（ＨＳＣｓ））；米国仮特許出願第６２／０９４，９０３号明細書、２０１４年１２月１９日、ゲノムワイズなインサートキャプチャシーケンシングによる二本鎖切断及びゲノム再編成の偏りのない同定（ＵＮＢＩＡＳＥＤ  ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＤＯＵＢＬＥ−ＳＴＲＡＮＤ  ＢＲＥＡＫＳ  ＡＮＤ  ＧＥＮＯＭＩＣ  ＲＥＡＲＲＡＮＧＥＭＥＮＴ  ＢＹ  ＧＥＮＯＭＥ−ＷＩＳＥ  ＩＮＳＥＲＴ  ＣＡＰＴＵＲＥ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ）；米国仮特許出願第６２／０９６，７６１号明細書、２０１４年１２月２４日、配列操作のためのシステムのエンジニアリング、方法並びに最適化酵素及びガイド足場（ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＯＦ  ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＥＮＺＹＭＥ  ＡＮＤ  ＧＵＩＤＥ  ＳＣＡＦＦＯＬＤＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ）；米国仮特許出願第６２／０９８，０５９号明細書、２０１４年１２月３０日、ＲＮＡターゲティングシステム（ＲＮＡ−ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭ）；米国仮特許出願第６２／０９６，６５６号明細書、２０１４年１２月２４日、不安定化ドメインを有する又はそれに関連するＣＲＩＳＰＲ（ＣＲＩＳＰＲ  ＨＡＶＩＮＧ  ＯＲ  ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＷＩＴＨ  ＤＥＳＴＡＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ  ＤＯＭＡＩＮＳ）；米国仮特許出願第６２／０９６，６９７号明細書、２０１４年１２月２４日、ＡＡＶを有する又はそれに関連するＣＲＩＳＰＲ（ＣＲＩＳＰＲ  ＨＡＶＩＮＧ  ＯＲ  ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＷＩＴＨ  ＡＡＶ）；米国仮特許出願第６２／０９８，１５８号明細書、２０１４年１２月３０日、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ複合体の挿入ターゲティングシステム（ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ  ＣＲＩＳＰＲ  ＣＯＭＰＬＥＸ  ＩＮＳＥＲＴＩＯＮＡＬ  ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭＳ）；米国仮特許出願第６２／１５１，０５２号明細書、２０１５年４月２２日、細胞外エキソソームレポートのための細胞ターゲティング（ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＦＯＲ  ＥＸＴＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＥＸＯＳＯＭＡＬ  ＲＥＰＯＲＴＩＮＧ）；米国仮特許出願第６２／０５４，４９０号明細書、２０１４年９月２４日、粒子送達成分を用いた障害及び疾患のターゲティング用ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ系及び組成物の送達、使用及び治療適用（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ  ＡＮＤ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ＵＳＩＮＧ  ＰＡＲＴＩＣＬＥ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ）；米国仮特許出願第６２／０５５，４８４号明細書、２０１４年９月２５日、最適化した機能性ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムによる配列操作のためのシステム、方法及び組成物（ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ  ＷＩＴＨ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ）；米国仮特許出願第６２／０８７，５３７号明細書、２０１４年１２月４日、最適化した機能性ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムによる配列操作のためのシステム、方法及び組成物（ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ  ＷＩＴＨ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ）；米国仮特許出願第６２／０５４，６５１号明細書、２０１４年９月２４日、インビボでの複数の癌突然変異の競合をモデル化するためのＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステム及び組成物の送達、使用及び治療適用（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＥＬＩＮＧ  ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＵＬＴＩＰＬＥ  ＣＡＮＣＥＲ  ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＶＩＶＯ）；米国仮特許出願第６２／０６７，８８６号明細書、２０１４年１０月２３日、インビボでの複数の癌突然変異の競合をモデル化するためのＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステム及び組成物の送達、使用及び治療適用（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＭＯＤＥＬＩＮＧ  ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＵＬＴＩＰＬＥ  ＣＡＮＣＥＲ  ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＶＩＶＯ）；米国仮特許出願第６２／０５４，６７５号明細書、２０１４年９月２４日、神経細胞／組織におけるＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステム及び組成物の送達、使用及び治療適用（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＮＥＵＲＯＮＡＬ  ＣＥＬＬＳ／ＴＩＳＳＵＥＳ）；米国仮特許出願第６２／０５４，５２８号明細書、２０１４年９月２４日、免疫疾患又は障害におけるＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ系及び組成物の送達、使用及び治療適用（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＥ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ＯＲ  ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ）；米国仮特許出願第６２／０５５，４５４号明細書、２０１４年９月２５日、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を用いた障害及び疾患のターゲティング用ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ系及び組成物の送達、使用及び治療適用（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ  ＡＮＤ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ＵＳＩＮＧ  ＣＥＬＬ  ＰＥＮＥＴＲＡＴＩＯＮ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ（ＣＰＰ））；米国仮特許出願第６２／０５５，４６０号明細書、２０１４年９月２５日、多機能性ＣＲＩＳＰＲ複合体及び／又は最適化酵素連結型機能性ＣＲＩＳＰＲ複合体（ＭＵＬＴＩＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ−ＣＲＩＳＰＲ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ  ＡＮＤ／ＯＲ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＥＮＺＹＭＥ  ＬＩＮＫＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ−ＣＲＩＳＰＲ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ）；米国仮特許出願第６２／０８７，４７５号明細書、２０１４年１２月４日、最適化した機能性ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムによる機能スクリーニング（ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＷＩＴＨ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ）；米国仮特許出願第６２／０５５，４８７号明細書、２０１４年９月２５日、最適化した機能性ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムによる機能スクリーニング（ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＷＩＴＨ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ）；米国仮特許出願第６２／０８７，５４６号明細書、２０１４年１２月４日、多機能性ＣＲＩＳＰＲ複合体及び／又は最適化酵素連結型機能性ＣＲＩＳＰＲ複合体（ＭＵＬＴＩＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＲＩＳＰＲ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ  ＡＮＤ／ＯＲ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＥＮＺＹＭＥ  ＬＩＮＫＥＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ−ＣＲＩＳＰＲ  ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ）；及び米国仮特許出願第６２／０９８，２８５号明細書、２０１４年１２月３０日、腫瘍成長及び転移のＣＲＩＳＰＲ媒介性インビボモデリング及び遺伝子スクリーニング（ＣＲＩＳＰＲ  ＭＥＤＩＡＴＥＤ  ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＭＯＤＥＬＩＮＧ  ＡＮＤ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＯＦ  ＴＵＭＯＲ  ＧＲＯＷＴＨ  ＡＮＤ  ＭＥＴＡＳＴＡＳＩＳ）も挙げられる。
【０６３０】
各々、新規ＣＲＩＳＰＲ酵素及びシステム（ＮＯＶＥＬ  ＣＲＩＳＰＲ  ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ）と題される、２０１５年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／１８１，７３９号明細書、２０１５年７月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／１９３，５０７号明細書、２０１５年８月５日に出願された米国仮特許出願第６２／２０１，５４２号明細書、２０１５年８月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／２０５，７３３号明細書、２０１５年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／２３２，０６７号明細書、２０１５年１２月１８日に出願された米国特許出願第１４／９７５，０８５号明細書、及び２０１６年６月１７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３８１８１号明細書が参照される。新規ＣＲＩＳＰＲ酵素及びシステム（ＮＯＶＥＬ  ＣＲＩＳＰＲ  ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ）と題される２０１６年４月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／３２４，８３４号明細書が参照される。各々、新規ＣＲＩＳＰＲ酵素及びシステム（ＮＯＶＥＬ  ＣＲＩＳＰＲ  ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ）と題される、２０１６年４月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／３２４，８２０号明細書、２０１６年６月７１日に出願された米国仮特許出願第６２／３５１，５５８号明細書、２０１６年７月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／３６０，７６５号明細書、及び２０１６年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／４１０，１９６号明細書が参照される。各々、新規ＣＲＩＳＰＲ酵素及びシステム（ＮＯＶＥＬ  ＣＲＩＳＰＲ  ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ）と題される、２０１６年４月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／３２４，７７７号明細書、２０１６年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／３７６，３７９号明細書、及び２０１６年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／４１０，２４０号明細書が参照される。
【０６３１】
これらの特許、特許公報、及び出願の各々、並びにそれらの中に又はそれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）及び出願引用文献において引用又は参照される全ての文献は、それらの中で言及される又はそれらの中にある任意の文献において言及される及び参照によって本明細書に援用される任意の製品に関する任意の指示書、説明書、製品仕様書、及びプロダクトシートと共に、本明細書によって参照により本明細書に援用され、且つ本発明の実施に用いることができる。全ての文献（例えば、これらの特許、特許公報及び出願並びに出願引用文献）は、各個別の文献が参照によって援用されることが具体的且つ個別的に示されたものとみなすのと同程度に参照により本明細書に援用される。
【０６３２】
また、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に関する一般情報に関しては、以下を挙げることができる（同様に参照により本明細書に援用される）：
・「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いた多重ゲノムエンジニアリング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ）」．Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｂａｒｒｅｔｔｏ，Ｒ．，Ｈａｂｉｂ，Ｎ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，＆  Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８１９−２３（２０１３）；
・「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を用いた細菌ゲノムのＲＮＡガイド下編集（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ）」．Ｊｉａｎｇ  Ｗ．，Ｂｉｋａｒｄ  Ｄ．，Ｃｏｘ  Ｄ．，Ｚｈａｎｇ  Ｆ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ  ＬＡ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｍａｒ；３１（３）：２３３−９（２０１３）；
・「複数の遺伝子に突然変異を有するマウスのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性ゲノムエンジニアリングによるワンステップ生成（Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｅ  Ｃａｒｒｙｉｎｇ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」．Ｗａｎｇ  Ｈ．，Ｙａｎｇ  Ｈ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ  ＣＳ．，Ｄａｗｌａｔｙ  ＭＭ．，Ｃｈｅｎｇ  ＡＷ．，Ｚｈａｎｇ  Ｆ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ  Ｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍａｙ  ９；１５３（４）：９１０−８（２０１３）；
・「哺乳類内因性転写及び後成状態の光学制御（Ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔａｔｅｓ）」．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ  ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ  ＡＥ，Ｈｓｕ  ＰＤ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ  Ｍ，Ｃｏｎｇ  Ｌ，Ｐｌａｔｔ  ＲＪ，Ｓｃｏｔｔ  ＤＡ，Ｃｈｕｒｃｈ  ＧＭ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ．Ａｕｇ  ２２；５００（７４６３）：４７２−６．ｄｏｉ：１０．１０３８／Ｎａｔｕｒｅ１２４６６．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ａｕｇ  ２３（２０１３）；
・「ゲノム編集特異性を増強するためのＲＮＡガイド下ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９による二重ニッキング（Ｄｏｕｂｌｅ  Ｎｉｃｋｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｌｉｎ，ＣＹ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ＪＳ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，ＡＥ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｉｎｏｕｅ，Ａ．，Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，＆  Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｃｅｌｌ  Ａｕｇ  ２８．ｐｉｉ：Ｓ００９２−８６７４（１３）０１０１５−５（２０１３−Ａ）；
・「ＲＮＡガイド下Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＤＮＡターゲティング特異性（ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）」．Ｈｓｕ，Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｒａｄｉｃｋ，ＴＪ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，ＬＡ．，Ｂａｏ，Ｇ．，＆  Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）；
・「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を用いたゲノムエンジニアリング（Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ）」．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１−３０８（２０１３−Ｂ）；
・「ヒト細胞におけるゲノム規模のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ノックアウトスクリーニング（Ｇｅｎｏｍｅ−Ｓｃａｌｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ）」．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｃ  １２．（２０１３）．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］；
・「ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとを有する複合体におけるｃａｓ９の結晶構造（Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃａｓ９  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ）」．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｓｈｅｈａｔａ，ＳＩ．，Ｄｏｈｍａｅ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｔａｎｉ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｎｕｒｅｋｉ，Ｏ．Ｃｅｌｌ  Ｆｅｂ  ２７，１５６（５）：９３５−４９（２０１４）；
・「哺乳類細胞におけるＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼＣａｓ９のゲノムワイドな結合（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｃａｓ９  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｗｕ  Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ  ＤＡ．，Ｋｒｉｚ  ＡＪ．，Ｃｈｉｕ  ＡＣ．，Ｈｓｕ  ＰＤ．，Ｄａｄｏｎ  ＤＢ．，Ｃｈｅｎｇ  ＡＷ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ  ＡＥ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  Ｓ．，Ｃｈｅｎ  Ｓ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ  Ｒ．，Ｚｈａｎｇ  Ｆ．，Ｓｈａｒｐ  ＰＡ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｒ  ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８８９（２０１４）；
・「ゲノム編集及び癌モデリングのためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ノックインマウス（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  Ｋｎｏｃｋｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ）」．Ｐｌａｔｔ  ＲＪ，Ｃｈｅｎ  Ｓ，Ｚｈｏｕ  Ｙ，Ｙｉｍ  ＭＪ，Ｓｗｉｅｃｈ  Ｌ，Ｋｅｍｐｔｏｎ  ＨＲ，Ｄａｈｌｍａｎ  ＪＥ，Ｐａｒｎａｓ  Ｏ，Ｅｉｓｅｎｈａｕｒｅ  ＴＭ，Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ  Ｍ，Ｇｒａｈａｍ  ＤＢ，Ｊｈｕｎｊｈｕｎｗａｌａ  Ｓ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ  Ｍ，Ｘａｖｉｅｒ  ＲＪ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＤＧ，Ｈａｃｏｈｅｎ  Ｎ，Ｒｅｇｅｖ  Ａ，Ｆｅｎｇ  Ｇ，Ｓｈａｒｐ  ＰＡ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ．Ｃｅｌｌ  １５９（２）：４４０−４５５  ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０１４（２０１４）；
・「ゲノムエンジニアリングに向けたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の開発及び適用（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」，Ｈｓｕ  ＰＤ，Ｌａｎｄｅｒ  ＥＳ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ．，Ｃｅｌｌ．Ｊｕｎ  ５；１５７（６）：１２６２−７８（２０１４）
・「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いたヒト細胞における遺伝子スクリーニング（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｃｒｅｅｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ）」，Ｗａｎｇ  Ｔ，Ｗｅｉ  ＪＪ，Ｓａｂａｔｉｎｉ  ＤＭ，Ｌａｎｄｅｒ  ＥＳ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｊａｎｕａｒｙ  ３；３４３（６１６６）：８０−８４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４６９８１（２０１４）；
・「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介性遺伝子不活性化のための高活性ｓｇＲＮＡの合理的設計（Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｇＲＮＡｓ  ｆｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」，Ｄｏｅｎｃｈ  ＪＧ，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ  Ｅ，Ｇｒａｈａｍ  ＤＢ，Ｔｏｔｈｏｖａ  Ｚ，Ｈｅｇｄｅ  Ｍ，Ｓｍｉｔｈ  Ｉ，Ｓｕｌｌｅｎｄｅｒ  Ｍ，Ｅｂｅｒｔ  ＢＬ，Ｘａｖｉｅｒ  ＲＪ，Ｒｏｏｔ  ＤＥ．，（オンライン発行  ３  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１４）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｄｅｃ；３２（１２）：１２６２−７（２０１４）；
・「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いた哺乳類脳における遺伝子機能のインビボ探索（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｒａｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）」，Ｓｗｉｅｃｈ  Ｌ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ  Ｍ，Ｂａｎｅｒｊｅｅ  Ａ，Ｈａｂｉｂ  Ｎ，Ｌｉ  Ｙ，Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ  Ｊ，Ｓｕｒ  Ｍ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ．，（オンライン発行  １９  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１４）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊａｎ；３３（１）：１０２−６（２０１５）；
・「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体によるゲノム規模の転写活性化（Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｃｏｍｐｌｅｘ）」，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ  ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ  ＡＥ，Ｊｏｕｎｇ  Ｊ，Ａｂｕｄａｙｙｅｈ  ＯＯ，Ｂａｒｃｅｎａ  Ｃ，Ｈｓｕ  ＰＤ，Ｈａｂｉｂ  Ｎ，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ  ＪＳ，Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  Ｈ，Ｎｕｒｅｋｉ  Ｏ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ．，Ｎａｔｕｒｅ．Ｊａｎ  ２９；５１７（７５３６）：５８３−８（２０１５）
・「誘導性ゲノム編集及び転写調節のためのスプリットＣａｓ９アーキテクチャ（Ａ  ｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」，Ｚｅｔｓｃｈｅ  Ｂ，Ｖｏｌｚ  ＳＥ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ．，（オンライン発行  ０２  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｆｅｂ；３３（２）：１３９−４２（２０１５）；
・「腫瘍成長及び転移マウスモデルにおけるゲノムワイドなＣＲＩＳＰＲスクリーニング（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｓｃｒｅｅｎ  ｉｎ  ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）」，Ｃｈｅｎ  Ｓ，Ｓａｎｊａｎａ  ＮＥ，Ｚｈｅｎｇ  Ｋ，Ｓｈａｌｅｍ  Ｏ，Ｌｅｅ  Ｋ，Ｓｈｉ  Ｘ，Ｓｃｏｔｔ  ＤＡ，Ｓｏｎｇ  Ｊ，Ｐａｎ  ＪＱ，Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ  Ｒ，Ｌｅｅ  Ｈ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ，Ｓｈａｒｐ  ＰＡ．Ｃｅｌｌ  １６０，１２４６−１２６０，Ｍａｒｃｈ  １２，２０１５（マウスにおける多重スクリーニング）、及び
・「黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９を用いたインビボゲノム編集（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９）」，Ｒａｎ  ＦＡ，Ｃｏｎｇ  Ｌ，Ｙａｎ  ＷＸ，Ｓｃｏｔｔ  ＤＡ，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ  ＪＳ，Ｋｒｉｚ  ＡＪ，Ｚｅｔｓｃｈｅ  Ｂ，Ｓｈａｌｅｍ  Ｏ，Ｗｕ  Ｘ，Ｍａｋａｒｏｖａ  ＫＳ，Ｋｏｏｎｉｎ  ＥＶ，Ｓｈａｒｐ  ＰＡ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ．，（オンライン発行  ０１  Ａｐｒｉｌ  ２０１５），Ｎａｔｕｒｅ．Ａｐｒ  ９；５２０（７５４６）：１８６−９１（２０１５）
・Ｓｈａｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いたハイスループット機能ゲノミクス（Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，２９９−３１１（Ｍａｙ  ２０１５）
・Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，「改良ＣＲＩＳＰＲ  ｓｇＲＮＡ設計の配列決定因子（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ  ｓｇＲＮＡ  ｄｅｓｉｇｎ）」，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５，１１４７−１１５７（Ａｕｇｕｓｔ  ２０１５）
・Ｐａｒｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，「初代免疫細胞におけるゲノムワイドなＣＲＩＳＰＲスクリーニングによる調節ネットワークの分析（Ａ  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｓｃｒｅｅｎ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  Ｄｉｓｓｅｃｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ）」，Ｃｅｌｌ  １６２，６７５−６８６（Ｊｕｌｙ  ３０，２０１５）
・Ｒａｍａｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，「ウイルスＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断はＢ型肝炎ウイルスを効率的に抑制する（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：１０８３３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１０８３３（Ｊｕｎｅ  ２，２０１５）
・Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，「黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９の結晶構造（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９）」，Ｃｅｌｌ  １６２，１１１３−１１２６（Ａｕｇ．２７，２０１５）
・Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５），「Ｃｐｆ１  ｉｓ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ」Ｃｅｌｌ  １６３，７５９−７７１（Ｏｃｔ．２２，２０１５）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０９．０３８．Ｅｐｕｂ  Ｓｅｐ．２５，２０１５
・Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５），「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ６０，３８５−３９７（Ｎｏｖ．５，２０１５）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１５．１０．００８．Ｅｐｕｂ  Ｏｃｔ  ２２，２０１５
・Ｙａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃｐｆ１  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ  ＲＮＡ」Ｃｅｌｌ  １６５，９４９−９６２（Ｍａｙ  ５，２０１６）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．０４．００３．Ｅｐｕｂ  Ａｐｒ．２１，２０１６
・Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｃｐｆ１  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｔｅｒｅｄ  ＰＡＭ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ」ｂｉｏＲｘｉｖ  ０９１６１１；ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０９１６１１  Ｅｐｕｂ  Ｄｅｃ．４，２０１６
この各々が参照により本明細書に援用され、本発明の実施において考慮されてもよく、及び以下に簡単に考察する：
・Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、サーモフィラス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９及びまた化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の両方に基づき、真核細胞で使用されるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をエンジニアリングし、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが低分子ＲＮＡの指図を受けてヒト及びマウス細胞で正確なＤＮＡ切断を誘導し得ることを実証した。この著者らの研究は更に、ニッキング酵素に変換されるＣａｓ９を使用して、最小限の変異原活性を有する真核細胞での相同性組換え修復を促進し得ることを示した。加えて、この著者らの研究は、複数のガイド配列を単一のＣＲＩＳＰＲ配列にコードすることによって哺乳類ゲノム内の内在性ゲノム遺伝子座部位でいくつかを同時に編集することが可能となり得ることを実証し、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ技術の容易なプログラム可能性及び広範な適用性を実証した。このようにＲＮＡを使用して細胞における配列特異的ＤＮＡ切断をプログラムすることが可能となり、ゲノムエンジニアリングツールの新しいクラスが定義された。これらの研究は更に、他のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が哺乳類細胞に移植可能である可能性があり、哺乳類ゲノム切断も媒介し得ることを示した。重要なことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のいくつかの側面を更に改良してその効率及び多用途性を高め得ることが想定され得る。
・Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、デュアルＲＮＡと複合体を形成したクラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のゲノムに正確な突然変異を導入した。この手法は、標的ゲノム部位におけるデュアルＲＮＡ：Ｃａｓ９誘導切断によって非突然変異細胞を死滅させることに頼ったもので、選択可能マーカー又は対抗選択系の必要性が回避される。この研究は、単一及び複数のヌクレオチド変化が生じるように短鎖ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の配列を変えることによってデュアルＲＮＡ：Ｃａｓ９特異性を再プログラム化すると、鋳型の編集が行われることを報告した。この研究は、２つのｃｒＲＮＡを同時に使用すると突然変異誘発の多重化が可能であることを示した。更に、この手法を組換えと組み合わせて用いたとき、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）では、記載される手法を用いて回収された細胞のほぼ１００％が所望の突然変異を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では回収された細胞の６５％が突然変異を含んだ。
・Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いることにより、胚性幹細胞における逐次的組換え及び／又は及び／又は時間のかかる単一突然変異を有するマウスの交雑による複数の段階で従来作成された複数の遺伝子に突然変異を保有するマウスを一段階で作成した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は機能的に重複する遺伝子及び上位遺伝子相互作用のインビボ研究を大幅に加速させ得る。
・Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９酵素及びまた転写活性化因子様エフェクターに基づくＤＮＡ結合ドメインの光学的及び化学的調節を可能にする多用途の且つロバストな技術が当該技術分野で必要とされていることに対処した。
・Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３−Ａ）は、Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異体を対のガイドＲＮＡと組み合わせて標的二本鎖切断を導入するという手法を記載した。これは、微生物ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のＣａｓ９ヌクレアーゼがガイド配列によって特異的なゲノム遺伝子座に標的化されるが、ガイド配列はＤＮＡ標的との幾らかのミスマッチに耐えることができるため、従って望ましくないオフターゲット突然変異誘発を促進し得るという問題に対処する。ゲノム中の個々のニックは高いフィデリティーで修復されるため、二本鎖切断には適切にオフセットしたガイドＲＮＡによる同時のニッキングが必要であり、標的切断のために特異的に認識される塩基の数が大きくなる。この著者らは、対のニッキングを使用して細胞系におけるオフターゲット活性を５０〜１，５００分の１に減らし、オンターゲット切断効率を犠牲にすることなしにマウス接合体における遺伝子ノックアウトを促進し得ることを実証した。この多用途戦略により、高い特異性が要求される多種多様なゲノム編集適用が可能となる。
・Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）は、標的部位の選択を知らせ、且つオフターゲット効果を回避するためのヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９ターゲティングの特異性を特徴付けた。この研究は、７００個を超えるガイドＲＮＡ変異体並びに２９３Ｔ及び２９３ＦＴ細胞の１００個を超える予測ゲノムオフターゲット遺伝子座におけるＳｐＣａｓ９誘導インデル突然変異レベルを評価した。この著者ら、ＳｐＣａｓ９が、ミスマッチの数、位置及び分布に感受性を示して配列依存的に種々の位置におけるガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間のミスマッチに耐えること。この著者らは更に、ＳｐＣａｓ９媒介性切断がＤＮＡメチル化の影響を受けないこと、ＳｐＣａｓ９及びｇＲＮＡの投与量を滴定してオフターゲット改変を最小限に抑え得ることを示した。加えて、哺乳類ゲノムエンジニアリング適用を促進するため、この著者らは、標的配列の選択及び検証並びにオフターゲット解析をガイドするウェブベースのソフトウェアツールの提供を報告した。
・Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３−Ｂ）は、哺乳類細胞における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同性組換え修復（ＨＤＲ）を用いたＣａｓ９媒介性ゲノム編集用並びに下流機能研究のための改変細胞系作成用の一組のツールを記載した。オフターゲット切断を最小限に抑えるため、この著者らは更に、対のガイドＲＮＡを含むＣａｓ９ニッカーゼ突然変異体を使用した二重ニッキング戦略を記載した。この著者らによって提供されるプロトコルから、標的部位の選択、切断効率の評価及びオフターゲット活性の分析に関する指針が実験的に導かれた。この研究は、標的設計から始めて、僅か１〜２週間以内に遺伝子改変を達成し得るとともに、２〜３週間以内に改変クローン細胞系を誘導し得ることを示した。
・Ｓｈａｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．は、ゲノムワイドな規模で遺伝子機能を調べる新しい方法を記載した。この著者らの研究は、６４，７５１個のユニークなガイド配列で１８，０８０個の遺伝子を標的化するゲノム規模のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリの送達が、ヒト細胞におけるネガティブ選択及びポジティブ選択の両方のスクリーニングを可能にしたことを示した。第一に、この著者らは、ＧｅＣＫＯライブラリを使用した、癌及び多能性幹細胞における細胞生存にとって不可欠な遺伝子の同定を示した。次に、この著者らは黒色腫モデルにおいて、その欠損が突然変異体プロテインキナーゼＢＲＡＦを阻害する治療薬ベムラフェニブに対する耐性に関わる遺伝子をスクリーニングした。この著者らの研究は、最も上位にランク付けされた候補に、以前検証された遺伝子ＮＦ１及びＭＥＤ１２並びに新規ヒットＮＦ２、ＣＵＬ３、ＴＡＤＡ２Ｂ、及びＴＡＤＡ１が含まれたことを示した。この著者らは、同じ遺伝子を標的化する独立したガイドＲＮＡ間における高度な一致及び高率のヒット確認を観察し、従ってＣａｓ９によるゲノム規模スクリーニングの有望さを実証した。
・Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．は、２．５Åの分解能でｓｇＲＮＡ及びその標的ＤＮＡと複合体形成する化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造を報告した。この構造から、標的認識ローブとヌクレアーゼローブとで構成された、それらの界面にある正電荷の溝にｓｇＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖を受け入れる２ローブ構成が明らかになった。認識ローブはｓｇＲＮＡ及びＤＮＡの結合に決定的に重要であるのに対し、ヌクレアーゼローブはＨＮＨ及びＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含み、これらのドメインは標的ＤＮＡのそれぞれ相補鎖及び非相補鎖の切断に適切な位置にある。ヌクレアーゼローブはまた、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）との相互作用に関与するカルボキシル末端ドメインも含む。この高分解能構造解析及び付随する機能解析により、Ｃａｓ９によるＲＮＡガイド下ＤＮＡターゲティングの分子機構が明らかになることで、ひいては新規の多用途ゲノム編集技術の合理的な設計への道が開かれつつある。
・Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．は、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）においてシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を負荷した化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）のゲノムワイドな結合部位をマッピングした。この著者らは、試験した４つのｓｇＲＮＡの各々が、多くの場合にｓｇＲＮＡにおける５ヌクレオチドシード領域及びＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）によって特徴付けられる数十個ないし数千個のゲノム部位にｄＣａｓ９を標的化することを示した。クロマチンが接触不可能であることにより、一致するシード配列を含む他の部位に対するｄＣａｓ９結合が減少し；従ってオフターゲット部位の７０％が遺伝子と会合する。この著者らは、触媒活性Ｃａｓ９を形質移入したｍＥＳＣにおける２９５個のｄＣａｓ９結合部位の標的シーケンシングから、バックグラウンドレベルを上回って突然変異した部位は１つのみ同定されたことを示した。この著者らは、Ｃａｓ９結合及び切断の２状態モデルを提案しており、このモデルではシードの一致が結合を引き起こすが、切断には標的ＤＮＡとの広範な対合が必要である。
・Ｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．はＣｒｅ依存性Ｃａｓ９ノックインマウスを樹立した。この著者らは、ニューロン、免疫細胞、及び内皮細胞においてガイドＲＮＡのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性、レンチウイルス媒介性、又は粒子媒介性送達を用いたインビボ並びにエキソビボゲノム編集を実証した。
・Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）は、細胞の遺伝子スクリーニングを含めたヨーグルトからゲノム編集に至るまでのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の歴史を広く考察するレビュー論文である。
・Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）は、ゲノム規模のレンチウイルスシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ライブラリを使用するポジティブ選択及びネガティブ選択の両方に好適なプールされた機能喪失型遺伝子スクリーニング手法に関する。
・Ｄｏｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．は、６個の内因性マウス遺伝子及び３個の内因性ヒト遺伝子のパネルの可能な全ての標的部位にわたってタイリングするｓｇＲＮＡのプールを作成し、その標的遺伝子のヌル対立遺伝子を産生するそれらの能力を抗体対比染色及びフローサイトメトリーによって定量的に評価した。この著者らは、ＰＡＭの最適化により活性が向上することを示し、また、ｓｇＲＮＡを設計するためのオンラインツールも提供した。
・Ｓｗｉｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．は、ＡＡＶ媒介性ＳｐＣａｓ９ゲノム編集により脳における遺伝子機能の逆遺伝学研究が可能となり得ることを実証している。
・Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）は、複数のエフェクタードメイン、例えば、転写アクチベーター、機能及びエピゲノム調節因子をステム又はテトラループなどのガイド上の適切な位置にリンカーを伴い及び伴わず付加する能力を考察している。
・Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．は、Ｃａｓ９酵素が２つにスプリットされることができ、ひいては活性化のためのＣａｓ９のアセンブリを制御し得ることを実証している。
・Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．は、マウスにおけるゲノムワイドなインビボＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９スクリーニングによって肺転移の調節遺伝子が明らかになることを実証することによる多重スクリーニングに関する。
・Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）はＳａＣａｓ９及びそのゲノム編集能力に関し、生化学アッセイからは推定できないことを実証している。
・Ｓｈａｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）は、触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）の融合物を用いて発現を合成的に抑制（ＣＲＩＳＰＲｉ）又は活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）する方法について記載し、アレイ化及びプール化されたスクリーニングを含めたゲノム規模のスクリーニング、ゲノム遺伝子座を不活性化させるノックアウト手法及び転写活性を調節するストラテジーにＣａｓ９を用いる進歩を示している。
・Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）は、ＣＲＩＳＰＲベースのスクリーニングにおけるシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の効率に寄与するＤＮＡ配列特徴を評価した。この著者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトの効率及び切断部位におけるヌクレオチド優先度を調査した。この著者らはまた、ＣＲＩＳＰＲｉ／ａの配列優先度がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトのものと実質的に異なることも見出した。
・Ｐａｒｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）は、ゲノムワイドなプールＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ライブラリを樹状細胞（ＤＣ）に導入することにより、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）による腫瘍壊死因子（Ｔｎｆ）の誘導を制御する遺伝子を同定した。Ｔｌｒ４シグナル伝達の既知の調節因子及びこれまで知られていない候補が同定され、ＬＰＳに対するカノニカルな応答への個別的な効果を有する３つの機能モジュールに分類された。
・Ｒａｍａｎａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）は、感染細胞におけるウイルスエピソームＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の切断を実証した。ＨＢＶゲノムは感染ヘパトサイトの核に、共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）と呼ばれる３．２ｋｂの二本鎖エピソームＤＮＡ種として存在し、ｃｃｃＤＮＡは、現在の治療法によってはその複製が阻害されないＨＢＶライフサイクルの主要な構成成分である。この著者らは、ＨＢＶの高度に保存された領域を特異的に標的化するｓｇＲＮＡがウイルス複製をロバストに抑制し、ｃｃｃＤＮＡを枯渇させることを示した。
・Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）は、５’−ＴＴＧＡＡＴ−３’ＰＡＭ及び５’−ＴＴＧＧＧＴ−３’ＰＡＭを含有する、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）及びその二本鎖ＤＮＡ標的との複合体中のＳａＣａｓ９の結晶構造を報告した。ＳａＣａｓ９とＳｐＣａｓ９の構造比較により、構造的保存及び多様性の両方が明らかとなり、それらの特徴的なＰＡＭ特異性及びオルソロガスｓｇＲＮＡ認識が説明された。
・Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）は、推定クラス２  ＣＲＩＳＰＲエフェクターであるＣｐｆ１の特徴付けを報告した。Ｃｐｆ１はＣａｓ９と異なる特徴を有してロバストなＤＮＡ干渉を媒介することが実証された。この干渉機構の同定により、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に関する我々の理解が深まり、そのゲノム編集適用が進歩する。
・Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）は、３つの異なるクラス２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の特徴付けを報告した。同定された系のうちの２つのエフェクター、Ｃ２ｃ１及びＣ２ｃ３は、Ｃｐｆ１と遠縁のＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含む。第３の系、Ｃ２ｃ２は、２つの予想ＨＥＰＮ  ＲＮアーゼドメインを有するエフェクターを含む。
・Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）は、構造誘導型飽和突然変異誘発スクリーニングを用いてＣｐｆ１のターゲティング範囲を増加させることを報告した。ＡｓＣｐｆ１変異体が、それぞれＴＹＣＶ／ＣＣＣＣ及びＴＡＴＶ  ＰＡＭを有する標的部位を切断することのできる突然変異Ｓ５４２Ｒ／Ｋ６０７Ｒ及びＳ５４２Ｒ／Ｋ５４８Ｖ／Ｎ５５２Ｒによってエンジニアリングされ、インビトロ及びヒト細胞における活性が増進した。
【０６３３】
また、「高度に特異的なゲノム編集のための二量体ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡガイド下ＦｏｋＩヌクレアーゼ（Ｄｉｍｅｒｉｃ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＦｏｋＩ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ）」，Ｓｈｅｎｇｄａｒ  Ｑ．Ｔｓａｉ，Ｎｉｃｏｌａｓ  Ｗｙｖｅｋｅｎｓ，Ｃｙｄ  Ｋｈａｙｔｅｒ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ａ．Ｆｏｄｅｎ，Ｖｉｓｈａｌ  Ｔｈａｐａｒ，Ｄｅｅｐａｋ  Ｒｅｙｏｎ，Ｍａｔｈｅｗ  Ｊ．Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ａｒｙｅｅ，Ｊ．Ｋｅｉｔｈ  Ｊｏｕｎｇ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２（６）：５６９−７７（２０１４）は、伸長配列を認識する、且つヒト細胞において高効率で内因性遺伝子を編集することのできる二量体ＲＮＡガイド下ＦｏｋＩヌクレアーゼに関する。
【０６３４】
加えて、ｓｇＲＮＡ・Ｃａｓ９タンパク質含有粒子を調製する方法であって、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質（及び任意選択でＨＤＲ鋳型）を含む混合物を、界面活性剤、リン脂質、生分解性ポリマー、リポタンパク質及びアルコールを含むか又はそれらから本質的になるか又はそれらからなる混合物と混合するステップを含む方法；及びかかる方法からの粒子に関して、参照により本明細書に援用される「粒子送達成分を用いた障害及び疾患のターゲティング用ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ系及び組成物の送達、使用及び治療適用（ＤＥＬＩＶＥＲＹ，ＵＳＥ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ  ＡＮＤ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ＵＳＩＮＧ  ＰＡＲＴＩＣＬＥ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ）」と題されるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７００５７号明細書（国際公開第２０１５／０８９４１９号パンフレット）（２０１４年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／０５４，４９０号明細書；２０１４年６月１０日に出願された同第６２／０１０，４４１号明細書；及び各々２０１３年１２月１２日に出願された同第６１／９１５，１１８号明細書、同第６１／９１５，２１５号明細書及び同第６１／９１５，１４８号明細書の１つ以上又は全てからの優先権を主張する）（「粒子送達ＰＣＴ」）が挙げられる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとが、有利には滅菌ヌクレアーゼフリー緩衝液、例えば１×ＰＢＳ中に、好適な、例えば３：１〜１：３又は２：１〜１：２又は１：１のモル比で、好適な温度、例えば１５〜３０℃、例えば２０〜２５℃、例えば室温で、好適な時間、例えば１５〜４５、例えば３０分間にわたり共に混合された。それとは別に、界面活性剤、例えばカチオン性脂質、例えば１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；リン脂質、例えばジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）；生分解性ポリマー、例えばエチレングリコールポリマー又はＰＥＧ、及びリポタンパク質、例えば低密度リポタンパク質、例えばコレステロールなどの、又はそれらを含む粒子成分が、アルコール、有利にはＣ１〜６アルキルアルコール、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、例えば１００％エタノール中に溶解された。これらの２つの溶液を共に混合すると、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体を含有する粒子が形成された。従って、複合体全体を粒子に製剤化する前に、ｓｇＲＮＡをＣａｓ９タンパク質と予め複合体化してもよい。製剤は、細胞への核酸の送達を促進することが知られる種々のモル比の種々の成分（例えば１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジテトラデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びコレステロール）を含んで作製されてもよい。例えばＤＯＴＡＰ：ＤＭＰＣ：ＰＥＧ：コレステロールのモル比はＤＯＴＡＰ１００、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ０、コレステロール０；又はＤＯＴＡＰ９０、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ１０、コレステロ���ル０；又はＤＯＴＡＰ９０、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ５、コレステロール５、ＤＯＴＡＰ１００、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ０、コレステロール０であってもよい。従って当該出願は、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質と粒子を形成する成分を混合すること；並びにかかる混合からの粒子を包含する。本発明の態様は、粒子；例えば、本発明にあるとおりのｓｇＲＮＡ及び／又はＣａｓ９を含む混合物と、例えば粒子送達ＰＣＴにあるとおりの、粒子を形成する成分とを混合して粒子を形成することにより、例えば、粒子送達ＰＣＴと類似した方法を使用する粒子、及びかかる混合ステップからの粒子（又は、当然ながら、本発明にあるとおりのｓｇＲＮＡ及び／又はＣａｓ９が関わる他の粒子）を含み得る。
【０６３５】
以下の実施例に本発明を更に説明するが、これらの実施例はあくまでも例示を目的として提供され、いかなる形であれ本発明を限定することは意図されない。
【実施例】
【０６３６】
実施例１：結晶構造を得るための実験手順
タンパク質調製：完全長ＡｓＣｐｆ１をコードする遺伝子を改変ｐＣｏｌｄ−ＧＳＴベクター（ＴａＫａＲａ）のＮｄｅｌ及びＸｈｏｌ部位間にクローニングした。このタンパク質を２０℃で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）において発現させて、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）によって精製した。溶出したタンパク質をＴＥＶプロテアーゼと共に４℃で一晩インキュベートしてＧＳＴタグを取り除き、Ｎｉ−ＮＴＡ、Ｍｏｎｏ  Ｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムで更にクロマトグラフィー精製した。ネイティブタンパク質についても同様のプロトコルを用いてＳｅＭｅｔ標識タンパク質を調製した。ＰＣＲ増幅鋳型を使用してｃｒＲＮＡをＴ７ポリメラーゼによってインビトロ転写し、１０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。標的ＤＮＡはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。精製したＣｐｆ１タンパク質をｃｒＲＮＡ及びＤＮＡと混合し（モル比１：１．５：２）、次にこの複合体を、１０ｍ＿Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＤＴＴを含有する緩衝液中、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。
【０６３７】
結晶学：精製したＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を２０℃でハンギングドロップ蒸気拡散法によって結晶化させた。１μｌの複合体溶液（Ａ２６０ｎｍ＜：：：＞１５）と１μｌのリザーバ溶液（１２％ＰＥＧ３，３５０、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭ酢酸アンモニウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１００ｍＭ  ＤＳＢ−２５６）とを混合することにより結晶が得られた。ネイティブタンパク質と同様の条件下でＳｅＭｅｔ標識タンパク質を結晶化させた。ＳＰｒｉｎｇ−８（兵庫県、日本）において００下ビームラインＢＬ３２ＸＵ及びＢＬ４１ＸＵでＸ線回折データを収集した。２５％エチレングリコールを補足したリザーバ溶液中に結晶を凍結保護処理した。Ｘ線回折データはＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ，２０１０）を用いて処理した。構造は、ＳＡＤ法により、ＳｅＭｅｔ標識結晶からの２．８Ａ分解能データを用いて決定した。ＳＨＥＬＸＤ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，２００８）及びａｕｔｏＳＨＡＲＰ（ｄｅｌａＦｏｒｔｅｌｌｅ  ａｎｄ  Ｂｒｉｃｏｇｎｅ，１９９７）を用いて潜在的な４４個のＳｅ原子のうち４０個の位置を決定した。ａｕｔｏＳＨＡＲＰを用いて初期位相を計算し、ＤＭ（Ｗｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を用いて２回のＮＣＳ平均化によって改善した。このモデルはＰＨＥＮＩＸ  ＡｕｔｏＳｏｌ（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を用いて自動で構築され、続いてＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ｃｏｗｔａｎ，２００４）を用いて手動でモデルを構築し、ＰＨＥＮＩＸ（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を用いて精密化した。未加工の２．４Ａ分解能データを使用して、得られたモデルを更に精密化した。
【０６３８】
実施例２：Ｃｐｆ１の結晶構造
ｃｒＲＮＡ（２４ｎｔ＋ＳＬ）、標的ＤＮＡ（２４ｎｔ＋１０ｎｔ）及び非標的ＤＮＡのセグメント（１０ｎｔ、ＴＴＴＡ  ＰＡＭ）と複合体化した突然変異Ｄ９０８Ａを含むＡｓＣｐｆ１から、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１複合体結晶構造を得た。
Ｐ２１２１２１：２．６Ａ  ｒｅｓ（Ｉｎｓドメインはディスオーダー）
Ｐ４１２１２：３．２Ａ  ｒｅｓ
アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）Ｃｐｆ１の結晶構造は、ＡｓＣｐｆ１結晶構造付属表に特徴付けられる。
【０６３９】
実施例３：ｃｒＲＮＡ及び標的ＤＮＡと複合体化したＣｐｆ１の結晶構造
Ｃｐｆ１は、ｃｒＲＮＡによって特異的ゲノム遺伝子座に標的化され得る微生物ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系由来のＲＮＡガイド下ヌクレアーゼである。本出願人らは、２．４Ａ分解能におけるｃｒＲＮＡ及びその標的ＤＮＡと複合体化したＡｓＣｐｆ１の結晶構造を報告する（図１〜図１５）。
【０６４０】
この例では、本出願人らは、２．４Ａ分解能におけるｃｒＲＮＡ及びその標的ＤＮＡと複合体化したＡｓＣｐｆ１の結晶構造を報告する。この高分解能構造により、ガイドＲＮＡ、標的ＤＮＡ、及びＣｐｆ１タンパク質を統合する重要な機能上の相互作用が明らかとなり、Ｃｐｆ１機能の増強並びに新規適用のエンジニアリングへの道が開かれる。
Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ−ＤＮＡ三元複合体の全体構造：本出願人らは、２４ヌクレオチド（ｎｔ）＋ＳＬ  ｃｒＲＮＡ及び２４＋１０ｎｔ標的ＤＮＡ、１０ｎｔ非標的ＤＮＡ（ＴＴＴＡ  ＰＡＭ）と複合体化した完全長ＡｓＣｐｆ１の結晶構造を、ＳｅＭｅｔ標識タンパク質を用いたＳＡＤ（単波長異常分散）法によって２．４Ａ分解能で解いた。
【０６４１】
図１〜図１５に示されるとおり、結晶構造から、Ｃｐｆ１が２つのローブ、認識（ＲＥＣ）ローブとヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブとからなることが明らかになった。ＡｓＣｐｆ１アミノ酸は、概して、ＡｓＣｐｆ１のうち図に示されるとおりの部分（例えば図１５を参照）及び表１に記載されるとおりの部分に割り当てられる。ＲＥＣローブは、ＲＥＣ１ドメインとＲＥＣ２ドメインとの２つのドメインに分けることができる。ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣ（残基８８４〜９３９、９５７〜１０６５、及び１２６２〜１３０７）、ＮＵＣ（残基１０６６〜１２６１）、ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）（残基５９８〜７１８）ドメイン、及びＷＥＤ（残基１〜２３、５２６〜５９７、及び７１９〜８８３）からなる。負電荷ｃｒＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド二重鎖は、ＲＥＣ及びＮＵＣローブ間の界面にある正電荷の溝に収まる。ＮＵＣローブにおいて、ＲｕｖＣドメインは３つのスプリットＲｕｖＣモチーフ（ＲｕｖＣ  Ｉ〜ＩＩＩ）が集まって形成され、これがＰＩドメインと界面を接して、ｃｒＲＮＡの３’テールと相互作用する正電荷表面を形成する。第２のヌクレアーゼドメインがＲｕｖＣ  ＩＩ〜ＩＩＩモチーフ間にあり、これはタンパク質の残りの部分とほんの僅か接触するに過ぎない。
【０６４２】
結晶構造に基づき以下の目的のアミノ酸位置が同定される：
【０６４３】
【表８】
2019503716.tif 000412
2019503716.tif 000413
2019503716.tif 000414
2019503716.tif 000415
2019503716.tif 000416
【０６４４】
実施例４：結晶構造を得るための実験手順
試料調製。完全長ＡｓＣｐｆ１（残基１〜１３０７）をコードする遺伝子を改変ｐＥ−ＳＵＭＯベクター（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ）のＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ部位間にクローニングした。このＡｓＣｐｆ１タンパク質を２０℃で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）において発現させて、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）及びＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でクロマトグラフィー精製した。このタンパク質をＴＥＶプロテアーゼと共に４℃で一晩インキュベートしてＨｉｓ６−ＳＵＭＯタグを取り除き、次にＮｉ−ＮＴＡカラムに通過させた。このタンパク質をＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で更にクロマトグラフィー精製した。セレノメチオニン（ＳｅＭｅｔ）標識ＡｓＣｐｆ１タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ８３４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）において発現させて、ネイティブタンパク質と同様のプロトコルを用いて精製した。ｃｒＲＮＡはＧｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎから購入した。標的及び非標的ＤＮＡ鎖はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。精製したＡｓＣｐｆ１タンパク質をｃｒＲＮＡ、標的ＤＮＡ鎖、及び非標的ＤＮＡ鎖（モル比、１：１．５：２．３：３．４）と混合し、次に再構成したＡｓＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ−標的ＤＮＡ複合体を、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＤＴＴからなる緩衝液中、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でゲルろ過クロマトグラフィーによって精製した。
【０６４５】
結晶学：精製したＡｓＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ−標的ＤＮＡ複合体を２０℃でハンギングドロップ蒸気拡散法によって結晶化させた。１μｌの複合体溶液（Ａ２８０ｎｍ＝１０）と１μｌのリザーバ溶液（８〜１０％ＰＥＧ３，３５０、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、及び１０〜１５％１，６−ヘキサンジオール）とを混合することによって結晶化ドロップを形成し、次に０．５ｍｌのリザーバ溶液に対してインキュベートした。１μｌの複合体溶液（Ａ２８０ｎｍ＝１０）と１μｌのリザーバ溶液（２７〜３０％ＰＥＧ４００、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、及び２００ｍＭ硫酸リチウム）とを同様の条件下で混合することにより、ＳｅＭｅｔ標識した複合体を結晶化させた。ネイティブ結晶は、１１％ＰＥＧ３，３５０、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５％１，６−ヘキサンジオール及び３０％エチレングリコールを含有する溶液中に凍結保護処理した。Ｓｅ−Ｍｅｔ標識した結晶は、３５％ＰＥＧ４００、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、２００ｍＭ硫酸リチウム及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する溶液中に凍結保護した。Ｘ線回折データを１００Ｋ下ＳＰｒｉｎｇ−８においてビームラインＢＬ４１ＸＵ及びＳｗｉｓｓ  Ｌｉｇｈｔ  ＳｏｕｒｃｅにおいてＰＸＩで収集した。Ｘ線回折データはＤＩＡＬＳ（Ｗａｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）及びＡＩＭＬＥＳＳ（Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，２０１３）を用いて処理した。構造はＰＨＥＮＩＸ  ＡｕｔｏＳｏｌ（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）を用いてＳｅ−ＳＡＤ法により決定した。構造モデルはＢｕｃｃａｎｅｅｒ（Ｃｏｗｔａｎ，２００６）を用いて自動で構築され、続いてＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ｃｏｗｔａｎ，２００４）を用いて手動でモデルを構築し、ＰＨＥＮＩＸ（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）を用いて構造を精密化した。
【０６４６】
【表９】
2019503716.tif 000417
【０６４７】
ＡｓＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ−標的ＤＮＡ複合体の全体構造。４３ｎｔ  ｃｒＲＮＡ、３４ｎｔ標的ＤＮＡ鎖、及び５’−ＴＴＴＮ−３’ＰＡＭを含有する１０ｎｔ非標的ＤＮＡ鎖と複合体化した完全長ＡｓＣｐｆ１（残基１〜１３０７）の２．８Å分解能結晶構造を単波長異常分散法（ＳＡＤ）法によって解いた（図１５及び図２２）。この構造から、ＡｓＣｐｆ１がαヘリックス認識（ＲＥＣ）ローブとヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブとからなる２ローブ構成をとり、ｃｒＲＮＡ−標的ＤＮＡヘテロ二重鎖がこれらの２つのローブ間にある正電荷の中心チャネルに結合していることが明らかになった（図１５Ｃ、図１５Ｄ及び図２３）。ＲＥＣローブはＲＥＣ１及びＲＥＣ２ドメインからなり、一方でＮＵＣローブはＲｕｖＣドメイン並びにＡ、Ｂ及びＣと称される３つの追加ドメインからなる（図１Ｃ）。
【０６４８】
Ｄａｌｉサーチ（Ｈｏｌｍ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｓｔｒｏｍ，２０１０）により、ＲＥＣ１、ＲＥＣ２、並びにＡ、Ｂ及びＣドメインと、利用可能なタンパク質構造のいずれとの間にも構造的類似性がないことが分かった。またＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）及びＨＨＰｒｅｄ（Ｓｏｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）を用いた配列データベース検索によっても、これらのドメインと現在のデータベース中にある任意のタンパク質配列との間に有意な類似性を見付けることはできなかった。従って、Ｃｐｆ１のこれらのドメインはＣｐｆ１タンパク質ファミリー外に検出可能なホモログを有さず、新規の構造フォールドをとるものと思われる（図１５Ｃ及び図２４）。
【０６４９】
ＲＥＣ１ドメインは１４個のαヘリックスを含み、一方、ＲＥＣ２ドメインは、９個のαヘリックス及び小さい逆平行シートを形成する２個のβストランドを含む（図２４Ａ及び図２４Ｂ）。ドメインＡ及びＢは、Ｃａｓ９のそれぞれＷＥＤ（ウェッジ）及びＰＩ（ＰＡＭ相互作用）ドメインと同様の機能的役割を果たすように見えるが、しかしＡｓＣｐｆ１のこれらの２つのドメインはＷＥＤ及びＰＩドメインと構造的に無関係である（以下に記載する）。ドメインＣはＤＮＡ切断に関与するものと見られる（以下に記載する）。従って、ドメインＡ、Ｂ及びＣは、それぞれＷＥＤ、ＰＩ及びＮｕｃドメインと称される。ＷＥＤドメインはＣｐｆ１配列中の３つの別個の領域（ＷＥＤ−Ｉ〜ＩＩＩ）が集まって形成される（図１５Ａ、図２４Ａ及び図２４Ｃ）。ＷＥＤドメインは、９本鎖の歪んだ逆平行βシート（β１〜β８及びβ１３）と、それに隣接する７個のαヘリックス（α１〜α６及びα９）を含むコアサブドメインと、４個のβストランド（β９〜β１２）及び２個のαヘリックス（α７及びα８）を含むサブドメインとに分けることができる（図２４Ａ及び図２４Ｃ）。
【０６５０】
Ｃｐｆ１配列アラインメントを調べると、ヘリックスα７及びα８がＣｐｆ１ホモログ間で保存されていないことが明らかになった（図２５）。ＰＩドメインは、７個のαヘリックス（α１〜α７）及びβヘアピン（β１及びβ２）を含み、ＷＥＤ−ＩＩ及びＷＥＤ−ＩＩＩ領域間に挿入され、一方、ＲＥＣローブはＷＥＤ−Ｉ及びＷＥＤ−ＩＩ領域間に挿入される（図１５Ａ及び図２４Ａ及び図２４Ｂ）。
【０６５１】
ＲｕｖＣドメインは３つのモチーフ（ＲｕｖＣ−Ｉ〜ＩＩＩ）を含み、これらはエンドヌクレアーゼ活性中心を形成する。ＲｕｖＣ−Ｉ及びＲｕｖＣ−ＩＩモチーフ間に特徴的なヘリックス（ブリッジヘリックスと称される）が位置して、ＲＥＣローブとＮＵＣローブとを接続している（以下に記載する）（図１５Ａ、図１５Ｃ及び図１５Ｄ）。ＮｕｃドメインはＲｕｖＣ−ＩＩ及びＲｕｖＣ−ＩＩＩモチーフ間に挿入される。
【０６５２】
ｃｒＲＮＡ及び標的ＤＮＡの構造。ｃｒＲＮＡは、２４ｎｔのガイドセグメント（Ｇ１〜Ｃ２４）と１９ｎｔの足場（Ａ（−１９）〜Ｕ（−１））（５’−ハンドルと称される）とからなる（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドＧ１〜Ｃ２０と標的ＤＮＡ鎖のヌクレオチドｄＣ１〜ｄＧ２０とが２０ｂｐ  ＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二重鎖を形成する（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドＡ２１はフリップアウトして一本鎖コンホメーションをとる。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドＡ２２〜Ｃ２４及び標的ＤＮＡ鎖のヌクレオチドｄＴ２１〜ｄＧ２４に電子密度は観察されなかったことから、結晶構造においてこれらの領域が可動性でディスオーダーであることが示唆される。標的ＤＮＡ鎖のヌクレオチドｄＧ（−１０）〜ｄＴ（−１）と非標的ＤＮＡ鎖のヌクレオチドｄＣ（−１０＊）〜ｄＡ（−１＊）とは二重鎖構造（ＰＡＭ二重鎖と称される）を形成する（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。
【０６５３】
結晶構造は、ｃｒＲＮＡ  ５’−ハンドルが、そのヌクレオチド配列から予想される単純なステム−ループ構造よりむしろシュードノット構造をとることを明らかにしている（図１６Ａ及び図１６Ｃ）。具体的には、５’−ハンドルのＧ（−６）〜Ａ（−２）とＵ（−１５）〜Ｃ（−１１）とが５個のワトソン・クリック塩基対（Ｇ（−６）：Ｃ（−１１）〜Ａ（−２）：Ｕ（−１５））を介してステム構造を形成し、一方、５’−ハンドルのＣ（−９）〜Ｕ（−７）がループ構造をとる。Ｕ（−１）とＵ（−１６）とが非カノニカルなＵ・Ｕ塩基対を形成する（図１６Ｄ）。Ｕ（−１０）とＡ（−１８）とが逆フーグスティーン型Ａ・Ｕ塩基対を形成し、シュードノット形成に関与する。Ｕ（−１０）のＯ４及び２’−ＯＨがそれぞれＡ（−１９）の２’−ＯＨ及びＮ１と水素結合する（図１６Ｅ）。加えて、Ｕ（−１７）のＮ３及びＯ４がそれぞれＵ（−１３）のＯ４及びＡ（−１２）のＮ６と水素結合し、それによりシュードノット構造を安定化させる（図１６Ｆ）。重要なことには、ｃｒＲＮＡのＵ（−１）、Ｕ（−１０）、Ｕ（−１６）及びＡ（−１８）はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系間で保存されており、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡが同様のシュードノット構造を形成することが示唆される。
【０６５４】
ｃｒＲＮＡの５’−ハンドルの認識。ｃｒＲＮＡの５’−ハンドルはＷＥＤドメインとＲｕｖＣドメインとの間の溝に結合する（図１６Ｇ）。５’−ハンドルのＵ（−１）・Ｕ（−１６）塩基対はＷＥＤドメインによって塩基特異的に認識される。Ｕ（−１）及びＵ（−１６）はそれぞれＨｉｓ７６１及びＡｒｇ１８／Ａｓｎ７５９と水素結合し、一方、Ｕ（−１）はＨｉｓ７６１にスタッキングする（図１６Ｈ）。これらの相互作用は、この位置にあるＵ・Ｕ塩基対がＣｐｆ１媒介ＤＮＡ切断に決定的に重要であるという前出の知見を説明する。Ａ（−１９）のＮ６がＬｅｕ８０７及びＡｓｎ８０８と水素結合し、一方、Ａ（−１８）及びＡ（−１９）の塩基部分がそれぞれＩｌｅ８５８及びＭｅｔ８０６とスタッキング相互作用を形成する（図１６Ｉ）。更に、５’−ハンドルのリン酸ジエステル骨格がＷＥＤ及びＲｕｖＣドメインと広範な相互作用網を形成する（図１７）。ｃｒＲＮＡ  ５’−ハンドル認識に関与する残基は概してＣｐｆ１タンパク質ファミリー内で保存されており（図２５）、ＡｓＣｐｆ１とｃｒＲＮＡとの間の観察される相互作用の機能的関連性が浮かび上がる。
【０６５５】
ｃｒＲＮＡ−標的ＤＮＡヘテロ二重鎖の認識。ｃｒＲＮＡ−標的ＤＮＡヘテロ二重鎖は、ＲＥＣ１、ＲＥＣ２及びＲｕｖＣドメインによって形成される正電荷の中心チャネル内に収まり、タンパク質によって配列非依存的に認識される（図１７、図１８Ａ、図１８Ｂ及び図２３）。ヘテロ二重鎖のＰＡＭ遠位領域及びＰＡＭ近位領域は、それぞれＲＥＣ１−ＲＥＣ２ドメイン及びＷＥＤ−ＲＥＣ１−ＲｕｖＣドメインによって認識される（図１７、図１８Ａ、図１８Ｂ及び図１８Ｃ）。標的ＤＮＡ鎖のリン酸骨格と相互作用する（図１８Ｂ）、ブリッジヘリックスのＡｒｇ９５１及びＡｒｇ９５５及びＲｕｖＣドメインのＬｙｓ９６８は、Ｃｐｆ１ファミリーメンバー間で保存されている（図２５）。特に、ｃｒＲＮＡのヌクレオチドＧ１〜Ａ８の糖−リン酸骨格はＷＥＤ及びＲＥＣ１ドメインと複数の接触をなし（図１７及び図１８Ｃ）、Ｃｐｆ１媒介ＤＮＡ切断には、５ｂｐ  ＰＡＭ近位領域、「シード」領域内の塩基対合が重要である。これらの観察から、Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体では、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体で観察されるとおり、ｃｒＲＮＡガイドのシードがほぼＡ型のコンホメーションに予め整えられ、標的ＤＮＡ鎖と対合するための核生成部位として働くことが示唆される。加えて、標的ＤＮＡ鎖のｄＴ（−１）とｄＣ１との間の骨格リン酸基（＋１リン酸と称される）が、Ｌｙｓ７８０の側鎖及びＧｌｙ７８３の主鎖アミド基によって認識される（図１８Ｃ）。同様にＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−標的ＤＮＡ複合体で観察されるとおり、この相互作用によって＋１リン酸基が回転し、それにより標的ＤＮＡ鎖のｄＣ１とｃｒＲＮＡのＧ１との間の塩基対合が促進される。ヘテロ二重鎖認識に関与するこれらの残基はＣｐｆ１ファミリーのほとんどのメンバー内で保存されており（図２５）、Ｒ１７６Ａ、Ｒ１９２Ａ、Ｇ７８３Ｐ及びＲ９５１Ａ突然変異体は活性の低下を呈した（図１８Ｄ）ことから、これらの残基の機能的関連性が確認された。まとめると、これらの観察は、Ｃｐｆ１のＲＮＡガイド下ＤＮＡ認識機構を明らかにしている。
【０６５６】
予想外にも、本構造により、２４ｎｔ  ｃｒＲＮＡガイドと標的ＤＮＡ鎖とが２４ｂｐでなく、むしろ２０ｂｐのＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二重鎖を形成することが明らかになった（図１８Ａ）。ＲＥＣ２ドメインのＴｒｐ３８２の側鎖がヘテロ二重鎖のＣ２０：ｄＧ２０塩基対とスタッキング相互作用を形成し、ひいてはＡ２１とｄＴ２１との間の塩基対合を妨げる（図１８Ｅ）。実際、Ｗ３８２Ａ突然変異体は活性低下を示したことから（図４Ｄ）、その機能的重要性が浮かび上がる。Ｔｒｐ３８２はＣｐｆ１ファミリーの一部のメンバー内で保存されており、一方、他のメンバーはこの位置に芳香族残基を含む（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）（図２５）。これらの観察は、Ｃｐｆ１が２０ｂｐ  ＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二重鎖を認識することを示しており、２０ｎｔ又は２４ｎｔのいずれかのガイドを含むｃｒＲＮＡを使用して、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）が標的ＤＮＡ鎖の同じ部位（２３番目のヌクレオチドと２４番目のヌクレオチドとの間）を切断したという前出の知見を説明することができる。
【０６５７】
５’−ＴＴＴＮ−３’ＰＡＭの認識。ＰＡＭ二重鎖は、ＡＴリッチのＤＮＡで観察されることが多い、狭い副溝を含む歪んだコンホメーションをとり、ＷＥＤ、ＲＥＣ１及びＰＩドメインによって形成される溝に結合する（図１９Ａ及び図２６Ａ）。ＰＡＭ二重鎖は、それぞれ主溝側及び副溝側からＷＥＤ−ＲＥＣ１及びＰＩドメインによって認識される（図１９Ｂ）。ＰＡＭ二重鎖のｄＴ（−１）：ｄＡ（−１＊）塩基対はタンパク質と塩基特異的接触を形成せず（図１９Ｂ）、これは５’−ＴＴＴＮ−３’ＰＡＭの４番目の位置における特異性の欠如と一致する。ＰＩドメインのＬｙｓ６０７は狭い副溝に挿入され、ＰＡＭ認識において決定的役割を果たす（図１９Ｂ）。ｄＴ（−２＊）のＯ２がＬｙｓ６０７の側鎖と水素結合を形成し、一方、ｄＡ（−２）の核酸塩基及びデオキシリボース部分が、それぞれＬｙｓ６０７及びＰｒｏ５９９／Ｍｅｔ６０４の側鎖とファンデルワールス相互作用を形成する（図１９Ｃ）。ｄＧ（−２）：ｄＣ（−２＊）塩基対のモデル化により、ｄＧ（−２）のＮ２とＬｙｓ６０７の側鎖との間に立体衝突があることが示され（図２６Ｂ）、この位置がｄＡ（−２）：ｄＴ（−２＊）は受け入れるが、ｄＧ（−２）：ｄＣ（−２＊）は受け入れないことが示唆された。これらの構造観察は、５’−ＴＴＴＮ−３’ＰＡＭの３番目のＴが必須であることを説明し得る。ｄＴ（−３＊）の５−メチル基がＴｈｒ１６７の側鎖メチル基とファンデルワールス相互作用を形成し、一方、ｄＡ（−３）のＮ３及びＮ７が、それぞれＬｙｓ６０７及びＬｙｓ５４８と水素結合を形成する（図１９Ｄ）。ｄＧ（−３）：ｄＣ（−３＊）塩基対のモデル化により、ｄＧ（−３）のＮ２とＬｙｓ６０７の側鎖との間に立体衝突があることが示された（図２６Ｃ）。これらの観察は、ＰＡＭの２番目のＴが必須であることと一致する。ｄＴ（−４＊）の５−メチル基はＴｈｒ１６７及びＴｈｒ５３９の側鎖メチル基に取り囲まれ、一方、ｄＡ（−４）のＯ４’はＬｙｓ６０７の側鎖と水素結合を形成する（図１９Ｅ）。特に、ｄＴ（−４＊）のＮ３及びＯ４は、それぞれｄＡ（−４）のＮ１及びｄＡ（−３）のＮ６と水素結合を形成する（図１９Ｅ）。モデル化により、ｄＡ（−３）はモデル化された塩基対、ｄＴ（−４）：ｄＡ（−４＊）、ｄＧ（−４）：ｄＣ（−４＊）及びｄＣ（−４）：ｄＧ（−４＊）と立体衝突を形成し得ることが示された（図２６Ｄ）。これらの構造観察は、ＰＡＭの１番目のＴが必須であることと一致する。Ｋ５４８Ａ及びＭ６０４Ａ突然変異体は活性の低下を呈し（図１９Ｆ）、Ｌｙｓ５４８及びＭｅｔ６０４がＰＡＭ認識に関与していることが確認された。更に重要なことに、Ｋ６０７Ａ突然変異体がほとんど活性を示さなかったことから（図１９Ｆ）、Ｌｙｓ６０７がＰＡＭ認識に決定的に重要であることが示唆された。まとめると、これらの結果は、ＡｓＣｐｆ１が塩基及び形状読取り機構の組み合わせによって５’−ＴＴＴＮ−３’ＰＡＭを認識することを示している。Ｔｈｒ１６７及びＬｙｓ６０７はＣｐｆ１ファミリー全体で保存されており、Ｌｙｓ５４８、Ｐｒｏ５９９、及びＭｅｔ６０４は部分的に保存されている（図２５）。これらの観察は、多様な細菌由来のＣｐｆ１ホモログがそのＴリッチＰＡＭを同じように認識するが、相互作用の細かい点は異なり得ることを示している。
【０６５８】
ＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼ及び推定上の第２のヌクレアーゼドメイン。ＲｕｖＣドメインは、３個のαヘリックス（α１〜α３）が隣接した５本鎖混合型β−シート（β１〜β５）からなる典型的なＲＮアーゼＨフォールド、並びに追加の２個のαヘリックス及びβストランドを含む（図２０Ａ）。保存されている負電荷残基、Ａｓｐ９０８、Ｇｌｕ９９３及びＡｓｐ１２６３が、Ｃａｓ９  ＲｕｖＣドメインと同様の活性部位を形成する（図２０Ｂ）。ＦｎＣｐｆ１で観察されるとおり、Ｄ９０８Ａ及びＥ９９３Ａ突然変異体はほとんど活性を有さず、一方、Ｄ１２６３Ａ突然変異体は著しい活性低下を呈したことから（図２０Ｃ）、ＤＮＡ切断におけるＡｓｐ９０８、Ｇｌｕ９９３及びＡｓｐ１２６３の役割が確認された。特に、ＲＮアーゼＨフォールドのストランドβ３とヘリックスα１との間にブリッジヘリックスが挿入され、ＲＥＣ２ドメインと相互作用する（図２０Ａ及び図２０Ｄ）。ブリッジヘリックスのＧｌｎ９５６の主鎖カルボニル基がＲＥＣ２ドメインのＬｙｓ４６８の側鎖と水素結合を形成する（図２０Ｅ）。加えて、ＲｕｖＣドメインのＴｒｐ９５８が、ＲＥＣ２ドメインのＬｅｕ４６７、Ｌｅｕ４７１、Ｔｙｒ５１４、Ａｒｇ５１８、Ａｌａ５２１及びＴｈｒ５２２によって形成される疎水性ポケットに受け入れられる（図２０Ｅ）。これらの残基は、Ｌｅｕ４６７及びＡｌａ５２１を除いて、Ｃｐｆ１ファミリーメンバー間で高度に保存されており（図２５）、Ｗ９５８Ａ突然変異体は活性低下を呈した（図２０Ｄ）。これらの観察から、ＲＥＣ及びＮＵＣローブ間のブリッジヘリックス媒介相互作用の機能的重要性が浮かび上がる。
【０６５９】
結晶構造から、ＲｕｖＣドメインのＲｕｖＣ−ＩＩ（ストランドβ５）モチーフとＲｕｖＣ−ＩＩＩ（ヘリックスα３）モチーフとの間に挿入されるＮｕｃドメインの存在が明らかになった。Ｎｕｃドメインは２つのリンカーループ（Ｌ１及びＬ２と称される）を介してＲｕｖＣドメインに接続される（図２０Ａ）。Ｎｕｃドメインは５個のαヘリックス及び９個のβストランドを含み、いかなる公知のヌクレアーゼ又はタンパク質とも検出可能な構造上又は配列上の類似性を示さない。特に、保存されている極性残基、Ａｒｇ１２２６及びＡｓｐ１２３５、及び部分的に保存されているＳｅｒ１２２８は、ＲｕｖＣドメインの活性部位に近接してクラスター化している（図２０Ｂ及び図２５）。Ｓ１２２８Ａ突然変異体は野生型ＡｓＣｐｆ１と同等のｄｓＤＮＡ切断活性を示した（図２０Ｃ）。対照的に、Ｄ１２３５Ａ突然変異体はｄｓＤＮＡ切断活性の低下を呈した（図２０Ｃ）。更に重要なことに、Ｒ１２２６Ａ突然変異体はｄｓＤＮＡ切断活性をほとんど示さず（図２０Ｃ）、ニッカーゼ活性を示したことから（図２９）、Ａｒｇ１２２６がＤＮＡ切断に決定的に重要であることが示された。更に、Ｒ１２２６Ａ突然変異体はニッカーゼとして働き、非標的ＤＮＡ鎖を切断したが、標的ＤＮＡ鎖は切断せず（図２０Ｆ）、Ｎｕｃドメインが標的ＤＮＡ鎖の切断に関与することが示唆された。ＦｎＣｐｆ１にあるとおり、ＡｓＣｐｆ１  ＲｕｖＣドメインの突然変異によって両方のＤＮＡ鎖の切断が消失し（図２７）、標的ＤＮＡ鎖及び非標的ＤＮＡ鎖の両方の切断にＲｕｖＣ触媒残基が必須であることが示された。まとめると、これらの結果は、Ｎｕｃ及びＲｕｖＣドメインがそれぞれ標的及び非標的ＤＮＡ鎖を切断すること、及びＮｕｃドメインによる恐らくは複合体のコンホメーション変化を通じた標的鎖切断にＲｕｖＣドメインが必要条件であることを示している。しかしながら、Ｃｐｆ１のＲＮＡガイド下ＤＮＡ切断機構を完全に特徴付けるには、更なる機能及び構造研究が必要である。
【０６６０】
ＡｓＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ−標的ＤＮＡ複合体の構造から、Ｃｐｆ１によるＲＮＡガイド下ＤＮＡ切断に関する機構的洞察が得られる。現在のところクラス２（シングルタンパク質）エフェクターの唯一利用可能な構造であるＣｐｆ１とＣａｓ９との間の構造比較は、それらのタンパク質がＲｕｖＣドメイン外で配列類似性を欠いているにしても、それらの全体的な構成がある程度類似していることを明らかにする（図２１Ａ〜図２１Ｄ）。両方のエフェクタータンパク質ともほぼ同じサイズで、個別的な２ローブ構造をとり、ここで２つのローブは特徴的なブリッジヘリックスによって接続されており、及びｃｒＲＮＡ−標的ＤＮＡヘテロ二重鎖は２つのローブ間の中心チャネルに収まる（図２１Ａ及び図２１Ｂ）。しかしながら、この類似性にも関わらず、Ｃａｓ９及びＣｐｆ１のＲｕｖＣヌクレアーゼドメインのみが相同であり、一方、タンパク質の残りの部分は配列も構造的類似性も共有しない。
【０６６１】
Ｃａｓ９構造の顕著な特徴の一つは、それぞれ標的及び非標的ＤＮＡ鎖を切断する２つの無関係なＨＮＨ及びＲｕｖＣヌクレアーゼドメインの入れ子状の配置である（図２１Ａ及び図２１Ｃ）。Ｃａｓ９では、ＨＮＨドメインがＲｕｖＣドメインのＲＮアーゼＨフォールドのストランドβ４とヘリックスα１との間に挿入される（図２１Ｅ）。対照的に、Ｃｐｆ１はＨＮＨドメインを欠き、代わりに、別の位置に（同様にＲｕｖＣ−ＩＩモチーフとＲｕｖＣ−ＩＩＩモチーフとの間ではあるが）、即ちＲＮアーゼＨフォールドのストランドβ５とヘリックスα３との間に挿入される無関係な新規ドメインを含有する（図２１Ｆ）。データから、Ｃａｓ９のＨＮＨドメインに類して、Ｃｐｆ１のこの新規ドメインが標的ＤＮＡ鎖を切断することが示された−ひいては呼称Ｎｕｃドメイン。特に、Ｃｐｆ１のＮｕｃドメインは、ヘテロ二重鎖外にある標的ＤＮＡ鎖の一本鎖領域の切断に好適な位置にあり（図２１Ｂ及び図２１Ｄ）、一方、Ｃａｓ９のＨＮＨドメインはヘテロ二重鎖内の標的ＤＮＡ鎖を切断する（図２１Ｃ）。これらの構造の違いはまた、なぜＣｐｆ１がＰＡＭ遠位部位に付着末端型のＤＮＡ二本鎖切断を誘導する一方でＣａｓ９はＰＡＭ近位部位に平滑末端を作り出すのかについても説明し得る。加えて、このドメインの１つの保存された極性残基（ＡｓＣｐｆ１におけるＡｒｇ１２２６）はＤＮＡ切断に不可欠であることが示されており、活性ＲｕｖＣドメインは両方のＤＮＡ鎖の切断に必須である。
【０６６２】
Ｃｐｆ１とＣａｓ９との構成比較は、Ｃｐｆ１とＣａｓ９との間の見かけ上の構造的及び機能的収束の程度が顕著であることを明らかにする。興味深いことに、Ｃｐｆ１とＣａｓ９とは異なる構造的特徴を用いてｃｒＲＮＡのシード領域及び標的ＤＮＡの＋１リン酸基を認識し、それによってＲＮＡガイド下ＤＮＡターゲティングを達成する。Ｃａｓ９では、シード領域はＲｕｖＣドメインとＲＥＣドメインとの間のブリッジヘリックスのアルギニンクラスターによってアンカリングされ、一方、＋１リン酸基はＲｕｖＣドメインとＷＥＤドメインとの間の「リン酸ロック」ループによって認識される（図２８Ａ）。対照的に、Ｃｐｆ１では、シード領域はＷＥＤ及びＲＥＣドメインによってアンカリングされ、一方、＋１リン酸基はＷＥＤドメインによって認識される（図２８Ｂ）。
【０６６３】
ＡｓＣｐｆ１構造からまた、Ｃｐｆ１とＣａｓ９との間の注目に値するＰＡＭ認識機構の違いも明らかになった。Ｃａｓ９では、非標的ＤＮＡ鎖のＰＡＭヌクレオチドが、ＰＩドメインの特異的残基との水素結合相互作用を通じて主に主溝側から読み取られる。化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９では、５’−ＮＧＧ−３’ＰＡＭの２番目のＧ及び３番目のＧが、二座配位水素結合を通じてＰＩドメインのそれぞれＡｒｇ１３３３及びＡｒｇ１３３５によって認識される（図２８Ａ）。対照的に、ＡｓＣｐｆ１では、標的ＤＮＡ鎖及び非標的ＤＮＡ鎖の両方のＰＡＭヌクレオチドが、副溝側及び主溝側の両方からＰＩドメインによって読み取られる。詳細には、他のタンパク質−ＤＮＡ複合体で観察されるとおり、ＰＩドメインにおける保存されたリジン残基（ＡｓＣｐｆ１のＬｙｓ６０７）がＰＡＭ二重鎖の狭い副溝に挿入され、ＰＡＭ認識において決定的に重要な役割を果たす（図２８Ｂ）。これらの構造観察は、Ｃａｓ９がＰＡＭを主に塩基読取り機構によって認識する一方、Ｃｐｆ１は塩基及び形状読取りを組み合わせてＰＡＭを認識することを示している。ＰＡＭ認識におけるこれらの機構的違いは、なぜＣａｓ９オルソログがＧリッチの多様なＰＡＭ配列を認識する一方で、Ｃｐｆ１ファミリーの幅広く異なるメンバーが同様のＴリッチＰＡＭを認識するのかについて説明し得る。
【０６６４】
実施例５：ＡｓＣｐｆ１突然変異体の作成。ヒトコドン最適化ＡｓＣｐｆ１突然変異体をゴールデンゲート戦略を用いてクローニングした。簡潔に言えば、野生型ＡｓＣｐｆ１（ｐＹ０１０）を鋳型として使用して、ＢｓｍＢＩ制限部位を含有するプライマーを用いて２つのＰＣＲ断片を増幅した。ＢｓｍＢＩ消化の結果、個別的な５’オーバーハングが得られ、これらはいずれかレシピエントベクターのＨｉｎｄＩＩＩ又はＸｂａＩオーバーハングに適合するか、又は２つのＡｓＣｐｆ１  ＤＮＡ断片のジャンクションに所望の点突然変異を再構成することになる。
【０６６５】
実施例６：２９３ＦＴ細胞におけるＡｓＣｐｆ１の切断活性。野生型又は突然変異体のＡｓＣｐｆ１を発現するプラスミドを、Ｎ末端及びＣ末端核局在化タグ（４００ｎｇ）及びｃｒＲＮＡを発現するプラスミド（１００ｎｇ）と共に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてヒト胎児腎臓２９３ＦＴ細胞に２４ウェルプレート中７５〜９０％コンフルエンシーでトランスフェクトした。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。先述のとおり、ディープシーケンシングによってインデルを分析した。
【０６６６】
実施例７：ｃｒＲＮＡの合成。ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７高収率ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ）を使用してインビトロ切断アッセイ用のｃｒＲＮＡを合成した。標的ＲＮＡ配列の逆相補体に対応するＤＮＡオリゴをＩＤＴから合成し、ショートＴ７プライミング配列にアニールした。Ｔ７転写を４時間実施し、次にＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＲＮＡＣｌｅａｎ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してＲＮＡを精製した。
【０６６７】
実施例７：ＡｓＣｐｆ１含有細胞ライセートの調製。６ウェルプレートで成長するＨＥＫ２９３細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬を使用してＡｓＣｐｆ１発現プラスミド（２μｇ）にトランスフェクトした。４８時間後、ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄することにより細胞を回収し、２５０ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロール、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び１×完全プロテアーゼ阻害薬カクテル錠（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｔａｂｌｅｔｓ）（商標）（Ｒｏｃｈｅ））に再懸濁した。１０分間の音波処理及び２０分間の遠心（２０，０００ｇ）の後、続いてインビトロ切断アッセイで使用するため上清を凍結した。
【０６６８】
実施例８：インビトロ切断アッセイ。インビトロ切断アッセイは、切断緩衝液（１×ＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）緩衝液（ＮＥＢ）、５ｍＭ  ＤＴＴ）中、ＡｓＣｐｆ１又はＳｐＣａｓ９のいずれかのタンパク質を含有する哺乳類細胞ライセートを用いて３７℃で２０分間実施した。切断反応には、５００ｎｇの合成ｃｒＲＮＡ及び２００ｎｇの標的ＤＮＡを使用した。基質ＤＮＡを調製するため、５’−ＴＴＴＡ−３’ＰＡＭを有する標的配列を含む６１１ｂｐ領域をｐＵＣ１９ベクターを鋳型として使用してＰＣＲ増幅した。蛍光標識基質を作成するため、ＰＣＲプライマーを５’ＥｎｄＴａｇ（商標）核酸標識システム（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって標識した；フォワード及びリバースプライマーを標識して、それぞれ標識された非標的鎖及び標的鎖を作成した。Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）ゲルＤＮＡリカバリーキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して反応物をクリーンアップし、１０％ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲルで泳動させた。Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬｘイメージングシステム（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を使用してゲルを可視化した。ＲｕｖＣドメイン突然変異体については、クリーンアップ反応物をＴＢＥ６％ポリアクリルアミド又はＴＢＥ−尿素６％ポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で泳動させて、次にゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。
【０６６９】
受託番号。ＡｓＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ−標的ＤＮＡ複合体の原子座標はタンパク質データバンクにＰＤＢコードＸＸＸＸで寄託されている。
【０６７０】
野生型アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ）Ｃｐｆ１配列を以下に再掲する。
【０６７１】
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【０６７２】
インビトロ切断の基質ＤＮＡ
ｃｇｇｇｇｃｔｇｇｃｔｔａａｃｔａｔｇｃｇｇｃａｔｃａｇａｇｃａｇａｔｔｇｔａｃｔｇａｇａｇｔｇｃａｃｃａｔａｔｇｃｇｇｔｇｔｇａａａｔａｃｃｇｃａｃａｇａｔｇｃｇｔａａｇｇａｇａａａａｔａｃｃｇｃａｔｃａｇｇｃｇｃｃａｔｔｃｇｃｃａｔｔｃａｇｇｃｔｇｃｇｃａａｃｔｇｔｔｇｇｇａａｇｇｇｃｇａｔｃｇｇｔｇｃｇｇｇｃｃｔｃｔｔｃｇｃｔａｔｔａｃｇｃｃａｇｃｔｇｇｃｇａａａｇｇｇｇｇａｔｇｔｇｃｔｇｃａａｇｇｃｇａｔｔａａｇｔｔｇｇｇｔａａｃｇｃｃａｇｇｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｔｃａｃｇａｃｇｔｔｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔｇａａｔｔｃｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｃｇｇｇｇａｔｃｃｔｔｔｃｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｃｇｇｇｇａｔｃｃｔＴＴａｇａｇａａｇｔｃａｔｔｔａａｔａａｇｇｃｃａｃｔｇｔｔａａａａａｇｃｔｔｇｇｃｇｔａａｔｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃａｇｃｔｔｇｇｃｇｔａａｔｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃｔｇｔｇｔｇａａａｔｔｇｔｔａｔｃｃｇｃｔｃａｃａａｔｔｃｃａｃａｃａａｃａｔａｃｇａｇｃｃｇｇａａｇｃａｔａａａｇｔｇｔａａａｇｃｃｔｇｇｇｇｔｇｃｃｔａａｔｇａｇｔｇａｇｃｔａａｃｔｃａｃａｔｔａａｔｔｇｃｇｔｔｇｃｇｃｔｃａｃｔｇｃｃｃｇｃｔｔｔｃｃａｇｔｃｇｇｇａａａｃｃｔｇｔｃｇｔｇｃｃａｇｃｔｇｃａｔｔａａｔｇａａｔｃｇｇｃｃａａｃｇｃｇｃｇｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔｔｔｇｃｇｔａｔｔｇｇｇｃ
ｃｒＲＮＡオリゴ
ＧＴＧＧＣＣＴＴＡＴＴＡＡＡＴＧＡＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＡＣＡＡＧＡＧＴＡＧＡＡＡＴＴＡＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣ
ＮＧＳプライマー
ＤＮＭＴ１−１＿Ｆｏｒ  ＧＣＴＴＡＧＡＧＣＡＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＡ
ＤＮＭＴ１−１＿Ｒｅｖ  ＣＴＣＡＡＡＣＧＧＴＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＴＴ
ＤＮＭＴ１−２＿Ｆｏｒ  ＴＧＡＡＣＧＴＴＣＣＣＴＴＡＧＣＡＣＴＣＴＧＣＣ
ＤＮＭＴ１−２＿Ｒｅｖ  ＣＣＴＴＡＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣ
＜＜文献リスト＞＞
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【０６７３】
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明したが、当業者には、かかる実施形態が単に例として提供されることは明らかであろう。ここで当業者には、多数の変形例、変更例、及び代替例が本発明から逸脱することなく想起されるであろう。本明細書に記載される発明の実施形態の様々な代替例を本発明の実施に用い得ることが理解されなければならない。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、及び特許請求の範囲に含まれる方法及び構造並びにそれらの均等物が本発明に包含されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ａ−ＣＯＮＴ】
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【図１Ｂ】
2019503716.tif 000426
【図１Ｂ−ＣＯＮＴ】
2019503716.tif 000427
【図１Ｃ】
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【図１Ｃ−ＣＯＮＴ】
2019503716.tif 000429
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
2019503716.tif 000435
【図６Ａ−６Ｂ】
2019503716.tif 000436
【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−９Ｂ】
2019503716.tif 000439
【図１０】
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【図１１】
2019503716.tif 000441
【図１２Ａ】
2019503716.tif 000442
【図１２Ｂ】
2019503716.tif 000443
【図１３】
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【図１４】
2019503716.tif 000445
【図１５Ａ−１５Ｂ】
2019503716.tif 000446
【図１５Ｃ】
2019503716.tif 000447
【図１５Ｃ−ＣＯＮＴ】
2019503716.tif 000448
【図１５Ｄ】
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【図１５Ｄ−ＣＯＮＴ】
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【図１６Ａ−１６Ｂ】
2019503716.tif 000451
【図１６Ｃ】
2019503716.tif 000452
【図１６Ｄ−１６Ｆ】
2019503716.tif 000453
【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【図１６Ｉ】
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【図１７】
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【図１７−ＣＯＮＴ】
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【図１８Ａ】
2019503716.tif 000459
【図１８Ｂ】
2019503716.tif 000460
【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
2019503716.tif 000463
【図１９Ａ】
2019503716.tif 000464
【図１９Ｂ】
2019503716.tif 000465
【図１９Ｃ−１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０Ａ】
2019503716.tif 000469
【図２０Ｂ】
2019503716.tif 000470
【図２０Ｃ】
2019503716.tif 000471
【図２０Ｄ】
2019503716.tif 000472
【図２０Ｅ】
2019503716.tif 000473
【図２０Ｆ】
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【図２０Ｆ−ＣＯＮＴ】
2019503716.tif 000475
【図２１Ａ】
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【図２１−ＣＯＮＴ】
2019503716.tif 000477
【図２１Ｂ】
2019503716.tif 000478
【図２１Ｂ−ＣＯＮＴ】
2019503716.tif 000479
【図２１Ｃ−２１Ｄ】
2019503716.tif 000480
【図２１Ｅ】
2019503716.tif 000481
【図２１Ｆ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ａ−ＣＯＮＴ−１】
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【図２３Ａ−ＣＯＮＴ−２】
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【図２３Ｂ】
2019503716.tif 000487
【図２３Ｂ−ＣＯＮＴ−１】
2019503716.tif 000488
【図２３Ｂ−ＣＯＮＴ−２】
2019503716.tif 000489
【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
2019503716.tif 000491
【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
2019503716.tif 000493
【図２５Ａ−ＣＯＮＴ−１】
2019503716.tif 000494
【図２５Ａ−ＣＯＮＴ−２】
2019503716.tif 000495
【図２５Ｂ】
2019503716.tif 000496
【図２５Ｂ−ＣＯＮＴ−１】
2019503716.tif 000497
【図２５Ｂ−ＣＯＮＴ−２】
2019503716.tif 000498
【図２６Ａ−２６Ｂ】
2019503716.tif 000499
【図２６Ｃ】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ−２９Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年9月28日(2018.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019503716000001.app
【国際調査報告】
2019503716.tif 000505
2019503716.tif 000506
2019503716.tif 000507
2019503716.tif 000508
2019503716.tif 000509