(57)【要約】本発明は、低粘度の抗原結合タンパク質を調整する方法に関する。この方法は、高粘度可変ドメインサブファミリー中の残基を対応する低粘度サブファミリー中の残基と置換することによって進む。この方法はさらに、Ｆｃドメイン中の残基を低粘度に関連する残基と置換すること、およびＦｃドメインのＣ末端に荷電残基を付加することを含む。本発明はさらに、この方法に作製される抗原結合タンパク質に関する。
2019532063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原結合タンパク質の粘度を減少させる方法であって、
ａ．前記抗原結合タンパク質がＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリーを含む場合、前記ＶＨ１配列を、８２Ｘ１、９４Ｘ２、および９５Ｘ３から選択される１つ以上の置換を含むように改変すること（ここで、Ｘ１はＲ、Ｋ、およびＨから選択され、Ｘ２はＳ、Ｔ、Ｎ、およびＱから選択され、Ｘ３はＲ、Ｋ、およびＨから選択される）；
ｂ．前記抗原結合タンパク質がＶＨ３｜３−３３生殖系列サブファミリーを含む場合、前記ＶＨ３配列を、１Ｘ４、１７Ｘ５、および８５Ｘ６から選択される１つ以上の置換を含むように改変すること（ここで、Ｘ４はＤおよびＥから選択され、Ｘ５はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびＭおよびＷから選択され、Ｘ６はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびＭから選択される；
ｃ．前記抗原結合タンパク質がＶＫ３｜Ｌ１６生殖系列サブファミリーを含む場合、前記ＶＫ３配列を、４Ｘ１０、１３Ｘ１１、７６Ｘ１２、７８Ｆ、９５Ｘ１３、９７Ｘ１４、および９８Ｐから選択される１つ以上の置換を含むように改変すること（ここで、Ｘ１０はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭから選択され、Ｘ１１はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭから選択され、Ｘ１２はＤおよびＥから選択され、Ｘ１３はＲ、ＫおよびＨから選択され、Ｘ１４はＤおよびＥから選択される）；
ｄ．前記抗原結合タンパク質が前記ＶＫ３｜Ｌ６生殖系列サブファミリーを含む場合、前記ＶＫ３配列を、７６Ｘ１２および９５Ｘ１３から選択される１つ以上の置換を含むように改変すること；
ｅ．Ｆｃドメイン配列を２５３Ｘ１５、４４０Ｘ１６、および４３９Ｘ１７から選択される１つ以上の置換を含むように改変すること（ここで、Ｘ１５はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびＭから選択され、Ｘ１６はＲ、Ｋ、およびＨから選択され、Ｘ１７はＤおよびＥから選択され、前記Ｆｃドメイン配列は４４０Ｘ１６および４３９Ｘ１７の１つのみを含む）；ならびに
ｆ．前記Ｆｃドメイン配列のＣ末端を、Ｘ１８Ｘ１９を含むように改変すること（ここで、Ｘ１８はＤおよびＥ、またはＨ、ＫおよびＲから選択される１〜４のアミノ酸であり、Ｘ１９はＰ、Ｍ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、ＹおよびＷから選択され、Ｘ１８がＤまたはＥを含むとき存在せず、Ｘ１８がそのＣ末端にＫまたはＲを含むとき存在し、Ｘ１８がそのＣ末端にＨを含むとき存在するかまたは存在しない）
から選択される、前記抗原結合タンパク質の配列に１つ以上の改変を作ることを含み、
サブパラグラフａ、ｂ、ｃ、およびｄにおけるアミノ酸はＡｈｏナンバリングシステムにより番号付けされており、サブパラグラフｅのアミノ酸はＥＵナンバリングシステムにより番号付けされている方法。
【請求項２】
前記抗原結合タンパク質は、置換を除いて、図１Ａおよび１Ｂから選択される抗体の配列（配列番号１６６および１６８；２および４；１７８および１８０；１７０および１７２；６および８；１０および１２；１４および１６；１８および２０；２２および２４；２６および２８；３０および３２；３４および３６；３８および４０；４３および４４；４６および４８；５０および５２；５４および５６；５８および６０；６２および６４；６６および６８；７０および７２；７４および７６；７８および８０；８２および８４；８６および８８；９０および９２；９４および９６；９８および１００；１０２および１０４；１０６および１０８；１１０および１１２；１１４および１１６；１１８および１２０；１２２および１２４；１２６および１２８；１３０および１３２；１３４および１３６；１５８および１６０；１３８および１４０；１４２および１４４；１４６および１４８；１５０および１５２；ならびに１５４および１５６）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリーを含む抗原結合タンパク質の前記ＶＨ１配列を、８２Ｒ、９４Ｓ、および９５Ｒから選択される１つ以上の置換を含むように改変することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリーを含む抗原結合タンパク質の前記ＶＨ１配列を、５９Ｘ２０（ここで、Ｘ２０はＲ、ＫおよびＨから選択される）の置換を含むように改変することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗原結合タンパク質は、置換を除いて、図１Ｂからの抗体ＡＦ、ＡＫ、ＡＬ、ＡＮおよびＡＯから選択される抗体の配列（配列番号１１４および１１６；１３４および１３６；１３８および１４０；１４６および１４８；ならびに１５０および１５２）を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＶＨ３｜３−３３生殖系列サブファミリーを含む抗原結合タンパク質の前記ＶＨ３配列を、１Ｅ、１７Ｇ、および８５Ａから選択される１つ以上の置換を含むように改変することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記抗原結合タンパク質は、置換を除いて、図１Ｂからの抗体ＡＱ、ＡＭ、ＡＩ、およびＡＧから選択される抗体の配列（配列番号１５８および１６０；１４２および１４４；１２６および１２８；ならびに１１８および１２０）を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
抗原結合タンパク質の前記ＶＫ３｜Ｌ１６配列を、４Ｌ、１３Ｌ、７６Ｄ、７８Ｆ、９５Ｒ、９７Ｅ、および９８Ｐから選択される１つ以上の置換を含むように改変することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原結合タンパク質は、置換を除いて、図１Ｂからの抗体ＡＦおよびＡＱから選択される抗体の配列（配列番号１１４および１１６；ならびに１５８および１６０）を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抗原結合タンパク質の前記ＶＫ３｜Ｌ６配列を、７６Ｄおよび９５Ｒから選択される１つ以上の置換を含むように改変することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗原結合タンパク質は、置換を除いて、図１Ｂからの抗体ＡＪの配列（配列番号１３０および１３２）を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｆｃドメイン配列を、２５３Ａ、４４０Ｋ、および４３９Ｅから選択される１つ以上の置換を含むように改変することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗原結合タンパク質は、置換を除いて、抗体ＢＡ、ＡＨ、およびＡＮから選択される抗体の配列（配列番号１７４および１７６；１２２および１２４；ならびに１４６および１４８）を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＦｃドメインのＣ末端を、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含むように改変することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＦｃドメインのＣ末端を、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含むように改変することを含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は２０１７年８月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／５４６，４６９号、２０１６年１２月０６日に出願された米国仮特許出願第６２／４３０，７７３号、および２０１６年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／４０１，７７０号の優先権を主張するものであり、これらは各々、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明はバイオ医薬品、特に治療用抗原結合タンパク質、その使用方法、その医薬組成物、およびそれらの製造方法に関する。特に、本発明は、粘度を低下させるために変異させた抗原結合タンパク質、特に抗体に関する。
【０００３】
配列表の簡単な説明
配列番号１〜配列番号３８３を含む「Ａ−２０６３−ＵＳ−ＰＳＰ３＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という表題の配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、それには本明細書に開示の核酸配列および／またはアミノ酸配列が含まれる。配列表は本明細書ではＥＦＳを介してＡＳＣＩＩテキスト形式で提出されており、したがって、紙およびコンピュータに読み込み可能な形式の両方を構成する。配列表は、ＰａｔｅｎｔＩｎを用いて２０１７年８月１６日に最初に作成され、サイズは４．３２ＭＢである。
【背景技術】
【０００４】
現在、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、市場の、および開発中の最新の治療用タンパク質のなかで最も一般的な治療法である。抗体間の差異は、主に抗原結合ドメインまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）にある。ＣＤＲにおけるこれらの差異は、バルク溶液粘度として現れる一過性タンパク質−タンパク質相互作用傾向に差異を生じさせると考えられる。いくつかのグループが、粘性抗体溶液中の抗体の可逆的クラスター（主に二量体）の存在を記載している。バルク溶液粘度挙動のメカニズムとして、これらのクラスタの相互作用を説明するために、ポリマー粘度のいくつかの理論的記述が提案されている。
【０００５】
抗体は、通常、アンタゴニストとして作用し、したがって、望ましくない相互作用を遮断するために、大量（しばしば、一用量あたり１００ｍｇを超える）が必要とされる。患者の快適さのために、１ｍＬ体積の単回皮下注射が、最も好ましい投与様式である。比較的小さい体積で大量のｍＡｂを投与する必要性は、１００ｍｇ／ｍｌ以上の高濃度製剤を必要とした。抗体は約１５０ｋＤａの分子量を有する大きな生体高分子であり、それらの高濃度は、濾過の間および注射針を通過する間の、ならびに皮下空間における、タンパク質−タンパク質およびタンパク質−壁の相互作用に起因して、高い剪断応力および高い粘度をもたらす。高粘度は、治療用抗原結合タンパク質の製造、およびそれらの患者への投与における課題、例えば、注射デバイスの機能不全、手動投与の困難性、バイオアベイラビリティの低下、および患者の不快に繋がる注射時の極めて高い背圧などの課題を提示する。
【０００６】
高濃度の治療用モノクローナル抗体溶液の開発および使用は、バイオ医薬品製造のコストが低下するにつれて加速されてきた。場合によっては、これらの抗体溶液は、製造および意図する用量の投与を困難にし得る粘性溶液特性を有する。抗体が「粘性」であるか、または「非粘性」であるかを決定すると思われるＣＤＲの差異は、おそらくタンパク質−タンパク質相互作用を駆動するＣＤＲの傾向に関連しているであろう。
【０００７】
高粘度をもたらす相互作用の性質を理解し、高粘度抗体製剤の粘度を低下させるために、産業界では多大な努力が続けられている。抗体製剤の粘度に影響を及ぼす最も重要なパラメータには、以下のものが含まれる。
・タンパク質のｐＩおよび溶液のｐＨによって規定される分子間相互作用。Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），“Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ＩｇＧ２  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐＨ  ａｎｄ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．１０２：４２９１−４３０４。
・電荷相互作用。Ｙａｄａｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），“Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｖｉｓｃｏｕｓ  ｅｆｆｅｃｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．１０１：９９８−１０１１；Ｙａｄａｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），”Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈａｒｇｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｎ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ９（４）：７９１−８０２；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４），“Ｄｉｐｏｌｅ−Ｄｉｐｏｌｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ａｔ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ”，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．３１（９）：２５４９−２５５８；Ｃｈａｕｄｈｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏａｒｓｅ−ｇｒａｉｎｅｄ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ”，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １１７：１２６９−１２７９。
・疎水性相互作用。Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｆｏｒ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｓａｌｔｓ  ａｓ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ−ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２９：３１０２−３１０９。
【０００８】
最も高い溶液粘度は、最も負の拡散相互作用パラメータｋＤ、最も高い見掛け半径および最も低い実効電荷の条件下で観察された。Ｎｅｅｒｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），“Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩｇＧ１  ａｎｄ  ＩｇＧ４  ｓｕｂｃｌａｓｓ−ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．４９：４００−４１０。浸透圧第２ビリアル係数（Ｂ（２））の成分である拡散相互作用パラメータ（ｋＤ）は濃縮ｍＡｂ溶液の粘度とよく相関した（Ｒ＞０．９）が、ｍＡｂ実効電荷は弱く相関し（Ｒ＜０．６）、弱い分子間相互作用が濃縮ｍＡｂ溶液の粘弾性挙動の支配に重要であることを示した。Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２），“Ｗｅａｋ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｇｏｖｅｒｎ  ｔｈｅ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ：ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ”，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１０３：６９−７８。本明細書で報告される研究では、３Ｄ構造に連結された一次配列が利用された。Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），“Ｙｅｔ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０を参照されたい。いくつかのｍＡｂ分子の粘度値を測定し、機械学習アルゴリズムを用いてｍＡｂの粘度予測モデルを開発した。構造位置、電荷および疎水性が、モデルに利用されるアミノ酸の主要なパラメータであった。
【０００９】
モノクローナル抗体の粘度は、以下の論文の分子情報を用いて評価した：Ｌｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４），“Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ：ｅｘｐｌａｉｎｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｉｎ  ｔｅｒｍｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３１：３１６１−３１７８；およびＳｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４），“Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ，ｃｌｅａｒａｎｃｅ，ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １１１：１８６０１−６。
【００１０】
抗体間の相互作用の最終結果は、粘性溶液を生じる相互作用の一過性ネットワーク（浸透ネットワーク）の延長か、または溶液レオロジーに何らかの影響を及ぼすより大きなオリゴマーをより大きな構造として形成するかのいずれかである。本明細書で報告する研究では、粘性抗体溶液に繋がる可能性のある特異的タンパク質−タンパク質相互作用を推定する試みにおいて、少数の粘性抗体を生化学的および生物物理学的分析の対象として使用した。
過去には、Ａｈｏナンバリングアプローチが、安定性および他の生物物理学的特性を改善するために利用された。Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＶＨ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｇｅｎｅｒａｌｉｚａｂｌｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：１５１７−１５２８；Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），“Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２５：５３１−５５３；Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），“Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：ＣＤＲ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｔｏ  ｓｔａｂｌｅ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４：１８４−１９９；およびＲｏｔｈｌｉｓｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），“Ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔ：ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｄ  Ｆａｂ  ｆｏｒｍａｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ”，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４７：７７３−７８９。Ａｈｏナンバリングシステムはまた、過去において、凝集の傾向を低減するために利用された。Ｂｏｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），米国特許第８，５４５，８４９号明細書。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），“Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ＩｇＧ２  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐＨ  ａｎｄ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．１０２：４２９１−４３０４
【非特許文献２】Ｙａｄａｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），“Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｖｉｓｃｏｕｓ  ｅｆｆｅｃｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．１０１：９９８−１０１１
【非特許文献３】Ｙａｄａｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），”Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈａｒｇｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｎ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ９（４）：７９１−８０２
【非特許文献４】Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４），“Ｄｉｐｏｌｅ−Ｄｉｐｏｌｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ａｔ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ”，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．３１（９）：２５４９−２５５８
【非特許文献５】Ｃｈａｕｄｈｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏａｒｓｅ−ｇｒａｉｎｅｄ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ”，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １１７：１２６９−１２７９
【非特許文献６】Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｆｏｒ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｓａｌｔｓ  ａｓ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ−ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２９：３１０２−３１０９
【非特許文献７】Ｎｅｅｒｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），“Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩｇＧ１  ａｎｄ  ＩｇＧ４  ｓｕｂｃｌａｓｓ−ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．４９：４００−４１０
【非特許文献８】Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２），“Ｗｅａｋ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｇｏｖｅｒｎ  ｔｈｅ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ：ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ”，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１０３：６９−７８
【非特許文献９】Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），“Ｙｅｔ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０
【非特許文献１０】Ｌｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４），“Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ：ｅｘｐｌａｉｎｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｉｎ  ｔｅｒｍｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３１：３１６１−３１７８
【非特許文献１１】Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４），“Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ，ｃｌｅａｒａｎｃｅ，ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １１１：１８６０１−６
【非特許文献１２】Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＶＨ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｇｅｎｅｒａｌｉｚａｂｌｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：１５１７−１５２８
【非特許文献１３】Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），“Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２５：５３１−５５３
【非特許文献１４】Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），“Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：ＣＤＲ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｔｏ  ｓｔａｂｌｅ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４：１８４−１９９
【非特許文献１５】Ｒｏｔｈｌｉｓｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），“Ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔ：ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｄ  Ｆａｂ  ｆｏｒｍａｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ”，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４７：７７３−７８９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、高粘度に関連することが示されているフレームワーク領域および／またはＦｃドメイン中の配列を改変することによって、抗原結合タンパク質の粘度を低下させる方法に関する。
【００１３】
以下のプロセスの詳細において、全ての可変領域アミノ酸はＡｈｏナンバリングによって特定され、保存領域の全てのアミノ酸はＥＵナンバリングによって特定される。Ａｈｏナンバリングは、他の主要なナンバリングスキーム、例えば、ＥＵ（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９６９），“Ｔｈｅ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｔｉｒｅ  ｇａｍｍａ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ，”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．６３，７８−８５）、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２），“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＶＨ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７）；（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），“Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｖ  ｋａｐｐａ  ｄｏｍａｉｎ”，ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：４６２８−４６３８）などとアラインし、相関する。４つのナンバリングシステムのいずれも、本明細書に記載の好ましいアミノ酸置換を特定するために互換的に使用することができる。
【００１４】
抗原結合タンパク質がＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリーを含む場合、この方法は、ＶＨ１配列を、８２Ｘ１、９４Ｘ２および９５Ｘ３から選択される１つ以上の置換を含むように改変することを含む（ここで、Ｘ１は塩基性残基（Ｒ、ＫまたはＨ）であり、Ｘ２は極性無電荷残基（Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱ）であり、Ｘ３は塩基性残基（Ｒ、ＫまたはＨ）である）。全ての残基は、Ａｈｏナンバリングシステムによって特定される。ＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリーの好ましい変異は、８２Ｒ、９４Ｓおよび９５Ｒである。ＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリーに適用されるこの方法は、置換５９Ｘ２０（ここで、Ｘ２０は塩基性残基（Ｒ、ＫまたはＨ）である）、好ましくは変異５９Ｋをさらに含み得る。
【００１５】
抗原結合タンパク質がＶＨ３｜３−３３生殖系列サブファミリーを含む場合、この方法は、ＶＨ３配列を、１Ｘ４、１７Ｘ５および８５Ｘ６から選択される１つ以上の置換を含むように改変することを含む（ここで、Ｘ４は負電荷残基（ＤまたはＥ）であり、Ｘ５は小さい疎水性残基（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬまたはＭ）であり、Ｘ６は小さい疎水性残基（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬまたはＭ）である）。全ての残基は、Ａｈｏナンバリングシステムによって特定される。ＶＨ３｜３−３３生殖系列サブファミリーの好ましい変異は、１Ｅ、１７Ｇおよび８５Ａである。
【００１６】
抗原結合タンパク質がＶＫ３｜Ｌ１６生殖系列サブファミリーを含む場合、この方法は、ＶＫ３配列を、４Ｘ１０、１３Ｘ１１、７６Ｘ１２、７８Ｆ、９５Ｘ１３、９７Ｘ１４および９８Ｐから選択される１つ以上の置換を含むように改変することを含む（ここで、Ｘ１０はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭから選択され、Ｘ１１はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭから選択され、Ｘ１２はＤおよびＥから選択され、Ｘ１３はＲ、ＫおよびＨから選択され、Ｘ１４はＤおよびＥから選択される）。全ての残基は、Ａｈｏナンバリングシステムによって特定される。ＶＫ３｜Ｌ１６生殖系列サブファミリーの好ましい変異は、４Ｌ、１３Ｌ、７６Ｄ、９５Ｒ、９７Ｅおよび９８Ｐである。
【００１７】
抗原結合タンパク質がＶＫ３｜Ｌ６生殖系列サブファミリーを含む場合、この方法は、ＶＫ３配列を、７６Ｘ１２および９５Ｘ１３から選択される１つ以上の置換を含むように改変することを含む。ＶＫ３｜Ｌ６生殖系列サブファミリーの好ましい変異は、７６Ｄおよび９５Ｒである。
【００１８】
本発明の方法はさらに、Ｆｃドメインを、２５３Ｘ１５、４４０Ｘ１６および４３９Ｘ１７から選択される１つ以上の置換を含むように改変することを含む（ここで、Ｘ１５は小さい疎水性残基（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬまたはＭ）であり、Ｘ１６は塩基性残基（Ｒ、ＫまたはＨ）であり、Ｘ１７は負電荷残基（ＤまたはＥ）であり、Ｆｃドメイン配列は４４０Ｘ１６および４３９Ｘ１７の１つのみを含む）。全ての残基は、ＥＵナンバリングシステムによって特定される。Ｆｃドメインの好ましい変異は、２５３Ａ、４４０Ｋおよび４３９Ｅである。
【００１９】
本発明の方法はさらに、Ｆｃドメイン配列のＣ末端を、Ｘ１８Ｘ１９を含むように改変することを含む（ここで、Ｘ１８はＤおよびＥ、またはＨ、ＫおよびＲから選択される１〜４のアミノ酸であり、Ｘ１９はＰ、Ｍ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、ＹおよびＷから選択され、かつＸ１８がＤまたはＥを含むとき存在せず、Ｘ１８がそのＣ末端にＫまたはＲを含むとき存在し、Ｘ１８がそのＣ末端にＨを含むとき存在するかまたは存在しない）。好ましいＦｃ  Ｃ末端の改変は、Ｃ末端にＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、ＥまたはＥＥを含む。
【００２０】
前述の方法は、以下の図１Ａおよび１Ｂに示す高粘度抗体に適用することが好ましい。ＶＨ１｜１−１８配列を含む方法の一部は、好ましくは、図１Ｂの抗体ＡＦ、ＡＫ、ＡＬ、ＡＮおよびＡＯに適用される。ＶＨ３｜３−３３配列を含む方法の一部は、好ましくは、図１Ｂの抗体ＡＱ、ＡＭ、ＡＩおよびＡＧに適用される。ＶＫ３｜Ｌ１６配列を含む方法の一部は、好ましくは、図１Ｂの抗体ＡＦおよびＡＱに適用される。ＶＫ３｜Ｌ６配列を含む方法の一部は、好ましくは、抗体ＡＪに適用される。
【００２１】
本発明の方法はさらに、抗原結合タンパク質および親抗体が同じ濃度で投与された場合、親抗体よりも速く最大血清濃度に達する抗原結合タンパク質を調製する方法を含み、この方法は、親抗体に配列改変４４０Ｘ１６（ここで、Ｘ１６はＲ、ＫおよびＨから選択される）を導入することを含む。好ましい方法では、配列改変抗原結合タンパク質は、皮下注射後、親抗体の少なくとも２倍の速さで最大血清濃度に達する。皮下注射により抗原結合タンパク質および親抗体が同じ濃度で投与された場合、親抗体よりも高い最大血清濃度に達する抗原結合タンパク質を調製する方法もまた本発明の範囲内であり、この方法は、親抗体に配列改変４４０Ｘ１６（ここで、Ｘ１６はＲ、ＫおよびＨから選択される）を導入することを含む。好ましい方法では、配列改変抗原結合タンパク質は、親抗体より少なくとも約２５％高い最大血清濃度に達する。これらの各方法では、好ましいＸ１６はＫであり、好ましい親抗体はＰＣＳＫ９ポリペプチドである（抗体ＡＫが最も好ましい）。
【００２２】
本発明はさらに、以下から選択される１つ以上の配列を含む変異抗原結合タンパク質に関する。
ａ．８２Ｘ１、９４Ｘ２、および９５Ｘ３から選択される１つ以上の置換を含むＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリー配列（ここで、Ｘ１はＲ、ＫおよびＨから選択され、Ｘ２はＳ、Ｔ、ＮおよびＱから選択され、Ｘ３はＲ、ＫおよびＨから選択される）；
ｂ．１Ｘ４、１７Ｘ５および８５Ｘ６から選択される１つ以上の置換を含むＶＨ３｜３−３３生殖系列サブファミリー配列（ここで、Ｘ４はＤおよびＥから選択され、Ｘ５はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭから選択され、Ｘ６はＧ．Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭから選択される）；
ｃ．４Ｘ１０、１３Ｘ１１、７６Ｘ１２、７８Ｆ、９５Ｘ１３、９７Ｘ１４および９８Ｐから選択される１つ以上の置換を含むＶＫ３｜Ｌ１６生殖系列サブファミリー（ここで、Ｘ１０はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭから選択され、Ｘ１１はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭから選択され、Ｘ１２はＤおよびＥから選択され、Ｘ１３はＲ、ＫおよびＨから選択され、Ｘ１４はＤおよびＥから選択され、変異抗原結合タンパク質は置換７８Ｆのみを含むことはない）。
ｄ．７６Ｘ１２および９５Ｘ１３から選択される１つ以上の置換を含むＶＫ３｜ＩＬ６生殖系列サブファミリー；
ｅ．２５３Ｘ１０、４４０Ｘ１１および４３９Ｘ１２から選択される１つ以上の置換を含むＦｃドメイン配列（ここで、Ｘ１０はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭから選択され、Ｘ１１はＲ、ＫおよびＨから選択され、Ｘ１２はＤおよびＥから選択され、Ｘ１６がＫで、かつＸ１７がＥであるとき、抗原結合タンパク質は、２５３Ｘ１５、またはサブパラグラフａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｆから選択される改変の少なくとも１つを含み、また、抗原結合タンパク質はＣＤ２０に特異的に結合する）；ならびに
ｆ．Ｃ末端にＸ１８Ｘ１９を含むＦｃドメイン配列（ここで、Ｘ１８はＤおよびＥ、またはＨ、ＫおよびＲから選択される１〜４のアミノ酸であり、Ｘ１９はＰ、Ｍ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、ＹおよびＷから選択され、かつＸ１８がＤまたはＥを含むとき存在せず、Ｘ１８がそのＣ末端にＫまたはＲを含むとき存在し、Ｘ１８がそのＣ末端にＨを含むとき存在するかまたは存在せず、Ｃ末端にＰＧＫＰ（配列番号３８１）、ＰＧＫＫＰ（配列番号３８２）、ＰＧＫＫＫＰ（配列番号３８３）またはＰＧＥが現れたとき、抗原結合タンパク質は、２５３Ｘ１５、またはサブパラグラフａ〜ｅから選択される置換の少なくとも１つを含み、また、抗原結合タンパク質はＣＤ２０またはＣＤ３８に特異的に結合する）。好ましいＦｃ  Ｃ末端の改変は、Ｃ末端にＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、ＥまたはＥＥを含む。
ここで、可変領域アミノ酸はＡｈｏナンバリングシステムにより番号付けされており、Ｆｃを含む保存領域のアミノ酸はＥＵナンバリングにより番号付けされている。
【００２３】
本発明による好ましい抗原結合タンパク質は、前述の改変が以下の図１Ａおよび１Ｂの抗体に適用されているものである。以下の抗原結合タンパク質もまた好ましい：
【００２４】
ＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリー配列は、８２Ｒ、９４Ｓおよび９５Ｒから選択される１つ以上の置換を含み、このような置換の全てを有する抗原結合タンパク質が最も好ましい；
【００２５】
ＶＨ３｜３−３３生殖系列サブファミリー配列は、１Ｅ、１７Ｇおよび８５Ａから選択される１つ以上の置換を含み、このような置換の全てを有する抗原結合タンパク質が最も好ましい；
【００２６】
ＶＫ３｜Ｌ１６生殖系列サブファミリー配列は、４Ｌ、１３Ｌ、７６Ｄ、９５Ｒ、９７Ｅおよび９８Ｐから選択される１つ以上の置換を含み、このような置換の全てを有する抗原結合タンパク質が最も好ましい；
【００２７】
ＶＫ３｜Ｌ６生殖系列サブファミリー配列は、７６Ｄおよび９５Ｒから選択される１つ以上の置換を含み、このような置換の全てを有する抗原結合タンパク質が最も好ましい；
【００２８】
Ｆｃドメイン配列は、２５３Ａ、４４０Ｋおよび４３９Ｅから選択される１つ以上の置換を含み、このような置換の全てを有する抗原結合タンパク質が最も好ましい；そして
【００２９】
ＦｃドメインのＣ末端は、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）およびＥから選択される配列を含む。
【００３０】
可変領域における上記の好ましいアミノ酸置換は全て、Ａｈｏナンバリングシステムによって特定される。Ｆｃを含む保存領域における残基は全て、ＥＵナンバリングシステムによって特定される。
【００３１】
本発明による好ましい抗原結合タンパク質には、上記のＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリー置換の１つ以上、最も好ましくは全てを有する、図１Ｂに記載の抗体ＡＦ、ＡＫ、ＡＬ、ＡＮおよびＡＯ；ＶＨ３｜３−３３生殖系列サブファミリー置換の１つ以上、最も好ましくは全てを有する、図１Ｂに記載の抗体ＡＱ、ＡＭ、ＡＩおよびＡＧ；ＶＫ３｜Ｌ１６生殖系列サブファミリー置換の１つ以上、最も好ましくは全てを有する、抗体ＡＦおよびＡＱ；ＶＫ３｜Ｌ６生殖系列サブファミリー置換の１つ以上、最も好ましくは全てを有する、図１Ｂに記載の抗体ＡＪ；および上記のＦｃ置換の１つ以上、好ましくは全てを有する、図１Ｂに記載の抗体ＢＡ、ＡＨおよびＡＮが含まれる。
【００３２】
上記の配列改変により、本発明はさらに、配列番号３５２、３５３、３５４、３６６および３６８から選択される重鎖配列を含み、好ましくは配列番号３５１の軽鎖配列も含む、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質に関する。
【００３３】
上記の配列改変により、本発明はまた、配列番号３５６、３５７および３５８から選択される重鎖配列を含み、好ましくは配列番号３５５の軽鎖配列をさらに含む、ｃ−ｆｍｓに特異的に結合する抗原結合タンパク質に関する。
【００３４】
上記の配列改変により、本発明はまた、配列番号３５９、３６１、３６２、３６４および３６８から選択される重鎖配列を含み、好ましくは配列番号３６０、３６３、３６５および３６７から選択される軽鎖配列をさらに含む、ＧＩＰＲに特異的に結合する抗原結合タンパク質に関する。
【００３５】
全ての改変抗原結合タンパク質は、未改変の抗体について以前に記載されたものと同じ兆候に有用である。
【００３６】
変異した重鎖を有する図１Ａおよび１Ｂからの各抗原結合タンパク質は、図１Ａおよび１Ｂの未改変の親抗体に記載されるような軽鎖配列をさらに含むことが好ましい。変異した軽鎖を有する前述の各抗原結合タンパク質は、上記のような、または図１Ａおよび１Ｂの未改変の親抗体に見られるような重鎖配列をさらに含むことが好ましい。
【００３７】
本発明は、改善された薬物動態学的特性を有する、上記の抗原結合タンパク質をさらに含む。本発明は、上記の配列改変のいずれかを任意選択的に有する抗原結合タンパク質であって、
ａ．４４０Ｘ１６配列改変を欠く親抗体に対して配列改変４４０Ｘ１６を含み、
ｂ．皮下注射により抗原結合タンパク質および親抗体が同じ濃度で投与された場合に、親抗体よりも速く最大血清濃度に達し、かつ
ｃ．皮下注射により抗原結合タンパク質および親抗体が同じ濃度で投与された場合に、親抗体よりも高い最大血清濃度に達する
抗原結合タンパク質を含む。
このような抗原結合タンパク質の好ましい親抗体は、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドであり、抗体ＡＫが最も好ましい。このような抗原結合タンパク質における好ましい置換基Ｘ１６はＫである。さらに、このような抗原結合タンパク質で高コレステロール血症を治療する方法も、本発明の範囲内である。
【００３８】
本発明はまた、本発明の抗原結合タンパク質をコードする単離された核酸、ならびに核酸を含むベクター、ベクターを含む宿主細胞、および抗原結合タンパク質を作製し、使用する方法に関する。
【００３９】
他の実施形態では、本発明は、抗原結合タンパク質を含む組成物、および抗原結合タンパク質を含むキット、ならびに抗原結合タンパク質を含む製品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、ｐＨ５．２の２０ｍＭ酢酸塩および９％スクロースを含む製剤緩衝液（ポリソルベートなし）中、１５０ｍｇ／ｍＬで製剤化されたＩｇＧ１およびＩｇＧ２モノクローナル抗体について測定された粘度値の表を示す。図１Ａおよび１Ｂは、試験された抗体の標的、ならびにそれらの軽鎖および重鎖のタイプ、生殖系列サブファミリー、濃度、ｐＩおよび粘度を示す。図１Ａおよび１Ｂ中の各抗体は、図および配列表に示すアミノ酸配列を有する。重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、配列表においてそれらの直前の配列番号を有する核酸によってコードされる。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、ｐＨ５．２の２０ｍＭ酢酸塩および９％スクロースを含む製剤緩衝液（ポリソルベートなし）中、１５０ｍｇ／ｍＬで製剤化されたＩｇＧ１およびＩｇＧ２モノクローナル抗体について測定された粘度値の表を示す。図１Ａおよび１Ｂは、試験された抗体の標的、ならびにそれらの軽鎖および重鎖のタイプ、生殖系列サブファミリー、濃度、ｐＩおよび粘度を示す。図１Ａおよび１Ｂ中の各抗体は、図および配列表に示すアミノ酸配列を有する。重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、配列表においてそれらの直前の配列番号を有する核酸によってコードされる。
【図１Ｃ】図１Ｃおよび１Ｄは、図１Ａおよび１Ｂの抗体のフレームワーク領域およびＦｃ領域の配列識別番号（配列番号）を示す。図１Ｄはまた、抗体ＢＡを示し、これは、図１７において説明する。
【図１Ｄ】図１Ｃおよび１Ｄは、図１Ａおよび１Ｂの抗体のフレームワーク領域およびＦｃ領域の配列識別番号（配列番号）を示す。図１Ｄはまた、抗体ＢＡを示し、これは、図１７において説明する。
【図２】図２は、本明細書において確認された高粘度および低粘度サブタイプ対を示す。
【図３】図３は、力価、最終生細胞密度（ＶＣＤ）、および細胞培養７日後の採取時の生存率の相対値を含む、ＡＫおよびＡＯ抗体分子ならびにそれらの変異体の発現結果を示す。ＡＫ値が１００％である。
【図４】図４は、ＡＫ親抗体（ＡＫ対照、ＡＫ）およびそれらの変異体の効力を示す。
【図５】図５は、親ＡＫ抗体および親ＡＯ抗体に対する変異体の粘度を示す。４３個の抗体のセットからの高粘度ＶＨ１｜１−１８および低粘度ＶＨ１｜１−０２の平均粘度値も比較のために示す。
【図６】図６は、高粘度ＶＨ１｜１−１８サブタイプおよび低粘度ＶＨ１｜１−０２サブタイプのｍＡｂの測定粘度値対計算による全分子ｐＩ値を示す。ＡＫ抗体およびＡＯ抗体の低粘度変異体も示す。
【図７】図７は、高粘度ＶＨ３｜３−３３サブタイプおよび低粘度ＶＨ３｜３−０７サブタイプのｍＡｂの測定による粘度値対計算による全分子ｐＩ値を示す。低粘度変異体ＡＱ（１、１７、８５）も示す。
【図８】図８は、高粘度ＶＫ３｜Ｌ１６およびＶＫ３｜Ｌ６サブファミリーならびに低粘度ＶＫ３｜Ａ２７サブファミリーを有するｍＡｂの測定による粘度値対計算による全分子ｐＩ値を示す。低粘度変異体ＡＱ（４  １３  ７６  ９５  ９７  ９８）も示す。
【図９】図９は、ｍＡｂの高粘度ＶＨ１｜１−１８サブタイプおよび低粘度ＶＨ１｜１−０２サブタイプ（生殖系列）のグローバル配列パラメータを示す表である。図９のｍＡｂは、粘度によって分類されている。表は、それらのｍＡｂ記号、測定された粘度値、計算されたｐＩ値、ならびにＶＬおよびＶＨ生殖系列を含む。ＶＨ生殖系列については、より高い粘度のＶＨ１｜１−１８は太字で示され、かつ下線を引いてある。重鎖フレームワーク３の配列を示す。高粘度と相関する残基は太字で示され、かつ下線を引いてある。ＶＨ１｜１−１８およびＶＨ１｜１−０２生殖系列サブファミリーについて、異なる残基がサブファミリーの典型的な残基であることを示すために、比較のためのＶベース配列が追加されている。
【図１０】図１０は、ＡＫおよびＡＯ抗体が生成されかつ特徴付けされた変異体を示す表である。
【図１１】図１１は、ＶＨ３重鎖を有する１３個のｍＡｂのグローバル配列パラメータを示す表である。図１１は、ｍＡｂ記号、測定された粘度値、計算されたｐＩ値、ＨＣおよびＬＣタイプ、ならびにＶＬおよびＶＨサブタイプ（生殖系列）を含む。より高い粘度のＶＨ３｜３−３３サブファミリーは、太字で示され、かつ下線を引いてある。高粘度と相関する残基は太字で示され、かつ下線を引いてある。ＶＨ３｜３−３３およびＶＨ３｜３−０７生殖系列サブファミリーについて、異なる残基がそれらのサブファミリーの典型的なものであることを示すために、比較のためのＶベース配列が追加されている。
【図１２】図１２は、ＶＨ３軽鎖を有する１４個のｍＡｂのグローバル配列パラメータを示す表である。図１２のｍＡｂは、粘度によって分類されており、ｍＡｂ記号、測定された粘度値、計算されたｐＩ値、ＨＣおよびＬＣタイプ、ならびにＶＬおよびＶＨサブタイプ（生殖系列）を含む。より高い粘度のＶＫ３｜Ｌ１６およびＶＫ３｜Ｌ６サブファミリーは太字で示され、かつ下線を引いてある。ＶＫ３｜Ａ２７サブファミリーと比較して、ＶＫ３｜Ｌ１６とＶＫ３｜Ｌ６サブファミリーとの間で一貫して異なっている軽鎖残基を右側に示す。ＶＫ３｜Ｌ１６およびＶＫ３｜Ｌ６サブファミリーの高粘度と関連する残基は太字で示され、かつ下線を引いてある。ＶＫ３｜Ｌ１６およびＶＫ３｜Ａ２７生殖系列サブファミリーについては、異なる残基がサブファミリーの典型的な残基であることを示すために、比較のためのＶベース配列が追加されている。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、特定の重鎖および軽鎖生殖系列ファミリーならびにＶＨ１、ＶＨ３およびＶＫ３の生殖系列サブファミリーを含む無傷の抗体分子についての、測定された粘度および計算されたｐＩ値の平均値を示す。Ｘ軸は、ファミリー、および各ファミリーおよびサブファミリーのメンバーの数を含む。
【図１４Ａ】図１４Ａは、Ｆｃ−Ｆｃ相互作用表面における変異が溶液粘度を低下させ得ることを示す。抗体ＡＫおよび抗体ＡＫ変異体Ｉ２５３ＡおよびＳ４４０Ｋの濃度の粘度を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、野生型補体活性を回復させる二重変異体が野生型粘度も回復させることを示す。図は、抗体ＡＫ、抗体ＡＫ変異体Ｉ２５３Ａ、抗体ＡＫ変異体Ｓ４４０Ｋ、および抗体ＡＫ二重変異体Ｋ４３９Ｅ／Ｓ４４０Ｋの濃度の粘度を示す。この図はまた、抗体ＡＫ変異体Ｋ４３９Ｅ、抗体ＡＫ変異体Ｈ４３３Ａ、および抗体ＡＫ変異体Ｎ４３４Ａの粘度を示し、これらは抗体ＡＫ親と比較して粘度を低下させない。
【図１５】図１５は、親抗体ＡＫおよび種々の変異体の絶対粘度値および相対粘度値を示す表である。親抗体ＡＫおよび変異体は、抗体ＡＫおよび低粘度変異体の薬物動態および薬力学の非ヒト霊長類研究に使用される。
【図１６】図１６は、ＥＤＣ化学架橋の模式図である（実施例２を参照）。
【図１７】図１７は、低粘度変異体に対するＦｃ変異のために選択されたタンパク質の粘度を示す表である。
【図１８】図１８は、抗体ＡＨのＥＤＣ化学架橋による抗体系オリゴマーの濃度依存性生成を示す。
【図１９】図１９Ａは、Ｆｃ領域におけるＳ４４０Ｋ変異が抗体ＡＱにおける粘度を低下させることを示す。（変異体の濃度は実際には１５０ｍｇ／ｍＬであることに留意されたい。）図１９Ｂは、指数関数的当てはめをした同じデータの散布図である。図１９Ｂの菱形は、示した濃度での未改変抗体ＡＱを示し、四角は１５０ｍｇ／ｍＬでのＳ４４０Ｋ変異体を示す。
【図２０】図２０Ａは、測定された濃度および粘度を含む、抗体ＡＱが産生され、特徴付けられた変異体を示す表である。図２０Ｂは、ＧＩＰによって活性化され、抗ＧＩＰＲ抗体によってブロックされたヒトＧＩＰ受容体を発現する２９３／ｈｕＧＩＰＲ細胞のｃＡＭＰ応答を示す。インビトロｃＡＭＰ活性は、粘度変異によっても同様に影響を受けなかった。効力は、アッセイの許容誤差内で同じであった。
【図２１】図２１は、以下の実施例においてさらに詳細に記載される、雄カニクイザルにおける単回投与皮下ボーラス薬物動態試験のための実験計画の概要を示す。
【図２２】図２２は、雄カニクイザル（Ｎ＝４匹の雄）に１０ｍｇ／ｋｇを皮下投与した後の抗体ＡＫまたは低粘度変異体ホモログの平均薬物動態パラメータ推定値を示す。粘度を低下させるＦｃ領域における変異の導入は、Ｔｍａｘを低下させ、Ｃｍａｘを増加させる。
【図２３】図２３は、予備試験（Ｄａｙ  ＣＬＡＢ）と比較したＬＤＬ−Ｃのパーセンテージを示す。＊変化率は、投与後の個々の動物の値を１日目の予備試験値で除したもので表す。４個の抗体（親抗体ＡＫ、ＡＫ  Ｆｃ変異体、ＡＫ  Ｆａｂ変異体、およびＡＫ  Ｆｃ／Ｆａｂ二重変異体）はいずれもＬＤＬ−Ｃの低下を誘発する。
【図２４】図２４Ａおよび２４Ｂは、血漿中の薬物動態プロファイル（μｇ／ｍＬ）を、対応する低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）濃度（ｍｇ／ｄＬ）プロファイルとともに示す。ＬＤＬ濃度および試験品の血清濃度は、４匹の動物の平均値で示す。実線を有する黒丸は、親抗体ＡＫの血清濃度を示す。破線を有する白四角は、Ｆａｂ変異を有する抗体の血清濃度を示す。実線を有する黒三角は、Ｆｃ変異を有する抗体の血清濃度を示す。破線を有する白菱形は、ＦａｂおよびＦｃの両変異を有する抗体の血清濃度を示す。これらのデータは、抗体製剤の粘度を低下させるＦｃ領域における変異の存在がＴｍａｘまでの時間の短縮およびより高いＣｍａｘをもたらすことを示す。親抗体の全ての変異体形態は、血清ＬＤＬ−Ｃを低下させる能力を保持している（下パネル）。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
用語の定義
以下の記載においては、多くの用語が広く用いられている。本発明の理解を容易にするために、以下の定義を提供する。
【００４２】
特に明記しない限り、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」および「少なくとも１つ」は、互換的に使用され、１つまたは２つ以上を意味する。
【００４３】
「抗原結合タンパク質」は、それが結合する別の分子（抗原）に対して強い親和性を有する抗原結合領域または抗原結合部分を含むタンパク質またはポリペプチドを指す。抗原結合タンパク質は、抗体、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体）、抗体誘導体、抗体アナログ、融合タンパク質、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む抗原受容体を包含する。
【００４４】
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は特異的抗原に対し結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体および抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によっては低いレベルで、また骨髄腫によっては高いレベルで産生される。したがって、本明細書中で使用される場合、用語「抗体」または「抗体ペプチド」は無傷な抗体、本明細書中に開示される抗体と特異的結合を競合する抗体、または、無傷な抗体と特異的結合を競合するその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体）を指し、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および二重特異性抗体を含む。特定の実施形態では、抗原結合フラグメントは、例えば、組換えＤＮＡ技術によって作製される。さらなる実施形態では、抗原結合フラグメントは、無傷の抗体の酵素的または化学的切断によって作製される。抗原結合フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および一本鎖抗体が含まれるが、これらに限定されない。本発明での使用に好適な例には、限定されないが、図１Ａおよび１Ｂに挙げた抗体、ならびにアバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アラシズマブペゴール、ＡＬＤ５１８、アレムツズマブ、アリロクマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトクス、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アチヌマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、トシリズマブ、バピヌズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビバツズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カンツズマブメルタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カツマキソマブ、ＣＣ４９、セデリズマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、シタツズマブボガトクス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、クレネズマブ、ＣＲ６２６１、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デミシズマブ、デノスマブ、デツモマブ、ドルリモマブアリトクス、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュピルマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エナバツズマブ、エンリモマブペゴール、エノキズマブ、エノキズマブ、エノチクマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エレヌマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エボロクマブ、エキシビビルマブ、エキシビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、ＦＢＴＡ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、ＧＳ６６２４、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブラブタンシン、インフリキシマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ、リビビルマブ、リゲリズマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マスリモマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトクス、ムロモナブ−ＣＤ３、ナコロマブタフェナトクス、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトクス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オデュリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パジバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピジリズマブ、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポネズマブ、プレザルマブ、プリリキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ１４０、クイリズマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラァフィビルマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレデュマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブペンデチデ、セクキヌマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブパプトクス、テフィバズマブ、テリモマブアリトクス、テナツモマブ、テフィバズマブ、テリモマブアリトクス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、テゼペルマブ、ＴＧＮ１４１２、トレメリムマブ、チシリムマブ、チルドラキズマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トシリズマブ、トラリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビシリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマフォドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブ、およびゾリモマブアリトクスが含まれる。
【００４５】
用語「単離された抗体」は、本明細書中で使用される場合、その天然環境の成分から識別され、分離および／または回収された抗体を指す。その天然環境の汚染成分は、抗体の診断用途または治療用途を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法による決定で抗体が９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を十分に得られる程度まで、あるいは（３）クマシーブルー、または好ましくは銀染色を用い、還元条件下または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質になるまで、精製される。単離された抗体には、その抗体の天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないので、組換え細胞内にインサイチュで存在する抗体が含まれる。しかし、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００４６】
抗原または他のポリペプチドの「結合する（している）」という用語は、本発明のリガンドポリペプチドの受容体への結合；本発明の受容体ポリペプチドのリガンドへの結合；本発明の抗体の抗原またはエピトープへの結合；本発明の抗原またはエピトープの抗体への結合；本発明の抗原の抗イディオタイプ抗体への結合；本発明の抗イディオタイプ抗体のリガンドへの結合；本発明の抗イディオタイプ抗体の受容体への結合、本発明の抗抗イディオタイプ抗体のリガンド、受容体または抗体への結合などを含むが、これらに限定されない。
【００４７】
用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。免疫グロブリンの１つの形態が、抗体の基本的構造単位を構成する。この形態は四量体であり、各々１本の軽鎖と１本の重鎖を持つ２つの同一の免疫グロブリン鎖対からなる。各々の対では、軽鎖および重鎖の可変領域が一緒に、抗原への結合を担い、定常領域は抗体エフェクター機能を担う。
【００４８】
完全長免疫グロブリンの「軽鎖」（約２５Ｋｄまたは約２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端の可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸）、およびＣＯＯＨ末端のカッパまたはラムダ定常領域遺伝子によってコードされる。完全長免疫グロブリンの「重鎖」（約５０Ｋｄまたは約４４６アミノ酸）は、同様に、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）および他の前述の定常領域遺伝子（約３３０アミノ酸）の１つによってコードされる。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４など）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥとして定義する。軽鎖および重鎖において、可変領域および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はまた、約１０以上のアミノ酸からなる「Ｄ」領域を含む。（一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９））、Ｃｈａｐｔｅｒ７を参照されたい（全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる）。
【００４９】
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインまたは領域は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）によって中断される「フレームワーク領域」（ＦＲ）を含む。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる）。ＦＲ残基は、本明細書で定義されるＣＤＲ領域残基以外の可変ドメイン残基である。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。したがって、「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的に同一（約８５％以上、通常９０〜９５％以上）のフレームワーク領域である。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域は、ＣＤＲを配置し、整列させる機能を有する。ＣＤＲは、主として抗原のエピトープへの結合に関与している。したがって、「ヒト化」免疫グロブリンという用語は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（通常、マウスまたはラット）免疫グロブリン由来の１つ以上のＣＤＲとを含む免疫グロブリンを指す。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。定常領域は存在する必要はないが、存在する場合、それらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％以上同一でなければならない。したがって、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、おそらくＣＤＲを除いて、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。さらに、最適な抗原結合親和性および特異性を保持するために、ヒトフレームワーク領域中の１つ以上の残基を親配列に逆変異させてもよい。このようにして、非ヒト親抗体由来のいくつかのフレームワーク残基は、その免疫原性を最小限に抑えながら親抗体の結合特性を保持するために、ヒト化抗体中に保持される。用語「ヒトフレームワーク領域」は、本明細書で使用される場合、そのような逆変異を有する領域を含む。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖の免疫グロブリンを含む抗体である。例えば、ヒト化抗体は、例えば、キメラ抗体の可変領域全体が非ヒトであるため、以下に定義されるような典型的なキメラ抗体を包含しない。
【００５０】
本発明のモノクローナル抗体および抗体コンストラクトは、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来するか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であり、一方、鎖の残りは、所望の生物学的活性を示す限り、別の種に由来するか、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５）。本明細書において興味深いキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界サル、Ａｐｅなど）に由来する可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「原始化（ｐｒｉｍｉｔｉｚｅｄ）」抗体が含まれる。キメラ抗体を作製するための様々な方法が記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号明細書；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第０１７１４９６号明細書；欧州特許第０１７３４９４号明細書；および英国特許第２１７７０９６号明細書を参照されたい。
【００５１】
「ヒト抗体」および「完全ヒト抗体」という用語はそれぞれ、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子を導入した動物から単離された抗体を含む、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有し、内因性免疫グロブリンを発現しない抗体、例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）抗体、およびＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．によって米国特許第５，９３９，５９８号明細書に記載されているような抗体を指す。
【００５２】
用語「遺伝子改変抗体」は、アミノ酸配列が天然の抗体の配列から改変された抗体を意味する。抗体の生成における組換えＤＮＡ技術の関連性のために、天然の抗体に見出されるアミノ酸の配列に限定される必要はなく、抗体は、所望の特性を得るために再設計することができる。多くの可能なバリエーションがあり、その範囲は、たった１個または数個のアミノ酸への変化から、例えば可変領域および／または定常領域の完全な再設計にまで及ぶ。定常領域の変化は、一般に、補体の結合、膜との相互作用、および他のエフェクター機能、ならびに製造性および粘度などの特性を改善または変更するために行われる。可変領域における変更は、抗原結合特性を改善するために行われる。
【００５３】
「Ｆａｂフラグメント」は、１本の軽鎖と、１本の重鎖のＣＨ１および可変領域とからなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【００５４】
「Ｆａｂ’フラグメント」は、１本の軽鎖と、２本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）２分子を形成し得るように、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域のより多くを含む１本の重鎖とを含む。
【００５５】
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、２本の軽鎖と、２本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含む２本の重鎖とを含む。
【００５６】
用語「Ｆｖフラグメント」および「一本鎖抗体」は、重鎖および軽鎖の両方の抗体可変領域を含むが、定常領域は欠くポリペプチドを指す。抗体全体と同様に、それは特異的抗原に選択的に結合することができる。わずか約２５ｋＤａの分子量のＦｖフラグメントは、２本の重タンパク質鎖および２本の軽鎖から構成される通常の抗体（１５０〜１６０ｋＤ）よりもはるかに小さく、Ｆａｂフラグメント（約５０ｋＤａ、１本の軽鎖および半分の重鎖）よりもさらに小さい。
【００５７】
「単一ドメイン抗体」は、単一ドメインＦｖ単位、例えば、ＶＨまたはＶＬからなる抗体フラグメントである。抗体全体と同様に、それは特異的抗原に選択的に結合することができる。わずか１２〜１５ｋＤａの分子量の単一ドメイン抗体は、２本の重タンパク質鎖および２本の軽鎖から構成される通常の抗体（１５０〜１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さく、Ｆａｂフラグメント（約５０ｋＤａ、１本の軽鎖および半分の重鎖）および一本鎖可変フラグメント（約２５ｋＤａ、２つの可変ドメイン、軽鎖由来の１つおよび重鎖由来の１つ）よりもさらに小さい。第１の単一ドメイン抗体を、ラクダ科の動物に見出される重鎖抗体から遺伝子工学により操作した。単一ドメイン抗体に関する研究のほとんどは、現在、重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖に由来するナノボディもまた、標的エピトープに特異的に結合することが示されている。
【００５８】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、ハイブリドーマ技術によって生成された抗体に限らない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を指し、それを生成する方法を指すものではない。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、それが由来する抗体のヒト抗原を選択的に阻害する。例えば、本明細書に記載のように置換された抗体ＡＦの配列を有する抗原結合タンパク質は、抗体ＡＦの図１Ｂの抗原を選択的に阻害する。抗体またはその機能的フラグメントは、特異的受容体の阻害アッセイにおける抗体のＩＣ５０が別の「参照」リガンドまたは受容体の阻害アッセイにおけるＩＣ５０よりも少なくとも５０倍低い場合、他の受容体またはリガンドと比較してその特異的受容体またはリガンドを「選択的に阻害」する。「ＩＣ５０」は、生物学的または生化学的機能の５０％阻害を達成するのに必要な用量／濃度である。放射性リガンドの場合、ＩＣ５０は、放射性リガンドの特異的結合の５０％を置換する競合リガンドの濃度である。任意の特定の物質またはアンタゴニストのＩＣ５０は、用量反応曲線を構築し、特定の機能アッセイにおけるアゴニスト活性の逆転に対する異なる濃度の薬物またはアンタゴニストの効果を試験することによって決定され得る。アゴニストの最大の生物学的応答の半分を阻害するのに必要な濃度を決定することにより、ＩＣ５０値を所与のアンタゴニストまたは物質について算出することができる。したがって、例えば、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその機能的フラグメントのＩＣ５０値は、機能的アッセイにおいてヒトＰＣＳＫ９受容体の活性化におけるＰＣＳＫ９の最大生物学的応答の半分を阻害するのに必要な抗体またはフラグメントの濃度を決定することによって算出することができる。特定のリガンドまたは受容体を選択的に阻害する抗体またはその機能的フラグメントは、そのリガンドまたは受容体に関する中和抗体または中和フラグメントであると理解される。したがって、いくつかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体または機能的フラグメントは、ヒトＰＣＳＫ９の中和抗体または中和フラグメントである。
【００６０】
本発明の置換抗原結合タンパク質は、それらが由来する非置換抗体を交差ブロックすることができる。用語「交差ブロック（する）」、「交差ブロック（された）」、および「交差ブロック（すること）」は、本明細書において互換的に使用され、他の抗原結合タンパク質（例えば、抗体または結合フラグメント）の標的（例えば、ヒトＰＣＳＫ９）への結合を妨害する抗原結合タンパク質の能力を意味する。抗体または結合フラグメントが標的への別の結合を妨害することができる程度、したがって、それが交差ブロックすると言うことができるか否かは、競合結合アッセイによって決定することができる。いくつかの実施形態では、本発明の交差ブロック性抗原結合タンパク質は、標的抗原に対する参照抗体の結合を、約４０％〜１００％、例えば約６０％〜約１００％、特に好ましくは約７０％〜１００％、より好ましくは約８０％〜１００％低減する。交差ブロックを検出するための特に好適な定量アッセイは、表面プラズモン共鳴技術を用いて相互作用の程度を測定するＢｉａｃｏｒｅ機を用いる。別の好適な交差ブロック定量アッセイは、ＦＡＣＳベースのアプローチを使用して、標的抗原に対する抗体の結合に関して抗体間の競合を測定する。
【００６１】
用語「核酸」または「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されたフラグメント、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成されたフラグメントなどのポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチドの単量体（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）、もしくは天然ヌクレオチドのアナログ（例えば、天然に存在するヌクレオチドのアルファ−エナンチオマ型）、または両者の組み合わせから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンまたはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖修飾には、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基による１つもしくは複数のヒドロキシル基の置換が含まれ、または糖は、エーテルもしくはエステルとして官能基が付加され得る。さらに、糖部分全体を、アザ糖および炭素環式糖アナログなどの、立体的および電子的に類似の構造体で置換することができる。塩基部分の修飾の例には、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、またはその他のよく知られた複素環式置換体が含まれる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合、またはそのような結合の類似結合によって結合され得る。ホスホジエステル結合の類似結合には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニリダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホロアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）などが含まれる。「核酸分子」という用語には、ポリアミド骨格に結合した天然に存在する、または修飾した核酸塩基を含む、いわゆる「ペプチド核酸」もまた含まれる。核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。
【００６２】
「核酸分子の相補体」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して逆方向の相補的ヌクレオチド配列を有する核酸分子を指す。
【００６３】
「縮重ヌクレオチド配列」という用語は、ポリペプチドをコードする参照核酸分子と比較して１つまたは複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を意味する。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、ＧＡＵおよびＧＡＣトリプレットはそれぞれＡｓｐをコードする）。
【００６４】
「単離された核酸分子」とは、生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれていない状態の核酸分子である。例えば、細胞のゲノムＤＮＡから分離された抗体の重鎖をコードするＤＮＡ分子は、単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物のゲノムに組み込まれていない、化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種の染色体の完全なＤＮＡ分子よりも小さい。
【００６５】
「核酸分子コンストラクト」は、天然には存在しない配置で組み合わされ、並置された核酸の断片を含むように、ヒトの介入によって改変されている、一本鎖または二本鎖の核酸分子である。
【００６６】
「相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）」は、酵素逆転写酵素によってｍＲＮＡ鋳型から形成される一本鎖ＤＮＡ分子である。一般に、ｍＲＮＡの一部と相補的なプライマーが、逆転写の開始に用いられる。当業者はまた、そのような一本鎖ＤＮＡ分子とその相補的ＤＮＡ鎖とからなる二本鎖ＤＮＡ分子を指して、「ｃＤＮＡ」という用語を使用する。「ｃＤＮＡ」という用語はまた、ＲＮＡ鋳型から合成されたｃＤＮＡ分子のクローンを指す。
【００６７】
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。一般に、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近い、遺伝子の５’非コード領域に位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列エレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴づけられる場合が多い。これらのプロモーターエレメントには、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＴＡＴＡ配列、ＣＡＡＴ配列、分化特異的エレメント（ＤＳＥ；ＭｃＧｅｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，７：５５１）、環状ＡＭＰ反応エレメント（ＣＲＥ）、血清反応エレメント（ＳＲＥ；Ｔｒｅｉｓｍａｎ（１９９０）、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．，１：４７）、グルココルチコイド反応エレメント（ＧＲＥ）、および他の転写因子の結合部位、例えば、ＣＲＥ／ＡＴＦ（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１９９３８）、ＡＰ２（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：２５７２８），ＳＰ１，ｃＡＭＰ反応エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ；Ｌｏｅｋｅｎ（１９９３），Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．，３：２５３）および八量体因子（一般に、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），ｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，ａｎｄ  Ｌｅｍａｉｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３０３：１を参照）。プロモーターが誘導性プロモーターである場合には、転写速度は誘導物質に応じて増大する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合には、転写速度は誘導物質による調節を受けない。抑制プロモーターもまた知られている。
【００６８】
「調節エレメント」は、コアプロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。例えば、調節エレメントは、特定の細胞、組織、または細胞小器官において独占的にまたは優先的に転写を可能にする細胞因子と結合する核酸配列を含み得る。このような種類の調節エレメントは、通常、「細胞特異的」、「組織特異的」、または「細胞小器官特異的」方法で発現する遺伝子と関連している。
【００６９】
「エンハンサー」は、転写開始部位に対するエンハンサーの距離または方向にかかわらず、転写効率を増大させることができる調節エレメントの一種である。
【００７０】
「異種ＤＮＡ」は、所与の宿主細胞内に天然では存在しないＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子の集団を指す。特定の宿主細胞に対して異種であるＤＮＡ分子は、宿主ＤＮＡが非宿主ＤＮＡ（すなわち、外因性ＤＮＡ）と結合している限り、宿主細胞種に由来するＤＮＡ（内因性ＤＮＡ）を含み得る。例えば、転写プロモーターを含む宿主ＤＮＡ断片に作動可能に連結したポリペプチドをコードする非宿主ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子であると見なされる。逆に、異種ＤＮＡ分子は、外因性プロモーターと作動可能に連結した内因性遺伝子を含み得る。別の説明として、野生型細胞に由来する遺伝子を含むＤＮＡ分子は、そのＤＮＡ分子が野生型遺伝子を欠く変異細胞に導入される場合、異種ＤＮＡと見なされる。
【００７１】
「発現ベクター」は、宿主細胞において発現する遺伝子をコードする核酸分子である。通常、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子、および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの制御下に置かれ、そして、このような遺伝子はプロモーター「に作動可能に連結されている」と言われる。同様に、調節エレメントおよびコアプロモーターは、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合、作動可能に連結されている。
【００７２】
「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターなどの異種核酸分子を含む細胞である。本文脈において、組換え宿主の例は、発現ベクターから本発明のアンタゴニストを産生する細胞である。対照的に、このようなアンタゴニストは前記アンタゴニストの「天然源」であり、発現ベクターを欠く細胞によって産生され得る。
【００７３】
「アミノ末端」および「カルボキシル末端」という用語は、本明細書においては、ポリペプチド内の位置を示すために用いられる。その状況が可能である場合、これらの用語は、近接していることまたは相対位置を示すために、ポリペプチドの特定の配列または部分に関して用いられる。例えば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端側に位置する特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端に近接して位置するが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル末端に位置するとは限らない。
【００７４】
「融合タンパク質」は、少なくとも２つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現するハイブリッドタンパク質である。例えば、融合タンパク質は、親和性マトリックスまたは目的の別の標的に結合するポリペプチドと融合した抗体重鎖の少なくとも一部を含み得る。
【００７５】
用語「受容体」は、「リガンド」と呼ばれる生物活性分子に結合する細胞関連タンパク質を意味する。この相互作用は、細胞に対するリガンドの効果を媒介する。受容体は、膜結合型、細胞質ゾル型または核型；単量体（例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、ベータアドレナリン受容体）または多量体（例えば、ＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、ＩＬ−３受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、エリスロポエチン受容体およびＩＬ−６受容体）であり得る。膜結合受容体は、細胞外リガンド結合ドメインと、通常、シグナル伝達に関与する細胞内エフェクタードメインとを含むマルチドメイン構造を特徴とする。特定の膜結合受容体において、細胞外リガンド結合ドメインおよび細胞内エフェクタードメインは、完全な機能的受容体を含む別々のポリペプチドに位置する。一般に、リガンドの受容体への結合は、エフェクタードメインと細胞中の他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体の構造変化をもたらし、これは次に、細胞の代謝の変化をもたらす。受容体−リガンド相互作用にしばしば関連する代謝事象には、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、環状ＡＭＰ産生の増加、細胞カルシウムの動員、膜脂質の動員、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解、およびリン脂質の加水分解が含まれる。
【００７６】
「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。例えば、構造遺伝子の場合、発現は、構造遺伝子のｍＲＮＡへの転写、およびｍＲＮＡから１つまたは複数のポリペプチドへの翻訳を含む。
【００７７】
「補体／抗補体対」という用語は、適切な条件下で非共有結合した安定な対を形成する異なる部分を示す。例えば、ビオチンおよびアビジン（またはストレプトアビジン）は、補体／抗補体対の原型的なメンバーである。他の例示的な補体／抗補体対には、受容体／リガンド対、抗体／抗原（またはハプテンまたはエピトープ）対、センス／アンチセンスポリヌクレオチド対などが含まれる。補体／抗補体対のその後の解離が望ましい場合、補体／抗補体対は、１０９Ｍ−１未満の結合親和性を有することが好ましい。
【００７８】
「検出可能な標識」とは、抗体部分と結合して診断に有用な分子を生じる分子または原子である。検出可能な標識の例には、キレート剤、光活性剤、放射性同位体、蛍光剤、常磁性イオン、またはその他のマーカー部分が含まれる。
【００７９】
「親和性タグ」という用語は、本明細書においては、第２ポリペプチドの精製もしくは検出を提供するか、または基質に対して第２ポリペプチドを付着させるための部位を提供する目的で、第２ポリペプチドに結合し得るポリペプチド断片を示すために用いられる。原理的には、抗体またはその他の特異的な結合剤が利用できる任意のペプチドまたはタンパク質を、親和性タグとして使用することができる。親和性タグには、ポリヒスチジントラクト、プロテインＡ（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５），ＥＭＢＯ  Ｊ．４：１０７５；Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８：３）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｇｅｎｅ，６７：３１，Ｇｌｕ−Ｇｌｕ親和性タグ（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：７９５２）、サブスタンスＰ、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド（Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１２０４）、ストレプトアビジン結合ペプチド、または他の抗原性エピトープもしくは結合ドメインが含まれる。一般的には、Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２：９５を参照されたい。親和性タグをコードするＤＮＡ分子は、商業的供給業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）から入手可能である。
【００８０】
用語「酸性残基」および「負電荷残基」は、酸性基を含む側鎖を有するアミノ酸残基を指す。例示的な酸性または負電荷残基には、ＤおよびＥが含まれる。
【００８１】
用語「アミド残基」は、酸性基のアミド誘導体を含む側鎖を有するアミノ酸を指す。例示的なアミド残基には、ＮおよびＱが含まれる。
【００８２】
用語「芳香族残基」は、芳香族基を含む側鎖を有するアミノ酸残基を指す。例示的な芳香族残基には、Ｆ、ＹおよびＷが含まれる。
【００８３】
用語「塩基性残基」および「正電荷残基」は、塩基性基を含む側鎖を有するアミノ酸残基を指す。例示的な塩基性または正電荷残基には、Ｈ、ＫおよびＲが含まれる。
【００８４】
用語「親水性残基」および「極性無電荷残基」は、極性基を含む側鎖を有するアミノ酸残基を指す。例示的な親水性または極性無電荷残基には、Ｃ、Ｓ、Ｔ、ＮおよびＱが含まれる。
【００８５】
用語「非官能性残基」および「小さい疎水性残基」は、酸性、塩基性、または芳香族基のない側鎖を有するアミノ酸残基を指す。例示的な非官能性の小さな疎水性残基には、Ｍ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌおよびノルロイシン（Ｎｌｅ）が含まれる。
【００８６】
本発明の一態様は、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドに関する。「ＰＣＳＫ９結合ポリペプチド」は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）タンパク質に結合するポリペプチドを意味する。場合によっては、ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドは、低密度脂質受容体（ＬＤＬＲ）へのＰＣＳＫ９の結合を遮断する。このような遮断性ＰＣＳＫ９結合ポリペプチドは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり得、そして以下の１つであり得る：
ａ．配列番号１３６のアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチド、および配列番号１３４のアミノ酸配列を有する軽鎖ポリペプチドを含むｍＡｂ（抗体ＡＫ、エボロクマブ）、またはその抗原結合フラグメント；
ｂ．ＰＣＳＫ９との結合に関してエボロクマブと競合するｍＡｂ；
ｃ．
ｉ．次の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖ポリペプチド：配列番号３７６または３７８のＣＤＲ１である重鎖ＣＤＲ１；配列番号３７６または３７８のＣＤＲ２である重鎖ＣＤＲ２；配列番号３７６または３７８のＣＤＲ３である重鎖ＣＤＲ３、および
ｉｉ．次の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖ポリペプチド：配列番号３７７または３７９のＣＤＲ１である軽鎖ＣＤＲ１；配列番号３７７または３７９のＣＤＲ２である軽鎖ＣＤＲ２；配列番号３７７または３７９のＣＤＲ３である軽鎖ＣＤＲ３
を含むｍＡｂ；
ｄ．ＰＣＳＫ９の次の残基の少なくとも１つに結合するｍＡｂであって、ＰＣＳＫ９は配列番号３６９のアミノ酸配列を含むｍＡｂ：Ｓ１５３、Ｄ１８８、Ｉ１８９、Ｑ１９０、Ｓ１９１、Ｄ１９２、Ｒ１９４、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｖ２００、Ｄ２２４、Ｒ２３７、およびＤ２３８、Ｋ２４３、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｓ３７６、Ｔ３７７、Ｆ３７９、Ｉ１５４、Ｔ１８９７、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｉ１９６、Ｍ２０１、Ｖ２０２、Ｃ２２３、Ｔ２２８、Ｓ２３５、Ｇ２３６、Ａ２３９、Ｇ２４４、Ｍ２４７、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｃ３７５、Ｃ３７８、Ｒ２３７、およびＤ２３８；
ｅ．以下を含む抗体によって結合されるエピトープと重なるＰＣＳＫ９のエピトープでＰＣＳＫ９に結合するｍＡｂであって：
ｉ．配列番号１３６のアミノ酸配列の重鎖可変領域；および
ｉｉ．配列番号１３４のアミノ酸配列の軽鎖可変領域、
ｉｉｉ．ｍＡｂのエピトープは、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質の上皮成長因子様反復Ａ（ＥＧＦ−Ａ）ドメインが結合する部位とさらに重なる（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｃｏｈｅｎ，＆Ｈｏｂｂｓ（２００７），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ，３２（２），７１−７７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｉｂｓ．２００６．１２．００８；Ｓｅｉｄａｈ＆Ｐｒａｔ（２００７）、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ（Ｂｅｒｌ），８５（７），６８５〜６９６）ｍＡｂ；
ｆ．以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖ポリペプチドを含むｍＡｂ：
ｉ．それぞれ配列番号３７３、３７４、および３７５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３；ならびに
ｉｉ．それぞれ配列番号３６９、３７０、および３７１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３；または
ｇ．配列番号３７８の重鎖変異領域配列および配列番号３７９の軽鎖変異領域配列を含むｍＡｂ。
【００８７】
好ましい実施形態
グローバル配列特徴と粘度との相関
本明細書の実施例１で報告された研究の主な目的は、高濃度モノクローナル抗体製剤の粘度を低下させる目的で、粘度と、ＩｇＧモノクローナル抗体のアミノ酸配列、またはグローバル配列特徴との間の関連を明らかにすることであった。そのために、４３の異なるモノクローナル抗体の粘度値を１５０ｍｇ／ｍｌで測定し、５〜３３ｃＰの広範囲の値を得た（図１Ａおよび１Ｂ）。軽鎖および重鎖の型、それらのサブタイプ（生殖系列）、およびｐＩなどのモノクローナル抗体の主要なグローバル配列特徴を計算し、粘度と相関させたが、直ちに有意な相関は明らかにしなかった（図１Ａおよび１Ｂ）。ＩｇＧアイソタイプ内の多型（アロタイプとして知られる）は、ヒト由来の血清学的試薬を用いて記載され（Ｒｏｐａｒｔｚ，Ｃ．，Ｓｃｈａｎｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｇ．（１９７６），“Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｌｌｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，”ＷＨＯ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｌｌｏｔｙｐｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ，ｈｅｌｄ  １６−１９  Ｊｕｌｙ  １９７４，Ｒｏｕｅｎ，Ｆｒａｎｃｅ；ｒｅｐｏｒｔ  ａｍｅｎｄｅｄ  Ｊｕｎｅ  １９７６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．３，３５７−３６２）、重鎖および軽鎖の保存領域におけるいくつかの特定の位置における特定のアミノ酸残基と相関した（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ  （２００９）Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，  ｍＡｂｓ  １，３３２−３３８．）（Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ，  Ｇ．，Ｄｅｋｋｅｒｓ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｒｉｓｐｅｎｓ，Ｔ．（２０１４）ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ  ａｎｄ  ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ｆｒｏｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｔｏ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，１−１７）。アロタイプは軽鎖および重鎖の他の保存領域に、いくつかの異なる残基（以下に記載される）を導入する。本研究で使用した全てのカッパ軽鎖は、同じ（３）アロタイプ（ＥＵナンバリングで残基Ａ１５３、Ｖ１９１を特徴とする）であった。全てのＩｇＧ２重鎖は、同じ（ｎ−）アロタイプ（Ｐ１８９を特徴とする）であった。４つのＩｇＧ１重鎖アロタイプが記載された（ＥＵナンバリングで次の関連残基を含む）：ｆ（Ｒ２１４）；ｚ（Ｋ２１４）；ａ（Ｄ３５６、Ｌ３５８）およびｘ（Ｇ４３１）（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ＆Ｌｅｆｒａｎｃ，２００９）（Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。Ｅ３５６、Ｍ３５８およびＡ４３１位に代替残基を有するＩｇＧ１重鎖は、これらのアミノ酸残基が他のＩｇＧサブクラスに存在するので、アロタイプを構成しない。ＩｇＧ１アロタイプ（ｘ）は、本研究では存在せず、全てのＩｇＧ１重鎖はＡ４３１を有した。ＩｇＧ１重鎖アロタイプ（ｆ）、（ｚ）、（ａ）および関連残基を図１Ａおよび１Ｂに示す。
【００８８】
図１Ａおよび１Ｂの抗体は、粘度によって分類されている。図１Ａおよび図１Ｂの表は、モノクローナル抗体名、測定濃度、測定粘度値、およびタイプ、サブタイプ、および計算されたｐＩを含むグローバル配列パラメータを含む。ＩｇＧ１型、ラムダ軽鎖およびＶＨ１重鎖サブタイプは、太字で示されている。
【００８９】
ＩｇＧ１およびＩｇＧ２重鎖ならびにカッパおよびラムダ軽鎖は、粘度範囲にわたってかなり均一に分布していた。サブタイプの配列評価は、以下のいくつかの高粘度および低粘度サブタイプ対を明らかにした：ＶＨ１｜１−１８およびＶＨ１｜１−０２；ＶＨ３｜３−３３およびＶＨ３｜３−０７；ＶＫ３｜Ｌ１６およびＶＫ３｜Ａ２７で、それぞれ０．０００２；０．０７６および０．０３１のランダム相関確率を有し、粘度残基と相関している（図２）。この研究ではＤおよびＪ領域配列に対する粘度の相関を探したが、有意な相関は見出されなかった。
【００９０】
図２は、粘度に対するランダム相関確率を示すｐ値を示す。図２はまた、高粘度サブタイプにおける残基、Ａｈｏナンバリングにおける位置、および低粘度サブタイプにおける残基を示す。
【００９１】
ＶＨ１サブタイプの１４のＩｇＧ分子のうち、高粘度はＶＨ１  １−１８サブタイプと強く関連し、低粘度はＶＨ１  １−０１サブタイプと強く関連し、これがランダムな一致である可能性は非常に低かった（図９）。
【００９２】
２つのサブタイプと粘度との間の相関を評価するために、スチューデントｔ検定による同じ母集団平均の確率を、ＶＨ１｜１−０２対ＶＨ１｜１−１８、ＶＨ３｜３−３３対ＶＨ３｜３−０７、およびＶＫ３｜Ｌ１６対ＶＫ３｜Ａ２７について、両側分布を有するｔ検定２標本等分散を用いて計算した。
【００９３】
高粘度の軽鎖ＶＫ３｜Ｌ１６と低粘度のＶＫ３｜Ａ２７との関連（ｔ検定、ｐ＝０．０３１）を検出した（図２、図１２、左側）。ＶＫ３｜Ｌ１６対ＶＫ３｜Ａ２７およびＶＨ３｜３−３３対ＶＨ３｜３−０７については、本明細書でさらに論じる。粘度との強い相関のために、ＶＨ１｜１−１８およびＶＨ１｜１−０２を以下のようにさらに評価した。次の工程として、４３の抗体鎖配列をアラインし、以下のように評価した。
【００９４】
配列アラインメントおよびナンバリングシステム
以下を含むいくつかのＩｇＧナンバリングシステムが存在する：
・ＥＵ−−Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９６９），“Ｔｈｅ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｔｉｒｅ  ｇａｍｍａ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．６３，７８−８５；
・Ｋａｂａｔ−−Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；
・Ｃｈｏｔｈｉａ−−Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＶＨ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），“Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｖ  ｋａｐｐａ  ｄｏｍａｉｎ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：４６２８−４６３８；
・Ａｈｏ−−Ｈｏｅｎｅｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），“Ｙｅｔ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９，６５７−６７０；
など。ＶＨ１サブタイプの重鎖のフレーム領域３について、上記の４つのナンバリングシステムを全て、図９の右側に示す。Ａｈｏスキームは、異なる抗体の可変ドメインの４００を超える結晶構造に由来するアミノ酸残基の空間位置を利用することによって構築された。３Ｄ構造をベースとしたナンバリングシステムであるため、Ａ．Ｈｏｎｅｇｇｅｒ（上記参照）によって定義されたＡｈｏナンバリングシステムを、本研究では使用した。これは、特にＣＤＲ中の残基について有意性がある：同じ数の残基は類似の空間領域に位置し、異なるＩｇＧ配列にわたって同等である。Ａｈｏナンバリングスキームにおける残基の位置は三次構造に関連するので、それらは生物物理学的および生化学的特性、そしておそらく粘度に、より関連しているはずである。本明細書のいくつかの表に示されるように、Ａｈｏナンバリングは他の主要なナンバリングスキームとアラインし、相関関係がある。４つのナンバリングシステムのいずれも、好ましいアミノ酸置換を特定するために互換的に使用することができる。重鎖可変領域は、異なるナンバリングシステムで以下の残基で終わる：１４９  Ａｈｏ、１１７  ＥＵ、１１３  Ｋａｂａｔ、１１３  Ｃｈｏｔｈｉａ。軽鎖可変領域は、１４９  Ａｈｏ、１０７  ＥＵ、１０７  Ｋａｂａｔ、１０７  Ｃｈｏｔｈｉａで終わる。Ａｈｏナンバリングは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ（例えば、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａでは８２ｂ）のように、ＣＤＲ残基に文字を使用する代わりに、ＣＤＲ領域により多くの数を割り当てる。その結果、同じ残基に対するＡｈｏの数は、多くの場合、より大きくなる。各可変領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を、以下の配列で含む：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。ＣＤＲは抗原に結合する目的で大きな配列多様性を提供するが（ＣＤＲ３領域が最も高頻度で結合する）、ＦＲ配列はより保存され、わずかな差異のみを含み、そのうちのいくつかはサブタイプ特異的である。
【００９５】
粘度に対する配列の相関
グローバル配列特徴を評価することに加えて、可変領域の配列をアラインして、粘度差の原因となる残基を明らかにした。視覚的観察に加えて、ソフトウェア機械学習アルゴリズムが開発され、粘度に最も影響を及ぼす残基を特定し、それらの配列から抗体の粘度値を予測するために適用された。予測モデルを、Ａｈｏアライン位置の残基の電荷および疎水性を用いて構築した。
【００９６】
重鎖ＶＨ１配列アラインメントならびに高粘度ＶＨ１  １−１８サブタイプの５つの配列および低粘度ＶＨ１  １−０２サブタイプ分子の５つの配列の評価は、フレームにおいて、２つのサブタイプ間でわずかに４つの残基のみが異なり、４つ全てがフレームワーク３に位置することを明らかにした（図９、右側）。ＣＤＲではより多くの配列の相違が観察されたが、ＣＤＲはしばしば抗原への結合に関与し、粘度を低下させる目的でＣＤＲを操作する（残基を変異させる）ことは効力を失う危険性が大きいので、これらは研究の範囲外とした。サブタイプに関連した粘度とＦＲ３の残基の差異は、Ａｈｏナンバリングで以下のアミノ酸置換が粘度を潜在的に低下させ得ることを示した：Ｔ８２Ｒ、Ｔ８６Ｉ、Ｒ９４ＳおよびＳ９５Ｒ。ソフトウェアアルゴリズムは４つの置換を支持し、また、以下の２つの置換が粘度の低下と相関することを示唆した：軽鎖のＦＲ１におけるＧ１３Ｖ／Ｌおよび重鎖のＣＤＲ２の端からのＳ５９Ｒ／Ｋ（後者の相間は、ＶＨ３サブタイプにおいて観察された）（図９、右側）。
【００９７】
示唆されるアミノ酸置換のインシリコによる評価
ＶＨ  Ｔ８２Ｒ。Ｒ８２はＶＨ１−０２で高頻度で生じる。ＩｇＧ構造モデリングは、重鎖Ａｈｏ位置８２がグロブリンフォールドの上部コアの一部であり、通常、抗原と接触しないが、Ｅｗｅｒｔｅｔ  ａｌ．（２００３），“Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２５：５３１−５５３によればＣＤＲ骨格と直接接触し得ることを示した。ＨＣ８２は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２骨格アミドとの非常に保存された主鎖−側鎖Ｈ結合相互作用を有する（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。Ｒ８２はまた、ＣＤＲ２ループの骨格酸素原子を調整し得る。
【００９８】
ＶＨ  Ｒ９４ＳおよびＳ９５Ｒ。Ｓ９４およびＲ９５は、ＶＨ１−０２において高頻度で生じる。これらの位置は、抗原結合ドメインから離れた表面に位置し、下部コアの一部と考えられる。
【００９９】
Ｔ８６Ｉ。Ｉ８６はＶＨ１−０２で高頻度で生じる。データは、表面の親水性残基（Ｔ）の疎水性残基（Ｉ）による置換を示唆し、これは潜在的に凝集をもたらし得る。
【０１００】
ＶＨ  Ｓ５９Ｒ／Ｋ−ＶＨ１およびＶＨ３では、親水性の５９位がより低い粘度と関連する。ＶＨ  Ｓ５９Ｒ／Ｋ位は、高い構造および配列の変動性を有し、相当に溶媒に曝露され、残基５８と６０との間に直接存在し、これらは上部コアの一部であり、結合に影響を及ぼし得る。構造は、残基５８および６０（特に、それが埋め込まれている場合には５８）の違いに直接依存する可能性が高い。Ｒ／Ｋ５９の出現頻度は低く（２％未満）、アミノ酸残基頻度分析によると、ＶＨ１では観察されなかった。全てのＲ／Ｋ５９は、１つ（ＶＨ４）を除いて、ＶＨ３データセット内にある。
【０１０１】
ＶＬ  Ｇ１３Ｖ／Ｌ−この位置は構造的に埋め込まれており、上記のＥｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．によれば、可変ドメインの下部コアの一部である。この観点から、より疎水性の高い残基へのＧ１３Ｖ変異は、コアをより強くするはずである。
【０１０２】
要約すると、インシリコによる配列分析は、提案された変異が、さらなるグリコシル化部位、または生理的もしくは穏やかな酸性製剤化条件（ＮＧ、ＮＳ、ＮＴ、ＤＧ、ＤＨ）下で急速な分解を受けやすい部位を導入しないことを示した。ＶＨ  Ｔ８２Ｒ、Ｔ８６Ｉ、Ｒ９４ＳおよびＳ９５Ｒ変異は、フレーム領域３においてサブタイプＶＨ１−１８からＶＨ１−０２へのスイッチを提供し、したがって、それらは、いかなる普通ではない、もしくは稀なモチーフを導入することはない。ＶＨ  Ｓ５９ＲおよびＶＬ  Ｇ１３Ｖ変異の追加は、ＶＨ１以外のＶＨ３サブタイプからのソフトウェアによって示唆された。ＨＣ  ＣＤＲ２の端にあるＳ５９Ｒを除いて、変異部位のどれも結合領域の近くに位置せず、したがって、効力／結合を妨げるリスクは低い。アルギニンは、５９位において非常に低い頻度の残基（Ｒ５９）であるので、その影響の予測は困難である。Ｔ８６Ｉは、凝集のリスクが高いと確認され、変異のリストから除去した。
【０１０３】
生成された変異体およびそれらの発現、効力、化学修飾、グリコシル化および粘度。
上記の考察を考慮して、いくつかの変異体を、効力を維持しながら粘度を低下させることを目的として、高粘度ＶＨ１−１８サブタイプの２つのＩｇＧ２抗体ＡＫおよびＡＯについて生成した（図９Ｂ）。図９Ｂは、モノクローナル抗体変異体記号ならびに重鎖および軽鎖上の関連する変異を含む。
【０１０４】
Ｓ５９Ｒ置換を含む２つのＡＫ変異体では、非常に低い発現レベルが観察された（図３に＊で印を付した）。生存率および生細胞密度もまた、それらの１つ、ＡＫ（５９  ８２  ９４  ９５  １３）では低かった。一方、Ｓ５９Ｒ置換を含む抗体ＡＯ変異体は、ＡＯ親分子の力価に匹敵する力価を生じた。統計は重鎖５９位について一般的な結論を下すのに十分ではなかったが、この例は、単一のアミノ酸置換が発現を劇的に変化させ得ることを示唆した。酸化、脱アミド化、異性化およびグリコシル化パターンを含む化学修飾は、ペプチドマッピングＬＣ−ＭＳ分析によって測定されるように、２つの親およびそれらの変異体の間で類似していた。
【０１０５】
親ＡＫ抗体および２つの十分に発現した変異体の効力値は、ＰＣＳＫ９への結合によって測定され、類似していた（図４）。最後に、ＡＫおよびＡＯ変異体の粘度の測定値は、予測されたように、親よりも有意に低かった（図５）。例えば、ＡＫ（８２  ９４  ９５）変異体は、親の粘度のわずか３９％であった。Ｓ５９Ｒ置換を含む２つのＡＯ変異体の粘度は、親の粘度の約２８％で、さらに低かった（図５）。Ｓ５９Ｒ変異体は、ＡＫ抗体では十分に発現せず、粘度を測定することはできなかった。比較のために、ＶＨ１｜１−１８およびＶＨ１｜１−０２生殖系列サブファミリーの平均粘度値を加えた。ＶＨ１｜１−１８サブファミリーとＶＨ１｜１−０２サブファミリーとの間で、ＣＤＲの８およびフレーム領域の４を含む、合計１２の一貫した配列差異が確認された（図９）。高粘度ＶＨ１｜１−１８から低粘度ＶＨ１｜１−０２へのアミノ酸置換のために、３つの部位（全てフレーム領域３にある）を選択した。フレーム中の３点の変異を、ＶＨ１｜１−１８サブファミリーの２つのｍＡｂ（ＡＫおよびＡＯ）に導入して、これらの残基のみをＶＨ１｜１−０２に存在する残基に変換した。可能な２倍の粘度低下を達成する機会は理論的に低い（３／１２）が、これらの置換はむしろ予想外に望ましい結果をもたらし、わずか３つの置換で、両方の抗体分子において、粘度は約２倍低下した。
【０１０６】
粘度対ｐＩ
ｐＩに対する粘度の依存性が４３ｍＡｂの全セットからは明らかではなかったが、ＶＨ１サブセットは、ｍＡｂのｐＩ値が、ｐＨ５．２の製剤中、ｐＩ８．５からｐＩ６．５に低下すると、粘度が着実に増加することを明らかに示した（図６）。高粘度ＶＨ１｜１−１８  ｍＡｂと低粘度ＶＨ１｜１−０２  ｍＡｂとの間のシフトも見られる。予測されたように、ＡＫおよびＡＯ抗体のＴ８２Ｒ、Ｒ９４ＳおよびＳ９５Ｒ変異体は、プロット上のＶＨ１｜１−１８領域からＶＨ１｜１−０２領域まで粘度スケールに沿って約２倍下方に移動した（図６）。変異体ＡＯ（５９  ８２  ９４  ９５）およびＡＯ（５９  ８２  ９４  ９５  １３）はさらに低い粘度およびわずかに高いｐＩに移動し、これは、ＶＨ１群外から採用されたＳ５９Ｒ置換が粘度をさらに低下させるのに有効であったことを示している。残念ながら、Ｒ５９を含むＡＫ変異体は十分に発現されず、５９位の低頻度アルギニン残基の出現が発現に影響を及ぼし得ることを示唆した。
【０１０７】
ｐＨ＜ｐＩの製剤（例えば、この研究で使用される穏やかな酸性製剤）における抗体のｐＩの増加は、一般的には粘度の減少をもたらす。この結果は、正に荷電した抗体分子のコロンビウムの反発力によって説明することができる。抗体などのタンパク質は低い溶解性および高い沈殿性を示し、これは高濃度で粘度に影響を及ぼすことが知られている。フレーム領域３におけるＶＨ１｜１−１８からＶＨ１｜１−０２への置換が粘度の２倍の減少および抗体ｐＩ値のわずかな増加をもたらしたことは興味深く、電荷の増加ではなく、むしろいくつかの構造的変化が、粘度の劇的な減少の原因であり得ることを示唆している。
【０１０８】
数百のＦａｂドメインの結晶構造を重ね合わせた後、全てのＶＨおよびＶＬ位置について水素結合相互作用を確認した（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）、“Ｙｅｔ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０）。データは、確認された位置が主鎖および側鎖水素結合相互作用（ＩＩＩ型ＡＫおよびＡＯ抗体分子について）によって他の残基に結合し得ることを示す。例えば、いくつかのＶＨ  ＩＩＩ型免疫グロブリン構造では９４が７７に結合し、９５が１８に、５９が６７、６６、６５、６１、６０に、ＶＬ１３が１４６、１４８に結合した。したがって、これらの位置での残基置換は、相互作用および免疫グロブリンフォールドを変化させ得る。ＡＫ抗体の結晶構造（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７），“Ｔｈｅ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＰＣＳＫ９：ａ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍａ  ＬＤＬ−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ”、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ１５：５４５−５２）は、３つの位置８２、９４および９５の全てがＦａｂ領域のまさに周辺にあり、溶媒および他の抗体分子に曝露されていることを示唆する。ＶＨ３（図１１）およびＶＫ３（図１２）のＦＲ３の位置における変化もまた粘度と相関する。粘度におけるそれらの役割の１つの説明は、ＦＲ３におけるこれらの位置が分子の周辺にあり、注入針内の運動と粘度測定に関連する剪断応力の間の分子間相互作用に積極的に関与することである。
【０１０９】
より低い粘度ＶＫ３｜Ａ２７およびより高い粘度ＶＫ３｜Ｌ１６抗体は、粘度とｐＩとの間の逆相関を示した（図８、図１２）。
【０１１０】
ｐＩはあまり強くないが、場合によっては粘度の有用な予測因子であることに言及する必要がある。一般に、粘度はｐＩの増加と共に減少し、ｐＩは考慮されるべきである。例えば、ＶＨ３｜３−３３の粘度値はより低くなり、より高いｐＩ抗体分子では、ＶＨ３｜３−０７と同様になる（図７）。したがって、ＶＨ３｜３−３３の粘度を予測する場合、ｐＩを考慮すべきである。
【０１１１】
ＶＨ３およびＶＫ３の生殖系列ファミリーのために提案された粘度低下
高粘度ＶＨ３｜３−３３および低粘度ＶＨ３｜３−０７抗体は平均すると、粘度に大きな差があるが、類似のｐＩ範囲を占める（図７）。予想外に、平均すると、ＶＨ３｜３−０７はより低い粘度を有し、またより低いｐＩを有し、これは、文献に報告された一般的な挙動と矛盾する。以下のＶＨ３｜３−３３分子の粘度値は、変異によって低下させることができる：ＡＱ、ＡＭ、ＡＩ、ＡＧ。
【０１１２】
高粘度ＶＫ３｜Ｌ１６および低粘度ＶＫ３｜Ａ２７軽鎖を有するモノクローナル抗体もまた、大きな粘度差を示したが、ｐＩ値は比較的小さな差を示し、これもまた、サブファミリー間の構造的差異を示唆した（図８）。以下のＶＫ３｜Ｌ１６分子の粘度値は、図１１に記載の変異によって低下させることができる：抗体ＡＱおよびＡＦ。
【０１１３】
グローバル配列特徴の分析は、以下の高／低粘度対を明らかにした：ＶＨ１｜１−１８／ＶＨ１｜１−０２；ＶＫ３｜Ｌ１６／ＶＫ３｜Ａ２７；およびＶＨ３｜３−３３／ＶＨ３｜３−０７で、それぞれ０．０００２；０．０３１および０．０７６の相関のｐ値を有する（図２）。粘度差に相関する配列位置および残基を特定し、粘度低下点変異の候補とみなすことができる（図２）。粘度に対するＶＨおよびＶＬファミリーの上記で実施された相関は、理論的には以下のＶＨおよびＶＬの組み合わせを有する抗体が最低の粘度を有することを示す（図１３ＡおよびＢ）：ＶＨではＶＨ２、ＶＨ３｜３−０７、ＶＨ１｜１−０２、およびＶＬではＶＫ３、ＶＬ１、ＶＫ３｜Ａ２７。ＶＨ１｜１−０２およびＶＫ３｜Ａ２７の構造の３つの抗体が実際に、本発明者らのセットにおいて生じ、そしてそれらは、実際、低い粘度値を示した：Ｂ（５．６ｃＰ）、Ｊ（８．２ｃＰ）、Ｙ（１２．１ｃＰ）。
【０１１４】
化学架橋の研究
高タンパク質濃度での化学架橋を用いて、粘性抗体溶液中の潜在的なタンパク質−タンパク質相互作用の広範な調査を試みた。化学架橋は、タンパク質の特定の部分が互いに相互作用することを実証するために使用される古典的な生化学的技術である。本明細書では、高濃度粘性抗体溶液中の潜在的なタンパク質‐タンパク質相互作用を明らかにするためのゼロレングス化学架橋試薬の使用について記載する。粘性および非粘性抗体の化学架橋結果を用いて、溶液中の潜在的なタンパク質−タンパク質相互作用のモデルを構築する。
【０１１５】
ＥＤＣによる化学架橋は、共通の化学的に架橋可能なオリゴマー分布の存在を明らかにする。オリゴマーパターンを生じる化学架橋は驚くべきことに、分子間ではなく、むしろ分子内架橋である。Ｆｃの頂部とＦａｂの底部との間の分子内架橋は、Ｆｃ−Ｆｃ媒介抗体オリゴマーの形成に有利であり得る抗体の立体構造を生じる。１ＨＺＨ抗体結晶構造は、ＩｇＧ１六量体を形成するのに重要なＦｃ−Ｆｃ相互作用を促進するために、Ｆｃドメインに対してピン止めされた１つのＦａｂアームを有する不斉単位中に抗体六量体を含有する。この立体構造の外観がタンパク質結晶中の六量体の形成に重要であるかどうかはわからない。Ｆａｂ−Ｆｃ分子内化学架橋が存在すると、溶液中で六量体を形成する傾向が増大することは、Ｆｃにピン止めされたＦａｂアームによってＦｃ−Ｆｃベースの抗体オリゴマーを形成する傾向が増大し得ることを示唆する。
【０１１６】
Ｆｃ−Ｆｃ相互作用の低下が溶液粘度を低下させ得る
科学文献には、Ｃｌｑ１およびＣＤＣ活性との相互作用に関連する抗体の六量体形成に関する研究が含まれる。Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒらは、Ｋ４３９ＥおよびＳ４４０Ｋを含む特定のＦｃ点変異を有する抗ＣＤ２０抗体がＣＤＣ活性を阻害するが、関連するＫ４３９Ｅ／Ｓ４４０Ｋ二重変異体がＣＤＣ活性を回復させることを見出した。また、Ｉ２５３Ａ変異はＣＤＣ活性を低下させた。Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４），“Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｉｓ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ＩｇＧ  Ｈｅｘａｍｅｒｓ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３：１２６０−３。Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒらは、それらが開示する変異体を抗体粘度に対する効果と関連させなかった。同様に、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｅｍｅｒら（２０１５）は、抗体のＣ末端の荷電残基が、ＩｇＧ六量体構造を形成する能力の低下により、Ｃｌｑ１相互作用を低下させ得ることを見出した。著者らは、ＩｇＧのＣ末端に荷電残基が存在することを抗体溶液の粘度に影響することに関連付けなかった。
【０１１７】
粘性抗体溶液中の抗体の六量体の観察は、抗体六量体結晶構造中に存在するＦｃ−Ｆｃ相互作用、およびＣｌｑ１（補体）の補充前に形成されると考えられる構造が化学架橋剤ＥＤＣの非存在下で粘性抗体溶液中に存在するであろうことを示唆した。Ｆｃ−Ｆｃ相互作用が溶液粘度に寄与し得るかどうかを試験するために、Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒらによって行われた研究に基づくＦｃ変異体をＡｍｇｅｎで作製した。次いで、これらの材料を、コーンプレートレオロジーによって抗ＰＣＳＫ９製剤緩衝液中で評価した。親抗ＰＣＳＫ９抗体ＡＫおよびＦｃ変異抗ＰＣＳＫ９抗体の比較は、Ｆｃに対するＦｃの親和性の低下が抗体の溶液粘度を低下させることを示した。点変異体はＦｃＲｎ結合能を保持し、生物活性に変化はなかった。野生型補体活性を回復させた二重変異体の野生型粘度に戻る能力は、Ｆｃ−Ｆｃ相互作用の能力が野生型レベルに回復する場合、粘度の減少が逆転し得ることを示す。溶液粘度を増加させるＦｃ−Ｆｃ媒介オリゴマー種の観察と合わせて、抗体溶液粘度に寄与する共通のＦｃ媒介タンパク質−タンパク質相互作用が存在する。ＤｉｅｂｏｌｄｅｒらによってＣＤＣ活性を低下させるものとして確認され、この研究において粘度について試験された５つの変異、Ｓ４４０Ｋ、Ｉ２５３Ａ、Ｋ４３９Ｅ、Ｈ４３３Ａ、Ｎ４３４Ａのうち、最初の２つのみが高濃度抗ＰＣＳＫ９製剤において粘度の低下を示したが、Ｋ４３９Ｅ、Ｈ４３３ＡおよびＮ３４３Ａは高濃度抗ＰＣＳＫ９製剤において粘度を低下させず、直接相関が存在せず、当業者がＤｉｅｂｏｌｄｅｒらによって提供される情報からより低い粘度を正確には予測できないことを示すことに留意する必要がある。Ｋ４３９Ｅ変異体はまた、高タンパク質濃度スクロース製剤において評価され、同じ濃度で親抗ＰＣＳＫ９変異体よりも粘性が低いことが見出された。抗ＰＣＳＫ９製剤中のアルギニンの存在は、Ｆｃ−Ｆｃ相互作用を減少させるためにＫ４３９Ｅ変異体に導入された負の電荷の有効性を減少させ得る電荷スクリーニングに寄与した可能性がある。Ｈ４３３ＡおよびＮ４３４Ａ変異体は、Ｋ４３９Ｅ変異体のような明白な電荷スクリーニング感受性を有さない。
【０１１８】
Ｆｃ−Ｆｃ相互作用は、２つの潜在的な方法で可能な潜在的相互作用の数を増加させることによって、溶液粘度に影響を及ぼし得る。それは、１抗体当たりの相互作用の数を、１抗体当たり２つのＣＤＲ媒介相互作用から、１抗体当たり、２つのＣＤＲ媒介相互作用＋２つのＦｃ媒介相互作用へと増加させることができる、または溶液中に存在するオリゴマー中で利用可能な遊離ＣＤＲ末端の数を変化させることができる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体のＦｃドメインが非常に類似しているという事実を考慮すると、Ｆｃ−Ｆｃ媒介相互作用が全ての抗体に存在する可能性が高い。非粘性抗体の分析は、Ｆｃ−Ｆｃ相互作用の存在を示す分子内架橋が、同じ濃度の粘性抗体とは対照的に、存在しないことを示す。これはＦｃ−Ｆｃ相互作用が、理論的には可能であるが、非粘性抗体には存在しないことを示唆する。ＣＤＲの次の最も近い隣接相互作用は、Ｆｃ−Ｆｃ相互作用を増強するために、Ｆｃ間の相対距離および相対配向に影響を及ぼし得る。これは、粘性抗体が室温でＦｃ−Ｆｃ相互作用を有する一方、非粘性抗体は有さない理由を説明し得る。
【０１１９】
Ｆｃ−Ｆｃ相互作用の存在はまた、抗体のオリゴマー（二量体、三量体、四量体など）が最大数の遊離ＣＤＲ末端を含む可能性を高める。遊離ＣＤＲ末端の数が多いほど、ＣＤＲの次の最も近い隣接相互作用の数が増加する。これは、次に、より効率的な「パーコレーション」の結果として、ネットワーク形成傾向を増大させ、溶液粘度を上昇させ得る。
【０１２０】
粘度を低下させるＣ末端修飾
抗体Ｃ末端の特定の修飾は、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を妨害する。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５），“Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｉｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ａ  ｐｒｏ−ｆｏｒｍ  ｔｈａｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｃｌｉｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｌｙｓｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｍａｘｉｍａｌ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”，ｍＡｂｓ  ７（４）：６７２−８０。著者らは、Ｃ末端リシンおよびＣ末端グルタミン酸がＣｌｑ１と最も効率的に相互作用することができる抗体の六量体をもたらすＦｃ−Ｆｃ相互作用の傾向を低下させる可能性があることを見出した。著者らは、Ｃ末端にＰＧＫＰ（配列番号３８１）、ＰＧＫＫＰ（配列番号３８２）、ＰＧＫＫＫＰ（配列番号３８３）、およびＰＧＥを有するＣＤ２０抗体およびＣＤ３８抗体の変異体を構築した。彼らは、これらの変異体がＣＤＣ活性を有意に低下させたか、または完全に失ったことを見出した。したがって、著者らが以前にＣＤＣ活性と相関したとした六量体化を変異が遮断したと結論付けることができる。六量体化と粘度との現在の相関を考慮すると、このような変異はまた、抗原結合タンパク質の粘度を低下させるはずである。したがって、Ｃ末端に正電荷アミノ酸または負電荷アミノ酸を配置することは、それが存在するＣ末端アミノ酸の付加であろうと置換であろうと、抗原結合タンパク質の粘度を低下させると結論付けることは妥当である。
【０１２１】
薬物動態パラメータを改善する配列改変
本発明はまた、粘度を低下させ得る変異を有する抗原結合タンパク質の薬物動態学的特性の改善の発見を含む。特に、Ｓ４４０Ｋ変異が、Ｔｍａｘ（最大濃度が観察された投与後の時間）およびＣｍａｘ（投与後に測定された最大観察濃度）の両方を改善することが見出された。任意選択的に他の変異を有する、Ｓ４４０Ｋを有する抗体ＡＫの変異体は、変異体および親抗体を同じ濃度で皮下注射した後、Ｔｍａｘが親抗体ＡＫの半分超減少したことが見出された。このような変異体はまた、変異体および親抗体の皮下注射後、２８％または４２％高いＣｍａｘを有することが見出された。図２２を参照されたい。
【０１２２】
核酸、ベクター、宿主細胞
本発明はまた、例えば、本明細書中に開示される二重特異性抗体の、軽鎖、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、重鎖、重鎖可変領域、重鎖定常領域、リンカー、ならびにこれらのいくつかおよび全ての成分、および組み合わせを含む、本発明の二重特異性抗体をコードする単離された核酸を含む。本発明の核酸には、本発明の核酸に対して少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％の相同性を有する核酸が含まれる。特定の配列を指す場合、用語「類似性パーセント」、「同一性パーセント」および「相同性パーセント」は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧ（登録商標）ソフトウェアプログラムに記載されるように使用される。本発明の核酸はまた、相補的核酸を含む。いくつかの例では、配列は、アラインすると、完全に相補的（ミスマッチなし）である。他の例では、配列中に約２０％までのミスマッチが存在し得る。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする核酸が提供される。
【０１２３】
本発明の核酸はベクター、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、人工染色体（ＢＡＣ、ＹＡＣ）またはウイルスにクローニングすることができ、このベクターには、別の遺伝子配列またはエレメント（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、結合した配列またはエレメントの複製をもたらすように挿入することができる。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、構成的に活性なプロモーター断片（以下に限定されないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子またはＬＴＲ配列など）、またはステロイド誘導性ｐＩＮＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの誘導性プロモーター配列を含有し、この核酸の発現は調節することができる。本発明の発現ベクターは、調節配列、例えば、内部リボソーム侵入部位をさらに含み得る。発現ベクターは、例えばトランスフェクションによって細胞に導入することができる。
【０１２４】
別の実施形態では、本発明は、以下の作動可能に連結されたエレメント；転写プロモーター；本発明の二重特異性抗原結合タンパク質、抗体または抗原結合フラグメントの重鎖をコードする第１の核酸分子；本発明の二重特異性抗原結合タンパク質、抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖をコードする第２の核酸分子；および転写ターミネーターを含む発現ベクターを提供する。別の実施形態では、本発明は、以下の作動可能に連結されたエレメント；第１の転写プロモーター；本発明の二重特異性抗原結合タンパク質、抗体または抗原結合フラグメントの重鎖をコードする第１の核酸分子；第１の転写ターミネーター；第２の転写プロモーター；本発明の二重特異性抗原結合タンパク質、抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖をコードする第２の核酸分子；および第２の転写ターミネーターを含む発現ベクターを提供する。
【０１２５】
目的のコード配列に作動可能に連結された分泌シグナルペプチド配列もまた、任意選択的に、発現ベクターによってコードされ得、その結果、所望するなら細胞から目的ポリペプチドがより容易に単離されるように、組換え宿主細胞に発現ポリペプチドを分泌させることができる。
【０１２６】
このようなベクターを含み、重鎖および軽鎖を発現する組換え宿主細胞もまた提供される。
【０１２７】
精製
抗体の精製方法は当該技術分野で知られており、本発明の抗体および二重特異性抗体の生成と共に使用され得る。本発明のいくつかの実施形態では、抗体精製の方法に、濾過、アフィニティカラムクロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、および濃縮が含まれる。濾過工程は、好ましくは限外濾過、より好ましくは限外濾過および透析濾過を含む。濾過は、好ましくは少なくとも約５〜５０回、より好ましくは１０〜３０回、最も好ましくは１４〜２７回行われる。アフィニティカラムクロマトグラフィは、例えば、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）アフィニティクロマトグラフィ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて行うことができる。好ましい実施形態では、アフィニティクロマトグラフィ工程は、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）−ｖＡカラムクロマトグラフィを含む。溶出液は、溶媒洗剤中で洗浄することができる。陽イオン交換クロマトグラフィには、例えば、ＳＰ−セファロース陽イオン交換クロマトグラフィが含まれ得る。陰イオン交換クロマトグラフィには、例えば、Ｑ−セファロースファストフロー陰イオン交換が含まれ得るが、これに限定されない。陰イオン交換工程は好ましくは非結合であり、これによりＤＮＡおよびＢＳＡを含む汚染物質を除去することができる。抗体産物は、好ましくは、例えば、Ｐａｌｌ  ＤＶ  ２０ナノフィルターを用いてナノ濾過される。抗体産物は、例えば、限外濾過および透析濾過によって濃縮することができる。この方法は、凝集体を除去するために、サイズ排除クロマトグラフィの工程をさらに含むことができる。精製のさらなるパラメータは、以下の実施例に記載されている。
【０１２８】
二重特異性抗体、抗体または抗原結合フラグメントはまた、当該技術分野で知られている他の方法、例えば、抗体および抗体フラグメントの化学的結合によって生成し得る。
【０１２９】
本明細書に引用される各原稿、研究論文、総説、要約、特許出願、特許または他の刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１３０】
本発明を以下の実施例によってさらに明らかにするが、それらは本発明の範囲を限定するものではない。
【０１３１】
実施例１
Ｆａｂ変異
材料
異なる標的および異なる配列を有する４３個のヒトおよびヒト化組換えモノクローナル抗体分子のセットを、標準的な手順に従って作製し、精製した（図１Ａおよび１Ｂ）。サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により＞９８％の同等の純度を有するセットを回収した。試料を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｔｉｒｒｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｄｅｌ  ８００３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて、２〜８℃、３０±１０ｐｓｉの最大圧力で、３ｍＬの最大圧力で濃縮した。それらを、２０ｍＭ酢酸塩、９％スクロース（ポリソルベートなし）を含有するｐＨ５．２の製剤緩衝液中で、おおよその体積減少に従って１５０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、２８０ｎｍでのタンパク質の吸光度（０．１〜１吸光度単位（ＡＵ）以内になるまで希釈した後）およびタンパク質特異的吸光係数を用いて最終濃度を決定した（±１０％）。
【０１３２】
同様の標準手順に従って、２つのｍＡｂのいくつかの低粘度変異体を作製し、精製し、製剤化した。それらには、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型に対する抗体（ＰＣＳＫ９、抗体ＡＫ）およびマクロファージコロニー刺激因子に対する抗体（Ｍ−ＣＳＦ、ＡＯ）が含まれた。
【０１３３】
粘度測定
粘度分析を、ＣＰ−４０スピンドルおよび試料カップを使用して、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＬＶ−ＤＶＩＩＩコーンプレート機器（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ、ＭＡ、ＵＳＡ）で行った。測定は全て２５℃で行い、試料カップに取り付けた水浴によって制御した。スピンドルのＲＰＭを増加させることによって、規定のトルク範囲（１０〜９０％）内で手作業により、多数の粘度測定値を収集した。得られた比較チャートの簡略化のため、１試料当たり１つの粘度値を報告するために測定値を平均した。
【０１３４】
配列アラインメント
構造に基づく配列アラインメントを、Ｚｕｅｒｉｃｈ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙからダウンロードしたＥｘｃｅｌ  Ｍａｃｒｏを用いて開発したＡｂ  Ｉｎｉｔｉｏソフトウェアツールによって行った。
【０１３５】
実施例２
Ｆｃ変異
変異体の発現および精製
材料および方法
・抗Ｃ−キット抗体（抗体ＢＡ、配列番号１７４および１７６、それぞれ配列番号１７３および１７５の核酸によってコードされる）、抗スクレロスチン抗体ＡＨ、および抗ＰＣＳＫ９抗体ＡＫ
・抗ストレプトアビジンＩｇＧ１およびＩｇＧ２。
・１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）
・ｎ−メチル−２−ピロリドンによる可溶化
・光散乱（ＬＳ）によるサイズ排除高速液体クロマトグラフィ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）
・還元およびアルキル化逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＡ  ＲＰ−ＨＰＬＣ）
・エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）によるトリプシンペプチドマップ
・コーンプレート型粘度計
【０１３６】
結果
高濃度モノクローナル抗体溶液のＥＤＣ架橋のＳＥ‐ＨＰＬＣは、オリゴマーを形成する傾向を示す
化合物１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いて、抗体中の酸性残基を抗体中の第一級アミン（Ｎ末端および／またはＬｙｓ残基）に化学架橋し、タンパク質−タンパク質相互作用の領域を決定するために他の研究で用いられている。カルボキシル基の第一級アミンへの近接は、アミド結合が２つの基の間に形成されるので重要である（図１６）。形成される架橋は、おそらく溶液中に存在する塩橋である。Ｃａｒｒａｗａｙ  ａｎｄ  Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｊｒ．（１９７２）．”Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２５：６１６−６２３。抗体パネルを、同一の溶液条件下、ＥＤＣで化学架橋した。過去のレオロジー研究では、パネル中の抗体のいくつかは粘性であり、いくつかは粘性でないことがわかった（図１７）。非粘性抗体は二量体含量がわずかに増加したが、より高次のものを大量には含まなかった。対照的に、粘性抗体は、大量の二量体ならびにより高次のオリゴマーを含有した。図１７に概要を示す。粘性であると確認された抗体は全て、二量体よりも大きいと思われるＥＤＣ架橋種を含有した。より大きなオリゴマー種の出現は、濃度に依存する（抗体ＡＨを一例として図１８に示す）。さらなる分析を容易にするために、化学架橋条件を変更して、架橋反応を完了させた。２００ｍｇ／ｍＬで化学架橋した後、溶液は固体になった。固体を緩衝液または緩衝３％ＮＭＰ溶液で再可溶化した。両試料のＳＥ−ＨＰＬＣ分析は、試料が類似していることを示した。緩衝３％ＮＭＰ溶液は、より多くの物質が溶液になるにつれて、タンパク質を有意により速く可溶化した。抗体ＡＨを再可溶化し、実施例としてさらに分析した。
【０１３７】
オンラインＬＳを用いたＳＥ−ＨＰＬＣによるサイズ分析
架橋した抗体の溶液を、オンライン光散乱を用いたＳＥ−ＨＰＬＣによって分析して、溶出種のサイズを決定した。ＳＥ−ＨＰＬＣは、ＥＤＣ化学架橋および３％ＮＭＰでの再可溶化の後、抗体ＡＨのオンライン光散乱分析を用いて行った。ＳＥ−ＨＰＬＣは、ＵＶおよびＲＩに存在する３つのピークを示した。第１のピークは、８４０．５ｋＤの質量を有する種として特定された。これは、８７３．２ｋＤの抗体ＡＨの六量体について予想される質量に近い。別の種は４９４．６ｋＤの質量を有し、これは、抗体ＡＨの三量体について予測された４３６．６ｋＤの質量に近い。第３の種は１３９．９ｋＤの質量を有し、これは、抗体ＡＨの単量体について予測された１４５．５ｋＤの質量に近い。
【０１３８】
ＥＤＣ架橋抗体ＡＨの還元およびアルキル化逆相ＨＰＬＣ
架橋抗体溶液を、還元およびアルキル化逆相高速液体クロマトグラフィによって分析した。軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）の両方の大部分の回収は、ＨＣまたはＬＣが互いに架橋されて、ＳＥＣ分析によって観察された架橋オリゴマーを反映する非天然ＬＣ−ＨＣペプチドまたは非天然ＬＣ−ＬＣまたはＨＣ−ＨＣペプチドを形成すると推定されたので、予想外であった。抗体ＡＨの場合、ＬＣは、非架橋抗体ＡＨ  ＬＣと全く同じ質量で同じ場所に溶出した。抗体ＡＨ中のＨＣには濃度依存性の変化があった。確認された質量が１００ｋＤの少量のＨＣ−ＨＣ架橋物質（約３３分で溶出、図２１）が存在する。１５０ｍｇ／ｍＬおよび２００ｍｇ／ｍＬでは、ＨＣ種の分布は類似している。より低いタンパク質濃度では、分布が約２８．５分で溶出するより多くの種を含む。ＨＣ種の分布は、最大量の六量体を含有する２００ｍｇ／ｍＬサンプルおよび非常に少ないオリゴマーを含有する１０ｍｇ／ｍＬサンプルを用いてＳＥＣによって分析されるように、各サンプル中に存在するオリゴマーの量と相関する。このパターンは、他の粘性抗体溶液において観察された。
【０１３９】
実施例３
抗ＰＣＳＫ９親抗体ＡＫおよび低粘度変異体の薬物動態および薬力学（ＰＫＰＤ）の非ヒト霊長類による研究
材料：抗体ＡＫおよびその変異体。重鎖中の全ての変異。
【０１４０】
Ｆａｂ変異体：Ｔ８２（７２）Ｒ、Ｒ９４（８４）Ｓ、Ｓ９５（８５）Ｒ；Ａｈｏナンバリング（実際のナンバリング）
【０１４１】
Ｆｃ変異体Ｓ（４３４）Ｋ（ＥＵナンバリングではＳ４４０Ｋ）：
【０１４２】
二重変異体：Ｔ８２（７２）Ｒ、Ｒ９４（８４）Ｓ、Ｓ９５（８５）Ｒ；Ｓ（４３４）Ｋ：
【０１４３】
４匹の雄カニクイザルの４群を本研究に使用した。各群は、以下のように、１０ｍｇ／ｋｇの１回の皮下（ＳＣ）投与を受けた。第１群は親抗体ＡＫ（１４０ｍｇ／ｍｌ）を受け；第２群はＦａｂ変異体（２１０ｍｇ／ｍｌ）を受け；第３群はＦｃ変異体（２１０ｍｇ／ｍｌ）を受け；第４群はＦａｂ／Ｆｃ変異体（２１０ｍｇ／ｍｌ）を受けた。第１群および第２群はまた、希釈剤対照のＳＣ投与を有した。Ｆａｂ変異体は、次の位置での置換、Ｔ８２（７２）Ｒ、Ｒ９４（８４）Ｓ、Ｓ９５（８５）Ｒを含んだ。Ｆｃ変異体は、Ｓ（４３４）Ｋの位置での置換を含んだ。
【０１４４】
２１０ｍｇ／ｍｌでの粘度を測定するために、親および全ての変異体を、１０ｍＭの酢酸塩、１５５ｍＭのＮ−アセチルアルギニン（ＮＡＲ）、７０ｍＭのＡｒｇＨＣｌ、ｐＨ５．４、０．０１％のポリソルベート８０中に２１０ｍｇ／ｍｌで配合した。粘度は、ＡＲＧ２コーン／プレートを用いて１０００秒−１および２５Ｃで測定した。図１５を参照されたい。
【０１４５】
試験デザインの概要：
４匹の雄カニクイザルの４群
・各群は、以下のような１回のＳＣ投与（１０ｍｇ／ｋｇ）を受けた：
第１群：親抗体ＡＫ（１４０ｍｇ／ｍｌ）
第２群：Ｆａｂ変異体（２１０ｍｇ／ｍｌ）
第３群：Ｆｃ変異体（２１０ｍｇ／ｍｌ）
第４群：Ｆａｂ／Ｆｃ変異体（２１０ｍｇ／ｍｌ）
・第１群および第２群はまた、希釈剤対照のＳＣ投与を有した
・投与３日後に注射部位の皮膚生検を実施
・病理組織学的分析の実施
・血漿ＬＤＬ、ＨＤＬ、総コレステロールおよびＰＫを投与後６週間追跡
【０１４６】
試験の結論
４つのホモログは全て、顕著なＬＤＬ低下を生じた
・投与２週間後、最大の減少：親での以前の観察より１週間遅い
・効果の底はＦａｂ／Ｆｃ変異体でさほど深くなかった（約７８％対約９０％）
・ベースラインへの戻りは、Ｆｃ変異体でわずかにより加速されているようである
・ＰＫ：平均暴露量（ＣｍａｘおよびＡＵＣｌａｓｔに基づく）は全ての処置群間で同程度であった（１．４倍以内）。
・抗ＰＣＳＫ９抗体ＡＫにおけるＦａｂおよび／またはＦｃの変異は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）（カニクイザル）の注射部位反応（ＩＳＲ）または薬物動態および薬力学（ＰＫＰＤ）プロファイルに有意な影響を及ぼさなかった。
Ｆａｂ変異体：Ｔ８２（７２）Ｒ、Ｒ９４（８４）Ｓ、Ｓ９５（８５）Ｒ；Ａｈｏナンバリング（実際のナンバリング）。
Ｆｃ変異体：Ｓ（４３４）Ｋ（ＥＵナンバリングではＳ４４０Ｋ）。
【０１４７】
実施例４
ＧＩＰＲ（２Ｇ１０．００６）抗体ＡＱの低粘度変異体の作製と特徴付け
抗体ＡＱの低粘度変異体のクローニング、発現、精製および高濃度製剤
ＧＩＰＲ（２Ｇ１０．００６）ＡＱ親は、米国仮特許出願第６２／３８７，４８６号明細書に、２Ｇ１０＿ＬＣ１．００６（引用特許出願の配列番号７４）として記載されている。前述の米国特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。変異部位Ｑ１（１）Ｅ、Ｒ１７（１６）Ｇ、Ｓ８５（７５）Ａを有する重鎖変異体ＡＱ（ＨＣ  １、１７、８５）、および変異部位Ｍ４（４）Ｌ、Ｖ１３（１３）Ｌ、Ａ７６（６０）Ｄ、Ｓ９５（７７）Ｒ、Ｑ９７（７９）Ｅ、Ｓ９８（８０）Ｐを有する軽鎖変異体ＡＱ（ＬＣ  ４  １３  ７６  ９５  ９７  ９８）を以下のように作製した。ＧＩＰＲ（２Ｇ１０．００６）（抗体ＡＱ）低粘度変異体の合成遺伝子を作製し、消化し、プラスミド発現ベクターにライゲートした。コンストラクトをＤＮＡシークエンシングによって確認した。安定な細胞プールを、クローンＣＨＯ宿主細胞株のエレクトロポレーションによって作製した。プールを、生存率が８５％を超えるまで選択下で培養した。プールを流加生産培養に１０日間播種し、遠心分離した培地を回収した。
【０１４８】
回収した上清を滅菌濾過し、先に記載した方法と同様の、プロテインＡ、陽イオン交換、および陰イオン交換からなる３カラムクロマトグラフィによって精製した（Ｓｈｕｋｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），“Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ―Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ  ８４８：２８−３９）。得られた精製プールを、２０ｍＭ酢酸塩および９％スクロースを含有するｐＨ５．２の製剤緩衝液（ポリソルベートなし）中に透析し、約５．２の最終ｐＨを達成し、遠心限外濾過によって３０ｋＤａカットオフフィルター上で約１５０ｍｇ／ｍＬに濃縮した（図２０Ａ）。
【０１４９】
効力の測定
グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド受容体（ＧＩＰＲ）を発現する哺乳動物細胞２９３／ｈｕＧＩＰＲを利用するアッセイによって、効力を測定した。抗ＧＩＰＲ親ＡＱおよび低粘度変異体の濃度の増加は、アッセイ中にモニターしたｃＡＭＰ変化を誘導するＧＩＰとＧＩＰＲとの相互作用を遮断した。アッセイの適用は、Ｔｓｅｎｇ  Ｃ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６），“Ｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｙ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＩＰ）．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ”，Ｊ．Ｃｌｉｎ．．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：２４４０−２４４５に先に記載された。
【０１５０】
粘度の測定
ＡＱおよび２つの低粘度変異体の粘度分析を、ＣＰ２５−１／ＴＧスピンドルを用いてＡｎｔｏｎ  Ｐａａｒレオメーターで行った。測定は全て２５℃で行い、試料カップに取り付けた水浴によって制御した。粘度の測定を、０から２０００ｒｐｍへ剪断速度を増加させながら手動で収集した。剪断速度１０００  １／ｓでの１０個の粘度測定結果および剪断速度２０００  １／ｓでの１０個の粘度測定結果を各試料について収集し、平均して、１試料当たり１つの粘度値を報告した。
【０１５１】
粘度測定は、粘度計の状態、室内の温度、および測定時の他のいくつかの小さいパラメータなどのいくつかのパラメータのわずかな変化にも敏感であるので、粘度測定の精度が正確度よりはるかに良好であることに留意する必要がある。したがって、１つの設定で全ての目的の試料を測定すること、または目的の試料を２つの設定で測定する場合、２つの設定で同じ参照標準を有することが重要である。
【０１５２】
結果
抗ＧＩＰＲ（２Ｇ１０．００６）抗体ＡＱは、重鎖ＶＨ３｜３−３３および軽鎖ＶＫ３｜Ｌ１６の高粘度生殖系列サブファミリーに属する。図１１および１２に由来するいくつかの変異を、ＡＱの粘度を低下させるためにインフレームで作製した。１つの粘度計設定で測定した親ＡＱおよび２つの変異体の粘度は、以下の値を示した：ＡＱ−１９．１ｃＰ、ＡＱ（ＨＣ  １、１７、８５）−１５．８ｃＰ、ＡＱ（ＬＣ  ４  １３  ７６  ９５  ９７  ９８）−１２．７ｃＰ（図２０）。親ＡＱに対して、重鎖変異体ＡＱ（ＨＣ  １、１７、８５）変異体は８３％であり、軽鎖変異体ＡＱ（ＬＣ  ４  １３  ７６  ９５  ９７  ９８）は６７％であった。図７および８は、ＶＨ３およびＶＫ３ファミリーメンバーについての粘度対ｐＩプロット上の変異体の位置を示す。インビトロｃＡＭＰ活性は、粘度変異によっても同様に影響を受けなかった。効力は、インビトロ細胞ベースのアッセイの許容誤差内で同じままであった（図２０Ｂを参照されたい）。要約すると、導入された変異は、効力を失うことなく粘度を低下させた。
【０１５３】
実施例５
ＧＩＰＲ低粘度変異軽鎖Ｖ７８Ｆ（ＡｈｏナンバリングではＬＣ  Ｖ７８Ｆ、リニアナンバリングではＬＣ  Ｖ６２Ｆ）
ＧＩＰＲ（２Ｇ１０．００６）抗体ＡＱは、Ａ５２Ｓｕ製剤中１５０ｍｇ／ｍＬで２３ｃＰの高粘度を示した。この抗体は、カッパ軽鎖における、低頻度残基Ｖ７８（Ａｈｏナンバリングで）（リニアナンバリングでＶ６２）を特徴とした（ＬＣ  Ｖ７８  Ａｈｏ）。カッパ生殖系列に関連する軽鎖配列では、Ｖ７８の発生頻度は＜１％であるが、Ｆ７８は＞９８％である。残基ＬＣ  Ｖ７８は、共分散から逸脱しているため注目を集めた。共分散分析は、抗体の可変領域における残基の生理化学的特性に基づいて、ペアワイズ保存残基位置を確立することを可能にし、不正確に配置された残基（多くの場合、非生殖系列残基である）を特定する。共分散分析はさらに、分子動力学シミュレーションによって明らかにされた大きな立体構造の変化をもたらす、より一般的な生殖系列配列で、逸脱した位置のアミノ酸を置換することを示唆し得る（Ｋａｎｎａｎ  Ｇ．，”Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”、米国特許出願第６１／４５１９２９号明細書、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２８５９６号明細書、国際公開第２０１２／１２５４９５号パンフレット）。共分散逸脱を排除し、ヒト配列の割合を増加させるために、ＬＣ  Ｖ７８Ｆ変異をＧＩＰＲ（２Ｇ１０．００６）抗体ＡＱに導入した。
【０１５４】
予期しなかったことに、変異体の粘度は２５％低下したが、ｃＡＭＰ（細胞ベース）アッセイでの測定で、同様のヒトＧＩＰＲに対する効力を維持した。ＧＩＰＲ（２Ｇ１０．００６）ＡＱ親およびそのＬＣ  Ｖ７８Ｆ変異体の両方の配列が、米国仮特許出願第６２／３８７，４８６号明細書に、それぞれ２Ｇ１０＿ＬＣ１．００６（引用された出願の配列番号７４）および２Ｇ１０＿ＬＣ１．００３（引用された出願の配列番号７１）として記載されている。この米国特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明において新たに発見されたのは、ＬＣ  Ｖ７８Ｆ変異によるこのような置換が粘度の約２５％の低下をもたらしたことである。ＧＩＰＲ＿２Ｇ１０．００６ＡＱおよびそのＶ７８Ｆ変異体の粘度分析を、２０ｍＭの酢酸塩、９％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０を含有するｐＨ５．２の製剤中、１０００の剪断速度および２５Ｃで、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ−Ｗａｔｅｒｓ  ＬＬＣ製のＡＲ−Ｇ２磁気ベアリングコーンプレート型レオメーターを用いて１５０ｍｇ／ｍｌで行った。コーンプレートサイズは、直径２０ｍｍ、コーン角１．９８８°であり、スチール−９９０９１８ペルチェプレートを備え、フロースイープ手順を使用して操作した。測定された粘度値は、ＧＩＰＲ＿２Ｇ１０．００６が２１ｃＰ、ＧＩＰＲ（２Ｇ１０．００３）ＬＣ  Ｖ７８Ｆ変異体が１５．３ｃＰであり、これは粘度の２５％減少である。
【０１５５】
前の例で述べたように、粘度測定の精度は、正確度よりもはるかに良好である。０．０１％のポリソルベートを含む１５０ｍｇ／ｍＬでの粘度は、通常、ポリソルベートを含まない場合よりも１０％低く、これはＧＩＰＲ（２Ｇ１０．００６）の場合に観察された。その粘度は、ポリソルベートなしでは２３ｃＰであり（４３抗体全てについて）、ポリソルベートを含む場合は２１ｃＰであった。
【０１５６】
実施例６
カニクイザルによる試験
ＡＫと称する抗体（対照、ＡＭＧ１４５およびエボロクマブとしても知られる）、ならびに実施例３に示したＦａｂ変異体、Ｆｃ変異体、および二重変異体を、実施例１および２に開示される方法論を使用して生成した。これらの抗体の薬物動態特性を、雄カニクイザルへの単回皮下ボーラス注射によってインビボで試験した。
【０１５７】
試験デザイン
雄カニクイザルを用いて試験を行った。動物は２．７〜３．８歳であり、２．９〜３．８ｋｇの体重であった。投与開始前７日間、動物を実験室での生活に順応させた。選択基準には、処置前のコレステロールレベル（ＬＤＬおよびＨＤＬを含む）レベルからの許容可能な結果が含まれた。投与開始前に、全ての動物を無作為化し、コンピュータに基づく無作為化手順を用いて群に割り当てた。
【０１５８】
試験品および対照品を、１日目に１回、適切な動物の背側中央領域に皮下投与した。注射部位を投与前に剃毛し、消えないインクでマークした。動物は、用量投与のために一時的に拘束し、鎮静剤の投与は行わなかった。各動物の用量体積は、最新の体重測定に基づいた。第１群および第２群には、用量溶液を、各動物の背中に２回皮下注射により投与した（試験物質を１回、希釈剤を１回）。注射部位は、少なくとも５〜６ｃｍ離した。試験物質を、各動物の脊柱の右側に投与した。希釈剤は、各動物の脊柱の左側に与えた。第３群および第４群には、用量溶液を、各動物の背中に単回皮下注射により投与した。各群の用量レベルおよび用量体積を図２１に要約する。
【０１５９】
血液試料を、この試験の生存期間（４３日）の種々の時点で、カリウム（Ｋ２）ＥＤＴＡを含有するチューブに静脈穿刺によって採取した。動物は、血清化学血液採取の前に絶食させなかった。
【０１６０】
試料を、血液採取後に冷却し、そして血清または血漿の調製のために分割した。試料を静かに混合し、遠心分離した。血液試料を、採取直後、約４℃で遠心分離（１５００〜２０００×ｇで約１０分間）するまで、氷上に維持した。得られた血漿または血清を分離し、２アリコート（一次およびバックアップ）に分割し、適切に標識したポリプロピレンチューブに移し、分析まで−８０℃に維持するように設定したフリーザーに保存した。血漿サンプルを用いて、薬物動態学的評価のための試験品濃度を決定し、血清試料をコレステロール、ＨＤＬ、およびＬＤＬについて分析した。
【０１６１】
薬物動態学的評価
血漿サンプルを、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、各試験抗体（抗体ＡＫ、ＡＫ  Ｆａｂ変異体、ＡＫ  Ｓ４４０Ｋ  Ｆｃ変異体、およびＡＫ  Ｆａｂ／Ｓ４４０Ｋ二重変異体）の濃度について分析した。アッセイは、捕捉試薬として組換えヒトＰＣＳＫ９を、検出試薬としてヒトＩｇＧ１に対する西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体を使用する。標準および品質管理サンプル（ＱＣ）を、抗体ＡＫまたは低粘度ホモログを１００％カニクイザルＫ２−ＥＤＴＡプールにスパイクすることによって調製する。Ｃｏｓｔａｒ９６ウェルマイクロプレートウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を、組換えヒトＰＣＳＫ９でコーティングする。ブロッキング工程の後、ＴＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のＢｌｏｃｋｅｒ（商標）ＢＬＯＴＴＯ中で１００の希釈係数で前処理した後、標準、マトリックスブランク（ＮＳＢ）、ＱＣ（ＱＣ）および試験試料をマイクロプレートウェルにロードする。試料中の抗体ＡＫは、マイクロプレート上にコーティングされた固定化組換えヒトＰＣＳＫ９に捕捉される。マイクロプレートウェルを洗浄することによって、結合していない物質を除去する。洗浄後、マウス抗ヒトＩｇＧ、Ａｂ３５、ＨＲＰ結合検出抗体をマイクロプレートウェルに添加して、捕捉された抗体ＡＫを結合させる。マイクロプレートウェルを洗浄することによって、結合していない検出抗体を除去する。結合したマウス抗ヒトＩｇＧ  Ａｂ３５  ＨＲＰ複合体の検出のために、１成分ＴＭＢ溶液をマイクロプレートウェルに添加する。ＴＭＢ基質溶液は過酸化物と反応し、ＨＲＰの存在下で、捕捉試薬によって結合した抗体ＡＫまたは低粘度変異体ホモログの量に比例する比色シグナルを生成する。２Ｎ硫酸を用いて発色を停止し、色の強度（光学濃度またはＯＤ）を４５０ｎｍマイナス６５０ｎｍで測定する。データを、１の重み付け係数を有する４パラメータ（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）回帰モデルを用いるＷａｔｓｏｎバージョン７．４  ＳＰ３（またはそれ以降）データ縮小パッケージを使用して縮小する。
【０１６２】
ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ薬物動態ソフトウェアを用いて薬物動態パラメータを推定した。皮下投与経路と一致する非コンパートメントアプローチを、パラメータ推定のために使用した。全てのパラメータは、１日目からの血漿中の個々の濃度から生成した。以下のパラメータを決定した：
Ｔｍａｘ（最大観察濃度が観察された投与後の時間）、
Ｃｍａｘ（投与後に測定された最大観察濃度）、
ＡＵＣ（０−ｔ）（線形または線形／対数台形法を用いて、投与開始から最後に観察された定量可能濃度の投与後の時間までの濃度対時間曲線下の面積）、
ＡＵＣ（０−ｔ）／Ｄ（ＡＵＣ（０−ｔ）を投与用量で除したもの）、および
ＲＡＵＣ（定常状態におけるＴ１からＴ２までの曲線下の面積を、最初の投与間隔中のＴ１からＴ２までの曲線下の面積で除したもの）。
【０１６３】
結果および考察
時間に対してプロットした試験品濃度を図２４Ａおよび２４Ｂに示す（各試験品の平均濃度、各時点でｎ＝４）。４つの試験品の薬物動態パラメータを図２２に要約する。Ｆｃ変異Ｓ４４０Ｋ（抗体ＡＫ（Ｆｃ変異体）および抗体ＡＫ（ＦｃおよびＦａｂ二重変異体）の両方）を含む抗体は、抗体ＡＫ（対照）と比較して、Ｔｍａｘの減少（それぞれ０．８１日および１日対２．５日）およびＣｍａｘの増加（それぞれ１２５μｇ／ｍＬおよび１１２μｇ／ｍＬ対８７．８μｇ／ｍＬ）を示し、抗体ＡＫ（Ｆａｂ変異体）は、粘度を低下させるＦｃ変異を含む抗体が、皮下注射後に血液循環に急速に分布することを示す。
【０１６４】
抗体ＡＫの全ての低粘度ホモログの投与は、ベースライン（−６日目）と比較して総コレステロール濃度の減少と関連する低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の予想される薬理学的な軽度から中等度の減少をもたらした。ＡＫ  Ｆａｂ変異体およびＡＫ  Ｓ４４０Ｋ  Ｆｃ変異体の投与後の総リポタンパク質コレステロールおよび低密度リポタンパク質コレステロールの減少の大きさは、２５日目のＡＫ  Ｓ４４０Ｋ  Ｆｃ変異体ならびに２９日目のＡＫ（対照）およびＡＫ  Ｆａｂ変異体のベースラインへの回復傾向を有する対照動物と一般に類似していた。ＡＫ  Ｆａｂ／Ｓ４４０Ｋ二重変異体の総リポタンパク質コレステロールおよび低密度リポタンパク質コレステロールの減少の大きさは、一般に、対照（１０ｍｇ／ｋｇでの抗体ＡＫ）と比較してさほど顕著ではなかった。どのＡＫ低粘度ホモログにおいても、高密度リポタンパク質に変化はなかった。ベースラインに対するＬＤＬ−Ｃの変化率を図２３で表にし、図２４Ａおよび２４Ｂにおいて、時間に対してプロットする。
【０１６５】
略語
本明細書を通して使用される略語は、以下のように定義される。
ＡＥＩ  アレル発現不均衡
ＡＮＯＶＡ  分散分析
ＡＵＣ  曲線下面積
ＢＳＡ  ウシ血清アルブミン
ＤＭＥＭ  ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ  １−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩
ＥＤＴＡ  エチレンジアミン四酢酸
ＥＬＩＳＡ  酵素結合免疫吸着検定法
ｅＱＴＬ  発現量的形質遺伝子座
ＥＳＩ−ＴＯＦ  エレクトロスプレーイオン化飛行時間
ＦＡＣＳ  蛍光標識細胞分取
ＦＢＳ  ウシ胎仔血清
ＦＰＬＣ  高速タンパク質液体クロマトグラフィ
ＦＶＢ  フレンド白血病ウイルス１ｂ（Ｆｖ１ｂ）アレルで同系交配されたマウス株
Ｈ＆Ｅ  ヘマトキキシリン−エオジン
ＨＡ  ヒポキサンチン
ＨＩＣ  疎水性相互作用クロマトグラフィ
ＨＰＬＣ  高速液体クロマトグラフィ
ＨＲＰ  西洋わさびペルオキシダーゼ
ＨＵＶＥＣ  ヒト臍帯静脈上皮細胞
ＩＢＤ  炎症性腸疾患
ＩＤＭＥＭ  グルタミンを含まないＤＭＥＭ
ＩＦＮ  インターフェロン
ＩＬ  インターロイキン
ＭＣＰ  単球走化性タンパク質
ＭＳＤ  高分子構造データベース
ＰＢＭＣ  末梢血単核細胞
ＰＢＳ  リン酸緩衝生理食塩水
ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＥＧ  ポリエチレングリコール
ＰＥＩ  ポリエチレンイミン
ＱＴＬ  量的形質遺伝子座
ＲＰＭＩ  Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで開発された培地
ＳＮＰ  単一ヌクレオチド多型
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸
ＴＭＢ  ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン
【０１６６】
本発明は、例えば以下を提供する。
(項目１)
抗原結合タンパク質の粘度を減少させる方法であって、
ａ．前記抗原結合タンパク質がＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリーを含む場合、前記ＶＨ１配列を、８２Ｘ１、９４Ｘ２、および９５Ｘ３から選択される１つ以上の置換を含むように改変すること（ここで、Ｘ１はＲ、Ｋ、およびＨから選択され、Ｘ２はＳ、Ｔ、Ｎ、およびＱから選択され、Ｘ３はＲ、Ｋ、およびＨから選択される）；
ｂ．前記抗原結合タンパク質がＶＨ３｜３−３３生殖系列サブファミリーを含む場合、前記ＶＨ３配列を、１Ｘ４、１７Ｘ５、および８５Ｘ６から選択される１つ以上の置換を含むように改変すること（ここで、Ｘ４はＤおよびＥから選択され、Ｘ５はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびＭおよびＷから選択され、Ｘ６はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびＭから選択される）；
ｃ．前記抗原結合タンパク質がＶＫ３｜Ｌ１６生殖系列サブファミリーを含む場合、前記ＶＫ３配列を、４Ｘ１０、１３Ｘ１１、７６Ｘ１２、７８Ｆ、９５Ｘ１３、９７Ｘ１４、および９８Ｐから選択される１つ以上の置換を含むように改変すること（ここで、Ｘ１０はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭから選択され、Ｘ１１はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭから選択され、Ｘ１２はＤおよびＥから選択され、Ｘ１３はＲ、ＫおよびＨから選択され、Ｘ１４はＤおよびＥから選択される）；
ｄ．前記抗原結合タンパク質が前記ＶＫ３｜Ｌ６生殖系列サブファミリーを含む場合、前記ＶＫ３配列を、７６Ｘ１２および９５Ｘ１３から選択される１つ以上の置換を含むように改変すること；
ｅ．Ｆｃドメイン配列を２５３Ｘ１５、４４０Ｘ１６、および４３９Ｘ１７から選択される１つ以上の置換を含むように改変すること（ここで、Ｘ１５はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびＭから選択され、Ｘ１６はＲ、Ｋ、およびＨから選択され、Ｘ１７はＤおよびＥから選択され、前記Ｆｃドメイン配列は４４０Ｘ１６および４３９Ｘ１７の１つのみを含む）；ならびに
ｆ．前記Ｆｃドメイン配列のＣ末端を、Ｘ１８Ｘ１９を含むように改変すること（ここで、Ｘ１８はＤおよびＥ、またはＨ、ＫおよびＲから選択される１〜４のアミノ酸であり、Ｘ１９はＰ、Ｍ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、ＹおよびＷから選択され、Ｘ１８がＤまたはＥを含むとき存在せず、Ｘ１８がそのＣ末端にＫまたはＲを含むとき存在し、Ｘ１８がそのＣ末端にＨを含むとき存在するかまたは存在しない）
から選択される、前記抗原結合タンパク質の配列に１つ以上の改変を作ることを含み、
サブパラグラフａ、ｂ、ｃ、およびｄにおけるアミノ酸はＡｈｏナンバリングシステムにより番号付けされており、サブパラグラフｅのアミノ酸はＥＵナンバリングシステムにより番号付けされている方法。
(項目２)
前記抗原結合タンパク質は、置換を除いて、図１Ａおよび１Ｂから選択される抗体の配列（配列番号１６６および１６８；２および４；１７８および１８０；１７０および１７２；６および８；１０および１２；１４および１６；１８および２０；２２および２４；２６および２８；３０および３２；３４および３６；３８および４０；４３および４４；４６および４８；５０および５２；５４および５６；５８および６０；６２および６４；６６および６８；７０および７２；７４および７６；７８および８０；８２および８４；８６および８８；９０および９２；９４および９６；９８および１００；１０２および１０４；１０６および１０８；１１０および１１２；１１４および１１６；１１８および１２０；１２２および１２４；１２６および１２８；１３０および１３２；１３４および１３６；１５８および１６０；１３８および１４０；１４２および１４４；１４６および１４８；１５０および１５２；ならびに１５４および１５６）を含む、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記ＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリーを含む抗原結合タンパク質の前記ＶＨ１配列を、８２Ｒ、９４Ｓ、および９５Ｒから選択される１つ以上の置換を含むように改変することを含む、項目１に記載の方法。
(項目４)
前記ＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリーを含む抗原結合タンパク質の前記ＶＨ１配列を、８２Ｒ、９４Ｓ、および９５Ｒの置換を含むように改変することを含む、項目２に記載の方法。
(項目５)
前記ＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリーを含む抗原結合タンパク質の前記ＶＨ１配列を、５９Ｘ２０（ここで、Ｘ２０はＲ、ＫおよびＨから選択される）の置換を含むように改変することをさらに含む、項目１に記載の方法。
(項目６)
前記ＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリーを含む抗原結合タンパク質の前記ＶＨ１配列を、５９Ｋの置換を含むように改変することをさらに含む、項目１に記載の方法。
(項目７)
前記ＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリーを含む抗原結合タンパク質の前記ＶＨ１配列を、５９Ｋの置換を含むように改変することをさらに含む、項目２に記載の方法。
(項目８)
前記抗原結合タンパク質は、置換を除いて、図１Ｂからの抗体ＡＦ、ＡＫ、ＡＬ、ＡＮおよびＡＯから選択される抗体の配列（配列番号１１４および１１６；１３４および１３６；１３８および１４０；１４６および１４８；ならびに１５０および１５２）を含む、項目３に記載の方法。
(項目９)
前記ＶＨ３｜３−３３生殖系列サブファミリーを含む抗原結合タンパク質の前記ＶＨ３配列を、１Ｅ、１７Ｇ、および８５Ａから選択される１つ以上の置換を含むように改変することを含む、項目１に記載の方法。
(項目１０)
前記ＶＨ３｜３−３３生殖系列サブファミリーを含む抗原結合タンパク質の前記ＶＨ３配列を、１Ｅ、１７Ｇ、および８５Ａの置換を含むように改変することを含む、項目２に記載の方法。
(項目１１)
前記抗原結合タンパク質は、置換を除いて、図１Ｂからの抗体ＡＱ、ＡＭ、ＡＩ、およびＡＧから選択される抗体の配列（配列番号１５８および１６０；１４２および１４４；１２６および１２８；ならびに１１８および１２０）を含む、項目１０に記載の方法。
(項目１２)
抗原結合タンパク質の前記ＶＫ３｜Ｌ１６配列を、４Ｌ、１３Ｌ、７６Ｄ、７８Ｆ、９５Ｒ、９７Ｅ、および９８Ｐから選択される１つ以上の置換を含むように改変することを含む、項目１に記載の方法。
(項目１３)
抗原結合タンパク質の前記ＶＫ３｜Ｌ１６配列を、４Ｌ、１３Ｌ、７６Ｄ、７８Ｆ、９５Ｒ、９７Ｅ、および９８Ｐの置換を含むように改変することを含む、項目２に記載の方法。
(項目１４)
前記抗原結合タンパク質は、置換を除いて、図１Ｂからの抗体ＡＦおよびＡＱから選択される抗体の配列（配列番号１１４および１１６；ならびに１５８および１６０）を含む、項目１３に記載の方法。
(項目１５)
抗原結合タンパク質の前記ＶＫ３｜Ｌ６配列を、７６Ｄおよび９５Ｒから選択される１つ以上の置換を含むように改変することを含む、項目１に記載の方法。
(項目１６)
抗原結合タンパク質のＶＫ３｜Ｌ６配列を、７６Ｄおよび９５Ｒの置換を含むように改変することを含む、項目２に記載の方法。
(項目１７)
前記抗原結合タンパク質は、置換を除いて、図１Ｂからの抗体ＡＪの配列（配列番号１３０および１３２）を含む、項目１６に記載の方法。
(項目１８)
前記Ｆｃドメイン配列を、２５３Ａ、４４０Ｋ、および４３９Ｅから選択される１つ以上の置換を含むように改変することを含む、項目１に記載の方法。
(項目１９)
前記Ｆｃドメイン配列を、２５３Ａ、４４０Ｋ、および４３９Ｅの置換を含むように改変することを含む、項目２に記載の方法。
(項目２０)
前記抗原結合タンパク質は、置換を除いて、抗体ＢＡ、ＡＨ、およびＡＮから選択される抗体の配列（配列番号１７４および１７６；１２２および１２４；ならびに１４６および１４８）を含む、項目１８に記載の方法。
(項目２１)
前記ＦｃドメインのＣ末端を、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含むように改変することを含む、項目１に記載の方法。
(項目２２)
前記ＦｃドメインのＣ末端を、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含むように改変することを含む、項目２に記載の方法。
(項目２３)
前記ＦｃドメインのＣ末端を、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含むように改変することを含む、項目１８に記載の方法。
(項目２４)
ａ．８２Ｘ１、９４Ｘ２、および９５Ｘ３から選択される１つ以上の置換を含むＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリー配列（ここで、Ｘ１はＲ、ＫおよびＨから選択され、Ｘ２はＳ、Ｔ、ＮおよびＱから選択され、Ｘ３はＲ、ＫおよびＨから選択される）；
ｂ．１Ｘ４、１７Ｘ５、および８５Ｘ６から選択される１つ以上の置換を含むＶＨ３｜３−３３生殖系列サブファミリー配列（ここで、Ｘ４はＤおよびＥから選択され、Ｘ５はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭから選択され、Ｘ６はＧ．Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭから選択される）；
ｃ．４Ｘ１０、１３Ｘ１１、７６Ｘ１２、９５Ｘ１３、９７Ｘ１４、および９８Ｐから選択される１つ以上の置換を含むＶＫ３｜Ｌ１６生殖系列サブファミリー配列（ここで、Ｘ１０はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭから選択され、Ｘ１１はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭから選択され、Ｘ１２はＤおよびＥから選択され、Ｘ１３はＲ、ＫおよびＨから選択され、Ｘ１４はＤおよびＥから選択され、前記抗原結合タンパク質は置換７８Ｆのみを含むことはない）；
ｄ．７６Ｘ１２および９５Ｘ１３から選択される１つ以上の置換を含むＶＫ３｜Ｌ６生殖系列サブファミリー配列；
ｅ．２５３Ｘ１５、４４０Ｘ１６、および４３９Ｘ１７から選択される１つ以上の置換を含むＦｃドメイン配列（ここで、Ｘ１５はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ、ＬおよびＭから選択され、Ｘ１６はＲ、ＫおよびＨから選択され、Ｘ１７はＤおよびＥから選択され、前記Ｆｃドメイン配列は４４０Ｘ１６および４３９Ｘ１７の１つのみを含み、Ｘ１６がＫであるか、Ｘ１７がＥであるとき、前記抗原結合タンパク質は、２５３Ｘ１５、またはサブパラグラフａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｆから選択される改変の少なくとも１つを含み、また、前記抗原結合タンパク質はＣＤ２０に特異的に結合する）；ならびに
ｆ．そのＣ末端にＸ１８Ｘ１９を含むＦｃドメイン配列（ここで、Ｘ１８はＤおよびＥ、またはＨ、ＫおよびＲから選択される１〜４のアミノ酸であり、Ｘ１９はＰ、Ｍ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、ＹおよびＷから選択され、かつＸ１８がＤまたはＥを含むとき存在せず、Ｘ１８がそのＣ末端にＫまたはＲを含むとき存在し、Ｘ１８がそのＣ末端にＨを含むとき存在するかまたは存在せず、前記ＦｃドメインのＣ末端にＰＧＫＰ（配列番号３８１）、ＰＧＫＫＰ（配列番号３８２）、ＰＧＫＫＫＰ（配列番号３８３）またはＰＧＥが現れたとき、前記抗原結合タンパク質は、２５３Ｘ１５、またはサブパラグラフａ〜ｅから選択される置換の少なくとも１つを含み、また、前記抗原結合タンパク質はＣＤ２０またはＣＤ３８に特異的に結合する）
から選択される１つ以上の配列改変を含む抗原結合タンパク質であって、
サブパラグラフａ、ｂ、ｃ、およびｄにおけるアミノ酸はＡｈｏナンバリングシステムにより番号付けされており、サブパラグラフｅのアミノ酸はＥＵナンバリングシステムにより番号付けされている抗原結合タンパク質。
(項目２５)
前記抗原結合タンパク質は、置換を除いて、図１Ａおよび１Ｂから選択される抗体の配列（配列番号１６６および１６８；２および４；１７８および１８０；１７０および１７２；６および８；１０および１２；１４および１６；１８および２０；２２および２４；２６および２８；３０および３２；３４および３６；３８および４０；４３および４４；４６および４８；５０および５２；５４および５６；５８および６０；６２および６４；６６および６８；７０および７２；７４および７６；７８および８０；８２および８４；８６および８８；９０および９２；９４および９６；９８および１００；１０２および１０４；１０６および１０８；１１０および１１２；１１４および１１６；１１８および１２０；１２２および１２４；１２６および１２８；１３０および１３２；１３４および１３６；１５８および１６０；１３８および１４０；１４２および１４４；１４６および１４８；１５０および１５２；ならびに１５４および１５６）を含む、項目２４に記載の抗原結合タンパク質。
(項目２６)
前記ＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリー配列は、８２Ｒ、９４Ｓ、および９５Ｒから選択される１つ以上の置換を含む、項目２４に記載の抗原結合タンパク質。
(項目２７)
前記ＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリー配列は、８２Ｒ、９４Ｓ、および９５Ｒの置換を含む、項目２５に記載の抗原結合タンパク質。
(項目２８)
前記ＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリー配列は、５９Ｘ２０（ここで、Ｘ２０はＲ、ＫおよびＨから選択される）の置換を含む、項目２４に記載の抗原結合タンパク質。
(項目２９)
前記ＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリー配列は、５９Ｋの置換を含む、項目２４に記載の抗原結合タンパク質。
(項目３０)
前記ＶＨ１｜１−１８生殖系列サブファミリー配列は、５９Ｋの置換を含む、項目２５に記載の抗原結合タンパク質。
(項目３１)
前記抗原結合タンパク質は、置換を除いて、図１Ｂからの抗体ＡＦ、ＡＫ、ＡＬ、ＡＮおよびＡＯから選択される抗体の配列（配列番号１１４および１１６；１３４および１３６；１３８および１４０；１４６および１４８；ならびに１５０および１５２）を含む、項目３０に記載の抗原結合タンパク質。
(項目３２)
前記ＶＨ３｜３−３３生殖系列サブファミリー配列は、１Ｅ、１７Ｇ、および８５Ａから選択される１つ以上の置換を含む、項目２４に記載の抗原結合タンパク質。
(項目３３)
前記ＶＨ３｜３−３３生殖系列サブファミリー配列は、１Ｅ、１７Ｇ、および８５Ａの置換を含む、項目２５に記載の抗原結合タンパク質。
(項目３４)
前記抗原結合タンパク質は、置換を除いて、図１Ｂからの抗体ＡＱ、ＡＭ、ＡＩ、およびＡＧから選択される抗体の配列（配列番号１５８および１６０；１４２および１４４；１２６および１２８；ならびに１１８および１２０）を含む、項目３３に記載の抗原結合タンパク質。
(項目３５)
前記ＶＫ３｜Ｌ１６配列は、４Ｌ、１３Ｌ、７６Ｄ、７８Ｆ、９５Ｒ、９７Ｅ、および９８Ｐから選択される１つ以上の置換を含む、項目２４に記載の抗原結合タンパク質。
(項目３６)
前記ＶＫ３｜Ｌ１６配列は、４Ｌ、１３Ｌ、７６Ｄ、９５Ｒ、９７Ｅ、および９８Ｐの置換を含む、項目２５に記載の抗原結合タンパク質。
(項目３７)
前記ＶＫ３｜Ｌ１６配列は、４Ｌ、１３Ｌ、７６Ｄ、９５Ｒ、９７Ｅ、および９８Ｐから選択される１つ以上の置換を含む、項目２６に記載の抗原結合タンパク質。
(項目３８)
前記ＶＫ３｜Ｌ１６配列は、４Ｌ、１３Ｌ、７６Ｄ、９５Ｒ、９７Ｅ、および９８Ｐから選択される１つ以上の置換を含む、項目２９に記載の抗原結合タンパク質。
(項目３９)
前記ＶＫ３｜Ｌ１６配列は、４Ｌ、１３Ｌ、７６Ｄ、９５Ｒ、９７Ｅ、および９８Ｐから選択される１つ以上の置換を含む、項目３２に記載の抗原結合タンパク質。
(項目４０)
前記抗原結合タンパク質は、置換を除いて、図１Ｂからの抗体ＡＦおよびＡＱから選択される抗体の配列（配列番号１１４および１１６；ならびに１５８および１６０）を含む、項目３６に記載の抗原結合タンパク質。
(項目４１)
前記ＶＫ３｜Ｌ６配列は、７６Ｄおよび９５Ｒから選択される１つ以上の置換を含む、項目２４に記載の抗原結合タンパク質。
(項目４２)
前記ＶＫ３｜Ｌ６配列は、７６Ｄおよび９５Ｒの置換を含む、項目２５に記載の抗原結合タンパク質。
(項目４３)
前記ＶＫ３｜Ｌ６配列は、７６Ｄおよび９５Ｒの置換を含む、項目２６に記載の抗原結合タンパク質。
(項目４４)
前記ＶＫ３｜Ｌ６配列は、７６Ｄおよび９５Ｒの置換を含む、項目２９に記載の抗原結合タンパク質。
(項目４５)
前記ＶＫ３｜Ｌ６配列は、７６Ｄおよび９５Ｒの置換を含む、項目３２に記載の抗原結合タンパク質。
(項目４６)
前記抗原結合タンパク質は、置換を除いて、図１Ｂからの抗体ＡＪの配列（配列番号１３０および１３２）を含む、項目３９に記載の抗原結合タンパク質。
(項目４７)
２５３Ａ、４４０Ｋ、および４３９Ｅから選択される１つ以上の置換を含むＦｃドメイン配列を含む、項目２４に記載の抗原結合タンパク質。
(項目４８)
２５３Ａ、４４０Ｋ、および４３９Ｅから選択される１つ以上の置換を含むＦｃドメイン配列を含む、項目２５に記載の抗原結合タンパク質。
(項目４９)
前記抗原結合タンパク質は、置換を除いて、抗体ＢＡ、ＡＨ、およびＡＮから選択される抗体の配列（配列番号１７４および１７６；１２２および１２４；ならびに１４６および１４８）を含む、項目４２に記載の抗原結合タンパク質。
(項目５０)
２５３Ａ、４４０Ｋ、および４３９Ｅの置換から選択される１つ以上の置換を含むＦｃドメイン配列を含む、項目２４に記載の抗原結合タンパク質。
(項目５１)
２５３Ａ、４４０Ｋ、および４３９Ｅの置換から選択される１つ以上の置換を含むＦｃドメイン配列を含む、項目２６に記載の抗原結合タンパク質。
(項目５２)
２５３Ａ、４４０Ｋ、および４３９Ｅから選択される１つ以上の置換を含むＦｃドメイン配列を含む、項目２９に記載の抗原結合タンパク質。
(項目５３)
２５３Ａ、４４０Ｋ、および４３９Ｅから選択される１つ以上の置換を含むＦｃドメイン配列を含む、項目３２に記載の抗原結合タンパク質。
(項目５４)
２５３Ａ、４４０Ｋ、および４３９Ｅから選択される１つ以上の置換を含むＦｃドメイン配列を含む、項目３５に記載の抗原結合タンパク質。
(項目５５)
２５３Ａ、４４０Ｋ、および４３９Ｅから選択される１つ以上の置換を含むＦｃドメイン配列を含む、項目３７に記載の抗原結合タンパク質。
(項目５６)
２５３Ａ、４４０Ｋ、および４３９Ｅから選択される１つ以上の置換を含むＦｃドメイン配列を含む、項目３８に記載の抗原結合タンパク質。
(項目５７)
２５３Ａ、４４０Ｋ、および４３９Ｅから選択される１つ以上の置換を含むＦｃドメイン配列を含む、項目３９に記載の抗原結合タンパク質。
(項目５８)
２５３Ａ、４４０Ｋ、および４３９Ｅから選択される１つ以上の置換を含むＦｃドメイン配列を含む、項目４１に記載の抗原結合タンパク質。
(項目５９)
２５３Ａ、４４０Ｋ、および４３９Ｅから選択される１つ以上の置換を含むＦｃドメイン配列を含む、項目４２に記載の抗原結合タンパク質。
(項目６０)
２５３Ａ、４４０Ｋ、および４３９Ｅから選択される１つ以上の置換を含むＦｃドメイン配列を含む、項目４３に記載の抗原結合タンパク質。
(項目６１)
２５３Ａ、４４０Ｋ、および４３９Ｅから選択される１つ以上の置換を含むＦｃドメイン配列を含む、項目４４に記載の抗原結合タンパク質。
(項目６２)
２５３Ａ、４４０Ｋ、および４３９Ｅから選択される１つ以上の置換を含むＦｃドメイン配列を含む、項目４５に記載の抗原結合タンパク質。
(項目６３)
前記ＦｃドメインのＣ末端に、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含む、項目２４に記載の抗原結合タンパク質。
(項目６４)
前記ＦｃドメインのＣ末端に、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含む、項目２６に記載の抗原結合タンパク質。
(項目６５)
前記ＦｃドメインのＣ末端に、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含む、項目２９に記載の抗原結合タンパク質。
(項目６６)
前記ＦｃドメインのＣ末端に、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含む、項目３２に記載の抗原結合タンパク質。
(項目６７)
前記ＦｃドメインのＣ末端に、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含む、項目３５に記載の抗原結合タンパク質。
(項目６８)
前記ＦｃドメインのＣ末端に、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含む、項目３７に記載の抗原結合タンパク質。
(項目６９)
前記ＦｃドメインのＣ末端に、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含む、項目３８に記載の抗原結合タンパク質。
(項目７０)
前記ＦｃドメインのＣ末端に、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含む、項目３９に記載の抗原結合タンパク質。
(項目７１)
前記ＦｃドメインのＣ末端に、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含む、項目４１に記載の抗原結合タンパク質。
(項目７２)
前記ＦｃドメインのＣ末端に、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含む、項目４２に記載の抗原結合タンパク質。
(項目７３)
前記ＦｃドメインのＣ末端に、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含む、項目４３に記載の抗原結合タンパク質。
(項目７４)
前記ＦｃドメインのＣ末端に、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含む、項目４４に記載の抗原結合タンパク質。
(項目７５)
前記ＦｃドメインのＣ末端に、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含む、項目４５に記載の抗原結合タンパク質。
(項目７６)
前記ＦｃドメインのＣ末端に、ＫＰ、ＫＫＰ、ＫＫＫＰ（配列番号３８０）、およびＥから選択されるアミノ酸配列を含む、項目４７に記載の抗原結合タンパク質。
(項目７７)
図１０から選択される一連の置換：
ａ．重鎖におけるＴ８２Ｒ、Ｒ９４Ｓ、およびＳ９５Ｒ、
ｂ．重鎖におけるＳ５９Ｋ、Ｔ８２Ｒ、Ｒ９４Ｓ、およびＳ９５Ｒ、
ｃ．重鎖におけるＴ８２Ｒ、Ｒ９４Ｓ、およびＳ９５Ｒと、軽鎖におけるＧ１３Ｌ、ならびに
ｄ．重鎖におけるＳ５９Ｋ、Ｔ８２Ｒ、Ｒ９４Ｓ、およびＳ９５Ｒと、軽鎖におけるＧ１３Ｌ
を含むことを除いて、ＰＣＳＫ−９結合ポリペプチドの重鎖および軽鎖配列を含み、
前記アミノ酸はＡｈｏナンバリングシステムによって番号付けされている、
ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質。
(項目７８)
前記ＰＣＳＫ−９結合ポリペプチドは、図１Ｂからの抗体ＡＫの重鎖および軽鎖配列（配列番号１３４および１３６）を含む、項目７７に記載の抗原結合タンパク質。
(項目７９)
Ｉ２５３Ａ、Ｓ４４０Ｋ、またはＫ４３９Ｅの置換の１つ以上を含むことを除いて、図１Ｂの抗体ＡＫの重鎖配列（配列番号１３６）を含み、前記アミノ酸はＥＵナンバリングシステムによって番号付けされている、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質。
(項目８０)
前記重鎖はさらに、Ｉ２５３Ａ、Ｓ４４０Ｋ、またはＫ４３９Ｅの置換の１つ以上を含み、前記アミノ酸はＥＵナンバリングシステムによって番号付けされている、項目７７に記載の抗原結合タンパク質。
(項目８１)
配列番号３５２、３５３、および３５４から選択されるアミノ酸配列を含む、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質。
(項目８２)
配列番号３５１および３６７から選択されるアミノ酸配列をさらに含む、項目８１に記載の抗原結合タンパク質。
(項目８３)
図１０から選択される一連の置換：
ａ．重鎖におけるＴ８２Ｒ、Ｒ９４Ｓ、およびＳ９５Ｒ、
ｂ．重鎖におけるＳ５９Ｋ、Ｔ８２Ｒ、Ｒ９４Ｓ、およびＳ９５Ｒ、
ｃ．重鎖におけるＴ８２Ｒ、Ｒ９４Ｓ、およびＳ９５Ｒと、軽鎖におけるＶ１３Ｌ、ならびに
ｄ．重鎖におけるＳ５９Ｋ、Ｔ８２Ｒ、Ｒ９４Ｓ、およびＳ９５Ｒと、軽鎖におけるＶ１３Ｌ
を含むことを除いて、図１Ｂの抗体ＡＯの重鎖および軽鎖配列（配列番号１５０および１５２）を含み、
前記アミノ酸はＡｈｏナンバリングシステムによって番号付けされている、
ｃ−ｆｍｓに特異的に結合する抗原結合タンパク質。
(項目８４)
配列番号３５６、３５７、および３５８から選択されるアミノ酸配列を含む、ｃ−ｆｍｓに特異的に結合する抗原結合タンパク質。
(項目８５)
配列番号３５５のアミノ酸配列をさらに含む、項目８４に記載の抗原結合タンパク質。
(項目８６)
配列番号３５９、３６１、３６２、３６４、および３６８から選択されるアミノ酸配列を含む、ＧＩＰＲに特異的に結合する抗原結合タンパク質。
(項目８７)
配列番号３６０、３６３、３６５、および３６７から選択されるアミノ酸配列をさらに含む、項目８６に記載の抗原結合タンパク質。
(項目８８)
ａ．前記抗原結合タンパク質は４４０Ｘ１６置換を欠く親抗体に対して置換４４０Ｘ１６を含み、
ｂ．皮下注射により前記抗原結合タンパク質および前記親抗体が同じ濃度で投与された場合に、前記抗原結合タンパク質は前記親抗体よりも速く最大血清濃度に達し、かつ
ｃ．皮下注射により前記抗原結合タンパク質および前記親抗体が同じ濃度で投与された場合に、前記抗原結合タンパク質は前記親抗体よりも高い最大血清濃度に達する、
項目２４に記載の抗原結合タンパク質。
(項目８９)
項目８８に記載の抗原結合タンパク質は、前記親抗体の少なくとも約２倍の速さで最大血清濃度に達する、項目８８に記載の抗原結合タンパク質。
(項目９０)
項目８８に記載の抗原結合タンパク質は、前記親抗体より少なくとも約２５％高い最大血清濃度に達する、項目８８に記載の抗原結合タンパク質。
(項目９１)
前記親抗体は、ＰＣＳＫ−９結合ポリペプチドである、項目８８に記載の抗原結合タンパク質。
(項目９２)
前記親抗体は、図１Ｂからの抗体ＡＫ（配列番号１３４および１３６）である、項目８８に記載の抗原結合タンパク質。
(項目９３)
Ｘ１６はＫである、項目８８に記載の抗原結合タンパク質。
(項目９４)
Ｘ１６はＫである、項目８９に記載の抗原結合タンパク質。
(項目９５)
Ｘ１６はＫである、項目９０に記載の抗原結合タンパク質。
(項目９６)
Ｘ１６はＫである、項目９１に記載の抗原結合タンパク質。
(項目９７)
Ｘ１６はＫである、項目９２に記載の抗原結合タンパク質。
(項目９８)
両方が同じ濃度で投与された場合に、親抗体より高い最大血清濃度に達し、親抗体より速く最大血清濃度に達する抗原結合タンパク質の調製方法であって、前記親抗体に配列改変４４０Ｘ１６（ここで、Ｘ１６はＲ、Ｋ、およびＨから選択される）を導入することを含む方法。
(項目９９)
前記抗原結合タンパク質は、前記親抗体の少なくとも２倍の速さで最大血清濃度に達する、項目９８に記載の方法。
(項目１００)
Ｘ１６はＫである、項目９８に記載の方法。
(項目１０１)
Ｘ１６はＫである、項目９９に記載の方法。
(項目１０２)
前記親抗体はＰＣＳＫ９結合ポリペプチドである、項目９８に記載の方法。
(項目１０３)
前記親抗体はＰＣＳＫ９結合ポリペプチドである、項目９９に記載の方法。
(項目１０４)
前記親抗体はＰＣＳＫ９結合ポリペプチドである、項目１００に記載の方法。
(項目１０５)
前記親抗原結合タンパク質は、図１Ｂからの抗体ＡＫ（配列番号１３４および１３６）である、項目９８に記載の抗原結合タンパク質。
(項目１０６)
前記親抗原結合タンパク質は、図１Ｂからの抗体ＡＫ（配列番号１３４および１３６）である、項目９９に記載の抗原結合タンパク質。
(項目１０７)
前記親抗原結合タンパク質は、図１Ｂからの抗体ＡＫ（配列番号１３４および１３６）である、項目１００に記載の抗原結合タンパク質。
(項目１０８)
患者のＰＣＳＫ９に関連する兆候を治療する方法であって、項目８１に記載の抗原結合タンパク質を投与することを含む方法。
(項目１０９)
前記ＰＣＳＫ９に関連する兆候は高コレステロール血症である、項目１０８に記載の方法。
(項目１１０)
患者のＰＣＳＫ９に関連する兆候を治療する方法であって、項目８２に記載の抗原結合タンパク質を投与することを含む方法。
(項目１１１)
前記ＰＣＳＫ９に関連する兆候は高コレステロール血症である、項目１１０に記載の方法。
(項目１１２)
患者のＰＣＳＫ９に関連する兆候を治療する方法であって、項目８８に記載の抗原結合タンパク質を投与することを含む方法。
(項目１１３)
前記ＰＣＳＫ９に関連する兆候は高コレステロール血症である、項目１１２に記載の方法。
【図１Ａ】
2019532063.tif 000003
【図１Ｂ】
2019532063.tif 000004
【図１Ｃ】
2019532063.tif 000005
【図１Ｄ】
2019532063.tif 000006
【図２】
2019532063.tif 000007
【図３】
2019532063.tif 000008
【図４】
2019532063.tif 000009
【図５】
2019532063.tif 000010
【図６】
2019532063.tif 000011
【図７】
2019532063.tif 000012
【図８】
2019532063.tif 000013
【図９】
2019532063.tif 000014
【図１０】
2019532063.tif 000015
【図１１】
2019532063.tif 000016
【図１２】
2019532063.tif 000017
【図１３】
2019532063.tif 000018
【図１４Ａ】
2019532063.tif 000019
【図１４Ｂ】
2019532063.tif 000020
【図１５】
2019532063.tif 000021
【図１６】
2019532063.tif 000022
【図１７】
2019532063.tif 000023
【図１８】
2019532063.tif 000024
【図１９】
2019532063.tif 000025
【図２０】
2019532063.tif 000026
【図２１】
2019532063.tif 000027
【図２２】
2019532063.tif 000028
【図２３】
2019532063.tif 000029
【図２４】
2019532063.tif 000030
【配列表】
2019532063000001.app
【国際調査報告】
2019532063.tif 000031
2019532063.tif 000032
2019532063.tif 000033
2019532063.tif 000034
2019532063.tif 000035