(57)【要約】  希少細胞を固定及び染色する組成物及び方法が本明細書で開示される。さらに、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を同定する方法が本明細書で開示される。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞試料の画像を撮って対象となる細胞を特定すること、染色された核領域の第１のピクセル強度を測定すること、バックグラウンド領域の第２のピクセル強度を測定すること、第２のピクセル強度を第１のピクセル強度から減算することによって対象となる細胞の倍数性状態を計算すること、及び対象となる細胞が循環腫瘍細胞であるかどうかを倍数性状態に基づいて判定することを含む。その方法は、機械学習アルゴリズムを使用して、特徴を特定し、特徴を処理して対象となるパラメーターを抽出し、対象となるパラメーターを解析し、対象となるパラメーターが所定の閾値より大きいか又は小さい場合に、対象となる細胞をＣＴＣに分類するように、コンピューターで実行することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を固定する試薬系であって、
アルコールで希釈された少なくとも３％（重量／体積）の第１の親水性ポリマー
を含む第１の固定バッファー、
少なくとも５％（体積／体積）の第２の親水性ポリマー、
少なくとも０．０１％（体積／体積）の界面活性剤、及び
少なくとも０．００５％（重量／体積）のクロムミョウバン
を含む第２の固定バッファー
を含み、前記第２の親水性ポリマー、界面活性剤、及びクロムミョウバンが、生理食塩水で希釈され、
前記第１の固定バッファーが、前記細胞に−５℃より低い温度で加えられる試薬系。
【請求項２】
細胞を固定する試薬系であって、
アルコールで希釈された３％〜２０％（重量／体積）の第１の親水性ポリマー
を含む第１の固定バッファー、
５％〜３０％（体積／体積）の第２の親水性ポリマー、
０．０１％〜１％（体積／体積）の界面活性剤、及び
０．００５％〜１％（重量／体積）のクロムミョウバン、
を含む第２の固定バッファー
を含み、前記第２の親水性ポリマー、界面活性剤、及びクロムミョウバンが、生理食塩水で希釈され、
前記第１の固定バッファーが、前記細胞に−９０℃〜−５℃の温度で加えられる試薬系。
【請求項３】
細胞を固定する試薬系であって、
５％（重量／体積）の、アルコールで希釈された第１の親水性ポリマー
を含む第１の固定バッファー、
１５％（体積／体積）の第２の親水性ポリマー、
０．４％（体積／体積）の界面活性剤、及び
０．０１％（重量／体積）のクロムミョウバン、
を含む第２の固定バッファー
を含み、前記第２の親水性ポリマー、界面活性剤、及びクロムミョウバンが、生理食塩水で希釈され、
前記第１の固定バッファーが、前記細胞に−１５℃より低い温度で加えられる試薬系。
【請求項４】
前記第１の親水性ポリマーがポリビニルピロリドン及びグリセロールのうちの１つである請求項３に記載の試薬系。
【請求項５】
前記第２の親水性ポリマーがグリセロール及びポリビニルピロリドンのうちの１つである請求項３に記載の試薬系。
【請求項６】
前記アルコールがメタノールである請求項３に記載の試薬系。
【請求項７】
前記界面活性剤がポリソルベート界面活性剤である請求項３に記載の試薬系。
【請求項８】
前記界面活性剤がポリソルベート２０である請求項３に記載の試薬系。
【請求項９】
前記第１及び第２の親水性ポリマーが同一である請求項３に記載の試薬系。
【請求項１０】
前記第１及び第２の親水性ポリマーが異なる請求項３に記載の試薬系。
【請求項１１】
細胞を固定するための試薬であって、
アルコールで希釈された少なくとも３％（重量／体積）の親水性ポリマー
を含み、前記細胞に−５℃より低い温度で加えられる試薬。
【請求項１２】
前記細胞が循環腫瘍細胞である請求項１１に記載の試薬。
【請求項１３】
前記細胞が組織切片に包埋される請求項１１に記載の試薬。
【請求項１４】
非特異的な染色を減らすために染色の前に細胞上又は細胞内の非特異的な結合部位をブロックする試薬であって、
親水性ポリマー、
界面活性剤、及び
加水分解コラーゲン
を含み、前記親水性ポリマー、界面活性剤、及び加水分解コラーゲンが生理食塩水で希釈される試薬。
【請求項１５】
非特異的な染色を減らすために染色の前に細胞上又は細胞内の非特異的な結合部位をブロックする試薬であって、
少なくとも１％（体積／体積）の親水性ポリマー、
少なくとも０．０１％（体積／体積）の界面活性剤、及び
少なくとも０．１％（重量／体積）の加水分解コラーゲン
を含み、前記親水性ポリマー、界面活性剤、及び加水分解コラーゲンが生理食塩水で希釈される試薬。
【請求項１６】
少なくとも０．０１Ｍグリシン
をさらに含む請求項１５に記載の試薬。
【請求項１７】
非特異的な染色を減らすために染色の前に細胞上又は細胞内の非特異的な結合部位をブロックする試薬であって、
１％〜５０％（体積／体積）の親水性ポリマー、
０．０１％〜２％（体積／体積）の界面活性剤、及び
０．１％〜１０％（重量／体積）の加水分解コラーゲン
を含み、前記親水性ポリマー、界面活性剤、及び加水分解コラーゲンが生理食塩水で希釈される試薬。
【請求項１８】
０．０１Ｍ〜１Ｍグリシン
をさらに含む請求項１７に記載の試薬。
【請求項１９】
非特異的な染色を減らすために染色の前に細胞上又は細胞内の非特異的な結合部位をブロックする試薬であって、
１５％（体積／体積）の親水性ポリマー、
０．４％（体積／体積）の界面活性剤、及び
２％（重量／体積）の加水分解コラーゲン
を含み、前記親水性ポリマー、界面活性剤、及び加水分解コラーゲンが生理食塩水で希釈される試薬。
【請求項２０】
０．３Ｍグリシン
をさらに含む請求項１９に記載の試薬。
【請求項２１】
前記加水分解コラーゲンがブタ由来である請求項１９に記載の試薬。
【請求項２２】
細胞を循環腫瘍細胞として同定する方法であって、
細胞試料の画像を撮って対象となる細胞を特定すること、
染色された核領域の第１のピクセル強度を測定すること、
バックグラウンド領域の第２のピクセル強度を測定すること、
前記第２のピクセル強度を前記第１のピクセル強度から減算することによって前記対象となる細胞の倍数性状態を計算すること、及び
前記対象となる細胞が循環腫瘍細胞であるかどうかを前記倍数性状態に基づいて判定すること
を含む方法。
【請求項２３】
前記対象となる細胞を特定することが、ＣＤ４５陰性及びビメンチン陽性細胞を特定することを含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞試料が１つ以上の細胞を含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
核染色剤で前記細胞試料を染色して、前記対象となる細胞前記染色された核領域を特定することをさらに含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記バックグラウンド領域が前記対象となる細胞を含まない請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記倍数性状態が１未満である場合に、前記対象となる細胞が前記循環腫瘍細胞であると判定される請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記倍数性状態が２を超える場合に、前記対象となる細胞が、前記循環腫瘍細胞であると判定される請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象となる細胞が増殖マーカーに対して陰性であり、前記倍数性状態が１と２の間である場合に、循環腫瘍細胞であると判定される請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記１つ以上の細胞をビメンチン染色剤及びＣＤ４５染色剤で染色すること
をさらに含む請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記核染色剤が、ＤＲＡＱ５、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ヨウ化プロピジウム、ヘマトキシリン、ケルンエヒトロート色素、ヘキスト、及びメチルグリーンからなる群より選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
１つ以上のアポトーシス細胞を除外すること
をさらに含む請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
カスパーゼ３に対する陽性染色によって前記１つ以上のアポトーシス細胞を特定すること
をさらに含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
１つ以上の有糸分裂細胞を除外すること
をさらに含む請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
リン酸化ヒストンＨ３又はＫｉ−６７に対する陽性染色によって前記１つ以上の有糸分裂細胞を特定すること
をさらに含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
細胞を循環腫瘍細胞として同定するコンピューター実装方法であって、
対象となる細胞の画像を得ること、
核領域若しくはマーカー、細胞質領域若しくはマーカー、膜領域若しくはマーカー、細胞領域若しくはマーカー、又はそれらの組み合わせを含む前記対象となる細胞と関連する特徴を特定すること、
前記特徴を処理して、蛍光強度、細胞の大きさ、細胞形状、細胞面積、細胞質面積、核面積、又はそれらの組み合わせを含む対象となるパラメーターを抽出すること、
前記対象となるパラメーターを解析すること、及び
前記対象となるパラメーターが、所定の閾値より大きいか又は小さい場合に、前記対象となる細胞を循環腫瘍細胞に分類すること
を含むコンピューター実装方法。
【請求項３７】
前記特徴が前記核領域であり、前記対象となるパラメーターが前記核領域の前記蛍光強度である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象となるパラメーターが２を超える場合、前記対象となる細胞が、前記循環腫瘍細胞であると分類される請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象となるパラメーターが１未満である場合、前記対象となる細胞が、前記循環腫瘍細胞であると分類される請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象となる細胞が増殖マーカーに対して陰性であり、前記対象となるパラメーターが１と２の間である場合、循環腫瘍細胞に分類される請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記画像を処理して前記画像の信号対ノイズの質をよくすること
をさらに含む請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記対象となる細胞を、ビメンチン染色剤、ＣＤ４５染色剤、及び前記核染色剤で染色すること
をさらに含む請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記対象となる細胞がＣＤ４５陰性及びビメンチン陽性である請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記核染色剤が、ＤＲＡＱ５、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ヨウ化プロピジウム、ヘマトキシリン、ケルンエヒトロート色素、ヘキスト、及びメチルグリーンからなる群より選択される請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象となる細胞をアポトーシス細胞として除外すること
をさらに含む請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
前記アポトーシス細胞をカスパーゼ３陽性として特定すること
をさらに含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記対象となる細胞を有糸分裂細胞として除外すること
をさらに含む請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
前記有糸分裂細胞をリン酸化ヒストンＨ３又はＫｉ−６７として特定すること
をさらに含む請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
解析が機械学習を用いて行われる請求項３６に記載の方法。
【請求項５０】
前記機械学習技術が、分類木、判別分析、ｋ近傍法、単純ベイズ、サポートベクターマシン、深層学習、又は畳み込みニューラルネットワークを含む請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記対象となる細胞の前記分類の信頼スコアを計算すること
をさらに含む請求項３６に記載の方法。
【請求項５２】
細胞を固定する方法であって、
アルコールで希釈された３％〜２０％（重量／体積）の第１の親水性ポリマー
を含む第１の固定バッファーを前記細胞に−５℃より低い温度で加えること、並びに
５％〜３０％（体積／体積）の第２の親水性ポリマー、
０．０１％〜１％（体積／体積）の界面活性剤、及び
０．００５％〜１％（重量／体積）のクロムミョウバン、
を含む第２の固定バッファーを前記細胞に加えること
を含み、前記第２の親水性ポリマー、界面活性剤、及びクロムミョウバンが生理食塩水で希釈される方法。
【請求項５３】
１％〜５０％（体積／体積）の親水性ポリマー、
０．０１％〜２％（体積／体積）の界面活性剤、及び
０．１％〜１０％（重量／体積）の加水分解コラーゲン、
を含むブロッキングバッファーを前記細胞に加えること
をさらに含み、前記第３の親水性ポリマー、界面活性剤、及び加水分解コラーゲンが、生理食塩水で希釈される請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記第１、第２、及び第３の親水性ポリマーが同一である請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記第１、第２、及び第３の親水性ポリマーが異なる請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１、第２、及び第３の親水性ポリマーが、グリセロール及びポリビニルピロリドンのうちの１つである請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
３％〜３０％（体積／体積）の第１の親水性ポリマー、及び
０．００５％〜１％（重量／体積）のクロムミョウバン、
を含むバッファーに覆われている前記細胞をスライド上で細胞遠心分離すること
をさらに含み、前記第１の親水性ポリマー及びクロムミョウバンが生理食塩水で希釈される請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記スライドがゼラチンでコーティングされる請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記スライドがクロムミョウバンでさらにコーティングされる請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞が循環腫瘍細胞である請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が組織切片に包埋される請求項５２に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞を蛍光色素分子タグ抗体で染色すること
をさらに含む請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年３月７日に出願された"Systems and Methods for Fixing Cells"と題する米国仮特許出願第６２／３０４，４５２号に基づく優先権を主張し、該開示は参照によりその全体が組み込まれる。
【０００２】
さらに本出願は、２０１６年３月２５日に出願された"Systems, Methods, and Compositions for Fixing and Staining Cells"と題する米国仮特許出願第６２／３１３，２５０号に基づく優先権を主張し、該開示は参照によりその全体が組み込まれる。
【０００３】
さらに本出願は、２０１６年３月２５日に出願された"Systems and Methods for Fixing Cells"と題する米国仮特許出願第６２／３１３，３６６号に基づく優先権を主張し、該開示は参照によりその全体が組み込まれる。
【０００４】
さらに本出願は、２０１６年１２月６日に出願された"Compositions and Methods for Identifying Circulating Tumor Cells"と題する米国仮特許出願第６２／４３０，５４２号に基づく優先権を主張し、該開示は参照によりその全体が組み込まれる。
参照による援用
【０００５】
本明細書中で言及される全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００６】
本開示は、全体として、分子生物学及び顕微鏡法の分野に関する。本明細書に記載されるのは、細胞を固定及び染色し、細胞の異数性を検出するための装置、系、及び方法である。
【背景技術】
【０００７】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、原発腫瘍から流出し、血管またはリンパ管の循環に入ったがん細胞である。ＣＴＣには、がんの増殖に資する体内の微環境に埋め込まれ、転移性がんをもたらすものがある。そのような転移性がんは、９０％のがん関連死の原因である（Fidler, IJ. (2003) “The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer 3, 453-458）。
【０００８】
ＣＴＣは転移性疾患の病因において鍵となる役割を果たすので、研究が精力的且つ活発に行われている領域となっている。従来は、ＣＴＣは、密度及び細胞の大きさなどの物理的性質、細胞表面関連マーカー、並びに／又はＣＴＣの免疫学的性質を用いて同定されてきた。残念なことに、そのような物理的性質、細胞表面関連マーカー、及び免疫学的性質は、疾患に寄与しない健康な細胞を同定することもあり、関連する病原性ＣＴＣを検出できないこともある。例えば、Veridex社のCellSearch（商標）は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）とサイトケラチンの両方に対する陽性染色を用いて、乳がん、結腸直腸がん及び前立腺がんにおけるＣＴＣを同定する。しかし、５０個の乳がん細胞株をＥｐＣＡＭ発現について調べたところ、２０％の細胞株はＥｐＣＡＭのレベルが低く、この２０％はCellSearch（商標）法で見逃されているであろうことが示唆された（Punnoose et al., (2010) 'Molecular biomarker analyses using circulating tumor cells.' PLoS One 5, el2517.）。
【０００９】
ＣＴＣを同定及び分析するための他の方法又は技術には制限があり、スループットが限定される、偽陽性の頻度が高い、細胞透過処理が必要である（その後の分析のほとんどで細胞が使えない）、ＥｐＣＡＭ（上記を参照されたい）に依存する、非常に変わりやすいマーカー若しくは性質（例えば、大きさ、密度）に依存する、又は細胞が該方法の最後にはもはや生存してない。
【００１０】
さらに、分析用に細胞を調製する方法は、典型的には、細胞及び／又は組織を損傷し、希少細胞集団を不明瞭にする可能性がある、アーティファクト、自家蛍光破片、又は細胞物質、及び／又は壊れた細胞膜の出現をもたらす。そのような方法では、架橋固定剤（例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドなど）又は沈殿固定剤（例えば、エタノール、メタノールなど）を含む固定剤を使用される。また、これらの固定剤は、細胞のリボ核酸（ＲＮＡ）を保つことができず、その後の遺伝的解析及びトランスクリプトーム解析を、不可能ではないにしても困難にする。
【００１１】
くわえて、複数の細胞バイオマーカーを染色し、染色された特徴又は生物学的特徴を染色されていない細胞の特徴とはっきりと区別することは困難である場合が多い。染色特異性を向上し、バックグラウンド染色を減少させ、信号対ノイズ比をよくするために、ブロッキングバッファーが一般的に使用される。ミルクから正常な血清や高度に精製されたタンパク質まで多岐にわたる物質が、細胞上の遊離部位に結合し、染色における抗体の非特異的結合を減らすためにブロッキングバッファー中に用いられている。しかし、一般的に使用されるブロッキングバッファーは、希少細胞、多抗体染色、及び４つ超える蛍光色素分子を必要とする染色には不十分である。
【００１２】
分子レベルでＣＴＣを解析して特徴付ける能力を上げることは、がんのスクリーニングと治療を強化し、生検などの侵襲的処置の必要性を減らすことになる。
【発明の概要】
【００１３】
本開示の１つの態様は、細胞を固定する試薬系対象とする。幾つかの実施形態では、試薬系は、アルコールで希釈された少なくとも３％（重量／体積）の第１の親水性ポリマーを含む第１の固定バッファー、並びに少なくとも５％（体積／体積）の第２の親水性ポリマー、少なくとも０．０１％（体積／体積）の界面活性剤、及び少なくとも０．００５％（重量／体積）のクロムミョウバンを含む第２の固定バッファーを含む。幾つかの実施形態では、第２の親水性ポリマー、界面活性剤、及びクロムミョウバンは、生理食塩水で希釈される。幾つかの実施形態では、第１の固定バッファーは細胞に−５℃より低い温度で加えられる。
【００１４】
本開示の別の態様は、細胞を固定する試薬系を対象とする。幾つかの実施形態では、試薬系は、アルコールで希釈された３％〜２０％（重量／体積）の第１の親水性ポリマーを含む第１の固定バッファー、並びに５％〜３０％（体積／体積）の第２の親水性ポリマー、０．０１％〜１％（体積／体積）の界面活性剤、及び０．００５％〜１％（重量／体積）のクロムミョウバンを含む第２の固定バッファーを含む。幾つかの実施形態では、第２の親水性ポリマー、界面活性剤、及びクロムミョウバンは、生理食塩水で希釈される。幾つかの実施形態では、第１の固定バッファーは細胞に−９０℃〜−５℃の温度で加えられる。
【００１５】
本開示の別の態様は、細胞を固定する試薬系を対象とする。幾つかの実施形態では、試薬系は、アルコールで希釈された５％（重量／体積）の第１の親水性ポリマーを含む第１の固定バッファー、並びに１５％（体積／体積）の第２の親水性ポリマー、０．４％（体積／体積）の界面活性剤、及び０．０１％（重量／体積）のクロムミョウバンを含む第２の固定バッファーを含む。幾つかの実施形態では、第２の親水性ポリマー、界面活性剤、及びクロムミョウバンは、生理食塩水で希釈される。幾つかの実施形態では、第１の固定バッファーは細胞に−１５℃より低い温度で加えられる。
【００１６】
幾つかの実施形態では、第１の親水性ポリマーはポリビニルピロリドン及びグリセロールのうちの１つである。
【００１７】
幾つかの実施形態では、第２の親水性ポリマーはグリセロール及びポリビニルピロリドンのうちの１つである。
【００１８】
幾つかの実施形態では、アルコールはメタノールである。
【００１９】
幾つかの実施形態では、界面活性剤はポリソルベート界面活性剤である。幾つかの実施形態では、界面活性剤はポリソルベート２０である。
【００２０】
幾つかの実施形態では、第１及び第２の親水性ポリマーは同じである。幾つかの実施形態では、第１及び第２の親水性ポリマーは異なる。
【００２１】
本開示の別の態様は、細胞を固定するための試薬を対象とする。幾つかの実施形態では、試薬は、アルコールで希釈された少なくとも３％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、試薬は細胞に−５℃より低い温度で加えられる。
【００２２】
幾つかの実施形態では、細胞は循環腫瘍細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は組織切片に包埋される。
【００２３】
本開示の別の態様は、非特異的な染色を減らすために染色の前に細胞上又は細胞内の非特異的な結合部位をブロックする試薬を対象とする。幾つかの実施形態では、試薬は、親水性ポリマー、界面活性剤、及び加水分解コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、親水性ポリマー、界面活性剤、及び加水分解コラーゲンは、生理食塩水で希釈される。
【００２４】
本開示の別の態様は、非特異的な染色を減らすために染色の前に細胞上又は細胞内の非特異的な結合部位をブロックする試薬を対象とする。幾つかの実施形態では、試薬は、少なくとも１％（体積／体積）の親水性ポリマー、少なくとも０．０１％（体積／体積）の界面活性剤、及び少なくとも０．１％（重量／体積）の加水分解コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、親水性ポリマー、界面活性剤、及び加水分解コラーゲンは、生理食塩水で希釈される。
【００２５】
幾つかの実施形態では、試薬は少なくとも０．０１Ｍグリシンをさらに含む。
【００２６】
本開示の別の態様は、非特異的な染色を減らすために染色の前に細胞上又は細胞内の非特異的な結合部位をブロックする試薬を対象とする。幾つかの実施形態では、試薬は、１％〜５０％（体積／体積）の親水性ポリマー、０．０１％〜２％（体積／体積）の界面活性剤、及び０．１％〜１０％（重量／体積）の加水分解コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、親水性ポリマー、界面活性剤、及び加水分解コラーゲンは、生理食塩水で希釈される。
【００２７】
幾つかの実施形態では、試薬は０．０１Ｍ〜１Ｍのグリシンをさらに含む。
【００２８】
本開示の別の態様は、非特異的な染色を減らすために染色の前に細胞上又は細胞内の非特異的な結合部位をブロックする試薬を含む。幾つかの実施形態では、試薬は、１５％（体積／体積）の親水性ポリマー、０．４％（体積／体積）の界面活性剤、及び２％（重量／体積）の加水分解コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、親水性ポリマー、界面活性剤、及び加水分解コラーゲンは、生理食塩水で希釈される。
【００２９】
幾つかの実施形態では、試薬０．３Ｍグリシンをさらに含む。
【００３０】
幾つかの実施形態では、加水分解コラーゲンはブタ由来である。
【００３１】
本開示の別の態様は、細胞を循環腫瘍細胞として同定する方法を対象とする。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞試料の画像を撮って対象となる細胞を特定すること、染色された核領域の第１のピクセル強度を測定すること、バックグラウンド領域の第２のピクセル強度を測定すること、第２のピクセル強度を第１のピクセル強度から減算することによって対象となる細胞の倍数性状態を計算すること、及び対象となる細胞が循環腫瘍細胞であるかどうかを倍数性状態に基づいて判定することを含む。
【００３２】
幾つかの実施形態では、対象となる細胞を特定することは、ＣＤ４５陰性及びビメンチン陽性細胞を特定することを含む。
【００３３】
幾つかの実施形態では、細胞試料は１つ以上の細胞を含む。
【００３４】
幾つかの実施形態では、該方法は、細胞試料を核染色剤で染色して、対象となる細胞の染色された核領域を特定することをさらに含む。
【００３５】
幾つかの実施形態では、バックグラウンド領域は対象となる細胞を含まない。
【００３６】
幾つかの実施形態では、対象となる細胞は、倍数性状態が１未満である場合に、循環腫瘍細胞であると判定される。幾つかの実施形態では、対象となる細胞は、倍数性状態が２より大きい場合に、循環腫瘍細胞であると判定される。幾つかの実施形態では、対象となる細胞は増殖マーカーに対して陰性であり、倍数性状態が１と２の間の場合に、循環腫瘍細胞であると判定される。
【００３７】
幾つかの実施形態では、該方法は、１つ以上の細胞をビメンチン染色剤及びＣＤ４５染色剤で染色することをさらに含む。
【００３８】
幾つかの実施形態では、核染色剤は、ＤＲＡＱ５、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ヨウ化プロピジウム、ヘマトキシリン、ケルンエヒトロート色素、ヘキスト、及びメチルグリーンからなる群より選択される。
【００３９】
幾つかの実施形態では、該方法は、１つ以上のアポトーシス細胞を除外することをさらに含む。
【００４０】
幾つかの実施形態では、該方法は、１つ以上のアポトーシス細胞をカスパーゼ３に対する陽性染色によって特定することをさらに含む。
【００４１】
幾つかの実施形態では、該方法は、１つ以上の有糸分裂細胞を除外することをさらに含む。
【００４２】
幾つかの実施形態では、該方法は、リン酸化ヒストンＨ３又はＫｉ−６７に対する陽性染色によって１つ以上の有糸分裂細胞を特定することをさらに含む。
【００４３】
本開示の別の態様は、細胞を循環腫瘍細胞として同定するコンピューター実装方法を対象とする。幾つかの実施形態では、該方法は、対象となる細胞の画像を得ること、対象となる細胞と関連する特徴が、核領域若しくはマーカー、細胞質領域若しくはマーカー、膜領域若しくはマーカー、細胞領域若しくはマーカー、又はそれらの組み合わせを含むように、特徴を特定すること、対象となるパラメーターが、蛍光強度、細胞の大きさ、細胞形状、細胞面積、細胞質面積、核面積、又はそれらの組み合わせを含むように、特徴を処理して対象となるパラメーターを抽出すること、対象となるパラメーターを解析すること、及び対象となるパラメーターが所定の閾値より大きいか又は小さい場合に、対象となる細胞を循環腫瘍細胞に分類することを含む。
【００４４】
幾つかの実施形態では、特徴は核領域であり、対象となるパラメーターは核領域の蛍光強度である。
【００４５】
幾つかの実施形態では、対象となるパラメーターが２より大きい場合、対象となる細胞は循環腫瘍細胞に分類される。幾つかの実施形態では、対象となるパラメーターが１未満である場合、対象となる細胞は循環腫瘍細胞に分類される。幾つかの実施形態では、対象となるパラメーターが１と２の間である場合、対象となる細胞は増殖マーカーに対して陰性であり、循環腫瘍細胞に分類される。
【００４６】
幾つかの実施形態では、該方法は、画像を処理して画像の信号対ノイズの質をよくすることをさらに含む。
【００４７】
幾つかの実施形態では、該方法は、対象となる細胞をビメンチン染色剤、ＣＤ４５染色剤、及び核染色剤で染色することをさらに含む。
【００４８】
幾つかの実施形態では、対象となる細胞は、ＣＤ４５陰性及びビメンチン陽性である。
【００４９】
幾つかの実施形態では、核染色剤は、ＤＲＡＱ５、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ヨウ化プロピジウム、ヘマトキシリン、ケルンエヒトロート色素、ヘキスト、及びメチルグリーンからなる群より選択される。
【００５０】
幾つかの実施形態では、該方法は、対象となる細胞をアポトーシス細胞として除外することをさらに含む。幾つかのそのような実施形態では、該方法は、アポトーシス細胞をカスパーゼ３陽性として特定することをさらに含みうる。
【００５１】
幾つかの実施形態では、該方法は、対象となる細胞を有糸分裂細胞として除外することをさらに含む。幾つかのそのような実施形態では、該方法は、有糸分裂細胞をリン酸化ヒストンＨ３又はＫｉ−６７として特定することをさらに含みうる。
【００５２】
幾つかの実施形態では、解析は機械学習を用いて行われる。幾つかのそのような実施形態では、機械学習技術は、分類木、判別分析、ｋ近傍法、単純ベイズ、サポートベクターマシン、深層学習、又は畳み込みニューラルネットワークを含む。
【００５３】
幾つかの実施形態では、該方法は、対象となる細胞の分類の信頼スコアを計算することをさらに含む。
【００５４】
本開示の別の態様は、細胞を固定する方法を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、アルコールで希釈された３％〜２０％（重量／体積）の第１の親水性ポリマーを含む第１の固定バッファーを細胞に−５℃より低い温度で加えること、並びに５％〜３０％（体積／体積）の第２の親水性ポリマー、０．０１％〜１％（体積／体積）の界面活性剤、及び０．００５％〜１％（重量／体積）のクロムミョウバンを含む第２の固定バッファーを細胞に加えることを含む。幾つかの実施形態では、第２の親水性ポリマー、界面活性剤、及びクロムミョウバンは、生理食塩水で希釈される。
【００５５】
幾つかの実施形態では、該方法は、ブロッキングバッファーを細胞に加えることをさらに含み、そのブロッキングバッファーは、１％〜５０％（体積／体積）親水性ポリマー、０．０１％〜２％（体積／体積）の界面活性剤、及び０．１％〜１０％（重量／体積）加水分解コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、第３の親水性ポリマー、界面活性剤、及び加水分解コラーゲンは、生理食塩水で希釈される。
【００５６】
幾つかの実施形態では、第１、第２、及び第３の親水性ポリマーは同じである。幾つかの実施形態では、第１、第２、及び第３の親水性ポリマーは異なる。幾つかの実施形態では、第１、第２、及び第３の親水性ポリマーはグリセロール及びポリビニルピロリドンのうちの１つである。
【００５７】
幾つかの実施形態では、該方法は細胞遠心分離することをさらに含む。幾つかのそのような実施形態では、細胞は、３％〜３０％（体積／体積）の第１の親水性ポリマー及び０．００５％〜１％（重量／体積）のクロムミョウバンを含むバッファーで覆われる。幾つかの実施形態では、第１の親水性ポリマー及びクロムミョウバンは生理食塩水で希釈される。
【００５８】
幾つかの実施形態では、スライドはゼラチンでコーティングされる。幾つかの実施形態では、スライドはクロムミョウバンでさらにコーティングされる。
【００５９】
幾つかの実施形態では、細胞は循環腫瘍細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は組織切片に包埋される。
【００６０】
幾つかの実施形態では、該方法は前記細胞を蛍光色素分子タグ抗体で染色することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
上記は概要であり、したがって必然的に詳細に制限がある。添付の図面を参照して、本技術の上記の態様、並びに他の態様、特徴、及び利点を、さまざまな実施形態に関連して以下に説明する。
【図１】図１は、細胞を固定する方法の１つの実施形態のフローチャートである。
【図２】図２は、循環腫瘍細胞としての細胞を同定する方法の１つの実施形態のフローチャートである。
【図３】図３は、細胞を循環腫瘍細胞として同定するコンピューター実装方法の１つの実施形態のフローチャートである。
【図４】図４は、図１〜３の方法を実行するように構成されたコンピューティングデバイスの概略図である。  図５Ａ〜８Ｂは、Ａ５４９細胞を抗サイトケラチンフィコエリスリン（ＰＥ）で染色し、緑色で示した実験の結果を示す。
【図５】図５Ａは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した０％（重量／体積）ＰＶＰ及び０．０１％（重量／体積）硫酸クロムカリウムを含むバッファー中で細胞を細胞遠心分離した実験の結果の一例を示す。  図５Ｂは、ＰＢＳで希釈した１％（重量／体積）ＰＶＰ及び０．０１％（重量／体積）硫酸クロムカリウムを含むバッファー中で細胞を細胞遠心分離した実験の結果の一例を示す。  図５Ｃは、ＰＢＳで希釈した１０％（重量／体積）ＰＶＰ及び０．０１％（重量／体積）硫酸クロムカリウムを含むバッファー中で細胞を細胞遠心分離した実験の結果の一例を示す。  図５Ｄは、ＰＢＳで希釈した２０％（重量／体積）ＰＶＰ及び０．０１％（重量／体積）硫酸クロムカリウムを含むバッファー中で細胞を細胞遠心分離した実験の結果の一例を示す。
【図６−１】図６Ａは、−１０℃で１００％メタノールを含む細胞外固定剤を用いて細胞を固定した実験の結果の一例を示す。  図６Ｂは、ドライアイス上で１００％メタノールを含む細胞外固定剤を用いて細胞を固定した実験の結果の一例を示す。  図６Ｃは、−１０℃で、メタノールで希釈した１％（重量／体積）ＰＶＰを含む細胞外固定剤を用いて細胞を固定した実験の結果の一例を示す。  図６Ｄは、ドライアイス上で、メタノールで希釈した１％（重量／体積）ＰＶＰを含む細胞外固定剤を用いて細胞を固定した実験の結果の一例を示す。
【図６−２】図６Ｅは、−１０℃で、メタノールで希釈した５％（重量／体積）ＰＶＰを含む細胞外固定剤を用いて細胞を固定した実験の結果の一例を示す。  図６Ｆは、ドライアイス上で、メタノールで希釈した５％（重量／体積）ＰＶＰを含む細胞外固定剤を用いて細胞を固定した実験の結果の一例を示す。  図６Ｇは、−１０℃で、メタノールで希釈した１０％（重量／体積）ＰＶＰを含む細胞外固定剤を用いて細胞を固定した実験の結果の一例を示す。  図６Ｈは、ドライアイス上で、メタノールで希釈した１０％（重量／体積）ＰＶＰを含む細胞外固定剤を用いて細胞を固定した実験の結果の一例を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｆは、Ａ５４９細胞を抗サイトケラチン（緑色で示される）及び抗ＣＤ４５（黄色で示される）で染色した実験の結果を示す。  図７Ａは、ＰＢＳで希釈した１５％（体積／体積）グリセロール及び０．０１％（重量／体積）硫酸クロムカリウムを含む細胞内固定剤を用いて室温で細胞を固定した実験の結果の一例を示す。  図７Ｂは、ＰＢＳで希釈した１５％（体積／体積）グリセロール及び０．０１％（重量／体積）硫酸クロムカリウムを含む細胞内固定剤を用いて塩氷上（例えば、約−２℃）で細胞を固定した実験の結果の一例を示す。  図７Ｃは、ＰＢＳで希釈した８％（体積／体積）グリセロール及び０．０１％（重量／体積）硫酸クロムカリウムを含む細胞内固定剤を用いて塩氷上（例えば約−２℃）で細胞を固定した実験の結果の一例を示す。  図７Ｄは、ＰＢＳで希釈した２５％（体積／体積）グリセロール及び０．０１％（重量／体積）硫酸クロムカリウムを含む細胞内固定剤を用いて塩氷上（例えば、約−２℃）で細胞を固定した実験の結果の一例を示す。  図７Ｅは、ＰＢＳで希釈した１５％（体積／体積）グリセロール及び０％（重量／体積）硫酸クロムカリウムを含む細胞内固定剤を用いて塩氷上（例えば、約−２℃）で細胞を固定した実験の結果の一例を示す。  図７Ｆは、ＰＢＳで希釈した１５％（体積／体積）グリセロール及び０．０１％（重量／体積）硫酸クロムカリウムを含む細胞内固定剤を用いて塩氷上（例えば、約−２℃）で細胞を固定した実験の結果の一例を示す。
【図８】図８Ａは、細胞をブロッキングバッファーでブロックした後に染色した実験の結果の一例を示す。ブロッキングバッファーには２％（重量／体積）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が含まれた。  図８Ｂは、細胞をブロッキングバッファーでブロックした後に染色した実験の結果の一例を示す。ブロッキングバッファーには２％（重量／体積）の加水分解コラーゲンが含まれた。
【図９】図９Ａは、１０％（重量／体積）ＰＶＰと０．０１％（重量／体積）硫酸クロムカリウムで図１に記載の方法に従って固定したＡ５４９細胞でスパイクし、ＤＲＡＱ５（パネルＡ）、AlexaFluor488−ビメンチン（パネルＢ）、AlexaFluor594−ｐａｎ−サイトケラチン（パネルＣ）、ＰＥ−ＥｐＣａｍ（パネルＤ）、Pacific Orange−ＣＤ４５（パネルＥ）、及びBV421−ＣＤ１４（パネルＦ）で染色した白血球を示す。  図９Ｂは、４％パラホルムアルデヒドで固定したＡ５４９細胞でスパイクし、ＤＲＡＱ５（パネルＡ）、AlexaFluor488−ビメンチン（パネルＢ）、AlexaFluor594−ｐａｎ−サイトケラチン（パネルＣ）、ＰＥ−ＥｐＣａｍ（パネルＤ）、Pacific Orange−ＣＤ４５（パネルＥ）、及びBV421−ＣＤ１４（パネルＦ）で染色した白血球を示す。
【図１０】図１０は、ナノグラムの５０万個の新鮮な細胞、又はパラホルムアルデヒド、メタノールを用いて、若しくは図１に記載の方法に従って固定した細胞の全ＲＮＡ含有量を示すヒストグラムを示す。
【図１１−１】図１１Ａは、前立腺がん細胞試料のBV421−ＣＤ４５染色の顕微鏡画像を示す。  図１１Ｂは、前立腺がん細胞試料のDyLight594−ビメンチン染色の顕微鏡画像を示す。
【図１１−２】図１１Ｃは、前立腺がん細胞試料中の細胞のバックグラウンド領域と核領域を特定する顕微鏡画像を示す。核領域はＤＲＡＱ５で染色されている。  図１１Ｄは、対象となる細胞の倍数性状態を示すヒストグラムを示す。
【図１２−１】図１２Ａは、前立腺がん細胞試料のBV421−ＣＤ４５染色の顕微鏡画像を示す。  図１２Ｂは、前立腺がん細胞試料のDyLight594−ビメンチン染色の顕微鏡画像を示す。
【図１２−２】図１２Ｃは、前立腺がん細胞試料中の細胞のバックグラウンド領域と核領域の特定を含む顕微鏡画像の分析を示す。核領域はＤＲＡＱ５で染色されている。  図１２Ｄは、対象となる細胞の倍数性状態を示すヒストグラムを示す。
【図１３−１】図１３Ａは、前立腺がん細胞試料のBV421−ＣＤ１４染色の顕微鏡画像を示す。  図１３Ｂは、前立腺がん細胞試料のPacific Orange−ＣＤ４５染色の顕微鏡画像を示す。
【図１３−２】図１３Ｃは、前立腺がん細胞試料のAlexaFluor488−ビメンチン染色の顕微鏡画像を示す。  図１３Ｄは、前立腺がん細胞試料中の細胞のバックグラウンド領域と核領域の特定を含む顕微鏡画像の分析を示す。核領域はＤＲＡＱ５で染色されている。  図１３Ｅは、対象となる細胞の倍数性状態を示すヒストグラムを示す。
【図１４−１】図１４Ａは、前立腺がん細胞試料のBV421−ＣＤ１４染色の顕微鏡画像を示す。  図１４Ｂは、前立腺がん細胞試料のPacific Orange−ＣＤ４５染色の顕微鏡画像を示す。
【図１４−２】図１４Ｃは、前立腺がん細胞試料のAlexaFluor488−ビメンチン染色の顕微鏡画像を示す。  図１４Ｄは、前立腺がん細胞試料中の細胞のバックグラウンド領域と核領域の特定を含む顕微鏡画像の分析を示す。核領域はＤＲＡＱ５で染色されている。  図１４Ｅは、対象となる細胞の倍数性状態を示すヒストグラムを示す。
【図１５−１】図１５Ａは、前立腺がん細胞試料のAlexaFluor488−ＣＤ４５染色の顕微鏡画像を示す。  図１５Ｂは、前立腺がん細胞試料のＰＥ−リン酸化セリン１０ヒストンＨ３染色の顕微鏡画像を示す。
【図１５−２】図１５Ｃは、前立腺がん細胞試料のAlexaFluor488−ビメンチン染色の顕微鏡画像を示す。  図１５Ｄは、前立腺がん細胞試料中の細胞のバックグラウンド領域と核領域の同定を含む顕微鏡画像の分析を示す。核領域はＤＲＡＱ５で染色されている。  図１５Ｅは、対象となる細胞の倍数性状態を示すヒストグラムを示す。
【図１６−１】図１６Ａは、前立腺がん細胞試料のBV421−ＣＤ３４染色の顕微鏡画像を示す。  図１６Ｂは、前立腺がん細胞試料のPacific Orange−ＣＤ４５染色の顕微鏡画像を示す。
【図１６−２】図１６Ｃは、前立腺がん細胞試料のAlexaFluor488−ビメンチン染色の顕微鏡画像を示す。  図１６Ｄは、前立腺がん細胞試料中の細胞のバックグラウンド領域と核領域の同定を含む顕微鏡画像の分析を示す。核領域はＤＲＡＱ５で染色されている。  図１６Ｅは、対象となる細胞の倍数性状態を示すヒストグラムを示す。
【図１７−１】図１７Ａは、前立腺がん細胞試料のBV421−ＣＤ１４染色の顕微鏡画像を示す。  図１７Ｂは、前立腺がん細胞試料のPacific Orange−ＣＤ４５染色の顕微鏡画像を示す。  図１７Ｃは、前立腺がん細胞試料のAlexaFluor488−ビメンチン染色の顕微鏡画像を示す。
【図１７−２】図１７Ｄは、前立腺がん細胞試料中の細胞のバックグラウンド領域と核領域の同定を含む顕微鏡画像の分析を示す。核領域はＤＲＡＱ５で染色されている。  図１７Ｅは、対象となる細胞の倍数性状態を示すヒストグラムを示す。
【００６２】
示された実施形態は単なる例であり、本開示を限定することを意図するものではない。概略図は、特徴及び概念を説明するために描かれており、必ずしも縮尺通りに描かれていない。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
上記は概要であり、したがって必然的に詳細に制限がある。本技術の上記の態様、並びに他の態様、特徴、及び利点を、さまざまな実施形態に関連して以下に説明する。以下の実施形態を含むことは、本開示をこれらの実施形態に限定することを意図するのではなく、当業者が企図された発明を作製し、使用することを可能にすることを意図する。本明細書に提示される発明の対象の趣旨又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用し、改変を行うことができる。本開示の態様は、本明細書に記載及び例示されているように、すべてが明示的に企図され、本開示の一部をなすさまざまな異なる組成（formulations）で構成、組み合わせ、改変、及び設計することができる。
【００６４】
明細書及び請求項で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈から明らかにそうでないことが示されない限り、単数と複数の両方の参照が含まれる。例えば、「細胞」という用語は、複数の細胞を包含しうるか、又は複数の細胞を含むことが企図される。時には、請求項及び開示は、「複数の」、「１つ以上の」、又は「少なくとも１つの」などの用語を含むことができるが、そのような用語がないことは、複数が考えられていないこと意味するものではなく、複数が考えられていないことを意味すると解釈されるべきではない。
【００６５】
「約」又は「およそ」という用語は、（例えば長さ又は圧力を定める）数字の指定又は範囲の前に使用される場合、値が（＋）又は（−）５％、１％、又は０．１％変動しうる近似値を指す。本明細書で提供される数値範囲はすべて、記述された始めの数と終わりの数を含む。「実質的に」という用語は、物質、組成物、又は方法の大部分（すなわち、５０％超）又は本質的にすべてを示す。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」又は「含む（comprises）」という用語は、組成物及び方法が列挙された要素を含み、くわえて任意の他のany other要素を含みうることを意味することを意図する。「から本質的になる（Consisting essentially of）」とは、組成物及び方法が列挙された要素を含み、記述された目的のための組み合わせに本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定められる要素から本質的になる組成物又は方法は、特許請求される開示の基本的及び新規の特徴に実質的に影響を与えない他の材料、特徴、又はステップを排除しないことになる。「からなる（Consisting of）」とは、組成物及び方法が列挙された要素を含み、些細な又は重要でない要素又はステップ以上のいずれのものを排除することを意味するものとする。これらの移行句の各々によって定義される実施形態は本開示の範囲内である。
【００６７】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の組成物、方法、及び系は、細胞を固定及び／又は染色するために使用される。例えば、細胞としては有核細胞が挙げられうる。幾つかの実施形態では、有核細胞としては、白血球、成熟細胞の前駆体、幹細胞、骨髄細胞、循環腫瘍細胞、がん細胞、体細胞、生殖系列細胞、懸濁液中の細胞、表面に付着した細胞、組織若しくは組織切片中の細胞、又はその他の形の細胞が挙げられる。
【００６８】
幾つかの実施形態では、細胞は１つ以上の固定剤又は固定バッファーで固定される。固定バッファーは、架橋固定剤、沈殿固定剤、酸化剤、水銀剤、及び／又はピクリン酸塩を含みうる。幾つかの実施形態では、固定剤は、メタノール、エタノール、プロパノール、その他のアルコール、又は混合された２つ以上のアルコールうちの１つ以上である。例えば、２つのアルコールは、５％：９５％の第１のアルコール：第２のアルコール〜９５％：５％の第１のアルコール：第２のアルコールの範囲の比で混合することができる。幾つかの実施形態では、固定剤はアセトン単独又はアルコールとの組み合わせである。例えば、アルコールとアセトンは、５％：９５％アセトン：アルコール〜９５％：５％アセトン：アルコールの範囲の比で混合することができる。
【００６９】
幾つかの実施形態では、固定剤は、生体適合性の保湿剤、親水性ポリマー、又は吸湿性ポリマーを含みうる。例えば、固定剤としては、グリセロール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、メチルセルロース、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ゼラチン、又はその他の吸湿性若しくは親水性ポリマーが挙げられうる。
【００７０】
幾つかの実施形態では、１つ以上の試薬、固定剤、又はアルコールは、希釈剤、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、水、緩衝生理食塩水、又は任意の他のタイプの生物学的バッファーで希釈される。幾つかの実施形態では、希釈剤のｐＨは中性である。幾つかの実施形態では、ｐＨは６．５〜８である。１つの実施形態では、ｐＨは実質的に又は約７である。１つの実施形態では、ｐＨは実質的に又は約７．４である。
【００７１】
幾つかの実施形態では、１つ以上の試薬、固定剤、又はアルコールは、重量／体積（ｗ／ｖ）パーセント、体積／体積（ｖ／ｖ）パーセント、モル濃度、総体積若しくは総重量のパーセント、オンス、ミリリットル、ミリグラム、若しくはグラム、又は用途に適したその他の測定単位によって測定される。
【００７２】
幾つかの実施形態では、細胞は、容器内又はその上で固定及び／又は染色することができる。例えば、容器としては、試験管、マイクロタイタープレート、キャピラリープレート、又はキャピラリーギャップ染色用カバープレート付き若しくは該カバープレート無しスライド、又はその他の装置（apparatus）若しくは装置（device）が挙げられる。
【００７３】
幾つかの実施形態では、容器はコーティングされておらず、その結果細胞は容器の表面に結合する。幾つかの実施形態では、容器はコーティングされており、その結果細胞の容器への結合がコーティングによって促進される。例えば、コーティングとしては、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、ヘパリン硫酸、及び／又はプロテオグリカンが挙げられうる。１つのそのような実施形態では、容器はゼラチンでコーティングされる。ゼラチンは、固定剤、例えばクロムミョウバン又はクロム（ＩＩＩ）塩を含みうる。
【００７４】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の本発明の１つ以上のバッファー、固定剤、容器、又は他の構成要素は、個別に、又は試薬系として若しくはキットでセットになって、販売、商品化、市販、宣伝、又はそうでなければ包装される。試薬系又はキットは、１つ以上のバッファー、固定剤、１つ以上の細胞を受ける容器、１つ以上の染色剤、１つ以上の抗体、及び／又は本明細書に記載の方法のすべて若しくは一部を完了するためのその他の構成要素を含みうる。
【００７５】
本明細書では、細胞試料中の希少細胞を同定する方法が開示される。幾つかの実施形態では、希少細胞は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）である。ＣＴＣとしては、循環腫瘍由来内皮細胞、腫瘍関連マクロファージ、又は他の腫瘍由来又は関連細胞が挙げられうる。ＣＴＣは、細胞試料、例えば、限定されないが、血液試料、リンパ試料、組織試料若しくは切片、生検試料、又は他の体液若しくは組織試料中で同定されうる。細胞試料としては、生細胞、透過処理した細胞、固定細胞、染色した細胞、又は他の処理済み細胞型が挙げられうる。
組成物
【００７６】
本明細書に記載されるように、細胞を固定するための試薬系又はキットは、１つ以上の試薬、バッファー、及び／又は固定剤を含む。試薬系は、細胞を保存し、並びに／又は染色及び／若しくは分析のために細胞を調製する働きをする。幾つかの実施形態では、試薬系は、第１の固定バッファー又は細胞外固定剤を含む。幾つかの実施形態では、試薬系は、第２の固定バッファー又は細胞内固定剤を含む。１つの実施形態では、細胞外固定剤と細胞内固定剤をあわせて１つのバッファー又は試薬が作られる。１つの実施形態では、細胞外固定剤と細胞内固定剤は、別々に、連続して又は実質的に同時に使用される。
【００７７】
幾つかの実施形態では、試薬系又はキットは細胞外固定剤を含む。細胞外固定剤は、細胞の外表面又は細胞外膜を固定又は保存する働きをする。細胞外固定剤は、アルコール又はアセトン及び親水性又は吸湿性ポリマーを含む。アルコールの例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、及びペンタノールが挙げられる。親水性又は吸湿性ポリマーの例としては、グリセロール、ＰＶＰ、ＰＥＧ、デキストラン、メチルセルロース、ＰＯＥ、コラーゲン、及びゼラチンが挙げられる。幾つかの実施形態では、細胞外固定剤中のアルコールは、２つ以上のアルコールの混合物を含む。幾つかの実施形態では、親水性又は吸湿性ポリマーは、２つ以上の親水性又は吸湿性ポリマーの混合物を含む。
【００７８】
幾つかの実施形態では、細胞外固定剤は、アルコールで希釈された親水性ポリマーを含む。親水性ポリマーは、固定過程の間に細胞内の水分を保ち、固定過程の間及びその後の細胞の完全性を向上する働きをする。幾つかの実施形態では、細胞外固定剤は、少なくとも３％重量／体積（ｗ／ｖ）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、細胞外固定剤は、少なくとも５％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、細胞外固定剤は、３％〜２０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、細胞外固定剤は、５％〜２０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。１つの実施形態では、細胞外固定剤は、アルコールで希釈された５％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、細胞外固定剤は、１％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。例えば、親水性ポリマーとしては、ＰＶＰ、グリセロール、ＰＥＧ、又は２つ以上の組み合わせを挙げることができ、アルコールとしては、メタノール、エタノール、又は両方の組み合わせを挙げることができる。幾つかの実施形態では、アルコールは、アセトンと置き換えられるか、又はアセトンと組み合わせて使用される。
【００７９】
幾つかの実施形態では、細胞外固定剤は、−５℃より低い又は−５℃未満の温度で細胞に加えられる。幾つかの実施形態では、細胞外固定剤は、−１０℃未満の温度で細胞に加えられる。幾つかの実施形態では、細胞外固定剤は、−２０℃未満又は−２０℃に等しい温度で細胞に加えられる。幾つかの実施形態では、細胞外固定剤は、−１０℃、−６０℃の温度、又はその間の任意の温度で細胞に加えられる。幾つかの実施形態では、細胞外固定剤は、−１５℃と−３０℃を含むその間の温度で細胞に加えられる。例えば、幾つかの実施形態では、細胞外固定剤は、−１５℃、−２０℃、−２５℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃、−９０℃、−１００℃、又は−１１０℃に等しい、実質的に等しい、又はおおよそ等しい温度で細胞に加えられる。１つの実施形態では、細胞外固定剤は、−１５℃未満又は−１５℃より低い温度で細胞に加えられる。１つの実施形態では、細胞外固定剤は、−６０℃未満又は−６０℃より低い温度で細胞に加えられる。幾つかの実施形態では、目標温度又は温度範囲は、細胞又は細胞を含む容器を、ドライアイス、液体窒素、目標温度に調整された冷凍庫、又は目標温度に調整された冷凍装置に置くことによって達成される。
【００８０】
幾つかの実施形態では、試薬系又はキットは細胞内固定剤を含む。細胞内固定剤は、細胞の細胞内区画又は細胞内領域を固定又は保存し、染色剤又は抗体が細胞の細胞内区画又は領域に達することができる手段、経路、又は穴を提供する働きをする。細胞内固定剤は、親水性又は吸湿性ポリマー、界面活性剤、乳化剤、又は界面活性剤（surfactant）、及び固定剤を含む。親水性又は吸湿性ポリマーの例としては、グリセロール、ＰＶＰ、ＰＥＧ、デキストラン、メチルセルロース、ＰＯＥ、コラーゲン、及びゼラチンが挙げられる。幾つかの実施形態では、親水性又は吸湿性ポリマーは２つ以上の親水性又は吸湿性ポリマーの混合物を含む。幾つかの実施形態では、界面活性剤は、非イオン性、イオン性（すなわち、カチオン性若しくはアニオン性）、又は双性イオン性である。界面活性剤の例としては、サポニン、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ツイーン−２０（すなわち、ポリソルベート２０）、ツイーン−４０、ツイーン−８０、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。固定剤の例としては、重クロム酸アンモニウム、硫酸クロムカリウム（すなわちクロムミョウバン）、クロム酸、塩化クロミル、クロム酸カリウム、重クロム酸カリウム、カルボジイミド（すなわちメタンジイミン）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。
【００８１】
幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、生理食塩水、水、リン酸緩衝生理食塩水、又は任意の緩衝溶液（buffer solution）で希釈された少なくとも５％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、少なくとも１０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、少なくとも１５％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、５％〜３０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、１０％〜３０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、１５％〜３０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、８％、１５％、２０％、２５％、又は３０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。１つの実施形態では、細胞内固定剤は、生理食塩水で希釈された１５％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。例えば、親水性ポリマーとしては、ＰＶＰ、グリセロール、ＰＥＧ、又は２つ以上の組み合わせが挙げられうる。
【００８２】
幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は界面活性剤を含む。界面活性剤は、細胞の細胞外膜に穴をあけ、細胞の細胞内区画又は領域に到達するようにバッファー、抗体、又は染色剤の経路、手段、又は経路を提供する働きをする。細胞内固定剤は、生理食塩水、水、リン酸緩衝生理食塩水、又は任意の緩衝溶液で希釈された少なくとも０．０１％（容積／容積）（ｖ／ｖ）の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、少なくとも０．２％（体積／体積）の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、少なくとも０．４％（体積／体積）の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、０．０１％〜１％（体積／体積）の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、０．２％〜０．６％（体積／体積）の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、０．４％〜１％（体積／体積）の界面活性剤を含む。１つの実施形態では、細胞内固定剤は、生理食塩水で希釈された０．４％（体積／体積）の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、０．１％、０．２％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、又は１％（体積／体積）の界面活性剤を含む。例えば、界面活性剤としては、ツイーン−２０、ツイーン−８０、トリトンＸ−１００、ジギトニン、サポニン、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、その他の任意の界面活性剤、又は２つ以上の界面活性剤の組み合わせが挙げられうる。
【００８３】
幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は固定剤をさらに含む。固定剤は、細胞の内部又は細胞内領域若しくは区画を固定又は保存する働きをする。細胞内固定剤は、生理食塩水、水、リン酸緩衝生理食塩水、又は任意の緩衝溶液で希釈された少なくとも０．００５％（重量／体積）の固定剤を含む。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、少なくとも０．００８％（重量／体積）の固定剤を含む。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、少なくとも０．０１％（重量／体積）の固定剤を含む。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、０．００８％〜０．５％（重量／体積）の固定剤を含む。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、０．０１％〜０．１％（重量／体積）の固定剤を含む。１つの実施形態では、細胞内固定剤は、生理食塩水で希釈された０．０１％（重量／体積）の固定剤を含む。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、０．２％、０．３％、０．４％、又は０．５％（重量／体積）の固定剤を含む。例えば、固定剤としては、重クロム酸アンモニウム、硫酸クロムカリウム（すなわち、クロムミョウバン）、塩化クロミル、クロム酸カリウム、重クロム酸カリウム、カルボジイミド（すなわち、メタンジイミン）、ＥＤＣ、ＣＭＣ、又は２つ以上の固定剤の組み合わせが挙げられうる。
【００８４】
幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、凍結温度未満の温度（例えば０℃未満）の温度で細胞に加えられる。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、１℃より低い又は１℃未満の温度で細胞に加えられる。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、０℃と−１０℃を含む又はその間の温度で細胞に加えられる。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、１℃と−５℃を含む又はその間の温度で細胞に加えられる。１つの実施形態では、細胞内固定剤は、実質的に０℃に等しい又約０℃の温度で細胞に加えられる。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は、−５℃、−４℃、−３℃、−２℃、−１℃、０℃、又は１℃で細胞に加えられる。幾つかの実施形態では、目標温度又は温度範囲は、細胞又は細胞を含む容器を、氷、塩氷、液体窒素、目標温度に調整された冷凍庫、又は目標温度に調整された冷凍装置に置くことによって達成される。
【００８５】
幾つかの実施形態では、細胞外固定剤に使用される親水性ポリマーは、細胞内固定剤に使用される親水性ポリマーと同じである。幾つかの実施形態では、細胞外固定剤に使用される親水性ポリマーは、細胞内固定剤に使用される親水性ポリマーと異なる。
【００８６】
幾つかの実施形態では、試薬系又はキットは、ブロッキングバッファーを含む。ブロッキングバッファーは、細胞の表面又は細胞内の非特異的な抗体又は染色剤結合部位をブロック又はそれらの部位に結合する働きをする。ブロッキングバッファーは、生理食塩水、水、リン酸緩衝生理食塩水、又は任意の緩衝溶液で希釈された親水性ポリマー、界面活性剤、及び加水分解コラーゲンを含む。
【００８７】
幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは、生理食塩水、水、リン酸緩衝生理食塩水、又は任意の緩衝溶液で希釈された少なくとも１％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは少なくとも１０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは少なくとも２０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは少なくとも３０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは１％〜５０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは１０％〜４５％（重量／体積）の親水性のものを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは２０％〜４０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。１つの実施形態では、ブロッキングバッファーは、生理食塩水で希釈された３０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。例えば、親水性ポリマーとしては、ＰＶＰ、グリセロール、ＰＥＧ、又は２つ以上の組み合わせが挙げられうる。
【００８８】
幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは、生理食塩水、水、リン酸緩衝生理食塩水、又は任意の緩衝溶液で希釈された少なくとも０．０１％（体積／体積）の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは少なくとも０．２％（体積／体積）の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは少なくとも０．４％（体積／体積）の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは０．０１％〜１％（体積／体積）の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは０．２％〜０．６％（体積／体積）の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは０．４％〜１％（体積／体積）の界面活性剤を含む。１つの実施形態では、ブロッキングバッファーは、生理食塩水で希釈された０．４％（体積／体積）の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは、０．０１％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、又は１％（体積／体積）の界面活性剤を含む。例えば、界面活性剤としては、ツイーン−２０、ツイーン−８０、トリトンＸ−１００、ジギトニン、サポニン、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、その他の界面活性剤、又は２つ以上の界面活性剤の組み合わせが挙げられる。
【００８９】
幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは加水分解コラーゲンを含む。加水分解コラーゲンは、細胞外表面上若しくは細胞内の非特異的な抗体若しくは染色剤結合部位に対する親和性をもつタンパク質又はそれらの部位に結合できるタンパク質として働く。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは少なくとも０．１％（重量／体積）の加水分解コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは少なくとも０．５％（重量／体積）の加水分解コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは少なくとも１％（重量／体積）の加水分解コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは少なくとも２％（重量／体積）の加水分解コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは０．１％〜１０％（重量／体積）の加水分解コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは０．５％〜５％（重量／体積）の加水分解コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは１％〜３％（重量／体積）の加水分解コラーゲンを含む。１つの実施形態では、ブロッキングバッファーは、生理食塩水で希釈された２％（重量／体積）の加水分解コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．２５％、１．５％、１．７５％、２％、２．２５％、２．５％、２．７５％、又は３％（重量／体積）の加水分解コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、加水分解コラーゲンは動物源に由来する。１つの実施形態では、加水分解コラーゲンはブタ（pig）又はブタ（porcine）に由来する。１つの実施形態では、加水分解コラーゲンはウシ（cow）又はウシ（bovine）由来する。１つの実施形態では、加水分解コラーゲンは魚に由来する。
【００９０】
幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーはグリシンを含む。グリシンは、普通ならバックグラウンド又はアーティファクトの増加をもたらす抗体又は染色剤に結合することになるタンパク質の遊離アルデヒド基に結合する働きをする。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは少なくとも０．０１Ｍグリシンを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは少なくとも０．１Ｍグリシンを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは少なくとも０．３Ｍグリシンを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは０．０１Ｍ〜１Ｍグリシンを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは０．１Ｍ〜０．５Ｍグリシンを含む。１つの実施形態では、ブロッキングバッファーは０．３Ｍグリシンを含む。幾つかの実施形態では、ブロッキングバッファーは０．０１Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ、０．３Ｍ、０．３５Ｍ、０．４Ｍ、０．４５Ｍ、又は０．５Ｍグリシンを含む。
【００９１】
幾つかの実施形態では、試薬系又はキットは細胞遠心分離バッファーを含む。細胞遠心分離バッファーは、細胞を保護し、及び／又は細胞が、例えば細胞遠心分離機を用いて容器に加えられる媒体を提供する働きをする。細胞遠心分離バッファーは、生理食塩水、水、リン酸緩衝生理食塩水、又は任意の緩衝溶液で希釈された親水性ポリマー及び固定剤を含む。
【００９２】
幾つかの実施形態では、細胞遠心分離バッファーは少なくとも３％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、細胞遠心分離バッファーは少なくとも５％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、細胞遠心分離バッファーは少なくとも１０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、細胞遠心分離バッファーは１％〜２０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、細胞遠心分離バッファーは５％〜１５％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。１つの実施形態では、細胞遠心分離バッファーは、生理食塩水で希釈された１０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、細胞遠心分離バッファーは、１％、３％、５％、７％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、又は２０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。
【００９３】
幾つかの実施形態では、細胞遠心分離バッファーは、生理食塩水、水、リン酸緩衝生理食塩水、又は任意の緩衝溶液で希釈された少なくとも０．００５％（重量／体積）の固定剤を含む。幾つかの実施形態では、細胞遠心分離バッファーは少なくとも０．００８％（重量／体積）の固定剤を含む。幾つかの実施形態では、細胞遠心分離バッファーは少なくとも０．０１％（重量／体積）の固定剤を含む。幾つかの実施形態では、細胞遠心分離バッファーは０．００８％〜０．５％（重量／体積）の固定剤を含む。幾つかの実施形態では、細胞遠心分離バッファーは０．０１％〜０．１％（重量／体積）の固定剤を含む。１つの実施形態では、細胞遠心分離バッファーは、生理食塩水で希釈された０．０１％（重量／体積）の固定剤を含む。幾つかの実施形態では、細胞遠心分離バッファーは、０．０００５％、０．００８％、０．０１％、０．０５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、又は０．５％（重量／体積）の固定剤を含む。例えば、固定剤としては、重クロム酸アンモニウム、硫酸クロムカリウム（すなわち、クロムミョウバン）、塩化クロミル、クロム酸カリウム、重クロム酸カリウム、カルボジイミド（すなわち、メタンジイミン）、ＥＤＣ、及びＣＭＣが挙げられうる。
【００９４】
幾つかの実施形態では、試薬系又はキットは、抗体結合バッファーを含む。抗体結合バッファーは、細胞の細胞外表面又は細胞内表面への抗体又は染色剤の結合を向上又は促進する働きをする。抗体結合バッファーは親水性ポリマー及び界面活性剤を含む。
【００９５】
幾つかの実施形態では、抗体結合バッファーは、生理食塩水、水、リン酸緩衝生理食塩水、又は任意の緩衝溶液で希釈された少なくとも５％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、抗体結合バッファーは、少なくとも１０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、抗体結合バッファーは、少なくとも１５％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、抗体結合バッファーは、５％〜３０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、抗体結合バッファーは、１０％〜３０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、抗体結合バッファーは、１５％〜３０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。１つの実施形態では、抗体結合バッファーは、生理食塩水で希釈された１５％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、抗体結合バッファーは、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、又は４０％（重量／体積）の親水性ポリマーを含む。例えば、親水性ポリマーとしては、ＰＶＰ、グリセロール、ＰＥＧ、又は２つ以上の組み合わせが挙げられうる。
【００９６】
幾つかの実施形態では、抗体結合バッファーは界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、抗体結合バッファーは、生理食塩水、水、リン酸緩衝生理食塩水、又は任意の緩衝溶液で希釈された少なくとも０．０１％（体積／体積）の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、抗体結合バッファーは、少なくとも０．２％（体積／体積）の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、抗体結合バッファーは、少なくとも０．４％（体積／体積）の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、抗体結合バッファーは、０．０１％〜１％（体積／体積）の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、抗体結合バッファーは、０．２％〜０．６％（体積／体積）の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、抗体結合バッファーは、０．４％〜１％（体積／体積）の界面活性剤を含む。１つの実施形態では、抗体結合バッファーは、生理食塩水で希釈された０．４％（体積／体積）の界面活性剤を含む。幾つかの実施形態では、抗体結合バッファーは、０．０１％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、又は１％（体積／体積）の界面活性剤を含む。例えば、界面活性剤としては、ツイーン−２０、ツイーン−８０、トリトンＸ−１００、ジギトニン、サポニン、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、他の任意の界面活性剤、又は２つ以上の界面活性剤の組み合わせが挙げられうる。
【００９７】
幾つかの実施形態では、試薬系又はキットは、細胞を、固定、染色、観察、及び／又は分析するための１つ以上の容器、例えばスライドを含む。容器の表面への細胞の接着を向上又は促進するために、１つ以上の容器は、ゼラチン、コラーゲン、又は別の細胞結合試薬でコーティングすることができる。ゼラチンの例としては、タイプＡ（すなわち酸硬化組織由来）及びタイプＢ（すなわち石灰硬化組織由来）が挙げられる。幾つかの実施形態では、ゼラチンはカチオン試薬を含む。カチオン試薬の例としては、硫酸クロムカリウム十二水和物、重クロム酸アンモニウム、硫酸クロムカリウム（すなわち、クロムミョウバン）、塩化クロミル、クロム酸カリウム、重クロム酸カリウム、カルボジイミド（すなわち、メタンジイミン）、ＥＤＣ、及びＣＭＣが挙げられる。カチオン試薬は、容器を正に帯電させて、負の電荷を有する細胞及び／又は組織切片の容器への引力及び付着を向上する働きをする。
【００９８】
幾つかの実施形態では、試薬系又はキットは容器洗浄バッファーを含む。容器洗浄バッファーは、容器の１つ以上の表面から破片及び／又は自家蛍光粒子を取り除く働きをする。幾つかの実施形態では、容器洗浄バッファーは、ある比率で酸とアルコールを含む。アルコールの例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、及びペンタノールが挙げられる。酸の例としては、塩酸、酢酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、及びヨウ化水素酸が挙げられる。幾つかの実施形態では、アルコールの酸に対する比は、５％：９５％、１０％：９０％、１５％：８５％、２０％：８０％、２５％：７５％、３０％：７０％、３５％：６５％、４０％：６０％、４５％：５５％、５０％：５０％、５５％：４５％、６０％：４０％、６５％：３５％、７０％：３０％、７５％：２５％、８０％：２０％、８５％：１５％、９０％：１０％、又は９５％：５％である。１つの実施形態では、アルコールの酸に対する比は５０％：５０％である。１つの実施形態では、アルコールの酸に対する比は４０％：６０％である。１つの実施形態では、アルコールの酸に対する比は６０％：４０％である。
方法
【００９９】
図１に示されるように、細胞を固定する方法１００は、アルコールで希釈した親水性ポリマーを含む第１の固定バッファーを細胞に加えることＳ１１０、並びに親水性ポリマー、界面活性剤、及び加水分解コラーゲンで希釈した親水性ポリマーを含む第２の固定バッファーを細胞に加えることＳ１２０を含む。この方法は、染色、観察、及び／又は分析するために細胞を固定又は保存する働きをする。
【０１００】
幾つかの実施形態では、第１の固定バッファーを細胞に加えることは、Ｓ１２０に記載のように、第１の固定バッファー又は細胞外固定剤を−５℃より低い又は−５℃未満の温度で細胞に加えることを含む。幾つかの実施形態では、第１の固定バッファー又は細胞外固定剤は−１０℃未満の温度で細胞に加えられる。幾つかの実施形態では、細胞外固定剤は−１５℃未満の温度で細胞に加えられる。幾つかの実施形態では、細胞外固定剤は−２０℃未満の温度で細胞に加えられる。幾つかの実施形態では、細胞外固定剤は−３０℃未満の温度で細胞に加えられる。幾つかの実施形態では、細胞外固定剤は−４０℃未満の温度で細胞に加えられる。幾つかの実施形態では、細胞外固定剤は−５０℃未満の温度で細胞に加えられる。幾つかの実施形態では、細胞外固定剤は−６０℃未満の温度で細胞に加えられる。親水性ポリマーと組み合わせた氷点下の温度は、細胞の完全性を保ち、アーティファクト又は細胞に関連する自家蛍光特性を減らす働きをする。幾つかの実施形態では、ブロック（block）Ｓ１２０は、細胞を細胞外固定剤とインキュベーションすることを含む。幾つかの実施形態では、インキュベーション時間は少なくとも５分である。幾つかの実施形態では、インキュベーション時間は少なくとも１０分である。幾つかの実施形態では、インキュベーション時間は少なくとも１５分である。１つの実施形態では、インキュベーション時間は１５分である。幾つかの実施形態では、インキュベーション時間は５分〜３０分である。
【０１０１】
ブロックＳ１３０において、第２の固定バッファーを細胞に加えることは、第２の固定バッファー又は細胞内固定剤を４℃より低い又は４℃未満の温度で細胞に加えることを含みうる。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は１℃未満の温度で細胞に加えられる。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は０℃未満の温度で細胞に加えられる。幾つかの実施形態では、細胞内固定剤は−２℃未満の温度で細胞に加えられる。親水性ポリマーと組み合わせた凍結温度は、細胞の完全性を保ち、アーティファクト又は細胞に関連する自家蛍光特性を減らす働きをする。幾つかの実施形態では、ブロックＳ１３０は、細胞を細胞内固定剤中でインキュベーションすることを含む。幾つかの実施形態では、インキュベーション時間は少なくとも２０分である。幾つかの実施形態では、インキュベーション時間は少なくとも３０分である。幾つかの実施形態では、インキュベーション時間は少なくとも６０分である。幾つかの実施形態では、インキュベーション時間は少なくとも１２０分である。幾つかの実施形態では、インキュベーション時間は少なくとも１８０分である。幾つかの実施形態では、インキュベーション時間は少なくとも２４０分である。１つの実施形態では、インキュベーション時間は３０分である。幾つかの実施形態では、インキュベーション時間は１５分〜３００分である。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、方法１００は、細胞をスライド上に細胞遠心分離することを記載するブロックＳ１１０を随意に含む。ブロックＳ１１０は、さらなる処理及び／又は分析のために細胞を容器に結合又は付着する働きをする。スライド又は容器は、物質又は試薬、例えば、カチオン性物質、コラーゲン、又はゼラチンでコーティングすることができる。幾つかの実施形態では、ブロックＳ１１０は、細胞をスライド又は容器上に細胞遠心分離する前に、容器又はスライドを洗浄することを含む。スライド又は容器は、本明細書の他の箇所に記載のように、容器洗浄バッファーで洗浄することができる。幾つかの実施形態では、ブロックＳ１１０は、細胞遠心分離の前に、本明細書の他の箇所に記載のように、細胞を細胞遠心分離バッファー中に懸濁させることを含む。幾つかの実施形態では、ブロックＳ１１０は、細胞遠心分離後に容器又はスライドを乾燥させて、過剰の細胞遠心分離バッファーを容器又はスライドの表面から取り除くことを含む。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、方法１００は、ブロッキングバッファーを細胞に加えることを記載するブロックＳ１４０を随意に含み、ブロッキングバッファーは、本明細書の他の箇所に記載のように、親水性ポリマー、界面活性剤、及び加水分解コラーゲンを含む。ブロックＳ１４０は、非特異的結合部位を無関係なタンパク質（例えば加水分解コラーゲン）で飽和させることによって、非特異的抗体又は染色剤の結合を減らす働きをする。幾つかの実施形態では、ブロックＳ１４０は、定められた温度で定められた時間、細胞をブロッキングバッファーとインキュベーションすることを含む。幾つかの実施形態では、その時間は少なくとも３０分である。幾つかの実施形態では、その時間は少なくとも４５分である。幾つかの実施形態では、その時間は少なくとも６０分である。幾つかの実施形態では、その時間は３０〜９０分である。幾つかの実施形態では、その時間は４５〜７５分である。１つの実施形態では、その時間は６０分である。幾つかの実施形態では、定められた温度は５℃より低い。幾つかの実施形態では、定められた温度は４℃より低い。幾つかの実施形態では、定められた温度は２℃より低い。幾つかの実施形態では、定められた温度は０℃より低い。幾つかの実施形態では、定められた温度範囲は−５℃〜５℃である。幾つかの実施形態では、定められた温度範囲は０℃〜４℃である。１つの実施形態では、定められた温度は約−２℃又は実質的に−２℃である。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、方法１００は、細胞を染色することを記載するブロックＳ１５０を随意に含む。ブロックＳ１５０は、細胞のさまざまな特徴又は領域を目立たせる又は対比によって引き立たせる働きをする。幾つかの実施形態では、染色としては、免疫蛍光染色、免疫組織化学、インサイチュハイブリダイゼーション、又はその他の染色技術が挙げられる。幾つかの実施形態では、染色は、目的のタンパク質又は核酸を認識する非標識又はタンパク質結合（例えばビオチン）一次抗体で細胞をタグ付けすること、及び一次抗体を認識する標識（例えば蛍光色素分子）又は酵素活性（例えばストレプトアビジン）二次抗体で一次抗体を標識することを含む。幾つかの実施形態では、染色は、目的のタンパク質又は核酸を認識する標識一次抗体で細胞を標識することを含む。標識としては、蛍光色素分子、酵素（例えばストレプトアビジン、西洋ワサビペルオキシダーゼなど）、生物発光分子、又は顕微鏡を使って視覚化できるその他のタイプの標識が挙げられうる。幾つかの実施形態では、細胞の染色は０℃未満の温度で行われる。幾つかの実施形態では、細胞の染色は−１℃未満の温度で行われる。幾つかの実施形態では、細胞の染色は−２℃未満の温度で行われる。幾つかの実施形態では、細胞の染色は−３℃未満の温度で行われる。幾つかの実施形態では、細胞の染色は、実質的に−２℃、−３℃、またはそれらの間の温度で行われる。
【０１０５】
図２に示されるように、循環腫瘍細胞として細胞を同定する方法２００の１つの実施形態は、ブロックＳ２１０において細胞試料の画像を撮って対象となる細胞を特定すること、ブロックＳ２２０において染色された核領域の第１のピクセル強度を測定すること、ブロックＳ２３０においてバックグラウンド領域の第２のピクセル強度を測定すること、ブロックＳ２４０において第１のピクセル強度から第２のピクセル強度を減算することによって対象となる細胞の倍数性状態を計算すること、及びブロックＳ２５０において対象となる細胞が循環腫瘍細胞であるかどうかを倍数性状態に基づいて判定することを含む。この方法は、細胞が、正倍数性、異数性、高異数倍数性、低異数倍数性であるかどうか、その他の点で異常なＤＮＡ量を有するかどうかを判定するために、染色された領域のピクセル強度又は蛍光強度を測定する働きをする。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞試料中の循環腫瘍細胞を同定する働きをする。該方法は、がん生物学分野で使用されるが、顕微鏡検査、細胞分析、細胞周期研究、又はその他の好適な用途、例えば研究用途又は教育用途に、付加的又は代替的に使用することができる。
【０１０６】
図２に示されるように、細胞を循環腫瘍細胞として同定する方法２００の１つの実施形態は、細胞試料の画像を撮って対象となる細胞を特定することを記載するブロックＳ２１０を含む。ブロックＳ２１０は、画像を処理して対象となる細胞を特定するために、細胞試料中の１つ以上の細胞を顕微鏡で観察す働きをする。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞試料を、１つ以上の染色剤、抗体、ＤＮＡ組み込み色素で、直接的又は間接的に（例えば二次抗体を用いて）、細胞内又は細胞外のいずれか又は両方で染色することを含む。細胞試料を染色することは、対象となる細胞上の１つ以上の目的のマーカーを目立たせること又は分析から除外するために１つ以上の細胞を目立たせることを含みうる。１つのそのような実施形態では、該方法は、細胞試料を核染色剤で染色して、対象となる細胞の染色された核領域を特定することを含む。核染色剤の非限定的な例としては、ＤＲＡＱ５、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヘマトキシリン、ケルンエヒトロート色素、ヘキスト、メチルグリーン、化学量論的なＤＮＡ結合を示す他の核色素、又は任意のそれらの組み合わせが挙げられる。さらに幾つかの実施形態では、対象となる細胞を同定することは、ＣＤ４５陰性細胞、ビメンチン陽性細胞、ＥｐＣＡＭ陽性細胞、ＥｐＣＡＭ陰性細胞、リン酸化セリン１０ヒストンＨ３陰性細胞、核増殖マーカー陰性細胞、Ｋｉ−６７陰性細胞、カスパーゼ３陰性細胞、アポトーシスマーカー陰性細胞、ＣＤ１４陰性細胞、ＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ３４陰性細胞、又はそれらのいずれかの組み合わせを同定することを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、例えば、細胞死若しくはＤＮＡ複製の正常又は健康な過程を経ている１つ以上のアポトーシス細胞、有糸分裂細胞、又はその他の細胞、又はがん若しくはがん性形質転換を示すその他のマーカーを示さない１つ以上の細胞を除外することを含む。
【０１０７】
図２に示されるように、細胞を循環腫瘍細胞として同定する方法２００の１つの実施形態は、染色された核領域の第１のピクセル強度を測定することを記載するブロックＳ２２０を含む。ブロックＳ２２０は、染色された核領域を手動で又は自動的に特定し、前記染色された核領域のピクセル強度を測定する働きをする。幾つかの実施形態では、該方法は、染色された核領域（すなわち、核周辺部）の第１の周辺部を特定することを含み、周辺部に含まれる領域のピクセル強度を測定することによって第１のピクセル強度が得られる。幾つかのそのような実施形態では、該方法は、核周辺部によって画定される面積に第１のピクセル強度を乗算することを含む。幾つかの実施形態では、該方法は第２の周辺部を特定することを含み、第２の周辺部は細胞の細胞膜（すなわち膜周辺部）を特定し、例えば細胞の大きさを決める。１つのそのような実施形態では、該方法は、第１の周辺部を第２の周辺部と比較して、核領域、細胞質領域、全細胞領域、又はそれらの間の比率を決めることを含む。
【０１０８】
図２に示されるように、細胞を循環腫瘍細胞として同定する方法２００の１つの実施形態は、バックグラウンド領域の第２のピクセル強度を測定することを記載するブロックＳ２３０を含む。ブロックＳ２３０は、手動で又は自動的にバックグラウンド領域を特定し、前記バックグラウンド領域のピクセル強度を測定する働きをする。幾つかの実施形態では、バックグラウンド領域は複数のバックグラウンド領域を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞又は他の細胞物質を欠くが、非特異的染色又はバックグラウンド染色を含みうるバックグラウンド領域を画定することを含む。さらに該方法は、バックグラウンド周辺部と呼ばれる、バックグラウンド領域の周りの周辺部を画定することを含みうる。したがって、該方法は、バックグラウンド周辺部によって画定される面積にバックグラウンド領域の第２のピクセル強度を乗算することを含みうる。
【０１０９】
図２に示されるように、細胞を循環腫瘍細胞として同定する方法２００の１つの実施形態は、第１のピクセル強度から第２のピクセル強度を減算することによって対象となる細胞の倍数性状態を計算することを記載するブロックＳ２４０を含む。ブロックＳ２４０は、第１のピクセル強度からバックグラウンドに由来する第２のピクセル強度を減算することによって、第１のピクセル強度から非特異的染色又はバックグラウンド染色のピクセル強度を除く働きをする。幾つかの実施形態では、倍数性状態は１又は実質的に１であり、正常又は健康量のＤＮＡを示す。幾つかの実施形態では、倍数性状態は１未満であり、アポトーシス細胞若しくは壊死細胞又は異常に低い量のＤＮＡを含むがん細胞を示す。幾つかの実施形態では、倍数性状態は２を超え、異常に高い量のＤＮＡを含むがん性細胞を示す。幾つかの実施形態では、倍数性状態は１と２の間又はちょうど２である。幾つかのそのような実施形態では、細胞が増殖マーカー又は有糸分裂マーカーに対して陰性である場合、細胞は異常に高い量のＤＮＡを含むがん細胞である可能性が高い。代替的に、幾つかのそのような実施形態では、細胞が増殖マーカー又は有糸分裂マーカーに対して陽性である場合、細胞は有糸分裂を介して進行する細胞である可能性が高い。幾つかの実施形態では、該方法は、アポトーシスマーカー、例えばカスパーゼ３をもつ細胞を対比染色することによって細胞がアポトーシス性又は壊死性である可能性を減らすことを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、増殖マーカー又は有糸分裂マーカー、例えばＫｉ−６７又はリン酸化セリン１０ヒストンＨ３をもつ細胞を対比染色することによって細胞が有糸分裂性である可能性を減らすことを含む。
【０１１０】
図２に示されるように、細胞を循環腫瘍細胞として同定する方法２００の１つの実施形態は、対象となる細胞が循環腫瘍細胞であるかどうかを倍数性状態に基づいて決定することを記載するブロックＳ２５０を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、倍数性状態が１未満である場合に、対象となる細胞を循環腫瘍細胞として同定することを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、倍数性状態が２を超える場合に、対象となる細胞を循環腫瘍細胞として同定することを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞が増殖又は有糸分裂マーカーに対して陰性である場合、且つ、細胞が１と２の間の倍数性状態を有する場合に、循環腫瘍細胞として対象となる細胞を同定することを含む。
【０１１１】
幾つかの実施形態では、該方法は、本明細書の他の箇所に記載の組成物及び方法を用いて、細胞試料又は対象となる細胞を固定することを含む。
【０１１２】
幾つかの実施形態では、該方法は、対象となる細胞を処理又は溶解して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質を抽出することを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を処理又は分析して、組織、がん、腫瘍、位置、環境、又は起源の系統を同定することを含む。
【０１１３】
幾つかの実施形態では、該方法は、疾患をもつ患者を対象となる細胞の同定に基づいて診断することを含む。
【０１１４】
図３に示されるように、細胞を循環腫瘍細胞として同定するコンピューター実装方法３００の１つの実施形態は、ブロックＳ３１０において対象となる細胞の画像を得ること、ブロックＳ３２０において対象となる細胞と関連する特徴が、核領域若しくはマーカー、細胞質領域若しくはマーカー、膜領域若しくはマーカー、細胞領域若しくはマーカー、又はそれらの組み合わせを含むように、特徴を特定すること、ブロックＳ３３０において対象となるパラメーターが、蛍光強度、細胞の大きさ、細胞形状、細胞面積、細胞質面積、核面積、又はそれらの組み合わせを含むように、特徴を処理して対象となるパラメーターを抽出すること、ブロックＳ３４０において対象となるパラメーターを解析すること、及びブロックＳ３５０において対象となるパラメーターが、所定の閾値より大きいか又は小さい場合に、対象となる細胞を循環腫瘍細胞に分類することを含む。該方法は、細胞が、正倍数性、異数性、高異数倍数性、低異数倍数性である、そうでなければ異常なＤＮＡ量を有するとして、細胞試料中の対象となる細胞を自動的に特定する働きをする。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞試料中の循環腫瘍細胞を同定する働きをする。該方法は、がん生物学分野で使用されるが、顕微鏡検査、細胞分析、細胞周期研究、又はその他の好適な用途、例えば研究用途又は教育用途に、付加的又は代替的に使用することができる。
【０１１５】
図３に示されるように、細胞を循環腫瘍細胞として同定するコンピューター実装方法３００の１つの実施形態は、対象となる細胞の画像を得ることを記載するブロックＳ３１０を含む。画像のタイプの非限定的な例としては、顕微鏡画像、共焦点画像、蛍光画像、フローサイトメトリー画像、又は別のタイプの画像が挙げられる。
【０１１６】
図３に示されるように、細胞を循環腫瘍細胞として同定するコンピューター実装方法３００の１つの実施形態は、対象となる細胞と関連する特徴が、核領域若しくはマーカー、細胞質領域若しくはマーカー、膜領域若しくはマーカー、細胞領域若しくはマーカー、又はそれらの組み合わせを含むように、特徴を特定することを記載するブロックＳ３２０を含む。幾つかの実施形態では、特徴は、細胞領域若しくはマーカー又は他の細胞特徴の非存在又は陰性染色に基づいて特定され、他の実施形態では、特徴は、細胞マーカー又は他の細胞特徴の存在又は陽性染色に基づいて特定される。幾つかの実施形態では、特徴を特定することは、ピクセル強度を測定すること、染色の位置を決定すること、例えば染色又は位置に基づいて核領域を特定すること、例えば染色又は位置に基づいて細胞質領域を特定すること、画像を処理してノイズを減らす若しくはコントラストを上げること、又は他の方法若しくは処理を含む。幾つかの実施形態では、特徴を特定することは、画像認識を使用することを含む。
【０１１７】
図３に示されるように、細胞を循環腫瘍細胞として同定するコンピューター実装方法３００の１つの実施形態は、対象となるパラメーターは、蛍光強度、細胞の大きさ、細胞形状、細胞面積、細胞質面積、核面積、又はそれらの組み合わせを含むように、特徴を処理して対象となるパラメーターを抽出することを記載するブロックＳ３３０を含む。幾つかの実施形態では、特徴は核領域であり、対象となるパラメーターは核領域の蛍光強度である。幾つかのそのような実施形態では、処理は、核の蛍光又はピクセル強度からバックグラウンドの蛍光又はピクセル強度を減算することを含む。さらに幾つかの実施形態では、処理は、核領域の面積を計算して、例えば、その面積にピクセル強度を掛けて核領域の総蛍光密度を計算することを含む。幾つかの実施形態では、処理は、第１の細胞の第１の核領域の第１のピクセル強度を第２の細胞の第２の核領域の第２のピクセル強度と比較して、例えば細胞全体にわたって染色強度を正規化すること、又は希少細胞、例えば循環腫瘍細胞を示す１つ以上の異常値を明らかにすることを含む。幾つかの実施形態では、この方法は、画像の信号対ノイズの質をよくするために画像を処理することを含む。処理の非限定的な例としては、利得を調整すること、オフセットを調整すること、各ピクセルの複数のスキャンを平均してピクセルの強度を決定すること、又はその他の方法が挙げられる。
【０１１８】
図３に示されるように、細胞を循環腫瘍細胞として同定するコンピューター実装方法３００の１つの実施形態は、対象となるパラメーターを解析することを記載するブロックＳ３４０を含む。幾つかの実施形態では、解析は機械学習技術を用いて行われる。幾つかのそのような実施形態では、機械学習技術は、分類木、判別分析、ｋ近傍法、単純ベイズ、サポートベクターマシン、深層学習、又は畳み込みニューラルネットワークを含む。１つの実施形態では、機械学習技術は深層学習を含む。別の実施形態では、機械学習技術は畳み込みニューラルネットワークを含む。幾つかの実施形態では、解析の結果は、例えばフィードバックループを用いて、系にフィードバックされ、その結果、系は、特徴を特定する能力及び／又は前記特徴を処理して対象となるパラメーターを抽出する能力を向上する。幾つかの実施形態では、解析は、ユーザーによって監視され、したがってユーザーは、例えば、偽陽性又は陰性を識別して、対象となる特徴及びパラメーターの解析の精度を高めることができる。
【０１１９】
図３に示されるように、細胞を循環腫瘍細胞として同定するコンピューター実装方法３００の１つの実施形態は、対象となるパラメーターが所定の閾値より大きいか又は小さい場合に、対象となる細胞を循環腫瘍細胞に分類することを記載するブロックＳ３５０を含む。幾つかの実施形態では、対象となるパラメーターが２より大きく、異常に高いＤＮＡ量を示す場合、対象となる細胞は循環腫瘍細胞に分類される。幾つかの実施形態では、対象となるパラメーターが１未満であり、異常に低いＤＮＡ量を示す場合、対象となる細胞は循環腫瘍細胞に分類される。幾つかの実施形態では、対象となる細胞が増殖マーカーに対して陰性であり、対象となるパラメーターが１と２の間である場合、対象となる細胞は循環腫瘍細胞に分類される。幾つかの実施形態では、該方法は、増殖マーカー及び／又は有糸分裂マーカーに対して陽性である試料中の細胞を除外することによって有糸分裂細胞を除外することを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、例えば、アポトーシス及び／又は壊死の作製者にとって陽性である試料中の細胞を除外することによってアポトーシス細胞又は壊死細胞を除外することを含む。
【０１２０】
幾つかの実施形態では、該方法は、対象となる細胞の分類の信頼スコア又は対象となる細胞が循環腫瘍細胞である確率を計算することを含む。
装置
【０１２１】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、コンピューター可読命令を記憶するコンピューター可読媒体を受けるように構成された機械として少なくとも部分的に具現化及び／又は実施することができる。命令は、システムと統合されたコンピューター実行可能構成部品と、プロセッサーによる実行のためのコンピューター可読命令を含むアプリケーションで構成されたコンピューティングデバイス上のプロセッサーの１つ以上の部分によって実行されうる。コンピューター可読媒体は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリー、ＥＥＰＲＯＭ、光学デバイス（例えばＣＤ若しくはＤＶＤ）、ハードドライブ、フロッピードライブ、又は任意の好適な装置などの任意の好適なコンピューター可読媒体に記憶することができる。コンピューター実行可能構成部品は、汎用若しくは特定用途向けプロセッサー、デジタルシグナルプロセッサー、又は他のプログラマブルロジックデバイスであってよいが、任意の好適な専用ハードウェア又はハードウェア／ファームウェアの組み合わせが、代替的又は付加的に命令を実行することができる。
【０１２２】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法は手動で実施することができ、幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、例えばコンピューティングデバイス２０００によって、部分的に又は完全に自動的に実行することができる。コンピューティングデバイス２０００は、据置型又はモバイルコンピューティングデバイスであってもよい。据置型コンピューティングデバイスの非限定的な例としては、ワークステーション、デスクトップ、又はその他の非ポータブルコンピューティングデバイスが挙げられる。モバイルコンピューティングデバイスの非限定的な例としては、ラップトップ、ネットブック、ノートブック、携帯電話、ウェアラブルデバイス、又はその他の好適なモバイルコンピューティングデバイスが挙げられる。幾つかの実施形態では、図４に示されるように、細胞を循環腫瘍細胞として同定するコンピューティングデバイス２０００は、プロセッサー２０１０、メモリー２０２０、及び随意にメモリー２０２０に記憶された１つ以上のアプリケーション２０３０を含む。プロセッサー２０１０は、１つ以上のデータバスを介してメモリー２０２０に接続される。プロセッサー２０１０は、メモリー２０２０から情報を読み出し、そのメモリーに情報を書き込む働きをする。メモリー２０２０は、プロセッサーによる実行のためのコンピューター可読命令を記憶するいずれの型のコンピューター可読媒体であってよい。コンピューター可読媒体の非限定的な例としては、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリー、ＥＥＰＲＯＭ、ハードディスクドライブ、ソリッドステートドライブ、又はその他の好適なバイスが挙げられる。幾つかの実施形態では、コンピューター可読命令は、非一過性のフォーマットで記憶されたソフトウェアを含む。幾つかの実施形態では、コンピューター可読命令は、メモリー２０２０にプログラムされてもよいし、アプリケーション２０３０としてメモリー２０２０にダウンロードされてもよい。プロセッサー２０１０は、１つ以上の命令セットを実行して、コンピューターの機能を達成することができ、例えば、オペレーティングシステムを実行すること、１つ以上のアプリケーションを実行すること、又は細胞を循環腫瘍細胞として同定する方法を実行することができる。幾つかのそのような方法は本明細書の他の箇所でより詳細に記載される。
【０１２３】
幾つかの実施形態では、図４に示されるように、コンピューティングデバイス２０００はグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）２０４０を含む。幾つかのそのような実施形態では、ＧＵＩ２０４０は、プロセッサー２０１０によって解析される１つ以上の細胞又は細胞集団を表示して、１つ以上の細胞を循環腫瘍細胞として同定しうる。代替的又は付加的に、ＧＵＩ２０４０は、１つ以上のパラメーター、ソフトウェアの機能、又はＧＵＩ外観を変更する１つ以上のコントロールを含んでもよい。幾つかの実施形態では、ＧＵＩ２０４０は、例えば、薄膜トランジスタ液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、インプレーススイッチングＬＣＤ、抵抗膜タッチスクリーンＬＣＤ、静電容量タッチスクリーンＬＣＤ、有機発光ダイオード（ＬＥＤ）、アクティブマトリクス型有機ＬＥＤ（ＡＭＯＬＥＤ）、スーパーＡＭＯＬＥＤ、Retinaディスプレイ、触覚（Haptic）／触覚（Tactile）タッチスクリーン、Gorilla Glass、又は量子ドットディスプレイを含むようにタッチ感応性能を含む。
【０１２４】
幾つかの実施形態では、図４に示されるように、コンピューティングデバイス２０００は電源２０５０を含む。電源２０５０は、コンセントからの交流を介してコンピューティングデバイス２０００に電力を供給することができる。代替的に、電源２０５０は、例えば再充電可能なバッテリー（例えばリチウムイオン）などのバッテリーを含んでもよい。
【０１２５】
幾つかの実施形態では、コンピューティングデバイス２０００は集積回路２０６０を含む。幾つかのそのような実施形態では、集積回路は、オペアンプ、ローパス、ハイパス、若しくはバンドパスフィルター、アナログ−デジタル変換器、及び／又は他の信号処理回路構成要素を含み、細胞の画像をフィルタリング、増幅、デジタル化、またはその他の方法で処理して、本明細書の他の箇所に記載のように、１つ以上のピクセル強度又は１つ以上の対象となるパラメーターを抽出することができる。
固定と染色  −  実施例
【０１２６】
以下は、細胞試料中の細胞を固定及び染色し、循環腫瘍細胞を同定するための本明細書の他の箇所に記載の方法の使用例である。試料は、本明細書の他の箇所に記載の方法及び組成物に従って調製した。特定の例が用いられるが、本明細書に記載の方法が、本明細書に提示のもの以外の例において使用されうることは当業者に理解されよう。
【０１２７】
実験設定
末梢静脈血を健康なボランティアから採取した。塩化アンモニウム溶解バッファーを用いて赤血球を溶解した。白血球をＰＢＳで２回洗浄した。がん細胞株Ａ５４９を、Ｔ７５細胞培養フラスコで、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で５％ＣＯ２にて培養した。トリプシン／ＥＤＴＡを用いて細胞を採取した。
【０１２８】
各実験では、別段の指示がない限り、２万個のがん細胞を２０万個の白血球にスパイクした。次いで、示されているさまざまな細胞遠心分離バッファーに細胞を再懸濁した。ゼラチンコーティングガラススライドをCytofuge IIチャンバーに載せ、Medite CytofugeII（Germany）で６００ｒｐｍにて１０分間回転させた。次いで、チャンバーをCytofugeから取り出し、スライドを取り外した。沈着した細胞を含むスライドを完全に乾燥させないように注意した。次に、示されているさまざまな細胞外固定バッファーでスライドをインキュベーションした。３０分後、スライドを取り出し、過剰の液体を、スライドを直立状態に保持しながら短時間ろ紙上に吸い取り、示されているさまざまな細胞内固定バッファーに浸した。さらに６０分後、スライドを細胞内固定バッファーから取り出し、Coverplates（Thermofisher）上にマウントし、示されているようにブロック及び染色した。
固定及び染色  −  実施例１
【０１２９】
細胞遠心分離バッファー
固定及び染色方法は変えずに、細胞遠心分離バッファー中の親水性ポリマー（例えばＰＶＰ）の量を変化させた。図５Ａ、５Ｂ、及び５Ｄに示されるように、細胞遠心分離バッファーは、ＰＶＰをそれぞれ０％、１％、又は２０％含む。すべての条件は、細胞遠心分離バッファー中に一定量の固定剤、０．０１％（重量／体積）硫酸クロムカリウムを含んだ。図５Ａ、５Ｂ、及び５Ｄに示されるように、細胞は、破壊された細胞外膜、細胞外膜小疱（すなわち細胞の細胞膜の突起又は突出）、及び細胞内に現れる染色アーティファクトを伴って不整であるように見える。対照的に、図５Ｃに示されるように、細胞遠心分離バッファーが１０％ＰＶＰを含む場合、細胞は、細胞外膜破壊又は小疱形成は極僅かで、球形及びインタクトであるように見える。
固定及び染色  −  実施例２
【０１３０】
細胞外固定剤
細胞内固定剤、細胞遠心分離バッファー、及び染色方法は変えずに、細胞外固定剤中の親水性ポリマーの量及び細胞を細胞外固定剤で固定する温度を変化させた。図６Ａ、６Ｃ、６Ｅ、及び６Ｇに示されるように、細胞固定剤を用いて細胞を固定する間、−１０℃の温度を用いた。図６Ｂ、６Ｄ、６Ｆ、及び６Ｈに示されるように、細胞をドライアイス上（例えば、実質的に又は約−６０℃〜−１１０℃）で細胞外固定剤を用いて固定した。図６Ｆに示されるように、メタノールで希釈した５％（重量／体積）親水性ポリマー（例えばＰＶＰ）を用いてドライアイス上で固定した細胞は、より少ない（図６Ａ〜６Ｄ）若しくはより多い（図６Ｇ〜６Ｈ）親水性ポリマーを含む細胞外固定剤で固定した細胞又はドライアイス上（図６Ｂ、６Ｄ、６Ｆ、及び６Ｈ）の代わりに−１０℃（図６Ａ、６Ｃ、６Ｅ、及び６Ｇ）で固定した細胞と比較して、完全性が向上し、アーティファクトが減り、染色が増強されている。
固定及び染色  −  実施例３
【０１３１】
細胞内固定剤
細胞外固定剤、細胞遠心分離バッファー、及び染色方法は変えずに、細胞内固定剤中の親水性ポリマー（例えばグリセロール）の量及び細胞を細胞内固定剤で固定する温度を変化させた。図７Ａ〜７Ｄに示されるように、細胞内固定剤には一定量の界面活性剤及び硫酸クロムカリウムが存在した。０．４％（体積／体積）ツイーン２０及び０．０１％（重量／体積）硫酸クロムカリウム。図７Ａに示されるように、細胞を室温で固定したとき、大部分の細胞が失われ、少数の残存細胞は完全性が低下し、分解が増加し、アーティファクトが増加している。図７Ｂに示されるように、細胞を実質的又は約−２℃で固定したとき、細胞は細胞外膜がインタクトであり、アーティファクトが減少し、染色が向上している。図７Ａ及び７Ｂに示されるように、細胞の消失（例えば、アポトーシス、細胞死など）を防ぎ、細胞の完全性を向上及び／又は維持するのに、細胞内固定剤による固定の間の凍結温度（例えば約０℃）又はわずかに氷点下の温度（例えば−１℃〜−４℃）は有利である。図７Ｃ及び７Ｄに示されるように、より高い濃度のグリセロールによって細胞形態がよくなる。図７Ｅ及び７Ｆに示されるように、固定剤（例えば硫酸クロムカリウム）の量を変化させ、親水性ポリマー及び界面活性剤の量は変えなかった：１５％（体積／体積）グリセロール及び０．４％（体積／体積）ツイーン２０。図７Ｅに示されるように、クロムカリウムを省略すると、結果として細胞が失われ、細胞形態の保持が悪くなる。図７Ｆに示されるように、０．０１％（重量／体積）硫酸クロムカリウムを含む１５％（体積／体積）グリセロールは、細胞細部の最適の解像度をもたらし、実質的に細胞消失が生じない。
固定及び染色  −  実施例４
【０１３２】
ブロッキングバッファー
無関係なタンパク質の種類を図８Ａと８Ｂとで変え、その一方で、無関係なタンパク質、親水性ポリマー、界面活性剤、及びアミノ酸の量は一定のままにした：２％（重量／体積）無関係なタンパク質、１５％（体積／体積）親水性ポリマー（例えばグリセロール）、０．４％（体積／体積）界面活性剤（例えばツイーン２０）、及び０．３Ｍグリシン。図８Ａに示されるように、ブロッキングバッファー中にウシ血清アルブミンを使用した場合、染色がくすみ、特異的染色はバックグラウンド染色の強度を有し、特異的に染色された特徴の特定を困難にする。図８Ｂに示されるように、加水分解コラーゲンをした場合、染色は明るく、高染色の特異的領域は、バックグラウンド染色と比較して容易に特定可能である。
固定及び染色  −  実施例５
【０１３３】
免疫蛍光染色
図９Ａに示されるように、細胞を標準的な実験スライド上で細胞遠心分離し、図１及び本明細書の他の箇所に記載の方法で処理した。細胞を、図９ＡのパネルＡに示されるＤＲＡＱ５（核）、図９ＡのパネルＢに示されるAlexaFluor488−ビメンチン、図９ＡのパネルＣに示されるAlexaFluor594−ｐａｎ−サイトケラチン、図９ＡのパネルＤに示されるＰＥ−ＥｐＣａｍ、図９ＡのパネルＥに示されるPacific Orange−ＣＤ４５、及び図９ＡのパネルＦに示されるBV421−ＣＤ１４で染色した。図９Ａに示されるように、核及び細胞構造が保存されている。ビメンチン（図９Ａ、パネルＢ）、サイトケラチン（図９Ａ、パネルＣ）、及びＥｐＣａｍ（図９Ａ、パネルＤ）は、著しく異なる細胞分布及び構造を示す。さらに、ＷＢＣ及びＣＤ１４（図９Ａ、パネルＦ）陽性細胞は、がん細胞と容易に区別することができる。
【０１３４】
図９Ｂに示されるように、図９Ａと同じドナー及び同じ細胞培養バッチからの細胞を、同じ日に、４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．５％サポニンで穴をあけ、ブロックし、図９ＢのパネルＡに示されるＤＲＡＱ５（核）、図９ＢのパネルＢに示されるAlexaFluor488−ビメンチン、図９ＢのパネルＣに示されるAlexaFluor594−ｐａｎ−サイトケラチン、図９ＢのパネルＤに示されるＰＥ−ＥｐＣａｍ、図９ＢのパネルＥに示されるPacific Orange−ＣＤ４５、及び図９ＢのパネルＦに示されるBV421−ＣＤ１４で染色した。図９Ｂに示されるように、ＷＢＣの核（図９Ｂ、パネルＡ）は拡散したように見え、サイトケラチン（図９Ｂ、パネルＣ）及びＥｐＣａｍ（図９Ｂ、パネルＤ）の形態及び分布は非常に類似したように見え、ＷＢＣ陽性及びＣＤ１４陽性（図９Ｂ、パネルＦ）細胞の形態は奇形であった。さらに、図９ＢのパネルＢに示されるように、ビメンチンは染色されない。また、図９ＢのパネルＤに示されるように、ＰＥチャネルではＷＢＣの高い自家蛍光が観察される。
固定及び染色  −  実施例６
【０１３５】
ＲＮＡ回収
肺がん細胞株Ａ５４９の５０万個の細胞を、Cytofuge 2（Statspin、USA）を用いてスライド上で回転させ、１０％（重量／体積）ＰＶＰ及び０．０１％（重量／体積）硫酸クロムカリウムで固定し、図１に記載の方法に従って染色した後のＲＮＡ回収を、２つの最も多用される方法であるパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定とメタノール固定に対して比較した。
【０１３６】
ＰＦＡ固定では、スライドを室温で５分間乾燥させ、４％ＰＦＡに１０分間浸し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／サポニン０．５％で１０分間インキュベーションし、再びＰＢＳで洗浄した。次いで、スライドをＰＢＳ／ＢＳＡ１％／ツイーン２０  ０．１％／グリシン０．３Ｍ中で３０分間ブロックし、ＰＢＳ／ＢＳＡ１％で６０分間モック染色し、ＰＢＳで洗浄した後、カバーガラスを載せた。
【０１３７】
メタノール固定では、スライドを室温で５分間乾燥させ、−２０℃に冷やした１００％メタノールに１０分間浸した。次いで、ＰＢＳ／ＢＳＡ１％／ツイーン２０  ０．１％／グリシン０．３Ｍ中で３０分間ブロックし、ＰＢＳ／ＢＳＡ１％で６０分間モック染色し、ＰＢＳで洗浄した後、カバーガラスを載せた。
【０１３８】
ＲＮＡ量の分析のためにカバースリップを取り除くまで、すべてのスライドを４℃で４８時間維持した。
【０１３９】
ＲＮＡ抽出では、市販のＲＮＡ抽出キットを使用した（Jena bioscience、Germany）。カバーガラスを取り除き、疎水性インクの円をスライド上の細胞の周りに描いた。５００マイクロリットルの溶解バッファーを加え、室温で５分間インキュベーションした。試料を吸引し、３００マイクロリットルのイソプロパノールと混合した。ミニスピンカラムを製造業者の取扱説明書に従って活性化バッファーを用いて調製し、試料をカラムに加えた。１０，０００ｇで３０秒間遠心分離した後、フロースルーを捨て、カラムを製造業者から供給された洗浄バッファーで２回洗浄した。次に、スピンカラムを新しいマイクロ遠心チューブに入れた。４０マイクロリットル溶出バッファーを各カラムに加え、室温で１分間インキュベーションした。次に、カラムを１０，０００ｇで１分間遠心分離し、フロースルーに得られたＲＮＡをQbit Fluorometer 3.0（Thermo Fisher）で測定した。ＲＮＡ量を、他の試料の固定と同じ日に同じ培養から得た新鮮な細胞から得た全ＲＮＡと比較し、その後、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に４℃で４８時間保存した。新鮮な細胞をＰＢＳで洗浄し、再計数した後にＲＮＡを抽出した。
【０１４０】
図１０に示されるように、図１及び本明細書の他の箇所に記載の方法は、新鮮な細胞と比較して最高で７０％のＲＮＡを保存し、それに対してメタノール固定及びＰＦＡ固定ではＲＮＡが実質的に失われる。したがって、本明細書に記載の方法及び組成物は、下流の（downstream）分子生物学的方法、例えば、遺伝子解析、トランスクリプトーム解析、及び次世代ＲＮＡシークエンシングを容易にする独自の利点をもたらす。
ＣＴＣの同定  −  実施例
【０１４１】
以下は、細胞試料中の循環腫瘍細胞を同定するための本明細書の他の箇所に記載の方法の使用例である。試料は、本明細書の他の箇所に記載の方法及び組成物に従って調製した。特定の例が使用されるが、本明細書に記載の方法は、本明細書に提示されているもの以外の例において使用されうることは当業者に理解されよう。
【０１４２】
対象となる細胞の核領域の総蛍光密度又は総ピクセル強度は、循環するがん細胞を同定するための貴重なマーカーである。細胞のＤＮＡ量は、膜（ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、白血球マーカー）、細胞質基質（ビメンチン）、及び／又は核抗原（例えば、Ｈ３Ｓｅｒ１０、有糸分裂マーカー、カスパーゼ−３、アポトーシスマーカー）の免疫染色と組み合わせて悪性腫瘍を確認又は除外する重要な指標として役立ちうる。
【０１４３】
本明細書の他の箇所に示され、記載されるように、有糸分裂を経ている健康な白血球（ＷＢＣ）で核ＤＮＡ量が２倍の増加を見出すことができる。しかし、有糸分裂を経るＷＢＣは、健常個体において非常に稀なことである（例えば、５０万個のＷＢＣ当たり１細胞未満）。正常な（Healthy）有糸分裂性のＷＢＣは、ＷＢＣマーカーＣＤ４５及び／又はＣＤ１４及び／又は他の発現並びにヒストン３のセリン１０でのリン酸化を特徴とし、文献で広く報告されており、時として有糸分裂細胞を検出するために日常診断で使用される。
【０１４４】
しかし、ヒストン３のセリン１０のリン酸化を伴わない（抗Ｈ３Ｓｅｒ１０抗体の結合がない）核ＤＮＡ量のいずれの２倍増加も、又は２倍以外のいずれの増加、特に２倍を超えるいずれの増加も、循環中に見出される細胞の悪性腫瘍に対する強い指標である。核ＤＮＡ含の減少はいずれも、ＣＤ３４などの造血幹細胞マーカーとともに評価され、カスパーゼ−３などのアポトーシスマーカーとともに評価され、臨床状況では、例えば、サラセミア又は循環内のアポトーシス細胞の頻度の上昇につながる他の疾患を除外して評価されなければならない。全血の長期保存は、アポトーシス細胞の頻度を増加させることにもつながりうることに留意されたい。
ＣＴＣの同定  −  実施例１
【０１４５】
図１１Ａは、前立腺がん細胞試料のBV421−ＣＤ４５染色の顕微鏡画像を示し、図１１Ｂは、同じ前立腺がん細胞試料のDyLight594−ビメンチン染色の顕微鏡画像を示す。図１１Ａ〜１１Ｂを比較すると、染色が、ビメンチン（図１１Ｂ）に対しては陽性であるが、ＣＤ４５（図１１Ａ）に対しては陰性である対象となる細胞４００が存在する。図１１Ｃに示されるＤＲＡＱ５での対象となる細胞４００の核染色は、図２〜３及び本明細書の他の箇所に記載のように対象となる細胞４００と細胞試料中の他の細胞４１０をバックグラウンド４２０に対して正規化したとき、対象となる細胞４００は、図１１Ｄのヒストグラムに示されるように、他の細胞４１０と比べてＤＮＡ量が減少する（０．７９×）ことを示す。これらのデータは、対象となる細胞が、循環腫瘍細胞又はアポトーシス性のいずれかであることと一致する。これら２つの可能性を区別するためには、１つ以上のアポトーシスマーカーを用いたさらなる分析が必要とされることになる。
ＣＴＣの同定  −  実施例２
【０１４６】
図１２Ａは、前立腺がん細胞試料のBV421−ＣＤ４５染色の顕微鏡画像を示し、図１２Ｂは、同じ前立腺がん細胞試料のDyLight594−ビメンチン染色の顕微鏡画像を示す。図１２Ａ〜１２Ｂを比較すると、染色が、ビメンチン（図１２Ｂ）に対しては陽性であるが、ＣＤ４５（図１２Ａ）に対しては陰性である対象となる細胞５００が存在する。図１２Ｃに示されるＤＲＡＱ５での対象となる細胞５００の核染色は、図２〜３及び本明細書の他の箇所に記載のように対象となる細胞５００と細胞試料中の他の細胞５１０をバックグラウンド５２０に対して正規化したとき、対象となる細胞５００は、図１２Ｄのヒストグラムに示されるように、他の細胞５１０と比べてＤＮＡ量が増加する（１．４５×）ことを示す。これらのデータは、対象となる細胞が、異数性細胞又は循環腫瘍細胞のいずれかであることと一致する。細胞が正常な有糸分裂を経ていないことを確認するためには、増殖マーカー又は有糸分裂マーカーでの染色が必要とされることになる。
ＣＴＣの同定  −  実施例３
【０１４７】
図１３Ａは、前立腺がん細胞試料のBV421−ＣＤ１４染色の顕微鏡画像を示し、図１３Ｂは、同じ前立腺がん細胞試料のPacific Orange−ＣＤ４５染色の顕微鏡画像を示し、図１３Ｃは、同じ前立腺がん細胞試料のAlexaFluor488−ビメンチン染色の顕微鏡画像を示す。図１３Ａ〜１３Ｃを比較すると、染色が、ビメンチン（図１３Ｃ）に対しては陽性であるが、ＣＤ４５（図１３Ｂ）とＣＤ１４（図１３Ａ）に対しては陰性である対象となる細胞６００が存在する。図１３Ｄに示されるＤＲＡＱ５での対象となる細胞６００の核染色は、図２〜３及び本明細書の他の箇所に記載のように対象となる細胞６００と細胞試料中の他の細胞６１０をバックグラウンド６２０に対して正規化したとき、対象となる細胞６００は、図１３Ｅのヒストグラムに示されるように、他の細胞６１０と比べてＤＮＡ量が増加する（１．４４×）ことを示す。これらのデータは、対象となる細胞が、異数性細胞又は循環腫瘍細胞のいずれかであることと一致する。細胞が正常な有糸分裂を経ていないことを確認するためには、増殖マーカー又は有糸分裂マーカーでの染色が必要とされることになる。
ＣＴＣの同定  −  実施例４
【０１４８】
図１４Ａは、前立腺がん細胞試料のBV421−ＣＤ１４染色の顕微鏡画像を示し、図１４Ｂは、同じ前立腺がん細胞試料のPacific Orange−ＣＤ４５染色の顕微鏡画像を示し、及び図１４Ｃは、同じ前立腺がん細胞試料のAlexaFluor488−ビメンチン染色の顕微鏡画像を示す。図１４Ａ〜１４Ｃを比較すると、染色が、ビメンチン（図１４Ｃ）に対しては陽性であるが、ＣＤ４５（図１４Ｂ）とＣＤ１４（図１４Ａ）に対しては陰性である２つの対象となる細胞７００Ａ、７００Ｂが存在する。図１４Ｄに示されるＤＲＡＱ５での対象となる細胞７００Ａ、７００Ｂの核染色は、図２〜３及び本明細書の他の箇所に記載のように対象となる細胞７００Ａ、７００Ｂと細胞試料中の他の細胞７１０をバックグラウンド７２０に対して正規化したとき、対象となる細胞７００Ａ、７００Ｂは、図１４Ｅのヒストグラムに示されるように、他の細胞７１０と比べてＤＮＡ量が増加する（それぞれ１．７７×及び１．７６×）ことを示す。これらのデータは、対象となる細胞が、異数性細胞又は循環腫瘍細胞のいずれかであることと一致する。細胞が正常な有糸分裂を経ていないことを確認するためには、増殖マーカー又は有糸分裂マーカーでの染色が必要とされることになる。
ＣＴＣの同定  −  実施例５
【０１４９】
図１５Ａは、前立腺がん細胞試料のPacific Orange−ＣＤ４５染色の顕微鏡画像を示し、図１５Ｂは、同じ前立腺がん細胞試料のＰＥ−リン酸化セリン１０ヒストンＨ３染色（すなわち増殖マーカー）の顕微鏡画像を示し、及び図１５Ｃは、同じ前立腺がん細胞試料のAlexaFluor488−ビメンチン染色の顕微鏡画像を示す。図１５Ａ〜１５Ｃを比較すると、染色が、ビメンチン（図１５Ｃ）、リン酸化セリン１０ヒストンＨ３（図１５Ｂ）、及びＣＤ４５（図１５Ａ）に対して陽性である対象となる細胞８００が存在し、細胞が良性で有糸分裂の過程を経ていることを示唆する。図１５Ｄに示されるＤＲＡＱ５での対象となる細胞８００の核染色は、図２〜３及び本明細書の他の箇所に記載のように対象となる細胞８００と細胞試料中の他の細胞８１０をバックグラウンド８２０に対して正規化したとき、対象となる細胞８００は、図１５Ｅのヒストグラムに示されるように、他の細胞８１０と比べてＤＮＡ量が増加する（２．０２×）ことを示す。これらのデータは、対象となる細胞が良性で有糸分裂の過程にあることと一致する。
ＣＴＣの同定  −  実施例６
【０１５０】
図１６Ａは、前立腺がん細胞試料のBV421−ＣＤ３４染色の顕微鏡画像を示し、図１６Ｂは、同じ前立腺がん細胞試料のPacific Orange−ＣＤ４５染色の顕微鏡画像を示し、及び図１６Ｃは、同じ前立腺がん細胞試料のAlexaFluor488−ビメンチン染色の顕微鏡画像を示す。図１６Ａ〜１６Ｃを比較すると、染色が、ビメンチン（図１６Ｃ）に対しては陽性、ＣＤ３４（図１６Ａ）に対しては弱い陽性であるが、ＣＤ４５（図１６Ｂ）に対しては陰性である対象となる細胞９００が存在する。図１６Ｄに示されるＤＲＡＱ５での対象となる細胞９００の核染色は、図２〜３及び本明細書の他の箇所に記載のように対象となる細胞９００と細胞試料中の他の細胞９１０をバックグラウンド９２０に対して正規化したとき、対象となる細胞９００は、図１６Ｅのヒストグラムに示されるように、他の細胞９１０と比べてＤＮＡ量が減少する（０．８３×）ことを示す。これらのデータは、対象となる細胞が異数性及び悪性であることと一致する。
ＣＴＣの同定  −  実施例７
【０１５１】
図１７Ａは、前立腺がん細胞試料のBV421−ＣＤ１４染色の顕微鏡画像を示し、図１７Ｂは、同じ前立腺がん細胞試料のPacific Orange−ＣＤ４５染色の顕微鏡画像を示し、及び図１７Ｃは、同じ前立腺がん細胞試料のAlexaFluor488−ビメンチン染色の顕微鏡画像を示す。図１７Ａ〜１７Ｃを比較すると、染色が、ビメンチン（図１７Ｃ）に対しては陽性、ＣＤ４５（図１７Ｂ）に対しては弱い陽性であるが、ＣＤ１４（図１７Ａ）に対しては陰性である対象となる細胞１０００が存在する。図１７Ｄに示されるＤＲＡＱ５での対象となる細胞１０００の核染色は、図２〜３及び本明細書の他の箇所に記載のように対象となる細胞１０００と細胞試料中の他の細胞１０１０をバックグラウンド１０２０に対して正規化したとき、対象となる細胞１０００は、図１７Ｅのヒストグラムに示されるように、他の細胞１０１０と比べてＤＮＡ量が減少する（０．７４×）ことを示す。これらのデータは、対象となる細胞が異数性及び悪性であることと一致する。
【０１５２】
本明細書に含まれる例及び説明は、限定ではなく例として、発明の対象が実施されうる特定の実施形態を示す。本開示の範囲から逸脱することなく構造的及び論理的な置換及び変更がなされうるように、他の実施形態を利用し、及びそれらから誘導することができる。本発明の対象のそのような実施形態は、単に便宜上、且つ、２つ以上が実際に開示される場合、本出願の範囲をいずれの単一の発明又は発明の概念にも自発的に（voluntarily）限定することを意図せずに、本明細書において、個々に又は集合的に、「発明」という用語で呼ばれる。したがって、特定の実施形態を本明細書に図示及び記載してきたが、同じ目的を達成するために計画されるいずれの構成も、示された特定の実施形態に置き換えることができる。本開示は、さまざまな実施形態のあらゆる改変又は変形を網羅することを意図している。上記の実施形態の組み合わせ、及び本明細書に具体的に記載されていない他の実施形態は、上記記載を検討することにより当業者ならば明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【国際調査報告】
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