(57)【要約】  本発明は、三次元のゲル状基質を調製するための材料を製造する方法に関し、そこでは、血小板濃縮物が提供され、そして、この血小板濃縮物から血小板が採取される。血小板は、血小板溶解物を製造するために、その後、溶解され、そして、前記血小板溶解物は、乾燥血小板溶解物ゲル材料を提供するために、その後、凍結乾燥される。本発明は、更に、血小板溶解物を含む血小板溶解物ゲル材料に関し、そこでは、この材料は、凍結乾燥された乾燥材料である。凍結乾燥されたゲルは、いかなる制限なしに生きた細胞を培養するために使用できる完全に機能性の血小板溶解物ゲルを提供するために、使用する場所で水の添加によって、容易に再構成されることができる。その結果、この方法は、細胞培養特性に対するいかなる影響なしに、血小板溶解物ゲルのより高い保存性を確保し、ゲル材料の輸送を促進する。そのような凍結乾燥されたｈＰＬ−ゲル上での細胞成長は、同様の細胞増殖及び増殖率を示し、そして、凍結乾燥なしで新鮮に調製されるｈＰＬ−ゲルと比較して播種されたＭＳＣｓの免疫表現型プロファイル及び分化能に対する凍結乾燥の何の効果も、観察され得ない。
2019517822.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
三次元のゲル状基質を調製するための材料を製造する方法であって：
−血小板濃縮物を提供すること；
−血小板濃縮物から血小板を採取すること；
−血小板溶解物を製造するために血小板を溶解すること、及び
−乾燥血小板溶解物ゲル材料を提供するために、前記血小板溶解物を凍結乾燥すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
少なくとも１つの培地成分が、血小板溶解物に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地成分が、細胞培養用の標準化された培地組成、好ましくはＤＭＥＭ培地を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記血小板溶解物ゲル材料が、１−５０％の血小板溶解物、好ましくは１−４０％の血小板溶解物、より好ましくは１−３０％の血小板溶解物、より好ましくは１−２０％の血小板溶解物、より好ましくは５−１５％の血小板溶解物、特に約１０％の血小板溶解物を含む、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
血小板が、凍結融解法によって溶解される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
血小板溶解物を含む血小板溶解物ゲル材料であって、凍結された乾燥材料である前記材料。
【請求項７】
少なくとも１つの培地成分を更に含む、請求項６に記載の血小板溶解物ゲル材料。
【請求項８】
前記培地成分が、細胞培養用の標準化された培地組成、好ましくはＤＭＥＭ培地を含む、請求項７に記載の血小板溶解物ゲル材料。
【請求項９】
１−５０％の血小板溶解物、好ましくは１−４０％の血小板溶解物、より好ましくは１−３０％の血小板溶解物、より好ましくは１−２０％の血小板溶解物、より好ましくは５−１５％の血小板溶解物、特に約１０％の血小板溶解物を含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の血小板溶解物ゲル材料。
【請求項１０】
細胞を培養するための三次元のゲル状基質を調製するための、請求項６〜８のいずれか１項に記載の血小板溶解物ゲル材料、特に請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法で製造される血小板溶解物ゲル材料の使用。
【請求項１１】
細胞が間葉系間質細胞である、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、三次元のゲル状基質を調製するための材料を製造する方法に関する。本発明は、更に、血小板溶解物ゲル材料及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術
必須の成長因子を持つ細胞を提供するために、細胞は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）又は他の血清が補足されている培地中で通常培養される。いかなる細胞型も、成長用血清を実際に必要とはしないけれども、例えば幹細胞などのほとんどの感受性細胞型は、これまでに血清含有培地に依然として依存する。しかし、治療的用途の観点から、結果の再現性を妨げる高いロット間変動、ウシの病原体（ウイルス及びプリオン）、及び潜在的な異種免疫反応（例えば抗ＦＣＳ抗体）に起因するＦＣＳの使用を避ける大きな関心が存在する（Heiskanen et al., 2007; Sundin et al., 2007）。化学的に定義される合成培養培地は現在は市販されているが、それらの正確な組成はしばしば非開示であり、そして、それらは、組換え成長因子などの他の異種成分をしばしば含む。
【０００３】
ヒト血小板溶解物（ＨＰＬ）は、ＦＣＳに対する他の魅力的な代替を表す。ＨＰＬは、簡単な凍結融解手順によって普通の血小板ユニットから発生させることができる。免疫学的な副作用又はウイルス感染のリスクを更に最小限にするために、同じドナーからＨＰＬを使用することさえ可能である。これらの検討は、骨髄からの間葉系間質細胞（ＭＳＣ）で実施された。そして、近年、ヒト脂肪組織からのＭＳＣの単離のためにＨＰＬを使用できることも、例証された（Blande et al., 2009）。
【０００４】
ＨＰＬ培地及び血小板溶解物を調製する方法は、ＥＰ０４１３７２７Ｂ１で公知である。この公知の方法に従うと、凝固を避けるために、クエン酸塩が全血に添加される。この血液から導かれる血漿は、血小板に富むペーストを得るために、遠心分離され、そして、その後、血小板を溶解して残りの成分を凝固するために、Ｃａ２＋が添加される。濾過された透明な溶解物は、ＨＰＬ含有培地を得るために、従来の栄養組成物と混合される。
【０００５】
更に、ＷＯ２００８／０３４８０３Ａ１は、血漿を含有しない血小板溶解物を含む細胞培養培地補足物を開示する。当該補足物は、アルブミン及びデキストランなどの追加の物質を更に含む。当該補足物を調製するために、血小板は、それらを凍結融解することによって溶解され、そして、酸性クエン酸ブドウ糖（ＡＣＤ）又はクエン酸リン酸ブドウ糖（ＣＰＤ）が、抗凝固剤として添加される。
【０００６】
しかし、例えば間葉系間質細胞（ＭＳＣ）などの多くの細胞は、それらが接触阻害されるまで、プラスチック接着単層で成長する。遅かれ早かれ、細胞の増殖速度は、それらが最終的に老化状態に到達するまで、衰える。これは、モルフォロジーの拡大、表面マーカーの表現の低減及び分化能の減少を伴う。このプロセスは、異なる亜細胞群、アポトーシス、及び群体範囲内の最後だが特に接触阻害に起因して培養細胞にわたって並行して起こらない。より低い播種密度は、細胞継代のより高い間隔を促進し、それ故に、増殖は、より大きな群体のリムでのみ起こり得る。その結果、プラスチック接着単層培養を使用する時、信頼できる増殖を達成して接触阻害を最小限にすることは、ほとんど可能ではない。その上、細胞継代は、細胞損傷ペプチダーゼ処理の使用なしでも、可能ではない。幹細胞培養では、プラスチック表面が細胞の望まれていない分化を引き起こし得るということが、プラスチック接着単層培養の他の欠点である。
【０００７】
ＷＯ２０１３／０００６７２Ａ１は、ゲル化抑制物質及び血小板溶解物を含む液体培地を使用して細胞を培養する方法を開示する。当該細胞は、血小板溶解物を含むがゲル化抑制物質に実質的に欠けている三次元のゲル状基質の内部及び／又はその表面上で培養され、そこでは、液体培地は、二相系を確立するためにゲル状基質上で層状にされる。このゲル上で培養された間葉系間質細胞（ＭＳＣｓ）は、組織培養プラスチック（ＴＣＰ）上で培養されたＭＳＣｓと比較して、著しくより高い増殖速度を示す。しかし、細胞を培養するためにゲル状基質がうまく適応されるけれども、ゲルは、長距離にわたって輸送することができず、より長時間にわたって安定ではないので、使用の場所で調製されなければならないということが、依然として欠点である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明の目的は、その細胞培養特性に対するかなりの影響なしに長期間にわたって保存できて容易に輸送できる三次元のゲル状基質を調製するための材料を製造する方法を提供することである。
【０００９】
当該目的は、以下の方法を提供することによって実現される：
三次元のゲル状基質を調製するための材料を製造する方法であって：
ａ）血小板濃縮物を提供すること；
ｂ）血小板濃縮物から血小板を採取すること；
ｃ）血小板溶解物を製造するために血小板を溶解すること、及び
ｄ）乾燥血小板溶解物ゲル材料を提供するために、前記血小板溶解物を凍結乾燥すること
を含む、前記方法。
【００１０】
ゲル状基質の形成に先立つ有利な工程は、血小板溶解物を凍結乾燥して乾燥パウダー状の血小板溶解物ゲル材料を形成することを含む。驚くべきことに、凍結乾燥工程は、ゲルの特性に対する何の影響もなく、そして、品質管理された条件下で長期間にわたって保存性を増加させることによって、より安定した補足物を提供する。すなわち、凍結乾燥された血小板溶解物ゲル材料は、安定しており、長期間にわたって保存できる。その上、凍結乾燥された材料は、容易に輸送できて、完全なゲル組成を使用場所に運搬できる。ユーザーは、使用場所で血小板溶解物ゲルを製造するプロセス全体を達成することを必要としない。その代わりに、血小板溶解物ゲル材料は、製造設備にて標準化されて制御された条件下で製造されて、乾燥ゲル材料は、その後、ユーザーによって容易に再構成されることができる使用する準備ができている材料の種類として、ユーザーに運搬される。
【００１１】
ヘパリンなどのいかなるゲル化抑制物質を含まないヒト血小板溶解物を含む組成物又は純粋なヒト血小板溶解物のゲル化は、約３７℃で１時間以内で自発的に起こる。すなわち、トロンビン及び／又はグルコン酸カルシウムなどの凝固誘発剤の添加は、ゲル化には必要ではない。その結果、もしも、凍結乾燥された血小板溶解物ゲル材料が水の添加によって再構成されるならば、当該材料は、完全に機能性の血小板溶解物ゲルが製造されるように、使用場所で自発的にゲル化する。
【００１２】
本発明の有利な形態では、血小板溶解物ゲルを、培養されるべき細胞の特定の必要性に適合させるために、少なくとも１つの培地成分が、血小板溶解物に添加される。培地成分は、例えば、細胞培養用の標準化された培地組成、好ましくはダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、特にＤＭＥＭ低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ）を含み得る。こうして、望まれない血清成分なしの細胞培養用の全ての必要な栄養成分及び必須の成長因子を含有する培地を、提供することができる。
【００１３】
本発明の他の有利な形態では、血小板溶解物ゲル材料は、１−５０％の血小板溶解物、好ましくは１−４０％の血小板溶解物、より好ましくは１−３０％の血小板溶解物、より好ましくは１−２０％の血小板溶解物、より好ましくは５−１５％の血小板溶解物、特に約１０％の血小板溶解物を含むことができる。
【００１４】
本発明の更に有利な形態では、血小板は、凍結融解法によって溶解される。例えば、採取された血小板ユニットは、−８０℃で２回凍結でき、そして、それぞれ３７℃で再融解できる。
【００１５】
当該目的は、血小板溶解物を含む血小板溶解物ゲル材料であって凍結乾燥された乾燥材料である前記材料を提供することのよっても実現される。当該乾燥ゲル材料は、安定しており、長期間にわたって保存できる。その上、凍結乾燥された材料は、容易に輸送できて、完全なゲル組成を使用場所に運搬できる。ユーザーは、使用場所で血小板溶解物ゲルを製造するプロセス全体を達成することを必要としない。その代わりに、血小板溶解物ゲル材料は、製造設備にて標準化されて制御された条件下で製造されて、乾燥ゲル材料は、その後、ユーザーによって容易に再構成されることができる使用する準備ができている材料の種類として、ユーザーに運搬される。
【００１６】
本発明の有利な形態では、血小板溶解物ゲル材料は、少なくとも１つの培地成分を更に含むことができ、それは、様々な細胞型を培養するために使用できる。本発明の有利な形態では、培地成分は、例えば、細胞培養用の標準化された培地組成、好ましくはダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、特にＤＭＥＭ低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ）を含み得る。こうして、望まれない血清成分なしの細胞培養用の全ての必要な栄養成分及び必須の成長因子を含有する培地が、提供される。
【００１７】
本発明の他の有利な形態では、血小板溶解物ゲル材料は、１−５０％の血小板溶解物、好ましくは１−４０％の血小板溶解物、より好ましくは１−３０％の血小板溶解物、より好ましくは１−２０％の血小板溶解物、より好ましくは５−１５％の血小板溶解物、特に約１０％の血小板溶解物を含むことができる。例えば、本発明に従う血小板溶解物ゲル材料は、１０％のＨＰＬ、８９％のＤＭＥＭ、及び２ｍＭのＬ−グルタミンから実質的に成ることができる。
【００１８】
本発明の他の側面は、細胞を培養するための三次元のゲル状基質を調製するための、血小板溶解物ゲル材料、特にここに記載されるような本発明に従う方法で製造される血小板溶解物ゲル材料の使用である。本発明の有利な形態では、細胞は、例えば、間葉系間質細胞であることができる。
【００１９】
得られるゲル状基質は、付着細胞、特に間葉系間質細胞（ＭＳＣ）又は線維芽細胞を増殖させるための完全な基質であることが、判明した。血小板溶解物を含むゲル状基質の使用は、ウシの病原体の伝染又は異種免疫反応のリスクを避け、そして、特に脂肪組織からのＭＳＣである大規模の細胞の増殖用のウシ胎児血清（ＦＣＳ）よりも更に効率的でもある。例えば、ヒト血小板溶解物（ＨＰＬ）は、脂肪組織由来のＭＳＣの累積集団倍加の最大数及び増殖速度を著しく増加させる。
【００２０】
例えば、培養されるべき細胞は、幹細胞又は始原細胞、特に好ましくは間葉系幹細胞、特に、間葉系間質細胞である。本発明の他の例示の形態では、細胞は、中胚葉細胞、好ましくは線維芽細胞又は間葉系間質細胞である。しかし、明らかに、他の型の細胞も、例えば、外胚葉又は内胚葉系譜から導かれる細胞や、初代細胞でさえ、培養できる。
【００２１】
本発明に従うゲル状基質は、細胞治療における医薬組成物として、有利に使用できる。特に、本発明に従うゲルの中に埋められた細胞、好ましくは幹細胞、特に間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、細胞交換、組織修復などのために、生きている動物又はヒトの体内に移植できる。代替として、本発明に従うゲル状基質は、周囲の組織又は血液の細胞用の適切な基質を提供するために、動物又はヒトの体内に注入及び／又は移植できる。本発明に従う医薬組成物は、例えば、関節、壊死、又は損傷組織と関連する他の疾病を治療するために、使用できる。
【００２２】
ここで使用される用語「凍結乾燥」とは、液体状態を経験しない凍結状態からガスの状態への水の転化を含む「凍結乾燥」プロセスのことを言う。凍結乾燥プロセスは、水含有材料から水分を除去し、その一方で、材料は凍結されたままである。凍結乾燥の基本的なプロセスは、以下の工程を含む：凍結、一次乾燥（昇華）、及び二次乾燥（脱着）。最初に、溶解した及び／又は懸濁した物質が、低温（例えば、−６０℃）で凍結される。ゆっくりとした凍結は、より大きな結晶を製造し、それは、昇華材料が抜けることを可能にする。いくつかの生成物はガラス状の材料を形成し、そして、凍結プロセスの間にアニーリングを要求できる。最初に温度を低下させてその後に温度上昇させてそしてその後に再び低下させるアニーリングは、構成物質を場所に閉じ込め、その後、結晶が成長するのを可能にする。凍結は、用途に応じて、１時間〜２４時間の範囲であることができる。工程２（一次乾燥）では、水又は希釈剤はその後に真空経由で抽出され、多孔性の乾燥「ケーキ」を結果として得る。昇華は、その臨界温度よりも低い生成物温度で真空下に起こる。これは、典型的に最も長いプロセスである。一次乾燥サイクルの終わりに、生成物は、３〜５％の含水量を有するであろう。残りの凍結されていない水分子を除去するための最終の乾燥工程（二次乾燥）が存在する。これは、生成物を加熱することによってなされる。二次乾燥は、約０．５％の水分レベルという結果になり得る。
【００２３】
本発明が、図面に関して詳細に更に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
図面の簡単な記述
【図１】図１は、従来のｈＰＬ−ゲル及び凍結乾燥されたｈＰＬ−ゲルでのＭＳＣｓの増殖速度を示す棒グラフを示す。細胞は、標準のｈＰＬ−ゲル又は凍結乾燥されたｈＰＬ−ゲル（ｌｙｏ−ｈＰＬ−ゲル）のいずれかで１５日間、成長した。細胞増殖測定では、両方の基質で同様の増殖速度を示した。
【図２】図２は、従来のｈＰＬ−ゲル及び凍結乾燥されたｈＰＬ−ゲルでの長期間の培養後のＭＳＣｓの増殖速度を示す棒グラフを示す。細胞は、標準のｈＰＬ−ゲル又は凍結乾燥されたｈＰＬ−ゲル（ｌｙｏ−ｈＰＬ−ゲル）のいずれかで５日間及び１０日間、成長した。細胞増殖測定では、両方の基質で同様の増殖速度を示した。
【図３】図３は、新鮮に調製された凍結乾燥されたｈＰＬ−ゲル及び１週齢の凍結乾燥されたｈＰＬ−ゲルでのＭＳＣｓの増殖速度を示す棒グラフを示す。ゲルプレートは、調製されて、ＲＴ、４℃及び３７℃で保存された。細胞は、凍結乾燥されたｈＰＬ−ゲル（ｌｙｏ−ｈＰＬ−ゲル）で７日間、成長した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の例示の及び好ましい形態の記述
間葉系間質細胞（ＭＳＣｓ）は、造血をサポートすることが可能な生物学的に重要な細胞集団であり、インビトロで間葉系及び非間葉系系譜に沿って分化でき、アロ応答を抑制することが可能で、そして、非免疫原性のように見える。これらの特性は、細胞治療における間葉系間質細胞の新しい役割を提案する。
【００２６】
the Ethic Committee of the University of Aachenによって承認されたガイドラインを使用する書面による同意後に、股関節の骨折での大腿骨頭から、ＭＳＣが単離された。
【００２７】
骨片がＰＢＳでフラッシュされ、その後、単核細胞（ＭＮＣ）がＢｉｏｃｏｌｌ（Biochrom AG, Berlin, Germany）で密度勾配によって単離された。１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（pen/strep; Lonza, Basel, Switzerland）及び２ｍＭのＬ−グルタミン（Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA）を含むダルベッコ変法イーグル培地−低グルコース（DMEM-LG; PAA, Pasching, Austria）中でフィブロネクチンのコーティングを施した細胞培養皿（Greiner, Kremsmunster, Austria）中で細胞が培養された。培養培地は、表示されているようにＨＰＬ又はＦＣＳ（HyClone, Bonn, Germany）が補足された。培養培地は、いつも１週間につき２回交換された。８０％に到達した時に合流細胞がトリプシン処理され、ノイバウエル計算板（Brand, Wertheim, Germany）でカウントされ、そして、１０４細胞／ｃｍ２で再播種された。累積集団倍加は、最初の継代以降で計算された。
【００２８】
ヒト血小板溶解物（ＨＰＬ）は、Horn et al. (2010)に記載されるように、健康なドナーの血小板ユニットから生成された。特に、ＨＰＬは、トリマアクセルコレクションシステム（CaridianBCT, Garching, Germany）を使用してアフェレーシスによって生成された。そのような血小板濃縮物は、酸性クエン酸ブドウ糖（ＡＣＤ）（１：１１  ｖ／ｖ）が補足された２００ｍＬ血漿中に２．０〜４．２×１０１１血小板の血小板含有量を有した。血小板ユニットは、等分され、−８０℃で２回凍結され、３７℃で再融解され、そして、４℃で３０分間２６００ｇで遠心分離されて細胞断片が除去されて、そして、等量にプールされた。上澄みが、０．２２μｍ  ＧＤ／Ｘ  ＰＶＤＦ濾過装置（Whatman, Dassel, Germany）を通して濾過され、ゲル化を避けるために２Ｕ／ｍＬヘパリンが場合により補足され、そして、−８０℃で保存された。
【００２９】
１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（pen/strep; Lonza, Basel, Switzerland）及び２ｍＭのＬ−グルタミン（Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA）を含むダルベッコ変法イーグル培地−低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ；ＰＡＡ）中で細胞培養皿（Greiner, Kremsmunster, Austria）中で細胞が培養された。培養培地／基質は、明細書中に示されるように、ＨＰＬが補足された。細胞は、１週間につき２回交換される培地で、５％二酸化炭素を含有する加湿雰囲気中で３７℃で培養された。
【００３０】
細胞増殖が、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）評価を介して評価された。ＭＳＣは、明細書中に示されるように０、１、５、１０、又は２０％のＨＰＬが補足された培養培地／基質中で９６−ウェルプレート（３，０００細胞／ウェル）で播種された。７日間の培養後、細胞は、ＰＢＳ（ＰＡＡ）で洗浄され、そして、ＰＢＳ中の１ｍＭ  ＭＴＴ（Sigma-Aldrich）で３．５時間培養された。過剰の溶液が廃棄され、結晶が、イソプロパノール中の４ｍＭ  ＨＣｌ中で分離された（共に、Roth, Karlsruhe, Germany）。光学密度（ＯＤ）が、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２０００プレートリーダー（Tecan Trading, Mannedorf, Switzerland）により波長５９０ｎｍで測定された。
【００３１】
例
ヒト血小板溶解物の生成：
血小板ユニットは、それらの使用期限後（採取後５日）、the Institute for Transfusion Medicine, RWTH Aachen University Medical Schoolによって親切にも提供された。血小板ユニットは、トリマアクセルコレクションシステム（CaridianBCT, Garching, Germany）を使用してアフェレーシスによって生成された。それは、酸性クエン酸ブドウ糖（ＡＣＤ）（１：１１  ｖ／ｖ）が補足された２００ｍＬの血漿中に２．０−４．２×１０１１の血小板を含む。４５ｍＬの等分した部分は、−８０℃で２回凍結されて、３７℃で再融解されて、その後、２，６００×ｇで３０分間、遠心分離された。上澄みは、０．２μｍ  ＧＤ／Ｘ  ＰＶＤＦフィルター（Whatman, Dassel, Germany）を通して濾過され、使用するまで−８０℃で保存された。この研究の実験は、４つのドナーの溶解物から各々成る３つのＨＰＬ−プールで実施されたが、個々のドナー由来のＨＰＬｓを使用しても、同様の結果が観察された。ＨＰＬｓは、血液型Ａから主に成ったが、組織的分析は、血液型のいかなる影響も示さなかった。
【００３２】
培養培地及びＨＰＬ−ゲル：
培養培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン（Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA）及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（pen/strep; Lonza, Basel, Switzerland）及びＨＰＬ（別段の指示がない限り１０％）を含むダルベッコ変法イーグル培地−低グルコース（DMEM-LG; PAA, Pasching, Austria）から成った。細胞は、組織培養プラスチック（TCP; Greiner, Kremsmunster, Austria）で培養された。ゲル調製では、ヘパリンなしの細胞培養培地を含有するＨＰＬが、細胞培養プレートに満たされた。培地に含まれるカルシウムに起因して、凝固カスケードが始まり、そして、ＨＰＬ−培地が３７℃で１時間以内でゲル化した。すなわち、純粋な又は希釈された血小板溶解物が、例えばトロンビン及び／又はグルコン酸カルシウムなどのいかなる凝固誘発剤も添加する必要なしに、約３７℃で自発的にゲル化する。得られるＨＰＬ−ゲルは、同じ量のＭＮＣが播種された細胞培養基質として使用された。比較として、８０％コラーゲンＧ（１２ｍＭ  ＨＣｌ中の３ｍｇ／ｍＬコラーゲンタイプＩ／ＩＩＩ；Biochrome, Berlin, Germany）から成るゲルが、上述の通りに使用された。細胞は、６個のウェルプレート又はＴ７５組織培養フラスコ（Nunc Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Germany）中で３７℃で培養された。
【００３３】
ＨＰＬゲルの弾性測定：
弾性測定では、ＨＰＬ−ゲルが、薄いカバースライドのトップ上の型としてプラスチックシリンダー（１４ｍｍの直径及び２ｍｍの高さ）を使用して５％、１０％及び２０％の濃度で、形成された。上記のようにゲル化後、型シリンダーが除去され、そして、ＨＰＬ−ゲルは公知質量のカバースライドをかぶせた。ゲル厚さが、長距離４０×Achroplan (NA 0.6, PH 2)対物レンズを備えている共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM 510 Meta, Zeiss, Germany）を使用して決定された。公知重量の追加のカバースライドの配置及びその後の厚さ測定が、各々のＨＰＬ−ゲルシリンダーで少なくとも２回繰り返された。ゲル厚さ（ｈ）、カバースライドの合計質量（ｍ）、ローディングに起因する厚さ低減（Ｄｈ）、及びゲル断面（Ａ）の測定量から、我々は、Ｅ＝（ｍ＊ｇ）／Ａ＊（ｈ／□ｌ）に従うゲルの弾性係数を計算した（ｇは、重力に起因する加速度を示す）。
【００３４】
骨髄からのヒト間葉系間質細胞の単離：
ＭＳＣが、プラスチック接着によって、単核細胞（ＭＮＣ）から単離された。要するに、大腿骨頭置換術を経験している患者の大腿骨頭からの骨片が、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）でフラッシュされた。その後、ＭＮＣは、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離（Ｂｉｏｃｏｌｌ分離溶液、密度１．０７７ｇ／ｌ、Biochrom AG, Berlin, Germany）によって単離されて、そして、ＰＢＳで２回洗浄された。少なくとも５×１０５のＭＮＣが、その後、６−ウェルプレート中のＴＣＰ、ＨＰＬ−ゲル又はコラーゲンゲル上で培養培地中に再懸濁された。細胞は、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃で培養された。最初の培地交換は、非付着細胞を除去するために４８時間後に実施された。その後、半分の培地変更が１週間につき２回実施されて、そして、ＭＳＣが下記のように更に継代された。
【００３５】
ヒト真皮線維芽細胞の単離：
線維芽細胞が、美容整形を経験している患者の皮膚サンプルから単離された。初期に、細胞は、グルタミン（ＰＡＡ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＡＡ）及び１０％のＦＣＳ（Biochrom, Berlin, Germany）が補足されたＤＭＥＭ−ＬＧ中で増殖された。３〜５の継代での細胞は、その後、上記のようにＨＰＬ−培養条件に移された。
【００３６】
走査型電子顕微鏡：
ヒトＭＳＣ／ＨＰＬ−ゲルマトリックスが、室温で少なくとも１時間、３％グルタルアルデヒド中で固定されて、ＰＢＳですすがれて、そして、室温で１０分間、３０％、５０％、７０％、９０％、及び１００％エタノール中で連続的に培養することによって脱水された。ＨＰＬ−ゲルは、その後、液体ＣＯ２中で臨界点乾燥されて、そして、イオンスパッタコーター（ＬＥＩＣＡ  ＥＭ  ＳＣＤ  ５００）を使用して３０ｎｍの金層のスパッタコーティングが施された。サンプルは、電子顕微鏡設備、RWTH Aachen University (ESEM XL 30 FEG, FEI, Philips, Eindhoven, Netherlands)で環境走査型電子顕微鏡を使用して分析された。
【００３７】
組織切片−ＨＥ染色：
組織学的分析では、表面に培養細胞を含むＨＰＬ−ゲルが、３．７％ホルムアルデヒド中で２４時間、固定された。構成物は、パラフィン包埋されて、垂直平面上に環境適応されて、回転ミクロトームで２μｍ厚さにカットされて（Leica, Wetzlar, Germany）、そして、ルーチンの組織学的プロトコルに従ってヘマトキシリン及びエオシンで染色された。
【００３８】
増殖評価及び生命力分析：
細胞増殖は、メチルチアゾリルテトラゾリウム（ＭＴＴ）評価を介して評価された。手短に言えば、３−６の継代のＭＳＣが、１％、５％、１０％又は２０％ＨＰＬが補足された培養培地中でＨＰＬ−ゲル上に９６−ウェルプレート（３，０００細胞／ｃｍ２）中に播種された。７日後、細胞は、ＰＢＳで洗浄されて、そして、３７℃で３．５時間、１ｍＭ  ＭＴＴ（Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA）で培養された。過剰の溶液が廃棄されて、そして、ホルマザン結晶が、イソプロパノール中の４ｍＭ  ＨＣｌ中で分析された（共に、Roth, Karlsruhe, Germanyから）。Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００プレートリーダー（Tecan Trading, Switzerland）を使用して、５９０ｎｍで吸光度が測定された。各々の測定は、４つの技術的レプリカを含んだ。代替として、上述の通りにカルボキシフルオレセインジアセテートＮ−スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）染色によって、増殖が推定された。更に、それぞれ、ＴＣＰ又はＨＰＬ−ゲル上での７日間の培養後、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジン−２−フェニルインドール；Molecular Probes）で、又は、５μｇ／ｍＬのフルオレセインジアセテート（Sigma）及び０．５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（BD Pharmingen）で、核染色又はライヴ・デッド染色が実施されて、そして、Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＬ  ＨＣ蛍光顕微鏡で分析された。
【００３９】
線維芽細胞様群体−形成ユニット（ＣＦＵ−ｆ）評価：
ＣＦＵ−ｆ評価が、ＴＣＰとＨＰＬ−ゲルの両方上で並行して９６−ウェルプレート（ウェル当り３３０，０００；１００，０００；３３，０００；１０，０００；３，０００；及び１，０００細胞；各々の実験での希釈工程当り少なくとも２４ウェル）中で制限希釈シリーズでプレーティングＭＮＣによって実施された。培地は、最初は４８時間後に、その後は１週間につき２回、交換された。培養での１４日後、細胞は、ＰＢＳで２回洗浄されて、そして、ＭＴＴでラベルされた。細胞成長を持つ全てのウェルはポジティブなスコアであって、そして、ＣＦＵ−ｆフリークエンシーが、ポアソン統計（L-calc; Stem Cell Technologies; Vancouver, Canada）によって、決定された。
【００４０】
ＭＳＣの継代及び長期間の培養：
ＴＣＰ上のＭＳＣが、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液０．２５％（Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA）を使用して８０％の密集度レベルに到達後に、連続的に継代された。ＨＰＬ−ゲル上の細胞が、ピペッティングによってゲルと一緒に採取された。それによって、ゲル−ＭＳＣ混合物は、培養培地で希釈されて、そして、その後、新鮮なＨＰＬ−ゲルコーティングを施したウェルプレート上にプレートされた。ＭＳＣ細胞数を決定するために、ＭＳＣ／ＨＰＬ−ゲル混合物のフラクションが、プラスチック表面への付着を促進するために２４時間ＴＣＰ上に播種された。プラスチック付着細胞は、その後、トリプシン処理されて、そして、ノイバウエル計算板（Brand, Wertheim, Germany）を使用して、細胞数が最終的に決定された。業界で公知のように、累積集団倍加（ｃＰＤ）及び継代（ＰＤＰ）当りの細胞集団倍加が計算された。代替として、ＭＳＣ／ＨＰＬゲルが、３７℃で１８時間、２０μｇプラスミン（原液２．７６ｍｇ／ｍＬ；Enzyme Research Laboratories, Indiana, USA）で培養された。
【００４１】
上記のようにプラスミンで又は５分間トリプシン／ＥＤＴＡで追加の培養の有り又は無しでピペッティングによって、ＨＰＬ−ゲル上のＭＳＣｓが採取された。全ての細胞は、ＴＣＰ上に再播種されて、そして、１日後、ＭＴＴ評価を使用して付着細胞及び非付着細胞の数が推定された。
【００４２】
免疫表現型分析：
ＭＳＣの特徴付けでは、我々は、表面マーカーのパネルを使用した。ＭＳＣは、単離されて、そして、ＴＣＰ上で又はＨＰＬ−ゲル上で３つの継代で培養された。フローサイトメトリー分析よりも前にＨＰＬ−ゲルを除去するために、我々は、ＴＣＰ上に１つの追加の継代用に細胞を播種したか、又は、我々は、ピペッティングによってＨＰＬ−ゲルを採取してそして培養培地中で細胞を１回洗浄した。各々の細胞調製は、以下のモノクローナル抗体と並行して染色された：マウス抗ヒトＣＤ１４−ＡＰＣ（クローンＭ５Ｅ２）、ＣＤ２９−ＰＥ（クローンＭＡＲ４）、ＣＤ３１−ＰＥ（クローンＷＭ５９）、ＣＤ３４−ＡＰＣ（クローン８Ｇ１２）、ＣＤ４５−ＡＰＣ（クローンＨＩ３０）、ＣＤ７３−ＰＥ（クローンＡＤ２）、ＣＤ９０−ＡＰＣ（クローン５Ｅ１０）（全ては、BD Bioscience, Heidelberg, Germany）及びＣＤ１０５−ＦＩＴＣ（クローンＭＡＲ−２２６；ImmunoTools, Friesoythe, Germany）。分析は、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩサイトメーター（BD Bioscience, Heidelberg, Germany）を使用して実施されて、そして、収集データは、ＷｉｎＭＤＩ  ２．９ソフトウエア（Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry）で分析された。異なる測定の統計的な比較では、我々は、蛍光強度を、対応する自己蛍光測定に標準化した。
【００４３】
インビトロで分化：
新鮮に単離されたＭＳＣは、ＨＰＬ−ゲル上に又はＴＣＰ上に直接播種されて、そして、インビトロでの分化より前に３継代で増殖された。その後、業界で公知のように、骨形成、脂質生成及び軟骨形成系譜に向かう分化が誘発された。ＨＰＬ−ゲル−ＭＳＣのこの分化は、ＨＰＬ−ゲル上で又はＴＣＰへ移した後、実施された。軟骨形成分化は、４００×ｇでの７分間の遠心分離後に３Ｄペレット培養中で実施された。３週間後、ルーチンの組織学的プロトコルに従って、アルシアンブルー及びヌクレアファーストレッド（軟骨形成分化サンプルのセクション用）で、又は、緑蛍光染料ＢＯＤＩＰＹ（４，４−ジフルオロ−１，２，５，７，８−ペンタメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン；Molecular Probes, Eugene, USA；脂質生成分化）で、アリザリンレッド染色（骨形成分化）によって、分化が分析されて、そして、Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＬ  ＨＣ蛍光顕微鏡（Leica, Wetzlar, Germany）で分析された。更に、脂質生成分化は、分化細胞（実験当り少なくとも３００細胞）に対して非分化の直接カウント及びＤＡＰＩでの全ての細胞の対比染色によって、ＴＣＰ及びＨＰＬ−ゲル上で定量化された。
【００４４】
統計：
結果は、独立の実験の平均±標準偏差として表される。相違の確率を推定するために、我々は、対応のある両側スチューデントのｔ−検定を採用した。
【００４５】
凍結乾燥：
ゲルを凍結乾燥フラスコ中に置いて、そして、フラスコを、機械冷凍、ドライアイス及びメタノール、又は液体窒素によって冷却されているシェル冷凍庫中で回転させることによって、凍結がなされる。より大きなスケールでは、凍結乾燥機を使用して、凍結は達成できる。この工程では、材料を、その三重点未満に冷却することが重要であり、そこでの最低温度で材料の固相及び液相が共存できる。これは、以下の工程では融解というよりむしろ昇華が起こるであろうということを確保する。より大きな結晶は、凍結乾燥するのにより容易である。より大きな結晶を製造するために、生成物は、ゆっくりと凍結すべきであるか、又は、温度の上げ下げのサイクルをとることができる（アニーリング）。凍結温度は、−５０℃〜−８０℃の間である。
【００４６】
一次乾燥フェーズの間に、圧力は（数ミリバールの範囲に）低くなり、そして、氷を昇華させるために十分な熱が凍結ゲルに供給される。この初期の乾燥フェーズでは、材料中の水の約９５％が昇華される。このフェーズは、ゆっくりであることができる。なぜなら、もしも過剰の熱が添加されると、材料の構造が変わり得るからである。このフェーズでは、圧力は、部分真空の適用を通して制御される。真空は、昇華を促進し、計画的な乾燥プロセスとしてそれを有用にする。更に、コールドコンデンサーチャンバ及び／又はコンデンサープレートは、水蒸気がその上に再凝固するための表面を提供する。コンデンサー温度は、典型的に、−５０℃（−６０°Ｆ）未満である。
【００４７】
二次乾燥フェーズは、凍結されない水分子を除去することをねらいとする。なぜなら、一次乾燥フェーズで氷はすでに除去されたからである。このフェーズでは、温度は、一次乾燥フェーズにおけるよりも高く上昇され、そして、水分子と凍結材料との間に形成されたいかなる物理化学的相互作用をも破壊する０℃よりも高い温度でさえもあり得る。圧力は、（例えば、ほんのわずかのパスカル又はマイクロバールの範囲に）脱着を促すためにこのステージで低くすることもできる。
【００４８】
凍結乾燥プロセスが完了後、材料がシールされる前に、窒素などの不活性ガスで真空は破られる。操作の終わりでは、生成物中の最終の残りの水の含有量は、約１％〜４％と極端に低い。
【００４９】
結果：
凍結乾燥されたｈＰＬ−ゲル上で成長した細胞は、同様の細胞増殖及び増殖率を示し、そして、凍結乾燥なしで新鮮に調製されたｈＰＬ−ゲルと比較して、播種されたＭＳＣｓの免疫表現型プロファイル及び分化能に対する凍結乾燥の効果は観察できなかった（図１）。凍結乾燥ｈＰＬ−ゲルを使用すると、ＭＳＣｓの長期間の培養は、細胞成長特性のいかなる相違もなしに同じ結果を示した（図２）。細胞増殖測定は、異なる保存条件下で安定したゲルを示した。特に、室温（ＲＴ）、４℃又は３７℃で１週間保存された凍結乾燥ｈＰＬ−ゲルは、依然として安定しており、そして、細胞増殖は、そのようなゲルを使用すると増加するようにさえみえる（図３）。全体では、この方法は、ゲル材料の輸送を促進して、そして、細胞培養特性に対するいかなる影響もなしに血小板溶解物ゲルのより高い保存性を確保する。
【００５０】
例えば、本発明に従う方法は、以下の工程を含む。最初に、ヒト血小板ユニットが、凍結融解法によって溶解される。遠心分離及び濾過後に、血小板溶解物が回収される。血小板溶解物は、その後、凍結乾燥によって乾燥されて、凍結乾燥されたヒト血小板溶解物ゲル（Ｌｙｏ−ｈＰＬ−ゲル）を製造する。凍結乾燥されたゲルは、使用場所での水の添加によって容易に再構成されることができて、いかなる制限なしに生きた細胞を培養するために使用できる完全に機能性の血小板溶解物ゲル（ｈＰＬ−ゲル）を提供できる。ヘパリンなどのいかなるゲル化抑制物質も含まない血小板溶解物のゲル化は、約３７℃で自発的に起こり、結果として血小板溶解物ゲルを得る。その結果、血小板溶解物は、ヒト血小板溶解物ゲル（ｈＰＬ−ゲル）を得るために、約３７℃でゲル化されることを可能にする。ｈＰＬ−ゲルを変性するために、Ｌｙｏ−ｈＰＬ−ゲルが水で溶解された後に、適切な細胞培養培地及び／又は適切な補足を、ゲル材料に添加できる。
【００５１】
非特許文献
2019517822.tif 000003
【００５２】
【図１】
2019517822.tif 000004
【図２】
2019517822.tif 000005
【図３】
2019517822.tif 000006
【国際調査報告】
2019517822.tif 000007
2019517822.tif 000008
2019517822.tif 000009