(57)【要約】  本発明により、特定のｐＨを有し、活性成分としてのアフリベルセプトと、酢酸塩緩衝剤とを含み、イオン性等張化剤を含まない眼科用医薬組成物が提供される。本発明の眼科用組成物は、冷蔵保管条件下のみならず、加速条件下および苛酷条件下でも、二量体不純物および多量体不純物の生成を著しく減少させることができ、生物学的活性を高いレベルで長期間維持することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼科用医薬組成物であって、ｐＨが５.２〜５.７であり、水性媒質中に（ａ）治療有効量のアフリベルセプト；（ｂ）５〜５０ｍＭの酢酸塩緩衝剤；（ｃ）６〜１２ｗ／ｖ％の糖または３〜７ｗ／ｖ％の糖アルコール；および（ｄ）０.０１〜０.１ｗ／ｖ％の界面活性剤を含み、かつイオン性等張化剤を含まない眼科用医薬組成物。
【請求項２】
前記アフリベルセプトが２０〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在することを特徴とする、請求項１に記載の眼科用医薬組成物。
【請求項３】
前記酢酸塩緩衝剤が酢酸ナトリウム緩衝剤であることを特徴とする、請求項１に記載の眼科用医薬組成物。
【請求項４】
前記酢酸塩緩衝剤が約１０〜２０ｍＭの範囲の濃度で存在することを特徴とする、請求項１に記載の眼科用医薬組成物。
【請求項５】
前記糖がスクロース、トレハロースまたはそれらの混合物であることを特徴とする、請求項１に記載の眼科用医薬組成物。
【請求項６】
前記糖がスクロースであることを特徴とする、請求項１に記載の眼科用医薬組成物。
【請求項７】
前記糖が約６〜８ｗ／ｖ％の範囲の濃度で存在することを特徴とする、請求項５または６に記載の眼科用医薬組成物。
【請求項８】
前記糖アルコールがソルビトールであることを特徴とする、請求項１に記載の眼科用医薬組成物。
【請求項９】
前記ソルビトールが約５ｗ／ｖ％の濃度で存在することを特徴とする、請求項８に記載の眼科用医薬組成物。
【請求項１０】
前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体、またはそれらの混合物であることを特徴とする、請求項１に記載の眼科用医薬組成物。
【請求項１１】
前記界面活性剤がポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートまたはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレートであることを特徴とする、請求項１０に記載の眼科用医薬組成物。
【請求項１２】
前記界面活性剤がポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートであることを特徴とする、請求項１１に記載の眼科用医薬組成物。
【請求項１３】
前記界面活性剤が約０.０３ｗ／ｖ％の濃度で存在することを特徴とする、請求項１２に記載の眼科用医薬組成物。
【請求項１４】
ｐＨが約５.５であり、４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト；１０〜１５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝剤；７ｗ／ｖ％のスクロース；０.０３ｗ／ｖ％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートおよび水性媒質からなる、眼科用医薬組成物。
【請求項１５】
ｐＨが約５.５であり、４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト；１０〜１５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝剤；８ｗ／ｖ％のトレハロース；０.０３ｗ／ｖ％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートおよび水性媒質からなる、眼科用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性成分としてアフリベルセプトを含む眼科用医薬組成物に関する。より詳しくは、本発明は、特定のｐＨを有し、酢酸塩緩衝剤を含み、イオン性等張化剤を含まないアフリベルセプト含有眼科用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、固形腫瘍、増殖性網膜症、老人性黄斑変性症（ＡＭＤ）、および関節リウマチなど、様々な疾患の発病に関与すると知られている。血管新生に必要な因子の１つである血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、ヒトのがんで発現し、腫瘍血管新生において重要な役割を果たす。また、眼球液中に高濃度のＶＥＧＦが存在することは、糖尿病性およびその他の虚血性網膜症患者の血管新生活性と高い相関があり（Ａｉｅｌｌｏ ＬＰ,ｅｔ ａｌ.,Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９４；３３１: １４８０−１４８７）、老人性黄斑変性症（ＡＭＤ）患者の脈絡膜新生血管膜における増殖因子の局在につながる（Ａｍｉｎ Ｒ１，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ. １９９４ Ｊｕｌ；３５(８)： ３１７８−８８）。したがって、抗ＶＥＧＦ抗体またはＶＥＧＦ阻害剤は、固形腫瘍および眼内血管新生に関連する疾患の治療における有望な候補でありうる。
【０００３】
ＶＥＧＦ阻害剤の１つであるアフリベルセプトは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ部分に融合されている、ヒトＶＥＧＦ受容体１および２の細胞外ドメイン由来のＶＥＧＦ結合部位からなる組換え融合タンパク質である。アフリベルセプトは、商標名Ｅｙｌｅａ（登録商標）として滲出型黄斑変性症の治療用として、米国および欧州で承認されている。
【０００４】
非最適条件下のタンパク質含有医薬組成物では、物理化学的変性が生じる。特に、タンパク質濃度、緩衝剤の種類、安定化剤の種類および濃度、有機共溶媒の種類および濃度、塩の濃度、ｐＨ、温度、空気との接触などの要因は、タンパク質の酸化、脱アミド化、異性体化、および重合に、大きな影響をもたらす。これらの変性は、タンパク質の凝集体、断片、および異性体を生成させ、生理活性を低下させる恐れがある。特にタンパク質の凝集は、不溶性微粒子の形成における重要な内在要因であり、免疫反応のような副作用を引き起こす恐れがある。また、眼科用製剤の特性上、不溶性微粒子は、厳格に制限あるいは規制されるべきである。
【０００５】
韓国特許第１０−１４０６８１１号（国際公開第ＷＯ２００７／１４９３３４号）には、アフリベルセプト；ポリソルベートなどの有機共溶媒；塩化ナトリウムまたは塩化カリウムから選択されたイオン性等張化剤；リン酸ナトリウム緩衝剤；およびスクロースなどの安定化剤をそれぞれ特定の濃度で含む、ｐＨ５.８〜７.０の眼科用製剤および凍結乾燥可能な製剤が開示されている。前記韓国特許第１０−１４０６８１１号に開示された製剤は、硝子体内投与に適したプレフィルドシリンジに適用することができる。
【０００６】
前記韓国特許第１０−１４０６８１１号に開示された眼科用製剤および凍結乾燥可能な製剤は、アフリベルセプトの凝集、断片化、および異性体化による不純物および副産物の生成を抑制する効果を有することが記載されている。しかし、前記製剤には、苛酷条件下、例えば、４０℃以上の高温条件下では、アフリベルセプに対する安定化効果が顕著に低下するという問題がある（韓国特許公開第１０−２０１７−００００３５６号）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、冷蔵保管条件だけでなく、加速条件および苛酷条件下でも、アフリベルセプト由来の不純物（二量体もしくは多量体不純物）の生成を最小化することができる眼科用製剤を開発するために、様々な研究を行った。特に、本発明者らは、緩衝剤、等張化剤、ｐＨの範囲などを含めて、製剤化に関する様々な研究を行った。その結果、本発明者らは、ＮａＣｌのようなイオン性等張化剤の使用が、アフリベルセプト由来の二量体もしくは多量体の生成を引き起こすことを見出した。また、本発明者らは、ＮａＣｌのようなイオン性等張化剤を使用せずに、糖または糖アルコールの量を調節して等張性を調節し、特定の緩衝剤（酢酸塩緩衝剤）を使用してｐＨを５.２〜５.７に調節した場合、二量体および多量体不純物の生成を著しく減少させることができ、生物学的活性を高いレベルで長期間維持できることを見出した。
【０００８】
したがって、本発明は、ｐＨが５.２〜５.７であり、酢酸塩緩衝剤を含み、イオン性等張化剤を含まないアフリベルセプト含有眼科用医薬組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様によれば、眼科用医薬組成物であって、ｐＨが５.２〜５.７であり、水性媒質中に（ａ）治療有効量のアフリベルセプト；（ｂ）５〜５０ｍＭの酢酸塩緩衝剤；（ｃ）６〜１２ｗ／ｖ％の糖または３〜７ｗ／ｖ％の糖アルコール；および（ｄ）０.０１〜０.１ｗ／ｖ％の界面活性剤を含み、かつイオン性等張化剤を含まない眼科用医薬組成物が提供される。
【００１０】
前記アフリベルセプトは、２０〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在してもよい。
【００１１】
前記酢酸塩緩衝剤は、酢酸ナトリウム緩衝剤であってもよい。前記酢酸塩緩衝剤は、好ましくは約１０〜２０ｍＭ、より好ましくは約１０〜１５ｍＭの範囲の濃度で存在してもよい。
【００１２】
前記糖は、好ましくはスクロース、トレハロースまたはそれらの混合物、より好ましくはスクロースまたはトレハロース、最も好ましくはスクロースであってもよい。前記糖は、約６〜８ｗ／ｖ％の範囲の濃度で存在してもよい。また、前記糖アルコールは、ソルビトールであってもよい。前記糖アルコールは、約５ｗ／ｖ％の濃度で存在してもよい。
【００１３】
前記界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体、またはそれらの混合物、好ましくはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートまたはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、より好ましくはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートであってもよい。一実施形態において、前記界面活性剤は、約０.０３ｗ／ｖ％の濃度で存在してもよい。
【００１４】
本発明の一実施形態において、４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト；１０〜１５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝剤；７ｗ／ｖ％のスクロース；０.０３ｗ／ｖ％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートおよび水性媒質からなり、ｐＨが約５.５である眼科用医薬組成物が提供される。
【００１５】
本発明の別の一実施形態において、４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト；１０〜１５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝剤；８ｗ／ｖ％のトレハロース；０.０３ｗ／ｖ％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートおよび水性媒質からなり、ｐＨが約５.５である眼科用医薬組成物が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、ＮａＣｌのようなイオン性等張化剤の使用がアフリベルセプト由来の二量体もしくは多量体の生成を引き起こすだけでなく、生物学的活性に影響を与えることが見出された。本発明に係る眼科用医薬組成物において、ＮａＣｌのようなイオン性等張化剤を使用せずに、糖または糖アルコールの量を調節して等張性を調節し、酢酸塩緩衝剤を使用してｐＨを５.２〜５.７に調節することによって、冷蔵保管条件だけでなく、加速条件および苛酷条件下でも、二量体および多量体不純物の生成を著しく減少させることができ、生物学的活性を高いレベルで長期間維持できる。したがって、本発明に係る眼科用医薬組成物は、物理化学的安定性および生物学的安定性を向上させることができ、滲出型老人性黄斑変性症および糖尿病性黄斑浮腫などの様々な眼疾患の患者における硝子体内投与および眼内投与のためのプレフィルドシリンジに、適切に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の眼科用医薬組成物を用いたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の血管形成評価を行って得た結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、眼科用医薬組成物であって、ｐＨが５.２〜５.７であり、水性媒質中に（ａ）治療有効量のアフリベルセプト；（ｂ）５〜５０ｍＭの酢酸塩緩衝剤；（ｃ）６〜１２ｗ／ｖ％の糖または３〜７ｗ／ｖ％の糖アルコール；および（ｄ）０.０１〜０.１ｗ／ｖ％の界面活性剤を含み、かつイオン性等張化剤を含まない眼科用医薬組成物を提供する。
【００１９】
本発明の医薬組成物において、活性成分として使用されるアフリベルセプトは、治療有効量で含有されてもよい。たとえば、アフリベルセプトは、１０〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは２０〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度、より好ましくは約４０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してもよいが、これらに限定はされない。
【００２０】
前記水性媒質は、酢酸塩緩衝剤とともに緩衝液を提供することができる任意の水性媒質を含み、例えば、注射用水、滅菌精製水などを含む。
【００２１】
前記酢酸塩緩衝剤は、アルカリ金属酢酸塩またはアルカリ土類金属酢酸塩を含む。たとえば、前記酢酸塩緩衝剤は、酢酸ナトリウム緩衝剤であってもよい。前記緩衝剤において、酢酸塩と金属（例えば、ナトリウム）との比を調節することによって、所望のｐＨを提供してもよい。前記酢酸塩緩衝剤は、５〜５０ｍＭ、好ましくは５〜３０ｍＭ、より好ましくは約１０〜２０ｍＭ、最も好ましくは約１０〜１５ｍＭの範囲の濃度で存在してもよいが、これらに限定はされない。
【００２２】
前記糖は、好ましくはスクロース、トレハロースまたはそれらの混合物、より好ましくはスクロースまたはトレハロース、最も好ましくはスクロースであってもよい。前記糖は、６〜１２ｗ／ｖ％、好ましくは６〜１０ｗ／ｖ％の範囲の濃度で存在してもよい。また、前記糖が約６〜８ｗ／ｖ％の範囲の濃度で存在する場合、医薬組成物は、優れた安定性のみならず、生理食塩水の浸透圧（約２９０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ）に近い浸透圧を示すことが、本発明により明らかになった。したがって、最も好ましくは、前記糖は、約６〜８ｗ／ｖ％の範囲の濃度で存在してもよい。また、前記糖アルコールは、ソルビトールであってもよい。前記糖アルコールは、約５ｗ／ｖ％の濃度で存在してもよい。
【００２３】
前記界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０など）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体（例えば、ポロキサマー１８８（登録商標）など）、またはそれらの混合物、好ましくはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート（ポリソルベート８０）、より好ましくはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートであってもよい。前記界面活性剤は、０.０１〜０.１ｗ／ｖ％の範囲の濃度で存在してもよい。一実施形態において、前記ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは、好ましくは０.０１〜０.０３ｗ／ｖ％の範囲の濃度、より好ましくは約０.０３ｗ／ｖ％の濃度で存在してもよい。別の実施形態において、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体は、好ましくは０.０３〜０.１ｗ／ｖ％の範囲の濃度で存在してもよい。
【００２４】
本発明の一実施形態において、４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト；１０〜１５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝剤；７ｗ／ｖ％のスクロース；０.０３ｗ／ｖ％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートおよび水性媒質からなり、ｐＨが約５.５である眼科用医薬組成物が提供される。
【００２５】
本発明の別の一実施形態において、４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト；１０〜１５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝剤；８ｗ／ｖ％のトレハロース；０.０３ｗ／ｖ％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートおよび水性媒質からなり、ｐＨが約５.５である眼科用医薬組成物が提供される。
【００２６】
本発明の医薬組成物は、ガラスバイアルに充填されてもよい。また、本発明の医薬組成物は、プレフィルドシリンジの形態で提供されてもよい。
【００２７】
以下、下記実施例により本発明についてさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲はこれらによって限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
眼科用組成物の調製および評価
（１）眼科用組成物の調製
下記表１および表２に示した成分および含量に従って、眼科用組成物を調製した。それぞれの組成物のｐＨは、酢酸ナトリウム緩衝剤のナトリウムと酢酸塩との比を変化させることによって調節するか、またはクエン酸ナトリウム緩衝剤のナトリウムとクエン酸塩との比を変化させることによって調節した。具体的には、それぞれのｐＨを有する酢酸ナトリウム緩衝剤またはクエン酸ナトリウム緩衝剤を調製した後、アフリベルセプト、糖（スクロースまたはトレハロース）または糖アルコール（ソルビトール）、およびポリソルベート２０を撹拌下で溶解させて、それぞれの製剤を調製した。製剤１−１３は、緩衝剤としてリン酸ナトリウムを使用し、イオン性等張化剤として塩化ナトリウムをさらに溶解させて調製した。また、製剤１−１４、２−１３、および２−１４は、イオン性等張化剤として塩化ナトリウムをさらに溶解させて調製した。得られた製剤それぞれの浸透圧を、表１および表２に示す。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
【表２】
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【００３１】
（２）苛酷条件下および加速条件下における、アフリベルセプト由来の断片、二量体、および多量体の生成の評価
先に調製した製剤それぞれを、３ｍｌのガラスバイアルに入れ、２５℃または４０℃で８週間保管した後、アフリベルセプト（単量体）およびその断片、二量体または多量体の含量を、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）および動的光散乱（ＤＬＳ）分析を通じて測定した。前記ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の条件は、以下の通りである；カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷＸＬ、７.８×３０（ＩＤｍｍ×Ｌｃｍ）（東ソー社製、Ｃａｔ.＃０８５４１）、移動相：２５０ｍＭ ＫＣｌおよび０.０５％ ＮａＮ３を含有する２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ６.２）、流速：０.５ｍｌ／分、および波長：２８０ｎｍ。前記ＤＬＳ分析は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いて、Ｚ平均および多分散指数（ＰＤＩ）を特定することによって行った。
【００３２】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を表３および表４に示し、ＤＬＳ分析の結果を表５および表６に示す。
【００３３】
【表３】
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【００３４】
【表４】
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【００３５】
【表５】
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【００３６】
【表６】
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【００３７】
表３〜６の結果からわかるように、ＷＯ２００７／１４９３３４に開示されている製剤（すなわち、製剤１−１３）を、加速条件下（２５℃）および苛酷条件下（４０℃）で８週間保管したところ、アフリベルセプト由来の二量体および多量体不純物が、高レベルで生成した。また、公知の製剤（すなわち、製剤１−１３）と同じイオン性等張化剤および糖を用いて調製し、製剤１−３と同じ酢酸ナトリウム緩衝剤を用いてｐＨを調整して調製した製剤１−１４および２−１３においては、アフリベルセプト由来の二量体および多量体不純物が、公知の製剤（すなわち、製剤１−１３）と同等レベルで生成した。これら結果から、アフリベルセプト由来の二量体および多量体不純物の生成は、イオン性等張化剤（たとえば、ＮａＣｌ）によって著しく増加することが確認できる。また、酢酸塩緩衝剤の代わりにクエン酸塩緩衝剤を含む製剤（すなわち、製剤２−１１および２−１２）の場合、クエン酸塩がイオン性塩として機能することによって、アフリベルセプト由来の二量体および多量体不純物の生成が著しく増加することが確認できる。
【００３８】
イオン性等張化剤を使用せず、糖の含量を増加させて調製した、多様なｐＨを有する眼科用製剤（すなわち、製剤１−１〜１−１２および製剤２−１〜２−１０）を、加速条件下（２５℃）および苛酷条件下（４０℃）下で８週間保管した後、アフリベルセプト由来の二量体および多量体不純物を測定した。その結果、ｐＨが５.２〜５.７であり、イオン性等張化剤を含まない製剤、すなわち、製剤１−２、１−３、１−４、１−８、１−９、１−１０および２−１〜２−１０では、アフリベルセプト由来の二量体および多量体不純物の生成が有意に減少した。特に、ｐＨが５．５であり、イオン性等張化剤を含まない製剤、すなわち、製剤１−３、１−９、２−２、２−３、２−４、２−７、２−８、および２−９では、アフリベルセプト由来の二量体および多量体不純物の生成が顕著に減少した。また、糖の代わりに糖アルコール（ソルビトール）を用いたこと以外は、製剤１−３と同じ成分を用いて調製した製剤１−１５でも、アフリベルセプト由来の二量体および多量体不純物の生成が顕著に減少した。これらのうち、製剤１−１５、２−２、２−３、２−４、２−７、２−８、および２−９の浸透圧は、点眼製剤において通常許容可能な有効浸透圧範囲、すなわち、約２３０〜３２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲にあった。特に、製剤２−３および２−８の浸透圧は、生理食塩水の浸透圧（２９０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ）に準じた約２７０〜３１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲にあったことから、これらの製剤は、眼科用製剤として非常に有用に用いることができる。
【００３９】
（３）冷蔵保管条件（４℃条件）下における、アフリベルセプト由来の断片、二量体、および多量体の生成の評価
製剤２−１〜２−１０、１−１３、２−１３および２−１４を、３ｍｌのガラスバイアルに入れ、４℃で６ヶ月間および１２ヶ月間保管した後、アフリベルセプト（単量体）およびその断片、二量体または多量体の含量を前記（２）と同一の方法で測定した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を表７および表８に示し、ＤＬＳ分析の結果を表９および表１０に示す。
【００４０】
【表７】
2019517513.tif 000009
【００４１】
【表８】
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【００４２】
【表９】
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【００４３】
【表１０】
2019517513.tif 000012
【００４４】
表７〜１０の結果からわかるように、４℃で６ヶ月間および１２ヶ月間保管したところ、イオン性等張化剤を含まない製剤（すなわち、製剤２−１〜２−１０）およびイオン性等張化剤を含む製剤（すなわち、製剤１−１３、２−１３、および２−１４）のいずれにおいても、アフリベルセプト由来の二量体および多量体不純物は低レベルであった。しかし、イオン性等張化剤を含まない製剤では、イオン性等張化剤を含む製剤と比べて、アフリベルセプト由来の二量体および多量体不純物の生成は有意に低いレベルであった。
【００４５】
（４）アスパラギン（Ａｓｎ）脱アミド化の分析
先に加速条件下（２５℃）および苛酷条件下（４０℃）で８週間保管した製剤１−２、１−３、１−４、１−８、１−９、１−１０、１−１３、１−１４、１−１５、２−１〜２−１０、２−１３および２−１４に対して、アスパラギン（Ａｓｎ）脱アミド化分析、すなわち、アスパラギン脱アミドの定量を目的としたイソアスパラギン酸定量分析を行い、そのタンパク質変性を評価した。また、４℃条件下で６ヶ月間および１２ヶ月間保管した製剤２−１〜２−１０、１−１３、２−１３および２−１４に対してイソアスパラギン酸定量分析を行い、そのタンパク質変性を評価した。
【００４６】
このアスパラギン脱アミド化分析は、ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）Ｉｓｏａｓｐａｒｔａｔｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｃａｔ.＃ＭＡ１０１０)を用いて、製造会社の説明書に従って実施した。その結果を表１１〜１４に示す。
【００４７】
【表１１】
2019517513.tif 000013
【００４８】
【表１２】
2019517513.tif 000014
【００４９】
【表１３】
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【００５０】
【表１４】
2019517513.tif 000016
【００５１】
表１１〜１４の結果からわかるように、加速条件下（２５℃）および苛酷条件下（４０℃）で８週間保管した本発明の組成物、すなわち、製剤１−２、１−３、１−４、１−８、１−９、１−１０および２−１〜２−１０では、脱アミド化生成物が有意に減少した。特に、ｐＨが５．５であり、イオン性等張化剤を含まない製剤、すなわち、製剤１−３、１−９、２−３および２−９では、脱アミド化生成物が顕著に減少した。
【００５２】
また、製剤２−１〜２−１０、１−１３、２−１３および２−１４を、４℃で６ヶ月間および１２ヶ月間保管したところ、イオン性等張化剤を含まない製剤（すなわち、製剤２−１〜２−１０）およびイオン性等張化剤を含む製剤（すなわち、製剤１−１３、２−１３、および２−１４）のいずれにおいても、脱アミド化生成物は低レベルであった。しかし、イオン性等張化剤を含まない製剤では、イオン性等張化剤を含む製剤と比べて、脱アミド化生成物は有意に低いレベルであった。
【００５３】
（５）細胞増殖に対する抑制の評価
先に加速条件下（２５℃）で８週間および４℃下で１２ヶ月間保管した製剤１−３、１−１３、２−３、２−８、および２−１３の生物学的活性を評価した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ)を血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）で処理すると、細胞が増殖する。前記条件下で、アフリベルセプト処理による、細胞増殖に対する抑制を評価するために、インビトロ試験を行った。
【００５４】
この試験は、ｒｈＶＥＧＦ１６５（Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ社製、Ｃａｔ.＃Ｃ−６４４２０）の終濃度５０ｎｇ／ｍｌ、アフリベルセプトの濃度勾配２.４〜２５００ｎｇ／ｍｌで行った。３７℃の、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター内で３時間、中和反応を行った。反応生成物で前記細胞を処理した後、３日間培養した。細胞増殖に対する抑制を評価するために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ分析（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｃａｔ.＃Ｇ３５８０、ＭＴＳ溶液）プロトコルに従って、５９０ｎｍにおける吸光度を測定し、５０％の抑制（ＩＣ５０）に必要な濃度を決定した。
【００５５】
この増殖抑制試験から得た各製剤のＩＣ５０値を、表１５に示す。
【００５６】
【表１５】
2019517513.tif 000017
【００５７】
表１５の結果からわかるように、加速条件下で長期間保管したところ、本発明によって得られた眼科用製剤は、従来の製剤と比較して、優れた安定性を有するのみならず、生物学的活性において約２０〜２５％の増加を示した。また、４℃の保管条件下で保管した際には、イオン性等張化剤を含まない製剤は、イオン性等張化剤を含む製剤よりも、生物学的活性において優れている。
【００５８】
（６）管形成に対する抑制の評価
先に加速条件下（２５℃）で８週間保管した製剤１−３、１−１３、２−３、２−８、および２−１３について、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の管形成分析を行った。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ)は、マトリゲルがコーティングされたプレートで、管を形成する。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）でＨＵＶＥＣを処理すると、ＨＵＶＥＣの管形成能が増加する。前記条件下で、アフリベルセプト処理による、管形成能に対する抑制を評価するために、インビトロ試験を行った。
【００５９】
１０μｌのマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ，ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ，Ｃａｔ. ＃３５６２３１）を、Ｉｂｉｄｉ社のマイクロスライドアンジオジェネシスｉｂｉＴｒｅａｔ（Ｃａｔ.＃８１５０６）キットの各ウェルに入れた後、３７℃で２時間、重合反応を行った。ｒｈＶＥＧＦ１６５（Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ社製、Ｃａｔ.＃Ｃ−６４４２０）の終濃度を１.５６ｎＭ（約６０ｎｇ／ｍｌ）に設定し、アフリベルセプトは１０ｎＭ（約１１５０ｎｇ／ｍｌ）の濃度となるよう設定する。３７℃の、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター内で３時間インキュベートした。前記細胞（１×１０４個／５０μｌ）をインキュベートした生成物と混合した後、それぞれマトリゲルがコーティングされたマイクロスライドアンジオジェネシスウェルに加えた。約１６時間後、管形成を観察した。
【００６０】
ＨＵＶＥＣによる管形成の顕微鏡写真を撮影した後、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）から配布されているＩｍａｇｅＪプログラム用の血管新生分析計を用いて、管形成の程度を測定した。管形成の抑制は、管の数および管を形成する分岐点の数を測定することによって、評価した。
【００６１】
ＨＵＶＥＣの管形成に対する抑制試験から得た、各製剤の結果を、下記表１６および図１に示す。
【００６２】
【表１６】
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【００６３】
また、４℃で１２ヶ月間保管した製剤についても、これと同じ試験を行った。その結果を表１７に示す。
【００６４】
【表１７】
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【００６５】
表１６および図１の結果からわかるように、本発明によって得られた眼科用製剤は、加速条件下で長期間保管したところ、従来の製剤に比べて安定性に優れるのみならず、対照群と同等レベルの管形成能を示す、すなわちイオン性等張化剤を含む製剤と比べて、管形成抑制が顕著に増加している。また、４℃の保管条件下で保管した際には、イオン性等張化剤を含まない製剤は、イオン性等張化剤を含む製剤よりも、ＨＵＶＥＣによる管形成に対する抑制活性において優れている。
【図１】
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【国際調査報告】
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