(57)【要約】本開示は、オキシム含有リンケージを介して水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコールポリマーに共有結合した第ＶＩＩＩ因子部分を含むコンジュゲートを提供する。中でも、対象コンジュゲートの調製に有用な水溶性ポリマーオキシアミン試薬のような、そのようなコンジュゲートの調製方法及び投与方法も提供する。本開示は、一般に、第ＶＩＩＩ因子部分と水溶性ポリマーとの間のリンケージがオキシム（〜ＣＨ＝Ｎ−Ｏ〜）を含む、水溶性ポリマー及び第ＶＩＩＩ因子部分のコンジュゲートに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オキシム含有リンケージを介して第ＶＩＩＩ因子部分の酸化された炭水化物に共有結合した水溶性ポリマーを含むコンジュゲート。
【請求項２】
構造ＰＯＬＹ−Ｘ−Ｏ−Ｎ＝ＣＨ−ＦＶＩＩＩを有し、式中、ＰＯＬＹは水溶性ポリマーであり、Ｘは１つ以上の原子を含む任意のスペーサーであり、ＦＶＩＩＩは第ＶＩＩＩ因子部分であり、〜ＣＨ−ＦＶＩＩＩは、前記第ＶＩＩＩ因子部分の酸化炭水化物のカルボニル基の残基である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
Ｘが加水分解に安定である、請求項２のコンジュゲート。
【請求項４】
Ｘが、Ｏ、Ｓ及びＮＨから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む、請求項２又は３に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
Ｘが、約５個の原子〜約２５個の原子の原子長を有する、請求項２〜４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記水溶性ポリマーが、ポリ（アルキレンオキシド）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記水溶性ポリマーが、２，０００ダルトン〜８５，０００ダルトンの重量平均分子量を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
構造：
ＣＨ３Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ’−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ＝ＣＨ−（ＦＶＩＩＩ）
を有し、式中、（ｍ’）は、０〜約４，０００の範囲であり、ＦＶＩＩＩは、第ＶＩＩＩ因子部分であり、〜ＣＨ−（ＦＶＩＩＩ）は、前記第ＶＩＩＩ因子部分の酸化炭水化物のカルボニル基の残基である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
【化１】
2019532019.tif 000029
から選択される構造を有し、
式中、上記の分枝状構造の各々に関する（ｍ’）又は（ｎ）は、独立して、約１〜約４，０００の範囲である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
（ｍ’）又は（ｎ）が約２２７である、請求項９に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
前記第ＶＩＩＩ因子部分が、ヒト組換えＢドメイン削除第ＶＩＩＩ因子である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
前記第ＶＩＩＩ因子部分が、ヒト組換え完全長第ＶＩＩＩ因子である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む組成物。
【請求項１４】
血友病Ａの処置のための、請求項１３に記載の組成物を患者に投与することを含む方法。
【請求項１５】
以下の構造：
【化２】
2019532019.tif 000030
（式中、Ｘは、１つ以上の原子を含むスペーサーであり、各（ｎ）は、約１〜約４，０００の範囲である。）を有する高分子オキシアミン試薬。
【請求項１６】
Ｘが、−ＮＨ（ＣＨ２）１〜６−であり又はこれを含む、請求項１５に記載の高分子オキシアミン試薬。
【請求項１７】
Ｘが、−ＮＨ（ＣＨ２）２−であり又はこれを含む、請求項１６に記載の高分子オキシアミン試薬。
【請求項１８】
Ｘが、−ＮＨ（ＣＨ２）１〜６ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２−である、請求項１５に記載の高分子オキシアミン試薬。
【請求項１９】
Ｘが、−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２−である、請求項１８に記載の高分子オキシアミン試薬。
【請求項２０】
血友病Ａ等の血液疾患の処置に使用するための請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１６年７月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／３６５，８３６号に対する優先権による利益を主張する。
【０００２】
本開示は、一般に、第ＶＩＩＩ因子部分と水溶性ポリマーとの間のリンケージがオキシム（〜ＣＨ＝Ｎ−Ｏ〜）を含む、水溶性ポリマー及び第ＶＩＩＩ因子部分のコンジュゲートに関する。より詳細には、ポリエチレングリコール等の水溶性ポリマーがオキシムリンケージを介して第ＶＩＩＩ因子分子の酸化された炭水化物部分に共有結合している。加えて、中でも、コンジュゲートの合成方法、コンジュゲートの精製方法、及び新しいポリマー−オキシアミン試薬等が本明細書に提供される。
【背景技術】
【０００３】
科学者及び臨床医は、活性薬剤を患者への送達に適した形態に発展させるための試みにおいて、多くの困難に直面している。例えば、ポリペプチドである活性薬剤は、多くの場合、経口的ではなく注射を介して送達される。この方法では、ポリペプチドは胃のタンパク質分解環境に暴露されることなく体循環に導入される。しかしながら、ポリペプチドの注射は、いくつかの欠点を有する。例えば、多くのポリペプチドは比較的短い半減期を有するため、注射の反復を必要とし、これは多くの場合不便であり、痛みを伴う。更に、いくつかのポリペプチドは、１つ以上の免疫応答を誘発する場合があり、その結果、患者の免疫系は免疫原性ポリペプチドを破壊するか又は中和することを試みることとなる。勿論、ポリペプチドが一旦破壊されるか又は中和されると、ポリペプチドはその意図された薬力学的活性を発揮することができない。それ故、ポリペプチド等の活性薬剤の送達は、これらの薬剤が注射によって投与される場合であっても問題を含むことが多い。
【０００４】
注射を介して活性薬剤を送達することの問題は、いくつかが対処に成功している。タンパク質の半減期を延長するために複数の技術が用いられおり、該技術には、アルブミン（Ｓｃｈｕｌｔｅ，Ｓ．（２０１１），Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２８  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ９−１２）又は抗体のＦｃ部分（Ｓｃｈｕｌｔｅ，Ｓ．（２０１１），Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２８  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ９−１２；Ｐｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１２），Ｂｌｏｏｄ  １１９，３０３１−３０３７）の遺伝子融合、リポソームとの非共有会合（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ６，２７７−２８３）、並びにポリエチレングリコール（Ｔｕｒｅｃｅｋ，Ｐ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｍｏｓｔａｓｅｏｌｏｇｉｅ  ３２  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ２９−３８；Ｔｕｒｅｃｅｋ，Ｐ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１６），Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０５，４６０−４７５）、シアル酸（Ｂａｄｅｒ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗａｒｄｗｅｌｌ，Ｐ．Ｒ．（２０１４）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ５，２３５−２３７）、デキストラン（Ｃａｌｉｃｅｔｉ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １４，８９９−９０８）及びヒドロキシエチル澱粉（Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３７，１７２３−１７２６）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２５，３２５９−３２６６）等の水溶性ポリマーに対するコンジュゲーションが挙げられる。例えば、水溶性ポリマーに対する活性薬剤のコンジュゲーションは、免疫原性及び抗原性が低下されたポリマー−活性薬剤コンジュゲートをもたらした。加えて、これらのポリマー−活性薬剤コンジュゲートは、多くの場合、腎臓を通したクリアランスの低下、及び／又は体循環における酵素的分解の低下に起因して、それらの非コンジュゲート化対応物と比較して非常に長い半減期を有する。長い半減期を有する結果として、ポリマー−活性薬剤コンジュゲートは少ない投与頻度を必要とし、ひいては痛みを伴う注射及び不便な医療専門家への訪問の全体的な回数を減少させる。更に、僅かにのみ可溶性の活性薬剤は、水溶性ポリマーにコンジュゲート化された場合、水溶性がかなり増大する可能性がある。
【０００５】
ポリエチレングリコールは、その実証された安全性と、局所及び内服の両方に関するＦＤＡによる認可に起因して、活性薬剤にコンジュゲート化されている。活性薬剤がポリエチレングリコール、即ち「ＰＥＧ」のポリマーにコンジュゲート化された場合、コンジュゲート化活性薬剤は、通常「ＰＥＧ化されている」と称される。ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）ＰＥＧ化インターフェロンα−２ａ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）ＰＥＧ化インターフェロンα−２ｂ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｋｅｎｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ）、及びＮＥＵＬＡＳＴＡ（商標）ＰＥＧ−フィルグラスチム（Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）等のＰＥＧ化巨大分子の商業的成功により、活性薬剤のコンジュゲート化形態の投与は、非コンジュゲート化対応物を超えるかなりの利点を有し得ることが示されている。ＭＯＶＡＮＡＴＩＫ（商標）（ナロキセゴール）（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＬＰ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）等のＰＥＧ化小分子も商業的に成功している。Ｈａｒｒｉｓらは、医薬品に関するＰＥＧ化の効果のいくつかの概説を提供している。Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２（３）：２１４−２２１。
【０００６】
これらの成功にも関わらず、ポリマーを活性薬剤にコンジュゲートして商業的に適切な薬物をもたらすことは、多くの場合困難である。例えば、コンジュゲーションは、薬理的活性に必要な活性薬剤上の部位に又はその付近に（例えば、結合部位に又はその付近に）結合したポリマーをもたらし得る。例えば、アミノ酸バックボーンのリシンにおけるランダムコンジュゲーションは、生物学的活性を有意に喪失させ得る。そのような場合、対応する長期の循環時間は、活性の喪失を補うのに十分であり又は十分ではない可能性がある。加えて、半減期の増大を有するコンジュゲートは、組み合わされた更に長い半減期によって、又は延長された半減期と治療的活性との有益な組み合わせによって、更に改善される可能性がある。
出血性疾患の分野では、タンパク質（例えば、第ＶＩＩＩ因子等の）が患者に投与されて、出血性疾患に対処し又は出血性疾患を寛解し得る。（中でも）非コンジュゲート化対応物と比較して長い半減期の利点を有する、第ＶＩＩＩ因子のＰＥＧ化のための様々な手法が記載されている。第ＶＩＩＩ因子のコンジュゲーションは、成功してはいるが、（例えば）第ＶＩＩＩ因子の更なるコンジュゲートを提供することによって、以前の成功が改善される可能性があり得る。従って、本開示は、この必要性及び他の必要性の解決を模索する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｃｈｕｌｔｅ，Ｓ．（２０１１），Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２８  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ９−１２
【非特許文献２】Ｐｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１２），Ｂｌｏｏｄ  １１９，３０３１−３０３７
【非特許文献３】Ｐｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ６，２７７−２８３
【非特許文献４】Ｔｕｒｅｃｅｋ，Ｐ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｍｏｓｔａｓｅｏｌｏｇｉｅ  ３２  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ２９−３８
【非特許文献５】Ｔｕｒｅｃｅｋ，Ｐ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１６），Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０５，４６０−４７５
【非特許文献６】Ｂａｄｅｒ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗａｒｄｗｅｌｌ，Ｐ．Ｒ．（２０１４）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ５，２３５−２３７
【非特許文献７】Ｃａｌｉｃｅｔｉ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １４，８９９−９０８
【非特許文献８】Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３７，１７２３−１７２６
【非特許文献９】Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２５，３２５９−３２６６
【非特許文献１０】Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２（３）：２１４−２２１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１つ以上の態様において、オキシム含有リンケージを介して水溶性ポリマーに共有結合した第ＶＩＩＩ因子部分を含むコンジュゲートを提供する。より詳細には、第ＶＩＩＩ因子部分の１つ以上の酸化された炭水化物に共有結合した１つ以上の水溶性ポリマーを含むコンジュゲートを本明細書に提供する。
【０００９】
例えば、いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、構造ＰＯＬＹ−Ｘ−Ｏ−Ｎ＝ＣＨ−ＦＶＩＩＩを有し、式中、ＰＯＬＹは水溶性ポリマーであり、Ｘは１つ以上の原子を含む任意のスペーサーであり、ＦＶＩＩＩは第ＶＩＩＩ因子部分であり、〜ＣＨ−ＦＶＩＩＩは、第ＶＩＩＩ因子部分の酸化炭水化物のカルボニル基の残基である。
【００１０】
スペーサーに関わらず、いくつかの実施形態では、スペーサーＸは加水分解に安定である。上記に関連するいくつかの更なる実施形態では、ＸはＯ、Ｓ及びＮＨから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む。前述の各々及び全てに関するいくつかの尚更なる関連実施形態では、Ｘは約５個の原子〜約２５個の原子の原子長を有する。
【００１１】
本明細書に提供するコンジュゲートのいくつかの好ましい実施形態では、水溶性ポリマーはポリ（アルキレンオキシド）である。
【００１２】
水溶性ポリマーに関する更なる別の実施形態では、水溶性ポリマーは、２，０００ダルトン〜８５，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。
【００１３】
いくつかの特定の実施形態では、コンジュゲートは、構造：
ＣＨ３Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ’−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ＝ＣＨ−（ＦＶＩＩＩ）
を有し、式中、（ｍ’）は、０〜約４，０００の範囲であり、ＦＶＩＩＩは、第ＶＩＩＩ因子部分であり、〜ＣＨ−（ＦＶＩＩＩ）は、第ＶＩＩＩ因子部分の酸化炭水化物のカルボニル基の残基である。
【００１４】
１つ以上の尚更なる実施形態において、水溶性ポリマーは分枝状である。１つ以上の関連実施形態において、コンジュゲートは、
【化１】
2019532019.tif 000002
から選択される構造を有し、式中、上記の分枝状構造の各々に関する（ｍ’）又は（ｎ）は、独立して約１〜約４，０００の範囲であり、Ｘは、実例的な実施形態の任意の１つ以上において前述した通りである。前述の分枝状構造に関するいくつかの実施形態において、（ｍ’）又は（ｎ）の各々は、約２２７である。
【００１５】
本明細書に提供する各々及び全部の実施形態における実例的な第ＶＩＩＩ因子部分は、中でも、例えばヒト組換えＢドメイン削除第ＶＩＩＩ因子、及びヒト組換え完全長第ＶＩＩＩ因子を含む。
【００１６】
例示的な実施形態の任意の１つ以上によるオキシム含有リンケージを介して水溶性ポリマーに共有結合した第ＶＩＩＩ因子部分と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む組成物も提供する。
【００１７】
更なる別の態様では、例えば血友病Ａ等の血液疾患の処置のための、上述した組成物を患者に投与することを含む方法を本明細書に提供する。
【００１８】
更なる別の態様では、以下の構造：
【化２】
2019532019.tif 000003
を有する高分子オキシアミン試薬を提供し、式中、Ｘは１つ以上の原子を含むスペーサーであり、各（ｎ）は、約１〜約４，０００の範囲である。
【００１９】
オキシアミン試薬（又は対応するコンジュゲート）に関するいくつかの実施形態では、Ｘは、−ＮＨ（ＣＨ２）１〜６−であり又はこれを含む。いくつかの特定の実施形態では、Ｘは、−ＮＨ（ＣＨ２）２−であり又はこれを含む。いくつかの尚更なる実施形態では、Ｘは、−ＮＨ（ＣＨ２）１〜６ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２−である。いくつかの特定の実施形態では、Ｘは、−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２−である。
【００２０】
１つ以上の更なる態様では、そのようなコンジュゲートの調製方法を提供する。
【００２１】
１つ以上の関連実施形態では、コンジュゲートを含む医薬製剤を提供する。
【００２２】
本明細書に提供する更なる別の１つ以上の追加の態様では、オキシム反応性基を有する水溶性ポリマー、又は第ＶＩＩＩ因子部分との反応後にオキシム含有リンケージを形成することが可能な反応性官能基を有する反応性水溶性ポリマーの調製方法を提供する。
【００２３】
尚更なる態様では、コンジュゲートの投与方法を提供する。
【００２４】
追加の態様及び実施形態は、以下の記載及び特許請求の範囲に示される。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本開示の特定の特徴を記載及び特許請求するにおいて、以下の用語は、特に示さない限り、下記に記載される定義に従って使用される。
【００２６】
本開示は、特定のポリマー、合成技術、活性薬剤等に限定されず、これは、それらが変動する場合があるためである。
【００２７】
本明細書中で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が特に明白に示さない限り複数の参照を含む。従って、例えば「ポリマー」に対する参照は、単一のポリマー及び２つ以上の同じ又は異なるポリマーを含み、「コンジュゲート」に対する参照は、単一のコンジュゲート及び２つ以上の同じ又は異なるコンジュゲートを含み、「賦形剤」に対する参照は、単一の賦形剤及び２つ以上の同じ又は異なる賦形剤を含む等である。
【００２８】
本明細書で使用される「ＰＥＧ」、「ポリエチレングリコール」及び「ポリ（エチレングリコール）」は、任意の水溶性ポリ（エチレンオキシド）を包含することが意図される。典型的には、本発明による使用のためのＰＥＧｓは、以下の構造「−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−」を含み、式中、（ｍ）は２〜４０００である。本明細書中で使用されるとき、ＰＥＧは、例えば合成形質転換中に末端酸素が除去されているか又はいないかに応じて、「−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−」及び「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−」も含む。ＰＥＧが更にスペーサー部分（下記により詳細に記載される）を含む場合、スペーサー部分を構成する原子は、水溶性ポリマーセグメントに共有結合した際、酸素−酸素結合（即ち、「−Ｏ−Ｏ−」、即ちペルオキシドリンケージ）の形成をもたらさない。明細書及び特許請求の範囲全体において、用語「ＰＥＧ」は、様々な末端又は「末端キャッピング」基等を有する構造を含むことを思い起こすべきである。用語「ＰＥＧ」はまた、大部分、即ち５０％を超える−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−モノマーサブユニットを含むポリマーも意味する。一般に、実質的に全部（及び好ましくは全部）のモノマーサブユニットは、エチレンオキシドサブユニットであるが、ポリエチレングリコールポリマーは、例えばコンジュゲーションのために、異なる末端キャッピング部分又は官能基を含んでもよい。特定の形態に関しては、ＰＥＧは、任意の数の様々な分子量、及び「分枝状」、「線状」、「分岐状」、「多官能性」等の構造又は形状（下記により詳細に記載される）をとることができる。
【００２９】
用語「末端（ｅｎｄ）キャッピングされた」又は「末端（ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ）キャッピングされた」は、本明細書で交換可能に使用されて、末端キャッピング部分を有するポリマーの末端又は終点を指す。典型的には、必ずではないが、末端キャッピング部分はヒドロキシ又はＣ１〜２０アルコキシ基を含む。従って、末端キャッピング部分の例としては、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ）及びベンジルオキシが挙げられる。追加の末端キャッピング部分としては、アリール、ヘテロアリール、シクロ、ヘテロシクロ等が挙げられる。前述の各々の飽和、不飽和、置換及び非置換形態が想定される。
【００３０】
末端キャッピング基はシランであってもよい。末端キャッピング基はまた、有利には、検出可能な標識を含むことができる。ポリマーが検出可能な標識を含む末端キャッピング基を有する場合、ポリマー及び／又はポリマーが連結した関心対象の部分（例えば、活性薬剤）の量又は位置を、好適な検出器を使用することにより決定することができる。そのような標識としては、非限定的に、蛍光発光体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、化学発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、酵素標識化に使用される部分、発色（例えば染料）、金属イオン、放射性部分等が挙げられる。好適な検出器としては、光度計、フィルム、分光計等が挙げられる。
【００３１】
ポリマー又は水溶性ポリマーに関連した「天然に存在しない」は、その全体としてのポリマーが天然に見出されないポリマーを意味する。しかしながら、天然に存在しないポリマー又は水溶性ポリマーは、そのポリマー構造全体が天然に見出されない限り、天然に存在する１つ以上のサブユニット又はサブユニットの部分を含むことができる。
【００３２】
用語「水溶性ポリマー」は、室温で水に可溶性の任意のポリマーである。典型的には、水溶性ポリマーは、濾過後の同じ溶液により透過される光の少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９５％を透過させるであろう。重量ベースで、水溶性ポリマーは、好ましくは水に少なくとも約３５％（重量による）可溶性であり、より好ましくは水に少なくとも約５０％（重量による）可溶性であり、尚より好ましくは水に約７０％（重量による）可溶性であり、尚より好ましくは水に約８５％（重量による）可溶性であろう。しかしながら、尚より好ましくは、水溶性ポリマーは水に約９５％（重量による）可溶性であり、最も好ましくは、水溶性ポリマーは水に完全に可溶性である。
【００３３】
ＰＥＧ等の本発明の水溶性ポリマーの文脈における分子量は、数平均分子量又は重量平均分子量のいずれかとして表すことができる。特に示さない限り、本明細書の分子量に対する全ての参照は、重量平均分子量を指す。数平均及び重量平均分子量の両方の決定は、ゲル浸透クロマトグラフィー又は他の液体クロマトグラフィー技術を用いて測定することができる。分子量値を測定するための他の方法、例えば数平均分子量を決定するための末端基分析若しくは束一的特性（例えば、氷点低下、沸点上昇、又は浸透圧）の測定の使用、又は重量平均分子量を決定するための光散乱技術、超遠心分離法若しくは粘度測定法の使用等も用いることができる。本明細書に記載されるポリマーは、典型的には多分散系であり（即ち、ポリマーの数平均分子量及び重量平均分子量は等しくない）、好ましくは約１．２未満、より好ましくは約１．１５未満、尚より好ましくは約１．１０未満、尚更により好ましくは約１．０５未満、最も好ましくは約１．０３未満の低いポリマー分散度を有する。
【００３４】
用語「スペーサー」又は「スペーサー部分」は、本明細書では、任意選択的に一部分と他の部分との間に出現する原子又は原子の集合を指すように使用される。
【００３５】
本明細書で使用される「有機基」は、例えば、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール及び置換アリールを含む。
【００３６】
「アルキル」は、典型的には約１〜２０個の原子長の範囲の炭化水素鎖を指す。そのような炭化水素鎖は、分枝状又は直鎖であってもよいが、一般に直鎖が好ましい。例示的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、３−メチルペンチル等が挙げられる。本明細書中で使用される「アルキル」は、低級アルキルを含む。
【００３７】
「低級アルキル」は、メチル、エチル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、及びｔｅｒｔ−ブチルにより例示されるような、１〜６個の炭素原子を含み、直鎖又は分枝状であり得るアルキル基を指す。
【００３８】
「シクロアルキル」は、好ましくは３〜約１２個の炭素原子、より好ましくは３〜約８個の炭素原子から構成される架橋、縮合、又はスピロ環式化合物を含む飽和環式炭化水素鎖を指す。
【００３９】
「非干渉置換基」は、分子中に存在する場合、一般に、分子中に含まれる他の官能基と非反応性である基である。
【００４０】
例えば「置換アルキル」におけるような用語「置換」は、１つ以上の水素原子が、限定するものではないが：Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、例えばシクロプロピル、シクロブチル等；ハロ、例えばフルオロ、クロロ、ブロモ及びヨード；シアノ；アルコキシ、低級フェニル；置換フェニル；等の１つ以上の非干渉置換基で置換された部分（例えば、アルキル基）を指す。「置換アリール」は、置換基としての１つ以上の非干渉基を有するアリールである。フェニル環上の置換の場合、置換基は、任意の配向（即ち、オルト、メタ又はパラ）にあり得る。「置換アンモニウム」は、置換基としての１つ以上の非干渉基（例えば、有機基）を有するアンモニウムである。
【００４１】
「アルコキシ」は、−Ｏ−Ｒ基を指し、式中、Ｒは、アルキル又は置換アルキル、好ましくはＣ１〜Ｃ２０アルキル（例えば、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ベンジル等）、より好ましくはＣ１〜Ｃ７アルキルである。
【００４２】
本明細書で使用される「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含む、２〜１５個の原子長の分枝状又は非分枝状の炭化水素基を指す。例示的なアルケニルとしては、（非限定的に）エテニル、ｎ−プロペニル、イソプロペニル、ｎ−ブテニル、イソブテニル、オクテニル、デセニル、テトラデセニル等が挙げられる。
【００４３】
本明細書で使用される用語「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を含む、２〜１５個の原子長の分枝状又は非分枝状の炭化水素基を指す。例示的なアルキニルとしては、（非限定的に）エチニル、ｎ−ブチニル、イソ−ペンチニル、オクチニル、デシニル等が挙げられる。
【００４４】
「アリール」は、各々５又は６個のコア炭素原子の１つ以上の芳香族環を意味する。アリールは、ナフチルにおけるような縮合、又はビフェニルにおけるような非縮合の、複数のアリール環を含む。アリール環はまた、１つ以上の環式炭化水素、ヘテロアリール、又は複素環式環と縮合されていても又は縮合されていなくてもよい。本明細書で使用される「アリール」は、ヘテロアリールを含む。芳香族含有部分（例えば、Ａｒ１、Ａｒ２等）は、アリールを含む構造を意味する。
【００４５】
「ヘテロアリール」は、１〜４個のヘテロ原子、好ましくはＮ、Ｏ、又はＳ、又はそれらの組み合わせを含むアリール基である。ヘテロアリール環はまた、１つ以上の環式炭化水素、複素環式、アリール、又はヘテロアリール環と縮合してもよい。
【００４６】
「複素環」又は「複素環式」は、不飽和又は芳香族特性を有する又は有さない、かつ炭素ではない少なくとも１つの環原子を有する、５〜１２個の原子、好ましくは５〜７個の原子の１つ以上の環を意味する。好ましいヘテロ原子としては、硫黄、酸素、及び窒素が挙げられる。
【００４７】
「置換ヘテロアリール」は、置換基としての１つ以上の非干渉基を有するヘテロアリールである。
【００４８】
「置換複素環」は、非干渉置換基から形成される１つ以上の側鎖を有する複素環である。
【００４９】
「求電子試薬」は、求核試薬と反応することが可能な求電子中心、即ち求電子性の中心を有する、イオン、又はイオン性であり得る原子若しくは原子の集合を指す。
【００５０】
「求核試薬」は、求核中心、即ち求核性の中心を有する、又は求電子試薬を伴う、イオン、又はイオン性であり得る原子若しくは原子の集合を指す。
【００５１】
「加水分解に安定な」リンケージ又は結合は、水中で実質的に安定な、即ち生理学的条件下で長期間に亘って任意の認識できる程度まで加水分解を受けない化学結合、典型的には共有結合を指す。加水分解に安定なリンケージの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：炭素−炭素結合（例えば、脂肪族鎖における）、エーテル、アミド等。一般に、加水分解に安定なリンケージは、生理学的条件下で１日当たり約１〜２％未満の加水分解率を示すものである。代表的な化学結合の加水分解率は、殆どの標準的な化学教科書に見出すことができる。いくつかのリンケージは、（例えば）隣接及び近接する原子と周囲条件とに応じて、加水分解に安定又は加水分解性であり得ることを指摘する必要がある。当業者は、例えば、関心対象のリンケージ含有分子を関心対象の条件下に置き、加水分解の証拠（例えば、単一の分子の切断により生じる２つの分子の存在及び量）を試験することによって、所定のリンケージ又は結合が所定の状況下で加水分解に安定又は加水分解性であるか否かを決定することができる。所定のリンケージ又は結合が加水分解に安定又は加水分解性であるか否かを決定するための当業者に既知の他の手法も使用することができる。
【００５２】
用語「活性薬剤」、「生物学的に活性な薬剤」及び「薬理学的に活性な薬剤」は、本明細書で交換可能に使用され、インビボ又はインビトロで証明され得るいくつかの薬理的な、多くの場合有益な、効果を提供する任意の薬剤、薬物、化合物、物質の組成物又は混合物を含むと定義される。これは、サプリメント、栄養剤、栄養医薬品（ｎｕｔｒｉｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、薬物、タンパク質、ワクチン、抗体、ビタミン、及び他の有益な薬剤を含む。本明細書中で使用されるこれらの用語は、更に、患者において局所又は全身効果を生じる任意の生理学的又は薬理学的に活性な物質を含む。好ましい生物学的に活性な薬剤は、第ＶＩＩＩ因子部分である。
【００５３】
「薬学的に許容され得る賦形剤」又は「薬学的に許容され得る担体」は、本発明の組成物に含ませることができ、患者に有意な有害な毒性効果を生じない賦形剤を指す。
【００５４】
「薬理学的に有効な量」、「生理学的に有効な量」、及び「治療的有効量」は、本明細書で交換可能に使用されて、所望のレベルの活性薬剤及び／又はコンジュゲートを血流中又は標的組織中に提供するのに必要なポリマー−活性薬剤コンジュゲート（典型的には医薬製剤中に存在する）の量を意味する。正確な量は、例えば医薬製剤の特定の活性薬剤、成分及び物理的特性、意図する患者集団、患者の考慮事項等、多数の因子に依存し、本明細書に提供する情報及び関連した文献にて入手可能な情報に基づいて当業者により容易に決定され得る。
【００５５】
本明細書に記載される特定の化合物は、特定の幾何異性体又は立体異性体型で存在することができる。本開示は、適用可能な場合、本開示の範囲内に含まれるシス−及びトランス−異性体、Ｒ−及びＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、それらのラセミ混合物及び他の混合物を含む、そのような化合物の全てを考慮する。
【００５６】
加えて、特定の化合物、ポリマー、コンジュゲート等は、塩基性官能基を含むことができ、従って薬学的に許容され得る酸と共に薬学的に許容され得る塩を形成することができる。これに関連して、用語「薬学的に許容され得る塩」は、比較的無毒の本発明の化合物の無機及び有機酸付加塩を指す。これらの塩は、投与ビヒクル若しくは剤形製造プロセスにおいてその場で、又は遊離塩基形態の化合物を好適な有機若しくは無機酸と別々に反応させ、そのように形成された塩を続く精製中に単離することにより調製することができる。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、及びラウリルスルホン酸塩等が挙げられる。（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９参照）。
【００５７】
薬学的に許容され得る塩は、例えば無毒有機又は無機酸から誘導される、化合物の従来の無毒塩又は第４級アンモニウム塩を含む。例えば、そのような従来の無毒塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等の無機酸から誘導されるもの；及び酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタン二スルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸等の有機酸から調製される塩が挙げられる。
【００５８】
他の場合、化合物、ポリマー、コンジュゲート等は、１つ以上の酸性官能基を含むことができ、従って薬学的に許容され得る塩基と共に薬学的に許容され得る塩を形成することができる。この場合の用語「薬学的に許容され得る塩」は、そのような化合物、ポリマー又はコンジュゲートの比較的無毒の無機及び有機塩基付加塩を指す。これらの塩は、同様に、投与ビヒクル又は剤形製造プロセスにおいてその場で、又は精製した遊離酸形態の化合物を、薬学的に許容され得る金属カチオンの水酸化物、炭酸塩若しくは重炭酸塩等の好適な塩基と、アンモニアと、又は薬学的に許容され得る有機第１級、第２級若しくは第３級アミンと別々に反応させることにより、調製することができる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及びアルミニウム塩等が挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン等が挙げられる。（例えば、上記のＢｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．参照）。
【００５９】
ポリマーの文脈における「多官能性」は、３つ以上の官能基を含むポリマーを意味し、ここで官能基は同一でも又は異なってもよい。多官能性ポリマーは、典型的にはポリマー中に約３〜１００個の官能基、又は３〜５０個の官能基、又は３〜２５個の官能基、又は３〜１５個の官能基、又は３〜１０個の官能基を含み、又は３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個の官能基を含むであろう。「二官能性」ポリマーは、同じ（即ち、ホモ二官能性）又は異なる（即ち、ヘテロ二官能性）２つの官能基を含むポリマーを意味する。
【００６０】
ポリマーの形状又は構造全体に関連した「分枝状」は、２つ以上のポリマー「アーム」を有するポリマーを指す。分枝状ポリマーは、２つのポリマーアーム、３つのポリマーアーム、４つのポリマーアーム、６つのポリマーアーム、８つのポリマーアーム又はそれを超えるアームを有し得る。高度に分枝状のポリマーの１つの特定のタイプは、樹状ポリマー又はデンドリマーであり、これは、本発明の目的のために、分枝状ポリマーの構造とは異なる構造を有すると考慮される。
【００６１】
「デンドリマー」又は樹状ポリマーは、球状のサイズ単分散ポリマーであり、全ての結合が中心にある焦点、即ちコアから放射状に現れ、規則的な分枝パターン及び各々が分枝点に寄与する反復単位を有する。デンドリマーは、コアカプセル化等の特定の樹状状態特性を示し、他のタイプのポリマーとは異なる独特のものとしている。
【００６２】
「実質的に」又は「本質的に」は、ほぼ全く又は完全に、例えば所定の量の９５％以上、を意味する。
【００６３】
本明細書に記載される塩基性又は酸性反応関与体は、それらの中性、荷電、及び任意の対応する塩形態を含む。
【００６４】
用語「患者」又は「対象」は、本明細書に提供するコンジュゲート又は組成物の投与によって予防又は処置することができる状態を患う又は該状態に罹りやすい生物を指し、ヒト及び動物の両方を含む。対象としては、哺乳動物（例えば、ハツカネズミ、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等）が挙げられるがこれらに限定されず、好ましくはヒトである。
【００６５】
「任意の」及び「任意選択的に」は、続いて記載される状況が生じ得又は生じ得ないことを意味し、従ってその記載は、その状況が生じる場合と生じない場合とを含む。
【００６６】
本明細書で使用される「ハロ」指示物（例えば、フルオロ、クロロ、ヨード、ブロモ）は、一般に、ハロゲンが分子に結合している場合に使用されるが、接尾辞「化物」（例えば、フッ化物、塩化物、ヨウ化物、臭化物等）は、ハロゲンがその独立したイオン形態で存在する場合（例えば、脱離基が分子を離れる場合等）に使用される。
【００６７】
本詳解の文脈において、１つの構造又は式に関連して提供される可変物の定義は、文脈が特に指定しない限り、異なる構造で繰り返される同じ可変物に適用できることを認識するべきである。
【００６８】
概説
第ＶＩＩＩ因子等の血液因子のランダムＰＥＧ化は、以前に記載されており、治療的に有益な生成物をもたらすことができる。例えば、米国特許第７，１９９，２２３号明細書を参照されたい。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子等のタンパク質における非常に多数のリシンに起因して、ランダムＰＥＧ化は、例えばコンジュゲート混合物の再現可能な調製、生成物の特徴付け、及び生成物が治療的に有用であるように十分な生理活性を維持する、該生成物の形成、において困難が存在し得る。
【００６９】
炭水化物基を含む第ＶＩＩＩ因子等のタンパク質の場合、炭水化物におけるＰＥＧ化は、生物学的活性を妨げる可能性が比較的低いと思われる位置に、ＰＥＧを配置する可能性を提供する。タンパク質の炭水化物部分へのＰＥＧのコンジュゲーションを促進するための酵素を使用した炭水化物ＰＥＧ化は、主な血液因子、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸ及びＦＶＩＩＩのＰＥＧ化に関して以前記載されている（Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｂｌｏｏｄ  １１８，２３３３−２３４１；Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ，Ｈ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００８），Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  １００，９２０−９２８；Ｔｉｅｄｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）；Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １１，６７０−６７８；Ａｇｅｒｓｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １８，９４１−９４７；Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ，Ｈ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１３），Ｂｌｏｏｄ  １２１，２１０８−２１１６）。しかしながら、この手法は、結果として得られるＰＥＧ化タンパク質を生成するために追加の酵素のＧＭＰ生成を必要とする。Ｏ−又はＮ−結合グリカンの糖における反応性基の形成のための化学的酸化手法（即ち、非酵素的）は、酵素的酸化と比較した場合に、より直接的な手法を提供するが、一般に使用される過酷な反応条件は、有意なタンパク質不活性化の可能性に起因して、第ＶＩＩＩ因子等の大きな血液因子分子に含まれる炭水化物の酸化には適さないと考えられる。そのような手法は、第ＶＩＩＩ因子に関して仮定される場合があるが、本発明者らは、任意のそのような酸化及びその後のコンジュゲーションが首尾よく行われ、第ＶＩＩＩ因子部分のかなりの活性の維持が不随することに気づいていない。驚くべきことに、本発明者らは、追加の酵素又はタンパク質操作を必要とすることなく、またタンパク質の活性を破壊することなく、ＦＶＩＩＩのコンジュゲーションを可能にする、グリコール及び炭水化物の古典的な過ヨウ素酸塩酸化を用いた条件を見出した。タンパク質結合炭水化物の化学的ＰＥＧ化は、典型的には、非反応性糖ヒドロキシルを反応性アルデヒドへと酸化した後、適切なＰＥＧ試薬にカップリングして、安定な連結コンジュゲートを達成することを必要とする。
【００７０】
過ヨウ素酸ナトリウムを使用した穏やかな酸化（約１ｍＭ）条件は、糖タンパク質炭水化物ツリーに見出される末端糖であるＮ−アセチル−Ｄ−ノイラミン酸（シアル酸）のビシナルヒドロキシル基を選択的に酸化することができる。高濃度の過ヨウ素酸塩は、他の糖の隣接ヒドロキシル含有炭素結合を切断し、望ましくない開環をもたらし得る。過ヨウ素酸塩の酸化を注意深く制御することにより、タンパク質の非シアル酸部分にトリチウムを組み込むことなく、放射標識体内分布研究のための炭水化物残基の選択的トリチウム標識の成功が可能となる。
【化３】
2019532019.tif 000004
【００７１】
過剰の過ヨウ素酸塩を、例えば大過剰のエチレングリコールを用いてクエンチした後、ホルムアルデヒドを迅速に除去することにより、タンパク質アミンとの逆反応が最小限となる（Ｗｏｌｆｅ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ  Ｈａｇｅ，Ｄ．Ｓ．（１９９５），Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３１，１２３−１３０）。
【００７２】
本明細書に記載されるように、炭水化物ＰＥＧ化のための好ましいカップリングは、任意選択的にＰＥＧとオキシアミン基との間のリンカーを有し得る、水溶性ポリマーオキシアミン試薬の使用を伴う。下記の実例的反応スキームでは、リンカーは存在しない。オキシムリンケージは、ヒドラジド官能化ポリエチレングリコール試薬を使用して得られたリンケージよりも高い安定性を有するため好ましい。
【化４】
2019532019.tif 000005
【００７３】
この手法は、完全長ＦＶＩＩＩにはリシン（１５９）よりも遥かに少ない炭水化物部分（２３鎖）が存在するという事実により、炭水化物部分に対する結合に基づくＦＶＩＩＩのＰＥＧ化に特に有利である（Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．，ｖａｎ  Ｍｏｕｒｉｋ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｍｅｒｔｅｎｓ，Ｋ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２，３９８３−３９９６）。水溶性ポリマーオキシム連結コンジュゲート第ＶＩＩＩ因子、コンジュゲート自体、関連高分子試薬及び関連方法の提供を取り巻く詳細は、以下のセクションに記載されている。
【００７４】
水溶性ポリマー
例示的コンジュゲートの記載に先立って、水溶性ポリマーの特徴を下記に詳解する。水溶性ポリマーの様々な実施形態は、各々、本開示の対象である反応性水溶性ポリマー、コンジュゲート、組成物、関連方法等に適用される。
【００７５】
所定の水溶性ポリマーに関連して、各水溶性ポリマー（例えば、ＰＯＬＹ、ＰＯＬＹ１及びＰＯＬＹ２）は、ポリマーが水溶性及び非ペプチド性である限り、任意のポリマーを含むことができる。本明細書で使用するための水溶性ポリマーは、好ましくはポリ（エチレングリコール）であるが、例えば他の水溶性ポリマー、例えば他のポリ（アルキレングリコール）［「ポリ（アルキレンオキシド）」とも称される］、例えばポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコール及びプロピレングリコール等のコポリマー、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（糖類）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、米国特許第５，６２９，３８４号明細書に記載されているようなポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）であってもよい。水溶性ポリマーは、前述のいずれかのホモポリマー、コポリマー、ターポリマー、非ランダムブロックポリマー、及びランダムブロックポリマーであってもよい。加えて、水溶性ポリマーは線状であり得るが、下記に更に詳細に記載するように、他の形態（例えば、分枝状、分岐状等）であってもよい。全体構造内に存在する状況では、水溶性ポリマーは、１〜約３００個の末端を有する。
【００７６】
高分子試薬が２つ以上の水溶性ポリマーを含む場合、全体構造における各水溶性ポリマーは、同じでも又は異なってもよい。しかしながら、全体構造における全ての水溶性ポリマーは、同じタイプのものであることが好ましい。例えば、所定の構造内の全ての水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）ポリマーであることが好ましい。
【００７７】
任意の個々の水溶性ポリマーの重量平均分子量は様々であり得るが、任意の所定の水溶性ポリマーの重量平均分子量は、典型的には以下の範囲内であろう：１００ダルトン〜約１５０，０００ダルトン。しかしながら、例示的な範囲としては、以下の範囲内の重量平均分子量が挙げられる：約８８０ダルトン〜約５，０００ダルトンの範囲内；５，０００ダルトン超〜約１００，０００ダルトンの範囲内；約６，０００ダルトン〜約９０，０００ダルトンの範囲内；約１０，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲内；１０，０００ダルトン超〜約８５，０００ダルトンの範囲内；約２０，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲内；約５３，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲内；約２５，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲内；約２９，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲内；約３５，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲内；約８８０ダルトン〜約６０，０００ダルトンの範囲内；約４４０ダルトン〜約４０，０００ダルトンの範囲内；約４４０ダルトン〜約３０，０００ダルトンの範囲内；及び約４０，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲内。任意の所定の水溶性ポリマーに関して、これらの範囲の１つ以上にある分子量を有するＰＥＧが好ましい。
【００７８】
水溶性ポリマーに関する例示的な重量平均分子量としては、約１００ダルトン、約２００ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約４４０ダルトン、約５００ダルトン、約６００ダルトン、約７００ダルトン、約７５０ダルトン、約８００ダルトン、約９００ダルトン、約１，０００ダルトン、約１，５００ダルトン、約２，０００ダルトン、約２，２００ダルトン、約２，５００ダルトン、約３，０００ダルトン、約４，０００ダルトン、約４，４００ダルトン、約４，５００ダルトン、約５，０００ダルトン、約５，５００ダルトン、約６，０００ダルトン、約７，０００ダルトン、約７，５００ダルトン、約８，０００ダルトン、約９，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約１１，０００ダルトン、約１２，０００ダルトン、約１３，０００ダルトン、約１４，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン、約１６，０００ダルトン、約１７，０００ダルトン、約１８，０００ダルトン、約１９，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン、約２２，５００ダルトン、約２５，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、約３５，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約４５，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン、約５５，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約６５，０００ダルトン、約７０，０００ダルトン、及び約７５，０００ダルトンが挙げられる。前述の任意の総重量平均分子量を有する水溶性ポリマーの分枝状型（例えば、２つの２２０，０００ダルトンのポリマーから構成される分枝状の４０，０００ダルトンの水溶性ポリマー）も使用することができる。
【００７９】
ＰＥＧが高分子試薬の場合、ＰＥＧは、典型的には多数の（ＯＣＨ２ＣＨ２）モノマー［又は（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）モノマー、どのようにＰＥＧが定義されるかに応じて］を含む。明細書全体に使用されるように、反復単位の数は、「（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ」における下付き文字「ｎ」により特定される。従って、（ｎ）の値は、典型的には、以下の範囲の１つ以上に含まれる：２〜約３４００、約４〜約１５００、約１００〜約２３００、約１００〜約２２７０、約１３６〜約２０５０、約２２５〜約１９３０、約４５０〜約１９３０、約１２００〜約１９３０、約５６８〜約２７２７、約６６０〜約２７３０、約７９５〜約２７３０、約７９５〜約２７３０、約９０９〜約２７３０、及び約１，２００〜約１，９００。分子量が既知である任意の所定のポリマーの場合、ポリマーの総重量平均分子量を反復モノマーの分子量で除算することにより、反復単位（即ち、「ｎ」）の数を決定することできる。
【００８０】
各水溶性ポリマーは、典型的には生体適合性及び非免疫原性である。生体適合性に関連して、物質は、生体組織に関連した物質単独又は他の物質（例えば、活性薬剤）を伴う使用（例えば、患者への投与）に関連した有益な効果が、臨床医、例えば内科医により評価して、任意の有害効果より勝る場合、生体適合性と見なされる。非免疫原性に関連して、物質は、生体組織に関連した物質単独又は別の物質を伴う使用が免疫応答（例えば、抗体の形成）を生じない場合、又は、免疫応答が生じる場合に、そのような応答が、臨床医により評価して、臨床的に有意である又は重要であると考えられない場合、非免疫原性と見なされる。本明細書に記載される水溶性ポリマー、及び活性薬剤とポリマーのコンジュゲートは、生体適合性及び非免疫原性であることが特に好ましい。
【００８１】
一形態では、遊離又は非結合ＰＥＧは、各末端がヒドロキシル基で終結している線状ポリマーである：
ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ’−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
式中、（ｍ’）は、典型的には０〜約４，０００、好ましくは約２０〜約１，０００の範囲である。前述のＰＥＧは、ＰＥＧジオールとも称され、第ＶＩＩＩ因子部分、例えば第ＶＩＩＩ因子部分のカルボキシル基との反応に好適な、ＰＥＧ反応関与体を提供するための出発物質として使用され得る。いくつかの場合、ポリエチレングリコールポリマーにおける反復単位の数は、本明細書に（ｍ’）ではなく（ｎ）により指定され得る。そのような場合、本明細書に提供する（ｍ’）の実例的な値及び範囲は、（ｎ）にも適用される。上記した前述のポリマー、α−，ω−ジヒドロキシポリ（エチレングリコール）は、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨとして短縮形で表すことができ、−ＰＥＧ−記号は、以下の構造単位：
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ’−ＣＨ２ＣＨ２−
（式中、（ｍ’）は、上記に定義した通りである）を表すことができることが理解される。
【００８２】
例えば、反応性ＰＥＧ試薬又はオキシム含有リンカーを有する対応する第ＶＩＩＩ因子部分コンジュゲートの調製に有用な遊離又は非結合ＰＥＧの他のタイプは、メトキシ−ＰＥＧ−ＯＨ、即ち、略してｍＰＥＧであり、ここで一方の末端は比較的不活性のメトキシ基であると共に、他方の末端はヒドロキシル基である。ｍＰＥＧの構造を下記に示す。
ＣＨ３Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ’−ＣＨ２ＣＨ２−
（式中、（ｍ’）は、上述した通りである。）
【００８３】
米国特許第５，９３２，４６２号明細書に記載されているような多アーム又は分枝状ＰＥＧ分子も、ＰＥＧポリマーとして使用することができる。例えば、ＰＥＧは、構造：
【化５】
2019532019.tif 000006
を有し得る。
（式中：
ｐｏｌｙａ及びｐｏｌｙｂは、メトキシポリ（エチレングリコール）等のＰＥＧｓ（同じ又は異なる）であり；
Ｒ’’は、Ｈ、メチル又はＰＥＧバックボーン等の非反応性部分であり；
Ｐ及びＱは、非反応性リンケージである。好ましい実施形態において、分枝状ＰＥＧポリマーは、メトキシポリ（エチレングリコール）二置換リシンであり、第ＶＩＩＩ因子部分との反応後、オキシム含有リンケージを有するコンジュゲートを形成する。）
【００８４】
加えて、ＰＥＧは、分岐状ＰＥＧを含むことができる。遊離又は非結合分岐状ＰＥＧの例を、以下の式：
【化６】
2019532019.tif 000007
により表す。式中：Ｘは、スペーサー部分であり、各Ｚは、規定長さの原子の鎖によってＣＨに結合したオキシアミンである。Ｚ官能基を分枝炭素原子に結合する原子の鎖は、連結基の役割を果たし、例えばアルキル鎖、エーテル鎖、エステル鎖、アミド鎖及びそれらの組み合わせを含み得る。米国特許第６，３６２，２５４号明細書は、本明細書に開示した第ＶＩＩＩ因子部分コンジュゲートを提供するのに使用可能な様々な分岐状ＰＥＧ構造を開示している。
【００８５】
更に、ＰＥＧは、下記のような分枝状形態を有することができ、水溶性ポリマーは、以下の分枝状構造を含む：
【化７】
2019532019.tif 000008
式中、各（ｍ’）は、独立して、２〜４０００、又は約１〜約３，０００、又は１〜約２，０００、好ましくは約２０〜約１，０００の値を有する整数である。
【００８６】
ＰＥＧポリマーは、ＰＥＧ鎖の末端ではなくＰＥＧの長さに沿って共有結合した、オキシアミン等の反応性基を有するペンダントＰＥＧ分子を含むことができる。ペンダント反応性基は、直接、又はアルキレン基等のスペーサー部分を介して、ＰＥＧに結合され得る。
【００８７】
用語ポリ（エチレングリコール）又はＰＥＧは、ＰＥＧの上記の全形態を表し又は含むことが当業者により理解される。
【００８８】
当業者は、実質的に水溶性ポリマーに関する前述の詳解が、決して網羅的なものではなく、単なる実例であり、上述した性質を有する全ての高分子材料が考慮されることを認識するであろう。本明細書中で使用される用語「水溶性ポリマー」は、分子と、第ＶＩＩＩ因子部分等の他の部分に結合した水溶性ポリマー部分との両方を指す。水溶性ポリマーの以下の記載は、高分子試薬だけでなく、記載された高分子試薬を使用して形成された対応するコンジュゲートにも適用可能である。
【００８９】
本明細書に記載されるコンジュゲートの形成に使用される水溶性ポリマー含有高分子試薬の官能基は、オキシアミン、「〜Ｏ−ＮＨ２」である（アミノ−オキシポリマーとも称される）。従って、反応性ＰＥＧは、特定の場合、下記に示すように、任意選択的に、分子のＰＥＧ部分と反応性オキシアミンとの間に介在する１つ以上の追加の原子、即ちスペーサーを含むことができる。
ＰＥＧ−Ｘ−Ｏ−ＮＨ２
【００９０】
オキシアミン−末端高分子試薬は、第ＶＩＩＩ因子部分（例えば、炭水化物）のカルボニル基と反応して、第ＶＩＩＩ因子部分と、前述したポリエチレングリコール等の水溶性ポリマーとの間に、オキシムリンケージを提供することができる。典型的には、必ずではないが、カルボニル基は、第ＶＩＩＩ因子部分内のアルデヒド（例えば、第ＶＩＩＩ因子部分の酸化後に生成した）の一部である。加えて、しかしながら、カルボニル基は、第ＶＩＩＩ因子部分内のケトンの一部であってもよい。一般的に、そのような反応性ＰＥＧｓは、上記に示した次の式、ＰＥＧ−Ｘ−Ｏ−ＮＨ２により包含され、ここでＰＥＧは、例えば線状、分枝状、分岐状等、本明細書に記載される形態のいずれかを有することができ、Ｘは、１つ以上の原子からなる、任意のスペーサーであり、もし存在する場合、加水分解に安定なものが好ましい。
【００９１】
典型的には、Ｘは、Ｏ、又はＳ、又はＮＨ等の少なくとも１つのヘテロ原子を含む。実例的な例を以下に提供する。一般に、Ｘは、１〜約５０個の原子、又は約４個の原子〜約５０個の原子、又は約５個の原子〜約２５個の原子、又は更により好ましくは約５個の原子〜約２０個の原子、又は３〜約１５個の原子の原子長を有する。例示的なスペーサーとしては、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−［ＣＨ２］０〜６−（ＯＣＨ２ＣＨ２）０−２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−からなる群から独立して選択されるもの等のセグメントを挙げることができる。しかしながら、本開示の目的のために、一連の原子は、その一連の原子が水溶性ポリマーセグメントに直接隣接し、その一連の原子が別のモノマーに過ぎず、従って提案されるスペーサー部分がポリマー鎖の単なる延長を表す場合、スペーサーではない。本明細書に記載されるスペーサー又はリンカーはまた、上記の基の任意の２つ以上の組み合わせを、任意の配向で含んでもよい。実例的ＰＥＧ−オキシアミンを、以下の表に示す：
【００９２】
【表１】
2019532019.tif 000009
【００９３】
【表２】
2019532019.tif 000010
【００９４】
【表３】
2019532019.tif 000011
【００９５】
【表４】
2019532019.tif 000012
【００９６】
表１に提供したＰＥＧ試薬に関連して、前述の構造は塩酸塩等のその薬学的に許容され得る塩形態も含むことを理解するべきである。表１の構造に関連して、Ｘは、本明細書で前述したような１つ以上の原子を含むスペーサーである。可変物Ｘを含む前述の各構造に適用可能な１つ以上の特定の実施形態では、スペーサーＸは、〜ＮＨ（ＣＨ２）１〜６〜と等しく又はこれを含み、ここでメチレンの数は、１、２、３、４、５及び６から選択される。より詳細には、スペーサーＸは、〜ＮＨ（ＣＨ２）２〜と等しく又はこれを含む。適切な前述の各構造に適用可能な別の好ましいスペーサーは、〜ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２〜である。このスペーサーは、追加のカルボキサミドメチル基と共にセグメント、〜ＮＨ（ＣＨ２）２〜を含む。より一般的には、追加の特定のスペーサーは、例えば〜ＮＨ（ＣＨ２）１〜６ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２〜を含み、ここでアミノ基の間に挿入される介在メチレン基の数は、１、２、３、４、５及び６から選択される。即ち、いくつかの実施形態では、介在メチレンの数は１であり；尚いくつかの別の実施形態では、数は２であり；尚いくつかの更なる実施形態では、数は３であり；尚いくつかの別の実施形態では、４の数であり；尚いくつかの更なる実施形態では、数は５であり；いくつかの追加の実施形態では、数は６である。更に、明白に示されていないが、上記の表１は、構造Ｉ〜ＸＸＩＩの各々に関して、対応するＰＥＧ−第ＶＩＩＩ因子部分（本明細書で時折ＦＶＩＩＩ及びＦ８とも称される）コンジュゲートを明白に記述することも意図され、ここで構造Ｉ〜ＸＸＩＩの各々に関して、〜ＯＮＨ２は〜ＯＮＨ＝ＣＨ−（ＦＶＩＩＩ）で置き換えられ、第ＶＩＩＩ因子部分に対する結合は、第ＶＩＩＩ因子部分の１つ以上の酸化炭水化物を介する。
【００９７】
例示的な高分子試薬は、例えば以下の構造：
【化８】
2019532019.tif 000013
（式中、Ｘは、上記に一般に記載されているスペーサーである）を有するものを含む。
【００９８】
第ＶＩＩＩ因子部分のカルボニル基は、分子の一部として存在してもよく、又は第ＶＩＩＩ因子活性を有するタンパク質の修飾を介して得られてもよい。第ＶＩＩＩ因子活性を有するタンパク質を修飾する１つの手法において、タンパク質（少なくとも１つのグリコシル化修飾を有する）は酸化条件に供され（例えば、過ヨウ素酸塩又は任意の他の好適な酸化剤に暴露され）て、それにより第ＶＩＩＩ因子部分に含まれる１つ以上のヒドロキシ基を酸化して、カルボニル含有（例えば、アルデヒド含有）第ＶＩＩＩ因子部分をもたらし、このカルボニル基は、ＰＥＧオキシアミン等の水溶性ポリマーオキシアミンとの反応に好適である。過ヨウ素酸塩は、タンパク質の活性を有意に害することなく、第ＶＩＩＩ因子部分に存在する炭水化物中のビシナルジオールを酸化するのに使用できることが見出された。例えば酸化からもたらされる、第ＶＩＩＩ因子部分の糖又は炭水化物部分に存在するカルボニル基（例えば、アルデヒド）へのオキシムリンケージを介した共有結合により形成されたコンジュゲートは、時折グリココンジュゲートと称され得る。上記に言及したように、リシン（１５９）と比較した場合、完全長第ＶＩＩＩ因子中の有意により少ない（２３鎖）（即ち本明細書に記載される手法を用いて１４％のみの）炭水化物に起因して、オキシム含有リンケージを介して、第ＶＩＩＩ因子分子の周知の領域に水溶性ポリマーが共有結合した、より高いポリマー指向性の修飾第ＶＩＩＩ因子部分に到達することができる。例えば、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）のドメイン構造及び翻訳後修飾が図示されている、Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ（２０１０），１６，６−１５の図１を参照されたい。成熟ＦＶＩＩＩは、個別のドメイン構造内に配置されている２３３２アミノ酸からなる：Ａ１（残基１〜３３６）、Ａ２（３７３〜７１０）、Ｂ（７４１〜１６４８）、Ａ３（１６９０〜２０１９）、Ｃ１（２０２０〜２１７２）及びＣ２（２１７３〜２３３２）。Ａドメインは、酸性領域ａ１（３３７〜３７２）、ａ２（７１１〜７４０）及びａ３（１６４９〜１６８９）により境界をつけられる。Ｃｙｓ−残基の大部分はジスルフィド架橋に関与するが、いくつかは遊離システインとして存在する。ＦＶＩＩＩは、高度にグリコシル化され、炭水化物残基の殆どはＢドメイン内に存在する。Ｂドメインは、およそ７つのＯ−結合グリカン（その正確な位置は分かっていない）と、Ｎ−結合グリコシル化のための１６個の部位とを含む。５つのＮ−結合グリカンは他のドメイン内に見出され、そのうちの２つはマンノース型グリカンである。従って、本明細書に記載される第ＶＩＩＩ因子ポリマー修飾手法は、特に完全長第ＶＩＩＩ因子を使用する場合、Ｂドメインが高度にグリコシル化されていることによって、ＰＥＧ結合の大部分をＢドメイン内に集中させるのに有効である。
【００９９】
追加の例示的高分子試薬を以下に更に詳細に論じる。任意の式又は構造に立体化学は詳細に示されていないが（高分子試薬、コンジュゲート、又は任意の他の式若しくは構造のいずれに関しても）、提供される式及び構造は、両方のエナンチオマー、並びに各エナンチオマーを等量で（即ち、ラセミ混合物）及び非等量で含む組成物を考慮していることを思い起こす必要がある。
【０１００】
例示的線状高分子試薬は、以下の構造を有する：
ＣＨ３Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ’−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ２
式中、（ｍ’）は、典型的には０〜約４，０００、又は約０〜約３，０００、又は約０〜約２，０００、好ましくは約２０〜約１，０００の範囲である。上記に示した構造を有する特定の実例的線状ＰＥＧオキシアミンは、例えば、約５，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン、又は約３０，０００ダルトンの分子量を有するであろう。前述の線状ＰＥＧオキシアミンは、スペーサーを含まず；このＰＥＧ試薬では、ポリエチレングリコールはオキシアミン基に共有結合している。この式に包含される高分子試薬は、文献に記載されている手法に従って合成することができ、また商業的に（例えば、ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＵＳＡ，Ｐｌａｎｏ，ＴＸから）得ることができる。例えば、ＰＥＧオキシアミンは、Ｓ．Ａｌｂｒｅｃｈｔ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２００６，１６３５−１６３８に記載されているように、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−ヒドロキシカルバメートをＰＥＧ−Ｏ−メタンスルホネートによりＯーアルキル化した後、酸性Ｎ−脱保護することにより、メトキシ−ＰＥＧ（即ち、末端ヒドロキシル基の変換）から調製することができる。そのような高分子試薬を用いて調製される代表的な第ＶＩＩＩ因子部分コンジュゲートは、支持実施例に記載されている。
【０１０１】
追加の実例的分枝状ＰＥＧオキシアミン試薬は、以下を含む：
【化９】
2019532019.tif 000014
【０１０２】
別の例示的ＰＥＧオキシアミン試薬は、以下の分枝状構造を有する：
【化１０】
2019532019.tif 000015
式中、本明細書に提供する各構造の（ｍ’）又は（ｎ）は、典型的には約１〜約４，０００、又は約１〜約３，０００、又は１〜約２，０００、好ましくは約２０〜約１，０００の範囲である。この分枝状ＰＥＧ試薬は、本明細書で時にはＲＵ−ＰＥＧ２−オキシアミンと称される。上記の構造を有する特定の分枝状ＰＥＧｓは、各々が約１０，０００ダルトンの分子量を有する２つのＰＥＧ「アーム」を有し、従って各ＰＥＧアームにおいて（ｍ’）が約２２７である。前述の構造による追加の実例的分枝状ＰＥＧオキシアミンは、各々が約５，０００ダルトン、又は１０，０００ダルトン（前述のように）、又は２０，０００ダルトン等の分子量を有する２つのＰＥＧ「アーム」又は分枝を有する。上記の分枝状構造において、２つのＰＥＧアーム、ＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ’〜は、２−（４−（（２−（２−（アミノオキシ）アセトアミド）エチル）アミノ）−４−オキソブトキシ）プロパン−１，３−ジイルジカルバメートである有機コアから延びる。上記に示す分枝状構造において、分枝状ＰＥＧとオキシアミン基との間に介在するセグメント又はスペーサーは、〜（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２〜であるが、上述したような任意の好適なスペーサーを使用することができる。
【０１０３】
第ＶＩＩＩ因子部分に関連して（例えば、ＰＥＧオキシアミン等の水溶性ポリマーオキシアミンとの反応に関して）、本発明に有用な第ＶＩＩＩ因子部分は、天然のヒト第ＶＩＩＩ因子と同じ活性（必ずではないが、同じ程度の活性）を有し、かつグリコシル化されている（即ち、グリコシド結合した単糖類等の糖残基を含む）任意のタンパク質を含む。可能な第ＶＩＩＩ因子部分には、２，３５１アミノ酸の、Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２として構造的に組織化された単鎖糖タンパク質である天然のヒト第ＶＩＩＩ因子が含まれる。しかしながら、発現されたポリペプチドが小胞体の内腔内に移動された際、１９アミノ酸シグナル配列が切断され、第２の配列がもたらされる。ここで提供されたこの第２の配列は、先導する１９アミノ酸を欠いている。本明細書で使用するための第ＶＩＩＩ因子部分は、認識される。第ＶＩＩＩ因子部分は単に第ＶＩＩＩ因子の「活性」形態（例えば、第ＶＩＩＩａ因子）に限定されず、用語「第ＶＩＩＩ因子部分」は「前駆体」形態、及び同様の凝血原効果を有する他の物質を包含することが認識されるであろう。
【０１０４】
任意の所定の部分に関して、その部分が第ＶＩＩＩ因子活性を有するか否かを決定することができる。例えば、いくつかの動物系統は、そのような系統から発生した動物が非常に低く不十分なレベルの第ＶＩＩＩ因子を有するように、血友病に関する遺伝子変異を有した状態で意図的に飼育されている。そのような系統は、非限定的に、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，Ａｌｂａｎｙ，ＮＹ及びＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ，ＮＣ等の様々な供給源から入手することができる。これらの供給源の両方は、例えば、イヌ血友病Ａを患うイヌを提供する。問題となっている任意の所定の部分の第ＶＩＩＩ因子活性を試験するために、この部分を疾病動物に注入し、小さい切り傷を作製し、出血時間を対照としての非処理疾病動物と比較する。第ＶＩＩＩ因子活性の決定に有用な別の方法は、補因子及び凝血原活性を決定することである。例えば、Ｍｅｒｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．８５：１３３−４２を参照されたい。当業者に既知の他の方法も、所定の部分が第ＶＩＩＩ因子活性を有するか否かの決定に使用することができる。そのような方法は、その部分自体（従って「第ＶＩＩＩ因子部分」として使用できる）、及びオキシム含有リンケージを有する対応するポリマー−部分コンジュゲートの両方の第ＶＩＩＩ因子活性を決定するのに有用である。
【０１０５】
第ＶＩＩＩ因子部分の非限定的な例としては、以下が挙げられる：第ＶＩＩＩ因子；第ＶＩＩＩａ因子；第ＶＩＩＩ因子：Ｃ；第ＶＩＩＩ因子：ｖＷＦ；Ｂドメイン削除第ＶＩＩＩ因子（及び第ＶＩＩＩ因子の他の切断型）；米国特許第６，１５８，８８８号明細書に記載されているもの等のハイブリッドタンパク質；米国特許出願公開第２００３／００７７７５２号明細書に記載されているもの等の第ＶＩＩＩ因子活性を有するグリコシル化タンパク質；及び第ＶＩＩＩ因子活性を有するペプチド模倣物。好ましい切断型第ＶＩＩＩ因子（用語「Ｂドメイン削除第ＶＩＩＩ因子」により包含される）は、Ａｒｇ７５９〜Ｓｅｒ１７０９の領域内の少なくとも５８１アミノ酸に対応する削除を有する、より好ましくは削除が領域Ｐｒｏ１０００〜Ａｓｐ１５８２、領域Ｔｈｒ７７８〜Ｐｒｏ１６５９、及び領域Ｔｈｒ７７８〜Ｇｌｕ１６９４の１つに対応するヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列を有するタンパク質に対応する。
【０１０６】
第ＶＩＩＩ因子部分に関連して、少なくともある程度の第ＶＩＩＩ因子活性を維持する、前述の任意の生物学的に活性な断片、削除変異体、置換変異体又は付加変異体も使用することができる。
【０１０７】
第ＶＩＩＩ因子部分は、有利には、結合がオキシム含有結合である限り、例えばリシン、システイン及び／又はアルギニン等の１つ以上のアミノ酸残基を含むように修飾されて、アミノ酸の側鎖内の原子へのポリマーの簡易結合を提供することができる。アミノ酸残基を付加する技術は、当業者に周知である。
【０１０８】
更に、活性薬剤は血液由来の供給源から得ることができる。例えば、第ＶＩＩＩ因子は、当業者に既知の沈殿及び遠心分離技術を使用してヒト血漿から分画することができる。例えば、Ｗｉｃｋｅｒｈａｕｓｅｒ（１９７６）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  １６（４）：３４５−３５０及びＳｌｉｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  １６（６）：６１６−６２６を参照されたい。第ＶＩＩＩ因子は、ヒト顆粒球からも単離することができる。Ｓｚｍｉｔｋｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ（Ｂｕｄａｐ．）１１（１−２）：１７７−１８７を参照されたい。
【０１０９】
加えて、活性薬剤は、組換え方法により得ることができる。要約すると、組換え方法は、所望のポリペプチド又は断片をコードする核酸を構築し、この核酸を発現ベクター内にクローニングし、宿主細胞（例えば、細菌、酵母、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞若しくはベビーハムスター腎臓細胞等の哺乳動物細胞）を形質転換し、核酸を発現させて所望のポリペプチド又は断片を生成することを含む。組換えポリペプチドをインビトロで及び原核生物及び真核生物宿主細胞内で生成し及び発現させる方法は、当業者に既知である。例えば、米国特許第４，８６８，１２２号明細書を参照されたい。
【０１１０】
上記の例示的第ＶＩＩＩ因子部分は、適用可能な場合、その類似体、作動薬、拮抗薬、阻害剤、異性体、及び薬学的に許容され得る塩形態を包含することが意図される。ペプチド及びタンパク質に関連して、本開示は、その合成、組換え、天然、グリコシル化、及び非グリコシル化形態、並びに生物学的に活性な断片を包含することが意図される。加えて、第ＶＩＩＩ因子部分に関連した用語「活性薬剤」は、コンジュゲーション前の活性薬剤、及びコンジュゲーション後の活性薬剤「残基」を包含することが意図される。
【０１１１】
本明細書に提供する第ＶＩＩＩ因子部分に関する典型的なコンジュゲーション反応の一般的概略を以下に提供する：
【化１１】
2019532019.tif 000016
【０１１２】
例示的なコンジュゲートは、以下の式
【化１２】
2019532019.tif 000017
のものを含み、式中、ＰＥＧは、任意のＰＥＧ部分、特に本明細書に記載されるものを包含し、Ｘは、上記に詳細に記載した、任意のスペーサー部分である。オキシム含有リンケージを介して第ＶＩＩＩ因子部分に結合したＰＥＧ部分に関する好適な及び例示的な分子量値は、上記に記載されている。例えば、１つの実例的第ＶＩＩＩ因子部分コンジュゲートは、概して以下に記載され、スペーサーＸは一般式に存在しない：
ＣＨ３Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ’−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ＝ＣＨ−（ＦＶＩＩＩ）
式中、（ｍ’）は、典型的には０〜約４，０００の範囲であり、Ｆ８は、カルボニル含有第ＶＩＩＩ因子部分の残基である。即ち、オキシムの「ＣＨ」は、ＰＥＧ−オキシアミン試薬との反応前の第ＶＩＩＩ因子部分のカルボニル基の炭素原子を表す。
【０１１３】
更なる実例的第ＶＩＩＩ因子部分コンジュゲートとしては、例えば、
【化１３】
2019532019.tif 000018
が挙げられ、式中、上記の各分枝状構造の（ｍ’）又は（ｎ）は、典型的には約１〜約４，０００、又は約１〜約３，０００、又は１〜約２，０００、好ましくは約２０〜約１，０００の範囲である。いくつかの実施形態において、各ＰＥＧ「アーム」は、約１０，０００ダルトンの分子量を有し、従って（ｍ’）は各ＰＥＧアーム内で約２２７である。
【０１１４】
実施例１〜３に詳細に記載されるように、分枝状ポリエチレングリコールオキシアミンの調製方法も本明細書に提供する。この方法では、典型的にはＮＨＳ−エステル等の活性エステルとして活性化された分枝状逆ウレタンＰＥＧ試薬（しかし、任意の好適な活性エステルを使用することができる）を、例えば、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）１〜６ＮＨ２等のジアミンと反応させて、対応する逆ウレタンＰＥＧカルボキサミド−アミン中間体を提供する。下記に提供する一般的反応スキームを参照されたい。
【化１４】
2019532019.tif 000019
【０１１５】
反応は、典型的には、塩基、例えばトリエチルアミンの存在下、例えばジクロロメタン又はクロロホルム等の有機溶媒中で行われる。好ましくは、反応は、乾燥（即ち、無水）溶媒を用いて不活性雰囲気下で行われる。典型的な反応時間としては、約１時間〜約１０時間、又は約１時間〜約８時間が挙げられ、反応は、一般に、０℃〜約６０℃の範囲の温度で行われる。
【０１１６】
好ましくは、反応は、室温（約２０℃〜約２５℃）で行われる。次いで、例えばアルコール（例えば、イソプロピルアルコール）を用いた沈殿により中間体ＲＵ−ＰＥＧ２カルボキサミドアミン中間体を回収し、好適に乾燥させる。追加の詳細に関しては、反応がエチレンジアミンを用いて行われる実施例１を参照されたい。次いで、ＲＵ−ＰＥＧ２カルボキサミドアミン中間体を、従来のカップリング化学及び条件（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルピリジンの存在下でのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩等のカップリング剤の存在下）を用いて、カルボキシ−保護２−（カルボニルアミノオキシ）酢酸と反応させて、対応する保護オキシアミン生成物を提供し、ここで任意の好適な保護基を使用することができる。ｔ−Ｂｏｃ保護基を含む実例的保護ＲＵ−ＰＥＧ２−オキシアミン生成物を下記に提供する。
【化１５】
2019532019.tif 000020
次いで、例えば、ｔ−Ｂｏｃ保護基の場合、トリフルオロ酢酸を用いて保護基を除去して、所望の生成物を提供する。生成物は、典型的には上述したようにアルコール、例えばイソプロピルアルコールを用いた沈殿により回収され、以下の構造（その塩形態を含む）を有する：
【化１６】
2019532019.tif 000021
【０１１７】
第ＶＩＩＩ因子部分コンジュゲートの調製方法も本明細書に提供し、該方法は、ポリマー、例えばＰＥＧ部分と、生物学的に活性な薬剤、即ち第ＶＩＩＩ因子との間に共有オキシム結合を形成するのに好適な条件下で、オキシアミン基を支持する高分子試薬を第ＶＩＩＩ因子部分と接触させるステップを含む。典型的には、ポリマー反応関与体、即ちポリマーオキシアミンを等モル量（反応性基との反応に好適な基の所望の数に関連して）又はモル過剰で第ＶＩＩＩ因子部分と反応させる。例えば、支持実施例を参照されたい。例えば、高分子試薬を、約１：１（高分子試薬：活性薬剤）、１：１、１．５：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、８：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１又は更にはそれを超えるモル比で標的活性薬剤に加え得る。所望の程度のポリマー結合が生じるまで、又は実質的に更なるコンジュゲーションが生じなくなるまで（これは、一般に、反応の進行を経時的に監視することにより決定することができる）、コンジュゲーション反応を進行させる。反応の進行は、様々な時点で反応混合物からアリコートを引き抜き、反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法又は任意の他の好適な分析方法により分析することによって監視することができる。形成されたコンジュゲート又は残留する非コンジュゲート化ポリマーの量に関連して一旦プラトーに達したら、反応が完了したと考える。典型的には、コンジュゲーション反応は、数分間〜数時間（例えば、５分間〜２４時間又はそれを超える）の間のいずれかの時間を要する。得られた生成物の混合物は、必ずではないが、好ましくは精製されて、過剰な試薬、非コンジュゲート化反応関与体（例えば、活性薬剤）望ましくない多コンジュゲート化種、及び遊離又は未反応ポリマーを分離する。次いで、得られたコンジュゲートは、ＭＡＬＤＩ、キャピラリー電気泳動、ゲル電気泳動、及び／又はクロマトグラフィー等の分析方法を用いて更に特徴付けられ得る。
【０１１８】
例えば、代表的な実施例４、５及び６に記載されているように、第ＶＩＩＩ因子は一般に、最初に、第ＶＩＩＩ因子部分を過ヨウ素酸塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム）等の化学的酸化剤と共にインキュベートして、それにより第ＶＩＩＩ因子の１つ以上の炭水化物を酸化させることによって、水溶性ポリマーオキシアミン試薬、例えばＰＥＧオキシアミンとの反応のために活性化される。例えば、酸化剤は、第ＶＩＩＩ因子部分の好適な緩衝液の溶液に、典型的には約６のｐＨで添加される。第ＶＩＩＩ因子部分の代表的な濃度は、好適な緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム、塩化物カルシウム、及びツイーン８０を含む）中で、約１．０ｍｇ／ｍＬ〜約７ｍｇ／ｍＬ、又は約２．０ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬ、又は約３〜４ｍｇ／ｍＬの範囲である。酸化は、好ましくは光の非存在下、例えば暗所内で行われる。次いで、タンパク質内の炭水化物基を酸化させるのに十分であるが、活性の有意な喪失をもたらさない好適な期間、例えば約１０分間〜約２時間、好ましくは約１時間未満、又は約３０〜約４５分間、反応を進行させる。酸化は、典型的には約５℃〜約３５℃、又は約５℃〜約２５℃の範囲の温度で行われる。次いで、酸化された第ＶＩＩＩ因子、即ち、ＰＥＧオキシアミンとの反応に好適な反応性アルデヒド基を提供するよう酸化された１つ以上の炭水化物を有する第ＶＩＩＩ因子は、回収され、好適な生理活性アッセイ、例えば凝固活性の測定を用いて、その生理活性が維持されていることを確認する。
【０１１９】
このように調製された酸化第ＶＩＩＩ因子を、次いで本明細書で前述したようなＰＥＧオキシアミン等の水溶性ポリマーオキシアミンと反応させる。例えば、酸化第ＶＩＩＩ因子は一般に、必ずではないが、酸化第ＶＩＩＩ因子部分に対してモル過剰にあり（例えば、２５０モル過剰とほぼ等モル、例えば５倍、１０倍、３０倍、５０倍、７０倍、１００倍、１２０倍、１５０倍、２００倍及び３００倍モル過剰（前述の任意の２つの組み合わせにより到達される範囲を明白に含む）にある。オキシム−カップリング反応は、一般に、約０．５時間〜約２４時間、又は約１時間〜約８時間の期間、約２℃〜約３５℃の温度（例えば、約２０〜２５℃の室温で行われる。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーオキシアミン試薬と第ＶＩＩＩ因子部分とのカップリング反応は、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、スルファニル酸、ｏ−アミノベンズアミド、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、ｏ−アニシジン、ｍ−アニシジン、及びｐ−アニシジンから選択される触媒の非存在下で行われる。いくつかの特定の実施形態では、水溶性ポリマーオキシアミン試薬と第ＶＩＩＩ因子部分との間のカップリング反応は、トルイジンの非存在下で行われる。いくつかの別の実施形態では、反応は、アニリンの非存在下で行われる。
【０１２１】
次いで、酸化された第ＶＩＩＩ因子部分に残留する未反応アルデヒド基を、好適なキャッピング剤、例えばメトキシルアミン塩酸塩等のアルコキシアミン（例えば、１Ｎ水酸化ナトリウム等の水酸化ナトリウム中の）等の好適なキャッピング剤の添加によりキャッピングする（即ち、非反応性とする）ことが望ましい。得られた反応混合物を次いで追加の期間、例えば約１０分間〜約５時間、又は約１５分間〜２時間、又は約１５分間〜１時間反応させる。キャッピング反応の後、好適な緩衝液を添加することにより反応混合物のｐＨを約ｐＨ７に調整してもよい。得られたＰＥＧ−オキシム−第ＶＩＩＩ因子コンジュゲート混合物を、次いで多数の好適な方法のいずれかにより更に精製してもよい。好適な精製方法としては、例えば、クロマトグラフィー、濾過及び沈殿が挙げられる。実例的なクロマトグラフ法としては、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、親和性クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィーが挙げられ、好ましい精製方法はアニオン交換クロマトグラフィーである。
【０１２２】
上述したように、所望であれば、（例えば）反応条件を調整することにより、コンジュゲーションの程度（即ち、ＰＥＧオキシアミン試薬に対するＰＥＧ化の程度）を調整することができる。例えば、異なる番号が付けられたポリマー（即ちＰＥＧ）−対−ＦＶＩＩＩ比（例えば、１−ｍｅｒ、２−ｍｅｒ、３−ｍｅｒ等、ここで「１−ｍｅｒ」は、第ＶＩＩＩ因子部分に対する１ポリマーを示し、「２−ｍｅｒ」は、第ＶＩＩＩ因子部分当たり２ポリマーを示し、その他も同様）は、完了に到達する前にコンジュゲーション反応を停止する、又は因子部分に対するＰＥＧオキシアミンのモル比を変化させる等により、得ることができる。コンジュゲーション反応は、例えばクエンチ剤の添加（例えば、メトキシアミン等のアルコキシアミンを用いたクエンチ）を含む様々な方法で停止することができる。
【０１２３】
コンジュゲートのポルキマー（ｐｏｌｋｙｍｅｒ）結合の程度（即ち、第ＶＩＩＩ因子の１つ以上の酸化炭水化物（例えば、アルデヒド）とＰＥＧオキシアミンとの反応により、第ＶＩＩＩ因子の炭水化物部分に結合した高分子試薬の数−多くの場合、コンジュゲート組成物の状況における平均数の観点から表される−）を特徴づけることが可能である。第ＶＩＩＩ因子部分コンジュゲートに共有結合した水溶性ポリマー分子の平均数を決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ、ＩＥＣ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ等の分析技術を用いることができる。ＰＥＧ化度を決定する例示的手法は、実施例４に記載されている。用いられる方法において、ＰＥＧ−オキシム−第ＶＩＩＩ因子コンジュゲート組成物は、プロナーゼ等のプロテアーゼにより消化されて、第ＶＩＩＩ因子を徹底的に消化し、それにより第ＶＩＩＩ因子に共有結合していたＰＥＧ部分を解放することが望ましい。次いで、解放された水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの量を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、又はＲＰ−ＨＰＬＣ等の適切な方法を用いて定量化する。
【０１２４】
本明細書に提供する方法は、第ＶＩＩＩ因子−ＰＥＧオキシムコンジュゲートを提供するのに有効であり、ここでＰＥＧ（又はより一般的には、水溶性ポリマー）は、オキシム含有リンケージを介して第ＶＩＩＩ因子部分の炭水化物に共有結合している。支持実施例から明らかなように、例えば約１〜約２０の範囲の、比較的高い及び低い平均ＰＥＧ化度の両方を有する実例的コンジュゲート（及びコンジュゲート組成物）が調製されている。第ＶＩＩＩ因子−線状ＰＥＧオキシム炭水化物ベースのコンジュゲートの場合、組成物の平均ＰＥＧ化度は、約４〜約２０の範囲内である。第ＶＩＩＩ因子−線状ＰＥＧオキシム炭水化物ベースのコンジュゲートの好ましい組成物は、約３〜約８、又はより好ましくは約４〜約７の平均ＰＥＧ化度を有する。即ち、いくつかの実施形態では、好ましい組成物は、以下の構造：［ＣＨ３Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ’−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ＝ＣＨ］３〜８−（ＦＶＩＩＩ）による第ＶＩＩＩ因子−線状ＰＥＧオキシム炭水化物ベースのコンジュゲートを含み、式中、ｍ’は、以前記載された通りである。いくつかの更なる実施形態では、好ましい組成物は、以下の構造：［ＣＨ３Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ’−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ＝ＣＨ］４〜７−（ＦＶＩＩＩ）による第ＶＩＩＩ因子−線状ＰＥＧオキシム炭水化物ベースのコンジュゲートを含み、式中、ｍ’は、以前記載された通りである。前述のいくつかの追加の実施形態では、平均ＰＥＧ化度は、約６である。実例的組成物は、前述の構造によるコンジュゲートを含み、ここでポリエチレングリコール鎖は、各々が約２０，０００ダルトンの平均分子量を有する第ＶＩＩＩ因子の炭水化物部分に共有結合している。
【０１２５】
次に実例的分枝状ＲＵ−ＰＥＧ−２オキシム−第ＶＩＩＩ因子コンジュゲート及び関連組成物を検討すると、組成物の平均ＰＥＧ化度は、幾分低く、例えば約０．５〜約４、又は約１〜約３．５の範囲内である。いくつかの実施形態において、以下の構造内の各ＰＥＧ鎖の分子量は、約１０，０００ダルトンである。
【化１７】
2019532019.tif 000022
【０１２６】
本明細書に提供する第ＶＩＩＩ因子コンジュゲート及び組成物は、驚くべきことに、第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性を測定する任意の好適なバイオアッセイに基づいて、非修飾第ＶＩＩＩ因子部分と比較した場合、有意な生物学的活性度を保持する。好ましいＰＥＧ−オキシム−第ＶＩＩＩ因子コンジュゲートは、非修飾第ＶＩＩＩ因子部分と比較した場合、例えば、例えば１段階ＡＰＴＴベース凝固アッセイ等の任意の好適なバイオアッセイに基づいて、約４５％〜約７５％又はそれを超える、又は５０％〜７５％又はそれを超える生物学的活性を保持する。
【０１２７】
第ＶＩＩＩ因子の治療的に有用なコンジュゲートの提供における困難は、半減期と生理活性との治療的に有用なバランスに到達することである。特に好ましいコンジュゲート及び関連組成物は、線状ＰＥＧオキシムに関して上述したように、第ＶＩＩＩ因子部分当たりのポリマー結合部位の平均数、例えば３〜８、又は４〜７、又は約６を有し、１段階ＡＰＴＴベース凝固アッセイ等の任意の好適なアッセイに基づいて、非修飾第ＶＩＩＩ因子部分と比較した場合に約４０％〜約７５％又はそれを超える生物学的活性を保持するもの）である。追加の好ましいコンジュゲート及び組成物は、第ＶＩＩＩ因子部分当たりの分枝状ポリマー結合部位の平均数が、例えば前述した分枝状逆ウレタンＰＥＧオキシアミン試薬を使用して、例えば０．５〜約４、又は約１〜３．５であり、１段階ＡＰＴＴベース凝固アッセイ等の任意の好適なアッセイに基づいて、非修飾第ＶＩＩＩ因子部分と比較した場合に約６０％又はそれを超える、例えば約６０％〜約８０％の生物学的活性を保持するもの）である。
【０１２８】
第ＶＩＩＩ因子−ＰＥＧオキシム含有コンジュゲートに関連して、コンジュゲートを精製して（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎから入手可能なイオン交換体のＭＡＣＲＯＣＡＰブランド等のポリマー−コンジュゲート化薬物の精製のために設計された樹脂を使用したイオン交換により）、異なるコンジュゲート化種を得る／単離することができる。代替的に、より好ましくは、より小さい分子量（例えば、約２０キロダルトン未満、より好ましくは約１０キロダルトン未満）のポリマーの場合、生成物混合物を精製して、第ＶＩＩＩ因子当たりの水溶性ポリマーセグメントの分布を得ることができる。例えば、生成物混合物を精製して、活性薬剤（例えば、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド）当たり１〜５の間のいずれかのＰＥＧｓの平均を得ることができる。最終的なコンジュゲート反応混合物の精製のための戦略は、例えば、使用するポリマーの分子量、特定の活性薬剤、所望の投与レジメン、並びに個々のコンジュゲートの残留活性及びインビボ特性を含む多くの因子に依存するであろう。
【０１２９】
所望であれば、異なる分子量を有するコンジュゲートは、ゲル濾過クロマトグラフィー（この手法は、ポリマーサイズが活性薬剤サイズに比較的近い場合に最良に機能する）を使用して単離することができる。即ち、ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、異なる番号が付けられたポリマー−対−活性薬剤比（例えば、１−ｍｅｒ、２−ｍｅｒ、３−ｍｅｒ等）をそれらの異なる分子量（ここで差異は、本質的に、水溶性ポリマーセグメントの平均分子量に対応する）に基づいて分画する。例えば、１００ｋＤａタンパク質が約２０ｋＤａの分子量を有する高分子試薬にランダムにコンジュゲート化した例示的反応においては、得られた反応混合物は、非修飾タンパク質（ＭＷ１００ｋＤａ）、１−ＰＥＧ化タンパク質（ＭＷ１２０ｋＤａ）、２−ＰＥＧ化タンパク質（ＭＷ１４０ｋＤａ）等を含む可能性がある。この手法は、異なる分子量を有するＰＥＧ及び他のポリマーコンジュゲートを分離するのに使用することができるが、この手法は一般に、タンパク質内に異なるポリマー結合部位を有する位置異性体の分離には無効である。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、ＰＥＧ  １−ｍｅｒｓ、２−ｍｅｒｓ、３−ｍｅｒｓ等の混合物を互いに分離することができるが、回収された各ＰＥＧ−ｍｅｒ組成物は、活性薬剤内の異なる反応性アミノ基（例えば、リシン残基）に結合したＰＥＧｓを含む場合がある。
【０１３０】
このタイプの分離を行うのに好適なゲル濾過カラムとしては、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能なＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）及びＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）カラムが挙げられる。特定のカラムの選択は、所望される所望の分画範囲に依存するであろう。溶出は、一般に、リン酸、酢酸等の好適な緩衝液を使用して行われる。収集した画分は、多数の異なる方法、例えば、（ｉ）タンパク質含有量に関する２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）、（ｉｉ）タンパク質含有量を決定するために、ＢＳＡを基準として使用する染料ベースの方法（例えば、ＢＣＡ）、（ｉｉｉ）ＰＥＧ含有量に関するヨウ素試験［Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０７：６０−６３］、及び（ｉｖ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）、その後のヨウ化バリウムを用いた染色、により分析することができる。
【０１３１】
加えて、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、異なる番号が付けられたポリマー−対−活性薬剤比（例えば、１−ｍｅｒ、２−ｍｅｒ、３−ｍｅｒ等）を分離することができる。イオン交換クロマトグラフィーを使用して、異なる番号が付けられたポリマー−対−タンパク質比を分離するために、カラムを介してコンジュゲート含有組成物を溶出することができ、非コンジュゲート化（即ち、未反応）ポリマーが最初に溶出し、次いでより高次の多コンジュゲート化種が溶出し、次いで漸次より低次の多コンジュゲート化種が溶出し、次いで非コンジュゲート化タンパク質で完了する。
【０１３２】
位置異性体の分離は、逆相−高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）Ｃ１８カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又はＶｙｄａｃ）を使用した逆相クロマトグラフィーにより、又はイオン交換カラム、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）イオン交換カラムを使用したイオン交換クロマトグラフィーにより行われる。同じ分子量を有するポリマー−活性薬剤異性体（位置異性体）を分離するために、どちらの手法も使用することができる。他の技術に加えて、ペプチドマッピングを使用して活性薬剤のポリマー結合の位置の決定を補助することができる。
【０１３３】
第ＶＩＩＩ因子部分の炭水化物に対するオキシムリンケージを含む第ＶＩＩＩ因子−水溶性ポリマーコンジュゲートは、その対応する非コンジュゲート化型と比較して増大したインビボ半減期を示す。インビボ半減期の増大は、文献に記載されているように、第ＶＩＩＩ因子欠損マウスにおいて、コンジュゲート及びコンジュゲーション前の第ＶＩＩＩ因子部分の薬物動態を測定することにより評価することができる。要約すると、第ＶＩＩＩ因子欠損マウスを第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子−水溶性ポリマーコンジュゲートのボーラス注射で処理し、血漿サンプル中の第ＶＩＩＩ因子抗原レベルを様々な時点で測定し得る。第ＶＩＩＩ因子抗原は、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定することができる。好ましいコンジュゲート及び組成物は、第ＶＩＩＩ因子活性の有意な測定値、例えば少なくとも約３０％以上、好ましくは少なくとも約４０％の非修飾第ＶＩＩＩ因子部分の保持、及び非修飾第ＶＩＩＩ因子の循環半減期の少なくとも約１．２〜約１．５倍に延長された循環半減期を有するであろう。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、完全長第ＶＩＩＩ因子、又は非Ｂドメイン削除第ＶＩＩＩ因子を使用する場合、対応するＰＥＧ−オキシム−第ＶＩＩＩ因子コンジュゲートは、第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン内に存在するグリコシル化部位の数に基づいて、Ｂドメイン内に相当な数のＰＥＧオキシム結合部位を有するであろう。例えば、Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ（２０１０），１６，６−１５を参照されたい。例えば、いくつかの実施形態では、コンジュゲート組成物における全ＰＥＧオキシム結合は、第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン内に位置する。更なる別の実施形態では、平均で、ＰＥＧオキシム結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）の９０％以上は、Ｂドメイン内にある。尚いくつかの別の実施形態では、平均でＰＥＧオキシム結合の８０％以上は、Ｂドメイン内にある。
【０１３５】
本開示は、本明細書に提供するコンジュゲート又は組成物を、１つ以上の薬学的に許容され得る賦形剤と組み合わせて含む医薬製剤も含む。一般に、コンジュゲート自体は固形（例えば、沈殿、凍結乾燥物等）であり、これは固形又は液状のいずれかであり得る好適な医薬賦形剤と組み合わせることができる。
【０１３６】
例示的な賦形剤としては、非限定的に、炭水化物、無機塩、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝液、酸、塩基、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられる。
【０１３７】
糖等の炭水化物、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖及び／又は糖ポリマー等の誘導体化糖は、賦形剤として存在することができる。特定の炭水化物賦形剤としては、例えば：果糖、麦芽糖、ガラクトース、ブドウ糖、Ｄ−マンノース、ソルボース等の単糖類；乳糖、ショ糖、トレハロース、セルビオース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、澱粉等の多糖類；及び、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトール等のアルジトールが挙げられる。
【０１３８】
賦形剤は、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二ナトリウム、及びそれらの組み合わせ等の無機塩又は緩衝液も含むことができる。
【０１３９】
製剤は、微生物増殖を防止又は阻止するための抗菌剤も含むことができる。本発明に好適な抗菌剤の非限定的な例としては、塩化ベンズアルコニウム、ベンゼトニウム塩化物、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４０】
抗酸化剤も製剤中に存在することができる。抗酸化剤は、酸化を防止することにより、コンジュゲート又は製剤の他の成分の変質を防止するのに使用される。本発明で使用するのに好適な抗酸化剤としては、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、ナトリウムホルムアルデヒドスルホキシレート、メタ重亜硫酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４１】
界面活性剤は、賦形剤として存在することができる。例示的な界面活性剤としては：「ツイーン２０」及び「ツイーン８０」等のポリソルベート、並びにＦ６８及びＦ８８（両方ともＢＡＳＦ，Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙから入手可能）等のプルロニック；ソルビタンエステル；レシチン及び他のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン（しかし、好ましくはリポソーム形態にない）等のリン脂質等の脂質、脂肪酸及び脂肪酸エステル；並びにコレステロール等のステロイドが挙げられる。
【０１４２】
酸又は塩基は、製剤中の賦形剤として存在し得る。使用できる酸の非限定的な例としては、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される酸が挙げられる。好適な塩基の例としては、非限定的に、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される塩基が挙げられる。
【０１４３】
医薬製剤は、全タイプの製剤、特に注射に適したもの、例えば再構成され得る粉末、並びに縣濁液及び溶液を包含する。組成物中の水溶性ポリマーオキシム−第ＶＩＩＩ因子コンジュゲート（即ち、本明細書に記載される活性薬剤とポリマーとの間で形成されたコンジュゲート）の量は、多数の因子に応じて変動するが、組成物が単位用量容器（例えば、バイアル）内に保管された場合に治療的に有効な用量であろう。加えて、医薬製剤は、注射器内に収容されてもよい。治療的に有効な用量は、どの量が臨床的に所望されるエンドポイントを生じるかを決定するために、コンジュゲートの量を増大させて繰り返し投与することにより、実験的に決定することができる。
【０１４４】
組成物中の任意の個々の賦形剤の量は、賦形剤の活性及び組成物の特定の必要性に応じて変動するであろう。典型的には、任意の個々の賦形剤の最適量は、日常的な実験により、即ち様々な量の賦形剤（少量から大量まで）を含む組成物を調製し、安定性及び他のパラメーターを試験した後、有意な有害作用を有することなく、最適なパフォーマンスが達成される範囲を決定することにより決定される。
【０１４５】
しかしながら、一般に賦形剤は、組成物中に約１重量％〜約９９重量％、好ましくは約５重量％〜９８重量％、より好ましくは約１５〜９５重量％の賦形剤の量で存在し、３０重量％未満の濃度が最も好ましい。
【０１４６】
これらの前述の医薬賦形剤は、他の賦形剤と共に、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５），ｔｈｅ  「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」，５２ｎｄ  ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ（１９９８），ａｎｄ  Ｋｉｂｂｅ，Ａ．Ｈ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２０００に記載されている。
【０１４７】
本発明の医薬製剤は、典型的には、必ずではないが、注射を介して投与され、従って一般に、投与の直前に液体溶液又は縣濁液である。医薬製剤は、シロップ剤、クリーム、軟膏、錠剤、散剤等の他の形態をとることもできる。経肺、直腸、経皮、経粘膜、経口、くも膜下腔内、皮下、動脈内等の他の投与モードも含まれる。
【０１４８】
前述したように、コンジュゲートは、静脈内注射により、又は比較的好ましくないが筋内若しくは皮下注射により非経口的に投与することができる。非経口投与に好適な製剤タイプとしては、中でも、注射の準備ができている溶液、使用前に溶媒と組み合わされる乾燥粉末、注射の準備ができている縣濁液、使用前にビヒクルと組み合わされる乾燥不溶性組成物、並びに投与前に希釈される乳剤及び液体濃縮物が挙げられる。
【０１４９】
本発明は、本明細書に提供する水溶性ポリマーオキシム−第ＶＩＩＩ因子コンジュゲートを、血友病Ａ等の、コンジュゲートを用いた処置に応答性の状態を患う患者に投与するための方法も提供する。方法は、一般に、注射を介して、治療的有効量のコンジュゲート（好ましくは、医薬製剤の一部として提供される）を投与することを含む。この投与方法を用いて、特定のコンジュゲートの投与により治療又は予防され得る任意の状態を処置することができる。当業者は、特定のコンジュゲートが効果的に処置できる状態を認識する。投与される実際の用量は、対象の年齢、体重、及び全身状態、並びに処置される状態の重篤さ、医療専門家の判断、並びに投与されるコンジュゲートに応じて変動するであろう。治療的有効量は、当業者に既知であり、並びに／又は関連する参考文書及び文献に記載されている。一般に、治療的有効量は、約０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは用量で０．０１ｍｇ／日〜７５ｍｇ／日、より好ましくは用量で０．１０ｍｇ／日〜５０ｍｇ／日の範囲である。例えば、例示的投与レジメンは、本明細書に提供するＰＥＧ−オキシム第ＶＩＩＩ因子コンジュゲートを約１０〜９０ＩＵ／ｋｇ、又は約１５〜８０ＩＵ／ｋｇ、又は約２０〜７５ＩＵ／ｋｇの用量で投与することを含み、各投与量のために、コンジュゲートは、例えば毎月１回、２週間に１回、毎週１回、又は更には毎週２回、投与される。
【０１５０】
この投与方法を用いて、コンジュゲートの投与により治療又は予防され得る任意の状態を処置することができる。当業者は、特定のコンジュゲートが効果的に処置できる状態を認識する。例えば、コンジュゲートを使用して血友病Ａを患う個人を処置することができる。加えて、コンジュゲートは、血友病を患う又は患わない患者における非制御の出血に対する予防薬としての使用に適している。従って、例えば、コンジュゲートは、手術前に非制御の出血の危険性のある患者に投与することができる。
【０１５１】
任意の所定のコンジュゲート（再度、好ましくは医薬製剤の一部として提供される）の単位投与量は、臨床医の判断、患者の必要性等に応じて、様々な投与スケジュールで投与することができる。特定の投与スケジュールは、当業者に既知であり、又は日常的な方法を用いて実験的に決定することができる。例示的な投与スケジュールとしては、非限定的に、１日５回、１日４回、１日３回、１日２回、１日１回、週に３回、週に２回、週に１回、月に２回、月に１回の投与、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。一旦臨床エンドポイントに到達したら、組成物の投与は停止される。
【０１５２】
本発明はその好ましい特定の実施形態に関連して記載されてきたが、前述の記載及び続く実験は、本発明の説明を意図するものであり、本発明の範囲を限定するものではないことを理解するべきである。本発明の範囲内の他の態様、利点及び修正は、本発明が属する技術分野の当業者に明らかとなる。
【０１５３】
本明細書に参照した全ての記事、書籍、特許、特許公開及び他の刊行物は、全体が参照により組み込まれる。
【実施例】
【０１５４】
本発明の実践は、特に示さない限り、当業者により理解され、文献に説明されているタンパク質化学等の従来の技術を使用する。以下の実施例では、使用する数字（例えば、量、温度等）に関連して正確性を確保するよう尽力したが、幾分かの実験誤差及び偏差を計上する必要がある。特に示さない限り、温度は摂氏であり、圧力は、海水面の大気圧又は大気圧付近である。全試薬は、特に示さない限り、商業的に得たものであった。
【０１５５】
以下の実例的ＰＥＧ化反応に使用した第ＶＩＩＩ因子は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ツイーン８０、ｐＨ７．１中３．５７ｍｇ／ｍｌの市販の完全長第ＶＩＩＩ因子（ＡＤＶＡＴＥ，Ｓｈｉｒｅ）であった。以後、この組成物を「ＦＶＩＩＩ溶液」と称する。
【０１５６】
タンパク質濃度は、ＢＳＡを基準として、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定した。
【０１５７】
以下の略語を使用する。
【０１５８】
実施例１
逆ウレタン（ＲＵ）−ＰＥＧ２−アミン、２０ｋＤの調製
【化１８】
2019532019.tif 000023
エチレンジアミン（１．２０ｇ、０．０２００モル）及びトリエチルアミン（１．０１ｇ、０．０２００モル）の無水ジクロロメタン（２００ｍＬ）溶液に、固体逆ウレタンＰＥＧ２−ＮＨＳ  ２０Ｋ（反応スキームの一番左、２０．０ｇ、０．００２０モル）を３０分間加え、この混合物を窒素雰囲気下で一晩撹拌した。次に、混合物を濾過し、減圧下で濃縮し、６００ｍＬのイソプロピルアルコールに加えた。沈殿生成物を濾去し、真空下で乾燥した。収率１９．２ｇ。
【０１５９】
ＮＭＲ分析は、逆−ウレタンＰＥＧ２−アミン−２０ｋＤ生成物の構造を確認した。
【０１６０】
実施例２
ｔ−Ｂｏｃ保護逆ウレタンＰＥＧ２−オキシミン（Ｏｘｙｍｉｎｅ）、２０ｋＤの調製
【化１９】
2019532019.tif 000024
ＲＵ−ＰＥＧ２−アミン２０Ｋ（１９．２ｇ、０．００１９モル）の無水ジクロロメタン（５００ｍＬ）溶液に、２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシ）酢酸（０．３６７ｇ、０．００１９モル）を加えた後、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．３６８ｇ、０．００１９モル）及びＮ，Ｎ−ジメチルピリジン（０．０５９ｇ、０．００４８モル）を加えた。この混合物を窒素雰囲気下で一晩撹拌し、次にこれをろ過し、減圧下で濃縮し、５００ｍＬのイソプロピルアルコールに加えた。沈殿生成物を濾去し、真空下で乾燥した。収率１９．２ｇ。
【０１６１】
ＮＭＲ分析は、得られた化合物の構造を確認した。
【０１６２】
実施例３
逆ウレタンＰＥＧ２−オキシアミン、２０ｋＤの調製
【化２０】
2019532019.tif 000025
ｔ−Ｂｏｃ保護逆ウレタンＰＥＧ２−オキシミン（Ｏｘｙｍｉｎｅ）２０Ｋ（１９．２ｇ、０．００１９モル）の無水ジクロロメタン（１００ｍＬ）及びトリフルオロ酢酸（１００ｍＬ）の混合物中の溶液を、室温で一晩撹拌した。次に、溶液を減圧下で濃縮し、５００ｍＬのイソプロピルアルコールに加えた。沈殿生成物を濾去し、真空下で一晩乾燥した。収率１９．２ｇ。（白色粉末、Ｍｎ＝２１９４６、多分散度１．００４）。
【０１６３】
ＮＭＲ分析は、得られた化合物の構造を確認した。
【０１６４】
実施例４
線状ｍＰＥＧ２０ｋＤ−オキシアミンを用いた完全長ｒＦＶＩＩＩの炭水化物ＰＥＧ化
例示的ＰＥＧ化反応に使用した第ＶＩＩＩ因子は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ツイーン８０、ｐＨ７．１中３．５７ｍｇ／ｍｌの市販の完全長第ＶＩＩＩ因子（ＡＤＶＡＴＥ，Ｓｈｉｒｅ）であった。以後、この組成物を「ＦＶＩＩＩ溶液」と称する。実例的反応性アミノオキシ−ＰＥＧとの反応の前に第ＶＩＩＩ因子を酸化して、炭水化物のビシナルジオールを、オキシアミンＰＥＧ試薬との反応に好適なアルデヒドに変換した。
【０１６５】
第ＶＩＩＩ因子の酸化：過ヨウ素酸塩酸化に先立って、ＦＶＩＩＩ溶液のｐＨを５００ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５溶液によりｐＨ７．１から６．０に調整した。新たに調製した過ヨウ素酸ナトリウム溶液の０．１Ｍ溶液０．０２４５ｍＬを、３．２７ｍＬ（３．２７ｍｇ／ｍＬ）のｐＨ６．０  ＦＶＩＩＩ溶液に移動した。反応混合物を暗所内にて室温で３０分間撹拌した。過ヨウ素酸塩酸化後、酸化ＦＶＩＩＩサンプルを、１０ｍＬ  Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラムを用いて、製造業者の指示書に従って２０ｍＭ  ＭＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０緩衝液中に緩衝液交換した。要約すると、カラムを遠心分離にかけて貯蔵液体を除去した後、５ｍＬ  ２０ｍＭ  ＭＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０緩衝液を３サイクルで添加し、遠心分離を行ってカラムを平衡化した。酸化ＦＶＩＩＩサンプルをスピンカラムに適用し、該カラムを再度遠心分離にかけて、酸化ＦＶＩＩＩを２０ｍＭ  ＭＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０緩衝液中に回収した。緩衝液交換後、ＦＶＩＩＩ濃度は３．１７ｍｇ／ｍＬと決定された。
【０１６６】
ＰＥＧ化及び続くメトキシアミンによる未反応アルデヒド基のキャッピング：０．２３ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬ  ｍＰＥＧ−２０Ｋオキシアミン（ＣＨ３Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ’−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ２、ＭＷ２０ｋＤ）溶液を、３．２７ｍＬの３．１７ｍｇ／ｍｌ酸化ＦＶＩＩＩ溶液に加えた（ｐＨ６．０）。反応混合物を室温で２時間撹拌した。酸化第ＶＩＩＩ因子の任意の未反応アルデヒド基をキャッピングするために、０．２３ｍＬの１００ｍｇ／ｍｌメトキシルアミン塩酸塩（１Ｎ  ＮａＯＨ中）をＰＥＧ化反応混合物に加え、室温で１５分間、更にインキュベートした。最終的に、反応混合物のｐＨを１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０により７．１に調整し、導電率が４．２ｍｓ／ｃｍ未満となるまで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２で希釈した。
【０１６７】
精製：アニオン交換クロマトグラフィーカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、５ｍＬ、カタログ番号：１７−１１５４−０１）をＡＫＴＡシステムと共に使用して、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩコンジュゲートを精製した。溶出緩衝液は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．１（緩衝液Ａ）、及び２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．１（緩衝液Ｂ）であった。サンプル負荷後、カラムを５ＣＶの緩衝液Ａで洗浄した後、１０ＣＶの０〜１００％  Ｂの勾配溶出を行った。ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩをプールし、１ｍＬの精製ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩをＰＥＧ化度分析のために取っておいた。最終的に、ツイーン８０を精製ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの残りに加えて、最終濃度０．１％とした。
【０１６８】
上述した一般的手法は、ＰＥＧ−５Ｋ−オキシアミンを使用した第ＶＩＩＩ因子コンジュゲートの調製にも用いた。異なるＰＥＧ化度を有するコンジュゲートは、第ＶＩＩＩ因子に対するＰＥＧ−オキシアミンのモル比を変動させることにより調製した。一般に、より高い第ＶＩＩＩ因子に対するＰＥＧの比は、より高いＰＥＧ化度を有するＰＥＧ−オキシム−第ＶＩＩＩ因子コンジュゲートをもたらした。
【０１６９】
ＰＥＧ化度（ＤＰ）の分析：ＰＥＧ化度の定義は、コンジュゲートにおけるＦＶＩＩＩ分子当たりのＰＥＧ−２０Ｋ又はＰＥＧ−５Ｋ分子の平均数である。即ち、ＰＥＧ化度は、ＰＥＧオキシアミンを用いたＰＥＧ化反応及び精製後の、オキシム含有リンケージ（即ち、オキシムリンケージ）を介して第ＶＩＩＩ因子部分に共有結合したＰＥＧ分子の数を記述する。ＦＶＩＩＩ−ＰＥＧ−２０Ｋ又はＦＶＩＩＩ−ＰＥＧ−５Ｋコンジュゲートをプロテアーゼ（プロナーゼ）により徹底的に消化して、タンパク質を消化し、それによりＰＥＧ（及び、潜在的にペプチド残基）を解放した。解放されたＰＥＧを、ＰＥＧ試薬を基準として使用して、ＨＰＬＣにより定量化した。要約すると、５μＬの３ｍｇ／ｍｌプロナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号：５３０７２）を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．１中の１４５μＬの０．６１ｍｇ／ｍｌ（タンパク質当量）のＰＥＧ化ＦＶＩＩＩに加えた。３７度で２４時間のインキュベーション後、ＰＥＧ試薬を基準として使用して、コンジュゲートから解放されたＰＥＧを、２０Ｋ  ＰＥＧ  ＦＶＩＩＩコンジュゲートの場合は屈折率検出器と連結したＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて、又は、５Ｋ  ＰＥＧ  ＦＶＩＩＩコンジュゲートの場合はＭＳ検出器と連結したＲＰ−ＨＰＬＣを用いて定量化した。この手法を用いれば、ＰＥＧ化度を決定することが可能であった。
【０１７０】
第ＶＩＩＩ因子−オキシム−ＰＥＧ−２０ｋＤ及び第ＶＩＩＩ因子−オキシム−ＰＥＧ−５ｄＤの複数のロットを調製及び分析した；より高いＰＥＧ化度を有するコンジュゲートは、一般に、第ＶＩＩＩ因子に対するＰＥＧオキシアミン試薬のモル比を増大させることによって調製した。ＰＥＧ−オキシム−２０ｋＤ−第ＶＩＩＩ因子コンジュゲートを調製し、約４〜２０の範囲内のＰＥＧ化度を有すると決定された。
【０１７１】
凝固活性をコンジュゲートに関して決定した（１段階ＡＰＴＴベース凝固アッセイ；Ｕ／ｍｇ）；ＰＥＧ−オキシム−２０ｋＤ−第ＶＩＩＩ因子コンジュゲートは、非修飾第ＶＩＩＩ因子に対して約５０パーセント〜約７５％の凝固活性を保持した。
【０１７２】
実施例５
線状ＭＰＥＧ５ｋＤ−オキシアミンを用いた完全長ｒＦＶＩＩＩの炭水化物ＰＥＧ化
上記の実施例４に記載したように、線状ＰＥＧ−５ｋＤオキシアミンを第ＶＩＩＩ因子上の炭水化物と反応させて（即ち、第ＶＩＩＩ因子の酸化、ＰＥＧ化及び未反応アルデヒド官能基のキャッピング）、対応するＰＥＧ−５ｋＤ−オキシム−第ＶＩＩＩ因子コンジュゲートを調製した。特定の反応関与体量をＰＥＧ化反応中に変動させて（例えば、第ＶＩＩＩ因子に対するＰＥＧ試薬の比）、異なるＰＥＧ化度を有するコンジュゲートを調製した。
【０１７３】
【表５】
2019532019.tif 000026
【０１７４】
ＰＥＧ化反応後、反応混合物のｐＨを１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０により７．１に調整し、反応混合物を更にＦＰＬＣ緩衝液Ａで希釈して導電率＜４．０ｍｓ／ｃｍ（４０〜６０ｍＬ）とした。以下の溶離系を用いてＦＰＬＣ精製を行った：カラムＱＨＰプレパック、５ｍＬ。緩衝液Ａ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．１／ＨＣｌ。緩衝液Ｂ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．１／ＨＣｌ。画分を収集し、分析して、ＰＥＧ化度を決定した。
【０１７５】
【表６】
2019532019.tif 000027
【０１７６】
実施例６
２０ｋＤ−ＲＵ−ＰＥＧ−オキシアミンを用いた完全長ｒＦＶＩＩＩの炭水化物ＰＥＧ化
第ＶＩＩＩ因子の酸化：過ヨウ素酸塩酸化に先立って、ＦＶＩＩＩ溶液のｐＨを５００ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５溶液によりｐＨ７．１から６．０に調整した。新たに調製した過ヨウ素酸ナトリウム溶液の０．１Ｍ溶液０．０５９２ｍＬを７．９ｍＬ（３．２７ｍｇ／ｍＬ）のｐＨ６．０  ＦＶＩＩＩ溶液に移動した。反応混合物を暗所内にて室温で３０分間撹拌した。過ヨウ素酸塩酸化後、酸化ＦＶＩＩＩサンプルを、１０ｍＬ  Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラムを用いて、製造業者の指示書に従って２０ｍＭ  ＭＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０緩衝液中に緩衝液交換した。要約すると、カラムを遠心分離にかけて貯蔵液体を除去した後、５ｍＬの２０ｍＭ  ＭＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０緩衝液を３サイクルで添加し、遠心分離を行ってカラムを平衡化した。酸化ＦＶＩＩＩサンプルをスピンカラムに適用し、該カラムを再度遠心分離にかけて、酸化ＦＶＩＩＩを２０ｍＭ  ＭＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０緩衝液中に回収した。緩衝液交換後、ＦＶＩＩＩ濃度は３．１７ｍｇ／ｍＬと決定された。
【０１７７】
ＰＥＧ化及び続くメトキシアミンによる酸化ＦＶＩＩＩの未反応アルデヒド基のキャッピング：逆ウレタンＰＥＧ２−オキシミン（Ｏｘｙｍｉｎｅ）２０Ｋの溶液を酸化ＦＶＩＩＩの溶液に加えた（ｐＨ６．０）。反応混合物を室温で約２時間撹拌した。酸化第ＶＩＩＩ因子の任意の未反応アルデヒド基をキャッピングするために、メトキシルアミン塩酸塩（１Ｎ  ＮａＯＨ中）をＰＥＧ化反応混合物に加え、室温で１５分間、更にインキュベートした。最終的に、反応混合物のｐＨを１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０により７．１に調整し、導電率が４．２ｍｓ／ｃｍ未満となるまで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２で希釈した。ＲＵ−ＰＥＧ２−オキシム−２０ｋＤ  ＰＥＧ化反応Ａ〜Ｄに関する試薬量及び反応条件を、以下の表にまとめる。
【０１７８】
【表７】
2019532019.tif 000028
【０１７９】
精製：アニオン交換クロマトグラフィーカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、５ｍＬ、カタログ番号：１７−１１５４−０１）をＡＫＴＡシステムと共に使用して、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩコンジュゲートを精製した。溶出緩衝液は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．１（緩衝液Ａ）、及び２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．１（緩衝液Ｂ）であった。サンプル負荷後、カラムを５ＣＶの緩衝液Ａで洗浄した後、１０ＣＶの０〜１００％  Ｂの勾配溶出を行った。ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩをプールし、１ｍＬの精製ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩをＰＥＧ化度分析のために取っておいた。最終的に、ツイーン８０を精製ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの残りに加えて、最終濃度０．１％とした。
【０１８０】
凝固活性をコンジュゲートに関して決定した（１段階ＡＰＴＴベース凝固アッセイ；Ｕ／ｍｇ）；ＲＵ−ＰＥＧ２−オキシム−２０ｋＤ第ＶＩＩＩ因子コンジュゲートは、非修飾第ＶＩＩＩ因子に対して約７０％を超える凝固活性を保持した。
【国際調査報告】
2019532019.tif 000031
2019532019.tif 000032
2019532019.tif 000033