(57)【要約】プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質を用いて、標的ゲノム修飾の効率および／または特異性を増大させ、または真核細胞中の特定のゲノム遺伝子座の検出を促進するための組成物および方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質またはプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質をコードする核酸；および（ｂ）少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を含む、組成物。
【請求項２】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が、ＲＮＡにガイドされたクラスター化した規則的に間隔が空いている短い回文配列リピート（RNA-guided clustered regularly interspersed short palindromic repeats、ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインと連結したプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、または非ヌクレアーゼドメインと連結したプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインが、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、触媒不活性なメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質、または転写活性化因子様エフェクターである、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
融合タンパク質の非ヌクレアーゼドメインが、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、シトルリン化活性、ヘリカーゼ活性、アミノ化活性、脱アミノ化活性、アルキル化活性、脱アルキル化活性、酸化活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有する、請求項２または３記載の組成物。
【請求項５】
融合タンパク質の非ヌクレアーゼドメインが、シトシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有する、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質が、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、触媒不活性なメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ、ＺＦＮニッカーゼ、ＴＡＬＥＮニッカーゼ、またはメガヌクレアーゼニッカーゼである、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質および少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸がＲＮＡまたはＤＮＡであり、かつ／または前記核酸がプラスミドベクターの一部またはウイルスベクターの一部である、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、または非ヌクレアーゼドメインと連結した触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質が触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、ここで各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムまたはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸がｍＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項８〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸および／または各ガイドＲＮＡをコードする核酸がプラスミドベクターの一部またはウイルスベクターの一部である、請求項８〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡが酵素的に合成されている、請求項８〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡが少なくとも部分的に化学合成されている、請求項８〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物を含むキット。
【請求項１６】
真核細胞中の標的ゲノム修飾の効率および／または特異性を増大させる方法であって、真核細胞に以下を導入することを含む方法：
（ａ）プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質またはプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質をコードする核酸、および；
（ｂ）少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸；
ここで、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は標的染色体配列を標的とし、少なくとも１つのプログラム可能な各ＤＮＡ結合タンパク質は、標的染色体配列の近位の部位を標的とし、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質と標的染色体配列の近位の部位との結合は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質の標的染色体配列へのアクセスしやすさを増大させ、これにより標的ゲノム修飾の効率および／または特異性を増大させる。
【請求項１７】
標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約２５０塩基対以内に位置している、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約１００塩基対以内に位置している、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約７５塩基対以内に位置している、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約５０塩基対以内に位置している、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約２５塩基対以内に位置している、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインと連結したプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、または非ヌクレアーゼドメインと連結したプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質である、請求項１６〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインが、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、触媒不活性なメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質、または転写活性化因子様エフェクターである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
融合タンパク質の非ヌクレアーゼ修飾ドメインが、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、シトルリン化活性、ヘリカーゼ活性、アミノ化活性、脱アミノ化活性、アルキル化活性、脱アルキル化活性、酸化活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有する、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２５】
融合タンパク質の非ヌクレアーゼドメインが、シトシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有する、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質が、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、触媒不活性なメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ、ＺＦＮニッカーゼ、ＴＡＬＥＮニッカーゼ、またはメガヌクレアーゼニッカーゼである、請求項１６〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、または非ヌクレアーゼドメインと連結した触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質が触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、ここで各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、請求項１６〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡが少なくとも部分的に化学合成されている、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡが酵素的に合成されている、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
真核細胞がインビトロである、請求項１６〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
真核細胞がインビボである、請求項１６〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
真核細胞が哺乳類細胞である、請求項１６〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
哺乳類細胞が非ヒト細胞である、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
真核細胞中の染色体配列を検出する方法であって、以下を含む方法：
Ｉ．真核細胞に、（ａ）少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質または少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸；および（ｂ）少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を導入する工程、ここで少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は標的染色体配列を標的とし、少なくとも１つのプログラム可能な各ＤＮＡ結合タンパク質は標的染色体配列の近位の部位を標的とし、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質と標的染色体配列の近位の部位との結合は、少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質の標的染色体配列へのアクセスしやすさを増大させる；および
ＩＩ．標的染色体配列に結合した少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質を検出する工程。
【請求項３６】
標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約２５０塩基対以内に位置している、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約１００塩基対以内に位置している、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約７５塩基対以内に位置している、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約５０塩基対以内に位置している、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約２５塩基対以内に位置している、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質の少なくとも１つの検出可能なマーカードメインが、蛍光タンパク質、蛍光タグ、エピトープタグ、またはプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質中に天然に存在するエピトープである、請求項３５〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質が、少なくとも１つの検出可能なマーカードメインと連結した触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、少なくとも１つの検出可能なマーカードメインと連結した触媒不活性なメガヌクレアーゼ、少なくとも１つの検出可能なマーカードメインと連結したＺｎフィンガータンパク質、または少なくとも１つの検出可能なマーカードメインと連結した転写活性化因子様エフェクターである、請求項３５〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質が、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、触媒不活性なメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ、ＺＦＮニッカーゼ、ＴＡＬＥＮニッカーゼ、またはメガヌクレアーゼニッカーゼである、請求項３５〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質が少なくとも１つの検出可能なマーカードメインと連結した触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質が触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、請求項３５〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡが少なくとも部分的に化学合成されている、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡが酵素的に合成されている、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
真核細胞が哺乳類細胞である、請求項３５〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
哺乳類細胞が非ヒト細胞である、請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
真核細胞が生存している、または固定されている、請求項３５〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
検出が、動的生細胞イメージング、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、免疫蛍光、免疫検出、ＲＮＡ−タンパク質結合、またはタンパク質−タンパク質結合を含む、請求項３５〜５０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、標的ゲノム修飾の効率および／または特異性を増大させる組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プログラム可能なエンドヌクレアーゼは真核生物における標的ゲノム編集または標的ゲノム修飾のためのますます重要なツールとなっている。最近、ＲＮＡにガイドされたクラスター化した規則的に間隔が空いている短い回文配列リピート（RNA-guided clustered regularly interspersed short palindromic repeats、ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムが新世代のゲノム修飾ツールとして現れてきた。これらの新しいプログラム可能なエンドヌクレアーゼは、前世代のヌクレアーゼ（Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）など）と比較してゲノム編集の性能を大きく向上させた。
【０００３】
しかしながら、全てのゲノム標的にこれらのプログラム可能なエンドヌクレアーゼによる効率的な修飾が利用できるわけではない。実際、いくつかのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ヒト細胞においてほとんどまたは全く活性を示さないようである。特にクロマチン構造は、これらのプログラム可能なエンドヌクレアーゼに対する障壁を示し得、これらが標的配列に結合するのを妨げ得る。したがって、これらのプログラム可能なエンドヌクレアーゼの標的配列へのアクセスしやすさを改善し、かつ／または標的ゲノム修飾の効率を改善する必要がある。さらに、オフターゲット効果を減少させることによって標的ゲノム修飾の特異性を増大させる必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の様々な態様において、（ａ）プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質またはプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質をコードする核酸、および（ｂ）少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を含む組成物である。一般に、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はヌクレアーゼ活性（すなわち、二本鎖配列の両方の鎖を切断する）または非ヌクレアーゼ活性（例えば、エピジェネティック修飾活性または転写制御活性）を有し、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質はヌクレアーゼ活性を有さない。
【０００５】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がヌクレアーゼ活性を有している実施態様において、例えばプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、ＲＮＡにガイドされたクラスター化した規則的に間隔が空いている短い回文配列リピート（RNA-guided clustered regularly interspersed short palindromic repeats、ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインと連結した（すなわち、二本鎖ＤＮＡ切断を生成する）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質およびそれらの組合せから選択され得る。
【０００６】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が非ヌクレアーゼ活性を有している実施態様において、例えばプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、非ヌクレアーゼ修飾ドメインと連結したプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質であり得る。ある実施態様において、融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、触媒不活性なメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質、または転写活性化因子様エフェクターであり得、融合タンパク質の非ヌクレアーゼ修飾ドメインは、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、シトルリン化活性、ヘリカーゼ活性、アミノ化活性、脱アミノ化活性、アルキル化活性、脱アルキル化活性、酸化活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有し得る。具体的な実施態様において、融合タンパク質の非ヌクレアーゼ修飾ドメインは、シトシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有する。
【０００７】
本明細書で開示される組成物のある実施態様において、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、触媒不活性なメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ、ＺＦＮニッカーゼ、ＴＡＬＥＮニッカーゼ、またはメガヌクレアーゼニッカーゼであり得る。
【０００８】
一般に、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質および／または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸は、ｍＲＮＡまたはＤＮＡである。いくつかの実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質および／または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸はベクター（例えば、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターなど）の一部である。
【０００９】
具体的な実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、または非ヌクレアーゼドメインと連結した触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含み、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含み、ここで各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む。様々な実施態様において、各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり得る。いくつかの実施態様において、各ガイドＲＮＡは少なくとも部分的に化学合成され得る。他の実施態様において、各ガイドＲＮＡは酵素的に合成され得る。さらなる実施態様において、各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸はｍＲＮＡであり得、各ガイドＲＮＡをコードする核酸はＤＮＡであり得る。さらなる他の実施態様において、各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸はｍＲＮＡであり得、各ガイドＲＮＡをコードする核酸はＤＮＡであり得る。ある実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸および／またはガイドＲＮＡをコードする核酸はベクター（例えば、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはアデノウイルスベクター）の一部であり得る。
【００１０】
本開示の別の態様は、上述の組成物のいずれか１つ以上を含むキットを包含する。
【００１１】
本開示のさらなる別の態様は、真核細胞中の標的ゲノム修飾の効率および／または特異性を増大させる方法を提供する。本方法は真核細胞に、（ａ）プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質またはプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質をコードする核酸、および（ｂ）少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を導入することを含む。プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は標的染色体配列を標的とし、少なくとも１つのプログラム可能な各ＤＮＡ結合タンパク質は、標的染色体配列の近位の部位を標的とする。少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質と標的染色体配列の近位の部位との結合は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質の標的染色体配列へのアクセスしやすさを増大させ、これにより標的ゲノム修飾の効率および／または特異性を増大させる。少なくとも１つのプログラム可能な各ＤＮＡ結合タンパク質に結合された近位部は、例えば標的染色体配列の一方の側の約２５０塩基対以内に位置している。いくつかの実施態様において、近位結合部位は標的染色体配列の一方の側の約２００ｂｐ未満または約１００ｂｐ未満に位置している。
【００１２】
本方法において使用されるプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインと連結したプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、または非ヌクレアーゼドメインと連結したプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質であり得る。融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、触媒不活性なメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質、または転写活性化因子様エフェクターであり得、融合タンパク質の非ヌクレアーゼ修飾ドメインは、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、シトルリン化活性、ヘリカーゼ活性、アミノ化活性、脱アミノ化活性、アルキル化活性、脱アルキル化活性、酸化活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有し得る。具体的な実施態様において、融合タンパク質の非ヌクレアーゼ修飾ドメインは、シトシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有する。
【００１３】
本方法において使用される少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質はＤＮＡに結合するが、ヌクレアーゼ活性（すなわち二本鎖切断活性）を持たない。ある実施態様において、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、触媒不活性なメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ、ＺＦＮニッカーゼ、ＴＡＬＥＮニッカーゼ、またはメガヌクレアーゼニッカーゼであり得る。
【００１４】
具体的な実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、または非ヌクレアーゼドメインと連結した触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含み、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含み、ここで各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む。
【００１５】
様々な実施態様において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ以上のプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質が真核細胞に導入される。具体的な実施態様において、真核細胞は哺乳類細胞またはヒト細胞である。
【００１６】
本開示のさらなる態様は、真核細胞中の染色体配列またはゲノム遺伝子座を検出する方法を包含する。本方法は真核細胞に、（ａ）少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質または少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸、および（ｂ）少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を導入することを含み、ここで少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は標的染色体配列を標的とし、少なくとも１つのプログラム可能な各ＤＮＡ結合タンパク質は標的染色体配列の近位の部位を標的とし、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質と標的染色体配列の近位の部位との結合は、少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質の標的染色体配列へのアクセスしやすさを増大させる。本方法はさらに、標的染色体配列に結合した少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質を検出することを含み得る。検出の工程は、生細胞または固定細胞中であり得、例えば動的生細胞イメージング、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、免疫蛍光、免疫検出、ＲＮＡ−タンパク質結合、またはタンパク質−タンパク質結合を含み得る。
【００１７】
本検出方法において使用される少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質はプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含み、これは触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、触媒不活性なメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質、または転写活性化因子様エフェクターであり得る。少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質の少なくとも１つの検出可能なマーカードメインは、例えば蛍光タンパク質、蛍光タグ、エピトープタグ、またはプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質中に天然に存在するエピトープであり得る。いくつかの実施態様において、少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質はさらに、非ヌクレアーゼ修飾を含み得る。少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質はＤＮＡに結合するが、ヌクレアーゼ活性（すなわち二本鎖切断活性）を持たない。いくつかの実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、触媒不活性なメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ、ＺＦＮニッカーゼ、ＴＡＬＥＮニッカーゼ、またはメガヌクレアーゼニッカーゼであり得る。具体的な実施態様において、少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを連結した触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり得、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり得る。
【００１８】
本開示の他の態様および特徴が以下に詳述される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本明細書において開示される方法のある実施態様の略図を示す。プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質の近位の結合は、標的部位のプログラム可能なヌクレアーゼへのアクセスしやすさを増大させ、これにより標的部位の切断効率を増大させる。
【００２０】
【図２】図２は、触媒不活性なＳｐＣａｓ９（ＳｐｄＣａｓ９）と近位部との結合がＦｎＣａｓ９による切断の効率を増大させることを示す。上部に示される配列は、ＰＯＲ遺伝子座におけるＦｎＣａｓ９標的部位とＳｐｄＣａｓ９の結合部位との相対的な位置を示す。Ｃｅｌ−Ｉヌクレアーゼアッセイの結果を下部に示す。
【００２１】
【図３Ａ】図３Ａは、触媒不活性なＳｐＣａｓ９（ＳｐｄＣａｓ９）の結合が、エピトープ標識（すなわちＦＬＡＧ（登録商標）標識）された触媒不活性なＣｊＣａｓ９（ＣｊｄＣａｓ９）のＰＯＲ遺伝子座中における以前はアクセスできなかった部位への結合およびアクセスしやすさを増大させるか否かを決定するための実験計画を示す。
【００２２】
【図３Ｂ】図３Ｂは、エピトープ標識されたＣｊｄＣａｓ９とＰＯＲおよびＡＡＶＳ１遺伝子座中の標的部位との結合を検出するために使用される、クロマチン免疫沈降結合アッセイの略図を示す。
【００２３】
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＳｐｄＣａｓ９と近位部との結合がエピトープ標識されたＣｊＣａｓ９とＰＯＲ遺伝子座中の以前はアクセスできなかった部位との結合を増大させることを示す。
【００２４】
【図４】図４は、触媒不活性なＳｐＣａｓ９（ＳｐｄＣａｓ９）と近位部との結合がＣｊＣａｓ９による切断の効率を増大させることを示す。上部に示される配列は、ＰＯＲ遺伝子座におけるＣｊＣａｓ９標的部位とＳｐｄＣａｓ９の結合部位との相対的な位置を示す。Ｃｅｌ−Ｉヌクレアーゼアッセイの結果を下部に示す。
【００２５】
【図５】図５は、触媒不活性なＳｐＣａｓ９（ＳｐｄＣａｓ９）と近位部との結合がＦｎＣａｆ１による切断の効率を増大させることを示す。ＰＯＲ遺伝子座におけるＦｎＣａｆ１標的部位とＳｐｄＣａｓ９結合部位との相対的な位置を上部に示し、Ｃｅｌ−Ｉヌクレアーゼアッセイの結果を下部に示す。
【００２６】
【図６】図６は、触媒不活性なＳｐＣａｓ９（ＳｐｄＣａｓ９）と近位部との結合がＣｊＣａｓ９による特異的な切断を増大させることを示す。ＨＢＤおよびＨＢＢ遺伝子座におけるＣｊＣａｓ９の標的部位、ならびにＨＢＢ遺伝子座におけるＳｐｄＣａｓ９の結合部位を上部に示す。Ｃｅｌ−Ｉヌクレアーゼアッセイの結果を下部に示す。
【００２７】
【図７】図７は、触媒不活性なＦｎＣａｓ９（ＦｎｄＣａｓ９）と近位部との結合がＳｐＣａｓ９による特異的な切断を増大させることを示す。ＰＯＲ遺伝子座におけるＳｐＣａｓ９標的部位とＦｎｄＣａｓ９結合部位との相対的な位置を上部に示す。Ｃｅｌ−Ｉヌクレアーゼアッセイの結果を下部に示す。
【００２８】
【図８】図８は、ｓｓＤＮＡオリゴを介した遺伝子編集の増強を示す。ＰＯＲ遺伝子座における標的部位とｓｓＤＮＡオリゴの配列との相対的な位置を上部に示す。ＥｃｏＲＩ部位を標的とする組込みの結果を下部に示す。ＥｃｏＲＩ部位の組込み効率（％）をＩｍａｇｅＪによって決定した。Ｍ：広範囲ＤＮＡマーカー。ＮＤ：決定されず。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示は、染色体ＤＮＡの標的指向性エンドヌクレアーゼおよび他のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質へのアクセスしやすさを増大させる組成物および方法を提供し、ここでアクセスしやすさの増大は標的ゲノム修飾またはエピジェネティック修飾の効率および／または特異性の増大を導く。いくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼはヒト細胞中で活性が減少し、または活性を示さないことが見出されている。ヌクレオソーム占有率、ヌクレオソームポジショニング、およびＤＮＡ配列のヒストン八量体への巻き付き方が、そのＤＮＡ配列がＤＮＡ結合タンパク質にどの程度アクセスできるかを決定し得ると考えられている(Chereji et al., Briefing Functional Genomics, 2014, 14:506-60)。したがって、局所的なクロマチン配置によって課せられた障害が、ヒト細胞における多くのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼの見かけ上の不活性に影響を与え得ると考えられる。本明細書で詳述するように、ＤＮＡ修飾タンパク質と標的指向性ＤＮＡ修飾タンパク質の標的部位の近位（すなわち約２５０塩基対以内）に位置する部位との結合が、標的指向性ＤＮＡ修飾タンパク質の標的部位へのアクセスしやすさを増大させ、これにより標的ゲノム修飾または標的エピジェネティック修飾の効率および／または特異性を増大させることが見出されている。したがって、本明細書で開示される組成物および方法は、これまでヒト細胞中で不活性であると考えられていたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを用いた効率的な標的ゲノム修飾／エピジェネティック修飾を可能にする。さらに本明細書で開示される組成物および方法はまた、ほとんど同一の標的部位間の選択的なゲノム修飾を改善し、これによりオフターゲット効果を減少させる。
【００３０】
（Ｉ）組成物
本開示のある態様は、（ａ）プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質またはプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質をコードする核酸、および（ｂ）少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を含む組成物を提供する。プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は下記のセクション（Ｉ）（ａ）において詳述され、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は下記のセクション（Ｉ）（ｂ）において詳述され、これらのタンパク質をコードする核酸は下記のセクション（Ｉ）（ｃ）において詳述される。
【００３１】
（ａ）プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、染色体ＤＮＡ中の特定の標的配列に結合するタンパク質であり、標的配列またはその付近のＤＮＡまたはＤＮＡに関連するタンパク質を修飾する。したがって、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はＤＮＡ結合ドメインおよび触媒活性な修飾ドメインを含む。
【００３２】
ＤＮＡ結合ドメインは種々のＤＮＡ配列を認識および結合するように設計または編集され得るという点で、プログラム可能である。いくつかの実施態様において、例えば、ＤＮＡ結合はタンパク質と標的ＤＮＡとの間の相互作用によって仲介される。したがって、ＤＮＡ結合ドメインは、タンパク質工学によって対象のＤＮＡ配列と結合するようにプログラムされ得る。他の実施態様において、例えば、ＤＮＡ結合はタンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよび標的ＤＮＡと相互作用するガイドＤＮＡによって仲介される。このような場合、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、適切なガイドＲＮＡを設計することによって対象のＤＮＡ配列を標的とし得る。
【００３３】
多様な修飾ドメインがプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に含まれ得る。いくつかの実施態様において、修飾ドメインはヌクレアーゼドメインであり、これはヌクレアーゼ活性を有し、二本鎖ＤＮＡ配列の両方の鎖を切断する（すなわち二本鎖切断を生成する）。次に、二本鎖切断は細胞のＤＮＡ修復過程（非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）など）によって修復され得る。結果として、ＤＮＡ配列は少なくとも１つの塩基対（最大で、例えば何千もの塩基対）の欠失、挿入および／または置換によって修飾され得る。ヌクレアーゼドメインを含むプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質の例は、限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインと連結したヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質、およびそれらの組合せを含む。ヌクレアーゼドメインを含むプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は下記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｉ）〜（ｖｉ）において詳述される。
【００３４】
他の実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質の修飾ドメインは、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がＤＮＡおよび／またはＤＮＡに関連するタンパク質の構造および／または活性を修飾するように、非ヌクレアーゼ活性（例えば、エピジェネティック修飾活性または転写制御活性）を有する。したがって、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインと連結した非ヌクレアーゼ修飾ドメインを含む融合タンパク質である。このようなタンパク質は下記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｖｉｉ）において詳述される。
【００３５】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、野生型または天然に存在するＤＮＡ結合および／または修飾ドメイン、天然に存在するＤＮＡ結合および／または修飾ドメインを修飾したバージョン、合成または人工ＤＮＡ結合および／または修飾ドメイン、およびそれらの組合せを含み得る。
【００３６】
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステム
いくつかの実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はＲＮＡにガイドされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムであり得、これはＤＮＡに二本鎖切断を導入する。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼシステムはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含む。
【００３７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ
ある実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＩ型（すなわちＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＥまたはＩＦ）、ＩＩ型（すなわちＩＩＡ、ＩＩＢまたはＩＩＣ）、ＩＩＩ型（すなわちＩＩＩＡまたはＩＩＩＢ）またはＶ型のＣＲＩＳＰＲシステムに由来し得、これらは様々な細菌および古細菌中に存在する。例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｓｐ．、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｓｐ．、Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｓｐ．、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｓｐ．、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｓｐ．、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐ．、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｓｐ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ｓｐ．、またはＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｓｐ．に由来し得る。さらなる他の実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、古細菌ＣＲＩＳＰＲシステム、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＸシステム、またはＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＹシステムに由来し得る(Burstein et al., Nature, 2017, 542(7640):237-241)。
【００３８】
ある特定の実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来し得る。別の特定の実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来し得る。別の特定の実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来し得る。別の特定の実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来し得る。
【００３９】
適切なＣＲＩＳＰＲタンパク質の限定されない例は、Ｃａｓタンパク質、Ｃｐｆタンパク質、Ｃ２ｃタンパク質（例えばＣ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃｄｃ３）、Ｃｍｒタンパク質、Ｃｓａタンパク質、Ｃｓｂタンパク質、Ｃｓｃタンパク質、Ｃｓｅタンパク質、Ｃｓｆタンパク質、Ｃｓｍタンパク質、Ｃｓｎタンパク質、Ｃｓｘタンパク質、Ｃｓｙタンパク質、Ｃｓｚタンパク質、およびそれらの誘導体または変異体を含む。具体的な実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質、Ｖ型Ｃｐｆ１タンパク質、またはそれらの誘導体であり得る。
【００４０】
いくつかの実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９（ＳｔＣａｓ９）であり得る。他の実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）であり得る。代替の実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９（ＦｎＣａｓ９）であり得る。さらなる他の実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ Ｃａｓ９（ＮｃＣａｓ９）であり得る。さらなる実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）、またはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）であり得る。
【００４１】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼはＲＮＡ認識および／またはＲＮＡ結合ドメインを含み、これはガイドＲＮＡと相互作用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼはまた、エンドヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質はＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含み、Ｃｐｆ１タンパク質はＲｕｖＣ様ドメインを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼはまた、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、ＲＮａｓｅドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、二量体形成ドメイン、および他のドメインを含み得る。
【００４２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼはさらに、核移行シグナル、細胞透過性ドメインおよび／またはマーカードメインのうち少なくとも１つを含み得る。核移行シグナルの限定されない例は、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）、ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号２）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２８）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２９）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３０）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号３１）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号３２）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号３３）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号３４）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号３５）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号３６）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号３７）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号３８）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号３９）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号４０）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号４１）、およびＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号４２）を含む。適切な細胞透過性ドメインの例は限定されないが、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４）、ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５）、ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６）、ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７）、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号４３）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号４４）、ＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号４５）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号４６）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号４７）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号４８）、およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号４９）を含む。マーカードメインは蛍光タンパク質および精製タグまたはエピトープタグを含む。適切な蛍光タンパク質は限定されないが、緑色蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、アザミグリーン、単量体アザミグリーン、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えばＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えばＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えばｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）お��びオレンジ蛍光タンパク質（例えばｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）を含む。適切な精製タグまたはエピトープタグの限定されない例は、６ｘＨｉｓ、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ、ＧＳＴおよびＭｙｃなどを含む。
【００４３】
核移行シグナル、細胞透過性ドメインおよび／またはマーカードメインは、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部の部位に位置し得る。いくつかの実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼはさらに、少なくとも１つの検出可能な標識を含み得る。検出可能な標識は、フルオロフォア（例えばＦＡＭ、ＴＭＲ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、Ｈａｌｏ ｔａｇまたは適切な蛍光タグ／色素）、発色団（例えばビオチンおよびジゴキシゲニンなど）、量子ドットまたは金粒子であり得る。検出可能な標識は、従来の方法によってタンパク質の任意のアミノ酸に結合し得る。
【００４４】
ガイドＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムはまた、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼおよび標的部位と相互作用し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを染色体配列中の標的部位に導く。標的部位は、配列がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接しているということを除いて配列の制限を有さない。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列は３’−ＮＧＧ、３’−ＮＧＧＮＧ、３’−ＮＮＡＧＡＡＷおよび３’−ＡＣＡＹを含み、Ｃｐｆ１のＰＡＭ配列は５’−ＴＴＮを含む（ここでＮは任意のヌクレオチドとして規定され、ＷはＡまたはＴのいずれかとして規定され、ＹはＣまたはＴのいずれかとして規定される）。
【００４５】
各ガイドＲＮＡは３つの領域を含み得る：染色体ＤＮＡ配列中の標的部位との相補性を有する５’末端の第１の領域、内部にあり、ステムループ構造を形成する第２の領域、および本質的に一本鎖のままである３’末端の第３の領域。第２および第３の領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と相互作用する二次構造を形成する。各ガイドＲＮＡの第１の領域は様々である（すなわち、配列特異的である）。第２および第３の領域は、特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と複合体を形成するガイドＲＮＡにおいて同一であり得る。
【００４６】
ガイドＲＮＡの第１の領域は標的配列と塩基対形成できるように、標的部位の配列（すなわちプロトスペーサー配列）との相補性を有する。例えば、ＳｐＣａｓ９ガイドＲＮＡの第１の領域はＧＮ１７−２０ＧＧを含み得る。一般に、ガイドＲＮＡの第１の領域（すなわちｃｒＲＮＡ）と標的配列との間の相補性は少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上である。様々な実施態様において、ガイドＲＮＡの第１の領域は約１０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド以上を含み得る。例えば、ガイドＲＮＡの第１の領域とｃＤＮＡ配列中の標的部位との間の塩基対形成する領域は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。例示的な実施態様において、ガイドＲＮＡの第１の領域は約１９、２０または２１ヌクレオチド長である。
【００４７】
ガイドＲＮＡはまた、二次構造を形成する第２の領域を含む。いくつかの実施態様において、この二次構造は少なくとも１つのステム（またはヘアピン）およびループを含む。各ループおよびステムの長さは様々であり得る。例えば、ループは約３〜約１０ヌクレオチド長の範囲であり得、ステムは約６〜約２０塩基対長の範囲であり得る。ステムは１〜約１０ヌクレオチドの１以上のバルジを含み得る。したがって、第２の領域の全長は約１６〜約６０ヌクレオチド長の範囲であり得る。ガイドＲＮＡはまた、本質的に一本鎖のままである３’末端の第３の領域を含む。したがって、第３の領域は、対象の細胞中のいかなる核酸配列との相補性も有さず、ガイドＲＮＡの残りの部分との相補性も有さない。第３の領域の長さは様々であり得る。一般に、第３の領域は約４ヌクレオチド長よりも長い。例えば、第３の領域の長さは約５〜約６０ヌクレオチド長の範囲であり得る。
【００４８】
ガイドＲＮＡの第２の領域と第３の領域の組合せ（ユニバーサル領域またはスキャホールド領域とも呼ばれる）の長さは約３０〜約１２０ヌクレオチド長の範囲であり得る。ある態様において、ガイドＲＮＡの第２の領域と第３の領域の組合せの長さは約７０〜約１００ヌクレオチド長の範囲である。
【００４９】
さらなる他の実施態様において、ガイドＲＮＡの第２および第３の領域は１以上の追加のステムループ領域を含み得、ここでステムループ領域はアプタマー配列を含む(Konermann et al., Nature3, 2015, 517(7536):583-588; Zalatan et al., Cell, 2015, 160(1-2):339-50)。適切なアプタマー配列は、ＭＳ２、ＰＰ７、ＣＯＭ、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ、ＰＲＲ１、ＨＳＦ１、ＡＩＤ、ＡＰＯＢＥＣ１、ｐ３００、ＴＥＴ１／２／３、ＶＰ６４、ＧＦＰ、Ｒｔａ、ｐ６５、ＭｙｏＤ１またはＶＰ１６０から選択されるアダプタータンパク質に結合するアプタマー配列を含む。このような実施態様において、ガイドＲＮＡの第２の領域と第３の領域の全長は、最大で約１２５ヌクレオチド、最大で約１５０ヌクレオチド、最大で約１７５ヌクレオチド、最大で約２００ヌクレオチド、最大で約２２５ヌクレオチド、最大で約２５０ヌクレオチド、最大で約２７５ヌクレオチド、または最大で約３００ヌクレオチドの範囲であり得る。
【００５０】
いくつかの実施態様において、ガイドＲＮＡは３つの領域全てを含む単一分子であり得る。他の実施態様において、ガイドＲＮＡは２つの別々の分子を含み得る。第１のＲＮＡ分子（すなわちｃｒＲＮＡ）は、ガイドＲＮＡの第１の領域およびガイドＲＮＡの第２の領域の「ステム」の半分を含み得る。第２のＲＮＡ分子（すなわちｔｒａｃｒＲＮＡ）は、ガイドＲＮＡの第２の領域の「ステム」の残り半分およびガイドＲＮＡの第３の領域を含み得る。したがって、この実施態様において、第１および第２のＲＮＡ分子はそれぞれ互いに相補的なヌクレオチド配列を含む。例えば、ある実施態様において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの各ＲＮＡ分子は他の配列と塩基対形成する（約６〜約２０ヌクレオチドの）配列を含み、機能的なガイドＲＮＡを形成する。例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。いくつかの態様において、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡは化学合成され得、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｔｒａｃｒＲＮＡはインビトロにおいて合成され得る（下記のセクション（Ｉ）（ｃ）参照）。他の実施態様において、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡのみを含み得る。
【００５１】
ガイドＲＮＡは、標準的なリボヌクレオチド、改変リボヌクレオチド（例えばプソイドウリジン）、リボヌクレオチド異性体、および／またはリボヌクレオチド類似体を含み得る。いくつかの実施態様において、ガイドＲＮＡはさらに、少なくとも１つの検出可能な標識を含み得る。検出可能な標識は、フルオロフォア（例えばＦＡＭ、ＴＭＲ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、Ｈａｌｏ ｔａｇまたは適切な蛍光色素）、発色団（例えばビオチンおよびジゴキシゲニンなど）、量子ドットまたは金粒子であり得る。当業者はｇＲＮＡ設計および作成に精通している（例えばｇＲＮＡ設計ツールがインターネット上または商業的な供給源から利用できる）。
【００５２】
ガイドＲＮＡは化学的、酵素的、またはそれらの組合せで合成され得る。例えば、ガイドＲＮＡは標準的なホスホロアミダイトに基づく固相合成法を用いて合成され得る。あるいは、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡをファージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター制御配列に作動可能に連結することによってインビトロで合成され得る。適切なファージプロモーター配列の例は、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６プロモーター配列、またはそれらの変異を含む。ガイドＲＮＡが２つの別々の分子（すなわちｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む実施態様において、ｃｒＲＮＡは化学合成され得、ｔｒａｃｒＲＮＡは酵素的に合成され得る。ガイドＲＮＡをコードする核酸はプラスミドベクターの一部であり得、このプラスミドベクターは追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択可能なマーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、および複製起点などをさらに含み得る。下記のセクション（Ｉ）（ｃ）において詳述されるように、ガイドＲＮＡをコードする核酸は真核細胞における発現のために、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）によって認識されるプロモーター制御配列に作動可能に連結してい得る。
【００５３】
（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム
他の実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステムであり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼがＤＮＡの一方の鎖のみを切断するように修飾されていることを除いて、上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｉ）に記述されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムに類似している。したがって、単一のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼシステムは二本鎖ＤＮＡにおいて一本鎖切断またはニックを生成し、対のオフセットガイドＲＮＡを含む対のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステムはＤＮＡの二本鎖切断を生成する。
【００５４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは１以上の変異および／または欠失によってニッカーゼに変換され得る。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼはヌクレアーゼドメイン（例えば、ＲｕｖＣ様ドメインまたはＨＮＨ様ドメイン）のうち１つにおいて１以上の変異を含み得る。例えば、１以上の変異はＲｕｖＣ様ドメイン中のＤ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａおよび／またはＤ９８６Ａであり得、または１以上の変異はＨＮＨ様ドメイン中のＨ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８５６Ａおよび／またはＮ８６３Ａであり得る。
【００５５】
（ｉｉｉ）Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ
さらなる他の実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はＺｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり得る。ＺＦＮは、ＤＮＡ結合Ｚｎフィンガー領域およびヌクレアーゼドメインを含む。Ｚｎフィンガー領域は約２〜７個のＺｎフィンガー（例えば約４〜６個のＺｎフィンガー）を含み得、ここで各Ｚｎフィンガーは３ヌクレオチドに結合する。Ｚｎフィンガー領域は任意のＤＮＡ配列を認識し、結合するように設計できる。Ｚｎフィンガー設計ツールまたはアルゴリズムがインターネット上または商業的な供給源から利用できる。Ｚｎフィンガーは適切なリンカー配列を用いて連結され得る。
【００５６】
また、ＺＦＮはヌクレアーゼドメインを含み、これはあらゆるエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから取得され得る。ヌクレアーゼドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの限定されない例は、限定されないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含み得る。いくつかの実施態様において、ヌクレアーゼドメインはＩＩ−Ｓ型制限エンドヌクレアーゼに由来し得る。ＩＩ−Ｓ型エンドヌクレアーゼは通常、認識／結合部位から数塩基対離れた部位でＤＮＡを切断し、そのようなものとして、分離可能な結合および切断ドメインを有する。これらの酵素は一般に、一時的に会合して二量体を形成し、ＤＮＡの各鎖をねじれた位置で切断する単量体である。適切なＩＩ−Ｓ型エンドヌクレアーゼの限定されない例は、ＢｆｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏＩＩおよびＳａｐＩを含む。いくつかの実施態様において、ヌクレアーゼドメインはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインまたはその誘導体であり得る。ＩＩ−Ｓ型ヌクレアーゼドメインは２つの異なるヌクレアーゼドメインの二量体化を促進するように修飾され得る。例えば、ＦｏｋＩの切断ドメインは特定のアミノ酸残基を変異させることによって修飾され得る。限定されない例として、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位のアミノ酸残基が修飾のための標的である。例えば、ある修飾されたＦｏｋＩドメインは、Ｑ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌおよび／またはＮ４９６Ｄ変異を含み得、他の修飾されたＦｏｋＩドメインは、Ｅ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋおよび／またはＨ５３７Ｒ変異を含み得る。
【００５７】
ＺＦＮは、核移行シグナル、細胞透過性ドメイン、および／またはマーカードメインのうち少なくとも１つをさらに含み得、これらは上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｉ）に記述されている。
【００５８】
（ｉｖ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ
代替の実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であり得る。ＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼドメインに連結している、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に由来する高度に保存された反復配列で構成されるＤＮＡ結合ドメインを含む。ＴＡＬＥは植物病原菌キサントモナスによって分泌されるタンパク質であり、宿主植物細胞において遺伝子の転写を変化させる。ＴＡＬＥ反復アレイは対象の任意のＤＮＡ配列を標的とするように、モジュラータンパク質設計を介して設計され得る。ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインは、上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｉｉｉ）に記述されているあらゆるヌクレアーゼドメインであり得る。具体的な実施態様において、ヌクレアーゼドメインはＦｏｋＩに由来している(Sanjana et al., 2012, Nat Protoc, 7(1):171-192)。
【００５９】
ＴＡＬＥＮはまた、核移行シグナル、細胞透過性ドメイン、マーカードメインおよび／または検出可能な標識のうち少なくとも１つを含み得、これらは上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｉ）に記述されている。
【００６０】
（ｖ）メガヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼ
さらなる他の実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はメガヌクレアーゼまたはその誘導体であり得る。メガヌクレアーゼは、長い認識配列（すなわち、認識配列が一般に約１２塩基対〜約４５塩基対の範囲である）によって特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼである。この要求の結果として、認識配列は一般に、所定のあらゆるゲノムにおいて一度しか生じない。メガヌクレアーゼの中で、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧと名付けられたホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーはゲノムの研究およびゲノム編集のための有用なツールとなっている。いくつかの実施態様において、メガヌクレアーゼはＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩまたはそれらの変異体であり得る。メガヌクレアーゼは当業者に周知の技術を用いてその認識配列を改変することによって、特定の染色体配列を標的とし得る。
【００６１】
代替の実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はレアカットエンドヌクレアーゼまたはその誘導体であり得る。レアカットエンドヌクレアーゼは部位特異的なエンドヌクレアーゼであり、その認識配列はゲノム中にまれに生じる（好ましくはゲノム中に一度しか生じない）。レアカットエンドヌクレアーゼは、７ヌクレオチドの配列、８ヌクレオチドの配列、またはそれよりも長い認識配列を認識し得る。レアカットエンドヌクレアーゼの限定されない例は、ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩ、ＰａｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＳｂｆＩおよびＦｓｅＩを含む。
【００６２】
メガヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼはまた、核移行シグナル、細胞透過性ドメイン、マーカードメインおよび／または検出可能な標識のうち少なくとも１つを含み得、これらは上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｉ）に記述されている。
【００６３】
（ｖｉ）ヌクレアーゼドメインを含むプログラム可能な融合タンパク質
さらなる他の実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、（二本鎖切断）ヌクレアーゼドメインと連結したプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質であり得る。融合タンパク質のヌクレアーゼドメインは、上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｉｉｉ）に記述されているヌクレアーゼドメインのいずれか、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９のＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインもしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、またはＣｐｆ１のヌクレアーゼドメイン）、またはメガヌクレアーゼもしくはレアカットエンドヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインであり得る。
【００６４】
融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、全てのヌクレアーゼ活性を有さないように修飾されたプログラム可能なエンドヌクレアーゼ（すなわちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼ）であり得る。したがって、融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは触媒不活性なメガヌクレアーゼであり得る。あるいは、融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質（例えば、Ｚｎフィンガータンパク質または転写活性化因子様エフェクターなど）であり得る。いくつかの実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性が変異および／または欠失によって除去された触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり得る。例えば、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣ様ドメインがＤ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａおよび／またはＤ９８６Ａ変異を含み、ＨＮＨ様ドメインがＨ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６５Ａおよび／またはＮ８６３Ａ変異を含む、触媒不活性な（不活性化）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）であり得る。あるいは、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン中に相当する変異を含む触媒不活性な（不活性化）Ｃｐｆ１タンパク質であり得る。さらなる他の実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性が変異および／または欠失によって除去された触媒不活性なメガヌクレアーゼ（例えば、触媒不活性なメガヌクレアーゼはＣ末端短縮化を含み得る）であり得る。
【００６５】
ヌクレアーゼ活性を含む融合タンパク質はまた、核移行シグナル、細胞透過性ドメイン、マーカードメインおよび／または検出可能な標識のうち少なくとも１つを含み得、これらは上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｉ）に記述されている。
【００６６】
（ｖｉｉ）非ヌクレアーゼドメインを含むプログラム可能な融合タンパク質／複合体
代替の実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、非ヌクレアーゼ修飾ドメインと連結したプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質であり得る。適切なプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｖｉ）に記述されている。
【００６７】
いくつかの実施態様において、非ヌクレアーゼ修飾ドメインはエピジェネティック修飾ドメインであり得、これはＤＮＡまたはクロマチン構造を変化させる（ＤＮＡ構造は変化させる場合もあり、または変化させない場合もある）。適切なエピジェネティック修飾ドメインの限定されない例は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性（例えばシトシンメチルトランスフェラーゼ）、ＤＮＡデメチラーゼ活性、ＤＮＡ脱アミノ化（例えば、シトシンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グアニンデアミナーゼ）、ＤＮＡアミノ化、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性（例えば、Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００に由来するＨＡＴドメイン）、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ活性、ヒストンキナーゼ活性、ヒストンホスファターゼ活性、ヒストンユビキチンリガーゼ活性、ヒストン脱ユビキチン化活性、ヒストンアデニル化活性、ヒストン脱アデニル化活性、ヒストンＳＵＭＯ化活性、ヒストン脱ＳＵＭＯ化活性、ヒストンリボシル化活性、ヒストン脱リボシル化活性、ヒストンミリストイル化活性、ヒストン脱ミリストイル化活性、ヒストンシトルリン化活性、ヒストンアルキル化活性、ヒストン脱アルキル化活性、またはヒストン酸化活性を有するエピジェネティック修飾ドメインを含む。具体的な実施態様において、エピジェネティック修飾ドメインは、シトシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み得る。
【００６８】
他の実施態様において、非ヌクレアーゼ修飾ドメインは、転写活性化ドメインまたは転写抑制因子ドメインであり得る。適切な転写活性化ドメインは、限定されないが、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６ドメイン、ＶＰ６４（これはＶＰ１６の四量体の誘導体である）、ＶＰ１６０、ＮＦκＢ ｐ６５活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１および２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、ヒト熱ショック因子１（ＨＳＦ１）由来の活性化ドメイン、またはＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核内因子）活性化ドメインを含む。適切な転写抑制因子ドメインの限定されない例は、誘導性ｃＡＭＰ初期抑制因子（ＩＣＥＲ）ドメイン、クルッペル関連ボックスＡ（ＫＲＡＢ−Ａ）抑制因子ドメイン、ＹＹ１グリシンリッチ抑制因子ドメイン、Ｓｐ１様抑制因子、Ｅ（ｓｐｌ）抑制因子、ＩκＢ抑制因子またはＭｅＣＰ２を含む。転写活性化ドメインまたは転写抑制因子ドメインは、ＤＮＡ結合タンパク質と遺伝子融合していてもよく、または非共有結合的なタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＲＮＡ相互作用、もしくはタンパク質−ＤＮＡ相互作用を介して結合していてもよい。
【００６９】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含んでいる実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡは、転写活性化因子、転写抑制因子またはエピジェネティック修飾タンパク質を結合するアプタマー配列を含み得る（Konermann et al., Nature, 2015, 517(7536):583-588; Zalatan et al., Cell, 2015, 160(1-2):339-50）。
【００７０】
非ヌクレアーゼ活性を含む融合タンパク質はまた、核移行シグナル、細胞透過性ドメイン、マーカードメインおよび／または検出可能な標識のうち少なくとも１つを含み得、これらは上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｉ）に記述されている。
【００７１】
（ｂ）プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質
組成物はまた、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質を含む。プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は特定のＤＮＡ配列に結合するが、ＤＮＡまたはＤＮＡに関連するタンパク質を修飾しないタンパク質である。
【００７２】
いくつかの実施態様において、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有さないように修飾されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり得る。例えば、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり得る。このため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、全てのヌクレアーゼ活性を除去するように変異および／または欠失によって修飾され得る。ある実施態様において、ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインは共に、ヌクレアーゼ活性を除去するように１以上の変異および／または欠失を含む。例えば、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣ様ドメインがＤ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａおよび／またはＤ９８６Ａ変異を含み、ＨＮＨ様ドメインがＨ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８５６Ａおよび／またはＮ８６３Ａ変異を含む、触媒不活性な（不活性化）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）であり得る。あるいは、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン中に相当する変異を含む触媒不活性な（不活性化）Ｃｐｆ１タンパク質であり得る。他の態様において、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｉｉ）に記述されるように、二本鎖配列の一方の鎖に切れ目を入れる（すなわちニッカーゼである）ように修飾されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質であり得る。
【００７３】
他の実施態様において、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が変異および／または欠失によって除去された触媒不活性なメガヌクレアーゼ（例えば、触媒不活性なメガヌクレアーゼはＣ末端短縮化を含み得る）であり得る。さらなる他の実施態様において、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、Ｚｎフィンガータンパク質または転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）であり得る。さらなる実施態様において、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ、ＺＦＮニッカーゼ、ＴＡＬＥＮニッカーゼまたはメガヌクレアーゼニッカーゼであり得る。ＺＦＮニッカーゼ、ＴＡＬＥＮニッカーゼおよびメガヌクレアーゼニッカーゼは、ニッカーゼが二本鎖配列の一方の鎖のみを切断するように、ヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインのうち１つにおいて変異および／または欠失を含む。
【００７４】
プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質はまた、核移行シグナル、細胞透過性ドメイン、マーカードメインおよび／または検出可能な標識のうち少なくとも１つを含み得、これらは上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｉ）に記述されている。
【００７５】
（ｃ）プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質またはプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸
上記のセクション（Ｉ）（ａ）に記述されるプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質または上記のセクション（Ｉ）（ｂ）に記述されるプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、直鎖状または環状、一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＮＡまたはＤＮＡは、対象の真核細胞中でのタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化され得る。コドン最適化プログラムはフリーウェアとして、または商業的供給源から利用できる。
【００７６】
いくつかの実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸はｍＲＮＡであり得る。ｍＲＮＡはインビトロで合成され得る。このため、ＤＮＡ修飾タンパク質または少なくとも１つのＤＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡは、ｍＲＮＡのインビトロ合成のためにファージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列に作動可能に連結され得る。例えば、プロモーター配列はＴ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーター配列またはＴ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーター配列の変種であり得る。そのような実施態様において、インビトロで転写されたＲＮＡは、精製、キャッピングおよび／またはポリアデニル化され得る。以下で詳述するように、ＤＮＡ修飾タンパク質またはＤＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡはベクターの一部であり得る。
【００７７】
他の実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸はＤＮＡであり得る。プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、対象の細胞内での発現のために少なくとも１つのプロモーター制御配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施態様において、ＤＮＡコード配列はまた、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０ポリＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルなど）および／または少なくとも１つの転写終結配列に連結され得る。
【００７８】
ある実施態様において、ＤＮＡコード配列は、細菌（例えば大腸菌）細胞または真核（例えば、酵母、昆虫または哺乳類）細胞におけるＤＮＡ修飾タンパク質またはＤＮＡ結合タンパク質の発現のために、プロモーター配列に作動可能に連結され得る。適切な細菌性プロモーターは、限定されないが、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペロンプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（ｔｒｐおよびｌａｃプロモーターのハイブリッド）、上記のいずれかの変種、および上記のいずれかの組合せを含む。適切な真核生物プロモーターの限定されない例には、構成的プロモーター、調節されたプロモーター、または細胞特異的プロモーターもしくは組織特異的プロモーターが含まれる。適切な真核生物の構成的プロモーター制御配列には、限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、サルウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子（ＥＤ−１）アルファプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、それらのフラグメント、または上記のいずれかの組み合わせが含まれる。適切な真核生物の調節されたプロモーター制御配列には、限定されないが、熱ショック、金属、ステロイド、抗生物質またはアルコールによって調節されたプロモーター制御配列が含まれる。組織特異的プロモーターの限定されない例は、Ｂ２９プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ１プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Ｆｌｔ−１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＩＣＡＭ−２プロモーター、ＩＮＦ−βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＮｐｈｓＩプロモーター、ＯＧ−２プロモーター、ＳＰ−Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、およびＷＡＳＰプロモーターを含む。プロモーター配列は野生型であってもよく、またはより効率的もしくは効果的な発現のために改変されていてもよい。
【００７９】
様々な実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質および／または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸はベクター中に存在し得る。適切なベクターには、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾンおよびウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクターなど）が含まれる。ある実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質および／または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡはプラスミドベクター中に存在し得る。適切なプラスミドベクターの限定されない例は、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびそれらの変異体を含む。他の実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質および／または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸は、ウイルスベクター中に存在し得る。プラスミドまたはウイルスベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択可能なマーカー配列（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子）、および複製起点などを含み得る。さらなる情報が、"Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003または"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001に見出され得る。
【００８０】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質および／または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはその変異体を含む実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質および／または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターは、１以上のガイドＲＮＡをコードする配列をさらに含み得る。ガイドＲＮＡをコードする配列は一般に、対象の真核細胞中におけるガイドＲＮＡの発現のために少なくとも１つの転写制御配列に作動可能に連結している。例えば、ガイドＲＮＡをコードする核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）によって認識されるプロモーター配列に作動可能に連結され得る。適切なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターの例には、限定されないが、哺乳類Ｕ６、Ｕ３、Ｈ１、および７ＳＬ ＲＮＡプロモーターが含まれる。
【００８１】
（ｄ）具体的な組成物
いくつかの実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質および１以上のプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、タンパク質（または、場合によりタンパク質−ＲＮＡ複合体）として提供される。プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質およびプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、細菌細胞または真核細胞において発現され得、当分野で周知の手段を用いて精製され得る。他の実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質および１以上のプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、それらをコードする核酸として提供される。
【００８２】
いくつかの実施態様において、組成物は、１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質／システムまたはそれをコードする核酸を含み得る。他の実施態様において、組成物は、２つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質／システムまたはそれらをコードする核酸を含み得る。さらなる他の実施態様において、組成物は、３つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質／システムまたはそれらをコードする核酸を含み得る。さらなる実施態様において、組成物は、４つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質／システムまたはそれらをコードする核酸を含み得る。さらなる他の実施態様において、組成物は、５つ以上のプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質／システムまたはそれらをコードする核酸を含み得る。
【００８３】
具体的な実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼ、または非ヌクレアーゼ修飾ドメインと連結した触媒不活性な（不活性化）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質）を含み得、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有さないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり得る。例えば、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり得る。一般に、各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つの核移行シグナルを含む。いくつかの反復において、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡとしてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含み得、ここで該タンパク質およびＲＮＡはその実体が分離されていてもよく、または複合体形成されていてもよい。ガイドＲＮＡは少なくとも部分的に化学合成され得る。ガイドＲＮＡは酵素的に合成され得る。他の反復において、組成物は、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含み得る。さらなる他の反復において、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含み得る。さらなる他の反復において、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質および／またはガイドＲＮＡをコードするプラスミドまたはウイルスベクターを含み得る。ある実施態様において、触媒活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質および触媒不活性な（不活性化）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は一般に、対象の真核細胞における最適な発現のためにコドン最適化されている。
【００８４】
（ＩＩ）キット
本開示のさらなる態様は、上記のセクション（Ｉ）において詳述された組成物を含むキットを提供する。キットは、上記で詳述されたように、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質および少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をタンパク質として、タンパク質−ＲＮＡ複合体として、または様々な構成要素をコードする核酸として提供し得る。キットは、遺伝子導入試薬、細胞増殖培地、選択培地、インビトロにおける転写試薬、核酸精製試薬、タンパク質精製試薬、および緩衝液などをさらに含み得る。本明細書で提供されるキットは一般に、下記で詳述される方法を実行するための説明書を含む。キットに含まれる説明書は、包装材に貼り付けられていてもよく、または添付文書として含まれていてもよい。説明書は通常、資料または印刷物であるが、そのようなものに限定されない。そのような説明書を格納でき、エンドユーザーに伝達できるあらゆる媒体が本開示によって想定される。そのような媒体には、限定されないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、および光学式媒体（例えばＣＤ ＲＯＭ）などが含まれる。本明細書において、用語「説明書」は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。
【００８５】
いくつかの実施態様において、キットのプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質および／または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含み得る。ある実施態様において、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。したがって、キットはユニバーサルなｔｒａｃｒＲＮＡを提供し得、キットのエンドユーザーが配列特異的なｃｒＲＮＡを提供し得る。いくつかの態様において、キットはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質およびｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。他の態様において、キットはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含み得る。
【００８６】
さらなる他の実施態様において、キットのプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質および／または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含み得る。上記で詳述されたように、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡのみを含む。いくつかの態様において、キットはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡを含み得、またはキットはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡおよびｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含み得る。他の態様において、キットはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のみを含み得、ここでキットのエンドユーザーがｃｒＲＮＡを提供する。
【００８７】
（ＩＩＩ）標的染色体部位へのアクセスしやすさを増大させる方法
本開示の別の態様は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質の、染色体ＤＮＡ中の標的配列へのアクセスしやすさを増大させることによって、真核細胞における標的ゲノム／エピジェネティック修飾の効率および／または特異性を増大させる方法を包含する。本方法は、対象の真核細胞に、（ａ）プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質またはプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質をコードする核酸、および（ｂ）少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を導入することを含む。プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、染色体ＤＮＡ中の標的配列（これは、ＤＮＡ修飾タンパク質がＤＮＡまたは関連タンパク質を修飾し得る部位である）を認識し、結合するように設計される。１以上のプログラム可能な各ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ修飾タンパク質の標的染色体配列の近位の配列を認識し、結合するように設計される。プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質およびプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、上記のセクション（Ｉ）において詳述されている。
【００８８】
一般に、標的染色体配列の近位の配列は、標的染色体配列の一方の側（すなわち上流または下流）の約２５０塩基対以内に位置している。近位部は二本鎖ＤＮＡの一方の鎖上に位置し得る。いくつかの実施態様において、標的染色体配列の近位の配列は、ＤＮＡ修飾タンパク質の標的染色体配列から約２５０ｂｐ未満、約２００ｂｐ未満、約１５０ｂｐ未満、約１００ｂｐ未満、約７５ｂｐ未満、約５０ｂｐ未満、約２５ｂｐ未満、約２０ｂｐ未満、約１５ｂｐ未満、約１０ｂｐ未満、または約５ｂｐ未満に位置し得る。ある実施態様において、標的染色体配列の近位の配列は、標的染色体配列の一方の側の約１ｂｐ〜約１０ｂｐ、約１１ｂｐ〜約２０ｂｐ、約２１ｂｐ〜約３０ｂｐ、約３１ｂｐ〜約４０ｂｐ、約４１ｂｐ〜約５０ｂｐ、約５１ｂｐ〜約６０ｂｐ、約６１ｂｐ〜約７０ｂｐ、約７１ｂｐ〜約８０ｂｐ、約８１ｂｐ〜約９０ｂｐ、約９１ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１０１ｂｐ〜約１５０ｂｐ、約１５１ｂｐ〜約２００ｂｐ、または約２０１ｂｐ〜約２５０ｂｐに位置し得る。他の実施態様において、標的染色体配列の近位の配列は、標的染色体配列の一方の側の約５ｂｐ〜約７５ｂｐ、約１０ｂｐ〜約５０ｂｐまたは約１５ｂｐ〜約２５ｂｐに位置し得る。
【００８９】
いくつかの実施態様において、本方法は、細胞に少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質を導入することを含み、このタンパク質の結合配列は、標的染色体配列の上流または下流のいずれかに位置している。他の実施態様において、本方法は、細胞に少なくとも２つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質を導入することを含み、これらのタンパク質の一方の結合配列は標的染色体配列の上流に位置し、他方の結合配列は標的染色体配列の下流に位置している。さらなる実施態様において、本方法は、細胞に少なくとも３つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質を導入することを含み、これらのタンパク質の結合配列は、標的染色体配列の上流または下流のいずれかに位置している。さらなる実施態様において、本方法は、細胞に少なくとも４つ以上のプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質を導入することを含み、これらのタンパク質の結合配列は、標的染色体配列の上流または下流のいずれかに位置している。これらの実施態様において、例えば、本方法は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質を導入することを含み得、これらのタンパク質の結合配列は、標的染色体配列の一方の側（すなわち上流または下流）の約２５０ｂｐ以内に位置している。
【００９０】
１以上のプログラム可能な各ＤＮＡ結合タンパク質と標的染色体配列の近位の部位との結合は、局所的なクロマチン配置を変化させ、これはプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質の（これまでアクセスできなかった）標的染色体配列へのアクセスしやすさの増大を導く（図１参照）。結果として、ＤＮＡ修飾タンパク質による修飾の効率が増大する（例えば実施例１〜３参照）。言い換えると、ＤＮＡ修飾タンパク質が細胞に単独で導入された場合と比較して、ＤＮＡ修飾タンパク質が細胞に１以上のプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質と組み合わせて導入された場合、ＤＮＡ修飾タンパク質による修飾の効率は増大する。
【００９１】
さらに、本明細書において開示される方法は、標的ゲノム修飾の特異性を増大させる。プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は特定の染色体座における標的配列を認識し、結合するように設計されるが、同一またはほとんど同一の配列が他の染色体位置に存在し得る（これはオフターゲット効果をもたらす）。しかしながら、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質と標的染色体配列との結合が、１以上のプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質と標的染色体配列の近位の配列との結合に大きく依存している実施態様において、１以上のプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質と対象の染色体座における標的配列の近位の部位との結合は、修飾イベントに対してさらなる特異性を提供する（実施例４参照）。
【００９２】
したがって、本明細書において開示される方法は、標的ゲノム編集（例えば、遺伝子修復、遺伝子ノックアウト、および遺伝子ノックインなど）、標的エピジェネティック修飾、および標的転写制御の効率および／または特異性を増大させ得る。
【００９３】
（ａ）細胞への導入
記述されるように、本方法は細胞に、（ａ）プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質またはプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質をコードする核酸、および（ｂ）少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を導入することを含む。プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は上記のセクション（Ｉ）（ａ）において詳述され、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は上記のセクション（Ｉ）（ｂ）において詳述され、ＤＮＡ修飾タンパク質またはプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸は上記のセクション（Ｉ）（ｃ）において記述されている。
【００９４】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質またはプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質をコードする核酸および少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸は、多様な手段によって対象の細胞に導入され得る。
【００９５】
いくつかの実施態様において、細胞には適切な分子（すなわちタンパク質、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）が遺伝子導入され得る。適切な遺伝子導入方法には、ヌクレオフェクション(nucleofection)（またはエレクトロポレーション）、リン酸カルシウム介在性遺伝子導入、カチオン性ポリマー遺伝子導入（例えば、ＤＥＡＥ−デキストランまたはポリエチレンイミン）、ウイルス形質導入、ビロソーム遺伝子導入、ビリオン遺伝子導入、リポソーム遺伝子導入、カチオン性リポソーム遺伝子導入、免疫リポソーム遺伝子導入、非リポソーム脂質遺伝子導入、デンドリマー遺伝子導入、熱ショック遺伝子導入、マグネトフェクション、リポフェクション、遺伝子銃送達、インペールフェクション(impalefection)、ソノポレーション、光学遺伝子導入、および専売薬によって増強される核酸の取り込みが含まれる。遺伝子導入方法は当分野で周知である（例えば、"Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003または"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001参照）。他の実施態様において、分子はマイクロインジェクション法によって細胞に導入され得る。例えば、分子は対象の細胞の細胞質または核に注入され得る。細胞に導入された各分子の量は様々であり得るが、当業者は適切な量を決定する手段に精通している。
【００９６】
様々な分子が細胞に同時または連続的に導入され得る。例えば、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質（またはそれをコードする核酸）および少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質（またはそれをコードする核酸）は同時に導入され得る。あるいは、一方が最初に細胞に導入され得、他方がその後に導入され得る。
【００９７】
一般に、細胞は細胞増殖および／または維持に適した条件下で維持される。適切な細胞培養条件は当分野で周知であり、例えば、Santiago et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105:5809-5814；Moehle et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, 104:3055-3060；Urnov et al., Nature, 2005, 435:646-651；およびLombardo et al., Nat. Biotechnol., 2007, 25:1298-1306に記載されている。当業者は、細胞を培養する方法が当分野で公知であり、細胞種に依存して様々であり得ることを認識している。あらゆる場合において、特定の細胞種のための最良の技術を決定するために通常の最適化が用いられ得る。
【００９８】
（ｂ）標的ゲノム修飾
１以上のプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質と標的染色体配列の近位の配列との結合は、局所的なクロマチン配置を変化させる（例えば、ヌクレオソーム構造が変化し得、かつ／またはヒストンが移動し得る）。結果として、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質を単独で使用する場合と比較して、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は標的染色体配列によりアクセスできる。このアクセスしやすさの増大は、標的ゲノム修飾の効率および／または特異性の増大をもたらす。標的ゲノム／エピジェネティック修飾は、ヌクレアーゼ活性または非ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ修飾タンパク質によって仲介され得る。
【００９９】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する実施態様において、ＤＮＡ修飾タンパク質は標的染色体配列に二本鎖切断を導入し得る。染色体配列中の二本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復プロセスによって修復され得る。ＮＨＥＪはエラーが発生しやすいため、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組合せが切断の修復中に生じ得る。したがって、標的染色体配列が修飾または不活性化され得る。例えば、コード配列のリーディングフレームのシフトにおける欠失、挿入または置換は、タンパク質産物の変化またはタンパク質産物が生じないこと（「ノックアウト」と呼ばれる）を導き得る。いくつかの反復において、本方法は、ドナー配列を含むドナーポリヌクレオチド（下記参照）を細胞に導入することをさらに含み得、相同組換え修復過程（ＨＤＲ）による二本鎖切断の修復中に、ドナーポリヌクレオチド中のドナー配列が標的染色体配列における染色体配列と交換され得、またはその染色体配列中に組み込まれ得るように、このドナー配列は標的染色体配列の一方の側に位置する配列と実質的な配列同一性を有する配列に隣接している。外来性配列の組込みは「ノックイン」と呼ばれる。上記で詳述されるように、本明細書において開示される方法はオフターゲット効果を減少させ、それにより標的ゲノム修飾の特異性を増大させる。
【０１００】
したがって、様々な反復において、標的ゲノム修飾の効率および／または特異性は、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質を単独で使用した場合と比較して、少なくとも約０．１倍、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、または約１００倍を超えて増大され得る。例えば、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は単独で使用される場合、検出可能なインデルまたは組込みイベントを有さなくてもよい。しかしながら、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質と組み合わせて使用される場合、インデルおよび組込みイベント（例えば、少なくとも約１％のインデル／組込み、少なくとも約５％のインデル／組込み、少なくとも約１０％のインデル／組込み、少なくとも約２０％のインデル／組込み、少なくとも約３０％のインデル／組込み、少なくとも約４０％のインデル／組込み、少なくとも約５０％のインデル／組込み、または約５０％を超えるインデル／組込み）が検出され得る。
【０１０１】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が非ヌクレアーゼ活性を有する実施態様において、ＤＮＡ修飾タンパク質は、標的染色体配列においてＤＮＡもしくは関連タンパク質を修飾し得、または標的染色体配列の発現を修飾し得る。例えば、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がエピジェネティック修飾活性を含む場合、ヒストンアセチル化、メチル化、リン酸化、アデニル化などの状態が修飾され得、またはＤＮＡメチル化、アミノ化などの状態が修飾され得る。例として、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がシトシンデアミナーゼ活性を含む実施態様において、標的染色体配列における１以上のシトシン残基がウラシル残基に変換され得る。あるいは、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が転写活性化活性または転写抑制因子活性を含む場合、標的染色体配列における転写が増加または減少し得る。結果として得られるエピジェネティック修飾または転写制御は、非ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質を単独で使用する場合と比較して、少なくとも約０．１倍、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、または約１００倍を超えて増大され得る。
【０１０２】
上述の標的ゲノム修飾／エピジェネティック修飾は単独で実行され得、または多重化され得る（すなわち、２以上の染色体配列が同時に標的にされ得る）。
【０１０３】
（ｃ）任意のドナーポリヌクレオチド
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がヌクレアーゼ活性を含む実施態様において、本方法はさらに、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み得る。ドナーポリヌクレオチドは一本鎖もしくは二本鎖であり得、直鎖状もしくは環状であり得、かつ／またはＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。いくつかの実施態様において、ドナーポリヌクレオチドはベクター（例えばプラスミドベクター）であり得る。
【０１０４】
ドナーポリヌクレオチドは少なくとも１つのドナー配列を含む。いくつかの態様において、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、内在性または天然染色体配列の修飾されたバージョンであり得る。例えば、ドナー配列は、ＤＮＡ修飾タンパク質によって標的とされた配列またはその付近における染色体配列の一部と本質的に同一であり得るが、少なくとも１つのヌクレオチド交換を含む。したがって、天然配列への組込みまたは天然配列との交換により、標的染色体位置における配列は少なくとも１つのヌクレオチド交換を含む。例えば、この交換は、１以上のヌクレオチドの挿入、１以上のヌクレオチドの欠失、１以上のヌクレオチドの置換、またはそれらの組合せであり得る。修飾された配列の「遺伝子修正」の組込みの結果として、細胞は標的染色体配列から修飾された遺伝子産物を産生し得る。
【０１０５】
他の態様において、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は外来性配列であり得る。本明細書において、「外来性」配列は、細胞に対して天然でない配列、または細胞のゲノムにおけるその配列の天然の位置が異なった位置にある配列を指す。例えば、外来性配列はタンパク質をコードする配列を含み得、これはゲノムへの組込みにより、細胞が組み込まれた配列によってコードされたタンパク質を発現できるように、外来性プロモーター制御配列に作動可能に連結され得る。あるいは、外来性配列は、その発現が内在性プロモーター制御配列によって調節されるように、染色体配列に組み込まれ得る。他の反復において、外来性配列は、転写制御配列、別の発現制御配列、およびＲＮＡをコードしている配列などであり得る。上述のように、外来性配列の染色体配列への組み込みは「ノックイン」と呼ばれる。
【０１０６】
当業者に認識され得るように、ドナー配列の長さは様々であり得る。例えば、ドナー配列は、数ヌクレオチドから数百ヌクレオチド、数百ヌクレオチドから数十万ヌクレオチドまでの長さにおいて様々であり得る。
【０１０７】
通常、ドナーポリヌクレオチドにおけるドナー配列は上流配列および下流配列に隣接しており、これらの配列はプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質によって標的とされる配列のそれぞれ上流および下流に位置する配列と実質的な配列同一性を有する。これらの配列類似性のために、ドナーポリヌクレオチドの上流配列および下流配列は、ドナー配列が染色体配列に組み込まれ得る（または、染色体配列と交換され得る）ように、ドナーポリヌクレオチドと標的染色体配列との間の相同組換えを可能にする。
【０１０８】
本明細書において、上流配列は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質によって標的とされる配列の上流の染色体配列との実質的な配列同一性を有する核酸配列を指す。同様に、下流配列は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質によって標的とされる配列の下流の染色体配列との実質的な配列同一性を有する核酸配列を指す。本明細書において、語句「実質的な配列同一性」は、少なくとも約７５％の配列同一性を有する配列を指す。したがって、ドナーポリヌクレオチドにおける上流配列および下流配列は、標的配列の上流の配列または下流の配列との約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得る。例示的な実施態様において、ドナーポリヌクレオチドにおける上流配列および下流配列は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質によって標的とされる配列の上流または下流の染色体配列との約９５％または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１０９】
いくつかの実施態様において、上流配列は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質によって標的とされる配列のすぐ上流に位置する染色体配列との実質的な配列同一性を有する。他の実施態様において、上流配列は、標的配列から約百（１００）ヌクレオチド以内の上流に位置する染色体配列との実質的な配列同一性を有する。したがって、例えば、上流配列は、標的配列から約１〜約２０、約２１〜約４０、約４１〜約６０、約６１〜約８０、または約８１〜約１００ヌクレオチド上流に位置する染色体配列との実質的な配列同一性を有し得る。いくつかの実施態様において、下流配列は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質によって標的とされる配列のすぐ下流に位置する染色体配列との実質的な配列同一性を有する。他の実施態様において、下流配列は、標的配列から約百（１００）ヌクレオチド以内の下流に位置する染色体配列との実質的な配列同一性を有する。したがって、例えば、下流配列は、標的配列から約１〜約２０、約２１〜約４０、約４１〜約６０、約６１〜約８０、または約８１〜約１００ヌクレオチド下流に位置する染色体配列との実質的な配列同一性を有し得る。
【０１１０】
各上流配列または下流配列は、約２０ヌクレオチド〜約５０００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施態様において、上流配列および下流配列は、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、４２００、４４００、４６００、４８００、または５０００ヌクレオチドを含み得る。具体的な実施態様において、上流配列および下流配列は約５０〜約１５００ヌクレオチド長であり得る。
【０１１１】
（ｅ）細胞種
多様な細胞が本明細書で開示される方法における使用に適している。一般に、細胞は真核細胞である。例えば、細胞は、ヒト哺乳類細胞、非ヒト哺乳類細胞、非哺乳類脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞または単細胞真核生物であり得る。いくつかの実施態様において、細胞はまた、１つの細胞胚であり得る。例えば、非ヒト哺乳類胚は、ラット、ハムスター、げっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマおよび霊長類胚を含む。さらなる他の実施態様において、細胞は幹細胞（胚性幹細胞、ＥＳ様幹細胞、胎生幹細胞、および成体幹細胞など）であり得る。ある実施態様において、幹細胞はヒト胚性幹細胞ではない。さらに、幹細胞は、ＷＯ２００３／０４６１４１（これはその全体が本明細書に組み込まれる）またはChung et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2:113-117)に開示される技術によって作製された幹細胞を含み得る。細胞はインビトロまたはインビボ（すなわち生体内）であり得る。例示的な実施態様において、細胞は哺乳類細胞である。特定の実施態様において、細胞はヒト細胞である。
【０１１２】
適切な哺乳類細胞の限定されない例には、ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；ヒトＵ２−ＯＳ骨肉腫細胞、ヒトＡ５９４細胞、ヒトＡ−４３１細胞およびヒトＫ５６２細胞；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；マウス骨髄腫ＮＳ０細胞、マウス胚性線維芽３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＢリンパ腫Ａ２０細胞；マウス黒色腫Ｂ１６細胞；マウス筋芽Ｃ２Ｃ１２細胞；マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞；マウス胚性間葉Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２細胞；マウスがんＣＴ２６細胞、マウス前立腺ＤｕＣｕＰ細胞；マウス乳腺ＥＭＴ６細胞；マウス肝がんＨｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞；マウス骨髄腫Ｊ５５８２細胞；マウス上皮ＭＴＤ−１Ａ細胞；マウス心筋ＭｙＥｎｄ細胞；マウス腎臓ＲｅｎＣａ細胞；マウス膵臓ＲＩＮ−５Ｆ細胞；マウス黒色腫Ｘ６４細胞；マウスリンパ腫ＹＡＣ−１細胞；ラット膠芽腫９Ｌ細胞；ラットＢリンパ腫ＲＢＬ細胞；ラット神経芽腫Ｂ３５細胞；ラット肝がん細胞（ＨＴＣ）；バッファローラット肝臓ＢＲＬ３Ａ細胞；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；イヌ乳腺（ＣＭＴ）細胞；ラット骨肉腫Ｄ１７細胞；ラット単球／マクロファージＤＨ８２細胞；サル腎臓ＳＶ−４０形質転換線維芽（ＣＯＳ７）細胞；サル腎臓ＣＶＩ−７６細胞；アフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ−７６）細胞が含まれる。哺乳類細胞株の広範なリストが、American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)のカタログに見出され得る。
【０１１３】
（ＩＶ）特定のゲノム遺伝子座を検出する方法
また、本明細書において、真核細胞中の特定のゲノム遺伝子座を検出または可視化する方法が提供される。１以上のプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質の近位の結合はクロマチン構造を変化させ、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質の以前にアクセスできなかった染色体座へのアクセスを増大させるため、上記のセクション（ＩＩＩ）において記述された方法は、特定のゲノム遺伝子座または標的染色体配列の検出を増強するように修飾され得る。本方法は真核細胞に、（ａ）少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質または少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸、および（ｂ）少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を導入することを含み、ここで少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は標的染色体配列を標的とし、１以上のプログラム可能な各ＤＮＡ結合タンパク質は標的染色体配列の近位の部位を標的とする。少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質と標的染色体配列の近位の部位との結合は、少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質の標的染色体配列へのアクセスしやすさを増大させる。本方法はさらに、標的染色体配列に結合した少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質を検出することを含む。
【０１１４】
少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む。適切なプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｖｉ）に記述されている。具体的な実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、触媒不活性なメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質、または転写活性化因子様エフェクターであり得る。プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質の少なくとも１つの検出可能なマーカードメインは蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ｅＧＦＰおよびＲＦＰなど）、蛍光タグ、またはエピトープタグ（これらは上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｉ）に記述されている）であり得る。ある実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質の少なくとも１つの検出可能なマーカードメインは、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質がプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質に対する抗体によって検出され得るように、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質中の天然に存在するエピトープであり得る。少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｉ）に記述されるように、少なくとも１つの核移行シグナルおよび／または細胞透過性ドメインをさらに含み得る。いくつかの実施態様において、少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、（上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｖｉ）に記述される）非ヌクレアーゼ修飾ドメインをさらに含み得る。
【０１１５】
１以上のプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は上記のセクション（Ｉ）（ｂ）に記述されている。一般に、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、触媒不活性なメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ、ＺＦＮニッカーゼ、ＴＡＬＥＮニッカーゼ、またはメガヌクレアーゼニッカーゼであり得る。
【０１１６】
本方法はさらに、標的染色体配列に結合している検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質を検出することを含み、この検出は動的生細胞イメージング、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、免疫蛍光、免疫検出、ＲＮＡ−タンパク質結合、およびタンパク質−タンパク質結合などを介し得る。検出工程は生細胞または固定細胞において実行され得る。
【０１１７】
本方法が生細胞中のクロマチン構造の動力学を検出することを含む実施態様において、検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質および１以上のプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、上記のセクション（ＩＩＩ）（ａ）において本質的に記述されるように、タンパク質または核酸として細胞に導入され得る。本方法が固定細胞中の標的染色体配列を検出することを含む実施態様において、検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質およびプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、タンパク質（またはＲＮＡ−タンパク質複合体）として細胞に導入され得る。細胞を固定および透過処理する手段は当分野で周知である。いくつかの実施態様において、固定細胞は化学プロセスおよび／または熱変性プロセスに曝露され得、二本鎖染色体ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変換し得る。他の実施態様において、固定細胞は化学プロセスおよび／または熱変性プロセスに曝露されない。
【０１１８】
具体的な実施態様において、検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、触媒不活性な（または不活性化）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質および蛍光タンパク質マーカードメインを含む融合タンパク質であり、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は触媒不活性な（または不活性化）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質である。
【０１１９】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質またはプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質のうちの少なくとも１つがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含む実施態様において、ガイドＲＮＡはインサイチュ(in situ)の検出（例えばＦＩＳＨまたはＣＩＳＨ）のための検出可能な標識をさらに含み得る。検出可能な標識は上記のセクション（Ｉ）（ａ）（ｉ）に詳述されている。いくつかの実施態様において、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質およびプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質はそれぞれＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含み、各ガイドＲＮＡは少なくとも１つの検出可能な標識を含み、それにより検出される信号の量または強度を増加させる。
【０１２０】
さらなる他の実施態様において、近位に結合したプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質および１以上のプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、近接ライゲーションアッセイを介して検出され得る。例えば、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は第１の抗体に結合され得、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質の少なくとも１つは第２の抗体に結合され得、これらはそれぞれ一本鎖近接検出オリゴヌクレオチド(single-stranded proximity detection oligonucleotide)に直接的または（例えば第２の抗体を介して）間接的に連結する。他の実施態様において、一本鎖近接検出オリゴヌクレオチドはガイドＲＮＡに直接的または間接的に連結し得る。さらなる他の実施態様において、一本鎖近接検出オリゴヌクレオチドはプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質またはプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質に直接的または間接的に連結し得る。近接検出オリゴヌクレオチドは、近位に位置する、染色体に結合しているタンパク質と複合体を形成し、インサイチュの近接依存的な増幅反応を介して検出され得る。インサイチュの近接依存的な増幅反応は近接ライゲーションアッセイ（PLA、Soderberg, et al., Nature Methods, 2006, 3(12):995-1000参照）またはハイブリダイゼーション連鎖反応の近接依存的な開始（proxHCR、Koos et al., Nature Communications, 2015, 6:7294, 10 pp.参照）であり得る。
【０１２１】
（Ｖ）応用
本明細書において開示される組成物および方法は、多様な治療応用、診断応用、産業的応用および研究応用において使用され得る。いくつかの実施態様において、本開示は、遺伝子の機能をモデル化および／または研究し、対象の遺伝子状態もしくはエピジェネティック状態を研究し、または様々な疾患もしくは障害に関与する生化学的経路を研究するために、細胞、動物または植物中の対象の任意の染色体配列を修飾するのに使用され得る。例えば、疾患または障害をモデル化するトランスジェニック生物が作製され得、ここで疾患または障害に関連する１以上の核酸配列の発現が変化している。疾患モデルは、生物に対する変異の効果を研究し、疾患の発生および／または進行を研究し、疾患に対する薬学的に活性な化合物の効果を研究し、かつ／または潜在的な遺伝子治療戦略の効力を評価するために使用され得る。
【０１２２】
他の実施態様において、組成物および方法は、効率的で費用効率の高い機能的なゲノムスクリーニング（これは特定の生物学的プロセスに関与する遺伝子の機能およびどのような遺伝子発現の変化が生物学的プロセスに影響を与え得るかを調べるために使用され得る）を実行するため、または細胞表現型と組み合わせたゲノム遺伝子座の飽和変異導入法もしくはディープスキャニング変異導入法(deep scanning mutagenesis)を実行するために使用され得る。例えば、飽和変異導入法またはディープスキャニング変異導入法は、遺伝子発現、薬剤耐性、および疾患の回復に必要な機能的要素の重要な最小限の特徴および別々の脆弱性を決定するために使用され得る。
【０１２３】
さらなる実施態様において、本明細書で開示される組成物および方法は、疾患または障害の存在を立証し、かつ／または処置の選択肢を決定するために使用される診断テストのために使用され得る。適切な診断テストの例には、がん細胞における特定の変異（例えば、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２などにおける特定の変異）の検出、特定の疾患に関与する特定の変異（例えば、トリヌクレオチド反復、鎌状赤血球症に関連するβグロビン内の変異、特定のＳＮＰなど）の検出、肝炎の検出、およびウイルス（例えばジカウイルス）の検出などが含まれる。
【０１２４】
さらなる実施態様において、本明細書で開示される組成物および方法は、特定の疾患または障害に関連する遺伝子変異を修正するため（例えば、鎌状赤血球症またはサラセミアに関連するグロビン遺伝子の変異を修正するため、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）に関連するアデノシンデアミナーゼ遺伝子の変異を修正するため、ハンチントン病の疾患原因遺伝子であるＨＴＴの発現を減少させるため、または網膜色素変性症の処置のためにロドプシン遺伝子の変異を修正するためなど）に使用され得る。このような修飾は、エクスビボ(ex vivo)の細胞において行われ得る。
【０１２５】
さらなる他の実施態様において、本明細書で開示される組成物および方法は、形質が改善し、または環境ストレスに対する抵抗性が増大した作物を作製するために使用され得る。本開示はまた、形質が改善した家畜または生産動物(production animal)を作製するために使用され得る。例えば、ブタは、生物医学的モデルとして（特に再生医療または異種移植において）ブタを魅力的なものとする多くの特徴を有する。
【０１２６】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed.  1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)；およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書において、以下の用語は他に明記されない限り、これらに帰する意味を有する。
【０１２７】
本開示またはその好ましい実施態様の要素を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「前記」は１以上の要素が存在することを意味することが意図されている。用語「含む」、「包含する」および「有する」は包含的であり、記載された要素以外のさらなる要素が存在し得ることを意味することが意図される。
【０１２８】
用語「約」は、数値ｘに関して使用される場合、例えばｘ±５％を意味する。
【０１２９】
本明細書において、用語「相補的」または「相補性」は、特定の水素結合を介した塩基対形成による二本鎖核酸の結合を指す。塩基対形成は、標準的なワトソン・クリック塩基対形成であり得る（例えば、５’−ＡＧＴＣ−３’は相補的配列３’−ＴＣＡＧ−５’と対形成する）。塩基対形成はまた、フーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合であり得る。相補性は通常、二本鎖領域に関して測定され、したがって例えばオーバーハングは除外される。二本鎖領域の２つの鎖の間の相補性は部分的であり得、いくつか（例えば７０％）の塩基のみが相補的である場合、割合（例えば７０％）として表現され得る。相補的でない塩基は「ミスマッチ」している。二本鎖領域の全ての塩基が相補的である場合、相補性は完全（すなわち１００％）であり得る。
【０１３０】
本明細書において、用語「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（すなわち、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、または触媒不活性化タンパク質）およびガイドＲＮＡを含む複合体を指す。
【０１３１】
本明細書における用語「内在性配列」は、細胞に対して天然である染色体配列を指す。
【０１３２】
本明細書における用語「外来性」は細胞に対して天然でない配列、または細胞のゲノムにおけるその配列の天然の位置が異なる染色体位置にある染色体配列を指す。
【０１３３】
本明細書において、「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エクソンおよびイントロンを含む）および遺伝子産物の生成を制御するあらゆるＤＮＡ領域を指し、これはそのような制御配列がコード配列および／または転写される配列に隣接しているか否かによらない。したがって、遺伝子は必ずしも限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列（リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位など）、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界要素、複製起点、マトリックス結合部位、および遺伝子座調節領域を含む。
【０１３４】
用語「異種」は、対象の細胞に対して内在性または天然でない実体を指す。例えば、異種タンパク質は外来性の供給源に由来しており、または元々由来していた（外因的に導入された核酸配列など）タンパク質を指す。場合により、異種タンパク質は対象の細胞によって正常に生成されない。
【０１３５】
本明細書において、用語「局所的なクロマチン構造」または「局所的なクロマチン配置」は、ヌクレオソーム構造および／またはヒストンタンパク質スペーシングを指し、ヌクレオソームのクロマチン繊維およびヘテロクロマチンへの圧縮を一般的に指さない。
【０１３６】
用語「ニッカーゼ」は、二本鎖核酸配列の一方の鎖を切断する（すなわち、二本鎖配列に切れ目を入れる）酵素を指す。例えば、二本鎖切断活性を有するヌクレアーゼは、ニッカーゼとして機能し、二本鎖配列の一方の鎖のみを切断するように変異および／または欠失によって改変され得る。
【０１３７】
本明細書において、用語「ヌクレアーゼ」は、二本鎖核酸配列の両方の鎖を切断する酵素を指す。
【０１３８】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、一本鎖型または二本鎖型のいずれかにおける、直鎖状構造または環状構造のデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的において、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定するものとして解釈されるべきではない。これらの用語は、天然のヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えばホスホロチオエート骨格）で修飾されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は同一の塩基対形成の特異性を有する（すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対形成する）。
【０１３９】
用語「ヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは標準的なヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジンおよびウリジン）、ヌクレオチド異性体、またはヌクレオチド類似体であり得る。ヌクレオチド類似体は、修飾されたプリン塩基もしくはピリミジン塩基または修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は天然に存在するヌクレオチド（たとえば、イノシン、プソイドウリジンなど）または天然に存在しないヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドの糖部分または塩基部分における修飾の限定されない例には、アセチル基、アミノ基、カルボキシ基、カルボキシメチル基、ヒドロキシ基、メチル基、ホスホリル基およびチオール基の付加（または除去）、ならびに塩基の炭素原子および窒素原子の他の原子への置換（たとえば、７−デアザプリン）が含まれる。また、ヌクレオチド類似体には、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびモルフォリノが含まれる。
【０１４０】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。
【０１４１】
本明細書において、用語「近位部」は、染色体ＤＮＡにおける標的配列の一方の側の約２５０塩基対以内に位置する結合部位またはヌクレオチド配列を指す。
【０１４２】
本明細書において、用語「プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質」は、染色体ＤＮＡ中の特定の標的配列に結合するように設計され、標的配列またはその付近のＤＮＡまたはＤＮＡに関連するタンパク質を修飾するタンパク質を指す。
【０１４３】
本明細書において、用語「プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質」は、染色体ＤＮＡ中の特定の標的配列に結合するように設計されたタンパク質を指すが、前記タンパク質は標的配列またはその付近のＤＮＡまたはＤＮＡに関連するタンパク質を修飾しない。
【０１４４】
用語「標的配列」、「標的染色体配列」および「標的部位」は互換的に使用され、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が標的とする染色体ＤＮＡ中の特定の配列、およびプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がＤＮＡまたはＤＮＡに関連するタンパク質を修飾する部位を指す。
【０１４５】
核酸およびアミノ酸の配列同一性を決定する技術は当分野で公知である。通常、このような技術には、遺伝子のためのｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされているアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第２のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較することが含まれる。ゲノム配列もまた、この様式で決定および比較され得る。一般に、同一性は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、それぞれヌクレオチドとヌクレオチドとの正確な一致またはアミノ酸とアミノ酸との正確な一致を指す。２以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、その割合同一性を決定することによって比較され得る。２つの配列の割合同一性は、核酸配列であるかアミノ酸配列であるかによらず、２つのアラインされた配列間の正確な一致の数をより短い配列の長さで割り、１００を乗じたものである。核酸配列のための近似アライメントは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)の局所的相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAによって開発され、Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)によって標準化されたスコア化マトリックスを用いることで、アミノ酸配列に適用され得る。配列の割合同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実施は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」の実用的用途におけるGenetics Computer Group (Madison, Wis.)によって提供されている。配列間の割合同一性または類似性を計算するのに適した他のプログラムは当分野で一般的に知られおり、例えば、別のアライメントプログラムは初期設定パラメータで使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下の初期設定パラメータを用いて使用され得る：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；ソーティング方法＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細はＧｅｎＢａｎｋのウェブサイト上に見出され得る。
【０１４６】
本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更が上述の細胞および方法において行われ得るため、上記の記載および以下で与えられる実施例に含まれるあらゆる事項は、限定的な意味ではなく説明として解釈されるべきであることが意図される。
【０１４７】
列挙された実施態様
以下の列挙された実施態様は、本発明の特定の態様を説明するために提示され、本発明の範囲を限定することは意図されない。
【０１４８】
１．（ａ）プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質またはプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質をコードする核酸、および（ｂ）少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を含む、組成物。
【０１４９】
２．プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が、ＲＮＡにガイドされたクラスター化した規則的に間隔が空いている短い回文配列リピート（RNA-guided clustered regularly interspersed short palindromic repeats、ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインと連結したプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、または非ヌクレアーゼドメインと連結したプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質である、実施態様１記載の組成物。
【０１５０】
３．融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインが、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、触媒不活性なメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質、または転写活性化因子様エフェクターである、実施態様２記載の組成物。
【０１５１】
４．融合タンパク質の非ヌクレアーゼドメインが、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、シトルリン化活性、ヘリカーゼ活性、アミノ化活性、脱アミノ化活性、アルキル化活性、脱アルキル化活性、酸化活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有する、実施態様２または３記載の組成物。
【０１５２】
５．融合タンパク質の非ヌクレアーゼドメインが、シトシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有する、実施態様４記載の組成物。
【０１５３】
６．少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質が、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、触媒不活性なメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ、ＺＦＮニッカーゼ、ＴＡＬＥＮニッカーゼ、またはメガヌクレアーゼニッカーゼである、実施態様１〜５のいずれかに記載の組成物。
【０１５４】
７．プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質および少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸が、ＲＮＡまたはＤＮＡであり、かつ／または前記核酸がプラスミドベクターまたはウイルスベクターの一部である、実施態様１〜６のいずれかに記載の組成物。
【０１５５】
８．プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、または非ヌクレアーゼドメインと連結した触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質が触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、ここで各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、実施態様１〜６のいずれかに記載の組成物。
【０１５６】
９．各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである、実施態様８記載の組成物。
【０１５７】
１０．各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである、実施態様９記載の組成物。
【０１５８】
１１．各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸がｍＲＮＡまたはＤＮＡである、実施態様８〜１０のいずれかに記載の組成物。
【０１５９】
１２．各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸および／または各ガイドＲＮＡをコードする核酸が、プラスミドベクターの一部またはウイルスベクターの一部である、実施態様８〜１１のいずれかに記載の組成物。
【０１６０】
１３．各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡが酵素的に合成されている、実施態様８〜１１のいずれかに記載の組成物。
【０１６１】
１４．各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡが少なくとも部分的に化学合成されている、実施態様８〜１１のいずれかに記載の組成物。
【０１６２】
１５．実施態様１〜１４のいずれかに記載の組成物を含むキット。
【０１６３】
１６．真核細胞中の標的ゲノム修飾の効率および／または特異性を増大させる方法であって、真核細胞に以下を導入することを含む方法：
（ａ）プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質またはプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質をコードする核酸、および；
（ｂ）少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸；
ここで、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は標的染色体配列を標的とし、少なくとも１つのプログラム可能な各ＤＮＡ結合タンパク質は、標的染色体配列の近位の部位を標的とし、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質と標的染色体配列の近位の部位との結合は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質の標的染色体配列へのアクセスしやすさを増大させ、これにより標的ゲノム修飾の効率および／または特異性を増大させる。
【０１６４】
１７．標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約２５０塩基対以内に位置している、実施態様１６記載の方法。
【０１６５】
１８．標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約１００塩基対以内に位置している、実施態様１７記載の方法。
【０１６６】
１９．標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約７５塩基対以内に位置している、実施態様１８記載の方法。
【０１６７】
２０．標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約５０塩基対以内に位置している、実施態様１９記載の方法。
【０１６８】
２１．標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約２５塩基対以内に位置している、実施態様２０記載の方法。
【０１６９】
２２．プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインと連結したプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、または非ヌクレアーゼドメインと連結したプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質である、実施態様１６〜２１のいずれかに記載の方法。
【０１７０】
２３．融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインが、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、触媒不活性なメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質、または転写活性化因子様エフェクターである、実施態様２２記載の方法。
【０１７１】
２４．融合タンパク質の非ヌクレアーゼ修飾ドメインが、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、シトルリン化活性、ヘリカーゼ活性、アミノ化活性、脱アミノ化活性、アルキル化活性、脱アルキル化活性、酸化活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有する、実施態様２２または２３に記載の方法。
【０１７２】
２５．融合タンパク質の非ヌクレアーゼドメインが、シトシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有する、実施態様２４記載の方法。
【０１７３】
２６．少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質が、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、触媒不活性なメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ、ＺＦＮニッカーゼ、ＴＡＬＥＮニッカーゼ、またはメガヌクレアーゼニッカーゼである、実施態様１６〜２５のいずれかに記載の方法。
【０１７４】
２７．プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、または非ヌクレアーゼドメインと連結した触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質が触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、ここで各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、実施態様１６〜２６のいずれかに記載の方法。
【０１７５】
２８．各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡが少なくとも部分的に化学合成されている、実施態様２７記載の方法。
【０１７６】
２９．各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡが酵素的に合成されている、実施態様２７記載の方法。
【０１７７】
３０．真核細胞がインビトロである、実施態様１６〜２９のいずれかに記載の方法。
【０１７８】
３１．真核細胞がインビボである、実施態様１６〜２９のいずれかに記載の方法。
【０１７９】
３２．真核細胞が哺乳類細胞である、実施態様１６〜３１のいずれかに記載の方法。
【０１８０】
３３．哺乳類細胞がヒト細胞である、実施態様３２記載の方法。
【０１８１】
３４．哺乳類細胞が非ヒト細胞である、実施態様３２記載の方法。
【０１８２】
３５．真核細胞中の染色体配列を検出する方法であって、以下を含む方法：
Ｉ．真核細胞に、（ａ）少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質または少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸；および（ｂ）少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質または少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を導入する工程、ここで少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は標的染色体配列を標的とし、少なくとも１つのプログラム可能な各ＤＮＡ結合タンパク質は標的染色体配列の近位の部位を標的とし、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質と標的染色体配列の近位の部位との結合は、少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質の標的染色体配列へのアクセスしやすさを増大させる；および
ＩＩ．標的染色体配列に結合した少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質を検出する工程。
【０１８３】
３６．標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約２５０塩基対以内に位置している、実施態様３５記載の方法。
【０１８４】
３７．標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約１００塩基対以内に位置している、実施態様３６記載の方法。
【０１８５】
３８．標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約７５塩基対以内に位置している、実施態様３７記載の方法。
【０１８６】
３９．標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約５０塩基対以内に位置している、実施態様３８記載の方法。
【０１８７】
４０．標的染色体配列の近位の部位が、標的染色体配列の一方の側の約２５塩基対以内に位置している、実施態様３９記載の方法。
【０１８８】
４１．少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質の少なくとも１つの検出可能なマーカードメインが、蛍光タンパク質、蛍光タグ、エピトープタグ、またはプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質中に天然に存在するエピトープである、実施態様３５〜４０のいずれかに記載の方法。
【０１８９】
４２．少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質が、少なくとも１つの検出可能なマーカードメインと連結した触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、少なくとも１つの検出可能なマーカードメインと連結した触媒不活性なメガヌクレアーゼ、少なくとも１つの検出可能なマーカードメインと連結したＺｎフィンガータンパク質、または少なくとも１つの検出可能なマーカードメインと連結した転写活性化因子様エフェクターである、実施態様３５〜４１のいずれかに記載の方法。
【０１９０】
４３．少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質が、触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、触媒不活性なメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼ、ＺＦＮニッカーゼ、ＴＡＬＥＮニッカーゼ、またはメガヌクレアーゼニッカーゼである、実施態様３５〜４２のいずれかに記載の方法。
【０１９１】
４４．少なくとも１つの検出可能なマーカードメインを含むプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質が少なくとも１つの検出可能なマーカードメインと連結した触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、少なくとも１つのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質が触媒不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、実施態様３５〜４３のいずれかに記載の方法。
【０１９２】
４５．各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡが少なくとも部分的に化学合成されている、実施態様４４記載の方法。
【０１９３】
４６．各ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡが酵素的に合成されている、実施態様４４記載の方法。
【０１９４】
４７．真核細胞が哺乳類細胞である、実施態様３５〜４６のいずれかに記載の方法。
【０１９５】
４８．哺乳類細胞がヒト細胞である、実施態様４７記載の方法。
【０１９６】
４９．哺乳類細胞が非ヒト細胞である、実施態様４７記載の方法。
【０１９７】
５０．真核細胞が生存している、または固定されている、実施態様３５〜４９のいずれかに記載の方法。
【０１９８】
５１．検出が、動的生細胞イメージング、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、免疫蛍光、免疫検出、ＲＮＡ−タンパク質結合、またはタンパク質−タンパク質結合を含む、実施態様３５〜５０のいずれかに記載の方法。
【実施例】
【０１９９】
以下の実施例は本開示の特定の態様を示す。
【０２００】
実施例１．Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（ＦｎＣａｓ９）遺伝子編集の増強
ＦｎＣａｓ９はＩＩＢ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９である。これは広く使用されているＳｐＣａｓ９よりも高い固有の特異性を示すが、ヒト細胞においてＳｐＣａｓ９よりも頑強性が低いことが見出されている。プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質と近位部との結合が、ヌクレアーゼがヒト細胞における他のアクセスできない標的（すなわちＰＯＲ遺伝子座）を切断することを可能とし得るか否かを決定するために、Ｋ５６２細胞に、細胞百万個当たり、５．６μｇのＦｎＣａｓ９プラスミドＤＮＡ、５μｇの触媒不活性化ＳｐＣａｓ９（ＳｐｄＣａｓ９）プラスミドＤＮＡ、および３μｇの各ｓｇＲＮＡのプラスミドＤＮＡを遺伝子導入した（図２参照）。ゲノムＤＮＡを遺伝子導入の３日後に回収し、標的領域を順方向プライマー５’−ＣＴＣＣＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＴＣＧＴＡＴ−３’（配列番号９）および逆方向プライマー５’−ＡＣＡＧＧＴＣＧＴＧＧＡＣＡＣＴＣＡＣＡ−３’（配列番号１０）を用いてＰＣＲで増幅した。標的に対するＦｎＣａｓ９による標的挿入／欠失を、Ｃｅｌ−Ｉヌクレアーゼ消化およびポリアクリルアミドゲル分析によって決定した。
【０２０１】
図２に示されるように、ＦｎＣａｓ９は単独で遺伝子導入された場合、標的を切断できなかった。しかし、局所的なクロマチン配置を破壊することを助けるためにＳｐｄＣａｓ９と組み合わせて遺伝子導入された場合、ＦｎＣａｓ９は標的を頑強なレベルで（ＳｐｄＣａｓ９を１つの近位部に結合するように使用した場合に１０〜１１％のインデルを伴って）切断できた。ＳｐｄＣａｓ９を２つの近位部に結合するように使用した場合、ＦｎＣａｓ９活性はさらに２８％のインデルに増加した。これらの結果は、本明細書において開示された方法が、エンドヌクレアーゼがアクセスできない他の標的を効率的に切断することを可能にし得、局所的なクロマチン配置を破壊するのに使用される２つの部位の間に相乗効果が存在することを示す。
【０２０２】
実施例２．Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）遺伝子編集の増強
ＣｊＣａｓ９はＩＩＣ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９である。ＣｊＣａｓ９はこれまでに特徴付けられた最も小さなＣａｓ９であり、特有のＡＣＡＹ ＰＡＭ要求を有する。しかし、このヌクレアーゼはヒト細胞中のほとんどの標的に対して不活性であることが見出されている。本明細書において開示される方法が、ＣｊＣａｓ９タンパク質がヒト細胞中のアクセスできない標的に結合することを可能にし得るか否かを決定するために、Ｋ５６２細胞に、細胞百万個当たり、４．２μｇのＦｌａｇ標識された触媒不活性化ＣｊＣａｓ９（ＣｊｄＣａｓ９）プラスミドＤＮＡ、５μｇの触媒不活性化ＳｐＣａｓ９（ＳｐｄＣａｓ９）プラスミドＤＮＡ、および３μｇの各ｓｇＲＮＡのプラスミドＤＮＡを遺伝子導入した（図３Ａ参照）。細胞を遺伝子導入の１６時間後にホルムアルデヒド中で固定し、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を抗ｆｌａｇ抗体を用いて行った。Ｆｌａｇ−ＣｊｄＣａｓ９による標的結合を、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって決定した。
【０２０３】
図３Ｃに示されるように、Ｆｌａｇ−ＣｊｄＣａｓ９は単独で遺伝子導入された場合、ＡＡＶＳ１遺伝子座における以前に公知のアクセス可能な標的に結合できたが、ＰＯＲ遺伝子座におけるアクセスできない標的に結合できなかった。しかしながら、局所的なクロマチン配置を破壊するためにＳｐｄＣａｓ９と組み合わせて遺伝子導入された場合、Ｆｌａｇ−ＣｊｄＣａｓ９はＡＡＶＳ１標的との結合よりもさらにより効率的にＰＯＲ標的に結合できた。
【０２０４】
標的ＤＮＡ切断に対する効果を調べるために、Ｋ５６２細胞に、細胞百万個当たり、４．２μｇのＣｊＣａｓ９プラスミドＤＮＡ、５μｇのＳｐｄＣａｓ９プラスミドＤＮＡ、および３μｇの各ｓｇＲＮＡのプラスミドＤＮＡを遺伝子導入した。ゲノムＤＮＡを遺伝子導入の３日後に回収し、標的領域を順方向プライマー５’−ＣＴＣＣＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＴＣＧＴＡＴ−３’（配列番号９）および逆方向プライマー５’−ＡＣＡＧＧＴＣＧＴＧＧＡＣＡＣＴＣＡＣＡ−３’（配列番号１０）を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＯＲ標的に対するＣｊＣａｓ９切断活性を、Ｃｅｌ−Ｉヌクレアーゼ消化およびポリアクリルアミドゲル分析によって決定した。図４に示されるように、ＣｊＣａｓ９はＳｐｄＣａｓ９を伴わずに標的を切断することはできなかった。しかし、ＳｐｄＣａｓ９と組み合わせて遺伝子導入された場合、ＣｊＣａｓ９は３４．１〜３７．９％のインデルを伴って効率的に標的を切断できた。これらの結果は、本明細書において開示される方法が、ヌクレアーゼがアクセスできない他の標的に効率的に結合し、切断することを可能にし得ることを示す。
【０２０５】
実施例３．Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）遺伝子編集の増強
ＦｎＣｐｆ１はＶ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。Ｃｐｆ１システムは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムとは著しく異なっている。Ｃａｓ９システムとは異なり、Ｃｐｆ１システムはｔｒａｃｒＲＮＡを用いず、標的化のために５’ＴリッチＰＡＭおよび単一ＲＮＡガイドを使用する(Zetsche et al., Cell, 2015, 163:1-13)。これらの「より新しい」ＣＲＩＳＰＲシステムは、遺伝子編集の実行をさらにより簡便にする可能性を有するが、多くのＣｐｆ１システムはヒト細胞中で不活性であることが見出されている。本明細書において開示される方法が、この異なる「不活性」Ｃｐｆ１ヌクレアーゼがヒト細胞中の内在性標的を切断することを可能にするか否かを決定するために、Ｋ５６２細胞に、細胞百万個当たり、５μｇのＦｎＣｐｆ１プラスミドＤＮＡ、５μｇのＳｐｄＣａｓ９プラスミドＤＮＡ、および３μｇの各ｓｇＲＮＡのプラスミドＤＮＡを遺伝子導入した（図５参照）。ゲノムＤＮＡを遺伝子導入の３日後に回収し、標的領域を順方向プライマー５’−ＣＴＣＣＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＴＣＧＴＡＴ−３’（配列番号９）および逆方向プライマー５’−ＡＣＡＧＧＴＣＧＴＧＧＡＣＡＣＴＣＡＣＡ−３’（配列番号１０）を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＯＲ標的に対するＦｎＣｐｆ１切断活性を、Ｃｅｌ−Ｉヌクレアーゼ消化およびポリアクリルアミドゲル分析によって決定した。
【０２０６】
図５に示されるように、ＦｎＣｐｆ１は単独で遺伝子導入された場合、標的を切断できなかったが、ＳｐｄＣａｓ９と組み合わせて遺伝子導入された場合、標的を効率的に切断できた。これらの結果は、本明細書において開示される方法が異なるＶ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに適用可能であることを示す。
【０２０７】
実施例４．ヒトＨＢＢおよびＨＢＤにおける同一の標的間の選択的編集
ヒト（すなわちＨＢＢおよびＨＢＤ）における２つの同一の標的を用いて、本明細書において開示される方法が、異なる遺伝子中の同一の部位間の選択的編集を促進できるか否かを決定した。Ｋ５６２細胞に、細胞百万個当たり、４．２μｇのＣｊＣａｓ９プラスミドＤＮＡ、５μｇのＳｐｄＣａｓ９プラスミドＤＮＡ、および３μｇの各ｓｇＲＮＡのプラスミドＤＮＡを遺伝子導入した（図６参照）。ゲノムＤＮＡを遺伝子導入の３日後に回収し、２つの標的領域を、ＨＢＢのための順方向プライマー５’−ＣＧＧＣＴＧＴＣＡＴＣＡＣＴＴＡＧＡＣＣＴＣＡ−３’（配列番号１１）および逆方向プライマー５’−ＧＣＡＧＣＣＴＡＡＧＧＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡ−３’（配列番号１２）、ならびにＨＢＤのための順方向プライマー５’−ＡＧＧＧＣＡＡＧＴＴＡＡＧＧＧＡＡＴＡＧＴＧＧＡＡ−３’（配列番号１３）および逆方向プライマー５’−ＣＣＡＡＧＧＧＴＡＧＡＣＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＣＴＧ−３’（配列番号１４）を用いてＰＣＲで増幅した。ＨＢＢ標的およびＨＢＤ標的に対するＣｊＣａｓ９切断活性を、Ｃｅｌ−Ｉヌクレアーゼ消化およびポリアクリルアミドゲル分析によって決定した。
【０２０８】
図６に示されるように、ＣｊＣａｓ９は単独で遺伝子導入された場合、いずれの標的も切断できなかった。しかし、ＨＢＢの近位の部位を標的とするＳｐｄＣａｓ９と組み合わせて遺伝子導入された場合、ＣｊＣａｓ９はＨＢＢ標的を効率的に切断し、同一のＨＢＤ標的を切断できなかった。最初の２つのレーンにおける２つのＣｅｌ−Ｉヌクレアーゼ消化のバンドは、Ｋ５６２細胞集団に存在するＳＮＰによって生じた。これらの結果は、遺伝子編集の選択性を改善するという開示された本方法の特有の能力を示す。
【０２０９】
実施例５．Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）遺伝子編集の増強
ＳｐＣａｓ９はＩＩＡ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９であり、真核細胞におけるその頑強な活性のためにゲノム修飾において広く使用されている。しかしながら、その活性は標的によって様々であり得る。本明細書において開示される方法がこのヌクレアーゼを増強し得るか否かを決定するために、Ｋ５６２細胞に、細胞百万個当たり、５μｇのＳｐＣａｓ９プラスミドＤＮＡ、５．６μｇの触媒不活性化ＦｎＣａｓ９（ＦｎｄＣａｓ９）、および３μｇの各ｓｇＲＮＡのプラスミドＤＮＡを遺伝子導入した（図７参照）。ゲノムＤＮＡを遺伝子導入の３日後に回収し、標的領域を順方向プライマー５’−ＣＴＣＣＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＴＣＧＴＡＴ−３’（配列番号９）および逆方向プライマー５’−ＡＣＡＧＧＴＣＧＴＧＧＡＣＡＣＴＣＡＣＡ−３’（配列番号１０）を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＯＲ標的に対するＳｐＣａｓ９切断活性を、Ｃｅｌ−Ｉヌクレアーゼ消化およびポリアクリルアミドゲル分析によって決定した。
【０２１０】
図７に示されるように、ＳｐＣａｓ９切断活性は、単独で遺伝子導入された場合と比較して、ＦｎｄＣａｓ９と組み合わせて遺伝子導入された場合に著しく増加した。これらの結果は、本明細書において開示される方法が頑強なエンドヌクレアーゼにも適用できることを示す。
【０２１１】
実施例６．ｓｓＤＮＡオリゴドナーを用いた遺伝子編集の増強
Ｋ５６２細胞に、細胞百万個当たり、４．２μｇのＣｊＣａｓ９プラスミドＤＮＡ、５μｇのＳｐｄＣａｓ９プラスミドＤＮＡ、３μｇの各ｓｇＲＮＡのプラスミドＤＮＡ、およびＥｃｏＲＩ制限部位の標的とされる組込みのための３００ｐｍｏｌの８８ｎｔ ｓｓＤＮＡオリゴドナーを遺伝子導入した。ゲノムＤＮＡを遺伝子導入の３日後に回収し、標的領域を順方向プライマー５’−ＣＴＣＣＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＴＣＧＴＡＴ−３’（配列番号９）および逆方向プライマー５’−ＡＣＡＧＧＴＣＧＴＧＧＡＣＡＣＴＣＡＣＡ−３’（配列番号１０）を用いてＰＣＲで増幅した。標的とされたＥｃｏＲＩ制限部位の組込みを、ＥｃｏＲＩ制限酵素での消化およびポリアクリルアミドゲル分析によって決定した。図８に示されるように、ｓｓＤＮＡオリゴドナーをＣｊＣａｓ９およびＳｐｄＣａｓ９と協調して遺伝子導入した場合、制限部位はＰＯＲ遺伝子座中に効率的（２８〜３７％）に組み込まれたが、オリゴドナーを単独またはＳｐｄＣａｓ９を伴わないＣｊＣａｓ９との組合せのいずれかにおいて遺伝子導入した場合、組込みは検出されなかった。これらの結果は、本明細書において開示される方法が、他のアクセスできない標的に対するｓｓＤＮＡオリゴドナーを用いた効率的な遺伝子編集を促進し得ることを示す。
【０２１２】
実施例７．生細胞中および固定細胞中の配列特異的なゲノムＤＮＡ検出の増強
Ｃａｓ９タンパク質と蛍光タンパク質との融合は、生細胞中の染色体の動態を検出することを可能にしている（Chen et al., Cell, 2013, 155:1479-91）。したがって、クロマチン構造の動態は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム複合体が様々なゲノム遺伝子座にアクセスする能力に影響を与えていると考えられる。したがって、ｄＣａｓ９−ＧＦＰを有するＣＲＩＳＰＲ（ｄＣａｓ９）複合体の近位のその複合体の配置は、クロマチン免疫沈降のために実施例２で観察されたものに類似する程度で、染色体の動態の検出を増強すると考えられる。例えば、ＣｊｄＣａｓ９はＧＦＰと融合され得、ＣｊｄＣａｓ９−ＧＦＰの検出可能な結合を妨げるクロマチン状態を含む領域を標的とし得る。ＳｐｄＣａｓ９に基づくシステムは、ＣｊｄＣａｓ９−ＧＦＰ標的の近位に設計され得、検出可能なシグナルを生成し得る。ＳｐｄＣａｓ９−ＧＦＰの結合および検出に対して抵抗性であるクロマチン領域のために、近位のＦｎｄＣａｓ９分子が使用され得、ＳｐＣａｓ９およびＦｎｄＣａｓ９の近位の標的化および二本鎖切断活性の増強のために実施例５で示されたものに類似する程度で検出を増強し得る。さらに、以前の研究が、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡとゲノムＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションの要求の程度が二本鎖切断の場合よりも結合の場合においてより低くなり得ることを示している(Wu et al., Nature Biotechnology, 2014, 32(7): 670-6)ことを考慮すると、近位のＣＲＩＳＰＲ結合の使用は、細胞中のゲノムＤＮＡ検出のための信号雑音比を増加させると考えられる。
【０２１３】
類似のＣＲＩＳＰＲに基づく検出方法が固定細胞に適用されている（Deng et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 2015, 112(38):11870-75）。したがって、近位のＣＲＩＳＰＲ標的化は、上述した生細胞のための様式に類似した様式で固定されたＤＮＡの検出を増強すると考えられる。固定細胞中のゲノムＤＮＡ鎖は化学的に架橋されているため、核酸プローブのハイブリダイゼーションによる配列情報の照合は通常、鎖を十分に分離するための熱プロセシングまたは化学的プロセシングを伴う前処理の工程を必要とする。したがって、近位のＣＲＩＳＰＲ標的化は固定されたＤＮＡをよりアクセスしやすくし、固定細胞の熱処理または化学処理の程度（または要求）を減少させる可能性がある。熱処理または化学処理の排除は、診断プロトコルの単純化、および生細胞生物学をより良く反映する細胞内分子構造の維持において利点を提供し、したがってより確かな情報に基づく診断結果を提供する。
【０２１４】
実施例８．真核細胞中のＣＲＩＳＰＲに基づく遺伝子活性化および遺伝子抑制の増強
Ｃａｓ９タンパク質と転写制御ドメインとの融合は、標的遺伝子の活性化および抑制を可能にする（Konermann et al., Nature, 2014; 517(7536):583-8; Gilbert et al., Cell, 2014, 159(3):547-661）。クロマチン構造の動態は、ＣＲＩＳＰＲ複合体が様々なゲノム遺伝子座にアクセスし、活性化または抑制を誘導する能力に影響を与えると考えられる。したがって、転写制御ドメインと融合したｄＣａｓ９を有するＣＲＩＳＰＲ（ｄＣａｓ９）複合体の近位のその複合体の配置は、クロマチン免疫沈降のために実施例２で観察されたものに類似する程度で標的遺伝子制御を増強すると考えられる。ＳｐｄＣａｓ９−転写制御因子による結合および修飾に対して抵抗性であるクロマチン領域のために、近位のＦｎｄＣａｓ９分子が使用され得、ＳｐＣａｓ９およびＦｎｄＣａｓ９の近位の標的化および二本鎖切断活性の増強のための実施例５で示されたものに類似する程度で、遺伝子活性化および遺伝子抑制を増強し得る。
【０２１５】
実施例９．真核細胞中のＣＲＩＳＰＲに基づくエピジェネティック修飾の増強
Ｃａｓ９タンパク質とエピジェネティック修飾ドメインとの融合は、標的エピジェネティック染色体修飾（ｐ３００によるヒストンアセチル化またはシトシンデアミナーゼによるシトシン脱アミノ化など）を可能にする(Hilton et al., Nat. Biotechnol; 2015, 33(5):510-7; Komor et al., Nature, 2016, 533(7603):420-4)。クロマチン構造の動態は、ＣＲＩＳＰＲ複合体が様々なゲノム遺伝子座にアクセスする能力に影響を与えると考えられる。したがって、エピジェネティック修飾因子と融合したｄＣａｓ９を有するＣＲＩＳＰＲ（ｄＣａｓ９）複合体の近位のその複合体の配置は、クロマチン免疫沈降のために実施例２で観察されたものに類似する程度で、染色体ＤＮＡ、局所的なタンパク質または局所的なＲＮＡの標的エピジェネティック修飾を増強するはずである。ＳｐｄＣａｓ９−エピジェネティック修飾因子による結合および修飾に対して抵抗性であるクロマチン領域のために、近位のＦｎｄＣａｓ９分子が使用され得、ＳｐＣａｓ９およびＦｎｄＣａｓ９の近位の標的化および二本鎖切断活性の増強のために実施例５で示されたものに類似する程度で検出を増強し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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