(57)【要約】  本発明は、癌の治療あるいは転移性癌の治療又は予防における使用のための、細胞の分泌型細胞外小胞（ＳＥＶ）を含有する組成物であって、斯かる細胞が、活性化Ｔ細胞、細胞質、カルシニューリン依存性４核内因子（ＮＦＡＴＣ４）を発現する細胞である、組成物に関する。本発明はさらに、癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療の治療効率を決定又は予測するためのインビトロ方法であって、ＴＧＦβ１発現レベルの増大を誘導するＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物の能力に基づく方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療あるいは転移性癌の治療又は予防における使用のための、細胞の分泌型細胞外小胞（secreted extracellular vesicles）（ＳＥＶ）を含有する組成物であって、前記細胞が、活性化Ｔ細胞、細胞質、カルシニューリン依存性４核内因子（nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 4 )（ＮＦＡＴＣ４）を発現する細胞である、組成物。
【請求項２】
前記ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞の分泌型細胞外小胞（ＳＥＶ）が、低い浸潤能を有する癌細胞から精製されており、好ましくは、前記ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶが、低い浸潤能を有する乳癌細胞から精製されている、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
前記ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶが、ＮＦＡＴＣ４をコードする核酸分子を含む発現ベクターによってトランスフェクトされた細胞から精製されている、請求項１又は請求項２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
前記ＮＦＡＴＣ４をコードする核酸分子を含む発現ベクターによってトランスフェクトされた細胞が、以下：
・低い浸潤能を有する癌細胞、及び
・正常細胞、
から選択され、好ましくは前記正常細胞が、治療されることになる患者由来の自己線維芽細胞、又はヒト胚細胞、特にＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、
請求項３に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
前記癌が固形癌から選択され；好ましくは乳癌、黒色腫、膵臓癌、膠芽腫（glioblastoma）、結腸直腸癌、及び肺癌から選択され；より好ましくは前記癌が、乳癌、黒色腫、膵臓癌、及び膠芽腫から選択され、最も好ましくは前記癌が、乳癌、特に転移性乳癌である、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
前記ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物が、静脈内又は腫瘍内経路によって投与されることを意図している、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
細胞の試料からＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物を調製するための方法であって、以下：
ａ）前記細胞においてＮＦＡＴＣ４発現又は活性を誘導し；
ｂ）前記誘導細胞を、その増殖を可能にする条件下で、ＳＥＶを含まない培養培地中で培養し；並びに
ｃ）誘導細胞のＳＥＶを精製すること、
を含む、方法。
【請求項８】
ＳＥＶを含有する組成物を調製するために使用される細胞が、以下：
・低い浸潤能を有する癌細胞、及び
・正常細胞、
から選択され、好ましくは前記正常細胞が、治療されることになる患者由来の自己線維芽細胞である、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＮＦＡＴＣ４発現の誘導が、ＮＦＡＴＣ４をコードする核酸分子を含む発現ベクターで、細胞をトランスフェクトすることによって行われ；好ましくは前記発現ベクターが、プラスミド又はウイルス発現ベクターである、請求項７又は請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
トランスフェクトされた細胞によるＳＥＶが、超遠心分離によって、以下のステップ：
ａ）培養した細胞を１３５０ＲＰＭで１０分間４℃でスピンし、上清を回収し；
ｂ）回収した上清を３５００ＲＰＭで２０分間４℃でスピンし、上清を回収し；
ｃ）回収した上清を１０，０００ＲＰＭで３０分間４℃でスピンし、上清を回収し；
ｄ）回収した上清を４０，０００ＲＰＭで９０分間４℃で超遠心分離し、ペレットを回収し；
ｅ）ペレットを冷ＰＢＳ中に再懸濁し；並びに
ｆ）４０，０００ＲＰＭで９０分間４℃で超遠心分離し、ペレットを回収すること、
を用いて精製される、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
治療の開始前に採取した癌患者の第１の生物学的試料と、治療の開始後の癌患者の第２の対応する生物学的試料とから、治療された癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療の治療効率を決定するためのインビトロ方法であって、以下：
ａ）前記第１及び第２の生物学的試料において少なくともトランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦβ１）発現レベルをインビトロで測定し；
ｂ）少なくとも測定されたＴＧＦβ１発現レベルを比較し；並びに
ｃ）前記比較から、前記治療された癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療の効率を決定し、ここで、治療の開始後の生物学的試料において測定された少なくともＴＧＦβ１発現レベルが、治療の開始前の生物学的試料において測定された少なくともＴＧＦβ１発現レベルよりも高い場合に、治療が効率的であると考えられること、
を含む、方法。
【請求項１２】
前記生物学的試料が、腫瘍試料、血液試料、血清試料、及び尿試料から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
癌患者の癌試料から、癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療の治療効率を予測するためのインビトロ方法であって、以下：
ａ）前記腫瘍試料において少なくともＴＧＦβ１発現レベルをインビトロで測定し；
ｂ）前記癌試料を、ＮＦＡＴＣ４を発現するＳＥＶを含有する組成物と共にインキュベートし；
ｃ）ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞によるＳＥＶを含有する組成物と共にインキュベートした前記腫瘍試料において、少なくともＴＧＦβ１発現レベルをインビトロで測定し；並びに
ｄ）ステップｃ）で測定した少なくともＴＧＦβ１発現レベルが、ステップａ）で測定した少なくともＴＧＦβ１発現レベルよりも高い場合に、前記癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療を効率的と予測し、そして、ステップｃ）で測定した少なくともＴＧＦβ１発現レベルが、ステップａ）で測定した少なくともＴＧＦβ１発現レベル以下である場合に、前記癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療を非効率的と予測すること、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記癌患者の２つの生物学的試料における少なくともＴＧＦβ１の発現レベルが、核酸レベルで、又はタンパク質レベルで測定される、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌が、固形癌から選択され；好ましくは乳癌、黒色腫、膵臓癌、膠芽腫、結腸直腸癌、及び肺癌から選択され；より好ましくは前記癌が、乳癌、特に転移性乳癌である、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は腫瘍学の分野にあり、より詳細には癌及び転移性癌の治療に関する。本発明は、癌の治療あるいは転移性癌の治療又は予防における使用のための、細胞の分泌型細胞外小胞（ＳＥＶ）を含有する組成物であって、斯かる細胞が、活性化Ｔ細胞、細胞質、カルシニューリン依存性４核内因子（ＮＦＡＴＣ４）を発現する細胞である、組成物に関する。本発明はさらに、癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療の治療効率を決定又は予測するためのインビトロ方法であって、発現レベルの増大を誘導するＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物の能力に基づく方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
乳癌は世界中の女性の死亡率の主要な原因である。これら患者の主な死因は原発性腫瘍ではなく遠隔転移であり、これは、癌細胞の遊走性及び浸潤性の表現型に直接関連している。さらに、抗癌剤に対するデノボ（de novo）耐性及び獲得耐性は、依然として乳癌の治療における主要な障害である。また、治療に対する耐性は、しばしば、増大した癌の浸潤能及び転移の発生に関連し、いくつかの治療が、最初は原発性癌を治療するのに効率的であるが、同時に、より浸潤性の細胞の出現を促進し、最終的に治療に対する耐性と併せて転移をもたらすことを示唆している。他の癌についても同様である。したがって、原発性癌に対して効率的であるだけでなく、浸潤能及び転移の発生を阻害することになる新たな治療法が必要とされている。
【０００３】
また、全ての患者に有効な治療法は無く、任意の所与の治療法に対して耐性である患者の割合は異なることがよく知られている。非効率的な治療の長期投与（費用がかかるだけでなく患者の健康に有害でもある）を避けるために、患者を治療する前又は直後に、所与の患者についての所与の治療法の効率を予測するか又は少なくとも決定する能力を有する試験も必要とされている。
【０００４】
別の研究により、分泌型細胞外小胞（ＳＥＶ）は、腫瘍組織及び多くの体液において容易に検出することができ、かつ、癌患者の腫瘍組織と、血清及び血漿との両方において高濃度で検出されることが明らかになった（Ticknerら、Front Oncol 4、127(2014)）。分泌型細胞外小胞（ＳＥＶ）は、約４０ｎｍ〜数μｍのサイズの範囲の細胞分泌小胞を指す一般用語である。その中でも、エクソソームは、最も顕著に説明されたクラスのＳＥＶを含む。エクソソームは、約１５０ｎｍ未満の直径を有し、かつエンドソーム区画の誘導体である。ＳＥＶは、親細胞に由来する細胞質及び膜タンパク質を含む。ＳＥＶのタンパク質含有量はそれらの細胞起源に依存し、ＳＥＶは特定の分子、特にエンドソーム関連タンパク質（例えばＣＤ６３）及び多胞体形成に関与するタンパク質に富んでいるだけでなく、標的化／接着分子も含む。注目すべきことに、ＳＥＶは、タンパク質だけでなく機能的ｍＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ及びｍｉＲＮＡも含み、場合によっては、受容細胞にそれらの遺伝物質を送達することが示されている。ＳＥＶの積荷（cargo）は、潜在的に特に、腫瘍に対する標的化治療のために興味深く、それは、ＳＥＶが細胞外区画に分泌されるためであり、細胞外区画では、それらの内容物がその脂質膜のために分解から保護され、１つの細胞から排出されたＳＥＶは、周囲の細胞と融合することができ、従ってシグナル伝達応答を開始する可能性を有することが知られている（Hendrix, A.ら、Cancer Res.70、9533−9537(2010)）。
【０００５】
しかしながら、癌細胞由来ＳＥＶは、多くが癌の進行及び転移に関与していることが示されている（van der Pol E.ら、Pharmacol Rev 64:A−AD、2012）。注目すべきことに、ＳＥＶは、乳癌の腫瘍形成、転移及び薬物耐性における汎用性のあるプロモーターとして機能することが示されている（Yuら、Cancer Sci 106(2015)959-964）。同様に、ＭＦＧＥ８／ラクトアドヘリン２７のＣ１Ｃ２−ドメインに融合した膜結合型ルシフェラーゼを暴露する腫瘍由来ＳＥＶを用いた研究は、血液循環においてわずか２分間の半減期を示す。それらが循環から消えた数時間後に、ＳＥＶは脾臓で回収され、黒色腫由来のＳＥＶはまた、肺、肝臓、及び骨髄−好ましい転移部位と考えられる器官に蓄積した（Peinado, H.ら、Nat.Med.18、883−891(2012);Takahashi, Y.ら、J.Biotechnol.165、77−84(2013)）。別の研究は、近年、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来のＳＥＶがインビボでＴ４７Ｄ細胞に輸送され、その浸潤を増強し得ることを示した（Zomer, A.ら、Cell 161、1046−1057(2015)）。これは、周囲及び遠隔組織の両方が原発性腫瘍の特徴をとることが知られているため、腫瘍形成において特に重要である。最近の研究により、乳癌ＳＥＶが、腫瘍増殖を促進するプレｍｉＲＮＡ（pre-miRNA）突然変異の部位であることが示されている（Melo, S.A.ら、Cancer Cell 26、707−721(2014)）。癌細胞由来ＳＥＶの使用は、癌治療に有用というよりもむしろ有害であると思われる。
【０００６】
結果として、ＳＥＶを用いて癌を治療するためのほとんどの試みは、癌特異的物質に対する免疫応答を促すという発想に依存しており、この発想は、腫瘍特異的ペプチドを充填した抗原提示細胞（ＡＰＣ）由来ＳＥＶ（特に樹状細胞（ＤＣ）由来エクソソーム、免疫応答を開始するのに有用な分子に富んでいる）を用いる。いくつかの免疫応答が観察されているが、観察された治療効率は一般に低かった（van der Pol E.ら、Pharmacol Rev 64:A−AD、2012）。
【０００７】
ＮＦＡＴ転写因子のファミリーは５つの遺伝子を含む。ＮＦＡＴファミリーの特定のメンバーを含む分子経路は、乳癌細胞の遊走及び浸潤能において強調されている（Jauliac Sら、(2002)、Nat Cell Biol 4：540−544）。また、発癌におけるＮＦＡＴ因子の機能についての証拠が増えている（Mancini M、Toker A.(2009)、Nat Rev Cancer 9：810−820）。ＮＦＡＴＣ４（ＮＦＡＴ３としても知られている）は、Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ２遺伝子を標的化することによって乳癌細胞の運動性を阻害することが示されている。特に、ＮＦＡＴ３は、低浸潤能のエストロゲン受容体ａ陽性（ＥＲＡ＋）乳癌細胞で特に発現していること、並びに、ＮＦＡＴ３の発現ベクターによる形質導入は、ＥＲＡ＋（低浸潤能）及びＥＲＡ−（高浸潤能）乳癌細胞両方の浸潤を阻害することが示されている（Fougere, M.ら、(2010)、Oncogene、29(15)、2292−2301）。
【０００８】
しかしながら、ＳＥＶ組成物は、それを分泌する細胞によって影響を受けるが、ＳＥＶの分子組成はそれを分泌する細胞の単なる反映ではない。対照的に、ＳＥＶは特定のタンパク質、脂質及びＲＮＡに富んでいるが、他のものは存在しないため、ＳＥＶへの分子の分類を制御する特殊なメカニズムが存在することを示している（Villarroya-Beltri C.ら、Semin Cancer Biol.2014 October ;28：3−13;Al-Nedawi, K.ら、Nature Publishing Group 10、619−624(2008);Ohshima, K.ら、PLoS ONE 5、e13247(2010);Soldevilla, B.ら、Hum.Mol.Genet.23、467−478(2014)）。特に、ＳＥＶは、それを分泌する細胞の膜貫通受容体、特に発癌性膜貫通受容体、例えばＥＧＦＲｖＩＩＩを含んでいることが知られている（Al-Nedawi, K.ら、Nature Publishing Group 10、619−624(2008)）。しかしながら、それを分泌する細胞の転写因子のＳＥＶにおける存在を保証することはできない。例えば、Al-Nedawi, K.らは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋グリオーマ細胞ＳＥＶが発癌性膜貫通受容体ＥＧＦＲｖＩＩＩを含み、それを他のＥＧＦＲｖＩＩＩ−グリオーマ細胞に送るが、ＥＧＦＲｖＩＩＩエフェクター、例えばＥｒｋ１／２及びＡｋｔは、ＳＥＶにおいてほとんど検出不可能であることを示した。
【０００９】
また、低浸潤能及び高浸潤能両方の乳癌細胞株によって分泌されたＳＥＶは、細胞遊走を促進することも示されており（Harris DA、ら、PLoS ONE 10(3)：e0117495.）、そのようなＳＥＶはむしろ癌の進行及び浸潤を促進するであろうことを示唆している。
【発明の概要】
【００１０】
発明の概要
本発明の文脈において、発明者ら驚くべきことに、ヒト線維芽細胞又は高度に浸潤性の乳癌細胞株によって産生されたＳＥＶとは対照的に、低浸潤性乳癌細胞によって分泌されたＳＥＶであって、ＮＦＡＴＣ４を発現するＳＥＶは、癌の進行及び浸潤を促進しないが、代わりにインビトロでの浸潤を阻害し、かつインビボ異種移植モデルでの腫瘍増殖及び転移を阻害することを見出した。本発明者らはまた、驚くべきことに、高度に浸潤性の細胞株の浸潤能に対する低浸潤性乳癌細胞によって産生されたＳＥＶの阻害効果が、低浸潤性ＳＥＶ産生細胞におけるＮＦＡＴＣ４の発現を必要とすることも見出した。
【００１１】
本発明者らはさらに、低浸潤性ＳＥＶ産生細胞におけるＮＦＡＴＣ４の発現が、高度に浸潤性の乳癌細胞株におけるＴＧＦβ１発現のデノボ誘導をもたらし、これは、ＳＥＶがインビトロで乳癌細胞浸潤を調節するために必要であり、かつインビボでの治療効率と相関していることを予期せず見出した。したがって、低浸潤性癌細胞によって産生されたＳＥＶを投与された患者におけるＴＧＦβ１濃度の上昇は、治療の治療効率のバイオマーカーとして使用され得る。
【００１２】
したがって、第１の態様では、本発明は、癌の治療あるいは転移性癌の治療又は予防における使用のための、細胞の分泌型細胞外小胞（ＳＥＶ）を含有する組成物であって、斯かる細胞が、活性化Ｔ細胞、細胞質、カルシニューリン依存性４核内因子（ＮＦＡＴＣ４）を発現する細胞である、組成物に関する。
【００１３】
第２の態様では、本発明はまた、細胞の試料からＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物を調製するための方法であって、以下：
ａ）前記細胞においてＮＦＡＴＣ４発現又は活性を誘導し；
ｂ）前記誘導細胞を、その増殖を可能にする条件下で、ＳＥＶを含まない培養培地中で培養し；並びに
ｃ）誘導細胞のＳＥＶを精製すること、
を含む、方法に関する。
【００１４】
第３の態様では、本発明はまた、治療の開始前に採取した癌患者の第１の生物学的試料と、治療の開始後の癌患者の第２の対応する生物学的試料とから、治療された癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療の治療効率を決定するためのインビトロ方法であって、以下：
ａ）前記第１及び第２の生物学的試料において少なくともトランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦβ１）発現レベルをインビトロで測定し；
ｂ）測定されたＴＧＦβ１発現レベルを比較し；並びに
ｃ）前記比較から、前記治療された癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療の効率を決定し、ここで、治療の開始後の生物学的試料において測定されたＴＧＦβ１発現レベルが、治療の開始前の生物学的試料におけるＴＧＦβ１発現レベルよりも高い場合に、治療が効率的であると考えられること、
を含む、方法に関する。
【００１５】
第４の態様では、本発明はまた、癌患者の癌試料から、癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療の治療効率を予測するためのインビトロ方法であって、以下：
ａ）前記腫瘍試料において少なくともＴＧＦβ１発現レベルをインビトロで測定し；
ｂ）前記癌試料を、ＮＦＡＴＣ４を発現するＳＥＶを含有する組成物と共にインキュベートし；
ｃ）ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞によるＳＥＶを含有する組成物と共にインキュベートした前記腫瘍試料において、少なくともＴＧＦβ１発現レベルをインビトロで測定し；並びに
ｄ）ステップｃ）で測定した少なくともＴＧＦβ１発現レベルが、ステップａ）で測定した少なくともＴＧＦβ１発現レベルよりも高い場合に、前記癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療を効率的と予測し、そして、ステップｃ）で測定した少なくともＴＧＦβ１発現レベルが、ステップａ）で測定した少なくともＴＧＦβ１発現レベル以下である場合に、前記癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療を非効率的と予測すること、
を含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｔ４７Ｄ及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によって産生されたＳＥＶのサイズ及び特異的マーカーによる特徴付け。NanoSightによって評価した、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ａ）及びＴ４７Ｄ（Ｂ）によって産生されたＳＥＶのサイズ分布の代表例。ＳＥＶ濃度（粒子／ｍｌ：ｐｐ／ｍＬ）を粒子サイズ（ｎｍ）の関数で示す。（Ｃ）ＳＥＶ特徴付けのためのウェスタンブロット：全細胞タンパク質抽出物を、カルネキシンに対する抗体；ＣＤ６３及びＣＤ８１を用いて両方の細胞型についてＳＥＶタンパク質画分と比較した。
【図２】低浸潤性Ｔ４７Ｄ及びＭＣＦ７細胞によって産生されたＳＥＶは、高度に浸潤性のＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＳＵＭ１５９ＰＴ乳癌細胞並びにＷＭ．２６６．４黒色腫細胞の浸潤を阻害する。（Ａ）ＷＴ  Ｔ４７Ｄ又はＷＴ  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１によって、あるいは２つの異なる女性の肌から得られた２つの異なる原発性真皮線維芽細胞（ＦＨＮ２１、ＦＨＮ３２）によって産生された３，７５ｘ１０8ｐｐのＳＥＶのいずれかで、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を２４時間処理し、そして、インビトロで６時間浸潤アッセイに供した（ｎ＝２；＊ｐ＜０，０５）。浸潤指数は、任意に１に設定した対照ウェル中の浸潤性細胞の数と比較した、処理ウェル中の浸潤性細胞の数の割合として計算される。（Ｂ）黒色腫細胞株（ＷＭ．２６６．４）を、ＷＴ  Ｔ４７Ｄによって産生された３，７５ｘ１０8ｐｐのＳＥＶで２４時間処理し、インビトロで６時間浸潤アッセイに供した（ｎ＝３；＊＊ｐ＜０，００５）。（Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、ＷＴ  Ｔ４７Ｄ又はＷＴ  ＭＣＦ７のいずれかによって産生された３，７５ｘ１０8ｐｐのＳＥＶで２４時間処理し、インビトロで６時間浸潤アッセイに供した（ｎ＝３；＊＊＊ｐ＜０，０００５）。（Ｄ）ＳＵＭ−１５９−ＰＴを、ＷＴ  Ｔ４７Ｄ又はＷＴ  ＭＣＦ７のいずれかによって産生された３，７５ｘ１０8ｐｐのＳＥＶで２４時間処理し、インビトロで６時間浸潤アッセイに供した（ｎ＝３；＊＊＊ｐ＜０，０００５）。
【図３】低浸潤性乳癌細胞由来のＳＥＶは、高度に浸潤性の乳癌細胞の増殖を改変しない。Ｔ４７Ｄ−ＷＴ由来のＳＥＶの指示量を用いて、高度に浸潤性のＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｎ＝２）（Ａ）を２４時間処理し、かつＳＵＭ−１５９−ＰＴ（ｎ＝２）（Ｂ）を２４、４８及び７２時間処理し、ＢｒｄＵ取り込み（Ａ）又は直接細胞計数（Ｂ）のいずれかによって細胞増殖を評価した。（Ｃ）高度に浸潤性のＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、Ｔ４７Ｄ−ＷＴ由来のＳＥＶを用いて４８時間処理して、細胞アポトーシスを評価した（ｎ＝２）。
【図４】高浸潤性細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＳＵＭ−１５９−ＰＴ）の浸潤能に対するＳＥＶの阻害効果は、低浸潤性ＳＥＶ産生細胞株Ｔ４７ＤにおけるＮＦＡＴ３の発現を必要とする。（Ａ）ｓｈＣｔｒｌ、ｓｈＮＦＡＴ３−３又はｓｈＮＦＡＴ３−４のいずれかを発現するＴ４７Ｄ細胞のウェスタンブロット。細胞溶解物全体を抗ＮＦＡＴ３によって暴露し、タンパク質の量を抗アクチンとの暴露によって正規化した。高度に浸潤性のＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｂ）又はＳＵＭ１５９ＰＴ（Ｃ）細胞を、低浸潤性Ｔ４７Ｄ乳癌細胞株ＷＴによって産生されたＳＥＶ、あるいは、内在性ＮＦＡＴ３の発現を５０％に減少させるｓｈＲＮＡ（ｓｈＮＦＡＴ３−３、ｓｈＮＦＡＴ３−４）並びに、対照としてのｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣｔｒｌ）を安定して発現するＳＥＶで前処理し又は前処理せずに、それらの浸潤能を試験した（ｎ＝３，＊＊ｐ＜０．００５）。浸潤指数は、任意に１に設定した対照ウェル中の浸潤性細胞の数と比較した、処理ウェル中の浸潤性細胞の数の割合として計算される。
【図５】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＴＧＦｂ１のデノボ誘導は、乳癌細胞浸潤を調節するためにＳＥＶを必要とする。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、アクチノマイシンの存在下又は非存在下で、ＷＴ−Ｔ４７Ｄによって分泌されたＳＥＶと共にインキュベートし、ＴＧＦβ１をＥＬＩＳＡによって測定した（ｎ＝２；＊ｐ＜０，０５）。（Ｂ）高度に浸潤性のＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、ｓｉＲＮＡ対照により、又は内在性ＴＧＦｂ１に向けられたｓｉＲＮＡにより、一時的にトランスフェクトし、低浸潤性ＷＴ−Ｔ４７Ｄ乳癌細胞株によって産生されたＳＥＶで前処理し又は前処理せずに、それらの浸潤能について試験した。場合によっては、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を外因性ＴＧＦｂ１で処理して、ｓｉＲＮＡの効果を逆転させた（ｎ＝２；＊ｐ＜０，００５）。
【図６】ＷＴ−Ｔ４７Ｄ細胞によって産生されたＳＥＶは、ｈＴＧＦＢ１プロモーターの活性を上方制御する能力がある。（Ａ）ｈＴＧＦｂ１プロモーターの模式図。６つの潜在的なＮＦＡＴ結合部位がＮＦＡＴ結合部位を用いて見出され、それらはアドレス：ソフトウェア：http://www.fast-db.com/perl/nfat.plで開発され；＋１開始部位に対する相対位置が示されている。（Ｂ）ＳＵＭ−１５９−ＰＴ細胞を、ｐＣＳ４−（ｎ）−ｂ−ガラクトシダーゼ及びｈＴＧＦｂ１プロモータープラスミド又は対照としてのｐＧＬ３ベーシックベクターを用いてコトランスフェクトし、ＷＴ−Ｔ４７ＤからのＳＥＶで処理するか又は処理しないままとした。２４時間後、細胞を、ルシフェラーゼ及びｂ−ガラクトシダーゼ活性について分析した。ｈＴＧＦｂ１プロモーター媒介性ルシフェラーゼ活性の定量化はｂ−ガラクトシダーゼの活性に対して正規化され、ｐＧＬ３ベーシックベクターの対照ルシフェラーゼ活性と比較した。（ｎ＝２；＊ｐ＜０，００５）。
【図７Ａ−７Ｂ】低浸潤性乳癌細胞株によって産生されたＳＥＶの静脈内注射は、腫瘍増殖及び転移の出現を阻害し、ＴＧＦｂ１の誘導と相関する。（Ａ）１００ｍｌのＰＢＳ中の１．１０6個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（Ｄ３Ｈ２ＬＮ）を、それぞれ６週齢の雌のマウスAthymic Nude-Foxn1nuマウスの左脂肪体（left Fat Pad）に注射した。腫瘍増殖は、平均腫瘍体積（ｃｍ３）として、脂肪体における細胞移植の７日後に、ＰＢＳで毎週静脈内注射されたマウスＮ°６２９（Ａ及びＢ）からのデータ、並びに、ＷＴ  Ｔ−４７Ｄによって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで毎週静脈内注射されたマウスＮ°６１０（Ａ）又はＮ°６２５（Ｂ）からのデータにより、提示される。血液中の血清ＴＧＦｂ１測定は、ｎｇ／ｍｌとして、ＰＢＳで毎週静脈内注射されたマウスＮ°６２９（Ａ及びＢ）からのデータ、並びに、ＷＴ  Ｔ４７Ｄによって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで毎週静脈内注射されたマウスＮ°６１０（Ａ）又はＮ°６２５（Ｂ）からのデータにより、提示される。（Ｃ及びＤ）４２日に開始して、毎週、生物発光画像（原発性腫瘍は黒色組織で遮蔽された）を、Xenogenシステムで取得して、転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によって生成された平均光子束を定量した。転移の定量化は、転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によって生成された平均光子束として、ＰＢＳで毎週静脈内注射されたマウスＮ°６２９（Ｃ及びＤ）からのデータ、並びに、ＷＴ  Ｔ４７Ｄによって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで毎週静脈内注射されたマウスＮ°６１０（Ｃ）又はＮ°６２５（Ｄ）からのデータにより、提示される。血中のＴＧＦｂ１測定は、ｎｇ／ｍｌとして、ＰＢＳで毎週静脈内注射されたマウスＮ°６２９（Ａ及びＢ）からのデータ、並びに、ＷＴ  Ｔ４７Ｄによって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶを静脈内に毎週注射されたマウスＮ°６１０（Ｃ）又はＮ°６２５（Ｄ）からのデータにより提示される。
【図７Ｃ−７Ｄ】低浸潤性乳癌細胞株によって産生されたＳＥＶの静脈内注射は、腫瘍増殖及び転移の出現を阻害し、ＴＧＦｂ１の誘導と相関する。（Ａ）１００ｍｌのＰＢＳ中の１．１０6個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（Ｄ３Ｈ２ＬＮ）を、それぞれ６週齢の雌のマウスAthymic Nude-Foxn1nuマウスの左脂肪体（left Fat Pad）に注射した。腫瘍増殖は、平均腫瘍体積（ｃｍ３）として、脂肪体における細胞移植の７日後に、ＰＢＳで毎週静脈内注射されたマウスＮ°６２９（Ａ及びＢ）からのデータ、並びに、ＷＴ  Ｔ−４７Ｄによって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで毎週静脈内注射されたマウスＮ°６１０（Ａ）又はＮ°６２５（Ｂ）からのデータにより、提示される。血液中の血清ＴＧＦｂ１測定は、ｎｇ／ｍｌとして、ＰＢＳで毎週静脈内注射されたマウスＮ°６２９（Ａ及びＢ）からのデータ、並びに、ＷＴ  Ｔ４７Ｄによって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで毎週静脈内注射されたマウスＮ°６１０（Ａ）又はＮ°６２５（Ｂ）からのデータにより、提示される。（Ｃ及びＤ）４２日に開始して、毎週、生物発光画像（原発性腫瘍は黒色組織で遮蔽された）を、Xenogenシステムで取得して、転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によって生成された平均光子束を定量した。転移の定量化は、転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によって生成された平均光子束として、ＰＢＳで毎週静脈内注射されたマウスＮ°６２９（Ｃ及びＤ）からのデータ、並びに、ＷＴ  Ｔ４７Ｄによって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで毎週静脈内注射されたマウスＮ°６１０（Ｃ）又はＮ°６２５（Ｄ）からのデータにより、提示される。血中のＴＧＦｂ１測定は、ｎｇ／ｍｌとして、ＰＢＳで毎週静脈内注射されたマウスＮ°６２９（Ａ及びＢ）からのデータ、並びに、ＷＴ  Ｔ４７Ｄによって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶを静脈内に毎週注射されたマウスＮ°６１０（Ｃ）又はＮ°６２５（Ｄ）からのデータにより提示される。
【図８Ａ−８Ｂ】低浸潤性乳癌細胞株によって産生されたＳＥＶの腫瘍内注射は、腫瘍増殖及び転移の出現を阻害し、ＴＧＦｂ１の誘導と相関する。（Ａ）１００ｍｌのＰＢＳ中の１．１０6個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（Ｄ３Ｈ２ＬＮ）を、それぞれ６週齢の雌のマウスAthymic Nude-Foxn1nuマウスの左脂肪体に注射した。腫瘍増殖は、平均腫瘍体積（ｃｍ３）として、脂肪体への細胞移植の７日後に、ＰＢＳで毎週腫瘍内注射されたマウスＮ°６１７（Ａ及びＢ）からのデータ、並びに、ＷＴ  Ｔ−４７Ｄによって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで毎週腫瘍内注射されたマウスＮ°６１４（Ａ）又はＮ°６０２（Ｂ）からのデータにより、提示される。血液中の血清ＴＧＦｂ１測定は、ｎｇ／ｍｌとして、ＰＢＳで毎週腫瘍内注射されたマウスＮ°６２９（Ａ及びＢ）からのデータ、並びに、ＷＴ  Ｔ４７Ｄによって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで毎週静脈内注射されたマウスＮ°６１７（Ａ）又はＮ°６０２（Ｂ）からのデータにより提示される。（Ｃ及びＤ）４２日に開始して、毎週、生物発光画像（原発性腫瘍は黒色組織で遮蔽された）を、Xenogenシステムで取得して、転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によって生成された平均光子束を定量した。転移の定量化は、転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によって生成された平均光子束として、ＰＢＳで毎週腫瘍内注射されたマウスＮ°６１７（Ｃ及びＤ）からのデータ、並びに、ＷＴ  Ｔ４７Ｄによって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで毎週腫瘍内注射されたマウスＮ°６１４（Ｃ）又はＮ°６０２（Ｄ）からのデータにより提示される。血中のＴＧＦｂ１測定は、ｎｇ／ｍｌとして、ＰＢＳで毎週腫瘍内注射されたマウスＮ°６１７（Ａ及びＢ）からのデータ、並びに、ＷＴ  Ｔ４７Ｄによって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで毎週腫瘍内注射されたマウスＮ°６１４（Ｃ）又はＮ°６０２（Ｄ）からのデータにより提示される。
【図８Ｃ−８Ｄ】低浸潤性乳癌細胞株によって産生されたＳＥＶの腫瘍内注射は、腫瘍増殖及び転移の出現を阻害し、ＴＧＦｂ１の誘導と相関する。（Ａ）１００ｍｌのＰＢＳ中の１．１０6個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（Ｄ３Ｈ２ＬＮ）を、それぞれ６週齢の雌のマウスAthymic Nude-Foxn1nuマウスの左脂肪体に注射した。腫瘍増殖は、平均腫瘍体積（ｃｍ３）として、脂肪体への細胞移植の７日後に、ＰＢＳで毎週腫瘍内注射されたマウスＮ°６１７（Ａ及びＢ）からのデータ、並びに、ＷＴ  Ｔ−４７Ｄによって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで毎週腫瘍内注射されたマウスＮ°６１４（Ａ）又はＮ°６０２（Ｂ）からのデータにより、提示される。血液中の血清ＴＧＦｂ１測定は、ｎｇ／ｍｌとして、ＰＢＳで毎週腫瘍内注射されたマウスＮ°６２９（Ａ及びＢ）からのデータ、並びに、ＷＴ  Ｔ４７Ｄによって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで毎週静脈内注射されたマウスＮ°６１７（Ａ）又はＮ°６０２（Ｂ）からのデータにより提示される。（Ｃ及びＤ）４２日に開始して、毎週、生物発光画像（原発性腫瘍は黒色組織で遮蔽された）を、Xenogenシステムで取得して、転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によって生成された平均光子束を定量した。転移の定量化は、転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によって生成された平均光子束として、ＰＢＳで毎週腫瘍内注射されたマウスＮ°６１７（Ｃ及びＤ）からのデータ、並びに、ＷＴ  Ｔ４７Ｄによって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで毎週腫瘍内注射されたマウスＮ°６１４（Ｃ）又はＮ°６０２（Ｄ）からのデータにより提示される。血中のＴＧＦｂ１測定は、ｎｇ／ｍｌとして、ＰＢＳで毎週腫瘍内注射されたマウスＮ°６１７（Ａ及びＢ）からのデータ、並びに、ＷＴ  Ｔ４７Ｄによって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで毎週腫瘍内注射されたマウスＮ°６１４（Ｃ）又はＮ°６０２（Ｄ）からのデータにより提示される。
【図９】ＳＥＶの腫瘍内注射の腫瘍増殖に対する阻害効果は、Ｔ４７Ｄ−ＳＥＶ産生細胞におけるＮＦＡＴ３の発現を必要とし、ＴＧＦｂ１の誘導と相関する。１００ｍｌのＰＢＳ中の１．１０6個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（Ｄ３Ｈ２ＬＮ）を、それぞれ６週齢の雌のマウスAthymic Nude-Foxn1nuマウスの左脂肪体に注射した。（Ａ）腫瘍増殖は、平均腫瘍体積（ｃｍ３）±ＳＥＭとして、脂肪体における細胞移植の７日後に、ＰＢＳで毎週腫瘍内注射されたマウスから（ＰＢＳ）、ｓｈＣｔｒｌ感染Ｔ４７Ｄ細胞によって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで毎週腫瘍内に注射されたマウスから（５０．１０8  Ｔ４７Ｄ−ｓｈＣｔｒｌ腫瘍内）、ｓｈＮＦＡＴ３−４感染Ｔ４７Ｄ細胞によって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで毎週腫瘍内に注射されたマウスから（５０．１０8  Ｔ４７Ｄ−ｓｈＮＦＡＴ３−４腫瘍内）、ｓｈＮＦＡＴ３−３感染Ｔ４７Ｄ細胞によって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで毎週腫瘍内に注射されたマウスから提示される、各群につき８匹のマウス。ＰＢＳで腫瘍内注射されたマウスで各時点について、両側の対応の無いスチューデントのｔ検定を用いて、比較を行った。（Ｂ）４２日に開始して、毎週、生物発光画像（原発性腫瘍は黒色組織で遮蔽された）を、Xenogenシステムで取得して、転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によって生成された平均光子束を定量した。転移の定量化は、転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によって生成された平均光子束として、ＰＢＳ、あるいは５０．１０8 ｐｐのＳＥＶ  Ｔ４７Ｄ−ｓｈＣｔｒｌ腫瘍内若しくは５０．１０8 ｐｐのＳＥＶ  Ｔ４７Ｄ−ｓｈＮＦＡＴ３−４腫瘍内、又は５０．１０8 ｐｐのＳＥＶのｓｈＮＦＡＴ３−３感染Ｔ４７Ｄ細胞によって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで毎週静脈内注射されたマウスからのデータにより提示される。＊ｐ＜０．０５  ＊＊ｐ＜０．００５及び  ＊＊＊ｐ＜０．０００５。（Ｃ）及び（Ｄ）血清を、群（Ａ）のマウスから毎週採取し、血清中に存在するＴＧＦｂ１の濃度を実験の最後にＥＬＩＳＡアッセイにより評価した。（Ｃ）各群の各点は、１〜９週の血清中のＴＧＦｂ１濃度の６０日平均を表す。ＰＢＳで腫瘍内注射されたマウスの各群で各時点について、両側の対応の無いスチューデントのｔ検定を用いて、比較を行った。＊ｐ＜０．０５。（Ｄ）データは、（Ａ）におけるように、１〜９週のマウスの各群について表される。
【図１０】Ｔ４７Ｄ細胞によって産生されたＳＥＶの遅延注射は、腫瘍増殖を阻害する。１００ｍｌのＰＢＳ中の０，５．１０6個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（Ｄ３Ｈ２ＬＮ）を、それぞれ６週齢の雌のAthymic Nude-Foxn1nuマウスの左脂肪体に注射した。（Ａ）腫瘍増殖は、平均腫瘍体積（ｃｍ３）＋／−ＳＥＭとして、２７日に開始してＰＢＳで静脈内に毎週注射されたマウスから（ＰＢＳ）、２７日に開始してＴ４７Ｄ−ＷＴ細胞によって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで静脈内に毎週注射されたマウスから提示される。（Ｂ）腫瘍増殖は、平均腫瘍体積（ｃｍ３）＋／−ＳＥＭとして、２７日に開始してＰＢＳで腫瘍内に毎週注射されたマウスから（ＰＢＳ）、２７日に開始してＴ４７Ｄ−ＷＴ細胞によって産生された５０．１０8ｐｐのＳＥＶで腫瘍内に毎週注射されたマウスから提示される。両側の対応の無いスチューデントの検定を用いて各時点について比較を行った。＊ｐ＜０，０５、＊＊ｐ＜０，００５、＊＊＊ｐ＜０，０００５．（８匹のマウス／群）。
【図１１】提案される療法開発の概略図。
【図１２】ＮＦＡＴ３は、Ｔ４７Ｄ細胞におけるようにＨＥＫ細胞において発現される。Ｔ４７Ｄ細胞及びＨＥＫ細胞を、非標的化ｓｉＲＮＡ対照（ｓｉＣｔｌ）又は内在性ＮＦＡＴ３を標的化するｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＦＡＴ３）のいずれかで、一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、全細胞溶解物を、ＮＦＡＴ３に対する抗体で内在性ＮＦＡＴ３についてプローブした。アクチンに対する抗体で膜をプロービングすることによって、等負荷（equal loading）の対照を評価した。
【図１３】ＮＦＡＴ３発現ＨＥＫ細胞の生成。（Ａ）ｔｄＴｏｍａｔｏタグと融合されたＨＥＫ細胞を感染させるために使用されるＮＦＡＴ３コンストラクトの表示。（Ｂ）Ｔ４７Ｄ乳癌細胞を、ＮＦＡＴ３  ＷＴのベクター対照、ΔＮＦＡＴ３又は最後の８５Ｃ末端アミノ酸を欠いたＮＦＡＴ３のいずれかで一時的にトランスフェクトし、古典的なトランズウェル（トランズウェル）浸潤アッセイにおいてそれらの浸潤能について評価した。（Ｃ）ＨＥＫ産生ＳＥＶにおける異なるＮＦＡＴ３コンストラクトの発現を、示された抗体を用いたウェスタンブロットによって評価した。
【図１４】ＨＥＫ細胞によって産生されたＳＥＶのサイズ及び特異的マーカーによる特徴付け。ＨＥＫ  ｔｏ−Ｃｔｌ（Ａ）、ＨＥＫ  ｔｏ−ＮＦＡＴ３（Ｂ）によって産生されたＳＥＶのサイズ分布の代表例。ＨＥＫ  ｔｏ−ΔＮＦＡＴ３（Ｃ）及びＨＥＫ  ｔｏ−ＮＦＡＴ３−８５Ｃ（Ｄ）は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔによって評価された。ＳＥＶ濃度（粒子／ｍｌ：ｐｐ／ｍＬ）は、粒子サイズ（ｎｍ）の関数で示される。
【図１５】ＮＦＡＴ３発現ＨＥＫ細胞によって産生されたエクソソームは、高度に浸潤性のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤を阻害する。（Ａ）高度に浸潤性の乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を、エクソソームを用いて前処理し又は前処理せずに、それらの浸潤能について試験した、ここで、斯かるエクソソームは、低浸潤性Ｔ４７Ｄ乳癌細胞株ＷＴ、あるいはｔｏ−ＮＦＡＴ３又はｔｏ−ΔＮＦＡＴ３又はｔｏ−ＮＦＡＴ３−８５Ｃ）のいずれか及び対照としての空ベクター（ｔｏ−Ｃｔｌ）を安定して発現するＨＥＫヒト胚細胞株のいずれかによって産生された。＊ｐ＜０．０５  ＊＊ｐ＜０．００５及び＊＊＊ｐ＜０．０００５、未処理細胞（−）と比較した。（ｎ＝２）。（Ｂ）高度に浸潤性の乳癌細胞（ＳＵＭ−１５９−ＰＴ）を、エクソソームを用いて前処理し又は前処理せずに、それらの浸潤能について試験した、ここで、斯かるエクソソームは、低浸潤性Ｔ４７Ｄ乳癌細胞株ＷＴ、あるいはｔｏ−ＮＦＡＴ３又はｔｏ−ΔＮＦＡＴ３又はｔｏ−ＮＦＡＴ３−８５Ｃ）のいずれか及び対照としての空ベクター（ｔｏ−Ｃｔｌ）を安定して発現するＨＥＫヒト胚細胞株のいずれかによって産生された。＊ｐ＜０．０５  ＊＊ｐ＜０．００５及び＊＊＊ｐ＜０．０００５、未処理細胞（−）と比較した。（ｎ＝２）（Ｃ）高度に浸潤性の膵臓癌細胞（ＢＸＰＣ３）を、エクソソームを用いて前処理し又は前処理せずに、それらの浸潤能について試験した、ここで、斯かるエクソソームは、低浸潤性Ｔ４７Ｄ乳癌細胞株ＷＴ、あるいはｔｏ−ＮＦＡＴ３又はｔｏ−ΔＮＦＡＴ３又はｔｏ−ＮＦＡＴ３−８５Ｃ）のいずれか及び対照としての空ベクター（ｔｏ−Ｃｔｌ）を安定して発現するＨＥＫヒト胚細胞株のいずれかによって産生された。＊ｐ＜０．０５  ＊＊ｐ＜０．００５及び＊＊＊ｐ＜０．０００５、未処理細胞（−）と比較した。（ｎ＝２）（Ｄ）高度に浸潤性の膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）癌細胞（Ｕ８７ＭＧ）を、エクソソームを用いて前処理し又は前処理せずに、それらの浸潤能について試験した、ここで、斯かるエクソソームは、低浸潤性Ｔ４７Ｄ乳癌細胞株ＷＴ、あるいはｔｏ−ＮＦＡＴ３又はｔｏ−ΔＮＦＡＴ３又はｔｏ−ＮＦＡＴ３−８５Ｃ）のいずれか及び対照としての空ベクター（ｔｏ−Ｃｔｌ）を安定して発現するＨＥＫヒト胚細胞株のいずれかによって産生された。＊ｐ＜０．０５  ＊＊ｐ＜０．００５及び＊＊＊ｐ＜０．０００５、未処理細胞（−）と比較した。（ｎ＝２）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞の分泌型細胞外小胞（ＳＥＶ）を含有する組成物による癌の治療あるいは転移性癌の治療又は予防
第１の態様では、本発明は、癌の治療あるいは転移性癌の治療又は予防における使用のための、組成物、特に、細胞の分泌型細胞外小胞（ＳＥＶ）を含有する医薬組成物であって、斯かる細胞が、活性化Ｔ細胞、細胞質、カルシニューリン依存性４核内因子（ＮＦＡＴＣ４）を発現する細胞である、組成物、に関する。
【００１８】
本発明はまた、癌の治療あるいは転移性癌の治療又は予防を必要とする患者において、癌を治療するため、あるいは転移性癌を治療又は予防するための方法であって、前記患者に、ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物の治療上有効量を投与すること、を含む、方法に関する。
【００１９】
本発明はまた、癌の治療あるいは転移性癌の治療又は予防を目的とする薬物を調製するための、ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物の使用に関する。
【００２０】
本発明はまた、癌の治療のため、あるいは転移性癌の治療又は予防のための、ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物の使用に関する。
【００２１】
分泌型細胞外小胞（ＳＥＶ）
「分泌型細胞外小胞（secreted extracellular vesicles）」又は「ＳＥＶ」とは、それらの原形質膜からそれらの微小環境中に細胞によって放出される膜小胞を意味する。本発明の文脈において、ＳＥＶは、典型的には、約５００ｎｍ以下、特に約３０〜約５００ｎｍ、又は約４０〜約５００ｎｍ、又は約５０〜約５００ｎｍの直径を有する。ＳＥＶはリン脂質膜によって取り囲まれており、斯かるリン脂質膜は好ましくは、比較的高レベルのコレステロール、スフィンゴミエリン、及びセラミドを含み、好ましくは界面活性剤耐性膜ドメイン（脂質ラフト）も含む。
【００２２】
ＳＥＶの膜タンパク質は、細胞と同じ配向（orientation）を有する。ＳＥＶは一般に、アクチンβ、膜輸送及び融合に関与するタンパク質（例えばＲａｂ、ＧＴＰａｓｅｓ、アネキシン、及びフロチリン）、輸送に必要なエンドソーム選別複合体（ＥＳＣＲＴ）の構成要素の複合体（例えばＡｌｉｘ）、腫瘍感受性遺伝子１０１（ＴＳＧ１０１）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ、例えばＨＳＰＡ８、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＣ７０及びＨＳＣ９０）、インテグリン（例えばＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｅ又はＣＤ６２Ｐ）、及びテトラスパン（特にＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ５３、ＣＤ９、及び／又はＣＤ３７）、の存在によって特徴づけられる。ＳＥＶはまた、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡも含み得る。
【００２３】
ＳＥＶは、様々な方法によってそれを分泌する細胞から調製することができ、最も一般的かつ最も好ましい方法は分画遠心分離である。本発明で使用されるＳＥＶを調製するために使用することができる方法は、Yakimchuk, K.、Materials and Methods、vol.5、2015に開示されたものを含む：
【００２４】
分画遠心分離：
上述したように、この方法は、本発明において最も一般的な技術の１つであり、かつ最も好ましい方法である。
【００２５】
この方法は、いくつかのステップからなり、好ましくは約４℃で行われ、少なくとも以下の３つのステップ１）〜３）を含む：
１）細胞及び細胞残屑を除去するための低速遠心分離、
２）より大きな小胞（１００ｎｍを超えるサイズ）を除去するための高速スピン、そして最後に、
３）ＳＥＶをペレット化する高速遠心分離。
【００２６】
ステップ１）において、細胞及び細胞残屑は、５〜３０分間、約１３００〜３５００ＲＰＭ（１分当たりの回転数）の遠心加速度を用いて除去される。任意により、ステップ１）は、２つの低速遠心分離、非常に低速の第１（例えば約１３５０ＲＰＭ）及び最高速の第２（例えば３５００ＲＰＭ）の低速遠心分離を含むことができる。
【００２７】
特に、１３５０ＲＰＭで１０分間約４℃でスピンし、次いで３５００ＲＰＭで２０分間約４℃でスピンすることが、ステップ１）で使用され得る。
【００２８】
ステップ２）では、より大きな小胞（１００ｎｍを超えるサイズ）が、１５〜４５分間約１００００ＲＰＭの遠心加速度を用いて除去される。特に、約１０，０００ＲＰＭ３０分間約４℃でスピンすることが、ステップ２）で使用され得る。
【００２９】
好ましくは少なくとも２回行われるステップ３）では、ＳＥＶは約４０  ０００ＲＰＭの遠心加速度を用いてペレット化される（６０〜１２０分間）。特に、４０，０００ＲＰＭで９０分間約４℃でスピンすることが、ステップ３）で使用され得る。
【００３０】
特に好ましいプロトコルは以下に記載した通りである：
ａ）培養した細胞を１３５０ＲＰＭで１０分間４℃でスピンし、上清を回収し；
ｂ）回収した上清を３５００ＲＰＭで２０分間４℃でスピンし、上清を回収し；
ｃ）回収した上清を１０，０００ＲＰＭで３０分間４℃でスピンし、上清を回収し；
ｄ）回収した上清を４０，０００ＲＰＭで９０分間４℃で超遠心分離し、ペレットを回収し；
ｅ）ペレットを冷ＰＢＳ中に再懸濁し；並びに
ｆ）４０，０００ＲＰＭで９０分間４℃で超遠心分離し、ペレットを回収する。
【００３１】
密度勾配遠心分離：
このアプローチは、超遠心分離とショ糖密度勾配とを組み合わせる。
【００３２】
より具体的には、密度勾配遠心分離を使用して、非小胞性粒子、例えばタンパク質及びタンパク質／ＲＮＡ凝集体からＳＥＶを分離する。したがって、この方法は、異なる密度の粒子から小胞を分離する。適切な遠心分離時間は非常に重要であり、そうでなければ、それらが同様の密度を有する場合、夾雑粒子が依然としてＳＥＶ画分に見られる。最近の研究は、遠心分離を行う前にショ糖勾配への超遠心分離からのＳＥＶペレットの適用を示唆している。
【００３３】
サイズ排除クロマトグラフィー：
サイズ排除クロマトグラフィーは、分子量ではなくサイズに基づいて巨大分子を分離するために使用される。この技術は、複数の細孔及びトンネルを含む多孔質ポリマービーズを充填したカラムを適用する。分子はその直径に応じてビーズを通過する。小さな半径の分子がカラムの細孔を通って移動するにはより時間がかかるが、巨大分子はカラムからより早く溶出する。サイズ排除クロマトグラフィーは、大分子と小分子の正確な分離を可能にする。また、異なる溶出溶液をこの方法に適用することができる。
【００３４】
濾過：
限外濾過膜をＳＥＶの単離に使用することもできる。微小胞のサイズに依存して、この方法はタンパク質及び他の巨大分子からのＳＥＶの分離を可能にする。ＳＥＶはまた、多孔質構造を介してそれらを捕捉することによって単離され得る（図２）。最も一般的な濾過膜は、０．８μｍ、０．４５μｍ又は０．２２μｍの孔径を有し、８００ｎｍ、４００ｎｍ又は２００ｎｍよりも大きなＳＥＶを収集するために使用することができる。特に、マイクロピラー（micropillar）多孔質シリコン線毛構造が、４０〜１００ｎｍのＳＥＶを単離するために設計された。最初のステップ中に、より大きな小胞は除去される。次のステップでは、ＳＥＶ集団が濾過膜上で濃縮される。単離ステップは比較的短いが、この方法は、ＰＢＳ緩衝液とシリコン混蔵とのプレインキュベーションを必要とする。次のステップでは、ＳＥＶ集団が濾過膜上で濃縮される。
【００３５】
ポリマーベースの沈殿：
ポリマーベースの沈殿法は、通常、生体液とポリマー含有沈殿液との混合、４℃でのインキュベーション、及び低速での遠心分離を含む。ポリマーベースの沈殿に使用される最も一般的なポリマーの１つはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。このポリマーによる沈殿は、単離ＳＥＶに対する穏やかな影響及び中性ｐＨの使用を含む多くの利点を有する。ＳＥＶの単離のためにＰＥＧを適用するいくつかの市販のキットが作製された。最も一般的に使用されるキットはＥｘｏＱｕｉｃｋ（商標）（System Biosciences、Mountain View、CA、USA）である。このキットは容易かつ迅速に実行でき、追加の装置を必要としない。最近の研究は、ＥｘｏＱｕｉｃｋ（商標）法で超遠心分離を用いて、ＳＥＶの最高収量が得られたことを実証した。
【００３６】
免疫学的分離：
ＳＥＶの免疫学的分離のいくつかの技術が、表面ＳＥＶ受容体又はＳＥＶ細胞内タンパク質に基づいて開発されている。しかしながらこれら方法は一般に、ＳＥＶタンパク質の検出、分析及び定量化のために主として適用される。
【００３７】
篩い分けによる単離：
この技術は、膜を介して生体液からＳＥＶを篩い分け、そして圧力又は電気泳動によって濾過を行うことによって、ＳＥＶを単離する。
【００３８】
ＮＦＡＴＣ４
「活性化Ｔ細胞、細胞質、カルシニューリン依存性４核内因子（Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 4）」又は「ＮＦＡＴＣ４」は本明細書で使用される場合、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅデータベースにおける公式記号ＮＦＡＴＣ４でヒト遺伝子によってコードされたタンパク質を指す。（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４７７６）又はその変異体は以下の通りである。ＮＦＡＴＣ４遺伝子は、「活性化Ｔ細胞、細胞質４核内因子」、「Ｔ細胞転写因子ＮＦＡＴ３」、「ＮＦＡＴ３」、「ＮＦ−ＡＴ３」、及び「ＮＦ−ＡＴＣ４」としても知られている。この遺伝子はいくつかのｍＲＮＡ及びタンパク質アイソフォームをコードし、それらの全ては本発明の文脈においてＮＦＡＴＣ４の定義に含まれる。ＮＦＡＴＣ４の種々のアイソフォームのｃＤＮＡ及びタンパク質配列は、以下の表１に記載される：
【００３９】
【表１−１】
2019513710.tif 000002
【表１−２】
2019513710.tif 000003
【表１−３】
2019513710.tif 000004
【表１−４】
2019513710.tif 000005
【表１−５】
2019513710.tif 000006
【表１−６】
2019513710.tif 000007
【表１−７】
2019513710.tif 000008
【表１−８】
2019513710.tif 000009
【表１−９】
2019513710.tif 000010
【表１−１０】
2019513710.tif 000011
【表１−１１】
2019513710.tif 000012
【表１−１２】
2019513710.tif 000013
【表１−１３】
2019513710.tif 000014
【表１−１４】
2019513710.tif 000015
【表１−１５】
2019513710.tif 000016
【００４０】
上述したように、ＮＦＡＴＣ４の全てのアイソフォームは、本発明の文脈においてＮＦＡＴＣ４の定義に含まれる。しかしながら、好ましい実施形態では、本発明に係る使用のための組成物中に存在するＳＥＶを分泌する細胞は、上記表１に開示されたＮＦＡＴＣ４のアイソフォーム２、９０２アミノ酸タンパク質（配列番号４）、又はその変異体を発現する。他の好ましいアイソフォームは、上記表１に開示されたアイソフォーム４（配列番号８、８３２アミノ酸）及び７（配列番号１４、９６５アミノ酸）であり、それは、これらアイソフォームがアイソフォーム２と以下に記載した変異体「ΔＮＦＡＴＣ４」の配列を共有するためであり、かつ、ΔＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶが発明者らによって非常に効率的であることが示されているためである。
【００４１】
本発明の文脈において、ＮＦＡＴＣ４の全てのアイソフォームがＮＦＡＴＣ４の定義に含まれるだけでなく、ＮＦＡＴＣ４の機能を維持するか又は天然ＮＦＡＴＣ４と比較して機能が向上した全ての変異体も含まれる。これらは特に対立遺伝子変異体を含む。
【００４２】
特に関心のある変異体はΔＮＦＡＴＣ４であり、これは上記表１に開示されたＮＦＡＴＣ４のアイソフォーム２に対応し、その５２１個のＮ末端アミノ酸が切断されている（Molkentinら、(1998)Cell 93：215-228の図１ＡのＲｅｓｃｕｅｄ  ＮＦ−ＡＴ３参照）：ΔＮＦＡＴＣ４アミノ酸配列を以下に示す：
DCAGILKLRNSDIELRKGETDIGRKNTRVRLVFRVHVPQGGGKVVSVQAASVPIECSQRSAQELPQVEAYSPSACSVRGGEELVLTGSNFLPDSKVVFIERGPDGKLQWEEEATVNRLQSNEVTLTLTVPEYSNKRVSRPVQVYFYVSNGRRKRSPTQSFRFLPVICKEEPLPDSSLRGFPSASATPFGTDMDFSPPRPPYPSYPHEDPACETPYLSEGFGYGMPPLYPQTGPPPSYRPGLRMFPETRGTTGCAQPPAVSFLPRPFPSDPYGGRGSSFSLGLPFSPPAPFRPPPLPASPPLEGPFPSQSDVHPLPAEGYNKVGPGYGPGEGAPEQEKSRGGYSSGFRDSVPIQGITLEEVSEIIGRDLSGFPAPPGEEPPA（配列番号15、381アミノ酸）
【００４３】
本発明の文脈において、ΔＮＦＡＴＣ４アミノ酸配列（配列番号１５）を含む任意のＮＦＡＴＣ４変異体を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物は、癌の治療、あるいは転移性癌の治療又は予防のために使用することができる。
【００４４】
細胞がＮＦＡＴＣ４の変異体を発現する場合、前記変異体は好ましくは、上記表１に開示されたＮＦＡＴＣ４のアイソフォーム２の８５Ｃ末端アミノ酸を含む（これは、ΔＮＦＡＴＣ４のアイソフォーム２の８５Ｃ末端アミノ酸と同じである）。
【００４５】
ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞
本発明の文脈において、ＮＦＡＴＣ４を発現する任意の細胞は、ＳＥＶの調製のために使用することができる。ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞の比限定的な例としては、以下：
・低い浸潤能を有する癌細胞、及び
・ＮＦＡＴＣ４を発現するように誘導された任意の細胞、
が挙げられる。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶは、低い浸潤能を有する癌細胞から精製されている。実際に、そのような癌細胞は一般にＮＦＡＴＣ４を発現する。
【００４７】
本明細書において、「浸潤能」又は「相対浸潤能」は、ＥＣＭ分解及びタンパク質分解を含むプロセスで、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を介して隣接組織に移動する癌細胞の能力を指す。特定の癌細胞の浸潤能は、浸潤アッセイにおいてインビトロ又はインビボで試験することができる。インビトロの浸潤アッセイは、一般に天然又は再構成マトリックスの使用に依存しており、これは試験される癌細胞に応じた好適な孔径（一般に５、８、１０、又は１２μｍ）のフィルター（膜とも称される）上に適用され、試験されることになる癌細胞のための化学誘引物質を含有する培地上に置かれる。次に、化学誘引培地に達するためにマトリックス及びフィルターを横切ることができる細胞の数に基づいて、浸潤指数を計算することができる。相対浸潤能は、同じアッセイにおいて既知の低浸潤性（例えばＴ４７Ｄ、ＭＣＦ７）又は高浸潤性（例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＵＭ１５９ＰＴ）細胞の数に対する浸潤性細胞の比として計算される。
【００４８】
様々なタイプの天然又は再構成マトリックスを使用することができ、これらに限定されるものではないが、細胞から単離された天然マトリックス（例えば「マトリゲル（Matrigel）」、Engelbreth-Holm-Swarm（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞）によって分泌されたゼラチン状タンパク質混合物、コラーゲンＩ又はＩＶゲルマトリックス、及びラミニンＩゲルマトリックスを含む。インビトロでの浸潤アッセイに用いられる最も一般的なマトリックスは、マトリゲルである。
【００４９】
上述したように、フィルターの孔径は試験される細胞のタイプに適合されるべきであり、一般に、細胞のタイプに応じて５、８、１０、及び１２μｍから選択される。乳癌細胞には、８μｍ孔フィルターが一般に適しているであろう。
【００５０】
試験される細胞のタイプに応じて、様々な化学誘引物質を化学誘引培地に使用することもできる。一般に使用される化学誘引物質は、馴化ＮＩＨ−３Ｔ３培地である。
【００５１】
浸潤レベルは、細胞のタイプ、マトリックスのタイプ及び厚さ、アッセイの持続時間、並びにフィルター上の初期細胞密度を含む種々のパラメータに依存する。したがって、細胞試料の浸潤能を定義するために、低浸潤能又は高浸潤能の参照細胞試料を新しい細胞試料と並行して試験すべきである。次に、新しい細胞試料の浸潤能を、参照細胞試料の浸潤指数とその浸潤指数との比較によって評価する。
【００５２】
ほとんどのタイプの癌について、低浸潤能又は高浸潤能の細胞株が先行技術において定義されている。本発明の文脈において、「低い浸潤能を有する癌細胞」とは、低浸潤能を有すると知られている同じ細胞型の少なくとも１つの癌細胞株の浸潤指数以下である、インビトロでの浸潤アッセイにおいて浸潤指数を有する癌細胞を指す。
【００５３】
低浸潤能又は高浸潤能の例を以下の表２に記載する。
【００５４】
【表２】
2019513710.tif 000017
【００５５】
乳癌細胞の場合、エストロゲン受容体α（ＥＲＡ）を発現する乳癌細胞は、一般に低い浸潤能を有し、したがって、ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶは、エストロゲン受容体α（ＥＲＡ）を発現する乳癌細胞から精製され得る。
【００５６】
あるいは、ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶは、ＮＦＡＴＣ４を発現するように誘導された任意の他の細胞から精製され得る。
【００５７】
「ＮＦＡＴＣ４を発現するように誘導された細胞」とは、ＮＦＡＴＣ４を天然に発現するか、又は発現しない細胞であるが、細胞におけるＮＦＡＴＣ４発現を誘導するか又はＮＦＡＴＣ４活性を増強することができる少なくとも１つの化合物で処理された細胞を意味する。出発細胞がＮＦＡＴＣ４を発現しない場合、その処理は出発細胞におけるＮＦＡＴＣ４発現を生じさせるか又はＮＦＡＴＣ４活性を増強することができるべきである。出発細胞が既にＮＦＡＴＣ４を発現する場合、その処理は出発細胞におけるＮＦＡＴＣ４発現を増加させるか又はＮＦＴＡＣ４活性を増強することができるべきである。
【００５８】
出発細胞の任意のタイプが使用されてもよく、これらに限定されるものではないが、以下：
・上記で定義した低い浸潤能を有する癌細胞、及び
・正常細胞、
を含む。
【００５９】
いずれの場合においても、初代細胞又は細胞株のいずれかが使用され得る。出発細胞の細胞型は特に限定されない。低い浸潤能を有する癌細胞には、以下に記載した癌細胞の任意のタイプが使用され得る。正常細胞の場合、線維芽細胞、上皮細胞、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓）、樹状細胞、幹細胞を含む任意の細胞型が使用され得る。「正常細胞」とは、腫瘍の起源を有さず、かつ正常組織に由来するか又は正常組織由来である細胞を意味する。換言すれば、正常細胞とは、初代非癌性細胞、又は正常で健康な初代細胞に由来する細胞株のいずれかを指す。さらに、付着細胞及び懸濁細胞の両方が使用され得るが、付着細胞が好ましい。
【００６０】
ヒト患者の治療のために、好ましくは、ヒト細胞（初代又は細胞株、付着又は懸濁、低い浸潤能を有する癌細胞又は正常細胞）が使用されることになる。
【００６１】
正常細胞がＮＦＡＴＣ４発現の誘導に使用される場合、好ましい実施形態では、前記正常細胞は、治療されることになる患者からの自己細胞（特に自己線維芽細胞）である。別の実施形態では、前記正常細胞はヒト胚細胞、特にＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
【００６２】
これは実際に、投与されたＳＥＶの組成物に対する任意の免疫応答を制限する。
【００６３】
ＮＦＡＴＣ４発現を誘導するための任意の好適な方法が使用され得る。
【００６４】
好ましい実施形態では、ＮＦＡＴＣ４発現の誘導のために、細胞は、ＮＦＡＴＣ４をコードする核酸分子を含む発現ベクターによってトランスフェクトされた。
【００６５】
「トランスフェクション」とは、当業者に知られている任意の好適な技術によって核酸を細胞内に意図的に導入するプロセスを意味する。特に、本発明の文脈において、トランスフェクションという用語は、核酸を細胞内に導入するためのウイルス及び非ウイルス的方法の両方を含むことが意図される。
【００６６】
「発現ベクター」は、本明細書で使用される場合、ＮＦＡＴＣ４をコードする核酸分子及びその発現を可能にするために必要なエレメントを含むベクターを指す。特に、ＮＦＡＴＣ４をコードする核酸分子は、適切な調節配列に操作可能に連結される。
【００６７】
本明細書で使用される場合、用語「調節エレメント」又は「調節配列」は、所与の宿主細胞又は対象における核酸分子（複数）の発現を可能にし、その発現に寄与し、又は調節する任意のエレメント、あるいはその誘導体（すなわちｍＲＮＡ）を指し、斯かる発現は複製、重複（duplication）、転写、スプライシング、翻訳、安定性及び／又は核酸（複数）の輸送を含む。調節配列の選択は、ベクターそれ自身及びトランスフェクトされることになる細胞のような因子に依存する可能性があり、かつ共通の一般的知識及びこのトピックに関する刊行物に基づいて当業者により容易に選択されるようになることが当業者によって理解されるであろう。真核細胞系における構成的発現に適したプロモーターとしては、ウイルスプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター又はエンハンサー、アデノウイルス初期及び後期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１のチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、及びレトロウイルス長末端反復（例えばＭｏＭｕＬＶ及びＲｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲｓ）、並びに細胞プロモーター、例えばホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。レンチウイルスベクターに適したプロモーターの例としては、Clontechにより市販されているｐＬＶＸ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１  Ｖｅｃｔｏｒに存在するプロモーターが挙げられる。
【００６８】
発現ベクターは特に、プラスミド及びウイルス発現ベクターから選択され得る。
【００６９】
「プラスミドベクター」は、本明細書で使用される場合、複製可能なＤＮＡコンストラクトを指す。好適なプラスミドベクターの代表例としては、限定することなく、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Invitrogen）、ｐＣＩ（Promega）、ｐＶＡＸ（Invitrogen）及びｐＧＷｉｚ（Gene Therapy System Inc）が挙げられる。トランスフェクションのために、プラスミドベクターは脂質又はポリマーと複合体化されて、粒子構造、例えばリポソーム、リポプレックス又はナノ粒子を形成することができる。
【００７０】
用語「ウイルスベクター」は本明細書で使用される場合、ウイルスゲノムの少なくとも１つのエレメントを含み、かつウイルス粒子に充填され得る核酸ベクターを指す。用語「ウイルス」、「ビリオン（virions）」、「ウイルス粒子」及び「ウイルスベクター粒子」は、互換的に使用され、ウイルス粒子の生成を可能にする好適な条件に従って核酸ベクターが適切な細胞又は細胞株に形質導入される際に形成されるウイルス粒子を指す。本発明の文脈において、用語「ウイルスベクター」は、核酸ベクター（例えばＤＮＡウイルスベクター）並びにその生成したウイルス粒子を含むように広く理解されなければならない。用語「感染性」とは、宿主細胞又は対象に感染及び侵入するウイルスベクターの能力を指す。
【００７１】
好ましい実施形態では、ＮＦＡＴＣ４をコードする核酸分子を含むウイルス発現ベクターが使用される。
【００７２】
ウイルスベクターは、複製可能（replication-competent）又は複製選択性であり得（例えば特定の宿主細胞において良好又は選択的に複製するように操作され）、あるいは複製欠損又は複製障害であるように遺伝的に無効化されうる。典型的には、そのようなベクターは市販されているか（例えばInvitrogen、Stratagene、Amersham Biosciences、Promega等において）、又は寄託機関、例えばthe American Type Culture Collection（ATCC、Rockville、Md.）から入手可能であるか、あるいは、それらの配列、構成及び製造方法を記載する多数の刊行物の主題であり、技術者がそれらを適用することを可能にする。
【００７３】
好適なウイルスベクターの代表例は、種々の異なるウイルス（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、泡沫状ウイルス、アルファウイルス、水疱性口炎ウイルス（vesicular stomatis virus）等から生成される。上記のように、用語「ウイルスベクター」は、ベクターＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、並びにその生成したウイルス粒子、特に感染性ウイルス粒子を包含する。
【００７４】
好ましい実施形態では、ＮＦＡＴＣ４をコードする核酸分子を含むレトロウイルス発現ベクター（及び特にレンチウイルス発現ベクター）が使用される。レトロウイルスは、分裂細胞に感染し、ほとんどの場合には分裂細胞に組み込まれる特性を有し、これに関して、本発明の文脈において、高レベルのＮＦＡＴＣ４を発現する細胞を産生するための使用に特に適している。好適なレトロウイルスは一般に、ＬＴＲ配列、カプシド形成領域、及びＮＦＡＴＣ４をコードする核酸分子を含む。組み換えレトロウイルスは、任意の起源（マウス、霊長類、ネコ、ヒト等）のレトロウイルスに由来することができ、特に、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）、ＭＶＳ（マウス肉腫ウイルス）、フレンドマウスレトロウイルス（Ｆｂ２９）、マウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）、ＬＮウイルス又はマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）由来である。それは、ウイルスポリペプチドｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖをトランスで供給することができるカプシド形成細胞株において増殖され、斯かるウイルスポリペプチドはウイルス粒子を構築するために必要とされる。そのような細胞株は文献に記載されている（ＰＡ３１７、Ｐｓｉ  ＣＲＩＰ  ＧＰ  ＋Ａｍ−１２、ＨＥＫ  ２９３Ｔ等）。本発明で使用されるレトロウイルス（及びより具体的にはレンチウイルス）の発現ベクターは、修飾、特にＬＴＲ（真核生物プロモーターによるプロモーター領域の置換）又はカプシド形成領域（異種カプシド形成領域による置換）における修飾を含み得る。本発明の文脈において使用され得る市販のレンチウイルスベクターの例としては、Clontechによって市販されているｐＬＶＸ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１ベクターが挙げられる。
【００７５】
しかしながら、ＮＦＡＴＣ４をコードする核酸分子を含む他のタイプのウイルス発現ベクターが使用されてもよい。
【００７６】
本発明の文脈において有用なウイルスベクターの例としては、種々のヒト又は動物起源（例えばイヌ、ヒツジ、サルアデノウイルス等）に由来し得るアデノウイルスベクターが挙げられる。任意の血清型を用いることができ、ヒトアデノウイルスが特に好ましく、そして亜属Ｃ、例えばＡｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６、及び亜属Ｂ、例えばＡｄ１１、Ａｄ３４及びＡｄ３５が特に好ましい。引用されたアデノウイルスはＡＴＣＣから入手可能であるか、又はその配列、構成及び製造方法を記載した多数の刊行物の主題であり、技術者がそれを適用することを可能にする。アデノウイルスベクターが使用される場合、それは好ましくは、おおよそ４５９位から３３２８位までに、又はおおよそ４５９位から３５１０位までに伸長するＥ１欠失を有するＥ１欠損アデノウイルスベクターである（ＧｅｎＢａｎｋに受託番号Ｍ７３２６０．１で開示されているＡｄ５の配列に対する参照による）。クローニング能（cloning capacity）は、アデノウイルスゲノムの追加の位置（複数）を欠失させることによって、さらに改善され得る（非必須Ｅ３領域の全て又は一部（例えばおおよそ２７８６７位から３０７４３までの欠失）あるいは他の必須Ｅ２及び／又はＥ４領域の全て又は一部）。次に、ＮＦＡＴＣ４をコードする核酸分子は、アデノウイルスゲノムの任意の位置に挿入することができ、Ｅ１及び／又はＥ３領域の代わりに挿入することが特に好ましい。それらは、問題となる領域の天然の転写方向に対してセンス又はアンチセンス方向に配置することができる。
【００７７】
本発明の文脈において使用され得るウイルスベクターの他の例としては、ポックスウイルスベクター、例えば鶏痘ベクター（例えばＦＰ９）、カナリア痘ベクター（例えばＡＬＶＡＣ）及びワクシニアウイルスベクターが挙げられ、後者が好ましい。好適なワクシニアウイルスとしては、限定するものではないが、Copenhagen株、Wyeth株、ＮＹＶＡＣ及び改変アンカラ（modified Ankara）（ＭＶＡ）株が挙げられる。組み換えポックスウイルスを構築及び産生するための一般的な条件は、当該技術分野においてよく知られている。ＮＦＡＴＣ４をコードする核酸分子は好ましくは、非必須の遺伝子座でポックスウイルスゲノム内に挿入される。チミジンキナーゼ遺伝子は、Copenhagenワクシニアベクターにおける挿入に、及びＭＶＡベクターにおける挿入のための欠失ＩＩ又はＩＩＩに特に適している。
【００７８】
本発明の文脈に適している他のウイルスベクターは、パラミクソウイルス科から得ることができるモリビリウイルスであり、麻疹ウイルスが特に好ましい。ＮＦＡＴＣ４をコードする核酸分子の、Ｐ及びＭ遺伝子間、又はＨ及びＬ遺伝子間の挿入は特に適切である。
【００７９】
あるいは、ＮＦＡＴＣ４をコードする核酸分子を含む発現ベクターで出発細胞をトランスフェクトする代わりに、出発細胞を、任意の他の好適な方法によって、ＮＦＡＴＣ４を発現するように又は増強されたＮＦＡＴＣ４活性を示すように誘導することができる。注目すべきことに、出発細胞は、化合物と接触され得るか、あるいは、ＮＦＡＴＣ４発現を誘導若しくは増大するか又はＮＦＡＴＣ４活性を増強することができるタンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターによってトランスフェクトされ得る。
【００８０】
癌治療
ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物は、癌の治療あるいは転移性癌の治療又は予防に使用され得る。
【００８１】
本明細書において、「癌」とは、無秩序な又は制御されない細胞増殖を特徴とする悪性新生物を指す。特に、「癌細胞」とは、無秩序な又は制御されない細胞増殖を有する細胞を指す。
【００８２】
用語「癌」は、原発性悪性腫瘍（「原発性癌」とも称され、その細胞が元の腫瘍部位以外の対象の体内の部位に移動していないものに対応する）及び二次悪性腫瘍（「二次癌」又は「転移性癌」とも称され、元の腫瘍部位とは異なる二次部位への腫瘍細胞の転移、遊走から生じるもの）を含む。
【００８３】
ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物を用いて治療され得る癌又は治療若しくは予防され得る転移性癌のタイプは、特に限定されない。そのような癌は特に、固形癌の群から選択され得る。固形癌は特に、癌腫（臓器、腺、又は身体構造の内層（上皮細胞）で始まる癌、「上皮癌」としても知られる）、肉腫（結合組織、例えば軟骨、脂肪、筋肉、腱、又は骨で始まる癌）、及び脳腫瘍（脳細胞で始まる癌、例えばグリオーマ、膠芽腫、及び星状細胞腫）を含む。癌はさらに、それが起源となった体の部分にちなんで命名される。癌が広がった場合、それは同じ名前を維持する。本発明の文脈において、癌は特に癌腫の群から選択され得、斯かる癌腫は、特にヒト対象の、乳癌、黒色腫、卵巣癌、消化器癌（結腸直腸癌、食道癌、胃癌を含む胃腸癌、膵臓癌、肝細胞癌、胆管細胞癌及び奇形癌とも称される）、肺癌、前立腺癌、及び咽喉癌、を含むがこれらに限定されない。本発明の文脈において、癌はまた、特にヒト対象の膠芽腫を含むがこれに限定されない脳腫瘍の群から選択され得る。好ましい実施形態では、癌は特に、乳癌、黒色腫、膵臓癌、結腸直腸癌、膠芽腫及び肺癌から選択されてもよく；より好ましくは前記癌は、乳癌、黒色腫、膵臓癌、及び膠芽腫から選択され、最も好ましくは前記癌は乳癌、特に転移性乳癌である。
【００８４】
そのような癌はまた、造血性癌の群から、特に白血病、リンパ腫及び骨髄腫からなる群、特にヒト患者の群から選択され得る。
【００８５】
本明細書において、用語「治療する」又は「治療」は、臨床的、組織学的、生化学的レベルで観察され得る患者の疾患の改善を意味する。特に、疾患の臨床的、組織学的、又は生化学的症状の任意の緩和は、「治療する」及び「治療」という用語に含まれる。したがって、原発性癌の文脈において、「治療する」又は「治療」は特に、癌の増殖又は転移による拡散を減少させるという事実に関する。したがって、転移性癌の文脈において、「治療する」又は「治療」は特に、転移性癌の増殖又は転移によるさらなる拡散を減少させるという事実に関する。治療は、薬剤の投与及び／又は２回以上の処置を必要とし得る。治療はまた、ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶと別の抗癌剤とを組み合わせる可能性を含む。この場合、２つの抗癌剤（ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶと他の抗癌剤）は、逐次又は同時に投与され得る。本明細書において、用語「逐次に」とは、第１の抗癌剤（ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶ又は他の抗癌剤）の投与（１又は複数の投与）、続いて、第１の抗癌剤の投与の停止及び第２の抗癌剤（他の抗癌剤又はＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶ）の投与（１又は複数の投与）することを指す。本明細書において、用語「同時に」とは、同じ期間にわたる２つの抗癌剤（ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶ及び他の抗癌剤）の投与を指す。これは、２つの抗癌剤（ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶ及び他の抗癌剤）の、両方の薬剤を含有する１つの組成物での、又は２つの薬剤のそれぞれを含有する別々の組成物での投与を含む。同じ期間にわたる混合投与（intermixed administration）（ある薬剤と他の薬剤との交互の投与）は、同時投与と考えられる。
【００８６】
抗癌剤は、外科的処置、化学療法、放射線療法、免疫療法、及び細胞療法から選択され得る。
【００８７】
本明細書において、用語「予防する」又は「予防」とは、疾患に関連する臨床的、組織学的又は生化学的事象の発症を予防又は遅延させるか、あるいはその強度を減少させるという事実を意味する。したがって、癌の文脈において、「予防する」又は「予防」は特に、新たな癌の増殖又は拡散を少なくとも部分的に阻害するという事実に関する。予防は、薬剤の投与及び／又は２回以上の処置を必要とし得る。予防の文脈においても、ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶは、逐次又は同時のいずれかで別の抗癌剤と組み合わせることができる。
【００８８】
本明細書において、用語「患者」は、哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、カンガルー、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、およびトランスジェニック非ヒト動物を指す。本発明の好ましい実施形態では、対象はヒト対象である。
【００８９】
ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物は、治療上有効量で投与される。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「治療上有効量（therapeutically efficient amount）」とは、意図される使用に十分な量を指す。本発明に係る抗癌組成物について、それは癌の増殖又は拡散を減少させるのに十分な量を指す。
【００９１】
マウスにおいて、マウス１匹につき５０．１０8ｐｐのＳＥＶ（Malvernによって市販されているNanoSight装置によって検出された粒子の数）の毎週用量の使用に成功した。そして、マウスが約１．５ｍＬの総血液量を有することを知って、１０8〜１０11ｐｐのＳＥＶの毎週用量が成功すると予測することができる。好適な用量は総血液量に基づいて他の種に外挿することができる。例えば、ヒト（約５Ｌの総血液量）では、少なくとも約１５．１０12のＳＥＶの容量が企図され得る。本発明の文脈において、組成物中に存在するＳＥＶの数は好ましくは、NanoSight装置（Malvernにより市販）を用いて決定され、この場合、ＳＥＶの数は、NanoSight装置によって検出された粒子の数に対応する「ｐｐ」として示される。したがって、ヒト（約５Ｌの総血液量）では、少なくとも約１５．１０12ｐｐのＳＥＶの用量が企図され得る。
【００９２】
投与される用量は、対象の年齢、体表面積又は体重、あるいは投与経路及び関連する生物学的利用能に応じて変化し得る。そのような用量適応は当業者に良く知られている。
【００９３】
ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物は任意の好適な投与経路によって投与することができ、斯かる投与経路は静脈内、腫瘍内、局所、鼻腔内、直腸、経口、経皮、皮下、及び舌下経路を含む。好ましい実施形態では、ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物は、静脈内又は腫瘍内経路によって投与されることが意図される。
【００９４】
選択された投与経路に応じて、当業者は、インビボ送達及び生物学的利用能を最適化するために、上記で定義した化合物又はその薬学的に許容される塩を製剤化する方法を知るであろう。特に、上記で定義したＳＥＶは、好適な薬学的に許容される担体、賦形剤、ビヒクル、保存剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、染料、香味料、浸透圧を調節することを意図した塩、緩衝剤、風味調整剤（taste correctors）、及び抗酸化剤と共に製剤化され得る。これら化合物は当業者に良く知られている。これら化学物質の詳細は、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing Co.、Easton、Pa.）の最新版で見ることができる。最適な送達製剤の選択は、選択された投与経路に応じて当業者によって選択されるであろう。
【００９５】
静脈内、腫瘍内又は鼻腔内投与のために、薬理学的に適合性の分散剤及び／又は湿潤剤を含有する水性懸濁液、等張生理食塩水溶液、又は滅菌、注射可能な溶液が使用され得る。賦形剤として、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などが使用され得る。
【００９６】
局所投与のために、組成物は、ゲル、ペースト、軟膏、クリーム、ローション、水性又は水性−アルコール液体懸濁液、油性溶液、ローション又は血清型の分散液、無水又は親油性ゲル、脂肪相を水相に分散させることによって又はその逆によって得られる液体又は半固体ミルクタイプの稠度を有する乳液、軟性又は半固体のクリーム又はゲルタイプの稠度の懸濁液又は乳液、あるいは、代替的に、イオン性及び／又は非イオン性タイプのマイクロエマルション、マイクロカプセル、微粒子、又は小胞分散体の形態で提示され得る。これら組成物は、標準的な方法に従って調製される。また、ＳＥＶのより深い浸透を可能にするために、界面活性剤が組成物中に含まれてもよい。増加した浸透を可能にする薬剤が、例えば鉱油、エタノール、トリアセチン、グリセリン及びプロピレングリコールから選択されてもよく；凝集剤は、例えばポリイソブチレン、ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコール、及び増粘剤を含む群から選択される。
【００９７】
直腸投与のために、直腸温度で融解する結合剤、例えばココアバター又は半固体若しくは液体ポリオール、例えばポリエチレングリコール、ワックス、天然油若しくは硬化油、脂肪、などにより調製され得る坐剤を使用することができる。
【００９８】
経口投与に適した単位用量投与製剤は特に、錠剤、被覆錠剤、丸剤、カプセル及び軟ゼラチンカプセル、経口粉末、顆粒、溶液および懸濁液を含む。
【００９９】
錠剤形態の固体組成物が調製される場合、主要活性成分は、医薬ビヒクル、例えばゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸若しくはステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアゴム又は類似体と混合され得る。錠剤は、サッカロース又は他の好適な材料でコーティングされてもよく、あるいはさらに、延長又は遅延された活性を有するように処理され、所定の量の活性成分を継続的に放出してもよい。
【０１００】
カプセル製剤は、活性成分をシンナー（thinner）と混合し、得られた混合物を軟質又は硬質カプセルに、賦形剤とともに注ぐことによって得ることができ、斯かる賦形剤は、例えば植物油、ワックス、脂肪、半固体又は液体ポリオール等である。
【０１０１】
シロップ又はエリキシル形態の製剤は、活性成分を、甘味料、防腐剤、並びに風味を与える剤及び好適な色素と共に含み得る。賦形剤が使用されてもよく、例えば水、ポリオール、サッカロース、転化糖、グルコース等である。
【０１０２】
粉末又は水分散性顆粒は、風味調整剤及び甘味料と共に、分散剤、湿潤剤、及び懸濁化剤との混合物中に活性成分を含み得る。
【０１０３】
皮下投与のために、任意の好適な薬学的に許容されるビヒクルが使用され得る。特に、薬学的に許容される油ビヒクル、例えばゴマ油が使用され得る。
【０１０４】
癌患者の正常細胞の試料からＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物を調製するための方法
第２の態様では、本発明はまた、細胞の試料からＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物を調製するための方法であって、以下：
ａ）前記細胞においてＮＦＡＴＣ４発現又は活性を誘導し；
ｂ）前記誘導細胞を、その増殖を可能にする条件下で、ＳＥＶを含まない培養培地中で培養し；並びに
ｃ）誘導細胞のＳＥＶを精製すること、
を含む、方法に関する。
【０１０５】
ステップａ）において、ＮＦＡＴＣ４発現又は活性は、上述のように出発細胞において誘導される。特に、上記で開示した任意のタイプの出発細胞を使用することができ（治療されることになる患者の正常細胞、特に自己細胞、特に自己線維芽細胞、あるいは線維芽細胞株、例えばＷＩ３８であって、既にワクチンの産生が認められている細胞が好ましい）、上記で開示されたＮＦＡＴＣ４発現又は活性の誘導の任意のタイプが使用され得る（ＮＦＡＴＣ４発現を誘導するためのウイルス、より具体的にはレンチウイルスベクターの使用が好ましい）。
【０１０６】
ステップｂ）において、誘導細胞は、その増殖を可能にする条件下で、ＳＥＶを含まない培養培地中で培養される。一部の市販の培養培地は既にＳＥＶフリーである。しかしながら、動物由来成分（例えば血清）を含有する培地については、培地のＳＥＶ枯渇が行われるべきである。これは、培養培地を３０，０００〜４０，０００ＲＰＭで８〜１６時間（例えば一晩）約４℃でスピンすることによって行われ得る。
【０１０７】
誘導細胞の増殖を可能にする条件は、方法で使用される出発細胞のタイプ（初代細胞／細胞系；細胞型、付着／懸濁細胞）に応じて異なり、細胞培養に関する共通の一般的知識に基づいて当業者によって決定され得る。細胞死及びアポトーシス体はＳＥＶペレットの汚染につながる可能性があるため、細胞が良好な状態にあるべきことは重要な点である。したがって、指数関数的増殖における誘導細胞の増幅及び維持を可能にする条件が使用されるべきであり、ＳＥＶは、細胞死が顕著になる増殖の対数期の終わり前に、すなわちプラトー前に、精製されるべきである。
【０１０８】
ステップｃ）において、ＳＥＶは上述したように培養上清から精製される。特に、上述した任意の精製の方法が使用されてもよく、上述のように分画遠心分離が好ましい。
【０１０９】
治療目的のために、好ましくは全方法を滅菌条件下で行うべきである。
【０１１０】
癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療の治療効率を決定又は予測するためのインビトロ方法
本発明者らは、ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶが、癌細胞におけるトランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦβ１）発現を誘導すること、並びに、動物モデルにおける癌の治療のインビボ効率が、治療された患者におけるＴＧＦβ１発現の増加と相関することを示した。
【０１１１】
それゆえ、第３の態様では、本発明はまた、治療の開始前に採取した癌患者の第１の生物学的試料と、治療の開始後の癌患者の第２の対応する生物学的試料とから、治療された癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞によるＳＥＶを含有する組成物による治療の治療効率を決定するためのインビトロ方法であって、以下：
ａ）前記第１及び第２の生物学的試料において少なくともトランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦβ１）発現レベルをインビトロで測定し；
ｂ）少なくとも測定されたＴＧＦβ１発現レベルを比較し；並びに
ｃ）前記比較から前記治療された癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療の効率を決定し、ここで、治療の開始後の生物学的試料において測定された少なくともＴＧＦβ１発現レベルが、治療の開始後の生物学的試料における少なくともＴＧＦβ１発現レベルよりも高い場合に、治療が効率的であると考えられること、
を含む、方法に関する。
【０１１２】
ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶによる治療の効率は、治療された患者におけるＴＧＦβ１発現の増加と相関するので、上記方法は、患者の２つの連続する生物学的試料、ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶによる治療の開始前に採取した第１の試料と、ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶによる治療の開始後に採取した第２の試料とにおけるＴＧＦβ１発現レベルの比較に依存する。
【０１１３】
「生物学的試料」とは、ＴＧＦβ１発現が測定され得る患者の任意の試料を指す。そのような試料は特に、腫瘍試料、血液試料、血清試料、及び尿試料を含む。比較の目的のために、第１及び第２の試料は好ましくは同じ性質であるべきである（例えば２つの腫瘍試料、２つの血液試料、２つの血清試料、又は２つの尿試料）。
【０１１４】
「トランスフォーミング成長因子ベータ１」又は「ＴＧＦβ１」とは、Entrez Geneデータベース中の公式記号ＴＧＦＢ１を有するヒト遺伝子によってコードされたタンパク質を指す。（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：７０４０）。ＴＧＦＢ１遺伝子はまた、「ＴＧＦ−ベータ−１」、「プレプロ−トランスフォーミング成長因子ベータ−１」、「ＣＥＤ」、「ＬＡＰ」又は「潜在関連ペプチド（latency-associated peptide）」、「ＤＰＤ１」、「ＴＧＦＢ」、及び「ＴＧＦベータ」としても知られている。ＴＧＦβ１のｃＤＮＡ及びタンパク質配列を以下の表３に記載する：
【０１１５】
【表３】
2019513710.tif 000018
【０１１６】
第４の態様では、本発明はまた、癌患者の癌試料から、癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療の治療効率を予測するためのインビトロ方法であって、以下：
ａ）前記腫瘍試料において少なくともＴＧＦβ１発現レベルをインビトロで測定し；
ｂ）前記癌試料を、ＮＦＡＴＣ４を発現するＳＥＶを含有する組成物と共にインキュベートし；
ｃ）ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞によるＳＥＶを含有する組成物と共にインキュベートした前記腫瘍試料において、少なくともＴＧＦβ１発現レベルをインビトロで測定し；並びに
ｄ）ステップｃ）で測定した少なくともＴＧＦβ１発現レベルが、ステップａ）で測定した少なくともＴＧＦβ１発現レベルよりも高い場合に、前記癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療を効率的と予測し、そして、ステップｃ）で測定した少なくともＴＧＦβ１発現レベルが、ステップａ）で測定した少なくともＴＧＦβ１発現レベル以下である場合に、前記癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療を非効率的と予測すること、
を含む、方法に関する。
【０１１７】
癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療の治療効率を予測するための方法では、癌細胞によってＴＧＦβ１発現を誘導又は増大させるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶの能力が試験される。ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶとの接触後の癌細胞によるＴＧＦβ１発現の増大は、治療効率を予測することになるが、ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶとの接触後の癌細胞によるＴＧＦβ１発現の安定性又は減少は、治療非効率性を予測することになる。
【０１１８】
「癌試料」とは、癌細胞を含む任意の試料を意味し、これらに限定されるものではないが、癌生検、又は完全若しくは部分的な癌の外科的切除、又は血液試料を含む。実際に、循環癌細胞は血液中に存在することが当該技術分野においてよく知られている。
【０１１９】
癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療の治療効率を決定又は予測するための上記インビトロ方法のいずれにおいても、前記癌患者の２つの生物学的試料におけるＴＧＦβ１の発現レベルは、任意の好適な方法によって測定することができる。
【０１２０】
特定の実施形態において、前記癌患者の２つの生物学的試料におけるＴＧＦβ１の発現レベルは、ＴＧＦβ１転写産物の量を測定することによって、核酸レベルで測定することができる。ＴＧＦβ１転写産物の量は、当業者によって知られている任意の技術によって測定することができる。特に、測定は、抽出されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）試料に対して直接、あるいは当該技術分野においてよく知られている技術によって抽出されたｍＲＮＡから調製した逆転写された（retrotranscribed）相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に対して行うことができる。ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ試料から、核酸転写産物の量は、当業者によって知られた任意の技術を用いて測定することができ、斯かる技術は、核酸マイクロアッセイ、定量的ＰＣＲ、次世代シークエンシング及び標識プローブを用いたハイブリダイゼーションを含む。
【０１２１】
特に、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）が有用であり得る。例えば、市販のｑＲＴ−ＰＣＲベースの方法（例えばTaqman（登録商標）Array）を用いることができ、プライマー及び／又はプローブの設計は、以下の表３に開示されたＴＧＦβ１の配列に基づいて容易に行われる。
【０１２２】
核酸アッセイ又はアレイはまた、インビトロでＴＧＦβ１の発現レベルを評価するために使用することができる。いくつかの実施形態では、核酸マイクロアレイを調製又は購入することができる。アレイは、典型的には、固体支持体と、該支持体に接触する少なくとも１つの核酸（ｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチド）とを含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の少なくとも一部に対応する。例えば、アッセイは、膜、チップ、ディスク、試験ストリップ、フィルター、マイクロスフェア、マルチウェルプレート等の形態であり得る。アッセイ系は、標的遺伝子に対応する核酸（ｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチド）が付着した固体支持体を有する。固体支持体は、例えば、プラスチック、シリコン、金属、樹脂、又はガラスを含み得る。アッセイ成分は調製され、遺伝子を検出するためのキットとして一緒にパッケージ化することができる。標的核酸試料の発現プロファイルを決定するために、前記試料は標識され、ハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイと接触され、マイクロアレイ表面に付着したプローブ配列に相補的である標的核酸間で複合体の形成をもたらす。次いで、標識ハイブリダイズされた複合体の存在が検出される。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変形が当業者に利用可能である。
【０１２３】
別の特定の実施形態では、前記癌患者の２つの生物学的試料におけるＴＧＦβ１の発現レベルは、タンパク質レベルで測定され得る。例えば、タンパク質レベルで、ＴＧＦβ１の発現レベルのインビトロ測定は、当業者に知られている任意の投薬方法によって行うことができ、ＥＬＩＳＡ又は質量分析法を含むがこれらに限定されない。これら技術は、任意の液体又は固体試料に容易に適合される。実際に、液体又は固体試料のタンパク質は、溶液でのＥＬＩＳＡ又は質量分析による測定のための当業者に良く知られた様々な技術を用いて抽出することができる。あるいは、生物学的試料におけるタンパク質の発現レベルは、組織切片に対して直接質量分析を用いることによって分析することができる。タンパク質レベルでのＴＧＦβ１発現の測定のために、ＥＬＩＳＡが好ましい技術である。
【０１２４】
上述した、癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療の治療効率を決定又は予測するためのインビトロ方法のいずれにおいても、試験患者は、上述した任意のタイプの癌に罹患している可能性がある。
【０１２５】
これは、上述した癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療の治療効率を決定するためのインビトロ方法に特に当てはまり、斯かる方法は癌試料を培養することを必要としない。本文脈において、治療されることになる患者が罹患している癌は、特に、固形癌から；好ましくは癌腫及び脳腫瘍から、より好ましくは乳癌、黒色腫、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、及び膠芽腫から選択されてもよく；さらにより好ましくは、前記癌は、乳癌、黒色腫、膵臓癌、及び膠芽腫から選択され、最も好ましくは前記癌は乳癌、特に転移性乳癌である。
【０１２６】
癌患者におけるＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶを含有する組成物による治療の治療効率を予測するための上記方法は、任意のタイプの癌に適用することができるが、それは好ましくは、液体癌、例えば白血病又はリンパ腫に罹患している患者に適用される。実際に、液体癌試料は、ＮＦＡＴＣ４を発現する細胞のＳＥＶとの接触の前後で、ＴＧＦβ１発現の測定のためにより容易に培養される。
【０１２７】
以下の実施例は単に本発明を説明することを意図する。
【実施例】
【０１２８】
実施例
実施例１：低浸潤性乳癌細胞によって産生されたＳＥＶは、癌の進行及び転移を阻害する
材料及び方法
細胞培養
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｔ−４７Ｄ、ＭＣＦ７、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、American Type Culture Collectionからのものであり、ＳＵＭ−１５９−ＰＴ細胞株はAlex Tokerにより提供され（Harvard Medical School）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  Ｄ３Ｈ２  ＬＮ−Ｌｕｃ及び４Ｔ１−Ｒｅｄ−ＦＬｕｃ細胞株はPerkin Elmerからのものであった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  Ｄ３Ｈ２  ＬＮ−Ｌｕｃ細胞株を、イーグルＭＥＭ、７５μｇ／ｍｌのゼオシン（Zeocin）中に維持した。４Ｔ１−Ｒｅｄ−ＦＬｕｃ細胞株は、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％のウシ胎仔血清中にあった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＳＵＭ−１５９−ＰＴ細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、低グルコース（１ｇ／ＬのＤ−グルコース）、１０％のウシ胎仔血清中に維持した。Ｔ−４７Ｄ及びＭＣＦ７を、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％のウシ胎仔血清中に維持した。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、高グルコース（４，５ｇ／ＬのＤ−グルコース）、１０％の新生仔牛血清中にあった。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、高グルコース（４，５ｇ／ＬのＤ−グルコース）、１０％のウシ胎仔血清中に維持した。全ての培地を２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンで補充した。
【０１２９】
ＳＥＶ産生
ＳＥＶ枯渇培地の調製
動物由来成分（例えば血清）を含有する培地については、培地のＳＥＶ枯渇を実施すべきである。
【０１３０】
１．最大で２０％の血清を含む培地を調製する（より高い血清濃度は推奨されない）。
２．超遠心分離機及びローターを４℃に予冷する。
・ＳＷ３２Ｔｉローターの場合：
ｉ．ポリアロマー（pollyallomer）３８．５ｍｌチューブ（３２６８２３）を使用する。それぞれ３８ｍｌの培地を充填し、重量でバランスをとる（０．０１〜０．０２ｇｒの差を目指す）。
ｉｉ．４℃で３０，０００ＲＰＭで一晩スピンする（標準化−１８時間）。
・Ｔｙｐｅ  ４５Ｔｉの場合：
ｉ．枯渇のために標識された６５ｍｌの再利用可能なチューブを使用する。それぞれ６５ｍｌの培地を充填し、重量でバランスをとる（０．０１〜０．０２ｇｒの差を目指す）。
ｉｉ．４℃で３８，０００ＲＰＭで一晩スピンする（標準化−１５時間）。
３．ペレットを乱さずに上清を注意深く採取する。
４．０．２２μｍでフィルターし４℃で保存する。１週間以内に使用する。
【０１３１】
培地変更
細胞タイプについてＳＥＶ産生のために最適化された細胞を増殖させ、指定された時点で枯渇したＳＥＶに変更する。
１．ＳＥＶ枯渇培地から培地を調製し、必要に応じて希釈する。
２．培地を吸引する。
３．１５０ｍｍのディッシュに対して、７ｍｌのＰＢＳを添加する。
４．全てのＰＢＳ又は残りの培地を十分に吸引する。
５．ＳＥＶ枯渇培地を添加する。
【０１３２】
ＳＥＶ産生
細胞タイプについてＳＥＶ産生のために最適化された細胞を増殖させ、必要に応じてＳＥＶ枯渇培地に変更し、指定された時点でＳＥＶ単離を実施した（典型的には培地変更後２４〜４８時間）。
【０１３３】
注意：細胞は良好な条件であるべきである。細胞死及びアポトーシス体はＳＥＶペレットの汚染につながる可能性がある。
【０１３４】
ＳＥＶが機能的アッセイに使用されることになる場合、無菌条件下で行う。
【０１３５】
ローターＴｙｐｅ  ４５Ｔｉを有する超遠心分離機を予冷する（このローターは冷却に長時間かかるため、産生を開始する前の晩に冷蔵庫に入れておくと良い）。
１．ディッシュから５０ｍｌチューブに培地を通す。
２．１３５０ＲＰＭで１０分間４℃でスピンする。
【０１３６】
並行して：代表的な数のディッシュについて（典型的には、３０ディッシュの産生につき３枚）：
ａ．ＰＢＳで洗浄し、吸引する
ｂ．トリプシンを添加し、分離するまで３７℃でインキュベートする
ｃ．１０％の血清、好ましくはＳＥＶ枯渇した血清を有する培地を添加する
ｄ．細胞を各ディッシュから別々にカウントし、産生に用いられた全細胞を記録する。
ｅ．冷ＰＢＳを添加する
ｆ．１３５０ＲＰＭで７分間４℃で遠心分離する。
ｇ．上清を吸収する
ｈ．タンパク質／ＲＮＡのために−８０℃で凍結する。
【０１３７】
３．上清を注意深く新しい５０ｍｌチューブに移す。ペレットと共にチューブを捨てる。
４．３５００ＲＰＭで培養室内で２０分間４℃でスピンする。
５．上清を注意深く新しい５０ｍｌチューブに移す。ペレットと共にチューブを捨てる。
６．遠心分離機５８１０ＲローターＦ−３４−６−３８で：１０，０００ＲＰＭで３０分間４℃でスピンする。
７．上清を注意深く、ローターＴｙｐｅ  ４５  Ｔｉ用の滅菌超遠心分離チューブ（チューブ３５５６２２）に移す。チューブにひびが入っていないことを注意深く確認する。チューブを６５ｍｌで充填し、重量でバランスをとる（０．０１〜０．０２ｇｒの差を目指す）。ペレット位置をマークするためにローターに近い側でチューブをマークする。この段階で、培地は、超遠心分離前に４℃で数日間（最大３〜４日）維持することができる。
【０１３８】
８．４０，０００ＲＰＭで９０分間４℃で超遠心分離する。
９．注意深く、ペレット位置から可能な限り離れて−上清を捨て、可能な最小量を残す（ペレットが見える場合は完全に吸引し、そうでない場合は最大で２ｍＬの培地を残す）。
１０．ｐ１０００を使用して、ペレットを２ｍＬの冷ＰＢＳ（又は残りの上清）中に再懸濁し、別のチューブに移す。
１１．２ｍｌの冷ＰＢＳを添加し、ｐ１０００で洗浄し、マークしたペレット位置を慎重に洗浄するよう注意する。同じチューブに移す。
１２．２ｍｌのＰＢＳでの洗浄を繰り返し、同じチューブに移す。
１３．全てのチューブについて繰り返し、全てを同じチューブに移す。
１４．チューブを冷ＰＢＳで６５ｍｌに充填し、重量のバランスをとる。
１５．４０，０００ＲＰＭで９０分間４℃で超遠心分離する。
【０１３９】
１６．注意深く、ペレット位置から可能な限り離れて−上清を捨て、可能な最小量を残す。
１７．残りの上清中に再懸濁するか、又は冷ＰＢＳを最小量で添加して再懸濁する（これは使用される細胞の量及び細胞タイプに依存するであろう）。マークされたペレット位置を慎重に洗浄するよう注意する。滅菌シリコンチューブに移す（ｓｉｇｍａ  Ｔ３２８１）。
１８．チューブ、特にペレット位置を、最小量の冷ＰＢＳで洗浄する。同じシリコンチューブに移す。
１９．採集量を測定し、記録を残す。
２０．滅菌シリコンチューブに分注し、−８０℃で保存する。
【０１４０】
重要な観察：
ＭＤＡ−ＭＢ  ２３１及びＳＵＭ  １５９  ＰＴ細胞の場合：１５０ｍｍ直径のディッシュ当たり１ｘ１０Ｅ６の細胞を播種する；３日後、培地をＳＥＶ枯渇に変更する；２日後、産生を開始する；
Ｔ４７−Ｄ細胞の場合：１５０ｍｍ直径のディッシュ当たり６ｘ１０Ｅ６の細胞を播種する；５日後、培地をＳＥＶ枯渇に変更する；２日後、産生を開始する；
ＭＣＦ７細胞の場合：１５０ｍｍ直径のディッシュ当たり７ｘ１０Ｅ６の細胞を播種する；５日後、培地をＳＥＶ枯渇に変更する；２日後、産生を開始する；
１５０ｍｍ直径のディッシュを使用する場合、細胞を２５ｍＬの培地中に維持する；
上記で挙げた細胞タイプの全てについて、第１の超遠心分離後であっても目に見えるペレットが得られるので、第１の超遠心分離後とＰＢＳ洗浄後の両方で全ての上清を除去して、上清中に依然として浮遊している可能性があるタンパク質による夾雑を避けることが重要である；
ＳＥＶ枯渇したＲＰＭＩ及びＤＭＥＭを、２０％の血清；１％Ｐ／Ｓ（及びｌ−ｇｌｕ、ＲＰＭＩの場合）で調製する。培地を、ＯＮ超遠心分離後に濾過し、冷蔵庫内で最大１か月保存することができる。産生用の細胞培地を変更する前に２０％のＳＥＶ枯渇培地を希釈する場合、新しいボトルの新鮮な培地を使用するべきである。希釈された培地は、産生用の細胞培地を変更する前に希釈時に再濾過するべきである。
【０１４１】
抗体及び試薬
以下の抗体を使用した:抗ＣＤ６３（#clone H5C6、BD Biosciences）、抗ＮＦＡＴ３（Sigma;#F1804、Thermo Scientific;#PA1-021、Santa-Cruz Biotechnology;sc-13036）、抗ＣＤ９（#clone CBL162、Millipore）、抗Ａｃｔｉｎ（Thermo Scientific;# MA5-15739）、ＥＳＲ１（Santa-Cruz Biotechnology;sc-543）。
組み換えＴＧＦＢ１はInvitrogenからのものであった（#PHG9214）
【０１４２】
ＳＥＶ特徴付け
ＳＥＶのサイズ分布をNanoSightによって評価した。
【０１４３】
ウェスタンブロット
４００  ０００  Ｔ４７Ｄ又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、laemelli緩衝液中でレーンごとに使用した。各ＳＥＶの２０ｕｇを、Laemelli緩衝液＋２％ＳＤＳ中でレーンごとに使用した。試料をゲル上にロードする前に９５℃で３０分間煮沸した。ゲルをニトロセルロース膜上に移し、１時間ＴＢＳ−０，０５％  Tween-20中、室温でブロックした。次いで膜を、図に示した異なる抗体と共に一晩インキュベートした。翌日、膜をＴＢＳ−０，０５％  Tween-20中で４回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体と共に１時間室温でインキュベートした。次いで、膜をＴＢＳ−０，０５％  Tween-20中で４回洗浄し、１時間室温でインキュベートし、ＥＣＬで暴露して、タンパク質を可視化した。
【０１４４】
浸潤アッセイ
浸潤アッセイを、Transwellチャンバ（Becton Dickinson）と、Matrigel（Becton Dickinson）でコーティングされた８−μｍ細孔膜を用いて、本質的に記載したように行った。関連するｓｉＲＮＡでトランスフェクトされていないか又はトランスフェクトされた細胞を、１０％のウシ胎仔血清を省いた培地で日中４回洗浄することによって飢餓状態にし、最終洗浄後、細胞６００ｕｌの１０％のウシ胎仔血清を含まない培地。翌日、細胞を、ＰＢＳ又は０，３７５．１０9粒子／ウェルのいずれかで１２ウェルプレート中で２４時間処理した。場合によっては、５ｎｇ／ｍＬの組み換えｈＴＧＦβ１（#PHG9214、Invitrogen）又はビヒクルを添加した。翌日、細胞をトリプシン処理し、０．１％のＢＳＡを含有する血清を含まない培地に採取し、細胞を各ウェルに添加した。馴化ＮＩＨ−３Ｔ３培地をチャンバの底部ウェルに添加した。６時間後、侵入しなかった細胞を綿棒を用いてフィルターの上面から除去し、そして、フィルターの下面に侵入した細胞を１００％メタノール中で１０分間固定し、次いで、クリスタルバイオレットで３０分間染色した。各Transwell中の全ての細胞をカウントした。各条件下で侵入した細胞の数を、１の比として任意に設定したＰＢＳ条件と比較した。アッセイが、ｓｉＲＮＡにより一時的にトランスフェクトされた細胞を用いて行われた場合、細胞の９５％が効果的にトランスフェクトされたので、細胞はクリスタルバイオレットで染色された。場合によっては、５ｎｇ／ｍＬの組み換えＴＷＥＡＫを、アッセイ中に細胞に６時間添加した。
【０１４５】
増殖及びアポトーシスアッセイ
アポトーシス試験
高度に浸潤性のＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ａ）を２４時間、及びＳＵＭ−１５９−ＰＴ（Ｂ）を２４時間、ＳＥＶの指示量で処理し、細胞アポトーシスを評価した。ＳＥＶ処理の２４時間後、細胞上清を除去し、細胞をトリプシン処理し、冷ＰＢＳ中で２回洗浄した。細胞を、冷結合緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％  ＢＳＡ）中で１．１０6細胞／ｍＬの濃度に再懸濁した。次いで、１００μＬの細胞（１ｘ１０５〜１ｘ１０６）をポリプロピレンＦＡＣＳチューブに入れ、１０μＬの標識Annexin Vを細胞に添加した。細胞を氷上で１５分間インキュベートし、光から保護した。次いで、洗浄することなく、３８０μＬの冷１Ｘ結合緩衝液を各チューブに添加し、アネキシン−Ｖ標識を、フローサイトメトリーによって直ちに分析して、アポトーシスを評価した。
【０１４６】
増殖試験
高度に浸潤性のＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ａ）を２４時間、並びにＳＵＭ−１５９−ＰＴ（Ｂ）を２４、４８及び７２時間、Ｔ４７Ｄ−ＷＴ由来ＳＥＶの指示量で処理して、細胞増殖を評価した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１増殖を、製造業者の推奨に従ってBrdU Incorporationアッセイによって評価した（Roche:# 11444611001）。
【０１４７】
ｓｈＲＮＡ
全てのｓｈＲＮＡは、ｐＧＩＰＺレンチウイルスベクターにクローニングされたDharmaconからのものであった。
pGIPZ sh（hNFAT3）-3 5‘-CAATGAACACCACCTTGGA-3’（クローンID：V3LHS_383428、配列番号18）
pGIPZ sh（hNFAT3）4 5’- AGTCTCAGGGAACATCCGC-3’（クローンID：V3LHS_383431、配列番号19）
pGIPZ sh（hTGFβ1）1 5’- ATGCTGTGTGTACTCTGCT-3’（クローンID：V3LHS_356824、配列番号20）
pGIPZ sh（hTGFβ1）2 5’- TGATGTCCACTTGCAGTGT-3’（クローンID：V3LHS_356823、配列番号21）
【０１４８】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子の産生
・１日目：
細胞を１０％ＳＶＦ／ＨＩＧＨ  ＤＭＥＭ中に播種する
【０１４９】
【表４】
2019513710.tif 000019
【０１５０】
・２日目：
１−リン酸カルシウムによるプラスミドトランスフェクション
【０１５１】
【表５】
2019513710.tif 000020
【０１５２】
２−ＣａＣｌ２の指示量を上記の希釈ＤＮＡに添加する
【０１５３】
【表６】
2019513710.tif 000021
【０１５４】
３−試薬を漏出することなく完全に混合するのに十分な速度でチューブをボルテックスする。ボルテックス中、指示量の２ｘ  ＨＢＳＳを滴下する：
【０１５５】
【表７】
2019513710.tif 000022
【０１５６】
４−室温で３分間インキュベートする。明白亜色の沈殿物がインキュベーション中に出現するはずである（沈殿物は常に明らかではない場合がある）。
５−トランスフェクションミックスの全量（３００μＬ又は２．１ｍＬ）を細胞に滴下する。
（注意：正確な容量はピペッティングロスのためにわずかに減少することがあるが、これはトランスフェクション効率に悪影響を与えないであろう）
６−細胞を３７℃で５％のＣＯ２で１０〜１６時間インキュベートする
【０１５７】
・３日目：
１−低血清培地（reduced serum medium）を調製する：
ａ．高グルコースＤＭＥＭ
ｂ．５％胎児ウシ
ｃ．２ｍＭのＬ−グルタミン
ｄ．１ｘペニシリン／ストレプトマイシン
２−リン酸カルシウム含有培地を細胞から除去し、１４ｍｌの低血清培地に換える。
３−細胞を３７℃で５％のＣＯ２でさらに４８時間インキュベートする。
【０１５８】
・５日目：ウイルス粒子の回収及び濃縮
１−１５ｍＬの滅菌蓋付きコニカルチューブに培地を除去することによって、培地変更から４８時間後にウイルス粒子含有上清を回収する。
２−１６００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって非付着細胞及び残屑をペレット化し、細胞残屑をペレット化する。
３−残りの細胞残屑を除去するための低速遠心分離ステップの後に上清を滅菌した０．２２〜０．４５μｍの低タンパク質結合フィルターを通す濾過ステップ。濾過したウイルス培地は超遠心分離チューブに直接入れる。
４−スイングバケット（swinging-bucket）超遠心分離ローターでの超遠心分離によって濃縮する。変化した上清を滅菌超遠心分離チューブに移す。血清を含まないＤＭＥＭでの超遠心分離中にチューブの破損を避けるために、チューブをほぼ満たす容量にする。
ＳＷ２８ローターの場合、２３，０００ｒｐｍで２時間４℃で遠心分離する。
５−所望の再懸濁容量のＤＭＥＭ（無血清）をチューブの底のペレットにピペッティングする。
６−可視ペレット（目に見える場合）は、トランスフェクトされた細胞の培養培地からの血清タンパク質から大部分が構成されている。ウイルス粒子は、タンパク質ペレットから除去する必要がある。ペレットにＤＭＥＭを添加した後、１０分間４℃でインキュベートする。次いで、気泡の形成を避けながら、約３０回やさしく上下にピペットする。
７−再懸濁したペレットを滅菌微量遠心チューブに移し、フルスピードで３〜４分間遠心分離する。この遠心分離は血清タンパク質をペレット化することになり、これはチューブの底に付着する。遠心分離後に、上清を新しい微量遠心チューブに移し、１００ｕｌのＰＢＳ中に再懸濁する（１回の感染につき２０ｕｌが使用されることになる。レンチウイルス粒子は常に−８０℃で保存する。
【０１５９】
レンチウイルス粒子による細胞の感染及び選抜
・１日目：
細胞を、その対応する培地中の１０％ＳＶＦ＋ＡＢにおける２４ウェルプレートに播種する
【０１６０】
【表８】
2019513710.tif 000023
【０１６１】
・２日目：
４ｕｇ／ｍｌのPolybreneで補充した対応する培地の２５０ｕｌで、培地を交換する
細胞に直接、２０ｕｌのウイルスを加えることによって感染させる
インキュベーターに４時間入れる
４時間後、ポリブレン（polybrene）で補充した対応する培地の１ｍｌ／ウェルを添加する
【０１６２】
・６日目：
細胞をトリプシン処理して、それを２５ｃｍのフラスコに移す
【０１６３】
・９日目：
細胞を実験室に戻し、それを以下に移す：
【０１６４】
【表９】
2019513710.tif 000024
【０１６５】
フラスコがコンフルエント（confluent）である場合、ＦＡＣＳの選別に進むことができる。
【０１６６】
・細胞選別：
１０．１０6細胞／ｍｌの選別のための濃度を有するべきである
１．細胞をトリプシン処理し、それらをカウントする
２．細胞を１回ＰＢＳで洗浄する
３．２Ｘ  ＡＢで完成したＰＢＳの必要量で細胞を再懸濁する
４．細胞をセルストレーナー（cell strainer）に通して凝集体を除去する
５．細胞をPolypropylene Facsチューブに移す
６．２Ｘ  ＡＢで完成した１００％のＳＶＦを含有する選別細胞を受けるためのチューブを準備する
７．ＳＶＦを含まないが２Ｘ  ＡＢを含む対応する培地を含有する選別細胞を増殖させるための６ウェルプレートを準備する（選別細胞が加えられることになる場合、そこには２０％のＳＶＦ最終があることになる）
８．次いで、異なる検証試験を実現するのに十分となるまで細胞を増殖させる。
９．クローンを凍結させることを忘れないこと。
【０１６７】
ｓｉＲＮＡ
全てのｓｉＲＮＡは、Dharmaconからのon Target plus smartpoolであった。
ヒトＴＧＦβ１の場合、ｓｉＲＮＡは以下のものであった：
siRNA1 5’- AUUGAGGGCUUUCGCUUA-3’（配列番号22）,
siRNA2 5’- CCGAGAAGCGGUACCUGAA-3’（配列番号23）,
siRNA3 5’- GCAGAGUACACAGCAUA-3’（配列番号24）,
siRNA4 5’- GGACUAUCCACCUGCAAGA-3’（配列番号25）,
ｓｉＲＮＡ対照はDharmaconからの有効な非ターゲティングスマートプール（validated non targeting smartpool）であった。配列は製造業者によって提供されなかった（参照Dharmacon：Ｄ−００１８１０−０２−２０）。一時的にヒトＴＧＦβ１をサイレンシングするために、本発明者らは、上記の特異的ｓｉＲＮＡｓを３０ｎＭで使用し、製造業者の指示に従って４８時間ＤｈａｒｍａＦＥＣＴで細胞をトランスフェクトした。内在性ＴＧＦβ１の効果的なダウンレギュレーションをＥＬＩＳＡによって確認した。
【０１６８】
ヒトＴＧＦβ１のためのＥＬＩＳＡ
細胞上清において
ＴＧＦβ１のためのＥＬＩＳＡを、製造業者に指示されたように１００μｌの活性化された細胞上清に対してR&D systemsからのキット（#DY240）を用いて行った
マウス血清において
血液をマウスから採取し、血清分離をBD Microtainer SSR Tubes（#365968）で行った。ＴＧＦβ１のためのＥＬＩＳＡを、製造業者に指示されたように１μｌの活性化された血清に対してR&D systemsからのキット（#DY240）を用いて行った
【０１６９】
プラスミド構築
ヒトＴＧＦβ１プロモーター（ＰＧＬ３−ｈＴＧＦβ１−１６７０）を、ＰＧＬ３ベーシックベクター（Promega）中にＭＤＡ−ＭＢ−２３１から単離したテンプレートとしてのゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲによってクローニングした。全ての構築はシークエンシングによって確認した。ｐＣＳ２−（ｎ）−βｇａｌは既に記載されている（Jauliac, Sら、(2002)Nature Cell Biology、4(7)、540−544）。
【０１７０】
細胞を、製造業者の指示に従ってLipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて適切なプラスミドにより一時的にトランスフェクトした。
【０１７１】
異なる構築の配列：
・ＰＧＬ３ベーシック（basic）（Promega、空ベクター）：配列番号２６；
・ＰＧＬ３−ｈＴＧＦβ１−１６７０プロモーター（ｈＴＧＦβ１プロモーターの制御下でのルシフェラーゼの発現）：配列番号２７；
【０１７２】
ルシフェラーゼアッセイ
細胞を、Lipofectamine 2000を用いて、ＰＧＬ３ベーシックプラスミド又はＰＧＬ３−ｈＴＧＦβ１−１６７０ルシフェラーゼプロモーターコンストラクトのいずれか、及びｐＣＳ２−（ｎ）−β−ガラクトシダーゼプラスミドによりコトランスフェクトした。翌日、細胞を、６ウェルプレート中で２４時間ＰＢＳ又は１．１０9粒子／ウェルのいずれかで処理した。２４時間後、細胞をReporter Lysis Buffer（Promega）で溶解し、ルシフェラーゼ及びβ−ｇａｌ活性を、ルミノメーターでLuciferase Assay System（Promega）及びGalacton-plus（Tropix）を使用して測定した。ルシフェラーゼ活性は、対応するβ−ｇａｌ活性に対して正規化された。
【０１７３】
マウス実験：
異種移植及びインビボでのフォローアップ
・Hsd:AthymicNude-Foxn1nu雌マウスにおけるＭＢ−２３１  Ｄ３Ｈ２  ＬＮ−Ｌｕｃについて
６週齢のHsd:AthymicNude-Foxn1nu雌マウスはEnvigo社からのものであった。マウスをいずれかの操作の前にＩＵＨ動物施設で１週間飼育した。マウスが７週齢に達したら、１００μｌのＰＢＳで希釈した１〜０．５．１０6個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１  Ｄ３Ｈ２  ＬＮ−Ｌｕｃ細胞を、第２の右下脂肪体に注射した。３日後、成功した異種移植を、ＰＢＳで希釈したXenoLight D-Luciferin, Potassium Saltを注射することによる発光によって可視化し、発光はXenogen systemで３０秒間起こった。各条件につき８匹のマウスの群を同等の発光で確立した。実験は２か月間行った。最初の月に、腫瘍サイズを月曜日及び木曜日にキャリパーで測定した。毎週火曜日に、マウスに、異なる実験に記載されているように２か月間腫瘍内又は静脈内に、５０．１０8個のＳＥＶ  Ｔ４７Ｄ−ＷＴ、Ｔ４７Ｄ−ｓｈＣｔｒｌ、Ｔ４７Ｄ−ｓｈＮＦＡＴ３−３又はＴ４７Ｄ−ｓｈＮＦＡＴ３−４を毎週注射した。毎週金曜日に、血液を眼窩後方から採取した。２か月目から転移が現れ始めるので、腫瘍サイズが測定されたら、転移形成の評価を月曜日及び木曜日に行った。マウスに、ＰＢＳで希釈したXenoLight D-Luciferin, Potassium Saltを注入し、生物発光画像（原発性腫瘍は黒色組織で遮蔽された）をＸｅｎｏｇｅｎシステムで取得して、転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  Ｄ３Ｈ２  ＬＮ−Ｌｕｃ細胞によって生成された平均光子束を定量した。転移の定量化は、転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  Ｄ３Ｈ２  ＬＮ−Ｌｕｃ細胞によって生成された平均光子束として提示される。２か月の終わりに、マウスを屠殺し、原発性腫瘍並びに肺、腋窩リンパ節及び肝臓を、その後の免疫蛍光標識のために−８０℃で保存した。
【０１７４】
結果
低浸潤性乳癌Ｔ４７Ｄ及びＭＣＦ７細胞によって産生されたＳＥＶの特徴付け
ＳＥＶＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＴ４７Ｄ細胞によって産生されたＳＥＶのサイズ分布の代表例は、図１Ａ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）及び図１Ｂ（Ｔ４７Ｄ）に表され、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＴ４７Ｄ  細胞によって産生されたＳＥＶが、１００〜２００ｎｍの同様の平均サイズを有することを示す。
【０１７５】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＴ４７Ｄ細胞によって産生されたＳＥＶはまた、ウェスタンブロットによっても特徴づけられ、カルネキシンに対する抗体；ＣＤ６３及びＣＤ８１を用いて全細胞抽出物と比較した（図１Ｃ）。結果は、精製された試料がＳＥＶのみを含有することを示し、これはＣＤ６３マーカーを発現するが、カルネキシンは発現しないためであり、前記試料には細胞は存在しないことを示している。
【０１７６】
低浸潤性乳癌Ｔ４７Ｄ−ＷＴ及びＭＣＦ７−ＷＴ細胞によって産生されたＳＥＶは、高度に浸潤性のＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＳＵＭ−１５９−ＰＴ乳癌細胞及びＷＭ．２６６．４黒色腫細胞の浸潤を特異的に阻害する。
【０１７７】
異なる細胞株からのＳＥＶを、古典的なトランズウェル（transwell）浸潤アッセイにおいて、高度に浸潤性の乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＵＭ１５９ＰＴ）又は黒色腫細胞（ＷＭ．２６６．４）の浸潤を調節するその特異的な能力を試験するために産生した。５つのタイプの細胞をＳＥＶの産生のために選択した：２つの低浸潤性乳癌細胞株（Ｔ４７Ｄ−ＷＴ、ＭＣＦ７）、１つの高度に浸潤性の乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、及び若年及び高齢のヒト検体から得られた２つのヒト線維芽細胞（ＦＨＮ２１−ＷＴ、２０歳；ＦＨＮ３２−ＷＴ、７４歳）。
【０１７８】
結果を図２に提示し、以下のことを示している：
・若年及び高齢ヒト検体から得られたヒト線維芽細胞（ＦＨＮ２１−ＷＴ及びＦＨＮ３２−ＷＴ）によって産生されたＳＥＶ、並びに高度に浸潤性の乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）によって産生されたＳＥＶは、高度に浸潤性の乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の浸潤指数を有意に変化させない（図２Ａ参照）；
・２つの低浸潤性乳癌細胞株、Ｔ４７Ｄ−ＷＴ及びＭＣＦ７−ＷＴ細胞によって産生されたＳＥＶは、高度に浸潤性の乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図２Ａ及び２Ｃ参照）及びＳＵＭ−１５９−ＰＴ（図２Ｄ参照）の浸潤指数を約５０％有意に減少させる。２つの異なる低浸潤性乳癌細胞株は同じ効果を有するという事実は、低浸潤性乳癌細胞株によって産生されたＳＥＶの阻害効果が、ＳＥＶ産生細胞株に対して特異的ではないが、一般的な効果であるということを強調している；
・低浸潤性乳癌細胞株Ｔ４７Ｄ−ＷＴ及びＭＣＦ７−ＷＴ細胞によって産生されたＳＥＶはまた、高度に浸潤性の黒色腫細胞株ＷＭ．２６６．４の浸潤指数を約６０％有意に減少させる（図２Ｂ参照）。２つの低浸潤性乳癌細胞株が高度に浸潤性の黒色腫細胞株に対して同じ効果を有するという事実は、低浸潤性乳癌細胞株によって産生されたＳＥＶの阻害効果が、その元の細胞タイプが何であっても、高度に浸潤性の乳癌細胞株に対して特異的ではないが、高度に浸潤性の細胞株に対して一般的な効果であるということを強調している。
【０１７９】
低浸潤性乳癌細胞（Ｔ４７Ｄ−ＷＴ）からのＳＥＶは、高度に浸潤性の乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＳＵＭ−１５９−ＰＴ）の増殖を改変しない
高度に浸潤性の乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＳＵＭ１５９ＰＴの増殖を変化させる低浸潤性乳癌細胞株Ｔ４７Ｄ−ＷＴ由来のＳＥＶの能力を、さらに評価し、並びにそれらの高度に浸潤性の乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のアポトーシスを誘導する能力を評価した。
【０１８０】
結果を図３に提示し、低浸潤性乳癌細胞株Ｔ４７Ｄ−ＷＴ由来のＳＥＶは、高度に浸潤性の乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図３Ａ参照）及びＳＵＭ１５９ＰＴ（図３Ｂ参照）の増殖を改変せず、かつ、高度に浸潤性の乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のアポトーシスを誘導しないことを示す。
【０１８１】
高度に浸潤性の細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＳＵＭ−１５９−ＰＴ）の浸潤能に対する、低浸潤性乳癌細胞株Ｔ４７Ｄによって産生されたＳＥＶの阻害効果は、低浸潤性ＳＥＶ産生細胞株Ｔ４７Ｄ−ＷＴにおけるＮＦＡＴ３の発現を必要とする。
本発明者らは、低浸潤性乳癌細胞株が、その低い浸潤能に必要とされる高浸潤性の乳癌細胞株と比較して特に多量のＮＦＡＴ３を発現することを以前に示した（Fougere, M.、ら、(2010)Oncogene、29(15)、2292−2301）。
【０１８２】
それゆえ、ＳＥＶ産生細胞（Ｔ４７Ｄ−ＷＴ）における内在性ＮＦＡＴ３が、高浸潤性細胞株の細胞浸潤を鈍らせるためにこれらＳＥＶに必要とされ得るという仮説が立てられた。この可能性を試験するために、内在性ＮＦＡＴ３の発現を５０％に減少させる２つのｓｈＲＮＡ（ＳｈＮＦＡＴ３−３、ＳｈＮＦＡＴ３−４）によって内在性ＮＦＡＴ３発現が減少されたＴ４７Ｄ細胞、あるいはｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣｔｒｌ）によって変更されなかったＴ４７Ｄ細胞を生成した（図４Ａ参照）。ＳＥＶはｓｈＲＮＡ発現Ｔ４７Ｄ細胞株から産生され、高度に浸潤性の細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＳＵＭ−１５９−ＰＴの浸潤能に対して試験した。
【０１８３】
結果は、図４Ｂ及び図４Ｃに提示され、ＳＥＶ−Ｔ４７Ｄ産生細胞株における内在性ＮＦＡＴ３の発現が、乳癌細胞浸潤を妨げるのに絶対的に必要であるということを実証し、これは、内在性ＮＦＡＴ３（ＳｈＮＦＡＴ３−３、ＳｈＮＦＡＴ３−４）の発現を５０％に減少させるｓｈＲＮＡを発現するＴ４７Ｄ細胞株から産生されたＳＥＶが、ｓｈＲＮＡを有さないＴ４７Ｄ細胞株（Ｔ４７Ｄ−ＷＴ）又は対照ｓｈＲＮＡを発現するＴ４７Ｄ細胞株（ｓｈＣｔｒｌ）から産生されたＳＥＶとは対照的に、高度に浸潤性の細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＳＵＭ−１５９−ＰＴの浸潤指数を減少させないためである。これらデータは、ＳＥＶ産生細胞株におけるＮＦＡＴ３発現が浸潤性阻害能を高浸潤性細胞株に転移する鍵であることを初めて示す。
【０１８４】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＴＧＦβ１のデノボ誘導は、ＳＥＶが乳癌細胞浸潤をを調節するためにに必要とされる。
Ｔ４７Ｄ−ＷＴ細胞株によって産生されたＳＥＶが高度に浸潤性の乳癌細胞株浸潤を妨げることができるメカニズムを明らかにし始めるために、受容細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）におけるＳＥＶによる異なる因子の調節を評価した。
【０１８５】
図５Ａに提示されたデータは、Ｔ４７Ｄ−ＷＴ細胞由来のＳＥＶが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるＴＧＦβ１分泌の増加を誘導することを示す。また、このＴＧＦβ１分泌の増加は活性転写を必要とし、これは転写阻害剤（アクチノマイシン）による細胞の前処理がこの分泌の増加を完全に防ぐためである。これらの結果は重要である。なぜなら、これらは、ＴＧＦβ１分泌の増加が、受容細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）で起こる活性機構（active mechanism）であり、かつ潜在的ＳＥＶ  ＴＧＦβ１タンパク質の寄与に関連していないことを実証するためである。
【０１８６】
次に、このＴＧＦβ１分泌の増加が、ＳＥＶが細胞浸潤を阻害するために必要である可能性を試験した。この目的のために、ＴＧＦβ１に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＴＧＦＢ１）又は対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｔｒｌ）によって、受容細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）において一過性のトランスフェクションアッセイで、内在性ＴＧＦβ１を独立して下方制御した。内在性ＴＧＦβ１の損失を補うために、受容細胞を外因性ＴＧＦβ１で処理した。図５Ｂに提示された結果は、ＳＥＶによるＴＧＦβ１分泌の増加が、細胞浸潤を阻害するために絶対的に必要とされることを実証し、これは、ＴＧＦβ１が下方制御されると、受容ｓｈＣｔｒｌ細胞（ｓｉＣｔｒｌ、＋ＳＥＶ）と比較して、ＳＥＶはもはや、細胞浸潤を妨げることができないためである（ｓｉＴＧＦＢ１、＋ＳＥＶ）。また、ＳＥＶとともに外因性ＴＧＦβ１を戻すことは、細胞浸潤を阻害するＳＥＶの能力を回復するのに十分である（ｓｉＴＧＦＢ１、＋ＳＥＶ、＋ＴＧＦβ１）。さらに、以前に内在性ＴＧＦｂ１を下方制御することなく外因性ＴＧＦβ１を添加することは（ｓｉＣｔｒｌ、＋／−ＳＥＶ、＋ＴＧＦｂ１）浸潤を阻害するのに十分ではなく、外因性ＴＧＦｂ１単独での治療が細胞浸潤を阻害するのに十分でないことを示している。これら結果は、高度に浸潤性の細胞株を受ける際に低浸潤性細胞株由来のＳＥＶがＴＧＦβ１分泌の転写増加を誘導することを実証し、これは浸潤を阻害するＳＥＶの能力に絶対的に必要である。
【０１８７】
Ｔ４７Ｄ−ＷＴ細胞によって産生されたＳＥＶは、ｈＴＧＦＢ１プロモーターの活性を上方制御する能力がある。
ｈＴＧＦｂ１プロモーターの模式図を図６Ａに示す。http://www.fast-db.com/perl/nfat.plで入手可能なソフトウェアを用いて決定されたＮＦＡＴ結合部位を用いて、６つの潜在的なＮＦＡＴ−結合部位が見出された。＋１開始部位に対する位置が示されている。
【０１８８】
したがって、Ｔ４７Ｄ−ＷＴ細胞によって産生されたＳＥＶが、ｈＴＧＦＢ１プロモーターの活性を上方制御することができるかを試験した。結果は、図６Ｂに提示され、Ｔ４７Ｄ−ＷＴ細胞によって産生されたＳＥＶが実際にｈＴＧＦＢ１プロモーターの活性を上方制御することを示している。
【０１８９】
低浸潤性乳癌細胞株Ｔ４７Ｄ−ＷＴによって産生されたＳＥＶの静脈内又は腫瘍内注射は、腫瘍増殖及び転移の出現を阻害し、ＴＧＦβ１の誘導と相関する。
次に、低浸潤性乳癌細胞によって産生されたＳＥＶが、インビトロで行ったものと同じ阻害効果をインビボモデルで誘導し得るかを試験した。この目的のために、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｄ３Ｈ２ＬＮ）を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、６週齢の雌マウスAthymic Nude-Foxn1nuマウスの左脂肪体に注射した。低浸潤性乳癌細胞株Ｔ４７Ｄ−ＷＴによって産生されたＳＥＶ、又は対照としてのＰＢＳを、細胞の異種移植の１週間後に、尾静脈内又は腫瘍内のいずれかに毎週注射した。腫瘍増殖のモニタリングを、１０週間、キャリパー測定によって行った。
【０１９０】
結果は、静脈内注射については図７、及び腫瘍内注射については図８に提示され、初めて、かつインビトロでは細胞増殖の阻害がないにも関わらず（図３）、Ｔ４７Ｄ−ＷＴ細胞由来のＳＥＶが、腫瘍増殖を有意に妨げることができること（静脈内：図７Ａ、マウスＮ°６１０；腫瘍内：図８Ａ、マウスＮ°６１４）を、インビボでＰＢＳを注射されたマウスと比較して（静脈内：図７Ａ  マウスＮ°６２９；腫瘍内：図８Ａ、マウスＮ°６１７）示している。
興味深いことに、両方の注射タイプ（静脈内又は腫瘍内）において、ＳＥＶの阻害効果は、処置マウスの血液中のＴＧＦβ１の誘導と密接に相関した。実際に、ＳＥＶの毎週注射が腫瘍増殖速度を改変しなかったマウスは、ＰＢＳを注射されたマウスと比較して（静脈内：図７Ｂ  マウスＮ°６２９；腫瘍内：図８Ｂ  マウスＮ°６１７）、血液中のＴＧＦβ１の増加を示さなかった（静脈内：図７Ｂ  マウスＮ°６２５；腫瘍内：図８Ｂ  マウスＮ°６０２）。
【０１９１】
同じ群のマウスにおいて、転移形成を、転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によって生成された平均光子束によって、Xenogen systemで、４２日目からの生物発光イメージングによって評価した（原発性腫瘍は黒色組織で遮蔽された）。結果は、静脈内注射については図７に、及び腫瘍内注射については図８に提示され、尾静脈内又は腫瘍内のいずれかに、Ｔ４７Ｄ−ＷＴ細胞由来のＳＥＶを注射されたマウスが、ＰＢＳを注射されたマウスと比較して（静脈内：図７Ｃ  マウスＮ°６２９；腫瘍内：図８Ｃ、マウスＮ°６１７）、有意に減少した転移の発生（unveiling）及び増殖を有すること（静脈内：図７Ｃ、マウスＮ°６１０；腫瘍内：図８Ｃ、マウスＮ°６１４）を初めて示している。
【０１９２】
また、腫瘍増殖について示されたように、転移に対するＳＥＶの阻害効果は、血液中のＴＧＦβ１の誘導と密接に相関した。実際に、ＳＥＶの毎週注射が転移の出現を改変しなかったマウスは、ＰＢＳを注射されたマウスと比較して（静脈内：図７Ｄ  マウスＮ°６２９；腫瘍内：図８Ｄ  マウスＮ°６１７）、血液中のＴＧＦβ１の増加を示さなかった（静脈内：図７Ｄ  マウスＮ°６２５；腫瘍内：図８Ｄ  マウスＮ°６０２）。
【０１９３】
これら結果は重要であり、低浸潤性乳癌細胞由来のＳＥＶが、インビボでの腫瘍増殖及び転移の出現を妨げることができ、かつ血液循環におけるＴＧＦβ１の増加と密接に相関することを初めて実証する。このＴＧＦβ１の増加は、癌患者におけるＳＥＶ注射の効率を評価するための良いツールとなり得る。
【０１９４】
ＳＥＶの腫瘍内注射の腫瘍増殖に対する阻害効果は、Ｔ４７Ｄ−ＳＥＶ産生細胞におけるＮＦＡＴ３の発現を必要とし、ＴＧＦβ１の誘導と相関する。
【０１９５】
次に、内在性ＮＦＡＴ３がｓｈＲＮＡによって下方制御された低浸潤性乳癌細胞によって産生されたＳＥＶが、インビボモデルで同じ阻害効果を誘導し得るかを試験した。
【０１９６】
この目的のために、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｄ３Ｈ２ＬＮ）を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、６週齢の雌マウスAthymic Nude-Foxn1nuマウスの左脂肪体に注射した。内在性ＮＦＡＴ３の発現を５０％に減少させるｓｈＲＮＡ（ＳｈＮＦＡＴ３−３、ＳｈＮＦＡＴ３−４）によって、又はｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣｔｒｌ）によってトランスフェクトされたＴ４７Ｄ細胞によって産生されたＳＥＶ、あるいは対照としてのＰＢＳを、細胞の異種移植の１週間後に、腫瘍内に毎週注射した。腫瘍増殖のモニタリングは、１０週間キャリパー測定によって行った。結果は、図９Ａに提示され、初めて、インビトロでの細胞増殖の阻害がないにも関わらず、Ｔ４７Ｄ−ｓｈＣｔｒｌ細胞由来のＳＥＶが、ＰＢＳを注入されたマウスと比較して、インビボで有意に腫瘍増殖を妨げることができたことを示している（約５０％の減少）。また、内在性ＮＦＡＴ３がＳＥＶ産生細胞において下方制御された場合（Ｔ４７Ｄ−ｓｈＮＦＡＴ３−３、Ｔ４７Ｄ−ｓｈＮＦＡＴ３−４）、それぞれのＳＥＶは、もはや腫瘍増殖を阻害することができず、かつ増殖速度は、ＰＢＳで処置した対照マウスと同じであった（図９Ａ参照）。これら結果は重要であり、初めて、低浸潤性乳癌細胞由来のＳＥＶが、インビボでの腫瘍増殖を妨げるためにＳＥＶ産生細胞において内在性ＮＦＡＴ３の発現を必要とすることを実証する。
【０１９７】
同じ群のマウスにおいて、転移形成を、転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によって生成された平均光子束により、Xenogen systemで、生物発光イメージングによって評価した（原発性腫瘍は黒色組織で遮蔽された）。結果は図９Ｂに提示され、Ｔ４７Ｄ−ｓｈＣｔｒｌ由来のＳＥＶを注射されたマウスが、ＰＢＳを注入されたマウスと比較して、有意に減少した転移の発生及び増殖を有することを示している。また、内在性ＮＦＡＴ３がＳＥＶ産生細胞において下方制御された場合（Ｔ４７Ｄ−ｓｈＮＦＡＴ３−３、Ｔ４７Ｄ−ｓｈＮＦＡＴ３−４）、そのそれぞれのＳＥＶはもはや転移形成を妨げず、かつ発生及び増殖速度は、ＰＢＳで処置した対照マウスと同一であった（図９Ｂ参照）。これら結果は、本発明者らが得たインビトロのデータを拡張し、初めて、低浸潤性乳癌由来のＳＥＶが、インビボでの転移形成を妨げることができ、かつＳＥＶ産生細胞における内在性ＮＦＡＴ３の発現を必要とすることを実証する。
【０１９８】
また、Ｔ４７Ｄ−ｓｈＣｔｒｌ細胞由来のＳＥＶの抗癌効果は、ＴＧＦβ１平均血清濃度の増加と相関することが今一度見出された（図９Ｃ及び９Ｄ参照）。
【０１９９】
低浸潤性乳癌細胞株Ｔ４７Ｄ−ＷＴによって産生されたＳＥＶの静脈内又は腫瘍内注射は、腫瘍が定着すると、腫瘍増殖及び転移の出現を阻害する。
次に、臨床条件を模倣するために、低浸潤性乳癌細胞によって産生されたＳＥＶが、腫瘍確立後のインビボモデルで同じ阻害効果を誘導し得るかを試験した。この目的のために、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｄ３Ｈ２ＬＮ）を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、６週齢の雌マウスAthymic Nude-Foxn1nuマウスの左脂肪体に注射した。Ｔ４７Ｄ細胞によって産生されたＳＥＶを、Ｄ３Ｈ２ＬＮ注射後に最初にＤ２７で注射した。腫瘍増殖のモニタリングを、ＳＥＶ注射後５週間キャリパー測定によって行った。結果を図１０Ａ及びＢに提示し、どの投与経路であっても（静脈内又は腫瘍内）、かつインビトロで細胞増殖の阻害がないにもかかわらず、Ｔ４７Ｄ細胞由来のＳＥＶは、ＰＢＳを注入されたマウスと比較して、腫瘍の確立から２７日後にインビボで有意に腫瘍増殖を妨げることができたことを初めて示している（約５０％の減少）。
【０２００】
結論
上記結果は、以下のことを示している：
・ヒト線維芽細胞により又は高度に浸潤性の乳癌細胞株により産生されたＳＥＶとは異なり、２つの低浸潤性乳癌細胞株によって産生されたＳＥＶは、２つの高度に浸潤性の乳癌細胞株及び高度に浸潤性の黒色腫細胞株の浸潤指数を減少させることができる。これは、低浸潤性癌細胞によって産生されたＳＥＶが、癌の進行及び転移を減少させるために使用することができることを示している。
【０２０１】
・浸潤性乳癌細胞株の増殖に対するインビトロでの効果がないにもかかわらず、低浸潤性乳癌細胞株によって産生されたＳＥＶは、さらに、インビボの異種移植モデルにおいて腫瘍増殖及び転移の両方を妨げることが見出され、さらに、低浸潤性癌細胞によって産生されたＳＥＶが、癌の進行及び転移を減少させるために使用することができることを実証する。
【０２０２】
・高度に浸潤性の細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＳＵＭ−１５９−ＰＴ）の浸潤能に対する、低浸潤性乳癌細胞株Ｔ４７Ｄによって産生されたＳＥＶの阻害効果は、低浸潤性ＳＥＶ産生細胞におけるＮＦＡＴ３の発現を必要とする。
【０２０３】
・低浸潤性ＳＥＶ産生細胞におけるＮＦＡＴ３の発現は、高度に浸潤性の乳癌細胞株におけるＴＧＦβ１のデノボ誘導をもたらし、これは、ＳＥＶがインビトロでの乳癌細胞浸潤を調節するために必要とされる。インビボで、低浸潤性乳癌細胞株によって産生されたＳＥＶに対する応答は、ＴＧＦβ１血清濃度と相関することが見出された。したがって、低浸潤性癌細胞によって産生されたＳＥＶを投与された患者におけるＴＧＦβ１濃度の上昇は、治療の治療効率のバイオマーカーとして使用され得る。
【０２０４】
実施例２：改変された自己又は非自己線維芽細胞によって産生されたＳＥＶは、浸潤を阻害する
低浸潤性乳癌細胞によるＮＦＡＴ３の発現は、癌の進行及び転移を阻害するためにこれらの細胞由来のＳＥＶに重要であることが見出されているので、ＮＦＡＴ３を発現するように誘導された健康な線維芽細胞の、癌の進行及び転移を阻害する能力をさらに試験した。
【０２０５】
これに基づいて、提案された治療法開発の概略図を図１０に示す。
【０２０６】
材料及び方法
他に特定しない限り、対応する試験について、実施例１と同じプロトコルが使用される。
【０２０７】
Balbcマウス皮膚からの線維芽細胞単離
剃毛したBalbcマウスからの皮膚を、Dispase II（Sigma；#000000004942078001）に一晩３７℃の５％ＣＯ２で置くことになる。２４時間後、真皮を表皮から分離し、真皮を非常に小さな部分に切断し、プラスチック培養プレート上に付着させる。次いで、１０ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、高グルコース（４，５ｇ／ＬのＤ−グルコース）、１０％のウシ胎仔血清を添加することになる。線維芽細胞が培養に沿って現れ、増幅されて、それらを後述する異なるレンチウイルスコンストラクトで感染させることができることになる。
【０２０８】
プラスミド構築
ヒトＮＦＡＴ３  ＷＴ、ＮＦＡＴ３−８５Ｃ、ΔＮＦＡＴ３  ＷＴ、ΔＮＦＡＴ３−８５Ｃを、既に記載したテンプレートプラスミドを用いて（Fougere, M.、ら、(2010)Oncogene、29(15)、2292-2301）ClontechからのｐＬＶＸ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１プラスミドにおけるｔｄ  Ｔｏｍａｔｏタグとの融合で、ＰＣＲによってクローニングした。全ての構築をシークエンシングにより確認した。
【０２０９】
ヒトＣＤ６３を、Curie InstituteのDr Clothilde Theryにより与えられたテンプレートとしてのプラスミドを用いて、ClontechからのｐＬＶＸ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１プラスミドにおけるｔｄ  Ｔｏｍａｔｏタグとの融合で、ＰＣＲによりクローニングした。全ての構築をシークエンシングにより確認した。
【０２１０】
細胞を、製造業者の指示に従ってLipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて適切なプラスミドで一時的にトランスフェクトした。
【０２１１】
異なる構築の配列：
・ｐＬＶＸ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１（Clonetech、空ベクター）：配列番号２８、配列番号３４のタンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１をコードする；
・ｐＬＶＸ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１−ＨＡ  ｈＮＦＡＴ３  ＷＴ（上記表１に定義されたＮＦＡＴＣ４のアイソフォーム２の発現ベクター）：配列番号２９、配列番号３５のタンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１をコードする；
・ｐＬＶＸ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１−ＨＡ  ｈＮＦＡＴ３−８５Ｃ（上記表１に定義されたＮＦＡＴＣ４のアイソフォーム２の発現ベクター、８５Ｃ末端アミノ酸が切断されている）：配列番号３０、配列番号３６のタンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１をコードする；
・ｐＬＶＸ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１  ｈΔＮＦＡＴ３  ＷＴ（上記表１に定義されたＮＦＡＴＣ４のアイソフォーム２の発現ベクター、５２１Ｎ末端アミノ酸が切断されている）：配列番号３１、配列番号３７のタンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１をコードする；
・ｐＬＶＸ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１  ｈΔＮＦＡＴ３−８５Ｃ（上記表１に定義されたＮＦＡＴＣ４のアイソフォーム２の発現ベクター、５２１Ｎ末端及び８５Ｃ末端アミノ酸が切断されている）：配列番号３２；
・ｐＬＶＸ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１−ｈＣＤ６３（ｈＣＤ６３の発現ベクター）：配列番号３３。
【０２１２】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるレンチウイルス粒子の産生
２日目のステップ２を除いて、実施例１に記載されたものと同じプロトコルが使用される：
【０２１３】
【表１０】
2019513710.tif 000025
【０２１４】
実施例３：
材料及び方法
レンチウイルスプラスミド構築
以下の実施例２の発現ベクターを使用した：
・ｐＬＶＸ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１（Clonetech、空ベクター、「ｔｏ−Ｃｔｌ」とも称される）：配列番号２８、配列番号３４のタンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１をコードする；
・ｐＬＶＸ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１−ＨＡ  ｈＮＦＡＴ３  ＷＴ（上記表１に定義されたＮＦＡＴＣ４のアイソフォーム２の発現ベクター、「ｔｏ−ＮＦＡＴ３  ＷＴ」とも称される）：配列番号２９、配列番号３５のタンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１をコードする；
・ｐＬＶＸ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１−ＨＡ  ｈＮＦＡＴ３−８５Ｃ（上記表１に定義されたＮＦＡＴＣ４のアイソフォーム２の発現ベクター、８５Ｃ末端アミノ酸が切断されている、「ｔｏ−ＮＦＡＴ３−８５Ｃ」とも称される）：配列番号３０、配列番号３６のタンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１をコードする；
・ｐＬＶＸ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１  ｈΔＮＦＡＴ３  ＷＴ（上記表１に定義されたＮＦＡＴＣ４のアイソフォーム２の発現ベクター、５２１Ｎ末端アミノ酸が切断されている、「ｔｏ−ΔＮＦＡＴ３」とも称される）：配列番号３１、配列番号３７のタンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１をコードする；
【０２１５】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるレンチウイルス粒子の産生
・１日目：
１０％ＳＶＦ／ＨＩＧＨ  ＤＭＥＭに細胞を播種する
【０２１６】
【表１１】
2019513710.tif 000026
【０２１７】
・２日目：
１−リン酸カルシウムによるプラスミドトランスフェクション
レンチウイルスＯＲＦ発現ベクターの場合
【０２１８】
【表１２】
2019513710.tif 000027
【０２１９】
２−ＣａＣｌ２の指示量を上記の希釈ＤＮＡに添加する
【０２２０】
【表１３】
2019513710.tif 000028
【０２２１】
３−試薬を漏出することなく完全に混合するのに十分な速度でチューブをボルテックスする。ボルテックスしながら、２ｘ  ＨＢＳＳの指示量を滴下する：
【０２２２】
【表１４】
2019513710.tif 000029
【０２２３】
４−室温で３分間インキュベートする。明白亜色の沈殿物がインキュベーション中に出現するはずである（沈殿物は常に明らかではない場合がある）。
５−トランスフェクションミックスの全量（３００μｔ又は２．１ｍＬ）を細胞に滴下する。
（注意：正確な容量はピペッティングロスのためにわずかに減少することがあるが、これはトランスフェクション効率に悪影響を与えないであろう）
６−細胞を３７℃で５％のＣＯ２で１０〜１６時間インキュベートする
【０２２４】
・３日目：
１−低血清培地を調製する：
ａ．高グルコースＤＭＥＭ
ｂ．５％胎児ウシ
ｃ．２ｍＭのＬ−グルタミン
ｄ．１ｘペニシリン／ストレプトマイシン
２−リン酸カルシウム含有培地を細胞から除去し、１４ｍｌの低血清培地に換える。
３−細胞を３７℃で５％のＣＯ２でさらに４８時間インキュベートする。
【０２２５】
・５日目：ウイルス粒子の回収及び濃縮
１−１５ｍＬの滅菌蓋つきコニカルチューブに培地を除去することによって、培地変更から４８時間後にウイルス粒子含有上清を回収する。
２−１６００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって非付着細胞及び残屑をペレット化して、細胞残屑をペレット化する。
３−残りの細胞残屑を除去するための低速遠心分離ステップの後に、上清を、滅菌した０．２２〜０．４５μｍの低タンパク質結合フィルターを通す濾過ステップ。濾過したウイルス培地は超遠心分離チューブに直接入れる。
４−スイングバケット超遠心分離ローターでの超遠心分離によって濃縮する。変化した上清を滅菌超遠心分離チューブに移す。超遠心分離によって濃縮するＤＭＥＭでの超遠心分離中にチューブの破損を避けるために、チューブをほぼ満たす容量にする。ＳＷ２８ローターの場合、２３，０００ｒｐｍで２時間４℃で遠心分離する。
５−所望の再懸濁容量のＤＭＥＭ（無血清）をチューブの底のペレットにピペッティングする。
６−可視ペレット（目に見える場合）は、トランスフェクトされた細胞の培養培地からの血清タンパク質から大部分が構成されている。ウイルス粒子は、タンパク質ペレットから除去する必要がある。ペレットにＤＭＥＭを添加した後、１０分間４℃でインキュベートする。次いで、気泡の形成を避けながら、約３０回やさしく上下にピペットする。
７−再懸濁したペレットを滅菌微量遠心チューブに移し、フルスピードで３〜４分間遠心分離する。この遠心分離は血清タンパク質をペレット化することになり、これはチューブの底に付着する。遠心分離後に、上清を新し微量遠心チューブに移し、１００ｕｌのＰＢＳに再懸濁する（１回の感染につき２０ｕｌが使用されることになる。レンチウイルス粒子は常に−８０℃で保存する。
【０２２６】
レンチウイルス粒子による細胞の感染及び選抜
・１日目：
細胞を、その対応する培地中の１０％ＳＶＦ＋ＡＢにおける２４ウェルプレートに播種する
【０２２７】
【表１５】
2019513710.tif 000030
【０２２８】
・２日目：
１−４ｕｇ／ｍｌのPolybreneで補充した対応する培地の２５０ｕｌで培地を交換する
２−細胞に直接、２０ｕｌのウイルスを加えることによって感染させる
３−インキュベーターに４時間入れる
４−４時間後、ポリブレンで補充した対応する培地の１ｍｌ／ウェルを添加する
【０２２９】
・６日目：
１−細胞をトリプシン処理して、それを２５ｃｍのフラスコに移す
【０２３０】
・９日目：
１−細胞を実験室に戻し、それを以下に移す：
【０２３１】
【表１６】
2019513710.tif 000031
【０２３２】
フラスコがコンフルエントである場合、ＦＡＣＳの選別に進むことができる。
【０２３３】
細胞選別：
１０．１０6細胞/mlの選別のための濃度を有するべきである
１．細胞をトリプシン処理し、それらをカウントする
２．細胞を１回ＰＢＳで洗浄する
３．２Ｘ  ＡＢで完成したＰＢＳの必要量で細胞を再懸濁する
４．細胞をセルストレーナー（cell strainer）に通して凝集体を除去する
５．細胞をPolypropylene Facsチューブに移す
６．２Ｘ  ＡＢで完成した １００％のＳＶＦを含有する選別細胞を受けるためのチューブを準備する
７．ＳＶＦを含まないが２Ｘ  ＡＢを含む対応する培地を含有する選別細胞を増殖させるための６ウェルプレートを準備する（選別細胞が加えられることになる場合、そこには２０％のＳＶＦ最終があることになる）
８．次いで、異なる検証試験を実現するのに十分となるまで細胞を増殖させる。
９．クローンを凍結させることを忘れないこと。
【０２３４】
抗体及び試薬
以下の抗体を使用した：Ａｎｔｉ−ＣＤ６３（#clone H5C6、BD Biosciences）、抗ＮＦＡＴ３（Sigma;#F1804、Thermo Scientific;#PA1-021、Santa-Cruz Biotechnology;sc-13036）、抗ＣＤ９（#clone CBL162、Millipore）、抗アクチン（Thermo Scientific;# MA5-15739）、抗tdTomato（SICGENANTIBODIES;#AB8181-200）。
【０２３５】
細胞を、製造業者の指示に従って、Lipofectamine 2000（Invitrogen）又はｓｉＲＮＡのためのDharmaFECT（Dharmacon）を用いて適切なプラスミドにより一時的にトランスフェクトした。
【０２３６】
結果
ＨＥＫ細胞株は、Ｔ４７Ｄ乳癌細胞株のように内在性ＮＦＡＴ３を発現する
本発明者らは、非乳癌細胞株においてＮＦＡＴ３  ＷＴ又はＮＦＡＴ３突然変異体を過剰発現させることによってＳＥＶの阻害能力を転移又は増強する可能性を試験するために、ＭＣＦ７及びＴ４７Ｄ以外の別の細胞株を用いる可能性を評価したかった。この目的のために発明者らは、増殖が容易で編集可能な細胞株であるＨＥＫ細胞株を選択した。本発明者らは、最初に、非標的ｓｉＲＮＡ対照（ｓｉＣｔｌ）又は内在性ＮＦＡＴ３を標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＦＡＴ３）のいずれかで一時的にトランスフェクトすることによって、内在性ＮＦＡＴ３の潜在的発現を評価した。対照として、本発明者らは、内在性ＮＦＡＴ３を発現するＴ４７Ｄ乳癌細胞株を使用した。結果は、図１２に提示され、ＨＥＫ細胞株が内在性ＮＦＡＴ３を発現することを示しており、この発現はＴ４７Ｄ乳癌細胞株におけるようにｓｉＮＦＡＴ３処理によって下方制御されている。
【０２３７】
ＨＥＫクローンを産生するために使用されるＮＦＡＴ３突然変異体
図１３Ａには、ＨＥＫクローンを生成するために使用されるｔｄＴｏｍａｔｏタグに融合された異なるＮＦＡＴ３突然変異体が図示される。野生型ＮＦＡＴ３（ＮＦＡＴ３  ＷＴ）、又は最初の３４２  Ｎ末端アミノ酸を欠いた恒常的活性（constitutively active）ＮＦＡＴ３突然変異体（ΔＮＦＡＴ３）、又は浸潤を阻害するのに必要な領域を欠失した不活性突然変異体（ＮＦＡＴ３−８５Ｃ）のいずれかを使用した。
【０２３８】
Ｔ４７Ｄ乳癌細胞株におけるＮＦＡＴ３過剰発現の特徴付け
Ｔ４７Ｄ乳癌細胞を、対照ベクター、あるいはＮＦＡＴ３  ＷＴ、ΔＮＦＡＴ３、又は最後の８５Ｃ末端アミノ酸を欠くＮＦＡＴ３を発現するベクターのいずれかで一時的にトランスフェクトし、古典的なトランズウェル浸潤アッセイでその浸潤能について評価した。
【０２３９】
結果は、図１３Ｂに提示され、以下のことを示している：
・ＮＦＡＴ３の過剰発現ＷＴ（ＮＦＡＴ３  ＷＴ）は、空ベクター（ベクター）でトランスフェクトされた細胞と比較して、Ｔ４７Ｄ乳癌細胞の浸潤指数を約５０％減少させる。
・ΔＮＦＡＴ３の過剰発現（ΔＮＦＡＴ３）、恒常的活性ＮＦＡＴ３突然変異体は、空ベクター（ベクター）でトランスフェクトされた細胞と比較して、ＮＦＡＴ３  ＷＴよりも良好な程度にＴ４７Ｄ乳癌細胞の浸潤指数を約７０％減少させる。
・ＮＦＡＴ３の過剰発現−８５Ｃ（ＮＦＡＴ３−８５Ｃ）、浸潤を阻害するのに必要な領域を欠失した不活性突然変異体は、ベクタートランスフェクト細胞（ベクター）及びＮＦＡＴ３  ＷＴ又はΔＮＦＡＴ３トランスフェクト細胞と比較して、もはや浸潤指数を減少させることができない。
【０２４０】
ｔｏ−Ｃｔｌ、ｔｏ−ＮＦＡＴ３  ＷＴ、ｔｏ−ΔＮＦＡＴ３及びｔｏ−ＮＦＡＴ３−８５Ｃを発現するＨＥＫ細胞によって産生されたＳＥＶの特徴付け
ｔｏ−Ｃｔｌ、ｔｏ−ＮＦＡＴ３  ＷＴ、ｔｏ−ΔＮＦＡＴ３及びｔｏ−ＮＦＡＴ３−８５ｃを発現するＨＥＫ細胞によって産生されたＳＥＶのサイズ分布の代表例を、図１４Ａ（ＨＥＫ  ｔｏ−Ｃｔｌ）、図１４Ｂ（ＨＥＫ  ｔｏ−  ＮＦＡＴ３  ＷＴ）、図１４Ｃ（ＨＥＫ  ｔｏ−ΔＮＦＡＴ３）及び図１４Ｄ（ＨＥＫ  ｔｏ−ＮＦＡＴ３−８５ｃ）に表し、ＨＥＫクローンによって産生されたＳＥＶが、１００〜２００ｎｍの同様の平均サイズを有することを示している。
【０２４１】
ＮＦＡＴ３  ＷＴ及びＮＦＡＴ３突然変異体を発現するＨＥＫ細胞株の生成
本発明者らは、レンチウイルス感染及びピューロマイシン選抜によって、ｔｏ−Ｃｔｌ、ｔｏ−ＮＦＡＴ３  ＷＴ、ｔｏ−ΔＮＦＡＴ３又はｔｏ−ＮＦＡＴ３−８５Ｃを発現する安定なＨＥＫクローンを生成した。
【０２４２】
結果は、図１３Ｃに提示され、ＨＥＫクローンがｔｏ−Ｃｔｌ、ｔｏ−ＮＦＡＴ３  ＷＴ又はｔｏ−ΔＮＦＡＴ３、又はｔｏ−ＮＦＡＴ３−８５Ｃを安定して発現することを示している。
【０２４３】
ＮＦＡＴ３過剰発現ＨＥＫ細胞によって産生されたＳＥＶは、ＮＦＡＴ３を内在的に発現する細胞、例えばＴ４７Ｄ細胞で産生されたＳＥＶよりも、高浸潤性の乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、膵臓癌ＢＸＰＣ３細胞、及び膠芽腫癌細胞の浸潤をより高度に阻害し、かつ、ＨＥＫ細胞は、対照ウイルスに安定して感染した（ＨＥＫ  ｔｏ−Ｃｔｌ）。
【０２４４】
対照ウイルス（ＨＥＫ  ｔｏ−Ｃｔｌ）で、あるいは、ＮＦＡＴ３  ＷＴ（ＨＥＫ  ｔｏ−ＮＦＡＴ３）又はＮＦＡＴ３恒常的活性突然変異体（ＨＥＫ  ｔｏ−ΔＮＦＡＴ３）又は最後の８５Ｃ末端アミノ酸を欠失したＮＦＡＴ３の不活性突然変異体（ＨＥＫ  ｔｏ−ＮＦＡＴ３−８５Ｃ）をコードするウイルスで、安定して感染されたＨＥＫ細胞由来のＳＥＶは、古典的なトランズウェル浸潤アッセイにおいて、高度に浸潤性の乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＵＭ−１５９−ＰＴ）、膵臓癌細胞（ＢＸＰＣ３）及び膠芽腫癌細胞（Ｕ８７ＭＧ）の浸潤を調節する特異的能力を試験する目的で産生された。対照として、細胞を、ＰＢＳ、又はＴ４７Ｄ乳癌細胞株で産生されたＳＥＶのいずれかで処理した。
【０２４５】
結果は、図１５に提示され、以下のことを示している：
・低浸潤性乳癌細胞株Ｔ４７Ｄによって産生されたＳＥＶは、全ての試験された細胞株の浸潤指数を約４０％〜６０％有意に減少させる：高度に浸潤性の乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１５Ａ参照）及びＳＵＭ−１５９−ＰＴ（図１５Ｂ参照）、膵臓細胞株ＢＸＰＣ３（図１５Ｃ参照）、及び膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ（図１５Ｄ参照）。
【０２４６】
・対照ウイルス（ＨＥＫ  ｔｏ−Ｃｔｌ）に感染したＨＥＫ細胞株によって産生されたＳＥＶは、高度に浸潤性の乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１５Ａ参照）、及び膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ（図１５Ｄ参照）の浸潤指数を約４０％〜４５％有意に減少させるが、膵臓細胞株ＢＸＰＣ３（図１５Ｃ参照）及びＳＵＭ−１５９−ＰＴ（図１５Ｂ参照）の浸潤指数は減少させない。
これらの結果は、ＮＦＡＴ３がＨＥＫ細胞株によって内在的に発現されるという事実と一致している（図１２参照、内在性ＮＦＡＴ３を標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＦＡＴ３）によってＨＥＫ細胞を標的化することは、ｓｉＲＮＡ対照（ｓｉＣｔｌ）でトランスフェクトしたＨＥＫ細胞と比較して、ＮＦＡＴ３発現の特異的減少がもたらされることを示している）。
【０２４７】
・ＮＦＡＴ３  ＷＴをコードするウイルスに感染したＨＥＫ細胞株（ＨＥＫ  ｔｏ−ＮＦＡＴ３）によって産生されたＳＥＶは、全ての試験された細胞株の浸潤指数を約４０％−６０％有意に減少させる：高度に浸潤性の乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１５Ａ参照）及びＳＵＭ−１５９−ＰＴ（図１５Ｂ参照）、膵臓細胞株ＢＸＰＣ３（図１５Ｃ参照）、及び膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ（図１５Ｄ参照）。この減少は、Ｔ４７Ｄ細胞株において（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１については図１５Ａ、及びＵ８７ＭＧについては図１５Ｄ参照）あるいはＨＥＫ  ｔｏ−Ｃｔｌ細胞株において（ＳＵＭ−１５９ＰＴについては図１５Ｂ、及びＢＸＰＣ３については図１５Ｃ参照）のいずれかで産生されたＳＥＶで癌細胞が処理される場合よりも高くなる傾向にある。
【０２４８】
・ＮＦＡＴ３の恒常的活性突然変異体に感染したＨＥＫ細胞株（ＨＥＫ  ｔｏ−ΔＮＦＡＴ３）によって産生されたＳＥＶは、全ての試験された細胞株の浸潤指数を約６０−８０％有意に減少させる：高度に浸潤性の乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１５Ａ参照）及びＳＵＭ−１５９−ＰＴ（図１５Ｂ参照）、及び膵臓細胞株ＢＸＰＣ３（図１５Ｃ参照）、及び膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ（図１５Ｄ参照）。この減少は、図１５における全ての癌細胞株について、ＨＥＫ  ｔｏ−ΔＮＦＡＴ３細胞株で産生されたＳＥＶで癌細胞が処理される場合よりもさらに高い。
【０２４９】
・その最後の８５Ｃ末端アミノ酸を欠失したＮＦＡＴ３の不活性突然変異体に感染したＨＥＫ細胞株（ＨＥＫ  ｔｏ−ＮＦＡＴ３−８５Ｃ）によって産生されたＳＥＶは、もはや、高度に浸潤性の乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１５Ａ参照）及びＳＵＭ−１５９−ＰＴ（図１５Ｂ参照）、及び膵臓細胞株ＢＸＰＣ３（図１５Ｃ参照）、及び膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ（図１５Ｄ参照）の浸潤指数を減少させることができない。
【０２５０】
これら結果は、ＳＥＶ産生細胞におけるＮＦＡＴ３の発現（内在性及び／又は外因性）は、ＳＥＶが乳癌、膵臓癌及び膠芽腫癌細胞の浸潤を阻害するために絶対的に必要とされることを、再度実証する。この阻害の強さは、ＷＴ  ＮＦＡＴ３の異所性発現によって増強することができる（ＨＥＫ  ｔｏ−ＮＦＡＴ３）。また、この浸潤の阻害は、ＮＦＡＴ３の恒常的活性突然変異体の異所性発現によって（浸潤指数の阻害の８０％まで）さらに増強することができる（ＨＥＫ  ｔｏ−ΔＮＦＡＴ３）。試験された全ての癌細胞株での浸潤指数の阻害におけるＮＦＡＴ３の役割の特異性は、その最後の８５Ｃ末端アミノ酸を欠失したＮＦＡＴ３の不活性突然変異体を発現するＨＥＫ細胞で産生されたＳＥＶによる浸潤がないことによって実証される（ＨＥＫ  ｔｏ−ＮＦＡＴ３−８５Ｃ）。
【０２５１】
これら結果は、別の細胞株（ＨＥＫ）におけるＮＦＡＴ３の異所性発現が、この他の細胞株によって産生されたＳＥＶにおけるＮＦＡＴ３の阻害効果を転移させるのに十分であることをさらに実証する。
【０２５２】
書誌参考文献
Al-Nedawi, K. et al. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells. Nature Publishing Group 10, 619-624 (2008).
Fougere, M., et al. (2010). NFAT3 transcription factor inhibits breast cancer cell motility by targeting the Lipocalin 2 gene. Oncogene, 29(15), 2292-2301.
Harris DA, et al. (2015) Exosomes Released from Breast Cancer Carcinomas Stimulate Cell Movement. PLoS ONE 10(3): e0117495.
Hendrix, A. et al. An Ex(o)citing Machinery for Invasive Tumor Growth. Cancer Res. 70, 9533-9537 (2010).
Jauliac S, et al. (2002). The role of NFAT transcription factors in integrin-mediated carcinoma invasion. Nat Cell Biol 4: 540-544.
Jauliac, S et al. (2002). The role of NFAT transcription factors in integrin-mediated carcinoma invasion. Nature Cell Biology, 4(7), 540-544.
Mancini M, Toker A. (2009). NFAT proteins: emerging roles in cancer progression. Nat Rev Cancer 9: 810-820.
Melo, S. A. et al. Cancer exosomes perform cell-independent microRNA biogenesis and promote tumorigenesis. Cancer Cell 26, 707-721 (2014).
Molkentin JD, Lu JR, Antos CL, Markham B, Richardson J, Robbins J et al. (1998). A calcineurin-dependent transcriptional pathway forcardiac hypertrophy. Cell 93: 215-228.
Ohshima, K. et al. Let-7 microRNA family is selectively secreted into the extracellular environment via exosomes in a metastatic gastric cancer cell line. PLoS ONE 5, e13247 (2010).
Peinado, H. et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat. Med. 18, 883-891 (2012).
Soldevilla, B. et al. Tumor-derived exosomes are enriched in ΔNp73, which promotes oncogenic potential in acceptor cells and correlates with patient survival. Hum. Mol. Genet. 23, 467-478 (2014).
Takahashi, Y. et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. J. Biotechnol. 165, 77-84 (2013).
Tickner, J. A., Urquhart, A. J., Stephenson, S.-A., Richard, D. J. & O'Byrne, K. J. Functions and therapeutic roles of exosomes in cancer. Front Oncol 4, 127 (2014).
van der Pol E. et al. Classification, Functions, and Clinical Relevance of Extracellular Vesicles. Pharmacol Rev 64:A-AD, 2012.
Villarroya-Beltri C. et al. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 2014 October ; 28: 3-13.
Yakimchuk, K. “Exosomes: isolation methods and specific markers,” Materials and Methods, vol. 5, 2015.
Zomer, A. et al. In Vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell 161, 1046-1057 (2015).
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図７Ｃ−７Ｄ】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【図８Ｃ−８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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