(57)【要約】  現時点で入手可能なものと比較して品質が向上している生物学的調製物を開示する。種々の胎盤／絨毛を有する絨毛膜の組織に由来する組成物を使用して、細胞の生理機能および病理学的過程を調節する組成物および方法が開示される。
2019508478.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎盤組織および１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤を含む胎盤由来組成物。
【請求項２】
前記１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤が、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、ウシ肺アプロチニン、Ｎ−（ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニル）−Ｌ−ロイシン４−グアニジノブチルアミド、ロイペプチン、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス−（２−アミノエチル（エーテル）ＮＮＮ’Ｎ’−四酢酸、塩化アンモニウム、ボセプレビル、ダノプレビル、ナルラプレビル、テラプレビル、またはバニプレビルを含む、請求項１に記載の胎盤由来組成物。
【請求項３】
前記胎盤組織が絨毛を有する絨毛膜である、請求項１または２に記載の胎盤由来組成物。
【請求項４】
前記胎盤組織が絨毛膜である、請求項１から３のいずれか一項に記載の胎盤由来組成物。
【請求項５】
調製物が、プロテアーゼ阻害剤の非存在下で調製される調製物と比較して高濃度のインターロイキンを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の胎盤由来組成物。
【請求項６】
胎盤組織および１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤を含む胎盤調製物であって、前記胎盤組織の処理が、
（１）均質化、および
（２）細胞溶解
を含む、胎盤調製物。
【請求項７】
前記胎盤組織の処理が、
（１）溶解した細胞の分離、
（２）凍結乾燥および／または凍結
をさらに含む、請求項６に記載の胎盤調製物。
【請求項８】
前記胎盤組織の処理が、濾過をさらに含む、請求項６または７に記載の胎盤調製物。
【請求項９】
前記１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤が、均質化の前に加えられる、請求項６から８のいずれか一項に記載の胎盤調製物。
【請求項１０】
前記１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤が、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、ウシ肺アプロチニン、Ｎ−（ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニル）−Ｌ−ロイシン４−グアニジノブチルアミド、ロイペプチン、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス−（２−アミノエチル（エーテル）ＮＮＮ’Ｎ’−四酢酸、塩化アンモニウム、ボセプレビル、ダノプレビル、ナルラプレビル、テラプレビル、またはバニプレビルを含む、請求項６から９のいずれか一項に記載の胎盤調製物。
【請求項１１】
前記胎盤組織が絨毛を有する絨毛膜である、請求項６から１０のいずれか一項に記載の胎盤調製物。
【請求項１２】
前記胎盤組織が絨毛膜である、請求項６から１１のいずれか一項に記載の胎盤調製物。
【請求項１３】
希釈剤、賦形剤、または担体をさらに含む、請求項６から１２のいずれか一項に記載の胎盤調製物。
【請求項１４】
前記調製物が、プロテアーゼ阻害剤の非存在下で調製される調製物と比較して高濃度のインターロイキンを含む、請求項６から１３のいずれか一項に記載の胎盤調製物。
【請求項１５】
前記プロテアーゼ阻害剤が、前記胎盤調製物から除去されない、請求項６から１４のいずれか一項に記載の胎盤調製物。
【請求項１６】
胎盤生成物を作製する方法であって、
（１）胎盤組織にプロテアーゼ阻害剤を加えること、
（２）前記胎盤組織を均質化すること、および
（３）前記胎盤組織を溶解すること
を含む、方法。
【請求項１７】
（１）溶解した細胞を分離すること、および
（２）前記生成物を凍結乾燥および／または凍結すること
をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記生成物を濾過することをさらに含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤が、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、ウシ肺アプロチニン、Ｎ−（ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニル）−Ｌ−ロイシン４−グアニジノブチルアミド、ロイペプチン、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス−（２−アミノエチル（エーテル）ＮＮＮ’Ｎ’−四酢酸、塩化アンモニウム、ボセプレビル、ダノプレビル、ナルラプレビル、テラプレビル、またはバニプレビルを含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
関節炎、創傷治癒、瘢痕処置、組織の増殖、組織の治癒、組織マトリックスの再生／修復、移植、炎症、ならびにＴＧＦ−βおよび他の胎盤タンパク質のシグナル伝達の調節に関連する状態を含む群から選択される疾病を有する個人を処置する方法であって、請求項１から１５のいずれか一項に記載の胎盤調製物を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年３月１４日に出願された米国仮出願第62/307,629号の優先権を主張する。
生物学的組成物、組成物を作製する方法、および組成物を使用する方法が、本明細書に記載される。実施形態において、組成物は胎盤組織に由来する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト胎盤は、胎児を母体の子宮壁に繋ぎ、実質的に、受胎から出産まで胎児の保護および発育を担う。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、組成物ならびに胎盤組織の生成物／組成物の調製および使用に関連する方法に関する。胎盤組織は、胎盤ディスクおよび羊膜嚢を含む。羊膜嚢は、２つの主な層である絨毛膜および羊膜を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ある実施形態において、本明細書に記載されている組成物はプロテアーゼ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、精製工程の間にプロテアーゼ阻害剤を胎盤組織に加えてもよく、また除去しなくてもよい。
【０００５】
特定の実施形態では、胎盤組織を処理し、望ましいタンパク質およびケモカインを胎盤組織から単離する。本発明の一実施形態において、方法は、プロテアーゼ阻害剤を胎盤生成物に加えること、その後、粗均質化（gross homogenization）および細胞溶解のうち１つまたは複数を実行することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、固形物の細胞構成成分からの液体の分離、濾過、凍結乾燥、および／または冷凍をさらに含む。
【０００６】
特定の実施形態では、本明細書に記載されている組成物を、関節炎、創傷治癒、瘢痕処置、組織の増殖および治癒、組織マトリックスの再生および修復、移植、炎症、ＴＧＦ−βおよび／または他のタンパク質のシグナル伝達の調節に関連する状態の処置に使用してもよい。
【０００７】
プロテアーゼ阻害剤を使用していない従来の組成物と比較してタンパク質濃度が上昇していることから、本発明の組成物および方法は望ましいと思われる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】プロテアーゼ阻害剤の存在下および非存在下の両方における胎盤組織由来のインターロイキン２およびマクロファージ炎症性タンパク質３のタンパク質濃度を示す図である。
【０００９】
【図２】プロテアーゼ阻害剤の存在下および非存在下の両方における胎盤組織由来の顆粒球走化性タンパク質２、単球走化性タンパク質１、およびマクロファージ炎症性タンパク質１のタンパク質濃度を示す図である。
【００１０】
【図３】プロテアーゼ阻害剤の存在下および非存在下の両方における胎盤組織由来のインターロイキン８のタンパク質濃度を示す図である。
【００１１】
【図４】プロテアーゼ阻害剤の存在下および非存在下の両方における胎盤組織由来のマクロファージ阻害因子のタンパク質濃度を示す図である。
【００１２】
【図５】（Ａ）血清を含まない陰性対照の存在下、（Ｂ）プロテアーゼ阻害剤の存在下で精製された血清の存在下、および（Ｃ）プロテアーゼ阻害剤の非存在下で精製された血清の存在下における、ヒト胎盤ホモジネート（ＨＰＨ）を使用した創傷治癒アッセイの結果を示す図である。本明細書で用いる場合、精製されるおよび単離されるという用語は互換可能である。
【００１３】
【図６】プロテアーゼ阻害剤、妊娠満期の羊水、および１６〜２０週の羊水を含む胎盤組成物中のタンパク質濃度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、組成物および胎盤組織の生成物／組成物を調製することに関連する方法に関する。ヒト胎盤は、胎児を母体の子宮壁に繋ぎ、実質的に、受胎から出産まで胎児の保護および発育を担う。妊娠の間、胎盤は、栄養素および酸素を供給すること、いくらかの免疫機能を果たすこと、ならびに細胞を遊走させるために働く小さいタンパク質である増殖因子およびサイトカインを放出することによって、胎児の発育を助ける。
【００１５】
妊娠の間、胎盤は、臍帯および羊水を介して、栄養素、増殖因子、およびサイトカインを胎児に供給する。胎児および胎盤はいずれも、母体とは全く異なる抗原を発現するが、妊娠の間、母体の免疫系による拒絶を回避する。胎盤組織の残留細胞、輸送特性、および制限された免疫応答は、胎盤組織を医学的用途に用いることを望ましいものおよび／または有利なものにする助けとなる。
【００１６】
胎盤組織は、通常、選択的帝王切開術後に採取してもよい。胎盤組織は、正常な経腟分娩後に採取してもよい。用途によっては、組織を未処理で使用することがある。しかし、胎盤組織の性能を向上することは、改良された医学的用途にとって有利であろう。例えば、胎盤組織のタンパク質、増殖因子、およびケモカインを単離することは、種々の医学的用途にとって有利でありかつ／または望ましい。
【００１７】
本発明の特定の実施形態を説明する目的のため、本明細書ではヒト胎盤組織に言及する。しかし、本発明の実施形態は、自然発生するヒト胎盤組織を含むことに限定されない。本発明の実施形態は、以下に限定されないが、天然もしくは合成のヒト胎盤組織、天然もしくは合成の哺乳動物胎盤組織、他の動物、例として、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、もしくはラクダ由来の天然もしくは合成の胎盤組織、ならびに／または胎盤組織と同等の性質を有する天然および／もしくは合成の組成物を含んでもよい。
【００１８】
胎盤組織は、胎盤ディスク、羊膜嚢、ならびに臍帯、その血管、および臍帯血管を保護するワルトンゼリーを含む。羊膜嚢は、外側の絨毛膜および内側の羊膜を含む。絨毛膜は、網状層、基底層、および栄養膜細胞層を含む。栄養膜細胞層は、母体の脱落膜に付着していることがある。臍帯は、胎盤と胎児を繋ぎ、酸素を豊富に含む血液および栄養素を胎児に輸送する。胎盤ディスクの大部分は、絨毛膜の絨毛樹の延長部である絨毛膜絨毛を含む。この構造を介して、胎児に栄養が供給され、胎児および母体のサイトカインおよび増殖因子の交換が行われる。
【００１９】
胎盤の絨毛は、（１）絨毛樹の表面全体を覆い、かつ絨毛間腔内で母体の血液に浸っている合胞体栄養細胞／栄養膜細胞層；（２）栄養膜細胞と胎児の血管の間の絨毛核の間質内にある間葉細胞、間葉由来のマクロファージ（ホーフバウエル細胞）、および線維芽細胞；ならびに（３）血管平滑筋細胞、血管周囲細胞（周皮細胞）、および血管内皮細胞を含む胎児の血管細胞といった、異なる細胞種をそれぞれに構成要素として有する３つの層から構成される。ホーフバウエル細胞は、胎盤において血管形成を開始するＶＥＧＦおよび他の血管新生促進因子を合成する。
【００２０】
胎児および胎盤はいずれも、母体とは全く異なる抗原を発現するが、妊娠の間、母体の免疫系による拒絶を回避する。胎盤組織の免疫応答が制限されていることは、妊娠の間、胎児の拒絶を回避することおいて、胎盤の一助となっていると信じられている。
【００２１】
胎盤組織の輸送性質、残留細胞、および制限された免疫応答は、胎盤組織を医学的用途に用いることを望ましいものにする助けとなる。胎盤組織は、選択的帝王切開術後に採取してもよい。胎盤組織はまた、正常な経腟分娩後に採取してもよい。胎盤組織は、ＦＤＡ登録組織バンクを介して入手してもよい。用途によっては、組織を未処理で使用することがある。しかし、胎盤組織の性能を向上することは、改良された医学的用途にとって有利であろう。
【００２２】
本明細書に記載されている胎盤の生成物／組成物は、先行技術の胎盤調製物と比較して有益な性質を有すると思われる。例えば、本発明の胎盤の生成物／組成物は、精製工程の間に胎盤組織に加えられ、除去されないプロテアーゼ阻害剤を含む。本発明の方法は、関節炎、創傷治癒、瘢痕処置、組織の増殖および治癒、移植、炎症、ならびにＴＧＦ−βおよび他のタンパク質のシグナル伝達の調節に関連する状態の処置を含む。
【００２３】
これまで、種々の調製物が胎盤から精製され、炎症の処置、瘢痕処置、ＴＧＦ−βシグナル伝達の調節、アポトーシスおよび関連状態の処置など、様々な目的のために使用されてきた。しかし、外来の添加物を調製物に加える場合（種々の羊膜または胎盤の調製物に加える添加物など）、政府規制当局が、より厳しい試験条件およびより大規模な臨床試験を要求することがあるため、当業者は、追加の費用、追加の規制要件、さらに他の要因のため、精製した調製物がこれらの添加物を含むことに消極的であった。しかし、これらの添加物を添加することおよび／またはこれらの添加物の添加を検討することに失敗した他者によって作製された調製物は、残念なことに、これらの調製物の本来の潜在的価値／使用を解き明かすことにも失敗している。これらの欠点を念頭において、本発明は開発された。
【００２４】
胎盤組成物
実施形態において、本発明は、胎盤組織の生成物および組成物に関する。本明細書で用いる場合、胎盤組織は、全体または部分的な、繁生絨毛膜組織、基底脱落膜組織、および／または相互に連結する組織を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物は、先行技術の従来の胎盤調製物と比較して有益な性質を有する。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている胎盤の生成物／組成物は、精製工程の間に胎盤組織に加えられるプロテアーゼ阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ阻害剤は、胎盤生成物中に残存してもよい。
【００２５】
ある実施形態では、関節炎、創傷治癒、瘢痕処置、組織の増殖および治癒、移植、炎症、ならびにＴＧＦ−βおよび他のタンパク質のシグナル伝達の調節に関連する状態を含む、種々の状態に罹患している個人を処置するために胎盤生成物を使用する前に、プロテアーゼ阻害剤を除去してもよい。例えば、プロテアーゼ阻害剤に特異的に結合する抗体を有するカラムを用いることによって、上記個人の処置前に、プロテアーゼ阻害剤を除去してもよい。本明細書で用いる場合、疾病、疾患、および状態という用語は、互換的に使用され得る。
【００２６】
ある実施形態において、本発明は、精製した組成物および胎盤／絨毛を有する絨毛膜の調製物、すなわち、胎盤／絨毛を有する絨毛膜の物質から調製され得る組成物に関する。いくつかの実施形態において、精製した組成物の少なくとも１種の成分は、胎盤／絨毛を有する絨毛膜の調製物から得てもよい。いくつかの実施形態において、本発明は、精製した組成物の少なくとも１種の成分を、ヒト胎盤および絨毛膜から得てもよい精製した組成物にも関する。ある実施形態において、本発明は、本明細書に記載されている精製した組成物および調製物のいずれかを調製する方法に関する。本発明は、前述の精製した組成物および調製物のいずれかを貯蔵および保存する方法にも関する。さらに、本発明は、保存方法、細胞培養方法、組織培養方法、治療方法、予防方法、および美容方法を含む、前述の精製した組成物および調製物を使用する方法に関する。
【００２７】
ある実施形態において、ある対象における炎症を軽減または予防する方法は、炎症の抑制または予防を必要とする対象に、有効量の炎症抑制組成物であって、胎盤から抽出したヒト羊膜、ヒト羊膜膠質、ヒト羊膜間質、胎盤／絨毛を有する絨毛膜、またはその組合せから選択する、少なくとも１種のヒト羊膜物質を含む組成物を提供することを含む。いくつかの実施形態では、物質を、ヒト羊膜物質から抽出してもよい。いくつかの実施形態においては、組成物は、例えば、架橋した高分子ヒアルロン酸（ＨＡ）、腫瘍壊死因子−刺激遺伝子６（ＴＳＧ−６）、ペントラキシン（ＰＴＸ−３）、およびトロンボスポンジン（ＴＳＰ−１）を含んでもよい。
【００２８】
いくつかの実施形態において、抽出方法は、ヒト胎盤を得ること、胎盤からヒト羊膜物質を単離すること、およびヒト羊膜物質を適当な緩衝剤中に均質化することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、凍結したまたはあらかじめ凍結したヒト胎盤を使用してもよい。胎盤が凍結されている場合、工程は、解凍した胎盤からヒト羊膜物質を単離する前に、胎盤を解凍することを含んでもよい。任意選択で、方法は、ホモジネートを粉末になるまで凍結乾燥することをさらに含んでもよい。任意選択で、方法は、非固形剤形または徐放性固形剤形のために、ホモジネートまたは粉末を薬学的に許容される担体と混合することを含んでもよい。ある実施形態において、調製工程は、ホモジネートを凍結乾燥するステップを、ホモジネートを遠心分離し、遠心分離したホモジネートからその上清を単離し、また任意選択で、上清を粉末になるまで凍結乾燥するステップに置き換えてもよい。ある実施形態では、代替方法としてまたは追加として、遠心分離したホモジネートを凍結してもよい。いくつかの実施形態では、組成物を、非固形剤形または徐放性固形剤形として形成してもよい。
【００２９】
ある実施形態において、本発明は、胎盤調製物に対する、本明細書に記載されている精製ステップのいずれかを実施する前に、プロテアーゼ阻害剤を胎盤調製物に加えることに関する。ある実施形態において、プロテアーゼ阻害剤は、精製プロトコール全体を通して、胎盤調製物中に残存してもよい。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ阻害剤は、精製した生成物が、明細書に開示された方法の１つのために使用される際に精製された胎盤調製物中に残存してもよい。ある実施形態において、精製プロトコールを実施する際に、プロテアーゼ阻害剤を、生細胞および／または生組織に加えてもよい。
【００３０】
一実施形態において、本発明は、胎盤由来の増殖因子および／またはサイトカインのうち１種または複数種を含む細胞不含組成物であって、少なくとも１種のプロテアーゼ阻害剤を含む、組成物に関する。
【００３１】
ある実施形態において、プロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、またはトリプシン阻害剤を阻害するより多くの阻害剤のうちの１種であってもよい。いくつかの実施形態において、１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、およびトリプシン阻害剤のすべてを阻害してもよい。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼを阻害してもよい。
【００３２】
一実施形態において、本発明で使用されるプロテアーゼ阻害剤は、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、ウシ肺アプロチニン、Ｎ−（ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニル）−Ｌ−ロイシン４−グアニジノブチルアミド、およびロイペプチンのうち１種または複数種を含む。ある実施形態において、使用され得る他のプロテアーゼ阻害剤は、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス−（２−アミノエチル（エーテル）ＮＮＮ’Ｎ’−四酢酸、塩化アンモニウム、ボセプレビル、ダノプレビル、ナルラプレビル、テラプレビル、またはバニプレビルを含む。
【００３３】
ある実施形態において、胎盤組成物は、絨毛膜、胎盤、羊膜シート、羊膜、臍帯、中胚葉、卵黄嚢、胚体外体腔、ホーフバウエル細胞、血管内皮細胞、および／または内胚葉のうち任意の１種または複数種からの組織および／または細胞由来であってもよい。一実施形態において、精製した胎盤組成物は、任意の精製ステップの前にプロテアーゼ阻害剤を加えられた絨毛膜からの細胞および／または組織由来である。一実施形態において、加えられ得るプロテアーゼ阻害剤は、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、ウシ肺アプロチニン、Ｎ−（ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニル）−Ｌ−ロイシン４−グアニジノブチルアミド、およびロイペプチンを含む。精製工程において、絨毛膜を出発物質として使用する場合、より均一な精製生成物が得られる場合があることが認められている。
【００３４】
組成物を精製する方法
ある実施形態において、本発明は、胎盤の細胞外マトリックスおよび細胞内区画の両方からのタンパク質を保存し得る、細胞を含まない調製物に関する。一実施形態において、本発明は、栄養膜細胞に認められるタンパク質を保存し得る、細胞を含まない調製物に関する。ある実施形態において、本発明は、胎児の発育のための種々のサイトカインおよび増殖因子を合成し得る細胞性栄養膜細胞中のタンパク質を保存し得る、細胞を含まない調製物に関する。代替方法としておよび／または追加として、本発明は、細胞栄養芽層の生成物を貯蓄し得る偽細胞である合胞体栄養細胞中に認められるタンパク質を保存し得る、細胞を含まない調製物に関する。合胞体栄養細胞は、基礎をなしているフィーダー層の単核の絨毛細胞栄養芽層の細胞間融合によって、妊娠全体を通して形成および拡大し得る多核の層である。
【００３５】
一実施形態では、精製工程全体を通してプロテアーゼ阻害剤を加えること、およびそれを組成物の一部として保持することによって、プロテアーゼ阻害剤を使用していない調製物と比較して、著しく高濃度のタンパク質を含有する組成物の単離が可能となり得る。例えば、ある実施形態では、以下のタンパク質のうちの少なくとも１種が、プロテアーゼ阻害剤を使用していない精製方法と比較して、高レベルで認められ得る：顆粒球走化性タンパク質２（ＧＣＰ−２）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、マクロファージ阻止因子（ＭＩＦ）、マクロファージ炎症性タンパク質１（ＭＥＰ−１α）、およびマクロファージ炎症性タンパク質３（ＭＩＰ−３α）。いくつかの実施形態において、これらのタンパク質のいくつかは、高濃度で認められた。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤の非存在下で試験を実施した調製物／組成物と比較して、これらのタンパク質のすべては、高濃度で認められた。
【００３６】
いくつかの実施形態において、精製タンパク質の濃度は、ヒトの妊娠１６週目の絨毛膜に存在するサイトカインおよび増殖因子に匹敵することがある。ある実施形態において、単離した組成物は、プロテアーゼ阻害剤を使用していない従来の調製物／組成物と比較して、優れた性質を示すことがある。例えば、本発明の方法を使用した調製物／組成物における創傷治癒は、プロテアーゼ阻害剤を含まない単離した組成物よりも、予想外に優れていることがある。
【００３７】
いくつかの実施形態において、組成物を精製する方法は、多くの精製ステップを含んでもよい。いくつかの実施形態において、精製の方法は、均質化および細胞溶解を含んでもよい。いくつかの実施形態において、精製の方法は、さらに組織の単離を含んでもよい。いくつかの実施形態において、胎盤は、組織から過剰な血液を除去することによって、組織を単離するための前処理を行ってもよい。例えば、処理に備えて通常生理食塩液中に保管し得る胎盤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液を含む容器に入れ、過剰な血液を除去するために混合してもよい。いくつかの実施形態では、溶液中の組織を入れた容器を、超音波処理してもよく、振盪プラットフォームに置いてもよく、または撹拌してもよい。いくつかの実施形態では、胎盤片を、実験室用ブレンダーまたは同等の手段を使用して、粗く均質化してもよい。任意選択で、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）を含む１ＸＰＢＳを用いて、断片を均質化してもよい。いくつかの実施形態において、ＰＩは、１Ｘ最終濃度であってもよい。理論に束縛されるものではないが、プロテアーゼ阻害剤は、胎盤の細胞に存在する、タンパク質、具体的には、増殖因子、ケモカイン、およびサイトカインの分解を予防すると思われる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、均質化工程の間に、均質化した溶液を分離し、遊離した過剰な血液を除去してもよい。いくつかの実施形態では、分離を、濾過または遠心分離によって実施し、液体を捨ててもよく、残った固形物をさらに処理する。遠心分離の間に、固形物は圧縮され、容器の底に塊を形成すると思われる。いくつかの実施形態では、固形物を、１回または複数回洗浄し、均質化した固形物から過剰な血液をさらに除去してもよい。任意選択で、さらに処理する前に、洗浄した固形物を冷却してもよい。いくつかの実施形態では、洗浄した固形物を１０℃未満に冷却してもよい。
【００３９】
いくつかの実施形態において、細胞溶解は、以下に限定されないが、高圧均質化、凍結／解凍、化学物質、超音波処理、浸透圧、高剪断混合、またはその組合せを含む種々の方法によって実施してもよい。理論に束縛されるものではないが、細胞溶解によって、細胞からケモカイン、サイトカイン、および増殖因子が放出されるであろう。いくつかの実施形態では、溶解した細胞または細胞破片を、液体から分離してもよい。液体または上清は、ケモカイン、サイトカイン、および増殖因子を含むことがあり、いくつかの実施形態では、さらに処理するために残してもよい。
【００４０】
いくつかの実施形態において、精製の方法は、均質化の前に組織の切離をさらに含んでもよい。任意の切離によって、均質化工程の効率が上昇し得る。切離によって、組織供給のサイズに関係なく、均質化に使用される方法が増加することもある。一例として、組織を２インチ×２インチなどの小片に切り分けてもよい。
【００４１】
いくつかの実施形態において、精製方法は、例えば、濾過または遠心分離によって、固形物の細胞構成成分からの液体の分離をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、精製方法は、凍結乾燥および／もしくは凍結または他の精製プロトコールをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ヒト胎盤ホモジネート（ＨＰＨ）調製物は、滅菌バイアルに入れた凍結乾燥、後の使用のために液体形態で滅菌バイアルに入れること、噴霧乾燥、または当業者に公知の他の方法によって保存してもよい。いくつかの実施形態では、ＨＰＨを他の胎盤生成物に加えてもよい。
【００４２】
いくつかの実施形態において、精製ステップは、（１）組織の単離、（２）均質化、（３）細胞溶解、（４）固形物の細胞構成成分からの液体の分離、および（５）凍結乾燥および／もしくは凍結または他の精製プロトコールを含んでもよい。
【００４３】
いくつかの実施形態において、組織が単離された後、プロテアーゼ阻害剤を加えてもよい。いくつかの実施形態において、細胞溶解の間、プロテアーゼ阻害剤は存在してもよい。ある実施形態において、プロテアーゼ阻害剤は、本明細書に記載されている方法で組成物を使用し得る場合を含め、組成物の精製全体を通して存在してもよい。
【００４４】
医薬的使用のための組成物
ある実施形態において、本発明は、医薬組成物の生成に関する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容されるその塩、溶媒和物、および生成物を含有してもよく、本発明の成分／化合物のバイオアベイラビリティを増加させる、または存続期間を延長させるために必要な希釈剤、賦形剤、担体、または他の物質を含有してもよい。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本発明の成分／化合物および組成物によって処置される対象としては、以下に限定されないが、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、イヌ、ネコ、ならびにチンパンジー、ゴリラ、アカゲザル、およびヒトなどの霊長類が含まれる。ある実施形態において、対象は、癌処置を必要とするヒトであってもよい。
【００４６】
本発明の成分／化合物を含有する医薬組成物は、それ自体または代替方法として、リポソーム、ミセル、および／もしくはナノスフェアを使用することのいずれかによる注射に適した形態であってもよい。代替方法として、いくつかの実施形態において、医薬組成物は、局所的な投与を可能にする形態であることがある。
【００４７】
代替方法として、いくつかの実施形態において、注射を意図した組成物は、任意の公知の方法に従って調製してもよく、またこのような組成物は、溶媒、共溶媒、可溶化剤、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、増粘剤、キレート剤、抗酸化剤、還元剤、抗菌性保存剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、増量剤、保護剤、張度調整剤、および特殊な添加物からなる群から選択される１種または複数種の薬剤を含んでもよい。さらに、注射剤の製造に適した他の非毒性の薬学的に許容される賦形剤を使用してもよい。
【００４８】
いくつかの実施形態において、組成物は、活性な胎盤成分を、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物として含む水性懸濁液であってもよい。このような賦形剤は、懸濁化剤および／または分散剤／湿潤剤を含んでもよい。懸濁化剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム、およびアカシアガムを含んでもよい。分散剤または湿潤剤は、レシチンなどの天然に存在するリン脂質、またはアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、酸化エチレンと長鎖脂肪族アルコールの縮合物、例えば、ヘプタデカエチルエネオキシセタノール、脂肪酸とヘキシトール由来の部分エステルと酸化エチレンの縮合物、例えば、ポリエチレンソルビトールモノオレエート、もしくは脂肪酸とヘキシトール無水物由来の部分エステルと酸化エチレンの縮合物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの合成した縮合物であってもよい。いくつかの実施形態において、水性懸濁液は、１種または複数種の着色剤を含有してもよい。
【００４９】
いくつかの実施形態において、油性懸濁液は、植物油、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはヤシ油、または流動パラフィンなどの鉱油に有効成分を懸濁することによって製剤化してもよい。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、ミツロウ、固形パラフィン、またはセチルアルコールを含んでもよい。いくつかの実施形態では、口当たりの良い経口調製物を形成するため、甘味剤および香料を加えてもよい。いくつかの実施形態において、これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加によって保存してもよい。
【００５０】
いくつかの実施形態において、水の添加によって水性懸濁液となる調製物に適した分散性散剤および顆粒剤は、有効成分を、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤、および１種または複数種の保存剤との混加物として提供してもよい。適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤は、すでに上述されたものによって例示されている。いくつかの実施形態において、追加の賦形剤、例えば、甘味剤、香料、および着色剤が存在してもよい。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、水中油型エマルジョンの形態であってもよい。油相は、植物油、例えば、オリーブ油もしくはラッカセイ油、鉱油、例えば、流動パラフィン、またはその混合物を含んでもよい。任意選択で、適当な乳化剤は、天然に存在するガム、例えば、アカシアガムまたはトラガカントガム、天然に存在するリン脂質、例えば、大豆、レシチン、およびエステル、脂肪酸とヘキシトール無水物由来の部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレエート、または上記部分エステルと酸化エチレンの縮合物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであってもよい。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、滅菌した注射用水性または油性懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、上述の適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用する公知の方法に従って製剤化してもよい。任意選択で、滅菌した注射用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒の滅菌した注射用溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオールの溶液であってもよい。いくつかの実施形態において、使用される許容される媒体および溶媒の中には、水、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、リンゲル液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、いくつかの実施形態では、滅菌した不揮発性油を、溶媒または懸濁媒質として都合よく使用し得る。この目的のため、任意の無刺激不揮発性油は、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを使用してもよい。さらに、いくつかの実施形態では、オレイン酸などの脂肪酸を、注射剤の調製物に使用してもよい。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本発明の溶液は、単位剤形または複数の剤形のいずれかで、特にガラス製の密閉容器に入れて提供されてもよい。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本発明の成分の薬学的に許容される任意の塩は、本発明の溶液を調製するために使用されてもよい。適当な塩の例は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などの鉱物無機酸との塩、および酢酸、コハク酸、酒石酸、アスコルビン酸、クエン酸、グルタミン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸などの特定の有機酸との塩であってもよい。ある実施形態において、本発明の成分は、一塩酸塩、二塩酸塩、または三塩酸塩を含む塩酸塩であってもよい。
【００５４】
いくつかの実施形態において、組成物は、溶媒、張度調整剤、安定化剤、保存剤、またはその混合物と同じであってもよい共可溶化剤などの、１種または複数種の追加の成分も含んでもよい。溶液製剤に適していると思われる溶媒、共可溶化剤、張度調整剤、安定化剤、および保存剤の例を、以下に記載する。
【００５５】
いくつかの実施形態において、適当な溶媒および共可溶化剤としては、以下に限定されないが、水；注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）；生理食塩水；アルコール、例として、エタノール、ベンジルアルコールなど；グリコールおよび多価アルコール、例として、プロピレングリコール、グリセリンなど；多価アルコールのエステル、例として、ジアセチン、トリアセチンなど；ポリグリコールおよびポリエーテル、例として、ポリエチレングリコール４００、プロピレングリコールメチルエーテルなど；ジオキソラン、例として、イソプロピリデングリセリンなど；ジメチルイソソルビド；ピロリドン誘導体、例として、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ポリビニルピロリドン（共可溶化剤のみ）など；ポリオキシエチレン化脂肪アルコール；ポリオキシエチレン化脂肪酸のエステル；ポリソルベート、例として、Tween（商標）、ポリプロピレングリコールのポリオキシエチレン誘導体、例として、Pluronics（商標）が含まれてもよい。適当な張度調整剤としては、以下に限定されないが、薬学的に許容される無機塩化物、例として、塩化ナトリウム；デキストロース；ラクトース；マンニトール；ソルビトールなどが含まれてもよい。
【００５６】
いくつかの実施形態において、生理学的投与に適した保存剤は、例えば、パラヒドロキシ安息香酸のエステル、例として、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、またはそれらの混合物、クロロクレゾールなどであってもよい。
【００５７】
いくつかの実施形態において、適当な安定化剤としては、以下に限定されないが、単糖類、例として、ガラクトース、フルクトース、およびフコース、二糖類、例として、ラクトース、多糖類、例として、デキストラン、環状オリゴ糖、例として、α−、β−、γ−シクロデキストリン、脂肪族ポリオール類、例として、マンニトール、ソルビトール、およびチオグリセロール、環状ポリオール類、例として、イノシトール、ならびに有機溶媒、例として、エチルアルコールおよびグリセロールが含まれる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、上述の溶媒ならびに共可溶化剤、張度調整剤、安定化剤、および保存剤は、単独で、またはそのうちの２種以上の混合物として溶液製剤に使用できる。
【００５９】
ある実施形態において、医薬溶液製剤は、本明細書に記載されている組成物または薬学的に許容されるその塩、および塩化ナトリウム溶液（すなわち、生理食塩水）、デキストロース、マンニトール、またはソルビトールからなる群から選択される薬剤であって、５％以下の量で薬剤を含んでよい。いくつかの実施形態では、貯蔵安定性を改善するため、このような製剤のｐＨを、薬学的に許容される酸または塩基を使用して調整してもよい。
【００６０】
いくつかの実施形態において、製剤中の活性な胎盤成分または薬学的に許容されるその塩の濃度は、１００ｍｇ／ｍＬ未満であってもよい。例えば、濃度は、１００ｍｇ／ｍＬ未満、７５ｍｇ／ｍＬ未満、５０ｍｇ／ｍＬ未満、１０ｍｇ／ｍＬ未満、または０．０１ｍｇ／ｍＬより高く１０ｍｇ／ｍＬ未満、または０．５ｍｇ／ｍＬから５ｍｇ／ｍＬの間、または１ｍｇ／ｍＬから３ｍｇ／ｍＬの間であってもよい。ある実施形態において、使用される濃度は、処置されている疾患および／または状態を十分に処置するために理想的な濃度であり得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、溶液製剤において、本発明の種々の組成物は、ｐＨ６未満の溶液中、より長期間、溶解性または安定性がより高いことがある。さらに、いくつかの実施形態において、本発明の組成物中の成分の酸性塩は、その遊離塩基の対応物よりも水溶液における溶解性が高いことがあるが、酸性塩を水溶液に加える場合、溶液のｐＨが低すぎて、投与に適さないことがある。したがって、いくつかの実施形態において、ｐＨ４．５を上回るｐＨの溶液製剤は、投与される組合せ製剤のｐＨが、ｐＨ４．５以上となるように、ｐＨ７を上回る希釈液と投与前に混合してもよい。一実施形態において、希釈液は、水酸化ナトリウムなどの薬学的に許容される塩基を含む。別の実施形態において、希釈液のｐＨは１０から１２の間であってもよい。別の実施形態において、投与される組合せ製剤のｐＨは５．０を上回ってもよい。別の実施形態において、投与される組合せ製剤のｐＨはｐＨ５．０から７．０の間であってもよい。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物はフィルターを通してもよい。任意で、例えば先に明記された種類の共可溶化剤、張度調整剤、安定化剤、および保存剤など、１種または複数種の追加の成分は、組成物を除菌フィルターに通す前に溶液に加えてもよい。
【００６３】
組成物を使用する方法
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物は、本発明が対処するよう設計された疾患および／または状態に使用されることが知られている他の組成物との組合せ療法に使用してもよい。併用投与する化合物／組成物の投与量は、使用される併用薬物の種類、使用される特定の薬物、処置される疾患または状態などに応じて変更してもよい。さらに、いくつかの実施形態において、１種または複数種の生物学的に活性な薬剤と併用投与する場合、その際に提供される化合物／組成物は、本発明の生物学的に活性な薬剤とともに、または連続的に、のいずれかで投与してもよい。連続して投与する場合、主治医は、生物学的に活性な薬剤と組合せてタンパク質を投与する適切な順序を決定してもよい。
【００６４】
ある実施形態において、複数の治療剤は、任意の順序または同時でも投与してよい。同時に投与する場合、複数の治療剤は、単一の統一形態で、または複数の形態（ほんの一例として、単一の丸薬または２つの個別の丸薬のいずれかとして）で提供されてもよい。任意で、治療剤のうちの１種が、複数回で投与されてもよく、または両方が複数回で投与されてもよい。同時に投与されない場合、複数回投与の間のタイミングは、０週間より長く、４週間より短い間で変更されてもよい。さらに、いくつかの実施形態では、組合せ方法、組合せ組成物、および組合せ製剤は、２種の薬剤のみの使用に限定されるものではなく、複数の治療的組合せの使用も想定され得る。
【００６５】
ある実施形態において、本明細書中に開示されている組合せ療法を構成する医薬剤は、組み合わせた剤形または実質的な同時投与を意図した個別の剤形であってもよい。任意で、組合せ療法を構成する医薬剤は、二段階投与を必要とするレジメンによって投与されるいずれかの治療用化合物と共に連続的に投与してもよい。いくつかの実施形態において、二段階投与レジメンは、活性薬剤の連続投与または個別の活性薬剤の間隔をあけた投与を必要とする場合がある。いくつかの実施形態において、複数の投与段階の間の期間は、医薬剤の力価、溶解度、バイオアベイラビリティ、血漿内半減期、および動態プロファイルなど、各医薬剤の性質によって、数分間から数時間の範囲であってもよい。
【００６６】
さらに、本発明の組成物および本明細書に記載されている精製した組成物は、患者に追加の利益または相乗的利益をもたらし得る工程と組み合わせて使用してもよい。ほんの一例として、患者に期待されることは、本明細書に記載されている方法であって、本明細書中に開示されている化合物の医薬組成物および／または他の治療法との組合せを、個人が特定の疾患または状態と相関することが知られている変異遺伝子の保有者であるかどうかを判定する遺伝子検査と組み合わせ得る方法において、治療的利益および／または予防的利益を見いだすことである。
【００６７】
本明細書に記載されている本発明の組成物および組合せ療法は、疾患または状態の発生前、発生中、または発生後に投与することができ、１種または複数種の有効成分を含有する組成物を投与するタイミングは、変更してもよい。したがって、例えば、化合物は、予防薬として使用してもよく、状態または疾患を発症する傾向を有する対象に対して、疾患または状態の発生を予防するため、継続的に投与し得る。いくつかの実施形態において、本発明の製剤および組成物は、症状の発生中または発生後可能な限り速やかに、対象に投与することができる。例えば、製剤および組成物は、症状の発生後最初の４８時間以内、または症状の発生後最初の４８時間以内、または症状の発生後最初の６時間以内、または症状の発生後の３時間以内に投与を開始し得る。いくつかの実施形態において、初回投与は、例えば、静脈内注射、ボーラス注射、５分間から約５時間にわたる点滴、丸薬、カプセル、経皮パッチ、口腔内送達、局所投与など、または任意のそれら組合せなどの任意の実用的な投与経路を介したものであってもよい。いくつかの実施形態において、製剤および組成物は、疾患または状態の発生が検出されたまたは疑われた後できる限り速やかに投与してもよく、例えば、約１カ月から約３カ月など、疾患の処置に必要な期間投与してもよい。処置の期間は、各対象によって変更可能であり、期間は、既知の基準を使用して決定され得る。例えば、疾患または状態を処置する成分を含有する組成物は、少なくとも２週間、または約１カ月から約５年間、または約１カ月から約３年間投与してもよい。
【００６８】
本発明は、本発明の組成物および製剤を、処置を必要とする疾患および状態を処置するために使用され得るキットにおいて使用することにも関する。いくつかの実施形態において、このようなキットは、バイアル、チューブなど、１種または複数種の容器を収納するために区切られた輸送体、包装、または容器を含むことができる。任意で、各容器は、本明細書に記載されている方法で使用される個別の要素の１つを含んでもよい。適当な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれ得る。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成し得る。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される製造品は、包装材料を含有してもよい。医薬包装材料の例としては、以下に限定されないが、選択された製剤ならびに投与および処置のために意図された様式に適したブリスターパック、瓶、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、瓶、および任意の包装材料が含まれる。本明細書で提供される組成物の多様な製剤は、任意の疾患、障害、または状態に対する様々な処置として検討し得る。
【００７０】
種々の使用の方法が、本発明で検討される。方法には、上記処置を必要とする個人の処置を含む、本発明の胎盤調製物を作製および使用する方法が含まれる。
【００７１】
胎盤調製物
ある実施形態において、本発明は、粗均質化および細胞溶解を含む処理ステップを経てもよい胎盤組織に由来するものであってもよい、胎盤調製物に関する。いくつかの実施形態において、胎盤調製物を生成するため、胎盤組織を、固形物の細胞構成成分からの液体の分離、濾過、ならびに凍結乾燥および／または冷凍をさらに含む処理ステップにかけてもよい。いくつかの実施形態において、胎盤調製物は、１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、胎盤調製物は、１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤をさらに含む胎盤調製物を生成するため、以下のステップ：（ａ）均質化、（ｂ）細胞溶解、（ｃ）固形物の細胞構成成分からの液体の分離、ならびに（ｄ）凍結乾燥および／または凍結を、この順序で経た胎盤組織に由来するものであってもよい。いくつかの実施形態では、調製物を、分離ステップ後および凍結乾燥ステップ前に濾過してもよい。
【００７２】
いくつかの実施形態において、胎盤調製物は、１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤を粗均質化前に加えることを含む。いくつかの実施形態において、１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤は、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、ウシ肺アプロチニン、Ｎ−（ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニル）−Ｌ−ロイシン４−グアニジノブチルアミド、およびロイペプチンのうち１つまたは複数を含む。任意で、１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤は、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、ウシ肺アプロチニン、Ｎ−（ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニル）−Ｌ−ロイシン４−グアニジノブチルアミド、およびロイペプチンからなる群から選択されてもよい。
【００７３】
いくつかの実施形態において、胎盤組織は絨毛膜であってもよい。いくつかの実施形態において、胎盤調製物は、希釈剤、賦形剤、または担体をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、胎盤調製物は、プロテアーゼ阻害剤の非存在下で調製される調製物と比較して、より高濃度のインターロイキンを含んでもよい。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ阻害剤を含む調製物中に存在する他のタンパク質は、プロテアーゼ阻害剤の非存在下で単離される調製物中のタンパク質と比較して、より高濃度で単離されてもよい。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ阻害剤は、胎盤調製物から除去されなくてもよい。
【００７４】
ある実施形態において、本発明は、関節炎、創傷治癒、瘢痕処置、組織の増殖、組織の治癒、組織マトリックスの再生／修復、移植、炎症、およびＴＧＦ−βのシグナル伝達の調節に関連する状態を含む群から選択される疾病を有する個人を処置する方法であって、本明細書に列挙される胎盤調製物を投与することを含む方法に関する。組織は、生物学で一般に認められている意味、すなわち同様の細胞の集合体という意味に従って本明細書で使用されている。具体的な組織としては、以下に限定されないが、筋肉、神経、骨、結合、上皮、血管などが含まれる。
【００７５】
ある実施形態において、本発明は、関節炎、創傷治癒、瘢痕処置、組織の増殖、組織の治癒、組織マトリックスの再生／修復、移植、炎症、ならびにＴＧＦ−βおよび他のタンパク質のシグナル伝達の調節に関連する状態を含む群から選択される疾病を有する個人を処置する方法であって、粗均質化および細胞溶解を含む処理ステップを踏みうる胎盤組織に由来し得る有効量の胎盤調製物を、上記個人に投与することを含む上記方法に関する。いくつかの実施形態において、処理ステップは、胎盤調製物を生成するため、固形物の細胞構成成分からの液体の分離、濾過、ならびに凍結乾燥および／または冷凍をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、胎盤調製物は、１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤をさらに含んでもよい。上記方法のいくつかの実施形態において、１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤は、粗均質化前に加えてもよい。いくつかの実施形態において、１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤は、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、ウシ肺アプロチニン、Ｎ−（ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニル）−Ｌ−ロイシン４−グアニジノブチルアミド、およびロイペプチンを含む群から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、胎盤組織は絨毛膜であってもよい。いくつかの実施形態において、１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤は、上記個人への胎盤調製物の投与前に除去されてもよい。
【００７６】
ある実施形態において、本発明は、関節炎、創傷治癒、瘢痕処置、組織の増殖、組織の治癒、組織マトリックスの再生／修復、移植、炎症、およびＴＧＦ−βのシグナル伝達の調節に関連する状態を含む群から選択される疾病を有する個人を処置するための胎盤調製物を作製する方法であって、胎盤調製物を生成するため、胎盤組織を入手すること、プロテアーゼ阻害剤を胎盤組織に加えること、その後、以下のステップ：（ａ）粗均質化、（ｂ）細胞溶解、（ｃ）固形物の細胞構成成分からの液体の分離、ならびに（ｄ）凍結乾燥および／または凍結のうち１つまたは複数を実行することを含んでもよい上記方法に関する。いくつかの実施形態において、濾過ステップは、分離ステップ後および凍結乾燥ステップ前に実施してもよい。
【００７７】
いくつかの実施形態において、分離ステップは、遠心分離によって実施してもよい。いくつかの実施形態において、凍結乾燥ステップは、減圧下で実施してもよい。例えば、凍結乾燥ステップは、０．５気圧以下、または０．３気圧以下、または０．２気圧以下、または０．１気圧以下、または０．０５気圧以下、または０．０１気圧以下、または０．００１気圧以下で実施してもよい。いくつかの実施形態において、胎盤組織は絨毛膜を含んでもよい。いくつかの実施形態において、胎盤組織は絨毛膜からなることがある。
【実施例１】
【００７８】
以下のとおり、胎盤／羊膜を入手し、ヒト胎盤ホモジネートを単離した。胎盤／羊膜は、胎盤提供によって契約病院から入手した。米国組織バンク協会（ＡＡＴＢ）のガイドラインに従って、ドナーのスクリーニングを行った。胎盤／羊膜は、０．９％通常生理食塩水（ＮＳ、１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、３０８ｍＯｓｍ／Ｌ）に入れられた。胎盤を、０．９％ＮＳから取り出し、胎盤ディスクを、羊膜、絨毛膜、および臍帯から分離し、およそ１．５インチ×２インチの小片に切り分けた。これらのより小さい小片の胎盤ディスクを、およそ４００ｍＬの１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、４．３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）を含む容器に入れた。容器を、振盪プラットフォームに置き、１２０ｒｐｍで１２〜２４時間振盪した。胎盤ディスクの小片を、１ＸＰＢＳまたはプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）を１Ｘ最終濃度（ＡＥＢＳＦ５００μＭ、アプロチニン１５０ｎＭ、Ｅ−６４  １μＭ、ロイペプチン１μＭ）で含有する１ＸＰＢＳと共に、実験室用ブレンダーを使用して粗く均質化した。粗ホモジネートを２５０ｍＬ容器に入れ、４，０００倍重力で１０分間遠心分離した。粗ホモジネートを、組織体積：総体積がおよそ１：５の割合となるように容器に注ぎ入れた。容器を、ボルテックスにかけ／振盪してペレットを再懸濁させた。懸濁液を、４，０００倍重力で１０分間遠心分離する。合計で３回洗浄されるように、この洗浄工程を繰り返す。最後の洗浄後は、混合物を遠心分離しなかった。これらの洗浄によって組織から血液が除去された。２５０ｍＬ容器の内容物を、１ＸＰＢＳまたは１ＸＰＢＳ−１ＸＰＩのいずれかで、体積が２倍になるまで希釈した。次に、混合物を、高圧ホモジナイザーに接続した保持型供給部に入れた。次に、ホモジネートを２５０ｍＬ容器に入れ、１５，０００倍重力で１０分間遠心分離した。
【００７９】
この工程を６つの胎盤ディスクに対して実施した。粗均質化ステップでは、胎盤ディスクを、最後に１ＸＰＢＳを用いる群と最後に１ＸＰＢＳ−１ＸＰＩを用いる別の群の２つの群に分けた。
【００８０】
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader（Bio-Rad Laboratories社製、Hercules、CA）を使用して、胎盤ディスクから抽出した溶液中に存在するサイトカインおよび増殖因子の量を定量化した。Bio-Plex Pro Human Chemokine plane、40-plexアッセイ（Bio-Rad Laboratories社製、Hercules、CA）を入手した。標準品を適切な希釈剤で希釈した。アッセイビーズを希釈し、５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに加え、アッセイ緩衝液で２回洗浄した。プレートを磁気プレートホルダー上に置き、溶液をウェルから除去した。標準品、サンプル、およびブランクを、９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、室温で１時間インキュベートした（注記：各標準品、サンプル、およびブランクに対して２回測定が行われた）。プレートを磁気プレートホルダー上に置き、溶液を除去し、洗浄緩衝液で洗浄し、さらにウェルプレートを磁気プレートホルダー上に置くことで洗浄緩衝液を除去することによって、プレートを洗浄した。検出抗体を各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ストレプトアビジン−ＰＥ指示薬を各ウェルに加えた。プレートを、室温の暗所で１０分間インキュベートした。プレートをアッセイ緩衝液中で３回洗浄し、MAGPIX multiplex readerで測定を行った。Bio-Plex readerソフトウェア（Bio-Rad Laboratories社製、Hercules、CA）でデータを分析し、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて処置群を比較した。
【００８１】
以下の表１は、プロテアーゼ阻害剤の存在下および非存在下における、胎盤から単離されたタンパク質濃度のデータを示す。
【表１】
2019508478.tif 000003
【００８２】
表１のデータは、プロテアーゼ阻害剤の添加によって、胎盤から単離された種々のタンパク質の量が増加することを示す。理論に束縛されるものではないが、タンパク質濃度の増加によって、種々のタンパク質のバイオアベイラビリティが増加し、疾患および／または状態を処置することに役立つ可能性が高い。
【００８３】
図１〜４は、プロテアーゼ阻害剤の存在下（濃い色のバー）およびプロテアーゼ阻害剤の非存在下（薄い色のバー）における、種々の羊膜タンパク質を定量するアッセイの結果を示す。図１は、胎盤組織から単離されたインターロイキン２（ＩＬ−２）およびマクロファージ炎症性タンパク質３（ＭＩＰ−３α）のタンパク質濃度を示す。図２は、胎盤組織から単離された顆粒球走化性タンパク質２（ＧＣＰ−２）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、およびマクロファージ炎症性タンパク質１（ＭＩＰ−１α）のタンパク質濃度を示す。図３は、胎盤組織から単離されたインターロイキン８（ＩＬ−８）のタンパク質濃度を示す。図４は、胎盤組織から単離されたマクロファージ阻止因子（ＭＩＦ）のタンパク質濃度を示す。プロテアーゼ阻害剤を含む組成物はすべて、プロテアーゼ阻害剤を含まないものと比較して、単離されたタンパク質濃度において統計的に有意な増加を示した。最も少ない増加はＩＬ−２であり、プロテアーゼ阻害剤を含む組成物中のＩＬ−２濃度がほぼ２４％増加し、ｐ値は０．０５未満であった（図１）。タンパク質濃度の同様の増加は、ＭＩＦ、ＧＣＰ−２、およびＭＩＰ−１αにおいて認められ、それぞれ、プロテアーゼ阻害剤を含まないものを上回って、プロテアーゼ阻害剤を含む組成物中、４２〜５２％の増加を示した。ＧＣＰ−２およびＭＩＰ−１αのｐ値は、０．０１未満であり、ＭＩＦのｐ値は、０．０５未満であった（図２および図４）。タンパク質濃度の有意な増加は、プロテアーゼが阻害された組成物中のＭＩＰ−３αおよびＭＣＰ−１において認められ、それぞれ１１１％および３１２％の増加と、２倍を超えるタンパク質濃度であった。ＭＩＰ−３αのｐ値は、０．０５未満であり、ＭＣＰ−１のｐ値は、０．０１未満であった（図１および図２）。タンパク質濃度の顕著な増加は、ＩＬ−８において認められ、プロテアーゼ阻害剤を含まないものを上回って、プロテアーゼ阻害剤を含む組成物中、１１７３％の増加であり、ｐ値は０．０５％未満であった（図３）。
【実施例２】
【００８４】
以下の方法は、本発明の胎盤調製物を作製するために用いることができる本発明の１つの工程の例示である。
【００８５】
ステップ１
胎盤／羊膜は、胎盤提供コーディネーターによって契約病院から入手する。コーディネーター／ＱＡ部門は、ＡＡＴＢおよび企業基準に従って、ドナーのスクリーニングを行う。コーディネーターは、胎盤／羊膜を、０．９％通常生理食塩水（ＮＳ）に入れる。
【００８６】
ステップ２
胎盤を、０．９％ＮＳから取り出し、およそ１．５インチ×２インチの小片に切り分ける。より小さい小片を、およそ４００ｍＬの１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の入った容器に入れる。容器を、振盪プラットフォームに置き、１２０ｒｐｍで１２〜２４時間振盪する。ＰＢＳ中で組織を振盪することによって、組織中から全量の血液を除去する。
【００８７】
ステップ３
粗均質化：胎盤小片を、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）も１Ｘ最終濃度で含有する１ＸＰＢＳと共に、実験室用ブレンダーを使用して粗く均質化した。胎盤の細胞内に存在するタンパク質、具体的には、増殖因子、ケモカイン、およびサイトカインの分解を防ぐため、プロテアーゼ阻害剤を用いてもよい。
【００８８】
遠心分離：粗ホモジネートを２５０ｍＬ容器に入れ、１０，０００×ｇで５分間遠心分離する。このステップによって、混合された組織から血液を含む液体が分離される。混合された組織は、容器の底でペレットを形成し得る。血液を含む液体は捨てられる。
【００８９】
洗浄：１ＸＰＩの１ＸＰＢＳを、組織体積：総体積が〜１：５の割合となるように容器に注ぎ入れる。容器を、ボルテックスにかけ／振盪してペレットを再懸濁させる。懸濁液を、４，０００×ｇで５分間遠心分離する。合計で３回洗浄されるように、この洗浄工程を繰り返す。最後の洗浄後は、混合物を遠心分離しない。これらの洗浄によって組織から血液を除去する。混合物を４℃に冷却する。
【００９０】
ステップ４
細胞溶解は、次の工程のうちの１つによって達成される。細胞溶解によって、ケモカイン、サイトカイン、および増殖因子が細胞から流出し得る。
【００９１】
高圧均質化：２５０ｍＬ容器の内容物を、１ＸＰＩの１ＸＰＢＳで希釈して体積を２倍にする。次に、混合物を、高圧ホモジナイザーに接続した冷却した保持型供給部に入れる。このステップの目的は、任意の非溶解細胞を溶解することである。ケモカインおよびサイトカインのレベルと生物活性に関する試験によって、圧力および試行回数を最適化することになる。
【００９２】
凍結／解凍：２５０ｍＬ容器の内容物を、滅菌バッグに入れ、ヒートシーラを使用して二重に密封した。密封後、バッグを、−３０℃のフリーザー内のトレーに置く。バッグの数は、粗ホモジネート混合物の総体積に基づいて変更する。トレーに置いた際にバッグの厚みがおよそ１インチとなる量まで、粗ホモジネートをバッグに注ぎ入れる。凍結した粗ホモジネートのバッグを、フリーザーから取り出し、３７．８℃〜４３．３℃の温水浴槽に置く。ホモジネートは、完全に解凍したら直ちに温水浴槽から取り出す。解凍した混合物を、容器に注ぎ入れ、手持ち式ホモジナイザーを高速で使用して混合する。混合した混合物を、無菌バッグに入れて密封する。合計最大３回の凍結／解凍されるように、この工程を繰り返す。
【００９３】
化学的溶解：粗ホモジネートを遠心分離し、上清を捨てる。ペレットをBio-Rad細胞洗浄緩衝液で洗浄する。細胞洗浄緩衝液の量は、組織体積に基づいて変更する。組織体積の２倍の緩衝液を加える。ペレットおよび緩衝液を、ボルテックスにかけ／撹拌してペレットを再懸濁させる。混合物を、１０，０００×ｇで５分間遠心分離する。上清を捨てる。Bio-Rad細胞溶解液を加える。細胞溶解液の量は、組織体積に基づいて変更する。組織堆積の２倍の溶解液を加える。ペレットおよび溶解液を、ボルテックスにかけ／撹拌してペレットを再懸濁させる。混合物を冷蔵庫に入れて５分間静置する。
【００９４】
遠心分離：上記の工程のうちの１つが完了した後、ホモジネートを、２５０ｍＬ容器に入れ、１５，０００Ｘｇで１０分間遠心分離する。このステップによって、液体から細胞破片を分離する。液体は、ケモカイン、サイトカイン、および増殖因子を含有するはずである。上清は保持される。
【００９５】
ステップ５
減圧濾過：上記のステップから得た上清を、減圧濾過システムに入れる。システムは２つのフィルターを備える。最初のフィルターは孔径１μｍ、続くフィルターは孔径０．４５μｍである。このステップは、残りすべての細胞破片を除去し、上清を清澄化するものである。濾液は保持される。
【００９６】
ステップ６
ＨＰＨ（ヒト胎盤ホモジネート）調製物−ＰＨは、以下のうちの１つの方法で保存可能である：（１）凍結乾燥し、凍結乾燥後の生物活性を確認する試験を行いつつ滅菌バイアルに入れる、（２）後の使用、例えば、注射のために液体剤形で滅菌バイアルに入れる、または（３）噴霧乾燥する。ＨＰＨは、羊膜など、他の胎盤生成物と組み合わせてもよい。一例である、浸漬羊膜では、以下の工程を用いてもよい。
【実施例３】
【００９７】
実施例１で生成された材料を使用した創傷アッセイ。
創傷治癒の標準ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイであるスクラッチアッセイを、胎盤ディスク抽出物からの１ＸＰＢＳおよび１ＸＰＢＳ−１ＸＰＩの両サンプル３つずつに対して実施した。ヒト皮膚線維芽細胞は、１０％でウシ胎児血清を有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、１２ウェルプレート中で培養された。単層が得られた際に、セルスクレーパーを使用して培地の底から細胞の細い線を除去した。ウェルを、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で３回洗浄して溶解細胞を除去した。各ウェル中において無血清ＤＭＥＭ中で総体積のおよそ１０％となる被験物を投与した。製造業者の使用説明書に従ってArrayScan ZTIで、最初の２４時間は２時間毎、その後、４８時間および７２時間後に１回撮影された顕微鏡写真によって、プレートを分析した。
【００９８】
図５に、創傷治癒アッセイの結果を示す。２４時間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ創傷治癒アッセイを実施し、（Ａ）陰性対照である、血清を含有していない通常増殖培地、（Ｂ）上記の培地中、プロテアーゼ阻害剤で処理した１０％体積のＨＰＨ溶液、または（Ｃ）Ａに記載されている培地中、プロテアーゼ阻害剤で処理していない１０％体積のＨＰＨ溶液を用いて、線維芽細胞を処理した。画像の一番上の線は、０時間における創傷の元の線を表し、一方で一番下の線は、創傷空間で最も遠くに移動した細胞の位置を示す。創傷治癒にとっては、より遠い距離のものが望ましい。画像は創傷後２４時間からのものである。阻害剤で処理したＨＰＨ（Ｂ）を用いた線維芽細胞の処理によって、陰性対照（Ａ）を用いた場合のほぼ２倍の細胞遊走が得られた。陰性対照（Ａ）は、阻害剤で処理していないＨＰＨの細胞遊走（Ｃ）とほぼ同等であった。
【実施例４】
【００９９】
胎盤／羊膜は、胎盤提供によって契約病院から入手した。米国組織バンク協会（ＡＡＴＢ）に従って、ドナーのスクリーニングを行った。胎盤／羊膜は、０．９％通常生理食塩水（ＮＳ、１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、３０８ｍＯｓｍ／Ｌ）に入れた。胎盤を、０．９％ＮＳから取り出し、胎盤ディスクを、羊膜、絨毛膜、および臍帯から分離し、およそ１．５インチ×２インチの小片に切り分けた。これらのより小さい小片の胎盤ディスクを、およそ４００ｍＬの１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、４．３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）が入った容器に入れた。容器を、振盪プラットフォームに置き、１２０ｒｐｍで１２〜２４時間振盪した。胎盤ディスクの小片を、１ＸＰＢＳ、または、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）を１Ｘ最終濃度（ＡＥＢＳＦ５００μＭ、アプロチニン１５０ｎＭ、Ｅ−６４  １μＭ、ロイペプチン１μＭ）で含有する１ＸＰＢＳと共に、実験室用ブレンダーを使用して粗く均質化した。粗ホモジネートを２５０ｍＬ容器に入れ、４，０００×重力（ｇ）で１０分間遠心分離した。粗ホモジネートを、組織体積：総体積がおよそ１：５の割合となるように容器に注ぎ入れた。容器を、ボルテックスにかけ／振盪してペレットを再懸濁させた。懸濁液を、４，０００×ｇで１０分間遠心分離した。合計で３回洗浄されるように、この洗浄工程を繰り返した。最後の洗浄後は、混合物を遠心分離しなかった。これらの洗浄によって組織から血液は除去される。２５０ｍＬ容器の内容物を、１ＸＰＢＳまたは１ＸＰＢＳ−１ＸＰＩのいずれかで、体積が２倍になるまで希釈した。次に、混合物を、高圧ホモジナイザーに接続した保持型供給部に入れた。次に、ホモジネートを２５０ｍＬ容器に入れ、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離した。この工程を６つの提供された胎盤ディスクに対して実施した。
【０１００】
妊娠満期の羊水は、提供によって契約病院から入手され、ＡＡＴＢ基準に従って、ドナーのスクリーニングを行った。サイトカインおよび増殖因子の定量のため、ドナー１０名からの液体を収集した。
【０１０１】
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader（Bio-Rad Laboratories社製、Hercules、CA）を使用して、胎盤ディスクから抽出した溶液中に存在するサイトカインおよび増殖因子の量を定量化した。Bio-Plex Pro Human Chemokine plane、40-plexアッセイ（Bio-Rad Laboratories社製、Hercules、CA）を入手した。標準品を適切な希釈剤で希釈した。アッセイビーズを希釈し、５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに加え、アッセイ緩衝液で２回洗浄した。プレートを磁気プレートホルダー上に置き、溶液をウェルから除去した。標準品、サンプル、およびブランクを、９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、室温で１時間インキュベートした（注記：各標準品、サンプル、およびブランクに対して２回測定が行われた）。プレートを磁気プレートホルダー上に置き、溶液を除去し、洗浄緩衝液で洗浄し、ウェルプレートを磁気プレートホルダー上に置くことで洗浄緩衝液を除去することによって、プレートを洗浄した。検出抗体を各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ストレプトアビジン−ＰＥ指示薬を各ウェルに加えた。プレートを、室温の暗所で１０分間インキュベートした。プレートをアッセイ緩衝液で３回洗浄し、MAGPIX multiplex readerで測定を行った。Bio-Plex readerソフトウェア（Bio-Rad Laboratories社製、Hercules、CA）でデータを分析し、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて処置群を比較した。
【０１０２】
１６〜２０週の羊水由来のサイトカインおよび増殖因子の値は、以下に挙げた出版物から得た：
１．Heikkinen J, Mottonen M, Pulkki K, Lassila O, Alanen A. Cytokine levels in midtrimester amniotic fluid in normal pregnancy and in the prediction of pre-eclampsia. Scand J Immunol. 2001;53(3):310-4。
２．Payne MS, Feng Z, Li S, Doherty DA, Xu B, Li J, Li L, Keelan JA, Zhou YH, Dickinson JE, Hu Y, Newnham JP. Second trimester amniotic fluid cytokine concentrations, Ureaplasma sp colonization status and sexual activity as predictors of preterm birth in Chinese and Australian women. BMC Pregnancy Childbirth. 2014;14:340。
３．Burns C, Hall ST, Smith R, Blackwell C. Cytokine levels in late pregnancy: Are female infants better protected against inflammation? Front Immunol; 6:318。
【０１０３】
結果を図６に示す。記載された方法によって生成される生成物は、標準偏差がより小さいことから示されるとおり、妊娠満期の羊水よりも、１６〜２０週の羊水の方がばらつきが少ない。記載された方法によって生成される生成物は、１１〜２５％変動する一方で、天然の生成物（両羊水）中の量は、４４〜１００％超変動し得る。記載された方法によって生成された生成物の炎症成分および抗炎症成分の間にもより望ましいバランスがある。炎症成分である、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αは、妊娠満期の羊水中で認められるよりも、記載された方法によって生成された生成物中の方が極めて少ない。ＩＬ−１０に対するＩＬ−６の割合は、妊娠満期の羊水中（３４．５）よりも、記載された方法によって生成された生成物中（１０．８）の方が望ましい。妊娠満期の羊水中で認められるよりも、記載された方法によって生成された生成物中の抗炎症成分である、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１の量はより多い。最終的に、記載された方法によって生成された生成物中のこれらのタンパク質、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、およびＭＣＰ−１の量は、妊娠満期の羊水よりも、報告されている１６〜２０週の羊水中の量と同程度である。
【０１０４】
本明細書で用いる「有効量」という用語は、処置する疾患または状態の症状のうち１種または複数種をある程度緩和する、投与される薬剤、化合物、または成分の十分な量を指す。結果として、疾患の徴候、症状、もしくは原因の減少および／または軽減、または他の望ましい生物学的システムの変化が生じ得る。例えば、治療的使用のための「有効量」とは、過度に有害な副作用を伴わずに、疾患症状の臨床的に有意義な減少を得るために必要とされる、本明細書中に開示されている化合物を含む組成物の量である。任意の個別の症例における適当な「有効量」は、用量漸増試験などの技術を用いて決定してもよい。本明細書中に開示されている化合物／成分の「有効量」は、過度の有害な副作用を伴わずに、望ましい薬理効果または治療的改善を達成するために有効な量である。「効果量」は、組成物の代謝、年齢、体重、対象の全身状態、処置される状態、処置される状態の重症度、および処方医師の判断に差異があるため、対象によって変化する可能性があると理解される。
【０１０５】
上記の任意の特徴が、上記の他の任意の特徴（これらの特徴が共に記載されていない場合であっても）と組み合わせることができることは検討されており、このため本発明の範囲内である。記載された任意の要素を、本発明の組成物（本発明の望ましい有用性をもたらすために必要なもの以外）および／または方法から削除することができることは、本発明で検討されており、このため本発明の範囲内であると理解されるべきである。範囲を開示する場合、その範囲の範囲内に適合する任意の数値的ポイントは、部分範囲の新規の評価項目として検討されることに留意すべきである。さらに、本発明の化合物、組成物、および方法に加えられる可能性のある若干の改良は、本発明で検討されていると理解されるべきである。いずれにしても、本発明は、続く以下の特許請求の範囲および法律が許す解釈の幅によって規定される。
【図１】
2019508478.tif 000004
【図２】
2019508478.tif 000005
【図３】
2019508478.tif 000006
【図４】
2019508478.tif 000007
【図５】
2019508478.tif 000008
【図６】
2019508478.tif 000009
【国際調査報告】
2019508478.tif 000010
2019508478.tif 000011