(57)【要約】  本発明は、乳酸桿菌属に属する選択された細菌株に、及び細菌バイオフィルムの処置並びに、特に、細菌バイオフィルムの形成を阻害する及び/又は減弱させることを目的とする防止処置のためのそれらの使用に関する。特に、本発明は、ラクトバチルス・プランタルムLMC1(DSM32252)、ラクトバチルス・リューテリLMC3(DSM32253)、ラクトバチルス・パラカゼイLMC4(DSM32254)、ラクトバチルス・リューテリLMC5(DSM32255)、ラクトバチルス・ラムノススLMC6(DSM32256)、ラクトバチルス・ラムノススLMC7(DSM32257)、ラクトバチルス・パラカゼイLMC8(DSM32258)、ラクトバチルス・リューテリLMC9(DSM32259)及びラクトバチルス・ラムノススLMC10(DSM32260)を含むか又はその代わりにそれらからなる群から選択される乳酸桿菌属に属する細菌株、並びに細菌バイオフィルムの処置のための及び特に、細菌バイオフィルムの形成を阻害する及び/又は減弱させることを目的とする防止処置のためのそれらの使用に関する。更に、本発明は、細菌バイオフィルムの処置のための、及び特に、細菌バイオフィルムの形成を阻害する及び/若しくは減弱させることを目的とする防止処置のための、1種若しくは複数の上で特定された細菌株及び、任意選択で、薬学的若しくは食品規格の技術的添加剤及び/若しくは賦形剤を含むか又はその代わりにそれらからなる混合物を含む薬学的組成物、医療器具のための組成物若しくは食料補完剤のための組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
全てDSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zell kulturen GmbH、Braunschweig,、ドイツ)に、2016年1月29日に寄託された、
ラクトバチルス・プランタルム、寄託番号DSM32252[LMC1];
ラクトバチルス・パラカゼイ、寄託番号DSM32254)[LMC4];
ラクトバチルス・ラムノスス、寄託番号DSM32256[LMC6];
ラクトバチルス・ラムノスス、寄託番号DSM32257[LMC7];
ラクトバチルス・パラカゼイ、寄託番号DSM32258[LMC8]
からなる群から選択される乳酸桿菌属に属するヒト起源の細菌株。
【請求項２】
前記株が、有害な細菌株、例えば、好ましくは、カンジダ、大腸菌、クレブシエラ、プロテウス・ミラビリス及びプロピオニバクテリウム・アクネス、黄色ブドウ球菌の中から選択される株によるバイオフィルムの形成に対して活性である、請求項1に記載の細菌株。
【請求項３】
全てDSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、Braunschweig、ドイツ)に、2016年1月29日に寄託された、
ラクトバチルス・プランタルム、寄託番号DSM32252[LMC1];
ラクトバチルス・パラカゼイ、寄託番号DSM32254[LMC4];
ラクトバチルス・ラムノスス、寄託番号DSM32256[LMC6];
ラクトバチルス・ラムノスス、寄託番号DSM32257[LMC7];
ラクトバチルス・パラカゼイ、寄託番号(DSM32258[LMC8]
及び/又はそれらの組合せ
を含むか又はその代わりにそれらからなる群から選択される、少なくとも1種の細菌株を含むか又はその代わりにそれらからなる混合物を含む組成物。
【請求項４】
ラクトバチルス・プランタルム(DSM32252)[LMC1];
ラクトバチルス・パラカゼイ(DSM32254)[LMC4];
ラクトバチルス・パラカゼイ(DSM32258)[LMC8]、及び/又は
それらの組合せ
を含むか又はその代わりにそれらからなる群から選択される、少なくとも1種の細菌株を含むか又はその代わりにそれらからなる混合物を含む、請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
薬物療法として使用するための、請求項3又は4に記載の組成物。
【請求項６】
手術創又は褥瘡潰瘍の場合、表面及び深部の感染の処置;
血管及び導尿カテーテルによる感染の処置;
ステント、心臓循環器系の器具、人工補綴物、補綴挿入、耳科、整形外科の及び歯科の人工補綴物、ネジ及び釘による感染の処置;
口腔感染及び口腔粘膜及び膣粘膜の感染の処置;
局所感染、耳炎、鼻副鼻腔炎、咽頭炎、喉頭炎及び肺炎の処置;
試験室において、組織及び人工補綴物に特に付着性を有する細菌バイオフィルムの微生物学的診断の可能性が改善されるようなそれらの処置;
手術器具及び一般的に健康管理分野における衛生器具(衛生化)によるバイオフィルムを除去するための処置;
環境、健康及び食品部門において、給水及び衛生化系及びその他において、レジオネラ菌又は他の有害な微生物により形成されるバイオフィルムを除去及び衛生化するための処置;
環境及び食品部門において、細菌のバイオフィルムが存在するコンテナー、容器及び含有タンクを清浄化するための処置;
薬物、抗生物質、消毒剤及び抗微生物活性を付与された物理的及び化学的薬剤に対する微生物のより大きい耐性に基づいて形成された細菌のバイオフィルムの処置
において使用するための、請求項3〜5のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記混合物中に含有される前記少なくとも1種の細菌株が、全量で、混合物1g当たり1×106から1×1012CFU;好ましくは混合物1g当たり1×107から1×1011CF;より好ましくは混合物1g当たり1×108から1×1010CFUを構成する量で存在する、請求項3〜6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物中に含有される前記少なくとも1種の細菌株が、全量で、組成物1g当たり1×106から1×1011CFU;好ましくは組成物1g当たり1×107から1×1010CF;より好ましくは組成物1g当たり1×108から1×109CFUを構成する量で存在する、請求項3〜7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、有害な細菌株、例えば、好ましくは、カンジダ、大腸菌、クレブシエラ、プロテウス・ミラビリス及びプロピオニバクテリウム・アクネス、黄色ブドウ球菌の中から選択される株によるバイオフィルムの形成に対して活性である、請求項3〜8のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸桿菌属(Lactobacillus)に属する選択された細菌株及び細菌バイオフィルムの処置のための、特に、細菌バイオフィルムの形成を阻害する及び/又は減弱させる目的の防止処置のためのそれらの使用に関する。特に、本発明は、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)LMC1(DSM32252)、ラクトバチルス・リューテリ(Lactobacillus reuteri)LMC3(DSM32253)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)LMC4(DSM32254)、ラクトバチルス・リューテリLMC5(DSM32255)、ラクトバチルス・ラムノスス(Lactobacillus rhamnosus)LMC6(DSM32256)、ラクトバチルス・ラムノススLMC7(DSM32257)、ラクトバチルス・パラカゼイLMC8(DSM32258)、ラクトバチルス・リューテリLMC9(DSM32259)及びラクトバチルス・ラムノススLMC10(DSM32260)を含むか又はその代わりにそれらからなる群から選択される乳酸桿菌属に属する細菌株に、及び細菌バイオフィルムの処置のための、特に、細菌バイオフィルムの形成を阻害する及び/又は減弱させることを目的とする防止処置のための使用に関する。更に、本発明は、細菌バイオフィルムの処置及び、特に、細菌バイオフィルムの形成を阻害する及び/又は減弱させることを目的とする防止処置のための1種又は複数の上で特定した細菌株及び、任意選択で、薬学的又は食品規格の技術的添加剤及び/又は賦形剤を含むか又はその代わりにそれらからなる混合物を含む、薬学的組成物、医療器具のための組成物又は食料補完物のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオメディカルの環境では、いわゆるバイオフィルムは、生物学的又は非生物学的表面に固定された微生物の群落で作製され、細胞外のエキソポリサッカライドマトリックスに組み込まれ/封入されている(1)。バイオフィルムの形成(これは、その産生の原因である特定の細菌の遺伝子制御下で起こる)は、多細胞生物体における細胞分化にたとえられてきた過程である。バイオフィルムの典型的な例としては、細菌が生物学的又は非生物学的表面に付着して、それに自らを固定して、ポリマー状の物質、特にポリサッカライドの細胞外マトリックスで構成された2つのコーティング層が形成されるように増殖し分裂するときに形成されるものが挙げられる。バイオフィルム内に組み込まれた細菌の表面にある前記細胞外マトリックスは、例えば、抗生物質等の外部薬剤の作用に対して細菌を効果的に保護する(2)。多くの研究により、バイオフィルムは、浮遊生物形態(3、4)にある同じ細菌と比較して百倍を超えて、抗菌剤に対する微生物の耐性を増大させることができて、その結果として、バイオフィルム内の細菌を排除することは非常に困難であり、その理由は、この生物学的構造に効果的に侵入することができる分子は存在しないからであることが、実際に示されている。世界の微生物集団のおよそ80%は、バイオフィルム状態で存在すること及び前述した微生物のバイオフィルムは、人類で見出され得る全微生物感染の75%を超える原因であることが推定されている(5)。細菌のバイオフィルムは、生存する有機体(例えば、ヒト又は動物)の外部表面若しくは内側若しくは近辺で、又は、例えば、人工補綴物の場合のように、滅菌が完全でない環境と関連する種々のタイプの理由で、形成され得る。更に、細菌バイオフィルムは、滅菌が完全でない無生物の表面、例えば、血管内カテーテル及び人工補綴インプラントでも(6)、又は例えば、骨、骨組織及び骨組織中における人工補綴物の挿入の場合にも形成され得る。そのような人工的表面におけるバイオフィルム内の微生物は、器具の挿入又は埋め込み中に患者自身又は医療従事者の皮膚菌叢にしばしば由来する。単なる非限定的な例として、優勢な微生物は、特に、血管内カテーテル上の、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌(Coagulase-Negative Staphylococci)、黄色ブドウ球菌(Staphyl
ococcus aureus)、種々のシュードモナス(Pseudomonas)の種、エンテロコッカス(Enterococcus)、ステノトロホモナス(Stenotrophomonas)、及びカンジダ(Candida);導尿カテーテル上の大腸菌(Escherichia Coli)、エンテロコッカス、シュードモナス、クレブシエラ(Klebsiella)、エンテロバクター(Enterobacter)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)及びカンジダ;及び臀部置換インプラント上の黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus emidermitis)及びプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)(6)を含むが、これらに限定されない。
【０００３】
そのようなタイプのインプラントは、しばしば患者の身体内に長期間とどまるので、これらの有害な微生物によるバイオフィルムの形成は、根治困難な重篤な局在化した及び/又は全身性の感染、例えば、骨及び骨髄に同時に影響する感染過程である骨髄炎等を生じさせることもある(6)。口内バイオフィルムも、口腔感染から単離されたバイオフィルムの種々のタイプにより示されるように、一過性の菌血を通して広がり得る微生物のための繁殖場を構成する(7)。剥離及びその結果のバイオフィルム中に存在する細菌の血行性の播種は、感染性心内膜炎、急性細菌性心筋炎、脳膿瘍、肝膿瘍、肺膿瘍及び海綿性瘻の血栓症の一部の形態と関連していた(8〜13)。口内バイオフィルムが全身性の健康に影響を有し得るという仮説は、歯周炎の患者における全身性の炎症のマーカーの上昇したレベルを報告する横断的な研究により支持される(14、15)。説得性のある証拠によれば、いずれも炎症性病因を有する歯周炎及び心臓血管及び脳血管の疾患及び真性糖尿病の間で、全身と口腔との関連が裏付けられている。更に、歯周炎と心臓血管の疾患との間の関連が、喫煙、年齢、教育、肥満度指数及びライフスタイル等の因子のような共通のリスク因子と関係なく示された(16)。
【０００４】
しかしながら、上で記載されたことと対照的に、胃腸管及び/又は女性尿生殖器管中に自然に存在するバイオフィルムも存在して、それらは、そのような構造(バイオフィルム)が、生物体中における領域の長期のコロニー形成及びこれらの細菌の持続性を容易にするので、生物体で保護的役割を果たし得る有益な微生物、例えば、乳酸桿菌及びサーモフィルス菌(Streptococcus thermophilus)等を含むことは注目に値する(17)。
【０００５】
とりわけ、抗生物質の効力の低下と関連する病原性細菌により産生される、細菌性微生物バイオフィルムのヒトの健康に対する不利な影響は、それ故に、それらの形成を阻害する(防止的作用)及び/又はそれらの増殖/発達を阻止及び/又は減弱させる(治療的作用)ことができて、それにより必要な/望ましい抗微生物/抗細菌処置の最適の適用を可能にすることができる抗バイオフィルム剤として効果的に作用することができる新しい生物学的に活性な生成物(例えば、抗生物質)に対する探求を刺激してきた。
【０００６】
しかしながら、本出願人の知るところでは、今日まで、上記のことを完全に満足できるように達成することができる生成物は、未だ同定/製造されていない。
【０００７】
したがって、この分野における開業医の役割に、バイオフィルムの形成を阻害する並びに/又はそれらの増殖/発達を阻止及び/若しくは減弱させて、それにより必要な/望ましい抗細菌処置の最適の適用を可能にするように、抗細菌バイオフィルム剤として効果的に作用することができる、彼らの自由裁量で使える生成物、組成物及び製剤を有することに、強い要望があり続ける(例えば、抗生物質)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Beikler T, Flemming T. Oral biofilm-associated diseases: trends and implications for quality of life, systemic health and expenditures. Periodontology 2000. 2011; 55:87-103.
【非特許文献２】Bjarnsholt T. The role of bacterial biofilms in chronic infections. APMIS Suppl. 2013;136:1-51.
【非特許文献３】Olson ME, Ceri H, Stremick, et al. Biofilm bacteria: formation and comparative susceptibility to antibiotics. Can J Vet Res. 2002;66:86-92.
【非特許文献４】Ceri H, Olson ME, Morck DW, et al. The MBEC assay system: Multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Meth Enzymol. 2001;337:377-384.
【非特許文献５】Davies D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov. 2003;2:114-122.
【非特許文献６】Hung CS, Henderson JP. Emerging Concepts of Biofilms in Infectious Diseases. Mo Med. 2009;106:292-296.
【非特許文献７】Li X, Kolltveit KM, Tronstad L, et al. Systemic diseases caused by oral infection. Clin Microbiol Rev. 2000;13:547-558.
【非特許文献８】Bartzokas CA, Johnson R, Jane M, et al. Relation between mouth and haematogenous infection in total joint replacements. BMJ. 1994;309:506-508.
【非特許文献９】Mueller AA, Saldamli B, Stubringer S, et al. Oral bacterial cultures in nontraumatic brain abscesses: results of a first-line study. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2009;107:469-476.
【非特許文献１０】MylonasAI, Tzerbos FH, Mihalaki M, et al. Cerebral abscess of odontogenic origin. J Cranio-maxillofac Surg. 2007;35:63-67.
【非特許文献１１】Parahitiyawa NB, Jin LJ, Leung WK, et al. Microbiology of odontogenic bacteremia: beyond endocarditis. Clin Microbiol Rev. 2009;22:46-64.
【非特許文献１２】Ulivieri S, Olivieri G, Filosomi G. Brain abscess following dental procedures. Case report. Minerva Stomatol.. 2007;56:303-305.
【非特許文献１３】Wagner KW, Schon R, Schumacher M, et al. Case report: brain and liver abscesses caused by oral infection with Streptococcus intermedius. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2006;102:e21-e23.
【非特許文献１４】Chapple IL. The impact of oral disease upon systemic health-symposium overview. J Dent. 2009; 37:S568-S571.
【非特許文献１５】Craig RG, Yip JK, So MK, et al. Relationship of destructive periodontal disease to the acute-phase response. J Periodontal. 2003;74:1007-1016.
【非特許文献１６】Persson GR, Persson RE. Cardiovascular disease and periodontitis: an update on the associations and risk. J Clin Periodontol. 2008;35:362-379.
【非特許文献１７】Jones SE, Versalovic J. Probiotic Lactobacillus reuteri biofilms produce antimicrobial and anti-inflammatory factors. BMC Microbiol. 2009;9:35-43.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、上で記載された技術的問題に適切な回答を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本出願人は、今回、ヒト起源の特定の選択された乳酸桿菌の適当な群が、上で記載された技術的問題に対する望ましい回答を提供することができることを、予想外に見出した。
【００１１】
本発明の目的は、添付の独立請求項に記載の乳酸桿菌属に属するヒト起源の1種又は複数の細菌株である。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、添付の独立請求項に記載の細菌バイオフィルムの処置に、特に、細菌バイオフィルムの形成を阻害する及び/又は減弱させることを目的とする防止処置のために使用するための乳酸桿菌属に属するヒト起源の1種又は複数の細菌株である。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、添付の独立請求項に記載の1種又は複数の上で特定された細菌株及び、任意選択で、薬学的又は食品規格の技術的添加剤及び/若しくは賦形剤を含むか又はその代わりにそれらからなる混合物を含む、薬学的組成物又は医療器具のための組成物又は食料補完剤のための組成物である。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、添付の独立請求項に記載の細菌バイオフィルムの処置で使用するための、特に、細菌バイオフィルムの形成を阻害する及び/又は減弱させることを目的とする防止処置のための、1種又は複数の上で特定された細菌株、並びに任意選択で、薬学的若しくは食品規格の技術的添加剤及び/若しくは賦形剤を含むか又はその代わりにそれらからなる混合物を含む、薬学的組成物又は医療器具のための組成物又は食料補完剤のための組成物である。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、添付の独立請求項に記載の前述した乳酸桿菌の使用である。特に、本発明の目的は、好ましくは、カンジダ、大腸菌、クレブシエラ、プロテウス・ミラビリス及びプロピオニバクテリウム・アクネス、黄色ブドウ球菌の中から選択される菌等の有害な細菌株によるバイオフィルム形成及び前記バイオフィルム形成と関係する障害又は病状の処置又は予防における使用のための、1種又は複数の以下の株
ラクトバチルス・プランタルム、寄託番号DSM32252[別称LMC1];
ラクトバチルス・パラカゼイ、寄託番号DSM32254[別称LMC4];
ラクトバチルス・ラムノスス、寄託番号DSM32256[別称LMC6];
ラクトバチルス・ラムノスス、寄託番号DSM32257[別称LMC7];
ラクトバチルス・パラカゼイ、寄託番号DSM32258[別称LMC8]
に属する微生物を含む組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図1は、黄色ブドウ球菌(対照)の上清におけるバイオフィルムの3D像を示す。バイオフィルムは、Film Tracer(商標)LIVE/DEAD(登録商標)Biofilm Viability Kitで染色されて;緑色の染色(SYTO9)は生存細胞を表し、赤色の染色(ヨウ化プロピジウム)は死んだ細胞を表す。
【図２】図2は、黄色ブドウ球菌(対照)の上清におけるバイオフィルムの断面像を示す。
【図３】図3は、LMC8の上清中でインキュベーション後の黄色ブドウ球菌により産生されたバイオフィルムの断面像を示す。バイオフィルム産生は実質的に非常に少なく/全くない。
【図４】図4は、関係のある株のタンパク質プロファイル(ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動)を示す。  ライン1〜2は、Master Cell Bank培養の株のタンパク質プロファイルを示す; (ラインを参照されたい);ライン1〜2及び3に関して、株のプロファイルは、ラクトバチルス・プランタルムという種に特徴的である(矢印を参照されたい)。ライン4及び1〜2において、株のタンパク質プロファイルは、異なった種に属する株(ラクトバチルス・パラカゼイDSM32258;十字印を参照されたい)から得られたものと異なる。
【図５】図5は、ラクトバチルス・プランタルムに対する陽性反応を示す。ここで、1.PCRマーカー:Sigma社50〜2000bp2.ブランク:DNAなし3.陰性参照:L.パラカゼイDSM56224.陽性参照:L.プランタルムDSM201745.株:L.プランタルムLMC-1ID19526.株:L.プランタルムLMC-1ID19525)16S rDNA遺伝子配列決定
【図６】図6及び図7は、NotI酵素(図6)及びSfiI酵素(図7)を用いたパルスフィールド電気泳動(PFGE)を示す。ここで、1.マーカー:Sigma社50〜1,000kb2.L.プランタルムLMC-1ID1952-起源-Master Cell Bank3.L.プランタルムLMC-1ID1952-6代目の継代株-Master Cell Bank生物学的特徴付け
【図７】図6及び図7は、NotI酵素(図6)及びSfiI酵素(図7)を用いたパルスフィールド電気泳動(PFGE)を示す。ここで、1.マーカー:Sigma社50〜1,000kb2.L.プランタルムLMC-1ID1952-起源-Master Cell Bank3.L.プランタルムLMC-1ID1952-6代目の継代株-Master Cell Bank生物学的特徴付け
【図８】図8は、タンパク質プロファイル(ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動)を示し、ここで、1.陰性参照:L.プランタルムLP01-LMGP-210212.株:L.パラカゼイLMC-4(ID1953)-Master Cell Bank(起源)3.株:L.パラカゼイLMC-4(ID1953)-Master Cell Bank(継代株13#6)4.陽性参照:L.パラカゼイLPC01-CNCMI-1390
【図９】図9は、プライマーW2/Y2を使用したポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を示す。反応は、ラクトバチルス・パラカゼイに対して陽性であり、ここで、1.PCRマーカー:Sigma社50〜2000bp2.ブランク:DNAなし3.陰性参照:L.カセイDSM200114.陽性参照:L.パラカゼイDSM56225.株:L.パラカゼイLMC-4ID19536.株:L.パラカゼイLMC-4ID19535)16SrDNA遺伝子の配列決定
【図１０】図10及び図11は、NotI酵素(図10)及びSfiI酵素(図11)を用いたパルスフィールド電気泳動(PFGE)を示し、ここで、1.L.パラカゼイLMC-4(ID1953)-培養起源-Master Cell Bank2.L.パラカゼイLMC-4(ID1953)-6代目の継代株-Master Cell Bank3.電気泳動のマーカー:Sigma社50〜1,000kb
【図１１】図10及び図11は、NotI酵素(図10)及びSfiI酵素(図11)を用いたパルスフィールド電気泳動(PFGE)を示し、ここで、1.L.パラカゼイLMC-4(ID1953)-培養起源-Master Cell Bank2.L.パラカゼイLMC-4(ID1953)-6代目の継代株-Master Cell Bank3.電気泳動のマーカー:Sigma社50〜1,000kb
【図１２】図12は、タンパク質プロファイル(ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動)を示し、ここで、1.陽性参照:L.パラカゼイLPC01ID1119-CNCMI-13902.株:L.パラカゼイLMC-8(ID1954)-Master Cell Bank(起源)3.株:L.パラカゼイLMC-8(ID1954)-Master Cell Bank(継代株13#6)4.陰性参照:L.プランタルムLP01ID1171-LMGP-21021  ライン2〜3は、Master Cell Bank培養の株のタンパク質プロファイルを示し; (ラインを参照されたい);ライン1及び2〜3では、株のプロファイルが、ラクトバチルス・パラカゼイ種に特徴的である(矢印を参照されたい)。ライン4及び2〜3に関しては、株のタンパク質プロファイルは、異なった種(ラクトバチルス・プランタルムLMGP-21021;十字印を参照されたい)に属する株から得られたものと異なる。
【図１３】図13は、プライマーW2/Y2を使用したポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を示し、ここで、反応はラクトバチルス・パラカゼイに対して陽性であり、1.PCRマーカー:Sigma社50〜2000bp2.ブランク:DNAなし3.陰性参照:L.カセイDSM200114.陽性参照:L.パラカゼイDSM56225.株:L.パラカゼイLMC-8ID19546.株:L.パラカゼイLMC-8ID1954である。
【図１４】図14及び図15は、NotI酵素(図14)及びSfiI酵素(図15)を用いたパルスフィールド電気泳動(PFGE)を示し、ここで、1.電気泳動のマーカー:Sigma社50〜1,000kb2.L.パラカゼイLMC-8(ID1954)-培養起源-Master Cell Bank3.L.パラカゼイLMC-8(ID1954)-6代目の継代株-Master Cell Bank
【図１５】図14及び図15は、NotI酵素(図14)及びSfiI酵素(図15)を用いたパルスフィールド電気泳動(PFGE)を示し、ここで、1.電気泳動のマーカー:Sigma社50〜1,000kb2.L.パラカゼイLMC-8(ID1954)-培養起源-Master Cell Bank3.L.パラカゼイLMC-8(ID1954)-6代目の継代株-Master Cell Bank
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の好ましい実施形態は、添付の独立請求項に記載されている。
【００１８】
以下の記載で開示された本発明の好ましい実施形態は、単に例として、本発明の適用の広い範囲を決して限定することなく、本明細書で示されるもので、それらは当業者には直ちに明らかであろう。
【００１９】
Table 1(表1)は、黄色ブドウ球菌によるバイオフィルム産生の、本発明の乳酸桿菌を使用して得られた阻害の百分率を例示する。
【００２０】
【表１】
2019524159.tif 000002
【００２１】
図1は、黄色ブドウ球菌(対照)の上清におけるバイオフィルムの3D像を示す。バイオフィルムは、Film Tracer(商標)LIVE/DEAD(登録商標)Biofilm Viability Kitで染色されて;緑色の染色(SYTO9)は生存細胞を表し、赤色の染色(ヨウ化プロピジウム)は死んだ細胞を表す。
【００２２】
図2は、黄色ブドウ球菌(対照)の上清におけるバイオフィルムの断面像を示す。
【００２３】
図3は、LMC8の上清中でインキュベーション後の黄色ブドウ球菌により産生されたバイオフィルムの断面像を示す。バイオフィルム産生は実質的に非常に少なく/全くない。
【００２４】
ラクトバチルス・プランタルム株(DSM32252)の特徴付け
株:ラクトバチルス・プランタルム
国際識別番号-ID:ID1952
プロバイオティック商品コード:LMC-1
DSMZ国際コレクションにおける寄託番号:DSM32252
株の特徴付け
起源
ラクトバチルス・プランタルム株は、Probiotical S.p.A社の関連会社であるMofinAlceグループの子会社であるBiolab Research srl社の研究所で単離され分析された。
【００２５】
生化学的特徴付け
1)Table 2(表2)は、糖発酵プロファイル(API 50CHL、bioMerieux社)を示す。
【００２６】
【表２Ａ】
2019524159.tif 000003
【００２７】
【表２Ｂ】
2019524159.tif 000004
【００２８】
2)Table 3(表3)は、酵素のプロファイル(API Zym、bioMerieux社)を示す。
【００２９】
【表３Ａ】
2019524159.tif 000005
【００３０】
【表３Ｂ】
2019524159.tif 000006
【００３１】
3)タンパク質プロファイル(ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動)
図4は、関係のある株のタンパク質プロファイル(ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動)を示す。
【００３２】
ライン1〜2は、Master Cell Bank培養の株のタンパク質プロファイルを示す; (ラインを参照されたい);ライン1〜2及び3に関して、株のプロファイルは、ラクトバチルス・プランタルムという種に特徴的である(矢印を参照されたい)。ライン4及び1〜2において、株のタンパク質プロファイルは、異なった種に属する株(ラクトバチルス・パラカゼイDSM32258;十字印を参照されたい)から得られたものと異なる。
【００３３】
分子的特徴付け
種特異的分類:
4)プライマーPLAN-F/P-REVを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
図5は、ラクトバチルス・プランタルムに対する陽性反応を示す。ここで、
1.PCRマーカー:Sigma社50〜2000bp
2.ブランク:DNAなし
3.陰性参照:L.パラカゼイDSM5622
4.陽性参照:L.プランタルムDSM20174
5.株:L.プランタルムLMC-1ID1952
6.株:L.プランタルムLMC-1ID1952
5)16S rDNA遺伝子配列決定
結果は、Blastプログラム(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)を用いて得られた。
【００３４】
【表４】
2019524159.tif 000007
【００３５】
スコア:同定の生物学的関連を評価するために使用した数。配列アラインメントで、スコアは、アラインメントの全体的な質を記載する数値である。より高い数が、より大きい類似性に対応する。
【００３６】
E値(期待値):研究者により正しく解釈されれば、2つの生物学的配列間の相関を示すスコアの尤度を示す値。E値が低いほど、スコアはより有意である。
【００３７】
指紋プロファイル
6)図6及び図7は、NotI酵素(図6)及びSfiI酵素(図7)を用いたパルスフィールド電気泳動(PFGE)を示す。ここで、
1.マーカー:Sigma社50〜1,000kb
2.L.プランタルムLMC-1ID1952-起源-Master Cell Bank
3.L.プランタルムLMC-1ID1952-6代目の継代株-Master Cell Bank
生物学的特徴付け
7)Table 4(表5)は、抗生物質耐性プロファイルを示す(E検定、ABBiodisk社)
【００３８】
【表５Ａ】
2019524159.tif 000008
【００３９】
【表５Ｂ】
2019524159.tif 000009
【００４０】
8)Table 5(表6)は、生物学的流体(模造胃液、模造膵液及び胆汁酸塩)に対する耐性を示す。
【００４１】
【表６】
2019524159.tif 000010
【００４２】
株ラクトバチルス・パラカゼイ(DSM32254)の特徴付け
株:ラクトバチルス・パラカゼイ
国際同定番号-ID:ID1953
プロバイオティック商品コード:LMC-4
DSMZ国際コレクションにおける寄託番号:DSM32254
【００４３】
株の特徴付け
起源
ラクトバチルス・パラカゼイ株は、Probiotical S.p.A社の関連会社Mofin Alceグループの子会社であるBiolab Research srl社の研究所で単離され分析された。
【００４４】
生化学的特徴付け
1)Table 6(表7)は、糖発酵プロファイル(API 50CHL、bioMerieux社)を示す。
【００４５】
【表７Ａ】
2019524159.tif 000011
【００４６】
【表７Ｂ】
2019524159.tif 000012
【００４７】
2)Table 7(表8)は、酵素のプロファイルを示す(API Zym、bioMerieux社)。
【００４８】
【表８Ａ】
2019524159.tif 000013
【００４９】
【表８Ｂ】
2019524159.tif 000014
【００５０】
3)図8は、タンパク質プロファイル(ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動)を示し、ここで、
1.陰性参照:L.プランタルムLP01-LMGP-21021
2.株:L.パラカゼイLMC-4(ID1953)-Master Cell Bank(起源)
3.株:L.パラカゼイLMC-4(ID1953)-Master Cell Bank(継代株13#6)
4.陽性参照:L.パラカゼイLPC01-CNCMI-1390
ライン2〜3は、Master CellBank培養の菌株のタンパク質プロファイルを示し;(ラインを参照されたい);ライン1及び2〜3で、菌株のプロファイルは、ラクトバチルス・パラカゼイ種で特徴的である(矢印を参照されたい)。ライン4及び2〜3に関して、菌株のタンパク質プロファイルは、異なった種(ラクトバチルス・プランタルムLMGP-21021;十字印を参照されたい)に属する菌株から得られたものと異なる。
【００５１】
分子的特徴付け
種特異的分類:
4)図9は、プライマーW2/Y2を使用したポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を示す。反応は、ラクトバチルス・パラカゼイに対して陽性であり、ここで、
1.PCRマーカー:Sigma社50〜2000bp
2.ブランク:DNAなし
3.陰性参照:L.カセイDSM20011
4.陽性参照:L.パラカゼイDSM5622
5.株:L.パラカゼイLMC-4ID1953
6.株:L.パラカゼイLMC-4ID1953
5)16SrDNA遺伝子の配列決定
結果は、Blastプログラム(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Biast.cgi)を用いて得られた。
【００５２】
【表９】
2019524159.tif 000015
【００５３】
スコア:同定の生物学的関連を評価するために使用した数。配列アラインメントで、スコアは、アラインメントの全体的な質を記載する数値である。より高い数が、より大きい類似性に対応する。
【００５４】
E値(期待値):研究者により正しく解釈されれば、2つの生物学的配列間の相関を示すスコアの尤度を示す値。E値が低いほど、スコアはより有意である。
【００５５】
指紋プロファイル
6)図10及び図11は、NotI酵素(図10)及びSfiI酵素(図11)を用いたパルスフィールド電気泳動(PFGE)を示し、ここで、
1.L.パラカゼイLMC-4(ID1953)-培養起源-Master Cell Bank
2.L.パラカゼイLMC-4(ID1953)-6代目の継代株-Master Cell Bank
3.電気泳動のマーカー:Sigma社50〜1,000kb
【００５６】
生物学的特徴付け
7)Table 8(表10)は、抗生物質耐性プロファイル(E検定、ABBiodisk社)を示す。
【００５７】
【表１０Ａ】
2019524159.tif 000016
【００５８】
【表１０Ｂ】
2019524159.tif 000017
【００５９】
8)Table 9(表11)は、生物学的流体(模造胃液、模造膵液及び胆汁酸塩)に対する耐性を示す。
【００６０】
【表１１】
2019524159.tif 000018
【００６１】
ラクトバチルス・パラカゼイ株(DSM32258)の特徴付け
株:ラクトバチルス・パラカゼイ
国際同定番号-ID:ID1954
プロバイオティック商品コード:LMC-8
DSMZ国際コレクションにおける寄託番号:DSM32258
【００６２】
株の特徴付け
起源
ラクトバチルス・パラカゼイ株は、Mofin Alceグループの子会社、Probiotical S.p.A社の関連会社であるBiolab Research srl社の研究所で単離され分析された。
【００６３】
生化学的特徴付け
1)Table 10(表12)は糖発酵プロファイルを示す(API 50CHL、bioMerieux社)。
【００６４】
【表１２Ａ】
2019524159.tif 000019
【００６５】
【表１２Ｂ】
2019524159.tif 000020
【００６６】
2)Table 11(表13)は、酵素のプロファイルを示す(API Zym、bioMerieux社)。
【００６７】
【表１３Ａ】
2019524159.tif 000021
【００６８】
【表１３Ｂ】
2019524159.tif 000022
【００６９】
3)図12は、タンパク質プロファイル(ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動)を示し、ここで、
1.陽性参照:L.パラカゼイLPC01ID1119-CNCMI-1390
2.株:L.パラカゼイLMC-8(ID1954)-Master Cell Bank(起源)
3.株:L.パラカゼイLMC-8(ID1954)-Master Cell Bank(継代株13#6)
4.陰性参照:L.プランタルムLP01ID1171-LMGP-21021
ライン2〜3は、Master Cell Bank培養の株のタンパク質プロファイルを示し; (ラインを参照されたい);ライン1及び2〜3では、株のプロファイルが、ラクトバチルス・パラカゼイ種に特徴的である(矢印を参照されたい)。ライン4及び2〜3に関しては、株のタンパク質プロファイルは、異なった種(ラクトバチルス・プランタルムLMGP-21021;十字印を参照されたい)に属する株から得られたものと異なる。
【００７０】
分子的特徴付け
種-特異的分類:
4)図13は、プライマーW2/Y2を使用したポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を示し、ここで、反応はラクトバチルス・パラカゼイに対して陽性であり、
1.PCRマーカー:Sigma社50〜2000bp
2.ブランク:DNAなし
3.陰性参照:L.カセイDSM20011
4.陽性参照:L.パラカゼイDSM5622
5.株:L.パラカゼイLMC-8ID1954
6.株:L.パラカゼイLMC-8ID1954
である。
5)16SrDNA遺伝子配列決定
【００７１】
【表１４】
2019524159.tif 000023
【００７２】
結果は、Blastプログラム(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)を使用して得られた。
【００７３】
スコア:同定の生物学的関連を評価するために使用した数。配列アラインメントで、スコアは、アラインメントの全体的な質を記載する数値である。より高い数が、より大きい類似性に対応する。
【００７４】
E値(期待値):研究者により正しく解釈されれば、2つの生物学的配列間の相関を示すスコアの尤度を示す値。E値が低いほど、スコアはより有意である。
【００７５】
指紋プロファイル
6)図14及び図15は、NotI酵素(図14)及びSfiI酵素(図15)を用いたパルスフィールド電気泳動(PFGE)を示し、ここで、
1.電気泳動のマーカー:Sigma社50〜1,000kb
2.L.パラカゼイLMC-8(ID1954)-培養起源-Master Cell Bank
3.L.パラカゼイLMC-8(ID1954)-6代目の継代株-Master Cell Bank
【００７６】
生物学的特徴付け
7)Table 12(表15)は、抗生物質耐性プロファイル(E検定、ABBiodisk社)を示す。
【００７７】
【表１５Ａ】
2019524159.tif 000024
【００７８】
【表１５Ｂ】
2019524159.tif 000025
【００７９】
8)Table 13(表16)は、生物学的流体(模造胃液、模造膵液及び胆汁酸塩)に対する耐性を示す。
【００８０】
【表１６】
2019524159.tif 000026
【００８１】
本発明は、
1.ラクトバチルス・プランタルムLMC1(DSM32252)、
2.ラクトバチルス・リューテリLMC3(DSM32253)、
3.ラクトバチルス・パラカゼイLMC4(DSM32254)、
4.ラクトバチルス・リューテリLMC5(DSM32255)、
5.ラクトバチルス・ラムノススLMC6(DSM32256)、
6.ラクトバチルス・ラムノススLMC7(DSM32257)、
7.ラクトバチルス・パラカゼイLMC8(DSM32258)、
8.ラクトバチルス・リューテリLMC9(DSM32259)、
9.ラクトバチルス・ラムノススLMC10(DSM32260)及び/又はそれらの混合物(群1)
を含むか又はその代わりに、それらからなる群から選択される乳酸桿菌属に属するヒト起源の少なくとも1種の細菌株に関する。
【００８２】
好ましい実施形態において、本発明は、
1.ラクトバチルス・プランタルムLMC1(DSM32252)、
3.ラクトバチルス・パラカゼイLMC4(DSM32254)、
5.ラクトバチルス・ラムノススLMC6(DSM32256)、
6.ラクトバチルス・ラムノススLMC7(DSM32257)、
7.ラクトバチルス・パラカゼイLMC8(DSM32258)、
及び/又はそれらの混合物(群2)
を含むか又はその代わりにそれからなる群から選択される乳酸桿菌属に属するヒト起源の少なくとも1種の細菌株に関する。
【００８３】
有利には、本発明は、
1.ラクトバチルス・プランタルムLMC1(DSM32252)、
3.ラクトバチルス・パラカゼイLMC4(DSM32254)、
7.ラクトバチルス・パラカゼイLMC8(DSM32258)、
及び/又はそれらの混合物(群3)
を含むか又はその代わりにそれからなる群から選択される乳酸桿菌属に属するヒト起源の少なくとも1種の細菌株に関する。
【００８４】
上でリストに挙げた本発明の細菌株は、下の実験の部で更に説明するように、健康な対象者の糞便試料から単離して、DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、Braunschweig、ドイツ)に29.01.2016年1月29日に寄託して、それぞれ受託番号-DSM32252-DSM32260で登録された。単に便宜上、前述した株を、それらのコードLMC1-3-4-5-6-78-9-10で記載することもある。
【００８５】
本発明は、コードLMC1-3-4-5-6-7-8-9-10を有して特徴付けられる上で記載された乳酸桿菌株の少なくとも1種、又はそうでなければ適切なそれらの組合せ(例えば、それらの2つ以上の又は全ての)を含むか又はその代わりにそれらからなる混合物を含む薬学的組成物/配合物にも関する。
【００８６】
一実施形態において、組成物は、群2の株の中から選択される少なくとも1種の細菌株を含むか又はその代わりにそれらからなる混合物を含む。
【００８７】
別の実施形態において、組成物は、群3の株の中から選択される少なくとも1種の細菌株を含むか又はその代わりにそれらからなる混合物を含む。
【００８８】
前記混合物において、本発明の乳酸桿菌株の少なくとも1種の細菌株又は組合せは、全量で、混合物1g当たり1×106から1×1012CFU;好ましくは混合物1g当たり1×107から1×1011CF;より好ましくは混合物1g当たり1×108から1×1010CFUを構成する量で存在する。
【００８９】
前記組成物において、本発明の乳酸桿菌株の少なくとも1種の細菌株、又は組合せは、全量で、組成物1g当たり1×106から1×1011CFU;好ましくは組成物1g当たり1×107から1×1010CF;より好ましくは組成物1g当たり1×108から1×109CFUを構成する量で存在する。
【００９０】
前記組成物は、必要な及び/又は適切な量の望ましい共配合物、賦形剤、担体、界面活性剤、助剤、防腐剤及び着色剤を更に含んでいてもよい。
【００９１】
前記物質は、薬学的製剤の当業者により知られて一般的に使用されているものの中から、品質及び量に関して適切に選択される。
【００９２】
前記薬学的組成物は、望ましい投与に最もよく適した形態で供給することができる。この形態は工業で調製される一般的に知られている薬学的形態の中から任意に選択することができる(例えば、経口、局所、注射可能)。経口投与のため組成物に関して、単に例として、前記組成物は、口内洗浄薬、錠剤、ロゼンジ、トローチ剤、ピル、カプセル(軟質又は硬質コーティング、制御された放出で)で、舌下投与のために散剤若しくは顆粒で、又は例えば、投与前に水中で再構成されるようにサシェにパックされた形態であることができるが、絶対にこれらに限定されない(必要に応じて、前記散剤又は顆粒は、適当な薬学的に許容されるポリマー又はポリマーの混合物により組み込まれるか又はコートされることが可能で、それらに特定の性質、例えば、胃に対する耐性及び/又は身体中の望ましい作用部位に応じた制御/遅延放出を与えることができる)。局所投与のための組成物に関して、単に例として、前記組成物は、ゲル剤、クリーム剤又は軟膏の形態であることができるが、これらに絶対に限定されない。
【００９３】
前記組成物は、工業で一般的に使用される周知の伝統的な技術及び製造設備(混合機、造粒機、攪拌機、包装機等)を使用して調製される。当業者は、その調製に対する技術的問題に最も適した方法を自らの知識に基づくことだけで問題なく同定及び選択することに困難を有さないであろう。
【００９４】
前に記載された本発明の細菌株(そのままで又は互いに組み合わせて)、並びにそれらの薬学的製剤は、細菌バイオフィルム(特に、健康に有害な病原性細菌により産生されるもの)の形成及び/又は増殖を、阻害及び/又は阻止及び/又は減弱することができて、それにより必要な/望まれる抗細菌処置の最適の適用を可能にする有効な又は少なくとも非常に有望な薬剤(例えば、抗生物質)であることが示された。
【００９５】
周知のように(19)及び前に言及されたように、細菌バイオフィルムは、しばしば、ヒトの健康に対して重大な役割を果たすが、それは、それらの細菌が抗細菌療法及び他の潜在的病原体に対して、並びに有害な細菌が通常は無菌的な解剖学的領域に侵入する感染性疾患で、細菌自体のための防御障壁を形成するからである。以下の実験の部で指摘するように、本発明の全ての乳酸桿菌株は、黄色ブドウ球菌によるバイオフィルム産生を有意な程度に阻害することができたことから(Table 1(表1))、臨床的関心のある病原性細菌に対する前記乳酸桿菌の重大な役割が強調される。特に、記載された例で、細菌株LMC1-4-67-8は、最大の阻害活性を示した。
【００９６】
【表１７】
2019524159.tif 000027
【００９７】
本発明の細菌株(群2及び/又は群3)及びそれらの薬学的組成物は、細菌バイオフィルム自体の形成及び増殖を防止及び阻害するそれらの能力のおかげで、細菌バイオフィルムに対して優れた/良好な活性をこのように示した。それ故、本発明の細菌株及びそれらの薬学的組成物は、薬物、抗生物質、消毒剤及び抗微生物活性を付与された他の全ての物理的及び化学的薬剤に対する、微生物のより大きい耐性の原因としてバイオフィルムの関与がある、健康に関係する及び健康に関係しない全ての状態で、有利に使用することができる。特に、本発明の細菌株(群2及び/又は群3)及びそれらの薬学的組成物は、これらに限定されないが、
全身の、例えば、これらに限定されないが手術創及び褥瘡潰瘍における、全ての表面及び深部の感染の処置;
人工補綴物又は骨組織における人工補綴物の挿入を含む全ての感染の処置;
血管及び導尿カテーテルによる感染の処置;
ステント、心臓循環器系の器具、耳科学の、整形外科の及び歯科の人工補綴物、ネジ及び釘による感染の処置;
口腔感染(例えば、抗バイオフィルム及び抗プラーク口内洗浄薬で)、及び口腔粘膜及び膣粘膜の感染の処置;
細菌のバイオフィルムが感染の持続因子として関与している局所感染(例えば、耳炎、鼻副鼻腔炎、咽頭炎、喉頭炎及び肺炎)の処置;
試験室において、細菌が組織及び人工補綴物に特に付着性を有し、したがってそれらの単離及び適切な同定が困難な場合に、微生物学的診断を改善するため;
一般的に(衛生化)、手術器具及び衛生器具からバイオフィルムを除去するための処置における健康管理の分野;
環境、健康及び食品部門において、給水及び衛生化系その他で、レジオネラ菌(Legionella)又は他の有害な微生物によって形成されたバイオフィルムの除去及び衛生化のため処置;
環境及び食品部門において、細菌のバイオフィルムが存在する衛生化コンテナー、容器及び含有タンクのための処置
において、有利に使用することができる。
【００９８】
それ故、本発明の対象の事物は、薬物療法として使用するための本発明の細菌株及びそれらの薬学的組成物に更に関する。
【００９９】
本発明の対象の事物は、薬物、抗生物質、消毒剤及び抗微生物活性を付与された他の全ての物理的及び化学的薬剤に対する微生物のより大きい耐性の原因としてバイオフィルムの関与がある、健康に関係する及び健康に関係しない状態の処置;特に非限定的例として上に記載されているが、これらに限定されない健康に関係する及び健康に関係しない状態の処置における薬物療法として使用するための本発明の細菌株及びそれらの薬学的組成物に更に関する。
【０１００】
黄色ブドウ球菌によるバイオフィルム形成を阻害するそれらの能力を検証するために実施された、本発明の乳酸桿菌を用いた実験を、絶対に限定にならない例として、下で記載する。
【０１０１】
材料及び方法
乳酸桿菌株及び黄色ブドウ球菌
この実験で使用した9種類の本発明の乳酸桿菌株(本文献では、既に前に言及したようにLMC1-3-4-5-6-7-8-9-10として示す)は、Microbiology Laboratory of the IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi(ミラノ、イタリア)で、健康な対象者の糞便試料から、既知の方法を使用して単離された。乳酸桿菌及び黄色ブドウ球菌の株を、培養ブロス-ブレインハートインフュージョン培地(BHI、bioMerieux社、Marcyl'Etoile、フランス)中、37℃の好気性条件下で終夜インキュベートした。
【０１０２】
乳酸桿菌株の上清の抗バイオフィルム活性の評価(クリスタルバイオレットアッセイ)
異なった乳酸桿菌株の上清の抗バイオフィルム活性は、試験される乳酸桿菌株から得られた上清とインキュベートされたときに、バイオフィルムを産生するその能力のために選択された黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性株により産生されたバイオフィルムの実体を定量することにより評価した。黄色ブドウ球菌によりその上清中でインキュベートされて産生されるバイオフィルムの量を陰性対照として使用した。乳酸桿菌の各株を、前に記載されたようにBHI中で24時間インキュベートした。それに続いて、各培養培地を、細菌の細胞を上清から分離するために、6,000rpmで10分間遠心分離した。次に、黄色ブドウ球菌の20μLの0.5McFarland懸濁液を、新しい96ウェルマイクロプレート中で、種々の乳酸桿菌の180μLの上清中でインキュベートした。24時間後に、非付着性細菌を含有する培地を除去して180μLの新鮮な上清で置き換えた。次にプレートを48時間インキュベートした。最後に、細菌のバイオフィルムを、Christensenら(18)により記載された分光光度法によって評価した。96ウェルプレート中で培養されたバイオフィルムを風乾して、5%クリスタルバイオレット(CV)溶液中に15分間浸漬することにより染色して、その後多数回洗浄した後、再び乾燥した。3mlのエタノール(96%)でバイオフィルム-CV結合を溶出させて、その後マイクロプレート分光光度計(Multiskan (商標) FC; Thermo Scientific社;ミラノ、イタリア)によって、595nmの波長で100μLの溶出溶液の吸光度を測定することにより、バイオフィルムのバイオマスを定量した。
【０１０３】
共焦点レーザー走査顕微鏡
共焦点のレーザー走査顕微鏡を使用して、クリスタルバイオレット分析から得られたデータを確認した。乳酸桿菌上清を使用したが、その場合、黄色ブドウ球菌によりそれ自体の上清中で産生されたバイオフィルムを陰性対照として使用した。微生物のバイオフィルムを、MBEC Biofilm Inoculators(Innovotech Inc.社、Edmonton、カリフォルニア州)のプレートでメーカーの使用説明書に従ってインキュベートした。ウェルに異なった乳酸桿菌の上清又は黄色ブドウ球菌株(対照)の上清の20μLの0.5McFarland懸濁液を用意した。上清は前に記載されたように調製した。Film Tracer(商標)LIVE/DEAD(登録商標)Biofilm Viability Kit(Molecular Probes、Life Technologies Ltd.社、Paisley、英国)を使用して試料中でバイオマスを明らかにした。全ての試料を、暗所において室温で、2種類の染色STYO9及びヨウ化プロピジウム(PI)の適切な体積の混合物(1mLの食塩水溶液中に3μLの各要素)を用いて15分間染色した。これにより、生存細菌を死菌から識別することが可能になった。染色されたバイオフィルムを、共焦点顕微鏡(Leica TCS SP5; Leica Microsystems CMS GmbH社、Mannheim、ドイツ)の下で63×油浸対物レンズを使用して検査した。488nmのレーザーを使用してSYTO9染色を励起しながら、蛍光発光を500nmと540nmの間で読み取った。PI染色を561nmのレーザーで励起して、その蛍光発光を600nmと695nmの間で読んだ。2チャンネルの同時取得を実施して、細菌の運動に起因する蛍光のスポット間の不正確な共位置測定を最小化した。各試料について、2μmの一連の光学区域を取得して、次にバイオフィルムの完全な厚さを得るためにz軸上で合わせて連続させて配置した。
【０１０４】
結果
乳酸桿菌株の上清の抗バイオフィルム活性の評価
測定は、種々の乳酸桿菌株の上清とインキュベートされたときに、バイオフィルムを産生するその能力(前に記載された)のために選択された、黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性株により産生されたバイオフィルムの量で行なった。得られたデータ(添付のTable 1(表1)に示した)は、本発明の乳酸桿菌株の大部分の、黄色ブドウ球菌によるバイオフィルムの産生を大きく阻害する(>50%の阻害)能力を示した。特に、LMC1、4、6、7及び8の上清と黄色ブドウ球菌が、それぞれインキュベートされた場合に、産生されたバイオフィルムの量は、大きく減少することが証明された。株LMC1、4、6、7及び8は、黄色ブドウ球菌によるバイオフィルムの産生を阻害する活性が最良の株であることを示した。
【０１０５】
共焦点レーザー走査顕微鏡
黄色ブドウ球菌によるバイオフィルムの産生に対する抗バイオフィルム活性が最良の株LMC8(Table 1(表1)を参照されたい)を、好ましい例として選択した。図1は、対照試料の3D再構成を表し、それに対して図2は、前記バイオフィルムの断面図を表す。図1及び図2は、対照試料で産生されたバイオフィルム(即ち、黄色ブドウ球菌の上清中で産生された黄色ブドウ球菌のバイオフィルム)を示す。黄色ブドウ球菌により産生されたバイオフィルムは、生存細胞(緑色)及び死んだ細胞(赤色)で構成されている。他方、図3は、黄色ブドウ球菌がLMC8の上清とインキュベートされたときに産生されたバイオフィルムを表す。図3を図1及び図2と比較すると、黄色ブドウ球菌によるバイオフィルムの産生は、株がLMC8の上清中でインキュベートされたときに、かなり減弱したことが明確に観察され得る。これらのデータは、クリスタルバイオレットアッセイから前に得られた結果を確認する。実質的に同じ方法及び前に記載された量と類似の量を採用した同じタイプの実験を、必要な変更を加えて、本発明の乳酸桿菌、特にLMC8株及びLMC1、LMC4、LMC6、LMC7株及びそれらの混合物を使用して、健康に有害な他の細菌株(例えばカンジダ、大腸菌、クレブシエラ、プロテウス・ミラビリス、プロピオニバクテリウム・アクネス)によるバイオフィルム形成に対して実施した。得られた結果は、先行する実験の部で黄色ブドウ球菌について記載された結果と一致することを示した。
【０１０６】
工業的適用の可能性
本発明の乳酸桿菌及びそれらの薬学的組成物は、細菌バイオフィルムに対する、細菌バイオフィルム自体の形成及び増殖を防止及び阻害するそれらの能力のおかげで、抗バイオフィルム活性を付与された薬剤として優れていることを示した。それ故、本発明の細菌株及びそれらの薬学的組成物は、薬物、抗生物質、消毒剤及び抗微生物活性を付与された他の全ての物理的及び化学的薬剤に対する微生物のより大きい耐性の原因として細菌バイオフィルムの関与がある全ての健康に関係する及び健康に関係しない状態で、有利に使用することができる。
【０１０７】
本発明の細菌株LMC-1DSM32252、LMC-3DSM32253、LMC-4DSM32254、LMC-5DSM32255、LMC-6DSM32256、LMC-7DSM32257、LMC-8DSM32258、LMC-9DSM32259、LMC-10DSM32260を、表現形の特徴付け(API 50CHL)及び種特異的PCRを用いた分子的同定により分類した。
【０１０８】
表現形による特徴付け:
API 50CHLギャラリー(bioMerieux社コード50300)により、微生物における炭水化物代謝の研究が可能である。
【０１０９】
それは、50本のマイクロチューブからなり、その最初のものは、活性成分を含まず、陰性対照(ブランク)を構成する。それに続くマイクロチューブは、各々、炭水化物のファミリー及び誘導体(配糖体、ポリオール、ウロン酸)に属する脱水された基質の明確に定義された量を含有する。
【０１１０】
これらの基質は代謝可能で、色の変化:嫌気性下で培地のpH指示薬(ブロモクレゾール紫)により明らかになった酸産生に基づいて、紫/すみれ色から緑色の種々の色調を経て黄色への変化を生ずる。
【０１１１】
手順;
培養培地を排除するために、試料を5分間10000rspmで遠心分離して、2mlの滅菌蒸留水に再懸濁した。接種物を、5mlの滅菌蒸留水中で、McFarlandスケール(bioMerieux社)で等量から2倍の量の試料を用いて調製した。この懸濁液をAPI 50CHL培地のアンプルで接種して、直ちにギャラリーに分注した。試料の嫌気性を確保するために、2滴のパラフィン(bioMerieux社)を各ドームに導入して、温度制御されたオーブン中において37℃でインキュベートした。
【０１１２】
ギャラリーの読みは、異なったインキュベーション時間、24及び48時間に行なった。
【０１１３】
種々の株の表現形の分類は、APIWEB Plusソフトウェアを使用して得た;プログラムが応答を計算して、タイプ指数(T)及び同定百分率(%id)を、分析の品質に関するコメントを加えて(Table 15(表19)における結果)帰属させた。
【０１１４】
炭水化物の使用は、ギャラリーの色における変化で現された。反応は、鮮明な緑色又は黄色が発色すれば陽性であり、暗緑色又は紫が発色すれば陰性である。ギャラリーの色の確認は、ブランクを表すギャラリーのn°.0と比較することにより容易になる。
【０１１５】
種特異的PCRによる分子的同定:
細菌の染色体内に16s及び23srRNAと呼ばれる遺伝子があり、これらがリボソームを生じさせる。この部分は可変領域を有する(同じ種の細菌で同じ配列を有する)。
【０１１６】
rRNAの可変領域に属する配列の特異性を探求することにより、それらの間に含まれる部分の増幅を生じさせる種特異的プライマーをデザインすることが可能である。
【０１１７】
熱増幅サイクル中に、プライマーは、テンプレートがそのためにデザインされた種に属しさえすれば、DNAをアニールして、増幅生成物として、寸法が染色体のDNAに沿ったオリゴヌクレオチドの部分に依存するフラグメントを、生ずることができて、それはプライマーよりはるかに長いであろう。
【０１１８】
手順:
試料は、MET_INT049、最新版に従って処理した。
【０１１９】
分類のために使用したプライマーの対を、Table 14(表18)に示す。
【０１２０】
【表１８】
2019524159.tif 000028
【０１２１】
細胞の溶解
各株の1mlの培養ブロスを、5分間10000rpmで遠心分離して、次に、細胞を1mlの滅菌水に再懸濁し、2μlの洗浄された細胞を18μlのMicro Lysis Buffer (Labogen社)に加えて、このように調製されたマイクロチューブをサーモサイクラーに負荷して特異的細胞溶解サイクルにかけた。
【０１２２】
溶解された材料を、そのままで、その後のDNA増幅等のために使用した。
【０１２３】
熱サイクルされるべき各試料について、PCR反応を、滅菌試験管に、12.5μlのPCR Master Mix(Promega社のコードM7502)、十分量の滅菌水、プライマー1(100μM、0.3μl)及びプライマー2(100μM、0.3μl)及び1μlのDNAをこの順で加えて、25μLの合計体積で準備した。
【０１２４】
各PCR反応のために、以下のものを導入した。国際コレクションからの及び分析を計画している試料と同じ細菌種に属する参照株のDNAからなる陽性対照、国際コレクションからの及び分析を計画している試料と異なる細菌種に属する参照株のDNAからなる陰性対照、及び任意の汚染について確認するための反応バッファーのみからなるブランク。
【０１２５】
試料及びTable 1(表1)に特定したそれぞれのアニーリング温度(Ta)に応じて、試料を、乳酸桿菌のための熱サイクル(MET-INT049、最新版)にかけた。
【０１２６】
得られた増幅物を、臭化エチジウム(5μl/10ml)で補完された1×TAEバッファー中で、1%アガロースゲルにおける電気泳動にかけた(30分、80V)。
【０１２７】
PCR50〜2000bpマーカー(SIGMA社のコードP9577)を使用して、増幅されたフラグメントのサイズを推定した。
【０１２８】
電気泳動作動の終了時に、トランスイルミネーター(ゲル-Doc、BIO-RAD社)を使用して、紫外線の下でアガロースゲルを検分した。結果をTable 15(表19)に示す。
【０１２９】
結果:
【０１３０】
【表１９】
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【０１３１】
(参考文献)
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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