(57)【要約】本発明は、コロイド懸濁液の形態又は乾燥形態であるナノカプセルに関する。ナノカプセルは、油の形態の有効成分と、イオン性界面活性剤と、任意で含まれる非イオン性界面活性剤と、親水性のポリマーとを少なくとも含む。本発明は、また、それらの製造方法及び使用方法に関する。【選択図】無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂溶性の有効成分と、イオン性界面活性剤とからなるか又はこれらを含む油性フラクションと、
上記油性フラクションを取り囲む親水性のポリマーと
を含有する
ナノカプセルのコロイド懸濁液。
【請求項２】
上記ナノカプセルは非イオン性界面活性剤を含む
請求項１に記載のコロイド懸濁液。
【請求項３】
上記有効成分はビタミンA、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK及びそれらの誘導体又はそれらの代謝物、精油、脂肪酸、油脂、並びにそれらの混合物から選択される
請求項１又は２に記載のコロイド懸濁液。
【請求項４】
上記有効成分は、
タイム、オレガノ、ローズマリー、ニンニク、ツバキ、マスタード、ショウガ、ウコン、ブドウ、柑橘類、イガマメ、ユッカ、ヨモギ、シナモン、ミント、クローブ、ベリー、クミン及びエキナセアの精油から選択される
請求項３に記載のコロイド懸濁液。
【請求項５】
上記イオン性界面活性剤は、分子量が最大で1500g/mol、好ましくは最大で1000g/molである
請求項１〜４のいずれか１項に記載のコロイド懸濁液。
【請求項６】
上記界面活性剤は、卵黄レシチン若しくは大豆レシチン、又はヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドに代表されるホスファチジルコリンから選択される
請求項１〜５のいずれか１項に記載のコロイド懸濁液。
【請求項７】
上記非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリオキシエチレン（EO）-ポリオキシプロピレン（PO）ブロックコポリマーとTween80とショ糖脂肪酸エステルとの配合物、及びそれらの混合物から選択される
請求項２〜６のいずれか１項に記載のコロイド懸濁液。
【請求項８】
上記ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマーは、xが75〜85及びyが25〜35であるEOx-POy-EOxのコポリマー、xが55〜65及びyが35〜45であるEOx-POy-EOxのコポリマー、並びにxが112〜123及びyが40〜50であるEOx-POy-EOxのコポリマーから選択される
請求項７に記載のコロイド懸濁液。
【請求項９】
上記ショ糖脂肪酸エステルは、ステアリン酸エステル又はパルミチン酸エステルである
請求項７に記載のコロイド懸濁液。
【請求項１０】
上記ポリマーは、キトサン、アルギン酸塩、ペクチン、デンプン、セルロース、カゼイン及びそれらの組み合わせから選択される
請求項１〜９のいずれか１項に記載のコロイド懸濁液。
【請求項１１】
上記有効成分の含有量は、上記ナノカプセルの乾燥質量に対して、少なくとも5質量％、好ましくは少なくとも25質量％、さらに好ましくは少なくとも50質量％である
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のコロイド懸濁液。
【請求項１２】
上記非イオン性界面活性剤の含有量は、上記ナノカプセルの乾燥質量に対して、少なくとも15質量％である
請求項２〜１１のいずれか１項に記載のコロイド懸濁液。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコロイド懸濁液を乾燥させることによって得ることができる、油の形態である少なくとも１つの有効成分と、1つのイオン性界面活性剤、1つの任意で含まれる非イオン性界面活性剤、及び1つの親水性のポリマーを含む
ナノカプセル。
【請求項１４】
ラクトースに吸着された
請求項１３に記載のナノカプセル。
【請求項１５】
請求項１３に記載のナノカプセルとラクトースとを含む微粒子。
【請求項１６】
上記脂溶性の有効成分と上記イオン性界面活性剤とからなるか又はこれらを含む上記油性フラクションを少なくとも含有する第1の相と、少なくとも上記ポリマーと任意で含まれる非イオン性界面活性剤とを含む水性の第2の層とが存在し、上記イオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤のモル濃度が、それぞれ、上記界面活性剤の臨界ミセル濃度（CMC）の100倍以上であるようにする工程と、
粗懸濁液を形成し、その後、ナノカプセルのコロイド懸濁液を形成するために、上記粗懸濁液を高圧下で均質化する工程とを備えた、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコロイド懸濁液を製造する方法。
【請求項１７】
上記第1の相及び上記第2の相が60〜70℃の範囲の温度である
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載の方法を実施することによって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のナノカプセルのコロイド懸濁液を調製し、
次いで、上記ナノカプセルをラクトースの存在下で噴霧乾燥させる
請求項１４に記載のナノカプセルの製造方法。
【請求項１９】
動物に栄養を与えるために、請求項１３に記載のナノカプセル又は請求項１５に記載の微粒子を使用する方法。
【請求項２０】
単胃動物に使用する請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は脂溶性の有効成分のナノカプセル、並びにその製造方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミン、脂肪酸、精油などの分子は、医薬品、化粧品及び農業食品産業、特に動物栄養の分野などの多くの技術分野で非常に広く使用されている。一例として、ビタミンA及びEは、一般に、動物の成長及び健康を促進する飼料の調製のために使用される。
【０００３】
それらの疎水的性質及びそれらの環境、特に熱的及び化学的不安定性によって、それらの調製、貯蔵、及び使用において、それらをカプセル化することが必要となる。
【０００４】
主にα-トコフェロール（α-TOL）の形態で存在するビタミンE又はトコフェロール（TOL）は、天然の状態では、あらゆる疎水性又は脂質の相においてどのような比率でも油状で親油性の混和性液体である。それは非常に不安定で、容易に酸化され、酸化状態では、その生物学的活性の大部分を失う。これは、動物に経口投与されると、急速に酸化されその酸化された不活性形態で主に吸収されるため、その生物学的利用率(bioavailability)は50％を超えない。また、経口投与される場合、ビタミンEは、一般に、例えばアセテートエステル及びビタミンE塩から選択されるより安定な誘導体の形態をとる。
【０００５】
ビタミンAは、例えばエステルなど、いくつかの形態として存在する。その最も安定した形態の一つは酢酸レチニル形態であり、家畜（トリ、ブタ及びウシ）によって最も頻繁に消費される。しかしながら、それは酸化、温度、光、酸の影響を受けやすい。それゆえ、医薬用途又は動物栄養においては、消化器系の最初の厳しい条件、特に酸性条件下に置かれると迅速に分解され、ビタミンAは生物学的に利用可能な形態とはならない。
【０００６】
これらの影響を受けやすい有効成分を最良の状態に維持するために、以前より、コーティング又はカプセル化によってそれらを保護できることが知られている。ビタミン、特にビタミンA及びEを、カプセル化するために、タンパク質を用いるなど様々な方法が開発され広く利用されている。
【発明の概要】
【０００７】
しかしながら、我々は依然として、生物学的利用率が高い脂溶性の有効成分の配合物を求めている。
【０００８】
出願人らは、その吸収、特に腸での吸収を増加させることができるそのような有効成分の新しい配合物を求めてきた。
【０００９】
これらの有効成分の大部分は一般に保護された形態で使用されるので、該有効成分がその遊離の活性形態で吸収させるような配合物を開発することがさらに不可欠である。このことは、保護形態の加水分解及び吸収がほぼ同時に起こることを意味する。
【００１０】
出願人らは、まず、そのような有効成分は、高い含有量でナノカプセルの配合物とされ得ること、及びそれは有機溶媒を使用しないという意味でクリーンな方法によるものであることを発見した。そして、出願人らは、その有効成分を活性形態で、すなわち上記の全ての要件を満たす形態で、放出することができるナノカプセルを開発した。
【００１１】
従って、本発明は、ナノカプセルの形態の脂溶性の有効成分を多く含む配合物に関する。好ましい実施形態では、現在の市場における配合物よりも生物学的利用率が高い。
【００１２】
本発明はさらに、そのようなナノカプセルを得るための工業的に利用可能で、且つ、環境に優しい製造方法を実施することを目的とする。さらに、出願人らによって開発された方法は、残留水分が低く（好ましくは8％未満）、貯蔵条件にかかわらず経時的に安定なナノカプセルをもたらす。
【００１３】
上記有効成分が利用される分野では、本発明に係るナノカプセルは、例えば、特に上記ナノカプセルを担体上に吸着させることにより、取扱いがもっと容易な微粒子などの形態にすることができる。以下の説明において、「粒子」は、上記ナノカプセルについて表現するものであり、例として、そのような粒子は、本発明のナノカプセルを含む微粒子である。有効成分が動物栄養である場合、ナノカプセルは、プレミックスへ取り込まれるために混合性の優れた乾燥粒子に配合されることが特に有利である。その意味では、そのような粒子は平均粒径が300μm未満の微粒子である。
【００１４】
以下、本発明の異なる対象を詳細に説明する。
【００１５】
以下、本発明をビタミンEを参照しながらより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではなく、あらゆる脂溶性の有効成分及びその混合物に適用されることは明らかである。
【００１６】
前述したように、本発明は、安定で生物学的利用率の高い脂溶性の少なくとも1種類の有効成分を高濃度で含むナノカプセルに関する。本発明に係るナノカプセルは、懸濁液の乾燥後に、コロイド懸濁液の形態であってもよく、又は乾燥形態であってもよい。
【００１７】
上記ナノカプセルは、コロイド懸濁液の形態であるか又は乾燥形態であるかにかかわらず、脂溶性の有効成分とイオン性界面活性剤とからなるか又はこれらを含む油性フラクションと、その油性フラクションを取り囲む親水性ポリマーとを少なくとも含有する。
【００１８】
出願人らは、ビタミンEを生物利用可能にするために、又は少なくとも生物学的利用率を高めるために、ナノカプセルは意外なことに少なくとも非イオン性界面活性剤をさらに含有しなければならないことを発見した。もちろん、有効成分の効果によっては、生物利用可能であることは望ましくないかもしれないし、又は禁じられたものかもしれず、その場合にはナノカプセルはそのような非イオン性界面活性剤を含有しない。
【００１９】
前述のように、本発明のナノカプセルは、あらゆる脂溶性の有効成分を輸送することを可能にする。従って、有効成分は、以下から選択することができる：
ビタミンA、D、E、Kなどの脂溶性ビタミン、それらの誘導体、及び、特にエステルで、例えば、酢酸エステル、プロピオン酸エステル又はコハク酸エステル、並びに、レチナール、レチノイン酸、25-ヒドロキシコレカルシフェロール及び1,25-ジヒドロキシコレカルシフェロールなどの代謝物；
カロテノイド；
精油、例えば、タイム、オレガノ、ローズマリー、ニンニク、ツバキ、マスタード、ショウガ、ウコン、ブドウ、柑橘類、イガマメ、ユッカ、ヨモギ、シナモン、ミント、クローブ、ベリー、クミン及びエキナセアの精油など；
飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸及び多価不飽和脂肪酸；
油脂。
【００２０】
有効成分が液体であるか、又は加熱によって液体となる可能性がある場合、その有効成分は、イオン性界面活性剤が存在する油相を構成することができる。
【００２１】
有効成分がナノカプセルの製造温度で液体状態でない場合、その有効成分は、担体として使用される油（一般的には不活性な油）の中に予め可溶化してもよい。一例として、この油はトリオレインであってもよい。
【００２２】
本発明のナノカプセルの興味深い点は、有効成分の含有量であり、その範囲は、ナノカプセルの乾燥質量に対して、例えば最小値が5質量％から50質量％以上、又は少なくとも90質量％にも及び得る。この含有量は、ナノカプセルの目的に応じて決定されるが、一般的には、ナノカプセルの乾燥質量に対して少なくとも5質量％、好ましくは少なくとも25質量％、より好ましくは少なくとも50質量％又は少なくとも70質量％、さらには少なくとも90質量％でさえある。
【００２３】
上記イオン性界面活性剤は、好ましくは分子量が最大で1500g/mol、さらには最大で1000g/molでさえあるものから選択される。1500g/molを超える場合、ナノカプセルはほとんど形成されない。これらの好ましい界面活性剤は、卵黄レシチン若しくは大豆レシチン、又はヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドに代表されるホスファチジルコリンから選択できる。正又は負に荷電したイオン性界面活性剤は、ポリマーの電荷と反対の電荷を有するように選択される。
【００２４】
上記非イオン性界面活性剤は、好ましくは、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリオキシエチレン（EO）-ポリオキシプロピレン（PO）ブロックコポリマーとTween80とショ糖脂肪酸エステル（特にパルミチン酸エステル及びステアリン酸エステル）との配合物、並びにそれらのあらゆる混合物から選択される。この定義の枠内で、好ましい界面活性剤は、EOx-POy-EOx（xは75〜85、yは25〜35）のコポリマー、EOx-POy-EOx（xは55〜65、yは35〜45）のコポリマー、EOx-POy-EOx（xは112〜123、yは40〜50）のコポリマー、並びにSISTERNA（登録商標）SP70及びPS750の商標で市販されているショ糖脂肪酸エステルである。
【００２５】
本発明に係るナノカプセルを得ることを可能にするポリマーは、電荷がイオン性界面活性剤の電荷とは反対であるカチオン性又はアニオン性ポリマーから選択される。それは、好ましくは天然由来のものであり、従って、好ましくは、キトサン、アルギン酸塩、ペクチン、デンプン、セルロース、カゼイン及びそれらの組み合わせから選択される1つ以上のポリマーである。従って、好ましいポリマー-イオン界面活性剤の組合せは、キトサンと卵黄レシチン、及びアルギン酸塩とCTABによって構成されるものである。
【００２６】
本発明の好ましい他の実施形態によれば、懸濁液中の上記定義の非イオン性界面活性剤の含有量は、ナノカプセルの乾燥質量に対して少なくとも15質量％である。
【００２７】
本発明の別の対象の1つは、上記のコロイド懸濁液の乾燥によって生じるナノカプセルである。従って、これらのナノカプセルは、脂溶性の有効成分、イオン性界面活性剤、任意で含まれる非イオン性界面活性剤及びポリマー、好ましくは親水性ポリマーを含有するか又はそれらからなる油性フラクションを少なくとも含み、上記ナノカプセルは本発明のコロイド懸濁液を乾燥することによって得られる。乾燥は、有利には、本発明のナノカプセルがラクトースに吸着されるので、ラクトースの存在下で行われる。
【００２８】
本発明はまた、上記ナノカプセルが担体に吸着された、ナノカプセルを含む粒子を提供する。この担体は、あらゆる不活性担体、例えばラクトースから選択することができる。好ましい他の実施形態では、これらの粒子は、ラクトースに吸着された本発明のナノカプセルを含む微粒子である。
【００２９】
本発明に係るナノカプセルの製造方法は、それらが懸濁液の処理後に、コロイド懸濁液の中にあるか又は乾燥状態にあるかどうかにかかわらず、本発明のさらに別の対象である。
【００３０】
従って、ナノカプセルのコロイド懸濁液の製造方法は、以下の工程を含む：
・一方で、少なくとも脂溶性の有効成分とイオン性界面活性剤とを含む又はそれらからなる油性フラクションを少なくとも含有する第1の相が存在し、他方で、少なくとも1つのポリマーと任意で含まれる非イオン性界面活性剤とを含む第2の水性の相が存在し、上記イオン性界面活性剤及び上記非イオン性界面活性剤のモル濃度は、適当であれば、上記イオン性界面活性剤及び上記非イオン性界面活性剤のそれぞれの臨界ミセル濃度（CMC）の100倍以上であり、有効成分、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤及びポリマーが上記の定義に合致する工程;
・粗懸濁液を形成し、その後、ナノカプセルのコロイド懸濁液を形成するために、高圧下で均質化する工程。
【００３１】
CMCの決定は、当業者に周知のあらゆる技術、例えば、ブレードテンションメーター又はリングテンションメーターによる表面張力の測定によって行うことができる。
【００３２】
有効成分が室温で液体ではないか又は粘性が高すぎる場合、油相及び水相を60〜70℃の範囲の温度にして、有効成分の溶融を可能にする。
【００３３】
粗懸濁液と呼ばれる懸濁液は、水相と油相を簡単に撹拌することによって得られる。その後、例えば少なくとも6分間、好ましくは少なくとも600バールに相当する高圧下で、その均質化が実施される。
【００３４】
上記のようなナノカプセルのコロイド懸濁液から本発明に係る乾燥ナノカプセルを得るために、上記ナノカプセルをラクトースの存在下で噴霧乾燥させる。この方法は、非粘着性であり室温で保存可能な粒子をもたらす。
【００３５】
本発明はまた、そのようなナノカプセルの使用方法に関する。そのような使用方法は、動物栄養（動物に与える栄養）、特に単胃動物の動物栄養の分野で大きな関心がもたれる。この意味では、それらは粒子の形態で、特に上記のような微粒子の形態で使用される。
【００３６】
以下の実施例において、α-トコフェロールアセテートナノカプセル（αTAC）の製造並びにインビトロ(in vitro）及びインビボ(in vivo)での試験で動物栄養の性能を明らかにすることによって、本発明を説明し、その利点を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】種々のTAC配合物におけるTACのインビトロでの生物可給性を示す。
【図２】種々のTAC配合物におけるTACのTOLへのインビトロでの加水分解率を示す。
【図３】種々のTAC配合物を強制投与した後のラットにおける血漿中αのTOL濃度（μM）を示す。
【図４】種々のTAC配合物を強制投与した後のオスのニワトリにおける血漿中のαTOL濃度（μg/ml）を示す。
【図５】種々のTAC配合物を強制投与した後のオスのニワトリにおける血漿中のαTOL濃度（μg/ml）を示す。
【図６】種々のTAC配合物を飼料に混ぜ、その飼料を与えた後のニワトリにおける血漿中のαTOL濃度（μg/ml）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下の実施例では、様々なパラメータ、特にビタミンEの生物学的利用率を分析する。
【００３９】
ビタミンE又はビタミンE誘導体などの、脂溶性の有効成分の生物学的利用率は、動物の飼料に投入されたビタミンEの濃度と比較した、又は、ビタミン誘導体が投与されたときに動物の飼料に投入されたビタミンE誘導体のビタミンE等量として表された濃度と比較した、血液中に放出されるビタミンEの濃度によって表される。ビタミンEの生物学的利用率のこの表し方は、消化経路において腸内でのビタミンE又はビタミンE誘導体の吸収を考慮したものである。
【００４０】
［実施例１］
（本発明に係るナノカプセルの製造方法）
＜配合物＞
この実施例で調製されたナノカプセルは、参照番号C24、A37及びC40によって識別される。
【００４１】
これらは、少なくとも以下を含むコロイド懸濁液から得られる：
・TAC
・卵レシチン（Lipoid E80）及びヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）から選択されるイオン性界面活性剤
・ナノカプセルC24及びA37については、非イオン性界面活性剤Lutrol（登録商標）-F68
・（カチオン性）キトサン及び（アニオン性）アルギン酸ナトリウムから選択される、少なくともイオン性で親水性のポリマー
上記コロイド懸濁液はその後ラクトースの存在下で乾燥される。
【００４２】
これらのナノ粒子の配合は、以下の表１に示され、成分の含有量は％（乾燥質量）で表される。
【００４３】
【表１】
2019513359.tif 000002
【００４４】
＜製造方法＞
ナノ粒子の製造方法は、以下の3つの工程を含む。
【００４５】
ナノ懸濁液を調製する工程；
ナノカプセルのコロイド懸濁液を調製する工程；
ナノカプセルを乾燥させる工程。
【００４６】
―ナノカプセルC24及びC37を製造する手順―
ナノ懸濁液の調製：
ナノカプセルC24の場合：
・イオン性界面活性剤、Lipoid E80をタービンで撹拌しながらTAC中に分散させ、その分散液を65℃にして油相を得る。
【００４７】
・非イオン性界面活性剤（Lutrol（登録商標）F68）を水に溶解し、その溶液を65℃にして、水相を得る。
【００４８】
ナノカプセルA37の場合：
・油相を構成するTACを65℃にし、イオン性界面活性剤CTABをその中に分散させる。
【００４９】
・非イオン性界面活性剤（Lutrol（登録商標）F68）を水に溶解し、その溶液を65℃にして、水相を得る。
【００５０】
次に、ナノカプセルC24及びA37の場合：
・撹拌しながら水相を油相に添加し、レイネリ(Reyneri)タービンを用いて65℃で15分間、600回/分の速度で攪拌し一次懸濁液又は粗懸濁液を形成する。
【００５１】
・懸濁液を高圧ホモジナイザーに移し、65℃で6分間、600バールの圧力で均質化してナノ懸濁液を得る。
【００５２】
ナノカプセルのコロイド懸濁液の調製：
・上記で得られたナノ懸濁液をLutrol（登録商標）F68の溶液で1/10に希釈する。
【００５３】
・キトサン酢酸溶液0.05g/LをナノカプセルC24に添加、又はアルギン酸ナトリウム溶液1.8g/LをナノカプセルA37に添加し、タービンの下で室温で2時間撹拌して、本発明に係るナノカプセルのコロイド懸濁液を得る。
【００５４】
ナノカプセルの乾燥：
・ナノカプセルをラクトースの存在化で噴霧乾燥させる。ポンプ流量15％、入口温度150℃、流量7mL/分及び圧縮空気流500L/hをパラメータとした。
【００５５】
―ナノカプセルC40を製造する手順―
ナノカプセルC40は、非イオン性界面活性剤を添加しないことを除いて、ナノカプセルC24について上述した方法に従って製造される。
【００５６】
ナノカプセルの特定：
ナノカプセルは、製造方法の2つの段階において、以下の表２に示すサイズによって特定される。この2つの段階うち第1段階はナノ懸濁液の形成時で、且つ、ポリマーの添加前である。そして第2段階はこの方法の最後の段階であり、且つ、ナノカプセルの乾燥前である。
【００５７】
【表２】
2019513359.tif 000003
【００５８】
以下の実施例は、TACの生物学的利用率を評価することにより、本発明に係るTAC配合物の興味深い点を説明する。
【００５９】
TAC配合物の生物学的利用率は、細胞代謝及び臓器機能のために使用される、腸粘膜によって吸収されるTOLの割合に対応する。この生物学的利用率は、特にTACの生物可給性(bioaccessibility)、すなわち混合ミセルに可溶化された配合物（TACの形態）中に存在するビタミンEの割合、及び消化器系で分泌されるカルボキシエステル加水分解酵素（CEH）によるTACのTOLへの加水分解などの、異なる因子の組み合わせである。
【００６０】
［実施例２］
（TAC配合物中のTACの生物学的利用率のインビトロ評価）
この試験は、Desmarchelierらによって説明されているものである（Mol. Nutr. Food Res. 2013年、57巻、1237-1245頁）。
【００６１】
これらのインビトロ評価においては、実施例１の異なるTAC配合物を含有する混合ミセルが調製される。これによって、腸に関与するミセルを模倣して消化の条件を再現することができる。
【００６２】
ビタミンEの生物可給性は、異なる配合物を含有する飼料のインビトロでの消化の後に計算される。これは、ミセル相においてHPLCで測定されたビタミンEと、十二指腸の段階の終わりに得られた消化物中においてHPLCで測定されたビタミンEとの比をとって決定される。
【００６３】
評価は3つのタイプの配合物で実施される：
・実施例１のナノカプセルC24及びA37；ナノカプセルA37は、2つの形態で試験する：ラクトース担体を含む粉末形態；及び
・シリカに吸着されたビタミンEオイルからなる参照用Promix製品（Promix及びPromix（2）は同じ製品の2回の反復である）
結果を図１に示す。
【００６４】
TAC（C24及びA37）のナノカプセルは、Promix製品と比較してビタミンEの生物可給性を増加させること、すなわち、インビトロでの消化の終わりで混合ミセルに可溶化される食品マトリックス中に含まれるビタミンEの量を増加させることが観察される。
【００６５】
［実施例３］
（CEHによるTACのTOLへの加水分解のインビトロ評価）
CEHによるビタミンE-アセテート（TAC）の加水分解の手順は、Desmarchelierらによって説明されている(Mol. Nutr. Food Res. 2013年、57巻、1237-1245頁)。
【００６６】
簡潔に説明すると、TACを含有する500μlの混合ミセルを30分間37℃に維持する。その後、10U/mLの濃度のCEHを30分間で添加する。次いで、遊離トコフェロール（TOL）の生成をHPLCによって測定する。
【００６７】
評価は3種類の配合物で実施される：
・実施例１のナノカプセルC24及びA37；
・ビタミンE油からなる参照用E Promixの製品
結果を図2に示す。
【００６８】
TACナノカプセル（C24及びA37）は、E Promix製品と比較してTACのTOLへの変換率を増大させ、より多くの量のビタミンEを吸収可能にする。
【００６９】
［実施例４］
（ラットにおけるTACの生物学的利用率のインビボ評価）
―手順―
この評価は、トコフェロールが不足した飼料で2週間飼育した生後6週目のオスのWistarラットで行う。
【００７０】
ラットを強制給餌前の夜に絶食させた。
【００７１】
ラット（n=10）に異なるTAC溶液5mgを5日間連続して強制給餌した：
・Microvit（登録商標）E Promix 50（シリカに吸着されたビタミンEアセテート）、
・実施例１の乾燥ナノカプセルC24、
・実施例１の乾燥ナノカプセルA37。
【００７２】
最後の強制給餌の3時間後、ラットを麻酔し、血液を心臓穿刺により収集し、遠心分離後に血漿を単離した。二度のヘキサン抽出後、血漿中のα-トコフェロール（αTOL）濃度をHPLCで測定した。
【００７３】
−結果−
結果を図３に示す。
【００７４】
配合物C24及びA37の強制給餌から得られた血漿のαTOL濃度は、それぞれ26％及び24％であり、Microvit（登録商標）E Promix 50の強制給餌のものよりも著しく高かった（P<0.001）。
【００７５】
［実施例５］
（オスのニワトリにおけるTACの生物学的利用率のインビボ評価）
―手順―
実験スキームは、Preveraudetらにより説明されている（British Poultry Science，56，1，94-102）。
【００７６】
簡潔に説明すると、60頭のオスのニワトリ（イサブラウン）を2室に分け、個々の檻に入れる。処置を行う1週間前に、ニワトリにビタミンEを含まない飼料を与える。
【００７７】
ニワトリ（1回の処置当たりn=10羽のニワトリ）に、異なるTAC溶液を強制給餌した。
【００７８】
第1室：実施例１の乾燥ナノカプセルC24、
対照として油の形態のTOL及びTAC
第2室：実施例１のC40乾燥ナノカプセル、
対照として油の形態のTOL及びTAC
カプセルに入れたビタミンE製品の強制給餌後、0、6、12、24、48及び96時間の給餌後に血液サンプルを採取した。遠心分離後、血漿を静かに注いで、HPLCによってその遊離トコフェロールを測定する。
【００７９】
―結果―
上記の24時間についての結果を図４に示し、96時間について結果を図５に示す。表３及び表４は、24時間及び96時間についての血液中のビタミンEの拡散についての結果を、曲線下面積（AUC）及びTACに対する割合で表した拡散率（％）として示す。
【００８０】
【表３】
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【００８１】
配合物C24による強制給餌は、配合物でないTACによる強制給餌よりも著しく高いαTOL濃度の血漿をもたらした。
【００８２】
【表４】
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【００８３】
配合物C40による強制給餌は、配合物でないTAC対照のものと血漿中αTOL濃度の優位な違いはない。これらは非イオン性界面活性剤の非存在下で調製したので、生物学的利用率はない。
【００８４】
［実施例６］
―手順―
トコフェロールの不足した飼料で7日間飼育された生後1日のニワトリ（ヒヨコ）について調べる。実験段階の全期間は、15日間であり、その間に、粒状の飼料と混合されたビタミンEの異なる投与（1回の投与につきn = 18）を受ける。事前に、ニワトリをケージごと6羽ずつのグループに分けた。生後21日で、ニワトリを安楽死させ、肝臓のサンプルを採取する。抽出後、この組織内のビタミンEを測定する。
【００８５】
ニワトリには以下の配合物で飼育した：
・Microvit（登録商標）E Promix 50、E50（シリカに吸着されたビタミンEアセテート）、
・実施例１の乾燥ナノカプセルC24。
【００８６】
カプセルに入れたビタミンE製品の強制給餌後、0、6、12、24、48及び96時間の給餌後に血液サンプルを採取した。遠心分離後、血漿を静かに注いで、HPLCによって遊離トコフェロールを測定する。
【００８７】
―結果―
結果を図６に示す。
【００８８】
配合物C24による強制給餌は、E50製品による強制給餌よりも著しく高い血漿中αTOL濃度をもたらした。
【００８９】
C24配合物の強制給餌の飼料は、投与量の効果を示す右勾配を比較に基づくと、配合物E50を用いた飼料よりも著しく高い肝臓αTOL濃度（+24％）をもたらしている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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