(57)【要約】  本発明は、高親和性でＰＤ−１に特異的に結合し、重鎖および軽鎖を含む、ＰＤ−１モノクローナル抗体、特にヒトＰＤ−１に対するモノクローナル抗体を提供する。本発明は、さらに、本発明の抗体をコードする核酸配列、クローニングまたは発現ベクター、宿主細胞および該抗体を発現または単離する方法を提供する。免疫複合体、本発明の抗体を含む治療的組成物も提供される。本発明はまた抗ＰＤ−１抗体で種々の癌を処置する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２４の１２８位、１２９位、１３０位、１３１位および１３２位のアミノ酸ならびに３５位、６４位、８２位、８３位のアミノ酸の少なくとも一つにアミノ酸を含むＰＤ−１のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
エピトープが配列番号２４の１２８位、１２９位、１３０位、１３１位および１３２位のアミノ酸を含む、ヒトおよびネズミ科ＰＤ−１のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
ネズミ科ＰＤ−１がマウスまたはラットＰＤ−１である、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
抗体が
ａ)ヒトＰＤ−１に２.１５Ｅ−１０Ｍ以下のＫＤで結合する；および
ｂ)マウスＰＤ−１に１.６７Ｅ−０８Ｍ以下のＫＤで結合する、
請求項１〜３の何れかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
抗体が次の性質の少なくとも一つを示す、請求項１〜４の何れかに記載の抗体：
ａ)ヒトＰＤ−１に４.３２Ｅ−１０Ｍ〜２.１５Ｅ−１０ＭのＫＤでおよびマウスＰＤ−１に５.３９Ｅ−０８Ｍ〜１.６７Ｅ−０８ＭのＫＤで結合する；
ｂ)ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４に実質的に結合しない；
ｃ)Ｔ細胞増殖を増加させる；
ｄ)インターフェロン−ガンマ産生を増加させる；または
ｅ)インターロイキン−２分泌を増加させる。
【請求項６】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８および９からなる群から選択される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％相同であるアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ここで、該抗体がＰＤ−１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８および９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ここで、該抗体がＰＤ−１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
ａ)配列番号１および２からなる群から選択される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％相同であるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
ｂ)配列番号３、４、５、６、７、８および９からなる群から選択される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％相同であるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含む抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ここで、該抗体がＰＤ−１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
ａ)配列番号１および２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
ｂ)配列番号３、４、５、６、７、８および９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含む抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ここで、該抗体がＰＤ−１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ここで、該抗体がＰＤ−１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域；および
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域、
を含む抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ここで、重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は配列番号１２および１３ならびにその保存的修飾配列からなる群から選択される配列であり、
該抗体がＰＤ−１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列が配列番号２０、２１、２２および２３からなる群およびその保存的修飾配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
重鎖可変領域ＣＤＲ２配列が配列番号１１のアミノ酸配列からなる群およびその保存的修飾配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１１または１２に記載の抗体。
【請求項１４】
軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列が配列番号１９のアミノ酸配列からなる群およびその保存的修飾配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１３の何れかに記載の抗体。
【請求項１５】
重鎖可変領域ＣＤＲ１配列が配列番号１０のアミノ酸配列からなる群およびその保存的修飾配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１４の何れかに記載の抗体。
【請求項１６】
軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列が配列番号１４、１５、１６、１７および１８のアミノ酸配列からなる群およびその保存的修飾配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１５の何れかに記載の抗体。
【請求項１７】
抗体がキメラまたはヒト化またはヒト抗体である、請求項１〜１６の何れかに記載の抗体。
【請求項１８】
抗体が次の性質の少なくとも一つを示す、請求項６〜１７の何れかに記載の抗体：
ａ)ヒトＰＤ−１に２.１５Ｅ−１０Ｍ以下のＫＤでおよびマウスマウスＰＤ−１に１.６７Ｅ−０８Ｍ以下のＫＤで結合する；
ｂ)ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４に実質的に結合しない；
ｃ)Ｔ細胞増殖を増加させる；
ｄ)インターフェロン−ガンマ産生を増加させる；または
ｅ)インターロイキン−２分泌を増加させる。
【請求項１９】
請求項１〜１８の何れかに記載の抗体または抗原結合フラグメントをコードする、核酸分子。
【請求項２０】
請求項１９の核酸分子を含む、クローニングまたは発現ベクター。
【請求項２１】
１以上の請求項２０に記載のクローニングまたは発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載の宿主細胞を培養し、抗体を単離することを含む、請求項１〜１８の何れかに記載の抗体を産生する方法。
【請求項２３】
抗体がＳＤラットのヒトＰＤ−１細胞外ドメインおよびマウスＰＤ−１細胞外ドメインでの免疫化により調製される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖導入遺伝子を含むトランスジェニックラットであって、該マウスが請求項１〜１８の何れかに記載の抗体を発現する、トランスジェニックラット。
【請求項２５】
請求項２４に記載のラットから製造されたハイブリドーマであって、該抗体を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項２６】
請求項１〜１８の何れかに記載の抗体または抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容される添加物、希釈剤または担体の１以上を含む、医薬組成物。
【請求項２７】
治療剤に連結された請求項１〜１８の何れかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、免疫複合体。
【請求項２８】
請求項２７に記載の免疫複合体および薬学的に許容される添加物、希釈剤または担体を含む、医薬組成物。
【請求項２９】
抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを製造する方法であって、
(ａ)
(ｉ)配列番号１０からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１１からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および配列番号１２および１３からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列；および／または
(ii)配列番号１４、１５、１６、１７および１８からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１９からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および配列番号２０、２１、２２および２３からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列
を準備し；そして
(ｂ)改変抗体配列をタンパク質として発現させる
ことを含む、方法。
【請求項３０】
対象に請求項１〜１８の何れかに記載の抗体または抗原結合フラグメントを投与することを含む、対象における免疫応答を調節する方法。
【請求項３１】
免疫障害または癌の処置または予防用医薬の製造における、請求項１〜１８の何れかに記載の抗体の使用。
【請求項３２】
対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、腫瘍細胞の増殖を阻害するために対象に治療有効量の請求項１〜１７の何れかに記載の抗体または抗原結合フラグメントを投与することを含む、方法。
【請求項３３】
腫瘍細胞が黒色腫、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌および直腸癌からなる群から選択される癌のものである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項３２または３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般にＰＤ−１に対する抗体およびその組成物ならびに抗ＰＤ−１抗体を使用するヒト疾患の処置における免疫療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
前臨床および臨床結果から、免疫チェックポイントの標的化が癌を有する患者の処置のための、最も有望なアプローチとなりつつあることを示す証拠が増え続けている。ＣＤ２８に対する相同性を有する免疫グロブリンスーパーファミリーの阻害性メンバーであるタンパク質プログラム死１(ＰＤ−１)は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞で発現され(Agata et al, supra; Okazaki et al (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8)、免疫系の刺激性および阻害性シグナルの制御に重要な役割を有する(Okazaki, Taku et al. 2007 International Immunology 19:813-824)。ＰＤ−１は、アポトーシス細胞における差次的発現のスクリーニング中に発見された(Ishida et al (1992) EMBO J 11:3887-95)。
【０００３】
ＰＤ−１は、Ｉｇ遺伝子スーパーファミリーの一部であるＩ型膜貫通タンパク質であり(Agata et al. (1996) bit Immunol 8:765-72)、ＰＤ−１の構造は、１個の免疫グロブリン可変様細胞外ドメインならびに免疫受容抑制性チロシンモチーフ(ＩＴＩＭ)および免疫受容スイッチチロシンモチーフ(ＩＴＳＭ)を含む細胞質ドメインからなる。ＣＴＬＡ−４と構造は類似するが、ＰＤ−１は、Ｂ７−１およびＢ７−２結合に重要なＭＹＰＰＰＹモチーフを欠く。ＰＤ−１は２個の既知リガンド、ＰＤ−Ｌ１(Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４)およびＰＤ−Ｌ２(Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３)を有し、これらは、Ｂ７ファミリーの細胞表面発現メンバーである(Freeman et al (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al (2002) Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−ＬｌおよびＰＤ−Ｌ２の両者は、ＰＤ−１に結合するが、ＣＤ２８ファミリーの他のメンバーに結合しないＢ７ホモログである。
【０００４】
ＰＤ−１は、免疫チェックポイントタンパク質の一つとして、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞に発現されるＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーであり(Agata et al, supra; Okazaki et al. (2002) Curr Opin Immunol 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8)、腫瘍細胞が免疫監視を逃れる主要な免疫耐性機構を提供する、Ｔ細胞の活動の制限に大きな役割を有する。ＰＤ−１は、Ｔ細胞のアネルギーまたは不応性の状態を誘発し、細胞が最適レベルのエフェクターサイトカインを産生することができなくなるようにする。ＰＤ−１は、生存シグナルを阻害する能力により、Ｔ細胞のアポトーシスも誘発し得る。ＰＤ−１欠損動物は、自己免疫性心筋症ならびに関節炎および腎炎を伴う狼瘡様症候群を含む、種々の自己免疫表現型を発症する(Nishimura et al. (1999) Immunity 11:141-51; Nishimura et al. (2001) Science 291:319-22)。さらに、ＰＤ−１は自己免疫性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)、Ｉ型糖尿病およびリウマチ性関節炎において役割を有することが判明している(Salama et al. (2003) J Exp Med 198:71-78: Prokunina and Alarcon-Riquelme (2004) Hum MoI Genet 13:R143; Nielsen et al. (2004) Lupus 11:510)。ネズミ科Ｂ細胞腫瘍株において、ＰＤ−１のＩＴＳＭは、ＢＣＲ介在Ｃａ２＋流および下流エフェクター分子のチロシンリン酸化のブロッキングに必須であることが示された(Okazaki et al. (2001) PNAS 98: 13866-71)。
【０００５】
活性化Ｔ細胞に発現されるＰＤ−１と腫瘍細胞に発現されるＰＤ−Ｌ１の相互作用は、免疫応答を負に制御し、抗腫瘍免疫を減衰させる。ＰＤ−Ｌｌは、多種のヒト癌に豊富である(Dong et al (2002) Nat. Med 8:787-9)。腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１発現は、食道、膵臓および他のタイプの癌における生存率減少と相関し、この経路を腫瘍免疫療法の新しい有望な標的として際立たせる。数グループがＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ相互作用が疾患を増悪させ、腫瘍浸潤性リンパ球減少、Ｔ細胞受容体介在増殖減少および癌細胞による免疫逃避をもたらすことを示している(Dong et al. (2003) J. MoI. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100)。免疫抑制は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌｌの局所相互作用阻害により逆転でき、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２の相互作用が同様にブロッキングされたとき、その効果は相加的である。
【０００６】
ＰＤ−１経路を標的とする複数の薬剤が、Bristol-Myers Squibb(ＢＭＳ)、Merck、RocheおよびGlaxoSmithKline(ＧＳＫ)などのいくつかの製薬会社により開発されている。臨床治験のデータは、種々のタイプの腫瘍を有する患者における持続性の臨床活性の初期の証拠および励みになる安全性プロファイルを示している。ＢＭＳにより開発された抗ＰＤ−１薬物であるニボルマブは、次世代分野の主役にされようとしている。現在、６つの後期治験で、肺癌患者(ｎ＝７２)の１８％、黒色腫患者(ｎ＝９８)のほぼ１／３および腎臓癌を有する患者(ｎ＝３３)の２７％を含む、５癌群の３つで、処置が腫瘍縮小を加速させた。Merckにより開発されたペムブロリズマブは、皮膚癌から優れたフェーズＩＢデータが得られた後、ＦＤＡの新しいブレークスルーの指定を得たＰＤ−１に対して作用するヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体である。フェーズＩＢ治験の結果は、癌患者(ｎ＝８５)の５１％の客観的抗腫瘍応答および患者の９％の完全奏功を示している。Rocheの実験的ＭＰＤＬ３２８０Ａ(アテゾリズマブ)は、種々のサイズの腫瘍を有する１４０名の進行癌患者中２９名(２１％)において腫瘍を縮小させる能力が示された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
治療剤として、ＰＤ−１に対する抗体を改良する余地がある。臨床治験で現在試験されているＰＤ−１に対するモノクローナル抗体の大部分は、ヒトＰＤ−１に対してのみであり、これは前臨床インビボアッセイを制限し、マウス由来タンパク質配列の免疫原性により有効性が削減された。マウスＰＤ−１と交差反応性を有するヒト化抗体はこの欠点を克服し、さらなる忍容性およびより高い効果をインビボで示した。従って、新規抗ＰＤ−１抗体に対する要望がなお存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の開示
本発明は、単離抗体、特にモノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体を提供する。
【０００９】
ある態様において、本発明は、配列番号２４の１２８位、１２９位、１３０位、１３１位および１３２位のアミノ酸ならびに３５位、６４位、８２位、８３位のアミノ酸の少なくとも一つにアミノ酸を含むＰＤ−１のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１０】
本発明はまた、エピトープが配列番号２４の１２８位、１２９位、１３０位、１３１位および１３２位のアミノ酸を含む、ヒトおよびネズミ科ＰＤ−１のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
【００１１】
ネズミ科ＰＤ−１がマウスまたはラットＰＤ−１である、前記抗体またはその抗原結合フラグメント。
【００１２】
抗体が
ａ)ヒトＰＤ−１に２.１５Ｅ−１０Ｍ以下のＫＤで結合する；および
ｂ)マウスＰＤ−１に１.６７Ｅ−０８Ｍ以下のＫＤで結合する、
前記抗体またはその抗原結合フラグメント。
【００１３】
抗体が
ａ)ヒトＰＤ−１に２.１５Ｅ−１０Ｍ以下のＫＤで結合し；かつ
ｂ)マウスＰＤ−１に１.６７Ｅ−０８Ｍ以下のＫＤで結合し；そして
抗体が次の性質の少なくとも一つを示す：
ａ)ヒトＰＤ−１に４.３２Ｅ−１０Ｍ〜２.１５Ｅ−１０ＭのＫＤでおよびマウスＰＤ−１に５.３９Ｅ−８Ｍ〜１.６７Ｅ−８ＭのＫＤで結合する；
ｂ)ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４に実質的に結合しない；
ｃ)Ｔ細胞増殖を増加させる；
ｄ)インターフェロン−ガンマ産生を増加させる；または
ｅ)インターロイキン−２分泌を増加させる、
前記抗体。
【００１４】
本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８および９からなる群から選択される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％相同であるアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する。
【００１５】
本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８および９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する。
【００１６】
本発明は、
ａ)配列番号１および２からなる群から選択される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％相同であるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
ｂ)配列番号３、４、５、６、７、８および９からなる群から選択される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％相同であるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する。
【００１７】
本発明は、
ａ)配列番号１および２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
ｂ)配列番号３、４、５、６、７、８および９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する。
【００１８】
種々の実施態様において、抗体は
ａ)配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
ｂ)配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する；
または抗体は
ａ)配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
ｂ)配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する；
または抗体は
ａ)配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
ｂ)配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する；
または抗体は
ａ)配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
ｂ)配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する；
または抗体は
ａ)配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
ｂ)配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する；
または抗体は
ａ)配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
ｂ)配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する；
または抗体は
ａ)配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
ｂ)配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する；
または抗体は
ａ)配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
ｂ)配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する；
または抗体は
ａ)配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
ｂ)配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する；
または抗体は
ａ)配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変領域；および
ｂ)配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する。
【００１９】
該抗体の配列は表１および配列表に示す。
【表１−１】
2019536432.tif 000002
【表１−２】
2019536432.tif 000003
【００２０】
他の態様において、本発明は、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する。
【００２１】
他の態様において、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域；およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、
ここで、重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は配列番号１２および１３ならびにその保存的修飾体からなる群から選択される配列を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する。
【００２２】
好ましくは、ここで、前記抗体の軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号２０、２１、２２および２３ならびにその保存的修飾体からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。
【００２３】
好ましくは、ここで、前記抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号１１のアミノ酸配列およびその保存的修飾体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
好ましくは、ここで、前記抗体の軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号１９のアミノ酸配列およびその保存的修飾体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２５】
好ましくは、ここで、前記抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号１０のアミノ酸配列およびその保存的修飾体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２６】
好ましくは、前記抗体の軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列は配列番号１４、１５、１６、１７および１８のアミノ酸配列ならびにその保存的修飾体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、本発明の抗体である。
【００２７】
より好ましい実施態様において、本発明は抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域；およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、
ａ)重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は配列番号１０を含み、ＣＤＲ２配列は配列番号１１から選択されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３配列は配列番号１２〜１３のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；かつ
ｂ)軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列は配列番号１４〜１８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２配列は配列番号１９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３配列は配列番号２０〜２３のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２８】
好ましい抗体は
ａ)配列番号１０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ)配列番号１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ)配列番号１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ)配列番号１４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ)配列番号１９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｆ)配列番号２０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する。
【００２９】
他の好ましい抗体は、
ａ)配列番号１０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ)配列番号１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ)配列番号１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ)配列番号１４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ)配列番号１９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｆ)配列番号２１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する。
【００３０】
他の好ましい抗体は、
ａ)配列番号１０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ)配列番号１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ)配列番号１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ)配列番号１５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ)配列番号１９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｆ)配列番号２１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する。
【００３１】
他の好ましい抗体は、
ａ)配列番号１０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ)配列番号１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ)配列番号１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ)配列番号１６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ)配列番号１９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｆ)配列番号２１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する。
【００３２】
他の好ましい抗体は、
ａ)配列番号１０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ)配列番号１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ)配列番号１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ)配列番号１７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ)配列番号１９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｆ)配列番号２１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する。
【００３３】
他の好ましい抗体は、
ａ)配列番号１０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ)配列番号１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ)配列番号１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ)配列番号１６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ)配列番号１９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｆ)配列番号２１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する。
【００３４】
他の好ましい抗体は、
ａ)配列番号１０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ)配列番号１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ)配列番号１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ)配列番号１７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ)配列番号１９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｆ)配列番号２１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する。
【００３５】
他の好ましい抗体は、
ａ)配列番号１０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ)配列番号１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ)配列番号１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ)配列番号１７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ)配列番号１９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｆ)配列番号２２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する。
【００３６】
他の好ましい抗体は、
ａ)配列番号１０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ)配列番号１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ)配列番号１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ)配列番号１８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ)配列番号１９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｆ)配列番号２３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する。
【００３７】
他の好ましい抗体は、
ａ)配列番号１０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ)配列番号１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ)配列番号１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ)配列番号１８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ)配列番号１９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｆ)配列番号２０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含み、ここで、該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する。
【００３８】
該抗体のＣＤＲ配列は表２および配列表に示す。
【表２】
2019536432.tif 000004
【００３９】
本発明の抗体はキメラまたはヒト化またはヒト抗体であり得る。
【００４０】
本発明の抗体は、次の性質の少なくとも一つを示し得る：
ａ)ヒトＰＤ−１に２.１５Ｅ−１０Ｍ以下のＫＤでおよびマウスマウスＰＤ−１に１.６７Ｅ−０８Ｍ以下のＫＤで結合する；
ｂ)ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４に実質的に結合しない；
ｃ)Ｔ細胞増殖を増加させる；
ｄ)インターフェロン−ガンマ産生を増加させる；または
ｅ)インターロイキン−２分泌を増加させる。
【００４１】
さらなる態様において、本発明は、該抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子を提供する。
【００４２】
本発明は、該抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子を含むクローニングまたは発現ベクターを提供する。
【００４３】
本発明はまた１以上のクローニングまたは発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００４４】
さらに他の態様において、本発明は、本発明の宿主細胞を培養し、抗体を単離することを含む、方法であって、該抗体がＳＤラットのヒトＰＤ−１細胞外ドメインおよびマウスＰＤ−１細胞外ドメインでの免疫化により調製される、方法を提供する。
【００４５】
本発明は、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスであって、本発明の抗体を発現するマウスを提供する。
【００４６】
本発明は、本発明のマウスから調製したハイブリドーマであって、該抗体を産生するハイブリドーマを提供する。
【００４７】
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体または該抗体の抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容される添加物、希釈剤または担体の１以上を含む、医薬組成物を提供する。
【００４８】
本発明は、治療剤に連結された、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、免疫複合体を提供する。
【００４９】
ここで、本発明は、該免疫複合体および薬学的に許容される添加物、希釈剤または担体を含む、医薬組成物を提供する。
【００５０】
本発明はまた抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを製造する方法であって、
(ａ)(ｉ)配列番号１０からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１１からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および配列番号１２および１３からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列；および／または(ii)配列番号１４、１５、１６、１７および１８からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１９からなる群から選択されるＣＤＲ２配列および配列番号２０、２１、２２および２３からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を準備し；そして
(ｂ)改変抗体配列をタンパク質として発現させる
ことを含む、方法を提供する。
【００５１】
本発明はまた、対象に本発明の抗体または該抗体の一つの抗原結合フラグメントを投与することを含む、対象における免疫応答を調節する方法を提供する。
【００５２】
本発明はまた免疫障害または癌の処置または予防用医薬の製造における、該抗体の使用を提供する。
【００５３】
本発明はまた、腫瘍細胞の増殖を阻害するために対象に治療有効量の該抗体または該抗原結合フラグメントを投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
【００５４】
ここで、本発明は、腫瘍細胞が黒色腫、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌および直腸癌からなる群から選択される癌のものである、該方法を提供する。
【００５５】
ここで、本発明は、該抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である、該方法を提供する。
【００５６】
本発明の特長および利点
本発明者らは、独占的ハイブリドーマテクノロジーを利用して、ヒト化ＰＤ−１に対する抗体を産生した。本明細書に記載される抗体は、ファミリー間(cross-family)反応なく、ヒトおよびマウスＰＤ−１タンパク質の両者に高結合親和性で、特異的に結合し、そしてＴ細胞増殖増強ならびにサイトカインＩＦＮ−γおよびインターロイキン−２産生増加を含む免疫応答を強力に調節する。
【００５７】
マウスＰＤ−１に結合する新規抗ＰＤ−１抗体は、免疫されたラットに由来し、これは、抗ＰＤ−１抗体が前臨床マウスモデルで使用できない不都合を解消し、ヒト化レベルは配列ヒト化後１００％に近づき、人体で使用する薬物の有害作用を大きく低減させる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、細胞表面ヒトおよびマウスＰＤ−１に結合するハイブリドーマ抗体のグラフを示す。図１ＡはヒトＰＤ−１への結合を示す。図１ＢはマウスＰＤ−１への結合を示す。
【００５９】
【図２】図２は、第一周変異導入ライブラリースクリーニングの結果を示す。配列決定し、第二周変異のための高親和性クローンついて変異解析する。
【００６０】
【図３】図３は、ＦＡＣＳによる異種間試験の結果を示す。図３Ａは、ヒトＰＤ−１トランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞への結合を示す。図３ＢはマウスＰＤ−１トランスフェクト２９３Ｆ細胞への結合を示す。図３Ｃは、活性化カニクイザルＰＢＭＣへの結合を示す。注：アイソタイプはヒトＩｇＧ４カッパであった。下も同様。
【００６１】
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡによる異種間試験の結果を示す。図４ＡはヒトＰＤ−１への結合を示す。図４ＢはマウスＰＤ−１への結合への結合を示す。図４ＣはカニクイザルＰＤ−１への結合を示す。
【００６２】
【図５】図５は、ファミリー間試験の結果を示す。抗ＰＤ−１抗体はヒトＰＤ−１に特異的に結合するが、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４には結合しない。
【００６３】
【図６】図６Ａは、ＰＤ−１トランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞へのヒトＰＤ−Ｌ１結合をブロッキングする抗ＰＤ−１抗体の結果を示す。図６Ｂは、ＰＤ−１トランスフェクト２９３Ｆ細胞へのマウスＰＤ−Ｌ１結合をブロッキングする抗ＰＤ−１抗体の結果を示す。
【００６４】
【図７】図７は、抗ＰＤ−１抗体がヒトＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１への結合をブロッキングできたことを示す。
【００６５】
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、抗ＰＤ−１抗体がベンチマーク抗体と同じまたは近いエピトープビンにあることを示唆する、エピトープビニングアッセイの結果を示す。図８Ａは、WBP305BMK1(ＵＳ９０８４７７６)に対するビニングを示す。図８Ｂは、キイトルーダ(ＵＳ８１６８７５７)に対するビニングを示す。
【００６６】
【図９】図９は、抗ＰＤ−１抗体とヒト／マウスＰＤ−１の交差反応性を示す。２μg／mLの各抗体を、９６ウェルプレートに一夜コーティングし、ｈＰＤ−１／ｍＰＤ−１−Ｈｉｓタンパク質とインキュベートし、ＨＲＰ−抗Ｈｉｓ抗体を検出のために加えた。
【００６７】
【図１０】図１０は、ｈＰＤ−１構造上にマッピングしたホットスポット残基を示す。(Ａ)：ｈＰＤ−Ｌ１結合部位。データは文献(Zak et al. 2015)から得た。(Ｂ−Ｃ)：抗体W3052_r16.88.9およびキイトルーダそれぞれの結合部位。データは表８から得た。図上の色は、各エピトープ間の差異の鑑別を助けるものである。
【００６８】
【図１１】図１１は、ヒトおよびネズミ科ＰＤ−１の比較を示す。これらの明瞭な構造差異(ＢＣループおよびＣ’Ｄループ(またはＰＤ−１上のＣ’’鎖))を橙色で印を付けた。(Ａ)：ｈＰＤ−１の構造(ＰＤＢは４ＺＱＫをコードする)。欠損ループ(Ａｓｐ８５〜Ａｓｐ９２)を、そのＮＭＲ構造に基づき再生した(ＰＤは２Ｍ２Ｄをコードする)。(Ｂ)。ｍＰＤ−１のコード(ＰＤＢは３ＢＩＫをコードする)。
【００６９】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、抗ＰＤ−１抗体がヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞の機能を増強できることを示す、ヒトアロＭＬＲの結果を示す。図１２Ａは、抗ＰＤ−１抗体が用量依存的様式でＩＬ−２分泌を増加させることを示す。図１２Ｂは、抗ＰＤ−１抗体が用量依存的様式でＩＦＮ−γ分泌を増加させることを示す。図１２Ｃは、抗ＰＤ−１抗体が用量依存的様式でＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖を増加させることを示す。
【００７０】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは、抗ＰＤ−１抗体がマウスＣＤ４＋  Ｔ細胞の機能を増強できることを示す、マウスアロＭＬＲの結果を示す。図１３Ａは、抗ＰＤ−１抗体が用量依存的様式でＩＬ−２分泌を増加させることを示す。図１３Ｂは、抗ＰＤ−１抗体が用量依存的様式でＩＦＮ−γ分泌を増加させることを示す。図１３Ｃは、抗ＰＤ−１抗体が用量依存的様式でＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖を増加させることを示す。
【００７１】
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、抗ＰＤ−１抗体がヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞の機能を増強できることを示す、ヒトアロＭＬＲの結果を示す。図１４Ａは、抗ＰＤ−１抗体が用量依存的様式でＩＦＮ−γ分泌を増加させることを示す。図１４Ｂは、抗ＰＤ−１抗体が用量依存的様式でＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖を増加させることを示す。
【００７２】
【図１５】図１５は、抗ＰＤ−１抗体がＴｒｅｇの抑制機能を逆転できることを示す。図１５Ａは、抗ＰＤ−１抗体がＩＦＮ−γ分泌を回復できることを示す。図１５Ｂは、抗ＰＤ−１抗体がＴ細胞増殖を回復できることを示す。
【００７３】
【図１６】図１６は、抗ＰＤ−１抗体が活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞のＡＤＣＣ活性に介在しないことを示す、ＡＤＣＣ試験の結果を示す。
【００７４】
【図１７】図１７は、抗ＰＤ−１抗体が活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞のＣＤＣ活性に介在しないことを示す、ＣＤＣ試験の結果を示す。
【００７５】
【図１８】図１８は、同系腫瘍ヌードマウスモデルにおける２Ｅ５処置後の体重変化を示す。データ点は平均体重を表す；エラーバーは標準誤差(ＳＥＭ)を表す。
【００７６】
【図１９】図１９は、相対的体重変化(％)を示す。相対的体重変化は、投与開始時の体重に基づき計算した。データ点は平均体重を表す；エラーバーは標準誤差(ＳＥＭ)を表す。
【００７７】
【図２０】図２０は、CloudmanS91同系腫瘍ヌードマウスモデルにおける２Ｅ５処置後の腫瘍増殖曲線を示す。データ点は平均体重を表す；エラーバーは標準誤差(ＳＥＭ)を表す。
【００７８】
【図２１】図２１は、CloudmanS91同系腫瘍ヌードマウスモデルにおける２Ｅ５処置後の生存曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
詳細な記載
本発明がより容易に理解され得るために、まずいくつかの用語を定義する。さらなる定義は、詳細な記載をとおして示される。
【００８０】
用語“プログラム死１”、“プログラム細胞死１”、“タンパク質ＰＤ−１”、“ＰＤ−１”、“ＰＤ１”、“ＰＤＣＤ１”、“ｈＰＤ−１”および“ｈＰＤ−Ｆ”は相互交換可能に使用され、ＰＤ−１と少なくとも一つの共通エピトープを有するバリアント、アイソフォーム、ヒトＰＤ−１の種ホモログおよびアナログを含む。
【００８１】
ここで使用する用語“抗体”は、抗体全体およびその任意の抗原結合フラグメント(すなわち、“抗原結合部分”)または一本鎖を含む。“抗体”は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２個の重(Ｈ)鎖および２個の軽(Ｌ)鎖を含むタンパク質またはその抗原結合部分をいう。各重鎖は重鎖可変領域(ここではＶＨと略す)および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域(ここではＶＬと略す)および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１ドメイン、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域を、フレームワーク領域(ＦＲ)と称されるより保存された領域が散在する、相補性決定領域(ＣＤＲ)と称される超可変性の領域にさらに細分できる。各ＶＨおよびＶＬは、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端で次の順位配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
【００８２】
ここで使用する用語“抗体”は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントもしくは誘導体をいい、インビトロで産生されたかまたはインビボで産生されたかにかかわらず、抗原結合部位を含むあらゆるポリペプチドを含む。本用語は、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異的、多特異的、非特異的、ヒト化、一本鎖、キメラ、合成、組み換え、ハイブリッド、変異および移植抗体を含むが、これらに限定されない。用語“抗体”はまたＦａｂ、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂおよび抗原結合機能、すなわち、ＰＤ−１に特異的に結合する能力を保持する他の抗体フラグメントなどの抗体フラグメントも含む。一般に、このようなフラグメントは抗原結合フラグメントを含む。
【００８３】
用語“抗原結合フラグメント”、“抗原結合ドメイン”および“結合フラグメント”は、抗体と抗原の間の特異的結合を担うアミノ酸を含む抗体分子の一部をいう。抗原が大きい場合において、抗原結合フラグメントは該抗原の一部にしか結合しないかもしれない。抗原結合フラグメントとの特異的相互作用を担う抗体分子の部分は、“エピトープ”または“抗原決定基”と称される。
【００８４】
抗原結合フラグメントは、一般に抗体軽鎖可変領域(ＶＬ)および抗体重鎖可変領域(ＶＨ)を含むが、必ずしも両者を含む必要はない。例えば、いわゆるＦｄ抗体フラグメントはＶＨドメインしか含まないが、なおインタクト抗体の一部抗原結合機能を保持する。
【００８５】
上記に添って、用語“エピトープ”は、上に規定した結合フラグメントにより特異的に結合／識別される、抗原決定基として定義される。結合フラグメントは、標的構造、例えばヒトおよびネズミ科ＰＤ−１に特有である立体構造または連続エピトープに特異的に結合される／相互作用する。配座的または不連続エピトープは、一次配列では離れているが、ポリペプチドが天然タンパク質／抗原に折り畳まれたとき分子表面で一体となる、２以上の分離したアミノ酸残基の存在によって、ポリペプチド抗原を特徴付ける。エピトープに貢献する２以上の分離したアミノ酸残基は、１以上のポリペプチド鎖の別のセクションに存在する。これらの残基は、ポリペプチド鎖がエピトープを構成するために三次元構造に折り畳まれたとき、分子表面で一体となる。対照的に、連続または線形エピトープは、ポリペプチド鎖の単一線形セグメントに存在する２以上の分離したアミノ酸残基からなる。
【００８６】
用語“ＰＤ−１のエピトープに結合する”は、ＰＤ−１ポリペプチドの線形アミノ酸配列または三次、すなわち、三次元立体構造により規定され得る、ＰＤ−１の特定のエピトープに対して特異的結合を有する抗体をいう。結合は、ＰＤ−１の部分への抗体親和性が、他の関連ポリペプチドに対する親和性より実質的に大きいことを意味する。用語“実質的に大きな親和性”は、他の関連ポリペプチドに対する親和性と比較して、ＰＤ−１の部分に対する親和性の測定可能な増加があることを意味する。好ましくは、親和性は、他のタンパク質に対してより、ＰＤ−１の特定の部分に対して少なくとも１.５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍またはそれ以上大きい。好ましくは、結合親和性は、酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)または蛍光励起細胞選別(ＦＡＣＳ)分析または表面プラズモン共鳴法(ＳＰＲ)により決定する。より好ましくは、結合特異性は蛍光励起細胞選別(ＦＡＣＳ)分析により測定し得る。
【００８７】
用語“交差反応性”は、ここに記載する抗原フラグメントのヒトおよびネズミ科(マウスまたはラット)における同一標的分子への結合をいう。それ故に、“交差反応性”は、様々な種で発現される同一分子Ｘへの、しかし、Ｘ以外の分子にではない、種間反応性と理解される。例えばヒトＰＤ−１を認識するモノクローナル抗体のネズミ科(マウスまたはラット)ＰＤ−１への異種間特異性は、例えば、ＦＡＣＳ分析により決定され得る。
【００８８】
ここで使用する用語“対象”は、あらゆるヒトまたは非ヒト動物を含む。用語“非ヒト動物”は、全脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの、哺乳動物および非哺乳動物を含む。特記された場合を除いて、用語“患者”または“対象”は相互交換可能に使用される。
【００８９】
用語“処置”および“治療”は、治療的処置および予防的／防止的対策の両者を意味する。処置を必要とするものは、既に特定の医学的障害を有する個体ならびに最終的に障害を獲得し得るものを含み得る。
【実施例】
【００９０】
実施例１：研究材料調製
１. 免疫原産生
細胞外ドメイン(ＥＣＤ)または完全長のＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１をコードするＤＮＡを合成し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３.３に挿入した。プラスミドＤＮＡをMax-prepし、挿入ＤＮＡ配列を配列決定により確認した。ヒトＦｃ、マウスＦｃおよびＨｉｓタグを含む種々のタグを含む融合タンパク質ＰＤ−１  ＥＣＤおよびＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤを、ヒトＰＤ−１  ＥＣＤ遺伝子のＣＨＯ−ＳまたはＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションにより得た。５日後、上清を一過性にトランスフェクトした細胞の培養物から得た。免疫化およびスクリーニングの使用のために融合タンパク質を精製し、定量した。
【００９１】
２. 安定な細胞株確立
抗体スクリーニングおよび検証のためのツールを得るために、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１トランスフェクト細胞株を得た。簡潔には、ＣＨＯ−Ｋ１または２９３Ｆ細胞を、製造業者のプロトコールに従いLipofectamine 2000 Transfectionキットを使用して、完全長ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を含むｐｃＤＮＡ３.３発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクション４８〜７２時間後、トランスフェクト細胞をブラストサイジンまたはＧ４１８を含む培地で培養して、ゲノムＤＮＡに安定に取り込まれたＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１遺伝子を有する細胞を選択した。その間に、細胞を所望の遺伝子ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１発現について確認した。発現が確認できたら、目的の単一クローンを限界希釈法により選択し、大容積にスケールアップした。確立されたモノクローナル細胞株を、低用量の抗生物質ブラストサイジンまたはＧ４１８を含む培地で維持した。
【００９２】
実施例２：抗体ハイブリドーマ産生
１. 免疫化
６〜８週齢の雌ＳＤラットを、刺激のために、足蹠注射によりTiterMax中１０μg／動物のヒトＰＤ−１  ＥＣＤタンパク質および１０μg／動物のマウスＰＤ−１  ＥＣＤタンパク質で免疫化し、アルミニウム中のヒトＰＤ−１  ＥＣＤタンパク質またはマウスＰＤ−１  ＥＣＤタンパク質で交互に週に２回ブーストした。血清抗体力価を、２週毎にＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳで測定した。
【００９３】
２. 細胞融合
血清抗体力価が十分に高くなったら、ラットを、アジュバントを伴わない等体積のＤ−ＰＢＳ(ダルベッコのリン酸緩衝化食塩水)中のヒトおよびマウスＰＤ−１  ＥＣＤタンパク質両方で、最終ブーストをした。細胞融合を次のとおり実施した。骨髄腫細胞ＳＰ２／０を調製し、骨髄腫細胞を融合１週間前に融解し、対数増殖で維持するために、融合前日まで毎日１：２で分割させた。免疫化ＳＤラットのリンパ節から単離したＢリンパ球を骨髄腫細胞と合わせた(１：１比で)。細胞をトリプシンで処理し、ＦＢＳで反応を停止させた。次いで細胞混合物を洗浄し、ＥＣＦに対して２×１０６細胞／mlでＥＣＦ溶液に再懸濁させた。電子的細胞融合(ＢＴＸ２０００)後、融合チャンバーからの細胞懸濁液を、即時により多くの培地を含む無菌チューブに移し、少なくとも２４時間、３７℃インキュベーターでインキュベートした。次いで細胞懸濁液を混合し、９６ウェルプレート(１×１０４細胞／ウェル)に移した。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２で培養し、定期的にモニターした。クローンが十分大きくなったら(７〜１４日後)、抗体スクリーニングのために１００μLの上清を組織培養プレートから９６ウェルアッセイプレートに移した。
【００９４】
３. ハイブリドーマ上清の第一、第二および確認スクリーニング
ＥＬＩＳＡアッセイを、ハイブリドーマ上清のヒトまたはマウスＰＤ−１タンパク質への結合を試験する第一スクリーニング法として使用した。簡潔には、プレート(Nunc)を、１μg／mlのヒトまたはマウスＰＤ−１  ＥＣＤで、一夜、４℃でコーティングした。ブロッキングおよび洗浄後、ハイブリドーマ上清を該コーティング済プレートに負荷し、室温で１時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄し、その後二次抗体ヤギ抗ラットＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰ(Bethyl)と１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を加え、２Ｍ  ＨＣｌで反応を停止させた。４５０nmでの吸光度を、マイクロプレートリーダー(Molecular Device)を使用して読んだ。
【００９５】
細胞膜に発現される立体構造的ＰＤ−１分子への抗ＰＤ−１抗体の天然結合を確認するために、第二スクリーニングとしてＰＤ−１トランスフェクト細胞株を使用するＦＡＣＳ分析を実施した。ヒトＰＤ−１を発現するＣＨＯ−Ｓ細胞またはマウスＰＤ−１を発現する２９３Ｆ細胞を、９６ウェルＵ底プレート(Corning)に１×１０５細胞／ウェルの密度で移した。次いでハイブリドーマ上清を加え、該細胞と１時間、４℃でインキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄後、二次抗体ヤギ抗ラットＦＩＴＣ(Jackson ImmunoResearch Lab)を適用し、細胞と４℃で暗所で１時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁するかまたは４％パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリー(ＢＤ)およびFlowJoソフトウェアにより分析した。親ＣＨＯ−Ｓまたは２９３Ｆ細胞株に結合する抗体を、それぞれ陰性対照として使用した。
【００９６】
可能性のあるアンタゴニストのヒットを選択するために、選択抗体をＦＡＣＳ分析によりリガンドＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１トランスフェクト細胞への結合をブロッキングする能力について、試験した。ヒトＰＤ−１を発現するＣＨＯ−Ｓ細胞またはマウスＰＤ−１を発現する２９３Ｆ細胞を、１×１０５細胞／ウェル濃度で９６ウェルＵ底プレート(ＢＤ)に移した。ハイブリドーマ上清を加え、該細胞を４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、マウスＦｃ融合ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質またはマウスＦｃ融合マウスＰＤ−Ｌ１タンパク質を加え、４℃で１時間インキュベートした。二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ  ＦＩＴＣ抗体(ラットＩｇＧ  Ｆｃと交差反応せず、Jackson ImmunoResearch Lab)を細胞と４℃で暗所で１時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁するかまたは４％パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリー(ＢＤ)およびFlowJoソフトウェアにより分析した。
【００９７】
図１は、細胞表面ヒトおよびマウスＰＤ−１への１６ハイブリドーマ抗体結合のグラフを示す。図１ＡはヒトＰＤ−１への結合を示す。図１ＢはマウスＰＤ−１への結合を示す。
【００９８】
４. ハイブリドーマサブクローニング
特異的結合およびブロッキング活性が第一および確認スクリーニングで確認されたら、陽性ハイブリドーマ細胞株をサブクローニングに使用した。簡潔には、各ハイブリドーマ細胞株について、細胞を計数し、２００μLクローニング培地あたり５細胞、１細胞または０.５細胞となるよう希釈した。細胞懸濁液を、９６ウェルプレートに２００μL／ウェルで、１プレートは５細胞／ウェル、１プレートは１細胞／ウェルおよび４プレートは０.５細胞／ウェルで播種した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で、上記のとおり結合ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳによりスクリーニングされる準備ができるまで、培養した。選択単一クローンのＥＳＮを回収し、該抗体をさらなる特徴付けのために精製した。
【００９９】
５. サブタイプ試験
ウェルあたり５０μLのヤギ抗ラットＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体(１μg／mL)で、マイクロタイタープレート(Nunc)を一夜コーティングした。ブロッキング後、５０μLのハイブリドーマ上清サンプルを各ウェルに加え、２時間、室温でインキュベートした。ヤギ抗ラットＩｇＧカッパまたはＨＲＰ標識ラムダ軽鎖二次抗体(Ｂエチル)は検出抗体である。発色のためにＴＭＢ基質を使用し、２Ｍ  ＨＣｌで反応を停止させた。４５０nmの光を吸収する値を、マイクロプレートリーダー(Molecular Device)を使用して読む。
【０１００】
表３は、１６ハイブリドーマ抗体のサブタイプ結果を示す。７抗体はポリクローナル抗体であり、９抗体はＩｇＧ２ａカッパサブタイプである。抗ＰＤ−１抗体がインビボでＡＤＣＣおよびＣＤＣの役割を避ける必要性を考慮して、ヒト化抗体をヒトＩｇＧ４カッパサブタイプとして構築する。
【表３】
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【０１０１】
実施例３：抗体ハイブリドーマ細胞配列およびヒト化抗体分子構築および親和性成熟
１. 抗体ハイブリドーマ細胞配列
ＲＮＡを、トリゾール試薬を使用してモノクローナルハイブリドーマ細胞から単離した。ＰＤ−１キメラ抗体のＶＨおよびＶＬを次のとおり増幅させた。ＲＮＡを、ここに記載する逆転写酵素を使用して、まずｃＤＮＡに逆転写させる。
【表４】
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【表５】
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【０１０２】
得られたｃＤＮＡを、続く所望の遺伝子に特異的なプライマーを使用するＰＣＲ増幅で鋳型として使用した。ＰＣＲ反応を次のとおり実施した。
【表６】
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【表７】
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【０１０３】
得られたＰＣＲ産物(１０μL)をｐＭＤ１８−Ｔベクターとライゲートした。上位１０コンピテント細胞を１０μLのライゲーション産物で形質転換した。陽性クローンを、Ｍ１３−４８およびＭ１３−４７プライマーを使用するＰＣＲと続く配列決定により確認した。
【０１０４】
２. ヒト化抗体分子構築
ハイブリドーマからのラット抗ＰＤ−１抗体を、ＰＤ−１への抗ＰＤ−１抗体結合の高い親和性および特異性により選択し、ヒト化して、ヒト抗体配列との相同性を改善した。該ヒト化法の利用はＣＤＲ移植技術と称される。ＦＲ領域およびＣＤＲ領域などの抗体の可変領域遺伝子をＫＡＢＡＴ系およびＩＭＧＴ系により分けた。抗体データベースにおいて、結合配列相同性のアラインメントおよび構造類似性に基づき、ネズミ科領域ＦＲ１−３の遺伝子をヒト化可変領域ＦＲ１−３に置き換え、ネズミ科遺伝子の領域ＦＲ４を最も類似する構造を有したＪＨおよびＪＫ遺伝子由来のヒト化ＦＲ４領域で置き換えた。鋳型配列検証およびコドン最適化後、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を合成し、発現ベクターにクローン化し、次いでヒト化抗体を発現させた。
【０１０５】
細胞表面ヒトおよびマウスＰＤ−１への結合能により、W3052_r16.88.9およびW3052_r16.81.3をヒト化のために選択した。表２は、ヒト化スコアの分析を示す。クローンW3052-16.88-z9-IgG4(42720)を、良好な親和性およびヒト化スコアなどの全てのこれらの因子を考慮して、親和性成熟のために選択した(表４)。
【０１０６】
【表８】
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【表９】
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【０１０７】
３. 親和性成熟
親クローンの３相補性決定領域(ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＫ  ＣＤＲ１およびＶＫ  ＣＤＲ３)の各アミノ酸を、ハイブリダイゼーション突然変異誘発法を使用して他の２０アミノ酸に個々に変異させた。２０アミノ酸をコードするＮＮＳコドンを含むＤＮＡプライマーを、各標的ＣＤＲ位置に変異を導入するために使用した。個々の縮重プライマーをハイブリダイゼーション突然変異誘発反応に使用した。簡潔には、各縮重プライマーをリン酸化し、次いで、ウリジニル化ｓｓＤＮＡと１０：１比で使用した。混合物を８５℃で５分加熱し、次いで１時間かけて５５℃に冷却した。その後、Ｔ４リガーゼおよびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを加え、混合物を１.５時間、３７℃でインキュベートした。ＶＨ  ＣＤＲおよびＶＬ  ＣＤＲの合成産物をそれぞれプールした。一般に、２００ngの該プールしたライブラリーＤＮＡをＢＬ２１細菌叢でのプラーク形成またはｓｃＦｖフラグメント産生のためにＢＬ２１に電気穿孔した。
【０１０８】
一次スクリーニングは、９６ウェルプレート(深ウェル)で増殖させた細菌のペリプラズム抽出物(ＰＥ)を使用して実施したシングル・ポイントＥＬＩＳＡ(ＳＰＥ)アッセイからなった。簡潔には、この捕捉ＥＬＩＳＡは、９６ウェルMaxisorp Immunoplateの個々のウェルを、ｐＨ９.２のコーティング緩衝液(２００mM  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３)中の抗ｃ−ｍｙｃ抗体で一夜、４℃でコーティングすることを含んだ。翌日、プレートをカゼインで１時間、室温でブロッキングした。次いでｓｃＦｖ  ＰＥをプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ビオチニル化抗原タンパク質をウェルに加え、混合物を１時間、室温でインキュベートした。続いて、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートと１時間、室温でインキュベートした。ＨＲＰ活性をＴＭＢ基質で検出し、２Ｍ  ＨＣｌで反応停止させた。プレートを４５０nmで読んだ。４５０nmで親クローンより大きな光学密度(ＯＤ)シグナルを示すクローンを取り、陽性結果を確認するためにデュプリケートでＥＬＩＳＡ(上記のとおり)により再アッセイした。繰り返し親抗体より大きなシグナルを示したクローンを配列決定した。次いでＣＤＲ変化を受けた各クローンのｓｃＦｖタンパク質濃度を、既知濃度のｓｃＦｖを参照として使用する定量的ｓｃＦｖ  ＥＬＩＳＡにより決定した。ｓｃＦｖタンパク質濃度を、ＥＬＩＳＡシグナルを参照ｓｃＦｖにより生じたシグナルと比較することにより、決定した。結合アッセイを、変異体ｓｃＦｖおよび親抗体の相対的結合親和性を決定するために、正規化ｓｃＦｖ濃度下、全陽性バリアントについてもう１回繰り返した。
【０１０９】
抗原への結合に有益であることが決定されたＶＨおよびＶＬにおける点変異を、さらに組み合わせて、さらなる結合相乗効果を獲得した。組み合わせ変異体をｓｃＦｖとして発現させ、捕捉ＥＬＩＳＡを使用してスクリーニングした。４５０nmで親クローンより大きなＯＤシグナルを示すクローンを配列決定し、さらに上記のとおり結合ＥＬＩＳＡで確認した。
【０１１０】
親和性成熟後、計１０個のヒト化抗体(２Ｅ５、２Ｇ４、１Ｇ１０、２Ｃ２、２Ｂ１、８Ｃ１０、１Ｈ６、５Ｃ４、Ａ６ＷおよびＬ１Ｉ)を得た。図２は、１回目の変異導入ライブラリースクリーニングからの結果を示した。ヒト、カニクイザルサルおよびマウスにおける１０ヒト化抗体の配列および親和性データを表５に示した。
【０１１１】
表５は、２回目の変異導入ライブラリースクリーニングからの結果を示した。クローン１Ｈ６、２Ｅ５、２Ｇ４および２Ｃ２を、さらなる分析のために選択した。
【表１０】
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【０１１２】
４. 抗体精製
親和性成熟ヒト化抗体を含むベクターを、抗体産生および発現のために２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。２９３Ｆ細胞の上清の抗体を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。
【０１１３】
実施例４：ヒト化抗体の特徴付け
１. ヒト、カニクイザルおよびマウスＰＤ−１への交差反応性(異種間)
１.１  ＦＡＣＳ
交差反応性をＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡにより測定した。ＦＡＣＳについて、抗ＰＤ−１抗体を、実施例２.３に記載のとおり細胞表面ヒト、マウスおよびカニクイザルＰＤ−１への結合について試験した。
図３は、ＦＡＣＳによる異種間試験の結果を示した。図３Ａは、ヒトＰＤ−１トランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞への結合を示した。抗体は、２.２０〜２.７８nMのＥＣ５０でヒトＰＤ−１に特異的に結合し得る。図３Ｂは、マウスＰＤ−１トランスフェクト２９３Ｆ細胞への結合を示した。抗体は、１１.８〜１５.１nMのＥＣ５０でマウスＰＤ−１に特異的結合し得る。図３Ｃは、用量依存的方法での活性化カニクイザルＰＢＭＣの結合を示した。アイソタイプはヒトＩｇＧ４カッパであった。下も同様。
【０１１４】
１.２  ヒト、カニクイザルおよびマウスＰＤ−１への交差反応性(異種間)
ＥＬＩＳＡについて、プレート(Nunc)をヒト、１μg／mlのカニクイザルまたはマウスＰＤ−１(Sino Biological)で、一夜、４℃でコーティングした。ブロッキングおよび洗浄後、抗体をブロッキング緩衝液で連続的に希釈し、プレートに加え、室温で１時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄し、その後二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰ(Bethyl)と１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を加え、２Ｍ  ＨＣｌで反応を停止させた。４５０nmでの吸光度を、マイクロプレートリーダー(Molecular Device)を使用して読んだ。
図４は、ＥＬＩＳＡによる異種間試験の結果を示した。図４Ａは、ヒトＰＤ−１への結合を示した。図４Ｂは、マウスＰＤ−１への結合を示した。図４Ｃは、カニクイザルＰＤ−１への結合を示した。
【０１１５】
２. ヒトＰＤ−１ファミリーメンバーＣＤ２８、ＣＴＬＡ４への交差反応性
ヒトＰＤ−１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはＩＣＯＳをそれぞれ発現する構築細胞株を、２×１０５細胞／ウェルの密度で９６ウェルＵ底プレート(ＢＤ)に移した。試験抗体を洗浄緩衝液(１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ)で希釈し、細胞と４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＦＩＴＣ(Jackson ImmunoResearch Lab)を加え、４℃で暗所で１時間インキュベートした。次いで細胞を１回洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁し、フローサイトメトリー(ＢＤ)およびFlowJoソフトウェアにより分析した。
図５は、ファミリー間試験の結果を示した。抗ＰＤ−１抗体はヒトＰＤ−１に特異的に結合できるが、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４には結合しない。
【０１１６】
３. ＰＤ−１へのリガンド結合のブロッキング
３.１  抗ＰＤ−１抗体がＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１結合をブロッキングする能力を、実施例２.３に記載するＦＡＣＳにより試験した。
【０１１７】
３.２  抗ＰＤ−１抗体がＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ２結合をブロッキングする能力を、ＥＬＩＳＡにより試験した。簡潔には、プレート(Nunc)を、１μg／mlのヒトＰＤ−１で、一夜、４℃でコーティングした。抗体をブロッキング緩衝液で連続的に希釈し、ｈｉｓタグ・コンジュゲートＰＤ−Ｌ２と混合した。該コーティング済プレートのブロッキングおよび洗浄後、抗体／ＰＤ−Ｌ２混合物を該プレートに加え、次いで室温で１時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄し、続いて二次抗体ヤギ抗ｈｉｓ  ＨＲＰ(GenScript)と１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を加え、２Ｍ  ＨＣｌで反応を停止させた。４５０nmでの吸光度を、マイクロプレートリーダー(Molecular Device)を使用して読んだ。
図６Ａは、ＰＤ−１トランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞へのヒトＰＤ−Ｌ１結合をブロッキングする抗ＰＤ−１抗体の結果を示した。図６Ｂは、ＰＤ−１トランスフェクト２９３Ｆ細胞へのマウスＰＤ−Ｌ１結合をブロッキングする抗ＰＤ−１抗体の結果を示す。図７は、抗ＰＤ−１抗体が用量依存的様式でＰＤ−１へのヒトＰＤ−Ｌ２結合をsy団できたことをしめした。
【０１１８】
４. 表面プラズモン共鳴法(ＳＰＲ)により試験した完全動的結合親和性
抗体を、ProteOn XPR36(Bio-Rad)を使用するＳＰＲアッセイにより、ＰＤ−１への親和性および結合速度論について特徴付けた。プロテインＡタンパク質(Sigma)をＧＬＭセンサーチップ(Bio-Rad)にアミンカップリングにより固定した。精製抗体をセンサーチップ上を流し、プロテインＡで捕捉させた。チップを９０°回転させ、ベースラインが安定するまでランニング緩衝液(１×ＰＢＳ／０.０１％Ｔｗｅｅｎ２０、Bio-Rad)で洗浄した。７濃度のヒトＰＤ−１およびランニング緩衝液を、３０μL／分の流速で１８０秒の結合相についてセンサーチップを流し、３００秒解離が続いた。再生後、７個の濃度のマウスＰＤ−１およびランニング緩衝液を、３０μL／分の流速で１８０秒の結合相についてセンサーチップを流し、３００秒解離が続いた。各ランの後、チップをｐＨ１.５  Ｈ３ＰＯ４で再生した。結合および解離曲線を、ProteOnソフトウェアを使用して、１：１ラングミュア結合モデルにより適合させた。
表６Ａ〜６Ｂは、ＳＰＲによるヒトおよびマウスＰＤ−１への完全動的結合親和性の結果を示した。WBP305BMK1を、ＢＭＳ特許ＵＳ９０８４７７６Ｂ２からの５Ｃ４のクローンに従い、合成した。キイトルーダは、Merckからの抗ＰＤ−１薬物であった。下も同様。結果は、ＳＰＲアッセイによるヒトＰＤ−１への親和性能力は、１.４３Ｅ−８〜５.６４Ｅ−９mol／Ｌであったことを示した。WBP305BMK1およびキイトルーダと比較すると、抗体２Ｅ５、２Ｇ４または２Ｃ２のＫＤ値は遙かに小さく、２Ｅ５、２Ｇ４または２Ｃ２がヒトＰＤ−１に良好な結合能を有したことを示した。さらに、マウスＰＤ−１に対する親和性能力は、９.３７Ｅ−９〜３.８９Ｅ−９mol／Ｌであった。
【０１１９】
【表１１】
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【表１２】
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【０１２０】
５. フローサイトメトリー(ＦＡＣＳ)により試験した抗ＰＤ−１抗体の細胞表面ＰＤ−１分子への結合親和性
ヒトＰＤ−１を発現するＣＨＯ−Ｓ細胞またはマウスＰＤ−１を発現する２９３Ｆ細胞を、１×１０５細胞／ウェルの密度で９６ウェルＵ底プレート(ＢＤ)に移した。試験抗体を、洗浄緩衝液(１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ)で１：２連続希釈し、細胞と４℃で１時間インキュベートした。二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＦＩＴＣ(ＩｇＧモルあたり３.０モルＦＩＴＣ(Jackson ImmunoResearch Lab))を加え、４℃で暗所で１時間インキュベートした。次いで細胞を１回洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁し、フローサイトメトリー(ＢＤ)により分析した。蛍光強度を、定量的ビーズに基づき、結合分子／細胞に変換した(QuantumTM MESF Kits, Bangs Laboratories, Inc.)。ＫＤをGraphpad Prism5を使用して計算した。
表７Ａ〜７Ｂは、フローサイトメトリーにより試験した細胞表面ヒトおよびマウスＰＤ−１分子への抗ＰＤ−１抗体の結合親和性の結果を示す。結果は、ＦＡＣＳアッセイによるヒトＰＤ−１への親和性能力が３.８０Ｅ−１０〜２.１５Ｅ−１０mol／Ｌであったことを示した。さらに、マウスＰＤ−１への親和性能力は５.３９Ｅ−８〜１.７４Ｅ−８mol／Ｌであった。
【０１２１】
【表１３】
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【表１４】
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【０１２２】
６. エピトープ・ビニング試験
抗ＰＤ−１抗体の結合エピトープを、ＦＡＣＳによりベンチマーク抗体ＡおよびＢと比較した。細胞表面にヒトＰＤ−１を発現するＣＨＯ−Ｓ細胞をビオチニル化ベンチマーク抗体ＡまたはＢ(１μg／ml)および試験抗体(洗浄緩衝液で連続的に希釈)の混合物と、４℃で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、第二抗体ストレプトアビジン−ＰＥを加え、３０分、４℃でインキュベートした。次いで細胞を１回洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁し、フローサイトメトリー(ＢＤ)により分析した。
【０１２３】
図８Ａ〜８Ｂは、抗ＰＤ−１抗体がベンチマーク抗体と同じまたは近いエピトープビンにあることを示唆する、エピトープビニングアッセイの結果を示した。図８Ａは、WBP305BMK1(ＵＳ９０８４７７６)に対するビニングを示した。図８Ｂは、キイトルーダ(ＵＳ８１６８７５７)に対するビニングを示した。
【０１２４】
さらに、ｈＰＤ−１でのアラニン走査実験を行い、その抗体結合への影響を評価した。ｈＰＤ−１のアラニン残基をグリシンコドンに変異させ、他の全ての残基をアラニンコドンに変異させた。ＨＰＤ−１細胞外ドメイン(ＥＣＤ)の各残基について、点アミノ酸置換を、２つの連続的ＰＣＲ工程を使用して行った。ヒトＰＤ−１のＥＣＤおよびＣ末端ＨｉｓタグをコードするpcDNA3.3-hPD-1_ECD.Hisプラスミドを鋳型とて使用し、一式の変異原性プライマーを、QuikChange電撃性多部位特異的突然変異誘発キット(Agilent technologies, Palo Alto, CA)を使用する、第一段階ＰＣＲに使用した。Ｄｐｎ  Ｉエンドヌクレアーゼを、変異鎖合成反応後親鋳型の消化に使用した。第二段階ＰＣＲにおいて、ＣＭＶプロモーター、ＰＤ−１の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)、Ｈｉｓタグおよび単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(ＴＫ)ポリアデニル化からなる線形ＤＮＡ発現カセットを増幅させ、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞(Life Technologies, Gaithersburg, MD)に一過性に発現させた。
【０１２５】
モノクローナル抗体W3052_r16.88.9およびキイトルーダを、ＥＬＩＳＡ結合アッセイのためにプレートコーティングさせた。定量化ＰＤ−１変異体またはヒト／マウスＰＤ−１＿ＥＣＤ.Ｈｉｓタンパク質(Sino Biological, China)を含む上清とインキュベート後、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体を検出抗体として加えた。吸光度を、対照変異体の平均に対して正規化した。結合倍率変化に対するさらなるカットオフ(＜０.５５)設定後、最終的に決定されたエピトープ残基が同定された。
【０１２６】
抗体W3052_r16.88.9およびキイトルーダのヒトおよびネズミ科両者のＰＤ−１への結合活性を行った(図９)。W3052_r16.88.9は、ｈＰＤ−１およびｍＰＤ−１の両者への結合が見られたが、キイトルーダはヒトのものにしか結合しなかった(図９)。W3052_r16.88.9のこの特有の機能的交差反応性は、前臨床試験における薬物安全性評価の際のより多くの動物モデル選択肢の提供に役立つ。観察された結合挙動の原因を探索するために、両抗体のエピトープマッピングを実施した。
【０１２７】
抗体結合が有意に減少した上位３０の点置換ｈＰＤ−１変異体を表８に示した。ｈＰＤ−１結晶構造のこれら全残基の位置の確認(ＰＤＢコード３ＲＲＱおよび４ＺＱＫ)により、一部アミノ酸(例えばＶａｌ１４４、Ｌｅｕ１４２、Ｖａｌ１１０、Ｍｅｔ１０８、Ｃｙｓ１２３など)がタンパク質に完全に埋没しており、あらゆる抗体と直接接触しそうにないことが確認された。観察された結合減少は、アラニン置換後のｈＰＤ−１構造の不安定性または崩壊に由来することが最も可能性があった。抗原構造分析により、残基の一部、例えばＶ１４４およびＬ１４２は結合活性に関与しないが、ｈＰＤ−１構造の安定性に応答することが期待される。両抗体に影響する変異体を、偽ホットスポットとして処理し、リストから除いた。結合倍率変化に対するさらなるカットオフ(＜０.５５)設定後、最終的に決定されたエピトープ残基を表９にリストした。W3052_r16.88.9について９位置およびキイトルーダについて５位置ある。
【０１２８】
表９におけるW3052_r16.88.9およびキイトルーダのエピトープ残基の比較は、２つの重複ホットスポット残基しか明らかにしなかった。残りはかなり違うように見え、２抗体がｈＰＤ−１結合およびｈＰＤ−Ｌ１ブロッキングの観点で、極めて異なる機構を採用しているはずであることを示す。表９における残基ＩＤの読み出しは、機構の解釈に直接的ではない。それ故に、表９における全データおよびｈＰＤ−Ｌ１結合部位を、良好な可視化および比較を得るために、ｈＰＤ−１の結晶構造上にマッピングした(図１０)。
【０１２９】
【表１５】
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ａ  結合の変化倍率は、数サイレントアラニン置換の結合に対する。
【０１３０】
【表１６】
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カットオフ：変化倍率＜０.５５
＊  ｍＰＤ−１で観察されたＣ’’鎖はｈＰＤ−１構造に存在しない。このβシートは、ｈＰＤ−１の無構造ループに置き換えられる。我々は、単にｍＰＤ−１との比較を容易にする目的のみで、この領域の標識のためにＣ’’をなお使用する。
【０１３１】
２つの調査抗体W3052_r16.88.9およびキイトルーダは、両者がｈＰＤ−１結合およびｈＰＤ−Ｌ１ブロッキングに機能的であるが、明らかに異なるエピトープを有する(図１０Ｂ、１０Ｃ)。キイトルーダのエピトープは、主にＰＤ−Ｌ１結合部位と決して交わらないＣ’Ｄループ(ＰＤ−１上のＣ’’鎖に対応)の残基により寄与された。これは、キイトルーダのｈＰＤ−Ｌ１ブロッキング機能が、抗体サイズにより提供される立体障害効果により依存することを示唆した。対照的に、エピトープマッピング結果は、抗体W3052_r16.88.9のエピトープが複数部位にまたがり分散され、ｈＰＤ−Ｌ１結合部位と直接重複するホットスポットからなったことを示す(図１０Ａ、１０Ｂ)。W3052_r16.88.9は、ｈＰＤ−Ｌ１を、共通結合部位への反応により、ｈＰＤ−Ｌ１と競合する手段によりブロッキングした。その上、W3052_r16.88.9は、ヒトおよびネズミ科ＰＤ−１が大きな構造差異を示す、柔軟性Ｃ’Ｄループ(または対応するＰＤ−１上のＣ’’鎖)と相互作用を有さなかった(図１１)。その結合部位は、大部分ＦＧループに位置した(Lin et al. (2008) PNAS 105: 3011-3016)。これは、なぜW3052_r16.88.9が両ＰＤ−１種に結合でき、一方キイトルーダがヒトのものにしか結合しないのかを説明する(図９)。この特有の機能的交差反応性により、W3052_r16.88.9の前臨床安全性評価がマウスモデルで実施でき、これは、開発を大きく単純化し、加速させる。全体的に見て、抗体W3052_r16.88.9は、キイトルーダより機能的であり、開発可能であることが予測される。
【０１３２】
７. 細胞ベースのアッセイにより試験した抗ＰＤ−１抗体のインビトロ機能
７.１  混合リンパ球反応(ＭＬＲ)を、抗ＰＤ−１抗体のＴリンパ球機能への影響の試験に使用した
ヒトＤＣ、ＣＤ４＋  Ｔ、ＣＤ８＋  Ｔおよび総Ｔ細胞単離：ヒトＰＢＭＣを、Ficoll-Paque PLUS(ＧＥ)勾配遠心分離を使用して健常ドナーから新たに単離した。単球を、製造業者の指示に従い、Human Monocyte Enrichment Kit(StemCell)を使用して単離した。細胞を、ｒｈＧＭ−ＣＳＦおよびｒｈＩＬ−４を含む培地で５〜７日培養し、樹状細胞を産生させた。ＭＬＲ１８〜２４時間前、１μg／mL  ＬＰＳを培養に添加して、ＤＣの成熟を誘発させた。ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞を、製造業者のプロトコールに従い、Human CD4+ T Cell Enrichment Kit(StemCell)を使用して単離した。マウスＣＤ４＋  Ｔ細胞を製造業者のプロトコールに従いMouse CD4+ T Cell Isolation Kit(StemCell)を使用して、Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓から得た。マウスＤＣを、ｒｍＧＭ−ＣＳＦおよびｒｍＩＬ−４を含む培地中、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄細胞から、５〜７日誘発させた。ＭＬＲ１８〜２４時間前、１μg／mL  ＬＰＳを培養に加えて、ＤＣの成熟を誘発した。
【０１３３】
簡潔には、一次樹状細胞(ＤＣ)刺激ＭＬＲを９６ウェル、Ｕ底組織培養プレートで、１０％ＦＣＳおよび１％抗生物質を含む２００μLのＲＰＭＩ  １６４０中、実施した。ＤＣを、１：１０〜１：２００  ＤＣ：Ｔ細胞比で、試験抗体またはベンチマーク抗体(１６６.７５nMから０.００６６７nMまで下がる、一般に全６濃度)存在下または非存在下、１×１０５  ＣＤ４＋  Ｔ細胞と混合した。Ｔ細胞機能に対する抗ＰＤ−１抗体の影響を決定するために、サイトカイン産生およびＴ細胞増殖を決定した。示す結果は、実施した最小５実験の代表である。
【０１３４】
サイトカイン検出：ヒトＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を、適合抗体対を使用する酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)により測定した。プレートを、それぞれヒトＩＦＮ−γ(cat# Pierce-M700A)またはＩＬ−２(cat# R&D-MAB602)特異的な捕捉抗体でプレコートした。ビオチンコンジュゲ-ト抗ＩＦＮ−γ抗体(cat# Pierce-M701B)または抗ＩＬ−２抗体(cat# R&D-BAF202)を検出抗体として使用した。
図１２Ａは、抗ＰＤ−１抗体が用量依存的様式でＩＬ−２分泌を増加させたことを示した。図１２Ｂは、抗ＰＤ−１抗体が用量依存的様式でＩＦＮ−γ分泌を増加させることを示す。
【０１３５】
増殖アッセイ：３Ｈ−チミジン(cat# PerkinElmer- NET027001MC)を、０.９％ＮａＣｌ溶液で１：２０に希釈し、細胞培養プレートに０.５μCi／ウェルで加えた。プレートを、５％ＣＯ２で３７℃で１６〜１８時間培養し、増殖細胞への３Ｈ−チミジン取り込みを決定した。図１２Ｃは、抗ＰＤ−１抗体が用量依存的様式でＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖を増加させることを示す。
抗ＰＤ−１抗体のマウスＴ細胞機能に対する効果を決定するために、サイトカイン産生およびマウスＴ細胞増殖を同様に決定した。図１３Ａ〜１３Ｃは、抗ＰＤ−１抗体がマウスＣＤ４＋  Ｔ細胞機能を増強できることを示す、マウスアロＭＬＲの結果を示した。図１３Ａは、抗ＰＤ−１抗体が用量依存的様式でＩＬ−２分泌を増加させたことを示した。図１３Ｂは、抗ＰＤ−１抗体が用量依存的様式でＩＦＮ−γ分泌を増加させたことを示した。図１３Ｃは、抗ＰＤ−１抗体が用量依存的様式でＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖を増加させたことを示した。
【０１３６】
７.２  自己抗原特異的免疫応答による細胞増殖およびサイトカイン産生に対するヒト抗ＰＤ−１抗体の効果
このアッセイにおいて、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＤＣは、同じドナー由来であった。簡潔には、ＣＤ４＋  Ｔ細胞をＰＢＭＣから精製し、ＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチドおよび低用量のＩＬ−２(２０Ｕ／mL)存在下培養し、その間にも、ＤＣを同一ドナーのＰＢＭＣからの単球のＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４中の培養により産生した。５日後、ＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチド処理ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ヒト抗ＰＤ−１抗体またはベンチマーク抗体(対照として)存在下または非存在下、ＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチドを瞬間適用したＤＣと共培養した。５日目、１００μLの上清を、上記のとおりＥＬＩＳＡによるＩＦＮ−γ測定のために、各培養から取った。ＣＭＶ  ｐｐ６５特異的Ｔ細胞の増殖を、上記のとおり３Ｈ−チミジン取り込みにより評価した。
図１４Ａ〜１４Ｂは、抗ＰＤ−１抗体がヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞の機能を増強できることを示す、ヒト自己ＭＬＲの結果を示した。図１４Ａは、抗ＰＤ−１抗体が用量依存的様式でＩＦＮ−γ分泌を増加させることを示した。図１４Ｂは、抗ＰＤ−１抗体が用量依存的様式でＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖を増加させることを示した。
【０１３７】
７.３  制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)抑制機能に対するヒト抗ＰＤ−１抗体の効果
Ｔ細胞の亜集団であるＴｒｅｇは、重要な免疫モジュレーターであり、自己耐容性維持に重要な役割を有する。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇの数の増加が、複数の癌の患者で見られ、より不良な予後と相関した。抗ＰＤ−１抗体がＴｒｅｇの免疫抑制的役割に影響するか否かを決定するために、Ｔｒｅｇ存在下、抗ＰＤ−１抗体処置を施したまたは施していないＴ細胞機能を比較した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋およびＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を、製造業者の指示に従い特異的抗ＣＤ２５マイクロビーズ(StemCell)を使用して分離した。２０００成熟ＤＣ、１×１０５  ＣＤ４＋ＣＤ２５−  Ｔ細胞、１×１０５  Ｔｒｅｇ細胞およびＰＤ−１抗体を、９６ウェルプレートでインキュベートした。プレートを３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターに５日間維持した。ＩＦＮ−γ産生およびＣＤ４＋ＣＤ２５細胞増殖を、上記のとおり試験した。
図１５は、抗ＰＤ−１抗体がＴｒｅｇの抑制機能を逆転できることを示す。図１５Ａは、抗ＰＤ−１抗体がＩＦＮ−γ分泌を回復できることを示した。図１５Ｂは、抗ＰＤ−１抗体がＴ細胞増殖を回復できることを示した。
【０１３８】
８. ＡＤＣＣおよびＣＤＣ試験
ＰＤ−１は、多様な細胞型で発現される。健常ＰＤ−１陽性細胞への毒性の可能性を最小化するために、抗ＰＤ−１抗体を、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)および補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)に介在する能力について評価した。
【０１３９】
８.１  ＡＤＣＣ試験
ヒト活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞および種々の濃度のＰＤ−１抗体を９６ウェルプレートで３０分プレインキュベートし、次いでＰＢＭＣをエフェクター／標的比５０：１で加えた。プレートを、３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターに６時間維持した。標的細胞溶解を、ＬＤＨベースの細胞毒性検出キット(cat# Roche-11644793001)により決定した。４９２nmでの吸光度を、マイクロプレートリーダー(Molecular Device)を使用して読んだ。ハーセプチン誘発ＳＫ−Ｂｒ−３細胞溶解を陽性対照として使用した。
図１６は、抗ＰＤ−１抗体が活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞のＡＤＣＣ活性に介在しなかったことを示す、ＡＤＣＣ試験の結果を示した。
【０１４０】
８.２  ＣＤＣ試験
ヒト活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞および種々の濃度のＰＤ−１抗体を９６ウェルプレートで混合した。ヒト補体(Quidel-A112)を１：５０の希釈比で加えた。プレートを、３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターに２時間維持した。標的細胞溶解を、CellTiter-Gloにより決定した。リツキサン(登録商標)誘発Ｒａｊｉ細胞溶解を陽性対照として使用した。発光を、マイクロプレートリーダー(Molecular Device)を使用して読んだ。
図１７は、抗ＰＤ−１抗体が活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞のＣＤＣ活性に介在しなかったことを示す、ＣＤＣ試験の結果を示した。
【０１４１】
実施例５：ヒトＰＤ−１に対するモノクローナル抗体を使用するインビボ腫瘍モデルの処置
１. 実験設計
【表１７】
2019536432.tif 000019
注：
１Ｎ：各群のマウス数
２用量−体積：マウスの体重により１０μL／ｇ。体重減少が１５％を超えたら、投与レジメンをそれに応じて調節すべきである。
【０１４２】
２. 方法
２.１  細胞培養
マウス黒色腫細胞CloudmanS91細胞(ATCC-CCL-53.1)を、単層としてインビトロで培養し、培養条件は、２.５％ＦＢＳおよび１５％ウマ血清、１００Ｕ／mLペニシリンおよび１００μg／mLストレプトマイシン添加Ｆ−１２Ｋ培地であり、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを使用して消化させ、週に２回定期的に継代した。約８０％〜９０％コンフルエントおよび必要な数になったとき、細胞を採取し、計数し、次いで接種した。
【０１４３】
２.２  腫瘍細胞の注入
０.１mL(５×１０５細胞)CloudmanS91細胞を、各動物の右背部に皮下的に接種した。腫瘍体積平均が約６４mm３に達したとき、投与を群で開始した。群分けおよび投与レジメンは表１０に示した。
【０１４４】
２.３  腫瘍試験および指数
実験指数は、腫瘍増殖が阻止されたか、遅延されたかまたは治癒したかの試験である。腫瘍直径を、週３回ノギスで測定した。腫瘍体積をＶ＝０.５ａ×ｂ２(式中、ａおよびｂは、それぞれ腫瘍の長径および短径を表す)を使用して、計算する。
【０１４５】
抗体の抗腫瘍有効性を、腫瘍増殖阻害ＴＧＩ(％)または相対的腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ(％)により評価した。ＴＧＩ(％)は腫瘍増殖阻害の率を反映した。ＴＧＩ(％)を次のとおり計算した。ＴＧＩ(％)＝[(１−(処置群投与終了時の平均腫瘍体積−処置群投与開始時の平均腫瘍体積))／(溶媒対照群投与終了時の平均腫瘍体積−溶媒対照群投与開始時の平均腫瘍体積)]×１００％。
【０１４６】
相対的腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ(％)を次のとおり計算した。Ｔ／Ｃ％＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％(ＴＲＴＶ：処置群ＲＴＶ；ＣＲＴＶ：陰性対照群ＲＴＶ)。相対的腫瘍体積(ＲＴＶ)を、ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０(式中、Ｖ０は群分け時の平均腫瘍体積(すなわち、ｄ０)であり、Ｖｔはある測定点の平均腫瘍体積であり；ＴＲＴＶおよびＣＲＴＶのデータを同じ日に取った)を使用して、腫瘍測定結果に従い計算した。
【０１４７】
Ｔ−Ｃ(日)は、腫瘍増殖遅延指数を表し、Ｔは処置群において腫瘍が予定した体積(例えば３００mm３)に到達したときに経過した平均日数を表し、Ｃは対照群の腫瘍が同一体積に到達したときの平均日数を表した。
【０１４８】
生存曲線をプロットし；動物生存期間を、投与から動物が死亡するまでまたは腫瘍体積が２０００mm３に到達するまでの時間として定義した。中央生存期間(日)を各群で計算した。延長された生存期間(ＩＬＳ)を、処理群とモデル対照群の中央生存期間の比較により計算し、モデル対照群の生存期間を超えるパーセンテージとして計算した。
【０１４９】
２.４  統計分析
各群の各時点の平均腫瘍体積および標準誤差(ＳＥＭ)を含むデータを、統計的に分析した(特定のデータについては表１１参照のこと)。実験は、投与後３７日目に完了した；投与後１３日目、動物を連続的に屠殺した；それ故、群間差異の統計分析および評価は、投与開始後１３日目の腫瘍体積。２群間比較について、データをＴ検定を使用して分析した；３群以上の間の比較について、データを一元配置ＡＮＯＶＡを使用して分析した。Ｆ値について統計的有意差が見られたら、データをゲイムス・ハウエル検定を使用して分析した。Ｆ値について統計的有意差が見られなかったら、ダネット(両側)検定を分析に使用した。ＳＰＳＳ  １７.０を全データ分析に使用した。ｐ＜０.０５を有意差として見なした。生存期間をカプラン・マイヤー法とログ・ランク検定を使用して、分析した。
【０１５０】
３. 結果
３.１  死亡率、罹病率および体重変化
動物の体重は、薬物毒性の測定のための間接的基準である。２Ｅ５のCloudmanS91皮下同系異種移植雌ＤＢＡ／２マウスモデルの体重に対する影響を図１８および図１９に示した。このモデルにおいて、全投与群は、有意な体重減少を示さなかった(図１８)。それ故に、２Ｅ５は黒色腫CloudmanS91のマウスモデルに明白な毒性は示さない。
【０１５１】
３.２  腫瘍体積
２Ｅ５処置後のCloudmanS91皮下同系異種移植雌ＤＢＡ／２マウスモデルの腫瘍体積を表１１に示した。
【表１８】
2019536432.tif 000020
注：
ａ. 平均±ＳＥＭ；
ｂ. 投与後日数。
【０１５２】
３.３  腫瘍増殖曲線
腫瘍増殖曲線を図２０に示した。
【０１５３】
３.４  抗腫瘍有効性評価
【表１９】
2019536432.tif 000021
注：
ａ. 平均±ＳＥＭ；
ｂ. 腫瘍増殖阻害を、Ｔ／ＣおよびＴＧＩ(ＴＧＩ(％)＝[１−(Ｔ１３−Ｔ０)／(Ｖ１３−Ｖ０)]×１００)により計算した；
ｃ. ｐ値を腫瘍体積により計算した。
【０１５４】
３.５  生存曲線ｓ
各群の生存曲線を図２１に示した。
【０１５５】
３.６  生存期間
【表２０】
2019536432.tif 000022
注：
ａ. ｐ値は、処置群と媒体対照群の間の比較を表した；
ｂ. 実験終了時、３mg／kg群(２Ｅ５)において、生存率は６６.７％であった。
【０１５６】
４. 考察
本試験において、CloudmanS91同系腫瘍モデルにおける２Ｅ５のインビボ有効性を評価した。種々の時点での各群の腫瘍体積を表１１、表１２および図２０に示し、生存期間を図２１および表１３に示した。投与後１３日目、溶媒対照群における腫瘍担持マウスの腫瘍体積は１,６２６mm３に達した。対照群と比較して、１mg／kg  ２Ｅ５群で弱い阻害効果が観察され、腫瘍体積は１,０８９mm３(Ｔ／Ｃ＝６８.１％、ＴＧＩ＝３４.４％、ｐ＝０.３６７)であり、腫瘍増殖遅延は０日であった。溶媒対照群と比較して、有意な抗腫瘍効果が３mg／kg  ２Ｅ５群で観察され、腫瘍体積は３６１mm３(Ｔ／Ｃ＝２２.９％、ＴＧＩ＝８１.０％、ｐ＝０.００８)であり、腫瘍増殖遅延は５日であった。溶媒対照群と比較して、有意な抗腫瘍効果が１０mg／kg  ２Ｅ５群でも観察され、腫瘍体積は６１４mm３(Ｔ／Ｃ＝３９.４％、ＴＧＩ＝６４.７％、ｐ＝０.０３６)であり、腫瘍増殖遅延は５日であった。
【０１５７】
本実験において、溶媒対照群における腫瘍担持マウスの中央生存期間は１６日であった。媒体対照群と比較して、１mg／kg  ２Ｅ５群における腫瘍担持マウスの中央生存期間は２０日であり、生存は２５％(ｐ＝０.０７７)延長され；３mg／kg  ２Ｅ５群における腫瘍担持マウスの生存率は６６.７％(ｐ＝０.００１)であった。１０mg／kg  ２Ｅ５群における腫瘍担持マウスの中央生存期間は３２日であり、生存は１００％(ｐ＝０.０２２)延長された。
【０１５８】
ヌードマウスの体重変化を図１９に示した。薬物２Ｅ５の良好な忍容性が全腫瘍担持マウスで見られ、全処置群で有意な体重減少は観察されなかった。要約すると、この実験において、有意な抗腫瘍効果が、CloudmanS91皮下同系腫瘍モデルについて、３mg／kg群および１０mg／kg群の両方で示され、これは用量依存性ではなかった。３mg／kg群における抗腫瘍効果は１０mg／kg群より良好であった。
【０１５９】
本発明の説明が、上記の実施例によりなされている。しかしながら、本発明が実施例に限定されないことは、当業者により理解される。本発明は、その精神または本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の形態に具現化され得る。それ故に、本発明の範囲は、上記の説明ではなく、添付する特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲に入る全ての変化が本発明の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
2019536432.tif 000023
【図２】
2019536432.tif 000024
【図３】
2019536432.tif 000025
【図４】
2019536432.tif 000026
【図５】
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【図６】
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【図７】
2019536432.tif 000029
【図８】
2019536432.tif 000030
【図９】
2019536432.tif 000031
【図１０】
2019536432.tif 000032
【図１１】
2019536432.tif 000033
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2019536432.tif 000036
【図１５】
2019536432.tif 000037
【図１６】
2019536432.tif 000038
【図１７】
2019536432.tif 000039
【図１８】
2019536432.tif 000040
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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