(57)【要約】  本発明は、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）および関連化合物を、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）および関連化合物に変換する共役生体内変換方法に関する。また、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来の新規ＮＡＤＰ＋依存性７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７α−ＨＳＤＨ）、その補因子スイッチ突然変異体のクローニング、発現および生化学的特性決定ならびに胆汁酸の酸化のためのその適用に関する。本発明のさらなる態様は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＮＡＤＰ＋依存性７α−ＨＳＤＨの新規ＮＡＤＰ依存性補因子スイッチ突然変異体および胆汁酸の酸化のためのその適用に関する。
2019517826.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１０】
2019517826.tif 000036
［式中、
Ｒは、アルキル、Ｈ、アルカリ金属イオンまたはＮ（Ｒ３）４＋（式中、残基Ｒ３は、同一または異なっており、Ｈまたはアルキルを表す）を表し、または基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１およびＲ２は互いに独立に、アルキル残基を表す）によって置換される］
で示されるウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）化合物を調製するための共役生体触媒方法であって、
ａ）７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７α−ＨＳＤＨ）および７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）ならびにＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋から選択される補因子の存在下で、一般式（２）
【化１１】
2019517826.tif 000037
［式中、
Ｒは、基−ＣＯ２Ｒについて上記で定義されるものと同一の意味を有するか、または酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２によって置換される］
で示されるケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）化合物を反応させるステップであって、前記７α−ＨＳＤＨおよび前記７β−ＨＳＤＨは、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨから選択される同一補因子系を利用する能力を有し、
ａ１）前記７α−ＨＳＤＨは、一般式（２）の前記ＣＤＣＡ化合物の、一般式（３）
【化１２】
2019517826.tif 000038
［式中、Ｒは、上記で、もしくは基−ＣＯ２Ｒにおいて同定されるとおりであるか、またはは、上記で定義されるような酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２によって置換される］
で示される対応する中間体７−ケトリトコール酸（７−ＫＬＣＡ）化合物への酸化を触媒し、
ａ２）前記７β−ＨＳＤＨは、反応ステップａ１）において形成されるような一般式（３）の前記７−ＫＬＣＡ化合物の、一般式（１）の前記ＵＤＣＡ化合物への還元を、反応ステップａ１）において消費された補因子の再生下で触媒するステップと、
ｂ）任意選択で、反応生成物をさらに精製するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップａ）が、単離された７α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨ酵素の存在下で、または前記酵素を機能的に発現する１種以上の組換え微生物の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記７α−ＨＳＤＨおよび前記７β−ＨＳＤＨが両方とも、補因子系ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨを利用する、または前記７α−ＨＳＤＨおよび前記７β−ＨＳＤＨが両方とも、補因子系ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを利用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記７α−ＨＳＤＨおよび前記７β−ＨＳＤＨの両方が、補因子系ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨを利用し、
ａ）前記７α−ＨＳＤＨが、
（１）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から単離され、少なくとも、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの立体特異的な酵素的酸化を触媒する、配列番号３７に従うアミノ酸配列を含む７α−ＨＳＤＨならびに配列番号３７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨを利用する能力および少なくとも、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの立体特異的な酵素的酸化を触媒する能力を保持するその突然変異体ならびに
（２）配列番号３４を有するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）７α−ＨＳＤＨの突然変異体である７α−ＨＳＤＨであって、突然変異体が、補因子としてのＮＡＤ＋の消費下で、少なくとも、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの立体特異的な酵素的酸化を触媒し、前記７α−ＨＳＤＨが、配列番号３４のＫ１６、Ａ３７およびＲ３８から選択される位置に少なくとも１つの突然変異を含み、配列番号３４に対して、少なくとも８０％の配列同一性を示す７α−ＨＳＤＨ
から選択され
ｂ）前記７β−ＨＳＤＨが、
（１）配列番号５４を有するコリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）７β−ＨＳＤＨの突然変異体である７β−ＨＳＤＨであって、突然変異体が、補因子としてのＮＡＤＨの消費下で、少なくとも、７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒し、前記７β−ＨＳＤＨが、配列番号５４のＴ１７、Ｇ３９、Ｒ４０、Ｒ４１およびＫ４４から選択される位置に少なくとも１つの突然変異を含み、配列番号５４に対して、少なくとも８０％の配列同一性を示す７β−ＨＳＤＨ
から選択される、前記の請求項のうち一項に記載の方法。
【請求項５】
前記７α−ＨＳＤＨおよび前記７β−ＨＳＤＨが両方とも、補因子系ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを利用し、
ａ）前記７α−ＨＳＤＨが
（１）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）から単離され、補因子としてのＮＡＤＰ＋の消費下で、少なくとも、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの立体特異的な酵素的酸化を触媒する、配列番号３４に従うアミノ酸配列を含む７α−ＨＳＤＨならびに配列番号３４に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを利用する能力および少なくとも、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの立体特異的な酵素的酸化を触媒する能力を保持するその突然変異体、
（２）配列番号３７を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）７α−ＨＳＤＨの突然変異体である７α−ＨＳＤＨであって、突然変異体が、補因子としてのＮＡＤＰ＋の消費下で、少なくとも、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの立体特異的な酵素的酸化を触媒し、前記７α−ＨＳＤＨが、配列番号３７のＤ４２およびＩ４３から選択される位置に少なくとも１つの突然変異を含み、配列番号３７に対して、少なくとも８０％の配列同一性を示す７α−ＨＳＤＨ
から選択され、
ｂ）前記７β−ＨＳＤＨが、
（１）少なくとも、補因子としてのＮＡＤＰＨの消費下で、７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒する、配列番号５４に従うアミノ酸配列を含み、コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）から単離される７β−ＨＳＤＨならびに配列番号５４に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを利用する能力および少なくとも、７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒する能力を保持する、その突然変異体、
（２）配列番号５４を有するコリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）７β−ＨＳＤＨの突然変異体である７β−ＨＳＤＨであって、突然変異体が、少なくとも、補因子としてのＮＡＤＰＨの消費下で、７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒し、前記７β−ＨＳＤＨが、配列番号５４のＴ１７、Ｇ３９およびＲ６４から選択される位置に少なくとも１の突然変異を含み、配列番号５４に対して、少なくとも８０％の配列同一性を示す７β−ＨＳＤＨ、
（３）配列番号５６に従うアミノ酸配列を含む７β−ＨＳＤＨであって、ルミノコッカス・グナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｎａｖｕｓ）から単離され、少なくとも、補因子としてのＮＡＤＰＨの消費下で、７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒する７β−ＨＳＤＨならびに配列番号５６に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを利用する能力および少なくとも、７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒する能力を保持するその突然変異体
から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
配列番号３７を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）７α−ＨＳＤＨの突然変異体である７α−ＨＳＤＨであって、突然変異体が、少なくとも、補因子としてのＮＡＤＰ＋の消費下で、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの立体特異的な酵素的酸化を触媒し、酵素が、配列番号３７のＤ４２およびＩ４３から選択されるアミノ酸配列位置に少なくとも１つの突然変異を含み、配列番号３７に対して、少なくとも８０％の配列同一性を示す、７α−ＨＳＤＨ。
【請求項７】
アミノ酸配列突然変異が、
ａ）Ｄ４２Ｘ１および／または
ｂ）Ｉ４３Ｘ２
［式中、Ｘ１は、アスパラギン酸（Ｄ）とは異なるアミノ酸残基を表し、Ｘ２は、イソロイシン（Ｉ）とは異なるアミノ酸残基を表す］
を含む単一または複数の突然変異から選択される、請求項６に記載の７α−ＨＳＤＨ。
【請求項８】
前記突然変異が、
ａ）単一突然変異
Ｄ４２Ｘ１および
Ｉ４３Ｘ２ならびに
ｂ）二重突然変異
Ｄ４２Ｘ１／Ｉ４３  Ｘ２
［式中、
Ｘ１は、Ｇ、ＡまたはＶを表し、
Ｘ２は、Ｒ、ＨまたはＫを表す］
から選択される、前記の請求項６および７のいずれか一項に記載の７α−ＨＳＤＨ。
【請求項９】
配列番号３７の７α−ＨＳＤＨと比較した場合に、以下の特徴プロフィール：
ａ）補因子としてＮＡＤＰ＋を用いるＣＤＣＡの酵素的酸化の間のＮＡＤＰ＋に対する増大した比活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）、
ｂ）ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに関する修飾された補因子特異性
を示し、
ｃ）特徴ａ）からｂ）が個別に、または任意の組合せで存在し得る、請求項６から８のいずれか一項に記載の７α−ＨＳＤＨ。
【請求項１０】
Ｃ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）から単離され、配列番号３４に従うアミノ酸配列を有する７α−ＨＳＤＨまたは配列番号３４を有するＣ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）７α−ＨＳＤＨの突然変異体であり、突然変異体が、補因子としてのＮＡＤ＋の消費下で、少なくとも、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの立体特異的な酵素的酸化を触媒し、酵素突然変異体が、配列番号３４のＫ１６、Ａ３７およびＲ３８から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置に突然変異を含み、配列番号３４に対して、少なくとも８０％の配列同一性を示す７α−ＨＳＤＨ。
【請求項１１】
アミノ酸配列突然変異が、
ａ）Ｋ１６Ｘ１
ｂ）Ａ３７Ｘ２
ｃ）Ｒ３８Ｘ３
［式中、Ｘ１は、リシン（Ｋ）とは異なるアミノ酸残基を表し、Ｘ２は、アラニン（Ａ）とは異なるアミノ酸残基を表し、Ｘ３は、アルギニン（Ｒ）とは異なるアミノ酸残基を表す］
を含む単一または複数の突然変異から選択される、請求項１０に記載の７α−ＨＳＤＨ。
【請求項１２】
前記突然変異が、
ａ）単一突然変異
Ｋ１６Ｘ１
Ａ３７Ｘ２
Ｒ３８Ｘ３
および
ｂ）二重突然変異
Ｋ１６Ｘ１／Ａ３７Ｘ２および
Ａ３７Ｘ２／Ｒ３８Ｘ３
［式中、Ｘ１は、Ａ、ＧまたはＤを表し、
Ｘ２は、ＤまたはＥを表し
Ｘ３は、Ｉを表す］
から選択される、前記の請求項１０および１１のいずれか一項に記載の７α−ＨＳＤＨ。
【請求項１３】
配列番号３４の７α−ＨＳＤＨと比較した場合に、以下の特徴プロフィール：
ａ）ケノデスオキシコール酸（ｃｈｅｎｏｄｅｓｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（ＣＤＣＡ）に対する増大した比活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）、
ｂ）補因子としてＮＡＤ＋を用いるＣＤＣＡの酵素的酸化の間のＮＡＤ＋に対する増大した比活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）、
ｃ）ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに関する修飾された補因子特異性、
ｄ）少なくとも１種の胆汁酸、特に、コール酸（ＣＡ）および／またはＣＤＣＡおよび／または７−ＫＬＣＡに対する、低減されたまたは失われた基質阻害
を示し、
ｅ）特徴ａ）からｄ）が、個別に、または任意の組合せで存在し得る、
請求項１０から１２のいずれか一項に記載の７α−ＨＳＤＨ。
【請求項１４】
前記の請求項６から１３のいずれか一項に記載の７α−ＨＳＤＨをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１５】
少なくとも１つの調節的配列の制御、請求項１４に記載の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む発現カセット。
【請求項１６】
請求項１５に記載の少なくとも１つの発現カセットを含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１４に記載の少なくとも１つのヌクレオチド配列または請求項１５に記載の少なくとも１つの発現カセットまたは請求項１６に記載の少なくとも１つの発現ベクターを保持する組換え微生物。
【請求項１８】
補因子再生に適したさらなるヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤＨ）から選択される少なくとも１つのさらなる酵素のコード配列をさらに保持する、請求項１７に記載の組換え微生物。
【請求項１９】
両方とも補因子系ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨを利用する７α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨを同時発現する、または両方とも補因子系ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを利用する７α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨを同時発現する、請求項１８に記載の組換え微生物。
【請求項２０】
請求項４および５の一方において定義される、７α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨを同時発現する、請求項１９に記載の組換え微生物。
【請求項２１】
７α−ケトステロイドの酵素的または微生物的合成のための生体触媒方法であって、対応する７−ヒドロキシステロイドは、請求項６から１３のうち一項の定義に従う７α−ＨＳＤＨ突然変異体の存在下で、または請求項１７から２０のうち一項に従う前記７α−ＨＳＤＨ突然変異体を発現する組換え微生物の存在下で酸化され、任意選択で、形成される反応生成物のうち１種が、反応混合物から単離される、生体触媒方法。
【請求項２２】
前記７−ヒドロキシステロイドが、
−コール酸（ＣＡ）
−ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、
−１２−ケト−ケノデオキシコール酸（１２−ケト−ＣＤＣＡ）から、好ましくは、酸化可能な前記７α−ＨＳＤＨ突然変異体、その誘導体、特に、酸の塩、アミドまたはアルキルエステルによって選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
酸化が、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下で、特にそれらの消費下で実施される、請求項２１または２２に記載のプロセス。
【請求項２４】
消費されたようなＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋が、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋再生酵素とカップリングすることによって再生され、前記酵素が、７β−ＨＳＤＨ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）およびギ酸（ｆｏｒｍｉａｔｅ）デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、グルコース−６リン酸−デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）から選択される、請求項２３に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）および関連化合物をウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）および関連化合物に変換する共役生体内変換方法に関する。また、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来の新規ＮＡＤＰ＋依存性７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７α−ＨＳＤＨ）、その補因子スイッチ突然変異体のクローニング、発現および生化学的特性決定ならびに胆汁酸の酸化のためのその適用にも関する。本発明のさらなる態様は、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のＮＡＤ＋依存性７α−ＨＳＤＨの新規ＮＡＤＰ依存性補因子スイッチ突然変異体および胆汁酸の酸化のためのその適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
胆汁酸は、脂質の吸収、乳化および消化のための生化学的構成要素である。それらは、非抱合型胆汁酸塩として肝臓においてコレステロールから合成され、次いで、グリシンおよびタウリンと抱合される。ヒト胆汁中の一次胆汁酸は、コール酸（ＣＡ）およびケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）であるが、二次胆汁酸デオキシコール酸（ＤＣＡ）およびリトコール酸（ＬＣＡ）は、Ｃ−７での側鎖アミド結合の加水分解および脱水酸基によって腸内細菌によってＣＡおよびＣＤＣＡから生成される。
【０００３】
Ｃ−７でα位にあるＯＨ基の脱水酸基に加えて、ＣＡまたはＣＤＣＡのこのアルコール基は、あるいは、腸内細菌叢由来の７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１５９）（７α−ＨＳＤＨ）によって、それぞれ、７−ケトデオキシコール酸または７−ケトリトコール酸に酸化され得る。ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のいずれかに応じて２種類の微生物酵素が記載されている。ＮＡＤ＋依存性酵素は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｔ．Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ、Ｈ．Ｈｉｇａｓｈｉ、Ａ．Ｋａｎａｔａｎｉ、Ｘ．Ｌｉｎ、Ｈ．Ｎａｇａｉ、Ｈ．Ｏｙａｍａら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ７α−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１７３巻（１９９１年）２１７３〜２１７９頁）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）（Ｍ．Ｂｅｎｎｅｔｔ、Ｓ．ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｊ．Ｃｏｌｅｍａｎ、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＡＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ７α−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ．、Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第４７巻（２００３年）４７５〜４８４頁．  ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２８４−００３−４０７９−４）、ブレビバクテリウム・フスカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｕｓｃｕｍ）（Ｖ．Ｐｒａｂｈａ、Ｍ．Ｏｈｒｉ、Ｒｅｖｉｅｗ：  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｂｉｏｔ．第２２巻（２００５年）１９１〜１９６頁．  ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１２７４−００５−９０１９−ｙ）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）（以前は、ザントモナス・マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ））（Ａ．Ｍｅｄｉｃｉ、Ｐ．Ｐｅｄｒｉｎｉ、Ｅ．Ｂｉａｎｃｈｉｎｉ、Ｇ．Ｆａｎｔｉｎ、Ａ．Ｇｕｅｒｒｉｎｉ、Ｂ．Ｎａｔａｌｉｎｉら、７α−ＯＨ  ｅｐｉｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ  ｖｉａ  ｏｘｉｄｏ−ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ．、Ｓｔｅｒｏｉｄｓ．第６７巻（２００２年）５１〜６頁．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／１１７２８５２１；Ｐ．Ｐｅｄｒｉｎｉ、Ｅ．Ａｎｄｒｅｏｔｔｉ、Ａ．Ｇｕｅｒｒｉｎｉ、Ｍ．Ｄｅａｎ、Ｇ．Ｆａｎｔｉｎ、Ｐ．Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ  ＣＢＳ  ８９７．９７  ａｓ  ａ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｎｅｗ  ７β−  ａｎｄ  ７α−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｈｏｌｙｌｇｌｙｃｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ：  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏ��  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ、Ｓｔｅｒｏｉｄｓ．第７１巻（２００５年）１８９〜９８頁．  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｒｏｉｄｓ．２００５．１０．００２）およびアシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）（Ｐ．Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉ、Ａ．Ｇｒａｎｄｉｎｉ、Ｄ．Ｐｅｒｒｏｎｅ、Ｐ．Ｐｅｄｒｉｎｉ、Ｇ．Ｆａｎｔｉｎ、Ｍ．Ｆｏｇａｇｎｏｌｏ、７α−  ａｎｄ  １２α−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  ｌｗｏｆｆｉｉ：  ａ  ｎｅｗ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｃｈｅｍｏ−ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ．、Ｓｔｅｒｏｉｄｓ．第７３巻（２００８年）１３８５〜１３９０頁．  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｒｏｉｄｓ．２００８．０６．０１３）から入手したが、ＮＡＤＰ＋依存性酵素は、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）（Ｊ．Ｃｏｌｅｍａｎ、Ｌ．Ｈｕｄｓｏｎ、Ｍ．Ａｄａｍｓ、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＡＤＰ−ｌｉｎｋｅｄ  ７ａｌｐｈａ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１７６巻（１９９４年）４８６５〜７４頁）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の種、ＶＰＩ  １２７０８株（［９］Ｃ．Ｆｒａｎｋｌｕｎｄ、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ，  ＮＡＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ７α−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０年）９８４２〜９８４９頁；Ｓ．Ｂａｒｏｎ、Ｃ．Ｆｒａｎｋｌｕｎｄ、Ｐ．Ｈｙｌｅｍｏｎ、Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ７α−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＶＰＩ  １２７０８．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１７３巻（１９９１年）４５５８〜６９頁）において見い出され、シュードモナス・テストステローニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）（Ｗ．Ｊｉ、Ｙ．Ｃｈｅｎ、Ｈ．Ｚｈａｎｇ、Ｘ．Ｚｈａｎｇ、Ｚ．Ｌｉ、Ｙ．Ｙｕ、Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ７α−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｎ  Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）においてつい最近公開された。バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）のいくつかの株は、一方は、ＮＡＤ＋に依存し、一方は、ＮＡＤＰ＋に依存する少なくとも２種の７α−ＨＳＤＨを含有する（Ｐ．Ｈｙｌｅｍｏｎ、Ｊ．Ｓｈｅｒｒｏｄ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ７α−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｎ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１２２巻（１９７５年）４１８〜４２４頁）。
【０００４】
７α−ＨＳＤＨは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の大きなファミリーに属する。これらの反応の高いエナンチオ選択性のために、ＡＤＨは、エナンチオピュアな物質を得るための大きな重要性を獲得した。環状化合物の中で、ステロイドは、その縮合環系ならびに種々のヒドロキシおよびケト基のために例外的な位置を有し、生体触媒修飾のための位置選択的およびジアステレオ選択的酵素を必要とする。この事実をもとに、多量のＨＳＤＨは、骨格としてステランを有する物質のみを許容する。Ｂ．フラジリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）由来の７α−ＨＳＤＨのようなわずかなＨＳＤＨのみが、非ステロイド系カルボニル化合物に対して無差別性を有する（Ｙ．Ｌｉｕ、Ｔ．Ｌｖ、Ｊ．Ｒｅｎ、Ｍ．Ｗａｎｇ、Ｑ．Ｗｕ、Ｄ．Ｚｈｕ、Ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ７α−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ｃａｒｂｏｎｙｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．、Ｓｔｅｒｏｉｄｓ．第７６巻（２０１１年）１１３６〜４０頁．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｒｏｉｄｓ．２０１１．０５．００１）。
【０００５】
調製適用のためには、ＣＤＣＡをウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）に変換する７α−ＨＳＤＨは、興味深いものである（スキーム１）。Ｃ−７のヒドロキシ基のエピマー化は、７α−ＨＳＤＨによってこの基を酸化することと、それに続いて、７β−ＨＳＤＨを還元適用することによって酵素的に達成され得る。
【０００６】
スキーム１：ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）へのエピマー化
【０００７】
【化１】
2019517826.tif 000003
【０００８】
ＵＤＣＡは、ヒトにおいて天然に低く存在する胆汁酸であり、普通、総胆汁酸（ｂｉｌｉａｒｙ  ａｃｉｄｓ）の４％未満に相当する（Ｐ．Ｌｅｐｅｒｃｑ、Ｐ．Ｇｅｒａｒｄ、Ｆ．Ｂｅｇｕｅｔ、Ｊ．−Ｐ．Ｇｒｉｌｌ、Ｐ．Ｒｅｌａｎｏ、Ｃ．Ｃａｙｕｅｌａら、Ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｆｌｏｒａ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ７α−  ａｎｄ  ７β−  ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｅｃｏｌ．  Ｈｅａｌ．  Ｄｉｓ．第１６巻（２００４年）１９５〜２０１頁）。治療薬として、原発性胆汁性肝硬変などの種々の肝臓疾患の治療のために、またはコレステロール胆石溶解療法において使用され得る（Ａ．Ｄｉ  Ｃｉａｕｌａ、Ｄ．Ｗａｎｇ、Ｈ．Ｗａｎｇ、Ｌ．Ｂｏｎｆｒａｔｅ、Ｐ．Ｐｏｒｔｉｎｃａｓａ、Ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｇａｌｌｓｔｏｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．第３９巻（２０１０年）２４５〜２６４頁．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｇｔｃ．２０１０．０２．００５；Ｇ．Ｋａｋｉｙａｍａ、Ｗ．Ｐａｎｄａｋ、Ｐ．Ｇｉｌｌｅｖｅｔ、Ｐ．Ｈｙｌｅｍｏｎ、Ｄ．Ｈｅｕｍａｎ、Ｋ．Ｄａｉｔａら、Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｅｃａｌ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｂｙ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｉｎ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ．、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．第５８巻（２０１３年）９４９〜９５５頁．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｈｅｐ．２０１３．０１．００３．）。中でもＵＤＣＡおよびＣＤＣＡは、胆石疾患の薬物治療のために何年も使用されている。
【０００９】
例えば、クロストリジウム・アブソナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｂｓｏｎｕｍ）（Ｉ．Ａ．Ｍａｃｄｏｎａｌｄ、Ｄ．Ｍ．Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ、Ｅｐｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｄｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ７α−ｈｙｄｒｏｘｙｌ−ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ：  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｂｓｏｎｕｍ  ａｎｄ  ７α−ｄｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ  （Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１７巻（１９８２年）２８７〜２９３頁．ｄｏｉ：１０．１０１６／００２２−４７３１（８２）９０２０３−５）もしくはユーバクテリウム・アエロファシエンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）（現在は、コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ））（Ｉ．Ｍａｃｄｏｎａｌｄ、Ｙ．Ｒｏｃｈｏｎ、Ｌ．Ｈｏｌｄｅｍａｎ、Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｙ  ａ  ７β−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−ｅｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ７α−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−ｅｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第４４巻（１９８２年）１１８７〜１１９５頁．ｄｏｉ：００９９−２２４０／８２／１  １１１８７−０９＄０２．００／０）の全細胞、または例えば、ザントモナス・マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）から単離された酵素（Ｐｅｒｄｉｎｉｅ上記を参照のこと）（包括的概要については、Ｔ．Ｅｇｇｅｒｔ、Ｄ．Ｂａｋｏｎｙｉ、Ｗ．Ｈｕｍｍｅｌ、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｏｕｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１９１巻（２０１４年）１１〜２１頁．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｔｅｃ．２０１４．０８．００６を参照のこと）を使用する、ＣＤＣＡの酵素によって触媒されたエピマー化に関するいくつかの試みが公開された。１つの欠点は、酸化された補酵素を再生する適当な方法の使用である。使用される酵素の別の不利点は、これまでのところ、７α−ＨＳＤＨの強力な基質阻害によるＣＤＣＡの不完全な酵素的酸化に由来する。例えば、クロストリジウム・アブソナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｂｓｏｎｕｍ）由来の酵素を使用することによって、基質阻害の効果が適切になる前の約１ｍＭの範囲の低い濃度の基質でのみ最大反応速度が達成され得る（Ｅ．Ｆｅｒｒａｎｄｉ、Ｄ．Ｍｏｎｔｉ、Ｉ．Ｐａｔｅｌ、Ｒ．Ｋｉｔｔｌ、Ｄ．Ｈａｌｔｒｉｃｈ、Ｓ．Ｒｉｖａら、Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｌａｃｃａｓｅ／Ｍｅｌｄｏｌａ’ｓ  Ｂｌｕｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＮＡＤ＋  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉ��  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎｓ、Ａｄｖ．  Ｓｙｎｔｈ．  Ｃａｔａｌ．第３５４巻（２０１２年）２８２１〜２８２８頁．  ｄｏｉ：１０．１００２／ａｄｓｃ．２０１２００４２９．）。
【００１０】
化学的および酵素的プロセスステップの組合せが純粋に化学的に実施される、またはそれからなる種々のその他のプロセスが、ＵＤＣＡの調製のための先行技術に記載されている。出発点は、各場合において、コール酸（ＣＡ）またはＣＡから調製されたＣＤＣＡである。
【００１１】
したがって、ＵＤＣＡ調製のための分類された化学法は、以下のとおりに表し得る：
【００１２】
【化２】
2019517826.tif 000004
【００１３】
重大な不利点は、中でも、以下である：化学的酸化は選択的ではないので、カルボキシル基ならびに３αおよび７α−ヒドロキシル基が、エステル化によって保護されなければならない。
【００１４】
酵素１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１２α−ＨＳＤＨ）の使用に基づく代替化学的／酵素的プロセスは、以下のように表すことができ、例えば、本明細書において出願人のＰＣＴ／ＥＰ２００９／００２１９０に記載されている。
【００１５】
【化３】
2019517826.tif 000005
【００１６】
１２α−ＨＳＤＨは、ＣＡを１２−ケト−ＣＤＣＡに選択的に酸化する。次いで、古典的な化学法に従って必要とされる２つの保護ステップが省略される。
【００１７】
さらに、Ｍｏｎｔｉ，Ｄ．ら、（Ｏｎｅ−Ｐｏｔ  Ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  １２−Ｋｅｔｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ：  Ｓｕｂｔｌｅ  Ｃｏｆａｃｔｏｒ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  Ｒｕｌｅ  ｔｈｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ  ｏｆ  Ｆｉｖｅ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  ｉｎ  ａ  Ｒｏｗ．  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＆  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ、２００９年）は、代替酵素的−化学的プロセスを記載しており、これは以下のように模式的に表し得る：
【００１８】
【化４】
2019517826.tif 000006
【００１９】
ＣＡは、まず、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ２５２８５由来の７α−ＨＳＤＨ（Ｚｈｕ，Ｄ．ら、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  −ｋｅｔｏｅｓｔｅｒｓ  ｂｙ  ａ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ７−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２００６年  第６２巻（１８号）：４５３５〜４５３９頁）および１２α−ＨＳＤＨから７，１２−ジケト−ＬＣＡに酸化される。これら２種の酵素は、各々ＮＡＤＨ依存性である。クロストリジウム・アブソナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｂｓｏｎｕｍ）ＡＴＣＣ２７５５５（ＤＳＭ  ５９９）由来の７β−ＨＳＤＨ（ＮＡＤＰＨ依存性）による還元後（ＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ｉ．Ａ．  および  Ｐ．Ｄ．  Ｒｏａｃｈ、Ｂｉｌｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ７  ａｌｐｈａ−  ａｎｄ  ７  ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｂｓｏｎｕｍ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１９８１年  第６６５巻（２号）：２６２〜９頁）、１２−ケト−ＵＤＣＡが形成される。最終生成物は、Ｗｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元によって得られる。この方法は、触媒される反応の平衡の位置のために、完全な反応が可能ではないことおよび反応の第１のステップのために、２種の異なる酵素を使用することが必要であり、これがプロセスをより高価なものにするという欠点を有する。補因子再生のために、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ；ＮＡＤ＋の再生のために）およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧｌｃＤＨまたはＧＤＨ、ＮＡＤＰＨの再生のために）が使用される。使用される補因子再生に伴う不利点として、得られる副生成物を、大変な困難を伴わないと反応混合物から除去することができず、その結果、反応平衡は正に影響を受けることができず、これが、遊離体の不完全な反応をもたらすということがある。
【００２０】
コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）株ＡＴＣＣ２５９８６（ＤＳＭ３９７９；以前は、ユーバクテリウム・アエロファシエンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ））由来の７β−ＨＳＤＨは、１９８２年に、ＨｉｒａｎｏおよびＭａｓｕｄａ（Ｈｉｒａｎｏ，Ｓ．およびＮ．Ｍａｓｕｄａ、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＡＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ７  ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ  ａｎｄ  Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９８２年  第４３巻（５号）：１０５７〜６３頁）によって記載された。
【００２１】
ＷＯ２０１１／０６４４０４には、約２８〜３２ｋＤａの分子量（ＳＤＳ−ゲル電気泳動で）、約５３〜６０ｋＤａの分子量（非変性条件、特に、ＳＤＳを含まないなどでのゲル濾過で）および７−ケト−ＬＣＡの７−カルボニル基の７β−ヒドロキシル基への立体選択的還元のための能力を有する、コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣＣ２５９８６由来の新規７β−ＨＳＤＨが記載されている。
【００２２】
さらに、ＷＯ２０１１／０６４４０４では、以下のように模式的に表し得る、ＵＤＣＡの調製のための方法が提供されている：
【００２３】
【化５】
2019517826.tif 000007
【００２４】
この場合には、ＣＡの酸化は、古典的な化学的経路によって簡単に起こる。ＤＨＣＡは、酵素７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨの対によって個別に連続してまたはワンポットで１２−ケト−ＵＤＣＡに還元される。したがって、ＵＤＣＡは、Ｗｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元と組み合わせて、ＣＡからたった３ステップで合成され得る。７β−ＨＳＤＨは、補因子ＮＡＤＰＨに依存性であるが、３α−ＨＳＤＨは、補因子ＮＡＤＨを必要とする。同一補因子に対して依存性の、または依存の拡大された（例えば補因子ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して）酵素の対を利用できることは、これが補因子再生を簡単にし得るので有利であろう。
【００２５】
活性が改善された、および／または補因子使用が変更されたコリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）由来の７β−ＨＳＤＨの新規突然変異体が、本明細書において特に参照される、本出願人のＷＯ２０１２／０８０５０４、ＷＯ２０１５／１９７６９８およびＷＯ２０１６／０１６２１３に記載されている。
【００２６】
本発明によって解決されるべき第１の問題は、ＵＤＣＡおよび関連化合物の生体触媒的調製のための新規アプローチの提供に関する。
【００２７】
本発明によって解決されるべきさらなる問題は、ＵＤＣＡおよび関連化合物の生体触媒的調製のためのこのような新規生体触媒アプローチにおける新規の改善された生体触媒適用に関する。
【発明の概要】
【００２８】
上記の問題は、驚くことに、同一補因子系を利用可能である７α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨ酵素の適した組合せを適用することによる、ＣＤＣＡのＵＤＣＡへの共役−自己完結型生体触媒エピマー化の提供によって解決された。エピマー化は、７α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨ酵素の適した組合せを発現する全細胞生体触媒の単離された酵素を用いて成功裏に実施された。
【００２９】
上記の問題は、驚くべきことに、既知７β−ＨＳＤＨ酵素と組み合わせた、このようなエピマー化反応において適用可能である新規７α−ＨＳＤＨ酵素の提供によって解決された。
【００３０】
一態様では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来の新規７α特異的ＮＡＤＰ＋依存性ＨＳＤＨをコードする遺伝子をクローニングし、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において異種性に発現させた。酵素を、Ｎ末端ヘキサｈｉｓ−タグを使用して精製し、生化学的に特性決定した。例えば、クロストリジウム・サルディニエンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｒｄｉｎｉｅｎｓｅ）または大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）由来の他の既知７α−ＨＳＤＨとは対照的に、Ｃ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来の酵素は、基質阻害を示さない。この酵素の適用性を実証するために、胆汁酸ＣＤＣＡの７−ケトリトコール酸（７−ＫＬＣＡ）への生体内変換を、ＮＡＤＰＨオキシダーゼを使用するＮＡＤＰ＋の同時再生を用いて実施し、完全変換（＜９９％）をもたらした。さらに、構造ベースの部位特異的突然変異誘発によって、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来の７α−ＨＳＤＨの補因子特異性を、ＮＡＤ（Ｈ）を許容するように変更した。
【００３１】
別の態様では、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のＮＡＤ（Ｈ）依存性７α−ＨＳＤＨの新規突然変異体が提供され、その突然変異体は、補因子ＮＡＤＰ（Ｈ）を利用した。突然変異体に、より良好な精製のためにＣ末端またはＮ末端ヘキサｈｉｓ−タグも提供された。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、Ｃ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（ＤＳＭ１２０５６）由来のヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの、いくつかの公開された７α−ＨＳＤＨとのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）およびクロストリジウム・ソルデリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ）の配列が、Ｃ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来のヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼのタンパク質配列と比較されている。補酵素特異性に関与するアミノ酸残基は、黒色フレーム中に示されており、触媒三残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｔｒｉａｄｅ）は、星を用いて示されている。グリシン−モチーフＧ（Ａ）ＸＸＸＧＸＧは、記載されるように示されている。黒色の影付きボックスは、保存されたアミノ酸を示し、灰色のものは、類似アミノ酸を強調する。ｃｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａを用いてアラインメントを作製し、可視化のために、ｊａｌｖｉｅｗアラインメントツールを使用した。
【図２】Ｃ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来の７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの異種発現および精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。１０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用した。レーンＭ、分子量マーカー、レーン１粗抽出物、レーン２精製Ｃｄ７α−ＨＳＤＨ。
【図３】図３は、異なる温度の７α−ＨＳＤＨの比活性を示す図である。粗抽出物を用い、ＣＤＣＡの酸化についての分光光度的アッセイを使用することによって、酵素活性に対する温度の効果を測定した（ｐＨ８．０の５０ｍＭ  ＫＰｉバッファー、１ｍＭ  ＣＤＣＡおよび０．５ｍＭ  ＮＡＤＰ＋）。
【図４】図４は、０〜２０ｍＭの生成物７−ＫＬＣＡの範囲で濃度を漸増させたＣｄ７α−ＨＳＤＨの相対活性を示す図である。基質として１ｍＭ  ＣＤＣＡを用いて、標準活性アッセイを使用した。
【図５】図５は、１８．５時間の間の５Ｕ  Ｃｄ７α−ＨＳＤＨおよび５０Ｕ  ＮＯＸを含有する水性系（ＫＰｉ、ｐＨ７．０）におけるＣＤＣＡ（１０ｍＭ）の生体内変換（Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ）を示す図である。３．５時間および７時間後、さらに５０Ｕ  ＮＯＸを反応物に添加した。ＣＤＣＡの濃度（
【化Ａ】
2019517826.tif 000008
）および７−ＫＬＣＡの濃度（
【化Ｂ】
2019517826.tif 000009
）は、ＨＰＬＣによって決定した。
【図６】図６は、厳密にＮＡＤ＋依存性のＨＳＤＨのＮＡＤ＋−結合領域のアミノ酸配列アラインメントを示す図である（クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来のＮＡＤＰ＋依存性酵素との比較における、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、バチルス・フラジリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）およびシュードモナス・テストステローニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）。保存されたＮＡＤ＋−結合モチーフＧ（Ａ）ＸＸＸＧＸＧは、アスタリスクによって印がつけられており、ＮＡＤＰ＋の結合に関与している１８アミノ酸下流の重要な負電荷を有する残基は、黒色フレーム中に示されている。
【図７】図７は、鋳型として炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（ＰＤＢ：４ＪＲＯ）由来のｆａｂＧを使用してＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴを用いてモデル化された、７α−ＨＳＤＨ／ＮＡＤＰ＋複合体（図Ａ）および７α−ＨＳＤＨ  Ａ３７Ｄ／ＮＡＤ（図Ｂ）の構造を示す図である。タンパク質骨格は、二次構造要素：赤色のα−ヘリックス、黄色のβ−シートおよび緑色の一本鎖によって着色されている。原子は、種類：酸素、赤色、窒素、青色、炭素、灰色およびリン、橙色に従って着色されている。
【図８】図８は、１０ｍＭ  ＣＤＣＡ、０．５ｍＭ  ＮＡＤ＋および粗抽出物酵素を使用する、突然変異体のＮＡＤ＋依存性活性の、Ｃｄ７α−ＨＳＤＨの野生型との比較を示す図である。
【図９】図９は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＮＡＤＰ＋依存性突然変異体および野生型７α−ＨＳＤＨの活性の比較を示す図である（粗抽出物を用いる活性アッセイ）。
【図１０】図１０は、粗抽出物および精製タンパク質について観察されたような７α−ＨＳＤＨの発現および精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（野生型およびＤ４２Ｇ／Ｉ４３Ｒ変異株）を示す図である。７α−ＨＳＤＨの発現は、意図されるタンパク質のおよそ８０％になる。サンプルの大きさは、約１０μｇタンパク質であった。レジェンド：Ｍ＝マーカー；ｌoｓｌ．＝粗生成物；ａｕｆｇ．＝精製生成物。
【図１１】図１１は、１ステップ法でのＣＤＣＡのＵＤＣＡへの生体内変換の反応スキームを示す図である。両酵素は、同一補因子を使用しなくてはならない。図Ａは、補酵素としてのＮＡＤ（Ｈ）に基づく反応変異体を例示するが、図Ｂは、ＮＡＤＰ（Ｈ）に基づく変異体を例示する。
【図１２】図１２は、１ステップ法での、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＮＡＤ依存性７β−ＨＳＤＨ［Ｇ３９Ｅ］および７α−ＨＳＤＨを用いるＣＤＣＡの変換を示す図である。
【図１３】図１３は、１ステップ法での、Ｃ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来の７β−ＨＳＤＨ［Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｅ］およびＣＤ７α−ＨＳＤＨを用いるＣＤＣＡの変換を示す図である。
【図１４】図１４は、１ステップ法での、全細胞触媒大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＢ０６（図Ａ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＢ０７（図Ｂ）を用いるＣＤＣＡの変換を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、特に、以下の特別な実施形態に関する：
１．一般式（１）、
【００３４】
【化６】
2019517826.tif 000010
【００３５】
［式中、
Ｒは、アルキル、Ｈ、アルカリ金属イオンまたはＮ（Ｒ３）４＋（式中、残基Ｒ３は、同一または異なっており、Ｈまたはアルキルを表す）を表し、または基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１およびＲ２は互いに独立に、アルキル残基を表し、Ｒは、好ましくは、Ｈを表す）によって置換される］
で示されるＵＤＣＡ化合物を調製するための共役、好ましくは、自己完結型生体触媒方法であって、
ａ）７α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨならびに好ましくは少なくとも触媒量のＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋から選択される補因子の存在下で、一般式（２）
【００３６】
【化７】
2019517826.tif 000011
【００３７】
［式中、
Ｒは、基−ＣＯ２Ｒについて上記で定義されるものと同一の意味を有するか、または酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２によって置換される］
で示されるＣＤＣＡ化合物を反応させるステップであって、前記７α−ＨＳＤＨおよび前記７β−ＨＳＤＨは、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨから選択される同一補因子系を利用する能力を有し、
ａ１）前記７α−ＨＳＤＨは、一般式（２）の前記ＣＤＣＡ化合物の、一般式（３）
【００３８】
【化８】
2019517826.tif 000012
【００３９】
［式中、Ｒは、上記で、もしくは基−ＣＯ２Ｒにおいて同定されるとおりであるか、または、上記で定義されるような酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２によって置換される］
で示される対応する中間体７−ＫＬＣＡ化合物への酸化を触媒し、
ａ２）前記７β−ＨＳＤＨは、反応ステップａ１）において形成されるような一般式（３）の前記７−ＫＬＣＡ化合物の、一般式（１）の前記ＵＤＣＡ化合物への還元を、反応ステップａ１）において消費された補因子の再生下で触媒するステップと
ｂ）任意選択で、反応生成物をさらに精製するステップと
を含む、方法。
【００４０】
２．ステップａ）が、単離された（精製された、濃縮されたまたは粗、好ましくは、純粋な）７α−ＨＳＤＨ酵素および単離された（精製された、濃縮されたまたは粗、好ましくは、純粋な）β−ＨＳＤＨ酵素の存在下で、または前記酵素を機能的に発現する１種以上の組換え微生物の存在下で実施される、実施形態１のプロセス。
【００４１】
３．前記７α−ＨＳＤＨおよび前記７β−ＨＳＤＨが両方とも、補因子系ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨを利用する；または前記７α−ＨＳＤＨおよび前記７β−ＨＳＤＨが両方とも、補因子系ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを利用する、実施形態１または２の方法。
【００４２】
４．前記７α−ＨＳＤＨおよび前記７β−ＨＳＤＨの両方が、補因子系ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨを利用し、
ａ）前記７α−ＨＳＤＨが、
（１）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から単離され、少なくとも、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの（特に、ＣＤＣＡの７−ＫＬＣＡへの）立体特異的な酵素的酸化を触媒する、配列番号３７に従うアミノ酸配列を含む７α−ＨＳＤＨならびに配列番号３７に対して、例えば、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％のような少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨを利用する能力および少なくとも、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの（特に、ＣＤＣＡの７−ＫＬＣＡへの）立体特異的な酵素的酸化を触媒する能力を保持するその突然変異体ならびに
（２）配列番号３４に従うアミノ酸配列を含むクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）７α−ＨＳＤＨの突然変異体である７α−ＨＳＤＨであって、突然変異体が、補因子としてのＮＡＤ＋の消費下で（すなわち、補因子系ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨの利用によって）、少なくとも、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの（特に、ＣＤＣＡの７−ＫＬＣＡへの）立体特異的な酵素的酸化を触媒し、前記７α−ＨＳＤＨが、配列番号３４のＫ１６、Ａ３７およびＲ３８から選択される位置に少なくとも１つの突然変異を含み、配列番号３４に対して、例えば、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％のような少なくとも８０％の配列同一性を示し、突然変異体が、本明細書において以下にさらに定義される７α−ＨＳＤＨ
から選択され
ｂ）前記７β−ＨＳＤＨが、
（１）配列番号５４を有するコリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）７β−ＨＳＤＨの突然変異体である７β−ＨＳＤＨであって、突然変異体が、補因子としてのＮＡＤＨの消費下で（すなわち、補因子系ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨの利用によって）、少なくとも、７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドへの（特に、７−ＫＣＬＡのＵＤＣＡへの）立体特異的な酵素的還元を触媒し、前記７β−ＨＳＤＨが、配列番号５４のＴ１７、Ｇ３９、Ｒ４０、Ｒ４１およびＫ４４から選択される位置に少なくとも１つの突然変異を含み、配列番号５４に対して、例えば、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％のような少なくとも８０％の配列同一性を示し、突然変異体が、本明細書において以下にさらに定義される、７β−ＨＳＤＨ
から選択される、前記の実施形態のうち１つのプロセス。
【００４３】
５．前記７α−ＨＳＤＨおよび前記７β−ＨＳＤＨが両方とも、補因子系ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを利用し、
ａ）前記７α−ＨＳＤＨが
（１）クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）から単離され、補因子としてのＮＡＤＰ＋の消費下で（すなわち、補因子系ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの利用によって）、少なくとも、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの（特に、ＣＤＣＡの７−ＫＬＣＡへの）立体特異的な酵素的酸化を触媒する、配列番号３４に従うアミノ酸配列を含む７α−ＨＳＤＨならびに配列番号３４に対して、例えば、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％のような少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを利用する能力および少なくとも、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの立体特異的な酵素的酸化を触媒する能力を保持するその突然変異体、
（２）配列番号３７を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）７α−ＨＳＤＨの突然変異体である７α−ＨＳＤＨであって、突然変異体が、補因子としてのＮＡＤＰ＋の消費下で（すなわち、補因子系ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの利用によって）、少なくとも、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの（特に、ＣＤＣＡの７−ＫＬＣＡへの）立体特異的な酵素的酸化を触媒し、前記７α−ＨＳＤＨが、配列番号３７のＤ４２およびＩ４３から選択される位置に少なくとも１つの突然変異を含み、配列番号３７に対して、例えば、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％のような少なくとも８０％の配列同一性を示し、突然変異体が、本明細書において以下にさらに定義される、７α−ＨＳＤＨ
から選択され、
ｂ）前記７β−ＨＳＤＨが、
（１）少なくとも、補因子としてのＮＡＤＰＨの消費下で（すなわち、補因子系ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの利用によって、７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒する、配列番号５４に従うアミノ酸配列を含み、コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）から単離される７β−ＨＳＤＨならびに配列番号５４に対して、例えば、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％のような少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを利用する能力および少なくとも、７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒する能力を保持する、その突然変異体、
（２）配列番号５４を有するコリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）７β−ＨＳＤＨの突然変異体である７β−ＨＳＤＨであって、突然変異体が、少なくとも、補因子としてのＮＡＤＰＨの消費下で（すなわち、補因子系ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ）の利用によって）、７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドヒドロキシステロイドへの（特に、７−ＫＣＬＡのＵＤＣＡへの）立体特異的な酵素的還元を触媒し、前記７β−ＨＳＤＨが、配列番号５４のＴ１７、Ｇ３９およびＲ６４から選択される位置に少なくとも１の突然変異を含み、配列番号５４に対して、例えば、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％のような少なくとも８０％の配列同一性を示し、突然変異体が本明細書において以下にさらに定義される、７β−ＨＳＤＨ、
（３）配列番号５６に従うアミノ酸配列を含む７β−ＨＳＤＨであって、ルミノコッカス・グナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｎａｖｕｓ）から単離され、少なくとも、補因子としてのＮＡＤＰＨの消費下で（すなわち、補因子系ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの利用によって）、７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドヒドロキシステロイドへの（特に、７−ＫＣＬＡのＵＤＣＡへの）立体特異的な酵素的還元を触媒する７β−ＨＳＤＨならびに配列番号５６に対して、例えば、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％のような少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを利用する能力および少なくとも、７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒する能力を保持するその突然変異体
から選択される、実施形態１から３の１つのプロセス。
【００４４】
６．配列番号３７を有する大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）７α−ＨＳＤＨの突然変異体である７α−ＨＳＤＨであって、突然変異体が、少なくとも、補因子としてのＮＡＤＰ＋の消費下で（すなわち、補因子系ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの利用によって）、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの（特に、ＣＤＣＡの７−ＫＬＣＡへの）立体特異的な酵素的酸化を触媒し、酵素が、配列番号３７のＤ４２およびＩ４３から選択されるアミノ酸配列位置に少なくとも１つの突然変異を含み、配列番号３７に対して、例えば、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％のような少なくとも８０％の配列同一性を示す、７α−ＨＳＤＨ。
【００４５】
７．アミノ酸配列突然変異が、
ａ）Ｄ４２Ｘ１および／または
ｂ）Ｉ４３Ｘ２
［式中、Ｘ１は、アスパラギン酸（Ｄ）とは異なるアミノ酸残基、特に、タンパク質原性アミノ酸残基、特に、任意の、比活性増大性および／または基質阻害低減性および／または補因子利用もしくは補因子特異性修飾性、特に、天然アミノ酸を表し、Ｘ２は、イソロイシン（Ｉ）とは異なるアミノ酸残基、特に、タンパク質原性アミノ酸残基、特に、任意の、比活性増大性および／または基質阻害低減性および／または補因子利用もしくは補因子特異性修飾性、特に、天然アミノ酸を表す］
を含む単一または複数の突然変異から選択される、実施形態６の７α−ＨＳＤＨ。
【００４６】
８．前記突然変異が、
ａ）単一突然変異
Ｄ４２Ｘ１および
Ｉ４３Ｘ２ならびに
ｂ）二重突然変異
Ｄ４２Ｘ１／Ｉ４３  Ｘ２
［式中、
Ｘ１は、Ｇ、ＡまたはＶを表し、
Ｘ２は、Ｒ、ＨまたはＫを表す］
から選択される、前記の実施形態６および７のいずれか１つに従う７α−ＨＳＤＨ。
このような二重突然変異体の限定されない例として、（Ｄ４２Ｇ／Ｉ４３Ｒ）、（Ｄ４２Ｇ／Ｉ４３Ｈ）、（Ｄ４２Ｇ／Ｉ４３Ｋ）、（Ｄ４２Ａ／Ｉ４３Ｒ）、（Ｄ４２Ａ／Ｉ４３Ｈ）、（Ｄ４２Ａ／Ｉ４３Ｋ）、（Ｄ４２Ｖ／Ｉ４３Ｒ）、（Ｄ４２Ｖ／Ｉ４３Ｈ）、（Ｄ４２Ｖ／Ｉ４３Ｋ）がある。
【００４７】
９．配列番号３７の７α−ＨＳＤＨと比較した場合に、以下の特徴プロフィール：
ａ）補因子としてＮＡＤＰ＋を用いるＣＤＣＡの酵素的酸化の間のＮＡＤＰ＋に対する増大した比活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）であって、
非突然変異酵素と比較した場合に、少なくとも１、５または１０％、特に、少なくとも１倍、より詳しくは、２〜１０倍増大される比活性、
ｂ）例えば、ＮＡＤＰ（Ｈ）に対するより顕著な特異性、ＮＡＤ（Ｈ）に対する低減された、より詳しくは、減少したまたは失われた特異性のような、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに関する修飾された補因子特異性
を示し、
ｃ）特徴ａ）からｂ）が個別に、または任意の組合せで存在し得る、実施形態６から８のいずれか１つに従う７α−ＨＳＤＨ。
【００４８】
１０．Ｃ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）から単離され、配列番号３４に従うアミノ酸配列を有する７α−ＨＳＤＨまたは配列番号３４に対して、例えば、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％のような少なくとも８０％の配列同一性を示すその機能的変異体、または配列番号３４を有するＣ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）７α−ＨＳＤＨの突然変異体であり、突然変異体が、補因子としてのＮＡＤ＋の消費下で（すなわち、補因子系ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨの利用によって）、少なくとも、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの（特に、ＣＤＣＡの７−ＫＬＣＡへの）立体特異的な酵素的酸化を触媒し、酵素突然変異体が、配列番号３４のＫ１６、Ａ３７およびＲ３８から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置に突然変異を含み、配列番号３４に対して、例えば、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは９９．５％のような、少なくとも８０％の配列同一性を示す突然変異体。
【００４９】
１１．アミノ酸配列突然変異が、
ａ）Ｋ１６Ｘ１
ｂ）Ａ３７Ｘ２
ｃ）Ｒ３８Ｘ３
［式中、Ｘ１は、リシン（Ｋ）とは異なるアミノ酸残基、特に、タンパク質原性アミノ酸残基、特に、任意の、比活性増大性および／または基質阻害低減性および／または補因子利用もしくは補因子特異性修飾性、特に、天然アミノ酸を表し、
Ｘ２は、アラニン（Ａ）とは異なるアミノ酸残基、特に、タンパク質原性アミノ酸残基、特に、任意の、比活性増大性および／または基質阻害低減性および／または補因子利用もしくは補因子特異性修飾性、特に、天然アミノ酸を表し、
Ｘ３は、アルギニン（Ｒ）とは異なるアミノ酸残基、特に、タンパク質原性アミノ酸残基、特に、任意の、比活性増大性および／または基質阻害低減性および／または補因子利用もしくは補因子特異性修飾性、特に、天然アミノ酸を表す］
を含む単一または複数の突然変異から選択される、実施形態１０の７α−ＨＳＤＨ。
【００５０】
１２．前記突然変異が、
ａ）単一突然変異
Ｋ１６Ｘ１
Ａ３７Ｘ２
Ｒ３８Ｘ３
および
ｂ）二重突然変異
Ｋ１６Ｘ１／Ａ３７Ｘ２および
Ａ３７Ｘ２／Ｒ３８Ｘ３
［式中、Ｘ１は、Ａ、ＧまたはＤを表し、
Ｘ２は、ＤまたはＥを表し
Ｘ３は、Ｉを表す］
から選択される、前記の実施形態１０および１１のいずれか１つに従う７α−ＨＳＤＨ。
このような二重突然変異体の限定されない例として、（Ｋ１６Ａ／Ａ３７Ｄ）、（Ｋ１６Ａ／Ａ３７Ｅ）、（Ｋ１６Ｇ／Ａ３７Ｄ）、（Ｋ１６Ｇ／Ａ３７Ｅ）  （Ｋ１６Ｄ／Ａ３７Ｄ）、（Ｋ１６Ｄ／Ａ３７Ｅ）、（Ａ３７Ｄ／Ｒ３８Ｉ）および（Ａ３７Ｅ／Ｒ３８Ｉ）がある。
【００５１】
１３．配列番号３４の７α−ＨＳＤＨと比較した場合に、以下の特徴プロフィール：
ａ）ＣＤＣＡに対する増大した比活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）であって、
非突然変異酵素と比較した場合に、少なくとも１、５または１０％、特に、少なくとも１倍、より詳しくは、２〜１０倍増大される比活性、
ｃ）補因子としてＮＡＤ＋を用いるＣＤＣＡの酵素的酸化の間のＮＡＤ＋に対する増大した比活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）であって、
非突然変異酵素と比較した場合に、少なくとも１、５または１０％、特に、少なくとも１倍、より詳しくは、２〜１０倍増大される比活性、
ｄ）例えば、ＮＡＤ（Ｈ）に対するより顕著な特異性、ＮＡＤＰ（Ｈ）に対する低減された、より詳しくは、減少したまたは失われた特異性のような、ＮＡＤ（Ｈ）およびＮＡＤＰ（Ｈ）に関する修飾された補因子特異性、
ｅ）例えば、１〜２００ｍＭ、２〜１５０ｍＭ、２．５〜１００ｍＭの範囲のような、例えば、＞１ｍＭの範囲のＫｉ値を有するような、少なくとも１種の胆汁酸、特に、ＣＡおよび／またはＣＤＣＡおよび／または７−ＫＬＣＡ、特に、ＣＤＣＡに対する、低減された、または好ましくは、本質的に失われた、より好ましくは、失われた基質阻害
を示し、
ｆ）特徴ａ）からｄ）が、個別に、または任意の組合せで存在し得る、
実施形態１０から１２のいずれか１つに従う７α−ＨＳＤＨ。
【００５２】
１４．前記の実施形態６から１３のいずれか１つに従う７α−ＨＳＤＨをコードするヌクレオチド配列。
【００５３】
１５．少なくとも１つの調節的配列の制御、実施形態１４の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む発現カセット。
【００５４】
１６．実施形態１５の少なくとも１つの発現カセットを含む発現ベクター。
【００５５】
１７．実施形態１４に従う少なくとも１つのヌクレオチド配列または実施形態１５に従う少なくとも１つの発現カセットまたは実施形態１６に従う少なくとも１つの発現ベクターを保持する組換え微生物。
【００５６】
１８．補因子再生に適したさらなるヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤＨ）から選択される少なくとも１つのさらなる酵素のコード配列をさらに保持する、実施形態１７に従う組換え微生物。
【００５７】
１９．両方とも補因子系ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨを利用する７α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨを同時発現する、または両方とも補因子系ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを利用する７α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨを同時発現する、実施形態１８に従う組換え微生物。
【００５８】
２０．実施形態４および５の一方において定義されるように、７α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨを同時発現する、実施形態１９に従う組換え微生物。
【００５９】
適した組換え微生物は、１以上の発現プラスミドで本明細書において定義されるように、このような７α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨ酵素の１以上のコピーを保持し得る。単一プラスミド系またはマルチコピープラスミド系が適用可能である（ＷＯ２０１２／０８０５０４を参照のこと）。例として、ｐＥＴ２１ａのような単一プラスミド系およびｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１、ｐＥＴＤｕｅｔ−１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１およびｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１のようなＮｏｖａｇｅｎｅｓ  Ｄｕｅｔベクターのようなマルチコピープラスミドが記載され得る（Ｎｏｖａｇｅｎ製のユーザープロトコールＴＢ３４０  Ｒｅｖ．  Ｅ０３０５も参照のこと）。
【００６０】
２１．７α−ケトステロイドの酵素的または微生物的合成のための生体触媒プロセスであって、対応する７−ヒドロキシステロイドは、実施形態６から１３のうち１つの定義に従う７α−ＨＳＤＨ突然変異体の存在下で、または実施形態１７から２０のうち１つに従う前記７α−ＨＳＤＨ突然変異体を発現する組換え微生物の存在下で酸化され、任意選択で、形成される反応生成物のうち１種が、反応混合物から単離される、プロセス。
【００６１】
２２．前記７−ヒドロキシステロイドが、
−コール酸（ＣＡ）
−ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、
−１２−ケトケノデオキシコール酸（１２−ケト−ＣＤＣＡ）から、好ましくは、酸化可能な前記７α−ＨＳＤＨ突然変異体、その誘導体、特に、酸の塩、アミドまたはアルキルエステルによって選択される、実施形態２１のプロセス。
【００６２】
２３．酸化が、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下で、特にそれらの消費下で実施される、実施形態１１または１２のプロセス。
【００６３】
２４．消費されたようなＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋が、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋再生酵素とカップリングすることによって再生され、前記酵素が、７β−ＨＳＤＨ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）およびギ酸（ｆｏｒｍｉａｔｅ）デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、グルコース−６リン酸−デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）から選択される、実施形態２３のプロセス。
【００６４】
上記で本明細書における特定のアミノ酸配列への任意の言及（配列番号３４、３７  ４０、４４、４７、５０、５４および５６のような）はまた、特に断りのない限り、特に、Ｈｉｓ−タグ配列、特に、ヘキサＨｉｓタグ配列によって延長された変異体のような、Ｎ末端またはＣ末端が延長されたその変異体に関する。
【００６５】
このようなＨｉｓ−タグ変異体の限定されない例として、配列番号３５、３８、４１、４２、４５、４８、５１および５２のものがある。
【００６６】
本発明のさらなる態様および実施形態
１．使用される一般定義および略語
用語「自己完結型」は、第１の部分還元反応または酸化反応によって消費される補因子が、それぞれ第２の部分酸化反応または還元反応によって本質的に完全に再生される共役酵素的還元反応を示す。
【００６７】
特に断りのない限り、用語「７β−ＨＳＤＨ」は、少なくとも、ＤＨＣＡまたは７，１２−ジケト−３α−ＣＡ（７，１２−ジケト−ＬＣＡ）の、３，１２−ジケト−７β−ＣＡまたは１２−ケト−ＵＤＣＡへの立体特異的および／または位置特異的還元を触媒し、特に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの化学量論的消費および任意選択で、対応する逆反応を伴う、デヒドロゲナーゼ酵素を意味する。「７β−ＨＳＤＨ」はまた、７−ケトリトコール酸（７−ＫＬＣＡ）のＵＤＣＡへの還元および任意選択で、対応する逆反応も触媒する。酵素は、天然である場合も、組換えによって製造された酵素である場合もあり、野生型酵素または適した突然変異によって、もしくはＨｉｓ−タグ含有配列のようなＣ末端および／もしくはＮ末端アミノ酸配列延長によって遺伝子修飾されたものであり得る。酵素は、基本的に、細胞性、例えば、タンパク質不純物と混合している可能性があるが、純粋形態であることが好ましい。検出の適した方法は、例えば、以下に示される実験の節に記載されている、または文献（例えば、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＡＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ７  ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ  ａｎｄ  Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ．  Ｓ  ＨｉｒａｎｏおよびＮ  Ｍａｓｕｄａ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９８２年）から公知である。この活性を有する酵素は、ＥＣ番号１．１．１．２０１の下に分類される。
【００６８】
特に断りのない限り、用語「７α−ＨＳＤＨ」は、少なくとも、ＣＤＣＡの７，−ＫＬＣＡ）への立体特異的および／または位置特異的酸化を触媒し、特に、ＮＡＤ（Ｐ）＋の化学量論的消費および任意選択で、対応する逆反応を伴うデヒドロゲナーゼ酵素を意味する。酵素は、天然である場合も、組換えによって製造された酵素である場合もあり、野生型酵素または適した突然変異によって、もしくはＨｉｓ−タグ含有配列のようなＣ末端および／もしくはＮ末端アミノ酸配列延長によって遺伝子修飾されたものであり得る。酵素は、基本的に、細胞性、例えば、タンパク質不純物と混合している可能性があるが、純粋形態であることが好ましい。検出の適した方法は、例えば、この活性を有する酵素が、ＥＣ番号１．１．１．１５９の下に分類されることを前提として、所与の実験の節に記載されている。
【００６９】
「純粋形態」または「純粋な」または「実質的に純粋な」酵素は、タンパク質を検出する通常の方法、例えば、ビウレット法またはローリーら（Ｒ．Ｋ．  Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９８２年）における記載を参照のこと）に従うタンパク質検出によって決定される、総タンパク質含量に対して、８０重量％を上回る、好ましくは、９０重量％を上回る、特に９５重量％を上回る、かなり特には、９９重量％を上回る純度の程度を有する酵素として、本発明に従って理解されるべきである。
【００７０】
「酸化還元等価物」とは、電子供与体または電子受容体、例えば、それぞれ、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＨ＋またはその還元形態ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨなどのニコチンアミド誘導体として使用可能な低分子有機化合物を意味する。「酸化還元等価物」および「補因子」は、本発明に関連して同義語として使用される。したがって、本発明の意味において「補因子」は、「酸化還元可能な補因子」として、すなわち、還元形態および酸化形態で存在し得る補因子として記載されることもある。
【００７１】
「費やされる」補因子は、基質の特定の還元または酸化反応の過程において、対応する酸化形態または還元形態に変換される、補因子の還元形態または酸化形態と理解されるべきである。再生によって、反応において形成される酸化または還元補因子形態が、還元または酸化出発形態に変換して戻され、その結果、基質の反応に再度利用可能である。
【００７２】
「変更された補因子利用」は、本発明に関連して、参照と比較した定性的または定量的変化として理解されるべきである。特に、変更された補因子利用は、アミノ酸配列突然変異を行うことによって観察し得る。次いで、この変化は、突然変異していない出発酵素と比較して決定できる。さらに、突然変異を行うことによって、特定の補因子に関する活性を増大または減少できる、または完全に妨げることができる。しかし、変更された補因子利用はまた、個々の補因子の特異性の代わりに、ここで、第１の補因子とは異なる、少なくとも１種のさらなる第２の補因子が使用可能であるような変化を含む（すなわち、拡張された補因子利用がある）。しかし、逆に、元々存在していた２種の異なる補因子を利用する能力を、特異性がこれらの補因子のうち１種についてのみ増大されるように、またはこれらの補因子のうち１種についてのみ減少されるように、または完全に排除されるように変更できる。例えば、補因子ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）に対して依存性である酵素は、ここで、補因子利用の変化のために、ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）および補因子ＮＡＤＰ（ＮＡＤＰＨ）の両方に対して依存性であり得る、またはＮＡＤ（ＮＡＤＨ）に対する元の依存を、ＮＡＤＰ（ＮＡＤＰＨ）に対する依存に完全に変換可能で、逆もまた真なり。
【００７３】
用語「ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ依存」または「ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ依存」は、特に断りのない限り、本発明に従って広く解釈されるべきである。これらの用語は、両方を含むが、「特異的」依存、すなわち、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨに対する排他的な依存が好ましく、ならびに、本発明に従って使用される酵素の、両補因子に対する依存、すなわち、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨに対する依存はあまり好ましくない。
【００７４】
対応して、これは、用語「ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ許容性」または「ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ許容性」に当てはまる。
【００７５】
用語「ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ再生性」または「ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ再生性」は、特に断りのない限り、本発明に従って広く解釈されるべきである。これらの用語は、両方を含むが、好ましくは、費やされる補因子ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを再生する「特異的」すなわち、排他的能力が好ましく、両補因子、すなわち、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを再生する能力はあまり好ましくない。
【００７６】
「タンパク質原性」アミノ酸は、特に（一文字コード）：Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｐ、Ｍ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲおよびＨを含む。
【００７７】
「固定化」とは、本発明によれば、固体、すなわち、周囲の液体培地、担体材料に本質的に不溶性のものの上への、本発明に従って使用される生体触媒、例えば、７β−ＨＳＤＨの共有結合または非共有結合を意味する。本発明によれば、本発明に従って使用される組換え微生物などの全細胞は、対応して、このような担体によって固定化できる。
【００７８】
「突然変異されていない酵素との比較において低減された基質阻害」とは、特定の基質について、突然変異されていない酵素を用いて観察される基質阻害が、もはや観察されないこと、すなわち、本質的にもはや測定可能ではないこと、またはより高い基質濃度でのみ生じる、すなわち、Ｋｉ値が増大されることを意味する。
【００７９】
「コール酸化合物」とは、コール酸の炭素骨格構造、特に、ステロイド構造ならびに環位置７および任意選択で、環位置３および／または１２にケトおよび／またはヒドロキシまたはアシルオキシ基の存在を有する本発明に従う化合物を意味する。
【００８０】
特定の種類の化合物、例えば、「コール酸化合物」または「ウルソデオキシコール酸化合物」は、特にまた、根底にある出発化合物（例えば、コール酸またはウルソデオキシコール酸）の誘導体も意味する。
【００８１】
前記誘導体は、「塩」、例えば、化合物のリチウム、ナトリウムおよびカリウム塩などのアルカリ金属塩ならびにアンモニウム塩であって、ＮＨ４＋塩または少なくとも１つの水素原子がＣ１〜Ｃ６−アルキル残基と置換され得るアンモニウム塩を含むアンモニウム塩を含む。通常のアルキル残基は、特に、メチル、エチル、ｎ−またはｉ−プロピル−、ｎ−、ｓｅｃ−またはｔｅｒｔ−ブチルおよびｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシルならびにそれらの単一にまたは多重に分岐した類似体などのＣ１〜Ｃ４−アルキル残基である。
【００８２】
本発明の化合物の「アルキルエステル」は、特に、低級アルキルエステル、例えば、Ｃ１〜Ｃ６−アルキルエステルである。制限されない例として、本発明者らは、メチル、エチル、ｎ−もしくはｉ−プロピル、ｎ−、ｓｅｃ−もしくはｔｅｒｔ−ブチルエステルまたは長鎖エステル、例えば、ｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシルエステルならびにそれらの単一にまたは多重に分岐した類似体に言及してもよい。
【００８３】
「アミド」は、特に、本発明の酸の、アンモニアまたは第１級もしくは第２級モノアミンとの反応生成物である。このようなアミンは、例えば、アルキル残基が、任意選択で、互いに独立に、例えば、カルボキシル、ヒドロキシル、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉなど）、ニトロおよびスルホネート基でさらに置換され得る、モノ−またはジ−Ｃ１〜Ｃ６−アルキルモノアミンである。
【００８４】
本発明の「アシル基」は、特に、２〜４個の炭素原子を有する非芳香族基、例えば、アセチル、プロピオニルおよびブチリルならびに任意選択で、置換単核芳香環を有し、適した置換が、例えば、ヒドロキシル、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉなど）、ニトロおよびＣ１〜Ｃ６−アルキル基、例えば、ベンゾイルまたはトルオイルから選択される芳香族基である。
【００８５】
用語「生体触媒方法」とは、本発明の少なくとも１種の酵素の触媒活性の存在下で実施される任意の方法、すなわち、生酵素または精製された酵素、溶解された、分散された、または固定化された酵素の存在下、またはこのような酵素活性を有するもしくは発現する全微生物細胞の存在下での方法を指す。したがって、生体触媒方法は、酵素的および微生物的方法の両方を含む。
【００８６】
用語「立体特異的」とは、本発明に従って製造される化合物のいくつかのあり得る立体異性体のうち１種が、本発明の酵素の作用によって少なくとも１つの不斉中心を有して、高い「エナンチオマー過剰」または高い「エナンチオマー純度」で、または「立体異性体的に純粋」に、例えば、少なくとも９０％ｅｅ、特に、少なくとも９５％ｅｅまたは少なくとも９８％ｅｅまたは少なくとも９９％ｅｅで製造されることを意味する。ｅｅ％値は、以下の式から算出される：
ｅｅ％＝［ＸＡ−ＸＢ］／［ＸＡ＋ＸＢ］＊１００
［式中、ＸＡおよびＸＢは、それぞれ、エナンチオマーＡおよびＢのモル分率を表す］。
【００８７】
本発明に従って使用されるか、調製されるヒドロキシステロイド化合物、例えば、コール酸、ウルソデオキシコール酸、１２−ケト−ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸および７−ケト−リトコール酸を、本発明のプロセスにおいて、他の立体異性体との混合物中でもしくは立体異性体的に純粋な形態で使用できる、またはそれから得ることができる。しかし、使用されるか、調製される化合物は、実質的に立体異性体的に純粋な形態で使用される、または単離されることが好ましい。
【００８８】
以下の表Ａは、構造式、化学名および本技術分野の関連する化合物のために使用される略語を示す：
【００８９】
【表１−１】
2019517826.tif 000013
【００９０】
【表１−２】
2019517826.tif 000014
【００９１】
【表１−３】
2019517826.tif 000015
【００９２】
２．  タンパク質または酵素
２．１  一般
本発明は、７β−ＨＳＤＨまたは７α−ＨＳＤＨ活性を有する具体的に開示されるタンパク質または酵素（配列番号３４、３７  ４０、４４、４７、５４および５６のような）またはその突然変異体に限定されず、むしろその機能的等価物にも拡張する。
【００９３】
具体的に開示される酵素の「機能的等価物」または類似体は、本発明に関連して、それらとは異なるが、所望の生物活性、例えば、７β  ＨＳＤＨまたは７α−ＨＳＤＨ活性を依然として有するポリペプチドである。
【００９４】
例えば、「機能的等価物」は、７β−ＨＳＤＨまたは７α−ＨＳＤＨ活性のために使用される試験において、本明細書において定義されるアミノ酸配列を含む出発酵素のものよりも少なくとも１％、例えば、少なくとも１０％または２０％、例えば、少なくとも５０％または７５％または９０％高いまたは低い活性を有する酵素と理解されるべきである。
【００９５】
機能的等価物は、さらに、４から１１のｐＨ範囲において安定であることが好ましく、６から１０、例えば、特に、８．５から９．５のｐＨ範囲中に最適ｐＨを、１５℃から８０℃または２０℃から７０℃、例えば、約４５から６０℃または約５０から５５℃の範囲中に最適温度を有することが有利である。
【００９６】
７β−ＨＳＤＨ活性は、種々の公知の試験を使用して検出できる。これに制限されるわけではないが、本発明者らは、相互参照される先行技術特許文献において定義されるような、または実験の節において記載されるような標準化された条件下で、参照基質、例えば、ＣＡまたはＤＨＣＡまたは７−ＫＬＣＡを使用する試験を言及可能である。
【００９７】
７α−ＨＳＤＨ活性を調べる試験もまた、それ自体公知である。これに制限されるわけではないが、本発明者らは、実験の節において定義されるような標準化された条件下で、参照基質、例えば、ＣＤＣＡを使用する試験を言及可能である。
【００９８】
本発明の「機能的等価物」とは、特に、前記のアミノ酸配列の少なくとも１つの配列位置に、具体的に述べられるもの以外であるが、それでもなお、前記の生物活性のうち１つを有するアミノ酸を有する「突然変異体」を意味する。「機能的等価物」は、したがって、１つ以上の、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または逆位によって得られる突然変異体を含み、述べられた変化は、それらが本発明の特性プロフィールを有する突然変異体につながる限り、任意の配列位置で起こり得る。機能的等価物は特にまた、突然変異体と変更されていないポリペプチドの間の反応性のパターンが、質的に一致する、すなわち、例えば、同一基質が異なる速度で変換される場合に生じる。適したアミノ酸置換の例を以下の表に示す：
【００９９】
【表２】
2019517826.tif 000016
【０１００】
上記の意味での「機能的等価物」はまた、記載されるポリペプチドの「前駆体」ならびにポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」である。
【０１０１】
「前駆体」は、所望の生物活性を有するまたは有さないポリペプチドの天然または合成前駆体である。
【０１０２】
表現「塩」は、本発明のタンパク質分子のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、それ自体公知の方法で調製でき、無機塩、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛塩ならびに有機塩基、例えば、トリエタノールアミンなどのアミン、アルギニン、リシン、ピペリジンなどを有する塩を含む。酸付加塩、例えば、塩酸または硫酸などの無機酸を有する塩ならびに酢酸およびシュウ酸などの有機酸を有する塩も、本発明の目的である。
【０１０３】
本発明のポリペプチドの「機能的誘導体」はまた、公知の技術を使用して、機能的アミノ酸側鎖で、またはそのＮ末端もしくはＣ末端で調製できる。このような誘導体は、例えば、カルボン酸基の脂肪族エステル、アンモニアとの、または第１級もしくは第２級アミンとの反応によって得ることが可能なカルボン酸基のアミド、アシル基との反応によって調製される遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体またはアシル基との反応によって調製される遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体を含む。
【０１０４】
「機能的等価物」はまた、天然に、その他の生物から得ることが可能なポリペプチドおよび天然に存在する変異体も含む。例えば、配列比較によって、相同配列領域を見い出すことができ、本発明の具体的な指示に基づいて等価酵素を決定できる。
【０１０５】
「機能的等価物」はまた、例えば、所望の生物学的機能を有する、本発明のポリペプチドの断片、好ましくは、個々のドメインまたは配列モチーフも含む。
【０１０６】
「機能的等価物」は、さらに、機能的Ｎ末端またはＣ末端連結で（すなわち、融合タンパク質部分の相互の実質的に機能的障害を伴わない）、前記のポリペプチド配列またはそれに由来する機能的等価物のうち１つおよび少なくとも１つのさらなるそれとは機能的に異なる異種配列を有する融合タンパク質である。前記異種配列の限定されない例として、例えば、シグナルペプチド、Ｈｉｓ−タグのようなヒスチジンアンカーまたは酵素がある。
【０１０７】
本発明に従って同様に含まれる「機能的等価物」は、具体的に開示されるタンパク質の相同体である。これらは、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）第８５巻（８号）、１９８８年、２４４４〜２４４８頁のアルゴリズムに従って算出される、具体的に開示されるアミノ酸配列のうち１つに対する少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも７５％、特に、少なくとも８５％、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の相同性（または配列同一性）を有する。本発明の相同ポリペプチドの相同性または同一性パーセンテージとは、特に、本明細書において具体的に記載されるアミノ酸配列の１つの全長に対するアミノ酸残基の同一性パーセンテージを意味する。
【０１０８】
同一性パーセンテージ値はまた、ＢＬＡＳＴアラインメント、ｂｌａｓｔｐ（タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムに基づいて、または以下に示されるＣｌｕｓｔａｌ設定を使用して決定できる。
【０１０９】
可能性あるタンパク質グリコシル化の場合には、本発明の「機能的等価物」は、脱グリコシル化またはグリコシル化形態およびグリコシル化パターンを変更することによって得ることが可能な修飾された形態の、上記で示される種類のタンパク質を含む。
【０１１０】
本発明のタンパク質またはポリペプチドの相同体は、突然変異誘発によって、例えば、点突然変異、タンパク質の延長または短縮によって製造できる。
【０１１１】
本発明のタンパク質の相同体は、突然変異体、例えば、短縮された突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。例えば、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によって、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的連結によって、タンパク質変異体の変化に富んだデータベースを製造できる。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性ある相同体のライブラリーを調製するために使用できる、非常に多数の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡシンセサイザーで実施でき、次いで合成遺伝子を、適した発現ベクター中にライゲーションできる。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物中に、可能性あるタンパク質配列の所望のセットをコードするすべての配列を提供することを可能にする。縮重オリゴヌクレオチドの合成の方法は、当業者には公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ、Ｓ．Ａ．（１９８３年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ第３９巻：３号、Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第５３巻：３２３号、Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ第１９８巻：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第１１巻：４７７）。
【０１１２】
点突然変異または短縮によって製造されているコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、および選択された特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が、先行技術において公知である。これらの技術は、本発明の相同体のコンビナトリアル突然変異誘発によって製造されている遺伝子バンクの迅速スクリーニングに適応させることができる。ハイスループット解析に基づいている、大きな遺伝子バンクをスクリーニングするために最も多く使用される技術は、遺伝子バンクを複製可能な発現ベクター中にクローニングすること、適した細胞を得られたベクターバンクを用いて形質転換することおよび所望の活性の検出が、その産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。再帰的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）、バンク中の機能的突然変異体の頻度を増大する技術を、相同体を同定するためのスクリーニング試験と組み合わせて使用できる（Ａｒｋｉｎ  および  Ｙｏｕｒｖａｎ  （１９９２年）ＰＮＡＳ第８９巻：７８１１〜７８１５頁；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ第６巻（３号）：３２７〜３３１頁）。
【０１１３】
２．２  特定の７β−ＨＳＤＨ酵素
２．２．１  野生型コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）７β−ＨＳＤＨおよび機能的等価物
本発明は、本明細書によって明確に参照される、本出願人の国際特許出願ＷＯ２０１１／０６４４０４に記載されるように、コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣＣ２５９８６由来の７β−ＨＳＤＨ野生型の使用をさらに含む。
【０１１４】
コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）ＤＳＭ３９７９から得ることが可能なこの７β−ＨＳＤＨは、特に、以下の特性の少なくとも１つの他のもの、例えば、２、３、４、５、６または７つまたはすべてのこのような特性を特徴とする：
ａ）分子量（ＳＤＳ−ゲル電気泳動）：約２８〜３２ｋＤａ、特に、約２９〜３１ｋＤａまたは約３０ｋＤａ、
ｂ）分子量（非変性条件における、特にＳＤＳを有さないなどのゲル濾過）：約５３〜６０ｋＤａ、特に、約５５〜５７ｋＤａ、例えば、５６．１ｋＤａ。これは、コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）ＤＳＭ３９７９由来の７β−ＨＳＤＨの二量体性を証明する、
ｃ）７−ケト−ＬＣＡの７−カルボニル基の、７β−ヒドロキシル基への立体選択的還元、
ｄ）ｐＨ８．５〜１０．５、特に、９〜１０の範囲のＵＤＣＡの酸化のための最適ｐＨ、
ｅ）ｐＨ３．５〜６．５、特に、ｐＨ４〜６の範囲のＤＨＣＡおよび７−ケト−ＬＣＡの還元のための最適ｐＨ、
ｆ）以下の表の各々の場合に具体的に示される値付近の±２０％、特に、±１０％、±５％、±３％、±２％または±１％の範囲の、そこに記載されている基質／補因子のうち少なくとも１つの、以下の表から得られる少なくとも１つの動態パラメータ。
【０１１５】
【表３】
2019517826.tif 000017
【０１１６】
ｇ）モルモット（Ｃａｖｉａ  ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）およびマウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）を含む動物１１β−ＨＳＤＨ亜群と関連する、コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）ＤＳＭ３９７９由来の原核生物の７β−ＨＳＤＨの系統学的配列類似性。
【０１１７】
例えば、この７β−ＨＳＤＨは、以下の特性または特性の組合せを示す：ａ）、ｂ）、ａ）およびｂ）、ａ）および／またはｂ）およびｃ）、ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）、ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）、ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）およびｆ）。
【０１１８】
この種類の７β−ＨＳＤＨまたはそれに由来する機能的等価物は、さらに以下を特徴とする
ａ）７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的還元および／または
ｂ）７位にケト基およびステロイド骨格に少なくとも１つのさらなるケト基を含むケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドへの、例えば、特に、７位のデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）によって触媒される、例えば、ＮＡＤＰＨ依存性である、対応する３，１２−ジケト−７β−コラン酸への位置特異的水酸化。
【０１１９】
前記７β−ＨＳＤＨは、特に、配列番号５４（受託番号：ＺＰ＿０１７７３０６１）に従うアミノ酸配列またはこの配列に対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５または９０、例えば、少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは９９．５％の同一性の程度を有し、任意選択で、以下の特性または特性の組合せ：上記の定義に従うａ）、ｂ）、ａ）およびｂ）、ａ）および／またはｂ）およびｃ）、ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）、ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）、ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）およびｆ）のうち１つをさらに特徴とするそれに由来する配列を有する。
【０１２０】
２．２．２  特定のコリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）７β−ＨＳＤＨ突然変異体
本発明は、本明細書によって明確に参照されるＷＯ２０１２／０８０５０４、ＷＯ２０１５／１９７６９８およびＷＯ２０１６／０１６２１３に記載されるような、コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣＣ２５９８６から得られる７β−ＨＳＤＨ野生型の突然変異体の使用をさらに含む。
【０１２１】
【表４】
2019517826.tif 000018
【０１２２】
上記の例はまた、Ｃ末端および／またはＮ末端が延長された、特に、Ｈｉｓ−タグ配列によって、より詳しくは、ヘキサ−Ｈｉｓ−タグ配列によって延長された変異体にも及ぶ。
【０１２３】
上記の突然変異体のいずれも、以下の位置Ｋ４４、Ｒ５３、Ｋ６１、Ｒ６４のうちいずれかにおいてさらに突然変異され得る。
【０１２４】
２．２．３  さらなる７β−ＨＳＤＨ
本発明は、本明細書によって明確に参照されるＣＮ１０５２７４０７０の下で公開される中国特許出願に記載されるようなルミノコッカス・グナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｎａｖｕｓ）由来の７β−ＨＳＤＨ野生型およびその突然変異体、特に、ＮＡＤＰ＋依存性突然変異体の使用をさらに含む。
【０１２５】
３．  核酸および構築物
３．１  核酸
本発明はまた、７β−ＨＳＤＨまたは７α−ＨＳＤＨ活性を有する酵素およびその突然変異体をコードする核酸配列に関する。
【０１２６】
本発明はまた、本明細書に記載される具体的な配列に対して特別な程度の同一性を有する核酸に関する。
【０１２７】
２種の核酸間の「同一性」とは、各場合における全核酸長にわたるヌクレオチドの同一性、特に、以下のパラメータを設定するＣｌｕｓｔａｌ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ、Ｓｈａｒｐ  ＰＭ．  Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ａ  ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ．  Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １９８９年４月、第５巻（２号）：１５１−１）を使用してＩｎｆｏｒｍａｘ社（ＵＳＡ）のベクターＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  ７．１ソフトウェアによる比較によって算出される同一性を意味する：
マルチプルアラインメントパラメータ：
Ｇａｐオープニングペナルティー                １０
Ｇａｐ伸長ペナルティー                        １０
Ｇａｐ分離ペナルティー範囲                    ８
Ｇａｐ分離ペナルティー                        オフ
アラインメント遅れの同一性％                  ４０
残基特異的ｇａｐ                              オフ
親水性残基ｇａｐ                              オフ
トランジション加重                            ０
ペアワイズアラインメントパラメータ：
ＦＡＳＴアルゴリズム                          オン
Ｋ−タプルサイズ                              １
Ｇａｐペナルティー                            ３
ウィンドウサイズ                              ５
最良対角数                                    ５
【０１２８】
代替として、同一性はまた、インターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＃  に従う、Ｃｈｅｎｎａ、Ｒａｍｕ、Ｓｕｇａｗａｒａ、Ｈｉｄｅａｋｉ、Ｋｏｉｋｅ、Ｔａｄａｓｈｉ、Ｌｏｐｅｚ、Ｒｏｄｒｉｇｏ、Ｇｉｂｓｏｎ、Ｔｏｂｙ  Ｊ、Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｄｅｓｍｏｎｄ  Ｇ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊｕｌｉｅ  Ｄ．  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｃｌｕｓｔａｌ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．  （２００３年）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  第３１巻（１３号）：３４９７〜５００頁に従い、以下のパラメータを用いて決定できる：
ＤＮＡ  ｇａｐオープンペナルティー                      １５．０
ＤＮＡ  ｇａｐ伸長ペナルティー                          ６．６６
ＤＮＡマトリックス                                      同一性
タンパク質ｇａｐオープンペナルティー                    １０．０
タンパク質ｇａｐ伸長ペナルティー                        ０．２
タンパク質マトリックス                                  Ｇｏｎｎｅｔ
タンパク質／ＤＮＡ  ＥＮＤＧＡＰ                        −１
タンパク質／ＤＮＡ  ＧＡＰＤＩＳＴ                      ４
【０１２９】
本明細書において言及されるすべての核酸配列（一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ配列、例えば、ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ）は、ヌクレオチドビルディングブロックから化学合成によって、例えば、二重らせんの個々の、重複する、相補的な核酸ビルディングブロックの断片縮合によってそれ自体公知の方法で製造できる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、ホスホロアミダイト法（Ｖｏｅｔ、Ｖｏｅｔ、第２版、Ｗｉｌｅｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、８９６〜８９７頁）によって公知の方法で実施できる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに、合成オリゴヌクレオチドを付け足すことおよびＤＡＮポリメラーゼのクレノー断片を使用してギャップを埋めることおよび連結反応および一般的なクローニング技術が記載されている。
【０１３０】
本発明はまた、人工ヌクレオチド類似体を使用してアクセス可能である、上記のポリペプチドおよびその機能的等価物のうち１つの核酸配列（一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ配列、例えば、ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ）コーディングに関する。
【０１３１】
本発明は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質またはその生物学的に活性なセグメントをコードする単離された核酸分子および例えば、本発明のコーディング核酸の同定または増幅のためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用可能な核酸断片の両方に関する。
【０１３２】
本発明の核酸分子は、コーディング遺伝子領域の３’末端および／または５’末端に由来する非翻訳配列をさらに含有し得る。
【０１３３】
本発明は、具体的に記載されるヌクレオチド配列またはそのセグメントと相補的である核酸分子をさらに含む。
【０１３４】
本発明のヌクレオチド配列は、その他の細胞型および生物中の相同配列の同定および／またはクローニングのために使用可能なプローブおよびプライマーを製造すること可能にする。これらのプローブまたはプライマーは、通常、本発明の核酸配列のセンス鎖または対応するアンチセンス鎖の少なくとも約１２、好ましくは、少なくとも約２５、例えば約４０、５０または７５の連続するヌクレオチドと、「ストリンジェントな」条件（以下を参照のこと）下でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【０１３５】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然供給源中に存在するその他の核酸分子から分離されており、組換え技術によって製造される場合には、さらに、その他の細胞性材料または培養培地を本質的に含まない、または化学的に合成される場合には、化学的前駆体もしくはその他の化学物質を含まないものであり得る。
【０１３６】
本発明の核酸分子は、分子生物学の標準技術および本発明に従って提供される配列情報を使用して単離できる。例えば、ｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブとして、具体的に開示される完全配列またはそのセグメントのうち１つおよび標準ハイブリダイゼーション技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．  および  Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年に記載されるような）を使用して適したｃＤＮＡライブラリーから単離できる。さらに、開示される配列またはそのセグメントのうち１つを含む核酸分子を、この配列に基づいて調製されるオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって単離できる。このように増幅された核酸は、適したベクター中にクローニングでき、ＤＮＡ配列解析を特性決定できる。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、標準的な合成技術によって、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーを用いて製造できる。
【０１３７】
本発明の核酸配列またはその誘導体、これらの配列の相同体または一部は、例えば、通常のハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ技術を用いて、その他の細菌から、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーによって単離できる。これらのＤＮＡ配列は、標準条件下で、本発明の配列とハイブリダイズする。
【０１３８】
「ハイブリダイズする」とは、標準条件下でのほとんど相補的な配列との結合のためのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの能力を意味するが、これらの条件下では、非相補的パートナー間で非特異的結合は起こらない。このために、配列は、９０〜１００％相補的であり得る。互いに特異的に結合可能である相補的配列の特性は、例えば、ノーザンもしくはサザンブロッティングにおいて、またはＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマー結合において利用される。
【０１３９】
保存された領域の短いオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションに使用されることが有利である。しかし、ハイブリダイゼーションに本発明の核酸または完全配列のより長い断片を使用することも可能である。これらの標準条件は、使用される核酸（オリゴヌクレオチド、より長い断片または完全配列）に応じて、またはハイブリダイゼーションにどの種類の核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡが使用されるかに応じて変わる。したがって、例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融点は、同一長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのものよりもおよそ１０℃低い。
【０１４０】
標準条件とは、例えば、核酸に応じて、０．１から５ｘＳＳＣ（１ＸＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の間の濃度を有する水性バッファー溶液中、またはさらに、５０％ホルムアミドの存在下での４２から５８℃の間の温度、例えば、５ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド中、４２℃を意味する。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、０．１ｘＳＳＣならびに約２０℃および４５℃の間、好ましくは、約３０℃および４５℃の間の温度であることが有利である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのために、ハイブリダイゼーション条件は、０．１ｘＳＳＣならびに約３０℃および５５℃の間、好ましくは、約４５℃および５５℃の間の温度であることが有利である。ハイブリダイゼーションのために示されるこれらの温度は、例えば、ホルムアミドの不在下で、およそ１００ヌクレオチドの長さおよび５０％のＧ＋Ｃ含量を有する核酸の融点値を算出される。ＤＮＡハイブリダイゼーションの実験条件は、関連する遺伝学教本、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９年に記載されており、例えば、核酸の長さ、ハイブリッドの種類またはＧ＋Ｃ含量に応じて、当業者によって公知の式から算出できる。当業者は、以下の教本：Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９８５年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（編）、１９８５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  のＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ；Ｂｒｏｗｎ（編）、１９９１年、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  のＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄからハイブリダイゼーションに関するさらなる情報を見い出し得る。
【０１４１】
「ハイブリダイゼーション」は、特に、ストリンジェントな条件下で起こり得る。これらのハイブリダイゼーション条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年、９．３１〜９．５７頁に、またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．  （１９８９年）、６．３．１〜６．３．６に記載されている。
【０１４２】
「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件は、特に、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０ｇ／ｍｌ非変性剪断サケ精子ＤＮＡからなる溶液中で４２℃で一晩のインキュベーションと、それに続く、６５℃の０．１ｘＳＳＣを用いる濾過洗浄ステップとして理解される。
【０１４３】
本発明はまた、具体的に開示されるまたは誘導可能な核酸配列の誘導体に関する。
【０１４４】
したがって、本発明のさらなる核酸配列は、例えば、配列番号３３、３６、３９、４３、４６、４９、５３または５５から誘導でき、それらとは、個々のまたはいくつかのヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失によって異なるが、さらに、所望の特性プロフィールを有するポリペプチドをコードする。
【０１４５】
本発明はまた、いわゆるサイレント突然変異を含む、または具体的に示される配列と比較して、特定の元の生物もしくは宿主生物のコドン使用に対応して変更される核酸配列ならびにその天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体にも及ぶ。
【０１４６】
本発明はまた、保存的ヌクレオチド置換（すなわち、問題のアミノ酸が、同一荷電、大きさ、極性および／または溶解度を有するアミノ酸と置換される）によって得ることが可能な配列に関する。
【０１４７】
本発明はまた、具体的に開示される核酸から配列多型によって誘導される分子に関する。これらの遺伝的多型は、天然変動のために集団内の個体間に存在し得る。これらの天然変動は、通常、遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の分散をもたらす。
【０１４８】
配列番号３３、３６、３９、４３、４６、４９、５３または５５の配列を有する本発明の核酸配列の誘導体とは、例えば、全配列領域にわたって、誘導されたアミノ酸レベルで少なくとも６０％の相同性、好ましくは、少なくとも８０％の相同性、極めて特に好ましくは、少なくとも９０％の相同性を有する（アミノ酸レベルでの相同性に関して、ポリペプチドの上記の情報に対して参照を行ってもよい）対立遺伝子変異体を意味する。相同性は、配列の部分領域で高いことが有利であり得る。
【０１４９】
さらに、誘導体はまた、本発明の、特に、配列番号３３、３６、３９、４３、４６、４９、５３または５５の核酸配列の相同体、特に、例えば、真菌または細菌相同体、短縮配列、コーディングおよび非コーディングＤＮＡ配列の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡと理解されるべきである。例えば、配列番号３３、３６、３９、４３、４６、４９、５３または５５に対する相同体は、配列番号３３、３６、３９、４３、４６、４９、５３または５５において示される全ＤＮＡ領域にわたって、ＤＮＡレベルで、少なくとも４０％の、好ましくは、少なくとも６０％の、特に好ましくは、少なくとも７０％の、極めて特に好ましくは、少なくとも８０％の相同性を有する。
【０１５０】
さらに、誘導体は、例えば、プロモーターとの融合物として理解されるべきである。示されるヌクレオチド配列に先行するプロモーターは、少なくとも１つのヌクレオチド交換、少なくとも１つの挿入、逆位および／または欠失によって変更され得るが、プロモーターの機能性または有効性は損なわれない。さらに、プロモーターの有効性は、その配列を変更することによって増大され得る、またはそれらは、異なる種の生物のより有効なプロモーターとでさえ完全に交換され得る。
【０１５１】
さらに、機能的突然変異体を製造する方法は、当業者に公知である。
【０１５２】
使用される技術に応じて、当業者は、遺伝子中にまたは非コーディング核酸領域（例えば、発現の調節にとって重要である）中にも完全にランダムな、またはより標的化された突然変異を挿入し、次いで、遺伝子バンクを調製できる。これに必要な分子生物学の方法は、当業者に公知であり、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１年に記載されている。
【０１５３】
遺伝子を修飾し、従って、これらがコードするタンパク質を修飾する方法は、当業者ならば精通している、例えば、
−遺伝子の個々のまたはいくつかのヌクレオチドの標的化された交換をもたらす、部位特異的突然変異誘発（Ｔｒｏｗｅｒ  ＭＫ（出版者）  １９９６年；  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、
−任意のアミノ酸のコドンが、遺伝子の任意の部位で交換または付加され得る、飽和突然変異誘発（Ｋｅｇｌｅｒ−Ｅｂｏ  ＤＭ、Ｄｏｃｋｔｏｒ  ＣＭ、ＤｉＭａｉｏ  Ｄ  （１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  第２２巻：１５９３頁；Ｂａｒｅｔｔｉｎｏ  Ｄ、Ｆｅｉｇｅｎｂｕｔｚ  Ｍ、Ｖａｌｃａｒｅｌ  Ｒ、Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇ  ＨＧ  （１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ第２２巻：５４１頁；Ｂａｒｉｋ  Ｓ  （１９９５年）  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ第３巻：１頁）、
−ヌクレオチド配列が不正確に機能するＤＮＡポリメラーゼによって突然変異される、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（エラープローンＰＣＲ）（Ｅｃｋｅｒｔ  ＫＡ、Ｋｕｎｋｅｌ  ＴＡ  （１９９０年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ第１８巻：３７３９頁）、
−例えば、欠損ＤＮＡ修復機序のために、ヌクレオチド配列の突然変異率の増大がある、変異誘発株における遺伝子の継代（Ｇｒｅｅｎｅｒ  Ａ、Ｃａｌｌａｈａｎ  Ｍ、Ｊｅｒｐｓｅｔｈ  Ｂ（１９９６年）Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔａｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ．  Ｉｎ：  Ｔｒｏｗｅｒ  ＭＫ（出版者）  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、または
−密接に関連する遺伝子のプールが形成され、消化され、断片が、鎖を分離し、再度一緒にすることを反復することによって、最後に全長のモザイク遺伝子が製造されるポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として使用される、ＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ  ＷＰＣ  （１９９４年）  Ｎａｔｕｒｅ  第３７０巻：３８９頁；Ｓｔｅｍｍｅｒ  ＷＰＣ  （１９９４年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ第９１巻：１０７４７頁）
など。
【０１５４】
いわゆる定向進化（とりわけ、Ｒｅｅｔｚ  ＭＴおよびＪａｅｇｅｒ  Ｋ−Ｅ  （１９９９年）、Ｔｏｐｉｃｓ  Ｃｕｒｒ  Ｃｈｅｍ第２００巻：３１頁；Ｚｈａｏ  Ｈ、Ｍｏｏｒｅ  ＪＣ、Ｖｏｌｋｏｖ  ＡＡ、Ａｒｎｏｌｄ  ＦＨ（１９９９年）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、Ｉｎ：  Ｄｅｍａｉｎ  ＡＬ、Ｄａｖｉｅｓ  ＪＥ（出版者）  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙに記載される）を使用して、当業者ならば、標的化された方法で、大規模に機能的突然変異体を製造できる。第１のステップでは、まず、例えば、上記で示される方法を使用してそれぞれのタンパク質の遺伝子バンクが製造される。遺伝子バンクは、適した方法で、例えば、細菌によって、またはファージディスプレイ系によって発現される。
【０１５５】
所望の特性と大部分対応する特性を有する機能的突然変異体を発現する宿主生物の関連遺伝子を、突然変異の別のラウンドに付し得る。存在する機能的突然変異体が、所望の特性を十分な程度に有するまで、突然変異のステップおよび選択またはスクリーニングのステップを繰り返し反復してもよい。この繰り返し手順を用いて、制限された数の突然変異、例えば、１〜５の突然変異を次第に実施し、関連酵素特性に対するその影響について評価し、選択できる。次いで、選択された突然変異体を、同様の方法で別の突然変異ステップに付し得る。結果として、調べられるべき個々の突然変異体の数は大幅に低減され得る。
【０１５６】
本発明の結果は、所望の修飾された特性を有するさらなる酵素の標的化された作製に必要である、問題の酵素の構造および配列に関する重要な情報を提供する。特に、いわゆる「ホットスポット」、すなわち、標的化された突然変異を導入することによって、酵素特性を修飾するのに適している可能性がある配列セグメントを規定できる。
【０１５７】
３．２  構築物
本発明は、調節核酸配列の遺伝制御下に、本発明の少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸配列を含有する発現構築物およびこれらの発現構築物のうち少なくとも１つを含むベクターにさらに関する。
【０１５８】
「発現ユニット」とは、本発明に従って、発現活性を有する核酸を意味し、これは、本明細書において定義されるような、発現されるべき核酸または遺伝子との機能的連結後に、この核酸またはこの遺伝子の発現、すなわち、転写および翻訳を調節するプロモーターを含む。したがって、用語「調節核酸配列」もまた、これに関連して使用される。プロモーターに加えて、その他の調節エレメント、例えば、エンハンサーも存在し得る。
【０１５９】
「発現カセット」または「発現構築物」とは、本発明によれば、発現されるべき核酸または発現されるべき遺伝子に機能的に連結される発現ユニットを意味する。発現ユニットとは対照的に、発現カセットは、したがって、転写および翻訳を調節する核酸配列だけではなく、転写および翻訳の結果としてタンパク質として発現されるべきである核酸配列も含む。
【０１６０】
用語「発現」または「過剰発現」は、本発明に関連して、対応するＤＮＡによってコードされる、微生物中の１種以上の酵素の細胞内活性の生成または増大を説明する。このために、例えば、生物中に遺伝子を挿入してもよく、存在する遺伝子を別の遺伝子と置き換えてもよく、遺伝子（単数または複数）のコピー数を増大させてもよく、強力なプロモーターを使用してもよく、または高い活性を有する対応する酵素をコードする遺伝子を使用してもよく、これらの尺度を任意選択で組み合わせてもよい。
【０１６１】
本発明の前記構築物は、それぞれのコード配列の５’−上流のプロモーターおよび３’−下流の終結配列および任意選択で、各場合において、コード配列と作動可能に連結されるさらなる通常の調節エレメントを含むことが好ましい。
【０１６２】
「プロモーター」、「プロモーター活性を有する核酸」または「プロモーター配列」とは、本発明によれば、転写されるべき核酸と機能的に連結している、前記核酸の転写を調節する核酸を意味する。
【０１６３】
「機能的」または「作動可能な」連結とは、これに関して、例えば、調節エレメントの各々が、核酸配列の転写においてその機能を果たすことができるような方法での、例えば、プロモーター活性を有する核酸の１種と、転写されるべき核酸配列および任意選択で、さらなる調節エレメント、例えば、核酸の転写を確実にする核酸配列、例えば、ターミネーターの連続配置を意味する。これは、化学的な意味での直接連結を必ずしも必要ではない。遺伝制御配列、例えば、エンハンサー配列は、より遠隔位置からでさえ、またはその他のＤＮＡ分子からでさえ、標的配列に対してその機能を発揮できる。転写されるべき核酸配列が、プロモーター配列の後ろに（すなわち、３’末端で）位置付けられ、その結果、２つの配列が共有結合によって一緒に連結される配置が好ましい。プロモーター配列と、導入遺伝子発現を起こすべき核酸配列の間の距離は、２００塩基対未満または１００塩基対未満または５０塩基対未満であり得る。
【０１６４】
プロモーターおよびターミネーターに加えて、言及され得るその他の調節エレメントの例として、標的化配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などがある。適した調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）に記載されている。
【０１６５】
本発明の核酸構築物は、特に、配列番号３３、３６、３９、４３、４６、４９、５３または５５の配列またはその誘導体および相同体ならびに遺伝子発現を制御する、例えば、増大するための１以上の調節シグナルと作動可能にまたは機能的に連結され得るそれから誘導され得る核酸配列を含む。
【０１６６】
これらの調節配列に加えて、これらの配列の天然調節が、実際の構造遺伝子の前にさらに存在する場合があり、任意選択で、天然調節が切られ、遺伝子の発現が増大されるように遺伝子修飾されている場合もある。しかし、核酸構築物は、より簡単な構築のもの、すなわち、コード配列の前にさらなる調節シグナルが挿入されていない、その調節を有する天然プロモーターが除去されていないものであり得る。実際、天然調節配列は、調節がもはや生じず、遺伝子発現が増大されるように突然変異される。
【０１６７】
好ましい核酸構築物はまた、核酸配列の発現の増大を可能にする、プロモーターと機能的に連結された前記の「エンハンサー」配列のうち１つ以上を含有することが有利である。ＤＮＡ配列の３’末端に、さらなる調節エレメントまたはターミネーターなどのさらなる有利な配列が挿入され得る。構築物は、本発明の核酸の１以上のコピーを含有し得る。構築物はまた、任意選択で、構築物の選択のための抗生物質耐性または栄養要求性補完遺伝子などのさらなるマーカーを含有し得る。
【０１６８】
適した調節配列の例は、グラム陰性菌において適用されることが有利である、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ−、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｒｈａＰ（ｒｈａＰＢＡＤ）ＳＰ６、λ−ＰＲなどのプロモーター中に、またはλ−ＰＬプロモーター中に含有されている。さらなる有利な調節配列は、例えば、グラム陽性プロモーターａｍｙおよびＳＰＯ２中、酵母または真菌プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａｌｐｈａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨ中に含有されている。人工プロモーターも調節に使用できる。
【０１６９】
宿主生物における発現のために、核酸構築物は、宿主における遺伝子の最適発現を可能にするベクター、例えば、プラスミドまたはファージ中に挿入されることが有利である。プラスミドおよびファージとは別に、ベクターはまた、当業者に公知のすべてのその他のベクター、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルスおよびアデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファージミド、コスミドおよび線形または環状ＤＮＡとして理解されるべきである。これらのベクターは、宿主生物中で自己複製され得る、または染色体性に複製され得る。これらのベクターは、本発明の別の構成を表す。
【０１７０】
適したプラスミドとして、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１もしくはｐＢｄＣＩ、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）における、ｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２もしくはｐＩＪ３６１、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）におけるｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４もしくはｐＢＤ２１４、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）におけるｐＳＡ７７もしくはｐＡＪ６６７、真菌におけるｐＡＬＳ１、ｐＩＬ２もしくはｐＢＢ１１６、酵母における２ａｌｐｈａＭ、ｐＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３もしくはｐＥＭＢＬＹｅ２３または植物におけるｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４もしくはｐＤＨ５１がある。前記のプラスミドは、可能性あるプラスミドの小さい選択を表す。さらなるプラスミドは、当業者に周知であり、例えば、書籍Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｐｏｕｗｅｌｓ  Ｐ．Ｈ．ら編  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５年、ＩＳＢＮ  ０４４４９０４０１８）において見い出し得る。
【０１７１】
ベクターの別の構成では、本発明の核酸構築物または本発明の核酸を含有するベクターはまた、線形ＤＮＡの形態で微生物中に挿入され得、異種または相同組換えによって宿主生物のゲノム中に組み込まれ得ることが有利である。この線形ＤＮＡは、プラスミドなどの線形化ベクターからなる、または本発明の核酸構築物もしくは核酸のみからなり得る。
【０１７２】
生物における異種遺伝子の最適発現のために、生物において使用される特定の「コドン使用」に従って、核酸配列を修飾することが有利である。「コドン使用」は、問題の生物のその他の既知遺伝子のコンピュータ評価に基づいて容易に決定できる。
【０１７３】
本発明の発現カセットは、適したプロモーターの、適したコーディングヌクレオチド配列およびターミネーターまたはポリアデニル化シグナルの融合によって調製される。このために、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）に、およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．ＢｅｒｍａｎおよびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ  （１９８４）に、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８７年）に記載されるものなどの通常の組換えおよびクローニング技術が使用される。
【０１７４】
適した宿主生物における発現のために、組換え核酸構築物または遺伝子構築物は、宿主における遺伝子の最適発現を可能にする宿主特異的ベクター中に挿入されることが有利である。ベクターは、当業者に周知であり、例えば、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」（Ｐｏｕｗｅｌｓ  Ｐ．Ｈ．ら、出版社、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５年）に見い出し得る。
【０１７５】
４．微生物
文脈により、用語「微生物」とは、出発（野生型）微生物または遺伝子修飾された組換え微生物または両方を意味する。
【０１７６】
本発明のベクターを使用して、例えば、少なくとも１つの本発明のベクターを用いて形質転換されている、および本発明のポリペプチドを製造するために使用可能な組換え微生物を製造できる。上記の本発明の組換え構築物は、適した宿主系に導入され、発現されることが有利である。好ましくは、それぞれの発現系において示される核酸の発現を引き起こすために、当業者に公知の一般的なクローニングおよびトランスフェクション法、例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどが使用される。適した系は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、出版社Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９７またはＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年に記載されている。タンパク質の異種発現のための細菌発現系の概説はまた、例えば、Ｔｅｒｐｅ，Ｋ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００６年）第７２巻：２１１〜２２２頁によって提供されている。
【０１７７】
原則として、すべての原核生物または真核生物は、本発明の核酸または核酸構築物のための組換え宿主生物として考慮に入り得る。細菌、真菌または酵母などの微生物が、宿主生物として使用されることが有利である。グラム陽性またはグラム陰性菌、好ましくは、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）、ストレプトマイセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）またはノカルジア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）の細菌、特に、好ましくは、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）またはロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌が使用されることが有利である。属および種大腸菌が極めて特に好ましい。さらに有利な細菌は、アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリアまたはガンマプロテオバクテリアの群中にさらに見い出し得る。
【０１７８】
本発明の宿主生物または宿主生物は、好ましくは、上記の定義に従う７β−ＨＳＤＨ活性を有する酵素をコードする、本発明に記載される核酸配列、核酸構築物またはベクターのうち少なくとも１つを含有する。
【０１７９】
本発明のプロセスにおいて使用される生物は、宿主生物に応じて当業者に公知の方法で増殖されるか、培養される。微生物は、通例、一般に糖の形態の炭素供給源、一般に酵母抽出物などの有機窒素供給源または硫酸アンモニウムなどの塩の形態の窒素供給源、鉄、マンガン、マグネシウム塩などの微量元素および任意選択で、ビタミンを含有する液体培地中で、０℃から１００℃の間、好ましくは、１０℃から６０℃の間の温度で、酸素エアレーションを伴って増殖される。液体栄養培地のｐＨは、固定値で維持され得る、すなわち、増殖する間、調節される場合も、調節されない場合もある。培養は、バッチ式、セミバッチ式または連続であり得る。栄養分は、発酵の開始時に供給される場合も、または半連続的にもしくは連続的に補充される場合もある。
【０１８０】
５．  酵素および突然変異体の組換え製造
本発明は、さらに、ポリペプチド産生微生物が培養され、任意選択で、ポリペプチドの発現が誘導され、後者が培養物から単離される、本発明のポリペプチドまたはその機能的な生物学的に活性な断片の組換え製造のためのプロセスに関する。ポリペプチドはまた、これが望まれる場合には、この方法で工業的規模で製造され得る。
【０１８１】
本発明に従って製造される微生物は、バッチ法（バッチ培養）で、またはフェドバッチまたは反復フェドバッチ法で連続的にまたは不連続的に培養され得る。既知培養法の概要は、Ｃｈｍｉｅｌの教本（Ｂｉｏｐｒｏｚｅβｔｅｃｈｎｉｋ  １．  Ｅｉｎｆｕｈｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ  ［Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １．  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ］  （Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、１９９１））に、またはＳｔｏｒｈａｓによる教本（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ  ｕｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ  Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ  ［Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ］）  （Ｖｉｅｗｅｇ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、１９９４））に見い出し得る。
【０１８２】
使用されるべき培養培地は、それぞれの株の必要条件を適宜満たさなければならない。種々の微生物の培養培地の説明は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡ、１９８１年）のマニュアル「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」に示されている。
【０１８３】
本発明に従って使用可能なこれらの培地は、通常、１種以上の炭素供給源、窒素  供給源、無機塩、ビタミンおよび／または微量元素を含む。
【０１８４】
好ましい炭素供給源として、モノ−、ジ−またはポリサッカライドなどの糖がある。極めて良好な炭素供給源として、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースがある。糖はまた、糖蜜または糖精製のその他の副生成物などの複合化合物によって培地に添加され得る。種々の炭素供給源の混合物を添加することも有利であり得る。その他の可能性ある炭素供給源として、ダイズオイル、ヒマワリオイル、ピーナッツオイルおよびココナッツオイルなどのオイルおよび脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸またはリノール酸などの脂肪酸、グリセロール、メタノールまたはエタノールなどのアルコールならびに酢酸または乳酸などの有機酸がある。
【０１８５】
窒素供給源は、通常、有機もしくは無機窒素化合物またはこれらの化合物を含有する材料である。窒素供給源の例は、アンモニアガスまたは硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムもしくは硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸、尿素、アミノ酸またはコーンスティープリカー、ダイズ粉、ダイズタンパク質、酵母抽出物、肉抽出物その他などの複合窒素供給源を含む。窒素供給源は、個別に、または混合物として使用され得る。
【０１８６】
培地中に含有され得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リン酸塩または硫酸塩を含む。
【０１８７】
使用される硫黄供給源は、硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物などの無機硫黄化合物であり得、メルカプタンおよびチオールなどの有機硫黄化合物でもあり得る。
【０１８８】
使用されるリン供給源は、リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩であり得る。
【０１８９】
キレート化剤を、溶液中の金属イオンを維持するために培地に添加できる。特に適したキレート化剤は、カテコールもしくはプロトカテキュエートなどのジヒドロキシフェノールまたはクエン酸などの有機酸を含む。
【０１９０】
本発明に従って使用される発酵培地は、通常、ビタミンまたは例えば、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸およびピリドキシンを含む成長プロモーターなどのその他の増殖因子も含有する。増殖因子および塩は、酵母抽出物、糖蜜、コーンスティープリカーなどといった培地の複合化合物に由来することが多い。さらに、適した前駆体が、培養培地に添加され得る。培地中の化合物の正確な組成は、特定の実験に強く依存しており、各特別の場合について個別に決定される。培地最適化に関する情報は、教本「Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（出版者Ｐ．Ｍ．Ｒｈｏｄｅｓ、Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７年）５３〜７３頁、ＩＳＢＮ  ０１９９６３５７７３）に見い出し得る。Ｓｔａｎｄａｒｄ  １（Ｍｅｒｃｋ）またはＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン（ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、ＤＩＦＣＯ）などといった成長培地はまた商業的供給業者から得られる。
【０１９１】
培地のすべての成分は、熱（１．５バールおよび１２１℃で２０分）を用いて、または滅菌濾過のいずれかによって滅菌される。成分は、必要に応じて一緒にまたは個別にのいずれかで滅菌され得る。培地のすべての成分は、培養の開始時に存在し得る、または任意選択で、連続的にまたはバッチ式で添加されてもよい。
【０１９２】
培養温度は、通常、１５℃と４５℃の間、好ましくは、２５℃〜４０℃であり、実験の間、一定に維持される場合も、変わる場合もある。培地のｐＨは、５〜８．５の範囲、好ましくは、およそ７．０でなくてはならない。培養ｐＨは、培養の間、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水などの塩基性化合物またはリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物を添加することによって制御され得る。起泡を制御するために、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用することが可能である。プラスミドの安定性を維持するために、抗生物質などの適宜選択的に作用する物質を培地に添加してもよい。好気条件を維持するために、周囲空気などの酸素または酸素含有ガス混合物を培養中に供給する。培養温度は、普通、２０℃〜４５℃である。培養は、最大の目的生成物が形成されるまで継続する。この狙いは、普通、１０時間から１６０時間内に到達される。
【０１９３】
次いで、発酵培養液はさらに処理される。必要条件に応じて、バイオマスは、遠心分離、濾過、デカントまたはこれらの方法の組合せなどの分離技術によって発酵培養液から完全にまたは部分的に回収される、または中に完全に残される場合もある。
【０１９４】
ポリペプチドが、培養培地中に分泌されない場合には、細胞を破壊することもでき、タンパク質単離の公知の方法によって溶解物から生成物を得ることができる。任意選択で、高頻度超音波を用いて、高圧によって、例えば、フレンチプレスで、浸透圧分解（ｏｓｍｏｌｙｓｉｓ）によって、界面活性剤、溶解酵素もしくは有機溶媒の作用によって、ホモジナイザーを使用して、または列挙された方法のうちいくつかの組合せによって細胞を破壊することもできる。
【０１９５】
ポリペプチドは、Ｑ−セファロースクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーなどの分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）などの既知クロマトグラフィーによって、および限外濾過、結晶化、塩析、透析および未変性ゲル電気泳動などのその他の通常の方法を用いて精製できる。適した方法は、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｂｅｒｌｉｎ中に、またはＣｏｏｐｅｒ，Ｆ．Ｇ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ  ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ］、Ｖｅｒｌａｇ  Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【０１９６】
組換えタンパク質を単離するために、ｃＤＮＡを規定のヌクレオチド配列を用いて延長し、したがって、例えば、より容易な精製のために役立つ、修飾されたポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするベクター系またはオリゴヌクレオチドを使用することが有利であり得る。この種の適した修飾として、例えば、アンカーとして機能するいわゆる「タグ」、例えば、ヘキサ−ヒスチジンアンカーとして知られる修飾または抗体によって抗原として認識され得るエピトープ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  （Ｎ．Ｙ．）  Ｐｒｅｓｓに記載される）がある。これらのアンカーは、タンパク質を固体担体、例えば、クロマトグラフィーカラム中に充填できる、またはマイクロタイタープレートもしくはいくつかのその他の支持体で使用可能なポリマーマトリックスに結合するのに役立ち得る。
【０１９７】
同時に、これらのアンカーはまた、タンパク質を認識するために使用できる。タンパク質の認識のために、蛍光色素、基質との反応後に検出可能な反応生成物を形成する酵素マーカーなどのさらに通常のマーカーまたは放射活性マーカーを、単独で、またはタンパク質の誘導体化のためのアンカーと組み合わせて使用できる。
【０１９８】
６．  酵素固定化
本明細書において記載される方法において、本発明の酵素は、遊離でまたは固定化されて使用できる。固定化された酵素は、不活性支持体に固定化されている酵素と理解されるべきである。適した支持体材料およびそれに固定化された酵素は、ＥＰ−Ａ−１１４９８４９、ＥＰ−Ａ−１０６９１８３およびＤＥ−ＯＳ  １００１９３７７３から、および本明細書において引用される参考文献から公知である。これに関して、これらの文書の開示内容が全参照される。適した支持体材料として、例えば、粘土、カオリナイトなどの粘土鉱物、珪藻土、パーライト、二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉、陰イオン交換体材料、ポリスチレンなどの合成ポリマー、アクリル樹脂、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂、ポリエチレンおよびポリプロピレンなどのポリウレタンおよびポリオレフィンが挙げられる。支持された酵素を調製するために、支持体材料は、微細に分割された、微粒子形態で普通使用され、多孔性形態が好ましい。支持体材料の粒径は、普通、５ｍｍ以下、特に、２ｍｍ以下である（粒径分布曲線）。同様に、デヒドロゲナーゼを、全細胞触媒として使用する場合には、遊離または固定化された形態が選択され得る。支持体材料は、例えば、アルギン酸Ｃａおよびカラゲニンである。酵素ならびに細胞はまた、グルタルアルデヒド（ＣＬＥＡと架橋する）と直接架橋され得る。固定化の対応するさらなる方法は、例えば、Ｊ．ＬａｌｏｎｄｅおよびＡ．Ｍａｒｇｏｌｉｎ「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」に、およびＫ．ＤｒａｕｚおよびＨ．Ｗａｌｄｍａｎｎ、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ２００２年、第ＩＩＩ巻、９９１〜１０３２頁、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍに記載されている。
【０１９９】
本発明を、以下の限定されない例によってより詳細に説明する。
【実施例】
【０２００】
実験部分
特に断りのない限り、本発明に関連して実施されるクローニングステップ、例えば、制限切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片の精製、ニトロセルロースおよびナイロンメンブランへの核酸の移動、ＤＮＡ断片の連結、微生物の形質転換、微生物の培養、ファージの増殖および組換えＤＮＡの配列解析は、特に断りのない限り、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）前掲に記載されるような周知の技術を適用することによって実施される。
【実施例１】
【０２０１】
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来の新規ＮＡＤＰ依存性７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、その突然変異体、特に、補因子スイッチ突然変異体のクローニング、発現および生化学的特性決定ならびに胆汁酸の酸化のためのその適用
この実施例では、Ｃ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（ＤＳＭ  １２０５６）由来の新規７α−ＨＳＤＨを成功裏にクローニングし、発現させ精製し、生化学的に特性決定した。すべての既知７α−ＨＳＤＨとは対照的に、この酵素は、胆汁酸に対して基質阻害を示さない。このＣｄ７α−ＨＳＤＨは、推定ステロイドオキシドレダクターゼと注解され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の７α−ＨＳＤＨ（ＮＡＤ＋依存性）のタンパク質配列に対して３０％（Ｎ．Ｔａｎａｋａ、Ｔ．Ｎｏｎａｋａ、Ｔ．Ｔａｎａｂｅ、Ｔ．Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ、Ｄ．Ｔｓｕｒｕ、Ｙ．Ｍｉｔｓｕｉ、Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｎａｒｙ  ａｎｄ  ｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ７α−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．第３５巻（１９９６年）７７１５〜３０頁．  ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ９５１９０４ｄ）およびＣ．ソルデリ（ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ）由来の７α−ＨＳＤＨ（ＮＡＤＰ＋依存性）に対して５５％（Ｊ．Ｃｏｌｅｍａｎ、Ｌ．Ｈｕｄｓｏｎ、Ｍ．Ａｄａｍｓ、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＡＤＰ−ｌｉｎｋｅｄ  ７ａｌｐｈａ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１７６巻（１９９４年）４８６５〜７４頁）の相同性を示した。７−ＫＬＣＡの生物変換のＨＰＬＣ解析によって、クローニングされた酵素が、胆汁酸の７α−ヒドロキシ基への可逆的な、立体特異的な還元を触媒することが確認された。
【０２０２】
１．材料および方法
１．１  化学物質
特に断りのない場合、すべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ  ＡｌｄｒｉｃｈまたはＣａｒｌ  Ｒｏｔｈから購入した。胆汁酸は、ＰｈａｒｍａＺｅｌｌ  ＧｍｂＨ（Ｒａｕｂｌｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ＭＣＬＡＢ（Ｎｉｍａｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）製のタンパク質精製用Ｎｉ−ＮＴＡ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５を使用した。遠心分離は、遠心機ＲＣ５ＢＰｌｕｓ、Ｍｉｋｒｏ２２およびＲｏｔｉｎａ  ３５Ｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。解析方法のために、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からＨＰＬＣカラムを購入した。制限酵素は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【０２０３】
１．２  分子クローニング
７α−ｈｓｄｈ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＹＰ＿００１０８６５２９．１）は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｓｉｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  （ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供されたクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（ＤＳＭ１２０５６）由来のゲノムＤＮＡから、標準ＰＣＲ技術によって入手した。以下のクローニングステップのために、制限酵素ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩの認識部位を有するプライマーを増幅のために使用した（
【化Ｃ】
2019517826.tif 000019
）。ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩの制限エンドヌクレアーゼ部位は、太字で書かれており、メチオニン／停止コドンには下線が引かれていた。作製されたＮｄｅＩ−ＮｏｔＩ断片を、Ｔ７−プロモーターの制御下にある市販のベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）中にライゲーションした。それによって、構築されたベクターは、Ｎ末端に６ｘＨｉｓタグを有しており、ｐＥＴ２８ａ＿Ｃｄ７α−ＨＳＤＨと名付けた。
【０２０４】
ｎｏｘ２遺伝子（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼをコードする）を、鋳型としてラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）（ＤＳＭ  ２０４５１）由来のゲノムＤＮＡを使用して増幅し、ｐＥＴ２８ａ（＋）における、制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩの認識部位を有するプライマーをＣ末端に６ｘＨｉｓタグを有する酵素の構築のために使用した（
【化Ｄ】
2019517826.tif 000020
）。ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩの制限エンドヌクレアーゼ部位は、太字であり、メチオニンコドンは、下線が引かれていた。作製されたＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片を、Ｔ７−プロモーターの制御下にある、市販のベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）中にライゲーションした。構築されたベクターは、ｐＥＴ２８ａ＿ＬｓＮＯＸと名付けられている。正しいインフレームのＤＮＡ配列および何らかの突然変異がないことは、シーケンシングによって確認した。ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）由来の前記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの対応するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４９および５０に示されている。
【０２０５】
１．３  Ｃｄ７α−ＨＳＤＨの部位特異的突然変異誘発
単一突然変異を配列番号３４の残基Ｌｙｓ１６およびＡｌａ３７で、二重突然変異を残基Ａｌａ３７／Ａｒｇ３８で、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）ＰＣＲプロトコールによって実施した。突然変異の導入のために使用されたフォワードおよびその相補的リバースプライマーは、表２中に示されている。ＰＣＲの得られたプラスミドを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α中に形質転換し、プラスミド調製とそれに続くＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によるシーケンシングのために、ＬＢ寒天プレートからコロニーを選び出した。
【０２０６】
【表５】
2019517826.tif 000021
【０２０７】
突然変異位置は、天然酵素のアミノ酸配（配列番号３４）を指す。
【０２０８】
１．４  細菌株および増殖条件
大腸菌株ＤＨ５α（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中、３７℃で増殖させた。組換えプラスミドを保持する大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨ細胞の出発培養物を、５ｍＬの、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢ培地中、３７℃で一晩培養した。これらの培養物を使用して、６００ｎｍ（ＯＤ６００）で０．０５光学濃度の最終濃度で、振盪フラスコ中での発現のために、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する、ＬＢまたはＴＢ培地（ＴＢ：１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ＫＰｉ）ｐＨ７．０中、２４ｇ  Ｌ−１酵母抽出物、１２ｇＬ−１カゼイン加水分解物、５ｇＬ−１  グリセロール）中の主培養物に播種した。ＯＤ６００が０．６から０．８の間の値に達した時点で、０．５ｍＭの最終濃度へのイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって、組換え７α−ＨＳＤＨの製造を誘導した。培養物を２５℃で２０時間振盪した、またはおよび遠心分離によって収穫した。
【０２０９】
１．５  細胞不含抽出物の調製
細菌培養物を、１０，０００ｘｇ、４℃で３０分間の遠心分離によって収穫した。細胞懸濁液（２０％）を、それぞれ、５０ｍＭ  ＫＰｉバッファーｐＨ８．０または溶解バッファー（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０）中で調製した。間に冷却期間を設けて３回の１分の超音波処理サイクル（２５％出力）によって、細胞を破壊した。溶解細胞を、４℃、１８，０００ｘｇで３０分間遠心分離し、それぞれ、ＨＳＤＨまたはＮＯＸ活性の決定のために上清を使用した。標準としてＢＳＡを使用するＢｒａｄｆｏｒｄ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １９７６）に従ってタンパク質濃度を決定した。
【０２１０】
１．６  酵素の精製
精製されたＣｄ７α−ＨＳＤＨは、Ｎｉ−ＮＴＡ固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって入手した。カラムは、２５ｍＬの溶解バッファー（１０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８）を用いて平衡化した。Ｃｄ７α−ＨＳＤＨ  ｈｉｓ−タグ（配列番号３５）融合タンパク質を含有する細胞溶解物をカラムに適用し、４０ｍＬの洗浄バッファー（２０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０）を用いて洗浄した。１０ｍＬの溶出バッファー（２５０ｍＭ  イミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ  ８．０）を用いて結合されたタンパク質を溶出した。ＰＤ１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いるゲル濾過による脱塩ステップ後、酵素を５０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ８．０中に保存し、使用まで＋４℃で維持した。
【０２１１】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼは、さらに精製せず、粗抽出物を使用した。
【０２１２】
１．７  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質解析
タンパク質過剰発現を、標準としてＢＳＡを使用するＢｒａｄｆｏｒｄに従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニタリングした。３０ｋＤａの予測される質量のために、１５％アクリルアミドを含有するｔｒｉｓ−グリシンゲルを使用した。サンプルを、ローディングバッファー中、９５℃で１０分間インキュベートし、１０μｇをゲルにロードした。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０を用いてゲルを染色し、変性条件下で、標準マーカー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）との比較によって分子量を決定した。
【０２１３】
１．８  酵素アッセイ
Ｃｄ７α−ＨＳＤＨについての酵素アッセイ混合物は、キュベット中に、１ｍＬの総容量中に、５０ｍＭ  ＫＰｉ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、それぞれ、０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１０ｍＭ胆汁酸およびタンパク質を含有していた。ＮＯＸについての酵素アッセイ混合物は、キュベット中に、１ｍＬの総容量中に、５０ｍＭ  ＫＰｉ（ｐＨ７．０）、０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨおよびタンパク質を含有していた。１ユニットの活性は、分光光度計（ＵＶ−１７００  ＰｈａｒｍａＳｐｅｃ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を使用する標準条件（３４０ｎｍ、３０℃、ｐＨ８．０）下でそれぞれ１μｍｏｌのＮＡＤＰ＋の還元または１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの酸化を触媒する酵素の量として定義された。還元アッセイ混合物は、８７４μＬのバッファー（５０ｍＭ  ＫＰｉバッファーｐＨ８．０）、１００μＬの７−ＫＬＣＡ（５０ｍＭ  ＫＰｉバッファーｐＨ８．０中、１００ｍＭ）、１６μＬのＮＡＤＰＨ（蒸留水中、１２．５ｍＭ）および１０μＬのＣｄ７α−ＨＳＤＨの酵素溶液を含有していた。ＮＯＸについてのアッセイは、９７４μＬのバッファー（５０ｍＭ  ＫＰｉバッファーｐＨ７．０）、１６μＬのＮＡＤＰＨ（蒸留水中、２５ｍＭ）および１０μＬの酵素溶液を含有する。酸化アッセイ混合物は、８７０μＬのバッファー（５０ｍＭ  ＫＰｉバッファーｐＨ８．０）、１００μＬのそれぞれＣＤＣＡまたはＣＡ（５０ｍＭ  ＫＰｉバッファーｐＨ８．０中、１００ｍＭ）、２０μＬのＮＡＤＰ＋（蒸留水中、２５ｍＭ）および１０μＬ酵素溶液を含有していた。酵素溶液の添加によって反応を開始し、３０秒にわたって測定した。動態定数（ＫＭおよびＶｍａｘ）を決定するために、非線形フィッティングアルゴリズム（Ｇｒａｐｈ  ｐａｄソフトウェア）を使用してミカエリス−メンテン方程式に従って、複数の測定値（少なくとも３連として）からパラメータを算出した。
【０２１４】
１．９  生成物のクロマトグラフィー的決定
ＨＰＬＣ解析を、１ｍｌ／分の流速でＨＰＬＣ  ＬＣ−２０１０ＡＨＴシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ）でＰｕｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標）ＳＴＡＲ  ＲＰ−１８カラム（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｍａｎｙ）で実施した。移動相は、２つの溶出剤からなっていた。溶出剤Ａは、蒸留水（オルトリン酸８５％を用いて調整されたｐＨ２．６）であり、溶出剤Ｂは、ＨＰＬＣ等級アセトニトリルであった。勾配プログラムの出発条件は、６５％の溶出剤Ａおよび３５％の溶出剤Ｂであった。システムは、２００ｎｍでＵＶ検出器によってモニタリングした。完全に、１ｍｇ／ｍｌの範囲の胆汁酸濃度を有する２０μｌのサンプルを解析した。同一濃度のＣＤＣＡ、７−ＫＬＣＡおよびＵＤＣＡの標品を参照として使用した。
【０２１５】
１．１０  小規模生体内変換
ＫＰｉ−バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）における小規模１０ｍＭ  ＣＤＣＡにおける生体内変換のために、０．１ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、０．５Ｕ  ｍＬ−１のＣｄ７α−ＨＳＤＨおよび５Ｕ  ｍＬ−１のＮＡＤＰＨ−オキシダーゼを２５℃でインキュベートした。生体内変換は、５００ｒｐｍの撹拌速度で１８時間、中に撹拌バーを備えるガラスバイアル中で行った。サンプルを周期的に取り出し、ＨＰＬＣ−解析のためにメタノール−水（ｐＨ２．６）（９：１  ｖ／ｖ）で希釈した。
【０２１６】
１．１１  構造モデリング
Ｃｄ７α−ＨＳＤＨの構造は、鋳型（ＰＤＢコード：４ＪＲＯ）［２２−２５］としてｆａｂＧを使用して「Ｓｗｉｓｓモデル」を用いてモデル化した。モデリングのために最高の類似性（３８％）のために、出発点としてＦａｂＧ［３−オキソアシル−（炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）由来のアシル−担体タンパク質）レダクターゼ］を選択した。３ＤＬｉｇａｎｄＳｉｔｅを使用して、補因子ＮＡＤ（Ｐ）Ｈをタンパク質の構造中に組み込んだ［２６］。Ｙａｓａｒａ（Ｙａｓａｒａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍ、バージョン１２．１１．２５）を用いて構造アラインメントおよび構造比較を実施した。
【０２１７】
２．  実施例Ｉの実験結果
Ｃ−７のヒドロキシル基のみが、α−からβ−位に変換されなければならないので、ＣＤＣＡは、ＵＤＣＡを合成するための魅力的な出発材料に相当する。このエピマー化は、７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤＨ）によって触媒されるＣ−７でのＣＤＣＡのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ生成性酸化を、７β−ＨＳＤＨによる７−ケト基のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消費性還元とカップリングすることによる酸化還元中立カスケード反応において到達され得る。
【０２１８】
２．１  配列および構造比較
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃ．パーフリンジェンス（ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、Ｃ．ソルデリ（ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ）およびＢ．フラジリス（ｆｒａｇｉｌｌｉｓ）由来の４種の７α−ＨＳＤＨならびに本発明のＣ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来のＨＳＤＨのアミノ酸配列アラインメントを、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ」アラインメントツールを使用して実施した（図１）。
【０２１９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、それぞれ、Ｂ．フラジリス（ｆｒａｇｉｌｌｉｓ）由来の調べられた酵素の種々の起源に関して全配列にわたって相当な配列同一性が観察された。さらに、いくつかの高度に保存された領域が存在する。これらの結果に基づいて、Ｃｄ７α−ＨＳＤＨは、短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ（ＳＤＲ）の通常のメンバーとして分類され得る（Ｐ．Ｌｅｐｅｒｃｑ、Ｐ．Ｇｅｒａｒｄ、Ｆ．Ｂｅｇｕｅｔ、Ｊ．−Ｐ．Ｇｒｉｌｌ、Ｐ．Ｒｅｌａｎｏ、Ｃ．Ｃａｙｕｅｌａら、Ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｆｌｏｒａ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ７α−  ａｎｄ  ７β−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｅｃｏｌ．  Ｈｅａｌ．  Ｄｉｓ．第１６巻（２００４年）１９５〜２０１頁．  ｄｏｉ：１０．１０８０／０８９１０６００４１００３３３９３）。さらに、本発明者らは、酵素と補酵素間の相互作用を理解するために、およびＮＡＤＰ（Ｈ）からＮＡＤ（Ｈ）への特異性を変更するためにＣｄ７α−ＨＳＤＨの構造をモデル化した。
【０２２０】
２．２  クローニング、過剰発現および精製
Ｃｄ７α−ＨＳＤＨおよびその突然変異体の組換え過剰発現のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｈｓｄ−  ｋａｎ＋ノックアウト突然変異体（大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨ）を宿主として使用し、高レベルの組換えＣｄ７α−ＨＳＤＨをもたらした。３０，１５４．３Ｄａの算出分子量を有する精製Ｃｄ７α−ＨＳＤＨ（配列番号３５）（Ｎ末端６ｘｈｉｓ−タグを含む）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって判断されるような３０ｋＤａの単一バンドとして同定した（図２）。この方法によって、すでに、粗抽出物中（レーン１）に、この酵素の高過剰発現を実証できた。
【０２２１】
２．３  酵素活性および動態定数
Ｃｄ７α−ＨＳＤＨの活性を、基質としてＣＤＣＡを使用して研究した。細胞不含粗抽出物では、活性は、ＣＤＣＡおよびＮＡＤＰ＋を用いて測定された精製サンプルの３．６Ｕ  ｍｇ−１および５．５Ｕ  ｍｇ−１であるとわかった。ＮＡＤ＋を用いた場合には、０．１１Ｕ  ｍｇ−１程度のわずかなバックグラウンド活性が検出されることもあった。ＴＢ培地における発現は、４．５Ｕ  ｍｇ−１（粗抽出物）および７．７Ｕ  ｍｇ−１（精製）（補因子としてＮＡＤＰ＋）のわずかに増大した活性をもたらした。
【０２２２】
基質および補因子の動態パラメータ（ＫＭおよびＶｍａｘ）は、表３にまとめられている。これらのデータは、ＣＡは、ＣＤＣＡよりも１０倍高い活性で酸化されることを示す。予期しないことに、ＣＤＣＡにつながるＮＡＤＰＨを用いる７−ケトリトコール酸（７−ＫＬＣＡ）の還元は、ＣＤＣＡの酸化の８．５Ｕ  ｍｇ−１と比較して、１．１Ｕ  ｍｇ−１という極めて低い活性で起こる。高濃度のＣＤＣＡについても、ＮＡＤＰ＋についても基質阻害が観察されなかったということは注目に値する。研究は、Ｃｄ７α−ＨＳＤＨの補因子依存性は、ＮＡＤ＋を上回ってＮＡＤＰ＋を好むということに関していた。ＮＡＤＰ＋を使用して、同一濃度のＮＡＤ＋を用いた場合に達成された活性と比較して、高ＣＤＣＡ基質濃度（≧２．５ｍＭ  ＣＤＣＡ）で活性の１００倍の増大が観察された。この挙動の理由は、補因子ＮＡＤ＋を用いた場合に観察された異常に強力な基質阻害である。０．１ｍＭ  ＣＤＣＡの小さい範囲内で最高の活性が生じ、より高い濃度で著しい低下を伴い、２．５ｍＭですでに、わずか約１０％の残存活性しか測定されなかった。
【０２２３】
【表６】
2019517826.tif 000022
【０２２４】
測定は、５μＭから３０ｍＭ胆汁酸の間の基質濃度範囲で、酸化のためには一定０．５ｍＭ  ＮＡＤ（Ｐ）＋および還元のためには０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨで実施した。補因子については、測定は、１μＭから１０ｍＭ  ＮＡＤＰ＋の間の範囲で、一定の１ｍＭ胆汁酸で実施した。ａ）＝０．１ｍＭ  ＣＤＣＡを上回る濃度では、強力な基質阻害によって、見かけのＶｍａｘを使用して動態パラメータを決定した。
【０２２５】
２．４  温度に対するＣｄ７α−ＨＳＤＨ活性の依存
基質としてＣＤＣＡを使用して、１５から６５℃の間で酵素活性に対する温度の影響を調べた（図３）。すべての測定は、精製タンパク質を用いて（Ｎ−Ｈｉｓ−タグを用いて）実施した。Ｃｄ７α−ＨＳＤＨは、４５℃まで活性のわずかな増大を示し、１１Ｕ  ｍｇ−１であった。４５℃から６０℃で、活性は急速に増大し、６０℃で最大であり（７７Ｕ  ｍｇ−１）、続いて、タンパク質変性のために急速に低下した。温度安定性に関して、６０℃で５分間のインキュベーションでわずか５％の残存活性しか検出されなかった。
【０２２６】
２．５  生成物濃度に対するＣｄ７α−ＨＳＤＨ活性の依存
Ｃｄ７α−ＨＳＤＨに対する生成物７−ＫＬＣＡの阻害効果は、ＣＤＣＡをＵＤＣＡに変換するプロセスにおける重大なパラメータである。したがって、本発明者らは、種々の濃度の７−ＫＬＣＡの存在下で、デヒドロゲナーゼの残存活性を測定した。測光アッセイは、標準活性アッセイと同様であり、ＣＤＣＡのみを１０ｍＭの代わりに１ｍＭで使用した。図４は、生成物７−ＫＬＣＡが、Ｃｄ７α−ＨＳＤＨ（Ｎ−Ｈｉｓ−タグを有する）の強力な阻害剤であることを示す。すでに、１ｍＭの生成物の存在下で、活性は２８％に低減され、２．５ｍＭで、わずか約１０％の残存活性しか測定できなかった。
【０２２７】
２．６  ＣＤＣＡの生体内変換
この酵素の適用性を確認するために、スキーム２に従うＮＡＤＰ＋の再生のために、３９ｍｇ（１０ｍＭ）のＣＤＣＡの１０ｍＬ規模の生体内変換を、Ｃｄ７α−ＨＳＤＨ（Ｎ−Ｈｉｓ−タグを有する）（配列番号３５）を、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）由来のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ（配列番号５１）（Ｃ−Ｈｉｓ−タグを有する）と組み合わせて使用して実施した。
【０２２８】
【化９】
2019517826.tif 000023
【０２２９】
ＨＰＬＣ解析は、７−ＫＬＣＡは、ＣＤＣＡからの唯一の生成物であり、１８．５時間後に＞９９％の変換を有していたということを示す（図５）。完全変換は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの不可逆性および高い駆動力のために唯一可能である。残念ながら、オキシダーゼは、制限された安定性を示し、従って、この酵素は、完全変換を確実にするために３および７時間後に補充されてきた。
【０２３０】
２．７  補酵素特異性の変換
野生型Ｃｄ７α−ＨＳＤＨ（Ｎ−Ｈｉｓ−タグを有するまたは有さない；配列番号３４または３５）は、ＮＡＤＰ＋に対して補酵素優先を示し、ＮＡＤ＋を用いる場合には小さな副活性（＜０．１％）を有する。しかし、ＮＡＤ＋のより低い費用およびより高い安定性のために、工業的使用におけるこの補酵素の適用は、有利であり得る。ＮＡＤ＋活性を増大するために、ＮＡＤＰ＋依存性Ｃｄ７α−ＨＳＤＨの補因子結合領域の、種々の生物に由来するＮＡＤ依存性ＨＳＤＨとのアミノ酸配列アラインメントを実施した（図６）。このアラインメントは、典型的なグリシンモチーフ（Ｇ／Ａ）ＸＸＸＧＸＧ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である）を示す補因子結合部位がより高く保存されていることを示した。Ａｌａ３７およびＡｒｇ３８を、位置Ａｌａ３７に酸性残基を、Ａｒｇ３８の代わりに小さい疎水性残基を導入することを目的とする突然変異のために標的とした。図７は、Ａｌａ３７の推定可能な機能は、２’−リン酸基のための空間を提供することであることを実証する。電荷斥力または立体障害によるいずれかの好ましくない相互作用によるＮＡＤＰ＋−結合の識別のために、アスパラギン酸またはグルタミン酸を導入することによって効果があり得る（図７、Ｂ）。
【０２３１】
実際、単一突然変異体Ａ３７ＥおよびＡ３７Ｄは、０．０４Ｕ  ｍｇ−１（ＮＡＤ＋）およびＮＡＤＰ＋を用いた場合に３．２Ｕ  ｍｇ−１を有する野生型酵素と比較して、ＮＡＤ＋に対する活性の増大（０．２および０．９Ｕ  ｍｇ−１）ならびにＮＡＤＰ＋に対する活性の低減（０．２および０．４Ｕ  ｍｇ−１）を示した。これは、野生型と関連する突然変異体Ａ３７Ｄの、ＮＡＤ＋を用いた場合の活性の２２倍の増大に対応する。この単一突然変異は、二重突然変異体Ａ３７Ｄ／Ｒ３８ＩまたはＡ３７Ｄ／Ｒ３８Ｌ（ＮＡＤ＋を用いた場合の両突然変異体の０．１Ｕ／ｍｇ）よりも良好なＮＡＤ＋特異的活性をもたらした。
【０２３２】
この酵素の構造モデリングのために、別のアミノ酸、Ｌｙｓ１６（配列番号３４）を、ＮＡＤＰ＋の２’−リン酸基とおそらくは相互作用すると同定した。この考察は、新規単一（Ｋ１６Ａ、Ｋ１６ＧおよびＫ１６Ｄ）および二重突然変異体（Ｋ１６Ａ／Ａ３７ＤおよびＫ１６Ｇ／Ａ３７Ｄ）の作製につながり、位置１６でアミノ酸を変更した。実際、グリシンからの小さい残基は、野生型酵素との比較において約６倍（０．２Ｕ  ｍｇ−１）、ＮＡＤ＋を用いた場合の活性を増大したのに対し、アラニンまたはアスパラギン酸の導入は（グリシンとの比較において）活性を低減した（それぞれ、０．０９および０．０１Ｕ  ｍｇ−１）ことを示し得る。しかし、すべての突然変異体（Ｋ１６Ａ、Ｋ１６ＧおよびＫ１６Ｄ）は、野生型と比較して高い活性を有する。二重突然変異体Ｋ１６Ｇ／Ａ３７ＤおよびＫ１６Ａ／Ａ３７Ｄは、補因子としてＮＡＤ＋を用いた場合に活性に対して増大効果を有さない。図８は、突然変異体のＮＡＤ＋活性をまとめている。
【０２３３】
さらに、最良のＮＡＤ＋−突然変異体Ａ３７Ｄについての動態パラメータを決定した。
【０２３４】
ＣＤＣＡに対する精製組換えＣｄ７α−ＨＳＤＨの動態パラメータを、０．５ｍＭの固定ＮＡＤ＋濃度でＣＤＣＡ濃度を０．０５から３０ｍＭに増大することによって、５０ｍＭ  ＫＰｉバッファー（ｐＨ８．０）中、２５℃で決定した。各試験は３連で実施した。補因子ＮＡＤ＋を用いた場合の強力な基質阻害のために、標準ミカエリス−メンテン方程式を用いるフィッティングは可能ではなかった。したがって、見かけのＶｍａｘを使用して動態パラメータを算出した。結果は、表４にまとめられている：
【０２３５】
【表７】
2019517826.tif 000024
【０２３６】
測定は、５μＭから３０ｍＭ  ＣＤＣＡの間の基質濃度範囲で一定の０．５ｍＭ  ＮＡＤ＋で実施した。補因子測定は、１μＭから７．５ｍＭ  ＮＡＤ＋の間の範囲で、一定の０．１ｍＭ  ＣＤＣＡで実施した。ａ）＝０．１ｍＭ  ＣＤＣＡを上回る濃度では、強力な基質阻害によって、見かけのＶｍａｘを使用して動態パラメータを決定した。
【０２３７】
３．まとめ
構造に基づく部位特異的突然変異誘発によって補酵素特異性をＮＡＤＰ＋からＮＡＤ＋に切り替えるための本発明者らの試みは、いくつかの突然変異体、特に、２種の酵素単一突然変異体（Ａ３７ＥおよびＡ３７Ｄ）をもたらし、野生型と比較して、ＮＡＤ＋を用いた場合に活性の有意な増大があった。特に、Ａ３７Ｄは、０．９Ｕ／ｍｇの比活性を示した。さらに、これは、この突然変異体について補酵素ＮＡＤＰ＋を用いた場合に活性の強力な低下をもたらした（野生型の３．２Ｕ／ｍｇとの比較において０．４Ｕ／ｍｇ残存活性。要するに、得られた突然変異体、特に、Ａ３７Ｄ酵素変異体は、ここで、７α−ＨＳＤＨ活性をＮＡＤＨオキシダーゼと組み合わせて７−ＫＬＣＡを得る可能性またはＮＡＤＨ依存性７β−ＨＳＤＨと組み合わせてＵＤＣＡを生成する可能性を提供する。
【実施例２】
【０２３８】
大腸菌由来の７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの新規ＮＡＤＰ依存性突然変異体、特に、補因子スイッチ突然変異体のクローニング、発現および生化学的特性決定ならびに胆汁酸の酸化のためのその適用
１．  材料および方法
１．１  化学物質
例えば、抗生物質のようなすべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＣａｒｌ  Ｒｏｔｈ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。すべての制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４ＤＮＡリガーゼは、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）は、Ｇｅｒｂｕ（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。
【０２３９】
１．２  培地＆バッファー：
ＬＢ培地：１リットルの培地あたり、トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ
ＫＰｉバッファー：１リットルのバッファーあたり、８．３ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４および０．３ｇ  ＫＨ２ＰＯ４を含有する（５０ｍＭ、ｐＨ８）
崩壊バッファー：１０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８
洗浄バッファー：２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８
溶出バッファー：２５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８
【０２４０】
１．３  微生物：
【０２４１】
【表８】
2019517826.tif 000025
【０２４２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）を、適した抗生物質を含有するＬＢ培地中、３７℃で増殖させた。
【０２４３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨ（特に、７α−ＨＳＤＨノックダウン突然変異体に関するＰｈａｒｍａｚｅｌｌ  ＧｍｂＨ特許出願ＷＯ２０１１／１４７９５７を参照のこと）を、適した抗生物質を含有するＬＢ培地中、３７℃で増殖させ、ＯＤ６００＝０．６〜０．８で０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを用いる誘導後に、２５℃、１３０ｒｐｍで２０時間インキュベートした。
【０２４４】
１．４  発現ベクターおよびベクター構築物：
組換え７α−ＨＳＤＨを発現させるために、発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）が適用され、以下のベクター構築物が作製されている：
・ｐＥＴ２８ａ（＋）＿７α−ＨＳＤＨ（−）：対応する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）７α−ＨＳＤＨ遺伝子が、標準手順によって切断部位ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ中にクローニングされたｐＥＴ２８ａ（＋）−ベクター。構築物は、６ｘＨｉｓ−タグを含有しない。
・ｐＥＴ２８ａ（＋）＿７α−ＨＳＤＨ（Ｎ）：対応する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）７α−ＨＳＤＨ遺伝子が、標準手順によって切断部位ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ中にクローニングされたｐＥＴ２８ａ（＋）−ベクター。この構築物は、Ｎ末端６ｘＨｉｓ−タグを含有する。
・ｐＥＴ２８ａ（＋）＿７α−ＨＳＤＨ（Ｃ）：対応する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）７α−ＨＳＤＨ遺伝子が、標準手順によって切断部位ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ中にクローニングされたｐＥＴ２８ａ（＋）−ベクター。前記構築物は、Ｃ末端６ｘＨｉｓ−タグを含有する。
【０２４５】
１．５  培養
ＬＢ培地中、３７℃で振盪フラスコ中で培養を実施した。ＯＤ６００＝０．６〜０．８で、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって遺伝子発現を誘導した。その後、細胞を２５℃で２０時間増殖させ、次いで、回収した。
【０２４６】
１．６  粗抽出物の製造
培養細胞を超音波処理（２５％（ｗ／ｖ）細胞懸濁液）によって破壊し、このように得られた粗抽出物を活性アッセイに適用した。
【０２４７】
１．７  ７α−ＨＳＤＨ活性測定のための標準条件
反応混合物は、１ｍｌの総容量中に以下を含有していた：
８８０μｌ      ５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）バッファー、ｐＨ８．０
１００μｌ      １００ｍＭ  ＣＤＣＡ（５０ｍＭ  ＫＰｉ、ｐＨ８中に溶解された）
１０μｌ        酵素溶液（上記のようなバッファー中、２〜６Ｕ／ｍｌの範囲の）
１０μｌ        ５０ｍＭ  ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋（ｄｄＨ２Ｏに溶解された）
【０２４８】
３４０ｎｍで３０秒の期間にわたって吸光度の増大を調べ、活性を酵素ユニットとして表した（１Ｕは、１μｍｏｌのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／分の変換に相当する）。モル吸光係数は、６．２２ｍＭ−１×ｃｍ−１とした。
【０２４９】
１．８  Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によるタンパク質決定
サンプル（１００μｌ）を９００μｌのＢｒａｄｆｏｒｄ試薬と混合し、暗所で少なくとも１５分間インキュベートした。タンパク質含量を、適用されるアッセイの濃度範囲において標準物質としてＢＳＡを用いて５９５ｎｍで決定した。
【０２５０】
１．９  分子生物学的方法
特に断りのない限り、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ  （１９９３年）；  Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ  （１９９０年）に開示されるような確立された方法が適用されている。
【０２５１】
１．１０．  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）−ＰＣＲ
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）−ＰＣＲ（ＱＣ−ＰＣＲ）によって、個々のアミノ酸残基の定方向交換を実施した。適用されたプライマーは、続く表６にまとめられている。前記プライマーは、位置４２および／または４３において意図されたアミノ酸交換を引きおこす。
【０２５２】
【表９】
2019517826.tif 000026
【０２５３】
前記反応を実施するために、第１のステップにおいて、変性ステップを９５℃で２分間実施した。その後、２３サイクルの変性（９５℃で３０秒）、プライマーハイブリダイゼーションおよび伸長（７２℃で１１分）を続けた。最後のステップとして、７２℃で１０分間最終伸長を実施し、その後、１５℃に冷却することによってポリメラーゼ連鎖反応を終結した。
【０２５４】
【表１０】
2019517826.tif 000027
【０２５５】
鋳型として、７α−ＨＳＤＨを有するｐＥＴ２８ａ−ベクター（野生型）コード配列を適用した。特に、突然変異されるべき遺伝子のＮ６−アデニン−メチル化二本鎖プラスミドＤＮＡを適用した。Ｎ６−アデニン−メチル化プラスミドＤＮＡを、ｄａｍ＋大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（上記で列挙されたような）から単離した。
【０２５６】
ＰＣＲを上記のように実施した。その後、ＰＣＲ産物をＡｎａｌｙｔｉｋ  ＪｅｎａのＰＣＲ精製キットによって精製した。親のＮ６−アデニン−メチル化ＤＮＡを制限酵素ｄｐｎＩによって消化した。この酵素は、非特異的にＮ６−アデニン−メチル化ＤＮＡを制限するという特別な特徴を有する。しかし、新規に形成された非メチル化ＤＮＡとは反応しない。精製されたＰＣＲ反応生成物に１μｌのｄｐｎＩを添加することによって、３７℃で少なくとも２時間または一晩、制限を実施した。
【０２５７】
８μｌの前記反応混合物を、１００μｌの化学的にコンピテントなＤＨ５α細胞の形質転換に適用した。
【０２５８】
１．１１．  発現および精製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨを、対応する発現構築物を用いて形質転換した。この目的のために、発現構築物を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨ株を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢ培地で増殖させた。遠心分離（１０．０００ｘｇ、３０分、４℃）によって細胞を回収した。ペレットを崩壊バッファー（２５％（ｗ／ｖ）細胞懸濁液）に懸濁した。細胞を冷却下で２分間超音波処理した（３０Ｗ、１０〜２５％作業間隔および１分の中断）。超音波処理装置Ｓｏｎｏｐｕｌｓ  ＨＤ２０７０（Ｂａｎｄｅｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を適用した。崩壊を３回反復した。細胞抽出物を遠心分離した（２０．０００×ｇ、３０分、４ｏＣ）。上清を、２５ｍｌの崩壊バッファーで平衡化しておいたカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）に適用した。４０〜５０ｍｌの洗浄バッファーを用いて洗浄することによって弱く結合するタンパク質を溶出した。１０ｍｌの溶出バッファーによってＨｉｓ−タグ−７α−ＨＳＤＨタンパク質を溶出した。プロセスを、室温で実施した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ限外濾過モジュールによって溶出液を濃縮し、ＰＤ１０カラムによってバッファー交換を実施して、イミダゾールを除去した。
【０２５９】
項目１．８の下で上記のように決定されたタンパク質濃度。さらに、各サンプルを、１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ染色によって解析した。
【０２６０】
２．  実施例ＩＩの実験結果
２．１  測光活性アッセイ
ＵＶ−１７００分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ）によって粗抽出物の測光活性アッセイを実施した（項目１．７の下で上記で記載された方法を参照のこと）。表８では、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋について得られたような個々の突然変異体の比活性値がまとめられている。
【０２６１】
【表１１】
2019517826.tif 000028
【０２６２】
最良の突然変異体（番号４）は、元の補因子ＮＡＤ＋についてわずかな活性のみおよび補因子ＮＡＤＰ＋について約６．３Ｕ／ｍｇの活性を示す。図９は、結果の図解を示す。
【０２６３】
２．２．  生化学的特性決定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、相同発現の発現力ならびに精製の質を評価した。図１０は、突然変異体７α−ＨＳＤＨ［Ｄ４２Ｇ／Ｉ４３Ｒ］のＳＤＳゲルを示す。野生型ならびにＮＡＤＰ＋突然変異体（Ｎ末端６ｘＨｉｓ−タグを有する）（配列番号４１）の分子量は、約２８．９ｋＤａである。図１０は、７α−ＨＳＤＨが、理論的分子量を示さないことを示す。むしろ、バンドは、約２５ｋＤａの分子量を示す。
【０２６４】
２．３．  ミカエリス−メンテン速度論
各突然変異体について、ならびに野生型酵素について、動態定数ＶｍａｘおよびＫＭを決定した。測定は、基質ＣＤＣＡおよび補酵素ＮＡＤ（Ｐ）＋について実施した。結果はまた、表９にまとめられている。測定は、精製タンパク質を用いて（項目７に従って）、０．５ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）＋の補因子の一定濃度で、ＣＤＣＡについて１０μＭから３０ｍＭの範囲の種々の基質濃度で実施した。補因子についての対応する定数は、１ｍＭのＣＤＣＡ濃度および１０μＭから５ｍＭの範囲の補因子濃度で実施した。
【０２６５】
【表１２】
2019517826.tif 000029
【０２６６】
ミカエリス−メンテングラフ（表されていない）は、前記の２種の酵素変異体の各々のＣＤＣＡの基質阻害を示す。突然変異体について、阻害はより顕著である。
【実施例３】
【０２６７】
ＣＤＣＡのＵＤＣＡへの共役自己完結型１ステップ変換
１．  材料および方法
１．１  化学物質
例えば、抗生物質のようなすべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｒｌ  ＲｏｔｈまたはＢｉｏｍｏｌ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。すべての制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４ＤＮＡリガーゼは、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）は、Ｇｅｒｂｕ（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。
【０２６８】
１．２  培地＆バッファー：
ＬＢ培地：１リットルの培地あたり、トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ
ＫＰｉバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ８）：１リットルのバッファーあたり、８．３ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４および０．３ｇ  ＫＨ２ＰＯ４
崩壊バッファー：１０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８
洗浄バッファー：２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８
溶出バッファー：２５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８
【０２６９】
１．３  微生物：
【０２７０】
【表１３】
2019517826.tif 000030
【０２７１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）を、適した抗生物質を含有するＬＢ培地中で増殖させた。
【０２７２】
大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨは、ＰｈａｒｍａＺｅｌｌ  ＧｍｂＨ（ＷＯ２０１１／１４７９５７を参照のこと）から入手した。
【０２７３】
１．４  発現ベクターおよびベクター構築物：
組換え７αおよび７β−ＨＳＤＨ酵素を発現させるために、それ自体公知の発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）ならびにｐＡＣＹＣＤｕｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）が使用され、以下のベクター構築物が調製されている：
・ｐＥＴ２８ａ（＋）＿７α−ＨＳＤＨ（Ｎ）［Ｄ４２Ｇ／Ｉ４３Ｒ］：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の７α−ＨＳＤＨの遺伝子が、制限部位ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩによって周知の方法でクローニングされたｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）−ＰＣＲによって、突然変異Ｄ４２ＧおよびＩ４３Ｒが導入されている。この構築物は、Ｎ末端６ｘＨｉｓ−タグを含有する（配列番号４１）。
・ｐＥＴ２８ａ（＋）＿Ｃｄ７α−ＨＳＤＨ（Ｎ）：Ｃ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来の７α−ＨＳＤＨの遺伝子が、制限部位ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩによって周知の方法でクローニングされたｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター。この構築物は、Ｎ末端６ｘＨｉｓ−タグを含有する（配列番号３５）。
・ｐＡ＿７β−ＨＳＤＨ：Ｃ．アエロファシエンス（ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）由来の７β−ＨＳＤＨの遺伝子が、制限部位ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩによって周知の方法でクローニングされたｐＡＣＹＣＤｕｅｔベクター。前記構築物は、６ｘＨｉｓ−タグを含有しない（配列番号５２）。
・ｐＡ＿７β−ＨＳＤＨ［Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｅ］：Ｃ．アエロファシエンス（ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）由来の７β−ＨＳＤＨ遺伝子が、制限部位ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩによって周知の方法でクローニングされたｐＡＣＹＣＤｕｅｔベクター。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）−ＰＣＲによって、突然変異Ｇ３９ＳおよびＲ６４Ｅが導入された。この構築物は、６ｘＨｉｓ−タグを含有しない（配列番号４５）。
・ｐＥＴ２８ａ（＋）＿７β−ＨＳＤＨ（Ｃ）［Ｇ３９Ｅ］：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の７α−ＨＳＤＨの遺伝子が、制限部位ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩによって周知の方法でクローニングされたｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）−ＰＣＲによって、突然変異Ｇ３９Ｅが導入された。この構築物は、Ｃ末端６ｘＨｉｓ−タグを含有する（配列番号４８）。
【０２７４】
ＣＤＣＡからのＵＤＣＡの１ステップ合成のために使用された組換え株が、表１１に列挙されている。
【０２７５】
【表１４】
2019517826.tif 000031
【０２７６】
前記ＤＢ０６およびＤＢ０７株を調製するために、株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨを、ＰｈａｒｍａＺｅｌｌ  ＧｍｂＨから入手して使用した（以下の記載を参照のこと）。
【０２７７】
１．５  培養
ＬＢ培地中、３７℃で振盪フラスコ中で培養を実施した。０．６〜０．８のＯＤ６００で、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって遺伝子発現を誘導した。その後、細胞を２５℃で２０時間増殖させ、次いで、回収した。
【０２７８】
１．６．  粗抽出物の調製
培養細胞を超音波処理し（２５％（ｗ／ｖ）細胞懸濁液）、得られた粗抽出物を遠心分離（２０．０００ｇ、３０分、４℃）して細胞断片を除去した。
【０２７９】
１．７．  ＨＳＤＨ活性アッセイのための標準条件
反応混合物は、１ｍｌの総容量中に以下を含有していた：
８８０μｌ      ５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）バッファー  、ｐＨ８．０
１００μｌ      １００ｍＭ  ＣＤＣＡまたは７−ＫＬＣＡ（５０ｍＭ  ＫＰｉ、ｐＨ８中に溶解された）
１０μｌ        酵素溶液（バッファー中に希釈された、１〜５Ｕ／ｍｌの範囲の）
１０μｌ        ５０ｍＭ  ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋（ｄｄＨ２Ｏに溶解された）
【０２８０】
３４０ｎｍで３０秒の期間にわたって吸光度の増大を調べ、活性を酵素ユニットとして表した（１Ｕは、１μｍｏｌ基質／分の変換に相当する）。モル吸光係数は、６．２２ｍＭ−１×ｃｍ−１とした。
【０２８１】
１．８  Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によるタンパク質決定
サンプル（１００μｌ）を９００μｌのＢｒａｄｆｏｒｄ試薬と混合し、暗所で少なくとも１５分間インキュベートした。タンパク質含量を、適用されるアッセイの濃度範囲において標準物質としてＢＳＡを用いて５９５ｎｍで決定した。
【０２８２】
１．９  分子生物学的方法
特に断りのない限り、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ  （１９９３年）；  Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ  （１９９０年）に開示されるような確立された方法が適用されている。
【０２８３】
１．１０．  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）−ＰＣＲ
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）−ＰＣＲ（ＱＣ−ＰＣＲ）によって、個々のアミノ酸残基の定方向交換を実施した。適用されたプライマーは、続く表１２にまとめられている。前記プライマーは、位置４２および／または４３において意図されたアミノ酸交換を引き起こす。
【０２８４】
【表１５】
2019517826.tif 000032
【０２８５】
前記反応を実施するために、第１のステップにおいて、変性ステップを９５℃で２分間実施した。その後、２３サイクルの変性（９５℃で３０秒）、プライマーハイブリダイゼーションおよび伸長（７２℃で１１分）を続けた。最後のステップとして、７２℃で１０分間最終伸長を実施し、その後、１５℃に冷却することによってポリメラーゼ連鎖反応を終結した。
【０２８６】
【表１６】
2019517826.tif 000033
【０２８７】
鋳型として、対応する野生型遺伝子を有するｐＥＴ２８ａベクターを適用した。特に、突然変異されるべき遺伝子のＮ６−アデニン−メチル化二本鎖プラスミドＤＮＡを適用した。Ｎ６−アデニン−メチル化プラスミドＤＮＡを、例えば、株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αのようなｄａｍ＋大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株から単離した。
【０２８８】
ＰＣＲを上記のように実施した。その後、ＰＣＲ産物をＡｎａｌｙｔｉｋ  ＪｅｎａのＰＣＲ精製キットによって精製した。親のＮ６−アデニン−メチル化ＤＮＡを制限酵素ｄｐｎＩによって消化した。この酵素は、非特異的にＮ６−アデニン−メチル化ＤＮＡを制限するという特別な特徴を有する。しかし、新規に形成された非メチル化ＤＮＡとは反応しない。精製されたＰＣＲ反応生成物に１μｌのｄｐｎＩを添加することによって、３７℃で少なくとも２時間または一晩、制限を実施した。
【０２８９】
８μｌの前記反応混合物を、１００μｌの化学的にコンピテントなＤＨ５α細胞の形質転換に適用した。
【０２９０】
１．１１．  個々の遺伝子の、ならびに全細胞生体触媒の発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨを、発現構築物を用いて形質転換した。この目的のために、発現構築物を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨ株を、対応する抗生物質（ｐＥＴ２８ａには５０μｇ／ｍｌカナマイシン、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔには３６μ／ｍｌクロラムフェニコールまたは全細胞生体触媒には４０μｇ／ｍｌカナマイシン＋２９μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）の存在下、ＬＢ培地で培養した（上記の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＢ０６およびＤＢ０７を参照のこと。
【０２９１】
細胞の培養は、３７℃、ＬＢ培地で一晩実施した。この培養から、発現培養物（一晩培養物の１％容量）を播種し、約０．６〜０．８のＯＤ６００で、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって遺伝子発現を誘導した。その後、回収まで、細胞を２５℃で２０時間増殖させた。細胞を遠心分離（１０．０００×ｇ、３０分、４℃）によって回収した。タンパク質濃度は、上記のように決定した。
【０２９２】
１．１２．  ＨＰＬＣ解析：方法および条件
胆汁酸および得られた生体内変換生成物を、アセトニトリル／水の勾配（リン酸を用いてｐＨ２．６に調整した）を使用する順相ＲＰ−ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−Ｓｙｓｔｅｍ  ＬＣ−２０１０ＡＨＴ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）によって解析した。
【０２９３】
勾配は以下である：
０〜１５分  一定４０％アセトニトリル、
１５〜１７分  ９０％アセトニトリルへの線形増大、
１７〜２７分  一定９０％アセトニトリル、
２７〜２９分  ４０％アセトニトリルへの線形増大、
２９〜３５分  一定４０％アセトニトリル。
【０２９４】
Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ  ＳＴＡＲ（登録商標）カラムＲＰ−１８エンドキャップ付（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、固定相として働き、２０μｌの希釈（９０％  ｖ／ｖメタノールを用いて）サンプルをカラム上にロードした。
【０２９５】
流速は、１ｍＬ  分−１で維持し、溶出物を２００ｎｍの波長でＵＶ検出器によって検出した。
【０２９６】
保持時間：ＵＤＣＡ：８．０分；７−ＫＬＣＡ：１１．７分；ＣＤＣＡ：１７．５分
【０２９７】
２．  実施例ＩＩＩの実験結果
２．１  ＣＤＣＡの１ステップ生体内変換の反応原理
図１１に表わされるような２つの共役（ｃｏｕｐｌｅｓ）系を確立した。補因子再生下で、ＣＤＣＡを７α−ＨＳＤＨを用いて７−ＫＬＣＡに酸化し、次いで、７−ＫＣＬＡを７β−ＨＳＤＨを用いてＵＤＣＡに還元する。図１１Ａは、補酵素としてＮＡＤ（Ｈ）に基づく反応変異体を示し、図１１Ｂは、ＮＡＤＰ（Ｈ）に基づく変異体を示す。共役プロセスは、単離酵素を用いて、または必要なＨＳＤＨ酵素を発現する全細胞を用いて実施した。
【０２９８】
２．２  単離酵素によるＵＤＣＡの合成
２５℃で１００ｍＭ  ＫＰｉバッファー（ｐＨ７．０）において標準化された、単離酵素を用いるＵＤＣＡの酵素的合成を実施した。反応混合物を５００〜７００ｒｐｍで磁気的に撹拌した。補因子濃度は、０．２５ｍＭ  ＮＡＤ＋とした。補因子としてＮＡＤ＋を用いる生体内変換のために、１Ｕ／ｍｌの酵素を用いて反応を実施し、補因子としてＮＡＤＰ＋を用いる生体内変換のために、０．５Ｕ／ｍｌの７α−ＨＳＤＨおよび１．０Ｕ／ｍｌの７β−ＨＳＤＨを用いて反応を実施した。事前に決定した時間間隔後に、サンプルを採取し、ＨＰＬＣによって解析した。
【０２９９】
第１の実験では、共役１ステップ法で、２５℃で１００ｍＭ  ＫＰｉバッファーｐＨ７．０において、ＮＡＤ（Ｈ）依存性７β−ＨＳＤＨ［Ｇ３９Ｅ］（配列番号４８）を用いて（７−ＫＬＣＡ還元のために）および大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）由来の７α−ＨＳＤＨを用いて（野生型配列番号３７）（ＣＤＣＡ酸化のために）、２５ｍＭ  ＣＤＣＡの変換を実施した。補因子濃度は、０．２５ｍＭ  ＮＡＤ＋とした。結果は、図１２に示されている。例示されるように、ＮＡＤ＋依存性７β−ＨＳＤＨを用いる直接共役酸化および還元反応におけるＣＤＣＡの１ステップ変換が作動可能である。
【０３００】
第２の実験では、補因子としてＮＡＤＰ（Ｈ）を用いる１ステップ法で生体内変換を実施した。１ステップ法で７β−ＨＳＤＨ［Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｅ］（配列番号４５）およびＣ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来のＣｄ７α−ＨＳＤＨ（配列番号３５）を用いて、２５℃で１００ｍＭ  ＫＰｉバッファーｐＨ６．０中で、１０ｍＭ  ＣＤＣＡの酵素的変換を実施した。補因子濃度は、０．５ｍＭ  ＮＡＤＰ＋とした。結果は、図１３に示されている。７−ＫＬＣＡ還元のために、Ｃ．アエロファシエンス（ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）由来のＮＡＤＰ＋依存性７β−ＨＳＤＨを適用し、ＣＤＣＡ酸化ステップのために、Ｃ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来の７α−ＨＳＤＨを適用した。例示されるように、ＮＡＤＰ＋依存性７β−ＨＳＤＨを用いる直接共役酸化および還元反応におけるＣＤＣＡの１ステップ変換が作動可能である。
【０３０１】
２．３  ＮＡＤＰ依存性７β−ＨＳＤＨおよび７α−ＨＳＤＨ酵素を発現する組換え全細胞触媒によるＵＤＣＡ合成
２５℃で１００ｍＭ  ＫＰｉバッファー（ｐＨ６．０）において標準化された、５ｍｇ／ｍｌの細胞（ＣＷＷ＝細胞湿潤重量）によるＵＤＣＡの合成を実施した。反応混合物を７００ｒｐｍで磁気的に撹拌した。反応混合物は、補因子として０．５ｍＭ  ＮＡＤＰ＋を含有していた。事前に決定した時間間隔後に、サンプルを採取し、ＨＰＬＣによって解析した。
【０３０２】
以下の全細胞触媒を適用した：
・Ｃ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来のＮＡＤＰ＋依存性野生型７α−ＨＳＤＨ（配列番号３５）およびＣ．アエロファシエンス（ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）由来のＮＡＤＰ＋依存性７β−ＨＳＤＨ二重突然変異体［Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｅ］（配列番号４４）を発現する、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＢ０６（ｐＥＴ２８ａ＿ＣＤ７α（Ｎ）  ＋  ｐＡ＿７β−ＨＳＤＨ［Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｅ］）
・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＮＡＤＰ＋依存性７α−ＨＳＤＨ二重突然変異体［Ｄ４２Ｇ／Ｉ４３Ｒ］（配列番号４１）およびＣ．アエロファシエンス（ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）由来のＮＡＤＰ＋依存性７β−ＨＳＤＨ二重突然変異体［Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｅ］（配列番号４４）を発現する、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＢ０７（ｐＥＴ２８ａ＿７α−ＨＳＤＨ（Ｎ）［Ｄ４２Ｇ／Ｉ４３Ｒ］  ＋  ｐＡ＿７β−ＨＳＤＨ［Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｅ］）。
【０３０３】
使用前に、透過処理のために細胞を少なくとも１回凍結した。図１４は、全細胞触媒大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＢ０６（図Ａ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＢ０７（図Ｂ）を用いる２５℃で１００ｍＭ  ＫＰｉバッファーｐＨ６．０における２５ｍＭ  ＣＤＣＡの対応する変換の結果を示す。補因子濃度は、０．５ｍＭ  ＮＡＤＰ＋とし、反応時間は４８時間とした。
【０３０４】
【表１７−１】
2019517826.tif 000034
【０３０５】
【表１７−２】
2019517826.tif 000035
【０３０６】
本明細書において記載された文書の開示内容は明確に参照される。
【図１】
2019517826.tif 000039
【図２】
2019517826.tif 000040
【図３】
2019517826.tif 000041
【図４】
2019517826.tif 000042
【図５】
2019517826.tif 000043
【図６】
2019517826.tif 000044
【図７Ａ）】
2019517826.tif 000045
【図７Ｂ）】
2019517826.tif 000046
【図８】
2019517826.tif 000047
【図９】
2019517826.tif 000048
【図１０】
2019517826.tif 000049
【図１１】
2019517826.tif 000050
【図１２】
2019517826.tif 000051
【図１３】
2019517826.tif 000052
【図１４】
2019517826.tif 000053
【配列表】
2019517826000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月31日(2018.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１０】
2019517826.tif 000054
［式中、
Ｒは、アルキル、Ｈ、アルカリ金属イオンまたはＮ（Ｒ３）４＋（式中、残基Ｒ３は、同一または異なっており、Ｈまたはアルキルを表す）を表し、または基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１およびＲ２は互いに独立に、アルキル残基を表す）によって置換される］
で示されるウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）化合物を調製するための共役生体触媒方法であって、当該方法は、
ｉ）７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７α−ＨＳＤＨ）および７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）ならびにＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋から選択される補因子の存在下で、一般式（２）
【化１１】
2019517826.tif 000055
［式中、
Ｒは、上記で定義されるものと同一の意味を有するか、または基−ＣＯ２Ｒは、上記で定義される酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２によって置換される］
で示されるケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）化合物を反応させるステップであって、前記７α−ＨＳＤＨおよび前記７β−ＨＳＤＨは、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨから選択される同一補因子系を利用する能力を有し、
ｉ１）前記７α−ＨＳＤＨは、一般式（２）の前記ＣＤＣＡ化合物の、一般式（３）
【化１２】
2019517826.tif 000056
［式中、Ｒは、上記で特定されるとおりであるか、または基−ＣＯ２Ｒは、上記で定義される酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２によって置換される］
で示される対応する中間体７−ケトリトコール酸（７−ＫＬＣＡ）化合物への酸化を触媒し、
ｉ２）前記７β−ＨＳＤＨは、反応ステップｉ１）において形成される一般式（３）の前記７−ＫＬＣＡ化合物の、一般式（１）の前記ＵＤＣＡ化合物への還元を、反応ステップｉ１）において消費された補因子の再生下で触媒するステップと、
ｉｉ）任意選択で、反応生成物をさらに精製するステップと、
を含み、そして
Ａ）前記７α−ＨＳＤＨおよび前記７β−ＨＳＤＨが両方とも、補因子系ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨを利用し、ここで
ａ）前記７α−ＨＳＤＨが、
配列番号３４のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）７α−ＨＳＤＨの突然変異体である７α−ＨＳＤＨであって、突然変異体が、補因子としてのＮＡＤ＋の消費下で、少なくとも、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの立体特異的な酵素的酸化を触媒し、前記７α−ＨＳＤＨが、配列番号３４のＫ１６、Ａ３７およびＲ３８から選択される位置に少なくとも１つの突然変異を含み、配列番号３４に対して、少なくとも８０％の配列同一性を示す７α−ＨＳＤＨ
から選択され、
ｂ）前記７β−ＨＳＤＨが、
配列番号５４のコリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）７β−ＨＳＤＨの突然変異体である７β−ＨＳＤＨであって、突然変異体が、補因子としてのＮＡＤＨの消費下で、少なくとも、７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒し、前記７β−ＨＳＤＨが、配列番号５４のＴ１７、Ｇ３９、Ｒ４０、Ｒ４１およびＫ４４から選択される位置に少なくとも１つの突然変異を含み、配列番号５４に対して、少なくとも８０％の配列同一性を示す７β−ＨＳＤＨ
から選択されるか、または
Ｂ）前記７α−ＨＳＤＨおよび前記７β−ＨＳＤＨが両方とも、補因子系ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを利用し、
ａ）前記７α−ＨＳＤＨが
配列番号３７の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）７α−ＨＳＤＨの突然変異体である７α−ＨＳＤＨであって、突然変異体が、補因子としてのＮＡＤＰ＋の消費下で、少なくとも、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの立体特異的な酵素的酸化を触媒し、前記７α−ＨＳＤＨが、配列番号３７のＤ４２およびＩ４３から選択される位置に少なくとも１つの突然変異を含み、配列番号３７に対して、少なくとも８０％の配列同一性を示す７α−ＨＳＤＨ
から選択され、
ｂ）前記７β−ＨＳＤＨが、
（１）少なくとも、補因子としてのＮＡＤＰＨの消費下で、７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒する、配列番号５４に従うアミノ酸配列を含み、コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）から単離される７β−ＨＳＤＨならびに配列番号５４に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを利用する能力および少なくとも、７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒する能力を保持する、その突然変異体、
（２）配列番号５４のコリンセラ・アエロファシエンス（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）７β−ＨＳＤＨの突然変異体である７β−ＨＳＤＨであって、突然変異体が、少なくとも、補因子としてのＮＡＤＰＨの消費下で、７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒し、前記７β−ＨＳＤＨが、配列番号５４のＴ１７、Ｇ３９およびＲ６４から選択される位置に少なくとも１の突然変異を含み、配列番号５４に対して、少なくとも８０％の配列同一性を示す７β−ＨＳＤＨ、
（３）配列番号５６に従うアミノ酸配列を含む７β−ＨＳＤＨであって、ルミノコッカス・グナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｎａｖｕｓ）から単離され、少なくとも、補因子としてのＮＡＤＰＨの消費下で、７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒する７β−ＨＳＤＨならびに配列番号５６に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを利用する能力および少なくとも、７−ケトステロイドの、対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒する能力を保持するその突然変異体
から選択される、方法。
【請求項２】
ステップａ）が、単離された７α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨ酵素の存在下で、または前記酵素を機能的に発現する１種以上の組換え微生物の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号３７の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）７α−ＨＳＤＨの突然変異体である７α−ＨＳＤＨであって、突然変異体が、少なくとも、補因子としてのＮＡＤＰ＋の消費下で、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの立体特異的な酵素的酸化を触媒し、酵素が、配列番号３７のＤ４２およびＩ４３から選択されるアミノ酸配列位置に少なくとも１つの突然変異を含み、ここで、
前記突然変異が、
ａ）単一突然変異
Ｄ４２Ｘ１および
Ｉ４３Ｘ２ならびに
ｂ）二重突然変異
Ｄ４２Ｘ１／Ｉ４３  Ｘ２
［式中、
Ｘ１は、Ｇ、ＡまたはＶを表し、
Ｘ２は、Ｒ、ＨまたはＫを表す］
から選択され、
配列番号３７に対して、少なくとも８０％の配列同一性を示す７α−ＨＳＤＨ。
【請求項４】
配列番号３７の７α−ＨＳＤＨと比較した場合に、以下の特徴プロフィール：
ａ）補因子としてＮＡＤＰ＋を用いるＣＤＣＡの酵素的酸化の間のＮＡＤＰ＋に対する増大した比活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）、
ｂ）ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに関する修飾された補因子特異性
を示し、
ｃ）特徴ａ）からｂ）が個別に、または任意の組合せで存在し得る、請求項３に記載の７α−ＨＳＤＨ。
【請求項５】
配列番号３４のＣ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）７α−ＨＳＤＨの突然変異体であり、突然変異体が、補因子としてのＮＡＤ＋の消費下で、少なくとも、７α−ヒドロキシステロイドの、対応する７−ケトステロイドへの立体特異的な酵素的酸化を触媒し、酵素突然変異体が、配列番号３４のＫ１６、Ａ３７およびＲ３８から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置に突然変異を含み、
前記突然変異が、
ａ）単一突然変異
Ｋ１６Ｘ１
Ａ３７Ｘ２
Ｒ３８Ｘ３
および
ｂ）二重突然変異
Ｋ１６Ｘ１／Ａ３７Ｘ２および
Ａ３７Ｘ２／Ｒ３８Ｘ３
［式中、Ｘ１は、Ａ、ＧまたはＤを表し、
Ｘ２は、ＤまたはＥを表し
Ｘ３は、Ｉを表す］
から選択され、
配列番号３４に対して、少なくとも８０％の配列同一性を示す７α−ＨＳＤＨ。
【請求項６】
配列番号３４の７α−ＨＳＤＨと比較した場合に、以下の特徴プロフィール：
ａ）ケノデスオキシコール酸（ｃｈｅｎｏｄｅｓｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（ＣＤＣＡ）に対する増大した比活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）、
ｂ）補因子としてＮＡＤ＋を用いるＣＤＣＡの酵素的酸化の間のＮＡＤ＋に対する増大した比活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）、
ｃ）ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに関する修飾された補因子特異性、
ｄ）少なくとも１種の胆汁酸、特に、コール酸（ＣＡ）および／またはＣＤＣＡおよび／または７−ＫＬＣＡに対する、低減されたまたは失われた基質阻害
を示し、
ｅ）特徴ａ）からｄ）が、個別に、または任意の組合せで存在し得る、
請求項５に記載の７α−ＨＳＤＨ。
【請求項７】
前記の請求項３から６のいずれか一項に記載の７α−ＨＳＤＨをコードするヌクレオチド配列。
【請求項８】
少なくとも１つの調節的配列の制御、請求項７に記載の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む発現カセット。
【請求項９】
請求項８に記載の少なくとも１つの発現カセットを含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項７に記載の少なくとも１つのヌクレオチド配列または請求項８に記載の少なくとも１つの発現カセットまたは請求項９に記載の少なくとも１つの発現ベクターを保持する組換え微生物。
【請求項１１】
補因子再生に適したさらなるヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤＨ）から選択される少なくとも１つのさらなる酵素のコード配列をさらに保持する、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
両方とも補因子系ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨを利用する７α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨを同時発現する、または両方とも補因子系ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを利用する７α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨを同時発現する、請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
請求項３から６のいずれか一項において定義される、７α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨを同時発現する、請求項１２に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
７α−ケトステロイドの酵素的または微生物的合成のための生体触媒方法であって、対応する７−ヒドロキシステロイドは、請求項３から６のうち一項の定義に従う７α−ＨＳＤＨ突然変異体の存在下で、または請求項１０から１３のうち一項に従う前記７α−ＨＳＤＨ突然変異体を発現する組換え微生物の存在下で酸化され、任意選択で、形成される反応生成物のうち１種が、反応混合物から単離される、生体触媒方法。
【請求項１５】
前記７−ヒドロキシステロイドが、
−コール酸（ＣＡ）
−ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、
−１２−ケト−ケノデオキシコール酸（１２−ケト−ＣＤＣＡ）から、好ましくは、酸化可能な前記７α−ＨＳＤＨ突然変異体、酸の塩、アミドまたはアルキルエステルから選択されるその誘導体、によって選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
酸化が、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下で、特にそれらの消費下で実施される、請求項１４または１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
消費されたようなＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋が、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋再生酵素とカップリングすることによって再生され、前記酵素が、７β−ＨＳＤＨ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）およびギ酸（ｆｏｒｍｉａｔｅ）デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、グルコース−６リン酸−デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）から選択される、請求項１６に記載のプロセス。
【国際調査報告】
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