(57)【要約】  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでベータ細胞を産生するためのイソオキサゾール９（ＩＳＸ−９）の使用【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでベータ細胞を産生するためのイソオキサゾール９（ＩＳＸ−９）の使用。
【請求項２】
前記ベータ細胞が、幹細胞及び／又は膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ベータ細胞が、ＭａｆＡを発現し、好ましくは更にＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１、ＮＫＸ２−２、ＮｅｕｒｏＤ１、及び／又はインスリンを発現する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
細胞をイソオキサゾール９（ＩＳＸ−９）と接触させるステップを含む、ベータ細胞を産生させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項５】
ＩＳＸ−９と接触した前記細胞が、幹細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＩＳＸ−９と接触した前記細胞が、膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞、未成熟ベータ細胞、又は成熟中ベータ細胞、好ましくはＰＥ細胞である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞を、ＩＳＸ−９の存在下で、約２〜５日間、好ましくは約４日間培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で準備された細胞を、ＩＳＸ−９の非存在下で、約４〜６日間、好ましくは約４日間、培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で準備された細胞を、ＩＳＸ−９の存在下で、約１０〜１４日間、好ましくは約１４日間、培養するステップと、を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
イソオキサゾール９（ＩＳＸ−９）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生可能なベータ細胞。
【請求項９】
前記ベータ細胞が、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法によって産生される、請求項８に記載のベータ細胞。
【請求項１０】
前記ベータ細胞が、幹細胞及び／又は膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生される、請求項８に記載のベータ細胞。
【請求項１１】
前記ベータ細胞が、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１、ＮＫＸ２−２、ＮｅｕｒｏＤ１、ＭａｆＡ、及び／又はインスリンを発現する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のベータ細胞。
【請求項１２】
前記ベータ細胞が、成熟中又は成熟したベータ細胞である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のベータ細胞。
【請求項１３】
療法で使用するための、好ましくは糖尿病を治療又は予防するための、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のベータ細胞。
【請求項１４】
請求項８〜１２のいずれか一項に記載の細胞を、ベータ細胞を必要としている対象に移植するステップを含む、糖尿病を治療又は予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓ベータ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生に関する。より具体的には、本発明は、幹細胞などの細胞を、成熟膵臓ベータ細胞の特性を有するインスリン産生細胞に分化させるための改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真性糖尿病（一般に糖尿病と称する）は、長期間にわたる高い患者の血糖レベルによって特徴付けられる代謝性疾患の群である。糖尿病は世界中で３億人を超える人々に影響を及ぼしている。
【０００３】
糖尿病には主として２つのタイプ（１型及び２型）があり、それらは原因及び治療方法が異なる。１型糖尿病は、通常は自己免疫機序による膵臓におけるインスリン産生ベータ細胞の破壊が原因である。２型糖尿病は、末梢組織におけるインスリン抵抗性が原因であり、膵臓ベータ細胞機能不全を合併している。
【０００４】
１型糖尿病の管理には、患者の生涯にわたって定期的なインスリン注射が必要である。対照的に、２型糖尿病は、食事、体重、及び身体運動の管理により制御することができるが、長期治療は、インスリン注射と場合により併用される投薬（例えばメトホルミン又はスルホニル尿素）が必要なことがある。
【０００５】
患者は、１型糖尿病及び２型糖尿病の両方を既存の治療で管理することができる場合があるが、現時点では治療法は存在せず、糖尿病は死亡リスクを有意に増加させる。
【０００６】
インスリン産生膵臓ベータ細胞の移植は、糖尿病、特に１型糖尿病の直接的治療にとって有望である。研究により、ドナーのヒト膵島を移植された患者は、５年を超えてインスリン注射をせずに生活し得ることが示された（Ｂｅｌｌｉｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１２：１５７６〜１５８３）。しかしながら、係る移植は、十分な品質のドナー組織の不足により制限されている。
【０００７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ由来のインスリン産生膵臓ベータ細胞、例えば幹細胞から産生されるそれらの利用は、移植療法を後退させる問題を改善することができる。更に、ベータ細胞の結果として得られる均一な供給は、疾患を治療するための新規な医薬品の同定を目的としたプログラムに有益となる。係るスクリーニングプログラムは、現在、適切な細胞の不足及び利用可能なそれらの細胞の変異性の高さにより妨げられている。
【０００８】
研究により、最終的な内胚葉細胞及びその後の膵臓前駆細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで高効率で調製することができ、これらの細胞は、げっ歯に移植された際、機能性ベータ細胞に分化し得ることが示されている（Ｋｒｏｏｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：４４３〜４５２；Ｒｅｚａｎｉａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６１：２０１６〜２０２９）。しかしながら、このｉｎ  ｖｉｖｏでの分化は十分に理解されておらず、そのプロセスがヒトでも起こるかどうかは不明である。
【０００９】
ヒト膵臓前駆細胞からインスリン産生細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生させるほとんどの試みは、未成熟又は異常な表現型を有する細胞を生成させてきた。例えば、得られた細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでグルコース刺激インスリン分泌を提供できず、適切なベータ細胞マーカー（例えばＮＫＸ６−１又はＰＤＸ１）を欠いていて、他のホルモンを異常発現し（例えばグルカゴン）、及び／又は移植後に適切な機能を欠いていた（Ｐａｇｌｉｕｃａ，Ｆ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  １５９：４２８〜４３９で概説されている）。
【００１０】
より最近のプロトコルは、成熟膵臓ベータ細胞に更に正確に似ている細胞を提供する改善を示している（Ｐａｇｌｉｕｃａ，Ｆ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  １５９：４２８〜４３９）。しかしながら、これらの方法により産生された細胞と天然に存在する成熟したベータ細胞との間には、依然として差異が残っている。
【００１１】
したがって、成熟膵臓ベータ細胞により近接した特性を有するインスリン産生細胞を提供する方法に関する多くのニーズが依然として存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、驚くべきことに、インスリン産生ベータ細胞を産生するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法の間に、細胞をイソオキサゾール９（ＩＳＸ−９）と接触させると、ＩＳＸ−９の非存在下で実施された同じプロトコルと比較して、成熟膵臓ベータ細胞に更に正確に似ている表現型を細胞が提供されることを見出した。例えば、本発明者らは、得られた細胞が、天然に存在する成熟したベータ細胞と同様にＭａｆＡを発現し、グルコース刺激に応答してインスリンを分泌することを見出した。
【００１３】
ＩＳＸ−９は、以前はヒトの死体の膵島及びＭＩＮ６膵臓ベータ細胞株と共に培養されてきた。これに関連して、長期間の培養に起因して、低レベルのインスリンを産生した膵島におけるインスリンの発現及び分泌を増加させることを見出した（Ｄｉｏｕｍ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８：２０７１３〜２０７１８）。しかしながら、この研究は、初代の成熟したベータ細胞を用いて行われ、ベータ細胞前駆体を分化させる方法においてＩＳＸ−９を使用するなんらの利点も明らかにしていなかった。
【００１４】
一態様において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでベータ細胞を産生するためのイソオキサゾール９（ＩＳＸ−９）の使用を提供する。ＩＳＸ−９は、多能性幹細胞又は膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞、好ましくはＰＥ細胞などの前駆細胞からベータ細胞を産生するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用することができる。
【００１５】
ＩＳＸ−９（すなわち、より成熟している、又はより完全に分化しているベータ細胞を提供するために使用される）の非存在下での同一の方法と比較して、ＩＳＸ−９は、ベータ細胞の成熟を改善するために（例えば、前駆細胞からベータ細胞を産生するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法の間に）使用することができる。ベータ細胞の成熟は、成熟中及び／又は成熟したベータ細胞マーカーの発現、例えばＭａｆＡ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１、ＮＫＸ２−２、ＮｅｕｒｏＤ１、及び／若しくはインスリン、好ましくはＭａｆＡの発現と、及び／又はプロインスリンをインスリン及びＣ−ペプチドへとプロセシングすることによって、またインスリン及びＣ−ペプチドを分泌することによってグルコースに鋭敏に応答するインスリン分泌細胞の能力と、によって特徴付けることができる。
【００１６】
一実施形態では、ベータ細胞はＭａｆＡを発現する。
【００１７】
別の実施形態において、ベータ細胞は、更に、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１、ＮＫＸ２−２、ＮｅｕｒｏＤ１、ＰＣＳＫ１、及び／又はインスリンを発現する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ベータ細胞において、ＭａｆＡ、ＮＫＸ２−２、ＮｅｕｒｏＤ１、及び／又はインスリンの発現を増加させるためのイソオキサゾール９（ＩＳＸ−９）の使用を提供する。好ましくは、ＩＳＸ−９のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用は、幹細胞、多能性幹細胞、又は膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞、好ましくはＰＥ細胞などの前駆細胞から産生されるベータ細胞における発現の増加を提供する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、細胞をイソオキサゾール９（ＩＳＸ−９）と接触させるステップを含む、ベータ細胞を産生するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。その方法は、前駆細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏでベータ細胞を産生する方法であり得る。好ましくは、ＩＳＸ−９と接触した細胞は成熟したベータ細胞よりも低分化である。
【００２０】
一実施形態において、ＩＳＸ−９と接触した細胞は、幹細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生される。
【００２１】
本発明の方法又は使用の間に、ＩＳＸ−９は、膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞と成熟中又は成熟したベータ細胞との間の連続体で成熟している細胞と接触することができる。
【００２２】
したがって、特定の日数、ＩＳＸ−９の存在下で培養された細胞は、膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞と成熟中又は成熟したベータ細胞との間の連続体で成熟している細胞であり得る。例えば、当該細胞は、ＩＳＸ−９の存在下で合計約１〜２０日間培養することができる。
【００２３】
一実施形態では、ＩＳＸ−９は、膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞、未成熟ベータ細胞、及び／又は成熟中ベータ細胞、好ましくはＰＥ細胞と接触する。
【００２４】
別の実施形態では、ＩＳＸ−９の存在下で、特定の日数、例えば合計約１〜２０日培養された細胞は、ＰＥ細胞である。
【００２５】
その方法の経過中に細胞が分化し、例えば、ＰＥ細胞は、方法の終わりまでに成熟中又は成熟したベータ細胞へと分化した可能性があることが理解されよう。
【００２６】
一実施形態において、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、合計約１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、又は１〜４日間、細胞を培養することを含む。別の実施形態において、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、合計約２〜２０、２〜１９、２〜１８、２〜１７、２〜１６、２〜１５、２〜１４、２〜１３、２〜１２、２〜１１、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、又は２〜４日間、細胞を培養することを含む。別の実施形態において、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、合計約３〜２０、３〜１９、３〜１８、３〜１７、３〜１６、３〜１５、３〜１４、３〜１３、３〜１２、３〜１１、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、又は３〜４日間、細胞を培養することを含む。別の実施形態において、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、合計約４〜２０、４〜１９、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、４〜１４、４〜１３、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、又は４〜５日間、細胞を培養することを含む。別の実施形態において、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、合計約４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、又は４〜１４日間、細胞を培養することを含む。別の実施形態において、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、合計約１０〜１８、１０〜１７、１０〜１６、１０〜１５、又は１０〜１４日間、細胞を培養することを含む。好ましくは、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、合計約４〜１８日間、細胞を培養することを含む。
【００２７】
一実施形態において、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、合計約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１日間、細胞を培養することを含む。
【００２８】
ＩＳＸ−９の存在下での培養の総時間は、１つのステップで実施してもよく、又は２つ以上の別々のステップで、例えば３つのステップ又は４つのステップに分けてもよい。好ましくは、ＩＳＸ−９の存在下での培養の総時間は２つの別々のステップに分割する。
【００２９】
一実施形態では、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、約１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、又は１〜２日間、好ましくは約１〜４日間、細胞を培養する第１のステップ、及びＩＳＸ−９の存在下で、約１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、又は１〜２日間、好ましくは約１〜１４日間、培養する第２のステップを含む。好ましくは、ＩＳＸ−９の存在下で培養する第１及び第２のステップは、ＩＳＸ−９の非存在下で培養するステップによって分離される。ＩＳＸ−９の非存在下での培養は、例えば、約１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、又は１〜２日間、好ましくは約１〜６日間であってもよい。
【００３０】
一実施形態では、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、約１〜７、２〜６、又は３〜５、好ましくは約３〜５日間、細胞を培養する第１のステップ、及びＩＳＸ−９の存在下で、約８〜１６、９〜１５、又は１０〜１４日間、好ましくは約１０〜１４日間、培養する第２のステップを含む。好ましくは、ＩＳＸ−９の存在下で培養する第１及び第２のステップは、ＩＳＸ−９の非存在下で培養するステップによって分離される。ＩＳＸ−９の非存在下での培養は、例えば、約２〜８、３〜７、又は４〜６日間、好ましくは約４〜６日間であってもよい。
【００３１】
一実施形態では、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１日間、好ましくは約４日間、細胞を培養する第１のステップ、及びＩＳＸ−９の存在下で、約１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１日間、好ましくは約１４日間、培養する第２のステップを含む。好ましくは、ＩＳＸ−９の存在下で培養する第１及び第２のステップは、ＩＳＸ−９の非存在下で培養するステップによって分離される。ＩＳＸ−９の非存在下での培養は、例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１日間、好ましくは約４日間であってもよい。
【００３２】
好ましい実施形態では、当該方法は、
（ａ）膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞を、ＩＳＸ−９の存在下で、約２〜５日間、好ましくは約４日間、培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で準備される細胞を、ＩＳＸ−９の非存在下で、約４〜６日間、好ましくは約４日間、培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で準備された細胞を、ＩＳＸ−９の存在下で、約１０〜１４日間、好ましくは約１４日間、培養するステップと、を含む。
【００３３】
別の態様において、本発明は、ＭａｆＡを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されたベータ細胞を提供する。そのベータ細胞は、幹細胞及び／又は膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞、好ましくはＰＥ細胞などの前駆細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生することができる。
【００３４】
本発明のベータ細胞は、イソオキサゾール９（ＩＳＸ−９）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生される。ベータ細胞は、前駆細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＳＸ−９と接触させることによって前駆細胞から産生することができる。前駆細胞は、例えば、膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞、未成熟ベータ細胞又は成熟中ベータ細胞であってもよい。好ましくは、前駆細胞はＰＥ細胞である。
【００３５】
別の態様において、本発明は、イソオキサゾール９（ＩＳＸ−９）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生可能なベータ細胞を提供する。好ましくは、ベータ細胞はＭａｆＡを発現する。ベータ細胞は、前駆細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＳＸ−９と接触させることによって前駆細胞から産生することができる。前駆細胞は、例えば、膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞、未成熟ベータ細胞又は成熟中ベータ細胞であってもよい。好ましくは、前駆細胞はＰＥ細胞である。本発明の方法により、ベータ細胞を産生することができる。
【００３６】
好ましくは、本発明のベータ細胞は、哺乳動物ベータ細胞、好ましくはヒトベータ細胞である。
【００３７】
一実施形態において、本発明のベータ細胞は、幹細胞及び／又は膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生される。
【００３８】
幹細胞は、例えば多能性幹細胞であってもよい。好ましくはヒト多能性幹細胞である。
【００３９】
別の実施形態において、本発明のベータ細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ナイーブ幹細胞、線維芽細胞、又は神経堤細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生される。好ましくは、本発明のベータ細胞は、ｉＰＳＣからｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生される。
【００４０】
好ましくは、本発明のベータ細胞が産生される細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である。
【００４１】
一実施形態において、本発明のベータ細胞は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１、ＮＫＸ２−２、ＮｅｕｒｏＤ１、及び／又はインスリンを更に発現する。
【００４２】
一実施形態において、本発明のベータ細胞は、グルコース刺激インスリン応答を提供する（すなわち、グルコースに曝露されるとインスリンを分泌する）。
【００４３】
一実施形態において、本発明のベータ細胞は成熟中ベータ細胞である。
【００４４】
別の実施形態において、本発明のベータ細胞は成熟したベータ細胞である。
【００４５】
別の態様において、本発明は、本発明の複数のベータ細胞を含む細胞の集団を提供する。
【００４６】
一実施形態において、細胞の集団の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％は、ＭａｆＡを発現する。
【００４７】
一実施形態では、細胞の集団の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％、好ましくは少なくとも２０％は、グルコース刺激インスリン応答を提供する（すなわち、グルコースに曝露されるとインスリンを分泌する）。
【００４８】
一実施形態では、細胞の集団の５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％未満、好ましくは４０％未満は、グルコース刺激グルカゴン応答を提供する（すなわち、グルコースに曝露されるとグルカゴンを分泌する）。
【００４９】
別の態様において、本発明は、本発明の使用又は方法によって産生可能なベータ細胞を提供する。
【００５０】
別の態様において、本発明は、療法で使用するための本発明のベータ細胞を提供する。
【００５１】
別の態様において、本発明は、糖尿病の治療又は予防に使用するための本発明のベータ細胞を提供する。
【００５２】
別の態様において、本発明は、糖尿病の治療又は予防のための医薬品を製造するために本発明のベータ細胞の使用を提供する。
【００５３】
別の態様において、本発明は、本発明のベータ細胞を必要とする対象に対して本発明のベータ細胞を移植するステップを含む、糖尿病を治療又は予防する方法を提供する。
【００５４】
別の態様では、本発明は、本発明のベータ細胞を候補薬剤と接触させるステップを含む、治療剤、例えば、糖尿病を治療又は予防するための薬剤のスクリーニング方法を提供する。その方法は、グルコース刺激インスリン応答を測定する後続のステップを含むことができる。候補薬剤との接触後のベータ細胞のグルコース刺激インスリン応答の改善は、候補薬剤が糖尿病を治療又は予防し得ることを示している場合がある。
【００５５】
好ましくは、候補薬剤は、候補薬剤のライブラリー内に含まれる。このスクリーニング方法は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、本発明のベータ細胞を移植された動物モデルを用いて）行うことができる。好ましくは、スクリーニング方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】Ｉｓｘ９の投与量を増加させた培養におけるＰＥ細胞の形態解析の図である。ＰＥ細胞は、Ｉｓｘ９を用いていない懸濁液（ＤＭＳＯ対照担体）中で、またＩｓｘ９（６μＭ、１２μＭ、２４μＭ、４８μＭ、及び６０μＭ）の濃度を増加させた懸濁液中で、４日間及び８日間培養した。各条件及び時点において、倍率５倍及び１０倍の画像を収集した。
【図２】Ｉｓｘ９にＰＥ細胞を曝露すると、細胞に対してグルコース応答特性が誘導されることを示している図である。Ａ：プロトコル設定のスキーム成熟ステップの間、成熟中ベータ細胞を、ＤＭＳＯ又はＩｓｘ９（６μＭ）に１３日間、７日間、又は２日間曝露した。Ｂ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌試験を行って、低グルコース濃度（２ｍＭ）又は高グルコース濃度（２０ｍＭ）によって誘導される、各条件（Ｉｓｘ９無し、Ｉｓｘ９に１３日間、Ｉｓｘ９に７日間、又はＩｓｘ９に２日間）におけるインスリンの分泌を測定した。インスリン分泌の刺激指数は、ｙ軸におけるグルコースの２つの濃度間で決定される。
【図３】Ｉｓｘ９へのＰＥ細胞の早期曝露は、内分泌前駆細胞並びに成熟したベータ細胞マーカーの遺伝子発現レベルを増加させることを示している図である。Ａ：プロトコル設定のスキームＢ：Ｉｓｘ９（６μＭ）に２〜６日間ＰＥ細胞を早期に曝露する（条件３）と、ＤＭＳＯ曝露（条件１）と比較して、分化のＤ１３においてＮｇｎ３、Ｎｋｘ２．２、及びＮｅｕｒｏＤ１のＲＮＡ発現レベルが増加する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟中ベータ細胞を２ステッププロトコルでＩｓｘ９（６μＭ）に曝露する（条件４）と、Ｎｋｘ２．２ＲＮＡ発現レベルの増加が分化のＤ２３において維持される。対照は初代ヒト膵島である。各対の第１のバーは２ｍＭであり、第２のバーは２０ｍＭである。
【図４】２ステップでＩｓｘ９にＰＥ細胞を曝露すると、細胞のグルコース応答特性が増加することを示している図である。Ａ：プロトコル設定のスキーム第１のステップでは、ＰＥ細胞を、２〜６日間、ＤＭＳＯ（条件１）又はＩｓｘ９（６μＭ）（条件２）に曝露した。第２のステップでは、成熟中ベータ細胞を、１０日間、ＤＭＳＯ（条件３）又はＩｓｘ９（６μＭ）（条件４）に曝露した。Ｂ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌試験を行って、低グルコース濃度（２ｍＭ）又は高グルコース濃度（２０ｍＭ）によって誘導される、各条件におけるインスリンの分泌を測定した。インスリン分泌の刺激指数は、ｙ軸におけるグルコースの２つの濃度間で決定される。左から右へ順に：ＮＫＸ６．１、Ｐｄｘ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２−２、ＮｅｕｒｏＤ１。
【図５】Ｉｓｘ９の存在下で懸濁液中又はトランスウェル培養系でＰＥ細胞を培養すると、改善されたグルコース依存性インスリン応答を示す図である。
【図６】Ｉｓｘ９の存在下で懸濁液中又はトランスウェル培養系でＰＥ細胞を培養すると、改善されたグルコース依存性インスリン応答の同じ効果を示している図である。
【図７】細胞のＦＡＣＳソーティングを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明の種々の好ましい特徴及び実施形態を、非限定的な例によって記述する。
【００５８】
本発明の実施は、特に指示がない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、生化学、分子生物学、微生物学、及び免疫学の従来技術を使用する。係る技術は文献で説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．９，１３  ａｎｄ  １６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｒｏｅ，Ｂ．，Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｊ．ａｎｄ  Ｋａｈｎ，Ａ．（１９９６）ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｐｏｌａｋ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  ＭｃＧｅｅ，Ｊ．Ｏ’Ｄ．（１９９０）Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、並びに、Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．及びＤａｈｌｂｅｒｇ，Ｊ．Ｅ．（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。これらの一般的なテキストの各々は、本明細書に参照により組み込まれる。
【００５９】
一態様において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでベータ細胞を産生するためのイソオキサゾール９（ＩＳＸ−９）の使用を提供する。
【００６０】
ベータ細胞の「産生」とは、その前駆細胞の制御された分化による、成熟度が低い前駆細胞からの、例えば、幹細胞からの、又は幹細胞とベータ細胞との間の分化経路上にある細胞型（例えば、膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞、未成熟ベータ細胞又は成熟中ベータ細胞、好ましくはＰＥ細胞）からの、産生を指す。本発明のベータ細胞を提供する分化は、その細胞の分化を所望の仕方で導く、すなわち成熟中又は成熟したベータ細胞になるように導く適切な条件下で前駆細胞を培養することによって、行うことができる。
【００６１】
イソオキサゾール９（ＩＳＸ−９）
イソオキサゾール９（ＩＳＸ−９；神経分化誘導剤ＩＩＩとしても知られている；ＣＡＳ  Ｎｏ．８３２１１５−６２−５）は以下の構造を有する分子である。
【化１】
2019503697.tif 000002
【００６２】
ＩＳＸ−９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで成体の神経幹細胞分化を誘導することが示されており、カルシウム活性化シグナル伝達経路を介して作用すると考えられる。
【００６３】
本発明の使用及び方法はまた、前駆細胞からベータ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生する間にＩＳＸ−９と実質的に同等の機能を提供するＩＳＸ−９の誘導体を使用することもできる。
【００６４】
一実施形態では、ＩＳＸ−９は、本発明では、約１〜６０、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、又は１〜１０μＭの濃度で使用される。好ましくは、ＩＳＸ−９は、本発明では約１〜１０μＭの濃度で使用される。
【００６５】
別の実施形態では、ＩＳＸ−９は、本発明では約１〜１１、２〜１０、３〜９、４〜８、又は５〜７μＭの濃度で使用される。好ましくは、ＩＳＸ−９は、本発明では約５〜７μＭの濃度で使用される。
【００６６】
別の実施形態では、ＩＳＸ−９は、本発明では約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５μＭの濃度で使用される。好ましくは、ＩＳＸ−９は、本発明では約６μＭの濃度で使用される。
【００６７】
膵臓
膵臓は、脊椎動物の消化器系と内分泌系の両方の器官である。膵臓は、内分泌腺として機能し、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵ポリペプチドを含むいくつかのホルモンを産生する。膵臓はまた、消化酵素を含有する膵液を小腸に分泌する。
【００６８】
ベータ細胞（β細胞）は、膵臓の膵島（ランゲルハンス島としても知られている）に自然に見出される細胞の一種である。ベータ細胞は、典型的には、膵島における細胞の約６５〜８０％を構成している。
【００６９】
ベータ細胞の主な機能は、ベータ細胞によって一旦放出された血糖濃度を低下させるホルモンであるインスリンを貯蔵及び放出することにある。
【００７０】
ベータ細胞は、より多くのインスリンを産生すると同時に、貯蔵したインスリンを放出することによって、血糖濃度の急上昇に対して迅速に応答することができる。
【００７１】
本発明の使用及び方法は、低分化細胞からベータ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生することができる。本発明のベータ細胞は、インスリンを産生することができる細胞、好ましくは、グルコース刺激インスリン応答を提供する（すなわち、グルコースに曝露されたときにインスリンを分泌する）細胞である。
【００７２】
ベータ細胞は、例えば、膵臓において自然に見出される完全に成熟したベータ細胞へと分化する成長の順で、例えば未成熟、成熟中、又は成熟した、として特徴付けることができる。好ましくは、本発明のベータ細胞は、成熟中又は成熟したベータ細胞である。
【００７３】
未成熟ベータ細胞は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１、ＮｅｕｒｏＤ１、及びインスリンの発現によって特徴付けることができる。
【００７４】
成熟中ベータ細胞は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１、ＮｅｕｒｏＤ１、ＧＬＵＴ２、ＰＣ１／３、ＰＣ２、及びインスリンの発現によって特徴付けることができる。好ましくは、成熟中ベータ細胞はまた、ＭａｆＡも発現する。別の実施形態では、インスリンを産生することができる細胞は、グルコースに応答性である。別の実施形態では、インスリンを産生することができる細胞は、Ｃ−ペプチドを分泌する。別の実施形態では、インスリンを産生することができる細胞は、ベータ細胞である。
【００７５】
本発明の文脈において、用語「前駆細胞」は、適当な条件下で培養されたときに、ベータ細胞に分化し得る任意の細胞（例えば始原細胞）を指す。
【００７６】
例示的な前駆細胞としては、幹細胞（本明細書に記載されている）、中内胚葉（ＭＥ）細胞、確定的内胚葉（ＤＥ）細胞、原腸（ＰＧ）細胞、後部前腸（ＰＦ）細胞、膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞、膵臓内分泌前駆細胞、未成熟ベータ細胞、及び成熟中ベータ細胞が挙げられる。好ましくは、前駆細胞は、膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞である。
【００７７】
ＭＥ細胞は、ＢＲＡ、ＦＧＦ４、ＷＮＴ３、及びＮＣＡＤの発現によって特徴付けることができる。
【００７８】
ＤＥ細胞は、ＳＯＸ１７、ＣＥＲ、ＦＯＸＡ２、及びＣＸＣＲ４の発現によって特徴付けることができる。
【００７９】
ＰＧ細胞は、ＨＮＦ１Ｂ及びＨＮＦ４Ａの発現によって特徴付けることができる。
【００８０】
後部前腸（ＰＦ）細胞は、ＰＤＸ１、ＨＮＦ６、ＰＲＯＸ１、及びＳＯＸ９の発現によって特徴付けることができる。
【００８１】
膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞は、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１、並びにＰＴＦ１Ａ、ＮＧＮ３、及びＮＫＸ２−２の発現によって特徴付けることができる。ＰＥ細胞としては、インスリン及びグルカゴンを発現するポリホルモン細胞も挙げることもできる。
【００８２】
膵臓内分泌前駆細胞は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１、及びＮＥＵＲＯＤ１の発現によって特徴付けることができる。
【００８３】
ＭａｆＡ
ＭａｆＡは、インスリンエンハンサーエレメントＲＩＰＥ３ｂに特異的に結合し、インスリン遺伝子発現を活性化する転写因子である。ＭａｆＡは、ＮＥＵＲＯＤ１及びＰＤＸ１と相乗的に協働する。
【００８４】
ＭａｆＡは、ベータ細胞成熟に関するマーカーである。
【００８５】
ヒトＭａｆＡのアミノ酸配列の一例は、ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿９６３８８３．２で寄託された配列である。
【００８６】
ヒトＭａｆＡのアミノ酸配列の例は、
ＭＡＡＥＬＡＭＧＡＥＬＰＳＳＰＬＡＩＥＹＶＮＤＦＤＬＭＫＦＥＶＫＫＥＰＰＥＡＥＲＦＣＨＲＬＰＰＧＳＬＳＳＴＰＬＳＴＰＣＳＳＶＰＳＳＰＳＦＣＡＰＳＰＧＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＳＳＱＡＧＧＡＰＧＰＰＳＧＧＰＧＡＶＧＧＴＳＧＫＰＡＬＥＤＬＹＷＭＳＧＹＱＨＨＬＮＰＥＡＬＮＬＴＰＥＤＡＶＥＡＬＩＧＳＧＨＨＧＡＨＨＧＡＨＨＰＡＡＡＡＡＹＥＡＦＲＧＰＧＦＡＧＧＧＧＡＤＤＭＧＡＧＨＨＨＧＡＨＨＡＡＨＨＨＨＡＡＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＡＧＨＧＧＧＡＧＨＨＶＲＬＥＥＲＦＳＤＤＱＬＶＳＭＳＶＲＥＬＮＲＱＬＲＧＦＳＫＥＥＶＩＲＬＫＱＫＲＲＴＬＫＮＲＧＹＡＱＳＣＲＦＫＲＶＱＱＲＨＩＬＥＳＥＫＣＱＬＱＳＱＶＥＱＬＫＬＥＶＧＲＬＡＫＥＲＤＬＹＫＥＫＹＥＫＬＡＧＲＧＧＰＧＳＡＧＧＡＧＦＰＲＥＰＳＰＰＱＡＧＰＧＧＡＫＧＴＡＤＦＦＬ（配列番号１）である。
【００８７】
分化の方法
本発明のベータ細胞は、イソオキサゾール９（ＩＳＸ−９）を使用して幹細胞及び／又は膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞などの前駆細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生することができる。
【００８８】
一態様において、本発明は、細胞をイソオキサゾール９（ＩＳＸ−９）と接触させるステップを含む、ベータ細胞を産生するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
【００８９】
ＩＳＸ−９と接触した細胞は、適切な条件下で培養すると、ベータ細胞に分化する能力を有する前駆細胞である。
【００９０】
本発明の方法又は使用の間に、ＩＳＸ−９を、膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞と成熟中又は成熟したベータ細胞との間の連続体上で成熟している細胞と接触させることができる。
【００９１】
したがって、特定の日数、ＩＳＸ−９の存在下で培養された細胞は、膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞と成熟中又は成熟したベータ細胞との間の連続体上で成熟している細胞であってもよい。例えば、当該細胞は、ＩＳＸ−９の存在下で、合計約１〜２０日間培養することができる。
【００９２】
一実施形態では、ＩＳＸ−９は、膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞、未成熟ベータ細胞、及び／又は成熟中ベータ細胞、好ましくはＰＥ細胞と接触する。
【００９３】
別の実施形態では、ＩＳＸ−９の存在下で、特定の日数、例えば合計約１〜２０日培養された細胞は、ＰＥ細胞である。
【００９４】
ＩＳＸ−９と最初に接触した細胞は、特定のタイプ（例えばＰＥ細胞）であり得るが、この方法の過程の間に細胞は分化し、したがって、ＩＳＸ−９は、本発明の方法の過程の間に、ＩＳＸ−９と最初に接触した細胞から分化した細胞と次のステップで接触し得る、ことが理解されよう。
【００９５】
一実施形態において、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、合計約１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、又は１〜４日間、細胞を培養することを含む。別の実施形態において、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、合計約２〜２０、２〜１９、２〜１８、２〜１７、２〜１６、２〜１５、２〜１４、２〜１３、２〜１２、２〜１１、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、又は２〜４日間、細胞を培養することを含む。別の実施形態において、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、合計約３〜２０、３〜１９、３〜１８、３〜１７、３〜１６、３〜１５、３〜１４、３〜１３、３〜１２、３〜１１、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、又は３〜４日間、細胞を培養することを含む。別の実施形態において、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、合計約４〜２０、４〜１９、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、４〜１４、４〜１３、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、又は４〜５日間、細胞を培養することを含む。別の実施形態において、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、合計約４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、又は４〜１４日間、細胞を培養することを含む。別の実施形態において、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、合計約１０〜１８、１０〜１７、１０〜１６、１０〜１５、又は１０〜１４日間、細胞を培養することを含む。好ましくは、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、合計約４〜１８日間、細胞を培養することを含む。
【００９６】
一実施形態において、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、合計約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１日間、細胞を培養することを含む。
【００９７】
ＩＳＸ−９の存在下での培養の総時間は、１つのステップで実施してもよく、又は２つ以上の別々のステップで、例えば３つのステップ又は４つのステップに分けてもよい。好ましくは、ＩＳＸ−９の存在下での培養の総時間は２つの別々のステップに分割する。
【００９８】
一実施形態では、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、約１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、又は１〜２日間、好ましくは約１〜４日間、細胞を培養する第１のステップ、及びＩＳＸ−９の存在下で、約１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、又は１〜２日間、好ましくは約１〜１４日間、培養する第２のステップを含む。好ましくは、ＩＳＸ−９の存在下で培養する第１及び第２のステップは、ＩＳＸ−９の非存在下で培養するステップによって分離される。ＩＳＸ−９の非存在下での培養は、例えば、約１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、又は１〜２日間、好ましくは約１〜６日間であってもよい。
【００９９】
一実施形態では、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、約１〜７、２〜６、又は３〜５、好ましくは約３〜５日間、細胞を培養する第１のステップ、及びＩＳＸ−９の存在下で、約８〜１６、９〜１５、又は１０〜１４日間、好ましくは約１０〜１４日間、培養する第２のステップを含む。好ましくは、ＩＳＸ−９の存在下で培養する第１及び第２のステップは、ＩＳＸ−９の非存在下で培養するステップによって分離される。ＩＳＸ−９の非存在下での培養は、例えば、約２〜８、３〜７、又は４〜６日間、好ましくは約４〜６日間であってもよい。
【０１００】
別の実施形態では、方法は、ＩＳＸ−９の存在下で、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１日間、好ましくは約４日間、細胞を培養する第１のステップ、及びＩＳＸ−９の存在下で、約１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１日間、好ましくは約１４日間、培養する第２のステップを含む。好ましくは、ＩＳＸ−９の存在下で培養する第１及び第２のステップは、ＩＳＸ−９の非存在下で培養するステップによって分離される。ＩＳＸ−９の非存在下での培養は、例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１日間、好ましくは約４日間であってもよい。
【０１０１】
好ましい実施形態では、当該方法は、
（ａ）膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞を、ＩＳＸ−９の存在下で、約３〜５日間、好ましくは約４日間、培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で準備された細胞を、ＩＳＸ−９の非存在下で、約４〜６日間、好ましくは約４日間、培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で準備された細胞を、ＩＳＸ−９の存在下で、約１０〜１４日間、好ましくは約１４日間、培養するステップと、を含む。
【０１０２】
ＩＳＸ−９の非存在下で培養するステップ（例えばステップ（ｂ））の後、細胞は分化して未成熟のベータ細胞になる可能性がある。ＩＳＸ−９の存在下で培養する第２のステップ（例えばステップ（ｃ））の後、細胞は分化して成熟中又は成熟したベータ細胞になった可能性がある。
【０１０３】
好ましい実施形態において、ＩＳＸ−９と接触した細胞、例えばＰＥ細胞は、幹細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生される。
【０１０４】
従来技術の方法は、本発明の目的のために使用又は適合させることができる。例えば、ベータ細胞に分化するプロセスの間にＰＥ細胞を培養するための方法は、Ｐａｇｌｉｕｃａ，Ｆ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ  １５９：４２８〜４３９に記載されている。係る方法は、ＩＳＸ−９の存在下で細胞培養を含むように適合させることができる。
【０１０５】
特に好ましい実施形態において、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、以下のステップ、すなわち
（ａ）膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞を、ＩＳＸ−９の非存在下で、約１〜３日間、好ましくは約２日間、培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で準備された細胞を、ＩＳＸ−９の存在下で、約２〜５日間、好ましくは約４日間、培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で準備された細胞を、ＩＳＸ−９の非存在下で、約４〜６日間、好ましくは約４日間、培養するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で準備された細胞を、ＩＳＸ−９の存在下で、約１０〜１４日間、好ましくは約１４日間、培養するステップと、を含む。
【０１０６】
ステップ（ａ）の前に、ＤＮａｓｅ  Ｉの存在下で、約１日間、ＰＥ細胞を培養することを含む更なるステップを行ってもよい。好ましくは、これは、好ましくは平底プレートを使用して、Ｉ培地［この培地の成分について助言を求む］で行う。
【０１０７】
ステップ（ａ）はＳ３  ＢＡＳＥ培地（ＭＣＤＢ１３１、８ｍＭのＤ−グルコース、１．２３ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、２％ＦＦＡ  ＢＳＡ、１：２００ＩＴＸ−Ｘ、２ｍＭのグルタマックス、１０Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び０．２５ｍＭのビタミンＣ）で行うことができる。好ましくは、この培地は、５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、０．２５μＭのＳａｎｔ１、１００ｎＭのＲＡ、及び１０μＭのＹ−２７６３２（Ｒｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を更に含む。
【０１０８】
ステップ（ｂ）は、Ｓ５  ＢＡＳＥ培地（ＭＣＤＢ１３１、２０ｍＭのＤ−グルコース、１．７５４ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、２％ＦＦＡ  ＢＳＡ、１：２００ＩＴＸ−Ｘ、２ｍＭのグルタマックス、１０Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．２５ｍＭのビタミンＣ、及び１０μｇ／ｍＬのヘパリン）で行うことができる。好ましくは、この培地は、１００ｎＭのＲＡ、１μＭのＸＸＩ、０．２５μＭのＳａｎｔ１，１０μＭのＡｌｋ５ｉ  ＩＩ、１μＭのＴ３、２０ｎｇ／ｍＬのベータ−セルリン、及び１０μＭのＹ−２７６３２（Ｒｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を更に含む。
【０１０９】
ステップ（ｃ）の最初の３日間は、Ｓ５  ＢＡＳＥ培地中で行ってもよい。好ましくは、この培地は、２５ｎＭのＲＡ、１μＭのＸＸＩ、１０μＭのＡｌｋ５ｉ  ＩＩ、１μＭのＴ３，２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン、及び１０μＭのＹ−２７６３２（Ｒｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を更に含む。
【０１１０】
ステップ（ｃ）の最後の１日は、成熟中のＢＡＳＥ培地（ＣＭＲＬ１０６６、１０％ＦＢＳ並びに１０Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）で行うことができる。好ましくは、この培地は、１０μＭのＡｌｋ５ｉ  ＩＩ、１μＭのＴ３、及び１０μＭのＹ−２７６３２（Ｒｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を更に含む。
【０１１１】
ステップ（ｄ）は成熟中のＢＡＳＥ培地で行うことができる。好ましくは、この培地は、１０μＭのＡｌｋ５ｉ  ＩＩ、１μＭのＴ３、及び１０μＭのＹ−２７６３２（Ｒｏｃｋ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を更に含む。
【０１１２】
好ましくは、ＩＳＸ−９は約６μＭの濃度で使用される。
【０１１３】
好ましくは、ステップ（ｂ）〜（ｄ）は気液界面培養を用いて行われる。
【０１１４】
好ましくは、ＰＥ細胞は、幹細胞、例えば多能性幹細胞、例えば誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）などからｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生される。
【０１１５】
幹細胞
本発明のベータ細胞は、幹細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生することができる。
【０１１６】
幹細胞は、より特殊化された細胞に分化する能力を有する細胞であり、分裂してより多くの幹細胞を産生することもできる。
【０１１７】
本発明の方法は、前駆細胞をイソオキサゾール９（ＩＳＸ−９）と接触させることを含むことができ、前駆細胞は、それ自体、幹細胞の分化によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生された。
【０１１８】
したがって、本発明の方法は、幹細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を産生するステップを含むことができる。
【０１１９】
好ましくは、本発明の幹細胞は多能性幹細胞である。
【０１２０】
多能性幹細胞は、際限なく増殖し、人体の全ての細胞型に分化できる幹細胞である。これらの幹細胞は、損傷又は疾患によって影響を受けた細胞を置換することができる単一の細胞源を提供することが期待できる。
【０１２１】
多能性幹細胞は、誘導多能性幹細胞又は胚性幹細胞の生成などのいくつかの技術を介して作製することができる。
【０１２２】
好ましくは、本発明の幹細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
【０１２３】
ｉＰＳＣは、成体細胞から直接作製することができる多能性幹細胞の一種である。当業者は、例えば、特定の転写因子を成体細胞に導入することによって、又は成体細胞を特定のタンパク質の組み合わせと接触させることによって、ｉＰＳＣを容易に調製することができる。
【０１２４】
ｉＰＳＣは、胚性材料を使用する必要性を克服しているという点において、またｉＰＳＣ（又はｉＰＳＣから産生された細胞）は、後に再導入される対象から調製され得るという点において、胚性幹細胞よりも有益である。係る自己細胞移植は、移植された材料の免疫拒絶の危険性を克服することができる。
【０１２５】
本発明の幹細胞は、胚性幹細胞であってもよく、特に、胚を破壊することなく産生された胚性幹細胞であってもよい。
【０１２６】
胚を破壊することなく、哺乳動物胚性幹細胞などの多能性幹細胞を産生するための方法は当技術分野で知られている。特に、マウス及びヒトの胚性幹細胞は、胚をそのまま残存させたまま、単一の割球から産生され得ることが示されている。例えば、Ｃｈｕｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４３９：２１６〜２１９では、単一の割球からマウス胚性幹細胞を作製するための方法を記載している。この手順のその後の進歩により、割球細胞株を他のＥＳＣと共培養する必要がない方法が提供された（Ｃｈｕｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２：１１３〜１１７）。
【０１２７】
好ましくは、本発明の幹細胞は、哺乳動物幹細胞、好ましくはヒト幹細胞である。
【０１２８】
疾患
本発明のベータ細胞は、長期にわたる高血糖レベルを特徴とする疾患の治療又は予防に使用することができる。係る病態は、インスリン抵抗性、糖尿病前症、１型又は２型糖尿病、及びメタボリックシンドロームを含む。
【０１２９】
インスリン抵抗性とは、身体がインスリンを産生するが、インスリンを有効に利用しない病態である。対象がインスリン抵抗性を有するとき、グルコースは細胞によって吸収される代わりに血液中に蓄積し、２型糖尿病又は糖尿病前症に至る。インスリン抵抗性とは、曝露されるインスリン濃度に対する標的細胞又は全器官の応答性の低下と定義することができる。この定義は、一般に、インスリン媒介グルコース処理に対する感受性の障害を指すために使用される。
【０１３０】
糖尿病前症は、糖尿病患者を診断するために必要な症状の全てが存在するわけではないが、血糖値が異常に高い医療段階である。糖尿病前症は、通常は、インスリン抵抗性を既に有する対象において起こる。インスリン抵抗性のみによって２型糖尿病が発症するわけではないが、インスリン産生ベータ細胞に関する需要の高さによって、しばしば疾患のステージを設定する。糖尿病前症では、ベータ細胞は、もはやインスリン抵抗性を克服するのに十分なインスリンを産生することができないために、血糖レベルが正常範囲を超えて上昇する。
【０１３１】
真性糖尿病（一般に糖尿病と称する）は、長期間にわたる高い患者血糖レベルによって特徴付けられる代謝性疾患の群である。糖尿病の２つの主要なタイプ（１型及び２型）は、原因が異なり、治療方法も異なる。
【０１３２】
１型糖尿病は、通常は自己免疫機序による膵臓におけるインスリン産生ベータ細胞の破壊が原因である。
【０１３３】
２型糖尿病は、末梢組織におけるインスリン抵抗性が原因であり、膵臓ベータ細胞機能不全を合併している場合がある。
【０１３４】
２型糖尿病は、世界的に有病率が上昇している慢性代謝性障害である。世界のいくつかの国では、影響を受ける対象の数が加齢母集団の増加により、次の１０年で倍増すると予測されている。
【０１３５】
２型糖尿病は、インスリン抵抗性、インスリン産生の低下、及び最終的な膵臓ベータ細胞不全によってもたらされるインスリン非感受性を特徴とする。これにより、肝臓、筋細胞、及び脂肪細胞へのグルコース輸送が減少する。高血糖に関連した脂肪の破壊が増加する。
【０１３６】
この機能不全の結果、空腹時に上昇するグルカゴン及び肝臓のグルコースの量が、食事によって抑制されない。インスリンの不適当な量及びインスリン抵抗性の上昇により、高血糖を生じる。
【０１３７】
２型糖尿病の対象は、糖尿病性ケトアシドーシス（ＤＫＡ）、高浸透圧性高血糖状態（ＨＨＳ）、網膜症、心疾患、腎症、及び神経障害を含む、様々な短期及び長期両方の合併症によりかかりやすい。このような合併症により、早期に死亡する場合がある。
【０１３８】
メタボリックシンドロームは、次の医学的状態、すなわち、腹部（中心性）肥満、高血圧、高空腹時血漿グルコース、高血清トリグリセリド、及び低い高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルの５つのうちの少なくとも３つが連続的に発症することである。メタボリックシンドロームは、心血管疾患及び糖尿病の発症リスクと関連がある。
【０１３９】
治療方法
一態様において、本発明は、例えば、糖尿病を治療又は予防する際に、療法で使用するために本発明のベータ細胞を提供する。
【０１４０】
治療又は予防は、本発明のベータ細胞を必要とする対象に本発明のベータ細胞を移植することを含むことができる。したがって、本発明は、本発明のベータ細胞を必要とする対象に本発明のベータ細胞を移植するステップを含む、糖尿病を治療又は予防する方法を提供する。
【０１４１】
治療又は予防されるべき糖尿病は、例えば、１型又は２型糖尿病であり得る。好ましくは、治療又は予防されるべき糖尿病は１型糖尿病である。
【０１４２】
本明細書における治療に関する全ての言及は、治癒的、緩和的、及び予防的治療を含むが、本発明の文脈において、予防に対する言及は、予防的治療とより一般的に関連がある、ことを理解すべきである。哺乳動物、特にヒトの治療が好ましい。ヒト及び動物の治療の両方が本発明の範囲内にある。
【０１４３】
移植
本発明のベータ細胞は、例えば、自己細胞移植手順の一部として、又は同種異系細胞移植手順の一部として対象に投与することができる。
【０１４４】
用語「自己細胞移植手順」とは、本発明のベータ細胞が投与される同じ対象から（本発明のベータ細胞が産生される）前駆細胞を得る手順を指す。
【０１４５】
自家移植手順は、免疫学的不適合と関連がある問題を回避し、遺伝的に適合したドナーの利用可能性にかかわらず対象にアクセス可能であるので、有益である。
【０１４６】
用語「同種異形細胞移植手順」は、本発明のベータ細胞が投与される異なる対象から（本発明のベータ細胞が産生される）前駆細胞を得る手順を指す。好ましくは、ドナーは、免疫学的不適合性のリスクを最小限に抑えるためにベータ細胞が投与される対象に遺伝子的に適合されることになる。
【０１４７】
本発明のベータ細胞の適切な用量は、治療的及び／又は予防的に有効であるような量である。投与されるべき用量は、治療されるべき対象及び病態に左右され、当業者は容易に決定することができる。
【０１４８】
医薬組成物
本発明の細胞は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤と共に対象に投与するために配合することができる。適切な担体及び希釈剤は、等張食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水を含み、潜在的にヒト血清アルブミンを含有する。
【実施例】
【０１４９】
実施例１
材料及び方法
凍結したＰＥ細胞を解凍し、ＵＬＡ  ６ＷＰ平底プレート中の１０Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅ  Ｉを含有するＩ培地中で１日間培養した。
【０１５０】
続いて、そのＰＥ細胞を、５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ、０．２５μＭのＳａｎｔ１、１００ｎＭのＲＡ、及び１０μＭのＹを含有するＳ３  ＢＡＳＥ培地（ＭＣＤＢ１３１、８ｍＭのＤ−グルコース、１．２３ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、２％ＦＦＡ  ＢＳＡ、１：２００ＩＴＸ−Ｘ、２ｍＭのグルタマックス、１００×ＰＳ、及び０．２５ｍＭのビタミンＣ）に移し、更に２日間培養した。
【０１５１】
次いで、得られた細胞を、トランスウェルプレートにおいて気液界面培養プロトコルを用いて４日間培養した。その培養を、１００ｎＭのＲＡ、１μＭのＸＸＩ、０．２５μＭのＳａｎｔ１、１０μＭのＡｌｋ５ｉ  ＩＩ、１μＭのＴ３、２０ｎｇ／ｍＬのベータ−セルリン、１０μＭのＹ、及び６μＭのイソオキサゾール９（ＩＳＸ−９）を含有するＳ５  ＢＡＳＥ培地（ＭＣＤＢ１３１、２０ｍＭのＤ−グルコース、１．７５４ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、２％ＦＦＡ  ＢＳＡ、１：２００ＩＴＸ−Ｘ、２ｍＭのグルタマックス、１００×ＰＳ、０．２５ｍＭのビタミンＣ、及び１０μｇ／ｍＬのヘパリン）で行った。
【０１５２】
続いて、その培地を、２５ｎＭのＲＡ、１μＭのＸＸＩ、１０μＭのＡｌｋ５ｉ  ＩＩ、１μＭのＴ３、２０ｎｇ／ｍＬのベータ−セルリン、及び１０μＭのＹを含有するＳ５  ＢＡＳＥ培地と交換し、細胞を更に３日間培養した。この培地にはＩＳＸ−９は存在していない。
【０１５３】
最後に、その培地を、１０μＭのＡｌｋ５ｉ  ＩＩ、１μＭのＴ３、及び１０μＭのＹを含有するＳ６  ＢＡＳＥ培地（ＣＭＲＬ１０６６、１０％ＦＢＳ、及び１００×ＰＳ）と交換し、細胞を更に１５日間培養した。培養の最終１４日間は、この培地に６μＭの濃度でＩＳＸ−９を添加した（すなわち、このステップにおける培養の第１日はＩＳＸ−９の非存在下で行った）。
【０１５４】
実施例２
用量応答試験を実施して、Ｉｓｘ９の毒性及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでのベータ細胞の分化に関して試験されるべきＩｓｘ９の最適濃度を決定した。高濃度のＩｓｘ９（２４μＭ〜６０μＭ）は、図１に示すように、培養８日後にＰＥ細胞の凝集体が嚢胞性になるので有毒であるように見える。対照的に、６及び１２μＭのＩｓｘ９を使用すると、ＰＥ細胞の凝集体の形態は、対照ＤＭＳＯ条件と比較して変化が無い。生理学的状態を維持するために、濃度６μＭのＩｓｘ９を全プロトコル用に使用した。成熟中ベータ細胞をＩｓｘ９に１３日間曝露すると、対照ＤＭＳＯ条件と比較して、細胞のグルコース刺激インスリン分泌が増加する（図２）。この効果は、６μＭのＩｓｘ９に対する曝露の持続時間と相関がある。これは、Ｉｓｘ９がｉＰＳＣ由来成熟中ベータ細胞の成熟を刺激することを実証している。Ｉｓｘ９の効果は、図３及び図４に示すように、ＰＥ細胞の段階での第１のステップでＩｓｘ９を添加すると強化される。Ｉｓｘ９は、Ｎｇｎ３などの内分泌マーカーのＲＮＡ発現レベルを増加させるが、ＮｅｕｒｏＤ１及びＮｋｘ２．２などのベータ細胞マーカーのＲＮＡ発現レベルも増加させる。これらの結果は、Ｉｓｘ９がｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたベータ細胞の機能を向上させるだけでなく、重要なベータ細胞特異的転写因子を誘導することによって、成熟状態を改善することを示している。
【０１５５】
更に、Ｉｓｘ９の存在下、懸濁液又はトランスウェル培養系でのＰＥ細胞の培養は、図５及び図６に示すように、改善されたグルコース依存性インスリン応答の同じ効果を示している。興味深いことに、Ｉｓｘ９は、ＰＣＳＫ１だけでなくＭＡＦＡ遺伝子発現レベルの増加も誘導している。両方のマーカーは、グルコースによって媒介されるインスリン分泌の応答を媒介するために重要である。ＭＡＦＡの発現は、図７に示すように、早くも分化のＤ９において免疫組織化学によって予想外に検出することもできる。しかしながら、成熟中ベータ細胞の細胞組成の分析では、Ｉｓｘ９がｉＰＳＣ由来ベータ細胞の成熟を促進するが細胞画分は増加させないことを示唆するＤＭＳＯを比較した場合、Ｉｓｘ９を添加したときに、インスリン陽性細胞の数又は量の増加は示されなかった。
【０１５６】
全ての結果は、Ｉｓｘ９が、ＭＡＦＡ発現を促進することによって３Ｄ培養系におけるｉＰＳＣ由来ＰＥ細胞のベータ細胞への成熟を改善することを立証している。
【０１５７】
上記明細書で言及した全ての出版物は、本明細書に参照により組み込まれる。本発明の記載された細胞、使用、及び方法の様々な改良及び変更は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明を特定の好適な実施形態と共に記載したが、請求される本発明は、こうした特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解すべきである。事実、記載された本発明を実施するためのモードの様々な修正は、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者に明らかであり、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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