(57)【要約】  本発明は、対象における炎症性疾患、障害または状態、特に炎症性腸疾患(ＩＢＤ)および／または結腸直腸癌などの消化管の炎症性疾患、障害または状態を処置するための組成物および方法に関する。本発明はまたプロバイオティック組成物および消化器障害の処置のための該組成物の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における炎症性疾患、障害または状態を処置する方法において使用するための、３−ヒドロキシ酪酸(３−ＨＢ)またはその塩。
【請求項２】
３−ＨＢの少なくとも約９０％が(Ｒ)−異性体((Ｒ)−３−ＨＢ)である、請求項１に記載の３−ＨＢ。
【請求項３】
対象における炎症性疾患、障害または状態を処置する方法において使用するための、３−ＨＢまたはその塩を含む医薬組成物。
【請求項４】
組成物が３−ＨＢまたはその塩を胃腸管、好ましくは胃腸管の管腔に送達するように製剤されている、請求項３に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項５】
対象における炎症性疾患、障害または状態を処置する方法において使用するための医薬組成物であって、ここで、組成物は３−ＨＢ送達手段を含み、方法が３−ＨＢ送達手段の胃腸管の管腔への送達を含む、医薬組成物。
【請求項６】
３−ＨＢ送達手段がプロドラッグまたは３−ＨＢを胃腸管の管腔に送達するための生物学的送達系である、請求項５に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項７】
生物学的送達系が３−ＨＢを産生する嫌気性細菌からなる、請求項６に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項８】
嫌気性細菌が遺伝子操作されている、請求項７に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項９】
嫌気性細菌が(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼを発現できる非天然遺伝子を含むブチレート産生細菌である、請求項８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１０】
嫌気性細菌が偏性嫌気性菌、好ましくはクロストリジウム・ブチリクムを形成する胞子である、請求項９に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１１】
３−ＨＢの少なくとも約９０％が(Ｒ)−異性体((Ｒ)−３−ＨＢ)である、請求項３〜１０の何れかに記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１２】
医薬組成物が放出調節のために製剤されている、請求項３〜１１の何れかに記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１３】
医薬組成物が経口投与用である、請求項５〜１２の何れかに記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１４】
医薬組成物が３−ＨＢまたはその塩または送達手段を含むコアを囲む放出調節層またはコーティングを含む、請求項１３に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１５】
医薬組成物が約５.５〜約７のｐＨで３−ＨＢまたはその塩または送達手段を胃腸管に送達するように製剤されている、請求項１３または請求項１４に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１６】
医薬組成物が食後経口投与５〜２４時間後に３−ＨＢまたはその塩または送達手段を胃腸管に送達するように製剤されている、請求項１３または請求項１４に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１７】
医薬組成物が３−ＨＢまたはその塩または送達手段を大腸、好ましくは大腸の嫌気性部分、好ましくは結腸および／または末端回腸に送達するように製剤されている、請求項１３〜１６の何れかに記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１８】
対象がヒトである、請求項１もしくは請求項２に記載の使用のための３−ＨＢまたは請求項３〜１７の何れかに記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１９】
炎症性疾患、障害または状態が炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、好ましくはクローン病または潰瘍性大腸炎、または結腸直腸癌である、請求項１もしくは請求項２に記載の使用のための３−ＨＢまたは請求項３〜１８の何れかに記載の使用のための医薬組成物。
【請求項２０】
対象における炎症性疾患、障害または状態を処置する方法であって、対象に
ａ) ３−ヒドロキシ酪酸(３−ＨＢ)またはその塩；
ｂ) ３−ＨＢまたはその塩を含む医薬組成物；および／または
ｃ) ３−ＨＢ送達手段を含む医薬組成物
を投与することを含む、方法。
【請求項２１】
実質的にここに記載する３−ヒドロキシ酪酸(３−ＨＢ)または医薬組成物。
【請求項２２】
(Ｒ)−３−ヒドロキシブチレートを産生する遺伝子操作された嫌気性細菌および経口摂取可能担体を含む、組成物。
【請求項２３】
細菌が(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼを発現できる非天然遺伝子を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
細菌がクロストリジウム綱細菌である、請求項２２または請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
細菌がクロストリジウム綱の分類群Ｉ、IVおよび／またはXIVａのものである、請求項２２〜２４の何れかに記載の組成物。
【請求項２６】
細菌がクロストリジウム属由来である、請求項２２〜２５の何れかに記載の組成物。
【請求項２７】
細菌がクロストリジウム・ブチリクムである、請求項２２〜２６の何れかに記載の組成物。
【請求項２８】
細菌がホスホトランスブチリラーゼおよび／または酪酸キナーゼをコードする天然遺伝子を有する、請求項２２〜２７の何れかに記載の組成物。
【請求項２９】
細菌が唯一の発酵産物として(Ｒ)−３−ヒドロキシブチレートを産生する、請求項２２〜２８の何れかに記載の組成物。
【請求項３０】
細菌が発酵産物として(Ｒ)−３−ヒドロキシブチレートをアセテートおよび／またはブチレートと組み合わせて産生する、請求項２２〜２９の何れかに記載の組成物。
【請求項３１】
医薬として使用するための薬学的に許容される担体を含む、請求項２２〜３０の何れかに記載の組成物。
【請求項３２】
消化器障害の処置または予防に使用するための、請求項２２〜３１の何れかに記載の組成物。
【請求項３３】
消化器障害が炎症性腸疾患または結腸癌である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
炎症性腸疾患が過敏性腸症候群、クローン病、嚢炎、憩室炎および潰瘍性大腸炎から選択される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
消化器細菌叢異常の処置に使用するための、請求項２２〜３１の何れかに記載の組成物。
【請求項３６】
クロストリジウム・ディフィシル感染の処置または予防に使用するための、請求項２２〜３１の何れかに記載の組成物。
【請求項３７】
対象における腸内細菌叢の調節に使用するための、請求項２２〜３１の何れかに記載の組成物。
【請求項３８】
動物給餌に使用するための、請求項２２〜３１の何れかに記載の組成物。
【請求項３９】
カプセル、錠剤または粉末の形態である、請求項２２〜３１の何れかに記載の組成物。
【請求項４０】
食品において使用するための、請求項２２〜３０の何れかに記載の組成物。
【請求項４１】
食品が飲料、飲み物、栄養補助食品または機能性食品である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
クロストリジウム種が胞子または栄養細胞の形態である、請求項２２〜４１の何れかに記載の組成物。
【請求項４３】
クロストリジウム種が１×１０６〜１×１０１０ＣＦＵ／組成物ｇの量で存在し得る、請求項２２〜４２の何れかに記載の組成物。
【請求項４４】
(Ｒ)−３−ヒドロキシブチレートを産生する遺伝子操作された嫌気性細菌を投与することを含む、消化器疾患または障害を処置または予防する方法。
【請求項４５】
(Ｒ)−３−ヒドロキシブチレートを産生する遺伝子操作された嫌気性細菌を投与することを含む、消化器細菌叢異常を処置または予防する方法。
【請求項４６】
(Ｒ)−３−ヒドロキシブチレートを産生する遺伝子操作された嫌気性細菌を投与することを含む、クロストリジウム・ディフィシル感染を処置または予防する方法。
【請求項４７】
(Ｒ)−３−ヒドロキシブチレートを産生する遺伝子操作された嫌気性細菌を投与することを含む、対象における腸内細菌叢を調節する方法。
【請求項４８】
動物に該細菌を含む餌または餌添加物を投与することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
細菌がクロストリジウム綱である、請求項４２〜４８の何れかに記載の方法。
【請求項５０】
細菌が(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼを発現できる非天然遺伝子を含む、請求項４２〜４９の何れかに記載の方法。
【請求項５１】
細菌を経口で投与することを含む、請求項４２〜５０の何れかに記載の方法。
【請求項５２】
さらにプレバイオティックを含む、請求項４２〜５１の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本発明は、対象における炎症性疾患、障害または状態、特に炎症性腸疾患(ＩＢＤ)および／または結腸直腸癌などの消化管の炎症性疾患、障害または状態の処置方法に使用するための３−ヒドロキシ酪酸(３−ＨＢ)またはその塩に関する。本発明はまたここに記載する組成物を含むプロバイオティック組成物および消化器障害の処置のための該組成物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
炎症は、感染、毒物暴露または細胞傷害の部位での白血球および血漿タンパク質の蓄積および活性化が関与する、免疫系の複雑な反応である。炎症は、感染制御および組織修復促進における保護機能としても働くが、組織損傷および疾患も引き起こし得る。ＩＢＤ、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎は、異常な腸管炎症応答を伴う。制御されない炎症はまた腸管で腫瘍形成も駆動し、ＩＢＤを有する患者の結腸直腸癌を発症するリスクは上昇する。
【０００３】
サイトカインおよびタンパク質の特定のネットワークが、炎症、特にＩＢＤなどの疾患の病因と関連付けられる腸管粘膜などの粘膜組織の炎症の制御に関与することが示唆されている。アミノサリチレートおよびステロイドを含む今日までの薬物療法は、症状改善を提供するが、根底の炎症過程を停止できず、疾患経過を変えない。
【０００４】
抗体などの生物学的製剤は、炎症性サイトカインまたはタンパク質をターゲティングすることにより、これらの慢性疾患の代替的処置選択肢を提供している。
【０００５】
炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−αは、特に腸管炎症における炎症において重要な役割を有するサイトカインの一例である(Neurath, M. F. (2014) Nature Reviews Immunology; 14: 329−342)。ＴＮＦ−αは線維芽細胞を活性化し、炎症誘発性サイトカイン産生および血管形成を刺激し、上皮細胞死を誘発し、アポトーシスに対するＴ細胞抵抗性に介在し、そしてカヘキシーを誘発する。抗ＴＮＦ−α剤は多数の研究の対象であり、多数の薬剤が乾癬、クローン病およびリウマチ性関節炎などの炎症性疾患の処置のために臨床的に承認されている(Neurath, M. F. (2014) Nature Reviews Immunology; 14: 329-342)。例はモノクローナル抗体インフリキシマブ(レミケード(登録商標))、アダリムマブ(ヒュミラ(登録商標))、セルトリズマブペゴール(シムジア(登録商標))およびゴリムマブ(シンポニー(登録商標))を含む。
【０００６】
ＩＬ−１２およびＩＬ−２３も炎症に役割を有し、特に腸管炎症と関連している(Teng, M. W. L., et al. (2015) Nature Medicine; 21: 719-729)。ＩＬ−１２およびＩＬ−２３は、クローン病を有する患者の炎症を起こした粘膜で誘発される。ＩＬ−１２は１型Ｔヘルパー(ＴＨ１)細胞を誘発し、クローン病はＴＨ１応答と関連することが判明している。１７型Ｔヘルパー(ＴＨ１７)細胞応答がクローン病および潰瘍性大腸炎において特定されており、ＩＬ−２３はＴＨ１７細胞のアクティベーターとして良く知られる。ＩＬ−１２およびＩＬ−２３は、サブユニット(ｐ４０)を共有し、市販薬ウステキヌマブはこのサブユニットを標的とし、クローン病に対して承認されている。リサンキズマブはＩＬ−２３に特有のｐ１９サブユニットに特異的であり、フェーズ２データはクローン病における有効性を示唆する(Neurath, M. F. (2017) Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology; 14: 269-278)。他の抗ＩＬ−２３剤は、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎およびリウマチ性関節炎などの炎症性疾患の処置のために臨床開発中である。
【０００７】
炎症誘発性サイトカインＩＬ−６も炎症に役割を有し、特に腸管炎症と関連している(Neurath, M. F. (2014) Nature Reviews Immunology; 14: 329-342)。ＩＬ−６はＴ細胞を活性化し、アポトーシスを阻止し、マクロファージ活性化を誘発し、免疫細胞を動員し、急性期タンパク質を活性化し、上皮細胞増殖を誘発し、そして腫瘍増殖を支持する(Neurath, M. F. (2014) Nature Reviews Immunology; 14: 329-342)。開発中の抗ＩＬ−６剤(例えばトシリズマブ)は、クローン病の処置について早期臨床有効性を示している。ＩＢＤ患者において、ＩＬ−６およびそのアゴニスト可溶性受容体ｓＩＬ−６Ｒが誘発され、Ｔ細胞活性化およびそのアポトーシスの抵抗性に介在する。ＩＬ−６ブロックは、実験的大腸炎で有効である(Neurath, M. F. (2017) Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology; 14: 269-278)。抗ＩＬ−６剤もリウマチ性関節炎などの炎症性疾患の処置のために臨床開発中であり、癌治療に対して承認されている。
【０００８】
ＩＬ−１β活性のブロックは、マクロファージ依存性ＩＬ−６分泌を減弱することにより、マウスにおける腫瘍形成を低減させる。ＩＬ−１β変換酵素(ＩＣＥ；カスパーゼ１としても知られる)  −  ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８を活性サイトカインに開裂する酵素  −  の欠損は、マウスをデキストラン硫酸ナトリウム(ＤＳＳ)誘発大腸炎から保護し、これはＩＬ−１ファミリーメンバーの遮断が慢性腸管炎症の治療に適切であり得ることを示唆する(Neurath, M. F. (2014) Nature Reviews Immunology; 14: 329-342)。
【０００９】
ＩＬ−１０は、抗原提示細胞およびＴ細胞による炎症誘発性サイトカイン産生を抑制し、制御性Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ３シグナル伝達を誘発する。ＩＬ−１０は、炎症性疾患、特に大腸炎などの腸管炎症と関連付けられている。例えば、ＩＬ−１０欠損はＩＢＤと関連する(Neurath, M. F. (2014) Nature Reviews Immunology; 14: 329-342)。
【００１０】
ＴＧＦ−β１は、マウスおよびヒト腸の多くの免疫および非免疫細胞で産生され、２つのＴＧＦ−β１受容体(Ｉ型およびII型)が実質的に全ての腸管細胞で発現される。ＴＧＦ−β１は、エフェクターＴ細胞およびマクロファージの活性化および機能を抑制し、制御性Ｆｏｘｐ３発現Ｔ細胞(Fantini, M. C., et al. (2004) J Immunol; 172: 5149-5153)およびＴＨ１７細胞両方の末梢分化に寄与する。これはまた白血球および炎症応答に参加する他の細胞の走化性勾配を提供し、細胞が活性化されたら、それを抑制する。ＴＧＦ−β１は、間質細胞による細胞外マトリクス分解プロテアーゼの産生を阻害し、同時にこれらの細胞のコラーゲン産生を刺激し、上皮細胞の辺縁化(margination)を促進する。ＴＧＦ−β１は粘膜免疫グロブリンＡ(ＩｇＡ)産生に関与する主要サイトカインである。炎症のマウスモデルにおいて作成されたデータと一致して、正常、腸管粘膜細胞または外植片と中和抗体の培養における内在性ＴＧＦ−β１活性のブロックは炎症性分子の誘発を増強し、一方組み換えＴＧＦ−β１での正常腸管免疫細胞刺激は炎症性シグナルを抑止する。モンジャーセンは、クローン病処置のための開発中の薬剤である。モンジャーセンは、マウスにおいてＴＧＦ−β１阻害因子(Ｓｍａｄ７)のノックダウンによりＴＧＦ−β１活性を回復させ、そうして炎症経路の抑制および大腸炎の解消をもたらす(Ardizzone, S., et al. (2016) Ther Adv Gastroenterol; 9(4): 527-532)。
【００１１】
サイトカインは、ＳＴＡＴ３およびＮＦ−κＢなどの細胞内シグナル伝達分子の活性化を介して腫瘍細胞の増殖、増大および生存を活性化させる(Neurath, M. F. (2014) Nature Reviews Immunology; 14: 329-342)。ＮＦ−κＢは、ＤＮＡ転写、サイトカイン産生および細胞生存を制御するタンパク質複合体である。ＩＢＤにおける慢性粘膜炎症は、結腸組織損傷をもたらす、抗レベルのＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびインターフェロン−γなどの炎症誘発性サイトカインを産生するエフェクター免疫細胞の過剰活性化が原因である。核転写因子ＮＦ−κＢは、この免疫学的状況で重要な制御因子の一つとして同定された。トリニトロベンゼンスルホン酸(ＴＮＢＳ)誘発大腸炎は、ｐ６５(ＮＦ−κＢのサブユニット)アンチセンスオリゴヌクレオチドの局所投与により首尾よく処置でき、ＮＦ−κＢ経路はＩＢＤの治療介入のための魅力的標的である。ＩＢＤに関与する全てのサイトカインおよびタンパク質と同様に、ＮＦ−κＢも正常細胞の生理に関与する。マウス肝細胞におけるＮＦ−κＢ活性化ブロックは、肝細胞癌の自然発症と関係付けられており、従って、ＮＦ−κＢ阻害を、炎症を起こした結腸粘膜内の免疫細胞に局所的に限定することが望まれる(Atreya, I. et al. (2008) Journal of Internal Medicine; 263: 591-596)。
【００１２】
ＩＢＤにおける組織リモデリングおよび破壊はマトリクスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)により制御される。ＭＭＰ９の発現がＩＢＤ、特に潰瘍性大腸炎患者で増加することが判明した。インビボ動物試験は、上皮透過性障害および炎症増強におけるＭＭＰ９の重要な役割を示差する(Neurath, M. F. (2017) Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology; 14: 269-278)。
【００１３】
サイトカインおよびタンパク質を標的とする生物学的製剤、例えばモノクローナル抗体は、その本質により標的に高度に特異的である。抗体療法は、長期不耐性による二次的失敗および休薬をしばしば伴う(Amiot, A. et al. (2015) Ther Adv Gastroenterol; 8(2): 66-82)。
【００１４】
ミヤリサン製薬株式会社(日本)は、消化管の健康のためのクロストリジウム・ブチリクム(Clostridium butyricum)(ＣＢＭ  ５８８株)プロバイオティックを生産する。この製品は、３−ＨＢを産生しない非遺伝子操作クロストリジウム株を使用する。クロストリジウム・ブチリクムは、ヒト腸内細菌叢で発見され、ヒトおよび動物健康のためのプロバイオティックとして安全に使用された実績がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
炎症性疾患、障害または状態、特に結腸直腸癌を含む腸管における炎症性疾患、障害または状態を処置するための新規治療剤の必要性が当分野でまだある。疾患、障害または状態の根底にある炎症過程を抑制するおよび／または疾患、障害または状態の経過を変えることが可能な治療剤についての必要性が当分野でまだある。より有効である；副作用が少ない；経口的に許容できる；投与が容易であり、処置スケジュールに対するコンプライアンスが改善した；および／または炎症部位での局所的な疾患、障害または状態の処置のために標的化された治療剤についての必要性が当分野でまだある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の要約
第一の態様において、本発明は、対象における炎症性疾患、障害または状態を処置する方法において使用するための３−ヒドロキシ酪酸(３−ＨＢ)またはその塩を提供する。
【００１７】
第二の態様において、本発明は、対象における炎症性疾患、障害または状態を処置する方法において使用するための３−ＨＢまたはその塩を含む医薬組成物を提供する。
【００１８】
第三の態様において、本発明は、対象における炎症性疾患、障害または状態を処置する方法において使用するための医薬組成物であって、ここで、組成物は３−ＨＢ送達手段を含み、方法は３−ＨＢ送達手段を消化器(ＧＩ)管の管腔および／または粘膜表面に送達することを含む。
【００１９】
第四の態様において、本発明は、対象にａ)３−ヒドロキシ酪酸(３−ＨＢ)またはその塩；ｂ)３−ＨＢまたはその塩を含む医薬組成物；および／またはｃ)３−ＨＢ送達手段を含む医薬組成物を投与することを含む、対象における炎症性疾患、障害または状態を処置する方法を提供する。
【００２０】
第五の態様において、本発明は、(Ｒ)−３−ＨＢを産生する遺伝子操作された嫌気性細菌および経口摂取可能担体を含むまたは本質的にこれらからなる組成物を提供する。
【００２１】
第六の態様において、本発明は、(Ｒ)−３−ヒドロキシブチレートを産生する遺伝子操作された嫌気性細菌を投与することを含む、消化器疾患または障害を処置または予防する方法を提供する。
【００２２】
第七の態様において、本発明は、(Ｒ)−３−ヒドロキシブチレートを産生する遺伝子操作された嫌気性細菌を投与することを含む、消化器細菌叢異常を処置または予防する方法を提供する。
【００２３】
第八の態様において、本発明は、(Ｒ)−３−ヒドロキシブチレートを産生する遺伝子操作された嫌気性細菌を投与することを含む、クロストリジウム・ディフィシル感染を処置または予防する方法を提供する。
【００２４】
第九の態様において、本発明は、(Ｒ)−３−ヒドロキシブチレートを産生する遺伝子操作された嫌気性細菌を投与することを含む、対象における腸内細菌叢を調節する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１Ａは、クロストリジウムにおける天然酸産生代謝経路を示す。
【００２６】
【図１Ｂ】図１Ｂは、非天然(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ導入後のクロストリジウムにおける酸産生代謝経路を示す。
【００２７】
【図２】図２は、カプリアビダス・ネカトール(Cupriavidus necator)からのｐｈａＢ遺伝子についてのコドン最適化ＤＮＡ配列を示す。
【００２８】
【図３】図３は、ｐＭＴＬ８３２５１(クロストリジウム・ブチリクム)におけるｐｆｄｘ＿ｐｈａＢのプラスミド地図を詳示する。
【００２９】
【図４Ａ】図４Ａは、野生型クロストリジウム・ブチリクム(ｗｔ)による(Ｒ)−３−ＨＢ、ブチレートおよびアセテートの経時的産生を示す。
【００３０】
【図４Ｂ】図４Ｂは、遺伝子操作されたクロストリジウム・ブチリクム(ＣＨＮ−１−ｐｈａＢ)による(Ｒ)−３−ＨＢ、ブチレートおよびアセテートの経時的産生を示す。
【００３１】
【図５】図５は、経時的にＣＦＵ／mLとして測定した野生型クロストリジウム・ブチリクムおよび遺伝子操作されたクロストリジウム・ブチリクム(ＣＨＮ−１−ｐｈａＢ)により産生された総ＣＦＵ(Ａ)および胞子(熱抵抗ＣＦＵ)(Ｂ)を示す。
【００３２】
【図６】図６は、経時的に野生型クロストリジウム・ブチリクムおよび遺伝子操作されたクロストリジウム・ブチリクム(ＣＨＮ−１−ｐｈａＢ)により産生された栄養細胞に対する胞子のパーセンテージを示す。
【００３３】
【図７】図７は、コロニー形成単位／mLとして表す改変ＢＩＭ上のＣＨＮ−１の総生細胞数を示す。ＣＦＵ／mLは、３つの独立した実験の平均として示し、エラーバーは標準偏差を表す。
【００３４】
【図８】図８は、コロニー形成単位／mLとして表す改変ＢＩＭ上の熱抵抗細胞数を示す。ＣＦＵ／mLは、３つの独立した実験の平均として示し、エラーバーは標準偏差を表す。
【００３５】
【図９】図９は、種々の時点で測定した、模擬結腸内のｐＨを示す。
【００３６】
【図１０】図１０は、選択した時点での模擬結腸におけるアセテート(mM)の存在を示す。
【００３７】
【図１１】図１１は、選択した時点での模擬結腸におけるブチレート(mM)の存在を示す。
【００３８】
【図１２】図１２は、複合実験の反復(Ａ)および各実験の反復(Ｂ)について２４時間での模擬結腸における(Ｒ)−３−ＨＢの産生を示す。
【００３９】
【図１３】図１３は、バイオリアクターでＣＨＮ−１を検出するための、オリゴヌクレオチドＩＳＲ−ＦおよびＩＳＲ−Ｒを使用する１６ｓ−２３ｓ遺伝子間スペーサー領域特異的ＰＣＲを示す。
【００４０】
【図１４】図１４は、バイオリアクターでＣＨＮ−１を検出するための、オリゴヌクレオチドｐｈａＢ−ＦおよびｐｈａＢ−Ｒを使用するｐｈａＢ特異的ＰＣＲを示す。
【００４１】
【図１５】図１５は、腸管オルガノイドモデルからのデータを示す。オルガノイドをＴＮＦα、ＴＮＦαとブチレートおよび／または(Ｒ)−３−ＨＢとインキュベートしたときの、炎症性因子ＮＦ−κＢ(Ａ)およびＴＮＦα(Ｂ)の非刺激オルガノイドに対する相対的発現(ｍＲＮＡ)レベルを提供する。
【００４２】
【図１６】図１６は、腸管オルガノイドモデルからのデータを示す。オルガノイドがＴＮＦ−α単独でまたは(Ｒ)−３−ＨＢ併用で刺激されたときの、炎症マーカーＩＬ−１０(Ａ)、ＩＬ−２３(Ｂ)、ＴＮＦ−α(Ｃ)、ＩＬ−１β(Ｄ)、ＴＧＦ−β１(Ｅ)、ＩＬ−６(Ｆ)およびＮＦ−κβ(Ｇ)についての非刺激オルガノイドに対する相対的発現(ｍＲＮＡ)を示す。
【００４３】
【図１７】図１７は、６０ng／mL  ＴＮＦ−αおよび漸増濃度のブチレートまたは(Ｒ)−３−ＨＢで処理したオルガノイドにおけるＩＬ−２３の相対的ｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【００４４】
【図１８】図１８は、エキソビボ組織モデルからのデータを示す。エキソビボ結腸組織サンプルがＴＮＦ−α単独でまたは(Ｒ)−３−ＨＢ併用で刺激されたときの、炎症マーカーＩＬ−１０(Ａ)、ＩＬ−１２(Ｂ)、ＩＬ−１β(Ｃ)およびＩＬ−６(Ｄ)についての非刺激組織サンプルに対する相対的タンパク質量(Luminex)を示す。
【００４５】
【図１９】図１９は、エキソビボ組織モデルからのデータを示す。比較Proteome Dot Blot Array実験を使用して、ＴＮＦ−α単独でまたは(Ｒ)−３−ＨＢ併用で刺激されたエキソビボ結腸組織サンプルにおけるタンパク質発現レベルを比較した。炎症マーカーＴＮＦ−α(Ａ)、ＩＬ−２３(Ｂ)およびＭＭＰ９(Ｃ)のデータを示す。
【００４６】
【図２０】図２０は、単独または共培養でクロストリジウム・ブチリクムおよびクロストリジウム・ディフィシルの胞子の発芽および伸長により得たＣＦＵ／mLを示す。
【００４７】
【図２１】図２１は、胃および小腸条件でインキュベーション後のＲＣＭ寒天プレート上のＣＨＮ−１の胞子のmL当たりのコロニー形成単位を示す。データ点は、３つの独立した実験の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
詳細な記載
ここに記載する本発明は、３−ＨＢ、特に(Ｒ)−異性体(Ｒ)−３−ヒドロキシブチレート((Ｒ)−３−ＨＢ)が腸管細胞から産生される多数の種々の炎症性サイトカインおよびシグナル伝達分子に作用する強力な抗炎症剤であるとの、本願発明者らの驚くべき発見に基づく。特に、本発明者らは、炎症を起こした腸管組織において、３−ＨＢが特定の炎症誘発性サイトカインおよびタンパク質(例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２およびＭＭＰ９)を下方制御し、特定の抗炎症性サイトカイン(例えばＩＬ−１０、ＴＧＦ−β１)を上方制御することを示した。関与するサイトカインおよびタンパク質は、多数の炎症性疾患、障害または状態、特にＩＢＤを含む胃腸管における炎症(例えばクローン病、潰瘍性大腸炎および結腸直腸癌)と関連付けられている。
【００４９】
本発明は、当分野における上記必要性に応える。特に、本発明は、多数の種々の炎症性サイトカインおよびタンパク質に対して広範な作用を有する炎症性疾患、障害または状態を処置する改善された治療を提供する。
【００５０】
本発明者らは、３−ＨＢが、炎症を起こした組織、特に腸管組織に局所的に送達されたとき、抗炎症効果を示すことを示している。本発明は、それ故に、炎症部位に局所送達され得る、炎症性疾患、障害または状態の処置のための改善された治療剤を提供する。
【００５１】
本発明は、根底にある炎症過程を抑制するおよび／または疾患経過を変える、炎症性疾患、障害または状態の処置のための改善された治療剤を提供する。
【００５２】
ある場合、本発明は、結腸直腸癌の予防的処置または治療を提供する。
【００５３】
特に、本発明は、個々のサイトカインを標的とする抗体などの生物学的製剤と比較して改善された、炎症性疾患、障害または状態のための治療を提供する。特に、３−ＨＢは、このような生物学的製剤と比較して、炎症を起こした組織における多数の種々の炎症性サイトカインおよびタンパク質に対して、広範な作用を有する。
【００５４】
ある態様において、本発明は、３−ＨＢを胃腸管に送達する医薬組成物を提供する。
【００５５】
腸内細菌叢は、結腸健康の促進と関連付けられている。これにより達成されると考えられる一つの機構は、食物繊維発酵による、短鎖脂肪酸類(ＳＣＦＡｓ)アセテート、プロピオネートおよびブチレートの産生を介する。ブチレートは、結腸健康に対するその効果、特に抗炎症および抗腫瘍効果の重要なメディエーターとして、最も注目を浴びている。腸内マイクロバイオーム解析は、潰瘍性大腸炎および結腸癌を有する患者の結腸におけるブチレート産生細菌の有意な減少を確認している(Frank, D. N., et al. (2007) Proc Natl Acad Sci; 104(34): 13780-13785; Wang, T., et al. (2012) The ISME Journal; 6: 320-329)。ブチレートでの結腸灌注が、潰瘍性大腸炎における炎症を低減できることが示されている(Hamer, H. M., et al. (2008) Aliment Pharmacol Ther; 27: 104-119)。
【００５６】
本発明者らは、３−ＨＢが、炎症を起こした組織、特に腸管組織においてブチレートよりも大きな程度で、いくつかの炎症誘発性サイトカインおよびタンパク質の相対的発現レベルを低下させ、抗炎症性サイトカインの相対的発現レベルを増加させることを示している。特に、(Ｒ)−３ＨＢは、低濃度(１０〜１００μM)でブチレートより大きなＩＬ−２３発現の低減効果を示している。
【００５７】
Ｄ−β−ヒドロキシブチレート(β−ＯＨＢ)としても知られる(Ｒ)−３−ＨＢは、肝臓で天然に産生され、血流に乗って、炭水化物制限の期間中、代謝基質として作用できる部位である肝外組織に循環されるケトン体である。(Ｒ)−３−ＨＢはまた種々のシグナル伝達経路において機能するが、成人の腸管内腔には通常見られない。解離(酸)形態での３−ＨＢの摂取は非実用的である。酸は摂取のために塩またはエステルとして製剤されるが、上述のシナリオにおいては、３−ＨＢは小腸に急速に吸収され、血流に入り、そこで希釈され、全身に分布される。３−ＨＢの塩の経口投与は、その製剤が危険な可能性のある高塩濃度(例えば、ナトリウム塩)となるために、不適当である。
【００５８】
本発明は、経腸で、好ましくは経口で投与できる医薬組成物を提供する。本発明は、それ故に、３−ＨＢのための経口的に許容でき、かつ十分に耐容性である医薬組成物を提供する。医薬組成物は、例えば、ケトン誘発食の遵守と比較して、患者コンプライアンスの改善を示す。
【００５９】
３−ＨＢは、腸管に、好ましくは腸管の嫌気性部分、好ましくは大腸、好ましくは結腸に送達され得る。３−ＨＢは、小腸で吸収されないように送達され得る。好ましくは、３−ＨＢは食道、胃または小腸に送達されない。本発明はまた、経腸で、好ましくは直腸に投与できる医薬組成物を提供する。
【００６０】
３−ＨＢは、それ故に、炎症部位、特に胃腸管の管腔に送達でき、そこで局所的に作用を発揮する。それ故に、有害副作用が最小化または回避される。特に、治療有効量のケトン体の送達および全身取り込みと関係する有害副作用(例えば、塩過負荷)が最小化または回避される。
【００６１】
３−ＨＢは、２異性体、(Ｒ)−３−ＨＢおよび(Ｓ)−３−ＨＢがあるキラル化合物である。本発明の３−ＨＢは、個々の異性体、異性体のラセミ混合物または異性体の非ラセミ混合物であり得る。(Ｒ)−３−ＨＢおよび(Ｓ)−３−ＨＢのラセミ混合物は、約５０重量％(Ｒ)−３−ＨＢおよび約５０重量％(Ｓ)−３−ＨＢを有する。あるいは、３−ＨＢの少なくとも約５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％または９０重量％が(Ｒ)−３−ＨＢであり、残りが(Ｓ)−３−ＨＢであり得る。好ましくは、３−ＨＢの実質的に全てまたは１００重量％が(Ｒ)−３−ＨＢであり得る。
【００６２】
(Ｒ)−３−ＨＢ対(Ｓ)−３−ＨＢのモル比は５：１より大きい、１０：１より大きい、５０：１より大きいまたは１００：１より大きいものであり得る。ある実施態様において、(Ｒ)−３−ＨＢ対(Ｓ)−３−ＨＢの比は、約１００〜５：１、１００〜５０：１、１００〜２０：１、５０〜５：１、２０〜５：１、１５〜５：１または約１５〜１０：１の範囲であり得る。
【００６３】
３−ＨＢは、(Ｒ)または(Ｓ)形態の純粋エナンチオマーまたは(Ｒ)−３−ＨＢと(Ｓ)−３−ＨＢのラセミ混合物として商業的に入手可能である。３−ＨＢはまた当分野で知られる方法により製造することもできる。好ましくは、３−ＨＢは、３−ＨＢを産生するように遺伝子操作された嫌気性細菌の発酵により産生され得る。３−ＨＢは、当分野で知られる方法により単離され得る。好ましくは、３−ＨＢは、キラル化合物を産生するここに記載の新規クロストリジウム株の発酵により産生し得る。例えば、１００重量％(Ｒ)−３−ＨＢであり得る３−ＨＢを、(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼを発現できる異種遺伝子を含む、クロストリジウム種、好ましくはクロストリジウム・ブチリクム(Clostridium butyricum)の発酵により産生できる。力価の増加は、酪酸キナーゼおよびホスホトランスブチリラーゼの発現ができる異種遺伝子の同時導入により達成され得る。(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼを発現できる異種遺伝子の導入は、(Ｒ)形態の３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの産生をもたらす。その後、天然レダクターゼ酵素が(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを(Ｒ)−３−ＨＢに変換する。あるいは、少なくとも約９０重量％(Ｒ)−３−ＨＢで残りが(Ｓ)−３−ＨＢであり得る３−ＨＢを、(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼを発現できる異種遺伝子を含むクロストリジウム種、好ましくは、クロストリジウム・ブチリクムの発酵により産生できる。３−ＨＢ力価の増加を、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ(ＰＣＴ)の発現ができる異種遺伝子の導入により達成できる。異種(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよびプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子の導入は、約１０：１比での(Ｒ)−３−ＨＢおよび(Ｓ)−３−ＨＢの産生をもたらす。
【００６４】
３−ＨＢは薬学的に許容される塩または溶媒和物の形態であり得る。ここで使用する“３−ＨＢ”は、３−ＨＢまたはその塩をいう。ここでいう“薬学的に許容される塩”は、医薬適用における使用に適するあらゆる塩調製物をいう。薬学的に許容される塩は、アミン塩、例えばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、アンモニア、ジエタノールアミンおよび他のヒドロキシアルキルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、１−パラ−クロロ−ベンジル−２−ピロリジン−１’−イルメチルベンゾイミダゾール、ジエチルアミンおよび他のアルキルアミン、ピペラジン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンなど；アルカリ金属塩、例えばリチウム、カリウム、ナトリウムなど；アルカリ土類金属塩、例えばバリウム、カルシウム、マグネシウムなど；遷移金属塩、例えば亜鉛、アルミニウムなど；他の金属塩、例えばリン酸水素ナトリウム、リン酸二ナトリウムなど；鉱酸、例えば塩酸塩、硫酸塩など；および有機酸の塩、例えば酢酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、フマル酸塩などを含む。
【００６５】
３−ＨＢをそれのみで投与することは可能であるが、３−ＨＢは医薬組成物中に含ませるのが好ましい。従って、本発明は、対象における炎症性疾患、障害または状態を処置する方法において使用するための３−ＨＢまたはその塩を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、医薬組成物は、３−ＨＢを胃腸管の管腔または粘膜表面で遊離させることにより、３−ＨＢを胃腸管に送達するために製剤される。
【００６６】
あるいは、医薬組成物は、他の手段により３−ＨＢを胃腸管の管腔または粘膜表面に送達できる。従って、本発明は、対象における炎症性疾患、障害または状態を処置する方法において使用するための医薬組成物であって、ここで、組成物は３−ＨＢ送達手段を含み、方法は、３−ＨＢ送達手段を胃腸管の管腔または粘膜表面に送達することを含む。
【００６７】
“３−ＨＢ送達手段”は、３−ＨＢまたはその塩を胃腸管の管腔に送達するための任意の化学的または生物学的手段を意味し得る。適当な例は、３−ＨＢのプロドラッグまたは３−ＨＢを胃腸管の管腔に送達する生物学的送達系を含む。このような送達手段は、下にさらに記載する。
【００６８】
本発明は、少なくとも一つの薬学的に許容される担体および所望により他の治療的および／または予防的成分を含む医薬組成物を含む。
【００６９】
本発明の医薬組成物は、３−ＨＢの治療有効量が送達されるように、かつ類似用途の薬剤の許容される任意の投与形態で投与される。
【００７０】
医薬組成物は、経口または直腸投与に適当なものを含む。好ましくは、投与は、苦痛の程度により調節できる便利な１日投与量レジメンを使用する経口である。
【００７１】
本発明の医薬組成物は、１以上の慣用のアジュバント、担体または希釈剤と共に調製し、単位投与量などの剤形にされ得る。医薬組成物および剤形は、慣用の成分を慣用の比率で含んでよく、剤形は、用いる意図する１日投与量範囲に対して適切な有効量の活性剤(ここに記載する３−ＨＢ)を含み得る。
【００７２】
医薬組成物は、特に、それが使用される態様によって、種々の形態の何れかを取り得る。それ故に、組成物は、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、クリーム剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、フォーム剤、ミセル液剤、リポソーム懸濁剤の形態または処置を必要とするヒトまたは動物に投与し得る任意の他の適当な形態であり得る。本発明の医薬組成物の担体は、投与される対象に十分に耐容性であるものでなければならない。
【００７３】
ここで使用する“薬学的に許容される担体”は、医薬組成物の製剤に有用であることが当業者に知られる、任意の既知化合物または既知化合物の組み合わせである。
【００７４】
活性剤は、対象における炎症性疾患、障害または状態の処置のための単剤療法(すなわち活性剤単独の使用)で使用され得る。あるいは、活性剤を、５−アミノサリチレート(５−ＡＳＡｓ)、例えば５−ＡＳＡ、メサラミン、スルファサラジン、オルサラジンおよびバルサラジド、特にAsacol HD(登録商標)、Delzicol(登録商標)、ペンタサ(登録商標)、リアルダ(登録商標)およびApriso(登録商標)；ステロイド、特にコルチコステロイド例えばヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニゾロンおよびブデソニド；免疫抑制剤を含む免疫調節剤、例えばアザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、シクロスポリン−Ａおよびタクロリムス；抗ＴＮＦ剤を含む生物剤、例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブおよびセルトリズマブペゴール、Ｔ細胞移送剤、例えばインテグリンブロッカーナタリズマブおよびベドリズマブ、抗生物質および非病原性微生物、例えば共生エシェリキア・コリ、ラクトバシラス種、サッカロミセスまたは寄生体豚鞭虫を含むプロバイオティクス；結腸直腸癌用化学療法剤、例えばカペシタビン(ゼローダ(登録商標))、フルオロウラシル(５−ＦＵ、アドルシル(登録商標))、イリノテカン(カンプトサール(登録商標))、オキサリプラチン(エロキサチン(登録商標))およびトリフルリジン／チピラシル(ＴＡＳ−１０２、ロンサーフ(登録商標))；抗血管形成治療剤を含む結腸直腸癌用標的化治療剤、例えばベバシズマブ(アバスチン(登録商標))、レゴラフェニブ(スチバーガ(登録商標))、ziv-aflibercept(ザルトラップ(登録商標))およびラムシルマブ(サイラムザ(登録商標))および上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)阻害剤、例えばセツキシマブ(アービタックス(登録商標))およびパニツムマブ(ベクティビックス(登録商標))；短鎖脂肪酸、例えばブチレート、例えば酪酸を含む１以上のさらなる活性剤の補助剤としてまたはそれと組み合わせて使用し得る。３−ＨＢを、上記の任意の１以上と、例えばアザチオプリンおよびインフリキシマブと組み合わせて使用し得る。好ましくは、３−ＨＢをブチレートと組み合わせて使用し得る。
【００７５】
ある好ましい実施態様において、薬学的に許容される担体は固体であってよく、組成物は散剤または錠剤の形態であり得る。固体の薬学的に許容される担体は、風味剤、緩衝剤、滑沢剤、安定化剤、可溶化剤、懸濁剤、湿潤剤、乳化剤、色素、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味剤、防腐剤、色素、コーティングまたは錠剤崩壊剤としても作用し得る、１以上の物質を含み得る。担体はまたカプセル充填材でもあり得る。散剤において、担体は、本発明の微粉化活性剤と混合された微粉末固体である。錠剤において、活性剤は、必要な圧縮特性を有する担体と適当な比率で混合し、所望の形状およびサイズに圧縮し得る。散剤および錠剤は、好ましくは９９％まで活性剤を含み得る。適当な固体担体は、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂を含む。他の実施態様において、薬学的に許容される担体はゲルであってよく、組成物はクリームなどの形態であり得る。
【００７６】
担体は、１以上の添加物または希釈剤を含み得る。このような添加物の例は、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、微結晶セルロース、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、リン酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、コロイド状二酸化ケイ素などである。
【００７７】
しかしながら、他の好ましい実施態様において、薬学的に許容される担体は液体であり、医薬組成物は溶液の形態であり得る。液体担体は、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシルおよび加圧組成物の製造において使用される。本発明の活性剤を水、有機溶媒、両者の混合物または薬学的に許容される油または脂肪などの薬学的に許容される液体担体に溶解または懸濁し得る。液体担体は、可溶化剤、乳化剤、緩衝液、防腐剤、甘味剤、風味剤、懸濁剤、濃化剤、着色剤、粘性調節剤、安定化剤または浸透圧調節剤などの他の適当な医薬品添加物を含み得る。経口投与用液体担体の適当な例は、水(部分的に上記の添加物、例えばセルロース誘導体を含む、好ましくはナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液)、アルコール(一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む)およびそれらの誘導体および油(例えば分別ヤシ油および落花生油)を含む。
【００７８】
本発明の医薬組成物は、他の溶質または懸濁剤(例えば、溶液を等張とするのに十分な食塩水またはグルコース)、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、ソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０(エチレンオキシドと共重合化されたソルビトールおよびその無水物のオレイン酸エステル)などを含む無菌溶液または懸濁液の形態で経口投与され得る。本発明により使用される薬剤はまた液体または固体組成物形態でも経口投与される。経口投与に適する組成物は、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤および散剤などの固体形態および液体形態を含むカプセル剤など、シロップ剤、エリキシル剤および懸濁液剤などの液剤形態を含み、この全て当業者に知られる。
【００７９】
本発明の医薬組成物はまた坐剤および浣腸製剤を含む直腸投与用にも製剤され得る。坐剤の場合、脂肪酸グリセリドまたはカカオバターの混合物などの低融点ワックスをまず融解させ、活性成分を均一に、例えば、撹拌により分散させる。次いで溶融均一混合物を便利な大きさの型に注加し、冷却し、固化させる。浣腸製剤は、ゲルもしくは軟膏を含む半固体または懸濁液、水溶液またはフォームを含む液体形態であり得て、これらは当業者に知られる。
【００８０】
他の適当な医薬担体およびそれらの製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22nd Edition, The pharmaceutical Press, London, Philadephia, 2013に記載される。
【００８１】
本発明の医薬組成物を、放出調節剤形として製剤できる。“放出調節”は、剤形が、同じ経路で投与された即時放出型剤形と活性剤の放出速度および／または部位が異なる、製剤であることを意味する。この修飾は、特別な製剤設計および／または製造方法により達成される。放出調節剤形は、経口投与放出調節剤形を含む。持続放出(または徐放)剤形は、長期にわたり持続放出を示す放出調節剤形である。遅延放出剤形において、活性物質の放出は、薬剤の投与または適用後一定時間遅延する(遅延はラグタイムとしても知られる)。その後の放出は、即時放出型剤形に類似し得る。多相放出剤形は、二相放出およびパルス状放出を含む。二相放出剤形において、薬物放出の第一相は、投与直後に治療剤レベルを提供する部分用量により決定され、第二徐放相は、長期の有効治療レベルの維持に必要な部分用量を提供する。パルス状薬物放出は、特定の時間間隔で瞬発的に薬物を送達することを意図する。多単位：多単位剤形は、例えばゼラチンカプセルに含まれるかまたは錠剤に圧縮された、各々放出制御添加物を含む複数の単位、例えばペレットまたはビーズを含む。一単位：一単位剤形は、１単位、例えば浸透圧錠剤のみからなる。
【００８２】
放出調節用添加物および製剤は当分野で周知であり、特定のテクノロジーは商業的に入手可能である。
【００８３】
適切には、本発明の医薬組成物は、好ましくは、経口投与により３−ＨＢを胃腸管に送達するために製剤される。ヒト胃腸管は、口から肛門まで伸び、食道、胃および腸を含む、消化構造からなる。胃腸管は、肝臓、胆管または膵臓などの付属の腺性臓器を含まない。腸管は小腸および大腸を含む。小腸は、十二指腸、空腸および回腸を含む。大腸は盲腸、結腸、直腸および肛門を含む。上部胃腸管は頬側口腔、咽頭、食道、胃および十二指腸を含む。下部胃腸管は、十二指腸より下の小腸および大腸を含む。好ましくは、本発明の医薬組成物は、３−ＨＢを胃腸管の管腔または粘膜表面に、より好ましくは大腸の管腔または粘膜表面に、より好ましくは結腸の管腔または粘膜表面に送達する。好ましくは、本発明の医薬組成物は、３−ＨＢを胃腸管、好ましくは結腸および／または終端小腸(回腸)の嫌気性部分に送達する。
【００８４】
安定性を増加させるものおよび親水性を増加させるものを含む薬物と担体の共有結合；ｐＨ感受性ポリマーでのコーティング；持続放出系の製剤；特に結腸細菌により分解される担体の開発；生体付着系；および浸透圧制御薬物送達系を含む、種々の戦略が、経口投与薬物の結腸へのターゲティングのために提案されている。ＩＢＤの局所処置のための５−アミノサリチル酸(５−ＡＳＡ)の送達を目的とした、種々のプロドラッグが開発されている。微生物分解可能ポリマー、特にアゾ架橋ポリマーが、結腸を標的とする薬物のコーティングとしての用途について研究されている。アミロース、イヌリン、ペクチンおよびグアーガムなどのある種の植物多糖は、消化器酵素に影響されないままであり、結腸標的化薬物送達系の製剤のための薬物のコーティングとして探索されている。さらに、植物多糖と、キトサンまたはその誘導体を含む甲殻類抽出物の組み合わせは、結腸送達系の開発で興味を引いている。
【００８５】
放出調節製剤のための添加物の例は、水中で迅速に膨張でき、その膨張構造に大量の水を保持する、ヒドロゲルである。種々のヒドロゲルが種々の薬物放出パターンを提供でき、結腸送達を促進するためのヒドロゲルの使用が研究されている。例えば、ヒドロゲルおよびキセロゲルは、高粘性アクリル酸樹脂ゲル、Eudispert hvを使用して製造されており、これは、長期にわたり直腸下部において優れた滞留性を有する。オイドラギット(登録商標)ポリマー(Evonik Industries)は、胃抵抗性、ｐＨ制御薬物放出、結腸送達、活性のおよび活性からの保護を含む、種々の形態のコーティングを提供する。
【００８６】
医薬組成物は、当分野で知られる技法の何れかにより、例えば、３−ＨＢ、１以上の薬学的に許容される担体、添加物および／または希釈剤および１以上の放出調節添加物の混合により製造され得る。医薬組成物は、当分野で知られる技法を使用して、３−ＨＢおよび１以上の薬学的に許容される担体、添加物および／または希釈剤および所望により１以上の放出調節添加物を含むコアを放出調節層またはコーティングでコーティングすることにより、製造され得る。例えば、コーティングは、既知プレス・コーターの何れかを使用する圧着により形成され得る。あるいは、医薬組成物は、造粒および凝集技法により製造できまたは噴霧乾燥技法、続いて乾燥により構築され得る。
【００８７】
コーティングの厚さは、上記技法の何れを用いても厳密に制御できる。当業者は、所望のラグタイムおよび／またはラグタイム後に薬物が放出される所望の速度を得るための手段として、コーティングの厚さを選択できる。
【００８８】
ｐＨ依存性系は、ヒト胃腸管のｐＨが胃(ｐＨは約１〜２であり得て、消化中にｐＨ４まで上昇する)から、消化の場所である小腸(ｐＨは約６〜７であり得る)を経て徐々に上昇し、遠位回腸で上昇するとの一般的知識に従う。ｐＨ感受性ポリマーを有するコーティング錠剤、カプセル剤またはペレット剤は、遅延放出を提供し、活性薬物を胃液から守る。
【００８９】
本発明の医薬組成物は、３−ＨＢを特定のｐＨで胃腸管に送達するために製剤され得る。商業的に入手可能な添加物は、３−ＨＢを胃腸管の特定の位置に送達するのに使用できる、オイドラギット(登録商標)ポリマーを含む。例えば、十二指腸でのｐＨは約５.５を超え得る。オイドラギット(登録商標)L 100-55(粉末)、オイドラギット(登録商標)L 30 D-55(水性分散体)および／またはAcryl-EZE(登録商標)(粉末)を、例えばオイドラギット(登録商標)L 100-55に基づき、使用準備済腸溶性コーティングとして使用し得る。空腸のｐＨは約６〜約７であり、オイドラギット(登録商標)L 100(粉末)および／またはオイドラギット(登録商標)L 12,5(有機溶液)を使用し得る。結腸への送達は、約７.０を超えるｐＨで達成でき、オイドラギット(登録商標)S 100(粉末)、オイドラギット(登録商標)S 12,5(有機溶液)および／またはオイドラギット(登録商標)FS 30 D(水性分散体)を使用し得る。特にオイドラギット(登録商標)FS 30 D製剤のために設計されたPlasACRYLTM T20流動促進剤および可塑剤プレミックスも使用し得る。
【００９０】
医薬組成物を、３−ＨＢを、約５.５以上、例えば約５.６、５.７、５.８または５.９以上；好ましくは６以上、例えば約６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７、６.８または６.９以上；好ましくは７以上、例えば約７.１、７.２、７.３、７.４、７.５、７.６、７.８、７.９または８のｐＨで送達するように製剤し得る。好ましくは、医薬組成物を、約５.５〜７、約６〜７.５または７〜８のｐＨで３−ＨＢを送達するように製剤し得る。ある実施態様において、医薬組成物は、３−ＨＢまたは３−ＨＢ送達手段を適切なｐＨで放出し、そうして３−ＨＢを胃腸管の管腔、好ましくは末端回腸および／または結腸に送達する。
【００９１】
空腹時に摂取した医薬組成物は、上行結腸に投与約５時間後に到達する可能性があり、実際の到達は胃内容排出速度に大きく依存する。結腸内への薬物送達は、この領域を通って移動する速度に大きく影響される。健康な男性で、カプセル剤および錠剤は、平均２０〜３０時間で結腸を通り抜ける。溶液および粒子は、通常近位結腸内で広範囲に拡散し、しばしば、大腸全体にわたり分散される。
【００９２】
本発明の医薬組成物は、胃腸管への時間制御型送達のために、すなわち３−ＨＢを投与後一定時間(ラグタイム)後に送達するように製剤され得る。
【００９３】
時間制御型送達のための商業的に入手可能な添加物は、オイドラギット(登録商標)RL PO(粉末)、オイドラギット(登録商標)RL 100(顆粒)、オイドラギット(登録商標)RL 30 D(水性分散体)およびオイドラギット(登録商標)RL 12,5(有機溶液)を含む。これらの添加物は、オイドラギット(登録商標)RSを種々の比率で組み合わせることにより、カスタマイズされた放出プロファイルを提供できる不溶性、高透過性、ｐＨ非依存性膨張添加物である。オイドラギット(登録商標)RS PO(粉末)、オイドラギット(登録商標)RS 100(顆粒)、オイドラギット(登録商標)RS 30 D(水性分散体)およびオイドラギット(登録商標)RS 12,5(有機溶液)は、オイドラギット(登録商標)RLを種々の比率で組み合わせることにより、カスタマイズされた放出プロファイルを提供できる、不溶性、低透過性、ｐＨ非依存性膨張添加物である。オイドラギット(登録商標)NE 30 D(水性分散体)、オイドラギット(登録商標)NE 40 D(水性分散体)およびオイドラギット(登録商標)NM 30 D(水性分散体)は、マトリクス形成剤であり得る、不溶性、低透過性、ｐＨ非依存性膨張添加物である。
【００９４】
好ましくは、医薬組成物は、３−ＨＢを胃腸管に投与約４時間後に送達するように製剤され得る。好ましくは、医薬組成物は、３−ＨＢを、投与約４〜４８時間後、好ましくは投与約５〜２４時間後、例えば、投与約５時間、１０時間、１５時間、２０時間または２４時間後；好ましくは投与約５〜１０時間、５〜１５時間、５〜２０時間または約１０〜２４時間、１５〜２４時間または２０〜２４時間後に送達するように製剤され得る。好ましくは、医薬組成物は食間にまたは食後、好ましくは食後に投与されるものである。ある実施態様において、医薬組成物は、３−ＨＢをラグタイム後放出する。あるいは、医薬組成物は、３−ＨＢ送達手段をラグタイム後放出する。
【００９５】
医薬組成物からの３−ＨＢまたは３−ＨＢ送達手段の適切なｐＨでのまたはラグタイム後の放出は、即時放出または放出調節のいずれかであり得る。即時放出および放出調節製剤は、当業者に知られる。
【００９６】
医薬組成物からの３−ＨＢまたは３−ＨＢ送達手段の放出は、製薬業界で知られる方法により測定され得る。薬物溶解試験は、品質管理目的(錠剤などの固体経口剤形のバッチ間一貫性を評価するため)および薬物開発(インビボ薬物放出プロファイルを予測するため)の両者の重大なインビトロ薬物放出情報を提供するために、日常的に使用されている。溶解試験は、USP Dissolution Apparatus 1  −  バスケット(３７℃)；USP Dissolution Apparatus 2  −  パドル(３７℃)；USP Dissolution Apparatus 3  −  往復動シリンダ(３７℃)；USP Dissolution Apparatus 4  −  フロースルーセル(３７℃)を含む、溶解装置で実施し得る。
【００９７】
好ましくは、適切なｐＨに到達するまでおよび／またはラグタイムが経過するまで、３−ＨＢが医薬組成物から実質的に放出されない。好ましくは、適切なｐＨに到達するまでおよび／またはラグタイムが経過するまで、医薬組成物から３−ＨＢ送達手段が実質的に放出されない。好ましくは、適切なｐＨに到達するまでおよび／またはラグタイムが経過するまで、医薬組成物から放出される３−ＨＢまたは３−ＨＢ送達手段は１０重量％未満であり、好ましくは医薬組成物から放出される３−ＨＢまたは３−ＨＢ送達手段は９重量％、８重量％、７重量％、６重量％、５重量％、４重量％、３重量％、２重量％または１重量％未満である。
【００９８】
特定の実施態様において、医薬組成物は、Multi Matrix MMX(登録商標)テクノロジー(Cosmo Pharmaceuticals Inc.)を使用して、好ましくは錠剤として製剤され得る。ＭＭＸ(登録商標)テクノロジーにより製造した錠剤は、錠剤が、プログラムされた溶解が開始される場所である指示された腸管領域に到達するまで放出を遅延させるｐＨ抵抗性アクリルコポリマーで被覆され、そうして活性剤を、上部胃腸管に存在する不利なｐＨ条件および酵素から保護する。結腸の長さにわたる放出調節は、患者に対する適用を単純にするだけでなく、活性医薬成分の炎症により影響を受けた表面への局所適用を可能にする。例えば、医薬組成物は、Zacol NMX(登録商標)(Cosmo Pharmaceuticals Inc.)として製剤でき、錠剤はカルシウム３−ＨＢ、マルトデキストリン、イヌリン、ソルビトール、ヒプロメロース、微結晶セルロース、加工コーンスターチ、クエン酸、コロイド状シリカ水和物、タルク、シェラック、ステアリン酸マグネシウム、ステアレート、レシチン、二酸化チタン、ヒドロキシプロピル、トリエチルシトレート；芳香：バニリンを含む。
【００９９】
他の実施態様において、医薬組成物は、カルシウムおよびマグネシウム(３−ヒドロキシ酪酸、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウムおよび中鎖トリグリセリド)で緩衝化した３−ＨＢ、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを含むカプセル殻を含み、固化防止剤二酸化ケイ素およびステアリン酸マグネシウムを含む、BioCare(登録商標)カプセルとして製剤され得る。カプセルは、長さ約２.３cmである。
【０１００】
医薬組成物は、審美的目的で(例えば着色剤)、安定性目的で(例えば、防湿層でコーティング)、矯味目的でまたは３−ＨＢ、プロドラッグ、送達系および／または添加物を侵襲性媒体から保護する目的で、薬学的に許容されるフィルムコーティングでオーバーコーティングし得る。好ましくは、医薬組成物は、例えば、アクリル酸および／またはメタクリル酸コポリマータイプＡおよび／またはタイプＢの混合物(例えば、オイドラギットS100および／またはオイドラギットL100として)に代表される、胃保護性または腸溶性コーティングでオーバーコーティングし得る。好ましくは、アクリル酸および／またはメタクリル酸コポリマータイプＡおよび／またはタイプＢの混合物は、１：５〜５：１の範囲である。胃保護性コーティングは、所望により可塑剤、色素、少なくとも一つの水−溶媒、少なくとも一つの有機溶媒またはこれらの混合物も含む。
【０１０１】
“プロドラッグ”は、活性薬物を放出するために体内で変換が必要である、薬物分子の誘導体を意味する。結腸薬物送達戦略は、結腸でのみ見られる酵素により代謝される、プロドラッグの使用を含む。
【０１０２】
生物学的送達系
ある実施態様において、３−ＨＢを胃腸管に送達する医薬組成物は、３−ＨＢを産生できる生物学的送達系を含む。
【０１０３】
“生物学的送達系”は、経口投与でき、３−ＨＢを産生できる微生物剤などの生物剤、好ましくは細菌剤を意味する。好ましくは、生物学的送達系は、３−ＨＢを産生できる遺伝子操作された嫌気性細菌であり得る。該細菌は、唯一の発酵産物としてまたはアセテートおよび／またはブチレートなどの短鎖脂肪酸類(ＳＣＦＡｓ)と組み合わせて、３−ＨＢを産生し得る。
【０１０４】
本発明の組成物は、３−ＨＢを産生する遺伝子操作された嫌気性細菌および経口摂取可能担体を含み得る。組成物は、３−ＨＢを対象に送達する。経口摂取されたら、該細菌は対象内で実質的に増殖し、３−ＨＢを産生し、消化管の嫌気性部分にそれを分泌する。該細菌は、３−ＨＢを、腸を通過するに連れてまたは上皮／粘膜細胞壁裏層に付着し始めたときに分泌する。
【０１０５】
該細菌は嫌気性細菌であり得る。嫌気性細菌は、酸素が限られた(低酸素)環境または完全に酸素が枯渇した(無酸素)環境で生存できる細菌である。これらは、酸素の存在により害され、嫌気性(無酸素)環境でしか増殖できない細菌である偏性嫌気性菌；好気性環境(有酸素)で生存できるが、呼吸器経路において最終電子受容体として分子酸素を使用できない耐気性細菌；ならびに好気性および嫌気性両者の環境で生存でき、好ましい電子受容体の利用可能性により、呼吸器経路において最終電子受容体として分子酸素または他の分子を使用できる通性嫌気性細菌を含む。好ましくは、細菌は偏性嫌気性菌である。
【０１０６】
ある実施態様において、細菌はクロストリジウム綱(Clostridia)である。(Ｒ)−３−ＨＢデヒドロゲナーゼ((Ｒ)−３−ＨＢＤ)を発現できる非天然遺伝子の導入は、(Ｒ)−３−ＨＢを産生できるクロストリジウム株をもたらす。操作されたクロストリジウム綱は、(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを産生する。天然ＰＴＢおよびＢＵＫ酵素は、もし存在するなら、(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを(Ｒ)−３−ＨＢに変換できる。(Ｒ)−３−ＨＢは腸に分泌される。
【０１０７】
主発酵産物としてブチレートを天然に産生するクロストリジウム綱が、ここで、ブチレートの代わりにまたはそれと組み合わせて、(Ｒ)−３−ＨＢを産生するように適合されている。クロストリジウム綱は、アセテート、プロピオネート、ビタミン類およびバクテリオシン類などの他の有用な発酵産物も産生し得る。
【０１０８】
天然腸内細菌叢の一部である細菌、すなわち腸で天然に見られる細菌が好ましい。ブチレートを天然で産生する細菌も好ましい。
【０１０９】
クロストリジウム綱は、本組成物に包含させるのに好ましい細菌綱である。クロストリジウム綱は、クロストリジウム科(Clostridiaceae)、クリステンセネラ科(Christensenellaceae)、ユーバクテリウム科(Eubacteriaceae)、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)、ペプトストレプトコッカス科(Peptostreptococcaceae)、ルミノコッカス科(Ruminococcacea)を含むが、これらに限定されない。好ましくは、存在する細菌は、クロストリジウム綱の分類群Ｉ、IVおよび／またはXIVａ由来である。好ましくは、該細菌は、下部消化管でしばしば検出されるクロストリジウム綱である。例えば、下部消化管で検出される種は、
クロストリジウム属(分類群１)由来の細菌であり、組成物に包含させるための好ましい種は、クロストリジウム・アセトブチリカム(C. acetobutylicum)、クロストリジウム・アルブスチ(C. arbusti)、クロストリジウム・オーランチブチリカム(C. aurantibutyricum)、クロストリジウム・ベイジェリンキ(C. beijerinckii)、クロストリジウム・セルロボランス(C. cellulovorans)、クロストリジウム・セルロリティカム(C. cellulolyticum)、クロストリジウム・サーモセラム(C. thermocellum)、クロストリジウム・サーモブチリカム(C. thermobutyricum)、クロストリジウム・パストゥリアヌム(C. pasteurianum)、クロストリジウム・クルイベリ(C. kluyveri)、クロストリジウム・ノービイ(C. novyi)、クロストリジウム・サッカロブチリカム(C. saccharobutylicum)、クロストリジウム・サーモスクシノゲネス(C. thermosuccinogenes)、クロストリジウム・サーモパルマリウム(C. thermopalmarium)、クロストリジウム・サッカロリティカム(C. saccharolyticum)、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム(C. saccharoperbutylacetonicum)、クロストリジウム・チロブチリカム(C. tyrobutyricum)、クロストリジウム・テタノモーファム(C. tetanomorphum)、クロストリジウム・マグナム(C. magnum)、クロストリジウム・リュングダリイ(C. ljungdahlii)、クロストリジウム・オートエタノゲナム(C. autoethanogenum)、クロストリジウム・ブチリクム(C. butyricum)、クロストリジウム・プニセウム(C. puniceum)、クロストリジウム・ディオリス(C. diolis)、クロストリジウム・５ホモプロピオニカム(C. 5 homopropionicum)および／またはクロストリジウム・ロゼウム(C. roseum)を含むが、これらに限定されない；
クリステンセネラ属、ユーバクテリウム属およびラクノスピラ属(分類群XIVａ)由来の細菌であり、組成物に包含させるための好ましい種は、ロゼブリア・インテスティナリス(Roseburia intestinalis)、ロゼブリア・ブロミ(Roseburia bromii)、ユウバクテリウム・レクターレ(Eubacterium rectale)、ユウバクテリウム・ハリイ(Eubacterium hallii)、アナエロスティペス種(Anaerostipes spp.)、ブチリビブリオ種(Butyrivibrio spp.)および／またはコプロコッカス種(Coprococcus spp.)を含むがこれらに限定されない；および
ルミノコッカス属(分類群IV)由来の細菌であり、組成物に包含させるための好ましい種は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ(Faecalibacterium prausnitzii)を含むが、これに限定されない。
【０１１０】
好ましくは、組成物における種はクロストリジウム・ブチリクムである。
【０１１１】
好ましくは、クロストリジウム綱はブチレート産生株である。周知のクロストリジウムのブチレート産生株は、アナエロスティペス種、ブチリビブリオ種、コプロコッカス種、ロゼブリア種、ユウバクテリウム・レクターレ関連およびユウバクテリウム・ハリイ関連種を含む。
【０１１２】
好ましくは、組成物におけるクロストリジウム種は胞子形成ができ、好ましくはクロストリジウム・ブチリクムである。好ましい実施態様において、株はＤＳＭ１０７０２およびＡＴＣＣ１９３９８である。
【０１１３】
操作された細菌は、(Ｒ)−３−ＨＢＤを発現できる非天然遺伝子を含み得る。(Ｒ)−３−ＨＢＤ(ＥＣ１.１.１.３６)を発現できる遺伝子は、ラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)、(カプリアビダス・ネカトール)、バチルス種(Bacillus sp)、クレブシエラ種(Klebsellia sp)、シュードモナス種(Pseudomonas sp)、例えばｐｈｂＢおよびｐｈａＢを含む生物からの遺伝子から選択されるが、これらに限定されない。
【０１１４】
適当な遺伝子は、UniProt Accession Nos. P14697(PHBB_CUPNH)、P50203(PHAB_ACISR)、A0A060V147(A0A060V147_KLESP)、C1D6J5(C1D6J5_LARHH)、F8GXX8(F8GXX8_CUPNN)、F8GP10(F8GP10_CUPNN)、G0ETI7(G0ETI7_CUPNN)、A9LLG6(A9LLG6_9BACI)、A0A0E0VPS5(A0A0E0VPS5_STAA5)、D5DZ99(D5DZ99_BACMQ)およびV6A8L4(V6A8L4_PSEAI)を含む。
【０１１５】
ある実施態様において、(Ｒ)−３−ＨＢＤ遺伝子はｐｈａＢである。ｐｈａＢ遺伝子の配列は、使用する特定のクロストリジウム種に対してコドン最適化され得る。ｐｈａＢの配列は、図２に示す配列(配列番号１)を含み得る。
【０１１６】
非天然(Ｒ)−３−ＨＢＤをコードする核酸は、図２のｐｈａＢ配列(配列番号１)と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％配列同一性を有する配列を含み得る。
【０１１７】
２配列間の同一性の決定利用可能な多数の方法がある。配列間の同一性の決定のための好ましいコンピュータープログラムは、ＢＬＡＳＴ(Atschul et al, Journal of Molecular Biology, 215, 403-410, 1990)を含むが、これに限定されない。好ましくは、コンピュータープログラムのデフォルトパラメータを使用する。
【０１１８】
クロストリジウム綱において、天然酵素は３−ヒドロキシブチレートレダクターゼ反応を触媒する。それ故に、ある実施態様において、クロストリジウム種は、(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを(Ｒ)−３−ＨＢに変換できる酵素をコードする遺伝子を含む。
【０１１９】
ＰＴＢおよびＢＵＫなどの天然酵素は、(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを、(Ｒ)−３−ヒドロキシブチレート−ホスフェートを経て(Ｒ)−３−ＨＢに変換する。それ故に、遺伝子操作された細菌は、ＰＴＢおよびＢＵＫをコードする天然遺伝子ならびに(Ｒ)−３−ＨＢＤをコードする非天然遺伝子を有し得る。
【０１２０】
クロストリジウム種はまたＰＴＢ、ＢＵＫ、ＰＣＴおよび／またはＢＵＴをコードするもののようなさらなる非天然遺伝子も含み得る。
【０１２１】
クロストリジウム種は、ｐｔｂおよびｂｕｋなどの、(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを(Ｒ)−３−ＨＢに変換できる還元酵素をコードする１以上の非天然遺伝子を含み得る。これらの遺伝子は、バチルス種、大腸菌またはクロストリジウム綱の他の種を含むが、これらに限定されない生物に由来し得る。
【０１２２】
さらに、クロストリジウム種は、ＰＣＴまたはＢＵＴなどの、ＳＣＦＡを産生するための酵素をコードする、１以上の天然または非天然遺伝子を含み得る。例えば、クロストリジウム・プロピオニクム(Clostridium propionicum)からのＰＣＴを、(Ｒ／Ｓ)−３−ヒドロキシブチレート−ＣｏＡとアセテートの間のＣｏＡ伝達反応を触媒するように、株に操作して入れ得る。
【０１２３】
用語“非天然遺伝子”は、その天然環境にない遺伝子であり、同じ属の他の種に入れられた、微生物のある種からの遺伝子を含む。
【０１２４】
非天然遺伝子は、クロストリジウム綱に対してコドン最適化されおよび／または該遺伝子のクロストリジウム綱における制御可能な発現を可能とするプロモーターの制御下に置かれることができる。酵素の発現レベルを、誘導性プロモーターおよび／または種々の強度のプロモーターを用いて、遺伝子発現を制御することにより最適化し得る。ある実施態様において、非天然遺伝子を天然クロストリジウム綱プロモーター、例えばフェレドキシンまたはチオラーゼプロモーターの制御下におく。他の適当なプロモーターは、当業者に知られる。
【０１２５】
非天然遺伝子を、組み換え微生物産生の分野で知られる標準プラスミド形質転換技法により、すなわちコンジュゲーションまたはエレクトロポレーションにより、クロストリジウム株に導入し得る。一例として、プラスミド形質転換はコンジュゲーションにより達成である。
【０１２６】
(Ｒ)−３−ＨＢＤを含む非天然遺伝子を、当業者に知られる遺伝子組込みテクノロジーを使用して、クロストリジウム綱の染色体に当業し得る。
【０１２７】
クロストリジウム綱は、天然に炭水化物を種々の還元発酵産物に変換する発酵代謝をする嫌気性細菌である。該細菌は、３および４炭素(Ｃ３／Ｃ４)化合物の産生について独特の代謝経路および生化学を有する。
【０１２８】
遺伝子操作されたクロストリジウム株の代謝経路を図１Ｂに記載する。遺伝子操作されたクロストリジウム種は、アセトアセチル−ＣｏＡを(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する、異種(Ｒ)−３−ＨＢＤ(図１Ｂにおける酵素Ａ)を担持する。(Ｒ)特異的３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、基質(アセトアセチル−ＣｏＡ)について天然ＨＢＤ酵素と競合する。天然クロトナーゼ(Ｃｒｔ)酵素は、(Ｒ)形態の３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに活性を有しないか、低活性しか有さず、(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡがＰＴＢおよびＢＵＫまたはＢＵＴなどの天然酵素により(Ｒ)−３−ＨＢに変換されることを可能とする。酵素ＰＴＢおよびＢＵＫはＲ形態特異的であり、(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ホスフェートを介して(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを(Ｒ)−３−ＨＢに変換する。
【０１２９】
使用される経路は、クロストリジウム種による。クロストリジウム属(クロストリジウム・ブチリクムを含む)を含むクロストリジウム科ファミリー(分類群Ｉ)において一般に見られるある種において、最終段階は２酵素、ＰＴＢおよびＢＵＫを必要とする。ラクノスピラ科ファミリー(分類群XIVａ)およびルミノコッカス属ファミリー(分類群IV)において一般に見られる他の種において、最終段階は１酵素、ＢＵＴを必要とする。ある種のクロストリジウム綱は、両系の酵素を担持し、(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを(Ｒ)−３−ＨＢに変換することが可能である。
【０１３０】
ＰＴＢ、ＢＵＫおよび／またはＢＵＴが天然プロバイオティック株に存在しないならば、これらの酵素をコードする異種遺伝子を、操作された株で発現させ得る。
【０１３１】
遺伝子操作された嫌気性細菌において(Ｒ)−３−ＨＢを産生する代替経路は、例えばチオエステラーゼをコードする、さらなる非天然遺伝子、すなわち大腸菌からのＴｅｓＢの導入による。これらの酵素は、それぞれ(Ｓ)−および(Ｒ)−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを(Ｓ)−および(Ｒ)−３−ＨＢに変換できる。
【０１３２】
クロストリジウムプロバイオティックは、該細菌の増殖に適当な条件下で実施する発酵により産生され得る。発酵後、該細菌を遠心分離を使用して精製し、活性を保持するように調製し得る。組成物中の該細菌は、生存可能生物として提供される。該組成物は、細菌胞子および／または栄養細胞を含み得る。該細菌を、細菌の活性を保持するように乾燥させ得る。適当な乾燥方法は、凍結乾燥、噴霧乾燥、加熱乾燥およびこれらの組み合わせを含む。次いで得られた粉末を、記載の１以上の薬学的に許容される添加物と混合し得る。
【０１３３】
胞子および／または栄養細菌を、ここに記載の、経口投与用の慣用の添加物および成分と製剤し得る。特に、製薬および栄養補助食品業界で慣例の脂肪および／または水性成分、湿潤剤、濃厚剤、防腐剤、テクスチャリング剤、風味増強剤および／またはコーティング剤、抗酸化剤、防腐剤および／または色素。適当な薬学的に許容される担体は、微結晶セルロース、セロビオース、マンニトール、グルコース、スクロース、ラクトース、ポリビニルピロリドン、ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウムおよびデンプンまたはこれらの組み合わせを含む。次いで、該細菌を、ここに記載する、適当な経口摂取可能形態に整形し得る。プロバイオティック細菌の適当な経口摂取可能形態は、製薬業界で周知の方法により製造し得る。
【０１３４】
ある実施態様において、３−ＨＢを産生する嫌気性細菌を、該細菌が所望の治療効果を提供する十分量で存在する限り、広範囲の濃度で医薬組成物に提供し得る。好ましくは、該細菌は、医薬組成物に、１×１０５〜１×１０１０コロニー形成単位／乾燥組成物ｇ(ＣＦＵ／ｇ)に相当する量で存在し、より好ましくは、該細菌は、１×１０８〜１×１０１０ＣＦＵ／乾燥組成物ｇに相当する量で存在する。組成物が錠剤の形態であるならば、該細菌は、２×１０５〜６×１０７ＣＦＵ／錠、好ましくは約３×１０５〜５×１０７ＣＦＵ／錠の量で存在し得る。好ましくは、該細菌は結腸で増殖および代謝し、腸管内腔に約１μm〜１０mM、好ましくは約１００μm〜５mM、好ましくは約１mM  ３−ＨＢを送達する。
【０１３５】
“３−ＨＢの送達”は、３−ＨＢが、炎症性疾患、障害または状態を処置するための治療効果を発揮するように、３−ＨＢが対象における特定の部位で利用可能となることを意味する。３−ＨＢは、３−ＨＢが局所で治療効果を有するために利用可能となるように、対象における特定の炎症部位に送達され得る。好ましくは、本発明の医薬組成物は、３−ＨＢを、炎症性疾患、障害または状態の部位に送達し、局所で治療効果を有する。例えば、３−ＨＢは、炎症部位に直接直腸的に送達され得る；３−ＨＢは、ここに記載するカプセル剤または錠剤などの経口剤形から、炎症部位で放出され得る；または３−ＨＢは、３−ＨＢを炎症部位で産生するプロドラッグまたは生物学的送達系などの３−ＨＢ送達系から放出され得る。
【０１３６】
投与すべき３−ＨＢの治療有効量は、用いる３−ＨＢ(例えば(Ｒ)−異性体対(Ｓ)−異性体比)、処置する対象、重症度および苦痛のタイプならびに投与方式および経路による。
【０１３７】
送達される３−ＨＢの量を考慮して、治療有効量は約０.１mg／キログラム(kg)体重〜約５００mg／kg体重、例えば約１mg〜約２５０mg／kg体重、例えば約１０mg〜約１８０mg／kg体重、例えば約２０mg〜約１５０mg／kg体重、例えば約６０mg〜約１２５mg／kg体重であり得る。例えば、治療有効量は、約１０mg〜約４０ｇ、例えば約８０mg〜約２０ｇ、例えば約１００mg〜約１５ｇ、例えば約１ｇ〜約１２ｇ、例えば約５ｇ〜約１０ｇであり得る。
【０１３８】
経口投与について、治療有効量は、約１０mg〜約２０ｇ、例えば約５０mg〜約２０ｇ、例えば約１００mg〜約２０ｇ、例えば約１００mg〜約１０ｇ、例えば約５００mg〜約１０ｇ、例えば５００mg〜５ｇ、例えば５００mg〜２ｇ、例えば１ｇ〜１５ｇ、例えば１ｇ〜１０ｇ、例えば１ｇ〜８ｇ、例えば１ｇ〜２ｇ、例えば１ｇ〜４ｇ、例えば２ｇ〜４ｇ、例えば２ｇ〜６ｇ、例えば４ｇ〜８ｇ、例えば４ｇ〜６ｇ、例えば５ｇ〜１０ｇ、例えば６ｇ〜１０ｇ、例えば６ｇ〜８ｇ、例えば８ｇ〜１２ｇ、例えば８ｇ〜１０ｇ、例えば１０ｇ〜１４ｇ、例えば１０ｇ〜１２ｇ、例えば１０ｇ〜２０ｇであり得る。好ましい実施態様において、治療有効量は、約１０mg〜約５０ｇ、例えば１０mg〜約３０ｇ、例えば約５０mg〜約３０ｇ、例えば約１００mg〜約３０ｇ、例えば約１００mg〜約１５ｇまたは例えば約５００mg〜約１５ｇであり得る。他の好ましい実施態様において、治療有効量は、約１ｇ〜５０ｇ、例えば５ｇ〜５０ｇ、例えば１０ｇ〜４０ｇ、例えば１ｇ〜３０ｇ、例えば５ｇ〜３０ｇ、例えば３ｇ〜２５ｇ、例えば１ｇ〜２０ｇ、例えば５ｇ〜２０ｇ、例えば１ｇ〜１０ｇ、例えば２０ｇ〜３０ｇ、例えば３０ｇ〜４０ｇまたは例えば５ｇ〜１５ｇであり得る。
【０１３９】
治療有効量の各用量は、数単位用量であり得る。単一固体単位用量は、例えば、約５０mg〜約３ｇ、例えば約１００mg〜約２ｇ、例えば約２５０mg〜約２ｇ、例えば約５００mg〜約２ｇ、例えば約２５０mg〜約１ｇ、例えば約５００mg〜約１ｇ、例えば１００mg〜５００mg、例えば１００mg〜１ｇ、例えば１００mg〜２ｇ、例えば２５０mg〜２ｇ、例えば２５０mg〜１ｇ、例えば５００mg〜２ｇ、例えば５００mg〜１ｇ、例えば１ｇ〜３ｇ、例えば１ｇ〜２ｇを含み得る。特記し得る特定の単位用量は、約１.５ｇ、１.６ｇ、１.７ｇ、１.８ｇ、１.９ｇおよび２ｇ、好ましくは約１.８ｇ；または約３００mgである。
【０１４０】
上に記載した用量の量を、例えば、１日１回、２回、３回または４回または週に１回または２回；好ましくは１日３回与え得る。例えば、経口投与について、３０mg〜約１２０ｇ、例えば約２４０mg〜約６０ｇ、例えば約３００mg〜約４５ｇ、例えば約３ｇ〜約３６ｇまたは例えば約１５ｇ〜約３０ｇの総１日用量を与え得る。ある好ましい実施態様において、経口投与のための総１日用量は、例えば約１ｇ〜約５０ｇ、例えば約１ｇ〜約３０ｇ、例えば約５ｇ〜約３０ｇ、例えば約５ｇ〜約２５ｇ、例えば約５ｇ〜約１５ｇ、好ましくは約５ｇ〜約１０ｇである。好ましくは、約１.８ｇを１日３回投与する。
【０１４１】
１用量を食事または軽食または液体の一部として投与でき、ここで、対象は、食事、軽食または液体(例えば水または果実飲料)と混ぜるまたは組み合わせるための乾燥用量を提供される。
【０１４２】
本発明によって、３−ＨＢを１以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与し得る。投与は、３−ＨＢと１以上のさらなる治療剤を含む製剤の投与または３−ＨＢおよび１以上のさらなる治療剤の別々の製剤の本質的に同時、逐次もしくは別々の投与を含む。ある実施態様において、３−ＨＢ送達手段はまた１以上のさらなる治療剤を胃腸管の管腔に送達し、好ましくは該さらなる治療剤はブチレートである。
【０１４３】
本発明はまた対象における炎症性疾患、障害または状態を処置する方法も含む。
【０１４４】
処置する方法は、３−ＨＢを、疾患、障害または状態の改善(すなわち、疾患、障害または状態またはその少なくとも一つの臨床症状の発症遅延もしくは停止または軽減)；患者により認識され得ないものを含む少なくとも一つの身体的パラメータの軽減または改善；身体的(例えば、認識できる症状の安定化)、生理的(例えば、身体的パラメータの安定化)または両者での疾患、障害または状態の調節；または疾患もしくは障害またはその臨床症状の発症または発生の予防または遅延の目的で投与することを含む。
【０１４５】
対象は、該対象がこのような処置から生物学的に、医学的にまたはクオリティ・オブ・ライフで利益を受けるならば、処置の必要がある。処置は、一般に３−ＨＢの治療有効量を投与する、医師により実施される。適切には対象はヒトである。
【０１４６】
３−ＨＢの治療有効量は、上記処置、例えば疾患、障害もしくは状態またはその症状の遅延、停止、軽減または予防に有効である、量である。一般に、処置を必要とする対象は、疾患、障害または状態の症状を呈する対象である。あるいは、対象は、疾患、障害もしくは状態に感受性であるかまたは疾患、障害もしくは状態について検査で陽性であるが、また症状を示していない可能性がある。
【０１４７】
好ましくは、３−ＨＢの治療有効量投与は、約１μM〜約１０mM、好ましくは約１００μM〜約５mM、好ましくは約１mMの濃度の３−ＨＢを、胃腸管の管腔、好ましくは結腸に提供する。
【０１４８】
炎症性疾患、障害または状態は、特に炎症性疾患、障害または状態、特にクローン病および潰瘍性大腸炎などのＩＢＤおよび結腸直腸癌を含む胃腸管における炎症性疾患、障害または状態に関与するものについて、高い炎症誘発性サイトカインまたはタンパク質および／または不十分な抗炎症性サイトカインまたはタンパク質レベルにより特徴付けられ得る。好ましくは、炎症性疾患、障害または状態は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＭＭＰ９およびＮＦ−κＢの１以上、好ましくは２、３、４、５、６またはそれ以上または全て；好ましくはＩＬ−２３の高いレベルにより特徴付けられる。好ましくは、炎症性疾患、障害または状態は、適切な免疫応答の達成および維持に不十分なＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−β１のレベルにより特徴付けられる。好ましくは、炎症性疾患、障害または状態は、高いＴＮＦ−α、ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２およびＭＭＰ９の２、３、４、５またはそれ以上または全ての高いレベルおよび適切な免疫応答の達成および維持にＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−β１の不十分なレベルにより；好ましくはＴＮＦ−α、ＩＬ−２３、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２およびＭＭＰ９の高いレベルおよびＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１の不十分なレベルにより特徴付けられ、所望によりさらにＮＦ−κＢの高いレベルにより特徴付けられる。
【０１４９】
炎症性疾患、障害または状態は、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８結合タンパク質、ＩＬ−１６、カスパーゼ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−１７ＡおよびＲＡＮＴＥＳ(ＣＣＬ５)、ＩＬ−２２およびＩＬ−２７の１以上の高いレベルおよび／または不十分なレベルにより特徴付けられ得る。
【０１５０】
炎症性疾患、障害または状態は、クローン病、潰瘍性大腸炎、嚢炎、膠原性大腸炎およびリンパ球性大腸炎などのＩＢＤ、結腸直腸癌、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、痛風、強直性脊椎炎またはＣＯＰＤであり得る。
【０１５１】
好ましくは、炎症性疾患、障害または状態は、胃腸管、好ましくは大腸、より好ましくは結腸の炎症性疾患、障害または状態である。好ましくは、炎症性疾患、障害または状態は、ＩＢＤ、好ましくはクローン病もしくは潰瘍性大腸炎または結腸直腸癌である。
【０１５２】
本発明はまた、ここに記載する(Ｒ)−３−ＨＢの産生が可能な遺伝子操作された嫌気性細菌などの生物学的送達系を含む組成物および消化器疾患および障害の処置におけるならびに動物健康のためのプロバイオティクスとしてのその使用に関する。
【０１５３】
該細菌は、このような経口組成物のための慣用の添加物および成分、すなわち特に医薬および栄養補助食品業界で慣用の脂肪および／または水性成分、湿潤剤、濃厚剤、防腐剤、テクスチャリング剤、風味増強剤および／またはコーティング剤、抗酸化剤、防腐剤および／または色素と製剤され得る。適当な薬学的に許容される担体は、微結晶セルロース、マンニトール、グルコース、ポリビニルピロリドンおよびデンプンまたはこれらの組み合わせを含む。次いで、該細菌を、適当な経口摂取可能形態に整形し得る。プロバイオティック細菌の適当な経口摂取可能形態は、製薬業界で周知の方法により製造し得る。
【０１５４】
経口投与される組成物は、例えばコーティング錠、ゲルカプセル、ゲル、エマルジョン、錠剤、カプセル、ヒドロゲル、フードバー、圧縮したまたは緩い粉末、液体懸濁液または溶液、菓子類製品または食物製品の形に製造され得る。好ましくは、該組成物は乾燥形態である。組成物のための好ましい経口形態は、カプセル、錠または粉末などの固体形態である。
【０１５５】
該組成物を、経口製剤、特にコーティング錠、ゲルカプセル、ゲル、エマルジョン、錠剤、カプセル、ヒドロゲルおよび粉末の製造のための、慣用の方法により製剤し得る。
【０１５６】
経口摂取可能担体はまた、飲料、飲み物、栄養補助食品または機能性食品などの食品でもあり得る。
【０１５７】
(Ｒ)−３−ＨＢを産生する遺伝子操作された嫌気性細菌はまた食品の一部として、すなわちヨーグルト、牛乳または豆乳にまたは栄養補助食品としても取り込まれ得る。このような食品および栄養補助食品は、食品業界および補助食品業界で周知の方法により製造され得る。
本組成物は、動物給餌製品に餌添加物として取り込まれ得る。
【０１５８】
本組成物はまた細菌叢異常の予防または処置にも使用され得る。消化器細菌叢異常は、広域抗生物質の使用により引き起こされ得る。本組成物は、抗生物質投与による細菌叢異常の処置および予防に使用し得る。
【０１５９】
細菌叢異常の間、対象は、クロストリジウム・ディフィシルを含む日和見性病原微生物に感受性である。本組成物は、細菌感染の処置または予防に使用され得る。本発明のある実施態様において、本組成物をクロストリジウム・ディフィシル感染の処置または予防に使用し得る。
【０１６０】
(Ｒ)−３−ＨＢを産生する遺伝子操作された嫌気性細菌を含む組成物は、対象における腸内細菌叢の調節にも使用し得る。(Ｒ)−３−ＨＢを産生する遺伝子操作された嫌気性細菌を含むまたはこれから本質的になる組成物を、健康対象に、すなわち、非治療的用途で投与する。組成物は、対象に経口投与し得る。
【０１６１】
遺伝子操作された細菌の腸における増殖およびコロニー形成の程度は、種および株選択および／または該細菌が繁殖する特定の食物をプレバイオティックとして、プロバイオティックを含むのと同じ用量内にまたは別々に摂取される組成物として提供することにより、制御し得る。
【０１６２】
本組成物はまたさらに投与したプロバイオティックの増殖を増強するためのプレバイオティックも含み得る。プレバイオティックは、(Ｒ)−３−ＨＢを産生する遺伝子操作された嫌気性細菌を含む組成物と逐次的に、同時にまたは別々に投与され得る。プレバイオティックおよび遺伝子操作された細菌を、同時投与のための同一組成物に一緒に製剤し得る。あるいは、該細菌およびプレバイオティックを、同時または逐次投与のために別々に製剤し得る。
【０１６３】
プレバイオティクスは、腸管でのプロバイオティクスの増殖を促進する物質である。それらは、該細菌により腸管で発酵される食品物質である。プレバイオティックの添加は、腸管におけるプロバイオティック株の増殖を促進できる媒体を提供する。細菌の増殖を促進する１以上の単糖、オリゴ糖、多糖または他のプレバイオティクスを使用し得る。
【０１６４】
好ましくは、プレバイオティックは、所望によりフルクトース、ガラクトース、マンノースを含むオリゴ糖；食物繊維、特に可溶性繊維、ダイズ繊維；イヌリン；またはこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。好ましいプレバイオティクスは、フルクト−オリゴサッカライド(ＦＯＳ)、ガラクト−オリゴサッカライド(ＧＯＳ)、イソマルト−オリゴサッカライド、キシロ−オリゴサッカライド、ダイズのオリゴ糖、グリコシルスクロース(ＧＳ)、ラクトスクロース(ＬＳ)、ラクツロース(ＬＡ)、パラチノース−オリゴサッカライド(ＰＡＯ)、マルト−オリゴサッカライド、ペクチン、これらの加水分解産物またはこれらの組み合わせを含む群から選択される。
【０１６５】
細菌から分泌される(Ｒ)−３−ＨＢは、腸の管腔内および／または粘膜層内で局所的に作用し、例えば微生物増殖のエンハンサーおよび／またはサプレッサーとして作用することにより、腸内細菌叢を調節し得る。
【０１６６】
ここに(添付する特許請求の範囲、要約および図面のいずれも含む)記載する全ての特性および／または開示された何らかの方法の工程の全てを、このような特性および／または工程の少なくとも一部が相互排他的である場合の組み合わせを除き、任意の組み合わせで、上記態様の何れかと組み合わせることができる。特に、ここに記載する活性剤および組成物の何れかを、記載する処置方法のいずれにも使用できる。任意かつ全てのこのような組み合わせは、本発明の一部を形成することは明らかに企図される。
【実施例】
【０１６７】
本発明を、次に下記実施例を参照して、さらに詳しく説明する。
【０１６８】
実施例１  −  ｐｈａＢを発現するクロストリジウム・ブチリクムにおける(Ｒ)−３−ＨＢの産生
１) 遺伝子合成
遺伝子カプリアビダス・ネカトールｐｈａＢを、クロストリジウム綱に対してコドン最適化した。図２は、Gene Art(登録商標)(Thermo Fisher Scientific)により合成されたコドン最適化配列の一例を示す。
【０１６９】
２) プラスミド構築
ｐｈａＢを、標準クローニング技法を使用してクロストリジウム・スポロゲネスＰｆｄｘプロモーター制御下にプラスミドｐＭＴＬ８３２５１にクローニングし、プラスミドpMTL83251_pfdx_phaBを得た(図３)。
【０１７０】
３) 株作成
プラスミドpMTL83251_pfdx_phaBを、コンジュゲーションドナーとして大腸菌ＣＡ４３４を使用して、クロストリジウム・ブチリクムＡＴＣＣ１９３９８／ＤＳＭ１０７０２にコンジュゲートした。株特異的コンジュゲーションプロトコールを適用した。簡潔には、プラスミドpMTL83251_pfdx_phaBを担持する大腸菌およびクロストリジウム・ブチリクムＣＡ４３４の一夜培養物を、それぞれ、９ml  ＬＢおよびＲＣブロスに接種した。ＯＤ６００が０.５〜０.７に到達するまで、培養物を増殖させた。１mlの大腸菌培養物を遠沈させ、ペレットを２００μl熱ショック(５０℃、１０分)クロストリジウム・ブチリクム培養物と混合した。細胞混合物を非選択的ＲＣＭプレートにスポットし、一夜インキュベートした。インキュベート混合物を５００μl  新鮮ＲＣＭに再懸濁させ、１０μg／ml  エリスロマイシンを含む選択培地に播種した。得られた接合完了体内のプラスミドの存在を、プラスミド特異的プライマーを使用するＰＣＲにより確認した。
【０１７１】
４) クロストリジウム・ブチリクムについての発酵データ
増殖法
１Ｌ当たり酵母抽出物１３ｇ、ペプトン１０ｇ、可溶性デンプン１ｇ、塩化ナトリウム５.０ｇ、酢酸ナトリウム３ｇ、システイン塩酸塩０.５ｇ、炭水化物２％を含むＲＣブロスを使用した。炭酸カルシウム１０ｇ／Ｌを、液体培養物にｐＨ制御のために添加した。固体培地は１５ｇ／Ｌ寒天を含んだ。
形質転換体を、種培養(ＲＣブロス)で一夜、３７℃で増殖させた。２％グルコースを含む１００ml  ＲＣブロスを、０.０５〜０.１の出発ＯＤまで接種した。株を、必要な抗生物質の存在下、３７℃で嫌気性に増殖させた。代謝解析用サンプルを一定間隔で取った。
【０１７２】
解析および結果
操作されたクロストリジウム・ブチリクム(ＣＨＮ−１)の培養上清を、３−ＨＢアッセイキット(Sigma Aldrich)を使用して(Ｒ)−３−ＨＢおよび(Ｓ)−３−ＨＢについて解析した。ｐｈａＢを発現する株は、(Ｒ)−３−ＨＢのみを産生した。ＣＨＮ−１および天然クロストリジウム・ブチリクムの培養上清を、ＨＰＬＣ−ＲＩを使用して、ＳＣＦＡｓおよび(Ｒ)−３−ＨＢの産生についても解析した。クロストリジウム・ブチリクムのｐｈａＢ発現株(ＣＨＮ−１)は、図４Ｂに示すとおり、２４時間増殖後約１８７mg／Ｌ産生された。野生型クロストリジウム・ブチリクム株は、図４Ａに示すとおり、ブチレートおよびアセテートのみを産生した。
【０１７３】
実施例２  −  結腸送達用製剤
Zacol NMX(登録商標)は、ＭＭＸ(登録商標)テクノロジーに基づき、結腸向けの栄養補助食品(機能性食品)である。これは、酪酸のカルシウム塩とイヌリンを組み合わせるＭＭＸ(登録商標)テクノロジーの提供に基づく、製品である。ＮＭＸ(登録商標)は、ＭＭＸ(登録商標)テクノロジーの機能性食品版である。錠剤は、カルシウム３−ＨＢ(０.３０７ｇ)、マルトデキストリン、イヌリン(０.２５０ｇ)、ソルビトール、ヒプロメロース、微結晶セルロース、加工コーンスターチ、クエン酸、コロイド状シリカ水和物、タルク、シェラック、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、レシチン、二酸化チタン、ヒドロキシプロピル、トリエチルシトレート；芳香：バニリンを含む。
BioCare形式。カプセルは、１８１５mg  ３−ＨＢ、２４３mg水酸化カルシウム、１２３mg水酸化マグネシウム、中鎖トリグリセリド、カプセル殻(ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、固化防止剤(二酸化ケイ素およびステアリン酸マグネシウム)を含む。１カプセルを１日３回食後に、または専門家の指示に従って、摂取する。
【０１７４】
実施例３  −細菌送達
クロストリジウム・ブチリクムの胞子形成
発酵と同じ培養培地および接種技法を使用した。サンプルを、実験開始時および７２時間にわたり一定間隔で採取し、栄養細胞対胞子の比を決定した。胞子の計数のために、サンプルを６５℃で３０分熱処理して、あらゆる栄養細胞を死滅させた。同時に、総ＣＦＵカウント(栄養細胞＋胞子)の計数のために取ったサンプルを、培地におけるさらなる増殖を阻止するためにベンチに置いた。次いで、熱処理および非熱処理サンプルを連続的に希釈し、野生型について非選択培地および操作された株について選択培地に、トリプリケートで２０μLの個別スポットに植種した。３７℃で嫌気性に一夜インキュベーション後、ＣＦＵ／mLを決定した。図５Ａ〜Ｂは、７２時間にわたる胞子の発生を示す。図６は、７２時間にわたる培養における総ＣＦＵ中の胞子のパーセンテージを示す。
錠剤製剤は、コーンスターチ、ラクトース、水和ケイ酸マグネシウム、微結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウムおよびスクロースを含む。
【０１７５】
実施例４  −  模擬結腸環境におけるＣＨＮ−１の評価
操作されたクロストリジウム・ブチリクム(ＣＨＮ−１)の胞子を、ｐＨ制御実験室規模バイオリアクターで産生した。株を、バイオリアクターに接種前、窒素および二酸化炭素フラッシュ嫌気性ワークステーションで３７℃で取り扱った。
ＣＨＮ−１を、胞子ストックから強化クロストリジウム寒天(Sigma-Aldrich, UK)プレートで増殖させた。単一コロニーを、改変強化クロストリジウム(ＲＣ)ブロス(１リットル当たり酵母１３ｇ、ペプトン１０ｇ、デンプン１ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、ＣＨ３ＣＯＯＮａ  ３ｇ、システイン塩酸塩０.５ｇ、ＣａＣＯ３  １０ｇ、グルコース２０ｇ)の摂取に使用し、次いでそれを改変ＲＣブロスで１００〜１０−８に連続的に希釈した。８〜１２時間後、１：１０希釈を、１日培養に最高希釈一夜培養増殖(通常１０−６)から新鮮改変ＲＣ中で調製した。１日培養を、一般に血清ボトルに移す前、１ 1/2〜２時間増殖させた。血清ボトルにゴム栓で蓋をして、嫌気生育を維持した。血清ボトルからの細菌培養を使用して、バイオリアクターに１：１０で摂取した。改変ＲＣを含むバイオリアクターを、必要に応じて、１２５rpm撹拌および６Ｌ／時間Ｎ２フラッシングしながら、３Ｍ  無菌ＫＯＨで６.５にｐＨ制御した。バイオリアクターを、ずっと３７℃に維持した。細胞塊を２４時間後に採取し、４℃で保存し、その後精製した。栄養細胞を、６５℃での熱処理により破壊した。精製は、無菌脱イオン水と、５０００×gで２０分の遠心分離を使用する反復洗浄工程を伴った。胞子を、改良型ノイバウエル血球計数機を使用して計数し、生存胞子数をＲＣ寒天上のコロニー形成単位により評価した。
【０１７６】
結腸環境でＣＨＮ−１胞子が発芽し、増殖する能力を、Molly et al., (1993) Appl Microbiol Biotechnolに記載の、近位大腸模擬条件を使用して評価した。結腸(例えばムチンまたはデンプンなどの宿主または食餌由来グリカン)に存在する栄養素を含む、還元糖予枯渇基礎結腸培地を、ダブルジャケットガラスバイオリアクターに加えた。ＣＨＮ−１胞子および／または糞便接種材料(faecal inoculum)を、嫌気性ワークステーション内でバイオリアクターに加えた。糞便接種材料を、１名の健常ドナーの糞便ドナー材料を、新鮮糞便サンプルと予還元リン酸緩衝液を１：５で混合し、５００×ｇの遠心分離により粒子を除去することにより調製した。次いで接種材料を、バイオリアクターに１：１０希釈で加えた。バイオリアクターをゴム栓で密閉して、嫌気生育を維持した。
実験は、トリプリケートで４つの異なる条件を含んだ：ｉ)濾過滅菌糞便懸濁液およびＣＨＮ−１を接種；ii)濾過滅菌糞便懸濁液、ＣＨＮ−１およびグルコース(１ｇ／Ｌ)を接種；iii)糞便懸濁液およびＣＨＮ−１を接種；およびiv)糞便懸濁液を接種。バイオリアクターを３７℃に維持し、９０rpmの連続混合を適用した。サンプルを、接種後ｔ＝０時間、２時間、４時間、６時間、２４時間、３０時間および４８時間に解析のために取った。
胞子の発芽、増殖およびＣＨＮ−１の代謝活性を、１)選択培地上のコロニー形成単位；２)ｐＨ低下；３)ＳＣＦＡ産生；および４)(Ｒ)−３−ＨＢの産生により評価した。５)ＣＨＮ−１の検出は、クロストリジウム・ブチリクム１６ｓ−２３ｓ遺伝子間スペーサー領域の検出およびｐｈａＢの検出のための２つの特異的ＰＣＲプロトコールを使用して実施した。
【０１７７】
１) コロニー形成単位を、Popoff (1984) J Clin Microbiolに記載の改変クロストリジウム・ブチリクム単離培地(ＢＩＭ)で、Ｄ−シクロセリンを唯一の抗生物質として２５０μg／mLの濃度で使用して評価した。この培地は、ＣＨＮ−１の選択的数え上げを可能とし、この株の補充をしなければ、コロニーが背景観察されない(検出閾値２００ＣＦＵ／mL)。総生細胞数(図７)を、サンプルを連続的に希釈し、改変ＢＩＭに播種することにより評価した。コロニー形成単位を、嫌気性条件で一夜インキュベーション後に数え上げた。熱抵抗細胞数(図８)を、サンプルを３０分、６５℃で低温殺菌し、連続希釈し、改変ＢＩＭに播種することにより評価した。コロニー形成単位を、嫌気性条件で一夜インキュベーション後に計数した。
図７に示すとおり、濾過滅菌糞便懸濁液およびＣＨＮ−１をグルコースを伴いまたは伴わずに接種したそれぞれのリアクターで計数した生細胞数に有意差はなかった。ＣＨＮ−１および糞便懸濁液を接種したバイオリアクターにおいて、実験の最初の６時間について生細胞数の恒常的な増加があり、ＣＨＮ−１の発芽および増殖を示した。２４時間後、糞便懸濁液を接種したものと比較して、濾過滅菌糞便懸濁液を接種したバイオリアクターでＣＨＮ−１の生細胞数が統計的に有意な高値であり(ｐ＜０.０５)、これらのバイオリアクターで糞便細菌叢とＣＨＮ−１の競合があったことを示した。ＣＨＮ−１を接種しなかったバイオリアクターは、ＣＦＵが検出閾値を超えて回復しなかった。
図８に示すとおり、濾過滅菌糞便懸濁液およびＣＨＮ−１をグルコースを伴いまたは伴わずに接種したそれぞれのバイオリアクターで計数した熱抵抗計数値に有意差はなかった。インキュベーション４〜２４時間で全バイオリアクターで熱抵抗計数値に恒常的な低下があり、栄養細胞増殖に至る胞子からの発芽および伸長を示した。
【０１７８】
２) 模擬結腸内の代謝活性により引き起こされるｐＨの低下(図９)を、Senseline F410 pH meter(ProSense, Oosterhout, NL)を使用してｔ＝０時間、６時間、２４時間および４８時間に測定した。
図９に示すとおり、実験開始時には４つの実験設定のｐＨに有意差はなかった。濾過滅菌糞便接種材料およびＣＨＮ−１を接種したバイオリアクターおよび糞便懸濁液およびＣＨＮ−１を播種したバイオリアクターのｐＨにも実験中あらゆる時点で、有意差はなかった。しかしながら、濾過滅菌糞便懸濁液およびＣＨＮ−１を接種したバイオリアクターのｐＨは、６時間以降の時点でグルコースを添加したものと比較して、統計的に有意な差があった(ｐ＜０.０２)。糞便懸濁液を接種したバイオリアクターも、ＣＨＮ−１を添加したものと添加していないものを比較して、６時間および２４時間の時点に統計的に有意な差があった(それぞれｐ＝０.００３および０.０１３３)。これは、ＣＨＮ−１が、滴下の最初の６時間内では、濾過滅菌糞便懸濁液および糞便懸濁液で、それぞれの背景で代謝的に活性であることを示す。
【０１７９】
３) ＳＣＦＡアセテート(図１０)およびブチラート(図１１)の産生を、De Weirdt et al. (2010) FEMS Microbiol Ecolに記載とおり、ガスクロマトグラフィーにより測定した。
図１０に示すとおり、糞便接種材料およびＣＨＮ−１を添加したバイオリアクターを、糞便接種材料のみと比較したとき、インキュベーション６時間後から実験終了時まで、アセテート濃度の統計的に有意な増加があった(ｐ＜０.０４)。糞便接種材料およびＣＨＮ−１を含むバイオリアクターにおいて、濾過滅菌糞便懸濁液およびＣＨＮ−１を含むものと比較したとき、アセテートの有意に高い量が、２４時間以降の時点で存在した(ｐ＜０.００３)。
図１１に示すとおり、糞便接種材料およびＣＨＮ−１を添加したバイオリアクターにおいて、糞便懸濁液のみを添加したものと比較して、ブチレート濃度の統計的に有意な増加が、実験をとおしてあった(ｐ＝０.０００１)。ＣＨＮ−１を糞便懸濁液を伴いまたは伴わずに含むバイオリアクターの間に有意差はなかった。グルコースがブチレート産生の前駆体として補われたリアクターで、最高量のブチレートが見られた(ｐ＜０.０４)。
【０１８０】
４) 模擬結腸における(Ｒ)−３−ＨＢの産生を、３５℃および５５分のランタイムに設定した、Dionex UltiMate 3000 System(Thermo Scientific, USA)上の３００mm×７.８mmで９μm粒子径のAminex HPX-87Hカラム(Biorad, USA)を使用するＨＰＬＣ−ＲＩにより測定した。移動相として、５mM  Ｈ２ＳＯ４を流速０.５mL／分で使用した。培養サンプルを、細孔径０.２２μmのレギュラーセルロースの１３mm直径のＫＸシリンジフィルター(Kinesis Ltd, UK)を使用して、解析前に濾過滅菌した。既知量の(Ｒ)−３−ＨＢをサンプルに添加し、その後サンプルを、内部標準として５０mM  バレラートを含む移動相と１：１で混合した。漸増濃度のグルコース、(Ｒ)−３−ＨＢ、ブチレート、アセテートおよびラクテートを含む較正標準を、添加されたサンプルと同時に流した。
図１２Ａに示すとおり、濾過滅菌糞便懸濁液、ＣＨＮ−１およびグルコースを接種したバイオリアクターにおいて、グルコース不含バイオリアクターと比較して、有意に高い量の(Ｒ)−３−ＨＢが産生された。ＣＨＮ−１を添加したバイオリアクターの何れにおいても、糞便懸濁液のみを添加したものと比較して、有意に高い量の(Ｒ)−３−ＨＢが存在した(ｐ＜０.０３)。これは、全てのバイオリアクターにおける(Ｒ)−３−ＨＢの産生が、ＣＨＮ−１の存在に依存することを示す。
図１２Ｂは、図１２Ａの三番目の実験条件(糞便懸濁液およびＣＨＮ−１を接種)について実施した３回の実験的反復の各々で測定された(Ｒ)−３−ＨＢ濃度を示す。これらの３つの値を合わせ、図１２Ａに示す。(Ｒ)−３−ＨＢは、全３反復で、摂食条件下、ヒト血清(０〜２００μM)で見られるベースライン濃度を超えて検出された。一つのリアクターは、約１mMのレベルを示した。この２００μM〜１mM  (Ｒ)−３−ＨＢの範囲は、実施例５および６に記載するとおり、２つのヒト結腸組織ベースのインビトロモデルにおいて、複数の炎症性タンパク質の発現低減および抗炎症性タンパク質の発現増加に有効であることが判明した。
【０１８１】
５) バイオリアクターにおけるＣＨＮ−１の存在を、株特異的ＰＣＲによりさらに確認した。これについて、２つの異なるセットのオリゴヌクレオチドを使用した(表１)。第一のセットは、Nakanishi et al. (2005) Microbiol Immunol.に記載のとおり、クロストリジウム・ブチリクムの１６ｓ−２３ｓ遺伝子間スペーサー領域を増幅させた。第二のセットは、統合ｐｈａＢ遺伝子を特に増幅させた。
【表１】
2019533010.tif 000002
ゲノムＤＮＡを、フェノール−クロロホルム抽出した後、両オリゴヌクレオチドセットを使用するＰＣＲに付した。
【０１８２】
図１３に示すとおり、クロストリジウム・ブチリクムの存在が、ＣＨＮ−１胞子を添加したバイオリアクターに対応するサンプル１〜９において確認された。低レベルのクロストリジウム・ブチリクム(生細胞数および熱抵抗計数検出レベル以下(図７および８))は、糞便懸濁液のみを添加したリアクター１０〜１２でも確認された。
図１４に示すとおり、ｐｈａＢの存在が、ＣＨＮ−１胞子を添加したバイオリアクターに対応するサンプル１〜９において確認された。アンプリコンは、糞便懸濁液のみを添加したリアクターで観察されず、これらのバイオリアクターにおいてｐｈａＢがないことが確認された。
まとめると、これらのデータは、ＣＨＮ−１胞子が模擬結腸環境で発芽できることを示す。これらの胞子の発芽は、続いて、ここではＳＣＦＡ濃度およびｐＨ低下である代謝活性の指標により示される、栄養細胞増殖に至る。本データはまたＣＨＮ−１が、結腸環境で通常見られない新規代謝産物、すなわち(Ｒ)−３−ＨＢの導入に成功したことも示す。
【０１８３】
実施例５  −  一次ヒト腸管オルガノイドを使用するモデル化炎症
一次ヒト腸管オルガノイドの炎症に対する(Ｒ)−３−ＨＢの効果を測定するために、女性６７歳ドナーの健常大腸サンプルを、実験前に８週間インビトロで培養した。Hannan et al., Stem Cell Reports. Vol. 1, 293-306 October 15, 2013において使用された方法。
【０１８４】
１) 炎症を誘発するために、オルガノイドをＴＮＦα(４０ng／mL)単独またはブチレート(１０μM)、(Ｒ)−３−ＨＢ(１０μM)またはブチレートと(Ｒ)−３−ＨＢと組み合わせて、１８時間処理した。続いて、細胞を溶解し、ＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲによる炎症因子、ＮＦ−κＢおよびＴＮＦαのｍＲＮＡ発現レベル測定のために単離した。
図１５は、１に設定した対照(非刺激サンプル)に対して標準化した、ブチレート、(Ｒ)−３−ＨＢまたはブチレートと(Ｒ)−３−ＨＢの組み合わせと組み合わせたＴＮＦαとのインキュベーションに応答した、一次ヒト腸管オルガノイドにより発現された炎症性因子、ＮＦ−κＢ(Ａ)およびＴＮＦα(Ｂ)の相対的ｍＲＮＡ発現レベルを示す。炎症因子ＮＦ−κＢおよびＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現は、ブチレート、(Ｒ)−３−ＨＢまたはブチレートと(Ｒ)−３−ＨＢの組み合わせでの処理により低減した。
【０１８５】
２) 炎症を誘発するために、オルガノイドをＴＮＦ−α(４０ng／mL)単独または(Ｒ)−３−ＨＢ(ナトリウム塩を１０μM)で１８時間処理した。続いて、細胞を溶解し、ＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成のために単離し、一団の炎症因子のｍＲＮＡ発現レベルをｑＰＣＲにより測定した。
図１６は、正規化対照(０に設定した非刺激サンプル)に対して標準化した、ＴＮＦ−α単独または(Ｒ)−３−ＨＢとの組み合わせとのインキュベーションに応答した、一次ヒト腸管オルガノイドにより発現された炎症性因子の相対的ｍＲＮＡ発現レベルを示す。炎症誘発性サイトカインおよびタンパク質ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＮＦ−κβのｍＲＮＡ発現は、ＴＮＦ−α単独での処理と比較して、(Ｒ)−３−ＨＢ存在下で低減した。抗炎症性サイトカインＴＧＦ−β１およびＩＬ−１０のｍＲＮＡ発現は、ＴＮＦ−α単独での処理と比較して、(Ｒ)−３−ＨＢ存在下で増加した。
ブチレートおよび(Ｒ)−３−ＨＢの両者は、炎症誘発性サイトカインおよびタンパク質ならびに抗炎症性サイトカインおよびタンパク質に作用する。(Ｒ)−３−ＨＢは、ＩＢＤの複数の重要な炎症誘発性制御因子に対してブチレートより大きな低減効果を有し、腸管炎症の主要な保護性制御因子にブチレートより大きな誘発効果を有する(データは示していない)。
【０１８６】
３) 炎症性刺激としてＴＮＦ−αとの共インキュベーションにより一次ヒト腸管オルガノイドにより生じた炎症性応答に対する(Ｒ)−３−ＨＢおよび関連ＳＣＦＡブチレートの効果を測定した。一次ヒト腸管オルガノイドを、Hannan et al. (2013) Stem Cell Reportsに記載のとおり、実験前８週間培養した。
炎症を誘発するために、オルガノイドを６０ng／mL  ＴＮＦ−α単独または種々の濃度の(Ｒ)−３−ＨＢのナトリウム塩またはブチレートで２４時間処理した。続いて、細胞を溶解し、ＲＮＡをｃＤＮＡ合成のためにRNeasy mini kit(Qiagen Ltd, Germany)を使用して単離した。ＩＬ−２３のｍＲＮＡ発現レベルを、SensiMix SYBR low-ROX kit(Bioline, UK)を使用するｑＰＣＲにより測定した。
値を未処理対照に対して正規化し、グラフはＴＮＦ−α単独(０として設定)で処理したおよびＴＮＦ−αとブチレートまたは(Ｒ)−３−ＨＢで処理したオルガノイドで測定したｍＲＮＡレベルの差を示す。
図１７は、６０ng／mL  ＴＮＦ−αおよび漸増濃度のブチレートまたは(Ｒ)−３−ＨＢで処理したオルガノイドにおけるＩＬ−２３の相対的ｍＲＮＡ発現レベルを示す。これらのデータは、１０〜１００μM濃度の(Ｒ)−３ＨＢが、ヒト腸粘膜におけるＩＬ−２３発現低減に有効であり得ることを示す。ＩＬ−２３はＩＢＤにおける炎症の重要なメディエーターであり、いくつかの医薬モノクローナル抗体薬物の標的である。(Ｒ)−３−ＨＢのこの濃度範囲は、インビトロ腸モデル化により証明されるとおり、細菌送達を使用して腸管内腔で達成可能である(図１２参照)。(Ｒ)−３−ＨＢは、これらの濃度でブチレートより大きなＩＬ−２３発現低減効果を有する。
【０１８７】
実施例６  −  エキソビボヒト結腸組織モデルを使用するモデル化炎症
結腸直腸検体は、患者のインフォームドコンセント書類への署名を得た後、腸管組織の外科的切除または組織診により得ることができる。
【０１８８】
材料：検体収集ポット、無菌メス、無菌鉗子、ペトリ皿、ＰＢＳ、ダルベッコ最小必須培地(ＤＭＥＭ)高グルコース、ウシ胎仔血清(ＦＣＳ)、Ｌ−グルタミン、抗生物質、蓋付き９６ウェルＵ底無菌プレート、マルチチャンネルピペッター。
【０１８９】
結腸直腸外植片の調製。組織切除後、検体を検査室への輸送のためにＤＭＥＭを含む検体収集ポットに維持する。検体をいくらかの培地を含むペトリ皿に移す。切除検体から筋肉を無菌メスで剥がす。残った組織を培地を含む新しいペトリ皿に移し、組織を上皮粘膜および粘膜筋板の両者を含む外植片に切断する(Berry N, Herrera C, Cranage M. Methods Mol. Biol. 2011; 665: 133-60)。アッセイに進む。
【０１９０】
候補化合物の前臨床評価。炎症を誘発するために、外植片を９６ウェルＵ底無菌プレート中で１００μlの炎症性刺激(ＴＮＦ−α  １５μg／ml)とインキュベートする。外植片を１時間１００mlの完全培地(ＦＣＳ、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質含有ＤＭＥＭ)とインキュベートする。目的化合物の活性を評価するために、１００μlの化合物(１０mM)を外植片に加える。次いで、組織外植片を５％ＣＯ２を含む雰囲気下、３７℃で２４時間培養する。陰性対照は、炎症性刺激および目的化合物の何れも添加せずに培養した組織外植片である(２００μlの完全培地添加)。陽性対照は、炎症性刺激のみで培養した外植片である。培養後、組織外植片を培養ウェルから除き、プレートを遠沈し、１８０μlの培養上清を回収する。上清および組織外植片を−８０℃で凍結する。次いで上清および／または組織外植片における目的分析物の定量を行う。
【０１９１】
培養上清におけるタンパク質濃度決定のためにLuminex法を使用した：
Luminexプロトコール：所内アッセイは、St Mary's Hospital, Paddington, LondonのDr. Carolina Herreraが実施した。Luminexアッセイ緩衝液：ＰＢＳ、ヤギ血清、マウス血清、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｒｉｓ  ｐＨ７−８。Luminex洗浄緩衝液：ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ−２０。操作：
アッセイプレート調製
１. アッセイプレートをアッセイ緩衝液で予湿
標品調製
１. １／３の希釈段階で１１標品調製
サンプル調製
１. パネル毎に必要に応じてサンプル希釈
ビーズ調製
１. ビーズを超音波処理およびボルテックス処理
２. ビーズをアッセイ緩衝液で希釈
アッセイ設定
１. プレートからアッセイ緩衝液除去
２. ５０μlの標品、ブランクおよびサンプルを対応ウェルに添加
３. ５０μlのビーズ混合物を各ウェルに添加
４. ホイルでプレートを被覆し、プレートシェーカーで１時間３０分振盪
【０１９２】
検出抗体カクテル添加
１. 検出抗体カクテルをアッセイ緩衝液で希釈
２. プレートを３回洗浄緩衝液で洗浄
３. ウェル当たり５０μl  検出抗体カクテル添加
４. 前記のとおりホイルで被覆し、１時間振盪
ストレプトアビジン−ＰＥ添加
１. ストレプトアビジン−ＰＥをアッセイ緩衝液で希釈
２. プレートを３回洗浄緩衝液で洗浄
３. 各ウェルに５０μlの希釈ストレプトアビジン−ＰＥ添加
４. ホイルで被覆し、３０分振盪
５. ３回洗浄し、１００μlのシース液を各ウェルに添加
６. Luminexでプレートを走らせる前に振盪するかまたは冷蔵庫に保存し、翌日までホイルで被覆。
【０１９３】
図１８は、正規化対照(０に設定した非刺激サンプル)に対して標準化した、ＴＮＦ−α単独(６０分)またはＴＮＦ−α(６０分)とのインキュベーション、続いて(Ｒ)−３−ＨＢへの暴露(２４時間)に応答して、エクスビボ結腸組織サンプルにより発現された炎症性因子の相対的タンパク質レベルを示す。３−ヒドロキシ酪酸のナトリウム塩および遊離酸の両者を、全て１０mM濃度で試験した。相対的タンパク質レベル[ng／mL]を、標準曲線を使用して決定した。炎症誘発性サイトカインおよびタンパク質ＩＬ−１２、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６のタンパク質濃度は、ＴＮＦ−α単独での処理と比較して、(Ｒ)−３−ＨＢ存在下で低減した。抗炎症性サイトカインＩＬ−１０のタンパク質濃度は、ＴＮＦ−α単独での処理と比較して、(Ｒ)−３−ＨＢの存在下で上昇した。ブチレートおよび(Ｒ)−３−ＨＢの両者は、炎症誘発性サイトカインおよびタンパク質および抗炎症性サイトカインおよびタンパク質に作用する。(Ｒ)−３−ＨＢは、ＩＢＤの複数の重要な炎症誘発性制御因子に対してブチレートより大きな低減効果を有し、腸管炎症の主要な保護制御因子対してブチレートより大きな誘発効果を有する(データは示していない)。
【０１９４】
Proteome ProfilerＴＭ Arrayを、免疫応答に関与する大きなタンパク質およびサイトカインのセットの相対的存在量の測定に使用した。実験条件および結腸組織サンプル調製は、上記と同じであった。Human XL Cytokine Array Kit(www.rndsystems.com)、Catalog Number ARY022をこの実験に使用した。サイトカイン、ケモカインおよび増殖因子は、細胞間コミュニケーションに介在する細胞外シグナル伝達分子である。これらの分子は細胞から放出され、細胞増殖、分化、遺伝子発現、遊走、免疫および炎症などの多くの生物学的過程に重大な役割を有する。大部分の生物学的過程において、複数のサイトカインが大きなネットワークで作動し、そこでは、１サイトカインの作用が他のサイトカインの存在または非存在により制御される。Human XL Cytokine Array Kitは、サンプル間のサイトカイン差を同時に検出するための迅速で、高感度かつ経済的なツールである。１０２のヒト可溶性タンパク質相対的発現レベルを、多数のイムノアッセイを行うことなく決定できる。
【０１９５】
アッセイの原理
捕捉および対照抗体は、ニトロセルロース膜にデュプリケートでスポッティングされている。細胞培養上清、細胞ライセート、血清、血漿、ヒト乳、尿、唾液または組織ライセートを希釈し、一夜、Proteome Profiler Human XL Cytokine Arrayとインキュベートする。膜を洗浄して非結合物質を除去し、続いてビオチニル化検出抗体のカクテルとインキュベーションする。次いでストレプトアビジン−ＨＲＰおよび化学発光検出試薬を適用し、結合したタンパク質量に対応するシグナルが、各捕捉スポットで生じる。
図１９は、正規化対照(０に設定した非刺激サンプル)に対して標準化した、ＴＮＦ−α単独(６０分)またはＴＮＦ−α(６０分)のインキュベーション、続いて(Ｒ)−３−ＨＢへの暴露(２４時間)に応答してエクスビボ結腸組織サンプルにより発現された、炎症性因子の相対的タンパク質存在量(非定量的)を示す。３−ヒドロキシ酪酸のナトリウム塩および遊離酸の両者を、全て１０mM濃度で試験した。炎症誘発性サイトカインおよびタンパク質ＴＮＦ−α、ＩＬ−２３およびＭＭＰ９のタンパク質濃度は、ＴＮＦ−α単独での処理と比較して、(Ｒ)−３−ＨＢ存在下で低下した。
【０１９６】
実施例７  −  発芽および伸長競合アッセイ
クロストリジウム・ディフィシルおよび遺伝子操作されたクロストリジウム・ブチリクムの胞子を、５日間インキュベーションした後の富栄養培地プレートから胞子ストックを収穫することにより得た。サンプルを６５℃で３０分熱処理して、残ったあらゆる栄養細胞を死滅させた。胞子発芽のために、５０μLの胞子培養物を、０.１％タウロコール酸ナトリウム(クロストリジウム・ディフィシル発芽誘導因子)を添加した１０mLの富栄養培地に接種した。クロストリジウム・ディフィシルおよびクロストリジウム・ブチリクムの胞子を、単一および共培養のトリプリケート実験に使用した。２４時間、嫌気性条件で３７℃でインキュベーション後、サンプルを各個々の実験から取り、連続希釈し、富栄養培地にトリプリケートで２０μLの個別のスポットに植種した。３７℃で嫌気性に一夜インキュベーション後、ＣＦＵ／mLを決定した。
図２０は、クロストリジウム・ディフィシルおよびクロストリジウム・ブチリクムの胞子の単独または共培養により得られたＣＦＵ／mLを示す。クロストリジウム・ディフィシルの発芽および／または伸長は、胞子がクロストリジウム・ブチリクム胞子と並んで共培養により発芽されたとき、完全に阻止された。
【０１９７】
実施例８  −  胃および小腸条件における生存評価
ＣＨＮ−１の胞子を１mL  ＰＢＳに再懸濁し、ｇ／Ｌでアラビノガラクタン、１、ペクチン、２、キシラン、１、デンプン、３、グルコース、０.４、酵母抽出物、３、ペプトン、１、ムチン、４、システイン、０.５およびペプシン、１を含む９mLの模擬胃培地(ＧＳＭ)に接種した。培地をオートクレーブ前に１Ｍ  ＨＣｌを使用してｐＨ３に調節した。ＧＳＭ培養を、嫌気性に、３７℃で１００rpmで撹拌しながら２時間インキュベートし、その後、ｇ／Ｌでパンクレアチン、３、脱水胆汁抽出物、８、重炭酸ナトリウム、１０を含む、５mLの予還元膵臓胆汁を添加した。培養を、嫌気性に、３７℃で５０rpmで撹拌しながら４時間インキュベートした。ＧＳＭは予還元しなかったが、胃で遭遇する好気性条件およびその後の嫌気性インキュベーションによる消化管の移動により遭遇する酸素減少を模倣するために、キャビネットに移す前に３７℃で保存した。サンプルをインキュベーションのｔ＝０時間、２時間、４時間および６時間に取った。サンプルを連続的に希釈し、ＲＣＭ寒天プレート上に３つの個別の２０μLスポットを植種した。プレートを嫌気性に３７℃で一夜インキュベートし、コロニーをカウントして、胃および小腸条件における胞子の生存能を評価した。
図２１は、ＣＨＮ−１の胞子が胃酸条件を生き残り、故に生存可能であることを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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