(57)【要約】本明細書に開示されるのは、免疫療法剤の徐放性のための自己分解性マイクロニードルである。また開示されるのは、免疫療法剤（たとえば、ａＰＤ１抗体）の徐送性のための自己分解性マイクロニードルパッチを使用して疾患（たとえば、がん）を治療するための方法である。【選択図】図１Ａ
2019508140.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基端部及び先端部を各含む複数のマイクロニードルと、
前記マイクロニードルの前記基端部が取り付けられる、または一体化される基材と、
免疫療法剤及びｐＨ変化剤を封入する酸分解性ナノ粒子と、
を含む、被験体の生物学的障壁を越えた物質の輸送のためのデバイス。
【請求項２】
前記免疫療法剤が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記免疫療法剤が抗ＰＤ１抗体である、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記抗ＰＤ１抗体がニボルマブである、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記抗ＰＤ１抗体がペンブロリズマブである、請求項３に記載のデバイス。
【請求項６】
前記免疫療法剤が抗ＣＴＬＡ４抗体である、請求項２に記載のデバイス。
【請求項７】
前記抗ＣＴＬＡ４抗体がイピリムマブである、請求項６に記載のデバイス。
【請求項８】
前記免疫療法剤が抗ＣＴＬＡ４抗体と併用する抗ＰＤ１抗体である、請求項２に記載のデバイス。
【請求項９】
前記ｐＨ変化剤がグルコースオキシダーゼである、請求項１から８のうちのいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記酸分解性ナノ粒子が修飾されたデキストランを含む、請求項１から９のうちのいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記酸分解性ナノ粒子が界面活性剤をさらに含む、請求項１から１０のうちのいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記界面活性剤がアルギン酸である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記マイクロニードルがヒアルロン酸を含む、請求項１から１２のうちのいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１４】
マイクロニードルパッチを被験体へ提供することであって、前記マイクロニードルパッチは、
基端部及び先端部を各含む複数のマイクロニードルと、
前記マイクロニードルの前記基端部が取り付けられる、または一体化される基材と、
免疫療法剤及びｐＨ変化剤を封入する酸分解性ナノ粒子と、
を含む、提供することと、
前記マイクロニードルを生物学的障壁内に挿入することと、
を備え、
前記ｐＨ変化剤は前記ｐＨを前記酸分解性ナノ粒子内で低下させ、
前記ｐＨにおける前記低下は前記ナノ粒子を分解させ、徐放性方式において前記免疫療法剤を前記被験体内へ放出させる、
必要とされている前記被験体における疾患を治療するための方法。
【請求項１５】
前記疾患ががんである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記がんがメラノーマである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫療法剤が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１４から１６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫療法剤が抗ＰＤ１抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗ＰＤ１抗体がニボルマブである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗ＰＤ１抗体がペンブロリズマブである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記免疫療法剤が抗ＣＴＬＡ４抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗ＣＴＬＡ４抗体がイピリムマブである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫療法剤が抗ＣＴＬＡ４抗体と併用する抗ＰＤ１抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｐＨ変化剤がグルコースオキシダーゼである、請求項１４から２３のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記酸分解性ナノ粒子が修飾されたデキストランを含む、請求項１４から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記酸分解性ナノ粒子が界面活性剤をさらに含む、請求項１４から２５のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記界面活性剤がアルギン酸である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記マイクロニードルがヒアルロン酸を含む、請求項１４から２７のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
生物学的障壁を越えて免疫療法剤を送達するための部品のキットであって、
マイクロニードルパッチ、
を備え、
前記マイクロニードルパッチは、
基端部及び先端部を各含む複数のマイクロニードルと、
前記マイクロニードルの前記基端部が取り付けられる、または一体化される基材と、
免疫療法剤及びｐＨ変化剤を封入する酸分解性ナノ粒子と、
を含む、前記キット。
【請求項３０】
前記免疫療法剤が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記免疫療法剤が抗ＰＤ１抗体である、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記抗ＰＤ１抗体がニボルマブである、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記抗ＰＤ１抗体がペンブロリズマブである、請求項３１に記載のキット。
【請求項３４】
前記免疫療法剤が抗ＣＴＬＡ４抗体である、請求項３０に記載のキット。
【請求項３５】
前記抗ＣＴＬＡ４抗体がイピリムマブである、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記免疫療法剤が抗ＣＴＬＡ４抗体と併用する抗ＰＤ１抗体である、請求項３０に記載のキット。
【請求項３７】
前記ｐＨ変化剤がグルコースオキシダーゼである、請求項２９から３６のうちのいずれか１項に記載のキット。
【請求項３８】
前記酸分解性ナノ粒子が修飾されたデキストランを含む、請求項２９から３７のうちのいずれか１項に記載のキット。
【請求項３９】
前記酸分解性ナノ粒子が界面活性剤をさらに含む、請求項２９から３８のうちのいずれか１項に記載のキット。
【請求項４０】
前記界面活性剤がアルギン酸である、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記マイクロニードルがヒアルロン酸を含む、請求項２９から４０のうちのいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年３月１日に出願された、米国仮特許出願第６２／３０１，７８９号の利益を主張し、この本開示は、参照により本明細書に明示的に援用される。
【０００２】
本開示は、マイクロニードルデバイス、及び免疫療法剤（たとえば、抗ＰＤ１抗体）の徐送性のための自己分解性マイクロニードルパッチを使用して疾患（たとえば、がん）を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
皮膚癌は、ヒトに、特にコーカソイドの中で、最も一般的な悪性腫瘍である。現在の推定では、５人に１人のアメリカ人が生涯に皮膚癌を発症することを示唆する（Ｓｉｍｏｅｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２０１５，３５７，（１），  ８−４２；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｈ．Ｗ．；Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１０，１４６，（３），２８３−２８７）。皮膚癌治療について、免疫療法は、過去数年間にわたり集中的に研究されてきた（Ｃｈｉｎｅｍｂｉｒｉ，Ｔ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１４，１９，（８），１１６７９−１１７２１；Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２，１２，（４），２５２−２６４）。これらの研究の中で、プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）経路を遮断するチェックポイント阻害剤は、強力な臨床効果を示した（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２，１２，（４），２５２−２６４；Ｇｕｂｉｎ，Ｍ．  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４，５１５，（７５２８），５７７−５８１；Ｔｕｍｅｈ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４，５１５，（７５２８），５６８−５７１）。Ｔ細胞上に発現するＰＤ−１受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の下流の抑制性シグナル伝達を促し、そしてＴ細胞の活性化を妨げることにより免疫系のダウンレギュレーションにおいて中心的な役割を果たす（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２，１２，（４），２５２−２６４；Ｃｈｉｎａｉ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２０１５，３６，（９），５８７−５９５；Ｇｕｂｉｎ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４，５１５，（７５２８），５７７−５８１）。抑制性受容体を標的とする抗ＰＤ−１抗体は、進行期メラノーマの第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相臨床試験において顕著な抗腫瘍活性を示した（Ｋｙｉ，Ｃ．；Ｐｏｓｔｏｗ，Ｍ．Ａ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ２０１４，５８８，（２），３６８−３７６；Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｒ．Ｊ．；Ｆｌａｈｅｒｔｙ，Ｋ．Ｔ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１５，１２，（１１），６２５−６２６；Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１２，３６６，（２６），２４４３−２４５４）。
【０００４】
メラノーマの治療について抗ＰＤ−１抗体の驚くべき臨床結果にもかかわらず、この手法の有効性は、まだ改善されていない。化学療法と比較してはるかに高いが、長期持続性奏効率及び全体奏効率は、増加する可能性がある（Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１４，３２，（１０），１０２０−１０３０）。また、必要とされる阻害剤の量により、治療費は継続不可能なほどに高い。加えて、用量依存性自己免疫疾患などの、副作用は、観測されている（Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１２，３６６，（２６），２４４３−２４５４；Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．Ｐ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００２，５４，（４），５３１−５４５；Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ，Ｓ．；Ｂｕｒｋｅ，Ｐ．Ａ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２０１４，１３，（９），６５５−７２）。したがって、免疫療法剤の送達及び有効性を改善するために新規のデバイス及び方法が必要性である。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書に開示されるのは、生理学的に制御可能な方式において免疫療法剤（たとえば、ａＰＤ１（抗ＰＤ１抗体））の徐送性のための革新的な自己分解性マイクロニードル（ＭＮ）パッチである。
【０００６】
本明細書に開示されるのは、
ｉ）基端部及び先端部を各含む複数のマイクロニードル、
ｉｉ）マイクロニードルの基端部が取り付けられる、または一体化される基材、及び
ｉｉｉ）免疫療法剤及びｐＨ変化剤を封入する酸分解性ナノ粒子、
を含む、被験体の生物学的障壁を越えた物質の輸送のためのデバイスである。
【０００７】
また、本明細書に開示されるのは、
ａ）マイクロニードルパッチを被験体へ提供し、そこでマイクロニードルパッチは、
基端部及び先端部を各含む複数のマイクロニードル、
マイクロニードルの基端部が取り付けられる、または一体化される基材、
免疫療法剤及びｐＨ変化剤を封入する酸分解性ナノ粒子、
を含み、
ｂ）マイクロニードルを生物学的障壁内へ挿入し、そこでｐＨ変化剤は酸分解性ナノ粒子内のｐＨを低下させ、そこでｐＨにおける低下はナノ粒子を分解させ、徐放性方式において免疫療法剤を被験体内へ放出させる、
ことを備える、それを必要としている被験体における疾患を治療するための方法である。
【０００８】
いくつかの実施形態において、疾患は、がんである。いくつかの実施形態において、がんは固形腫瘍である。一つの実施形態において、がんは、メラノーマである。
【０００９】
また、本明細書に開示されるのは、
ａ）基端部及び先端部を各含む複数のマイクロニードル、
マイクロニードルの基端部が取り付けられる、または一体化される基材、
を備える、マイクロニードルパッチ、及び
ｂ）免疫療法剤及びｐＨ変化剤を封入する酸分解性ナノ粒子、
を含む、生物学的障壁を越えて免疫療法剤を送達するための部品のキットである。
【００１０】
１つの実施形態において、酸分解性ナノ粒子は、修飾されたデキストランを含む。１つの実施形態において、酸分解性ナノ粒子は、ｐＨ感受性デキストランナノ粒子を含む。１つの実施形態において、ｐＨ変化剤は、グルコースオキシダーゼである。１つの実施形態において、ｐＨ変化剤は、カタラーゼと併用するグルコースオキシダーゼである。
【００１１】
１つの実施形態において、ナノ粒子は、界面活性剤を更に含む。１つの実施形態において、界面活性剤は、アルギン酸である。
【００１２】
１つの実施形態において、マイクロニードルは、ヒアルロン酸を含む。
【００１３】
１つの実施形態において、マイクロニードルは、血中グルコースをグルコン酸に変換する、免疫療法剤（たとえば、ａＰＤ１）及びグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）を封入する、ｐＨ感受性デキストランナノ粒子（ＮＰ）と一体化される生体適合性ヒアルロン酸から構成される。この実施形態において、酸性環境の生成は、ＮＰの自己解離を促進し、その後、免疫療法剤（たとえば、ａＰＤ１）の実質的な放出をもたらす。発明者らは、マイクロニードル（ＭＮ）パッチの単回投与でさえ、分解トリガーのないＭＮと、または同一の用量を含む遊離ａＰＤ１の腫瘍内注入と比較してＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマモデルおける強力な免疫反応を誘発することを確認した。さらに、この投与方針は、抗腫瘍有効性を強化するために、他の免疫調節剤（抗ＣＴＬＡ−４などの）と一体化し、併用療法を達成することが可能である。
【００１４】
さらに、本明細書に開示されるのは、
ｉ）基端部及び先端部を各含む複数のマイクロニードル、
ｉｉ）マイクロニードルの基端部が取り付けられる、または一体化される基材、及び
ｉｉｉ）治療剤、予防剤、または診断剤、及びｐＨ変化剤を封入する酸分解性ナノ粒子、
を含む、被験体の生物学的障壁を越えた物質の輸送のためのデバイスである。
【００１５】
添付の図面は、本明細書の部分に援用され、またはこの部分を構成し、下記のいくつかの態様を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａは、皮膚癌治療のためのａＰＤ１のマイクロニードル（ＭＮ）パッチ支援送達の概略図を示す。生理学的に自己解離したナノ粒子（ＮＰ）によって充填されるＭＮパッチにより送達されるａＰＤ１の概略図である。ＧＯｘ／ＣＡＴ酵素系がダブルエマルション法によりＮＰ内側に固定されながら、血中グルコースからグルコン酸への酵素媒介変換は、ＮＰの持続的解離を促進し、その後ａＰＤ１の放出をもたらす。
【図１Ｂ】図１Ｂは、皮膚癌治療のためのａＰＤ１のマイクロニードル（ＭＮ）パッチ支援送達の概略図を示す。ａＰＤ１によるＰＤ−１の遮断は、免疫系を活性化させ、皮膚癌細胞を破壊する。
【図２Ａ】図２Ａは、マイクロニードルに充填されたａＰＤ１の特性を示す。ＮＰのＳＥＭ画像（スケールバー：１０００ｎｍ）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、マイクロニードルに充填されたａＰＤ１の特性を示す。ＤＬＳにより決定される平均流体力学的サイズである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、マイクロニードルに充填されたａＰＤ１の特性を示す。ＭＮパッチのＳＥＭ画像（スケールバー：２００μｍ）。
【図２Ｄ】図２Ｄは、マイクロニードルに充填されたａＰＤ１の特性を示す。ＭＮ頂点のより高倍率のＳＥＭ撮像により、ＭＮがＮＰによって充填されたことを確認した（スケールバー：５μｍ）。
【図２Ｅ】図２Ｅは、マイクロニードルに充填されたａＰＤ１の特性を示す。ＦＩＴＣ抗体充填ＮＰを含んだ代表的なＭＮパッチの蛍光撮像（スケールバー：２００μｍ）。
【図２Ｆ】図２Ｆは、マイクロニードルに充填されたａＰＤ１の特性を示す。ＭＮの機械的特性。所望のＭＮについての破壊力は、０．３８Ｎ／ニードルとして定量的に測定された。
【図３Ａ】図３Ａは、ナノ粒子（ＮＰ）充填マイクロニードル（ＭＮ）の試験管内研究を示す。経時的に３７℃で、ＰＢＳ（左）内に、または１００ｍｇ／ｄＬ（右）のグルコース溶液内にインキュベートされた自己解離したＮＰの写真。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ナノ粒子（ＮＰ）充填マイクロニードル（ＭＮ）の試験管内研究を示す。３日間、１００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液内のインキュベーション前（左）、及びインキュベーション後（右）のＮＰ形態変化のＳＥＭ画像（スケールバー：１００ｎｍ）。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ナノ粒子（ＮＰ）充填マイクロニードル（ＭＮ）の試験管内研究を示す。経時的に３７℃で１００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液内にインキュベートされたＭＮの関連したｐＨ変化。この溶液内にインキュベートされるときに、最初の１０分内のＭＮの膨潤後に平衡状態に達した。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ナノ粒子（ＮＰ）充填マイクロニードル（ＭＮ）の試験管内研究を示す。Ａ４００ｎｍにおける９６ウェルプレート内でのＮＰ懸濁液のＵＶ吸光度。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ナノ粒子（ＮＰ）充填マイクロニードル（ＭＮ）の試験管内研究を示す。経時的に３７℃で１００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液内でインキュベートされたＭＮパッチから試験管内で蓄積したａＰＤ１の放出。エラーバーは、サンプル（ｎ＝３）の標準偏差（ＳＤ）に基づく。
【図４Ａ】図４Ａは、マイクロニードル（ＭＮ）により送達されるａＰＤ１の生体内抗皮膚癌治療を示す。マウス皮膚内へＭＮパッチの穿刺を示すトリパンブルー染色の画像（右）を含む、マウス背側及び関連する皮膚（赤い破線内の領域）をＭＮパッチにより経皮的に治療した（左）（スケールバー：１ｍｍ）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、マイクロニードル（ＭＮ）により送達されるａＰＤ１の生体内抗皮膚癌治療を示す。１本のＭＮにより穿刺されたマウス皮膚領域の断面のＨ＆Ｅ染色された切片を示す（スケールバー：２００μｍ）。
【図４Ｃ】図４Ｃは、マイクロニードル（ＭＮ）により送達されるａＰＤ１の生体内抗皮膚癌治療を示す。ＦＩＴＣ抗体充填ＭＮによって穿刺されたマウス皮膚のマージされた蛍光及び明視野像（緑色：ａＰＤ１）（スケールバー：２００μｍ）。
【図４Ｄ】図４Ｄは、マイクロニードル（ＭＮ）により送達されるａＰＤ１の生体内抗皮膚癌治療を示す。示された異なる群のＢ１６Ｆ１０腫瘍の生体内生物発光撮像（１．未治療、２．ＭＮ−ＧＯｘ、３．遊離ａＰＤ１、４．ＭＮ−ａＰＤ１、５．ＭＮ−ＧＯｘ−ａＰＤ１）。エラーバーは、３匹のマウスの標準偏差（ＳＤ）に基づく。
【図４Ｅ】図４Ｅは、マイクロニードル（ＭＮ）により送達されるａＰＤ１の生体内抗皮膚癌治療を示す。図４Ｄに従い定量化された腫瘍シグナル。
【図４Ｆ】図４Ｆは、マイクロニードル（ＭＮ）により送達されるａＰＤ１の生体内抗皮膚癌治療を示す。治療されたマウス、及び対照マウスについてのカプランマイヤー生存曲線。示されるのは、治療群あたり８匹のマウスである。
【図４Ｇ】図４Ｇは、マイクロニードル（ＭＮ）により送達されるａＰＤ１の生体内抗皮膚癌治療を示す。異なる時点でＭＮ−ＧＯｘ−ａＰＤ１または遊離ａＰＤ１によって治療された腫瘍の免疫蛍光染色（緑色：ａＰＤ１、青色：核）（スケールバー：１００μｍ）。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの事後検定を使用して２元配置分散分析により計算された。生存曲線の比較は、ログランク検定を使用して行われた。Ｐ値：＊，Ｐ＜０．０５。
【図５Ａ】図５Ａは、マイクロニードル（ＭＮ）により送達されたａＰＤ１の治療後の腫瘍内のＴ細胞湿潤の特性を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋Ｔ細胞湿潤を示す腫瘍の免疫蛍光（スケールバー：１００μｍ）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、マイクロニードル（ＭＮ）により送達されたａＰＤ１の治療後の腫瘍内のＴ細胞湿潤の特性を示す。フローサイトメトリーによって分析される、治療された腫瘍内のＴ細胞の代表的なプロット（ＣＤ３＋Ｔ細胞にゲートをかけられる）。
【図５Ｃ】図５Ｃは、マイクロニードル（ＭＮ）により送達されたａＰＤ１の治療後の腫瘍内のＴ細胞湿潤の特性を示す。図５Ｂによる腫瘍湿潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合。エラーバーは、３匹のマウスのＳＤに基づく。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの事後検定を使用して２元配置分散分析により計算された。Ｐ値：＊，Ｐ＜０．０５。
【図６】修飾されたデキストラン（ｍ−デキストラン）の合成及び分解経路を示す。
【図７】修飾されたデキストランの核磁気共鳴（ＮＭＲ）を示す。
【図８】ａＰＤ１とデキストランとの間の異なる重量比でａＰＤ１の充填容量を示す。
【図９】マイクロニードル（ＭＮ）パッチの写真を示す（スケールバー：５ｍｍ）。
【図１０】ｍ−ＨＡの合成ステップを示す。
【図１１】ＭＢＡとＨＡとの間の異なる重量比を備えるマイクロニードル（ＭＮ）の機械的特性を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、マイクロニードル内へのローダミン−ＨＡ及びＦＩＴＣ−ＮＰ取り込みを示す。ＦＩＴＣ抗体が充填されたＮＰによって充填されたローダミン標識付きＨＡマイクロニードルの代表的な共焦点画像、スケールバー１００μｍ。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、マイクロニードル内へのローダミン−ＨＡ及びＦＩＴＣ−ＮＰ取り込みを示す。マイクロニードル内へのローダミン−ＨＡ及びＦＩＴＣ−ＮＰ取り込みの定量化。分析は、製造プロセス中に５回の堆積により取得された全蛍光強度に正規化される、マイクロニードルの長さ沿いに収集された共焦点ｚスタックにおける全蛍光強度のＩｍａｇｅＪ測定を使用して実行された（示される結果は、条件ごとにｎ＝１５の個々のマイクロニードルから平均される）。
【図１３Ａ】図１３Ａは、３日間、１００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液内でのインキュベーション前のナノ粒子（ＮＰ）形態変化のＴＥＭ画像を示す（スケールバー：２００μｍ）。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、３日間、１００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液内でのインキュベーション後のナノ粒子（ＮＰ）形態変化のＴＥＭ画像を示す（スケールバー：２００μｍ）。
【図１４】動的光散乱により決定された、経時的に３７℃で１００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液内でのインキュベーション中にナノ粒子（ＮＰ）の平均の流体力学的粒径変化を示す。
【図１５】経時的に３７℃で１００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液内でインキュベートされるＭＮの関連するｐＨ変化を示す。差異は、調製中のＮＰの異なる酵素含量を示す。この溶液内でインキュベートされるときに最初の１０分内にＭＮの膨潤後に平衡状態に達した。
【図１６】３日間、３７℃でグルコース溶液内にインキュベートされるＭＮから放出されたａＰＤ１を示す。
【図１７】マイクロニードル（ＭＮ）内への封入後のａＰＤ１の生理活性を示す。
【図１８】Ｂ１６Ｆ１０細胞に関するインキュベーションの２４時間後の空のナノ粒子（ＮＰ）の細胞毒性研究を示す。エラーバーは、ＳＤ（ｎ＝６）を示す。
【図１９】ＭＮパッチを投与されたＨ＆Ｅに染色された皮膚（左）、及び投与後２日の周囲組織（右）を示す（スケールバー：２００μｍ）。
【図２０】５分、１０分、及び３０分における皮膚の穿刺痕を示す。
【図２１Ａ】図２１Ａは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍上のａＰＤ１の効果を示す。異なる群のＢ１６Ｆ１０腫瘍の生体内生物発光撮像を示した（１．未治療、２．ａＰＤ１  ｉ．ｖ．注入、３．ａＰＤ１によって充填されるＮＰの腫瘍内注入、４．ＭＮ−ＧＯｘ−ａＰＤ１）。エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）（ｎ＝３）に基づく。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍上のａＰＤ１の効果を示す。図２１Ａにより定量化された腫瘍シグナル。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍上のａＰＤ１の効果を示す。治療された群、及び対照群（ｎ＝７または８）についてのカプランマイヤー生存曲線（Ｐ値：＊，Ｐ＜０．０５）。
【図２２Ａ】図２２Ａは、腫瘍の成長についてａＰＤ１及びａＣＴＬＡ４治療の効果を示す。さまざまな治療後のマウスの異なる群の腫瘍成長曲線（群あたり７−８匹のマウス）示す。エラーバーは、ＳＥＭに基づく。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、腫瘍の成長についてａＰＤ１及びａＣＴＬＡ４治療の効果を示す。さまざまな治療後６０日におけるマウスの生存曲線を示す。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの事後検定を使用して２元配置分散分析により計算された（Ｐ値：＊，Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書に開示されるのは、免疫療法（たとえば、ａＰＤ１抗体）の徐送性について自己分解性マイクロニードル（ＭＮ）パッチを使用する免疫療法の徐送性のためのデバイス及び方法である。１つの実施形態において、マイクロニードルは、免疫療法剤及びｐＨ変化剤を封入するｐＨ感受性デキストランナノ粒子（ＮＰ）と一体化される生体適合性ヒアルロン酸から構成される。ｐＨ変化剤による酸性環境の生成は、ＮＰの自己解離を促進し、その後、免疫療法剤の徐放性をもたらす。発明者らは、マイクロニードルパッチの単回投与でさえ、分解トリガー（たとえば、グルコースオキシダーゼなどのｐＨ変化剤）を含まないマイクロニードルと、または免疫療法剤の同一用量による遊離ａＰＤ１の腫瘍内注入と比較されるときに、強力な免疫反応を誘発することを理解している。加えて、他の免疫調節剤（抗ＣＴＬＡ−４などの）を含むａＰＤ１の投与は、相乗的な抗腫瘍有効性をもたらした。
【００１８】
ここで本発明の実施形態へ詳細な参照を行い、本発明の実施例は、図面及び実施例に示される。しかしながら本発明は、多くの異なる形態に具現化されることができ、本明細書に記載される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。
【００１９】
別段の定めのない限り、本明細書に使用されるすべての技術的な、かつ科学的な用語は、本発明が帰属する当業者に一般的に理解されるものと同一の意味を有する。以下の定義は、本明細書に使用される用語の完全な理解のために提供される。
【００２０】
専門用語
本出願全体を通して使用される用語は、当業者にとって通常の、かつ典型的な意味で解釈されるべきである。しかしながら、出願人は、以下の用語が下記に定義されるような特定の定義を与えられることを望む。
【００２１】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明示的に別段に指示しない限り、複数の参照を含む。たとえば、「ａ  ｃｅｌｌ（１つの細胞）」は、複数の細胞を含み、その混合物を含む。
【００２２】
本明細書において使用される場合、用語「ことができる」、「任意選択により」、及び「ことが任意選択によりできる」は、交換可能に使用され、条件が発生しない事例と同様に条件が発生する事例を含むことを意味する。したがって、たとえば、製剤が「添加剤を含むことができる」という記述は、この製剤が添加剤を含まない事例と同様に、この製剤が添加剤を含む事例を有することを意味する。
【００２３】
用語「ａｂｏｕｔ（約）」及び「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ（約）」は、当業者により理解されるように「ｃｌｏｓｅ  ｔｏ（に近い）」として定義される。一方の非限定的な実施形態において、用語は、１０％内にあると定義される。他方の非限定的な実施形態において、用語は、５％内にあると定義される。さらに別の非限定的な実施形態において、用語は、１％内にあると定義される。
【００２４】
タンパク質の「活性」は、「生理活性」に関連する活性を有し、たとえば、転写、翻訳、細胞内移行、分泌、キナーゼによるリン酸化、プロテアーゼによる切断、及び／または他のタンパク質に対しホモフィリック結合、及びヘテロフィリック結合を含む。
【００２５】
用語「投与すること」は、吸入による、または埋め込み型リザーバを介して、経口、局所、静脈内、皮下、ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ（経皮的）、ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ（経皮）、筋肉内、関節内、非経口、細動脈内、真皮内、心室内、頭蓋内、腹腔内、病変内、鼻腔内、直腸、膣である投与を指す。投与することは、経皮マイクロニードルアレイパッチを使用して実行されることが可能である。用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病変内、及び頭蓋内注射または注入技術を含む。
【００２６】
「生体適合性」は、一般的に、レシピエントへ非毒性であり、被験体へいかなる重大で有害な影響をも及ぼさない、物質、及び任意の代謝産物またはその分解生成物を指す。
【００２７】
「組成物」は、活性剤と、別の化合物または組成物（不活性（たとえば、検出可能な薬剤または標識）または活性）、たとえば、アジュバントとの組み合わせを含むことを意図される。
【００２８】
本明細書において使用される場合、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（を含む）」は、組成物及び方法が列挙された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することを意図される。組成物及び方法を定義するために使用されるときに、「から本質的になる」は、これらの組み合わせに対していかなる本質的な意味を持つ他の要素をも除外することを意味するものとする。したがって、本明細書に定義されるようなこれらの要素から本質的になる組成物は、リン酸緩衝生理食塩水、防腐剤、及び同様のものなどの、単離及び精製方法、ならびに薬学的に許容可能な担体からの微量汚染物質を除外しない。「からなる」は、他の成分の微量元素より多いもの、及び本発明の組成物を投与するための実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれにより定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。
【００２９】
「対照」は、比較目的のために実験において使用される代替の被験体またはサンプルである。対照は、「陽性」または「陰性」であることが可能である。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「コンジュゲートされる」は、不可逆的な結合相互作用を指す。
【００３１】
本明細書において使用される場合、「置換する」は、たとえば、置換されるペプチド、化学物質、または核酸に比べて、その特定のタンパク質ドメインについて親和力を有する、化学物質、ペプチド、または核酸による、タンパク質ドメインとペプチドとの間の、タンパク質ドメインと化学物質との間の、タンパク質ドメインと核酸配列との間の、分子的な、または化学的な相互作用を中断することを指す。
【００３２】
本明細書において使用される場合、「リンカー」は、隣接する複数の分子を接合する１つの分子を指す。一般的にリンカーは、隣接する分子を接合すること、またはそれらの間のある程度の最小距離または他の空間的関係を維持すること以外に、特定の生理活性を有さない。いくつかの事例において、リンカーは、分子の、折りたたみ、正味電荷、または疎水性などの、隣接する分子のある特性に影響を与える、またはこの特性を安定させるために選択されることが可能である。
【００３３】
用語「ペプチド」、「タンパク質」、及び「ポリペプチド」は、交換可能に使用され、一方のアミノ酸のカルボキシル基により、他方のアミノ酸のアルファアミノ基へ結合される２つ以上のアミノ酸を含む、天然または合成分子を指す。
【００３４】
用語「担体」または「薬学的に許容可能な担体」は、一般的に安全かつ非毒性である医薬または治療用組成物を調製する際に有益である担体または添加剤を意味し、獣医学的使用、及び／またはヒトの医薬的または治療的使用のために許容可能である担体を含む。本明細書において使用される場合、用語「担体」または「薬学的に許容可能な担体」は、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション（油／水、または水／油エマルションなど）、及び／またはさまざまな種類の湿潤剤を含むことが可能である。本明細書において使用される場合、用語「担体」は、医薬製剤における使用のために当業者に周知の、また以下にさらに記述されるように当業者に周知の、いずれかの添加剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、脂質、安定剤、または他の材料を含む。
【００３５】
本明細書において使用される場合、用語「ポリマー」は、天然の、または合成の相対的に高い分子量の有機化合物を指し、その構造は、繰り返される小さな単位、モノマー（たとえば、ポリエチレン、ゴム、セルロース）により表されることが可能である。合成ポリマーは、モノマーの付加重合、または縮合重合により典型的に形成される。本明細書において使用される場合、用語「コポリマー」は、２つ以上の異なる繰り返す単位（モノマー残基）から形成されるポリマーを指す。実施例として、限定ではないが、コポリマーは、交互コポリマー、ランダムコポリマー、またはグラフトコポリマーであることが可能である。また、特定の態様において、１つのブロックコポリマーのさまざまなブロックセグメントがそれ自体に複数のコポリマーを含むことが可能であることを企図する。
【００３６】
範囲は、「約」の一方の特定の値から、及び／または「約」の他方の特定の値までの値として本明細書に表現されることが可能である。このような範囲を表現するときに、別の実施形態は、一方の特定の値から、及び／または他方の特定の値までの値を含む。同様に、値が近似値として表現されるときに、先行詞「約」の使用により、特定の値が別の実施形態を形成することを理解するであろう。各範囲の終点が他の終点に関して、また他の終点から独立して、の両方とも重要であることをさらに理解するであろう。本明細書に開示される複数の値があること、また各値がその値自体に加えて、「約」その特定の値として本明細書に開示されることをも理解する。たとえば、値「１０」を開示する場合に、つぎに「約１０」をも開示する。
【００３７】
用語「治療有効量」、または「治療有効用量」は、一般化された期間にわたり、研究者、獣医、医師または他の臨床医により探索されている、組織、系、動物またはヒトの生物学的反応または医学的反応を誘発する、免疫療法剤などの組成物の量を指す。いくつかの例において、所望の生物学的反応または医学的反応は、数日間、数週間、または数年間にわたる被験体への組成物の複数回の適用量の投与後に達成される。
【００３８】
本明細書において使用される場合、用語「ｔｒｅａｔ（治療する）」、「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療すること）」、「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」、及び文法上のその変形形態は、不調または状態の１つ以上の付随する症状の強度を部分的に、または完全に遅らせる、楽にする、やわらげる、または減らすこと、及び／または不調または状態の１つ以上の原因を楽にする、やわらげる、または遅らせることを備える。本発明による治療は、防止的に、予防的に、対症的に、または矯正的に適用されることができる。予防的な治療は、発症前に（たとえば、がんの明らかな徴候の前に）、早期発症中に（たとえば、がんの初期徴候及び症状中に）、またはがんの定着進展の後に、被験体へ施される。予防的投与は、感染症状発現前に、数日間から数年間行われることが可能である。
【００３９】
用語「特異的に結合する」は、本明細書において使用される場合、ポリペプチド（抗体を含む）または受容体を指すときに、タンパク質及び他の生物製剤の異種集団におけるタンパク質またはポリペプチドまたは受容体の存在を決定する結合反応を指す。したがって、所定の条件（たとえば、抗体の事例におけるイムノアッセイ条件）下で、特定のリガンドまたは抗体がサンプル内に存在する他のタンパク質へ、またはリガンドもしくは抗体が生物体に接触することができる他のタンパク質へ、有意な量で結合しないときに、特定のリガンドまたは抗体は、その特定の「標的」へ「特異的に結合する」（たとえば、抗体は内皮抗原へ特異的に結合する）。一般的に、第二分子を「特異的に結合する」第一分子は、約１０５Ｍ−１（たとえば、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、及び１０１２Ｍ−１またはこれより大きい）より大きい親和定数（Ｋａ）を含む。
【００４０】
用語「免疫チェックポイント阻害剤」または「免疫療法」は、１つ以上のチェックポイントタンパク質を、全体的に、または部分的に、減少させる、阻害する、妨げる、または調節する分子を指す。チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞の活性化または機能を調節する。複数のチェックポイントタンパク質は、ＣＴＬＡ−４及びそのリガンドＣＤ８０及びＣＤ８６、ならびにＰＤ１のリガンドＰＤＬ１及びＰＤＬ２を含むＰＤ１のように、既知である（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２−２６４，２０１２）。これらのタンパク質は、Ｔ細胞反応の共刺激または阻害相互作用の原因となる。免疫チェックポイントタンパク質は、生理学的免疫反応の自己寛容及び持続時間及び振幅を調節し、維持する。免疫チェックポイント阻害剤は、抗体を含む、または抗体から誘導される。
【００４１】
治療剤の用語「有効量」は、所望の効果を提供するのに非毒性であるが有益な薬剤の十分な量を意味する。「有効」である有益な薬剤の量は、被験体の年齢及び全身状態、特定の有益な単一の薬剤または複数の薬剤、及び同様のものにより、被験体ごとに異なる。したがって、正確な「有効量」を指定することは、常に可能ではない。しかしながら、いずれかの被験体事例において、適切な「有効」量は、日常的な実験を使用して当業者により決定されることができる。また、本明細書において使用される場合、そして特に別段に明記されない限り、有益な「有効量」は、治療有効量、及び予防有効量の両方に及ぶ量をも指すことが可能である。
【００４２】
治療効果を達成するために必要な薬物の「有効量」は、被験体の年齢、性別、及び体重などの要因により変わることができる。用法は、最適な治療反応を提供するように調節されることが可能である。たとえば、いくかに分割された用量は、毎日投与されることができる、またはこの用量は、治療状況の緊急性により示されるように比例して減少することができる。
【００４３】
本明細書において使用される場合、治療剤の「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するのに有効である量を指し、治療剤の「予防有効量」は、望ましくない生理的状態を予防するのに有効である量を指す。所与の治療剤の治療有効量及び予防有効量は、治療される不調または疾患の種類及び重症度、ならびに被験体の年齢、性別、及び体重などの要因に関して、一般的に変える。
【００４４】
また用語「治療有効量」は、所望の治療効果を促進するのに有効な、治療剤の量、または治療剤の送達速度（たとえば、経時的な量）を指すことが可能である。正確な所望の治療効果は、治療される状態、被験体の耐性、投与される薬物及び／または薬物製剤（たとえば、治療剤（薬）の効力、調剤内の薬物の濃度、及び同様のもの）、及び当業者により理解されるさまざまな他の要因により変わる。
【００４５】
本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容可能な」成分は、生物学的に、または他の点で望ましくない成分を指すことが可能であり、すなわち、この成分は、いかなる有意な望ましくない生物学的効果をも生じることなく、またはそれが含まれる製剤の他の成分のいずれかを含む有害な方式で相互作用することなく、本発明の医薬製剤に組み込まれ、本明細書に記述されるように被験体へ投与されることができる。用語「薬学的に許容可能な」は、添加剤を指すために使用されるときに、成分が毒物学的検査及び製造テストの必要な基準を満たしていること、またはそれが米国食品医薬品局により作成された不活性成分ガイドに含まれることを一般的に黙示する。
【００４６】
また、本明細書において使用される場合、「薬理学的に活性な」誘導体または類似体のように、用語「薬理学的に活性な」（または単に「活性な」）は、親化合物及びある程度ほぼ均等物として同一の種類の薬理学的に活性を有する誘導体または類似体（たとえば、塩、エステル、アミド、コンジュゲート、代謝産物、異性体、断片など）を指すことが可能である。
【００４７】
本明細書において使用される場合、用語「混合物」は、混合物の成分が完全に混和性ではない懸濁液及びエマルションと同様に、混合物の成分が完全に混和性である溶液を含むことが可能である。
【００４８】
本明細書において使用される場合、用語「被験体」は、限定されないが、ヒト、家畜、イヌ、ネコ、及び他の哺乳動物を含む、哺乳動物などの生存生物を指すことが可能である。治療剤の投与は、被験体の治療のために有効な適用量及び期間で実行されることが可能である。いくつかの実施形態において、被験体は、ヒトである。
【００４９】
本明細書において使用される場合、用語「ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ（徐放性）」または「徐放性薬物送達」または「ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ（徐放性）」は、生体内で所望の薬物動態プロファイルを達成するために、制御された方式において所与の剤形から薬物の放出または投与を指す。「制御された」薬物送達の態様は、所望の薬物放出の動態を確立するために、製剤及び／または剤形を操作する能力である。
【００５０】
本明細書において使用される場合、語句「ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（同時投与）」、「ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（併用する投与）」、「ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（同時投与）」、または「ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ（同時に投与される）」は、同時点で、または相互の直後に、化合物が投与されることを意味する。後者の事例において、２つの化合物は、化合物が同時点で投与されるときに達成される結果から観測される結果が区別できないほど、十分に近い時間に投与される。
【００５１】
マイクロニードルデバイス（パッチ）
本明細書に開示されるのは、生理学的に制御可能な方式において、免疫療法剤（たとえば、ａＰＤ１）の徐送性について革新的な自己分解性マイクロニードル（ＭＮ）パッチである。
【００５２】
本明細書に開示されるのは、
基端部及び先端部を各含む複数のマイクロニードル、
マイクロニードルの基端部が取り付けられる、または一体化される基材、及び
免疫療法剤及びｐＨ変化剤を封入する酸分解性ナノ粒子、
を含む、被験体の生物学的障壁を越えた物質の輸送のためのデバイスである。
【００５３】
また、本明細書に開示されるのは、
基端部及び先端部を各含む複数のマイクロニードルと、
マイクロニードルの基端部が取り付けられる、または一体化される基材と、
免疫療法剤及びｐＨ変化剤を封入する酸分解性ナノ粒子と、
を含む、マイクロニードルパッチ、
を備える、生物学的障壁を越えて免疫療法剤を送達するための部品のキットである。
【００５４】
１つの実施形態において、マイクロニードルは、ヒアルロン酸から構成される。１つの実施形態において、マイクロニードルは、ａＰＤ１及びグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）を封入するｐＨ感受性デキストランナノ粒子（ＮＰ）と一体化される生体適合性ヒアルロン酸から構成され、これは、血中グルコースをグルコン酸へ変換する。この実施形態において、酸性環境の生成は、ＮＰの自己解離を促進し、その後、ａＰＤ１の実質的な放出をもたらす。発明者らは、ＭＮパッチの単回投与でさえ、分解トリガーを含まないＭＮと、または同一の用量を含む遊離ａＰＤ１の腫瘍内注入と比較して、Ｂ１６Ｆ１０マウスのメラノーマモデルにおける強力な免疫反応を誘発することを明らかにした。さらに、この投与方針は、他の免疫調節剤（抗ＣＴＬＡ−４など）と一体化し、抗腫瘍有効性を強化するための併用療法を達成することが可能である。
【００５５】
免疫療法剤に加えて、レシピエントへ送達される薬剤は、治療剤、予防剤、または診断剤であることも可能である。たとえば、薬剤は、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸分子、脂質、有機分子、生物学的に活性な無機分子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることが可能である。たとえば、幅広い範囲の薬物は、本発明のマイクロニードルデバイス及び方法に関する送達のために調合されることができる。本明細書において使用される場合、用語「薬物」または「薬物製剤」は、いずれかの予防剤、治療剤、もしくは診断剤、または及び入れ墨、化粧品、及び同様のものについての薬学的な添加剤及び物質を含む、生物学的組織への導入に適切であることができる他の物質を指すために広範に使用される。薬物は、生理活性を有する物質であることが可能である。薬物製剤は、液体溶液、ゲル、固形粒子（たとえば、マイクロ粒子、ナノ粒子）、またはそれらの組み合わせのような、さまざまな形態を含むことができる。薬物は、小さな分子、大きな（すなわち、マクロ−）分子、またはそれらの組み合わせを含むことができる。代表的な、非限定的ではない、実施形態において、薬物は、免疫アジュバント（たとえば、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ））、アルミニウム塩（Ａｌｕｍ）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、アミノ酸、ワクチン、抗ウイルス剤、遺伝子送達ベクター、インターロイキン阻害剤、免疫調節剤、神経栄養因子、神経保護剤、抗新生物剤、化学療法剤、多糖類、抗凝固剤、抗生物質、鎮痛剤、麻酔剤、抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、及びウイルスの中から選択されることが可能である。
【００５６】
別の実施形態において、本明細書に開示されるのは、
基端部及び先端部を各含む複数のマイクロニードルと、
マイクロニードルの基端部が取り付けられる、または一体化される基材と、
治療剤、予防剤、または診断剤、及びｐＨ変化剤を封入する酸分解性ナノ粒子と、
を含む、被験体の生物学的障壁を越えた物質の輸送のためのデバイスである。
【００５７】
１つの実施形態において、ナノ粒子は、治療剤及びｐＨ変化剤を封入する。１つの実施形態において、ナノ粒子は、予防剤及びｐＨ変化剤を封入する。１つの実施形態において、ナノ粒子は、診断剤及びｐＨ変化剤を封入する。
【００５８】
薬物製剤は、当該技術分野において既知である、ｐＨ調節剤、粘性調節剤、希釈剤などを含む、１つ以上の薬物学的に許容可能な添加剤をさらに含むことができる。
【００５９】
１つの実施形態において、マイクロニードルは、ヒアルロン酸を含む。ヒアルロン酸に加えて、マイクロニードルは、金属、セラミックス、半導体、有機物、ポリマー、複合材料、またはそれらの組み合わせを含む、さまざまな材料も含むことができる。典型的な構成材料は、医薬品グレードのステンレス鋼、金、チタン、ニッケル、鉄、スズ、クロム、銅、パラジウム、白金、これらの合金または他の金属の合金、ケイ素、二酸化ケイ素、及びポリマー類を含む。代表的な生分解性ポリマーは、ＰＥＧ、ポリ無水物、ポリ（オルソ）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、及びポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）を含む、乳酸及びグリコール酸ポリラクチド、ポリグリコライド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、及びコポリマーなどの、ヒドロキシ酸のポリマー類を含む。
【００６０】
マイクロニードルは、生物学的障壁内へ挿入されながら、数日間まで適所に残りながら、また除去されながら、無傷のままである、機械的強度を有する。いくつかの実施形態において、マイクロニードルは、マイクロニードルがその意図された目的（たとえば、免疫療法剤の送達）を果たすのに少なくとも十分な長さ、無傷のままでなければならない。
【００６１】
マイクロニードルは、直線状またはテーパ状のシャフトを含むことが可能である。１つの実施形態において、マイクロニードルの直径は、マイクロニードルの基端部で最大であり、基端部の遠位端部における点へテーパ状になる。またマイクロニードルは、直線（テーパ状ではない）部分及びテーパ状部分の両方を含むシャフトを備えるように製造されることが可能である。これらのニードルは、テーパ状の端部を全く含まないことができる、すなわち、それらは、単純に、丸い、または平らな先端部を含む円筒体であることもできる。
【００６２】
マイクロニードルは、基材へ垂直に、または傾斜して向けられることが可能である。１つの実施形態において、マイクロニードルは、基材へ垂直に向けられるので、基材の単位面積あたりのマイクロニードルのより高い密度を提供することが可能である。マイクロニードルのアレイは、マイクロニードルの向き、高さ、または他のパラメータの混合を有することが可能である。
【００６３】
マイクロニードルは、垂直方向に円形断面を有する、またはこの断面が非円形であることが可能であるシャフトによって形成されることが可能である。たとえば、マイクロニードルの断面は、多角形（たとえば、星型、正方形、三角形）、長方形、または別の形状であることが可能である。断面寸法は、基部が約１００〜５００μｍであることが可能であり、また先端部が１と２０μｍとの間にあることが可能であるように、約１μｍと１０００μｍとの間にあることが可能である。１つの実施形態において、マイクロニードルは、基部で約３００μｍ、及び先端部で約５μｍであることが可能である。
【００６４】
マイクロニードルの長さは、約１０μｍと１ｍｍとの間にあり、好ましくは、４００μｍと１ｍｍとの間にある。１つの実施形態において、マイクロニードルの長さ（または高さ）は、約６００μｍである。この長さは、挿入された部分、及び挿入されていない部分の両方を考慮して、特定の用途のために選択される。マイクロニードルのアレイは、たとえば、さまざまな長さ、外径、内径、断面形状、及びマイクロニードル間の間隔を有する、マイクロニードルの混合物を含むことが可能である。１つの実施形態において、マイクロニードルは、６００μｍの先端部間の間隔を有する１５×１５アレイに配列される。
【００６５】
１つの実施形態において、酸分解性ナノ粒子は、修飾されたデキストランを含む。１つの実施形態において、酸分解性ナノ粒子は、アセタール修飾デキストランを含む。１つの実施形態において、修飾されたデキストランの合成は、図６に示される。
【００６６】
１つの実施形態において、ナノ粒子は、界面活性剤をさらに含む。１つの実施形態において、この界面活性剤は、アルギン酸である。
【００６７】
１つの実施形態において、ｐＨ変化剤は、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）である。グルコースオキシダーゼは、血中グルコースをグルコン酸へ変換する。これは、ｐＨにおける低下をもたらす。つぎに、ｐＨにおけるこの低下は、ナノ粒子の分解をもたらし、免疫療法剤の徐放性をもたらす。
【００６８】
治療方法
また本明細書に開示されるのは、それを必要とする被験体における疾患を治療するための方法であり、この方法は、
基端部及び先端部を各含む複数のマイクロニードルと、
マイクロニードルの基端部が取り付けられる、または一体化される基材と、
免疫療法剤及びｐＨ変化剤を封入する酸分解性ナノ粒子と、
を含む、マイクロニードルパッチを被験体へ提供し、
マイクロニードルを生物学的障壁内へ挿入する、
ことを備え、
そこでｐＨ変化剤は、酸分解性ナノ粒子内でｐＨを低下させ、そこでｐＨにおける低下は、ナノ粒子を分解し、徐放性方式において免疫療法剤を被験体内へ放出する。
【００６９】
本明細書に開示されるデバイス及び方法は、がんまたは腫瘍の治療のために有益である。１つの実施形態において、治療されるがんは、皮膚癌である。１つの実施形態において、がんは、メラノーマである。
【００７０】
本明細書に企図されるように、治療される癌は、原発腫瘍または転移性腫瘍であることが可能である。１つの態様において、本明細書に記述される方法を使用して、固形腫瘍、たとえば、メラノーマ、肺癌（肺腺癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、大細胞癌、細気管支肺胞上皮癌、気管支原発癌、非小細胞癌、小細胞癌、中皮腫を含む）と、乳癌（乳管癌、小葉癌、炎症性乳癌、明細胞癌、粘液癌、漿膜腔乳癌を含む）と、大腸癌（結腸癌、直腸癌、大腸腺癌）と、肛門癌と、膵癌（膵腺癌、膵島細胞癌、神経内分泌腫瘍を含む）と、前立腺癌と、前立腺腺癌と、卵巣癌（漿液性腫瘍、類内膜腫瘍及び粘液性嚢胞腺癌を含む卵巣上皮性癌または表層上皮性間質性腫瘍、性索間質性腫瘍）と、肝臓及び胆管癌（肝細胞癌、胆管癌、血管腫を含む）と、食道癌（食道腺癌及び扁平上皮癌を含む）と、口腔及び口咽頭扁平上皮癌と、唾液腺腺様嚢胞癌と、ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ（膀胱癌）と、ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（膀胱癌）と、子宮の癌（子宮内膜腺癌、目の、子宮乳頭状漿液性癌、子宮明細胞癌、子宮肉腫、平滑筋肉腫、混合ミュラー管腫瘍を含む）と、神経膠腫、神経膠芽腫、髄芽腫、及び他の脳の腫瘍と、腎臓癌（腎細胞癌、明細胞癌、ウィルムス腫瘍を含む）と、頭頸部の癌（扁平上皮細胞癌を含む）と、胃の癌（胃癌、胃腺癌、消化管間質腫瘍）と、精巣癌と、胚細胞腫瘍と、神経内分泌腫瘍と、子宮頸部癌と、消化管、乳房、及び他の器官のカルチノイドと、印環細胞癌と、肉腫を含む間葉腫瘍、線維肉腫、血管腫、血管腫症、血管周皮腫、疑似血管腫性間質肥厚、筋繊維芽細胞腫、線維腫症、炎症性筋繊維芽細胞腫、脂肪腫、血管脂肪腫、顆粒細胞腫、神経線維腫症、シュワン細胞腫、血管肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、メラノーマを含む皮膚、子宮頸部、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、膵臓の、脳の、甲状腺の、精巣の、腎臓の、膀胱の、軟部組織の、副腎の、尿道の、陰茎の癌、粘液肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、悪性線維性組織球腫、リンパ管肉腫、中皮腫、扁平上皮癌と、類表皮癌、悪性皮膚付属器腫瘍、腺癌、ヘパトーマ、肝細胞癌、腎細胞癌、副腎腫、胆管癌、移行上皮癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性細胞癌、神経膠腫退形成と、多形神経膠芽腫、神経芽細胞腫、髄芽細胞腫、悪性髄膜腫、悪性シュワン細胞腫、神経繊維肉腫、副甲状腺癌、甲状腺の髄様癌、気管支カルチノイド、褐色細胞腫、島細胞癌、悪性カルチノイド、悪性パラガングリオーマ、メラノーマ、メルケル細胞新生物、葉状嚢胞肉腫、唾液腺癌、胸腺癌、及びとりわけ膣の癌を治療する。
【００７１】
免疫療法剤（免疫チェックポイント阻害剤）及び免疫アジュバント
免疫チェックポイントタンパク質（免疫チェックポイント阻害剤）を阻害するために、既知である複数の免疫療法剤がある。既知の免疫チェックポイントタンパク質は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１及びそのリガンドＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２、さらにＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭ３、ＫＩＲを含む。ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭ３、及びＫＩＲに関連する経路は、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１依存性経路（たとえば、Ｐａｒｄｏｌｌ，２０１２．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２−２６４参照）と同様な免疫チェックポイント経路を構成するように、当該技術分野において認識される。
【００７２】
免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質の機能を阻害するいずれかの化合物である。１つの実施形態において、免疫チェックポイントタンパク質は、ヒト免疫チェックポイントタンパク質である。したがって、免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、ヒト免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤であることが可能である。免疫チェックポイントタンパク質は、当該技術分野に記述される（たとえば、Ｐａｒｄｏｌｌ，２０１２．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２−２６４参照）。
【００７３】
好ましい免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質を特異的に認識する抗体である。複数のＰＤ１、ＰＤＬ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＴＩＭ３及びＫＩＲ阻害剤は、既知であり、これらの既知の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤に類似し、代替の免疫チェックポイント阻害剤は、本明細書に開示されるデバイス及び方法を使用して投与されることができる。
【００７４】
ＰＤ−１阻害剤の実施例は、ペンブロリズマブ（旧名、ランブロリズマブ）、またはニボルマブ（これまでＭＤＸ−１１０６またはＢＭＳ−９３６５５８として知られている）などの完全ヒト抗体と同様にピディリズマブなどの、ヒトＰＤ−１を遮断するヒト化抗体を制限なく含む。イピリムマブは、以前はＹｅｒｖｏｙ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）という名前で販売されていた、完全ヒトＣＴＬＡ−４遮断抗体である。二番目のＣＴＬＡ−４阻害剤は、トレメリムマブである。１つの実施形態において、免疫療法は、ニボルマブである。
【００７５】
加えて、免疫チェックポイント阻害剤は、ＭＥＤＩ−４７３６（ＷＯ２０１１０６６３８９Ａ１に開示される）、ＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＵＳ８２１７１４９Ｂ２に開示される）、及びＭＩＨ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（１６．５９８３．８２）を介して取得可能なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）及び現在調査中の他のＰＤ−Ｌ１阻害剤などの、ＰＤ−Ｌ１を遮断するヒト化または完全ヒト抗体を制限なく含むことができる。ＰＤ−ＬＩへの追加の抗体は、アテゾリズマブ及びデュルバルマブを含む。
【００７６】
１つの実施形態において、ＫＩＲ阻害剤を投与する。リリルマブは、ＫＩＲ２ＤＬ１／２Ｌ３に結合するヒトモノクローナル抗体である。１つの実施形態において、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の阻害剤を投与する。ウレルマブは、ＣＤ１３７の細胞外ドメインを標的とする。
【００７７】
１つの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、上述される既知のＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１阻害剤（イピリムマブ、トレメリムマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ＡＭＰ−２４４、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＰＤＬ３２８ＯＡ、ＭＩＨ１）、またはそれらの組み合わせから選択されるように、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１阻害剤から好ましくは選択される。
【００７８】
上述される既知のＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１阻害剤などの、ＰＤ１及びＰＤ−Ｌ１阻害剤からの免疫チェックポイント阻害剤の選択は、さらに好ましく、さらに好ましい選択は、上述される既知のＰＤ１阻害剤などの、ＰＤ−１阻害剤から行われる。好ましい実施形態において、ＰＤ１阻害剤は、ニボルマブまたはペンブロリズマブまたはヒトＰＤ１に対する別のアンタゴニスト抗体である。
【００７９】
１つの実施形態において、免疫療法剤は、免疫アジュバントと併用して投与されることが可能である。免疫アジュバントは、他の免疫療法剤（たとえば、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、アルミニウム塩（Ａｌｕｍ）、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド含有ＤＮＡ）と併用して使用されるときに、免疫反応を加速する、延長する、または強化するように作用する、いずれかの物質である（Ｌｉｍ，ＹＴ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓ．２０１５  Ｊａｎ；４（１）：５４−５８参照）。
【実施例】
【００８０】
以下の実施例は、開示された発明の主題に従い、組成物、デバイス、方法、及び結果を示すために以下に記載される。これらの実施例は、本明細書に開示される発明の主題のすべての態様を含むことを意図されないが、むしろ代表的な方法及び結果を示すことを意図される。これらの実施例は、当業者に明らかである本発明の均等物及び変形形態を排除することを意図されない。
【００８１】
実施例１．抗ＰＤ１抗体のマイクロニードルパッチ支援送達により強化されたがん免疫療法
物質
すべての化学物質は、商業的供給源から取得され、さらなる精製なしで使用された。ヒアルロン酸ナトリウム（３００ｋＤａの分子量）は、Ｆｒｅｄａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｓｈａｎｄｏｎｇ、Ｃｈｉｎａ）から購入された。アルギン酸（Ｍｎ＝１６０ｋＤａ）、デキストラン（Ｍｎ＝９−１１ｋＤａ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）及びウシカタラーゼ（ＣＡＴ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入された。２−エトキシ−１−プロペンは、Ｓｙｎｔｈｏｎｉｘ  Ｉｎｃ．から取得された。脱イオン水は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＮａｎｏＰｕｒｅ精製システム（１８．２ＭΩ・ｃｍ−１より相対的に高い）により調製された。合成及び分析のためのすべての有機溶媒は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．から注文され、受け取ったまま使用された。
【００８２】
細胞株
マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入された。生物発光生体内腫瘍撮像のために、Ｂ１６Ｆ１０−ｌｕｃ細胞は、ＵＮＣのＤｒ．Ｌｅａｆ  Ｈｕａｎｇからの寄贈であった。これらの細胞は、１０％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって補充された、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に維持された。ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入され、１０％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって補充された、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に維持された。
【００８３】
抗体
生体内で使用されるａＰＤ１（抗ＰＤ１抗体）及びａＣＴＬＡ４（抗ＣＴＬＡ４抗体）は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ．から購入された。注射１回あたりの用量は、１ｍｇ／ｋｇであった。染色した抗体は、ＦＡＣＳについてのＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８を含み、製造業者の指示に従い分析された。染色された細胞は、Ｃａｌｉｂｕｒ  ＦＡＣＳ機器（ＢＤ）上で分析され、ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して分析された。
【００８４】
アクリル酸修飾ＨＡ（ｍ−ＨＡ）の合成及び特徴づけ
ｍ−ＨＡは、文献（Ｌｅｅ，Ｄ．−Ｋ．ｅｔ  ａｌ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ２０１５，９，（１１），１１４９０−１１５０１）に従い合成された。簡潔に、ＨＡの１．０ｇは、４℃で５０ｍＬのＤＩ水内に溶解し、これへ０．８ｍＬの無水メタクリル酸（ＭＡ）を滴下した。反応液は、５Ｎ  ＮａＯＨの追加によりｐＨ８−９に調整され、２４時間４℃で撹拌された。結果として生じたポリマーは、アセトン内に沈殿させた後に、エタノールによって３回洗浄することで得られた。この生成物は、ＤＩ水内に再溶解され、この溶液は、２日間ＤＩ水に対して透析された。ｍ−ＨＡは、凍結乾燥によって８７．５％の収率により達成された。修飾率は、密接に離隔したピークを分離させるために標準的なデコンボリューションアルゴリズムを実行した後に、５．７４及び６．１７ｐｐｍ（メタクリレートプロトン）におけるプロトンピーク下の面積比を、１．９９ｐｐｍ（ＨＡのＮ−アセチルグルコサミン）におけるプロトンピーク下の面積比と比較することにより１５％であると計算された。
ｍ−ＨＡ：１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３００ＭＨｚ，δｐｐｍ）：１．８５−１．９６（ｍ，３Ｈ，ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯ），１．９９（ｓ，３Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ３），５．７４（ｓ，１Ｈ，ＣＨ１Ｈ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯ），６．１７（ｓ，１Ｈ，ＣＨ１Ｈ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯ）。
【００８５】
ペンダントアセタール修飾デキストラン（ｍ−デキストラン）の合成及び特徴づけ
簡潔に、１．０ｇのデキストラン（分子量：９−１１ｋＤａ）は、加熱乾燥させたフラスコに加えられ、アルゴンによってパージされた。１０ｍＬの無水ＤＭＳＯは、デキストランが完全に溶解するまで加えられ、撹拌された。ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ、１５．６ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）は、この溶液に加えられ、その後、２−エトキシプロペン（４．１６ｍＬ、３７ｍｍｏｌ）が加えられた。混合物は、アルゴンによってパージされ、つぎに反応物の蒸発を防止するためにシールされた。この反応は、室温で３０分間撹拌され、つぎに１ｍＬのトリエチルアミンによってクエンチされた。得られた混合物は、沈殿し、分解を防ぐために塩基性水（ｐＨ約８）内で３回洗浄され、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分）により収集された。残留水は、凍結乾燥により除去された。
ｍ−デキストラン：１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ，δｐｐｍ）：１．１０（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ３），１．３０（ｍ，Ｃ（ＣＨ３）２），３．４０（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ３），３．５５−３．８５（ｂｒ，デキストランＣ２−Ｈ〜Ｃ６−Ｈ），４．８８（ｂｒ，デキストランＣ１−Ｈ）．
【００８６】
ナノ粒子の調製
ナノ粒子は、改善されたダブルエマルション（水中油中水型）溶媒蒸発／抽出法により調製された。簡潔に、２５ｍｇのｍ−デキストランを含む１ｍＬの有機相（ジクロロメタン（ＤＣＭ））は、０．２５ｍｇの抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む０．５ｍＬの水相のみによって、または４５サイクル（４５％のデューティサイクルに関して１秒ごとに）の超音波処理により１．２５ｍｇの酵素（グルコースオキシダーゼとカタラーゼとの重量比、４：１）とともに、乳化された。その後、一次エマルションは、直ちに２５ｍＬのアルギン酸水溶液（１％）内に注がれ、４５サイクルの超音波処理をされた。ダブルエマルションは、その後、１５０ｍＬのアルギン酸水溶液（０．２％）内に移された。混合された懸濁液は、蒸発によりＤＣＭを除去するために室温で撹拌された。２時間後に、得られたナノ粒子は、１０，０００ｒｐｍで遠心分離機にかけ、そして３回蒸留水中で懸濁する手順を繰り返すことにより洗浄され、収集された。ダブルエマルションの調製についてｍ−デキストラン／抗ＰＤ−１抗体／酵素の最終重量比は、１００／１／５と決定された。イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識抗体を含む粒子は、上記と同一の方式で作製された。
【００８７】
抗体封入ナノ粒子の充填容量（ＬＣ）及び封入効率（ＥＥ）は、マウスモノクローナル抗体ＥＬＩＳＡアッセイを介して非封入ＩｇＧ量を測定し、そして基本補正として空の粒子を使用することにより決定された。ＬＣ及びＥＥは、ＬＣ＝（Ａ−Ｂ）／Ｃ、ＥＥ＝（Ａ−Ｂ）／Ａとして計算され、そこでＡは、抗体の所期の封入量であり、Ｂは、回収液内の抗体の遊離量であり、Ｃは、粒子の総重量であった。粒径及び多分散強度は、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定された。ＮＰのゼータ電位は、ＤＩ水における適切な希釈後に、同一の機器を使用して、それらの電気泳動移動度により決定された。測定は、室温で３回行われた。
【００８８】
ナノ粒子（ＮＰ）形態は、走査型電子顕微鏡によって調べられた。粒子は、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の脱イオン水内で懸濁し、そして得られた分散液は、シリコンウェハ上に滴下され、一晩室温下で空気乾燥させた。つぎに、これらの粒子は、金／パラジウムによりスパッタコーティングされ、撮像された。これらの画像は、２０ｋＶで動作する、ＪＥＯＬ６４００Ｆ  ＳＥＭ（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）によりキャプチャされた。
【００８９】
ナノ粒子充填マイクロニードルの製造及び特徴づけ
この研究における、すべてのＭＮは、円筒状ホールのアレイを作製するために、直接にレーザアブレーションにより機械加工される、Ｂｌｕｅａｃｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄから６個の均一なシリコーンモールドを使用して製造された。各マイクロニードルは、約５μｍの先端部半径を有する６００μｍの高さへテーパ状になる、３００μｍ×３００μｍの円形基部を有する。マイクロニードルは、６００μｍの先端部間の間隔によって１５×１５アレイ内に配列された。
【００９０】
ナノ粒子の調製後に、調製されたナノ粒子は、バスソニケーター内の０．６ｍＬ蒸留水中に１分間分散した。つぎに、５０μＬのＮＰ懸濁液（２ｍｇのＮＰを含む）は、各シリコーンマイクロモールド表面上へのピペット操作後に、ＮＰ溶液をマイクロニードルのキャビティ内に流入させるために５分間真空（６００ｍｍＨｇ）状態にすることによって、直接堆積した。その後、マイクロモールドは、ＮＰをマイクロニードルキャビティ内へ圧縮するために、２０分間、ｒｐｍ＝２０００で、Ｈｅｔｔｉｃｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ３２Ｒ遠心分離機へ移された。この堆積プロセスは、合計５回繰り返され、製造中のモールド表面上の残留物ＮＰは、いかなる望ましくない結果をも除外するために取り除かれた。より良いマイクロニードル形態のために、４ｃｍ×９ｃｍの銀接着テープ片は、２ｃｍ×２ｃｍのマイクロモールドベースプレート周囲に適用された。加えて、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ、４ｗｔ％）及び光開始剤（Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９、０．０５ｗｔ％）溶液を含む３ｍＬの予め混合されたｍ−ＨＡ（４ｗｔ％）は、調製されたマイクロモールドリザーバに加えられた。最後に、デバイスは、６−８時間、２５℃で真空デシケータ内において乾燥を受けた。乾燥が完了した後に、マイクロニードルアレイは、シリコーンモールドから慎重に分離され、３０秒間、ＵＶ光（波長：３２０−４５０ｎｍ）に曝露された。このニードルベースは、注入シリンジに適合するように調整されることが可能である。得られた製品は、３０日間までシールされた６個のウェルコンテナ内に保管されることが可能である。蛍光マイクロニードルは、ＦＩＴＣ標識ナノ粒子及びＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ標識ｍ−ＨＡによって製造された。マイクロニードルのこの形態は、ノースカロライナ州立大学における分析機器設備において、ＦＥＩ  Ｖｅｒｉｏｓ４６０Ｌ電界放出形走査型電子顕微鏡（ＦＥＳＥＭ）上で特徴づけられた。ＭＮの蛍光画像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  IＸ７０マルチパラメータ蛍光顕微鏡によって撮影された。ＵＶ架橋プロセスは、Ｄｙｍａｘ  ＢｌｕｅＷａｖｅ７５ＵＶ硬化スポットランプを使用して行われた。
【００９１】
機械的強度試験
ＭＮの機械的強度測定は、張力負荷フレーム上に周囲条件及び等尺性試験条件下で行われた。張力は、応力−ひずみゲージ上のｙ方向沿いにマイクロニードルアレイを圧縮するステンレス鋼プレートとして連続して監視された。初期ゲージは、ＭＮ先端部とステンレス鋼プレートとの間に２．００ｍｍ、ロードセル容量として１０．００Ｎに設定された。ＭＮアレイパッチに向かう最上部ステンレス鋼プレートの移動速度は、０．１ｍｍ／ｓであった。ＭＮの破壊力は、このニードルが座屈し始めるときに記録された。
【００９２】
皮膚穿刺効率試験
ＭＮアレイは、３０分間マウスの背側に適用され、除去された。このマウスは、安楽死し、皮膚サンプルは、ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ）に包埋され、ドライアイス上のイソペンタンバス内で急速凍結された。凍結された組織は、切片（１０μｍ厚）にされ、顕微鏡スライド上に載せられ、−８０℃で保管された。ＦＩＴＣ標識マイクロニードルの挿入後の皮膚組織切片の蛍光顕微鏡写真は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  IＸ７０マルチパラメータ蛍光顕微鏡によって撮影された。このサンプルは、ＮＣ州立大学獣医学部の組織学研究所にてヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色された。別の実験において、励起された皮膚の部位は、撮像前に５分間、トリパンブルーによって染色された。乾燥組織ペーパーを含む皮膚の表面から残留染料を拭き取った後に、皮膚サンプルは、光学顕微鏡によって観察された（ＬｅｉｃａＥＺ４Ｄ実体顕微鏡）。
【００９３】
試験管内におけるＭＮからの抗体放出研究
試験管内におけるＭＮからの抗体の放出は、３７℃でオービタルシェーカー上の６個のウェルプレート内の２ｍＬのＰＢＳ緩衝剤（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）内に、ＭＮパッチのインキュベーションを介して評価された。さまざまなグルコース量は、最終的なグルコース濃度（０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ）に到達するまで各チューブに加えられた。所定の時間に、２５μＬのサンプルは、分析用に取り除かれ、つぎに２５μＬの新鮮な放出培地は、一定の容量に維持するためにウェルに加えられ、インキュベータ内に戻された。このサンプルのｐＨ値は、ｐＨメーター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＢ１５）により記録され、つぎに合計抗体含量は、ＥＬＩＳＡを使用して調べられた。各ウェルの吸光度は、４５０ｎｍでＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計内に検出され、この濃度は、抗体標準曲線から補間された。
【００９４】
細胞毒性研究
ＭＮに対する細胞毒性研究は、Ｂ１６Ｆ１０細胞を使用して実行された。細胞は、ウェルあたり５，０００細胞の密度で９６ウェルプレート内に播種され、５００ｍＬの培地あたり、１０％のウシ胎仔成長血清（ＦＢＳ）、１×Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、１×Ｌ−グルタミン及び２．５μＬのベータメルカプトエタノール（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含む、１００μＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、２５ｍＭのグルコース）内に培養された。つぎに、これらのプレートは、空のＭＮとインキュベートされた放出培地の段階希釈液の追加前に、７０−８０％の培養密度に到達するために５％のＣＯ２内に３７℃で１２時間、インキュベートされた。２４時間ＭＮとのインキュベーション後に、これらの細胞は、ＰＢＳ溶液によって洗浄され、１００μＬの新鮮なＦＢＳ遊離ＤＭＥＭ、及び２０μＬの新たに調製された３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−ｙｌ）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド溶液（ＭＴＴ溶液、５ｍｇ／ｍＬ）とインキュベートされた。これらのプレートは、４時間追加でインキュベートされた。４時間後に、この溶液は、慎重に除去された後に、つぎに１５０μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えられた。これらのプレートの吸光度は、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＮＣ、ＵＳＡ）を使用して、５９０ｎｍ、及び６２０ｎｍの基準波長で読み出された。
【００９５】
マウス及び生体内腫瘍モデル
メスのＣ５７Ｂ６マウスは、Ｊａｃｓｏｎ  Ｌａｂ（ＵＳＡ）から購入された。すべてのマウス研究は、ノースカロライナ州立大学及びチャペルヒルのノースカロライナ大学において動物実験委員会により承認された動物プロトコルの内容で実行された。マウスは、秤量され、異なる群にランダムに分けられた。１×１０６ルシフェラーゼ標識Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞がマウスの背側に移植された１０日後（この腫瘍は約５０−６０ｍｍ３に達する）、ａＰＤ１（１ｍｇ／ｋｇ）は、腫瘍内／静脈内注入により、またはマイクロニードルによりマウス内に投与された。腫瘍成長は、Ｂ１６Ｆ１０細胞の生物発光シグナルにより監視された。また腫瘍は、デジタルノギスにより測定された。この腫瘍体積（ｍｍ３）は、（長径×短径２）／２として計算された。
【００９６】
生体内生物発光及び撮像
生物発光画像は、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍによって収集された。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）は、動物（１０μＬ／ｇの体重）内へのＤＰＢＳ（１５ｍｇ／ｍｌ）内のｄ−ルシフェリン（Ｐｉｅｒｃｅ）の腹腔内注入の１０分後に、データを取得するために使用された。
【００９７】
共焦点顕微鏡検査
腫瘍は、マウスから切断され、最適な切断培地（Ｏ．Ｃ．Ｔ．）内で急速凍結された。いくつかのマイクロメータ切片は、クライオトームを使用して切断され、スライド上に載せられた。切片は、ＰＢＳによる再水和前に、氷冷アセトン内に１０分間固定された。ＢＳＡ（３％）による遮断後に、切片は、一晩、４℃で一次抗体によって染色された。スライドは、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して分析された。
【００９８】
ＥＬＩＳＡ
ａＰＤ１の生理活性を試験するために、全ａＰＤ１は、ＥＬＩＳＡアッセイについてＭＮパッチから異なる時点で抽出された。Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ９０１８ＥＬＩＳＡプレートは、ＰＢＳ内で精製されたマウスＰＤ１タンパク質によってコーティングされた。このプレートは、シールされ、一晩４℃でインキュベートされた。洗浄及び遮断後に、ａＰＤ１のサンプルは、室温で２時間、ウェル内へ加えられた。洗浄緩衝剤による洗浄後に、ＨＲＰ−コンジュゲート抗ラットｌｇ（Ｈ＋Ｌ）ｍＡｂｓは、室温で１時間、ウェル内に加えられ、その後洗浄された。ＴＭＢ基質溶液は、ａＰＤ１の生理活性の検出のために加えられた。
【００９９】
統計分析
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（５．０）を使用して評価された。統計的有意性は、対のスチューデントｔ検定及び２元配置分散分析によって計算された。０．０５以下のＰ値は、有意とみなされた。
【０１００】
結果
この実施例において開示されるのは、メラノーマの方向へａＰＤ１の徐送性のための生理学的自己分解性ＭＮパッチ支援がん免疫療法である（図１Ａ、図１Ｂ）。ＭＮは、過去１０年間、経皮薬物送達において広く研究されてきた（Ｃｈｉａｐｐｉｎｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２０１５；Ｙｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１５，１１２，（２７），８２６０−８２６５；Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２００８，２０，（５），９３３−９３８；Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ，Ｍ．Ｒ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００４，５６，（５），５８１−５８７；Ｌｅｅ，Ｄ．−Ｋ．ｅｔ  ａｌ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ２０１５，９，（１１），１１４９０−１１５０１）。皮膚は、免疫監視システムとして機能する活性保護障壁である。ＭＮは、免疫細胞に富む表皮内へ無痛で穿刺し、そしてａＰＤ１を所属リンパ及び毛細血管へ送達し、そのＴ細胞との相互作用を促進することが可能である（Ｈａｒｖｅｙ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０１０，２８，（１），１０７−１１６）。腫瘍微小環境におけるａＰＤ１の保持を高め、酵素が媒介した持続的な薬物放出を提供し、他の治療薬との容易な併用を可能にする目的に関して、ＭＮは、ｐＨ感受性デキストランＮＰと一体化された（Ｌｕ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１４，１９４，１−１９）。各ＭＮは、ａＰＤ１及びグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）を封入するＮＰと一体化される、生体適合性ヒアルロン酸（ＨＡ）から構成される。ＧＯｘは、酸素（Ｏ２）の存在下で血中グルコースをグルコン酸に変換するために適用される。カタラーゼ（ＣＡＴ）は、Ｏ２の再生によりグルコース酸化を支援し、望ましくない過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を消費するのに役立つ。
【化１】
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【０１０１】
ＮＰ内側に固定化されたＧＯｘ／ＣＡＴ酵素系に関して、グルコン酸の酵素媒介生成は、ＮＰの段階的自己解離を促進し、３日間の投与期間にわたりａＰＤ１の徐放性をもたらす（Ｍｕｒａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２０１３，１２，（１１），９９１−１００３；Ｃｈｅｎ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１５，７３，２１４−２３０）。ＭＮパッチの単回投与は、トリガー要素（ｐＨ変化剤）（ＧＯｘ）のないＭＮ、または遊離ａＰＤ１の腫瘍内注入を越える、強い免疫反応をＢ１６Ｆ１０マウスのメラノーマモデルに誘発する。加えて、ＭＮは、免疫療法の効率を高めるために他の免疫調節剤と併用された療法のためのプラットフォームとして機能する。これらの結果は、がん免疫原性を改善し、またメラノーマの臨床治療を促進する、簡単かつ安全な技術を介してａＰＤ１の革新的な送達方針をＭＮパッチ支援システムが提供することを実証する。
【０１０２】
自己解離ナノ粒子（ＮＰ）は、４つの成分、酸分解性ポリマーマトリックス、高分子電解質ベースの界面活性剤、ＧＯｘ／ＣＡＴ酵素系、及びａＰＤ１から構成された。天然デキストランは、完全に生体適合性であり、生分解性であり、幅広く利用可能であり、修飾するのに容易であり、またＮＰのマトリックス成分として選択された（Ｎａｅｓｓｅｎｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，３２，（８），３２３−３３４）。エトキシプロペンは、ヒドロキシルのペンダントアセタールへの８９％置換を有する誘導されたデキストラン（ｍ−デキストランと称される）を与えた、酸触媒反応を介してデキストランへコンジュゲートされた（図６、７）（Ｂａｃｈｅｌｄｅｒ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，（３２），１０４９４−１０４９５；Ｇｕ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ２０１３，７，（５），４１９４−４２０１）。ｍ−デキストランは、有機溶媒に可溶であり、ダブルエマルションプロセスにおいてＮＰの形成中にａＰＤ１の封入を可能にした（Ｇｕ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｇ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ２０１３，７，（５），４１９４−４２０１）。アニオン性多糖、アルギン酸は、負に帯電した表面コーティングを形成するために、界面活性剤としてさらに組み込まれた。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像（図２Ａ）内に描写されるように、得られたＮＰは、単分散粒径を有する球形状を備える。動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定された平均流体力学的サイズは、２５０ｎｍであった（図２Ｂ）。ＮＰは、抗体の有意な漏出なしで、または４℃で３週間明らかな形態変化なしで、７．１ｗｔ％の抗体充填容量を有した（図８）。
【０１０３】
ナノ粒子（ＮＰ）は、投与を容易にするためにメラノーマ部位方向への封入されたａＰＤ１の送達のためにポリマーベースのＭＮ内にさらに埋め込まれた。２２５ＭＮのアレイは、６００μｍの中心間の間隔によって９×９ｍｍ２のパッチ上に組み立てられた（図９）。各ニードルは、３００μｍの基部における直径、６００μｍの高さ、及び５μｍの曲率半径へテーパ状になる鋭い先端部を有する、円錐形状であった（図２Ｃ）。ＨＡは、その優れた生体適合性、機械的特性、及び調整された架橋密度のために、ポリマーＭＮについての構造上の材料として選択された（図２Ｆ）。ＭＮマトリックスは、ＵＶ光（３０秒間、９ｍＷ／ｃｍ２の強度において３６５ｎｍ、有意な光毒性のないウェル最適化プロトコル）への曝露時に、原位置重合を介して、架橋されたヒアルロン酸（ＨＡ）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ）、及び光開始剤（Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９、０．０５ｗｔ％）から作製され（Ｙｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１５，１１２，（２７），８２６０−８２６５；Ｂｒｙａｎｔ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｅｄ．２０００，１１，（５），４３９−５７）（図１０）、これは、抗体を変性させること、またはそれらの安定性に影響を与えることを回避するために軽度の反応条件を与える（Ｙｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２０１５，ＤＯＩ：１０．１００２／ｍａｃｐ．２０１５００２９６；ＤｅＭｕｔｈ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２０１３，１２，（４），３６７−３７６）。加えて、ＭＢＡとＨＡとの間のより高い重量比は、ＭＮの向上した機械的特性を反映した（図１１）。多重堆積により、ＮＰは、ニードル先端部に濃縮された。充填された薬物の蛍光強度における規則的な線形増加は、堆積サイクルが共焦点顕微鏡により測定された５倍まで増加しながら、観測された（図１２Ａ、図１２Ｂ）。充填されたＮＰの分布は、ＳＥＭ画像においてさらに確認された（図２Ｄ）。ＦＩＴＣ−抗体充填ＮＰを含んだ代表的なＭＮパッチの蛍光図は、ＮＰがＭＮの先端部に主に分布していたことを明らかに示した（図２Ｅ）。所望のＭＮについての破壊力は、０．３８Ｎ／ニードル（図２Ｆ）として定量的に測定され、これは、破壊せずに皮膚挿入を容易にするのに十分な強度を与える（Ｇｉｔｔａｒｄ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｄｈｅｓ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３，２７，（３），２２７−２４３）。ａＰＤ１の徐放性プロファイルを調べるために、ＧＯｘがないＮＰ、またはこれがあるＮＰは、ヒト体内の正常血糖レベル（１００ｍｇ／ｄＬ）でグルコースを含むＰＢＳ緩衝剤内に両方インキュベートされた。ＧＯｘを含むＮＰは、インキュベーション溶液の透明度と同様に、４００ｎｍでのＵＶ吸光度の低下（図３Ｄ）に応じて、その後３日間で段階的に解離した（図３Ａ）（Ｔａｏ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．ＡＣＳ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ２０１１，３，（９），３６３８−３６４５）。ＳＥＭ及びＴＥＭ画像によって、ＮＰの構造変化をさらに妥当性確認した（図３Ｂ、図１３Ａ、図１３Ｂ）。埋め込まれたＮ���を含むＭＮの記録されたｐＨ値は、経時的に７．１０から４．２８へ低下し、グルコースのグルコン酸への酵素変換を確認した（図３Ｃ）。一方、ＧＯｘを含むＮＰの流体力学的サイズ変化は、着実に減少した（図１４）。対照的に、顕著な解離は、ＧＯｘを含まない対照サンプル内で観測されなかった。またａＰＤ１の放出動態を評価した。ＮＰを含むニードルの先端部は、グルコース溶液内に８０時間インキュベートされた。徐放性プロファイルは、ＧＯｘを含むＭＮから達成されたが、ＧＯｘを含まないサンプルから有意ではない放出を収集した（図３Ｅ）。加えて、ａＰＤ１の放出動態は、ＮＰ内の酵素の充填量を変えることにより調整されることも可能である（図１５）。したがって、ａＰＤ１の治療効率は、メラノーマの異なるステージに応じて酵素のレベルを変えることによってさらに最適化されることが可能である。正常なグルコース濃度内の薬物放出を調査したが、正常血糖範囲内の異なるグルコースレベル間で有意な差は、観測されなかった（図１６）。合わせて、これらの結果は、ＭＮからのａＰＤ１の放出がグルコース媒介及びｐＨ依存方式であったことを検証した。また、ＭＮ内への封入後のａＰＤ１の生理活性を試験した（図１７）。４℃で１ヶ月間保管した後に、９０％を超えるａＰＤ１がＰＤ１抗原を結合する生理活性を残したと推定した。
【０１０４】
得られたＭＮパッチは、トリパンブルー染色すること、ならびにヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｍ）を染色することによって証明されるように、効果的にマウスの皮膚を穿刺することが可能であった（図４Ａ−４Ｂ）。マウス皮膚内への挿入時に、ＭＮは、約２００μｍの深さまで穿刺した（図４Ｂ）。このシステムの生体適合性を評価するために、Ｂ１６Ｆ１０細胞に対するナノ粒子（ＮＰ）及びその分解生成物の細胞毒性は、０．１から１．０ｍｇ／ｍＬに及ぶ、さまざまな濃度で評価された。研究されたすべての濃度について、ｍ−デキストランベースのＮＰ、及び関連した分解生成物は、細胞生存率の有意な低下を示さなかった（図１８）。パッチの生体内生体適合性をさらに調査するために、ＭＮ注入後に皮膚がすぐに回復し、そして周囲の組織と比較して投与後２日目に、領域内で観測された有意な炎症がなかったことがわかった（図１９−２０）。
【０１０５】
ＭＮパッチにより送達されたａＰＤ１の抗皮膚癌効率を評価するために、メラノーマのＢ１６Ｆ１０マウスモデルは、臨床転移性メラノーマを模造するために使用された。Ｂ１６Ｆ１０−ｌｕｃがん細胞は、メスＣ５７ＢＬ／６マウスの後部背面領域内の皮下に移植された。腫瘍サイズが約５０−６０ｍｍ３に達した後に、ＭＮパッチ（ＧＯｘを含む）と、遊離ａＰＤ１と、ＧＯｘを含むまたは含まないａＰＤ１によって充填されたＭＮパッチとは、単回の局所投与によって腫瘍部位（パッチ面積は腫瘍部位より大きかった）上に投与された。群間の抗メラノーマ効率を比較するために、マウスは、ａＰＤ１の相対的により低い用量（１回の適用量：１ｍｇ／ｋｇ）によって治療された。２週間後に、腫瘍成長は、容易に視覚化され、Ｂ１６Ｆ１０−ｌｕｃ細胞の生物発光シグナルによって測定された（図４Ｄ−４Ｅ）。対照ＭＮパッチ（ＧＯｘを含む）治療が治療されなかった群と比較して腫瘍退縮についてほとんど効果がなかったことを観測した。遊離ａＰＤ１によって治療されたマウスが最初の数日間に腫瘍成長の遅延を示したが、その後、腫瘍再発は、劇的に生じた。ＧＯｘ充填なしでＭＮ−抗ＰＤ−１によって治療された群における腫瘍退縮についての効果は、ａＰＤ１の制限された放出によって限定された。対照的に、ＭＮパッチ（ＧＯｘを含む）によって送達されたａＰＤ１を受容するマウスは、有意な持続的腫瘍阻害を示し、腫瘍のうちのいくつかは、治療後に全くみえなくなった。重要なことに、４０％のマウスがａＰＤ１−ＧＯｘ−ＭＮパッチによって治療された後に４０日依然として生存していたことがわかった。きわめて対照的に、対照群ではいずれのマウスも生存しなかった（図４Ｆ）。この注目すべき抗腫瘍効果は、腫瘍部位内のＭＮによるａＰＤ１の徐放性、及び腫瘍微小環境内のａＰＤ１の強化された保持に起因する可能性がある。
【０１０６】
つぎに治療された腫瘍は、異なる時点で免疫染色のために収集された。対照として、遊離ａＰＤ１が腫瘍内に直接に注入されたときに、強力な抗体シグナルは、投与日（０日目）に腫瘍部位内でみられた。しかしながら、これらのシグナルは、つぎの３日間で有意に減少し、他の組織内への抗体の拡散を示すが、ＭＮにより送達されるａＰＤ１は、腫瘍部位にみつかった抗体の連続して観測されたシグナルをもたらすことが可能である。腫瘍微小環境内のａＰＤ１の存在は、腫瘍の微小環境内の抑制応答対細胞毒性応答のバランスを変える際に重要な役割を果たし（Ｚｏｕ，Ｗ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００５，５，（４），２６３−２７４）、がん細胞を認識し、そして破壊する免疫細胞をもたらす。
【０１０７】
治療後に免疫細胞の腫瘍部位内への湿潤を研究するために、つぎに腫瘍からの腫瘍湿潤リンパ球（ＴＩＬ）は、治療の１０日後に、採取され、免疫蛍光及びフローサイトメトリーによって分析された。免疫蛍光染色は、治療されていない腫瘍がＴ細胞湿潤を制限していることを明らかにした（図５Ａ）。対照的に、ＭＮ−ＧＯｘ−ａＰＤ１治療されたマウスからの腫瘍は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の両方によって著しく湿潤された。ａＰＤ１がＭＮパッチにより送達された後の腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントは、遊離ａＰＤ１治療群内のそれの１．５倍であり、対照ＭＮまたは治療されていない群内のそれと比較して２倍であった（図５Ｂ−５Ｃ）。
【０１０８】
さらなるステップにおいて、ＭＮパッチの抗メラノーマ効果は、ａＰＤ１（１ｍｇ／ｋｇ）によって充填された自己解離ＮＰの静脈内（ｉ．ｖ．）注入または直接腫瘍内注入によって、ａＰＤ１の全身投与を含む以前の方法と比較された。図２１Ａ―図２１Ｃに示されるように、ＭＮ−ＧＯｘ−ａＰＤ１によって治療されたマウスは、他の治療と比較して有意な抗腫瘍効率を示した。約５０％のマウスは、４０日内にａＰＤ１−ＧＯｘ−ＭＮパッチにより治療された後に、生存し、腫瘍は検出不可能であった。ａＰＤ１の全身投与、または自己解離ａＰＤ１−ＮＰの腫瘍内注入は、平均生存時間を穏やかに増加させたが、いずれのマウスも４０日に生存しなかった。これらの結果は、我々のＭＮが投与後の腫瘍内のａＰＤ１の保持を強化し、ａＰＤ１チェックポイント阻害によって強化されたがん免疫療法をもたらすことを明らかに示した。
【０１０９】
抗ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞活性を促進し、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を無効にする別のチェックポイント抗体である（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２，１２，（４），２５２−２６４；Ｗａｎｇ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２０１４，２６，（４８），８１５４−８１６２）。ａＰＤ１治療後のＴＩＬ上で観測されたＣＴＬＡ４発現の増加（Ｌｕｓｓｉｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ２０１５，３，（１），１−１１；Ｃｕｒｒａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１０，１０７，（９），４２７５−４２８０）によって、ＭＮによる抗ＣＴＬＡ４抗体（ａＣＴＬＡ４）及びａＰＤ１の併用の同時送達は、抗体の半分の用量に関してこれらの療法の有効性における増加について調査された。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマを保有するマウスは、ＩｇＧ（１ｍｇ／ｋｇ、アイソタイプ対照）、ａＣＴＬＡ４（１ｍｇ／ｋｇ）、ａＰＤ１（１ｍｇ／ｋｇ）によって充填された、またはａＣＴＬＡ４及びａＰＤ１（それぞれ０．５ｍｇ／ｋｇ）によって共充填された、ＭＮ−ＧＯｘによって治療された。図２２Ａに示されるように、著しい相乗効果は、ａＣＴＬＡ４単独、ａＰＤ１単独、またはＩｇＧ  ＭＮ治療されたマウスと比較して、ＭＮを介して同時送達されたａＣＴＬＡ４及びａＰＤ１の併用によって達成された。さらに、ＭＮによって送達されたａＣＴＬＡ４及びａＰＤ１の併用は、６０日内のａＣＴＬＡ４及びａＰＤ１の併用によって治療されたマウスの約７０％内の長期間の無病生存によってメラノーマの完全な制御をもたらした（図２２Ｂ）。
【０１１０】
要約すると、ＭＮパッチ支援免疫療法は、皮膚癌の強化された治療のためにａＰＤ１を送達することが可能である。このパッチは、痛みを伴わずに表皮を穿刺し、そして間質液中に入るようになり、そのペイロードを腫瘍微小環境へ効率的に送達することが可能である。各ニードル内のナノ粒子（ＮＰ）は、ａＰＤ１及びグルコースオキシダーゼ酵素を含み、これらは、ＮＰの「自己解離」を促進し、続いて持続的方式においてａＰＤ１の放出を促進する。メラノーマを含むマウスモデルを使用した生体内研究は、ＭＮパッチの単回投与が同一用量の腫瘍内（ｉ．ｔ．）注入に関して得られたものに優り腫瘍成長を阻害したことを示した。さらに、ａＣＴＬＡ４及びａＰＤ１によって共充填されたＭＮは、メラノーマの相乗的治療をもたらした。まとめると、これらの結果は、ＭＮ支援送達システムが改善された安全性、免疫原性及びロジスティック操作を備えるがん免疫療法剤の投与についての新規のプラットフォーム技術を提供することを示す。
【０１１１】
参考文献
特許出願及び刊行物を含む、本開示のすべての論文及び参考文献は、すべての目的のために参考により援用される。
【０１１２】
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２３．Ｃｈｉａｐｐｉｎｉ，Ｃ．；Ｄｅ  Ｒｏｓａ，Ｅ．；Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．；Ｌｉｕ，Ｘ．；Ｓｔｅｅｌｅ，Ｊ．；Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｍ．；Ｔａｓｃｉｏｔｔｉ，Ｅ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２０１５．
２４．Ｙｕ，Ｊ．；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．；Ｙｅ，Ｙ．；ＤｉＳａｎｔｏ，Ｒ．；Ｓｕｎ，Ｗ．；Ｒａｎｓｏｎ，Ｄ．；Ｌｉｇｌｅｒ，Ｆ．Ｓ．；Ｂｕｓｅ，Ｊ．Ｂ．；Ｇｕ，Ｚ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１５，１１２，（２７），８２６０−８２６５．
２５．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｓ．Ｐ．；Ｍｕｒｔｈｙ，Ｎ．；Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ，Ｍ．Ｒ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２００８，２０，（５），９３３−９３８．
２６．Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ，Ｍ．Ｒ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００４，５６，（５），５８１−５８７．
２７．Ｌｅｅ，Ｄ．−Ｋ．；Ｋｉｍ，Ｓ．Ｖ．；Ｌｉｍａｎｓｕｂｒｏｔｏ，Ａ．Ｎ．；Ｙｅｎ，Ａ．；Ｓｏｕｎｄｉａ，Ａ．；Ｗａｎｇ，Ｃ．−Ｙ．；Ｓｈｉ，Ｗ．；Ｈｏｎｇ，Ｃ．；Ｔｅｔｒａｄｉｓ，Ｓ．；Ｋｉｍ，Ｙ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ２０１５，９，（１１），１１４９０−１１５０１．
２８．Ｈａｒｖｅｙ，Ａ．Ｊ．；Ｋａｅｓｔｎｅｒ，Ｓ．Ａ．；Ｓｕｔｔｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｈａｒｖｅｙ，Ｎ．Ｇ．；Ｍｉｋｓｚｔａ，Ｊ．Ａ．；Ｐｅｔｔｉｓ，Ｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０１０，２８，（１），１０７−１１６．
２９．Ｌｕ，Ｙ．；Ｓｕｎ，Ｗ．；Ｇｕ，Ｚ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１４，１９４，１−１９．
３０．Ｍｕｒａ，Ｓ．；Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｊ．；Ｃｏｕｖｒｅｕｒ，Ｐ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２０１３，１２，（１１），９９１−１００３．
３１．Ｃｈｅｎ，Ｑ．；Ｋｅ，Ｈ．；Ｄａｉ，Ｚ．；Ｌｉｕ，Ｚ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１５，７３，２１４−２３０．
３２．Ｎａｅｓｓｅｎｓ，Ｍ．；Ｃｅｒｄｏｂｂｅｌ，Ａ．；Ｓｏｅｔａｅｒｔ，Ｗ．；Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ｅ．Ｊ．Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，３２，（８），３２３−３３４．
３３．Ｂａｃｈｅｌｄｅｒ，Ｅ．Ｍ．；Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ，Ｔ．Ｔ．；Ｂｒｏａｄｅｒｓ，Ｋ．Ｅ．；Ｄａｓｈｅ，Ｊ．；Ｆｒｅｃｈｅｔ，Ｊ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，（３２），１０４９４−１０４９５．
３４．Ｇｕ，Ｚ．；Ａｉｍｅｔｔｉ，Ａ．Ａ．；Ｗａｎｇ，Ｑ．；Ｄａｎｇ，Ｔ．Ｔ．；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．；Ｖｅｉｓｅｈ，Ｏ．；Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．Ｓ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ２０１３，７，（５），４１９４−４２０１．
３５．Ｂｒｙａｎｔ，Ｓ．Ｊ．；Ｎｕｔｔｅｌｍａｎ，Ｃ．Ｒ．；Ａｎｓｅｔｈ，Ｋ．Ｓ．Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｅｄ．２０００，１１，（５），４３９−５７．
３６．Ｙｅ，Ｙ．；Ｙｕ，Ｊ．；Ｇｕ，Ｚ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２０１５，ＤＯＩ：１０．１００２／ｍａｃｐ．２０１５００２９６．
３７．ＤｅＭｕｔｈ，Ｐ．Ｃ．；Ｍｉｎ，Ｙ．；Ｈｕａｎｇ，Ｂ．；Ｋｒａｍｅｒ，Ｊ．Ａ．；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．；Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．；Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｐ．Ｔ．；Ｉｒｖｉｎｅ，Ｄ．Ｊ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２０１３，１２，（４），３６７−３７６．
３８．Ｇｉｔｔａｒｄ，Ｓ．Ｄ．；Ｃｈｅｎ，Ｂ．；Ｘｕ，Ｈ．；Ｏｖｓｉａｎｉｋｏｖ，Ａ．；Ｃｈｉｃｈｋｏｖ，Ｂ．Ｎ．；Ｍｏｎｔｅｉｒｏ−Ｒｉｖｉｅｒｅ，Ｎ．Ａ．；Ｎａｒａｙａｎ，Ｒ．Ｊ．Ｊ．Ａｄｈｅｓ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３，２７，（３），２２７−２４３．
３９．Ｔａｏ，Ｐ．；Ｖｉｓｗａｎａｔｈ，Ａ．；Ｓｃｈａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｓ．；Ｂｅｎｉｃｅｗｉｃｚ，Ｂ．Ｃ．；Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．Ｗ．ＡＣＳ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ２０１１，３，（９），３６３８−３６４５．
４０．Ｚｏｕ，Ｗ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００５，５，（４），２６３−２７４．
４１．Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２，１２，（４），２５２−２６４．
４２．Ｗａｎｇ，Ｃ．；Ｘｕ，Ｌ．；Ｌｉａｎｇ，Ｃ．；Ｘｉａｎｇ，Ｊ．；Ｐｅｎｇ，Ｒ．；Ｌｉｕ，Ｚ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２０１４，２６，（４８），８１５４−８１６２．
４３．Ｌｕｓｓｉｅｒ，Ｄ．Ｍ．；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．；Ｈｉｎｇｏｒａｎｉ，Ｐ．；Ｂｌａｔｔｍａｎ，Ｊ．Ｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ２０１５，３，（１），１−１１．
４４．Ｃｕｒｒａｎ，Ｍ．Ａ．；Ｍｏｎｔａｌｖｏ，Ｗ．；Ｙａｇｉｔａ，Ｈ．；Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１０，１０７，（９），４２７５−４２８０．
【０１１３】
別段の定めのない限り、本明細書に使用されるすべての技術及び科学用語は、開示された本発明が帰属する当業者により一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に引用される刊行物、及びそれらが引用される資料は、参照により具体的に援用される。
【０１１４】
当業者は、複数の変更形態及び修正形態が本発明の好ましい実施形態に行われることが可能であり、またこのような変更形態及び修正形態が本発明の趣旨から逸脱することなく行われることが可能であることを理解するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が本発明の真の趣旨及び範囲内にあるような、これらのような均等な変形形態を網羅することを意図する。
【図１Ａ】
2019508140.tif 000004
【図１Ｂ】
2019508140.tif 000005
【図２Ａ】
2019508140.tif 000006
【図２Ｂ】
2019508140.tif 000007
【図２Ｃ】
2019508140.tif 000008
【図２Ｄ】
2019508140.tif 000009
【図２Ｅ】
2019508140.tif 000010
【図２Ｆ】
2019508140.tif 000011
【図３Ａ】
2019508140.tif 000012
【図３Ｂ】
2019508140.tif 000013
【図３Ｃ】
2019508140.tif 000014
【図３Ｄ】
2019508140.tif 000015
【図３Ｅ】
2019508140.tif 000016
【図４Ａ】
2019508140.tif 000017
【図４Ｂ】
2019508140.tif 000018
【図４Ｃ】
2019508140.tif 000019
【図４Ｄ】
2019508140.tif 000020
【図４Ｅ】
2019508140.tif 000021
【図４Ｆ】
2019508140.tif 000022
【図４Ｇ】
2019508140.tif 000023
【図５Ａ】
2019508140.tif 000024
【図５Ｂ】
2019508140.tif 000025
【図５Ｃ】
2019508140.tif 000026
【図６】
2019508140.tif 000027
【図７】
2019508140.tif 000028
【図８】
2019508140.tif 000029
【図９】
2019508140.tif 000030
【図１０】
2019508140.tif 000031
【図１１】
2019508140.tif 000032
【図１２Ａ】
2019508140.tif 000033
【図１２Ｂ】
2019508140.tif 000034
【図１３Ａ】
2019508140.tif 000035
【図１３Ｂ】
2019508140.tif 000036
【図１４】
2019508140.tif 000037
【図１５】
2019508140.tif 000038
【図１６】
2019508140.tif 000039
【図１７】
2019508140.tif 000040
【図１８】
2019508140.tif 000041
【図１９】
2019508140.tif 000042
【図２０】
2019508140.tif 000043
【図２１Ａ】
2019508140.tif 000044
【図２１Ｂ】
2019508140.tif 000045
【図２１Ｃ】
2019508140.tif 000046
【図２２Ａ】
2019508140.tif 000047
2019508140.tif 000048
【図２２Ｂ】
2019508140.tif 000049
【国際調査報告】
2019508140.tif 000050
2019508140.tif 000051
2019508140.tif 000052