(57)【要約】  本発明は、物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節するために使用することができる表面トポグラフィに関する。そのようなトポグラフィは、細胞の挙動を調節するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで適用することができる。特定の例には、免疫反応を調節する本発明のトポグラフィを備えたインプラント、または骨形成を増加させるインプラントが含まれる。本発明はさらに、細胞の挙動を調節するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用される物に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節することができる１つまたは複数のトポグラフィを有する表面部を備える物であって、前記トポグラフィは規則的なパターンの突起を有する表面を備え、前記突起は１つまたは複数の突起要素を含み、前記突起要素は、頂部表面領域を有する前記表面の上に隆起した表面部分および前記頂部表面領域を前記表面と接続する周囲側面として定義され、前記各突起要素は前記表面の上で０．５〜５０μｍの最大高さを有し、
ａ）隣接する前記突起間の平均距離が０〜５０μｍであり、
ｂ）前記突起の前記頂部表面領域の面積が１〜６０００μｍ２であり、および、
ｃ）前記突起が前記表面の３〜９０％を覆う、
物。
【請求項２】
ａ）前記突起が１つの突起要素を有する場合、
前記表面に対して平行な前記頂部表面領域の周囲内で最も長い直線フィッティングの長さとして定義される前記突起の長さは、０．０１〜１００μｍであり、
前記長さに対して垂直であって、前記表面に対して平行な前記頂部表面領域の前記周囲内で最も長い直線フィッティングの長さとして定義される前記突起の幅は、０．０１〜１００μｍであり、
ｂ）前記突起が複数の突起要素を有する場合、
前記表面に対して平行な前記頂部表面領域の前記周囲内で最も長い直線フィッティングの長さとして定義される各突起要素の長さは、０．０１〜１００μｍであり、
前記長さに対して垂直であって、前記表面に対して平行な前記頂部表面領域の前記周囲内で最も長い直線フィッティングの長さとして定義される各突起要素の幅は、０．０１〜１００μｍであり、
ｃ）同じ突起の隣接する突起要素の２つの周囲間の平均距離は、０〜５０μｍである、
請求項１に記載の物。
【請求項３】
前記表面部は、金属材料、高分子材料、複合材料またはセラミック材料を含む、
請求項１または２に記載の物。
【請求項４】
突起の前記規則的なパターンは、前記表面の上に置くことができる交差するグリッド線の格子によって定義され、前記グリッド線は各単位セルが最大１つの突起を含むように、単位セルのパターンを定義する、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の物。
【請求項５】
前記表面部に、好ましくは１つ、しかし１０を超えない、異なるトポグラフィを含む、物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節するための、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の物。
【請求項６】
骨形成を刺激するための、異物に対する免疫反応の調節に使用するための、または細胞培養のための、
請求項５に記載の物。
【請求項７】
インプラントとして使用するための、請求項５または６に記載の物。
【請求項８】
骨形成分化を刺激する、肝細胞の表現型および機能を維持する、または免疫反応を刺激および／もしくは抑制する、
請求項７に記載の使用のための物。
【請求項９】
前記インプラントが歯科用インプラントまたは整形外科用インプラントであり、前記トポグラフィが、
ａ）隣接する前記突起間の平均距離が２〜２５μｍであり、および
ｂ）前記突起の前記頂部表面領域の面積が３０〜７５０μｍ２であり、および、
ｃ）前記突起が前記表面の３０〜６５％を覆うこと、
によって定義される、
請求項７または８に記載の使用のための物。
【請求項１０】
前記インプラントが肝臓インプラントであり、前記トポグラフィが、
ａ）隣接する前記突起間の平均距離が３〜２５μｍであり、および
ｂ）前記突起の前記頂部表面領域の面積が２０〜２５０μｍ２であり、および、
ｃ）前記突起が前記表面の８〜３５％を覆うこと、
によって定義される、
請求項７または８に記載の使用のための物。
【請求項１１】
当該物が免疫反応を抑制することによって異物に対する免疫反応を調節し、前記トポグラフィが、
ａ）隣接する前記突起間の平均距離が２〜１２μｍであり、および
ｂ）前記突起の前記頂部表面領域の面積が２０〜２００μｍ２であり、および、
ｃ）前記突起が前記表面の２６〜５０％を覆うこと、
によって定義される、
請求項７または８に記載の使用のための物。
【請求項１２】
当該物が免疫反応を刺激することによって異物に対する免疫反応を調節し、前記トポグラフィが、
ａ）隣接する前記突起間の平均距離が５〜１２μｍであり、および
ｂ）前記突起の前記頂部表面領域の面積が２０〜７０μｍ２であり、および、
ｃ）前記突起が前記表面の１５〜２５％を覆うこと、
によって定義される、
請求項７または８に記載の使用のための物。
【請求項１３】
当該物が、異物に対する早期段階での免疫反応を刺激することによって、異物に対する免疫反応を調節して、より低い最終段階での免疫反応をもたらし、前記トポグラフィが、
ａ）隣接する前記突起間の平均距離が１２．１〜２０μｍであり、および、
ｂ）前記突起の前記頂部表面領域の面積が２５〜６５μｍ２であり、および、
ｃ）前記突起が前記表面の５〜１０％を覆うこと、
によって定義される、
請求項７または８に記載の使用のための物。
【請求項１４】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節するための請求項５または６に記載の物。
【請求項１５】
前記調節が肝細胞の表現型および機能を維持することを含み、前記各トポグラフィが、
ａ）隣接する前記突起間の平均距離が３〜２５μｍであり、
ｂ）前記突起の前記頂部表面領域の面積が２０〜２５０μｍ２であり、および、
ｃ）前記突起が前記表面部の８〜３５％を覆うこと、
によって定義される、
請求項１４に記載の物。
【請求項１６】
前記トポグラフィは規則的なパターンの突起によって定義される規則的なパターンの谷を有する頂部表面領域を含むものとしてあるいは定義され、前記谷は谷底、第１の谷壁および第２の谷壁を含み、前記第１の谷壁は第１の谷壁セクションおよび必要に応じて第１の谷壁のパンクチャーを含み、前記第２の谷壁は第２の谷壁セクションおよび必要に応じて第２の谷壁のパンクチャーを含み、前記第１および前記第２の谷壁セクションは前記谷に隣接する突起の側面によって定義され、前記第１および前記第２の谷壁のパンクチャーは前記谷に対して垂直および前記谷底に対して平行な線が前記谷に隣接する前記突起に接触しない前記谷壁の部分として定義され、
ａ）前記谷壁は、前記谷底から前記頂部表面領域までの前記谷底に対して垂直な距離として定義される、０．５〜５０μｍの高さを有し、
ｂ）前記第１および第２の谷壁の前記谷壁の輪郭は独立して０〜４０μｍであり、
ｃ）前記第１および第２の谷壁セクションの長さは独立して０．０１〜１００μｍであり、
ｄ）前記第１および第２の谷壁のパンクチャーがある場合、その長さは、独立して０〜５０μｍであり、
ｅ）前記谷の平均幅は０〜５０μｍである、
請求項１〜１５で定義される物。
【請求項１７】
物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節する方法であって、
１）適切な培地中の１つまたは複数の細胞を、規則的なパターンの突起を有する表面部と接触させる工程であって、前記規則的なパターンの突起は前記表面部の上に置かれ得る交差するグリッド線の格子によって定義され、前記グリッド線は各単位セルが最大１つの突起を含むように、単位セルのパターンを定義し、前記突起が１つまたは複数の突起要素を含み、前記突起要素は、頂部表面領域を有する表面の上に隆起した表面部分および前記頂部表面領域を前記表面と接続する周囲側面として定義され、前記各突起要素は前記表面の上に０．５〜５０μｍの最大高さを有し、
ａ）隣接する前記突起間の平均距離が０〜５０μｍであり、
ｂ）前記突起の前記頂部表面領域の面積が１〜６０００μｍ２であり、および
ｃ）前記突起が前記表面の３〜９０％を覆う、
工程と、
２）前記細胞が前記表面に対して応答することを可能にする工程と、
を含む方法。
【請求項１８】
生細胞が肝細胞であり、トポグラフィが、
ａ）隣接する前記突起間の平均距離が３〜２５μｍであり、
ｂ）前記突起の前記頂部表面領域の面積が２０〜２５０μｍ２であり、および
ｃ）前記突起が前記表面部の８〜３５％を覆うこと、
によって定義される、
請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死に限定されることなく、細胞の生理学的状態を変化させることが見い出されている表面トポグラフィに関する。本発明はさらに、細胞の挙動を変化させるためにｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用することができる少なくとも１つのこのようなトポグラフィを提供する物、およびそのような物を用いて細胞の挙動を変化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は表面と接触して相互作用することが知られている。自然界では、細胞とその環境との間の直接的な物理的相互作用は、それらの正常な生理学的挙動の一部である。例えば、細胞培養皿のような自然環境外で細胞を培養する場合、または股関節インプラントまたはペースメーカーのような医療用インプラントに曝された場合のように、それらの生理機能は典型的には元の環境と同じではない。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびインプラント表面上でこれらの細胞応答を最適化するための多くの努力がなされている。
【０００３】
例えば、細胞培養において、できるだけ自然に増殖でき、および／または分化のような明確な生物学的特徴を現し、および／または明確な化学的、物理的もしくは電気的な刺激に反応するようにする目的のために、細胞を適切な培養培地の表面に置くことができる。細胞の挙動を変化させるための従来の戦略は、種々のホルモン、化学物質、成長因子、酵素、塩などを加えることであり、増殖または誘発した分化のような、変化した細胞応答の影響を有し得た。しかし、そのような変化は表面でなされるけれども、細胞表面および／または細胞内部のホルモン、化学物質、成長因子、酵素、塩などの相互作用を通じて、このような従来の培養における変化した細胞挙動は、一般的に化学的に誘発される。そのような従来の培養および医療用インプラントでは、表面に存在する潜在的な微細パターンは一般に考慮されない。
【０００４】
物理的な相互作用が細胞挙動に影響を及ぼすことが最近になって分かってきた。例えば、化学的エッチングおよび／または機械的ブラストによって引き起こされる表面の微小な粗さを特徴とするチタンベースのインプラントは、インプラントを骨／歯科組織に橋渡しする新しく形成された組織の機械的強度を改善することが示されている（非特許文献１）。
【０００５】
細胞レベルでのトポグラフィカルな手がかりの影響は、異なる細胞タイプで観察されている。例えば、平滑な基材と比較して、ナノトポグラフィを特徴とする表面上で培養すると、肝細胞の接着、形態および機能が顕著に改善されることが示されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｕｓｅｒ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １９９８；１３（５）：６１１-６１９．，  Ｂｕｓｅｒ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；４５（２）：７５〜８３．
【非特許文献２】Ｙｏｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  ＡＣＳ  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ２０１５；  ５：１２２９９〜１２３０８．
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】（ａ）１つの突起要素を有する２つの隣接する突起の概略平面図。（想像上の）サンプル線は、２つの隣接する突起間の平均距離を測定するために使用される方法を示す。（ｂ）２つの突起要素を有する２つの隣接する突起の概略平面図。（想像上の）サンプル線は、２つの隣接する突起間の平均距離を測定するために使用される方法を示す。（ｃ）１つの突起要素を含む２×２パターンの突起の３Ｄ概略平面図。突起、谷壁、谷壁セクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）および谷壁のパンクチャー（ｐｕｎｃｔｕｒｅ）が示される。（ｄ）２つの突起要素を含む２×２パターンの突起の３Ｄ概略平面図。突起、谷壁、谷壁セクションおよび谷壁のパンクチャーが示される。
【図２】トポグラフィＨ１〜Ｈ１０はアカゲザル由来の培養肝細胞に影響を及ぼす。（ａ）解析されたセクション内の付着細胞の数および（ｂ）細胞によって覆われた表面領域を解析した。（ｃ）非パターン化（ＮＰ）基材および（ｄ）トポグラフィＨ３を特徴とする基材上で培養された細胞の視覚化。条件：コラーゲンコーティングをしていない全ての基材、培養の３１日目、コントロールとしてのＮＰのレベルは、赤線で示される。
【図３】トポグラフィＨ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６およびＨ８はアカゲザル由来の培養肝細胞に影響を及ぼす。（ａ、ｄ）解析されたセクション内の付着細胞の総数、（ｂ、ｅ）細胞によって覆われた表面領域、並びに（ｃ、ｆ）（ａ〜ｃ）８日後および（ｄ〜ｆ）３１日後のマラリア原虫感染効率を解析した。条件：コラーゲンコーティングをしていない全ての基材。
【図４】トポグラフィＨ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６およびＨ８は培養中の初代ヒト由来肝細胞（ＰＨＨ）に影響を及ぼす。解析されたセクション内に付着した細胞の総数（ａ、ｃ）、並びに（ａ、ｂ）培養１４日後および（ｃ、ｄ）培養３０日後の細胞によって覆われた表面領域（ｂ、ｄ）を解析した。条件：ＮＰ（コントロール）、コラーゲンサンドイッチを含むコラーゲンコーティング有りおよび無しの全ての基材がベンチマークとして含まれる。
【図５】トポグラフィＨ３、Ｈ４およびＨ８は、培養中の初代ヒト由来肝細胞（ＰＨＨ）に影響を及ぼす。１４日後に、（ａ）ＨＮＦ４α、（ｂ）アルブミンおよび（ｃ）Ｃｙｐ３Ａ４を含む肝細胞機能のバイオマーカーをｍＲＮＡレベルで解析した。条件：ＮＰ（コントロール）、コラーゲンサンドイッチを含むコラーゲンコーティング有りおよび無しの全ての基材がベンチマークとして含まれる。赤い線は、３日目（１に設定）のコラーゲンサンドイッチにおける発現マーカーのレベルを示し、他の全てのサンプルを（ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）に標準化するために使用される。
【図６】トポグラフィＨ３は、培養物中のヒト由来肝細胞（ＰＨＨ）に影響を及ぼす。最長２４時間に至るまで（ａ）ＨＮＦ４α、（ｂ）アルブミンおよび（ｃ）Ｃｙｐ３Ａ４、（ｄ）Ｃｙｐ２Ｃ９、（ｅ）Ｃｙｐ１Ａ２および（ｆ）Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄ）を含む肝細胞機能のバイオマーカーを解析した。条件：ＮＰ（コントロール）、コラーゲンサンドイッチを含むコラーゲンコーティング有りおよび無しの全ての基材がベンチマークとして含まれる。赤い線は、３日目（１に設定）のコラーゲンサンドイッチにおける発現マーカーのレベルを示し、他の全てのサンプルを（ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）に標準化するために使用される。
【図７】（ａ）移植の８週間後に骨組織と接触する骨形成の特性のために選択された２つの異なるトポグラフィを特徴とするチタンインプラントの組織学的セクションの２つの典型的な画像。（ｂ）移植の８週間後に骨組織と接触する骨形成の特性のために選択された２つの異なるトポグラフィを特徴とするチタンインプラントの組織学的セクションの２つの典型的な画像。
【図８】トポグラフィＯ１、Ｏ６およびＯ７はｉｎ  ｖｉｖｏで骨形成の特性に影響を及ぼす。（ａ）骨からインプラントを分離するのに必要な引き抜き力および（ｂ）骨と直接接触するインプラント表面のパーセンテージを解析した。条件：ウサギで４週間および８週間の移植、トポグラフィＯ１、Ｏ６およびＯ７を特徴とするインプラント、非パターン化インプラントを含むコントロール。
【図９】トポグラフィは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマクロファージ付着および異物巨細胞形成に影響を与える。典型的な画像は、１０日目の非パターン化基材（左、コントロール）に対するトポグラフィＩ１（中央）およびＩ５（右）の効果を示す。矢印は異物巨細胞（ＦＢＧＣ）を示す。
【図１０】トポグラフィＩ１、Ｉ２、Ｉ５、Ｉ６およびＩ７はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫制御機構に影響を及ぼす。（ａ）ｍｍ２当たりの細胞（単核および多核細胞）の総数、（ｂ）ｍｍ２当たりの異物巨細胞（多核細胞）の総数および（ｃ）細胞当たりの核の平均数を核の最大数を示すバーの上に示す。非パターン化サンプル（ＮＰ）をコントロールとして含めた。条件：単球単離から始めて１０日間培養する。
【図１１】トポグラフィＩ１、Ｉ２、Ｉ５、Ｉ６およびＩ７はｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫制御機構に影響を及ぼす。（ａ〜ｄ）９日目および（ｅ〜ｈ）６０日目における（ａ、ｅ）免疫細胞の侵入、（ｂ、ｆ）ＦＢＧＣ形成、（ｃ、ｇ）線維形成および（ｄ、ｈ）線維症莢膜の厚さを解析した。条件：ＮＰ（コントロール）、シリコンエラストマー（ＳＥ、標準物質）およびｅｍｐｔｙ  ｗｏｕｎｄ（疑似）を含むマウスの皮下移植。棒グラフは中央値の２５〜７５パーセンタイルレベルを示し、「エラーバー」は、測定された最低レベルおよび最高レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
一般的な実施形態：細胞反応を調節するためのトポグラフィ
本発明は、表面トポグラフィ、およびそのようなトポグラフィの１つまたは複数を備えた表面部を有する物に関する。表面トポグラフィは、表面部に規則的に間隔を置いて配置された突起の存在によって形成され、２つの代替的な定義によって定義することができる。１つの定義において、表面トポグラフィは、隣接する突起間の平均距離、突起の頂部表面領域、並びに表面部の被覆率、さらには突起の長さおよび幅（「突起」の定義）によって定義され得る。別の定義では、トポグラフィは、突起の間に位置する谷（「谷」の定義）によって定義され得る。これらの定義は、トポグラフィの２つの代替的な数値表現として機能する。
【０００９】
「突起」の定義
本発明は、物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節することができる１つまたは複数のトポグラフィを有する表面部を備える物を提供し、トポグラフィは規則的なパターンの突起を有する表面を備え、この突起は１つまたは複数の突起要素を備え、突起要素は、頂部表面領域を有する表面の上に隆起した表面部分および頂部表面領域を表面と接続する周囲側面として定義され、各突起要素表面の上で０．５〜５０μｍの最大高さを有し、
ａ）隣接する突起間の平均距離は０〜５０μｍであり、
ｂ）突起の頂部表面領域の面積は１〜６０００μｍ２であり、および
ｃ）突起は表面の３〜９０％を覆う。
【００１０】
好ましくは、本発明の物は、以下のような突起または突起要素の長さおよび幅を有する。
ａ）突起が１つの突起要素を備える場合、
表面に対して平行な頂部表面領域の周囲内で最も長い直線フィッティングの長さとして定義される突起の長さは、０．０１〜１００μｍであり、
長さに対して垂直であって、表面に対して平行な頂部表面領域の周囲内の最も長い直線フィッティングの長さとして定義される突起の幅は、０．０１〜１００μｍであり、
ｂ）突起が複数の突起要素を備える場合、
表面に対して平行な頂部表面領域の周囲内で最も長い直線フィッティングの長さとして定義される各突起要素の長さは、０．０１〜１００μｍであり、
長さに対して垂直であって、表面に対して平行な頂部表面領域の周囲内で最も長い直線フィッティングの長さとして定義される各突起要素の幅は、０．０１〜１００μｍであり、
同じ突起の隣接する突起要素の２つの周囲間の平均距離は、０〜５０μｍである。
【００１１】
このトポグラフィは、規則的なパターンの突起を有する表面を備える。突起は、１つまたは複数の突起要素で構成され、要素は、突起が形成されている表面の上に隆起した表面部分、すなわち、関連する突起または突起要素を取り囲む表面である。各突起要素は、隆起表面部分と、頂部表面領域と、頂部表面領域を表面と接続する周囲側面とによって定義される。隆起表面部分は、頂部表面領域と周囲側面との合計である。１つの突起は、単一の突起要素として定義されてもよいが、１つの突起は、複数の突起要素を備えてもよい。１つの好ましい実施形態では、突起は単一の突起要素を有する。別の好ましい実施形態では、突起は、少なくとも２つの突起要素を備える。
【００１２】
このように、突起は表面上の小さなバンプまたはバンプの群である。突起は、物の表面における谷の三次元ネットワークをそれらの間に定義する。特定のサイズ、形状および形態を有する突起の規則的なパターンは、細胞応答、とりわけ物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節することができるトポグラフィをもたらすことが見い出された。
【００１３】
規則的なパターンは、各単位セルが最大１つの突起を備えるように、単位セルのパターンを定義する、表面上に置かれ得る、交差するグリッド線の格子によって定義することができる。交差するグリッド線の格子は物理的に存在する必要はないが、好ましくは規則的なパターンを定義する仮想的な方法であるため、単位セルは任意の形状を有することができる。好ましくは、単位セルは、長方形、特に正方形、台形、三角形または六角形の形状を有する。
【００１４】
この文脈において規則的なパターンは、ｍ個の単位セルからなるトポグラフィの任意のセクション、例えばｎ×ｎの配置が、そのセクションに隣接する複数のセクションに繰り返し存在することを意味する。好ましくは、ｍおよびｎは１であるが、特に異なる形状または異なって配向した突起を有する単位セルの場合、または三角形、六角形または台形単位セルの場合、ｍは４〜１６であり、ｎは２〜４であり得る。
【００１５】
単位セルは、例えば、１〜１００００μｍ２、好ましくは１〜２５００μｍ２、より好ましくは２５〜２０００μｍ２、より好ましくは１００〜１０００μｍ２の表面積を有することができる。正方形または長方形の単位セルの場合、単位セルは、（１〜１００）μｍ×（１〜１００）μｍ、好ましくは（１〜５０）μｍ×（１〜５０）μｍの長さ×幅の寸法を有することができる。非常に好ましい実施形態では、単位セルは正方形であり、５μｍ×５μｍ〜４５μｍ×４５μｍ、好ましくは５μｍ×５〜３０μｍ×３０μｍ、例えば５μｍ×５μｍ、１０μｍ×１０μｍ、１５μｍ×１５μｍ、２０μｍ×２０μｍ、２５μｍ×２５μｍまたは２８μｍ×２８μｍである。
【００１６】
交差するグリッド線のパターンによって定義された単位セルは、それぞれが最大で単一の突起を備え、その突起は上記の定義ような複数の突起要素から構成されてもよい。好ましくは、各単位セルは等しい寸法の突起を備え、すなわち、各単位セルは互いに同一の突起を備える。突起の寸法は、例えば、突起の高さ、単位セル内の突起要素の数および相対位置、各突起要素の長さおよび幅、表面に対する周囲側面の角度、および各突起要素の頂部表面領域の形状を含む。
【００１７】
突起の高さ、または少なくとも突起要素の高さは、表面から０．５〜５０μｍの間にある。すなわち、突起が複数の突起要素を備える場合、突起の様々な突起要素の高さは、上述の境界内で異なってもよいが、各突起要素の高さは、表面上で０．５〜５０μｍの間にあり得る。しかしながら、好ましくは、各突起要素の高さは同じである。高さは、表面上、特に単位セル内の周囲表面領域上の、突起または突起要素の頂部表面領域の最大高さとして測定される。
【００１８】
さらに好ましくは、突起の高さは１〜４５、好ましくは２〜４０μｍ、より好ましくは３〜３５、より好ましくは４〜３０μｍ、さらにより好ましくは５〜２８μｍ、さらにより好ましくは６〜２８μｍである。
【００１９】
単位セル内の突起要素の数および相対位置は、規則的な突起パターンが得られる限り、単位セルごとに互いに異なってもよい。すなわち、同じまたは異なる突起を含む２つ以上の異なる単位セルを定義することができ、この単位セルは規則的なパターンで、例えば表面上に交互に配置される。等しい寸法の突起を有する三角形または台形の単位セルの場合、これは、異なる向きを有する同じ突起の規則的なパターン、例えば、表面上で交互に反対の向きをもたらすことがある。単一の異なる突起を有する２つの異なる正方形の単位セルの場合、前記単位セルの交互のパターンは、前記突起の列の規則的なパターンをもたらし、その列は、単位セルの端に平行に配置されるか、単位セルの対角線に平行に配置される。あるいは、同じ突起を有する正方形の単位セルは、異なる向きで突起が規則的に分布する表面を得るために、表面上で異なって配向されてもよい。
【００２０】
各々が単位セルの概念を適用することによって突起の規則的なパターンを得る無数の方法を案出することができ、本発明で使用することができる。しかし、正方形、長方形および六角形の単位セルは、全て同じ方向に配向され、一方、三角形の単位セルは、交互に配向されることが好ましい。さらに好ましくは、全ての単位セルは同一の突起を含む。
【００２１】
各突起の長さ（または複数の突起要素を含む突起の場合、各突起要素の長さ）は、表面に平行であって、突起または突起要素の頂部表面領域の周囲内の最も長い直線フィッティングの長さとして定義される。
【００２２】
単一の突起要素のみを含む突起の場合、突起の長さは０．０１〜１００μｍである。好ましくは、長さは０．５〜５０μｍ、より好ましくは１〜４０μｍである。
【００２３】
複数の突起要素を含む突起の場合、突起要素の長さは０．０１〜１００μｍである。好ましくは、長さは０．１〜４５μｍ、より好ましくは０．５〜４０μｍ、さらにより好ましくは１〜３０μｍである。
【００２４】
各突起の幅（または、複数の突起要素を含む突起の場合、各突起要素の幅）は、表面に平行であり、長さに垂直である突起または突起要素の頂部表面領域の周囲内の最も長い直線フィッティングの長さとして定義される。
【００２５】
単一の突起要素のみを含む突起の場合、突起の幅は０．０１〜１００μｍである。好ましくは、幅は０．５〜５０μｍ、より好ましくは１〜４０μｍである。
【００２６】
複数の突起要素を含む突起の場合、突起要素の幅は０．０１〜１００μｍである。好ましくは、幅は０．１〜４５μｍ、より好ましくは０．５〜４０μｍ、さらにより好ましくは１〜３０μｍである。
【００２７】
さらに、複数の突起要素を含む突起の場合、単位セル内の突起要素の数および相対位置は、突起の寸法の重要な特徴である。
【００２８】
同じ突起の隣接する突起要素間の平均距離は、互いに面する突起要素の側面を約０．４μｍの等しい線分に分割し、第１の突起要素の各線分の、面している隣接する突起要素の線分までの距離（図参照）を決定することによって決定される。全ての距離の平均は、突起要素間の平均距離である。言うまでもなく、突起が３つ以上の突起要素を備える場合、同じ突起の第２の突起要素に対する１つの突起要素の平均距離は、同じ突起の同じ突起要素の第３の突起要素までの平均距離とは異なり得る。表面と突起要素の周囲側面との間の角度が９０°でない場合、隣接する突起間の平均距離は、突起の高さの半分で決定される。同じタイプの計算が、図１ａおよび１ｂに例示されているように、２つの面する突起間の平均距離を決定するために適用される。この文脈において、「面する」とは、隣接する突起間の距離が、それらの突起の間に延伸する線分に基づいて、最も短い突起の長さにわたって決定されることを意味する。
【００２９】
一般に、２つの突起の間の平均距離は、０〜５０μｍ、好ましくは０．５〜４０μｍ、さらにより好ましくは１〜３０μｍ、さらにより好ましくは２〜２５μｍである。同一の突起内の２つの突起要素間の平均距離も同様に定義される。より好ましい実施形態において、一方向における２つの隣接する突起間の平均距離が０である場合、その距離に垂直な方向における隣接する突起間の平均距離は０より大きくなければならない。さらにより好ましい実施形態において、任意の方向における隣接する突起間の平均距離は０より大きい。
【００３０】
また、表面トポグラフィは、面する突起間の最短距離および最長距離を決定することによって定義することができる。最短距離は、２つの隣接する突起または突起要素の間に描くことができる平均距離の計算のために、上記で定義した最短直線によって定義される。最短距離は、好ましくは０〜５０μｍ、より好ましくは０〜４０μｍ、より好ましくは０〜２０μｍ、さらに好ましくは０〜１０μｍである。さらに好ましい実施形態では、最短距離は１〜５０μｍ、好ましくは２〜４０μｍ、より好ましくは３〜３０μｍ、さらにより好ましくは４〜２０μｍである。
【００３１】
最長距離は、２つの隣接する突起または突起要素の間に描くことができる平均距離の計算のために、上記で定義した最長直線として定義される。最長距離は０〜５０μｍ、好ましくは０．５〜４０μｍ、より好ましくは１〜３５μｍとすることができる。さらに好ましい実施形態では、最長距離は２〜５０μｍ、好ましくは３〜４０μｍ、より好ましくは４〜３０μｍ、さらにより好ましくは５〜２０μｍである。
【００３２】
突起要素の周囲側面は、側面が表面と交差する位置の表面と０°〜１８０°の間の任意の角度を有することができる。９０°の角度は、表面に対して垂直であると定義され、０°と９０°の間の角度は、頂部表面領域が表面の隆起部分よりも大きい状況として定義され、その結果、頂部表面領域が少なくとも表面を部分的に覆う。９０°と１８０°の間の角度は、頂部表面領域が表面の隆起部分よりも小さい状況として定義される。表面の隆起部分は、表面と交差する点における突起の周囲として定義される。このように、０°と９０°との間の角度は、表面上にぶら下がる頂部表面領域を有する突起要素をもたらし、９０°と１８０°の間の角度は、頂部表面領域に向かって徐々に上昇する突起要素をもたらす。
【００３３】
好ましくは、突起または突起要素の少なくとも一部、好ましくは突起または突起要素の全体の周囲側面は、表面に対して４５°〜１３５°、より好ましくは６０°〜１２０°、さらにより好ましくは７５°〜１１５°、さらにより好ましくは８０°〜１００°の角度を有する。最も好ましくは、突起または突起要素の少なくとも一部、好ましくは突起または突起要素の全体の周囲側面は、例えば８８〜９２°の角度で、側面が表面と交差する位置で表面に実質的に垂直に延びる。さらに好ましい実施形態では、全ての突起要素は、側面が表面と交差する位置で表面と略同じ角度を有する。
【００３４】
各突起要素の頂部表面領域の形状もまた、突起の寸法の重要な特徴であり、突起（または突起要素）の形状とも称される。これは、この形状が、隣接する組織の細胞が固定を提供するために成長する谷壁の形状を定義するためである。頂部表面領域の周囲の形状は、表面に対して平行に決定される。このように、突起要素の平面図であり、任意の幾何学的形状を有していてもよい。いくつかの実施形態では、形状は、円形、楕円形、三角形、正方形、長方形、台形、五角形、六角形、七角形または八角形を含むことができる。このような一般的に知られている形状は、ここでは基本形状と呼ばれる。さらなる実施形態では、形状は、基本形状の組み合わせを含むことができる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、各突起／突起要素の頂部表面領域の形状は、正方形、三角形、円形、八角形、五角星形、六角形、三角星形、半月形、または角を取り除いた円形（「パックマン」）のように、単一の幾何学的形状でなくてもよい。いくつかの実施形態では、形状は、円形、楕円形、または多角形、三角形、矩形、正方形、六角形、星形、平行四辺形などの形状でなくてもよい。
【００３６】
いくつかの実施形態では、突起は、表１に示す形状を有することができる。他の実施形態では、トポグラフィは、表１に示すような形状の突起を備えない。一実施形態では、トポグラフィは表１の形状１を有していない。別の実施形態では、トポグラフィは表１の形状２を有しない。別の実施形態では、トポグラフィは表１の形状３を有しない。また他の実施形態では、トポグラフィは表１の形状３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２を独立して有しない。いくつかの実施形態では、トポグラフィは、表１のトポグラフィの選択を備えず、さらなる実施形態では、トポグラフィは、表１の全ての形状を備えない。
【００３７】
【表１】
2019513409.tif 000003
【００３８】
好ましい実施形態では、頂部表面領域は、表面に対して実質的に平行に配置された表面であるが、頂部表面領域は、例えばわずかにドーム形状などの、わずかに凹状または凸状であってもよい。
【００３９】
特に好ましい突起（または突起要素）は、複雑な形状を得るために、好ましくは１つまたは複数の架橋または重複部分によって相互接続された基本形状の重なり合った、または隣接する組み合わせを備える。明確に定義された複雑な形状を有する突起による物理的刺激による細胞集団の細胞応答、とりわけ形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節する効果は、突起の寸法だけでなく、突起（または突起要素）の形状だけからも影響を受ける。類似の高さ、重量、長さおよび幅を有するが、形状が異なる突起の場合、物理的に刺激する表面部の細胞応答に明確な効果がある。物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死の調節に対する突起の形状の個々の効果は、実施例においてさらに詳述される。
【００４０】
突起（または突起要素）が基本形状の組み合わせを備える場合、複雑な形状を得ることができる。複雑な形状は、重複するまたは隣接する円形、楕円形、三角形、正方形、長方形、台形、五角形、六角形、七角形または八角形の形状を備えることができる。隣接する基本形状の場合、隣接する基本形状は重複する（架橋）部分によって接続されることが好ましいため、基本形状の平面図は、基本形状のみの表面領域よりも大きな表面領域を有する。別個の形状に対して増加した表面領域は、好ましくは基本形状間に位置し、基本形状間の接触点の任意の幅を効果的に増大させる。
【００４１】
さらに好ましくは、突起（または突起要素）の周囲側面は、角度によって接続された一連の直線部であり得る、連続的な側面である。あるいは、滑らかに湾曲した周囲側面を得るために、直線部分および／または角度を滑らかに湾曲させることができる。
【００４２】
この文脈で、滑らかに湾曲した周囲側面とは、単に、周囲側面が丸みを帯びたコーナーを有していることを意味する。コーナーは、正方形、三角形および六角形のコーナーのような形状上の存在から生じる可能性があるが、そのようなコーナーはまた、突起要素の２つの隣接する形状間の接点から、または突起要素の２つの基本形状間の重複する（または架橋する）部分の存在から生じる可能性がある。つまり、この意味でのコーナーとは、突起を平面から見たときのコーナーをいう。突起要素の周囲側面の全てのコーナーが丸みを帯びると、円滑に湾曲した周囲側面が得られる。
【００４３】
好ましい実施形態では、突起は複雑な形状を有する。複雑な形状は、基本形状が単一の突起要素として存在するか、または重複するかまたは隣接する基本形状として存在する基本形状の組み合わせである。複雑な形状は、周囲側面のコーナーの数によってさらに定義される。この点で、コーナーは、直線状または丸みを帯びたコーナーであってもよく、周囲側面（平面図）における任意の方向の任意の変化として定義することができる。周囲側面の長さの５％の長さの線の形状を有するコーナーは、「湾曲」と呼ばれる。周囲側面の直線を「直線」と呼ぶ。
【００４４】
コーナーは狭くても、または広くてもよい。狭いコーナーは、９０°未満の角度を有するコーナーである。すなわち、コーナーが狭くなると、形状上の「スパイク」が生じ、スパイクは突起に対して内向きまたは外向きのいずれかとなる。広いコーナーは、突起の周囲側面が９０°超の角度をなすコーナーである。真直ぐなコーナーは、９０°の角度を有するコーナーである。
【００４５】
複雑な形状は、少なくとも１つの広いコーナーを有する形状として定義され、好ましくは、狭いコーナーの数は、広いコーナーの数と同じではない。あるいは、複雑な形状は、少なくとも１つの（好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つの）湾曲および少なくとも１つのコーナー（好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つのコーナー）を備える。さらなる代替的な好ましい実施形態では、複雑な形状は、少なくとも１つの湾曲および少なくとも１つの直線の両方を備える。さらに好ましい実施形態では、複雑な形状は、３つ以上の直線、好ましくは４つ以上、より好ましくは５つ以上の直線を含む形状であり、全ての直線の少なくとも７５％（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％の直線）は異なる長さである。他の好ましい実施形態では、複雑な形状は少なくとも３つの湾曲を備える。
【００４６】
特定の単位セルの突起に隣接する（または面している）突起は、その特定の単位セルと辺を共有する単位セル内に存在する突起である。隣接する単位セルも同様に定義される。特定の単位セルとコーナーを共有するだけの単位セルは隣接しない。規則的な突起のパターンが与えられると、１つの突起は、例えば、三角形の単位セルの場合には３つの突起に隣接し、台形、正方形または長方形の単位セルの場合には４つの突起に、六角形の単位セルの場合には６つの突起に隣接する。
【００４７】
突起の頂部表面領域は、その最も隆起した周囲における突起の表面領域として定義される。上記のことから、突起が複数の突起要素を備える場合、突起の頂部表面領域は、突起要素の最も隆起した周囲でそれぞれ決定される、突起の全ての突起要素の全表面領域の合計である。突起の頂部表面領域の面積は、例えば、突起（または突起要素）の頂部表面領域を構成する画素数（０．４μｍ×０．４μｍ要素）を数えることによって決定することができる。
【００４８】
突起の頂部表面領域の面積は、１〜６０００μｍ２、好ましくは１０〜３０００μｍ２、より好ましくは２０〜１５００μｍ２、より好ましくは２５〜１０００μｍ２、さらにより好ましくは３０〜７５０μｍ２である。
【００４９】
突起の被覆率は、突起によって覆われた全領域に対する頂部表面領域の割合として定義される。したがって、被覆率は、表面トポグラフィの総面積で割った全ての頂部表面領域の面積の合計を１００倍にした％値である。これは、単位セルのどのパーセンテージが突起の頂部表面領域を備えるのかを計算することと同じである。
【００５０】
突起は、表面部の３〜９０％、好ましくは表面部の５〜８０％、より好ましくは表面部の１０〜７５％、より好ましくは２０〜７０％、より好ましくは３０〜６５％を覆う。したがって、突起は、単位セルの３〜９０％、好ましくは単位セルの５〜８０％、より好ましくは単位セルの１０〜７５％、より好ましくは単位セルの２０〜７０％、より好ましくは単位セルの３０〜６５％を覆う。
【００５１】
「谷」の定義
上述したように、突起の規則的なパターンは、同時に谷のパターンを定義する。したがって、本発明の表面トポグラフィは、物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節するための表面部によって定義され、前記トポグラフィは規則的なパターンの谷を有する頂部表面領域を含むものとして定義され、前記谷は谷底、第１の谷壁および第２の谷壁を含み、前記第１の谷壁は第１の谷壁セクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）および必要に応じて第１の谷壁のパンクチャー（ｐｕｎｃｔｕｒｅ）を含み、前記第２の谷壁は第２の谷壁セクションおよび必要に応じて第２の谷壁のパンクチャーを含み、前記第１および前記第２の谷壁セクションは前記谷に隣接する突起の側面によって定義され、前記第１および前記第２の谷壁のパンクチャーは前記谷に対して垂直および前記谷底に対して平行な線が前記谷に隣接する前記突起に接触しない前記谷壁の部分として定義され、
ａ）谷壁は、谷底から頂部表面領域までの谷底に垂直な距離として定義される、０．５〜５０μｍの高さを有し、
ｂ）第１および第２の谷壁の輪郭は、独立して０〜４０μｍであり、
ｃ）第１および第２の谷壁セクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）の長さは、独立して０．０１〜１００μｍであり、
ｄ）第１および第２の谷壁のパンクチャー（ｐｕｎｃｔｕｒｅ）があれば、その長さは、独立して０〜５０μｍであり、
ｅ）谷の平均幅は０〜５０μｍである。
【００５２】
頂部表面領域は、上記で定義されており、突起の全ての頂部表面領域によって定義される領域である。突起の間に一連の谷が定義される。谷は２つの谷壁によって定義され、谷壁は、谷に隣接する突起の周囲側面の部分を備える。谷壁は、谷に隣接する突起の周囲側面の部分の、谷方向に沿った仮想的な直線平均である。図１ｃと１ｄを参照。
【００５３】
このように、谷壁は、谷壁セクションを備え、谷壁セクションは、谷に隣接する突起の側面（つまり、突起の周囲側面の一側面）によって定義される。したがって、谷壁セクションは、谷壁上に、突起の存在によって定義される長さの仮想直線である。一方向（すなわち、規則的なパターンの一方向において隣接する突起間の平均距離が０である場合）において接触する突起の場合、その方向における谷壁は谷壁セクションのみを備え、谷壁のパンクチャーは含まない。
【００５４】
しかし、突起が個々に離間した突起、すなわち全ての方向における平均距離が０より大きくなるように全ての隣接する突起と間隔を有する好ましい実施例では、谷壁は谷壁のパンクチャーをさらに備える。
【００５５】
谷壁のパンクチャーは、谷壁に垂直で谷底に平行な線が、谷に隣接する突起と接触しない部分として定義される。したがって、それは、谷壁セクションが存在しない谷壁の部分、すなわち、谷に隣接する突起がない部分である。図１ｃと１ｄを参照。
【００５６】
突起の形状に応じて、谷を定義する第１および第２の谷壁は、同じまたは異なっていてもよく、同じまたは異なる谷壁の輪郭を有してもよい。
【００５７】
谷底は、突起の間に位置する表面、頂部表面領域から可能な限り遠い距離にある表面として定義される。谷底は、処理により若干の曲率を有することがあり、その場合、谷底は、第１の谷壁が立ち上がる点から第２の谷壁が立ち上がる点まで延びている。このように、谷を形成する突起間の平均距離によって定義することもできる。
【００５８】
突起の高さに沿って、谷壁は、谷底から頂部表面領域までの、谷底に垂直な距離として定義される、０．５〜５０μｍの高さを有する。好ましくは、谷壁の高さは、１〜４５μｍ、より好ましくは２〜４０μｍ、より好ましくは３〜３５μｍ、より好ましくは４〜３０μｍ、さらにより好ましくは５〜２８μｍ、さらにより好ましくは６〜２８μｍである。
【００５９】
谷壁は、谷に隣接する突起の形状によって定義される。これらの形状は不規則であるので、谷壁は谷壁の輪郭によっても定義される。この点で、谷壁の輪郭は、谷壁に垂直な方向における凹凸として定義され、谷壁セクションのみに基づいて計算される。谷壁における谷壁のパンクチャーは計算から除外される。
【００６０】
谷壁の輪郭は、谷壁からの谷壁セクションの各点の距離の算術平均として表される。従来、
【数１】
2019513409.tif 000004
として現され、ここで、Ｒａは谷壁の輪郭であり、ｎはデータ点の数であり、｜ｙｉ｜は、谷壁に垂直な、すなわち谷壁セクションの平均表面に対して垂直である谷壁セグメントまでの距離を示す正の数である。ｎの大きさは、通常、例えば０．４μｍとすることができるＲａを測定するために使用される装置の分解能に依存し、式中、ｎは谷壁セクションの長さ（μｍ）である。Ｒａは、表面トポグラフィの平面画像の数学的解析によって適切に決定することができる。
【００６１】
谷壁の輪郭は、０〜４０μｍ、好ましくは０．１〜３０μｍ、より好ましくは０．５〜１５μｍ、さらにより好ましくは０．８〜１０μｍである。谷壁の輪郭が０の場合、谷壁を定義する全ての突起は、例えば正方形または長方形の突起の場合に起こり得るように、谷に平行な直線を有することを示す。勿論、突起の形状によっては、第１および第２の谷壁の輪郭が異なっていてもよい。「粗さ」という用語は、通常、表面の表面粗さに適用されるものの、ここで使用される「輪郭」または谷壁の輪郭という用語は、「粗さ」という用語と同等とみなすことができ、表面に対して垂直であり（水平面に対して）垂直方向における平均表面の凹凸によって決定される。この場合、谷壁の輪郭は、谷壁の粗さ、すなわち水平に配置されたトポグラフィ上に備わる垂直な表面の粗さであり、これは谷壁に垂直であり、表面トポグラフィに対して平行な方向の平均谷壁の凹凸によって決定される。
【００６２】
谷壁セクションの長さは、表面に対して平行な頂部表面領域の周囲内の最も長い直線フィッティングが谷壁に対して平行である場合の突起の長さと同じであってもよい。他の場合には、谷壁セクションは突起（または突起要素）の長さよりも短い。このように谷壁セクションの長さは０．０１〜１００μｍ、好ましくは谷壁セクションの長さは０．０５〜５０μｍ、より好ましくは０．１〜４０μｍである。谷を定義する突起の形状に応じて、谷を定義する２つの谷壁の谷壁セクションの長さは同じであっても異なっていてもよい。
【００６３】
谷壁のパンクチャーの長さは、一般に０〜５０μｍ、好ましくは０．５〜４０μｍ、より好ましくは１〜３０μｍ、さらにより好ましくは２〜２５μｍである。谷壁のパンクチャーそれ自体は谷を定義し、それは関心のある谷に垂直に配置している。谷を定義する突起の形状に応じて、第１および第２の谷壁における谷壁のパンクチャーの長さは、同じであっても異なっていてもよい。
【００６４】
谷の平均幅は０〜５０μｍである。谷の平均幅は、突起または突起要素間の平均距離に沿って定義され、谷の面する側面上で谷壁セグメントを約０．４μｍの線分に分割し、谷の一方の側の谷壁セクションの各線分と（同じ）谷の反対側の隣接する突起の谷壁セクションの面する線分との間の距離を測定し、それらの平均をとることによって計算される。平均谷幅は、隣接する２つの突起間の平均距離である。
【００６５】
谷の平均幅は、好ましくは０．５〜４０μｍ、より好ましくは１〜３０μｍ、より好ましくは２〜２５μｍである。
【００６６】
あるいは、谷幅は、上記で定義した対向する突起間の最短距離および最長距離に沿って、同じ谷の反対側の面する突起間の最短および最長距離によって定義されてもよい。
【００６７】
より好ましい実施形態では、表面トポグラフィは、隣接する突起に接触しない個々に離間した突起を備える。したがって、突起間の距離、すなわち谷幅は、０より大きく、各谷壁は谷壁のパンクチャーを備える。この実施形態では、交差する谷の規則的なパターンが得られる。この実施形態では、各谷壁は、谷壁セクションおよび谷壁のパンクチャーを備える。
【００６８】
少なくとも、多数の突起または突起要素の側面が、側面が表面と交差する位置で表面に対して実質的に垂直に延びることが好ましいので、谷壁が谷底に対して実質的に垂直であることも好ましい。谷壁が谷底に対して有することができる角度は、周囲側面が表面と有し得る角度と一致するように定義される。
【００６９】
したがって、単一の突起要素を含む単一のタイプの突起のみを含むトポグラフィの場合、全ての谷壁セクションは、（谷に隣接する突起の周囲側面によって定義される）同一の輪郭を有する。この場合、谷壁セクションは、谷壁のパンクチャーと交互に配置され、パンクチャーは全て同じ長さを有する。
【００７０】
複数の突起要素を含む突起を備えるトポグラフィの場合、または異なる形状もしくは異なる方向に突出した突起を含むトポグラフィの場合、単一の突起は、異なる輪郭を有する複数の谷壁セクションを定義し、等しくない長さであり得る複数の谷壁のパンクチャーを有する複数の谷壁セクションを定義する。この場合、谷壁セクションは規則的な順序で谷壁のパンクチャーと交互になる。
【００７１】
物
上記定義されたトポグラフィは、好ましくは、金属、高分子、複合材料またはセラミック材料を含む表面部を有する物の上に存在する。表面部は、物の外表面部または内表面部であってもよい。外表面部は、細胞が物に接触したときに、物の外側に位置する、細胞によって自由に接触できる表面部である。外表面部または内表面部は、穴、孔または窪みを含むことができる。
【００７２】
適当な材料は本技術分野において公知であり、当面の用途に適した任意の材料を含む。すなわち、本発明のトポグラフィを例えば反応装置に適用するには、反応装置を構築するのに適した材料を使用すべきである。同様に、インプラント上に本発明のトポグラフィを適用するには、インプラントを構築するのに適した材料を使用すべきである。当業者は、どのタイプの材料がどのタイプの用途に適しているかを知っており、それに応じて適切な材料を選択することができる。適切な材料の例は、チタン（例えば、硬質（整形外科用または歯科用）医療用インプラント）、ポリウレタン（例えば、腹部メッシュおよび化粧用インプラント）およびポリスチレン（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養製品）である。
【００７３】
本発明による１つ（または複数）のトポグラフィを含む物は、特定の材料上に特別に成形された微細構造を作成するための任意の公知技術によって作製することができる。当業者は、どのタイプの技術がどのタイプの材料に適しているのかを知っている。適切な技術の例は、３Ｄプリント、レーザー印刷、書き込み、層ごとのコーティング、エレクトロスピニング、堆積技術、スプレーおよびスパッタリング、スタンピング、（ホット）プレス、（ホット）エンボス、（ナノ）インプリント、（射出）成形、鋳造、エッチング、レーザー加工、レーザー切断およびアブレーション、（精密）電気化学加工、（精密）電気化学グリッディング、並びに（精密）放電加工などである。
【００７４】
本発明の物は、好ましくは、レーザー加工、精密技術、彫刻、印刷、コーティング、スタンピング、または物の上へのトポグラフィのエッチングによって行われる。あるいは、物は、射出成形などの単一のプロセスでトポグラフィを有するように形成されてもよい。記載されているトポグラフィを有する物を得るための適切な技術は、本技術分野で周知である。
【００７５】
印刷は、本技術分野で知られているように、金属基材、高分子基材、セラミック基材、複合基材またはその他の基材の表面部に表面突起を３Ｄ印刷、レーザー印刷および書き込みすることによって達成することができる。
【００７６】
コーティングは、基材上に突起を作製し、次いでスプレー、スパッタリング、層状コーティング、エレクトロスピニング、または溶液からの沈殿を使用して表面部をコーティングすることによって達成され得る。
【００７７】
スタンピングは、最初に、ネガ型の突起を含むモールドを製造し、その後、プレス、ホットプレス、エンボス加工、ホットエンボス加工、インプリントおよびナノインプリントなどの技術を使用して、表面部にそのモールドをスタンプすることによって達成することができる。射出成形、溶融物からの加工、またはキャスティングを含む他の技術も可能である。
【００７８】
エッチングは、表面トポグラフィを得るために、モールによって保護されていない表面部の一部を除去するために、適切なモールだけでなく、酸および／または有機溶媒などの液体および／または蒸気の形態で異なる溶媒を使用することによっても達成され得る。レーザー加工、彫刻およびアブレーション技術を用いて、トポグラフィを適切な材料の表面に彫刻することもできる。精密技術は、（精密）電気化学機械加工、（精密）電気化学グリッディング、（精密）放電加工を含むことができる。
【００７９】
より好ましい実施形態では、規則的なパターンの突起を含むトポグラフィは、物の分離不可能な部分である。これは、物にトポグラフィをスタンプすること、印刷すること、エッチングすること、コーティングすることによって、または上述した他の方法を使用して、例えば、射出成形などの単一のプロセスで物を形成することによって、達成することができる。
【００８０】
突起（谷底）、周囲側面（谷壁セクション）および／または突起の頂部表面領域の間の表面は、平滑または実質的に平滑であり、すなわち、約０の粗さ（すなわち、０±０．０１μｍ）であってもよい。
【００８１】
しかし、任意の実施形態では、突起および／または頂部表面領域および／または周囲側面の間の表面は、０．０１μｍ〜１０μｍ、好ましくは０．０５〜８μｍ、さらにより好ましくは０．１〜５μｍである。また、粗さは、０．２〜２０または０．１５〜３μｍであってもよい。これに関して、粗さは、トポグラフィの形成の前または後に、表面部のエッチング、ブラストまたはブラッシングなどの技術によって得られる表面粗さである。したがって、同じ式で簡略化され計算された谷壁の輪郭は、その面に垂直な谷壁の粗さとみなすことができる。
【００８２】
粗さは、原子間力顕微鏡解析を用いて決定することができる。ランダムに粗面化された表面部は、規則的なパターンの突起を含む表面トポグラフィの従来のエッチング、ブラッシング、ブラストなどによって得ることができる。あるいは、インプラントの表面部などの平坦な表面部は、本発明の表面トポグラフィが形成された後に最初に粗くされてもよい。
【００８３】
ランダムに粗面化された表面部が本発明の突起を依然として含んでいることが不可欠であるので、明細書のどこかに示されたサイズを有する突起が存在したままであるように、ランダムに粗面化された表面部は、突起の高さおよび／または幅よりも大きい粗さを有しないかもしれない。
【００８４】
本発明のトポグラフィは、規則的に間隔をあけて配置された多数の突起からなる表面トポグラフィである。したがって、突起を含む単位セルは、上記のように単一のトポグラフィを提供するように表面部にわたって分布する。単一のトポグラフィにおける単位セルの数は、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００、さらにより好ましくは少なくとも２００、さらにより好ましくは少なくとも５００、さらにより好ましくは少なくとも１０００である。かなりの表面部にわたって延在するトポグラフィは、特定の組織などの大きな細胞収集機能に大きな影響を及ぼす可能性がある。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用、例えば、細胞培養または組織の成長、またはインプラントの作成などのｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に適切であると考えられる。
【００８５】
本発明のトポグラフィは、物理的刺激による、細胞反応、特に、細胞集団の形態形成、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節することができる。すなわち、本発明のトポグラフィは、形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死の変化を誘導することによって、１つまたは複数の生細胞の挙動を変化させることができる。その挙動は物理的刺激によって変化する。
【００８６】
この文脈における物理的刺激は、挙動の変化を誘発する信号が、とりわけ、細胞が位置する周囲の形状、硬度およびサイズ、すなわちトポグラフィによって移されることを意味する。細胞の「周辺」は細胞を直接調節する。物理的刺激とは、表面のトポグラフィ自体が、細胞の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死などの様々な態様で細胞応答を変化させることを意味し、この応答は異なるトポグラフィで異なる。細胞または細胞集団と接触して表面トポグラフィを変化させることにより、細胞の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死が影響し、全ての他のパラメータは同等に維持される。
【００８７】
一例として、特定のパラメータを有する単一のトポグラフィ上での細胞培養は、わずかな増殖を示すことができ、異なるセットのパラメータにトポグラフィを変更することにより、他は同等の条件下では高い増殖を示す細胞培養につながり得る。
【００８８】
細胞集団の細胞は、トポグラフィの突起の間、すなわち谷間、および／または突起の頂部、すなわちトポグラフィの頂部表面領域に位置する。これは、トポグラフィによる細胞集団の物理的刺激を最大にする。
【００８９】
変化した挙動に関与する物理的刺激は、挙動を変化させる化学的刺激とは別の効果である。化学的刺激において、挙動を変化させるために細胞によって受け取られたシグナルの始まりは、添加された化合物または表面化学（例えば、バルク材料、コーティングまたは表面機能化の選択）によって化学的に誘導され、その後、細胞表面で受容体と相互作用するシグナル伝達分子または細胞内の受容体分子と相互作用するように細胞に入るシグナル伝達分子によって、移される。現在観察されている、挙動を変化させる物理的刺激のメカニズムはまだ完全に理解されていないが、実施例は、化学的刺激ではなく表面トポグラフィの形状が、細胞集団の細胞形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死の観察された調節の開始を引き起こしていることを示す。したがって、細胞の物理的刺激は、表面および／または環境の化学とは無関係である。表面トポグラフィの物理的刺激によって開始される変化した細胞生理学的挙動は、シグナル伝達分子および受容体分子に対する細胞応答およびそれとの相互作用に影響を及ぼす可能性がある。
【００９０】
実施例１〜７では、データは、トポグラフィが無い同じ物質は同様に細胞挙動を調節しなかったが、異なる細胞タイプの物理的な刺激によって、細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死において、チタン、ポリウレタン、およびポリスチレンを含む様々なトポグラフィを特徴とする材料の効果を示す。
【００９１】
形態の調節は、細胞の形状の変化、例えば、伸展または伸長、平坦または円形、核の形状の変化、細胞または核の大きさの変化、細胞の表面領域、細胞の長さ、細胞の周辺、細胞のアスペクト比および偏心、接着点並びに細胞骨格の仮足および組織の存在、すなわちアクチン繊維の組織化が含まれる。いくつかの実施形態において、本発明の表面トポグラフィは、細胞形態、特にヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の細胞形態を調節しない。
【００９２】
細胞の細胞骨格は、連結された繊維および細管のネットワークからなり、細胞質の環境を形成する。アクチンマイクロファイバーは、細胞の細胞骨格における主要なフィラメントである。細胞骨格内のアクチン繊維の再編成は、細胞の形状および細胞の挙動に影響を及ぼす。
【００９３】
仮足は細胞の細胞質の延長物であり、アクチン繊維の再編成によって細胞によって形成される。仮足は、細胞の動きおよび栄養素の取り込みなどの細胞機能に関与している。局所癒着は、基材または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への細胞付着に使用される細胞構造である。機械的な力および化学的信号は、基材またはＥＣＭまたは他の細胞から、局所癒着を介して細胞に移される。したがって、細胞の形状は、とりわけ、仮足および／または局所癒着の再配向によって、細胞機能に影響を及ぼすようである。
【００９４】
細胞の形態学的変化は、通常、細胞内の細胞質、核または特異的タンパク質を視覚化するために免疫蛍光（抗体）標識または組織学的染色を用いた、明視野または免疫蛍光顕微鏡によって観察される。異なる画像解析ソフトウェアを用いて、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒのような形態学的観察を定量化することができる。
【００９５】
増殖の調節には、以下のパラメータ、すなわち、細胞数、増殖速度（特定の時点における既存の細胞数と基材上に付着または播種された細胞の初期数との比、あるいは、細胞集団の倍増に要する時間）、細胞コロニー数およびそのようなコロニー内の細胞数、基材上の細胞層の培養密度、細胞間の結合によって示され得る増殖または有糸分裂の増加または減少が含まれる。
【００９６】
増殖パラメータは、細胞の核および／または細胞質および／または細胞膜成分などの染色の有無にかかわらず細胞の生存または最終段階の画像化、およびＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒのような適切な画像解析ソフトウェアを用いた細胞数の定量化によって測定され得る。細胞を溶解し、溶解物中のＤＮＡの量を測定し、細胞の代謝活性を測定し、基材から細胞を分離し、手動または自動細胞カウンターを用いてそれらをカウントするなどの他の技術も、細胞増殖を定量化するために使用することができる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本発明の表面トポグラフィは、特にヒト誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の増殖の調節を誘導しない。
【００９８】
生化学的機能の調節には、細胞内でまたは細胞に関連して起こる全ての化学的過程および反応が含まれる。これらのプロセスには、生合成および細胞代謝、タンパク質合成、タンパク質転写およびタンパク質分泌、酵素反応および酵素発現、膜チャネルおよび受容体を介した生化学輸送、細胞シグナル伝達、および細胞の免疫反応が含まれる。
【００９９】
分化の調節は、特定の細胞型への分化、分化したまたは未分化の表現型の維持、特定の機能の維持、分化した細胞型からの脱分化、および別の細胞型への再分化を含む。
【０１００】
より分化した細胞型への幹細胞または前駆細胞の変化は、分化と呼ばれる。分化した細胞は、特定のタンパク質マーカーおよび機能を発現する。分化した細胞は、同じ表現型を維持し、それらの分化した表現型を失い、未分化細胞に変わる（脱分化）か、または別の分化した細胞型に変化する（再分化）。
【０１０１】
様々な公知の分子生物学の技術は、細胞生化学機能および分化状態を解析するために用いられる。例えば、細胞の分化は、蛍光顕微鏡または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）と組み合わせた分化特異的タンパク質の（組み合わせた）免疫蛍光標識（抗体標識）を用いて細胞を画像化することによって特徴付けることができる。定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含むタンパク質または遺伝子レベルでの特定の細胞型の特異的マーカーの発現を定量化するために、他の技術を使用することができる。
【０１０２】
細胞付着の調節は、基材に付着した細胞数の増加または減少、細胞間のタイトジャンクションの形成、焦点接着の形成、細胞付着に関与するタンパク質の分泌、表面からの細胞の分離、細胞同士の分離、表面への細胞の付着の強さなどを含む。
【０１０３】
細胞付着の調節は、細胞質または焦点接着タンパク質の免疫蛍光標識（明視野、蛍光または走査電子）顕微鏡技術および細胞の画像化、細胞溶解および溶解物中のＤＮＡ量の測定、細胞の代謝活性の計測、基材からの細胞の切り離し、および手動または自動細胞カウンターなどを用いた細胞のカウント、によって測定することができる。細胞付着の調節は、接着細胞が関与するあらゆる用途において重要である。細胞付着は、生体物質との細胞相互作用の主要なステップの１つであり、基本的に細胞と生体物質との間の全ての将来の相互作用に影響を及ぼす。例えば、マクロファージの付着を促進する生体材料は、線維組織による被包化のレベルに影響し得る。血小板の付着がより低い生体材料は、血液凝固を抑制することができる。
【０１０４】
細胞遊走の調節には、ある領域における細胞の、異なる領域に向かう（微小な）動き、または異なる領域に移転する動きが含まれる。
【０１０５】
細胞遊走の調節は、ライブイメージング、経時顕微鏡、蛍光標識などによって測定することができる。細胞遊走の調節は、胚および成体組織形成、組織再生および代謝回転、治療戦略の開発、創傷および欠陥の治癒、並びに免疫反応などの組織発生の全ての状態に影響し得る。
【０１０６】
細胞シグナル伝達の調節には、細胞間の任意の物理的または化学的相互作用（細胞−細胞相互作用）、遺伝子発現、タンパク質生産および分泌を調整することが含まれる。
【０１０７】
細胞シグナル伝達の調節は、免疫蛍光染色、ｑＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどの技術を用いて、生細胞から発現または分泌されるバイオマーカーを定量化することによって測定することができる。
【０１０８】
細胞シグナル伝達の調節は、形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走および細胞死を含む、外来生体材料に対する細胞運命および反応を支配する全てのプロセスに影響し得る。
【０１０９】
細胞死の調節には、細胞アポトーシス（プログラム細胞死）、ネクローシス、有糸分裂の破滅または細胞成分の死滅（自食）の増加または減少が含まれる。
【０１１０】
アポトーシスなどの細胞死の調節は、生死アッセイ、細胞数のカウント、アポトーシスマーカーの免疫蛍光染色などによって測定することができる。
【０１１１】
アポトーシスまたはネクローシスなどの細胞死の調節は、生細胞の培養および成長を支持するために、または疾患および癌治療のための治療方法を開発するために開発されたシステムに影響し得る。
【０１１２】
好ましい実施形態において、物理的刺激による細胞集団の細胞形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死の調節は、細胞形態、増殖、生化学的機能、分化および付着の調節を含む。好ましい実施形態において、細胞応答の調節は、細胞形態の調節を含む。他の好ましい実施形態において、細胞応答の調節は、細胞増殖の調節を含む。他の好ましい実施形態において、細胞応答の調節は、細胞の生化学的機能の調節を含む。他の好ましい実施形態において、細胞応答の調節は、細胞分化の調節を含む。他の好ましい実施形態において、細胞応答の調節は、細胞付着の調節を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、物理的刺激による細胞集団の細胞形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死の調節は、分化を調節するためにヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を物理的に刺激すること、最も顕著には脂肪生成分化を阻害することを含まない。他の実施形態において、このような調節は、細胞付着、増殖および形態の調節によって、または細胞形態、接着および機能の調節によって、腎臓上皮細胞を物理的に刺激することを含まない。さらに他の実施形態において、そのような刺激は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで多能性増殖を維持するための誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の物理的刺激を含まない。
【０１１４】
本発明のトポグラフィに用いることができる細胞集団は、特に限定されない。細胞集団は、必要に応じて適切な培地中に１つまたは複数の生細胞を備える。細胞集団は、単一の細胞型を備えるかもしれないが、細胞共培養または生体組織などにおいて複数の細胞型を備えることもできる。
【０１１５】
細胞集団は、ヒト、植物、動物、原生生物、酵母および真菌に由来するような真核細胞の集団である。細胞は、任意の植物、微生物、または動物に由来し、任意のタイプであり得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、細胞はヒトｉＰＳＣではない。他の実施形態では、細胞はｈＭＳＣではない。
【０１１７】
哺乳動物細胞、特にヒト、サル、ウシ、ブタ、ラットまたはマウスの細胞が好ましい。さらに好ましくは、哺乳動物細胞は、好ましくはマクロファージおよび肝細胞の中に含まれる間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨芽細胞、免疫反応関連細胞を含む。
【０１１８】
細胞は、生存または死亡したドナーの組織から単離、細胞培養、より高い有効性で細胞型を分化させること、より進行した分化状態を有する細胞型から脱分化させること、または異なる分化状態を有する細胞型から再分化させること、のような公知の方法で得られ得る。組織からの細胞単離または細胞診は、１つまたは複数の酵素、例えばコラゲナーゼによる細胞の細胞外マトリックスの消化を含む。ほとんどの場合、組織は異なる細胞型または細胞集団からなるため、一般に細胞単離の次のステップには細胞の精製が含まれる。他の技術が細胞型に応じた細胞を得るために用いられ得る。例えば、赤血球は、全血を遠心分離し、異なるタイプの細胞を含む分離した層を収集することによって得ることができる。
【０１１９】
本発明の物は、本技術分野で公知のように、適切な培養培地と共に使用することができる。そのような培養培地は水を含み、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および成長因子、アミノ酸、ビタミン、グルコース、無機塩および抗生物質などのようなタンパク質をさらに含み得る。本発明の物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで適用するためには、好適な培養培地の使用が好ましい。他の条件では、細胞はマトリゲルもしくはアガロースゲルのようなゲル上、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、またはポリアミンなどのコーティング上で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水などの他の液体中で培養するか、またはヒドロゲルまたはポリマーキャリアなどの生体材料に埋め込まれてもよい。細胞は、固定溶液を用いて固定され、湿潤条件または乾燥条件で解析され得る。
【０１２０】
本発明はさらに、物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節する方法であって、
１）適切な培地における１つまたは複数のセルを、規則的なパターンの突起を有する表面部に接触させる工程であって、表面部の上に置くことができる交差するグリッド線の格子によって定義される突起の規則的なパターンであって、グリッド線は各単位セルが最大１つの突起を備え、その突起が１つまたは複数の突起要素を備え、その突起要素が頂部表面領域を有する表面の上に隆起した表面部分および頂部表面領域を表面と接続する周囲側面として定義されるように単位セルのパターンを定義し、各突起要素は表面の上で０．５〜５０μｍの最大高さを有し、
ａ）隣接する突起間の平均距離は０〜５０μｍであり、
ｂ）突起の頂部表面領域の面積は１〜６０００μｍ２であり、そして
ｃ）突起は、表面の３〜９０％を覆う、
工程と、
２）細胞が表面に応答することを可能にする工程と、
を含む方法である。
【０１２１】
本発明の方法は、以下に説明する特定の適用目的のそれぞれに適合させることができる。本発明の方法はｉｎ  ｖｉｖｏでの方法であり得るが、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法である。
【０１２２】
本発明の物は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用することができる。
一実施形態では、本発明の物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節する。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用は、例えば、上記で定義したトポグラフィを備える表面部上の細胞の培養を含む。この実施形態では、本発明の物の上または中で培養された細胞は、直接的または間接的に、それらの挙動を変化させるために物理的に刺激される。
【０１２３】
例えば、物は、例えば、培養フラスコ、プレート、皿、スライド、ボトル、チャンバまたはバッグのような、細胞培養のための表面を有する、細胞培養のための物であってもよく、その表面は上記で定義したトポグラフィを備える。
【０１２４】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のための物についてのトポグラフィは、様々なサイズのものであり得る。例えば、培養フラスコは、表面積が５〜１００００ｃｍ２、好ましくは１０〜５０００ｃｍ２、より好ましくは１５〜１０００ｃｍ２のトポグラフィ特徴表面を有し、培養プレートのウェル内に存在するトポグラフィ特徴表面は、通常、１ウェル当たり０．０１〜１０ｃｍ２の表面積を有する。
【０１２５】
本発明はさらに、物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調節するための、本発明の物の使用に関する。物は、以下に説明する特定の用途ごとの使用に適合させることができる。
【０１２６】
別の実施形態では、本発明の物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に適合される。そのような実施形態は、好ましくは、上記のように、好ましくは細胞生化学機能、細胞付着または物理的刺激による分化を調節するためのトポグラフィを有するインプラントである。
【０１２７】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用の一実施形態では、本発明は、物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節するための、上記定義された物の適用によって、患者の治療方法を含む。そのような方法は、後述する特定の適用目的ごとにトポグラフィを有する物に基づくことができる。
【０１２８】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用の別の実施形態では、本発明は、物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死の調節における使用における、上記定義された物に関する。物は、以下に説明する特定の適用目的のいずれかに使用するためのものであってもよい。
【０１２９】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のさらなる実施形態において、本発明は、物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死の調節における、上記定義された物の使用に関する。この物は、以下に説明する特定の適用目的のいずれかに使用するためのものであってもよい。
【０１３０】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のさらに別の好ましい実施形態では、本発明は、物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死の調節のための薬剤の製造における、上記定義された物の使用に関する。薬剤は、以下に記載される特定の適用目的のいずれかを標的とすることができる。
【０１３１】
本発明の上記で一般的に定義された態様およびパラメータの全ては、上記で定義された他の態様およびパラメータと組み合わせることができる。さらに、その態様またはパラメータが、上記で使用されたものとは異なる言い回しまたはパラメータを使用して適用目的のために具体的に記述されていない限り、上記で定義された一般的に定義された態様およびパラメータのそれぞれは、以下で定義される各特定の適用目的のためにも適用される。そのような場合、以下の特定の適用目的のために定義された態様およびパラメータは、上記定義された同じ態様またはパラメータの一般的な定義を覆す。
【０１３２】
細胞応答の特定の適用のための実施形態
一実施形態では、本発明の物は、その表面部に、好ましくは１つ、しかし１０を超えない、異なるトポグラフィを備える。すなわち、この実施形態では、本発明の物は、多くとも１０、好ましくは多くとも９、より好ましくは多くとも８、より好ましくは多くとも７、より好ましくは多くとも６、より好ましくは多くとも５、より好ましくは多くとも４、より好ましくは多くとも３、より好ましくは多くとも２、そして最も好ましくは１つのトポグラフィを有する。この実施形態では、トポグラフィは、１μｍ〜１０ｍの長さ、幅または直径を有することができる。そのようなトポグラフィの表面積は、用途に応じて１μｍ２〜１００ｍ２であり得る。
【０１３３】
この実施形態では、特定の用途のために、物理的刺激による細胞応答を促進するために、１つ（または多くても数個）の選択されたトポグラフィが選択される。トポグラフィは任意の形状を有することができる。用途は、培養ウェアまたは培養プラットフォーム（例えば、チップまたはマイクロ流体デバイス）、バイオリアクター、膜またはインプラントを含む細胞培養のための物を含むが、これに限定されない。当業者は、本発明のトポグラフィを適用するために無数の方法を思いつくことができる。
【０１３４】
本発明の利点は、細胞応答の正確な調節、成長因子または（タンパク質）コーティングを使用する必要のない物理的刺激、異なる材料および生成物に適用されるアプローチの柔軟性に制限されないが、浸出または層欠陥、およびバッチ間の差はない。
【０１３５】
細胞応答の特定の適用のための別の実施形態において、本発明の物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に適合される。そのような使用は、生体内に移植されるかまたは一時的に挿入されるトポグラフィを有する物を備えることができる。この場合、物はインプラントであることが好ましい。したがって、本発明はさらに、インプラントとして使用するための上記定義されるような物に関する。
【０１３６】
インプラントは、一時的インプラントまたは持続的インプラントであってもよい。一時的インプラントは、本技術分野で公知の、限定された持続時間の間体内に留まり、その目的を発揮した後に身体から取り除かれ得るか、または身体内でゆっくりと分解し得るインプラントである。永続的インプラントは、原則として、無期限に所定の位置に留まるべきインプラントであるが、対象のインプラントの寿命要因（例えば摩耗）の影響を受けやすい。
【０１３７】
本発明はさらに、上記定義したトポグラフィを含むインプラントを用いて、インプラントを必要とする対象を治療する方法に関する。本発明のインプラントは、例えば、整形外科または歯科インプラント、肝臓インプラント、または免疫反応を制御するインプラントであり得る。本発明の他のインプラントは、筋肉インプラント、神経系インプラント、脊髄コード刺激インプラント、電気音響インプラント、深部脳刺激器、ペースメーカーインプラント、美容インプラント、乳房修復インプラント、（腹部）メッシュインプラントを含む電気刺激インプラントであり得る。このようなインプラントは、免疫反応の適切な調節を必要とする。
【０１３８】
インプラントである本発明の実施形態では、本発明の表面トポグラフィを備えたインプラントが所望の応答を提供するために細胞を調節するということが明確な利点である。これは、例えば、周辺組織の調節された内方成長、周辺細胞の分化調節、または調節された細胞付着を可能にする。整形外科または歯科インプラントの場合、利点は、骨または歯の組織内またはその上へのインプラントのより良好な固定をもたらす新しい骨の形成／内方成長を増加させることができることである。
【０１３９】
あるいは、これは、例えば、インプラントに対する免疫反応の低下を可能にし、線維性組織による、インプラントの問題となる被包化またはインプラントの拒絶を減少させるという利点をもたらす。さらにあるいは、これは、例えば、血液凝固および血栓症を回避するために、インプラントの表面上の内皮細胞の機能的単層を有するという利点を有する、内皮細胞の付着および増殖の増加を可能にする。さらにあるいは、これは、細胞の長期生存率および機能性を増加させる利点を有する、増殖の増加および肝細胞の表現型の維持を可能にする。
【０１４０】
本発明のインプラントは、本技術分野で公知であるように、上記の技術のいずれかによって作製することができる。トポグラフィを有する者に提供するための適切な技術の例は、上記に記載されている。
【０１４１】
以下に定義される特定の適用目的のそれぞれについて、特定の形状を有する突起を含むトポグラフィは、「ヒット」トポグラフィとして説明される。これらのトポグラフィは、実施例セクションの表に示されている。上記の一般的な説明の下で、および／または以下に説明する特定の適用目的の下で列挙された各態様およびパラメータは、別段の記載がない限り、各ヒットトポグラフィに適用され得る。
【０１４２】
ヒットトポグラフィは、その適用目的に最適な効果を有する突起形状を反映する。しかしながら、適用目的ごとに、トポグラフィの効果が、ヒットトポグラフィと同様の形状を有するトポグラフィについて同じであると仮定することは合理的である。形状が似ているかどうかは本質的に目で比較することによって判断される。本技術分野で知られているように、突起の中心点を数学的に定義することによって数値的に表現することができる。その中心点から周囲側面の特定の点までの距離は、その特定の点に向く半径と呼ばれる。形状は、比較された形状の中心点を整列させ、ヒットトポグラフィの形状にできるだけ一致するように形状を配向することによって、類似の形状を重ねる場合、その類似の形状の半径は、周囲側面の任意の点でヒットトポグラフィの半径から１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２．５％以下、さらにより好ましくは１％以下外れる。
【０１４３】
肝細胞
一実施形態では、本発明の物は、肝細胞を調節するための物であり得る。この文脈において、肝細胞は、肝臓組織で見られる主細胞として定義され、肝臓のほとんどの生化学的機能に関与し、上記のように、アカゲザル、マウスなどを含む任意のヒトまたは動物に由来し得る。この文脈における肝細胞はまた、肝細胞前駆細胞、および肝細胞様細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２のような不死化細胞株）を指す。
【０１４４】
この実施形態では、トポグラフィは、
ａ）隣接する突起間の平均距離は０〜５０μｍ、好ましくは０．５〜４０μｍ、より好ましくは１〜３０μｍ、さらにより好ましくは３〜２５μｍであって、
ｂ）突起の頂部表面領域の面積は、１〜６０００μｍ２、好ましくは１０〜３０００μｍ２、好ましくは１５〜１５００μｍ２、より好ましくは１７〜１０００μｍ２、さらにより好ましくは２０〜２５０μｍ２であって、
ｃ）突起は、表面部の３〜９０％、好ましくは５〜５０％、より好ましくは７〜４０％、さらにより好ましくは８〜３５％を覆う。
【０１４５】
さらに、トポグラフィは、突起／突起要素の長さが、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．５〜５０μｍ、より好ましくは１〜４０μｍ、さらにより好ましくは２〜３５μｍであり、突起／突起要素の幅が、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．５〜５０μｍ、より好ましくは１〜３５μｍ、さらにより好ましくは４〜２３μｍであることによって定義され得る。
【０１４６】
あるいは、本発明の肝細胞を調節するための物は、
ａ）谷底から頂部表面領域までの距離、谷底に対して垂直な距離を０．５〜５０μｍ、好ましくは１〜４０μｍ、より好ましくは２〜３５μｍ、より好ましくは４〜３０μｍ、さらにより好ましくは５〜２８μｍと定義した谷壁の高さ、
ｂ）第１および第２の谷壁の輪郭は、独立して０〜４０μｍ、好ましくは０．１〜３５μｍ、より好ましくは０．５〜３０μｍ、さらにより好ましくは１〜２０μｍであり、
ｃ）第１および第２の谷壁セクションの長さは、独立して０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．１〜５０μｍ、より好ましくは１〜４０μｍ、さらにより好ましくは２〜３２μｍであり、
ｄ）第１および第２の谷壁のパンクチャーがあれば、その長さは、独立して、０〜５０、好ましくは０．２〜４０、より好ましくは０．５〜３５μｍであり、
ｅ）谷の平均幅は、０〜５０μｍ、好ましくは０．５〜４０μｍ、より好ましくは１〜３０μｍ、さらにより好ましくは３〜２５μｍである。
【０１４７】
したがって、本発明はまた、生細胞が肝細胞であり、トポグラフィが上記定義した通りであり、上記定義した物理的刺激によって、細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節する方法に関する。
【０１４８】
任意の材料は物を作成するために使用されるが、好ましくは、物、または少なくともトポグラフィを有するその表面部は、ガラス、金属または高分子材料、さらにより好ましくは高分子材料で作られる。最も好ましくは、物は、ポリスチレン、ポリプロピレン、コラーゲン、ラミニン、ポリアミン、およびマトリゲルのようなヒドロゲル、およびアガロースゲルを有する表面部を含む。
【０１４９】
この実施形態に適した培養培地には、水、グルコース、タンパク質、アミノ酸、ビタミン、ペニシリン、抗生物質、および無機塩の１つまたは複数の成分が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５０】
肝細胞の調節は、肝細胞様形態の刺激、短時間および／またはより多くのサイクルでの肝細胞の増殖、表現型および肝細胞特異的機能性を保持しながら培養中の肝細胞の長期の維持、早期および後期ポイントにおける幹細胞付着刺激、および早期の細胞死の防止を含む。この機能性は、シトクロムタンパク質（ＣＹＰ）、アルブミン、Ｅ−カドヘリン、ＣＤ８１などの解毒マーカーを含む、肝細胞の機能的バイオマーカーの評価によって確認することができる。これらのマーカーの発現は、ｑＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光染色、ウェスタンブロットおよび蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの様々な技術を用いて、遺伝子およびタンパク質レベルで評価することができる。
【０１５１】
それらの表現型を保持しながら、長期間にわたり機能的肝細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養をサポートすることができる表面トポグラフィのグループが同定されている。これらのトポグラフィをポリスチレン（ＰＳ）基材に埋め込み、コラーゲンコーティングの追加の有無に関わらず使用し、従来の細胞培養技術を用いて肝細胞との相互作用を調査した。
【０１５２】
選択されたトポグラフィを特徴とするサンプルは、そのような表面トポグラフィがないサンプルと比較して、より高い細胞付着を可能にした。アカゲザルおよびヒト起源の肝細胞は、トポグラフィ埋め込み基材上において、表面にコラーゲンコーティングされたＰＳと表面にコラーゲンコーティングされていないＰＳの両方で培養した場合、少なくとも１ヶ月間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養で維持することができた。これは、現在のゴールドスタンダード、すなわちコラーゲンサンドイッチ培養物（肝細胞がその間で培養されるコラーゲンの二重層）が、肝細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養を最大８〜１０日間サポートすることができる。トポグラフィが埋め込まれた基材上で培養された肝細胞は、機能性について特徴付けられ、完全に機能すること、すなわち、１０を超える解毒および代謝活性マーカーを含む肝細胞特異的マーカーの適切な発現であることが見い出された。コラーゲンコーティングを有しないトポグラフィが埋め込まれた基材上で培養された肝細胞は、コラーゲンコーティングを有するトポグラフィが埋め込まれた基材と比較して、解析された肝細胞特異的マーカーの同等またはより高いレベルを発現し、選択されたトポグラフィがコラーゲン余剰により高価、面倒および容易に失敗するコーティングを作成することを証明する。同様に、コラーゲンコーティングの有無にかかわらず、トポグラフィが埋め込まれた基材上に播種された肝細胞は、マラリア原虫にうまく感染し、培養物中で１ヶ月間維持され、病理学的条件下での肝細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養をサポートする表面トポグラフィの有効性を示した。
【０１５３】
別の実施形態では、肝細胞はｉｎ  ｖｉｖｏで調節される。この実施形態では、本発明の物は、肝臓インプラントであり得る。この実施形態では、「突起」の定義におけるパラメータである平均距離、頂部表面領域の面積、被覆率、長さおよび幅、およびパラメータである谷壁の高さ、谷壁の輪郭、谷壁のセクションおよびパンクチャーの長さ、および谷の平均幅は、肝細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養について上記で定義した通りである。
【０１５４】
本発明による肝臓インプラントは、定義された表面トポグラフィを備えた少なくとも１つの表面部を有し、肝細胞を設けることができる物であり得る。好ましくは、インプラントは、トポグラフィを有する表面部に肝細胞を保持する手段をさらに備える。
【０１５５】
トポグラフィを有する表面部上に肝細胞を保持する適切な手段としては、例えば、ヒドロゲル層、高分子層、タンパク質コーティングなどが挙げられる。好ましくは、このような層は、物の上の肝細胞に到達するためにｉｎ  ｖｉｖｏで細胞が機能するための栄養素および他の必須成分の拡散を可能にして、および／または表面に対するより良好な細胞付着をもたらす。
【０１５６】
肝臓インプラントは、肝臓の機能に関与する肝細胞および他のタイプの細胞の生物学的応答を調節するために、表面部に複数の、例えば最大１０個の表面トポグラフィを備えることができる。
【０１５７】
肝臓インプラントはまた、３Ｄ足場、好ましくは上記で定義したような材料でできており、多孔質である、表面部に１つまたは複数の表面トポグラフィを含み、肝細胞成長および組織形成のための適切な環境を提供する。
【０１５８】
上記で定義されたトポグラフィを有する肝臓インプラントの利点は、身体によって生成されるかまたは薬物などの身体に導入される生化学化合物の代謝および解毒を含む、肝臓の機能を回復または強化することである。
【０１５９】
肝細胞を調節するための本発明のトポグラフィのさらなる使用には、例えば、人工肝臓、肝臓再生のための３Ｄ足場、薬物スクリーニングプラットフォーム、およびバイオセンサーが含まれる。これらの装置は、上述のような異なる技術を用いて製造することができ、表面部に１〜１０個の調節表面トポグラフィを備えることができる。Ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のために、物は、ドナーからの細胞、実験環境で培養された自己細胞または異なる供給源の細胞のような、細胞を伴うか否かにかかわらず体内に導入することができる。
【０１６０】
骨形成
この実施形態では、本発明の物は、物理的刺激が骨形成の生化学的機能、分化および付着の調節であることによる細胞集団の細胞応答、最も顕著には形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節する整形外科または歯科インプラントである。この実施形態において細胞応答が調節される細胞は、好ましくは骨芽細胞である。
【０１６１】
この実施形態は、天然組織の代替品であり、人工的に作られた、ヒトまたは動物の骨もしくは歯の中もしくは上に移植するための、骨形成を刺激する医療装置、好ましくはインプラントなどの物に関する。生物医学的インプラントであるインプラントは、好ましくは、ヒトまたは動物の骨もしくは歯の中もしくは上に移植される。１つの好ましい実施形態では、インプラントは、ヒトの骨または歯に移植される。別の好ましい実施形態では、インプラントは、動物の骨または歯に移植される。
【０１６２】
骨は、骨芽細胞によって合成された天然のミネラル化された構造であり、脊椎動物の身体に強度およびサポートを提供する機能を有する。また、骨は、身体の動きを可能にするために、筋肉の付着をしっかりサポートする。
【０１６３】
骨は一般に２つのタイプで存在するといわれており、皮質骨組織は骨の硬い外層であり、滑らかで、白く、輝く外観を有する。それは、骨芽細胞およびミネラル化組織が存在する微視的カラムの高密度ネットワークからなる。
【０１６４】
海綿状の骨としても知られる海綿骨は、骨の内部に見られ、多かれ少なかれ多孔性の骨組織のネットワークからなる。骨組織間の空間には、骨の内部の生細胞に栄養素を供給するために、骨髄および幹細胞が血管と共に存在する。
【０１６５】
歯は、人間および他の脊椎動物の顎に見られる高度に石灰化した組織で作られた小さな構造物であり、咀嚼や会話において重要な役割を果たす。歯は、それぞれ歯根および歯冠と呼ばれる歯肉の内側および外側の２つの部分を有する。歯の組織には、硬い無機質マトリックス中の生細胞から作られたエナメル質の下にある層である象牙質である、リン酸カルシウムを主成分とする歯の最も硬く、外層であるエナメル質、生細胞、血管および神経を含む歯のより柔らかい内部構造、セメント質、歯の歯根を歯肉および顎にしっかりと連結する層、および最後に顎骨に歯を保持することにも関与する歯周靭帯を含む異なる層がある。
【０１６６】
骨組織および歯組織は、他のほとんどの組織タイプと同様に、連続的に形成および分解される。ミネラル化環境のために、骨および歯の組織の形成および分解の速度は、大部分の他の組織タイプと比較して比較的遅い。したがって、欠陥が生じた場合、骨または歯の組織の再生は、他の組織タイプの再生よりも時間がかかる。さらに、大きな骨または歯のセグメントが欠陥または欠損している場合、再生は不可能である可能性がある。
【０１６７】
そのような場合、本発明によるインプラントは、骨または歯の中もしくは上に移植されてもよい。これは身体部分の自然な機能の回復に影響する。好ましくは、骨インプラントの場合、インプラントは少なくとも部分的に皮質骨内に移植される。歯のインプラントは、好ましくは、顎骨または歯の組織に移植される。以下に定義されるその特定のトポグラフィによる本発明のインプラントは、骨形成を刺激し、それと共にインプラントの組織内方成長による骨または歯への固定を刺激する。
【０１６８】
この文脈における組織内方成長とは、インプラント上および／またはインプラント内、好ましくは天然の骨または歯の組織およびインプラントが結合する境界における骨または歯形成のプロセスを意味すると理解される。天然の骨または歯の中もしくは上にインプラントを移植するとき、この境界には小さな間隙があり、インプラントとの境界で隙間内の天然の骨または歯の組織に存在する骨芽細胞、エナメル芽細胞、象牙芽細胞またはセメント芽細胞などのような自然にそのような組織を形成する細胞によって形成される天然の骨または歯の組織により時間内に満たされる。このように、組織内方成長は、インプラントが移植される骨または歯の組織の上もしくは中にインプラントを固定する、インプラント上もしくはインプラント内への天然の骨または歯の組織の成長である。
【０１６９】
本発明のトポグラフィは骨形成を刺激し、好ましくは、それと共に骨または歯の組織内もしくは上へのインプラントの固定を増加させる。固定力の増加は、隙間における骨形成のプロセスが加速されること、および／またはインプラントが骨または歯の中もしくは上に固定される強度が増加することを意味する。また、固定力の増加は、天然組織の内方成長によってもたらされる、周囲の骨または歯の組織とインプラントとの間の固定が、インプラントの置換を回避または延期させるために、より長く保持され得ることを意味し得る。
【０１７０】
骨形成の増加は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてトポグラフィ上で成長する幹細胞に存在するアルカリホスファターゼ酵素（ＡＬＰ）、オステオカルシン（ＯＣ）、オステオポンチン（ＯＰ）および／または骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）の量を解析することなどの種々の方法により測定される。
【０１７１】
インプラントをインプラント部位から引っ張るために必要な力を測定する前に、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験を実施することにより、固定力を測定することができる。
【０１７２】
本発明のトポグラフィは、骨形成を刺激するための医療装置などの物、好ましくは、組織の内方成長が望まれる場所で骨または歯の中もしくは上に移植されるインプラントに存在する。好ましくは、天然の骨または歯の組織への固定の増加から利益を得られるインプラントの全ての位置は、本発明のトポグラフィによって覆われる。
【０１７３】
好ましい実施形態では、本発明の装置は、ヒトまたは動物の骨の中もしくは上、好ましくはヒトの骨の中または上に移植される。この場合、インプラントは、整形外科インプラントと呼ばれる。
【０１７４】
代替的な好ましい実施形態では、本発明の装置は、ヒトまたは動物の顎骨もしくは歯の中もしくは上、好ましくはヒトの顎骨または歯の中もしくは上に移植される。この場合、インプラントは歯科インプラントと呼ばれる。
【０１７５】
この実施形態では、本発明の物に存在するトポグラフィは、以下のように定義することができ、
ａ）隣接する突起間の平均距離は、０〜５０μｍ、好ましくは０．５〜４０μｍ、さらにより好ましくは１〜３０μｍ、さらにより好ましくは２〜２５μｍであり、
ｂ）突起の頂部表面領域の面積は、１〜６０００μｍ２、好ましくは１０〜３０００μｍ２、より好ましくは２０〜１５００μｍ２、より好ましくは２５〜１０００μｍ２、さらにより好ましくは３０〜７５０μｍ２であり、および
ｃ）突起は、表面部の３〜８０％、好ましくは表面部の１０〜７５％、より好ましくは２０〜７０％、より好ましくは３０〜６５％を覆う。
【０１７６】
また、突起が１つの突起要素のみを備えるトポグラフィにおける突起の長さは、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．５〜５０μｍ、より好ましくは１〜４０μｍであり、突起が複数の突起要素を備えるトポグラフィにおける突起の長さは、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．１〜４５μｍ、より好ましくは０．５〜４０μｍ、さらにより好ましくは１〜３０μｍとすることができる。
【０１７７】
突起が１つの突起要素のみを備えるトポグラフィにおける突起の幅は、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．５〜５０μｍ、より好ましくは１〜４０μｍであり、突起が複数の突起要素を備えるトポグラフィにおける突起の幅は、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．１〜４５μｍ、より好ましくは０．５〜４０μｍ、さらにより好ましくは１〜３０μｍとすることができる。
【０１７８】
あるいは、整形外科用または歯科用インプラントは、少なくとも１つのトポグラフィを有する物として定義することができ、
ａ）谷壁の高さは、０．５〜５０μｍ、好ましくは１〜４０μｍ、より好ましくは２〜３５μｍ、より好ましくは４〜３０μｍ、さらにより好ましくは５〜２８μｍであり、
ｂ）谷壁の輪郭は、０〜４０μｍ、好ましくは０．１〜３０μｍ、より好ましくは０．５〜１５μｍ、さらにより好ましくは０．８〜１０μｍであり、
ｃ）谷壁セクションの長さは、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．０５〜５０μｍ、より好ましくは０．１〜４０μｍであり、
ｄ）谷壁のパンクチャーの長さは０〜５０μｍ、好ましくは０．５〜４０μｍ、より好ましくは１〜３０μｍ、さらにより好ましくは２〜２５μｍであり、
ｅ）谷の平均幅は、０〜５０μｍ、好ましくは０．５〜４０μｍ、より好ましくは１〜３０μｍ、より好ましくは２〜２５μｍである。
【０１７９】
本発明による整形外科用または歯科用インプラントの利点は、周囲の天然（骨および歯）組織へのインプラントの固定を改善することである。
【０１８０】
整形外科インプラントは、欠損した関節または骨を置換するために、または損傷した骨を支持するために製造された医療装置である。現在説明されているような表面トポグラフィを含むものから利益を得られる適切な整形外科用インプラントの例には、膝置換インプラント、大腿骨コンポーネントおよび脛骨ステムプレート、（全）股関節置換インプラント大腿ステムおよび寛骨臼シェル、肘および指インプラントステムおよびヒンジ、顎顔面インプラント、頭蓋骨インプラント、肩インプラント、足首インプラント、爪、ネジ、留め針、ロッドおよびプレートのような（外部）固定インプラント、脊柱ケージ、脊椎板、椎弓根ネジおよびロッドを含む注入脊柱再生に用いられるインプラント、および頚椎板を含む。
【０１８１】
好ましくは、整形外科インプラントは、膝置換インプラント、大腿骨コンポーネントおよび脛骨ステムプレート、（全）股関節置換インプラント大腿骨ステムおよび寛骨臼シェル、ならびに脊椎ケージ、脊椎板、椎弓根ネジおよびロッドを含む注入脊柱再建に用いられるインプラントおよび子宮頸部椎骨プレートを含む。
【０１８２】
歯科用インプラントは、顎または頭蓋骨の骨と接触して、歯冠、ブリッジ、入れ歯、顔面補綴物などの歯科用補綴物を支えるか、または歯列矯正アンカーとして機能するための外科用コンポーネントである。現在記載されているトポグラフィを含むことから利益を得られることができる適切な歯科インプラントの例は、顎および顎顔面インプラント、歯科用プレートおよびフレームワーク、歯科用ベースネジおよびポストネジ、歯冠インプラントを含む。好ましくは、歯科用インプラントは、歯科用プレートおよびフレームワーク、歯科用ベースネジまたはポストネジである。
【０１８３】
上述した骨形成生化学機能、分化および付着の調節のための物は、インプラントの製造のための任意の公知の方法によって作製することができる。そのような方法は、一般的に上記に記載され、本技術分野で公知である。
【０１８４】
免疫制御機構
別の実施形態では、物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死の調節は、免疫制御機構を含む。この文脈における免疫制御機構とは、体内に移植された、または体内に存在する異物、すなわち異物反応に対する免疫反応を調節することを意味する。免疫制御機構には、異物巨細胞（ＦＢＧＣ）の形成、炎症反応、マクロファージの関与、線維形成および異物の被包化を制御することが含まれる。このように、本発明はさらに、免疫細胞の免疫制御機構のための物を提供し、トポグラフィは上記で定義した通りである。
【０１８５】
免疫反応は、より一定の、安定した最終段階が後に続く（早期段階での）即時応答を有する。早期段階では、急性反応は異物の受け入れを制御する上で非常に重要であり（生体適合性）、最終段階での（慢性）免疫活性レベルへの重要なドライバーでもある。最初の反応は、適切であるが最小限の被包化および不活性（非炎症性）最終段階を可能にするために、適切であるが制御されたレベルにある必要があると考えられる。しかし、正確なメカニズムはまだ完全には理解されていない。好ましい実施形態では、免疫制御トポグラフィの３つのクラスを定義することができ、（１）早期段階での低い免疫反応を、後期段階での低い反応と組み合わせて、以後、Ｌ／Ｌと呼び、これは免疫反応を低下させることを意味する。（２）早期段階での高い免疫反応を、後期段階での高い反応と組み合わせて、以後、Ｈ／Ｈと呼び、これは免疫反応を増加させることを意味する。（３）早期段階での高い免疫反応を、後期段階での低い反応と組み合わせて、以後、Ｈ／Ｌと呼ぶ。
【０１８６】
好ましい実施形態では、免疫反応を調節するためのＬ／Ｌ型のトポグラフィは、以下のように定義することができ、
ａ）隣接する突起間の平均距離は０〜５０μｍ、好ましくは０．５〜４０μｍ、より好ましくは１〜２０μｍ、さらにより好ましくは２〜１２μｍであり、および
ｂ）突起の頂部表面領域の面積は１〜６０００μｍ２、好ましくは１０〜３０００μｍ２、より好ましくは１５〜１５００μｍ２、より好ましくは２０〜１０００μｍ２、さらにより好ましくは２０〜２００μｍ２、最も好ましくは２５〜２００μｍ２であり、および
ｃ）突起は、表面部の３〜９０％、好ましくは５〜８０％、より好ましくは１０〜７５％、さらにより好ましくは２６〜５０％を覆う。
【０１８７】
また、突起が１つの突起要素のみを備えるトポグラフィにおける突起の長さは、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．５〜５０μｍ、より好ましくは１〜５０μｍ、さらにより好ましくは２〜４０μｍであり、突起が複数の突起要素を備えるトポグラフィにおける突起の長さは、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．１〜４５μｍ、より好ましくは０．５〜４０μｍ、さらにより好ましくは１〜３０μｍとすることができる。
【０１８８】
突起が１つの突起要素のみを備えるトポグラフィにおける突起の幅は、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．５〜５０μｍ、より好ましくは１〜５０μｍ、さらにより好ましくは２〜４０μｍであり、突起が複数の突起要素を備えるトポグラフィにおける突起の幅は、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．１〜４５μｍ、より好ましくは０．５〜４０μｍ、さらにより好ましくは１〜３０μｍとすることができる。
【０１８９】
あるいは、Ｌ／Ｌ型の免疫制御インプラントは、少なくとも１つのトポグラフィを有する物として定義することができ、
ａ）谷壁の高さは、０．５〜５０μｍ、好ましくは１〜４０μｍ、より好ましくは２〜３５μｍ、より好ましくは４〜３０μｍ、さらにより好ましくは５〜２８μｍであり、
ｂ）谷壁の輪郭は、０〜４０μｍ、好ましくは０．１〜３５μｍ、より好ましくは０．５〜３０μｍ、さらにより好ましくは１〜２０μｍであり、
ｃ）谷壁セクションの長さは、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．１〜５０μｍ、より好ましくは１〜４０μｍ、さらにより好ましくは２〜３２μｍであり、
ｄ）谷壁のパンクチャーの長さは、０〜５０μｍ、好ましくは０．２〜４０μｍ、より好ましくは０．５〜３５μｍであり、
ｅ）谷の平均幅は、０〜５０μｍ、好ましくは０．５〜４０μｍ、より好ましくは１〜２０μｍ、さらにより好ましくは２〜１２μｍである。
【０１９０】
そのようなトポグラフィは、異物に対する免疫反応を低下させることができ、好ましくは異物周囲の被包化組織および炎症活性を最小限に抑えることができる。
【０１９１】
さらに、本発明の物は、異物への免疫反応を刺激するために用いられ、好ましくは異物の制御された被包化を強化するために用いられ得る。
【０１９２】
この実施形態で用いられ得るトポグラフィは、Ｈ／Ｈタイプのトポグラフィであり、これは以下のように定義することができ、
ａ）隣接する突起間の平均距離は０〜５０μｍ、好ましくは０．５〜４０μｍ、より好ましくは２〜２０μｍ、さらにより好ましくは５〜１２μｍであり、および
ｂ）突起の頂部表面領域の面積は１〜６０００μｍ２、好ましくは１０〜３０００μｍ２、より好ましくは２０〜１０００μｍ２、より好ましくは２５〜２５０μｍ２、さらにより好ましくは２０〜７０μｍ２であり、および
ｃ）突起は、表面部の３〜９０％、好ましくは５〜５０％、より好ましくは１０〜４０％、さらにより好ましくは１５〜２５％を覆う。
【０１９３】
また、突起が１つの突起要素のみを備えるトポグラフィにおける突起の長さは、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．５〜５０μｍ、より好ましくは１〜５０μｍ、さらにより好ましくは２〜４０μｍであり、突起が複数の突起要素を備えるトポグラフィにおける突起の長さは、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．１〜４５μｍ、より好ましくは０．５〜４０μｍ、さらにより好ましくは１〜３０μｍとすることができる。
【０１９４】
突起が１つの突起要素のみを備えるトポグラフィにおける突起の幅は、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．５〜５０μｍ、より好ましくは１〜５０μｍ、さらにより好ましくは２〜４０μｍであり、突起が複数の突起要素を備えるトポグラフィにおける突起の幅は、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．１〜４５μｍ、より好ましくは０．５〜４０μｍ、さらにより好ましくは１〜３０μｍとすることができる。
【０１９５】
あるいは、Ｈ／Ｈ型の免疫制御インプラントは、少なくとも１つのトポグラフィを有する物として定義することができ、
ａ）谷壁の高さは、０．５〜５０μｍ、好ましくは１〜４０μｍ、より好ましくは２〜３５μｍ、より好ましくは４〜３０μｍ、さらにより好ましくは５〜２８μｍであり、
ｂ）谷壁の輪郭は、０〜４０μｍ、好ましくは０．１〜３５μｍ、より好ましくは０．５〜３０μｍ、さらにより好ましくは１〜２０μｍであり、
ｃ）谷壁セクションの長さは、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．１〜５０μｍ、より好ましくは１〜４０μｍ、さらにより好ましくは２〜３２μｍであり、
ｄ）谷壁のパンクチャーの長さは０〜５０μｍ、好ましくは０．５〜４０μｍ、より好ましくは１〜３０μｍ、さらにより好ましくは２〜２５μｍであり、
ｅ）谷の平均幅は、０〜５０μｍ、好ましくは０．５〜４０μｍ、より好ましくは２〜２０μｍ、さらにより好ましくは５〜１２μｍである。
【０１９６】
また、本発明の物は、低下した最終段階の免疫反応を可能にするために、異物に対する早期免疫反応を刺激するために使用でき、好ましくは最終段階で異物周辺の被包化組織および炎症活性を最小化することができる。
【０１９７】
この実施形態で用いられ得るトポグラフィは、Ｈ／Ｌタイプのトポグラフィを有し、これは以下のように定義することができ、
ａ）隣接する突起間の平均距離は、０〜５０μｍ、好ましくは０．５〜４０μｍ、より好ましくは５〜３０μｍ、さらにより好ましくは１２．１〜２０μｍであり、および
ｂ）突起の頂部表面領域の面積は、１〜６０００μｍ２、好ましくは１０〜３０００μｍ２、より好ましくは２０〜１０００μｍ２、より好ましくは２５〜２５０μｍ２、さらにより好ましくは２５〜６５μｍ２であり、および
ｃ）突起は、表面部の３〜９０％、好ましくは４〜５０％、より好ましくは５〜３０％、さらにより好ましくは５〜１０％を覆う。
【０１９８】
また、突起が１つの突起要素のみを備えるトポグラフィにおける突起の長さは、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．５〜５０μｍ、より好ましくは１〜５０μｍ、さらに好ましくは２〜４０μｍであり、突起が複数の突起要素を備えるトポグラフィにおける突起の長さは、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．１〜４５μｍ、より好ましくは０．５〜４０μｍ、さらにより好ましくは１〜３０μｍとすることができる。
【０１９９】
突起が１つの突起要素のみを備えるトポグラフィにおける突起の幅は、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．５〜５０μｍ、より好ましくは１〜５０μｍ、さらにより好ましくは２〜４０μｍであり、突起が複数の突起要素を備えるトポグラフィにおける突起の幅は、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．１〜４５μｍ、より好ましくは０．５〜４０μｍ、さらにより好ましくは１〜３０μｍとすることができる。
【０２００】
あるいは、Ｈ／Ｌ型の免疫制御インプラントは、少なくとも１つのトポグラフィを有する物として定義することができ、
ａ）谷壁の高さは、０．５〜５０μｍ、好ましくは１〜４０μｍ、より好ましくは２〜３５μｍ、より好ましくは４〜３０μｍ、さらにより好ましくは５〜２８μｍであり、
ｂ）谷壁の輪郭は、０〜４０μｍ、好ましくは０．１〜３５μｍ、より好ましくは０．５〜３０μｍ、さらにより好ましくは１〜２０μｍであり、
ｃ）谷壁セクションの長さは、０．０１〜１００μｍ、好ましくは０．１〜５０μｍ、より好ましくは１〜４０μｍ、さらにより好ましくは２〜３２μｍであり、
ｄ）谷壁のパンクチャーの長さは、０〜５０μｍ、好ましくは０．５〜４０μｍ、より好ましくは１〜３０μｍ、さらにより好ましくは２〜２５μｍであり、
ｅ）谷の平均幅は、０〜５０μｍ、好ましくは０．５〜４０μｍ、より好ましくは５〜３０μｍ、さらにより好ましくは１２．１〜２０μｍである。
【０２０１】
白血球としても知られる免疫細胞は、細菌、ウイルスおよび体内に移植された生体材料などの他の外部物体を含む異物に対して身体を防御する免疫系の細胞である。これらの細胞は、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、巨核球、好塩基球、好中球、好酸球、樹状細胞、リンパ球、マスト細胞、ナチュラルキラー細胞、異物巨細胞（ＦＢＧＣ）および他の多核細胞を含む。免疫細胞は、血液または他の組織中に見られることができ、よく知られているように、ヒトまたは動物を含む様々な出所から得られる。
【０２０２】
移植された生体材料のような異物に対する人体の（免疫）反応は、異物反応（ＦＢＲ）と呼ばれる。免疫細胞は異物反応を誘導する。異物反応は、異物の周りの線維性組織の莢膜の形成をもたらし得る。被包化として知られているこのプロセスは、異物および周囲の創傷組織に対する炎症反応の最終段階および慢性反応である。このプロセスは、身体を守り、創傷治癒プロセスを開始するために自然に起こるが、移植された生体材料に望ましくない影響をもたらし、その機能を損なう可能性がある。したがって、移植された生体材料またはｉｎ  ｖｉｖｏで用いられる材料に対する異物反応の調節は、生体材料のデザインにおいて重要な問題である。
【０２０３】
この目的のために、生体材料のデザインの変更および生体材料の物理化学的特性を含む化学レベルで主に焦点を当てたいくつかのアプローチが開発されている。ここでは、特定のトポグラフィで生体材料の表面をパターニングすることによって、その生体材料の化学的性質とは無関係に、免疫細胞の異物に対する反応を調節（刺激または下方調節）することができることが示される。
【０２０４】
上記のように、本発明の目的を達成するために任意の材料を使用することができる。
【０２０５】
免疫細胞の調節は、形態に影響を及ぼし、付着および増殖を刺激または抑制し、単核細胞の多核細胞への融合を刺激または抑制し、免疫細胞表現型を維持または変化させ（細胞の分化）、免疫細胞の機能に影響を及ぼし、免疫反応の活性化に影響を及ぼし、細胞死を刺激または防止し、細胞の遊走を制御し、およびインプラント部位での線維性莢膜の形成の調節に影響を及ぼすことを含む。
【０２０６】
例えば、適切な表面トポグラフィは、インプラント部位を取り囲む組織への血液からのマクロファージの到達を刺激または防止することによって、免疫細胞遊走を調節することができる。
【０２０７】
別の例として、トポグラフィは、異物へのマクロファージの付着を刺激し、マクロファージの融合およびＦＢＧＣの形成を誘導することができる。反対に、他の表面トポグラフィは、マクロファージの融合を妨げ、ＦＢＧＣの形成を減少させる。あるいは、マクロファージの付着は、ＦＢＧＣ形成が阻害される間、刺激され得、またはその逆もあり得る。
【０２０８】
免疫制御機構の調節は、表面に付着した免疫細胞またはインプラント部位に遊走した免疫細胞の標識、および免疫蛍光染色の実施によって追跡することができ、次いでイメージング技術によって追跡することができる。さらに、免疫細胞において発現した表面マーカーを検出するために、すなわち細胞のタイプを検出するために、ＦＡＣＳなどの他の技術を使用することができる。さらに、免疫細胞の分化および生体機能を解析するために、免疫蛍光染色、ｑＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、マイクロアレイ、組織学、電子顕微鏡画像などの技術を使用することができる。
【０２０９】
免疫反応の調節はまた、マウス、ラット、ウサギなどの様々な動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで解析することができ、移植された材料および周辺組織は、（免疫）組織学的技術（免疫蛍光染色、比色染色）、電子顕微鏡イメージング、ｑＰＣＲおよびＲＮＡ解析、サイトカイン放出の解析、機械的試験などによって解析され得る。
【０２１０】
バイオリアクター、チップ、（薬物）スクリーニングプラットフォームおよび／または生体分子（ワクチン／タンパク質／抗体）生産プラットフォームのように、フラスコ、プレート、バッグ、ペトリ皿、皿、容器などの培養器具を使用して、免疫細胞の調節は、上記で定義したようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用される。
【０２１１】
好ましい実施形態では、トポグラフィは、ポリウレタン（ＰＵ）表面に対する単球／マクロファージの応答に強い影響を及ぼす。表面トポグラフィは、マクロファージの付着に実質的に影響し得る。細胞への影響は、付着した細胞の数に制限されるのみではなく、細胞領域などの細胞の形態学的性質の変化を含む。さらに、これらの表面は、マクロファージの融合に影響を及ぼし、したがって、異物巨細胞の形成に強い影響を及ぼす。これらの効果は、選択された表面トポグラフィを特徴とするＰＵ基材上で単球を培養して１０日後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境において観察された。これらの免疫反応性トポグラフィのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの適用には、細胞の免疫反応または関連生理学を研究または解析するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養モデル、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ疾患モデルが含まれるが、これに限定されない。この早期免疫反応は、インプラント受容のために重要であり、免疫反応の後期段階でインプラントの受容を促進する。
【０２１２】
しかしながら、好ましくは、免疫反応の調節は、ｉｎ  ｖｉｖｏで適用される。バイオセンサーおよび生体電極、胸部インプラントなどの化粧用インプラント、小骨インプラントなどの骨インプラント、血管インプラント（血管人工グラフト、血管アクセス）、透析アクセス、人工内耳インプラントおよび心血管インプラントを含むがこれに限定されない任意の長期または慢性的に移植された装置には、免疫反応を調節するために、本発明のトポグラフィを設けることができる。
【０２１３】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでは、トポグラフィを特徴とするＰＵ基材が、皮下マウスモデルにおける早期および後期ＦＢＲに影響を及ぼした。異なる表面は、非常に軽いものから強いものまでの範囲のＦＢＲを誘導することができた。周辺組織への免疫細胞の浸潤（炎症活性レベルの測定）、マクロファージの存在およびＦＢＧＣの形成、インプラント周囲の線維性莢膜の形成およびインターフェースでのインプラントの被包化は、異なる表面トポグラフィの存在によって影響を受けるＦＢＲ関連パラメータのいくつかであった。
【０２１４】
ＰＵインプラント周囲の繊維状莢膜の厚さは、インプラントの表面に異なる表面トポグラフィを導入すると変化した。ＦＢＲの後期（最終）段階では、非パターン化コントロール基材およびシリコーンエラストマーコントロール材料と比較して、いくつかの表面トポグラフィは線維性莢膜の量がはるかに低く、または、異物が実際に移植されなかった創傷（疑似）と同等であるか低くさえあった。これらの表面トポグラフィは、免疫反応を明らかに低下させ、インプラントの被包化を防止し、これによりインプラントの機能性が改善され、患者の結果が改善され得る。
【０２１５】
明瞭化および簡潔な説明の目的のために、特徴は、同じまたは別個の実施形態の一部として本明細書に記載されるが、本発明の範囲は、記載される特徴の全てまたは一部の組み合わせを有する実施形態を含み得る。特に、一般的な説明の下で説明される特徴は、特定の実施形態の一部であり得る。
【０２１６】
本発明を以下の非限定的な実施例によって説明する。
【０２１７】
実施例
全ての実施例の材料および方法
サンプル製作
実施例では、金属およびポリマー基材が使用される。個々のトポグラフィを特徴とする完全金属サンプル、すなわちチタン（Ｔｉ）について、以下の手順を適用して、１０μｍの高さを有する突起を作製する。
１．アニールされたＴｉプレート（純度９９．６％）は研磨され（約０〜０．０１μｍの粗さ）、洗浄される。
２．９００ｎｍのＳｉＯｘ（プラズマ化学気相堆積、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｌａｓｍａｌａｂ  ｓｙｓｔｅｍ  ８０）、リソグラフィー（ポジティブフォトレジストＯＩＲ  ９０６−１２、Ａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｉｎｃ）およびハードベーク（Ｔ＝１２０℃、６０秒）を堆積する。
３．エッチングＳｉＯｘ層：Ｃ４Ｆ８流量２０ｓｃｃｍ、Ｈｅ流量１５０ｓｃｃｍ、ＣＨ４流量１５ｓｃｃｍ、誘導結合プラズマ（２８００Ｗ）、容量結合プラズマ（３５０Ｗ）（Ｔ＝−１０℃、２分）を用いた４．５分間の方向性反応性イオンエッチング（Ａｄｉｘｅｎ  ＡＭＳ  １００  ＳＥ）を行う。
４．Ｏｘｙｇｅｎ  ｐｌａｓｍａ（Ｔｅｐｌａ  ３００Ｅ）でフォトレジストを剥がす。
５．エッチＴｉ基材：エッチングステップ（Ｃｌ２／ＢＣｌ３／Ａｒプラズマの組み合わせ、４５秒）および酸化ステップ（Ｏ２プラズマ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｌａｓｍａｌａｂ  ｓｙｓｔｅｍ  １００、１５秒；Ｏ２流量３０ｓｃｃｍ、５００ＷのＩＣＰ、１５ＷのＣＣＰおよび３３ｍＴｏｒｒの３０圧力）を交互に行う。
【０２１８】
ポリマー基材の場合、様々な異なるトポグラフィおよび１つの個々のトポグラフィを保持する基材を含む両方の基材について、以下の手順に従う。
１．クロミウムマスクを使用したフォトリソグラフィーによって逆トポグラフィデザインを保持するシリコンウェハー（モールド）を製作する。
２．シリコンウェハーをペルフルオロデシルトリクロロシラン（ＦＯＴＳ、ＡＢＣＲ）で被覆する。
３．オプションで、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ  Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４（登録商標）、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）およびＯｒｍｏＳｔａｍｐ（Ｍｉｃｒｏ  Ｒｅｓｉｓｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＧｍｂＨ）の中間モールドにトポグラフィデザインを複製する。
４．シリコンウェハーまたは中間モールド（全てのサンプルが７８℃で脱型）を使用して、ポリマーサンプルにトポグラフィをホットエンボスする。
５．オプション：関心のある金属でスパッタコートする。
６．Ｏ２ガスプラズマ（細胞培養基材の標準処理）する。
【０２１９】
【表２】
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【０２２０】
細胞培養および解析
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実施例では、関心を有する細胞を、様々なトポグラフィと１つの個々のトポグラフィを保持する基材との間の比較を可能にするように適合された基材上で培養した。
以下の手順で行われる。
１．滅菌（７０％エタノール）および基材を湿らせる（細胞培養培地、最小２４時間）。
２．オプション：室温でインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、０．０２Ｍ酢酸、１００μｌ／ウェル、１時間の新鮮な２０μｇ／ｍｌコラーゲンＩ（ｒａｔ−ｔａｉｌ、ＶＷＲ）を用いたコラーゲンコーティングを行う。
３．目的の細胞を播種し（詳細は表３を参照）、２〜３日ごとに培地交換しながら、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。
【０２２１】
【表３】
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ＦＢＳ＝１０％ウシ胎仔血清（Ｌｏｎｚａ）、ｌ−ｇｌｕ＝２ｍＭ  ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、ＡｓＡｃ＝０．２ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ＝１００Ｕ  ｍｌ−１ペニシリンおよび１００ｇ  ｍｌ−１ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含む。
＊プロトコルは、Ｒｅｐｎｉｋ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００３；  ２７８  （１−２）：２８３−２９２．に記載されている。
【０２２２】
４．採取後、サンプルを４％パラホルムアルデヒドで固定し、細胞を蛍光標識する（詳細は表４を参照）。
【０２２３】
【表４】
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【０２２４】
５．（Ｉ）各ＴｏｐｏＵｎｉｔの画像をキャプチャした自動スライドスキャナを使用して比較トポグラフィを画像化するか、または（ＩＩ）トポグラフィを特徴とする基材のためにランダムに選択した１０枚の画像をキャプチャする。適切な培養品質（細胞数、分布）および画質の両方について得られた画像の評価を行う。
６．ＭＡＴＬＡＢスクリプトおよびＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒを使用して画像を解析する［Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ＡＥ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００６；７：Ｒ１００，Ｈｕｌｓｍａｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ  ２０１５；５（１５）：２９，Ｕｎａｄｋａｔ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ  ２０１１，１０８：１６５６５］（解析パラメータの詳細は表５を参照）。
【０２２５】
【表５】
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【０２２６】
７．様々な方法を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検証および二次スクリーニング
マラリア感染（実施例２）：２日目に５００００個のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  Ｃｙｎｏｍｏｌｇｉスポロゾイト／ウェル（１３０μｌ中）を添加し、Ｐ．スポロゾイトを視覚化するための標識の間にＨＳＰ７０（Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０）を含める。感染細胞の数を手動で数量化し、感染効率（感染細胞数／細胞総数）を計算する。
ｑＰＣＲ（実施例３−４）：Ｔｒｉｓｏｌプロトコルを用いてｍＲＮＡを単離し、すなわちＴｒｉｓｏｌ中で細胞を溶解し、ｍＲＮＡを含む溶解物を精製する。２つの複製の溶解物をプールし、プールあたり３つの測定を行う（６つの生物学的複製）。特定の遺伝子のために、メーカーのプロトコルに従ってｉＳｃｒｉｐｔ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて単離したＲＮＡをｃＤＮＡに合成し、Ｓｙｂｒ  ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびプライマー（Ｓｉｇｍａ）を用いて定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のために水で希釈した（表６）。遺伝子発現をハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨレベル（ΔＣＴ法）に標準化し、その後、３日目にコラーゲンサンドイッチにおける同じマーカーのレベルに標準化して、ｆｏｌｄ誘導を示した（ΔΔＣＴ法）。
【０２２７】
【表６】
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【０２２８】
８．種々の動物モデルを用いたｉｎ  ｖｉｖｏでの検証
【０２２９】
骨軟骨統合の確認のためのウサギ大腿骨モデル（実施例５）
完全なチタントポグラフィ特徴サンプル（コイン型、直径６．２５ｍｍ、厚さ１．９５ｍｍ）をコントロールとともに、２４匹の雌のニュージーランドホワイトウサギに移植し、新しい骨形成およびオッセオインテグレーションを評価した。サンプルをまずアセトン中で１時間、ＩＰＡ中で１時間超音波洗浄し、オートクレーブを用いて滅菌した。動物研究の手順は地方倫理委員会によって承認された。
【０２３０】
移植は、全身麻酔および無菌条件下で実施した。ペントバルビタールナトリウム（３．０ｍｇ／ｋｇ体重）の静脈内適用による鎮静の後、動物は手術部位を剃毛され、ヨウ素および７０％エタノール（ＥｔＯＨ）で滅菌した。大腿骨の近位部分では、下にある骨膜が露出するまで、また骨膜にまで５ｃｍの切れ目を入れた。骨膜を表面から除去した。２つの孔を開け、インプラントを孔に入れ、メッシュプレートによって所定の位置に保持した。皮下層を再配置し、４−０の絹縫合糸で縫合した。動物を４週間または８週間後に犠牲にし、移植した大腿骨を除去した。次いで、外植されたサンプルを１０％中性緩衝ホルマリン中に固定し、さらなる解析／特徴付けのために７０％ＥｔＯＨで維持した。
【０２３１】
解析は以下のように行われた。（１）メカニカルプルベンチを用いたプルアウト引っ張り試験：１ｍｍ／分の速度でサンプルに引っ張り力を加え、適用された全ての力を記録しながらインプラントを骨から分離し、および（２）組織学：固定したサンプルをエタノール系列で脱水し、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）に埋め込んだ。組織学的切片を作製し、１％メチレンブルーおよび０．３％ベーシックフクシン溶液で染色した。１サンプル当たり３切片をスキャンし、骨−インプラント接触率（％ＢＩＣ）を測定した（間隙または繊維組織のないインプラントへの直接的な骨接触を伴う全ての領域として定義）。
【０２３２】
免疫調節を確認するためのマウス皮下モデル（実施例７）
マウスの免疫反応を評価するために、コントロールと共に、ポリウレタン（ＰＵ）インプラントを６４匹の雌マウス（Ｈａｒｌａｎ、約９ヶ月齢、１８〜２０ｇ、条件ごとに同一の２つのインプラントを４匹のマウス（ｎ＝８））に移植した。非パターン化（ＮＰ）インプラント、空傷（疑似群）およびシリコンエラストマーコントロール（ＳＥ、直径２．５ｍｍおよび厚さ０．６ｍｍの二等分したカテーテル、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ）をコントロールとして含めた。この研究はオランダの法律によって適切かつ倫理的に認可されたプロトコルのもとで行われた。
【０２３３】
移植は、全身麻酔および無菌条件下で実施した。層流キャビネット中の酸素中２％イソフルラン（Ｐｈａｒｍａｃｈｅｍｉｅ）による鎮静後、疼痛制御のために外科手術の１５分前にブプレノルフィン（Ｔｅｍｇｅｓｉｃ、ＲＢ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、０．０５ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射を行い、マウスの背中を剃毛し、７０％エタノールで消毒した。マウスの背中の両側において、０．４ｃｍの切れ目を脊椎の側面１ｃｍに作製した。次いで、１ｃｍの長さのインプラントを、滅菌ピンセットを用い、最小限の組織損傷で皮下に配置した。切れ目を閉じた。疑似群およびＳＥコントロールも同様に移植した。外科手術後、マウスを創傷が治癒するまで個々に収容した。次いで、試験の終了までマウスをペアにして収容した。試験の９日後または６０日後に、それぞれ早期および後期の免疫反応を示し、マウスを倫理的に承認されたプロトコルに従って犠牲にし、サンプルを皮下組織および結合皮膚と一緒に採取した。各生検の半分を４％パラホルムアルデヒド、続いてメチルメタクリレート／ブチルメタクリレート（ＭＭＡ／ＭＢＡ、Ｍｅｒｃｋ）で固定し、３μｍセクションをカットし、アセトンで脱プラズマ化し、脱塩水で洗浄した。生検ごとに、３つの連続セクションをヘマトキシレンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）またはＦ４／８０で染色した。
【０２３４】
Ｈ＆Ｅ染色（核および細胞質染色のため）は、スライドをヘマトキシリン中で５分間インキュベートし、続いて水で５分間洗浄し、エオシンで対比染色し再度洗浄する必要がある。次に、スライドをエタノールおよびキシレン中で脱水のためにインキュベートし、Ｖｅｃｔａｍｏｕｎｔ（ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）を用いてカバースリップ上に載せた。
【０２３５】
ＰＳＲ（コラーゲンおよびコラーゲンに富む組織を視覚化するため）では、スライドをＰＳＲ溶液（Ｋｌｉｎｉｐａｔｈ）中で２０分間インキュベートし、０．１Ｎ  ＨＣｌで洗浄し、エタノールおよびキシレンで脱水する必要がある。スライドは上記のように実装された。
【０２３６】
Ｆ４／８０（マクロファージ集団のタンパク質マーカー）は、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノール中、暗所で２０分間インキュベートし、水で洗浄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．９％ＮａＣｌ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中でインキュベートし、再度洗浄され、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｋｌｉｎｉｐａｔｈ）を用いて１０分間インキュベートし、次いでラット抗マウスモノクローナルＦ４／８０抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＴＢＳ中で１：１０００）を用いて一晩インキュベートし、ウサギ抗ラットｉｇＧ抗体（ＳＢＡ／ＩＴＫ、ＴＢＳ中で１：３０００および２０％正常マウス血清）を用いて３０分間インキュベートし、ＢｒｉｇｈｔＶｉｓｉｏｎ抗ウサギＡＰ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ）で３０分間、および最後にベクターブルー（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）で１０分間洗浄した。次いで、スライドをＴＢＳ、次いで水道水で洗浄し、ヘマトキシリンで１分間染色し、再度水道水で洗浄した。乾燥後、スライドを取り付け、スキャンし、画像化および解析した（デジタル病理ソフトウェア、ＩｎｔｅｌｌｉＳｉｔｅ、Ｐｈｉｌｉｐｓ）。
【０２３７】
免疫細胞の浸潤、ＦＢＧＣの形成、インプラントの被包化およびインプラント周囲の線維組織の形成について、スライドを０〜３（０＝なし、１＝軽度、２＝中程度および３＝重度）とスコア付けした。インプラント周囲の繊維結合組織の厚さを、インプラント周囲の６つのランダムな部位で測定した。繊維層の厚さのスコアリングおよび測定は、別々に２人で目隠しをして行った。
【０２３８】
実施例１：培養中に原生アカゲザル由来の肝細胞を維持するための表面トポグラフィ
表７は、培養中の肝細胞（Ｈ１−１０）の機能性を維持および増加させることができるトポグラフィを示し、幾何学的形状およびポリスチレンにしたときの解析パラメータの性能を示す。コントロールとして、非パターン化（ＮＰ）基材（ポリスチレンも含む）およびより「基本的な」デザインのトポグラフィ（三角形、Ｂ１−２）の選択が含まれる。低い細胞数は、低い付着および／または低い細胞生存を示すが、高い細胞数（＞６０）は、これらの細胞が適切な肝細胞形態および表現型を発現しないため、望ましくない。したがって、中程度の数の細胞レベルが、特に適切な表面被覆率および細胞形態（ヒットトポグラフィの選択時に目視により判断される）と組み合わされた場合、最良の性能（４０〜６０）を示す。
【０２３９】
トポグラフィＨ１〜Ｈ１０は、細胞数が２９〜３６％の細胞の覆いを伴う結合した中程度の付着細胞数（４４〜６０）を有する。対照的に、ＮＰ基材は、より低い細胞被覆率（２７％）と組み合わせて、ローエンド（４４）に向かって傾いて付着した中程度の細胞数を有する。しかし、ＮＰ基材上で最も顕著なのは、乏しい細胞形態および表現型の喪失であり、これは培養時間を長くした後の乏しい結果に相関がある（図２ｃ、培養３１日目の画像参照）。基本的なトポグラフィは、低い細胞被覆を伴う少ない細胞数（適切な肝細胞培養が維持できない）または多い細胞数および／または細胞被覆（非機能性および非表現型肝細胞でさえ）のいずれかを生じる。Ｂ１は、３６％の突起被覆率（８〜３５％の最高性能トポグラフィの範囲を超える）で、平均細胞被覆率（３５％）の多い細胞数（７３）をもたらし、これらの細胞は小さく、ウェル拡散および適切な形態を提示せず、それをもって表現型および機能性を有しない。Ｂ２は、７％の突起被覆率（最良性能のトポグラフィの範囲未満）で、低い細胞被覆率（２２％）で少ない細胞数（３５）をもたらし、適切な肝細胞培養を示さない。
【０２４０】
トポグラフィの検証
検証により、肝細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養をサポートする際のトポグラフィの有効性が確認された。通常の組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）は肝細胞を５日未満、コラーゲンコーティングしたＴＣＰＳでは１０〜１４日までサポートするが、最高性能のトポグラフィ（コラーゲンコーティングの有無にかかわらず）は肝細胞を最大３１日間サポートする。
【０２４１】
全部で１０のトポグラフィは、肝細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養を強く促進する。トポグラフィを特徴とする基材は、非パターン化コントロール表面（図２ａ）と比較して、培養の３１日後に表面に２〜６倍の細胞が付着し、ＣＤ８１陽性であり、したがって肝細胞であることが確認された。また、細胞は、非パターン化コントロール表面と比較して、トポグラフィを特徴とする表面の２〜５倍の表面領域をカバーする（図２ｂ）。最後に、トポグラフィを特徴とする基材上で培養された肝細胞は、非パターン化コントロール基材に見られる肝細胞の形態を強く制御し（図２ｃ）、肝臓における肝細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ（天然の）組織および形態（Ｈ３、図２ｄ）に非常によく似た形態を有する。
【０２４２】
トポグラフィの二次スクリーニング
実験１における最高性能を有するトポグラフィ（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８）をさらに検証した。３１日の検証に加えて、最大８日目の培養を現在の標準と比較するために、８日目も含めた。また、サンプルの一部はマラリア原虫に感染させ、肝細胞機能を証明した（マラリア原虫は機能性肝細胞のみに感染することができる）。
【０２４３】
再度、多い細胞数、高い細胞被覆（図３ａ、ｂ、ｄおよびｅ）並びにＣＤ８１の適切な発現を示すスクリーニングおよび検証結果が確認された。
【０２４４】
トポグラフィを特徴とする基材に対する感染効率は、８日目に０．５％まで、そして３１日目には０．１５％（図３ｃ、ｆ）まで上昇した。これらの感染レベルは、非パターン化コラーゲンコート表面（８日目）を用いた標準レベルと一致する。３１日目のレベルは、非パターン化（コラーゲンコーティング）した表面で１０〜１４日を超えて肝細胞を培養することができないため、比較することができない。しかし、３１日目にマラリア原虫のスポロゾイトがまだ検出されているという事実は前例のないものであり、抗マラリア薬の研究開発に大きなチャンスをもたらすトポグラフィの唯一の利点である。
【０２４５】
結論
同定された表面トポグラフィは、コラーゲン、肝細胞付着を必要とすることなく促進し、マラリア原虫の存在下でさえ、肝細胞表現型を発現しながら、それらのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養を３１日間サポートする。非常に対照的に、現在の標準的な方法は、最大８〜１１日間のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養のみを可能にし、コラーゲンを必要とする。培養中の肝細胞をサポートする最良の表面トポグラフィは、２０〜２５０μｍ２の頂部表面領域の面積、８〜３５％の表面被覆率および３〜２５μｍの突起間の平均距離を有する突起を有する。
【０２４６】
実施例２：培養中に初代ヒト由来肝細胞を維持するための表面トポグラフィ
コラーゲンコーティングの有無にかかわらず、トポグラフィは、初代ヒト由来肝細胞（ＰＨＨ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養の延長をサポートするために検証された。肝細胞をコラーゲンの２つの層の間で培養するゴールドスタンダード「コラーゲンサンドイッチ」（ＣＳ）は、コントロールとしてベンチマーク（１４日まで）および非パターン化（ＮＰ）表面として含まれる。
【０２４７】
結果
全てのトポグラフィを特徴とする基材は、コラーゲンの有無にかかわらず、非パターン化コントロールおよび両方の時点で優れていた。１４日目（図４ａ、ｂ）および３０日目（図４ｃ、ｄ）の両方において、細胞の総数および表面の被覆率は、ＣＳ（１４日目のみ）および非パターン化コントロールよりもトポグラフィを特徴とする基材でより高く、さらに３０日目には有意に大きくなった。しかし、最も顕著な影響は細胞形態において見られた。特定のトポグラフィでは、細胞は天然の（ｉｎ  ｖｉｖｏ）肝臓組織および形態とは明らかに類似していたが、他のトポグラフィおよび非パターン化コントロールでは、細胞はそのような組織および細胞形状を示さなかった。コラーゲンでトポグラフィ特徴表面をコーティングしても、結果にはほとんど影響しなかった。
【０２４８】
結論
本発明のトポグラフィは、ＰＨＨの適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養を１ヶ月延長するための優れた性能を示したが、現在のゴールドスタンダードＣＳは最大２週間しか使用できず、実際には８日間のみしか使用することができない。肝細胞培養をサポートするために最も優れた表面トポグラフィは、２０〜２５０μｍ２の頂部表面領域の面積、８〜３５％の表面被覆率および３〜２５μｍの突起間の平均距離を有する突起を有する。
【０２４９】
実施例３：初代ヒト由来肝細胞を機能的に維持するための表面トポグラフィ
実施例１〜２の最も有望なトポグラフィ（Ｈ３、Ｈ４およびＨ８、コラーゲンコーティングの有無）は、２週間のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養中に機能性を示すＰＨＨ肝細胞特異的表現型の発現について解析される。ＣＳおよびＮＰ表面はコントロールとして含まれる。１４日目のトポグラフィ特徴表面上の遺伝子発現レベル（全てＣＳの３日目のレベルで標準化された）を１４日目および３日目のＣＳレベルと比較する。
【０２５０】
結果
ＨＮＦ４α（図５ａ、肝細胞特異的タンパク質の転写および肝細胞機能の調節を含む）は、コラーゲンコーティングを有する全てのトポグラフィを特徴とする基材において、１４日目のＣＳと比較して、さらに３日目のＣＳのレベルでさえも高く発現する。
【０２５１】
アルブミン（図５ｂ、肝細胞代謝の指標）は、長期のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養において代謝関連表現型を維持し、おそらくさらに促進するための表面トポグラフィの効率を露わにし、両方の時点でＣＳと比較して、コラーゲンコーティングの有無にかかわらず、トポグラフィを特徴とする基材において、実質的により高く発現した（４倍以上）。
【０２５２】
Ｃｙｐ３Ａ４（図５ｃ、重要な解毒マーカー）は、コラーゲンの有無にかかわらず、これらの表面トポグラフィを適用することによるこの機能関連表現型の改善を示す両方の時点でのＣＳと比較して、トポグラフィを特徴とする全基材において非常に高く発現した（４倍まで）。
【０２５３】
トポグラフィを特徴とする表面上の他のＣｙｐマーカー（解毒に関与するＣｙｐ２Ｂ６、Ｃｙｐ１Ａ２、Ｃｙｐ２Ｃ９）の発現は、（Ｃｙｐ２Ｂ６およびＣｙｐ１Ａ２）よりも高い、またはＣＳ（Ｃｙｐ２Ｃ９）と類似していた（１４日目）。
【０２５４】
ＣＤ８１およびＥ−カドヘリン（細胞付着、タイトジャンクションの形成および細胞間伝達に関与）について、トポグラフィを特徴とする表面での発現レベルはＣＳに匹敵し、１４日目のＮＰと比較してより高かった。
【０２５５】
結論
トポグラフィは、早期の時点での現在のゴールドスタンダードに匹敵し、長期間にわたって肝細胞表現型を維持することができた。いくつかの場合において、機能性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養の１４日間でさえ増加した。肝細胞培養をサポートする最良の表面トポグラフィは、２０〜２５０μｍ２の頂部表面領域の面積、８〜３５％の表面被覆率および３〜２５μｍの突起間の平均距離を有する突起を有する。
【０２５６】
実施例４：長期培養で初代ヒト由来肝細胞を機能的に維持するための表面トポグラフィ
コラーゲンの有無にかかわらず、実施例１〜３の最も有望なトポグラフィ（Ｈ３）を、２４日間の培養期間中にその表現型を維持するかまたは回復するＰＨＨに対するその効果について解析する。解析された遺伝子は、実施例３と同様であった。ＣＳ（最大１４日）およびＮＰコントロールが含まれる。
【０２５７】
結果
Ｈ３表面では、コラーゲンコーティングの有無にかかわらず、全ての解析された遺伝子（図６）は、細胞が正常な肝細胞の状態に回復する必要がある時間であると見なされる３日目のレベルと比較して、全ての時点（８〜２４日目）で実質的により高く発現した。対照的に、ＣＳ中の全てのバイオマーカーの発現は、３日目と同じレベルで維持されるか、または時間とともに（最大１４日間）、（非常に）低レベルに減少する。２４日目にＨ３表面をＣＳと直接比較すると、８日目（ゴールドスタンダード）、３日目でさえ、全ての遺伝子がＣＳよりもＨ３上で依然として類似またはより（非常に）高いレベルで発現した。
【０２５８】
結論
表面形状Ｈ３を特徴とするＰＳ基材は、現在のゴールドスタンダードと比較して肝細胞表現型および機能性を維持することができただけでなく、代謝活性、シグナル伝達、タンパク質分泌および解毒を含むこれらの機能をさらに促進し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養を少なくとも２４日に延長することを可能にする（現在のゴールドスタンダードの８日間と比較して）。肝細胞培養をサポートする上で最良の性能を示す表面トポグラフィは、２０〜２５０μｍ２の頂部表面領域の面積、８〜３５％の表面被覆率および３〜２５μｍの突起間の平均距離を有する突起を有する。
【０２５９】
【表７−１】
2019513409.tif 000010
【０２６０】
【表７−２】
2019513409.tif 000011
【０２６１】
実施例５：骨／歯科インプラントのオッセオインテグレーションおよび固定を促進するための表面トポグラフィ
様々な異なるトポグラフィを備えるチタンコートチップが整形外科および歯科インプラントの骨への固定化および骨固定を改善する目的で、新しい骨形成を刺激するためにヒト間葉系間質細胞（ｈＭＳＣ）の骨形成分化を改善する表面トポグラフィを研究するために使用された。ｈＭＳＣが骨形成系統に分化して新たな骨を形成するとき、それらは骨形成マーカーＡＬＰを発現し、したがってマーカーとして使用された。
【０２６２】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのトポグラフィの検証
表５に記載されたパラメータの組み合わせに従ってＡＬＰ発現を刺激したトポグラフィをヒットトポグラフィとして選択した（表８、Ｏ１〜Ｏ１０）。トポグラフィＯ１〜１０でのＡＬＰ発現は、積分ＡＬＰ強度（ｉＡＬＰ）が約６００〜１０００を超え、相対積分ＡＬＰ強度（ｒｉＡＬＰ）が３６〜５８に及ぶ範囲にある。非常に対照的に、非パターン化（ＮＰ）コントロール基材は１４（ｉＡＬＰ）および２１２（ｒｉＡＬＰ）、基本的なトポグラフィ（三角形および長方形、Ｂ３〜５）は１４〜１９（ｉＡＬＰ）およびほぼ３５０〜５００以上（ｒｉＡＬＰ）の値である。これらの基本的なトポグラフィは、最良の性能を有するトポグラフィ（４〜２５％ｖｓ３０〜６５％）の範囲をはるかに下回る突起表面被覆率を有し、また、突起頂部表面領域は、最高の性能を有するトポグラフィ（２５〜２９μｍ２ｖｓ３０〜７５０μｍ２）よりも低い範囲である。このデータは、ＡＬＰ発現および骨形成を刺激する際の表面トポグラフィＯ１〜Ｏ１０の優位性を示す。
【０２６３】
タンパク質発現（ＦＡＣＳ）、遺伝子発現（ｑＰＣＲ）および石灰化（テトラサイクリン染色）を含む周知のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの技術を用いたヒット表面の検証は、ヒットトポグラフィの有効性およびＮＰ表面と比較した優れた性能を裏付けた。
【０２６４】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでのトポグラフィの検証
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験での最良の性能を有するトポグラフィは、フルボディチタン内に製造され、ウサギ大腿骨モデルにｉｎ  ｖｉｖｏで移植され、４および８週間でオッセオインテグレーション能力を評価した。比較のためにＮＰコントロールをこの研究に含めた。
【０２６５】
機械的および組織学的解析（図７）の両方が、トポグラフィを特徴とするインプラントは新しい骨組織の形成を刺激することを明らかにした。引き抜き試験（図８ａ）は、ＮＰコントロールが４週間および８週間後に最も低いレベルのオッセオインテグレーションを有することを示している。４週間で、ヒットトポグラフィの１つを特徴とする全てのインプラントは、ＮＰコントロールの引き抜き力の２〜４倍を必要とし、１つのヒットトポグラフィを特徴とするインプラントは、ＮＰコントロールの引き抜き力の５倍以上を必要とする。８週間で、ＮＰコントロールは、４週間で最良のスコアリングトポグラフィと比較すると、引き離すのに必要な力は依然として、より少ない。ヒットトポグラフィを特徴とするインプラントは、ＮＰコントロールの約２倍の力を必要とし、１つのトポグラフィは３倍以上の力を必要とする。
【０２６６】
組織学的骨インプラント（ＢＩＣ）接触解析（図８ｂ）は、ＮＰコントロールが４週間および８週間の両方で約１０％の低いＢＩＣを有することを示している。トポグラフィを特徴とするインプラントは、動物間での変動が高いが、両方の時点でＢＩＣがはるかに高いことを示している。結果は、８週間のインプラントを特徴とするヒットトポグラフィについて、最大８０％のＢＩＣを示す。
【０２６７】
これらの結果は、関連するｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいてオッセオインテグレーションを誘導するヒットトポグラフィの有効性の実証を提供する。
【０２６８】
結論
同定されたトポグラフィは、非パターン化コントロールインプラントと比較して、高度に強化されたオッセオインテグレーション特性を有する。結果はさらに、規則的なパターンの突起／谷を有する本発明のトポグラフィが、ランダムに粗面化された表面を有する臨床的に適用されたベンチマークよりも良好なオッセオインテグレーションを提供することを示す。したがって、本発明のトポグラフィは、公知のインプラントと比較して、増大した固定および増加した骨形成を示す。
【０２６９】
骨形成を刺激する最良の表面トポグラフィは、３０〜７５０μｍ２、好ましくは１５０〜４５０μｍ２の頂部表面領域の面積、３０〜６５％、好ましくは３５〜６０％の表面被覆率、および２〜２５μｍ、好ましくは５〜１５μｍの突起間の平均距離を有する突起を有する突起を有する。
【０２７０】
【表８−１】
2019513409.tif 000012
【０２７１】
【表８−２】
2019513409.tif 000013
【０２７２】
実施例６：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫反応を調節するための表面トポグラフィ
免疫細胞の生体材料への応答を調節する表面トポグラフィは、ポリウレタンから作られたトポグラフィを用いて識別された。身体に生体材料を移植すると、身体が生体材料を取り囲む負傷した組織を治癒し、異種生体材料を除去／分離しようとする免疫反応が誘発される。この反応は異物反応（ＦＢＲ）と呼ばれる。第１に、急性反応は生体材料の受容にとって重要であるが、インプラント周囲の線維性莢膜の過剰形成を含む慢性炎症過程に繋がる可能性がある。したがって、我々は、ＦＢＲ、および特に異物巨細胞（ＦＢＧＣ、多核細胞）の関連する形成をマーカーとして使用する。
【０２７３】
ＦＢＲを調節する能力を有する表面トポグラフィを選択し、スケールアップした基材（２ｃｍ２表面積）に埋め込み、１ドナーを用いて検証した。
【０２７４】
２人のドナーによる二次スクリーニングは、免疫反応の短い段階のためのｉｎ  ｖｉｖｏでの環境をよりよく模倣するために、単離の間にフィコール勾配を排除することにより、単核細胞（単球を含む）のより複雑な混合集団を含む。非パターン化（ＮＰ）基材をコントロールとして含めた。
【０２７５】
トポグラフィのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検証
表５に記載されたパラメータの組み合わせによって評価された、マクロファージの付着およびＦＢＧＣへの融合に最も強く影響するトポグラフィは、ヒットトポグラフィとして選択された（表９、Ｉ１〜１３）。トポグラフィはｉｎ  ｖｉｔｒｏでマクロファージの付着および融合を刺激および抑制することができる。刺激トポグラフィ（Ｉ１〜４）は、多数の多核（１２〜１６）の多数のマクロファージ（１２〜１５）を抑制し、トポグラフィ（Ｉ５〜１３）の抑制はマクロファージ付着の低さ（３〜６）および多核形成の少なさ（４〜５）につながる。対照的に、Ｂ６および基本的なトポグラフィ（円および三角形、Ｂ６−７）は、マクロファージ付着（ＮＰ：６、Ｂ６−７：８−１０）および多核形成（ＮＰ：５、Ｂ６−７：Ｂ７−１０）の両方に適度の影響を誘発し、免疫反応を制御することはできない。Ｂ６は、最良の性能を有するトポグラフィの３つのグループ全てで（１９μｍ２ｖｓ２０μｍ２以上）の範囲を下回る突起頂部表面領域の面積を有するが、Ｂ７は、３つのグループの最良の性能を有するトポグラフィの３つのグループの全てで（１３％ｖｓ１５〜２５％のＨ／Ｈ、５〜１０％のＨ／Ｌおよび２６〜５０％のＬ／Ｌ）の範囲外の表面被覆率を有する。
【０２７６】
これらの表面トポグラフィの検証は、免疫反応を大きく調節するためのトポグラフィの有効性を裏付けるものである。説明のために、図９は、ＮＰ表面と比較して、トポグラフィを特徴とする表面（Ｉ１およびＩ５）上でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマクロファージ付着およびＦＢＧＣ形成の早期段階を示し、Ｉ５表面はマクロファージの付着および融合が低く、一方、表面Ｉ１はマクロファージの付着およびＦＢＧＣ形成が強く、強いＦＢＲを示す。ＮＰはマクロファージと比較して付着細胞の数が少ないが、いくつかの多核細胞が形成される。
【０２７７】
二次検証は、トポグラフィがｉｎ  ｖｉｔｒｏでの早期段階でマクロファージ付着およびＦＢＧＣ形成に強く影響することを明らかにしている（図１０）。低付着トポグラフィ対高付着トポグラフィのマクロファージ付着の差は最大５倍、およびＮＰ表面に対する低付着トポグラフィとの比較では最大１．５倍であった。いくつかのトポグラフィではさらに減少しているが、低付着トポグラフィ対高付着トポグラフィでのＦＢＧＣ形成はさらに大きく減少し、ＮＰ表面に対する低付着トポグラフィとの比較では最大２倍である。この効果はまた、細胞当たりの核の平均数が、高付着対低付着トポグラフィで有意に高いことを意味する。ＮＰ表面を、低付着トポグラフィを特徴とする表面と比較すると、マクロファージの付着自体に影響を及ぼす以外に、ＦＢＧＣ形成および１つの大きな細胞と融合する細胞の数が有意に減少することが際立っている。
【０２７８】
結論
同定されたトポグラフィは、マクロファージの付着およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの条件下でのＦＢＧＣへのそれらの融合を介して、早期段階の免疫制御機構を操作することにおいて大いに成功している。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマクロファージおよび／またはＦＢＧＣ形成の早期段階での高い付着を刺激する表面トポグラフィは、最終段階での影響に関して２つの群に分けられ、Ｉ２およびＩ４は最終段階の免疫反応を刺激し、この群は２０〜７０μｍ２の頂部表面領域の面積、１５〜２５％の表面被覆率および５〜１２μｍの突起間の平均距離を有する突起を有する群、Ｉ１およびＩ３は最終段階の免疫反応を低下させ、この群は２５〜６５μｍ２の頂部表面領域の面積、５〜１０％の表面被覆率および１２．１〜２０μｍの突起間の平均距離を有する突起を有する群である。一方、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの早期段階でマクロファージおよびＦＢＧＣ形成の低い付着を誘導し（Ｉ５〜Ｉ１３）、最終段階の免疫反応を低下させる表面トポグラフィは、２５〜２００μｍ２の頂部表面領域の面積、２６〜５０％の表面被覆率および２〜１２μｍの突起間の平均距離を有する突起を有する。トポグラフィの３つのグループ全ては、早期段階と後期段階の両方で免疫制御機構に影響を及ぼし、免疫反応を下方調節または刺激すべき最終用途に応じて使用することができる。
【０２７９】
【表９−１】
2019513409.tif 000014
【０２８０】
【表９−２】
2019513409.tif 000015
【０２８１】
【表９−３】
2019513409.tif 000016
【０２８２】
実施例７：免疫反応を調節するためのｉｎ  ｖｉｖｏでの表面トポグラフィ
免疫反応を調節するために選択された表面トポグラフィのｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を評価するために、これらのトポグラフィを特徴とするインプラントを皮下マウスモデルに入れた。
【０２８３】
結果
表面トポグラフィは、コントロールと比較して、両方の時点（図１１）でのマウスの免疫系反応に実質的に影響を及ぼした。
【０２８４】
疑似条件（異物が移植されておらず、処置自体にのみ反応する）は、一般的に、予想されるように、全ての他の状態と比較して、早期段階（９ｄ）および後期段階（６０ｄ）の両方において最も軽い免疫反応を有する。ＳＥ基準物質は、他の移植されたサンプルと比較して、より強い免疫反応を示し、９日目に、他のインプラントと比較して、ほとんどが既にハイエンドにあるが、特に６０日目に、より多くの免疫反応活性および線維形成があり、その結果、インプラント周囲の結合組織のはるかに厚い層が形成される。この結果は、シリコンエラストマーがよく知られている「正常な」炎症反応のために含まれているとして予想される。慢性移植および良好な生体適合性のためにデザインされた非パターン化ＰＵインプラントに対する免疫反応は、最初はより軽度なものから緩やかなものまであり、適度の免疫活性および線維性莢膜形成を生じる（９ｄ）。一般に、ＳＥ基準物質よりも低いが、時間の経過におけるＮＰインプラントに対する反応は、ＳＥコントロールグループに対する反応と最も類似している。
【０２８５】
表面トポグラフィＩ１（Ｈ／Ｌ型）を特徴とするＰＵインプラントに対する免疫反応は、軽度な反応として開始し、ＮＰと比較してわずかに低下するが、６０日で免疫反応は非常に軽度である。Ｉｎ  ｖｉｖｏでの早期段階の結果は、早期段階のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのモデル（実施例６）における比較的高いマクロファージの付着およびＦＢＧＣ形成と一致する。最終段階で最も低い免疫活性レベルの１つを示すこのトポグラフィの現象は、非常に興味深く、まだ完全には理解されていないが、最初の急性反応が適切および制御されていることに関連すると仮定される。最終段階におけるこのトポグラフィ上のＦＢＧＣ形成および線維形成は、低い免疫活性および細い線維性莢膜形成の場合と同様に、非常に当然（非常に小さな変動）かつ軽度な結果である。
【０２８６】
トポグラフィＩ２（Ｈ／Ｈ型）は、Ｉ１に匹敵する早期段階で、両方の時点で適度なものから重度までの免疫反応を誘導したが、この時点ではこのレベルに留まった。トポグラフィＩ５（Ｌ／Ｌ型）も、早期段階で適度なものから重度までの免疫反応を有し、後期段階では軽度になるが、他のトポグラフィと比較して、莢膜はより厚い。
【０２８７】
トポグラフィＩ６（タイプＬ／Ｌ）は、表面トポグラフィ、ＮＰおよびＳＥグループを有する生体材料と比較して、最も軽度のＦＢＲを示す。この反応は、擬似群に最も近いが、最も薄い線維性の莢膜に至る後の段階で、軽度から適度までの反応として開始し、その反応を続ける。トポグラフィＩ７（Ｌ／Ｌ型）は、９日目に最初に同様の軽度から適度までのＦＢＲを示すが、後の時点でＦＢＲはより適度である。
【０２８８】
形成された結合組織に基づく全てのインプラントを比較すると、初期（９ｄ）トポグラフィＩ６およびＩ７は、実施例６に示されたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果の早期段階と一致する最も薄い線維性莢膜を誘導する。ＦＢＲの最終段階では、表面トポグラフィＩ１およびＩ６は、他の表面トポグラフィおよびＮＰコントロールと比較して、擬似コントロールよりもさらに低く、線維性被包化を最小限に誘導する。
【０２８９】
結論
表面トポグラフィは、早期段階（急性期）および後期段階（慢性期）の両方の段階で、異物（免疫）反応を調節することができる。トポグラフィ特徴インプラントに対するＦＢＲは、非常に軽度なものから重度なものまで様々であり、炎症反応および線維性莢膜の形成およびその厚さに影響を及ぼす。本発明の表面トポグラフィは、早期段階の低い免疫反応および後期段階での低い免疫反応を可能にし、後期段階でのＦＢＲ（２ヶ月）での線維性被包化を減少させ、これらの表面は２５〜２００μｍ２の頂部表面領域の面積、２６〜５０％の表面被覆率および２〜１２μｍの突起間の平均距離を有する突起を有していた。さらに、本発明の表面トポグラフィは、早期段階で高い免疫反応および後期段階での高い免疫反応を可能にし、後期段階でのＦＢＲ（２ヶ月）での制御された線維性被包化の刺激につながり、これらの表面は２０〜７０μｍ２の頂部表面領域の面積、１５〜２５％の表面被覆率および５〜１２μｍの突起間の平均距離を有する突起を有していた。さらに、本発明の表面トポグラフィは、早期段階で高く、および後期段階で低い免疫反応を可能にし、後期段階でのＦＢＲ（２ヶ月）での線維性被包化を減少させ、これらの表面は２５〜６５μｍ２の頂部表面領域の面積、５〜１０％の表面被覆率および１２．１〜２０μｍの突起間の平均距離を有する突起を有していた。
【０２９０】
（付記）
（付記１）
物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節することができる１つまたは複数のトポグラフィを有する表面部を備える物であって、前記トポグラフィは規則的なパターンの突起を有する表面を備え、前記突起は１つまたは複数の突起要素を含み、前記突起要素は、頂部表面領域を有する前記表面の上に隆起した表面部分および前記頂部表面領域を前記表面と接続する周囲側面として定義され、前記各突起要素は前記表面の上で０．５〜５０μｍの最大高さを有し、
ａ）隣接する前記突起間の平均距離が０〜５０μｍであり、
ｂ）前記突起の前記頂部表面領域の面積が１〜６０００μｍ２であり、および、
ｃ）前記突起が前記表面の３〜９０％を覆う、
物。
【０２９１】
（付記２）
ａ）前記突起が１つの突起要素を有する場合、
前記表面に対して平行な前記頂部表面領域の周囲内で最も長い直線フィッティングの長さとして定義される前記突起の長さは、０．０１〜１００μｍであり、
前記長さに対して垂直であって、前記表面に対して平行な前記頂部表面領域の前記周囲内で最も長い直線フィッティングの長さとして定義される前記突起の幅は、０．０１〜１００μｍであり、
ｂ）前記突起が複数の突起要素を有する場合、
前記表面に対して平行な前記頂部表面領域の前記周囲内で最も長い直線フィッティングの長さとして定義される各突起要素の長さは、０．０１〜１００μｍであり、
前記長さに対して垂直であって、前記表面に対して平行な前記頂部表面領域の前記周囲内で最も長い直線フィッティングの長さとして定義される各突起要素の幅は、０．０１〜１００μｍであり、
ｃ）同じ突起の隣接する突起要素の２つの周囲間の平均距離は、０〜５０μｍである、
付記１に記載の物。
【０２９２】
（付記３）
前記表面部は、金属材料、高分子材料、複合材料またはセラミック材料を含む、
付記１または２に記載の物。
【０２９３】
（付記４）
突起の前記規則的なパターンは、前記表面の上に置くことができる交差するグリッド線の格子によって定義され、前記グリッド線は各単位セルが最大１つの突起を含むように、単位セルのパターンを定義する、
付記１〜３のいずれか１つに記載の物。
【０２９４】
（付記５）
前記表面部に、好ましくは１つ、しかし１０を超えない、異なるトポグラフィを含む、物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節するための、
付記１〜４のいずれか１つに記載の物。
【０２９５】
（付記６）
骨形成を刺激するための、異物に対する免疫反応の調節に使用するための、または細胞培養のための、
付記５に記載の物。
【０２９６】
（付記７）
インプラントとして使用するための、付記５または６に記載の物。
【０２９７】
（付記８）
骨形成分化を刺激する、肝細胞の表現型および機能を維持する、または免疫反応を刺激および／もしくは抑制する、
付記７に記載の使用のための物。
【０２９８】
（付記９）
前記インプラントが歯科用インプラントまたは整形外科用インプラントであり、前記トポグラフィが、
ａ）隣接する前記突起間の平均距離が２〜２５μｍであり、および
ｂ）前記突起の前記頂部表面領域の面積が３０〜７５０μｍ２であり、および、
ｃ）前記突起が前記表面の３０〜６５％を覆うこと、
によって定義される、
付記７または８に記載の使用のための物。
【０２９９】
（付記１０）
前記インプラントが肝臓インプラントであり、前記トポグラフィが、
ａ）隣接する前記突起間の平均距離が３〜２５μｍであり、および
ｂ）前記突起の前記頂部表面領域の面積が２０〜２５０μｍ２であり、および、
ｃ）前記突起が前記表面の８〜３５％を覆うこと、
によって定義される、
付記７または８に記載の使用のための物。
【０３００】
（付記１１）
当該物が免疫反応を抑制することによって異物に対する免疫反応を調節（ｒｅｇｕｌａｔｅ）し、前記トポグラフィが、
ａ）隣接する前記突起間の平均距離が２〜１２μｍであり、および
ｂ）前記突起の前記頂部表面領域の面積が２０〜２００μｍ２であり、および、
ｃ）前記突起が前記表面の２６〜５０％を覆うこと、
によって定義される、
付記７または８に記載の使用のための物。
【０３０１】
（付記１２）
当該物が免疫反応を刺激することによって異物に対する免疫反応を調節し、前記トポグラフィが、
ａ）隣接する前記突起間の平均距離が５〜１２μｍであり、および
ｂ）前記突起の前記頂部表面領域の面積が２０〜７０μｍ２であり、および、
ｃ）前記突起が前記表面の１５〜２５％を覆うこと、
によって定義される、
付記７または８に記載の使用のための物。
【０３０２】
（付記１３）
当該物が、異物に対する早期段階での免疫反応を刺激することによって、異物に対する免疫反応を調節して、より低い最終段階での免疫反応をもたらし、前記トポグラフィが、
ａ）隣接する前記突起間の平均距離が１２．１〜２０μｍであり、および、
ｂ）前記突起の前記頂部表面領域の面積が２５〜６５μｍ２であり、および、
ｃ）前記突起が前記表面の５〜１０％を覆うこと、
によって定義される、
付記７または８に記載の使用のための物。
【０３０３】
（付記１４）
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）するための付記５または６に記載の物。
【０３０４】
（付記１５）
前記調節が肝細胞の表現型および機能を維持することを含み、前記各トポグラフィが、
ａ）隣接する前記突起間の平均距離が３〜２５μｍであり、
ｂ）前記突起の前記頂部表面領域の面積が２０〜２５０μｍ２であり、および、
ｃ）前記突起が前記表面部の８〜３５％を覆うこと、
によって定義される、
付記１４に記載の物。
【０３０５】
（付記１６）
前記トポグラフィは規則的なパターンの突起によって定義される規則的なパターンの谷を有する頂部表面領域を含むものとしてあるいは定義され、前記谷は谷底、第１の谷壁および第２の谷壁を含み、前記第１の谷壁は第１の谷壁セクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）および必要に応じて第１の谷壁のパンクチャー（ｐｕｎｃｔｕｒｅ）を含み、前記第２の谷壁は第２の谷壁セクションおよび必要に応じて第２の谷壁のパンクチャーを含み、前記第１および前記第２の谷壁セクションは前記谷に隣接する突起の側面によって定義され、前記第１および前記第２の谷壁のパンクチャーは前記谷に対して垂直および前記谷底に対して平行な線が前記谷に隣接する前記突起に接触しない前記谷壁の部分として定義され、
ａ）前記谷壁は、前記谷底から前記頂部表面領域までの前記谷底に対して垂直な距離として定義される、０．５〜５０μｍの高さを有し、
ｂ）前記第１および第２の谷壁の前記谷壁の輪郭は独立して０〜４０μｍであり、
ｃ）前記第１および第２の谷壁セクションの長さは独立して０．０１〜１００μｍであり、
ｄ）前記第１および第２の谷壁のパンクチャーがある場合、その長さは、独立して０〜５０μｍであり、
ｅ）前記谷の平均幅は０〜５０μｍである、
付記１〜１５で定義される物。
【０３０６】
（付記１７）
物理的刺激による細胞集団の形態、増殖、生化学的機能、分化、付着、遊走、シグナル伝達、および／または細胞死を調節する方法であって、
１）適切な培地中の１つまたは複数の細胞を、規則的なパターンの突起を有する表面部と接触させる工程であって、前記規則的なパターンの突起は前記表面部の上に置かれ得る交差するグリッド線の格子によって定義され、前記グリッド線は各単位セルが最大１つの突起を含むように、単位セルのパターンを定義し、前記突起が１つまたは複数の突起要素を含み、前記突起要素は、頂部表面領域を有する表面の上に隆起した表面部分および前記頂部表面領域を前記表面と接続する周囲側面として定義され、前記各突起要素は前記表面の上に０．５〜５０μｍの最大高さを有し、
ａ）隣接する前記突起間の平均距離が０〜５０μｍであり、
ｂ）前記突起の前記頂部表面領域の面積が１〜６０００μｍ２であり、および
ｃ）前記突起が前記表面の３〜９０％を覆う、
工程と、
２）前記細胞が前記表面に対して応答することを可能にする工程と、
を含む方法。
【０３０７】
（付記１８）
生細胞が肝細胞であり、トポグラフィが、
ａ）隣接する前記突起間の平均距離が３〜２５μｍであり、
ｂ）前記突起の前記頂部表面領域の面積が２０〜２５０μｍ２であり、および
ｃ）前記突起が前記表面部の８〜３５％を覆うこと、
によって定義される、
付記１７に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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