(57)【要約】  活性ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６及びＵＬ１４７タンパク質を欠いているＣＭＶベクターを開示するものであって、ＣＭＶの発現を拘束する１つ又は複数のｍｉｃｒｏＲＮＡ認識配列（ＭＲＥ）も含み得るＣＭＶベクターを開示する。開示されるＣＭＶベクターによる免疫化により、ＭＨＣ−Ｉａ、ＭＨＣ−ＩＩ又はＭＨＣ−Ｅにより拘束されているＣＤ８＋  Ｔ細胞の、様々なＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の選択が可能になる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの異種抗原をコードする第一の核酸配列と、
（ｂ）ＣＭＶの増殖に必須又は該増殖を増強しているＣＭＶ遺伝子に操作可能に連結された第一のｍｉｃｒｏＲＮＡ認識配列（ＭＲＥ）を含む第二の核酸配列であって、該ＭＲＥが、内皮細胞系列の細胞によって発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡの存在下において発現を抑制するものである、第二の核酸配列と、を含むサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクターであって、
該ベクターは、活性ＵＬ１２８タンパク質又はそのオーソログを発現しない、活性ＵＬ１３０タンパク質又はそのオーソログを発現しない、活性ＵＬ１４６又はそのオーソログを発現しない、及び、活性１４７タンパク質又はそのオーソログを発現しない、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクター。
【請求項２】
前記ＭＲＥは、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２２１／２２２、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−２９６及びｍｉＲ−３２８のうちの１つ又は複数の存在下において発現を抑制する、請求項１記載のＣＭＶベクター。
【請求項３】
前記ＭＲＥは、ｍｉＲ−１２６−３ｐの存在下において発現を抑制する、請求項２記載のＣＭＶベクター。
【請求項４】
前記ＭＲＥは、ｍｉＲ−１２６−３ｐの存在下においてＵＬ１２２（ＩＥ２）及びＵＬ７９の発現を抑制する、請求項３記載のＣＭＶベクター。
【請求項５】
前記少なくとも１つの異種抗原は、病原体特異抗原、腫瘍抗原、組織特異抗原又は宿主の自己抗原を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のＣＭＶベクター。
【請求項６】
前記宿主の自己抗原は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変領域由来の抗原又はＢ細胞受容体の可変領域由来の抗原である、請求項５記載のＣＭＶベクター。
【請求項７】
前記病原体特異抗原は、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、マラリア原虫（Plasmodium parasites）、及び、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）からなる群から選択される病原体に由来するものである、請求項５記載のＣＭＶベクター。
【請求項８】
前記腫瘍抗原は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、大腸癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、及び、胚細胞腫瘍からなる群から選択される癌に関連するものである、請求項５記載のＣＭＶベクター。
【請求項９】
前記ＣＭＶベクターは、活性ＵＬ８２（ｐｐ７１）タンパク質又はそのオーソログを発現しない、請求項１から８のいずれか一項に記載のＣＭＶベクター。
【請求項１０】
前記ＣＭＶベクターは、活性ＵＳ１１タンパク質又はそのオーソログを発現しない、請求項１から９のいずれか一項に記載のＣＭＶベクター。
【請求項１１】
前記ＣＭＶベクターは、活性ＵＬ８２（ｐｐ７１）タンパク質もしくは活性ＵＳ１１タンパク質、又はそのオーソログを発現しない、請求項１から８のいずれか一項に記載のＣＭＶベクター。
【請求項１２】
前記ＣＭＶベクターは、ヒトＣＭＶベクター（ＨＣＭＶ）、カニクイザルＣＭＶ（ＣｙＣＭＶ）ベクター又はアカゲザルＣＭＶ（ＲｈＣＭＶ）ベクターである、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＣＭＶベクター。
【請求項１３】
対象において、少なくとも１つの異種抗原に対する免疫応答を生成する方法であって、該方法は、
前記対象に対して、請求項１から１２のいずれか一項に記載のＣＭＶベクターを効果量で投与して、前記少なくとも１つの異種抗原に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘発することを含む、方法。
【請求項１４】
前記ＣＭＶベクターによって誘発されたＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちの少なくとも１０％が、ＭＨＣ−Ｅ又はそのオーソログによって拘束されている、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％又は少なくとも７５％が、ＭＨＣ−Ｅ又はそのオーソログによって拘束されている、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記ＣＭＶベクターによって誘発されたＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちの１０％未満が、ＭＨＣ−クラスＩａ又はそのオーソログによって拘束されている、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
ＭＨＣ−Ｅによって拘束されるＣＤ８＋  Ｔ細胞の一部が、ベクターで免疫した他の対象のうちの少なくとも９０％で共有されるペプチドを認識する、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
前記対象に対して、少なくとも１つの異種抗原をコードする核酸配列を含む第二のＣＭＶベクターを投与することをさらに含む、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第二のＣＭＶベクターは、ＵＬ１２８又はそのオーソログ、ＵＬ１２９又はそのオーソログ、ＵＬ１４６又はそのオーソログ、及び、ＵＬ１４７又はそのオーソログからなる群から選択される１つ又は複数の活性タンパク質を発現する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記第一のＣＭＶベクター及び前記第二のＣＭＶベクターの前記少なくとも１つの異種抗原は、同一の抗原である、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第二のＣＭＶベクターは、前記第一のＣＭＶベクターの前、同時又は後に投与される、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象は、事前にＣＭＶに曝露している、請求項１３から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である、請求項１３から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＭＶベクターを投与することは、前記ＣＭＶベクターの、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内又は経口の投与を含む、請求項１３から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞からのＣＤ８＋  ＴＣＲを同定することをさらに含むものであって、該ＣＤ８＋  ＴＣＲがＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識するものである、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＤ８＋  ＴＣＲは、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列決定によって同定される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）少なくとも１つの異種抗原をコードする第一の核酸配列と、
（ｂ）ＣＭＶの増殖に必須又は該増殖を増強しているＣＭＶ遺伝子に操作可能に連結された第一のｍｉｃｒｏＲＮＡ認識配列（ＭＲＥ）を含む第二の核酸配列であって、該ＭＲＥが、内皮細胞系列の細胞によって発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡの存在下において発現を抑制するものである、第二の核酸配列と、
（ｃ）ＣＭＶの増殖に必須又は該増殖を増強しているＣＭＶ遺伝子に操作可能に連結された第二のＭＲＥを含む第三の核酸配列であって、該ＭＲＥが、骨髄細胞系列の細胞によって発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡの存在下において発現を抑制するものである、第三の核酸配列と、を含むサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクターであって、
該ベクターは、活性ＵＬ１２８タンパク質又はそのオーソログを発現しない、活性ＵＬ１３０タンパク質又はそのオーソログを発現しない、活性ＵＬ１４６又はそのオーソログを発現しない、及び、活性ＵＬ１４７タンパク質又はそのオーソログを発現しない、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクター。
【請求項２８】
前記第二の核酸配列は、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２２１／２２２、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−２９６及びｍｉＲ−３２８の存在下において発現を抑制するＭＲＥを含む、請求項２７記載のＣＭＶベクター。
【請求項２９】
前記第二の核酸配列は、ｍｉＲ−１２６−３ｐの存在下において発現を抑制するＭＲＥを含む、請求項２８記載のＣＭＶベクター。
【請求項３０】
前記ＭＲＥは、ｍｉＲ−１２６−３ｐの存在下においてＵＬ１２２（ＩＥ２）及びＵＬ７９の発現を抑制する、請求項２９記載のＣＭＶベクター。
【請求項３１】
前記第三の核酸配列は、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ１４６ａ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−１２５のうちの１つ又は複数の存在下において発現を抑制するＭＲＥを含む、請求項２７から３０のいずれか一項に記載のＣＭＶベクター。
【請求項３２】
前記第三の核酸配列は、ｍｉＲ−１４２−３ｐの存在下において発現を抑制するＭＲＥを含む、請求項３１記載のＣＭＶベクター。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの異種抗原は、病原体特異抗原、腫瘍抗原、組織特異抗原又は宿主の自己抗原を含む、請求項２７から３２のいずれか一項に記載のＣＭＶベクター。
【請求項３４】
前記宿主の自己抗原は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変領域由来の抗原又はＢ細胞受容体の可変領域由来の抗原である、請求項３３記載のＣＭＶベクター。
【請求項３５】
前記病原体特異抗原は、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、マラリア原虫（Plasmodium parasites）、及び、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）からなる群から選択される病原体に由来するものである、請求項３３記載のＣＭＶベクター。
【請求項３６】
前記腫瘍抗原は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、大腸癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、及び、胚細胞腫瘍からなる群から選択される癌に関連するものである、請求項３３記載のＣＭＶベクター。
【請求項３７】
前記ＣＭＶベクターは、活性ＵＬ８２（ｐｐ７１）タンパク質又はそのオーソログを発現しない、請求項２７から３６のいずれか一項に記載のＣＭＶベクター。
【請求項３８】
前記ＣＭＶベクターは、活性ＵＳ１１タンパク質又はそのオーソログを発現しない、請求項２７から３７のいずれか一項に記載のＣＭＶベクター。
【請求項３９】
前記ＣＭＶベクターは、活性ＵＬ８２（ｐｐ７１）タンパク質もしくは活性ＵＳ１１タンパク質、又はそのオーソログを発現しない、請求項２７から３６のいずれか一項に記載のＣＭＶベクター。
【請求項４０】
前記ＣＭＶベクターは、ヒトＣＭＶベクター（ＨＣＭＶ）、カニクイザルＣＭＶ（ＣｙＣＭＶ）ベクター又はアカゲザルＣＭＶ（ＲｈＣＭＶ）ベクターである、請求項２７から３９のいずれか一項に記載のＣＭＶベクター。
【請求項４１】
対象において、少なくとも１つの異種抗原に対する免疫応答を生成する方法であって、該方法は、
前記対象に対して、請求項２７から４０のいずれか一項に記載のＣＭＶベクターを効果量で投与して、前記少なくとも１つの異種抗原に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘発することを含む、方法。
【請求項４２】
前記ＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちの少なくとも５０％が、ＭＨＣ−クラスＩａ又はそのオーソログによって拘束されている、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記対象に対して、少なくとも１つの異種抗原をコードする核酸配列を含む第二のＣＭＶベクターを投与することをさらに含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記第二のＣＭＶベクターは、ＵＬ１２８又はそのオーソログ、ＵＬ１２９又はそのオーソログ、ＵＬ１４６又はそのオーソログ、及び、ＵＬ１４７又はそのオーソログからなる群から選択される１つ又は複数の活性タンパク質を発現する、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記第一のＣＭＶベクター及び前記第二のＣＭＶベクターの前記少なくとも１つの異種抗原は、同一の抗原である、請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記第二のＣＭＶベクターは、前記第一のＣＭＶベクターの前、同時又は後に投与される、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記対象は、事前にＣＭＶに曝露している、請求項４１から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である、請求項４１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＣＭＶベクターを投与することは、前記ＣＭＶベクターの、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内又は経口の投与を含む、請求項４１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
少なくとも１つの異種抗原をコードする核酸配列を含むヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ベクターであって、該ベクターは、活性ＵＬ１２８タンパク質又はそのオーソログを発現しない、活性ＵＬ１３０タンパク質又はそのオーソログを発現しない、活性ＵＬ１４６又はそのオーソログを発現しない、及び、活性ＵＬ１４７タンパク質又はそのオーソログを発現しない、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ベクター。
【請求項５１】
前記少なくとも１つの異種抗原は、病原体特異抗原、腫瘍抗原、組織特異抗原又は宿主の自己抗原を含む、請求項５０記載のＨＣＭＶベクター。
【請求項５２】
前記宿主の自己抗原は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の可変領域由来の抗原又はＢ細胞受容体の可変領域由来の抗原である、請求項５１記載のＨＣＭＶベクター。
【請求項５３】
前記病原体特異抗原は、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、マラリア原虫（Plasmodium parasites）、及び、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）からなる群から選択される病原体に由来するものである、請求項５１記載のＨＣＭＶベクター。
【請求項５４】
前記腫瘍抗原は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、大腸癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、及び、胚細胞腫瘍からなる群から選択される癌に関連するものである、請求項５１記載のＨＣＭＶベクター。
【請求項５５】
前記ＨＣＭＶベクターは、活性ＵＬ８２（ｐｐ７１）タンパク質又はそのオーソログを発現しない、請求項５０から５４のいずれか一項に記載のＨＣＭＶベクター。
【請求項５６】
前記ＨＣＭＶベクターは、活性ＵＳ１１タンパク質又はそのオーソログを発現しない、請求項５０から５５のいずれか一項に記載のＨＣＭＶベクター。
【請求項５７】
前記ＨＣＭＶベクターは、活性ＵＬ８２（ｐｐ７１）タンパク質もしくは活性ＵＳ１１タンパク質、又はそのオーソログを発現しない、請求項５０から５４のいずれか一項に記載のＨＣＭＶベクター。
【請求項５８】
対象において、少なくとも１つの異種抗原に対する免疫応答を生成する方法であって、該方法は、
前記対象に対して、請求項５０から５７のいずれか一項に記載のＨＣＭＶベクターを効果量で投与して、前記少なくとも１つの異種抗原に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘発することを含む、方法。
【請求項５９】
前記ＨＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちの少なくとも１０％が、ＭＨＣ−Ｅ又はそのオーソログによって拘束されている、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
前記ＨＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちの少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％又は少なくとも７５％が、ＭＨＣ−Ｅ又はそのオーソログによって拘束されている、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記ＨＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちの少なくとも１０％が、クラスＩＩのＭＨＣ又はそのオーソログによって拘束されている、請求項５８記載の方法。
【請求項６２】
前記ＨＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちの少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％又は少なくとも７５％が、クラスＩＩのＭＨＣ又はそのオーソログによって拘束されている、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
ＭＨＣ−Ｅによって拘束されるＣＤ８＋  Ｔ細胞の一部が、ベクターで免疫した他の対象のうちの少なくとも９０％で共有されるペプチドを認識する、請求項５８記載の方法。
【請求項６４】
ＭＨＣ−ＩＩによって拘束されるＣＤ８＋  Ｔ細胞の一部が、ベクターで免疫した他の対象のうちの少なくとも９０％で共有されるペプチドを認識する、請求項５８記載の方法。
【請求項６５】
前記対象に対して、少なくとも１つの異種抗原をコードする核酸配列を含む第二のＣＭＶベクターを投与することをさらに含む、請求項５８から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記第二のＣＭＶベクターは、ＵＬ１２８又はそのオーソログ、ＵＬ１２９又はそのオーソログ、ＵＬ１４６又はそのオーソログ、及び、ＵＬ１４７又はそのオーソログからなる群から選択される１つ又は複数の活性タンパク質を発現する、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
前記第一のＣＭＶベクター及び前記第二のＣＭＶベクターの前記少なくとも１つの異種抗原は、同一の抗原である、請求項６５又は６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記第二のＣＭＶベクターは、前記第一のＣＭＶベクターの前、同時又は後に投与される、請求項６５から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記対象は、事前にＣＭＶに曝露している、請求項５８から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である、請求項５８から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＨＣＭＶベクターを投与することは、前記ＨＣＭＶベクターの、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内又は経口の投与を含む、請求項５８から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞からのＣＤ８＋  ＴＣＲを同定することをさらに含むものであって、該ＣＤ８＋  ＴＣＲがＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識するものである、請求項５９又は６０に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＣＤ８＋  ＴＣＲは、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列決定によって同定される、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
ＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞を生成する方法であって、該方法が、
（１）対象に対して、請求項１から１２又は５０から５７のいずれか一項に記載のＣＭＶベクターを効果量で投与して、ＭＨＣ−Ｅ／ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞の集合を生成することと、
（２）前記ＣＤ８＋  Ｔ細胞の集合からの第一のＣＤ８＋  ＴＣＲを同定することであって、該第一のＣＤ８＋  ＴＣＲがＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識するものであることと、
（３）前記対象から１つ又は複数のＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離することと、
（４）ある発現ベクターで１つ又は複数のＣＤ８＋  Ｔ細胞をトランスフェクションすることであって、該発現ベクターが第二のＣＤ８＋  ＴＣＲをコードする核酸配列と、前記第二のＣＤ８＋  ＴＣＲをコードする前記核酸配列に操作可能に連結されたプロモーターとを含み、前記第二のＣＤ８＋  ＴＣＲは、第一のＣＤ８＋  ＴＣＲのＣＤＲ３α及びＣＤＲ３βを含み、それによってＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識する１つ又は複数のトランスフェクションされたＣＤ８＋  Ｔ細胞を生成することとを含む、方法。
【請求項７５】
前記第一のＣＤ８＋  ＴＣＲは、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列決定によって同定される、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
前記第二のＣＤ８＋  ＴＣＲは、前記第一のＣＤ８＋  ＴＣＲのうちのＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β及びＣＤＲ３βを含む、請求項７４又は７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記第二のＣＤ８＋  ＴＣＲをコードする核酸配列は、前記第一のＣＤ８＋  ＴＣＲをコードする核酸配列と一致する、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
前記対象に対して前記ＣＭＶベクターを投与することは、前記ＣＭＶベクターの、前記対象に対する皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内又は経口の投与を含む、請求項７４から７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記対象は、事前にＣＭＶに曝露している、請求項７４から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である、請求項７４から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＣＭＶベクターの前記少なくとも１つの異種抗原は、腫瘍抗原を含む、請求項７４から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記腫瘍抗原は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、大腸癌、腎細胞癌（ＣＣ）、及び、胚細胞腫瘍からなる群から選択される癌に関連するものである、請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
前記対象に対して、トランスフェクションされたＣＤ８＋  Ｔ細胞を投与して、癌を治療することをさらに含む、請求項８１又は８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＣＭＶベクターの前記少なくとも１つの異種抗原は、病原体特異抗原を含む、請求項７４から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記病原体特異抗原は、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、マラリア原虫（Plasmodium parasites）、及び、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）からなる群から選択される病原体に由来するものである、請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
前記対象に対して、トランスフェクションされたＣＤ８＋  Ｔ細胞を投与して、病原性感染を治療することをさらに含む、請求項８４又は８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記ＣＭＶベクターの前記少なくとも１つの異種抗原は、宿主の自己抗原又は組織特異抗原を含む、請求項７４から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記宿主の自己抗原は、ＴＣＲの可変領域由来の抗原又はＢ細胞受容体の可変領域由来の抗原である、請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
前記対象に対して、トランスフェクションされたＣＤ８＋  Ｔ細胞を投与して、自己免疫疾患又は免疫障害を治療することをさらに含む、請求項８７又は８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記対象に対して、トランスフェクションされたＣＤ８＋  Ｔ細胞を投与して、宿主の自己抗原又は組織特異抗原に対する自己免疫応答を誘導することをさらに含む、請求項８７又は８８に記載の方法。
【請求項９１】
ＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞を生成する方法であって、該方法が、
（１）第一の対象に対して、請求項１から１２又は５０から５７のいずれか一項に記載のＣＭＶベクターを効果量で投与して、ＭＨＣ−Ｅ／ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞の集合を生成することと、
（２）前記ＣＤ８＋  Ｔ細胞の集合からの第一のＣＤ８＋  ＴＣＲを同定することであって、該第一のＣＤ８＋  ＴＣＲがＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識するものであることと、
（３）第二の対象から１つ又は複数のＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離することと、
（４）ある発現ベクターで１つ又は複数のＣＤ８＋  Ｔ細胞をトランスフェクションすることであって、該発現ベクターが第二のＣＤ８＋  ＴＣＲをコードする核酸配列と、前記第二のＣＤ８＋  ＴＣＲをコードする前記核酸配列に操作可能に連結されたプロモーターとを含み、前記第二のＣＤ８＋  ＴＣＲは、第一のＣＤ８＋  ＴＣＲのＣＤＲ３α及びＣＤＲ３βを含み、それによってＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識する１つ又は複数のトランスフェクションされたＣＤ８＋  Ｔ細胞を生成することとを含む、方法。
【請求項９２】
前記第一のＣＤ８＋  ＴＣＲは、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列決定によって同定される、請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
前記第一の対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である、請求項９１又は９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記第二の対象は、ヒト又は非ヒト霊長類である、請求項９１から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記第一の対象は非ヒト霊長類であり、かつ、前記第二の対象はヒトであって、前記第二のＣＤ８＋  ＴＣＲは、前記第一のＣＤ８＋  ＴＣＲの非ヒト霊長類ＣＤＲ３α及びＣＤＲ３βを含む、キメラ非ヒト霊長類−ヒトＣＤ８＋  ＴＣＲである、請求項９１から９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記第二のＣＤ８＋  ＴＣＲは、前記第一のＣＤ８＋  ＴＣＲのうちの非ヒト霊長類ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β及びＣＤＲ３βを含む、請求項９５記載の方法。
【請求項９７】
前記第二のＣＤ８＋  ＴＣＲは、前記第一のＣＤ８＋  ＴＣＲのうちのＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β及びＣＤＲ３βを含む、請求項９１から９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記第二のＣＤ８＋  ＴＣＲをコードする核酸配列は、前記第一のＣＤ８＋  ＴＣＲをコードする核酸配列と一致する、請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
前記第二のＣＤ８＋  ＴＣＲは、キメラＣＤ８＋  ＴＣＲである、請求項９１から９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記第二のＣＤ８＋  ＴＣＲは、前記第一のＣＤ８＋  ＴＣＲのうちのＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β及びＣＤＲ３βを含む、請求項９９記載の方法。
【請求項１０１】
前記第一の対象に対して前記ＣＭＶベクターを投与することは、前記ＣＭＶベクターの、前記第一の対象に対する皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内又は経口の投与を含む、請求項９１から１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記第一の対象は、事前にＣＭＶに曝露している、請求項９１から１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記少なくとも１つの異種抗原は、腫瘍抗原を含む、請求項９１から１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記腫瘍抗原は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、大腸癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、及び、胚細胞腫瘍からなる群から選択される癌に関連するものである、請求項１０３記載の方法。
【請求項１０５】
前記第二の対象に対して、トランスフェクションされたＣＤ８＋  Ｔ細胞を投与して、癌を治療することをさらに含む、請求項１０３又は１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記少なくとも１つの異種抗原は、病原体特異抗原を含む、請求項９１から１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記病原体特異抗原は、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、マラリア原虫（Plasmodium parasites）、及び、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）からなる群から選択される病原体に由来するものである、請求項１０６記載の方法。
【請求項１０８】
前記第二の対象に対して、トランスフェクションされたＣＤ８＋  Ｔ細胞を投与して、病原性感染を治療することをさらに含む、請求項１０６又は１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記少なくとも１つの異種抗原は、宿主の自己抗原又は組織特異抗原を含む、請求項９１から１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記宿主の自己抗原は、ＴＣＲの可変領域由来の抗原又はＢ細胞受容体の可変領域由来の抗原である、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１１】
前記第二の対象に対して、トランスフェクションされたＣＤ８＋  Ｔ細胞を投与して、自己免疫疾患又は免疫障害を治療することをさらに含む、請求項１０９又は１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記対象に対して、トランスフェクションされたＣＤ８＋  Ｔ細胞を投与して、宿主の自己抗原又は組織特異抗原に対する自己免疫応答を誘導することをさらに含む、請求項１０９又は１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
請求項７４から１１２のいずれか一項に記載の方法によって生成されるＣＤ８＋  Ｔ細胞。
【請求項１１４】
前記ＣＭＶベクターの前記少なくとも１つの異種抗原は、腫瘍抗原を含む、請求項１１３記載のＣＤ８＋  Ｔ細胞。
【請求項１１５】
前記腫瘍抗原は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、大腸癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、及び、胚細胞腫瘍からなる群から選択される癌に関連するものである、請求項１１４記載のＣＤ８＋  Ｔ細胞。
【請求項１１６】
前記ＣＭＶベクターの前記少なくとも１つの異種抗原は、病原体特異抗原を含む、請求項１１３記載のＣＤ８＋  Ｔ細胞。
【請求項１１７】
前記病原体特異抗原は、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、マラリア原虫（Plasmodium parasites）、及び、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）からなる群から選択される病原体に由来するものである、請求項１１６記載のＣＤ８＋  Ｔ細胞。
【請求項１１８】
前記ＣＭＶベクターの前記少なくとも１つの異種抗原は、宿主の自己抗原又は組織特異抗原を含む、請求項１１３記載のＣＤ８＋  Ｔ細胞。
【請求項１１９】
前記宿主の自己抗原は、ＴＣＲの可変領域由来の抗原又はＢ細胞受容体の可変領域由来の抗原である、請求項１１８記載のＣＤ８＋  Ｔ細胞。
【請求項１２０】
癌を治療する方法であって、請求項１１４又は１１５に記載のＣＤ８＋  Ｔ細胞を、対象に投与することを含む、方法。
【請求項１２１】
病原性感染を治療する方法であって、請求項１１６又は１１７に記載のＣＤ８＋  Ｔ細胞を、対象に投与することを含む、方法。
【請求項１２２】
自己免疫疾患又は免疫障害を治療する方法であって、請求項１１８又は１１９に記載のＣＤ８＋  Ｔ細胞を、対象に投与することを含む、方法。
【請求項１２３】
宿主の自己抗原又は組織特異抗原に対する自己免疫応答を誘導する方法であって、請求項１１８又は１１９に記載のＣＤ８＋  Ｔ細胞を、前記対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年１０月１８日出願の米国仮出願第６２／４０９，８４０号の優先権の利益を請求し、その開示はその全体を参照により本明細書に組み入れられたものとする。
【０００２】
本発明は、免疫化におけるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクターの使用に関するものであり、より詳細には、ＭＨＣ−Ｅ拘束性を特徴とするＴ細胞応答の生成に関するものである。特定の実施形態は、ＭＨＣ−Ｅによって拘束されるＣＤ８＋  Ｔ細胞の生成に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
政府支援の認定
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（アメリカ国立衛生研究所）により与えられた助成番号第Ｐ０１  ＡＩ０９４４１７号及び第Ｒ０１  ＡＩ１１７８０２号の条項のもと、米国政府の支援によって行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００４】
ＥＦＳ−ＷＥＢ経由で電子的に提出した配列表の参照
電子的に提出した配列表（名称：３９１９．０１４ＰＣ０１＿ＳＴ２５、サイズ：１，０６３バイト、作成日：２０１７年１０月１８日）の内容は、その全体を参照により本明細書に組み入れられたものとする。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書において、遺伝子改変したＣＭＶワクチンベクターを開示する。遺伝子改変したＣＭＶワクチンベクターの実施形態においては、本明細書に記載の遺伝子改変により、細胞表面のＭＨＣ−ＩＩタンパク質及びＭＨＣ−Ｅタンパク質によって拘束される、固有のエピトープを認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘発する能力を含む、ＣＭＶワクチンベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞応答のエピトープターゲティングと主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ（Major Histocompatibility Complex））の拘束性とが変化する。本明細書に記載のＣＭＶワクチンベクターが誘発するＭＨＣ−ＩＩ及びＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答は非古典的であり、病原体に対する天然の免疫応答において稀に観察される。さらに、本明細書に記載のＣＭＶワクチンベクターが誘発するＭＨＣ−ＩＩ及びＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の幅と効力は、遺伝子改変していないＣＭＶワクチンベクターでは観察されない。一部の実施形態においては、特定の理論により拘束されることなく、発明者は、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＭＨＣ−Ｅ拘束性免疫応答に対して病原体及び腫瘍の免疫回避の適応がないことを活用できるということと、またそうした応答を主に又は排他的に誘発することができる本明細書に記載の遺伝子改変したＣＭＶワクチンベクターが、標的である病原体及び腫瘍に対する固有に効力あるワクチンの可能性を提供するということとを考えている。この仮定は、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発するワクチンのみが、非ヒト霊長類ＡＩＤＳモデルにおける攻撃に対して保護をするという発見と一貫性がある。さらに、ＭＨＣ−Ｅは、ＭＨＣ−Ｅ拘束性エピトープを標的とする防御反応が個体間で保存されるように、多型を抑えている。したがって、一部の実施形態においては、本明細書に記載の遺伝子改変されたＣＭＶワクチンベクターは、遺伝子的に多様な個体間で共有されているあるＭＨＣ−Ｅ拘束性Ｔ細胞応答を誘発する。
【０００６】
本明細書においては、少なくとも１つの異種抗原をコードする第一の核酸配列と、内皮細胞系列の細胞によって発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡの存在下において発現を抑制するｍｉｃｒｏＲＮＡ認識配列（ＭＲＥ（microRNA recognition element））を含む第二の核酸配列とを含む、ＣＭＶベクターを開示する。ＭＲＥは、ＣＭＶの増殖に必須又は該増殖を増強しているＣＭＶ遺伝子に操作可能に連結している。ベクターは、活性ＵＬ１２８タンパク質若しくはそのオーソログ、活性ＵＬ１３０タンパク質若しくはそのオーソログ、活性ＵＬ１４６タンパク質若しくはそのオーソログ、又は、活性ＵＬ１４７タンパク質若しくはそのオーソログを発現しない。
【０００７】
また本明細書においては、少なくとも１つの異種抗原をコードする第一の核酸配列と、内皮細胞系列の細胞によって発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡの存在下において発現を抑制するＭＲＥを含む第二の核酸配列と、骨髄細胞系列の細胞によって発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡの存在下において発現を抑制するＭＲＥを含む第三の核酸配列とを含む、ＣＭＶベクターも開示する。これらＭＲＥは、ＣＭＶの増殖に必須又は該増殖を増強しているＣＭＶ遺伝子に操作可能に連結している。ベクターは、活性ＵＬ１２８タンパク質若しくはそのオーソログ、活性ＵＬ１３０タンパク質若しくはそのオーソログ、活性ＵＬ１４６タンパク質若しくはそのオーソログ、又は、活性ＵＬ１４７タンパク質若しくはそのオーソログを発現しない。
【０００８】
また本明細書においては、少なくとも１つの異種抗原をコードする核酸配列を含むヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ベクターも開示する。ベクターは、活性ＵＬ１２８タンパク質若しくはそのオーソログ、活性ＵＬ１３０タンパク質若しくはそのオーソログ、活性ＵＬ１４６タンパク質若しくはそのオーソログ、又は、活性ＵＬ１４７タンパク質若しくはそのオーソログを発現しない。
【０００９】
また本明細書においては、対象において、少なくとも１つの異種抗原に対する免疫応答を生成する方法も開示する。この方法は、対象に対して、本明細書に開示するタイプのＣＭＶベクターを効果量で投与して、少なくとも１つの異種抗原に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘発することを伴う。一部の実施形態においては、このベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちの少なくとも１０％が、ＭＨＣ−Ｅ又はそのオーソログによって拘束されている。さらなる実施形態においては、このベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちの１０％未満が、多型ＭＨＣ−クラスＩａ又はそのオーソログによって拘束されている。代替的な実施形態においては、このベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちの少なくとも５０％が、ＭＨＣ−クラスＩａ又はそのオーソログによって拘束されている。さらに他の実施形態においては、このベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちの少なくとも１０％が、ＭＨＣ−ＩＩ又はそのオーソログによって拘束されている。
【００１０】
本明細書に開示するＣＭＶベクターの異種抗原は、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、マラリア原虫（Plasmodium parasites）及び結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に由来する病原体特異抗原を含む、任意の異種抗原であり得る。他の実施形態においては、異種抗原は、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、大腸癌、腎細胞癌、及び、胚細胞腫瘍に関連する腫瘍抗原を含む、腫瘍抗原であり得る。一部の実施形態においては、異種抗原は、例えばＴ細胞受容体の可変領域由来の抗原又はＢ細胞受容体の可変領域由来の抗原を含む、組織特異抗原又は宿主の自己抗原であり得る。
【００１１】
また本明細書においては、ＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞を生成する方法も開示する。この方法は、第一の対象に対して、ＣＭＶベクターを効果量で投与して、ＭＨＣ−Ｅ／ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞の集合を生成することを伴う。ＣＭＶベクターは、少なくとも１つの異種抗原をコードする第一の核酸配列を含むが、活性ＵＬ１２８タンパク質若しくはそのオーソログ、活性ＵＬ１３０タンパク質若しくはそのオーソログ、活性ＵＬ１４６タンパク質若しくはそのオーソログ、又は、活性ＵＬ１４７タンパク質若しくはそのオーソログを発現しない。一部の実施形態においては、ＣＭＶベクターは、内皮細胞系列の細胞によって発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡの存在下において発現を抑制するＭＲＥを含む第二の核酸配列をさらに含む。異種抗原は、病原体特異抗原、腫瘍抗原、自己抗原又は組織特異抗原を含む任意の抗原であることが可能である。一部の実施形態においては、この方法は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の集合からの第一のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体を同定することをさらに含み得るものであって、該第一のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が、ＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識する。一部の実施形態においては、第一のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体は、ＤＮＡ又はＲＮＡの配列決定によって同定される。一部の実施形態においては、この方法は、ある発現ベクターで、第一の対象若しくは第二の対象から単離された１つ又は複数のＴ細胞をトランスフェクションすることをさらに含み得るものであって、該発現ベクターが、第二のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列を含み、該第二のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体が、第一のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体のＣＤＲ３α及びＣＤＲ３βを含み、それによって、ＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識する１つ又は複数のトランスフェクションされたＣＤ８＋  Ｔ細胞が生成される。一部の実施形態においては、この方法は、トランスフェクションされたＣＤ８＋  Ｔ細胞を第一の対象又は第二の対象に投与して、例えば癌である疾患、病原性感染、又は、自己免疫疾患若しくは自己免疫障害を治療することをさらに含み得る。一部の実施形態においては、この方法は、トランスフェクションされたＣＤ８＋  Ｔ細胞を第一の対象又は第二の対象に投与して、自己抗原又は組織特異抗原に対する自己免疫応答を誘導することをさらに含み得る。
【００１２】
また本明細書においては、以下の工程を含む方法によって調製されたＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するトランスフェクションされたＣＤ８＋  Ｔ細胞も開示するものであって、該方法は、（１）第一の対象に対して、ＣＭＶベクターを効果量で投与して、ＭＨＣ−Ｅ／ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞の集合を生成する工程と、（２）ＣＤ８＋  Ｔ細胞の集合からの第一のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体を同定する工程であって、該第一のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体がＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来複合体を認識するものである工程と、（３）第一の対象又は第二の対象から、１つ又は複数のＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離する工程と、（４）ある発現ベクターで、第一の対象若しくは第二の対象から単離された１つ又は複数のＣＤ８＋  Ｔ細胞をトランスフェクションし、それによってＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するトランスフェクションされたＴ細胞を作製する工程とを含む。ＣＭＶベクターは、少なくとも１つの異種抗原をコードする第一の核酸配列を含むが、活性ＵＬ１２８タンパク質若しくはそのオーソログ、活性ＵＬ１３０タンパク質若しくはそのオーソログ、活性ＵＬ１４６タンパク質若しくはそのオーソログ、又は、活性ＵＬ１４７タンパク質若しくはそのオーソログを発現しない。一部の実施形態においては、ＣＭＶベクターは、内皮細胞系列の細胞によって発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡの存在下において発現を抑制するＭＲＥを含む第二の核酸配列をさらに含む。発現ベクターは、第二のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列と、第二のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体をコードする該核酸配列に操作可能に連結するプロモーターとを含むものであって、第二のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体が、第一のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体のＣＤＲ３α及びＣＤＲ３βを含む。異種抗原は、病原体特異抗原、腫瘍抗原、自己抗原又は組織特異抗原を含む任意の抗原であることが可能である。また本明細書においては、例えば癌である疾患、病原性感染、又は、自己免疫疾患若しくは自己免疫障害を治療する方法であって、第一の対象又は第二の対象に対して、ＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するトランスフェクションされたＣＤ８＋  Ｔ細胞を投与することを含む方法も開示する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
添付の図面とあわせて、以下に記載する発明を実施するための形態によって、実施形態が容易に理解されることとなる。実施形態は、限定ではなく例として添付の図面の各図に示す。
【図１】図１は、それぞれ異なるようにプログラムされたＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクターによって誘発されたＳＩＶｇａｇ特異ＣＤ８＋  Ｔ細胞の、エピトープターゲティング及びＭＨＣ拘束性を示している。指定されたＲｈＣＭＶベクターにより誘発されたＳＩＶｇａｇ特異ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を、１２５個の連続した１５ｍｅｒ  ｇａｇペプチド（１１アミノ酸オーバーラップを含む）の認識を検出するフローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を用いてエピトープマッピングした。特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を生じた個々のペプチドをボックスで示しており、抗−汎ＭＨＣ−Ｉ  ｍＡｂであるＷ６／３２（非多型ＭＨＣ−Ｅ及び多型ＭＨＣ−Ｉａの両分子の認識を阻害する）と、ＭＨＣ−Ｅを阻害するペプチドＶＬ９と、ＭＨＣ−ＩＩを阻害するペプチドＣＬＩＰとによる阻害によって決定されたとおりに、ＭＨＣ拘束性を指定するものである模様をボックスに施すようにしている。ＭＨＣ−Ｉａ、ＭＨＣ−Ｅ及びＭＨＣ−ＩＩによる拘束性は、それぞれ、Ｗ６／３２単独（白）、ＶＬ９単独（４５度ハッチング）、及びＣＬＩＰ単独（水平ハッチング）が阻害している、＞９０％の応答に基づくものとしたが、これら基準を満たさなかった応答については不定（黒）とした。矢印は、ＭＨＣ−ＩＩスーパートープ（supertope）（水平ハッチング）及びＭＨＣ−ＥスーパートープＭＨＣ−Ｅスーパートープ（４５度ハッチング）を示している。
【図２】図２は、ワクチン未接種のままのアカゲザル（ＲＭ）（ｎ＝１５、下段）、又は、６８−１株ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクター（ｎ＝１５、上段左）、６８−１．２株ＲｈＣＭＶベクター（ｎ＝１５、上段中央）若しくはＵＬ１２８−欠失（ΔＵＬ１２８）６８−１．２  ＲｈＣＭＶベクター（ｎ＝１４、上段右）でワクチン接種したアカゲザル（ＲＭ）の、繰り返しの、用量限界での直腸内へのＳＩＶｍａｃ２３９の攻撃の結果を示している。全てのベクターが、同一のＳＩＶ  Ｇａｇ、Ｒｅｔａｎｅｆ（Ｒｅｖ／Ｎｅｆ／Ｔａｔの融合）及び５’−Ｐｏｌインサートを発現した。
【図３】図３は、ＣｙＣＭＶコンストラクトの配列決定カバレッジマップを示している。ＣｙＣＭＶ−ＢＡＣの次世代シーケンス解析（Next Generation Sequencing）で、精度管理をパスした全ての配列決定の読み値が、ＣｙＣＭＶ−ＢＡＣの新規の集積したコンセンサス配列に対して並列された。コンストラクト毎にコンセンサス配列のＯＲＦマップを示している。上部のバーは、所与のＢＡＣと親ＢＡＣ配列との間のヌクレオチド同一性の割合を示しており、濃い灰色は１００％同一である。Ｃｙ１３．１  ＯＲＦと置き替わるＳＩＶｇａｇ配列並びにＨＣＭＶ  ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６及びＵＬ１４７のＣｙＣＭＶホモログを、上部のバー内で薄い灰色で示している。親ＢＡＣ及びＣｙＣＭＶΔＲＬ１３／Ｇａｇ間における有一の配列の相違は、ＲＬ１３のＣｙＣＭＶホモログがＳＩＶｇａｇで置換されていることである。さらにＣｙＣＭＶΔＲＬ１３／ＧａｇΔＵＬ１２８−１３０はＵＬ１２８及びＵＬ１３０のホモログを欠いているのに対し、一方、ＣｙＣＭＶΔＲＬ１３／ＧａｇΔＵＬ１２８−１３０ΔＵＬ１４６−１４７内においては、ＨＣＭＶ  ＵＬ１４６及びＵＬ１４７の６つのホモログがさらに欠失している。大多数の配列では、望ましくない組換え又は偽の変異は存在しない。
【図４】図４は、細菌人工染色体（３１９０８）にクローニングすることで生成されて、またＨＣＭＶ  ＵＬ１２８及びＵＬ１３０に相同である遺伝子が、単独で欠失（ΔＵＬ１２８−ＵＬ１３０）又はＨＣＭＶ  ＵＬ１４６及びＵＬ１４７に相同である６つの遺伝子のファミリーと組み合わせて欠失（ΔＵＬ１２８−ＵＬ１３０＋ΔＵＬ１４６／７ファミリー）している、ＣｙＣＭＶコンストラクトの概略図を示している。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃは、ＣｙＣＭＶΔＲＬ１３／ＧａｇΔＵＬ１２８−１３０ベクターでワクチン接種したカニクイザルからの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のフローサイトメトリーのプロットを示している。図５Ａは、４アミノ酸オーバーラップの１５ｍｅｒ  ＳＩＶｇａｇペプチド（ＧＡＧ  ＯＲＦ）で、又は、ＭＨＣ−ＩＩ若しくはＭＨＣ−Ｅのスーパートープに対応する図示したＳＩＶｇａｇペプチド（Ｇａｇ５３はＳＩＶｍａｃ２３９のｇａｇタンパク質中のアミノ酸（amino-acid）配列２１１〜２２２に対応するペプチドと等しく、Ｇａｇ７３はＡＡ２９０〜３０１に対応するペプチドと等しく、Ｇａｇ６９はＡＡ２７６〜２８４に対応するペプチドと等しく、Ｇａｇ１２０はＡＡ４８２〜４９０に対応するペプチドと等しい）で刺激した、ＣｙＣＭＶΔＲＬ１３／ＧａｇΔＵＬ１２８−１３０ベクターでワクチン接種したカニクイザルからのＰＢＭＣのフローサイトメトリーのプロットを示している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、汎−ＭＨＣ−Ｉ阻害ｍＡｂであるＷ６／３２（ＭＨＣ−Ｅ及びＭＨＣ−Ｉａの両方を阻害する抗ＭＨＣ−Ｉ）、ＭＨＣ−ＩＩを結合するＣＬＩＰペプチド（抗ＭＨＣ−ＩＩ）又はＭＨＣ−Ｅを結合するＶＬ９ペプチド（抗ＭＨＣ−Ｅ）の存在下で、非スーパートープであるＭＨＣ−ＩＩ又はＭＨＣ−Ｉａ拘束性ペプチド（Ｇａｇ１２はＳＩＶｍａｃ２３９ｇａｇ中のＡＡ４５〜５９と等しく、Ｇａｇ３３は１３２〜１４０ＡＡと等しい）と共にインキュベーション後のＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なフローサイトメトリーのプロットを示している。
【図５Ｃ】図５Ｃは、１２５個の連続した１５ｍｅｒ  ｇａｇペプチド（１１アミノ酸オーバーラップを含む）の認識を検出するフローサイトメトリーによるＩＣＳを用いた、ＳＩＶｇａｇ特異ＣＤ８＋  Ｔ細胞のエピトープターゲティング及びＭＨＣ拘束性を示している。特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を生じた個々のペプチドをボックスで示しており、抗−汎ＭＨＣ−Ｉ  ｍＡｂであるＷ６／３２と、ＭＨＣ−Ｅを阻害するペプチドＶＬ９と、ＭＨＣ−ＩＩを阻害するペプチドＣＬＩＰとによる阻害によって決定されたとおりに、ＭＨＣ拘束性を指定するものである模様をボックスに施すようにしている。ＭＨＣ−Ｉａ、ＭＨＣ−Ｅ及びＭＨＣ−ＩＩによる拘束性は、それぞれ、Ｗ６／３２単独（左下角から右上角方向のハッチング）、ＶＬ９単独（右下角から左上角方向のハッチングと水平ハッチング）、及びＣＬＩＰ単独（黒）が阻害している、＞９０％の応答に基づくものとしたが、これら基準を満たさなかった応答については不定（白）とした。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、ＣｙＣＭＶΔＲＬ１３／ＧａｇΔＵＬ１２８−１３０ΔＵＬ１４６−１４７ベクターでワクチン接種したカニクイザルからのＰＢＭＣのフローサイトメトリーのプロットを示している。図６Ａは、４アミノ酸オーバーラップの１５ｍｅｒ  ＳＩＶｇａｇペプチド（ＧＡＧ  ＯＲＦ）で、又は、ＭＨＣ−ＩＩ若しくはＭＨＣ−Ｅのスーパートープに対応する図示したＳＩＶｇａｇペプチドで刺激した、ＣｙＣＭＶΔＲＬ１３／ＧａｇΔＵＬ１２８−１３０ΔＵＬ１４６−１４７ベクターでワクチン接種したカニクイザルからのＰＢＭＣのフローサイトメトリーのプロットを示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、汎−ＭＨＣ−Ｉ阻害ｍＡｂであるＷ６／３２（抗ＭＨＣ−Ｉ）、ＭＨＣ−ＩＩを結合するＣＬＩＰペプチド（抗ＭＨＣ−ＩＩ）、又はＭＨＣ−Ｅを結合するＶＬ９ペプチド（抗ＭＨＣ−Ｅ）の存在下で、スーパートープであるＭＨＣ−ＩＩ又はＭＨＣ−Ｅ拘束性ペプチドと共にインキュベーション後のＣＤ８＋  Ｔ細胞の代表的なフローサイトメトリーのプロットを示している。
【図６Ｃ】図６Ｃは、１２５個の連続した１５ｍｅｒ  ｇａｇペプチド（１１アミノ酸オーバーラップを含む）の認識を検出するフローサイトメトリーによるＩＣＳを用いた、ＳＩＶｇａｇ特異ＣＤ８＋  Ｔ細胞のエピトープターゲティング及びＭＨＣ拘束性を示している。特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を生じた個々のペプチドをボックスで示しており、抗−汎ＭＨＣ−Ｉ  ｍＡｂであるＷ６／３２と、ＭＨＣ−Ｅを阻害するペプチドＶＬ９と、ＭＨＣ−ＩＩを阻害するペプチドＣＬＩＰとによる阻害によって決定されたとおりに、ＭＨＣ拘束性を指定するものである模様をボックスに施すようにしている。ＭＨＣ−Ｉａ、ＭＨＣ−Ｅ及びＭＨＣ−ＩＩによる拘束性は、それぞれ、Ｗ６／３２単独（左下角から右上角方向のハッチング）、ＶＬ９単独（右下角から左上角方向のハッチングと水平ハッチング）、及びＣＬＩＰ単独（黒）が阻害している、＞９０％の応答に基づくものとしたが、これら基準を満たさなかった応答については不定（白）とした。
【図７】図７は、ＲｈＣＭＶ分離株６８−１と、野生型の完全長ゲノムに６８−１を遺伝子操作することによって生成したＲｈＣＭＶコンストラクト（ＦＬ）との概略図を示している。ＦＬの或るコンストラクトは、ＨＣＭＶ  ＵＬ１２８及びＵＬ１３０に相同であるＲｈＣＭＶ遺伝子を、単独で欠失（ΔＵＬ１２８−ＵＬ１３０）又はＨＣＭＶ  ＵＬ１４６及びＵＬ１４７に相同である６個のＲｈＣＭＶ遺伝子のファミリーと組み合せて欠失（ΔＵＬ１２８−ＵＬ１３０＋ΔＵＬ１４６／７ファミリー）させた。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｄは、図示したコンストラクトを接種したアカゲザルにおける、全ＳＩＶｇａｇ（オーバーラップペプチドを用いて）又は図示したＭＨＣ−Ｅ若しくはＭＨＣ−ＩＩ拘束性「スーパートープ」ペプチドに対するＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示している。Ｔ細胞応答は、図示した接種後の日におけるＰＢＭＣのＩＣＳで測定した。図８Ａは、ＦＬ−ＲｈＣＭＶΔＲＬ１３ｇａｇを接種したアカゲザルのＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示している。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＦＬ−ＲｈＣＭＶΔＲＬ１３ｇａｇΔＵＬ１２８−ＵＬ１３０を接種したアカゲザルのＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示している。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＦＬ−ＲｈＣＭＶΔＲＬ１３ｇａｇΔＵＬ１２８−ＵＬ１３０ΔＵＬ１４６（３）を接種したアカゲザルのＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示している。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ＦＬ−ＲｈＣＭＶΔＲＬ１３ｇａｇΔＵＬ１２８−ＵＬ１３０ΔＵＬ１４７（６）を接種したアカゲザルのＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示している。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｃは、図示したコンストラクトを接種したアカゲザルにおける、全ＳＩＶｇａｇ（オーバーラップペプチドを用いて）又は図示したＭＨＣ−Ｅ若しくはＭＨＣ−ＩＩ拘束性「スーパートープ」ペプチドに対するＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示している。Ｔ細胞応答は、図示した接種後の日におけるＰＢＭＣのＩＣＳで測定した。図９Ａは、ＦＬ−ＲｈＣＭＶΔＲＬ１３ｇａｇΔＵＬ１２８−ＵＬ１３０ＨＣＭＶＵＬ１４６−ＵＬ１４７を接種したアカゲザルのＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＦＬ−ＲｈＣＭＶΔＲＬ１３ｇａｇΔＵＬ１２８−ＵＬ１３０ＨＣＭＶＵＬ１４６を接種したアカゲザルのＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示している。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＦＬ−ＲｈＣＭＶΔＲＬ１３ｇａｇΔＵＬ１２８−ＵＬ１３０ＨＣＭＶＵＬ１４７を接種したアカゲザルのＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示している。
【図１０】図１０は、ｇａｌＫ組換え（galK recombination）を経るＲｈＣＭＶ  Ｒｈ１５６／Ｒｈ１０８  ｍｉＲ−１２６−３ｐ変異体ウイルスの生成の概略図を示している。Ｒｈ１５６及びＲｈ１０８は、それぞれ、必須ＨＣＭＶ遺伝子ＵＬ１２２（ＩＥ２）及びＵＬ７９のＲｈＣＭＶホモログである。
【図１１】図１１は、図示した細胞型（ＰＢＭＣから得たＣＤ１４＋単球由来であり、ｍ−ＣＳＦの存在下で１０日間培養した、アカゲザル肺線維芽細胞、アカゲザル臍静脈内皮細胞、アカゲザルマクロファージ）中でのｍｉＲ−１２６−３ｐ発現を示す棒グラフである。ｍｉＲ発現は、１０ｎｇのＲＮＡからのｑＰＣＲにより測定した。複製数は、標準曲線により決定した。
【図１２】図１２は、ｍｉＲ−１２６−３ｐ模倣体（“＋ｍｉＲ−１２６”）若しくはコントロールｍｉＲＮＡ（“＋Ｎｅｇ”）でトランスフェクションされたアカゲザル線維芽細胞中における、ＲｈＣＭＶ  ６８−１  ＲＴＮ  Ｒｈ１５６／Ｒｈ１０８  ｍｉＲ−１２６−３ｐ（“６８−１  ｍｉＲ−１２６”）ウイルス又はＲｈＣＭＶ  ６８−１  ＲＴＮ  Ｒｈ１５６／Ｒｈ１０８  ｍｉＲ−１２６変異体（“６８−１  ｍｉＲ−１２６ｍｕｔ”）ウイルスを用いた多段階増殖曲線を示す２種類のプロットのセットを示している。６８−１株ＲｈＣＭＶは、ＨＣＭＶ  ＵＬ１２８及びＵＬ１３０のみならずＵＬ１４６及びＵＬ１４７のホモログを欠いている。ＲＴＮは、ＥＦ１ａプロモーターを介して発現されてＲｈＣＭＶ遺伝子Ｒｈ２１１に挿入されるＳＩＶｍａｃ２３９のｒｅｖタンパク質、ｔａｔタンパク質及びｎｅｆタンパク質の融合タンパク質と等しい。このウイルスは、Ｒｈ１５６及びＲｈ１０８それぞれの３’−非翻訳領域内のｍｉｒ１２６−３ｐに関する４つのターゲティング配列を含有する。
【図１３】図１３は、内皮細胞中における、ＲｈＣＭＶ  ６８−１．２  Ｒｈ１５６／Ｒｈ１０８  ｍｉＲ−１２６−３ｐ（“６８−１．２  ｍｉＲ−１２６”）ウイルス又はＲｈＣＭＶ  ６８−１  Ｒｈ１５６／Ｒｈ１０８  ｍｉＲ−１２６変異体（“６８−１．２  ｍｉＲ−１２６ｍｕｔ”）ウイルスを用いた多段階増殖曲線を示す２種類のプロットのセットを示している。６８−１．２株は、異なるＲｈＣＭＶ株のＵＬ１２８及びＵＬ１３０ホモログを含有し、ＵＬ１４６及びＵＬ１４７ホモログを欠失している。このウイルスは、Ｒｈ１５６及びＲｈ１０８それぞれの３’−非翻訳領域内のｍｉｒ１２６−３ｐに関する４つのターゲティング配列を含有する。
【図１４】図１４は、６８−１  ＲｈＣＭＶｍｉＲ１２６／ＳＩＶｇａｇを接種したアカゲザル（ＲＭ）におけるＳＩＶｇａｇ特異Ｔ細胞の頻度と、ＳＩＶｇａｇ特異ＣＤ８＋  Ｔ細胞の会合したエピトープターゲティング及びＭＨＣ拘束性とを示している。６８−１株ＲｈＣＭＶは、ＨＣＭＶ  ＵＬ１２８及びＵＬ１３０のみならずＵＬ１４６及びＵＬ１４７のホモログを欠いている。ＳＩＶｍａｃ２３９のＳＩＶｇａｇは、ＥＦ１ａプロモーターを介して発現されてＲｈＣＭＶ遺伝子Ｒｈ２１１に挿入される。このウイルスは、Ｒｈ１５６及びＲｈ１０８それぞれの３’−非翻訳領域内のｍｉｒ１２６−３ｐに対する４つのターゲティング配列を含有する。  図１４の上図は、６８−１  ＲｈＣＭＶｍｉｒ１２６／ＳＩＶｇａｇを接種した２匹のＲＭにおいて、経時的に測定したＳＩＶｇａｇ特異Ｔ細胞の頻度を示している。上図左は、４アミノ酸がオーバーラップし、ＳＩＶｇａｇタンパク質全体をカバーする、１２５個のオーバーラップ１５ｍｅｒペプチドのプールに対する、各ＲＭにおけるＳＩＶｇａｇに対するＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示している。上図中央は、ＭＨＣ−Ｅによって提示される２つのＳＩＶｇａｇスーパートープペプチドＧａｇ６９及びＧａｇ１２０に対する、各ＲＭにおけるＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示している。上図右は、ＭＨＣ−ＩＩによって提示される２つのＳＩＶｇａｇスーパートープペプチドＧａｇ５３及びＧａｇ７３に対する、各ＲＭにおけるＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示している。図１４の下図は、ＳＩＶｇａｇ特異ＣＤ８＋  Ｔ細胞のエピトープターゲティング及びＭＨＣ拘束性を示しており、特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を生じる個々のペプチドをボックスで図示している。抗−汎ＭＨＣ−Ｉ  ｍＡｂであるＷ６／３２と、ＭＨＣ−Ｅを阻害するペプチドＶＬ９と、ＭＨＣ−ＩＩを阻害するペプチドＣＬＩＰとによる阻害によって決定されたとおりに、ＭＨＣ拘束性を指定するものである模様をボックスに施すようにしている。ＭＨＣ−Ｉａ、ＭＨＣ−Ｅ及びＭＨＣ−ＩＩによる拘束性は、それぞれ、Ｗ６／３２単独（黒）、Ｗ６／３２及びＶＬ９単独（中程度の塗りつぶし）、及びＣＬＩＰ単独（明るい塗りつぶし）が阻害している、＞９０％の応答に基づくものとしたが、これら基準を満たさなかった応答については不定（白）とした。
【図１５】図１５は、４つのアミノ酸がオーバーラップしている１５ｍｅｒ  ＳＩＶｇａｇペプチド（ＳＩＶｇａｇ  ＯＲＦ）で又はＭＨＣ−ＩＩ若しくはＭＨＣ−Ｅスーパートープに対応する図示したＳＩＶｇａｇペプチドで刺激した、ＲｈＣＭＶ株６８−１ｍｉＲ１２６／ｇａｇベクターをワクチン接種したアカゲザルからのＰＢＭＣを示すフローサイトメトリーのプロットのセットを示している。ＭＨＣ−Ｅ又はＭＨＣ−ＩＩ結合性ＳＩＶｇａｇペプチドに応答するＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＣＤ６９及びＴＮＦ−α発現を介して同定した。
【図１６】図１６は、ｇａｌＫ組換えを経るＲｈＣＭＶ  Ｒｈ１５６／Ｒｈ１０８  ｍｉＲ−１２６−３ｐ／ｍｉＲ−１４２−３ｐ変異体ウイルスの生成の概略図を示している。Ｒｈ１５６及びＲｈ１０８は、それぞれ、必須ＨＣＭＶ遺伝子ＵＬ１２２（ＩＥ２）及びＵＬ７９のＲｈＣＭＶホモログである。
【図１７】図１７は、６８−１  ＲｈＣＭＶｍｉｒ１２６ｍｉｒ１４２／ＳＩＶｇａｇを接種したアカゲザル（ＲＭ）のＳＩＶｇａｇ特異Ｔ細胞の頻度と、ＳＩＶｇａｇ特異ＣＤ８＋  Ｔ細胞の会合したエピトープターゲティング及びＭＨＣ拘束性とを示している。６８−１株ＲｈＣＭＶは、ＨＣＭＶ  ＵＬ１２８及びＵＬ１３０のみならずＵＬ１４６及びＵＬ１４７のホモログを欠いている。ＳＩＶｍａｃ２３９のＳＩＶｇａｇは、ＥＦ１ａプロモーターを介して発現されてＲｈＣＭＶ遺伝子Ｒｈ２１１に挿入される。このウイルスは、Ｒｈ１５６及びＲｈ１０８それぞれの３’−非翻訳領域内の、ｍｉｒ１２６−３ｐに対する２つのターゲティング配列と、骨髄細胞特異ｍｉｒ１４２−３ｐに対する２つのターゲティング配列とを含有する。  図１７の上図は、６８−１  ＲｈＣＭＶｍｉｒ１２６ｍｉｒ１４２／ＳＩＶｇａｇを接種した１匹のＲＭにおいて、経時的に測定したＳＩＶｇａｇ特異Ｔ細胞の頻度を示している。図１７の上図左は、４アミノ酸がオーバーラップし、ＳＩＶｇａｇタンパク質全体をカバーする、１２５個のオーバーラップ１５ｍｅｒペプチドのプールに対する、各ＲＭにおけるＳＩＶｇａｇに対するＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示している。図１７の上図中央は、ＭＨＣ−Ｅによって提示される２つの共通のＳＩＶｇａｇペプチドに対する、各ＲＭにおけるＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示している。図１７の上図右は、ＭＨＣ−ＩＩによって提示される２つの共通のＳＩＶｇａｇペプチドに対する、各ＲＭにおけるＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示している。図１７の下図は、ＳＩＶｇａｇ特異ＣＤ８＋  Ｔ細胞のエピトープターゲティング及びＭＨＣ拘束性を示しており、特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を生じる個々のペプチドをボックスで図示している。抗−汎ＭＨＣ−Ｉ  ｍＡｂであるＷ６／３２と、ＭＨＣ−Ｅを阻害するペプチドＶＬ９と、ＭＨＣ−ＩＩを阻害するペプチドＣＬＩＰとによる阻害によって決定されたとおりに、ＭＨＣ拘束性を指定するものである模様をボックスに施すようにしている。ＭＨＣ−Ｉａ、ＭＨＣ−Ｅ及びＭＨＣ−ＩＩによる拘束性は、それぞれ、Ｗ６／３２単独（白）、Ｗ６／３２及びＶＬ９単独（４５度ハッチング）並びにＣＬＩＰ単独（水平ハッチング）が阻害している、＞９０％の応答に基づくものとしたが、これら基準を満たさなかった応答については不定（黒）とした。これら結果は、６８−１  ＲｈＣＭＶ（＝ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６、ＵＬ１４７のホモログを欠失している）のｍｉｒ１２６ｍｉｒ１４２／ＳＩＶｇａｇが、ＭＨＣ−Ｉａ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞のみを誘発するということを示唆している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下の発明を実施するための形態においては、その一部を形成し、実行され得る実施形態を説明するものとして示されている、添付の図面を参照するものである。他の実施形態を利用してもよく、またこの開示の範囲を逸脱することなく構造的又は論理的な変更を行うことができるということを理解されたい。したがって、以下の発明を実施するための形態は、限定的な意味で捉えるべきでないものであり、実施形態の範囲は、添付の請求項とその均等物によって規定される。
【００１５】
実施形態の理解の際に有用となり得るような方法で、複数の別個の操作として様々な操作が順次記載され得るが、記載の順序については、これら操作が順序依存的であるということを暗示するものとして解釈されるべきでない。
【００１６】
説明には、上方／下方、後／前、及び、上／下等、遠近法に基づく記載を用いることがある。こうした記載は、単に議論を促すために用いるものであり、開示の実施形態の適用を限定することを意図するものではない。
【００１７】
「連結（結合）した」という語と「接続した」という語とは、それらの派生語と共に用いられ得る。これらの語は、互いに同義として意図されるものではないということを理解されたい。むしろ特定の実施形態においては、「接続した」は、２以上の要素が直接、互いに物理的又は電気的に接触しているということを示すために用いられ得る。「連結（結合）した」は、２以上の要素が直接、物理的又は電気的に接触していることを意味することができるが、「連結（結合）した」はまた、２以上の要素が、直接、互いに接続していないが、それでもなお互いに協働又は相互作用しているということを意味することもできる。
【００１８】
この明細書では、「Ａ／Ｂ」という形態又は「Ａ及び／又はＢ」という形態の句は、（Ａ）、（Ｂ）又は（Ａ及びＢ）を意味する。この明細書では、「Ａ、Ｂ及びＣのうちの少なくとも１つ」という形態の句は、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ａ及びＢ）、（Ａ及びＣ）、（Ｂ及びＣ）又は（Ａ、Ｂ及びＣ）を意味する。この明細書では、「（Ａ）Ｂ」という形態の句は、（Ｂ）又は（ＡＢ）を意味し、すなわちＡは任意の構成要素である。
【００１９】
この明細書では、「一実施形態（ある実施形態）」又は「実施形態」という語を用い得、それぞれ、同一若しくは異なる実施形態のうちの１つ又は複数を指し得る。また、実施形態に関して用いられる「含む・備える（comprising）」、「含む（including）」、「有する（having）」等の語は、同義である。
【００２０】
本明細書の実施形態では、組換えＣＭＶベクターであって、少なくとも１つの異種タンパク質抗原と、ＣＭＶの増殖に必須又は該増殖を増強しているＣＭＶ遺伝子に操作可能に連結している内皮細胞系列の細胞によって発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡに対して特異的である少なくとも１つのｍｉｃｒｏＲＮＡ認識配列とをコードする核酸を含むがこれに限定されない、組換えＣＭＶベクターを提供する。このベクターは、活性ＵＬ１２８タンパク質若しくはそのオーソログ、活性ＵＬ１３０タンパク質若しくはそのオーソログ、又は、活性ＵＬ１４６／１４７タンパク質若しくはそのオーソログを発現しない。また、本明細書では、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ベクターであって、少なくとも１つの異種タンパク質抗原をコードする核酸を含み、活性ＵＬ１２８タンパク質若しくはそのオーソログ、活性ＵＬ１３０タンパク質若しくはそのオーソログ、又は、活性ＵＬ１４６／１４７タンパク質若しくはそのオーソログを発現しない組換えＨＣＭＶベクターを含むがこれに限定されない、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ベクターも提供する。対象において異種抗原に対する免疫応答を生成する方法等である、この新規の組換えＣＭＶベクターを使用する方法が、さらに開示される。
Ｉ．用語
【００２１】
特に記載がない限り、技術用語は従来の慣習に従って使用する。
【００２２】
本明細書に引用する全ての公報、特許、特許出願、インターネットサイト、及び、受託番号／データベース配列（ポリヌクレオチド及びポリペプチドの両配列を含む）は、あたかも個々の独立の公報、特許、特許出願、インターネットサイト、又は、受託番号／データベース配列が参照によって組み入れられるようにして具体的にそれぞれが記載されているかのようであるのと同等に、本明細書においてその全体を参照により本明細書に組み入れられたものとする。
【００２３】
本明細書に記載のものと類似又は均等である方法及び材料を、この開示の実施又は試験に用いることができるが、好適な方法及び材料について以下に記載する。さらに、材料、方法及び実施例は、単なる説明であり、限定することを意図するものではない。この開示の様々な実施形態の検討を促進するために、以下に特定の用語を説明する。
【００２４】
抗原：本明細書で用いる場合、「抗原」又は「免疫原」という語は、区別なく用いるものであり、対象において免疫応答を誘導することができるような、典型的にはタンパク質である物質を指す。この語はまた、対象に対して投与されると（直接、又は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列若しくはベクターを対象に投与することによって）、タンパク質がそのタンパク質に対する体液型及び／又は細胞型の免疫応答を誘起することができるという意味では、免疫学的に活性であるタンパク質を指すものでもある。
【００２５】
投与：本明細書で用いる場合、「投与」という語は、任意の有効な経路で、外来性抗原を含む効果量のＣＭＶベクターを含む組成物等である試薬を、対象に供給する又は与えることを意味する。例示的な投与経路には、注射（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内及び静脈内等）、経口、舌下、直腸、経皮、鼻腔内、膣内、及び、吸入の経路が含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
効果量：本明細書で用いる場合、「効果量」という語は、異種抗原、又は、ＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識するトランスフェクションされるＣＤ８＋  Ｔ細胞を含むＣＭＶベクター等である試薬の量であって、症状若しくは疾患の前兆若しくは徴候を軽減するか取り除く、又は、抗原に対する免疫応答を誘導する等である、所望の応答を生じさせるのに十分である量を指すものである。一部の実施形態においては、「効果量」は、１種若しくは複数種の症状及び／又は障害若しくは疾患のうちいずれかについての根底にある原因を治療（予防を含む）する量である。効果量は、治療効果量であり得、それは特定の疾患若しくは症状の１種又は複数種の前兆又は徴候、例えば感染症、癌若しくは自己免疫疾患に関連した１種又は複数種の前兆又は徴候等が発達するのを防止するような量を含む。
【００２７】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ：本明細書で用いる場合、「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」という語は、遺伝子発現の制御に関与する、主要なクラスの生体分子を指す。例えばヒトの心臓、肝臓又は脳において、ｍｉＲＮＡは、組織の特定又は細胞系列の決定において役割を果たしている。さらに、ｍｉＲＮＡは、初期発生、細胞増殖及び細胞死及びアポトーシス、並びに、脂肪代謝を含めた種々のプロセスに影響を与える。大量のｍｉＲＮＡ遺伝子、多様な発現パターン、及び、豊富な潜在的なｍｉＲＮＡ標的は、ｍｉＲＮＡが、遺伝子の多様性の重要な源であり得るということの示唆である。
【００２８】
成熟ｍｉＲＮＡは、典型的に、ｍｉＲＮＡに対して相補的である配列を含むｍＲＮＡの発現を調節する、１８〜２５ヌクレオチドの非コードＲＮＡである。これら小ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡの安定性及び／又は翻訳を調節することによって遺伝子発現を制御することが知られている。例えばｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲと結合して翻訳を抑制する。ｍｉＲＮＡはまた、標的ｍＲＮＡと結合して、ＲＮＡｉ経路を介して遺伝子抑制を媒介することもできる。ｍｉＲＮＡはまた、クロマチン凝縮を引き起こすことによって遺伝子発現を調節することもできる。
【００２９】
ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ転写物上のどこかでｍｉＲＮＡと直接塩基対を作り相互作用する任意の配列として規定される、ｍｉＲＮＡ認識配列（ＭＲＥ）と結合することによって、１つ又は複数の特異的なｍＲＮＡ分子の翻訳を抑制する。しばしば、ＭＲＥはｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に存在するが、それはまた、コード配列内又は５’ＵＴＲ内にも存在し得る。ＭＲＥは、ｍｉＲＮＡに対して完全に相補的である必要はなく、通常、ｍｉＲＮＡに対して相補的である２〜３の塩基のみを有し、またそれらの相補性の塩基内に１つ又は複数のミスマッチをしばしば含有する。ＭＲＥは、ＭＲＥが操作可能に連結されている遺伝子（生体内での増殖に必須又は該増殖を増強しているＣＭＶ遺伝子等）の翻訳が、ＲＩＳＣ等であるｍｉＲＮＡ抑制機序によって抑制されるのに十分であるｍｉＲＮＡによって結合することが可能である任意の配列とすることができる。
【００３０】
変異：本明細書で用いる場合、「変異」という語は、核酸又はポリペプチドの配列内における、正常なコンセンサス配列又は「野生型」配列との何らかの相違を指す。変異体は、変異を含む任意のタンパク質又は核酸配列である。さらに、変異をもつ細胞又は有機体はまた、変異体とも称され得る。
【００３１】
コード配列の変異の一部のタイプには、点変異（個々のヌクレオチド又はアミノ酸における相違）、サイレント変異（アミノ酸変化をもたらさないヌクレオチドにおける相違）、欠失（遺伝子のコード配列全体の欠失も含めて、１つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸を欠いているという相違）、フレームシフト変異（３で割り切れない数のヌクレオチドの欠失がアミノ酸配列の変更をもたらすような相違が含まれる。アミノ酸内で相違をもたらす変異はまた、アミノ酸置換変異とも称し得る。アミノ酸置換変異は、アミノ酸配列内の特定の位置における、野生型と比べたアミノ酸の変化で説明され得る。
【００３２】
ヌクレオチド配列又は核酸配列：「ヌクレオチド配列」及び「核酸配列」という語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）配列を指すものであって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡ複合体、又は、合成核酸を含むがこれらに限定されない。核酸は、一本鎖であり得、又は、一部若しくは完全に二本鎖（二重鎖（duplex））であり得る。二重鎖核酸は、ホモ二重鎖又はヘテロ二重鎖であり得る。
【００３３】
操作可能に連結：本明細書で「操作可能に連結」という語を用いる場合、第一の核酸配列が、第二の核酸配列に対してそれが影響を及ぼすような形で配置されるとき、第一の核酸配列は、第二の核酸配列に操作可能に連結されているものである。例えば、ｍｉＲＮＡがＭＲＥに結合することでコード配列の発現が抑制されるものであれば、ＭＲＥは、それが抑制する該コード配列に操作可能に連結されている。操作可能に連結されたＤＮＡ配列同士は、隣接し得るか、又は、それらはある距離を隔てて作用できる。
【００３４】
プロモーター：本明細書で用いる場合、「プロモーター」という語は、核酸の転写を支配する複数の核酸制御配列のいずれかを指し得る。典型的には、真核生物プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーター、ＴＡＴＡ要素、又は１つ若しくは複数の転写因子によって認識されるその他の特異的なＤＮＡ配列の場合等については、転写開始部位近傍に必要な核酸配列を含む。プロモーターによる発現は、エンハンサー要素又はリプレッサー要素によってさらに調節され得る。多数の例のプロモーターが利用可能であり、当業者にとって周知である。特定のポリペプチドをコードする核酸配列に操作可能に連結するプロモーターを含む核酸を、発現ベクターと称し得る。
【００３５】
組換え体：本明細書で用いる場合、核酸又はポリペプチドに関連の「組換え体」という語は、天然に生じるものではない配列や、又は、例えば異種抗原を含むＣＭＶベクターである、配列のうちの２以上の異なるように分割されたセグメントを人工的に結合することによって作製される及び／若しくは生体内での増殖に必須又は該増殖を増強しているＣＭＶ遺伝子に操作可能に連結されたｍｉＲＮＡ応答配列（response element）を付加することによる複製欠損性が作製されている配列を有する組換え体を指す。この人工的な結合はしばしば、化学合成によって、又は、より一般的には遺伝子工学技術等による核酸の単離された配列の人工的な操作によって成し遂げられる。組換えポリペプチドはまた、天然源のポリペプチドではない宿主有機体に移動される組換え核酸（例えば、異種抗原を含むＣＭＶベクターを形成するポリペプチドをコードする核酸）を含む、組換え核酸を用いて作製されたポリペプチドを指すこともできる。
【００３６】
複製欠損性：本明細書で用いる場合、「複製欠損性」ＣＭＶは、宿主細胞に入ると、ウイルス複製を受けることができないか、そのゲノムを複製するウイルスの能力が有意に制限されることによりウイルス粒子が産生されるか、播種欠損（dissemination-deficient）であるか、又は、伝播欠損（spread-deficient）であるようなウイルスである。例えば、播種欠損である複製欠損性ウイルスは、それらのゲノムを複製することはできるものの、他の細胞を感染させることはできないものであり、これは感染した細胞からウイルス粒子が放出されないこと又は非感染性であるウイルス粒子が放出されることのいずれかの理由によるものである。別の例では、伝播欠損である複製欠損性ウイルスは、それらのゲノムを複製することはでき、また別の細胞を感染させることもでき得るものの、感染した宿主から分泌されず、そのためにウイルスは宿主から宿主へと伝播することができない。一部の実施形態においては、複製欠損性ＣＭＶは、ウイルス複製に必須である１つ若しくは複数の遺伝子（「必須遺伝子」）又は最適複製に必要である１つ若しくは複数の遺伝子（「増強性遺伝子（augmenting gene）」）の発現の欠如をもたらす変異を含むＣＭＶである。ＣＭＶの必須遺伝子及び増強性遺伝子は、この技術分野で説明されており（特に、米国特許出願公開第２０１３／０１３６７６８号、これは参照により本明細書に組み入れられる）、本明細書において開示される。
【００３７】
薬剤的に許容できるキャリア：本明細書で用いる場合、使用における「薬剤的に許容できるキャリア」は、従来のものである。Remington’s Pharmaceutical Sciences, by E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition, 1995には、本明細書で開示する組成物の医薬デリバリーに好適である組成物及び剤形が記載されている。概して、キャリアの性質は、採用される特定の投与形態に依存することとなる。例えば、非経口製剤は通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、ブドウ糖水溶液（aqueous dextrose）、グリセロール等の薬剤的及び生理的に許容できる液体を担体として含む注射用液体を含む。固形組成物（粉剤、錠剤、タブレット剤又はカプセル剤等）では、従来の無毒性固体キャリアとして、例えば医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン又はステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。投与されようとする医薬組成物は、生物学的に中性であるキャリアに加えて、湿潤剤又は乳化剤、防腐剤及びｐＨ緩衝剤等である無毒性の補助物質を少量含有してもよく、例えば酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレートである。
【００３８】
ポリヌクレオチド：本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」という語は、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のポリマーを指す。ポリヌクレオチドは、４つの塩基、アデニン、シトシン、グアニン及びチミン／ウラシル（ウラシルはＲＮＡで用いられる）から作製されている。核酸からのコード配列は、核酸によってコードされたタンパク質の配列を示している。
【００３９】
ポリペプチド：「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「アミノ酸配列」という語は、本明細書において区別なく使用し、あらゆる長さのアミノ酸残基のポリマーを指すものである。当該ポリマーは、直鎖状又は分枝鎖状であり得、改変アミノ酸又はアミノ酸アナログを含み得、またアミノ酸以外の化学部分（chemical moiety）によって中断されていてもよい。これら語はまた、天然に、又は、例えばジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、若しくは、標識若しくは生理活性成分との複合化等であるその他の操作若しくは修飾である介入によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。
【００４０】
配列同一性／類似性：本明細書で用いる場合、２つ以上の核酸配列間若しくは２つ以上のアミノ酸配列間における同一性／類似性は、配列間における同一性又は類似性の点で表現されている。配列同一性は、パーセント同一性で測定され得、割合が高いほど、配列の同一性が高い。配列類似性は、パーセント同一性又はパーセント類似性で測定され得（保存的なアミノ酸置換を考慮に入れる）、割合が高いほど、配列の類似性が高い。有意に高い配列同一性と、互いに同一又は類似である機能も有するポリペプチド又はそのタンパク質ドメイン（例えば、異なる種において同一の機能を果たすタンパク質又はタンパク質の機能若しくはその規模が変わらないタンパク質の変異形態）を、「ホモログ」と称し得る。
【００４１】
比較のための配列のアラインメント法は、この技術分野で周知である。様々なプログラムとアラインメントアルゴリズムが、Smith & Waterman, Adv  Appl  Math  2, 482 (1981)；Needleman & Wunsch, J  Mol  Biol 48, 443 (1970)；Pearson & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 85, 2444 (1988)；Higgins & Sharp, Gene 73, 237-244 (1988)；Higgins & Sharp, CABIOS 5, 151-153 (1989)；Corpet et al, Nuc Acids Res 16, 10881-10890 (1988)；Huang et al, Computer App Biosci 8, 155-165 (1992)及び、Pearson et al, Meth Mol Bio 24, 307-331 (1994)に記載されている。さらに、Altschul et al, J Mol Biol 215, 403-410 (1990)には、配列アラインメント法及び相同性の算出についての詳細な検討が提示されている。
【００４２】
配列解析プログラム、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘに関連して用いられる、ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（上記のAltschul et al, (1990)）が、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ、米国国立医学図書館、メリーランド州２０８９４、ベセスダ、第３８Ａビル、部屋番号８Ｎ８０５）を含めた複数の提供元及びインターネット上で利用可能である。さらなる情報は、ＮＣＢＩウェブサイトに見ることができる。
【００４３】
ＢＬＡＳＴＮを用いて核酸配列を比較し、一方、ＢＬＡＳＴＰを用いてアミノ酸配列を比較する。比較した２つの配列が相同性を共有していれば、その場合指定の出力ファイルでは、並列された配列として相同であるそれらの領域が提示されることとなる。比較した２つの配列が相同性を共有していなければ、その場合指定の出力ファイルでは、並列された配列は提示されない。
【００４４】
並列されると、両配列における同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基が存在する位置の数を計数することにより、一致数が決定される。パーセント配列同一性は、一致数を、同定された配列内に示される配列の長さ又は関節単位での長さ（articulated length）（例えば、同定された配列内に示される配列のうちの連続する１００個のヌクレオチド又はアミノ酸残基）のいずれかで除算した後、得られた値に１００を乗算して求める。例えば、１１５４個のヌクレオチドを有する試験配列と並列したときに一致数が１１６６である核酸配列は、該試験配列に対して７５．０パーセントが同一である（１１６６÷１５５４×１００＝７５．０）。パーセント配列同一性の値は、小数点第１位に丸める。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３及び７５．１４は四捨五入で切り捨てて７５．１になり、一方、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８及び７５．１９は切り上げて７５．２になる。長さの値は、常に整数であることとなる。別の例では、以下の通り同定された配列のうちの連続する２０個のヌクレオチドと並列する、２０ヌクレオチド領域を含有する標的配列は、その同定された配列に対して７５パーセント配列同一性を共有する領域を含有する（すなわち、１５÷２０×１００＝７５）。
【００４５】
約３０個のアミノ酸より長いアミノ酸配列同士の比較では、デフォルトパラメータ（ギャップ存在コストを１１、残基当たりのギャップコストを１）に設定されたデフォルトのＢＬＯＳＵＭ６２行列を用いて、Ｂｌａｓｔ  ２配列関数を採用する。ホモログは典型的に、ｎｒデータベース、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース及びＰａｔｅｎｔｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ等のデータベースと共に、ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｂｌａｓｔ  ２．０でギャップありのｂｌａｓｔｐを用いることにより、あるアミノ酸配列との完全長アラインメントについて計数された、少なくとも７０％の配列同一性を所有することを特徴とする。ｂｌａｓｔｎプログラムを用いて検索されるクエリは、ＤＵＳＴでフィルタリングされる（Hancock & Armstrong, Comput Appl Biosci 10, 67-70 (1994)）。他のプログラムではＳＥＧが用いられる。さらに、手動アラインメントを行ってもよい。さらに高い類似性をもつタンパク質は、この方法で評価すると高いパーセント同一性を示すこととなり、例えば、あるタンパク質に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を示す。
【００４６】
短いペプチド（約３０個未満のアミノ酸）を並列する場合には、アラインメントは、Ｂｌａｓｔ  ２配列関数を用いて、デフォルトパラメータ（オープンギャップペナルティを９、拡張ギャップペナルティを１）に設定されるＰＡＭ３０行列を採用して行われる。参照配列に対してさらに高い類似性をもつタンパク質は、この方法で評価すると高いパーセント同一性を示すこととなり、例えば、あるタンパク質に対して少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を示す。全配列未満の配列が配列同一性に関して比較される場合、ホモログは典型的に、１０〜２０個のアミノ酸という短い範囲について少なくとも７５％の配列同一性を所有することとなり、参照配列に対するそれらの同一性に応じて、少なくとも８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を所有し得る。こうした短い範囲についての配列同一性を決定する方法は、ＮＣＢＩウェブサイトに記載されている。
【００４７】
２つの核酸分子が密接に関連していることを示す指標の一つに、上記したように、２つの分子がストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズするということがある。それにもかかわらず、高い同一性を示さない核酸配列同士は、遺伝子コードの縮重によって、同一の又は類似の（保存された）アミノ酸配列をコードすることができる。この縮重で、核酸配列内で変化が生じ得、実質的に同一のタンパク質を全てがコードする複数の核酸分子を産生し得る。こうした相同する核酸配列は、例えば、あるタンパク質をコードする核酸に対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を所有することができる。
【００４８】
対象（subject）：本明細書で用いる場合、「対象」という語は、多細胞性の脊椎生体、ヒト及び非ヒト哺乳動物の両方を含むカテゴリを指す。
【００４９】
スーパートープ（supertope）：本明細書で用いる場合、「スーパートープ」又は「スーパートープペプチド」という語は、ＭＨＣハプロタイプに関係なく、すなわち所与のＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩの対立遺伝子が存在しても存在しなくても、集団のうち９０％超でＴ細胞により認識されるエピトープ又はペプチドを指す。
【００５０】
治療：本明細書で用いる場合、「治療」という語は、疾患の前兆若しくは徴候又は病状を改善する介入を指す。本明細書で用いる場合、疾患、病状又は徴候に関連する「治療」、「治療する」及び「治療すること」という語はまた、治療の観察可能である任意の有益な効果を指す。有益な効果は、例えば、感受性が強い対象における疾患の臨床症状の発症の遅延、疾患の一部又は全ての臨床症状についての重症度の軽減、疾患の進行の遅れ、疾患の再発数の減少、対象の健康全般若しくは幸福度の改善によって、又は、特定の疾患に対して特異的であるこの技術分野で周知の他のパラメータによって証明され得る。予防的治療は、疾患の前兆を呈していない又はごく初期の前兆を呈する対象に対して、病態が進行するリスクを軽減する目的で施される治療である。治療的治療は、疾患の前兆及び徴候が現れた後の対象に施される治療である。
ＩＩ．組換えＣＭＶベクターとその使用方法
【００５１】
本明細書においては、有機体を繰り返し感染させることができるヒト又は動物のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクターを開示する。ＣＭＶベクターは、異種タンパク質抗原をコードし、また活性ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６及びＵＬ１４７タンパク質の発現を欠く、核酸配列を含む。ベクターは、活性ＵＬ４０、ＵＳ２７及びＵＳ２８遺伝子を含有する。一部の実施形態においては、ＣＭＶベクターは、ヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）ベクター、カニクイザルＣＭＶ（ＣｙＣＭＶ）ベクター又はアカゲザルＣＭＶ（ＲｈＣＭＶ）ベクターである。
【００５２】
また、本明細書においては、上記した修飾の全てを含み、また内皮細胞によって発現されるｍｉＲＮＡの存在下において発現を抑制するｍｉＲＮＡ認識配列（ＭＲＥ）の役割を果たす核酸配列をさらに含むＣＭＶベクターも開示する。内皮細胞によって発現されるこうしたｍｉＲＮＡの例としては、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２２１／２２２、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−２９６及びｍｉＲ−３２８が挙げられる（Wu F, Yang Z, Li G. Role of specific microRNAs for endothelial function and angiogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 2009;386(4):549. doi:10.1016/j.bbrc.2009.06.075.)；参照により本明細書に組み入れられる）。ＭＲＥは、生体内でのＣＭＶの増殖に必須又は該増殖を増強しているＣＭＶ遺伝子に操作可能に連結している。こうした遺伝子の例としては、ＩＥ２及びＵＬ７９、又はそのオーソログが挙げられる。１、２、３又はそれ以上のＣＭＶ遺伝子はそれぞれ、ベクター内の１、２、３又はそれ以上のＭＲＥに操作可能に連結され得る。
【００５３】
一部の実施形態においては、このＭＲＥは、内皮細胞によって発現されるｍｉＲＮＡの存在下において発現を抑制する任意のｍｉＲＮＡ認識配列であり得る。一部の実施形態においては、ベクターのＭＲＥは、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２２１／２２２、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−２９６及びｍｉＲ−３２８のうちの１つ又は複数の存在下において発現を抑制する。一部の実施形態においては、ベクターのＭＲＥは、ｍｉＲ−１２６−３ｐ（配列番号１）の存在下において発現を抑制する。一部の実施形態においては、ベクターのＭＲＥは、配列番号２の配列を含む。
【００５４】
一部の実施形態においては、本明細書で開示するＣＭＶベクターは、内皮細胞系列の細胞によって発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡの存在下において発現を抑制する第一のＭＲＥと、骨髄細胞系列の細胞によって発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡの存在下において発現を抑制する第二のＭＲＥとを含む。一部の実施形態においては、第一のＭＲＥは、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２２１／２２２、ｍｉＲ−３７８、及びｍｉＲ−２９６、及びｍｉＲ−３２８のうちの１つ又は複数の存在下において発現を抑制する。一部の実施形態においては、第一のＭＲＥは、ｍｉＲ−１２６−３ｐ（配列番号１）の存在下において発現を抑制する。一部の実施形態においては、ベクターの第一のＭＲＥは、配列番号２の配列を含む。一部の実施形態においては、第二のＭＲＥは、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ１４６ａ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−１２５のうちの１つ又は複数の存在下において発現を抑制する。一部の実施形態においては、第二のＭＲＥは、ｍｉＲ−１４２−３ｐ（配列番号３）の存在下において発現を抑制する。一部の実施形態においては、ベクターの第二のＭＲＥは、配列番号４の配列を含む。ｍｉＲ−１４２−３ｐの存在下において発現を抑制するＭＲＥを含むＣＭＶベクターは、例えば国際公開第２０１７／０８７９２１号に開示されており、その全体を参照により本明細書に組み入れられたものとする。
【００５５】
こうしたＭＲＥは、ｍｉＲＮＡの正確な相補体であり得る。あるいは、他の配列を、所与のｍｉＲＮＡに対するＭＲＥとして用いてもよい。例えば、ＭＲＥは配列から予測され得る。一例では、ｍｉＲＮＡは、ウェブサイトmicroRNA.org（www.microrna.org）で検索することができる。そして、ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的の一覧が列記されることとなる。例えば、以下のページ：http://www.microrna.org/microrna/getTargets.do?matureName=hsa-miR-142-3p&organism=9606は、２０１５年１０月６日に最終アクセスを行ったものであるが、ｍｉＲ−１４２−３ｐの推定のｍＲＮＡ標的が列記される。このページに列記された各標的については、「アラインメント詳細（alignment details）」にアクセスでき、推定のＭＲＥにアクセスできる。一部の実施形態においては、ベクターのＭＲＥは、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２２１／２２２、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−２９６及びｍｉＲ−３２８のうちの１つ又は複数の存在下において発現を抑制する。一部の実施形態においては、ベクターのＭＲＥは、ｍｉＲ−１２６−３ｐ（配列番号１）の存在下において発現を抑制する。さらなる実施形態においては、ベクターのＭＲＥは、ｍｉＲ−１４２−３ｐ（配列番号３）の存在下において発現を抑制し得る。一部の実施形態においては、ベクターのＭＲＥは、配列番号２のヌクレオチド配列を有する。さらなる実施形態においては、ベクターのＭＲＥは、配列番号４のヌクレオチド配列を有する。
【００５６】
当業者は、文献から、内皮細胞又はマクロファージ等の骨髄細胞において発現されたｍｉＲＮＡの存在下において抑制することを誘導することが予測される、検証された、推定の又は変異したＭＲＥ配列を選択することができる。一例としては、上記で参照したウェブサイトがある。当業者はその後、それによってレポーター遺伝子（蛍光タンパク質、酵素又は他のレポーター遺伝子等）が、構成的活性型プロモーター又は細胞特異プロモーター等のプロモーターによってなされる発現を有するような発現コンストラクトを獲得することができる。ＭＲＥ配列はその後、この発現コンストラクト内に導入され得る。発現コンストラクトは、適切な細胞内にトランスフェクトされ得、該細胞は、目的のｍｉＲＮＡでトランスフェクトされる。レポーター遺伝子の発現がないということは、ＭＲＥがｍｉＲＮＡの存在下において遺伝子発現を抑制しているということを示唆している。
【００５７】
病原体特異抗原は、任意のヒト病原体又は動物病原体から誘導できる。病原体は、ウイルス病原体であり得、抗原は、該ウイルス病原体由来のタンパク質であり得る。ウイルスには、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、カポジ肉腫ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ヒトパピローマウイルス、狂犬病ウイルス、風疹ウイルス、ヒトボカウイルス（Human bocavirus）、及びパルボウイルスＢ１９が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
病原体は、細菌性病原体であり得、また抗原は、該細菌性病原体由来のタンパク質であり得る。病原菌には、百日咳菌（Bordetella pertussis）、ライム病菌（Borrelia burgdorferi）、ウシ流産菌（brucella abortus）、イヌ流産菌（Brucella canis）、ヤギ流産菌（Brucella melitensis）、ブタ流産菌（Brucella suis）、カンピロバクタージェジュニ菌（Campylobacter jejuni）、クラミジア肺炎病原体（Chlamydia pneumoniae）、トラコーマ病原体（Chlamydia trachomatis）、オウム病クラミドフィラ（Chlamydophila psittaci）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、フェカリス菌（Enterococcus faecalis）、フェシウム菌（Enterococcus faecium）、大腸菌（Escherichia coli）、野兎病菌（Francisella tularensis）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、レジオネラ・ニューモフィラ菌（Legionella pneumophila）、レプトスピラ・インターロガンス（Leptospira interrogans）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、らい菌（Mycobacterium leprae）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、マイクロバクテリア・ウルセランス（Mycobacterium ulcerans）、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、斑点熱リケッチア（Rickettsia rickettsii）、チフス菌（Salmonella typhi）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ソンネ菌（Shigella sonnei）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、腐性ブドウ球菌（Staphylococcus saprophyticus）、Ｂ群溶血性レンサ球菌（Streptococcus agalactiae）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、コレラ菌（Vibrio cholera）及びペスト菌（Yersinia pestis）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
病原体は、寄生体であり得、抗原は、該寄生体病原体由来のタンパク質であり得る。寄生体は、アカントアメーバ、バベシア症、バランチジウム症、ブラストシストーシス（Blastocystosis）、コクシジウム（Coccidia）、二核アメーバ症、アメーバ症、ジアルジア症、イソスポーラ症、リーシュマニア症、原発性アメーバ髄膜脳炎（ＰＡＭ）、マラリア、リノスポリジウム症、トキソプラズマ症−寄生性肺炎、トリコモナス症、睡眠病及びシャガス病等である、原生動物又は疾患を引き起こす原生動物であり得るが、これらに限定されない。寄生体は、鉤虫症／鉤虫、アニサキス症、回虫−寄生性肺炎、回虫−ベイリスアスカリス症、サナダムシ−条虫症、肝吸虫症、Ｄｉｏｃｔｏｐｈｙｍｅ  ｒｅｎａｌｉｓ感染症、裂頭条虫症−サナダムシ、ギニア虫−メジナ虫症、エキノコックス症−サナダムシ、蟯虫−蟯虫症、肝吸虫−肝蛭症、肥大吸虫症−腸管寄生吸虫、顎口虫症、膜様条虫症、ロア糸状虫症、カラバル腫脹、マンソネラ症、フィラリア症、横川吸虫症−腸管寄生吸虫、河川盲目症、中国肝吸虫、肺吸虫症、肺吸虫、住血吸虫症−ビルハルツ住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫症又は巻貝熱（全ての型）、腸性血吸虫症、尿路住血吸虫症、日本住血吸虫による住血吸虫症、アジア腸性血吸虫症、弧虫症、糞線虫症−寄生性肺炎、無鉤条虫、有鉤条虫、トキソカラ症、旋毛虫症、セルカリア皮膚炎（Swimmer's itch）、鞭虫、及び、象皮病、リンパ系フィラリア症等である、蠕虫有機体若しくは虫であり得るか又は蠕虫有機体若しくは虫によって引き起こされる疾患であり得るが、これらに限定されない。寄生体は、寄生虫、ハルザン症候群、ハエ幼虫症、スナノミ、ヒトヒフバエ（Human Botfly）及びカンディルー等であるがこれらに限定されない、有機体又は有機体によって引き起こされる疾患であり得る。寄生体は、南京虫、アタマジラミ−シラミ症、コロモジラミ−シラミ症、ケジラミ−シラミ症、ニキビダニ−毛包虫症、疥癬、らせん虫及びコクリオミイヤ属等であるがこれらに限定されない、外寄生生物又は外寄生生物によって引き起こされる疾患であり得る。
【００６０】
抗原は、癌由来のタンパク質であり得る。本明細書で用いる場合、癌（Ｃａｎｃｅｒ）は、白血病、リンパ腫、肉腫及び固形腫瘍由来の癌を含む。癌には、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、小児小脳又は小児大脳の星細胞腫、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹部神経膠腫、脳腫瘍、小脳星細胞腫の脳腫瘍、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫の脳腫瘍、上衣腫の脳腫瘍、髄芽腫の脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍の脳腫瘍、視路及び視床下部膠腫の脳腫瘍、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、小児のカルチノイド腫瘍、消化管のカルチノイド腫瘍、原発不明癌腫、原発性の中枢神経リンパ腫、小児の小脳星細胞腫、小児の大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、Ｅｗｉｎｇ肉腫ファミリー腫瘍、小児の頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼球内黒色腫の眼癌、網膜芽細胞腫の眼癌、胆嚢癌、胃（胃部）癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭蓋外、性腺外又は卵巣の胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、脳幹の神経膠腫、小児大脳星細胞腫の神経膠腫、小児視経路及び視床下部の神経膠腫、胃カルチノイド、有毛細胞白血病、頭頚部癌、心臓の癌（Heart cancer）、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、小児の視床下部及び視経路神経膠腫、眼球内黒色腫、島細胞癌（膵島）、カポジ肉腫、腎癌（腎細胞癌）、喉頭癌、白血病、急性リンパ芽球性の白血病（急性リンパ性白血病とも称する）、急性骨髄性の白血病（急性骨髄性白血病とも称する）、慢性リンパ性の白血病（慢性リンパ性白血病とも称する）、慢性骨髄性の白血病（慢性骨髄性白血病とも称する）、毛様細胞の白血病、口唇及び口腔癌、肝癌（原発性）、非小細胞の肺癌、小細胞の肺癌、リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ホジキンを除く、古い分類の全てのリンパ腫）、原発性中枢神経系リンパ腫、致死性疾患マーカスホイットル（Marcus Whittle）、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｉｍ型マクログロブリン血症、骨／骨肉腫の悪性線維性組織球腫、小児の髄芽腫、黒色腫、眼内（目）の黒色腫、メルケル細胞癌、成人の悪性中皮腫、小児の中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、口腔癌、小児の多発性内分泌腫症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、慢性の骨髄性白血病、成人の急性骨髄性白血病、小児の急性骨髄性白血病、多発性の骨髄腫（骨髄の癌）、慢性の骨髄増殖性疾患、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌（表面上皮−間質性腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、島細胞の膵癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚腫、小児の松果体芽腫及びテン���上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腺腫、形質細胞腫／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎癌）、腎盂及び尿管の移行細胞癌、網膜芽細胞腫、小児の横紋筋肉腫、唾液腺癌、Ｅｗｉｎｇファミリー腫瘍性肉腫、カポジ肉腫、軟部組織の肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚癌（非黒色腫性）、皮膚癌（黒色腫性）、メルケル細胞の皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌−皮膚癌（非黒色腫性）参照、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、胃癌、小児のテント上原始神経外胚葉性腫瘍、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（菌状息肉腫とセザリー症候群）、精巣腫瘍、咽頭癌、小児の胸腺腫、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、小児の甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行細胞癌、妊娠性絨毛腫瘍、成人の原発部位不明の癌、小児の原発部位不明の癌、腎盂及び尿管移行細胞癌、尿道癌、子宮内膜の子宮癌、子宮肉腫、膣癌、小児の視経路及び視床下部神経膠腫、外陰癌、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｍ型マクログロブリン血症及びウィルムス腫瘍（腎癌）を含むが、これらに限定されない。
【００６１】
ベクターは、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６もしくはＵＬ１４７又はそのホモログ又はそのオーソログ（他の種を感染させるＣＭＶのホモログ遺伝子）をコードする核酸配列内に変異が存在することに起因して、活性ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、Ｕ１４６、ＵＬ１４７タンパク質を発現しない。この変異は、活性タンパク質の発現の欠如をもたらすものであれば任意の変異であってよい。こうした変異は、点変異、フレームシフト変異、タンパク質をコードする配列のうちの全て未満の欠失（トランケーション変異）若しくはタンパク質をコードする核酸配列のうちの全ての欠失、又はその他の変異を含み得る。
【００６２】
さらなる例においては、ベクターは、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０又はＵＬ１４６又はＵＬ１４７タンパク質の発現を阻害するアンチセンス又はＲＮＡｉの配列（ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）を含む、ベクター内における核酸配列が存在することに起因して、活性ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６又はＵＬ１４７タンパク質を発現しない。変異並びに／又はアンチセンス及び／若しくはＲＮＡｉを任意の組み合わせで用いて、活性ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６又はＵＬ１４７を欠いているＣＭＶベクターを生成することができる。
【００６３】
ＣＭＶベクターは、この技術分野で公知であるさらなる不活性化変異を含み、不活性化ＵＳ１１変異又は不活性化ＵＬ８２（ｐｐ７１）変異又はその他の不活性化変異等である、様々な免疫応答をもたらし得る。ＣＭＶベクターはまた、生体内におけるウイルス播種（viral dissemination）（すなわち、細胞から細胞への伝播）に必須又は増強している、この技術分野で公知のウイルスタンパク質をコードする１つ又は複数のウイルス遺伝子において少なくとも１つの不活性化変異を含んでもよい。こうした不活性化変異は、点変異、フレームシフト変異、トランケーション変異又はウイルスタンパク質をコードする核酸配列のうちの全ての欠如の結果として生じ得る。不活性化変異は、最終的に機能の低下又はウイルスタンパク質の機能を完全な喪失につながる、ウイルス遺伝子内の任意の変異を含む。一部の実施形態においては、ＣＭＶベクターは、活性ＵＬ８２（ｐｐ７１）タンパク質又はそのオーソログを発現しない。一部の実施形態においては、ＣＭＶベクターは、活性ＵＳ１１タンパク質又はそのオーソログを発現しない。一部の実施形態においては、ＣＭＶベクターは、活性ＵＬ８２（ｐｐ７１）タンパク質もしくは活性ＵＳ１１タンパク質、又はそのオーソログを発現しない。
【００６４】
また本明細書においては、対象において異種抗原に対するＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を生成する方法も開示する。この方法は、対象に対してＣＭＶベクターを効果量で投与することを伴う。一実施形態においては、ＣＭＶベクターは、活性ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６又はＵＬ１４７タンパク質を発現しない少なくとも１つの異種抗原及び核酸配列をコードする核酸配列を有することを特徴とする。このベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞応答は、ＭＨＣ−Ｅによって提示されるエピトープに対するＣＤ８＋  Ｔ細胞の少なくとも１０％であることを特徴とする。さらなる例においては、このＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちの少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９５％が、ＭＨＣ−Ｅによって拘束されている。一部の実施形態においては、ＭＨＣ−Ｅによって拘束されるＣＤ８＋  Ｔ細胞が、このベクターで免疫した他の対象のうちの少なくとも９０％で共有されるペプチドを認識する。一部の実施形態においては、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＭＨＣ−Ｅによって提示されるスーパートープに対するものである。一部の実施形態においては、この方法はまた、クラスＩＩのＭＨＣによって拘束されるＣＤ８＋  Ｔ細胞を生成し得る。一部の実施形態においては、ベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞の少なくとも１０％が、クラスＩＩのＭＨＣ又はそのオーソログによって拘束されている。一部の実施形態においては、ベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちの少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％又は少なくとも７５％が、クラスＩＩのＭＨＣ又はそのオーソログによって拘束されている。一部の実施形態においては、クラスＩＩのＭＨＣによって拘束されるＣＤ８＋  Ｔ細胞が、ベクターで免疫した他の対象のうちの少なくとも９０％で共有されるペプチドを認識する。一部の実施形態においては、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、クラスＩＩのＭＨＣによって提示されるスーパートープに対するものである。
【００６５】
第二の実施形態においては、ＣＭＶベクターは、必須ＣＭＶ遺伝子ＩＥ２及びＵＬ７９又はそのオーソログに操作可能に連結されているｍｉＲＮＡ認識配列（ＭＲＥ）としての役割を果たす核酸配列を有することを特徴とする。一部の実施形態においては、ＭＲＥは、内皮細胞系列の細胞によって発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡの存在下において発現を抑制する。一部の実施形態においては、ＭＲＥは、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２２１／２２２、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−２９６及びｍｉＲ−３２８のうちの１つ又は複数の存在下において発現を抑制する。一部の実施形態においては、ＭＲＥは、ｍｉＲ−１２６−３ｐの存在下において発現を抑制する。ベクターはまた、少なくとも１つの異種抗原を含有し、活性ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６又はＵＬ１４７タンパク質を発現しない。このベクターはまた、活性ＵＬ４０、ＵＳ２８及びＵＳ２７を含有する。このベクターにより誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞応答は、ＭＨＣ−Ｅによって提示されるエピトープに対するＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちの少なくとも１０％であることを特徴とする。さらなる例においては、ＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちの少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％又は少なくとも７５％が、ＭＨＣ−Ｅによって拘束されている。一部の実施形態においては、ＭＨＣ−Ｅによって拘束されるＣＤ８＋  Ｔ細胞の一部は、ベクターで免疫した他の対象のうちの少なくとも９０％で共有されるペプチドを認識する。
【００６６】
一部の実施形態においては、この方法は、ＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞からのＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体を同定することをさらに含むものであって、該ＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体がＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識するものである。一部の実施形態においては、ＣＤ８＋  Ｔ受容体が、ＲＮＡ又はＤＮＡ配列決定によって同定される。
【００６７】
第三の実施形態においては、ＣＭＶベクターは、必須ＣＭＶ遺伝子ＩＥ２及びＵＬ７９又はそのオーソログに操作可能に連結するＭＲＥの役割を果たす２つの核酸配列を有することを特徴とする。一部の実施形態においては、第一のＭＲＥが、内皮細胞系列の細胞によって発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡの存在下において発現を抑制し、第二のＭＲＥが、骨髄細胞系列の細胞によって発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡの存在下において発現を抑制する。一部の実施形態においては、第一のＭＲＥは、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２２１／２２２、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−２９６及びｍｉＲ−３２８のうちの１つ又は複数の存在下において発現を抑制する。一部の実施形態においては、第一のＭＲＥは、ｍｉＲ−１２６−３ｐの存在下において発現を抑制する。一部の実施形態においては、第二のＭＲＥは、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ１４６ａ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−１２５のうちの１つ又は複数の存在下において発現を抑制する。一部の実施形態においては、第二のＭＲＥは、ｍｉＲ−１４２−３ｐの存在下において発現を抑制する。このベクターはまた、少なくとも１つの異種抗原を含有し、活性ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６又はＵＬ１４７タンパク質を発現しない。このベクターはまた、活性ＵＬ４０、ＵＳ２８及びＵＳ２７を含有する。このベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞応答は、ＭＨＣクラスＩａによって提示されるエピトープに対するＣＤ８＋  Ｔ細胞のうちの少なくとも５０％であることを特徴とする。
【００６８】
一部の実施形態においては、この方法は、ＣＭＶベクターによって誘発されるＣＤ８＋  Ｔ細胞からのＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体を同定することをさらに含むものであって、該ＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体がＭＨＣクラスＩ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識するものである。一部の実施形態においては、ＣＤ８＋  Ｔ受容体が、ＲＮＡ又はＤＮＡ配列決定によって同定される。
【００６９】
また本明細書においては、ＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞を生成する方法も開示する。この方法は、第一の対象（又は動物）に対してＣＭＶベクターを効果量で投与して、ＭＨＣ−Ｅ／ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞の集合を生成することを伴う。ＣＭＶベクターは、少なくとも１つの異種抗原をコードする第一の核酸配列を含むが、活性ＵＬ１２８タンパク質若しくはそのオーソログ、活性ＵＬ１３０タンパク質若しくはそのオーソログ、活性ＵＬ１４６タンパク質若しくはそのオーソログ、又は、活性ＵＬ１４７タンパク質若しくはそのオーソログを発現しない。一部の実施形態においては、ＣＭＶベクターは、内皮細胞系列の細胞によって発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡの存在下において発現を抑制するＭＲＥを含む第二の核酸配列をさらに含む。異種抗原は、病原体特異抗原、腫瘍抗原、組織特異抗原又は宿主の自己抗原を含む任意の抗原であり得る。一部の実施形態においては、宿主の自己抗原は、Ｔ細胞受容体又はＢ細胞受容体の可変領域由来の抗原である。この方法は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の集合からの第一のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体を同定することをさらに含み、該第一のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体がＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識するものである。一部の実施形態においては、第一のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列決定によって同定される。一部の実施形態においては、この方法は、ある発現ベクターで、１つ又は複数のＣＤ８＋  Ｔ細胞をトランスフェクションすることを含み得るものであって、該発現ベクターが第二のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列と、Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列に操作可能に連結されたプロモーターとを含み、第二のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体が、第一のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体のＣＤＲ３α及びＣＤＲ３βを含み、それによってＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識する１つ又は複数のトランスフェクションされたＣＤ８＋  Ｔ細胞を生成する。発現ベクターでトランスフェクションするための１つ又は複数のＣＤ８＋  Ｔ細胞は、第一の対象又は第二の対象から単離され得る。一部の実施形態においては、この方法は、１つ又は複数のトランスフェクションされたＴ細胞を第一又は第二の対象に投与して、例えば癌である疾患、病原性感染、又は、自己免疫疾患若しくは自己免疫障害を治療することをさらに含み得る。一部の実施形態においては、この方法は、１つ又は複数のトランスフェクションされたＴ細胞を第一又は第二の対象に投与して、組織特異抗原又は宿主の自己抗原に対する自己免疫応答を誘導することをさらに含み得る。
【００７０】
また、以下の工程を含む方法によって調製されるＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するトランスフェクションされたＣＤ８＋  Ｔ細胞も開示するものであって、該方法は、（１）第一の対象に対して、ＣＭＶベクターを効果量で投与して、ＭＨＣ−Ｅ／ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞の集合を生成する工程と、（２）ＣＤ８＋  Ｔ細胞の集合からの第一のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体を同定する工程であって、該第一のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体がＭＨＣ−Ｅ／異種抗原由来ペプチド複合体を認識するものである工程と、（３）第一の対象又は第二の対象から、１つ又は複数のＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離する工程と、（４）ある発現ベクターで、第一若しくは第二の対象から単離された１つ又は複数のＣＤ８＋  Ｔ細胞をトランスフェクションし、それによってＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するトランスフェクションされたＴ細胞を作製する工程とを含む。ＣＭＶベクターは、少なくとも１つの異種抗原をコードする第一の核酸配列を含むが、活性ＵＬ１２８タンパク質若しくはそのオーソログ、活性ＵＬ１３０タンパク質若しくはそのオーソログ、活性ＵＬ１４６タンパク質若しくはそのオーソログ、又は、活性ＵＬ１４７タンパク質若しくはそのオーソログを発現しない。一部の実施形態においては、ＣＭＶベクターは、内皮細胞系列の細胞によって発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡの存在下において発現を抑制するＭＲＥを含む第二の核酸配列をさらに含む。発現ベクターは、第二のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列と、第二のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体をコードする該核酸配列に操作可能に連結するプロモーターとを含むものであって、第二のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体が、第一のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体のＣＤＲ３α及びＣＤＲ３βを含む。異種抗原は、病原体特異抗原、組織特異抗原、宿主の自己抗原又は腫瘍抗原を含む任意の抗原であり得る。一部の実施形態においては、第一のＣＤ８＋  Ｔ細胞受容体が、ＲＮＡ又はＤＮＡ配列決定によって同定される。また本明細書においては、例えば癌である疾患、病原性感染、又は、自己免疫疾患若しくは自己免疫障害を治療する方法も開示するものであって、該方法は、ＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するトランスフェクションされたＴ細胞を、第一又は第二の対象に投与することを含む。また本明細書においては、宿主の自己抗原又は組織特異抗原に対する自己免疫応答を誘導する方法も開示するものであって、該方法は、ＭＨＣ−Ｅ−ペプチド複合体を認識するトランスフェクションされたＴ細胞を、第一又は第二の対象に投与することを含む。
【００７１】
さらなる例においては、方法は、第二のＣＭＶベクターであって、第二の異種抗原をコードする核酸配列を含む該第二のＣＭＶベクターを、対象に効果量で投与することを伴う。この第二のベクターは、活性ＵＬ１２８若しくはＵＬ１３０タンパク質及び／又は活性ＵＬ１４６若しくは１４７タンパク質を伴うＣＭＶベクターを含む、任意のＣＭＶベクターであり得る。第二のＣＭＶベクターは、第二の異種抗原を含み得る。第二の異種抗原は、第一のＣＭＶベクターにおける異種抗原と同一である異種抗原を含む、任意の異種抗原であり得る。第二のＣＭＶベクターは、第一のＣＭＶベクターの投与の前、該投与と同時又は該投与の後を含む、第一のＣＭＶベクターの投与と相対的な任意の時間に投与され得る。これは、第一のベクターの、任意の数の月前若しくは後、任意の数の日前若しくは後、任意の数の時間前若しくは後、任意の数の分前若しくは後、又は、任意の数の秒前若しくは後に、第二のベクターを投与することを含む。
【００７２】
ヒト又は動物のＣＭＶベクターは、発現ベクターとして用いられる場合、ヒト等である選択された対象において本質的に非病原性である。一部の実施形態においては、ＣＭＶベクターは、選択された対象においてそれらが非病原性である（宿主間で伝播ができない）ように改変されている。
【００７３】
異種抗原は、ＣＭＶ由来ではない任意のタンパク質又はその断片であり得、癌抗原、病原体特異抗原、モデル抗原（リゾチームＫＬＨ又は卵白アルブミン）、組織特異抗原、宿主の自己抗原又はその他の抗原を含む。
【００７４】
病原体特異抗原は、任意のヒト病原体又は動物病原体に由来し得る。病原体は、ウイルス性病原体、細菌性病原体又は寄生体であり得、また抗原は、該ウイルス性病原体、細菌性病原体又は寄生体に由来するタンパク質であり得る。寄生体は、有機体であり得るか又は有機体によって引き起こされる疾患であり得る。例えば寄生体は、原生動物、疾患を引き起こす原生動物、蠕虫有機体若しくは虫、蠕虫有機体によって引き起こされる疾患、外寄生生物、又は、外寄生生物によって引き起こされる疾患であり得る。
【００７５】
抗原は、癌由来のタンパク質であり得る。或る実施形態においては、癌は、白血病又はリンパ腫である。或る実施形態においては、癌は、固形腫瘍由来である。或る実施形態においては、癌には、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、大腸癌、腎細胞癌、及び、胚細胞腫瘍が含まれる。
【００７６】
抗原は、宿主の自己抗原であり得る。宿主の自己抗原には、Ｔ細胞受容体の可変領域又はＢ細胞受容体の可変領域に由来する抗原が含まれるが、これに限定されない。抗原は、組織特異抗原であり得る。組織特異抗原には、精子抗原又は卵抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
本明細書に開示されるＣＭＶベクターは、組換えＣＭＶウイルス若しくはベクター及び薬剤的に許容できるキャリア若しくは希釈剤を含有する、免疫原性、免疫学的又はワクチンの組成物として用いられ得る。組換えＣＭＶウイルス又はベクター（又はその発現産物）を含有する免疫学的な組成物は、局所的又は全身性である、免疫応答を誘発する。この応答は、その必要はないが防御的とすることができる。組換えＣＭＶウイルス又はベクター（又はその発現産物）を含有する免疫原性の組成物は同様に、その必要はないが防御的とすることができる、局所的又は全身性の免疫応答を誘発する。ワクチン組成物は、局所的又は全身性の免疫応答を誘発する。したがって、「免疫学的な組成物（immunological composition）」及び「免疫原性の組成物（immunogenic composition）」という語には、「ワクチン組成物」が含まれる（前者の２つの語は防御組成物であり得るため）。
【００７８】
本明細書に開示されるＣＭＶベクターは、組換えＣＭＶウイルス若しくはベクター及び薬剤的に許容できるキャリア若しくは希釈剤を含む、免疫原性、免疫学的又はワクチンの組成物を対象に投与することを含む、対象において免疫学的応答を誘導する方法で用いられ得る。本明細書では、「対象」という語には、非ヒト霊長類及びヒトを含む全ての動物が含まれ、一方、「動物」にはヒトを除く全ての脊椎動物種が含まれ、「脊椎動物」には、動物（animals）（本明細書においては「動物（animal）」を用いる）及びヒトを含む全ての脊椎動物が含まれる。もちろん、「動物」のサブセットは「哺乳動物」であり、それにはこの明細書では、ヒトを除く全ての哺乳動物が含まれるものとする。
【００７９】
本明細書に開示されるＣＭＶベクターは、組換えＣＭＶウイルス又はベクター及び薬剤的に許容できるキャリア又は希釈剤を含有する治療組成物において用いられ得る。本明細書に開示されるＣＭＶベクターは、ＣＭＶゲノムの必須又は必須でない領域内に、異種抗原をコードする配列を含むＤＮＡを挿入することによって調製され得る。この方法は、ＣＭＶゲノムから１又は複数の領域を欠失することをさらに含み得る。この方法は、生体内における組換えを含み得る。そのためこの方法は、ＣＭＶゲノムの一部と相同であるＤＮＡ配列と隣接している異種ＤＮＡを含むドナーＤＮＡの存在下で、細胞に適合する媒地中でＣＭＶ  ＤＮＡで細胞をトランスフェクションし、それによって異種ＤＮＡがＣＭＶのゲノム内に導入されて、その後任意に生体内における組換えによって改変されたＣＭＶを回収することを含み得る。この方法はまた、ＣＭＶ  ＤＮＡを開裂して開裂されたＣＭＶ  ＤＮＡを獲得することと、開裂されたＣＭＶ  ＤＮＡに対して異種ＤＮＡをライゲーションしてＣＭＶ−異種ＤＮＡ複合体を獲得することと、ある細胞をＣＭＶ−異種ＤＮＡ複合体でトランスフェクションすることと、その後任意に異種ＤＮＡの存在によって改変されたＣＭＶを回収することとを含み得る。生体内における組換えが包含されることから、この方法はまたＣＭＶとは異質であるポリペプチドをコードする、ＣＭＶ中で天然に生じないドナーＤＮＡを含むプラスミドを提供するものであるため、該ドナーＤＮＡはＣＭＶ  ＤＮＡのセグメントの範囲内にあり、そうでなければＣＭＶの必須又は必須でない領域からのＤＮＡがドナーＤＮＡに隣接しているように、ＣＭＶゲノムの必須又は必須でない領域と共直線性であるものとする。異種ＤＮＡは、所望される場合、ＣＭＶ内に挿入されて、そのＤＮＡの安定な組込み及びその発現が得られるような任意の配向で組換えＣＭＶを生成し得る。
【００８０】
組換えＣＭＶベクター内の異種抗原をコードするＤＮＡはまた、プロモーターを含み得る。プロモーターは、ヘルペスウイルス等の任意の源からのものであり得、ヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）、アカゲザルＣＭＶ（ＲｈＣＭＶ）、マウス等である内在性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター又は他のＣＭＶプロモーターを含む。プロモーターはまた、ＥＦ１αプロモーター等である非ウイルス性プロモーターであり得る。プロモーターは、ウイルスによってもたらされるトランス活性化タンパク質でトランス活性化された領域と、短縮された（truncated）転写的に活性のプロモーターが誘導される完全長プロモーターのうちの最小限のプロモーター領域とを含む、短縮された転写的に活性のプロモーターであり得る。プロモーターは、最小限のプロモーターに相当するＤＮＡ配列及び上流調節配列の会合により構成され得る。最小限のプロモーターは、ＣＡＰ部位にＴＡＴＡボックスを合わせて構成され（転写の塩基レベルに対して最小限の配列、非調節レベルの転写）、「上流調節配列」は、上流の配列及びエンハンサーの配列から構成される。また、「短縮された（truncated）」という語は、完全長のプロモーターが完全に存在していない、すなわち、プロモーターの一部が除去されていることを示す。短縮されたプロモーターは、ＭＣＭＶ又はＨＣＭＶ、例えばＨＣＭＶ−ＩＥ又はＭＣＭＶ−ＩＥ等のヘルペスウイルス由来であり得る。塩基対に基づく完全長プロモーターから、最大４０％及び最大９０％のサイズの減少であり得る。プロモーターはまた、改変された非ウイルスプロモーターであり得る。ＨＣＭＶプロモーターについては、米国特許第５，１６８，０６２号及び第５，３８５，８３９号が参考にされる。それからの発現のためにプラスミドＤＮＡでトランスフェクションされる細胞については、Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550‐2561が参考にされる。また種々の伝染病に対する簡易かつ有効なワクチン接種法としてのプラスミドＤＮＡの直接注射については、Science, 259:1745‐49, 1993が参考にされる。したがって、ベクターＤＮＡの直接注射によってこのベクターを用いることができるということは、この開示の範囲内である。
【００８１】
また、短縮された転写的に活性なプロモーターを含む組換えウイルス又はプラスミド内に挿入され得る発現カセットも開示する。発現カセットは、機能的な短縮されたポリアデニル化シグナルであって、例えば短縮されているが未だ機能的であるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルをさらに含み得る。より大きいシグナルを提供するその性質を考慮すると、短縮されたポリアデニル化シグナルが機能的であるということは確かに驚くべきことである。短縮されたポリアデニル化シグナルにより、ＣＭＶ等である組換えウイルスの挿入サイズの制限の問題が対処される。発現カセットはまた、それが挿入されるウイルスまたは系に対して異種であるＤＮＡを含み、そのＤＮＡは、本明細書に記載するような異種ＤＮＡであり得る。
【００８２】
ワクチン又は免疫学的な組成物において使用する抗原については、ステッドマン医学大辞典（Stedman’s Medical Dictionary）（１９８２年第２４版、例えばワクチンの定義（ワクチン製剤において用いられる抗原の一覧））も参照されたいものであり、こうした抗原又は該抗原からの目的のエピトープが用いられ得る。異種抗原については、当業者は、過度な実験なしに、アミノ酸及びペプチド又はポリペプチドの相当するＤＮＡ配列についての知識からのみならず、特定のアミノ酸の性質（例えば、サイズ、電荷等）及びコドンディクショナリー（codon dictionary）から、異種抗原及びそれに対するコードＤＮＡを選択してよい。
【００８３】
抗原のＴエピトープを決定するひとつの方法には、エピトープマッピングが関与する。オリゴ−ペプチド合成によって、異種抗原のオーバーラップペプチドが生成する。その後個々のペプチドは、天然タンパク質により誘発される抗原と結合する又はＴ細胞若しくはＢ細胞の活性化を誘導するそれらの能力について試験される。このアプローチは、Ｔ細胞がＭＨＣ分子と複合化している短い直鎖状のペプチドを認識することから、Ｔ−細胞エピトープのマッピングに特に有用とされていた。
【００８４】
異種抗原に対する免疫応答は、概して、以下のとおり生じる：タンパク質がより小さいペプチドに切断されて、別の細胞表面上に位置する「主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）」と称される複合体内に存在するときにのみ、Ｔ細胞がタンパク質を認識する。ＭＨＣ複合体には２つのクラス、クラスＩ及びクラスＩＩがあり、各クラスは、多数の異なる対立遺伝子でできている。様々な種及び個々の対象は、様々なタイプのＭＨＣ複合体対立遺伝子を有し、それらは違ったＭＨＣタイプを有するといわれている。ＭＨＣクラスＩ分子の１つのタイプは、ＭＨＣ−Ｅと呼ばれる（ヒトについてはＨＬＡ−Ｅ、ＲＭについてはＭａｍｕ−Ｅ、マウスについてはＱａ−１ｂ）。
【００８５】
異種抗原をコードする配列を含むＤＮＡは、それ自体が、ＣＭＶベクター内において発現を行うプロモーターを含み得るか、又は、該ＤＮＡは、異種抗原のコードＤＮＡに制限され得るということに留意されたい。このコンストラクトは、内在性ＣＭＶプロモーターに対して、プロモーターに操作可能に連結され、それによって発現されるような配向で配置され得る。また、異種抗原をコードするＤＮＡの複数の複製、又は、強力な若しくは早期のプロモーター若しくは早期及び晩期のプロモーター若しくはそれらの任意の組合せの使用は、発現を増強又は増加させるようにして行われ得る。そのため、異種抗原をコードするＤＮＡは、ＣＭＶ−内在性プロモーターに対して好適に配置され得、又は、それらプロモーターは、異種抗原をコードするＤＮＡと一緒に別の位置において挿入されるように移動され得る。複数の異種抗原をコードする核酸は、ＣＭＶベクター内に包括され得る。
【００８６】
また、開示されるＣＭＶベクターを含有する医薬組成物及び他の組成物が開示される。こうした医薬組成物及び他の組成物は、この技術分野において公知である任意の投与手順において用いられるように調製され得る。こうした医薬組成物は、非経口経路（皮内、筋肉内、皮下、静脈内又は他の経路）を経由するものであり得る。投与はまた、例えば経口、経鼻、経外陰部等である、粘膜経路経由であってもよい。
【００８７】
開示される医薬組成物は、製剤分野の当業者にとって周知である標準技術に従って調製され得る。こうした組成物は、品種又は種、年齢、性別、体重及び特定の患者の症状、並びに投与経路等の因子を考慮に入れて、医療分野の当業者にとって周知である投与量及び技術によって、投与され得る。組成物は、単独で投与され得るか、又は、他のＣＭＶベクターと若しくは他の免疫学的、抗原性の若しくはワクチン若しくは治療的な組成物と一緒に投与若しくは連続投与され得る。こうした他の組成物には、精製された天然抗原若しくはエピトープ又は組換えＣＭＶ若しくは別のベクター系による発現からの抗原若しくはエピトープが含まれ得、上記で述べた因子を考慮して投与される。
【００８８】
組成物の例としては、例えば経口、経鼻、経肛門、例えば経膣である経外陰部等の開口への投与用の懸濁液、シロップ剤又はエリキシル剤等の液状製剤、及び、滅菌懸濁液又は乳濁液等の非経口、皮下、皮内、筋肉内若しくは静脈内投与（例えば、注射投与）用の製剤が挙げられる。こうした組成物においては、組換え体が、好適なキャリア、希釈剤又は滅菌水、生理食塩水、グルコース等の賦形剤と混合され得る。
【００８９】
抗原性、免疫学的な又はワクチンの組成物は典型的に、アジュバントと、所望の応答を誘発する量のＣＭＶベクター又は発現産物とを含有し得る。ヒトへの用途では、ミョウバン（alum）（リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム）が典型的なアジュバントである。試験及び動物への用途において用いられる、サポニン及びその精製された成分Ｑｕｉｌ Ａ、完全フロイントアジュバント並びに他のアジュバントは、毒性を有し、ヒトワクチンでの使用にはその可能性が制限される。Goodman‐Snitkoff et al., J. Immunol. 147:410‐415 (1991)に記載されるような、ムラミルジペプチド、モノホスホリルリピドＡ、リン脂質複合体等の化学的に定義された調製、Miller et al., J. Exp. Med. 176:1739‐1744 (1992)に記載されるようなプロテオリポソーム内のタンパク質のカプセル化、及び、ノバソーム（Novasome）リピド小胞（ニューハンプシャー州ナシュアのＭｉｃｒｏ  Ｖｅｓｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）等のリピド小胞内のタンパク質のカプセル化が用いられ得る。
【００９０】
組成物は、非経口的（例えば、筋肉内、皮内又は皮下）投与又は開口への投与であって、例えば舌下（例えば経口）、胃内、口腔内や、肛門内、膣内等を含む粘膜への投与により免疫化するための単一の投薬形態に包装されていてもよい。そしてまた、効果投薬量及び投与経路は、組成物の性質、発現産物の性質、組換えＣＭＶを直接用いる場合には発現レベル、ならびに、宿主の品種又は種、年齢、性別、体重、状態及び性質等の公知の因子のみならず、ＬＤ５０、及び公知であるが過度の実験を必要としない他のスクリーニング手順によって決定される。発現産物の投薬量は、数マイクログラムから数百マイクログラムの範囲であり得、例えば、５〜５００μｇであり得る。ＣＭＶベクターは、任意の好適な量で投与されて、これら投薬量レベルにおいて発現が達成され得る。非限定的な例としては、ＣＭＶベクターが、少なくとも１０２ｐｆｕの量で投与され得、したがってＣＭＶベクターは、少なくともこの量で又は約１０２ｐｆｕから約１０７ｐｆｕの範囲で投与され得る。他の好適なキャリア又は希釈剤は、防腐剤を含む若しくは含まない、水又は緩衝食塩液であり得る。ＣＭＶベクターは、投与時に再懸濁するように凍結乾燥されていてもよく、又は、溶液状態であってもよい。「約」は、規定された値の１％、５％、１０％又は２０％の範囲内を意味し得る。
【００９１】
本開示のタンパク質及びそれらをコードする核酸は、本明細書において図示及び記載されているものそのものである配列とは異なり得るということを理解されたい。すなわち、この開示は、配列がこの開示の方法に従って機能する限りにおいて、示している配列に対して、欠失、付加、短縮及び置換が考慮される。この点について、置換は概して本質的に保存的であることとなり、すなわちそれら置換はアミノ酸のファミリー内で起こるものである。例えば、アミノ酸は概して、４つのファミリー、（１）酸性−アスパラギン酸及びグルタミン酸、（２）塩基性−リシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、及び、（４）無電荷の極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、及びチロシンに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、芳香族アミノ酸に分類されることもある。単離される、ロイシンのイソロイシン若しくはバリンでの置換若しくはその逆の置換、アスパラギン酸のグルタミン酸との置換若しくはその逆の置換、トレオニンのセリンとの置換若しくはその逆の置換、又は、あるアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸との保存的な置換は、生物活性に大きな影響を及ぼすこととならないということは、合理的に予測できることである。したがって、記載されるタンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するが、タンパク質の免疫原性に実質的に影響を及ぼさないマイナーなアミノ酸置換を所有するタンパク質が、この開示の範囲である。
【００９２】
本開示の核酸配列は、コドン最適化され得るものであり、例えばヒト細胞での使用のためにコドンが最適化され得る。例えば、任意のウイルス配列又は細菌性配列がそのように変更され得る。Andre et al., J. Virol. 72:1497‐1503, 1998に記載されているように、ＨＩＶ及び他のレンチウイルスを含む多くのウイルスが、大量のレアコドンを使用して、これらコドンを所望の対象において共通に使用されるコドンに対応するように変更することによって、異種抗原の発現の増加が達成できる。
【００９３】
機能的に及び／又は抗原的に同等であるＣＭＶベクターの変異体及び誘導体をコードする核酸配列並びにそれに含まれる糖タンパク質が、考慮される。これら機能的に同等である変異体、誘導体及び断片は、抗原活性を保持する能力を示す。例えば、コードされたアミノ酸配列を変えることがないＤＮＡ配列における変化のみならず、アミノ酸残基の保存的置換、１個又は数個のアミノ酸の欠失若しくは付加、並びにアミノ酸アナログによるアミノ酸残基の置換をもたらす変化は、コードされたポリペプチドの性質に有意に影響を及ぼすことのないものである。保存的なアミノ酸置換は、グリシン／アラニン、バリン／イソロイシン／ロイシン、アスパラギン／グルタミン、アスパラギン酸／グルタミン酸、セリン／トレオニン／メチオニン、リシン／アルギニン及びフェニルアラニン／チロシン／トリプトファンである。一実施形態においては、変異体は、目的の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド又はポリペプチドに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の相同性又は同一性を有する。
【００９４】
配列同一性又は相同性は、配列ギャップを最小化しながら、オーバーラップ及び一致を最大化するようにして並列したときに配列同士を比較することによって決定される。特に、配列同一性は、複数の数学アルゴリズムのうちのいずれかを用いることで決定してもよい。２つの配列の比較に用いる数学アルゴリズムの非限定的な例には、Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87: 2264‐2268のアルゴリズムがあり、Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993;90: 5873‐5877として修正されている。
【００９５】
配列の比較に用いる数学アルゴリズムの別の例には、Myers & Miller, CABIOS 1988;4: 11‐17のアルゴリズムがある。こうしたアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを用いる場合、ＰＡＭ１２０加重残基表（PAM120 weight residue table）と、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４とを用いることができる。局所的な配列類似性の領域及びアライメントを同定するためのさらに別の有用なアルゴリズムは、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85: 2444‐2448に記載されているＦＡＳＴＡアルゴリズムである。
【００９６】
本開示による使用に有利なものには、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ（ワシントン大学ＢＬＡＳＴ）バージョン２．０ソフトウェアがある。ＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン２．０の、いくつかのＵＮＩＸ（登録商標）プラットフォームで実行可能なプログラムは、ftp://blast.wustl.edu/blast/executablesよりダウンロードできる。このプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づくものであり、そしてそれは、パブリックドメインＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４（Altschul & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460‐480；Altschul et al., Journal of Molecular Biology 1990; 215: 403‐410；Gish & States, 1993; Nature Genetics 3: 266‐272；Karlin & Altschul, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873‐5877；その全てが参照により本明細書に組み入れられる）に基づくものである。
【００９７】
この開示の様々な組換えヌクレオチド配列並びに抗体及び／又は抗原は、標準の組換えＤＮＡ及びクローニングの技術を用いて作製される。こうした技術は、当業者にとって周知である。例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）を参照されたい。
【００９８】
本開示のヌクレオチド配列は、「ベクター」内に挿入され得る。「ベクター」という語は当業者によって広く使用及び理解されるものであり、本明細書で用いる場合、「ベクター」という語は、当業者にとっての意味と一致して用いられる。例えば、「ベクター」という語は、ある環境から別の環境への核酸分子の移動を可能にさせる若しくは促す、又は、核酸分子の操作を可能にさせる若しくは促すような担体を指すために、当業者によって通常用いられる。
【００９９】
本開示の、ウイルスの発現を可能にさせる任意のベクターを、本開示に従って用いることができる。或る実施形態においては、開示されるウイルスは、タンパク質性ワクチンの産生において等の種々用途にその後用いることができるコードされた異種抗原（例えば、病原体特異抗原、ＨＩＶ抗原、腫瘍抗原及び抗体）を産生するために、生体外で（例えば細胞を含まない発現系を用いて）及び／又は生体外で増殖させた培養細胞中で用いることができる。こうした用途では、生体外及び／又は培養細胞中においてウイルスの発現を可能にさせる任意のベクターを用いることができる。
【０１００】
発現させようとする開示の異種抗原に関して、該異種抗原のタンパク質コード配列は、タンパク質の転写及び翻訳を支配する調節配列又は核酸制御配列に「操作可能に連結」されるはずである。本明細書で用いる場合、コード配列及び核酸制御配列又はプロモーターは、それらが、核酸制御配列の影響又は制御のもとにコード配列の発現又は転写及び／又は翻訳をさせるような方法で共有結合しているとき、「操作可能に連結」しているという。「核酸制御配列」は、それに対して操作可能に連結されている核酸配列又はコード配列の発現を支配する、プロモーター、エンハンサー、ＩＲＥＳ、イントロン及び本明細書に記載の他の配列等であるがこれらに限定されない、任意の核酸配列であり得る。「プロモーター」という語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに関する開始部位周辺で群をなし、また開示のタンパク質コード配列に操作可能に連結されたときにコードタンパク質の発現をもたらす、一群の転写性制御モジュールを指すために本明細書で用いることとする。本開示の導入遺伝子の発現は、一部の特定の外的刺激であって、限定するものではないがテトラサイクリン等の抗生剤、エクジソン等のホルモン、又は重金属等に曝露したときにのみ、転写を開始する、構成的プロモーターの又は誘導性プロモーターの制御下にあり得る。プロモーターはまた、特定の細胞型、組織又は有機体に対して特異的であり得る。多くの好適なプロモーター及びエンハンサーは、この技術分野で公知であり、また任意のこうした好適なプロモーター又はエンハンサーを、開示の導入遺伝子の発現に用いることができる。例えば、好適なプロモーター及び／又はエンハンサーは、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃプロモーターデータベース（ＥＰＤＢ）から選択することができる。
【０１０１】
この開示は、異種タンパク質抗原を発現する組換えウイルスベクターに関する。一部の例においては、抗原はＨＩＶ抗原である。有利には、ＨＩＶ抗原には、いずれも参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００８／０１９９４９３Ａ１号及び第２０１３／０１３６７６８Ａ１号で述べられているＨＩＶ抗原が含まれるが、これに限定されるものではない。ＨＩＶ、核酸又はその免疫原性断片は、ＨＩＶタンパク質抗原として用いることができる。例えば、米国特許出願公開第２００８／０１９９４９３Ａ１号及び第２０１３／０１３６７６８Ａ１号で述べられているＨＩＶヌクレオチドを用いることができる。ＨＩＶ抗体によって認識される任意の抗原を、ＨＩＶタンパク質抗原として用いることができる。タンパク質抗原はまた、ＳＩＶ抗原であってもよい。例えば、米国特許出願公開第２００８／０１９９４９３Ａ１号及び第２０１３／０１３６７６８Ａ１号で述べられているＳＩＶ抗原を用いることができる。
【０１０２】
本開示に従って用いられるベクターは、開示の抗原を発現できるように、プロモーター又はエンハンサー等、好適な遺伝子調節領域を含有し得る。
【０１０３】
例えばＨＩＶ−１抗原に対する免疫応答、及び／又は、対象における発現に好適であり、かつ、生体内での使用が安全であるような、ＨＩＶ−１に対する防御免疫の発現ベクターを生成するために、対象において生体内で開示の抗原を発現することが選択されるはずである。一部の例においては、開示のＨＩＶ−１の免疫原性組成物及びワクチンの前臨床試験等のために、実験動物において抗体及び／又は抗原を発現することが望まれ得る。他の例においては、開示の免疫原性組成物及びワクチンの臨床試験において及び実際の臨床的使用等において、ベクターは、ヒト対象において抗原を発現することができる。
【０１０４】
本明細書に記載のＣＭＶベクターは、宿主間の伝播を防止することができ、それによって、ＣＭＶの感染の結果としての合併症に直面することとなる免疫無防備状態の対象又は他の対象を感染させることを、ウイルスにできないようにさせるような変異を含有し得る。本明細書に記載のＣＭＶベクターはまた、免疫優性のエピトープ及び非免疫優性のエピトープの提示のみならず非標準のＭＨＣ拘束ももたらすような変異を含有してもよい。しかしながら、本明細書に記載のＣＭＶベクターにおける変異は、これまでにＣＭＶに感染したことのある対象を再感染させるベクターの能力には影響を及ぼさない。こうしたＣＭＶ変異は、例えば、米国特許出願公開第２０１３−０１３６７６８号、第２０１０−０１４２８２３号、第２０１４−０１４１０３８号及びＰＣＴ出願国際公開第２０１４／１３８２０９号に記載されており、その全ては参照により本明細書に組み入れられたものとする。
【０１０５】
開示のＣＭＶベクターは、生体内に投与することができるが、例えば、ＭＨＣ−Ｅ（又はそのホモログ若しくはそのオーソログ）によって拘束されているＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の割合が高いことを特徴とする免疫応答を含む、ＣＤ８＋免疫応答を含む、免疫原性応答を生成することを目指す。例えば、一部の実施形態においては、ＲｈＣＭＶを用いた免疫原性組成物及びワクチンの前臨床試験のために、アカゲザル等の実験動物において、開示のＣＭＶベクターを使用することが望まれ得る。他の例においては、ＨＣＭＶを用いた免疫原性組成物の臨床試験において及び実際の臨床的使用等において、ヒト対象において開示のＣＭＶベクターを使用することが望ましいであろう。
【０１０６】
こうした生体内での用途のため、開示のＣＭＶベクターは、薬剤的に許容できるキャリアをさらに含む免疫原性組成物のうちの成分として投与される。開示の免疫原性組成物は、病原体特異抗原を含む異種抗原に対する免疫応答を刺激するのに有用であり、またＡＩＤＳの予防、改善若しくは治療のためにＨＩＶ―１に対する予防的若しくは治療的なワクチンのうちの１つ又は複数の成分として用いることができる。開示の核酸及びベクターは、遺伝子ワクチン、すなわち開示の抗原をコードする核酸を、その後抗原が対象において発現されて免疫応答が誘発されるようにして、ヒト等の対象に送達するためのワクチンを提供するのに特に有用である。
【０１０７】
免疫化スケジュール（又はレジメン）は、動物（ヒトを含む）に関して周知であり、特定の対象及び免疫原性組成物に関して容易に決定することができる。したがって、免疫原は、対象に対して１回又は複数回投与され得る。好ましくは、免疫原性組成物のそれぞれの投与間に所定の時間間隔をあける。この間隔は対象毎に異なるものであるが、典型的には１０日間から数週間の範囲とし、しばしば２、４、６又は８週間とする。ヒトの場合、この間隔は、典型的には２から６週間である。本開示の特に有利な実施形態においては、この間隔はより長いものとし、有利には、約１０週間、１２週間、１４週間、１６週間、１８週間、２０週間、２２週間、２４週間、２６週間、２８週間、３０週間、３２週間、３４週間、３６週間、３８週間、４０週間、４２週間、４４週間、４６週間、４８週間、５０週間、５２週間、５４週間、５６週間、５８週間、６０週間、６２週間、６４週間、６６週間、６８週間又は７０週間である。免疫化レジメンは、典型的には免疫原性組成物の１回から６回の投与を含むが、１回又は２回又は４回程度でもよい。免疫応答を誘導する方法はまた、免疫原を含むアジュバントを投与することを含んでもよい。一部の例においては、年一回、年二回又は他の長期間（５〜１０年）の追加免疫によって、初回の免疫化プロトコルを補ってもよい。本方法はまた、種々のプライム−ブースト法を含む。これら方法では、１回又は複数回の初回免疫化（priming immunization）に次いで、１回又は複数回の追加免疫化が続く。実際の免疫原性組成物は、免疫化毎及び免疫原性組成物のタイプ（例えば、タンパク質又は発現ベクターを含む）毎に同一又は異なるものであり得、免疫原の経路及び剤形もまた変動し得る。例えば、ある発現ベクターを初回及び追加免疫のステップに用いる場合、それは、同じタイプ又は異なるタイプのもののいずれであってもよい（例えば、ＤＮＡ又は細菌性若しくはウイルス性の発現ベクター）。有用なプライム−ブースト法のひとつは、４週間空けて２回の初回免疫化を行い、次いで最後の初回免疫化後４週目及び８週目に２回の追加免疫化を行う。また当業者にとっては、開示のＤＮＡ、細菌性及びウイルス性の発現ベクターを用いてプライム−ブースト法を提供することを包含するいくつかの順序変更及び組合せが存在するということが容易に明らかであろう。ＣＭＶベクターは、様々な病原体から誘導される様々な抗原を発現しながら、繰り返し用いることができる。
【実施例】
【０１０８】
以下の実施例は、単に説明をするためのものである。この開示に照らして、当業者は、過度の実験を行うことなく、これら実施例及び開示された発明の他の実施例の変形が可能であるということを認識するであろう。
【０１０９】
実施例１
ＳＩＶに対しての保護のために重要であるＭＨＣ−Ｅ応答
６８−１株ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクターは、悪性度の高いＳＩＶに対して観察された中で最良の保護をもたらす（Hansen, S.G. et al. Profound early control of highly pathogenic SIV by an effector memory T-cell vaccine. Nature 473, 523-7, (2011)；Hansen, S.G. et al. Immune clearance of highly pathogenic SIV infection. Nature 502, 100-4, (2013)；Hansen, SG. et al. Effector memory T cell responses are associated with protection of rhesus monkeys from mucosal simian immunodeficiency virus challenge. Nature medicine 15, 293-9, (2009)（以下、「Ｈａｎｓｅｎ  ２００９」と称する）。特に、６８．１株は、ＭＨＣ−Ｅ及びＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発する（Hansen, S.G. et al. Cytomegalovirus vectors violate CD8+ T cell epitope recognition paradigms. Science 340, 1237874 (2013)（以下、「Ｈａｎｓｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１３」と称する）；Hansen, S.G. et al. Broadly targeted CD8(+) T cell responses restricted by major histocompatibility complex E. Science 351, 714-20 (2016)（以下、「Ｈａｎｓｅｎ２０１６」と称する））が、媒介的な保護におけるこうした「非古典的（unconventional）」Ｔ細胞応答の重要性は、これまでに判断されていない。
【０１１０】
ＲｈＣＭＶ  ６８−１は、ＨＣＭＶ  ＵＬ１２８及びＵＬ１３０のホモログを欠いており、ＲｈＣＭＶ  ６８−１へのＵＬ１２８及びＵＬ１３０の再挿入（６８−１．２株ＲｈＣＭＶ／ｇａｇ（ＵＬ１２８／ＵＬ１３０修復））で、ＭＨＣ−Ｅ及びＭＨＣ−ＩＩからＭＨＣ−Ｉａへの完全な交換がもたらされる（図１）（Ｈａｎｓｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１３も参照のこと）。また、ＵＬ１２８又はＵＬ１３０が、６８−１．２株（６８−１．２株ＲｈＣＭＶ／ｇａｇ（ＵＬ１３０修復）及び６８−１．２株ＲｈＣＭＶ／ｇａｇ（ＵＬ１２８修復））から欠失することで、ＭＨＣ−Ｉ及びＭＨＣ−ＩＩであって、ＭＨＣ−ＩＩスーパートープ特異性又はＭＨＣ−Ｅ拘束性のＣＤ８＋  Ｔ細胞ではない混合表現型をもたらす（図１）（国際公開第２０１４／１３８２０９号も参照のこと）。
【０１１１】
ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発する能力を欠いているベクターが 、悪性度が高いＳＩＶに対してアカゲザル（ＲＭ）を保護することができるか否かを決定するために、ＲＭに対して、以下の３種のベクター：ＲｈＣＭＶ  ６８−１（ＵＬ１２８及びＵＬ１３０欠失）、６８−１．２（ＵＬ１２８及びＵＬ１３０インタクト）及びＵＬ１２８を欠失した６８−１．２（ＵＬ１３０インタクト）のうちの１つをワクチン接種した。各ベクターは、ＳＩＶ抗原、ＳＩＶｇａｇ、ＳＩＶｒｅｖ−ｔａｔ−ｎｅｆ−及びＳＩＶｐｏｌを発現した。Ｈａｎｓｅｎ  ２００９に記載の方法を用いて、ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクターを、ｔ＝０週とｔ＝１８週とに２回皮下投与し（１ベクター当たり５×１０６ＰＦＵ）、第９１週に、繰り返しの用量限界での直腸内へのＳＩＶｍａｃ２３９の攻撃を開始した。ＳＩＶ  Ｖｉｆ特異Ｔ細胞応答が新規に発生することによってＳＩＶ感染の「取得」が確認されるまで、全てのＲＭに低投与量のＳＩＶｍａｃ２３９で繰り返し攻撃し、結果は、決定的にＳＩＶ感染した動物でのみ判断した。ワクチンにはＳＩＶ  Ｖｉｆは含まれていなかったため、これら応答は、ＳＩＶ感染に由来するものである。６８−１  ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶでワクチン接種したＲＭ１５匹のうち８匹が、（典型的）ストリンジェントなＳＩＶ制御を見せ、６８−１．２及びＵＬ１２８欠失６８−１．２  ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶでワクチン接種したＲＭの全てが、ワクチン未接種のコントロールと同様に、攻撃後に、明らかな進行性感染症を見せた（図２）。腟内経路からＳＩＶｍａｃ２３９で攻撃した雌ＲＭにおいて、６８−１及び６８−１．２のＲｈＣＭＶ／ＳＩＶのワクチン接種を６８−１対６８−１．２で比較する独立の実験では、同一の結果が観察された。ＳＩＶ特異ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の規模及び機能表現型が、３ワクチン群全てで比較可能であったが、ベクターの免疫原性における特筆すべき相違は、ＳＩＶ特異ＣＤ８＋  Ｔ細胞によって標的とされたエピトープの性質のみであった。詳細には、６８−１は、ＭＨＣ−Ｅ又はＭＨＣ−ＩＩ拘束性であり、（ΔＵＬ１２８）６８−１．２は、ＭＨＣ−Ｉａ又はＭＨＣ−ＩＩ拘束性であり（ＭＨＣ−ＩＩスーパートープは除く）、６８−１．２は、ＭＨＣ−Ｉａ拘束性のみであった。これら結果は、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞及び、可能性のあるＭＨＣ−ＩＩスーパートープ特異ＣＤ８＋  Ｔ細胞が、ＳＩＶに対する保護のために重要であるということを強く示唆している。
【０１１２】
実施例２
カニクイザルにおけるＭＨＣ−Ｅ応答の誘導に必要な、ＵＬ１２８及びＵＬ１３０のホモログに加えたＵＬ１４６及びＵＬ１４７ホモログ遺伝子の欠失
ＲｈＣＭＶ  ６８−１は、複数の遺伝子欠失、遺伝子逆転（inversion）及び単一点突然変異を含有する線維芽細胞適応ウイルス（fibroblast-adapted virus）である（Malouli, D. et al., Reevaluation of the Coding Potential and Proteomic Analysis of the BAC-Derived Rhesus Cytomegalovirus Strain 68-1. J Virol 86, 8959-73 (2012)）。さらに、野生型ＲｈＣＭＶは、ＭＨＣ−ＩＩ及びＭＨＣ−Ｅ応答を誘発しない（Ｈａｎｓｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１３及びＨａｎｓｅｎ  ２０１６）。ＲｈＣＭＶと同様に、野生型ＨＣＭＶは、例外的な状況においてのみ、ＨＬＡ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発する（Pietra, G. et al. HLA-E-restricted recognition of cytomegalovirus-derived peptides by human CD8+ cytolytic T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 10896-10901 (2003)）。ＲＭにおける野生型ＲｈＣＭＶと、またおそらくヒトにおける野生型ＨＣＭＶとは、ＵＬ１２８及びＵＬ１３０が存在することに起因してＭＨＣ−Ｅ応答を誘発しないと考えられる。しかしながら、このことは、６８−１における他の変異が、ＭＨＣ−Ｅ応答に必要であるという可能性を排除するものではない。この可能性に対処するため、ＭＨＣ−Ｅ応答の誘発に必要な遺伝子改変を、別の種であるカニクイザル（M. fascicularis）で決定した。
【０１１３】
非古典的（unconventional）ＣＤ８＋  Ｔ細胞がカニクイザルにおいて誘発されるか否かを決定するために、カニクイザルＣＭＶ（ＣｙＣＭＶ）を細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてクローン化した。Ｃｙ１３．１遺伝子、ＲｈＣＭＶ  Ｒｈ１３．１及びＨＣＭＶ  ＲＬ１３のホモログが、ＳＩＶｇａｇで置き換えられた。得られたＣｙＣＭＶ  ＢＡＣは、次世代シーケンシングで完全に配列決定され、それは全ての予想されるオープンリーディングフレームが存在していることを実証した（図３）。ＵＬ１２８−１３０の欠失がＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発するのに十分であるか否かを調べるために、ＨＣＭＶ  ＵＬ１２８及びＵＬ１３０に相同であるＣｙＣＭＶ遺伝子を、前駆体コンストラクトから欠失させて、ＣｙＣＭＶ  ΔＲＬ１３／ＳＩＶｇａｇ  ΔＵＬ１２８−１３０を生成した（図４）。
【０１１４】
ＣｙＣＭＶ  ΔＲＬ１３／ＳＩＶｇａｇ  ΔＵＬ１２８−１３０の免疫原性を、カニクイザルに接種して、ＳＩＶｇａｇペプチドに対する末梢血のＣＤ８＋メモリーＴ細胞応答を監視することによって生体内で評価した。ＣｙＣＭＶ  ΔＲＬ１３／ＳＩＶｇａｇ  ΔＵＬ１２８−１３０ベクターでワクチン接種したカニクイザルのＰＢＭＣを、４つのアミノ酸がオーバーラップする１５ｍｅｒ  ＳＩＶｇａｇペプチド（ＧＡＧ  ＯＲＦ）で、又は、ＭＨＣ−ＩＩもしくはＭＨＣ−Ｅスーパートープに対応する図示したＳＩＶｇａｇペプチドで刺激して、フローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を実行した。スーパートープペプチドは、ＭＨＣハプロタイプにかかわらず、すなわち所与のＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩ対立遺伝子が存在するか存在しないかにかかわらず、９０％以上の動物で認識されるペプチドである。ＭＨＣ−Ｅ又はＭＨＣ−ＩＩ結合性ＳＩＶｇａｇペプチドに応答するＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの発現を介して同定した（図５Ａ）。動物は、タンパク質全体をカバーするオーパーラップペプチド（ＧＡＧ  ＯＲＦ）でＴ細胞が刺激されたときに、ＳＩＶｇａｇに対する頑健なＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘発した。しかしながら、ＣｙＣＭＶ  ΔＲＬ１３／ＳＩＶｇａｇ  ΔＵＬ１２８−１３０は、ＲｈＣＭＶ  ６８−１で免疫した全てのマカクにおいて事前に検出されたものであるＭＨＣ−Ｅスーパートープ応答（Ｈａｎｓｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３及びＨａｎｓｅｎ  ２０１６に記載のペプチドＧａｇ６９及びＧａｇ１２０）又はＭＨＣ−ＩＩスーパートープ応答（Ｈａｎｓｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３及びＨａｎｓｅｎ  ２０１６に記載のＧａｇ５３及びＧａｇ７３）を認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘発しなかった（図５Ｂ）。代わりとして、ＣｙＣＭＶ  ΔＲＬ１３／ＳＩＶｇａｇ  ΔＵＬ１２８−１３０が、ＭＨＣ−Ｉ及びＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の混合を誘導した（図５Ｃ）。しかしながら、ＭＨＣ−ＩＩスーパートープ応答は観察されなかった。これら結果は、野生型カニクイザルＣＭＶからＵＬ１２８及びＵＬ１３０を欠失させることが、ＭＨＣ−Ｅ拘束性及びＭＨＣ−ＩＩスーパートープ特異ＣＤ８＋  Ｔ細胞の誘発に不十分であるということを示唆している。
【０１１５】
少なくとも２つの異なる可能性：ａ）カニクイザルが、ＭＨＣ−Ｅ拘束性及びＭＨＣ−ＩＩスーパートープ特異ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発することができないこと、又は、ｂ）ＲｈＣＭＶ  ６８−１におけるさらなる変異が、このウイルスに、アカゲザルにおけるＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発できるようにさせることが、これら結果を説明しているだろう。ＲｈＣＭＶ  ６８−１はまた、ＵＬ１２８及びＵＬ１３０のホモログに加えて、ＨＣＭＶ  ＵＬ１４６及びＵＬ１４７に対して相同である遺伝子も欠いている（Oxford, K. L., M. K. Eberhardt, K. W. Yang, L. Strelow, S. Kelly, S. S. Zhou, and P. A. Barry. 2008. Protein coding content of the ULb' region of wild-type rhesus cytomegalovirus. Virology 373:181-8；参照により本明細書に組み入れられる）。野生型ＲｈＣＭＶは、これらＣＸＣ−ケモカイン様タンパク質の６つの複製をコードし、そのうちの３つがＲｈＣＭＶ  ６８−１において欠失し、残りの３つの遺伝子の発現はわかっていない。このＲｈＣＭＶ  ６８−１の特徴を要約するために、ＵＬ１２８及びＵＬ１３０のホモログのみならず、ＵＬ１４６及びＵＬ１４７の６つの全てのホモログもまた欠いているＣｙＣＭＶを生成させた（図４）。ＣｙＣＭＶΔＲＬ１３／ｇａｇΔＵＬ１２８−１３０ΔＵＬ１４６−１４７ベクターでワクチン接種したカニクイザルのＰＢＭＣを、４つのアミノ酸がオーバーラップする１５ｍｅｒ  ＳＩＶｇａｇペプチド（ＧＡＧ  ＯＲＦ）で、又は、ＭＨＣ−ＩＩもしくはＭＨＣ−Ｅスーパートープに対応する図示したＳＩＶｇａｇペプチドで刺激して、フローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を実行した。ＭＨＣ−Ｅ又はＭＨＣ−ＩＩ結合性ＳＩＶｇａｇペプチドに応答するＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの発現を介して同定した。ＣｙＣＭＶ  ΔＲＬ１３／ＳＩＶｇａｇΔＵＬ１２８／１３０ΔＵＬ１４６でカニクイザルをワクチン接種することで、ＭＨＣ−Ｅ及びＭＨＣ−ＩＩの両スーパートープを認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発した（図６Ａ）。詳細には、Ｇａｇ６９は、ＭＨＣ−Ｅ拘束性（ＭＨＣ−Ｅは非多型のＭＨＣ−１分子である）と一貫して、抗−ＭＨＣ−Ｉ及びＶＬ９ペプチドによって阻害されるがＣＬＩＰペプチドでは阻害されず、一方、Ｇａｇ７３は、ＭＨＣ−ＩＩ拘束性と一貫して、ＣＬＩＰペプチドによって阻害されるが抗−ＭＨＣ−Ｉ又はＶＬ９ペプチドでは阻害されなかった（図６Ｂ）。これら結果は、ＣｙＣＭＶ  ΔＲＬ１３／ＳＩＶｇａｇΔＵＬ１２８−１３０ΔＵＬ１４６−１４７が、ＭＨＣ−Ｅ及びＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発するが多型のＭＨＣ−Ｉａ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞は誘発しないということを示唆している（図６Ｃ）。
【０１１６】
まとめると、これらデータは、ＵＬ１４６／１４７ファミリーのＣＸＣケモカイン様タンパク質が、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞のみならずＭＨＣ−ＩＩスーパートープ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の誘導を阻害するということを示唆している。したがって、これらデータは、ＭＨＣ−Ｅ拘束性及びＭＨＣ−ＩＩスーパートープ特異性のＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＵＬ１２８及びＵＬ１３０の両方を欠くのみならず、ＵＬ１４６及びＵＬ１４７のホモログの全て又は該ホモログの一部若しくは全部を欠いているＣＭＶベクターによってのみ誘導され得るという概念を支持している。ＲｈＣＭＶによるＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の誘導はまた、これまでに、ＵＬ４０及びＵＳ２８のホモログの存在を必要とすることも示されている。ＣｙＣＭＶはまた、これら遺伝子を含有していたため、これら結果は、ＣＭＶベクターが、以下の遺伝子構造を有していれば、単にＭＨＣ−Ｅ応答を誘発することとなるということを示唆している：ＵＬ１２８及びＵＬ１３０又はホモログが欠失していること；ＵＬ１４６若しくはＵＬ１４７若しくはホモログの一部又は全部が欠失していること；ＵＬ４０又はホモログが存在していること；及び、ＵＳ２８又はホモログが存在していること。
【０１１７】
実施例３
アカゲザルにおけるＭＨＣ−Ｅ応答の誘導を阻害する、アカゲザルＣＭＶ及びヒトＣＭＶのＵＬ１４６ホモログ
ＲｈＣＭＶのＵＬ１４６／１４７ホモログ遺伝子が、ＵＬ１２８及びＵＬ１３０が欠失していたとしてもＲＭにおけるＭＨＣ−Ｅ応答の誘導を同様に阻害するか否かを実証するために、高度に変異したＲｈＣＭＶ  ６８−１を生じさせる、元来の配列のＲｈＣＭＶの分離株を回復することによって、野生型のＲｈＣＭＶを生成した。ＲｈＣＭＶ  ６８−１前駆体ウイルスのＵＬｂ’領域を、Ｇｉｌｌら（Gill, R. B. et al., Coding potential of UL/b' from the initial source of rhesus cytomegalovirus Strain 68-1. Virology 447, 208-212）によって記載された元来の分離株から配列決定した。ＲｈＣＭＶ  ６８−１細菌人工染色体（ＢＡＣ）の遺伝子改変を用いることによって、一連の変異誘発工程において、野生型の完全長のゲノム（ＦＬ−ＲｈＣＭＶ）を再形成した（図７）。ＦＬ−ＲｈＣＭＶ−ＢＡＣを開始点として用いて、ＳＩＶｇａｇをＨＣＭＶ  ＲＬ１３のＲｈＣＭＶホモログに挿入して、ＦＬ−ＲｈＣＭＶΔＲＬ１３ｇａｇを生成した。ＲＭに接種すると、ＳＩＶｇａｇに対するＣＤ８＋  Ｔ細胞応答が観察されたが、ＭＨＣ−ＩＩ又はＭＨＣ−Ｅスーパートープに対しての応答はなかった（図８Ａ）。次に、ＵＬ１２８及びＵＬ１３０のＲｈＣＭＶホモログを欠失させて、ＦＬ−ＲｈＣＭＶΔＲＬ１３ｇａｇΔＵＬ１２８−１３０を生成した。ＲＭに接種すると、ＳＩＶｇａｇ特異ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答が同様に観察されたが、ＭＨＣ−Ｅ又はＭＨＣ−ＩＩスーパートープに対しての応答はなかった（図８Ｂ）。これら観察は、ケモカインのＨＣＭＶ  ＵＬ１４６／１４７遺伝子ファミリーのＲｈＣＭＶホモログが、ＭＨＣ−Ｅ拘束性及びＭＨＣ−ＩＩスーパートープ特異性のＣＤ８＋  Ｔ細胞の誘導を阻害しているということを強く示唆していた。
【０１１８】
６８−１  ＲｈＣＭＶは、ＨＣＭＶ  ＵＬ１４６及びＵＬ１４７の６つのホモログのうち３つのみを欠いているため、ＨＣＭＶ  ＵＬ１４６及びＵＬ１４７の中央の３つのホモログが欠失して、このことにより、ＵＬ１２８−１３０欠失ＲｈＣＭＶが、ＭＨＣ−Ｅ拘束性及びＭＨＣ−ＩＩスーパートープ特異性のＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発できるようになるか否かを判断した。しかしながら驚くべきことに、ＦＬ−ＲｈＣＭＶΔＲＬ１３ｇａｇΔＵＬ１２８−１３０ΔＵＬ１４６（３）は、ＭＨＣ−ＩＩ又はＭＨＣ−Ｅによって拘束されるスーパートープエピトープに対するＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発することができなかった（図８Ｃ）。これら結果は、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発するために、６つのうち３つ以上のホモログを欠失又は不活性化させる必要であるということを強く示唆している。そのため、ＵＬ１４６及びＵＬ１４７の６つの全てのホモログを欠失させて、ＦＬ−ＲｈＣＭＶΔＲＬ１３ｇａｇΔＵＬ１２８−１３０ΔＵＬ１４６（６）を生成した。このベクターで接種したＲＭは、ＭＨＣ−ＩＩ及びＭＨＣ−Ｅスーパートープを認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発することができた（図８Ｄ）。これら結果は、ＵＬ１４６及びＵＬ１４７の６つの全てのホモログを欠失させることで、ＵＬ１２８＋１３０を欠いたＲｈＣＭＶが、ＭＨＣ−Ｅ拘束性及びＭＨＣ−ＩＩスーパートープ特異性のＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発できるようになるということを実証している。
【０１１９】
ＣｙＣＭＶ及びＲｈＣＭＶの両方が、２つのＨＣＭＶ遺伝子ＵＬ１４６及びＵＬ１４７に対して相同である６つの遺伝子を含有している。まとめると、上記したデータは、カニクイザルＣＭＶ及びアカゲザルＣＭＶの両方のこれらケモカイン様遺伝子が、ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の誘導を阻害しているということを示唆している。この阻害効果が、ＨＣＭＶにおいて保存されたか否かを決定するために、ＢＡＣ組換え技術によって、ＨＣＭＶ  ＵＬ１４６及びＵＬ１４７を単独で又は組み合わせて、ＦＬ−ＲｈＣＭＶΔＲＬ１３ｇａｇΔＵＬ１２８−１３０ΔＵＬ１４６（６）内に挿入した。以下の３つの異なるキメラベクターを生成した：ＦＬ−ＲｈＣＭＶΔＲＬ１３ｇａｇΔＵＬ１２８−１３０ｈｃｍｖＵＬ１４６−ＵＬ１４７（対応するＲｈＣＭＶホモログの代わりに両ＨＣＭＶ遺伝子を含有する）；ＦＬ−ＲｈＣＭＶΔＲＬ１３ｇａｇΔＵＬ１２８−１３０ｈｃｍｖＵＬ１４６（対応するＲｈＣＭＶホモログの代わりにＨＣＭＶ  ＵＬ１４６を含有する）；及び、ＦＬ−ＲｈＣＭＶΔＲＬ１３ｇａｇΔＵＬ１２８−１３０ｈｃｍｖＵＬ１４７（対応するＲｈＣＭＶホモログの代わりにＨＣＭＶ  ＵＬ１４７を含有する）。ＲＭにこれら３つのコンストラクトを接種した場合、３つの組換えベクターのうち、ＭＨＣ−ＩＩ又はＭＨＣ−Ｅスーパートープを認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発したものはなかった（図９Ａ〜９Ｃ）。これら結果は、ＭＨＣ−Ｅ拘束性及びＭＨＣ−ＩＩスーパートープ特異性のＣＤ８＋  Ｔ細胞を阻害する能力は、ＨＣＭＶに保存されている特徴であるということを示唆している。これら及びここまでの結果に基づけば、ＨＣＭＶベクターは、ＭＨＣ−Ｅ拘束性及びＭＨＣ−ＩＩスーパートープ特異性のＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発するために以下の特徴を有する必要があるということもまた明らかである：ａ）ＵＬ１２８及びＵＬ１３０両方を欠いていること；ｂ）ＵＬ１４７及びＵＬ１４７を欠いていること；ｃ）ＵＬ４０が存在していること；ｄ）ＵＳ２８又はＵＳ２７のいずれかが存在していること。
【０１２０】
実施例４
ＭＨＣ−Ｅによって大部分が拘束されているＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘発する内皮細胞特異ｍｉｃｒｏＲＮＡ認識配列（ＭＲＥ）を含むＣＭＶベクター
内皮細胞系列細胞におけるＲｈＣＭＶベースのベクターの複製能力を制限するために、ＲｈＣＭＶ  ６８−１を改変して、必須ウイルス遺伝子の３’ＵＴＲ内に内皮細胞特異ｍｉＲ−１２６−３ｐ標的配列を含有させた。ｍｉＲ−１４２−３ｐの組織特異発現を呈する骨髄細胞系列細胞と同様に、内皮細胞は、細胞系列特異的であるｍｉＲ−１２６−３ｐを発現する。２つの必須ＲｈＣＭＶ遺伝子（ＨＣＭＶ  ＵＬ１２２（ＩＥ２）に対して相同である必須最初期遺伝子Ｒｈ１５６と、ＨＣＭＶ  ＵＬ７９に対して相同である必須最初期遺伝子Ｒｈ１０８）の３’ＵＴＲ内にｍｉＲ−１２６−３ｐ標的部位を挿入することにより、これらウイルスの必須タンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳の阻害に起因して、ｍｉＲ−１２６−３ｐを高度に発現する内皮細胞内のウイルス複製が阻害されるという仮説を立てた。
【０１２１】
ｇａｌＫが介在するＢＡＣ組換えを用いて、ｇａｌＫ選択カセットをＲｈ１５６の３’ＵＴＲ内に挿入して、その後、８つのランダムなヌクレオチドで分離されたｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位の４つの複製を含有する人工カセットで置換した。その後、第二の一連の組換えを行い、それによって、ｇａｌＫカセットをＲｈ１０８の３’ＵＴＲ内に挿入して、これを上記したような人工カセットで置換した（図１０）。さらにこれらベクターは、ＳＩＶｇａｇ由来の異種抗原を、この抗原の遺伝子Ｒｈ２１１内への挿入（ＥＦ１αプロモーターの制御下で）によって発現した。組換えが良好であるかを、挿入部位に隣接する領域に対して設計されたプライマーでのＰＣＲを用いて、次いでＰＣＲ産物の配列決定をすることによって確認した。次にインタクトなＢＡＣ  ＤＮＡを初代アカゲザル線維芽細胞内に電気穿孔して、ウイルスを回収し、ウイルスＤＮＡもまた配列決定した。
【０１２２】
肺線維芽細胞、臍帯静脈内皮細胞及びマクロファージは、アカゲザル由来のものとした。各細胞型からＲＮＡを単離して、全サンプルに対して、ｍｉＲ−１２６−３ｐ及びｍｉＲ−１４２−３ｐについてのｑＲＴ−ＰＣＲを行った。ｍｉＲ−１２６−３ｐ及びｍｉＲ−１４２−３ｐの複製数は、標準曲線を用いて、１０ｎｇのＲＮＡより決定された。ｍｉＲ−１２６−３ｐ  ｍｉＲＮＡは、アカゲザルの内皮細胞内では高度に発現されたが、末梢血由来のマクロファージ又は初代線維芽細胞においては、低いレベルであった。対照的に、ｍｉＲ−１４２−３ｐはマクロファージ内では高度に発現されたが、内皮細胞又は線維芽細胞においては発現されなかった（図１１）。これらデータは、アカゲザルの内皮細胞系列細胞が、アカゲザルの線維芽細胞又はマクロファージと比較してｍｉＲ−１２６−３ｐをずっと高いレベルで発現するということを実証しており、内皮細胞における必須のＲｈＣＭＶ転写物を標的とするためにこのｍｉＲＮＡを用いているという理論をもたらすものである。
【０１２３】
ｍｉＲ−１２６−３ｐレベルが高い細胞においては、ｍｉＲ−１２６−３ｐをロードしたＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）がＲｈ１５６及びＲｈ１０８の３’ＵＴＲに結合して翻訳を阻害することとなるため、必須遺伝子（Ｒｈ１５６及びＲｈ１０８等）内にｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位を含有するウイルスは、その増殖が厳しく制限される。ウイルス複製に対するｍｉＲ−１２６−３ｐ発現の影響を実証するために、ｍｉＲ−１２６−３ｐ又はネガティブコントロール模倣体を、アカゲザル線維芽細胞内にトランスフェクションして、ｍｉＲ−１２６−３ｐ標的部位を含有する６８−１  ＲｈＣＭＶのウイルス増殖又は同等のサイズの組み換えた（scrambled）配列（６８−１  Ｒｈ１５６／Ｒｈ１０８  ｍｉＲ−１２６ｍｕｔ）を監視した。詳細には、テロメル化（telomerized）アカゲザル線維芽細胞を、ネガティブコントロールｍｉＲＮＡ又はｍｉＲ−１２６  ＲＮＡ模倣体でトランスフェクションし、トランスフェクションの２４時間後、細胞を、ＭＯＩ０．０１で、ＲｈＣＭＶ  ６８−１  Ｒｈ１５６／Ｒｈ１０８  ｍｉＲ−１２６又はＲｈＣＭＶ  ６８−１  Ｒｈ１５６／Ｒｈ１０  ｍｉＲ−１２６ｍｕｔに感染させた。細胞及び上清を、図示した時間に収穫して、アカゲザル線維芽細胞に滴定した。図１２に示すように、コントロールｍｉＲＮＡのトランスフェクションではなくｍｉＲ−１２６−３ｐ模倣体のトランスフェクションで、細胞におけるウイルス増殖及び上清へのウイルス放出が、６８−１  ＲｈＣＭＶ  Ｒｈ１５６／Ｒｈ１０８  ｍｉＲ−１２６に関しては厳しく阻害されていたが、６８−１  ＲｈＣＭＶ  Ｒｈ１５６／Ｒｈ１０８  ｍｉＲ−１２６ｍｕｔに関しては阻害されなかった。
【０１２４】
ｍｉＲ−１２６−３ｐが、内皮細胞におけるウイルス増殖を阻害しているということをさらに実証するために、ｍｉＲ−１２６−３ｐ標的部位を、インタクトな五量体複合体に起因してＲｈＣＭＶ  ６８−１よりも効率的に体外で内皮細胞に感染するものであるＲｈＣＭＶ  ６８−１．２内のＩＥ２及びＵＬ７９ホモログの３’ＵＴＲに挿入した。初代アカゲザル内皮細胞を、ＭＯＩ０．０１で、６８−１．２  ＲｈＣＭＶ  Ｒｈ１５６／Ｒｈ１０８  ｍｉＲ−１２６又は６８−１．２  ＲｈＣＭＶ  Ｒｈ１５６／Ｒｈ１０８  ｍｉＲ−１２６ｍｕｔに感染させた。感染した細胞又は上清を、感染後７日目、１４日目、２１日目、及び２８日目に収穫し、次いでアカゲザル線維芽細胞にウイルス滴定を行った。図１３に示すように、アカゲザル内皮細胞中でウイルスが増殖する能力は、６８−１．２  ＲｈＣＭＶ  Ｒｈ１５６／Ｒｈ１０８  ｍｉＲ−１２６−３ｐでは厳しく制限されたが、組み換えたｍｉＲ−１２６−３ｐ標的配列を含有するコントロールＲｈＣＭＶ  ６８−１．２（６８−１．２  ＲｈＣＭＶ  Ｒｈ１５６／Ｒｈ１０８  ｍｉＲ−１２６ｍｕｔ）ではされなかった。
【０１２５】
ｍｉＲ−１２６拘束性ウイルスの免疫原性は、生体内で評価した。アカゲザルを６８−１  ＲｈＣＭＶ  Ｒｈ１５６／Ｒｈ１０８  ｍｉＲ−１２６／ＳＩＶｇａｇベクター（ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６及びＵＬ１４７のホモログを欠いているが、ＨＣＭＶ  ＵＬ４０及びＵＳ２８の機能性ホモログは含有しており、またＥＦ１αプロモーターの制御下でＳＩＶｇａｇ導入遺伝子を含有する）でワクチン接種し、末梢血のＣＤ８＋メモリーＴ細胞を単離してフローサイトメトリーによるＩＣＳを介して、オーバーラップＳＩＶｇａｇペプチドに対する応答を解析した（図１５）。この動物は、ＳＩＶｇａｇに関するオーバーラップペプチドの存在下でＣＤ６９及びＴＮＦαのアップレギュレーションで示されるようにタンパク質全体に対して、頑健なＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘発した。この結果は、ワクチンベクターの全体的な免疫原性が、ｍｉＲ−１２６−３ｐ標的部位の導入によって汚染されていないということを示唆した。しかしながら、ベクターは、ＭＨＣ−Ｅによって拘束されるＣＤ８＋  Ｔ細胞は誘発したが、ＭＨＣ−ＩＩ拘束性エピトープに対するＣＤ８＋  Ｔ細胞は誘発しなかった。このＴ細胞表現型をさらに特徴付けるために、２匹のＲＭに６８−１  ＲｈＣＭＶ  ｍｉＲ−１２６／ＳＩＶｇａｇでワクチン接種して、１２５個のＳＩＶｇａｇペプチドのそれぞれのＭＨＣ拘束性を、それぞれＭＨＣ−Ｅ又はＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を阻害する、ＶＬ９ペプチド又はＣＬＩＰペプチドの存在下又は不在下において、ＩＣＳによってＴ細胞応答を測定することで決定した。図１４に示すように、６８−１  ＲｈＣＭＶ  ｍｉＲ−１２６／ＳＩＶｇａｇで免疫化したＲＭから得られたＣＤ８＋  Ｔ細胞によって認識される全てのぺプチドが、ＭＨＣ−Ｅによって提示された。これら結果は、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６及びＵＬ１４７のホモログを欠いており、ＵＬ４０及びＵＳ２８のホモログを発現するということを理由に、ＲｈＣＭＶ  ６８−１がＭＨＣ−Ｅ及びＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発するということを示唆している。ｍｉＲ−１２６−３ｐをこの骨格に挿入することによって、ＭＨＣ−ＩＩ応答が除去された。
【０１２６】
これらデータは、内皮細胞の感染がＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の誘導に必要であるということを実証している。ゆえに、ｍｉＲ−１２６−３ｐ標的部位の挿入により、「ＭＨＣ−Ｅのみ」のベクター、すなわち排他的にＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞は誘発するが、多型ＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩ分子によって拘束されるＴ細胞は誘発しないベクターが結果として生じる。ＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＳＩＶ及びおそらくＨＩＶに対する保護のために必要であるため、これらデータはまた、ベクターの効能がｍｉＲ−１２６−３ｐ挿入によって改善され得、ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を保護エピトープ上に集中させることとなるということを示唆している。したがって、ＭＨＣ−Ｅ最適化ＨＣＭＶベクターは、以下の特徴を有するはずである：ａ）ＵＬ１２８及びＵＬ１３０の両方を欠いていること；ｂ）ＵＬ１４６及びＵＬ１４７の両方を欠いていること；ｃ）ＵＬ４０が存在していること；ｄ）ＵＳ２８又はＵＳ２７のいずれかが存在していること；及び、ｅ）必須遺伝子、例えばＩＥ２又はＵＬ７９（又はＨＣＭＶの増殖に必須であることが知られている遺伝子のうちのいずれか）の３’ＵＴＲにｍｉＲ−１２６−３ｐ標的部位を挿入すること。
【０１２７】
実施例５
ＭＨＣ−Ｉａによって大部分が拘束されているＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘発する内皮細胞特異性及び骨髄細胞特異性のｍｉｃｒｏＲＮＡ認識配列（ＭＲＥ）の両方を含むＣＭＶベクター
必須ウイルス遺伝子の３’ＵＴＲにおいて骨髄特異ｍｉＲ−１４２−３ｐ標的配列を含有するように改変されたＲｈＣＭＶ  ６８−１が、ＭＨＣ−ＩＩのみのベクター設計をもたらすＭＨＣ−ＩＩ応答を維持しながら、正反対の表現型のｍｉＲ−１２６−３ｐ挿入がＭＨＣ−Ｅ応答を完全に欠如させたということがこれまでに示された（国際公開第２０１７／０８７９２１号を参照のこと）。ｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−１２６−３ｐを組み合せた挿入による影響を決定するために、ＢＡＣ組換えを用いて、ｍｉＲ−１２６−３ｐ及びｍｉＲ−１４２−３ｐのそれぞれの２つの複製をＲｈ１５６及びＲｈ１０８の３’ＵＴＲに挿入した（図１６）。さらにこれらベクターは、ＳＩＶｇａｇ由来の異種抗原を、この抗原の遺伝子Ｒｈ２１１内への挿入（ＥＦ１αプロモーターの制御下で）によって発現した。組換えが良好であるかを、挿入部位に隣接する領域に対して設計されたプライマーでのＰＣＲを用いて、次いでＰＣＲ産物の配列決定をすることによって確認した。次にインタクトなＢＡＣ  ＤＮＡを初代アカゲザル線維芽細胞内に電気穿孔して、ウイルスを回収し、ウイルスＤＮＡもまた配列決定した。
【０１２８】
ｍｉＲ−１２６／ｍｉＲ−１４２−拘束性ウイルスの免疫原性は、生体内で評価した。アカゲザルを６８−１  ＲｈＣＭＶ  Ｒｈ１５６／Ｒｈ１０８  ｍｉＲ−１２６  ｍｉＲ−１４２／ＳＩＶｇａｇベクター（ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６及びＵＬ１４７のホモログを欠いているが、ＨＣＭＶ  ＵＬ４０及びＵＳ２８の機能性ホモログは含有しており、またＥＦ１αプロモーターの制御下でＳＩＶｇａｇ導入遺伝子を含有する）でワクチン接種し、末梢血のＣＤ８＋メモリーＴ細胞を単離してフローサイトメトリーによるＩＣＳを介して、ＳＩＶｇａｇペプチドに対する応答を解析した（図１７）。この動物は、オーバーラップペプチドを用いたＩＣＳで測定したように、全ＳＩＶｇａｇタンパク質に対する頑健なＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘発した。しかしながら、ベクターは、ＭＨＣ−ＩＩ又はＭＨＣ−Ｅ拘束性スーパートープペプチドのいずれかを認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞を確かに誘発した。このＴ細胞の表現型をさらに特徴付けるために、１２５個のＳＩＶｇａｇペプチドそれぞれのＭＨＣ拘束性を、汎−ＭＨＣ−Ｉ（ＭＨＣ−Ｉａ及びＭＨＣ−Ｅの両方を阻害する）、ＶＬ９ペプチド（ＭＨ−Ｅを阻害する）又はＣＬＩＰペプチド（ＭＨＣ−ＩＩを阻害する）の存在下又は不在下において、ＩＣＳによってＴ細胞応答を測定することによって決定した。図１７に示すように、６８−１  ＲｈＣＭＶ  ｍｉＲ−１２６ｍｉＲ−１４２／ＳＩＶｇａｇで免疫化したＲＭから得られたＣＤ８＋  Ｔ細胞によって認識される全てのぺプチドが、ＭＨＣ−Ｉａによって提示された。これら結果は、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６及びＵＬ１４７又はそのホモログを欠いており、またＵＬ４０及びＵＳ２８のホモログを発現するベクターがリプログラミングされて、ｍｉＲ−１２６−３ｐ及びｍｉＲ−１４２−３ｐの両方を挿入することによってＭＨＣ−Ｉａ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発するということを示唆している。
【０１２９】
表１に、上記した実施例で得られた結果を要約している。全ての遺伝子に対してインタクトであり、細胞型特異ｍｉＲによって拘束されていない野生型ＣＭＶが、従来のＭＨＣ−Ｉ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発する。ＵＬ１２８及びＵＬ１３０の欠失（単独で又は組合せのいずれかで）が、ＭＨＣ−Ｉ及び（非スーパートープの）ＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の混合を誘発するベクターを結果として生じる。ＵＬ１４６又はＵＬ１４７のホモログと共にＵＬ１２８及びＵＬ１３０を欠失していることが、ＭＨＣ−ＩＩ及びＭＨＣ−Ｅスーパートープに対する応答を含む、ＭＨＣ−ＩＩ及びＭＨＣ−Ｅによって拘束されるＴ細胞応答を誘発する。これら遺伝子の全てが欠失しているベクターのみが、ＭＨＣ−Ｅ及びＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発する。ＵＬ１４６及びＵＬ１４７のホモログを欠いているが、ＵＬ１２８及びＵＬ１３０のホモログは含有しているベクターは、ＭＨＣ−Ｅ又はＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発しないが、代わりに従来のＭＨＣ−Ｉ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発する。ｍｉＲ−１２６−３ｐターゲティングを介して内皮細胞におけるウイルス遺伝子発現を拘束することによって、ＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の誘導が阻害され得、結果として、排他的なＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘導するベクターが生じる。ｍｉＲ−１２６−３ｐ及びｍｉＲ−１４２−３ｐのターゲティングを介して内皮細胞及び骨髄細胞系統の細胞の両方におけるウイルス遺伝子発現を拘束することによって、ＭＨＣ−ＩＩ及びＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方の誘導が阻害され得、結果として、排他的なＭＨＣ−Ｉａ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘導するベクターが生じる。
表１：ＣＭＶベクターの特定のＭＨＣ拘束性を生じる遺伝子改変のまとめ
【表１】
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＊必須ウイルス遺伝子ＩＥ２（Ｒｈ１５６）及びＵＬ７９（Ｒｈ１０８）の３’ＵＴＲへのｍｉＲ標的配列の４つの複製の挿入
＊＊ＭＨＣ−Ｅ拘束性応答のプライミングもまた、Ｒｈ６７及びＲｈ２１４／２２０又はそれらのＨＣＭＶオーソログ（ＵＬ４０及びＵＳ２７／２８）のインタクトな機能に依存する。
【０１３０】
実施例６
ＭＨＣ−Ｅの文脈における目的のペプチドに対するＣＤ８＋  Ｔ細胞の特異性の生成
古典的多型ＭＨＣ−ｌａ分子の文脈における目的の抗原由来ペプチドを認識するＴ細胞受容体を用いて、癌又は感染症等の疾患の免疫療法のために自己（autologous）Ｔ細胞をトランスフェクションすることができる。このアプローチに対する主な障害は、患者に合致するＭＨＣ−ｌａに対する所与のＴＣＲの使用を制限する、ヒト集団におけるＭＨＣ−ｌａの多様性である。非古典的で、非多型のＭＨＣ−Ｅの文脈における目的の抗原由来ペプチド（例えば、腫瘍抗原由来ペプチド及び病原体由来ペプチド）を認識するＴＣＲを生成することによって、ＭＨＣの合致は時代遅れとなっており、得られるＴＣＲは、全ての患者において使用が可能となる。
【０１３１】
ＭＨＣ−Ｅ／ペプチド複合体を認識するＣＤ８＋  Ｔ細胞は天然では珍しく、腫瘍抗原、病原体由来抗原、組織特異抗原又は宿主の自己抗原等である目的の抗原に対するこうしたＴ細胞を生成するための信頼できる方法は現在のところ存在しない。本明細書に記載の方法は、ＨＣＭＶ  ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６及びＵＬ１４７に対して相同である遺伝子を欠いているアカゲザルのサイトメガロウイルス（ＲｈＣＭＶ）及びカニクイザルのサイトメガロウイルス（ＣｙＣＭＶ）のベクターが、高い頻度でＭＨＣ−Ｅ拘束性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘発するという発見に基づいている。ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１４６及びＵＬ１４７を欠失したＲｈＣＭＶ又はＣｙＣＭＶ内に、目的の抗原を挿入することによって、ＭＨＣ−Ｅにより提示される個々のペプチドに対するＣＤ８＋  Ｔ細胞を生成することができる。ＣＭＶベクターは、ｍｉＲ−１２６−３ｐ等である内皮細胞系列細胞によって発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡの存在下において遺伝子発現を抑制するＭＲＥを含ませることによって、さらに改変され得る。ＭＨＣ−Ｅ／ペプチド認識ＴＣＲは、いくつかの方法のうちのいずれかによって同定することが可能であるが、概して、単一細胞のｃＤＮＡ、クローン的に広がった単一細胞のｃＤＮＡ、又は、ペプチド特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のディープシーケンシングプールのｃＤＮＡからのＰＣＲによっていずれかにより直接、アルファ鎖及びベータ鎖を配列決定することに頼っている。あるいは、配列は、単一細胞、クローン的に広がった単一細胞又はペプチド特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のプールに関する全トランスクリプトームライブラリをはじめに作製することによってＲＮＡテンプレートを拡大することによって、間接的に誘導されてもよい。ペプチド特異的可変配列は、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）又はｍＲＮＡで行われるＲＮＡテンプレート（ＳＭＡＲＴ）プロトコルの５’末端におけるスイッチング機構によって生成され得る。隣り合う定常領域内に留まるＰＣＲ又は同様に単一ペプチド反応性ＣＤ８＋細胞の全トランスクリプトームライブラリからのＰＣＲは、直接配列決定可能であるか又はそれらのそれぞれのＴＣＲ可変領域に対して高重複度で配列決定可能である。ペプチド反応性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の個々又はプールのＴＣＲ配列に由来するアルファ鎖及びベータ鎖の検証された組み合わせは、さらに合成又はクローン化することができる。得られたＴＣＲコンストラクトはその後、治療（例えば、癌治療又は感染症治療）として患者にその後施すことができるＴ細胞にトランスフェクションすることが可能である。ＴＣＲ可変領域のクローニング法及びトランスフェクション法はまた、Barsov EV et al., PLoS One 6, e23703 (2011)において論じられており、それは参照によって本明細書に組み入れられたものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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