(57)【要約】本開示は、Ｔ細胞性悪性腫瘍が発現する抗原を標的とする、同胞殺し抵抗性のキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞の使用を提供する。
2019524156.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）であって、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞が、前記キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損しており、前記キメラ抗原受容体が、悪性Ｔ細胞に発現する抗原に特異的に結合する、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項２】
前記抗原が、ＣＤ７、ＣＤ５、ＣＤ２、ＣＤ３０、及びＣＤ４からなる群から選択される、請求項１に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項３】
前記抗原が、ＣＤ７である、請求項１に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項４】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞が、自殺遺伝子をさらに含む、先行請求項のいずれかに記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項５】
ヒトＣＤ３４のｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合した、改変されたヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を前記自殺遺伝子がコードする、請求項４に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項６】
内在性のＴ細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の改変であって、その結果、内在性のＴ細胞受容体が介在するシグナル伝達が前記ＣＡＲ−Ｔ細胞において遮断される前記改変をさらに含む、請求項１に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項７】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＣＤ７の改変を含み、ＴＲＡＣの改変をさらに含む、請求項１に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞。
【請求項８】
悪性Ｔ細胞の死滅方法であって、前記方法が、前記悪性Ｔ細胞と、請求項１に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞と、の接触を含む、前記方法。
【請求項９】
前記Ｔ細胞性悪性腫瘍が、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞性悪性腫瘍が、非ホジキンリンパ腫である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞が、骨髄性悪性腫瘍及びリンパ性悪性腫瘍の治療に使用される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
Ｔ細胞性悪性腫瘍を有する哺乳類の治療方法であって、前記方法が、複数のキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞を前記哺乳類に投与することを含み、それぞれのＣＡＲ−Ｔ細胞が、同一のキメラ抗原受容体を含み、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞が、前記キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損しており、前記キメラ抗原受容体が、悪性Ｔ細胞に発現する抗原に特異的に結合する、前記方法。
【請求項１３】
悪性Ｔ細胞に発現する前記抗原が、ＣＤ７、ＣＤ５、ＣＤ２、ＣＤ３０、及びＣＤ４からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
悪性Ｔ細胞に発現する前記抗原が、ＣＤ７である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
内在性のＴ細胞受容体が介在するシグナル伝達が前記ＣＡＲ−Ｔ細胞において遮断される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞が、同種反応性または移植片対宿主病を誘導しない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞が、同胞殺しを誘導しない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｔ細胞性悪性腫瘍が、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｔ細胞性悪性腫瘍が、非ホジキンリンパ腫である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞が、骨髄性悪性腫瘍及びリンパ性悪性腫瘍の治療に使用される、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年８月３日出願の米国仮出願第６２／３７０，４８５号、２０１７年４月６日出願の米国仮出願第６２／４８２，５７０号、及び２０１７年５月１２日出願の米国仮出願第６２／５０５，６１４号の利益を主張すると共に、これらの文献に関し、これらの文献は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、一般に、Ｔ細胞療法に関する。具体的には、本開示は、操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞及びその使用方法に関する。開示の組成物及び方法は、骨髄性悪性腫瘍及びリンパ性悪性腫瘍の治療に特に有用である。
【０００３】
配列リストの参照
配列リストの紙コピー、及び当該配列リストのコンピュータ可読形態が後半に添付され、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。コンピュータ可読形態に記録された情報は、記載の配列リストと同一のものであり、米国特許法施行規則第１．８２１条第（ｆ）項に従うものである。
【背景技術】
【０００４】
Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変することができ、ＣＡＲは、抗原認識部分及びＴ細胞活性化ドメインから構成される融合タンパク質である。キメラ抗原受容体Ｔ細胞は、Ｂ細胞性悪性腫瘍に対して並外れた臨床的効力を示す。しかしながら、Ｔ細胞性悪性腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔ細胞療法の開発は問題含みであることが判明しており、この原因の一部は、悪性Ｔ細胞とエフェクターＴ細胞との間で共通の標的抗原が発現することによるものである。ＣＡＲ−Ｔ細胞で標的抗原が発現すると、ＣＡＲ−Ｔ細胞の同胞殺し（ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ）につながって効力が減少し、臨床的な有用性も低下し得る。したがって、同胞殺しを誘導することのない、Ｔ細胞性悪性腫瘍の治療に有効なＣＡＲ−Ｔ細胞が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
１つの態様では、本開示は、キメラ抗原受容体を含むＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を提供し、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損しており、キメラ抗原受容体は、悪性の腫瘍またはがんの表面に発現する抗原に特異的に結合する。さまざまな態様では、抗原は、悪性Ｔ細胞に発現し得る。例えば、抗原は、ＣＤ７、ＣＤ５、ＣＤ２、ＣＤ３０、またはＣＤ４であり得る。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、自殺遺伝子も含み得る。あるいは、またはさらに、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、内在性のＴ細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）に対する改変を含み得、その結果、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が介在するシグナル伝達がＣＡＲ−Ｔ細胞において遮断される。
【０００６】
別の態様では、本開示は、悪性腫瘍を有する哺乳類の治療方法を提供し、この方法は、複数のキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞を哺乳類に投与することを含み、それぞれのＣＡＲ−Ｔ細胞は、同一のキメラ抗原受容体を含み、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損しており、キメラ抗原受容体は、対象の悪性の腫瘍またはがんに発現する抗原に特異的に結合する。さまざまな態様では、抗原は、悪性Ｔ細胞に発現し得る。例えば、抗原は、ＣＤ７、ＣＤ５、ＣＤ２、ＣＤ３０、またはＣＤ４であり得る。複数のＣＡＲ−Ｔ細胞は、自殺遺伝子も含み得る。あるいは、またはさらに、複数のＣＡＲ−Ｔ細胞は、内在性のＴ細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）に対する改変を含み得、その結果、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が介在するシグナル伝達がＣＡＲ−Ｔ細胞において遮断される。
【０００７】
別の態様では、本開示は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を必要とする対象における移植片対宿主病の予防方法または低減方法を提供し、この方法は、複数のキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞を哺乳類に投与することを含み、それぞれのＣＡＲ−Ｔ細胞は、（ａ）同一のキメラ抗原受容体と、（ｂ）自殺遺伝子、及び／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が介在するシグナル伝達がＣＡＲ−Ｔ細胞において遮断されるようになる改変と、を含み、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損しており、キメラ抗原受容体は、対象の悪性の腫瘍またはがんに発現する抗原に特異的に結合する。さまざまな態様では、抗原は、悪性Ｔ細胞に発現し得る。例えば、抗原は、ＣＤ７、ＣＤ５、ＣＤ２、ＣＤ３０、またはＣＤ４であり得る。さらに別の態様では、対象は、同種ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を必要とし得る。
【０００８】
別の態様では、本開示は、同種ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を必要とする対象における同種反応性の予防方法または低減方法を提供し、この方法は、複数のキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞を哺乳類に投与することを含み、それぞれのＣＡＲ−Ｔ細胞は、（ａ）同一のキメラ抗原受容体と、（ｂ）自殺遺伝子、及び／または内在性のＴ細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の改変であって、その結果、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が介在するシグナル伝達がＣＡＲ−Ｔ細胞において遮断されるようになる改変と、を含み、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損しており、キメラ抗原受容体は、対象の悪性の腫瘍またはがんに発現する抗原に特異的に結合する。さまざまな態様では、抗原は、悪性Ｔ細胞に発現し得る。例えば、抗原は、ＣＤ７、ＣＤ５、ＣＤ２、ＣＤ３０、またはＣＤ４であり得る。
【０００９】
本開示の追加の態様及び反復説明が以下に示される。
【００１０】
出願ファイルは、カラーで作成された図面を少なくとも１つ含む。カラー図面（複数可）を含むこの特許出願刊行物のコピーは、依頼及び必要手数料の支払いに応じて特許庁によって提供されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞の模式図を示す。
【図２】ＣＤ７遺伝子座の遺伝子編集を行うと、野生型（ＷＴ）Ｔ細胞と比較してＴ細胞の＞９０％においてＣＤ７の発現が失われることを示す。
【図３】図３Ａは、ＣＤ７遺伝子を編集したＣＤ７ＣＡＲ−Ｔ（ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７）細胞が、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病細胞であるＣＤ７陽性ＭＯＬＴ３細胞をインビトロで効率的に死滅させることを示す。図３Ｂは、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病細胞であるＣＤ７陽性ＨＳＢ−２細胞をＣＤ７ΔＣＡＲＴ７がインビトロで効率的に死滅させることを示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、急性リンパ芽球性白血病細胞であるＣＤ７陽性Ｔ細胞をＣＤ７ΔＣＡＲＴ７がインビボで効率的に死滅させることを示す。図４Ａは、処理スケジュールを示す。図４Ｂは、対照と比較してＣＤ７−ＣＡＲマウスにおいて腫瘍が減少することを示す。図４Ｃは、対照と比較して、マウスから発せられる総フォトン数がＣＤ７ＣＡＲマウスにおいて減少することを示す。図４Ｄは、ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞で処理されたマウスと比較して、ＣＤ７ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与されたマウスが有意に長く生存したことを示す。
【図５】図５Ａ〜図５Ｊは、ＣＡＲＴ７が同胞殺しを誘導したことを示す。図５Ａは、抗ＣＤ７−ＣＡＲコンストラクト及び抗ＣＤ１９−ＣＡＲコンストラクトの模式図を示す。図５Ｂは、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ１５を添加したＸｃｙｔｅ培地において抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在下でＴ細胞を培養したもの示す。図５Ｃは、ＣＡＲＴ１９とは対照的に、ＣＡＲＴ７が同胞殺しを受け、形質導入後の数日の間、強固に増殖できないことを示す。図５Ｄは、ＣＡＲＴ７細胞の表現型がＣＤ４に偏っていることを示す。図５Ｅは、ＣＤ７を標的とするｇＲＮＡによる編集効率を、野生型細胞と比較してインデルを含むシークエンシングリードの割合として示す。図５Ｆは、フローサイトメトリーによって遺伝子編集効率を決定するための実験的な設計を示す。図５Ｇは、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０を使用して解析したフローサイトメトリーデータを示す。図５Ｈは、ＣＤ７ｇ４を用いた遺伝子編集の後にＣＤ７＋であった細胞の割合を示す。図５Ｉは、ＣＤ７ｇ４を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による遺伝子編集の後のＣＤ７遺伝子座の標的化ディープシークエンシングによって非相同末端結合が検出されたことを示す。図５Ｊは、ＣＤ７ｇ４を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による遺伝子編集の後の初代Ｔ細胞の生存率を示す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｇは、インビトロ及びインビボでＣＤ７ΔＣＡＲＴ７がＴ−ＡＬＬ細胞株を効率的に死滅させることを示す。図６Ａは、遺伝子編集されたＣＡＲ−Ｔの生成を示す模式図を示す。図６Ｂは、ＶｉａＳｔａｉｎ（商標）と共にＮｅｘｃｅｌｏｍ  Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒを使用して決定した細胞数を示す。図６Ｃは、レンチ−ＧＦＰ（ＧＦＰ＋Ｔ細胞）で形質導入した野生型Ｔ細胞が、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ１９と比較してＣＤ７ΔＣＡＲＴ７によって効率的に排除されたことを示す。図６Ｄは、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ１９比較してＣＤ７ΔＣＡＲＴ７がＣＤ７＋Ｔ−ＡＬＬ細胞株（ＭＯＬＴ−４細胞、ＭＯＬＴ−３細胞、及びＨＳＢ−２細胞）を効率的に死滅させることを示す。図６Ｅは、ＣＣＲＦ−ＣＥＭＣＢＲ−ＧＦＰを注射したＮＳＧマウスをＣＤ７ΔＣＡＲＴ７またはＣＤ７ΔＣＡＲＴ１９で処理する実験的な設計を示す。図６Ｆは、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ１９で処理したマウスと比較して、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７で処理したマウスでは、生存期間が有意に長期化したことを示す。図６Ｇは、ＢＬＩイメージングによって調べると、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ１９で処理したマウスと比較して、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７で処理したマウスでは、腫瘍量が有意に減少したことを示す。
【図７】図７Ａ〜図７Ｇは、ＣＤ７及びＴＲＡＣを欠損したＵＣＡＲＴ７細胞が、Ｔ−ＡＬＬ細胞株をインビトロで効率的に死滅させることを示す。図７Ａは、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ１５を添加したＸｃｙｔｅ培地において抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在下（ビーズと細胞との比３：１）で実施したＴ細胞の培養の模式図を示す。活性化後の＋２日目に、ビーズを除去し、Ｌｏｎｚａ  ｎｕｃｅｌｅｏｆｅｃｔｏｒ４Ｄ（商標）、１５μｇのｓｐＣａｓ９ｍＲＮＡ、２０μｇのＣＤ７ｇＲＮＡ、及び２０μｇのＴＲＡＣｇＲＮＡを使用して、４ｘ１０６個のＴ細胞の電気穿孔を実施した。製造者の説明に従い、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ抗ＣＤ３マイクロビーズを使用して＋７日目にＣＤ３＋ＣＡＲ−Ｔを枯渇させ、さらに２日間培養した。図７Ｂ〜図７Ｃは、マルチプレックスな遺伝子編集の結果、ＴＲＡＣとＣＤ７との二重欠失が高効率で生じることを、ＦＡＣＳ、ならびにＣＤ７遺伝子座（図７Ｄ）及びＴＲＡＣ遺伝子座（図７Ｅ）の標的化ディープシークエンシングによって決定したものを示す。図７Ｆは、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７及びＵＣＡＲＴ７が強固に増殖するが、それらから産生する細胞数が少ないことを示し、このことは、遺伝子編集が生じなかった残存Ｔ細胞と、遺伝子編集は生じたが、表面にＣＤ７を依然として発現する細胞と、の両方の同胞殺しに起因する可能性がある。図７Ｇは、標的に対するエフェクターの比が低い場合でさえ、ＣＤ７＋Ｔ−ＡＬＬ細胞株のインビトロでの死滅効率においてＵＣＡＲＴ７がＣＤ７ΔＣＡＲＴ７と同等であったことを示す。
【図８】図８Ａ〜図８Ｂは、ＵＣＡＲＴ７が患者の初代Ｔ−ＡＬＬ芽球をインビトロで死滅させることを示す。ＣＤ７＋Ｔ−ＡＬＬを有する３人の個別患者から得た初代芽球を、１５０ｎＭのカルボキシフルオセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。標識した細胞を、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７、ＵＣＡＲＴ７、またはそれらのそれぞれのＣＤ１９対照のいずれかと１：１の比で共インキュベート（３連で２４時間）した後、ＦＡＣＳ分析に供した。Ａｃｃｕｃｏｕｎｔ蛍光ビーズを使用して実際の細胞数を決定した。Ｇａｌｌｉｏｓサイトメーターを使用してデータを収集した。図８Ａは、代表的なＦＡＣＳプロットを示す。図８Ｂは、ＣＤ７ΔＣＡＲ１９及びＵＣＡＲＴ１９と比較して、ＣＤ７ΔＣＡＲ７及びＵＣＡＲＴ７がＴ−ＡＬＬ芽球を効率的に死滅させたことを示す。
【図９】図９Ａ〜図９Ｆは、ＵＣＡＲＴ７が、異種ＧｖＨＤを誘導することなく、患者の初代Ｔ−ＡＬＬ芽球をインビボで死滅させることを示す。図９Ａは、実験的な設計を示す。図９Ｂは、腫瘍とＴ細胞との両方が示されるように血液を解析した代表的なフローサイトメトリープロットを示す。図９Ｃは、マウス及びヒトの血液中のＣＤ４５細胞全体に占める腫瘍細胞の割合を示す。図９Ｄは、マウス及びヒトの脾臓中のＣＤ４５細胞全体に占める腫瘍細胞の割合を示す。図９Ｅは、Ｃｏｏｋｅに従って評価した臨床的なＧｖＨＤスコアを示す。図９Ｆは、野生型Ｔ細胞、ＴＲＡＣΔＴ細胞、ＵＣＡＲＴ７、及びＵＣＡＲＴ１９を注入した後のマウスの代表的な画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示との関連では、ＣＡＲ−Ｔ細胞が、別のＣＡＲ−Ｔ細胞の標的となり（この別のＣＡＲ−Ｔ細胞は、標的となるＣＡＲ−Ｔ細胞と同一のキメラ抗原受容体を含む）、この別のＣＡＲ−Ｔ細胞によって死滅させられるとき、同胞殺しが生じる。この理由は、標的となるＣＡＲ−Ｔ細胞が、両方のＴ細胞に存在するキメラ抗原受容体によって特異的に認識される抗原を発現するためである。当該技術分野において知られるこの問題を克服するために、本開示は、キメラ抗原受容体を含むＴ細胞を提供し、このＴ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損している。本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、このＴ細胞のキメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損しているため、このＴ細胞は、「同胞殺し抵抗性」と称される。本開示は、当該Ｔ細胞の操作方法及びその使用も包含する。
【００１３】
下記のセクションでは、本発明のさまざまな態様についてさらに詳細に記載される。
【００１４】
Ｉ．ＣＡＲ−Ｔ細胞
本開示の１つの態様は、キメラ抗原受容体を含むＴ細胞を包含し、このＴ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損しており、すなわち、同胞殺し抵抗性のＣＡＲ−Ｔ細胞である。
【００１５】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞である。本明細書で使用される「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という語句は、当該技術分野において一般に使用されており、細胞内ドメインに結合した抗原特異的細胞外ドメインを有する組換え融合タンパク質を指し、この細胞内ドメインは、上記細胞外ドメインに抗原が結合すると、特定の機能を実施するように細胞を誘導する。「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」、及び「キメラ免疫受容体」という用語はそれぞれ、「キメラ抗原受容体」という用語と互換的に本明細書で使用され得る。キメラ抗原受容体は、ＭＨＣ非依存性抗原への結合と、その細胞内ドメインを介する活性化シグナルの伝達と、の両方の能力をそれが有することによって、他の抗原結合物質とは区別される。ＣＡＲの細胞外部分及び細胞内部分については、以下により詳細に議論される。
【００１６】
キメラ抗原受容体の抗原特異的細胞外ドメインは、抗原（典型的には、悪性腫瘍の表面に発現する抗原）を認識して特異的に結合する。抗原特異的細胞外ドメインは、例えば、約０．１ｐＭ〜約１０μＭ、好ましくは約０．１ｐＭ〜約１μＭ、より好ましくは約０．１ｐＭ〜約１００ｎＭの親和性定数または相互作用の親和性（ＫＤ）で抗原に結合するとき、その抗原に特異的に結合する。相互作用の親和性の決定方法は、当該技術分野において知られている。本開示のＣＡＲにおける使用に適した抗原特異的細胞外ドメインは、任意の抗原結合ポリペプチドであり得、多種多様なものが当該技術分野において知られている。場合によっては、抗原結合ドメインは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。抗体に基づく他の認識ドメイン（ｃＡｂ  ＶＨＨ（ラクダ抗体の可変ドメイン）及びそのヒト化バージョン、ＩｇＮＡＲ  ＶＨ（サメ抗体の可変ドメイン）及びそのヒト化バージョン、ｓｄＡｂ  ＶＨ（単一ドメイン抗体の可変ドメイン）、ならびに「ラクダ化」抗体の可変ドメイン）が使用に適している。場合によっては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に基づく認識ドメイン（単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、Ｖ．アルファ及びＶ．ベータという２つのドメインを含む単鎖ＴＣＲ）など）も使用に適している。
【００１７】
適切な抗原には、Ｔ細胞に特異的な抗原及び／またはＴ細胞に特異的ではない抗原が含まれ得る。好ましい実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞のキメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原、及びＣＡＲ−Ｔ細胞が欠損する抗原は、悪性Ｔ細胞に発現する抗原であり、より好ましくは、非悪性Ｔ細胞と比較して悪性Ｔ細胞に過剰発現する抗原である。「悪性Ｔ細胞」は、Ｔ細胞性悪性腫瘍に由来するＴ細胞である。「Ｔ細胞性悪性腫瘍」という用語は、Ｔ細胞前駆体、成熟Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞に由来する悪性腫瘍の広く、高度に異種性の分類を指す。Ｔ細胞性悪性腫瘍の例には、限定はされないが、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）白血病、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型陽性（ＨＴＬＶ−１＋）成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、ならびにさまざまな末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）（限定はされないが、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、ＡＬＫ陽性未分化大細胞リンパ腫、及びＡＬＫ陰性未分化大細胞リンパ腫を含む）が含まれる。例えば、非限定的な例として、ＣＤ７、ＣＤ５、ＣＤ２、ＣＤ３０、及びＣＤ４が、悪性Ｔ細胞に発現する適切な抗原であり得る。１つの実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ７に特異的に結合するキメラ抗原受容体の細胞外ドメインを含む。別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ５に特異的に結合するキメラ抗原受容体の細胞外ドメインを含む。さらに別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ２に特異的に結合するキメラ抗原受容体の細胞外ドメインを含む。さらに別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ３０に特異的に結合するキメラ抗原受容体の細胞外ドメインを含む。追加のさらに別の実施形態では、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ４に特異的に結合するキメラ抗原受容体の細胞外ドメインを含む。
【００１８】
上記のように、１つの実施形態では、抗原は、ＣＤ７である。ＣＤ７は、Ｔ細胞表面膜結合型糖タンパク質である。ＣＤ７は、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）及び非ホジキンＴ細胞リンパ腫（ＮＨＬ）を含めて、Ｔ細胞性悪性腫瘍に過剰発現し得る。本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ７を過剰発現する悪性Ｔ細胞を標的とするために使用され得る。
【００１９】
本開示のキメラ抗原受容体は、抗原特異的細胞外ドメインに抗原が結合するとＴ細胞に細胞内シグナルを与える細胞内ドメインも含む。本開示のキメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、そのキメラ受容体を発現するＴ細胞のエフェクター機能の少なくとも１つを活性化することを担う。「エフェクター機能」という用語は、分化した細胞の特定の機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。ナイーブなメモリーＴ細胞またはメモリー型Ｔ細胞におけるエフェクター機能には、抗原依存性増殖も含まれ得る。したがって、「細胞内ドメイン」という用語は、細胞外ドメインに抗原が結合するとエフェクター機能シグナルを伝達し、特定の機能を実施するようにＴ細胞を誘導する、ＣＡＲの一部分を指す。適切な細胞内ドメインの例には、限定はされないが、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖またはその相同体のいずれか（例えば、イータ、デルタ、ガンマ、またはイプシロン）、ＭＢ１鎖、Ｂ２９、ＦｃＲＩＩＩ、ＦｃＲＩ、及びシグナル伝達分子（ＣＤ３．ゼータなど）の組み合わせ、ならびにＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、ＤＡＰ−１０、ＯＸ４０、及びそれらの組み合わせ、ならびに他の同様の分子及び断片が含まれる。Ｆｃ．ガンマ．ＲＩＩＩ及びＦｃ．イプシロン．ＲＩなどの、活性化タンパク質のファミリーの他のメンバーの細胞内シグナル伝達部分が使用され得る。通常は、細胞内ドメイン全体が用いられることになるが、多くの場合、細胞内ポリペプチド全体を使用することは必ずしも必要にはならない。細胞内シグナル伝達ドメインを切り詰めた部分が有用であり得る範囲においては、そのような切り詰めた部分が依然としてエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりにそのような切り詰めた部分が使用され得る。したがって、細胞内ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な、細胞内ドメインの任意の切り詰めた部分を含むことが意図される。
【００２０】
典型的には、抗原特異的細胞外ドメインは、膜貫通ドメインによってキメラ抗原受容体の細胞内ドメインに連結される。膜貫通ドメインは、細胞膜を横切ってＴ細胞表面にＣＡＲを固定すると共に、細胞外ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結し、それによって、Ｔ細胞表面でのＣＡＲの発現に影響を及ぼす。キメラ抗原受容体は、１つもしくは複数の共刺激ドメイン及び／または１つもしくは複数のスペーサーもさらに含み得る。共刺激ドメインは、サイトカイン産生、増殖、細胞傷害性、及び／または持続性をインビボで増進する共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する。スペーサーは、（ｉ）抗原特異的細胞外ドメインを膜貫通ドメインに連結し、（ｉｉ）膜貫通ドメインを共刺激ドメインに連結し、（ｉｉｉ）共刺激ドメインを細胞内ドメインに連結し、及び／または（ｉｖ）膜貫通ドメインを細胞内ドメインに連結する。例えば、抗原特異的細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサードメインを含めると、抗原結合ドメインの可動性及びそれによるＣＡＲの機能に影響し得る。適切な膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及びスペーサーは、当該技術分野において知られている。
【００２１】
本開示によって包含されるＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損しており、それ故に、同胞殺し抵抗性である。いくつかの実施形態では、このＴ細胞の抗原は改変され、その結果、キメラ抗原受容体は、もはやその改変抗原には特異的に結合しない。例えば、キメラ抗原受容体によって認識される抗原のエピトープが、１つもしくは複数のアミノ酸変更（例えば、置換もしくは欠失）によって改変され得るか、または抗原からエピトープが欠失され得る。他の実施形態では、Ｔ細胞における抗原の発現は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれを超える割合で低減される。タンパク質の発現の低減方法は、当該技術分野において知られており、こうした方法には、限定はされないが、タンパク質をコードする核酸配列に機能可能なように連結されたプロモーターの改変または交換が含まれる。さらに他の実施形態では、抗原を発現しないようにＴ細胞が改変され、この改変は、例えば、抗原をコードする遺伝子の欠失または破壊によって実施される。上記の実施形態のそれぞれでは、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原のうちの１つ、または好ましくはすべてを欠損し得る。抗原を欠損するようにＴ細胞を遺伝子改変する方法は、当該技術分野においてよく知られており、非限定的な例は、上記のものである。例示の実施形態では、抗原を欠損するようにＴ細胞を改変するためにＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９による遺伝子編集を使用することができ、このことは、例えば、実施例４〜８の方法に記載されている。
【００２２】
本開示によって包含されるＣＡＲ−Ｔ細胞は、内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によるシグナル伝達をさらに欠き得る。さまざまな実施形態では、本明細書に開示のＣＡＲ−Ｔ細胞における内在性のＴＣＲによるシグナル伝達を低減または除去することが望ましくあり得る。例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞における内在性のＴＣＲによるシグナル伝達を低減または除去すると、同種Ｔ細胞がＣＡＲ−Ｔ細胞の産生に使用されるとき、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）が予防または低減され得る。内在性のＴＣＲによるシグナル伝達の低減方法または除去方法は、当該技術分野において知られており、こうした方法には、限定はされないが、ＴＣＲ受容体の一部（例えば、ＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）など）の改変が含まれる。ＴＲＡＣを改変すると、ＴＣＲが介在するシグナル伝達が遮断され得る。したがって、致死的なＧｖＨＤを誘導することなく、ＣＡＲ−Ｔ細胞の供給源として同種Ｔ細胞を安全に使用することが、ＴＲＡＣの改変によって可能となり得る。
【００２３】
あるいは、またはさらに、本開示によって包含されるＣＡＲ−Ｔ細胞は、１つまたは複数の自殺遺伝子をさらに含み得る。本明細書で使用される「自殺遺伝子」は、当該技術分野において知られる標準的な方法によってＣＡＲ−Ｔ細胞に導入される核酸配列であって、活性化すると、そのＣＡＲ−Ｔ細胞を死に至らしめる核酸配列を指す。自殺遺伝子は、必要に応じて、ＣＡＲ−Ｔ細胞の効果的な追跡及び排除をインビボで促進し得る。自殺遺伝子の活性化による死滅の促進は、当該技術分野において知られる方法において生じ得る。当該技術分野において知られる適切な自殺遺伝子療法系には、限定はされないが、さまざまな単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）／ガンシクロビル（ＧＣＶ）自殺遺伝子療法系、または誘導可能なカスパーゼ９タンパク質が含まれる。例示の実施形態では、自殺遺伝子は、ＣＤ３４／チミジンキナーゼキメラ自殺遺伝子である。
【００２４】
例示の実施形態では、本開示は、ＣＤ７に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含むＴ細胞を提供し、このＴ細胞は、ＣＤ７を欠損している（例えば、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７細胞）。非限定的な例では、（ａ）Ｔ細胞が発現するＣＤ７の改変であって、その結果、キメラ抗原受容体がもはやその改変ＣＤ７に特異的に結合しなくなる改変、（ｂ）Ｔ細胞における抗原の発現が、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれを超える割合で低減される、Ｔ細胞の改変、または（ｃ）ＣＤ７が発現しなくなる、Ｔ細胞の改変（例えば、ＣＤ７をコードする遺伝子の欠失もしくは破壊によるもの）に起因してＣＤ７の欠損が生じる。別の実施形態では、Ｔ細胞は、自殺遺伝子、及び／または内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が介在するシグナル伝達がＴ細胞において遮断されるようになる改変を含む。非限定的な例では、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７細胞において発現する自殺遺伝子は、ヒトＣＤ３４のｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合した、改変されたヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードし、ＴＣＲの遮断が生じる改変は、内在性のＴ細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）に対する改変である。
【００２５】
別の例示の実施形態では、本開示は、ＣＤ５に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含むＴ細胞を提供し、このＴ細胞は、ＣＤ５を欠損している（例えば、ＣＤ５ΔＣＡＲＴ５細胞）。非限定的な例では、（ａ）Ｔ細胞が発現するＣＤ５の改変であって、その結果、キメラ抗原受容体がもはやその改変ＣＤ５に特異的に結合しなくなる改変、（ｂ）Ｔ細胞における抗原の発現が、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれを超える割合で低減される、Ｔ細胞の改変、または（ｃ）ＣＤ５が発現しなくなる、Ｔ細胞の改変（例えば、ＣＤ５をコードする遺伝子の欠失もしくは破壊によるもの）に起因してＣＤ５の欠損が生じる。別の実施形態では、Ｔ細胞は、自殺遺伝子、及び／または内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が介在するシグナル伝達がＴ細胞において遮断されるようになる改変を含む。非限定的な例では、ＣＤ５ΔＣＡＲＴ５細胞において発現する自殺遺伝子は、ヒトＣＤ３４のｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合した、改変されたヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードし、ＴＣＲの遮断が生じる改変は、内在性のＴ細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）に対する改変である。
【００２６】
別の例示の実施形態では、本開示は、ＣＤ２に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含むＴ細胞を提供し、このＴ細胞は、ＣＤ２を欠損している（例えば、ＣＤ２ΔＣＡＲＴ２細胞）。非限定的な例では、（ａ）Ｔ細胞が発現するＣＤ２の改変であって、その結果、キメラ抗原受容体がもはやその改変ＣＤ２に特異的に結合しなくなる改変、（ｂ）Ｔ細胞における抗原の発現が、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれを超える割合で低減される、Ｔ細胞の改変、または（ｃ）ＣＤ２が発現しなくなる、Ｔ細胞の改変（例えば、ＣＤ２をコードする遺伝子の欠失もしくは破壊によるもの）に起因してＣＤ２の欠損が生じる。別の実施形態では、Ｔ細胞は、自殺遺伝子、及び／または内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が介在するシグナル伝達がＴ細胞において遮断されるようになる改変を含む。非限定的な例では、ＣＤ２ΔＣＡＲＴ２細胞において発現する自殺遺伝子は、ヒトＣＤ３４のｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合した、改変されたヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードし、ＴＣＲの遮断が生じる改変は、内在性のＴ細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）に対する改変である。
【００２７】
別の例示の実施形態では、本開示は、ＣＤ３０に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含むＴ細胞を提供し、このＴ細胞は、ＣＤ３０を欠損している（例えば、ＣＤ３０ΔＣＡＲＴ３０細胞）。非限定的な例では、（ａ）Ｔ細胞が発現するＣＤ３０の改変であって、その結果、キメラ抗原受容体がもはやその改変ＣＤ３０に特異的に結合しなくなる改変、（ｂ）Ｔ細胞における抗原の発現が、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれを超える割合で低減される、Ｔ細胞の改変、または（ｃ）ＣＤ３０が発現しなくなる、Ｔ細胞の改変（例えば、ＣＤ３０をコードする遺伝子の欠失もしくは破壊によるもの）に起因してＣＤ３０の欠損が生じる。別の実施形態では、Ｔ細胞は、自殺遺伝子、及び／または内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が介在するシグナル伝達がＴ細胞において遮断されるようになる改変を含む。非限定的な例では、ＣＤ３０ΔＣＡＲＴ３０細胞において発現する自殺遺伝子は、ヒトＣＤ３４のｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合した、改変されたヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードし、ＴＣＲの遮断が生じる改変は、内在性のＴ細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）に対する改変である。
【００２８】
別の例示の実施形態では、本開示は、ＣＤ４に特異的に結合するキメラ抗原受容体を含むＴ細胞を提供し、このＴ細胞は、ＣＤ４を欠損している（例えば、ＣＤ４ΔＣＡＲＴ４細胞）。非限定的な例では、（ａ）Ｔ細胞が発現するＣＤ４の改変であって、その結果、キメラ抗原受容体がもはやその改変ＣＤ４に特異的に結合しなくなる改変、（ｂ）Ｔ細胞における抗原の発現が、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくはそれを超える割合で低減される、Ｔ細胞の改変、または（ｃ）ＣＤ４が発現しなくなる、Ｔ細胞の改変（例えば、ＣＤ４をコードする遺伝子の欠失もしくは破壊によるもの）に起因してＣＤ４の欠損が生じる。別の実施形態では、Ｔ細胞は、自殺遺伝子、及び／または内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が介在するシグナル伝達がＴ細胞において遮断されるようになる改変を含む。非限定的な例では、ＣＤ４ΔＣＡＲＴ４細胞において発現する自殺遺伝子は、ヒトＣＤ３４のｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合した、改変されたヒト単純ヘルペスウイルス１型−チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードし、ＴＣＲの遮断が生じる改変は、内在性のＴ細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）に対する改変である。
【００２９】
Ｔ細胞におけるＣＡＲの設計方法、送達方法、及び発現方法、ならびに臨床グレードのＣＡＲ−Ｔ細胞集団の製造方法については、当該技術分野において知られている。例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０１２，１８（１０）：２７８０−９０を参照のこと。当該文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、操作されたＣＡＲは、レトロウイルスを使用してＴ細胞に導入され得、こうしたレトロウイルスによって、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列が標的細胞ゲノムへと効率的かつ安定的に組み込まれる。ウイルスベクターの産生方法の例は、実施例４〜８の方法に記載されている。当該技術分野において知られる他の方法には、限定はされないが、レンチウイルスによる形質導入、トランスポゾンに基づく系、直接的なＲＮＡ導入、ならびにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、ＣａｓｌＯｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６などの、適切なＣａｓタンパク質を使用するＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型の系）が含まれる。
【００３０】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、当該技術分野において知られる任意の適切なＴ細胞供給源から生成され得、こうしたＴ細胞供給源には、限定はされないが、対象から採取されたＴ細胞が含まれる。対象は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を必要とするＴ細胞性悪性腫瘍を有する患者であるか、またはＣＡＲ−Ｔ細胞療法を必要とするＴ細胞性悪性腫瘍を有する対象と同一の種の対象であり得る。採取されたＴ細胞は、当該技術分野において一般に知られる方法を使用してエクスビボで増殖処理がなされた後、ＣＡＲが形質導入されることで、ＣＡＲ−Ｔ細胞を生成し得る。
【００３１】
ＣＡＲ−Ｔ細胞を生成するために自己Ｔ細胞を使用することは、可能ではあるものの、特有の課題が生じ得るものである。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を必要とする対象は、悪性腫瘍の治療を受けている可能性があり、この治療は、宿主のＴ細胞の数及び機能に影響を及ぼし、それによって、ＣＡＲ−Ｔ細胞へと効率的に操作変換し得るＴ細胞の数を減らし得るものである。また、Ｔ細胞性血液悪性腫瘍と正常なＴエフェクターとは、同一の表面抗原の多くを同時発現し得るものであり、このことによって、ゲノム編集及びレンチウイルスによる形質導入を行うために悪性Ｔ細胞から正常なＴエフェクターを分離精製することが非常に困難なことになっている。さらに、精製プロセスが絶対的なものでなければ、悪性Ｔ細胞における標的抗原（ＣＤ７など）を欠失させてしまうリスクが生じ得、同胞殺しを行うＣＡＲ−Ｔ細胞に対して潜在的に抵抗性の混入Ｔ細胞性癌の集団が生成するという結果をまねく。したがって、正常なエフェクターＴ細胞に悪性Ｔ細胞が混入するリスクを避けるために、患者由来のＴ細胞を使用してＴ細胞性悪性腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔ細胞を生成することは望ましくない場合がある。
【００３２】
混入リスクを克服するために、Ｔ細胞性悪性腫瘍を有さない別の対象（ドナー対象）に由来するＴ細胞を使用して同種療法のためのＣＡＲ−Ｔ細胞が生成され得る。同種療法のためのＴ細胞は、単一の対象または複数の対象から採取され得る。血液細胞の採取方法、Ｔ細胞の単離方法及び濃縮方法、ならびにエクスビボでのその増殖方法は、当該技術分野において知られる方法によるものであり得る。
【００３３】
例示の実施形態では、ＣＤ２８及び４−１ＢＢの内部シグナル伝達ドメインを有する第３世代のＣＡＲの骨格へと、商業的に合成された抗ＣＤ７単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をクローニングすることによって、ＣＤ７に特異的なＣＡＲＴ細胞のためのＣＡＲが生成され得る。Ｐ２Ａペプチドの後にｈＣＤ３４の細胞外ドメインを付加することで、ウイルスによる形質導入の後のＣＡＲの検出と、抗ｈＣＤ３４磁性ビーズを使用する精製と、の両方が可能になり得る。ＣＤ７に特異的なＣＡＲの生成方法の例は、実施例４〜８の方法に記載されている。他の悪性Ｔ細胞抗原に特異的なＣＡＲを調製するために同様の方法に従うことができる。
【００３４】
別の態様では、ＣＡＲ−Ｔ細胞対照が創出され得る。対照ＣＡＲ−Ｔ細胞は、悪性Ｔ細胞に発現しない抗原に結合する細胞外ドメインを含み得る。対照ＣＡＲ−Ｔ細胞対照が結合する抗原は、ＣＤ１９であり得る。ＣＤ１９は、Ｂ細胞に発現するが、Ｔ細胞には発現しない抗原であるため、ＣＤ１９に結合するように構成された細胞外ドメインを有するＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｔ細胞に結合しないことになる。こうしたＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲＴ１９細胞と呼ばれ得るものであり、ＣＡＲＴ７細胞の結合効率及び非特異的な結合を分析するための対照として使用され得る。
【００３５】
ＩＩ．ＣＡＲ−Ｔ細胞の使用方法
別の態様では、本開示は、悪性Ｔ細胞の死滅方法を提供し、この方法は、悪性Ｔ細胞と、キメラ抗原受容体を含む有効量のＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）と、の接触を含み、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原を欠損しており、キメラ抗原受容体は、悪性細胞に発現する抗原に特異的に結合する。さまざまな実施形態では、悪性細胞は、悪性Ｔ細胞である。別の実施形態では、抗原は、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３０、またはそれらの任意の組み合わせである。適切なＣＡＲ−Ｔ細胞は、セクションＩに詳細に記載されている。例示の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７細胞、ＣＤ５ΔＣＡＲＴ５細胞、ＣＤ３０ΔＣＡＲＴ３０細胞、ＣＤ４ΔＣＡＲＴ４細胞、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００３６】
悪性細胞と有効量のＣＡＲ−Ｔ細胞との接触では、一般に、ＣＡＲ−Ｔ細胞のキメラ抗原受容体が、悪性細胞の表面に存在するその同種抗原に結合するようになるために十分な時間、ＣＡＲ−Ｔ細胞と悪性細胞とを混合することが必要である。このことは、インビトロまたはエクスビボで生じ得る。本明細書で使用される「有効量」という用語は、測定可能な作用が生じる量を意味し、こうした作用は、例えば、抗原依存性の細胞増殖、サイトカイン分泌、細胞傷害性の死滅などである。有効量は、当該技術分野において知られる方法、及び／または実施例においてさらに詳細に記載される方法を使用して決定され得る。
【００３７】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞性悪性腫瘍を有する対象の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞性悪性腫瘍は、血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞性悪性腫瘍は、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）またはＴ細胞性非ホジキンリンパ腫（Ｔ−ＮＨＬ）である。方法は、複数のキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞を治療的に有効な量で対象に投与することを含み、それぞれのＣＡＲ−Ｔ細胞は、同一のキメラ抗原受容体を含み、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体によって特異的に認識される抗原を欠損しており、キメラ抗原受容体は、悪性Ｔ細胞に発現する抗原に特異的に結合する。さまざまな実施形態では、抗原は、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３０、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。適切な対象には、任意の哺乳類、好ましくは、ヒトが含まれる。適切なＣＡＲ−Ｔ細胞は、セクションＩに詳細に記載されている。例示の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７細胞、ＣＤ５ΔＣＡＲＴ５細胞、ＣＤ３０ΔＣＡＲＴ３０細胞、ＣＤ４ΔＣＡＲＴ４細胞、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。方法は、同種ＣＡＲ−Ｔ細胞療法または自己ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を含み得るが、セクションＩにおいて議論した理由から、同種ＣＡＲ−Ｔ細胞療法が好ましくあり得る。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、他の療法を伴うものであり得、こうした他の療法には、限定はされないが、免疫療法、化学療法、または放射線療法が含まれる。
【００３８】
別の態様では、本開示は、非Ｔ細胞性の骨髄性悪性腫瘍またはリンパ性悪性腫瘍を有する対象の治療方法を提供する。この方法は、複数のキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞を治療的に有効な量で対象に投与することを含み、それぞれのＣＡＲ−Ｔ細胞は、同一のキメラ抗原受容体を含み、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体によって特異的に認識される抗原を欠損しており、キメラ抗原受容体は、非Ｔ細胞性の骨髄性悪性腫瘍またはリンパ性悪性腫瘍に発現する抗原に特異的に結合する。適切な対象には、任意の哺乳類、好ましくは、ヒトが含まれる。適切なＣＡＲ−Ｔ細胞は、セクションＩに詳細に記載されている。例示の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７細胞である。方法は、同種ＣＡＲ−Ｔ細胞療法または自己ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を含み得るが、セクションＩにおいて議論した理由から、同種ＣＡＲ−Ｔ細胞療法が好ましくあり得る。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、他の療法を伴うものであり得、こうした他の療法には、限定はされないが、免疫療法、化学療法、または放射線療法が含まれる。
【００３９】
別の態様では、本開示は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を必要とする対象における移植片対宿主病の予防方法または低減方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を必要とする対象は、Ｔ細胞性悪性腫瘍、非Ｔ細胞性の骨髄性悪性腫瘍またはリンパ性悪性腫瘍を有する対象である。方法は、複数のキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞を治療的に有効な量で対象に投与することを含み、それぞれのＣＡＲ−Ｔ細胞は、（ａ）同一のキメラ抗原受容体と、（ｂ）自殺遺伝子、及び／または内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が介在するシグナル伝達がＣＡＲ−Ｔ細胞において遮断されるようになる改変と、を含み、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体によって特異的に認識される抗原を欠損しており、キメラ抗原受容体は、悪性腫瘍に発現する抗原に特異的に結合する。さまざまな実施形態では、悪性細胞は、悪性Ｔ細胞である。別の実施形態では、抗原は、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３０、またはそれらの任意の組み合わせである。適切な対象には、任意の哺乳類、好ましくは、ヒトが含まれる。方法は、同種ＣＡＲ−Ｔ細胞療法または自己ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を含み得るが、セクションＩにおいて議論した理由から、同種ＣＡＲ−Ｔ細胞療法が好ましくあり得る。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、他の療法を伴うものであり得、こうした他の療法には、限定はされないが、免疫療法、化学療法、または放射線療法が含まれる。
【００４０】
別の態様では、本開示は、同種ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を必要とする対象における同種反応性の予防方法または低減方法を提供する。いくつかの実施形態では、同種ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を必要とする対象は、Ｔ細胞性悪性腫瘍、非Ｔ細胞性の骨髄性悪性腫瘍またはリンパ性悪性腫瘍を有する対象である。方法は、複数のキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞を治療的に有効な量で対象に投与することを含み、それぞれのＣＡＲ−Ｔ細胞は、（ａ）同一のキメラ抗原受容体と、（ｂ）自殺遺伝子、及び／または内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が介在するシグナル伝達がＣＡＲ−Ｔ細胞において遮断されるようになる改変と、を含み、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体によって特異的に認識される抗原を欠損しており、キメラ抗原受容体は、悪性腫瘍に発現する抗原に特異的に結合する。さまざまな実施形態では、悪性細胞は、悪性Ｔ細胞である。別の実施形態では、抗原は、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ３０、またはそれらの任意の組み合わせである。適切な対象には、任意の哺乳類、好ましくは、ヒトが含まれる。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、他の療法を伴うものであり得、こうした他の療法には、限定はされないが、免疫療法、化学療法、または放射線療法が含まれる。
【００４１】
上記の態様のさまざまな実施形態では、複数のＣＡＲ−Ｔ細胞は、複数のＣＤ７ΔＣＡＲＴ７細胞、複数のＣＤ５ΔＣＡＲＴ５細胞、複数のＣＤ３０ΔＣＡＲＴ３０細胞、複数のＣＤ４ΔＣＡＲＴ４細胞、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、自殺遺伝子、及び／または内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が介在するシグナル伝達がＣＡＲ−Ｔ細胞において遮断されるようになる改変を含み得る。
【００４２】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、静脈内経路によって対象に投与され得、例えば、静脈内注入によって投与される。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、単一の用量または複数の用量で投与され得る。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、静脈内投与に適した医薬組成物において注射され得る。静脈内投与に適した医薬組成物は、当該技術分野において知られている。本開示の医薬組成物は、追加の成分をさらに含み得る。例えば、そのような成分は、注射されるＣＡＲ−Ｔ細胞の生存率及び／または活性を維持するために使用され得る。１つの実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞組成物は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を維持するためにＩＬ−２を含み得る。
【００４３】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、有効用量で投与され得る。有効用量は、１つまたは複数の用量であり得、所望の治療作用を得るために十分なものである。ＣＡＲ−Ｔ細胞の典型的な用量は、治療を受ける対象の体重Ｋｇ当たり約１ｘ１０５〜５ｘ１０７個の範囲の細胞数であり得る。有効用量は、悪性腫瘍のステージ、対象の健康、及び悪性腫瘍の型に基づいて計算され得る。複数の用量が投与される状況では、その用量及び用量間隔は、治療に対する対象の応答に基づいて決定され得る。
【００４４】
本明細書で使用される「有効用量」または「治療的に有効な量」は、治療効果または予防効果が得られる量を意味する。
【００４５】
本明細書で使用される「治療作用」という用語は、悪性細胞の数の減少、余命の増加、または悪性病状と関連するさまざまな生理学的症状の寛解などによって明らかになり得る生物学的作用を指す。
【実施例】
【００４６】
下記の実施例は、本開示のさまざまな実施形態を示すために含まれる。以下に続く実施例に開示される手法は、本発明の実施に際してうまくいくものであることが本発明者らによって発見された手法を示すものであり、それ故に、その実施に好ましい様式を構成するものであると考え得ることを当業者なら理解されよう。しかしながら、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、開示される特定の実施形態に多くの変更を施し、それによって同様または類似の結果を依然として得ることができることを、本開示の観点から当業者なら理解されよう。
【００４７】
実施例の序論
Ｔ細胞性悪性腫瘍は、小児と成人との両方において再発率及び死亡率が高く、現在のところ有効な治療または標的治療が存在しない破壊的な血液癌のクラスとなっている。集中的な多剤併用化学療法レジメンが採られるにもかかわらず、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）の５年を超える生存率は、成人で５０％未満であり、小児で７５％である。最初の治療後に再発する者については、救援化学療法レジメンによって寛解が誘導される割合は、症例の２０〜４０％である。同種幹細胞移植が唯一の根治療法であるが、それにはリスク及び毒性が伴う。
【００４８】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されたＴ細胞は、有望ながん免疫療法である。そのような標的治療は、Ｂ細胞性の白血病及びリンパ腫を有する患者において、寛解を誘導すると共に、長期の無再発生存期間でさえも誘導する大きな潜在力を有することが示されている。したがって、Ｔ細胞性悪性腫瘍に対する標的治療は、重大なアンメットメディカルニーズとなっている。しかしながら、Ｔ細胞性悪性腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の臨床的な開発を制限している課題がいくつか存在する。第１に、Ｔエフェクター細胞とＴ細胞性悪性腫瘍との間で共通の標的抗原が発現する結果、ＣＡＲ−Ｔ細胞の同胞殺しまたは自己死滅が生じる。第２に、適切な数の自己Ｔ細胞を悪性細胞の混入なしに収集することは、ひいき目に見ても、技術的に困難であり、法外に費用がかかる。第３に、同種ドナーに由来する遺伝子改変ＣＡＲ−Ｔ細胞を使用すると、免疫障害を有するＨＬＡ適合レシピエントまたはＨＬＡ不適合レシピエントへの注入時に、致死的な移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）が生じるという結果をまねき得る。
【００４９】
多くのＴ細胞性悪性腫瘍がＣＤ７を過剰発現しており、Ｔ細胞性癌の免疫療法のための魅力的な標的となっている。しかしながら、ＣＡＲ−Ｔの操作に使用されるものを含めて、正常なＴ細胞もまた、ＣＤ７を発現する（＞８６％）。したがって、ＣＤ７を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｔ細胞の同胞殺しを誘導し、これによって治療潜在力が制限される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＣＤ７及びＴ細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）を欠失させると共に、こうした同一のＴ細胞に対してＣＤ７標的型ＣＡＲの形質導入も併せて行うことで、エフェクターＴ細胞による顕著な同胞殺しを伴うことなく、悪性Ｔ細胞の効率的な標的化及び死滅が生じるであろうという仮説を立てた。ＴＲＡＣを欠失させると、ＴＣＲが介在するシグナル伝達が遮断されることで、致死的なＧｖＨＤを誘導することなく、ＣＡＲ−Ｔの供給源として同種Ｔ細胞を安全に使用することが可能になり、ＣＡＲＴ７療法に抵抗性のＣＤ７欠失悪性細胞が混入するリスクがなくなる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による高効率な遺伝子編集を使用することで、ＣＤ７及びＴＲＡＣを欠失しており、ＣＤ７を標的とするＣＡＲ−Ｔ（ＵＣＡＲＴ７）を生成した。こうしたＵＣＡＲＴ７細胞は、異種ＧｖＨＤをもたらすことなく、ヒトＴ−ＡＬＬ細胞株及び患者由来の初代Ｔ−ＡＬＬをインビトロ及びインビボで効率的に死滅させる。したがって、ＣＡＲ−Ｔ療法を使用してＴ細胞性悪性腫瘍を効率的に治療するための「即時使用が可能な（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）」方針のための前臨床データが提示され、これは初めてのことである。
【００５０】
実施例１：ＣＡＲ−Ｔ細胞の遺伝子編集
Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変することができ、ＣＡＲは、抗原認識部分及びＴ細胞活性化ドメインから構成される融合タンパク質である。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｂ細胞性悪性腫瘍に対して並外れた臨床的効力を示す。しかしながら、Ｔ細胞性悪性腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔ療法の開発は問題含みであることが判明しており、この原因の一部は、Ｔ細胞性悪性腫瘍とエフェクターＴ細胞との間で共通の標的抗原が発現することによるものである。ＣＡＲ−Ｔ細胞で標的抗原が発現すると、ＣＡＲ−Ｔ細胞の同胞殺しにつながって効力が減少し、臨床的な有用性も低下し得る。ＣＡＲ−Ｔの遺伝子編集を介すことで、ＣＡＲ−Ｔ（及びＴ細胞性悪性腫瘍）に通常発現するＴ細胞特異的標的抗原が効率的に欠失し、その結果、遺伝子編集されたＣＡＲ−Ｔ細胞を使用すると、顕著な「同胞殺し」を伴わずにＣＡＲ−Ｔが効率的に増殖し、腫瘍標的が効率的に死滅し得ることが実証された。ＣＤ７の両方の対立遺伝子が欠失したＴ細胞産物であって、ＣＤ７が欠失するように遺伝子編集されたＴ細胞においてＣＤ７−ＣＡＲを過剰発現するＴ細胞産物（図１）の開発について記載される。この手法は拡大適用され、その結果、さまざまなＴ細胞性癌及び正常なＴ細胞に発現する他のＴ細胞抗原（ＣＤ５、ＣＤ４、及びＣＤ２など）が包含され得る。さらに、ＣＡＲ発現用のレンチウイルスコンストラクト及びレトロウイルスコンストラクトへの自殺遺伝子の組み込みが、挿入突然変異と白血病誘発との両方からの保護に使用されるだけでなく、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の長期の血球減少に対しても使用されることになる。
【００５１】
実施例２：ＣＤ７遺伝子座の遺伝子編集は、ＣＤ７の発現消失をもたらした
接着分子であるＣＤ７は、Ｔ−ＡＬＬ（Ｔ急性リンパ芽球性白血病；９８％）及び他のＴ細胞性悪性腫瘍に高度に発現しており、Ｔ細胞性癌の免疫療法のための魅力的な標的であることが判明している。しかしながら、ＣＤ７は、活性化Ｔ細胞に高度に発現する（＞８６％）。ＣＡＲ−Ｔ細胞でのＣＤ７の発現を除去するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用した。ｈＣＤ７を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｃｏｒｅによって設計及び活性の検証を実施した。最も高い活性を有するｇＲＮＡを商業的に合成し、改変された塩基（２’Ｏｍｅ及びホスホロチエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉａｔｅ））を組み込むことによってｇＲＮＡの安定性を向上させた。ＣＤ７ＣＡＲを生成するために、商業的な遺伝子合成を使用して抗ＣＤ７単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を創出し、ＣＤ２８及び４−１ＢＢの内部シグナル伝達ドメインを有する第３世代のＣＡＲの骨格（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＣ．Ｊｕｎｅ博士によって供与された）にクローニングした。ヒトＣＤ３４の細胞質側を切り詰めた変異体（またはＣＤ３４−ＴＫ７５キメラ自殺遺伝子；Ｅｉｓｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５）を、Ｐ２Ａペプチドを介する形で発現するようにコンストラクトを改変することで、ウイルスによる形質導入の後にＣＡＲを検出できるようにした。ヒト初代Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して４８時間活性化した後、ビーズを除去し、ＣＤ７ｇＲＮＡ（２０μｇ）及びＣａｓ９ｍＲＮＡ（１５μｇ）を用いて電気穿孔を実施した。その後、Ｔ細胞を２４時間休ませた。３日目に、ＣＤ７−ＣＡＲ、ＣＤ７−ＣＡＲ−Ｐ２Ａ−ＣＤ３４、ＣＤ７−ＣＡＲ−Ｐ２Ａ−ＣＤ３４−ＴＫ７５、または対照ＣＤ１９−ＣＡＲのいずれかをコードするレンチウイルス粒子でＴ細胞の形質導入を実施し、さらに６日間増殖させた。フローサイトメトリーによって形質導入効率及びＣＤ７の除去を確認した。ＣＤ７遺伝子座を遺伝子編集した結果、対照Ｔ細胞と比較して、Ｔ細胞の＞９０％においてＣＤ７の発現が消失した（図２）。
【００５２】
実施例３：ＣＤ７ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ７陽性Ｔ−ＡＬＬ細胞をインビトロで効率的に死滅させる
遺伝子編集された（ＣＤ７が欠失した）ＣＤ７ＣＡＲ−Ｔ細胞がＣＤ７＋Ｔ−ＡＬＬ細胞株をインビトロで標的とする能力を試験した。４時間のクロム遊離アッセイによって決定すると、ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞とは対照的に、ＣＤ７＋細胞株であるＭＯＬＴ−３及びＨＳＢ−２をＣＤ７ＣＡＲ−Ｔ細胞が効率的に死滅させた（図３）。ＣＤ７を欠失したＣＤ７ＣＡＲ−ＴがＴ−ＡＬＬをインビボで根絶する能力を試験した。ＮＳＧマウスに亜致死性の照射（２００ｃＧｙ）を実施した後、ＣＢＲ（クリックビートルレッド）ルシフェラーゼを発現するように改変された５ｘ１０５個のＭＯＬＴ−３Ｔ−ＡＬＬ細胞を注入した。３日目に単一用量のＣＡＲ−Ｔ（３ｘ１０６個）を静脈内注射した。生物発光イメージングによって評価すると、ＣＤ７ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与したマウスでは、ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与したマウスと比較して腫瘍量が有意に減少した。さらに、ＣＤ７ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与したマウスは、ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞で処理したマウスと比較して有意に長く生存した（ｐ＝０．００１８、図４）。こうしたデータは、ゲノム編集と組み合わせたＴ細胞養子療法が、Ｔ−ＡＬＬを標的とするための有望な治療であることを支持するものである。
【００５３】
実施例４〜８の方法
ＣＡＲの設計
抗ＣＤ７単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の商業的な遺伝子合成を使用することによってＣＤ７−ＣＡＲを生成し、ＣＤ２８及び４−１ＢＢの内部シグナル伝達ドメインを有する第３世代のＣＡＲの骨格にクローニングした。Ｅｆ１α  ｐＥＬＮＳレンチウイルスプラスミドは、Ｃａｒｌ  Ｊｕｎｅ博士の好意で供与されたものである（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）。Ｐ２Ａペプチドを介する形でｈＣＤ３４の細胞外ドメインを発現するようにコンストラクトを改変することで、ウイルスによる形質導入の後のＣＡＲの検出と、必要に応じて、抗ｈＣＤ３４磁性ビーズを使用するＣＡＲ−Ｔの精製と、の両方を実施できるようにした。ＣＡＲＴ１９は、非標的指向性対照として使用した。
【００５４】
ウイルスベクターの産生
レンチウイルスを得るために、製造者の説明に従ってＣａｌＰｈｏｓ（商標）哺乳類遺伝子導入キット（Ｔａｋａｒａ）を使用し、ＣＡＲレンチウイルスベクター、及びパッケージングプラスミドであるｐＭＤ．Ｌｇ／ｐＲＲＥ、ｐＭＤ．Ｇ、ｐＲＳＶ．Ｒｅｖ１，２でＬｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞株（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）の遺伝子導入を実施した。遺伝子導入から３６時間後にウイルスを収集し、フィルターにかけて細胞片を除去し、２５０００ｒｐｍ、４℃で超遠心分離（Ｏｐｔｉｍａ  ＬＥ−８０Ｋ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ  Ｉ．Ｎ）を９０分間実施することによって濃縮した。リン酸緩衝生理食塩水にウイルスを再懸濁し、液体窒素において急速凍結させ、単回使用分量として−８０℃で保存した。
【００５５】
ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９による遺伝子編集
ガイドＲＮＡは、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＆  ｉＰＳＣによって設計及び活性の検証を実施した（配列番号７〜１６）。ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ４Ｄ（Ｌｏｎｚａ  ＮＪ）（プログラムＦＦ−１２０）を使用し、ｇＲＮＡをコードするプラスミド（４００ｎｇ、Ａｄｄｇｅｎｅ４３８６０）及びｓｐＣａｓ９をコードするプラスミド（５００ｎｇ、Ａｄｄｇｅｎｅ４３９４５）を２０μｌのＰ３溶液に含め、電気穿孔によって白血病細胞株Ｋ５６２に導入した。
【００５６】
ＲＮＡガイドは、当該ｇＲＮＡの５’末端及び３’末端の３つの末端塩基の位置に２’−Ｏ−メチル及び３’ホスホロチオエートを有する塩基が組み込まれるように商業的に合成（Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）することで、ヌクレアーゼ活性から保護した。配列番号１７〜１９は、全ガイド配列である。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）ｍＲＮＡ（５ｍｅＣ、Ψ）は、Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。
【００５７】
遺伝子編集ＣＡＲ−Ｔ
５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５を添加したＸｃｙｔｅ培地において抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在下（ビーズと細胞との比３：１）でＴ細胞を培養した。活性化後の＋２日目にビーズを除去し、ａｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ４Ｄ（プログラムＥＯ−１１５）を使用し、１５μｇのｓｐＣａｓ９（Ｔｒｉｌｉｎｋ，ＣＡ）及び２０μｇのそれぞれのｇＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を含む１００μｌのＰ３緩衝液において４ｘ１０６個のＴ細胞の電気穿孔を実施した。＋３日目に、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ．Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）（最終濃度６μｇ／ｍｌ）の存在下でＣＡＲ７またはＣＡＲ１９（対照）のレンチウイルス粒子で細胞の形質導入を実施した。細胞をさらに６日間増殖させた後、下流の実験において使用した。
【００５８】
標的化ディープシークエンシング
ＣＤ７遺伝子座は、プライマー（フォワードプライマーＧＣＣＴＧＣＧＴＧＧＧＡＴＣＴＡＣＣＴＧＡＧＧＣＡ［配列番号１］、及びリバースプライマーＡＧＣＴＡＴＣＴＡＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣ［配列番号２］）を用いて増幅した。ＴＲＡＣ遺伝子座は、フォワードプライマーＴＧＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＧＧＡＡＡＴＧＡ［配列番号３］、及びリバースプライマーＲ＿  ＧＴＣＡＧＡＴＴＴＧＴＴＧＣＴＣＣＡＧＧＣ［配列番号４］を用いて増幅した。ＰＣＲ産物は、Ｉｌｌｕｍｉａ  ＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してシークエンシングした。編集効率は、野生型細胞から得られたリードにアライメントしたときにインデルを含むシークエンシングリードの割合として決定した。
【００５９】
細胞株
ＣＤ７陽性Ｔ−ＡＬＬ細胞株であるＭＯＬＴ−３（ＡＣＣ８４）、ＭＯＬＴ−４（ＡＣＣ３６２）、ＨＳＢ−２（ＡＣＣ４３５）、及びＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＣＣ２４０）は、ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｌｅｉｂｎｉｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から直接的に入手した。細胞株は、ＤＳＭＺによってマイコプラズマ汚染が試験され、特徴付けられたものである。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞は、ＥＦ１αＣＢＲ−ＧＦＰレンチウイルスで形質導入した。ＧＦＰ陽性細胞を選別し、クローニングすることでＣＣＲＦ−ＣＥＭＣＢＲ−ＧＦＰ細胞株を確立した。
【００６０】
クロム遊離アッセイ
５％のウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩにおいて、２５：１〜０．２５：１の範囲のエフェクター：標的［Ｅ：Ｔ］比でＭＯＬＴ−３細胞株、ＭＯＬＴ４細胞株、ＨＳＢ２細胞株、またはＣＣＲＦ細胞株（総細胞数４ｘ１０４個／ウェル）と共にＣＡＲ−Ｔをインキュベートした。クロム−５１遊離アッセイは、以前に説明したように実施した。
【００６１】
インビトロでの初代Ｔ−ＡＬＬの死滅アッセイ．
同意を得た患者由来の初代Ｔ−ＡＬＬは、Ｓｉｔｅｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＩＲＢ番号２０１１０８２５１）から入手した。すべての対象からインフォームドコンセントを得た。１５０ｎＭのカルボキシフルオセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）で初代細胞を標識することで、Ｔ−ＡＬＬ芽球とＣＡＲ−Ｔとを区別できるようにした。ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７、ＵＣＡＲＴ７、またはそれらのそれぞれのＣＤ１９対照のいずれかと共に１：１の比で標識細胞を２４時間、共インキュベートした後、ＦＡＣＳ分析に供した。７−アミノアクチノマイシンＤ及びＳＰＨＥＲＯ  ＡｃｃｕＣｏｕｎｔフルオロスフェア（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用し、フローサイトメトリーによって生存標的細胞の絶対細胞数を定量化した。データは、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０を使用して解析した。
【００６２】
同胞殺しアッセイ
５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ１５を添加したＸｃｙｔｅ培地において抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在下（ビーズと細胞との比３：１）で野生型Ｔ細胞を培養した。４８時間後にビーズを除去し、レンチウイルス粒子でＴ細胞の形質導入を実施することでＧＦＰを発現させた。形質導入から７２時間後に、フローサイトメトリーを使用してＧＦＰを対象としてＴ細胞を選別し、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７、ならびに２０ｎｇ／ｍｌのＦＬ３ＴＬを添加したＸｃｙｔｅ培地においてＣＤ７ΔＣＡＲＴ７またはＣＤ７ΔＣＡＲＴ１９と共に１：１の比で２４時間、共インキュベートした。総生存細胞に占める割合としてＧＦＰ＋細胞のパーセントを計算し、総生存細胞は、７−アミノアクチノマイシンＤを使用し、フローサイトメトリーによって定量化した。
【００６３】
Ｔ細胞表現型の解析
培養したＴ細胞をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡにおいて洗浄し、４％のラット血清を添加した５０ｕＬのＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において細胞数が１ｘ１０６個となるように４Ｃで１５分間再懸濁した。その後、下記の抗体フルオロフォア複合体（別段の記載があるもの以外はすべて、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した）を使用し、１００μＬのＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒにおいて細胞を４℃で３０分間インキュベートした：ＣＤ７  ＢＶ４２１、ＣＤ４  ＢＶ５１０、ＣＣＲ４  ＢＶ６０５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８  ＢＶ６５０、ＣＤ１９６  ＢＶ７８６（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３  ＡＦ４８８、ＣＤ４５ＲＡ  ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、ＣＤ１８３  ＰＥ、ＣＤ１９７  ＰＥ−ＣＦ５９４、ＣＤ１８５  ＰＥ−Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及びＣＣＲ１０  ＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。フルロフォア（ｆｌｕｒｏｐｈｏｒｅ）複合化抗体の全詳細は、表１に示される。その後、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡにおいて細胞を２回洗浄し、ＺＥ５（Ｙｅｔｉ）サイトメーター（ＢｉｏＲａｄ／Ｐｒｏｐｅｌ  Ｌａｂｓ）でデータを取得した。コンペンセーション及び解析は、１つの抗体フルオロフォア複合体を除外したもの（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）（ＦＭＯ）を対照として使用し、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で実施した。統計解析は、２元配置ＡＮＯＶＡをボンフェローニの事後補正と併せて使用し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７で実施した。
表１．フローサイトメトリーに使用した複合化抗体の詳細．
2019524156.tif 000003
【００６４】
動物モデル
動物のプロトコールについては、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの規制を遵守した。マウスの実験ではすべて、６〜１０週齢のＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）を使用した。すべての実験において雄性マウスと雌性マウスとの両方を使用し、処理群に無作為に割り付けた。
【００６５】
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ異種移植モデル
Ｔ−ＡＬＬ細胞株であるＣＣＲＦ−ＣＥＭを、ＧＦＰ及びクリックビートルレッドルシフェラーゼ（ＣＢＲ）を過剰発現するように改変して使用し、ＣＤ７ΔＣＡＲ７の抗白血病作用をインビボで試験した。ＮＳＧマウスの尾静脈に１ｘ１０５個のＣＣＲＦ−ＣＥＭＣＢＲ−ＧＦＰを０日目に注射した。雄性マウスと雌性マウスとの両方を使用した。ＣＣＲＦ−ＣＥＭＣＢＲ−ＧＦＰ細胞を投与したマウスにＣＡＲ−Ｔ（２ｘ１０６個）を１日目に注射した。ＣＣＲＦ−ＣＥＭＣＢＲ−ＧＦＰ腫瘍のインビボでの増殖を追跡するために、５０μｇ／ｇのＤ−ルシフェリン（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ，Ｉｔａｓｃａ，ＩＬ，ＵＳＡ）をマウスに腹腔内注射し、画像化を行った。統計的考察：ログランク（マンテル・コックス）検定を使用して生存における有意差を決定した。ＢＬＩイメージングによって定義される腫瘍量の統計解析は、反復測定データに対して２元配置ＡＮＯＶＡを使用した後、ステップダウン方式のボンフェローニ多重比較補正を使用して決定した。
【００６６】
患者由来の異種移植モデル
Ｔ−ＡＬＬ  ＰＤＸ  ＤＦＣＩ１２は、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ（ＰＲｏＸｅ）．ｗｗｗ．ＰＲｏＸｅ．ｏｒｇから入手した。１ｘ１０６個のＰＤＸ  ＤＦＣＩ１２細胞を０日目にＮＳＧに移植した後、２ｘ１０６個のＵＣＡＲＴ７、ＵＣＡＲＴ１９、ＴＲＡＣΔ、または野生型Ｔを＋１日目に注入した。１週間後に、フローサイトメトリーによって末梢血及び脾臓を分析した。赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して赤血球を溶解し、氷冷ＰＢＳで洗浄した。染色緩衝液（０．５％のウシ血清アルブミン及び２ｍＭのＥＤＴＡを添加したＰＢＳ）に細胞を再懸濁し、下記の蛍光色素標識モノクローナル抗体の力価測定済飽和希釈液と共に４℃で３０分間インキュベートすることによってフローサイトメトリー向けに試料を調製した；ＣＤ３４−ＰＥ、ＣＤ７−ＢＶ４２１、ＣＤ４−ＡＰＣ、ＣＤ８−ＰＥＣｙ７、ｍＣＤ４５−ＢＶ５１０、及びｈＣＤ４５−ＡＰＣ−Ｈ７。抗体の全詳細は、表１において知ることができる。抗体は、別段の記載がない限り、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。データは、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０を使用して解析した。
【００６７】
オフターゲット解析
ｄｓＯＤＮのゲノム挿入
２つの改変オリゴヌクレオチド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＩＡ）をアニーリングさせることによって、平滑末端を有する二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである二本鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を調製した。
【００６８】
Ｒｅｖ＿５Ｐｈｏｓ／Ａ＊Ｔ＊ＡＣＣＧＴＴＡＴＴＡＡＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＣＴＣＡＡＴＴＡＡ＊Ａ＊Ｃ（配列番号５）、及びＦｏｒ＿／５Ｐｈｏｓ／Ｇ＊Ｔ＊ＴＴＡＡＴＴＧＡＧＴＴＧＴＣＡＴＡＴＧＴＴＡＡＴＡＡＣＧＧＴ＊Ａ＊Ｔ＊（配列番号６）は、ホスホロチオエート結合を示し、５ｐｈｏｓは、５’リン酸化を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による初代Ｔ細胞の遺伝子編集は、１００ｐｍｏｌのｄｓＯＤＮを添加した以外は、以前に説明したように実施した。細胞は、さらに７日間培養した後に収集し、ＤＮＡの抽出（ＤＮＡｅａｓｙ  Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に供した。
【００６９】
ｄｓＯＤＮ捕捉
ベイト設計及びプロトコールをある程度改変することなく、小さな目立たないゲノム遺伝子座をハイブリッド捕捉することが困難なことは明らかであり得る。挿入されるｄｓＯＤＮ配列に相補的な改変ｘＧＥＮ  Ｌｏｃｋｄｏｗｎプローブを利用し、３４ｂｐのＤＮＡであるｄｓＯＤＮを含む断片を濃縮した。ｘＧｅｎ  Ｌｏｃｋｄｏｗｎプローブは、競合ハイブリダイゼーション様式で関与することでハイブリッドプルダウン効率が最大化するように設計した。新規の設計は、２塩基のオフセット設計でタグ領域を調べる複数のプローブからなるものである。さらに、改変ｘＧｅｎ  Ｌｏｃｋｄｏｗｎプローブは、標的配列への結合が増進し、１２０ｎｔのＤＮＡである標準的なｘＧｅｎ  Ｌｏｃｋｄｏｗｎプローブのものに近い融解温度となるように設計した。３４ｂｐのタグを含むｇＤＮＡのサブセットの濃縮結果が良好なものになるようにストレプトアビジン／ビオチン介在性のプルダウン機構を改変した。
【００７０】
２５０ｂｐの挿入断片を標的とし、ＳｃｉＣｌｏｎｅ  ＮＧＳ機器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）でＫＡＰＡ  ＨＴＰライブラリーキット（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用し、２５０ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて自動化デュアルインデックスライブラリーを構築した。デュアルインデックスＫＡＰＡライブラリープライマー配列は、配列番号２０〜配列番号５４である。８サイクルのＰＣＲに向けてライブラリーを濃縮した。捕捉前に１６のライブラリーをプールし、５μｇのライブラリープールを生成した。３４ｂｐのＯＤＮ配列を標的とするｘＧｅｎ  Ｌｏｃｋｄｏｗｎプローブのカスタムセット（ＩＤＴ）とライブラリープールをハイブリダイズさせた。捕捉されたライブラリープールの濃度を、ｑＰＣＲ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を介して正確に決定し、その結果、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ４０００プラットフォームに適したクラスター数が得られた。２ｘ１５０の配列データから、試料当たり平均３．５Ｇｂのデータが得られた。
【００７１】
ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ
標的化捕捉実験のために構築した現存する１６のデュアルインデックスＫＡＰＡライブラリーをＧｕｉｄｅ−Ｓｅｑ増幅に利用した。試料当たり２０ｎｇの現存ライブラリー、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  Ｒｅａｄｙｍｉｘ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及び１０μＭのプライマーを用いてＰＣＲ反応を組み立てた。ＰＣＲ条件は、下記のとおりである：
ライブラリー生成のためのＰＣＲサイクリングパラメータ
５０μＬの反応のための混合物
２５μＬ  ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ
１．０μＬ  １０μＭのＰ５
１．５μＬ  １０μＭのＧＳｉＰ
ｘμＬ  ２０ｎｇの現存デュアルインデックスライブラリー
ｙμＬ  ヌクレアーゼ非含有水
サイクル条件
９５℃５分
［９５℃３０秒、７０℃（−１℃／サイクル）２分、７２℃３０秒］を１５サイクル
［９５℃３０秒、５５℃１分、７２℃３０秒］を１０サイクル
７２℃５分
４℃保持
【００７２】
ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑインデックスプライマー（ＧＳｉＰ）は、Ｐ７移植配列及び８ｂｐの試料インデックスが組み込まれつつ、センスＧｕｉｄｅ−ｓｅｑ  ＯＤＮ配列及びアンチセンスＧｕｉｄｅ−ｓｅｑ  ＯＤＮ配列が標的となるように設計した。
【００７３】
ｑＰＣＲ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を介して３２の増幅産物ライブラリー（１６のセンス及び１６のアンチセンス）を正確に定量化することで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ４０００プラットフォームに適したクラスター数が得られた。増幅産物ライブラリーを正規化し、共にプールした。増幅産物ライブラリープールと標的化捕捉プールとを等モル濃度で混合してから、１つのレーンの２ｘ１５０のＨｉＳｅｑ４０００配列データ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を得た。
【００７４】
データ解析
ＢＷＡ  ＭＥＭ  ｖ０．７．１０を使用し、配列を参照ゲノム（ビルドＧＲＣｈ３７−ｌｉｔｅ）にアライメントした。ｇｕｉｄｅ−ｓｅｑパッケージの改変バージョンを使用することで、裏付けとなる少なくとも１０個のリードを伴って標的配列が存在する１０−ｂｐのスライディングウィンドウを同定した。オフターゲットアライメントを特徴付けるために、切断点の両サイドに隣接する３５ｂｐの参照配列を読み出し、観測配列とのアライメントをとった。保持されるべきフォワード方向とリバース方向との両方に裏付けとなるリードを少なくとも１個有することを部位の条件とした。対照試料の１つにおいても同定された部位はいずれも除外した。コード利用情報：改変ｇｕｉｄｅ−ｓｅｑコードは、ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｃｈｒｉｓａｍｉｌｌｅｒ／ｇｕｉｄｅｓｅｑで利用可能である。
【００７５】
実施例４：ＣＤ７−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、同胞殺しを大幅に誘導する．
ＣＤ７−ＣＡＲ−Ｔ（ＣＡＲＴ７）を生成するために、抗ＣＤ７単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を商業的に合成し、ＣＤ２８及び４−１ＢＢの内部シグナル伝達ドメインを有する第３世代のＣＡＲの骨格にクローニングした。Ｐ２Ａペプチドの後にｈＣＤ３４の細胞外ドメインを付加することで、ウイルスによる形質導入の後のＣＡＲの検出と、抗ｈＣＤ３４磁性ビーズを使用する精製と、の両方を可能にした（図５Ａ）。ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ−Ｔ（ＣＡＲＴ１９）を、無関係のＣＡＲ−Ｔ対照として使用した。Ｔ細胞の形質導入の後、ＣＡＲＴ１９と比較してＣＡＲＴ７の存在数が有意に少なかった（図５Ｃ）。さらに、ＣＡＲＴ１９と比較すると、ＣＡＲＴ７にはＣＤ４の表現型への偏りが存在した（図５Ｄ）。
【００７６】
実施例５：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＣＤ７の欠失
同胞殺しを阻止するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による遺伝子編集を使用してＣＡＲ−ＴにおけるＣＤ７を欠失させた。ＣＤ７を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計し、その活性を検証した（配列番号７〜１６）。ｇＲＮＡをコードするプラスミド及びＣａｓ９をコードするプラスミドを、電気穿孔によってＫ５６２白血病細胞株に導入した。ＣＤ７遺伝子座を横断する標的化ディープシークエンシングによって決定すると、ＣＤ７ｇ４及びＣＤ７ｇ１０の遺伝子編集効率が最も高く（図５Ｅ）、追加検討には、ＣＤ７ｇ４及びＣＤ７ｇ１０を選択した。ＣＤ７ｇ４ガイド及びＣＤ７ｇ１０ガイドは、当該ｇＲＮＡの５’及び３’の３つの末端塩基の位置に２’−Ｏ−メチル及び３’ホスホロチオエートを有する塩基が組み込まれるように商業的に合成することで、ヌクレアーゼ活性から保護した１５。ＣＤ７ｇ４とＣＤ７ｇ１０との両方による遺伝子編集の効力をヒト初代Ｔ細胞において試験した。ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ｍＲＮＡを用いて活性化Ｔ細胞の電気穿孔を実施し（図５Ｆ）、その後、＋７日目にフローサイトメトリーによって解析した。ＣＤ７の発現除去においてＣＤ７ｇ４が最も有効であり、ＣＤ７＋Ｔ細胞の割合を９８．８％±０．１７から９．１％±１．７４に低減した（図５Ｇ〜Ｈ）。ＣＤ７遺伝子座が効率的に破壊されたことは、標的化ディープシークエンシングにおいてＣＤ７の配列リードの８９．１４％にインデルが観測されたことによって確認した（図５Ｉ）。電気穿孔の２４時間後に生存率の減少が確認されたが、この減少は、最小限のものにすぎなかった（図５Ｊ）。Ｔ細胞におけるＣＤ７の発現除去においてＣＤ７ｇ４が最も有効であったため、以後の実験はすべて、ＣＤ７ｇ４を使用して実施した。
【００７７】
実施例６：ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７は、同胞殺しを阻止し、インビトロ及びインビボでＴ−ＡＬＬを効率的に死滅させる．
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＣＤ７の遺伝子編集の後、ＣＤ７を編集したＴ細胞（ＣＤ７Δ）の形質導入をＣＡＲＴ７コンストラクトで実施することで、図５Ａに示されるように、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７を生成した。ＣＡＲ７またはＣＡＲ１９対照のいずれかでウイルスによる形質導入を実施（３日目）する１日前にｓｐＣａｓ９ｍＲＮＡ（１５μｇ）及びＣＤ７ｇ４（２０μｇ）を用いて活性化Ｔ細胞の電気穿孔を実施した。細胞をさらに６日間培養した（図６Ａ）。遺伝子編集後にＣＤ７の表面発現が残存したことに起因して低レベルの同胞殺しが生じたと予測され、このことは、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７の生成量がＣＤ７ΔＣＡＲＴ１９と比較してやや低下したことによって確認された（７．５倍と１２．６倍との対比（６日経過時の増殖倍率）（図６Ｂ））。ＧＦＰの形質導入を行った自己Ｔ細胞は、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７によって効率的に死滅したが、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ１９によっては死滅せず、このことによって、ＣＡＲ−ＴでＣＤ７を標的とするときにはＣＤ７を欠失させる必要があることが確認された（図６Ｃ）。最終的に、４時間のＣｒ遊離アッセイによって決定すると、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ１９とは対照的に、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７は、ＣＤ７＋Ｔ−ＡＬＬ細胞株であるＭＯＬＴ−４（７０％ＣＤ７＋）、ＭＯＬＴ−３（９６％ＣＤ７＋）、及びＨＳＢ−２（９９％ＣＤ７＋）を効率的に死滅させた（図６Ｄ）。Ｔ−ＡＬＬの異種モデルにおけるＣＤ７ΔＣＡＲＴ７の活性を評価するために、クリックビートルレッドルシフェラーゼ（ＣＢＲ）で標識した１ｘ１０５個のＣＣＲＦ−ＣＥＭＴ−ＡＬＬ（ＣＤ７＋が９９％（ＦＡＣＳによる値））細胞をＮＳＧレシピエントに静脈内注射した後、２ｘ１０ｘ６個のＣＤ７ΔＣＡＲＴ７細胞または非標的指向性ＣＤ７ΔＣＡＲＴ１９対照細胞を＋１日目に注入した（図６Ｅ）。ＣＤ７ΔＣＡＲＴ１９を投与したマウス、または腫瘍のみを注射したマウスとは対照的に、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７を投与したマウスでは、生存期間が有意に長期化し（図６Ｆ）、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって決定すると、腫瘍量が減少した（図６Ｇ）。患者の初代Ｔ−ＡＬＬ細胞に対するＣＤ７ΔＣＡＲＴ７の効力を評価するために、患者由来の異種移植片に対してＣＡＲ−Ｔを試験した。しかしながら、腫瘍のみを投与したマウスにおいてのみＴ−ＡＬＬ芽球が検出可能であり、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７またはＣＤ７ΔＣＡＲＴ１９または非操作Ｔ細胞のいずれを投与したマウスにおいてもＴ−ＡＬＬ芽球は排除され、このことは、ＮＳＧマウスにおいて非形質導入ヒトＴ細胞とＣＤ７ΔＣＡＲＴ１９との両方と同様のレベルの同種反応性をＣＤ７ΔＣＡＲＴ７がインビボで維持したことを示唆している。
【００７８】
実施例７：ＣＡＲＴ７においてＴＲＡＣとＣＤ７とを二重欠失させると、同胞殺し及びＧｖＨＤが阻止され、強固なＣＤ７誘導型Ｔ−ＡＬＬ死滅が維持される．
致死的なＧｖＨＤのリスクに起因し、同種反応性障壁によって非自己Ｔ細胞の使用が制限されることを克服するために、ＣＤ７とＴ細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）との両方が遺伝子的に欠失したＣＡＲ−Ｔを生成した。ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡ配列は、Ｏｓｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌから得た。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用してＴ細胞を２日間活性化した後、ビーズを除去し、２０μｇのＣＤ７ｇ４、２０μｇのＴＲＡＣｇ、及び１５μｇのＣａｓ９ｍＲＮＡを用いて電気穿孔を実施した（図７Ａ）。ＦＡＣＳ分析によって決定すると、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９によるマルチプレックスな遺伝子編集の結果、細胞の７２．８％±１．９２においてＣＤ７とＴＲＡＣとが同時に欠失した（図７Ｂ〜Ｅ）。
【００７９】
当該分野の最近の命名法に従い、ＣＤ７ΔＴＲＡＣΔＣＡＲＴ７を普遍的なＣＡＲＴ７またはＵＣＡＲＴ７と命名した１７。ＵＣＡＲＴ７は、Ｔ−ＡＬＬ細胞株をインビトロで死滅させることにおいて、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７と同等に有効であった。ＵＣＡＲＴ７は、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７と比較すると、増殖が不完全であることはなかったが、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７で観測されたように、ＵＣＡＲＴ７では、ＣＤ１９対照ＣＡＲＴと比較してＣＡＲ−Ｔの増殖及び生成量がやや低下する結果となった（図７Ｆ）。ＴＲＡＣの遺伝子編集が不完全であると、潜在的に同種反応性のＣＤ３＋ＣＡＲ−Ｔが残存するため、潜在的に同種反応性のこうしたＣＤ３＋ＣＡＲ−Ｔを、抗ＣＤ３磁性ビーズを使用する負の選択によって＋８日目に枯渇させた。ＵＣＡＲＴ７とＣＤ７ΔＣＡＲＴ７との両方が、ＣＤ７＋Ｔ−ＡＬＬ細胞株であるＭＯＬＴ３、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＨＳＢ−２をインビトロで死滅させ、この死滅は、ＣＤ７とＴＲＡＣとの二重欠失での効力減少を伴わずに、同等に高い効率で生じた（図７Ｇ）。興味深いことに、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ１９と比較すると、ＵＣＡＲＴ１９による非特異的な死滅は、エフェクターと標的と（Ｅ：Ｔ）の比が高いと減弱しており、このことは、ＴＲＡＣの欠失後に同種反応性が減少することを示唆している。
【００８０】
次に、ＵＣＡＲＴ７が初代Ｔ−ＡＬＬ芽球をインビトロで死滅させる能力を試験した。初代Ｔ−ＡＬＬとＣＡＲ−Ｔとは、抗原の発現が類似していることから、初代Ｔ−ＡＬＬ細胞をＣＦＳＥで標識することでＴ−ＡＬＬをＣＡＲ−Ｔと明確に区別した。Ｔ−ＡＬＬ細胞を１：１の比でＣＡＲ−Ｔと共に２４時間インキュベートした。それぞれのＣＤ１９対照ＣＡＲ−Ｔと比較して、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７とＵＣＡＲＴ７との両方が、３つすべての初代試料を通じて平均で９５％のＴ−ＡＬＬ芽球を死滅させており（図８Ａ）、これによって、ヒト初代Ｔ−ＡＬＬに対する並外れた効力がインビトロで実証された。
【００８１】
初代Ｔ−ＡＬＬ  ＰＤＸを有するＮＳＧマウスに対して、野生型Ｔ細胞、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ、及びＣＤ７ΔＣＡＲＴ１９のいずれかを注入したときの抗腫瘍活性という観点から、同種反応性の移植片対白血病効果（ＧｖＬ）または異種ＧｖＨＤを伴うことなく、ＵＣＡＲＴ７が初代Ｔ−ＡＬＬをインビボで死滅させる能力を試験した（図９Ａ）。野生型Ｔ細胞のレシピエントと比較すると、ＴＲＡＣが欠失するように編集したＴ細胞（ＴＲＡＣΔ）のレシピエントの腫瘍量は、血液（図９Ｂ〜Ｃ）と脾臓（図９Ｄ）との両方において多いことが示された（＋４８日目、脾臓（ｐ＜０．０００１）、血液（ｐ＝０．０００１））。さらに、野生型Ｔ細胞のレシピエントでは、同種反応性Ｔ細胞の相当な増殖（図９Ｂ）及び重度のＧｖＨＤ（平均臨床ＧｖＨＤスコア＝５．６６、ｐ＜０．０００１（図９Ｅ））が観測された。対照的に、ＴＲＡＣΔＴ細胞を投与したマウスでは、ＧｖＨＤは全く存在せず、Ｔ細胞は検出不可能であった（ｐ＜０．０００１、図９Ｅ、Ｆ）。ＰＤＸのみの対照で観測された腫瘍量が多かった（図９Ｃ）ことと類似して、ＵＣＡＲＴ１９を投与したマウスでは、こうしたマウスの総ＣＤ４５＋細胞の＞５６％をＴ−ＡＬＬが構成しており、このことと比較して、ＵＣＡＲＴ７を投与したマウスの末梢血にはＴ−ＡＬＬ芽球は存在しなかった（ｐ＜０．０００１）。脾臓において整合性を有する結果が観測されており（図９Ｄ、ＵＣＡＲＴ７  ＜３％  Ｔ−ＡＬＬとＵＣＡＲＴ１９＝８５．８７％  Ｔ−ＡＬＬとの対比（ｐ＜０．０００１））、ＴＲＡＣΔＴ細胞、ＵＣＡＲ１９、及びＰＤＸのみのレシピエントマウスでは脾腫が見られた。全く対照的に、ＵＣＡＲＴ７のレシピエントの脾臓のサイズは正常であった。さらに、ＵＣＡＲＴ１９とは異なり、ｈＣＤ３４エピトープによって検出すると、注射の６週間後にＵＣＡＲＴ７を検出することが可能であり（図９Ｂ）、このことによって、ＵＣＡＲＴ７がインビボでの持続性を有することが実証された。
【００８２】
実施例８：オフターゲットヌクレアーゼ活性
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって高効率な遺伝子編集を行うと、こうしたＴ細胞の生物学に対して潜在的に有害な作用を及ぼし、ひいては、ＵＣＡＲＴ７が注入されるレシピエントに対して潜在的に有害な作用を及ぼし得る、望ましくないオフターゲット遺伝子変化が誘導され得る。ヒト初代Ｔ細胞におけるオフターゲット遺伝子変化を評価するために２つの異なる手法を使用し、これらの手法は両方共、短い二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）がＤＮＡ二本鎖切断位置に挿入されることを利用するものである。第１のプロトコールでは、バーコードインデックスを含めずに、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑの改変バージョンを利用することで、挿入されたｄｓＯＤＮを囲む標的部位を、ＰＣＲを使用して特異的に増幅した。第２の手法では、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）の捕捉プローブを使用することで、標的ｄｓＯＤＮ配列を含む遺伝子座を濃縮した。手法は両方共、ｄｓＯＤＮが挿入された遺伝子座の同定に次世代シークエンシングを使用するものである。オフターゲットヌクレアーゼ活性の真の部位を確実に同定するために、それぞれの条件（ＣＤ７ｇ４、ＴＲＡＣｇ、及びＣＤ７ｇとＴＲＡＣｇとの組み合わせ）を３連で実施し、その結果、反復検体当たり平均１．２６ｘ１０６個（平均値）のシークエンシングリードが得られた。カバレッジが＞１０ｘの双方向シークエンシングリードを有する遺伝子座を解析に含めた。第１に、それぞれの手法がオンターゲット部位を同定する能力を評価した。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑとｄｓＯＤＮ捕捉との両方でオンターゲット活性部位が強固に同定され、それぞれの条件においてそれぞれのオンターゲット部位で得られたカバレッジは３つすべての反復検体を通じて３００Ｘ〜２２，０００Ｘであった（表２及び表３）。次に、同一の厳密性を使用してオフターゲットヌクレアーゼ活性を評価した。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑでは、マルチプレックスに編集されたＴ細胞（ＣＤ７ｇ４＋ＴＲＡＣｇ）に単一のオフターゲット部位が存在し、このオフターゲット部位は、ＲＢＭ３３のイントロンへの挿入に相当する部位であり、３つすべての反復検体に存在することが明らかとなった。ｄｓＯＤＮ捕捉によって評価すると、オンターゲット活性のカバレッジは高かったものの、オフターゲット部位は全く観測されなかった（表２）。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ解析の厳密性を緩めて２つ以上の反復検体に存在する潜在的なオフターゲット部位を含めることで、我々は、ＣＤ７については潜在的なオフターゲット部位を追加で４つ同定し、ＴＲＡＣについては部位を４つ同定し、ＣＤ７及びＴＲＡＣのマルチプレックスな遺伝子編集については潜在的なオフターゲット活性部位を追加で１つ同定した（表２）。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって同定された遺伝子座は、ｄｓＯＤＮ捕捉を使用して得られたデータには存在せず、厳密性を下げてこうしたデータを解析した後にオフターゲットヌクレアーゼ活性部位が追加で同定されることもなかった。こうした結果は、ＣＤ７ｇ４及びＴＲＡＣｇＲＮＡを個別または組み合わせて用いるとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって初代Ｔ細胞が高効率に遺伝子編集され、この遺伝子編集は、こうしたプラットフォームを使用��ると、顕著なオフターゲット活性を伴わないことを示唆している。
表２：ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑを使用して同定されたヌクレアーゼ活性部位。オンターゲット活性は、濃い灰色で強調されている。
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表３：ｄｓＯＤＮプローブ捕捉を使用して同定されたヌクレアーゼ活性部位。オンターゲット活性は、濃い灰色で強調されている。
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【００８３】
実施例４〜８の考察
この報告では、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９による遺伝子編集によってＣＤ７とＴＲＡＣとの両方を欠損したヒトＴ細胞が生成することが実証された。こうした遺伝子編集Ｔ細胞をレンチウイルスによってＣＤ７−ＣＡＲを形質導入したもの（ＵＣＡＲＴ７）は、同胞殺し、またはＴ細胞介在性の異種ＧｖＨＤを結果として伴うことなく、ＣＤ７＋初代ヒトＴ−ＡＬＬ及びＴ−ＡＬＬ細胞株をインビトロ及びインビボで効率的に死滅させるようになる。Ｔ細胞性悪性腫瘍を標的とする以前のＣＡＲ−Ｔは、同胞殺しを部分的に誘導するが、この研究では、こうした以前のＣＡＲ−Ｔに改良が加わっている。Ｐｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．では、結果的にＣＤ４＋Ｔ細胞を完全に消失させる、ＣＤ４＋標的に対するＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔ介在性細胞傷害性を維持したＣＤ４標的型ＣＡＲ−Ｔの前臨床開発について記載されている。同様に、Ｍａｍｏｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌでは、誘導される同胞殺しが一過性にすぎず、活性化野生型Ｔ細胞ではＣＤ５がほとんど普遍的に発現するにもかかわらず、ＣＤ５  ＣＡＲ−Ｔの十分な増殖を可能にするＣＤ５標的型ＣＡＲ−Ｔについて記載されている。
【００８４】
ＮＨＬ及びＴ−ＡＬＬの大部分においてＣＤ７が高度に発現することから、ＣＤ７を標的として選択した。Ｔ細胞性悪性腫瘍に加えて、ＣＤ７は、ＡＭＬの約２４％に発現しており、白血病幹細胞のマーカーであると考えられるため、骨髄性ならびにリンパ性の悪性腫瘍の治療にＣＡＲＴ７を使用し得る。さらに、免疫機能に影響を与えることなくＴ細胞において欠失し得る抗原を標的とする必要があった。ＣＤ７を遺伝子欠損したマウスは、正常なリンパ球集団を有しており、表現型的に正常である（正常な寿命を有する）と共に、同種刺激及び細胞分裂刺激に応じてＴ細胞活性を維持する。したがって、ＣＤ７は、ＡＭＬとＴ細胞性悪性腫瘍との両方がＣＡＲ−Ｔの標的となるように遺伝子編集するための理想的な候補である。
【００８５】
ＣＤ７の欠失（主にＣＤ４＋及びＣＤ７−のＣＡＲＴ７が生き伸びる）を行わずにＣＡＲＴ７を使用すると、広範な同胞殺しが生じた２４。こうしたデータは、自体はＣＤ７を欠失したＣＡＲＴ７を使用することの重要性を強調するものである。そのような細胞は、ＣＤ４細胞のバランスのとれた増殖を伴って細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞が増殖することを可能にしつつ、同胞殺しに対する最適な抵抗性を生み出す。実際、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９介在性にＣＤ７を高効率に遺伝子欠失させると、ＣＡＲ７の同胞殺しが軽減し、ＣＤ７タンパク質が失われると（ＣＤ７タンパク質の消失は、遺伝子欠失からは遅れて生じ得る）、細胞は、完全な同胞殺し抵抗性を示した。
【００８６】
ＣＡＲＴ７を生成するために自己Ｔ細胞を使用すると、特有の課題が生じる。第１に、再発性のＴ−ＡＬＬ及びＴ−ＮＨＬを有する患者は、Ｔ細胞毒（プリンヌクレオシド類似体（フルダラビン、クラドリビン、ネララビン）及びＴ細胞細胞傷害性モノクローナル抗体（Ｃａｍｐａｔｈ）など）で既に重度に治療されることが多い。したがって、Ｔ細胞の数及び機能が顕著に低下した状態であり得、そのため、治療効果を得るための、ＣＡＲＴ７の効率的な生成、十分な数、及び機能が制限される。第２に、ほとんどのＴ細胞性血液悪性腫瘍及び正常なＴエフェクターは、同一の表面抗原の多くを共発現しており、このことによって、遺伝子編集及びレンチウイルスによる形質導入を行うために悪性Ｔ細胞から正常なＴエフェクターを分離精製することが非常に困難なことになっている。精製プロセスが絶対的なものでなければ、悪性Ｔ細胞におけるＣＤ７を欠失させてしまうリスクが生じることになり、そうなると、ＵＣＡＲＴ７に対して潜在的に抵抗性の混入Ｔ細胞性癌の集団が生成する。したがって、正常なエフェクターＴ細胞に悪性Ｔ細胞が混入するという潜在的なリスクが存在することから、Ｔ細胞性悪性腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔ細胞を生成するために患者由来のＴ細胞を使用することは不可能である。したがって、編集によってＴＲＡＣを除外することによってＣＤ７ΔＣＡＲＴ７をさらに改変することで、ＧＶＨＤを誘導するリスクを伴わずに同種ドナーＴ細胞を使用できるようにした。同種ドナーＴ細胞から生成され、ＣＤ１９に対する同種反応性が存在しないＴＲＡＣ編集ＣＡＲ−ＴであるＵＣＡＲＴ１９がヒト初回投与試験で成功を収めた後、我々はＵＣＡＲＴ７を開発し、このＵＣＡＲＴ７は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるマルチプレックスな遺伝子編集によって、オフターゲット作用を最小化しつつＣＤ７とＴＲＡＣとの両方を高効率で欠失させることに我々が成功したものである。ＵＣＡＲＴ７は、Ｔ−ＡＬＬ細胞株及び患者の初代Ｔ−ＡＬＬを、ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７と同等に効率的にインビトロで死滅させた。ＣＤ７ΔＣＡＲＴ７は、Ｔ−ＡＬＬ  ＰＤＸに対して同種反応性の抗白血病活性をインビボで示したが、これとは異なり、ＵＣＡＲＴ７は、ＧｖＨＤを誘導することなく、同種反応性とは無関係にＣＡＲ７介在性の強固な死滅を示した。このことは、ＴＲＡＣの欠失によってＣＡＲ介在性の細胞傷害性は変わらず、その上で、ＧｖＨＤが完全に阻止されることを示唆している。
【００８７】
Ｔ細胞に加えて、ＮＫ細胞もまたＣＤ７を発現する。ＵＣＡＲＴ７が介在することによってＴ細胞及びＮＫ細が死滅することは、ＵＣＡＲＴ７に対する同種拒絶を阻止または限定し、ＵＣＡＲＴ７の持続性を向上させる可能性があり得る。我々の免疫不全ＰＤＸ  ＴモデルではＵＣＡＲＴ７の持続性が観測されるものの、Ｔ細胞新生物の治療を受けるヒトにおけるＵＣＡＲＴ７の持続性を完全に特徴付けるためには、臨床試験が必要となるであろう。
【００８８】
ＣＤ７の遺伝子編集、ＴＲＡＣの遺伝子編集、またはマルチプレックスな遺伝子編集に伴う強固なオフターゲットヌクレアーゼ活性は観測されなかったが、高忠実度Ｃａｓ９（ＳｐＣＡＳ９−ＨＦ１）が最近開発されたことにより、望ましくない遺伝子的な事象のリスクがさらに低減される可能性がある。さらに、最近報告されたようにＴＲＡＣ遺伝子座にＣＡＲを直接的に挿入するか、または可能性として、ＣＤ７遺伝子座にＣＡＲを直接的に挿入すると、ウイルスベクターによる望ましくない遺伝子座への無作為な組み込みに起因するがん化のリスクがさらに軽減されると想定される。さらに、ＣＤ３４−ＴＫなどの自殺遺伝子を含めることがベクターによって可能であり、自殺遺伝子を含めると、［１８Ｆ］ＦＨＢＧ  ＰＥＴ−ＣＴイメージングを使用する遺伝子改変Ｔ細胞の効率的な追跡と、インビボでのＴ細胞の排除と、の両方が可能になることがヒト初回投与試験において以前に示されている。この方針は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による遺伝子編集及びウイルスによる組み込みから生じる潜在的な毒性またはがん化からの保護につながると想定される。
【００８９】
この研究は、Ｔ細胞性悪性腫瘍に対する臨床的に実行可能な最初の養子Ｔ細胞遺伝子療法を示すものである。具体的には、ヒトＴ細胞のマルチプレックス（ＣＤ７ｘＴＲＡＣ）な遺伝子編集の後に、レンチウイルスによって第３世代のＣＤ７−ＣＡＲを形質導入すると、同胞殺しに完全抵抗性であり、同種反応性またはＧｖＨＤ潜在力をインビボで示さないＵＣＡＲＴ７が得られることが示されている。これによって、「即時使用が可能な（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）」腫瘍非含有同種Ｔ細胞をＣＡＲ−Ｔの供給源として使用することが可能になる。こうした遺伝子改変Ｔ細胞を、ヒトＴ−ＡＬＬ細胞株またはヒトの初代Ｔ−ＡＬＬ  ＰＤＸ腫瘍を保有するＮＳＧマウスにおいて使用すると、こうした腫瘍が、異種ＧｖＨＤの徴候を伴わずに、迅速かつ効率的にインビボで排除される。こうした発見は、再発性及び難治性のＴ細胞性血液悪性腫瘍を有する小児及び成人の治療に特化したクリニックへとこうした知見を結び付けるためのさらなる取り組みに正当性を与えるものである。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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