(57)【要約】  本開示は、例えば固形腫瘍などのがんを治療する、組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、例えば赤血球系細胞の固形腫瘍への浸透を促進するポリペプチドなどの外因性ポリペプチドを発現する、赤血球系細胞を含んでなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の除核赤血球系細胞を含んでなる製剤の有効量を対象の血流に投与するステップを含んでなる、例えば結合剤などの薬剤を対象の血管外部位に送達する方法であって、前記複数の各細胞が、その表面上に、例えば腫瘍抗原などの前記血管外部位に存在する抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる、外因性ポリペプチドを含んでなり、
それによって例えば結合剤などの薬剤を前記血管外部位に送達する、方法。
【請求項２】
複数の除核赤血球系細胞を含んでなる製剤を対象に（例えば対象の血流に）投与するステップを含んでなる、例えば難治性または再発性などの耐性のあるがんを有する対象を治療する方法であって、
前記複数の各細胞が、その表面上に、例えば腫瘍細胞抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドを前記がんを治療するのに十分な量で含んでなり、
それによって前記がんを治療する、方法。
【請求項３】
複数の除核赤血球系細胞を含んでなる製剤を対象の血流に投与するステップを含んでなる、対象の血管化固形腫瘍を治療する方法であって、
複数の各細胞が、その表面上に、例えば腫瘍細胞抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドを前記血管化固形腫瘍を治療するのに十分な量で含んでなり、
それによって前記血管化固形腫瘍を治療する、方法。
【請求項４】
前記外因性ポリペプチドが、膜貫通ドメインおよび抗体を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体がｓｃＦｖである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が抗ＣＤ２０抗体であり、前記腫瘍抗原がＣＤ２０である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が抗ＰＤ−Ｌ１抗体であり、前記腫瘍抗原がＰＤ−Ｌ１である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記外因性ポリペプチドが、１０４、１０５、または１０６を超えるコピー数で存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記赤血球系細胞が第２の外因性ポリペプチドをさらに含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記がんが機能的カスパーゼアポトーシス経路を欠いている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記がんが表８の変異を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記がんが表１の抗体治療薬に対して耐性である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の除核赤血球系細胞が、（ａ）腫瘍サイズの減少、（ｂ）腫瘍増殖速度の低下、（ｃ）腫瘍細胞死の増加、（ｄ）腫瘍進行の減少、（ｅ）転移数の減少、（ｆ）転移率の低下、（ｇ）腫瘍再発の減少、（ｈ）対象の生存率の増加、（ｉ）対象の無増悪生存期間の延長の１つ（またはそれ以上、例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上）をもたらすのに有効な量および時間で投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の除核赤血球系細胞が、例えばＢ細胞などの標的がん細胞に、例えばカスパーゼ非依存性アポトーシスおよび／またはカスパーゼ依存性アポトーシスなどのアポトーシスをもたらすのに有効な量および時間で投与される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が抗ＣＤ２０抗体であり、前記複数の除核赤血球系細胞が前記がん細胞の表面上のＣＤ２０の超架橋を誘導する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）前記腫瘍に内在する外因性タンパク質を発現する前記除核赤血球系細胞と、（ｉｉ）前記対象の血流中の外因性タンパク質を発現する前記除核赤血球系細胞の数との比率が、例えば前記腫瘍内の赤血球系細胞蓄積のピーク時に１：１を超える、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
（ｉ）外因性タンパク質を発現する前記除核赤血球系細胞と、（ｉｉ）前記腫瘍内の内在性赤血球系細胞との比率が少なくとも２：１である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍に存在する例えば抗体などの結合剤の量が、例えば遊離抗体などの、例えば赤血球系細胞に会合していない抗体などの、その他の点では類似した結合剤の量よりも少なくとも２倍多い、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
外因性タンパク質を発現する前記除核赤血球系細胞の前記腫瘍内の持続性が、前記結合剤を欠くその他の点では類似した除核赤血球系細胞と比較して少なくとも２倍増加している、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象がヒト対象である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１６年１２月２日に出願された米国特許出願第６２／４２９，２７５号明細書の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
赤血球は、例えば、毒性代謝物を分解するための、または生体異物を不活性化するための、および他の生物医学的用途における、薬物送達系としての使用が検討されている。
【０００３】
配列表
本出願は、その内容全体が参照により援用される、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含む。２０１７年１２月１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｒ２０８１−７０１８ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは２２０，０５７バイトである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、例えばがん細胞を滅殺することによって、および／またはがんに対する免疫応答を刺激することによって、がんを治療するための細胞系を含む。固形腫瘍の治療における一課題は、治療薬、特に細胞療法のような大型の薬剤が、時に腫瘍塊に浸透できないことである。本開示は、とりわけ、結合剤を含んでなる赤血球系細胞が血管系に送達され得て、次に血管系外に出て固形腫瘍に蓄積することを示す。本開示はまた、抗がん剤（例えば抗体）を含んでなる赤血球系細胞が、抗体単独に耐性のあるがんを治療し得ることも示す。したがって、本開示は、例えば固形腫瘍に浸透させるための細胞系に関連する、組成物および方法を提供する。
【０００５】
いくつかの実施形態では、細胞系は、標的化機能、がん細胞殺滅機能、免疫チェックポイント阻害、および／または同時刺激を有する、１つまたは複数の外因性ポリペプチドを発現する赤血球系細胞に関与する。
【０００６】
本開示は、いくつかの態様では、複数の赤血球系細胞（例えば本明細書に記載の赤血球系細胞）を含んでなる製剤を対象に投与するステップを含んでなる、がん（例えば本明細書に記載のがん）を有する対象を治療する方法を提供し、各赤血球系細胞は、抗がん剤（例えば本明細書に記載の抗がん剤）を含んでなる。抗がん剤は、腫瘍部分に結合する薬剤（例えばポリペプチド、例えば細胞表面腫瘍部分に結合する抗体）および／または例えば免疫賦活性サイトカイン、腫瘍飢餓酵素（例えばアスパラギナーゼ、メチオニンγリアーゼ、またはセリンデヒドロゲナーゼ）、細胞傷害性小分子、放射性核種、化学療法薬、毒素、小分子、タンパク質治療薬、がんワクチン、チェックポイントモジュレーター、アポトーシス促進剤、補体依存細胞傷害性（ＣＤＣ）刺激因子、またはその断片もしくは変異型などの抗腫瘍効果を有する薬剤であってもよい。いくつかの実施形態では、免疫賦活性サイトカインは、１型サイトカインまたは２型サイトカイン、またはその断片もしくは変異型である。いくつかの実施形態では、１つの薬剤が、腫瘍結合活性および抗腫瘍効果の双方を有し得る。いくつかの実施形態では、複数の各赤血球系細胞は、腫瘍結合剤と、抗腫瘍効果を有する異なる薬剤とを有し、薬剤は別々でありまたは連結していてもよく、例えば別々の薬剤（例えば分離ポリペプチド）または例えば融合体などの連結配列）として発現される。
【０００７】
本開示は、いくつかの態様では、例えば赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの複数の細胞を含んでなる製剤を対象に（例えば対象の血流に）投与するステップを含んでなる、例えば難治性または再発性などの耐性のあるがんを有する対象を治療する方法を提供し、
複数の各細胞は、その表面上に、例えば腫瘍細胞抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドをがんを治療するのに十分な量で含んでなり、それによってがんを治療する。
【０００８】
本開示は、いくつかの態様では、例えば赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの複数の細胞を含んでなる製剤を対象に（例えば対象の血流に）投与するステップを含んでなる、例えば結合剤などの薬剤を、例えば対象の難治性または再発性がんなどの耐性のある細胞に送達する方法を提供し、
複数の各細胞は、その表面上に、例えば腫瘍細胞抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドを含んでなり、それによって作用因子を耐性のあるがんの細胞に送達する。
【０００９】
本開示はまた、いくつかの態様では、例えば赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの複数の細胞を含んでなる製剤を対象に（例えば対象の血流に）投与するステップを含んでなる、未治療耐性がんを有する対象を治療する方法も提供し、
複数の各細胞は、その表面上に、例えば腫瘍細胞抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドをがんを治療するのに十分な量で含んでなり、それによってがんを治療する。
【００１０】
本開示はまた、いくつかの態様では、例えば赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの複数の細胞を含んでなる製剤を対象に（例えば対象の血流に）投与するステップを含んでなる、例えば結合剤などの薬剤を対象の未治療耐性がんの細胞に送達する方法も提供し、
複数の各細胞は、その表面上に、例えば腫瘍細胞抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドを含んでなり、それによって薬剤を未治療耐性がんの細胞に送達する。
【００１１】
本開示はまた、いくつかの態様では、例えば赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの複数の細胞を含んでなる製剤を対象に（例えば対象の血流に）投与するステップを含んでなる、例えば構成的プロモーターの制御下にある細胞周期遺伝子位置の転座などの発がん性変異を含んでなるがんを有する対象を治療する方法も提供し、
複数の各細胞は、その表面上に、例えば腫瘍細胞抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドをがんを治療するのに十分な量で含んでなり、それによって薬剤を未治療耐性がんの細胞に送達する。
【００１２】
本開示はまた、いくつかの態様では、例えば赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの複数の細胞を含んでなる製剤を対象に（例えば対象の血流に）投与するステップを含んでなる、例えば結合剤などの薬剤を例えば構成的プロモーターの制御下にある細胞周期遺伝子位置の転座などの発がん性変異を含んでなる対象のがん細胞に送達する方法も提供し、
複数の各細胞は、その表面上に、例えば腫瘍細胞抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドを含んでなり、それによって薬剤をがんの細胞に送達する。
【００１３】
本開示はまた、いくつかの態様では、膜貫通ドメインと腫瘍抗原に結合する結合ドメインと（例えば結合ドメインが抗ＣＤ２０抗体ドメインである）を含んでなる、融合タンパク質を含んでなる、例えば赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの細胞製剤を対象に投与するステップを含んでなる、Ｂ細胞がんを有する対象を治療する方法、または薬剤を対象のがん性Ｂ細胞に送達する方法も提供し、対象は表１から選択される抗体、例えば抗ＣＤ２０抗体に対する耐性を生じており、
ａ）操作された赤血球系細胞外面上の融合タンパク質の数は、１０４を超え、例えば２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４を超え、または１０５を超え、例えば２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、５×１０６、または１×１０７を超え（および任意選択的に最大１×１０７または１×１０８）、または約１×１０４−３×１０４、１×１０４−５×１０４、１×１０４−７×１０４、１×１０４−９×１０４であり、または
ｂ）操作された赤血球系細胞の外面上の融合タンパク質の数は、または腫瘍抗原の結合ドメイン親和性は、
ｉ）例えばＢ細胞などの標的がん細胞の表面のＣＤ２０分子などの、例えば表１の抗原などの、例えば本明細書に記載の抗原などの腫瘍抗原のクラスター形成、
ｉｉ）例えばＢ細胞などの標的がん細胞の表面のＣＤ２０などの、例えば表１の抗原などの、例えば本明細書に記載の抗原などの腫瘍抗原の超クラスター形成、
ｉｉｉ）例えばＢ細胞などの標的がん細胞の表面のＣＤ２０などの、例えば表１の抗原などの、例えば本明細書に記載の抗原などの腫瘍抗原の架橋、
ｉｖ）例えばＢ細胞などの標的がん細胞の表面のＣＤ２０などの、例えば表１の抗原などの、例えば本明細書に記載の抗原などの腫瘍抗原の超架橋、
ｖ）例えばＢ細胞などの標的がん細胞の例えばカスパーゼ非依存性アポトーシスおよび／またはカスパーゼ依存性アポトーシスなどのアポトーシス、
ｖｉ）例えばＢ細胞、またはそれらの組み合わせなどの標的がん細胞における、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼの活性化、Ｆａｓ分子のクラスター形性、ＢＣＬ２の阻害または下方制御、および／またはＢＣＬｘｌの阻害または下方制御を誘導するのに十分であり、
それによって対象を治療し、または薬剤をがん性Ｂ細胞に送達する。
【００１４】
本開示はまた、いくつかの態様では、膜貫通ドメインと、腫瘍抗原に結合する結合ドメインとを含んでなる融合タンパク質を含んでなる、例えば赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの細胞も提供し（例えば結合ドメインが抗ＣＤ２０抗体ドメインまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗体ドメインである）、
ａ）赤血球系細胞外面上の融合タンパク質の数は、１０４を超え、例えば２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４を超え、または１０５を超え、例えば２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、５×１０６、または１×１０７を超え（および任意選択的に最大１×１０７または１×１０８）、または約１×１０４〜３×１０４、１×１０４〜５×１０４、１×１０４〜７×１０４、１×１０４〜９×１０４であり、または
ｂ）赤血球系細胞の外面上の融合タンパク質の数は、または腫瘍抗原の結合ドメイン親和性は、
ｉ）例えばＢ細胞などの標的がん細胞の表面のＣＤ２０分子などの、例えば表１の抗原などの、例えば本明細書に記載の抗原などの腫瘍抗原のクラスター形性、
ｉｉ）例えばＢ細胞などの標的がん細胞の表面のＣＤ２０などの、例えば表１の抗原などの、例えば本明細書に記載の抗原などの腫瘍抗原の超クラスター形成、
ｉｉｉ）例えばＢ細胞などの標的がん細胞の表面のＣＤ２０などの、例えば表１の抗原などの、例えば本明細書に記載の抗原などの腫瘍抗原の架橋、
ｉｖ）例えばＢ細胞などの標的がん細胞の表面のＣＤ２０などの、例えば表１の抗原などの、例えば本明細書に記載の抗原などの腫瘍抗原の超架橋、
ｖ）例えばＢ細胞などの標的がん細胞の例えばカスパーゼ非依存性アポトーシスおよび／またはカスパーゼ依存性アポトーシスなどのアポトーシス、
ｖｉ）例えばＢ細胞、またはそれらの組み合わせなどの標的がん細胞における、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼの活性化、Ｆａｓ分子のクラスター形性、ＢＣＬ２の阻害または下方制御、および／またはＢＣＬｘｌの阻害または下方制御を誘導するのに十分である。
【００１５】
本開示はまた、特定の態様では、例えば赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの複数の細胞を含んでなる製剤を対象の血流に投与するステップを含んでなる、対象において血管化固形腫瘍を治療する方法も提供し、
複数の各細胞は、その表面上に、例えば腫瘍細胞抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドを血管化固形腫瘍を治療するのに十分な量で含んでなり、それによって血管化固形腫瘍を治療する。
【００１６】
本開示はまた、いくつかの態様では、例えば赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの複数の細胞を含んでなる製剤を対象の血流に投与するステップを含んでなる、例えば結合剤などの薬剤を対象の血管化固形腫瘍の細胞に送達する方法も提供し、
複数の各細胞は、その表面上に、例えば腫瘍細胞抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドを結合剤を血管化固形腫瘍の腫瘍細胞に送達するのに十分な量で含んでなり、それによって例えば結合剤などの薬剤を血管化固形腫瘍の腫瘍細胞に送達する。
【００１７】
本開示はまた、いくつかの態様では、例えば赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの複数の細胞を含んでなる製剤を対象の血流に投与するステップを含んでなる、例えば対象の固形腫瘍において抗がん抗体などの抗がん剤を富化する方法、または対象の固形腫瘍を治療する方法も提供し、
複数の各細胞は、抗がん剤を固形腫瘍を治療するのに十分な量で含んでなり、任意選択的に、抗がん剤は、例えば腫瘍細胞抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドを含んでなり、それによって抗がん剤を富化し、または固形腫瘍を治療する。
【００１８】
本開示はまた、いくつかの態様では、例えば赤血球系細胞などの複数の細胞を含んでなる製剤を対象の血流に投与するステップを含んでなる、例えば対象の固形腫瘍において抗がん抗体などの抗がん剤を富化する方法、または対象の固形腫瘍を治療する方法も提供し、
複数の各細胞は、抗がん剤を固形腫瘍治療するのに十分な量で含んでなり、
抗がん剤は、例えば腫瘍細胞抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドを含んでなり、
それによって抗がん剤を富化し、または固形腫瘍を治療する。
【００１９】
本開示、特定の態様では、例えば赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの複数の細胞を含んでなる製剤の有効量を対象の血流に投与するステップを含んでなる、赤血球系細胞を対象の血管外部位に送達する方法をさらに提供し、
複数の各細胞は、その表面上に、例えば腫瘍抗原などの血管外部位に存在する抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる、外因性ポリペプチドを含んでなり、
それによって赤血球系細胞を血管外部位に送達する。
【００２０】
本開示は、特定の態様では、例えば赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの複数の細胞を含んでなる製剤の有効量を対象の血流に投与するステップを含んでなる、例えば結合剤などの薬剤を対象の血管外部位に送達する方法をさらに提供し、
複数の各細胞は、その表面上に、例えば腫瘍抗原などの血管外部位に存在する抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドを含んでなり、
それによって例えば結合剤などの薬剤を血管外部位に送達する。
【００２１】
本開示はまた、いくつかの態様では、例えば赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの複数の細胞を含んでなる製剤を対象の血流に投与するステップを含んでなる、例えば対象の前血管化固形腫瘍などの非血管化固形腫瘍を治療する方法も提供し、
複数の各細胞は、その表面上に、例えば腫瘍細胞抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドを非血管化固形腫瘍を治療するのに十分な量で含んでなり、
それによって前血管化固形腫瘍を治療する。
【００２２】
本開示はまた、いくつかの態様では、例えば赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの複数の細胞を含んでなる製剤を対象の血流に投与するステップを含んでなる、例えば結合剤などの薬剤を例えば対象の前血管化固形腫瘍などの非血管化固形腫瘍の細胞に送達する方法も提供し、
複数の各細胞は、その表面上に、例えば腫瘍細胞抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドを結合剤を非血管化固形腫瘍の腫瘍細胞に送達するのに十分な量で含んでなり、
それによって薬剤を非血管化固形腫瘍の腫瘍細胞に送達する。
【００２３】
本開示はまた、いくつかの態様では、例えば赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの複数の細胞を含んでなる製剤を対象に（例えば対象の血流に）投与するステップを含んでなる、がんを有する対象を治療する方法も提供し、
複数の各細胞は、その表面上に、例えば腫瘍細胞抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドを含んでなり、
赤血球系細胞の表面の結合因子密度は、結合剤が腫瘍細胞抗原と結合すると、腫瘍抗原が脂質ラフト中に蓄積し、抗腫瘍細胞抗原の分布が、腫瘍細胞におけるシグナル伝達を変化させるのに十分に撹乱され、がん細胞の表面の腫瘍抗原密度が顕著に変化し、抗アポトーシス経路（例えばＢＣＬ２および／またはＢＣＬｘｌ経路）が抑制され、がん細胞のアポトーシス経路が誘導され、がん細胞の壊死性経路が誘導され、またはがん細胞の膜特性が有意に変化し、またはそれらの組み合わせが生じるのに十分であり、
それによってがんを治療する、方法。
【００２４】
本開示はまた、いくつかの態様では、例えば腫瘍細胞抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドを含んでなる赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの細胞も提供し、
赤血球系細胞の表面の結合因子密度は、結合剤が腫瘍細胞抗原と結合すると、腫瘍抗原が脂質ラフト中に蓄積し、抗腫瘍細胞抗原の分布が、腫瘍細胞におけるシグナル伝達を変化させるのに十分に撹乱され、がん細胞の表面の腫瘍抗原密度が顕著に変化し、抗アポトーシス経路（例えばＢＣＬ２および／またはＢＣＬｘｌ経路）が抑制され、がん細胞のアポトーシス経路が誘導され、がん細胞の壊死性経路が誘導され、またはがん細胞の膜特性が有意に変化し、またはそれらの組み合わせが生じるのに十分である。
【００２５】
本開示はまた、いくつかの態様では、例えばその表面上に、例えば腫瘍浸潤性リンパ球上で発現される免疫チェックポイント分子などの免疫チェックポイント分子（例えばＰＤ１）に、機能的に結合する免疫チェックポイントリガンド（例えばＰＤ−Ｌ１）の能力を妨害する部分を含んでなる、赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）を対象に（例えば対象の血流に）投与するステップを含んでなる、例えば対象の血管化腫瘍などの腫瘍を治療する方法も提供し、
その部分が融合タンパク質として発現される場合、
ｉ）赤血球系細胞表面の融合タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％は、同一配列を有し、
ｉｉ）融合タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％は、同一膜貫通領域であり、
ｉｉｉ）融合タンパク質は完全長内因性膜タンパク質を含まず、例えば完全長内因性膜タンパク質のセグメントを含んでなり、このセグメントは、完全長内因性膜タンパク質の少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、２００、または５００個のアミノ酸を欠き；
ｉｖ）融合タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％は、１、２、３、４、５、１０、２０、または５０個のアミノ酸を超えて互いに異ならず、
ｖ）その部分は、ＬＰＸＴＧなどのソルターゼ転移シグネチャ（すなわち、ソルターゼ反応によって生成され得る配列）を欠いており、
ｖｉ）その部分は、１、２、３、４、または５つ未満の配列が異なる融合ポリペプチド上に存在し；
ｖｉｉ）その部分は、単一の融合ポリペプチド上に存在し；
ｖｉｉｉ）融合タンパク質は、内因性膜貫通タンパク質と部分との接合部にＧｌｙ−Ｇｌｙを含有せず；または
ｉｘ）融合タンパク質はＧｌｙ−Ｇｌｙを含有せず、または細胞外領域にＧｌｙ−Ｇｌｙを含有せず、膜貫通部分の１、２、３、４、５、１０、２０、５０、または１００個のアミノ酸内の細胞外領域にＧｌｙ−Ｇｌｙを含有せず；またはそれらの組み合わせであり、
それによって腫瘍を治療する。
【００２６】
本開示はまた、いくつかの態様では、例えばその表面上に、例えば腫瘍浸潤性リンパ球上で発現される免疫チェックポイント分子などの免疫チェックポイント分子（例えばＰＤ１）と機能的に結合する、免疫チェックポイントリガンド（例えばＰＤ−Ｌ１）の能力を妨害する部分を含んでなる赤血球系細胞も提供し、
その部分が融合タンパク質として発現される場合、
ｉ）赤血球系細胞表面の融合タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％は、同一配列を有し、
ｉｉ）融合タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％は、同一膜貫通領域であり、
ｉｉｉ）融合タンパク質は完全長内因性膜タンパク質を含まず、例えば完全長内因性膜タンパク質のセグメントを含んでなり、このセグメントは、完全長内因性膜タンパク質の少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、２００、または５００個のアミノ酸を欠き；
ｉｖ）融合タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％は、１、２、３、４、５、１０、２０、または５０個のアミノ酸を超えて互いに異ならず、
ｖ）その部分は、ソルターゼ転移シグネチャを欠いており、
ｖｉ）その部分は、１、２、３、４、または５つ未満の配列が異なる融合ポリペプチド上に存在し；
ｖｉｉ）その部分は、単一の融合ポリペプチド上に存在し；
ｖｉｉｉ）融合タンパク質は、内因性膜貫通タンパク質と部分との接合部にＧｌｙ−Ｇｌｙを含有せず；または
ｉｘ）融合タンパク質はＧｌｙ−Ｇｌｙを含有せず、または細胞外領域にＧｌｙ−Ｇｌｙを含有せず、膜貫通部分の１、２、３、４、５、１０、２０、５０、または１００個のアミノ酸内の細胞外領域にＧｌｙ−Ｇｌｙを含有せず、またはそれらの組み合わせである。
【００２７】
本開示はまた、いくつかの態様では、例えばその表面上に、例えば共刺激分子、例えば４−１ＢＢＬまたはその断片などの刺激性分子を含んでなる赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）を対象に（例えば対象の血流に）投与するステップを含んでなる、例えば対象の血管化腫瘍などの腫瘍を治療する方法も提供し、
例えば共刺激分子などの刺激分子のレベル、または例えば共刺激分子などの刺激分子の免疫細胞（例えばＴ細胞）上の結合パートナーに対する親和性は、免疫細胞増殖を誘導し、サイトカイン（例えばＩＬ２またはＩＦＮ−γ）の分泌を増加させ、例えば腫瘍浸潤リンパ球および／またはＴ細胞などの免疫細胞における、活性化誘導性細胞死を減少させるのに十分であり、
その部分が融合タンパク質として発現される場合、
ｉ）赤血球系細胞表面の融合タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％は、同一配列を有し、
ｉｉ）融合タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％は、同一膜貫通領域であり、
ｉｉｉ）融合タンパク質は完全長内因性膜タンパク質を含まず、例えば完全長内因性膜タンパク質のセグメントを含んでなり、このセグメントは、完全長内因性膜タンパク質の少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、２００、または５００個のアミノ酸を欠き；
ｉｖ）融合タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％は、１、２、３、４、５、１０、２０、または５０個のアミノ酸を超えて互いに異ならず、
ｖ）その部分は、ソルターゼ転移シグネチャを欠いており、
ｖｉ）その部分は、１、２、３、４、または５つ未満の配列が異なる融合ポリペプチド上に存在し；
ｖｉｉ）その部分は、単一の融合ポリペプチド上に存在し；
ｖｉｉｉ）融合タンパク質は、内因性膜貫通タンパク質と部分との接合部にＧｌｙ−Ｇｌｙを含有せず；または
ｉｘ）融合タンパク質はＧｌｙ−Ｇｌｙを含有せず、または融合タンパク質はＧｌｙ−Ｇｌｙを含有せず、または細胞外領域にＧｌｙ−Ｇｌｙを含有せず、膜貫通部分の１、２、３、４、５、１０、２０、５０、または１００個のアミノ酸内の細胞外領域にＧｌｙ−Ｇｌｙを含有せず；またはそれらの組み合わせであり、
それによって腫瘍を治療する。
【００２８】
本開示はまた、いくつかの態様では，例えばその表面上に、例えば共刺激分子、例えば４−１ＢＢＬまたはその断片などの刺激性分子を含んでなる赤血球系細胞も提供し、例えば共刺激分子などの刺激分子のレベル、または例えば共刺激分子などの刺激分子の免疫細胞（例えばＴ細胞）上の結合パートナーに対する親和性は、免疫細胞増殖を誘導し、サイトカイン（例えばＩＬ２またはＩＦＮ−γ）の分泌を増加させ、例えば腫瘍浸潤リンパ球および／またはＴ細胞などの免疫細胞における、活性化誘導性細胞死を減少させるのに十分であり、
その部分が融合タンパク質として発現される場合、
ｉ）赤血球系細胞表面の融合タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％は、同一配列を有し、
ｉｉ）融合タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％は、同一膜貫通領域であり、
ｉｉｉ）融合タンパク質は完全長内因性膜タンパク質を含まず、例えば完全長内因性膜タンパク質のセグメントを含んでなり、このセグメントは、完全長内因性膜タンパク質の少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、２００、または５００個のアミノ酸を欠き；
ｉｖ）融合タンパク質の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または９９％は、１、２、３、４、５、１０、２０、または５０個のアミノ酸を超えて互いに異ならず、
ｖ）その部分は、ソルターゼ転移シグネチャを欠いており、
ｖｉ）その部分は、１、２、３、４、または５つ未満の配列が異なる融合ポリペプチド上に存在し；
ｖｉｉ）その部分は、単一の融合ポリペプチド上に存在し；
ｖｉｉｉ）融合タンパク質は、内因性膜貫通タンパク質と部分との接合部にＧｌｙ−Ｇｌｙを含有せず；
ｉｘ）融合タンパク質はＧｌｙ−Ｇｌｙを含有せず、または融合タンパク質はＧｌｙ−Ｇｌｙを含有せず、または細胞外領域にＧｌｙ−Ｇｌｙを含有せず、膜貫通部分の１、２、３、４、５、１０、２０、５０、または１００個のアミノ酸内の細胞外領域にＧｌｙ−Ｇｌｙを含有せず；またはそれらの組み合わせである。
【００２９】
本開示はまた、いくつかの態様では、例えば赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの複数の細胞を含んでなる製剤を対象に（例えば対象の血流に）投与するステップを含んでなる、例えば対象のＴ細胞などの免疫エフェクター細胞を刺激する方法も提供する。
複数の各細胞は、その表面上に、免疫エフェクター細胞を刺激するのに十分な量で、共刺激分子（例えば４−１ＢＢ−Ｌ、ＯＸ４０−Ｌ、ＧＩＴＲ−Ｌ、またはＩＣＯＳ−Ｌ）を含んでなる、外因性ポリペプチドを含んでなり、
それによって免疫エフェクター細胞を刺激する。
【００３０】
本開示はまた、いくつかの態様では、例えば赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）などの複数の細胞を含んでなる製剤を対象に（例えば対象の血流に）投与するステップを含んでなる、例えば固形腫瘍などのがんを検出する方法も提供し、
複数の各細胞は、その表面上に、例えば腫瘍細胞抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドを含んでなり、
複数の各細胞はまた、（例えば細胞内部の細胞表面上に）、例えば放射性核種、フルオロフォア、生物発光剤、またはＭＲＩ造影剤などの生体内画像化によって検出可能な標識も含んでなり；
例えばＭＲＩまたは放射線学的検出によって標識を検出し、
それによってがんを検出する。
【００３１】
本開示はまた、いくつかの態様では、その表面上に、例えば腫瘍細胞抗原に対する抗体などの結合剤を含んでなる、外因性ポリペプチド、および
例えば放射性核種、フルオロフォア、生物発光剤、またはＭＲＩ造影剤などの生体内画像化によって検出可能な標識（例えば細胞内部の細胞表面上の）を含んでなる赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）も提供する。
【００３２】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の赤血球系細胞を提供するステップを含んでなる、抗がん剤を送達し、提示しまたは発現させる方法を提供する。
【００３３】
いくつかの態様では、本開示は、赤血球系細胞前駆体を外因性ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸と接触させること、および除核の発生を可能にする条件に細胞を置くことを提供する、本明細書に記載の赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞）を製造する方法を提供する。
【００３４】
いくつかの態様では、本開示は、例えば本明細書に記載の複数の赤血球系細胞（例えば除核赤血球系細胞など）を例えば少なくとも１０８、１０９、１０１０、１０１１、または１０１２個含んでなる、例えば薬品などの調製品を提供する。
【００３５】
以下の実施形態は、本明細書のあらゆる態様、例えば上記のあらゆる組成物および方法に適用され得る。
【００３６】
いくつかの実施形態では、薬剤は、治療薬（例えば抗がん剤）または診断薬（例えば生体内画像化によって検出可能な標識）である。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｔ細胞の活性化、刺激、または増殖を促進する。いくつかの実施形態では、薬剤は、がん細胞の増殖または生存を阻害する。いくつかの実施形態では、薬剤は、本明細書に記載の薬剤の２つ以上の特徴を有する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、例えば赤血球系細胞などの細胞は、自己由来である。いくつかの実施形態では、細胞は同種異系である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、細胞系は、（ａ）腫瘍サイズの減少、（ｂ）腫瘍増殖速度の低下、（ｃ）腫瘍細胞死の増加、（ｄ）腫瘍進行の減少、（ｅ）転移数の減少、（ｆ）転移率の低下、（ｇ）腫瘍再発の減少、（ｈ）対象の生存率の増加、（ｉ）対象の無増悪生存期間の延長の１つ（または１つ以上、例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上）をもたらすのに有効な量および時間で投与される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、腫瘍は非転移性である。いくつかの実施形態では、腫瘍は転移性である。いくつかの実施形態では、腫瘍は血管化および非転移性である。いくつかの実施形態では、腫瘍は１つまたは複数の腫瘍血管を含んでなる。いくつかの実施形態では、腫瘍（例えば血管化腫瘍）は、ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦを分泌する。いくつかの実施形態では、腫瘍（例えば非血管化腫瘍）はＶＥＧＦまたはｂＦＧＦを産生しない。いくつかの実施形態では、腫瘍（例えば非血管化腫瘍）は、ＰＧＫなどの抗ＶＥＧＦ酵素を産生する。いくつかの実施形態では、腫瘍（例えば血管化腫瘍）、ＰＧＫなどの抗ＶＥＧＦ酵素を産生しない。いくつかの実施形態では、腫瘍は壊死性領域を含んでなる。いくつかの実施形態では、腫瘍は血管新生促進因子を発現する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、がんは、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、またはＶＥＧＦなどの本明細書の１つまたは複数の腫瘍抗原、またはそれらの組み合わせを発現する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、がんは表１のがんであり、がん抗原は表１のがん抗原である。いくつかの実施形態では、がんは表３のがんである。いくつかの実施形態では、がんは機能的カスパーゼアポトーシス経路を欠いている。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は表３の固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は原発性腫瘍または転移性腫瘍病変である。いくつかの実施形態では、原発性腫瘍の部位は知られている。いくつかの実施形態では、がんは原発不明がん以外である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、投与後に、赤血球系細胞は、腫瘍の血管外領域、腫瘍の非壊死性領域、または腫瘍の間質性領域に内在しまたは持続する。いくつかの実施形態では、腫瘍内に持続する赤血球系細胞は、腫瘍内に少なくとも３、６、または１２時間または１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、または２８日間（例えば最大１４または２８日間）にわたり内在する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の表面の結合剤の量は十分であり、またはその標的に対する結合剤の結合親和性は十分であり、または赤血球系細胞は十分な量で対象に投与され、
ａ）腫瘍内の（または１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、または１０００ｍｍ３の腫瘍領域中の）腫瘍細胞に対する赤血球系細胞の比率は、少なくとも約１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：５０、または１：１００（例えば最大約１００：１または１０：１）であり；
ｂ）腫瘍内の内在性赤血球系細胞に対する赤血球系細胞の比率は、少なくとも２：１、５：１、１０：１、２０：１、５０：１、１００：１、１，０００：１、または１０，０００：１（例えば最大１００：１、１，０００：１または１０，０００：１）であり；
ｃ）例えばＣＤ２０などのがん細胞表面タンパク質の超架橋を誘導し；
ｄ）対象の血流中の赤血球系細胞数に対する腫瘍内に内在する赤血球系細胞の比率は、例えば細胞の投与の少なくとも１時間または１２時間または１日、３、日、５日、または７日後に、または腫瘍内の赤血球系細胞蓄積ピーク時に、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１  １０：１、２０：１、または１００：１を超え（任意選択的に最大１０：１または１００：１）；
ｅ）例えば腫瘍内に（または１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、または１０００ｍｍ３の腫瘍領域中に）内在する抗体などの結合剤の量は、例えば遊離抗体などの赤血球系細胞に会合していない抗体などのその他の点では類似した結合剤の量よりも、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、５０、または１００倍大きく（および、任意選択的に最大１０または１００倍大きく）；
ｆ）例えば結合剤を欠く類似赤血球系細胞などの参照と比較して、腫瘍内の赤血球系細胞の持続性を（例えば少なくとも２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、２００、または５００倍）高め；
ｇ）腫瘍または１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、または１０００ｍｍ３の腫瘍領域中の赤血球系細胞の濃度は、腫瘍外区画と比較して富化され、例えば細胞の投与の少なくとも１時間または１２時間または１日、３、日、５日、または７日後に、または腫瘍内の赤血球系細胞蓄積ピーク時に；対象中の赤血球系細胞の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または９５％（および任意選択的に最大９５％または９９％）は、腫瘍内に見られ、赤血球系細胞の３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％未満は、例えば肝臓などの第２の区画内に見られ；
ｈ）腫瘍の血管系隣接領域（例えば１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、または１０００ｍｍ３の領域）中の赤血球系細胞の濃度は、腫瘍の血管系遠位領域（例えば１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、または１０００ｍｍ３領域）と比較して富化され、例えば細胞の投与の少なくとも１時間または１２時間または１日、３、日、５日、または７日後に、または腫瘍内の赤血球系細胞の蓄積ピーク時に、対象の赤血球系細胞の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または９５％（および任意選択的に最大９５％または９９％）は、血管系隣接領域に見られ、赤血球系細胞の３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％未満、または検出不能量は、血管系遠位領域に見られ；任意選択的に、血管隣接領域は血管の０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、または５ｃｍ以内（例えば最高５ｃｍ）であり、腫瘍の血管遠位領域は血管よりも２、３、４、５、または１０ｃｍ遠く；
ｊ）循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は輸液反応、重度の粘膜皮膚反応、Ｂ型肝炎ウイルス再活性化、または進行性多巣性白質脳症、またはそれらの組み合わせを経験せず；
ｋ）赤血球系細胞は、対象に投与された後に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月間（および任意選択的に最大６、９または１２ヶ月間）にわたり、腫瘍部位に存在しおよび／または活性であり；または
ｌ）がん細胞は、赤血球系細胞の存在下において、赤血球系細胞またはそれらの任意の組み合わせを含まない同一量の同一結合剤の存在下におけるがん細胞よりも高い速度で、細胞死（例えばＡＤＣＣまたはアポトーシス、例えばカスパーゼ非依存性アポトーシス）を被る。
【００４４】
いくつかの実施形態では、循環中の表面上に結合剤を含んでなる赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、例えば赤血球系細胞に会合していない抗体などの遊離結合剤に関連する副作用を経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＣＤ２０に結合する場合、例えば結合剤がリツキシマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、輸液反応、重度の皮膚粘膜反応、Ｂ型肝炎ウイルス再活性化、または進行性多巣性白質脳症、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＣＤ５２に結合する場合、例えば結合剤がアレムツズマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、血球減少症、輸液反応、感染症、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＨＥＲ２／ｎｅｕに結合する場合、例えば結合剤がａｄｏ−トラスツズマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、肝毒性、肝不全、左心室の駆出率低下、または胚胎児毒性、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＨＥＲ２／ｎｅｕに結合する場合、例えば結合剤がトラスツズマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は心筋症、輸液反応、肺毒性、または胚胎児毒性、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＥＧＦＲに結合する場合、例えば結合剤がニモツズマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、筋痛、傾眠、見当識障害、血尿症、および肝機能酵素の増加、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＥＧＦＲに結合する場合、例えば結合剤がセツキシマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、輸液反応または心肺停止、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＶＥＧＦに結合する場合、例えば結合剤がベバシズマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、胃腸穿孔、手術と創傷治癒の合併症、出血、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＣＤ３３に結合する場合、例えば結合剤がゲムツズマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、アナフィラキシー、輸液反応、肺事象、肝毒性、またはそれらの組み合わせなどの過敏性反応を経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＣＤ２０に結合する場合、例えば結合剤がイブリツモマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、深刻な輸液反応、（例えば長期のおよび／または重度の）血球減少症、または重度の皮膚および皮膚粘膜反応、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＣＤ２０に結合する場合、例えば結合剤がトシツモマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、深刻なアレルギー反応または（例えば長期のおよび／または重度の）血球減少症、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＥＧＦＲに結合する場合、例えば結合剤がパニツマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、皮膚科毒性を経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＣＤ２０に結合する場合、例えば結合剤がオファツムマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、Ｂ型肝炎ウイルス再活性化または進行性多巣性白質脳症、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＣＴＬＡ−４に結合する場合、例えば結合剤がイピリムマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、免疫介在性の有害反応（例えば小腸結腸炎、肝炎、皮膚炎、神経障害、または内分泌障害）またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＣＤ３０に結合する場合、例えば結合剤がブレンツキシマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、進行性多巣性白質脳症、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＨｅｒ２に結合する場合、例えば結合剤がペルツズマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、左心室の機能不全または胚胎児毒性、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＣＤ２０に結合する場合、例えば結合剤がオビヌツズマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、Ｂ型肝炎ウイルス再活性化または進行性多巣性白質脳症、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＰＤ−１に結合する場合、例えば結合剤がニボルマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、免疫介在性事象（例えば間質性肺炎、大腸炎、肝炎、内分泌障害、腎炎および腎機能不全、皮膚有害反応、または脳炎）、輸液反応、同種異系ＨＳＣＴの合併症、または胚胎児毒性、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＰＤ−１に結合する場合、例えば結合剤がペンブロリズマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、免疫介在性の有害反応（例えば大腸炎、肝炎、下垂体炎、腎炎、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症）または胚胎児毒性、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＰＤＧＦ−Ｒαに結合する場合、例えば結合剤がオララツマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、輸液関連反応物または胚胎児毒性、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＰＤ−Ｌ１に結合する場合、例えば結合剤がアテゾリズマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、免疫関連有害反応（例えば間質性肺炎、肝炎、大腸炎、内分泌障害、筋無力症候群、重症筋無力症、ギラン・バレーまたは髄膜脳炎、膵臓炎）、眼球炎症性毒性、感染症、輸液反応、または胚胎児毒性、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＳＬＡＭＦ７に結合する場合、例えば結合剤がエロツズマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、輸液反応、感染症、第２の原発性悪性腫瘍、肝毒性（ｈＨｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＥＧＦＲに結合する場合、例えば結合剤がネシツムマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、心肺停止、低マグネシウム血症、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤を結合する場合ＣＤ３８、例えば結合剤がダラツムマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、輸液反応、好中球減少症、または血小板減少症、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＶＥＧＦＲ２に結合する場合、例えば結合剤がラムシルマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、出血、動脈血栓塞栓性、高血圧、輸液関連、穿孔、肝硬変を有する患者における臨床的悪化、後部白質脳症症候群、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＧＤ２に結合する場合、例えば結合剤がジヌツキシマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、輸液反応または神経障害、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＣＤ１９およびＣＤ３に結合する場合、例えば結合剤がブリナツモマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、サイトカイン放出症候群または神経学的毒性、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＩＬ−６に結合する場合、例えば結合剤がシルツキシマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、輸液関連反応または胃腸穿孔、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では���例えば結合剤がＲＡＮＫリガンドに結合する場合、例えば結合剤がデノスマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、感染症、皮膚科反応、顎の骨壊死、または骨代謝回転の抑制、またはそれらの組み合わせを経験しない。いくつかの実施形態では（例えば結合剤がＥｐＣＡＭおよびＣＤ３に結合する場合、例えば結合剤がカツマキソマブまたはその断片もしくは変異型を含んでなる場合）、循環中の赤血球系細胞の数は十分に少なく、その結果、患者は、腹痛、発熱、疲労、または悪心／嘔吐、またはそれらの組み合わせを経験しない。
【００４５】
いくつかの実施形態では、少なくとも約１×１０１０、２×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、５×１０１１、（例えば最大１×１０１２）個の赤血球系細胞が対象に投与される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドは、膜貫通ドメインをさらに含んでなる。いくつかの実施形態では，結合剤は、抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体、ｓｃＦｖ、またはナノボディである。いくつかの実施形態では、結合剤は、抗ＣＤ２０抗体または抗ＰＬ−Ｌ１抗体を含んでなる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、結合剤は、抗ＣＤ２０抗体以外、リツキシマブ以外、またはがん幹細胞抗原（例えばＣＤ４４、ＣＤ４７、ＭＥＴ、ＥｐＣａｍ、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、またはＣＤ１９）に対する抗体以外である。いくつかの実施形態では、結合剤は、ＣＤ１３３、ＣＤ３、ＣＤ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ４４、ＣＤ２４、またはＣＤ１３３に対する抗体以外である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞抗原は、膜リンタンパク質などの膜タンパク質である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、その他の点では類似した遺伝子操作されていない赤血球系細胞よりも大きな親和性で、非壊死性腫瘍細胞に結合し、またはそれと会合し、例えば少なくとも２、５、１０、２０、５０、または１００倍（および任意選択的に最大１０倍または１００倍）低いＫｄを有する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、結合剤は、標的化活性を有し（例えば結合剤を欠くその他の点では類似した赤血球系細胞より高いレベルで、腫瘍における赤血球系細胞の蓄積を引き起こす）、抗がん活性を有する（例えば未処置がんと比較して、がん細胞死を引き起こし、または腫瘍増殖を遅延させる）。いくつかの実施形態では、結合剤は標的化活性を有し、抗がん活性を有しない。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗がん剤は、免疫賦活性サイトカイン、腫瘍飢餓酵素（例えばアスパラギナーゼ、メチオニンγリアーゼ、またはセリンデヒドロゲナーゼ）、細胞傷害性小分子、放射性核種、化学療法薬、毒素、小分子、タンパク質治療薬、チェックポイントモジュレーター、またはアポトーシス促進剤、またはその断片もしくは変異型の１つまたは複数を含んでなる。いくつかの実施形態では、免疫賦活性サイトカインは、１型サイトカインまたは２型サイトカイン、またはその断片もしくは変異型である。いくつかの実施形態では、免疫賦活性サイトカインは、ＩＬ−２またはＩＬ−１２、またはその断片もしくは変異型である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、第２の薬剤をさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、抗がん剤（例えば第２の抗がん剤）および／または第２の外因性ポリペプチドである、いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、放射性核種、化学療法薬、毒素、小分子、またはタンパク質治療薬を含んでなる。いくつかの実施形態では、第２の外因性ポリペプチドは、チェックポイントモジュレーター、アポトーシス促進剤、または腫瘍飢餓酵素（例えばアスパラギナーゼ）を含んでなる。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は免疫機能を促進し、例えば第２の薬剤は、炎症促進性サイトカインまたは免疫チェックポイント分子阻害剤を含んでなる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、赤血球系細胞を含んでなる場合、赤血球系細胞を含まないその他の点では類似した第２の薬剤の同一量と比較して、安全性の改善または副作用の低減を示す。
【００５４】
いくつかの実施形態では、結合剤または第２の薬剤は、がん細胞に対する免疫細胞活性を増加させ、がんに向けて免疫細胞を動員し、免疫細胞活性化を増加させ、免疫チェックポイント阻害に対する免疫細胞耐性を増加させ、またはそれらの組み合わせを引き起こす。いくつかの実施形態では、結合剤または第２の薬剤は、アポトーシスを増加させる。いくつかの実施形態では、結合剤または第２の薬剤は、例えばカルシウムレベルを増加させるなど、例えば特定のイオンのレベルを増加させまたは減少させるなど、がん細胞内のイオンレベルを調節する。いくつかの実施形態では、結合剤または第２の薬剤は、腫瘍細胞内のカルシウムチャネル活性を調節する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、耐性のあるがんは、例えば表１の抗体治療薬などの抗体治療薬に対して耐性がある。いくつかの実施形態では、耐性のあるがんは、小分子薬物に対して耐性がある。いくつかの実施形態では、小分子薬物は、例えば本明細書に記載の化学療法薬などの化学療法薬である。いくつかの実施形態では、例えば耐性のある対象に関する実施形態では、対象は表１の抗体による治療に応答できなかった。いくつかの実施形態では、対象は表１の抗体に対して未治療である。いくつかの実施形態では、抗体は、例えばリツキシマブなどの抗ＣＤ２０抗体である。いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、表１の標的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、例えばＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａの定義を使用して、表２からのＣＤＲまたはＶＲを含んでなる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本明細書の方法（例えば耐性のあるがんを治療する方法）は、膜貫通ドメインと抗体ドメインとを含んでなる融合タンパク質を含んでなる赤血球系細胞製剤を対象に投与するステップを含んでなり、抗体ドメインは腫瘍抗原に結合する。いくつかの実施形態では、がんは、その抗原に結合する抗体に対して耐性になっている。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞を構成する抗体ドメインは、がんがそれに対して耐性である抗体治療薬と比較して、同一ＣＤＲを有し、または１、２、３、４、または５個以下の変異により異なるＣＤＲを有し、例えば患者はその抗体治療薬による治療後に再発する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、例えば耐性のある対象に関する実施形態では、患者は抗がん抗体治療薬に対する内因性抗体を含んでなり、例えば患者は、ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）を含んでなる。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞による治療後、患者は治療前レベルの抗薬物抗体と比較して、例えばＨＡＭＡなどの抗薬物抗体レベルの低減を示す。いくつかの実施形態では、例えば患者は、損なわれたカスパーゼ依存性アポトーシス経路を有し、例えば誘導型または実行型カスパーゼなどのカスパーゼに変異を有する。いくつかの実施形態では、変異は、カスパーゼ２、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ３、カスパーゼ６、またはカスパーゼ７にある。いくつかの実施形態では、がん細胞の少なくとも１サブセットは、例えばＣＤ２０または表１の標的などの抗がん抗体治療薬によって結合されるタンパク質に影響を及ぼす変異（例えば欠失）を有しない。
【００５８】
いくつかの実施形態では、例えば発がん性変異を有するがんを治療することを伴う実施形態では、方法は、がんが変異を有するという知識を得ることを含む。いくつかの実施形態では、がんは、例えば表８から選択される変異などの第２の発がん性変異を含んでなる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチド（例えば共刺激分子）のレベル、または免疫細胞（例えばＴ細胞）上の結合パートナーに対する外因性ポリペプチドの親和性は、免疫細胞増殖を誘導するのに十分である。
【００６０】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、または０．５％のＮａＣｌで、５０％未満の細胞溶解の浸透圧脆弱性を有する。いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞は、例えば網状赤血球などの野生型の未処理赤血球系細胞とほぼ同じ直径または体積を有する。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％を超え、または１０％を超える胎児ヘモグロビンを含んでなる。いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞は、その細胞膜の細胞表面側の単分子層上に、野生型の未処理赤血球系細胞とほぼ同じホスファチジルセリン含有量を有する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、グリコフォリンＡ（ＧＰＡ）、グリコフォリンＢ、グリコフォリンＣ、グリコフォリンＤ、ｋｅｌｌ、バンド３、アクアポリン１、ｇｌｕｔ  １、ｋｉｄｄ抗原タンパク質、またはアカゲザル抗原の膜貫通部分を含んでなる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節を伴う実施形態では、その部分は表４の抗体、表４の抗原に結合する抗体である。いくつかの実施形態では、その部分（例えばＰＤ−Ｌ１に結合する部分）は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、またはＰＤ１の細胞外断片である。いくつかの実施形態では、その部分は、免疫チェックポイントリガンド（例えばＰＤ−Ｌ１）に結合する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本明細書の組成物または方法は、例えば外因性ポリペプチドを含んでなる複数の赤血球系細胞と共に混合された、外因性ポリペプチドを欠く赤血球系細胞集団を投与するステップを含んでなる。いくつかの実施形態では、組成物または方法は、１００％未満の効率で形質移入または形質導入された細胞集団を投与するステップを含んでなる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、例えば共刺激分子が関与する実施形態では、赤血球系細胞は、例えば結合部分を含んでなる外因性ポリペプチドなどの標的化部分をさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、結合部分は、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞などの免疫エフェクター細胞上の抗原に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、腫瘍細胞上にあるまたは腫瘍微小環境内に存在する、抗原に結合する。いくつかの実施形態では、共刺激分子は、４−１ＢＢ−Ｌ、ＯＸ４０−Ｌ、ＧＩＴＲ−Ｌ、またはＩＣＯＳ−Ｌである。
【００６５】
いくつかの実施形態では、刺激性分子は、例えばＴ細胞などの免疫エフェクター細胞を刺激する分子である。いくつかの実施形態では、刺激性分子は、一次刺激剤または共刺激分子である。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、共刺激分子および一次刺激剤を含んでなる。その他の実施形態では、赤血球系は、共刺激分子を含んでなり、一次刺激剤を含まない。いくつかの実施形態では、赤血球系は、共刺激分子を含んでなり、外因性一次刺激剤を含まない。
【００６６】
いくつかの実施形態では、例えば耐性のある対象に関与する実施形態では、操作された赤血球系細胞の外面上の融合タンパク質の数、または腫瘍抗原に対する結合ドメインの親和性は、例はＢ細胞などの標的細胞に対する赤血球系細胞の結合を誘導するのに十分である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、投与は全身的または局所的である。いくつかの実施形態では、投与は、例えば静脈内投与、例えば静脈内点滴などの血流への投与である。いくつかの実施形態では、投与は腫瘍への投与である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞はその表面上に、
ｉ）第１の共刺激分子（例えば本明細書に記載の共刺激分子、例えば表５の共刺激分子）と、
ｉｉ）第２の共刺激分子（例えば表５の共刺激分子）と、
ｉｉｉ）任意選択的に、第３のまたはそれ以上の共刺激分子（例えば表５の共刺激分子）と、
ｉｖ）任意選択的に、腫瘍抗原に結合する標的化部分と
を含んでなる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞はその表面上に、
ｉ）第１の免疫チェックポイント分子に結合する第１の薬剤（例えば本明細書に記載の免疫チェックポイント分子に結合する薬剤、例えば表４の免疫チェックポイント分子に結合する薬剤、例えば表４の抗体またはその他の結合因子）と、
ｉｉ）第２の免疫チェックポイント分子に結合する第２の薬剤（例えば表４の抗体またはその他の結合因子などの表４の免疫チェックポイント分子に結合する薬剤）と、
ｉｉｉ）任意選択的に、免疫チェックポイント分子（例えば表４の免疫チェックポイント分子）に結合する第３のまたはそれ以上の薬剤と、
ｉｖ）任意選択的に、腫瘍抗原に結合する標的化部分と
を含んでなる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞はその表面上に、
ｉ）共刺激分子（例えば本明細書に記載の共刺激分子、例えば表５の共刺激分子、例えば４−１ＢＢＬ）と、
ｉｉ）免疫チェックポイント分子に結合する薬剤（例えば本明細書に記載の免疫チェックポイント分子に結合する薬剤、例えば表４の免疫チェックポイント分子に結合する薬剤、例えば表４の抗体またはその他の結合因子、例えば抗ＰＤ−Ｌ１）と、
ｉｉｉ）任意選択的に、腫瘍抗原に結合する標的化部分と
を含んでなる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、例えば生体内画像化のための赤血球系細胞が関与する実施形態では、赤血球系細胞は、例えば１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ、８９Ｚｒ、および６８ＧａなどのＰＥＴ同位体を含んでなる標識を含んでなる。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、例えばルシフェラーゼなどの生物発光剤を含んでなる標識を含んでなる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、除核赤血球系細胞によって保持されない１つまたは複数の外因性核酸によってコードされる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、例えば実施例５のアッセイなどのＰＢＭＣ増殖アッセイにより、例えば赤血球系細胞を欠くサンプルと比較して、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の双方の増殖などのＴ細胞増殖を、例えば少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、または１０倍促進する。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、例えば５日間などの同一時間にわたり、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖をＣＤ４＋Ｔ細胞よりも例えば少なくとも２倍または３倍の増加など、より強力に促進する。いくつかの実施形態では、アッセイ開始時の赤血球系細胞とＰＭＢＣの比率は約１：１である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、例えば実施例５のアッセイなどのフローサイトメトリーアッセイにより、Ｔ細胞サンプルにおける、例えばＩＦＮｇ、ＴＮＦａまたはＩＦＮｇおよびＴＮＦａの双方の分泌などのサイトカイン分泌を促進する。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、外因性タンパク質を欠くその他の点では類似した赤血球系細胞で処理されたその他の点では類似した細胞サンプルと比較して、例えば少なくとも２、３、４、または５倍の増加などのサイトカイン分泌の増加を促進する。いくつかの実施形態では、サイトカイン分泌の増加は、少なくとも部分的にはサイトカイン分泌細胞（例えばＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の双方）の増殖の増加に起因する。
【００７５】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞（例えば抗ＰＤ−Ｌ１抗体を発現する赤血球系細胞）を使用して、ＰＤ−Ｌ１を発現するがんが治療される。いくつかの実施形態では、がん細胞は、例えば腫瘍細胞中のＰＤ−Ｌ１発現を増加させるのに十分な量で、例えば内在性ＩＦＮ−γなどのＩＦＮ−γに曝露される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、細胞当たり、少なくとも１００，０００、１２５，０００、１５０，０００、２００，０００、２５０，０００、３００，０００、３５０，０００、または４００，０００個のＰＤ−Ｌ１のコピーを発現する。
【００７６】
関連する態様では、本開示は、
（ａ）腫瘍細胞が細胞当たり、例えば１００，０００、１２５，０００、１５０，０００、２００，０００、２５０，０００、３００，０００、３５０，０００、または４００，０００の１つなどの参照値よりも多いＰＤ−Ｌ１ポリペプチド数を有するかどうかなどの、腫瘍上のＰＤ−Ｌ１発現の存在またはレベルに関する情報を（直接的または間接的に）取得するステップと、
（ｂ）（ａ）に対応して、例えばその表面上に抗ＰＤ−Ｌ１抗体などの抗ＰＤ−Ｌ１結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドを含んでなる除核赤血球系細胞などの本明細書に記載の複数の除核赤血球系細胞を含んでなる、治療法または治療薬投与を選択するステップと
を含んでなる方法を提供する。
【００７７】
本明細書に記載の細胞系は、細胞系の一部ではない別の（１つまたは複数の）抗増殖性、抗新生物性または抗腫瘍性の薬物または治療と組み合わせて使用されてもよい。このような薬物または治療としては、例えば、細胞毒性薬（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、コルチコステロイド）などの化学療法薬；チロシンキナーゼ阻害剤およびプロテアソーム阻害剤などのがん増殖遮断薬；Ｔ細胞療法（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法）（例えば、ＰＭＩＤ：２６６１１３５０を参照されたい）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞免疫調節（例えば、ＰＭＩＤ：２６６９７００６を参照されたい）；およびがんワクチン（ＰＭＩＤ：２６５７９２２５）；Ｌ−アスパラギナーゼおよびボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））などのその他の化学薬品が挙げられる。例えば、ホルモン感受性がんのために、ホルモン療法（または抗ホルモン療法）が使用され得る。
【００７８】
本明細書に記載の細胞系は、外科手術、放射線療法、または寒冷療法などのがんのための非薬物治療と組み合わせて使用されてもよい。場合によっては、本発明の治療方法は、２つまたはそれ以上のその他の治療法または薬物と組み合わされた本明細書に記載の細胞系を含んでもよく、例えば、乳がんは、外科手術または放射線療法と組み合わせた本明細書に記載の細胞系と、化学療法カクテルまたは生物学的製剤（例えば、抗ＨＥＲ２抗体）との組み合わせで治療されてもよい。
【００７９】
本開示は、前述の態様および／または実施形態の任意の１つまたは複数の全ての組み合わせ、ならびに詳細な説明および実施例に記載される実施形態の任意の１つまたは複数との組み合わせを検討する。
【００８０】
本明細書に記載されるものと同様のまたは同等の方法および材料が、本発明でまたは本発明の試験で用いられ得るが、適切な方法および材料は下述のとおりである。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献（例えば、配列データベース参照番号）は、その全体が参照により援用される。例えば、本明細書において、例えば、本明細書中の任意の表において参照される全てのＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、ＮＣＢＩおよびＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により援用される。別段の指定がない限り、本明細書中の任意の表を含む本明細書で特定される配列受入番号は、２０１６年１２月２日現在のデータベース入力項目を参照する。１つの遺伝子またはタンパク質が複数の配列受入番号を参照する場合、配列変異型の全てが包含される。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】（左から右へ）抗ＣＤ２０抗体単独、二次抗アイソタイプ抗体との「架橋」抗ＣＤ２０抗体」、対照ＲＣＴ−ＨＡ−ＧＰＡ（１：１または１：５）、またはＲＣＴ−抗ＣＤ２０（１：１または１：５）抗体単独で処理された、リンパ腫細胞株におけるアポトーシスのレベルを示すグラフである。
【図２】カスパーゼ依存性アポトーシス阻害剤（ＦＭＫ）の存在下または非存在下において、ＲＣＴ−抗ＣＤ２０または対照ＲＣＴ−ＨＡ−ＧＰＡで処理された、ＣＤ２０＋リンパ腫細胞のアポトーシスのレベルを示すグラフである。１−１および１−５は、それぞれ、１：１および１：５のリンパ腫細胞とＲＣＴとの比を示す。
【図３】ＲＣＴ−抗ＣＤ２０または対照ＲＣＴ−ＨＡ−ＧＰＡで処置されたマウスに由来する、ＣＤ２０＋腫瘍の組織切片を示す。Ｈ＆Ｅ、ヘマトキシリン、エオシンは有核細胞、内因性赤血球、操作された赤血球系細胞を検出する。ＣＤ３１染色は、内皮血管系を検出する。ＣＤ２０染色は、Ｒａｍｏｓ腫瘍細胞を検出する。ＨＡは、操作された赤血球系細胞を検出する。
【図４】対照ＲＣＴ−ＨＡ−ＧＰＡ（上側パネル）またはＲＣＴ−抗ＣＤ２０（下側パネル）で処置されたマウスにおける、異種移植片腫瘍の蛍光画像である。
【図５】免疫チェックポイント阻害剤を含んでなるＲＣＴによる、ＩＬ−２分泌のレスキューを示すグラフである。左から右へ、バーは以下に相当する：ジャーカット（ジャーカット細胞単独、ベースライン）、ジャーカット／Ｚ１３８（ＮＨＬＺ１３８細胞と共培養されたジャーカット細胞、ＩＬ−２分泌の阻害を示す）、ジャーカット／Ｚ１３８／非形質導入ＲＣＴ（ＮＨＬＺ１３８細胞および非形質導入対照赤血球系細胞と共培養されたジャーカット細胞、ＩＬ−２分泌がレスキューされないことを示す）、ジャーカット／Ｚ１３８／ａｔｅｚｏ−ｆｌａｇ  ＲＣＴ（ＮＨＬＺ１３８細胞およびＲＣＴ−抗ＰＤＬ１と共培養されたジャーカット細胞、ＩＬ−２分泌のレスキューを示す）、ジャーカット／Ｚ１３８／Ｉｐｉ−ｆｌａｇ  ＲＣＴ（ＮＨＬＺ１３８細胞およびＲＣＴ−抗ＣＴＬＡ４と共培養されたジャーカット細胞、ＩＬ−２分泌のレスキューを示す）。次の５本のバーは、ジャーカット細胞の非存在下では、ＩＬ−２分泌が低いかまたは皆無であることを示す。一番右のバーは、ジャーカット細胞が非形質導入対照赤血球系細胞と共培養された場合における、ほぼベースラインレベルのＩＬ−２分泌を示す。
【図６】標準的な抗原免疫復活アッセイにおける、インターフェロン−γ分泌を示すグラフである。一番左のバー、ＰＢＭＣ単独は、ベースラインのインインターフェロン−γ分泌を示した。次の５本のバー、示された数の対照ＲＣＴ−ＨＡ−ＧＰＡ細胞と共培養されたＰＢＭＣは、ベースラインと同様のインターフェロンγ分泌レベルを示した。右端の５本のバー、示された数のＲＣＴ−抗ＰＤ１細胞と共培養されたＰＢＭＣは、インターフェロンγ分泌レベルの増加を示した。
【図７】ジャーカット細胞がＲＣＴ−４１ＢＢＬまたは非形質導入対照赤血球系細胞と共培養された場合における、ＲＬＵで測定されたルシフェラーゼ活性によって示される、ＮＦκＢ活性化を示すグラフである。
【図８】細胞当たり示されたコピー数の４−１ＢＢ−Ｌを有する赤血球系細胞から得られた、ＮＦκＢ活性化を示すグラフである。
【図９】抗４−１ＢＢ抗体と比較した、示された数の４−１ＢＢ−Ｌ  ＲＣＴ細胞から得られた、ＮＦκＢ活性化を示すグラフである。
【図１０】抗４−１ＢＢ抗体と比較して、４−１ＢＢ−Ｌ  ＲＣＴ細胞によって誘導された、ＣＤ４＋Ｔ細胞の変化倍率（左側パネル）、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の変化倍率（右側パネル）を示す一対のグラフである。
【図１１】抗４−１ＢＢ抗体と比較して、４−１ＢＢ−Ｌ  ＲＣＴ細胞によって誘導された、ＩＦＮ−γ分泌（左側パネル）およびＴＮＦ−α分泌（右側パネル）を示す一対のグラフである。
【図１２】４１ＢＢＬ−ＲＣＴで処置されたマウスおよび未処理対照における腫瘍サイズを示す、経時変化である。
【図１３】抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはアイソタイプ対照抗体を有する赤血球系細胞について、血管内の赤血球系細胞に対する腫瘍内の赤血球系細胞の比率を示す。
【図１４】示されたＲＣＴによって誘導されたシグナル伝達、増殖、サイトカインレベル、および抗原免疫復活活性における、およその倍率変化レベルを要約するチャートである。
【図１５】示された赤血球系細胞の示された腫瘍細胞への結合を定量化するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
定義
本明細書の用法では、「抗体」という用語は、例えば、免疫グロブリン鎖または少なくとも１つの免疫グロブリン可変領域配列を含むその断片などのタンパク質またはその一部を指す。「抗体」という用語は、抗体および抗体断片を包含する。一実施形態では、抗体は、例えば、二重特異性抗体などの多特異性抗体である。抗体の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、直鎖抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのどちらか）などの単一ドメイン抗体、ラクダ科動物ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結する２つのＦａｂ断片を含む二価の断片などの抗体断片から形成される多特異性抗体、抗体から単離されたエピトープ結合断片、マキシ抗体、ミニ抗体、ナノボディ、細胞内抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体、ｖ−ＮＡＲ、およびｂｉｓ−ｓｃＦｖが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８３】
本明細書の用法では、「併用療法」または「組み合わせ投与」は、特定の疾患または病状に対する治療レジメンの一部として、２つ（以上）の異なる薬剤または治療法が対象に投与されることを意味する。治療レジメンは、各薬剤の投与の用量および周期性を含み、その結果、対象に対する別個の薬剤の効果が重複する。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤の送達は同時でありまたは並行し、薬剤は共配合されてもよい。その他のいくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤は共配合されずに、規定レジメンの一部として逐次様式で投与される。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤または治療法の組み合わせ投与の結果、症状またはその他の障害関連パラメータの低下は、１つの薬剤または治療法が単独で、または他の薬剤の不存在下で与えられる場合に観察されるであろうものを上回る。２つの治療法の効果は、部分的に相加的、完全に相加的であり得て、または相加的を上回り得る（例えば、相乗的）。各治療薬の逐次投与または実質的に同時の投与は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、および粘膜組織を介する直接吸収をはじめとするが、これに限定されるものではない、任意の適切な経路によってもたらされ得る。治療薬は、同一経路によってまたは異なる経路によって投与され得る。例えば、組み合わせの第１の治療薬が静脈内注射によって投与されてもよい一方で、組み合わせの第２の治療剤は経口的に投与されてもよい。
【００８４】
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、本明細書の用法では、抗原特異性および結合親和性をもたらす、抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。例えば一般に、各重鎖可変領域に３つのＣＤＲ（例えばＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、各軽鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）とがある。所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（“Ｋａｂａｔ”ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ），Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８（“Ｃｈｏｔｈｉａ”ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ）によって記載されるものをはじめとするいくつかの周知のスキームのいずれか、またはそれらの組み合わせを使用して判定され得る。
【００８５】
Ｋａｂａｔ番号付けスキームの下では、いくつかの実施形態では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）中のＣＤＲアミノ酸残基に、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）の番号が付けられ、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）中のＣＤＲアミノ酸残基に、２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）の番号が付けられる。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームの下では、いくつかの実施形態では、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸に、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）の番号が付けられて、ＶＬ中のＣＤＲアミノ酸残基に、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）の番号が付けられる。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａを組み合わせた番号付けスキームでは、いくつかの実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔ  ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ、またはその双方の一部であるアミノ酸残基に対応する。例えばいくつかの実施形態では、ＣＤＲは、例えば哺乳類ＶＨ、例えばヒトＶＨなどのＶＨ中のアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲｌ）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）に対応し；例えば哺乳類ＶＬ、例えばヒトＶＬなどのＶＬ中のアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲｌ）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）に対応する。
【００８６】
本明細書の用法では、「除核」とは、例えば成熟赤血球への分化によってその核を失った細胞などの核を欠く細胞を指す。
【００８７】
「赤血球系細胞」は、本明細書の用法では、有核赤血球、赤血球前駆体、および除核赤血球を含む。例えば臍帯血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、脾臓コロニー形成（ＣＦＵ−Ｓ）細胞、共通骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ）細胞、未分化胚芽細胞コロニー成形細胞、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、巨核球−赤血球系前駆（ＭＥＰ）細胞、赤血球系コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｅ）、網状赤血球、赤血球、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、多染性正赤芽球、正染性正赤芽球は、いずれも赤血球系細胞である。赤血球系細胞の製剤は、これらの細胞のいずれかまたはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、不死胞または不死化細胞である。例えば不死化赤芽球細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃを発現してＰ５３を抑制する、ＣＤ３４＋造血前駆細胞のレトロウイルス形質導入によって作製され得る（例えばＨｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１３，ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ３に記載されるように）。さらに、細胞は、自己由来用途を意図してもよく、または同種異系輸血の供給源を提供してもよい。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は培養される。一実施形態では、赤血球系細胞は除核赤血球である。
【００８８】
本明細書の用法では、「外因性ポリペプチド」という用語は、そのタイプの野生型細胞によって産生されず、または外来ポリペプチドを含有する細胞よりも野生型細胞においてより低いレベルで存在するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、細胞に導入された核酸によってコードされるポリペプチドであり、その核酸は任意選択的に細胞によって保持されない。
【００８９】
本明細書の用法では、腫瘍抗原の「超架橋」は、その抗原を細胞表面上にクラスター形成させ、または界面活性剤不溶性細胞膜複合体もしくはシグナル伝達プロセシングセンターに再分布させることを指す。この再分布は、例えばＰｏｌｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ２０  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｉｔｓ  Ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ａ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １，１９９８，ｖｏｌ．１６１  ｎｏ．７  ３２４２−３２４８に記載されるようにアッセイされてもよい。超架橋は、腫瘍抗原間の共有結合の形成を必要としない。
【００９０】
「内在する」という用語は、本明細書の用法では、薬剤が腫瘍内に存在することに関して、薬剤が腫瘍の境界内、例えば腫瘍細胞間または腫瘍細胞内に存在することを指す。
【００９１】
「持続的」という用語は、本明細書の用法では、薬剤が腫瘍内で持続的であることに関して、薬剤が長期間または所定の時間にわたり腫瘍内に持続的に存在することを指す。例えば薬剤が腫瘍抗原に結合する標的化部分を含んでなる場合、標的化部分を含んでなる薬剤が標的化部分を欠くその他の点では類似した薬剤（例えば未修飾赤血球系細胞）よりも長く腫瘍内に継続的に内在する場合、その薬剤は腫瘍内で持続する。いくつかの実施形態では、腫瘍内に持続する薬剤は、腫瘍内に少なくとも３、６、または１２時間または１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、または２８日間（例えば最大１４または２８日間）にわたり内在する。
【００９２】
本明細書で使用される「耐性の」腫瘍は、治療に反応しない腫瘍を指す。耐性の腫瘍は、治療法で処置された対象の腫瘍であってもよく、腫瘍は治療法に対する応答を示さず、例えば患者は治療に対して難治性であり、例えば患者は応答性期間のない進行性疾患を示した。耐性の腫瘍はまた、治療法で処置されて初期応答（例えば完全寛解または部分寛解）を示したが、その後患者が改善を示さなくなった（例えば患者の応答が頭打ちになった）、または再発した（例えば患者は反応期間の後に進行性の疾患を示した）対象における腫瘍であってもよい。耐性の腫瘍はまた、例えば治療法で処置されていない対象の腫瘍などの未治療耐性の腫瘍、例えば腫瘍生検の生体外アッセイを用いて、または腫瘍配列決定によって、腫瘍が治療法に対して耐性があると判定された腫瘍であってもよい。耐性の腫瘍はまた、例えばそれが治療に耐性であることを示す、変異またはステージなどの特徴を有する腫瘍であってもよい。一実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞によって送達された治療薬は、本明細書に記載の赤血球系細胞によってでなく自由に送達された同一治療薬よりも有効であり、例えばその治療薬による治療に対して耐性がある腫瘍を治療するのに有用である。一実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞によって送達される治療薬は、異なる治療薬による治療に対して耐性がある腫瘍を治療するために投与される。一実施形態では、赤血球系細胞による治療は、耐性の前に開始される。一実施形態では、赤血球系細胞による治療は、耐性の後に開始される。
【００９３】
「難治性」腫瘍は、本明細書の用法では、治療法によって治療されたが十分な反応を示さなかった腫瘍を指し、例えば患者は治療後に、応答無し（ＮＲ）または進行性疾患（ＰＤ）として分類される。一実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞によって送達された治療薬は、本明細書に記載の赤血球系細胞によってでなく自由に送達された同一治療薬よりも有効であり、例えばその治療薬による治療に対して難治性である、または難治性になった腫瘍を治療するのに有用である。一実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞によって送達された治療薬は異なる治療薬に対して難治性である、または難治性になった腫瘍を治療するために投与される。一実施形態では、赤血球系細胞による治療は、腫瘍が難治性になる前に開始される。一実施形態では、赤血球系細胞による治療は、腫瘍が難治性になった後に開始される。
【００９４】
「再発性」腫瘍は、本明細書の用法では、寛解に入り（例えば治療法による治療後の例えば完全寛解または部分寛解）、その後進行した腫瘍を指す。一実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞によって送達された治療薬は、本明細書に記載の赤血球系細胞によってでなく自由に送達された同一治療薬よりも有効であり、例えばその治療薬による治療後に再発した腫瘍を治療するのに有用である。一実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞によって送達される治療薬は、異なる治療薬による治療後に再発した腫瘍を治療するために投与される。一実施形態では、赤血球系細胞による治療は、寛解中に開始される。一実施形態では、赤血球系細胞による治療は、再発の後に開始される。
【００９５】
「腫瘍」は、本明細書の用法では、制御されない増殖を有する複数の異常細胞を指す。「腫瘍」および「がん」という用語は、本明細書で同義的に使用され、例えばどちらの用語も、例えばびまん性または循環性などの固形および液体の腫瘍を包含する。一実施形態では、がんまたは腫瘍は前がん性である。一実施形態では、がんまたは腫瘍は悪性である。様々ながんの例が本明細書に記載され、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺がんなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９６】
「腫瘍細胞」および「がん細胞」という用語は、本明細書で同義的に使用され、細胞または腫瘍またはがんを指す。
【００９７】
本明細書で「がん抗原」と同義的に使用される「腫瘍抗原」は、例えば腫瘍の表面上に存在する、腫瘍細胞を構成する部分（例えばペプチドまたはタンパク質）を指す。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原はまた、１つまたは複数の非がん性細胞型（例えばがんを有する対象における非がん性細胞）上にも、例えば同一レベルまたは異なるレベルで存在する。一実施形態では、腫瘍抗原は、非腫瘍細胞上よりも腫瘍細胞上に高い平均数で存在する。いくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍細胞上に存在するポリペプチド、またはその部分である。抗原は、例えば抗体または非抗体結合パートナーなどの結合パートナーによって結合されてもよい。
【００９８】
本明細書の用法では、ポリペプチドの「変異型」という用語は、そのポリペプチドと比較して、例えば、１つまたは複数の置換、挿入または欠失などの少なくとも１つの配列の相違を有するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、変異型は、そのポリペプチドと、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。変異型には、断片も含まれる。いくつかの実施形態では、断片は、完全長ポリペプチドと比較して、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその双方で（それぞれ独立して）、１、２、３、４、５、１０、２０、または１００個のアミノ酸を欠く。
【００９９】
腫瘍に関連して本明細書の用法では、「血管新生」は、血管形成を誘導したおよび／または腫瘍血管を含んでなる腫瘍を指す。腫瘍血管は正常血管とは異なり、組織学によって、例えば不規則な形状および拡張によって区別され得て；腫瘍細胞および内皮細胞を含んでなってもよい。
【０１００】
外因性タンパク質
外因性タンパク質の１つまたは複数は、例えば、ヒト細胞である哺乳類細胞などの真核細胞に特徴的な、翻訳後修飾を有してもよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の外因性タンパク質は、グリコシル化され、リン酸化され、またはその双方である。糖タンパク質の生体外検出は、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）法の変法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびウェスタンブロット上で慣例的に達成される。糖タンパク質の細胞局在化は、当該技術分野で公知のレクチン蛍光コンジュゲートを利用して達成されてもよい。リン酸化は、ホスホ特異的抗体を用いてウェスタンブロットによって評価されてもよい。
【０１０１】
翻訳後修飾としてはまた、疎水性基へのコンジュゲーション（例えば、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、プレニル化、またはＧＰＩ化）、補因子へのコンジュゲーション（例えば、リポイル化、フラビン部分（例えば、ＦＭＮまたはＦＡＤ）、ヘムＣ、ホスホパンテテイニル化、またはレチニリデンシッフ塩基形成）、ジフタミド形成、エタノールアミンホスホグリセロール付着、ヒプシン形成、アシル化（例えば、Ｏ−アシル化、Ｎ−アシル化、またはＳ−アシル化）、ホルミル化、アセチル化、アルキル化（例えば、メチル化またはエチル化）、アミド化、ブチリル化、γ−カルボキシル化、マロニル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ＡＤＰ−リボース化などのヌクレオチド付加、酸化、リン酸エステル（Ｏ結合型）またはホスホロアミダート（Ｎ結合）形成、（例えば、リン酸化またはアデニリル化）、プロピオニル化、ピログルタミン酸形成、Ｓ−グルタチオン付加、Ｓ−ニトロシル化、スクシニル化、硫酸化、ＩＳＧ化、ＳＵＭＯ化、ユビキチン化、ＮＥＤＤ化、またはアミノ酸の化学修飾（例えば、シトルリン化、脱アミド、脱離（ｅｌｉｍｉｎｙｌａｔｉｏｎ）、またはカルバミル化）、ジスルフィド架橋の形成、ラセミ化（例えば、プロリン、セリン、アラニン、またはメチオニンのラセミ化）も挙げられる。いくつかの実施形態では、グリコシル化としては、糖タンパク質を生じる、アルギニン、アスパラギン、システイン、ヒドロキシリジン、セリン、スレオニン、チロシン、またはトリプトファンへのグリコシル基の付加が挙げられる。いくつかの実施形態では、グリコシル化は、例えば、Ｏ結合型グリコシル化またはＮ結合グリコシル化を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の外因性ポリペプチドは、少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、または８００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、または７００〜８００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、５００、４５０、４００、３５０、または３００アミノ酸長未満である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞は、少なくとも１，０００、５，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、または５００，０００コピーの本明細書に記載の外因性ポリペプチドを含んでなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞は、例えば４−１ＢＢＬを含んでなる外因性ポリペプチドなどの、約２００，０００、１５０，０００〜２５０，０００、１００，０００〜３００，０００、または２００，０００〜３００，０００コピーの本明細書に記載の外因性ポリペプチドを含んでなる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の外因性ポリペプチドは、例えば二量体、三量体、四量体、または六量体などの多量体を形成する。いくつかの実施形態では、（例えば４−１ＢＢＬを含んでなる）外因性ポリペプチドは、例えば赤血球系細胞の表面上の三量体などの三量体を形成する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、例えば外因性ポリペプチド、例えば表面露出外因性ポリペプチド、例えば表１の腫瘍抗原などの本明細書に記載の腫瘍抗原に結合する、膜貫通ドメインを含んでなる表面露出ポリペプチドなどの薬剤を含んでなる。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、例えば表１または表２の抗体もしくはその他の結合因子、またはその断片もしくは変異型を含んでなる、外因性ポリペプチドなどの薬剤を含んでなる。例えば断片または変異型は、表１または表２の抗体に対応する、例えばｓｃＦｖなどの単一ドメイン抗体であり得る。別の例として、断片または変異型は、例えば軽鎖可変断片、重鎖可変断片、またはその双方などの、表１または表２の抗体の抗原結合断片であり得る。別の例として、断片または変異型は、表１または表２の結合剤の活性断片であり得る。別の例として、断片または変異型は、例えば表１または表２の抗体と、または軽鎖可変断片、重鎖可変断片、またはその双方と、少なくとも７０％、７５％、８０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する抗体などの、表１または表２の抗体と１００％未満の配列同一性を有する抗体であり得る。例えば断片または変異型は、表１または表２の抗体と同一ＣＤＲを有し得るが、フレームワークおよび／または定常領域に１つまたは複数の変異を有する。別の例として、断片または変異型は、例えば表１または表２の結合剤またはその活性部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する結合剤などの、表１または表２の結合剤と１００％未満の配列同一性を有する結合剤であり得る。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドの１つまたは複数は、例えば内在性赤血球タンパク質またはその断片との融合体などの融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、例えばＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型赤血球膜貫通タンパク質などの膜貫通タンパク質またはその膜貫通断片を含んでなる。いくつかの実施形態では、膜貫通タンパク質は、ＧＰＡまたはその膜貫通断片である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、例えば、本明細書中の配列番号１に記載されるような、またはその膜貫通部分、または前述のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するポリペプチドなどである、ＧＰＡまたはその膜貫通部分を含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＡポリペプチドは結合ドメインのＣ末端である。いくつかの実施形態では、ＧＰＡポリペプチドは、
【化１】
2019536793.tif 000002
またはその膜貫通部分、または前述のいずれかと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するポリペプチドの配列を有する。いくつかの実施形態では、ＧＰＡポリペプチドは抗体ドメインのＣ末端である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、配列番号８０または配列番号８１のポリペプチド、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列、またはその機能的断片を含んでなる。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢＬの機能性断片は４−１ＢＢ結合断片である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１の機能性断片はＰＤ−Ｌ１結合断片である。
【０１０９】
一実施形態では、外因性ポリペプチドは、アポトーシスを媒介する細胞受容体に対するリガンドを含んでなる。一実施形態では、リガンドは、例えば野生型または変異ＴＲＡＩＬポリペプチドなどのＴＲＡＩＬ受容体リガンド、またはＴＲＡＩＬ受容体に結合する抗体であり、標的細胞においてアポトーシスを誘発する。いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞は、１つまたは複数の（例えば２つまたは３つの）ＴＲＡＩＬ受容体リガンドを含んでなる。いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞は、例えば本明細書に記載の標的化部分などの標的化部分をさらに含んでなる、１つまたは複数のＴＲＡＩＬ受容体リガンドを含んでなる。
【０１１０】
ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）は、アポトーシスを誘導するＴＮＦファミリーのメンバーである。ＴＲＡＩＬは、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１およびＴＲＡＩＬ  Ｒ２の少なくとも２つの受容体を有する。ＴＲＡＩＬ受容体作動薬、例えば、受容体の１つまたは複数に結合するＴＲＡＩＬの変異体、またはＴＲＡＩＬＲ１またはＴＲＡＩＬＲ２の片方または双方に結合する抗体（例えば、Ｇａｓｐａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ２００９  Ｊｕｎ  １４（６）、Ｂｕｃｈｓｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ  ２００７  Ａｕｇ３（４）を参照されたい）は、広範ながんの臨床療法として開発されている。いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞は、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１リガンドおよびＴＲＡＩＬ  Ｒ２リガンドを含んでなる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上の外因性ポリペプチドは、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーまたはその一部を含む。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、細胞死受容体ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）およびＤＲ５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）の片方または双方に結合する。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ／ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ／ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ／ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ／ＴＲＡＩＬＲ４、またはＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ／ＯＰＧの１つまたは複数に結合する。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、ＭＡＰＫ８／ＪＮＫ、カスパーゼ８、およびカスパーゼ３の１つまたは複数を活性化する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ＴＲＡＩＬポリペプチドは、本明細書の配列番号２〜６のいずれかの配列、またはそれに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を有するＴＲＡＩＬ作動薬である。配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ（基本的局所アライメント検索ツール）によって測定される。配列番号２〜６は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｍｏｈｒ  ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣＣａｎｃｅｒ（２０１５）１５：４９４）にさらに記載される。
【０１１３】
配列番号２
可溶性ＴＲＡＩＬ変異型ＤＲ４−１
【化２】
2019536793.tif 000003
配列番号３
可溶性ＴＲＡＩＬ変異型ＤＲ４−２
【化３】
2019536793.tif 000004
配列番号４
可溶性ＴＲＡＩＬ変異型ＤＲ４−３
【化４】
2019536793.tif 000005
配列番号５
可溶性ＴＲＡＩＬ変異型ＤＲ５−１
【化５】
2019536793.tif 000006
配列番号６
可溶性ＴＲＡＩＬ変異型ＤＲ５−２
【化６】
2019536793.tif 000007
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ＴＲＡＩＬ受容体リガンドは、例えば抗体フラグメントなどの抗体を含んでなる。いくつかの実施形態では、抗体は、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１およびＴＲＡＩＬ  Ｒ２の片方または双方を認識する。抗体は、例えばマパツムマブ（ヒト抗ＤＲ４ｍＡｂ）、チガツズマブ（ヒト化抗ＤＲ５ｍＡｂ）、レキサツムマブ（ヒト抗ＤＲ５ｍＡｂ）、コナツムマブ（ヒト抗ＤＲ５ｍＡｂ）、またはアポマブ（ヒト抗ＤＲ５ｍＡｂ）であってもよい。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、ＴＲＡＩＬ受容体に結合する少なくとも１つの抗体と、少なくとも１つのＴＲＡＩＬポリペプチドとを含んでなる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、標的化活性を有する結合剤を含んでなる。いくつかの実施形態では、結合剤はまた抗がん活性も有し、例えば同一外因性ポリペプチドが、抗がん剤および標的化剤である。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、例えば抗がん活性を有する第２の外因性ポリペプチドなどの第２の薬剤を含んでなる。いくつかの実施形態では、標的化剤は、例えば、固形腫瘍細胞などのがん細胞にまたはその近くに結合し、第２の薬剤（例えば、第２のポリペプチド）は抗がん機能を有する。いくつかの実施形態では、作用部位は腫瘍血管系である。いくつかの実施形態では、標的化剤は、血管新生マーカーに結合し、例えば、ａｖＢ１、ａｖＢ３、またはａｖＢ５、またはａ４ｂ１インテグリンなどのインテグリン、例えば、合成ペプチドノッチン（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，ＪＡＣＳ  ２０１６，１３７（１））、または例えば、エキスタチン、ＲＧＤ、ＥＥＴＩ２．５Ｆ、またはＶＣＡＭ−１などの内因性または天然リガンドに結合し、または血管新生に際しても豊富に見られる前立腺特異的膜抗原に結合する。いくつかの実施形態では、標的化剤は、（例えば、多発性骨髄腫細胞において発現される）ＣＤ２６９、または（例えば、ＡＬＭ細胞において発現される）ＣＤ１２３、（例えば、Ｔ細胞において発現され；ＣＤ８０／ＣＤ８６によって結合され得る）ＣＤ２８、（例えば、卵巣がんにおいて発現される）ＮＹ−ＥＳＯ−１などのがん細胞マーカーに結合する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、抗がん剤は、腫瘍細胞が成長するために選択的に要求する代謝産物を分解する、例えばアスパラギナーゼ、メチオニンγリアーゼ（ＭＧＬ）、セリンデヒドロゲナーゼなどの酵素、またはその断片もしくは変異型を含んでなる。抗がん剤は、例えば血管増殖を防止するためのアンギオポエチン（アンギオポエチン）の阻害剤、またはＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲの阻害剤などの血管新生の阻害剤であってもよい。抗がん剤は、例えば共刺激分子（例えば表５の共刺激分子）、免疫チェックポイント阻害剤（例えば表４を参照されたい）またはサイトカインまたはＴ細胞活性化リガンドなどのＴ細胞を活性化する免疫賦活性分子であってもよい。抗がん剤は、例えば、Ｔ細胞または炎症性マクロファージなどの免疫エフェクター細胞に結合し、エフェクター細胞を捕捉して腫瘍の近傍に持ち込んでもよい。抗がん剤は、例えば、ＴＲＡＩＬまたはＦＡＳ−Ｌまたは他のデスリガンド、または毒素などの細胞死の直接的なメディエーターであり得る。いくつかの実施形態では、抗がん剤は、例えば、作動性抗体などのＴＲＡＩＬ受容体の作動薬を含んでなる。いくつかの実施形態では、抗がん剤はアポトーシス促進剤である。いくつかの実施形態では、抗がん剤はアジュバントを含んでなる。これらの抗がん剤のいずれについても、最終結果は、腫瘍部位に局在する赤血球治療剤（ＲＣＴ）であり、したがってその抗腫瘍効果をその効能を高める場所に集中させる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、免疫チェックポイント分子を阻害する。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、（例えば膜貫通部分および表面露出部分を含んでなる）赤血球系細胞の表面上に位置し、免疫チェックポイント分子に結合する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、免疫チェックポイント分子を阻害する。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、阻害抗体（例えば単一特異性抗体、モノクローナル抗体、または一本鎖抗体などの抗体）である。抗体は、例えばヒト化または完全ヒトであってもよい。その他のいくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、例えばＦｃ−受容体融合タンパク質などの融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質と相互作用する抗体などの薬剤である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、免疫チェックポイント受容体のリガンドと相互作用する抗体などの薬剤である。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ＣＴＬＡ−４（例えばイピリムマブ／ヤーボイまたはトレメリムマブなどの抗ＣＴＬＡ４抗体）の阻害剤（例えば阻害抗体または小分子阻害剤）である。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ＰＤ−１（例えばニボルマブ／Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）；ペンブロリズマブ／キイトルーダ（登録商標）；ピジリズマブ／ＣＴ−０１１）の阻害剤（例えば阻害抗体または小分子阻害剤）である。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、Ｄ−Ｌ１（例えばＭＰＤＬ３２８０Ａ／ＲＧ７４４６；ＭＥＤＩ４７３６；ＭＳＢ００１０７１８Ｃ；ＢＭＳ９３６５５９）の阻害剤（例えば阻害抗体または小分子阻害剤）である。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ＰＤＬ２（例えばＡＭＰ２２４などのＰＤＬ２／Ｉｇ融合タンパク質）の阻害剤（例えば阻害抗体またはＦｃ融合物または小分子阻害剤）である。一実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、Ｂ７−Ｈ３（例えばＭＧＡ２７１）、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、Ｂ−７ファミリーリガンド、またはそれらの組み合わせの阻害剤（例えば阻害抗体または小分子阻害剤）である。
【０１１９】
免疫チェックポイント分子の阻害剤は、少なくとも４つの主要なカテゴリーに分類され得る：ｉ）Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で直接、阻害経路を遮断する抗体などの薬剤（例えばニボルマブおよびペンブロリズマブのようなＰＤ−１標的化抗体、ＴＩＭ−３を標的化する抗体、およびＬＡＧ−３、２Ｂ４、ＣＤ１６０、Ａ２ａＲ、ＢＴＬＡ、ＣＧＥＮ−１５０４９またはＫＩＲを標的化する抗体）、ｉｉ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞上で直接、刺激経路を活性化する抗体などの薬剤（例えばＯＸ４０、ＧＩＴＲ、または４−１ＢＢを標的化する抗体）、ｉｉｉ）免疫細胞上で抑制経路を遮断するか、または抗体依存性細胞毒性に頼って免疫細胞の抑制的集団を枯渇させる、抗体などの薬剤（例えばイピリムマブなどのＣＴＬＡ−４標的化抗体、ＶＩＳＴＡを標的化する抗体、およびＰＤ−Ｌ２、Ｇｒ１、またはＬｙ６Ｇを標的化する抗体）、およびｉｖ）がん細胞上で直接、抑制経路を遮断するか、または抗体依存性細胞毒性に頼ってがん細胞に対する細胞毒性を増強する、抗体分子などの薬剤（例えばリツキシマブ、ＰＤ−Ｌ１を標的化する抗体、およびＢ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｇａｌ−９、またはＭＵＣ１を標的とする抗体）。本明細書に記載されるこのような薬剤は、例えばＴｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５；Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２０１２に記載されように設計および製造され得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、例えば外因性ポリペプチド、例えば表面露出外因性ポリペプチド、例えば表４の免疫チェックポイント分子に結合する膜貫通ドメインを含んでなる表面露出ポリペプチドなどの薬剤を含んでなる。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、例えば表４の抗体もしくはその他の結合因子、またはその断片もしくは変異型を含んでなる、外因性ポリペプチドなどの薬剤を含んでなる。例えば断片または変異型は、表４の抗体に対応する、例えばｓｃＦｖなどの単一ドメイン抗体であり得る。別の例として、断片または変異型は、例えば軽鎖可変断片、重鎖可変断片、またはその双方などの、表４の抗体の抗原結合断片であり得る。別の例として、断片または変異型は、表４の結合剤の活性断片であり得る。別の例として、断片または変異型は、例えば表４の抗体と、または軽鎖可変断片、重鎖可変断片、またはその双方と、少なくとも７０％、７５％、８０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する抗体などの、表４の抗体と１００％未満の配列同一性を有する抗体であり得る。例えば断片または変異型は、表４の抗体と同一ＣＤＲを有し得るが、フレームワークおよび／または定常領域に１つまたは複数の変異を有する。別の例として、断片または変異型は、例えば表４の結合剤またはその活性部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する結合剤などの、表４の結合剤と１００％未満の配列同一性を有する結合剤であり得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、例えば外因性ポリペプチド、例えば表面露出外因性ポリペプチド、例えば表５の共刺激分子を含んでなる膜貫通ドメインを含んでなる表面露出ポリペプチドまたはその断片もしくは変異型などの薬剤を含んでなる。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、例えば表５の共刺激分子を含んでなる外因性ポリペプチドまたはその断片もしくは変異型などの薬剤を含んでなる。例えば断片または変異型は、例えば共刺激分子と少なくとも７０％、７５％、８０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する共刺激分子などの、表５の共刺激分子と１００％未満の配列同一性を有するタンパク質配列であり得る。いくつかの実施形態では、断片または変異型は、例えば表５の共刺激分子の１、２、３、４、または５イソ型などの共刺激分子のイソ型、またはその断片もしくは変異型である。いくつかの実施形態では、断片または変異型は、表５の共刺激分子の成熟形態であり、例えば表５の共刺激分子のプロセスされた形態の配列を有する。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８ａｌｐｈａ、ＣＤ８ｂｅｔａ、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、およびＣＤ１９ａ、またはその断片もしくは変異型の１つまたは複数を含んでなる。
【０１２３】
別の例として、赤血球系細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）とがん細胞を互いに近傍に持ち込んで、免疫エフェクター細胞によるがん細胞の殺滅を促進する。したがって、いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドはがん細胞の細胞表面マーカーに結合し、第２のポリペプチドは免疫エフェクター細胞の細胞表面マーカーに結合する。第１および第２のポリペプチドは、例えば、抗体を含んでなってもよい。いくつかの実施形態では、がん細胞マーカーは、ＣＤ１９（例えば、Ｂ細胞急性白血病において発現される）、ＥｐＣＡＭ（例えば、ＣＴＣにおいて発現される）、ＣＤ２０（例えば、Ｂ細胞急性白血病において発現される）、ＣＤ４５（例えば、ＣＴＣにおいて発現される）、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２（例えば、乳がん細胞において発現される）から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞マーカーはＣＤ３である。
【０１２４】
本明細書に記載のポリペプチドのビヒクル
本明細書の多くの実施形態では、１つまたは複数の外因性ポリペプチドが赤血球系細胞の上または中に位置する一方で、本明細書に記載の任意の外因性ポリペプチドはまた、別のビヒクルの上または中に位置し得るものと理解される。ビヒクルは、例えば細胞、赤血球系細胞、小体、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、またはエキソソームを含んでなり得る。ビヒクルは、例えばナノ粒子または直径が１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、１，５００、２，０００、または２，５００ｎｍを超える粒子などの粒子であってもよい。例えばいくつかの態様では、本開示は、例えばその表面上に本明細書に記載の１つまたは複数の薬剤を含んでなる、ビヒクル（例えば細胞、赤血球系細胞、小体、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、またはエキソソーム）を提供する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、表２、表４、または表５のいずれかのポリペプチドから選択された薬剤、またはその断片もしくは変異型、またはその作動薬または拮抗薬、またはそれに対する抗体を含んでなる。いくつかの実施形態では、ビヒクルは、例えば本明細書に記載の任意の薬剤対などの本明細書に記載の２つ以上の薬剤を含んでなる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、ビヒクルは赤血球系細胞を含んでなる。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、有核赤血球、赤血球前駆体、または除核赤血球である。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、臍帯血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、脾臓コロニー形成（ＣＦＵ−Ｓ）細胞、共通骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ）細胞、未分化胚芽細胞コロニー成形細胞、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、巨核球−赤血球系前駆（ＭＥＰ）細胞、赤血球系コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｅ）、網状赤血球、赤血球、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、多染性正赤芽球、正染性正赤芽球、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は不死胞または不死化細胞である。いくつかの実施形態では、ビヒクルは、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞などの免疫エフェクター細胞を含んでなる。いくつかの実施形態では、細胞は自己由来または同種異系である。
【０１２６】
異種細胞集団
本明細書の多くの実施形態では、１つまたは複数の（例えば２つ以上の）外因性ポリペプチドが単一細胞上または中に位置する一方で、本明細書に記載の任意のポリペプチドまたはポリペプチドの組み合わせはまた、複数の細胞の上に位置し得るものと理解される。例えばいくつかの態様では、本開示は複数の赤血球系細胞を提供し、複数の第１の細胞は第１の外因性ポリペプチドを含んでなり、複数の第２の細胞は第２の外因性ポリペプチドを含んでなる。いくつかの実施形態では、複数の細胞は、例えば本明細書に記載の任意のポリペプチド一対などの本明細書に記載の２つ以上のポリペプチドを含んでなる。いくつかの実施形態では、集団中の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、または１％未満の細胞は、第１の外因性ポリペプチドおよび第２の外因性ポリペプチドの双方を含んでなる。
【０１２７】
膜内にカプセル化された細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の除核赤血球系細胞またはその他のビヒクルは、例えば半透膜などの膜内にカプセル化される。いくつかの実施形態では、膜は、例えばアニオン性アルギン酸多糖類などの多糖類を含んでなる。いくつかの実施形態では、半透膜は、細胞を通過させないが、例えば代謝産物、タンパク質またはＤＮＡなどの小分子または巨大分子の通過を許す。いくつかの実施形態では、膜は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｌｉｅｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ：ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５，９５−１０７（２０１４）に記載されるものである。理論による拘束は望まないが、いくつかの実施形態では、膜は、細胞を免疫系から保護しおよび／または複数の細胞を近接して保持し、互いの相互作用または互いの産物の相互作用を促進する。
【０１２８】
除核赤血球系細胞の物理的特性
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の除核赤血球系細胞は、例えば、浸透圧脆弱性、細胞サイズ、ヘモグロビン濃度またはホスファチジルセリン含有量などの、本明細書に記載の１つまたは複数（例えば、２、３、４、またはそれ以上）の物理的特徴を有する。理論による拘束は望まないが、いくつかの実施形態では、外因性タンパク質を発現する除核赤血球系細胞は、野生型の未処理赤血球系細胞に似た物理的特性を有する。対照的に、低浸透圧性に負荷された赤血球系細胞は、時には、浸透圧の脆弱性の増加、細胞サイズの変化、ヘモグロビン濃度の減少、または細胞膜の細胞表面側の単分子上のホスファチジルセリンレベルの増加などの異常な物理的特徴を示す。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞は、細胞によって保持されないか、精製されていないか、または赤血球系細胞の外部に完全に存在しなかった、外因性核酸によってコードされる外因性タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、安定剤を欠く組成物中にある。
【０１３０】
浸透圧脆弱性
いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞は、外因性ポリペプチドを含まない単離された未培養除核赤血球系細胞と実質的に同じ浸透圧膜脆弱性を示す。いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞の集団は、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、または０．５％のＮａＣｌで、５０％未満の細胞溶解の浸透圧脆弱性を有する。浸透圧脆弱性は、いくつかの実施形態では、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットの実施例５９の方法を用いて決定される。
【０１３１】
細胞サイズ
いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞は、ほぼ野生型の未処理赤血球系細胞の直径または容積を有する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の集団は約４、５、６、７、または８ミクロンの平均直径を有し、任意選択的に、集団の標準偏差は１、２、または３ミクロン未満である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の赤血球系細胞は、約４〜８、５〜７、または約６ミクロンの直径を有する。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の直径は、約１ミクロン未満、約２０ミクロンを超える、約１ミクロン〜約２０ミクロン、約２ミクロン〜約２０ミクロン、約３ミクロン〜約２０ミクロン、約４ミクロン〜約２０ミクロン、約５ミクロン〜約２０ミクロン、約６ミクロン〜約２０ミクロン、約５ミクロン〜約１５ミクロンまたは約１０ミクロン〜約３０ミクロンである。細胞の直径は、いくつかの実施形態では、Ａｄｖｉａ  １２０血液検査システムを用いて測定される。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の平均赤血球容積の容積（ｔｈｅ  ｖｏｌｕｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅａｎ  ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ  ｖｏｌｕｍｅ）は、１０ｆＬ、２０ｆＬ、３０ｆＬ、４０ｆＬ、５０ｆＬ、６０ｆＬ、７０ｆＬ、８０ｆＬ、９０ｆＬ、１００ｆＬ、１１０ｆＬ、１２０ｆＬ、１３０ｆＬ、１４０ｆＬ、１５０ｆＬを超え、または１５０ｆＬを超える（ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ．．．ｏｒ  ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ）。一実施形態では、赤血球系細胞の平均赤血球容積は、３０ｆＬ、４０ｆＬ、５０ｆＬ、６０ｆＬ、７０ｆＬ、８０ｆＬ、９０ｆＬ、１００ｆＬ、１１０ｆＬ、１２０ｆＬ、１３０ｆＬ、１４０ｆＬ、１５０ｆＬ、１６０ｆＬ、１７０ｆＬ、１８０ｆＬ、１９０ｆＬ、２００ｆＬ未満であり、または２００ｆＬ未満である（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ．．．ｏｒ  ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ）。一実施形態では、赤血球系細胞の平均赤血球容積は、８０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、または４００〜５００フェムトリットル（ｆＬ）である。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の集団は、本段落に記載される平均赤血球容積を有し、集団の標準偏差は、５０、４０、３０、２０、１０、５、または２ｆＬ未満である。平均赤血球容積は、いくつかの実施形態では、例えば、コールターカウンターなどの血液学的分析装置を用いて測定される。
【０１３４】
ヘモグロビン濃度
いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞は、野生型未処理赤血球系細胞と同様のヘモグロビン含有量を有する。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％を超え、または１０％を超える胎児ヘモグロビンを含む。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、少なくとも約２０、２２、２４、２６、２８、または３０ｐｇの、任意選択的に、約３０ｐｇに至る、総ヘモグロビンを含む。ヘモグロビンレベルは、いくつかの実施形態では、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットの実施例３３のドラブキン試薬法を用いて判定される。
【０１３５】
ホスファチジルセリン含有量
いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞は、その細胞膜の細胞表面側の単分子層上に、野生型の未処理赤血球系細胞とほぼ同じホスファチジルセリン含有量を有する。ホスファチジルセリンは、主に、野生型の未処理赤血球系細胞の細胞膜の細胞質側の単分子層上にあり、低張負荷は、ホスファチジルセリンを細胞表面側の単分子層に分布させ、免疫応答を始動し得る。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の集団は、アネキシンＶ染色について陽性である約３０、２５、２０、１５、１０、９、８、６、５、４、３、２、または１％未満の細胞を含む。ホスファチジルセリン曝露は、いくつかの実施形態では、例えば、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットの実施例５４の方法を用いて、ＰＳに優先的に結合するアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣについて染色し、フローサイトメトリーによってＦＩＴＣ蛍光を測定することで評価される。
【０１３６】
その他の特性
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の集団は、ＧＰＡに対して陽性である、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％（任意選択的に、９０または１００％に至る）の細胞を含む。ＧＰＡの存在は、いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳを用いて検出される。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞は、対象において少なくとも３０、４５、または９０日間の半減期を有する。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞を含む細胞の集団は、約１０、５、４、３、２または１％未満の棘状赤血球を含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は除核される。いくつかの実施形態では、例えば、赤血球系細胞などの細胞は、例えば、不活性化されている、非機能性核を含有する。
【０１４０】
汎用ドナー赤血球系細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞は、細胞が投与される対象にとって、自己由来および／または同種異系である。例えば対象にとっての赤血球系細胞同種異系は、１つまたは複数の血液型特異的赤血球系細胞（例えば細胞は、対象と同一血液型であり得る）、または１つまたは複数の汎用ドナー赤血球系細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の除核赤血球系細胞は、参照細胞と比較して免疫原性が低下しており、例えば１つまたは複数の血液型抗原のレベルが低下している。
【０１４１】
同種異系細胞が輸血に使用される場合、急性血管内溶血性輸血反応を予防するために、適合性のＡＢＯ血液型が選択され得る。ＡＢＯ血液型は、血液型抗原ＡおよびＢの有無、赤血球の表面の糖タンパク質および糖脂質に会合するオリゴ糖鎖末端に見られる単糖炭水化物構造に基づいて定義される（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：４５４−４６４（２００７）で概説される）。Ｏ型赤血球は、Ａ抗原もＢ抗原のどちらも含有しないことから、それらは例えばＡ、Ｂ、ＡＢ、またはＯ型レシピエントなどの任意のＡＢＯ血液型のレシピエントに、安全に輸血され得る。Ｏ型赤血球は汎用と考えられており、全ての輸血において使用されてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される赤血球系細胞はＯ型である。対照的に、Ａ型赤血球系細胞はＡ型およびＡＢ型レシピエントに与えられてもよく、Ｂ型赤血球系細胞はＢ型およびＡＢ型レシピエントに与えられてもよく、ＡＢ型赤血球系細胞はＡＢレシピエントトに与えられてもよい。
【０１４２】
場合によっては、非Ｏ型赤血球系細胞を汎用血液型に変換することが有益であり得る。Ａ型およびＢ型赤血球の表面の免疫優性単糖類の酵素的除去を用いて、Ｏ型様赤血球系細胞の集団が作製されてもよい。（例えばＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：４５４−４６４（２００７）を参照されたい）。Ｂ型赤血球系細胞は、生コーヒー豆由来のα−ガラクトシダーゼを使用して変換されてもよい。代案としては、またはこれに加えて、Ｅ．メニンゴセプチカム（Ｅ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌由来のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼ酵素活性を用いて、免疫優性Ａ抗原およびＢ抗原が赤血球系細胞上に存在する場合、それぞれ除去されもよい（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：４５４−４６４（２００７））。一例では、本明細書に記載されるように単離された充填赤血球系細胞が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼのどちらかの存在下で、２００ｍＭグリシン（ｐＨ６．８）および３ｍＭ  ＮａＣｌ中で２６℃で６０分間にわたり培養される（約３００μｇ／ｍｌ充填赤血球系細胞）。処理後、赤血球系細胞は、遠心分離によって生理食塩水中で３〜４回濯いで洗浄され、標準的な血液銀行技術に従ってＡＢＯ型判定される。
【０１４３】
ＡＢＯ血液型システムは輸血および移植において最も重要である一方で、いくつかの実施形態では、投与される赤血球系細胞とレシピエントとの間でその他の血液型を一致させること、または１つまたは複数のその他の（例えばマイナー）血液型に汎用的な赤血球系細胞を選択または作製することが有用であり得る。第２の血液型はＲｈシステムであり、個人はＲｈ＋またはＲｈ−であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞はＲｈ−である。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、Ｏ型かつＲｈ−型である。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞は、例えばＬｅ（ａ−ｂ−）（ルイス抗原システム）、Ｆｙ（ａ−ｂ−）（Ｄｕｆｆｙシステム）、Ｊｋ（ａ−ｂ−）（Ｋｉｄｄシステム）、Ｍ−Ｎ−（ＭＮＳシステム）、Ｋ−ｋ−（Ｋｅｌｌシステム）、Ｌｕ（ａ−ｂ−）（Ｌｕｔｈｅｒａｎシステム）、およびＨ抗原陰性（Ｂｏｍｂａｙ表現型）などの１つまたは複数のマイナー血液型抗原、またはそれらの任意の組み合わせについて陰性である。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、Ｏ型および／またはＲｈ−型である。マイナー血液型は、例えばそれぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、Ａｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ“Ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｄｏｎｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｃａｒｅ  ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｉｎ  ｎｏｒｔｈ  Ｉｎｄｉａ”Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｍａｒ；４８（１）：５１−５４  ａｎｄ  Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ“Ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ”Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ａｎａｅｓｔｈ．２０１４  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；５８（５）：５２４−５２８に記載される。
【０１４５】
除核赤血球系細胞を製造する方法
外因性ポリペプチドを含んでなる除核赤血球系細胞を製造する方法は、それぞれその内容全体が参照により援用される、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットおよび国際公開第２０１５／１５３１０２号パンフレットに記載される。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、例えば、ＣＤ３４＋造血前駆細胞などの造血前駆細胞を、１つまたは複数の外因性ポリペプチドをコードする核酸または核酸群と接触させ、細胞が培養中で増殖して分化できるようにする。
【０１４７】
核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。例えば、レトロウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ１）などのレンチウイルス、および泡沫状ウイルスなどのスプマウイルスをはじめとするいくつかのウイルスが、遺伝子移入ビヒクルとして使用されてもよい。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、国際公開第２０１４／１８３０７１号パンフレットまたは国際公開第２０１４／１８３０６６号パンフレットに記載されるような、Ｓｏｒｔａｇ技術を用いて作製される。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、少なくとも１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、または１００，０００倍に（任意選択的に、１００，０００、２００，０００、または５００，０００倍に至るまで）増殖される。細胞数は、いくつかの実施形態では、自動細胞計数器を使用して測定される。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の集団は、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９８％の（任意選択的に、約８０、９０、または１００％に至る）除核赤血球系細胞を含む。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の集団は、１％未満の生存除核細胞を含有し、例えば、検出可能な生存除核細胞を含有しない。核除去は、いくつかの実施形態では、核染色を用いるＦＡＣＳによって測定される。いくつかの実施形態では、集団中の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０％の（任意選択的に、約７０、８０、９０、または１００％に至る）赤血球系細胞は、１つまたは複数（例えば、２、３、４またはそれ以上）の外因性ポリペプチドを含む。ポリペプチドの発現は、いくつかの実施形態では、ポリペプチドに対する標識抗体を用いて、ＦＡＣＳによって測定される。いくつかの実施形態では、集団中の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０％の（任意選択的に、約７０、８０、９０、または１００％に至る）赤血球系細胞は核除去され、１つまたは複数の外因性ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の集団は、約１×１０９〜２×１０９、２×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜２×１０１０、２×１０１０〜５×１０１０、５×１０１０〜１×１０１１、１×１０１１〜２×１０１１、２×１０１１〜５×１０１１、５×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２〜２×１０１２、２×１０１２〜５×１０１２、または５×１０１２〜１×１０１３個の細胞を含む。
【０１５１】
例えば、赤血球系細胞などの本明細書中の組成物による治療法
外因性薬剤（例えば、ポリペプチド）を含む（例えば、発現する）赤血球系細胞の投与方法は、例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットおよび国際公開第２０１５／１５３１０２号パンフレットに記載される。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞は、例えば、ヒトなどの哺乳動物などの対象に投与される。治療され得る例示的哺乳類としては、限定されるものではないが、ヒト、飼育動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、および実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）が挙げられる。本明細書に記載の方法は、ヒト治療および獣医学用途の双方に応用可能である。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、１、２、３、４、５または６ヶ月毎に患者に投与される。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の１用量は、約１×１０９〜２×１０９、２×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜２×１０１０、２×１０１０〜５×１０１０、５×１０１０〜１×１０１１、１×１０１１〜２×１０１１、２×１０１１〜５×１０１１、５×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２〜２×１０１２、２×１０１２〜５×１０１２、または５×１０１２〜１×１０１３個の細胞を含む。
【０１５５】
いくつかの態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載の赤血球系細胞などの本明細書に記載される組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、本明細書に記載の疾患または病状を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患または病状はがん、例えば、本明細書に記載のがんである。いくつかの態様では、本開示は、例えば、がんなどの本明細書に記載の疾患または病状を治療するための、例えば、本明細書に記載の赤血球系細胞の使用を提供する。いくつかの態様では、本開示は、例えば、がんなどの本明細書に記載の疾患または病状を治療する薬剤を製造するための、例えば、本明細書に記載の赤血球系細胞の使用を提供する。
【０１５６】
がん型としては、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、腸がん、脳腫瘍、乳がん、原発不明がん（ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｕｎｋｎｏｗｎ  ｐｒｉｍａｒｙ）、骨転移がん、脳転移がん、肝臓転移がん、肺転移がん、カルチノイド、子宮頸がん、絨毛がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、眼がん、胆嚢がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、妊娠性絨毛腫瘍（ＧＴＴ）、有毛細胞白血病、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、黒色腫皮膚がん、中皮腫、男性がん、奇胎妊娠、口腔および中咽頭がん、骨髄腫、鼻および洞がん、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、食道がん、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、前立腺がん、希少がん、直腸がん、唾液腺がん、二次がん、皮膚がん（非黒色腫）、軟部組織肉腫、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、精巣がん、甲状腺がん、原発不明がん（ｕｎｋｎｏｗｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮がん、膣がん、および外陰部がんが挙げられる。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、がんは高度に免疫原性のがんであり、例えばがんは、（例えばがん生検の分析によって判定されるように）以下の特徴の１つまたは複数を有する：（ａ）腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、例えば１０００個の腫瘍細胞当たり少なくとも１、５、１０、１００個のＴＩＬ；（ｂ）変異、例えば腫瘍ゲノムＤＮＡのメガベース当たり０．１以上の体細胞変異；（ｃ）新生抗原、１つまたは複数の内因性Ｔ細胞受容体を有する１つまたは複数の新生抗原および／または新生抗原のプロセシングされ提示された部分を認識する、１つまたは複数のイディオタイプクローン；（ｄ）三次リンパ構造；（ｅ）炎症性遺伝子発現の高発現、例えば非がん組織におけるベースライン発現を超えるサイトカインの２倍の発現増加；および（ｆ）免疫抑制表現型を示す免疫細胞、例えばサイトカイン発現を欠く樹状細胞。がんのこれらの特徴を評価する方法は、公知である（例えばＣｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００  Ｍａｙ；６（５）：１８７５−８１；Ｎａｔｕｒｅ．２０１３  Ａｕｇ  ２２；５００（７４６３）：４１５−２１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２４７７．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ａｕｇ  １４；Ｎａｔｕｒｅ．２０１４  Ｎｏｖ  ２７；５１５（７５２８）：５７７−８１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３９８８；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４  Ｎｏｖ；３５（１１）：５７１−８０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｔ．２０１４．０９．００６．Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｏｃｔ  ２２；Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３  Ｄｅｃ  １１；４：４３８．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１３．００４３８；Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００９  Ｊａｎ；４５（２）：２２８−４７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｊｃａ．２００８．１０．０２６を参照されたい。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は原発性腫瘍内にある。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は循環腫瘍細胞以外である。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、腫瘍は表８の遺伝子の変異を含んでなる。いくつかの実施形態では、表８の遺伝子の変異は表８の３列目で規定される変異である。いくつかの実施形態では、がんは、例えば表８の遺伝子の変異（例えば表８の３列目で規定される変異）と第２の変異などの少なくとも２つの異なる変異を含んでなる。いくつかの実施形態では、第２の変異は、例えば表８の３列目で規定される変異などの表８の遺伝子の変異である。いくつかの実施形態では、腫瘍内の一部の細胞が変異を含んでなり、その他の細胞は変異を含まない。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、腫瘍はｐ５３ヌル細胞を含まない。いくつかの実施形態では、腫瘍を有する患者は、ｐ５３ヌル変異についてヘテロ接合性でない。
【０１６１】
腫瘍の変異状態は、ＰＣＲ、マイクロアレイ、または例えばハイスループットＤＮＡ配列決定のような核酸配列決定などのいくつかの方法によって判定され得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、腫瘍は、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ−１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９、および１９Ａ２４とも称される）；Ｃ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１またはＣＬＥＣＬ１）；ＣＤ３３；上皮成長因子受容体変異型ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２−８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２−３）ｂＤＧａｌｐ（１−４）ｂＤＧｌｃｐ（１−１）Ｃｅｒ）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（ＴｎＡｇ）または（ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；がん胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮性細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン−１３受容体サブユニットα−２（ＩＬ−１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２）；メソテリン；インターロイキン１１受容体α（ＩＬ−１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（ＴｅｓｔｉｓｉｎまたはＰＲＳＳ２１）；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ−β）；発生期特異的胚性抗原−４（ＳＳＥＡ−４）；ＣＤ２０；葉酸受容体α；受容体チロシンタンパク質キナーゼＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面結合（ＭＵＣ１）；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経性細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２変異（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロサム、マクロペイン）サブユニット、β型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）からなる発がん遺伝子融合タンパク質およびエーベルソンマウス白血病ウイルス発がん遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）（ｂｃｒ−ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２−３）ｂＤＧａｌｐ（１−４）ｂＤＧｌｃｐ（１−１）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量−黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体β；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；第Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨ糖セラミド（ＧｌｏｂｏＨ）の六糖部分；乳腺分化抗原（ＮＹ−ＢＲ−１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体β３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲγ  Ａｌｔｅｒｎａｔｅ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ−１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ−Ａ１）；染色体１２ｐ（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）上に位置するＥＴＳ転座変異型遺伝子６；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンギオポエチン結合細胞表面受容体２（同点２）；黒色腫がん精巣抗原−１（ＭＡＤ−ＣＴ−１）；黒色腫がん精巣抗原−２（ＭＡＤ−ＣＴ−２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３変異体；プロステイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺がん腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１またはガレクチン８）、Ｔ細胞１によって認識される黒色腫抗原（ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１）；ラット肉腫（Ｒａｓ）変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；黒色腫のアポトーシス阻害剤（ＭＬ−ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；対になってボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ｍｙｃトリ骨髄球腫症ウイルス発がん遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）；チトクロームＰ４５０  １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合剤（ジンクフィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳまたはＢｒｏｔｈｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  Ｓｉｔｅｓ）、Ｔ細胞３によって認識される扁平上皮がん抗原（ＳＡＲＴ３）；対合ボックスタンパク質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ−ＴＥＳ１）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ−４）；滑膜肉腫、Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物の受容体（ＲＡＧＥ−１）；腎臓遍在性１（ＲＵ１）；腎臓遍在性２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒト乳頭腫ウイルスＥ６（ＨＰＶＥ６）；ヒト乳頭腫ウイルスＥ７（ＨＰＶＥ７）；腸管カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０−２変異（ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球結合免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；Ｆｃ断片ｏｆＩｇＡ受容体（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リ��パ球抗原７５（ＬＹ７５）；Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；および免疫グロブリンλ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）の１つまたは複数から選択される腫瘍抗原を含んでなる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、腫瘍は、例えば表１もしくは表２の抗体、またはその断片もしくは変異型を含んでなる治療法によって治療されているが、それに対して耐性であり応答しない。例えば断片または変異型は、表１または表２の抗体に対応する、例えばｓｃＦｖなどの単一ドメイン抗体であり得る。別の例として、断片または変異型は、例えば軽鎖可変断片、重鎖可変断片、またはその双方などの、表１または表２の抗体の抗原結合断片であり得る。別の例として、断片または変異型は、表１または表２の結合剤の活性断片であり得る。別の例として、断片または変異型は、例えば表１または表２の抗体と、または軽鎖可変断片、重鎖可変断片、またはその双方と、少なくとも７０％、７５％、８０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する抗体などの、表１または表２の抗体と１００％未満の配列同一性を有する抗体であり得る。例えば断片または変異型は、表１または表２の抗体と同一ＣＤＲを有し得るが、フレームワークおよび／または定常領域に１つまたは複数の変異を有する。別の例として、断片または変異型は、例えば表１または表２の結合剤またはその活性部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する結合剤などの、表１または表２の結合剤と１００％未満の配列同一性を有する結合剤であり得る。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は化学療法薬を含んでなる。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は化学療法薬と組み合わせて投与され、例えば赤血球系細胞は化学療法薬の前、後、またはそれと同時に投与される。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞および化学療法薬は混合されており、いくつかの実施形態では、それらは別々の調製物中にある。赤血球系細胞および化学療法薬は、同一投与経路（例えば静脈内）または異なる投与経路（例えば静脈内および経口）によって投与されてもよい。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、化学療法薬は、微小管阻害剤、ＤＮＡ複製阻害剤、光増感剤、または酵素阻害剤である。いくつかの実施形態では、化学療法薬は微小管阻害剤である（例えば微小管集合を遮断するビンカアルカロイド、または微小管脱集合を遮断するタキサンもしくはエポチロン）。いくつかの実施形態では、化学療法薬はＤＮＡ複製阻害剤である（例えば葉酸、プリン、ピリミジン、またはＤＮＡの代謝拮抗剤などの代謝拮抗剤；トポイソメラーゼＩまたはＩＩの阻害剤などのトポイソメラーゼ阻害剤；またはアルキル化剤、白金ベース薬剤、非古典的ＤＮＡ架橋剤、またはインターカレーターなどのＤＮＡ架橋剤）。いくつかの実施形態では、光増感剤はポルフィリン誘導体である。
【０１６６】
より具体的には、いくつかの実施形態では、ビンカアルカロイドは、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンフルニン、ビンデシン、またはビノレルビンから選択される。いくつかの実施形態では、タキサンは、カバジタキセ、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、またはテセタキセルから選択される。いくつかの実施形態では、葉酸代謝拮抗剤は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤（例えばアミノプテリン、メトトレキサート、ペメトレキセド、またはプララトレキサート）またはチミジル酸シンターゼ阻害剤（例えばラルチトレキセドまたはペメトレキセド）から選択される。いくつかの実施形態では、プリン代謝拮抗剤は、アデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えばペントスタチン）、ハロゲン化／リボヌクレオチド還元酵素阻害剤（例えばクラドリビン、クロファラビン、フルダラビン）、またはチオプリン（例えばチオグアニンまたはメルカプトプリン）から選択される。いくつかの実施形態では、ピリミジン代謝拮抗剤は、チミジル酸シンターゼ阻害剤（例えばフルオロウラシル、カペシタビン、テガフール、カルモフール、またはフロクスウリジン）、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤（例えばシタラビン）、リボヌクレオチド還元酵素阻害剤（例えばゲムシタビン）または低メチル化剤（例えばアザシチジンまたは（ｏｆ）デシタビン）から選択される。いくつかの実施形態では、デオキシリボヌクレオチド代謝拮抗剤は、リボヌクレオチド還元酵素阻害剤（例えばヒドロキシカルバミド）である。いくつかの実施形態では、トポイソメラーゼ阻害剤は、例えばカンプトテカ化合物、例えばカンプトテシン、コシテカン、ベロテカン、ギマテカン、エキサテカン、イリノテカン、ルルトテカン、シラテカン、トポテカン、またはルビテカンなどのトポイソメラーゼＩの阻害剤である。いくつかの実施形態では、トポイソメラーゼ阻害剤は、例えばポドフィルム化合物（例えばエトポシドまたはテニポシド）などのトポイソメラーゼＩＩの阻害剤である。いくつかの実施形態では、トポイソメラーゼ阻害剤は、例えばアントラサイクリン（例えばアクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、ピラルビシン、バルルビシン、または（Ｖａｌｒｕｂｉｃｉ，ｏｒｎ）ゾルビシン）またはアントラセンジオン（例えばミトキサントロンまたはピクサントロン）などのインターカレーション活性を有する。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、アルキル化剤は、例えばメクロレタミン、シクロホスファミド（例えばイホスファミドまたはトロホスファミド）、クロランブシル（例えばメルファランまたはプレドニムスチン）、ベンダムスチン、ウラムスチン、またはエストラムスチンなどのナイトロジェンマスタードである。いくつかの実施形態では、アルキル化剤は、例えばカルムスチン、ロムスチン、フォテムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、またはストレプトゾシンなどのニトロソ尿素である。いくつかの実施形態では、アルキル化剤は、例えばブスルファン（例えばマンノスルファンまたはトレオスルファン）などのアルキルスルホネートである。いくつかの実施形態では、アルキル化剤は、例えばカルボコン、チオテパ、トリアジコン、またはトリエチレンメラミンなどのアジリジンである。いくつかの実施形態では、白金ベースの薬剤は、カルボプラチン、シスプラチン、ジシクロプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、またはサトラプラチンから選択される。いくつかの実施形態では、非古典的ＤＮＡ架橋剤は、ヒドラジン（例えばプロカルバジン）、トリアゼン（例えばダカルバジンまたはテモゾロマイド）、アルトレタミン、ミトブロニトール、またはピポブロマンである。いくつかの実施形態では、インターカレーターは、例えば（アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、またはプリカマイシン）などのストレプトミセス化合物である。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、光増感剤は、アミノレブリン酸／アミノレブリン酸メチル、エファプロキシラル、ポルフィリン誘導体（例えばポルフィマーナトリウムタラポルフィン、テモポルフィン、またはベルテポルフィン）から選択される。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、酵素阻害剤は、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えばティピファニブ）、ＣＤＫ阻害剤（例えばアルボシジブ、セリシクリブ、またはパルボシクリブ）、プロテアソーム阻害剤（例えば（ボルテゾミブ、カーフィルゾミブ、またはイキサゾミブ）、ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えばアナグレリド）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ阻害剤（例えばチアゾフリン）、アラキドン酸５−リポキシゲナーゼ阻害剤（例えばマソプロコール）、ＰＡＲＰ阻害剤（例えばオラパリブまたはルカパリブ）、ＨＤＡＣ阻害剤（例えばベリノスタット、パノビノスタット、ロミデプシン、またはボリノスタット）またはホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤、例えば（イデラリシブ）から選択される。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、化学療法薬は受容体拮抗薬である。いくつかの実施形態では、受容体拮抗薬は、エンドセリン受容体拮抗薬（例えばアトラセンタン）、レチノイドＸ受容体拮抗薬（例えばベキサロテン）、または性ステロイド（例えばテストラクトン）から選択される。いくつかの実施形態では、化学療法薬は、アムサクリン、トラベクテジン、レチノイド（例えばアリトレチノインまたはトレチノイン）、三酸化ヒ素、アスパラギン枯渇（例えばペグアスパラガーゼのアスパラギナーゼ）から選択される。セレコキシブ、デメコルチン、エレスクロモール、エルサミトルシン、エトグルシド、ロニダミン、ルカントン、ミトグアゾン、ミトタン、オブリメルセン、オマセタキシンメペスクシナート、またはエリブリン。
【０１７１】
表
【０１７２】
【表１−１】
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【０１７３】
【表１−２】
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【０１７４】
【表２−１】
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【０１７５】
【表２−２】
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【０１７６】
【表２−３】
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【０１７７】
【表２−４】
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【０１７８】
【表２−５】
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【０１７９】
【表２−６】
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【０１８０】
【表２−７】
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【０１８１】
【表２−８】
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【０１８２】
【表２−９】
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【０１８３】
【表２−１０】
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【０１８４】
【表２−１１】
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【０１８５】
【表２−１２】
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【０１８６】
【表２−１３】
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【０１８７】
【表２−１４】
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【０１８８】
【表２−１５】
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【０１８９】
【表２−１６】
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【０１９０】
【表２−１７】
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【０１９１】
【表２−１８】
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【０１９２】
【表２−１９】
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【０１９３】
【表２−２０】
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【０１９４】
【表２−２１】
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【０１９５】
【表３−１】
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【０１９６】
【表３−２】
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【０１９７】
【表４】
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【０１９８】
【表５】
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【０１９９】
【表６】
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【０２００】
【表７】
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【０２０１】
【表８−１】
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【０２０２】
【表８−２】
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【０２０３】
【表８−３】
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【０２０４】
【表８−４】
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【０２０５】
【表８−５】
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【０２０６】
【表８−６】
2019536793.tif 000042
【０２０７】
【表８−７】
2019536793.tif 000043
【０２０８】
【表８−８】
2019536793.tif 000044
【０２０９】
【表８−９】
2019536793.tif 000045
【０２１０】
【表８−１０】
2019536793.tif 000046
【０２１１】
【表８−１１】
2019536793.tif 000047
【０２１２】
【表８−１２】
2019536793.tif 000048
【０２１３】
【表８−１３】
2019536793.tif 000049
【０２１４】
【表８−１４】
2019536793.tif 000050
【０２１５】
【表８−１５】
2019536793.tif 000051
【０２１６】
【表８−１６】
2019536793.tif 000052
【０２１７】
【表８−１７】
2019536793.tif 000053
【０２１８】
【表８−１８】
2019536793.tif 000054
【０２１９】
【表８−１９】
2019536793.tif 000055
【０２２０】
【表８−２０】
2019536793.tif 000056
【０２２１】
【表９】
2019536793.tif 000057
【実施例】
【０２２２】
実施例１：腫瘍抗原に対する結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドを発現する赤血球系細胞は、腫瘍抗原を発現する細胞に結合してアポトーシスを促進し、固形腫瘍に浸透する
Ｎ末端からＣ末端方向に、リツキシマブＣＤ２０  ｓｃＦｖドメイン、ＨＡエピトープ標識、および完全長ＧＰＡを含んでなる、融合タンパク質（細胞外、膜貫通、および細胞内ドメインを含む）（ＲＣＴ−抗ＣＤ２０）をそれらの表面上に発現する除核赤血球系細胞を作製した。完全長ＧＰＡのＮ末端に融合したＨＡエピトープ標識（ＲＣＴ−ＨＡ−ＧＰＡ）のみを表面上に発現する、対照除核赤血球系細胞を作製した。外因性タンパク質を発現する赤血球系細胞を作製する方法は、例えば国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットに記載される。
【０２２３】
ＲＣＴ−抗ＣＤ２０は、フローサイトメトリーによって示されるように、多数のＣＤ２０発現細胞株に結合した（表６を参照されたい）。結合量は、細胞株のＣＤ２０のレベルと相関した（データ未掲載）。
【０２２４】
ＲＣＴ−抗ＣＤ２０のＲａｍｏｓＣＤ２０−発現細胞への結合もまた、免疫蛍光によって視覚化された。細胞をＣＤ２０（例えばＲａｍｏｓ細胞上）、ＨＡ（αＣＤ２０−ＲＣＴおよび対照ＲＣＴ−ＨＡ−ＧＰＡ上のタグ）、およびＤＮＡ（ＤＡＰＩを使用）について染色した。ＣＤ２０＋Ｒａｍｏｓ細胞とＲＣＴ−抗ＣＤ２０の共培養は、ＣＤ２０およびＨＡの広範な共局在を示し、ＲＣＴがＣＤ２０＋細胞に結合してＣＤ２０の超架橋を誘導することが示唆された（データ未掲載）。対照的に、ＣＤ２０＋Ｒａｍｏｓ細胞と対照ＲＣＴ−ＨＡ−ＧＰＡの共培養は、ＣＤ２０およびＨＡの最小限の共局在を示した。
【０２２５】
ＲＣＴ−抗ＣＤ２０細胞を、様々なリンパ腫亜型に相当するＣＣＤ２０＋ヒトリンパ腫細胞株のパネル；ＤｏＨＨ２（濾胞性リンパ腫）、Ｒａｍｏｓ（バーキットリンパ腫）、Ｇｒａｎｔａ−５１９（マントル細胞リンパ腫）、およびＳＵ−ＤＨＬ−４（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）と共培養することによって、ＲＣＴ−抗ＣＤ２０細胞とＣＤ２０発現細胞との間の相互作用がアポトーシスを誘導し得るかどうかをさらに評価した。全ての場合において、ＲＣＴ−抗ＣＤ２０共培養は、ＲＣＴ−ＨＡ−ＧＰＡまたは可溶性リツキシマブモノクローナル抗体単独と比較して、アポトーシスの増加をもたらした（図１）。理論による拘束は望まないが、生体外における直接的な腫瘍細胞殺滅は、リンパ腫細胞上のＣＤ２０の超架橋のために、モノクローナル抗体単独よりも有効であると仮定された。
【０２２６】
可溶性リツキシマブと比較したＲＣＴ−抗ＣＤ２０の性能を定量化した。上述のアポトーシス実験において、ＲＣＴ−抗ＣＤ２０上の抗ＣＤ２０分子の数を定量的フローサイトメトリーによって測定した。ＲＣＴ−抗ＣＤ２０とリンパ腫細胞との比が１：１のサンプルでは、誘導アポトーシスの同様のレベルにもかかわらず、可溶性抗体条件におけるよりも約１１．６倍少ない抗ＣＤ２０分子がＲＣＴ上にあった。ＲＣＴ−抗ＣＤ２０とリンパ腫細胞との比が１：５のサンプルでは、ＲＣＴ−抗ＣＤ２０によるアポトーシスの誘導がはるかに強いにもかかわらず、ＲＣＴ上の抗ＣＤ２０分子は可溶性抗体条件よりも約２．３倍少なかった。したがって、可溶性抗体が、赤血球系細胞がマウントされた抗体よりも著しく高いレベルで存在していても、赤血球系細胞ははるかにより強い効果を示した。
【０２２７】
リツキシマブはカスパーゼ媒介アポトーシスを通じてＣＤ２０＋細胞を滅殺すると考えられているので、抗ＣＤ２０抗体単独でまたはＲＣＴ−抗ＣＤ２０で処理したＣＤ２０＋細胞において、この経路を試験した。ＲＣＴ−抗ＣＤ２０細胞または対照ＲＣＴ−ＨＡ−ＧＰＡを、ＣＤ２０発現標的細胞に添加した。共培養物を、カスパーゼ媒介アポトーシスの阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、または対照としてのＤＭＳＯで処理した。標的細胞のアポトーシスを測定した。図２に示されるように、カスパーゼ媒介アポトーシスの阻害剤の存在下であってさえも、ＲＣＴ−抗ＣＤ２０はＲａｍｏｓ細胞におけるアポトーシスを強く促進した。この驚くべき結果は、ＲＣＴ−抗ＣＤ２０が、対応する抗体単独のそれとは異なる機序を通じて、ＣＤ２０＋がん細胞を殺滅することを示唆する。結果は、例えばカスパーゼ依存性アポトーシス経路の障害のために、抗ＣＤ２０抗体などの抗体に対して再発性または抵抗性である患者において、それでもなお赤血球上に提示されるその抗体に対して感受性であり得ることを暗示する。
【０２２８】
ＲＣＴ−抗ＣＤ２０が引き起こすアポトーシスの機序をさらに特徴付けるために、ＢＣＬ−ｘＬおよびＢＣＬ−２レベルを調べた。ＲＣＴ−抗ＣＤ２０または対照ＲＣＴ−ＨＡ−ＧＰＡ細胞を３つのがん細胞株（Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、またはＤｏＨＨ２）のそれぞれと共に培養した。がん細胞上のＢＣＬ−ｘＬおよびＢＣＬ−２の表面レベルをフローサイトメトリーによって測定した。各株において、ＲＣＴ−抗ＣＤ２０はＢＣＬ−ｘＬおよびＢＣＬ−２レベルを減少させたが、対照ＲＣＴ−ＨＡ−ＧＰＡはそうでなかった（表７を参照されたい）。ＢＣＬ２およびＢＣＬｘｌ抗アポトーシス経路の阻害は、用量依存的であった。
【０２２９】
ＲＣＴ−抗ＣＤ２０はまた、固形腫瘍に浸透する能力についても試験した。赤血球系細胞は抗体よりはるかに大きいことから、赤血球系細胞が固形腫瘍に効率的に浸透できることは予想されなかった。（例えばＮｅｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．ＤＯＩ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ−ｍｅｄ−０６２３１５−１２０２４５，Ｔｈｕｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２００８．０４．０１２を参照されたい。）免疫不全マウスに、Ｒａｍｏｓ細胞を皮下注射することによって、異種移植腫瘍を形成した。マウスに、ｍＲＢＣ−抗ＣＤ２０または対照ｍＲＢＣ−ＨＡ−ＧＰＡを静脈内投与した。ｍＲＢＣ−抗ＣＤ２０は、ｍＲＢＣ−ＨＡ−ＧＰＡと比較して、例えばＨ＆Ｅ染色およびＨＡ染色によって、広範な腫瘍浸透を示した（図３）。特に、ｍＲＢＣ−抗ＣＤ２０が腫瘍の非壊死性領域に侵入したのに対して、ｍＲＢＣ−ＨＡ−ＧＰＡは、一般に腫瘍の血管系または壊死性領域に限定されていた（図３）。蛍光標識ＲＣＴ−抗ＣＤ２０を使用して、対照ｍＲＢＣ−ＨＡ−ＧＰＡと比較して特異的な腫瘍浸透も示された（図４）。腫瘍内部のｍＲＢＣ−抗ＣＤ２０の平均蛍光強度は、対照ｍＲＢＣ−ＨＡ−ＧＰＡの２倍以上高かった。これらのデータは、抗ＣＤ２０抗体などの腫瘍結合部分を含んでなる赤血球系細胞の治療用途を支持する。それらはまた、赤血球系細胞を例えばＣＤ２０陽性腫瘍などの腫瘍に向けるための標的化ツールとしての、抗ＣＤ２０抗体などの腫瘍結合部分の使用も支持する。
【０２３０】
実施例２：免疫チェックポイント阻害剤を発現する赤血球系細胞はＴ細胞のチェックポイント阻害を防止する
それらの表面上に、Ｎ末端からＣ末端方向にｓｃＦｖ抗体ドメイン、エピトープ標識（ＨＡまたはＦｌａｇのどちらか）、および完全長ＧＰＡ（細胞外、膜貫通、および細胞質ドメインを含んでなる融合タンパク質を発現する、除核赤血球系細胞を作製した。ｓｃＦｖドメインは、ＰＤ−１（ＲＣＴ−抗ＰＤ１）、ＰＤ−Ｌ１（ＲＣＴ−抗ＰＤＬ１）、またはＣＴＬＡ４（ＲＣＴ−抗ＣＴＬＡ４）に対する特異的結合剤であった。抗ＰＤ−１抗体ドメインは、ペンブロリズマブベースである。抗ＰＤ−Ｌ１抗体ドメインは、アテゾリズマブベースである。抗ＣＴＬＡ４抗体ドメインは、イピリムマブベースである。
【０２３１】
抗ＰＤ‐Ｌ１および抗ＣＴＬＡ４ポリペプチドの強固な発現がフローサイトメトリーアッセイで観察され、抗ＰＤ−Ｌ１をコードするベクターによる形質移入後に、９５．７％を超える細胞が抗ＰＤ−Ｌ１を発現した。同様に、抗ＣＴＬＡ４をコードするベクターによる形質移入後に、９５．２％を超える細胞が抗ＣＴＬＡ４を発現した。
【０２３２】
細胞をジャーカット／ＩＬ−２アッセイで試験した。ジャーカットＴリンパ球は典型的にＩＬ−２を分泌し、刺激に際してＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＣＴＬＡ４もまた発現する。ジャーカット細胞とＮＨＬ細胞（Ｚ１３８）との共培養は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＣＴＬＡ４シグナル伝達を通じて免疫チェックポイントを誘発し、ジャーカット細胞ＩＬ−２分泌の下方制御をもたらす。ＲＣＴなどの被検物質を共培養物に添加する。免疫チェックポイントを阻害し、それによってＴ細胞活性を維持する被検物質の能力は、高いＩＬ−２分泌レベルの維持によって検出される。
【０２３３】
Ｚ−１３８（ＮＨＬ）とジャーカット細胞との共培養時に、ＩＬ−２分泌の６０％の阻害がジャーカットＩＬ−２アッセイで観察された（図５）。非形質導入対照ＲＣＴは、阻害効果をレスキューしない。しかし、ＲＣＴ−抗ＰＤＬ１はＲＣＴ−抗ＣＴＬＡ４と同様に、Ｔ細胞ＩＬ−２分泌のレスキューおよび回復を示した（図５）。この実験は、免疫チェックポイント阻害剤を発現するＲＣＴが、Ｔ細胞のチェックポイント阻害を防止することによって免疫応答を促進し得ることを示す。
【０２３４】
ＲＣＴ−抗ＰＤ１およびＲＣＴ−抗ＰＤ１が、抗原免疫復活アッセイにおいて活性化を引き起こす能力をアッセイした。ＣＭＶ陽性ドナー由来のＰＢＭＣをＣＭＶペプチドで刺激した。免疫チェックポイント阻害に感受性である記憶Ｔ細胞を、対照ＰＢＭＣまたはコントロールＲＣＴと比較して、ＲＣＴ−抗ＰＤ−１またはＲＣＴ−抗ＰＤ−Ｌ１と共培養することで、活性化およびγインターフェロンセクレチン（ｓｅｃｒｅｔｉｎ）について試験した。抗原免疫復活アッセイにおいて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のインターフェロンγ分泌の３〜４倍の増加が実証された（図６）。対照ＲＣＴ−ＨＡ−ＧＰＡは、インターフェロン−γレベルを増加させなかった。ＲＣＴ−抗ＰＤＬ１は、このアッセイでは、インターフェロン−γ分泌の３〜６倍の増加を示した（データ未掲載）。この実験は、免疫チェックポイント阻害剤を発現するＲＣＴが、Ｔ細胞のチェックポイント阻害を防止することによって免疫応答を促進し得ることを示す。
【０２３５】
ＰＢＭＣ増殖を促進する能力について、ＲＣＴ−抗ＰＤＬ１を試験した。ＰＢＭＣとＲＣＴ−抗ＰＤＬ１との共培養は、ＰＢＭＣ単独と比較して、ＰＢＭＣ細胞の３．６倍の増加をもたらした。ＰＢＭＣと対照ＲＣＴ−ＨＡ−ＧＰＡとの共培養は、２．３倍のみの増加をもたらした。この実験は、免疫チェックポイント阻害剤を発現するＲＣＴが、それによって免疫応答を促進し得る付加機構を示唆する。
【０２３６】
実施例３：共刺激分子を発現する赤血球系細胞はＴ細胞活性を促進する
Ｎ末端からＣ末端方向に、４−１ＢＢＬドメイン、エピトープ標識（ＨＡまたはＦｌａｇ）、および完全長ＧＰＡ（細胞外、膜貫通、および細胞質ドメイン）（ＲＣＴ−４１ＢＢＬ）を含んでなる融合タンパク質をそれらの表面上に発現する、除核赤血球系細胞を作製した。４１−ＢＢ−Ｌは、抗原提示細胞上で発現されてＴ細胞上の４１−ＢＢ受容体に結合する、共刺激タンパク質である。
【０２３７】
ＲＣＴ−４１−ＢＢ−Ｌの組換え４１−ＢＢへの結合をフローサイトメトリーを用いて判定した。
【０２３８】
４−１ＢＢおよびＮＦκＢ−Ｌｕｃ２Ｐ（ＮＦκＢ制御ルシフェラーゼレポーターコンストラクト）を過剰発現するジャーカットＴ細胞との共培養によって、ＲＣＴ−４１ＢＢＬをアッセイした。４−１ＢＢＬが結合すると、Ｔ細胞は、一般にＮＦκＢシグナル伝達の増加、増殖の増加、ＩＬ−２およびインターフェロン−γ分泌の増加、および活性化誘導細胞死からの保護を示す。アッセイでは、ルシフェラーゼ活性によって測定されるように、ＲＣＴ−４１ＢＢＬは、対照と比較してＮＦκＢ活性化を３０倍刺激した（図７）。非形質導入除核赤血球系細胞は、ルシフェラーゼレベルを上昇させなかった。
【０２３９】
さらに、ＰＢＭＣとＲＣＴ−４１ＢＢＬとの共培養は、ＰＢＭＣ単独と比較してＴ細胞増殖の１．７倍の増加を示した。
【０２４０】
これらの実験は、除核赤血球系細胞がＰＢＭＣ増殖を促進し、免疫細胞活性化に関与するＴ細胞細胞内シグナル伝達経路を活性化させる様式で、共刺激分子を成功裏に提示し得ることを示す。
【０２４１】
実施例４：腫瘍抗原およびＴＲＡＩＬリガンドに対する結合剤を同時発現する赤血球系細胞は腫瘍抗原を発現するがん細胞におけるアポトーシスを促進する
上述の方法を用いて、赤血球系細胞が抗ＣＤ２０ならびにＴｒａｉｌリガンド（アポトーシス誘導剤）を同時に発現するように操作された場合、Ｒａｍｏｓ細胞とＲＣＴ−抗ＣＤ２０、ＲＣＴ−Ｔｒａｉｌ、およびＲＣＴ−抗ＣＤ２０＋Ｔｒａｉｌ（同時発現される）との共培養は、４８時間後にそれぞれ３２％、４７％、および７６％のアポトーシスをもたらし、腫瘍細胞殺滅に対する同時発現ＲＣＴの相乗効果が示唆される。
【０２４２】
実施例５：共刺激分子を発現する赤血球系細胞はＴ細胞活性を促進する
本明細書に記載され、以下の表に示されるように、４−１ｂＢ−Ｌ−ＨＡに対するｍＲＮＡの漸増量を成熟期のＲＣＴに電気穿孔することによって、異なる量の４−１ｂＢ−Ｌ−ＨＡを発現する赤血球系細胞を作製した。発現細胞のパーセントおよび細胞当たりで発現されたコピーとして測定した場合の双方で、電気穿孔されたｍＲＮＡの量が多いほど、コードされたタンパク質の発現はより大きかった。表１０は、二重反復試験に基づく発現レベルを要約する。
【０２４３】
【表１０】
2019536793.tif 000058
【０２４４】
電気穿孔後に、ＮＦｋＢルシフェラーゼアッセイで赤血球系細胞の活性を試験した。手短に述べると、赤血球系細胞をルシフェラーゼプロモーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の下で、４−１ＢＢおよびＮＦｋＢを発現する市販のジャーカット細胞と共に培養した。このシステムでは、市販のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定される増加したルシフェラーゼ活性は、ＮＦｋＢの活性化を示唆する。細胞膜上に異なる量の４−１ＢＢ−Ｌを発現する５０，０００個のＲＣＴと共に、１００，０００個のジャーカット４−１ＢＢ  ＮＦｋＢ／Ｌｕｃ細胞を培養した。細胞を６時間培養し、その後、ルシフェラーゼ活性を測定した。図８に提示されるデータは、ルシフェラーゼ活性の強堅固な増加が最初は用量依存的であり、次に、細胞当たりで発現される２００，０００コピーの４−１ＢＢ−Ｌの後に平坦域になることを示す。このデータは、これらのアッセイ条件下では、細胞当たり２００，０００コピーの４−１ＢＢ−Ｌで最大ルシフェラーゼ活性に達することを示す。
【０２４５】
別の実験では、Ｔ細胞活性を促進する能力について、４−１ＢＢ−Ｌ  ＲＣＴを抗４−１ＢＢ抗体ウトミルマブと比較した。４−１ＢＢ−Ｌ  ＲＣＴまたは対照ＲＣＴ（非形質導入）の漸増細胞数（１２，５００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、または４００，０００個）と共に、１００，０００個のジャーカット４−１ＢＢ  ＮＦｋＢ／Ｌｕｃ細胞を培養した。ジャーカット４−１ＢＢ  ＮＦｋＢ／Ｌｕｃ細胞はまた、０．００２５ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲のウトミルマブを架橋させるために使用した二次抗ヒトＩｇＧの存在下または非存在下で、４−１ＢＢ作動薬ウトミルマブの漸増濃度（０．００１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の濃度）と共に培養した。結果は、このアッセイにおいて、ウトミルマブ単独ではＮＦκＢ活性は増加せず、試験したいずれの濃度の二次抗体単独でもまたは対照ＲＣＴでも増加しなかったことを示す。二次抗ヒトＩｇＧ抗体によって架橋された高濃度のウトミルマブ（０．１ｎＭ以上）は、ルシフェラーゼ活性の４〜６倍の増加をもたらし、ＮＦｋＢプロモーター活性化を示唆した。ジャーカット４−１ＢＢ  ＮＦｋＢ／Ｌｕｃ細胞と４−１ＢＢ−Ｌ  ＲＣＴとの培養は、１２，５００個のＲＣＴで開始して、ＮＦｋＢのより強い活性化を誘導し、２０倍のＮＦｋＢ活性化をもたらした（図９）。最大活性は、ジャーカット４−１ＢＢ  ＮＦｋＢ／Ｌｕｃ細胞と共に培養した２００，０００個のＲＣＴで見られ、ルシフェラーゼ活性、したがってＮＦｋＢ活性の９０倍の増加をもたらした。したがって、４−１ＢＢＬを発現する赤血球系細胞は、架橋抗体と比較して劇的に高い（約１５倍高い）Ｔ細胞活性の誘導をもたらす。理論による拘束は望まないが、赤血球系細胞表面における４−１ＢＢＬの三量体化は、その高活性に寄与してもよい。
【０２４６】
４−１ＢＢ−Ｌ  ＲＣＴは、ＰＢＭＣ増殖もまた増加させることが示された。３人の異なるドナーからのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＡｓｔｒａｔｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから入手し、増殖アッセイで分析した。製造業者のプロトコルに従って、ＰＢＭＣをＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ（ＣＴＦＲ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）で標識した。１０００００個のＣＴＦＲ標識ＰＢＭＣを未処理のままにして、または０．５ｕｇ／ｍＬのＣＤ３抗体で刺激した。二次抗ヒトＩｇＧ抗体（２．５ｎＭ、２５ｎＭまたは２５０ｎＭ）の存在下または非存在下で、１２，５００、２５，０００または５０，０００個のＲＣＴ（対照または４−１ＢＢ−Ｌを発現する）または漸増用量のウトミルマブ（１ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭ）またはアイソタイプ対照抗体と共に、細胞を培養した。細胞を５日間培養し、フローサイトメトリーで分析した。図１０に示されるように、架橋抗体を有するウトミルマブは、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の増殖のわずかな増加をもたらした。他方、ＣＴＦＲ  ＰＢＭＣとＲＣＴ  ４−１ＢＢ−Ｌとの培養は、ＣＤ４増殖に用量依存的な２〜２．５倍の増加、およびＣＤ８細胞の増殖に用量依存的な４〜７倍の増加をもたらした。データは、３人の異なるヒトドナーからのＰＢＭＣの増殖を表し、ＣＤ４およびＣＤ８増殖における増加倍数の計算は、ＣＤ３抗体と同じドナー由来のＰＢＭＣの増殖と比較したものであった。この実験は、ＲＣＴ  ４−１ＢＢ−Ｌが、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の双方の増殖を促進し、ＣＤ４＋細胞よりもＣＤ８＋細胞においてより強固な効果を有することを示唆する。
【０２４７】
Ｔ４−１ＢＢ−Ｌ  ＲＣＴはまた、サイトカイン分泌も増加させることが示された。３人の異なるドナーからのヒトＰＢＭＣをＡｓｔｒａｔｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから入手し、そしてサイトカイン分泌アッセイで分析した。１００，０００個のＣＴＦＲ標識ＰＢＭＣを未処理のままにして、または０．５ｕｇ／ｍＬのＣＤ３抗体で刺激した。二次抗ヒトＩｇＧ抗体（２．５ｎＭ、２５ｎＭ、２５０ｎＭまたは２．５ｕＭ）の存在下または非存在下で、１２，５００、２５，０００、５０，０００または１００，０００個のＲＣＴ（対照または４−１ＢＢ−Ｌ）、または漸増用量のウトミルマブ（１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭまたは１ｕＭ）またはアイソタイプ対照と共に、細胞を培養した。細胞を５日間培養し、製造者のプロトコルに従って、フローサイトメトリーに基づくサイトカインパネル（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ｌｅｇｅｎｄｐｌｅｘヒト炎症パネル）で、サイトカイン分泌について分析した。図１１に提示されたデータは、ウトミルマブ単独では、二次抗体架橋で４００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮｇおよび６００ｐｇ／ｍＬの最大分泌をもたらした一方で、ＰＢＭＣのＲＣＴ−４−１ｂＢとの培養は、１５００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮｇをもたらしたことを示唆する。同様の効果はＴＮＦα分泌でも見られ、ＰＢＭＣをＲＣＴ−４−１ＢＢ−Ｌと共に培養するとＴＮＦα分泌の強固な増加がもたらされ、これはウトミルマブ単独でもまたはトミルマブと二次抗体でも見られない。
【０２４８】
実施例６：４１ＢＢＬを含んでなる赤血球系細胞は生体内で腫瘍増殖を遅延させる
結腸がんのＭＣ３８マウスモデル系を用いて、４−１ＢＢＬを含んでなる赤血球系細胞の腫瘍増殖に対する効果を試験した。理論により拘束されることなく、４１ＢＢＬは、先天性および適応性免疫アームの双方で、多様な免疫エフェクター応答を誘発することによって腫瘍増殖を遅延させると考えられている。最も強力な応答は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞が増殖し、それらのエフェクター能力が、インターフェロンγ産生の増加と複数のグランザイムの発現を通じて増加するように、刺激する。対照的に、複数の４−１ＢＢ作動薬を使用した既報の前臨床データは、ＭＣ３８またはその他のモデルにおいて、単剤抗腫瘍活性をほとんどまたは全く示さなかった（Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ，２０１４；Ｋｕｄｏ−Ｓａｉｔｏ，ｅｔ  ａｌ，２００６；Ｋｏｃａｋ，  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ  ２００６；Ｔｉｒａｐｕ，ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４；Ｊｏｈｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ  ２０１２）。
【０２４９】
細胞を４−１ＢＢＬにコンジュゲートさせ、その結果、９４．７％の細胞がｍ４−１ＢＢ−Ｌで標識された。フローサイトメトリーを用いて、細胞当たりの標識された分子の量を定量化した。動物に投与するためには、１用量当たり平均で１．１ｅ９個のｍ４−１ＢＢ−Ｌ  ｍＲＢＣを投与し、１用量当たり０．０８４ｍｇ／ｋｇのｍ４−１ＢＢ−Ｌに相当する細胞当たり平均３６，２００個のｍ４−１ＢＢ−Ｌ分子を投与した。
【０２５０】
６〜８週齢の１４匹のメスＣ５７／Ｂ６マウスの左側腹部に、５×１０５個のＭＣ−３８細胞を皮下接種した。動物の体重および状態を毎日記録し、腫瘍を週に３回測定した。
【０２５１】
各腫瘍を２つの寸で測定することにより、腫瘍を週に３回測定した。（Ｌ×Ｗ２）／２の標準式を用いて、腫瘍体積を計算した。各時点で、各群について平均腫瘍重量および標準誤差を計算した。
【０２５２】
未処置対照と比較したｍ４−１ＢＢ−Ｌ  ｍＲＢＣの観察された抗腫瘍活性が図１２に示され、ｍ４−１ＢＢ−Ｌ  ｍＲＢＣで処置したマウスにおける腫瘍増殖の減少が実証される。腫瘍体積分布は、研究の早くも５日目から９日目までに、群間における統計的に有意な差を実証した（Ｐ＜０．０５、Ｔ検定）。
【０２５３】
体重を毎日記録した。体重の変化を１日目に記録された体重と比較して、各マウスについて計算した。ほとんどのマウスの全体的な体重の増加によって示されるように、治療は良好に耐容された。体重のいくらかの減少を示したマウスでは、研究全体にわたり全身重量の５％を超える体重低下はなかった。
【０２５４】
これらのデータは、赤血球系細胞を通じた４−１ＢＢ−Ｌの細胞性提示の有意な有効性および効力を支持する。
【０２５５】
実施例７：腫瘍抗原に対する結合剤を含んでなる外因性ポリペプチドを発現する赤血球系細胞は固形腫瘍に浸透する
除核赤血球系細胞をそれらの表面で抗ＰＤ−Ｌ１に結合させ、マウスの腫瘍に浸潤する能力について試験した。
【０２５６】
マウスにＢ１６Ｆ１０細胞ＳＣを接種した。投与前に腫瘍を４００立方ｍｍまで成長させた。マウスＲＢＣを抗マウスＰＤ−Ｌ１由来のフラグメント抗体（Ｆａｂ）およびアイソタイプ対照にコンジュゲートさせた。コンジュゲートされたマウスＲＢＣを製造元のプロトコルに従ってＣＴＦＲで標識した。細胞を動物に注入した。注入の１日後、腫瘍を採取した。腫瘍を切片化し、抗ＣＤ３１で染色して腫瘍血管系を視覚化し、ＤＡＰＩで核を視覚化した。染色切片をスキャンし、写真を撮影した。Ｈａｌｏソフトウェアを用いて、腫瘍領域と血管系領域を特定した。これら２つの領域における標識されたＲＢＣの総細胞数を、アイソタイプ対照および抗ＰＤ−Ｌ１の双方について数えた。腫瘍内に見いだされたＲＢＣと、血管内に見いだされたＲＢＣとの比率を計算した。図１３に提示されたデータは、アイソタイプ対照コンジュゲートＲＢＣについて、血管内のＲＢＣと腫瘍内のＲＢＣとの比率が１であることを示唆しており（８匹のマウスからの腫瘍における測定の平均）、腫瘍および血管系における同様の量が示される。血管内のＲＢＣと腫瘍内のＲＢＣとの比率は、抗ＰＤ−Ｌ１処置マウスについて１．７であり、アイソタイプ対照マウスと比較して、抗ＰＤ−Ｌ１群における腫瘍内のＲＢＣの富化が示される。２群間の比率の差はＰ＜０．０１（スチューデントＴ検定）であり、統計的に有意であった。
【０２５７】
理論による拘束は望まないが、より高いレベルのＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍は、より低いレベルのＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍よりも、抗ＰＤ−Ｌ１を含んでなるＲＣＴに対してより良好に応答してもよい。１０ｎｇ／μｌのＩＦＮ−γで刺激した場合、Ｂ１６Ｆ１０細胞は、細胞あたり約３００，０００コピーのＰＤ−Ｌ１を発現した。対照的に、同一条件下で、ＣＴ２６細胞は１細胞当たり約１５０，０００コピーのＰＤ−Ｌ１を発現し、Ａ２０細胞は１細胞当たり約１００，０００コピーのＰＤ−Ｌ１を発現した。ＰＤ−Ｌ１コピー数は、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒキット（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて測定した。それらの表面に抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含んでなる赤血球系細胞は、ＩＦＮ−γ処理Ｂ１６Ｆ１０細胞およびＣＴ２６に対して、Ａ２０細胞に対するよりも大きな結合を示し、腫瘍細胞上でのより高いレベルのＰＤ−Ｌ１発現と一致して、赤血球系細胞の腫瘍細胞への結合の増加をもたらした。
【０２５８】
実施例８：２つの薬剤を発現する赤血球系細胞はどちらのポリペプチドを単独で発現させた場合よりも大きな免疫エフェクター細胞刺激を促進する。
１人のドナーからのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＡｓｔｒａｔｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから得て、ＩＬ−２サイトカイン分泌アッセイで分析した。５００，０００個のＰＢＭＣを５ｕｇ／ｍＬのＣＤ３抗体で刺激した。細胞を５００，０００個のＲＣＴ対照細胞と、または抗ＰＤ−Ｌ１もしくは４−１ＢＢ−Ｌを発現するＲＣＴと共に培養した。並行して、５００，０００個のＲＣＴ−抗ＰＤ−Ｌ１と、４−１ＢＢ−Ｌを発現する５００，０００個のＲＣＴとの組み合わせを試験した。また並行して、抗ＰＤ−Ｌ１および４−１ＢＢ−Ｌの双方を発現する５００，０００個の細胞を試験した。２４時間後、上清を収集し、ＩＬ−２ＥＬＩＳＡを実施して、ＲＣＴ−抗ＰＤ−Ｌ１およびＲＣＴ  ４−１ＢＢ−Ｌとの培養の結果としての培地へのＩＬ−２分泌を評価した。ＲＣＴ抗ＰＤ−Ｌ１は、ＰＢＭＣ単独と比較して、ＩＬ−２分泌の４倍の増加をもたらした。ＲＣＴ  ４−１ＢＢ−Ｌが、４−１ＢＢ−Ｌの１０倍の分泌増加をもたらしたのに対して、ＲＣＴ抗ＰＤ−Ｌ１とＲＣＴ−４−１ＢＢ−Ｌとの組み合わせは、ＩＬ−２分泌の１３倍の増加をもたらした。非重複細胞集団においてＰＤ−Ｌ１および４−１ＢＢ−Ｌが発現された場合に、同じ１３倍の増加が、ＲＣＴ上で同時発現された抗ＰＤ−Ｌ１および４−１ＢＢ−Ｌで測定された；しかし同時発現細胞は、非重複細胞集団（合計１，０００，０００個の細胞）と比較して、半分の用量（５００，０００個の細胞）でこの効果を達成した。
【０２５９】
この実験は、２つの薬剤を発現する赤血球系細胞が、単独で発現されたどちらかのポリペプチドよりも大きい免疫エフェクター細胞刺激（サイトカイン分泌によって測定される）を生じたことを示唆する。ここで使用された２つの薬剤は、共刺激分子（４−１ＢＢＬ）、および免疫チェックポイント分子に結合する薬剤（抗ＰＤ−Ｌ１）であった。さらに、２つの薬剤が異なる細胞集団において発現された場合よりも、２つの薬剤が同一細胞上で発現された場合の方が効果が大きかった。
【０２６０】
実施例９：抗がん剤を発現するＲＣＴはシグナル伝達、増殖、サイトカイン分泌、および抗原免疫復活を促進する
図１４の表は、４−１ＢＢ−Ｌ、ＯＸ４０−Ｌ、ＧＩＴＲ−Ｌ、およびＩＣＯＳ−Ｌを発現するＲＣＴを用いて作成されたデータを要約する。シグナル伝達活性は、４−１ＢＢ−Ｌ、ＯＸ４０−Ｌ、およびＧＩＴＲ−Ｌ（それぞれＮＦｋＢ／Ｌｕｃを発現するジャーカット細胞と４−１ＢＢ、ＯＸ４０またはＧＩＴＲの受容体とを有する）について実施例５に記載のＮＦｋＢ／Ｌｕｃアッセイを指す。増殖アッセイおよびサイトカイン分泌アッセイを実施例５に記載されるように実施した。抗原免疫復活アッセイは、２ｕｇ／ｍＬのＣＭＶ感染細胞（Ａｓｔａｒｔｅ）の溶解物を使用して刺激した、ＣＭＶ陽性ドナー（Ａｓｔａｒｔｅ）由来の２００，０００個のＰＢＭＣを使用して実施した。次に、示される外因性タンパク質を発現する１００，０００個のＲＣＴと共に、ＰＢＭＣを４日間培養した。フローサイトメトリーを用いて、記憶Ｔ細胞集団の存在について細胞を分析し、ＣＤ４＋およびＣＤ４５ＲＯ＋である細胞を検出した。これらの実験からの上清を収集し、ＥＬＩＳＡを用いてＩＦＮｇについて分析した。これらの実験は、様々な共刺激分子を発現する赤血球系細胞がＴ細胞活性化を誘導することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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